Способ определения антибиотиков в сыром молоке
METHOD FOR DETERMINING ANTIBIOTICS IN RAW MILK

Изобретение относится к области молочной промышленности и может быть использовано при анализе сырого молока для определения опасных для живых организмов антибиотиков, предпочтительно, непосредственно на ферме и/или ином сельскохозяйственном комплексе.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Из уровня техники известен способ определения антибиотиков, содержащих β-лактамный цикл, в жидкости биологического происхождения, включающий следующие стадии: приведение определенного объема указанной жидкости биологического происхождения в контакт с некоторым количеством распознающего агента и термостатирование полученной при этом смеси в условиях, в которых возможно комплексообразование антибиотиков, которые могут присутствовать в указанной биологической жидкости, с распознающим агентом; приведение смеси, полученной на стадии, в контакт с, по меньшей мере, одним эталонным антибиотиком, иммобилизованным на подложке, в условиях, которые делают возможным образование комплекса эталонного антибиотика с тем количеством распознающего агента, которое, не прореагировало на первой стадии; и определенное количество распознающего агента, связанного с подложкой, по которому судят о количестве антибиотика в исследуемой жидкости, при этом распознающий агент представляет собой рецептор, чувствительный к антибиотикам, содержащим β-лактамное кольцо, полученный из Bacillus licheniformis (RU 2213973 С2, 10.10.2003).
Известна иммунохроматографическая тест-полоска для одновременного определения наличия четырех групп антибиотиков и казеина в молоке или молочных продуктах, представляющая собой конструкцию, выполненную из подложки с последовательно закрепленными на ее поверхности поочередно в ряд четырьмя мембранами, первая из которых фильтрующая мембрана для нанесения исследуемого образца, вторая из которых конъюгатная мембрана с нанесенными на ее поверхность компонентами, конъюгированными с меткой и специфично связывающие антибиотики и казеин, третья из которых рабочая мембрана, поверхность которой включает контрольную область тест-область для определения антибиотика группы β-лактамов, тест-область для определения антибиотика группы тетрациклинов, тест-область для определения антибиотика группы стрептомицинов, тест-область для определения антибиотика группы производных левомицетина, тест-область для определения казеина, где тест-область включает конъюгат белка-носителя с определяемым антигеном, четвертая из которых адсорбирующая мембрана (RU 191660 U1, 15.08.2019).
3
3
4
2
4
Известен способ количественного определения левомицетина методом дифференциальной вольтамперометрии, заключающийся в том, что левомицетин переводят из пробы в раствор, проводят кислотный гидролиз и осаждают белок из гидролизата с последующим вольтамперометрическим определением, при этом вольтамперометрическое определение левомицетина осуществляют путем регистрации катодных пиков антибиотика на индикаторном ртутно-пленочном или стеклоуглеродном электродах в дифференциальном режиме съемки вольтамперограмм при соответствующих потенциалах -(0,67±0,05) В и -(0,60±0,03) В относительно насыщенного хлорид серебряного электрода на фонах 0,1 моль/дм аммония лимоннокислого двузамещенного (рН 4,7-5,1) или 0,1 моль/дм (NH)SO с добавлением HCl до рН 5,1 при скорости развертки потенциала 10-25 мВ/с, и концентрацию левомицетина определяют до высоте пика методом добавок аттестованных смесей (RU 2180748 С1, 20.03.2002).
Известно устройство для хроматографического анализа, используемое для иммуноанализов, которое позволяет проводить быстрые и удобные анализы биологически важных аналитов и выполнять необходимые экстракции in situ без использования отдельного оборудования для экстракции. Устройство обладает широким динамическим диапазоном и защищено от влияния частиц или окрашенных компонентов. В одной из форм устройство включает в себя первый противоблок, содержащий зону приготовления образца, приспособленную для получения исследуемого образца, и. второй противоблок, содержащий хроматографическую среду, первый и второй противоблоки могут быть установлены друг против друга с тем, чтобы прикладыванием к хроматографической среде зоны приготовления образца перенести в нее исследуемый образец, предпочтительно, когда аналит обнаруживается с помощью визуально детектируемой метки, другие варианты устройства отличаются расположением блоков с целью обеспечения оптимальной хроматографии ряда аналитов, а также осуществления двунаправленной хроматографии; последующие варианты оказываются подходящими для проведения конкурентных иммуноанализов (RU 2124729 С1, 10.01.1999).
