Способность миокарда крыс к самообновлению в экспериментах in vitro: пролиферативная активность неонатальных кардиомиоцитов

Способность миокарда крыс к самообновлению в экспериментах in vitro: пролиферативная активность неонатальных кардиомиоцитов

Т.А. Голованова, Г.Б. Белостоцкая

Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург Федеральный центр сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова Минздравсоцразвития РФ, Санкт-Петербург

Regeneration of rat cardiac myocytes in vitro: the proliferative activity of neonatal cardiac myocytes

T.A. Golovanova, G.B. Belostotskaya

Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of RAS, Saint-Petersburg V.A. Almazov Federal Heart, Blood and Endocrinology Centre, Saint-Petersburg

Полное прекращение деления кардиомиоцитов (КМЦ) в сердце млекопитающих в первую неделю постнатальной жизни является неразрешенной загадкой эволюции и непреодолимым препятствием для гистотипической регенерации поврежденного миокарда у человека. Было показано, что в первичной культуре кардиомиоцитов новорожденной крысы воспроизводятся процессы, происходящие в сердце в раннем постнатальном онтогенезе. Как и in vivo после всплеска митотической активности в первые 2—4 сут. жизни, деление КМЦ в культуре также прекращалось через 4—5 сут. после посева. При этом, как и в организме, наблюдалось митотическое деление 60% клеток, после прекращения которого происходило нарастание их объема, что также аналогично процессу гипертрофии клеток в организме. Объем кардиомиоцитов увеличивался с 819±68 мкм3 в 1-е сут. до 1532±212 мкм3 на 3-и и до 3246±190 мкм3 на 6-е сут. культивирования. Причем скорость нарастания объема клеток в культуре практически полностью совпадала со скоростью гипертрофии КМЦ в организме. Как и in vivo гипертрофия сопровождалась образованием полиплоидных и многоядерных, в основном двуядерных клеток. Анализ перераспределения кардиомиоцитов по объему в процессе культивирования указывает на то, что 60% кардиомиоци-тов переходят от гиперплазии к гипертрофии, останавливаясь на границе фаз G/M.

Полученные результаты позволяют утверждать, что первичная культура клеток миокарда адекватно воспроизводит события, происходящие in vivo, и является ценным инструментом для изучения процессов, прекращающих пролиферацию кардиомиоцитов взрослых млекопитающих.

Ключевые слова: кардиомиоциты, пролиферация, митоз, полиплоидизация, многоядерность.

Утрата способности клеток сердечной мышцы млекопитающих к самообновлению, присущему костистым рыбам и амфибиям, которые полностью восстанавливают объем и функцию сердца при удалении 20% миокарда [1], является непреодолимым препятствием для полноценной гистотипической регенерации поврежденного миокарда у человека. Было установлено, что переключение гиперплазии на гипертрофию происходит в сердце млекопитающих между 3-и и 4-и сут. после рождения [2, 3]. Кроме того, было показано, что в постнатальном периоде значительно возрастает доля S-фазных кардиомиоцитов [4], а также снижается экспрессия и активность ряда регуляторов клеточного цикла и утрачивается пролиферативная активность взрослых

e-mail: gbelost@mail.ru

In mammalian heart, cardiac myocyte division ceases within the first week of postnatal life posing one of the most intriguing questions of evolution. Stimulation of cardiac myocyte proliferation during postnatal period would have profound impact on cardiac regeneration in humans. It has been shown that the primary culture of cardiac myocytes obtained from newborn rat could serve as an appropriate model for the investigation of the processes taking place in the heart during early postnatal ontogenesis. Similarly to the in vivo situation, the increased mitotic activity observed during the first 2—4 days after birth is diminished in cardiac myocyte culture within 4—5 days of culturing. Besides, 60% of cultured cells underwent mitotic division followed by increase in their volume which also closely resembles the process of cardiac myocyte hypertrophy in vivo. The cardiac myocyte volume was progressively increased during culturing and equaled to 819±68, 1532±212, and 3246±190^mP on the 1st, 3rd, and 6th day of culture, respectively. Furthermore, the rate of cardiac myocyte growth in culture was similar to the pattern of myocyte hypertrophy observed in the in vivo settings. Myocyte hypertrophy in culture was associated with the formation of polyploid and multinucleated, most commonly binucleated, cells which is generally analogous to the in vivo myocyte hypertrophy. The analysis of myocyte volume distribution suggested that during cultivation nearly 60% of cells are switched from hyperplasia to hypertrophy, stopping at the G/M boundary of the cell cycle.

