КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ СВЯЗЫВАНИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ С ЛИМФОИДНОЙ ТКАНЬЮ И ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ЗАРОДЫШЕВЫХ ЦЕНТРОВ В ЛИМФАТИЧЕСКИХ ТКАНЯХ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITION OF STEM CELLS AND PRECURSOR CELLS BINDING WITH LYMPHOID TISSUE AND FOR REGENERATION OF GERMINAL CENTERS IN LYMPH TISSUES

Перекрестные ссылки на родственные заявки
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной патентной заявки США №61/374943, поданной 18 августа 2010 года; предварительной патентной заявки США №61/441485, поданной 10 февраля 2011 года; и предварительной патентной заявки США №61449372, поданной 4 марта 2011 года. Все вышеуказанные заявки полностью включены в настоящий документ посредством ссылок.
Область изобретения
[0002] Объект настоящего изобретения относится к способам и композициям для модуляции связывания стволовых клеток с органами и тканями и для регенерации зародышевых центров в лимфатических тканях.
Уровень техники
[0003] Регенеративная медицина представляет собой способ создания живых функциональных тканей для регенерации или замены функции ткани или органа, утраченной в результате повреждения или врожденных дефектов. Эта область техники включает перспективы регенерации поврежденных тканей и органов в организме путем стимуляции исцеления ранее невосстанавливаемых органов.
[0004] Один из способов, используемых для регенерации функции ткани или органа, представляет собой доставку стволовых клеток в пораженный орган или ткань. В то же время, стволовые клетки не в достаточной степени удерживаются органом, являющимся мишенью для регенерации ткани, даже при непосредственном введении стволовых клеток в ткани поврежденного органа. Интраскопические исследования на людях и животных показали, что большинство доставленных стволовых клеток обнаруживаются в селезенке в течение часа после инъекции стволовых клеток. Исследования на животных также показали, что хирургическое удаление селезенки до лечения стволовыми клетками после индуцированного инфаркта миокарда улучшало функциональное восстановление поврежденного сердца (Blood, Vol 84, No 5:1482-1491, 1994; NATURE 410:701-705, 2001). Кроме того, показано, что спленэктомия улучшала энграфтмент у пациентов-людей после трансплантации костного мозга (Stem Cells Dev 13(1):51-62, 2004; Transplant Proc. 28(2):736-7, 1996; Am J Hematol. 22(3):275-83, 1986). В то же время спленэктомия ассоциируется с хирургической смертностью, сепсисом и пожизненными тромботическими осложнениями (Blood Rev. 14(3):121-129, 2000; Leukemia. 15(3):465-467,2001; Pediatr Transplant 13(2):171-176, 2009).
[0005] Таким образом, существует потребность в разработке способов и композиций, которые можно использовать для предотвращения локализации стволовых клеток в селезенке и других лимфоидных тканях без удаления селезенки.
Сущность изобретения
Краткий обзор
[0006] Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность путем обеспечения способов и композиций для ингибирования связывания стволовых клеток с лимфоидной тканью, включающих введение стволовых клеток в организм в сочетании с терапевтическим агентом или агентами, ингибирующими связывание стволовых клеток с лимфоидной тканью, в частности, с зародышевыми центрами в лимфатических узлах и зародышевыми центрами в селезенке. Термин "в сочетании с" означает совместно, до или после лечения стволовыми клетками. "Лечение стволовыми клетками" означает акт введения стволовых клеток в организм, мобилизации стволовых клеток из эндогенных пулов стволовых клеток организма, или стимуляции спонтанного высвобождения стволовых клеток из эндогенных пулов стволовых клеток организма.
[0007] Например, пациенты, подвергавшиеся лечению стволовыми клетками с целью регенерации органов, демонстрировали снижение смертности и улучшение функции после лечения стволовыми клетками, хотя лечение стволовыми клетками, как правило, не восстанавливало функциональное состояние пациента до повреждения органа. Снижение связывания стволовых клеток с селезенкой и другими органами лимфатической системы повышает количество циркулирующих стволовых клеток, которые могут связываться с поврежденным органом и, тем самым, повышает степень функционального восстановления, вызванного лечением этого пациента стволовыми клетками.
[0008] При введении терапевтических агентов, ингибирующих связывание стволовых клеток с лимфатическими тканями, предпочтительно вводить терапевтические агенты за 1-14 дней до начала лечения, более предпочтительно - за 3-7 дней и наиболее предпочтительно - за 3-4 дня до лечения стволовыми клетками или мобилизации стволовых клеток. При введении терапевтических агентов, ингибирующих связывание стволовых клеток с лимфатическими тканями, в сочетании со стволовыми клетками, спонтанно высвобождаемыми из эндогенных пулов стволовых клеток организма, предпочтительно вводить терапевтические агенты в течение 1-60 дней, более предпочтительно - 1-30 дней, и наиболее предпочтительно - 1-14 дней.
[0009] Агенты, ингибирующие связывание стволовых клеток с лимфоидной тканью, в частности, с зародышевыми центрами лимфоидных тканей, включают радиацию, химиотерапевтические агенты, иммунодепрессанты и антагонисты CD45 и CD26. Стволовые клетки, присутствующие в мононуклеарных фракциях цельной крови или костного мозга, или очищенные стволовые клетки цельной крови или костного мозга связываются с областями белой пульпы в селезенке, конкретнее, с зародышевыми центрами в белой пульпе лимфатической ткани, в том числе селезенки, а еще конкретнее - с активными зародышевыми центрами в белой пульпе селезенки. Антитела к CD45, в частности, к эпитопу, идентифицированному с помощью моноклональных IgG2b-антител крысы 30-F11 против CD45 мыши, снижают связывание стволовых клеток с выявленными участками в селезенке, что повышает количество стволовых клеток, доступных для биораспределения в поврежденный орган-мишень, и усиливает регенерацию тканей и функциональное восстановление.
[0010] В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения вводят терапевтические агенты, снижающие, уничтожающие или удаляющие активные зародышевые центры лимфоидной ткани, что приводит к снижению связывания стволовых клеток с лимфатической тканью. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения описаны способы снижения количества активных зародышевых центров в селезенке с целью снижения связывания стволовых клеток с селезенкой, за счет чего повышается количество циркулирующих стволовых клеток, доступных для доставки или хоуминга в поврежденные органы, нуждающиеся в регенерации. Агенты, подавляющие иммунный ответ, могут уменьшить количество активных зародышевых центров в селезенке и других лимфатических тканях. Основные категории иммуномодуляторов включают агенты, нарушающие синтез пуринов, антиметаболиты, радиацию, облучение селезенки, иммунодепрессанты, глюкокортикоиды, антагонисты бета-амилоида, агенты против резус-фактора, антагонисты ФНО, антиэотаксины, антагонисты Т-клеточного рецептора (TCR), антагонисты интерферонов, антагонисты интерферона-альфа, антагонисты интерферона-бета, антагонисты интерферона-гамма, антагонисты ТФР, антагонисты ТФР-альфа, антагонисты ТФР-бета, антагонисты интегринов, антагонисты альфа-4, антагонисты интерлейкинов, антагонисты интерлейкина-1, антагонисты интерлейкина-2, антагонисты интерлейкина-4, антагонисты интерлейкина-5, антагонисты интерлейкина-6, антагонисты интерлейкина-12, антагонисты интерлейкина-13, антагонисты интерлейкина-23, антагонисты IgE, антагонисты белка сосудистой адгезии (VAP), антагонисты В7, антагонисты фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС), антагонисты BAFF (BLyS), антагонисты CTLA4, антагонисты комплемента, антагонисты CD2, антагонисты CD3, антагонисты CD4, антагонисты CD5, антагонисты CD20, антагонисты CD23, антагонисты CD25a, антагонисты CD40, антагонисты CD154 (CD40L), антагонисты CD62L, антагонисты CD80, антагонисты CD147, антагонисты LFA1, антагонисты CD11a, антагонисты CD18, ингибиторы синтеза пуринов, ингибиторы синтеза пиримидинов, антипролиферативные агенты, антиметаболиты, антифолаты и антагонисты mTOR.
[ООН] Недостаточность аденозиндезаминаз также приводит к снижению образования активных зародышевых центров за счет агентов, вызывающих накопление дезоксиАТФ (J Immunol 171: 5562-5570, 2003). Кроме того, агенты, усиливающие экспрессию или активирующие CCR7, вызывают снижение образования активных зародышевых центров.
[0012] Для ингибирования образования зародышевых центров лимфоидных тканей или уничтожения или удаления зародышевых центров также можно использовать химиотерапевтические агенты. Типичные примеры включают алкилирующие агенты, антиметаболиты, алкалоиды растительного происхождения, ингибиторы топоизомераз, противоопухолевые средства и триоксид мышьяка.
[0013] Примеры алкилирующих агентов включают цисплатин и карбоплатин, а также оксалиплатин. Они нарушают функционирование клетки за счет образования ковалентных связей с амино-, карбоксильными, сульфгидрильными и фосфатными группами биологически значимых молекул.
[0014] Примерами антиметаболитов являются азатиоприн, меркаптопурин, капецитабин фторурацил, которые встраиваются в ДНК. Они предотвращают включение этих веществ в ДНК во время S-фазы (клеточного цикла), останавливая нормальное развитие и деление клетки. Они также влияют на синтез РНК. Благодаря своей эффективности эти препараты являются наиболее широко используемыми цитостатиками.
[0015] Алкалоиды включают алкалоиды барвинка и таксаны. Алкалоиды барвинка включают винкристин, винбластин, винорелбин и виндезин. Таксаны включают таксол, паклитаксел и доцетаксел.
[0016] Топоизомеразы являются ключевыми ферментами, поддерживающими топологию ДНК. Ингибирование топоизомераз типа I или типа II вносит помехи как в транскрипцию, так и в репликацию ДНК, нарушая правильную суперспирализацию ДНК. Некоторые ингибиторы топоизомеразы I типа включают камптотецины: иринотекан и топотекан. Примеры ингибиторов топоизомераз II типа включают амсакрин, этопозид, этопозидфосфат и тенипозид.
[0017] Противоопухолевые агенты включают дактиномицин, доксорубицин, эпирубицин и блеомицин.
Определения
Определения, используемые для описания вариантов воплощения настоящего изобретения:
[0018] Термин агонист, как используется здесь, означает любую структуру, активирующую специфический рецептор или последующий сигнальный путь, необходимый для опосредования действия(й) рецептора. Агонисты могут включать антитела, фрагменты антител, растворимые лиганды, низкомолекулярные соединения, циклические пептиды, перекрестно сшивающие агенты, но не ограничиваются ими.
[0019] Термин антагонист, как используется здесь, означает любую структуру, препятствующую связыванию с детекторной(ыми) структурой(ами) рецептора, или активации специфического рецептора или последующего сигнального пути, необходимого для опосредования действия(й) рецептора. Антагонисты могут включать антитела, фрагменты антител, растворимые лиганды, рецепторы Fc-гибридов, химерные рецепторы, низкомолекулярные соединения, циклические пептиды, пептиды, но не ограничиваются ими.
[0020] Термин ингибитор, как используется здесь, означает любую структуру, снижающую влияние конкретного лиганда или его рецептора на мишень. Ингибиторы могут представлять собой низкомолекулярные соединения, антисмысловые агенты, нуклеиновые кислоты, в том числе миРНК и микроРНК.
Лимфатическая ткань, лимфатические узлы, селезенка и зародышевые центры
[0021] Лимфатическая ткань является специализированной формой ретикулярной соединительной ткани в лимфатической системе, которая содержит большое количество лимфоцитов. Этот тип ткани составляет селезенку, тимус и миндалины, а также висцеральные узлы, пейеровы бляшки и млечные сосуды, ассоциированные со слизистой оболочкой желудочно-кишечного тракта.
[0022] Лимфатические узлы представляют собой небольшие шарообразные органы иммунной системы, широко распространенные в организме, включая подмышечные впадины и желудочно-кишечный тракт, и связанные лимфатическими сосудами. Лимфатические узлы представляют собой место дислокации В-клеток, Т-клеток и других клеток иммунной системы. Лимфатические узлы находятся по всему телу и действуют в качестве фильтров или ловушек для инородных частиц. Лимфатические узлы окружены фиброзной капсулой, а внутри лимфатических узлов фиброзная капсула расширяется, образуя трабекулы. Вещество лимфатических узлов делится на внешнюю кору и внутренний мозговой слой, окруженный корой со всех сторон, за исключением ворот, где мозговое вещество находится в непосредственном контакте с поверхностью. Внешняя кора состоит в основном из В-клеток, расположенных в виде фолликулов, которые могут развиваться в зародышевый центр при стимуляции антигеном, а более глубокая кора в основном состоит из Т-клеток. Существует зона, известная как зона подкорки, где Т-клетки (или клетки, в основном являющиеся эритроцитами), в основном взаимодействуют с дендритными клетками, и где существует плотная ретикулярная сеть.
[0023] Селезенка представляет собой орган брюшной полости, расположенный с левой стороны живота между желудком и диафрагмой. Этот орган представляет собой основную регуляторную область иммунной системы. Это сосудистый орган, обильно снабжающийся артериальной кровью. При входе в селезенку поток крови поступает в сеть из расширенных кровеносных сосудов, или "синусов", которые находятся между большими массами лимфоцитов. Стены синусов содержат фагоциты, способные поглощать мертвые клетки и инородные частицы крови и удалять их из общего кровотока. Как и лимфатические узлы, селезенка является важным источником антител, однако в большей степени, чем лимфатические узлы, селезенка связана с удалением аномальных или нормальных пришедших в негодность ("умирающих") эритроцитов из кровотока за счет их разрушения.
[0024] Селезенка содержит как белую, так и красную пульпу. Красная пульпа селезенки содержит макрофаги, которые обычно отфильтровывают и удаляют из кровотока стареющие или дефектные эритроциты крови (RBC) и бактерии или эритроциты, покрытые антителами. Белая пульпа селезенки содержит скопления лимфоидной ткани и имеет важное значение для иммунного надзора и ответа: она синтезирует антитела против внедряющихся патогенов и высвобождает тромбоциты и нейтрофилы в ответ на кровотечение или инфекцию. Считается, что во время развития организма селезенка играет несколько ролей, в том числе, является первым центром кроветворения (в шесть недель внутриутробного развития). Хотя долгое время считалось, что селезенка теряет свою кроветворную функцию на ранних стадиях развития, когда кроветворная функция переходит к костному мозгу, в ходе последних исследований выявлено, что селезенка у взрослых является центром формирования стволовых клеток, дифференциации стволовых клеток в разные линии и хранения стволовых клеток (Trends Mol Med 11(6):271-276, 2005). В то же время области селезенки, где накапливаются экзогенные стволовые клетки, и молекулярные механизмы, посредством которых экзогенные стволовые клетки связываются с селезенкой, неизвестны.
[0025] Периартериальные лимфоидные муфты (PALS) белой пульпы селезенки населены преимущественно Т-клетками, в то время, как скопления лимфоидной ткани населены преимущественно В-клетками. Зародышевые центры (GC) представляют собой области в лимфатических узлах или лимфатических узелках в периферических лимфоидных тканях и в белой пульпе селезенки, где зрелые В-лимфоциты, также известные как центроциты, быстро пролиферируют, дифференцируются, мутируют за счет соматического гипермутирования и подвергаются переключению классов во время образования антител. Зародышевые центры являются важной частью В-клеточного гуморального иммунного ответа. Они динамично развиваются после активации В-клеток Т-зависимым антигеном. Гистологически GC описываются как микроскопически отличимые области лимфоидной ткани. Активированные В-клетки мигрируют из первичного очага в систему первичных фолликулов и начинают моноклональную экспансию в среду фолликулярных дендритных клеток (FDC).
[0026] Через несколько суток экспансии в В-клетках происходит мутация ДНК, кодирующей антитела, и, таким образом, в зародышевом центре возникает разнообразие клонов. Этот процесс включает случайные замены, делеции и инсерции, обусловленные соматическим гипермутированием. Под действием некоторого неидентифицированного сигнала от FDC созревающие В-клетки (центробласты) мигрируют из темной зоны в светлую зону и начинают экспонировать антитела на своей поверхности; на этой стадии они называются центроцитами. Центроциты находятся в состоянии активированного апоптоза и конкурируют за сигналы выживания от FDC, презентирующих антиген. Считается, что этот процесс зависит от сродства антител к антигену. Затем функциональные В-клетки взаимодействуют с Т-хелперами, получая сигналы окончательной дифференцировки. Эта дифференцировка также включает переключение изотипа, например, с IgM на IgG. Считается, что взаимодействие с Т-клетками предотвращает образование аутоантител. В-клетки становятся либо плазмоцитами, распространяющими антитела, либо В-клетками памяти, которые будут активированы при последующих контактах с тем же антигеном. Согласно гипотезе рециклинга, они также могут перезапустить весь процесс пролиферации, мутации и отбора.
[0027] В-клетки, содержащиеся в области белой пульпы селезенки, можно разделить на конкретные области, определенные путем окрашивания конкретными молекулярными маркерами. Пограничная зона селезенки содержит зрелые нециркулирующие В-клетки, которые граничат с белой пульпой, создавая границу между белой и красной пульпой, и экспрессируют высокие уровни CD21, CD24, IgM и CD79a и измеримые уровни CD9 и CD22. Область мантии окружает фолликулы нормальных зародышевых центров и экспрессирует CD21, CD23 и CD38. Фолликулярная зона находится в зародышевых центрах и экспрессирует высокие уровни IgD и CD23, промежуточные уровни CD21 и CD24, а также может быть идентифицирована путем окрашивания агглютинином арахиса (PNA). Зародышевый центр наилучшим образом отличается по связыванию PNA и экспрессирует более высокие уровни CD54, чем фолликулярная зона. Зародышевые центры содержат специфическую популяцию Т-хелперов, которые, по-видимому, равномерно распределены во всех зародышевых центрах. Зародышевые центры традиционно связывают с иммунными реакциями, требующими участия Т-хелперов, хотя это не является абсолютным. Зародышевые центры представляют собой области, где происходят мутации гипервариабельных генов и образуются В-клетки, продуцирующие высокоаффинные IgG. Активные зародышевые центры содержат заметное количество макрофагов и дендритных клеток, экспрессирующих CD21. Фолликулярные центры также можно определить по экспрессии CD45R (В220) (Toxicologic Pathology, 35:366-375, 2007). Обнаружено, что фолликулярные центры CD45R окружают зародышевые центры, экспрессирующие Вс16 и Вс12. BioEssays 29:166-177, 2007; Toxicol Pathol 34(5): 648-655, (2006)].
