Идентификация пигментов каллусной культуры Iris ensata Tnunb. потенциальных пищевых красителей

2001

Известия Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра

Том 129

В.Г.Рыбин, Е.В.Болтенков*, Д.В.Куклев

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПИГМЕНТОВ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ IRIS ENSATA TNUNB. -ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ПИЩЕВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ

Среди веществ, определяющих внешний вид пищевых продуктов, одними из важнейших являются красители. Пищевые красители применяются во многих отраслях пищевой промышленности: кондитерской, рыбной и т.д. (Борисочкина, 1976; Харламова, Кафка, 1979; Булдаков, 1996).

Красители, используемые для пищевых продуктов, в зависимости от их происхождения подразделяются на натуральные и синтетические. Несмотря на то что искусственные красители по сравнению с естественными имеют существенные технологические преимущества, с гигиенической точки зрения они заслуживают критического отношения, так как среди этой группы практически нет безвредных веществ, а многие являются канцерогенами, мутагенами или аллергенами (Булдаков, 1996). Поэтому применение синтетических красителей ограничивается как путем сокращения числа допустимых соединений (в России и странах СНГ разрешено использование индигокармина и тартразина (Булдаков, 1996)), так и путем расширения ассортимента нетоксичных натуральных красителей (Росивал и др., 1982).

Среди натуральных красителей наиболее распространены вещества, относящиеся по химической природе к каротиноидам, флавоноидам (ан-тоцианы, флавоны, флавонолы), хлорофиллам, беталаинам и хинонам (Timberlake, Henry, 1986). Традиционно натуральные пищевые красители получают из плодов и цветков дикорастущих растений либо из отходов консервной промышленности (Минаева, 1978; Харламова, Кафка, 1979; Новрузов, 1996).

Несмотря на то что естественные красители не относятся к нутри-ентам, их использование оправданно не только способностью усиливать или восстанавливать цвет продуктов. Флавоноидные красители обладают рядом ценных качеств, которые определяют их биологическую активность. Антиоксидантные и антирадикальные свойства полифенолов лежат в основе таких проявлений их биологической активности, как капилляроукрепляющий, гепатозащитный, мембранопротективный эффекты и, прежде всего, в основе их противолучевого и антистрессового действия (Барабой, Хомчук, 1998). Биофлавоноиды, помимо P-витаминной активности (способности нормализовать нарушенную проницаемость капилляров), служат синергистами витамина C и предохраняют его от избыточного окисления, сохраняя тем самым биологическую активность

99

(Herrmann, 1976). Некоторые флавоноиды благодаря антиокислительным свойствам являются активными ингибиторами окислительных ферментов (Запрометов, 1974; Fo rmica, Regelson, 1995; N agao et al., 1999; Sugihara et al., 1999).

По мере роста требований к применению пищевых добавок интерес к флавоноидам как промышленным пищевым красителям природного происхождения, несомненно, будет увеличиваться, что в первую очередь связано с поиском новых, нетрадиционных источников получения. Обосновано это тем, что при получении натуральных красителей не всегда можно обеспечить постоянство состава, так как качество натуральных красителей зависит от условий, в которых развивались растения (географическое положение, климат, почва, питание и др.).

Альтернативным источником получения флавоноидов являются культивируемые in vitro клетки и ткани растений (Fujita, 1985; Бриттон, 1986; Dornenburg, Knorr, 1996). В лаборатории биотехнологии Биологопочвенного института ДВО РАН получена каллусная культура дальневосточного вида рода Iris L. - I. ensata Thunb. (Iridaceae), синтезирующая в зависимости от условий культивирования желтые и красные пигменты.

Использование метода культуры клеток и тканей для биотехнологического производства вторичных метаболитов растений имеет ряд преимуществ. Это прежде всего независимость от климатических условий, сезона года, объема получаемого сырья, возможность получения экологически чистого продукта по сравнению с природным сырьем.