The results obtained indicate that cell growth patterns in primary cardiac myocyte culture share a lot of similarity with the in vivo cardiac myocyte growth. Primary cardiac myocyte culture is a valuable tool for investigation of the processes responsible for cessation of cardiac myocyte division in adult mammals.

Key words: cardiomyocytes, proliferation, mitosis, polyploidy, multinucleate myocytes.

миоцитов [5], что вызывает их остановку в клеточном цикле [2—6].

Прекращение пролиферации кардиомиоцитов у взрослых млекопитающих и поиски путей, способных заставить их возобновить деление, или клеток, способных дифференцироваться в полноценные кардиомиоциты в локусе повреждения сердечной мышцы, послужило в последнее время толчком к появлению большого количества работ, посвященных этим вопросам. Работа американских ученых [7] о полном восстановлении структуры и функции миокарда однодневных мышей после 15% резекции левого желудочка продемонстрировала наличие регенерационного потенциала у млекопитающих в раннем неонатальном периоде и полного прекращения этой функции в конце первой недели жизни.

Целью нашего исследования было изучение «поведения» клеток миокарда новорожденной крысы в первичной культуре в первые дни после посева для сопоставления с процессами, происходящими в организме млекопитающих в первые дни после рождения. Это позволило создать клеточную модель для последующего изучения причин полного прекращения пролиферации зрелых кардиомиоцитов в сердце млекопитающих.

Материал и методы

В работе использовали новорожденных крыс линии Wistar, усыпленных ингаляцией СО2 (согласно международным правилам работы с животными). При ферментативном разрушении сердечной мышцы использовали метод Лэма с соавт. (2002) в собственной модификации [8]. Выделенные сердца промывали в растворе Рингера (мМ: 146 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 11 глюкозы, 10 HEPES, pH-7,4), измельчали и инкубировали в этом же растворе с добавлением коллагеназы I типа (Sigma, США) в концентрации 1 мг/мл и 0,12% трипсина (Биолот, РФ) в течение 20—30 мин при температуре 37оС. Полученную суспензию отстаивали в течение 2—3 мин для осаждения неразрушенных кусочков ткани. Супернатант осаждали на центрифуге при 1500 об/мин в течение 10 мин. Клетки переносили в теплую питательную среду DMEM с 10% сыворотки плодов коров (Биолот, РФ) с добавлением 50 ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Биолот, РФ) и преинку-бировали в стеклянных чашках Петри (Медполимер, РФ) в течение 30—40 мин для очистки популяции от примеси посторонних клеток. Клетки выращивали в 40 мм чашках Петри на 2 полосках покровного стекла (12x24 мм), предварительно покрытых слоем поли-д-лизина в концентрации 0,1 мг/мл (Эпидбио-мед, Россия). Рассев производили в концентрации 1x105 кл/мл. Культивирование проводили в СО2-инкубаторе при 5% СО2, влажности 95% и температуре 37°С. Питательную среду меняли дважды в неделю.

Для построения кривой роста клетки выращивали в 24-луночных планшетах (Costar, США) в 0,5 мл питательной среды. Каждый день в камере Фукса-Розенталя подсчитывали количество клеток в лунках, снимая их с поверхности с помощью смеси 0,25% трипсин/0,03% версен (Биолот, РФ) в соотношении 1:3. Данные 4 экспериментов с тремя повторами в каждом усредняли.

