УСИЛЕНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА ПТИЦ, ИНДУЦИРОВАННОГО ВИРУСНЫМ ВЕКТОРОМ
INTENSIFIED IMMUNE RESPONSE OF BIRDS INDUCED BY VIRAL VECTOR

Настоящее изобретение относится к области ветеринарной вакцинационной иммунологии, и в частности, к вакцине, содержащей вектор на основе герпесвируса птиц, олигодезоксинуклеотид и фармацевтически приемлемый носитель. Также изобретение относится к способам и применению вакцины и олигодезоксинуклеотида.
Хорошо известно, что олигодезоксинуклеотиды могут стимулировать врожденную иммунную систему, присутствующую у большинства позвоночных. Впервые это было опубликовано Krieg et al. для неметилированных CpG-мотивов, присутствующих в бактериальной ДНК (1995, Nature, vol. 374, p. 546). В последующие два десятилетия этот процесс был выявлен как часть прямого ответа на инвазию микроорганизмов посредством распознавания консервативных структур (так называемых патоген-ассоциированных молекулярных паттернов), существующих, например, в геномном материале вирусов и бактерий. Для этой цели врожденная иммунная система использует специфичные паттерн-распознающие рецепторы, такие как Толл-подобные рецепторы (TLR).
TLR являются трансмембранными гликопротеинами типа I, и связывание агонистического лиганда индуцирует димеризацию TLR, что приводит - в случае большинства TLR - к связыванию MyD88. Это инициирует каскад передачи сигнала в клетке, приводящий к активации фактора транскрипции NFkappaB. В свою очередь это приводит к экспрессии интерферонов типа 1 (ИФН1α и ИФН1β) и провоспалительных цитокинов (интерлейкина (ИЛ)-1 бета, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12 и фактора некроза опухоли). Кроме того, это является основой для стимуляции вторичного, приобретенного иммунитета (Kawai & Akira, 2010, Nature Immunol., vol. 11, p. 373).
У млекопитающих TLR, специализирующимся на детекции неметилированных CpG-мотивов, является TLR9. Однако в геноме птиц отсутствует ген TLR9; вместо этого обнаружено, что в качестве функционального гомолога TLR9 млекопитающих действует TLR21 (Brownlie et al., 2009, Mol. Immunol., vol. 46, p. 3163; Keestra et al., 2010, J. of Immunol., vol. 185, p. 460). TLR21 не исследовали так тщательно, как TLR9, но оба из них обладают рядом схожих функциональных черт: специфичностью в отношении неметилированных CpG-мотивов и внутриклеточной локализацией.
Описано использование иммуностимулирующего олигодезоксинуклеотида, содержащего неметилированные CpG-мотивы, (INO) в качестве вакцинного адъюванта (Krieg, A.M., 2007, Proc. Am. Thorac. Soc., vol. 4, p. 289), а также для применения в области ветеринарии. Его использовали, например, для домашней птицы: в вакцине для защиты кур от болезни Ньюкасла (Linghua et al., 2007, Vet. Immun. and Immunopath., vol. 115, p. 216); инфекционного бурсита (Mahmood et al., 2006, Vaccine vol. 24, p. 4838) или птичьего гриппа (Hung et al., 2011, Vaccine, vol. 29, p. 29). См. обзор в Dar et al. (2009, Japan Poultry Science, vol. 46, p. 69).
Недавно было описано несколько семейств INO, см.: WO 2012/089800 (семейство X4), WO 2012/160183 (семейство X43) и WO 2012/160184 (семейство X23). Эти INO являются особенно эффективными в качестве агонистов TLR21 птиц, имея высокий иммуномодулирующий эффект при низких концентрациях. Их добавление в вакцину повышает иммуногенность антигенного компонента этой вакцины. Таким образом, можно снижать количество антигена в вакцине с таким агонистом TLR21, одновременно достигая того же уровня иммунопротекции, что и без агониста.
У млекопитающих TLR9 в большом количестве экспрессируется на плазмацитоидных дендритных клетках. Эти клетки являются специализированными продуцентами интерферонов типа I, являющихся сильными противовирусными средствами. Таким образом, важной активностью агониста TLR9 является действие в качестве противовирусного средства, в частности, против ДНК-вирусов, таких как аденовирус или герпесвирус; см. Tang et al. (2010, Sci. China Life Sci., vol. 53, p. 172). На практике это является очень эффективным, например, аденовирус, который служил в качестве вектора для доставки гена, быстро элиминировался из инокулированного организма-хозяина посредством противовирусного эффекта индуцированной активации TLR9 (Nayak & Herzog, 2010, Gene Ther., vol. 17, p. 295). Аналогично, врожденная иммунная система эффективно атакует несколько типов герпесвирусов, таких как HSV1, HSV2, VZV и цитомегаловирус (Yu et al., 2011, Cell. Mol. Immunol., vol. 8, p. 181; Gaajetaan et al., 2012, Antiviral Res., vol. 93, p. 39; Ong et al., May 2013, Blood, DOI 10,1182; Zhang et al., 2013, Plos One, vol. 8, e52003; и обзор Martinez-Martin, 2010, Frontiers in Biosc. S2, p. 718). Этот противовирусный эффект также определяли в случае ветеринарной инфекции герпесвирусом: вирусом болезни Ауески у поросят (Linghua et al., 2008, Vaccine, vol. 26, p. 224).
В заключение: также известно, что агонисты TLR9 являются сильными иммуностимуляторами, индуцирующими эффективную элиминацию вирусной инфекции, в частности, ДНК-вирусами, такими как герпесвирус.
Хорошо известным способом активной вакцинации организмов-мишеней является инокуляция вектором; как правило, это живой рекомбинантный микроорганизм с низкой патогенностью, реплицирующийся в организме-мишени и экспрессирующий антиген из патогенного микроорганизма, против которого вакцинируют организм-мишень. Это является удобной альтернативой классической инактивированной вакцине, в которой, как правило, используют большие количества антигена в повторяющихся дозах и адъювант для усиления иммунной системы организма-мишени.
Для векторной вакцины, являющейся живым микроорганизмом-возбудителем инфекции, характерна способность к репликации. Эта репликация обеспечивает ряд преимуществ, например: векторную вакцину можно вводить в относительно низких количествах, и вектор обеспечивает длительное презентирование экспрессируемого антигена иммунной системе организма-мишени.
До некоторой степени инокуляция организма-мишени живой рекомбинантной векторной вакциной, таким образом, не сильно отличается от "нормальной" инфекции и включает развитие продуктивной инфекции с помощью вектора и индукцию иммунного ответа в организме-мишени. Развитие иммунитета против самого вектора (если это и происходит) может не являться таким же значительным, как против антигена, который доставляют с помощью вектора, посредством экспрессии гена, являющегося гетерологичным по отношению к вектору. Этот ген, как правило, получают из микроорганизма, патогенного для организма-мишени, и он кодирует белок-антиген (или соответствующую его часть), индуцирующий протективный иммунитет против патогенного микроорганизма-донора.
Известно несколько типов векторных вакцин с учетом разнообразия микроорганизмов, таких как вирусы, бактерии или паразиты. Ряд из них используют коммерчески, особенно в области ветеринарии, где экономическая сторона живой векторной вакцины является наиболее важной: относительно дешевая вакцина, которую можно вводить организмам-мишеням способами массовой вакцинации. Ярким примером ветеринарного рынка с низкой нормой прибыли при высоком объеме производства является птицеводство.
Наиболее используемые вакцины на основе вирусных векторов в случае домашней птицы основаны на герпесвирусах птиц, таких как вирус энтерита уток (DEV), вирус инфекционного ларинготрахеита (ILTV) или герпесвирус индеек (HVT).
DEV является альфагерпесвирусом, инфицирующим птиц отряда Гусеобразные (уток, гусей и лебедей) всех возрастов. Его также называют герпесвирус Anatid-1 или вирус чумы уток. Его используют в качестве векторной вакцины против птичьего гриппа (Liu et al., 2011, J. of Virol., vol. 85, p. 10989).
ILTV также известен как герпесвирус Gallid-1, и он вызывает тяжелую респираторную инфекцию у кур и фазанов. В своей ослабленной форме его также используют в качестве вектора против птичьего гриппа (Pavlova et al., 2009, Vaccine, vol. 27, p. 773).
HVT является вирусом из семейства вирусов болезни Марека (MDV), являющихся альфагерпесвирусами, инфицирующими виды птиц. HVT является MDV серотипа 3, и он также известен как герпесвирус Meleagrid 1 или герпесвирус индеек. Обнаружено, что HVT является полностью непатогенным для кур и является распространенной вакциной, например, штаммы HVT FC-126 и PB1.
MDV серотипа 2 (MDV2, также известный как герпесвирус Gallid-3) является практически непатогенным для кур. Его используют в качестве вектора и в качестве вакцины, например штамм SB1 (Petherbridge et al., 2009, J. Virol. Meth., vol. 158, p. 11).
