ВАКЦИНА АССОЦИИРОВАННАЯ ПРОТИВ АДЕНОВИРУСНОЙ, ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ, ПАРАГРИППА-3 И ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ-БОЛЕЗНИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ИНАКТИВИРОВАННАЯ ЭМУЛЬСИОННАЯ
INACTIVATED EMULSION VACCINE ASSOCIATED AGAINST ADENOVIRAL, HERPES VIRUS INFECTION, PARAINFLUENZA-3 AND VIRAL DIARRHEA - MUCOSAL DISEASE OF CATTLE

Вакцина ассоциированная против аденовирусной, герпесвирусной инфекций, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности против вирусных респираторно-кишечных инфекций телят и обуславливаемых ими нарушений репродуктивной функции взрослого поголовья крупного рогатого скота (КРС).
Респираторные и желудочно-кишечные болезни молодняка крупного рогатого скота остаются одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии животных во многих странах мира, в том числе и России. В этиопатогенезе их с большей постоянностью регистрируются вирус парагриппа-3 (ПГ-3), герпесвирус типа I, вирус вирусной диареи - болезни слизистых (ВД-БС), респираторно-синцитиальный вирус, парво- и реовирусы, а также рота-, коронавирусы, патогенные виды бактерий, хламидий и микоплазм. Эти болезни, протекающие преимущественно в виде смешанной инфекции, широко распространены в современных крупных молочных комплексах и потери молодняка в них достигают 35-50% (Гаффаров Х.З. Инфекционные болезни рогатого скота хламидийной, микоплазменной и вирусной этиологии, разработка диагностических и лечебно-профилактических препаратов // Автореф. дис. … док. вет. Наук. - Казань. - 1986. - 39 с.).
Достоверно установлено участие в данной патологии и аденовирусов КРС I и II подгрупп, которые по мнению ряда ученых являются одним из четырех наиболее вероятных возбудителей респираторных заболеваний КРС и по распространенности стоят на втором месте после парагриппа-3. Кроме того, они признаны этиологическим агентом неопластических процессов и бессимптомных инфекций у человека и животных и потому имеют гораздо большее эпизоотическое и социально-экономическое значение, чем предполагалось раньше (Гуненков В.В., Сюрин В.Н., Вертинская К.К. Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота / Малоизвестные вирусные инфекции крупного рогатого скота. - Москва, 1972.- 47 с.; Mocsari Е. et al., 1974. - // Acta Vet. Acad. Sci. Hung. - 1974. -24. - №1-2. - P.39-43; Mohanty S.B. Comparative studies of Bovine Adenovims // Amer. J. Vet. Res. - 1971. - V.32. - №12. - P.1899-1905).
Касаясь спектра патогенности аденовирусов КРС в естественных условиях, следует заметить, что аденовирусная инфекция у телят от 2-недельного до 2-4-месячного возраста характеризуется острым течением, развиваются бронхопневмония, энтериты и конъюнктивиты, вследствие воспалительных процессов слизистых оболочек дыхательных путей и пищеварительного тракта. У взрослого поголовья КРС инфекция протекает латентно, сопровождаясь длительным вирусоносительством. Выделение аденовируса из плодов свидетельствует о возможности транспланцентарной передачи возбудителя.
Аденовирусы КРС представлены шестью серотипами, проявляющими различия в антигенной структуре: аденовирусы 1, 2 и 3-го серотипов реагируют перекрестие между собой, но не взаимодействуют с сыворотками 4, 5 и 6-го серотипов, что явилось причиной их деления на две антигенной подгруппы (Bartha A. Proposal for sub grouping of bovine adenoviruses // Acta vet. Acad. Sci. Hung. - 1969. - 19. - №3. - P.313-321; Rondhuis P.R. Bovine Adenoviruses. A Comparative Serological and Experimental Study // Drukkerij-Uitgeverij G. van Dijk N.V. Breukelen. - 1970. - P.218).
Аденовирусная инфекция КРС была впервые установлена в США в 1959 году (Klein H., Maitzman W., Levine A.J. Structure function relationships of the adenovirus DNA-binding protein // J. Biol. Chem. - 1979. - V.254. - P.11051-11060) затем в Англии (Darbyshire J.H. Bovine Adenoviruses // J. Amer. Vet. Med. Assoc. - 1968. - V.152. - P.786-792), Венгрии (Aldasy P., Csontos L., Bartha A. Pneumoenteritis in Caives Caused by Adenoviruses //Acta Vet. Acad. Sci. Hung. - 1965. - 15. - P.175-176), Голландии (Rondhuis P.R. Anew Bovine Adenovirus // Arch. ges. Virusforsch. - 1968. - 25. - P.235-236), Японии (Inaba Y., Tanaka Y., Sato Y., Ito K., Ito H., Matumoto M. Bovine adenovirus. II A.Serotype. Fukuroi, Recoverend from Japanene Cattle // Jap.J. MicrobioL - 1968. - 12. - P.219-229). Несколько позже это заболевание было зарегистрировано в Италии, Польше, ФРГ, Канаде, Австралии, Болгарии и в других странах.
О широком распространении аденовирусной инфекции свидетельствуют частые случаи выделения при инфекционных респираторных заболеваниях телят, а также высокий процент серопозитивности у взрослого скота. Так, в реакции нейтрализации (РН) аденовирусные антитела обнаружены у 66,8% (Sawhney D.S. Vadehre D.V, Baker R.C. // Poultry Sci. - 1973. - 52. - №2. - P.465-473), 60% (Adamesteanu L., Adamesteanu C. // Rev. zootehn. si med. vet. - 1973. - V.23. - №9.- P.51-56) от всего обследованного поголовья и у 73,41% животных в тех группах, в которых в период исследования наблюдались клинические симптомы респираторно-кишечных заболеваний.
В большинстве случаев в этиологии респираторных заболеваний телят удавалось установить участие не только аденовирусов, но и других, таких как вирусов ПГ-3, инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи и хламидий (Sawhney D.S. et al., 1973). Однако Mocsari, E. et al. считает, что аденовирусы играют более важную роль в этиологии респираторных и кишечных заболеваний телят, чем вирус инфекционного ринотрахеита и хламидий.
Экспериментальное заражение телят в возрасте 20-25 дней (Аугустинавичус Б.В. / в кн. Науч.-тех. информация. - Литов. науч. - иссл. вет. институт. - 1966. - С.3-5), 8 недель (Pons W.A., Cucullu A.F., Franz A.O., Lee Louise S., Goldblatt Leo A. // J. Assoc. Offic. Anal. Chem. - 1973. - 56. - №4. - P.803-807), 6-12 недель и даже 8-месячных животных аденовирусом КРС вызывало клинически выраженное заболевание. Более того, вирусы 3-го и 4-го серотипов вызывают более тяжелое заболевание у телят, чем вирусы 1-го и 2-го серотипов, которые вызывают легкую реакцию или вовсе ее не вызывают у телят, лишенных молозива или выкормленных на обычном рационе (Gillespie J. // J. Amer. Vet. Med. Assoc. - 1973. - 163. -№7. - Р.901).
Первые сообщения о неблагополучии хозяйств в отношении аденовирусной инфекции в СССР появилось в конце 60-х годов (Алиева Н.А., Ганиев М.К., Дрейзин Р.С., Алиева Р.А., Сарыев Г.А. Аденовирусная инфекция телят // Труды АзНИВИ. - 1967. - Т. XXI; Гуненков В.В., Халенев Г.А., Сюрин В.Н. Вирусные и хламидиозные респираторные и кишечные инфекции крупного рогатого скота // Животноводство и ветеринария. Проблемы ветеринарии, серия «Итоги науки и техники». - Москва, 1975. - Т.8. - С.87-95).
В период 1998-2003 гг. был регистрирован самый высокий уровень заболеваемости телят аденовирусной инфекцией в хозяйствах Московской области. Из 108 обследованных хозяйств во всех случаях установлена циркуляция вирусов ПГ-3 (100%), ИРТ (63,8%), вируса ВД-БС (38,8%), аденовируса (36,2%) и респираторно-синцитиального вируса (4,6%). Полученные данные указывают на значительную роль аденовирусной инфекции в этиологической структуре респираторно-кишечной патологии крупного рогатого скота в хозяйствах Российской Федерации (Лобова Т.П. Усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота // Автореф. дис. … канд. биол. наук. - ФГОУ ВПО МГАВМиБ. - Москва. - 2006. - 19 с.).
С целью выяснения этиологии смешанных респираторных заболеваний в различных регионах Среднего Поволжья и Урала, в 2001-2004 годы было исследовано 1665 проб сывороток крови различных половозрастных групп крупного рогатого скота из 76 неблагополучных хозяйств на наличие антител к вирусам ПГ-3, ИРТ, ВД-БС и аденовирусной инфекции. Результаты исследований показали, что наибольший процент положительных проб выявлено к вирусу ПГ-3 - 76,6% и к вирусу ИРТ - 35%, а к аденовирусу - 18,4%, ВД-БС - 17,9% (Ахметсафин Р.Г. Усовершенствование средств диагностики и специфической профилактики смешанных респираторных инфекций телят // Автореф. дис. … канд. вет. наук. - Казань. - 2005. - 19 с.).
Меры профилактики и борьбы с аденовирусной инфекцией в Российской Федерации (РФ), традиционно используемые в настоящее время, не решают проблему вследствие недостаточно полного раскрытия этиологии данного симптомокомплекса в каждом отдельном случае, неизученности принципиальных особенностей ее проявления в современных крупных комплексах, отсутствия в них системного сероиммунологического мониторинга в отношении основных возбудителей респираторно-кишечной патологии, создающего трудности определения ведущей роли того или иного инфекционного агента при смешанных инфекциях, и, наконец, ветеринарная служба страны в настоящее время реально не располагает высокоэффективными методами и средствами ее диагностики и какими-либо биопрепаратами для ее специфической профилактики.
Обращает на себя внимание высказывание ряда ученых о том, что достижения в иммунопрофилактике аденовирусной инфекции более скромны, чем при других вирусных заболеваниях телят респираторно-кишечного комплекса (Edwards G.S., Wogan G.N. // Biochim. biophys. acta. - 1970. - V.224. - 597 p.; Darbyshire J.H. Bovine Adenoviruses // J. Amer.Vet. Med. Assoc. - 1968. - V.152. - P.786-792). Это обусловлено рядом трудностей, очевидно, в первую очередь, связано с множеством типов возбудителя и латентным течением у взрослых животных (Сюрин Н.В., Самуйленко А.Я. Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота // Вирусные болезни животных. - Москва. - ВНИТИБП, 1998. - С.795-801).