Способность сердечных клеток к делению оценивали по митотическому индексу (МИ) и накоплению митотических клеток в присутствии колхицина (Кх). МИ (отношение числа митотических ядер к интерфазным) и долю многоядерных клеток определяли на окрашенных гематоксилином препаратах путем подсчета 1000 клеток на каждый срок фиксации с использованием тринокулярного светового микроскопа H 605T (WPI, США). Клетки выращивали на покровных стеклах и ежедневно фиксировали смесью ледяной уксусной кислоты и спирта (1:3). Кх в конечной концентрации 0,05 мкг/мл добавляли ежедневно в очередные 3 лунки планшета с клетками и определяли долю к-митозов на микроизображениях, полученных на следующий день (через 24 ч).

Кинетику изменений и морфологию клеток прослеживали путем прижизненного микрофотографирования растущей популяции в чашках Петри на

инвертированном микроскопе с использованием цифровой камеры или на окрашенных гематоксилином препаратах. Морфометрические параметры клеток определяли на микроизображениях клеток, снятых с поверхности смесью трипсин/версен (1:3), с помощью программы ВидеоТестМорфология (Ви-деоТестМорфология, РФ). Объем клеток вычисляли по формуле:

V = 3,14/6-d2-D, где d — малый диаметр (ширина); D — большой диаметр клетки (длина).

Микроизображения получали с помощью цветной цифровой камеры Leica DFC300 FX (Германия) и инвертированного микроскопа PIM-III (WPI, США) с объективом x40.

Статистическую обработку результатов производили с помощью программы Microsoft Excel 7.0. Данные представляли как среднее ± ошибка среднего (M±m).

Результаты

За 4—5 сут. культивирования количество клеток увеличивалось более чем в 4 раза (рис. 1). Данные по накоплению к-митозов, (рис. 2А) демонстрируют всплеск митотической активности со 2-х по 4-е сут. культивирования. Доля клеток, остановленных в метафазе с помощью Кх, достигала 20—23% ежедневно. Затем количество митотических клеток снижалось и держалось на уровне 6—7% в последующие дни наблюдения (7—8 сут.). Таким образом, было установлено, что около 70% кардиомиоцитов вступали в деление на протяжении первых 2—5 сут. развития in vitro, а МИ в этот период колебался в диапазоне от 1,6 до 0,4 % (табл.). При этом митотическое деление на стадиях профазы, метафазы и анафазы регистрировалось не только в первые 5 дней развития клеток миокарда в культуре, но и на всех сроках наблюдения — до 8 сут. (рис. 3). В качестве редкого события было зарегистрировано, что гипертрофированные 6—8-суточные кардиомиоциты не только вступали в митоз, но и могли завершить его благополучным цитокинезом (рис. 3Г).

Параллельно делению клеток было зарегистрировано нарастание среднего объема кардиомиоцитов от 819±68 мкм3 — в 1-е сут., до 1532±212 мкм3 — на 3-и сут. и до 3246±190 мкм3 — на 6-е сут. развития (рис. 2Б).

Рис.1. Кривая нарастания количества клеток в первичной культуре кардиомиоцитов новорожденной крысы

5

2

5

О)

Д1

Ю

О

Время культивирования, сут.

Рис. 2. Кривые изменения доли делящихся клеток и объема (гипертрофии) клеток в первичной культуре кардиомиоцитов новорожденной крысы: А - доля митотических клеток (к-митозов, колхицин 0,05 мкг/мл); Б - нарастание объема кардиомиоцитов в процессе культивирования

Рис. 3. Неонатальные кардиомиоциты крыс линии Wistar на разных сроках культивирования:

А - профаза, 8 сут. культивирования; Б - метафаза, 3 сут.; В - анафаза, 8 сут.; Г - цитокинез, 6 сут.;

Д - трехъядерный кардиомиоцит (одно ядро в интерфазе и два ядра в профазе), 4 сут.; Е - двуядерный кардиомиоцит (одно ядро в интерфазе, другое - в метафазе), 3 сут.; Ж - одно-, двух- и трехядерные кардиомиоциты, 3 сут.; З - пятиядерный кардиомиоцит, 4 сут.; И - полиплоидный кардиомиоцит, 8 сут.

