КРАСНЫЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БИОСЕНСОР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ
RED FLUORESCENT BIOSENSOR FOR DETECTION OF HYDROGEN PEROXIDE IN LIVING CELLS

1.Область изобретения
Данное изобретение относится в основном к области биологии и химии. В частности, изобретение направлено на биосенсоры для детекции пероксида водорода, сконструированные на основе флуоресцентных белков.
2. Уровень техники
[01] Флуоресцентные белки семейства GFP (Green Fluorescent Protein, GFP), включая собственно GFP из медузы Aequorea victoria (avGFP), его мутанты и гомологи, сегодня широко известны благодаря их интенсивному использованию в качестве флуоресцентных маркеров in vivo в биомедицинских исследованиях, что детально рассмотрено Lippincott-Schwartz и Patterson в Science (2003) 300(5616):87-91 и Chudakov et al. (Physiol Rev. 2010 Jul; 90(3): 1103-63).
[02] Флуоресцентные белки способны к флуоресценции при облучением светом подходящей длины волны. Флуоресцентные свойства этих белков обусловлены взаимодействием двух или более аминокислотных остатков, формирующих хромофор, а не флуоресценцией какого-либо одного аминокислотного остатка.
[03] GFP гидромедузы Aequorea aequorea (синоним A. victoria) был описан Johnson et al. в J Cell Comp Physiol. (1962), 60:85-104, как часть биолюминесцентной системы медузы, где GFP играет роль вторичного эммитера, преобразовывающего синий свет от фотобелка экворина в зеленый свет. кДНК, кодирующая A. victoria GFP была клонирована Prasher et al. (Gene (1992), 111(2):229-33). Оказалось, что этот ген может быть гетерологично экспрессирован в практически любом организме благодаря уникальной способности GFP автокаталитически образовывать хромофор (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805). Эти сведения открыли широкие перспективы для использования GFP в клеточной биологи, в качестве генетически кодируемой флуоресцирующей метки.
[04] GFP был использован в широком спектре приложений, включая исследование экспрессии генов и локализацию белков (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805, and Heim et al. in Proc. Nat. Acad. Sci. (1994), 91: 12501-12504), как инструмент для визуализации внутриклеточного распределения органелл (Rizzuto et al., Curr. Biology (1995), 5: 635-642), для визуализации транспорта белков по секреторному пути (Kaether and Gerdes, FEBS Letters (1995), 369: 267-271).
[05] Были проведены многочисленные исследования для улучшения свойств avGFP (Aequorea victoria GFP) и для получения вариантов GFP, пригодных и оптимизированных для различных исследовательских целей. Была проведена оптимизация генетического кода avGFP (codon usage) для повышения уровня экспрессии в клетках млекопитающих ("гуманизированный" GFP, Haas, et al., Current Biology (1996), 6: 315-324; Yang, et al., Nucleic Acids Research (1996), 24: 4592-4593). Были получены различные мутанты GFP, в том числе "усиленный зеленый флуоресцентный белок" (EGFP), имеющий две аминокислотные замены: F64L и S65T (Heim et al., Nature 373 (1995), 663-664). Другие мутанты являются синим, голубым и желто-зеленым спектральными вариантами avGFP и содержат замены аминокислотных остатков, формирующих хромофор, и\или остатков, формирующих окружение хромофора.
[06] В 1999 г. гомологи GFP были клонированы из небиолюминесцентных видов Anthozoa (Matz et al., Nature Biotechnol. (1999), 17: 969-973). Это открытие продемонстрировало, что эти белки не являются обязательно компонентом биолюминесцентной системы. GFP-подобные белки из Anthozoa обладали большим спектральным разнообразием и включали циановые, зеленые, желтые, красные флуоресцентные белки и фиолетово-синие нефлуоресцентные хромопротеины (CPs) (Matz et al., Bioessays (2002), 24(10):953-959). В дальнейшем кДНК GFP-подобных белков были клонированы из ряда гидроидных медуз и из копепод (Shagin et al., Mol Biol Evol. (2004), 21(5):841-850). Сегодня семейство GFP-подобных белков включает сотни флуоресцентных и окрашенных гомологов GFP. Сходство этих белков с GFP варьирует от 80-90% до менее чем 25% идентичности аминокислотной последовательности.
[07] Были получены кристаллические структура avGFP дикого типа, GFP S65T мутанта и ряда гомологов GFP (Ormo et al. Science (1996) 273: 1392-1395; Wall et al. Nat Struct Biol (2000), 7: 1133-1138; Yarbrough et al. Proc Natl Acad Sci U S A (2001) 98: 462-467; Prescott et al. Structure (Camb) (2003), 11: 275-284; Petersen et al. J Biol Chem (2003), 278: 44626-44631; Wilmann et al. J Biol Chem (2005), 280: 2401-2404; Remington et al. Biochemistry (2005), 44, 202-212; Quillin et al. Biochemistry (2005), 44: 5774-5787). Было постулировано, что все члены семейства обладают общей 3D структурой (GFP-подобным доменом), представляющей собой так называемый "бочонок" из 11 бета-слоев, образующих компактную встречно-параллельную структуру, внутри которой располагается альфа-спираль, содержащая хромофор. Хромофор формируется внутри GFP-подобного домена путем окислительной циклизации трех консервативных аминокислотных остатков в центральном регионе альфа-спирали (Cody et al., Biochemistry (1993) 32, 1212-1218). Положения аминокислотных остатков, формирующих хромофор, соответствует Ser65-Tyr66-Gly67 региону avGFP. Эти аминокислотные остатки легко могут быть идентифицированы у любого GFP-подобного белка путем выравнивания его последовательности с последовательностью avGFP.
[08] Флуоресцентные белки представляют собой уникальное семейство структурно родственных белков, которые способны формировать хромофор автокаталитически без привлечения внешних субстратов или кофакторов. Под действием индуцирующего света, хромофор производит флуоресценцию, легко детектируемую с помощью современного лабораторного оборудования (спектрофлуориметр, флуоресцентный микроскоп, флуоресцентно-активируемый клеточный сортер, планшетный флуориметр).
[09] Процесс автокаталитического формирования хромофора белков с различными спектральными свойствами подробно описан в ряде статей и включает несколько химических реакций (Heim et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1994; 91:12501-12504; Ormo et al. Science. 1996;273:1392-1395; Yang et al. Nat Biotechnol. 1996; 14:1246-1251; Brejc et al. J. Proc Natl Acad Sci USA. 1997; 94: 2306-2311; Palm et al. Nat Struct Biol. 1997;4:361-365; Gurskaya et al., BMC Biochem. 2001; 2:6; Gross et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97:11990-11995; Wall et al. Nat Struct Biol. 2000; 7:1133-1138; Yarbrough et al., J. Proc Natl Acad Sci USA. 2001; 98:462-467; Pakhomov, A.A. and Martynov, V. I. Chem. Biol. 2008, 15, 755- 764; Quillinet al. (2005) Biochemistry 44, 5774-5787; Yampolsky et al. (2005) Biochemistry 44, 5788-5793; Shu et al. (2006) Biochemistry 45, 9639-9647; Kikuchi et al. (2008) Biochemistry 47, 11573-11580; Yampolsky et al., Biochemistry, 2009, 48 (33). pp 8077-8082).
[10] GFP-подобные белки широко используют для создания генетически-кодируемых биосенсоров. Исследование внутриклеточных процессов с помощью таких генетически кодируемых биосенсоров становятся все более популярным, так как только такие сенсоры могут дать информацию об изменении исследуемого параметра непосредственно в живой системе. Такие биосенсоры востребованы как в фундаментальных исследованиях сигнальных путей организма, так и при тестировании токсических и лекарственных препаратов на модельных клеточных линиях или организмах. В сравнении с химическими и физическими методами регистрации биологически активных субстанций биосенсорами, требующими экзогенно добавляемых красителей, субстратов или кофакторов, генетически кодируемые нанобиосенсоры относятся к классу безреагентных и многоразовых сенсоров. Использование флуоресцентных белков в качестве передатчиков информации стало наиболее эффективным подходом к разработке генетически-кодируемых сенсоров.
[11] Биосенсоры на основе флуоресцентных белков представляют собой химерные белки, в состав которых входит сенсорный домен - белковый домен, чувствительный к изменению определенного параметра клетки, например, изменению концентрации какого-либо иона или молекулы (ионов кальция, перекиси водорода, ионов водорода и т.д.). В качестве сигнальной части биосенсора используют GFP-подобные белки или их варианты, подвергнутые круговой пермутации (Suslova and Chudakov, Trends Biotechnol. 23 (12) (2005), 605-13; Griesbeck, Curr Opin Neurobiol., 2004, v.14(5), pp.636-641; Bunt and Wouters, Int Rev Cytol., 2004, v.237, pp.205-277).
[12] Создание пермутированных GFP-подобных белков необходимо для увеличения подвижности хромофорного окружения и, следовательно, для большей лабильности спектральных свойств белка. Круговая пермутация флуоресцентных белков описана Topell S. и Glockshuber R. (Methods in Molecular Biology. 183, 31-48; 2002). Например, для круговой пермутации avGFP в его первичную структуру вносится разрыв в область между 144 и 149 аминокислотами, нативные N- и С-концы совмещаются при помощи полипептидного линкера. Новые N- и С-концы находятся в непосредственной близости от хромофора и могут влиять на его микроокружение. Круговая пермутация производится на уровне нуклеиновой кислоты путем оперативного сшивания 3'- и 5'-концов нуклеотидной последовательности, кодирующей флуоресцентный белок, и внесения разрыва в последовательность между кодонами, кодирующими новые N и С-концевые аминокислоты. Методы для получения таких конструкций хорошо известны специалистам в данной области.
[13] В результате круговой пермутации кпФБ приобретает способность реагировать на конформационные перестройки в области новых N и С-концов изменением спектра флуоресценции (сенсоры с использованием обычных флуоресцентных белков оказались малочувствительными).