В нашей стране в 70-80-е годы изыскания эффективных методов иммунопрофилактики данной инфекции проводились в двух направлениях: путем создания пассивной защиты с помощью поливалентных гипериммунных сывороток и формирования активного иммунитета с помощью вакцин.
Для специфической профилактики вирусных респираторно-кишечных инфекций молодняка и маточного поголовья крупного рогатого скота в РФ применяют живые и инактивированные вакцины.
Известна вирусвакцина «ТКА-ВИЭВ» против инфекционного ринотрахеита КРС, которая используется в случаях возникновения этой инфекции, иммунизируют всех животных, находящихся в эпизоотическом очаге, а также в хозяйствах мясного направления при стационарном неблагополучии - всех животных, подозрительных по заболеванию и подозреваемых в заражении.
Известна «Вакцина инактивированная против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота», которая была разработана на основе полевых штаммов «КЛБ» и «Русь 18/81», относящихся к I и II подгруппам соответственно (Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Коленкова Л.М., Литвинов Т.И., Лобова Т.П. Вакцина против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота / Авт. свидетельство №4486434/30-13/138050 от 29.08.89). Вакцина была изготовлена Покровским заводом биологических препаратов в количестве 125 литров. Биопрепарат был применен в хозяйствах Краснодарского края, Киргизской ССР и Белорусской ССР. Испытанная вакцина была признана безвредной и иммуногенной для глубокостельных коров и телят в возрасте 10-15 дней.
Однако смешанный характер проявления вирусных респираторно-кишечных инфекций и особенности циркуляции этих вирусов предполагает большую эффективность ассоциированных вакцин и применение моновакцин не обеспечивает положительной динамики заболеваний (Вазир Я., Белоусова Р.В., Устинова Г.И. Испытания бивалентной вакцины против аденовирусной инфекции и вирусной диареи крупного рогатого скота на кроликах с использованием иммуномодуляторов // Ветеринарная патология. - 2007. - №3(22). - С.199-202; Матвеева И.Н. Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных // Автореф. дис. … док. биол. наук. - Щелково. - 2008. - 53 с.).
Известна вакцина против парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота сухая, культуральная ассоциированная, содержащая лиофилизированный вакцинный вирус ПГ-3 (штамм «ПТК-45/86») и вакцинный вирус инфекционного ринотрахеита (штамм «ТКА-ВИЭВ-В2»), выращенные в культуре клеток почки теленка и защитную среду высушивания. Вакцину вводят подкожно телятам в возрасте 1-6 месяцев двукратно, 7 месяцев и старше - однократно.
3
3
Известна вакцина, ассоциированная против парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита и хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная. В состав вакцины входят инактивированные антигены ПГ-3 (штамм «ПТК-45/86»), инфекционного ринотрахеита (штамм «ТКА-ВИЭВ-В2») и возбудителя хламидийного аборта коров (штамм «250»), эмульгированные в масляном адъюванте. Телят иммунизируют с 10-20-дневного возраста двукратно, в дозе 1 см, вакцину вводят внутримышечно; телятам старше 6 месяцев, коровам и быкам-производителям в дозе 2 см.
Известна вакцина инактивированная комбинированная против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза телят (Комбовак - К), представляющая собой комплексный препарат для профилактики 3-х вирусных и бактериальных болезней крупного рогатого скота, характеризующихся желудочно-кишечным синдромом. Вакцина изготовлена из инактивированных штаммов трех вирусов: рота-, корона- и вирусной диареи, протективных антигенов эшерихий: соматических 09, 078, 0115; капсульных полисахаридных К80, К30; адгезивных антигенов К99, F-41; термостабильных и термолабильных инактивированных энтеротоксинов.
Известна вакцина инактивированная комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и пастереллеза телят (Комбовак-Р). Вакцина изготовлена из инактивированных штаммов вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи и двух видов пастерелл: Pasteurella multocida (серовары A, В и D) Pasteurella haemolitica.
Известна вакцина комбинированная против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, респираторно-синцитиальной, рота- и коронавирусной болезней телят (Комбовак), представляющая собой композицию из 6 штаммов вирусов, инактивированных формалином и сорбированных на 6%-ном геле гидроокиси алюминия (ГОА) и сапонина, предназначенная для иммунизации телят, нетелей и коров, в хозяйствах, неблагополучных по желудочно-кишечным и респираторным болезням.
3
3
Известна вакцина «Тривак» (ВИЭВ) для профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (Юров К.П., Вечеркин А.С., Шуляк А.Ф., Жидков С.А. / Заявка на патент 96123539/13 от 11.12.1996). Вакцина содержит антиген из аттенуированного вируса инфекционного ринотрахеита (штамм «ТКА-ВИЭВ-В2»), антиген из аттенуированного вируса ВД-БС (штамм «ВК-1), аттенуированного вируса парагриппа-3 (штамм «ПТК-45/86») и защитную среду на основе желатина и сахарозы. Вакцину вводят внутрикожно, двукратно, телятам в дозе 0,2 см, взрослым животным по 0,4 см.
Общим недостатком вышеперечисленных известных вакцин является отсутствие в их составе антигена аденовирусов КРС 1-ой и 11-ой подгрупп, что значительно снижает их эффективность.
Из приведенной информации следует, что в настоящее время отечественных аналогов вакцин, предназначенных для специфической профилактики вирусных респираторных инфекций телят и вызываемых ими патологий репродуктивных органов маточного поголовья, изготовленных на основе антигенов аденовирусов крупного рогатого скота I и II-подгрупп, герпесвируса типа I, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, не существует.
Литературные данные свидетельствуют о том, что во многих странах производятся моно-, би- и поливалентные вакцины против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота, отличающихся как по набору аденовирусных компонентов, сочетанию их с другими вирусами, а также по методам их изготовления, так их применения (Gole J. // J. Amer. Vet. Med. Assoc. - 1973. - №7. - Р.836-839; Phillipp J.I.H., Sands J.H. The Isolation of Bovine Adenovirus Serotypes 4 and 7 in Britain // Res. Vet. ScL - 1972. - 13. - P.386-387; Tribe G.W., Kerry J.B. Combined bovine parainfluenza and adenovirus vaccine // Vet. Rec. - 1969. - V.84. - P.299-303). В работах ряда авторов была показана перспективность и целесообразность создания ассоциированных вакцин с обязательным включением в их состав двух подгрупп аденовирусов: как 1, 3-го, так и 4 и 5-го серотипов. Причем была установлена более высокая иммуногенность ее с адъювантом из эмульсии твин-арлацель-байол, чем с адъювантом из 10-20% гидроокиси алюминия (Bürki F., 1973; Schipper E., Nicolet J., König H., Steck F. Virus bedingte Respirations-Krankheiten in Kälber und Ridermastbetreiben // Schweiz. Arch. Tierheilkunde. - 1972. - H.114. - S.334-361). Активную иммунизацию телят осуществляли по различным программам в зависимости от эпизоотической ситуации. Причем вакцинируют как молочное стадо, так и молодняк различного возраста.
1. В Венгрии впервые применили живую аденовирусную вакцину, приготовленную из штамма ТНТ/62 4-го типа, прошедшего 72 пассажа в культуре клеток тестикул бычка (Bartha A. Immunization experiments on calves with type 4 bovine adenovirus // Acta vet. Acad. Sci. Hung. - 1967. - V.-17. - P.209-216).
2. В Болгарии была сконструирована инактивированная вакцина с адъювантом на основе антигенов вируса инфекционного ринотрахеита, вируса ПГ-3, аденовируса типа 1 (штамм «Bovine-10») и аденовируса типа 3 (штамм «WBR-1»). Было изготовлено 16 серий вакцины и испытание их проводилось на 170 телятах в возрасте 45-180 дней. Животные вакцинировались подкожно, двукратно с 23-дневным интервалом в дозе 7 мл на теленка, а также 54 стельные коровы. У телят специфические антитела впервые были выявлены на 14-й день после вакцинации, а максимальные титры антител достигали через 28 дней после ревакцинации (Haralambiev H., Draganov, M., Zwetkov P. Hyperimmunserum Against Myxovirus Parainfluenza-3 and Bovine Adenovirus in Prophylaxis of Respiratory Disease in Calves // Arch. Exptl. Vet. Med. - 1972. - V.26. - P.273-276).
3. В Великобритании для специфической профилактики респираторных вирусных инфекций использована вакцина «Pneumovac Plus (C-Vet)». В состав вакцины входят антигены парагриппа-3 (штамм SF-4), аденовируса 3 серотипа (штамм «WBR-1»), реовируса 1 типа (штамм «Lang strain»), вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек (штамм «Nadi»), вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и гель гидроокиси алюминия. Препарат вводится внутримышечно молодняку крупного рогатого скота, начиная с 14-дневного возраста, повторно вакцинируют в 5- и 10-недельном возрасте (Morzaria S.P., Richards M.S., Harkness J.W., Maund B.A. A field trial with a multicomponent inactivated respiratory viral vaccine // The Veterinary Record. - 1979. - V.11. - №3. - P.410-414).
Известна «Вакцина против энзоотической бронхопневмонии для крупного рогатого скота инактивированная», содержащая инактивированная антигены вируса парагриппа-3 (штамм «SF-4»), аденовируса крупного рогатого скота 1-го (штамм «Bovine 10»), 3-го (штамм «WBR-1») серотипов первой подгруппы и 5-го (штамм «Munich 293/3») серотипа второй подгруппы, реовируса 1-го (штамм «Lang») и 3-го (штамм «Dearing») серотипов, репродуцированные в соответствующих чувствительных биологических системах и подвергнутые инактивации формалином и ГОА-адъювант в эффективном соотношении (Animal Health Products / Vaccine against enzootic bronchopneumonia, inactivated, for cattle («Bovigrip») Aqueous suspension for subcutaneous injection. / Hoechst Veterinar GmbH. - 1992. - P.37-39)
3
Следовательно, вакцина содержит в своем составе антигены аденовирусов 1-ой и 2-ой подгрупп, реовирусов I и III серогрупп, а также вируса парагриппа-3. Вакцину вводят подкожно в дозе 5 см, телят иммунизируют двукратно с интервалом от 4-недельного до 6-недельного возраста их жизни.