MDV серотипа 1 (MDV1, герпесвирус Gallid-2) является исходно патогенным для домашней птицы, но известны ослабленные штаммы, такие как: RB1B, 814 и CVI-988 Риспенс, используемые в качестве вакцины или в качестве живого вектора (Cui et al., 2013, PLoS One, 2013; 8(1): e53340)
in ovo
MDV1, MDV2 и HVT являются системными вирусами, которые можно использовать в качестве вакцин для кур в раннем возрасте: в день их вылупления из яйца (день 1) или даже до вылупления, когда они еще находятся в яйце. Этот последний подход, так называемая "вакцинация ", является формой пренатальной вакцинации, как правило, используемой приблизительно в день 18 эмбрионального развития (ED) приблизительно за 3 дня до вылупления.
HVT используют в качестве живой вакцины на основе вирусного вектора в течение длительного периода времени (см. WO 87/04463) и для экспрессии и доставки различных антигенов из патогенов домашней птицы, таких как: белок слияния (F) вируса болезни Ньюкасла (NDV) (Sondermeijer et al., 1993, Vaccine, vol. 11, p. 349); вирусный белок 2 (VP2) вируса инфекционного бурсита (IBDV) (Darteil et al., 1995, Virology, vol. 211, p. 481); белок гемагглютинин (HA) вируса птичьего гриппа (AIV) (WO 2012/052384); и белки gD и gI вируса инфекционного ларинготрахеита (ILTV) (Hein et al., 2008, 43rd Natl. meeting Poultry Health & Processing, Ocean City, MD, p. 73-74). Кроме того, описывают экспрессию паразитарного антигена (Cronenberg et al., 1999, Acta Virol., vol. 43, p. 192). В недавних разработках описывают конструкции вектора HVT, экспрессирующие несколько гетерологичных генов, например: генов F NDV и VP2 IBDV в WO 2013/057235, и генов F NDV и gD/gI ILTV в WO 2013/057236.
Таким образом, ряд векторных вакцин HVT для домашней птицы используют коммерчески, например экспрессирующие белок F NDV: Innovax™-ND (MSD Animal Health) и Vectormune™ HVT-NDV (Ceva); VP2 IBDV: Vaxxitek™ HVT+IBD (Merial; ранее известный как Gallivac™ HVT-IBD), и Vectormune™ HVT-IBD (Ceva); и gD/gI ILTV: Innovax™-LT (MSD Animal Health).
Одной из проблем использования живого герпесвируса в качестве векторной вакцины является задержка возникновения иммунитета, которая ему необходима: по своей природе живому вектору, такому как герпесвирус (птиц), сначала необходимо вызвать продуктивную инфекцию в вакцинированном организме-мишени и реплицировать самого себя. Как правило, это занимает приблизительно от 3 до 7 дней. Только тогда возникает какой-либо существенный уровень экспрессии гетерологичного гена, после чего иммунная система организма-мишени активируется против экспрессируемого антигена; это занимает 2-3 недели. Таким образом, в целом, развитие целевого иммунного ответа, который может эффективно защищать против тяжелого заражения патогеном, являющимся донором гетерологичного гена, может занять до 4 недель. Это не является значительным недостатком, когда организм-мишень живет годами и имеет достаточно времени для развития и усиления своего иммунитета. Однако, в случае птицеводства продолжительность жизни организма-мишени, как правило, является короткой, и бремя полевой инфекции является высоким.
Способы повышения уровня иммунитета у птиц с помощью векторной вакцинации находят в повышении уровня экспрессии встраиваемого гетерологичного гена, например, посредством оптимизации силы его промотора (см. WO 2012/052384). Однако это не приводит к раннему возникновению иммунитета. Таким образом, в этой области существует постоянная потребность в усовершенствовании иммунизации птиц с помощью живых векторных вакцин для обеспечения как можно более раннего возникновения протективного иммунитета.
Таким образом, целью настоящего изобретения является преодоление недостатка и решение проблемы на современном уровне техники посредством обеспечения раннего возникновения у птиц иммунитета против антигена, экспрессируемого и доставляемого векторной вакциной на основе герпесвируса птиц.
Неожиданно обнаружено, что этой цели можно достигать с использованием олигодезоксинуклеотида, являющегося агонистом Толл-подобного рецептора (TLR) 21 птиц. Это обеспечивает усиление иммунного ответа у птиц против антигена, экспрессируемого векторной вакциной на основе герпесвируса птиц.
Например, обнаружено, что развитие протективного иммунного ответа у молодых кур против NDV из вектора HVT, несущего ген NDV-F, в норме занимает 3-4 недели после вакцинации, однако, при добавлении агониста TLR21 птиц эффективной защиты против тяжелой NDV-индуцированной инфекции достигали уже через две недели p.v. Если рассматривать 6-недельную продолжительность жизни бройлерных кур, это развитие иммунитета на 1-2 недели раньше является существенным повышением эффективности вакцинации вектором и имеет большое значение для выпуска продукции в коммерческом птицеводческом производстве.
Это усиление вектор-индуцированного иммунитета нельзя было предвидеть в итоге активации TLR21 птиц, т.к. он известен своей индукцией мощного противовирусного эффекта, аналогичного активности его функционального гомолога у млекопитающих TLR9. Таким образом, авторы настоящего изобретения были удивлены, обнаружив, что после добавления агониста TLR21 птиц вектор на основе герпесвируса птиц не элиминировался быстро, но, напротив, мог пролиферировать и экспрессировать свой гетерологичный ген. В частности, вектор на основе герпесвируса птиц мог осуществлять это так, что это приводило к возникновению иммунитета, являвшегося эффективным против экспрессируемого антигена после вакцинации гораздо раньше, чем в случае иммунизации без агониста TLR21.
В настоящее время неизвестно как или почему это явление происходит, и, т.к. мало известно о работах по (врожденной) иммунной системе птиц, объяснение недоступно из существующего уровня техники. Таким образом, неизвестно, является ли наблюдаемый эффект агониста TLR21 результатом иммунного ответа, являющегося, в некоторой степени, более быстрым, более сильным и/или более эффективным.
Не будучи связанными какой-либо теорией или моделью, с помощью которой можно было бы объяснить эти наблюдения, авторы настоящего изобретения предполагают, что активация врожденной иммунной системы птиц посредством агониста TLR21 птиц индуцирует у целевой птицы иммунологическую среду, неожиданно являющуюся благоприятной, а не вредной, для репликации и экспрессии вектора на основе герпесвируса птиц.
Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к вакцине, содержащей вектор на основе герпесвируса птиц, олигодезоксинуклеотид и фармацевтически приемлемый носитель, где вектор на основе герпесвируса птиц содержит гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген микроорганизма, являющегося патогенным для птиц, и где олигодезоксинуклеотид является агонистом Толл-подобного рецептора (TLR) 21 птиц.
Вакцина по изобретению обеспечивает усиление иммунного ответа птиц против гетерологичного антигена, экспрессируемого вектором на основе герпесвируса птиц.
Хорошо известно, что "вакцина" является композицией, содержащей иммунологически активное соединение в фармацевтически приемлемом носителе. "Иммунологически активное соединение" или "антиген" представляет собой молекулу, распознаваемую иммунной системой организма-мишени и направляющую иммунный ответ. Источником ответа может являться врожденный или приобретенный иммунитет, и ответ может являться клеточным и/или гуморальным.
Этот иммунный ответ способствует профилактике, улучшению, снижению чувствительности или лечению заболевания или нарушения, являющегося результатом инфекции, вызываемой микроорганизмом, у вакцинированного целевого животного. Защиты достигают в результате доставки по меньшей мере одного антигена, полученного из этого микроорганизма. Это будет приводить к тому, что у целевого животного будут наблюдать снижение количества или интенсивности клинических признаков, вызываемых микроорганизмом. Это может являться результатом снижения инвазии, колонизации или скорости распространения инфекции, вызываемой микроорганизмом, приводящего к снижению количества или тяжести повреждений и эффектов, вызываемых микроорганизмом или ответом организма-мишени на него.
Определение эффективности вакцины по изобретению против патогена птиц находится в пределах навыков обычного практикующего специалиста, например, посредством мониторинга иммунного ответа после вакцинации или после провокационной инфекции, например, посредством мониторинга клинических признаков заболевания у организма-мишени, клинических показателей, серологических параметров или посредством повторного выделения патогена, и сравнения этих результатов с ответами, наблюдаемыми у ложно-вакцинированных животных.
Различные варианты осуществления и предпочтительные варианты вакцины по изобретению изложены ниже.
