АНТИТЕЛА К PD-1(CD279)
ANTIBODIES TO PD-1(CD279)

1. Перекрестная ссылка на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет в соответствии с 119(e) раздела 35 Свода федеральных законов США на основании предварительной заявки на патент США № 62/394314, поданной 14 сентября 2016 года, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей полноте.
2. Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был предоставлен в электронном виде в формате ASCII и настоящим включен посредством ссылки во всей полноте. Указанная ASCII-копия, созданная 10 августа 2017 года, называется 381493-327WO_SL.txt и имеет размер 33195 байт.
3. Область техники
Настоящая заявка относится, помимо всего прочего, к новым антителам к PD-1, композициям, содержащим данные новые антитела, нуклеиновым кислотам, кодирующим данные антитела, а также способам их получения и применения.
4. Уровень техники
Виды терапии рака предусматривают широкий диапазон терапевтических подходов, включая хирургическое вмешательство, облучение и химиотерапию. Несмотря на то, что различные подходы обеспечивают широкий выбор способов лечения рака, доступных практикующему врачу, существующие терапевтические средства характеризуются целым рядом недостатков, таких как отсутствие избирательности при нацеливании на раковые клетки относительно нормальных здоровых клеток, а также развитие устойчивости рака к лечению.
Недавно разработанные подходы, основанные на целенаправленно воздействующих терапевтических средствах, которые преимущественно нарушают клеточные процессы в раковых клетках, а не в нормальных клетках, привели к схемам химиотерапии с меньшим количеством побочных эффектов по сравнению с нецеленаправленно воздействующими видами терапии, такими как лучевая терапия.
Иммунотерапия рака превратилась в перспективный терапевтический подход, дополняющий существующие стандарты лечения. См., например, Miller, et al. Cancer Cell, 27, 439-449 (2015). Такие иммунотерапевтические подходы включают разработку антител, применяемых для модулирования иммунной системы для уничтожения раковых клеток.
Например, взаимодействие PD-1, рецептора клеточной поверхности I типа, с любым из его двух лигандов, PD-L1 или PD-L2, приводит к доминирующему отрицательному сигналу для контрольных точек, который ограничивает последующую активацию клеток, запускаемую антигенным рецептором. Лиганды для PD-1 дифференциально экспрессируются на различных тканях и типах клеток, включая антигенпрезентирующие клетки иммунной системы, и их экспрессия повышена на многих типах опухолевых клеток. Повышение экспрессии PD-L1 в пределах опухолевого микроокружения представляет собой предположительный механизм того, как опухоли подрывают защитные противоопухолевые иммунные ответы хозяина. Антитела, направленные на PD-1, которые блокируют взаимодействие рецептора с любым из его лигандов, приводят к ингибированию передачи отрицательного сигнала. Было продемонстрировано, что in vitro ингибирование опосредованного PD-1 сигнала для контрольных точек приводит к продолжительной антиген-специфической активации T-клеток. Было показано, что in vivo блокировка PD-1 усиливает противоопухолевые иммунные ответы как на мышиных моделях сингенной опухоли, так и в клинических испытаниях на людях.
Противоопухолевые иммунные ответы у пациентов с солидными опухолями были усилены за счет лечения, направленного против PD-1. Существуют два одобренных и продаваемых на рынке антагонистических моноклональных антитела к PD-1: ниволумаб (OPDIVO) и пембролизумаб (KEYTRUDA), которые были одобрены в США и Европейском Союзе для лечения таких заболеваний, как неоперабельная или метастатическая меланома и метастатический немелкоклеточный рак легкого. Лечение пациентов с помощью данных средств приводило к противоопухолевым ответам, измеряемым по увеличению и выживаемости без прогрессирования и/или общей выживаемости.
Последняя неудача OPDIVO в замедлении прогрессирования запущенного рака легкого у группы пациентов, ранее не получавших лечение, в клиническом испытании, сравнивающем OPDIVO с традиционной химиотерапией, подчеркивает необходимость в альтернативных подходах и дополнительных средствах лечения рака, дополняющих существующие терапевтические стандарты лечения.
5. Краткое описание изобретения
H
L
В настоящем изобретении представлены антитела к PD-1 и их связывающие фрагменты, которые специфически связываются с PD-1. Аминокислотные последовательности иллюстративных CDR, а также аминокислотные последовательности областей V и V тяжелой и легкой цепей иллюстративных антител к PD-1 представлены в подробном описании ниже. Антитела, представленные в данном документе, препятствуют взаимодействию рецептора PD-1 с любым из его лигандов (PD-L1, SEQ ID NO:3; PD-L2, SEQ ID NO:4), что приводит к ингибированию передачи отрицательного сигнала и повышенной регуляции адаптивного иммунного ответа.
Антитела к PD-1 могут содержать модификации и/или мутации, которые изменяют свойства антител, как, например, увеличивают период полужизни, увеличивают или уменьшают ADCC и т. д., как известно из уровня техники.
В данном документе также представлены нуклеиновые кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела к PD-1 по настоящему изобретению, а также векторы, содержащие нуклеиновые кислоты. Помимо этого, в данном документе представлены прокариотические и эукариотические клетки-хозяева, трансформированные с помощью вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, кодирующую раскрытое антитело к PD-1, а также эукариотические клетки-хозяева (например, клетки, полученные от млекопитающих), сконструированные для экспрессии нуклеотидных последовательностей. Также представлены и дополнительно обсуждаются в подробном описании ниже способы получения антител путем культивирования клеток-хозяев и выделения антител.
В другом аспекте настоящего изобретения представлены композиции, содержащие антитела к PD-1, описанные в данном документе. Композиции обычно содержат одно или несколько антител к PD-1, описываемых в данном документе, и/или их соли, и один или несколько наполнителей, носителей или разбавителей.
В настоящем изобретении представлены способы лечения субъектов, таких как субъекты-люди, с диагностированной солидной опухолью или злокачественным заболеванием крови с помощью антитела к PD-1. Способ обычно предусматривает введение субъекту определенного количества антитела к PD-1, описанного в данном документе, эффективного для обеспечения терапевтического эффекта. У субъекта может быть диагностировано любое из целого ряда солидных опухолей или злокачественных заболеваний крови, которые могут быть впервые диагностированными, рецидивирующими или рецидивирующими и рефрактерными. Антитело к PD-1, как правило, вводят в виде внутривенной инфузии два раза в неделю, один раз в неделю, один раз каждые две недели, один раз каждые три недели, один раз каждые четыре недели, один раз каждые пять недель, один раз каждые шесть недель, один раз каждые семь недель или один раз каждые восемь недель.
Антитела к PD-1 можно вводить в виде отдельных терапевтических средств (монотерапия) или в дополнение или совместно с другими терапевтическими средствами, которые, как правило, но необязательно, применяют для лечения солидной опухоли или злокачественного заболевания крови. Терапевтические средства, как правило, будут применяться в дозе, посредством пути введения и при частоте введения, которые одобрены для них, но их можно применять при более низких дозах.
Антитела к PD-1 можно вводить посредством различных путей или способов введения, включая без ограничения внутривенную инфузию и/или инъекцию, внутриопухолевую инъекцию и подкожную инъекцию. Вводимое количество будет зависеть от пути введения, схем дозирования, типа рака, подлежащего лечению, стадии рака, подлежащего лечению, и прочих параметров, таких как возраст и масса пациента, как хорошо известно из уровня техники. Конкретные иллюстративные схемы дозирования, которые, как ожидается, обеспечивают терапевтический эффект, представлены в подробном описании.
6. Краткое описание фигур
На ФИГ. 1A-1B показаны аминокислотные последовательности PD-1 человека (SEQ ID NO:1), PD-1 мыши (SEQ ID NO:2), PD-L1 человека (SEQ ID NO:3) и PD-L2 человека (SEQ ID NO:4). На ФИГ. 1A изображены последовательности PD-1 человека и мыши; на ФИГ. 1B изображены последовательности PD-L1 и PD-L2 человека.
H
L
На ФИГ. 2 представлены аминокислотные последовательности областей V и V в иллюстративных антителах к PD-1 по настоящему изобретению.
На ФИГ. 3A-3C показаны эффекты окислительных условий и условий с переменной температурой на иллюстративное гуманизированное антитело Hu12A11.2b1 и его точковые мутации в остатке 99 согласно Kabat в CDR-H3. На ФИГ. 3A изображено связывание Hu12A11.2b1, хранящегося при -80, 5, 25 или 40°C в течение 30 дней или подвергнутого воздействию окислительных условий (1% пероксида водорода, "1% HP"; или 1% трет-бутилгидропероксида, "1% TBHP") с PD-1 на клетках Jurkat; на ФИГ. 3B изображено связывание антител к PD-1, Hu12A11.2b1, Hu12A11.2b2, Hu12A11.2b3 и Hu12A11.2b4; на ФИГ. 3C изображено связывание Hu12A11.2b4 с PD-1 на клетках Jurkat после инкубации при -80, 5, 25 или 40°C в течение 30 дней.
На ФИГ. 4A-4B показана биологическая активность ниволумаба и Hu12A11.2b4 в анализах ответа смешанных лимфоцитов (MLR) и ответа на стимуляцию антигеном столбнячного анатоксина. На ФИГ. 4A показано повышение уровней IL-2 или интерферона-гамма (IFN-γ) в культурах смешанных лейкоцитов после обработки с помощью 10 мкг/мл ниволумаба, Hu12A11.2b4 или изотипического контроля. На ФИГ. 4B показан ответ в виде повышения уровня IFN-γ, зависимый от дозы ниволумаба, Hu12A11.2b4 или изотипического контроля, в анализе ответа на столбнячный анатоксин.
7. Подробное описание
Настоящее изобретение относится к антителам и фрагментам, которые специфически связывают PD-1, композициям, содержащим данные антитела, полинуклеотидам, кодирующим антитела к PD-1, клеткам-хозяевам, способным вырабатывать данные антитела, способам и композициям, применимым для получения данных антител и связывающих фрагментов, и к различным способам применения вышеуказанного.
H
H
L
L.
Как будет понятно специалистам в данной области, антитела являются "модульными" по своей природе. На протяжении настоящего изобретения будут описаны различные конкретные варианты осуществления различных "модулей", составляющих антитела. В качестве конкретных неограничивающих примеров описаны различные конкретные варианты осуществления CDR V, цепей V, CDR V и цепей V Предусмотрено, что все конкретные варианты осуществления могут быть объединены друг с другом, как если бы каждая конкретная комбинация была явно описана отдельно.
7.1. Сокращения
Описываемые в данном документе антитела, связывающие фрагменты и полинуклеотиды во многих вариантах осуществления описаны с помощью их соответствующих полипептидных или полинуклеотидных последовательностей. Если не указано иное, полипептидные последовательности представлены в ориентации N→C; полинуклеотидные последовательности - в ориентации 5'→3'. Для полипептидных последовательностей можно применять традиционные трех- или однобуквенные сокращения кодируемых генетическим кодом аминокислот, которые указаны в таблице 1 ниже.
ТАБЛИЦА 1Сокращения кодируемых аминокислот
Аминокислота
Трехбуквенное сокращение
Однобуквенное сокращение
Аланин
Ala
A
Аргинин
Arg
R
Аспарагин
Asn
N
Аспарагиновая кислота
Asp
D
Цистеин
Cys
C
Глутаминовая кислота
Glu
E
Глутамин
Gln
Q
Глицин
Gly
G
Гистидин
His
H
Изолейцин
Ile
I
Лейцин
Leu
L
Лизин
Lys
K
Метионин
Met
M
Фенилаланин
Phe
F
Пролин
Pro
P
Серин
Ser
S
Треонин
Thr
T
Триптофан
Trp
W
Тирозин
Tyr
Y
Валин
Val
V
Определенные последовательности определяются структурными формулами, указывающими аминокислотные остатки, относящиеся к определенным классам (например, алифатические, гидрофобные и т. д.). Различные классы, к которым относятся кодируемые генетическим кодом аминокислоты, используемые в данном документе, указаны в таблице 2 ниже. Некоторые аминокислоты могут относиться более чем к одному классу. Цистеин, который содержит сульфгидрильную группу, и пролин, который является конформационно ограниченным, не принадлежат ни к одному из классов.
ТАБЛИЦА 2Классы кодируемых аминокислот
Класс
Аминокислоты
Алифатические
A, I, L,V
Ароматические
F, Y, W
Неполярные
M, A, I, L, V
Полярные
N, Q, S, T
Основные
H, K, R
Кислые
D, E
Малые
A, G
Сокращения, используемые для различных иллюстративных антител, раскрытых в данном документе, приведены в таблице 3 ниже.
ТАБЛИЦА 3Сокращения антител
Клон/Название
Сокращение
Последовательность V<sub>H</sub> (ФИГ. 2)
Последовательность V<sub>L</sub> (ФИГ. 2)
12A11 мыши
Mu12A11
V<sub>H</sub> Mu12A11
SEQ ID NO:31
V<sub>L</sub> Mu12A11
SEQ ID NO:41
Гуманизированное 12A11.1b
Hu12A11.1b
V<sub>H</sub> Hu12A11.1b
SEQ ID NO:32
V<sub>L</sub> Hu12A11.1a
SEQ ID NO:42
Гуманизированное 12A11.2b с CDR мыши
Hu12A11.2b1
V<sub>H</sub> Hu12A11.2b
SEQ ID NO:33
V<sub>L</sub> Hu12A11.1a
SEQ ID NO:42
Гуманизированное 12A11.2b с M99I в CDR-H3
Hu12A11.2b2
M99I-вариант V<sub>H</sub> Hu12A11.2b
SEQ ID NO:34
V<sub>L</sub> Hu12A11.1a
SEQ ID NO:42
Гуманизированное 12A11.2b с M99V в CDR-H3
Hu12A11.2b3
M99V-вариант V<sub>H</sub> Hu12A11.2b
SEQ ID NO:35
V<sub>L</sub> Hu12A11.1a
SEQ ID NO:42
Гуманизированное 12A11.2b с M99L в CDR-H3
Hu12A11.2b4
M99L-вариант V<sub>H</sub> Hu12A11.2b
SEQ ID NO:36
V<sub>L</sub> Hu12A11.1a
SEQ ID NO:42
7.2. Определения
Если в данном документе не определено иначе, научные и технические термины, используемые в связи с настоящим изобретением, должны иметь значения, которые обычно понятны специалистами в данной области.
7.3. Антитела к PD-1 и связывающие фрагменты
В одном аспекте настоящее изобретение касается антител и/или их связывающих фрагментов, которые специфически связывают рецептор белка 1 запрограммированной клеточной гибели (PD-1) (также известный как PDCD1, CD279, PD1, SLEB2 или SLE1).
Используемый в данном документе термин "антитело" (Ab) относится к молекуле иммуноглобулина, которая специфически связывает конкретный антиген, в данном случае PD-1. В некоторых вариантах осуществления антитела к PD-1 по настоящему изобретению связываются с PD-1 человека и тем самым оказывают модулирующее воздействие на иммунную систему. Обусловленный этим ответ иммунной системы является цитотоксическим для опухолевых клеток. Антитела к PD-1 по настоящему изобретению содержат определяющие комплементарность участки (CDR), также известные как гипервариабельные участки, в вариабельных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более высококонсервативные части вариабельных доменов называются каркасными участками (FR). Как известно из уровня техники, аминокислотное положение/граница, определяющие гипервариабельный участок антитела, могут варьировать в зависимости от контекста, и из уровня техники известны различные определения. Некоторые положения в пределах вариабельного домена могут рассматриваться как гибридные гипервариабельные положения в том смысле, что эти положения можно считать находящимися в пределах гипервариабельного участка по одному набору критериев, и в то же время их можно считать находящимися за пределами гипервариабельного участка по другому набору критериев. Одно или несколько из этих положений также могут находиться в расширенных гипервариабельных участках. В настоящем изобретении представлены антитела, содержащие модификации в таких гибридных гипервариабельных положениях. Каждый из вариабельных доменов нативных тяжелой и легкой цепей содержит четыре участка FR, преимущественно принимающих конфигурацию β-складчатой структуры, соединенных тремя CDR, которые образуют петли, соединяющие β-складчатые структуры и в некоторых случаях образующие их часть. CDR в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга с помощью FR-участков и вместе с CDR из другой цепи участвуют в образовании мишень-связывающего центра антител. См. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health, Bethesda, Md. 1987). Используемая в данном документе нумерация аминокислотных остатков иммуноглобулина выполняется согласно системе нумерации аминокислотных остатков иммуноглобулина по Kabat et al., если не указано иное.
1
2
1
2
3
4
1
2
4
1
Антитела по настоящему изобретению могут быть поликлональными, моноклональными, сконструированными с помощью генной инженерии и/или иным образом модифицированными по своей природе, включая без ограничения химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, одноцепочечные антитела и т. д. В различных вариантах осуществления антитела содержат всю константную область антитела или ее часть. В некоторых вариантах осуществления константная область представляет собой изотип, выбранный из: IgA (например, IgA или IgA), IgD, IgE, IgG (например, IgG, IgG, IgG или IgG) и IgM. В конкретных вариантах осуществления антитела, описанные в данном документе, содержат IgG. В других вариантах осуществления антитела к PD-1 содержат IgG. В еще одних вариантах осуществления антитела к PD-1 содержат IgG. Используемая в данном документе "константная область" антитела предусматривает природную константную область, аллотипы или природные варианты, такие как D356E и L358M или A431G в IgG человека. См., например, Jefferis and Lefranc, MAbs, 1(4): 332-338 (Jul-Aug 2009).
1
2
3
4
Легкая константная область антитела к PD-1 может представлять собой каппа (κ) легкую область или лямбда (λ) область. λ-Легкая область может принадлежать к любому из известных подтипов, например λ, λ, λ или λ. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 содержит каппа (κ) легкую область.
Используемый в данном документе термин "моноклональное антитело" не ограничивается антителами, полученными посредством гибридомной технологии. Моноклональное антитело получают из одного клона, включая любой эукариотический, прокариотический или фаговый клон, с помощью любых доступных или известных из уровня техники способов. Моноклональные антитела, применимые в случае настоящего изобретения, можно получать с применением огромного множества методик, известных из уровня техники, включая применение гибридомной технологии, рекомбинантной технологии и технологии фагового дисплея или их комбинации. Во многих путях применения по настоящему изобретению, включая in vivo применение антител к PD-1 у людей, подходящим образом могут использоваться химерные, гуманизированные или человеческие антитела.
Используемый в данном документе термин "химерное" антитело относится к антителу, имеющему вариабельные последовательности, полученные из отличного от человеческого иммуноглобулина, такого как крысиное или мышиное антитело, и константные области человеческого иммуноглобулина, как правило, выбранные из матрицы человеческого иммуноглобулина. Способы получения химерных антител известны из уровня техники. См., например, Morrison, 1985, Science 229(4719):1202-7; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214-221; Gillies et al., 1985, J. Immunol. Methods 125:191-202; патенты США №№ 5807715; 4816567 и 4816397.
"Гуманизированные" формы отличных от человеческих (например, мышиных) антител представляют собой химерные иммуноглобулины, которые содержат минимальные последовательности, полученные из отличного от человеческого иммуноглобулина. В целом, большинство гуманизированных антител будет содержать по меньшей мере один и, как правило, два вариабельных домена, в которых все или практически все участки CDR соответствуют таковым из отличного от человеческого иммуноглобулина, а все или практически все участки FR имеют последовательность человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело также может содержать по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, таковую с консенсусной последовательностью человеческого иммуноглобулина. Способы гуманизации антитела известны из уровня техники. См, например, Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-7; патенты США №№ 5530101, 5585089, 5693761, 5693762 и 6180370 от Queen et al.; EP239400, публикацию согласно PCT WO 91/09967; патент США № 5225539; EP592106, EP519596, Padlan, 1991, Mol. Immunol., 28:489-498; Studnicka et al., 1994, Prot. Eng. 7:805-814; Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973; и патент США № 5565332.
