ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ (VLP) СОБАЧЬЕГО ПАРВОВИРУСА (CPV) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
VACCINES BASED ON VIRUS-LIKE PARTICLES (VLP) OF CANINE PARVOVIRUS (CPV) AND APPLICATION THEREOF

Перекрестные ссылки на имеющие отношение заявки
Эта заявка претендует на все преимущества заявки USSN 62/234,196, зарегистрированной 29 сентября 2015, и включенной в настоящий документ путем отсылки во всей своей полноте. Все прочие ссылки, приведенные в настоящем документе, аналогично включены путем отсылки во всей их полноте.
Заявление в отношении списка последовательностей
Список последовательностей, связанный с данной заявкой, предоставлен в текстовом формате вместо бумажной копии, и включен в настоящий документ путем отсылки в описании. Имя текстового файла, содержащего список последовательностей: MER 14-252P_ST25.txt. Размер текстового файла 82 КБ; он был создан на 13 июля 2015; и представлен в электронном виде через EFS-Web, одновременно с подачей описания.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области вакцинологии, и более конкретно, к проблеме преодоления действия материнских антител (MDA). Более конкретно, изобретение относится к преодолению действия MDA путем введения животным, включая собак, комбинации вирусоподобных частиц и модифицированного живого вируса (MLV), в комбинации с одновременным введением, в последовательном введении или в режиме введения прайм-буст. Еще более конкретно, изобретение относится к композициям для индуцирования защитного иммунитета против парвовируса (CPV) у собак и щенков, независимо от присутствия CPV MDA в собаках и щенках.
Уровень техники
Собачий парвовирус (CPV), прежде всего, представляет собой кишечный патоген, который заражает собак, особенно молодых собак. Парвовирусная инфекция характеризуется острой диареей, лихорадкой и лейкопенией у собак и щенков, старше 4-5 недель, и в редких случаях заболеванием миокарда у более молодых щенков. Смертность от этого заболевания у невакцинированных собак очень высока. И хотя существует несколько вакцин против CPV, при наличии антител, полученных от матери (MDA), существует тенденция к блокированию способности в других случаях эффективных вакцин обеспечивать защитный иммунитет.
Новорожденные щенки приобретают пассивные иммунитеты против таких заболеваний, как инфекция CPV, при выкармливании их матерью, особенно в течение первых двух дней жизни. Щенок, который был вскормлен молозивом, молоком, которое производится в первую очередь, и (MDA) в молозиве передаются щенку. Для собак - и для многих других млекопитающих - уровень пассивного иммунитета, обеспечиваемый молозивом, постепенно уменьшается по мере катаболизма MDA. Как таковой, возраст, в котором щенок больше не защищен MDA, варьирует в широких пределах, в зависимости от потребления щенком молозива, количества содержавшихся в нем антител и ряд других факторов.
Особая проблема при вакцинации щенков заключается в том, чтобы вводить вакцины в соответствии с временными рамками, которые обеспечивают защиту, которая перекрывает защиту, обеспечиваемую материнскими антителами, и начинается, когда материнские антитела начинают ослабевать. В настоящее время, вакцинные схемы для щенков обычно начинаются примерно с 6-недельного возраста и после этого примерно каждые 3 недели проводятся бустер-инъекции, например, на 9, 12 и иногда на 15 неделе. Однако для того, чтобы этот режим обеспечивал полную защиту, первая доза вакцины должна немедленно вызвать защитный иммунный ответ. Это ожидание совершенно нереалистично, в частности, из-за незрелости иммунной системы щенка и периода времени, необходимого для установления иммунного ответа. Кроме того, ситуация осложняется тем, что остаточные MDA, которая могут сохраняться до возраста шести недель, нейтрализуют вакцины MLV. В настоящее время, все коммерчески доступные вакцины CPV представляют собой вакцины MLV.
Важно отметить, что в то время как щенок с MDA CPV может не реагировать на любые вакцины MLV CPV, он все еще может быть заражен вирулентным полевым штаммом CPV, и у него может развиться собачий парвовироз. Из-за вмешательства MDA, полная защита обычно не развивается до тех пор, пока не будет дан полный курс вакцинации. Как следствие, возрастная смертность из-за инфекции CPV достигает пика до завершения протоколов вакцинации. Соответственно, разработка вакцины, которая активно иммунизирует щенков после первой инъекции - и в присутствии MDA - является одной из самых важных неудовлетворенных потребностей в ветеринарии собак.
Еще одна проблема в ветеринарной медицине - это лечение рака, например, у собак. Существующие инструменты для лечения рака имеют множество ограничений, особенно, для гериатрических собак. Введение онколитических парвовирусов для уничтожения раковых клеток открывает большие перспективы в качестве эффективного лечения рака (Rommelaere et al, Cytokine & Growth Factor Reviews 21:185-195, 2010; и патент США № 7,179,456, принадлежащий Rommelaere et al, полное содержание которых включено в настоящем документе путем отсылки) и может применяться к собакам. Однако наличие ранее существовавших антител к парвовирусам (например, в результате вакцинации) делает этот метод неэффективным, поскольку парвовирус будет нейтрализован существующими антителами. Кроме того, генная терапия у собак редко проводится в настоящее время, но может стать перспективным методом лечения различных заболеваний, если подходящие векторы нуклеиновой кислоты будут идентифицированы. Соответственно, способы преодоления действия существующих антител были бы полезны для применения помимо вакцинации.
В свете вышесказанного, существует потребность в вакцинах с повышенной безопасностью и хорошей эффективностью, включая способность преодолевать действие MDA, включая вакцины, которые обеспечивают защиту от гетерологичных штаммов CPV.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, включающие антигены вирусоподобных частиц CPV (VLP), вакцины модифицированного живого вируса CPV (MLV), способы вакцинации против CPV и наборы для применения с такими способами и композициями.
Обеспечиваются композиции или вакцины, включающие антигенный полипептид CPV и его фрагменты и варианты. Антигены CPV и их фрагменты и варианты обладают иммуногенными и защитными свойствами. Антигены CPV могут быть получены с помощью бакуловирусного вектора экспрессии в клетках насекомых, и собраны в капсиды, не содержащие CPV или VLPs CPV (вирусоподобные частицы).
Антигенные полипептиды и их фрагменты и варианты могут входить в состав вакцин с модифицированными живыми вирусами CPV или без них и/или в фармацевтические композиции. Такие вакцины или композиции могут быть применены для вакцинации животного и обеспечивают защиту от гомологичных и гетерологичных штаммов CPV.
Важно отметить, что авторы изобретения неожиданно и с удивлением обнаружили, что введение композиций, включающих как MLV, так и VLP (каждый антиген, соответствующий одному и тому же патогену, но не обязательно кодирующий или имеющий одну и ту же часть или ген или его субъединицу), способен преодолеть действие MDA для получения защитного иммунитета против последующего вирулентного заражения указанным патогеном. Соответственно, в конкретном воплощении, изобретение обеспечивает комбинацию вакцин, включающих как MLV CPV, так и VLP CPV, которые вызывают защитный иммунитет у щенков, независимо от того, имеют ли щенки циркулирующие MDA против CPV.
В другом воплощении, изобретение обеспечивает комбинацию вакцин, включающих как MLV, так и VLP, соответствующих другим патогенам, если вмешательство MDA представляет собой проблему. Например, молодые коровы, свиньи, кошки, козы, овцы, лошади и другие имеют циркулирующие MDA против различных патогенов. В каждом случае, присутствие данных MDA может влиять на эффективность вакцин. Теперь, когда это раскрытие было сделано, авторы изобретения предполагают, что введение комбинации обоих MLV + VLP преодолеет MDA независимо от патогена. Патогены могут включать, без ограничений: вирус ящура (FMDV), вирус свиного репродуктивного и респираторного синдрома (PRRSV), вирус собачьей чумы (CDV), вирус панлейкопении кошек FPL и вирус конского гриппа (EIV). Специалисту будет понятно, что этот подход, предусматривающий MLV + VLP, может быть применен в любом случае, где вмешательство MDA создает проблему.
Наборы, включающие, по меньшей мере, один антигенный полипептид или его фрагмент или вариант, и инструкции по применению также обеспечивают.
Краткое описание чертежей
Следующее подробное описание, приведенное в виде примеров, но не предназначенное для ограничения изобретения исключительно описанными конкретными вариантами осуществления, может быть лучше понято в сочетании с прилагаемыми чертежами, на которых:
фиг. 1 отображает таблицу, суммирующую последовательности ДНК и белка;
фиг. 2 изображает карту плазмиды pMEB072;
фиг. 3 изображает карту плазмиды pMEB073;
фиг. 4 представляет собой электронную микрофотографию VLP CPV, показывающую правильную форму и морфологию для парвовирусоподобных вирионов;
фиг. 5 представляет собой Вестерн-блот, показывающий уровни VLP CPV и сопутствующие данные;
фиг. 6 представляет собой Вестерн-блот, показывающий уровни VLP CPV и сопутствующие данные;
фиг. 7 представляет собой график, показывающий титры CPV, определенные с помощью ELISA после вакцинации;
фиг. 8 представляет собой график, показывающий титры CPV, определенные с помощью ELISA, после вакцинации штаммами Souriou & Bari (низкая доза, без адъюванта) или pMEB072-продуцированными VLP CPV. Появление происходит быстрее в группе, получавшей VLP;
3
фиг. 9 представляет собой график, показывающий титры CPV, определенные с помощью ELISA, после вакцинации штаммами Souriou & Bari (промежуточная доза, с адъювантом) или pMEB073-продуцированными VLP CPV (с Al(OH)+сапонин). Появление происходило еще быстрее в группе, получавшей VLP;
3
фиг. 10 представляет собой график, показывающий титры CPV, определенные с помощью ELISA, после вакцинации штаммами Souriou & Bari (высокая доза) или pMEB073-продуцированными VLP CPV (с Al(OH)+сапонин). Появление происходило быстро во всех трех группах;
фиг. 11 представляет собой ClustalW выравнивание SEQ ID NOs: 1, 3, 4 и 6;
фиг. 12 представляет собой график, показывающий индивидуальные титры анти-CPV антител (IHA), в соответствии с обработкой (MLV или MLV + VLP на D0) и днем. Каждая строка соответствует одному индивидууму, и размер точек соответствует числу значений в указанной комбинации дня и титра. Показаны данные только от собак, имевшие титр D0 IHA ≥ 40;
фиг. 13 представляет собой график, показывающий средние анти-CPV титры антител (IHA) в соответствии с обработкой (MLV или MLV + VLP на D0) и днем. «Ящики» представляют медианные, 25-й и 75-й процентили, и концы усов представляют значения в пределах 1,5-кратного межквартильного диапазона; каждый символ представляет одно значение;
фиг. 14 представляет собой график, показывающий средние анти-CPV титры антител (определенные с помощью ELISA log10 OD50) в зависимости от дня после вакцинации и группы (Gr A: VLP SC 500 мкл; Gr D VLP перорально; Gr E: Ad5 CPV 8,64 log10; Gr G: Ad5 CDV). Собак вакцинировали на D0 и D28. Средние значения представлены как +/- одна стандартная ошибка среднего; каждая точка представляет собой одно значение;
фиг. 15 представляет собой график, показывающий процент ответивших для исследования, раскрытого в примере 7;
фиг. 16 представляет собой график, показывающий титры HAI;
фиг. 17 представляет собой график, показывающий среднее геометрическое титра CPV-нейтрализующих антител;
фиг. 18 представляет собой график, показывающий процент отвечающих по группам и дням;
фиг. 19 представляет собой график, показывающий среднее геометрическое для титра антител к CPV по группам и дням.
Осуществление изобретения
Обеспечивают композиции, включающие полипептид CPV, антиген и его фрагменты и варианты, которые вызывают иммунный ответ у животного. Антигенные полипептиды или их фрагменты или варианты получают с помощью бакуловирусного экспрессионного вектора в клетках насекомых. Антигенные полипептиды или фрагменты или варианты могут быть составлены в вакцины или фармацевтические композиции с модифицированными живыми вирусами CPV или без них и применены для того, чтобы вызвать или стимулировать защитный ответ у животного. В одном из воплощений полипептидный антиген представляет собой полипептид капсиды CPV или его активный фрагмент или вариант. Антигены CPV могут быть собраны в пустые капсиды CPV или VLP CPV (вирусоподобные частицы).
Признано, что антигенные полипептиды изобретения могут представлять собой полноразмерные полипептиды или их активные фрагменты или варианты. Под «активными фрагментами» или «активными вариантами» подразумевают, что фрагменты или варианты сохраняют антигенную природу полипептида. Таким образом, настоящее изобретение охватывает любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV, который вызывает иммуногенный ответ у животного. Полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV может представлять собой любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV, такой как, но без ограничений, его белок, пептид или фрагмент или вариант, который вызывает, индуцирует или стимулирует ответ у животного, такого как овца, корова, коза или свинья.
Настоящее изобретение относится к вакцинам или композициям для собак, которые могут включать эффективное количество рекомбинантного антигена CPV. В некоторых воплощениях, вакцины или композиции представляют собой безадъювантные вакцины или композиции, и могут включать фармацевтически или ветеринарно-приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.
В некоторых воплощениях, ответ животного представляет собой защитный иммунный ответ.
Под «животным» подразумевают млекопитающих, птиц и т.п. Животное или хозяин включает млекопитающих и человека. Животное может быть выбрано из группы, состоящей из лошадиных (например, лошадь), собачьих (например, собаки, волки, лисы, койоты, шакалы), кошачьих (например, львы, тигры, домашние кошки, дикие кошки, другие большие кошки и другие кошачьи, включая гепардов и рысь), овец (например, овца), быков (например, крупный рогатый скот), свиней (например, свинья), козлов (например, козел), птиц (например, курица, утка, гусь, индейка, перепелка, фазан, попугай, зяблики, ястреб, ворона, страус, эму и казуар), приматов (например, полуобезьяна, долгопят, мартышка, гиббон, обезьяна) и рыб. Термин «животное» также включает индивидуальное животное на всех этапах развития, включая эмбриональные и фетальные стадии.
Если не указано иное, все технические и научные термины, примененные в настоящем документе, имеют такое же значение, как обычно понимается обычным специалистом в области, к которой относится это раскрытие. Термины в единственном числе включают в себя множественное число, если контекст явно не указывает на иное. Точно также слово «или» предназначено для включения «и», если контекст явно не указывает на иное.
Следует отметить, что в этом раскрытии и, в особенности, в формуле изобретения и/или пунктах, такие термины как «включает», «включенный», «включающий» и им подобные могут иметь значение, приписываемое ему в Патентным законодательством США; например, они могут означать «содержит», «содержащийся», «содержащий» и т.п., и такие термины как «состоящий в основном из» и «состоит в основном из» имеют значение, приписываемое им в Патентном законодательстве США, например, они допускают элементы, явно не указанные, но исключают элементы, которые обнаружены в известном уровне техники, или которые влияют на основные или новые характеристики изобретения.
Антигенные полипептиды изобретения способны защищать от CPV. То есть, они способны стимулировать иммунный ответ у животного. Под терминами «антиген» или «иммуноген» понимают вещество, которое индуцирует специфический иммунный ответ у животного-хозяина. Антиген может включать целый организм, убитый, аттенуированный или живой; субъединицу или часть организма; рекомбинантный вектор, содержащий вставку с иммуногенными свойствами; часть или фрагмент ДНК, способный индуцировать иммунный ответ при презентации животному-хозяину; полипептид, эпитоп, гаптен или любую их комбинацию. Альтернативно, иммуноген или антиген могут включать токсин или антитоксин.
Термин «иммуногенный белок, полипептид или пептид», как применен в настоящем документе, включает полипептиды, которые иммунологически активные в том смысле, что после введения хозяину, они способен вызывать иммунный ответ гуморального и/или клеточного типа, направленные против белка. Предпочтительно белковый фрагмент таков, что он обладает существенно такой же иммунологической активностью как полный белок. Таким образом, белковый фрагмент в соответствии с изобретением включает или состоит в основном из или состоит из, по меньшей мере, одного эпитопа или антигенной детерминанты. «Иммуногенный» белок или полипептид, как используется в настоящем документе, включает полноразмерную последовательность белка, его аналогов или его иммуногенных фрагментов. Термином «иммуногенный фрагмент» обозначают фрагмент белка, который включает один или несколько эпитопов и, таким образом, вызывает описанный выше иммунологический ответ. Такие фрагменты могут быть идентифицированы с применением любого числа методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области техники. Смотри, например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996). Например, линейные эпитопы могут быть определены с помощью, например, одновременное синтезирование большого количества пептидов на твердых подложках, пептидов, соответствующих частям белковой молекулы, и проведение реакции пептидов с антителами, в то время как пептиды все еще остаются прикрепленными к подложкам. Такие методики известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 4,708,871; Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986. По аналогии, конформационные эпитопы легко идентифицируют путем определения пространственной конформации аминокислот, например, с помощью, например, рентгеновской кристаллографии и 2-мерного ядерного магнитного резонанса. Смотри, например, Epitope Mapping Protocols, supra. Способы, особенно применимые к белкам T. parva, полностью описаны в PCT/US2004/022605, включенной в настоящем документе путем отсылки во всей своей полноте.
Как обсуждалось, изобретение охватывает активные фрагменты и варианты антигенного полипептида. Таким образом, термин «иммуногенный белок, полипептид или пептид» дополнительно рассматривает делеции, вставки и замены в последовательности, до тех пор, пока полипептид способен продуцировать иммунологический ответ, как определен в настоящем документе. Термин «консервативная вариация» означает замену аминокислотного остатка другим биологически подобным остатком или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, так что кодируемый аминокислотный остаток не изменяется или представляет собой другой биологически подобный остаток. В этой связи, особенно предпочтительными заменами будут, как правило, консервативные по своей природе, т.е. это те замены, которые происходят в пределах семейства аминокислот. Например, аминокислоты обычно подразделяют на четыре семейства: (1) кислые - аспартат и глутамат; (2) основные - лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные - аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные - глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серин, треонин, тирозин. Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда классифицируют как ароматические аминокислоты. Примеры консервативных вариаций включают замену одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, другим гидрофобным остатком или замену одного полярного остатка на другой полярный остаток, такую как замену аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую кислоту или глутамина на аспарагин и т.п.; или аналогичную консервативную замену аминокислоты на структурно родственную аминокислоту, которая не будет оказывать существенного влияния на биологическую активность. Белки, имеющие существенно сходную аминокислотную последовательность как референсная молекула, но обладающие незначительными аминокислотными заменами, которые не влияют существенно на иммуногенность белка, находятся, следовательно, в пределах определения референсного полипептида. Все полипептиды, полученные в результате данных модификации, включены в настоящем документе. Термин «консервативная вариация» также включает применение замещенной аминокислоты вместо незамещенной исходной аминокислоты при условии, что антитела, возникающие в ответ на замещенный полипептид, также иммунореагируют с незамещенным полипептидом.
Термин «эпитоп» относится к сайту на антигене или гаптене, на которые отвечают специфические B-клетки и/или T-клетки. Термин также применяют взаимозаменяемо с терминами «антигенная детерминанта» или «сайт антигенной детерминанты». Антитела, которые распознают тот же эпитоп, могут быть идентифицированы в простом иммуноанализе, показывающем способность одного антитела блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью.
«Иммунологический ответ» на композицию или вакцину представляет собой развитие в хозяине клеточного и/или опосредуемого антителами иммунного ответа на представляющую интерес композицию или вакцину. Как правило, «иммунологический ответ» включает, без ограничений, один или несколько из следующих эффектов: продукцию антител, B-клеток, T-клеток хелперов, и/или цитотоксических T-клеток, направленных специфически на антиген или антигены, включенные в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно, хозяин покажет или терапевтический, или защитный иммунологический ответ, так что будет усилена устойчивость к новой инфекции и/или клиническая тяжесть заболевания будет снижена. Такая защита будет продемонстрирована либо снижением, либо отсутствием симптомов, обычно проявляемых инфицированным хозяином, более коротким временем восстановления и/или пониженным титром вируса у инфицированного хозяина.
Синтетические антигены также включены в рамки определения, например, полиэпитопы, фланкирующие эпитопы и другие рекомбинантные или синтетически полученные антигены. Смотри, например, Bergmann et al., 1993; Bergmann et al., 1996; Suhrbier, 1997; Gardner et al., 1998. Иммуногенные фрагменты, для целей настоящего изобретения, как правило, включают, по меньшей мере, примерно 3 аминокислоты, по меньшей мере, примерно 5 аминокислот, по меньшей мере, примерно 10-15 аминокислот или примерно 15-25 аминокислот или более аминокислот, от молекулы. Не существует критического верхнего предела длины фрагмента, который может включать практически полноразмерную белковую последовательность или даже слитый белок, включающий, по меньшей мере, один эпитоп белка.
Соответственно, минимальная структура эпитопа, экспрессирующего полинуклеотид, состоит в том, что она включает или состоит в основном из или состоит из нуклеотидов, кодирующих эпитоп или антигенную детерминанту полипептида CPV. Полинуклеотид, кодирующий фрагмент полипептида CPV, может включать или состоит в основном из или состоит из как минимум 15 нуклеотидов, примерно 30-45 нуклеотидов, примерно 45-75 или, по меньшей мере, 57, 87 или 150 последовательных или прилегающих нуклеотидов последовательности, кодирующей полипептид. Процедуры определения эпитопа, такие как, генерирование библиотек перекрывающихся пептидов (Hemmer et al., 1998), Pepscan (Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1985; Van der Zee R. et al., 1989; Geysen, 1990; Multipin. RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron) и алгоритмы (De Groot et al., 1999; PCT/US2004/022605) могут быть применены в практике изобретения.
Термин «нуклеиновая кислота» и «полинуклеотид» относится к РНК или ДНК, которые представляют собой линейные или разветвленные, одно- или двухцепочечные молекулы или их гибрид. Термин также охватывает гибриды РНК/ДНК. Ниже приведены неограничивающие примеры полинуклеотидов: ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК любой последовательности, выделенная РНК любой последовательности, зонды и праймеры из нуклеиновой кислоты. Полинуклеотид может включать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, урацил, другие сахара и связывающие группы, такие как фторрибозу и тиолат, и нуклеотидные ответвления. Последовательность нуклеотидов может быть дополнительно модифицирована после полимеризации, например, с помощью конъюгации, с метящим компонентом. Другие виды модификаций, включенные в данное определение, представляют собой кэпы, замену одного или нескольких природных нуклеотидов аналогом, и введение средств для прикрепления полинуклеотида к белкам, ионы металлов, метящие компоненты, другие полинуклеотиды или твердую подложку. Полинуклеотиды могут быть получены с помощью химического синтеза или получены из микроорганизма.
Термин «ген» широко применяют для обозначения любого сегмента полинуклеотида, связанного с биологической функцией. Таким образом, гены включают интроны и экзоны как в геномной последовательности или просто кодирующие последовательность, как в кДНК, и/или регуляторные последовательности, необходимые для их экспрессии. Например, понятие ген также относится к фрагменту нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует мРНК или функциональную РНК или кодирует специфический белок, и которая включает регуляторную последовательности.