Наиболее близким аналогом заявленного изобретения является система обнаружения остатков антибиотиков и определения их концентраций в молоке, содержащая канал притока молока и термостатированные параллельные каналы потока молока, каждый из которых содержит кислородный датчик, интегрированный с разным ферментом, формирующий датчик, которые вместе формируют массив биодатчиков, и средство сепарации нестандартного молока, подключенное к устройству обработки сигналов, и канал оттока молока, при этом для одновременного обнаружения различных антибиотиков и определения их концентрации во время дойки в реальном времени система содержит дополнительный параллельный канал потока молока, включающий в себя кислородный датчик с носителем фермента, но без фермента, и устройство гидролиза, расположенное между каналом притока молока и параллельными каналами потока молока, и упомянутое устройство гидролиза содержит физическое и/или химическое средство для регулируемого гидролиза лактозы для получения заданных равных концентраций глюкозы и галактозы в каждой исследуемой пробе молока, и каждый биодатчик в массиве биодатчиков интегрирован с разным ферментом, который катализирует окисление глюкозы и галактозы молекулярным растворенным кислородом, и каталитическая активность упомянутых ферментов увеличивается или уменьшается в присутствии антибиотиков, и количество упомянутых ферментов достаточно для генерирования уменьшения переходной фазы концентрации кислорода, которая измеряется с заданной точностью перед тем, как анализируемое молоко смешивается с молоком высокого качества (RU 2524624 С2, 27.07.2014).
Существенным недостатком известных технических решений является длительность, сложность и трудоемкость их реализации.
ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание, эффективного способа определения наличия антибиотиков в сыром молоке, предпочтительно непосредственно во время дойки.
Технический результат, достигаемый при решении поставленной задачи, заключается в создании быстрого и точного способа определения наличия антибиотиков в сыром молоке.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для достижения указанного технического результата предложен способ определения антибиотиков в сыром молоке, который включает отбор проб сырого молока; приготовление буферного раствора с рН, выбранным из диапазона 4,0-8,0; нанесение полученного буферного раствора на электроды электрохимических сенсоров; проведение измерений проб сырого молока с использованием сенсорной платформы, состоящей из тест-полоски и потенциостата, при этом тест-полоски с электродами изготавливают с помощью трафаретной или струйной печати на подложке, и они представляют собой массив электродов, при этом селективный слой на поверхность электродов наносится с помощью химической модификации поверхности при использовании полиэлектролитов, в качестве селективного элемента используют аптамеры, а потенциостат включает в себя модули для наложения и снятия электрического сигнала, модули для преобразования и передачи сигнала; при этом обработку полученных электрических сигналов производят методом математической статистики, полученные значения сравнивают с эталонными значениями, и по результату данного сравнения определяют наличие антибиотиков в сыром молоке и их концентрацию с определенной точностью. При этом, в качестве антибиотиков можно определять антибиотики бета-лактамного типа, тетрациклиновой группы, левомицетина и стрептомицина.
При этом, процесс определения антибиотиков в сыром молоке можно производить непосредственно во время дойки.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Наличие и концентрацию антибиотиков в сыром молоке определяют с помощью устройства, которое представляет собой тест-полоску с электродами и подключенный к ней потенциостат, при этом обработка данных осуществляется с помощью программного обеспечения.