Применение новых источников пищевых красителей во многих случаях ограничено отсутствием сведений о способах идентификации и определения их химического состава (Булдаков, 1996). Поэтому в последнее время возрос интерес к изучению пигментного состава растительного сырья и продуктов его переработки (Escarpa, Go nzalez, 1998; Justesen et al., 1998; Coiffon et al., 1999; Филиппова и др., 2000; Careri et al., 2000; Revilla, Ryan, 2000). В то же время проводятся интенсивные исследования по установлению взаимосвязи химического строения с биологической активностью, в частности рассматривается влияние структуры на анти-оксидантные свойства веществ (Sugihara et al., 1999; Magnani et al., 2000).

Цель настоящей работы - изучение условий биосинтеза красных пигментов в каллусной культуре Iris ensata Thunb. - потенциального источника естественных красителей, - установление структуры пигментов и разработка метода их выделения.

Культивирование каллусной ткани I. ensata, индуцированной из зародышей, проводили на модифицированной агаризованной питательной среде, содержащей минеральные соли среды MC (Murashige, Skoog, 1962) и органические добавки (Болтенков и др., 2000). Во всех вариантах эксперимента начальная масса каллусов была одинакова (50 мг). В состав питательных сред вносили экзогенные фитогормоны: 2,4-дихлор-феноксиуксусную кислоту (2,4-Д), 6-бензиламинопурин (БАП) и кине-тин (КИН). Каллусную ткань инкубировали в темноте при температуре 22-24 оС и относительной влажности воздуха 70 %. Продолжительность пассажа составляла 45 сут. Все эксперименты проводили с 20-кратной повторностью.

Экстракцию пигментов из воздушно-сухой биомассы проводили 96 % -ным водным этанолом при 25 оС. Полученные экстракты центрифугировали при 10000 об./мин и минус 20 оС, супернатант отделяли, филь-

100

тровали и упаривали в вакууме до постоянного веса. Получали 300-500 мг сухой смеси из 4-5 г исходной ткани.

Тонкослойную хроматографию (TCX) осуществляли на пластинках Silufol ("Kavalier", ЧCФP) с применением систем растворителей: гек-сан - диэтиловый эфир (1: 1), этилацетат, бензол и бензол-этилацетат (1: 1). Для обнаружения неокрашенных веществ на хроматограммах использовали 5 %-ный раствор серной кислоты в метаноле либо 10 %-ный раствор фосфорномолибденовой кислоты в этаноле.

Колоночную хроматографию проводили с использованием силикагеля Порокварц ПКН-200 (100-200 мкм, “ APO”, Россия). На колонку с 20 г силикагеля наносили 0,5 г сухой смеси, полученной после экстракции. Элюировали в следующей последовательности: гексан (600 мл) ^ бензол (500 мл) ^ этилацетат (900 мл) ^ этанол (50 мл). Элюат собирали в пробирки по 10 мл. Фракции, по данным TCX содержащие близкие по составу смеси, объединяли, упаривали и высушивали в вакууме при температуре 35 oC до постоянного веса.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (BЭЖX) осуществляли на жидкостном хроматографе LC-6A (“Shimadzu”, Япония) с использованием колонки Zorbax ODS (4,6 х 250 мм, 5 мкм, “DuPont”, CШA) и предколонки Sh im-Pack FLC-ODS (4,6 x 50 мм, 3 мкм, “Shimadzu”, Япония) при температуре 55 oC. Peгиcтpaцию сигнала проводили с использованием УФ-детектора с диодной матрицей SPD-M6A (“Shimadzu”, Япония). C помощью препаративной BЭЖX на колонке Zorbax ODS (9,4 х x 250 мм, 5 мкм), используя в качестве элюента систему растворителей ацетонитрил - вода - уксусная кислота (30,0: 70,0: 0,05), из 1 мг исходной смеси, обогащенной красным пигментом, получали 0,8 мг хроматографически однородного продукта, имеющего красное окрашивание (RT = = 13,53 мин, Rf 0,04 (этилацетат)).

Спектроскопическое оборудование. Масс-спектры регистрировали на приборе LKB-9000S (Швеция) при ионизации электронным ударом (70 эВ) и прямым вводом пробы в источник. Температура ионного источника 210 oC. BЭЖX-мacc-cпeктpoмeтpию проводили на хромато-масс-спектрометре Agilent MSD 1100 (‘Hewlett Packard”, CШA) в режиме химической ионизации элюентом при атмосферном давлении, при регистрации положительных ионов. УФ-спектры регистрировали в кювете УФ-детектора SPD-M6A жидкостного хроматографа LC-6A (“Shimadzu”, Япония).