Известна «Вакцина против энзоотической бронхопневмонии и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, инактивированная для крупного рогатого скота», содержащая инактивированные антигены парагриппа-3 (штамм «SF-4»), аденовируса КРС 1-го (штамм « Bovine 10») и 3-го (штамм «WBR-1») серотипов, вируса инфекционного ринотрахеита (штамм «Calw»), реовируса 1-го (штамм «Lang») и 3-го (штамм «Dearing») серотипов, репродуцированных в чувствительных биологических системах и подвергнутые инактивации формалином и ГОА-адъювант в эффективном соотношении. Вакцину под названием «Bovigrip plus» производит крупнейшая в мире немецкая компания «Hoecht Veterinar GmbH», успешно используется во многих странах Западной Европы (Animal Health Products / Vaccine against enzootic bronchopneumonia and infectious bovine rhinotracheitis (IBR), inactivated, for cattle. Aqueous suspension for subcutaneous injection. / Hoechst Veterinar GmbH, 1992. - P.41-43).
50
1. Наиболее близкой к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является «Инактивированная концентрированная поливалентная вакцина против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, аденовирусной инфекции и вирусной диареи крупного рогатого скота» (Белоусова Р.В., Третьякова И.В., Лобова Т.П., Тиганова Н.В., Киш Л.К., Кузнецов Д.П. / Заявка на изобретение №2010152945/10 от 24.12.2010), включающая раздельное культивирование вирусов инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, вирусной диареи, сбор культуральной жидкости и получение антигенов, отличающаяся тем, что дополнительно вводят штамм «Bovine-10» аденовируса 1-ой подгруппы, который культивируют в культуре клеток «ПТ-80», получают вирус с инфекционным титром 6-7 lg ТЦД /мл, затем полученные вирусы инактивируют формалином до 0,2-0,3% конечной концентрации при температуре 37-38°С в течение 72 ч при рН 7,2-7,4 и концентрируют в 5 раз ПЭГ-6000 в конечной концентрации 9-11% в растворе 0,5-0,6 М хлорида натрия, далее полученные антигены смешивают в равных объемах 1:1:1, добавляют официнальный адъювант - гидроокись алюминия до 2-3% конечной концентрации и получают вакцину.
Анализ приведенной информации показывает, что проблема специфической профилактики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота до настоящего времени не решена. Создание ассоциированных вакцин против аденовирусной инфекции КРС с учетом превалирующих этиологических вирусных агентов, выявляемых проведением сероиммунологического мониторинга, могло быть перспективным и экономически целесообразным.
3
Прототипом - исходным образцом при создании новой вакцины, предлагаемого изобретения являлась «Инактивированная бивалентная вакцина против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота и способ профилактики вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота» (Белоусова Р.В., Лобова Т.П., Третьякова И.В., Вазир Я. / Заявка на изобретение №2008103716/13 от 06.02.2008). Из описания изобретения к патенту следует, что вакцина включает в себя антигены аденовируса первого серотипа (штамм «Bovine-10»), штамма «Орегон» вируса вирусной диареи, инактивированных формалином, концентрированных в 5 раз полиэтиленглюколем-6000 (ПЭГ-6000) и депонированных на гидроокиси алюминия в эффективном соотношении. Предложенную вакцину вводят животным внутримышечно с интервалом 13-16 дней в дозе 1 см.
Вакцина-прототип имеет существенные недостатки:
- она не обеспечивает защиту животных от герпесвирусной инфекции типа I и парагриппа-3;
- она не обеспечивает защиту животных от аденовирусной инфекции, вызываемой аденовирусами второй подгруппы, которые в антигенном отношении отличаются между собой и могут вызывать различные патологические процессы в организме животных, несмотря на применение вакцин содержащих антигены аденовирусов иных подгрупп;
- пятикратная концентрация антигенных вирусных компонентов вакцины-прототипа может быть не достаточной для создания напряженного иммунитета у вакцинированных животных;
- гидроокись алюминия - это относительно слабый адъювант, не способный обеспечить длительное освобождение антигена из места введения вакцины, использованный нами масляный адъювант дает эмульсию типа «вода-масло», которая освобождает антигены в течение более длительного времени, чем гидроокись алюминия и аналогичные адсорбенты, это объясняет более мощную иммунную стимуляцию после первой иммунизации животных масляными вакцинами.
В связи с этим проблема создания вакцины ассоциированной, инактивированной, концентрированной и эмульсионной против аденовирусной инфекции, включая антигены I и II подгрупп, герпесвирусной инфекции типа I, парагриппа-3 и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, обладающей высокой антигенной и иммуногенной активностью и безвредностью, продолжает оставаться актуальной и является основным направлением исследований по ее совершенствованию.
Необходимость разработки и производства этой ассоциированной вакцины обусловлена многообразием форм клинического проявления аденовирусной инфекции у телят различных возрастных групп, широкой распространенностью ее в животноводческих комплексах РФ, течением болезни преимущественно по типу смешанных инфекций, формируемых чаще всего с участием герпесвируса типа I, вирусов парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек.
Результаты исследований, проведенные нами, показали, что установлена серопозитивность 65,0% исследованных проб к вирусу ПГ-3, к аденовирусу 48,3%, к герпесвирусу типа I 41,0%, к ВД-БС 39,4%. Полученные результаты указывают на факт циркуляции этих возбудителей среди различных возрастных групп крупного рогатого скота (табл.1).
Известно положение о том, что в естественных условиях одновременное или последовательное воздействие на организм животных нескольких возбудителей, взаимообуславливая действие друг друга, усугубляет и ухудшает течение инфекционного процесса. Это подтверждено результатами исследований как зарубежных, так и отечественных ученых.
Задачей настоящего изобретения является получение высокоиммуногенной ассоциированной инактивированной эмульсионной вакцины против аденовирусной, герпесвирусной типа I, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота на основе производственных штаммов, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации, пригодных для изготовления ассоциированного эмульсионного препарата, создающего эффективную защиту плода, новорожденных телят, молодняка периода доращивания и откорма, а также стельных коров и телок от указанных выше респираторно-кишечных вирусных инфекций и вызываемых ими патологий репродуктивных органов маточного поголовья, широко распространенных и постоянно циркулирующих в скотоводческих предприятиях Российской Федерации.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала эффективных, безвредных и ареактогенных ассоциированных вакцин против вирусных инфекций крупного рогатого скота.
Указанный технический результат достигнут созданием вакцины, обладающей высокой иммуногенной активностью, существенно отличающейся по комплексу вирусных антигенных компонентов от имеющихся средств профилактики, производимыми в настоящее время в РФ, и широким спектром специфической защиты плода, новорожденных телят, молодняка периода доращивания и откорма, стельных коров и телок, от инфицирования эпизоотическими (полевыми) штаммами аденовирусов I и II-подгрупп, герпесвируса типа I, парагриппа-3 и вируса ВД-БС, циркулирующих на территории Российской Федерации.
Предлагаемая вакцина содержит активное биологическое вещество в виде авирулентных очищенных и концентрированных антигенов штаммов «Adeno III WBR-1» 3-го серотипа первой подгруппы и «Adeno IV Wey bridge СТ2» 4-го серотипа второй подгруппы, штамма «ТКА-ВИЭВ-В2» герпесвируса типа I, штамма «SF-4» вируса парагриппа-3, штамма «ВК-1» вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, полученных в культурах клеток млекопитающих и целевых добавок в виде масляного адъюванта в эффективном соотношении. Первые два штамма аденовирусов получены из Центральной ветеринарной лаборатории МСХ Великобритании, изучены их иммунобиологические свойства. Штаммы аденовирусов «Adeno III WBR-1», «Adeno IV Weybridge CT2» и вируса парагриппа-3 «SF-4» депонированы в лаборатории по хранению и изучению штаммов особо опасных болезней животных (музей штаммов), используемых в ветеринарии и животноводстве Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности животных (ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»), Штамм «ТКА-ВИЭВ-В2» герпесвируса типа I и «ВК-1»вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек КРС депонированы в коллекции ФГБУ «ВГНКИ».
Сущность изобретения заключается в следующем: «Ассоциированная вакцина против аденовирусной, герпесвирусной инфекций, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» содержит концентрированные антигены аденовирусов КРС I и II-подгрупп, герпесвируса типа I, вируса ВД-БС крупного рогатого скота, эмульгированных в масляном адъюванте, при следующем соотношении компонентов, об.% 1:1:1:1:1 (инактивированных формалином до конечной концентрации 0,2-0,3%).
Авирулентная, очищенная и концентрированная культуральная суспензия аденовируса крупного рогатого скота I подгруппы штамм «Adeno III WBR1-ДЕП»), полученная в перевиваемой культуре клеток почек эмбриона коровы (линия MDBK) с инфекционным титром не менее 6,25 lg ТЦД<sub>50</sub>/мл
10,0-11,0
Авирулентная, очищенная и концентрированная культуральная суспензия аденовируса крупного рогатого скота II подгруппы штамм «Adeno IV Weybridge СТ2-ДЕП», полученная в перевиваемой культуре клеток почки теленка Taurus-1 (T-1) с инфекционным титром не менее 6,5 lg ТЦД<sub>50</sub>/мл
10,0-11,0
Авирулентная, очищенная и концентрированная культуральная суспензия герпесвируса типа I крупного рогатого скота штамм «ТКА-ВИЭВ-В2-ДЕП», полученная в перевиваемой культуре клеток «MDBK» с инфекционным титром не менее 7,5 lg ТЦД<sub>50</sub>/мл
10,0-11,0
Авирулентная, очищенная и концентрированная культуральная суспензия вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота, полученная в перевиваемой культуре клеток легких эмбриона коровы (ЛЭК) штамм «SF-4-ДЕП» с инфекционным титром не менее 6,5 lg ТЦД<sub>50</sub>/мл и активностью в РГА не менее 6 lg<sub>2</sub> (1:64)
10,0-11,0
Авирулентная, очищенная и концентрированная культуральная суспензия вируса ВД-БС крупного рогатого скота штамм «ВК-1-ДЕП», полученная в перевиваемой культуре клеток «MDBK» с инфекционным титром не менее 6,5 lg ТЦД<sub>50</sub>/мл
10,0-11,0
Целевая добавка - адъювант
до 100,0
Штаммы вирусов, используемых в качестве производственных, характеризуются следующими признаками и свойствами:
- штамм «Adeno III WBRl-ДЕП» аденовируса крупного рогатого скота I подгруппы и штамм «Adeno IV Weybridge СТ2-ДЕП» аденовируса крупного рогатого скота II подгруппы являются представителями рода Mastadenovirus семейства Adenoviridae. Вирусные частицы правильной многранной (икосаэдры) формы. Геном вирусов представлен двухспиральной, нефрагментированной линейной молекулой ДНК. Вирионы имеют диаметр 70-80 нм, вирусы устойчивы к эфиру, хлороформу, сапонину, дезоксихолату натрия, трипсину. Обработка хлороформом повышает инфекционный титр вирусов на 0,5 lg. Аденовирусы устойчивы к изменению рН среды от 3,0 до 9,0 в течение 3 ч при комнатной температуре. При 4° хранятся более 6 месяцев, при комнатной температуре 1-4 месяца, длительно сохраняют инфекционную активность при -30°С. Вирусы устойчивы к повторному замораживанию и оттаиванию, сохраняются при рН 6,0-9,0 и хорошо переносят лиофильную сушку. Штаммы не обладают гемагглютинирующими свойствами.
