СПОСОБ ОЦЕНКИ РЕАКЦИИ БЛАСТТРАНСФОРМАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛУОРИМЕТРИИ ПРИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВАЦИИ АНТИГЕНОМ
METHOD FOR EVALUATING LYMPHOCYTE BLAST-TRANSFORMATION REACTION BY FLOW CYTOMETRY AT SPECIFIC ACTIVATION BY ANTIGEN

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и может быть использовано для оценки интенсивности специфической активации антигеном лимфоцитов крови человека. Для этого проводят оценку реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) при стимуляции их в течение 72 часов антигеном, иммунофлуоресцентным методом на проточном цитофлуориметре. В качестве маркера бластных форм лимфоцитов используют моноклональные антитела к CD34.
Пролиферативный ответ лимфоцитов на определенный антиген дает представление о наличии и выраженности специфической сенсибилизации организма. Специфическими митогенами являются растворимые и корпускулярные антигены, которые вовлекают в процесс бласттрансформации иммунные к ним Т- и В-лимфоциты. В отличие от неспецифических стимуляторов, антигены активируют только те лимфоциты, которые несут специфические к нему рецепторы.
РБТЛ изучают в культуре лимфоцитов in vitro. При постановке РБТЛ у человека берут кровь, выделяют из нее лейкоциты и вносят их в среду 199, затем добавляют специфический антиген или митоген. Учет реакции после стимуляции антигенами производят через 3-5 суток. Под влиянием специфических антигенов в бласты трансформируются не более 7-12% малых лимфоцитов.
Количество образовавшихся бластных клеток в мазках крови определяют с использованием обзорной окраски по Романовскому-Гимзе [B.C. Камышников, 2011]. Однако из-за низкой объективности и трудоемкости (подсчет не менее 1000 лимфоцитов) учета результатов реакции микроскопическим методом был заменен на метод с использованием радиоактивной метки 3Н-тимидина, которая при инкубации встраивается в бласттрансформированные лимфоциты, с последующим подсчетом радиоактивности на автоматическом сцинтилляционном β-счетчике [Дж. М. Клаус, 1990]. Использование радиоактивной метки в РБТЛ  считается объективным методом учета при исследовании функционального состояния лимфоцитов в качестве показателя активности клеточного иммунитета, который описан как в отечественной, так и в зарубежной литературе [К.А. Лебедев, И.Д. Понякин, 2003; Л. Йегер, 2007; Т.В. Ferreira et all, 2014; J. Kolata et all, 2015]. Однако необходимость использования радиоактивного 3Н-тимидина в качестве метки для оценки функционального состояния лимфоцитов при антигенной стимуляции в РБТЛ резко ограничивает широкое внедрение метода в лабораторную практику, так как требует специальных условий для его проведения. Прототипом предлагаемого способа, можно считать метод использования моноклональных антител к рецептору Ki-67 для оценки пролиферативной активности лимфоцитов при стимуляции фитогемагглютинином [Е.Г. Артеменко, 2004; Т.И. Булычева, Н.Л. Дейнеко, А.А. Григорьев, 2014]. Однако в данном случае учет реакции проводят методом непрямой иммунофлюоресценции с помощью люминесцентного микроскопа, что также усложняет учет реакции (подсчет не менее 1000 клеток) и не исключает долю субъективности, за счет разного восприятия у исследователей интенсивности свечения флюорохрома.
Спектр применения РБТЛ в практике достаточно широк: оценка иммунного статуса, изучение механизмов активации клеток при пролиферации, оценка действия иммунотропных и иммуномодулирующих средств [Н.Н. Дергунова, 2003; B.C. Камышников, 2011; P.C. Janson, 2011; Р. Marits, 2014]. В последнее время в связи с резким увеличением количества работ по трансплантации органов и костного мозга, при онкологических и онкогематологических заболеваниях этот тест становится особенно востребованным. В связи с вышеизложенным, в настоящее время повышается актуальность внедрения новых, объективных способов учета результатов РБТЛ с использованием высокоточного аналитического оборудования.
В практике здравоохранения при иммунофенотипировании бластных форм лимфоцитов используют моноклональные антитела к CD34 [С.А. Луговская, М.Е. Почтарь, 2005; Г.Э. Плужникова, 2008; В. А. Зурочка, А.В. Зурочка, Е.Г. Костоломова, 2012; W.R. Widowati et all, 2014; F. Liu et all, 2015].