В рамках изобретения, термин "содержащий" (а также его варианты, такие как "содержат", "содержит" и "содержащийся") относится ко всем элементам в любой возможной комбинации, возможной для изобретения, предусмотренным или включенным в текстовый раздел, параграф, пункт формулы изобретения и т.д., в котором этот термин используют, даже если такие элементы или комбинации не перечисляют явным образом; и он не относится к исключению любого из таких элементов или комбинаций. Таким образом, любой такой текстовый раздел, параграф, пункт формулы изобретения и т.д. также может относиться к одному или нескольким вариантам осуществления, где термин "содержащий" (или его варианты) заменяют такими терминами, как "состоит из", "состоящий из" или "по существу, состоящий из".
Aves
Термин "птица" относится к организму таксономического класса ; предпочтительными птицами являются птицы, имеющие значение для людей или ветеринарии, такие как: курица, индейка, утка, гусь, куропатка, павлин, перепел, голубь, фазан, цесарка, вьюрок, ворона, длиннохвостый попугай, попугай, ара, макао, какаду, вьюрок, сокол, ястреб, эму, казуар и страус. Более предпочтительными являются птицы, выбранные из группы, состоящей из: курицы, индейки, утки и гуся. Наиболее предпочтительной является курица. По изобретению птица может быть любой породы, типа или вариетета, например, несушки, племенные птицы, бройлеры, комбинированные породы или родительские линии любой из таких пород. Предпочтительными типами являются бройлер, племенная птица и несушка. Наиболее предпочтительными являются бройлерные куры.
В рамках изобретения, не является необходимым иметь один и тот же вид птиц в качестве мишени для вакцинации, в качестве источника вектора на основе герпесвируса птиц и в качестве источника микроорганизма, патогенного для птиц. Один, два или все из них могут иметь источником различных птиц. Например, вакцина для кур на основе вектора герпесвируса индейки (HVT), экспрессирующего антиген HA вируса птичьего гриппа, выделенного из чайки.
Herpesviridae
Alphaherpesvirinae
Термин "герпесвирус" хорошо известен в этой области и относится к вирусу, принадлежащему к таксономическому семейству . Предпочтительными являются герпесвирусы из подсемейства . Более предпочтительными являются DEV, ILTV, HVT, MDV2 и MDV1. Еще более предпочтительными являются HVT, MDV2 и MDV1; наиболее предпочтительным является HVT.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению вектор на основе герпесвируса птиц является одним или несколькими, выбранными из: вируса энтерита уток, вируса инфекционного ларинготрахеита, герпесвируса индеек, вируса болезни Марека серотипа 2 и вируса болезни Марека серотипа 1.
В рамках изобретения, термин "вектор" хорошо известен в этой области как живой рекомбинантный микроорганизм-носитель, выживающей в инокулированной целевой птице без очевидного вреда для организма-мишени и экспрессирующий и доставляющий в иммунную систему организма-мишени антиген, экспрессирующийся с гетерологичной нуклеотидной последовательности, которую он содержит. Как будет очевидно специалисту в этой области, по существу, вектор может экспрессировать и доставлять несколько антигенов, кодируемых одним или несколькими гетерологичными генами.
Предпочтительно, герпесвирусный вектор для вакцины по изобретению получают из известной векторной вакцины на основе герпесвируса с документально подтвержденной стабильной и эффективной репликацией и экспрессией гетерологичного антигена.
В рамках изобретения, для конструирования вектора на основе герпесвируса птиц исходным материалом является вирион герпесвируса, представляющий собой вирусную частицу в оболочке, содержащую относительно большой геном из линейной двухцепочечной ДНК. Герпесвирусы птиц имеют распространенную и консервативную организацию генома с уникальными длинными и уникальными короткими областями, фланкированными повторами. Несколько герпесвирусных геномных последовательностей являются общедоступными, например, в GenBank™: DEV: EU082088, ILTV: NC_006623, HVT: AF291866, MDV2: HQ840738 и MDV1: AF147806.
Для встраивания гетерологичной нуклеотидной последовательности в векторы на основе герпесвирусов (птиц) можно использовать различные способы молекулярной биологии. Например, в случае HVT - с использованием гомологичной рекомбинации (Sondermeijer et al., 1993, выше), регенерации космид (патент США № 5961982) или бакмид (искусственных бактериальных хромосом) (Baigent et al., 2006, J. of Gen. Virol., vol. 87, p. 769). Предпочтительными способами встраивания являются регенерация космид, например, как описано в WO 93/25665, или использование бакмид, как описано в EP 996738. По существу, в нем используют набор больших перекрывающихся субгеномных фрагментов генома вектора на основе герпесвируса птиц для реконструкции полного генома посредством котрансфекции в клетки-хозяева. Т.к. одна из космид несет экспрессирующую кассету, она становится стабильно интегрированной в геном вектора на основе герпесвируса птиц.
Кроме того, описаны несколько подходящих, не являющихся необходимыми, участков для встраивания конструкции гетерологичного гена в геном герпесвируса птиц; например, в случае HVT - в уникальную короткую область (EP 431668) или в уникальную длинную область генома (WO 87/04463). Предпочтительными участками встраивания являются участки Us2 и Us10.
Кроме того, описаны различные промоторы, запускающие экспрессию гетерологичной нуклеотидной последовательности в векторах на основе герпесвируса птиц, такие как: промотор PRV gpX (WO 87/04463), промотор вируса саркомы Рауса LTR, ранний промотор SV40, предранний промотор 1 цитомегаловируса человека (hCMV IE1) (EP 719864) и промотор гена бета-актина курицы (EP 1298139).
В рамках изобретения, термин "гетерологичный" означает, что нуклеотидная последовательность не присутствует в родительском микроорганизме, использованном для получения вектора по изобретению.
Термин "нуклеотидная последовательность" известен в этой области как молекулярная цепь нуклеотидов со способностью "кодировать" белковый антиген. Это хорошо известная в молекулярной биологии концепция, и она относится к центральной догме молекулярной биологии, где последовательность ДНК транскрибируется в мРНК, и мРНК транслируется в аминокислотную последовательность (часть) белка. Таким образом, нуклеотидная последовательность "кодирует" белок.
Чтобы приводить к точной экспрессии белкового антигена, нуклеотидная последовательность, предпочтительно, является открытой рамкой считывания (ORF), что означает, что она не содержит нежелательных стоп-кодонов, которые будут преждевременно терминировать транскрипцию в мРНК. Нуклеотидная последовательность может являться "геном" (т.е. ORF, кодирующей полный белок) или фрагментом гена. Она может иметь природное или синтетическое происхождение. Кроме того, нуклеотидная последовательность нуждается в контроле последовательностью промотора, инициирующей процесс транскрипции. Как правило, его обозначают как промотор, "функционально связанный" с нуклеотидной последовательностью, где оба соединены на одной и той же ДНК в эффективной близости и без сигналов или последовательностей между ними, которые могли бы помешать эффективной транскрипции.
По изобретению используемая последовательность промотора, по существу, может являться любым промотором при условии обеспечения эффективной и длительной экспрессии гетерологичной нуклеотидной последовательности.
Комбинацию нуклеотидной последовательности и промотора часто называют "экспрессирующей кассетой"; такую кассету легко можно конструировать, обрабатывать и клонировать с использованием нуклеиновой кислоты-носителя, такой как клонирующая плазмида. Все они хорошо известны в этой области.
В рамках изобретения, стабильное встраивание гетерологичной нуклеотидной последовательности в геном герпесвируса птиц можно осуществлять любым подходящим способом, обеспечивающим то, что получаемый рекомбинантный герпесвирусный вектор способен проявляться свои благоприятные эффекты в отношении безопасной, стабильной и эффективной экспрессии гетерологичного антигена.
Предпочтительно, нуклеотидная последовательность по изобретению кодирует полный белок, но также может кодировать часть белка, например, зрелую форму белка, т.е. без "лидерной последовательности", "якоря" или "сигнальной последовательности". Нуклеотидная последовательность даже может кодировать только конкретную часть белка, такую как часть, содержащая иммунопротективный эпитоп.
В связи с этим, в рамках изобретения, "белок" является молекулярной цепью аминокислот. Белок может являться нативным или зрелым белком, пре- или пробелком или иммуногенным фрагментом белка. В частности, в определение белка включены пептиды, олигопептиды и полипептиды.
Как правило, клетка-хозяин, в которой реплицируется рекомбинантный вектор на основе герпесвируса птиц, обеспечивает биомолекулярный аппарат, регулирующий процесс экспрессии. Модифицируя важные элементы, можно оптимизировать экспрессию антигена, например, в отношении уровня и качества; все это находится в пределах возможностей специалистов в этой области.
Хорошо известно, что термин "олигодезоксинуклеотид" означает молекулярную цепь дезоксинуклеотидов, ДНК, являющуюся относительно короткой, приблизительно от приблизительно 5 до приблизительно 500 нуклеотидов. Такая полимерная молекула содержит дезоксирибозы, соединенные фосфодиэфирными связями, и каждая из них несет органическое основание: цитозин, тимин, аденин или гуанин.
