Первый среди равных. Один из самых экспресных и доступных методов биотестирования - бактериально люминесцентный тест

Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

157

insoluble complex polysaccharides // Biomass Convers.: Methods and Protocols. 2012. — Vol. 908, N 11. — P. 109-118.

2. Беседнова Н.Н., Запорожец Т.С. Фундаментальные и прикладные аспекты изучения биополимеров из гидробионтов Тихого океана // Бюлл. СО РАМН. 2008. — Т. 132 № 4. — С. 16-21.

3. Бурцева Ю. В., Кусайкин М. И., Сова B. B., Шевченко Н. М., Скобун С. А., Звягинцева Т. Н. Распространение фукоиданаз и некоторых гликозидаз среди морских безпозвоночных // Биология моря. 2000. — Т. 26, № 6. — С. 429-432.

4. Кузнецова Т.А., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н. Биологическая активность фукои-данов из бурых водорослей и перспективы их применения // Антибиот. химиотер. 2004. — Т. 49 № 5.

— С. 24-27.

5. Макаренкова И.Д., Дерябин П.Г, Львов Д.К, Звягинцева Т.Н, Беседнова Н.Н. Противовирусная активность сульфатированного полисахарида из бурой водоросли Laminaria japonica в в отношении инфекции культур клеток, вызванной вирусом гриппа А птиц (H5N1) // Вопр. вирусологии. 2010.

— Т. 1, — С. 41-45.

6. Abdian P.L., Caramelo J. J., Ausmees N., Zorreguieta A. RapA2 is a calcium-binding lectin composed of two highly conserved cadherin-like domains that specifically recognize Rhizobium leguminosarum acidic exopolysaccharides // J. Biol. Chem. 2013. — Vol. 288, N 4. — P. 2893-904.

7. Cao L., Yan X., Borysenko C.W., Blair H.C., Wu C., Yu L. CHLD. A cadherin-like domain in Proteobacteria and Cyanobacteria // FEMS Microbiol. Lett. 2005. — Vol. 251, N 2. — P. 203-209.

8. Colin S., Deniaud E., Jam M., Descamps V., Chevolot Y., Kervarec N., Yvin J., Barbeyron T., Michel G., Kloareg B. Cloning and biochemical characterization of the fucanase FcnA: definition of a novel glycoside hydrolase family specific for sulfated fucans // Glycobiology. 2006. — Vol. 16 N11. — P. 1021-1032.

9. Chevolot L., Foucault A., Chaubet F., Kervarec N., Sinquin C., Fisher A.M., Boisson-Vidal C. Further data on the structure of brown seaweed fucans: relationships with anticoagulant activity // Carbohydr. Res. 1999. — Vol. 319, N 1-4. — P. 154-165.

10. Cho J.H., Muralidharan V., Vila-Perello M., Raleigh

D.P., Muir T.W., Palmer III A.G. Tuning protein autoinhibition by domain destabilization // Nat. Struct. Mol. Biol. 2011. — Vol. 18, N 5 —P. 550-555.

11. Descamps V., Colin S., Lahaye M., Jam M., Richard C., Potin P., Barbeyron T., Yvin J., Kloareg B. Isolation and culture of a marine bacterium degrading the sulfated fucans from marine brown algae // Mar. Biotechnol. 2006. — Vol. 8, N 1. — P. 27-39

12. Fraiberg M., Borovok I., Wainer R.M., Lamed R., Bayer E.A. Bacterial cadherin domains as carbohydrate binding modules: determination of affinity constants to

13. Fraiberg M., Borovok I., Bayer E.A., Wainer R.M., Lamed R. Codherin domein in polysaccharidedegrading marine bacterium Saccharophagus degradans 2-40 are carbohydrate binding modules // J. Bacteriol. 2011. — Vol. 193, N 1. — P. 283-285.

14. Hayashi K., Nakano T., Hashimoto M., Kanekiyo K., Hayashi T. Defensive effects of a fucoidan from brown alga Undaria pinnatifida against herpes simplex virus infection // Int. J. Immunopharmacol. 2008. — Vol. 8 N1. — P. 109-116.

15. Jin W., Zhanga Q., Wanga J., Zhanga W. A comparative study of the anticoagulant activities of eleven fucoidans // Carbohydr. Polym. 2013. — Vol. 91, N 1. — P. 1-6.

