Способ получения полисахаридов из шрота (отходов переработки) бурых водорослей
METHOD FOR OBTAINING POLYSACCHARIDES FROM MEAL (PROCESSING WASTE) OF BROWN ALGAE

Изобретение относится к медицинской и лечебно-профилактической практике, к химико-фармацевтической, пищевой, косметической промышленности, а именно к способам получения полисахаридов из углеводсодержащих отходов переработки морских водорослей.
Уровень техники
Природные глубокие эвтектические растворители (ПГЭР) являются экологически чистой и безопасной альтернативой органическим растворителям таким как этанол, ацетон, хлороформ для экстракции биологически активных веществ из растительного сырья, включая бурые водоросли [Облучинская, Е.Д., Даурцева, А.В., Пожарицкая, О.Н., Флисюк, Е.В., Шиков, А.Н. (2019). Природные глубокие эвтектические растворители как альтернативные экстрагенты для извлечения флоротанинов бурых водорослей. Химико-фармацевтический журнал, 53(3), 45-49.; Obluchinskaya, E.D., Pozharitskaya, O.N., Zakharova, L.V., Daurtseva, A.V., Flisyuk, E.V., Shikov, A.N. (2021). Efficacy of natural deep eutectic solvents for extraction of hydrophilic and lipophilic compounds from Fucus vesiculosus. Molecules, 26(14), 4198.]. Органические растворители оказывают негативное действие на окружающую среду и рабочую зону, требуют использования специального оборудования, сложных систем очистки, и не подходят для реализации экологически чистых технологий. ПГЭР преимущественно применяются для извлечения из природного сырья фенольных соединений, алкалоидов, гликозидов, пигментов. Их действие основано на донорно-акцепторном взаимодействии компонентов растворителя, где роль доноров выполняют такие вещества как холина хлорид, бетаин, роль акцепторов выполняют органические кислоты (молочная, яблочная и другие), моносахариды, аминокислоты и другие соединения. ПГЭР обладают большим разнообразием составов. Так на основе молочной кислоты создано не менее 10-15 растворителей, так же часто применяют ПГЭР на основе яблочной кислоты (примеры см. в таблице 1). Для приготовления эвтектических растворителей ПГЭР используют L-молочную кислоту, бетаин, холина хлорид, яблочную кислоту, глюкозу и другие компоненты в определенных молярных соотношениях (см. табл. 1). Компоненты смеси нагревают до 50-80°С при перемешивании до образования прозрачной однородной жидкости. Приготовленные таким образом ПГЭР используют для получения экстрактов, в частности содержащих полифенолы, пигменты и другие биологически активные вещества из растений и водорослей.
Вместе с тем пока не решена проблема утилизации шрота (отходов переработки сырья) после обработки ПГЭР, так как в большинстве случаев это густая трудно высушиваемая масса, имеющая сильно кислую реакцию среды. В серии предварительных экспериментов нами было установлено, что шрот после получения ПГЭР-экстрактов из бурых водорослей содержит достаточное количество углеводов - полисахаридов фукоидана, ламинарана, альгинатов с учетом их различного содержания в исходном сырье (таблица 2).
В научной и технической литературе практически не описаны методы получения полисахаридов - альгинатов, ламинаранов и фукоиданов из отходов переработки водорослей по общей простой технологии. Обычно для каждого полисахарида предусмотрена отдельная технология или отдельный этап многостадийной комплексной переработки свежих, замороженных или сухих слоевищ. Эти технологии или этапы часто индивидуальны в зависимости от вида используемых водорослей. Важно отметить, что полисахаридный состав и содержание в бурых водорослях кроме видоспецифичности, изменяется под влиянием различных факторов, таких как сезон сбора, соленость, температура, фаза размножения и роста водорослей. Поэтому одни и те же слоевища водорослей могут содержать слишком низкие количества полисахаридов и их получение может быть экономически нецелесообразным. Для практических производственных целей существенно разработать простую гибкую технологию получения полисахаридов, подходящую для любых видов бурых водорослей, с различным их содержанием, что особенно актуально в отношении отходов переработки водорослей.