"Человеческие антитела" предусматривают антитела, имеющие аминокислотную последовательность человеческого иммуноглобулина, и они включают антитела, выделенные из библиотек человеческих иммуноглобулинов или из животных, которые являются трансгенными по одному или нескольким человеческим иммуноглобулинам и которые не экспрессируют эндогенные иммуноглобулины. Человеческие антитела можно получать различными способами, известными из уровня техники, включая способы фагового дисплея с применением библиотек антител, полученных из последовательностей человеческих иммуноглобулинов. См. патенты США №№ 4444887 и 4716111; и публикации согласно PCT WO 98/46645; WO 98/50433; WO 98/24893; WO 98/16654; WO 96/34096; WO 96/33735 и WO 91/10741. Человеческие антитела также можно получить с применением трансгенных мышей, которые не способны экспрессировать функциональные эндогенные иммуноглобулины, но которые могут экспрессировать гены человеческого иммуноглобулина. См., например, публикации согласно PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; патенты США №№ 5413923; 5625126; 5633425; 5569825; 5661016; 5545806; 5814318; 5885793; 5916771 и 5939598. Помимо этого, можно привлечь компании, такие как LakePharma, Inc. (Бельмонт, Калифорния) или Creative BioLabs (Ширли, Нью-Йорк), для получения человеческих антител, направленных на выбранный антиген, с применением технологии, подобной описанной выше. Полностью человеческие антитела, которые распознают выбранный эпитоп, можно создать с применением методики, обозначаемой "управляемый отбор". В данном подходе выбранное не относящееся к человеческому моноклональное антитело, например мышиное антитело, применяют для управления отбором целиком человеческого антитела, распознающего тот же эпитоп (см., Jespers et al., 1988, Biotechnology 12:899-903).
Антитела к PD-1 по настоящему изобретению предусматривают полноразмерные (интактные) молекулы антитела.
2
В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении также предусмотрены связывающие фрагменты антитела к PD-1, которые способны к специфическому связыванию PD-1. Примеры связывающих фрагментов антитела предусматривают в качестве примера, но без ограничения, Fab, Fab', F(ab'), Fv-фрагменты, одноцепочечные Fv-фрагменты и однодоменные фрагменты.
2
2
Fab-фрагмент содержит константный домен легкой цепи и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков на карбокси-конце домена СН1 тяжелой цепи, включая один или несколько цистеиновых остатков из шарнирной области антитела. F(ab')- фрагменты получают путем расщепления дисульфидной связи в цистеиновых остатках шарнирной области продукта пепсинового расщепления F(ab'). Рядовым специалистам в данной области известны дополнительные схемы химического связывания фрагментов антител. Fab- и F(ab')-фрагменты, не содержащие Fc-фрагмент интактного антитела, быстрее выводятся из кровотока животных и могут характеризоваться меньшим неспецифическим связыванием в ткани, чем интактное антитело (см., например, Wahl et al., 1983, J. Nucl. Med. 24:316).
H
L
H
L
"Fv"-фрагмент представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный центр распознавания и связывания мишени. Эту область составляет димер из одного вариабельного домена тяжелой цепи и одного вариабельного домена легкой цепи в плотной нековалентной связи (димер V-V). Они находятся в такой конфигурации, что три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием мишень-связывающего центра на поверхности димера V-V. Зачастую шесть CDR обеспечивают мишень-связывающую специфичность антитела. Однако в некоторых случаях даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфические в отношении мишени) может обладать способностью распознавать и связывать мишень, хотя и с более низкой аффинностью, чем полный центр связывания.
H
L
H
L
"Одноцепочечный Fv" или "scFv" связывающие фрагменты антитела содержат домены V и V антитела, причем эти домены присутствуют в одной полипептидной цепи. Обычно полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами V и V, который позволяет scFv образовать структуру, необходимую для связывания мишени.
H
L
"Однодоменные антитела" состоят из одного домена V или V, которые проявляют достаточную степень аффинности в отношении PD-1. В конкретном варианте осуществления однодоменное антитело представляет собой камелизированное антитело (см., например, Riechmann, 1999, Journal of Immunological Methods 231:25-38).
Антитела к PD-1 по настоящему изобретению предусматривают дериватизированные антитела. К примеру, но без ограничения, дериватизированные антитела, как правило, модифицированы посредством гликозилирования, ацетилирования, пегилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации с помощью известных защитных/блокирующих групп, протеолитического расщепления и образования связи с клеточным лигандом или другим белком. Любую из многочисленных химических модификаций можно проводить с помощью известных методик, включая без ограничения специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т. д. Помимо этого, производное может содержать одну или несколько неприродных аминокислот, например, с применением технологии Ambrx (см., например, Wolfson, 2006, Chem. Biol. 13(10):1011-2).
Антитела к PD-1 или связывающие фрагменты могут представлять собой антитела или фрагменты, последовательности которых были модифицированы для изменения по меньшей мере одной биологической эффекторной функции, опосредуемой константной областью. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 может быть модифицировано для ослабления по меньшей мере одной биологической эффекторной функции, опосредуемой константной областью, по сравнению с немодифицированным антителом, например, ослабление связывания с одним или несколькими Fc-рецепторами (FcγR), такими как FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA и/или FcγRIIIB. Связывание с FcγR может быть ослаблено за счет мутирования сегмента константной области иммуноглобулина антитела в определенных участках, необходимых для взаимодействий с FcγR (см., например, Canfield and Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173:1483-1491; и Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662). При ослаблении способности антитела к связыванию FcγR также могут ослабляться другие эффекторные функции, которые основаны на взаимодействиях с FcγR, таких как опсонизация, фагоцитоз и антигензависимая клеточная цитотоксичность ("ADCC").
Антитело к PD-1 или связывающий фрагмент, описанные в данном документе предусматривают антитела, которые были модифицированы для приобретения или улучшения по меньшей мере одной биологической эффекторной функции, опосредуемой константной областью, по сравнению с немодифицированным антителом, например, улучшения взаимодействий с FcγR (см., например, заявку на патент США № 2006/0134709). Например, антитело к PD-1 по настоящему изобретению может иметь константную область, которая связывает FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIA и/или FcγRIIIB с большей аффинностью, чем соответствующая константная область дикого типа.
2
Таким образом, антитела по настоящему изобретению могут характеризоваться изменениями в биологической активности, которые приводят к увеличению или уменьшению опсонизации, фагоцитоза или ADCC. Такие изменения известны из уровня техники. Например, модификации антител, которые ослабляют активность ADCC, описаны в патенте США № 5834597. Иллюстративный вариант, снижающий ADCC, соответствует "мутанту 3" (также известному как "M3", показанный на ФИГ. 4 патента США № 5834597), в котором остатки 234 и 237 (с использованием нумерации EU) замещены аланиновыми остатками. Разновидность мутанта 3 (также известного как "M3") может быть использована в целом ряде изотипов антител, например IgG.
Дополнительные замены, которые могут модифицировать связывание FcγR и/или ADCC-эффекторную функцию антитела к PD-1, включают замену K322A или двойную замену L234A и L235A в области Fc. См., например, Hezareh, et al. J. Virol., 75 (24): 12161-12168 (2001).
В некоторых вариантах осуществления антитела к PD-1 по настоящему изобретению характеризуются низкими уровнями фукозы или ее отсутствием. Отсутствие фукозы в антителах коррелировало с повышенной активностью ADCC, особенно при низких дозах антитела. См. Shields et al., 2002, J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J. Biol. Chem. 278:3466-73. Способы получения антител, не содержащих фукозу, предусматривают выращивание клеток YB2/0 миеломы крысы (ATCC CRL 1662). Клетки YB2/0 характеризуются низким уровнем экспрессии мРНК FUT8, которая кодирует α-1,6-фукозилтрансферазу, фермент, необходимый для фукозилирования полипептидов.
1
1
1
Антитела к PD-1 по настоящему изобретению могут содержать модифицированные (или вариантные) домены CH2 или целые домены Fc, которые включают аминокислотные замены, увеличивающие связывание с FcγRIIB и/или ослабляющие связывание с FcγRIIIA по сравнению со связыванием соответствующей области CH2 или Fc дикого типа. Вариантные домены CH2 или вариантные домены Fc были описаны в заявке на патент США № 2014/0377253. Вариантный домен CH2 или вариантный домен Fc, как правило, включают одну или несколько замен в положении 263, положении 266, положении 273 и положении 305, при этом нумерация остатков в домене Fc приведена согласно EU-индексу по Kabat. В некоторых вариантах осуществления антитела к PD-1 содержат одну или несколько замен относительно домена CH2 дикого типа, которые выбраны из V263L, V266L, V273C, V273E, V273F, V273L, V273M, V273S, V273Y, V305K и V305W. В конкретных вариантах осуществления одна или несколько замен в домене CH2 относительно домена CH2 IgG человека выбраны из V263L, V273E, V273F, V273M, V273S и V273Y. Например, одна или несколько замен в домене CH2 IgG может представлять собой V273E. В другом конкретном варианте осуществления антитело к PD-1 по настоящему изобретению содержит вариантную шарнирную область IgG, содержащую аминокислотную замену V263L.
1
Другие примеры вариантных доменов CH2 или вариантных доменов Fc, которые могут обеспечивать усиленное связывание с FcγRIIB и/или ослабленное связывание с FcγRIIIA по сравнению со связыванием соответствующей области CH2 или Fc дикого типа, включают примеры из Vonderheide et al. Clin. Cancer Res., 19 (5), 1035-1043 (2013), такие как S267E или S267E/L328F в IgG человека.
4
Антитела к PD-1 или связывающие фрагменты, которые содержат константную область IgG человека, могут содержать мутацию S228P, которая, как сообщалось, предотвращает обмен плечами в Fab. См., например, Silva, JP et al. Journal of Biological Chemistry, 290(9), 5462-5469 (2015).
В некоторых вариантах осуществления антитела к PD-1 или связывающие фрагменты включают модификации, которые увеличивают или уменьшают их аффинность связывания с фетальным Fc-рецептором FcRn, например, за счет мутирования сегмента константной области иммуноглобулина в определенных участках, вовлеченных во взаимодействия FcRn (см., например, WO 2005/123780). В конкретных вариантах осуществления антитело к PD-1 класса IgG мутировано таким образом, что по меньшей мере один из аминокислотных остатков 250, 314 и 428 константной области тяжелой цепи замещен сам по себе или в любых их комбинациях, как, например, в положениях 250 и 428, или в положениях 250 и 314, или в положениях 314 и 428, или в положениях 250, 314 и 428, при этом конкретной комбинацией являются положения 250 и 428. В положении 250 замещающим аминокислотным остатком может быть любой аминокислотный остаток, отличный от треонина, включая без ограничения аланин, цистеин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, метионин, аспарагин, пролин, глутамин, аргинин, серин, валин, триптофан или тирозин. В положении 314 замещающим аминокислотным остатком может быть любой аминокислотный остаток, отличный от лейцина, включая без ограничения аланин, цистеин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, метионин, аспарагин, пролин, глутамин, аргинин, серин, треонин, валин, триптофан или тирозин. В положении 428 замещающими аминокислотными остатками может быть любой аминокислотный остаток, отличный от метионина, включая без ограничения аланин, цистеин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, аспарагин, пролин, глутамин, аргинин, серин, треонин, валин, триптофан или тирозин. Иллюстративной заменой, которая, как известно, модифицирует эффекторную функцию Fc, является замена M428L в Fc, которая может встречаться в комбинации с заменой T250Q в Fc. Дополнительные конкретные комбинации подходящих аминокислотных замен определены в таблице 1 патента США № 7217797. Такие мутации увеличивают связывание с FcRn, что защищает антитело от разрушения и увеличивает период его полужизни.
Антитело к PD-1 может иметь одну или несколько аминокислот, вставленных в один или несколько из его CDR, например, как описано в Jung and Plückthun, 1997, Protein Engineering 10:9, 959-966; Yazaki et al., 2004, Protein Eng. Des Sel. 17(5):481-9. Epub 2004 Aug 17; и заявке на патент США № 2007/0280931.
Антитела к PD-1 с высокой аффинностью в отношении PD-1 человека могут быть востребованными для терапевтических и диагностических путей применения. Соответственно, в настоящем изобретении рассматриваются антитела, характеризующиеся высокой аффинностью связывания с PD-1 человека. В конкретных вариантах осуществления антитела к PD-1, которые связывают PD-1 человека, характеризуются аффинностью, составляющей по меньшей мере приблизительно 100 нМ, но могут проявлять более высокую аффинность, например по меньшей мере приблизительно 90 нМ, 80 нМ, 70 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 40 нМ, 30 нМ, 25 нМ, 20 нМ, 15 нМ, 10 нМ, 7 нМ, 6 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,1 нМ, 0,01 нМ или даже выше. В некоторых вариантах осуществления антитела связывают PD-1 человека с аффинностью, варьирующей в диапазоне от приблизительно 1 пМ до приблизительно 100 нМ, или аффинностью, варьирующей в диапазоне между любыми из вышеуказанных величин.
Аффинность антител к PD-1 в отношении PD-1 человека можно определять с применением методик, хорошо известных из уровня техники или описанных в данном документе, таких как, например, но без ограничения, ELISA, изотермическая титрационная калориметрия (ITC), поверхностный плазмонный резонанс или флуоресцентный поляризационный анализ.
H
H
H
H
L
L
L
L
H
L
H
L
Антитела к PD-1 обычно содержат тяжелую цепь, содержащую вариабельную область (V), имеющую три определяющих комплементарность участка ("CDR"), называемые в данном документе (в порядке N→C) CDR№1 V, CDR№2 V и CDR№3 V, и легкую цепь, содержащую вариабельную область (V), имеющую три определяющие комплементарность участка, называемые в данном документе (в порядке N→C) CDR№1 V, CDR№2 V и CDR№3 V. В данном документе представлены аминокислотные последовательности иллюстративных CDR, а также аминокислотные последовательности областей V и V тяжелой и легкой цепей иллюстративных антител к PD-1. Конкретные варианты осуществления антител к PD-1 предусматривают такие иллюстративные последовательности CDR и/или V и/или V, а также антитела, которые конкурируют за связывание PD-1 человека с такими антителами.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 является подходящим для введения человеку. В конкретном варианте осуществления антитело к PD-1 является гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления аминокислотные последовательности CDR антитела к PD-1 выбраны из следующих последовательностей:
CDR
Последовательность (N→C)
Идентификатор
CDR №1 V<sub>H</sub>:
GYTFTHYGMN
(SEQ ID NO:11)
CDR №2 V<sub>H</sub>:
WVNTYTGEPTYADDFKG
(SEQ ID NO:12)
CDR №3 V<sub>H</sub>:
EGEGLGFGDEGEGIGFGDEGEGVGFGDEGEGMGFGD
(SEQ ID NO:13)(SEQ ID NO:21)(SEQ ID NO:22)(SEQ ID NO:23)
CDR №1 V<sub>L</sub>:
RSSQSIVHSHGDTYLE
(SEQ ID NO:14)
CDR №2 V<sub>L</sub>:
KVSNRFS
(SEQ ID NO:15)
CDR №3 V<sub>L</sub>:
FQGSHIPVT
(SEQ ID NO:16)
Конкретные иллюстративные варианты осуществления антител к PD-1 с вышеуказанными CDR описаны в данном документе. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 имеет CDR под SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 и 16. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 имеет CDR под SEQ ID NO: 11, 12, 21, 14, 15 и 16. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 имеет CDR под SEQ ID NO: 11, 12, 22, 14, 15 и 16. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 имеет CDR под SEQ ID NO: 11, 12, 23, 14, 15 и 16.
H
L
H
L
В некоторых вариантах осуществления каждый CDR антитела к PD-1 независимо от других выбран таким образом, что его последовательность соответствует соответственному CDR антитела, представленного в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 представляет собой IgG и имеет V и V, последовательность которых соответствует V и Vантитела, представленного в таблице 3.
H
L
H
L
H
L
H
L
H
L
H
L
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 содержит цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:31; и цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:41. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 содержит цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:32; и цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:42. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 содержит цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:33; и цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:42. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 содержит цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:34; и цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:42. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 содержит цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:35; и цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:42. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 содержит цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:36; и цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:42.
H
L
H
L
H
H
H
H
H
H
L
L
L
L
L
L
Специалисту в данной области будет понятно, что определенные мутации в последовательности V или V антитела к PD-1, описанного в данном документе, допускают нахождение антител к PD-1 в пределах объема настоящего изобретения. Мутации могут включать аминокислотные замены, добавления или делеции в последовательности V или V, раскрытой в данном документе, при сохранении значительной активности против PD-1. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 содержит последовательность V, характеризующуюся по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с последовательностью V любого из антител, показанных в таблице 3. Антитело к PD-1 может содержать последовательность V, имеющую до 8, до 7, до 6, до 5, до 4, до 3 или до 2 мутаций по сравнению с последовательностью V любого из антител, показанных в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 может содержать последовательность V, имеющую 5 или меньше, 4 или меньше, 3 или меньше или 2 или меньше мутаций по сравнению с последовательностью V любого из антител, показанных в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 содержит последовательность V, характеризующуюся по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с последовательностью V любого из антител, показанных в таблице 3. Антитело к PD-1 может содержать последовательность V, имеющую до 8, до 7, до 6, до 5, до 4, до 3 или до 2 мутаций по сравнению с последовательностью V любого из антител, показанных в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 может содержать последовательность V, имеющую 5 или меньше, 4 или меньше, 3 или меньше или 2 или меньше мутации по сравнению с последовательностью V любого из антител, показанных в таблице 3.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи согласно:
EIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTHYGMNWVRQAPGQGLEWVGWVNTYTGEPTYADDFKGRLTFTLDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGEGLGFGDWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:51);
и аминокислотную последовательность легкой цепи согласно:
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSHGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPVTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:61),
где подчеркнутые аминокислоты представляют CDR, а выделенные курсивом аминокислоты представляют константные области.
Могут встречаться посттрансляционные модификации последовательностей антитела к PD-1, такие как отщепление одного или нескольких (например, 1, 2, 3 и более) аминокислотных остатков на С-конце тяжелой цепи антитела.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 содержит аминокислотную последовательность тяжелой цепи согласно:
EIQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTHYGMNWVRQAPGQGLEWVGWVNTYTGEPTYADDFKGRLTFTLDTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCTREGEGLGFGDWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:52);
и аминокислотную последовательность легкой цепи согласно:
DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSHGDTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHIPVTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:61),
где подчеркнутые аминокислоты представляют CDR, а выделенные курсивом аминокислоты представляют константные области.
Дополнительные посттрансляционные модификации антитела к PD-1 могут включать гликозилирование. Обычные двухантенные комплексы могут состоять из сердцевинной структуры, имеющей два остатка N-ацетилглюкозамина (GlcNAc), три остатка маннозы и два остатка GlcNAc, которые соединены β-1,2-связью с α-6-маннозой и α-3-маннозой с образованием двух антенн. К сердцевине могут быть присоединены один или несколько остатков фукозы (Fuc), галактозы (Gal), высокоманнозных гликанов Man-5 или Man-9, GlcNAc в точках ветвления и сиаловой кислоты, в том числе остатки N-ацетилнейраминовой кислоты (NANA) или N-гликолилнейраминовой кислоты (NGNA). N-связанные гликоформы могут включать G0 (белок, имеющий сердцевинную двухантенную гликозилированную структуру), G0F (фукозилированный G0), G0F-GlcNAc, G1 (белок, имеющий сердцевинную гликозилированную структуру с одним остатком галактозы), G1F (фукозилированный G1), G2 (белок, имеющий сердцевинную гликозилированную структуру с двумя остатками галактозы) и/или G2F (фукозилированный G2). В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 имеет гликан G0F.