Штамм аденовируса «Adeno III WBR-1-ДЕП» в культуре клеток линии МДВК и штамм «Adeno IV Weybridge СТ2-ДЕП» в культуре клеток почки теленка Taurus-1 (T-1) вызывают ЦПД через 48-72 часов после заражения. Видимые цитопатические изменения, индуцируемые вирусом, характеризуются укрупнением и округлением клеток. В последующем клетки постепенно группируются в конгломераты в виде комков, гроздьев, образуя пустоты в монослое, напоминающие соты.
- Штамм «ТКА-ВИЭВ-В2-ДЕП» герпесвируса типа I крупного рогатого скота герпесвируса типа I рода Herpesvirus семейства Herpesviridae представляет собой однородную популяцию ДНК-содержащего вируса, полученный путем воздействия ультрафиолетовыми лучами на исходный вирулентный вирус ИРТ в дозе, близкой к пороговой. Капсид гексогональной формы, диаметр 100-110 нм, состоит из 162 капсомеров. Вакцинный штамм «ТКА-ВИЭВ-В2-ДЕП» обладает высокими иммуногенными свойствами и определен нами в качестве производственного для изготовления ассоциированной вакцины.
50
3
Герпесвирус типа I репродуцируется в монослое клеток почки эмбриона коровы и его цитопатогенное действие наступает через 48-96 часов. Вирус, выращенный в монослое перевиваемых линий МДВК, обладает стабильной активностью и достигает 6,75-7,25 lg ТЦД/см. Репродукция вируса сопровождается подавлением митотической активности клеток и образованием внутриядерных включений. Вирус легко концентрируется и очищается центрифугированием в градиенте коллоидной окиси кремния - полиэтиленгликоля. Осадить его можно метанолом, ацетоном, сернокислым магнием и сернокислым аммонием. Ацетон, эфир, хлороформ и этиловый спирт инактивируют вирус немедленно. При температуре -60-70°С вирус выживает 7-9 месяцев, температура 56° инактивирует его через 20 мин, 37° - через 4-10 суток, 22° - через 50 суток. При 4° активность вируса снижается через 30-40 суток лишь на 1 lg. Лиофилизация почти не снижает его активность.
- штамм «SF-4-ДЕП» вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота является представителем рода Paramyxovirus семейства Paramyxoviridae. Вирионы округло-овальной формы, состоящие из оболочки и внутреннего компонента. Диаметр вирионов 150-250 нм, геном вируса представлен несегментированной однонитевой линейной РНК. При 4° без консерванта через 3-4 месяца полностью утрачивает инфекционную активность, при -60° вирус сохраняется инфекционным в течение нескольких месяцев. При многократном замораживании и оттаивании вирусной суспензии инфекционная активность быстро утрачивается. Штамм «SF-4-ДЕП» не агглютинирует эритроциты кур, лошади, хорошо агглютинирует эритроциты морской свинки и в более низком титре эритроциты кролика, свиньи, коровы, обезьяны, мыши, человека (0 группы). Штамм чувствителен к эфиру и дезоксихилату, к кислому рН (3,0).
Штамм «SF-4-ДЕП» вируса ПГ-3 в культуре клеток ЛЭК вызывает ЦПД через 72 ч после заражения. Видимые цитопатические изменения, индуцируемые вирусом, характеризовались образованием гранулированных и вакуолизированных округлых клеток или многоядерных симпластов, возникших в результате слияния нескольких клеток. Клетки, инфицированные вирусом ПГ-3, вызывают диффузную адсорбцию эритроцитов морской свинки.
3
- штамм «ВК-1-ДЕП» вируса ВД-БС крупного рогатого скота является представителем рода Pestivirus семейства Flaviviridae, геном вируса представлен однонитевой РНК. Величина вирионов 40-100 нм, плавучая плотность в градиенте плотности сахарозы 1,5-1,19 г/см.
Чувствителен к эфиру, хлороформу и трипсину. Прогревание при 50°С в течение 10 мин приводит к инактивации аттенуированного вируса. Замораживание при -20°С и оттаивание снижает титр инфекционной активности в культуре клеток. В отличие от исходного эпизоотического штамма вируса аттенуированный штамм приобрел большую устойчивость к воздействию рН 3,0.
6,0-6,5
50
Не агглютинирует эритроциты морской свинки, барана, крупного рогатого скота и птиц. Размножается с развитием цитопатического действия в культурах клеток ПЭК, почки теленка (ПТ), почки эмбриона свиньи (ПЭС). По мере развития ЦПД клетки постепенно отторгаются от поверхности стекла, образуя островки. Вирус достигает инфекционного титра 10 ТЦД/мл.
В организме морских свинок и крупного рогатого скота вызывает образование вируснейтрализующих антител. У вакцинированного крупного рогатого скота стимулирует образование местного и гуморального иммунитета. Вызывает слабую реакцию у некоторых вакцинированных телят при подкожном, внутримышечном и интраназальном введениях пятикратной иммунизирующей дозы: 1-2-дневное повышение температурной реакции тела на 0,3-0,5°С, незначительное снижение количества лейкоцитов, без других отклонений от клинической и физиологической нормы (Жидков С.А., Крюков Н.Н. Штамм вируса Bovine viral Diarrhea-mucosal disease virus для изготовления вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота // Авт. свидетельство SU 1322673 от 09.09.85). В лиофилизированном состоянии при 4-10°С хранится в течение года, практически не снижая инфекционной активности.
Штаммы вирусов, принятые заявителем в качестве производственных, обладают высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации, отличаются высокой продуктивностью в чувствительных биологических системах культивирования. Они свободны от контаминации бактериями, грибковой микрофлорой, микоплазмами и сопутствующими вирусами. Экспериментально в лабораторных условиях и производственных опытах подтверждена возможность их использования для изготовления ассоциированной вакцины, создающей напряженный и продолжительный иммунитет у вакцинированных животных.
2. Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения.
Определение из перечня выявленных аналогов прототипа (ассоциированные вакцины «Bovigrip», «Bovigrip plus», в состав которых включены инактивированные антигены парагриппа-3 (штамм «SF-4»), аденовируса КРС 1-го (штамм «Bovine 10») и 3-го (штамм «WBR-1») серотипов, вируса инфекционного ринотрахеита (штамм «Calw»), производства «Hoecht Veterinar GmbH») как наиболее близкого по совокупности признаков по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.
Следовательно, заявляемое решение соответствует условию патентоспособности «Новизна».
Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности «Изобретательский уровень» проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения.
Результаты поиска показали, что предлагаемое решение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания, а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.
Следовательно, предлагаемая ассоциированная вакцина соответствует условию патентоспособности «Изобретательский уровень».
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.
3
Пример 1. Производственный штамм «Adeno III WBR1-ДЕП» аденовируса крупного рогатого скота I подгруппы для изготовления предлагаемой вакцины репродуцируют в перевиваемой культуре клеток почек эмбриона коровы (линия MDBK), выращенной в роллерных трехлитровых бутылях на комбинированной ростовой среде, состоящей из среды 199 - 10%, ГЛА - 40%, Игла МЕМ - 40%, сыворотки крупного рогатого скота - 10% и антибиотиков. Культуру выращивают в течение 3-4 суток при посевной концентрации 140-150 тыс. клеток в 1 см среды.
3
Для получения 10 л вирусной суспензии берут 28-35 бутылей с культурой клеток емкостью 3,0 дм каждый.
3
3
3
50
50
Ростовую среду сливают, вносят поддерживающую среду (ГЛА - 60%, Игла МЕМ - 40% и антибиотики: стрептомицин - 100 мкг/см, пенициллин - 100 ЕД./см) в количестве 300-350 см, в которую предварительно вносят аденовирус крупного рогатого скота штамм «Adeno III WBR1-ДЕП» из расчета 0,2-1 ТЦД/клетку. Бутыли инкубируют в роллерной установке при 37-38°С в течение 48-72 часов. Сбор культуральной жидкости производят в период выраженного цитопатического эффекта - максимального накопления вируса. Инфекционный титр вируса должен быть не ниже 6,25 lg ТЦД/мл.
Освобождение вируса из клеток осуществляют путем трехкратного замораживания и оттаивания. Полученный вируссодержащий материал очищают от клеточного детрита путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 минут, соблюдая стерильные условия.
Очищенную вируссодержащую суспензию подвергают инактивации формалином (содержанием активного формальдегида 37-38%) в конечной концентрации 0,2-0,3% при температуре 37°С в течение 72 ч при периодическом перемешивании.
3
Концентрирование антигена аденовируса I подгруппы проводят с помощью ПЭГ-6000 до конечной концентрации 7-8% (вес. объем) и хлорида натрия до конечной концентрации 3% в течение 24 ч при температуре 4°С. Вирусный белок осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 60 минут и ресуспендирование осадка проводят 0,85% раствором натрия хлорида. Полученный концентрированный антиген стандартизируют путем количественного определения специфического белка на спектрофотометре. Концентрация белка должна быть в пределах 1,8-2 мг/см. Концентрированный антигенный материал проверяют на стерильность, авирулентность по общепринятой методике.