[14] Эффективность биосенсоров на основе кпФБ, полученных из avGFP была продемонстрирована на примере сенсора на ионы кальция (Nagai et al, Ргос Natl Acad Sci USA. 98(6) (2001), 197-202). кпФБ был так же использован для изготовления сенсора на пероксид водорода HyPer (Belousov et al., Nature Method.4, 281-286; 2006).
2
2
[15] HyPer представляет собой химерный белок, состоящий из регуляторного домена белка OxyR E.coli, реагирующего с пероксидом водорода и интегрированного в пептидную цепь OxyR пермутированного желтого флуоресцентного белка cpYFP (Рис.1). HyPer представляет собой конструкцию, в которой cpYFP соединен с двумя фрагментами чувствительного к НО домена OxyR посредством коротких пептидных линкеров. Нуклеотидные последовательности, кодирующие фрагменты белка OxyR и cpYFP, оперативно сшиты между собой с использованием линкерных последовательностей. Линкерные последовательности - нуклеотидные последовательности, кодирующие одну или несколько аминокислот, используются для повышения подвижности частей химерного белка относительно друг друга и способствуют его лучшему фолдированию (формированию правильной 3D-структуры) (Belousov et al. (2006), Nature Methods; 3(4): 281-286).
2
2
2
2
[16] Транскрипционный фактор Ε. coli OxyR активирует экспрессию ряда генов в ответ на увеличение концентрации НО. OxyR состоит из двух доменов, различающихся функционально. N-концевой домен (первые 80 аминокислот) образует ДНК-связывающий участок, в то время как С-концевой домен (81-305 аминокислот) выполняет регуляторную функцию и способствует олигомеризации белка (Choi et al., Cell. 105, 103-113; 2001). В присутствии HO происходит образование дисульфидной связи между цистеиновыми остатками Cys-199 и Cys-208 OxyR белка, что приводит к конформационным изменениям всего регуляторного домена OxyR (Belousov et al., Nature Method.4, 281-286; 2006).
2
2
2
2
[17] HyPer позволяет анализировать изменение концентрации перекиси водорода внутри живых клеток. Перекись водорода (НО) - важная сигнальная молекула, ответственная за включение ряда внутриклеточных каскадов (Yoshizumi et al, J Biol Chem. 2000, V.275(16), pp.11706-11712; Abe et al, J Biol Chem. 1996, V.271(28), pp.16586-16590; Schrecket al, EMBO J. 1991, V.10(8), pp.2247-2258; Meyer et al, EMBO J. 1993, V.12(5), pp.2005-2015). Многие внешние стимулы вызывают внутриклеточную продукцию НО, которая в свою очередь приводит к активации белковых каскадов. При появлении перекиси водорода в окружающей HyPer среде, происходит окисление домена OxyR и изменение его конформации, которое в свою очередь вызывает изменение спектральных характеристик флуоресцентного белка. Эти изменения могут быть зарегистрированы с помощью визуального скрининга, спектрофотометрии, спектрофлуориметрии, флуоресцентной микроскопии, с помощью FACS или другим общепринятым способом для регистрации спектральных характеристик флуоресценции. Через некоторое время происходит восстановление биосенсора за счет работы клеточных систем, восстанавливающих дисульфидные связи в домене OxyR. Восстановление OxyR in vitro глуторедоксином-1 и тиоредоксином было показано Aslund et al. (Biochemistry. 96, 6161-6165; 1999).
[18] Были разработаны улучшенные мутантные варианты HyPer с увеличенным динамическим диапазоном (Markvicheva et al., Bioorg Med Chem. 2011; 19(3):1079-84) и измененным временем полужизни (Bilan et al., ACS Chem Biol. 2013, 15;8(3):535-42).
[19] Все разработанные варианты HyPer имеют в своей основе cpYFP и имеют одинаковые максимумы возбуждения и эмиссии флуоресценции. Сходными спектральными характеристиками обладает и большинство биосенсоров на основе флуоресцентных белков, что делает невозможным их одновременное использование для мониторинга сразу нескольких биологических процессов внутри клетки. Таким образом, создание биосенсоров, имеющих иные спектральные характеристики, крайне востребовано и позволит осуществлять одновременный анализ нескольких клеточных параметров непосредственно в живой клетке.
[20] Наибольший интерес представляет создание биосенсоров с эмиссией в красной области спектра. Такие биосенсоры могут быть использованы в системах in vivo, благодаря лучшему прохождению красной флуоресценции через ткани животных. Поглощение и автофлуоресценция таких биомолекул, как меланины, кератин, гемоглобин в области 450-500 нм затрудняют возбуждение и детекцию флуоресценции биосенсоров на основе желтых и зеленых флуоресцентных белков, YFP и GFP. Красные флуоресцентные белки поглощают свет в области 550-580 нм и флуоресцируют в области длин волн 600-620 нм, таким образом, их спектральные пики находятся в так называемом «спектральном окне» поглощения живых образцов, поэтому красные белки возбуждаются светом относительно низкой интенсивности, который хорошо проникает в толстые слои ткани, и позволяют детектировать флуоресценцию низкой интенсивности.
[21] В то время как потребность в сенсорах на основе пермутированных красных флуоресцентных белков велика, такие сенсоры появились лишь недавно. Это связано, в первую очередь, с трудностями в получении круговых пермутантов красных флуоресцентных белков. До недавнего времени таких белков было мало и возможность их использования в сенсорах обсуждалась лишь теоретически. Более того, встраивание красных пермутированных белков в другие белковые домены зачастую не приводило к получению функционального сенсора (Li et al., Photochem Photobiol 2008, 84, 111-119; Akerboom et al., Front Mol Neurosci. 2013;6:2). В настоящий момент разнообразие красных биосенсоров на основе пермутированных флуоресцентных белков ограничено единичными вариантами сенсоров для мониторинга изменений концентрации ионов кальция (Zhao et al, Science. 2011; 333(6051): 1888-1891; Akerboom et al., Front Mol Neurosci. 2013;6:2) и невозможно предсказать, сохранит ли красный флуоресцентный белок способность к флуоресценции после встраивания в сенсорный белковый домен OxyR и будут ли конформационные изменения сенсорного домена эффективно передаваться на микроокружение хромофора красного пермутированного белка, вызывая изменение спектральных свойств биосенсора.
[22] 3. Раскрытие изобретения
[23] Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентный белок, проявляющий свойства биосенсора для детекции пероксида водорода и обладающий эмиссией в красной области спектра (HyPer-Red).
2
2
[24] В некоторых воплощениях, нуклеиновая кислота настоящего изобретения кодирует флуоресцентный химерный белок, состоящий из регуляторного домена белка OxyR E.coli, реагирующего с пероксидом водорода и интегрированного в пептидную цепь OxyR пермутированного красного флуоресцентного белка mApple (cp-mApple). cp-mApple оперативно связан с двумя фрагментами чувствительного к НО домена OxyR посредством коротких пептидных линкеров 1 и 2 (Рис.1).
[25] В некоторых воплощениях, нуклеиновая кислота настоящего изобретения кодирует флуоресцентный биосенсор HyPer-Red, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID NO:2.
[26] В некоторых воплощениях, нуклеиновая кислота настоящего изобретения имеет нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:01.
[27] В некоторых воплощениях, нуклеиновая кислота настоящего изобретения кодирует флуоресцентный белок-биосенсор для детекции пероксида водорода, слитый с сигналом внутриклеточной локализации. Молекулы нуклеиновых кислот, которые отличаются от представленных нуклеотидных последовательностей вследствие вырожденности генетического кода, также входят в рамки настоящего изобретения.
[28] В других воплощениях также обеспечиваются векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения, и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Кроме того, также обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения. В других воплощениях обеспечиваются функциональные флуоресцентные биосенсоры настоящего изобретения, которые кодируются нуклеиновыми кислотами указанными выше.
[29] Краткое описание рисунков
[30] Рисунок 1 иллюстрирует принципиальную схему строения биосенсора для детекции пероксида водорода.
[31] Рисунок 2 иллюстрирует динамику изменения сигнала биосенсора HyPerRed после добавления экзогенного пероксида водорода в бактериальной суспензии.
[32] Рисунок 3 показывает графики спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции HyPerRed.
[33] Рисунок 4 показывает уровень сигнала HyPerRed в клетках HeLa Kyoto на добавление различных концентраций экзогенного пероксида водорода.
[34] Рисунок 5 показывает график изменения сигнала HyPerRed, HyPerRedC 199S и HyPer в клетках HeLa Kyoto в ответ на добавление EGF к клеточной среде в концентрации 100 нг/мл.
[35] Рисунок 6 показывает изменение флуоресценции HyPerRed, Blue-GECO и локализации EGFR-YFP в индивидуальной клетке HeLa Kyoto в ответ на добавление EGF к клеточной среде в концентрации 100 нг/мл. На верхней панели видно перераспределение белка слияния EGFR-YFP, образование эндосом на плазматической мембране клетки (1-2 мин) и их перераспределение в цитоплазме (8-15 мин). На средней панели видно как короткие выбросы кальция в цитоплазме клеток вызывают резкие скачки интенсивности флуоресценции Blue-GECO (2, 15 мин). На нижней панели видно постепенное увеличение интенсивности HyPerRed в ответ продукцию пероксида водорода. Представлены данные, обработанные в программе Image J, цвета соответствуют уровню флуоресценции клеток в соответствии с приведенными шкалами.
[36] Рисунок 7 показывает график изменения флуоресценции HyPerRed, Blue-GECO и локализации EGFR-YFP в индивидуальной клетке HeLa Kyoto в ответ на добавление EGF к клеточной среде в концентрации 100 нг/мл. Для EGFR-YFP показано отношение интенсивности флуоресценции YFP в цитоплазме клетки к интенсивности флуоресценции YFP на плазматической мембране клетки, для HyPerRed, Blue-GECO - изменение интенсивности флуоресценции указанных сенсоров в цитоплазме клетки.