Известен способ получения сульфатированного полисахарида бурых водорослей фукоидана, обладающего антикоагулянтным и иммунотропным действием (патент РФ на изобретение №2247574). Оно представляет собой фукоидан, полученный путем экстракции водой бурой водоросли Fucus evanescens при температуре 20-60°С с последующим осаждением этанолом. Фукоидан получают следующим способом. Свежую или замороженную (после дефростации) водоросль обрабатывают этанолом с целью ее обезжиривания и удаления пигмента. Затем водоросль сушат на воздухе, грубо измельчают и обрабатывают водой (1:20 вес/объем) сначала при комнатной температуре (5 часов), а затем при 50-60°С при перемешивании в течение 5 часов. Экстракт концентрируют при пониженном давлении до 1/4-1/5 первоначального объема и доводят рН суспензии до значения 3,0. Затем отделяют образовавшийся осадок центрифугированием, доводят рН супернатанта до нейтрального титрованием гидроокисью натрия, диализуют против воды. Затем высаждают натриевую соль фукоидана двумя объемами 96% этанола. Осадок трижды промывают 50% водным этанолом и сушат 96% этанолом. Получают целевой продукт фукоидан.
Известен способ получения водорастворимых полисахаридов бурых водорослей (патент РФ на изобретение №2135518). Способ предусматривает обработку свежих, или свежезамороженных, или сухих водорослей органическими растворителями с целью удаления низкомолекулярных веществ, экстракцию полисахаридов 0,1 N соляной кислотой при комнатной температуре и водой при 50-60°С. Разделение ламинаранов и фукоиданов и последующее их фракционирование осуществляют с помощью гидрофобной хроматографии. Последовательно полученные экстракты полисахаридов наносят на колонки раздельно. В качестве гидрофобного сорбента используют полихром-1.
Известен способ комплексной переработки бурых водорослей для получения препаратов медицинского и косметологического назначения (патент РФ на изобретение №2240816). Способ заключается в том, что растительное сырье обрабатывают этанолом, экстракт отделяют, этанол отгоняют, получают концентрат биологически активных и низкомолекулярных соединений, затем обработанную водоросль экстрагируют, экстракт концентрируют, нейтрализуют и получают концентрат, содержащий полисахарид-1, представляющий смесь ламинарана и фукоидана, смесь нейтрализуют, последовательно осаждают фукоидан (F1) и ламинаран (L1), остаток водоросли дважды экстрагируют, экстракты объединяют, концентрируют, высушивают, получают полисахарид-2, представляющий смесь ламинарана, фукоидана и полиманнуроновой кислоты, доводят рН до определенного значения, отделяют осадок полиманнуроновой кислоты, осадок растворяют, нейтрализуют и осаждают соль полиманнуроновой кислоты (М), супернатант нейтрализуют, осаждают последовательно фукоидан (F2) и ламинаран (L2), затем остаток водоросли подвергают щелочной обработке, экстракт концентрируют, нейтрализуют и осаждают полисахарид-3, представляющий соль альгиновой кислоты (А), осадок промывают и высушивают. Способ позволяет комплексно переработать бурые водоросли и одновременно получить индивидуальные препараты кислых и нейтральных полисахаридов и концентрат низкомолекулярных биологически активных веществ.
Известен способ переработки водорослей с получением продукта, содержащего альгинат натрия (патент РФ на изобретение №2019981). Сущность изобретения: измельчение водорослей до размера частиц 5-15 мм проводят предварительной обработкой в кислой среде, обработку кислотой ведут в течение 0,5 -1,5 ч при рН 2,0 - 4,0, после чего их промывают в морской, а затем в пресной воде до рН 6,0 - 6,6, перед обработкой углекислой солью промытую массу нагревают до температуры 60 - 70°С, обработку углекислой солью проводят при интенсивном перемешивании в течение 10-15 мин, в качестве углекислой соли используют бикарбонат натрия, а измельчение полученной массы проводят путем гомогенизации, после чего массу замораживают.
