Применение технологии твердофазной ферментации в производстве биопродуктов

УДК 663.11, 663.18, 663.541

Б. А. Кулишов, Ле Ань Туан

ПРИМЕНЕНИЕ ТЕХНОЛОГИИ ТВЕРДОФАЗНОЙ ФЕРМЕНТАЦИИ В ПРОИЗВОДСТВЕ БИОПРОДУКТОВ

Ключевые слова: субстрат, микроорганизмы, твердофазная ферментация, биопродукты.

Проведен анализ областей применения технологии твердофазной ферментации. Показана перспективность применения метода твердофазной ферментации в производстве биологически активных веществ, в пищевой промышленности, производстве биотоплива, утилизации сельскохозяйственных отходов.

Keywords: substrate, yeast, bacteria, digestion, waste treatment, biogas solid, state fermentation.

The analysis of the applications of solid-phase fermentation technology was produced. The prospects of applying the method of solid-state fermentation in the production of biologically active substances in the food industry, biofuel production and utilization of agricultural waste is showed.

Актуальность. Развитие пищевой биотехнологии определяет совершенство современной пищевой промышленности и способствует эффективному использованию сырье и вторичных ресурсов. Продукты, получаемые из отходов биотехнологическими способами, выгодно отличаются от традиционных химических тем, что сырьем для их получения служат возобновляемое сырье животного и растительного происхождения. Индустриальная биотехнология сводится к ферментационным процессам, проводимым в жидкой (ЖФФ) и твердой (ТФФ) фазах. Занимаясь их разработкой, исследователи руководствуются следующими основными соображениями: получаемые продукты не должны представлять опасности для окружающей среды, а их себестоимость должна быть как можно ниже. Традиционным способом применения твердофазной ферментации является производство продуктов вторичного метаболизма (антибиотики, алкалоиды, гормоны роста и т. д.), биологическое топливо, ферменты, органические кислоты, ароматические соединения, биологические методы детоксикации агропромышленных отходов, пищевые добавки, биофармацевтические продукты и т.д. [1,2].

Цель настоящей работы - анализ областей применения твердофазной ферментации в производстве биопродуктов в микробиологической, химической, пищевой, топливной, биохимической промышленностях.

ТФФ сводится к культивированию микроорганизмов на твердых субстратах в отсутствии свободной влаги. При культивировании микроорганизмов методом ТФФ в качестве субстратов используют рис, пшеницу, ячмень, просо, бобовые культуры. Представляют интерес и нетрадиционные субстраты, такие как отруби пшеницы, соевый жмых, отходы целлюлозно-бумажной промышленности.

Преимущества ТФФ следующее:

1. Низкое содержание возможности контаминации дрожжами.

2. Условия окружающей среды подобны естественной среде обитания для грибов, которые

перед ЖФФ

воды уменьшает бактериями и

составляют основную группу микроорганизмов, используемых для ТФФ.

3. Более высокий уровень аэрации, особенно необходимый в процессах с интенсивным окислительным метаболизмом.

4. Инокуляция вместе со спорами облегчает однородное рассеивание в среде.

5. Твердые субстраты обычно дают все питательные вещества, необходимые для роста колонии.

6. Обогащенные субстраты позволяют использовать более простые и экономичные конструкции биореакторов.

7. Малые энергозатраты.

8. В силу высокой концентрации биопродукта необходимость в специальных растворителях снижена.

9. Низкий уровень влажности может положительно сказаться на производстве определенных продуктов, которые не могут быть культивированы в условиях ЖФФ.

10. Производительность для продуктов, полученных ТФФ, более высокая.

В то же время ТФФ имеет некоторые недостатки при сравнении с ЖФФ:

1. Могут использоваться только микроорганизмы, которые способны расти при низких уровнях влажности.

2. Обычно субстраты требуют предварительной обработки (уменьшение размера, гомогенизация, химический или ферментативный гидролиз, варка или обработка паром).

3. Затруднен анализ параметров биомассы (влажность, рН, массообмен, теплообмен).

4. Возникают трудности в контроле параметров процесса (рН фактор, влагосодержание и концентрация субстрата, кислорода и биомассы).

5. Много важных научных и технических аспектов очень слабо изучены. Информация о проектировании и работе биореакторов в крупном масштабе недостаточна.

6. Возможность контаминации нежелательными грибами.

7. Затруднения в отводе теплоты, выделяемой в течение роста.

8. Экстракты, содержащие продукты, полученные ТФФ, часто являются вязкими.

9. В некоторых видах ТФФ аэрация может быть затруднена из-за высокой концентрации твердых частиц.

10. Продолжительность культивирования увеличена в связи с необходимостью в прорастании спор.