16. Lee J.B., Hayashi K., Hashimoto M., Nakano T., Hayashi T. Novel antiviral fucoidan from sporophyll of Undaria pinnatifida (Mekabu) // Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 2004. — Vol. 52, N 9. — P. 1091-1094.

17. Nishino T., Yokoyama G., Dobashi K., Fujihara M., Nagumo T. Isolation, purification, and characterization of fucose-containing sulfated polysaccharides from the brown seaweed Ecklonia kurome and their blood-anticoagulant activities // Carbohydr. Res. 1989. — Vol. 186, N 1. — P. 119-129.

18. Silchenko A.S., Kusaykin M.I., Kurilenko V.V., Zakharenko A.M., Isakov V.V., Zaporozhets T.S., Gazha A.K., Zvyagintseva T.N. Hydrolysis of fucoidan by fucoidanase isolated from the marine bacterium, Formosa algae // Mar. Drugs. - 2013. - Vol. 11, N 7. -P. 2413-2430.

19. Pat. USA 6489155 (B1). Enzymes capable of degrading a sulfated-fucose-containing polysaccharide and their encoding genes / Takayama M., Koyama N., Sakai T., Kato I.; assignee: Takaro Shuzo CO., LTD (JP).—publl. 03.12.2002.

20. Usui T., Asari K., Mizuno T. Isolation of Highly Purified Fucoidan from Eisenia-Bicyclis and Its AntiCoagulant and Anti-Tumor Activities // Agric. Biol. Chem. 1980. — Vol. 44, N 8. — P. 1965-1966.

21. Yamasaki-Miyamoto Y., Yamasaki M., Tachibana H., Yamada K. Fucoidan Induces apoptosis through activation of caspase-8 on human breast cancer MCF-7 cells // J. Agric. Food Chem. 2009. — Vol. 57, N 18. — P. 8677-8682.

22. Zonga A.,Cao H., Wang F. Anticancer polysaccharides from natural resources: A review of recent research // Carbohydr. Polym. 2012. — Vol. 90, N 4. — P. 13951410.

ПЕРВЫЙ СРЕДИ РАВНЫХ. ОДИН ИЗ САМЫХ ЭКСПРЕСНЫХ И ДОСТУПНЫХ МЕТОДОВ БИОТЕСТИРОВАНИЯ - БАКТЕРИАЛЬНО ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ ТЕСТ

Зарубина А. П.

Канд. биол. наук, старший научный сотрудник кафедры микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва

Сорокина Е. В.

Канд. биол. наук, научный сотрудник кафедры микробиологии МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва АННАТАЦИЯ

Среди разнообразных тест-объектов для первичной оценки интегральной токсичности различных веществ и их смесей, новых материалов, включая наноструктурные, а также физические факторы следует отметить бактери-

158

Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

альный люминесцентный тест, который по праву можно отнести к наиболее результативным и доступным из используемых биотестов. На сегодняшний день необходимо уделить особое место использованию в биотестировании «батареи» тестов, учитывая, что многие организмы могут отличаться чувствительностью к разным токсикантам. Ключевые слова: биолюменесценция, биотест, достоинства биотестирования, токсичность.

Основными преимуществами люминесцентного бактериального теста перед другими биотестами являются:

• экспрессность анализа (время анализа 5 - 30 мин);

• безвредность технологии;

• количественная оценка анализа, точность и воспроизводимость результатов (ошибка не более 10%);

• удобство и простота анализа (небольшое число вспомогательных подготовительных операций, автоматическое определение индекса токсичности исследуемых ксенобиотиков с помощью современных люминометров);

• оценка метаболического статуса бактериальной клетки, как целостного организма, а не только показателя функционирования люминесцентной системы;

• корреляция полученных данных действия различных токсических веществ с использованием бактериальной люминесценции и общепринятых тестов, включая разные высшие организмы (коэффициент корреляции (ЕС50 с ЛД50) от 0.8 до 0.95);

• стабильность и стандартность люминесцентного биотеста (лиофильновысушенные клетки биотеста в виде стандартных партий пригодны для анализа в течение 6 месяцев при хранении +40С; после регидратирования биотест стабилен по свечению);

• малый объем анализируемого образца (1 мл - 0.1 и менее);

• свидетельство о характере токсического действия ксенобиотиков: при увеличении показателей токсичности во времени - аккумулирование эффекта, аддитивное или синергическое действия, а при уменьшении показателей токсичности - временное токсическое действие;

