Полимеразная цепная реакция как метод генной диагностики в молочном скотоводстве

УДК 636.082.12/575

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ КАК МЕТОД ГЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ

В МОЛОЧНОМ СКОТОВОДСТВЕ

© Е.И. Кийко

Ключевые слова: полимеразная цепная реакция (ПЦР); точковые мутации; амплификация ДНК; праймеры.

Дано понятие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), его характеристики и важности при диагностике точ-ковых мутаций, являющихся основной причиной полиморфизма ДНК.

Метод полимеразной цепной реакции (HUP) с последующим рестрикционным анализом дал возможность идентифицировать генотипы белков молока на ранних стадиях развития животного, что значительно ускоряет решение некоторых актуальных задач современной селекции. Использование ПЩ’ облегчает процедуру анализа и открывает возможность массовых иссле-дований ДНК сельскохозяйственных животных и проведения практической селекции на уровне генотипов. Преимущество генной диагностики объясняется тем, что она базируется непосредственно на анализе наследственной информации, лежащей в основе того или иного признака.

Широкое применение метода KOP ускорило и упростило диагностику точковых мутаций, которые являются причиной полиморфизма большинства генов белков молока. Высокая чувствительность метода позволяет определить аллели, различающиеся заменой лишь одного полиморфизма большинства генов белков молока.

0^ - это селективная амплификация (фактически, клонирование) некоего фрагмента ДНК in vitro, инициируемая синтетическими олигонуклеотидными праймерами (затравками), позволяющая за короткий срок выделить и размножить определенную последовательность в неограниченном количестве - 108 раз. Особенность состоит в том, что амплификации подвергается область, находящаяся между участками отжига праймеров, первичная структура которых должна быть известна (или задана) заранее. Метод был разработан Saiki R.K. et al. (1985). Каждый цикл DHP состоит из тепловой денатурации ДНК, ее отжига с праймером и удлинения цепи (элонгации). Смена этих этапов проводится простым изменением температур. Праймеры при этом ориентируются на матрице так, что число циклов репликации растет экспоненциально, соответственно, увеличивается и число копий специфической нуклеотидной последовательности [1].

ПЦP позволяет выявлять уникальные нуклеотидные последователь-ности, характерные как для определенного вида животных, так и для определенного гена. Для этого в реакционную смесь добавляют в большом избытке специфичные для данной последовательности олигонуклеотидные праймеры (обычно одноцепочные фрагменты ДНК длиной 18-22 последовательных нук-

леотидов), комплементарные двум различным цепям специфического фрагмента ДНК. Праймеры ориентируют таким образом, что после отжига к матрице они своими 3'-концами располагаются друг против друга. Праймеры в ПЦР служат начальными пунктами (затравками) синтеза ДНК термостабильной Taq-полимеразой, которая в присутствии ионов Мg2+ катализирует синтез новой цепи ДНК из дезоксирибонук-леотидтрифосфатов (Днтф) в направлении 5' ^ 3' [2; 3]. Поскольку праймер участвует в гибридизации с обеими цепями ДНК, то, как нативная последовательность, так и синтезируемые продукты ПЦР могут служить матрицами в последующих циклах репликации. Вследствие этого последовательности, присутствующие в образце в минимальном количестве (одна или несколько копий) и не поддающиеся обнаружению никакими другими методами, легко выявляются с помощью ПЦР. ПЦР позволяет найти всего одну аномальную последовательность на 100 000-1000 000 нормальных клеток [4].

Каждый цикл ПЦР занимает от 2 до 5 мин., и обычно для достижения необходимой чувствительности достаточно 15-35 циклов, т. е. 2-3 часа. Так как содержание продуктов ПЦР достаточно велико, для их идентификации можно использовать неизотопные методы, добавление бромида димидия или бромида эти-дия в гель.

Амплифицированные в ходе ПЦР фрагменты ДНК имеют размер, определяемый суммой размеров праймеров и расстоянием между их 3'-концами и в большинстве случаев лежит в диапазоне 100-300 нуклеотидов, скорость репликации с помощью Taq-полимеразы составляет 35-100 нуклеотидов в секунду. Для проведения ПЦР обычно используют ДНК-полимеразу, выделенную из ТИегтш aquaticis, у которой отсутствует корректирующая 3' ^ 5'-активность и частота ошибок при считывании достигает 1/10 000 нуклеотидов. Этой точности достаточно для того, чтобы возникающие при репликации последовательности-мишени ошибки не создавали особых проблем [5].