В некоторых вариантах осуществления антитела к PD-1 конкурируют с эталонным антителом за связывание PD-1 человека в in vitro анализах. В некоторых вариантах осуществления антитела к PD-1 конкурируют за связывание PD-1 человека на клетках, экспрессирующих PD-1 человека. Эталонное антитело может представлять собой любое из антител к PD-1, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления эталонное антитело представляет собой антитело, представленное в таблице 3. В конкретных вариантах осуществления эталонное антитело выбрано из антитела мыши 12A11 ("Mu12A11"). В некоторых вариантах осуществления эталонное антитело представляет собой гуманизированную версию Mu12A11. В конкретном варианте осуществления эталонное антитело представляет собой гуманизированное антитело 12A11.1b ("Hu12A11.1b") или гуманизированное антитело 12A11.2b M99L ("Hu12A11.2b4").
В некоторых вариантах осуществления антитела к PD-1 оказывают антагонистическое воздействие на, например ингибируют, PD-1 человека (SEQ ID NO:1). Антагонизм в отношении рецептора PD-1 может происходит за счет целого ряда механизмов, например путем ингибирования связывания PD-1 с PD-L1 (SEQ ID NO:3) или PD-L2 (SEQ ID NO:4) человека.
Антитела к PD-1, описанные в данном документе обычно специфически связываются с PD-1 человека. Перекрестная реактивность антител при связывании с PD-1 от других видов, например от обезьяны, например макака-крабоеда, может обеспечивать такие преимущества, как возможность тестирования биологической активности на животных моделях в виде обезьян. Такое тестирование на животной модели можно применять для скрининга антител к PD-1 для отбора в отношении свойств, связанных с эффективностью, например благоприятных фармакокинетических параметров, или свойств, связанных с безопасностью, например сниженной гепатотоксичности. В некоторых вариантах осуществления антитела к PD-1 связываются с PD-1 макака-крабоеда, а также PD-1 человека.
Анализы конкурентного связывания включают без ограничения иммунологический анализ с мечением радиоактивным веществом (RIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), сэндвич-ELISA, анализы по методу сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) и анализы по методу поверхностного плазмонного резонанса.
При проведении анализа конкурентного связывания антител между эталонным антителом и тестируемым антителом (независимо от вида или изотипа) сначала можно пометить эталонное антитело с помощью детектируемой метки, такой как флуорофор, биотин, или ферментативной (или даже радиоактивной) метки для обеспечения возможности последующей идентификации. В этом случае клетки, экспрессирующие PD-1 человека, инкубируют с немеченым тестируемым антителом, добавляют меченое эталонное антитело и измеряют интенсивность связанной метки. Если тестируемое антитело конкурирует с меченым эталонным антителом за счет связывания с частично совпадающим эпитопом, интенсивность будет пониженной по сравнению с контрольной реакцией, проводимой без тестируемого антитела.
80%
80%
80%
В конкретном варианте осуществления данного анализа сначала определяют концентрацию меченого эталонного антитела, которая приводит к 80% от максимального связывания ("конц.") в условиях проведения анализа (например, при определенной плотности клеток), и анализ конкурентного связывания проводят с 10X конц. немеченого тестируемого антитела и конц. меченого эталонного антитела.
i
Ингибирование можно выразить в виде константы ингибирования или K, которую рассчитывают по следующей формуле:
i
50
d
K=IC/ (1+[концентрация эталонного Ab]/K),
50
d
i
где IC представляет собой концентрацию тестируемого антитела, которая приводит к 50%-ному ослаблению связывания эталонного антитела, а K представляет собой константу диссоциации эталонного антитела, показатель его аффинности в отношении PD-1 человека. Антитела, которые конкурируют с антителами к PD-1, раскрытыми в данном документе, могут характеризоваться K, составляющей от 10 пМ до 10 нМ в условиях анализа, описанных в данном документе.
В различных вариантах осуществления считается, что тестируемое антитело конкурирует с эталонным антителом, если оно уменьшает связывание эталонного антитела на по меньшей мере приблизительно 20% или более, например, на по меньшей мере приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или даже более, или на процент, варьирующий в диапазоне между любыми из вышеуказанных величин, при концентрации эталонного антитела, которая составляет 80% от максимального связывания при конкретных условиях анализа, а концентрации тестируемого антитела, которая в 10 раз превышает концентрацию эталонного антитела.
Конкретный анализ и условия анализа, пригодные для проведения оценки того, конкурирует ли антитело за связывание PD-1 человека с эталонным антителом, как описано в данном документе, приведены в разделе 8.1.5.
7.4. Полинуклеотиды, кодирующие антитела к PD-1, системы экспрессии и способы получения антител
Настоящее изобретение охватывает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие гены легкой и тяжелой цепи иммуноглобулинов для антител к PD-1, векторы, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, способные вырабатывать антитела к PD-1 по настоящему изобретению.
Антитело к PD-1 по настоящему изобретению может быть получено за счет рекомбинантной экспрессии генов легкой и тяжелой цепи иммуноглобулина в клетке-хозяине. Для рекомбинантной экспрессии антитела клетку-хозяина трансфицируют одним или несколькими рекомбинантными векторами экспрессии, несущими фрагменты ДНК, кодирующие легкую и тяжелую цепи иммуноглобулина для антитела, вследствие чего легкая и тяжелая цепи экспрессируются в клетке-хозяине и, необязательно, секретируются в среду, в которой культивируются клетки-хозяева, при этом из данной среды антитела можно выделять. Для получения генов тяжелой и легкой цепей антитела, встраивания данных генов в векторы для рекомбинантной экспрессии и введения векторов в клетки-хозяева применяют стандартные методики рекомбинантной ДНК, такие как описанные в Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition (Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Cold Spring Harbor, N. Y., 1989), Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. et al., eds., Greene Publishing Associates, 1989) и в патенте США № 4816397.
Для получения нуклеиновых кислот, кодирующих такие антитела к PD-1, сначала получают фрагменты ДНК, кодирующие вариабельные области легкой и тяжелой цепи. Данные ДНК можно получить за счет амплификации и модификации ДНК зародышевого типа или кДНК, кодирующей последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепей, например, с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). Из уровня техники известны последовательности ДНК зародышевого типа для генов вариабельных областей тяжелой и легкой цепей человека (см., например, базу данных последовательностей зародышевого типа человека "VBASE"; см. также Kabat, E. A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 22T:116-198; и Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836; содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки).
H
L
L
H
После получения фрагментов ДНК, кодирующих сегменты V и V, связанные с антителом к PD-1, такие фрагменты ДНК можно дополнительно подвергнуть манипуляциям с помощью стандартных методик рекомбинантной ДНК, например, для превращения генов вариабельной области в гены полноразмерной цепи антитела, в гены Fab-фрагмента или в ген scFv. В ходе таких манипуляций фрагмент ДНК, кодирующий V или V, функционально связывают с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Подразумевается, что термин "функционально связанный", используемый в данном контексте, означает, что два фрагмента ДНК соединены таким образом, что аминокислотные последовательности, кодируемые этими двумя фрагментами ДНК, остаются в пределах рамки считывания.
H
H
1
2
3
4
1
4
H
Выделенную ДНК, кодирующую область V, можно превратить в ген полноразмерной тяжелой цепи путем функционального связывания ДНК, кодирующей V, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CH1, CH2, CH3 и необязательно CH4). Последовательности генов константных областей тяжелых цепей человека известны из уровня техники (см., например, Kabat, E.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, охватывающие данные области, можно получить с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область IgG, IgG, IgG, IgG, IgA, IgE, IgM или IgD, но в определенных вариантах осуществления она принадлежит IgG или IgG. Для получения гена тяжелой цепи Fab-фрагмента ДНК, кодирующую V, можно функционально связывать с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область CH1 тяжелой цепи.
L
L
H
L
4
3
H
L
L
H
Выделенную ДНК, кодирующую область V, можно превратить в ген полноразмерной легкой цепи (а также ген легкой цепи Fab) путем функционального связывания ДНК, кодирующей V, с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, CL. Последовательности генов константных областей легкой цепи человека известны из уровня техники (см., например, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, охватывающие данные области, можно получить с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа-цепи или лямбда-цепи, но в определенных вариантах осуществления она представляет собой константную область каппа-цепи. Для создания гена scFv фрагменты ДНК, кодирующие V и V, функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующим аминокислотную последовательность (Gly~Ser) (SEQ ID NO:5), таким образом, чтобы последовательности V и V могли экспрессироваться в виде непрерывного одноцепочечного белка с областями V и V, соединенными гибким линкером (см., например, Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554).
Для экспрессии антител к PD-1 по настоящему изобретению ДНК, кодирующие неполные или полноразмерные легкую и тяжелую цепи, полученные, как описано выше, вставляют в векторы экспрессии, вследствие чего гены становятся функционально связанными с последовательностями контроля транскрипции и трансляции. В данном контексте подразумевается, что термин "функционально связанный" означает, что ген антитела лигируют в вектор таким образом, чтобы последовательности контроля транскрипции и трансляции внутри вектора выполняли свою предусматриваемую функцию, заключающуюся в регулировании транскрипции и трансляции гена антитела. Вектор экспрессии и последовательности, контролирующие экспрессию, выбирают так, чтобы они были совместимыми с используемой для экспрессии клеткой-хозяином. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно вставить в отдельные векторы или, что более типично, оба гена вставляют в один и тот же вектор экспрессии.
H
L
H
L
Гены антитела вставляют в вектор экспрессии с помощью стандартных способов (например, путем лигирования комплементарных сайтов рестрикции на фрагменте гена антитела и векторе или путем лигирования "тупых" концов, если сайты рестрикции отсутствуют). До вставки последовательностей легкой или тяжелой цепи, связанных с антителом к PD-1, вектор экспрессии уже может нести последовательности константных областей антитела. Например, один подход к превращению последовательностей V и V, связанных с моноклональными антителами к PD-1, в гены полноразмерного антитела, заключается в том, чтобы вставить их в векторы экспрессии, которые уже кодируют константные области тяжелой и легкой цепи соответственно, вследствие чего сегмент V функционально связывается с сегментом(сегментами) СН внутри вектора, а сегмент V функционально связывается с сегментом CL внутри вектора. Дополнительно или альтернативно, вектор для рекомбинантной экспрессии может кодировать сигнальный пептид, который содействует секреции цепи антитела из клетки-хозяина. Ген цепи антитела можно клонировать в вектор таким образом, чтобы сигнальный пептид был связан в рамке считывания с амино-концом цепи антитела, кодируемой геном. Сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид иммуноглобулина или гетерологичный сигнальный пептид (т. е. сигнальный пептид из отличного от иммуноглобулина белка).
В дополнение к генам цепи антитела векторы для рекомбинантной экспрессии по настоящему изобретению несут регуляторные последовательности, которые контролируют экспрессию генов цепи антитела в клетке-хозяине. Подразумевается, что термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования), которые обеспечивают контроль транскрипции или трансляции генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990. Специалистам в данной области будет понятно, что конструирование вектора экспрессии, в том числе выбор регуляторных последовательностей, может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, необходимый уровень экспрессии белка и т. д. Подходящие регуляторные последовательности для экспрессии в клетках-хозяевах, полученных от млекопитающего, включают вирусные элементы, которые приводят к высоким уровням экспрессии белка в клетках млекопитающих, такие как промоторы и/или энхансеры, полученные из цитомегаловируса (CMV) (такие как промотор/энхансер CMV), вируса обезьян 40 (SV40) (такие как промотор/энхансер SV40), аденовируса (например, главный поздний промотор аденовируса (AdMLP)) и вируса полиомы. Более подробное описание вирусных регуляторных элементов и их последовательностей см., например, в патенте США № 5168062 от Stinski, патенте США № 4510245 от Bell et al. и патенте США № 4968615 от Schaffner et al.
-
В дополнение к генам цепи антитела и регуляторным последовательностям рекомбинантные векторы экспрессии по настоящему изобретению могут нести дополнительные последовательности, такие как последовательности, которые регулируют репликацию вектора в клетках-хозяевах (например, точки начала репликации) и гены селектируемых маркеров. Ген селектируемого маркера облегчает отбор клеток-хозяев, в которые был введен вектор (см., например, патенты США №№ 4399216, 4634665 и 5179017, все от Axel et al.). Например, как правило, ген селектируемого маркера придает клетке-хозяину, в которую был введен вектор, устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин или метотрексат. Подходящие гены селектируемых маркеров предусматривают ген дигидрофолатредуктазы (DHFR) (для применения в DHFR клетках-хозяевах с отбором/амплификацией под действием метотрексата) и ген neo (для отбора по G418). Для экспрессии легкой и тяжелой цепей вектор(векторы) экспрессии, кодирующий(кодирующие) тяжелую и легкую цепи, вводят в клетку-хозяина путем трансфекции с помощью стандартных методик. Подразумевается, что различные формы термина "трансфекция" охватывают огромное множество методик, широко применяемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорацию, липофекцию, осаждение с помощью фосфата кальция, трансфекцию, опосредованную DEAE-декстраном, и т. п.
-
Антитела по настоящему изобретению можно экспрессировать либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках-хозяевах. В определенных вариантах осуществления экспрессия антител осуществляется в эукариотических клетках, например клетках-хозяевах, полученных от млекопитающего, с оптимальной секрецией надлежащим образом свернутого и иммунологически активного антитела. Иллюстративные клетки-хозяева, полученные от млекопитающего, для экспрессии рекомбинантных антител по настоящему изобретению включают клетки яичников китайского хомячка (клетки CHO) (включая клетки DHFRCHO, описанные в Urlaub and Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, применяемые с селектируемым маркером DHFR, например, как описано в Kaufman and Sharp, 1982, Mol. Biol. 159:601-621), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. Когда векторы для рекомбинантной экспрессии, кодирующие гены антитела, вводятся в клетки-хозяева, полученные от млекопитающего, антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для обеспечения возможности экспрессии антитела в клетках-хозяевах или секреции антитела в культуральную среду, в которой клетки-хозяева выращиваются. Антитела можно выделять из культуральной среды с применением стандартных способов очистки белка. Клетки-хозяева также можно применять для получения частей интактных антител, таких как Fab-фрагменты или молекулы scFv. Понятно, что видоизменения вышеописанной процедуры находятся в пределах объема настоящего изобретения. Например, может потребоваться трансфекция клетки-хозяина с помощью ДНК, кодирующей либо легкую цепь, либо тяжелую цепь (но не обе) антитела к PD-1 по настоящему изобретению.
Технологию рекомбинантной ДНК также можно применять для удаления некоторых или всех ДНК, кодирующих любую одну или обе из легкой и тяжелой цепей, которые не являются необходимыми для связывания PD-1 человека. Антитела по настоящему изобретению также охватывают молекулы, экспрессируемые за счет таких усеченных молекул ДНК.
Для рекомбинантной экспрессии антитела к PD-1 по настоящему изобретению, можно осуществлять совместную трансфекцию клетки-хозяина двух векторов экспрессии по настоящему изобретению, первого вектора, кодирующего полипептид, полученный из тяжелой цепи, и второго вектора, кодирующего полипептид, полученный из легкой цепи. Два вектора могут содержать идентичные селектируемые маркеры, или каждый из них может содержать отдельный селектируемый маркер. В качестве альтернативы, можно применять один вектор, который кодирует полипептиды как тяжелой, так и легкой цепей.
После того, как была получена нуклеиновая кислота, кодирующая одну или несколько частей антитела к PD-1, в кодирующую последовательность можно включить дополнительные изменения или мутации, например, для создания нуклеиновых кислот, кодирующих антитела с различными последовательностями CDR, антитела с уменьшенной аффинностью в отношении Fc-рецептора или антитела различных подклассов.
nd
Антитела к PD-1 по настоящему изобретению также могут быть получены за счет химического синтеза (например, с помощью способов, описанных в Solid Phase Peptide Synthesis, 2 ed., 1984 The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.). Вариантные антитела также могут быть получены с применением бесклеточной платформы (см., например, Chu et al., Biochemia No. 2, 2001 (Roche Molecular Biologicals) и Murray et al., 2013, Current Opinion in Chemical Biology, 17: 420-426).
После того как антитело к PD-1 по настоящему изобретению было получено за счет рекомбинантной экспрессии, его можно очистить с помощью любого известного из уровня техники способа очистки молекулы иммуноглобулина, например, с помощью хроматографии (например, ионообменной, аффинной и эксклюзионной колоночной хроматографии), центрифугирования, методики, основанной на дифференциальной растворимости, или любой другой стандартной методики для очистки белков. Кроме того, для облегчения очистки антитела к PD-1 по настоящему изобретению можно сливать с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в данном документе или иным образом известными из уровня техники.
TM
После выделения антитела к PD-1, при необходимости его можно подвергать дополнительной очистке, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (см., например, Fisher, Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology, Work and Burdon, eds., Elsevier, 1980) или гель-фильтрационной хроматографии на колонке Superdex 75 (Pharmacia Biotech AB, Уппсала, Швеция).
7.5. Фармацевтические композиции
Антитела к PD-1, описанные в данном документе, могут быть составлены в виде композиций, содержащих антитело и один или несколько носителей, наполнителей и/или разбавителей. Композиции могут быть составлены для конкретных путей применения, как, например, для путей применения в ветеринарии или для фармацевтических путей применения у человека. Форма композиции (например, сухой порошок, жидкий состав и т. д.) и наполнители, разбавители и/или носители будут зависеть от предполагаемых путей применения антитела и, в случае терапевтических путей применения, способа введения.
В случае терапевтических путей применения композиции могут обеспечиваться как часть стерильной фармацевтической композиции, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель. Такая композиция может иметь любую подходящую форму (в зависимости от требуемого способа ее введения пациенту). Фармацевтическую композицию можно вводить пациенту различными путями, как, например, перорально, трансдермально, подкожно, интраназально, внутривенно, внутримышечно, в опухоль, интратекально, местно или локально. Наиболее подходящий способ введения в любом конкретном случае будет зависеть от конкретного антитела, субъекта, природы и тяжести заболевания и физического состояния субъекта. Фармацевтическую композицию, как правило, вводят внутривенно или подкожно.
В целях удобства фармацевтические композиции могут быть представлены в виде единичных дозированных форм, содержащих заранее определенное количество антитела к PD-1, описанного в настоящем документе, на дозу. Количество антитела к PD-1, включенного в единичную дозу, будет зависеть от заболевания, подлежащего лечению, а также от других факторов, хорошо известных из уровня техники. Такие единичные дозы могут быть представлены в форме лиофилизированного сухого порошка, содержащего количество антитела, подходящее для одного введения, или в форме жидкости. Единичные лекарственные формы в виде сухого порошка могут быть упакованы в набор, содержащий шприц, подходящее количество разбавителя и/или другие компоненты, применимые для введения. В целях удобства единичные дозы в жидкой форме могут обеспечиваться в форме шприца, предварительно заполненного количеством антитела к PD-1, подходящим для одного введения.
Фармацевтические композиции также могут обеспечиваться в нерасфасованной форме, содержащей количества антитела к PD-1, подходящие для многократных введений.