11. Продолжительность культивирования значительно больше, чем в ЖФФ.

Часть выявленных недостатков ТФФ, по сравнению с ЖФФ, может быть снята при глубоком изучении твердофазной ферментации. Ряд исследователей утверждают, что ТФФ эффективнее и экономичнее, чем ЖФФ в производстве широкого спектра биопродуктов (корма, ферменты, органические кислоты, ароматизаторы,

антибиотики, компост, биопестициды и т.д).

Результаты проведенных экспериментов убедительно показывают, что качество продуктов, полученных ТФФ, в ряде случаев значительно выше, чем продуктов, полученных жидкофазным способом. В связи с этим считается, что целесообразно проводить дальнейшие исследования в области твердофазной ферментации по устранению недостатков, связанных с анализом биомассы, контролированием основных параметров процесса, контаминацией, отводом метаболической теплоты и аэрацией [3].

Твердофазное культивирование

используется для выращивания микроорганизмов с целью выделения биомассы, либо продуктов метаболизма, либо микробного измененного питательного субстрата (например, в технологии производства пищевых продуктов). Твердофазное культивирование подразумевает рост

микроорганизмов или грибков на твердых субстратах в газовой фазе, но без свободной водной фазы.

При выборе микроорганизмов для культивирования необходимо учитывать их специфические свойства. Бактерии и дрожжи также могут быть культивированы твердофазным способом. Однако мицелиальные грибы лучше всего приспособлены для ТФФ вследствие их физиологических, энзимологических и

биохимических свойств. Характерный способ роста грибов позволяет мицелиальным грибам проникнуть в твердые субстраты, что также дает им главное преимущество перед одноклеточными

микроорганизмами для колонизации субстрата и использования доступных питательных веществ. Кроме того, их способность расти в условиях низкого влагосодержания и высокого осмотического давления делает грибы эффективными и конкурентоспособными в естественной микрофлоре для биоконверсии твердых субстратов.

В ТФФ можно выявить два типа процессов, в зависимости от природы твердой фазы. В первом случае твердые частицы субстрата служат основой для роста и источником питательных веществ. Такими субстратами являются не растворимые в воде гетерогенные материалы - побочные продукты

от сельскохозяйственной и пищевой промышленности, которые имеют крахмалистую или лигноцеллюлозную природу (зерна и побочные продукты зерна, маниока, картофель, бобы и мякоть сахарной свеклы).

Во втором случае субстрат, в качестве которого используются выжимки сахарной свеклы, пенька, инертные волокна, смолы, пена полиуретана и вермикулит, пропитан жидкой средой, которая содержит все питательные вещества (сахар, липиды, органические кислоты и т.д.). Этот способ используется реже, но обладает рядом преимуществ. Использование определенной жидкой среды и инертной основы улучшает управление процессом, но этот способ не всегда экономически целесообразен [4].

Основными факторами, оказывающими влияние на результаты ТФФ, являются такие свойства субстрата, как размер частиц, их форма и пористость, а также условия массобмена в питательной среде, температура, уровень кислотности и влагосодержание среды. Роль влагосодержания субстрата была широко описана и рассмотрена различными авторами [5,6,7].

Влагосодержание - критический фактор ТФФ, который влияет на рост и биосинтез метаболитов. Оптимальный уровень влажности субстрата колеблется между 30 и 75 %. Более низкое влагосодержание вызывает снижение

растворимости питательных веществ, споруляцию. Более высокий уровень влажности вызывает помехи роста, сокращение пористости и обмен кислородом, увеличивается риск бактериального загрязнения [5,6].

В ТФФ различают два типа массопередачи: в микромасштабе (передачей в клетки и из клеток микроорганизма) и в макромасштабе (передача кислорода, конвекция) вне клеток.

Выделение теплоты в ТФФ - результат метаболизма, влияет непосредственно на прорастание спор, рост и формирование продукта. Количество выделяемой теплоты зависит от вида микроорганизмов, пористости, диаметра частиц и толщины слоя субстрата.

Контролировать температуру при ТФФ значительно сложнее, чем при ЖФФ, из - за физико-химических свойств субстрата. Уровень рН фактора регулируется дозированием источников азота (соли аммония, нитраты).

Методом твердофазной ферментации производят традиционные пищевые продукты бренда «код», индонезийского <йетреЬ» или индийского «ragi». ТФФ также используется для производства ферментов, органических кислот, биопестицидов, биологического топлива, ароматизаторов, биоремидации, биологической деградации опасных веществ, детоксикации агропромышленных остатков. Твердофазный способ ферментации нашел широкое распространение в различных отраслях промышленности [3].