Исследовано влияние 2,4-Д и цитокининов на ростовые характеристики каллусной культуры I. ensata (табл. 1). Инкубирование каллус-ной ткани в темноте на среде, содержащей 1 мг/л 2,4-Д и 0,5 мг/л БAП, способствовало наибольшему приросту биомассы; ткань имела желтую окраску. Изменение условий культивирования, а именно уменьшение содержания 2,4-Д или исключение его из состава питательной среды, способствовало окрашиванию ткани в красный цвет, но при этом рост каллусов замедляется (табл. 1).

Таким образом, для получения красного пигмента следует применять двухэтапное культивирование каллусной ткани данного вида: на первом этапе создать условия для накопления биомассы каллусов, а на втором - для синтеза пигмента.

Aнaлиз экстрактов методом TCX показал наличие в них как окрашенных, так и неокрашенных соединений (рис. 1). Качественная реакция на гликозиды (опрыскивание пластинок a-нафтолом) показала отсут-

101

Таблица 1

Влияние фитогормонов на прирост биомассы и окрашивание каллусной ткани Iris ensata

Table 1

Influence of phytohormones on the growth of biomass and coloration of Iris ensata callus tissue

Концентрация Окраска каллусной

фитогормонов, мг/л ткани

2,4-Д БАП КИН Желтая Красная

Прирост биомассы, мг*

0,1 0,1 - + + 480±24

0,1 0,5 - + + 372 ±17

0,3 0,5 - + + 467 ±24

0,5 0,5 - + + 374±22

1,0 0,1 - + + 735±23

1,0 0,5 - + - 947 ±18

1,0 2,5 - + - 921±28

3,0 0,1 - + - 400 ± 18

3,0 0,5 - + - 604±20

5,0 0,5 - + - 356 ±16

1,0 - 0,1 + - 655±16

1,0 - 0,5 + - 729±26

1,0 - 2,5 + - 806±30

* Представлены средние арифметические значения и их стандартные ошибки. +(—) - наличие (отсутствие) окрашивания.

ствие последних среди экстрагированных пигментов. Результаты ТСХ-анализа показали, что в смеси пигментов присутствует как минимум два соединения, имеющих желтую окраску (рис. 1, а), и два - красно-оранжевую. В результате исследований хроматографических (ТСХ) свойств пигментов обнаружено, что наиболее приемлемой элюирующей системой для предварительного ТСХ-анализа пигментов

из каллусной ткани I. ensata является 100 %-ный этила-

цетат (рис. 1). Однако для отделения желтых пигментов от красных элюирование необходимо проводить бензолом. Исходя из результатов ТСХ-анализа подобраны параметры для разделения желтых и красных пигментов I. ensata методом препаративной колоночной хроматографии, а именно: после нанесения смеси пигментов на колонку необходимо предварительно элюировать ее последовательно гексаном для отделения неполярных неокрашенных соединений (рис. 1, б), бензолом для отделения желтых пигментов, а затем, увеличивая полярность элюирующей системы путем добавления этилацетата, добиваться разделения красных пигментов.

Выбор условий для проведения ВЭЖХ-анализа смеси пигментов показал, что наилучшего разделения соединений удалось добиться, используя элюент ацетонитрил - вода - уксусная кислота (30,0: 70,0: 0,01), который является приемлемой элюирующей системой для получения хорошего разрешения пиков, соответствующих индивидуальным пигментам (рис. 2).

Однако детальное исследование индивидуальности пиков с использованием их У Ф-спектральных характеристик показало, что осуществить разделение пигментов, отмеченных на хроматограмме как пик № 4 (рис. 2), не удалось. Это видно на участке проекционной хроматограммы той же смеси пигментов (рис. 3).

