Фармацевтический анализ 4-аминофенола в парацетамоле методом ВЭЖХ

С. Ю. Гармонов, И. А. Салахов, Г. Р. Нурисламова,

Р. Н. Исмаилова, В. Ф. Сопин

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ 4-АМИНОФЕНОЛА В ПАРАЦЕТАМОЛЕ МЕТОДОМ ВЭЖХ

Ключевые слова: высокоэффективная жидкостная хроматография, парацетамол, контроль качества.

Разработана методика количественного определения 4-аминофенола в лекарственных смесях на основе парацетамола при использовании метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Установлены условия хроматографического разделения лекарственных веществ на обращенной фазе С18. Предложенная методика апробирована при анализе средств для лечения простуды и гриппа.

Keywords: high performance liquid chromatography, paracetamol, quality assurance.

The technique of quantitative determination of 4-aminophenol in the medicinal mixes on basis paracetamol is developed at use of a method of a high performance liquid chromatography. Conditions of chromatographic separations of a drugs on turned phase C18 are established. The offered technique is approved at the analysis of means for treatment of cold and a flu.

4-Аминофенол (АФ) находит широкое применение в фармацевтической химии при синтезе лекарственного вещества парацетамол. Этот препарат является эффективным анальгетиком-антипиретиком и широко применяется в медицине [1]. Содержание токсичного АФ в препаратах на основе парацетамола строго нормируется [1]. В связи с высокой гепато-, нефро- и генотоксичностью АФ актуальной задачей является оценка безопасности фармацевтических продуктов, а также сертификации готовых препаратов и лекарственных форм в процессе их хранения.

В настоящее время в фармацевтическом анализе метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) занимает ключевую роль в контроле качества ЛС в силу ряда преимуществ в анализе сложных смесей, высокой точности и экспрессности [2,3]. Описанные в нормативной документации ВЭЖХ методики анализа препаратов на основе парацетамола совместимы с рядом трудностей, поскольку количественное содержание компонентов действующих веществ и примеси АФ в лекарственных формах сильно различается, в анализе применяется несколько элюирующих смесей и не решается проблема обеспечения высокой чувствительности аналитических определений [4,5]. По этой причине необходимо использование предварительных трудоемких операций концентрирования, что обуславливает многостадийность анализа в целом, снижает его экспрессность и экономичность.

В связи с этим целью настоящей работы является разработка высокочувствительной методики определения 4-аминофенола в лекарственных препаратах с использованием об-ращено-фазной ВЭЖХ.

Экспериментальная часть

Исследования проводили на жидкостном хроматографе LC-20 фирмы "Schimadzu" (Япония), состоящем из насоса для создания градиента высокого давления (LC-20AB), термостата колонок (CTO-20A), инжектора «Реодайн», вакуум-дегазатора, последовательно соединенных диодно-матричного (SPD-M 20A) и флуоресцентного (КР-10АХ1) детекторов. Обработку данных и запись хроматограмм осуществляли на персональном компьютере с помощью программного обеспечения LC Solution версии 1.22. Разделение проводили на колонке с обращенной фазой Symmetry С18 (4,6 мм х 150 мм х 5 мкм) с предколонкой Symmetry С18 (3,9 мм х 20 мм х 5 мкм). Аналитические определения проводили в следующих условиях: скорость потока - 1,0 мл/мин, объем вводимой пробы - 20 мкл, температура колонки 40 0С.

Для приготовления элюентов использовали ацетонитрил для хроматографии ос.ч. сорт 0 (Криохром, Санкт-Петербург), ацетонитрил "Lab-scan" марки Ultra Gradient (Ирландия) и сверхчистую воду, полученную на установке MilliporWaters (США) из бидистилированной воды. В качестве стандартов определяемых веществ использовали стандартные образцы анализируемых веществ (Fluka и Sigma), а также вспомогательные вещества, входящие в состав таблеток - фармакопейной чистоты.