3
3
3
Пример 2. Производственный штамм «Adeno IV Weybridge СТ2-ДЕП» аденовируса крупного рогатого скота II подгруппы для изготовления предлагаемой вакцины репродуцируют в культуре клеток перевиваемой культуре клеток почки теленка Taurus-1 (T-1) выращенной в роллерных трехлитровых бутылях на ростовой среде Игла МЕМ-90%, сыворотки крупного рогатого скота - 10% и антибиотиков (стрептомицин - 100 мкг/см, пенициллин - 100 ЕД./см). Культуру выращивают в течение 3-4 суток при посевной концентрации 140-150 тыс. клеток в 1 см среды.
3
Для получения 10 л вирусной суспензии берут 35-37 бутылей с культурой клеток емкостью 3,0 дм каждый.
3
50
50
Ростовую среду сливают, вносят поддерживающую, состоящую из среды Игла MEM и антибиотиков в количестве 300 см, в которую предварительно вносят аденовирус крупного рогатого скота штамм «Adeno IV Weybridge СТ2-ДЕП» из расчета 0,2-1 ТЦД/клетку. Бутыли с зараженным монослоем инкубируют в роллерной установке при 37-38°С в течение 48-72 часов. Инфекционный титр вируса в культуральной суспензии должен быть не ниже 6,5 lg ТЦД/мл.
Полученный вируссодержащий материал трехкратно замораживают при -20°С и оттаивают при 37°С, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут с целью освобождения от клеточного детрита.
Вируссодержащую суспензию инактивируют формалином (содержанием активного формальдегида 37-38%) в конечной концентрации 0,2-0,3% при температуре 37°С в течение 72 ч при периодическом перемешивании.
3
Концентрирование антигена аденовируса II подгруппы проводят с помощью ПЭГ-6000 до конечной концентрации 7-8% (вес. объем) и хлорида натрия до конечной концентрации 3% в течение 24 ч при температуре 4°С. Осаждают вирусный белок путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 60 минут, полученный осадок ресуспендируют 0,85% раствором натрия хлорида. Стандартизацию антигена проводят на спектрофотометре. Концентрация специфического белка должна быть в пределах 1,8-2 мг/см. Концентрированный антигенный материал проверяют на стерильность и авирулентность.
3
Пример 3. Производственный штамм «ТКА-ВИЭВ-В2-ДЕП» герпесвируса типа I крупного рогатого скота для изготовления предлагаемой вакцины репродуцируют в перевиваемой культуре клеток почек эмбриона коровы (линия MDBK), выращенной на комбинированной ростовой среде, состоящей из среды 199 - 10%, ГЛА - 40%, Игла МЕМ - 40%, сыворотки крупного рогатого скота - 10% и антибиотиков. При посевной концентрации 140-150 тыс. клеток в 1 см среды формирование сплошного монослоя в роллерных трехлитровых бутылях происходит в течение 3-4 суток при температуре 37±0,5°С в условиях термальной комнаты.
3
Для получения 10 л вирусной суспензии берут 28-35 бутылей (емкость 3,0 дм) с монослоем культуры клеток линии MDBK.
3
3
3
50
50
После слития ростовой среды вносят поддерживающую среду (ГЛА-60%, Игла МЕМ-40% и антибиотики: стрептомицин - 100 мкг/см, пенициллин - 100 ЕД./см) в количестве 300-350 см, в которую предварительно вносят герпесвируса типа I штамм «ТКА-ВИЭВ-В2-ДЕП» из расчета 0,1-1 ТЦД/клетку. Бутыли инкубируют в роллерной установке при 37-38°С в течение 48-72 часов. Сбор культуральной жидкости производят в период выраженного цитопатического эффекта - максимального накопления вируса. Инфекционный титр вируса должен быть не ниже 7,5 lg ТЦД/мл.
Вируссодержащий материал трехкратно замораживают при -20°С и оттаивают при 37°С, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут с целью освобождения от клеточного детрита.
Очищенную вируссодержащую суспензию подвергают инактивации формалином (содержанием активного формальдегида 37-38%) в конечной концентрации 0,2-0,3% при температуре 37°С в течение 72 ч при периодическом перемешивании.
3
Концентрирование антигена герпесвируса типа I проводиться ПЭГ-6000, который добавляется в очищенную вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 7-8% (вес. объем), добавляют хлорида натрия до конечной концентрации 3%. Концентрирование проводится в течение 24 ч при температуре 4°С. Вирусный белок осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 60 минут. Полученный концентрированный антиген стандартизируют путем количественного определения специфического белка на спектрофотометре. Концентрация вирусного белка должна быть в пределах 1,8-2 мг/см. Концентрированный антигенный материал проверяют на стерильность, авирулентность.
Пример 4. Производственный штамм «SF-4-ДЕП» вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота для изготовления предлагаемой вакцины репродуцируют в перевиваемой культуре клеток легких эмбриона коровы (ЛЭК).
3
3
Культуру клеток «ЛЭК» при посевной концентрации 140-150 тыс. клеток в 1 см выращивают в матрасах емкостью 1,5 дм в течение 3-4 суток на комбинированной среде, состоящей из среды ГЛА - 60%, Игла MEM - 30% и 10% сыворотки крупного рогатого скота.
3
3
50
Для получения 10 л вирусной суспензии берут 65-70 матрасов с культурой клеток емкостью 1,5 дм каждый. После слива ростовой среды в матрасы вносят суспензию парагриппа-3 из расчета 0,2-1 ТЦД/клетку. Адсорбцию вируса проводят при 37°С в течение 1 часа. После этого в матрасы вносят 150 см поддерживающей среды, состоящей из Игла MEM 40% и среды ГЛА 60%, антибиотиков. Культивирование ведут при 37°С в течение 72-96 часов. В качестве контроля оставляют незараженными 3 матраса, в которых не должно быть каких-либо деструктивных изменений в период культивирования. Зараженные матрасы с 80-90% поражением клеточного монослоя отбирают, трехкратно замораживают при -20°С и оттаивают.
2
Полученный вируссодержащий материал очищают от клеточного детрита путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 минут, соблюдая стерильные условия. Гемагглютинирующую активность штамма «SF-4-ДЕП» вируса ПГ-3 крупного рогатого скота определяют в РГА с 1% суспензией эритроцитов морской свинки при 20-22°С. Гемагглютинирующая активность вируса ПГ-3 крупного рогатого скота должна быть не менее 6 log (1:64).
Очищенную вируссодержащую суспензию подвергают инактивации формалином (содержанием активного формальдегида 37-38%) в конечной концентрации 0,2-0,3% при температуре 37°С в течение 72 ч при периодическом перемешивании.
3
Пример 5. Производственный штамм «ВК-1-ДЕП» ВД-БС крупного рогатого скота для изготовления предлагаемой вакцины репродуцируют в культуре клеток почек эмбриона коровы (линия MDBK), выращенной на комбинированной ростовой среде, состоящей из среды 199-10%, ГЛА-40%, Игла МЕМ-40%, сыворотки крупного рогатого скота - 10% и антибиотиков. Посевная концентрация 140-150 тыс. клеток в 1 см среды, монослой в роллерных трехлитровых бутылях формируется в течение 3-4 суток при температуре 37±0,5°С в условиях термальной комнаты.
3
Для получения 10 л вирусной суспензии берут 28-35 бутылей (емкость 3,0 дм) с монослоем культуры клеток линии MDBK.
3
3
3
50
50
Перед заражением ростовую среду сливают, вносят поддерживающую среду (ГЛА - 60%, Игла МЕМ - 40% и антибиотики: стрептомицин - 100 мкг/см, пенициллин - 100 ЕД./см) в количестве 300-350 см, в которую предварительно вносят вирус ВД-БС штамм «ВК-1-ДЕП» из расчета 0,2-1 ТЦД/клетку. Инкубацию проводят в роллерной установке при 37-38°С в течение 48-72 часов. Сбор культуральной жидкости производят в период выраженного цитопатического эффекта - максимального накопления вируса. Инфекционный титр вируса должен быть не ниже 6,5 lg ТЦД/мл.
Вируссодержащий материал трехкратно замораживают при -20°С и оттаивают при 37°С, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут с целью освобождения от клеточного детрита.
Очищенную вируссодержащую суспензию подвергают инактивации формалином (содержанием активного формальдегида 37-38%) в конечной концентрации 0,2-0,3% при температуре 37°С в течение 72 часов.
3
Концентрирование антигена вируса ВД-БС проводят ПЭГ-6000, который добавляется в очищенную вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 7-8% (вес. объем), добавляют хлорида натрия до конечной концентрации 3%. Концентрирование проводиться в течение 24 ч при температуре 4°С. Вирусный белок осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 60 минут. Полученный концентрированный антиген стандартизируют путем количественного определения специфического белка на спектрофотометре. Концентрация вирусного белка должна быть в пределах 1,8-2 мг/см. Концентрированный антигенный материал проверяют на стерильность, авирулентность.
Пример 6. Масляный адъювант для изготовления предлагаемой вакцины готовят из синтетического масла ПЭС-3М (кремнеорганическая жидкость ГОСТ 13004-77) и ланолина безводного, взятых в соотношении 84:16 объемных частей. Смесь масла и ланолина смешивают, автоклавируют при 120°С (1,0 атм.) в течение 40 мин. Готовый адъювант охлаждают, проверяют на стерильность по общепринятой методике.
Пример 7. Вакцину ассоциированную против аденовирусной, герпесвирусной инфекций, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированную эмульсионную готовят путем диспергирования смеси концентрированных антигенных материалов из штаммов «Adeno III WBR1-ДЕП» аденовируса крупного рогатого скота I подгруппы, «Adeno IV Weybridge СТ2-ДЕП» аденовируса крупного рогатого скота II подгруппы, «ТКА-ВИЭВ-В2-ДЕП» герпесвируса типа I, «SF-4-ДЕП» вируса парагриппа-3, «ВК-1-ДЕП» вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота.
Для этого концентрированные антигенные материалы, полученные так, как описано в примерах 1, 2, 3, 4 и 5, смешивают между собой в соотношении 1:1:1:1:1, т.е. берется 1 часть антигенного материала аденовируса крупного рогатого скота I подгруппы, 1 часть аденовируса крупного рогатого скота II подгруппы, 1 часть герпесвируса типа I, 1 часть парагриппа-3 и 1 часть вируса ВД-БС.
