КОМБИНАЦИЯ EGF/GHRP-6 ДЛЯ НЕЙРОРЕГЕНЕРАЦИИ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ ПОСЛЕ АУТОИММУННОГО ПОВРЕЖДЕНИЯ
EGF/GHRP-6 COMBINATION FOR CENTRAL NERVOUS SYSTEM NEUROREGENERATION AFTER AUTOIMMUNNE DAMAGE

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к медицине, а конкретнее к неврологии, и направлено на стимуляцию нейрорегенерации центральной нервной системы после аутоиммунного повреждения, в частности для лечения и профилактики рецидивов у пациентов, пораженных рассеянным склерозом и нейромиелитом зрительного нерва, введением композиции, содержащей эпидермальный фактор роста и пептид-6, высвобождающий гормон роста.
Описание предшествующего уровня техники
Рассеянный склероз (MS) и нейромиелит зрительного нерва (ON) представляют собой аутоиммунные демиелинизирующие заболевания, которые поражают людей молодого возраста, в основном женщин, вызывая развивающиеся со временем неблагоприятные последствия в виде потери трудоспособности и прострации. Частота возникновения MS тесно коррелирует с показателями высокой индустриализации и развития в ведущих промышленно развитых странах. Центральная нервная система представляет собой преимущественную область, где часто обнаруживаются иммунологические реакции в виде аутоиммунных реакций. Это происходит, когда по неопределенным причинам оказывается несостоятельным клеточный и гуморальный регуляторный механизм, который определяет состояние, при котором образующиеся на периферии аутореактивные клетки против миелиновых антигенов (что является часто встречающимся обстоятельством), такие как активированные лимфоциты, проходят через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и находят свои мишени внутри паренхимы центральной неровной системы. Возникает ряд явлений, подобных каскадным, которые вызывают развитие демиелинизации, реактивного астроцитоза и гибели нейронов и олигодендроцитов.
Аутоиммунная реакция внутри центральной нервной системы направлена против миелиновых антигенов, так что сначала повреждение ограничивается миелиновыми листками, которые оборачивают аксоны главных нейронов, а затем переходит на олигодендроциты, которые ответственны за продукцию миелина, и на другую группу нейронов, неспецифически повреждаемых вследствие распространения аутоиммунной реакции.
Развивающиеся вследствие этого демиелинизация и гибель нейронов или вследствие некроза, или апоптоза ведут к потере двигательной и сенсорной функции, которая бессистемно поражает разнообразные структуры в организме человека. Процесс ремиелинизации при MS и ON в целом ограничен и носит преходящий характер. Хотя этот процесс ремиелинизации возможен, он зависит от баланса между аутореактивными астроцитами и олигодендроцитами (John G.R., Shankar S.L., Shafit-Zagardo B., Massimi A., Lee S.C., Raine C.S. et al. (2002) Multiple sclerosis: re-expression of a developmental that restricts oligodendrocyte maturation Nature Medicine 8(10): 1115-1121).
Среди стратегий регенерации нейронов очень перспективными предложениями были лечение факторами роста, такими как эпидермальный фактор роста (EGF) и бычий фактор роста фибробластов (bFGF), демонстрирующие, что мультипотентные, недифференцированные линии клеток, выделенные из коры головного мозга, реагируют на эти факторы роста, дифференцируясь в сторону различных линий клеток, таких как астроциты типа I и II, миелинизирующие олигодендроциты и различные типы нейронов (Mehler M.F., Gokhan S. (1999) Postnatal cerebral cortical multipotent progenitors: regulatory mechanisms and potential role in the development of novel neural regenerative strategies. Brain Pathol; 9(3):515-526).