Разрешение остальных пиков было удовлетворительным (спектральная чистота пиков составляла 0,99), что дало возможность говорить об индивидуальности соединений, соответствующих этим пикам (см. рис. 2). Однако пик № 6, соответствующий одному из желтых пигментов, накладывался на пик, соответствующий неокрашенному компоненту, присутствующему в исходной смеси в значительных количествах, что вид-

102

но из результатов ТСХ-анализа (см. рис. 1, б). Таким образом, показано, что использование ВЭЖХ для разделения смеси пигментов на индивидуальные компоненты без проведения предварительного фракционирования не может привести к желаемому результату - получению индивидуальных пигментов с целью установления их структуры.

Рис. 1. ТСХ-анализ экстракта из каллусной ткани I. ensata: а - непрояв-ленные пластинки, б - пластинки, проявленные 10 %-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле; 1 - желтые пигменты, 2 - красно-оранжевые пигменты

Fig. 1. TLC-analysis of extract from I. ensata callus tissue: а - the plates

were not developed, б - the plates were developed by 10 % solution of phospho-molybdic acid in ethanol; 1 - yellow pigments, 2 - red-orange pigments

Рис. 2. ВЭЖХ-анализ исходной смеси пигментов каллусной ткани I. ensata. Цифрами обозначены пики, соответствующие соединениям, имеющим максимумы поглощения более 300 нм

Fig. 2. HPLC analysis of initial mixture of pigments from I. ensata callus tissue. Peaks of compounds with X more 300 nm were marked

^ max

В результате применения метода колоночной хроматографии для

разделения смеси пигментов были получены 16 фракций, содержащих

концентраты окрашенных компонентов смеси, которые далее анализи-

103

ровали методами ТСХ и ВЭЖХ. Сравнение результатов анализа полученных фракций показало, что только 4 из них содержат главные пигменты. Эти фракции далее были детально исследованы методами ВЭЖХ (рис. 4), УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ-масс-спектрометрии (табл. 2).

Рис. 3. Временной отрезок проекционной хроматограммы (11,5-13,0 мин) ВЭЖХ-анализа исходной смеси пигментов каллусной ткани I. ensata. Цифрами

обозначены максимумы пиков, входящих в неразрешенный пик № 4 (рис. 2) Fig. 3. The time interval of two dimentional cromatogramm (11,5-13,0 min) of HPLC analysis of the initial mixture of pigments from I. ensata callus tissue. The maximum of peakes, that contain in unresolved peak number 4 (fig. 2), were marked

0 4 0 12 16 20 24 20 32 36 40

Время, мин

[0 .044

0 3 6 9 12 15 10 21 24 27 30

Время, мин

Рис. 4. ВЭЖХ-анализ пигментсодержащих фракций, полученных после предварительного разделения исходной смеси пигментов I. ensata методом колоночной хроматографии на силикагеле: а - фракция № 5, б - № 7, в - № 11, г - № 15

Fig. 4. HPLC-analisys of fractions, obtained after separation of initial mixture of pigments from I. ensata callus tissue by column chromatography on Silica gel, and containing main pigments: а - fraction 5, б - fraction 7, в - fraction 11, г -fraction 1 5

Таблица 2

Спектральные данные главных пигментов, полученных после предварительного разделения исходной смеси методом колоночной хроматографии на силикагеле

Table 2

Spectral data of main pigments, obtained after obtained after separation of initial mixture of pigments from I. ensata callus tissue by column chromatography on Silica gel

Фракция Молекулярная масса, Да X нм max

15 270 371

11 268 356

7 270 370

5 272 382

Сравнение УФ-спектральных характеристик и молекулярных масс пигментов каллусной ткани I. ensata (табл. 2) с величинами, полученными из литературных источников, показало, что исследуемые соедине-

105

ния относятся к классу флавоноидов. Это обстоятельство объясняется прежде всего наличием в их структуре характерного для флавоноидов хромофора (рис. 5), обусловливающего поглощение в области 300-400 нм.

Рис. 5. Структура хромофора флавоноидов, отвечающая поглощению в области 300-400 нм

Fig. 5. The structure of flavonoids chromop-hore having absorbance at 300-400 nm

Сравнение значений молекулярных масс и УФ-спектральных характеристик у исследуемых пигментов и известных флавоноидов дали основание для предположения, что изменение условий культивирования каллусной ткани I. ensata способствует биосинтезу изомеров известных представителей флавоноидов.

