Связь полиморфизма гена fabp2 (-561a>c) c содержанием абдоминального жира у кур мясного направления

УДК 575.162:636.5

Связь полиморфизма гена FABP2 (-561А>С) с содержанием абдоминального жира у кур мясного

направления

Ларкина Татьяна Александровна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник

e-maИ:tanya.larkma2015@yandex.ш

Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных, филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр животноводства -ВИЖ имени академика Л.К. Эрнста»

Аннотация. Птицеводство - одна из наиболее динамичных, высокоразвитых и наукоемких отраслей отечественного животноводства. За последние годы уровень мяса птицы, особенно за счет выращивания цыплят-бройлеров, в мясном балансе стран мира достиг более 33 %, в России - 40 %. В то же время стало очевидным, что липидная питательность мяса птицы нуждается в коррекции в целях повышения её биологической ценности. Примерно 15-20% массы тушки у современных бройлерных пород приходится на жир. Это происходит потому, что селекция мясной птицы ведется только на скорость роста без учета ее склонности к жироотложению. Жирность достаточно хорошо наследуется у птиц, коэффициент наследуемости ^2) варьируется от 0,5 до 0,8. Имеется острая необходимость в поиске молекулярных маркеров для селекции родительских линий бройлеров на снижение содержания абдоминального жира, что позволит увеличить пищевую ценность тушки и уменьшить расходы на кормление. Целью данной работы является анализ распределения частот генотипов мононуклеотидного полиморфизма гена FABP2 (-561А>С) в группах кур с разным содержанием абдоминального жира. FABP2 обладает высоким сродством к насыщенным жирам и обеспечивает захват, внутриклеточный транспорт и метаболизм длинноцепочечных жирных кислот, действуя в основном в кишечнике. У курицы этот ген располагается на 4 хромосоме. По результатам исследования по гену FABP2 (-561А>С) частота встречаемости генотипов СС (0,42), АС (0,35), АА (0,23). Бройлеры кросса «Иза Хаббард Ф-15 с гетерозиготным генотипом АС немного превосходят по содержанию жира особей с гомозиготными генотипами, но эти различия статистически не значимы. Возможно, для получения более значимого результата требуется увеличить выборку и добавить в изучение еще один ген, связанный с жиронакоплением и рассмотреть уже аддитивный механизм работы генов.

Ключевые слова: бройлер, абдоминальный жир, ген FABP2, SNP, ПЦР-ПДРФ, генотипирование, масса, содержание абдоминального жира.

Введение. Исследования биологических механизмов отложения абдоминального жира в птицеводстве - важная задача на сегодняшний день. Поиском полиморфизмов в генах, участвующих в липидном обмене, занимаются многие ученые передовых стран. Изучение этого процесса предполагает проведение исследований на белковом, транскрипционном и геномном уровнях [1]. Например, повышенное содержание насыщенных жирных кислот может привести к отложению большого количества нежелательного холестерина, что в свою очередь может негативно сказываться на здоровье потребителей, если не будут предприняты предупреждающие меры. К тому же избыток жира в тушке может быть причиной болезненных состояний в жизни самой птицы (слабость ног) или негативно влиять на воспроизводительные качества птицы [2].

В современном животноводстве наиболее актуальными становятся исследования, направленные на поиск и выявление молекулярно-генетических маркеров, связанных с продуктивностью сельскохозяйственных животных [3]. Использование генетического полиморфизма генов, определяющих формирование продуктивности, может повысить интенсивность селекции и раскрыть генетический потенциал птиц [4]. Секвенирование генома, особенно картирование SNP, существенно ускоряет работу по подбору генов-кандидатов. В 2004 г. геном кур был полностью расшифрован. Он насчитывает 24 тыс. генов, а так же более 1 млрд. SNP [5]. Последние разработки в технологии полногеномного секвенирования позволили обнаружить тысячи SNP и indel-полиморфизмов (небольшие вставки и делеции). Эти варианты генетического полиморфизма могут быть использованы для анализа потенциальных функциональных (причинных) мутаций [6].