[37] Осуществление изобретения
[38] Для более полного раскрытия вышеперечисленных характеристик настоящего изобретения ниже предлагается детальное описание изобретения, кратко сформулированного выше, в виде ссылок на воплощения, некоторые из которых проиллюстрированы дополнительными фигурами. При этом следует отметить, что прилагаемые фигуры иллюстрируют лишь типичные воплощения настоящего изобретения и, следовательно, не должны быть восприняты в качестве ограничения объема изобретения, которое может допускать другие в равной степени эффективные воплощения.
2
2
[39] Как указано выше, настоящее изобретение направлено на молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, представляющий собой химерный белок, состоящий из регуляторного домена белка OxyR E.coli, реагирующего с пероксидом водорода и интегрированного в пептидную цепь OxyR пермутированного красного флуоресцентного белка mApple (cp-mApple). cp-mApple оперативно связан с двумя фрагментами чувствительного к НО домена OxyR посредством коротких пептидных линкеров 1 и 2.
[40] Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения получены с помощью рекомбинантных технологий. В предпочтительных воплощениях, нуклеиновые кислоты настоящего изобретения кодируют белок, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2. В некоторых воплощениях, нуклеиновые кислоты, кодируют белок, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:2, слитый с сигналом определенной внутриклеточной локализации. Также обеспечиваются векторы и кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Кроме того, обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения.
[41] Указанные нуклеиновые кислоты применяются во многих различных приложениях и методах для мониторинга изменений концентрации пероксида водорода внутри живых клеток и выявления клеток, в которых произошла активация продукции переоксида водорода. Наконец, обеспечиваются выделенные белки, представляющие собой биосенсоры, кодируемые нуклеиновыми кислотами настоящего изобретения.
[42] Определения
[43] Различные термины, относящиеся к биологическим молекулам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения.
[44] Как здесь используется, термин «флуоресцентный белок» означает белок, относящийся к семейству GFP-подобных белков, который обладает способностью к флуоресценции; например, он может проявлять низкую, среднюю или интенсивную флуоресценцию при облучении светом с подходящей для возбуждения длиной волны. Флуоресцентное свойство флуоресцентного белка представляет собой такое свойство, которое является результатом работы хромофора, образующегося путем автокаталитической циклизации трех или более аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Как таковые, флуоресцентные белки настоящего изобретения не включают белки, которые обладают флуоресценцией за счет отдельных флуоресцирующих остатков, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин. Термин «флуоресцентный белок» относится так же к флуоресцентным белкам GFP-семейства, подвергнутым круговой пермутации.
[45] Как здесь используется, термин "avGFP" относится к зеленому флуоресцентному белку из медузы Aequorea victoria, включая варианты avGFP, известные из уровня техники, сконструированные для обеспечения большей интенсивности флуоресценции или флуоресценции в других цветовых областях. Последовательность дикого типа avGFP была раскрыта в Prasher et al. (1992, Gene 111: 229-33).
[46] Как здесь используется, термины "флуоресцентный белок, подвергнутый круговой пермутации", «пермутированный флуоресцентный белок» или "кпФБ" относится к белку, полученному из флуоресцентного белка (например из avGFP) с помощью генно-инженерной модификации нуклеиновой кислоты, в результате которой С- и N-концы исходного флуоресцентного белка оказываются оперативно слиты, а новые С- и N- концы формируются вблизи хромофора. Упоминание белок, пермутированного по позициям N1-N2, где N1 и N2 - номера аминокислотных остатков в полипептидной цепи, означает, что N1 - номер аминокислотного остатка в исходном белке, который образовал новый С-конец кпФБ, а N2 - номер аминокислотного остатка в исходном белке, который образовал новый N- конец.
[47] Круговая пермутация, как правило, не влияет на формирование «бочонка» GFP-подобного домена и формирование активного (способного к флуоресценции) хромофора. Круговая пермутация приводит к тому, что возрастает способность кпФБ менять спектральные характеристики при конформационных изменениях белковых доменов или полипептидов, оперативно слитых с его С- и N-концами.
[48] Термин "гуманизированный" относится к изменению нуклеотидной последовательности флуоресцентного белка, сделанной для оптимизации генетического кода кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих (Yang et al., 1996, Nucleic Acids Research 24:4592-4593).
[49] Как здесь используется, термин "выделенный" означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях.
[50] Как здесь используется, термин "мутант" или "производное" относятся к белку, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены и/или замещены и/или удалены (делетированы) и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков настоящего изобретения. Как здесь используется, термин "мутант" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин "мутант" здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.
[51] Как здесь используется, "гомология" - это термин, использующийся для описания взаимосвязи последовательностей нуклеотидов или аминокислот с другими последовательностями нуклеотидов или аминокислот, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями.
[52] Как здесь используется, аминокислотная или нуклеотидная последовательности "по существу сходны" или "по существу такие же, как референсная последовательность, если аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют по крайней мере 85% идентичности с указанной последовательностью внутри выбранного для сравнения региона. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере, 85% идентичности, по крайней мере, 90% идентичности, по крайней мере, 95% идентичности или по крайней мере, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности. Две последовательности, которые идентичны одна другой, также по существу сходны.
[53] Процент идентичности последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, pp.403-10 (1990). Для целей настоящего изобретения сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ Blast, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами, может быть использовано для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями.
[54] Как здесь используется, термин "подобные белки" или "по существу сходные белки" относится к белкам, которые имеют аминокислотные последовательности, идентичные по крайней мере на 85%, как правило идентичные на 90% или более, чаще всего идентичные по крайней мере на 95% или более (например на 96% и более, 97% и более, 98%) и более, 99% и более, 100%). Длина гомологичных аминокислотных последовательностей у «подобных белков» при этом может составлять, по крайней мере, 100 аминокислотных остатков, чаще, по крайней мере, 200 аминокислотных остатков, или 300 аминокислотных остатков.
[55] В некоторых воплощениях, термин "подобные белки" или "по существу сходные белки" относится к белкам, которые имеют аминокислотные последовательности целого белка, идентичные по крайней мере на 85%, как правило идентичные на 90% или более, чаще всего идентичные по крайней мере на 95% или более (например на 96% и более, 97% и более, 98% и более, 99% и более, 100%).
[56] Как здесь используется, термин "функциональный" означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность может функционировать для указанного испытания или задачи. Термин "функциональный", используемый для описания биосенсора для детекции пероксида водорода настоящего изобретения, означает, что он меняет спектральные характеристики при увеличении концентрации пероксида водорода в среде.
[57] Как здесь используется, термин «среда» по отношению к биосенсору для детекции пероксида водорода означает любую среду, в которой этот биосенсор может функционировать. Для выделенного белка это может быть любой буферный раствор, в котором этот сенсор сохраняет функциональность. Для белка, экспрессированного в клетке, это цитоплазма или внутриклеточный компартмент, в котором биосенсор локализован.
[58] Как здесь используется, "биохимические свойства" относятся к белковому фолдингу (сворачиванию) и скорости созревания, полупериоду окисления, полупериоду восстановления после реакции с пероксидом водорода, времени полужизни, способности к агрегации, способности к олигомеризации, рН и температурной стабильности, и другим подобным свойствам.
[59] Как здесь используется, "флуоресцентные свойства" или "спектральные свойства" относятся к коэффициенту молярной экстинкции при подходящей длине волны, к квантовому выходу флуоресцентции, форме спектра возбуждения флуоресценции или спектра эмиссии, длине волны, соответствующей максимуму возбуждения флуоресценции, и длине волны, соответствующей максимуму испускания, отношению амплитуды возбуждения флуоресценции при двух разных длинах волн, отношению амплитуды испускания при двух разных длинах волн, времени жизни возбужденного состояния, и анизотропии оптических свойств. Измеряемая разница может быть определена как количество любого количественного флуоресцентного свойства, например, интенсивность флуоресцентции при определенной длине волны, или интегральная флуоресценция на всем спектре испускания.
[60] Ссылка на нуклеотидную последовательность, "кодирующую" полипептид, означает, что с нуклеотидной последовательности в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин так же включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности, кодирующие одинаковую аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, включают последовательности, содержащие интроны.
[61] Термин «оперативно связанный», «оперативно слитый» или ему подобный при описании структуры биосенсора или химерных белков на его основе относится к полипептидным последовательностям, которые находятся в физической и функциональной связи одна с другой. В наиболее предпочтительных воплощениях, основные функции полипептидных компонентов химерной молекулы не изменены по сравнению с функциональными свойствами выделенных полипептидных компонентов. Например, OxyR домен, входящий в состав биосенсора настоящего изобретения, сохраняет способность связывать пероксид водорода, а кпБФ - способность к флуоресценции. В случае, когда биосенсор настоящего изобретения сшит с представляющим интерес сигналом внутриклеточной локализации, химерный белок сохраняет способность реагировать на появление пероксида водорода, но локализуется в определенном клеточном компартменте. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, нуклеотидные последовательности, кодирующие химерный белок, включающий "оперативно связанные" компоненты (белки, полипептиды, линкерные последовательности, белковые домены и т.д.), состоят из фрагментов, кодирующих указанные компоненты, где эти фрагменты ковалентно связаны таким образом, что в ходе трансляции и транскрипции нуклеотидной последовательности продуцируется полноразмерный химерный белок. Иными словами, фрагменты соединены таким образом, что в местах их соединения отсутствуют 'сбойки' рамки считывания и стоп-кодоны.
2
2
[62] Как здесь используется, термины «перекись водорода» и «пероксид водорода» относятся к молекуле, имеющей формулу НО.
[63] Как здесь используется, термин «сигнал биосенсора» означает детектируемое изменение спектральной характеристики биосенсора в ответ на пероксид водорода.