[0028] CD45 является общим лейкоцитарным антигеном, также известным как PTPRC (протеинтирозинфосфатаза, рецепторная, типа С), встречающимся на всех дифференцированных гемопоэтических клетках, кроме эритроцитов и плазмоцитов. Он также экспрессируется при лимфомах, В-клеточном хроническом лимфолейкозе, волосатоклеточном лейкозе и остром нелимфобластном лейкозе. Показано, что он необходим для передачи сигнала антиген - рецептор в В- и Т-клетках. Семейство CD45 состоит из нескольких членов, которые являются продуктами единого сложного гена. Этот ген содержит 34 экзона, и три экзона первичных транскриптов подвергаются альтернативному сплайсингу, образуя до восьми различных зрелых мРНК, а после трансляции - восемь различных белковых продуктов. Эти три экзона образуют изоформы RA, RB и RC.
[0029] Существуют различные изоформы антигена CD45. Изоформы антигена CD45 включают CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RAB, CD45RAC, CD45RBC, CD45RO, CD45R (АВС). CD45RA располагается на наивных Т-клетках, а CD45RO располагается на Т-клетках памяти. CD45 также является высокогликозилированным. CD45R является самым длинным белком и перемещается на отметку 200 кДа после выделения из Т-клеток. В-клетки также экспрессируют CD45R с более тяжелыми гликозидными группами, увеличивающими его молекулярную массу до 220 кДа, вследствие чего эта изоформа получила название В220; изоформа В-клеток с массой 220 кДа. Экспрессия В220 не ограничивается В-клетками; он также может экспрессироваться на активированных Т-клетках, на субпопуляции дендритных клеток и других антигенпрезентирующих клетках. Наивные Т-лимфоциты экспрессируют крупные изоформы CD45 и обычно положительны по CD45RA. Активированные Т-лимфоциты и Т-клетки памяти экспрессируют наиболее короткую изоформу CD45, CD45RO, в которой отсутствуют экзоны RA, RB и RC. Эта наиболее короткая изоформа способствует активации Т-клеток. Цитоплазматический домен CD45 является одним из крупнейших известных доменов и обладает активностью фосфатазы, удаляющей ингибиторную фосфатную группу тирозинкиназы, называемой Lck (в Т-клетках) или Lyn/Fyn/Lck (в В-клетках), и активирует ее. CD45 может существовать как в мономерной, так и в димерной форме, и димеризация может подавлять фосфатазную активность CD45 (Blood vl03 (9):3440-3447, 2004).
[0030] Поскольку CD45 экспрессируется на всех кроветворных клетках и является наиболее широко экспрессируемым из всех гемопоэтических антигенов, его используют для выделения популяции клеток, которая также содержит гемопоэтические стволовые клетки, в транспланте и других моделях реконструкции стволовых клеток; в то же время мезенхимальные стволовые клетки, хотя и происходят из популяции более ранних CD45+-предшественников, как правило, оказываются CD45-OTpHnaTenbHbiMH (Stem Cells 28:140-151, 2010). На мышах продемонстрировано, что полное отсутствие всех изоформ CD45 влияет на сохранение, подвижность и хоуминг стволовых клеток в костном мозге и играет роль в образовании функциональных В-клеток в селезенке из более ранних стволовых клеток (J. Exp. Med. 205:2381-2395, 2008). Представляет интерес, что мыши с нокаутом по CD45, у которых отсутствуют все изоформы CD45, характеризуются пониженным количеством гемопоэтических cKit+Lin- клеток-предшественников в костном мозге, но повышенным количеством в селезенке.
[0031] 30-F11 представляет собой моноклональное IgG2b крысы против тимуса и селезенки мыши. Клон 30-F11 реагирует с обоими аллоантигенами (CD45.1 и CD45.2) и всеми изоформами CD45. 30-F11 и клон 30-F4 блокируют связывание друг друга с CD45, что указывает на их связывание с одним и тем же или перекрывающимися эпитопами CD45 (J Immunol 127(3):982-986, 1981). Аналогично, оба эти клона перекрестно блокируются антителами, описанными Dennert et al., в то же время антитела 55-6.1 против CD45 не характеризуются перекрестным блокированием с 30-F11 или 30-F4 (Cell Immunol 53:350-364, 1980).
[0032] Радиоактивно меченое антитело 30-F11 характеризуется наиболее высоким уровнем накопления в селезенке мыши (60%), причем накопление в костном мозге составляет лишь 20% (Blood 93(2):737-745, 1999), и было использовано для адресной доставки облучающего агента в гемопоэтические органы мыши. Антитело 30-F11 в сочетании с антигеном Seal использовали для идентификации фракций стволовых клеток мышц мыши, поскольку CD45 экспрессируется на всех кроветворных клетках (PNAS 99 1341-1346, 2002). Радиоактивно меченые 30-F11 и f(ab)’2-фрагменты 30-F11 оценивали как способ доставки агента для лучевой терапии. Наиболее значительное поглощение 30-F11 имело место в селезенке мышей, а затем в подмышечных лимфатических узлах (Cancer Res 52(5): 1228-34, 1992).
[0033] Полипептид CD45 можно получить с помощью опубликованных процедур. Способы получения поликлональных и моноклональных антител против CD45 хорошо известны в данной области техники (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); и Hurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications (CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla., 1982), включенные в настоящий документ посредством ссылок). Как очевидно для специалиста в данной области техники, поликлональные антитела можно получить из различных теплокровных животных, например, лошадей, коров, коз, овец, собак, кур, кроликов, мышей и крыс. Хорошо известно получение гуманизированных антител. См. Riechmann L, dark M, Waldmann H, Winter G (1988). "Reshaping human antibodies for therapy". Nature 332 (6162): 332:323. Queen С, Schneider WP, Selick HE, Payne PW, Landolfi NF, Duncan JF, Avdalovic NM, Levitt M, Junghans RP, Waldmann ТА. (Dec 1989). "A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor.". Proc Nati AcadSci USA. 86 (24): 10029-33.. Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen ТЕ, Sandlie I. (May 1997). "Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.". J Immunol Methods 204 (1): 77-87.
Способы и агенты для предотвращения связывания стволовых клеток с лимфатической тканью
[0034] Другие конкретные варианты воплощения обеспечивают способ ослабления связывания стволовых клеток с селезенкой путем воздействия на селезенку раствора антагонистов антигена кластера дифференцировки 45 (CD45). Раствор антагонист антигена CD45 можно скомпоновать или составить с целью связывания с эпитопом 30-F11. Раствор антагонистов антигена CD45 можно составить с целью стимуляции терапевтической регенерации путем усиления доставки стволовых клеток в поврежденные ткани или органы. Раствор, содержащий антитела к антигену CD45, можно составить с целью связывания с эпитопом 30-F11 и человеческим эквивалентом эпитопа 30F-11.
[0035] Настоящее изобретение описывает способы снижения связывания стволовых клеток с лимфатической тканью, например, лимфатическими узлами и селезенкой, и варианты использования этих способов для лечения пациентов-людей. Изобретение описывает конкретную область в селезенке, где циркулирующие стволовые клетки связываются с селезенкой, и способы повышения или снижения связывания стволовых клеток с данной областью. Иммунофлуоресцентный и гистологический анализ свежих толстых срезов селезенки продемонстрировал, что стволовые клетки, циркулирующие в сосудистой системе, связываются с активными зародышевыми центрами в селезенке при введении т vivo или ex vivo, как показано в примерах 1, 2, 3 и 4. Один способ снижения количества стволовых клеток, связывающихся с селезенкой, представляет собой доставку агентов, блокирующих связывание введенных стволовых клеток с молекулярной мишенью в активных зародышевых центрах селезенки. В соответствии со способом по настоящему изобретению, антитела 30-F11 связываются с антигеном CD45 мыши и блокируют связывание стволовых клеток с зародышевыми центрами селезенки мыши. Антитела против CD45 человека, которые могут быть эквивалентны IgG2b крысы 30-F11 против CD45 мыши, включают YAML568, распознающее эпитоп Р CD45 человека (J Nucl Med 47:1335-1341, 2006; In: Leucocyte Typing III: White Cell Differentiation Antigens pp811-814, 1987; Transplantation 40:538-544, 1985), клон HI 30 против CD45 или антитела YTH-24 и YTH-54 против CD45 человека.
[0036] Другой вариант воплощения настоящего изобретения представляет собой использование антагонистов CD26, например, антител к CD26, для ингибирования связывания стволовых клеток с зародышевыми центрами. Поскольку CD26 экспрессируется стволовыми клетками и представляет собой антиген, присутствующий на стволовых клетках, обладающих адгезией к лимфатической ткани, в частности, зародышевым центрам в лимфатической ткани. При блокировании CD26 на стволовых клетках стволовые клетки не способны связываться с лимфатической тканью.
Агенты, ингибирующие и подавляющие образование зародышевых центров или уничтожающие или удаляющие зародышевые центры
[0037] Еще один вариант воплощения настоящего изобретения представляет собой ингибирование связывания стволовых клеток с лимфатическими тканями путем ингибирования или подавления пролиферации зародышевых центров или уничтожения или удаления зародышевых центров. Зародышевые центры (GC) динамично развиваются после активации В-клеток Т-зависимым антигеном. Т-клеточный антиген, активирующий В-клетки и, следовательно, индуцирующий пролиферацию зародышевых центров, представляет собой CD40L (также известный как CD 154), который связывается с рецептором CD40, присутствующим на В-клетках. Это связывание CD40L с рецептором CD40 не только активирует В-клетки, но и индуцирует пролиферацию зародышевых центров. Таким образом, еще один вариант воплощения настоящего изобретения включает введение в организм агента, ингибирующего связывание CD40L с CD40. Примерами таких агентов являются антагонистические антитела к CD40 или CD40L.
[0038] Еще один белок, важный для развития зародышевых центров, представляет собой "белок, ассоциированный с молекулой активации сигнального пути лимфоцитов" (SAP). (Hai Qui, et al., Nature, 455:764-769 (2008). Таким образом, антитела против SAP должны ингибировать образование зародышевых центров и, таким образом, ингибировать связывание стволовых клеток с лимфатическими тканями.
[0039] IL-21 представляет собой еще один полипептид, важный для дифференцировки В-клеток зародышевых центров и пролиферации по механизму, присущему В-клеткам. Отсутствие сигнального пути IL-21 сильно влияет на В-клеточный ответ на белковый антиген, снижает образование плазмоцитов в селезенке и костном мозге и продолжительность существования и функционирования GC, влияя на их пролиферацию, превращение в В-клетки памяти и созревание аффинности. [Zotos, D., et al. JEM 207: 365-378 (2010)]. Таким образом, путем введения в организм антагонистов, например, антител к IL-21, можно подавлять зародышевые центры и ингибировать их образование. Эти антагонисты должны ингибировать связывание стволовых клеток с лимфатической тканью и селезенкой за счет отсутствия зародышевых центров в лимфатической ткани.
[0040] Химиотерапевтические агенты могут ингибировать связывание стволовых клеток с зародышевыми центрами лимфоидных тканей, в том числе лимфатических узлов, пейеровых бляшек и белой пульпы селезенки. Кроме того, агенты, подавляющие иммунный ответ, могут снижать количество активных зародышевых центров в селезенке. Такие агенты включают:
[0041] Азатиоприн, (IMURAN, Prometheus Laboratories, Сан-Диего, штат Калифорния, США), ежедневно вводимый в дозе 3-5 мг/кг, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Азатиоприн нарушает синтез пуринов (аденина и гуанина), необходимый для синтеза ДНК. Быстрорастущие клетки, включая Т-клетки и В-клетки, особенно страдают от ингибирования синтеза пуринов.
[0042] Кортикостероиды, например, дексаметазон, преднизолон, метилпреднизолон, дексаметазона натрия фосфат и бетаметазон. Таблетки дексаметазона (Merck) и инъекции дексаметазона натрия фосфата можно назначать за 1-14 дней до начала лечения стволовыми клетками, более предпочтительно - за 3-7 дней и наиболее предпочтительно - за 3-4 дня до начала лечения стволовыми клетками. Общее количество вводимого дексаметазона представляет собой количество, достаточное для подавления зародышевых центров лимфатической ткани, за счет чего стволовые клетки не могут связываться с лимфатической тканью. Общее количество дексаметазона в течение периода времени может варьировать от 2 мг до 3 г, предпочтительно в общей сложности 27 мг. Суточная доза дексаметазона может варьировать от 0,75 мг до 700 мг в день, предпочтительно 7 мг в день. Дексаметазон, как и другие глюкокортикостероиды, ингибирует образование и пролиферацию зародышевых центров в лимфатических тканях.
[0043] Микофеноловую кислоту (капсулы Myfbrtic с замедленным высвобождением, Novartis Pharmaceuticals Corporation, Ист-Гановер, штат Нью-Джерси, США в дозе 720 мг дважды в сутки (общая суточная доза 1440 мг) на пустой желудок, за час до или через два часа после приема пищи), предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Таблетки и капсулы, суспензию для перорального применения (CellCept Roche Labs, Натли, штат Нью-Джерси, США, мофетила микофенолат), мофетила микофенолат гидрохлорид для внутривенных инъекций, 2-морфолиноэтиловый эфир микофенольной кислоты (МРА), вводимые в/в в дозе 1 г два раза в день или перорально в дозе 1,5 г два раза в день, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Микофеноловая кислота ингибирует инозинмонофосфатдегидрогеназу - фермент, регулирующий скорость синтеза гуанинмонофосфата в пути синтеза пуринов de novo, используемом при пролиферации В- и Т-лимфоцитов. Микофенолят является мощным средством и может использоваться вместо более старого антипролиферативного препарата азатиоприна. Он обычно используется как часть трехкомпонентной схемы лечения иммунодепрессантами, включающей также ингибитор кальциневрина (циклоспорин или такролимус) и преднизолон.
[0044] Лефлуномид, Sanofi-Aventis U.S. LLC, Бриджуотер, штат Нью-Джерси, США, вводимый в суточной дозе 100 мг в течение трех дней за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Лефлуномид является ингибитором синтеза пиримидина, принадлежащим к классу лекарственных средств БПРП (болезнымодифицирующих противоревматических препаратов), который является очень неоднородным с химической и фармакологической точки зрения. Лефлуномид представляет собой иммуномодулятор, ингибирующий дигидрооротатдегидрогеназу (сокращенно DHODH; фермент, участвующий в синтезе пиримидина de novo).
[0045] Терифлуномид, активный метаболит лефлуномида, Sanofi-Aventis U.S. LLC, Бриджуотер, штат Нью-Джерси, США, вводимый в суточной дозе 100 мг в течение трех дней, желательно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0046] Метотрексат - антиметаболит и антифолат.Он действует за счет ингибирования метаболизма фолиевой кислоты. Его вводят перорально или внутримышечно в суточной дозе от 15 до 30 мг в течение до пяти дней, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Mylan Pharmaceuticals, Моргантаун, штат Западная Виргиния, США.
Иммунодепрессанты-макролиды:
[0047] Такролимус снижает продукцию интерлейкина-2 (IL-2) Т-клетками. Выпускается в форме капсул или препаратов для инъекций, вводят в дозе 0,10-0,15 мг/кг/день, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. (Astellas Pharma US, Inc., Дирфилд, штат Иллинойс, США).
[0048] Циклоспорин - считается, что циклоспорин связывается с цитозольным белком циклофилином (иммунофилином) иммунокомпетентных лимфоцитов, особенно Т-лимфоцитов. Реализуется на рынке как Sandimmune в форме капсул, раствора для перорального применения или инъекций, и используется в дозе 14-18 мг/кг/день, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. (Novartis Pharmaceuticals Corporation, Ист-Гановер, штат Нью-Джерси, США).
[0049] Пимекролимус (элидел) является макролактамным производным аскомицина. In vitro показано, что пимекролимус связывается с макрофилином-12 и ингибирует кальциневрин. Таким образом, пимекролимус ингибирует активацию Т-клеток, ингибируя синтез и высвобождение цитокинов из Т-клеток. Пимекролимус также предотвращает высвобождение воспалительных цитокинов и медиаторов из тучных клеток. Пимекролимус используют в виде 1% крема для наружного применения в течение до 6 недель, предпочтительно до начала терапии стволовыми клетками.
[0050] Гусперимус является производным противоопухолевого антибиотика спергуалина и ингибирует интерлейкин-2-стимулируемое созревание Т-клеток в S- и 02/М-фазах и созревание Т-клеток в Thi - эффекторные Т-клетки, секретирующие интерферон-гамма, что приводит к подавлению роста активированных наивных CD4 Т-клеток. Его вводят п/к в дозе 0,5 мг/кг/день в течение 21 суток подряд, с предпочтительным завершением курса за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Nippon Kayaku Co., Ltd.
[0051] Эверолимус (RAD-001), вводимый перорально в дозе 10 мг/день, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Выпускается Novartis, Ист-Гановер, штат Нью-Джерси, США, под торговой маркой Zortress (США).