В одном аспекте настоящего изобретения, способ определения антибиотиков в сыром молоке включает следующие стадии:
- подготовка проб сырого молока, предпочтительно сразу после дойки или непосредственно во время дойки;
- нанесение проб сырого молока на поверхность тест-полосок, содержащих электроды с электрохимическими сенсорами;
- приготовление фосфатного буферного раствора, например, к 250,0 мл 0,2 М раствора калия дигидрофосфата прибавляют 175,0 мл 0,2 М раствора натрия гидроксида. Доводят объем раствора водой до 1000,0 мл и, при необходимости, корректируют рН;
- предварительное нанесение на поверхность электродов слоя соли, которая при взаимодействии с молоком создает буферный раствор с рН 4,0-8,0, для более точного проведения анализа;
- проведение электрохимических измерений с помощью потенциостата, для чего к электродам электрохимического сенсора прикладывают различные развертки по напряжению, при этом происходит окисление или восстановление антибиотика на поверхности электрода, либо образование комплексов на поверхности электрода;
- регистрация вольтамперных зависимостей процессов с помощью потенциостата;
- преобразование и обработка полученных электрических сигналов методом математической статистики;
- сравнение полученных значений с эталонными значениями;
- определение наличия антибиотиков в сыром молоке и количественного содержания.
Предпочтительно, что в качестве антибиотиков определяют антибиотики бета-лактамного типа, тетрациклиновой группы, левомицетина и стрептомицина.
3
Предпочтительно, чтобы определение антибиотиков в молоке происходило непосредственно во время дойки. Для этого сенсорную платформу встраивают в автоматическую систему доения, и проведение анализа пробы происходит в камере объемом, предпочтительно, не менее 2 см, в которую осуществляют отбор сырого молока непосредственно во время доения. В этой же камере находятся непосредственно и тест-полоски, содержащие электроды электрохимических сенсоров, предварительно нанесенным. на них буферным раствором с выбранным из диапазона рН 4,0-8,0.
В качестве буферного раствора можно использовать натрий-фосфатный буфер, который представляет собой водный раствор солей, содержащий хлорид натрия, гидрофосфат натрия, хлорид калия и дигидрофосфат калия, а также натрий-ацетатный буфер, содержащий ацетат натрия и уксусную кислоту.
При этом общее время анализа пробы сырого молока составляет не более 20 мин.
При этом вышеописанный способ осуществляют с помощью устройства, которое представляет собой тест-систему: тест-полоску с электродами, подключенный к ним потенциостат, и программное обеспечение, осуществляющее обработку полученных данных.
Тест-полоску с электродами изготавливают с помощью трафаретной или струйной печати на подложке, при этом тест-полоска представляет собой массив электродов. В качестве электродов используют металлы переходной группы и их оксиды, предпочтительно медь, серебро, хром, марганец, железо, кобальт, никель, цинк, кадмий, галлий, титан, ванадий, а также различные модификации углерода, предпочтительно графит, стеклоуглерод, угольная сажа, микрочастицы углерода.
На поверхность электродов с помощью химической модификации поверхности наносится селективный слой. Селективный слой содержит селективные элементы аптамеры, которые иммобилизуются на поверхности электрода.
Для иммобилизации аптамеров используют метод последовательного ионного наслаивания, что позволяет увеличить количество нанесенных на электрод аптамеров и приводит к увеличению чувствительности электрохимического сенсора. В качестве соиммобилизуемого слоя возможно использование полиэлектролитов различного заряда, молекулярного веса и разной силы. Полиэлектролиты представляют собой органический материал или полимер, выбранный из группы, включающей полиалкиленимин или состоящей из них, например полиэтиленимина, полистиролсульфоната, полиаллиламина, поливинилового спирта, полигидроксимаслянной кислоты, полистирола, полидиаллилдиметиламмонийхлорида, полиметакриловой кислоты, полиалкиленгликоля, например полиэтиленгликоль, поливинилпиридина и биополимеры, в частности полимеры на основе полисахаридов, и полиаминокислоты, такие как желатин, хитозан, агароза, целлюлоза, альгиновая кислота, декстран, казеин, полиаргинин, полиглицин, полиглутаминовая кислота, полиаспарагиновая кислота и производные, сополимеры или смеси.