Чувствительность метода зависит от числа циклов ПЦР. Число циклов ограничено, с одной стороны, частичной инактивацией полимеразы и истощением участвующих в реакции праймеров и дезоксирибонуклео-зидтри-фосфатов, а с другой - тем, что избыточное

число циклов приводит к наработке продуктов неспецифической амплификации. Для повышения эффективности каждого цикла необходимо оптимизировать и другие параметры.

В ходе ПЦР образцы инкубируют при трех различных температурах, соответствующих трем этапам цикла: денатурации мишени (90-96° С), отжигу (35-65° С) и удлинению праймера (72° C). Начальный прогрев - 5 мин. при 95° С обеспечивает полную денатурацию всех молекул ДНК в образце, и последующая денатурация в каждом цикле амплификации будет занимать меньше времени. Температура отжига определяет жесткость условий гибридизации праймеров с мишенью и, следовательно, специфичность амплификации. Она зависит от длины праймера, его первичной структуры (процента GC-оснований) и ионной силы ПЦР-буфера. Высокая ионная сила буфера и высокое содержание GC-оснований в праймерном олигонуклеотиде увеличивают эффективную температуру отжига. Для точного расчета оптимальной температуры отжига праймера (по его нуклеотидному составу) существует множество различных программ и алгоритмов. Упрощенный же расчет можно провести, используя приведенные ниже формулы:

Tm = [

если суммарная длина олигонуклеотида не превышает 20 оснований.

Tm = 22 + 1.46

если суммарная длина олигонуклеотида составляет 2030 оснований.

В любом случае расчетная температура отжига праймера является приблизительной и требует экспериментальной оптимизации. Очевидно, что чем выше температура, при которой проводится отжиг (при длине и составе праймера = const), тем меньше вероятность неспецифичного связывания праймера с матрицей. Температура на этапе элонгации зависит от типа используемой ДНК-полимеразы и обычно составляет 72° C, т. к. при таких условиях чаще всего используемая Taq обладает оптимальной активностью. Необходимое время элонгации определяется размером продуктов ампли-фикации. Считается, что копирование каждой 1000 п. н. занимает 1 мин. [4]. Конечный продукт ПЦР - специфический фрагмент ДНК, концами

которого являются 5'-олигонуклеотидных праймеров.

Наряду с новыми методами диагностики точковых мутаций, являющихся основной причиной полиморфизма ДНК: аллель-специфической ПЦР (AS-PCR) [6] и полиморфизмом структуры одноцепочной ДНК (SSCP-PCR) [7], активно используют метод ПЦР-ПДРФ анализа. При проведении ПДРФ анализа, с целью выявления полиморфизма, продукты ПЦР подвергают рестрикционно-энзиматическому гидролизу, после чего разделяют образующиеся фрагменты в геле [8]. Данный метод является стандартным и наиболее часто используется для диагностики точковых мутаций. Эндонуклеаза рестрикции, узнающая специфические последовательности, расщепляет по ним ДНК с образованием фрагментов, длину которых можно определить с помощью электрофореза в агарозном геле. Электрофорез в агарозном геле позволяет легко, без применения изотопов, обнаружить рестрицированную ДНК и определить размер фрагментов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White TJ. Optimization of PCRs. In PCR protocols: A guide to methods and applications // Academic Press. San Diego, 1990. P. 3-12.

2. Калашникова Л.А., Дунин И.М., Глазко В.И., Рыжова Н.В., Голубина Е.П. ДНК-технологии оценки сельскохозяйственных животных. Лесные Поляны, 1999. 148 с.

3. Saiki R.K., Gelfand D., Staffel S. et al. Primer-directed enzymatic amplication of with a thermostable DNA polymerase // Science. 1988. V. 239. P. 487-491.

4. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярногенетический анализ биоптатов // Методы. Молекулярная клиническая диагностика. М.: Мир, 1999. С. 395-528.

5. Вартапетян А.Б. Полимеразно-цепная реакция // Молекулярная биология. 1991. Т. 23. № 4. С. 926-936.

6. Newton C.R., Graham A., Heptinstall L.E., Powell S.J., Summers C., Kalsheker N., Smith J.C., Markharm A.F. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS) // Nucl. Acids. Res. 1989. V. 17. P. 2503-2516

7. Erlich H.A., Gelfand D., Sninsky JJ. Recent advances in the polymerase chain reaction // Sc. 1989. P. 1643-1650.

8. Сингер М., Берг П. Гены и геномы: в 2 т. М.: Мир, 1998.

Поступила в редакцию 1 ноября 2010 г.

Kiyko E.I. Polymer chain reaction as method of gene diagnostics in milk cattle breeding

The notion of polymer chain reaction (PCR), its characteristics and importance at diagnostics of point mutations which are the main reason of poly-morphysm of DNA is given.

Key words: polymer chain reaction (PCR); point mutations; amplification of DNA; primers.