[64] Как здесь используется, термин «чувствительностью биосенсора к лиганду» означает диапазон концентраций лиганда, которые вызывают детектируемый ответ биосенсора.
[65] Как здесь используется, термин «динамический диапазон» означает отношение максимального уровня сигнала биосенсора (в полностью окисленном состоянии) к уровню исходного сигнала (в полностью восстановленном состоянии).
[66] Молекулы нуклеиновых кислот
[67] Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2.
[68] Как здесь используется, молекула нуклеиновой кислоты - это молекула ДНК, такая как геномная ДНК или кДНК молекула, или молекула РНК, такая как молекула мРНК. Как здесь используется, термин "кДНК" относится к нуклеиновым кислотам, которые обладают размещением элементов последовательности, найденным в нативных зрелых видах мРНК, где элементы последовательности - это экзоны и 5' и 3' некодирующие области.
[69] Структура биосенсора схематически изображена на рисунке 1. Методы получения таких слитых белков хорошо известны в данной области. Например, части нуклеиновой кислоты, кодирующие различные элементы, могут быть встроены в полилинкер вектора, таким образом, что эти части окажутся оперативно связаны и между ними не будет стоп-кодонов в рамке считывания и не будет сбоек рамки считывания. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть собрана из фрагментов с помощью ДНК-лигазы или ПЦР с праймерами, содержащими части, комплементарные концевым последовательностям соединяемых фрагментов.
[70] Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая флуоресцентный биосенсор, может быть синтезирована из подходящих нуклеозидтрифосфатов. Например, доступность информации о последовательности аминокислот или информации о нуклеотидной последовательности дает возможность изготовить выделенные молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретении с помощью олигонуклеотидного синтеза. В случае информации о последовательности аминокислот может быть синтезировано несколько нуклеиновых кислот, отличающихся друг от друга вследствие вырожденности генетического кода. Методы выбора вариантов кодонов для требуемого хозяина хорошо известны в данной области. Синтетические олигонуклеотиды могут быть приготовлены с помощью фосфорамидитного метода, и полученные конструкты могут быть очищены с помощью методов хорошо известных в данной области, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или других методов, как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и по инструкции, описанной в, например, United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. Длинные двухцепочечные молекулы ДНК настоящего изобретения могут быть синтезированы за следующие стадии: несколько меньших фрагментов с необходимой комплементарностью, которые содержат подходящие концы, способные к когезии с соседним фрагментом, могут быть. Соседние фрагменты могут быть сшиты с помощью ДНК-лигазы или метода, основанного на ПЦР. Нуклеиновая кислота, кодирующая биосенсор или его фрагмент, может быть выделена любым из многих известных методов.
[71] Кроме того, также обеспечиваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые кодируют биосенсор настоящего изобретения. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же самые аминокислоты. В частности вырожденные варианты нуклеиновых кислот создаются, чтобы увеличить экспрессию в клетке-хозяине. В этом воплощении, кодоны нуклеиновой кислоты, которые не являются предпочтительными или являются менее предпочтительными в генах клетки-хозяина, заменены кодонами, которые обильно представлены в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, где указанные замененные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту.
[72] Особенный интерес представляют гуманизированные версии нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Как здесь используется, термин "гуманизированный" относится к заменам, сделанным в последовательности нуклеиновой кислоты для оптимизации кодонов для экспрессии белка в клетках млекопитающих (человека) (Yang et al., Nucleic Acids Research (1996) 24: 4592-4593). См. также Патент США №5795737, который описывает гуманизацию белков, раскрытие которого здесь включено ссылкой.
[73] В некоторых воплощениях, молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения - это ДНК (или кДНК) молекула, содержащая открытую рамку считывания, которая кодирует биосенсор настоящего изобретения и способна в подходящих условиях (например, физиологические внутриклеточные условия) быть использована для экспрессии белка в клетке-хозяине. Настоящее изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты, которые гомологичны, по существу сходны, идентичны или получены из нуклеиновых кислот, кодирующих белки настоящего изобретения. Указанные нуклеиновые кислоты находятся в среде, отличной от среды, в которой они находятся в естественных условиях, например, они выделены, представлены в увеличенном количестве, находятся или экспрессированы в системах in vitro или в клетках или организмах, отличных от тех, в которых они находятся в естественных условиях.
[74] Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть выделены и получены по существу в очищенной форме. По существу очищенная форма означает, что нуклеиновые кислоты являются, по меньшей мере, на 50% чистыми, обычно, по меньшей мере, на 90% чистыми и обычно являются "рекомбинантными", то есть, фланкированы одним или более нуклеотидов, - с которыми она обычно не связана в хромосоме, встречающейся в природе в ее естественном организме-хозяине.
[75] Изменения или различия в нуклеотидной последовательности между высоко сходными нуклеотидными последовательностями могут представлять нуклеотидные замены в последовательности, которые возникают в процессе нормальной репликации или дупликации. Другие замены могут быть специально рассчитаны и вставлены в последовательность для определенных целей, таких как изменение кодонов определенных аминокислот или нуклеотидной последовательности регуляторного региона. Такие специальные замены могут быть произведены in vitro с помощью различных технологий мутагенеза или получены в организмах-хозяевах, находящихся в специфических селекционных условиях, которые индуцируют или отбирают эти изменения. Такие специально полученные варианты последовательности могут быть названы "мутантами" или "производными" исходной последовательности.
[76] Мутантные или производные нуклеиновые кислоты могут быть получены на матричной нуклеиновой кислоте, выбранной из вышеописанных нуклеиновых кислот, путем модификации, делеции или добавления одного или более нуклеотидов в матричной последовательности или их комбинации, для получения варианта матричной нуклеиновой кислоты. Модификации, добавления или делеции могут быть выполнены любым способом, известным в данной области (см. например Gustin et al., Biotechniques (1993) 14: 22; Barany, Gene (1985) 37: 111-123; и Colicelli et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 199:537-539, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp.15.3-15.108), включая подверженный ошибкам ПЦР (error-prone PCR), shuffling, олигонуклеотид-направленный мутагенез, ПЦР со сборкой, парный ПЦР мутагенез, мутагенез in vivo, кассетный мутагенез, рекурсивный множественный мутагенез, экспоненциальный множественный мутагенез, сайт-специфический мутагенез, случайный мутагенез, генное реассемблирование (gene reassembly), генный сайт-насыщающий мутагенез (GSSM), искусственную перестройку с лигированием (SLR) или их комбинации. Модификации, добавления или делеции могут быть также выполнены методом, включающим рекомбинацию, рекурсивную рекомбинацию последовательностей, фосфотиоат-модифицированный мутагенез ДНК, мутагенез на урацил-содержащей матрице, мутагенез с двойным пропуском, точечный восстановительный по рассогласованию мутагенез, мутагенез штамма, дефицитного по восстановлениям, химический мутагенез, радиоактивный мутагенез, делетационный мутагенез, рестрикционно-избирательный мутагенез, рестрикционный мутагенез с очисткой, синтез искусственных генов, множественный мутагенез, создание химерных множественных нуклеиновых кислот и их комбинации.
[77] Также обеспечиваются нуклеиновые кислоты, кодирующие химерные белки, состоящие из биосенсора настоящего изобретения и сигнала определенной внутриклеточной локализации. Такие химерные белки могут быть получены путем оперативного соединения нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, кодирующей биосенсор, и нуклеиновой кислоты, кодирующей сигнал внутриклеточной локализации. Методы получения таких нуклеиновых кислот хорошо известны специалистам в данной области.
[78] Также обеспечиваются вектор и другие конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие заявленные нуклеиновые кислоты. Подходящие векторы включают вирусные и невирусные векторы, плазмиды, космиды, фаги и т.д., предпочтительно плазмиды, и используются для клонирования, амплификации, экспрессии, переноса и т.д., последовательности нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в подходящего хозяина. Выбор подходящего вектора является понятным для квалифицированного специалиста в данной области, и известно много таких доступны коммерчески векторов. Для приготовления конструкции, полноразмерная нуклеиновая кислота или ее часть обычно встраивается в вектор посредством прикрепления ДНК-лигазой к расщепленному ферментами рестрикции сайту в векторе. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть вставлена гомологичной рекомбинацией in vivo, обычно, присоединением гомологичных участков к вектору на флангах желательной нуклеотидной последовательности. Гомологичные участки добавляют лигированием олигонуклеотидов или полимеразной цепной реакцией, с использованием праймеров, включающих, например, как гомологичные участки, так и часть желательной нуклеотидной последовательности.
[79] Также обеспечиваются кассеты экспрессии или системы, использованные inter alia для получения заявленных биосенсоров или химерных белков на их основе или для репликации заявленных молекул нуклеиновой кислоты. Кассета экспрессии может существовать как внехромосомный элемент или может быть включена в геном клетки в результате введения указанной кассеты экспрессии в клетку.
[80] В экспрессионном векторе или кассете экспрессии указанная нуклеиновая кислота является функционально связанной с регуляторной последовательностью, которая может включать промоторы, энхансеры, терминаторы, операторы, репрессоры и индукторы и обеспечивает инициацию считывания РНК (транскрипции) в клетке-хозяине. В экспрессионном векторе или кассете экспрессии нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть также связана с сигналами терминации транскрипции, функциональными в клетке-хозяине. Методы изготовления кассет экспрессии или систем для экспрессии желаемого продукта известны специалистом, квалифицированным в данной области.
[81] Вышеописанные системы экспрессии могут использоваться в прокариотических или эукариотических хозяевах. Клеточные линии, которые устойчиво экспрессируют белки настоящего изобретения, могут быть выбраны способами, известными в данной области (например, котрансфекция с селектируемым маркером, таким как dhfr, gpt, неомицин, гигромицин, что делает возможным выявление и выделение транфецированных клеток, которые содержат ген, включенный в геном).
