Уровень экспрессии некоторых адгезивных молекул интактными и уф-облученными т-лимфоцитами крови человека

Медицинская Иммунология 2009, Т. 11, № 1, стр. 79-84 © 2009, СПб РО РААКИ

Краткие сообщения

УРОВЕНЬ ЭКСПРЕССИИ НЕКОТОРЫХ АДГЕЗИВНЫХ МОЛЕКУЛ ИНТАКТНЫМИ И УФ-ОБЛУЧЕННЫМИ Т-ЛИМФОЦИТАМИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Артюхов В.Г., Путинцева О.В., Дубова С.М.

ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Резюме. С помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа показана различная УФ-чувствительность адгезивных молекул (CD2, CD11a и CD29) мембран Т-лимфоцитов. Установлена фоторезистентность CD2- и CDHa-антигенов по отношению к действию УФ-света в дозах 151-906 Дж/м2; большая доза УФ-излучения (1359 Дж/м2) оказывает депрессивное действие на уровень их экспрессии. Выявлено иммуномодулирующее влияние УФ-света на экспрессию трансмембранного белка CD29 Т-клетками. Проанализирована зависимость между аминокислотным составом и фоточувствительностью CD2-, CD11a- и CD29-антигенов Т-лимфоцитов.

Ключевые слова: адгезивные молекулы, экспрессия, фоточувствительность, ИФА.

Artyukhov V.G., Putintseva O.V., Dubova S.M.

EXPRESSION LEVELS OF SOME ADHESION MOLECULES IN THE INTACT AND UV-IRRADIATED Т-LYMPHOCYTES FROM HUMAN BLOOD

Abstract. While employing an enzyme linked immunosorbent assay, it was shown that UV-sensitivity is different for various adhesion molecules

Введение

Необходимым условием для реализации иммунного ответа организма на введение чужеродного антигена является взаимодействие иммунокомпетентных клеток друг с другом при комплементарном реагировании адгезивных молекул на их поверхности. Начальные этапы «симбиотических» взаимоотношений клеток иммунной системы и конкретные адгезивные молекулы, принимающие в них участие, в настоящее время достаточно хорошо изучены [18, 19, 29].

Адрес для переписки:

Артюхов Валерий Григорьевич,

ГОУ ВПО «Воронежский государственный университет», кафедра биофизики и биотехнологии 394006, г. Воронеж, Университетская площадь, 1. Тел.: (4732)20-85-86.

Факс: (4732)20-83-08.

E-mail: аvg@main.vsu.ru

Процесс активации реагирующих клеток начинается с образования связи между CD2-рецепторами Т-лимфоцитов и их лигандами на антигенпредставляющих клетках (АПК) — CD58-молекулами [19, 24, 25, 28]. Данная пара маркеров обеспечивает слабое взаимодействие между клетками и их первоначальную взаимную ориентацию. Следующим этапом активационного процесса является реагирование LFA-1-рецепторов Т-лимфоцитов с ICAM-1-молекулами АПК, что способствует прекращению перемещения клеток относительно друг друга и инициирует формирование стабильных зон контакта между Т-клетками и АПК [23, 25-27]. Последнее служит основой иммунного распознавания Т-лимфоцитами чужеродного антигенного пептида [19, 21]. Данный процесс сопровождается изменением конформации маркеров LFA-1 и связь между клетками становится более сильной и продолжительной. В течение следующего

79

Артюхов В.Г., Путинцева О.В., Дубова С.М.

Медицинская Иммунология

часа осуществляются события взаимной активации контактирующих клеток [21, 23]. Затем активированные Т-лимфоциты мигрируют в окружающие ткани при участии VLA (CD49/CD29) интегринов, экспрессирующихся на их мембранах и обеспечивающих взаимодействие клеток с экстрацеллюлярнвш матриксом [19, 20, 22].

В современной клинической практике широко применяется оптическое излучение различного спектрального диапазона, в частности УФ-свет. Для коррекции нарушений в работе иммунной системы больных с различной этиологией используется метод аутотрансфузии УФ-облученной крови. При модификации крови УФ-излучением происходят структурнофункциональные изменения поверхности иммунокомпетентных клеток, что существенно влияет на уровень экспрессии ряда поверхностных антигенов и рецепторов [2, 4, 10, 13-16].

В связи с вышеизложенным определенный интерес представляет изучение влияния УФ-света на экспрессию некоторых адгезивных молекул (CD2, CD11a и CD29) мембранами Т-лимфоцитов крови человека, посредством которых осуществляются начальные этапы взаимодействия между клетками в процессе активации работы иммунной системы.