Изобретение дополнительно включает комплементарную цепь к полинуклеотиду, кодирующему антиген, эпитоп или иммуноген CPV. Комплементарная цепь может быть полимерной и иметь любую длину, и может содержать дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды и аналоги в любой комбинации.
Термины «белок», «пептид», «полипептид» и «полипептидный фрагмент» применяют взаимозаменяемо в настоящем документе для обозначения полимеров аминокислотных остатков любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может включать модифицированные аминокислоты или аминокислотные аналоги, и он может прерываться химическими группами, отличными от аминокислот. Термины также охватывают полимер аминокислот, который был модифицирован в природных условиях или в результате вмешательства; например, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидация, ацетилирование, фосфорилирование или любые другие манипуляции или модификации, такие как конъюгация с метящим или биоактивным компонентом.
Термин «изолированный» биологический компонент (такой как нуклеиновая кислота или белок или органелла) относится к компоненту, который был существенно отделен или очищен от других биологических компонентов в клетке организма, в которой компонент существует в природе, например, другие хромосомные и экстра-хромосомные ДНК и РНК, белки и органеллы. Нуклеиновые кислоты и белки, которые были «изолированы», включают нуклеиновые кислоты и белки, очищенные с помощью стандартных способов очистки. Термин также охватывает нуклеиновые кислоты и белки, полученные с помощью рекомбинантных технологий, а также химическим синтезом.
Термин «очищенный», как применен в настоящем документе, не требует абсолютной чистоты; скорее, его применяют как относительный термин. Таким образом, например, препарат очищенного полипептида - это препарат, который в большей степени обогащен полипептидом, чем полипептид в своем естественном окружении. То есть полипептид отделяют от клеточных компонентов. Под «существенно очищенный» понимают, что полипептид представляет несколько воплощений, в которых, по меньшей мере, 60%, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95% или, по меньшей мере, 98% или более клеточных компонентов или материалов было удалено. Аналогично, полипептид может быть частично очищен. Под «частично очищенный» понимают, что удалили менее чем 60% клеточных компонентов или материала. То же самое относится к полинуклеотидам. Полипептиды, раскрытые в настоящем документе, могут быть очищены с помощью любого из способов, известных в данной области техники.
Как отмечено выше, антигенные полипептиды или их фрагменты или варианты представляют собой антигенные полипептиды CPV, которые получают с помощью бакуловирусного экспрессионного вектора в клетках насекомых. Фрагменты и варианты раскрытых полинуклеотидов и полипептидов, кодируемых таким образом, также охвачены настоящим изобретением. Термин «фрагмент» предназначен для обозначения части полинуклеотида или части антигенной аминокислотной последовательности, кодируемой таким образом. Фрагменты полинуклеотида могут кодировать белковые фрагменты, которые сохраняют биологическую активность природного белка и, следовательно, обладают иммуногенной активностью, как отмечено в других местах в настоящем документе. Фрагменты полипептидной последовательности сохраняют способность индуцировать защитный иммунный ответ у животного.
Термин «варианты» предназначен для обозначения существенно сходных последовательностей. Для полинуклеотидов вариант включает делецию и/или вставку одного или нескольких нуклеотидов в один или несколько сайтов внутри природного полинуклеотида и/или замену одного или нескольких нуклеотидов в одном или нескольких сайтах в природном полинуклеотиде. Как применен в настоящем документе, «природный» полинуклеотид или полипептид включает природную нуклеотидную последовательность или аминокислотную последовательность, соответственно. Варианты конкретного полинуклеотида изобретения (т.е. референсного полинуклеотида) также могут быть оценены путем сравнения процента идентичности последовательности между полипептидом, кодируемым вариантом полинуклеотида, и полипептидом, кодируемым референсным полинуклеотидом. Термин «вариант» белка предназначен для обозначения белка, полученного из природного белка делецией или вставкой одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах в природный белок и/или заменой одной или нескольких аминокислот в одном или нескольких сайтах в природном белке. Варианты белков, охваченные настоящим изобретением, представляют собой биологически активные белки, т.е. способные вызывать иммунный ответ.
В одном из аспектов, настоящее изобретение обеспечивает полипептиды CPV из изолятов CPV. В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает полипептид, имеющий последовательность, как указана в SEQ ID NOs: 1, 3, 4, 6, 8-10, и ее вариант или фрагмент.
В другом аспекте, изобретение относится к свободным капсидам CPV или VLP CPV (вирусоподобные частицы). Капсиды могут включать, состоять в основном из или состоять из полипептидов CPV VP2 или вариантов, включая их усеченные варианты.
Кроме того, гомологи полипептидов CPV предназначены для охвата настоящим изобретением. Термин «гомологи», как используется в настоящем документе, включает ортологи, аналоги и паралоги. Термин «аналоги» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые имеют одинаковую или сходную функцию, но которые развивались отдельно у неродственных организмов. Термин «ортологи» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам от разных видов, но которые эволюционировали от общего предкового гена путем видообразования. Обычно, ортологи кодируют полипептиды, имеющие одинаковые или сходные функции. Термин «паралоги» относится к двум полинуклеотидам или полипептидам, которые связаны дублированием в геноме. Паралоги, как правило, имеют разные функции, но эти функции могут быть связаны. Аналоги, ортологи и паралоги полипептида CPV дикого типа могут отличаться от полипептида CPV дикого типа пост-трансляционными модификациями, различием в аминокислотной последовательности или и тем, и другим. В особенности, гомологи изобретения, в общем, будут проявлять, по меньшей мере, 80-85%, 85-90%, 90-95% или 95%, 96%, 97%, 98%, 99% идентичности последовательности, со всей или частью полинуклеотидной последовательности CPV дикого типа, и будут проявлять сходную функцию. Варианты включают аллельные варианты. Термин «аллельный вариант» относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащим полиморфизмы, которые приводят к изменениям в аминокислотных последовательностях белка и которые существуют в природной популяции (например, виды или разновидности вируса). Такие природные аллельные вариации, как правило, могут привести к 1-5% дисперсии в полинуклеотиде или полипептиде. Аллельные варианты могут быть определены секвенированием представляющей интерес последовательности нуклеиновой кислоты в ряде различных видов, которое может быть легко выполнено с применением зондов гибридизации для идентификации того же генетического локуса гена в данных видах. Любые и все такие вариации нуклеиновой кислоты и полученные аминокислотные полиморфизмы или вариации, которые представляют собой результат природных аллельных вариаций и которые не меняют функциональную активность представляющего интерес гена, предназначены для включения в объем изобретения.
Как применен в настоящем документе, термин «производное» или «вариант» относится к полипептиду или нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид, который имеет одну или несколько консервативных вариации аминокислот или другие минорные модификации, такие как (1) соответствующий полипептид имеет существенно эквивалентную функцию по сравнению с полипептидом дикого типа или (2) антитело, возникшее против этого полипептида, обладает иммунореактивностью с полипептидом дикого типа. Данные варианты или производные включают полипептиды, имеющие минорные модификации первичных аминокислотных последовательностей полипептида CPV, что может привести к пептидам, которые имеют существенно эквивалентную активность по сравнению с немодифицированным аналогом полипептида. Такие модификации могут быть специально полученными, например, полученными с помощью сайт-специфического мутагенеза, или могут быть спонтанными. Термин «вариант» дополнительно относится к делециям, вставкам и заменам в последовательность, пока полипептид функционирует, производя иммунологический ответ, как определен в настоящем документе.
Термин «консервативная вариация» обозначает замену аминокислотного остатка другим биологически сходным остатком или замену нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты, такую, что кодируемый аминокислотный остаток не изменяется или представляет собой другой биологически похожий остаток. В этой связи, особенно предпочтительны замены, которые, в общем, консервативны по природе, как описано выше.
Полинуклеотиды раскрытия включают последовательности, которые вырождены в результате генетического кода, например, путем применения оптимизированного кодона для конкретного хозяина. Термин «оптимизированный», как используется в настоящем документе, относится к полинуклеотиду, который создан с помощью генно-инженерных методик для увеличения его экспрессия в данном виде. Для обеспечения оптимизированных полинуклеотидов, кодирующих полипептиды CPV, последовательность ДНК гена белка CPV может быть модифицирована для 1) включения кодонов, предпочитаемых генами с высоким уровнем экспрессии в определенном виде; 2) включения A+T или G+C содержания в композицию нуклеотидных оснований до величины, обнаруживаемой в существенной степени у указанных видов; 3) формирования инициирующей последовательности у указанных видов; или 4) устранения последовательностей, которые вызывают дестабилизацию, несоответствующее полиаденилирование, деградацию и терминацию РНК или которые образуют вторичные структуры типа шпилек, или сайтов сплайсинга РНК. Увеличенная экспрессия белка CPV в указанных видах может быть достигнута за счет учета частоты распределения использования кодона у эукариот и прокариот или у определенного вида. Термин «частота использования предпочтительного кодона» относится к предпочтению, проявляемому специфической клеткой-хозяином в использовании нуклеотидных кодонов для определения данной аминокислоты. Существует 20 природных аминокислот, большинство из которых определяются более чем одним кодоном. Следовательно, все вырожденные нуклеотидные последовательности включены в раскрытие до тех пор, пока аминокислотная последовательность полипептида CPV, кодируемая нуклеотидной последовательностью, функционально не меняется.
Идентичность последовательности между двумя аминокислотными последовательностями может быть установлена с помощью матриц попарного распределения и blosum62, применяя стандартные параметры (смотри, например, алгоритм BLAST или BLASTX, доступный на сервере «Национального центра биотехнологической информации» (NCBI, Bethesda, Md., США), а также в работе Altschul et al.; и, таким образом, в этом документе термин «распределяют» говорит о применении алгоритма или матрицы BLAST или BLASTX и BLOSUM62).
Термин «идентичность» в отношении последовательности может относиться к числу позиций с идентичными нуклеотидами или аминокислотами, деленному на число нуклеотидов или аминокислот в более короткой из двух последовательностей, в которой выравнивание двух последовательностей может быть определено в соответствии с алгоритмом Уилбера и Липмана (Wilbur и Lipman), например, применяя окно, размером в 20 нуклеотидов, длину слова, равную 4 нуклеотидам, и штраф за пропуск в последовательности, равный 4, и данные компьютерного анализа и интерпретации последовательности, включая выравнивание, могут быть удобно получены с помощью коммерчески доступные программ (например, Intelligenetics™ Suite, Intelligenetics Inc. CA). Если последовательности РНК называют сходными или они имеют степень идентичности или гомологии последовательности с последовательностями ДНК, тимидин (T) в последовательности ДНК считается равным урацилу (U) в последовательности РНК. Таким образом, последовательности РНК находятся в пределах объема изобретения и могут быть получены из последовательностей ДНК, считая тимидин (T) в последовательности ДНК равным урацилу (U) в последовательностях РНК.
Идентичность последовательностей или сходство последовательностей двух аминокислотных последовательностей или идентичность последовательностей между двумя нуклеотидными последовательностями может быть определена с помощью пакета программного обеспечения Vector NTI (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA).
Следующие документы обеспечивают алгоритмы для сравнения относительной идентичности или гомологии последовательностей, и дополнительно или альтернативно в отношении вышеизложенного, идеи в данных ссылках могут быть применены для определения процентов гомологии или идентичности: Needleman SB and Wunsch CD; Smith TF and Waterman MS; Smith TF, Waterman MS and Sadler JR; Feng DF and Dolittle RF; Higgins DG and Sharp PM; Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ; and, Devereux J, Haeberlie P and Smithies O. И, без излишнего экспериментирования, квалифицированный специалист может обратиться ко многим другим программам или ссылкам для определения процентов гомологии.
Реакция гибридизации может быть выполнена в условиях различной «строгости». Условия, которые увеличивают жесткость реакции гибридизации, хорошо известны. Смотри, например, «Molecular Cloning: A Laboratory Manual», второе издание (Sambrook et al., 1989).
Изобретение дополнительно охватывает полинуклеотиды CPV, которые содержатся в молекуле вектора или в векторе экспрессии и функционально связаны с промоторным элементом и, необязательно, с энхансером.
Термин «вектор» относится к рекомбинантной ДНК или РНК плазмиды или вируса, который включает гетерологичный полинуклеотид для доставки в целевую клетку, или in vitro, или in vivo. Гетерологичный полинуклеотид может включать последовательность, представляющую интерес для целей профилактики или терапии, и необязательно может быть представлен кассетой экспрессии. Как применен в настоящем документе, вектор не должен быть способен к репликации в конечной целевой клетке или субъекте. Термин включает клонирующие векторы и вирусные векторы.
Термин «рекомбинантный» означает полинуклеотид полусинтетического или синтетического происхождения, который или не встречается в природе, или связан с другим полинуклеотидом в расположении, не встречающемся в природе.
«Гетерологичный» означает полученный из объекта, генетически отличающегося от частей другого объекта, с которыми он сравнивается. Например, полинуклеотид может быть помещен с помощью генно-инженерной методики в плазмиду или вектор, полученный из другого источника, и представляет собой гетерологичный полинуклеотид. Промотор, удаленный из его нативной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, отличной от нативной последовательности, представляет собой гетерологичный промотор.
Настоящее изобретение относится к овечьим, коровьим, козьим и свиным вакцинам или фармацевтическим или иммунологическим композициям, которые могут включать эффективное количество рекомбинантных антигенов CPV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, адъювант, наполнитель или разбавитель.
Объект изобретения, описанный в настоящем документе, направлен, частично, на композиции и способы, относящиеся к антигену CPV, полученному в системе экспрессии бакуловирус/клетки насекомых, которая высоко иммуногена и защищает животных от заражения гомологичными и гетерологичными штаммами CPV.
Композиции
Настоящее изобретение относится к вакцине или композиции CPV, которые могут включать эффективное количество рекомбинантного антигена CPV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель. В одном из воплощений, рекомбинантный антиген CPV экспрессируют с помощью бакуловирусного вектора экспрессии в клетках насекомых.
Одно из воплощений изобретения относится к вакцине или композиции, включающей пустые капсиды CPV или VLP (вирусоподобные частицы) CPV. Пустые капсиды CPV или VLP (вирусоподобные частицы) CPV получают экспрессией капсидного белка CPV.
Настоящее изобретение также относится к способам получения данных вакцин, применению антигенов для получения данных вакцин и способам вакцинации с их применением.
Настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, в особенности к кДНК, и к аминокислотным последовательностям, модифицированным по сравнению с природными последовательностями вируса. Изобретение также относится к продуктам экспрессии модифицированных нуклеотидных последовательностей и к антигенам CPV и вирусу, включающему данные модификации.
Настоящее изобретение охватывает любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV, который вызывает иммуногенный ответ у животного, такого как овца, корова, коза или свинья. Полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV может представлять собой любой полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV, такой как, но без ограничений, белок, пептид или его фрагмент, который вызывает, индуцирует или стимулирует ответ у животного, такого как собака.
В воплощении, в котором иммунологическая композиция или вакцина CPV представляет собой рекомбинантную иммунологическую композицию или вакцину, композиция или вакцина, включающая рекомбинантный вектор и представляющая собой безадъювантную композицию или вакцину, может необязательно включать фармацевтически или ветеринарно приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель; рекомбинантный вектор представляет собой бакуловирусный вектор экспрессии, который может включать полинуклеотид, кодирующий полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV. Полипептид, антиген, эпитоп или иммуноген CPV может представлять собой капсидный белок и любой его фрагмент.
В одном из воплощений, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая один или несколько антиген(антигенов) CPV представляет собой кДНК, кодирующую капсидный белок CPV. В другом воплощении, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая один или несколько антиген(антигенов) CPV представляет собой кДНК, кодирующую фрагмент капсидного белка CPV.
В другом воплощении, антиген CPV может быть получен из штамма CPV 100869-1.
Настоящее изобретение относится к композиции или вакцине CPV, которые могут включать эффективное количество рекомбинантного антигена CPV. Композиция или вакцина CPV не содержит адъювант. Композиция или вакцина CPV может необязательно содержать фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.
Изобретение дополнительно охватывает полинуклеотиды CPV, содержащиеся в молекуле вектора или в экспрессионном векторе и функционально связанные с элементом промотора и необязательно с энхансером.
В одном из аспектов, настоящее изобретение обеспечивает полипептиды CPV, имеющие последовательности, как указаны в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10, и их варианты или фрагменты.
В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с антигенным полипептидом изобретения, в особенности, с полипептидами, имеющими последовательности, как указаны в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10.
В еще одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает фрагменты и варианты полипептидов CPV, указанных выше (SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10), которые могут быть легко получены специалистом в данной области техники с применением хорошо известных молекулярно-биологических методик.
Варианты представляют собой гомологичные полипептиды, имеющие идентичность аминокислотной последовательности, по меньшей мере, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% по сравнению с аминокислотной последовательностью, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10.
Иммуногенный фрагмент полипептида CPV включает, по меньшей мере, 8, 10, 15 или 20 последовательных аминокислот, по меньшей мере, 21 аминокислоту, по меньшей мере, 23 аминокислоты, по меньшей мере, 25 аминокислот или, по меньшей мере, 30 аминокислот полипептида CPV, имеющего последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10 или их варианты. В другом воплощении, фрагмент полипептида CPV включает специфический антигенный эпитоп, обнаруженный на полноразмерном полипептиде CPV. Однако специалисту понятно, что достаточная часть полипептида CPV должны присутствовать, чтобы позволить образование VLP CPV.
В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, кодирующий полипептид CPV, такой как полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10. В еще одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, кодирующий полипептид, имеющий, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10 или консервативных вариант, аллельный вариант, гомолог или иммуногенный фрагмент, включающие, по меньшей мере, восемь или, по меньшей мере, десять последовательных аминокислот одного из данных полипептидов или комбинации данных полипептидов.
В другом аспекте, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, как указана в SEQ ID NO: 2, 5, 7, 11 или 12, или ее вариант. В еще одном аспекте, настоящее изобретение обеспечивает полинуклеотид, имеющий, по меньшей мере, 70%, по меньшей мере, 75%, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности последовательности с одним полинуклеотидом, имеющим последовательность, как указана в SEQ ID NO: 2, 5, 7, 11 или 12, или ее вариант.
Полинуклеотиды изобретения могут включать дополнительные последовательности, такие как дополнительные кодирующие последовательности в пределах одной и той же единицы транскрипции, элементы управления, такие как промоторы, сайты связывания рибосом, 5’UTR, 3’UTR, терминаторы транскрипции, сайты полиаденилирования, дополнительные транскрипционные единицы под контролем того же или другого промотора, последовательности, которые позволяют клонирование, экспрессию, гомологичную рекомбинацию и трансформацию клетки-хозяина, и любые такие конструкты, какие могут быть желательны для обеспечения воплощений изобретения.
Элементы для экспрессии полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена CPV преимущественно присутствуют в векторе изобретения. В минимальном порядке, они включают, состоят в основном из или состоят из инициирующего кодона (ATG), стоп-кодона и промотора, и, необязательно, также последовательности полиаденилирования для некоторых векторов, таких как плазмида и некоторых вирусных векторов, например, вирусных векторов, отличных от поксвирусов. Если полинуклеотид кодирует полибелковый фрагмент, например, пептид CPV, предпочтительно, в векторе, ATG помещают на 5' рамки считывания и стоп-кодон помещают на 3'. Могут присутствовать другие элементы для контроля экспрессии, такие как последовательности энхансера, стабилизирующие последовательности, такие как интрон, и сигнальные последовательности, позволяющие секретировать белки.
Настоящее изобретение также относится к препаратам, включающим векторы, такие как экспрессионные векторы, например, к терапевтическим композициям. Препараты могут включать один или несколько векторов, например, экспрессионные векторы экспрессии, такие как in vivo векторы экспрессии, включающие и экспрессирующие один или несколько полипептидов, антигенов, эпитопов или иммуногенов CPV. В одном из воплощений, вектор содержит и экспрессирует полинуклеотид, который включает, состоит в основном из или состоит из полинуклеотида, кодирующего (и предпочтительно экспрессирующего) антиген, эпитоп или иммуноген CPV, в фармацевтически или ветеринарно приемлемом носителе, наполнителе или разбавителе. Таким образом, в соответствии с воплощением изобретения, другие векторы или векторы в препарате включают, состоят в основном из или состоят из полинуклеотида, который кодирует, и в соответствующих условиях вектор экспрессирует один или несколько других белков полипептида CPV, его антигена, эпитопа или иммуногена или фрагмента.
В соответствии с еще одним воплощением вектор или векторы в препарате включают или состоят в основном из или состоят из полинуклеотида(полинуклеотидов), кодирующего(кодирующих) один или несколько белков полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена CPV или его фрагмента(фрагментов), вектора или векторов, экспрессирующих полинуклеотид(полинуклеотиды). В другом воплощении, препарат включает один, два или более векторов, включающих полинуклеотиды, кодирующие и экспрессирующие, предпочтительно in vivo, полипептид, антиген, слитый белок CPV или его эпитоп.
В соответствии с еще одним дополнительным воплощением изобретения, экспрессионный вектор представляет собой плазмидный вектор или ДНК-плазмидный вектор, в особенности вектор экспрессии in vivo. В конкретном, неограничивающем примере, плазмида pVR1020 или 1012 (VICAL Inc.; Luke et al., 1997; Hartikka et al., 1996, смотри, например, патенты США №№ 5,846,946 и 6,451,769) может быть применена в качестве вектора для вставки полинуклеотидной последовательности. Плазмиду pVR1020 получали из pVR1012, и она содержала сигнальную последовательность человеческого tPA. В одном из воплощений сигнальные человеческие tPA включают от аминокислоты M(1) до аминокислоты S(23) в Genbank под номером доступа HUMTPA14. В другом конкретном, неограничивающем примере плазмида, примененная в качестве вектора для вставки полинуклеотидной последовательности, может содержать последовательность сигнального пептида лошади IGF1 от аминокислоты M(24) до аминокислоты A(48) в Genbank под номером доступа U28070. Дополнительную информацию о ДНК-плазмидах, которые могут быть приняты во внимание или применены на практике, можно найти, например, в патентах США №№ 6,852,705; 6,818,628; 6,586,412; 6,576,243; 6,558,674; 6,464,984; 6,451,770; 6,376,473 и 6,221,362.
Термин плазмида охватывает любые единицы транскрипции ДНК, включающие полинуклеотид в соответствии с изобретением и элементы, необходимые для его экспрессии in vivo в клетке или в клетках желаемого хозяина или мишени; и, в этой связи, следует отметить, что суперспирализованая или не-суперспирализованая, кольцевая плазмида, также как и линейная форма, предназначены для включения в пределы объема изобретения.