В зерновой и крупяной промышленности методом ТФФ получают красный ячмень, подвергая ячмень ферментации с использованием культуры

Monascus purpureus. Следует отметить, что антиокислительная активность красного ячменя в 1970 раз больше, чем природного витамина Е. Биологической функцией красной ячменя является задержка старения человека, укрепление иммунной системы, стимуляция устранения тяжелых металлов из человеческого тела [8,9].

Уже достаточно давно методы ТФФ широко применяются для получения сырья кондитерского производства - какао. Ферментация является первоначальной стадией обработки свежих какао бобов. При ферментации происходят изменения в пульпе и семядолях, связанные с действием ферментов. Различают внешнюю ферментацию, обусловленную биохимическими процессами в пульпе, и внутреннюю - связанную с физико-химическими процессами в семядолях. Внешняя ферментация (в пульпе) создает условия для внутренней ферментации (в какао бобах), что смягчает горький вяжущий вкус какао бобов и изменяет их окраску. Длительность ферментации выбирается в зависимости от сортовых особенностей бобов. Ферментация благородных сортов длится 2 - 3 суток, а потребительских 5 - 7 суток. После ферментации какао бобы подвергают сушке. Сушка может производиться естественным путем (солнечная сушка) или нагретым воздухом при температуре 40 °С. Во время сушки удаляется от 60 до 40 % влаги, продолжаются процессы аэробной стадии ферментации, что сопровождается уменьшением горького и вяжущего вкуса и усилением коричневой окраски бобов. Таким образом, ферментация и сушка свежих бобов являются необходимой и важной стадией их первичной обработки, в результате которой изменяется структура, оболочка и ядро становятся более твердыми и хрупкими, что позволяет транспортировать и складировать какао бобы. Благодаря низкой влажности они могут храниться длительное время без признаков порчи. Кроме того, улучшается вкус и аромат, цвет какао бобов из белого или фиолетового изменяется в коричневый или коричнево - красный. Эти изменения в свойствах и химическом составе какао бобов имеют важное значение в шоколадном производстве.

Очень важное значение ТФФ имеет при производстве черного чая. Термин «ферментация» по отношению к чайному производству впервые стал использоваться в 1901 г. как название процесса окисления, начатого ферментами чая. На долю процесса ферментации выпадает основная часть химических преобразований, происходящих при изготовлении чая. Результатом этого процесса является образование теафлавинов и теарубигинов, придающих настою черного чая его характерный красно - коричневый цвет.

Одним из самых важных процессов в обработке кофейных зерен также является ферментация. После сбора плодов кофейные «вишни» обрабатывают одним из двух традиционных способов - «сухим» или «влажным». В первом («сухом») случае собранные плоды раскладываются прямо под солнцем, сушатся до

полного усыхания, а затем с них счищается кожура. Во влажной же обработке с плодов сначала счищается кожура, зерна моются, а затем начинается процесс их ферментации. Для этого кофейные зерна погружаются в баки - бассейны с водой на время от 12 до 36 часов. Энзимы и бактерии расщепляют мякоть вишни. Очищенные зерна промывают и сушат на солнце либо в механических сушилках. Метод сушки зависит от региона произрастания. Благодаря сухой или влажной обработке кофейные зерна в результате ферментации приобретают вкус и аромат, который раскрывается при жарке зерен и в готовом напитке.

Если провести дополнительную

ферментацию зерен кофе дрожжевыми или грибными культурами, то можно получить принципиально другие напитки на основе дополнительно ферментированного кофе [10].

Биокатализ на твердофазном субстрате является одним из этапов производства этанола из растительного сырья. Используя амилолитические ферменты, производят гидролиз крахмала до глюкозы, которые затем сбраживаются дрожжами. [11,12].

Твердофазная ферментация позволяет также осуществлять комплексную переработку сельскохозяйственных отходов, в частности, навоза, помета и растительных отходов. При этом каждый компонент сначала подготавливается по отдельности, затем они смешиваются, образуя питательную среду для развития микроорганизмов с наиболее оптимальным соотношением питательных веществ и минеральных компонентов [13,14,18,19].

Анаэробное сбраживание из навоза крупного рогатого скота или свиней позволяет получить шлам, содержащий растворенные азотистые питательные вещества и летучие жирные кислоты. Весь анаэробный ил, в том числе жидкая и твердая фаза, непосредственно используются в формировании ферментационной среды для аэробной ферментации. Побочным продуктом является газ, содержащий метан, который формируется в анаэробной стадии и может быть использован в качестве котельного топлива.