[82] Белковый продукт, кодируемый нуклеиновой кислотой изобретения, может быть получен путем экспрессии в любой удобной системе экспрессии, включая, например, бактериальные системы, дрожжевые системы, клетки насекомых, земноводных или клетки млекопитающих. Например, для получения белка могут использоваться клетки-хозяева, такие как Е. coli, В. subtilis, S. cerevisiae, клетки насекомого в комбинации с бакуловирусными векторами, или клетки высшего организма, такого как позвоночные, например, COS 7 клетки, НЕК 293, СНО, ооциты Xenopus и т.д.
[83] Если используется любая вышеупомянутая клетка-хозяин или другие подходящие клетки-хозяева или организмы для репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот изобретения, то полученная реплицированная нуклеиновая кислота, экспрессированный белок или полипептид находятся в рамках притязания изобретения как продукт клетки-хозяина или организма. Продукт может быть выделен подходящим способом, известным в данной области.
[84] Белки
[85] Нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению кодируют флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода. Аминокислотная последовательность биосенсора настоящего изобретения показана в SEQ ID NO:2.
[86] Заявленный биосенсор обладает способностью к детектируемой флуоресценции, которая может быть зарегистрирована с помощью визуального скрининга, спектрофотометрии, спектрофлуориметрии, флуоресцентной микроскопии, с помощью FACS или другим общепринятым способом для регистрации флуоресценции.
[87] Заявленный биосенсор имеет максимум (пик) эмиссии в диапазоне от 550 нм до 700 нм, обычно в диапазоне от 580 нм до 650 нм, например при 605 нм.
[88] Заявленный биосенсор имеет пик возбуждения флуоресценции в диапазоне от 450 нм до 600 нм, обычно в диапазоне от 500 нм до 580 нм, например при 575 нм.
[89] При появлении пероксида водорода заявленный биосенсор переходит в окисленное состояние. При окислении биосенсора меняется интенсивность эмиссии флуоресценции.
[90] Заявленный биосенсор обладает широким динамическим диапазоном. Заявленный биосенсор имеет динамический диапазон от 1,3 до 5, чаще от 1,5 до 3, например, заявленный биосенсор имеет динамическим диапазоном 1.8 в бактериальных клетках при окислении пероксидом водорода в концентрации 200-290 мкМ.
[91] Также обеспечиваются функциональные биосенсоры, которые по существу сходны с указанным выше биосенсором, где «по существу сходны» означает, что эти белки имеют аминокислотную последовательность, идентичную последовательности SEQ ID NO:02, по крайней мере, на 85% идентичности, обычно, по крайней мере, 90% и чаще, по крайней мере, 95%, (например 95% и выше; 96% и выше, 97% и выше; 98% и выше: 99% и выше или 100% идентичности последовательности).
[92] Например, мутанты биосенсора могут быть получены с использованием стандартных методов молекулярной биологии, как подробно описано в разделе "молекулы нуклеиновых кислот" выше. Примеры обеспечивают общие приемы и использование стандартных способов, так что специалисты, квалифицированные в данной области, могут легко получить ряд дополнительных мутантов и проверить, было ли изменено биологическое (например, биохимическое, спектральное, и т.д.) свойство. Например, интенсивность флуоресценции может быть измерена с использованием спектрофлуориметра при различных длинах волн возбуждения.
[93] Биосенсоры настоящего изобретения присутствуют в среде, отличной от их естественной среды; например, они рекомбинантны. Белки настоящего изобретения могут находиться в выделенном состоянии, что означает, что белки по существу свободны от других белков и других биологических молекул, присутствующих в естественной среде, таких как олигосахариды, нуклеиновые кислоты и их фрагменты и т.п., где термин "по существу свободны" в этом случае означает, что меньше чем 70%, обычно меньше чем 60% и чаще меньше чем 50% композиции, содержащей выделенный белок, представляет собой некоторые другие биологические молекулы, чем встречающиеся в природе. В некоторых воплощениях, белки присутствуют в по существу очищенной форме, где "по существу очищенная форма" означает очищенная, по меньшей мере, на 95%, обычно, по меньшей мере, на 97% и чаще, по меньшей мере, на 99%.
[94] Заявленные биосенсоры могут быть получены, например, экспрессией рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность, белка, представляющего интерес, в соответствующем хозяине, как описано выше. Для очистки белка могут применяться любые обычные методики, где подходящие методы очистки белка описаны в Guide to Protein Purification (Deuthser ed., Academic Press, 1990). Например, лизат может быть приготовлен из исходного источника и очищен с использованием ВЭЖХ, вытеснительной хроматографии, гель-электрофореза, аффинной хроматографии и т.п.
[95] Также обеспечиваются белки слияния, включающие биосенсор настоящего изобретения, слитые с последовательностью внутриклеточной локализации (например, с сигналом локализации в ядре, в пероксисомах, аппарате Гольджи, митохондрии и т.д.). Полипептид, обеспечивающий определенную внутриклеточную локализацию, может быть оперативно присоединен к N-концу и/или С-концу биосенсора. Сигналы внутриклеточной локализации хорошо известны специалистам в данной области и описаны, например, Nakai K. (Advances in Protein Chemistry, Vol.54, 2000, p.277-344).
[96] Трансформанты
[97] Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения используют для получения трансформантов, включая трансгенных организмов или сайт-специфичных генных изменений в клеточных линиях. Трансгенные клетки, заявленные в изобретении, содержат одну или более нуклеиновых кислот, заявленных по настоящему изобретению, в качестве трансгена. Для целей изобретения любая приемлемая клетка-хозяин может быть использована, включая прокариотические (например, Escherichia coli, Streptomyces sp., Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, и т.д.) или эукариотические клетки-хозяева. Трансгенный организм, заявленный по изобретению, может быть прокариотическим или эукариотическим организмом, включая бактерии, цианобактирии, грибы, растения и животные, в которых одна или больше клеток организма содержат гетерогенную нуклеиновую кислоту, заявленную по изобретению, введенную посредством вмешательства человека, такими способами как технологии трансгеноза, которые известны в данной области.
nd
[98] Выделенная нуклеиновая кислота настоящего изобретения может быть введена в хозяина способами, известными в данной области, например инфицированием, трансфекцией, трансформацией или трансконъюгацией. Способы переноса молекулы нуклеиновой кислоты (то есть ДНК) в такие организмы широко известны и обеспечивается в ссылках, таких как Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 Ed., (2001) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).
nd
[99] В одном воплощении, трансгенный организм может быть прокариотическим организмом. Способы трансформации прокариотических хозяев хорошо описаны в данной области (например, см. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995) John Wiley & Sons, Inc).
[100] В другом воплощении, трансгенными организмами могут быть грибы, например дрожжами. Дрожжи широко используются как носители для экспрессии гетерогенного гена (например, см. Goodey et al. Yeast biotechnology, D R Berry et al., eds, (1987) Allen and Unwin, London, pp. 401-429) и King et al Molecular and Cell Biology of Yeasts, Ε F Walton and G Τ Yarronton, eds, Blackie, Glasgow (1989) pp. 107-133). Несколько типов дрожжевых векторов доступны, включая интегративные векторы, которые требуют рекомбинации с геномом хозяина для их поддержки, и автономно реплицирующиеся плазмидные векторы.
nd
[101] В другом воплощении, трансгенными организмами могут быть животные. Трансгенные животные могут быть получены трансгенными способами, известными в данной области и обеспечиваются в ссылках, таких как Pinkert, Transgenic Animal Technology: a Laboratory Handbook, 2nd edition (2203) San Diego: Academic Press; Gersenstein and Vintersten, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd ed, (2002) Nagy A. (Ed), Cold Spring Harbor Laboratory; Blau et al., Laboratory Animal Medicine, 2 Ed., (2002) Fox J.G., Anderson L.C., Loew F.M., Quimby F.W. (Eds), American Medical Association, American Psychological Association; Gene Targeting: A Practical Approach by Alexandra L. Joyner (Ed.) Oxford University Press; 2nd edition (2000). Например, трансгенные животные могут быть получены гомологичной рекомбинацией, где изменяется эндогенный локус. Альтернативно, конструкция нуклеиновой кислоты включается случайным образом в геном. Векторы для устойчивого включения включают плазмиды, ретровирусы и другие животные вирусы, YAC, и т.п. Нуклеиновые кислоты могут быть введены в клетку непосредственно или опосредованно, введением в прекурсор клетки, путем намеренной генетической манипуляции, такой как микроинъекция или инфицирование рекомбинантным вирусом или рекомбинантным вирусным вектором и т.п. Термин «генетическая манипуляция» не включает классическое скрещивание или оплодотворение in vitro, а предпочтительно является направленным на введение рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот. Эти молекулы нуклеиновой кислоты могут быть включены в хромосому или они являться внехромосомными реплицирующими ДНК. Конструкции ДНК для гомологичной рекомбинации будут содержать, по меньшей мере, часть нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, где ген имеет желательную генетическую модификацию(ции) и включает области гомологии с целевым локусом. Конструкциям ДНК для произвольного включения не обязательно содержать область гомологии с медиатором рекомбинации. Легко могут быть включены маркеры для положительной и отрицательной селекции. Способы получения клеток, имеющих целевые генные модификации, через гомологическую комбинацию известны в данной области. Для различных способов трансфекции клеток млекопитающих, см. Keown et al., Meth. Enzymol. (1990) 185:527-537.
[102] Трансгенные животные могут быть любыми животными, не относящимися к человеку, включая млекопитающее, не относящееся к человеку (например, мышь, крыса), птицу или амфибию и т.д., и использованы в функциональном исследовании, скрининге лекарственного средства и т.п.