[0052] Талидомид. Талидомид может снизить уровень ФНОа (Thalomid, Celgene Corporation, Саммит, штат Нью-Джерси, США). Приемлемая дозировка составляет 100-300 мг/день, предпочтительно перед сном через 1 час после ужина, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0053] Леналидомид является производным талидомида, в 50000 раз более мощным, чем талидомид, в отношении ингибирования фактора некроза опухолей-альфа, и характеризуется меньшим количеством тяжелых побочных реакций на препарат.(Celgene Corporation, Саммит, штат Нью-Джерси, США) вводят перорально в дозе 25 мг раз в день в течение 1-21 суток, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0054] Анакинра представляет собой рекомбинантный негликозилированный вариант IL-1RA человека (RA - антагонист рецептора), выпускаемый Kineret Biovitrum, Стокгольм, Швеция, вводимый в виде концентрата для инъекций, содержащего по 100 мг агента на однократную дозу, в течение 7-14 дней, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0055] Инфликсимаб (торговое название REMICADE) представляет собой моноклональное антитело против фактора некроза опухолей альфа (ФНОа). Centocor Ortho Biotech, Хоршем, штат Пенсильвания, США; вводят путем внутривенного вливания в дозе от 3 мг/кг до 10 мг/кг, в течение 7-14 дней и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0056] Голимумаб (CNTO 148) представляет собой моноклональное антитело человека и продается под торговой маркой Simponi. Мишенью голимумаба является ФНО-альфа. Centocor Ortho Biotech, Хоршем, штат Пенсильвания, США; вводят путем подкожной инъекции в дозе 50 мг в 0,5 мл в течение 7-14 дней и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0057] Адалимумаб (HUMIRA, Abbott Laboratories, Норт-Чикаго, штат Иллинойс, США) представляет собой ингибитор ФНО; адалимумаб связывается с ФНОа, предотвращая активацию им рецепторов ФНО; адалимумаб сконструирован на основе полностью человеческого моноклонального антитела, выпускается в заполненных 0,8 мл шприцах, а также в заполненных шприцах-ручках, содержащих по 40 мг адалимумаба. Для подавления зародышевых центров до введения стволовых клеток следует вводить, по меньшей мере, 40 мг адалимумаба в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-7 дней до введения стволовых клеток. Предпочтительно следует ввести две 40-мг дозы адалимумаба в течение 7-14 дней и предпочтительно за 3-7 дней до введения стволовых клеток.
[0058] Цертолизумаба пэгол представляет собой моноклональное антитело против фактора некроза опухолей альфа. Точнее, он представляет собой ПЭГилированный Fab’-фрагмент гуманизированного ФНО-ингибиторного моноклонального антитела. Его вводят в виде двух подкожных инъекций по 200 мг в течение 7-14 дней и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. (UCB Inc, Атланта, штат Джорджия, США).
[0059] Темсиролимус (Pfizer Corporation) является специфическим ингибитором mTOR (мишень рапамицина у млекопитающих) и нарушает синтез белков, регулирующих пролиферацию, рост и выживание опухолевых клеток. Рекомендуемая доза темсиролимуса составляет 25 мг при в/в вливании в течение 30-60 минут, в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0060] Зотаролимус является полусинтетическим производным рапамицина (Abbot Laboratories, Норт-Чикаго, штат Иллинойс, США)
[0061] Биолимус А9, Biosensors International, Сингапур
[0062] Экулизумаб (торговое название Soliris) представляет собой моноклональное антитело против белка С5 комплемента. Это антитело блокирует расщепление С5 и останавливает комплемент-опосредованное разрушение клеток. Soliris вводят путем в/в вливания в дозах 600 мг или 900 мг в течение 7-14 дней и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток (Alexion Pharmaceuticals, Чешир, штат Коннектикут, США).
[0063] Меполизумаб (предлагаемый под торговым названием Bosatria) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, распознающее интерлейкин-5 (IL-5), вводимое путем вливания в дозе 750 мг в течение 7-14 дней и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. GlaxoSmithKline, Кинг-оф-Праша, штат Пенсильвания, США.
[0064] Омализумаб (торговое название Xolair (ксолар), Genentech/Novartis) представляет собой гуманизированное антитело. Омализумаб представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело IgGlk, полученное из ДНК и избирательно связывающееся с иммуноглобулином Е (IgE) человека. Ксолар (омализумаб) вводят п/к в дозе от 150 до 375 мг в течение 7-14 дней, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0065] Нерелимомаб (BAYX) представляет собой антитело мыши против ФНО и может назначаться в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0066] Фаралимомаб представляет собой антитело мыши против ФНО и может назначаться в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0067] Элсилимомаб (также известный как В-Е8) представляет собой моноклональное антитело мыши и иммунодепрессант.В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0068] Лебрикизумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, предназначенное для специфического связывания с IL-13; его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Genentech, Саут-Сан-Франциско, штат Калифорния, США.
[0069] Устекинумаб (экспериментальное название CNTO 1275, патентованное коммерческое название Stelara, Centocor) представляет собой моноклональное антитело человека. Он направлен против интерлейкина-12 и интерлейкина-23, естественных белков, регулирующих иммунную систему и иммуноопосредованные воспалительные расстройства. Его вводят по схеме, включающей 2 инъекции с интервалом в один месяц по 90 или 45 мг или однократную 45-мг инъекцию и завершающейся за 7-14 дней, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0070] Муромонаб-СОЗ (торговое название Orthoclone OKT3, выпускается Janssen-Cilag) представляет собой моноклональное антитело, мишенью которого является рецептор CD3, мембранный белок на поверхности Т-клеток. Его вводят в дозе 5 мг/день в болюсной внутривенной инъекции в течение 10-14 дней. Прием следует завершить за 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Детям с массой тела менее 30 фунтов следует вводить 2,5 мг/день (Ortho Biotech, Раритан, штат Нью-Джерси, США).
[0071] Отеликсизумаб представляет собой моноклональное антитело, мишенью которого является эпсилон-цепь CD3. Его вводят в дозе 5 мг/день в болюсной внутривенной инъекции в течение 10 - 14 дней. Прием предпочтительно следует завершить в течение 7-14 дней и за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Детям с массой тела менее 30 фунтов следует вводить 2,5 мг/день. Указанное антитело разработано Tolerx, Inc в сотрудничестве с GlaxoSmithKline и выпускается Abbott Laboratories.
[0072] Теплизумаб представляет собой гуманизированное Fc-сконструированное моноклональное антитело, также известное как MGA031 и пОКТЗу! (Ala-Ala). Оно представляет собой антитело против CD3. Его можно вводить в соответствии с настоящим изобретением в дозе 5 мг/день в болюсной внутривенной инъекции в течение 10-14 дней. Прием следует завершить за 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Детям с массой тела менее 30 фунтов следует вводить 2,5 мг/день (ЕЙ Lilly, Индианаполис, штат Индиана, США).
[0073] Визилизумаб (предварительное торговое название Nuvion, PDL BioPharma Inc) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, мишенью которого является CD3 на активированных Т-клетках. Его можно вводить в соответствии с настоящим изобретением в дозе 5 мг/день в болюсной внутривенной инъекции в течение 10 - 14 дней. Прием следует завершить за 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Детям с массой тела менее 30 фунтов следует вводить 2,5 мг/день.
[0074] Кленоликсимаб представляет собой моноклональное антитело против CD4. Его можно вводить в соответствии с настоящим изобретением в дозе 5 мг/день в болюсной внутривенной инъекции в течение 10-14 дней. Прием следует завершить за 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0075] Келиксимаб представляет собой моноклональное антитело, связывающееся с лейкоцитами через белок CD4. Его вводят путем вливания в дозе 3 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0076] Занолимумаб (предполагаемое торговое название Humax-CD4) представляет собой моноклональное антитело человека, мишенью которого является CD4; его вводят в дозе 20 мг/кг/день в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. (Genmab, A/S COPENHAGEN/TenX Biopharma, Inc., Филадельфия, штат Пенсильвания, США).
[0077] Эфализумаб (торговое название Raptiva, Genentech, Merck Serono) представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело. Эфализумаб связывается с субъединицей CD 11 а антигена 1, ассоциированного с функционированием лимфоцитов. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить раз в неделю в виде подкожной инъекции в дозе 20 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0078] Эрлизумаб, также известный как rhuMAb, представляет собой рекомбинантное гуманизированное моноклональное антитело, разработанное компанией Genentech при сотрудничестве с Roche. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить раз в неделю в виде подкожной инъекции в дозе 20 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Препарат действует, блокируя фактор роста кровеносных сосудов. В частности, мишенями эрлизумаба являются CD 18 и интегрин LFA-1.
[0079] Афутузумаб представляет собой моноклональное антитело против CD20. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить раз в неделю в виде подкожной инъекции в дозе 20 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. (Hoffmann-La Roche Inc.)
[0080] Окрелизумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против CD20. Его мишенью являются зрелые В-лимфоциты. Его разрабатывают Genentech, дочерняя компания Hoffmann-La Roche, и Biogen Idee. В соответствии с настоящим изобретением, его вводят в дозах 200 мг и 600 мг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0081] Пасколизумаб представляет собой гуманизированное моноклинальное антитело против IL-4. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить раз в неделю в виде подкожной инъекции в дозе 20 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
2
2
2
[0082] Лумиликсимаб представляет собой моноклональное антитело, мишенью которого является CD23. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозах от 50 мг/м до 450 мг/м и до 500 мг/м в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Этот препарат представляет собой химерное антитело Масаса irus и Homo sapiens. (Biogen IDEC).
[0083] Тенеликсимаб представляет собой химерное моноклональное антитело к иммуностимулирующему белку CD40. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить раз в неделю в виде подкожной инъекции в дозе 20 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0084] Торализумаб (IDEC 131) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить раз в неделю в виде подкожной инъекции в дозе 20 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток (IDEC Pharmaceuticals Corporation).
[0085] Аселизумаб представляет собой антитело против CD62L, вводимое путем в/в вливания в дозах от 0,5 мг/кг до 1,0 мг/кг и 2,0 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
2
[0086] Галиксимаб представляет собой моноклональное антитело против CD80 (Biogen Idec), в/в вводимое в дозе 500 мг/м в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Этот препарат представляет собой химерное антитело Масаса irus и Homo sapiens.
[0087] Гавилимомаб представляет собой моноклональное антитело мыши (также известное как ABX-CBL, разработанное Abgenix). Он связывается с антигеном CD 147. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить путем в/в вливания в дозе 20 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0088] BG9588 представляет собой гуманизированное антитело против CD40L, вводимое в дозе 20 мг/кг в течение 7-14 дней и за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Введение антител к CD 154, также называемому лигандом CD40 или CD40L, представляющему собой белок, в основном экспрессирующийся на активированных Т-клетках и являющийся членом ФНО-надсемейства молекул. Он связывается с CD40 на антигенпрезентирующих клетках (АПК), что приводит к многим эффектам в зависимости от типа клетки-мишени. В целом, CD40L играет роль ко-стимуляторной молекулы и индуцирует активацию АПК в сочетании со стимуляцией Т-клеточных рецепторов молекулами МНС на АПК. В общей сложности у CD40L существуют три партнера по связыванию: CD40, интегрин α5β1 и αIIbβ3.
[0089] (Hu5c8) 5c8, моноклональное антитело, связывающееся с CD154 (лигандом CD40), таким образом блокируя взаимодействие между CD40 и CD154, вводят в дозе 20 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0090] Белимумаб (зарегистрированное название Benlysta, ранее известен как LymphoStat-B), представляет собой полностью человеческое моноклональное антитело, специфически распознающее и ингибирующее биологическую активность стимулятора В-лимфоцитов (BLyS), также известного как фактор активации В-клеток, принадлежащий к семейству ФНО (BAFF, Human Genome Sciences). В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0091] Ипилимумаб (также известный как MDX-010 или MDX-101) представляет собой моноклональное антитело человека против CTLA-4 (антигена, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами), разработанное Bristol-Myers Squibb. В соответствии с настоящим изобретением, его вводят в дозе 10 мг активного препарата/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0092] Тремелимумаб (ранее называвшийся тицилимумаб, СР-675, 206) представляет собой полностью человеческое моноклональное IgG2 антитело производства Pfizer. Он связывается с белком CTLA-4, который экспрессируется на поверхности активированных Т-лимфоцитов. Тремелимумаб блокирует связывание лигандов антиген-представляющих клеток В7.1 и В7.2 с CTLA-4, что приводит к ингибированию B7-CTLA-4-опосредованного подавления активации Т-клеток; впоследствии В7.1 или В7.2 может взаимодействовать с другим рецепторным белком поверхности Т-клеток, CD28, что приводит к B7-CD28-oпocpeдoвaннoй активации Т-клеток, не уравновешивающейся В7-CTLA-4-опосредованным ингибированием. Тремелимумаб вводят путем в/в вливания в дозах 3 мг/кг, 6 мг/кг, 10 мг/кг, 15 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0093] Бертилимумаб представляет собой моноклональное антитело человека, связывающееся с эотаксином-1. (iCo Therapeutics Inc., Ванкувер, провинция Британская Колумбия, Канада). В соответствии с настоящим изобретением, его вводят в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0094] Лерделимумаб (CAT-152) представляет собой антитело против ТФР-бета-2, разработанное Cambridge Antibody Technology. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0095] Метелимумаб (CAT-192) представляет собой моноклональное антитело (IgG4) человека, разработанное Cambridge Antibody Technology и нейтрализующее ТФР-бета-1. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Натализумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против молекулы клеточной адгезии а4-интегрина. Он совместно выпускается Biogen Idee и Elan под названием Tysabri, a ранее назывался Antegren. Натализумаб вводят в дозе 300 мг путем внутривенного вливания на протяжении приблизительно одного часа в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0096] Тоцилизумаб или атлизумаб, разработанный Hoffmann-La Roche и Chugai под торговыми названиями Actemra и RoActemra, представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против рецептора интерлейкина-б (IL-6R). В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить путем внутривенного вливания в дозе 8 мг/кг в течение 7-14 дней, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0097] Одулимомаб представляет собой моноклональное антитело мыши против альфа-цепи белка антигена 1, ассоциированного с функционированием лимфоцитов, который участвует в иммунных реакциях. Его вводят в дозе 10 мг активного препарата/кг в течение 7-14 дней и за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0098] Базиликсимаб (торговое название Simulect) представляет собой химерное моноклональное антитело мыши-человека к цепи a (CD25) рецептора IL-2 Т-клеток. Доза составляет 20 мг дважды в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[0099] Даклизумаб (торговое название Zenapax) представляет собой терапевтическое гуманизированное моноклональное антитело к альфа-субъединице рецептора IL-2 Т-клеток. Roche Pharmaceuticals, Hoffmann - La Roche Inc, 340 Кингсланд-стрит, Натли, штат Нью-Джерси, США. Его вводят в дозе 10 мг активного препарата/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00100] Инолимомаб представляет собой моноклональное антитело мыши против альфа-цепи рецептора интерлейкина-2. OPi (ранее Orphan Pharma International). Его вводят в дозе 10 мг активного препарата/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00101] Золимомаб аритокс представляет собой моноклональное антитело мыши против CD5, связанное с А-цепью белка рицина (что отражено в названии препарата аритокс). В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00102] Аторолимумаб представляет собой моноклональное антитело мыши против резус-фактора. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00103] Цеделизумаб представляет собой моноклональное антитело против CD4. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00104] Дорликсизумаб представляет собой химерное/гуманизированное моноклональное антитело и иммунодепрессант.Его вводят в дозе 10 мг активного препарата/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00105] Фонтолизумаб (торговое название HuZAF) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против интерферона-гамма. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в/в в дозе 4,0 мг/кг или 10,0 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток (PDL Biopharma).
[00106] Гантенерумаб представляет собой моноклональное антитело против бета-амилоида (Roche). Его вводят в дозе 10 мг активного препарата/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00107] Гомиликсимаб представляет собой моноклональное антитело, мишенью которого является рецептор низкоаффинного IgE (FceRII или CD23). В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00108] Маслимомаб представляет собой моноклональное антитело мыши, мишенью которого является Т-клеточный рецептор. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00109] Моролимумаб представляет собой моноклональное антитело человека против резус-фактора человека. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00110] Пекселизумаб представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент моноклонального антитела, мишенью которого является компонент 5 системы комплемента. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00111] Реслизумаб представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против IL-5. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить путем вливания в предпочтительной дозе 3,0 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. (Ception Therapeutics Inc).
[00112] Ровелизумаб, так же известный как LeukArrest и Hu23F2G, представляет собой гуманизированное моноклональное антитело против CD11/CD18, подавляющее лейкоциты. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00113] Сиплизумаб (MEDI-507) представляет собой моноклональное антитело против CD2 с IgG1-каппа человека к CD2. Указанный агент оказывает мощное иммуномодулирующее действие, избирательно подавляющее функции Т- и NK-клеток. Сиплизумаб связывается с CD2, специфическим рецептором, обнаруживаемым в Т-клетках и NK-клетках, тем самым вызывая иммунный ответ, приводящий к лизису CD2+-клеток, избирательному подавлению иммунной системы и контролю роста активированных Т-клеток. В соответствии с настоящим изобретением, Сиплизумаб можно вводить в предпочтительной дозе 0,04 мг/кг в/в и 5 или 7 мг/кг п/к в течение 7-14 дней, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток (Medimmune).