Переносчик жирных кислот FABP2 кодируется одноименным геном. Два варианта гена, отличающиеся на один нуклеотид, кодируют разные варианты белка, отличающиеся на одну аминокислоту. Замена нуклеотида гуанина на аденин в ДНК приводит к замене аланина на треонин в белке. Эта мутация является доминантной, в результате достаточно унаследовать мутантный вариант гена от отца или от матери, для проявления его действия. Вероятность появления эффекта у детей составляет 50%. При этом мутантный вариант обладает повышенным сродством к длинноцепочечным жирам, что приводит к усилению транспорта жиров в кишечнике и устойчивости к инсулину [7].

Эпистаз определяется как взаимодействие между двумя или более генами или их мРНК или белковыми продуктами, влияющими на одну черту. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, что эпистаз может иметь важное значение при определении генетической архитектуры комплексных признаков у домашних животных. Ацетил-коэнзим карбоксилаза альфа (ACACA) и белок FABP2 являются ключевыми факторами липогенеза и транспорта в клетке. Они играют важную роль в накоплении веса брюшной жировой ткани в растущем организме курицы. В исследовании китайских ученых полиморфизмы 2292 G>A ацетил-коэнзим карбоксилаза альфа и -561A>C в FABP2 были обнаружены у двух линий бройлеров, которые были отобраны в разных направлениях увеличения и уменьшения содержания жира в брюшной полости. Данные результаты полезны для дальнейшего понимания генетического взаимодействия между генами-кандидатами, которые влияют на депонирование жира в брюшной части тела бройлеров [8].

Белки FABP2 могут быть включены в процессы модуляции роста и пролиферации клеток. В данном гене обнаружен полиморфизм в кодоне 54, что влечет замену аланина (Ala) на треонин (Thr). В работе Тавридоу и соавторов показано, что у

людей европеоидной расы наличие генотипа ^г/Т^54 статистически достоверно связано с ожирением [9].

Таким образом, целью данной работы является анализ распределения частот генотипов однонуклеотидного полиморфизма гена FABP2 (-561А>С) в группах кур с разным содержанием абдоминального жира.

Материал и методы.

Материалом для наших исследований послужила ДНК, выделенная из 150 образцов печени бройлеров кросса «Иза Хаббард Ф-15» в возрасте 35 дней из частного фермерского хозяйства. ДНК выделяли по стандартной методике с использованием протеиназы К (Сибэнзим, Новосибирск) и фенола [10]. Анализ последовательности FABP2 в области мутации показал, что мутация приводит к узнаванию сайта рестрикции рестриктазой TaqI (последовательность узнавания ТС^А). В этой связи, для теоретического моделирования тест-системы анализа полиморфизма -561А>С гена FABP2 был выбран метод ПЦР-ПДРФ анализа.

В таблице 1 представлены инструменты для проведения ПЦР-ПДРФ для выявления изучаемого SNP в гене FABP2.

Таблица 1 - Инструменты для выявления одиночного нуклеотидного полиморфизма (Б^) в гене FABP2

Ген, номер замены Замена Т° отжига Праймеры Эндонуклеаза Размер фрагментов, п.о.

FABP2 rs16414509 A>C 62 FW :ACAGAGCATTCACTGAATGG RV:TTGGCCATTCTAATTTGGTGA TaqI 190, 130, 60

Полимеразную цепную реакцию проводили в соответствии с рекомендациями производителя в амплификаторе IQ5 (Bio-Rad, США). Для рестрикции в пробирку добавляли необходимое количество эндонуклеазы TaqI (Сибэнзим, Новосибирск), перемешивали и ставили на инкубацию на 2 часа в термостат (t=65°C).

По окончании инкубации проводили электрофоретическое разделение фрагментов в 1,5%-ом агарозном геле при 150В в буфере ТВЕ с добавлением бромистого этидия до конечной концентрации 30 нг/мл и визуализировали фрагменты под ультрафиолетовым светом.

В качестве маркера позволяющего оценить длину фрагментов ДНК на геле, был взят puC19 DNA (Fermentas). Сигнал флуоресценции фотографировали в системе гель-документации фирмы Kodak (EDAS 290).

Статистическую обработку проводили при помощи пакета программ AtteStat12.0.5. (http://www.twirpx.com/file/166961/) и Instat+v3.37 (http://www. obnovisoft1.ru/instat).

Результаты и обсуждение.

