СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СОЕДИНЕНИЙ, ПРЕПЯТСТВУЮЩИХ СТАРЕНИЮ
METHOD OF PRODUCTION PROTEINS USING COMPOUNDS THAT PREVENT AGING

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее описание относится в общем к получению белков в культурах клеток млекопитающих. Более конкретно, настоящее описание относится к культивированию клеток млекопитающих в присутствии соединения, препятствующего старению, например карнозина, с целью поддержания жизнеспособности и увеличения продуктивности при высоком качестве. Путем культивирования клеток получают многие белковые продукты. Эти продукты, такие как моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, можно использовать в терапевтических целях, научных исследованиях или других приложениях. Клетки животных и, в частности, клетки млекопитающих часто используют для получения белков. К сожалению, использование клеток животных делает процесс получения более продолжительным и дорогим.
Добавление химического агента в культуральную среду может увеличить продуктивность клеток путем стимуляции продуцирования продукта клетками, что обеспечивает увеличение конечного выхода. Оптимальный агент для использования зависит от нескольких факторов, включая целевой белок и тип клеток. Подобные факторы влияют также на количество и время добавления выбранного агента в культуральную среду. Примеры агентов: алканоые кислоты и солиб производные мочевины или диметилсульфооксид (DMSОб ДМСО). Химические агенты, такие как бутират натрия, могут иметь различное влияние на получение белка. Добавление агента может увеличить удельную продуктивность клеток, но может также иметь цитотоксичный эффект и ингибировать рост и жизнеспособность клеток.
В процессе продуцирования белка клетками белок секретируется в среду, в которой клетки культивируют. Конкретный белок, однако, не является единственным веществом в среде; высокомолекулярные агрегаты, кислые молекулы и другие вещества также часто присутствуют в среде и могут сделать процесс очистки более трудоемким и дорогостоящим. Доступны технологии и способы, улучшающие качество продукта, обеспечивающие более эффективную очистку белков. Они включают, среди прочего, изменение параметров работы биореактора или использование другой линии клеток. Тем не менее остается потребность в технологиях получения белков и способах, обеспечивающих улучшение процесса очистки.
Следовательно, необходим химический агент для добавления в культуральную среду, который может усилить экспрессию представляющего интерес белка при сохранении высокой жизнеспособности клеток. Кроме того, необходим агент, который увеличивает качество белкового продукта путем снижения содержания высокомолекулярных агрегатов и кислотных молекул в культуральной среде.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно некоторым вариантам реализации настоящее описание относится к способу усиленной продукции белкового продукта. Например, в некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает способы культивирования клеток-хозяев, экспрессирующих белок, представляющий интерес, в среде, содержащей вещество, препятствующее старению, что обеспечивает усиление общего продуцирования белка. В некоторых вариантах реализации подобное вещество, препятствующее старению, содержит карнозин.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение обеспечивает композиции, которые усиливают продуцирование белка, представляющего интерес. Например, в некоторых вариантах реализации настоящее изобретение обеспечивает культуральную среду, включающую вещество, препятствующее старению, что усиливает продуцирование белка, представляющего интерес, который экспрессируется в клетке-хозяине. В некоторых вариантах реализации такое вещество, препятствующее старению, содержит карнозин. В некоторых вариантах реализации генетически измененные клетки-хозяева смешивают с инокуляционной средой с образованием культуральной среды, которую выращивают в биореакторе. В ходе производственного цикла получения желаемого белкового продукта можно изменять условия работы биореактора и/или вносить дополнительные компоненты с целью увеличения продуктивности и/или поддержания жизнеспособности. Дополнительные компоненты могут включать питательную среду и/или одну или более добавок таких, например, как указано в настоящем описании, карнозин и/или другие вещества, препятствующие старению.
Клетки-хозяева млекопитающих, например клетки яичника китайского хомячка, могут испытывать снижение жизнеспособности в биореакторе при приближению к окончанию производственного цикла. Было обнаружено, что добавление агента, препятствующего старению, такого как карнозин или его аналоги, в культуральную среду помогает поддерживать на более высоком уровне число жизнеспособных клеток и жизнеспособность клеток к моменту сбора белка.
Кроме того, в рамках настоящего изобретения можно применять такой способ увеличения продуктивности, как, например, изменение температуры после окончания фазы роста и/или в течение фазы образования продукта. В качестве одного из примеров: в ходе производства белкового продукта, а именно антитела к фактору дифференцирования роста - 8 (GDF-8), снизили температура, что способствовало инициации продуцирования и увеличивало продуктивность. В некоторых вариантах реализации добавление вещества, препятствующего старению, такого как карнозин, помогает увеличить продуктивность культуры клеток. В некоторых вариантах реализации вещество, препятствующее старению, можно добавлять перед, в течение и/или после такого изменения температуры.
Также было обнаружено, что добавление вещества, препятствующего старению, такого как карнозин, в культуральную среду увеличивает общее качество белкового продукта. В ходе получения белка в культуральной среде присутствуют высокомолекулярные агрегаты, а также нежелательные молекулы. Добавление карнозина уменьшает количество высокомолекулярных агрегатов и увеличивает качество продукта. В некоторых вариантах реализации добавление вещества, препятствующего старению, иного, чем карнозин, снижает накопление подобных высокомолекулярных агрегатов и улучшает качество продукции. В некоторых вариантах реализации карнозин добавляют совместно с одним или более дополнительными веществами, препятствующих старению.
Концентрация вещества, препятствующего старению (например, карнозина), добавляемого в культуральную среду, может варьироваться в зависимости от многих параметров процесса, включая, наряду с другими, например, тип клеток, продукт, представляющий интерес, и условия работы биореактора. Кроме того, карнозин можно заменить его аналогами: ацетил-карнозином, гомо-карнозином, ансерином и β-аланином. В некоторых вариантах реализации карнозин применяют совместно с одним или более других соединений, препятствующих старению. В некоторых вариантах реализации концентрация агента, препятствующего старению (например, карнозина), в культуральной среде составляет приблизительно от 5 мМ до 100 мМ. В некоторых вариантах реализации концентрация составляет приблизительно от 10 до 40 мМ. В некоторых вариантах реализации концентрация составляет приблизительно 20 мМ.
В данном способе получения белка можно применять любые подходящие способы культивирования клеток и инокуляционные среды. Можно применять как сывороточные, так и бессывороточные среды. Более того, можно применять методы культивирования, наиболее подходящие для конкретного типа клеток и белкового продукта. Подобные процедуры известны и понятны средним специалистам в области культивирования клеток.
Другие особенности и преимущества настоящего описания станут очевидны приведенного ниже описания и формулы изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1a. Влияние карнозина на кислотные пики у линии для MYO 29.
Фигура 1b. Влияние карнозина на высокомолекулярные агрегаты.
Фигура 1c. Влияние добавления карнозина в различные дни на кислотные пики.
Фигура 1d. Влияние добавления карнозина в различные дни на высокомолекулярные агрегаты.
Фигура 2a. Влияние карнозина на плотность жизнеспособных клеток в каждый из дней.
Фигура 2b. Влияние карнозина на жизнеспособность клеток в каждый из дней.
Фигура 2c. Влияние карнозина на титр в каждый из дней.
Фигура 2d. Влияние карнозина на кумулятивную удельную продуктивность клеток.
Фигура 2e. Влияние карнозина на высокомолекулярные агрегаты.
Фигура 3a. Влияние различных концентраций карнозина на плотность жизнеспособных клеток.
Фигура 3b. Влияние различных концентраций карнозина на жизнеспособность клеток в каждый из дней.
Фигура 3c. Влияние различных концентраций карнозина на титр в каждый из дней.
Фигура 3d. Влияние различных концентраций карнозина на кумулятивную специфичную продуктивность клеток.
Фигура 3e. Влияние различных концентраций карнозина на высокомолекулярные агрегаты.
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Согласно устаявшемуся правилу, в настоящей заявке, в том числе и в формуле изобретения, существительные в единственном числе подразумевают «один или более». Несмотря на то, что изобретение описано с определенной степенью конкретизации, очевидно, что множество альтернатив, модификаций и вариантов станут ясны для специалистов в данной области после ознакомления с описанием. Соответственно подразумевается, что все подобные альтернативы, модификации и варианты, которые находятся в рамках сущности и объема изобретения, входят в объем формулы изобретения.