С целью установления структуры главных окрашенных компонентов исходной смеси, содержащихся в 4 фракциях, полученных после предварительного разделения методом колоночной хроматографии, была проведена тонкая очистка окрашенных соединений методом препаративной ВЭЖХ. В результате получены 3 главных пигмента, которые исследовали спектральными методами анализа (масс-спектрометрия, УФ-спек-трофотометрия). На основании данных масс-спектрометрии триметилси-лил-производных метоксимов исследуемых пигментов установлено, что все эти компоненты исходной смеси пигментов представляют собой изомеры с общим структурным фрагментом (рис. 6). Основанием этому служит фрагментация молекулярных ионов производных исследуемых соединений, которая охарактеризована на рис. 7.

Рис. 6. Общий структурный фрагмент исследуемых пигментов

F i g. 6. G eneral st r uctural f ragment of the investigated pigments

Рис. 7. О сновная структурная фрагментация молекулярных ионов производных главных 3 окрашенных компонентов исходной смеси Fig. 7. The p rimary st ruc-tural fragmentation of molecular ions of derivatives of the main co l o red components of initial mixture

Показанные на рис. 7 фрагменты молекулы соответствуют исходной структуре триметилсилильного производного метоксима соединения, показанного на рис. 8.

Mr = 369,49 Mr = 268,26

Рис. 8. Структурные формулы одного из главных компонентов исходной смеси пигментов (II) и триметилсилил производного его метоксима (I). Фрагментация соответствует показанной на рис. 6

Fig. 8. The structure of main component of initial mixture of pigments (II) and trimethylsilyl derivative of its methoxyme (I). Fragmentation is shown on fig. 6

Положение метоксильной группы в кольце В у данного типа соединений методом масс-спектрометрии установить не удалось. Все три исследуемых соединения имели одинаковые масс-спектры, но различались по У Ф-спектральным характеристикам, что вполне согласуется с литературными данными, так как положение метоксильной группы заметно влияет на максимум поглощения подобных соединений (Chemistry..., 1962; Mabry, 1969; Mabry et al., 1970).

Различие в структурах, вероятно, обусловлено изомерией положения метоксильной группы при атомах углерода в кольце В молекул данных соединений.

Таким образом, определены условия биосинтеза красных пигментов в каллусной культуре Iris ensata. Показано, что красное окрашивание каллусной ткани обусловлено изменением гормонального состава питательной среды. Получены индивидуальные пигменты из каллусной ткани I. ensata последовательным проведением колоночной хроматографии на силикагеле и высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе. Установлено, что основными пигментами, придающими красную окраску каллусной ткани данного вида, являются изомеры моногидрокси-монометоксифлавона (рис. 8, структура II).

Авторы выражают благодарность д.б.н. В.П.Булгакову (БПИ ДВО РАН) за критические замечания к рукописи статьи.

Литература

Барабоп В.А., Хомчук Ю.В. Механизм антистрессового и противолучевого действия растительных фенольных соединений // Укр. биохим. журн. -1998. - Т. 70. - С. 13-23.

Болтенков Е.В., Лабецкая Н.В., Журавлев Ю.Н. Получение и культивирование каллусной ткани Iris setosa Pall. ex Link. // Биотехнология. -2000. - № 5. - С. 47-51.

Борисочкина Л.И. Антиокислители, консерванты, стабилизаторы, красители, вкусовые и ароматические вещества в рыбной промышленности. - М.: Пищ. пром-сть, 1976. - 183 с.

Бриттон Г. Биохимия природных пигментов. - М.: Мир, 1986. - 422 с.

Булдаков А.С. Пищевые добавки. Справочник. - СПб: UT, 1996. - 240 с.

107

Запрометов М. Н. Основы биохимии фенольных соединений. - М., 1974. - 214 с.

Минаева В.Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическое использование. - Новосибирск: Наука, 1978. - 254 с.