Динамика изменения количества митотических и многоядерных кардиомиоцитов в процессе культивирования

Варианты Время культивирования, сутки

2 3 4 5 6 7 8

Митотические клетки (МИ %) 16* (1,6)** 13* (1,3)** 4* (0,4)** 8* (0,8)** 10* (1,0)** 15* (1,5)** 6* (0,6)**

Двуядерные клетки 11 12 34 33 32 80 94

Клетки с 3 ядрами 2 2 - - 2 2 2

Клетки с 4 ядрами 2 1 - - - - -

Примечание; * — количество митотических и многоядерных кардиомиоцитов среди 1000 клеток на каждый срок фиксации; ** — митотический индекс (МИ): отношение количества митотических ядер к интерфазным.

Значительный разброс клеток миокарда по размеру уже в первые сутки культивирования (следующий день после посева) позволил нам провести условное разделение клеток по объему на 6 субпопуляций: 1 — до 249 мкм3, 2 — от 250 до 499 мкм3, 3 — от 500 до 999 мкм3, 4 — от 1000 до 1999 мкм3, 5 — от 2000 до 3999 мкм3 и 6 — от 4000 до 16000 мкм3 (рис. 4А). Анализ кривых на рис. 4 показывает, что доля клеток 3-й субпопуляции резко падает в первые дни развития культуры, а 2-й субпопуляции — сначала незначительно возрастает с 12 до 17%, а затем снижается до 2—4%. Поскольку при продвижении клеток по митотическому циклу размеры клеток в начале (фаза G1) и конце (фазы Gг/M) цикла должны отличаться приблизительно в 2 раза, ко 2-й субпопуляции можно отнести кардиомиоциты, находящиеся в фазе G1, а к 3-ей — клетки в фазе Gг/M. Из этого предположения следует, что на следующий день после посева кардиомиоцитов новорожденной крысы преобладали клетки, находящиеся на завершающих стадиях митотического цикла ^^М). На этот срок культивирования их доля составляла 60%, а после 4 сут. инкубирования доля клеток, принадлежащих к 2-й и 3-й субпопуляциям, не превышала 5% от общего количества клеток.

Из рис. 4Б видно, что параллельно делению мио-цитов наблюдается гипертрофическое нарастание объема у части культивируемых клеток. Уже на следующий день после посева 23% клеток превышают размеры пролиферирующих

кардиомиоцитов, имея объем от 1000 до 2000 мкм3. Сначала доля этих клеток возрастает, а затем по мере нарастания количества клеток с объемом от 2000 до 4000 мкм3 (48%) и даже с объемом 4000— 16 000 мкм3 (15%) на 4-й день культивирования — падает. Фракция очень крупных клеток, более 16 000 мкм3, не превышала 3—5%.

Процесс гипертрофии кардиомиоцитов сопровождался появлением полиплоидных (рис. 3И) и многоядерных, в основном двуядерных клеток (см. табл., рис. 3Ж, З). Наличие клеток с двумя ядрами регистрировалось со 2-х сут. (около 1%), доходя до 9,5% к 8-м суткам развития в культуре. Доля кардиомиоцитов с большим числом ядер (3—4) колебалась в диапазоне от 0,1 до 0,2% на всех сроках наблюдения. «Поведению» очень мелких клеток с объемом менее 250 мкм3 будет посвящено следующее сообщение.

