Повышение эффективности лечения больных животных лекарственноустойчивыми микобактериями туберкулёза

ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ЛЕКАРСТВЕННОУСТОЙЧИВЫМИ МИКОБАКТЕРИЯМИ ТУБЕРКУЛЁЗА

В.М. Коломиец, А.А. Евглевский, И.В. Коломиец, Д.А. Евглевский

Аннотация. В связи с ростом заболеваний туберкулезом, вызванного лекарственноустойчивыми микобак-териями, сообщается об апробации антибиотика, полученного методом полимеризации для лечения лекарст-венноустойчивого туберкулеза.

Ключевые слова: туберкулез, антибиотики, лекарственная устойчивость.

Многолетнее применение противомикробных средств и воздействие физических и химических мутагенов привело к появлению микробов, устойчивых к антибиотикам, в том числе продуцирующих расщепляющие антибиотики ферменты бета-лактамозы. Для повышения эффективности антибиотиков в их химическую структуру вводят фтор, пиперазиновый радикал или комбинируют с другими антибиотиками: суббактам с ампициллином, янтарной, лимонной, фумаровой и другими органическими кислотами и их солями (сук-цинатами, пробиотиками). Наибольший антибактериальный эффект получен при комбинации с клавулано-вой кислотой.

В настоящее время при стабилизации эпидемической ситуации по туберкулезу нарастает угроза снижения эффективности лечения из-за роста случаев заболевания, вызванных лекарственноустойчивыми штаммами возбудителя (ЛУ МБТ). При антибактериальной терапии туберкулеза одним из основных применяемых антибиотиков является стрептомицин, и именно резко возросла частота выделения устойчивых к нему М.tuberculosis (ЛУб МБТ). Замена антибиотика при ЛУб МБТ требует изменения режимов лечения и использования более токсичных и дорогостоящих препаратов резервного ряда (канамицин, фторхинолоны).

Целью исследований является повышение активности антибиотиков, в том числе стрептомицина, для преодоления лекарственной устойчивости к ним возбудителей.

Исследования проведены в два этапа. На первом исследованы антибиотики различных групп, в частности пенициллин, гентамицин, тетрациклин, амоксиклав, неомицин, полимиксин, эритромицин и канамицин, производства различных фирм и разрешенные к применению в РФ. С целью повышения устойчивости к расщепляющему действию бактериальных ферментов и создания стабильной структуры проведена их полимеризация и детоксикация с помощью растворов формалина под воздействием различной продолжительности температурных режимов. Ранее для детоксикации и полимеризации с целью повышения эффективности антибиотиков формалин не использовали.

На втором этапе использованы выделенные от больных штаммы М.tuberculosis, устойчивость к стрептомицину определена методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена. Модифицированный антибиотик стрептомицин получили путем полимеризации и детоксикации стандартного препарата раствором формалина под воздействием температуры в течение 5-7 суток. В полученном методом полимеризации и детоксикации антибиотике концентрация формалина в лиофилизированном виде снижается до 0,01%, исходная концентрация антибиотика не изменилась. Эффективность модифицированного стрептомицина исследовали лабораторным методом и в эксперименте на животных (морские свинки).

Результаты исследований. На первом этапе использовано по 60 флаконов лиофилизированных пеницил-

лина, эритромицина, канамицина, тетрациклина, гента-мицина, полимиксина, неомицина и амоксиклава, в которые с помощью шприца внесли по 5,0 мл раствора формалина и подвергли детоксикации и полимеризации путем температурного воздействия в течение 7 суток. Далее методом титрования определено остаточное содержание формалина в растворах антибиотиков до и после лиофилизации и установлено, что в жидких растворах антибиотиков содержание формалина снизилось до 0,05%, а после лиофилизации содержание формалина составило 0,01%.

Следующим этапом стало определение безвредности модифицированных антибиотиков. Белым мышам подкожно введено по 0,2-0,3 мл модифицированного пенициллина и полимиксина, трехкратно, у животных не было отмечено выраженных токсических явлений и гибели при наблюдении в течение 12 суток. При пятикратном с интервалом в 1 сутки подкожном введении 5 телятам пенициллина, 5 телятам гентамицина, 5 телятам тетрациклина и 5 телятам полимиксина все животные остались живыми, на месте введения препаратов не отмечено гнойно-некротических поражений в течение 20 суток. Подкожное введение морским свинкам модифицированного пенициллина в объеме 2-3 мл трехкратно с интервалом 24 часа также не вызвало образования гнойных абсцессов на месте введения и гибели животных в течение 15 суток.

Антибиотическую активность полученных антибиотиков определяли в отношении тест-микроорганизмов -эшерихий, стафилококков, сальмонелл, Bac.Subtilis и протея, выделенных от больных животных и птиц. Использовали метод серийных разведений (ЕД/мл, мкг/мл) модифицированных препаратов и проводили сравнительную оценку их эффективности) при посеве в жидкой среде, содержащей 10000 микробных клеток в 1 мл, и сравнивали с соответствующими им коммерческими препаратами.