Фармацевтические композиции могут быть приготовлены для хранения в виде лиофилизированных составов или водных растворов путем смешивания антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами, как правило, используемыми в данной области техники (все из которых в данном документе называются "носители"), т. е. буферными средствами, стабилизирующими средствами, консервантами, изотонирующими добавками, неионогенными детергентами, антиоксидантами и разными другими добавками. См. Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980). Такие добавки должны быть нетоксичными для получающих их пациентов в используемых дозах и концентрациях.
Буферные средства помогают поддерживать pH в диапазоне, близком к физиологическим условиям. Они могут присутствовать в самых разных концентрациях, но, как правило, они будут присутствовать в концентрациях от приблизительно 2 мМ до приблизительно 50 мМ. Подходящие буферные средства для применения по настоящему изобретению предусматривают как органические, так и неорганические кислоты и их соли, как, например, цитратные буферы (например, смесь цитрата мононатрия и цитрата динатрия, смесь лимонной кислоты и цитрата тринатрия, смесь лимонной кислоты и цитрата мононатрия и т. п.), сукцинатные буферы (например, смесь янтарной кислоты и сукцината мононатрия, смесь янтарной кислоты и гидроксида натрия, смесь янтарной кислоты и сукцината динатрия и т. п.), тартратные буферы (например, смесь винной кислоты и тартрата натрия, смесь винной кислоты и тартрата калия, смесь винной кислоты и гидроксида натрия и т. п.), фосфатные буферы (например, смесь фосфорной кислоты и фосфата мононатрия, смесь фосфорной кислоты и фосфата динатрия, смесь фосфата мононатрия и фосфата динатрия и т. п.), глюконатные буферы (например, смесь глюконовой кислоты и глюконата натрия, смесь глюконовой кислоты и гидроксида натрия, смесь глюконовой кислоты и глюконата калия и т. п.), оксалатный буфер (например, смесь щавелевой кислоты и оксалата натрия, смесь щавелевой кислоты и гидроксида натрия, смесь щавелевой кислоты и оксалата калия и т. п.), лактатные буферы (например, смесь молочной кислоты и лактата натрия, смесь молочной кислоты и гидроксида натрия, смесь молочной кислоты и лактата калия и т. п.) и ацетатные буферы (например, смесь уксусной кислоты и ацетата натрия, смесь уксусной кислоты и гидроксида натрия и т. п.). Помимо этого, можно использовать фумаратные буферы, гистидиновые буферы и соли триметиламина, такие как 2-амино-2-гидроксилметил-пропан-1,3-диол (т. е. Tris, THAM или трис(гидроксиметил)аминометан).
Для обеспечения изотоничности жидких композиций по настоящему изобретению можно добавить изотонирующие добавки, иногда известные как "стабилизаторы", и они включают многоатомные сахароспирты, например трехатомные или высшие сахароспирты, такие как глицерин, эритрит, арабит, ксилит, сорбит и маннит. Стабилизаторы относятся к широкой категории наполнителей, которые могут выполнять функцию от объемообразующего средства до добавки, которая солюбилизирует терапевтическое средство или помогает предотвратить денатурацию или прилипание к стенке контейнера. Типичные стабилизаторы могут представлять собой многоатомные сахароспирты (перечисленные выше); аминокислоты, такие как аргинин, лизин, глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аланин, орнитин, лейцин, 2-фенилаланин, глутаминовая кислота, треонин и т. д., органические сахара или сахароспирты, такие как лактоза, трегалоза, стахиоза, маннит, сорбит, ксилит, рибит, миоинозит, галактит, глицерин и т. п., включая циклиты, такие как инозит; полиэтиленгликоль; полимеры аминокислот; серосодержащие восстанавливающие средства, такие как мочевина, глутатион, тиоктовая кислота, тиогликолят натрия, тиоглицерин, α-монотиоглицерин и тиосульфат натрия; низкомолекулярные полипептиды (например, пептиды из 10 остатков или меньше); гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; моносахариды, такие как ксилоза, манноза, фруктоза, глюкоза; дисахариды, такие как лактоза, мальтоза, сахароза и трегалоза; и трисахариды, такие как раффиноза; и полисахариды, такие как декстран. Стабилизаторы могут присутствовать в количествах, варьирующих от 0,5 до 10 мас. % в пересчете на массу антитела к PD-1.
Неионогенные поверхностно-активные вещества или детергенты (также известные как "смачивающие средства") можно добавлять для содействия солюбилизации гликопротеина, а также для защиты гликопротеина от агрегации, вызываемой перемешиванием, что также позволяет подвергать состав стрессовому воздействию со сдвигом поверхности без денатурации белка. Подходящие неионогенные поверхностно-активные вещества включают полисорбаты (20, 80 и т. д.), полоксамеры (184, 188 и т. д.) и полиолы-плюроники. Неионогенные поверхностно-активные вещества могут присутствовать в диапазоне от приблизительно 0,05 мг/мл до приблизительно 1,0 мг/мл.
Конкретный иллюстративный вариант осуществления водной композиции, подходящей для введения посредством внутривенной инфузии, предусматривает 20 мг/мл антитела к PD-1, содержащего последовательность тяжелой цепи под SEQ ID NO:51 или SEQ ID NO:52 и последовательность легкой цепи под SEQ ID NO:61, 15 мМ гистидинового буфера, pH 5,7, 8,0% (вес/объем) сахарозы и 0,05% (вес/объем) полисорбата 80. Композиция может быть представлена в форме лиофилизированного порошка, который при растворении с помощью стерильной воды или другого раствора, подходящего для инъекции или инфузии (например, 0,9% солевого раствора, раствора Рингера, раствора Рингера с лактатом и т. д.), приводит к получению вышеуказанной водной композиции. Композиция или другие варианты осуществления композиций также могут быть представлены в форме шприца или другого устройства, подходящего для инъекции и/или инфузии, предварительно заполненного количеством композиции, подходящим для однократного введения антитела к PD-1.
7.6. Способы применения
7.6.1. Терапевтический эффект
Данные, представленные в данном документе, демонстрируют, что раскрытые антитела к PD-1 оказывают антагонистическое воздействие на PD-1 в присутствии раковых клеток и обладают сильной in vivo противораковой активностью в отношении таких видов рака, как солидные опухоли и злокачественные заболевания крови. Соответственно, антитела к PD-1, связывающие фрагменты и/или фармацевтические композиции, содержащие антитела к PD-1, можно применять терапевтически для лечения солидных опухолей или злокачественных заболеваний крови.
В некоторых вариантах осуществления способ предусматривает введение пациенту-человеку, имеющему солидную опухоль, определенного количества антитела к PD-1, которое оказывает антагонистическое воздействие на PD-1 и уничтожает опухолевые клетки на уровне, эффективном для обеспечения терапевтического эффекта. Солидные опухоли, которые можно лечить с помощью антитела к PD-1, включают без ограничения виды рака надпочечников, виды рака мочевого пузыря, виды рака костей, виды рака головного мозга, виды рака молочной железы (например, трижды негативный рак молочной железы), виды рака шейки матки, виды колоректального рака, виды рака эндометрия, виды рака пищевода, виды рака глаза, виды рака желудка, виды рака головы и шеи, виды рака почки (например, запущенная почечно-клеточная карцинома), виды рака печени (например, гепатоцеллюлярная карцинома, холангиокарцинома), виды рака легкого (например, немелкоклеточный рак легкого, мезотелиома, мелкоклеточный рак легкого), виды рака головы и шеи, виды меланомы (например, неоперабельная или метастатическая меланома, запущенная злокачественная меланома), виды рака ротовой полости, виды рака яичника, виды рака полового члена, виды рака простаты, виды рака поджелудочной железы, виды рака кожи (например, карцинома из клеток Меркеля), виды рака яичка, виды рака щитовидной железы, виды рака матки, виды рака влагалища и опухоли с доказанной недостаточностью репарации ошибочно спаренных оснований ДНК. Раковые опухоли могут состоять из опухолевых клеток, которые экспрессируют PD-L1 или PD-L2, раковые опухоли состоят из опухолевых клеток, которые не экспрессируют PD-L1 или PD-L2, или раковые опухоли состоят из опухолевых клеток, некоторые из которых экспрессируют PD-L1 или PD-L2, а некоторые из которых не экспрессируют. Рак может представлять собой впервые диагностированную и ранее не подвергавшуюся лечению форму солидной опухоли или может представлять собой рецидивирующую, рефрактерную, или рецидивирующую и рефрактерную, или метастатическую форму. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака головы и шеи, рака почки, рака легкого, лимфомы, меланомы и рака желудка. В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из меланомы (например, неоперабельной или метастатической меланомы), рака легкого (например, немелкоклеточного рака легкого) и почечно-клеточной карциномы (например, запущенной почечно-клеточной карциномы). В некоторых вариантах осуществления солидная опухоль выбрана из трижды негативного рака молочной железы, рака яичника, гепатоцеллюлярной карциномы, рака желудка, мелкоклеточного рака легкого, мезотелиомы, холангиокарциномы, карциномы из клеток Меркеля и опухолей с доказанной недостаточностью репарации ошибочно спаренных оснований ДНК. В определенных вариантах осуществления меланома представляет собой неоперабельную или метастатическую меланому BRAF V600 дикого типа. В других определенных вариантах осуществления меланома представляет собой неоперабельную или метастатическую меланому BRAF V600 с мутациями. В определенных вариантах осуществления рак легкого представляет собой метастатический немелкоклеточный рак легкого с текущим прогрессированием или после химиотерапии на основе платины. В определенных вариантах осуществления рак легкого представляет собой локально запущенный или метастатический немелкоклеточный рак легкого, который не поддался лечению терапевтическим средством на основе платины и не подвергался воздействию средства, нацеливающегося на PD-1. В определенных вариантах осуществления рак головы и шеи представляет собой метастатическую (диссеминированную) плоскоклеточную карциному головы и шеи, локализованную в ротовой полости, ротовой части глотки, гортанной части глотки и гортани, которая считается некурабельной местными средствами терапии. В определенных вариантах осуществления почечно-клеточная карцинома представляет собой запущенную почечно-клеточную карциному, которую ранее лечили с помощью антиангиогенного терапевтического средства.
В некоторых вариантах осуществления способ по настоящему изобретению включает введение пациенту-человеку, имеющему злокачественное заболеванием крови, определенного количества антитела к PD-1, которое оказывает антагонистическое воздействие на PD-1 и уничтожает злокачественные клетки на уровне, эффективном для обеспечения терапевтического эффекта. Раковые опухоли могут состоять из злокачественных клеток, которые экспрессируют PD-L1 или PD-L2, раковые опухоли состоят из злокачественных клеток, которые не экспрессируют PD-L1 или PD-L2, или раковые опухоли состоят из злокачественных клеток, некоторые из которых экспрессируют PD-L1 или PD-L2, а некоторые из которых не экспрессируют. Рак может представлять собой впервые диагностированную и ранее не подвергавшуюся лечению форму злокачественного заболевания крови или может представлять собой рецидивирующую, рефрактерную, или рецидивирующую и рефрактерную, или метастатическую форму злокачественного заболевания крови. Злокачественные опухоли на основе гемопоэтических клеток, которые можно лечить с помощью антитела к PD-1, включают без ограничения виды миеломы (например, множественную миелому), виды лимфомы (например, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, макроглобулинемию Вальденстрема, лимфому из клеток мантийной зоны), виды лейкоза (например, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз) и миелодиспластические синдромы.
Как обсуждается выше, раскрытые в настоящем изобретении антитела к PD-1 модулируют иммунологический ответ. Соответственно, пациенты, имеющие ослабленную иммунную систему, могут быть исключены из лечения. В некоторых вариантах осуществления пациента исключают после определения его, как соответствующего одному или нескольким из следующих критериев: (1) активное или ранее документально зафиксированное аутоиммунное заболевание (в том числе без ограничения воспалительное заболевание кишечника, целиакия, синдром Вегенера) в течение периода последних 2 лет (субъектов с детской атопией или астмой, витилиго, алопецией, синдромом Хашимото, болезнью Грейвса или псориазом, не требующими системного лечения (в течение периода последних 2 лет), не исключают); (2) первичный иммунодефицит, трансплантация костного мозга, хронический лимфоцитарный лейкоз, трансплантация паренхиматозных органов в анамнезе или ранее клинически диагностированный туберкулез; (3) коагулопатия или тромбоцитарное нарушение в анамнезе; (4) подтвержденные положительные результаты теста на вирус иммунодефицита человека (HIV) или хронический или активный гепатит B или C у субъектов (субъекты, имеющие гепатит B или C в анамнезе, выздоровление которых после получения противовирусной терапии было документально зафиксировано, могут быть включены в лечение); (5) предшествующая иммуноопосредованная нейротоксичность или пневмония ≥3 степени при получении иммунотерапии (в том числе без ограничения средств, направленных против CTLA-4, PD-L1 или PD-1). Кроме того, любое другое предшествующее иммуноопосредованное нежелательное явление ≥3 степени при получении иммунотерапии, которое не было устранено или не стало бессимптомным в течение периода 3 месяцев; (6) получение живой аттенуированной вакцины в течение периода 28 дней до приема первой дозы антитела к PD-1.
Антитело к PD-1 по настоящему изобретению можно вводить отдельно (монотерапия) или в дополнение или совместно с другими противораковыми видами терапии и/или целенаправленно воздействующими или не оказывающими целенаправленного воздействия противораковыми средствами. При введении антитела к PD-1 в качестве монотерапии можно применять одно или несколько антител. Вне зависимости от того, вводят ли антитело к PD-1 как монотерапию или в дополнение или совместно с другими видами терапии или средствами, его количество вводят таким образом, что общая схема лечения обеспечивает терапевтический эффект.
Под терапевтическим эффектом подразумевают, что применение антител к PD-1 для лечения рака у пациента приводит к любому продемонстрированному клиническому результату по сравнению с отсутствием терапии (когда это необходимо) или с известным стандартом лечения. Клинический результат можно оценить с помощью любого способа, известного рядовому специалисту в данной области. В одном варианте осуществления клинический результат оценивают на основании частоты объективных ответов (ORR) (определяемой с помощью RECIST версии 1.1), продолжительности ответа (DOR), выживаемости без прогрессирования (PFS) и/или общей выживаемости (OS). В некоторых вариантах осуществления признаком терапевтического эффекта является полный ответ. В некоторых вариантах осуществления признаком терапевтического эффекта является частичный ответ. В некоторых вариантах осуществления признаком терапевтического эффекта является стабилизация заболевания. В некоторых вариантах осуществления признаком терапевтического эффекта является увеличение общей выживаемости. В некоторых вариантах осуществления терапевтический эффект может представлять собой увеличение времени до прогрессирования заболевания и/или уменьшение симптомов или улучшение качества жизни. В других вариантах осуществления терапевтический эффект может не распространяться на увеличение периода контроля заболевания, а скорее заметно снижать тяжесть симптомов, что приводит к улучшению качества жизни. Как будет очевидно специалистам в данной области, терапевтический эффект может наблюдаться при применении антител к PD-1 отдельно (монотерапия) или в дополнение или совместно с другими видами противораковой терапии и/или целенаправленно воздействующими или не оказывающими целенаправленного воздействия противораковыми средствами.
Как правило, терапевтический эффект оценивают с применением стандартных клинических тестов, разработанных для измерения ответа на новое средство для лечения рака. Для оценки терапевтического эффекта антител к PD-1, описанных в данном документе, можно применять один или комбинацию из следующих тестов: (1) критерии оценки ответа солидных опухолей (RECIST) версии 1.1, (2) иммунозависимые RECIST (irRECIST), (3) общее состояние согласно Восточной объединенной онкологической группе (ECOG), (4) иммунозависимые критерии ответа (irRC), (5) оценка заболевания посредством оценки опухолевых антигенов, (6) валидированные шкалы оценок результатов, сообщаемых пациентами, и/или (7) оценки Каплана-Мейера для общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования.
Оценка изменения опухолевой нагрузки является важной особенностью клинической оценки средств для терапии рака. Как уменьшение размеров опухоли (объективный ответ), так и время до развития прогрессирования заболевания являются важными конечными точками в клинических испытаниях относительно рака. Стандартизированные критерии ответа, известные как RECIST (критерии оценки ответа солидных опухолей), были опубликованы в 2000 году. Обновленная версия (RECIST 1.1) была выпущена в 2009 году. Критерии RECIST, как правило, используют в клинических испытаниях, в которых первичной конечной точкой исследования является объективный ответ, а также в тех испытаниях, в которых проводят оценку стабилизации заболевания, прогрессирования опухоли или времени до прогрессирования, поскольку такие показатели результата основаны на оценке анатомической опухолевой нагрузки и ее изменении в ходе испытания. В таблице 4 представлены определения критериев ответа, используемых для определения объективного ответа опухоли на исследуемое лекарственное средство, такое как антитела к PD-1, описанные в данном документе.
ТАБЛИЦА 4
Ответ
Критерии
Полный ответ (CR)
Исчезновение всех целевых очагов. Размер всех патологических лимфатических узлов (как целевых, так и нецелевых) должен уменьшиться по короткой оси до <10 мм.
Частичный ответ(PR)
Уменьшение суммы диаметров целевых очагов на по меньшей мере 30%, при этом эталоном считается исходная сумма диаметров.
Прогрессирование заболевания (PD)
Увеличение суммы диаметров целевых очагов на по меньшей мере 20%, при этом эталоном считается наименьшая сумма за период исследования (она предусматривает исходную сумму, если таковая является наименьшей за период исследования). В дополнение к относительному увеличению на 20%, абсолютное увеличение суммы также должно составлять по меньшей мере 5 мм. (Примечание: появление одного или нескольких новых очагов также считается прогрессированием).
Стабилизация заболевания(SD)
Не наблюдается ни достаточное уменьшение размеров опухоли, чтобы соответствовать критериям PR, ни достаточное увеличение, чтобы соответствовать критериям PD, при этом эталоном считается наименьшая сумма диаметров в ходе исследования.
Вторичные показатели результата, которые можно применять для определения терапевтического эффекта антител к PD-1, описанных в данном документе, предусматривают: частоту объективного ответа (ORR), выживаемость без прогрессирования (PFS), общую выживаемость (OS), продолжительность полного ответа (DOR) и глубину ответа (DpR). ORR определяют как долю участников, у которых был достигнут полный ответ (CR) или частичный ответ (PR). PFS определяют как время от даты введения первой дозы антитела к PD-1 до прогрессирования заболевания или смерти, в зависимости от того, что наступит раньше. OS определяют как период времени либо от даты постановки диагноза, либо от начала лечения заболевания, в течение которого пациенты с диагностированным заболеванием остаются в живых. DOR определяют как время от первоначального CR или PR участника до периода прогрессирования заболевания. DpR определяют как процентное значение уменьшения размеров опухоли, наблюдаемого в момент максимального ответа, по сравнению с исходной опухолевой нагрузкой. Клинические конечные точки как для ORR, так и для PFS можно определить на основании критериев RECIST 1.1, описанных выше.
Дополнительные критерии, которые можно применять для клинической оценки, предназначенной специально для пациентов с раком, подвергающихся иммунотерапевтическому лечению, включают стандартизированные иммунозависимые критерии RECIST (irRECIST). См., например, Nishino, M. et al. Eur. J. Radiol., 84(7), страницы 1259-1268 (июль 2015 года). В этих руководствах вышеупомянутые критерии RECIST 1.1 модифицированы с учетом возможных иммуномодулирующих эффектов. В таблице 5 представлены определения критериев ответа, используемых для определения объективного ответа опухоли на иммуномодулирующее лекарственное средство, такое как антитела к PD-1, описанные в данном документе.
