БИОСЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАГРЯЗНЕННОСТИ ВОДЫ ОРГАНИЧЕСКИМИ ВЕЩЕСТВАМИ

Полезная модель относится к области охраны окружающей среды и биотехнологии, а именно к устройствам для экспресс-анализа проб сточных вод (муниципальных и промышленных), образцов воды, полученных из объектов окружающей среды (реки, озера, водохранилища).
Известны биосенсоры, определяющие в водной среде органические соединения, относящиеся к поверхностно-активным веществам [RU 2092838, 1997.10.10, G01N 33/18]. Одним из параметров, определяющим общую загрязненность проб воды органическими веществами, является биологическое (биохимическое) потребление кислорода (БПК).
5
В настоящее время в России в лабораториях тепловодоканала используют метод определения БПК. БПК - параметр качества воды, определяемый как количество кислорода, необходимое для биохимического окисления содержащихся в воде органических соединений. В стандартном случае БПК измеряют в течение 5 суток при температуре 20°С [Методика технологического контроля работы очистных сооружений городской канализации. Москва. Стройиздат 1977 г.].
Длительное время анализа является недостатком стандартного метода оценки БПК при определении загрязненности воды.
2
В случае, если БПК равна 2-3 г O/л, то вода признается чистой и может быть сброшена в реку. При больших значениях БПК необходима дополнительная очистка воды.
В соответствии с мировой практикой эффективным подходом для оценки загрязненности воды является биосенсорный. За рубежом в анализаторах подобного типа в качестве биорецептора применяются дрожжевые штаммы Arxula adeninivorans для определения БПК. Так в работе [С.Chan, M.Lehmann, K.Chan, P.Chan, В.Gruendig, G.Kunze and R.Renneber. Designing an amperometric thick-film microbial BOD sensor //
Biosens. Bioelectron. 2000. V.15. №7-8. P.343-353] используют штамм Arxula adeninivorans LS3.
Однако чувствительность биосенсора с использованием указанного штамма к действию моноароматических соединений и ПАВ не известна.
Задача, на решение которой направлена заявляемая полезная модель - создание устройства для определения загрязненности воды органическими веществами.
Технический результат, который может быть получен при использовании полезной модели, заключается в том, что предлагаемый биосенсор обеспечивает быстрое определение загрязненности воды органическими веществами.
Сущность полезной модели заключается в том, что биосенсор для определения загрязненности воды органическими веществами включает кислородный электрод Кларка, сопряженный с биорецептором, содержащим иммобилизованные на носителе клетки штаммов дрожжей Arxula adeninivorans BKM Y-2676 или Arxula adeninivorans ВГИ 78(6).
Штамм дрожжей Arxula adeninivorans BKM Y-2676 получен из Всероссийской коллекции культур (Catalogue of Microbial Cultures 2007. P.284, Pushchino 2007). Штамм дрожжей Arxula adeninivorans ВГИ 78(6) описан в работе В.И.Голубева: Таксонометрическая характеристика дрожжей, используемых в гидролизно-дрожжевых производствах // Прикл. биохимия и микробиология. 1994. Т.30. Вып.1. С.132-136.
Биосенсор для определения загрязненности воды органическими веществами включает электрод Кларка 1, на котором размещен биорецептор 2, содержащий иммобилизованные на носителе клетки штаммов дрожжей Arxula adeninivorans BKM Y-2676 или Arxula adeninivorans ВГИ 78(6) с помощью фиксатора 3.
В экспериментах по созданию биосенсора в качестве контрольного раствора используют глюкозо-глутаматную смесь (ГГС). Концентрация ГГС
2
равная 0.15 г/л соответствует БПК 220 г О/л [Stuart E. Strand, Dale A. Carlson. Rapid BOD measurement for municipal wastewater samples using a biofilm electrode // Journal Water Pollution Control Federation. 1984. V.56. №5].
Диапазон детекции БПК составляет 30-1000 мг/л, операционная стабильность 4 суток без потери активности, продолжительность анализа 10 мин, ошибка измерения не более 5%.
На фиг.1 представлена схема биосенсора для определения загрязненности воды органическими веществами путем определения биохимического (биологического) потребления кислорода (БПК). На фиг.2 представлены калибровочные зависимости ответа (нА/с) биосенсоров на основе дрожжевых клеток Arxula adeninivorans BKM Y-2676 и Arxula adeninivorans ВГИ 78(6) от концентрации БПК (мг/л). Диапазон детекции БПК составил 30-1000 мг/л.
В качестве носителя для клеток, используемых в биорецепторе, могут использоваться полисахаридные гели, поливиниловые спирты, целлюлозные мембраны, стекловолокна, в частности стеклобумага.
Для создания биорецептора используют штамм дрожжей Arxula adeninivorans BKM Y-2676 или Arxula adeninivorans ВГИ 78(6). Штаммы обладают широкой субстратной специфичностью при окислении органических соединений (фиг.3). Расширен спектр определяемых соединений: додецилсульфат натрия, бензоат и катехол.
Штаммы дрожжей Arxula adeninivorans BKM Y-2676 и поддерживают на сусло-агаре при 4°С. Для засева используют 2-3-х суточные культуры на скошенном сусло-агаре. Для получения биомассы культивирование дрожжей проводят в жидкой среде следующего состава, г/л: глюкоза 5.0; пептон 2.5; дрожжевой экстракт 0.5 в витаминных пробирках по 10 мл среды при 37°С на качалке (220 об/мин) в течение 40 часов. Дрожжи отделяют центрифугированием при 12000 об/мин в течение 5 мин, дважды промывают 30 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7.6). Дрожжевые клетки ресуспендируют в том же буфере и иммобилизуют на носителе.
Иммобилизацию дрожжевых клеток проводят методом физической адсорбции на хроматографической бумаге Wathman GF/A (Великобритания). Клеточную суспензию (100 мг сырого веса/мл) наносят микропипеткой по 10 мкл на полоску стеклобумаги, формируя пятно диаметром 3-5 мм и высушивают на воздухе в течение 30 мин. Полученный биорецептор помещают на рабочую поверхность электрода и фиксируют.
Принцип определения загрязненности воды органическими веществами основан на измерении скорости потребления кислорода клетками штамма дрожжей в процессе окисления органических соединений, содержащихся в образце.
Биосенсор для определения работает следующим образом. Электрод Кларка 1 с размещенным на нем биорецептором 2, содержащим иммобилизованные клетки штамма дрожжей Arxula adeninivorans BKM Y-2676 или Arxula adeninivorans ВГИ 78(6), погружают в измерительную ячейку с 30 мМ натрий-фосфатным буферным раствором (рН 7.6) и регистрируют силу тока, отражающую содержание кислорода в среде (фоновое).
2
Добавляют аликвоту анализируемого образца и регистрируют потребление кислорода. Рассчитывают величину изменения максимальной скорости потребления кислорода (ответ сенсора, dI/dt, нА/с) и определяют содержание ВПК по предварительно построенной калибровочной кривой (фиг.2). БПК определяют, зная, что 0.15 г/л ГГС соответствует 220 г О/л. Измерения проводят при комнатной температуре и постоянном перемешивании.
Таким образом, предлагаемый биосенсор на основе штаммов дрожжей Arxula adeninivorans BKM Y-2676 или Arxula adeninivorans ВГИ 78(6) обеспечивает быстрое определение загрязненности воды органическими веществами и не требует больших затрат на изготовление.
Кроме того, биосенсор может быть использован в полевых условиях.