Материалы и методы

Лимфоциты выделяли из дефибринирован-ной крови 16 доноров методом седиментации в градиенте плотности фиколл-урографина (р = 1,077 г/мл) [1]. Разделение смеси клеток на Т-и В-субпопуляции осуществляли по методу P. Terasaki [9].

Полученную суспензию Т-лимфоцитов в объеме 2 мл облучали в термостатируемой (37 °C) стеклянной кювете светом ртутно-кварцевой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240-390 нм. Интенсивность облучения равнялась 151 Дж/м2 в минуту на расстоянии 0,23 м от объекта. Время экспозиции составляло 1, 3, 6 и 9 минут, что соответствовало дозам облучения 151, 453, 906 и 1359 Дж/м2.

Для определения уровня экспрессии изучаемых маркеров на поверхности мембран нативных и фотомодифицированных Т-лимфоцитов применяли метод непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, который проводили на плоскодонных полистирольных планшетах («Медполимер», Москва). В работе использовали моноклональные антитела серии LT2, LT11a и LT29 к CD2-антигену, CDHa-субъединице LFA-1 и CD29-субъединице VLA-рецепторов человека, соответственно, и коньюгат козьих антител против IgG, меченных пероксидазой хрена (ООО «Сорбент», Москва). В качестве

субстрата для фермента использовали раствор ортофенилендиаминдигидрохлорида в цитратно-ацетатном буфере (pH = 5,0) с добавлением 0,2% раствора пероксида водорода. Результаты учитывали спектрофотометрически при X = 492 нм на вертикальном фотометре «Униплан» (Пикон, Москва) и выражали в относительных единицах оптической плотности (отн. ед.).

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью прикладных программ «Statistica 6.0». Достоверность различий контрольных и опытных значений сравниваемых показателей определяли по t-критерию Стьюдента. При этом рассчитывали степень варьирования показателя при повторных определениях внутри опыта.

Результаты

Нами было установлено, что уровень экспрессии CD2- и CDHa-маркеров на поверхности мембран нативных Т-лимфоцитов крови доноров в среднем составил 0,427±0,050 отн. ед. и 0,292±0,018 отн. ед. соответственно (рис. 1). Воздействие УФ-излучения в диапазоне доз 151-906 Дж/м2 на суспензию Т-клеток не приводило к статистически достоверным изменениям уровня экспрессии изучаемых антигенов по сравнению с нативными образцами. Облучение Т-лимфоцитов максимальной из используемых нами доз УФ-света (1359 Дж/м2) способствовало снижению ИФА-сигнала на 20,8% и на 18,2% соответственно относительно контроля.

По характеру ответа CD29-антигенов на модификацию Т-лимфоцитов УФ-светом доноры были разделены на две группы. Уровень экспрессии CD29-молекул на поверхности мембран интактных Т-клеток I группы доноров (10 человек) составил в среднем 0,188±0,014 отн. ед. (рис. 2). Облучение суспензии иммунокомпетентных клеток УФ-светом в дозах 151, 453 и 906 Дж/м2 способствовало усилению ИФА-сигнала на 25%, 21% и 29% соответственно по сравнению с необлученными лимфоцитами. Максимальная доза УФ-света (1359 Дж/м2) не вызывала статистически достоверных изменений уровня экспрессии CD29-молекул Т-лимфоцитами относительно контрольных образцов.

Во II группу вошли 6 доноров, уровень экспрессии CD29 молекул нативными Т-лимфоцитами которых был изначально выше, чем у лиц первой группы, и в среднем составил 0,246±0,023 отн. ед. (рис. 2). Облучение образцов Т-клеток УФ-светом во всем используемом диапазоне доз (151-1359 Дж/м2) индуцировало падение экспрессии исследуемых молекул на 26%, 18%, 20% и 39% соответственно по сравнению с контролем.

80

2009, Т. 11, № 1

УФ-свет, экспрессия молекул адгезии

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0

Доза облучения, Дж/м2

Экспрессия CD2-антигенов  Экспрессия CD11a-антигенов

Рисунок 1. Изменение уровня экспрессии CD2 и CD11a молекул мембранами Т-лимфоцитов под действием УФ-излучения

0,30

о

Доза облучения, Дж/м2

Экспрессия 002-антигенов  Экспрессия CDIIa-антигенов

Рисунок 2. Влияние УФ-света на уровень экспрессии CD29-молекул мембранами Т-лимфоцитов

Обсуждение

CD2-pe^nTop представляет собой трансмембранный гликопротеид, состоящий из 324 аминокислотных остатков (АО). Его внеклеточная область содержит 2 дисульфидных мостика.