Новрузов Э.Н. Перспективные пищевые красильные растения Азербайджана // 1-я Всерос. конф. по ботаническому ресурсоведению. - СПб., 1996. - С. 202-203.

Росивал Л., Энгст Р., Соколай А. Посторонние вещества и пищевые добавки в продуктах. - М.: Лег. и пищ. пром-сть, 1982. - 264 с.

Филиппова Р.Л., Филатова И.А., Колесников А.Ю. Значение в профилактике заболеваний фенольных соединений плодов и ягод // Пищ. пром-сть. - 2000. - № 8. - С. 35-37.

Харламова О.А., Кафка Б.В. Натуральные пищевые красители. - М.: Пищ. пром-сть, 1979. - 190 с.

Careri M., Elviri L., Mangia A., Musci M. Spectrophotometric and coulometric detection in the high-performance liq uid chromatography of flavonoids and optimization of sample treatment for the determination of q uercetin in orange juice // J. Chromatogr. - 2000. - Vol. 881. - P. 449-460.

Chemistry of flavonoid compounds / Ed. T.A.Geissman. - Oxford: Pergamon Press, 1962. - 666 p.

Coiffon J.-P., Mouly P.P., Gaydou E.M. Anthocyanic pigment determination in red fruit juices , concentrated juices and syrus using liq uid chromatography // Anal. Chim. Acta. - 1999. - Vol. 382. - P. 39-50.

Dornenburg H., Knorr D. Generation of colors and flavors in plant cell and tissue cultures // Crit. Rev. Plant. Sci. - 1996. - Vol. 15. - P. 141-168.

Escarpa A., Gonzalez M.C. High-performance liq uid chromatography with diode-array detection for the determination of phenolic compounds in pell and pulp from different apple varieties // J. Chromatogr. - 1998. - Vol. 823. - P. 331-337.

Formica J.V., Regelson W. Review of the biology of q uercetin and related bioflavonoids // Food Chem. Toxic. - 1995. - Vol. 33. - P. 1061-1080.

Fujita Y. Production of plant pigments by plant tissue and cell culture // J. Synth. Org. Chem. - 1985. - Vol. 43. - P. 1003-1012.

Herrmann K. Flavonols and flavones in food plants: a review // J. Food

Technol. - 1976. - Vol. 11. - P. 433-448.

Justesen U., Knuthsen P., Leth T. Quantitative analysis of flavonols, fla-vones,and flavanones in fruits , vegetables and beverages by high-performance liq uid chromatography with photo-diode array and mass spectrometric detection // J. Chromatogr. - 1998. - Vol. 799. - P. 101-110.

Mabry T.J. The ultraviolet and nuclear magnetic resonance analysis of fla-fonoids // Perspectives in phytochemistry / Ed. J.B.Harborne, T.Swain. - L.; N.Y.: Academic Press, 1969. - P. 1-45.

Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. The systematic identification of flavonoids. - B.; Heidelberg; N.Y.: Springer-Verlag, 1970. - 355 p.

Magnani L., Gaydou E.M., Hubaud J.C. Spectrophotometric measurement of antioxidant properties of flavones and flavonols against superoxide anion // Anal. Chim. Acta. - 2000. - Vol. 411. - P. 209-216.

Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 15. - P. 473-497.

Nagao A., Seki M., Kobayashi H. Inhibition of xanthine oxidase by flavonoids // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 1999. - Vol. 63. - P. 1787-1790.

Revilla E., Ryan J.-M. Analysis of several phenolic compounds with potential antioxidant properties in grape extracts and wines by high-performance liq uid chromatography-photodiode array detection without sample preparation // J. Chromatogr. - 2000. - Vol. 881. - P. 461-469.

Sugihara N., Arakawa T., Ohnishi M., Furuno K. Anti- and pro-oxidative effects of flavonoids on metal-induced lipid hydroperoxide-dependent li pid peroxidation in cultured hepatocytes loaded with a-linolenic acid // Free Radical Biol. Med. - 1999. - Vol. 27. - P. 1313-1323.

Timberlake C.F., Henry B.S. Plant pigments as natural food colours // Endeavour (OXF). - 1986. - Vol. 10. - P. 31-36.

108