Дизайн тест-системы предполагает использование двух прай-меров прямого (5'-ACAGAGCATTCACTGAATGGGC-3') и обратного (5'-TTGGCCATTCTAATTTGGTGA-3'), фланкирующих мутацию с двух сторон и ампли-фицирующих фрагмент длиной 190 п.о. Рестрикционный гидролиз ПЦР-фрагмента рестриктазой TaqI приводит к образованию двух фрагментов длиной 130 и 60 п.о., специфичеких для аллеля С, в то время как немутантному аллелю А соответствует неристрикцированный фрагмент длиной 190 п.о. (рис. 1).

FABP2 FW

íaql

Г

*

Аллель С 130 п о. 60 п о FABE2 RV

Аллель А 190 и.о. -4- -

Рисунок 1. Теоретическая модель тест-системы определения полиморфизма РДВР2 на основе ПЦР-ПДРФ Примечание: FABp2_FW и FABP2_RV - праймеры, фланкирующие амплифицированный фрагмент; * - место

исследуемой мутации; длины фрагментов в парах оснований (п.о.).

Использование разработанной нами тест-системы позволяет четко диагностировать генотипы бройлеров по гену РДВР2 (рис. 2).

Рисунок 2. Результаты генотипирования бройлеров кросса «Иза Хаббард Ф-15» по FABP2, с разработанной

тест-системой на основе ПЦР-ПДРФ Примечание: М-Маркер puC19 DNA. 3,6,8-генотип АА; 1, 5-генотип СС, 2,4,7-АС.

В таблице 2 представлены результаты анализа влияния генотипов по SNP (замена rs16414509 A>C) гена FABP2 у бройлеров с разным содержанием абдоминального жира.

Таблица 2. Различия по массе и содержанию абдоминального жира в генотипических классах гена FABP2 по SNP

Признак АА (n = 34) M±m s v АС(п=53) M±m s v СС(п=63)^ s v

Масса жира (г) 23,7±1,06 8,08 0,23 26,05±1,0 8,08 0,35 22,9±1,57 7,2 0,42

Содержание жира (%) 1,07±0,4 0,33 0,23 1,2±0,4 0,3 0,35 1,06±0,07 0,33 0,42

Примечание: M±m - среднее значение ± ошибка среднего; s - стандартное' отклонение; v - частота генотипов.

С помощью программы Instat+ v3.37 были проанализированы данные, а именно, получена связь генотипов АА, АС и СС гена FABP2 с признаком содержания абдоминального жира (рис. 3).

Рисунок 3. Ассоциация генотипов АА, АС и СС гена FABP2 (замена ^16414509 А>С) с признаком содержания

абдоминального жира

Выводы. Поиск полиморфизмов в генах, участвующих в липидном обмене, -важная задача на сегодняшний день для многих ученых передовых стран. Найдены точечные мутации в гене A-FABP, которые являются маркерами для отбора линий бройлеров с высоким содержанием внутримышечного жира [11]. По результатам наших исследований по гену FABP2 (-561А>С) частота встречаемости генотипов СС (0,42), АС (0,35), АА (0,23). Бройлеры кросса «Иза Хаббард Ф-15 с гетерозиготным генотипом АС немного превосходят по содержанию жира особей с гомозиготными генотипами, но эти различия статистически не значимы. Медианы всех трех генотипов находятся практически на одном уровне, что говорит о незначительных отличиях. Возможно, для получения более значимого результата требуется увеличить выборку и добавить в изучение еще один ген, связанный с жиронакоплением и рассмотреть уже аддитивный механизм работы генов [12].

Исследования проведены при финансовой поддержке ФАНО, тема ГЗ:

АААА - А18- 118021590138-1.

Список литературы:

1. Ларкина, Т.А. Изучение экспрессии генов-кандидатов массы абдоминального жира у домашней курицы (Gallus gallus) / Т.А. Ларкина, А.Л. Сазанова, К.А. Фо-мичев, О.Ю. Баркова, А.А. Сазанов, Т. Малевски, K. Ящак // Генетика. - 2011. - Т. 47. - №8 - С. 1140-1144.

2. Архипов, А.В. Источник незаменимых жирных кислот в организме / А.В. Архипов // Птицеводство. - 2012. - № 11. - С. 38-39.