Методика выполнения анализа. Для приготовления анализируемого раствора измельчают и растирают анализируемые таблетки. Отвешивают 0,3 г (точная навеска) порошка растертых таблеток, растворяют в деионизированной воде и переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, энергично встряхивают, обрабатывают ультразвуком 5 мин и доводят водой до метки. Перед вводом в колонку пробы фильтруют через мембранный фильтр с размером частиц 0,45 мкм. По 20 мкл исследуемого раствора и раствора стандартного образца с помощью микрошприца вводят в хроматограф. Массу определяемых веществ в одной таблетке вычисляют по формуле:

X —( S|< тст mc)/( SCT тн)>

где Sk и Sct - средние значения площадей пиков определяемых компонентов на хроматограммах испытуемого и стандартного образца соответственно; mCT, mc, тн — масса стандарта определяемого вещества в растворе стандартного образца, средняя масса таблетки и масса навески растертых таблеток, взятой для приготовления испытуемого раствора соответственно в граммах.

Результаты и их обсуждение

В процессе работы выполнена оптимизация пробоподготовки и хроматографических условий разделения. В кислой среде АФ значительно более стабилен по сравнению с нейтральной средой, где он окисляется со временем в окрашенный хинон. Пробоподготов-ка заключалась в использовании в качестве растворителя 0,05%-ного раствора трифторук-сусной кислоты с обработкой ультразвуком в течение 5 минут и фильтрованием пробы. Как показали проведенные эксперименты, этих условий достаточно для полного количественного извлечения АФ из лекарственных форм.

При выборе и обосновании условий хроматографического разделения использовали режим изократического элюирования на фазах С18, широко распространенных в аналитической практике. Однако определение АФ при этих условиях представляет трудную задачу ввиду сложности фоновой матрицы и его малых концентраций 0,05% - 0,5% (мас.) относительно содержания парацетамола в ЛС. Кроме того, АФ является гидрофильным соединением, практически не удерживаемом на традиционных обращенных фазах С18.

Для повышения эффективности разделения и улучшения формы пика использован прием введения ион-парного реагента при ВЭЖХ определениях. Наличие фенильного гидроксила позволяет для органических соединений с кислотными свойствами в качестве ион-парных реагентов использовать алкиламины в нейтральной среде. Входящая в их состав основная аминогруппа позволяет реализовать на основе солей алкилсульфонатов ион-парный механизм удерживания и разделения в кислой среде. В жидкостной хроматогра-

фии должное распространение получили алкилсульфонаты с длиной углеводородных радикалов Сб-Сз. В тоже время более доступно использование додецилсульфата натрия в более низких по сравнению с алкилсульфонатами концентрациях в подвижной фазе. Обладая более высокой удерживающей способностью, алкилсульфат позволяет использовать высокое содержание органического модификатора для получения приемлемых времен удерживания АФ (рис. 1). В то же время большинство остальных компонентов матрицы и действующих веществ элюируются вместе с пиком перераспределения, не мешая определению примеси (рис. 2). Была показана возможность количественного анализа трудноудерживае-мой примеси 4-аминофенола в присутствии аскорбиновой кислоты на колонке Symmetry С18 одновременно с количественным определением действующих веществ парацетамола, аскорбиновой кислоты и хлорфенирамина малеата. Удерживание компонентов матрицы с основными свойствами, в частности фенирамина, при этом значительно возрастает, что позволяет достоверно отделять все компоненты смеси от примеси АФ (рис. 3). В качестве детектора наряду со спектрофотометрическим (аналитическая длина волны 272 нм) возможно использование и флуоресцентного, что позволяет значительно увеличить селективность и предел детектирования аналита. Для АФ оптимальные параметры флуоресцентного детектора составили: длина волны возбуждения 260 нм, эмиссии 340 нм.

mAU

mV

mAU

mV

Рис. 1 - Хроматограммы 4-аминофенола в концентрациях 2,5 мкг/мл

mV mAU

Рис. 2 - Хроматограмма таблеток «Антигриппин для детей» с добавкой стандартного образца 4-аминофенола в концентрации 1 мкг/мл

mAU mV

Рис. 3 - Хроматограмма таблеток «Терафлю» с добавкой стандартного образца 4-аминофенола в концентрации 2,5 мкг/мл