Антигенный материал концентрированный из штамма «Adeno III WBRl-ДЕП» аденовируса крупного рогатого скота
10,0-11,0
Антигенный материал концентрированный из штамма «Adeno IV Weybridge СТ2-ДЕП» аденовируса крупного рогатого скота
10,0-11,0
Антигенный материал концентрированный из штамма «ТКА-ВИЭВ-В2-ДЕП» герпесвируса типа I
10,0-11,0
Антигенный материал концентрированный из штамма «SF-4-ДЕП» парагриппа-3
10,0-11,0
Антигенный материал концентрированный из штамма «ВК-1-ДЕП» вируса ВД-БС
10,0-11,0
Полученную смесь концентрированных антигенов тщательно эмульгируют с масляным адъювантом в соотношении 1:1 (об.%:50:50).
Ассоциированную вакцину разливают в стерильные стеклянные флаконы и контролируют в соответствии с техническими условиями.
По внешнему виду вакцина представляет собой стойкую эмульсию розовато-белого цвета. При длительном хранении в верхней части флакона допускается незначительное (до 10%) расслоение эмульсии, восстанавливающейся при взбалтывании.
Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 28085-89, путем высева на МПА, МПБ, МППБ и агар Сабуро. Вакцина не должна давать роста бактерий и грибов ни в одной из засеянных пробирок, т.е. должна быть стерильной.
3
Для определения остаточной вирулентности ассоциированную вакцину разводят в соотношении 1:10 и в объеме 0,1 см мерной пипеткой вносят в 5 флаконов с перевиваемыми культурами клеток Т-1, ЛЭК, МДВК выдерживают в течение 1,5-2 ч при 37°С, а по 5 флаконов с указанной культурой клеток оставляют в качестве контроля. После адсорбции инокулят сливают, во флаконы с культурами клеток Т-1, ЛЭК, МДВК вносят поддерживающую среду с антибиотиками и инкубируют в термостате при 37°С 5-7 дней. Все флаконы с культурами клеток периодически просматривают под микроскопом с целью обнаружения ЦПД аденовируса, герпесвируса типа I, ПГ-3 и вируса диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота.
Полученные культуральные суспензии используют для последующих двух «слепых» пассажей. На третьем пассаже в перевиваемых культурах клеток Т-1, ЛЭК, МДВК характерное ЦПД аденовируса, герпесвируса, ПГ-3 и ВД-БС не выявляется, что свидетельствует об авирулентности ассоциированной вакцины.
3
Для проверки безвредности вакцину вводят внутрибрюшинно 10 белым мышам в дозе 0,25 см. Вакцина считается безвредной, если белые мыши в течение 10 суток остаются клинически здоровыми без каких-либо патологических изменений.
2
2
Вязкость вакцины определяется на вискозиметре ВПЖ-2, и ее выражают в мм/с. Предлагаемая вакцина, содержащая в качестве целевой добавки масляный адъювант (синтетическое масло ПЭС-3М и ланолин безводный), образующий тип эмульсии «вода-масло», имеет вязкость 38±0,5 мм/с.
Для определения стабильности препарата образцы вакцины замораживают при -40°С в течение 1 часа. По истечении указанного времени пробирки с вакциной помещают на 1 час в термостат при 37°С. В пробирках после замораживания и выдерживания в термостате в верхней части может наблюдаться отслоение 0,5-1% прозрачного масла, а остальная часть представлена эмульсией. В данном случае вакцина считается стабильной.
3
Для проверки реактогенности препарата вакцину вводят внутримышечно в область бедра 3 кроликам в дозе 2 см. За клиническим состоянием животных ведут наблюдение в течение 14 суток. В процессе наблюдения за клиническим состоянием животных, которым вводилась вакцина существенного отклонения общего и местного характера, не выявлено. У подопытных животных отмечалось незначительное повышение местной температуры в месте инъекции, но при этом общее состояние оставалось удовлетворительным. На разрезе тканей признаков воспаления не выявлено. Следовательно, ассоциированная вакцина относится к типу ареактогенных препаратов.
3
Антигенную активность контролируют на трех кроликах живой массой 2,5-3,0 кг, которым вакцину вводят внутримышечно, двукратно с интервалом 21 день в дозе по 2 см. Кровь у кроликов берут из ушной вены через 21-30 дней после второй вакцинации. Сыворотку исследуют на наличие специфических антител к антигенам аденовируса, герпесвируса типа I и ВД-БС - в ИФА, парагриппа-3 - в РТГА. Одновременно берут кровь у двух невакцинированных кроликов и используют сыворотку для контроля.
Серию вакцины считают прошедшей контроль на антигенную активность, если титр вирусоспецифических антител через 21-30 дней после II вакцинации составляет к аденовирусу, герпесвирусу типа I, вирусу ВД-БС не менее 1:1600 в ИФА, к ПГ-3 1:160 и более в РТГА (табл.2). Изготовленная вакцина имеет оптимальный состав компонентов, об.%:
Антигенный материал, концентрированный из штамма «Adeno III WBR1-ДЕП» аденовируса КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток почек эмбриона коровы (линия MDBK) с биологической активностью не менее 6,25 lg ТЦД<sub>50</sub>/мл и инактивированного формалином (конечная концентрация 0,2-0,3%)
10,0-11,0
Антигенный материал концентрированный из штамма «Adeno IV Weybridge СТ2-ДЕП» аденовируса КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток почки теленка Taurus-1 (T-1) с  биологической активностью не менее 6,5 lg ТЦД<sub>50</sub>/мл и инактивированного формалином (конечная концентрация 0,2-0,3%)
10,0-11,0
Антигенный материал концентрированный из штамма «ТКА-ВИЭВ-В2-ДЕП» герпесвируса типа I, репродуцированного в культуре клеток почек эмбриона коровы (линия MDBK) с биологической активностью не менее 7,5 lg ТЦД<sub>50</sub>/мл и инактивированного формалином (конечная концентрация 0,2-0,3%)
10,0-11,0
Антигенный материал концентрированный из штамма «SF-4 - ДЕП» парагриппа-3 КРС, репродуцированного в перевиваемой культуре клеток легких эмбриона коровы (ЛЭК) с биологической активностью не менее 6,5 lg ТЦД<sub>50</sub>/мл и гемагглютинирующей активностью не менее 6 logs (1:64), инактивированного формалином (конечная концентрация 0,2-0,3%)
10,0-11,0
Антигенный материал концентрированный из штамма «ВК-1-ДЕП» вируса ВД-БС КРС репродуцированного в культуре клеток почек эмбриона коровы (линия MDBK) с биологической активностью не менее 6,5 lg ТЦД<sub>50</sub>/мл, инактивированного формалином (конечная концентрация 0,2-0,3%)
10,0-11,0
Целевая добавка - адъювант
до 100
Содержание антигенных материалов вакцине в указанных выше пределах является их эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата от использования изобретения.
Вакцина предназначена для специфической профилактики респираторных и желудочно-кишечных заболеваний молодняка.
Вакцину применяют для профилактики аденовирусной, герпесвирусной инфекций, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота в угрожаемых и стационарно неблагополучных хозяйствах.
Вакцину вводят телятам и взрослому поголовью внутримышечно в области средней трети шеи, соблюдая правила асептики и антисептики, по следующей схеме:
3
- глубокостельных коров и нетелей вакцинируют дважды: первый раз за 40-50 дней до отела, второй раз - за 15-20 дней до отела в дозе по 2 см с целью профилактики респираторных и желудочно-кишечных заболеваний у новорожденных телят, создавая тем самым колостральный иммунитет.
3
- телят иммунизируют с 25-30-дневного возраста в дозе по 1 смдвукратно, с интервалом 21 день, с целью профилактики вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекций. Ревакцинацию проводят через 6 месяцев.
3
- телят старше 6 месяцев и быков-производителей вакцинируют двукратно, с интервалом 21 день, в дозе по 2 см. Через 6 месяцев ревакцинируют.
Вакцина вызывает формирование иммунного ответа у крупного рогатого скота к аденовирусу, герпесвирусу типа I, парагриппу-3 и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек. Иммунитет у привитых животных наступает через 21-30 дней после двукратного применения и сохраняется в течение 6 месяцев. Специфические антитела от вакцинированных коров передаются с молозивом новорожденным телятам. Вакцина безвредна, лечебными свойствами не обладает.
Пример 8. Проведены испытания по определению прививной дозы «Ассоциированной вакцины против аденовирусной, герпесвирусной инфекций, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной», изготовленной из концентрированных антигенных материалов штаммов «Adeno III WBR1-ДЕП» аденовируса крупного рогатого скота I подгруппы, «Adeno IV Weybridge СТ2-ДЕП» аденовируса КРС II подгруппы, «ТКА-ВИЭВ-В2-ДЕП» герпесвируса типа I, «SF-4-ДЕП» вируса парагриппа-3, «ВК-1-ДЕП» вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, как описано в примере 7.
Определение прививной дозы экспериментальной серии ассоциированной вакцины проводилось на крупном рогатом скоте в производственных условиях ООО «Золотая Нива» Кайбицкого района РТ.
3
3
3
3
3
3
3
3
Для этой цели, предварительным исследованием сывороток крови от животных, сформированы три группы животных разных возрастных групп по принципу аналога в количестве 15 голов, серонегативных или имеющих низкий уровень антител в отношении аденовируса, герпесвируса типа I, ПГ-3 и ВД-БС крупного рогатого скота. Каждую дозу препарата вводили 5 животным. Вакцину вводили внутримышечно в среднюю треть шеи двукратно с интервалом в 21 день по схеме: глубокостельным коровам и нетелям - по 1 см, 2 см и 3 см (первый раз - за 40-50 дней, второй раз - за 15-20 дней до отела); телятам 25-30 дневного возраста - 0,5 см, 1 см, 2 см; молодняку старше 6 месяцев - по 1 см, 2 см и 3 см.
С целью определения динамики нарастания титров специфических антител взятие крови у животных всех групп проводили до вакцинации, через 21 день после первой и второй иммунизации. Пробы сыворотки крови исследовали на наличие антител к ПГ-3 в РТГА, к аденовирусам, герпесвирусу типа I и вирусу ВД-БС в ИФА. Статистически обработанные результаты исследований представлены в таблицах 3, 4, 5.