3. Зиновьева, Н.А. Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных. Аналитический обзор / Н.А. Зиновьева, В.А. Багиров, Е.А. Гладырь, О.Ю. Осадчая // Сельскохозяйственная биология. - 2016. - Т. 51. -№ 2. - С. 264-268.

4. Kulibaba, R.A. Prolactin and growth hormone gene polymorphisms in chicken lines of Ukrainian selection / R.A. Kulibaba, A.P. Podstreshnyi // Cytology and Genetics. - 2012. - № 46. - P. 390-395.

5. Godoy, T.F. SNP and INDEL detection in a QTL region on chicken chromosome

2 associated with muscle deposition / T.F. Godoy, G.C. Moreira, C. 113 Boschiero, A.A. Gheyas, G. Gasparin, M. Paduan, S.C.S. Andrade, H. Montenegro, D.W. Burt, M.C. Ledur, L.L. Coutinho // Animal Genetics. - 2015. - № 46. - P.158- 163.

6. Kranis A. Development of a highdensity 600K SNP genotyping array for chicken / A. Kranis, A.A. Gheyas, C. Boschiero // BMC Genomics. - 2013. - № 14. - P. 1-13.

7. Бойко, А.В. Ген FABP2 - белок, связывающий жирные кислоты в кишечнике [Электронный ресурс] / А.В. Бойко // Моя генетика. - 2014. - № 1. - Режим доступа: http: //mygenetics.ru.

8. Hu, G. Epistatic effect between ACACA and FABP2 gene on abdominal fat traits in broilers / G. Hu, S. Wang, J. Tian, L. Chu, H. Li // Genet Genomics. - 2010. -V. 37. - P. 505-512.

9. Tavridou, A. Thr54 allele of fatty-acid binding protein 2 gene is associated with obesity but not type 2 diabetes mellitus in a Caucasian population / A. Tavridou, K.I. Arvanitidis, A. Tiptiri-Kourpeti, I. Petridis, G. Ragia, S. Kyroglou, D. Christakidis, V.G. Manolopoulos // Diabetes Res Clin Pract. - 2009. - V. 84 - P.132-137.

10. Мазин, А.В. Методы молекулярной генетики и генной инженерии / А.В. Ма-зин, К.Д. Кузнеделов, А.С. Краев // Ин-т цитологии и генетики. - 1990. - С. 13-14.

11. Wang, Y. Correlation of the A-FABP Gene Polymorphism and mRNA Expression with Intramuscular Fat Content in Three-Yellow Chicken and Hetian-Black Chicken / Y. Wang, H. Chen, D. Han, Y. Chen, G. Muhatai, T. Kurban, J. Xing, J. He // Anim Biotechnol. - 2016. - V. 10. - P. 1-7.

12. Ларкина, Т.А. Аллельные варианты и экспрессия генов-кандидатов содержания абдоминального жира у кур / Т.А. Ларкина // Диссертация кандидата биологических наук 03.02.07. - СПб. - Тярлево. - 2017. - С. 103.

References:

1. Larkina T.A., Sazanova A.L., Fomichev K.A., Barkova O.Yu., Sazanov A.A., Malevski T., Yashchak K. Expression study of candidate genes of abdominal fat mass in a domestic chicken. Genetika [Genetics], 2011, Vol. 47, no.8, pp. 1140-1144 (in Russian).

2. Arkhipov A.V. Source of essential fatty acids of the body. Ptitsevodstvo [Poultry Farming], 2012, no. 11, pp. 38-39 (in Russian).

3. Zinov'yeva N.A., Bagirov V.A., Gladyr' E.A., Osadchaya O.Yu. Modern achievements and problems in biotechnology of agricultural animals. Analytical review. Sel'skokhozyaystvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2016, Vol. 51, no. 2, pp.264268 (in Russian).

4. Kulibaba R.A., Podstreshnyi A.P. Prolactin and growth hormone gene polymorphisms in chicken lines of Ukrainian selection. Cytology and Genetics, 2012, no. 46, pp.390-395.