При подобранных условиях разделения достигаются оптимальные значения времени удерживания и симметрии пика. Аналитические характеристики методики приведены в табл. 1. Хороший результат разделения компонентов смеси, достигнутый в предлагаемых условиях, отражается и в разрешающей способности. Специфичность методики оценивалась по совпадению времен удерживания анализируемых компонентов с соответствующими стандартами и по доказательству отсутствия влияния действующих и вспомогательных веществ на аналитические определения. При этом точность метода описывается метрологическими характеристиками в соответствии с рекомендациями фармакопеи [6]. Правильность определений оценивалась добавкой стандарта АФ в лекарственные смеси (табл. 2).

Экспериментально возможность хроматографического определения АФ в анализируемых смесях проверена в различных готовых лекарственных формах (табл. 3).

Таблица 1 - Аналитические характеристики методики ВЭЖХ анализа 4-аминофенола

Длина волн, нм Диапазон определяемых содержаний, мкг/мл Наклон градуиро- вочной зависи- мости Ь Коэф- фициент корреля- ции Предел детекти- рования, мкг/мл Предел обнару- жения, мкг/мл

272 0,1 - 5 18089 630 0,9999 0,093 0,306

Евозб= 260

Еэмис = 340 0,1 - 2 319376 1003 0,9999 0,012 0,040

Таблица 2 - Оценка правильности определений 4-аминофенола

Компонент (анализируемая матрица) Содержание компонента, моль/л Введено 4-аминофенола, мкг/мл Найдено 4-аминофенола, мкг/мл Эг

Парацетамол 0,50-10-5 0,545 0,540±0,020 0,03

1,00-10-4 1,090 1,150±0,069 0,05

2,50-10"3 2,725 2,77±0,16 0,05

Аскорбиновая кислота 5-10"5 1,09 1,053±0,045 0,03

Ацетилсалициловая кислота 5-10"5 1,09 1,093±0,046 0,02

Фенол 5-10"5 1,09 1,062±0,040 0,03

Терафлю (порошок) - 2,47 2,35±0,15 0,04

Антигриппин (таблетки) - 1,20 1,19±0,03 0,04

Цитрамон (таблетки) - 0,55 0,55±0,020 0,03

Таблица 3 - Результаты определения 4-аминофенола в лекарственных формах

Лекарственная форма Найдено х 10-3, %

Парацетамол 3,9±0,2

Панадол 2,6±0,1

Эффералган 1,30+0,08

Цитрамон П 2,1 ±0,1

Антигриппин 0,6+0,03

Колдрекс 0,8±0,03

Таким образом, предложенная методика анализа обеспечивает получение достоверных и воспроизводимых результатов количественного определения АФ в присутствии действующих веществ в препаратах на основе парацетамола.

Литература

1. Смирнов, В.С. Современные средства профилактики гриппа и ОРВИ / В.С. Смирнов // Санкт-Петербург: Фарминдекс, 2004. С. 15-16.

2. Kazakevich, Y. HPLC for pharmaceutical scientists / Y. Kazakevich, R. Lobrutto // New Jersey: John Wiley - 2007. - 1135 p.

3. Lunn, G. HPLC methods for recently approved pharmaceuticals / G. Lunn.// New Jersey: John Wiley & Sons, Inc., Hoboken - 2005. - 717 p.

4. НД 42-14117-06. Антигриппин. Таблетки шипучие для взрослых.

5. НД 42-14116-06. Антигриппин. Таблетки шипучие для детей.

6. Государственная фармакопея СССР. Выпуск 2. Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологических испытаний. М.: Медицина, 1989. 400 с.

© С. Ю. Гармонов - д-р хим. наук, проф. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ, serggar@mail.ru; И. А. Салахов - асп. той же кафедры; Г. Р. Нурисламова -асп. той же кафедры; Р. Н. Исмаилова - канд. хим. наук, доц. той же кафедры; В. Ф. Сопин - д-р хим. наук, проф. зав. каф. аналитической химии, сертификации и менеджмента качества КГТУ.