ТАБЛИЦА 5
Ответ
Критерии
Полный ответ (irCR)
Полное исчезновение всех измеримых и неизмеримых очагов. Размер лимфатических узлов должен уменьшиться до < 10 мм по короткой оси.
Частичный ответ(irPR)
Уменьшение общей измеренной опухолевой нагрузки на ≥30% относительно исходного уровня, нецелевые очаги соответствуют критериям irNN, и не наблюдается явное прогрессирование новых неизмеримых очагов.
Прогрессирование заболевания (irPD)
Увеличение на по меньшей мере 20% и абсолютное увеличение на по меньшей мере 5 мм для TMTB по сравнению с наиболее низким уровнем или irPD для нецелевых или новых неизмеримых очагов. Подтверждение прогрессирования рекомендуется проводить через по меньшей мере 4 недели после первой оценки соответствия критериям irPD.
Несоответствие критериям irCR или несоответствие критериям irPD (irNN)
Целевое заболевание не было идентифицировано на исходном уровне, и в ходе последующего наблюдения пациент не соответствует критериям irCR или irPD
Стабилизация заболевания(irSD)
Не наблюдается ни достаточное уменьшение размеров опухоли, чтобы соответствовать критериям irPR, ни достаточное увеличение, чтобы соответствовать критериям irPD, при этом эталоном считается наименьшая сумма диаметров в ходе исследования.
irNE
Используется в исключительных случаях, в которых имеет место недостаточное количество данных.
Шкалу общего состояния согласно ECOG, показанную в таблице 6, используют для описания уровня функционирования пациента с точки зрения его способности заботиться о себе, повседневной активности и физических возможностей. Шкала была разработана Восточной объединенной онкологической группой (ECOG), которая в настоящее время является частью Онкологической исследовательской группы ECOG-ACRIN, и опубликована в 1982 году.
ТАБЛИЦА 6
Степень
Общее состояние согласно ECOG
0
Полностью активный, способный без ограничений выполнять всю ту же деятельность, что и до заболевания.
1
Ограниченный в физически напряженной деятельности, но способный ходить и способный выполнять работу легкого или сидячего характера, например, легкую работу по дому, работу в офисе.
2
Способный ходить и способный к полноценному самообслуживанию, но не способный выполнять никакую работу; находится на ногах в течение более 50% часов бодрствования
3
Способный только к ограниченному самообслуживанию; прикованный к постели или креслу в течение более 50% часов бодрствования
4
Полностью нетрудоспособный; неспособный к самообслуживанию; полностью прикован к постели или креслу
5
Смерть
Еще один набор критериев, который можно применять, чтобы полностью охарактеризовать и определить ответ на иммунотерапевтические средства, такие как средства противораковой терапии на основе антител, представляет собой иммуннозависимые критерии ответа (irRC), которые были разработаны для измерения солидных опухолей в 2009 году и обновлены в 2013 году (Wolchok, et al. Clin. Cancer Res. 2009; 15(23): 7412-7420 и Nishino, et al. Clin. Cancer Res. 2013; 19(14): 3936-3943). Обновленные критерии irRC, как правило, используют для оценки эффекта иммунотерапевтического средства, такого как антитело к PD-1, описанное в данном документе, на опухолевую нагрузку, и ответ определяют согласно таблице 7.
ТАБЛИЦА 7
Ответ
Критерии
Полный ответ (CR)
Исчезновение всех целевых очагов за два последовательных обследования с интервалом не менее чем 4 недели
Частичный ответ (PR)
Уменьшение суммы наибольших диаметров целевых очагов на по меньшей мере 30%, при этом эталоном считается исходная сумма диаметров.
Прогрессирование заболевания (PD)
Увеличение суммы диаметров целевых очагов на по меньшей мере 20%, при этом эталоном считается наименьшая сумма за период исследования (она предусматривает исходную сумму, если таковая является наименьшей за период исследования). (Примечание: появление одного или нескольких новых очагов считают прогрессированием. Результаты измерения новых очагов включают в сумму результатов измерений).
Стабилизация заболевания(SD)
Не наблюдается ни достаточное уменьшение размеров опухоли, чтобы соответствовать критериям PR, ни достаточное увеличение, чтобы соответствовать критериям PD, при этом эталоном считается наименьшая сумма диаметров в ходе исследования.
Опухолевые антигены, которые можно применять для оценки терапевтического эффекта антител к PD-1, описанных в данном документе, включают ApoE, CD11c, CD40, CD45 (PTPRC), CD49D (ITGA4), CD80, CSF1R, CTSD, GZMB, Ly86, MS4A7, PIK3AP1, PIK3CD, CD74, CCL5, CCR5, CXCL10, IFNG, IL10RA1, IL-6, ACTA2, COL7A1, LOX, LRRC15, MCPT8, MMP10, NOG, SERPINE1, STAT1, TGFBR1, CTSS, PGF, VEGFA, C1QA, C1QB, ANGPTL4, EGLN, ANGPTL4, EGLN3, BNIP3, AIF1, CCL5, CXCL10, CXCL11, IFI6, PLOD2, KISS1R, STC2, DDIT4, OX40, OX40L, PFKFB3, PGK1, PDK1, AKR1C1, AKR1C2, CADM1, CDH11, COL6A3, CTGF, HMOX1, KRT33A, LUM, WNT5A, IGFBP3, MMP14, CDCP1, PDGFRA, TCF4, TGF, TGFB1, TGFB2, CD11b, ADGRE1 (EMR1, F4/80), CD86, CD68, MHC-класса II, CD3, HLA-DR, CD4, CD3, CD5, CD19, CD7, CD8, CD16, TCRαβ, TCRγδ, PD-1, PD-L1, CTLA-4, кислую фосфатазу, ACTH, щелочную фосфатазу, альфа-фетопротеин CA-125, CA15-3, CA19-9, CA-195, C-212, CA-549, кальцитонин, катехоламины, катепсин-D, CEA, ERBB2 (HER2/neu), хромогранин-A, c-Myc, EGFR, ERA (анализ эстрогеновых рецепторов), ферритин, гастрин, 5-HIAA, hCG, альфа-HCG, бета-HCG, HVA, LDH1-5, NSE (нейрон-специфическая енолаза), панкреатический полипептид, PLAP, PLP, PRA (прогестероновый рецептор A), C-пептид проинсулина, PSA, SMA, SCC, тиреоглобулин, TDT, TPA и альфа-TSH. Данные опухолевые антигены можно оценивать на уровне ДНК, РНК или белка с применением методик секвенирования ДНК, методик секвенирования РНК, микроматричного анализа на генном чипе, способов на основе ПЦР, способов проточной цитометрии или иммуногистохимии, которые известны экспертам в данной области.
Одним иллюстративным терапевтическим эффектом в результате применения антител к PD-1, описанных в данном документе, для лечения солидных опухолей, независимо от того, вводят их как монотерапию или в дополнение или совместно с другими видами терапии или средствами, является полный ответ. Другим иллюстративным терапевтическим эффектом в результате применения антител к PD-1, описанных в данном документе, для лечения солидных опухолей, независимо от того, вводят их как монотерапию или в дополнение или совместно с другими видами терапии или средствами, является частичный ответ.
Для обозначения ответа, предоставляемого каждым пациентом через определенную систему предоставления информации, также можно применять валидированные шкалы результатов, сообщаемых пациентами. Такие шкалы результатов не акцентируют внимание на заболевании, а связаны с сохранением функционирования при лечении хронического состояния. Одним неограничивающим примером валидированной шкалы результатов, сообщаемых пациентами, является PROMIS (Информационная система для измерения результатов, сообщаемых пациентами) от Национальных институтов здравоохранения Соединенных Штатов Америки. Например, с помощью инструмента для оценки функционального статуса PROMIS для взрослых пациентов с раком можно оценивать сообщаемые самими пациентами возможности функционирования верхних конечностей (например, точную координацию движений), нижних конечностей (например, ходьбу или подвижность) и центральных частей тела (например, подвижность шеи и спины) и обычные формы повседневной активности, такие как выполнение обычных дел.
Кривые Каплана-Мейера (Kaplan and Meier, J. Am. Stat. Assoc. 1958; 53(282): 457-481) также можно использовать для оценки общей выживаемости и выживаемости без прогрессирования у пациентов с раком, проходящих терапию антителом к PD-1, по сравнению со стандартом лечения.
7.6.2. Виды дополнительной терапии
Антитела к PD-1 можно использовать в дополнение или совместно с другими средствами или видами лечения, обладающими противораковыми свойствами. При применении в качестве дополнительной терапии антитело к PD-1 и другое(другие) средство(средства) может(могут) составляться вместе в одном комбинированном фармацевтическом составе или может(могут) составляться и вводиться отдельно, либо в виде одной координированной схемы введения доз, либо в виде разных схем введения доз. Средства, вводимые в дополнение или совместно с антителами к PD-1, как правило, будут характеризоваться взаимодополняющими видами активности для антител к PD-1, вследствие чего антитела и другие средства не будут оказывать неблагоприятного воздействия друг на друга.
Средства, которые можно применять в качестве дополнительной терапии с антителами к PD-1, включают без ограничения алкилирующие средства, ингибиторы ангиогенеза, антитела, антиметаболиты, антимитотические средства, антипролиферативные средства, противовирусные средства, ингибиторы аврора-киназы, факторы, способствующие апоптозу (например, ингибиторы семейства Bcl-2), активаторы пути рецепторов смерти, ингибиторы Bcr-Abl киназы, антитела BiTE (биспецифические активаторы, привлекающие T-клетки), конъюгаты антител и лекарственных средств, модификаторы биологических ответов, ингибиторы тирозинкиназы (BTK) Брутона, ингибиторы циклинзависимых киназ, ингибиторы клеточного цикла, ингибиторы циклооксигеназы-2, DVD, ингибиторы рецепторов гомолога вирусного онкогена лейкоза (ErbB2), ингибиторы факторов роста, ингибиторы белка 90 теплового шока (HSP-90), ингибиторы гистондеацетилазы (HDAC), средства гормональной терапии, иммунологические препараты, ингибиторы ингибиторов белков апоптоза (IAP), интеркалирующие антибиотики, ингибиторы киназ, ингибиторы кинезинов, ингибиторы Jak2, ингибиторы мишени рапамицина у млекопитающих, микроРНК, ингибиторы митоген-активируемых киназ, регулируемых внеклеточными сигналами, мультивалентные связывающие белки, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства (NSAID), ингибиторы поли-АДФ(аденозиндифосфат)- рибозо-полимеразы (PARP), химиотерапевтические препараты на основе платины, ингибиторы Polo-подобных киназ (Plk), ингибиторы фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), ингибиторы протеасом, аналоги пуринов, аналоги пиримидинов, ингибиторы рецепторных тирозинкиназ, ретиноиды/дельтоиды, растительные алкалоиды, малые ингибирующие рибонуклеиновые кислоты (siRNA), ингибиторы топоизомераз, ингибиторы убиквитинлигазы и т. п., а также комбинации одного или нескольких из этих средств.
Антитела BiTE представляют собой биспецифические антитела, которые заставляют T-клетки атаковать раковые клетки посредством одновременного связывания с этими двумя клетками. Затем T-клетка атакует целевую раковую клетку. Примеры антител BiTE включают адекатумумаб (Micromet MT201), блинатумомаб (Micromet MT103) и т. п. Не ограничиваясь теорией, одним из механизмов, с помощью которых Т-клетки запускают апоптоз у целевой раковой клетки, является экзоцитоз компонентов цитолитической гранулы, которые включают перфорин и гранзим B.
3
SiRNA представляют собой молекулы, которые содержат эндогенные РНК-основания или химически модифицированные нуклеотиды. Модификации не приводят к прекращению функционирования клетки, а скорее придают ей повышенную устойчивость и/или повышенную клеточную активность. Примеры химических модификаций включают фосфоротиоатные группы, 2'-дезоксинуклеотид, рибонуклеотиды, содержащие 2'-OCH, 2'-F-рибонуклеотиды, 2'-метоксиэтил-рибонуклеотиды, их комбинации и т. п. siRNA могут иметь различные значения длины (например, 10-200 пар оснований) и различные структуры (например, шпильки, одиночные/двойные нити, петли, однонитевые разрывы/двухнитевые разрывы, ошибочные спаривания) и подвергаются процессингу в клетках с обеспечением сайленсинга активных генов. Двухнитевая siRNA (dsRNA) может иметь равное количество нуклеотидов на каждой нити (тупые концы) или асимметричные (липкие) концы. Выступ из 1-2 нуклеотидов может присутствовать на смысловой и/или антисмысловой нити, а также присутствовать на 5'- и/или 3'-концах данной нити.
Мультивалентные связывающие белки представляют собой связывающие белки, содержащие два или более антигенсвязывающих центра. Мультивалентные связывающие белки конструируют так, чтобы они содержали три или более антигенсвязывающих центра, и они, как правило, представляют собой антитела, не встречающиеся в природе. Термин "мультиспецифический связывающий белок" означает связывающий белок, способный связывать две или более родственные или неродственные мишени. Связывающие белки с двойным вариабельным доменом (DVD) представляют собой тетравалентные или мультивалентные связывающие белки, содержащие два или более антигенсвязывающих центров. Такие DVD могут быть моноспецифическими (то есть способными связывать один антиген) или мультиспецифическими (то есть способными связывать два или более антигенов). DVD-связывающие белки, содержащие два DVD-полипептида тяжелой цепи и два DVD-полипептида легкой цепи, обозначаются как DVD-Ig. Каждая половина DVD-Ig содержит DVD-полипептид тяжелой цепи, DVD-полипептид легкой цепи и два антигенсвязывающих центра. Каждый связывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, содержащие в общей сложности 6 CDR, вовлеченных в связывание антигена, на антигенсвязывающий центр.

Алкилирующие средства включают без ограничения алтретамин, AMD-473, AP-5280, апазиквон, бендамустин, бросталлицин, бусульфан, карбоквон, кармустин (BCNU), хлорамбуцил, CLORETAZINE (ларомустин, VNP 40101M), циклофосфамид, дакарбазин, эстрамустин, фотемустин, глюфосфамид, ифосфамид, KW-2170, ломустин (CCNU), мафосфамид, мелфалан, митобронитол, митолактол, нимустин, N-оксид азотистого иприта, ранимустин, темозоломид, тиотепу, TREANDA (бендамустин), треосульфан и трофосфамид.
Ингибиторы ангиогенеза включают без ограничения ингибиторы эндотелий-специфической рецепторной тирозинкиназы (Tie-2), ингибиторы рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR), ингибиторы рецепторов фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ингибиторы дельта-подобного лиганда 4 (DLL4), ингибиторы рецепторов инсулиноподобного фактора роста-2 (IGFR-2), ингибиторы матриксной металлопротеиназы-2 (MMP-2), ингибиторы матриксной металлопротеиназы-9 (MMP-9), ингибиторы рецепторов тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), аналоги тромбоспондина и ингибиторы рецепторной тирозинкиназы фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR).
Конъюгаты антител и лекарственных средств включают без ограничения таковые, которые нацеливаются на киназу c-Met (например, ADC, описанные в патенте США № 7615529), LRRC15, CD30 (например, ADCETRIS (брентуксимаб ведотин)), CS1 (например, ADC, описанные в публикации заявки на патент США № 20160122430), DLL3 (например, ровалпитузумаб тезирин (ROVA-T)), HER2 (например, KADCYLA (трастузумаб эмтанзин)), EGFR (например, ADC, описанные в публикации заявки на патент США № 20150337042) и пролактиновый рецептор (например, ADC, описанные в публикации заявки на патент США № 20140227294).
Антиметаболиты включают без ограничения ALIMTA (пеметрексед динатрия, LY231514, MTA), 5-азацитидин, XELODA (капецитабин), кармофур, LEUSTAT (кладрибин), клофарабин, цитарабин, цитарабина окфосфат, цитозин-арабинозид, децитабин, дефероксамин, доксифлуридин, эфлорнитин, EICAR (5-этинил-1-β-D-рибофуранозилимидазол-4-карбоксамид), эноцитабин, этнилцитидин, флударабин, 5-фторурацил отдельно или в комбинации с лейковорином, GEMZAR (гемцитабин), гидроксимочевину, ALKERAN (мелфалан), меркаптопурин, 6-меркаптопурина рибозид, метотрексат, микофеноловую кислоту, неларабин, нолатрексед, окфосфат, пелитрексол, пентостатин, ралтитрексед, рибавирин, триапин, триметрексат, S-1, тиазофурин, тегафур, TS-1, видарабин и UFT.
Противовирусные препараты включают без ограничения ритонавир, ацикловир, цидофовир, ганцикловир, фоскарнет, зидовудин, рибавирин и гидроксихлорохин.
Ингибиторы аврора-киназ включают без ограничения ABT-348, AZD-1152, MLN-8054, VX-680, специфические ингибиторы аврора A-киназы, специфические ингибиторы аврора В-киназы и ингибиторы всех аврора-киназ.
Ингибиторы белка Bcl-2 включают без ограничения ABT-263 (навитоклакс), AT-101 ((-)госсипол), GENASENSE (G3139 или облимерсен (антисмысловой олигонуклеотид, нацеливающийся на Bcl-2)), IPI-194, IPI-565, N- (4- (4- ((4'-хлор(1,1'-бифенил)- 2-ил)метил)пиперазин-1-ил)бензоил)- 4- (((1R)- 3- (диметиламино)- 1- ((фенилсульфанил)метил)пропил)амино)- 3-нитробензолсульфонамид), N- (4- (4- ((2- (4-хлорфенил)- 5,5-диметил-1-циклогекс-1-ен-1-ил)метил)пиперазин-1-ил)бензоил)- 4- (((1R)- 3- (морфолин-4-ил)- 1- ((фенилсульфанил)метил)пропил)амино)- 3- ((трифторметил)сульфонил)бензолсульфонамид, венетоклакс и GX-070 (обатоклакс).
Ингибиторы киназ Bcr-Abl включают без ограничения DASATINIB (BMS-354825) и GLEEVEC (иматиниб).
Ингибиторы BTK включают без ограничения ибрутиниб и акалабруниб.
Ингибиторы CDK включают без ограничения AZD-5438, BMI-1040, BMS-032, BMS-387, CVT-2584, флавопиридол, GPC-286199, MCS-5A, PD0332991, PHA-690509, селициклиб (CYC-202, R-росковитин) и ZK-304709.
Ингибиторы COX-2 включают без ограничения ABT-963, ARCOXIA (эторикоксиб), BEXTRA (валдекоксиб), BMS347070, CELEBREX (целекоксиб), COX-189 (люмиракоксиб), CT-3, DERAMAXX (деракоксиб), JTE-522, 4-метил-2- (3,4-диметилфенил)- 1- (4-сульфамоилфенил-1H-пиррол), MK-663 (эторикоксиб), NS-398, парекоксиб, RS-57067, SC-58125, SD-8381, SVT-2016, S-2474, T-614 и VIOXX (рофекоксиб).
Ингибиторы EGFR включают без ограничения ABX-EGF, иммунолипосомы, нацеливающиеся на EGFR, EGF-вакцину, EMD-7200, ERBITUX (цетуксимаб), HR3, IgA-антитела, IRESSA (гефитиниб), TARCEVA (эрлотиниб или OSI-774), TAGRISSO (осимертиниб), TP-38, слитый белок с EGFR и TYKERB (лапатиниб).