Каждая плазмида включает или содержит или состоит в основном из, в дополнение к полинуклеотиду, кодирующему антиген, эпитоп или иммуноген CPV, необязательно слитому с последовательностью, варианта, аналога или фрагмента гетерологичного пептида, функционально связанного с промотором или под контролем промотора или в зависимости от промотора. В общем, целесообразно применять сильный промотор, функциональный в эукариотических клетках. Сильный промотор может представлять собой, но без ограничений, немедленно-ранний цитомегаловирусный промотор (CMV-IE) человеческого или мышиного происхождения или необязательно имеющий другое происхождение, такое как из крысы или морской свинки, суперпромотор (Super promoter) (Ni, M. et al., Plant J. 7, 661-676, 1995). Промотор CMV-IE может включать фактическую промоторную часть, которая может быть связана или может быть не связана с энхансерной частью. Отсылка может быть сделана к EP-A-260 148, EP-A-323 597, патентам США №№ 5,1 68,062, 5,385,839, и 4,968,615, а также к заявке PCT № WO87/03905. Промотор CMV-IE предпочтительно представляет собой человеческий CMV-IE (Boshart et al., 1985) или мышиный CMV-IE.
В более общих терминах, промотор бывает вирусного, растительного или клеточного происхождения. Сильный вирусный промотор, отличный от CMV-IE, который может быть с пользой применен в практике изобретения, представляет собой ранний/поздний промотор вируса SV40 или промотор LTR вируса Rous sarcoma. Сильный клеточный промотор, который может быть с пользой применен в практике изобретения, представляет собой промотор гена цитоскелета, такой как, например, десминовый промотор (Kwissa et al., 2000) или актиновый промотор (Miyazaki et al., 1989).
Плазмиды могут включать другие элементы контроля экспрессии. Особенно выгодно включать стабилизирующую последовательность (стабилизирующие последовательности), например, последовательность(последовательности) интронов, например, интрон спиртовой дегидрогеназы кукурузы (Callis et al. Genes & Dev,1(10):1183-1200, Dec. 1987), первый интрон hCMV-IE (заявка PCT № WO1989/01036), интрон II гена кроличьего β-глобина (van Ooyen et al., 1979). В другом воплощении, плазмиды могут включать 3’ UTR. 3’ UTR может представлять собой, но без ограничений, 3’ UTR нопалинсинтазы (Nos) agrobacterium (Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence. Depicker, A. et al. J. Mol. Appl. Genet., 1982; Bevan, NAR, 1984, 12(22): 8711-8721).
Что касается сигналов полиаденилирования (полиA) для плазмидных и вирусных векторов, отличных от поксвирусов, могут быть применены сигналы поли(A) гена бычьего гормона роста (bGH) (смотри U.S. 5,122,458) или сигналы поли(A) гена кроличьего β-глобина или сигналы поли(A)вируса SV40.
Термин «клетка-хозяин» означает прокариотическую или эукариотическую клетку, которая была генетически изменена или может быть генетически изменена введением экзогенного полинуклеотида, такого как рекомбинантная плазмида или вектор. Когда речь идет о генетически измененной клетке, термин относится как к исходно измененной клетке, так и к ее потомству.
В одном из воплощений, рекомбинантный антиген CPV экспрессируют в клетках насекомых.
В конкретном воплощении, антиген CPV экспрессируют в клетках SF9.
Способы применения
В воплощении, объект изобретения, раскрытый в настоящем документе, направлен на способ вакцинации овец, коров, коз или свиней, включающий введение овце, корове, козе или свинье эффективного количества вакцины, которая может включать эффективное количество рекомбинантного антигена CPV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.
В одном из воплощений настоящего изобретения, способ включает однократное введение композиции вакцины, составленной в виде эмульсии в соответствии с изобретением. Например, в одном из воплощений, иммунологическая или вакцинная композиция включает бакуловирус-экспрессированные антигены CPV, включая полипептиды и VLP (вирусоподобные частицы) или пустые капсиды. По данным электронной микроскопии клетки насекомых, трансформированные бакуловирусными экспрессионными векторами, продуцируют VLP CPV или свободные капсиды CPV, и, таким образом, иммунологическая или вакцинная композиция в соответствии с настоящим изобретением охватывает иммунологическую или вакцинную композицию, включающую VLP CPV или пустые капсиды CPV.
В воплощении, объекты изобретения, раскрытые в настоящем документе, направлены на способ вакцинации овец, коров, коз или свиней, включающий введение овце, корове, козе или свинье антигена CPV, полученного с помощью бакуловирусного вектора в клетках насекомых.
В воплощении, объект изобретения, раскрытый в настоящем документе, направлен на способ вызова иммунного ответа, включающий введение овце, корове, козе или свинье вакцины, включающей антиген CPV, полученный с помощью бакуловирусного вектора в клетках насекомых.
В воплощении, объект изобретения, раскрытый в настоящем документе, направлен на способ получения вакцины или композиции, включающей изолированный антиген CPV, полученный с помощью бакуловирусного вектора в клетках насекомых, и необязательно комбинирования с фармацевтически или ветеринарно приемлемым носителем, наполнителем или разбавителем.
Как гомологичные, так и гетерологичные штаммы CPV применяют для заражения при проверке эффективности вакцины. Введение может быть подкожным или внутримышечным. Введение может быть безыгольным (например, Bioject).
В одном из воплощений изобретения, может быть применен режим прайм-буст, который включает, по меньшей мере, одно примирующее введение и, по меньшей мере, одно стимулирующее введение, с использованием, по меньшей мере, одного общего полипептида, антигена, эпитопа или иммуногена. Как правило, иммунологическая композиция или вакцина, примененная в примирующем введении, отличается по своей природе от примененной в качестве стимулирующей. Однако следует отметить, что та же самая композиция может быть применена в качестве примирующего введения и стимулирующего введения. Данный протокол введения называют «прайм-буст».
Прайм-буст в соответствии с настоящим изобретением может включать рекомбинантный вирусный вектор, применяемый для экспрессии кодирующей последовательности CPV или ее фрагментов, кодирующих антигенный полипептид или его фрагмент или вариант. Конкретно, вирусный вектор может экспрессировать ген CPV или его фрагмент, который кодирует антигенный полипептид. Вирусный вектор, предусмотренный настоящим документом, включает, но без ограничений, поксвирус [например, вирус осповакцины или ослабленный вирус осповакцины, вирус птичьей оспы или ослабленный вирус птичьей оспы (например, оспы канареек, оспы-дифтерита птиц, оспы горлиц, оспы голубей, перепелиной оспы, ALVAC, TROVAC; смотри, например, US 5,505,941, US 5,494,8070), вирус оспы енотов, вирус оспы свиней и т.п., аденовирус (например, человеческий аденовирус, собачий аденовирус), вирус герпеса (например, собачий вирус герпеса, вирус герпеса индеек, вирус болезни Марека, вирус инфекционного ларинготрахеита, вирус герпеса кошачьих, вирус ларинготрахеита (ILTV), вирус бычьего герпеса, вирус герпеса свиней), бакуловирус, ретровирус и т.п. В другом воплощении, вектор экспрессии на основе вируса птичьей оспы может представлять собой вектор на основе вируса оспы канареек, такой как, ALVAC. Еще в одном воплощении, вектор экспрессии на основе вируса птичьей оспы может представлять собой вектор на основе вируса оспы-дифтерита птиц, такой как, TROVAC. Антиген CPV изобретения, который нужно экспрессировать, вставляют под контролем специфического поксвирусного промотора, например, промотора энтомопоксвируса Amsacta moorei 42K (Barcena, Lorenzo et al. 2000), промотора вируса осповакцины 7,5 кДа (Cochran et al., 1985), промотора вируса осповакцины I3L (Riviere et al., 1992), промотора вируса осповакцины HA (Shida, 1986), промотора вируса коровьей оспы ATI (Funahashi et al., 1988), промотора вируса осповакцины H6 (Taylor et al., 1988b; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989), inter alia.
В другом аспекте прайм-буст протокола изобретения, композицию, включающую антиген CPV изобретения, вводят с последующим введением вакцины или композиции, включающей рекомбинантный вирусный вектор, который содержит и экспрессирует антиген CPV in vivo, или инактивированной вирусной вакцины или композиции, включающей антиген CPV или ДНК-плазмидную вакцину или композицию, которая содержит или экспрессирует антиген CPV. Аналогично, прайм-буст протокол может включать введение вакцины или композиции, включающей рекомбинантный вирусный вектор, который содержит и экспрессирует антиген CPV in vivo или инактивированную вирусную вакцину или композицию, включающую антиген CPV или ДНК-плазмидную вакцину или композицию, которая содержит или экспрессирует антиген CPV, с последующим введением композиции, включающей антиген CPV изобретения. Кроме того, следует отметить, что как примирующее, так и повторное введение может включать композицию, включающую антиген CPV изобретения.
Прайм-буст протокол включает, по меньшей мере, одно прайм-введение и, по меньшей мере, одно буст-введение с применением, по меньшей мере, одного общего полипептида и/или его вариантов или фрагментов. Вакцина, примененная в прайм-введение, может быть отличается по своей природе от тех, которые применяют в качестве второй стимулирующей вакцины. Прайм-введение может включать одно или несколько введений. По аналогии, буст-введение может включать одно или несколько введений.
Объем дозы композиций для целевых видов, которые представляют собой млекопитающих, основанных на вирусных векторах, например, композициях, основанных на не-поксвирус-вирусных-векторах, равен, в общем, примерно от 0,1 до примерно 5,0 мл, примерно от 0,1 до примерно 3,0 мл, и примерно от 0,5 мл до примерно 2,5 мл.
Эффективность вакцин может быть протестирована через примерно 2-4 недели после последней иммунизации путем заражения животных, таких как кошки или собаки, вирулентным штаммом CPV.
Дополнительную информацию о данных штаммах CPV можно обнаружить на веб-страницах сайта European Bioinformatics Information (EMBL-EBI), и все связанные нуклеотидные последовательности включены в настоящем документе путем отсылки. Авторы изобретения предполагают, что все штаммы CPV, как перечисленные в настоящем документе, так и те, которые еще должны быть определены, могут быть экспрессированы в соответствии с идеями настоящего раскрытия для получения, например, эффективных композиций вакцины. Как гомологичные, так и гетерологичные штаммы применяют для заражения для тестирования эффективности вакцин. Животное может быть заражено внутрикожно, подкожно, с помощью спрея, внутриносовым, внутриглазным, внутритрахеальным путем и/или перорально.
Прайм-буст введения могут быть предпочтительно осуществлены с разницей в 1-6 недель, например, примерно с разницей в 4 недели. В соответствии с одним из воплощений, стимулирование раз в полгода или ежегодное стимулирование, предпочтительно, с применением вирусной основанной на векторе вакцины, также предусматривается. Животные предпочтительно должны быть в возрасте, по меньшей мере, от 6 до 8 недель во время первого введения.
Композиции, включающие рекомбинантные антигенные полипептиды изобретения, примененные в прайм-буст протоколах, были безадъювантными, и могли, необязательно, содержаться в фармацевтически или ветеринарно приемлемом носителе, разбавителе или наполнителе. Протоколы изобретения защищают животное от CPV и/или предупреждают прогрессирование заболевания в инфицированном животном.
Специалисту в данной области техники должно быть понято, что раскрытие в настоящем документе обеспечивают путем примеров, и настоящее изобретение не ограничивается ими. Из раскрытия в настоящем документе и знаний в данной области техники, квалифицированный специалист может определить число введений, путь введения и дозы, которые будут применять для каждого протокола инъекции, без какого-либо неоправданного экспериментирования.
Настоящее изобретение предусматривает, по меньшей мере, одно введение животному эффективного количества терапевтической композиции, сделанной в соответствии с изобретением. Животное может представлять собой самца, самку, беременную самку и новорожденного. Данное введение может быть произведено различными путями, включая, но без ограничений, внутримышечную (IM), внутрикожную (ID) или подкожную (SC) инъекцию или путем интраназального или перорального введения. Терапевтическая композиция в соответствии с изобретение также может быть введена с помощью безыгольных устройств (как, например, с помощью Pigjet, Dermojet, Biojector, Avijet (Merial, GA, США), Vetjet или устройств Vitajet (Bioject, Oregon, США)). Другой подход к введению композиции плазмиды заключается в применении электропорации (смотри, например, Tollefsen et al., 2002; Tollefsen et al., 2003; Babiuk et al., 2002; заявка PCT № WO99/01158). В другом воплощении, терапевтическую композицию доставляют животному с помощью генной пушки или бомбардировки частицами золота.
В одном из воплощений, изобретение обеспечивает введение терапевтически эффективного количества композиции для доставки и экспрессии антигена или эпитопа CPV в клетку-мишень. Определение терапевтически эффективного количества представляет собой рутинную экспериментальную процедуру для обычного специалиста в данной области техники. В одном из воплощений, композиция включает вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, которая экспрессирует антиген или эпитоп CPV и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель. В другом воплощении, фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, разбавитель или наполнитель облегчает трансфекцию, или другие пути переноса полинуклеотидов в животное-хозяина и/или улучшает сохранность вектора или белка в хозяине.
В одном из воплощений, объект изобретения, раскрытый в настоящем документе, обеспечивает способ обнаружения для различения инфицированного и вакцинированного животного (DIVA).
В настоящем документе раскрыто, что применение вакцины или композиции настоящего изобретения позволяет обнаруживать инфекцию CPV у животного. В настоящем документе раскрыто, что применение вакцины или композиции настоящего изобретения позволяет обнаруживать инфекцию у животных путем различения между инфицированными и вакцинированными животными (DIVA).
Изделие
В воплощении, объект изобретения, раскрытый в настоящем документе, направлен на набор для выполнения способа вызова или индуцирования иммунного ответа, который может включать любые из рекомбинантных иммунологических композиций или вакцин CPV или инактивированных иммунологических композиций или вакцин CPV, рекомбинантных вирусных композиций или вакцины CPV, и инструкции для осуществления данного способа.
Другое воплощение изобретения представляет собой набор для выполнения способа индуцирования иммунологического или защитного ответа против CPV у животного, включающий композицию или вакцину, включающие антиген CPV изобретения, и вирусную иммунологическую композицию или вакцину рекомбинантного CPV, и инструкции для выполнения способа доставки в эффективном количестве для вызова иммунного ответа у животного.
Другое воплощение изобретения представляет собой набор для выполнения способа индуцирования иммунологического или защитного ответа против CPV у животного, включающий композицию или вакцину, включающие антиген CPV изобретения и иммунологическую композицию или вакцину инактивированного CPV, и инструкции для выполнения способа доставки в эффективном количестве для вызывания иммунный ответ у животного.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к набору для прайм-буст вакцинации в соответствии с настоящим изобретением, как описано выше. Набор может включать, по меньшей мере, два флакона: первый флакон, содержащий вакцину или композицию для прайм-вакцинации в соответствии с настоящим изобретением, и второй флакон, содержащий вакцину или композицию для буст-вакцинации в соответствии с настоящим изобретением. Набор может предпочтительно содержать дополнительные первый или второй флаконы для дополнительных прайм-вакцинаций или дополнительных буст-вакцинаций.
Следующие воплощения охвачены изобретением. В воплощении раскрыта композиция, включающая антиген CPV или его фрагмент или вариант и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель. В другом воплощении раскрыта описанная выше композиция, в которой антиген CPV или его фрагмент или вариант включает иммуногенный фрагмент, включающий, по меньшей мере, 15 аминокислот антигена CPV. В воплощении раскрыты описанные выше композиции, в которых антиген CPV или его фрагмент или вариант частично очищены. В воплощении раскрыты описанные выше композиции, в которых антиген CPV или его фрагмент или вариант существенно очищены.
В воплощении раскрыты описанные выше композиции, в которых антиген CPV или его фрагмент или вариант представляет собой полипептид CPV. В воплощении раскрыты описанные выше композиции, в которых полипептид CPV представляет собой капсидный белок или его фрагмент. В воплощении раскрыты описанные выше композиции, в которых антиген CPV или его фрагмент или вариант имеет, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности с последовательностью, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10. В одном из воплощений раскрыты описанные выше композиции, в которых антиген CPV кодируется полинуклеотидом, имеющим, по меньшей мере, 70% идентичности последовательности с последовательностью, как указана в SEQ ID NO: 2, 5, 7, 11 или 12. В другом воплощении раскрыт способ вакцинации животного, восприимчивого к CPV, включающие введение композиции вышеуказанному животному. В воплощении раскрыт способ вакцинации животного, восприимчивого к CPV, включающий прайм-буст режим. В воплощении раскрыт существенно очищенный антигенный полипептид, экспрессированный в клетках насекомых, в котором полипептид включает: аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 80% идентичности последовательности с полипептидом, имеющим последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10. В любом воплощении животное предпочтительно представляет собой кошку или собаку. В одном из воплощений раскрыт способ диагностики инфекции CPV у животного. Еще в одном воплощении раскрыт набор для прайм-буст вакцинации, включающий, по меньшей мере, два флакона, в котором первый флакон содержит композицию настоящего изобретения, и второй флакон содержит композицию для буст-вакцинация, включающий композицию, включающую рекомбинантный вирусный вектор, или композицию, включающую инактивированную вирусную композицию или ДНК-плазмидную композицию, которая содержит или экспрессирует антиген CPV.
Фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители или разбавители или наполнители хорошо известны специалисту в данной области техники. Например, фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель или разбавитель или наполнитель может представлять собой раствор 0,9% NaCl (например, солевой раствор) или фосфатный буфер. Другой фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель или разбавитель или наполнители, которые могут быть применены для способов данного изобретения включают, без ограничений, поли-(L-глутамат) или поливинилпирролидон. Фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель или разбавитель или наполнители могут представлять собой любое соединение или комбинацию соединений, облегчающих введение вектора (или белка, экспрессированного из вектора изобретения in vitro); предпочтительно, носитель, разбавитель или наполнитель может облегчить трансфекцию и/или улучшить сохранение вектора (или белка). Дозы и объемы доз в настоящем документе обсуждаются в общем описании и также могут быть определены квалифицированным специалистом из этого раскрытия, прочитанного в сочетании со знаниями в данной области техники, без любого неоправданного экспериментирования.
Катионные липиды, содержащие соль четвертичного аммония, которые предпочтительно, но не исключительно, подходят для плазмиды, предпочтительно представляют собой липиды, имеющие следующую формулу:
1
2
в которой R представляет собой насыщенный или ненасыщенный неразветвленный алифатический радикал, имеющий от 12 до 18 атомов углерода, R представляет собой другой алифатический радикал, содержащий 2 или 3 атома углерода, и X представляет собой аминную или гидроксильную группу, например, DMRIE. В другом воплощении катионный липид может быть связан с нейтральным липидом, например, DOPE.
Среди данных катионных липидов, предпочтение отдают DMRIE (N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметил-2,3-бис(тетрадецикло)-1-пропан аммония; WO96/34109), предпочтительно связанному с нейтральным липидом, предпочтительно, с DOPE (диолеоил-фосфатидилэтаноламин; Behr, 1994), с образованием DMRIE-DOPE.
Предпочтительно, плазмиду, смешанную с адъювантом, формируют для немедленного приема и предпочтительно одновременно с введением препарата или незадолго до введения препарата; например, незадолго до введения или перед введением формируют смесь плазмида-адъювант, предпочтительно чтобы дать достаточно времени перед введением для того, чтобы смесь образовала комплекс, например, между примерно 10 и примерно 60 минутами перед введением, например, приблизительно, за 30 минут до введения.
Если присутствует DOPE, то молярное отношение DMRIE:DOPE равно предпочтительно от примерно 95: примерно 5 до примерно 5: примерно 95, более предпочтительно, примерно 1: примерно 1, например, 1:1.
Массовое соотношение DMRIE или DMRIE-DOPE адъювант:плазмида может быть между примерно 50: примерно 1 и примерно 1: примерно 10, такое как, примерно 10: примерно 1 и примерно 1: примерно 5, и примерно 1: примерно 1 и примерно 1: примерно 2, например, 1:1 и 1:2.
В другом воплощении, фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель, адъювант или разбавитель может представлять собой эмульсию вода-в-масле. Примеры подходящих эмульсий вода-в-масле включают вакцинные эмульсии на масляной основе вода-в-масле, которые стабильны и текучи при 4°C, содержащие: от 6 до 50% (объем/объем) , предпочтительно от 12 до 25% водной фазы, содержащей антиген (объем/объем), от 50 до 94% (объем/объем) масляной фазы, содержащей полностью или частично неметаболизируемое масло (например, минеральное масло, такое как парафиновое масло) и/или метаболизируемое масло (например, растительное масло или жирную кислоту, сложные эфиры полиолов или спиртов), от 0,2 до 20 p/v% поверхностно-активных веществ, предпочтительно, от 3 до 8 p/v%, последний в целом или частично или в смеси или с сложными эфирами полиглицерина, указанными полиглицерин сложными эфирами, предпочтительно представляющими собой (поли)рицинолеаты полиглицерина или полиоксиэтиленовые масла рицина или еще гидрогенизованные полиоксиэтиленовые масла рицина. Примеры поверхностно-активных веществ, которые могут быть применены в эмульсии вода-в-масле, включают сложные эфиры этоксилированного сорбитана (например, полиоксиэтилена (20) сорбитанмоноолеат (TWEEN 80), доступный от компании AppliChem, Inc., Cheshire, CT) и сложные эфиры сорбитана (например, сорбитанмоноолеат (SPAN 80), доступный о от компании Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Кроме того, в отношении эмульсии вода-в-масле, смотри также патент США № 6,919,084, например, пример 8 в нем, включенный в настоящем документе путем отсылки. В некоторых воплощениях, содержащая антиген водная фаза включает солевой раствор, включающий один или несколько буферных агентов. Фосфатный буферный солевой раствор представляет собой пример подходящего буферного раствора. В предпочтительном воплощении, эмульсия вода-в-масле может представлять собой тройную эмульсию вода/масло/вода (W/O/W) (патент США № 6,358,500). Примеры других подходящих эмульсий описаны в патенте США № 7,371,395.
Иммунологические композиции и вакцины в соответствии с изобретение могут включать или состоят в основном из одного или нескольких адъювантов. Подходящие адъюванты для применения в практике настоящего изобретения представляют собой (1) полимеры акриловой или метакриловой кислоты, малеинового ангидрида и алкенильные производные полимеров, (2) иммуностимулирующие последовательности (ISS), такие как олигодезоксирибонуклеотидные последовательности, имеющие один или несколько неметилированных CpG-единиц (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) эмульсию масло в воде, такую как эмульсия SPT, описанная на странице 147 руководства «Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”, опубликованного M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995, и эмульсия MF59, описанная на странице 183 той же работы, (4) катионные липиды, содержащие соль четвертичного аммония, например, DDA (5) цитокины, (6) гидроксид алюминия или фосфат алюминия, (7) сапонин или (8) другие адъюванты, обсуждаемые в любом из процитированных документах и включенных путем отсылки в настоящую заявку или (9) любые их комбинации или смеси.