Использование полиэлектролитов позволяет эффективно иммобилизировать аптамеры на поверхности электрода благодаря структуре полиэлектролитов и их физико-химическим свойствам. Последний адсорбированный слой на поверхности электрода должен обеспечить предотвращение неспецифической адсорбции. В качестве первого слоя используют катионный водорастворимый полиэлектролит. Молекулярный вес полиэлекгролитов подбирается для эффективного ноструктурирования с иммобилизуемыми биологическими молекулами. Выбор катионного полиэлектролита также объясняется тем, что следующий слой - аптамеры, при заданных рН имеет частично отрицательный заряд. Дальнейшее нанесение противоположно заряженных слоев полиэлектролитов проводят с целью создания барьера между анализируемым раствором и нанесенным чувствительным слоем - аптамерами. Отрицательно заряженный полиэлектролит используют для нанесения последующих слоев совместно с катионным полиэлектролитом. Молекулярный вес анионного полиэлектролита предпочтительно близок к молекулярному весу катионного полиэлектролита.
Синтез аптамеров для каждого антибиотика проводится с помощью ПЦР амплификации. Например, отбор связывающих аптамеров осуществляется с помощью процесса систематической эволюции лигандов путем экспоненциального обогащения, в котором покрытые антибиотиком магнитные шарики подвергают воздействию библиотеки одноцепочечной ДНК. Библиотека синтетической ДНК состоит из центральной рандомизированной области из 43 нуклеотидов, фланкированной двумя последовательностями связывания константных праймеров. В результате, например, для цефкинома аптамер имеет следующую структуру: (5'-GCTGTGTGACTCCTGCAA-N43-GCAGCTGTATCTTGTCTCC-3').
Подключенный к электродам потенциостат включает в себя модули для наложения и снятия электрического сигнала, модули для преобразования и передачи сигнала посредством беспроводного (Bluetooth, Wi-Fi) или проводного способа передачи сигнала (USB).
Потенциостат позволяет преобразовывать химический сигнал в электрический, а также передавать измеренные данные на персональный компьютер или облачное хранилище данных. В облачном хранилище данных или на персональном компьютере проводится обработка и интерпретация данных. Результатом обработки данных является систематизированная информация о количественном содержании веществ в определяемых образцах молока. Эта информация будет формировать цифровой отпечаток продукта, который производится из объектов анализа, или продукта, который сам является объектом анализа.
Обработку полученных данных производят с помощью программного обеспечения. Приложение написано на Java для мобильной ОС Android. При его разработке использовались стандартные библиотеки - для работы с Bluetooth, а также сторонние библиотеки: Retrofit - для взаимодействия с клиент-сервером. База данных SQLite используется для хранения данных на устройстве.
Данные датчика обрабатывают с помощью микросхемы, встроенной в схему потенциостата, для беспроводной связи датчика со смартфоном пользователя был выбран Bluetooth, потому что BLE имеет низкое энергопотребление и реализован во всех современных устройствах как общий режим связи. Таким образом, предложенное устройство совместимо со всеми смартфонами без дополнительного оборудования.
Приложение включает программное обеспечение для всех функциональных модулей, удобный графический интерфейс и полную документацию по использованию.
Приложение включает алгоритмы нейронной сети, которая обучается в ходе эксперимента, и успешная оценка такой нейросети в предсказании заданных свойств будет сигнализировать об окончании эксперимента.
Поиск и подключение программного обеспечения к потенциостату осуществляют с помощью беспроводного (Bluetooth, Wi-Fi) или проводного (USB) соединения. В программном обеспечении запускают определение наличия и измерение концентрации антибиотиков в образце с помощью кнопки «Старт». Измерение электрических сигналов проводят в течении 5-20 минут. В конце измерения, полученные данные подвергаются обработке и коррекции с помощью алгоритмов программного обеспечения. Результат выводится на персональном компьютере или смартфоне в виде количественной характеристики - концентрации четырех типов антибиотиков. Также результат анализа автоматически отправляется для записи в журнал в облачном хранилище данных, а также в сторонние системы учета данных. Возможна отправка результатов анализа в виде автоматически сформированного отчета по электронной почте или в виде оповещения на смартфон.