Ингибиторы рецептора ErbB2 включают без ограничения CP-724-714, CI-1033 (канертиниб), HERCEPTIN (трастузумаб), TYKERB (лапатиниб), OMNITARG (2C4, пертузумаб), TAK-165, GW-572016 (ионафарниб), GW-282974, EKB-569, PI-166, dHER2 (HER2-вакцина), APC-8024 (HER-2-вакцина), биспецифическое антитело к HER/2neu, B7.her2IgG3, трифункциональные биспецифические антитела AS HER2, mAB AR-209 и mAB 2B-1.
Ингибиторы гистондеацетилазы включают без ограничения депсипептид, LAQ-824, MS-275, трапоксин, субероиланилид гидроксамовой кислоты (SAHA), TSA и вальпроевую кислоту.
Ингибиторы HSP-90 включают без ограничения 17-AAG-nab, 17-AAG, CNF-101, CNF-1010, CNF-2024, 17-DMAG, гелданамицин, IPI-504, KOS-953, MYCOGRAB (рекомбинантное антитело человека к HSP-90), NCS-683664, PU24FCl, PU-3, радицикол, SNX-2112, STA-9090 и VER49009.
Ингибиторы белков апоптоза включают без ограничения HGS1029, GDC-0145, GDC-0152, LCL-161 и LBW-242.
Активаторы пути рецепторов смерти включают без ограничения TRAIL, антитела или другие средства, которые нацеливаются на TRAIL или рецепторы смерти (например, DR4 и DR5), такие как апомаб, конатумумаб, ETR2-ST01, GDC0145 (лексатумумаб), HGS-1029, LBY-135, PRO-1762 и трастузумаб.
Ингибиторы кинезина включают без ограничения ингибиторы Eg5, такие как AZD4877, ARRY-520; и ингибиторы CENPE, такие как GSK923295A.
Ингибиторы JAK-2 включают без ограничения CEP-701 (лезауртиниб), XL019 и INCB018424.
Ингибиторы MEK включают без ограничения ARRY-142886, ARRY-438162, PD-325901 и PD-98059.
Ингибиторы mTOR включают без ограничения AP-23573, CCI-779, эверолимус, RAD-001, рапамицин, темсиролимус, АТР-конкурентные ингибиторы TORC1/TORC2, включая PI-103, PP242, PP30 и Торин 1.
Нестероидные противовоспалительные лекарственные средства включают без ограничения AMIGESIC (салсалат), DOLOBID (дифлунисал), MOTRIN (ибупрофен), ORUDIS (кетопрофен), RELAFEN (набуметон), FELDENE (пироксикам), ибупрофен крем, ALEVE (напроксен) и NAPROSYN (напроксен), VOLTAREN (диклофенак), INDOCIN (индометацин), CLINORIL (сулиндак), TOLECTIN (толметин), LODINE (этодолак), TORADOL (кеторолак) и DAYPRO (оксапрозин).
Ингибиторы PDGFR включают без ограничения C-451, CP-673 и CP-868596.
Средства химиотерапии на основе платины включают без ограничения цисплатин, ELOXATIN (оксалиплатин), эптаплатин, лобаплатин, недаплатин, PARAPLATIN (карбоплатин), сатраплатин и пикоплатин.
Ингибиторы Polo-подобных киназ включают без ограничения BI-2536.
Ингибиторы фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) включают без ограничения вортманин, LY294002, XL-147, CAL-120, ONC-21, AEZS-127, ETP-45658, PX-866, GDC-0941, BGT226, BEZ235 и XL765.
Аналоги тромбоспондина включают без ограничения ABT-510, ABT-567, ABT-898 и TSP-1.
Ингибиторы VEGFR включают без ограничения ABT-869, AEE-788, ANGIOZYME™ (рибозим, который ингибирует ангиогенез (Ribozyme Pharmaceuticals (Боулдер, Колорадо) и Chiron (Эмеривилл, Калифорния)), акситиниб (AG-13736), AZD-2171, CP-547632, CYRAMZA (рамуцирумаб), IM-862, MACUGEN (пегаптамиб), NEXAVAR (сорафениб, BAY43-9006), пазопаниб (GW-786034), ваталаниб (PTK-787, ZK-222584), SUTENT (сунитиниб, SU-11248), STIVARGA (регорафениб), ловушку для VEGF и ZACTIMA™ (вандетаниб, ZD-6474).
Антибиотики включают без ограничения интеркалирующие антибиотики акларубицин, актиномицин D, амрубицин, аннамицин, адриамицин, BLENOXANE (блеомицин), даунорубицин, CAELYX или MYOCET (липосомальный доксорубицин), элсамитруцин, эпирубицин, гларубицин, ZAVEDOS (идарубицин), митомицин C, неморубицин, неокарциностатин, пепломицин, пирарубицин, ребеккамицин, стималамер, стрептозоцин, VALSTAR (валрубицин) и зиностатин.
TM
Ингибиторы топоизомеразы включают без ограничения акларубицин, 9-аминокамптотецин, амонафид, амсакрин, бекатекарин, белотекан, BN-80915, CAMPTOSAR (иринотекана гидрохлорид), камптотецин, CARDIOXANE (дексразоксин), дифломотекан, эдотекарин, ELLENCE или PHARMORUBICIN (эпирубицин), этопозид, эксатекан, 10-гидроксикамптотецин, гиматекан, луртотекан, митоксантрон, Onivyde (липосомальный иринотекан), оратецин, пирарбуцин, пиксантрон, рубитекан, собузоксан, SN-38, тафлупозид и топотекан.
Антитела включают без ограничения AVASTIN (бевацизумаб), CD40-специфические антитела, chTNT-1/B, деносумаб, ERBITUX (цетуксимаб), HUMAX-CD4 (занолимумаб), IGF1R-специфические антитела, линтузумаб, OX-40-специфические антитела, PANOREX (эдреколомаб), RENCAREX (WX G250), RITUXAN (ритуксимаб), тицилимумаб, трастузумаб, пертузумаб, VECTIBIX (панитумумаб) и антитела к CD20 типов I и II.
Средства гормональной терапии включают без ограничения ARIMIDEX (анастрозол), AROMASIN (экземестан), арзоксифен, CASODEX (бикалутамид), CETROTIDE (цетрореликс), дегареликс, деслорелин, DESOPAN (трилостан), дексаметазон, DROGENIL (флутамид), EVISTA (ралоксифен), AFEMA™ (фадрозол), FARESTON (торемифен), FASLODEX (фулвестрант), FEMARA (летрозол), форместан, глюкокортикоиды, HECTOROL (доксеркальциферол), RENAGEL (севеламера карбонат), лазофоксифен, лейпролида ацетат, MEGACE (мегестерол), MIFEPREX (мифепристон), NILANDRON™ (нилутамид), NOLVADEX (тамоксифена цитрат), PLENAXIS™ (абареликс), преднизон, PROPECIA (финастерид), рилостан, SUPREFACT (бусерелин), TRELSTAR (рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона (LHRH)), VANTAS (имплантат с гистрелином), VETORYL (трилостан или модрастан) и ZOLADEX (фосрелин, гозерелин).
Дельтоиды и ретиноиды включают без ограничения сеокальцитол (EB1089, CB1093), лексакальцитрол (KH1060), фенретинид, PANRETIN (алиретиноин), ATRAGEN (липосомальный третиноин), TARGRETIN (бексаротен) и LGD-1550.
Ингибиторы PARP включают без ограничения ABT-888 (велипариб), KU-59436, AZD-2281 (олапариб), AG-014699 (рукапариб), MK4827 (нирапариб), BMN-673 (талазопариб), инипариб, BSI-201, BGP-15, INO-1001 и ONO-2231.
Растительные алкалоиды включают без ограничения винкристин, винбластин, виндезин и винорелбин.
Ингибиторы протеосом включают без ограничения VELCADE (бортезомиб), KYPROLIS (карфилзомиб), MG132, NPI-0052 и PR-171.
Примеры иммунологических средств включают без ограничения интерфероны, ингибиторы контрольных точек иммунного ответа, костимулирующие средства и другие иммуноукрепляющие средства. Интерфероны включают интерферон альфа, интерферон альфа-2a, интерферон альфа-2b, интерферон бета, интерферон гамма-1a, ACTIMMUNE (интерферон гамма-1b) или интерферон гамма-n1, их комбинации и т. п. Ингибиторы контрольных точек иммунного ответа включают антитела, которые нацеливаются на PD-L1 (например, дурвалумаб, атезолизумаб, авелумаб, MEDI4736, MSB0010718C и MPDL3280A) и CTLA4 (антиген 4 цитотоксических лимфоцитов, например, ипилимумаб, тремелимумаб). Костимулирующие средства включают без ограничения антитела против CD3, CD40, CD40L, CD27, CD28, CSF1R, CD137 (например, урелумаб), B7H1, GITR, ICOS, CD80, CD86, OX40, OX40L, CD70, HLA-DR, LIGHT, LIGHT-R, TIM3, A2AR, NKG2A, KIR (например, лирилумаб), TGF-β (например, фрезолимумаб) и их комбинации.
90
Другие средства включают без ограничения ALFAFERONE (IFN-α), BAM-002 (окисленный глутатион), BEROMUN (тасонермин), BEXXAR (тозитумомаб), CAMPATH (алемтузумаб), дакарбазин, денилейкин, эпратузумаб, GRANOCYTE (ленограстим), лентинан, лейкоцитарный альфа-интерферон, имиквимод, вакцину против меланомы, митумомаб, молграмостим, MYLOTARG™ (гемтузумаб озогамицин), NEUPOGEN (филграстим), OncoVAC-CL, OVAREX (ореговомаб), пемтумомаб (Y-muHMFG1), PROVENGE (сипулейцел-Т), саргарамостим, сизофилан, тецелейкин, THERACYS (бацилла Кальметта-Герена), убенимекс, VIRULIZIN (иммунотерапевтическое средство, Lorus Pharmaceuticals), Z-100 (специфичное вещество Маруяма (SSM)), WF-10 (тетрахлордекаоксид (TCDO)), PROLEUKIN (альдеслейкин), ZADAXIN (тималфазин), ZINBRYTA (даклизумаб, полученный высокопродуктивным способом) и ZEVALIN (Y-ибритумомаб тиуксетан).
Модификаторы биологического ответа представляют собой средства, которые модифицируют защитные механизмы живых организмов или биологические ответы, такие как выживание, рост или дифференцировка клеток ткани, направляя их таким образом, чтобы они проявляли противоопухолевую активность, и включают без ограничения крестин, лентинан, сизофиран, пицибанил, PF-3512676 (CpG-8954) и убенимекс.
Аналоги пиримидина включают без ограничения цитарабин (ara C или арабинозид C), цитозин-арабинозид, доксифлуридин, FLUDARA (флударабин), 5-FU (5-фторурацил), флоксуридин, GEMZAR (гемцитабин), TOMUDEX (ратитрексед) и TROXATYL™ (триацетилуридин троксацитабин).
Аналоги пуринов включают без ограничения LANVIS (тиогуанин) и PURINETHOL (мрекаптопурин).
Антимитотические средства включают без ограничения батабулин, эпотилон D (KOS-862), N- (2- ((4-гидроксифенил)амино)пиридин-3-ил)- 4-метоксибензолсульфонамид, иксабепилон (BMS-247550), TAXOL (паклитаксел), TAXOTERE (доцетаксел), PNU100940 (109881), патупилон, XRP-9881 (ларотаксел), винфлунин и ZK-EPO (синтетический эпотилон).
Ингибиторы убиквитин-лигаз включают без ограничения ингибиторы MDM2, такие как нутлины, и ингибиторы NEDD8, такие как MLN4924.
Антитела к PD-1 также можно применять для повышения эффективности лучевой терапии. Примеры лучевой терапии включают наружную дистанционную лучевую терапию, внутреннюю лучевую терапию (т. е. брахитерапию) и системную лучевую терапию.

Антитела к PD-1 можно вводить в дополнение или совместно с другими химиотерапевтическими средствами, такими как ABRAXANE™ (ABI-007), ABT-100 (ингибитор фарнезилтрансферазы), ADVEXIN (вакцина Ad5CMV-p53), ALTOCOR или MEVACOR (ловастатин), AMPLIGEN (поли I:поли C12U, синтетическая РНК), APTOSYN (эксисулинд), AREDIA (памидроновая кислота), арглабин, L-аспарагиназа, атаместан (1-метил-3,17-дион-анроста-1,4-диен), AVAGE (тазаротен), AVE-8062 (производное комбреастатина), BEC2 (митумомаб), кахектин или кахексин (фактор некроза опухоли), канваксин (вакцина), CEAVAC (противораковая вакцина), CELEUK (целмолейкин), CEPLENE (гистамина дигидрохлорид), CERVARIX (вакцина против вируса папилломы человека), CHOP (C: CYTOXAN (циклофосфамид); H: ADRIAMYCIN (гидроксидоксорубицин); O: винкристин (ONCOVIN); P: преднизон), CYPAT™ (ципротерона ацетат), комбрестатин A4P, DAB(389)EGF (каталитический и транслокационный домены дифтерийного токсина, слитые посредством линкера His-Ala с эпидермальным фактором роста человека) или TransMID-107R™ (дифтерийные токсины), дакарбазин, дактиномицин, 5,6-диметилксантенон-4-уксусная кислота (DMXAA), энилурацил, EVIZON™ (скваламина лактат), DIMERICINE (липосомный лосьон T4N5), дискодермолид, DX-8951f (экзатекана мезилат), энзастаурин, EPO906 (эпотилон B), GARDASIL (квадривалентная рекомбинантная вакцина против вируса папилломы человека (типов 6, 11, 16, 18)), GASTRIMMUNE, GENASENSE, GMK (ганглиозид-конъюгированная вакцина), GVAX (вакцина против рака предстательной железы), галофугинон, гистерелин, гидроксикарбамид, ибандроновая кислота, IGN-101, IL-13-PE38, IL-13-PE38QQR (цинтредекина бесудотокс), IL-13-экзотоксин pseudomonas, интерферон-α, интерферон-γ, JUNOVAN™ или MEPACT™ (мифамуртид), лонафарниб, 5,10-метилентетрагидрофолат, милтефосин (гексадецилфосфохолин), NEOVASTAT (AE-941), NEUTREXIN (триметрексата глюкуронат), NIPENT (пентостатин), ONCONASE (фермент рибонуклеаза), ONCOPHAGE (вакцина для лечения меланомы), ONCOVAX (IL-2 вакцина), ORATHECIN™ (рубитекан), OSIDEM (лекарственное средство на основе клеток и антитела), OVAREX MAb (мышиное моноклональное антитело), паклитаксел, PANDIMEX™ (агликоновые сапонины из женьшеня, включающие 20(S)- протопанаксадиол (aPPD) и 20(S)- протопанаксатриол (aPPT)), панитумумаб, PANVAC-VF (экспериментальная противораковая вакцина), пэгаспаргаза, PEG-интерферон A, феноксодиол, прокарбазин, ребимастат, REMOVAB (катумаксомаб), REVLIMID (леналидомид), RSR13 (эфапроксирал), SOMATULINE LA (ланреотид), SORIATANE (ацитретин), стауроспорин (Streptomyces staurospores), талабостат (PT100), TARGRETIN (бексаротен), TAXOPREXIN (DHA-паклитаксел), TELCYTA (канфосфамид, TLK286), темилифен, TEMODAR (темозоломид), тесмилифен, талидомид, THERATOPE (STn-KLH), тимитак (2-амино-3,4-дигидро-6-метил-4-оксо-5- (4-пиридилтио)хиназолина дигидрохлорид), TNFERADE™ (аденовектор: ДНК-носитель, содержащий ген фактора некроза опухоли α), TRACLEER или ZAVESCA (бозентан), третиноин (ретин-A), тетрандрин, TRISENOX (триоксид мышьяка), VIRULIZIN, украин (производное алкалоидов из чистотела большого), витаксин (антитело к αvβ3), XCYTRIN (мотексафин гадолиния), XINLAY™ (атразентан), XYOTAX™ (паклитаксел полиглюмекс), YONDELIS (трабектедин), ZD-6126, ZINECARD (дексразоксан), ZOMETA (золедроновая кислота) и зорубицин, а также комбинации любых из этих средств.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 вводят в дополнение или совместно с конъюгатом антитело-лекарственное средство, нацеливающимся на киназу c-Met, для лечения немелкоклеточного рака легкого, рака головы и шеи, рака поджелудочной железы, колоректального рака или рака желудка.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 вводят в дополнение или совместно с конъюгатом антитело-лекарственное средство, нацеливающимся на LRRC15, для лечения немелкоклеточного рака легкого, рака головы и шеи, рака поджелудочной железы, саркомы, трижды негативного рака молочной железы или меланомы.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 вводят в дополнение или совместно с конъюгатом антитело-лекарственное средство, нацеливающимся на EGFR, для лечения глиобластомы.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 вводят в дополнение или совместно с конъюгатом антитело-лекарственное средство, нацеливающимся на CS1, для лечения злокачественного заболевания крови, такого как множественная миелома.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 вводят в дополнение или совместно с конъюгатом антитело-лекарственное средство, нацеливающимся на DLL3, для лечения мелкоклеточного рака легкого или глиобластомы.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 вводят в дополнение или совместно с белком, направленным против CD40, для лечения рака головы и шеи, рака легкого (такого как аденокарцинома, немелкоклеточный рак легкого, мезотелиома, мелкоклеточный рак легкого), меланомы, рака яичника или рака поджелудочной железы.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 вводят в дополнение или совместно с венетоклаксом для лечения злокачественного заболевания крови, такого как хронический лимфоцитарный лейкоз.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 вводят в дополнение или совместно с ибрутинибом для лечения злокачественного заболевания крови, такого как хронический лимфоцитарный лейкоз, лимфом из клеток мантийной зоны, или макроглобулинемия Вальденстрема, или солидной опухоли.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 вводят в дополнение или совместно с ипилимумабом и конъюгатом антитело-лекарственное средство, нацеливающимся на киназу c-Met, для лечения немелкоклеточного рака легкого.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 вводят в дополнение или совместно с ипилимумабом и конъюгатом антитело-лекарственное средство, нацеливающимся на LRRC15, для лечения немелкоклеточного рака легкого.
7.7. Дозы и схемы введения
Количество вводимых антител к PD-1 будет зависеть от множества факторов, включая без ограничения конкретный тип солидной опухоли, подлежащей лечению, стадию солидной опухоли, подлежащей лечению, способ введения, частоту введения, необходимый терапевтический эффект и другие параметры, такие как возраст, масса и другие характеристики пациента и т. д. Определение доз, эффективных для обеспечения терапевтического эффекта при конкретных путях и частоте введения, находится в пределах возможностей специалистов в данной области.
Дозы, эффективные для обеспечения терапевтического эффекта, можно первоначально оценить на животных моделях in vivo или в клинических условиях. Подходящие животные модели для множества заболеваний известны из уровня техники.