Эмульсия масло-в-воде (3), которая особенно подходит для вирусных векторов, может быть на основе: легкое жидкое парафиновое масло (типа из Европейской фармакопеи), изопреноидное масло, такое как сквалан, сквален, масло, полученное в результате олигомеризации алкенов, например, изобутен или децен, сложные эфиры кислот или спиртов, имеющие неразветвленную алкильную группу, такие как растительные масла, этилолеат, пропиленгликоль, ди(каприлат/капрат), глицерина три(каприлат/капрат) и пропиленгликоля диолеат или сложные эфиры разветвленных жирных спиртов или кислот, особенно, сложные эфиры изостеариновой кислоты.
Масло применяют в комбинации с эмульгаторами для образования эмульсии. Эмульгаторы могут представлять собой неионные поверхностно-активные вещества, такие как: сложные эфиры, с одной стороны, сорбита, маннита (например, ангидроманитололеат), глицерина, полиглицерина или пропиленгликоля, и, с другой стороны, олеиновой, изостеариновой, рицинолевой или гидроксистеариновой кислот, указанные сложные эфиры необязательно бывают этоксилированными или представляют собой блоки сополимеров полиоксипропилен-полиоксиэтилен, такие как Pluronic, например, L121.
Среди типа (1) адъювантных полимеров, предпочтение отдают полимерам сшитых акриловой или метакриловой кислоты, особенно, сшитых посредством полиалкениловых простых эфиров сахаров или полиспиртов. Данные соединения известны под названием карбомер (Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996). Специалист в данной области техники также может обратиться к патенту США № 2,909,462, который обеспечивает такие акриловые полимеры, сшитые с помощью полигидроксильного соединения, имеющего, по меньшей мере, три гидроксильные группы, предпочтительно, не более восьми таких групп, атомы водорода, по меньшей мере, трех гидроксильных групп замененные ненасыщенными, алифатическими радикалами, имеющими, по меньшей мере, два атома углерода. Предпочтительны те радикалы, которые содержат от 2 до 4 атомов углерода, например, винилы, аллилы и другие этиленовые ненасыщенные группы. Ненасыщенные радикалы также могут содержать другие заместители, такие как метил. Особенно подходят продукты, продаваемые под названием Carbopol (BF Goodrich, Ohio, США). Они сшиты с помощью аллилсахарозы или аллилпентаэритрита. Среди них делают отсылку на Carbopol 974P, 934P и 971P.
Что касается сополимеров малеинового ангидрида-алкенильного производного, то предпочтение отдают EMA (Monsanto), которые представляют собой неразветвленные или сшитые сополимеры этилена-малеинового ангидрида, и они, например, сшиты с помощью дивинилового эфира. Отсылку также можно сделать на J. Fields et al., 1960.
Что касается структуры, то полимеры акриловой или метакриловой кислоты и EMA предпочтительно формируются основными единицами, имеющими следующую формулу:
1
2
3
в которой: R и R, которые может быть одинаковыми или разными, представляют собой H или CH; x = 0 или 1, предпочтительно x = 1; y = 1 или 2, с x + y = 2.
Для EMA, x = 0 и y = 2 и для карбомеров x = y = 1.
Данные полимеры растворимы в воде или физиологическом солевом растворе (20 г/л NaCl), и pH может быть доведен до от 7,3 до 7,4, например, содой (NaOH), для обеспечения раствора адъюванта, в котором вектор(вектора) экспрессии может(могут) быть включены. Концентрация полимера в конечной иммунологической или вакцинной композиции может изменяться от примерно 0,01 до примерно 1,5% масс./объем, от примерно 0,05 до примерно 1% масс./объем, и от примерно 0,1 до примерно 0,4% масс./объем.
Цитокин или цитокины (5) могут быть в белковой форме в иммунологической или вакцинной композиции или могут быть совместно экспрессированы в хозяине с иммуногеном или иммуногенами или его(их) эпитоп(эпитопами). Предпочтение отдают совместной экспрессии цитокина или цитокинов, либо тем же вектором, который экспрессирует иммуноген или иммуногены или его(их) эпитоп(эпитопы) или отдельным вектором для него.
Изобретение охватывает получение таких комбинаций композиций; например, путем смешивания активных компонентов, предпочтительно, вместе и с носителем, цитокином и/или разбавителем.
Цитокины, которые могут быть применены в настоящем изобретении, включают, без ограничений, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарный/макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), интерферон α (IFNα), интерферон β (IFNβ), интерферон γ, (IFNγ), интерлейкин-1α (IL-1α), интерлейкин-1β (IL-1β), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкин-3 (IL-3), интерлейкин-4 (IL-4), интерлейкин-5 (IL-5), интерлейкин-6 (IL-6), интерлейкин-7 (IL-7), интерлейкин-8 (IL-8), интерлейкин-9 (IL-9), интерлейкин-10 (IL-10), интерлейкин-11 (IL-11), интерлейкин-12 (IL-12), фактор некроза опухолей α (TNFα), фактор некроза опухолей β (TNFβ), полиинозиновую кислоту и поли цитидиловую кислоту, цитидин-фосфат-гуанозин олигодезоксинуклеотиды (CpG ODN) и трансформирующий фактор роста β (TGFβ). Понятно, что цитокины могут быть введены совместно и/или введены последовательно с иммунологической или вакцинной композицией настоящего изобретения. Таким образом, например, вакцина настоящего изобретения также может содержать экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая экспрессирует in vivo подходящий цитокин, например, цитокин, соответствующий данному хозяину, которого предстоит вакцинировать или, в котором должен быть вызван иммунологический ответ (например, бычий цитокин для препаратов для введения коровам).
2
20
3
20
4
20
В случае иммунологической композиции и/или вакцины, основанной на полипептидах, экспрессированных в системе бакуловирус/клетки насекомых, доза может включать, от примерно 1 мкг до примерно 2000 мкг, от примерно 50 мкг до примерно 1000 мкг, и от примерно 100 мкг до примерно 500 мкг антигена, эпитопа или иммуногена CPV. Доза может включать от примерно 10 до примерно 10 VLPs, от примерно 10 до примерно 10, от примерно 10 до примерно 10. Объемы доз могут быть между примерно 0,1 и примерно 10 мл, между примерно 0,2 и примерно 5 мл. В общем, специалист знает много стратегий дозирования, и сможет оптимизировать дозирование без осуществления немаршрутизируемой работы.
В одном из аспектов, изобретение обеспечивает комбинированную вакцину, включающую компонент вирусоподобной частицы (VLP) и компонент модифицированного живого вируса (MLV), в которой как VLP, так и MLV направлены против одного и того же патогена или заболевания, и в которой комбинированная вакцина преодолевает действие материнских антител (MDA).
В некоторых воплощениях, комбинированная вакцина обеспечивает защитный иммунитет при однократном приеме.
В некоторых воплощениях, патоген или заболевание представляет собой собачий парвовирус (CPV).
В некоторых воплощениях, патоген или заболевание представляет собой вирус ящура (FMDV).
В некоторых воплощениях, компонент VLP комбинации включает, по меньшей мере, по меньшей мере, 10% VLPs CPV (масс./масс.) как функцию от общего содержания белка.
В некоторых воплощениях, компонент VLP включает, по меньшей мере, 20% VLPs CPV (масс./масс.).
В некоторых воплощениях, VLP CPV экспрессируется с помощью бакуловирусного вектора в клетках насекомых.
В некоторых воплощениях, VLP CPV включает, по меньшей мере, один CPV капсидный белок.
В некоторых воплощениях, VLP CPV включает полипептид CPV, имеющий последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 9 или 10; или, VLP CPV включает полипептид CPV, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности последовательности, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6, 8, 9 или 10.
В некоторых воплощениях, VLP CPV включает полипептид CPV, кодируемый полинуклеотидом, имеющим последовательность, как указана в SEQ ID NO: 2, 5 или 7; или, VLP CPV включает полипептид CPV, кодируемый полинуклеотидом, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности с последовательностью, как указана в SEQ ID NO: 2, 5 или 7.
В некоторых воплощениях, комбинированная вакцина безадъювантна и необязательно включает фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель.
В другом аспекте, изобретение обеспечивает плазмиду, полезную для получения VLP CPV, включающую полинуклеотид, кодирующий антиген CPV, имеющий последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10, или полинуклеотидную последовательность, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичности с последовательностью, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10.
В некоторых воплощениях, полинуклеотид включает последовательность или состоит из последовательности, как указана в SEQ ID NO: 2, 5, 7, 11 или 12.
В некоторых воплощениях, плазмида состоит из последовательности, как указана в SEQ ID NO:11 или 12.
В некоторых воплощениях, плазмида стабильно трансформирована в клетку насекомых, которая экспрессирует VLPs CPV.
В другом аспекте, изобретение обеспечивает существенно очищенный пустой капсид CPV или VLP CPV, экспрессированную в клетках насекомых, в которой пустая капсида CPV или VLP включает полипептид, имеющий последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10; или, пустая капсида CPV или VLP включает полипептид, имеющий, по меньшей мере, 90% идентичности с последовательностью, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10.
В некоторых воплощениях, пустая капсида CPV или VLP состоит из полипептида, имеющего последовательность, как указана в SEQ ID NO: 1, 3, 4, 6 или 8-10.
В другом аспекте, изобретение обеспечивает способ вызова иммунного ответа против CPV у животного, включающий введение животному композиции, вакцины, комбинации вакцины и VLP, раскрытых в настоящем документе.
В некоторых воплощениях, иммунный ответ защищает вакцинированных от последующего воздействия вирулентным CPV. Воздействие может быть природным или экспериментальным.
В некоторых воплощениях, иммунный ответ вызывают у вакцинированных животных вне зависимости от присутствия у указанных животных высоких уровней материнских антител (MDA) против CPV. Термин «высокие уровни» имеет обычное значение, и, в общем, относится к уровням MDA, которые препятствуют способности вакцин предшествующего уровня техники вызывать сильный защитный ответ у MDA-позитивных животных.
Изобретение теперь будет дополнительно описано с помощью следующих неограничивающих примеров.
Примеры
Если не указано иное, конструирование ДНК-вставок, плазмид и рекомбинантных вирусных или бакуловирусных векторов осуществляли с применением стандартных молекулярно-биологических методик, описанных в руководстве J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989).
Пример 1. Конструкция и экспрессия антигенов капсиды CPV в системе бакуловирус/клетки насекомых
Задача: Генерировать основанную на pVL1393 плазмиду для переноса, кодирующую капсидный белок CPV (собачий парвовирус, серотип 2c штамма Souriou), оптимизированную для клеток насекомых, и генерировать рекомбинантный бакуловирус BacMEB072 для экспрессии вирусоподобных частиц (VLP). Референсная последовательность представляла собой штамм Souriou 2c (Merial), имеющий обозначение в Genbank BAD34656 / Swissprot P61826 (SEQ ID NO: 1).
Ген капсиды CPV (1755 bp) кодирует полипептид из 584 аминокислот (не содержащий сигнальный пептид). Последовательность, кодирующую белок CPV VP2 (SEQ ID NO: 1) клонировали, и оптимизировали кодоны соответствующей последовательности ДНК (SEQ ID NO: 5) для клеток насекомых. Потенциальные функциональные домены показаны в приведенной ниже таблице 1.
Таблица 1. Потенциальные функциональные домены были следующими
(в соответствии с обозначением по Swiss-prot на P61826)
Предполагаемые домены
от до (или положение)
Длина
Сигнальная последовательность
Нет
зрелая цепь VP2
1-584
584
N-гликозилирование
25-47-64-180-443-505-517
сайты N-гликозилирования
490-494
Генерация плазмиды pMEB072. Капсид CPV, оптимизированный для экспрессии в клетках насекомых (SEQ ID NO: 1), клонировали в коммерческую плазмиду pVL1393 (Pharmingen) с применением сайтов XbaI и Bam HI обоих вектора и вставки для генерации экспрессионной плазмиды pMEB072.
Генерация рекомбинантного бакуловируса BacMEB072. Примененный бакуловирусный вектор представлял собой AcNPV, модифицированный летальной делецией, которая нейтрализуется только через гомологичную рекомбинацию (BaculoGold DNA, Pharmingen). Плазмиду pMEB072 применяли для генерации рекомбинантного бакуловируса, кодирующего ген капсида CPV штамма Souriou серотип 2c под контролем полиэдринового промотора, путем гомологичной рекомбинации. Клетки насекомых Spodoptera frugiperda (Sf) 9 были совместно трансфицированы плазмидой pMEB072, и Bsu36I линеаризованную AcNPV ДНК с тройным разрывом, в соответствии с протоколом производителя (Baculogold, Pharmingen). Рекомбинантный бакуловирус из супернатанта совместной транфекции был дважды очищен методом бляшек. Пять клонов были амплифицированы (посев 1) при 28°C в монослойном флаконе25 см². Инфицированные клетки и супернатанты анализировали на экспрессию капсида CPV с помощью дот-блот с применением моноклональных антител, специфичных к антигену капсида CPV (CPV103B10A). Клон 1 показал правильный профиль Dot Blot. Данный клон был дополнительно амплифицирован (посев 2) при 28°C в 50 мл в колбе Эрленмейера (суспензия) при 105 оборотов в минуту. Третий пересев (посев 3) проводили в 200 мл для получения основного вирусного материала, примененного для экспрессии белок. Данный основной вирусный материал затем титровали путем анализа бляшек. Основной вирусный материал получали, применяя среду SF900II, дополненную 2% FCS. После титрования рекомбинантный бакуловирусный материал (посев 3) применяли для продукции белка в свободной от сыворотки среде.
Анализ экспрессии бакуловирусного BacMEB072
Таблица 2
Плазмида
Размер (AA)
PM (кДа)
Сигнальный пептид
Таг
N-гликозилирование
Дисульфидный мостик
локализация
pMEB062
545
59,2
нет
нет
10 потенциальных сайтов
нет
секреция
Клетки насекомых (Sf9) инфицировали BacMEB072 в множественности заражения (MOI), равном 1 БОЕ/мл. Клетки насекомых растили при 105 оборотов в минуту в среде Sf900II без FCS в течение 4-х дней при 28°C. Продукцию белка анализировали путем представления целых лизатов Sf9 и культурального супернатанта на SDS-PAGE (4-20%, Invitrogen), с последующим дот-блотом с моноклональным антителом (CPV103B10A). Растворимость экспрессированных белков исследовали, лизируя клеточные осадки в лизирующем буфере (50 мМ Трис-HCl pH 8, 500 мМ NaCl + антипротеаза), озвучивали 3X (15 сек при 20% мощности, 30 сек ожидания, 15 сек при 20% мощности; 5 мин лизис на льду). Растворимые белки отделяли от нерастворимого материала центрифугированием (30 мин при 11000 центробежного ускорения при 4°C).
Полосу, ожидаемого размера, экспрессировали в осадке инфицированных клеток, лизированных и осветленных, как наблюдали по окрашиванию кумасси. Белок накапливался в клетках, но его также обнаруживали в растворимой фракции после лизиса. Идентичность белка VP2 подтверждали с помощью дот-блота анализа, применяя специфическое моноклональное антитело против капсида CPV (CPV103B10A).
11
С помощью электронно-микроскопического (EM) анализа подтверждали правильную само-сборку капсидного белка в VLP, которые имели диаметр, равный 25-30 нм, и правильную морфологию парвовирус-подобных вирионов (фиг. 4). Оптимальные условия для продукции VLP заключались в применении MOI=0,1 и сборе клеток на 5-ый день после заражения. Хотя другие условия были предусмотрены, данные конкретные условия давали концентрацию, равную примерно 10 VLP на мл.
Пример 2. Продукция BacMEB073, содержащего укороченный VP2 CPV
Целью работы была генерация основанной на pVL1393 плазмиды для переноса, кодирующей укороченный капсидный белок VP2 CPV (собачий парвовирус, серотип 2c штамма Souriou), оптимизированной для млекопитающих, и затем генерировать соответствующий рекомбинантный бакуловирус BacMEB073, экспрессирующий VLP. 9 N-концевых аминокислот (-9AA) удаляли в целях повышения экспрессии VP2 без предотвращения образования VLP (Hurtado et al. Journal of Virology, August 1996). Кроме того, добавляли три аминокислоты (M, L и K) в целях улучшения структуры и формирования капсида (Gilbert et al., Journal of Nanobiotechnology, 2006). До этого раскрытия, было неизвестно, какое влияние оказывает введение как делеции, так и вставки на экспрессию VP2 CPV и последующее образование капсида.
Укороченный (делеция 9 аминокислот на N-конце, замещенных дополнительными MLK) и оптимизированный для млекопитающих (Geneart) ген VP2 был дополнительно клонирован в плазмиде pVL1393 с применением сайтов Bam HI и Xba I как вектора, так и вставки.
Генерация бакуловирусного вектора и экспрессия белка. Бакуловирусный вектор: AcNPV, модифицированный летальной делецией, которая нейтрализуется только через гомологичную рекомбинацию (BaculoGold DNA, Pharmingen).
Генерация рекомбинантного бакуловируса BacMEB073. Плазмиду pMEB073 применяли для генерации рекомбинантного бакуловируса, кодирующего укороченный ген капсиды CPV, серотип 2c штамма Souriou, под контролем полиэдринового промотора, путем гомологичной рекомбинации. Клетки насекомых Spodoptera frugiperda (Sf) 9 были совместно трансфицированы плазмидой pMEB073 и Bsu36I, линеаризованной AcNPV ДНК с тройным разрезом, в соответствии с протоколом производителя (Baculogold, Pharmingen). Рекомбинантный бакуловирус из супернатанта совместной трансфекции был дважды очищен способом бляшкообразования. Пять клонов амплифицировали (посев 1) при 28°C в 25 см² в монослое во флаконе. Инфицированные клетки и супернатанты анализировали на экспрессию капсида CPV способом дот-блот, применяя моноклональные антитела, специфические к антигену капсида CPV (CPV103B10A). Клон 1 показал правильный профиль дот-блота. Данный клон дополнительно амплифицировали (посев 2) при 28°C в 50 мл колбе Эрленмейера (суспензия) при 105 оборотов в минуту. Третий посев (посев 3) в 200 мл проводили для получения основного вирусного материала, примененного для экспрессии белка. Данный основной вирусный материал затем титровали, анализируя бляшкообразование. Основной вирусный материал получали, применяя среду SF900II, дополненную 2% FCS.
После титрования рекомбинантный основанный на бакуловирусе материал (посев 3) применяли для продукции белка в свободной от сыворотки среде.
Анализ экспрессии
Таблица 3. Ожидаемые рекомбинанты
Плазмида
Размер (AA)
PM (кДа)
сигнальный пептид
Сайт N-гликозилирования
Дисульфидный мостик
Субклеточная локализация
pMEB073
578
64,1
нет
11, 19, 40, 50, 58, 66, 72, 79, 80, 511
нет
секретируемый
Клетки насекомых (Sf9) инфицировали BacMEB073 при MOI = 1 БОЕ/мл. Клетки насекомых растили при 105 оборотов в минуту в среде Sf900II без FCS в течение 4 дней при 28°C. Продукцию белка анализировали путем нанесения целых лизатов Sf9 и культурального супернатанта на SDS-PAGE (4-20%, Invitrogen) с последующим дот-блотом с моноклональным антителом (CPV103B10A).
Растворимость экспрессированных белков исследовали, лизируя клеточные осадки в лизирующем буфере (50 мМ Трис-HСl pH 8, 500 мМ NaCl + антипротеаза), озвучивание 3X (15’’ при 20% мощности, 30’’ перерыв, 15’’ при 20% мощности, 5’ перерыв на льду). Растворимые белки отделяли от нерастворимого материала центрифугированием (30’ мин при 11 000 центробежного ускорения при 4°C).
Результаты и заключение. Полоса ожидаемого размера в 64 кДа экспрессируется в клеточном осадке инфицированных клеток, лизированных и осветленных, как видно по окрашиванию кумасси. Белок накапливался в клетках, но обнаруживался и в растворимой фракции после лизиса. Идентичность белка VP2 подтверждали с помощью дот-блот анализа, применяя специфическое к капсиду CPV mAb (CPV103B10A).
12
EM-анализ подтвердил самосборку капсидного белка в VLP с диаметром, равным 25-30 нм, а также правильную морфологию парвовирус-подобных вирионов при концентрации, равной 10VLP на мл (фиг. 4). Продукция VLP была оптимальной при MOI=0,1 при сборе через 5 дней после инфекции, хотя другие условия также давали высокие уровни VLP.
Пример 3. Вакцинация собак бакуловирус-экспрессированным капсидным белком CPV
Первая задача исследования заключалась в оценке и сравнении безопасности и иммуногенности 2 вирусоподобных частиц (VLP) CPV2 штамма Souriou у щенков (т.е. BacMEB072 и BacMEB073, которые были описаны в примерах 1 и 2). Вторая задача заключалась в оценке эффектов адъюванта гидроксида алюминия/сапонин или Iscomatrix на иммуногенность VLP, полученных с помощью BacMEB072 и BacMEB073. Восемь недельных щенков были вакцинированы и обследованы, как показано на таблице 4.
Таблица 4. Экспериментальный дизайн исследования укороченного VP2 VLP CPV против полноразмерного VP2 MLV CPV
Группа
Антиген:VLP CPV2
Адъювант
Вакцинация
Клинический мониторинг
Сыворотки
Цельная кровь(гепарин натрия)
A (n=6)
BacME073(укороченный)
Нет
D0 & D28 с помощью SC с 1 мл, содержавшем25 мкг активногоингредиента
D0, D0+4-6 ч, D1, D2D28, D28+4-6 ч, D29, D30
D-7, D0*, D7, D28, D35, D42, D70
D35, D42
B (n=6)
BacME073(укороченный)
Gel Al(OH)<sub>3</sub> (1,7 мг) +Сапонин (12 гемолитических единиц)
C (n=6)
BacME072(неукороченный)
Нет
D (n=6)
BacME072(неукороченный)
Gel Al(OH)<sub>3</sub>(1,7 мг) + Сапонин (12 гемолитических единиц)
E (n=6)
BacME072(неукороченный)
Iscomatrix(75 мкг)
F (n=5)
Контроль
Контроль
* перед вакцинацией
3
3
3
В терминах безопасности, Al(OH)/сапонин не индуцирует ни общих реакций, ни каких-либо других признаков за исключением местного нагревания и набухания. Умеренный отек наблюдали через 3-4 дня после каждой вакцинации у большинства собак. Iscomatrix оказался очень безопасным адъювантом. В терминах иммуногенности, вакцинация щенков CPV2 VLP была способна индуцировать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ без существенных различий между укороченным или полноразмерным VP2, связанным с VLP. Примечательно, что постоянство гуморального иммунного ответа увеличивалось, если VLP применяли с адъювантом, или с Al(OH)/сапонин, или с Iscomatrix, без каких-либо существенных различий между двумя исследованными адъювантами. Кроме того, адъювант Iscomatrix увеличивал магнитуду ответа IFN-гамма не только по сравнению с группой без адъюванта, но также по сравнению с группой Al(OH) и сапонина.