Как представлено в настоящем описании, олигодезоксинуклеотид может содержать модификации, например, модификацию фосфодиэфирной связи в фосфотиоатный, фосфодитиоатный или дефосфо-мостик. Примерами дефосфо-мостика являются метилгидроксиламино-, формацеталевая и диметиленсульфоновая группы.
Альтернативно, олигодезоксинуклеотид, представленный в настоящем описании, может содержать модификацию, относящуюся к замене природного нуклеозидного основания неприродным нуклеозидным основанием, таким как: 5-фторцитозин, 7-деаза-7-замещенный гуанин, 7-деаза-8-замещенный гуанин, урацил, 2-тиоурацил, дигидроурацил, 5-замещенный урацил, 5-бром-цитозин, 6-замещенный аденин, 6-замещенный цитозин или N4-замещенный цитозин.
Кроме того, другие возможные модификации относятся к замене единицы сахара дезоксирибозы единицей модифицированного сахара, например, L-2’-дезоксирибозой или 2’-L-арабинозой.
Такие модификации можно осуществлять для модифицирования или оптимизации фармакологических характеристик олигодезоксинуклеотида, таких как его биодоступность или время полужизни. Например, олигодезоксинуклеотид можно составлять в виде фармацевтически приемлемой соли или преобразовывать в фармацевтически приемлемый сложный эфир или простой эфир, например, на 5’- или 3’-конце гидроксильной группы.
Все эти модификации хорошо известны специалисту в этой области, и их можно осуществлять с использованием общепринятых способов и материалов.
В случае олигодезоксинуклеотидов, используемых в качестве агонистов TLR9 млекопитающих, показано, что полезно использование фосфо(ди)тиоатных связей, улучшающих стабильность, а также иммуностимулирующую активность. Однако, в рамках изобретения, стабильность не кажется критической, и неожиданно обнаружено, что при взаимодействии с TLR21 птиц олигодезоксинуклеотид, основанный исключительно на фосфодиэфирных связях, имеет более высокую иммуностимулирующую активность, чем аналогичный олигодезоксинуклеотид, содержащий фосфо(ди)тиоатные связи.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления олигодезоксинуклеотид для использования в изобретении в качестве агониста TLR21 птиц находится в фосфодиэфирной форме.
"Фармацевтически приемлемый носитель" является средством, способствующим эффективному введению иммунологически активного соединения вакцины, не имеющим (тяжелых) побочных эффектов в отношении здоровья целевого животного, которому его вводят. Такой носитель, например, может являться стерильной водой, физиологически приемлемой солью или фосфатно-солевым буфером. В более сложной форме носитель, например, может являться буфером, который может содержать дополнительные добавки, такие как стабилизаторы или консерванты. Подробности и примеры описывают, например, в хорошо известных справочниках, таких как: "Remington: the science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472) и "Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN 0444819681).
Например, стандартным стабилизатором для основанных на HVT живых вирусных (векторных) вакцин является: дилюент Nobilis™ CA, где CA означает "клеточно-ассоциированный"; который содержит в воде для инъекций: сахарозу, панкреатический гидролизат казеина, натрий-фосфатный буфер и краситель фенолфталеин. Этот стабилизатор для HVT легко можно использовать для разведения, хранения и введения агониста TLR21 птиц, представленного в настоящем описании. Другими примерами являются:,
"Антиген" по изобретению является белком (или его иммуногенной частью), который может индуцировать иммунный ответ. Предпочтительно, антиген имеет такую длину, аминокислотную последовательность, структуру, форму или качество, что иммунный ответ, который он индуцирует в вакцинированном организме-мишени, имеет достаточную силу для защиты от патогенного микроорганизма.
Предпочтительным антигеном для использования в изобретении является белок, способный индуцировать в организме-мишени протективный иммунитет против микроорганизмов, из которых получали этот антиген. Как правило, они являются белковыми антигенами, экспрессируемыми или экспонируемыми снаружи микроорганизма или его клетки-хозяина; часто такие белки участвуют в процессах, затрагивающих инфективность или вирулентность микроорганизмов, такие как белки, участвующие во взаимодействии, прикреплении и/или проникновении в клетки-хозяева, инвазии, поглощении питательных веществ, подвижности, эндо- или экзотоксичности и т.д.
В случае, когда патогенный для птиц микроорганизм является вирусом, таким белковым антигеном, например, является: белок оболочки вируса, капсида или матрикса или вирусным белком, делающим возможным образование вирусоподобных частиц.
Предпочтительными вирусными антигенами для использования в изобретении являются: NDV-F или -HN (гумагглютинин-нейраминидаза), ILTV-gD и -gI, IBDV-VP2, IBV-S (шип) или -M (матрикс), и AIV-HA, -NA или -M (нейраминидаза).
В случае бактериального микроорганизма предпочтительным белковым антигеном является белок мембраны, такой как белок наружной мембраны, пептидогликан, гликопротеин, липопротеин, белок периплазматической мембраны, или белок S-слоя, или белок из пилей, поринов, фимбрий или жгутиков.
Антиген "из микроорганизма" относится к биологическому объекту, являющемуся источником нуклеотидной последовательности, кодирующей антиген, и для защиты против которого предназначена герпесвирусная векторная вакцина, представленная в настоящем описании. Кодирующую антиген нуклеотидную последовательность можно получать из такого микроорганизма прямо или косвенно. Например, с помощью прямого выделения из микроорганизма, или ее можно получать синтетически, с использованием информации о микроорганизме. Полученная кодирующая нуклеотидная последовательность может являться молекулой ДНК или РНК в зависимости от исходного материала для ее выделения. Для экспрессии с помощью вектора на основе герпесвируса птиц нуклеотидная последовательность должна находиться в форме ДНК. Специалисту в этой области хорошо известны способы выделения одного или другого типа нуклеиновой кислоты из различных исходных материалов и, при необходимости, способы превращения одного типа в другой.
В этой области хорошо известны микроорганизмы, являющиеся "патогенными для птиц", по изобретению. Они включают все типы микроорганизмов: вирусы, бактерии, паразиты, грибы, риккетсии, простейших и т.д. Предпочтительный микроорганизм, служащий источником нуклеотидной последовательности, кодирующей один или несколько антигенов, экспрессируемых герпесвирусным вектором, представленным в настоящем описании, выбран из: вируса, бактерии, паразита и гриба, все из которых являются патогенными для птиц.
В предпочтительном варианте осуществления вирус, патогенный для птиц, выбран из: вируса инфекционного бронхита, NDV, аденовируса птиц, астровируса птиц, парамиксовируса птиц, вируса синдрома снижения яйценоскости, fowl adenovirus, IBDV, вируса анемии цыплят, вируса энцефаломиелита птиц, вируса оспы птиц, вируса ринотрахеита индеек, вируса чумы уток, вируса гепатита уток, вируса оспы голубей, MDV, вируса лейкоза птиц, ILTV, метапневмовируса птиц, вируса птичьего гриппа, парвовируса гусей и реовируса.
Escherichia
Salmonella
Ornithobacterium
Haemophilus
Pasteurella
Bordetella
Erysipelothrix
Mycoplasma
Campylobacter
Borrelia
Enterococcus
Avibacterium
Riemerella
Listeria
Shigella
Streptococcus
Staphylococcus
Mycobacterium
Chlamydia
Clostridium
В предпочтительном варианте осуществления патогенная для птиц бактерия выбрана из рода бактерий: , , , , , , , , , , , , , , , , , ,  и .
Eimeria
Cryptosporidium
В предпочтительном варианте осуществления патогенный для птиц паразит выбран из рода паразитов:  и .
Aspergillus
Candida
В предпочтительном варианте осуществления патогенный для птиц гриб выбран из рода грибов:  и .
В предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению вектор на основе герпесвируса птиц представляет собой HVT, и агонистом TLR21 птиц является X4-I-minG (SEQ ID NO:1).
В предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению вектор на основе герпесвируса птиц представляет собой HVT, и агонистом TLR21 птиц является X4-pent (SEQ ID NO:4).
Эти микроорганизмы и вызываемые ими заболевания хорошо известны в этой области, и их описывают, например, в хорошо известных справочниках, таких: "The Merck veterinary manual" (10th ed., 2010, C.M. Kahn edt., ISBN: 091191093X) и "Diseases of Poultry" (12th ed., 2008, Y.M. Saif edt., ISBN-10: 0813807182).
В рамках изобретения, названия микроорганизмов, используемые в настоящем описании, такие как названия герпесвирусного вектора и микроорганизмов, патогенных для птиц, представлены в настоящем описании так, как их в настоящее время используют в научной литературе. Таким образом, эти названия относятся к микроорганизмам, в настоящее время классифицированным по таксономическим группам с этими названиями. Изобретение также включает микроорганизмы, подклассифицированные в них каким-либо образом, например, как подвид, штамм, изолят, генотип, вариант или подтип и т.п. Эти микроорганизмы обладают характерными чертами членов их таксономической группы, такими как их морфологические, геномные и биохимические характеристики, а также их биологическими характеристиками, такими как физиологическая, иммунологическая или паразитарная характеристики. Как известно в этой области, классификация микроорганизмов основана на комбинации таких признаков.