[00114] Тализумаб (TNX-901) представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, разработанное Тапох в Хьюстоне, штат Техас, США. Оно сконструировано таким образом, что его мишенью является иммуноглобулин Е (или IgE) и, в частности, IgE-экспрессирующие В лимфоциты, при отсутствии связывания с IgE, уже связанного с рецепторами IgE на тучных клетках и базофилах. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00115] Омализумаб представляет собой моноклональное антитело против IgE, разработанное Тапох, Novartis и Genentech. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00116] Телимомаб аритокс представляет собой моноклональное антитело мыши. Указанное антитело связано с А-цепью белка рицина (что находит отражение в названии препарата аритокс). В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00117] Вапаликсимаб представляет собой химерное моноклональное антитело против VAP-1. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00118] Вепалимомаб представляет собой моноклональное антитело мыши против VAPI. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в дозе 10 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00119] Абатацепт (выпускаемый под названием Orencia) представляет собой гибридный белок, состоящий из иммуноглобулина, объединенного с внеклеточным доменом CTLA-4, молекулы, способной связывать В7, тем самым препятствуя полной активации Т-клеток. Абатацепт следует вводить в виде 30-минутного внутривенного вливания в соответствии с заданным режимом введения в зависимости от массы тела. Дозы предпочтительно должны составлять 500 мг для пациента с массой тела <60 кг; 750 мг для 60 кг - 100 кг, и 1 грамм для >100 кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00120] Белатацепт (Bristol-Myers-Squibb) представляет собой гибридный белок, состоящий из Fc-фрагмента иммуноглобулина IgG1 человека, связанного с внеклеточным доменом CTLA-4, который представляет собой ключевую молекулу для костимуляции Т-клеток, выборочно блокирующую процесс активации Т-клеток. Он разработан компанией… Он отличается от абатацепта (Orencia) всего 2 аминокислотами. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в виде 30-минутного внутривенного вливания в соответствии с заданным режимом введения в зависимости от массы тела при предпочтительных дозировках 500 мг для пациента с массой тела <60 кг; 750 мг для 60 кг-100 кг и 1 грамм для >100 кг, вводимых в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00121] Этанерцепт (торговое название Enbrel, Amgen, Таузенд-Оукс, штат Калифорния, США) представляет собой препарат для лечения аутоиммунных заболеваний путем нарушения действия фактора некроза опухолей (ФНО, часть иммунной системы), выступая в качестве ингибитора ФНО. Этанерцепт можно вводить подкожно (п/к) в дозе 25 мг или 50 мг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00122] Пэгсунерцепт представляет собой пэгилированный растворимый рецептор фактора некроза опухолей. В соответствии с настоящим изобретением, его можно вводить в предпочтительной дозе 9 мг/кг п/к в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00123] Афлиберцепт представляет собой белок, состоящий из сегментов внеклеточных доменов рецепторов 1 (VEGFR1) и 2 фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR2) человека, объединенных с константной областью (Fc) IgGI человека с потенциальной антиангиогенной активностью, и совместно разрабатывается компаниями Sanofi-Aventis и Regeneron Pharmaceuticals. Афлиберцепт ("ловушка для ФРЭС"), антиангиогенный агент, представляет собой гибридный белок, специально разработанный для связывания всех форм фактора роста эндотелия сосудов А (так называемого ФРЭС-А). Кроме того, афлиберцепт связывает плацентарный фактор роста (PLGF), который также вовлечен в опухолевый ангиогенез. Афлиберцепт можно вводить путем инъекции или в/в вливания в предпочтительных дозировках 2 мг на килограмм (мг/кг) или 4 мг/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно вводят за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
[00124] Алефацепт представляет собой гибридный белок: он объединяет фрагмент антитела и белок, блокирующий рост некоторых типов Т-клеток. AMEVIVE (алефацепт) представляет собой иммуносупрессорный димерный гибридный белок, состоящий из внеклеточного С02-связывающего фрагмента антигена 3, ассоциированного с функционированием лейкоцитов (LFA-3) человека, связанного с Fc-фрагментом (шарнирный, СН2- и СН3-домены) IgGI человека. Предпочтительная дозировка составляет 7,5 мг в/в или 15 мг в/м; ее предпочтительно вводят в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Astellas Pharma US, Inc., Дирфилд, штат Иллинойс, США 60015.
[00125] Рилонацепт, также известный как "ловушка для IL-1" (выпускается под торговым названием Arcalyst), представляет собой димерный гибридный белок, состоящий из внеклеточного домена рецептора интерлейкина-1 человека и FC-домена IgGI человека, который связывает и нейтрализует IL-1 человека. Лечение следует начинать с нагрузочной дозы в 320 мг, доставляемой в виде двух 2-мл подкожных инъекций по 160 мг каждая, вводимых в один и тот же день в два разных участка тела, в течение 7-14 дней и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Для пациентов-детей в возрасте от 12 до 17 лет: Лечение следует начинать с нагрузочной дозы в 4,4 мг/кг, при максимальной дозе 320 мг, доставляемой в виде одной или двух 2-мл подкожных инъекций при максимальном объеме однократной инъекции 2 мл, в течение 7-14 дней и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Выпускается компанией Regeneron.
[00126] Дацетузумаб (также известный как SGN-40 или huS2C6) представляет собой моноклональное гуманизированное антитело против CD40. Антиген CD40 экспрессируется на высоком уровне при большинстве гематологических злокачественных новообразований В-линии, в том числе множественной миеломе, неходжкинской лимфоме и хроническом лимфолейкозе. CD40 также обнаруживается на многих типах солидных опухолей, в том числе раке мочевого пузыря, почек и яичников и на клетках, участвующих в иммунологических расстройствах. Его вводят в предпочтительной дозе 1 6 мг активного препарата/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Seattle Genetics, Inc.
[00127] HCD122 представляет собой полностью человеческое антагонистическое моноклональное антитело против CD40. CD40 представляет собой рецептор поверхности клеток, играющий ключевую роль в иммунном ответе, а также сигнальных путях, участвующих в росте и выживаемости клеток, за счет его активации лигандом CD40 (CD40L). Он обычно сверхэкспрессируется и активируется при В-клеточных злокачественных новообразованиях. В соответствии с настоящим изобретением, указанный агент можно вводить в дозе 10 мг активного препарата/кг в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Он разрабатывается XOMA/NOVARTIS ONCOLOGY.
2
[00128] Ритуксимаб, продаваемый под торговыми названиями ритуксан (Rituxan) и мабтера (MabThera), Genentech, Inc, Сан-Франциско, штат Калифорния, США, представляет собой химерное моноклональное антитело против белка CD20, который обнаруживается главным образом на поверхности В-клеток. Поэтому он может уничтожать В-клетки. CD20 широко экспрессируется на В-клетках, начиная с ранних предшественников до более дифференцированных В-клеток, но отсутствует на окончательно дифференцированных плазмоцитах. Ритуксан поставляется в концентрации 10 мг/мл в одноразовых ампулах по 100 мг (10 мл) или 500 мг (50 мл). Его можно вводить путем вливания со скоростью 50 мг/час. При отсутствии токсичности при вливании можно увеличить скорость вливания на 50 мг/ч каждые 30 минут до максимальной скорости 400 мг/час; указанный препарат предпочтительно вводят в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Предпочтительная рекомендуемая доза составляет 375 мг/м при в/в вливании; ее предпочтительно вводят за 3-4 дня до введения стволовых клеток.
2
[00129] Ритуксимаб также можно вводить в качестве компонента зевалина (Zevalin) путем вливания ритуксимаба в предпочтительной дозировке 250 мг/м в течение 4 часов до введения индий-111- (In-111-) зевалина и в течение 4 часов до введения иттрий-90- (Y-90-) зевалина; это следует выполнять в течение 7-14 дней, и предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Ритуксан также можно вводить в комбинации с метотрексатом, предпочтительно за 3-4 дня до введения стволовых клеток. Biogen Idee Inc. и Genentech USA, Inc.
[00130] Ибритумомаб тиуксетан, продаваемый под торговым названием Zevalin, представляет собой моноклональное антитело для лучевой терапии, мишенью которого являются В-клетки. В указанном препарате используют моноклональные антитела IgGI мыши ибритумомаб в сочетании с хелатором тиуксетаном, к которому добавляют радиоактивный изотоп (иттрий-90 или индий-111). Тиуксетан представляет собой модифицированную версию DTPA, углеродный каркас которого содержит изотиоцианатбензильную и метальную группу.
[00131] Недостаточность аденозиндезаминаз также приводит к снижению образования активных зародышевых центров за счет агентов, вызывающих накопление дезоксиАТФ (J Immunol 171: 5562-5570, 2003). Кроме того, агенты, усиливающие экспрессию или активирующие CCR7, вызывают снижение образования активных зародышевых центров.
Стволовые клетки: определение, выделение, доставка и терапевтическое использование
[00132] Термин стволовых клеток в рамках настоящего изобретения включает любые клетки, способные дифференцироваться в желательную ткань. Такие клетки включают плюрипотентные стволовые клетки, эмбриональные стволовые клетки, мультипотентные взрослые стволовые клетки и клетки-предшественники. "Стволовая клетка" представляет собой клетку эмбриона, плода или взрослого организма, способную, при определенных условиях, воспроизводить себя в течение длительного периода или, в случае взрослой стволовой клетки, на протяжении всей жизни организма. Она также может давать начало специализированным клеткам, составляющим ткани и органы организма.
[00133] "Плюрипотентные стволовые клетки" способны давать начало типам клеток, развивающимся из трех зародышевых листков (мезодермы, эндодермы и эктодермы), из которых возникают все клетки организма. Известные природные источники плюрипотентных стволовых клеток человека представляют собой клетки, выделенные и культивируемые из ранних эмбриональных тканей человека, которые должны были стать частью гонад.
[00134] "Эмбриональная стволовая клетка" происходит от группы клеток, называемых внутренней клеточной массой, являющейся частью раннего (4 - 5-сутки) эмбриона, называемого бластоцистой. После извлечения из бластоцисты клетки внутренней клеточной массы можно культивировать в эмбриональные стволовые клетки.
[00135] "Взрослая стволовая клетка" представляет собой недифференцированную (неспециализированную) клетку, которая присутствует в дифференцированной (специализированной) ткани, обновляется и становится специализированной, давая начало всем специализированным типам клеток ткани, в которой она находится при переносе в соответствующую ткань. Взрослые стволовые клетки способны воспроизводить свои идентичные копии в течение всей жизни организма. Это свойство называется "самообновлением". Взрослые стволовые клетки обычно делятся с получением клеток-предшественников, которые затем дифференцируются или развиваются в "зрелые" типы клеток, которые обладают характерной формой и специализированными функциями, например, сокращением у мышечной клетки или передачей сигнала у нервной клетки. Источники взрослых стволовых клеток включают костный мозг, кровь, роговицу и сетчатку глаза, головной мозг, скелетные мышцы, пульпу зуба, печень, кожу, слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта и поджелудочную железу, но не ограничиваются ими.
[00136] Доставка или введение стволовых клеток в организм включает как доставку или введение экзогенных стволовых клеток, так и мобилизацию эндогенных стволовых клеток, а также повышение биодоступности спонтанно высвобожденных эндогенных стволовых клеток.
[00137] Стволовые клетки костного мозга представляют собой наиболее изученный тип взрослых стволовых клеток. В настоящее время они используются в медицине для восстановления различных компонентов крови и иммунной системы путем трансплантации в костный мозг. В настоящее время идентифицированы два основных типа стволовых клеток, встречающиеся в костном мозге: гемопоэтические стволовые клетки (ГСК, или С034+-клетки), которые, как считается, обычно образуют клетки крови и иммунной системы и стромальные (мезенхимальные) стволовые клетки (МСК), которые, как считается, обычно образуют кость, хрящ, мышцы и жир. В то же время недавно продемонстрировано, что оба типа стволовых клеток костного мозга характеризуются значительной пластичностью и мультипотентностью по отношению к способности образовывать одну и ту же ткань. Костный мозг, расположенный в медуллярной полости костей, является основным центром кроветворения у взрослых людей. Он образует около шести миллиардов клеток на килограмм массы тела в сутки. Гемопоэтически активный (красный) костный мозг регрессирует после рождения и до позднего подросткового возраста, после чего он сосредотачивается в нижней части черепа, позвонках, плечевом и тазовом поясе, ребрах и грудине. Жировые клетки замещают кроветворные клетки в костях кистей, стоп, ног и рук (желтый костный мозг). Жир занимает до приблизительно пятидесяти процентов пространства красного костного мозга у взрослых, и с возрастом медленно происходит дальнейшее жировое перерождение. У очень старых организмов может происходить желатиновое преобразование жира в слизистый материал (белый костный мозг). Желтый костный мозг может возвращаться к состоянию активного гемопоэтического костного мозга в случае продолжительной потребности, например, гемолитической анемии. Таким образом, кроветворение может быть усилено за счет увеличения объема красного костного мозга и снижения времени развития (перехода) предшественников в зрелые клетки.
[00138] Строма костного мозга состоит главным образом из сети синусов, которые возникают на эндосте из корковых капилляров и заканчиваются в собирающих сосудах, которые входят в систему венозного кровообращения. Трехслойная стенка синуса состоит из эндотелиальных клеток, слаборазвитой, тонкой базальной мембраны, и адвентициальных ретикулярных клеток, представляющих собой фибробласты, способные превращаться в адипоциты. Эндотелий и ретикулярные клетки являются источниками гемопоэтических цитокинов. Кроветворение происходит в межсинусовом пространстве и контролируется сложным комплексом стимулирующих и ингибирующих цитокинов, контактов "клетка-клетка" и действия компонентов внеклеточного матрикса на ближайшие клетки. В этой уникальной среде лимфогемопоэтические стволовые клетки дифференцируются во все виды клеток крови. Зрелые клетки образуются и высвобождаются, поддерживая устойчивые концентрации клеток крови. Система может удовлетворить повышенную потребность в дополнительных клетках, возникающую в результате кровопотери, гемолиза, воспаления, иммунных цитопений и других причин.
[00139] "Клетка-предшественник" является частично специализированной, она самообновляется и также способна давать начало дифференцированным клеткам. Исследователи часто отличают клетки-предшественники от взрослых стволовых клеток на том основании, что когда стволовая клетка делится, одна из двух новых клеток часто представляет собой стволовую клетку, способную к повторному самовоспроизведению. В противоположность этому, при делении клетки-предшественника она может образовывать новые клетки-предшественники или две специализированные клетки. Клетки-предшественники могут замещать поврежденные или мертвые клетки, тем самым поддерживая целостность и функции тканей, например, печени или головного мозга.
[00140] Хорошо известны средства для выделения и культивирования стволовых клеток, используемые в настоящем изобретении. Пуповинная кровь является богатым источником гемопоэтических стволовых клеток. Стволовые клетки, полученные из пуповинной крови, и клетки, полученные из костного мозга или периферической крови, по всей видимости, очень сходны при использовании для трансплантации. Плацента является легкодоступным источником мезенхимальных стволовых клеток. Кроме того, показано, что мезенхимальные стволовые клетки могут быть получены из жировой ткани и клетки стромы костного мозга и предположительно присутствуют в других тканях. Амниотическая жидкость и ткань являются еще одним источником стволовых клеток. Несмотря на значительные качественные и количественные различия в органах, из которых можно получить взрослые стволовые клетки, исходные различия между клетками могут быть относительно поверхностными и уравновешенными сходным диапазоном их пластичности. Например, взрослые стволовые клетки, как гемопоэтические, так и мезенхимальные, при соответствующих условиях могут стать клетками сердечной мышечной ткани. Разграничение полного диапазона потенциальных возможностей взрослых стволовых клеток еще только начинается. Стволовые клетки можно выделить и дифференцировать с помощью известных способов. Например, клетки костного мозга мышей выделяют, умерщвляя мышь, разрезая кости ног ножницами и вымывая стволовые клетки. Стволовые клетки можно также выделить из клеток костного мозга путем пэннинга клеток костного мозга с помощью антител, связывающих нежелательные клетки, например, CD4+ и CD8+ (Т-клетки), CD45+ (все В-клетки), GR-1 (гранулоциты). В качестве примера этой процедуры см. Inaba et al., J. Exp.Med. 176:1693-1702 (1992).
[00141] На Фиг.1 показан типичный вид слоев, полученных в результате центрифугирования цельной крови в градиенте. 1 - тромбоциты, 2 - лейкоцитарная пленка с мононуклеарами и стволовыми клетками, 3 - фиколл, и 4 - осадок эритроцитов и стволовых клеток.
[00142] CD34+ гемопоэтические стволовые клетки человека можно получить из различных источников, в том числе пуповинной крови, костного мозга и мобилизованной периферической крови. Очистку от СD34+-клеток можно выполнить с помощью аффинных процедур, использующих антитела. Процедура выделения СD34+-клеток на колонке для аффинной хроматографии описана Но et al., Stem Cells 13 (suppl. 3): 100-105(1995). См. также Brenner, Journal of Hematotherapy 2:7-17 (1993). Известны способы выделения, очистки и культивирования мезенхимальных стволовых клеток. Кроме того, известны специфические антигены для МСК (см. патенты США №№5486359 и 5837539).
[00143] Стволовые клетки характеризуются способностью к самообновлению путем митоза и к дифференцировке в разнообразные специализированные типы клеток. Существует иерархия стволовых клеток. Тотипотентные стволовые клетки представляют собой клетки, например, оплодотворенную яйцеклетку, которые могут давать начало всем тканям, необходимым для развития всего организма. Плюрипотентные стволовые клетки представляют собой клетки, которые могут давать начало стволовым клеткам всех 3 зародышевых листков, и включают такие клетки как эмбриональные стволовые клетки, сперматогониальные стволовые клетки (Cell. 119(7): 1001-1012, 2009; NATURE 440:1199-1203, 2006) или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, которые при введении в тетраплоидный эмбрион могут давать начало целому организму (Stem Cell Rev. 2010), но не необходимым внеэмбриональным тканям, например, плаценте. Очень мелкие стволовые клетки, аналогичные эмбриональным, представляют собой клетки, находящиеся в костном мозге, крови, сердце и других тканях взрослого организма, которые могут давать начало клеткам линий всех 3 зародышевых листков; в то же время, исследования с помощью тетраплоидного комплементационного анализа до сих пор не показали, что указанные клетки могут давать начало целому организму, так что неясно, являются ли они истинными плюрипотентными стволовыми клетками, активности которых при тетраплоидной комплементации препятствует соматический импринтинг, или они являются более ограниченными, но чрезвычайно пластичными мультипотентными стволовыми клетками (DEVELOPMENTAL DYNAMICS 236:3309-3320, 2007). Мультипотентные стволовые клетки представляют собой такие клетки как гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) (J Exp Med. 207(6): 1127-1130, 2010) стволовые клетки жировой ткани (ASC) (Stem Cells Dev. 2010 [принято в печать]) или мезенхимальные стволовые клетки (МСК) (StemBook, Cambridge (MA): Harvard Stem Cell Institute; 2008-2009), которые могут давать начало различным функционирующим клеткам ограниченных линий.
[00144] Стволовые клетки могут дополнительно характеризоваться тем, в какой степени они могут дифференцироваться, и различаются по дифференцировочной потенции. Потенция определяет потенциал дифференцировки (способность дифференцироваться в различные типы клеток) стволовой клетки.
[00145] Тотипотентные (или омнипотентные) стволовые клетки могут дифференцироваться в эмбриональные и внеэмбриональные типы клеток. Такие клетки могут образовать целый жизнеспособный организм. Эти клетки образуются в результате слияния яйцеклетки и сперматозоида. Клетки, образованные в результате первых нескольких делений оплодотворенной яйцеклетки также являются тотипотентными.
[00146] Плюрипотентные стволовые клетки являются потомками тотипотентных клеток и могут дифференцироваться почти во все клетки, то есть клетки, происходящие от любого из трех зародышевых листков.