Пример 4. Вакцинация собак бакуловирус-экспрессированными VLP CPV или MLV CPV (штаммы Souriou или Bari)
3
3
Задача исследования заключалась в сравнении иммунного ответа у щенков, вакцинированных VLP CPV, Souriou MLV CPV или Bari MLV CPV. В первом эксперименте сравнивали 1,52 log10 TCID50/мл (IFI) Souriou; 1,0 log10 TCID50/мл (HA) Bari; и pMEB072 VLP (результаты на фиг. 8). Во втором эксперименте сравнивали 2,21 log10 TCID50/мл (IFI) Souriou; 2,0 log10 TCID50/мл (HA) Bari; и pMEB073-продуцированные VLP в адъюванте Al(OH) + сапонин (результаты на фиг. 9). Наконец, в третьем эксперименте сравнивали 3,81 log10 TCID50/мл (IFI) Souriou; 3,0 log10 TCID50/мл (HA) Bari; и pMEB072-продуцированные VLP в адъюванте Al(OH) + сапонин (результаты на фиг. 10). Вместе взятые, данные результаты показали, что VLP CPV, сделанный в соответствии с настоящим раскрытием, обеспечивает сопоставимый иммунный ответ по сравнению с типичным MLV CPV. Важно отметить, VLP были способны индуцировать более быстрый иммунный ответ по сравнению как с низкой, так и с промежуточной дозой любого штамма MLV.
Пример 5. Вакцинация собак MLV CPV или бакуловирус-экспрессированным капсидным белком CPV + MLV CPV
Задача исследования заключалась в оценки иммуногенности различных вакцин-кандидатов, введенных в различных дозах и подкожно щенкам с материнскими антителами. Перед данным исследованием не было известно, могут ли VLP CPV преодолевать действие материнских антител для индукции защитного иммунитета у щенков.
Таблица 5. Экспериментальный дизайн исследования VLP CPV против MLV CPV
Группа
Вакцина, введенная SC на день 0
Образец крови(6 мл /щенка)
Анализ
A
MLV CPV(n = 9)
CPV2 MLV5,5log10 (1 мл)
D0*, D7, D14, D21, D28, D34, D42, D56
Определение анти-CPV антител(Ингибирование гемагглютинациии/или ELISA)
B
VLP CPV + MLV CPV(n= 10)
VLP CPVЦелевая доза:500 мкг (1 мл)+ CPV2 MLV5,5log10 (1 мл)
Как показано на фиг. 11, фиг. 12 и в таблице 6, титры антител CPV были значительно выше в группе MLV + VLP. Эти данные указывают, что добавление VLP CPV к композиции вакцины было достаточно для преодоления материнских антител, что дает удивительный и неожиданный результат. Авторы изобретения предполагают, что VLP захватывают значительную долю циркулирующих MDA CPV, что, в свою очередь, позволяет VLP и MLV CPV активно иммунизировать щенков.
Таблица 6. Анти-CPV титры антител (IHA) в соответствии с днями после вакцинации
Группа
ID
0
7
14
21
MLV
2252826
10
<5
2560
320
MLV
2253001
10
<5
1280
<5
MLV
2284928
80
<5
<5
<5
MLV
2284973
80
20
<5
20
MLV
2284975
80
20
<5
10
MLV
2285160
<5
<5
<5
5
MLV
2285360
160
40
<5
20
MLV
2285367
40
<5
<5
20
MLV
2285387
10
5
<5
<5
MLV+VLP
2252827
80
640
1280
320
MLV+VLP
2252828
5
160
5120
2560
MLV+VLP
2284818
10
640
2560
2560
MLV+VLP
2284843
10
640
2560
1280
MLV+VLP
2284861
20
1280
1280
1280
MLV+VLP
2284935
40
640
1280
320
MLV+VLP
2284941
80
640
1280
640
MLV+VLP
2284943
20
320
1280
1280
MLV+VLP
2284978
40
1280
1280
1280
MLV+VLP
2285000
80
320
640
640

MLV: Модифицированная живая вакцина (PRIMODOG 5,5log10/мл)
VLP: вирусоподобная частица, 500 мкг
Пример 6. Вакцинация собак бакуловирус-экспрессированным капсидным белком CPV, MLV CPV или CDV на основе аденовирусного вектора
Задача исследования заключалась в оценке иммуногенности нескольких доз различных вакцин-кандидатов, введенных разными путями. Различные кандидаты представляли собой VLP CPV и рекомбинантные аденовирусы, экспрессировавшие или гены CPV, или гены CDV (чумка собак).
Таблица 7. Экспериментальный дизайн исследования VLP CPV против Адено-CPV и против адено-CDV
Группа
Вакцина введена на D0 и D28**Доза и путь
Взятые образцы
Анализы
A
VLP+_1(n=6)
VLP CPVВысокая доза(500 мкл основного раствора/доза)SC (1 мл)
Флаконы с кровью:D0, D7, D14, D21, D28, D35, D42, D56 и D63Флаконы с кровью с гепарином:D7, D31, D35, D56
Определение анти-CDV антител(ELISA и/или ингибирование гемагглютинации)
Клеточный и/или иммунный ответ B-клеток памяти
B
VLP+_2(n=6)
C
VLP-**(n=6)
VLP CPVНизкая доза(50 мкл основного раствора/доза)SC (1 мл)
D
VLP_Перорально(n=6)
VLP CPV2 мл неразбавленного основного раствораПерорально
E
Ad5_CPV+(n=6)
Адено-CPVvAD3032высокая дозацелевая доза (8,64 log 10 TCID50/мл *)SC (1 мл)
F
Ad5_CPV(n=6)
Адено-CPVvAD3032низкая доза(целевая доза 7,64 log 10 TCID50/мл *)SC (1 мл)
G
Ad5_CDV-(n=6)
Адено-CDVvAD3031низкая доза(целевая доза 7,34 log 10 TCID50/мл *)SC (1 мл)
Определение анти-CDV антител (серонейтрализация)
H
Ad5_CDV+(n=6)
Адено-CDVvAD3031высокая доза(целевая доза 8,34 log 10 TCID50/мл *)SC (1 мл)
Как показано на фиг. 13, группы A и E индуцируют у щенков защитные уровни титров антител против CPV.

Пример 7. Вакцинация собак бакуловирус-экспрессированым капсидным белком CPV (VLP), VLP + RECOMBITEK C4, один RECOMBITEK C4 или NOBIVAC 3
Задача исследования заключалась в оценке антительного ответа после введения различных экспериментальных композиций поливалентных вакцин, содержащих обычный CPV-2 MLV или бакуловирус-экспрессированную вакцину рекомбинантных вирусоподобных частиц (VLP) CPV-2c и одну конкурентную/коммерческую вакцину у собак с MDA CPV.
Сорок 6-7-недельных положительных по материнским антителам (MDAs) собак породы бигль от суки, ранее иммунизированной CPV во время беременности, были случайным образом разбиты на группы обработки (n=10 собак) с помощью помета и титра антител. Титрования образцов крови, собранные на день -27, применяли для рандомизации. Всех собак вакцинировали дважды, с промежутком в 21 день, назначенной вакциной в соответствии с приведенной ниже таблицей 8. Щенки имели материнские Ab (MDA) к CPV на D0.

Таблица 8. Экспериментальный дизайн исследования VLP CPV против RECOMBITEK C4 и NOBIVAC
Группы
Вакцинация на день 0 и день 21
Титры
№ собаки
1
VLP CPVТестируемая вакцина #4 (1 мл)*VLPs CPV-2c
273,5 мкг общего белка7,1 Log HA титр
10
2
VLP CPV#4 (0,5 мл) *VLPs CPV-2c+RECOMBITEK<sup></sup> C4#1 (CDV- CAV-CPi, CPV2)*** (1 мл)
273,5 мкг общего белка7,1 Log HA титрCPV: 6,9 TCID50/млCDV: 7,1 TCID50/млCPi: 5,8 TCID50/млCAV2: 6,0 TCID50/мл
10
3
RECOMBITEK<sup></sup> C4#1 (CDV- CAV-CPi, CPV2)*** (1 мл)
CPV: 6,9 TCID50/млCDV: 7,1 TCID50/млCPi: 5,8 TCID50/млCAV2: 6,0 TCID50/мл
10
4
NOBIVAC<sup></sup> 3(CDV- CAV2-CPV2) (1 мл)
Неизвестен
10
*Вирусоподобные частицы собачьего парвовируса VP2: VLPs CPV-2c
**Введена на той же стороне, что и одновременная вакцина, отступив приблизительно 3 см
***Вакцину CDV-CAV-CPi-CPV2 обозначили как C4
HA: Гемагглютинация в 0,5 мл
Кровь собирали от всех собак на дни 0, 7, 15, 21, 28, 35 и 42 и сыворотки тестировали на антитела к CPV с помощью анализов HAI и нейтрализации антителами сыворотки (SNA).
Титры CPV HAI регистрировали как обратные самому высокому разведению, предупреждающему гемагглютинацию, и величину <20 считали отрицательной.

За исключением 2-х собак в группе 3 (C4) все собаки в каждой протестированной группе были положительными в отношении CPV по данным HAI на день 0, перед вакцинацией. Сероконверсию после вакцинации определяли как увеличение в титре в 4 раза или более от дня 0. После первой вакцинация, 6 из 10 собак, вакцинированных VLP-CPV2c (группа 1), и 6 из 10 собак, вакцинированных VLP-CPV2c-C4 (группа 2), претерпевали сероконверсию ко дню 7. На день 7 в группах 3 и 4 (т.е. в группах несодержавших VLPs) не было отвечающих на вакцинацию. Ко дню 21, 5 из 10 собак из группы 2 (VLP-CPV2c- C4), 4 из 10 из группы 1 (VLP-CPV2c), 3 из 10 из группы 4 (NOBIVAC3) и 2 из 10 из группы 3 (C4) претерпевали сероконверсию (фиг. 15).

После второй вакцинации, ко дню 35 (2 недели после вакцинации) сероконверсию наблюдали у всех собак из группы 2 (VLP-CPV2c- C4) и 4 (NOBIVAC3) с последующими 9 в группе 3 (C4) и 8 в группе 1 (VLP-CPV2c). Обработка VLP + C4 (группа 2) индуцировала самое высокое среднее геометрическое титра антител на протяжении всего исследования. Смотри фиг. 17. Через семь дней после V2, на день 28, GMT данной группы был в -7,5 раз выше, чем с одним VLP (GMT= 520), в -9 раз выше, чем с одним C4 (GMT =422) и в -28 раз выше, чем в группе NOBIVAC3 (GMT=139).
Таблица 9. Титры IHA по ID и дню для VLP CPV v.

Исследование RECOMBITEK C4 и NOBIVAC
Таблица 10. Сводная статистика для VLP CPV v.

Исследование RECOMBITEK C4 и NOBIVAC

Пример 8. Вакцинация собак бакуловирус-экспрессированным капсидным белком CPV (VLP), VLP + RECOMBITEK C4, только RECOMBITEK C4 или NOBIVAC 3
Задача данного исследования заключалась в оценке антительного ответа на CPV после введения экспериментальных вирусоподобных частиц, сделанных из капсидного белка VP2 собачьего парвовируса типа 2c (VLPs CPV-2c) в различных титрах в комбинации с композицией поливалентной вакцины CPV-2 MLV и с одной коммерческой вакциной у собак с MDA к CPV.
Пятьдесят 6-7-недельных положительных по материнским антителам (MDAs) собак породы бигль от сук, ранее иммунизированных CPV во время беременности, были случайным образом разбиты на пять групп обработки (n=10 собак на группу) с учетом помета и титра антител. Титрования от образцов крови, собранных на день -15, применяли для рандомизации.
Вакцины получали с помощью регидратации лиофилизированного компонента компонентом разбавителя. Лиофилизированная серия, примененная для тестируемых вакцин #1, #2, #3 и #5, была одной и той же экспериментальной 4-направленной (C4) вакциной. Титры для каждого компонента были следующими: CPV:6,1 Log TCID50/мл (~0,2 мл культуры 1X), CDV: 7,3 Log TCID50/мл, CPi: 5,5 Log TCID50/мл и CAV2:6,0 Log TCID50/мл. Всех собак вакцинировали дважды, через 21 день назначенной вакциной в соответствии с приведенной ниже таблицей 11.

Таблица 11. Экспериментальный дизайн исследования VLP CPV против RECOMBITEK C4 и NOBIVAC
ГРУППА(n=10)
Лиофилизованный компонент вакцины
Компонент разбавителя вакцины
1C4 + Высокая доза VLP-CPV2c
CDV-CAV2-CPi-CPV
VLPs CPV-2c; lot #: 14Дек15Неразбавленный7,0 Log aHA/мл~10 мл культуры 1X
2C4 +Средняя доза VLP-CPV2c
CDV-CAV2-CPi-CPV
VLPs CPV-2c; lot #: 14Дек15Разбавленный 1:5 в воде6,3 Log aHA / мл~2 мл культуры 1X
3C4 + Низкая доза VLP- CPV2c
CDV-CAV2-CPi-CPV
VLPs CPV-2c; lot #: 14Дек15Разбавленный 1:25 в воде5,7 Log aHA / мл~0,4 мл культуры 1X
4Nobivac 3 DAPv
Nobivac Собачий 3(CDV-CAV2-CPV2)(1 мл)
Неизвестен
5C4 Нет VLP- CPV2c
CDV-CAV2-CPi-CPV
Вода
Кровь собирали от всех собак на дни 0, 7, 15, 21, 28, 34 и 42, и сыворотки тестировали на антитела к CPV с помощью анализа реакции торможения гемагглютинации (HAI).
Титры CPV HAI регистрировали как обратные самому высокому разведению, предупреждающему гемагглютинацию, и величину <20 считали отрицательной. Все собаки в каждой группе были положительными по CPV согласно анализу HAI на день 0, перед вакцинацией (средние титры GMT для всех групп между 42.87 и 80). Сероконверсию после вакцинации определяли как увеличение в титре в 4 раза или более от дня 0. Сероконвертирование собак характеризовали как отвечающих на вакцинацию (фиг. 18). Через семь дней после первой вакцинации, 5 из 10 собак, вакцинированных самой высокой дозой VLP-CPV2c- C4 (группа 1), и 1 из 10 собак, вакцинированных средней дозой VLP-CPV2c-C4 (группа 2), претерпевали сероконверсию. В группах 3, 4 и 5 (т.е. в группах, содержавших низкую дозу или не содержавших VLP) на день 7 не было отвечающих на вакцинацию. Через двадцать один день после первой вакцинации, все собаки из группы 1 (высокая доза VLP-CPV2c- C4), 3 из 10 из группы 2 (средняя доза VLP-CPV2c- C4), 1 из 10 из группы 3 (низкая доза VLP-CPV2c- C4). Не было отвечающих на вакцинацию в группах 4 и 5 (т.е. в группах, не содержавших VLP) (фиг. 18).
На день 34, через 13 дней после второй вакцинации, сероконверсию наблюдали у всех собак из группы 1 (высокая доза VLP-CPV2c-C4) и 4 (NOBIVAC3) с последующими 9 в группе 2 (средняя доза VLP-CPV2c-C4), 6 в группе 3 (низкая доза VLP-CPV2c-C4) и 1 в группе 5 (C4, нет VLP).

Как показано на фиг. 19, обработка в высокой дозе VLP + C4 (группа 1) индуцирует самое высокое среднее геометрическое титра антител на протяжении всего исследования. Через тринадцать дней после V2, на день 34, GMT данной группы был равен 4457,22, затем следовала группа со средней дозой VLP-CPV2c-C4 и группы NOBIVAC3; (GMT=1470,33), с низкой дозой VLP-CPV2c-C4 (GMT =298,57) и только C4 (GMT =45,95).

Таблица 12. Результаты исследования HI по группам, ID и дню второй VLP CPV против RECOMBITEK C4 и NOBIVAC
День
0
7
15
21
28
34
42
Группа
*Вакцина
ID
1
Тестируемая вакцина #1 (rDAPP; C4) + VLPs CPV-2c 7,1 Log HA
PFE6
40
320
640
1280
5120
5120
2560
PRD6
40
5120
5120
2560
5120
5120
2560
QFC6
40
5120
5120
5120
10240
10240
5120
QOE6
20
160
2560
2560
10240
5120
5120
RIE6
80
80
40
20
1280
2560
2560
RKD6
80
320
1280
640
10240
5120
2560
SPF6
160
80
2560
1280
10240
10240
5120
TAF6
80
160
1280
640
10240
5120
5120
VAF6
80
160
80
80
640
1280
1280
VCE6
40
80
80
40
5120
2560
2560
GMT
56,57
298,57
735,17
519,84
5120,00
4457,22
3151,73
2
Тестируемая вакцина #2 (rDAPP; C4) + VLPs CPV-2c 6,4 Log HA
PWF6
40
160
320
160
2560
2560
1280
QBF6
160
160
80
40
640
640
320
QLE6
40
80
1280
2560
10240
10240
5120
RJD6
80
80
320
160
2560
1280
1280
RWE6
80
80
20
<20
80
2560
1280
RXE6
40
80
20
20
320
640
640
STE6
80
40
20
20
40
640
320
SUF6
40
40
40
20
160
5120
2560
TBF6
80
40
40
40
320
2560
1280
VDE6
80
40
40
20
40
160
160
GMT
64,98
69,64
74,64
56,57
393,97
1470,33
905,10
3
Тестируемая вакцина #3 (rDAPP; C4) + VLPs CPV-2c 5,7 Log HA
QDE6
80
40
20
20
40
80
80
QED6
40
40
320
320
2560
2560
1280
QKE6
40
20
<20
<20
40
160
160
RGF6
40
80
40
20
40
1280
640
RPD6
40
40
20
20
40
1280
640
RTF6
40
40
20
<20
80
1280
1280
SCE6
20
20
<20
<20
1280
1280
1280
SQF6
80
40
40
20
40
160
160
UOE6
40
20
20
<20
40
20
<20
UXF6
40
40
20
20
20
<20
<20
GMT
42,87
34,82
30,31
26,39
85,74
298,57
242,51
4
Nobivac Собачий 3-DAPv
PCE6
20
<20
<20
<20
40
640
640
QCF6
80
40
20
<20
<20
2560
640
RFF6
160
40
20
20
20
1280
640
RLD6
160
160
20
<20
<20
2560
1280
ROD6
160
40
20
<20
<20
1280
1280
SDE6
40
40
20
<20
40
1280
1280
SWE6
40
20
<20
<20
<20
640
320
SXE6
40
20
20
<20
<20
1280
1280
TCE6
160
40
<20
20
<20
2560
1280
UYF6
160
160
40
40
<20
2560
1280
GMT
80,00
42,87
21,44
21,44
22,97
1470,33
905,10
5
Тестируемая вакцина #5 (rDAPP; C4)
PBE6
20
<20
<20
<20
80
1280
640
REF6
80
40
20
<20
<20
<20
<20
RHE6
160
20
<20
<20
<20
<20
<20
RUE6
80
80
40
20
<20
<20
<20
SVF6
160
<20
<20
<20
<20
<20
<20
TDE6
160
160
40
<20
<20
<20
<20
ULF6
20
20
<20
<20
<20
320
320
UPE6
80
20
<20
<20
<20
80
320
UZF6
160
160
40
20
20
<20
<20
VBF6
80
20
20
20
<20
<20
<20
GMT
80,00
37,32
24,62
20,00
22,97
45,95
49,25
* Для целей примера 8, приведенные ниже названия будут применены в следующих таблицах и графиках.
* C4 + Высокая доза VLP-CPV2c = Тестируемая вакцина #1
* C4 + Средняя доза VLP-CPV2c = Тестируемая вакцина #2
* C4 + Низкая доза VLP-CPV2c = Тестируемая вакцина #3
* C4 + Нет VLP-CPV2c = Тестируемая вакцина #5

Таблица 13. Сводная статистика* исследования по группам для второй VLP CPV против RECOMBITEK C4 и NOBIVAC
День
Группа
Вакцина
N
Среднее геометрическое
Среднее арифметическое
Медиа-на
Мин
Макс
0
1
C4 + Высокая доза VLP-CPV2c
10
56,57
66,00
60
20,0
160,0
2
C4 + Средняя доза VLP-CPV2c
10
64,98
72,00
80
40,0
160,0
3
C4 + низкая доза VLP-CPV2c
10
42,87
46,00
40
20,0
80,0
4
Nobivac Собачий 3-DAPv
10
80,00
102,00
120
20,0
160,0
5
C4 + No VLP-CPV2c
10
80,00
100,00
80
20,0
160,0
7
1
C4 + Высокая доза VLP-CPV2c
10
298,57
1160,00
160
80,0
5120,0
2
C4 + Средняя доза VLP-CPV2c
10
69,64
80,00
80
40,0
160,0
3
C4 + низкая доза VLP-CPV2c
10
34,82
38,00
40
20,0
80,0
4
Nobivac Собачий 3-DAPv
10
42,87
58,00
40
20,0
160,0
5
C4 + No VLP-CPV2c
10
37,32
56,00
20
20,0
160,0
15
1
C4 + Высокая доза VLP-CPV2c
10
735,17
1876,00
1280
40,0
5120,0
2
C4 + Средняя доза VLP-CPV2c
10
74,64
218,00
40
20,0
1280,0
3
C4 + низкая доза VLP-CPV2c
10
30,31
54,00
20
20,0
320,0
4
Nobivac Собачий 3-DAPv
10
21,44
22,00
20
20,0
40,0
5
C4 + No VLP-CPV2c
10
24,62
26,00
20
20,0
40,0
21
1
C4 + Высокая доза VLP-CPV2c
10
519,84
1422,00
960
20,0
5120,0
2
C4 + Средняя доза VLP-CPV2c
10
56,57
306,00
30
20,0
2560,0
3
C4 + низкая доза VLP-CPV2c
10
26,39
50,00
20
20,0
320,0
4
Nobivac Собачий 3-DAPv
10
21,44
22,00
20
20,0
40,0
5
C4 + No VLP-CPV2c
10
20,00
20,00
20
20,0
20,0
28
1
C4 + Высокая доза VLP-CPV2c
10
5120,00
6848,00
7680
640,0
10240,0
2
C4 + Средняя доза VLP-CPV2c
10
393,97
1696,00
320
40,0
10240,0
3
C4 + низкая доза VLP-CPV2c
10
85,74
418,00
40
20,0
2560,0
4
Nobivac Собачий 3-DAPv
10
22,97
24,00
20
20,0
40,0
5
C4 + No VLP-CPV2c
10
22,97
26,00
20
20,0
80,0
34
1
C4 + Высокая доза VLP-CPV2c
10
4457,22
5248,00
5120
1280,0
10240,0
2
C4 + Средняя доза VLP-CPV2c
10
1470,33
2640,00
1920
160,0
10240,0
3
C4 + низкая доза VLP-CPV2c
10
298,57
812,00
720
20,0
2560,0
4
Nobivac Собачий 3-DAPv
10
1470,33
1664,00
1280
640,0
2560,0
5
C4 + No VLP-CPV2c
10
45,95
182,00
20
20,0
1280,0
42
1
C4 + Высокая доза VLP-CPV2c
10
3151,73
3456,00
2560
1280,0
5120,0
2
C4 + Средняя доза VLP-CPV2c
10
905,10
1424,00
1280
160,0
5120,0
3
C4 + низкая доза VLP-CPV2c
10
242,51
556,00
400
20,0
1280,0
4
Nobivac Собачий 3-DAPv
10
905,10
992,00
1280
320,0
1280,0
5
C4 + No VLP-CPV2c
10
49,25
142,00
20
20,0
640,0
Таблица 14. Число отвечающих на вакцинацию (сероконверсия) по группам и дням; 1=Yes, 0=No; сероконверсию определяли как 4-кратное или более увеличение в титре от базовой линии.