Маркер LFA-1 образован двумя субъединицами — CD11a и CD18, — из которых более специфичной является первая. Она включает в себя 1145 АО и образует 7 дисульфидных связей.

VLA (CD49/CD29) рецепторы, так же как и предыдущий маркер, состоят из 2 субъединиц.

Общей для данных рецепторов является трансмембранная молекула CD29, полипептидная (ПП) цепь которой насчитывает 778 АО и имеет во внеклеточном регионе 28 дисульфидных связей.

Основными хромофорами УФ-света в белковых молекулах являются ароматические и серосодержащие аминокислотные остатки — фенилаланин, тирозин, триптофан, цистеин и метионин [7, 8, 11, 17]. В связи с этим нами была проанализирована первичная структура CD2-, CD29- и CDHa-антигенов для выяснения зависимости между аминокислотным

81

Артюхов В.Г., Путинцева О.В., Дубова С.М.

Медицинская Иммунология

составом их ПП цепей и степенью ответной реакции изучаемых антигенов на воздействие широкого диапазона доз УФ-света (240-390 нм).

В таблице 1 представлено содержание потенциальных фотохромофоров в ПП цепях (взяты из Protein Datа Base) исследуемых антигенов. Анализ данных этой таблицы показывает, что количество ароматических и серосодержащих АО возрастает в ряду: CD2-рецептор (26) ^ CD29^^ тиген (119) ^ CDHa-молекула (136). Однако процентное содержание акцепторов УФ-света относительно общего числа АО ПП цепи составляет 8, 15 и 12%, соответственно, т.е. является максимальным в молекуле CD29.

Таким образом, молекулы CD29-антигена имеют наибольшее число дисульфидных связей и самое высокое процентное содержание хромофоров УФ-излучения по сравнению с другими исследованными нами молекулами. Возможно, именно с этим связана высокая чувствительность CD29-маркеров и фоторезистентность CD2-и CDHa-молекул по отношению к действию УФ-света в дозах 151-906 Дж/м2. Проведенный нами сравнительный анализ влияния различных доз УФ-света на уровень экспрессии исследуемых антигенов, представленный в таблице 2, также подтверждает повышенную фотолабильность молекул CD29-антигена Т-лимфоцитов.

Кроме того, нами была выявлена зависимость между исходным уровнем экспрессии CD29-мар-кера и ответной реакцией его молекул на воздействие УФ-излучения: тестируемый показатель возрастал после УФ-облучения Т-лимфоцитов у доноров с исходно низкими и снижался у лиц с исходно высокими его значениями. Следовательно, облучение Т-лимфоцитов УФ-светом в дозах 151-1359 Дж/м2 оказывало иммуномодулирующее действие на экспрессию CD29-молекул на поверхности мембран исследуемых клеток.

Выявленное нами на поверхности мембран УФ-облученных Т-клеток понижение уровня экспрессии CD2- и CDHa-маркеров (1359 Дж/м2) и CD29-молекул доноров II группы (151-1359 Дж/м2) может быть обусловлено процессами десорбции иммунных маркеров [5, 12], а также изменением конформации фотомодифицированных молекул, что, вероятно, затрудняет их взаимодействие со специфическими антителами. Повышение экспрессии CD29-молекул I группы доноров после УФ-облучения иммунокомпетентных клеток может быть связано с экспонированием на поверхность мембраны ранее недоступных предсуществующих маркеров и/или синтезом de novo их молекул. Разнонаправленные изменения (повышение или снижение экспрессии) состояния поверхностных антигенов могут быть обусловлены процессами пероксид-

ТАБЛИЦА 1. СОДЕРЖАНИЕ НЕКОТОРЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В ПОЛИПЕПТИДНЫХ ЦЕПЯХ CD2 молекулы, CDH-СУБъедИНИцЕ LFA-1-РЕцЕпТОРА И CD29-СУБЪЕДИНИЦЕ VLA-РЕцЕпТОРОВ

Рецепторная молекула CD2 CD11a CD29

Общее кол-во а.о. в ПП, шт. 324 1145 778

Кол-во тирозинов (Tyr), шт. 6 31 23

Кол-во метионинов (Met), шт. 3 22 11

Кол-во цистеинов (Cys), шт. 5 21 55

Кол-во триптофанов (Trp), шт. 4 9 3

Кол-во фенилаланинов (Phe), шт. 8 53 27

Общее кол-во ароматических и серосодержащих АО в ПП цепи, шт. 26 136 119

Кол-во ароматических и серосодержащих АО в ПП цепи, % 8 12 15

Кол-во дисульфидных связей (-S-S-) в молекуле, шт. 2 7 28

таблица 2. изменение уровня экспрессии некоторых маркеров т-лимфоцитов после воздействия различных доз уф-света (240-390 нм) в % по отношению к контролю

Анализируемый показатель Доза УФ-света, Дж/м2

151 453 906 1359

CD2 - - - 20,8 |

CD11a - - - 18,2 |

CD29 (1 группа доноров) 25 t 21 t 29 t -

CD29 (2 группа доноров) 26 | 18 | 20 | 39 |

Примечание. Т - увеличение уровня экспрессии молекул на поверхности мембран Т-лимфоцитов; I - снижение уровня экспрессии молекул на поверхности мембран Т-лимфоцитов.