[00147] Мультипотентные стволовые клетки могут дифференцироваться в ряд клеток, но только в клетки близкородственного семейства.
[00148] Олигопотентные стволовые клетки могут дифференцироваться только в несколько типов клеток, например, лимфоидные или миелоидные стволовые клетки.
[00149] Унипотентные клетки могут образовывать клетки только одного типа, их собственного, но обладают способностью к самообновлению, что отличает их от нестволовых клеток (например, мышечные стволовые клетки).
[00150] Два основных типа стволовых клеток млекопитающих представляют собой: эмбриональные стволовые клетки, выделенные из внутренней клеточной массы бластоцисты, и взрослые стволовые клетки, находящиеся в тканях взрослого организма.
[00151] Взрослые стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, находящиеся во всех частях организма после эмбрионального развития, размножающиеся путем деления клеток для пополнения отмирающих клеток и регенерации поврежденных тканей. Они также называются соматическими стволовыми клетками и могут обнаруживаться как в молодых, так и во взрослых организмах животных и людей. Типы взрослых стволовых клеток включают гемопоэтические стволовые клетки, стволовые клетки молочной железы, мезенхимальные клетки, эндотелиальные стволовые клетки, нервные стволовые клетки, обонятельные стволовые клетки взрослых, стволовые клетки, происходящие из жировой ткани, стволовые клетки нервного валика и стволовые клетки семенников.
[00152] Клетки-предшественники имеют тенденцию дифференцироваться в клетку определенного типа. В отличие от стволовых клеток, тем не менее, они являются уже гораздо более специализированными: они направленно дифференцируются в свою "целевую" клетку. Наиболее важное различие между стволовыми клетками и клетками-предшественниками состоит в том, что стволовые клетки могут реплицироваться до бесконечности, в то время как клетки-предшественники могут делиться только ограниченное количество раз. Дискуссия об их точном определении продолжается и указанная концепция все еще формируется.
[00153] Термины "клетка-предшественник" и "стволовая клетка" иногда приравниваются друг к другу.
[00154] Продемонстрировано, что стволовые клетки, обнаруживаемые в мононуклеарной фракции цельной крови, костном мозге, жировой ткани, пуповинной крови и других тканях, а также выделенные стволовые клетки из указанных мононуклеарных фракций приносят пользу пациентам-людям. Мононуклеар периферической крови (МПК) представляет собой любую клетку крови, содержащую круглое ядро. Например, лимфоцит, моноцит или макрофаг. Указанные клетки крови являются критическим компонентом иммунной системы, противостоящим инфекции и приспосабливающимся к внедряющимся внешним агентам. Популяция лимфоцитов состоит из Т-клеток (CD4- и CD8-положительных, ~75%), В-клеток и NK-клеток (общее содержание ~25%). МПК часто выделяют из цельной крови с помощью фикола, гидрофильного полисахарида, разделяющего слои крови, причем моноциты и лимфоциты образуют лейкоцитарную пленку под слоем плазмы. Эта лейкоцитарная пленка содержит МПК. Кроме того, МПК можно выделить из цельной крови с помощью гипотонического лизиса, предпочтительно лизирующего эритроциты. Этот способ приводит к получению нейтрофилов и других полиморфно-ядерных (ПМЯ) клеток, важных для врожденной иммунной защиты. Фракции МПК аспиратов костного мозга используют для лечения пациентов после инфаркта миокарда и, как показано, снижают последующую смертность и несколько улучшают функционирование сердца у указанных пациентов (Eur Heart J 27:2775-2783, 2006). В то время как показатель смертности значительно снижается за счет лечения такого типа, функционирование сердца улучшается лишь незначительно. Радионуклидная томография таких пациентов показывает, что большинство, до 97%, внутрикоронарно введенных стволовых клеток мононуклеарной фракции не задерживаются в сердце, но преимущественно обнаруживаются в селезенке и печени в течение 60-90 минут после инъекции (Circulation 111:2198-2202, 2005). Другие топографические исследования аналогичным образом демонстрируют, что стволовые клетки, обнаруживаемые в мононуклеарной фракции цельной крови, костном мозге, жировой ткани, пуповинной крови, плаценте, амниотической жидкости и других тканях, а также выделенные стволовые клетки этих мононуклеарных фракций накапливаются в селезенке множества различных организмов (STEM CELLS 24:2279-2283, 2006; J Nucl Med 45:512-518, 2004; J Nucl Med 47:1212-1219, 2006; J Nucl Med 47:1295-1301, 2006).
[00155] Исследования на животных продемонстрировали, что введение большего количества мононуклеарных клеток костного мозга приводит к улучшенной регенерации сердца и восстановлению функций (Circulation 114:2163-2169, 2006). Вместе с тем это требует аспирации больших объемов костного мозга пациента (до 200 мл) под общей анестезией, что считается крайне нежелательным для пациентов с угнетенной функцией сердца, недавно перенесших инфаркт. Исследователи также пытались концентрировать вводимые стволовые клетки для лучшего адресного воздействия на органы и удерживания клеток в них. Хотя обогащение количества вводимых CD34+-клеток приводит к усиленному накоплению СD34+-клеток в сердце после внутрикоронарной инъекции, считается, что этот способ обогащенной доставки стволовых клеток является субоптимальным, поскольку на данный момент неизвестно, какие конкретные стволовые клетки, содержащиеся во фракции мононуклеарных клеток, необходимы для регенерации ткани (Circulation 111:2198-2202, 2005). Более того, показано, что очищенные мезенхимальные стволовые клетки (МСК) человека усиливают энграфтмент CD34+-стволовых клеток пуповинной крови человека (Hematology VOL 14 NO 3:125-132, 2009).
[00156] Стволовые клетки могут быть аутологичными или полученными от неродственного донора. Стволовые клетки могут содержаться в мононуклеарной фракции костного мозга, цельной крови, пуповинной крови, жировой ткани или других источников, или могут быть выделены путем селекции из CD34, CD133, CD105, CD117, SSEA1-4, исключения красителя или других специфических антигенов стволовых клеток. Стволовые клетки можно выделить из цельной крови, костного мозга, пуповинной крови, жировой ткани, соскобов ткани со слизистой органов обоняния и других источников стволовых клеток, которые можно диссоциировать на суспензии одиночных клеток, например, пуповинной ткани, путем центрифугирования в градиенте плотности с использованием фиколлгипака или других доступных для приобретения градиентов. Стволовые клетки можно выделить из фракции мононуклеарных клеток, полученных в результате таких процедур. В качестве альтернативы, стволовые клетки можно обнаружить в других фракциях после центрифугирования в градиенте плотности (Stem Cells and Development 2011 Bhartiya et. al.) Например, пуповинную кровь можно разбавить в соотношении 1:1 PBS, аккуратно наслоить на Histopaque 1077 (Sigma) и центрифугировать при 1500 об/мин при комнатной температуре в течение 30 минут.Полученные слои, как изображено на Фигуре 1, можно обрабатывать далее для выделения стволовых клеток. Слой 1 представляет собой слой тромбоцитов, слой 2 представляет собой лейкоцитарную пленку, содержащую мононуклеары, слой 3 представляет собой слой фиколла, а слой 4 представляет собой слой осадка эритроцитов. Слои 1, 2 и 3 можно собрать, разбавить подходящей средой, например, DMEM F12, содержащей или не содержащей FBS, и повторно центрифугировать, получая осадок клеток. Слой 4 можно разбавить подходящей средой, например, DMEM F12, и центрифугировать при 800 об/мин в течение 15 минут при комнатной температуре на стандартной настольной центрифуге. Стволовые клетки можно выделить преимущественно из слоя 2 (лейкоцитарной пленки) и слоя 4 (осадка эритроцитов).
[00157] Стволовые клетки можно дополнительно характеризовать и выделить с помощью специфических антигенов на их поверхности с помощью сортировщиков клеток, например, ARIA от BD, с помощью магнитных колонок, например, доступных у Miltenyi, с помощью магнитных частиц и магнитов DYNAL и других способов разделения на основе антител/антигенов, известных специалистам в данной области техники. Стволовые клетки также можно идентифицировать и выделить по их способности связываться с другими клетками, как описано в настоящей заявке.
[00158] Плюрипотентные стволовые клетки можно характеризовать по экспрессии стадиеспецифического эмбрионального антигена (SSEA), факторов транскрипции Oct4 и Nanog и других маркеров. Гемопоэтические стволовые клетки характеризуются по экспрессии таких маркеров как CD34, CD133, ckit. Scal, а также являются CD45-положительными. Сокращение CD относится к семейству антигенов и означает "кластер дифференцировки".
[00159] Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) представляют собой мультипотентные стволовые клетки, дающие начало всем типам клеток крови, включая клетки миелоидного (моноциты и макрофаги, нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, эритроциты, мегакариоциты/тромбоциты, дендритные клетки) и лимфоидного ряда (Т-клетки, В-клетки, NK-клетки). Кроветворная ткань содержит клетки с долгосрочной и краткосрочной регенерационной способностью и коммитированные мультипотентные, олигопотентные и унипотентные предшественники. ГСК составляют 1:10000 клеток миелоидной ткани. ГСК экспрессируют следующие антигены: CD34, CD90 (Thyl), CD45, CD41, CD105, CD117 (c-kit), SCF (лиганд kit), Ly6A/E (sca-1), CD127, CD44, CD33, CD38, CD14, CD106, CD84, CD90, Flk-1, CD164, Notchi, CD338 (ABCG2), CD202b, CD184, AC133 (=CD133) и CXCR4.
[00160] Мезенхимальные стволовые клетки, или МСК, представляют собой мультипотентные стволовые клетки, которые могут дифференцироваться в различные типы клеток, включая остеобласты (клетки кости), хондроциты (клетки хряща) и адипоциты (жировые клетки). Мезенхимальные стволовые клетки характеризуются экспрессией CD45, CD90, CD105, CD34, CD31, CD29, CD106, CD44, CD51, CD166, Ly6A/E (sca-1), CD117, CD71, CD 10, CD49d, CD49e, TNAP, FTP LAR, антигена W5C5, антигена W3D5, антигена W4A5 и CXCR4.
[00161] Эндотелиальные стволовые клетки (или эндотелиальные клетки-предшественники) представляют собой мультипотентные стволовые клетки. Они представляют собой один из трех типов стволовых клеток, обнаруживаемых в костном мозге, и экспрессируют следующие антигены: CD45, CD31, CD34, CD105, CD 146, CD106, CD54, CD117, CD102, CD120a, CD120b, CD14, CD29, CD49d, CD49e, CD49f, CD62P, CD62L и CXCR4.
[00162] Нервные стволовые клетки (НСК) представляют собой самообновляющиеся мультипотентные клетки, образующие клетки основных фенотипов нервной системы. Нервные клетки-предшественники и стволовые клетки выделяют из ткани полосатого тела, в том числе поджелужочковой зоны - одного из нейрогенных центров - головного мозга взрослых мышей и из различных областей головного мозга взрослого организма, включая области, не являющиеся нейрогенными, например, спинного мозга, и из различных организмов, включая человека. НСК экспрессируют следующие антигены: CD29, CD146, Notchi, Ki67, CD24, CD49f, виментин, CD81 и CXCR4. Нервные клетки-предшественники экспрессируют следующие антигены: антиген 57D2, антиген W4A5 и CXCR4.
[00163] Эмбриональные, сперматогониальные, тестикулярные и плюрипотентные стволовые клетки, например, клетки из iPS, SCNT, ANT-OAR, экспрессируют следующие антигены: CD24, CD9, Nanog, Smad, Runx2, с myc, CD30, GSC, Oct3/4, Sox2, SSEA 1 (CD15), SSEA 4, CD324, CD29, Tra-1-60, Tra-1-81, CD338 (ABCG2), CD49f, FoxD3, Stat3, Hox 11 и CXCR4.
[00164] Очень мелкие аналоги эмбриональных клеток (VSEL) положительны по SSEA1, Oct4, Nanog, Rexl и другим маркерам плюрипотентных стволовых клеток и по CD133, CD34, АР, cMet, LIF-R и CXCR4. (J Am Coil Cardiol 53(1):10-20, 2009; Stem Cell Rev 4:89-99, 2008). Кроме того, в рабочем порядке идентифицируют новые стволовые клетки, характеризующиеся другими маркерами, например, Нох11+-стволовые клетки из селезенки взрослого организма (Horm Metab Res 40:137 - 146, 2008). Установлено, что эмбриональная стволовая клетка, остающаяся в селезенке взрослого организма, способна регенерировать клетки островков Лангергаса поджелудочной железы; в то же время, эта клетка присутствует в С045-отрицательной фракции селезенки (Mol Cell Proteomics 4(10): 1459-1470, 2005). Хотя Нох11+-клетки селезенки отрицательны по CD45, они экспрессируют OCT3/4, SOX2, KLF4, c-MYC и NANOG, что делает их потенциально эквивалентными эмбриональным стволовым клеткам и индуцированным плюрипотентным стволовым клеткам (iPS) (Int J Biochem Cell Biol. 2009 Dec 18).
Терапевтическое использование стволовых клеток
+
+
-
[00165] Изучается и совершенствуется терапия многих заболеваний стволовыми клетками. Условия, при которых терапия стволовыми клетками может оказаться полезной, включают: заболевания глаз, нервные заболевания, заболевания ЖКТ, заболевания скелетно-мышечного аппарата, обменные заболевания, эндокринные заболевания, сосудистые заболевания, респираторные заболевания, заболевания сердца, сердечнососудистые заболевания, заболевания, опосредованные иммунной системой, заболевания, опосредованные аутоиммунитетом, и все заболевания, при которых может оказаться полезной регенеративная терапия. Информация о клинических испытаниях, содержащаяся на веб-сайте NIH www.clinicaltrials.gov, включает перечисление более 3000 исследований стволовых клеток. Тестируемые заболевания включают: васкулит, ревматические расстройства с использованием эндотелиальных клеток-предшественников, терапевтическую реваскуляризацию путем имплантации аутологичных мононуклеаров пациентам с заболеваниями соединительной ткани, повторное введение гранулоцитарного колониестимулирующего фактора для мобилизации стволовых клеток крови у пациентов с прогрессирующим супрануклеарным параличом, кортикобазальную дегенерацию и множественную системную атрофию; гематологические злокачественные новообразования, лейкозы, лимфомы, рак, остеопетроз, апластическую анемию и цитопении, серповидноклеточную анемию и талассемию, недостаточность лимбальных стволовых клеток, рак молочной железы, острый инфаркт миокарда (см. патент США №7862810 - выделение и культивирование c-kit-положительных стволовых клеток сердца), заболевание коронарных артерий (см. патент США №7470538 - выделение и введение путем вливания в коронарную артерию обогащенных CD133/CD34/CXCR4-клeтoк, выделенных из пуповинной крови), заболевание периферических сосудов, сердечную недостаточность, сахарный диабет I типа (см. публикацию патентной заявки США №2011000830 - инсулинпродуцирующие мезенхимальные стволовые клетки, полученные из жировой ткани человека, для лечения сахарного диабета), сахарный диабет 2 типа, инсульт, повреждение спинного мозга, нейробластому, рассеянный склероз (см. публикацию патентной заявки США №20100166712 - введение аутологичных предшественников нервных клеток, полученных из мезенхимальных стволовых клеток, для лечения рассеянного склероза), системный склероз, системную красную волчанку, заживление хронических ран, ожоги, заживление переломов, регенерацию хряща, опухоли ЦНС, остеоартрит, почечную недостаточность, болезнь Паркинсона (см. публикацию патентной заявки США №20100010087 - способы индукции миграции и специализации стволовых клеток с помощью ЕС-18), миеломы, диабетическую стопу, цирроз печени и билиарный цирроз, дилатационную кардиомиопатию, анемию, пигментную дистрофию сетчатки, болезнь Крона, диабетическую невропатию, мастоцитоз, рак яичников, эпилепсию, миастению гравис, аутоиммунные заболевания, гранулематоз, остеонекроз, печеночную недостаточность, болезнь Пелицеуса-Мерцбахера, липодистрофию, демиелинезирующие заболевания, дефекты хряща, заболевание сетчатки, волчаночныи нефрит, болезнь Альцгеймера, черепномозговую травму, саркому, миозит, гипергликемию, макулодистрофию, неспецифический язвенный колит, мышечную дегенерацию и др. Ограничения этой терапии стволовыми клетками включают неспособность к оптимальной доставке и пересадке стволовых клеток в конкретный пострадавший орган или в кроветворные центры в костном мозге и селезенке.
Доставка экзогенных стволовых клеток
[00166] Стволовые клетки можно доставлять в организм пациента многими путями. Например, стволовые клетки в соответствующем вспомогательном веществе, оптимизирующем жизнеспособность стволовых клеток и устраняющим слипание клеток, можно вводить внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, внутрикожно, подкожно, внутрибрюшинно, интраперикардиально, интраокулярно, трансваскулярно, трансэндокардиально, трансэпикардиально, транссептально, эпикардиально, в транскоронарную вену, путем чрескожной трансмиокардиальной реваскуляризации, интратекально, внутрь органа, интраназально, интравентрикулярно или интраэпидурально с помощью игл, катетеров или другим малоинвазивным способом. Стволовые клетки также можно вводить этими путями в "матричной" смеси или суспендированной смеси, предназначенной для стимуляции удерживания стволовых клеток в месте инъекции, например, в коллагене, фибриногене, фибронектине, ламинине, альгинате, агарозе, метилцеллюлозе, липосомах, наночастицах, мицеллах, альбуминовых пузырьках, жирных кислотах или других полутвердых суспендированных составах.
[00167] Системы доставки на основе катетеров, которые можно использовать для доставки стволовых клеток, включают стандартные катетеры-баллоны для вливаний при ангиопластике, катетеры для чрескожной доставки в коронарную артерию, системы заполнения катетеров-баллонов с доставкой по проводнику и остановленным потоком, катетеры Свана-Ганза, катетеры Хикмана, катетеры Фолея, центральные венозные катетеры, катетеры типа свиного хвостика, системы SmartPort™, магнит-управляемые катетеры с металлическим наконечником, например, систему Gentle Touch Magnetic Navigation System, разработанную Stereotaxis Inc или Mitralign, систему Accucinch, а также катетеры, вводимые непосредственно в орган, например, HELIX™, MyoCathTM, NOGA R-guided Myostar™, Stiletto™, или систему внутрисосудистой доставки с ультразвуковым управлением (ВСУЗИ) TransAccess Delivery System™, или катетеры для внутриартериальной доставки, например, OpenSail™, Concerto™, катетер для вливания с помощью микрошприца от Mercator и катетер Maverick ™, или терапию с помощью имплантируемых устройств, например, левожелудочковых аппаратов вспомогательного кровообращения (LVAD), бивентрикулярных устройств вспомогательного кровообращения (BiVAD), системы OptimizerTM, катетеров для внутриклеточной доставки, например, описанных в патенте США 2009/0299269.