Специалисту в этой области очевидно, что хотя микроорганизмы, являющиеся предметом настоящего изобретения, в настоящее время классифицируют в эти группы, например, род или вид, это является таксономической классификацией, которая может измениться, т.к. новая информация приведет к реклассификации в новую или другую таксономическую группу. Однако, т.к. это не изменяет микроорганизмы сами по себе или их антигенный репертуар, но только их научное название или классификацию, такие реклассифицированные микроорганизмы остаются в пределах объема изобретения.
Термин "Толл-подобный рецептор 21 птиц" хорошо известен в этой области, и последовательности ДНК и аминокислотные последовательности нескольких таких рецепторов находятся в общедоступных базах данных в виде отдельного гена или белка, в виде части геномной последовательности или в виде части гена с указанием различий по отношению к известным последовательностям TLR21. В качестве примера из GenBank, в случае курицы: NM_001030558 и NW_003763865. Другие последовательности TLR21 птиц также описаны, например, для вьюрка, сокола и зарянки, соответственно: GU904859, GU904941 и JX502652. Также описывали TLR21 различных типов и пород кур. Ссылки см. в: Ciraci & Lamont, 2011, Dev. & Comp. Immunol., vol. 35, p. 392; Alcaide & Edwards, 2011, Mol. Biol. Evol., vol. 28, p. 1703; и Ruan et al., 2012, Poultry Sci., vol. 91, p. 2512.
Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что общедоступными являются другие последовательности TLR21 птиц, хотя и неаннотированные или неправильно аннотированные; например, ген TLR21 индейки доступен под регистрационным № XM_003209691, где он отмечен как "TLR13-подобный". Также см. Ramasamy et al. (2012, Mol. Biol. Rep., vol. 39, p. 8539). Несмотря на это, этот ген проявляет значительную гомологию по отношению к гену TLR21 кур, и при клонировании в системе клетки HEK293/индикатор pNifTy2 этот TLR индейки являлся высокочувствительным к неметилированным CpG-мотивам. Субклонированный TLR21 индейки тестировали с агонистом TLR9 млекопитающих "2006" и с некоторыми из агонистов TLR21 птиц, представленными в настоящем описании: обнаруживали, что "2006" имеет EC50 для этого рецептора 6,6 нМ, что сравнимо с таковым для "X4-I-minG", но "X4-pent" являлся более активным и имел EC50 1,6 нМ.
in vivo
Систему клетки HEK293/индикатор pNifTy2 можно использовать для скрининга и определения агонистов TLR21, а также рецепторов TLR21. Она основана на детекции активации NFkappaB, являющейся результатом активации рецептора (в этом случае - TLR21 птиц), который экспонируют клетки, посредством детекции экспрессии маркерного гена с помощью реакции окрашивания. Это описывают, например, в WO 2012/089800, и это делает возможным удобное, быстрое и параллельное сравнение больших количеств молекул агонистов-кандидатов в диапазоне концентраций. Также описаны другие детекторные системы для активации TLR21 птиц, например, с использованием клеточной линии макрофагов курицы HD11 (Ciraci & Lamont, выше), выделяющих монооксид азота после стимуляции CpG. В других клеточных системах можно использовать транзиторно трансфицированные клетки, а также в равной степени возможны тесты .
Таким образом, специалист в этой области способен идентифицировать последовательности гена и белка TLR21 птиц, а также подтверждать, что кодируемый белок в действительности является рецептором для неметилированных CpG-мотивов.
in vivo
Аналогично, детекцию того, является ли олигодезоксинуклеотид "агонистом" TLR21 птиц по изобретению, легко можно осуществлять, например, с использованием известного TLR21 птиц. В этой области агонист определяют как соединение, которое может связываться с биологическим рецептором и запускать его активацию или ответ. В рамках изобретения, агонист TLR21 птиц содержит неметилированный CpG-мотив. При использовании детекторной клеточной системы или модели  такой агонист будет стимулировать уровень активности TLR21, более высокий, чем в его покоящемся, неактивированном состоянии. Предпочтительно, активность агониста является от высокой до очень высокой; ее можно определять с использованием от низких до очень низких концентраций агониста. Например, в то время как хорошо известный стандартный CpG-олигодезоксинуклеотид, такой как "ODN 2006" (Krug et al., 2001, Eur. J. Immunol., vol. 31, p. 2154) будет активировать TLR21 птиц, когда он находится в микромолярном или верхнем наномолярном диапазоне, предпочтительный олигодезоксинуклеотид по изобретению является активным в нижнем наномолярном, или даже пикомолярном, диапазоне концентраций.
Одним из удобных способов определения и сравнения агонистической активности агонистов TLR21 птиц по изобретению является определение их значения EC50, например, в системе клетки HEK293/индикатор pNifTy2, экспрессирующей TLR21 птиц, как описано в WO 2012/089800. Значение EC50 является полумаксимальной эффективной концентрацией и представляет собой концентрацию олигодезоксинуклеотида, необходимую для индуцирования количества репортерного фермента SEAP в исследуемой репортерной клеточной системе, при котором получают полумаксимальную абсорбцию. Предпочтительные агонисты TLR21 для использования в изобретении имеют значение EC50 в наномолярном, или даже пикомолярном, диапазоне.
Таким образом, предпочтительный агонист TLR21 птиц по изобретению имеет значение EC50 ниже 1 мМ, более предпочтительно - ниже 500 нМ, 100 нМ, 10 нМ, 1 нМ, 500 пМ, 100 пМ или даже ниже 50 пМ в порядке возрастания предпочтительности.
На современном уровне техники описаны такие высокоактивные агонисты TLR21 птиц, например, семейства соединений X4 (WO 2012/089800), X43 (WO 2012/160183) и X23 (WO 2012/160184). Эти соединения являются сильными агонистами TLR21, активирующими TLR21 птиц даже в очень низких концентрациях.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению агонист TLR21 птиц выбран из семейства X4, X43 или X23.
Само собой разумеется, что вакцина по изобретению также может содержать несколько агонистов TLR21, и их можно выбирать из одного, двух или всех трех из этих семейств соединений.
Семейство X4 агонистов TLR21 описывают в WO 2012/089800; таким образом, его описание включено в качестве ссылки в полном объеме.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению агонист TLR21 птиц имеет общую формулу: 5'-[N1]x [N7]r {N3 [N4]p C G [N5]q N6}n [N8]s [N2]z-3', где: N1=C или G; N2=C или G; N3=T, C или G; N4=C или T, при условии, что если N3=C, то N4=T; N5=C или T; N6=A, T, G или C; N7=A, T, C или G; N8=A, T, C или G; x=3-10; n=2-100; z=0-10; r=0-8, при условии, что если N7=T, то r=1-25; p=1-6, при условии, что если N4=T, то p=1-25; q=1-6, при условии, что если N5=T, то q=1-25; и s=0-8, при условии, что если N8=T, то s=1-25.
Семейство X43 агонистов TLR21 описывают в WO 2012/160183; таким образом, его описание включено в качестве ссылки в полном объеме.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению агонист TLR21 птиц имеет общую формулу: 5'-[G]x {[T]p T T C G T C [T]q}n [G]z-3', где: p=1-15; q=1-15; n=2-100; x=3-10; и z=0-10.
Семейство X23 агонистов TLR21 описывают в WO 2012/160184; таким образом, его описание включено в качестве ссылки в полном объеме.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцины по изобретению агонист TLR21 птиц имеет общую формулу: 5'-[G]x {T C G T C G}n T C G [G]z-3', где: x=3-20; z=0-10; и n=2-100.
Как представлено в настоящем описании, агонисты TLR21 можно получать различными способами, все из которых известны в этой области. (Ellington & Pollard, 2001, in: Synthesis and purification of oligonucleotides. Current Protocols in Molecular Biology, unit 2.11, p. 1-25; J. Wiley & sons Inc.). Кроме того, многие коммерческие поставщики предлагают синтез олигодезоксинуклеотидов на заказ, с модификациями по желанию, в любом масштабе. Например: BioSpring (Frankfurt a. M., Germany), и Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Germany).
При исследовании настоящего изобретения обнаружено, что агонисты TLR21, представленные в настоящем описании, в основном, имеют более высокую агонистическую активность, если они являются более длинными; в частности, олигонуклеотиды более 100 нуклеотидов в длину являются высокоактивными. Однако такие длинные олигодезоксинуклеотиды становятся все более сложными для надежного синтеза и очистки. Кроме того, для использования в ветеринарии более длинные олигодезоксинуклеотиды быстро становятся слишком дорогими. Таким образом, агонист TLR21 для применения в вакцине по изобретению, предпочтительно, составляет от приблизительно 20 до приблизительно 70 нуклеотидов в длину, более предпочтительно - от 22 до 60, от 25 до 50, от 30 до 45 или даже от приблизительно 30 до приблизительно 40 нуклеотидов в порядке возрастания предпочтительности.