Двукратное введение ассоциированной вакцины в среднем обеспечивало выработку антител в ИФА в пределах у глубокостельных коров и нетелей к аденовирусу I подгруппы 2400,00±565,69, аденовирусу II подгруппы 2880,00±357,77, к герпесвирусу 2560,00±438,18, к ВД-БС 2240,00±438,18 и к ПГ-3 в РТГА 512,00±87,64; у телят 25-30-дневного возраста к аденовирусу I подгруппы 2080,00±536,66, аденовирусу II подгруппы 2240,00±438,18, к герпесвирусу 1600,00±0,00, к ВД-БС 1440,00±178,89 и к ПГ-3 164,00±53,10; у молодняка старше 6-месячного возраста к аденовирусу I подгруппы 2560,00±438,18, аденовирусу II подгруппы 2560,00±438,18, к герпесвирусу 2560,00±438,18, к ВД-БС 2880,00±357,77 и к ПГ-3 384,00±71,55.
3
3
3
Таким образом, были определены оптимальные двукратные прививные дозы вакцины для крупного рогатого скота различных возрастных групп, которые составили: для глубокостельных коров и нетелей 2 см, телят 25-30-дневного возраста 1 см, молодняка старше 6-месячного возраста 2 см.
Пример 9. Проведены испытания антигенной активности и эффективности «Ассоциированной вакцины против аденовирусной, герпесвирусной инфекций, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной» на крупном рогатом скоте в производственных условиях.
Согласно данным ветеринарной службы хозяйства желудочно-кишечные и респираторные заболевания молодняка наблюдаются ежегодно и проявляются в основном в осенне-зимний и весенний период. В 2011 году (за период с января по октябрь) получен 281 теленок, из них заболело 75 телят, что составляет 26,6%, пало 20 телят - 7,1% от общего поголовья полученного молодняка.
3
3
3
Вакцинации подвергались телята с 25-30-дневного возраста, глубокостельные коровы и нетели, молодняк до 12 месяцев. Вакцину вводили внутримышечно в среднюю треть шеи: глубокостельным коровам и нетелям за 40-50 дней и 15-20 дней до отела по 2 см; молодняку до 6 месяцев по 1 см и молодняку старше 6 месяцев по 2 см двукратно с интервалом 21 день. Вакцинировано 800 голов крупного рогатого скота. В поствакцинальный период у привитых животных отклонений от физиологической нормы не наблюдалось.
Изучение динамики нарастания титров специфических антител в сыворотке крови КРС проводили до вакцинации и через 21 день после второй иммунизации (n=20). С целью определения напряженности колострального иммунитета исследовали сыворотки крови молодняка до 14-дневного возраста (n=20). Пробы сыворотки крови исследовали на наличие антител к ПГ-3 в РТГА, к аденовирусу, герпесвирусу типа I и вирусу ВД-БС в ИФА и реакции нейтрализации (РН) (табл.6).
Уровень специфических антител в сыворотке молозива отелившихся вакцинированных коров определяли к ПГ-3 в РТГА, к аденовирусу, герпесвирусу типа I и вирусу ВД-БС в ИФА, контрольной группой служили не вакцинированные животные (n=10). Статистически обработанные результаты исследований представлены в таблице 7.
Двукратное введение ассоциированной вакцины в среднем обеспечивало выработку антител в ИФА (РН) в пределах у глубокостельных коров и нетелей к аденовирусу I подгруппы 2500,00±234,20 (56,00±7,85), аденовирусу II подгруппы 2740,00±195,86 (60,00±7,71), к герпесвирусу 2340,00±234,95 (54,40±8,20), к ВД-БС 2220,00±219,75 (54,40±9,63) и к ПГ-3 в РТГА 552,00±55,19; у телят 25-30-дневного возраста к аденовирусу I подгруппы 2240,00±286,19 (57,26±8,46), аденовирусу II подгруппы 2120,00±266,46 (56,00±9,11), к герпесвирусу 1040,00±124,19 (49,60±7,23), к ВД-БС 1360,00±246,23 (51,20±5,53) и к ПГ-3 158,00±58,36; у молодняка до 14-дневного возраста к аденовирусу I подгруппы 1120,00±92,25 (38,40±3,01), аденовирусу II подгруппы 1100,00±98,18 (39,20±3,47), к герпесвирусу 1080,00±136,76 (36,00±3,55) к ВД-БС 1200,00±94,15 (44,00±3,93) и к ПГ-3 168,00±19,66. В 2012 году от вакцинированных коров и нетелей получено 268 телят, из них заболело 32 теленка, что составляет 11,9%, пало 12 телят - 4,4% от общего поголовья полученного молодняка.
Производственное испытание ассоциированной вакцины против аденовирусной, герпесвирусной инфекций, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной показало, что она безвредна, ареактогенна и вызывает формирование напряженного иммунного ответа у животных после двукратной вакцинации. Изучением эффективности ассоциированной вакцины в условиях хозяйства установлено, что она обеспечивает защиту новорожденных телят, молодняка периода доращивания от вирусных респираторных и желудочно-кишечных инфекций, а также стельных коров и телок от патологий репродуктивных органов.
Таблица 1
Результаты серологического мониторинга в отношении аденовируса, герпесвируса типа I, парагриппа-3 и ВД-БС крупного рогатого скота
№ п/п
Название хозяйств
Кол-во проб
ПГ-3
ИРТ
ВД-БС
Аденовирус
РТГА
ИФА
ИФА
ИФА
Республика Татарстан
1
ООО «Навруз» Агрызского р-на
47
39
9
9
36
2
ЗАО «Агро-Инвест» Аксубаевского р-на РТ
55
30
7
6
17
3
ООО «Ак Барс Агро» Арского р-на
36
16
21
13
17
4
ООО «Золотая Нива» Кайбицкого р-на
105
42
28
45
27
5
ООО «Золотая Нива» (отд. «Ульянково») Кайбицкого р-на
50
50
2
9
41
6
ООО «Бахетле-Агро» Нижнекамского р-на
33
26
33
32
18
7
ООО А/Ф «Южная» Нурлатского р-на
33
17
10
10
5
8
КФХ «Сулейманова» Нурлатского р-на
19
10
6
9
3
Нижегородская область РФ
9
СПК «Пошатовский» Краснооктябрьского р-на
11
11
9
7
5
10
ООО «Трехозерское» Краснооктябрьского р-на
10
2
10
8
8
11
ООО «Развитие» Краснооктябрьского р-на
25
25
20
23
23
Республика Мордовия
12
ООО АФ «Рязановка» Старо-Шайговского р-на
28
10
8
10
15
13
ЗАО «ВКМ-Агро» Рузаевского р-на
30
29
22
7
21
Республика Марий Эл
14
ЗАО «Марийское» Медведевского р-на
25
23
23
12
9
Количество исследованных проб, всего:
507
из них положительных:
кол-во
330
208
200
245
в %
65,0
41,0
39,4
48,3
Таблица 3
Уровень антител в сыворотке крови крупного рогатого скота до вакцинации ассоциированной вакциной против аденовирусной, герпесвирусной инфекций, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной, эмульсионной (M±m, n=5, p<0,05)
№ п/п
Возрастная группа
Доза, см<sup>3</sup>
Титр антител
AB-III (ИФА)
AB-IV (ИФА)
ИРТ (ИФА)
ПГ-3 (РТГА)
ВД-БС (ИФА)
1
глубокостельные коровы и нетели
1
120,00±54,77
40,00±44,72
160,00±44,72
52,00±13,42
160±44,72
2
280,00±54,77
80,00±54,77
200,00±70,71
36,00±4,47
160±44,72
3
160,00±44,72
80,00±54,77
160,00±44,72
40,00±12,25
120±36,51
2
телята 25-30-дневного возраста
0,5
160,00±83,67
0,00±0,00
40,00±44,72
16,00±8,37
0,00±0,00
1
120,00±9,44
0,00±0,00
40,00±44,72
20,00±17,32
80±54,77
2
40,00±44,72
40,00±44,72
0,00±0,00
12,00±8,94
0,00±0,00
3
молодняк старше 6 месяцев
1
160,00±44,72
120,00±89,44
40,00±44,72
4,00±4,47
80±54,77
2
160,00±44,72
80,00±54,77
160,00±109,54
4,00±4,47
80±54,77
3
80,00±54,77
120,00±54,7
120,00±54,77
12,00±8,94
120±54,77
Таблица 4
Уровень антител в сыворотке крови крупного рогатого скота после I вакцинации ассоциированной вакциной против аденовирусной, герпесвирусной инфекций, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной, эмульсионной (M±m, n=5, p<0,05)
№ п/п
Возрастная группа
Доза, см<sup>3</sup>
Титр антител
AB-III (ИФА)
AB-IV (ИФА)
ИРТ (ИФА)
ПГ-3 (РТГА)
ВД-БС(ИФА)
1
глубокостельные коровы и нетели
1
1200,00±282,84
880,00±328,63
1280,00±219,09
192,00±35,78
560,00±109,54
2
1840,00±657,27
1200,00±282,84
1760,00±438,18
208,00±53,67
800,00±0,00
3
2240,00±438,18
2080,00±536,66
2400,00±565,69
320,00±97,98
880,00±328,63
2
телята 25-30-дневного возраста
0,5
1280,00±219,09
880,00±219,09
480,00±89,44
24,00±4,47
400,00±0,00
1
1360,00±558,57
960,00±303,32
560,00±109,54
32,00±5,48
480,00±89,44
2
1520,00±536,66
1280,00±219,09
640,00±109,54
52,00±30,50
640,00±268,33
3
молодняк старше 6 месяцев
1
1920,00±357,77
1280,00±536,66
880,00±219,09
160,00±0,00
960,00±303,32
2
2080,00±536,66
1280,00±219,09
1120,00±219,09
256,00±43,82
1120,00±219,09
3
2880,00±357,77
1440,00±178,89
1920,00±606,63
320,00±97,98
1600,00±0,00
Таблица 5
Уровень антител в сыворотке крови крупного рогатого скота после II вакцинации ассоциированной вакциной против аденовирусной, герпесвирусной инфекции, парагриппа-3 и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной, эмульсионной (M±m, n=5, p<0,05)
№ п/п
Возрастная группа
Доза, см<sup>3</sup>
Титр антител
AB-III (ИФА)
AB-IV (ИФА)
ИРТ (ИФА)
ПГ-3 (РТГА)
ВД-БС(ИФА)
1
глубокостельные коровы и нетели
1
2240,00±657,27
2080,00±536,66
2400,00±565,69
320,00±97,98
1920,00±606,63
2
2400,00±565,69
2880,00±357,77
2560,00±438,18
512,00±87,64
2240,00±438,18
3
2560,00±438,18
3200,00±0,00
2560,00±438,18
768,00±141,11
2400,00±565,69
2
телята 25-30 -дневного возраста
0,5
1920,00±357,77
1920,00±357,77
1200,00±282,84
68,00±27,93
960,00±178,89
1
2080,00±536,66
2240,00±438,18
1600,00±0,00
164,00±53,10
1440,00±178,89
2
2560,00±438,18
2240,00±438,18
1920,00±357,77
192,00±60,66
1840,00±657,27
3
молодняк старше 6 месяцев
1
2240,00±438,18
1440,00±178,89
1360,00±558,57
320±0,00
1760,00±438,18
2
2560,00±438,18
2560,00±438,18
2560,00±438,18
384,00±71,55
2880,00±357,77
3
2880,00±357,77
2880,00±357,77
2560,00±438,18
448,00±87,64
2880,00±357,77
Таблица 7
Уровень антител в молозиве крупного рогатого скота после иммунизации ассоциированной вакциной против аденовирусной, герпесвирусной инфекций, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной (M±m, n=10, p<0,05)
Группа животных
Титр антител
AB-III (ИФА)
AB-IV (ИФА)
ИРТ (ИФА)
ПГ-3 (РТГА)
ВД-БС (ИФА)
вакцинированные коровы и нетели
2560,00±275,41
2880,00±490,10
2560,00±674,62
256,00±51,52
2560,00±674,62
контрольная
160,00±52,59
120,00±56,22
240,00±87,77
28,00±10,52
200,00±62,85
Источники информации
1. Алиева, Н.А. Аденовирусная инфекция телят / Н.А.Алиева, М.К.Ганиев, Дрейзин Р.С., Алиева Р.А., Г.А. Сарыев // Труды АзНИВИ. - 1967. - Т.XXI.