Недостатками перечисленных способов являются: применение токсичных легко-воспламеняемых растворителей - этанола 96% и других органических растворителей, применение гидрофобного сорбента высокой стоимости, использование соляной кислоты, относящейся к токсичным и сильнодействующим веществам, концентрирование водных извлечений при пониженном давлении - вакуум-выпаривание - энергоемким и неэкономичным способом. Осаждение спиртом также сопровождается большими потерями конечных продуктов. В процессе получения фукоидана или альгината отдельно происходят потери других ценных полисахаридов, невысокий выход целевого продукта при использовании сырья с низким содержанием целевых полисахаридов. Недостатками известных способов, кроме вышеуказанных, является многостадийность и широкая вариабельность применяемых технических приемов, что влечет за собой использование разнообразного оборудования, часто дорогостоящего.
Наиболее близкое техническое решение описано в технологии получения экстракта фукуса обладающего антикоагулянтным действием (патент РФ на изобретение №2506089). Способ получения сухого экстракта фукуса путем комплексной переработки фукуса пузырчатого Fucus vesiculosus, заключающийся в том, что сухие слоевища водорослей измельчают, экстрагируют смесью метиленхлорида со спиртом этиловым в соотношении 94,2:5,86% в аппарате Сокслета, концентрируют в вакууме на роторном испарителе, сушат в вакууме на роторном испарителе, сушат в вакуум-сушильном шкафу с получением липидно-пигментного комплекса - густого экстракта, затем шрот экстрагируют методом перколяции 85-90%-ным этанолом с принудительной циркуляцией экстрагента через каждый час настаивания в течение 3-5 ч, фильтруют, концентрируют в вакууме на роторном испарителе, кристаллизуют, фильтруют на нутч-фильтре, сушат и очищают методом колоночной хроматографии с использованием оксида алюминия и получают маннит очищенный, затем оставшийся шрот экстрагируют методом перколяции 5-15%-ным водным этанолом 4-6 часов при температуре 30-40°С и рН=3-4 методом перколяции с ультразвуковой обработкой, фильтруют, концентрируют на ультрафильтрационной установке и сушат в распылительной сушилке и получают полисахаридный комплекс - сухой экстракт фукуса, затем шрот экстрагируют 1,5%-ным раствором карбоната натрия, обрабатывают серной кислотой, концентрируют на роторном испарителе, очищают диализом через целлофановую мембрану, сушат в вакуум-сушильном шкафу или лиофилизацией и получают полисахарид альгинат натрия, фильтруют, концентрируют на ультрафильтрационной установке и сушат в распылительной сушилке.
К недостатку способа также можно отнести применение органических растворителей и многостадийность получения биологически активных веществ.
Способ получения полисахаридов из шрота (отходов переработки) бурых водорослей как и известные, заключается в том, что слоевища водорослей экстрагируют, реакционную смесь разделяют на фракции, концентрируют, жидкий экстракт сушат.
Технической проблемой изобретения является разработка простой, экологичной и экономичной технологии рационального использования отходов переработки бурых водорослей.
Техническим результатом изобретения является разработка одностадийного способа получения полисахаридов из шрота (отходов переработки) бурых водорослей с сохранением их нативных свойств, с высоким выходом, с высоким содержанием основного действующего вещества, учитывающего особенности каждого вида сырья.
Технический результат достигается тем, что в качестве сырья используют отходы переработки водорослей, образующиеся в процессе получения полифенольных экстрактов с помощью природных глубоких эвтектических растворителей (ПГЭР) на основе молочной или яблочной кислоты. После отделения жидкого ПГЭР-экстракта фильтрацией или центрифугированием шрот водорослей загружают в экстрактор и экстрагируют при рН=2,0-5,0 при температуре 20-60°С в течение 1-24 ч. рН регулируют добавлением 10-80% раствора молочной или яблочной кислоты соответственно. Для интенсификации процесса экстракции и перемешивания среды применяют УЗ-аппарат типа "горн". Затем реакционную смесь нейтрализуют добавлением раствора 0,1 н NaOH или КОН, выдерживают при температуре экстракции 1-24 ч, отделяют от твердого остатка фильтрацией или центрифугированием. Жидкий экстракт фильтруют через мембрану с диаметром пор 300-500 кДа для отделения высоко-молекулярных полисахаридов. Фильтрат пропускают через мембрану 50-100 кДа для получения полисахаридов средней молекулярной массы, затем через мембрану 5-30 кДа для удаления низкомолекулярных примесей. Концентрированные жидкие экстракты сушат лиофильно или под вакуумом или в распылительной сушилке.