Термин «соединение, препятствующее старению» относится здесь к любому агенту или соединению, которое при добавлении к культуре клеток стимулирует жизнеспособность, рост и/или продолжительность жизни растущих в ней клеток. В некоторых вариантах реализации применение подобного соединения, препятствующего старению, в культуре клеток приводит к увеличению титра, увеличению удельной продуктивности клеток, увеличению жизнеспособности клеток, увеличению интегральной плотности жизнеспособных клеток, уменьшению накопления высокомолекулярных агрегатов и/или уменьшению накопления кислотных молекул, которые наблюдались бы в среде при отсутствии соединения, препятствующего старению, в идентичных в остальном условиях культивирования. Неограничивающие примеры соединений, препятствующих старению, которые можно применять в способах и композициях согласно настоящему изобретению, включают: карнозин, ацетил-карнозин, гомо-карнозин, ансерин и β-аланин. В некоторых вариантах реализации в композициях и способах согласно настоящему изобретению возможно применять два или более соединений, препятствующих старению.
Термин «клетка-хозяин» относится к клеткам, которые могут быть генетически изменены и/или способны расти и выживать в культуральной среде. Как правило, данные клетки могут экспрессировать большое количество эндогенного или гетерологичного белка, представляющего интерес, и могут либо удерживать, либо секретировать белок в культуральную среду.
Клетки-хозяева, как правило, представляют собой «клетки млекопитающих», включая неограничивающий пример - клетки позвоночных, в том числе клетки из: почки детеныша хомячка (ВНК), яичника китайского хомячка (CHO), почки человека (293), нормального диплоидного зародыша макаки-резуса (FRhL-2) и миеломы мыши (например, SP2/0 and NSO). Средний специалист в данной области сможет определить другие клетки-хозяева, которые можно использовать в соответствии со способами и композициями настоящего изобретения.
Термин «культуральная среда» относится к раствору, содержащему питательные вещества для поддержания выживания клеток в условиях, при которых клетки могут расти и продуцировать целевой белок. Фраза «среда для инокуляции» или «инокуляционная среда» относятся к раствору или веществу, содержащему питательные вещества, в котором инициируется культура клеток. В некоторых вариантах реализации «питательная среда» питательные, аналогичные содержащимся в среде для инокуляции, но представляет собой раствор или вещество, которым клетки питают после инициации культуры. В некоторых вариантах реализации питательная среда содержит один или более компонентов, которые не присутствуют в среде для инокуляции. В некоторых вариантах реализации в питательной среде отсутствуют один или более компонентов, присутствующих в среде для инокуляции. Лицо, имеющее средние навыки в области культивирования клеток, не проводя излишних экспериментов, сможет определить, какие компоненты составят среду для инокуляции и питательную среду. Как правило, данные растворы обеспечивают заменимые и незаменимые аминокислоты, витамины, источники энергии, липиды и микроэлементы, необходимые клеткам для роста и выживания. В некоторых вариантах реализации среда для инокуляции, питательная среда или обе эти среды содержат соединение, препятствующее старению.
Термин «характеристика культуры клеток» относится здесь к наблюдаемым и/или поддающимся измерению характеристикам клеточной культуры. Способы и композиции согласно настоящему изобретению преимущественно применяют для улучшения одной или более характеристик культуры клеток. В некоторых вариантах реализации улучшение характеристики культуры клеток заключается в увеличении значения характеристики культуры клеток. В некоторых вариантах реализации, улучшение характеристики культуры клеток заключается в уменьшении значения характеристики культуры клеток. В качестве неограничевающих примеров характеристик культуры клеток могут выступать: титр, удельная продуктивность клеток, жизнеспособность клеток, интегральная плотность жизнеспособных клеток, накопление высокомолекулярных агрегатов и/или накопление кислотных молекул. Лицу, имеющему средние навыки в данной области, будут известны и другие характеристики культуры клеток, которые можно улучшить путем применения способов и композиций настоящего изобретения.
Термин «определенная среда» относится здесь к среде, состав которой известен и контролируется. Определенные среды не содержат сложных добавок, таких как сыворотка и гидролизаты, которые содержат неизвестные и/или неконтролируемые компоненты.
Термин «сложная среда» относится здесь к среде, содержащей по крайней мере один компонент, название (природа) или количество которого либо неизвестны, либо неконтролируемы.
Термин «линия клеток» относится, в целом, к исходным клеткам-хозяевам, которые экспрессируют белок, представляющий интерес. В некоторых вариантах реализации, эти клетки подвергли трансформирации эндогенной ДНК, кодирующей целевой белок и/или содержащей управляющие последовательности, которые активируют экспрессию соответствующих последовательностей, вне зависимости от того, являются они эндогенными или гетерологичными. В некоторых вариантах реализации клетки, произошедшие от клеток, подвергшихся такой генетической модификации, образуют линию клеток и их помещают в культуральную среду для выращивания и получения белкового продукта. В некоторых вариантах реализации клеточная линия состоит из исходных клеток-хозяев, которые не были подвергнуты трансформации экзогенной ДНК и экспрессируют эндогенный белок, представляющий интерес.
Термин «фаза роста» культуральной среды относится к периоду, когда клетки претерпевают быстрые деления и растут экспоненциально или близко к экспоненциальному росту. Как правило, клетки культивируют в условиях, оптимизированных для роста клеток обычно на протяжении 1-4 дней. Условия фазы роста могут включать температуру приблизительно от 35°C до 42°C, обычно 37°C. Продолжительность фазы роста и условия культивирования в течение фазы роста могут варьировать, но в целом известны лицу, имеющему средние навыки в области культивировании клеток. В некоторых вариантах реализации в течение фазы роста в культуральную среду могут добавлять питательную среду.
«Переходная фаза» имеет место в течение периода, когда культуральную среду переводят из условий, характерных для фазы роста, в условия, характерные для фазы образования продукта. В течение переходной фазы часто меняют факторы, подобные температуре, среди прочего. В некоторых вариантах реализации в течение переходной фазы в культуральную среду могут доавлять питательную среду.
«Фаза образования продукта» наступает после фазы роста и переходной фазы. Экспоненциальный рост клеток заканчивается, и приоритетной задачей становится получение белка. Для инициации продуцирования, в культуральную среду, возможно, вносят добавки. В некоторых вариантах реализации в культуральную среду в фазе образования продукта вносят питательную среду. Кроме того, в большинстве случаев температура культуральной среды в фазе образования продукта может быть ниже, чем в фазе роста, что, как правило, стимулирует продуцирование. Фаза образования продукта продолжается до достижения желаемой конечной точки.
Фраза «плотность жизнеспособных клеток» обозначает общее число клеток, которые выживают в определенном объеме (как правило, в миллилитре) культуральной среды. Фраза «жизнеспособность клеток» обозначает выраженное в процентах число живых клеток, отнесенное к общему числу клеток (мертвых и живых).
«Интегральная плотность жизнеспособных клеток», «ИПЖК»: Термин «интегральная плотность жизнеспособных клеток», или «ИПЖК», обозначает здесь среднюю плотность жизнеспособных клеток на протяжении культивирования, умноженное на продолжительность культивирования. Если количество полученного белка пропорционально числу жизнеспособных клеток на протяжении культивирования, то интегральная плотность жизнеспособных клеток является полезным инструментом для оценки количества белка, продуцируемого на протяжении культивирования.
Термин «высокомолекулярные агрегаты» относится в основном к белкам с неверной укладкой цепи или неправильной ассоциацией по крайней мере двух полипептидов. Ассоциации могут возникать любыми путями, включая, но, не ограничиваясь: ковалентные, нековалентные, дисульфидные или необратимые взаимодействия. В некоторых вариантах реализации способы и композиции согласно настоящему изобретению успешно применяют для уменьшения накопления высокомолекулярных агрегатов.
Термин «антиоксидант» относится здесь к соединению, которое обладает способностью предотвращать окислительное повреждение липидов, белков, ДНК и других важных макромолекул путем блокирования свободных радикалов.