[00168] Стволовые клетки также можно вводить пациенту, используя инвазивные хирургические средства, а затем вводить непосредственно в орган или наносить на орган. Средства нанесения композиции стволовых клеток на орган включают, в числе прочего, коллагеновые матрицы, композиции внеклеточного матрикса, биополимерные микронити из фибрина или другого материала внеклеточного матрикса, пластыри, содержащие внеклеточный матрикс и биоразлагаемые материалы, фибриновые пластыри, пластыри на основе альгината или агарозы, каркасные структуры из материалов внеклеточного матрикса и биоразлагаемого физиологически инертного материала, который может включать такие компоненты как декстраны, покрытие стволовых клеток органоспецифическими антигенами или связывающими молекулами, остаточные внеклеточные матриксы, также известный как каркасы, или бесклеточный матрикс донорских или трупных органов, гидролизованных ex vivo, и контактные линзы.
Мобилизация эндогенных стволовых клеток
[00169] Другой способ лечения пациентов с помощью стволовых клеток включает мобилизацию выхода стволовых клеток их собственных организмов из органов, например, костного мозга, и поступления в кровоток. Например, такие терапевтические средства как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (ГКСФ; филграстим (Filgrastim)), поступающий в продажу как нейпоген (Neupogen) или в более длительно действующих формах, например, Neulasta, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМКСФ; Sargramostim), поступающий в продажу как Leukine, AMD3100, поступающий в продажу как Mozobil/Plerixafor от Genzyme Corporation, вызывают увеличение количества стволовых клеток в кровотоке. Нейпоген поставляется в одноразовых ампулах или одноразовых шприцах, содержащих 300 или 480 мкг филграстима. Вспомогательное вещество состоит из следущего: ацетат, сорбит, полисорбат 80, натрий и вода для инъекций. Нейпоген используется в клинике внутривенно два раза в день, подкожно раз в день или подкожно в качестве хронического лечения. Использование нейпогена утверждено для ускорения восстановления количества нейтрофилов у онкологических больных, получающих миелосупрессивную химиотерапию, у пациентов с острым миелолейкозом, получающих индуцирующую или консолидирующую химиотерапию, у онкологических больных, получающих пересадку костного мозга, у пациентов с тяжелой хронической нейтропенией и у пациентов, подвергающихся отбору и терапии клетками-предшественниками периферической крови. Нейпоген, как правило, вводят ежедневно в дозировке между 3 и 69 микрограммами на килограмм массы тела, начиная через 4 дня после химиотерапии, при длительности лечения от 2 до 20 дней. В соответствии с листком-вкладышем для нейпогена, ГКСФ регулирует продукцию нейтрофилов в костном мозге и влияет на пролиферацию, дифференцировку и выбранную конечную функциональную активацию предшественников нейтрофилов (включая усиленную фагоцитарную активность, активацию клеточного метаболизма, ассоциированного с респираторным взрывом, антителозависимую цитотоксичность и повышенную экспрессию некоторых функций, ассоциированных с антигенами на поверхности клеток). Кроме того, показано, что ГКСФ мобилизует стволовые клетки в кровоток за счет: его действия по снижению экспрессии CXCL12 в строме костного мозга и снижения экспрессии CXCR4, за счет стимуляции удаления N-конца CXCR4 (1), за счет снижения экспрессии VCAM в костном мозге (2). Показано, что ГКСФ повышает уровень CXCL2, родственного лиганда CXCR2. Также показано, что ГКСФ, ввиду утверждения его использования для клинической терапии, повышает количество очень мелких стволовых клеток, подобных эмбриональным, в кровотоке.
[00170] В соответствии с листком-вкладышем, применение Leukine показано для мобилизации гемопоэтических клеток-предшественников в периферической крови для отбора путем лейкафереза. Мобилизация позволяет отобрать повышенное количество клеток-предшественников, способных к энграфтменту, по сравнению с отбором без мобилизации. После миелоаблятивной химиотерапии трансплантация повышенного количества клеток-предшественников может привести к более быстрому энграфтменту, что может привести к снижению необходимости в поддерживающей терапии. Восстановление миелоидного ростка в дальнейшем ускоряют путем введения Leukine после трансплантации клеток-предшественников периферической крови. Рекомендуемая доза Leukine составляет 250 микрограммов на квадратный метр площади поверхности тела в сутки; его вводят в виде 24-часового внутривенного вливания или раз в день подкожно. Оптимальное время лечения Leukine для мобилизации стволовых клеток в кровоток, по-видимому, составляет 5 дней. Кроме того, показано, что Leukine эффективен в сочетании с ГКСФ у пациентов со слабой мобилизацией в ответ на введение только ГКСФ.
28
54
8
[00171] Химическое название Mozobil (мозобил) - 1,1’-[1,4-фенилен-бис(метилен)]-бис-1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан. Его молекулярная формула - CHN. Мозобил является ингибитором рецептора хемокина CXCR4 и блокирует связывание его родственного лиганда SDF-1 (CXCL12). Мозобил повышает количество циркулирующих стволовых клеток за счет нарушения связывания стволовых клеток, экспрессирующих CXCR4, с SDF-1 (CXCL12), экспрессируемым клетками стромы и другими клетками костного мозга. Оптимальная мобилизация после лечения мозобилом основана на активации комплемента. Подкожные инъекции мозобила предназначены для использования в комбинации с нейпогеном для мобилизации гемопоэтических стволовых клеток в периферическую кровь для отбора и последующей аутологичной трансплантации пациентам с неходжкинской лимфомой (НХЛ) и множественной миеломой (ММ). Мозобил поступает в продажу в одноразовых флаконах, содержащих 1,2 мл раствора с концентрацией активного агента 20 мг/мл. Пациентов лечат мозобилом в соответствии со следующей рекомендованной схемой, описанной на листке-вкладыше: начинают лечение мозобилом после получения пациентом ГКСФ раз в день в течение 4 дней; повторяют введение дозы мозобила в течение до 4 дней подряд; дозу выбирают, исходя из 0,24 мг/кг фактической массы тела; вводят путем подкожной инъекции приблизительно за 11 часов до начала афереза. Показано, что комбинация ГКСФ и мозобила позволяет мобилизовать большее количество примитивных стволовых клеток в кровоток, чем применение только G-CSF.
[00172] Другие известные агенты для мобилизации стволовых клеток, включая гемопоэтические стволовые клетки, в кровоток, включают фактор роста гепатоцитов (HGF), эритропоэтин, паратиреоидный гормон, FltS-лиганд, фактор стволовых клеток (ФСК). Другие агенты, заведомо или предположительно вызывающие усиленную мобилизацию стволовых клеток и клеток-предшественников в кровоток включают, в числе прочего: агенты, усиливающие пролиферацию стволовых клеток, например, колониестимулирующие факторы, агенты, повышающие продукцию эндогенного ГКСФ, например, бета-глюкан грифолы курчавой, агенты, снижающие экспрессию SDF-1 или CXCR4, включая подавляющие агонисты CXCR4, агенты, снижающие сродство связывания SDF-1 или CXCR4, агенты, подавляющие сигнальный путь CXCR4, агенты, блокирующие бионакопление стволовых клеток вне циркуляторного русла, агенты, усиливающие выход стволовых клеток в кровоток, например, за счет активации комплемента или повышения сфингозин-1-фосфата в плазме, агенты, стимулирующие экспрессию CXCR2 в костном мозге или экспрессию его родственного лиганда CXCL2, агенты, снижающие экспрессию УСАМ в костном мозге, например, химиотерапевтический циклофосфамид, агонисты ретиноевых рецепторов, низкомолекулярные ингибиторы VLA-4, например, BI05192 или другие блокаторы VLA4, активаторы металлопротеиназ или карбоксипептидаз, разрушающие CXCL12, экспрессируемый в костном мозге, или выбранные схемы химиотерапии, или схемы введения циклофосфамида или ингибитора топоизомеразы этопозида на фоне лечения ГКСФ, пероральное введение фукоидана, мобилизацию за счет хемокина CXCL2 и коломиновой кислоты.
Спонтанно высвобожденные эндогенные стволовые клетки [00173] Еще один способ лечения пациентов с помощью стволовых клеток включает предотвращение изоляции спонтанно высвобожденных эндогенных стволовых клеток в лимфатических тканях. Стволовые клетки и клетки-предшественники ежедневно спонтанно высвобождаются в кровоток. Эксперименты на парабиотических мышах показали, что селезенка свободно обменивается стволовыми клетками и клетками-предшественниками с кровотоком. Кроме того, продемонстрировано, что к повышению уровней циркулирующих стволовых клеток и клеток-предшественников приводят болезненные состояния, например, в числе прочего, гиперхолестеринемия, сердечный приступ, инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST или заболевание коронарных артерий, перевяка артерии или транзиторная ишемия, временное пребывание на средней высоте над уровнем моря, первичный гиперпаратиреоз и повреждение пигментного эпителия сетчатки. Предотвращение изоляции спонтанно высвобожденных или вызванных болезнью стволовых клеток в лимфатических тканях обеспечивает доступность большего количества стволовых клеток для регенерации поврежденных тканей или органов.
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ РЕГЕНЕРАЦИИ ЗАРОДЫШЕВЫХ ЦЕНТРОВ В ЛИМФАТИЧЕСКИХ ТКАНЯХ
[00174] Настоящее изобретение удовлетворяет указанную потребность путем представления способов и композиций для регенерации, омоложения и повышения количества зародышевых центров в лимфатических тканях после лучевой терапии или химиотерапии. Терапевтические средства, омолаживающие или восстанавливающие зародышевые центры в лимфатических тканях согласно настоящему изобретению включают активаторы иммунной системы, костимуляторы, адъюванты и их комбинации.
[00175] В одном варианте воплощения настоящего изобретения зародышевые центры в лимфатических тканях восстанавливают путем введения адъювантов. Примеры таких адъювантов включают патоген-ассоциированные молекулярные паттерны, липосомы, липополисахариды, "молекулярные клетки" для антигена, компоненты клеточных стенок бактерий, нуклеиновые кислоты, поглощенные путем эндоцитоза, например, двуцепочечную РНК (дцРНК), одноцепочечную ДНК (оцДНК) и ДНК, содержащую неметилированный CpG-динуклеотид, минеральные соли, например, гидроксид алюминия (алюминиевые квасцы), фосфат алюминия, фосфат кальция, гидроксид алюминия, фосфат калия-алюминия, гидрофосфат натрия-алюминия и гидроксифосфат-сульфат алюминия. Другие адъюванты включают эмульсии типа "масло в воде", например, сквалена, монтанида ISA720 (сквален) или ISA 51 (Drakeol), MF59 (Novartis) и SBAS2. Еще один класс адъювантов, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением, представляют собой адъюванты на основе частиц, например, виросомы, сапонины и липиды, включающие продукты микробного происхождения, например, монофосфорил-липид А, CpG-мотивы, производное БЦЖ-вакцины, называемое BCG-CWS (Mycobacterium bovis).
[00176] Липополисахариды и митогены, например конканавалин А, компоненты клеточных стенок бактерий, археосомы (простые эфиры-глицеролипиды археи Methanobrevibacter smithii), агонист TLR4 - глюкопиранозиллипидный адъювант (GLA), липополисахариды и БЦЖ (Immune Design), агонисты TLR2, БЦЖ, пептидогликан и грамположительные бактерии, агонист TLR5 - флагеллин, антигены яиц шистосом (SEA), Listeria monocytogenes (LM). Другие адъюванты включают агонисты и активаторы толл-подобных рецепторов, включая CpG-олигонуклеотиды длиной до 100 оснований, наиболее предпочтительно - длиной 20 оснований, агонисты TLR1, например, Pam3Cys, агонисты TLR2, например, Pam3Cys; агонисты TLR3, например, дцРНК и поли1:С, агонисты TLR7, например, имидазолхинолены, например, имиквимод (R-839) и резиквимод (R-848), агонисты TLR8, например, резиквимод (R-848); и агонисты TLR9, например, поли1:С и CpG. Кроме того, настоящее изобретение включает использование растительных адъювантов, бета глюкана, QS21 на основе сапонина и конканавалина А.
[00177] Еще один вариант воплощения настоящего изобретения состоит из способов увеличения количества активных зародышевых центров в селезенке для усиления энграфтмента трансплантов стволовых клеток и гематологического восстановления пациентов, подвергающихся лечению рака, немиелоаблятивной или миелоаблятивной терапии, включая химиотерапию, лучевую терапию и комбинированное лечение. Увеличение количества активных зародышевых центров приводит к усиленному связыванию и энграфтменту стволовых клеток в селезенке и, следовательно, ускоренному темпу восстановления кроветворения после кондиционирующих схем химиотерапии и лечения рака. Кроме лечения рака и лейкозов, немиелоаблятивную терапию используют для лечения аутоиммунных заболеваний (Pediatr Clin North Am. 57(1):239-71, 2010), включая диабет I типа (JAMA, 297(14):1568-1576, 2007), волчанку и рассеянный склероз (www.clinicaltrials.gov). Настоящее изобретение обеспечивает способы усиления восстановления кроветворения у больных раком или аутоиммунными заболеваниями, подвергающихся миелоаблятивному или немиелоаблятивному кондиционированию, за счет увеличения количества зародышевых центров селезенки и, таким образом, стимуляции связывания, энграфтмента и пролиферации трансплантированных стволовых клеток. Например, пациенты, получающие лечение стволовыми клетками после миелоаблятивной или немиелоаблятивной кондиционирующей схемы, подвергаются риску заражения и смерти в течение времени, необходимого для энграфтмента введенных стволовых клеток и восстановления кроветворения. Ускорение и стимуляция энграфтмента стволовых клеток за счет увеличения количества зародышевых центров селезенки, доступных для связывания стволовых клеток, могут уменьшить время, необходимое для восстановления кроветворения и, тем самым, уменьшить риск заражения и смерти этих больных.
[00178] Стволовые клетки могут быть аутологичными или полученными от неродственного донора. Стволовые клетки могут содержаться в мононуклеарной фракции костного мозга, цельной крови, пуповинной крови, жировой ткани или других источников, или могут быть выделены путем селекции из CD34, CD133, СD105, CD117, SSEA1-4, исключения красителя или других специфических антигенов стволовых клеток.
[00179] Количество зародышевых центров селезенки можно специфически увеличить за счет способов лечения, активирующих рецептор CD40 (Blood. 104:4088-4096, 2004; J. Clin. Invest. 112:1506-1520 2003) (50) (51). Функциональный рецептор представляет собой тример или мультимер CD40 с компонентами TNFR1 или TNFR2. Примеры процедур, которые активируют рецептор CD40, включают: Агонистические антитела к CD40, активирующие рецептор CD40, соответствующие конформации solCD40L, которые могут активировать рецептор CD40, и агенты, повышающие экспрессию рецептора CD40 путем изменения скорости транскрипции, например, за счет фактора транскрипции AKNA, содержащего мотив AT-hook, стабильности мРНК или стабильности белка, также могут стимулировать активность и передачу сигнала. В качестве альтернативы, члены семейств TRAF и TTRAP взаимодействуют с рецептором CD40 и опосредуют его сигнальный путь, что приводит к повышению количества активных зародышевых центров. Агенты, активирующие циклооксигеназу 2 или рецептор ЕР2 В-клеток зародышевых центров, воспроизводят взаимодействие с рецептором CD40 и могут усилить образование активных зародышевых центров. Другие средства для активации образования и поддержания функционирования зародышевого центра включают ингибирование или утрату CCR7 (J. Leukoc. Biol. 85: 409-417, 2009). Другие средства для активации образования и поддержания функционирования зародышевого центра включают ингибирование или утрату CCR7 (J. Leukoc. Biol. 85: 409-417, 2009).
[00180] Еще один вариант воплощения настоящего изобретения состоит из введения включает введение иммуностимулирующих молекул для стимуляции регенерации зародышевых центров в лимфатической ткани. Иммуностимулирующие молекулы могут представлять собой антитела, гибридные белки, растворимые лиганды, низкомолекулярные соединения, регуляторы транскрипции, стабилизаторы мРНК или белка и другие Иммуностимулирующие агенты. Например, можно активировать костимулирующий путь CD28 с помощью растворимых белков В7 и антитела, например, соединения 1412 от TeGenero.
[00181] TON 1412 представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, разработанное как агонист рецептора CD28 Т-лимфоцитов, стимулирующее продукцию и активацию Т-лимфоцитов. Boerhinger Ingelheim выпускает TGN1412.
[00182] Дополнительные костимулирующие молекулы и пути включают лиганд 0Х40/0Х40, лиганд 4-1 ВВ/4-1 ВВ, семейство B7/CD28; B7-1/CD80, CD28, B7-2/CD86, CTLA-4, B7-H1/PD-L1, ICOS, B7-H2, PD-1, B7-H3, PD-L2/B7-DC, В7-Н4, PDCD6, BTLA, костимулирующие молекулы надсемейства ФНО; 4-1BB/TNFRSF9/CD137, лиганд 4-1BB/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, лиганд CD27/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, лиганд CD30/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, лиганд CD40/TNFSF5, GITR/TNFRSF18, лиганд GITR/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, OX40/TNFRSF4, лиганд OX40/TNFSF4 и TACI/TNFRSF13B, семейство SLAM; 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6 и SLAM/CD150 и другие костимулирующие молекулы; CD2, CD53, CD82/Kai-l, CD90/Thyl, CD96, CD 160, Ikaros, интегрин-альфа-4ЛгЮ49а, интегрин-альфа-4-бета-!, интегрин-альфа-4-бета-7/ЬРАМ-1, LAG-3, LMIR1/CD300A, CRTAM, DAP12, дектин-1/СЬЕС7А, DPPIV/CD26, EphB6, TCL1A, TIM-1/KIM-l/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, HLA-DR и эфрины.