В качестве сырья используют шрот (отходы переработки) любого вида бурых водорослей, которые первоначально были в свежем, замороженном или сухом состоянии (лат. Phaeophyceae), предварительно оценив полисахаридный состав шрота по известным методикам [Качество, безопасность и методы анализа продуктов из гидробионтов. Вып. 3. - М.: Изд-во ВНИРО, 2009. - 108 с.].
Предложенная технология обеспечивает решение проблемы рационального использования отходов переработки бурых водорослей и способствует снижению загрязнения окружающей среды, благодаря отсутствию органических растворителей, и тому, что в качестве сырья используют отходы переработки бурых водорослей, образующихся, например, после извлечения полифенольных экстрактов, полученных на основе глубоких эвтектических растворителей на основе молочной или яблочной кислоты. При такой переработке бурых водорослей отходы состоят из шрота, представляющего собой густую измельченную влажную массу, содержащую большое количество углеводов (полисахаридов). Немаловажной особенностью является простота аппаратурного оформления процесса, так как для его осуществления необходимым и достаточным является один экстрактор периодического действия, нутч- или друк-фильтр, устройство для мембранной фильтрации или ультрафильтрации, сушилка лиофильная, распылительная или вакуумная. Такой набор оборудования существует на многих пищевых или фармацевтических производствах.
Подтверждение возможности получения данным способом заявленного технического результата - разработка простого, экологичного, экономичного и одностадийного способа получения полисахаридов из шрота (отходов переработки) бурых водорослей, с сохранением их нативных свойств, с высоким выходом как полисахаридных фракций так и основного действующего вещества, приводится в следующих конкретных примерах.
Пример 1. Получение полисахаридов из шрота свежих фукусовых водорослей Баренцева моря.
1 кг шрота бурой водоросли фукус пузырчатый (Fucus vesiculosus L.) после отделения фильтрацией жидкого ПГЭР-экстракта на основе молочной кислоты (ПГЭР 1 см. табл. 1) загружают в экстрактор и экстрагируют 50 л водного раствора молочной кислоты при рН=2,0 при температуре 60°С в течение 1 ч. рН регулируют добавлением 80% раствора молочной кислоты. Для интенсификации процесса экстракции и перемешивания среды применяют ультразвуковой аппарат серии "Волна" типа "горн", интенсивность ультразвуковой обработки составляла 600 Вт/дм3. Затем реакционную смесь нейтрализуют добавлением раствора 0,1 н NaOH до рН=7,0. Реакционную смесь выдерживают при температуре экстракции 1 ч, и в горячем виде отделяют от твердого остатка фильтрацией на нутч-фильтре. Жидкий экстракт фильтруют через мембрану с диаметром пор 300 кДа для отделения высоко-молекулярных полисахаридов (Фракция ВМП 1-1). Фильтрат пропускают через мембрану 50 кДа для получения полисахаридов средней молекулярной массы (Фракция ВМП 2-1), затем через мембрану 5 кДа (Фракция ВМП 3-1) для удаления низкомолекулярных примесей. Концентрированные жидкие экстракты фракций ВМП 1-3 сушат лиофильно.
Химический состав полученных продуктов показан в таблице 3. Состав моносахаридов представлен в таблице 4.
Пример 2. Получение полисахаридов из шрота сухих фукусовых водорослей Баренцева моря.
1 кг шрота бурой водоросли фукус двусторонний (Fucus distichus L.) после отделения фильтрацией жидкого ПГЭР-экстракта на основе яблочной кислоты (ПГЭР 8 см. табл. 1) загружают в экстрактор и экстрагируют 50 л водного раствора яблочной кислоты при рН=5,0 при температуре 20°С в течение 24 ч. рН регулируют добавлением 20% раствора яблочной кислоты. Для интенсификации процесса экстракции и перемешивания среды применяют ультразвуковой аппарат серии "Волна" типа "горн", интенсивность ультразвуковой обработки составляла 600 Вт/дм3. Затем реакционную смесь нейтрализуют добавлением раствора 0,1 н КОН до рН=7,0. Реакционную смесь выдерживают при температуре экстракции 24 ч, и отделяют от твердого остатка центрифугированием при 6000 об/мин. Жидкий экстракт фильтруют через мембрану с диаметром пор 500 кДа для отделения высоко-молекулярных полисахаридов (Фракция ВМП 1-2). Фильтрат пропускают через мембрану 100 кДа для получения полисахаридов средней молекулярной массы (Фракция ВМП 2-2), затем через мембрану 30 кДа (Фракция ВМП 3-2) для удаления низкомолекулярных примесей. Концентрированные жидкие экстракты фракций ВМП 1 -3 сушат в вакуум-сушильном шкафу.
Химический состав полученных продуктов показан в таблице 3. Состав моносахаридов представлен в таблице 4.
Пример 3. Получение полисахаридов из шрота замороженных ламинариевых водорослей Баренцева моря.
1 кг шрота бурой водоросли ламинария сахаристая (Saccharina latissima L.) после отделения фильтрацией жидкого ПГЭР-экстракта на основе яблочной кислоты (ПГЭР 5 см. табл. 1) загружают в экстрактор и экстрагируют 50 л водного раствора яблочной кислоты при рН=5,0 при температуре 50°С в течение 3 ч. рН регулируют добавлением 10% раствора яблочной кислоты. Для интенсификации процесса экстракции и перемешивания среды применяют ультразвуковой аппарат серии "Волна" типа "горн", интенсивность ультразвуковой обработки составляла 600 Вт/дм3. Затем реакционную смесь нейтрализуют добавлением раствора 0,1 н NaOH до рН=7,0. Реакционную смесь выдерживают при температуре экстракции 3 ч, отделяют от твердого остатка фильтрацией на нутч-фильтре. Жидкий экстракт фильтруют через мембрану с диаметром пор 500 кДа для отделения высоко-молекулярных полисахаридов (Фракция ВМП 1-3). Фильтрат пропускают через мембрану 50 кДа для получения полисахаридов средней молекулярной массы (Фракция ВМП 2-3), затем через мембрану 5 кДа (Фракция ВМП 3-3) для удаления низкомолекулярных примесей. Концентрированные жидкие экстракты фракций ВМП 1-3 сушат в распылительной сушилке.
Химический состав полученных продуктов показан в таблице 3. Состав моносахаридов представлен в таблице 4.
Пример 4. Получение полисахаридов из шрота замороженного аскофиллума Баренцева моря.
1 кг шрота бурой водоросли аскофиллум узловатый (Ascophyllum nodosum L. le Jolis) после отделения фильтрацией жидкого ПГЭР-экстракта на основе молочной кислоты (ПГЭР 4 см. табл. 1) загружают в экстрактор и экстрагируют 50 л водного раствора молочной кислоты при рН=3,0 при температуре 40°С в течение 12 ч. рН регулируют добавлением 60% раствора яблочной кислоты. Для интенсификации процесса экстракции и перемешивания среды применяют ультразвуковой аппарат серии "Волна" типа "горн", интенсивность ультразвуковой обработки составляла 600 Вт/дм3. Затем реакционную смесь нейтрализуют добавлением раствора 0,1 н NaOH до рН=7,0. Реакционную смесь выдерживают при температуре экстракции 12 ч, и в отделяют от твердого остатка фильтрацией на друк-фильтре. Жидкий экстракт фильтруют через мембрану с диаметром пор 500 кДа для отделения высоко-молекулярных полисахаридов (Фракция ВМП 1-4). Фильтрат пропускают через мембрану 100 кДа для получения полисахаридов средней молекулярной массы (Фракция ВМП 2-4), затем через мембрану 30 кДа (Фракция ВМП 3-4) для удаления низкомолекулярных примесей. Концентрированные жидкие экстракты фракций ВМП 1-3 сушат лиофильно.
Предложенный способ является простым, быстрым и экологичным, поскольку исключает использование токсичных и пожаро-взрывоопасных реагентов, предусматривает рациональное использование отходов переработки морских бурых водорослей с помощью яблочной или молочной кислот и воды, не требует использования сложных дорогостоящих аппаратов, не загрязняет окружающую среду. Полисахариды получают с высоким технологическим выходом, а также с высоким содержанием основного действующего вещества (фукоидана, ламинарана, альгината).
Полисахариды, полученные по данному способу с учетом особенностей каждого вида сырья, могут быть применены в медицинской, фармацевтической, косметической и пищевой промышленности.