Аналогично, обнаружено, что агонист TLR21, представленный в настоящем описании, является более активным в качестве агониста TLR21 птиц, когда участок G-нуклеотидов на 3’-конце (т.е. в 5'-3'-направлении) CpG-мотива является более коротким или даже отсутствует, и участок G-нуклеотидов на 5’-конце (т.е. в 3'-5'-направлении) CpG-мотива является более длинным.
Это было неожиданностью и отличием TLR21 птиц от TLR9 млекопитающих, т.к. авторы настоящего изобретения наблюдали, что в случае агонистов TLR9 млекопитающих активность является более высокой при коротком/отсутствующем 5’-G-участке и длинном 3’-G-участке.
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления агониста TLR21 из семейства X4: s=0 и z=0.
Таблица 1Дополнительные предпочтительные агонисты TLR21 птиц для использования в изобретении
Агонист TLR21 птиц
Нуклеотидная последовательность
Длина
EC50
SEQ ID NO:
Семейство X4:
X4-I-minG
GGGGGGTTTCGTTTTTTCGTTTTTTCGTTT
30
1,9 нМ
1
X4-Li8
GGGGGGTTCGTTTTTTTTCGTTTTTTTTCGTTGGGGG
37
950 пМ
2
X4-Bo9
GGGGGGTTTTTTTTTCGTTTTCGTTTTCGTTTTTTTTTGGGGG
43
714 пМ
3
X4-pent
GGGGGGTTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTTGGGGG
41
430 пМ
4
X4-III-trip
GGGGGGTTTTTCGTTTTTTTTTTCGTTTTTTTTTTCGTTTTTGGGGG
47
330 пМ
5
X4-IIq3-5
GGGGGGTTTTCGTTTTTTTTCGTTTTTTTTCGTTTTTTTTCGTTTT
46
70 пМ
6
X4-pent-3min5G
GGGGGGTTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTTTTCGTT
36
25 пМ
7
X4-II-minG
GGGGGGTTTTCGTTTTTTTTCGTTTTTTTTCGTTTT
36
23 пМ
8
Семейство X43:
X43-tri3g
GGGGGGTTCGTCTTCGTCTTCGTCGGG
27
700 пМ
9
X43-quad
GGGGGGTTCGTCTTCGTCTTCGTCTTCGTCGGGGG
35
560 пМ
10
X43-pent
GGGGGGTTCGTCTTCGTCTTCGTCTTCGTCTTCGTCGGGGG
41
400 пМ
11
X43-II-5732
GGGGGGGTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTTTTTCGTCTTGG
39
55 пМ
12
Семейство X23:
X23N-6
GGGGGGGTCGTCGTCGTCGTCGTCG
25
600 пМ
13
X23-quad
GGGGGGGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGGGGG
35
390 пМ
14
X23n-8
GGGGGGGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG
31
250 пМ
15
X23N-12
GGGGGGGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCG
43
250 пМ
16
X23-pent
GGGGGGGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGTCGGGGGG
41
<200 пМ
17
В предпочтительном варианте осуществления агониста TLR21 из семейства X43: z=0.
Кроме того, в предпочтительном варианте осуществления агониста TLR21 из семейства X23: z=0.
Дополнительными предпочтительными вариантами осуществления агониста TLR21 из семейства X4 являются те, в которых: N1=G; N7=G; r=3-8 (предпочтительно, r=5); N3=T; N4=T; p=2-6; N5=T; N6=T; q=2-6; и n=3-10 (предпочтительно, n=3-5).
Более предпочтительным агонистом TLR21 из семейства X4 является тот, в котором: {N3 [N4]p C G [N5]q N6}=TTCGTT, или TTTCGTTT, например, олигонуклеотиды X4-pent и X4-I-minG, соответственно, т.к. они представляют собой хороший компромисс между активностью и размером и стоимостью.
Дополнительные предпочтительные агонисты TLR21 из всех трех описываемых семейств соединений для применения в вакцине по изобретению представлены в таблице 1. Указанное значение EC50 определяли с использованием системы клетки HEK293/индикатор pNifTy2, экспрессирующей TLR21 курицы.
Вакцина по изобретению, по существу, может иметь довольно простой состав: олигодезоксинуклеотид в зависимости от его состава можно просто растворять в водном буфере, и вектор на основе герпесвируса птиц может содержаться в растворе, содержащем вирус и буфер, стабилизирующий его жизнеспособность. При смешивании с фармацевтически приемлемым носителем по изобретению получают вакцину по изобретению.
Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к способу получения вакцины по изобретению, включающему смешивание вектора на основе герпесвируса птиц, агониста TLR21 птиц, представленных в настоящем описании, и фармацевтически приемлемого носителя.
Продукт, получаемый этим способом, является вакциной по изобретению, усиливающей иммунный ответ птиц против антигена, экспрессируемого вектором на основе герпесвируса птиц.
in vitro
Герпесвирусный вектор для применения в вакцине по изобретению получают стандартными способами культивирования вирусов. После продуцирования в животных-хозяевах предпочтительной является пролиферация в культуре  в подходящих клетках-хозяевах, например: в первичных клетках, таких как эмбриональные фибробласты кур (CEF) (для HVT и MDV), или в стабильной клеточной линии, такой как клетки гепатомы кур леггорн (LMH) (для ILTV). Такие способы хорошо известны и легко применимы специалистом в этой области. Например, герпесвирусный вектор по изобретению конструируют посредством трансфекции и рекомбинации и выбирают желаемый рекомбинантный вирус. Затем вирусные векторы получают промышленным способом в более крупных объемах. Из таких культур собирают суспензию, содержащую вирус, в виде инфицированных целых клеток или в виде гомогената клеток, полученного ультразвуком, эту суспензию составляют в виде вакцины и вирусный векторный продукт упаковывают и хранят до дальнейшего использования.
Смешивание олигодезоксинуклеотида, вектора и носителя для получения вакцины по изобретению можно осуществлять различными способами и в различном порядке; например, два из этих трех компонентов можно заранее смешивать друг с другом перед добавлением третьего компонента. Это может быть полезным по ряду экономических или практических причин, например, для контроля качества, снижения стоимости и трудозатрат, или по причинам, связанным с хранением и логистикой. Таким образом, можно получать и хранить промежуточный продукт, а конечную полную вакцину получать исключительно незадолго до отправки или даже незадолго до использования.
После обширного тестирования на качество, количество и стерильность вакцину можно выпускать в продажу.
Общие способы и соображения, применимые в отношении получения вакцин, хорошо известны в этой области и описаны, например, в постановлениях правительства (Фармакопее) и в справочниках, таких как: "Veterinary vaccinology" и "Remington" (см. выше).
В предпочтительном варианте осуществления герпесвирусный вектор по изобретению является существующим коммерческим вакцинным продуктом, таким образом, для получения вакцины по изобретению необходимо только добавлять олигонуклеотид, представленный в настоящем описании. Это может осуществлять производитель в контролируемых условиях или просто специалист в месте вакцинации. В последнем случае вакцину по любому из вариантов осуществления изобретения можно получать в виде набора частей, содержащего вектор на основе герпесвируса птиц и олигодезоксинуклеотид в отдельных контейнерах.
Альтернативно, герпесвирусный вектор и олигодезоксинуклеотид, представленные в настоящем описании, можно смешивать в композицию, являющуюся промежуточным продуктом для вакцины по изобретению, таким как смесь в стабилизаторе или дилюенте. Аналогично другим возможным промежуточным продуктам это может быть предпочтительным в терминах качества или экономии при получении композиции таким способом.
Таким образом, в дополнительных аспектах изобретение относится к:
- композиции, содержащей вектор на основе герпесвируса птиц и олигодезоксинуклеотид, представленные в настоящем описании.
- вакцине для птиц, содержащей композицию по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
- способу получения вакцины по изобретению, включающему смешивание композиции по изобретению и фармацевтически приемлемого носителя.
- применению композиции по изобретению для производства вакцины для птиц.
Вакцина по любому из вариантов осуществления изобретения может содержать стабилизатор, например, для защиты чувствительных компонентов от деградации, для повышения срока годности вакцины и/или для улучшения эффективности хранения, например, для замораживания или лиофилизации. Как правило, стабилизаторы являются крупными молекулами с большой молекулярной массой, такими как липиды, углеводы или белки; например, сухое молоко, желатин, сывороточный альбумин, сорбит, трегалоза, спермидин, декстран или поливинилпирролидон, и буферами, такими как буферы с фосфатами щелочных металлов.
Предпочтительно, стабилизатор не содержит соединения животного происхождения или даже химического состава, как описывают в WO 2006/094974.
Также можно добавлять консерванты, например, тиомерсал, мертиолат, феноловые соединения и/или гентамицин.