[00183] Другие агенты, способные усиливать регенерацию зародышевых центров, представляют собой агенты, как известно, вызывающие цитокиновый взрыв, например, антитела против CD20 (ритуксимаб).
[00184] Другие иммуноактивирующие агенты могут включать агонисты рецептора IL21, в том числе агонистические антитела.
[00185] Другие адъюванты, использованные на доклинической и клинической стадиях, включают:
[00186] Нуклеиновые кислоты, поглощенные путем эндоцитоза, например, двухцепочечную РНК (дцРНК), одноцепочечную ДНК (оцДНК) и ДНК, содержащую неметилированный CpG-динуклеотид.
[00187] Аденовирус и компоненты аденовируса, например, аденовирус 5 типа (Ad5).
[00188] Агонисты и активаторы рецепторов аналога гена, индуцируемого ретиноевой кислотой (RIG)-l (RLR).
[00189] Активаторы или агонисты Р2Х1, Р2Х4 или Р2Х7.
[00190] Агонисты и активаторы рецепторов аналога нуклеотид-связывающего домена олигомеризации (NLR).
[00191] Advax, липосомы, хитозановые микросферы и диметилдиоктилдециламмонийбромид (DDA).
2
4
[00192] Новейшие разрабатываемые адъюванты человека представляют собой ISCOMS, QS21, AS0 и AS0.
4
[00193] AS0 представляет собой деацилированный монофосфорил-липид A (MPL) плюс алюминий.
[00194] CpG-олигонуклеотиды могут быть длиной до 100 оснований, наиболее предпочтительно - длиной 20 оснований.
[00195] Антитело ОКТЗ против CD3 также можно вводить внутривенно (в/в) для индукции регенерации зародышевых клеток в лимфатических тканях.
[00196] Настоящее изобретение также состоит из введения двух или более терапевтических агентов для получения зародышевых центров в лимфатических тканях. В еще одном варианте воплощения настоящего изобретения стволовые клетки вводят в сочетании с терапевтическим агентом, регенерирующим зародышевые центры.
Дозирование адъювантов
[00197] Фосфат алюминия-калия можно вводить в дозе приблизительно 0,17 мг.
[00198] Фосфат алюминия можно вводить в дозе приблизительно 1,5 мг.
[00199] Гидроксид алюминия можно вводить в дозе от приблизительно 0,15 мг до приблизительно 0,3 мг. Соли алюминия в целом можно вводить в дозах до 0,85 мг.
[00200] Гидроксифосфат алюминия можно вводить в дозе приблизительно 0,225 мг.
[00201] В комбинации гидроксид алюминия и фосфат алюминия можно вводить в объединенной дозе приблизительно 0,45 мг.
Дозирование масляных эмульсий
[00202] SBAS-2 представляет собой эмульсию MPL и QS21 типа "масло в воде".
[00203] Эмульсии типа "масло в воде", например, монтанид ISA720 (сквален) или ISA51 (Drakeol).
[00204] Сквален содержится в адъюванте MF59, используемом Novartis и дозируемом в концентрации 1,95% активности адъюванта или 2 части на сто частей или 4 грамма на 100 мл в инъекции объемом 0,5-1 мл.
[00205] Адъювант MF59 (Lipovant) содержит 4-5% (масс/об) сквалена, 0,5% (масс/об) Tween 80, 0,5% Span 85, и, необязательно, различное количество мурамилтрипептидфосфатидилэтаноламина (МТР-РЕ), который активирует распознающие рецепторы, не являющиеся TLR, известные как NOD-LRRS).
Дозирование продуктов микробного происхождения
8
[00206] Производное БЦЖ-вакцины, называемое BCG-CWS (Mycobacterium bovis) содержит 1-8×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) на флакон для взрослых, половинную дозы для детей.
[00207] Археосомы (простые эфиры-глицеролипиды археи Methanobrevibacter smithii) используют в дозе от 0,1 до 500 мкг на грамм массы тела и наиболее предпочтительно - 38 микрограммов на мг массы тела.
Дозирование агонистов и активаторов толл-подобных рецепторов
[00208] CpG-олигонуклеотиды длиной до 100 оснований, наиболее предпочтительно - длиной 20 оснований, используют в дозах 1, 10, 100, 500 микрограммов на 20-25 граммов массы тела. Предпочтительная доза составляет 10 мкг на 20-25 мг массы тела.
[00209] Костимулирующий путь CD28 можно активировать с помощью растворимых белков В7 и антитела, например, соединения 1412 от TeGenero. TON 1412 представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, разработанное как агонист рецептора CD28 Т-лимфоцитов, стимулирующее продукцию и активацию Т-лимфоцитов. Boerhinger Ingelheim выпускает TGN1412. Для целей активации иммунной системы для регенерации лимфатических зародышевых центров предпочтительная доза TGN1412 должна составлять менее 0,1 мг/кг массы тела при введении путем 3-6-минутного вливания. Эффективные дозы TGN1412 для регенерации зародышевых центров должны составлять от 0,001 мг/кг до 0,1 мг/кг, предпочтительно 0,01 мг/кг.
2
2
2
[00210] Другие агенты, способные усиливать регенерацию зародышевых центров, представляют собой агенты, как известно, вызывающие цитокиновый взрыв, например, антитела против CD20 (ритуксимаб) в дозе 50 мг/мм или 150 мг/мм, но менее 375 мг/мм; антитела ОКТЗ против CD3, вводимые внутривенно (в/в) в предпочтительной дозе менее 5 мг/день в течение 10-14 дней; антитела против CD52 (Campath), вводимые в дозе 30 мг путем 2-часового вливания три раза в неделю в течение периода времени до 12 недель.
[00211] Дополнительные иммуноактивирующие агенты могут включать агонисты рецептора IL21, в том числе агонистические антитела в дозах от 0,001 мг/кг до 50 мг/кг, предпочтительно от 0,01 до 0,1 мг/кг. Агонисты белковых лигандов можно дозировать ежедневно от 0,0001 мг/кг до 50 мг/кг в течение 28 дней после миелоаблятивного или немиелоаблятивного лечения. Агонисты белковых лигандов в общем случае пригодны для использования при 1/10 от дозы терапевтических антител в зависимости от молекулярной массы и биораспределения агониста.
[00212] Низкомолекулярные иммуноактиваторы можно доставлять перорально в однократной дозе от 1 мг до 1000 мг ежедневно или через определенные промежутки времени, которые могут включать каждые 2 часа, каждые 4-6 часов или более длительные интервалы.
[00213] AS04 представляет собой деацилированный монофосфорил-lipd A (MPL) плюс алюминий в дозе 50 мкг в 0,5 мл Fendrix (GSK) в комбинации с 0,5 мг фосфата алюминия.
[00214] CpG-олигонуклеотиды длиной до 100 оснований, наиболее предпочтительно - длиной 20 оснований, используют в дозах 1, 10, 100, 500 микрограммов на 20-25 граммов массы тела плюс алюминиевые квасцы. Предпочтительная доза составляет 10 мкг на 20-25 мг массы тела.
Введение
[00215] Введение терапевтических агентов, индуцирующих регенерацию зародышевых центров в лимфатических тканях, можно осуществлять любым способом, в том числе внутривенно, внутриартериально, перорально, внутримышечно, в виде аэрозоля, путем ингаляции, внутрикожно, подкожно, внутрибрюшинно, интраперикардиально, интраокулярно, трансваскулярно, трансэндокардиально, трансэпикардиально, транссептально, эпикардиально, в транскоронарную вену, путем чрескожной трансмиокардиальной реваскуляризации, интратекально, внутрь органа, интраназально, интравентрикулярно или интраэпидурально с помощью иглы, катетера или другим малоинвазивным способом.
[00216] Приведенные ниже примеры иллюстрируют экспериментальные результаты использования способов и композиций для регуляции или снижения количества сайтов связывания, доступных для участия в связывании стволовых клеток.
Пример 1
Обогащенные стволовыми клетками мононуклеарные фракции костного мозга и цельной крови связываются с В-клеточными областями на границе белой пульпы селезенки при введении аллогенным мышам
2
[00217] Мононуклеарные фракции костного мозга и цельной крови самца мыши 129S1/SvlmJ выделяли с помощью Histopaque и объединяли. Клетки инкубировали при 37°C, 5% CO в течение 4 суток для отмирания дифференцированных соматических клеток и, таким образом, концентрирования фракции стволовых клеток среди мононуклеаров. Полученные клетки затем метили реагентом для мечения клеток cell tracker orange (СТО, Invitrogen) в соответствии с инструкцией изготовителя. Приблизительно 10 миллионов меченых клеток вводили путем ретроорбитальной инъекции реципиентам из одного помета; через 90 минут мышь обескровливали и собирали кровь, сосудистую систему промывали от остаточных эритроцитов и извлекали селезенку. Селезенку фиксировали в течение ночи в 1% ПФА, а затем включали в агарозу с низкой температурой плавления и гелеобразования и получали срезы толщиной 200 микрон. Стволовые клетки мононуклеарных фракций, связавшиеся с селезенкой, визуализировали с использованием иммунофлуоресценции. Меченые мононуклеары, содержащие фракцию стволовых клеток, связались с В-клеточными областями на границе белой пульпы селезенки. Иммунофлуоресцентная проверка мононуклеарной фракции цельной крови, собранной в ходе обескровливания, показала, что приблизительно 40000 из 10 миллионов введенных меченых клеток продолжали находиться в кровотоке через 90 минут после инъекции.
[00218] Результаты и выводы: СТО-меченые стволовые клетки обогащенных мононуклеаров связались с периферией областей белой пульпы. Связывание клеток гистологически проявлялось в В-клеточных областях. Это показывает, что обогащенные стволовыми клетками мононуклеарные фракции костного мозга и цельной крови связываются с В-клеточными областями на границе белой пульпы селезенки при введении аллогенным мышам.
Пример 2
Очищенные CD34+, CD105+ и CD117+ стволовые клетки связываются с той же областью селезенки, что и мононуклеарные фракции, содержащие меченые стволовые клетки.
[00219] Мононуклеарные фракции костного мозга и цельной крови самца мыши выделяли с помощью Histopaque и объединяли. Мононуклеары, меченые реагентом для мечения клеток cell tracker green (CTG, Invitrogen), затем инкубировали с биотин-мечеными антителами к CD34, ckit и CD 105 и очищали с использованием колонок для магнитного разделения Miltenyi в соответствии с рекомендациями изготовителя. Часть выделенных мононуклеаров отдельно метили СТО. Один миллион СТО-меченых мононуклеаров совместно инкубировали с 205000 CTG-меченых очищенных стволовых клеток на 100-200-микронных свежих срезах селезенки в течение 12-18 часов при 4°C. Срезы селезенки тщательно промывали для удаления несвязанных клеток, фиксировали в течение одного часа в 1% ПФА, а затем изготавливали из них влажные препараты для флуоресцентной визуализации. Программное обеспечение MetaMorph использовали для захвата и наложения полученного связывания по красному (мононуклеары) и зеленому каналам (стволовые клетки).
[00220] Результаты и выводы: очищенная популяция стволовых клеток связывалась с той же областью селезенки, что и фракция мононуклеаров. Это означает, что CD34+, CD105+ и CD117+ стволовые клетки связываются с той же областью селезенки, что и мононуклеарные фракции, содержащие меченые стволовые клетки.
Пример 3
Стволовые клетки мононуклеарной фракции костного мозга и цельной крови связываются с PNA-положительными областями в зародышевых центрах селезенки.
[00221] Мононуклеары костного мозга и цельной крови взрослых мышей выделяли с помощью Histopaque. Полученные мононуклеары окрашивали реагентами для мечения клеток, например, CellTracker Orange, Green или Blue, Dil, or кальцеин оранжевый или синий в соответствии с рекомендациями изготовителя. ПТС-меченые PNA (10 мкг), IgD (10 мкг) или антитела против CD21 (10 мкг) использовали для идентификации специфических В-клеточных областей в белой пульпе селезенки. PNA метил зародышевые центры, IgD - фолликулярные зоны, а антитела против CD21 - пограничные зоны и зоны мантии. ПТС-меченые антитела против CD3 (от 200 нг до 1 мкг) использовали для идентификации Т-клеточных областей в белой пульпе селезенки. После тщательной промывки связанные клетки и антитела фиксировали на срезах селезенки с помощью 1% ПФА в течение 1 часа при 4°C. С помощью программного обеспечения MetaMorph рассматривали флуоресценцию на влажных препаратах срезов и получали изображения.
[00222] Результаты и выводы: СТО-меченые мононуклеары связывались после 15 часов инкубирования при 4°C с активными РNA+-зародышевыми центрами. Колокализация связывания СТО-меченных мононуклеаров и IgD или антител против CD21 не наблюдалась. Это означает, что стволовые клетки мононуклеарной фракции костного мозга и цельной крови связываются с PNA-положительными IgD-отрицательными CD21-отрицательными областями в зародышевых центрах селезенки.
Пример 4
CD34+, CD105+, СР117+-стволовые клетки, выделенные из мононуклеарных фракций цельной крови и костного мозга, связываются с РNА+-зародышевыми центрами белой пульпы селезенки.
[00223] Мононуклеарные фракции цельной крови и костного мозга мышей объединяли, метили СТО, а затем инкубировали с биотинилированными антителами против CD34, CD117 и CD105, а затем клетки, связанные с антителами, выделяли с помощью колонок для магнитного разделения клеток Miltenyi в соответствии с инструкциями изготовителя. Количество выделенных CD34+CD105+CD117+-стволовых клеток находилось в диапазоне от 0,3% до 3% от исходной фракции мононуклеаров.
[00224] Полученные CD34+ CD105+ CD117+-клетки совместно инкубировали в течение 15 часов с 10 мкг PNA на свежих срезах селезенки мыши. Положительные клетки вносили из расчета 100000 клеток на срез селезенки (А), 50000 (Б), 25000 (В) или 10000 (Г) клеток на срез селезенки. Как и при инкубировании мононуклеаров, очищенные стволовые клетки связывались с PNA-положительными зародышевыми центрами белой пульпы селезенки. Стволовые клетки связывались в зависимости от концентрации. Клетки связываются с дискретными нишами в зародышевых центрах, и количества добавленных клеток более приблизительно 100000 приводят к более сильному сигналу связывания, а не расширению сигнала на дополнительные ниши (см. пример 2).
[00225] Результаты и выводы - Указанные результаты означают, что CD34+, CD105+, С0117+-стволовые клетки, выделенные из мононуклеарных фракций цельной крови и костного мозга, связываются с PNA+-зapoдышeвыми центрами белой пульпы селезенки.
Пример 5
Связывание стволовых клеток в мононуклеарной фракции блокируется антителами против CD45.
[00226] Связывание мононуклеаров и стволовых клеток со срезами селезенки блокировалось моноклональными IgG2b крысы против CD45 мыши (от 800 нанограммов до 4 микрограммов), но не антителами против CD45R (10 микрограммов) или против CD3 (1 микрограмм). Антитело крысы 30-F11 против CD45 мыши (Santa Cruz Biotechnology) или антитело 17А2 против CD3 (Santa Cruz Biotechnology) разбавляли 1:50 или 1:10 и совместно инкубировали с 250000 СТО-меченых мононуклеаров в течение часа. Связывание мононуклеаров подсчитывали визуально как количество ниш связывания и размер ниш. Контрольные свежие срезы селезенки, обработанные СТО-мононуклеарами, содержали 3-6 ниш связывания мононуклеаров среднего и большого размера на срез. Антитело против CD3 не влияло на количество или размер ниш связывания мононуклеаров. Антитело 30-F11 против CD45 при разбавлении 1:50 снижало количество и размер ниш связывания мононуклеаров в два раза. Антитело 30-F11 против CD45 при разведении 1:10 полностью устраняло связывание СТО-мононуклеаров со свежими срезами селезенки.
[00227] В еще одном эксперименте меченые мононуклеары инкубировали со срезами селезенки в течение часа в присутствии антител 30-F11 против CD45 (4 микрограмма) или антител РС3/188А против CD3 (1 микрограмм). (Santa Cruz Biotechnology).
[00228] В еще одном эксперименте мононуклеары, меченые cell tracker orange (СТО), инкубировали в течение 15 часов при 4°C с антителами против CD45R или антителом 30-F11 против CD45. Антитело к CD45R (Miltenyi Biotec), разбавленное 1:10 (5 мкг), не блокировало связывание СТО-мононуклеаров со свежими срезами селезенки мыши. В противоположность этому, антитело 30-F11 против CD45 (Santa Cruz) при разбавлении 1:10 (4 мкг) ослабляло связывание СТО-меченых мононуклеаров со свежими срезами селезенки. CD45R связывался с В-клетками фолликулярной зоны, но не с активными зародышевыми центрами.
[00229] Совместное инкубирование с антителом 30F-11 против CD45 при разбавлении 1:10 снижало связывание СТО-меченых мононуклеаров со свежими срезами селезенки приблизительно на 75%.
[00230] Результаты и выводы: Эти данные показывают, что связывание стволовых клеток в мононуклеарной фракции блокируется антителом против CD45.
Пример 6
Эпитоп CD45, связываемый IgG2b-антителом 30-F11 крысы против CD45 мыши. 30-F11 связывает все изоформы CD45 мыши.
[00231] Картирование эпитопа точного связывания 30-F11 никогда не проводили. 30-F11 получили путем иммунизации клетками селезенки и тимуса мыши. Внеклеточный домен изоформы 1 CD45 мыши состоит из аминокислот 24-564. В изоформе 2 отсутствуют аминокислоты 31-73, в то время как в изоформе 3 отсутствуют аминокислоты 31-169. Поскольку сообщалось, что 30-F11 связывало все изоформы CD45 мыши, то эпитоп связывания должен находиться между аминокислотами 170-564 изоформы 1. Антигенные области белков можно предсказать, используя алгоритмы гидрофобности (по Kyte-Doolittle) и доступности, находящиеся на веб-сайте SwisProt. Антигенные области, по всей вероятности, находятся в областях, обладающих как низкой гидрофобностью, так и высокой доступностью. Аминокислотные остатки в области 501-521 последовательности человека характеризуются низкой прогнозируемой гидрофобностью, что указывает на наличие потенциального антигенного сайта в этой области белка. Эта область также является весьма консервативным от мыши к человеку. (См. Okumura M., et аl. 1996 Aug 15; 157(4): 1569-75).