Антитела к PD-1, раскрытые в данном документе, можно вводить любым путем, подходящим для состояния, подлежащего лечению. В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 представляет собой любое из гуманизированных антител, перечисленных в таблице 3. В конкретном варианте осуществления антитело к PD-1 имеет тяжелую цепь в соответствии с SEQ ID NO:51 или SEQ ID NO:52 и легкую цепь в соответствии с SEQ ID NO:61. Антитело к PD-1, как правило, будут вводить парентерально, т. е. с помощью инфузии, подкожной, внутримышечной, внутривенной (IV), внутрикожной, интратекальной, болюсной, внутриопухолевой инъекции или эпидуральной инъекции ((Shire et al., 2004, J. Pharm. Sciences 93(6):1390-1402)). В одном варианте осуществления антитело к PD-1 представлено в виде лиофилизированного порошка во флаконе. Флаконы могут содержать 100 мг, 110 мг, 120 мг, 150 мг, 200 мг, 250 мг, 300 мг или 400 мг антитела к PD-1. Перед введением лиофилизированный порошок растворяют стерильной водой для инъекций (SWFI) или другой подходящей средой с получением раствора, содержащего 20 мг/мл антитела к PD-1. В некоторых вариантах осуществления полученный растворенный раствор дополнительно разбавляют солевым раствором или другой подходящей средой для инфузий и вводят посредством IV инфузии два раза каждые 7 дней, один раз каждые 7 дней, один раз каждые 14 дней, один раз каждый 21 день, один раз каждые 28 дней, один раз каждые 35 дней, один раз каждые 42 дня, один раз каждые 49 дней или один раз каждые 56 дней. В некоторых вариантах осуществления в рамках первого цикла инфузию выполняют в течение 90 минут. В некоторых вариантах осуществления последующие инфузии выполняют в течение 60 минут.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 вводят в виде IV инфузии один раз каждые 7 дней из расчета 0,1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2,0 мг/кг, 3,0 мг/кг, 4,0 мг/кг, 5,0 мг/кг, 6,0 мг/кг, 8,0 мг/кг или 10,0 мг/кг.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 вводят в виде IV инфузии один раз каждые 14 дней из расчета 0,1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2,0 мг/кг, 3,0 мг/кг, 4,0 мг/кг, 5,0 мг/кг, 6,0 мг/кг, 8,0 мг/кг или 10,0 мг/кг.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 вводят в виде IV инфузии один раз каждый 21 день из расчета 0,1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2,0 мг/кг, 3,0 мг/кг, 4,0 мг/кг, 5,0 мг/кг, 6,0 мг/кг, 8,0 мг/кг или 10,0 мг/кг.
В некоторых вариантах осуществления антитело к PD-1 вводят в виде IV инфузии один раз каждые 28 дней из расчета 0,1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1,0 мг/кг, 2,0 мг/кг, 3,0 мг/кг, 4,0 мг/кг, 5,0 мг/кг, 6,0 мг/кг, 8,0 мг/кг или 10,0 мг/кг.
В одном иллюстративном варианте осуществления антитело к PD-1 применяют в дополнение к ипилимумабу (YERVOY) для лечения немелкоклеточного рака легкого. Антитело к PD-1 вводят посредством IV инфузии один раз каждый 21 день из расчета 1,0 мг/кг или 3,0 мг/кг. Ипилимумаб вводят посредством внутривенной инфузии в дозе 1 мг/кг один раз каждые три недели в виде четырех доз. После последней дозы ипилимумабы антитело к PD-1 вводят посредством IV инфузии один раз каждые 14 дней из расчета 1,0 мг/кг или 3,0 мг/кг. Терапию антителом к PD-1 в дополнение к ипилимумабу продолжают до момента прогрессирования заболевания или до тех пор, пока пациент переносит лечение.
В одном иллюстративном варианте осуществления антитело к PD-1 применяют в дополнение к ипилимумабу (YERVOY) для лечения немелкоклеточного рака легкого. Антитело к PD-1 вводят посредством IV инфузии один раз каждые 14 дней из расчета 1,0 мг/кг или 3,0 мг/кг. Ипилимумаб вводят посредством внутривенной инфузии в дозе 1 мг/кг один раз каждые шесть недель в виде четырех доз. Терапию антителом к PD-1 в дополнение к ипилимумабу продолжают до момента прогрессирования заболевания или до тех пор, пока пациент переносит лечение.
В одном иллюстративном варианте осуществления антитело к PD-1 применяют в дополнение к ипилимумабу (YERVOY) для лечения немелкоклеточного рака легкого. Антитело к PD-1 вводят посредством IV инфузии один раз каждые 14 дней из расчета 1,0 мг/кг или 3,0 мг/кг. Ипилимумаб вводят посредством внутривенной инфузии в дозе 1 мг/кг один раз каждые двенадцать недель в виде четырех доз. Терапию антителом к PD-1 в дополнение к ипилимумабу продолжают до момента прогрессирования заболевания или до тех пор, пока пациент переносит лечение.
При введении в дополнение или совместно с другими средствами, такими как другие химиотерапевтические средства, антитела к PD-1 можно вводить по той же схеме, что и другое(другие) средство(средства), или по другой схеме. При введении по той же схеме антитело к PD-1 можно вводить до другого средства, после него или одновременно с ним. В некоторых вариантах осуществления, где антитело к PD-1 вводят в дополнение или совместно со стандартами лечения, антитело к PD-1 можно начинать вводить до начала приема стандартной терапии, например, за день, за несколько дней, за неделю, за несколько недель, за месяц или даже за несколько месяцев до начала приема средств стандарта лечения. В некоторых вариантах осуществления, где антитело к PD-1 вводят в дополнение или совместно со стандартами лечения, антитело к PD-1 можно начинать вводить после начала приема стандартной терапии, например через день, через несколько дней, через неделю, через несколько недель, через месяц или даже через несколько месяцев после начала приема средств стандарта лечения.
Как будет понятно специалистам в данной области, рекомендуемые дозы для различных средств, описанных выше, может потребоваться скорректировать для оптимизации ответа пациента и получения максимального терапевтического эффекта.
7.8. Иллюстративные варианты осуществления
Ниже приведены иллюстративные пронумерованные варианты осуществления настоящего изобретения.
H
L
H
H
H
L
L
L
1. Связывающий белок на основе антитела к PD-1, который содержит (i) цепь V, содержащую три CDR; и (ii) цепь V, содержащую три CDR, где: CDR №1 V представляет собой GYTFTHYGMN (SEQ ID NO:11); CDR №2 V представляет собой WVNTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO:12); CDR №3 V представляет собой EGEGLGFGD (SEQ ID NO:13); CDR №1 V представляет собой RSSQSIVHSHGDTYLE (SEQ ID NO:14); CDR №2 V представляет собой KVSNRFS (SEQ ID NO:15); и CDR №3 V представляет собой FQGSHIPVT (SEQ ID NO:16).
H
L
2. Связывающий белок на основе антитела к PD-1 согласно варианту осуществления 1, который содержит цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:31; и цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:41.
3. Связывающий белок на основе антитела к PD-1 согласно варианту осуществления 1, который является гуманизированным.
H
L
4. Связывающий белок на основе антитела к PD-1 согласно варианту осуществления 3, который содержит цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:36; и цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:42.
H
L
H
H
H
L
L
L
5. Связывающий белок на основе антитела к PD-1, который содержит (i) цепь V, содержащую три CDR; и (ii) цепь V, содержащую три CDR, где: CDR №1 V представляет собой GYTFTHYGMN (SEQ ID NO:11); CDR №2 V представляет собой WVNTYTGEPTYADDFKG (SEQ ID NO:12); CDR №3 V представляет собой EGEGMGFGD (SEQ ID NO:23); CDR №1 V представляет собой RSSQSIVHSHGDTYLE (SEQ ID NO:14); CDR №2 V представляет собой KVSNRFS (SEQ ID NO:15); и CDR №3 V представляет собой FQGSHIPVT (SEQ ID NO:16).
H
L
6. Связывающий белок на основе антитела к PD-1 согласно варианту осуществления 5, который содержит цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:33; и цепь V, последовательность которой соответствует SEQ ID NO:42.
7. Связывающий белок на основе антитела к PD-1 согласно любому из вариантов осуществления 1-6, который представляет собой IgG.
1
8. Связывающий белок на основе антитела к PD-1 согласно варианту осуществления 7, который представляет собой IgG, необязательно содержащий вариантный домен CH2, содержащий аминокислотные замены L234A и L235A.
4
9. Связывающий белок на основе антитела к PD-1 согласно варианту осуществления 7, который представляет собой IgG, необязательно содержащий вариантную область Fc, содержащую аминокислотную замену S228P.
10. Связывающий белок на основе антитела к PD-1 согласно варианту осуществления 8, который содержит тяжелую цепь, соответствующую последовательности под SEQ ID NO:51 или SEQ ID NO:52, и легкую цепь, соответствующую последовательности под SEQ ID NO:61.
D
11. Связывающий белок на основе антитела к PD-1 согласно любому из вариантов осуществления 1-10, который характеризуется K, составляющей менее приблизительно 100 нМ.
D
12. Связывающий белок на основе антитела к PD-1 согласно варианту осуществления 11, который характеризуется K, составляющей менее приблизительно 10 нМ.
13. Фармацевтическая композиция, содержащая связывающий белок на основе антитела к PD-1 согласно любому из вариантов осуществления 1-12 и фармацевтически приемлемый носитель.
14. Нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую связывающий белок на основе антитела к PD-1 согласно любому из вариантов осуществления 1-12.
15. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту согласно варианту осуществления 14.
16. Прокариотическая клетка-хозяин, трансформированная вектором согласно варианту осуществления 15.
17. Эукариотическая клетка-хозяин, трансформированная вектором согласно варианту осуществления 15.
18. Эукариотическая клетка-хозяин, сконструированная для экспрессии нуклеиновой кислоты согласно варианту осуществления 14.
19. Эукариотическая клетка-хозяин согласно варианту осуществления 18, которая представляет собой клетку-хозяина млекопитающего.
20. Способ получения его связывающего белка на основе антитела к PD-1, предусматривающий: (a) культивирование клетки-хозяина согласно варианту осуществления 17 или варианту осуществления 18 и (b) выделение связывающего белка на основе антитела к PD-1.
21. Способ активации иммунной системы, предусматривающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, связывающего белка на основе антитела к PD-1 согласно любому из вариантов осуществления 1-12 или фармацевтической композиции согласно варианту осуществления 13.
22. Способ лечения рака, предусматривающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, связывающего белка на основе антитела к PD-1 согласно любому из вариантов осуществления 1-12 или фармацевтической композиции согласно варианту осуществления 13.
23. Способ согласно варианту осуществления 22, где рак выбран из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака головы и шеи, рака почки, рака легкого, лимфомы, меланомы и рака желудка.
24. Способ согласно варианту осуществления 23, где рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого.
25. Способ согласно варианту осуществления 22, в котором связывающий белок на основе антитела к PD-1 вводят в виде монотерапии.
26. Способ согласно варианту осуществления 22, в котором связывающий белок на основе антитела к PD-1 вводят в дополнение или совместно с другим средством, обычно применяемым для лечения рака.
27. Способ согласно варианту осуществления 26, в котором другое средство выбирают из облучения, химиотерапии, конъюгата антитела и лекарственного средства, антитела к CD40, антитела к CTLA-4 и антитела к OX40.
28. Способ согласно варианту осуществления 27, в котором средств для химиотерапии представляет собой цисплатин, карбоплатин, паклитаксел, доцетаксел, гемцитабин, винорелбин, винбластин, иринотекан, этопозид или пеметрексед или их фармацевтически приемлемую соль.
29. Способ согласно варианту осуществления 27, в котором конъюгат антитела и лекарственного средства нацеливается на киназу c-Met.
30. Способ согласно варианту осуществления 27, в котором конъюгат антитела и лекарственного средства нацеливается на LRRC15.
31. Способ согласно варианту осуществления 27, в котором конъюгат антитела и лекарственного средства нацеливается на EGFR.
32. Способ согласно варианту осуществления 27, в котором конъюгат антитела и лекарственного средства нацеливается на CS1.
33. Способ согласно варианту осуществления 27, в котором конъюгат антитела и лекарственного средства представляет собой ровалпитузумаб тезирин.
34. Способ согласно варианту осуществления 27, в котором антитело к CTLA-4 представляет собой ипилимумаб.
8. ПРИМЕРЫ
Следующие примеры, которые освещают некоторые признаки и свойства вариантов осуществления антител к PD-1, описанных в данном документе, приведены для целей иллюстрации, а не для ограничения.
Пример 1. Материалы и способы
8.1.1. Связывание антител со связанным на планшете PD-1 человека в анализе ELISA
96-луночные планшеты Immunolon 4xHB покрывали с помощью 1 мкг/мл слияния PD-1 человека-Fc при 4°C на протяжении ночи. Планшеты блокировали с помощью PBS, содержащего 1% BSA, в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем трижды промывали с помощью PBS, содержащего 0,1% Tween 20 (PBST), с применением устройства для отмывки планшетов. Затем планшеты, покрытые PD-1, инкубировали с указанными концентрациями антител при комнатной температуре (RT) в течение одного часа. Планшеты четыре раза промывали с помощью PBST и затем инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре с 100 мкл специфического к Fab-фрагменту человека антитела козы, конъюгированного с биотином, приготовленного в разведении 1:5000 в PBS, содержащем 1% BSA. Планшеты промывали пять раз в PBST и в каждую лунку добавляли по 100 мкл стрептавидина, конъюгированного с HRP, в разведении 1:1000 и инкубировали в течение 30 минут при RT. Планшеты промывали пять раз в PBST и в каждую лунку добавляли по 100 мкл TMB One Component и инкубировали при RT до проявления цвета (примерно 5-10 минут). Оптическую плотность (OD) считывали при 650 нм с применением Spectromax190 (Molecular Devices).
8.1.2. Связывание антител с PD-1 человека, экспрессированным на клеточной поверхности
6
Клетки Jurkat, экспрессирующие PD-1, собирали из колб и ресуспендировали до 2×10 клеток/мл в PBS, содержащем 1% BSA. 100 мкл клеток добавляли в круглодонный 96-луночный планшет, содержащий 100 мкл протитрованного тестируемого антитела или изотипического контроля. Клетки инкубировали с антителами при комнатной температуре в течение 25 минут и затем дважды промывали с помощью PBS, содержащего 1% BSA. Клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл вторичного антитела козы к Fab человека, конъюгированного с PE, в разведении 1:250. После 25 минут инкубации при RT клетки дважды промывали с помощью PBS, содержащего 1% BSA, и ресуспендировали в 200 мкл 1% BSA. Клетки анализировали с применением проточного цитометра Becton Dickinson FACSCanto. Данные анализировали с применением программного обеспечения BD FACSDiva (версия 8.0.1).
8.1.3. Связывание антител со связанным на планшете PD-1 макака-крабоеда в анализе ELISA
96-луночные планшеты Immunolon 4xHB покрывали с помощью 1 мкг/мл слияния PD-1 макака-крабоеда-Fc в DPBS при 4°C на протяжении ночи. Планшеты блокировали с помощью PBS, содержащего 1% BSA, в течение 30 минут при RT и затем трижды промывали с помощью PBST (PBS с 0,1% Tween 20) с применением устройства для отмывки планшетов. Затем планшеты, покрытые PD-1, инкубировали с указанными концентрациями антител при комнатной температуре в течение одного часа. Планшеты четыре раза промывали с помощью PBST и затем инкубировали в течение 1 часа при RT с 100 мкл специфического к Fab-фрагменту человека антитела козы, конъюгированного с биотином, приготовленного в разведении 1:5000 в PBS, содержащем 1% BSA. Планшеты промывали пять раз в PBST и в каждую лунку добавляли по 100 мкл стрептавидина, конъюгированного с HRP, в разведении 1:1000 и инкубировали в течение 30 минут при RT. В дальнейшем планшеты пять раз промывали в PBST и в каждую лунку добавляли 100 мкл TMB. One component и инкубировали при RT до проявления цвета (примерно 5-10 минут). Оптическую плотность (OD) считывали при 650 нм с применением Spectromax190 (Molecular Devices).
8.1.4. Связывание антител с активированными CD4+ T-клетками человека
6
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) человека выделяли из лейкоцитарных пленок, приобретенных в Stanford Blood Center (Пало-Альто, Калифорния). Вкратце, лейкоцитарные пленки разводили в соотношении 1:1 с помощью PBS без магния и кальция. Разведенную кровь (30 мл) наслаивали на 15 мл 90% Ficoll-Paque Plus, подготовленного в PBS без магния и кальция, содержащегося в пробирках SepMate. Пробирки центрифугировали при 1200 g в течение 10 минут. Среднюю фазу собирали и дважды промывали в 1x PBS. PBMC культивировали при 2×10 клеток/мл в течение 48 часов в среде RPMI, содержащей 10% HI FCS с 1 мкг/мл PHA и 50 Ед/мл рекомбинантного IL-2 человека. Клетки собирали, промывали и инкубировали с антителами при RT в течение 25 минут. Меченные клетки дважды промывали с помощью PBS, содержащего 1% BSA. Клетки ресуспендировали в 100 мкл PBS+1% BSA и добавляли антитело козы к Fab-фрагменту человека, конъюгированное с PE, и антитело к CD4, конъюгированное с FITC, в разведении 1:250. Через 30 минут клетки дважды промывали с помощью PBS, содержащего 1% BSA, и ресуспендировали в 200 мкл 1% BSA. Клетки анализировали с применением проточного цитометра Becton Dickinson FACSCanto. Данные анализировали с применением программного обеспечения BD FACSDiva (версия 8.0.1).
8.1.5. Аффинность связывания с PD-1 в анализе поверхностного плазмонного резонанса
a
d
D
-1
-1
-1
Кинетические показатели связывания антител к PD-1 с рекомбинантным растворимым ECD (внеклеточным доменом) PD-1 определяли за счет измерений, основанных на поверхностном плазмонном резонансе, которые выполняли на устройстве Biacore T200 при 25°C с применением подхода с анализом захвата Fc. Рекомбинантные внеклеточные домены PD-1 человека (остатки 1-167) и PD-1 макака-крабоеда (остатки 21-167) приобретали из коммерческого источника и дополнительно очищали посредством гель-фильтрации в 10 мМ HEPES, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA. Подготовку чипа и измерения кинетических показателей связывания выполняли в аналитическом буфере HBS-EP+ (10 мМ HEPES, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05% Tween 20). В ходе подготовки чипа для захвата Fc приблизительно 2000 RU поликлонального антитела козы к Fc IgG человека, разведенного до 25 мкг/мл в 10 мМ ацетате натрия (pH 4,5), непосредственно иммобилизировали на поверхности биосенсорного чипа CM5 с применением стандартного набора для сочетания с амином согласно инструкциям и процедурам производителя. Непрореагировавшие фрагменты на поверхности биосенсора блокировали с помощью этаноламина. Для измерений кинетических показателей связывания каждый цикл анализа состоял из следующих стадий: (1) захват тестируемого антитела только на тестируемой поверхности; (2) введение аналита (ECD PD-1 или только буфера) как над эталонной, так и над тестируемой поверхностью, 240 мкл при 80 мкл/мин., после чего диссоциацию контролировали в течение 900 секунд при 80 мкл/мин.; и (3) регенерация поверхности захвата с помощью введений 10 мМ гидрохлорида глицина, pH 1,5, как над эталонной, так и над тестируемой поверхностью. В ходе анализа все измерения сравнивали с поверхностью захвата отдельно (т. e. без захваченного тестируемого антитела), а введение буфера отдельно применяли для двойного сравнения с эталоном. Введения PD-1 находились в диапазоне концентрации от 900 нМ до 11,1 нМ в виде рандомизованной серии 3-кратных разбавлений. Данные обрабатывали и глобально аппроксимировали к модели связывания 1:1 с применением программного обеспечения для оценки Biacore T200, чтобы определить кинетические константы скорости связывания, k (M⋅с) и k (с), и равновесную константу диссоциации K (M).