2. Аугустинавичус, Б.В. / в кн. Науч.-тех. информация. - Литов. науч.-иссл. вет. институт. - 1966. - С.3-5.
3. Ахметсафин, Р.Г. Усовершенствование средств диагностики и специфической профилактики смешанных респираторных инфекций телят / Р.Г.Ахметсафин // Автореф. дис. … канд. вет. наук. - Казань. - 2005. - 19 с.
4. Белоусова, Р.В. Инактивированная бивалентная вакцина против вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота и способ профилактики вирусной диареи и аденовирусной инфекции крупного рогатого скота / Р.В.Белоусова, Т.П.Лобова, И.В.Третьякова, Я.Вазир / Заявка на изобретение №2008103716/13 от 06.02.2008.
5. Белоусова, Р.В. Способ изготовления инактивированной концентрированной поливалентной вакцины против инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3, аденовирусной инфекции и вирусной диареи крупного рогатого скота / Р.В.Белоусова, И.В.Третьякова, Т.П.Лобова, Н.В.Тиганова, Л.К.Киш, Д.П.Кузнецов / Заявка на изобретение №2010152945/10 от 24.12.2010.
6. Вазир, Я. Испытания бивалентной вакцины против аденовирусной инфекции и вирусной диареи крупного рогатого скота на кроликах с использованием иммуномодуляторов / Я.Вазир, Р.В.Белоусова, Г.И.Устинова // Ветеринарная патология. - 2007. - №3(22). - С.199-202.
7. Гаффаров, Х.З. Инфекционные болезни рогатого скота хламидийной, микоплазменной и вирусной этиологии, разработка диагностических и лечебно-профилактических препаратов / Х.З. - Гаффаров // Автореф. дис. … док. вет. наук - Казань. - 1986. - 39 с.
8. Гуненков, В.В. Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота / В.В.Гуненков, В.Н.Сюрин, К.К.Вертинская / Малоизвестные вирусные инфекции крупного рогатого скота. - Москва, 1972. - 47 с.
9. Гуненков, В.В. Вирусные и хламидиозные респираторные и кишечные инфекции крупного рогатого скота. / В.В.Гуненков, Г.А.Халенев, В.Н.Сюрин // Животноводство и ветеринария. Проблемы ветеринарии, серия «Итоги науки и техники». - Москва, 1975. -  Т.8. - С.87-95.
10. Жидков, С.А. Штамм вируса Bovine viral Diarrhea-mucosal disease virus для изготовления вакцины против вирусной диареи крупного рогатого скота / С.А.Жидков, Н.Н.Крюков // Авт. свидетельство SU 1322673 А1 от 09.09.85.
11. Лобова, Т.П. Усовершенствование лабораторной диагностики аденовирусной инфекции крупного рогатого скота / Т.П.Лобова // Автореф. дис. … кан. биол. наук. - ФГОУ ВПО МГАВМиБ. - Москва. - 2006. - 19 с.
12. Матвеева, И.Н. Промышленные технологии изготовления компонентов моно- и комплексных диагностикумов инфекционных заболеваний животных / И.Н.Матвеева / Автореф. дис. … док. биол. наук. - Щелково. - 2008. - 53 с.
13. Сюрин, В.Н. Вакцина против аденовирусной инфекции крупного рогатого скота / В.Н.Сюрин, Р.В.Белоусова, Л.М.Коленкова, Т.И.Литвинов, Т.П.Лобова / Авт. свидетельство №4486434/30-13/138050 от 29.08.89.
14. Сюрин, Н.В. Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота / В.Н.Сюрин, А.Я.Самуйленко // Вирусные болезни животных. - Москва. - ВНИТИБП. - 1998. - С.795-801.
15. Юров, К.П. Вакцина «Тривак (ВИЭВ) для профилактики инфекционного ринотрахеита, парагриппа-3 и вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота» / К.П.Юров, А.С.Вечеркин, А.Ф.Шуляк, С.А.Жидков / Заявка на патент №96123539/13 от 11.12.1996.
16. Adamesteanu, L., Adamesteanu С. // Rev. zootehn. si med. vet. - 1973. - V.23. - №9. - Р.51-56.
17. Aldasy, P. Pneumoenteritis in Caives Caused by Adenoviruses / P.Aldasy, L.Csontos, A.Bartha // Acta Vet. Acad. Sci. Hung. - 1965. - 15. - P.175-176.
18. Animal Health Products / Vaccine against enzootic bronchopneumonia and infectious bovine rhinotracheitis (IBR) («Bovigrip plus»), inactivated, for cattle. Aqueous suspension for subcutaneous injection. / Hoechst Veterinar GmbH, 1992. - P.41-43.
19. Animal Health Products / Vaccine against enzootic bronchopneumonia, inactivated, for cattle («Bovigrip») Aqueous suspension for subcutaneous injection. / Hoechst Veterinar GmbH. - 1992. - P.37-39.
20. Bartha, A. Immunization experiments on calves with type 4 bovine adenovirus / A. Bartha // Acta vet. Acad. Sci. Hung. - 1967. - V.-17. - P.209-216.
21. Bartha, A. Proposal for sub grouping of bovine adenoviruses / A. Bartha // Acta vet. Acad. Sci. Hung. - 1969. - V.19. - №3. - P.313-321.
22. Burki, F. Experimental Adenovirus Vaccines in Cattle / F. Burki // J. Amer. Vet. Med. Assoc. - 1973. - V.163. - №7. - P.897-900.
23. Darbyshire, J.H. Bovine Adenoviruses / J.H.Darby shire // J. Amer. Vet. Med. Assoc. - 1968. - V.152. - P.786-792.
24. Edwards, G.S. Wogan G.N. // Biochim. biophys. acta. - 1970. - V.224. - 597 p.
25. Gillespie, J. // J. Amer. Vet. Med. Assoc. - 1973. - 163. - №7. - Р.901.
26. Gole, J. // J. Amer. Vet. Med. Assoc. - 1973. - №7. - Р.836-839.
27. Haralambiev, H. Hyperimmunserum Against Myxovims Parainfluenza-3 and Bovine Adenovirus in Prophylaxis of Respiratory Disease in Calves / H.Haralambiev, M.Draganov, P.Zwetkov // Arch. Exptl. Vet. Med. - 1972. - V.26. - P.273-276.
28. Inaba, Y. Bovine adenovirus. II A.Serotype. Fukuroi, Recoverend from Japanene Cattle / Y.Inaba, Y.Tanaka, Y.Sato, K.Ito, H.Ito, M.Matumoto // Jap. J. Microbiol. - 1968. - 12. - P.219-229.
29. Klein, H. Structure function relationships of the adenovirus DNA-binding protein / H.Klein, W.Maitzman, A.J.Levine // J. Biol. Chem. - 1979. - V.254. - P.11051-11060.
30. Mocsari, E., Saghy E., Kiss J., Fulessy E., Ovary. // Acta Vet. Acad. Sci. Hung. - 1974. - 24. - №1-2. - P.39-43.
31. Mohanty, S.В. Comparative studies of Bovine Adenovirus // Amer. J. Vet. Res. - 1971. - V.32. - №12. - P.1899-1905.
32. Morzaria, S.P. A field trial with a multicomponent inactivated respiratory viral vaccine / S.P.Morzaria, M.S.Richards, J.W.Harkness, B.A.Maund // The Veterinary Record. - 1979. - V.11. - №3 - P.410-414.
33. Phillipp, J.I.H. The Isolation of Bovine Adenovirus Serotypes 4 and 7 in Britain / J.I.H.Phillipp, J.H.Sands // Res. Vet. Sci. - 1972. - 13. - P.386-387.
34. Pons, W.A., Cucullu A.F., Franz A.O., Lee Louise S., Goldblatt Leo A. // J. Assoc. Offic. Anal. Chem. - 1973. - 56. - №4. - P.803-807.
35. Rondhuis, P.R. Anew Bovine Adenovirus / P.R.Rondhuis // Arch. ges. Virusforsch. - 1968. - 25. - P.235-236.
36. Rondhuis, P.R. Bovine Adenoviruses. A Comparative Serological and Experimental Study / P.R.Rondhuis // Drukkerij-Uitgeverij G. van Dijk N.V. Breukelen. - 1970. - P.218.
37. Sawhney, D.S. Vadehre D.V., Baker R.C. // Poultry Sci. - 1973. - 52. - №2. - P.465-473.
38. Schipper, E. Virus bedingte Respirations-Krankheiten in Kalber und Ridermastbetreiben / E.Schipper, J.Nicolet, H.Konig, F.Steck // Schweiz. Arch. Tierheilkunde. - 1972. - H. 114. - S.334-361.
39. Tribe, G.W. Combined bovine parainfluenza and adenovirus vaccine / G.W.Tribe, J.B.Kerry. // Vet. Rec. - 1969. - V.84. - P.299-303.