ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦЕЛЕВЫХ НУКЛЕИНОВОКИСЛОТНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ПУТЕМ РАСЩЕПЛЕНИЯ ЗОНДИРУЮЩЕГО ОЛИГОНУКЛЕОТИДА И ГИБРИДИЗАЦИИ

1. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет одиночную метку;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, с получением содержащего одиночную метку фрагмента;
(c) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что содержащий одиночную метку фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от одиночной метки на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
2. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(а) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; РО имеет систему двух взаимодействующих меток, содержащую донорную молекулу и акцепторную молекулу;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, с разделением системы двух взаимодействующих меток, в результате чего образуются содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент;
(c) осуществление реакции гибридизации путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; при этом сигнал от дуплекса нерасщепленный РО/СО отличается от сигнала, поступающего тогда, когда по меньшей мере один из фрагментов, содержащий донорную молекулу фрагмент и содержащий акцепторную молекулу фрагмент, не гибридизуется с СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от системы двух взаимодействующих меток на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
3. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО) на твердой подложке, включающий:
(a) гибридизацию нуклеиновокислотной последовательности-мишени с зондирующим олигонуклеотидом (РО); при этом РО содержит узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) приведение в контакт продукта со стадии (а) с ферментом, обладающим 5'-нуклеазной активностью, в условиях, подходящих для расщепления РО; при этом, когда РО гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, происходит расщепление РО под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью с получением отщепленного фрагмента;
(c) осуществление реакции гибридизации в присутствии интеркалируюшего агента путем приведения в контакт продукта со стадии (b) с захватывающим олигонуклеотидом (СО), иммобилизованным на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО; причем реакцию гибридизации проводят в таких условиях, что отщепленный фрагмент не гибридизуется с СО, а нерасщепленный РО гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО; и
(d) детекцию наличия расщепления РО путем измерения сигнала от интеркалирующего агента на твердой подложке; тем самым наличие расщепления РО указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
4. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот в анализе с РОСН (расщеплением и гибридизацией РО), на твердой подложке для применения в способе по любому из пп. 1, 2 и 3, содержащий:
(a) зондирующий олигонуклеотид (РО), содержащий узнающий мишень участок, содержащий гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени; и
(b) захватывающий олигонуклеотид (СО), иммобилизованный на твердой подложке; при этом СО содержит нуклеотидную последовательность, способную к гибридизации с РО, в результате чего РО, не расщепленный под действием фермента, обладающего 5'-нуклеазной активностью, гибридизуется с СО с образованием дуплекса нерасщепленный РО/СО.