Обсуждение

Сопоставление наших результатов в экспериментах in vitro с данными других авторов, полученными на крысах in vivo, выявляет совпадение ряда параметров развития сердечных клеток в постнатальном периоде. Так, нами было установлено, что в первые 4 дня развития в первичной культуре около 60% клеток вступает в митотическое деление, а затем доля делящихся клеток снижается до 6—7% (рис. 2А). В исследованиях на животных было показано, что количество кардиомиоцитов увеличивается на 68%

70

< 250 мкм3

70

60

1000-1999 мкм3

2000-3999 мкм3

Б

Время культивирования, сут.

Время культивирования, сут.

Рис. 4. Кривые распределения клеток миокарда по объему в процессе культивирования:

А - в популяции с объемом до 999 мкм3; Б - в популяции с объемом от 1000 мкм3 до 16 000 мкм3

в первые 3 дня постнатального развития [3]. Затем доля клеток, способных к пролиферации, опускается до 16% и держится на этом уровне на протяжении всей жизни животных [9], а объем возрастает в 2,5 раза с 3-го по 12-й день роста крыс (с 1416±320 до 3533±339 мкм3) [3]. Однако в наших исследованиях объем кардиомиоцитов к 3-му дню культивирования возрастал в 1,9 раз, а к 6-му дню — в 4 раза (рис. 2Б).

Много работ посвящено изучению вопроса прекращения пролиферации кардиомиоцитов в постна-тальном периоде. Эксперименты на кардиомиоцитах крыс разного возраста (1—12 сут. после рождения] показали, что почти все кардиомиоциты были одно-ядернымии и объем клеток не изменялся до трехсуточного возраста. На 4-й день появлялись двуядер-ные миоциты и регистрировалось увеличение объема клеток. Доля клеток с 2 ядрами достигала 90% к 12 сут., причем образованию двуядерных клеток предшествовал синтез ДНК без последующего митотического деления [3]. По нашим данным доля двуя-дерных миоцитов в первые 3 дня составляла около 1%, увеличиваясь до 3% после завершения волны делений и достигала 9—10% к 8 дню развития в первичной культуре (см. табл.).

Прекращение деления кардиомиоцитов после всплеска митотической активности дало основание считать, что переключение пролиферации на гипертрофию происходит в постнатальном периоде между 3-м и 4-м днями развития [2, 3]. Другими авторами было обнаружено значительное возрастание в процессе развития доли S-фазных миоцитов [4]. Была установлена связь между снижением экспрессии и активности ряда регуляторов клеточного цикла (ци-клинов и циклин-зависимых киназ) в процессе развития сердечных миоцитов и потерей способности к пролиферации у миоцитов взрослых млекопитающих [5]. А. Лери с соавт. (2000) изучали теломеразную активность, отражающую пролиферативную способность клеток. Авторы регистрировали активность теломеразы в кардиомиоцитах молодых крыс, полностью зрелых крыс и стареющих особей, опровергнув мнение, что кардиомиоциты являются окончательно дифференцированными клетками, потерявшими способность к пролиферации [10]. В наших исследованиях на первичной культуре клеток миокарда новорожденных крыс было выявлено наличие делящихся кардиомиоцитов на различных стадиях митоза уже во время их гипертрофического развития с 6-го по 8-й дни культивирования. Были обнаружены клетки на стадии профазы (рис. 3А), анафазы (рис. 3В) и даже кардиомиоциты, благополучно завершающие

ЛИТЕРАТУРА:

1. Poss K. D., Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Semin. Cell Dev. Biol. 2007; 18:36—45.

2. McGill, C. J., Brooks, G. Cell cycle control mechanisms and their role in cardiac growth. Cardiovasc. Res. 1995; 30:557—69.

3. Li E., Wang X., Capasso J.M., Gerdes A.M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell. Cardiol. 1996; 28[8]:1737—46.

4. Poolman R.A., Gilchrist R., Brooks G. Cell cycle profiles and expressions of p21CIPl AND P27KIP1 during myocyte development. Int. J. Cardiol. 1998; 67[2]:133-142.

5. Brooks G., Poolman R.A., McGill C.J., Li J.M. Expression and activities of cyclins and cyclin-dependent kinases in developing rat ventricular myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 1997; 29[8]:2261—71.