Пример 7
Иммуностимуляторы усиливают образование зародышевых центров и повышают связывание фракции стволовых клеток-мононуклеаров с селезенкой
[00232] Активные зародышевые центры формировали у здоровых мышей путем целенаправленной иммунизации с использованием неполного адъюванта Фрейнда или Ribi. Мышам внутрибрюшинно (IP) вводили 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда (FIA), смешанного 1:1 с PBS, или с 0,5 мл адъюванта RIBI в день 0. В день 7 или день 14 после иммунизации мышей внутрибрюшинно гепаринизировали 100 Ед гепарина за 30 минут до анестезии авертином. Мышей обескровливали путем ретроорбитального кровотечения, получая в общей сложности от 1,5 до 1,8 мл цельной крови, добавляемые к 200 мкл 5 Ед/мл гепарина в 15-мл конической пробирке. Затем перерезали брюшную аорту и полую вену и полностью вымывали оставшуюся кровь из сосудистой системы путем медленного выталкивающего вливания 10 мл гепарина 5 Ед/мл в восходящую грудную полую вену. Селезенку удаляли и помещали в питательную среду, а затем включали в мягкую агарозу и разрезали, получая одинаковые срезы толщиной 200 микрон. Костный мозг вымывали из грудины и бедренной кости забуференным физиологическим раствором Хэнкса, фракции мононуклеарных стволовых клеток цельной крови и костного мозга выделяли с использованием Histopaque и объединяли. ПТС-меченый PNA (10 мкг) использовали для идентификации зародышевых центров на срезах селезенки путем инкубирования при 4°C в течение ночи. После инкубирования в течение ночи с PNA без промывки СТО-меченые фракции мононуклеарных стволовых клеток добавляли к срезам на один час при температуре 4°C. После тщательной промывки связанные клетки и меченый PNA фиксировали на срезах селезенки с помощью 1% ПФА в течение 1 часа при 4°C. С помощью программного обеспечения MetaMorph рассматривали флуоресценцию на влажных препаратах срезов и получали изображения.
[00233] Связывание PNA через 7 дней после иммунизации было аналогичным у мышей, обработанных FIA и RIBI, и почти в два раза превышало связывание у контрольных мышей. Вместе с тем, мыши, обработанные FIA, были более здоровыми, чем мыши, обработанные RIBI, поэтому все последующие эксперименты проводили с использованием FIA. При сравнении 7 и 14 дня после обработки FIA отмечено, что PNA-яркость была выше на 7 день, однако на 14 день активные зародышевые центры были более плотными и компактными. По сравнению с контролем FIA иммунизация удваивала количество активных зародышевых центров в селезенке мышей. Добавление СТО-меченых фракций мононуклеарных стволовых клеток, выделенных из контрольных мышей, к селезенке показало, что усиленное образование активных зародышевых центров, наблюдавшееся у мышей, обработанных FIA, также привело к значительно более выраженному связыванию мононуклеарных стволовых клеток с селезенкой. Связывание мононуклеарных стволовых клеток на 7 день было повышено приблизительно в 3-5 раз по сравнению со связыванием с селезенкой контрольных мышей, в то время как связывание фракции мононуклеарных стволовых было повышено до, а в некоторых случаях - более чем в 10 раз по сравнению со связыванием с селезенкой контрольных мышей.
[00234] Результаты и выводы: Эти данные показывают, что иммуностимуляторы усиливают образование зародышевых центров и повышают связывание фракции стволовых клеток-мононуклеаров с селезенкой.
Пример 8
Ингибирование образования активных зародышевых центров снижает связывание стволовых клеток с селезенкой ex vivo.
[00235] Мышей обрабатывали 1 мг дексаметазона, растворенного в этаноле (1 часть), и PBS (9 частей) путем внутрибрюшинной инъекции за 7 дней до удаления их селезенок и стволовых клеток для анализа связывания стволовых клеток со срезами селезенки ex vivo. Контрольных мышей обрабатывали только этанолом (1 часть) и PBS (9 частей), при общем объеме 1 мл. На 7 день мышей отбирали и обрабатывали, как подробно описано в примере 7. Фракции мононуклеарных стволовых клеток контрольных мышей использовали для исследования связывания с контрольными и обработанными дексаметазоном срезами селезенки. Связывание мононуклеарных стволовых клеток на 7 день было понижено на 30-40% после однократной обработки 1 мг дексаметазона за 7 дней до эксперимента.
[00236] Однократная обработка 1 мг дексаметазона за 7 дней до пробоотбора снижала массу селезенки в среднем на 22%, снижала среднее количество циркулирующих мононуклеаров на 34%, и уменьшала PNA-меченые зародышевые центры на величину до 24%; тем не менее, процент стволовых клеток в мононуклеарных фракциях цельной крови или костного мозга не снижался и, фактически, повышался в среднем на 32% по сравнению с контролем.
[00237] Результаты и выводы: Эти данные показывают, что иммунодепрессанты уменьшали количество связывающихся клеток мононуклеарных фракций в селезенке обработанных мышей.
Пример 9
Ингибирование образования активных зародышевых центров снижает связывание стволовых клеток с селезенкой in vivo.
2
[00238] Наивную контрольную мышь внутрибрюшинно гепаринизировали 100 Ед гепарина за 30 минут до анестезии авертином. Мышь обескровливали путем ретроорбитального кровотечения, получая в общей сложности от 1,5 до 1,8 мл цельной крови, добавляемые к 200 мкл 5 Ед/мл гепарина в 15-мл конической пробирке. Затем перерезали брюшную аорту и полую вену и полностью вымывали оставшуюся кровь из сосудистой системы путем медленного выталкивающего вливания 10 мл гепарина 5 Ед/мл в восходящую грудную полую вену. Костный мозг вымывали из грудины и бедренной кости забуференным физиологическим раствором Хэнкса, фракции мононуклеарных стволовых клеток цельной крови и костного мозга выделяли с использованием Histopaque и объединяли. Фракции мононуклеарных стволовых клеток ресуспендировали в ростовой среде (DMEM с добавлением 10% FBS) и инкубировали при 37°C и 5% CO в течение ночи. На следующее утро мононуклеарные стволовые клетки метили cell tracker green (CTG) в соответствии с инструкцией изготовителя.
[00239] Немедленно после CTG-окрашивания наивных контрольных мононуклеарных стволовых клеток, каждой мыши-реципиенту в ретроорбитальный синус вводили приблизительно 6 млн CTG-мононуклеаров в объеме 100 мкл на 7 день. Пять контрольных мышей получали внутрибрюшинные инъекции 100 мкл этанола и 900 мкл PBS в день 0 и день 4; 3 мышей внутрибрюшинно обрабатывали 1 мг дексаметазона в день 0 и день 4; и двух мышей внутрибрюшинно обрабатывали 1 мг дексаметазона в день 0, день 2 и день 5. Через час мышей обескровливали путем ретроорбитального кровотечения. Затем перерезали брюшную аорту и полую вену и полностью вымывали оставшуюся кровь из сосудистой системы путем медленного выталкивающего вливания 10 мл гепарина 5 Ед/мл в восходящую грудную полую вену. Селезенку извлекали и хранили на льду в RPMI без фенолового красного плюс 1% BSA. Костный мозг вымывали из грудины и бедренной кости забуференным физиологическим раствором Хэнкса, и фракции мононуклеарных стволовых клеток цельной крови и костного мозга выделяли с использованием Histopaque.
[00240] Селезенки диссоциировали на суспензии одиночных клеток и определяли степень связывания введенных путем инъекции CTG-мононуклеаров в селезенке с помощью проточной цитометрии. Дексаметазон (в общем количестве 2 мг) снижал общее количество накопленных CTG-мононуклеаров в селезенке на 33-43%, в то время как 3-мг общая доза дексаметазона снижала общее количество накопленных CTG-мононуклеаров в селезенке приблизительно на 70%.
[00241] Результаты и выводы: Эти данные показывают, что 7-дневная обработка иммунодепрессантом снижала количество экзогенно введенных мононуклеарных стволовых клеток, связанных в селезенке.
Пример 10
Ингибирование образования активных зародышевых центров снижает связывание стволовых клеток с селезенкой.
(Прогноз)
[00242] Людей-добровольцев профилактически лечили доступными для приобретения общими иммунодепрессантами, например, преднизолоном, в соответствии с установленными клиническими протоколами, используя дозы, ограничивающие или полностью исключающие все побочные эффекты агентов. Еще одну группу людей-добровольцев лечили антагонистическими антителами к CD40, например, моноклональными антителами HCD-122 против CD40 в дозах от 5 до 100 мг/кг.
[00243] Перед последним днем или в последний день профилактического лечения иммунодепрессантами выделяли аутологичные стволовые клетки в мононуклеарной фракции из 50 мл костного мозга гребня подвздошной кости или продуктов афареза цельной крови. Полученную мононуклеарную фракцию, содержащую стволовые клетки, метили 2-[18F]-фтор-2-дезокси-D-глюкозой (18F-ФДГ) для последующей 3D-ПЭТ или соответствующей меткой для радионуклидной визуализации для последующей ОФЭКТ. Фракции, содержащие меченые мононуклеарные стволовые клетки в количестве от 2 до 10 миллионов стволовых клеток, вводили внутривенно и определяли их биораспределение с помощью ПЭТ или ОФЭКТ через 60-90 минут и до 48 часов после введения. Стволовые клетки среди мононуклеаров накапливались преимущественно в селезенке здоровых добровольцев в течение 90 минут после инъекции. В противоположность этому, добровольцы, получавшие иммунодепрессанты и HCD-122, характеризовались пониженным накоплением фракций мононуклеарных стволовых клеток в селезенке.
Пример 11
Ингибирование или снижение образования активных зародышевых центров улучшает доставку стволовых клеток в сердце и стимулирует функциональное восстановление у мышей.
(Прогноз)
[00244] Мышам PN и 12981/SvlmJ возрастом 3 месяца и 12 месяцев внутривенно (в/в; 250 мг/инъекцию в дни 0, 2 и 4) вводили моноклональные антитела против CD40L (PharMingen) или контрольный Ig хомяка (Pierce, Рокфорд, штат Иллинойс, США). Стволовые клетки мононуклеарной фракции цельной крови и костного мозга отбирали от наивных мышей из одного помета, метили красителями cell tracker, например, СТО, а затем стволовые клетки очищали с использованием биотинилированных антител против CD34, CD105, SSEA1 и CD117 и колонок для магнитного разделения Miltenyi. Экспериментальным мышам ретроорбитально или внутривенно вводили от 100000 до 1000000 очищенных стволовых клеток в день 5. Через 15-24 часа мышей обескровливали и собирали кровь, сосудистую систему промывали от остаточных эритроцитов и удаляли селезенку для флуоресцентной визуализации накопления стволовых клеток. Накопление стволовых клеток проявлялось в активных РМА+-зародышевых центрах, причем контрольные мыши PN, обработанные Ig, демонстрировали значительно большее количество активных зародышевых центров и, как следствие, повышенное связывание стволовых клеток по сравнению с мышами 129S1. Мыши 129S1, обработанные моноклональными антителами против CD40L, характеризовались небольшим количеством или отсутствием проявляемых активных зародышевых центров и незначительным связыванием или отсутствием связывания стволовых клеток. Мыши PN, обработанные моноклональными антителами против CD40L, демонстрировали пониженное количество активных зародышевых центров по сравнению с контрольными мышами PN, обработанными Ig, и, как следствие, параллельное снижение связывания стволовых клеток.
[00245] Для исследования регенерации сердца у указанных мышей, мышам PN и 12981/SvlmJ возрастом 3 месяца и 12 месяцев внутривенно (в/в; 250 мг/инъекцию в дни 0, 2 и 4) вводили моноклональные антитела против CD40L (PharMingen) или контрольный Ig хомяка (Pierce, Рокфорд, штат Иллинойс, США). В день 4 мышей наркотизировали, выполняли эхокардиографию для определения фонового функционирования и объемов сердца, а затем перманентно перевязывали переднюю нисходящую ветвь левой коронарной артерии путем торакотомии, вызывая инфаркт приблизительно 70% свободной стенки левого желудочка.
[00246] Стволовые клетки мононуклеарной фракции цельной крови и костного мозга отбирали от наивных мышей из одного помета и очищали с использованием биотинилированных антител против CD34, CD105, SSEA1 и CD117 и колонок для магнитного разделения Miltenyi. Экспериментальным мышам ретроорбитально или внутривенно вводили от 100000 до 1000000 очищенных стволовых клеток в день 7, через 3 дня после перманентной перевязки передней нисходящей ветви левой коронарной артерии. Последовательные сеансы эхокардиографии у мышей проводили в день 14, день 21 и день 28.
[00247] Мыши, обработанные контрольными Ig, не получавшие инъекции стволовых клеток, демонстрировали значительное снижение сердечной функции и повышение конечного диастолического объема, конечного систолического объема и повышение толщины стенок, не подвергавшихся инфаркту, причем 50-100% мышей погибали от сердечной недостаточности до 28 дня. Мыши 129S1, обработанные контрольными Ig, получавшие инъекции стволовых клеток, демонстрировали снижение смертности от сердечной недостаточности и незначительное улучшение функции сердца по сравнению с мышами, не получавшими инъекции стволовых клеток. Мыши PN, обработанные контрольными Ig, получавшие инъекции стволовых клеток, не демонстрировали улучшения выживаемости или функции по сравнению с мышами 129S1. В противоположность этому, мыши 129S1, обработанные моноклональными антителами против CD40L, получавшие инъекции стволовых клеток, демонстрировали значительное улучшение выживаемости и функции сердца по сравнению со всеми другими группами мышей, в то время как мыши PN, обработанные моноклональными антителами против CD40L, получавшие инъекции стволовых клеток, характеризовались улучшенной выживаемостью и функцией сердца по сравнению с мышами PN, обработанными контрольными Ig и получавшими инъекции стволовых клеток.
Пример 12
Ингибирование или снижение образования активных зародышевых центров улучшает доставку стволовых клеток в сердце и стимулирует функциональное восстановление у людей.
(Прогноз)
[00248] Пациенты с острым инфарктом миокарда с подъемом сегмента ST, после успешного лечения путем чрескожного коронарного вмешательства с имплантацией стента в острой фазе инфаркта, соответствовали критериям отбора для исследования. Пациентов лечили моноклональными антителами против CD40L Replizumab в дозах 5, 10, 20 или 100 мг/кг в 1 день путем 30-минутного вливания IV.
[00249] Через 3-15 дней после инфаркта миокарда выделяли мононуклеары из 50 мл аспирата костного мозга с помощью фиколл-гипака (Pharmacia, Упсала, Швеция). Весь процесс, от аспирации костного мозга до получения продукта, осуществляли в соответствии с надлежащей практикой организации производства.
[00250] Сердечную функцию отслеживали с помощью МРТ; дополнительные результаты включали смерть, повторный инфаркт миокарда и последующую реваскуляризацию или госпитализацию (бессобытийная выживаемость). По сравнению с пациентами, получавшими плацебо, пациенты, получавшие лечение стволовыми клетками, ранее характеризовались сокращением частоты бессобытийной выживаемости в течение года на 80% по сравнению с 55-60%. Пациенты, получавшие лечение антителами против CD40L и стволовыми клетками, характеризовались улучшенной бессобытийной выживаемостью по сравнению с пациентами, получавшими лечение только стволовыми клетками. Кроме того, пациенты, получавшие лечение антителами против CD40L и стволовыми клетками, демонстрировали дальнейшее снижение объемов желудочков по сравнению с пациентами, получавшими лечение только стволовыми клетками, и улучшение параметров сердечного выброса.
Пример 13
Идентификация и выделение партнера по связыванию стволовых клеток мононуклеарной фракции в селезенке мышей
[00251] Мононуклеарные фракции костного мозга и цельной крови самца мыши 12981/SvlmJ выделяли с использованием Histopaque, объединяли и метили СТО в соответствии с инструкцией изготовителя. Селезенки диссоциировали на суспензии из одиночных клеток и метили СТВ. Стволовые клетки получали путем культивирования мононуклеаров в течение 7 дней в ростовой среде, а затем - в течение 7 дней в ростовой среде без FBS, дополненной 120 нг/мл фактора стволовых клеток и 25% сывороткой лошади и сбора неадгезивных клеток. Как правило, до 40% неадгезивных клеток экспрессировали CD34, CD105, SSEA1 и/или CD117. Стволовые клетки метили СТО.
2
[00252] СТВ-меченые спленоциты инкубировали на качалке при 37°C, 5% СO с СТО-мечеными мононуклеарами в соотношении 1:1 (10 миллионов СТВ-меченых спленоцитов и 10 миллионов мононуклеаров в 500-мкл объеме PBS) или в соотношении 100:1 (10 миллионов СТВ-меченных спленоцитов и 100000 СТО-меченых стволовых клеток в 500-мкл объеме PBS). Аликвоты отбирали, не прерывая процесс, и исследовали на проточном цитометре Beckman Coulter Gallios с захватом флуоресценции FL2 и FL9. Связывание клетка-клетка проявлялось как время-зависимое увеличение двойных положительных сигналов СТВ+СТО+ в правом верхнем (UR) квадранте скаттерграммы. Фон UR составил 0,15%. Максимальное связывание спленоцитов и стволовых клеток составило 2,6% UR за 50 минут, а максимальное связывание спленоцитов и мононуклеаров составило 5% UR за 30 минут.
[00253] Результаты и выводы: Эти данные свидетельствуют о том, что клетки селезенки, участвующие в связывании стволовых клеток с селезенкой, можно идентифицировать и выделить с помощью проточной цитометрии.
[00254] Хотя проиллюстрирован и описан предпочтительный вариант воплощения, как отмечалось выше, в него можно внести различные изменения без отступления от рамок изобретения. Соответственно, рамки изобретения не ограничиваются описанием предпочтительного варианта воплощения. Вместо этого изобретение должно полностью определяться ссылкой на формулу изобретения, приведенную ниже.