5. Godoy T.F. Moreira G.C. Boschiero C., Gheyas A.A., Gasparin G., Paduan M., Andrade S.C.S., Montenegro H., Burt D.W., Ledur M.C., Coutinho L.L. SNP and INDEL detection in a QTL region on chicken chromosome 2 associated with muscle deposition. Animal Genetics, 2015, no. 46, pp.158- 163.

6. Kranis A. Gheyas A.A., Boschiero C. Development of a highdensity 600K SNP genotyping array for chicken. BMC Genomics, 2013, no.14, pp.1-13.

7. Boyko A.V. FABP2 gene as a protein binding fatty acids in the intestine. My Genetics, 2014, no. 1. Available at: http: //mygenetics.ru.

8. Hu G., Wang S., Tian J., Chu L., Li H. Epistatic effect between ACACA and FABP2 gene on abdominal fat traits in broilers. Genet Genomics, 2010, V. 37, pp. 505-512.

9. Tavridou A., Arvanitidis K.I., Tiptiri-Kourpeti A., Petridis I., Ragia G., Kyroglou S., Christakidis D., Manolopoulos V.G. The 54 allele of fatty-acid binding protein 2 gene is associated with obesity but not type 2 diabetes mellitus in a Caucasian population. Diabetes Res Clin Pract. , 2009, V. 84, pp.132-137.

10. Mazin A.V., Kuznedelov K.D., Krayev A.S. Metody molekulyarnoy genetiki i gennoy inzhenerii [Methods of molecular genetics and genetic engineering]. Institute of Cytology and Genetics Publ., 1990, pp. 13-14.

11. Wang Y., Chen H., Han D., Chen Y., Muhatai G., Kurban T. , Xing J., He J. Correlation of the A-FABP Gene Polymorphism and mRNA Expression with Intramuscular Fat Content in Three-Yellow Chicken and Hetian-Black Chicken. Anim Biotechnol. , 2016, V. 10, pp. 1-7.

12. Larkina T.A. Allel'nyye varianty i ekspressiya genov-kandidatov soderzhaniya abdominal'nogo zhira u kur. Kand. Diss. [Allelic variants and expression of candidate genes for abdominal fat in chickens. Cand. Diss.]. St. Petersburg-Tyarlevo, 2017. 103p.

Relationship of FABP2 (-561A> C) gene polymorphism with abdominal fat content in chickens of meat poultry

production

Larkina Tat'yana Aleksandrovna, Candidate of Science (Biology), junior research scientist

e-mail: tanya.larkina2015@yandex.ru

Russian Research Institute of Farm Animal Genetics and Breeding, branch of the L.K. Ernst Federal Science Center for Animal Husbandry.

Abstract. Poultry farming is one of the most dynamic, highly developed and knowledge-intensive branches of domestic livestock production. In recent years, in the meat balance the poultry meat level has reached more than 33% in the world and 40% in Russia, especially by means of growing chicken broilers. At the same time, it has become evident that the lipid nutritional value of poultry meat needs correction in order to increase its biological value. About 15-20% of the modern broiler carcass is fat. This occurs due to meat poultry selection in the context of the growth rate, without taking into account its propensity to fat deposition. Fatness is inherited in birds fairly well. The heritability estimate (h2) varies from 0.5 to 0.8. There is an urgent need to find molecular markers for breeding broiler lines to reduce the abdominal fat content. It is to increase the nutritional value of the carcass and reduce the cost of feeding.

The purpose of this study is to analyze the frequency genotype distribution of mononucleotide polymorphism of FABP2 (-561A> C) gene in groups of chikens with different abdominal fat content. FABP2 has a high affinity for saturated fats and provides capture, intracellular transport and metabolism of long chain fatty acids, acting mainly in the intestine. In chicken, this gene is located on the 4th chromosome.

According to the results of FABP2 (-561A> C) gene test, the incidence of CC, AC and AA genotypes is the following: (0.42), (0.35) and (0.23), respectively. As for the fat content, Iza Hubbard F-15 cross broilers with heterozygous AS genotype slightly outperform the ones with homozygous genotypes, but these differences are not statistically significant. Perhaps, to obtain a more meaningful result, it is required to increase the sampling, add another gene associated with fat accumulation and study the additive mechanism of the gene work.

Keywords: broiler, abdominal fat, FABP2 gene, SNP, PCR-RFLP, genotyping, weight, abdominal fat content.