Само собой разумеется, что добавление в вакцину по изобретению других соединений, таких как носители, дилюенты, эмульсии и т.п., также входит в объем изобретения. Такие добавки описывают в хорошо известных справочниках, таких как: "Remington" и "Veterinary Vaccinology" (см. выше). Однако ни один из компонентов вакцины не должен мешать жизнеспособности или развитию продуктивной инфекции, вызываемой вектором на основе герпесвируса птиц, или усилению иммунного ответа птиц агонистом TLR21 птиц.
Это также относится к составу вакцины по изобретению в виде лиофилизированного продукта, который может делать возможным длительное хранение при температурах выше 0°C, например, при 4°C. Однако, является ли это благоприятным в конкретном случае, зависит от характеристик вектора на основе герпесвируса птиц, используемого по изобретению, т.к. некоторые герпесвирусы, например, MDV1, плохо переносят лиофилизацию.
Вакцина по изобретению может дополнительно содержать так называемый "наполнитель"; он может обеспечивать поддержку компонентам вакцины, присоединяясь к ними без ковалентной связи. Такими наполнителями, помимо прочего, являются биомикрокапсулы, микроальгинаты, липосомы, макрозоли, гидроксид, фосфат, сульфат или оксид алюминия, диоксид кремния, Kaolin™, и Bentonite™, все из которых известны в этой области.
Примером является наполнитель, в котором антиген частично включен в иммуностимулирующий комплекс, так называемый ISCOM™ (см. EP 109942).
Кроме того, вакцина по изобретению может содержать одно или несколько подходящих поверхностно-активных соединений или эмульгаторов, например, компонент из семейства Span™ или Tween™.
Специалисту в этой области будет понятно, что любую и все добавки необходимо проверять и тестировать на совместимость с вектором на основе герпесвируса птиц и олигодезоксинуклеотидом по изобретению.
Количество вектора на основе герпесвируса птиц на дозу вакцины по изобретению для птицы не является настолько критичным, как это было бы для вакцины инактивированного типа. Это является результатом того, что вектор на основе герпесвируса птиц сам будет реплицироваться и, таким образом, увеличивать свое количество в организме целевой птицы до уровня виремии, являющегося биологически постоянным. Несмотря на это, необходимо вводить минимальную дозу для достижения эффективного "захвата" векторной вакцины. В связи с этим, существуют различные способы определения количества живого герпесвируса; удобным является способ, в котором подсчитывают существующие жизнеспособные вирусные частицы, такой как анализ бляшкообразования на слое восприимчивых клеток. Затем количество вектора на основе герпесвируса птиц по изобретению можно выражать в виде количества бляшкообразующих единиц (БОЕ). Какая доза составляет эффективную дозу инокулята, зависит от жизнеспособности и репликативной способности конкретного герпесвируса, используемого в качестве вектора по изобретению.
7
2
6
3
5
3
4
Предпочтительное количество вектора на основе герпесвируса птиц по изобретению в вакцине по изобретению составляет от приблизительно 10 до приблизительно 1×10 БОЕ вектора на основе герпесвируса птиц на дозу, более предпочтительно - от 1×10 до 1×10, от 1×10 до 1×10, от 1×10 до 1×10 и даже от 1000 до 5000 БОЕ/дозу в порядке возрастания предпочтения.
В случае, когда вектор на основе герпесвируса птиц по изобретению является клеточно-связанным вирусом, таким, какой можно использовать в случае HVT или MDV, вектор можно вводить в клеточно-ассоциированной форме. В этом случае одна доза для птиц содержит от 100 до 10000 инфицированных клеток-хозяев на дозу, предпочтительно - 100-5000 инфицированных клеток, более предпочтительно - 200-2000 инфицированных клеток-хозяев на дозу.
Помимо усиленной иммунной защиты, которую уже обеспечивает вакцина по изобретению, предпочтительным может являться добавление одного или нескольких дополнительных иммуноактивных компонентов. Такой компонент может являться антигеном, дополнительным INO, иммуностимулирующим веществом, цитокином и/или вакциной для получения комбинированной вакцины. Это обеспечивает преимущества в терминах стоимости, эффективности и гуманного обращения с животными. Альтернативно, в вакцину можно добавлять саму вакцину по изобретению.
in ovo
По существу, вакцину по изобретению можно вводить целевым птицам разными путями и в различные моменты их жизни, при условии того, что инокулированный рекомбинантный вектор на основе герпесвируса птиц может вызывать протективную инфекцию против гетерологичного антигена. По существу, это не зависит от возраста целевой птицы, массы, пола, иммунологического статуса и т.д., хотя, несомненно, полезно вакцинировать здоровые организмы-мишени, и вакцинировать как можно раньше для противодействия бремени полевой инфекции, например, MDV, NDV или IBDV. Таким образом, предпочтительно применять вакцину по изобретению как можно раньше, предпочтительно, в день вылупления (день 1) или даже , например, через 18 дней ED. Коммерчески доступным является подходящее оборудование для автоматических инъекций в яйцо в промышленном масштабе. Это обеспечивает самую раннюю возможную защиту, одновременно минимизируя затраты на рабочую силу.
in ovo
Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления вакцину по изобретению вводят .
in ovo
Известны различные пути инокуляции , такие как инокуляция в желточный мешок, эмбрион или аллантоисную полость; и при необходимости их можно оптимизировать.
Альтернативно, можно использовать парентеральную инокуляцию отдельных птиц. Предпочтительно, ее осуществляют внутримышечно или подкожно. Другими полезными путями иммунизации являются алиментарный, интестинальный или мукозальный путь; например, пероральный, назальный, ороназальный или глазной путь. Это можно осуществлять любым способом вакцинации с помощью капель или спрея. Дополнительным примером этих путей введения является удобство и экономия массового использования.
Составами вакцины по изобретению, подходящими для инъекций являются, например, суспензия, раствор, дисперсия или эмульсия.
В зависимости от пути введения вакцины по изобретению необходимой может являться регуляция вакцинной композиции. Это находится в пределах возможностей специалиста в этой области и, как правило, включает корректировку эффективности или безопасности вакцины. Это можно осуществлять, регулируя дозу вакцины, количество, частоту, путь, используя вакцину в другой форме или составе или регулируя или добавляя другие компоненты вакцины (например, стабилизатор или адъювант).
in ovo
Например, чтобы быть подходящей для введения , вакцинная композиция должна быть очень мягкой для того, чтобы не снижать вылупляемость яиц. Однако даже в этом случае может происходить некоторое снижение вылупляемости, например, в результате механического повреждения эмбриона при самой инокуляции, инфекции и т.д.
in ovo
Авторы настоящего изобретения установили, что олигодезоксинуклеотид, представленный в настоящем описании, можно вводить курам  в количестве по меньшей мере 10 мкг на дозу, не вызывая проявлений патологической реакции. Однако, такое количество может являться экономически нецелесообразным. Кроме того, авторы настоящего изобретения наблюдали, что конкретный агонист TLR21 может иметь такую оптимальную эффективную дозу, что более высокое или более низкое количество будет иметь низкий эффект усиления иммунитета; например, в одном эксперименте на животных доза агониста TLR21 птиц 0,1 мкг на курицу превосходила дозы 0,01 мкг или 1 мкг на курицу. Специалисту в этой области будет понятно, что это может зависеть от различных параметров, таких как: специфическая активность используемого олигодезоксинуклеотида, вид целевых птиц, состав, способ введения и т.д., и специалист будет способен оптимизировать такие условия путем рутинного экспериментирования.
Определение количества олигодезоксинуклеотида для использования в изобретении легко можно осуществлять рядом способов, например, колоночной хроматографией с детекцией посредством спектрофотометрии поглощения УФ-излучения при вычисленном коэффициенте экстинкции конкретного олигодезоксинуклеотида, подвергаемого тестированию, как правило, в диапазоне приблизительно 250-280 нм.
Таким образом, в рамках изобретения, предпочтительное количество олигодезоксинуклеотида, представленного в настоящем описании, на дозу для птицы составляет от 0,1 нг до 1 мг, более предпочтительно - от 1 нг до 100 мкг, еще более предпочтительно - от приблизительно 10 нг до приблизительно 10 мкг на дозу для птицы, и наиболее предпочтительно - приблизительно от 30 нг до 3 мкг на дозу для птицы.
Вакцину по изобретению, в равной степени, можно использовать в качестве профилактического и терапевтического лечения, и она противодействует развитию и/или прогрессированию птичьего патогена, инфекции или клинических признаков заболевания.
Кроме того, вакцину по изобретению можно эффективно использовать для первичной вакцинации, после которой можно осуществлять и которую можно усиливать вторичной вакцинацией с использованием вакцины по изобретению или инактивированной вакцины для птиц.