Предварительная обработка целлюлозных растительных остатков, таких как солома зерновых культур, включает в себя обработку слабоконцетрированной щелочью с целью смягчения целлюлозного материала и улучшения условий ферментации гриба. Концентрация используемой реагентов и степень предварительной обработки осуществляется в зависимости от процентного содержания биомассы, и, следовательно, требуемого содержания белка в продукте. Консистенция стерильной суспензии смеси ферментационной среды, как правило, является такой, которая подходит для обычных методов жидкофазной ферментации - примерно 3 % концентрации твердых веществ. Ферментация, однако, может быть осуществлена в любой требуемой концентрации в пределах допустимого с помощью обычных методов, с увеличением

концентрации твердых веществ до 30 %. Жидкая фаза может быть повторно использована [13,14].

Твердая фаза содержит Chaetomium cellulolyticum в различных количествах, в зависимости от степени и предварительной обработки и брожения. Продукт содержит от 20 до около 80 % сухих веществ. Остальная часть твердой фазы содержит неферментированные растительные остатки. Продукты, имеющие содержание биомассы больше, чем примерно 55 % сухих веществ могут быть использованы в качестве животных кормов для жвачных и нежвачных животных, а продукты с содержанием биомассы меньше этой величины могут быть использованы в первую очередь для жвачных животных кормов.

Белковые продукты, полученные в результате предлагаемой технологии, являются пригодными в качестве кормовых добавок для животных и птицы. Применение таких добавок в корма животных влияет и на получаемую из них продукцию, так, например, изменяется содержание витаминов группы В в молоке коров [15].

Процессы ТФФ находят применение и в других отраслях промышленности - для защиты сеянцев растений [16,17].

Выводы

Технология твердофазной ферментации, имея свои преимущества, является перспективным направлением развития микробиологической, химической, пищевой, топливной, биохимической промышленностей.

Литература

1. Р.М. Рабинович, Автореф. дисс. канд. биол. наук., Тверский гос. технологический ун-т, Тверь, 2006. 151 с.

2. Винаров Ю.А., Гордеев Л.С., Кухаренко А.А., Панфилов В.И. Ферментационные аппараты для

процессов микробиологического синтеза. ДеЛи Принт, Москва, 2005, 278 с.

3. К.А. Смирнов, Ю.Д. Алашкевич, Н.С. Решетова, Химия растительного сырья, 3, 161-164, (2009).

4. B.K. Lonsane, N.P. Ghildyal, S. Budiatman, S.V. Ramakrishna, Microbiological Technology, 258-265 (1995).

5. Т.И. Громовых, С.В Прудникова, В.С Громовых, О.А. Могильная, Микология и фитопатология, 35, 56-61 (2001).

6. N. Perez-Guerra, Torrado-Agrasar, C. Lopez-Macias, L. Pastrana. Electronic journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry, 343-350, (2003).

7. K. S. M. S. Raghavarao, T. V. Ranganathan, N.G. Karanth Biochemical Engineering. Applied and environmental microbiology, 127-135, (2003).

8. Н.А. Ушакова, Е.С. Бродский, А.А. Козлова, А.В. Нифатов, Прикладная биохимия и микробиология, 45, 61-67, (2009).

9. Пат. РФ 2244444. (1999).

10. Пат. США 20070128326. (2007).

11. Пат. США 8232082. (2012).

12. С.А. Карпов, Защита окружающей среды в нефтегазовом комплексе, 8, 18-23. (2007).

13. Пат. США 4526791. (1985).

14. Пат. США 6916652. (2005).

15. Г.В. Карпова, Р.Т., Маннапова. Вестник Оренбургского государственного универститета, 1, 107-110, (2007).

16. Т.И. Громовых, И.И. Гайдашева В.А. Ушанова, В.С. Садыкова, Г.А. Сизых, Хвойные бореальной зоны, XXIV, 4, 482-486. (2007).

17. Ю.А. Литовка, А.Г. Савицкая, Т.В. Рязанова, Н.А. Нешумаева, Химия растительного сырья, 3, 167-172, (2011).

18. Т.Н. Липатова. Вестник Казанского технологического университета,17, 8, 201, (2014).

19. Р.Т. Валеева, С.Г. Мухачев, А.И. Кашапова, Э.И. Нуретдинова, М.Ю. Шурбина. Вестник Казанского технологического университета, 17, 20, 156, (2014).

© Б. А. Кулишов - магистр кафедры Пищевая инженерия малых предприятий КНИТУ, nosfera-tu@mail.ru; Ле Ань Туан, аспирант кафедры Пищевая биотехнология КНИТУ, letuan.tnvn@gmail.com.

© B. A. Kulishov - master Department of food engineering in small enterprises, Kazan National Research Technological University, nosfera-tu@mail.ru; Le Anh Tuan - Ph.D. Student, Department of food Biotechnology, Kazan National Research Technological University, letuan.tnvn@gmail.com