Модуляция цитотоксического противоопухолевого ответа в культуре мононуклеарных клеток с помощью дендритных клеток

МОДУЛЯЦИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ОТВЕТА В КУЛЬТУРЕ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК

с помощью дендритных клеток

В.В. КУРИЛИН1, И.А. ОБЛЕУХОВА1, Е.В. ЯКУшЕНКО1, ю.а. лопатникова1, в.к. якушенко2, с.в. сенников1

НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск1 МКБ №11, Центр колопроктологии, г. Новосибирск2

Актуальность. В настоящее время наиболее перспективным из разрабатываемых подходов в лечении онкобольных является эффективная и селективная активация Т-клеточного противоопухолевого иммунитета с помощью иммунокомпетентных клеток. Ключевым звеном в реализации этой задачи являются антигенпрезентирующие клетки - дендритные клетки (ДК).

Целью исследования была разработка подхода стимуляции противоопухолевого иммунитета в культуре мононуклеарных клеток больных колоректальным раком с помощью ДК, нагруженных опухолевыми антигенами.

Материал и методы. В работе использована периферическая кровь (25 мл) и образец опухоли (аденокарцинома толстой или прямой кишки) от 6 пациентов, полученный на базе хирургического отделения МКБ .№11. Из периферической крови получали мононуклеарные клетки (МНК) на градиенте фиккол-урографина (р=1,077). Далее выделяли моноциты путём адгезии на пластике в течение 2 ч, при 5% СО2 и 37оС. К прилипшей фракции МНК добавлялись 50 нг/мл рчГМ-КСФ, 100 нг/мл рчИЛ-4 на срок 48 ч для получения незрелых ДК. Для презентации антигена брали лизат опухоли из расчёта 100 мкг/мл, который добавляли к незрелым ДК и инкубировали в течение 18-20 ч, контролем были ДК, без введения антигена (ДК0). Для дальнейшего созревания использовали рчФНО-а (25 нг/мл). Далее МНК сокультивировали с ДК, ДК0 в соотношении 10:1. Для сравнения активации лимфоцитов при сокультивировании с ДК в отдельные лунки с МНК и ДК добавляли 10 нг/мл рчИЛ-12 и 100 нг/мл рчИЛ-18. Все образцы делали в дубле (подгруппы - спонтанная и антигенстимулиро-

ванная). Через 48 ч во вторые лунки в дублях добавляли лизат опухоли в количестве 100 мкг/мл. Спустя 52 ч проводили тест на цитотоксичность («Promega») МНК к опухолевым клеткам. Созревание ДК оценивалось методом проточной цитофлюорометрии по экспрессии CD14, CD83, CD86, CD11c, HLA-DR и захвату FITC-декстрана ДК. Опухолевые клетки получали путём механической гомогенизации образца опухоли, а лизат опухолевых клеток - путём 3 циклов замораживания-оттаивания с последующим измерением содержания белка по методу Брэдфорд. Статистическую обработку результатов производили с применением непараметрического критерия Манна-Уитни.

Результаты. При культивирования ДК было отмечено увеличение экспрессии маркеров созревания CD86, CD83/CD86, НЬЛ^И, CD11c и снижение экспрессии CD14 и захвата меченого декстрана, что свидетельствует об эффективности используемого протокола для получения культуры зрелых ДК. Было установлено достоверное увеличение цитотоксичности в культуре МНК при сокультивировании с ДК0 (5,7 vs 30,8%), что указывает на способность ДК, без примирования антигеном, активировать Т-лимфоциты. При этом увеличение цитотокси-ческого ответа при сокультивировании МНК с ДК было больше в 1,6 раза в группе с предварительной активацией ДК опухолевым лизатом. При дополнительной стимуляции Т-клеточного ответа ИЛ-12 и ИЛ-18 было отмечено достоверное увеличение цитотоксичности в группе МНК, по сравнению с аналогичной группой без добавления цитокинов (5,7 vs 26,2%). Следует отметить достоверное увеличение цитотоксичности МНК при сокультивировании с ДК, нагруженных лизатом, и ИЛ-12, ИЛ-18 по срав-

нению с ДК без дополнительной стимуляции ИЛ-12 и ИЛ-18 достоверно стимулируют цито-

цитокинами (44,9 vs 66,5%). токсичность лимфоцитов к опухолевым клеткам

Выводы. Показано, что зрелые ДК, нагру- больных колоректальным раком по сравнению

женные опухолевым лизатом, в сочетании с с группами контроля.

СОПРЯЖЁННОСТЬ ПАРАМЕТРОВ ИММУННОГО СТАТУСА

с эффективностью неоадъювантной терапии

РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

я.в. кухарев, а.в. дорошенко, н.а. тарабановская, ю.л. кокорина

НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск

Неоадъювантная химиотерапия (НАХТ) широко используется при лечении рака молочной железы (РМЖ). В последние годы идёт активный поиск предсказательных критериев эффективности НАХТ. Доказано, что иммунная система способна контролировать опухолевый рост и вносит вклад в эффективность цитоста-тической терапии рака. Ведутся исследования предиктивных возможностей иммунной системы для цитостатической химиотерапии. Не исключено, что исходное состояние иммунной системы и динамика иммунологических показателей на фоне НАХТ связана с эффективностью химиотерапевтического вмешательства.

Цель: выявить особенности параметров иммунного статуса, сопряжённые с различной эффективностью НАХТ у больных РМЖ.

Материал и методы. В исследование включена 131 больная раком молочной железы (РМЖ), 11-Ш стадии (средний возраст 51,34±10,28 лет) и 24 относительно здоровые женщины сопоставимого возраста (группа контроля). До начала лечения и после НАХТ были проведены тесты иммунного статуса 1-го и 2-го уровней, оценивалась концентрация в сыворотке растворимого Fas-рецептора и Fas-лиганда. Эффективность НАХТ оценивалась по изменению размера опухоли в процентах от исходного по критериям ВОЗ. Статистический анализ проводился с использованием критериев Манна-Уитни, Вилкоксона. корреляционного анализа по Спирмену, дискриминантного и регрессионного анализа. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты. В зависимости от результатов непосредственной эффективности НАХТ

больные были разделены на 4 группы: полной регрессии опухоли (I группа), частичной регрессии (II группа), стабилизации (III группа) и прогрессирования первичной опухоли (IV группа). В сравнении с показателями здоровых доноров иммунный статус больных I группы до лечения отличался значимо более высоким относительным уровнем мононуклеаров периферической крови (МНПК), несущих Fas-лиганд на мембране, и более низким иммунорегуляторным индексом (CD4/CD8). Высокая спонтанная секреция ]Ь-1 до лечения была значимо выше у больных с полной регрессией опухоли в сравнении с контролем, а также показателями больных II и

III групп. Концентрация IgG в сыворотке крови у больных I группы была выше в сравнении с уровнем данного иммуноглобулина у больных с частичной регрессией и прогрессированием первичного опухолевого узла.

Спонтанная продукция !Ь-10 МНПК до лечения у больных с полной регрессией была значимо выше в сравнении с данным показателем у больных IV группы, а стимулированная - в сравнении с уровнем секреции у больных III и

IV групп. Пролиферативная активность МНПК, стимулированная ФГА, до лечения была значимо ниже контроля во всех группах больных, за исключением пациенток с полной регрессией опухоли. Уровень спонтанной продукции TNF-a до лечения был значимо выше в сравнении с показателями здоровых доноров во всех группах больных, за исключением пациенток, входящих в IV группу. Спонтанная продукция !Ь-4 у пациенток с прогрессированием опухоли до лечения была ниже контрольного показателя.