Термин «антитело» здесь включает белки, содержащие по крайней мере один, но, как правило, два VH-домена (вариабельные домены тяжелой цепи) или их участков и/или по крайней мере один, но, как правило, два VL-домена (вариабельные домены легкой цепи) или их участков. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой тетрамер, состоящий из двух тяжелых цепей иммуноглобулина и двух легких цепей иммуноглобулина, в котором тяжелые и легкие цепи иммуноглобулина соединены между собой, например, дисульфидным связями. Антитела или их части могут быть получены из любого источника, исключают включая, но не ограничиваясь: антитела и части антител грызунов, приматов (например, человек и отличные от человека), верблюдов, а также полученные рекомбинантным способами, например химерные, гуманизированные и/или образованные in vitro, как описано в настоящем документе более подробно.
Примеры связывающих фрагментов антитела, объединенных термином «антиген-связывающий фрагмент», включают, но не ограничиваются: (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')2-фрагмент, бивалентный фрагмент, состоящий из двух Fab-фрагментов, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирой области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (v) dAb-фрагмент, состоящий из домена VH; (vi) верблюжий или подобный верблюжьему домен; (vii) одноцепочечный Fv (scFv); (viii) биспецифичное антитело; и (ix) один или более фрагментов молекулы иммуноглобулина, соединенных с областью Fc. Кроме того, несмотря на то, что два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются различными генами, их можно соединить методами рекомбинации синтетическим линкером, который позволяет им образовывать единую белковую цепь, в которой области VL и VH соединены с образованием моновалентной молекулы (известна, как одноцепочечный Fv (scFv); см, например. Bird et al. (1988) Science 242: 423-26; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 5879-83). Подразумевается, что подобные одноцепочечные антитела такжи входят в понятие «антиген-связывающий фрагмент» антитела. Такие фрагменты могут быть получены традиционными методиками, известными специалистам в данной области, и функциональности данных фрагментов оценивают так же, как и функциональность интактных антител.
«Антиген-связывающий фрагменты» могут, возможно, дополнительно содержать группировку, которая увеличивает одно или более свойств, таких как, например, стабильность, функция эффекторной клетки или фиксация комплемента. Например, антиген-связывающий фрагмент может дополнительно содержать пегилированные группировки, альбумин или константную область тяжелой и/или легкой цепи.
Подразумевается, что у антитела, отличного от «биспецифических» или «бифункциональных» антител, все сайты связывания идентичны. «Биспецифические» или «бифункциональные антитела» представляют собой искусственные гибридные антитела, состоящие из двух различных пар тяжелая/легкая цепь и двух различных сайтов связывания. Биспецифические антитела можно получить различными способами, включая слияние гибридом или соединение Fab-фрагментов. См., например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J.Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
Для получения антител или их антигенсвязывающих сайтов можно применять множество методов, известных специалистам в данной области. Например, моноклональные антитела можно получать путем генерирования гибридом в соответствии с известными способами. Из гибридом, полученных подобным образом, отбирают (как правило, с использованием стандартных методов, таких как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и поверхностный плазменный резонанс (Biacore™)), одну или более гибридом, которые продуцируют антитело, которое специфически связывается с определенным антигеном. В качестве иммуногена можно применять любую форму заданного антигена, например рекомбинантный антиген, формы, встречающиеся в природе, любые их варианты и фрагменты, а также их антигенные пептиды.
Один из характерных способов получения антител включает скрининг библиотеки экспрессии белков, например библиотек фагового или рибосомального дисплея. Фаговый дисплей описан, например, в Ladner et al., U.S. Patent No. 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; and WO 90/02809.
В дополнение к использованию дисплеев можно применять указаный антиген для иммунизации не являющегося человеком животного, например грызуна, например мыши, хомячка или крысы. В некоторых вариантах реализации не являющееся человеком животное содержит по крайней мере часть гена иммуноглобулина человека. Например, можно создать линию мышей с нарушенной продукцией антител мыши с большими фрагментами локусов Ig человека. При помощи гибридомной технологии можно получить и отобрать антиген-спецефичные моноклональные антитела, полученные из генов, с желаемой специфичностью. См., например XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21, US 2003 - 0070185, WO 96/34096, опубликовано 31 октября 1996, и Заявка РСТ No. PCT/US96/05928, поданная 29 Апреля, 1996.
В некоторых вариантах реализации моноклональные антитела получают из животного, которое не является человеком, и затем модифицируют: например, получают гумманизированные, деиммунизированные, химерные антитела с использованием технологий рекомбинантной ДНК, известных из уровня техники. Описано множество подходов, пригодных для получения химерных антител. См., например, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., U.S. Patent No. 4,816,567; Boss et al.. Патент США №. 4,816,397; Tanaguchi et al.. Европейская патентная публикация EP 171496; Европейская патентная публикация 0173494 Патент Великобритании GB 2177096 B. Гуманизированные антитела также могут быть получены, например, с использованием трансгенных мышей, которые экспрессируют гены тяжелой и легкой цепей человека, но неспособны экспрессировать гены эндогенных тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина мышей. У Winter описан пример способа прививки CDR (гипервариабельных участков), который можно использовать для приготовления описанных в настоящей заявке гуманизированных антител (Патент США №5,225,539). Можно заменить все гипервариабельные участки конкретного антитела человека по крайней мере частью CDR организма, не являющегося человеком, или можно заменить только некоторые из гипервариабельных участков на CDR организма, не являющегося человеком. Необходимо заменить лишь определенное число CDR, необходимых для связывания гуманизированного антитела с соответствующим антигеном.
Гуманизированные антитела или их фрагменты могут быть получены путем замены последовательность последовательности вариабельного Fv-домена, который не вовлечен напрямую в связывание с антигеном, на эквивалетную последовательность вариабельного Fv-домена человека. Примеры способов получения гуманизированных антител или их фрагментов приведена в Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; by Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; и в US 5,585,089; US 5,693,761; US 5,693,762; US 5,859,205 и US 6,407,213. Такие методы включают выделение, модифицирование и экспрессию последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют вариабельные Fv-домены иммуноглобулина (полностью или их части), принадлежащие, по крайней мере одной из цепей: тяжелой и легкой. Такие нуклеиновые кислоты можно получить из гибридом, продуцирующих антитело к определенной мишени, как описано выше, а также из других источников. Рекомбинантные ДНК, кодирующие молекулы гуманизированного антитела, впоследствии можно клонировать в подходящем векторе экспрессии.
В некоторых вариантах реализации гуманизированные антитела оптимизируют путем введения: консервативных замен, замен консенсусных последовательностей, замещн зародышевой линии и/или обратных мутаций. Такие измененные молекулы иммуноглобулинов могут быть получены любым из способов, известных в данной области (например, Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. EnzymoL, 92: 3-16, 1982), a также могут быть получены согласно идеям, изложенным в публикациях РСТ WO 92/06193 или EP 0239400.
Антитело или его фрагмент можно модифицировать путем специфического удаления эпитопов T-клеток человека или путем «деиммунизации» способами, описанными в WO 98/52976 и WO 00/34317. Вкратце, можно провести анализ вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела на пептиды, которые связываются с ГКГС II-ого типа; данные пептиды представляют собой потенциальные эпитопы T-клеток (как определено в WO 98/52976 и WO 00/34317). Для определения потенциальных эпитопов Т-клеток, можно применять подход компьютерного моделирования, получивший название «peptide threading» (название пептидов), и, кроме того, можно провести поиск в базе данных пептидов, связывающих ГКГС человека II-ого, на мотивы, представленные в последовательностях VH и VL, как описано в WO 98/52976 и WO 00/34317. Данные мотивы связывают любой из 18 основных DR-аллотипов ГКГС II, и таким образом представляют собой потенциальные эпитопы T-клеток. Выявленные потенциальные эпитопы T-клеток можно уничтожить путем замены небольшого числа остатков аминокислот в вариабельных доменах, или, более предпочтительно, путем замены одной аминокислоты. Как правило, делают консервативные замены. Часто, но не обязательно, используют аминокислоту, имеющую позицию, характерную для последовательности антитела зародышевой линии человека. Последовательности зародышевых линий человека раскрыты, например, в Tomlinson et al. (1992) J.Mol.Biol. 227: 776-798; Cook, G.P. et al. (1995) Immunol. Today Vol.16 (5): 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 799-817; и Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 4628-4638. Каталог V BASE предоставляет всестороннюю информацию о последовательностях вариабельных областей иммуноглобулинов человека (составлено Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Кембридж, Великобритания). Эти последовательности можно применять в качестве источника последовательности человека, например каркасных участков или CDR. Можно также использовать консенсусные рамочные участки, например, как описано в US 6,300,064.
В некоторых вариантах реализации антитело может содержать измененную константную область иммуноглобулина или Fc-область. Например, антитело, полученной в соответствии с идеями настоящего изобретения, может связывать более прочно или с большей специфичностью эффекторную молекулу, такую как комплемент и/или рецептор Fc, которая может контролировать несколько иммунных функций антитела, таких как активность эффекторных клеток, лизис, активность, опосредуемую комплементом, выведение антител из организма и период полувыведения антител. Как правило, к рецепторам Fc, которые связываются с Fc-регионом антитела (например, IgG антитела) относятся, но не ограничиваются ими, подкалассы рецепторов FcyRI, FcyRII и FcyRIII и FcRn, в том числе аллельные варианты и образованные в результате альтернативного сплайсинга формы этих рецепторов. Рецепторы Fc описаны в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods 4: 25-34, 1994; and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41, 1995.
Термин «биореактор» относится здесь к резервуару, который может содержать культуральную среду, и внутренние параметры которого, такие как pH и температура, можно контролировать в ходе культивирования.
«Культивирование с подпиткой» обозначает способ культивирования клеток, при котором сначала клетки вносят в биореактор в инокуляционной среде. В ходе производственного цикла, стадиях в культуральную среду один или более раз вносят питательную среду, содержащую питательные компоненты и/или другие добавки.
«Периодическое культивирование» обозначает способ культивирования клеток, при котором клетки вносят в биореактор вместе со всеми питательными веществами и добавками, необходимыми для прохождения полного производственного цикла. На протижении производственного цикла в среду не вносят никаких питательных добавок.
«Перфузионное культивирование» обозначает способ культивирования клеток, отличный от культивирования с подпиткой и от периодического культивирования, в котором процесс культивирования не прекращают, или возможно не прекращают перед выделением и/или очисткой экспрессированного белка, представляющего интерес, и в котором новые питательные вещества и другие компоненты периодически или непрерывно добавляют в культуру, и в течение которого экспрессированный белок периодически или непрерывно собирают. Состав добавляемых питательных веществ можно менять в ходе культивировании клеток, в зависимости от потребностей клеток, требований оптимального выхода белка и/или множества любых других факторов, известных средним специалистам в данной области.
Термин «экспрессия» относится к транскрипции и трансляции, которые проходят внутри клетки-хозяина. Уровень экспрессии обозначает обычно количество белка, продуцируемого клеткой-хозяином.
Термины «белок» или «белковый продукт» обозначает одну или более цепей аминокислот. В настоящей заявке термин «белок» является синонимом термина «полипептид» и, как принято в данной области, обозначает по крайней мере одну цепь аминокислот, соединенных пептидными связями. В некоторых вариантах реализации «белок, представляющий интерес» представляет собой белок, кодируемый экзогенной молекулой нуклеиновой кислоты, которую трансформировали в клетку-хозяина. В некоторых вариантах реализации «белок, представляющий интерес» представляет собой белок, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, которая является эндогенной по отношению к клетке-хозяину. В некоторых вариантах реализации экспрессию такого эндогенного белка, представляющего интерес, меняют путем трансформации клеток-хозяев экзогенной молекулой нуклеиновой кислоты, которая может, например, содержать одну или более регуляторных последовательностей и/или кодировать белок, увеличивающий экспрессию белка, представляющего интерес. Способы и композиции согласно настоящему изобретению можно быть применять для получения любого белка, представляющего интерес, включая, но не ограничиваясь, белки, имеющие терапевтическое, фармацевтическое, диагностическое, сельскохозяйственное и/или любое другое из множества значений, подходящих для коммерческих, экспериментальных и/или других приложений. В некоторых вариантах реализации белки, полученные с применением способов и/или композиций согласно настоящему изобретению, возможно, подвергают дальнейшей обработке или модифицируют. Например, белки, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть гликозилированы.
6
6
«Удельная продуктивность клеток» и тому подобное относится к удельному, в расчете на клетку, уровню экспрессии продукта. Удельную продуктивность клеток, как правило, измеряют в микрограммах белка, произведенного 10 клетками за день, или в пикограммах белка, произведенного 10 клетками за день.
Термин «титр» относится здесь к суммарному количеству экспрессируемого рекомбинантного белка, продуцируемого клеточной культурой в определенном количестве объема среды. Титр, как правило, выражают в миллиграммах или микрограммах белка на миллилитр среды.
Специалисту в данной области будет ясно, что способы, описанные здесь, можно использовать для культивирования множества хорошо известных клеток млекопитающих, которые повседневно используют и культивируют в данной области техники, т.е. применение способов, описанных здесь, не ограничивается только данным описанием.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ И НЕКОТОРЫЕ ВАРИАНТЫ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Было обнаружено, что использование соединения, препятствующего старению, такого как карнозин, влияет на жизнеспособность и продуктивность культуры клеток. Например, добавление карнозина сохраняет жизнеспособность клеток, а также улучшает продуктивность клеток и улучшает качество целевого белкового продукта.
Карнозин является антиоксидантом и соединением, препятствующим старению, которое также является природным дипептидом, высокий уровень которого присутствует (до 20 Мм) в мышечных и нервных тканях у животных. Будучи антиоксидантом, карнозин к тому же является поглотителем свободных радикалов ингибитором гликации.
В целом, карнозин трансформирует химически активные группировки в нереакционноспособные, защищая, таким образом, белки, ДНК и другие важные макромолекулы. Как соединение, препятствующее старению, карнозин способен продлевать продолжительность жизни клеток диплоидных фибробластов человека и легких человеческого эмбриона (первичные клеточные линии) при концентрации от 20 мМ в культуральной среде. Согласно настоящему изобретению неожиданно было обнаружено преимущество применения соединения, препятствующего старению (включая, но не ограничиваясь, карнозином), в клеточной культуре для получения белка, представляющего интерес. В некоторых вариантах реализации использование подобного соединения, препятствующего старению, в клеточной культуре для получения белка, представляющего интерес, приводит к улучшению одной или нескольких характеристик культуры клеток, включая, но не ограничиваясь: увеличение титра, увеличение удельной продуктивности клеток, увеличенние жизнеспособности клеток, увеличение интегральной плотности жизнеспособных клеток, уменьшение накопления высокомолекулярных агрегатов и/или уменьшение накопления кислотных молекул.
Было показано, что карнозин цитотоксичен для трансформированных и опухолевых клеток человека и грызунов в минимальной питательной среде (Minimal Essential Medium, MEM, Sigma), которая содержит более низкие уровни глюкозы, однако не является таковым в среде Игла в модификации Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMEM, Sigma), содержащей 1 мМ пируват (Holliday et al, Biochemistry (Москва), 65: 843-848,846). Кроме того, диализированная фетальная сыворотка крупного рогатого скота с удаленными низкомолекулярными компонентами увеличивала цитотоксический эффект карнозина. Там же. Было также установлено, что 1 мМ оксолоацетата и 1 мМ α-кетоглутарата, ни один из них не являлся компонентом инокуляционной или питательной среды в примерах с использованием карнозина, имели эффект, сопоставимый с влиянием пирувата. (Там же.) Пируват натрия, однако, является исходным компонентом инокуляционной среды, в концентрации 0.5 мМ, не столько из-за добавления карнозина, сколько для имитирования in vivo условий в системе биореактора, а также в качестве потенциального альтернативного источника энергии. Инокуляционная среда также не содержит сыворотки, что позволяет предположить, что карнозин может иметь цитотоксичный эффект. Согласно данному источнику добавление карнозина в культуральную среду может вызывать цитотоксичный эффект, схожий с тем, который наблюдался в среде MEM в работе Holliday. При использовании способов и/или композиций согласно настоящему изобретению подобный цитотоксичный эффект уменьшается или элиминируется, а жизнеспособность клеток и выход белка увеличиваются.
Некоторые варианты реализации определяют концентрацию карнозина в культуральной среде приблизительно от 5 мМ и до 100 мМ. Некоторые варианты реализации определяют концентрацию карнозина в культуральной среде приблизительно от 10 мМ до 40 мМ, например концентрацию приблизительно 20 мМ. Некоторые варианты реализации определяют концентрацию карнозина в культуральной среде приблизительно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 мМ или выше. В некоторых вариантах реализации заданная концентрация карнозина в культуральной среде достигается путем многократного добавления карнозина на протяжении процесса культивирования клеток, например, в составе одной или более питательных сред. Используемая концентрация карнозина зависит от используемых культуральной среды и клеточной линии, среди других факторов, включающих желаемое влияние на клеточную линию или продукт, которого хотят добиться. Для получения аналогичного результата в средут также можно добавлять аналоги карнозина, например ацетил-карнозин, гомо-карнозин, ансерин и β-аланин. В культуральную среду можно добавлять один или несколько из этих аналогов. Некоторые варианты реализации предполагают присутствие подобных аналогов в культуральной среде, в которой отсутствует карнозин. Некоторые варианты реализации предполагают присутствие подобных аналогов в культуральной среде совместно с карнозином. Некоторые варианты реализации определяют концентрацию подобных аналогов примерно 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13. 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 мМ или выше.
В некоторых вариантах реализации с целью получения белка, представляющего интерес, клетки-хозяева вначале трансфецируют или трансформируют экзогенной ДНК, кодирующей белок, таким образом получают клетки, которые конститутивно продуцируют целевой белковый продукт. В некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты, вносимая в клетку, кодирует белок, который должен экспресироваться согласно настоящему изобретению. В некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты, вводимая в клетку, кодирует белок, который желательно получить в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах реализации молекула нуклеиновой кислоты содержит регуляторную последовательность или кодирует генный продукт, который индуцирует или усиливает экспрессию целевого белка клетками. В качестве неограничивающего примера, подобный генный продукт может представлять собой вектор транскрипции, который увеличивает экспрессию белка, представляющего интерес.
В некоторых вариантах реализации, нуклеиновая кислота, которая управляет экспрессией белка, стабильно встроена в клетку-хозяина. В некоторых вариантах реализации, нуклеиновая кислота, которая управляет экспрессией белка, временно встроена в клетку-хозяина. Средний специалист в данной области сможет выбрать, стабильно или временно вводить нуклеиновую кислоту в клетку-хозяина в зависимости от экспериментальных, коммерческих или других нужд.
Ген, кодирующий белок, представляющий интерес, возможно, может быть сцеплен с одним или несколькими регуляторными элементами контроля генов (элементами генетического контроля). В некоторых вариантах реализации элемент генетического контроля направляет конститутивную экспрессию белка. В некоторых вариантах реализации может быть использован элемент генетического контроля, обеспечивающий индуцибильную экспрессию гена, кодирующего белок, представляющий интерес. Использование индуцибильного элемента генетического контроля (например, индуцибельного промотора) позволяет регулировать продукцию белка в клетке. Неограничивающие примеры потенциально пригодных индуцибельных генетических контрольных элементов, которые можно применять в эукариотических клетках, включают: элементы, регулируемые гормонами (см. например Mader, S. and White, J. H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5603-5607, 1993); элементы, регулируемые синтетическими лигандами (см. например Spencer, D.M. et al. Science 262: 1019-1024, 1993); элементы, регулируемые ионизационным излучением (см. например Manome, Y. et al., Biochemistry 32:10607-10613, 1993; Datta, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10149-10153, 1992). В соответствии со способами и композициями, описанными здесь можно исполыцовать дополнительные клеточно-специфичные или другие регуляторные системы, известные в данной области.
Любая клетка-хозяин, пригодная для культивирования и экспрессии белка может быть использована в соответствии с настоящим изобретением. Клетка-хозяин, как правило, представляет собой клетку млекопитающего, более конкретно, клетку животного, такую как клетки яичника китайского хомячка (CHO). Другие неограничивающие примеры клеток млекопитающих, которые можно исполыцовать в соответствии с настоящим изобретением, включают: линию миеломы мыши BALB/c (NSO/I, ЕСАСС No: 85110503); ретинобласты человека (PER.C6 (CmCeII, Leiden, Нидерланды); линия почки обезьяны CV1, трансформированная SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линия почки эмбриона человека (клетки 293 или 293 субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al., J. Gen ViroL, 36:59 (1977)); клетки яичника китайского хомячка +/-DHFR (CHO, Uriaub and Chasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216 (1980)); клетки Сертоли мыши (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленной мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1 587); клетки карциномы шейки матки (HeLa, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крыс буффало (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (HEP G2, HB 8065); опухоль молочной железы мышей (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al„ Annals N.Y. Acad.. Sci., 383: 44-68 (1982)); клетки MRC-5; клетки FS4; и линия гепатомы человека (Hep G2).
Любой белок, который может быть экспрессирован в хозяйской клетке, можно продуцировать согласно способам и композициям настоящего изобретения. Белок может экспрессироваться с эндогенного, по отношению к хозяйской клетке, гена или с гетерологичного гена, который ввели в клетку-хозяина. Белок может быть природного происхождения или, в качестве альтернативы, может иметь последовательность, которая была сконструирована и выбрана руками человека. Продуцируемый белок может быть составлен из фрагментов, которые в природе встречаются отдельно. Дополнительно или в качестве альтернативы, сконструированный белок может включать один или более фрагментов, которые в природе не встречаются.
В некоторых вариантах реализации способы и композиции настоящего изобретения применяют для экспрессии фармацевтически или коммерчески значимых ферментов, рецепторов, антител, гормонов, регуляторных факторов, антигенов, связующих агентов и т.д. В приведенных примерах генетически измененные клетки продуцируют антитело к фактору дифференцировки роста - 8 (growth differentiation factor-8, GDF-8). Неограничивающие иллюстративные варианты реализации названы Муо29, Муо28 и Муо22. Данные иллюстративные варианты реализации представлены в форме изотипов IgG человека. В раскрытых неограничивающих примерах используется MYO29, описанное в патенте № WO 2004/037861 «Нейтрализующие антитела к GDF-8 и их применение», включенном сюда путем ссылки. Средний специалист в данной области сможет определить и другие полезные и/или желательные белки, которые могут быть экспрессированны в соответствии со способами и композициями настоящего изобретения.
Для получения целевого белкового продукта линии клеток можно культивировать множеством способов. Культивирование клеток можно осуществлять как в малых, так и в больших масштабах, в зависимости от назначения культуральной среды или применения продукта. Например, клетки можно выращивать в биореакторе. В некоторых вариантах реализации объем биореактора составляет по крайней мере 1 литр, но может составлять 10, 100, 250, 500, 1, 000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000 литров и более или любой другой промежуточный объем.
Кроме того, к биореакторам, которые можно использовать, относятся, но не ограничиваются ими: биореактор с перемешиванием, реактор с псевдоожиженным слоем, биореактор с системой полых волокон или вращающийся флакон. Кроме того, система может функционировать в любом из режимов: периодическом, с подпиткой или непрерывном/перфузионном. Среднему специалисту в области культивирования клеток известны биореакторы и режимы для контроля и мониторинга культуральной среды. В настоящем примере в системе использовали биореактор с перемешиванием, работающий в режиме с подпиткой.
Биореактор, как правило, загружают инокуляционной средой и выбранной линией клеток, например линией клеток MYO-29, которую можно подвергнуть трансфекции, чтобы обеспечить стабильную экспрессию и продуцирование целевого белкового продукта. В качестве базовой среды можно использовать коммерчески доступные среды, такие как Минимальная Питательная Среда (MEM, Sigma), среда Хама F10 (Ham's F10, Sigma) или среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM, Sigma). Указанные базовые питательные среды можно затем дополнить аминокислотами, витаминам, микроэлементами и/или другими компонентами с образованием инокуляционной или питательной среды, которые используются в ходе производственного цикла. В некоторых вариантах реализации базовую среду изменяют, чтобы добиться устойчивого роста клеток, увеличить жизнеспособность клеток, увеличить продуктивность клетки, увеличить интегральную плотность жизнеспособных клеток и/или улучшить качество производимого белка в присутствии карнозина. В качестве примера, основную среду можно обогатить пируватом, оксалоацетатом и/или α-кетоглутаратом. Средний специалист в данной области сможет, не проводя лишних экспериментов, изменить базовую среду для использования согласно способам и композициям настоящего изобретения.
В некоторых вариантах реализации клетки культивируют в любой из множества сред с определенным химическим составом, содержащей соединение, препятствующее старению, в которой компоненты среды известны и могут контролироваться. Например, определенная среда, как правило, не содержит сложных добавок, таких как сыворотка или гидролизаты. В некоторых вариантах реализации клетки культивируют в любой из множества сложных сред, содержащих соединение, препятствующее старению, в которых не все компоненты среды известны и/или их можно контролировать. В некоторых вариантах реализации подобное соединение, препятствующее старению, представляет собой карнозин.
2
Параметры (условия) биореактора, контролируют, как обычно, значение pH устанавливают приблизительно от 6.5 до 7.5. Значение pH регулируют с использованием кислоты, как правило, CO, или основания, такого как бикарбонат натрия. В ходе фазы роста растворенный кислород поддерживают в интервале примерно от 5 до 90% от насыщения воздуха, а температура поддерживается от 30°C до 42°C. Лицо, имеющее средние навыки в области культивирования, не проводя излишних экспериментов, сможет изменить условия работы биореактора в зависимости от линии клеток и применяемых способов, для достижения желаемых результатов.
Композиции и способы настоящего изобретения можно применять с любым способом или системой культивирования клеток, которые допускают экспрессию белков. Например, клетки, экспрессирующие белок, представляющий интерес, можно выращивать методами периодического культивирования или культивирования с подпиткой, в которых культивирование прекращают после успешной экспрессии белка, после чего экспрессированный белок собирают и, возможно, очищают. В качестве альтернативы, клетки, экспрессирующие белок, представляющий интерес, можно выращивать методом перфузионного культивирования, при котором культивирование не прекращают и в культуру периодически или постоянно вносят новые питательные вещества и другие компоненты, и в ходе которого экспрессированный белок периодически или непрерывно собирают.
После посева клеток они проходят фазу роста, в ходе которой число клеток растет, как правило, экспоненциально. В ходе фазы роста температуру или интервал температур культуры клеток выбирают, основываясь, прежде всего, на температуре или интервале температур, при котором клеточная культура остается жизнеспособной, при котором наблюдается высокий уровень продуцирования белка, при котором продукция или накопление продуктов метаболизма минимальны, и/или любой комбинации этих и других факторов, рассматриваемых исполнителем как важные. В качестве одного из неограничивающих примеров: клетки CHO хорошо растут и продуцируют белок на высоком уровне при температуре приблизительно 37°C. В общем, большинство клеток млекопитающих растут хорошо и/или могут продуцировать высокие уровни белка в интервале примерно от 25°C до 42°C, хотя методы, приведенные в настоящем описании, не ограничены этими температурами. Некоторые клетки млекопитающих хорошо растут и/или могут продуцировать высокие уровни белка в интервале примерно от 35°C до 40°C. В некоторых вариантах реализации культуру клеток растят при температуре 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 или 45°C, один или большее число раз в течение фазы роста. Средние специалисты в данной области смогут выбрать подходящую для выращивания клеток температуру или интервал температур, в зависимости от потребностей клеток и требований исполнителя.
За фазой роста следует переходная фаза, в ходе которой клетки адаптируются ко всем изменениям, происходящим в окружающей среде, таким как изменение температуры. Производимые изменения, как правило, являются параметрами фазы образования продукта. В приведенных примерах, на 4 день температуру уменьшали примерно с 37°C до 31°C. Однако температурный сдвиг можно производить более одного раза и не обязательно в сторону уменьшения. Более того, переходная фаза и температурный сдвиг могут происходить в любой из дней производственного цикла. Несмотря на то, что большинство способов получения включают многофазный процесс, карнозин также можно использовать и в однофазном процессе.
При изменении температуры культуры, температурный сдвиг может быть относительно постепенным. Например, полное завершение изменения температуры может занять несколько часов или дней. С другой стороны, изменение температуры может быть довольно резким. Температуру можно постепенно увеличивать или уменьшать в ходе процесса культивирования. С другой стороны, температуру можно увеличивать или уменьшать на дискретные значения в различные моменты в ходе процесса культивирования. Последующая(ие) температура(ы) или интервал(ы) температур могут быть ниже или выше, чем инициирующая или предыдущая(ие) температура(ы) или интервал(ы) температур. Среднему специалисты в данной области будет понятно, что в данных вариантах реализации применяют многократные, дискретные сдвиги температуры. Например, температуру можно изменить один раз (на более высокую или более низкую температуру или интервал температур), выдержать клетки при этой температуре или в этом интервале температур в течение определенного промежутка времени, после чего температуру можно изменить еще раз на новую температуру или интервал температур, которые могут быть как выше, так и ниже предыдущих температуры или интервала температур. Температуру культуры после каждого дискретного сдвига можно оставлять неизменной или поддерживать в пределах определенного интервала температур.
В заключение наступает фаза образования продукта, в ходе которой число клеток существенно не увеличивается и клетки продуцируют целевой белковый продукт. Однако среднему специалисту в данной области известно, что в некоторых вариантах реализации клетки могут продолжать расти, а их количество увеличиваться, и в течение фазы образования продукта. В ходе этой фазы условия работы в биореакторе поддерживают условия, при которых клетки, вероятнее всего, будут продуктивными. Например, обычно поддерживают температуру, отличную от температуры фазы роста, способствующую продуцированию белкового продукта, например 31°C. В ходе производственного цикла, можно подкармливать клетки питательной средой, содержащей питательные вещества и добавки, в которых клетки могут нуждаться. Например, в некоторых случаях может быть полезно или необходимо на поздних стадиях фазы образования продукта обогатить клеточную культуру питательными веществами или другими компонентами среды, клетки расходуют или метаболизируют. В качестве неограничивающего примера: может быть полезно или необходимо обогатить клеточную культуру гормонами и/или другими ростовыми факторами, определенными ионами (такими, как натрий, хлор, кальций, магний и фосфаты), буферными веществами, витаминами, нуклеозидами или нуклеотидами, микроэлементами (неорганические компоненты, обычно присутствующие в очень небольших конечных концентрациях), аминокислотами, липидами, глюкозой или другими источникам энергии. Эти добавки можно вносить в культуру клеток однократно вносить их в клеточную культуру путем серии добавлений. В некоторых вариантах реализации в ходе фазы образования продукта соединение, препятствующее старению, добавляют в питательную среду один или более раз.
Согласно некоторым вариантам реализации применение соединения, препятствующего старению, например карнозина, в культуральной среде на протяжении фазы образования продукта, которое вводят в инокуляционную среду или питательную среду, повышает жизнеспособность клеток и/или удельную продукцию белка, что улучшает общий выход получаемого белка.
Аспекты способа производства белка определяет специалист в области культивирования клеток. Такие параметры как плотность посева, продолжительность производственного культивирования, рабочие условия в процессе сбора, наряду с другими, в том числе вышеупомянутыми, зависят от линии клеток и культуральной среды. Таким образом, средний специалист в области культивирования клеток сможет определить данные параметры без дополнительной экспериментальной работы.
Как и в случае с температурой или интервалом температур в ходе фазы роста, температуру или интервал температур культуры клеток в ходе фазы образования продукта следует выбирать на основании температуры или интервала температур, при которых: клеточная культура сохраняет жизнеспособность, продуцирует высокие уровни белка, продуцирование или накопление продуктов метаболизма минимальны, и/или в зависимости от любых комбинации этих и других факторов, рассматриваемых исполнителем, как важные. Как правило, большинство клеток млекопитающих сохраняют жизнеспособность и продуцируют высокие уровни белкам в интервале примерно от 25°C до 42°C, хотя способы, приведенные в настоящем описании, не ограничены этими температурами. В некоторых вариантах реализации клетки млекопитающих сохраняют жизнеспособность и продуцируют высокие уровни белка белок в интервале примерно от 25°C до 35°C. В некоторых вариантах реализации культуру клеток выращивают при температуре 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 или 45°C один или большее число раз в ходе фазы образования продукта. Средние специалисты в данной области смогут выбрать подходящие для выращивания клеток температуру(ы) или интервал(ы) температур в зависимости от индивидуальных потребностей клеток и личных требований к продукции заказчика. Клетки можно выращивать любое количество времени, в зависимости от нужд заказчика и собственных потребностей клеток.
В некоторых вариантах реализации периодическое культивирование или культивирование с подпиткой прекращают, как только культура достигает одного или нескольких важных параметров, которые определяются нуждами заказчика. В некоторых вариантах реализации периодическое культивирование или культивирование с подпиткой прекращают, как только уровень экспрессированного белка достигает достаточно высокого титра, как только плотность клеток достигает достаточно высокого уровня, как только уровень экспрессированного белка достигает достаточно высокой плотности клеток, и/или в случае, когда следует предотвратить нежелательное продуцирование или накопление продуктов метаболизма (например, молочной кислоты и/или аммония). Средний специалист в данной области сможет определить другие существенные условия культивировании, которые можно использовать для определения времени прекращения периодического культивирования или культивирования с подпиткой, основываясь на экспериментальных, коммерческих и/или других соображениях.
В некоторых вариантах реализации, по завершении производственного цикла белковый продукт извлекают из культуральной среды и затем выделяют, используя традиционные методики разделения. Например, первоначально белок можно отделить путем центрифугирования, с сохранением супернатанта, содержащего белок. Дополнительно или в качестве альтернативы белковый продукт может быть связан с поверхностью клетки-хозяина. В подобных вариантах реализации на первом этапе процесса очистки удаляют среду, а клетки-хозяева, экспрессирующие белок, лизируют. Лизирование клеток-хозяев млекопитающих можно осуществлять любьм из способов, известных специалистам в данной области, включая физическое разрушение стеклянными шариками или действие высокого значения pH.
Белок можно дополнительно, кроме того, выделить с использованием традиционных способов очистки белков. Способы выделения и очистки целевого белкового продукта известны специалистам в области культивирования клеток. Конкретные способы зависят от клеточной линии и извлекаемого продукта.
Соединение, препятствующее старению, например карнозин, можно добавить в культуральную среду в момент времени, оптимальный для конкретного способа культивирования клеток. В приведенных примерах добавление карнозина проводили после того, как фаза роста была по существу завершена, в переходной фазе. В процессе добавления культуральная среда адаптировалась к новой температуре, установленной в результате температурного сдвига. Как правило, в переходной фазе добавляют агенты для стимулирования фазы образования продукта. Карнозин, однако, можно добавить в любой момент производственного цикла, обеспечивающий оптимальный результат, включая фазу роста и фазу образования продукта. Также карнозин можно добавлять в комбинации с другими компонентами, такими как питательная среда. В некоторых вариантах реализации соединение, препятствующее старению, вводят в инокуляционную среду и оно присутствует в культуре клеток на протяжении всего процесса культивирования клеток. В некоторых вариантах реализации в культуральную среду вводят два или более соединений, препятствующих старению. В некоторых вариантах реализации два или более соединений, препятствующих старению, вводят в инокуляционной среде, и они присутствуют в клеточной культуре на протяжении всего процесса культивирования клеток, в то время как другое соединение, препятствующее старению, применяют после того, как культивирование началось.
В некоторых вариантах реализации концентрация соединения, препятствующего старению, в клеточной культуре различна для различных типов клеток и продуктов. В некоторых вариантах реализации концентрация карнозина в клеточной культуре различна для различных типов клеток и продуктов. В общем, концентрация является достаточной для усиления продуктивности и качества без проявления цитотоксического действия. В приведенных примерах интервал включает, но не ограничивается, от 5 мМ до 100 мМ. Следует отметить, что используемая концентрация карнозина может варьировать в зависимости от культуральной среды. Подходящую концентрацию карнозина для отдельных линий клеток можно определить с помощью обычных маломасштабных экспериментов, таких, например, как в 2-литровом биореакторе, с использованием стандартных методов. Средний специалист в данной области, не проводя излишних экспериментов, сможет определить благоприятную или оптимальную концентрацию карнозина или другого соединения, препятствующего старению, с использованием способов культивирования клеток и способов диагностики, известных в данной области техники.
Одно из преимуществ добавления карнозина или другого соединения, препятствующего старению, по сравнению с химическими агентами это влияние на жизнеспособность. Как правило, добавление химического агента, такого как бутират натрия приводит к прекращению клеточного роста и снижению числа жизнеспособных клеток (Kim et al. Biotechnol Bioeng, 71: 184-193, 184). Однако приведенные ниже примеры демонстрируют, что добавление карнозина в культуральную среду приводит к повышенной жизнеспособности к моменту сбора, по сравнению с культурой клеток, выращенной в отсутствие соединения, препятствующего старению, такого как карнозин. Более того, подобные культуры клеток, содержащие карнозин, демонстрируют увеличение удельной продуктивности. Положительное воздействие на жизнеспособность клеток и специфичную продуктивность приводи к увеличению общего выхода.
Другое преимущество заключается в том, что соединение, препятствующее старению, такое как карнозин, уменьшает количество высокомолекулярных агрегатов и/или число кислотных молекул. Уменьшение количества высокомолекулярных агрегатов и кислотных группировок упрощает очистку белкового продукта. Возможность более эффективной очистки белка позволяет уменьшить затраты на производство белкового продукта. В некоторых вариантах реализации для уменьшения количества высокомолекулярных агрегатов и кислотных молекул используют соединение, препятствующее старению, отличное от карнозина. В некоторых вариантах реализации для уменьшения количества высокомолекулярных агрегатов и кислотных группировок используют два или более соединений, препятствующих старению.
В некоторых вариантах реализации клетки выращивают в соответствии с любым из способов культивирования клеток, приведенных в Патентных Заявках США 11/213308, 11/213317 и 11/213633, каждая из которых была подана 25 августа 2005 года и каждая из которых включена в настоящий документ во всей полноте путем ссылки. Например, в некоторых вариантах реализации клетки можно выращивать в культуральной среде, в которой совокупная концентрация аминокислот более 70 мМ. В некоторых вариантах реализации клетки можно вырастить в культуральной среде, в которой молярное отношение совокупного глутамина к совокупному аспаргину меньше примерно 2. В некоторых вариантах реализации клетки можно выращивать в культуральной среде, в которой молярное отношение совокупного глутамина ко всем аминокислотам меньше примерно 0.2. В некоторых вариантах реализации клетки можно выращивать в культуральной среде, в которой молярное отношение всех неорганических ионов ко всем аминокислотам находится в интервале от примерно 0.4 до примерно 1. В некоторых вариантах реализации клетки можно выращивать в культуральной среде, в которой совокупная концентрация глутамина и аспаргина находится в интервале примерно от 16 до 36 мМ. В некоторых вариантах реализации клетки можно выращивать в культуральной среде, в которой совмещены одно, два, три, четыре или все пять предыдущих параметров среды. Использование подобных сред позволяет добиться высокого уровня продукции белка и уменьшить накопление некоторых нежелательных факторов, таких как аммоний и/или молочная кислота.
В некоторых вариантах реализации клетки выращивают в соответствии с одним или несколькими условиями, описанными в Предварительной Патентной Заявке США №60/830658, поданной 13 июля 2006 года и включенной в настоящий документ во всей полноте посредством ссылки. Например, в некоторых вариантах реализации клетки выращивают в культуральной среде, которая содержит марганец в концентрации приблизительно от 10 до 600 нМ. В некоторых вариантах реализации клетки выращивают в культуральной среде, которая содержит марганец в концентрации приблизительно от 20 до 100 нМ. В некоторых вариантах реализации клетки выращивают в культуральной среде, которая содержит марганец в концентрации приблизительно 40 нМ. Применение таких сред для получения гликопротеинов приводит к получению гликопротеинов с улучшенными параметрами гликозилирования (например, с повышенным числом остатков сахаров, ковалентно присоединенных к олигосахаридной цепи).
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения белки, полученные в соответствии с одним или несколькими способами настоящего изобретения, могут иметь фармакологической значение и могут быть использованы для приготовления фармацевтических препаратов. Белки, полученные в соответствии с одним или несколькими способами настоящего изобретения, можно вводить субъекту или предварительно подготавливать для доставки любым из доступных путей, включая, без ограничения, парентеральный (например, внутривенно), внутрикожный, подкожный, оральный, назальный, бронхиальный, глазной, трансдермальный (топический), трансмукозальный, ректальный и вагинальный пути введения. Фармацевтические композиции согласно данному изобретению, как правило, включают очищенные белки, экспрессированные линиями клеток млекопитающих, агенты доставки (например, катионные полимеры, молекулы пептидов - транспортеры, ПАВ и т.д., как описано выше) в сочетании с приемлемыми фармацевтическими наполнителями. Используемая здесь формулировка «фармацевтически приемлемый носитель» включает: растворители, дисперсионные среды, оболочки, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание агенты и подобные агенты, пригодные для фармацевтическое введения. В композицию также можно включить дополнительные активные соединения.
Фармацевтическую композицию составляют таким образом, чтобы она была совместима с предполагающимся путем введения. Подобные составы должны быть известны специалистам в данной области. В некоторых вариантах реализации белок, полученный в соответствии с настоящим изобретением, перерабатывают в форму для орального и/или парентерального введения. В некоторых вариантах реализации для более легкого введения и унификации дозировок, подобные формы для орального и/или парентерального введения изготавливают в виде формы единичного дозирования, в которых каждая единица содержит определенное количество активного белка, рассчитанное для достижения желаемого терапевтического эффекта, совместно с необходимым фармацевтическим носителем. Средний специалист в данной области сможет разработать форму единичного дозирования, пригодную для белков, полученных согласно настоящему изобретению.
Выше подробно рассмотрены некоторые варианты реализации и аспекты. Ниже настоящее описание проиллюстрировано также неограничивающими примерами. Средним специалистам в данной области будет понятно, что различные модификации этих вариантов реализации входят в объем прилагаемой формулы изобретения. Следует отметить, что добавление карнозина и/или других соединений, препятствующих старению, одинаково применимо с другими культурами клеток млекопитающих и белковыми продуктами. Объем настоящего изобретения определяется формулой изобретения и ее эквивалентами, которые не ограничиваются и не сводятся к настоящему описаниею и отдельным вариантам реализации.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Эксперименты с карнозином в чашках
Линию клеток MYO-29 культивировали в биореакторе, в бессывороточной производственной среде, в рабочем объеме 1 литр, на четвертый день температуру изменили с 37 C на 31 C. pH внутри биореактора поддерживали на уровне 7.00, уровень растворенного кислорода - 30% насыщения воздуха. На 4, 7 и 10 день из биореактора отобрали культуральную среду, переносили на чашки с рабочим объемом 8 мл и поместили в термостат с температурой 31°C, где культуру в чашках растили до 12 дня. На 5 и 7 день к клеткам добавляли питательную среду. На 5 день в клеточные культуры добавили 10% (об./об.) питательной среды, на 7 день в клеточные культуры добавили 5% (об./об.) питательной среды. На 4, 7 и 10 день, соответственно, в чашки добавиляли 10 мМ карнозина, культуральную среду собрали на 12 день.
На Фигуре 1a показано влияние добавления карнозина на величину кислотных пиков в культуре на 7 день. На Фигуре 1b показано влияние карнозина на высокомолекулярные агрегаты на 7 день. На Фигуре 1c показано влияние добавление карнозина на 4 день, по сравнению с добавлением карнозина на 7 день, по сравнению с добавлением карнозина на 10 день, на кислотные пики. На фигуре 1d показаны результаты того же самого эксперимента при определении высокомолекулярных агрегатов. Во всех случаях карнозин имел положительный эффект на уменьшение как кислотных пиков, так высокомолекулярных агрегатов при культивировании на чашках.
Пример 2
Влияние добавления карнозина в культуральную среду
6
В пять биореакторов, в бессывороточной инокуляционной среде, с плотностью 0,9×10 кл/мл, в рабочем объеме 1 литр внесли клеточную линию MYO-29. На 3, 5, 7 и 12 день 14-дневнего цикла во все биореакторы загрузили 5% (об./об.) питательной среды. На 10 день 5% (об./об.) питательной среды загрузили в два контрольных биореактора и один, содержащий карнозин. В биореакторах поддерживали следующие условия: температура 37°C, pH 7.00, уровень растворенного кислорода 30% насыщения воздухом. Перемешивание проводили со скоростью 200 оборотов в минуту, барботируемый газ представлял собой смесь воздуха и 7% диоксида углерода.
Все клетки культивировали в течение 4 дней, после чего в два биореактора внесли 20 мМ карнозина, контроль карнозина не содержал, та же на 4 день температуру во всех биореакторах изменили на 31°C. Работу биореакторов остановили на 14 день производственного цикла. В ходе производственного цикла отбирали пробы для отслеживания развития культуральной среды. Контроли повели себя, как и ожидалось.
На Фигуре 2a показана плотность жизнеспособных клеток в каждый из дней. На фигуре 2b показано, что плотность жизнеспособных клеток в биореакторах, содержащих карнозин, была выше к моменту остановки по сравнению с двумя биореакторами, не содержащими карнозин. На Фигуре 2c показан титр в биореакторах, в двух биореакторах, содержащих карнозин, к моменту остановки, титр был более высок. В культурах, содержащих карнозин, наблюдалась лучшая, кумулятивная удельная продуктивность клеток, что показано на Фигуре 2d. На фигуре 2e показано количество высокомолекулярных агрегатов и показано уменьшение высокомолекулярных агрегатов в биореакторах, содержащих карнозин.
Пример 3
Влияние добавления различных концентраций карнозина
6
В четыре биореактора в бессывороточной инокуляционной среде, с плотностью 0,4×10 кл/мл, в рабочем объеме 1 литр внесли клеточную линию MYO-29. На 7 день 14-дневнего цикла во все биореакторы загрузили 5% (об./об.) питательной среды. В биореакторе поддерживали следующие условия: температура 37°C, pH 7.00, уровень растворенного кислорода 30% насыщения воздуха. Перемешивание проводили со скоростью 200 оборотов в минуту, барботируемый газ представлял собой смесь воздуха и 7% диоксида углерода.
Все клетки культивировали в течение 4 дней, после чего температуру во всех биореакторах изменили на 31°C.
Также на 4 день в первый биореактор внесли 20 мМ карнозина, во второй 40 мМ карнозина, контроль карнозина не содержал. Работу всех биореакторов остановили на 12 день производственного цикла. В ходе производственного цикла отбирали пробы для отслеживания развития культуральной среды. Контроли повели себя, в целом, как и ожидалось, за исключением одного из контролей, в котором жизнеспособность клеток в каждый из дней была ниже, чем наблюдалось ранее.
На фигуре 3a показана плотность жизнеспособных клеток в каждый из дней, во всех биореакторах наблюдалась схожая картина по сравнению с ожидаемым результатом в биореакторе с 40 мМ карнозина. На фигуре 3b показано, что жизнеспособность клеток в каждый из дней в биореакторах с карнозином была выше к моменту остановки в сравнении с двумя контрольными биореакторами, не содержавшими карнозина. На фигуре 3c показан титр в каждый из дней, в биореакторах, содержащих карнозин и в одном из контрольных схожая картина. В биореакторе, содержащем 40 мМ карнозина, кумулятивная удельная клеточная продуктивность была выше (Фигура 3d). На фигуре 3е показано количество высокомолекулярных агрегатов, во всех случаях наблюдалось уменьшение количества высокомолекулярных агрегатов при добавлении карнозина по сравнению с контролем.
Хотя некоторые варианты реализации и представлены в настоящем описании, приведенное выше описание выполняет исключительно иллюстративную функцию. Для специалистов в области культивирования будут очевидны дальнейшие модификации описанных здесь вариантов реализации, и подразумевается, что все подобные модификации входят объем вариантов реализации, определенных приложенной формулой изобретения.