Таким образом, доказана возможность повышения на 50±10% бактерицидного действия на E.coli, S.aureus, S.dublin, Вас. Subtilis и Рг. Vulgaris антибиотиков пенициллина, эритромицина, канамицина, тетрациклина, гентамицина, полимиксина, неомицина после детокси-кации и полимеризации их раствором формалина, под воздействием различной температуры.

На втором этапе у десяти больных туберкулезом различной продолжительности и с различными клиническими формами выделены из мокроты M.tuberculosis, с вторичной (4) и первичной (6) ЛУs МБТ, в т.ч. у 4 - с ассоциированной к изониазиду (SH) и рифампицину (HSP) Выделенные культуры были посеяны на классические среды Левенштейна-Йенсена, которые содержали субстанцию обычного стандартного стрептомицин (контрольная группа) или (опытная группа) модифицированный антибиотик стрептомицин, обработанный по заявляемому способу. Учет результатов роста проводили последовательно каждые десять дней в течение 45 дней. В контрольной группе отмечался рост всех десяти культур, в опытной группе выявлен рост только 2 культур с лУs МБТ, ассоциированной SH и HSP.

Далее животных, 26 морских свинок, заразили дозой 1 мг культуры M.tuberculosis (до 40 млн. микробных тел), устойчивой к стрептомицину и выделенной от больного туберкулезом человека, и на 12 день после заражения вводили препарат стрептомицин, обработанный 0,15±0,05%-ным раствором формалина при 40±2°С в течение 5-7 суток с целью его полимеризации и де-токсикации, в дозе 25 мг/кг веса животного, внутри-

мышечно. Ежедневно, однократно, вводили суточную дозу препарата в течение 16 суток.

В 1-й, группе сравнения, вводили по 100.000 ЕД производственного стрептомицина. Во 2-й группе животным вводили модифицированный препарат стрептомицина, по такой же схеме. В контрольной группе животным лечение не проводили.

В результате в контрольной группе животные погибли через 35-40 суток после заражения. Из 1 группы 3 животных погибли через 40 и остальные 7 через 45-50 суток. Во второй группе все животные оставались живы в течение трех месяцев после лечения (т.е. через 4 месяца после заражения).

При патоморфологическом исследовании у животных 1 группы обнаружены выраженные поражения внутренних органов - генерализованный туберкулез. Гистологически в легких, печени, селезенке определялись множественные продуктивно-некротические гранулемы с некоторым преобладанием продуктивного компонента, клеточный состав гранулем представлен эпителиоидными клетками с примесью гигантских клеток типа Пирогова, большим количеством мононуклеа-ров. Помимо этого, в легких картина по типу интерсти-циальной пневмонии, в печени - гепатит. По сравнению с данными исследований остальных групп животных в данной группе некротический компонент количественно выражен более всего.

В то же время у убитых животных из 2 группы, леченых модифицированным стрептомицином, во внутренних органах выявлены немногочисленные бугорки, практически без язв. Гистологически в легких - множественные гранулемы, центры которых представлены казеозным некрозом, по периферии выраженная моно-нуклеарная инфильтрация с единичными гигантскими клетками типа Пирогова; определялась выраженная мононуклеарная инфильтрация межальвеолярных перегородок. В селезенке наблюдалась делимфатизация, множественные гранулемы, центры которых представлены казеозным некрозом, по периферии - выраженная мононуклеарная инфильтрация с единичными гигантскими клетками типа Пирогова. Печень - очаговая, преимущественно мононуклеарная инфильтрация портальных трактов. В целом выраженное преобладание продуктивного компонента над некротическим.

Таким образом, в эксперименте у животных доказана эффективность лечения лекарственноустойчивого туберкулеза модифицированным препаратом стрептомицином, в отличие от применения обычного стрептомицина. Показано проведение клинических испытаний с целью внедрения препарата в практику фтизиатрии.

Результаты исследований являются приоритетными и защищены патентами.

Информация об авторах

Коломиец Владислав Михайлович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фтизиопульмоноло-гии ГБОУ ВПО «Курский ГМУ», 8-960-690-97-52.

Евглевский Анатолий Алексеевич, доктор ветеринарных наук, профессор кафедры эпизоотологии, радиобиологии и фармакологии ФГБОУ ВПО «Курская ГСХА».

Коломиец Игорь Владиславович, кандидат медицинских наук, директор филиала страховой компании «РОСНО», отдел медицинского страхования, (4712) 52-07-14.

Евглевский Дмитрий Анатольевич, кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник, Курский НИИ АПП, тел. (4712)53-77-05 и (4712)58-27-60.