• косвенное свидетельство химической природы исследуемого ксенобиотика по изменению во времени показателей его токсического действия: усиление токсичности предполагает наличие в исследуемом образце токсичного тяжелого металла, а усиление с последующей стабилизацией или с некоторым последующим снижением токсичности предполагает наличие в исследуемом образце токсичного органического соединения;

• возможность не только быстро и экономно определить токсичность ксенобиотика, но и выяснить, насколько стабильны по токсичности ксенобиотики во времени и токсичны ли продукты их деградации во времени в различных исследуемых средах (например, пестициды в почве);

• возможность экспрессно оценивать действие как физических факторов (например, биологические эффекты действия ионизирующей радиации, нетеплового электромагнитного излучения, так и химических веществ, и их смесей;

• широкая возможность проведения анализа и санитарно-гигиенического контроля в лабораторных и полевых условиях для регулярного мониторинга в режиме реального времени или в системе on-line. Однако при всех достоинствах биотестирования на

основе бактериального люминесцентного тест-обьекта следует указать на некоторые его недостатки, которые

устраняются совершенствованием методов анализа (приведены ниже):

1. разница pH в контроле и исследуемом образце;

2. окрашенные растворы (яркая окраска);

3. наличие осмопротектора (например, у природных морских тест-обьектов - биосенсоров;

4. температурные ограничения (~не выше 15-200С) проведения анализа (например, используемые на практике природные морские тест-объекты);

5. во многих случаях одновременно анализируют небольшое число проб (отсутствие маштабируемо-сти);

6. затруднительно оценить истинную токсичность ксенобиотика (отсутствие острой, непосредственно проявляющейся токсичности) в случае проявления отдаленных последствий токсичности (хроническое действие на репродуктивность или метаболические, медленно проявляющиеся реакции, то есть отсроченная токсичность во времени);

7. отсутствие прямой связи высокой токсичности ксенобиотика и выживаемости клеток тест-обьекта (только цитоцидные ксенобиотики вызывают летальность клеток тест-объекта, а высокая токсичность нецитоцидного действия токсичного ксенобиотика может прямо не влиять на выживаемость клеток тест-объекта).

К настоящему времени совершенствуют методы биотестирования на основе бактериальной люминесценции, которые позволяют преодолеть указанные выше недостатки и ограничения биотестирования:

Метод биотестирования на основе люминесцентных бактерий позволяет проводить анализы в достаточно широком диапазоне pH (от 6.0 до 7.7). Однако в анализах рекомендовано использовать стандартные значения исследуемых растворов при pH близких 7 (7.0-7.6).

Усовершенствованием метода для стандартизации pH контрольных и исследуемых образцов является использование определенного буфера.

Для определения токсичности цветных образцов некоторыми исследователями предложен модифицированный метод биотестирования, связанный с изменением процедуры анализа.

Наличие осмопротектора для морских клеток тест-обьекта (например, тест-система «Микротокс») может приводить к ложноположительным или ложноотрицательным результатам анализа. В связи с этим обстоятельством в настоящее время в анализах используют генно-инженерные штаммы бактерий с созданным светящимся фенотипом (например, такие как Escherichia coli тест-системы «Эколюм»), не требующие осмопротектора. Кроме того, имеется потребность в природных микроорганизмах, позволяющих использовать их в качестве биолюминесцентных биосенсоров без осмопротектора, например, таких как светящиеся почвенные бактерии Photorhabdus luminescens. В МГУ им. М.В. Ломоносова на кафедре мие-робиологии проводят работы по разработке тест-системы на основе Photorhabdus luminescens. Однако следует отметить, что для широкого использования в биотестировании еще не разработана удобная тест-система на основе этих бактерий.

Евразийский Союз Ученых (ЕСУ) # 8 (17), 2015 | БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

159

При использовании метода биотестирования в широком диапазоне температур (28-370С) также перспективно использование созданных генно-инженерных штаммов бактерий со светящимся фенотипом (например, Escherichia coli с клонированным lux-опероном Ph. luminescens). Перспективу представляют и природные бактерии Ph. luminescens - единственные известные почвенные люминесцентные бактерии. Их использование позволяет проведение анализа при более высокой температуре (до 370С).