[103] Также могут быть получены трансгенные растения. Способы получения трансгенных растительных клеток и растений описаны в патентах США №№5767367; 5750870; 5739409; 5689049; 5689045; 5674731; 5656466; 5633155; 5629470; 5595896; 5576198; 5538879; 5484956; раскрытия которых включены сюда ссылкой. Способы получения трансгенных растений также рассмотрены в Plant Biochemistry and Molecular Biology (eds. Lea and Leegood, John Wiley & Sons) (1993) pp.275-295 и в Plant Biotechnology and Transgenic Plants (eds. Oksman-Caldentey and Barz), (2002) 719 p. Например, эмбриогенные эксплантаты, содержащие соматические клетки, могут использоваться для получения трансгенного хозяина. После сбора клеток или тканей, экзогенная ДНК, представляющая интерес, вводится в растительные клетки, при этом известен для такого введения ряд различных способов. При наличии выделенных протопластов, возникает возможность для введения ДНК через опосредованные протоколы передачи гена, включая инкубацию протопластов с очищенной ДНК, такой как плазмида, содержащая целевую экзогенную последовательность, в присутствии поливалентных катионов (например, PEG или PLO); или электропорацию протопластов в присутствии выделенной ДНК, включающей целевую экзогенную последовательность. Протопласты, которые успешно включили экзогенную ДНК, затем отбирают, выращивают в каллус, и, в конечном счете, в трансгенное растение при контакте с подходящими количествами стимулирующих факторов, таких как ауксины и цитокины. Могут использоваться другие подходящие способы получения растения, которые доступны для квалифицированных специалистов в данной области, такие, как применение "генной пушки", или Agrobacterium-опосредованная трансформация.
[104] Способы применения
[105] Биосенсоры настоящего изобретения являются генетически кодируемыми флуоресцентными белками, меняющими спектральные свойства в присутствии перекиси водорода. Они могут быть использованы для мониторинга продукции перекиси водорода внутри живых клеток при различных биологических процессах. Для осуществления мониторинга должна быть получена нуклеиновая кислота, кодирующая биосенсор. Получение таких конструкций очевидно для любого специалиста в данной области. Полученная конструкция должна быть встроена в кассету экспрессии (или вектор), обеспечивающую временную или постоянную экспрессию этой нуклеиновой кислоты в клетках-хозяевах. Вектор или кассета экспрессии может содержать элементы, обеспечивающие адресную доставку конструкции в интересующие клетки, или находится в составе частиц, обеспечивающих адресную доставку. После трансфекции клеток вектором и по истечении времени, необходимого для наработки в клетках продукта экспрессии, может быть осуществлен мониторинг продукции перекиси водорода в данных клетках.
[106] Биосенсоры настоящего изобретения находят использование в скрининге препаратов, вызывающих активацию определенных белковых каскадов, например, активацию тирозинкиназ в клеточных линиях. Примером применения биосенсоров могут служить автоматизированные скрининги множества клеток, описанные, например, в патенте США №5989835.
[107] Заявленные биосенсоры также находят использование в применении при сортировке клеток, активированных флюоресценцией, (FACS). В таких применениях заявленный биосенсор используется для мечения популяции клеток, стимулированных каким-либо фактором к продукции перекиси водорода, и полученная меченая популяция клеток затем подвергается сортировке в устройстве для сортировки клеток, активированных флуоресценцией, как известно в данной области. Способы FACS описаны в патентах США №№5968738 и 5804387.
[108]
[109] Благодаря эмиссии флуоресценции в красной области спектра заявленные биосенсоры также находят применение как метки продукции перекиси водорода in vivo для трансгенных животных. Например, экспрессия заявленного белка может сопровождаться тканеспецифичными промоторами, где такие способы находят применение в исследованиях для генной терапии, таких как тестирование эффективности лекарственных препаратов на животных моделях. Типичное применение флуоресцентных биосенсоров у трансгенных животных, которое поясняет такие применения, описано в W0 00/02997.
[110] Следующие примеры предлагается в качестве иллюстративных, но не ограничивающих.
[111] Примеры
[112] Пример 1
[113] Получение биосенсора HyPerRed для детекции пероксида водорода.
[114] Для получения нуклеиновых кислот кодирующих химерные белки и круговые пермутанты необходимого состава использовали метод "overlap extention" для продуктов ПЦР (Horton et al., 1989, Gene. 77, 61-8). Для амплификации использовали Tersus полимеразу (Евроген) и ген специфические праймеры, в структуру которых вводили области перекрывания, необходимые линкерные последовательности и/или сайты для эндонуклеаз рестрикции. Использовали следующие параметры ПЦР: денатурация 95°С -12 сек, отжиг праймеров 63°С - 30 сек, синтез 72°С - 40-90 сек. Количество циклов ПЦР - 23-25.
[115] После амплификации полученные фрагменты отделяли от матрицы и праймеров при помощи электофореза в 1% агарозном геле на ТАЕ-буфере с бромистым этидием, а затем экстрагировали их из геля с помощью коммерчески доступных наборов для выделения ДНК из геля и реакционных смесей (Quigen, Германия). Выделенные фрагменты ДНК, объединяли в полноразмерную конструкцию методом «overlap extention» ПЦР в присутствии Tersus полимеразы. В этом методе в качестве матрицы и праймеров применяются присутствующие в реакционной смеси фрагменты с взаимокомплементарными участками. Использовали следующие параметры ПЦР: денатурация 95°С - 12 сек, отжиг праймеров 60°С - 2 мин, синтез 72°С - 40 сек. Количество циклов ПЦР - 10-12.
[116] Амплификацию полноразмерной конструкции, полученной на предыдущем этапе, производили методом ПЦР с добавлением концевых генспецифических праймеров. Использовали следующие параметры ПЦР: денатурация 95°С - 12 сек, отжиг праймеров 60°С - 30 сек, синтез 72°С - 1,5 мин. Количество циклов ПЦР - 15.
[117] Нуклеиновая кислота, кодирующая HyPer, была получена из коммерчески доступного вектора pHyPer-cyto (Евроген, Россия). Фрагменты OxyR, фланкирующие cpYFP, были амплифицированы с помощью ген-специфических праймеров.
[118] Подвергнутый круговой пермутации белок cpTagFP635 был получен на основе последовательности TagFP635 (другое название - mKate) из вектора pTagFP635-C (Евроген, Россия). Для этого фрагменты TagFP635 были амплифицированы с помощью ген специфических праймеров, которые имели комплементарный участок, кодирующий линкер между исходными С- и N-концами пермутанта. Было сконструировано несколько вариантов cp-TagFP635 с пермутацией по позициям 15-14, 40-39, 42-41, 91-90, 105-104, 120-119, 176-175, 141-140, 144-143, 150-149, 198-197, 201-200, и 200-199.
[119] Полученные нуклеиновые кислоты были оперативно слиты с нуклеиновыми кислотами, кодирующими фрагменты OxyR, с использованием рандомизированных (случайных) линкеров между флуоресцентной частью cpTagFP635 и сенсорной частью OxyR-RD длиной 3 аминоксилотных остатка. Примеры нуклеотидной и аминокислотной последовательностей варианта белка OxyR-cpTagFP635 (позиция пермутации cpTagFP635 141-140) показаны в SEQ ID No:3 и 4, соответственно. Далее полученные конструкты были клонированы в бактериальный экспрессионный вектор pQE30 (Qiagen) по сайтам BamHI и HindIII и использованы для трансформации E. coli и приготовления экспрессионных бактериальных библиотек.
[120] Лигирование полученных фрагментов в вектор осуществляли с использованием лигазы фага Т4 (Sibenzyme). Реакцию проводили в объеме 15 мкл по протоколу производителя. Инкубацию проводили в течение 16-18 часов при 14°С.
[121] Электоропорацию проводили для трансформации клеток лигатом, предварительно переосажденным этанолом и растворенном в стерильной деионизованной воде. Компетентные клетки для электоропорации, расфасованные по 40 мкл в бессолевом растворе глицерина, хранили на -70°. Перед трансформацией их размораживали 10 минут на льду, добавляли 50-100 нг ДНК и помещали в предварительно охлажденные кюветы для электоропорации (BioRad). Электоропорацию проводили на приборе MicroPulser (BioRad), программа Eel. Затем суспензию компетентных клеток смешивали с 1000 мкл среды SOB, инкубировали 40 минут при перемешивании на 37°С и рассеивали на твердую среду LB с антибиотиком.
[122] Большая часть библиотек была не флуоресцентной. В случае позиций встраивания 150-149 и 201-200 большая часть библиотеки содержала красные флуоресцентные варианты сенсора, но они не созревали при 37°С (созревали только при 25°С, что препятствует их использованию в животных клетках) и, самое главное, не реагировали на добавление перекиси водорода.
[123] Случайный мутагенез по всей аминокислотной последовательности полученных флуоресцентных вариантов химерного белка OxyR-TagFP635 не привел к получению функционального белка, проявляющего свойства биосенсора на пероксид водорода.
[124] Изменение линкерных последовательностей 1 и 2 на случайные последовательности длиной 2 и 2 аминокислоты или 3 и 2 аминокислоты (как в HyPer) приводили к увеличению яркости флуоресценции и увеличению скорости созревания, но не влияли на способность белка изменять спектральные характеристики в присутствии пероксида водорода.
[125] Таким образом, не удалось получить флуоресцентный химерный белок, проявляющий свойства биосенсора на пероксид водорода на основе cp-TagFP635.
[126] Следующим кандидатом для создания красного флуоресцентного биосенсора для детекции пероксида водорода был выбран подвергнутый круговой пермутации белок mApple. Белок mApple относится к линии красных флуоресцентных белков mFruits, производных первого красного тетрамерного белка DsRed, отличающихся от DsRed сниженной склонностью к олигомеризации (преимущественно мономерные белки) и более высокой интенсивностью флуоресценции. Максимум возбуждения флуоресценции белка mApple составляет 575 нм, максимум эмиссии флуоресценции - 605 нм. Подвергнутый круговой пермутации белок mApple (cpRFP) был ранее использован для получения красного флуоресцентного биосенсора внутриклеточных концентраций ионов кальция R-GECOl (Zhao et al., Science. 2011; 333(6051): 1888-1891).