Обработка сигнала производится следующим образом: полученные вольтамперные значения подвергают вероятностной статистической обработке, после которой каждому значению присваивается статистическая значимость. Затем в соответствии с присвоенной статистической значимостью полученные сигналы относятся к значениям, полученным для вольтамперных зависимостей антибиотика различной концентрации (контрольные знанения) Близкие значения позволяют отнести исследуемый образец к определенной концентрации антибиотика.
Вероятностная статистическая обработка может происходить, например, следующим образом:
Входные сигналы (вольтамперные значения) для обработки методом математической статистики собираются в массивах х = [х1, х2, х3, …, xN]. Каждому значению присваиваются статистические веса w = [w1, w2, w3, …, wN], которые также представляют собой массива значений. При вводе данных, каждому значению вольтамперной зависимости присваивается случайное значение статистического веса. Сумма произведений статистических весов будет создавать значение z:
где b - слагаемое, которое увеличивает степень свободы функции z.
Далее, значение z подвергается обработке по формуле
k
k
Следующим этапом проходит сравнение полученного значения σ с ожидаемым значением, полученным при обучении на модельных растворах молока с антибиотиком. Для этого каждое значение σ каждой концентрации каждого антибиотика (k) сравнивается с каждым значением t, полученным при тренировке.
k
k
k
Δ = t - σ
Затем рассчитывается ошибка сигнала:
k
k
k
k
δ = Δ ⋅ σ ⋅ (1-σ)
k
k
k
k
k
δ = (t-σ) ⋅ σ ⋅ (1-σ)
Далее, методом итераций производится обновление статистических весов w для каждого значения вольтамперной зависимости (х):
r
где 1 - множитель (в диапазоне от 0 до 1), полученный при тренировке на модельных растворах молока с антибиотиком.
Каждой точке вольтамперной зависимости исследуемого образца присваивается статистический вес:
Наибольшее значение статистического веса указывает на концентрацию соответствующего антибиотика. Ошибка определения рассчитывается по формуле
В результате проведенных операций получают значение содержания антибиотика каждой группы в молоке, которое сравнивается с контрольным значением для каждой группы антибиотиков. Более низкое значение, чем контрольное, свидетельствует о пригодности молока к употреблению.
Группа антибиотиков представляют собой группу, состоящую из амоксицилина, ампициллина, бензициллина, гетациллина, дигидрострептомицина, диклоксациллина, доксициклина, клоксациллина, левомицетина (хлорамфеникол), нафциллина, оксациллина, окситетрациклина, пенициллина g, пенициллина v, пиперациллина, прокаин-пенициллина, стрептомицина, тетрациклина, тикарциллина, хлортетрациклина, цефадроксила, цефазолина, цефалексина, цефалония, цефалониума, цефапирина, цефацетрила, цефкинома, цефоксазола, цефоперазона, цефотаксима.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Способ определения антибиотиков в сыром молоке
Пробу сырого молока (образец 1) помещали в емкость для анализа объемом до 1 мл. Объем анализируемой пробы составлял от 0,01 мл до 0,5 мл. После отбора пробы, в емкость для анализа опускали тест-полоску с электродами, с предварительно нанесенным на них буферным раствором и присоединенными к потенциостату с помощью коннектора.
Затем, на персональном компьютере или смартфоне запускали программное обеспечение и определяли концентрацию каждого вида антибиотика путем анализа полученных данных.
В результате проведенного исследования и последующего анализа полученных данных установлено, что содержание антибиотика тетрациклиновой группы в образце 1 составляет 0,001 мг/л, при этом содержание данного антибиотика в эталонной пробе молока составляет 0,003 мг/л, следовательно, содержание антибиотика в исследуемой пробе молока содержится в допустимых значениях. Таким образом, исследуемое молоко пригодно к использованию.
Предложенный способ обеспечивает быстрое и точное определение наличия антибиотиков и их концентрации в сыром молоке.