День
0
7
15
21
28
34
42
Группа
Вакцина
ID
0
1
1
1
1
1
1
1
C4 + Высокая доза VLP-CPV2c
PFE6
PRD6
0
1
1
1
1
1
1
QFC6
0
1
1
1
1
1
1
QOE6
0
1
1
1
1
1
1
RIE6
0
0
0
0
1
1
1
RKD6
0
1
1
1
1
1
1
SPF6
0
0
1
1
1
1
1
TAF6
0
0
1
1
1
1
1
VAF6
0
0
0
0
1
1
1
VCE6
0
0
0
0
1
1
1
Total
0
5
7
7
10
10
10
2
C4 + Средняя доза VLP-CPV2c
ID
0
1
1
1
1
1
1
PWF6
QBF6
0
0
0
0
1
1
1
QLE6
0
0
1
1
1
1
1
RJD6
0
0
1
1
1
1
1
RWE6
0
0
0
0
0
1
1
RXE6
0
0
0
0
1
1
1
STE6
0
0
0
0
0
1
1
SUF6
0
0
0
0
1
1
1
TBF6
0
0
0
0
1
1
1
VDE6
0
0
0
0
0
0
0
Total
0
1
3
3
7
9
9
3
C4 + низкая доза VLP-CPV2c
ID
0
0
0
0
0
0
0
QDE6
QED6
0
0
1
1
1
1
1
QKE6
0
0
0
0
0
1
1
RGF6
0
0
0
0
0
1
1
RPD6
0
0
0
0
0
1
1
RTF6
0
0
0
0
0
1
1
SCE6
0
0
0
0
1
1
1
SQF6
0
0
0
0
0
0
0
UOE6
0
0
0
0
0
0
0
UXF6
0
0
0
0
0
0
0
Total
0
0
1
1
2
6
6
4
Nobivac Собачий 3-DAPv
ID
0
0
0
0
0
1
1
PCE6
QCF6
0
0
0
0
0
1
1
RFF6
0
0
0
0
0
1
1
RLD6
0
0
0
0
0
1
1
ROD6
0
0
0
0
0
1
1
SDE6
0
0
0
0
0
1
1
SWE6
0
0
0
0
0
1
1
SXE6
0
0
0
0
0
1
1
TCE6
0
0
0
0
0
1
1
UYF6
0
0
0
0
0
1
1
Total
0
0
0
0
0
10
10
5
C4 + Нет VLP-CPV2c
ID
0
0
0
0
1
1
1
PBE6
REF6
0
0
0
0
0
0
0
RHE6
0
0
0
0
0
0
0
RUE6
0
0
0
0
0
0
0
SVF6
0
0
0
0
0
0
0
TDE6
0
0
0
0
0
0
0
ULF6
0
0
0
0
0
1
1
UPE6
0
0
0
0
0
0
1
UZF6
0
0
0
0
0
0
0
VBF6
0
0
0
0
0
0
0
Total
0
0
0
0
1
2
3
Соответственно, VLP CPV способствовали более раннему возникновению иммунитета (OOI) по сравнению с одной MLV в MDA+ щенках, и VLP CPV обладали синергическим эффектом с MLV C4 в MDA+ щенках. Заявитель утверждает, что данные результаты были неожиданными и чрезвычайно благоприятными. Преодоление материнских антител уже давно было вызовом для биологов, работающих в области вакцинации, и эти данные указывают на то, что подход VLP + MLV, раскрытый в настоящем документе, может быть широко применен для решения проблемы обеспечения MDA+ потомства с защитным иммунитетом.
--->
SEQUENCE LISTING
<110> Merial, Inc.
David, Frederic
Hannas-Djebbara, Zahia
Poulet, Herve
Minke, Jules
<120> Canine Parvovirus (CPV) Virus-like Particle (VLP) Vaccines and
uses thereof
<130> MER 14-252
<150> 62/234,196
<151> 2015-09-29
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 584
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VP2 of Canine parvovirus - GenBank BAD34656.1
<400> 1
Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg
1 5 10 15
Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln
35 40 45
Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn
50 55 60
Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met
85 90 95
Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val
100 105 110
Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu
115 120 125
Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu
130 135 140
Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro
145 150 155 160
Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala
165 170 175
Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser
180 185 190
Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp
195 200 205
Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly
210 215 220
Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp
225 230 235 240
Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg
245 250 255
Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro
260 265 270
Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro
275 280 285
Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly
290 295 300
Tyr Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly
305 310 315 320
Asn Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val
325 330 335
Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro
340 345 350
Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu
355 360 365
Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His
370 375 380
Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr
385 390 395 400
Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln
405 410 415
Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Glu Asp Asn Val Leu Leu Pro
420 425 430
Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe
435 440 445
Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr
450 455 460
Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro
465 470 475 480
Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly
485 490 495
Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro
500 505 510
Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp
515 520 525
Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr
530 535 540
Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn
545 550 555 560
Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser
565 570 575
Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr
580
<210> 2
<211> 9632
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pVL1393 - 9632 bp baculovirus transfer vector from Invitrogen
<400> 2
aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt 60
gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt 120
ataaaagatt ctaatctgat atgttttaaa acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac 180
gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt 240
ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg 300
gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata 360
gttcaagaat ttattgacac ggtaaaagaa tttacagaaa agtgtcccgg catgttggtg 420
ggcgtgcact gcacacacgg tattaatcgc accggttaca tggtgtgcag atatttaatg 480
cacaccctgg gtattgcgcc gcaggaagcc atagatagat tcgaaaaagc cagaggtcac 540
aaaattgaaa gacaaaatta cgttcaagat ttattaattt aattaatatt atttgcattc 600
tttaacaaat actttatcct attttcaaat tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta 660
tgcttcgctt gctccgttta gcttgtagcc gatcagtggc gttgttccaa tcgacggtag 720
gattaggccg gatattctcc accacaatgt tggcaacgtt gatgttacgt ttatgctttt 780
ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca 840
cgcacaacac cggatgtttg cgcttgtccg cggggtattg aaccgcgcga tccgacaaat 900
ccaccacttt ggcaactaaa tcggtgacct gcgcgtcttt tttctgcatt atttcgtctt 960
tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt acatgcggtt tagatcagtc atgacgcgcg 1020
tgacctgcaa atctttggcc tcgatctgct tgtccttgat ggcaacgatg cgttcaataa 1080
actcttgttt tttaacaagt tcctcggttt tttgcgccac caccgcttgc agcgcgtttg 1140
tgtgctcggt gaatgtcgca atcagcttag tcaccaactg tttgctctcc tcctcccgtt 1200
gtttgatcgc gggatcgtac ttgccggtgc agagcacttg aggaattact tcttctaaaa 1260
gccattcttg taattctatg gcgtaaggca atttggactt cataatcagc tgaatcacgc 1320
cggatttagt aatgagcact gtatgcggct gcaaatacag cgggtcgccc cttttcacga 1380
cgctgttaga ggtagggccc ccattttgga tggtctgctc aaataacgat ttgtatttat 1440
tgtctacatg aacacgtata gctttatcac aaactgtata ttttaaactg ttagcgacgt 1500
ccttggccac gaaccggacc tgttggtcgc gctctagcac gtaccgcagg ttgaacgtat 1560
cttctccaaa tttaaattct ccaattttaa cgcgagccat tttgatacac gtgtgtcgat 1620
tttgcaacaa ctattgtttt ttaacgcaaa ctaaacttat tgtggtaagc aataattaaa 1680
tatgggggaa catgcgccgc tacaacactc gtcgttatga acgcagacgg cgccggtctc 1740
ggcgcaagcg gctaaaacgt gttgcgcgtt caacgcggca aacatcgcaa aagccaatag 1800
tacagttttg atttgcatat taacggcgat tttttaaatt atcttattta ataaatagtt 1860
atgacgccta caactccccg cccgcgttga ctcgctgcac ctcgagcagt tcgttgacgc 1920
cttcctccgt gtggccgaac acgtcgagcg ggtggtcgat gaccagcggc gtgccgcacg 1980
cgacgcacaa gtatctgtac accgaatgat cgtcgggcga aggcacgtcg gcctccaagt 2040
ggcaatattg gcaaattcga aaatatatac agttgggttg tttgcgcata tctatcgtgg 2100
cgttgggcat gtacgtccga acgttgattt gcatgcaagc cgaaattaaa tcattgcgat 2160
tagtgcgatt aaaacgttgt acatcctcgc ttttaatcat gccgtcgatt aaatcgcgca 2220
atcgagtcaa gtgatcaaag tgtggaataa tgttttcttt gtattcccga gtcaagcgca 2280
gcgcgtattt taacaaacta gccatcttgt aagttagttt catttaatgc aactttatcc 2340
aataatatat tatgtatcgc acgtcaagaa ttaacaatgc gcccgttgtc gcatctcaac 2400
acgactatga tagagatcaa ataaagcgcg aattaaatag cttgcgacgc aacgtgcacg 2460
atctgtgcac gcgttccggc acgagctttg attgtaataa gtttttacga agcgatgaca 2520
tgacccccgt agtgacaacg atcacgccca aaagaactgc cgactacaaa attaccgagt 2580
atgtcggtga cgttaaaact attaagccat ccaatcgacc gttagtcgaa tcaggaccgc 2640
tggtgcgaga agccgcgaag tatggcgaat gcatcgtata acgtgtggag tccgctcatt 2700
agagcgtcat gtttagacaa gaaagctaca tatttaattg atcccgatga ttttattgat 2760
aaattgaccc taactccata cacggtattc tacaatggcg gggttttggt caaaatttcc 2820
ggactgcgat tgtacatgct gttaacggct ccgcccacta ttaatgaaat taaaaattcc 2880
aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa 2940
aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg 3000
aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta 3060
aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag 3120
gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta 3180
atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag 3240
ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata 3300
aaacaattat aaatgctaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa 3360
catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa 3420
aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt tcacataaac 3480
tagacgcctt gtcgtcttct tcttcgtatt ccttctcttt ttcatttttc tcctcataaa 3540
aattaacata gttattatcg tatccatata tgtatctatc gtatagagta aattttttgt 3600
tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttttc 3660
tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta 3720
aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt 3780
acgcagcttc ttctagttca attacaccat tttttagcag caccggatta acataacttt 3840
ccaaaatgtt gtacgaaccg ttaaacaaaa acagttcacc tcccttttct atactattgt 3900
ctgcgagcag ttgtttgttg ttaaaaataa cagccattgt aatgagacgc acaaactaat 3960
atcacaaact ggaaatgtct atcaatatat agttgctgat atcatggaga taattaaaat 4020
gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa 4080
aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atcccgggta 4140
ccttctagaa ttccggagcg gccgctgcag atctgatcct ttcctgggac ccggcaagaa 4200
ccaaaaactc actctcttca aggaaatccg taatgttaaa cccgacacga tgaagcttgt 4260
cgttggatgg aaaggaaaag agttctacag ggaaacttgg acccgcttca tggaagacag 4320
cttccccatt gttaacgacc aagaagtgat ggatgttttc cttgttgtca acatgcgtcc 4380
cactagaccc aaccgttgtt acaaattcct ggcccaacac gctctgcgtt gcgaccccga 4440
ctatgtacct catgacgtga ttaggatcgt cgagccttca tgggtgggca gcaacaacga 4500
gtaccgcatc agcctggcta agaagggcgg cggctgccca ataatgaacc ttcactctga 4560
gtacaccaac tcgttcgaac agttcatcga tcgtgtcatc tgggagaact tctacaagcc 4620
catcgtttac atcggtaccg actctgctga agaggaggaa attctccttg aagtttccct 4680
ggtgttcaaa gtaaaggagt ttgcaccaga cgcacctctg ttcactggtc cggcgtatta 4740
aaacacgata cattgttatt agtacattta ttaagcgcta gattctgtgc gttgttgatt 4800
tacagacaat tgttgtacgt attttaataa ttcattaaat ttataatctt tagggtggta 4860
tgttagagcg aaaatcaaat gattttcagc gtctttatat ctgaatttaa atattaaatc 4920
ctcaatagat ttgtaaaata ggtttcgatt agtttcaaac aagggttgtt tttccgaacc 4980
gatggctgga ctatctaatg gattttcgct caacgccaca aaacttgcca aatcttgtag 5040
cagcaatcta gctttgtcga tattcgtttg tgttttgttt tgtaataaag gttcgacgtc 5100
gttcaaaata ttatgcgctt ttgtatttct ttcatcactg tcgttagtgt acaattgact 5160
cgacgtaaac acgttaaata aagcttggac atatttaaca tcgggcgtgt tagctttatt 5220
aggccgatta tcgtcgtcgt cccaaccctc gtcgttagaa gttgcttccg aagacgattt 5280
tgccatagcc acacgacgcc tattaattgt gtcggctaac acgtccgcga tcaaatttgt 5340
agttgagctt tttggaatta tttctgattg cgggcgtttt tgggcgggtt tcaatctaac 5400
tgtgcccgat tttaattcag acaacacgtt agaaagcgat ggtgcaggcg gtggtaacat 5460
ttcagacggc aaatctacta atggcggcgg tggtggagct gatgataaat ctaccatcgg 5520
tggaggcgca ggcggggctg gcggcggagg cggaggcgga ggtggtggcg gtgatgcaga 5580
cggcggttta ggctcaaatg tctctttagg caacacagtc ggcacctcaa ctattgtact 5640
ggtttcgggc gccgtttttg gtttgaccgg tctgagacga gtgcgatttt tttcgtttct 5700
aatagcttcc aacaattgtt gtctgtcgtc taaaggtgca gcgggttgag gttccgtcgg 5760
cattggtgga gcgggcggca attcagacat cgatggtggt ggtggtggtg gaggcgctgg 5820
aatgttaggc acgggagaag gtggtggcgg cggtgccgcc ggtataattt gttctggttt 5880
agtttgttcg cgcacgattg tgggcaccgg cgcaggcgcc gctggctgca caacggaagg 5940
tcgtctgctt cgaggcagcg cttggggtgg tggcaattca atattataat tggaatacaa 6000
atcgtaaaaa tctgctataa gcattgtaat ttcgctatcg tttaccgtgc cgatatttaa 6060
caaccgctca atgtaagcaa ttgtattgta aagagattgt ctcaagctcg ccgcacgccg 6120
ataacaagcc ttttcatttt tactacagca ttgtagtggc gagacacttc gctgtcgtcg 6180
acgtacatgt atgctttgtt gtcaaaaacg tcgttggcaa gctttaaaat atttaaaaga 6240
acatctctgt tcagcaccac tgtgttgtcg taaatgttgt ttttgataat ttgcgcttcc 6300
gcagtatcga cacgttcaaa aaattgatgc gcatcaattt tgttgttcct attattgaat 6360
aaataagatt gtacagattc atatctacga ttcgtcatgg ccaccacaaa tgctacgctg 6420
caaacgctgg tacaatttta cgaaaactgc aaaaacgtca aaactcggta taaaataatc 6480
aacgggcgct ttggcaaaat atctatttta tcgcacaagc ccactagcaa attgtatttg 6540
cagaaaacaa tttcggcgca caattttaac gctgacgaaa taaaagttca ccagttaatg 6600
agcgaccacc caaattttat aaaaatctat tttaatcacg gttccatcaa caaccaagtg 6660
atcgtgatgg actacattga ctgtcccgat ttatttgaaa cactacaaat taaaggcgag 6720
ctttcgtacc aacttgttag caatattatt agacagctgt gtgaagcgct caacgatttg 6780
cacaagcaca atttcataca caacgacata aaactcgaaa atgtcttata tttcgaagca 6840
cttgatcgcg tgtatgtttg cgattacgga ttgtgcaaac acgaaaactc acttagcgtg 6900
cacgacggca cgttggagta ttttagtccg gaaaaaattc gacacacaac tatgcacgtt 6960
tcgtttgact ggtacgcggc gtgttaacat acaagttgct aacgtaatca tggtcatagc 7020
tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca 7080
taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct 7140
cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac 7200
gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 7260
tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 7320
tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 7380
ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 7440
agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 7500
accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 7560
ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 7620
gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 7680
ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 7740
gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 7800
taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag 7860
tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 7920
gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 7980
cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 8040
agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 8100
cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 8160
cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat 8220
ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct 8280
taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt 8340
tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat 8400
ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta 8460
atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg 8520
gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt 8580
tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg 8640
cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg 8700
taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc 8760
ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa 8820
ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac 8880
cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt 8940
ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg 9000
gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa 9060
gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata 9120
aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca 9180
ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc 9240
gtttcggtga tgacggtgaa aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt 9300
gtctgtaagc ggatgccggg agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg 9360
ggtgtcgggg ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata 9420
tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc 9480
cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc 9540
agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc 9600
agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg cc 9632
<210> 3
<211> 584
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CPV Souriou (serotype 2c)
<400> 3
Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg
1 5 10 15
Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln
35 40 45
Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn
50 55 60
Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met
85 90 95
Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val
100 105 110
Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu
115 120 125
Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu
130 135 140
Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro
145 150 155 160
Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala
165 170 175
Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser
180 185 190
Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp
195 200 205
Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly
210 215 220
Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp
225 230 235 240
Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg
245 250 255
Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro
260 265 270
Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro
275 280 285
Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly
290 295 300
Tyr Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly
305 310 315 320
Asn Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val
325 330 335
Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro
340 345 350
Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu
355 360 365
Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His
370 375 380
Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr
385 390 395 400
Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln
405 410 415
Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Glu Asp Asn Val Leu Leu Pro
420 425 430
Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe
435 440 445
Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr
450 455 460
Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro
465 470 475 480
Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly
485 490 495
Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro
500 505 510
Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp
515 520 525
Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr
530 535 540
Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn
545 550 555 560
Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser
565 570 575
Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr
580
<210> 4
<211> 584
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Non-Truncated CPV VP2 in pMEB072
<400> 4
Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg
1 5 10 15
Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln
35 40 45
Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn
50 55 60
Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Val Asn Asn Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met
85 90 95
Ala Leu Asp Asp Thr His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val
100 105 110
Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu
115 120 125
Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu
130 135 140
Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro
145 150 155 160
Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala
165 170 175
Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser
180 185 190
Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp
195 200 205
Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly
210 215 220
Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp
225 230 235 240
Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg
245 250 255
Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro
260 265 270
Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro
275 280 285
Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly
290 295 300
Tyr Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly
305 310 315 320
Asn Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val
325 330 335
Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro
340 345 350
Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu
355 360 365
Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His
370 375 380
Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr
385 390 395 400
Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln
405 410 415
Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Glu Asp Asn Val Leu Leu Pro
420 425 430
Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe
435 440 445
Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr
450 455 460
Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro
465 470 475 480
Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly
485 490 495
Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro
500 505 510
Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp
515 520 525
Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr
530 535 540
Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn
545 550 555 560
Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser
565 570 575
Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr
580
<210> 5
<211> 1752
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMEB072 Codon-optimized nucleic acid encoding CPV VP2 (SEQ ID
NO:4)
<400> 5
atgtccgacg gtgctgtgca gcccgacggt ggccagcccg ctgtgcgtaa cgagcgtgct 60