+
Реакция основана на экспрессии гемопоэтическими бластными лимфоидными клетками антигена CD34 и заключается в том, что клетки инкубируют с моноклональными антителами к CD34. Подсчет количества бластных форм лимфоцитов (CD34) осуществляют автоматически с помощью проточной цитофлуориметрии.
В доступной литературе не обнаружены данные об использовании проточной цитофлуориметрии для подсчета бласттрансформированных клеток в РБТЛ с применением моноклональных антител к CD34.
Задачей изобретения является повышение качества учета активированных антигеном лимфоцитов в РБТЛ с использованием моноклональных антител CD34 при помощи проточного цитофлуориметра.
2
Заявляемый способ осуществляется следующим образом. В стерильную пробирку, содержащую 1 мл среды 199, добавить 100 Ед пенициллина и 10 Ед стрептомицина, внести антиген и 100 мкл плазмы с лейкоцитами крови пациентов. Для оптимального протекания РБТЛ необходимо присутствие макрофагов, поэтому использовать высокоочищенные лимфоциты не рекомендуется [В.А. Зурочка, А.В. Зурочка, Е.Г. Костоломова, 2012], для моделирования клеткам специфического микроокружения в смесь добавляли 100 мкл аутологичной сыворотки. Реакционную смесь культивировали в CO-инкубаторе при 37°С в течение 72 часов с последующим центрифугированием при оборотах 2000g 10 мин, надосадочную жидкость сливали. К 50 мкл осажденных клеток приливали 10 мкл моноклональных антител к антигену CD34, конъюгированных с флуорохромом, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее добавляли 500 мкл лизирующего раствора в разведении 1:10, не содержащего фиксирующих компонентов, и инкубировали в течение 10-12 минут в темноте при комнатной температуре. Клетки осаждали центрифугированием при 2000g в течение 5 минут, освобождали от надосадочной жидкости. К получившемуся осадку приливали 450 мкл отмывочного буфера (Cell Wash) и ресуспендировали. Подсчитывали количество бластных клеток (CD34) на проточном цитофлуориметре, при этом в каждой пробе анализировали 30000 клеток.
Подсчет количества бластных клеток (CD34) осуществляли непосредственно после окончания реакции.
+
На примере больных бруцеллезом была изучена специфичность и чувствительность предлагаемого способа. В качестве антигена использовали бруцеллин - производство «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России (Россия). Для определения специфичности заявляемого способа, при постановке РБТЛ, в плазму вносили антигены: тулярин - производство «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития России» (Россия) и туберкулин - производство ФГУП СПбНИИВС ФМБА (Россия). Пред постановкой РБТЛ определяли фоновое количество CD34 лимфоцитов у больных бруцеллезом и относительно здоровых доноров. Для контроля спонтанной неспецифической пролиферации лимфоцитов у обследуемых, в пробы вносили равный с антигеном объем (50 мкл) стерильного физиологического раствора.
Проведена сравнительная оценка способов подсчета бластных клеток в анализируемом материале по заявляемому способу и применяемого в лабораторной практике обзорного окрашивания мазков по Романовскому-Гимзе. Объектом исследования служили 55 образцов крови больных бруцеллезом (40) и относительно здоровых доноров (15).
Постановку РБТЛ с плазмой крови каждого образца осуществляли одновременно. Осажденные клетки после инкубации использовали для приготовления мазков на предметном стекле с последующей их окраской по Романовскому-Гимзе и подсчетом количества бластных клеток в световом микроскопе. Часть клеток инкубировали с моноклональными антителами к антигену CD34, и по окончании инкубации определяли количество бластных лимфоцитов в проточно-цитометрическом анализе.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Microsoft Excel 2010. Для выявления статистической значимости различий результатов использовали t-критерий Стьюдента, при уровне достоверности Р≤0,05.
Полученные результаты представлены в таблице. Как видно из таблицы, уровень пролиферативного ответа лимфоцитов на бруцеллин, у неинфицированных возбудителем бруцеллеза и больных бруцеллезом, достоверно различался (Р≤0,001).
+
Активация лимфоцитов крови туберкулином и тулярином не стимулировала статистически достоверного увеличения количества CD34 клеток, выявляемых после постановки РБТЛ, что свидетельствует о специфичности предлагаемого способа.
Таким образом, предлагаемый способ оценки реакции бласттрансформации лимфоцитов при стимуляции антигеном, с применением проточной цитофлуориметрии не требует специальных условий проведения, как при использовании радиоактивной метки, отличается простотой учета и высокой объективностью за счет большего количества автоматически учтенных клеток (30000 клеток), высокой чувствительностью (100%) и специфичностью (>99%).