Режим дозирования для введения вакцины по изобретению целевой птице может включать однократные или многократные дозы, которые можно вводить одновременно или последовательно способом, совместимым с необходимой дозировкой и составом вакцины, и в таком количестве, которое будет иммунологически эффективным для целевой птицы.
Протокол введения вакцины по изобретению теоретически интегрируют в существующие схемы вакцинации другими вакцинами для целевых птиц.
in ovo
Предпочтительно, вакцину по изобретению вводят только один раз в день вылупления или  в день 18 ED. Однако, в зависимости от типа птиц, подлежащих вакцинации, и их случному плану, может потребоваться ревакцинация птиц один раз, несколько раз или даже периодически.
in ovo
Объем вакцины по изобретению на дозу для птицы можно оптимизировать в соответствии с предполагаемым путем введения: инокуляцию , как правило, осуществляют с использованием объема приблизительно от 0,05 до 0,5 мл/яйцо, и парентеральную инъекцию, как правило, осуществляют с использованием объема приблизительно от 0,1 до 1 мл/птицу. Оптимизация объема дозы вакцины находится в пределах возможностей специалистов в этой области.
Вакцина по изобретению, по существу, является "маркерной вакциной" для микроорганизма, против которого защищает экспрессируемый вектором гетерологичный ген, т.к. генерируемый им иммунитет направлен только против одного (или нескольких) белков из этого микроорганизма. Это делает возможной "дифференциацию инфицированных и вакцинированных животных", так называемый подход "DIVA". Его легко можно осуществлять посредством серологического анализа, такого как ELISA или иммунофлуоресцентный анализ.
Полезного эффекта изобретения, усиление иммунного ответа птиц против антигена, экспрессируемого и доставляемого вектором на основе герпесвируса птиц, достигают после введения птицам вектора на основе герпесвируса птиц и олигодезоксинуклеотида, представленных в настоящем описании. Существует несколько способов, которыми можно осуществлять это введение и получать полезный эффект. Они приводят к различным аспектам и вариантам осуществления изобретения. В частности, птиц можно иммунизировать вакциной по одному из вариантов осуществления изобретения или отдельными компонентами такой вакцины. Подробности этих различных вариантов осуществления описывают и иллюстрируют с помощью примеров в настоящем описании.
Например, вектор на основе герпесвируса птиц и олигодезоксинуклеотид, представленные в настоящем описании, можно комбинировать в одной вакцине из отдельных компонентов или из промежуточной композиции, как представлено в настоящем описании. Альтернативно, птиц можно инокулировать вектором и олигодезоксинуклеотидом раздельно, например, если вектор уже составили в виде вакцины, то олигодезоксинуклеотид можно добавлять в эту вакцину или вводить отдельно. При введении в виде раздельных инокуляций предпочтительно проводить инокуляцию вектором на основе герпесвируса птиц и инокуляцию олигодезоксинуклеотидом, представленными в настоящем описании, целевых птиц не более чем с 3-дневным интервалом. Ниже приведен пример этого, в котором описывают, что раздельное введение олигодезоксинуклеотида, представленного в настоящем описании, в пределах до трех дней после введения вектора на основе герпесвируса птиц все равно являлось эффективным в усилении иммунного ответа.
Таким образом, по изобретению вектор на основе герпесвируса птиц и олигодезоксинуклеотид, представленные в настоящем описании, можно вводить птицам в виде одиночного или двойного введения; одиночное введение - когда оба комбинируют в одном составе; двойное введение может являться введением в разные моменты времени или одновременно, но в разные участки тела, разными путями или разными способами. При раздельном введении вектор и олигодезоксинуклеотид вводят целевой птице с интервалом не более чем 3 дня, причем любой из них можно вводить первым.
Таким образом, в дополнительном аспекте изобретение относится к способу вакцинации птиц, включающему введение птицам вектора на основе герпесвируса птиц, представленного в настоящем описании, и олигодезоксинуклеотида, представленного в настоящем описании.
Введение может являться комбинированным или раздельным по месту, пути или способу. Специалист в этой области способен тестировать варианты этих возможных путей введения для получения протокола, являющегося оптимальным для конкретного вида птиц или желаемой иммунологической защиты.
В дополнительном аспекте изобретение относится к агонисту TLR21, представленному в настоящем описании, для применения в усилении иммунного ответа у птиц против антигена, экспрессируемого вектором на основе герпесвируса птиц, представленным в настоящем описании.
В дополнительном аспекте изобретение относится к агонисту TLR21, представленному в настоящем описании, для применения в способе вакцинации птиц для усиления иммунного ответа у птиц против антигена, экспрессируемого вектором на основе герпесвируса птиц, представленным в настоящем описании.
В дополнительном аспекте изобретение относится к применению агониста TLR21, представленного в настоящем описании, для производства вакцины для птиц для усиления иммунного ответа у птиц против антигена, экспрессируемого вектором на основе герпесвируса птиц, представленным в настоящем описании.
В дополнительном аспекте изобретение относится к способу усиления иммунного ответа у птиц против антигена, экспрессируемого вектором на основе герпесвируса птиц, представленным в настоящем описании, включающему введение птицам агониста TLR21, представленного в настоящем описании.
Далее изобретение описывают с помощью неограничивающих примеров, представленных ниже.
Примеры
Пример 1: Синтез и очистка агонистов TLR21
Олигодезоксинуклеотиды для использования в экспериментах по настоящему изобретению заказывали в BioSpring (Frankfurt a. M., Germany) и получали их очищенными и лиофилизированными, в указанном количестве. Их разводили в подходящем буфере в зависимости от экспериментального использования. Концентрацию проверяли от случая к случаю с помощью эксклюзионной хроматографии, комбинированной с УФ-мониторингом, но обнаруживали, что она являлась правильной во всех случаях.
Пример 2: Вектор на основе герпесвируса птиц
Вектор на основе герпесвируса птиц, используемый для некоторых из экспериментов, HVT-F-VP2, имел в основе HVT и содержал ген F из NDV, а также ген VP2 из IBDV, встроенные в область Us2. Конструирование вектора, его получение в клетках, определение количества и т.д. осуществляли, как описано в WO 2013/057235.
Пример 3: Тестирование активности агониста TLR21 птиц
in vitro
Использование линии клеток HEK293, трансформированной с использованием рецептора TLR21 курицы для тестирования и определения характеристик кандидатов-агонистов TLR21 птиц описывают, например, в WO 2012/089800. Однако, вкратце: клетки HEK293 трансфицировали с использованием плазмиды pNiFty2-SEAP, репортерной в отношении активации NFkappaB (InvivoGen, San Diego, CA, USA). Клональные клеточные линии подвергали селекции и использовали для трансфекции с использованием гена TLR21 курицы. Клональные клеточные линии снова подвергали селекции. Их использовали для детекции активации NFkappaB после инкубации с различными концентрациями олигодезоксинуклеотидов-агонистов TLR21 птиц. Считывание осуществляли посредством колориметрической детекции активности секретируемой SEAP (секретируемой эмбриональной щелочной фосфатазы) с помощью спектрофотометрии OD 405 нм. Строили ее график как mOD405 нм/мин, как функции градиента концентрации агониста. Значимыми результатами являлись результаты с высоким уровнем окрашивания при относительно низкой концентрации агониста.
Пример 4: Тестирование активности агониста TLR21 птиц
в отношении иммунитета, индуцируемого вектором на основе герпесвируса птиц
in vivo
4.1. Введение
in vivo
Этот эксперимент планировали для тестирования эффекта агониста TLR21 X4-I-minG (EC50=1,9 нМ)  в отношении иммунитета, индуцируемого вектором на основе герпесвируса птиц, у кур. Тестировали различные временные точки введения агониста TLR21 птицам, вакцинированным вектором, при одном и том же количестве агониста.
4.2. Материалы и способы
4.2.1. Дизайн эксперимента
Семь (7) групп SPF белых кур леггорн (n=25/группу) возрастом 1 день вакцинировали однократно s.c. в основание шеи с использованием вектора HVT-F-VP2 (экспрессирующего антигены NDV-F и IBDV-VP2): группы 3-9. В группе 2 s.c. инъецировали только агонист TLR21 в T=0, и группа 1 являлась невакцинированным контролем заражения.
В несколько моментов времени после вакцинации агонист TLR21 инъецировали s.c. в основание шеи согласно режиму введения для распределения по группам и дозировке. Образцы крови получали до вакцинации (T=0) из 20 вылупившихся одновременно цыплят путем кровопускания и в T=2 недели после вакцинации из 5 выбранных случайным образом вакцинированных/получивших инъекцию птиц из групп 2-9, после чего этих 40 животных исключали из эксперимента и формировали новые n=20/группу. Сыворотку использовали для определения титров антител против NDV и IBDV. После забора крови 25 невакцинированных контрольных животных (группа 1) случайным образом разделяли по 8 группам вакцинированных/получивших инъекцию животных, т.е. в каждую группу помещали по 3 контрольных животных (n=23/группу; 1 группа с n=24). