Иммунобиологическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вирусов SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) и SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron) (варианты)
IMMUNOBIOLOGICAL AGENT AND METHOD FOR ITS USE FOR INDUCTION OF SPECIFIC IMMUNITY AGAINST VIRUSES SARS-COV-2 VARIANT B.1.617.2 (DELTA) AND SARS-COV-2 VARIANT B.1.1.529 (OMICRON) (VARIANTS)

Область техники.
Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Предложенное средство может применяться для профилактики заболеваний, вызванных различными вариантами вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.
Уровень техники.
Эпидемия коронавирусной инфекции COVID-19, которая началась в конце 2019 года в Китайской Народной Республике, за несколько месяцев распространилась по всему миру и бросила беспрецедентный вызов современной системе здравоохранения. В настоящее время число заболевших COVID-19 более 540 млн человек, а число погибших более 6,3 млн человек.
COVID-19 - это острая респираторная инфекция, которая может протекать как в легкой, так и в тяжелой форме. Наиболее частым осложнением заболевания является вирусная пневмония, которая может привести к острому респираторному дистресс-синдрому и последующей острой дыхательной недостаточности. Кроме того, при тяжелом течении болезни могут возникнуть такие осложнения, как полиорганная недостаточность, септический шок и венозная тромбоэмболия. Возбудителем заболевания является одноцепочечный РНК-содержащий вирус SARS-CoV-2, относящийся к семейству Coronaviridae к линии Beta-CoV.
К настоящему времени было разработано несколько вакцин против коронавируса SARS-CoV-2.
Фармацевтическая компания Pfizer при сотрудничестве с биотехнологической компанией BioNTech разработала вакцину BNT162b2 (tozinameran). Данная вакцина представляет собой липидные наночастицы, внутрь которых инкапсулирована мРНК с оптимизированными кодонами, которая кодирует тримеризованный S белок SARS-CoV-2, полученный из изолята Wuhan-Hu-1 (GenBank: QHD43416.1; аминокислоты 1-1273), содержащий стабилизирующие мутации K986P и V987P. (Sahin U, Muik A, Vogler I, Derhovanessian E, Kranz LM, Vormehr M, Quandt J, Bidmon N, Ulges A, Baum A, Pascal KE, Maurus D, Brachtendorf S, Lörks V, Sikorski J, Koch P, Hilker R, Becker D, Eller AK, Grützner J, Tonigold M, Boesler C, Rosenbaum C, Heesen L, Kühnle MC, Poran A, Dong JZ, Luxemburger U, Kemmer-Brück A, Langer D, Bexon M, Bolte S, Palanche T, Schultz A, Baumann S, Mahiny AJ, Boros G, Reinholz J, Szabó GT, Karikó K, Shi PY, Fontes-Garfias C, Perez JL, Cutler M, Cooper D, Kyratsous CA, Dormitzer PR, Jansen KU, Türeci Ö. BNT162b2 vaccine induces neutralizing antibodies and poly-specific T cells in humans. Nature. 2021 Jul;595(7868):572-577. doi: 10.1038/s41586-021-03653-6. Epub 2021 May 27. PMID: 34044428.).
Фармацевтическая компания Moderna в сотрудничестве с Национальным Институтом здоровья (США) разработала вакцину mRNA-1273. Активным компонентом данной вакцины является мРНК с оптимизированными кодонами, кодирующая стабилизированный до слияния полноразмерный S белок SARS-CoV-2 (изолят Wuhan-Hu-1, эталонная последовательность NCBI: NC_045512.2), которая окружена липидной оболочкой (L. A. Jackson et al. An mRNA Vaccine against SARS-CoV-2 - Preliminary Report. N Engl J Med 2020; 383:1920-1931; Corbett KS, Edwards DK, Leist SR, Abiona OM, Boyoglu-Barnum S, Gillespie RA, Himansu S, Schäfer A, Ziwawo CT, DiPiazza AT, Dinnon KH, Elbashir SM, Shaw CA, Woods A, Fritch EJ, Martinez DR, Bock KW, Minai M, Nagata BM, Hutchinson GB, Wu K, Henry C, Bahl K, Garcia-Dominguez D, Ma L, Renzi I, Kong WP, Schmidt SD, Wang L, Zhang Y, Phung E, Chang LA, Loomis RJ, Altaras NE, Narayanan E, Metkar M, Presnyak V, Liu C, Louder MK, Shi W, Leung K, Yang ES, West A, Gully KL, Stevens LJ, Wang N, Wrapp D, Doria-Rose NA, Stewart-Jones G, Bennett H, Alvarado GS, Nason MC, Ruckwardt TJ, McLellan JS, Denison MR, Chappell JD, Moore IN, Morabito KM, Mascola JR, Baric RS, Carfi A, Graham BS. SARS-CoV-2 mRNA vaccine design enabled by prototype pathogen preparedness. Nature. 2020 Oct;586(7830):567-571. doi: 10.1038/s41586-020-2622-0. Epub 2020 Aug 5. PMID: 32756549; PMCID: PMC7581537).
Оксфордский университет в сотрудничестве с фармацевтической компанией AstraZeneca разработал векторную вакцину ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222). Активным компонентном данной вакцины является аденовирус шимпанзе ChAdOx1, содержащий кодон-оптимизированную кодирующую последовательность полноразмерного S белка вируса SARS-CoV-2 (изолят Wuhan-Hu-1, GenBank MN908947) с лидерной последовательностью тканевого активатора плазминогена (M. Voysey et al. Safety and efficacy of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine (AZD1222) against SARS-CoV-2: an interim analysis of four randomised controlled trials in Brazil, South Africa, and the UK. The Lancet. Vol.397, Issue 10269, P99-111, 2021). На данной технологии также основана вакцина Covishiels (производства Serum Institute of India Pvt Ltd).
Компания CanSino разработала векторную вакцину против COVID-19, в основе которой репликативно-дефектный аденовирус человека 5 серотипа (Ad5), экспрессирующий оптимизированный полноразмерный S гликопротеин SARS-CoV-2 (изолят Wuhan-Hu-1, GenBank YP_009724390) (Feng-Cai Zhu et al. Immunogenicity and safety of a recombinant adenovirus type-5-vectored COVID-19 vaccine in healthy adults aged 18 years or older: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2 trial. The Lancet. Vol.369, Issue 10249, P479-488, 2020).
Исследовательские группы Johnson and Johnson и Janssen Pharmaceutical в сотрудничестве с Медицинским центром Beth Israel Deaconess, с помощью технологии Janssen AdVac создали несколько кандидатных вакцин. После проведенных исследований безопасности и эффективности была выбрана кандидатная вакцина Ad26.COV2.S (Ad26COVS1). Активным компонентном данной вакцины является рекомбинантный аденовирусный вектор 26 серотипа с делецией Е1 и Е3 области, содержащий ген S белка SARS-CoV-2 изолят Wuhan-Hu-1, с мутацией сайта расщепления фурина и с двумя пролин-стабилизирующими мутациями (Solforosi L, Kuipers H, Jongeneelen M, Rosendahl Huber SK, van der Lubbe JEM, Dekking L, Czapska-Casey DN, Izquierdo Gil A, Baert MRM, Drijver J, Vaneman J, van Huizen E, Choi Y, Vreugdenhil J, Kroos S, de Wilde AH, Kourkouta E, Custers J, van der Vlugt R, Veldman D, Huizingh J, Kaszas K, Dalebout TJ, Myeni SK, Kikkert M, Snijder EJ, Barouch DH, Böszörményi KP, Stammes MA, Kondova I, Verschoor EJ, Verstrepen BE, Koopman G, Mooij P, Bogers WMJM, van Heerden M, Muchene L, Tolboom JTBM, Roozendaal R, Brandenburg B, Schuitemaker H, Wegmann F, Zahn RC. Immunogenicity and efficacy of one and two doses of Ad26.COV2.S COVID vaccine in adult and aged NHP. J Exp Med. 2021 Jul 5;218(7):e20202756. doi: 10.1084/jem.20202756. PMID: 33909009; PMCID: PMC8085771; Sadoff J, Le Gars M, Shukarev G, Heerwegh D, Truyers C, de Groot AM, Stoop J, Tete S, Van Damme W, Leroux-Roels I, Berghmans PJ, Kimmel M, Van Damme P, de Hoon J, Smith W, Stephenson KE, De Rosa SC, Cohen KW, McElrath MJ, Cormier E, Scheper G, Barouch DH, Hendriks J, Struyf F, Douoguih M, Van Hoof J, Schuitemaker H. Interim Results of a Phase 1-2a Trial of Ad26.COV2.S Covid-19 Vaccine. N Engl J Med. 2021 May 13;384(19):1824-1835. doi: 10.1056/NEJMoa2034201. Epub 2021 Jan 13. PMID: 33440088; PMCID: PMC7821985.).
Вакцина CoronaVac (Sinovac Biotech)- жидкая инактивированная цельновирионная вакцина, в основе которой лежит вариант SARS-CoV-2 CN02, выделенный от госпитализированного пациента в начале 2020 г (Zhang Y, Zeng G, Pan H, Li C, Hu Y, Chu K, Han W, Chen Z, Tang R, Yin W, Chen X, Hu Y, Liu X, Jiang C, Li J, Yang M, Song Y, Wang X, Gao Q, Zhu F. Safety, tolerability, and immunogenicity of an inactivated SARS-CoV-2 vaccine in healthy adults aged 18-59 years: a randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 1/2 clinical trial. Lancet Infect Dis. 2021 Feb;21(2):181-192. doi: 10.1016/S1473-3099(20)30843-4. Epub 2020 Nov 17. PMID: 33217362; PMCID: PMC7832443).
Все вышеперечисленные фармацевтические компании начали разработку вакцин сразу после начала пандемии. Первые кандидатные препараты были получены через несколько месяцев. Однако, период доклинических и клинических исследований вакцин, а также период налаживания их производства занял больше года. За прошедшее время вирус SARS-CoV-2 постепенно мутировал. Поэтому к моменту проведения масштабной кампании вакцинации, эффективность вакцин против новых вариантов SARS-CoV-2 оказалась снижена. При этом чем больше мутаций накапливается в S белке коронавируса, тем ниже становится эффективность вакцинных препаратов, в которых он является основным антигеном. Так, например, эффективность двукратной вакцинации BNT162b2, заявленная производителем составляет 95%, тогда как против варианта SARS-CoV-2 Alpha эффективность вакцинации снижается до 93,7%, а против варианта SARS-CoV-2 Delta - до 88,0% (Bernal et al. Effectiveness of Covid-19 Vaccines against the B.1.617.2 (Delta) Variant. N Engl J Med. 2021 Aug 12;385(7):585-594. doi: 10.1056/NEJMoa2108891. Epub 2021 Jul 21. PMID: 34289274; PMCID: PMC8314739. При этом варианты SARS-CoV-2 не одинаково распространяются в мире. Так варианты, обладающие повышенной трансимиссивностью и способностью ускользать от естественного и искусственного иммунитета распространяются быстрее и постепенно вытесняют остальные варианты вируса.
В настоящее время доминирующим вариантом SARS-CoV-2 в мире является вариант B.1.1.529 (Omicron), имеющий большое количество мутаций в S белке. Результаты исследования, проведенного Andrews N и соавт.показали, что эффективность вакцин против данного варианта SARS-CoV-2 продолжает снижаться. Так, например, вакцина ChAdOx1 nCoV-19 через 20 недель после вакцинации не обладала протективным эффектом против варианта B.1.1.529 (Omicron), а эффективность вакцины BNT162b2 после двух доз составляла 65,5% через 2-4 недели, снижаясь до 8,8% через 25 и более недель (Andrews N. et el. Covid-19 Vaccine Effectiveness against the Omicron (B.1.1.529) Variant. N Engl J Med. 2022 Apr 21;386(16):1532-1546. doi: 10.1056/NEJMoa2119451. Epub 2022 Mar 2. PMID: 35249272; PMCID: PMC8908811).
Таким образом, в настоящий момент необходима разработка нового иммунобиологического средства, которое способно индуцировать иммунный ответ к актуальным вариантам SARS-CoV-2.
Известно техническое решение (патент RU2743963C1), в котором описано создание и использование средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме. Данное изобретение основано на использовании в качестве активных компонентов рекомбинантных аденовирусов человека 26 серотипа и 5 серотипа, а также рекомбинантного аденовируса обезьян 25 серотипа, содержащих один из нескольких вариантов экспрессионной кассеты с геном S антигена вируса SARS-CoV-2. Данное техническое решение было выбрано авторами изобретения за прототип.Недостатком прототипа является использование гена S белка раннего изолята вируса SARS-CoV-2, вследствие чего наблюдается снижение эффективности вакцины против вариантов SARS-CoV-2 B.1.617.2 (Delta) и B.1.1.529 (Omicron)
Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке иммунобиологического средства, лишенного данных недостатков.
Осуществление изобретения.
Технической задачей заявленной группы изобретений является создание средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) и вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron).
Технический результат заключается в создании безопасного и эффективного иммунобиологического средства обеспечивающего развитие реакций гуморального и клеточного иммунного ответа против вариантов вируса SARS-CoV-2 B.1.617.2 (Delta) и B.1.1.529 (Omicron) у широких слоев населения.
Указанный технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее в качестве активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.
Кроме того, технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее в качестве активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3.
Также, технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, представляющее собой смесь иммунобиологического средства, содержащего в качестве активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 и иммунобиологического средства, содержащего в качестве активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:2.
Также, технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, представляющее собой смесь иммунобиологического средства, содержащего в качестве активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 и иммунобиологического средства, содержащего в качестве активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:3.
Кроме того, технический результат достигается тем, что создано иммунобиологическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, представляющее собой смесь иммунобиологического средства, содержащего в качестве активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 и иммунобиологического средства, содержащего в качестве активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3.
При этом разработанное иммунобиологическое средство может находиться в жидкой или лиофилизированной форме.
Причем буферный раствор фармацевтического средства для жидкой формы содержит, масс. %:
трис
от 0,1831 до 0,3432
хлорид натрия
от 0,3313 до 0,6212
сахароза
от 3,7821 до 7,0915
магния хлоридагексагидрат
от 0,0154 до 0,0289
ЭДТА
от 0,0029 до 0,0054
полисорбат-80
от 0,0378 до 0,0709
этанол 95%
от 0,0004 до 0,0007
вода
остальное
А буферный раствор восстановленной лиофилизированной формы средства содержит, масс. %:
трисхлорид натриясахарозамагния хлоридагексагидратЭДТАполисорбат-80вода
от 0,0180 до 0,0338от 0,1044 до 0,1957от 5,4688 до 10,2539от 0,0015 до 0,0028от 0,0003 до 0,0005от 0,0037 до 0,0070остальное
Также технический результат достигается за счет того, что предложено применение разработанного иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2, где указанное средство предназначено для интраназального или внутримышечного введения или совместного интраназального и внутримышечного введения.
9
11
9
11
9
11
9
11
Причем в частном случае выполнения средство интраназально вводят в дозе от 5*10- 5*10вирусных частиц или внутримышечно в дозе от 5*10- 5*10 вирусных частиц. А совместное введение интраназально и внутримышечно осуществляют в дозе от 5*10 до 5*10вирусных частиц внутримышечно, в дозе от 5*10 до 5*10 вирусных частиц интраназально.
Совместное введение предусматривает интраназальное и внутримышечное введение в рамках одной процедуры вакцинации.
Кроме того, в частном случае выполнения указанное средство может применяться у детей.
Краткое описание фигур.
На фиг.1 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунобиологическим средством по оценке доли пролиферирующих CD4+и CD8+лимфоцитов в ответ на стимуляцию антигеном (S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2).
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - экспериментальные группы.
11
1) Ad26-S-delta, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
2) Ad26-S-omicron, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
3) Ad5-S-delta, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
4) Ad5-S-omicron, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
5) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
6) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, внутримышечно, 10вч/200 мкл
11
7) Ad26-null, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
8) Ad5-null, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
9) Ad26-S-delta, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
10) Ad26-S-omicron, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
11) Ad5-S-delta, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
12) Ad5-S-omicron, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
13) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
14) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, интраназально, 10вч/200 мкл
11
15) Ad26-null, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
16) Ad5-null, интраназально, 10вч/200 мкл.
17) Плацебо (буфер), 200 мкл
На фиг.2 представлены результаты оценки эффективности иммунизации разработанным иммунобиологическим средством по оценке доли пролиферирующих CD4+и CD8+лимфоцитов в ответ на стимуляцию антигеном (S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529).
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - экспериментальные группы.
11
1) Ad26-S-delta, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
2) Ad26-S-omicron, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
3) Ad5-S-delta, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
4) Ad5-S-omicron, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
5) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
6) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, внутримышечно, 10вч/200 мкл
11
7) Ad26-null, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
8) Ad5-null, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
9) Ad26-S-delta, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
10) Ad26-S-omicron, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
11) Ad5-S-delta, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
12) Ad5-S-omicron, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
13) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
14) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, интраназально, 10вч/200 мкл
11
15) Ad26-null, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
16) Ad5-null, интраназально, 10вч/200 мкл.
17) Плацебо (буфер), 200 мкл
Реализация изобретения.
Для создания безопасного и эффективного иммунобиологического средства для индукции иммунитета против коронавируса SARS-CoV-2 была выбрана векторная система на основе аденовирусов. Аденовирусные векторы обладают целым рядом преимуществ: они не способны размножаться в клетках человека, проникают как в делящиеся, так и неделящиеся клетки, способны индуцировать клеточный и гуморальный иммунный ответ, обеспечивают высокий уровень экспрессии целевого антигена. Авторами патента было выбрано два серотипа аденовирусов - human adenovirus 26-го серотипа и human adenovirus 5-го серотипа. Данные вирусы генетически сильно различаются, что обеспечит преодоление трудностей, связанных с наличием у пациентов предсуществующего иммунного ответа к некоторым серотипам аденовирусов. При этом появляется возможность использования изобретения, по которому вариант фармацевтического средства выбирается после оценки иммунного статуса пациента к серотипам аденовирусных векторов.
В качестве антигена был выбран S белок SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) или S белок SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron). Это трансмембранный гликопротеин I типа, который отвечает за связывание, слияние и проникновение вирусных частиц в клетку. Было показано, что он является основной мишенью вируснейтрализующих антител (Liang M et al, SARS patients-derived human recombinant antibodies to S and M proteins efficiently neutralize SARS-coronavirus infectivity. Biomed Environ Sci. 2005 Dec;18(6):363-74).
Для эффективной экспрессии целевого белка было разработано несколько вариантов экспрессионных кассет:
1. Экспрессионная кассета SEQ ID NO:1, которая содержит:
- CMV-промотор от вируса Human betaherpesvirus 5, последовательность которого в кассетах немного больше, чем CMV-промотор, границы которого очерчены в статье PMID: 2985280 (DOI: 10.1016/s0092-8674(85)80025-8). Таким образом, до CMV-промотора находится фрагмент цитомегаловирусного генома (51 п.о.), который оказывает положительное влияние на вторичную структуру мРНК и экспрессию целевого гена.
- Сайт инициации транскрипции (transcription initiation site+1), который начинается с нуклеотидов TCAGATC, и таким образом, находится за 59 нуклеотидов до стартового кодона, что позволяет увеличить продолжительность и силу трансляции РНК.
- последовательность Козак (GGTACC), которая важна для инициации трансляции.
- открытую рамку считывания гена S белка вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta)
- полный сигнал полиаденилирования вируса SV40 (SV40-PA).
2.  Экспрессионная кассета SEQ ID NO:2, которая содержит:
- CMV-промотор от вируса Human betaherpesvirus 5, последовательность которого в кассетах немного больше, чем CMV-промотор, границы которого очерчены в статье PMID: 2985280 (DOI: 10.1016/s0092-8674(85)80025-8). Таким образом, до CMV-промотора находится фрагмент цитомегаловирусного генома (51 п.о.), который оказывает положительное влияние на вторичную структуру мРНК и экспрессию целевого гена.
- Сайт инициации транскрипции (transcription initiation site+1), который начинается с нуклеотидов TCAGATC, и таким образом, находится за 46 нуклеотидов до стартового кодона, что позволяет увеличить продолжительность и силу трансляции РНК.
- последовательность Козак (GGTACC), которая важна для инициации трансляции
- открытую рамку считывания гена S белка вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron).
- полный сигнал полиаденилирования вируса SV40 (SV40-PA).
3. Экспрессионная кассета SEQ ID NO:3, которая содержит:
- CMV-промотор от вируса Human betaherpesvirus 5, последовательность которого в кассетах немного больше, чем CMV-промотор, границы которого очерчены в статье PMID: 2985280 (DOI: 10.1016/s0092-8674(85)80025-8). Таким образом, до CMV-промотора находится фрагмент цитомегаловирусного генома (51 п.о.), который оказывает положительное влияние на вторичную структуру мРНК и экспрессию целевого гена.
- Сайт инициации транскрипции (transcription initiation site+1), который начинается с нуклеотидов TCAGATC, и таким образом, находится за 46 нуклеотидов до стартового кодона, что позволяет увеличить продолжительность и силу трансляции РНК.
- последовательность Козак (GGTACC), которая важна для инициации трансляции.
- открытую рамку считывания гена S белка вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron).
- сайты рестрикции (EcoRV, MspI, XbaI)
- полный сигнал полиаденилирования вируса SV40 (SV40-PA).
Таким образом, были разработаны следующие экспрессионные векторы:
1. Экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad-26-S-delta).
2. Экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:2 (Ad26-S-omicron).
3. Экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad-5-S-delta).
4. Экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:3 (Ad5-S-omicron).
Полученные экспрессионные векторы являются активными компонентами разработанных вариантов иммунобиологического средства.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Получение иммунобиологического средства по п.1.
Активным компонентом иммунобиологического средства по п.1 является экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. Кроме активного компонента в состав иммунобиологического средства может входить любой фармацевтически приемлемый буфер или другие вещества, способствующие повышению стабильности и/или эффективности активного компонента.
Для получения активного компонента иммунобиологического средства вначале разработали дизайн экспрессионных кассет: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2. Синтез генов осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Для получения рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России: плазмида pAd26-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа, и плазмида pAd26-too, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией E1 и Е3-областей.
На первом этапе работы, с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pAd26-Ends, были получены плазмиды pAd26-Ends-S-delta, pAd26-Ends-S-omicron, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd26-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd26-too-S-delta, pAd26-too-S-omicron, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа и с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, соответственно.
На следующем этапе плазмиды pAd26-too-S-delta, pAd26-too-S-omicron гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.
В результате проведенной работы был получен экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad26-S-delta) или SEQ ID NO:2 (Ad26-S-omicron), который является активным веществом разработанного иммунобиологического средства.
По аналогичной схеме был получен контрольный экспрессионный вектор, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2: Ad26-null.
Полученные экспрессионные векторы были очищены методом ВЭЖХ и смешаны с буферным раствором.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено иммунобиологическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее в качестве активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad26-S-delta) или SEQ ID NO:2 (Ad26-S-omicron).
Пример 2. Получение иммунобиологического средства по п.2.
Активным компонентом иммунобиологического средства по п.2 является экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3. Кроме активного компонента в состав иммунобиологического средства может входить любой фармацевтически приемлемый буфер или другие вещества, способствующие повышению стабильности и/или эффективности активного компонента.
Для получения активного компонента иммунобиологического средства вначале разработали дизайн экспрессионных кассет (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3). Синтез генов осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).
Для получения рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа было использовано две плазмиды, полученные в ФГБУ «НИЦЭМ им Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России:
- плазмида pAd5-Ends, несущая плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа (одно плечо гомологии представляет собой начало генома аденовируса человека 5-го серотипа (от левого инвертированного концевого повтора до Е1-области) и последовательность вирусного генома, включающую pIX белок; второе плечо гомологии содержит последовательность нуклеотидов после ORF3 Е4-области до конца генома)
- плазмида pAd5-too, несущая геном рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа с делецией E1 и Е3-областей.
На первом этапе работы, с помощью методов генной инженерии на основе плазмиды pAd5-Ends, были получены плазмиды pAd5-Ends-S-delta, pAd5-Ends-S-omicron, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа. Далее полученные плазмиды линеаризовали по уникальному сайту гидролиза и каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd5-too. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd5-too-S-delta, pAd5-too-S-omicron, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:3, соответственно.
На следующем этапе плазмиды pAd5-too-S-delta, pAd5-too-S-omicron гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293.
В результате проведенной работы был получен экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad5-S-delta) или SEQ ID NO:3 (Ad5-S-omicron), который является активным веществом разработанного иммунобиологического средства.
По аналогичной схеме был получен контрольный экспрессионный вектор, не содержащий гена S белка вируса SARS-CoV-2: Ad5-null.
Полученные экспрессионные векторы были очищены методом ВЭЖХ и смешаны с буферным раствором.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено иммунобиологическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, содержащее в качестве активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad5-S-delta) или SEQ ID NO:3 (Ad5-S-omicron).
Пример 3. Получение иммунобиологического средства по п.3.
Активными компонентами иммунобиологического средства по п.3 являются:
1) экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1(Ad26-S-delta)
2) экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:2 (Ad26-S-omicron).
Экспрессионные векторы на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа были получены как описано в примере 1.
Активные компоненты могут быть смешаны в любых соотношениях, которые позволяют каждому из компонентов вызывать иммунный ответ в организме млекопитающих.
В качестве примера были использованы следующие соотношения компонентов (вектор, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad26-S-delta) к вектору, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:2 (Ad26-S-omicron)) - 1: 20, 1:10, 1:1, 10:1, 20:1.
Кроме активных компонентов в состав иммунобиологического средства может входить любой фармацевтически приемлемый буфер или другие вещества, способствующие повышению стабильности и/или эффективности активного компонента. В данном случае, был использован буфер для жидкой формы средства: трис(гидроксиметил)аминометан - 1,21 мг, натрия хлорид - 2,19 мг, сахароза - 25,0 мг, полисорбат 80 - 250 мкг, магния хлорида гексагидрат - 102,0 мкг, ЭДТА динатриевая соль дигидрат - 19,0 мкг, этанол 95% - 2,5 мкл, вода для инъекций - до 0,5 мл.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено иммунобиологическое средство, содержащее одновременно два активных компонента, представляющих собой экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad26-S-delta) и экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:2 (Ad26-S-omicron).
Пример 4. Получение иммунобиологического средства по п.4.
Активными компонентами иммунобиологического средства по п.4 являются:
1) экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1(Ad5-S-delta);
2) экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:3 (Ad5-S-omicron).
Экспрессионные векторы на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа были получены как описано в примере 2.
Активные компоненты могут быть смешаны в любых соотношениях, которые позволяют каждому из компонентов вызывать иммунный ответ в организме млекопитающих.
В качестве примера были использованы следующие соотношения компонентов (вектор, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad5-S-delta) к вектору, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:3 (Ad5-S-omicron)) - 1: 20, 1:10, 1:1, 10:1, 20:1.
Кроме активных компонентов в состав иммунобиологического средства может входить любой фармацевтически приемлемый буфер или другие вещества, способствующие повышению стабильности и/или эффективности активного компонента. В данном случае, был использован буфер для жидкой формы средства: трис(гидроксиметил)аминометан - 1,21 мг, натрия хлорид - 2,19 мг, сахароза - 25,0 мг, полисорбат 80 - 250 мкг, магния хлорида гексагидрат - 102,0 мкг, ЭДТА динатриевая соль дигидрат - 19,0 мкг, этанол 95% - 2,5 мкл, вода для инъекций - до 0,5 мл.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено иммунобиологическое средство, содержащее одновременно два активных компонента, представляющих собой экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad5-S-delta) и экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:3 (Ad5-S-omicron).
Пример 5. Получение иммунобиологического средства по п.5.
Активными компонентами иммунобиологического средства по п.5 являются:
1) экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1(Ad26-S-delta) или SEQ ID NO:2(Ad26-S-omicron);
2) экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1(Ad5-S-delta) или SEQ ID NO:3 (Ad5-S-omicron).
Экспрессионные векторы на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа были получены как описано в примере 1. Экспрессионные векторы на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа были получены как описано в примере 2. Активные компоненты могут быть смешаны в любых соотношениях, которые позволяют каждому из компонентов вызывать иммунный ответ в организме млекопитающих.
Кроме активных компонентов в состав иммунобиологического средства может входить любой фармацевтически приемлемый буфер или другие вещества, способствующие повышению стабильности и/или эффективности активного компонента. В данном случае, был использован буфер для жидкой формы средства: трис(гидроксиметил)аминометан - 1,21 мг, натрия хлорид - 2,19 мг, сахароза - 25,0 мг, полисорбат 80 - 250 мкг, магния хлорида гексагидрат - 102,0 мкг, ЭДТА динатриевая соль дигидрат - 19,0 мкг, этанол 95% - 2,5 мкл, вода для инъекций - до 0,5 мл.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено иммунобиологическое средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, представляющее собой смесь иммунобиологического средства, содержащего в качестве активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1(Ad26-S-delta) или SEQ ID NO:2(Ad26-S-omicron) и иммунобиологического средства, содержащего в качестве активного компонента экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1(Ad5-S-delta) или SEQ ID NO:3(Ad5-S-omicron).
Пример 6. Разработка буферного раствора для жидкой формы иммунобиологического средства.
Авторами изобретения был подобран буферный раствор на водной основе, обеспечивающий стабильность рекомбинантных аденовирусных частиц. Для поддержания рН раствора в буфер добавили Трис(гидроксиметил)аминометан (Трис). Для достижения необходимой ионной силы и осмолярности был добавлен хлорид натрия. Для криопротекции в буфер добавили сахарозу. Магния хлорида гексагидрат добавили в качестве источника двухвалентных катионов, ЭДТА - в качестве ингибитора свободно-радикального окисления, полисорбат-80 - в качестве поверхностно-активного вещества, этанол 95% - в качестве ингибитора свободно-радикального окисления.
Для определения концентрации веществ, входящих в состав буферного раствора для жидкой формы средства, было получено несколько вариантов экспериментальных групп (таблица 1). В каждый из полученных буферных растворов добавляли одно из средств:
10
10
11
1. иммунобиологическое средство, содержащее одновременно два активных компонента, представляющих собой экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad26-S-delta) и экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5,со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:2 (Ad26-S-omicron), в соотношении 1:1, в концентрации 5*10вч:5*10вч (итого:10 вч)).
10
10
11
2. иммунобиологическое средство, содержащее одновременно два активных компонента, представляющих собой экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad5-S-delta) и экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:2 (Ad5-S-omicron), в соотношении 1:1, в концентрации 5*10вч:5*10вч (итого:10 вч)).
Полученные средства хранили при температуре -18°С и -70°С в течение 3 месяцев, затем размораживали и оценивали изменение титра рекомбинантных аденовирусов.
Таблица 1
- Состав экспериментальных буферных растворов для жидкой формы средства.
№группы
Состав буферного раствора
Трис (мг)
Хлорид натрия (мг)
Сахароза (мг)
Магния хлорида гексагидрат (мг)
ЭДТА (мг)
Полисорбат-80 (мг)
Этанол 95% (мг)
Вода
1
0,968
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
2
1,815
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
3
1,21
1,752
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
4
1,21
3,285
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
5
1,21
2,19
20
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
6
1,21
2,19
37,5
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
7
1,21
2,19
25
0,0816
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
8
1,21
2,19
25
0,153
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
9
1,21
2,19
25
0,102
0,0152
0,25
0,0025
до 0,5 мл
10
1,21
2,19
25
0,102
0,0285
0,25
0,0025
до 0,5 мл
11
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,2
0,0025
до 0,5 мл
12
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,375
0,0025
до 0,5 мл
13
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,002
до 0,5 мл
14
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,00375
до 0,5 мл
15
1,21
2,19
25
0,102
0,019
0,25
0,0025
до 0,5 мл
Результаты проведенного эксперимента показали, что титр рекомбинантных аденовирусов после их хранения в буферном растворе для жидкой формы средства при температурах -18°С и -70 °С в течение 3 месяцев не изменялся.
Таким образом, разработанный буферный раствор для жидкой формы средства обеспечивает стабильность всех компонентов разработанного средства в следующем диапазоне действующих веществ (масс %):
Трис: от 0,1831 масс.% до 0,3432 масс.%;
Хлорид натрия: от 0,3313 масс.% до 0,6212 масс.%;
Сахароза: от 3,7821 масс.% до 7,0915 масс.%;
Магния хлорида гексагидрат: от 0,0154 масс.% до 0,0289 масс.%;
ЭДТА: от 0,0029 масс.% до 0,0054 масс.%;
Полисорбат-80: от 0,0378 масс.% до 0,0709 масс.%;
Этанол 95%: от 0,0004 масс.% до 0,0007 масс.%;
Растворитель: остальное.
Пример 7. Разработка буферного раствора для лиофилизированной формы иммунобиологического средства.
Авторами изобретения был подобран буферный раствор на водной основе, обеспечивающий стабильность рекомбинантных аденовирусных частиц во время лиофилизации и в процессе хранения. Для поддержания рН раствора в буфер добавили Трис(гидроксиметил)аминометан (Трис). Для достижения необходимой ионной силы и осмолярности был добавлен хлорид натрия. Для криопротекции в буфер добавили сахарозу. Магния хлорида гексагидрат добавили в качестве источника двухвалентных катионов, ЭДТА - в качестве ингибитора свободно-радикального окисления, полисорбат-80 - в качестве поверхностно-активного вещества, этанол 95% - в качестве ингибитора свободно-радикального окисления.
Для определения концентрации веществ, входящих в состав буферного раствора для лиофилизированной формы средства, было получено несколько вариантов экспериментальных групп (таблица 2). В каждый из полученных буферных растворов добавляли один из активных компонентов средства:
10
10
11
1. иммунобиологическое средство, содержащее одновременно два активных компонента, представляющих собой экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad26-S-delta) и экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 26-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, а область ORF6-Ad26 заменена на ORF6-Ad5,со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:2 (Ad26-S-omicron), в соотношении 1:1, в концентрации 5*10вч:5*10вч (итого:10 вч)).
10
10
11
2. иммунобиологическое средство, содержащее одновременно два активных компонента, представляющих собой экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1 (Ad5-S-delta) и экспрессионный вектор на основе генома рекомбинантного штамма human adenovirus 5-го серотипа, в котором делетированы Е1 и Е3 области, со встроенной экспрессионной кассетой SEQ ID NO:3 (Ad5-S-omicron), в соотношении 1:1, в концентрации 5*10вч:5*10вч (итого:10 вч)).
Полученные средства лиофилизировали и хранили при температуре+2 и+8°С в течение 3 месяцев, затем оценивали изменение титра рекомбинантных аденовирусов.
Таблица 2
- Состав экспериментальных буферных растворов для лиофилизированной формы иммунобиологического средства.
№группы
Состав буферного раствора
Трис (мг)
Хлорид натрия (мг)
Сахароза (мг)
Магния хлорида гексагидрат (мг)
ЭДТА (мг)
Полисорбат-80 (мг)
Вода
1
0,1936
1,403
73,5
0,0204
0,0038
0,05
до 1 мл
2
0,363
1,403
73,5
0,0204
0,0038
0,05
до 1 мл
3
0,242
1,1224
73,5
0,0204
0,0038
0,05
до 1 мл
4
0,242
2,1045
73,5
0,0204
0,0038
0,05
до 1 мл
5
0,242
1,403
58,8
0,0204
0,0038
0,05
до 1 мл
6
0,242
1,403
110,25
0,0204
0,0038
0,05
до 1 мл
7
0,242
1,403
73,5
0,01632
0,0038
0,05
до 1 мл
8
0,242
1,403
73,5
0,0306
0,0038
0,05
до 1 мл
9
0,242
1,403
73,5
0,0204
0,00304
0,05
до 1 мл
10
0,242
1,403
73,5
0,0204
0,0057
0,05
до 1 мл
11
0,242
1,403
73,5
0,0204
0,0038
0,04
до 1 мл
12
0,242
1,403
73,5
0,0204
0,0038
0,075
до 1 мл
13
0,242
1,403
73,5
0,0204
0,0038
0,05
до 1 мл
Результаты проведенного эксперимента показали, что титр рекомбинантных аденовирусов после их хранения в буферном растворе для лиофилизированной формы средства при температуре+2°С и+8 °С в течение 3 месяцев не изменялся.
Таким образом, разработанный буферный раствор для лиофилизированной формы вакцины обеспечивает стабильность всех компонентов разработанного средства в следующем диапазоне действующих веществ:
Трис: от 0,0180 масс.% до 0,0338 масс.%;
Хлорид натрия: от 0,1044 масс.% до 0,1957 масс.%;
Сахароза: от 5,4688 масс.% до 10,2539 масс.%;
Магния хлорида гексагидрат: от 0,0015 масс.% до 0,0028 масс.%;
ЭДТА: от 0,0003 масс.% до 0,0005 масс.%;
Полисорбат-80: от 0,0037 масс.% до 0,0070 масс.%;
Растворитель: остальное.
Пример 8. Токсичность разработанного средства при однократном введении (острая токсичность) на мышах.
В данном исследовании оценивали острую токсичность разработанных иммунобиологических средств. В исследовании были использованы аутбредные мыши, обоих полов, массой 18-20 грамм, возрастом 6-8 недель.
8
8
Расчет дозы средства проводили исходя из иммунизирующей дозы (10в.ч.), полученной в предварительном эксперименте на чувствительном виде животных - сирийских хомячках. Расчет доз для мышей проводили исходя из массы тела. Минимальной дозой для токсикологических экспериментов была выбрана доза для мыши 10в.ч., как наиболее близкая к терапевтической. Для пересчета доз не использовался коэффициент межвидового пересчета, дозы получены путем прямого пересчета на массу тела, согласно рекомендация ВОЗ для вакцинных препаратов.
В результате, для введения мышам в данном эксперименте выбрали следующие дозы средства:
8
10в.ч. - близкая к эффективной дозе (ЭД) для мышей;
9
10в.ч. - увеличенная ЭД для мышей в 20 раз;
10
10в.ч. - увеличенная ЭД для мышей в 200 раз;
11
10в.ч. - увеличенная ЭД для мышей в 2000 раз;
Таким образом, были получены следующие экспериментальные группы животных:
8
1) Ad26-S-delta, 1*10в.ч., 20 мышей;
9
2) Ad26-S-delta, 1*10в.ч., 20 мышей;
10
3) Ad26-S-delta, 1*10в.ч., 20 мышей;
11
4) Ad26-S-delta, 1*10в.ч., 20 мышей;
8
5) Ad26-S-omicron, 1*10в.ч., 20 мышей;
9
6) Ad26-S-omicron, 1*10в.ч., 20 мышей;
10
7) Ad26-S-omicron, 1*10в.ч., 20 мышей;
11
8) Ad26-S-omicron, 1*10в.ч., 20 мышей;
8
9) Ad5-S-delta, 1*10в.ч., 20 мышей;
9
10) Ad5-S-delta, 1*10в.ч., 20 мышей;
10
11) Ad5-S-delta, 1*10в.ч., 20 мышей;
11
12) Ad5-S-delta, 1*10в.ч., 20 мышей;
8
13) Ad5-S-omicron, 1*10в.ч., 20 мышей;
9
14) Ad5-S-omicron, 1*10в.ч., 20 мышей;
10
15) Ad5-S-omicron, 1*10в.ч., 20 мышей;
11
16) Ad5-S-omicron, 1*10в.ч., 20 мышей;
8
17) Ad26-S-delta/ Ad26-S-omicron, 1:1, 1*10в.ч., 20 мышей;
9
18) Ad26-S-delta/ Ad26-S-omicron, 1:1, 1*10в.ч., 20 мышей;
10
19) Ad26-S-delta/ Ad26-S-omicron, 1:1, 1*10в.ч., 20 мышей;
11
20) Ad26-S-delta/ Ad26-S-omicron, 1:1, 1*10в.ч., 20 мышей;
8
21) Ad5-S-delta/ Ad5-S-omicron, 1:1, 1*10в.ч., 20 мышей;
9
22) Ad5-S-delta/ Ad5-S-omicron, 1:1, 1*10в.ч., 20 мышей;
10
23) Ad5-S-delta/ Ad5-S-omicron, 1:1, 1*10в.ч., 20 мышей;
11
24) Ad5-S-delta/ Ad5-S-omicron, 1:1, 1*10в.ч., 20 мышей;
25) плацебо (буферный раствор), 20 мышей.
Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.
Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных: активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей. Физиологические функции: дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет.На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалось от контрольных.
На 14 сутки от начала эксперимента, осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животные в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.
Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.
При макроскопическом исследовании не обнаружено влияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Статистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.
Таким образом, результаты данного эксперимента показывают, что разработанные варианты иммунобиологического средства в данном диапазоне доз не проявляют токсичности для млекопитающих.
Пример 9. Определение эффективности однократной иммунизации животных разработанными вариантами иммунобиологического средства на основе экспрессионных векторов Ad26-S-delta и Ad5-S-delta по оценке гуморального иммунного ответа против S белка вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta).
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18 г.Все животные были разделены на 17 групп по 5 животных, которым однократно вводили различные варианты разработанного средства. Были сформированы следующие группы животных:
10
1) Ad26-S-delta, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
2) Ad26-S-delta, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
10
3) Ad26-S-delta, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
4) Ad26-S-delta, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
10
5) Ad26-null, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
6) Ad26-null, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
10
7) Ad26-null, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
8) Ad26-null, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
10
9) Ad5-S-delta, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
10) Ad5-S-delta, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
10
11) Ad5-S-delta, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
12) Ad5-S-delta, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
10
13) Ad5-null, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
14) Ad5-null, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
10
15) Ad5-null, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
16) Ad5-null, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
17) плацебо (буфер), 200 мкл.
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген - S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta), адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре+4°С.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5% молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 3.
Таблица 3
- Титр антител к S белку SARS-CoV-2 в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-S-delta, внутримышечно,5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
1838
2
Ad26-S-delta, внутримышечно,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
3676
3
Ad26-S-delta, интраназально,5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
919
4
Ad26-S-delta, интраназально,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
2111
5
Ad26-null, внутримышечно,5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
6
Ad26-null, внутримышечно,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
7
Ad26-null, интраназально,5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
8
Ad26-null, интраназально,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
9
Ad5-S-delta, внутримышечно,5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
22286
10
Ad5-S-delta, внутримышечно,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
44572
11
Ad5-S-delta, интраназально, 5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
8445
12
Ad5-S-delta, интраназально,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
19401
13
Ad5-null, внутримышечно,5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
14
Ad5-null, внутримышечно,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
15
Ad5-null, интраназально,5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
16
Ad5-null, интраназально,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
17
плацебо (буфер), 200 мкл.
0
10
11
Как видно из результатов эксперимента однократное введение всех вариантов разработанного средства (как внутримышечное, так и интраназальное) в концентрациях 5*10вирусных частиц/дозу до 5*10вирусных частиц/дозу обеспечивает образование антител против вакцинного антигена.
Таким образом, можно заключить, что варианты разработанного иммунобиологического средства на основе экспрессионных векторов Ad26-S-delta и Ad5-S-delta вызывают гуморальный иммунный ответ против SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta).
Пример 10. Определение эффективности двукратной иммунизации животных разработанными вариантами иммунобиологического средства на основе экспрессионных векторов Ad26-S-delta и Ad5-S-delta по оценке гуморального иммунного ответа против S белка вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta).
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18 г.Все животные были разделены на 13 групп по 5 животных, которым однократно вводили различные варианты разработанного средства. Были сформированы следующие группы животных:
11
11
1) Ad26-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл; Ad26-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл.
11
11
2) Ad26-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл; Ad26-S-delta, ин, 10вч/200 мкл.
11
11
3) Ad26-S-delta, ин, 10вч/200 мкл; Ad26-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл.
11
11
4) Ad5-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл; Ad5-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл.
11
11
5) Ad5-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл; Ad5-S-delta, ин, 10вч/200 мкл.
11
11
6) Ad5-S-delta, ин, 10вч/200 мкл; Ad5-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл.
11
11
7) Ad5-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл; Ad26-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл.
11
11
8) Ad5-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл; Ad26-S-delta, ин, 10вч/200 мкл.
11
11
9) Ad5-S-delta, ин, 10вч/200 мкл; Ad26-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл.
11
11
10) Ad26-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл; Ad5-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл.
11
11
11) Ad26-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл; Ad5-S-delta, ин, 10вч/200 мкл.
11
11
12) Ad26-S-delta, ин, 10вч/200 мкл; Ad5-S-delta, в/м, 10вч/200 мкл.
13) плацебо (буфер), 200 мкл.
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген - S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta), адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре+4°С.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5% молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°C на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5)  Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 4.
Таблица 4
- Титр антител к S белку SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad26-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
25600
2
Ad26-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad26-S-delta, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
22286
3
Ad26-S-delta, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad26-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
25600
4
Ad5-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad5-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
67559
5
Ad5-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad5-S-delta, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
77605
6
Ad5-S-delta, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad5-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
77605
7
Ad5-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad26-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
89144
8
Ad5-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad26-S-delta, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
89144
9
Ad5-S-delta, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad26-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
77605
10
Ad26-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad5-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
89144
11
Ad26-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad5-S-delta, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
102400
12
Ad26-S-delta, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad5-S-delta, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
89144
13
плацебо (буфер), 200 мкл.
0
Как видно из результатов эксперимента двукратное введение всех тестируемых вариантов разработанного средства обеспечивает образование антител против вакцинного антигена.
Таким образом, можно заключить, что варианты разработанного иммунобиологического средства на основе экспрессионных векторов Ad26-S-delta и Ad5-S-delta вызывают гуморальный иммунный ответ против SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) при двукратном введении.
Пример 11. Определение эффективности однократной иммунизации животных разработанными вариантами иммунобиологического средства на основе экспрессионных векторов Ad26-S-omicron и Ad5-S-omicron по оценке гуморального иммунного ответа против S белка вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron).
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18 г.Все животные были разделены на 17 групп по 5 животных, которым однократно вводили различные варианты разработанного средства. Были сформированы следующие группы животных:
10
1) Ad26-S-omicron, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
2) Ad26-S-omicron, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
10
3) Ad26-S-omicron, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
4) Ad26-S-omicron, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
10
5) Ad26-null, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
6) Ad26-null, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
10
7) Ad26-null, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
8) Ad26-null, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
10
9) Ad5-S-omicron, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
10) Ad5-S-omicron, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
10
11) Ad5-S-omicron, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
12) Ad5-S-omicron, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
10
13) Ad5-null, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
14) Ad5-null, внутримышечно, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
10
15) Ad5-null, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
11
16) Ad5-null, интраназально, 5*10вирусных частиц/200 мкл.;
17) плацебо (буфер), 200 мкл.
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген - S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron), адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре+4°С.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5% молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°C на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 5.
Таблица 5
- Титр антител к S белку SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron) в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-S-omicron, внутримышечно,5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
2111
2
Ad26-S-omicron, внутримышечно,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
2786
3
Ad26-S-omicron, интраназально,5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
1213
4
Ad26-S-omicron, интраназально,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
2111
5
Ad26-null, внутримышечно,5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
6
Ad26-null, внутримышечно,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
7
Ad26-null, интраназально,5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
8
Ad26-null, интраназально,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
9
Ad5-S-omicron, внутримышечно,5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
16890
10
Ad5-S-omicron, внутримышечно,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
33779
11
Ad5-S-omicron, интраназально,5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
8445
12
Ad5-S-omicron, интраназально,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
16890
13
Ad5-null, внутримышечно, 5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
14
Ad5-null, внутримышечно,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
15
Ad5-null, интраназально,5*10<sup>10 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
16
Ad5-null, интраназально,5*10<sup>11 </sup>вирусных частиц/200 мкл.;
0
17
плацебо (буфер)
0
10
11
Как видно из результатов эксперимента однократное введение всех вариантов разработанного средства (как внутримышечное, так и интраназальное) в концентрациях 5*10вирусных частиц/дозу до 5*10вирусных частиц/дозу обеспечивает образование антител против вакцинного антигена.
Таким образом, можно заключить, что варианты разработанного иммунобиологического средства на основе экспрессионных векторов Ad26-S-omicron и Ad5-S-omicron вызывают гуморальный иммунный ответ против SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron).
Пример 12. Определение эффективности двукратной иммунизации животных разработанными вариантами иммунобиологического средства на основе экспрессионных векторов Ad26-S-omicron и Ad5-S-omicron по оценке гуморального иммунного ответа против S белка вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron).
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18 г.Все животные были разделены на 13 групп по 5 животных, которым однократно вводили различные варианты разработанного средства. Были сформированы следующие группы животных:
11
11
1) Ad26-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл; Ad26-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл.
11
11
2) Ad26-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл; Ad26-S-omicron, ин, 10вч/200 мкл.
11
11
3) Ad26-S-omicron, ин, 10вч/200 мкл; Ad26-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл.
11
11
4) Ad5-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл; Ad5-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл.
11
11
5) Ad5-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл; Ad5-S-omicron, ин, 10вч/200 мкл.
11
11
6) Ad5-S-omicron, ин, 10вч/200 мкл; Ad5-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл.
11
11
7) Ad5-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл; Ad26-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл.
11
11
8) Ad5-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл; Ad26-S-omicron, ин, 10вч/200 мкл.
11
11
9) Ad5-S-omicron, ин, 10вч/200 мкл; Ad26-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл.
11
11
10) Ad26-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл; Ad5-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл.
11
11
11) Ad26-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл; Ad5-S-omicron, ин, 10вч/200 мкл.
11
11
12) Ad26-S-omicron, ин, 10вч/200 мкл; Ad5-S-omicron, в/м, 10вч/200 мкл.
13) плацебо (буфер), 200 мкл.
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген - S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron), адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре+4°С.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5% молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°C на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 6.
Таблица 6
- Титр антител к S белку SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron) в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
№
Название группы животных
Титр антител
1
Ad26-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad26-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
19401
2
Ad26-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad26-S-omicron, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
19401
3
Ad26-S-omicron, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad26-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
16890
4
Ad5-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad5-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
51200
5
Ad5-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad5-S-omicron, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
67559
6
Ad5-S-omicron, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad5-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
58813
7
Ad5-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad26-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
51200
8
Ad5-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad26-S-omicron, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
67559
9
Ad5-S-omicron, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad26-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
58813
10
Ad26-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad5-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
67559
11
Ad26-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad5-S-omicron, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
67559
12
Ad26-S-omicron, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;Ad5-S-omicron, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл.
58813
13
плацебо (буфер), 200 мкл
0
Как видно из результатов эксперимента двукратное введение всех тестируемых вариантов разработанного средства обеспечивает образование антител против вакцинного антигена.
Таким образом, можно заключить, что варианты разработанного иммунобиологического средства на основе экспрессионных векторов Ad26-S-omicron и Ad5-S-omicron вызывают гуморальный иммунный ответ против SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron) при двукратном введении.
Пример 12. Определение эффективности однократной иммунизации животных разработанным вариантом иммунобиологического средства на основе двух экспрессионных векторов (Ad26-S-delta, Ad26-S-omicron) по оценке гуморального иммунного ответа.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18 г.Все животные были разделены на 11 групп по 5 животных, которым однократно внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство, представляющее собой смесь двух экспрессионных векторов (Ad26-S-delta и Ad26-S-omicron) (получение данного средства описано в примере 3). Животным вводили различные варианты средства, которые отличались соотношением активных компонентов (от 1: 20 до 20:1). Специалисту среднего уровня очевидно, что активные компоненты могут быть смешаны в любых соотношениях, которые позволяют каждому из компонентов вызывать иммунный ответ в организме млекопитающих.
Таким образом, были сформированы следующие группы животных:
10
1) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1: 20, 5*10вч/200 мкл;
10
2) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:10, 5*10вч/200 мкл;
10
3) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, 5*10вч/200 мкл;
10
4) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 10:1, 5*10вч/200 мкл;
10
5) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 20:1, 5*10вч/200 мкл;
11
6) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1: 20, 5 *10вч/200 мкл;
11
7) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:10, 5 *10вч/200 мкл;
11
8) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, 5 *10вч/200 мкл;
11
9) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 10:1, 5 *10вч/200 мкл;
11
10) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 20:1, 5 *10вч/200 мкл;
11) плацебо (буфер), 200 мкл.
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген - S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) или S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron), адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре+4°С.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5% молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°C на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 7.
Таблица 7
- Титр антител к S белку SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 и к S белку SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron) в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
№
Название группы животных
Титр антител к S белку SARS-CoV-2вариант B.1.617.2 (Delta)
Титр антител к S белку SARS-CoV-2вариант B.1.1.529 (Omicron)
1
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:20, 5*10<sup>10 </sup>вч/200 мкл;
264
2425
2
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:10, 5*10<sup>10 </sup>вч/200 мкл;
1213
1838
3
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, 5*10<sup>10 </sup>вч/200 мкл;
2111
1838
4
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 10:1, 5*10<sup>10 </sup>вч/200 мкл;
2425
919
5
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 20:1, 5*10<sup>10 </sup>вч/200 мкл;
3676
200
6
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:20, 5 *10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
400
4850
7
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:10, 5 *10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
1600
2786
8
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, 5 *10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
2786
2111
9
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 10:1, 5 *10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
2786
1056
10
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 20:1, 5 *10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
4850
459
11
плацебо (буфер), 200 мкл.
0
0
10
11
Как видно из результатов эксперимента однократное внутримышечное введение всех вариантов разработанного средства (при соотношениях активных компонентов от 1:20 до 20:1) в концентрациях от 5*10вирусных частиц/дозу до 5*10вирусных частиц/дозу обеспечивает образование антител против обоих антигенов.
Таким образом, можно заключить, что вариант разработанного иммунобиологического средства на основе двух экспрессионных векторов (Ad26-S-delta и Ad26-S-omicron) индуцирует развитие гуморального иммунного ответа против двух вариантов SARS-CoV-2 (B.1.617.2 (Delta) и B.1.1.529 (Omicron)).
Пример 14. Определение эффективности однократной иммунизации животных разработанным вариантом иммунобиологического средства на основе двух экспрессионных векторов (Ad5-S-delta, Ad5-S-omicron) по оценке гуморального иммунного ответа.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18 г.Все животные были разделены на 11 групп по 5 животных, которым однократно внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство, представляющее собой смесь двух экспрессионных векторов (Ad5-S-delta и Ad5-S-omicron) (получение данного средства описано в примере 4). Животным вводили различные варианты средства, которые отличались соотношением активных компонентов (от 1:20 до 20:1). Специалисту среднего уровня очевидно, что активные компоненты могут быть смешаны в любых соотношениях, которые позволяют каждому из компонентов вызывать иммунный ответ в организме млекопитающих.
Таким образом, были сформированы следующие группы животных:
10
1) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1: 20, 5*10вч/200 мкл;
10
2) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:10, 5*10вч/200 мкл;
10
3) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, 5*10вч/200 мкл;
10
4) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 10:1, 5*10вч/200 мкл;
10
5) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 20:1, 5*10вч/200 мкл;
11
6) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1: 20, 5 *10вч/200 мкл;
11
7) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:10, 5 *10вч/200 мкл;
11
8) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, 5 *10вч/200 мкл;
11
9) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 10:1, 5 *10вч/200 мкл;
11
10) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 20:1, 5 *10вч/200 мкл;
11) плацебо (буфер), 200 мкл.
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген - S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) или S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron), адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре+4°С.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5% молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 8.
Таблица 8
- Титр антител к S белку SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 и к S белку SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron) в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
№
Название группы животных
Титр антител к S белку SARS-CoV-2вариант B.1.617.2 (Delta)
Титр антител к S белку SARS-CoV-2вариант B.1.1.529 (Omicron)
1
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron,1: 20, 5*10<sup>10 </sup>вч/200 мкл;
800
2425
2
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron,1:10, 5*10<sup>10 </sup>вч/200 мкл;
1838
1838
3
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron,1:1, 5*10<sup>10 </sup>вч/200 мкл;
11143
1838
4
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron,10:1, 5*10<sup>10 </sup>вч/200 мкл;
16890
919
5
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron,20:1, 5*10<sup>10 </sup>вч/200 мкл;
29407
200
6
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron,1: 20, 5 *10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
1213
4850
7
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron,1:10, 5 *10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
2786
2786
8
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, 5 *10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
19401
2111
9
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron,10:1, 5 *10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
29407
1056
10
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron,20:1, 5 *10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
38802
459
11
плацебо (буфер), 200 мкл.
0
0
10
11
Как видно из результатов эксперимента однократное внутримышечное введение всех вариантов разработанного средства (при соотношениях активных компонентов от 1: 20 до 20:1) в концентрациях от 5*10вирусных частиц/дозу до 5*10вирусных частиц/дозу обеспечивает образование антител против обоих антигенов.
Таким образом, можно заключить, что вариант разработанного иммунобиологического средства на основе двух экспрессионных векторов (Ad5-S-delta и Ad5-S-omicron) индуцирует развитие гуморального иммунного ответа против двух вариантов SARS-CoV-2 (B.1.617.2 (Delta) и B.1.1.529 (Omicron)).
Пример 15. Определение эффективности последовательной иммунизации животных иммунобиологическим средством, содержащим два экспрессионных вектора на основе human adenovirus 26-го серотипа (Ad26-S-delta, Ad26-S-omicron) и иммунобиологическим средством, содержащим два экспрессионных вектора на основе human adenovirus 5-го серотипа (Ad5-S-delta, Ad5-S-omicron) по оценке гуморального иммунного ответа.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18 г.Все животные были разделены на 17 групп по 5 животных, которым последовательно с интервалом в 3 недели вводили один из вариантов разработанного иммунобиологического средства на основе двух экспрессионных векторов (получение данных средств описано в примерах 3,4).
Таким образом, были сформированы следующие группы животных:
11
11
1) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, в/м, 1:1, 10вч/200 мкл;
11
11
2) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл;
11
11
3) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл;
11
11
4) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл;
11
11
5) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл;
11
11
6) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл;
11
11
7) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл;
11
11
8) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл;
11
11
9) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл;
11
11
10) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл;
11
11
11) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл;
11
11
12) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл;
11
11
13) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл;
11
11
14) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл;
11
11
15) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл;
11
11
16) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, в/м, 10вч/200 мкл;
17) плацебо (буфер), 200 мкл.
Через три недели после последней иммунизации у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген - S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) или S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron), адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре+4°С.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания осуществилась "забивка" планшета 5% молоком, растворенном в буфере для блокирования неспецифического сигнала в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений. Всего было приготовлено 12 разведений каждого образца.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 9.
Таблица 9
- Титр антител к S белку SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 и к S белку SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron) в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
№
Название группы животных
Титр антител к S белку SARS-CoV-2вариант B.1.617.2 (Delta)
Титр антител к S белку SARS-CoV-2вариант B.1.1.529 (Omicron)
1
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, в/м, 1:1, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
11143
4850
2
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
12800
6400
3
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
7352
5572
4
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
12800
11143
5
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
25600
11143
6
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
19401
9701
7
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
11143
12800
8
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
22286
11143
9
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
44572
22286
10
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
44572
19401
11
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
44572
11143
12
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
38802
19401
13
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
44572
19401
14
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
38802
11143
15
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
38802
11143
16
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, ин, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, в/м, 10<sup>11 </sup>вч/200 мкл;
44572
22286
17
плацебо (буфер), 200 мкл.
0
0
Как видно из результатов эксперимента последовательное введение различных вариантов разработанного средства (как внутримышечное, так и интраназальное) обеспечивает образование антител против обоих антигенов.
Таким образом, можно заключить, что все варианты разработанного иммунобиологического средства на основе двух экспрессионных векторов (Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron и Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron) индуцируют развитие гуморального иммунного ответа против двух вариантов SARS-CoV-2 (B.1.617.2 (Delta) и B.1.1.529 (Omicron)).
Пример 16. Определение эффективности иммунизации разработанным иммунобиологическим средством по оценке доли пролиферирующих лимфоцитов.
Пролиферативный анализ позволяет оценивать способность лимфоцитов усиленно делиться после встречи с антигеном. Для того, чтобы оценить пролиферацию авторы использовали окраску лимфоцитов флуоресцентным красителем CFSE. Данный краситель связывается с клеточными белками, и сохраняется долгое время и при этом никогда не передается соседним клеткам в популяции. Однако, флуоресцентная метка передается дочерним клеткам. Концентрация метки, а, следовательно, и интенсивность флуоресценции, снижаются ровно в два раза. Поэтому делящиеся клетки легко отслеживать по уменьшению их флуоресценции.
В эксперименте использовались мыши линии C57BL/6. Все животные были разделены на 17 групп (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:
11
1) Ad26-S-delta, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
2) Ad26-S-omicron, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
3) Ad5-S-delta, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
4) Ad5-S-omicron, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
5) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
6) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, внутримышечно, 10вч/200 мкл
11
7) Ad26-null, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
8) Ad5-null, внутримышечно, 10вч/200 мкл.
11
9) Ad26-S-delta, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
10) Ad26-S-omicron, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
11) Ad5-S-delta, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
12) Ad5-S-omicron, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
13) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
14) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, интраназально, 10вч/200 мкл
11
15) Ad26-null, интраназально, 10вч/200 мкл.
11
16) Ad5-null, интраназально, 10вч/200 мкл.
17) плацебо (буфер), 200 мкл
Через две недели животных усыпляли. Из селезенки выделяли лимфоциты методом центрифугирования в градиенте фиколла-урографина. Затем выделенные клетки окрашивали CFSE по методике (B.J. Quah et. al., Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, Nature Protocols, 2007, №2(9), 2049-2056) и культивировали в присутствие антигена. Далее клетки анализировали методом проточной цитофлуориметрии. Полученные результаты представлены на Фиг.1.,2. Как видно из результатов эксперимента, разработанные иммунобиологические средства по п.1, п.2, п.3, п.4 в данной дозе эффективно стимулируют пролиферацию лимфоцитов.
Таким образом, можно заключить, что полученные аденовирусные конструкции индуцируют формирование антиген-специфического иммунного ответа (как CD4+, так и CD8+).
Пример 17. Оценка иммуногенности разработанного средства при совместной внутримышечной и интраназальной иммунизации.
В эксперименте использованы мыши линии C57/Bl6, самки 18-20 г., 5 животных/группе. Были сформированы следующие группы животных:
10
10
1) Ad26-S-delta интраназально, 5*10 вч/дозу и одновременно Ad26-S-delta внутримышечно 5*10 вч/дозу.
10
10
2) Ad26-S-omicron интраназально, 5*10 вч/дозу и одновременно Ad26-S-omicron внутримышечно 5*10 вч/дозу.
10
10
3) Ad5-S-delta интраназально, 5*10 вч/дозу и одновременно Ad5-S-delta внутримышечно 5*10 вч/дозу.
10
10
4) Ad5-S-omicron интраназально, 5*10 вч/дозу и одновременно Ad5-S-omicrone внутримышечно 5*10 вч/дозу.
10
10
5) Ad26-S-delta интраназально, 5*10 вч/дозу и одновременно Ad5-S-delta внутримышечно 5*10 вч/дозу.
10
10
6) Ad5-S-delta интраназально, 5*10 вч/дозу и одновременно Ad26-S-delta внутримышечно 5*10 вч/дозу.
10
10
7) Ad26-S-omicron интраназально, 5*10 вч/дозу и одновременно Ad5-S-omicron внутримышечно 5*10 вч/дозу.
10
10
8) Ad5-S-omicron интраназально, 5*10 вч/дозу и одновременно Ad26-S-omicron внутримышечно 5*10 вч/дозу.
9) плацебо (буфер), 200 мкл
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) по следующему протоколу:
1) Антиген - S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) или S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron), адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре+4°С.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5% молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.
3) Образцы сывороток иммунизированных мышей разводили вначале в 100 раз, а затем делали серию двукратных разведений.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 10.
Таблица 10
- Титр антител к S белку SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 и к S белку SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron) в сыворотке крови мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
№
Название группы животных
Титр антител к S белку SARS-CoV-2вариант B.1.617.2 (Delta)
Титр антител к S белку SARS-CoV-2вариант B.1.1.529 (Omicron)
1
Ad26-S-delta интраназально, 5*10<sup>10</sup> вч/дозу и одновременно Ad26-S-delta внутримышечно 5*10<sup>10</sup> вч/дозу.
3200
132
2
Ad26-S-omicrone интраназально, 5*10<sup>10</sup> вч/дозу и одновременно Ad26-S-omicrone внутримышечно 5*10<sup>10</sup> вч/дозу.
115
1838
3
Ad5-S-delta интраназально, 5*10<sup>10</sup> вч/дозу и одновременно Ad5-S-delta внутримышечно 5*10<sup>10</sup> вч/дозу.
29407
115
4
Ad5-S-omicrone интраназально, 5*10<sup>10</sup> вч/дозу и одновременно Ad5-S-omicrone внутримышечно 5*10<sup>10</sup> вч/дозу.
115
19401
5
Ad26-S-delta интраназально, 5*10<sup>10</sup> вч/дозу и одновременно Ad5-S-delta внутримышечно 5*10<sup>10</sup> вч/дозу.
38802
100
6
Ad5-S-delta интраназально, 5*10<sup>10</sup> вч/дозу и одновременно Ad26-S-delta внутримышечно 5*10<sup>10</sup> вч/дозу.
33779
115
7
Ad26-S-omicrone интраназально, 5*10<sup>10</sup> вч/дозу и одновременно Ad5-S-omicrone внутримышечно 5*10<sup>10</sup> вч/дозу.
132
16890
8
Ad5-S-omicrone интраназально, 5*10<sup>10</sup> вч/дозу и одновременно Ad26-S-omicrone внутримышечно 5*10<sup>10</sup> вч/дозу.
100
19401
9
плацебо (буфер), 200 мкл
0
0
Результаты данного эксперимента подтверждают возможность использования разработанного средства для индукции специфического иммунитета к вирусу SARS-CoV-2 путем совместного и одновременного внутримышечного и интраназального введения.
Пример 18. Оценка способности разработанного средства индуцировать иммунный ответ у молодых животных.
Для данного исследования использовали молодых мышей линии BALB/c (возраст 21-28 дней). Животные были распределены на группы по 10 шт, которым вводили с интервалом в 2 недели следующие средства:
9
9
1) Ad26-S-delta, внутримышечно, 5*10вч/200 мкл; Ad5-S-delta, внутримышечно, 5*10вч/200 мкл.
9
9
2) Ad5-S-delta, внутримышечно, 5*10вч/200 мкл; Ad26-S-delta, внутримышечно, 5*10вч/200 мкл.
9
9
3) Ad26-S-omicron, внутримышечно, 5*10вч/200 мкл; Ad5-S-omicron, внутримышечно, 5*10вч/200 мкл.
9
9
4) Ad5-S-omicron, внутримышечно, 5*10вч/200 мкл; Ad26-S-omicron, внутримышечно, 5*10вч/200 мкл.
9
9
5) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, 5*10вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, 5*10вч/200 мкл.
9
9
6) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, 5*10вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, 5*10вч/200 мкл.
9
9
7) Ad26-S-delta, интраназально, 5*10вч/200 мкл; Ad5-S-delta, интраназально, 5*10вч/200 мкл.
9
9
8) Ad5-S-delta, интраназально, 5*10вч/200 мкл; Ad26-S-delta, интраназально, 5*10вч/200 мкл.
9
9
9) Ad26-S-omicron, интраназально, 5*10вч/200 мкл; Ad5-S-omicron, интраназально, 5*10вч/200 мкл.
9
9
10) Ad5-S-omicron, интраназально, 5*10вч/200 мкл; Ad26-S-omicron, интраназально, 5*10вч/200 мкл.
9
9
11) Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, интраназально, 5*10вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, интраназально, 5*10вч/200 мкл.
9
9
12) Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, интраназально, 5*10вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, интраназально, 5*10вч/200 мкл.
13) Буфер, внутримышечно, 200 мкл; буфер, внутримышечно, 200 мкл;
14) Буфер, интраназально, 200 мкл; буфер, интраназально, 200 мкл.
Через 14 дней после последней иммунизации определяли титр IgG антител в сыворотке крови животных.
Для этого:
1) Антиген - S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) или S белок вируса SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron), адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение 16 часов при температуре+4°С.
2) Далее для избавления от неспецифического связывания в лунки планшета добавляли 5% молоко в TPBS 100 мкл/лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37°С на протяжении часа.
3) Образцы сыворотки разводили в 25 раз и далее методом 2-х кратных разведений.
4) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
5) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
6) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
7) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена.
8) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
9) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером
10) Затем добавили раствор тетраметилбензидина (ТМВ), который является субстратом пероксидазы хрена и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450 нм.
Титр антител определяли, как последнее разведение, в котором оптическая плотность раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные результаты (среднее геометрическое значение) представлены в таблице 11.
Таблица 11
- Титр антител к S белку SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 и к S белку SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529 (Omicron) в сыворотке крови молодых мышей (среднее геометрическое значение титра антител).
№
Название группы животных
Титр антител к S белку SARS-CoV-2вариант B.1.617.2 (Delta)
Титр антител к S белку SARS-CoV-2вариант B.1.1.529 (Omicron)
1
Ad26-S-delta, внутримышечно, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл; Ad5-S-delta, внутримышечно, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл.
11143
100
2
Ad5-S-delta, внутримышечно, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл; Ad26-S-delta, внутримышечно, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл.
9701
115
3
Ad26-S-omicron, внутримышечно, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл; Ad5-S-omicron, внутримышечно, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл.
115
7352
4
Ad5-S-omicron, внутримышечно, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл; Ad26-S-omicron, внутримышечно, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл.
132
7352
5
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл.
9701
8445
6
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл.
11143
9701
7
Ad26-S-delta, интраназально, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл; Ad5-S-delta, интраназально, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл.
8445
132
8
Ad5-S-delta, интраназально, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл; Ad26-S-delta, интраназально, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл.
7352
115
9
Ad26-S-omicron, интраназально, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл; Ad5-S-omicron, интраназально, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл.
152
8445
10
Ad5-S-omicron, интраназально, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл; Ad26-S-omicron, интраназально, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл.
132
9701
11
Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, интраназально, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл; Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, интраназально, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл.
9701
8445
12
Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron, 1:1, интраназально, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл; Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron, 1:1, интраназально, 5*10<sup>9 </sup>вч/200 мкл.
6400
7352
13
Буфер, внутримышечно, 200 мкл; буфер, внутримышечно, 200 мкл;
0
0
14
Буфер, интраназально, 200 мкл; буфер, интраназально, 200 мкл.
0
0
Как видно из результатов эксперимента последовательное введение различных вариантов разработанного средства (как внутримышечное, так и интраназальное) обеспечивает образование антител против обоих антигенов у молодых животных.
Таким образом, можно заключить, что все варианты разработанного иммунобиологического средства на основе двух экспрессионных векторов (Ad26-S-delta:Ad26-S-omicron и Ad5-S-delta:Ad5-S-omicron) индуцируют развитие гуморального иммунного ответа против двух вариантов SARS-CoV-2 (B.1.617.2 (Delta) и B.1.1.529 (Omicron)) у молодых животных.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность разработанных вариантов иммунобиологического средства, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против вируса SARS-CoV-2 и промышленную применимость.
--->
-
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.3//EN"
"ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing   dtdVersion="V1_3" fileName="последовательности 2.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2" productionDate="2022-08-19">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>2022-08</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2022-08-19</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">федеральное государственное бюджетное
учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии
и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи"
Министерства здравоохранения Российской Федерации</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>The National Research Center for Epidemiology
and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya of the
Ministry of Health of the Russian Federation </ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Иммунобиологическое средство и
способ его использования для индукции специфического иммунитета против
вирусов SARS-CoV-2 вариант B.1.617.2 (Delta) и SARS-CoV-2 вариант B.1.1.529
(Omicron) (варианты).</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>3</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>4705</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..4705</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgtt
acataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatg
ttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggc
agtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattat
gcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtga
tgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattga
cgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacg
caaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctaga
gatctggtaccgtcgacgcggccgctcgagcctaagcttggtaccatgtttgtgttccttgtgttattgccactag
tctctagtcagtgtgtgaacctgcgcacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgt
gtactaccccgacaaggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaac
gtgacctggttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttca
acgacggggtgtactttgccagcaccgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacag
caagacccagagcctgctgatcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagttctgcaac
gaccccttcctggacgtctactatcacaagaacaacaagagctggatggaaagcggagtgtacagcagcgccaaca
actgcaccttcgagtacgtgtcccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcg
cgagttcgtgttcaagaacatcgacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcaacctcgtgcgggat
ctgcctcagggcttctctgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacac
tgctggccctgcacagaagctacctgacacctggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttacta
tgtgggctacctgcagcctagaaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgt
gctctggatcctctgagcgagacaaagtgcaccctgaagtccttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagca
acttccgggtgcagcccaccgaatccatcgtgcggttccccaatatcaccaatctgtgccccttcggcgaggtgtt
caatgccaccagattcgcctctgtgtacgcctggaaccggaagcggatcagcaattgcgtggccgactactccgtg
ctgtacaactccgccagcttcagcaccttcaagtgctacggcgtgtcccctaccaagctgaacgacctgtgcttca
caaacgtgtacgccgacagcttcgtgatccggggagatgaagtgcggcagattgcccctggacagacaggcaagat
cgccgactacaactacaagctgcccgacgacttcaccggctgtgtgattgcctggaacagcaacaacctggactcc
aaagtcggcggcaactacaattaccggtaccggctgttccggaagtccaatctgaagcccttcgagcgggacatct
ccaccgagatctatcaggccggcagcaaaccttgtaacggcgtggaaggcttcaactgctacttcccactgcagtc
ctacggctttcagcccacaaatggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgagcttcgaactgctgcat
gcccctgccacagtgtgcggccctaagaaaagcaccaatctcgtgaagaacaaatgcgtgaacttcaacttcaacg
gcctgaccggcaccggcgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatattgc
cgataccacagacgccgtacgagatccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtg
tctgtgatcacccctggcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccagggagtgaactgtaccgaagtgc
ccgtggccattcacgccgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccag
agccggctgtctgatcggagccgagcacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgt
gccagctaccagacacagacaaacagccgcagacgggccagatctgtggccagccagagcatcattgcctacacaa
tgtctctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaacttcaccatcagcgt
gaccacagagatcctgcctgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccacc
gagtgctccaacctgctgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaatagagccctgacagggatcgccgtgg
aacaggacaagaacacccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccctcctatcaaggacttcgg
cggcttcaatttcagccagattctgcccgatcctagcaagcccagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttc
aacaaagtgacactggccgacgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatc
tgatttgcgcccagaagtttaacggactgacagtgctgccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagtacac
atctgccctgctggccggcacaatcacaagcggctggacatttggagctggcgccgctctgcagatcccctttgct
atgcagatggcctaccggttcaacggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgcca
accagttcaacagcgccatcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcagaa
cgtggtcaaccagaatgcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaacttcggcgccatcagctct
gtgctgaacgacatcctgagcagactggacaaggtggaagccgaggtgcagatcgacagactgatcaccggaaggc
tgcagtccctgcagacctacgttacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctctgccaatctggccgc
caccaagatgtctgagtgtgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctgatgagc
ttccctcagtctgcccctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccgctcaagagaagaatttcacca
ccgctccagccatctgccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcacccattg
gttcgtgacccagcggaacttctacgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgac
gtcgtgatcggcattgtgaacaataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactgg
ataagtactttaagaaccacacaagccccgacgtggacctgggcgacatcagcggaatcaatgccagcgtcgtgaa
catccagaaagagatcgaccggctgaacgaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactg
gggaagtacgagcagtacatcaagtggccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtga
tggtcacaatcatgctgtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctg
caagttcgacgaggacgattctgagcccgtgctcaaaggagtcaaattacattacacataagatatccgatccacc
ggatctagataactgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacc
tccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaa
ataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactc
atcaatgtatctta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>4689</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..4689</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgtt
acataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatg
ttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggc
agtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattat
gcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtga
tgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattga
cgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacg
caaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctaga
gatctggtaccgtcgagcctaagcttggtaccatgtttgtgttccttgtgttattgccactagtctctagtcagtg
tgtgaacctgaccacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgac
aaggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttcc
acgtcatctccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactttgc
cagcatcgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacagcaagacccagagcctgctg
atcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcctggatcaca
agaacaacaagagctggatggaaagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtc
ccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttcaagaacatc
gacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcatcgtggaacctgaacgggatctgcctcagggcttct
ctgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggcactgcacag
gtcctatctgacacctggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcag
cctagaaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctga
gcgagacaaagtgcaccctgaaaagcttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttcagagttcaacc
caccgagagcattgtgagatttcccaacatcaccaatctgtgtccctttgatgaggtgttcaatgccaccaggttc
gcaagcgtgtatgcctggaacaggaaacgcatctccaactgcgttgcagactacagtgttctgtacaatcttgcac
ccttcttcaccttcaagtgctatggagtgtctcccactaagctgaacgatctgtgcttcaccaatgtgtatgctga
cagctttgtgatcagaggagacgaagtgagacagattgctcctggacagacagggaacatcgcagactacaactac
aaacttccagatgacttcactggctgtgtcattgcctggaactccaacaagctggacagcaaggtgtctgggaact
acaactatctgtacagactgtttcggaagagcaacctgaaaccctttgagagagacatctctacagagatctacca
agctggcaacaaaccctgcaatggcgttgctggcttcaactgctactttccactgaagtcctacagcttcagaccc
acctatggagttggccatcaaccctacagagtggttgttctgagctttgaacttttgcatgcaccagccactgtgt
gtggtcccaagaagtctaccaatctggtgaagaacaagtgtgtgaactttaacttcaacggcctgaaaggcaccgg
cgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatattgccgataccacagacgcc
gtacgagatccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctg
gcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccagggcgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgc
cgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatc
ggagccgagtacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctaccaaacac
agacaaagagccacagacgggccagatctgtggccagccagagcatcattgcctacacaatgtctctgggcgccga
gaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctg
cctgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgctccaacctgc
tgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaagagagccctgacagggatcgccgtggaacaggacaagaacac
ccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccctcctatcaagtacttcggcggcttcaatttcagc
cagattctgcccgatcctagcaagcccagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactgg
ccgacgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaa
gtttaagggactgactgtgctgccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacatctgccctgctggcc
ggcacaatcacaagcggctggacatttggagctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctacc
ggttcaacggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgc
catcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaaccacaat
gcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaagttcggagccatcagctctgtgctgaacgacatct
tcagcagactggacaaggtggaagccgaggtgcagatcgacagactgatcaccggaaggctgcagtccctgcagac
ctacgttacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgtctgag
tgtgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctgatgagcttccctcagtctgccc
ctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccgctcaagagaagaatttcaccaccgctccagccatctg
ccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcgg
aacttctacgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattg
tgaacaataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggataagtactttaagaa
ccacacaagccccgacgtggacctgggcgacatcagcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatc
gaccggctgaacgaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagt
acatcaagtggccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgct
gtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgcaagttcgacgaggac
gattctgagcccgtgctcaaaggagtcaaattacattacacataagatatccgatccaccggatctagataactga
tcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaa
acataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatc
acaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatctta
</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>4716</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..4716</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q3">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgtt
acataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatg
ttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggc
agtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattat
gcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtga
tgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattga
cgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacg
caaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctaga
gatctggtaccgtcgagcctaagcttggtaccatgtttgtgttccttgtgttattgccactagtctctagtcagtg
tgtgaacctgaccacaagaacccagctgcctccagcctacaccaacagctttaccagaggcgtgtactaccccgac
aaggtgttcagatccagcgtgctgcactctacccaggacctgttcctgcctttcttcagcaacgtgacctggttcc
acgtcatctccggcaccaatggcaccaagagattcgacaaccccgtgctgcccttcaacgacggggtgtactttgc
cagcatcgagaagtccaacatcatcagaggctggatcttcggcaccacactggacagcaagacccagagcctgctg
atcgtgaacaacgccaccaacgtggtcatcaaagtgtgcgagttccagttctgcaacgaccccttcctggatcaca
agaacaacaagagctggatggaaagcgagttccgggtgtacagcagcgccaacaactgcaccttcgagtacgtgtc
ccagcctttcctgatggacctggaaggcaagcagggcaacttcaagaacctgcgcgagttcgtgttcaagaacatc
gacggctacttcaagatctacagcaagcacacccctatcatcgtggaacctgaacgggatctgcctcagggcttct
ctgctctggaacccctggtggatctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggcactgcacag
gtcctatctgacacctggcgatagcagcagcggatggacagctggtgccgccgcttactatgtgggctacctgcag
cctagaaccttcctgctgaagtacaacgagaacggcaccatcaccgacgccgtggattgtgctctggatcctctga
gcgagacaaagtgcaccctgaaaagcttcaccgtggaaaagggcatctaccagaccagcaacttcagagttcaacc
caccgagagcattgtgagatttcccaacatcaccaatctgtgtccctttgatgaggtgttcaatgccaccaggttc
gcaagcgtgtatgcctggaacaggaaacgcatctccaactgcgttgcagactacagtgttctgtacaatcttgcac
ccttcttcaccttcaagtgctatggagtgtctcccactaagctgaacgatctgtgcttcaccaatgtgtatgctga
cagctttgtgatcagaggagacgaagtgagacagattgctcctggacagacagggaacatcgcagactacaactac
aaacttccagatgacttcactggctgtgtcattgcctggaactccaacaagctggacagcaaggtgtctgggaact
acaactatctgtacagactgtttcggaagagcaacctgaaaccctttgagagagacatctctacagagatctacca
agctggcaacaaaccctgcaatggcgttgctggcttcaactgctactttccactgaagtcctacagcttcagaccc
acctatggagttggccatcaaccctacagagtggttgttctgagctttgaacttttgcatgcaccagccactgtgt
gtggtcccaagaagtctaccaatctggtgaagaacaagtgtgtgaactttaacttcaacggcctgaaaggcaccgg
cgtgctgacagagagcaacaagaagttcctgccattccagcagtttggccgggatattgccgataccacagacgcc
gtacgagatccccagacactggaaatcctggacatcaccccttgcagcttcggcggagtgtctgtgatcacccctg
gcaccaacaccagcaatcaggtggcagtgctgtaccagggcgtgaactgtaccgaagtgcccgtggccattcacgc
cgatcagctgacacctacatggcgggtgtactccaccggcagcaatgtgtttcagaccagagccggctgtctgatc
ggagccgagtacgtgaacaatagctacgagtgcgacatccccatcggcgctggcatctgtgccagctaccaaacac
agacaaagagccacagacgggccagatctgtggccagccagagcatcattgcctacacaatgtctctgggcgccga
gaacagcgtggcctactccaacaactctatcgctatccccaccaacttcaccatcagcgtgaccacagagatcctg
cctgtgtccatgaccaagaccagcgtggactgcaccatgtacatctgcggcgattccaccgagtgctccaacctgc
tgctgcagtacggcagcttctgcacccagctgaagagagccctgacagggatcgccgtggaacaggacaagaacac
ccaagaggtgttcgcccaagtgaagcagatctacaagacccctcctatcaagtacttcggcggcttcaatttcagc
cagattctgcccgatcctagcaagcccagcaagcggagcttcatcgaggacctgctgttcaacaaagtgacactgg
ccgacgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacattgccgccagggatctgatttgcgcccagaa
gtttaagggactgactgtgctgccaccactgctgaccgatgagatgatcgcccagtacacatctgccctgctggcc
ggcacaatcacaagcggctggacatttggagctggcgccgctctgcagatcccctttgctatgcagatggcctacc
ggttcaacggcatcggagtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaaccagttcaacagcgc
catcggcaagatccaggacagcctgagcagcacagcaagcgccctgggaaagctgcaggacgtggtcaaccacaat
gcccaggcactgaacaccctggtcaagcagctgtcctccaagttcggagccatcagctctgtgctgaacgacatct
tcagcagactggacaaggtggaagccgaggtgcagatcgacagactgatcaccggaaggctgcagtccctgcagac
ctacgttacccagcagctgatcagagccgccgagattagagcctctgccaatctggccgccaccaagatgtctgag
tgtgtgctgggccagagcaagagagtggacttttgcggcaagggctaccacctgatgagcttccctcagtctgccc
ctcacggcgtggtgtttctgcacgtgacatacgtgcccgctcaagagaagaatttcaccaccgctccagccatctg
ccacgacggcaaagcccactttcctagagaaggcgtgttcgtgtccaacggcacccattggttcgtgacccagcgg
aacttctacgagccccagatcatcaccaccgacaacaccttcgtgtctggcaactgcgacgtcgtgatcggcattg
tgaacaataccgtgtacgaccctctgcagcccgagctggacagcttcaaagaggaactggataagtactttaagaa
ccacacaagccccgacgtggacctgggcgacatcagcggaatcaatgccagcgtcgtgaacatccagaaagagatc
gaccggctgaacgaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgacctgcaagaactggggaagtacgagcagt
acatcaagtggccctggtacatctggctgggctttatcgccggactgattgccatcgtgatggtcacaatcatgct
gtgttgcatgaccagctgctgtagctgcctgaagggctgttgtagctgtggcagctgctgcaagttcgacgaggac
gattctgagcccgtgctcaaaggagtcaaattacattacacataagatatccgatccaccggatctagataagata
tccgatccaccggatctagataactgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaa
cctcccacacctccccctgaacctgaaacataaaatgaatgcaattgttgttgttaacttgtttattgcagcttat
aatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtt
tgtccaaactcatcaatgtatctta</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---