[127] Нуклеиновая кислота, кодирующая cpRFP, была амплифицирована с помощью ген-специфических праймеров с плазмиды №32444, CMV-R-GEC01, полученной через сервис Addgene (США) и оперативно слита с нуклеиновыми кислотами, кодирующими фрагменты OxyR, с использованием линкеров идентичных тем, что использовались при создании биосенсора HyPer.
[128] Полученный после экспрессии в E.coli белок HyPerRed-SAG-GT (SEQ ID NO:5, 6) имел слабую флуоресценцию и не реагировал на изменение концентрации пероксида водорода в среде. Таким образом, прямая замена последовательности кругового пермутанта cpYFP в составе сенсора HyPer на последовательность cpRFP с сохранением линкерных последовательностей сенсора HyPer, не привела к получению чувствительной к пероксиду водорода версии сенсора.
[129] Предположение о том, что фунционально эффективной единицей переноса является флуоресцентное ядро сенсора и его линкерные участки, также не подтвердилось: варианты сенсора HyPer, содержащие линкерные участки и флуоресцентное ядро сенсора R-GEC01, были также не чувствительны к пероксиду водорода и характеризовались крайне низкой интенсивностью флуоресценции.
[130] В дальнейшем мы варьировали длину рандомизированных линкерных участков в комбинациях 2 и 2, 3 и 2, 3 и 3 аминокислотных остатка на первый и второй линкер соответственно.
[131] Для получения функционального биосенсора на пероксид водорода была приготовлена библиотека вариантов HyPer-cpRFP в которых связь между фрагментами OxyR и cpRFP осуществлялась с помощью рандомизированных (случайных) линкерных последовательностей длиной 2 или 3 аминокислотных остатка.
[132] Был проведен скрининг полученных библиотек для выявления чувствительных к пероксиду водорода версий белка. Для этого чашки Петри с бактериальными колониями при комнатной температуре фотографировали под флуоресцентным бинокулярным микроскопом (Olympus US SZX12), затем опрыскивали из мелкодисперсного пульверизатора водным раствором 200 мкМ пероксида водорода, выдерживали в течение 1-1,5 мин до впитывания капель, и снова фотографировали. Обе фотографии обрабатывали в программе EMBL Image J: вычитали значение фонового сигнала и сравнивали интенсивности флуоресценции отдельных колоний до и после опрыскивания. Если соотношение интенсивностей превышало 1,1, такие колонии пересевали на новые чашки Петри с LB-агаром и ампициллином и подращивали при 37°С в течение 10-12 часов, а затем анализировали с помощью флуоресцентного спектрофлуориметра Varían Сагу Eclipse: клетки, являющиеся потомками одного клона, в небольшом количестве отбирали и суспендировали в 1,5-2 мл буфера PBS в кювете для спектрофлуориметра. Детектировали спектры возбуждения или эмиссии соответствующих белков в присутствии и отсутствии насыщающей концентрации пероксида водорода.
[133] В результате был отобран вариант, названный HyPerRed, отвечающий на добавление пероксида водорода 80%-повышением интенсивности флуоресценции. Тестирование бактериальной суспензии в присутствии различных концентраций пероксида водорода показало, что минимальный ответ HyPerRed в бактериальных клетках наблюдается при добавлении 30 мкМ пероксида водорода, а динамический диапазон сенсора составляет 1,8-кратное увеличение флуоресценции (Рисунок 2).
[134] Экспрессионный вектор на основе pQE-30, кодирующий HyPerRed, был очищен из бактериальной культуры с помощью колонок для очистки плазмидной ДНК MiniPrep (Евроген) и секвенирован. Нуклеотидная и аминокислотная последовательности HyPerRed показаны в SEQ ID NO:1 и 2. Было показано, что HyPerRed имеет линкеры 1 и 2 длиной 3 аминокислотных остатка с составом Pro, Arg, Thr и Ala, Gly, Val, соответственно.
[135] Таким образом, было показано, что длина и состав линкеров являются индивидуальными для каждого биосенсора и могут принципиально влиять на его функциональность.
[136] Пример 2
[137] Исследование свойств выделенного белка HyperRed.
4
[138] Экспрессионный вектор на основе pQE-30, кодирующий HyPerRed, был получен, как описано в примере 1 и использован для химической трансформации клеток E.coli штамма XL 1 Blue. Клетки были высеяны на чашки Петри с твердой питательной LB средой и ампициллином (100 мкг/мл) и подращены в течение 14 ч при 37°С. Затем колонии были пересеяны в 200 мл среды LB и подращены при 25°С на термостатируемом шейкере при постоянном перемешивании 190 об/мин в течение 36-38 ч. Затем клетки осадили центрифугированием с охлаждением в центрифуге Beckman J21 при 4000g в течение 30 мин. Осадок клеток ресуспендировали в 7 мл 40 мМ Tris-HCl, содержащего 150 мМ KCl, 10 мМ MgSO и 2 мМ меркаптоэтанол (буфер А), и лизировали с помощью ультразвукового гомогенизатора Sonic Vibra cell 5 на ледяной бане в течение 30 мин. Полученный лизат центрифугировали в центрифуге Beckman J21 при 18000g при 4°С в течение 30 мин. Для очистки белка из супернатанта использовали Talon Metal Affinity Resin (Clontech, CIIIA), согласно протоколу производителя.
[139] Полученный белок использовали для изучения его спектральных свойств на спектрофотометре Varían Саrу Eclipse. Аликвоту белка растворяли в 1,5-2 мл буфера PBS в кювете для флуориметра так, чтобы значение интенсивности флуоресценции в максимуме составляло 100-150 единиц. Детектировали спектры возбуждения и эмиссии белка, реакцию на перемешивание, изменение состава буфера.
[140] Графики спектров возбуждения и эмиссии флуоресценции HyPerRed представлены на Рис.3.
[141] Чувствительность выделенного белка к пероксиду водорода оказалась сравнима с таковой для исходного сенсора HyPer. Нижняя граница чувствительности состававила 50 нМ, верхняя - 290 нМ, динамический диапазон белка снизился с 80% до 66% повышения интенсивности флуоресценции. Снижение динамического диапазона ответа на пероксид водорода выделенного белка по отношению к ответу в суспензии клеток Е. coli может быть следствием частичного окисления целевого белка, так как редокс-активные белки в редких случаях удается выделить в нативном и полностью восстановленном состоянии (Kim et al., 2002, Cell. 109, 383-96; Brejc et al., 1997, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 2306-11).
[142] Выделенный белок не реагировал на добавление очищенной воды, ФБС, время инкубации в буфере, перемешивание раствора.
[143] Сравнение параметров яркости очищенного белка относительно белков выделенных белков mKate2 (Евроген) и HyPer, полученных по такому же протоколу. Концентрации выделенных белков были определены спектрофотометрическим методом и методом Бредфорда. Далее аликвоты белков были разведены до одинаковой молярной концентрации белка и были измерены поглощение и эмиссия флуоресценции этих растворов.
[144] Квантовый выход флуоресценции, QY (Quantum Yield) определяли по формуле:
[145] ,
[146] Где Abs1 - поглощение исследуемого белка в максимуме поглощения, Abs2 - поглощение белка стандарта в его максимуме поглощения, Em1 - эмиссия флуоресценции белка стандарта в максимуме эмиссии флуоресценции, Em2 - эмиссия исследуемого белка в максимуме его эмиссии флуоресценции, QY1 - квантовый выход белка-стандарта, QY2 - квантовый выход исследуемого белка.
[147] Квантовые выходы исследованных белков составили для HyPer - 0, 22, а для HyPerRed - 0,29. Поглощение в максимуме возбуждения флуоресценции составило для HyPer - 22400, а для HyPerRed - 39000. Таким образом, яркость рекомбинантного флуоресцентного белка HyPerRed in vitro, определяемая как произведение поглощения и квантового выхода, оказалась в несколько раз выше чем у HyPer, что делает HyPerRed предпочтительным сенсором для микроскопии в толстых слоях тканей.
[148] Пример 3
[149] Исследование свойств HyperRed, экспрессированного в эукариотических клетках
[150] Экспрессионный вектор на основе pQE-30, кодирующий HyPerRed, был получен? как описано в примере 1.
[151] Для переклонирования нуклеиновой кислоты HyPerRed из вектора pQE30 в вектор pCleGFP (Клонтех, США) ее амплифицировали с использованием концевых ген-специфических праймеров, содержащих сайты рестрикции для переклонирования, и полимеразу Tersus (Евроген). Проводили 22 цикла ПЦР в режиме: денатурация 95°С - 12 сек; отжиг 60°С - 20 сек; элонгация 72°С - 1 мин. Полученные фрагменты очищали с помощью фенольно-хлороформной экстракции и лигировали в pCleGFP, предварительно подвергнутый рестрикции по аналогичным сайтам, на место EGFP.
[152] В качестве контроля использовали кодирующий HyPer экспрессионный вектор pHyPer-cyto (Евроген).
[153] Клетки HeLa Kyoto рассаживали за сутки до трансфекции на чашки в среде DMEM, содержащей 10% инактивированной эмбриональной сыворотки (РАА Laboratories) из расчета 20-50 тыс. клеток на одну чашку.
[154] Для трансфекции применяли реагент X-tremegene 9 и модифицированный протокол фирмы производителя. На 100 мкл среды Opti Mem добавили 3 мкл X-tremegene 9, после интенсивного перемешивания инкубировали 6 минут. К раствору образовавшихся липосом добавляли плазмидную ДНК (1 мкг) в 50 мкл среды Opti Mem, перемешивали и инкубировали 30 минут. Затем трансфекционную смесь добавляли в 2 мл среды DMEM, содержащей 10% инактивированной эмбриональной сыворотки и инкубировали клетки в ней в течение ночи.