6. Brooks G., Poolman R.A., Li J.M. Arresting developments in the cardiac myocyte cell cycle: role of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cardiovasc. Res. 1998; 39[2]:301-311.

деление, на стадии цитокинеза (рис. 3Г). Фигуры митоза были также зафиксированы в многоядерных кардиомиоцитах, причем ядра находились в различных фазах клеточного цикла. Например, в трехядер-ной клетке 2 ядра — в профазе, а одно — в интерфазе (рис. 3Е), а в двуядерном миоците — одно в интерфазе, а другое — в метафазе (рис. 3Д).

По мнению Г. Брукс с соавт. (1998) прекращение деления кардиомиоцитов млекопитающих характеризуется их задержкой в клеточном цикле [6]. Согласно этой гипотезе авторы предположили, что арест клеток происходит в фазе G1, после чего кардиомио-циты становятся на путь гипертрофии [2, 3]. Однако по другим данным 80% зрелых кардиомиоцитов останавливаются на границе фаз G0/G1 и 15—20% клеток задерживаются в фазах G^M [4—6].

Анализ перераспределения кардиомиоцитов по объему в процессе культивирования в наших экспериментах (рис. 4А) позволяет предположить, что исходные Gг-миоциты с объемом 500—999 мкм3 не переходят в разряд более мелких G1-клеток (объем 250—499 мкм3), по-видимому, из-за блока в G2/M ф азе, а на чинают увеличив аться в размера х, формируя субпопуляцию крупных кардиомиоцитов с объемом 1000—1999 мкм3 (рис. 4Б). Исходя из доли Gг-популяции на следующий день после посева (рис. 4А), мы предполагаем, что 60% кардиомиоци-тов переходят от гиперплазии к гипертрофии, останавливаясь на границе фаз G^M.

В качестве гипотезы, объясняющей прекращение пролиферации кардиомиоцитов через несколько дней после рождения, было выдвинуто предположение, что во время эмбрионального развития клетки миокарда программируются на фиксированное и ограниченное число делений [11]. При этом клетки переходят к постмитотическому состоянию автономно, независимо от окружающей среды — и в организме, и в культуре.

Таким образом, суммируя приведенные данные, можно заключить, что в первичной культуре полностью воспроизводятся процессы, которые происходят в неонатальном миокарде млекопитающих. При этом совпадают не только сроки перехода от гиперплазии к гипертрофии, но и количество делящихся клеток в первые дни после посева (около 60—70%), а также размеры гипертрофированных кардиомиоцитов. Это позволяет рассматривать первичную культуру клеток миокарда новорожденной крысы в качестве адекватной модели для изучения процессов, блокирующих пролиферацию кардиомиоцитов.

Работа поддержана грантом РФФИ № 11-04-00993-а.

7. Porrello E.R., Mahmoud A.I., Simpson E., Hill J.A., Richardson J.A., Olson E.N., Sadek H.A. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 2011; 331:1078—80.

8. Lam M.L., Bartoli M., Claycomb W.C. The 21-day postnatal rat ventricular cardiac muscle cell in culture as an experimental model to study adult cardiomyocyte gene expression. Mol. Cell. Biochem. 2002; 229[1—2]:51—62.

9. Kajstura J., Pertoldi B., Leri A., Beltrami C.A., Deptala A., Darzynkiewicz Z, Anversa P. Telomere shortening is an in vivo marker of myocyte replication and aging. Am. J. Pathol. 2000; 156[3]:813—19.

10. Leri A., Malhotra A., Liew CC., Kajstura J., Anversa P. Telomerase activity in rat cardiac myocytes is age and gender dependent. J. Mol. Cell. Cardiol. 2000; 32[3]:385—90.

11. Armstrong M.T., Lee D.Y., Armstrong P.B. Regulation of Proliferation of the Fetal Myocardium. Dev. Dynamics. 2000; 219:226-36.

Поступила 21.10.2011