accggttccg gtaacggttc aggcggaggt ggaggtggtg gttccggcgg tgtgggcatc 120
tccaccggca ccttcaacaa ccagaccgag ttcaagttcc tcgagaacgg ttgggtggag 180
atcaccgcta actcctcccg tctggtgcac ctgaacatgc ccgagtccga gaactaccgt 240
cgtgtggtgg tgaacaacct ggacaagacc gctgtgaacg gtaacatggc tctggacgac 300
acccacgctc agatcgtgac cccctggtcc ctggtggacg ctaacgcttg gggcgtgtgg 360
ttcaaccccg gtgactggca gctgatcgtg aacaccatgt ccgagctgca cctggtgtcc 420
ttcgagcaag agatcttcaa cgtcgtcctc aagaccgtgt ccgagtccgc tacccagccc 480
cccaccaagg tgtacaacaa cgacctgacc gcttccctga tggtcgctct ggactccaac 540
aacaccatgc ccttcacccc cgctgctatg cgttccgaga ccctgggctt ctacccctgg 600
aagcccacca tccccacccc ctggcgttac tacttccagt gggaccgtac cctgatcccc 660
tcccacaccg gtacttccgg cacccccacc aacatctacc acggcaccga ccccgacgac 720
gtgcagttct acaccatcga gaactccgtg cccgtgcacc tgctgcgtac cggtgacgag 780
ttcgctaccg gaaccttctt cttcgactgc aagccctgcc gtctgaccca cacctggcag 840
accaaccgtg ctctgggtct gcctcccttc ctgaactccc tgccccaggc tgagggtggc 900
accaacttcg gttacatcgg tgtgcagcag gacaagcgtc gtggtgtgac ccagatgggt 960
aacaccaact acatcaccga ggctaccatc atgcgtcccg ctgaggtcgg ctactccgct 1020
ccctactact ccttcgaggc ttccacccag ggccccttca agacccccat cgctgctggt 1080
cgtggtggtg ctcagaccga cgagaaccag gctgctgacg gtgacccccg ttacgctttc 1140
ggtcgtcagc acggccaaaa gaccaccacc accggcgaga cccccgagcg tttcacctac 1200
atcgctcacc aggacaccgg tcgttacccc gagggcgact ggattcagaa catcaacttc 1260
aacctgcccg tgaccgagga caacgtgctg ctgcccaccg accccatcgg tggcaagacc 1320
ggtatcaact acactaacat cttcaacacc tacggtcctc tgaccgctct gaacaacgtg 1380
ccccccgtgt accccaacgg ccagatctgg gacaaggagt tcgacaccga cctgaagccc 1440
cgtctgcacg tgaacgctcc cttcgtgtgc cagaacaact gccctggcca gctgttcgtc 1500
aaggtggccc ccaacctgac caacgagtac gaccctgacg cttccgctaa catgtcccgt 1560
atcgtgacct actccgactt ctggtggaag ggcaagctgg tgttcaaggc caagctgcgt 1620
gcttctcaca cctggaaccc catccagcag atgtccatca acgtggacaa ccagttcaac 1680
tacgtgccct ccaacatcgg tggaatgaag atcgtgtacg agaagtccca gctggctccc 1740
cgtaagctgt ac 1752
<210> 6
<211> 578
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Truncated CPV VP2 in pMEB073
<400> 6
Met Leu Lys Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg Asn Glu Arg Ala Thr Gly
1 5 10 15
Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Val
20 25 30
Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln Thr Glu Phe Lys Phe Leu
35 40 45
Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn Ser Ser Arg Leu Val His
50 55 60
Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg Arg Val Val Val Asn Asn
65 70 75 80
Leu Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met Ala Leu Asp Asp Thr His
85 90 95
Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val Asp Ala Asn Ala Trp Gly
100 105 110
Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu Ile Val Asn Thr Met Ser
115 120 125
Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu Ile Phe Asn Val Val Leu
130 135 140
Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro Pro Thr Lys Val Tyr Asn
145 150 155 160
Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala Leu Asp Ser Asn Asn Thr
165 170 175
Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser Glu Thr Leu Gly Phe Tyr
180 185 190
Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp
195 200 205
Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly Thr Ser Gly Thr Pro Thr
210 215 220
Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp Val Gln Phe Tyr Thr Ile
225 230 235 240
Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg Thr Gly Asp Glu Phe Ala
245 250 255
Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro Cys Arg Leu Thr His Thr
260 265 270
Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro Pro Phe Leu Asn Ser Leu
275 280 285
Pro Gln Ala Glu Gly Gly Thr Asn Phe Gly Tyr Ile Gly Val Gln Gln
290 295 300
Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly Asn Thr Asn Tyr Ile Thr
305 310 315 320
Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr
325 330 335
Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro Phe Lys Thr Pro Ile Ala
340 345 350
Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu Asn Gln Ala Ala Asp Gly
355 360 365
Asp Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His Gly Gln Lys Thr Thr Thr
370 375 380
Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr Ile Ala His Gln Asp Thr
385 390 395 400
Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln Asn Ile Asn Phe Asn Leu
405 410 415
Pro Val Thr Glu Asp Asn Val Leu Leu Pro Thr Asp Pro Ile Gly Gly
420 425 430
Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe Asn Thr Tyr Gly Pro Leu
435 440 445
Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr Pro Asn Gly Gln Ile Trp
450 455 460
Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro Arg Leu His Val Asn Ala
465 470 475 480
Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly Gln Leu Phe Val Lys Val
485 490 495
Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro Asp Ala Ser Ala Asn Met
500 505 510
Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp Trp Lys Gly Lys Leu Val
515 520 525
Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr Trp Asn Pro Ile Gln Gln
530 535 540
Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn Tyr Val Pro Ser Asn Ile
545 550 555 560
Gly Gly Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser Gln Leu Ala Pro Arg Lys
565 570 575
Leu Tyr
<210> 7
<211> 1536
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMEB073 codon-optimized nucleic acid sequence encoding CPV VP2
(SEQ ID NO:6)
<400> 7
atgcccgaga gcgagaacta ccggagagtg gtggtgaaca acctggacaa gaccgccgtg 60
aacggcaata tggccctgga tgacacccac gcccagatcg tgaccccctg gagcctggtg 120
gacgccaacg cctggggagt gtggttcaac cctggcgact ggcagctgat cgtgaacacc 180
atgagcgagc tgcacctggt gtccttcgag caggagattt tcaacgtggt gctgaaaacc 240
gtgtccgaga gcgccaccca gccccccacc aaagtgtaca acaacgacct gaccgcctcc 300
ctgatggtgg ccctggacag caacaacacc atgcccttca cccctgccgc catgagaagc 360
gagaccctgg gcttctaccc ttggaagccc accatcccca ccccttggcg gtactacttc 420
cagtgggaca ggaccctgat ccccagccac accggcacca gcggcacccc taccaatatc 480
taccacggca ccgaccctga tgacgtgcag ttctacacca tcgagaacag cgtgcctgtg 540
cacctgctga gaaccggcga cgagttcgcc accggcacat tcttcttcga ctgcaagccc 600
tgcagactga cccacacctg gcagaccaac agagccctgg gcctgcctcc tttcctgaac 660
agcctgcccc aggccgaggg cggcaccaac ttcggctaca tcggcgtgca gcaggacaag 720
agaagaggcg tgacccagat gggcaacacc aactacatca ccgaggccac catcatgaga 780
cccgccgaag tgggctacag cgccccctac tacagcttcg aggccagcac ccagggcccc 840
ttcaagaccc ccatcgccgc tggcagaggc ggagcccaga ccgacgagaa ccaggccgcc 900
gacggcgacc ccagatacgc cttcggcaga cagcacggcc agaaaaccac caccaccggc 960
gagacccccg agagattcac ctacatcgcc caccaggaca ccggcagata ccccgagggc 1020
gactggattc agaacatcaa cttcaacctg cccgtgaccg aggataatgt gctgctgccc 1080
accgacccca tcggcggcaa gaccggcatc aactacacca acatcttcaa cacctacggc 1140
cccctgaccg ccctgaataa cgtgcccccc gtgtacccca acggccagat ttgggacaag 1200
gagttcgaca ccgacctgaa gcctaggctg cacgtgaatg cccccttcgt gtgtcagaac 1260
aactgccctg gccagctgtt tgtgaaagtg gcccccaacc tgaccaacga gtacgatcct 1320
gacgccagcg ccaacatgag ccggatcgtg acctacagcg acttctggtg gaagggcaag 1380
ctggtgttca aggccaagct gagagccagc cacacatgga accccatcca gcagatgagc 1440
atcaacgtgg acaaccagtt caactacgtg cccagcaata tcggcggcat gaagatcgtg 1500
tacgagaaga gccagctggc ccccagaaag ctgtac 1536
<210> 8
<211> 584
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GenBank: AHW47988.1
<400> 8
Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg
1 5 10 15
Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln
35 40 45
Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn
50 55 60
Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Lys
65 70 75 80
Arg Val Val Val Asn Asn Met Asp Lys Thr Ala Val Lys Gly Asn Met
85 90 95
Ala Leu Asp Asp Thr His Val Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val
100 105 110
Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu
115 120 125
Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Arg Glu
130 135 140
Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro
145 150 155 160
Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala
165 170 175
Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser
180 185 190
Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp
195 200 205
Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly
210 215 220
Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Val Tyr His Gly Ser Asp Pro Asp Asp
225 230 235 240
Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg
245 250 255
Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro
260 265 270
Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro
275 280 285
Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ser Glu Gly Ile Thr Asn Phe Gly
290 295 300
Asp Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly
305 310 315 320
Asn Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val
325 330 335
Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro
340 345 350
Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu
355 360 365
Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Lys Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His
370 375 380
Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr
385 390 395 400
Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln
405 410 415
Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Lys Asp Asn Val Leu Leu Pro
420 425 430
Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe
435 440 445
Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr
450 455 460
Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro
465 470 475 480
Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly
485 490 495
Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro
500 505 510
Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp
515 520 525
Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr
530 535 540
Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn
545 550 555 560
Tyr Val Pro Asn Asn Ile Gly Ala Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser
565 570 575
Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr
580
<210> 9
<211> 584
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GenBank: AHW47989.1
<400> 9
Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg
1 5 10 15
Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Ile Ser Thr Gly Thr Phe Asn Asn Gln
35 40 45
Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn
50 55 60
Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Lys
65 70 75 80
Arg Val Val Val Asn Asn Met Asp Lys Thr Ala Val Lys Gly Asn Met
85 90 95
Ala Leu Asp Asp Thr His Val Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val
100 105 110
Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu
115 120 125
Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu
130 135 140
Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro
145 150 155 160
Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala
165 170 175
Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser
180 185 190
Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp
195 200 205
Arg Tyr Tyr Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly
210 215 220
Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Val Tyr His Gly Ser Asp Pro Asp Asp
225 230 235 240
Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg
245 250 255
Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Lys Pro
260 265 270
Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro
275 280 285
Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ser Glu Gly Ile Thr Asn Phe Gly
290 295 300
Asp Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly
305 310 315 320
Asn Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val
325 330 335
Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro
340 345 350
Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu
355 360 365
Asn Gln Ala Ala Asp Gly Asp Pro Lys Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His
370 375 380
Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr
385 390 395 400
Ile Ser His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln
405 410 415
Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Lys Asp Asn Val Leu Leu Pro
420 425 430
Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe
435 440 445
Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr
450 455 460
Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro
465 470 475 480
Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly
485 490 495
Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro
500 505 510
Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp
515 520 525
Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr
530 535 540
Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn
545 550 555 560
Tyr Val Pro Asn Asn Ile Gly Ala Met Lys Ile Val Tyr Glu Lys Ser
565 570 575
Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr
580
<210> 10
<211> 584
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GenBank: ADA61118.1
<400> 10
Met Ser Asp Gly Ala Val Gln Pro Asp Gly Gly Gln Pro Ala Val Arg
1 5 10 15
Asn Glu Arg Ala Thr Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ile Ser Thr Gly Ala Phe Asn Asn Gln
35 40 45
Thr Glu Phe Lys Phe Leu Glu Asn Gly Trp Val Glu Ile Thr Ala Asn
50 55 60
Ser Ser Arg Leu Val His Leu Asn Met Pro Glu Ser Glu Asn Tyr Arg
65 70 75 80
Arg Val Val Val Asn Asn Met Asp Lys Thr Ala Val Asn Gly Asn Met
85 90 95
Ala Leu Asp Asp Ile His Ala Gln Ile Val Thr Pro Trp Ser Leu Val
100 105 110
Asp Ala Asn Ala Trp Gly Val Trp Phe Asn Pro Gly Asp Trp Gln Leu
115 120 125
Ile Val Asn Thr Met Ser Glu Leu His Leu Val Ser Phe Glu Gln Glu
130 135 140
Ile Phe Asn Val Val Leu Lys Thr Val Ser Glu Ser Ala Thr Gln Pro
145 150 155 160
Pro Thr Lys Val Tyr Asn Asn Asp Leu Thr Ala Ser Leu Met Val Ala
165 170 175
Leu Asp Ser Asn Asn Thr Met Pro Phe Thr Pro Ala Ala Met Arg Ser
180 185 190
Glu Thr Leu Gly Phe Tyr Pro Trp Lys Pro Thr Ile Pro Thr Pro Trp
195 200 205
Arg Tyr His Phe Gln Trp Asp Arg Thr Leu Ile Pro Ser His Thr Gly
210 215 220
Thr Ser Gly Thr Pro Thr Asn Ile Tyr His Gly Thr Asp Pro Asp Asp
225 230 235 240
Val Gln Phe Tyr Thr Ile Glu Asn Ser Val Pro Val His Leu Leu Arg
245 250 255
Thr Gly Asp Glu Phe Ala Thr Gly Thr Phe Phe Phe Asp Cys Thr Pro
260 265 270
Cys Arg Leu Thr His Thr Trp Gln Thr Asn Arg Ala Leu Gly Leu Pro
275 280 285
Pro Phe Leu Asn Ser Leu Pro Gln Ser Glu Gly Ala Thr Asn Phe Gly
290 295 300
Asp Ile Gly Val Gln Gln Asp Lys Arg Arg Gly Val Thr Gln Met Gly
305 310 315 320
Asn Thr Asn Tyr Ile Thr Glu Ala Thr Ile Met Arg Pro Ala Glu Val
325 330 335
Gly Tyr Ser Ala Pro Tyr Tyr Ser Phe Glu Ala Ser Thr Gln Gly Pro
340 345 350
Phe Lys Thr Pro Ile Ala Ala Gly Arg Gly Gly Ala Gln Thr Asp Glu
355 360 365
Asn Gln Ala Ala Asp Gly Glu Pro Arg Tyr Ala Phe Gly Arg Gln His
370 375 380
Gly Gln Lys Thr Thr Thr Thr Gly Glu Thr Pro Glu Arg Phe Thr Tyr
385 390 395 400
Ile Ala His Gln Asp Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Gly Asp Trp Ile Gln
405 410 415
Asn Ile Asn Phe Asn Leu Pro Val Thr Asn Asp Asn Val Leu Leu Pro
420 425 430
Thr Asp Pro Ile Gly Gly Lys Thr Gly Ile Asn Tyr Thr Asn Ile Phe
435 440 445
Asn Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ala Leu Asn Asn Val Pro Pro Val Tyr
450 455 460
Pro Asn Gly Gln Ile Trp Asp Lys Glu Phe Asp Thr Asp Leu Lys Pro
465 470 475 480
Arg Leu His Val Asn Ala Pro Phe Val Cys Gln Asn Asn Cys Pro Gly
485 490 495
Gln Leu Phe Val Lys Val Ala Pro Asn Leu Thr Asn Glu Tyr Asp Pro
500 505 510
Asp Ala Ser Ala Asn Met Ser Arg Ile Val Thr Tyr Ser Asp Phe Trp
515 520 525
Trp Lys Gly Lys Leu Val Phe Lys Ala Lys Leu Arg Ala Ser His Thr
530 535 540
Trp Asn Pro Ile Gln Gln Met Ser Ile Asn Val Asp Asn Gln Phe Asn
545 550 555 560
Tyr Val Pro Ser Asn Ile Gly Gly Met Lys Ile Val Phe Glu Lys Ser
565 570 575
Gln Leu Ala Pro Arg Lys Leu Tyr
580
<210> 11
<211> 11387
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMEB072
<400> 11
aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt 60
gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt 120
ataaaagatt ctaatctgat atgttttaaa acacctttgc ggcccgagtt gtttgcgtac 180
gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt 240
ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg 300
gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata 360
gttcaagaat ttattgacac ggtaaaagaa tttacagaaa agtgtcccgg catgttggtg 420
ggcgtgcact gcacacacgg tattaatcgc accggttaca tggtgtgcag atatttaatg 480
cacaccctgg gtattgcgcc gcaggaagcc atagatagat tcgaaaaagc cagaggtcac 540
aaaattgaaa gacaaaatta cgttcaagat ttattaattt aattaatatt atttgcattc 600
tttaacaaat actttatcct attttcaaat tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta 660
tgcttcgctt gctccgttta gcttgtagcc gatcagtggc gttgttccaa tcgacggtag 720
gattaggccg gatattctcc accacaatgt tggcaacgtt gatgttacgt ttatgctttt 780
ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca 840
cgcacaacac cggatgtttg cgcttgtccg cggggtattg aaccgcgcga tccgacaaat 900
ccaccacttt ggcaactaaa tcggtgacct gcgcgtcttt tttctgcatt atttcgtctt 960
tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt acatgcggtt tagatcagtc atgacgcgcg 1020
tgacctgcaa atctttggcc tcgatctgct tgtccttgat ggcaacgatg cgttcaataa 1080
actcttgttt tttaacaagt tcctcggttt tttgcgccac caccgcttgc agcgcgtttg 1140
tgtgctcggt gaatgtcgca atcagcttag tcaccaactg tttgctctcc tcctcccgtt 1200
gtttgatcgc gggatcgtac ttgccggtgc agagcacttg aggaattact tcttctaaaa 1260
gccattcttg taattctatg gcgtaaggca atttggactt cataatcagc tgaatcacgc 1320
cggatttagt aatgagcact gtatgcggct gcaaatacag cgggtcgccc cttttcacga 1380
cgctgttaga ggtagggccc ccattttgga tggtctgctc aaataacgat ttgtatttat 1440
tgtctacatg aacacgtata gctttatcac aaactgtata ttttaaactg ttagcgacgt 1500
ccttggccac gaaccggacc tgttggtcgc gctctagcac gtaccgcagg ttgaacgtat 1560
cttctccaaa tttaaattct ccaattttaa cgcgagccat tttgatacac gtgtgtcgat 1620
tttgcaacaa ctattgtttt ttaacgcaaa ctaaacttat tgtggtaagc aataattaaa 1680
tatgggggaa catgcgccgc tacaacactc gtcgttatga acgcagacgg cgccggtctc 1740
ggcgcaagcg gctaaaacgt gttgcgcgtt caacgcggca aacatcgcaa aagccaatag 1800
tacagttttg atttgcatat taacggcgat tttttaaatt atcttattta ataaatagtt 1860
atgacgccta caactccccg cccgcgttga ctcgctgcac ctcgagcagt tcgttgacgc 1920
cttcctccgt gtggccgaac acgtcgagcg ggtggtcgat gaccagcggc gtgccgcacg 1980
cgacgcacaa gtatctgtac accgaatgat cgtcgggcga aggcacgtcg gcctccaagt 2040
ggcaatattg gcaaattcga aaatatatac agttgggttg tttgcgcata tctatcgtgg 2100
cgttgggcat gtacgtccga acgttgattt gcatgcaagc cgaaattaaa tcattgcgat 2160
tagtgcgatt aaaacgttgt acatcctcgc ttttaatcat gccgtcgatt aaatcgcgca 2220
atcgagtcaa gtgatcaaag tgtggaataa tgttttcttt gtattcccga gtcaagcgca 2280
gcgcgtattt taacaaacta gccatcttgt aagttagttt catttaatgc aactttatcc 2340
aataatatat tatgtatcgc acgtcaagaa ttaacaatgc gcccgttgtc gcatctcaac 2400
acgactatga tagagatcaa ataaagcgcg aattaaatag cttgcgacgc aacgtgcacg 2460
atctgtgcac gcgttccggc acgagctttg attgtaataa gtttttacga agcgatgaca 2520
tgacccccgt agtgacaacg atcacgccca aaagaactgc cgactacaaa attaccgagt 2580
atgtcggtga cgttaaaact attaagccat ccaatcgacc gttagtcgaa tcaggaccgc 2640
tggtgcgaga agccgcgaag tatggcgaat gcatcgtata acgtgtggag tccgctcatt 2700
agagcgtcat gtttagacaa gaaagctaca tatttaattg atcccgatga ttttattgat 2760
aaattgaccc taactccata cacggtattc tacaatggcg gggttttggt caaaatttcc 2820
ggactgcgat tgtacatgct gttaacggct ccgcccacta ttaatgaaat taaaaattcc 2880
aattttaaaa aacgcagcaa gagaaacatt tgtatgaaag aatgcgtaga aggaaagaaa 2940
aatgtcgtcg acatgctgaa caacaagatt aatatgcctc cgtgtataaa aaaaatattg 3000
aacgatttga aagaaaacaa tgtaccgcgc ggcggtatgt acaggaagag gtttatacta 3060
aactgttaca ttgcaaacgt ggtttcgtgt gccaagtgtg aaaaccgatg tttaatcaag 3120
gctctgacgc atttctacaa ccacgactcc aagtgtgtgg gtgaagtcat gcatctttta 3180
atcaaatccc aagatgtgta taaaccacca aactgccaaa aaatgaaaac tgtcgacaag 3240
ctctgtccgt ttgctggcaa ctgcaagggt ctcaatccta tttgtaatta ttgaataata 3300
aaacaattat aaatgctaaa tttgtttttt attaacgata caaaccaaac gcaacaagaa 3360
catttgtagt attatctata attgaaaacg cgtagttata atcgctgagg taatatttaa 3420
aatcattttc aaatgattca cagttaattt gcgacaatat aattttattt tcacataaac 3480
tagacgcctt gtcgtcttct tcttcgtatt ccttctcttt ttcatttttc tcctcataaa 3540
aattaacata gttattatcg tatccatata tgtatctatc gtatagagta aattttttgt 3600
tgtcataaat atatatgtct tttttaatgg ggtgtatagt accgctgcgc atagtttttc 3660
tgtaatttac aacagtgcta ttttctggta gttcttcgga gtgtgttgct ttaattatta 3720
aatttatata atcaatgaat ttgggatcgt cggttttgta caatatgttg ccggcatagt 3780
acgcagcttc ttctagttca attacaccat tttttagcag caccggatta acataacttt 3840
ccaaaatgtt gtacgaaccg ttaaacaaaa acagttcacc tcccttttct atactattgt 3900
ctgcgagcag ttgtttgttg ttaaaaataa cagccattgt aatgagacgc acaaactaat 3960
atcacaaact ggaaatgtct atcaatatat agttgctgat atcatggaga taattaaaat 4020
gataaccatc tcgcaaataa ataagtattt tactgttttc gtaacagttt tgtaataaaa 4080
aaacctataa atattccgga ttattcatac cgtcccacca tcgggcgcgg atccgccacc 4140
atgtccgacg gtgctgtgca gcccgacggt ggccagcccg ctgtgcgtaa cgagcgtgct 4200
accggttccg gtaacggttc aggcggaggt ggaggtggtg gttccggcgg tgtgggcatc 4260
tccaccggca ccttcaacaa ccagaccgag ttcaagttcc tcgagaacgg ttgggtggag 4320
atcaccgcta actcctcccg tctggtgcac ctgaacatgc ccgagtccga gaactaccgt 4380
cgtgtggtgg tgaacaacct ggacaagacc gctgtgaacg gtaacatggc tctggacgac 4440
acccacgctc agatcgtgac cccctggtcc ctggtggacg ctaacgcttg gggcgtgtgg 4500
ttcaaccccg gtgactggca gctgatcgtg aacaccatgt ccgagctgca cctggtgtcc 4560
ttcgagcaag agatcttcaa cgtcgtcctc aagaccgtgt ccgagtccgc tacccagccc 4620
cccaccaagg tgtacaacaa cgacctgacc gcttccctga tggtcgctct ggactccaac 4680
aacaccatgc ccttcacccc cgctgctatg cgttccgaga ccctgggctt ctacccctgg 4740
aagcccacca tccccacccc ctggcgttac tacttccagt gggaccgtac cctgatcccc 4800
tcccacaccg gtacttccgg cacccccacc aacatctacc acggcaccga ccccgacgac 4860
gtgcagttct acaccatcga gaactccgtg cccgtgcacc tgctgcgtac cggtgacgag 4920
ttcgctaccg gaaccttctt cttcgactgc aagccctgcc gtctgaccca cacctggcag 4980
accaaccgtg ctctgggtct gcctcccttc ctgaactccc tgccccaggc tgagggtggc 5040
accaacttcg gttacatcgg tgtgcagcag gacaagcgtc gtggtgtgac ccagatgggt 5100
aacaccaact acatcaccga ggctaccatc atgcgtcccg ctgaggtcgg ctactccgct 5160
ccctactact ccttcgaggc ttccacccag ggccccttca agacccccat cgctgctggt 5220
cgtggtggtg ctcagaccga cgagaaccag gctgctgacg gtgacccccg ttacgctttc 5280
ggtcgtcagc acggccaaaa gaccaccacc accggcgaga cccccgagcg tttcacctac 5340
atcgctcacc aggacaccgg tcgttacccc gagggcgact ggattcagaa catcaacttc 5400
aacctgcccg tgaccgagga caacgtgctg ctgcccaccg accccatcgg tggcaagacc 5460
ggtatcaact acactaacat cttcaacacc tacggtcctc tgaccgctct gaacaacgtg 5520
ccccccgtgt accccaacgg ccagatctgg gacaaggagt tcgacaccga cctgaagccc 5580
cgtctgcacg tgaacgctcc cttcgtgtgc cagaacaact gccctggcca gctgttcgtc 5640
aaggtggccc ccaacctgac caacgagtac gaccctgacg cttccgctaa catgtcccgt 5700
atcgtgacct actccgactt ctggtggaag ggcaagctgg tgttcaaggc caagctgcgt 5760
gcttctcaca cctggaaccc catccagcag atgtccatca acgtggacaa ccagttcaac 5820
tacgtgccct ccaacatcgg tggaatgaag atcgtgtacg agaagtccca gctggctccc 5880
cgtaagctgt actaataatc tagaattccg gagcggccgc tgcagatctg atcctttcct 5940
gggacccggc aagaaccaaa aactcactct cttcaaggaa atccgtaatg ttaaacccga 6000
cacgatgaag cttgtcgttg gatggaaagg aaaagagttc tacagggaaa cttggacccg 6060
cttcatggaa gacagcttcc ccattgttaa cgaccaagaa gtgatggatg ttttccttgt 6120
tgtcaacatg cgtcccacta gacccaaccg ttgttacaaa ttcctggccc aacacgctct 6180
gcgttgcgac cccgactatg tacctcatga cgtgattagg atcgtcgagc cttcatgggt 6240
gggcagcaac aacgagtacc gcatcagcct ggctaagaag ggcggcggct gcccaataat 6300
gaaccttcac tctgagtaca ccaactcgtt cgaacagttc atcgatcgtg tcatctggga 6360
gaacttctac aagcccatcg tttacatcgg taccgactct gctgaagagg aggaaattct 6420
ccttgaagtt tccctggtgt tcaaagtaaa ggagtttgca ccagacgcac ctctgttcac 6480
tggtccggcg tattaaaaca cgatacattg ttattagtac atttattaag cgctagattc 6540
tgtgcgttgt tgatttacag acaattgttg tacgtatttt aataattcat taaatttata 6600
atctttaggg tggtatgtta gagcgaaaat caaatgattt tcagcgtctt tatatctgaa 6660
tttaaatatt aaatcctcaa tagatttgta aaataggttt cgattagttt caaacaaggg 6720
ttgtttttcc gaaccgatgg ctggactatc taatggattt tcgctcaacg ccacaaaact 6780
tgccaaatct tgtagcagca atctagcttt gtcgatattc gtttgtgttt tgttttgtaa 6840
taaaggttcg acgtcgttca aaatattatg cgcttttgta tttctttcat cactgtcgtt 6900
agtgtacaat tgactcgacg taaacacgtt aaataaagct tggacatatt taacatcggg 6960
cgtgttagct ttattaggcc gattatcgtc gtcgtcccaa ccctcgtcgt tagaagttgc 7020
ttccgaagac gattttgcca tagccacacg acgcctatta attgtgtcgg ctaacacgtc 7080
cgcgatcaaa tttgtagttg agctttttgg aattatttct gattgcgggc gtttttgggc 7140
gggtttcaat ctaactgtgc ccgattttaa ttcagacaac acgttagaaa gcgatggtgc 7200
aggcggtggt aacatttcag acggcaaatc tactaatggc ggcggtggtg gagctgatga 7260
taaatctacc atcggtggag gcgcaggcgg ggctggcggc ggaggcggag gcggaggtgg 7320
tggcggtgat gcagacggcg gtttaggctc aaatgtctct ttaggcaaca cagtcggcac 7380
ctcaactatt gtactggttt cgggcgccgt ttttggtttg accggtctga gacgagtgcg 7440
atttttttcg tttctaatag cttccaacaa ttgttgtctg tcgtctaaag gtgcagcggg 7500
ttgaggttcc gtcggcattg gtggagcggg cggcaattca gacatcgatg gtggtggtgg 7560
tggtggaggc gctggaatgt taggcacggg agaaggtggt ggcggcggtg ccgccggtat 7620
aatttgttct ggtttagttt gttcgcgcac gattgtgggc accggcgcag gcgccgctgg 7680
ctgcacaacg gaaggtcgtc tgcttcgagg cagcgcttgg ggtggtggca attcaatatt 7740
ataattggaa tacaaatcgt aaaaatctgc tataagcatt gtaatttcgc tatcgtttac 7800
cgtgccgata tttaacaacc gctcaatgta agcaattgta ttgtaaagag attgtctcaa 7860
gctcgccgca cgccgataac aagccttttc atttttacta cagcattgta gtggcgagac 7920
acttcgctgt cgtcgacgta catgtatgct ttgttgtcaa aaacgtcgtt ggcaagcttt 7980
aaaatattta aaagaacatc tctgttcagc accactgtgt tgtcgtaaat gttgtttttg 8040
ataatttgcg cttccgcagt atcgacacgt tcaaaaaatt gatgcgcatc aattttgttg 8100
ttcctattat tgaataaata agattgtaca gattcatatc tacgattcgt catggccacc 8160
acaaatgcta cgctgcaaac gctggtacaa ttttacgaaa actgcaaaaa cgtcaaaact 8220
cggtataaaa taatcaacgg gcgctttggc aaaatatcta ttttatcgca caagcccact 8280
agcaaattgt atttgcagaa aacaatttcg gcgcacaatt ttaacgctga cgaaataaaa 8340
gttcaccagt taatgagcga ccacccaaat tttataaaaa tctattttaa tcacggttcc 8400
atcaacaacc aagtgatcgt gatggactac attgactgtc ccgatttatt tgaaacacta 8460
caaattaaag gcgagctttc gtaccaactt gttagcaata ttattagaca gctgtgtgaa 8520
gcgctcaacg atttgcacaa gcacaatttc atacacaacg acataaaact cgaaaatgtc 8580
ttatatttcg aagcacttga tcgcgtgtat gtttgcgatt acggattgtg caaacacgaa 8640
aactcactta gcgtgcacga cggcacgttg gagtatttta gtccggaaaa aattcgacac 8700
acaactatgc acgtttcgtt tgactggtac gcggcgtgtt aacatacaag ttgctaacgt 8760
aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 8820
tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc taactcacat 8880
taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcatt 8940
aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct tccgcttcct 9000
cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 9060
aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 9120
aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 9180
tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 9240
caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 9300
cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 9360
ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 9420
gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 9480
agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 9540
gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 9600
acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 9660
gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 9720
gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 9780
cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 9840
caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 9900
gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct 9960
cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta 10020
cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct 10080
caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg 10140
gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa 10200
gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt 10260
cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta 10320
catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca 10380
gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta 10440
ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct 10500
gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg 10560
cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg gggcgaaaac 10620
tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact 10680
gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca ggaaggcaaa 10740
atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 10800
ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 10860
gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 10920
acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 10980
cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 11040
agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 11100
cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 11160
tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca 11220
tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct 11280
cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa 11340
cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc cagtgcc 11387
<210> 12
<211> 11385
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pMEB073
<400> 12
ctagaattcc ggagcggccg ctgcagatct gatcctttcc tgggacccgg caagaaccaa 60
aaactcactc tcttcaagga aatccgtaat gttaaacccg acacgatgaa gcttgtcgtt 120
ggatggaaag gaaaagagtt ctacagggaa acttggaccc gcttcatgga agacagcttc 180
cccattgtta acgaccaaga agtgatggat gttttccttg ttgtcaacat gcgtcccact 240
agacccaacc gttgttacaa attcctggcc caacacgctc tgcgttgcga ccccgactat 300
gtacctcatg acgtgattag gatcgtcgag ccttcatggg tgggcagcaa caacgagtac 360
cgcatcagcc tggctaagaa gggcggcggc tgcccaataa tgaaccttca ctctgagtac 420
accaactcgt tcgaacagtt catcgatcgt gtcatctggg agaacttcta caagcccatc 480
gtttacatcg gtaccgactc tgctgaagag gaggaaattc tccttgaagt ttccctggtg 540
ttcaaagtaa aggagtttgc accagacgca cctctgttca ctggtccggc gtattaaaac 600
acgatacatt gttattagta catttattaa gcgctagatt ctgtgcgttg ttgatttaca 660
gacaattgtt gtacgtattt taataattca ttaaatttat aatctttagg gtggtatgtt 720
agagcgaaaa tcaaatgatt ttcagcgtct ttatatctga atttaaatat taaatcctca 780
atagatttgt aaaataggtt tcgattagtt tcaaacaagg gttgtttttc cgaaccgatg 840
gctggactat ctaatggatt ttcgctcaac gccacaaaac ttgccaaatc ttgtagcagc 900
aatctagctt tgtcgatatt cgtttgtgtt ttgttttgta ataaaggttc gacgtcgttc 960
aaaatattat gcgcttttgt atttctttca tcactgtcgt tagtgtacaa ttgactcgac 1020
gtaaacacgt taaataaagc ttggacatat ttaacatcgg gcgtgttagc tttattaggc 1080
cgattatcgt cgtcgtccca accctcgtcg ttagaagttg cttccgaaga cgattttgcc 1140
atagccacac gacgcctatt aattgtgtcg gctaacacgt ccgcgatcaa atttgtagtt 1200
gagctttttg gaattatttc tgattgcggg cgtttttggg cgggtttcaa tctaactgtg 1260
cccgatttta attcagacaa cacgttagaa agcgatggtg caggcggtgg taacatttca 1320
gacggcaaat ctactaatgg cggcggtggt ggagctgatg ataaatctac catcggtgga 1380
ggcgcaggcg gggctggcgg cggaggcgga ggcggaggtg gtggcggtga tgcagacggc 1440
ggtttaggct caaatgtctc tttaggcaac acagtcggca cctcaactat tgtactggtt 1500
tcgggcgccg tttttggttt gaccggtctg agacgagtgc gatttttttc gtttctaata 1560
gcttccaaca attgttgtct gtcgtctaaa ggtgcagcgg gttgaggttc cgtcggcatt 1620
ggtggagcgg gcggcaattc agacatcgat ggtggtggtg gtggtggagg cgctggaatg 1680
ttaggcacgg gagaaggtgg tggcggcggt gccgccggta taatttgttc tggtttagtt 1740
tgttcgcgca cgattgtggg caccggcgca ggcgccgctg gctgcacaac ggaaggtcgt 1800
ctgcttcgag gcagcgcttg gggtggtggc aattcaatat tataattgga atacaaatcg 1860
taaaaatctg ctataagcat tgtaatttcg ctatcgttta ccgtgccgat atttaacaac 1920
cgctcaatgt aagcaattgt attgtaaaga gattgtctca agctccgcac gccgataaca 1980
agccttttca tttttactac agcattgtag tggcgagaca cttcgctgtc gtcgacgtac 2040
atgtatgctt tgttgtcaaa aacgtcgttg gcaagcttta aaatatttaa aagaacatct 2100
ctgttcagca ccactgtgtt gtcgtaaatg ttgtttttga taatttgcgc ttccgcagta 2160
tcgacacgtt caaaaaattg atgcgcatca attttgttgt tcctattatt gaataaataa 2220
gattgtacag attcatatct acgattcgtc atggccacca caaatgctac gctgcaaacg 2280
ctggtacaat tttacgaaaa ctgcaaaaac gtcaaaactc ggtataaaat aatcaacggg 2340
cgctttggca aaatatctat tttatcgcac aagcccacta gcaaattgta tttgcagaaa 2400
acaatttcgg cgcacaattt taacgctgac gaaataaaag ttcaccagtt aatgagcgac 2460
cacccaaatt ttataaaaat ctattttaat cacggttcca tcaacaacca agtgatcgtg 2520
atggactaca ttgactgtcc cgatttattt gaaacactac aaattaaagg cgagctttcg 2580
taccaacttg ttagcaatat tattagacag ctgtgtgaag cgctcaacga tttgcacaag 2640
cacaatttca tacacaacga cataaaactc gaaaatgtct tatatttcga agcacttgat 2700
cgcgtgtatg tttgcgatta cggattgtgc aaacacgaaa actcacttag cgtgcacgac 2760
ggcacgttgg agtattttag tccggaaaaa attcgacaca caactatgca cgtttcgttt 2820
gactggtacg cggcgtgtta acatacaagt tgctaaccgg cggttcgtaa tcatggtcat 2880
agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa 2940
gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc 3000
gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc 3060
aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact 3120
cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 3180
ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 3240
aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 3300
acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 3360
gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 3420
ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 3480
gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 3540
cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 3600
taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 3660
atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga 3720
cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 3780
cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 3840
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 3900
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 3960
tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 4020
aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc 4080
tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg 4140
gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag 4200
atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt 4260
tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag 4320
ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 4380
ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 4440
tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 4500
ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 4560
ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 4620
tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca 4680
gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 4740
taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 4800
cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 4860
agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 4920
gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 4980
ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa 5040
ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg 5100
cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag 5160
cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg 5220
gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc 5280
atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt 5340
cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 5400
gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt 5460
cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca gtgccaagct ttactcgtaa agcgagttga 5520
aggatcatat ttagttgcgt ttatgagata agattgaaag cacgtgtaaa atgtttcccg 5580
cgcgttggca caactattta caatgcggcc aagttataaa agattctaat ctgatatgtt 5640
ttaaaacacc tttgcggccc gagttgtttg cgtacgtgac tagcgaagaa gatgtgtgga 5700
ccgcagaaca gatagtaaaa caaaacccta gtattggagc aataatcgat ttaaccaaca 5760
cgtctaaata ttatgatggt gtgcattttt tgcgggcggg cctgttatac aaaaaaattc 5820
aagtacctgg ccagactttg ccgcctgaaa gcatagttca agaatttatt gacacggtaa 5880
aagaatttac agaaaagtgt cccggcatgt tggtgggcgt gcactgcaca cacggtatta 5940
atcgcaccgg ttacatggtg tgcagatatt taatgcacac cctgggtatt gcgccgcagg 6000
aagccataga tagattcgaa aaagccagag gtcacaaaat tgaaagacaa aattacgttc 6060
aagatttatt aatttaatta atattatttg cattctttaa caaatacttt atcctatttt 6120
caaattgttg cgcttcttcc agcgaaccaa aactatgctt cgcttgctcc gtttagcttg 6180
tagccgatca gtggcgttgt tccaatcgac ggtaggatta ggccggatat tctccaccac 6240
aatgttggca acgttgatgt tacgtttatg cttttggttt tccacgtacg tcttttggcc 6300
ggtaatagcc gtaaacgtag tgccgtcgcg cgtcacgcac aacaccggat gtttgcgctt 6360
gtccgcgggg tattgaaccg cgcgatccga caaatccacc actttggcaa ctaaatcggt 6420
gacctgcgcg tcttttttct gcattatttc gtctttcttt tgcatggttt cctggaagcc 6480
ggtgtacatg cggtttagat cagtcatgac gcgcgtgacc tgcaaatctt tggcctcgat 6540
ctgcttgtcc ttgatggcaa cgatgcgttc aataaactct tgttttttaa caagttcctc 6600
ggttttttgc gccaccaccg cttgcagcgc gtttgtgtgc tcggtgaatg tcgcaatcag 6660
cttagtcacc aactgtttgc tctcctcctc ccgttgtttg atcgcgggat cgtacttgcc 6720
ggtgcagagc acttgaggaa ttacttcttc taaaagccat tcttgtaatt ctatggcgta 6780
aggcaatttg gacttcataa tcagctgaat cacgccggat ttagtaatga gcactgtatg 6840
cggctgcaaa tacagcgggt cgcccctttt cacgacgctg ttagaggtag ggcccccatt 6900
ttggatggtc tgctcaaata acgatttgta tttattgtct acatgaacac gtatagcttt 6960
atcacaaact gtatatttta aactgttagc gacgtccttg gccacgaacc ggacctgttg 7020
gtcgcgctct agcacgtacc gcaggttgaa cgtatcttct ccaaatttaa attctccaat 7080
tttaacgcga gccattttga tacacgtgtg tcgattttgc aacaactatt gttttttaac 7140
gcaaactaaa cttattgtgg taagcaataa ttaaatatgg gggaacatgc gccgctacaa 7200
cactcgtcgt tatgaacgca gacggcgccg gtctcggcgc aagcggctaa aacgtgttgc 7260
gcgttcaacg cggcaaacat cgcaaaagcc aatagtacag ttttgatttg catattaacg 7320
gcgatttttt aaattatctt atttaataaa tagttatgac gcctacaact ccccgcccgc 7380
gttgactcgc tgcacctcga gcagttcgtt gacgccttcc tccgtgtggc cgaacacgtc 7440
gagcgggtgg tcgatgacca gcggcgtgcc gcacgcgacg cacaagtatc tgtacaccga 7500
atgatcgtcg ggcgaaggca cgtcggcctc caagtggcaa tattggcaaa ttcgaaaata 7560
tatacagttg ggttgtttgc gcatatctat cgtggcgttg ggcatgtacg tccgaacgtt 7620
gatttgcatg caagccgaaa ttaaatcatt gcgattagtg cgattaaaac gttgtacatc 7680
ctcgctttta atcatgccgt cgattaaatc gcgcaatcga gtcaagtgat caaagtgtgg 7740
aataatgttt tctttgtatt cccgagtcaa gcgcagcgcg tattttaaca aactagccat 7800
cttgtaagtt agtttcattt aatgcaactt tatccaataa tatattatgt atcgcacgtc 7860
aagaattaac aatgcgcccg ttgtcgcatc tcaacacgac tatgatagag atcaaataaa 7920
gcgcgaatta aatagcttgc gacgcaacgt gcacgatctg tgcacgcgtt ccggcacgag 7980
ctttgattgt aataagtttt tacgaagcga tgacatgacc cccgtagtga caacgatcac 8040
gcccaaaaga actgccgact acaaaattac cgagtatgtc ggtgacgtta aaactattaa 8100
gccatccaat cgaccgttag tcgaatcagg accgctggtg cgagaagccg cgaagtatgg 8160
cgaatgcatc gtataacgtg tggagtccgc tcattagagc gtcatgttta gacaagaaag 8220
ctacatattt aattgatccc gatgatttta ttgataaatt gaccctaact ccatacacgg 8280
tattctacaa tggcggggtt ttggtcaaaa tttccggact gcgattgtac atgctgttaa 8340
cggctccgcc cactattaat gaaattaaaa attccaattt taaaaaacgc agcaagagaa 8400
acatttgtat gaaagaatgc gtagaaggaa agaaaaatgt cgtcgacatg ctgaacaaca 8460
agattaatat gcctccgtgt ataaaaaaaa tattgaacga tttgaaagaa aacaatgtac 8520
cgcgcggcgg tatgtacagg aagaggttta tactaaactg ttacattgca aacgtggttt 8580
cgtgtgccaa gtgtgaaaac cgatgtttaa tcaaggctct gacgcatttc tacaaccacg 8640
actccaagtg tgtgggtgaa gtcatgcatc ttttaatcaa atcccaagat gtgtataaac 8700
caccaaactg ccaaaaaatg aaaactgtcg acaagctctg tccgtttgct ggcaactgca 8760
agggtctcaa tcctatttgt aattattgaa taataaaaca attataaatg ctaaatttgt 8820
tttttattaa cgatacaaac caaacgcaac aagaacattt gtagtattat ctataattga 8880
aaacgcgtag ttataatcgc tgaggtaata tttaaaatca ttttcaaatg attcacagtt 8940
aatttgcgac aatataattt tattttcaca taaactagac gccttgtcgt cttcttcttc 9000
gtattccttc tctttttcat ttttctcctc ataaaaatta acatagttat tatcgtatcc 9060
atatatgtat ctatcgtata gagtaaattt tttgttgtca taaatatata tgtctttttt 9120
aatggggtgt atagtaccgc tgcgcatagt ttttctgtaa tttacaacag tgctattttc 9180
tggtagttct tcggagtgtg ttgctttaat tattaaattt atataatcaa tgaatttggg 9240
atcgtcggtt ttgtacaata tgttgccggc atagtacgca gcttcttcta gttcaattac 9300
accatttttt agcagcaccg gattaacata actttccaaa atgttgtacg aaccgttaaa 9360
caaaaacagt tcacctccct tttctatact attgtctgcg agcagttgtt tgttgttaaa 9420
aataacagcc attgtaatga gacgcacaaa ctaatatcac aaactggaaa tgtctatcaa 9480
tatatagttg ctgatatcat ggagataatt aaaatgataa ccatctcgca aataaataag 9540
tattttactg ttttcgtaac agttttgtaa taaaaaaacc tataaatatt ccggattatt 9600
cataccgtcc caccatcggg cgcggatccc gggtcgacgc caccatgctg aagggcggcc 9660
agcctgctgt gagaaacgag agagccaccg gcagcggcaa tggcagcggc ggagggggcg 9720
gaggaggatc tggcggagtg ggcatcagca ccggcacctt caacaaccag accgagttca 9780
agttcctgga gaacggctgg gtggagatca ccgccaacag cagcagactg gtgcacctga 9840
acatgcccga gagcgagaac taccggagag tggtggtgaa caacctggac aagaccgccg 9900
tgaacggcaa tatggccctg gatgacaccc acgcccagat cgtgaccccc tggagcctgg 9960
tggacgccaa cgcctgggga gtgtggttca accctggcga ctggcagctg atcgtgaaca 10020
ccatgagcga gctgcacctg gtgtccttcg agcaggagat tttcaacgtg gtgctgaaaa 10080
ccgtgtccga gagcgccacc cagcccccca ccaaagtgta caacaacgac ctgaccgcct 10140
ccctgatggt ggccctggac agcaacaaca ccatgccctt cacccctgcc gccatgagaa 10200
gcgagaccct gggcttctac ccttggaagc ccaccatccc caccccttgg cggtactact 10260
tccagtggga caggaccctg atccccagcc acaccggcac cagcggcacc cctaccaata 10320
tctaccacgg caccgaccct gatgacgtgc agttctacac catcgagaac agcgtgcctg 10380
tgcacctgct gagaaccggc gacgagttcg ccaccggcac attcttcttc gactgcaagc 10440
cctgcagact gacccacacc tggcagacca acagagccct gggcctgcct cctttcctga 10500
acagcctgcc ccaggccgag ggcggcacca acttcggcta catcggcgtg cagcaggaca 10560
agagaagagg cgtgacccag atgggcaaca ccaactacat caccgaggcc accatcatga 10620
gacccgccga agtgggctac agcgccccct actacagctt cgaggccagc acccagggcc 10680
ccttcaagac ccccatcgcc gctggcagag gcggagccca gaccgacgag aaccaggccg 10740
ccgacggcga ccccagatac gccttcggca gacagcacgg ccagaaaacc accaccaccg 10800
gcgagacccc cgagagattc acctacatcg cccaccagga caccggcaga taccccgagg 10860
gcgactggat tcagaacatc aacttcaacc tgcccgtgac cgaggataat gtgctgctgc 10920
ccaccgaccc catcggcggc aagaccggca tcaactacac caacatcttc aacacctacg 10980
gccccctgac cgccctgaat aacgtgcccc ccgtgtaccc caacggccag atttgggaca 11040
aggagttcga caccgacctg aagcctaggc tgcacgtgaa tgcccccttc gtgtgtcaga 11100
acaactgccc tggccagctg tttgtgaaag tggcccccaa cctgaccaac gagtacgatc 11160
ctgacgccag cgccaacatg agccggatcg tgacctacag cgacttctgg tggaagggca 11220
agctggtgtt caaggccaag ctgagagcca gccacacatg gaaccccatc cagcagatga 11280
gcatcaacgt ggacaaccag ttcaactacg tgcccagcaa tatcggcggc atgaagatcg 11340
tgtacgagaa gagccagctg gcccccagaa agctgtactg ataat 11385
<---