8.1.6. Блокирование взаимодействия PD-1 с PD-L1 и PD-L2
6
5
Клетки HEK 293G, экспрессирующие PD-1 человека, собирали из колб с конфлюэнтными слоем. Клетки ресуспендовали в PBS при концентрации 2×10 клеток/мл. Клетки (1×10) добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета с V-образным дном и клетки блокировали в течение 15 минут при 4°C с применением блокировки FcR человека. В отдельных планшетах готовили растворы тестируемых антител и изотипического контроля с применением 3-кратного разведения, начиная с концентрации 20 мкг/мл. Клетки промывали в 1x PBS и в планшет, содержащий клетки, добавляли 50 мкл приготовленных разведений антител и 50 мкл лигандов PD-L1 с His-меткой или PD-L2 с His-меткой (10 мкг/мл). Клетки инкубировали при 4°C в течение 30 минут и дважды промывали с помощью 1x PBS. В каждую лунку добавляли антитело к His, конъюгированное с APC (50 мкл), приготовленное при разведении 1:50 в PBS, и инкубировали в течение 30 минут при 4°C. Клетки дважды промывали, ресуспендировали в PBS и обнаруживали с помощью LSR II Fortessa (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния).
8.1.7. Анализ ответа аллогенных смешанных лимфоцитов (MLR) человека с применением очищенных CD4 T-клеток и дендритных клеток
8
5
4
5
PBMC человека выделяли из лейкоцитарных пленок, приобретенных в Stanford Blood Center (Пало-Альто, Калифорния). Вкратце, лейкоцитарные пленки разводили в соотношении 1:1 с помощью PBS без магния и кальция. Разведенную кровь (30 мл) наслаивали на 15 мл 90% Ficoll-Paque Plus, подготовленного в PBS без магния и кальция, содержащегося в пробирках SepMate. Пробирки центрифугировали при 1200 g в течение 10 минут. Среднюю фазу собирали и дважды промывали в 1x PBS. Клетки ресуспендировали при 1×10 на мл в среде AIM-V, содержащей бета-меркаптоэтанол. Дендритные клетки (DC) получал за счет культивирования пластик-адгезивных PBMC во колбах T75 в присутствии 80 нг/мл GM-CSF и 50 нг/мл IL-4 в течение 7 дней. В день 5 в культуры DC добавляли 50 пг/мл IL-1α и 200 пг/мл TNF-α. В день 7 DC собирали из колб, облучали в течение 7,3 минуты при 414 Р/мин. и ресуспендировали до конечной концентрации 1×10 клеток/мл в полной среде (RPMI с L-глутамином, содержащая 10% FBS, 1x не относящихся к незаменимым витаминам, 1% раствор пенициллина/стрептомицина, 1% пирувата натрия, 1% HEPES). Аллогенные CD4 T-клетки человека выделяли с применение набора для выделения CD4 T-клеток. DC (1×10/лунка) и очищенные CD4 T-клетки (1×10/лунка) добавляли в планшет с U-образным дном. В планшет, содержащий DC и T-клетки, добавляли тестируемое антитело или изотипический контроль (10 мкг/мл). Спустя пять дней инкубации супернатант собирали и анализировали на содержание IL-2 и IFN-γ с применением набора гранул для цитометрического анализа Milliplex. Содержание IFN-γ измеряли с применением системы BioRad Bioplex (Bioplex manager 6.0).
8.1.8. Ответ на стимуляцию антигеном с применением столбнячного анатоксина
6
5
PBMC человека выделяли из лейкоцитарных пленок, приобретенных в Stanford Blood Center, как описано ранее. Клетки ресуспендировали до конечной концентрации 2×10 клеток/мл в среде AIM-V, содержащей бета-меркаптоэтанол. Вносили PBMC в лунки (2×10) с 0,2 мкг/мл столбнячного анатоксина. Титровали антитело и планшеты инкубировали в течение пяти дней. Супернатанты собирали в день 5 и оценивали на содержание IFN-γ с применением набора гранул для цитометрического анализа Milliplex. Содержание IFN-γ измеряли с применением системы BioRad Bioplex (Bioplex manager 6.0).
Пример 2. Получение и гуманизация мышиных антител к PD-1
Мышей иммунизировали в соответствии со способами, известными из уровня техники (E. Harlow, D. Lane. Antibody: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1998)). Изотип каждого моноклонального антитела определяли с применением набора для определения изотипа мышиных антител (Roche). Клоны гибридом, вырабатывающие антитела, представляющие интерес, очищали, а их дополнительные характеристики аффинности определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса и конкуренции с лигандами (ELISA).
Клонирование и конструирование вектора экспрессии осуществляли с помощью способов, известных из уровня техники для экспрессии рекомбинантных моноклональных антител.
H
L
H
L
Гуманизацию области V антитела проводили, как описано Queen, C. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989; 86:10029-10033). Канонические структуры CDR определяли согласно Huang et al. (Methods, 2005; 36:35-42). Идентифицировали последовательности вариабельных областей зародышевого типа человека с одинаковыми или наиболее сходными каноническими структурами CDR и соответствующие последовательности V-, V- и J-сегментов человека выбирали для получения каркасных участков для вариабельной области антитела к PD-1. В положениях каркасных областей, в которых компьютерная модель позволяла предположить значительный контакт с CDR, аминокислоты из V-областей мышиных антител к PD-1 использовали вместо исходных аминокислот каркасных участков человека (обратные мутации). Полные аминокислотные последовательности областей V и V иллюстративных мышиных и гуманизированных антител показаны на ФИГ. 2.
H
H
H
H
H
H
H
H
L
L
Мышиное антитело к PD-1, Mu12A11, гуманизировали в соответствии со способом, описанным выше. Гуманизированными версиями V Mu12A11 были V Hu12A11.1b и V Hu12A11.2b. V Hu12A11.1b имела каркасные области V 7-4-1 c четырьмя обратными мутациями V2I, M48V, F67L и A93T. V Hu12A11.2b имела каркасные области V 1-69 с семью обратными мутациями V2I, M48V, V67L, I69F, A71L, E73T и A93T. Каждую из двух гуманизированных V могли комбинировать с гуманизированной легкой цепью V Hu12A11.1a, которая имела каркасные участки V 2-28 с одной обратной мутацией I2V.
Пример 3. Устойчивость антител к PD-1
Устойчивость иллюстративных антител определяли путем измерения связывания PD-1 антителами после обработки в окислительных условиях или условиях с переменной температурой.
H
H
H
50
С помощью оценки в отношении подверженных воздействию мотивов идентифицировали консервативный остаток метионина в положении 99 по Kabat (M99), который, как полагают, не только доступен для растворителя, но и склонен к дезамидированию. Образцы исходного антитела M99, Hu12A11.2b1, подвергали воздействию условий ускоренной деградации для увеличения потенциального дезамидирования (ФИГ. 3A). Образцы, обработанные с помощью 1% пероксида водорода (1% HP) или 1% трет-бутилгидропероксида (1% TBHP), демонстрировали потерю аффинности связывания, что позволяет предположить потенциальное окисление остатка метионина-99. Конструировали набор из антител, содержащих точковые мутации в положении M99, включая мутации по типу замены на изолейцин (M99I, Hu12A11.2b2, имеющее V в соответствии с SEQ ID NO:34), валин (M99V, Hu12A11.2b3, имеющее V в соответствии с SEQ ID NO:35) и лейцин (M99L, Hu12A11.2b4, имеющее V в соответствии с SEQ ID NO:36). Варианты антитела подвергали скринингу на связывание с клетками Jurkat, трансфицированными PD-1 человека, и определяли значения EC (ФИГ. 3B). Все три антитела, содержащих точковые мутации, аналогичным образом связывались с PD-1 на клеточной поверхности, но антитело с вариантом M99L показало более высокую активность связывания по сравнению с вариантами M99V или M99I.
50
Обнаружили, что вариант M99L, Hu12A11.2b4, полностью сохраняет связывающую способность после тестирования температурной устойчивости (ФИГ. 3C). Инкубация Hu12A11.2b4 при -80, 5, 25 или 40°C привела к отсутствию значимой потери активности с точки зрения EC или максимальной интенсивности флуоресценции (MFI).
Пример 4. Аффинность связывания антител к PD-1
В таблице 4-1 ниже показаны данные по in vitro аффинности связывания иллюстративного антитела Hu12A11.2b4 в сравнении с известным из литературы антителом к PD-1, ниволумабом, полученным согласно процедурам из патента США № 9073994. Hu12A11.2b4 проявляло свойства связывания с PD-1, аналогичные таковым для ниволумаба в соответствии с данными поверхностного плазмонного резонанса, анализа ELISA c PD-1 человека (Hu) или макака-крабоеда (Cyno) или анализа с клетками Jurkat человека, как измерено в анализах из примера 1.
Таблица 4-1Свойства связывания выбранных антител к PD-1
Антитело
SPR,K<sub>D</sub> (M)*
Hu ELISA, EC<sub>50</sub> (пМ)
Hu ELISA, OD<sub>650</sub> max
Cyno ELISA, EC<sub>50</sub> (пМ)
Hu Jurkat, EC<sub>50</sub> (пМ)
Ниволумаб
2,9E-09
101
2,2
70
56
Hu12A11.2b4
2,1E-09
197
2,9
102
45
-9
*SPR=поверхностный плазмонный резонанс, как определено в соответствии с примером 1; показано экспоненциальное представление чисел (например, 3,0E-09=3,0 × 10).
Пример 5. Биологическая активность антитела к PD-1 Hu12A11.2b4
Hu12A11.2b4 оценивали в отношении биологической активности в целом ряде in vitro анализов на клетках человека, описанных в примере 1. Как показано в таблице 5-1, Hu12A11.2b4 продемонстрировал связывание с PD-1 в CD4+ T-клетках на уровне 180 пМ. В дополнение было показано, что активность Hu12A11.2b4, направленная против PD-1, по меньшей мере частично опосредована его способностью блокировать взаимодействие PD-L1 или PD-L2 с PD-1, как оценено с помощью проточной цитометрии. Данная биологическая активность соответствовала активности Hu12A11.2b4 в отношении рекомбинатных T-клеток Jurkat, экспрессирующих ген люциферазы светлячка под контролем элементов отклика NFAT с конститутивной экспрессией PD-1 человека (анализ Jurkat NFAT).
Таблица 5-1Биологическая активность иллюстративных антител к PD-1
Антитело
EC<sub>50</sub> связывания CD4+ T-клеток (пМ)
Блокирование PD-L1 (мкг/мл)
Блокирование PD-L2 (мкг/мл)
Jurkat NFATEC<sub>50</sub> (мкг/мл)
Ниволумаб
180
0,106
0,233
15±20
Hu12A11.2b4
180
0,045
0,132
4,5±6,5
50
Антитело к PD-1, Hu12A11.2b4, дополнительно продемонстрировало улучшение иммунологического ответа в in vitro анализах. Как показано на ФИГ. 4A, обработка культур смешанных лейкоцитов с помощью 10 мкг/мл Hu12A11.2b4 приводила к значимому повышению содержания IL-2, а также повышению содержания IFN-γ в приблизительно 7,4 раза. На ФИГ. 4B показано, что при применении Hu12A11.2b4 из расчета 10 мкг/мл проявлялся ответ на стимуляцию столбнячным анатоксином, который приблизительно в 6 раз превышал отсутствие обработки антителом, при EC=161 нг/мл.
50
Наблюдаемая in vitro биологическая активность Hu12A11.2b4 была аналогична таковой, измеренной у ниволумаба, применяемого в примере 4. С точки зрения иммунологического ответа при применении антитела сравнения, ниволумаба, из расчета 10 мкг/мл проявлялось повышение содержания IFN-γ в приблизительно 5,6 раз в MLR, а при ответе на стимуляцию столбнячным анатоксином - в приблизительно 6 раз по сравнению с отсутствием обработки антителом, при EC=218 нг/мл.
Все публикации, патенты, заявки на патент и другие документы, процитированные в данной заявке, настоящим включены посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей в той же степени, как если бы было отдельно указано, что каждая отдельная публикация, патент, заявка на патент или другой документ включены посредством ссылки для всех целей.
Хотя были проиллюстрированы и описаны различные конкретные варианты осуществления, будет понятно, что могут производиться различные изменения без отклонения от сущности и объема изобретения (изобретений).
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ABBVIE BIOTHERAPEUTICS INC.
<120> АНТИТЕЛА К PD-1 И ИХ ПУТИ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 381493-327WO
<140>
<141>
<150> 62/394,314
<151> 2016-09-14
<160> 61
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 288
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1. 5                   10                  15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20                  25                  30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35                  40                  45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50                  55                  60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65                  70                  75                  80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85                  90                  95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100                 105                 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115                 120                 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130                 135                 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145                 150                 155                 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165                 170                 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180                 185                 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195                 200                 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210                 215                 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225                 230                 235                 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245                 250                 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260                 265                 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275                 280                 285
<210> 2
<211> 288
<212> БЕЛОК
<213> Mus sp.
<400> 2
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1. 5                   10                  15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20                  25                  30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35                  40                  45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50                  55                  60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65                  70                  75                  80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85                  90                  95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100                 105                 110
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115                 120                 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130                 135                 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145                 150                 155                 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala
165                 170                 175
Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val
180                 185                 190
Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp
195                 200                 205
Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala
210                 215                 220
Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro
225                 230                 235                 240
Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly
245                 250                 255
Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln
260                 265                 270
Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275                 280                 285
<210> 3
<211> 290
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1. 5                   10                  15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20                  25                  30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35                  40                  45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50                  55                  60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65                  70                  75                  80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85                  90                  95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100                 105                 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115                 120                 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130                 135                 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165                 170                 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180                 185                 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195                 200                 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210                 215                 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225                 230                 235                 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245                 250                 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260                 265                 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275                 280                 285
Glu Thr
290
<210> 4
<211> 262
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 4
Leu Gln Leu His Gln Ile Ala Ala Leu Phe Thr Val Thr Val Pro Lys
1. 5                   10                  15
Glu Leu Tyr Ile Ile Glu His Gly Ser Asn Val Thr Leu Glu Cys Asn
20                  25                  30
Phe Asp Thr Gly Ser His Val Asn Leu Gly Ala Ile Thr Ala Ser Leu
35                  40                  45
Gln Lys Val Glu Asn Asp Thr Ser Pro His Arg Glu Arg Ala Thr Leu
50                  55                  60
Leu Glu Glu Gln Leu Pro Leu Gly Lys Ala Ser Phe His Ile Pro Gln
65                  70                  75                  80
Val Gln Val Arg Asp Glu Gly Gln Tyr Gln Cys Ile Ile Ile Tyr Gly
85                  90                  95
Val Ala Trp Asp Tyr Lys Tyr Leu Thr Leu Lys Val Lys Ala Ser Tyr
100                 105                 110
Arg Lys Ile Asn Thr His Ile Leu Lys Val Pro Glu Thr Asp Glu Val
115                 120                 125
Glu Leu Thr Cys Gln Ala Thr Gly Tyr Pro Leu Ala Glu Val Ser Trp
130                 135                 140
Pro Asn Val Ser Val Pro Ala Asn Thr Ser His Ser Arg Thr Pro Glu
145                 150                 155                 160
Gly Leu Tyr Gln Val Thr Ser Val Leu Arg Leu Lys Pro Pro Pro Gly
165                 170                 175
Arg Asn Phe Ser Cys Val Phe Trp Asn Thr His Val Arg Glu Leu Thr
180                 185                 190
Leu Ala Ser Ile Asp Leu Gln Ser Gln Met Glu Pro Arg Thr His Pro
195                 200                 205
Thr Trp Leu Leu His Ile Phe Ile Pro Ser Cys Ile Ile Ala Phe Ile
210                 215                 220
Phe Ile Ala Thr Val Ile Ala Leu Arg Lys Gln Leu Cys Gln Lys Leu
225                 230                 235                 240
Tyr Ser Ser Lys Asp Thr Thr Lys Arg Pro Val Thr Thr Thr Lys Arg
245                 250                 255
Glu Val Asn Ser Ala Ile
260
<210> 5
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1. 5                   10                  15
<210> 6
<400> 6
000
<210> 7
<400> 7
000
<210> 8
<400> 8
000
<210> 9
<400> 9
000
<210> 10
<400> 10
000
<210> 11
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 11
Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr Gly Met Asn
1. 5                   10
<210> 12
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 12
Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1. 5                   10                  15
Gly
<210> 13
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 13
Glu Gly Glu Gly Leu Gly Phe Gly Asp
1. 5
<210> 14
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 14
Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser His Gly Asp Thr Tyr Leu Glu
1. 5                   10                  15
<210> 15
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 15
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1. 5
<210> 16
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 16
Phe Gln Gly Ser His Ile Pro Val Thr
1. 5
<210> 17
<400> 17
000
<210> 18
<400> 18
000
<210> 19
<400> 19
000
<210> 20
<400> 20
000
<210> 21
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 21
Glu Gly Glu Gly Ile Gly Phe Gly Asp
1. 5
<210> 22
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 22
Glu Gly Glu Gly Val Gly Phe Gly Asp
1. 5
<210> 23
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид"
<400> 23
Glu Gly Glu Gly Met Gly Phe Gly Asp
1. 5
<210> 24
<400> 24
000
<210> 25
<400> 25
000
<210> 26
<400> 26
000
<210> 27
<400> 27
000
<210> 28
<400> 28
000
<210> 29
<400> 29
000
<210> 30
<400> 30
000
<210> 31
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 31
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1. 5                   10                  15
Thr Val Met Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Val
35                  40                  45
Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Leu Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Thr Arg Glu Gly Glu Gly Met Gly Phe Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 32
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1. 5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Leu Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Glu Gly Glu Gly Met Gly Phe Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 33
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1. 5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Leu Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Glu Gly Glu Gly Met Gly Phe Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 34
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1. 5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Leu Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Glu Gly Glu Gly Ile Gly Phe Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 35
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1. 5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Leu Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Glu Gly Glu Gly Val Gly Phe Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 36
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1. 5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Leu Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Glu Gly Glu Gly Leu Gly Phe Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<400> 37
000
<210> 38
<400> 38
000
<210> 39
<400> 39
000
<210> 40
<400> 40
000
<210> 41
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 41
Asp Val Leu Met Thr Gln Ile Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1. 5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
His Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Ile Pro Val Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 42
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 42
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1. 5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
His Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Ile Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 43
<400> 43
000
<210> 44
<400> 44
000
<210> 45
<400> 45
000
<210> 46
<400> 46
000
<210> 47
<400> 47
000
<210> 48
<400> 48
000
<210> 49
<400> 49
000
<210> 50
<400> 50
000
<210> 51
<211> 448
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 51
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1. 5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Leu Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Glu Gly Glu Gly Leu Gly Phe Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210> 52
<211> 447
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 52
Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1. 5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr His Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Trp Val Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Leu Thr Phe Thr Leu Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg Glu Gly Glu Gly Leu Gly Phe Gly Asp Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115                 120                 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130                 135                 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165                 170                 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180                 185                 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195                 200                 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210                 215                 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245                 250                 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260                 265                 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275                 280                 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290                 295                 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305                 310                 315                 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325                 330                 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340                 345                 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355                 360                 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370                 375                 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385                 390                 395                 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405                 410                 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420                 425                 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
<210> 53
<400> 53
000
<210> 54
<400> 54
000
<210> 55
<400> 55
000
<210> 56
<400> 56
000
<210> 57
<400> 57
000
<210> 58
<400> 58
000
<210> 59
<400> 59
000
<210> 60
<400> 60
000
<210> 61
<211> 219
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический
полипептид"
<400> 61
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1. 5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20                  25                  30
His Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85                  90                  95
Ser His Ile Pro Val Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115                 120                 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130                 135                 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145                 150                 155                 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165                 170                 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180                 185                 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195                 200                 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<---