82

2009, Т. 11, № 1

УФ-свет, экспрессия молекул адгезии

ного фотоокисления липидов, индуцированными в мембранах клеток УФ-излучением [3, 7, 17].

Снижение уровня экспрессии исследуемых маркеров (CD2, CD11a и CD29) Т-лимфоцитами в результате протекания вышеописанных процессов может привести к угнетению реакций формирования ориентировочных и стабильных зон контакта между клетками, связывания клеток с внеклеточным матриксом, а также к изменению процесса миграции лимфоцитов в окружающие ткани и, как следствие, к торможению развития иммунного ответа. Увеличение экспрессии CD29-антигенов фотомодифицированными Т-клетками некоторых доноров, вероятно, будет сопровождаться противоположными эффектами: более быстрым переходом активированных Т-лимфоцитов через эндотелиальный барьер и более прочным их взаимодействием с экстра-целлюлярным матриксом.

Итак, анализ полученных результатов показал, что УФ-свет (240-390 нм) в дозе 1359 Дж/м2 оказывает иммунодепрессивное действие на уровень экспрессии CD2- и CDHa-молекул, а в дозах 151-1359 Дж/м2 — иммуномодулирующее влияние на экспрессию CD29-антигенов, следствием чего может быть изменение способности иммуноцитов взаимодействовать друг с другом и с клетками организма в ходе развития ответной реакции иммунной системы на экзо- и эндогенные стимулы.

Список литературы

1. Антитела. Методы. Кн. 2: Пер. с англ. / Под ред. Д. Кэтти. — М.: Мир, 1991. — 384 с.

2. Артюхов В.Г., Гусинская В.В., Михиле-ва Е.А. Изменения локализации CR1-рецепторов на поверхности нейтрофильных лейкоцитов, индуцированные УФ-светом // Иммунология. — 2006. - Т. 27, № 1. - С. 6-9.

3. Артюхов В.Г., Наквасина М.А. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами. — Воронеж: Изд-во Воронеж. ун-та, 2000. - 296 с.

4. Артюхов В.Г., Путинцева О.В., Дмитриев Е.В. Влияние ультрафиолетового излучения на структурно-функциональное состояние Т- и В-лимфоцитов крови человека // Радиационная биология. Радиоэкология. — 2003. — № 1. — С. 82-86.

5. Арцишевская Р.А., Миронова А.П., Самойлова К.А. Десорбция гликопротеинов с поверхности лимфоцитов периферической крови человека после облучения коротковолновыми УФ-лучами // Цитология. — 1984. — Т. 26, № 2. — С.209-214.

6. Боценовский В.А., Барышников А.Ю. Молекулы клеточной адгезии // Успехи современной биологии. — 1994. — Т. 114, № 6. — С. 741-752.

7. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. — М.: Дрофа, 2006. — 286 с.

8. Владимиров Ю.А., Проскурина Е.В. Лекции по медицинской биофизике. — М.: Изд-во Моск. ун-та: Академкнига, 2007. — 432 с.

9. Зарецкая Ю.М. Клиническая иммуногенетика. — М.: Медицина, 1983. — 208 с.

10. Колтаков И.А., Артюхов В.Г., Путинцева О.В. Экспрессия CD3-маркеров на поверхности мембран Т-лимфоцитов в условиях УФ-облучения // Тезисы докл. ХХ съезд физиологического общества им. И.П. Павлова. — М., 4-8 июня 2007. — М.: Издательский дом «Русский врач», 2007. — С. 273.

11. Конев С.В., Волотовский И.Д. Фотобиология. — Минск.: Изд-во БГУ, 1979. — 383 с.

12. Крыленков В.А., Брудная М.С., Комис-сарчик Я.Ю. Электронно-микроскопическое исследование поверхности необлученных и УФ-облученных лимфоцитов крови человека // Цитология. — 1983. — Т 25, № 4. — С. 476-479.