Для совершенствования возможностей маштабиру-емости анализов при биотестировании вводят в процедуры анализа уменьшение объема проб, используя микропланшеты при автоматизации получения результатов анализов.

Выращивание в жидкой питательной среде клеток тест-объекта позволяет оценить истинную токсичность ксенобиотика в случае проявления отдаленных последствий токсичности, а именно хроническое действие токсиканта на репродуктивность или метаболические, медленно проявляющиеся реакции клеток.

Действие высокой токсичности ксенобиотика может быть связано с цитотоксическим (может проявляться полным подавлением интенсивности люминесценции -высоким индексом токсичности) или цитоцидным (убитые клетки не светятся) действием на тест-организм. При необходимости этот показатель следует определить дополнительным анализом (например, подсчетом выживаемости бактерий по числу КОЕ или другим методом. Например, так была установлена разница во времени бактерицидного действия ионного и коллоидного серебра.

В заключение следует подчеркнуть, что биотестирование на основе бактериальной люминесценции несомненно ценно и превосходит по доступности из-за изложенных достоинств для практического и исследовательского применения. В последние десятилетия создают и специфические бактериальные люминесцентные тесты, с чувствительными промоторами к определенным веществам. Очевидно, что у них хорошая перспектива.

Неизменна потребность в природных люминесцентных биотестах, так как остается дискуссионным вопрос о безопасности использования генно-инженерных штаммов без риска сброса их в природную среду. В этом плане актуально создание стандартного люминесцентного биосенсора на основе единственных представителей природных почвенных светящихся бактерий Ph. luminescens. Они безопасны для практического использования и лишены многих недостатков тест-объектов на основе природных морских светящихся бактерий. Биотест с использованием почвенных светящихся бактерий Ph. luminescens - симбионтов энтомонематод и паразитов насекомых, пер-

спективен для использования в биотестировании в медицинских исследованиях (клетки бактерий имеют толстые слизистые оболочки клеток, типичные для патогенных бактерий) и оценки загрязнения почв (почвенная экосистема нуждается в быстром мониторинге ее безопасности).

Наряду с этим следует отметить, что необходимо уделить особое место использованию в биотестировании «батарее» тестов, учитывая, что многие организмы могут отличаться чувствительностью к разным токсикантам. Любые стандартные люминесцентные биосенсоры могут использоваться как самостоятельно, так и при включении их в «батареи» биотестирования с общепринятыми тесторганизмами.

Список литературы

1. Методики измерений интегральной токсичности воды, почв, воздуха, материалов и изделий имеют свидетельство о метрологической аттестации (4/7-93), зарегистрированы в Департаменте Госсанэпиднадзора РФ (№№ 11-1/131-09, 11-1/132-09, 11-1/133-09, 11-1/134-09) и Госкомэкологии (сертификат Госстандарта России № 01.19.231/2001). Методики измерений интегральной токсичности №№ 11-1/131-09, 11-1/132-09, 11-1/133-09, 11-1/134-09 свидетельство о метрологической аттестации (4/7-93), Департамент Госсанэпиднадзора РФ) свидетельство о метрологической аттестации Госкомэкологии сертификат Госстандарта России № 01.19.231/2001.

2. Backhaus T., Froehner K., Altenburger R., Grimme L. H. Toxicity testing with Vibrio fischeri: a comparison between the long term (24 h) and the short term (30 min) bioassay.// Chemosphere. 1997. V.35. P.29252938.

3. Bulich A. A., Tung K.-K., Scheibner G. The luminescent bacteria toxicity test: its potential use as an in vitro alternative. //Biolum. Chemilum. 1990. V. 5. № 2. P. 71-77.

4. Danilov V.S., Zarubina A.P, Eroshnicov G.E., Solov’eva L.N., Kartashev F.V., Zavil’gelsky G.B. The biolumiscent sensor systems with lux-operons from various species of luminescent bacteria. //Moscow University Biologocal Sciences Bulletin. 2002. №3. P. 20-24.

5. Kaiser K. L. Correlation of Vibrio fischeri bacteria test data with bioassay data for other organisms // Environ. Health Perspect. 1998. Vol. 106. № 2. P. 583-591

6. Schmitz R.P.H., Kretkowski С., Eisentraeger A., Dott W. Ecotoxicological testing with new kinetic Photophabdus luminescens growth and luminescence inhibition assay in microtitration scale. //Chemosphere. 1999. V. 38. N 1. P.67-78.