[155] На следующий день среду меняли и на 2 мл свежей среды DMEM, содержащей 10% инактивированной эмбриональной сыворотки. За 10 мин до микроскопии среду во всех чашках заменяли на раствор Хэнкса с вересом без бикарбоната натрия.
[156] Измерение активности сенсоров проводили на первый и второй день после трансфекции.
[157] Для визуализации флуоресценции трансфецированных клеток на следующий день после трансфекции использовали флуоресцентный микроскоп Leica DMI 6000. Микроскопию клеток проводили при температуре 37°С, детекцию флуоресценции проводили в каналах, соответствующих значениям возбуждения и эмиссии флуоресценции использованного в работе флуоресцентного белка: HyPerRed - канал ТХ2, EGFR-YFP - канал GFP, HyPer - каналы FRET (CFP-YFP) и GFP.
[158] Использовали объективы: НСХ Р2 ApoLambda blue 63*1,4 Oil и HCX PL АРО CS 40.0x1.25 OIL UV. Экспозиция составляла 100-300 мсек с интервалами 5 секунд. Через 30 сек после начала эксперимента к клеткам добавляли пероксид водорода до конечной концентрации 180 мкМ. Полученные серии изображений анализировали с помощью программы Leica Application Suite Advanced Fluorescense (LAS AF). Конечную обработку и обсчет изображений осуществляли с помощью программы EMBL Image J и Excel.
[159] Без дополнительного сигнала локализации HyPerRed равномерно распределяется в клетке, заполняет цитоплазму и нуклеоплазму клеток. Диапазон реакции сенсора был аналогичен его реакции в бактериальных клетках и составлял 80% - повышение флуоресценции в ответ на добавление пероксида водорода. После окисления сигнал сенсора возвращался к исходному значению, благодаря восстановлению биосенсора за счет работы клеточных ферментативных систем. Диапазон регистрируемых HyPerRed концентраций пероксида водорода показан на рис.4.
[160] Минимальный детектируемый ответ вызывает добавление к клеточной среде пероксида водорода до конечной концентрации 6 мкМ, что аналогично чувствительности к пероксиду водорода сенсора HyPer. по имеющимся литературным данным, при добавлении к эукариотическим клеткам пероксида водорода цитоплазматическая концентрация пероксида водорода достигает значений в 200-500 раз более низких. Таким образом, изменение сигнала в ответ на добавление 6 мкМ пероксида водорода к клеточной среде эквивалентно изменению в ответ на 12-24 нМ пероксида водорода в цитоплазме клетки.
[161] HyPerRed и HyPer были протестированы на возможность детекции низких физиологических концентраций лигандов в живых клетках. В качестве модельной системы была использована физиологическая стимуляция клеток Hela Kyoto эпидермальным ростовым фактором (EGF).
3
3
[162] Связывание EGF с рецептором (EGFR) на поверхности клетки вызывает активацию тирозинкиназного домена рецептора, который фосфорилирует фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3K), активируя ее. PI3K превращает фосфатидилинозитолдифосфат (PIP2) в фосфатидилинозитолтрисфосфат (PIP). PIP взаимодействует с Racl, стимулируя обмен GDP на GTP, что приводит к активации Racl. Активация Racl приводит к активации комплекса NADPH-оксидазы и продукции пероксида водорода, который способен вызывать активацию исследуемых сенсоров. Концентрация пероксида водорода повышается локально до 50-200 нМ, но даже равномерно перераспределяющийся в цитоплазме сенсор способен детектировать эти низкие концентрации пероксида (Mishina et al., 2011, Antioxidants & redox signaling. 14, 1-7.), т.к. полупериод его окисления в разы меньше полупериода его восстановления.
[163] При физиологической стимуляции клеткам HeLa Kyoto на первый и второй день после трансфекции промывали 1 мл раствора Хенкса с 20 мМ HePesNa, сменяли среду DMEM на 2 мл Image Media (среды DMEM без фенолового красного и бикарбоната натрия, не содержащей инактивированной бычьей сыворотки и витаминов, добавлен 20 мМ HePesNa и 20 мМ глутамин, концентрация глюкозы низкая (1 г/л)). Клетки переносили в термостатируемую камеру на температуру 37°С на 2 часа.
[164] После этого периода из чашки с клетками в отдельную пробирку отбирали 300 мкл среды, поддерживая ее температуру равной 37°С.
[165] Начинали съемку со следующими параметрами: объектив НСХ PL АРО CS 40.0×1.25 OIL UV, экспозиция составляла 100-150 мсек с интервалами 20 секунд. Через 2 мин после начала эксперимента к клеткам добавляли отобранную ранее аликвоту среды (300 мкл) с добавленным EGF до конечной концентрации 100 нг/мл в клеточной среде в чашке и продолжали съемку до 20 мин. Полученные серии изображений анализировали с помощью программы Leica Application Suite Advanced Fluorescense (LAS AF). Конечную обработку и обсчет изображений осуществляли с помощью программы EMBL Image J и Excel.
[166] В качестве контроля использовали мутантный вариант HyPerRed с мутацией C199S, ключевой аминокислоты OxyR белка, важной для образований дисульфидной связи в ответ на появление пероксида водорода. Нуклеиновая кислота HyPerRed-C199S была получена с помощью сайт-направленного мутагенеза нуклеиновой кислоты HyPerRed. В экспериментах в бактериальной суспензии и при экспрессии в эукариотической культуре HeLa Kyoto аналогичных тем, что описаны в примерах 1 и 3, выше, HyPerRed-C199S был не чувствителен к добавлению экзогенного пероксида водорода.
2
2
[167] В ходе физиологической стимуляции EGF, сигнал биосенсоров HyPer и HyPerRed изменялся пропорционально. Время и характер ответа различался у разных клеток в одном эксперименте, т.к. ответ на стимуляцию является индивидуальным. На рис.5 приведен график типичной реакции клеток HeLa Kyoto в ответ на стимуляцию EGF. Реакция является двухфазной, первая фаза является быстрой, в ней производится наибольшее количество НО, вторая фаза отличается менее интенсивной, но более длительной продукцией пероксида водорода. HyPerRed-C199S не менял спектральных свойств в ответ на стимуляцию.
[168] Пример 4
[169] Использование HyperRed для мулитипараметрической микроскопии.
[170] При котрансфекции несколькими векторами целевые плазмиды смешивали в 50 мкл среды Opti Mem в равных количествах, чтобы конечное количество ДНК составляло 2 мкг. На 100 мкл среды Opti Mem добавили 6 мкл X-tremegene 9, после интенсивного перемешивания инкубировали 6 минут. К раствору образовавшихся липосом добавляли подготовленную плазмидную ДНК, перемешивали и инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Затем трансфекционную смесь добавляли в 2 мл среды DMEM, содержащей 10% инактивированной эмбриональной сыворотки и инкубировали клетки в ней в течение ночи. Последующие действия проводились аналогично протоколу трансфекции одной конструкцией, описанному в Примере 3.
[171] Для мулитипараметрической микроскопии была использована модель стимуляции клеток HeLa Kyoto эпидермальным ростовым фактором.
[172] Клетки были трансфецированы тремя конструкциями, кодирующими белок слияния рецептора эпидермального фактора роста с желтым флуоресцентным белком (EGFR-YFP), голубой флуоресцентный белок-бисенсор B-GECO для мониторинга изменений концентрации ионов кальция и HyPerRed. Экспрессионные вектора для экспрессии EGFR-YFP и B-GECO были получены через сервис Addgene.
[173] HyPerRed и B-GECO не несли дополнительных сигналов локализации и были равномерно распределены в цитоплазме и нуклеоплазме трансфецированных клеток, белок EGFR-YFP в отсутствии ростовых факторов был локализован на плазматической мембране клеток, согласно нормальной локализации EGFR.
[174] Как было описано выше в Примере 3, при связывании EGFR с его лигандом происходит активация тирозинкиназного домена рецептора с образованием двух вторичных мессенджеров - PIP3 и IP3 за счет действия PI3K и PLC соответственно, которые, в свою очередь, вызывают выброс кальция из эндоплазматического ретикулума (действие IP3) и активацию NADPH-оксидазы (действие PIP3) с последующей продукцией пероксида водорода. Эти этапы работы сигнальной системы клетки были зарегистрированы с помощью мультипараметрической микроскопии (Рис.6).
[175] В течение нескольких секунд после добавления EGF к клеточной среде наблюдается образование эндоцитарных везикул с EGFR-YFP. На рис.7 приведено изменение интенсивности флуоресценции EGFR-YFP, эндосомы с рецептором образуются на мембране клетки и транспортируются в цитоплазматические компартменты клетки. Далее происходит краткосрочное повышение концентрации кальция в цитоплазме некоторых клеток, и спустя 5-6 мин в цитоплазме клеток повышается уровень пероксида водорода, реакция аналогична наблюдаемой на клетках HeLa Kyoto, трансфецированных только конструкцией HyPerRed.
[176] Таким образом, визуализируются три этапа активации тирозинкиназного сигнального каскада, запускаемого при стимуляции EGFR, а именно эндоцитоз рецептора, выброс кальция из эндоплазматического ретикулума, и генерацию пероксида водорода, - в одной живой клетке. Возможность совместной микроскопии нескольких флуоресцентных конструкций открывает новые возможности изучения взаимосвязи сигнальных процессов in vivo.
[177] Все публикации и патентные заявки, цитируемые в настоящем описании, вводятся в настоящее описание посредством ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или патентная заявка была конкретно и отдельно введена посредством ссылки. Цитирование любой публикации приводится в соответствии с контекстом и интерпретацией по настоящему изобретению и не должно истолковываться как признание любой такой публикации прототипом данного изобретения.