13. Оболенская К.Д., Гамова И.М., Самойлова К.А. Изменение экспрессии мембранных рецепторов иммунокомпетентных клеток крови, индуцированные различными методами фотомодификации крови // Цитология. — 1991. — Т. 33, № 9. — С. 63.

14. Оболенская К.Д., Гамова И.М., Самойлова К.А., Глазанова Т.В., Бубнова Л.Н. Увеличение экспрессии мембранных маркеров иммунокомпетентных клеток после УФ-облучения крови в терапевтической дозе и ретрансфузии УФ-облученной крови // Цитология. — 1991. — Т. 33, № 9. — С. 92.

15. Путинцева О.В., Артюхов В.Г., Коломы-цева М.П. О регуляции уровня экспрессии антигенов локуса В ГКГС мембран лимфоцитов различными дозами УФ-света // Проблемы теоретической биофизики: Тезисы докл. Международной школы. — М., 15-20 июня 1998. — М., 1998. — С. 163.

16. Путинцева О.В., Артюхов В.Г., Дмитриев Е.В. Влияние УФ-облучения В-лимфоцитов крови человека на экспрессию в них некоторых антигенов и рецепторов // Цитология. — 2001. — Т. 43, № 4. — С. 364-365.

17. Рощупкин Д.И., Артюхов В.Г. Основы фотобиофизики. — Воронеж: Изд-во Воронеж. ун-та, 1997. — 116 с.

18. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы. — СПб.: Наука, 2001. — Т. 1,2. — 390 с.

83

Артюхов В.Г., Путинцева О.В., Дубова С.М.

Медицинская Иммунология

19. Ярилин А.А. Симбиотические взаимоотношения клеток иммунной системы // Иммунология. - 2001. - № 4. - С. 16-20.

20. Arroyo A.G., Sanchez-Mateos P, Campanero M.R., Martin-Padura I., Dejana E., Sanchez-Madrid F. Regulation of the VLA integrin-ligand interac-tions through the beta 1 subunit // J. Cell Biol. - 1992. - Vol. 117, N 3. - P 659-670.

21. Damle N.K., Klussman K., Aruffo A. Intercellular adhesion molecule-2, a second counterreceptor for CD11a/CD18 (leukocyte function-associated antigen-1), provides a costimulatory signal for T-cell receptor-initiated activation of human T-cells // J. Immunol. - 1992. - Vol. 148, N 3. -P 665-671.

22. Faveeuw C., Di Mauro M.E., Price A.A., Ager A. Roles of alpha(4) integrins/VCAM-1 and LFA-1/ICAM-1 in the binding and transendothelial migration of T-lymphocytes and T-lymphoblasts across high endothelial venules // Int. Immunol. -2000. - Vol. 12, N 3. - P 241-251.

23. Gaillard T., Martin E., San Sebastian E., Cossfo F.P, Lopez X., Dejaegere A., Stote R.H. Comparative normal mode analysis of LFA-1 integrin I-domains // J. Mol. Biol. - 2007. - Vol. 374, N 1. -P 231-249.

24. Huet S., Boumsell L., Raynal B., Degos L., Dausset J., Bernard A. Role in T-cell activation for HLA class I molecules from accessory cells: further distinction between activation signals delivered

to T-cells via CD2 and CD3 molecules // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1987.- Vol. 84, N 20. -P. 7222-7226.

25. Makgoba M.W, Sanders M.E., Shaw S. The CD2-LFA-3 and LFA-1-ICAM pathways: relevance to T-cell recognition // Immunol. Today. - 1989. -Vol. 10, N 12. - P 417-422.

26. Nurmi S.M., Autero M., Raunio A.K., Gahmberg C.G., Fagerholm S.C. Phosphorylation of the LFA-1 integrin beta2-chain on Thr-758 leads to ad-hesion, Rac-1/Cdc42 activation, and stimulation of CD69 expression in human T-cells // J. Biol. Chem. - 2007. - Vol. 282, N 2. - P 968-975.

27. Smith A., Stanley P, Jones K., Svensson L., McDowall A., Hogg N. The role of the integrin LFA-1 in T-lymphocyte migration // Immunol. Rev. -2007. - Vol. 218. - P 135-146.

28. Wang J., Smolyar A., Tan K., Liu J., Kim M., Sun Z.J., Wagner G., Reinherz E.L. Structure of a Heterophilic Adhesion Complex between the Human CD2 and CD58 (LFA-3) Counterreceptors // Cell. - 1999. - Vol. 97. - P 791-803.

29. Yong K., Khwaja A. Leucocyte cellular adhesion molecules // Blood Rev. - 1990. - Vol. 4, N 4. - P 211-225.

поступила в редакцию 25.08.2008 принята к печати 04.09.2008

84