Пептид-6, высвобождающий гормон роста (GHRP-6), увеличивает экспрессию инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF-1) в центральной нервной системе (Frago L.M., Paneda C, Dickson S.L., Hewson A.K., Argente J., Chowen J.A. (2002) Growth hormone (GH) and GH-releasing peptide-6 increase brain insulin-like growth factor-l expression and activate intracellular signaling pathways involved in neuroprotection. Endocrinology 143(10):4113-4122). IGF-1 участвует в процессах, подобных созреванию олигодендроцитов (Wilson H.C., Onischke C, Raine C.S. (2003) Human oligodendrocyte precursor cells in vitro: phenotypic analysis and differential response to growth factors. Glia 44(2): 153-165), прерывая пути апоптоза, которые зависят от активации TNF-альфа (фактора некроза опухолей альфа), в то же самое время защищая от повреждения, вызванного этим фактором, при РС и ON (Ye P, D'Ercole A.J. (1999) Insulin-like growth factor 1 protects oligodendrocytes from tumor necrosis factor-alpha-induced injury. Endocrinology 140(7):3063-3072). IGF-1 также осуществляет подавляющую регуляцию экспрессии молекул, связанных с классом I MHC (главного комплекса гистосовместимости) (Ito T, Ito N, Bettermann A, Tokura Y, Takigawa M, Paus R. (2004) Collapse and restoration of MHC class-l-dependent immune privilege: exploiting the human hair follicle as a model. Am. J. Pathol 164(2):623-634). На животных моделях ЕАЕ (экспериментального аутоиммунного энцефалита) IGF-1 снижает поражение сосудистого эндотелия ГЭБ, количество и размер склеротических бляшек, основных поражений при MS (Li W, Quigley L, Yao D.L, Hudson L.D, Brenner M, Zhang B.J et al. (1998) Chronic relapsing experimental autoimmune encephalonyelitis: effects of insulin-like growth factor-1 treatment on clinical deficits, lesion severity, glial responses, and blood brain barrier defects. J Neuropathol Exp Neurol 57(5):426-438).
При систематическом введении GHRP-6 увеличивает уровни эндогенного адренокортикотропного гормона (ACTH) (Martins M.R, Pinto A.C, Brunner E, Silva M.R, Lengyel A.M. (2003) GH-releasing peptide (GHRP-6)-induced ACTH release in patients with addison's disease: effect of glucocorticoid withdrawal. J Endocrinol 5 Invest. 26(2): 143-147). ACTH как эндогенный стероидный высвобождающий фактор оказывает благоприятный эффект противодействия аутореактивным расстройствам и в течение длительного времени представлял собой традиционный препарат для лечения по поводу MS (Oishi C, Sakuta M. (2003) Steroid therapy for multiple sclerosis. Nippon Rinsho 61 (8): 1361-1366).
EGF местно синтезируется в центральной нервной системе (ЦНС) микроглией, происходящими из крови макрофагами, а также некоторыми нейронами. По прохождении через ГЭБ и оболочки, выстилающие желудочки, EGF способен также попадать в ЦНС. EGF наделяли определенным рядом физиологических функций, таких как развитие ЦНС, поддержание и дифференциация паренхиматозных клеток ЦНС, виды действия, которые в значительной степени связаны с процессами нервной регуляции и с механизмами выживания, запускаемыми после инсультов (Plata-Salaman C.R. (1991) Epidermal growth factor and the nervous system. Peptides 12(3):653-663).
EGF стимулирует клеточную пролиферацию и выживание внутри ЦНС (Thome R.G, Hrabetova S, Nicholson С (2004) Diffusion of Epidermal Growth Factor in Rat Brain Extracellular Space Measured by Integrative Optical Imaging. J Neurophysiol 92(6):3471-3481).
Стимулированные EGF олигодендроциты приобретают усиленный ремиелинизирующий потенциал. EGF вносит вклад в процесс пролиферации олигодендроцитов, таким образом содействуя началу клеточного деления и дальнейшей дифференцировке в специализированные клетки, такие как зрелые олигодендроциты, астроциты и шванновские клетки. EGF содействует таким явлениям как нейрогенез, осуществляемый генерированием новых нейронов (Crang A.J., Gilson J.M., Li W.W., Blakemore W.F. (2004) The remyelinating potential and in vitro differentiation of MOG-expressing oligodendrocyte precursors isolated from the adult rat CNS. Eur J Neurosci 20(6): 1445-1460; Raineteau O., Rietschin L, Gradwohl G., Guillemot F., Gahwiler B.H. (2004) Neurogenesis in hippocampal slice cultures. Mol Cell Neurosci 26(2):241-250). Эти явления вероятно чаще наблюдаются после того, как олигодендроциты подверглись повреждению, свидетельствуя о том, что опосредованные EGF воздействия на регенеративный процесс следуют за взаимодействиями между EGF и системой передачи сигналов, которая специфически активируется в поврежденных олигодендроцитах. Это также свидетельствует о том, что модуляция этой системы передачи сигналов может усилить механизмы, направленные на ремиелинизацию (Wang K., Wang J..J, Wang Y., He Q.H., Wang X., Wang X.M. (2004) Infusion of epidermal growth factor and basic fibroblast growth factor into the striatum of parkinsonian rats leads to in vitro proliferation and differentiation of adult neural progenitor cells. Neurosci Lett 364(3): 154-158; Knapp P.E., Adams M.H. 5 (2004) Epidermal growth factor promotes oligodendrocyte process formation and regrowth after injury. Exp Cell Res 296(2):135-144).
В течение последних нескольких лет были предложены комплексные терапевтические вмешательства, такие как комбинированные способы лечения и/или системные способы лечения, которые не решили проблемы, связанные с лечением, но позволили подступиться к сложным патофизиологическим проблемам в узловых точках рассматриваемых заболеваний. Пока нет комбинированного способа лечения различными факторами роста или комбинацией одного из них с альтернативными молекулами, имеющими положительный тропизм в отношении ЦНС.
Идеальное лечение должно было бы быть сосредоточено на уменьшении выраженности симптомов, связанных с первоначальной вспышкой заболевания, и должно было бы снизить до минимума частоту рецидивов. Поэтому сохраняется заинтересованность в разработке более эффективного способа лечения для профилактики рецидивов различных клинических форм MS и NO.
Ранее предлагалось введение комбинации EGF в терапевтически эффективных концентрациях и стимулирующего секрецию GHRP-6 для профилактики и лечения повреждений нервной ткани вследствие недостатка артериального кровоснабжения (WO 02/053167).
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение основано на способе, в котором совместное введение EGF и GHRP-6 представляет усовершенствованное лечение по поводу аутоиммунных расстройств ЦНС. Эта комбинация защищает и вызывает обратное развитие повреждений, связанных с аутоиммунными реакциями, при хронических процессах в ЦНС, в частности при рассеянном склерозе и нейромиелите зрительного нерва.
По сравнению с каждым ингредиентов в отдельности комбинация вызывает более длительно существующий эффект и существенное снижение частоты рецидивов, другими словами, она эффективнее запускает регенеративные процессы. Используемый здесь термин «более длительно существующий эффект» означает, что активные ингредиенты ведут к облегчению связанных с MS и NO симптомов в течение более длительного периода времени, а также обеспечивая профилактику эпизодов рецидивов. Это обеспечит восстановление пораженных неврологических функций вследствие демиелинизации и потери нейронов вследствие апоптоза/некроза, вызванного аутоиммунным повреждением. С другой стороны, активные ингредиенты фармацевтической комбинации представляют собой аутологичные белки и пептиды, обладающие естественными способностями обеспечивать регуляторную стимуляцию клеток с тем, чтобы стимулировать их пролиферацию после введения экзогенных пептидов. Таким образом, можно противодействовать аутоиммунной реакции, так как ролью регуляторных Т-клеток является существенное опосредование иммунологической толерантности (Jörn G., Benedikt В., Bruno K. (2004) Medullary Epithelial Cells of the Human Thymus Express a Highly Diverse Selection of Tissue-specific Genes Colocalized in Chromosomal Clusters. J Exp Med 199(2): 155-166.); (Dayne M., Christophe B. (2004) Back to Central Tolerance. Immunity 20:509-516); (Mark S.A., Emily S.V., Ludger K., Zhibin C, Stuart P.B., Shannon J.T. et al. (2002) Projection of an Immunological Self Shadow Within the Thymus by the Aire Protein. Science 298:1395-1400) (Shimon S. (2004) Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses. Annual Review of Immunology 22:531-562).
Благодаря синергическому эффекту EGF и GHRP-6 в отношении нейротропных и нейрорегенеративных явлений, эту комбинацию можно применять при ускорении процессов нейрогенеза, который содействует восстановлению неврологических функций, потерянных вследствие повреждения, вызванного аутоиммунными процессами. Комбинированное лечение EGF и GHRP-6 может быть связано с любой антиоксидантной терапией. Терапевтические введение данной комбинации для регенерации и защиты нервной ткани требует схем повторного введения. Как описано в настоящем изобретении, активный ингредиент, именуемый EGF, может быть получен у любого вида животных, включая овец, коров, свиней и людей, в его нативной последовательности или в его вариантах и из любого источника, такого как синтетический, естественный или рекомбинантный. Предпочтительной формой в данном случае является человеческий EGF в его нативной последовательности, а наиболее предпочтителен человеческий рекомбинантный EGF. Активный ингредиент, именуемый здесь пептидом, высвобождающим гормон роста (GHRP), представляет собой гексапептид, имеющий следующую последовательность: His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH sub 2, полученную посредством химического синтеза.
В конкретном варианте осуществления, терапевтические дозы, вводимые во время кризов MS и ON, находятся в диапазоне от 5 до 200 мкг/кг/д для EGF и от 0,5 до 350 мкг/кг/д для GHRP-6 в течение 20-30 дней.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, дозы, вводимые в периоды между кризами, для предотвращения рецидивов, находятся в диапазоне от 0,5 до 50 мкг/кг/дней для каждого из ингредиентов в течение периода до 130 д. Комбинацию необходимо вводить в виде болюса. Путь введения может быть парентеральным, в периферические вены, внутримышечным или внутрибрюшинным. Носители, используемые для введения, включают физиологический солевой раствор, раствор лактата Рингера, человеческую плазму, раствор человеческого альбумина, 5% декстрозу, раствор желатина или их смеси.
С целью достижения максимальной терапевтической эффективности при лечении рассеянного склероза, при рецидивирующей-ремиттирующей или вторичной прогрессирующей клинических формах, первое введение необходимо производить одновременно с продромальными явлениями заболевания (индивидуализированно). В фазы ремиссии предлагаются длительные терапевтические схемы указанными выше дозами в качестве профилактики рецидивов.
При других клинических формах рассеянного склероза предлагаются длительные схемы лечения с применением терапевтических доз.
Наряду с другими аспектами настоящего изобретения, комбинация EGF/GHRP-6 вызывает пролиферацию естественных и адаптивных регуляторных Т-клеток, которые предотвращают начало тяжелых клинических форм ЕАЕ в экспериментах адоптивной передачи.
Комбинацию EGF/GHRP-6 можно использовать в рамках одной фармацевтической композиции или смешиванием независимых ингредиентов непосредственно перед применением. Комбинацию активных ингредиентов можно использовать посредством устройств медленного высвобождения. Если препаративная форма лиофилизирована, ее необходимо развести непосредственно перед применением.
Подробное описание конкретных вариантов осуществления/
Примеры
Пример 1
. Терапевтический эффект фармацевтической комбинации EGF/GHRP-6 на биологической модели экспериментального аутоиммунного энцефалита (ЕАЕ).
Для оценки терапевтической эффективности фармацевтической комбинации EGF/GHRP-6 была создана экспериментальная модель ЕАЕ, которая представляет экспериментальный аналог у животных заболевания рассеянным склерозом у людей.
Самок крыс линии Lewis (130 г) подкожно иммунизировали гомогенатом спинного мозга морских свинок (5 мг) в PBS (солевом растворе с фосфатным буфером) (50%) и полным адъювантом Фрейнда (50%) в 0 и 6-й день. Через 10 дней после первой иммунизации начинали проведение лечения по схеме с использованием комбинации EGF/GHRP-6 (200 мкг/кг/д - 740 мкг/кг/д), независимых активных ингредиентов EGF (200 мкг/кг/д), GHRP-6 (740 мкг/кг/д) и плацебо (PBS). Терапевтической схеме следовали в течение 10 дней, используя внутрибрюшинное введение. Клинические балльные оценки были основаны на следующей градации: 0: отсутствие симптомов, 1: паралич хвоста; 2: паралич любой из задних конечностей; 3: полный паралич задних конечностей; 4: полный паралич передних и задних конечностей; 5: умирание или смерть. Потерю массы тела и несостоятельность сфинктеров мочевого пузыря и прямой кишки, которая также является клиническим признаком заболевания, оценивали в баллах добавлением 0,5 к описанному ранее клиническому показателю. Через 40 дней после первой иммунизации животных наркотизировали и подвергали эвтаназии, головной и спинной мозг обрабатывали для патогистологического анализа с учетом следующих параметров: количество и размер околососудистых воспалительных инфильтратов, количество демиелинизационных поражений, количество апоптозных нейронов и глиальных клеток и реактивность астроцитов. Микроскопическое исследование проводили слепым методом.
Как показано в таблице 1, комбинация EGF/GHRP-6 защищает животных от экспериментально вызванного развития ЕАЕ, только у 50% этих животных развилась самая незначительная форма заболевания, в то время как остальные животные оставалась не пораженными. Напротив, в остальных группах заболеваемость составила 100% (у групп, получавших лечение независимыми активными ингредиентами и плацебо). Средний клинический показатель у животных, получавших комбинированное лечение EGF/GHRP-6, составил 0,37±0,47. Для групп, получавших лечение отдельными ингредиентами, средние клинические показатели составили 1,37±1,7 для EGF и 1,5±1,6 для GHRP-6, а у группы, получавшей лечение плацебо, средний клинический показатель составил 1,7±1,4. Каждая группа состояла из 8 крыс. Статистическая значимость отличий между группами составила p<0,001. Использовали множественный сравнительный тест Newman Keuls.
Таблица 1
Клиническое обобщение терапевтического эффекта у крысс вызванным развитием ЕАЕ
Группы
Частота (%)
Дни начала (средняя ± стандартное отклонение)
Клинические балльные оценки
Средняя ± стандартное отклонение
Макс.
Мин.
Длительность заболевания
Контроль
0
0
0
0
0
0
EGF
100
12,5±0,57
1,37±1,7
5
1
12,7±4,1
GHRP-6
100
13,7±2,3
1,5±1,6
4
0,5
15,5±6,7
EGF/GHRP-6
50
12±0
0,37±0,47
1
0
9±1,4
Плацебо
100
12,2±0,5
1,7±1,4
4
0,5
13,2±8,1
Как показано в таблице 2, патоморфологическое исследование головного и спинного мозга животных, включенных в различные группы, показало, что даже при наличии одинаковой ситуации в отношении реактивных астроцитов, их количество (р=0,028 по непарному Т критерию) и размер сосудистой манжеты у животных, получавших лечение EGF/GHRP-6, меньше, чем у группы, получавшей плацебо.
Таблица 2
Околососудистые воспалительные инфильтратыв головном и спинном мозге животных
Группы
Количество околососудистых воспалительных инфильтратов (средняя ± стандартное отклонение)
Контроль
0
EGF
4,5±1,9
GHRP-6
2,25±1,25
EGF/GHRP-6
2±0,8
Плацебо
5±2,1
Этот эксперимент продемонстрировал, что фармацевтическая комбинация EGF/GHRP-6 защищает животных от развития тяжелых клинических форм заболевания. Механизмы, лежащие в основе этого защитного эффекта, представляют собой увеличенную продукцию миелина олигодендроцитами и последующую ремиелинизацию пораженных нервных структур. Другой механизм связан с целостностью ГЭБ во избежание прохождения аутореактивных клеток в паренхиму головного мозга.
Пример 2
. Защитный эффект фармацевтической комбинации EGF/GHRP-6 на экспериментальной модели ЕАЕ по профилактической схеме.
Для оценки профилактического эффекта комбинации EGF/GHRP-6 на экспериментальной модели ЕАЕ, представляющей заболевание людей MMS, самок крыс линии Lewis (130 г), подкожно иммунизировали гомогенатами спинного мозга морских свинок (5 мг) в PBS (50%) и полным адъювантом Фрейнда (50%) в 0 и 6-й день. За 10 дней до первой иммунизации начинали проведение профилактической схемы лечения с использованием комбинации EGF/GHRP-6 (200 мкг/кг/д - 740 мкг/кг/д) и отдельных активных ингредиентов EGF (200 мкг/кг/д), GHRP-6 (740 мкг/кг/д) и плацебо (PBS). Профилактической схеме следовали в течение 10 дней (от -10 до -1 дня перед первой иммунизацией), используя внутрибрюшинное введение. Клинические балльные оценки были основаны на следующей градации: 0: отсутствие симптомов, 1: паралич хвоста; 2: паралич любой из задних конечностей; 3: полный паралич задних конечностей; 4: полный паралич передних и задних конечностей; 5: умирание или смерть. Потерю массы тела и несостоятельность сфинктеров мочевого пузыря и прямой кишки, которая также является клиническим признаком заболевания, оценивали в баллах добавлением 0,5 к описанному ранее клиническому показателю. Через 40 дней после первой иммунизации животных наркотизировали и подвергали эвтаназии, головной и спинной мозг обрабатывали для патогистологического анализа (10% формалин, окрашивание гематоксилином и эозином и люксолом синим). Для патогистологического анализа учитывали следующие параметры: количество и размер околососудистых воспалительных инфильтратов, количество демиелинизационных поражений, количество апоптозных нейронов и глиальных клеток и реактивность астроцитов. Микроскопическое исследование проводили слепым методом.
Как показано в таблице 3, использованная фармацевтическая комбинация EGF/GHRP-6 по профилактической схеме защищала животных от вызванного развития ЕАЕ. У 100% животных, получавших лечение EGF/GHRP-6, развилась легкая форма заболевания (клинические балльные оценки 0,5-1). Напротив, в группах, получавших лечение отдельными ингредиентами, у 75% животных развилась тяжелая клиническая форма ЕАЕ (клинические балльные оценки 3-4). Средний клинический показатель, обнаруженный у животных, получавших лечение фармацевтической комбинацией EGF/GHRP-6, составил 0,68±0,25. Для групп, получавших лечение отдельными ингредиентами, средние клинические показатели составили 2,8±0,99 для EGF и 2,7±1,03 для GHRP-6 (Р=0,0003, по сравнению с животными, получавшими лечение EGF/GHRP-6). В каждой группе было использовано по 8 крыс. Для статистического сравнения использовали Т-критерий Mann Whitney; при сравнении группы, получавшей лечение комбинацией и группы плацебо, была получена величина 0,0003, по сравнению с группой, получавшей лечение фармацевтической комбинацией.
Таблица 3
Клиническое обобщение профилактического эффектау крыс с вызываемым развитием ЕАЕ
Группы
Частота (%)
Дни начала (средняя ± стандартное отклонение)
Клинические балльные оценки
Средняя ± стандартное отклонение
Макс.
Мин.
Контроль
0
0
0
0
0
EGF
100
11,5±0,57
2,8±0,99
4
1
GHRP-6
100
11,7±2,3
2,7±1,03
4
1
EGF/GHRP-6
100
10±0
0,68±0,75
1
0,5
Плацебо
100
12,2±0,5
3±1,4
5
1
Как показано в таблице 4, патоморфологический анализ головного и спинного мозга у экспериментальных групп показывает, что даже в одинаковых случаях наличия реактивных астроцитов количество (р=0,025 по непарному Т-критерию) и размер околососудистой манжеты у животных, получавших профилактическое лечение EGF/GHRP-6, меньше, чем у группы, получавшей плацебо.
Таблица 4
Околососудистые воспалительные инфильтраты в головном испинном мозге животных, получавших профилактическое лечение
Группы
Количество околососудистых воспалительных инфильтратов (средняя ± стандартное отклонение)
Контроль
0
EGF
4±1,6
GHRP-6
2,7±1,95
EGF/GHRP-6
1,5±1
Плацебо
5±2,1
Этот эксперимент продемонстрировал, что фармацевтическая комбинация EGF/GHRP-6, используемая профилактически, защищает животных от развития ЕАЕ в ее самой тяжелой клинической форме. Более того, он демонстрирует высокую корреляцию между клиническим развитием и гистологическими данными. Механизмы, объясняющие этот защитный эффект, связаны с индукцией дифференциации клеток, предшественников нейронов, в олигодендроциты, которые предварительно кондиционированы и активны в плане продукции миелина. Сохранение целостности ГЭБ предотвратит прохождение аутореактивных клеток в сторону паренхимы головного мозга, что представляет собой еще один процесс, объясняющий защитную роль профилактического применения фармацевтической комбинации EGF/GHRP-6.
Пример 3
. Исследование доз, синергизма-потенцирования между активными ингредиентами фармацевтической комбинации.
При поиске диапазона доз фармацевтической комбинации, которые были бы эффективны для обеспечения терапевтического эффекта, использовали указанную выше модель ЕАЕ. Самок крыс линии Lewis (130 г) подкожно иммунизировали гомогенатами спинного мозга морских свинок (5 мг) в PBS (50%) и полным адъювантом Фрейнда (50%) в 0 и 6-й день. Через 10 дней после первой иммунизации начинали проведение терапевтической схемы лечения с использованием комбинации EGF/GHRP-6 в различных концентрациях.
EGF/GHRP-6 (400 мкг/кг/д - 1480 мкг/кг/д)
EGF/GHRP-6 (200 мкг/кг/д - 740 мкг/кг/д)
EGF/GHRP-6 (100 мкг/кг/д - 340 мкг/кг/д)
EGF/GHRP-6 (50 мкг/кг/д - 170 мкг/кг/д)
EGF/GHRP-6 (25 мкг/кг/д - 85 мкг/кг/д)
EGF/GHRP-6 (12 мкг/кг/д - 40 мкг/кг/д).
Этой терапевтической схеме следовали в течение 10 дней, используя внутрибрюшинное введение. Клинические балльные оценки были основаны на следующей градации: 0: отсутствие симптомов, 1: паралич хвоста; 2: паралич любой из задних конечностей; 3: полный паралич задних конечностей; 4: полный паралич передних и задних конечностей; 5: умирание или смерть. Потерю массы тела и несостоятельность сфинктеров мочевого пузыря и прямой кишки, которая также является клиническим признаком заболевания, оценивали в баллах добавлением 0,5 к описанному ранее клиническому показателю. Через 40 дней после первой иммунизации животных наркотизировали и подвергали эвтаназии, головной и спинной мозг обрабатывали для патогистологического анализа (10% формалин, окрашивание гематоксилином и эозином и люксолом синим). При патогистологическом анализе учитывали следующие параметры: количество и размер околососудистых воспалительных инфильтратов, количество демиелинизационных поражений, количество апоптозных нейронов и глиальных клеток и реактивность астроцитов. Микроскопическое исследование проводили слепым методом.
В группе, получавшей лечение EGF/GHRP-6 (400 мкг/кг/д - 1480 мкг/кг/д), 25% животных оставались не пораженными, у 75% животных проявлялась легкая форма заболевания (0,5-1). Средний клинический показатель составил 0,62±0,44. В группе, получавшей лечение EGF/GHRP-6 (200 мкг/кг/д - 740 мкг/кг/д), 25% животных оставались не пораженными, у 75% животных проявлялась легкая форма заболевания (0,5-1). Средний клинический показатель составил 0,5±0,37.
В группе, получавшей лечение EGF/GHRP-6 (100 мкг/кг/д - 340 мкг/кг/д), 12,5% животных оставались не пораженными, у 87,5% животных проявлялась легкая форма заболевания (0,5-1). Средний клинический показатель составил 0,62±0,35.
В группе, получавшей лечение EGF/GHRP-6 (50 мкг/кг/д - 170 мкг/кг/д), у 100% животных развилась ЕАЕ, у 12,5% имелась промежуточная клиническая форма (2), а у остальных проявлялась легкая форма заболевания (0,5-1). Средний клинический показатель составил 0,93±0,49.
В группе, получавшей лечение EGF/GHRP-6 (25 мкг/кг/д - 85 мкг/кг/д), у 100% животных развилась ЕАЕ, у 37,5% имелась промежуточная клиническая форма (2), а у остальных проявлялась легкая форма заболевания (0,5-1). Средний клинический показатель составил 1,25±0,65.
В группе, получавшей лечение EGF/GHRP-6 (12 мкг/кг/д - 40 мкг/кг/д), у 100% животных развилась ЕАЕ, у 12,5% имелась самая тяжелая клиническая форма (3), у 37,5% имелась промежуточная клиническая форма (2), а у остальных проявлялась легкая форма заболевания (0,5-1). Средний клинический показатель составил 1,37±0,87.
В таблицах 5 и 6 показаны клинические и патогистологические результаты. Патогистологический анализ показал, что не было статистических различий количества лимфоцитарных околососудистых инфильтратов в группах с индуцированной ЕАЕ, получавших лечение EGF/GHRP-6 (400 мкг/кг - 1480 мкг/кг, 200 мкг/кг - 740 мкг/кг, 100 мкг/кг - 340 мкг/кг, 50 мкг/кг - 170 мкг/кг и 25 мкг/кг - 85 мкг/кг). В группе, получавшей лечение фармацевтической комбинацией EGF/GHRP-6 (12 мкг/кг - 40 мкг/кг), количество околососудистых инфильтратов проявляло тенденцию к повышению (р=0,040), но это различие не было статистически значимым. Эти результаты демонстрируют, что имеется диапазон доз от 50 до 400 мкг/кг/д для EGF от от 170 мкг/кг/д до 1,4 мг/кг/д для GHRP-6, который обеспечивает препаративную форму комбинации, сохраняющую свою полезность для защиты против индукции ЕАЕ (табл. 5).
Таблица 5
Клиническое обобщение зависимости реакции от дозы исинергизм-потенцирование между отдельными ингредиентамикомбинации EGF/GHRP-6
Группы EGF/GHRP-6
Частота (%)
Клинические балльные оценки
Средняя ± стандартное отклонение
Максимум
Минимум
EGF/GHRP-6 (400 мкг/кг - 1480 мкг/кг)
75
0,62±0,44
0
1
EGF/GHRP-6 (200 мкг/кг - 740 мкг/кг)
75
0,5±0,37
0
1
EGF/GHRP-6 (100 мкг/кг - 340 мкг/кг)
87,5
0,65±0,35
0
1
EGF/GHRP-6 (50 мкг/кг - 170 мкг/кг)
100
0,93±0,49
0,5
2
EGF/GHRP-6 (25 мкг/кг - 85 мкг/кг)
100
1,25±0,65
0,5
2
EGF/GHRP-6 (12 мкг/кг - 40 мкг/кг)
100
1,3±0,87
0,5
3
Таблица 6
Околососудистые воспалительные инфильтраты в головном и спинном мозге каждой экспериментальной группы
Группы EGF/GHRP-6
Количество околососудистиых воспалительных инфильтратов (средняя ± стандартное отклонение
EGF/GHRP-6 (400 мкг/кг - 1480 мкг/кг)
2,7±0,95
EGF/GHRP-6 (200 мкг/кг - 740 мкг/кг)
2,7±0,5
EGF/GHRP-6 (100 мкг/кг - 340 мкг/кг)
2,2±1,2
EGF/GHRP-6 (50 мкг/кг - 170 мкг/кг)
3±1,4
EGF/GHRP-6 (25 мкг/кг - 85 мкг/кг)
3,2±0,95
EGF/GHRP-6 (12 мкг/кг - 40 мкг/кг)
4±0,8
Пример 4
. Оценка эффекта фармацевтической комбинации EGF/GHRP-6 при генерировании естественной реакции регуляторных Т-клеток.
+
20 самок крыс линии Lewis (130 г) подкожно иммунизировали гомогенатами спинного мозга морских свинок (5 мг) в PBS (50%) и полным адъювантом Фрейнда (50%) в 0 и 6-й день. Через 10 дней после первой иммунизации начинали проведение терапевтической схемы лечения с использованием комбинации EGF/GHRP-6 (200 мкг/кг/д - 740 мкг/кг/д) с последующим в течение дополнительных 10 дней ее внутрибрюшным введением 10 из иммунизированных крыс (группа А). Другим 10 крысам вводили PBS в качестве плацебо (группа В). Через 1 неделю после последнего введения животных обеих групп наркотизировали для кровопускания и получения посредством этого мононуклеарных лимфоцитов периферической крови. Лимфоциты, полученные у групп А и В, обрабатывали для отделения клеток CD4.
+
+
Анализ с использованием FACS (лазерного анализатора клеток по интенсивности флюоресценции) клеток CD4. CD25 составил 14,67% в группе А и 3,8% в группе, получавшей PBS (группе В).
+
Других самок крыс линии Lewis (130 г) подкожно иммунизировали гомогенатами спинного мозга морских свинок (5 мг) в PBS (50%) и полным адъювантом Фрейнда (50%) в 0 и 6-й день. Через 10 дней после первой иммунизации подгруппу (n=8) переводили на внутривенное введение 500000 клеток CD4 от группы В.
Клинические балльные оценки были основаны на следующей градации: 0: отсутствие симптомов, 1: паралич хвоста; 2: паралич любой из задних конечностей; 3: полный паралич задних конечностей; 4: полный паралич передних и задних конечностей; 5: умирание или смерть. Потерю массы тела и несостоятельность сфинктеров мочевого пузыря и прямой кишки, которая также является клиническим признаком заболевания, оценивали в баллах добавлением 0,5 к описанному ранее клиническому показателю. Через 40 дней после первой иммунизации животных наркотизировали и подвергали эвтаназии, головной и спинной мозг обрабатывали для патогистологического анализа (10% формалин окрашивание гематоксилином и эозином и люксолом синим). Для патогистологического анализа учитывали следующие параметры: количество и размер околососудистых воспалительных инфильтратов, количество демиелинизационных поражений, количество апоптозных нейронов и глиальных клеток и реактивность астроцитов. Микроскопическое исследование проводили слепым методом.
+
+
+
+
+
Как показано в таблице 7, введение клеток CD4 животным с индуцированной ЕАЕ и получавшим лечение фармацевтической комбинацией защищает хозяина от развития ЕАЕ. Только у 50% животных, которым вводили клетки CD4, полученные от группы А, у которой развилась легкая клиническая форма ЕАЕ (клиническая балльная оценка 0,5-1), остальные 50% оставались не пораженными. Напротив, у 100% животных, которым вводили клетки CD4, полученные от группы В, развилась ЕАЕ, у 62,5% в тяжелой клинической форме (клиническая балльная оценка 2-4), а у 37,5% в легкой клинической форме (клиническая балльная оценка 0,5-1). В подгруппе, переведенной на введение клеток CD4, полученных от группы А, средний клинический показатель составил 0,31±0,34. В подгруппе, переведенной на введение клеток CD4, полученных от группы В, средний клинический показатель составил 2,1±0,99 (Р=0,0003). Для статистического анализа использовали Т критерий Mann Whitney.
Таблица 7
Защитный эффект адоптивного переноса клеток
Группы
Частота (%)
Дни начала (Средняя ± стандартное отклонение)
Клиническая балльная оценка
Средняя ± стандартное отклонение
Максимум
Минимум
Группа А
50
10±0
0,31±0,34
1
0
Группа В
100
11,5±0,57
2,1 ± 0,99
4
1
+
+
Как показано в таблице 8, гистологический анализ головного и спинного мозга в экспериментальной группе показал, что даже при наличии аналогичной ситуации в отношении реактивных астроцитов, количество (р=0,0001) и размер сосудистых манжет у крыс-хозяев клеток CD4, полученных от группы А, меньше, чем у крыс, которым адоптивно переносили клетки CD4, полученные от группы В.
Таблица 8
Околососудистые воспалительные инфильтратыв головном и спинном мозге каждой экспериментальной группы
Группы
Количество околососудистых воспалительных инфильтратов (Средняя ± стандартное отклонение)
Хозяин клеток CD4<sup>+</sup>, полученных от группы А
2,1±0,8
Хозяин клеток CD4<sup>+</sup>, полученных от группы В
6,5±1,7
Эти результаты демонстрируют, что лечение фармацевтической комбинацией способно вызвать пролиферацию естественных регуляторных Т-клеток, которые защищают от развития тяжелых клинических форм ЕАЕ в экспериментах адоптивного переноса.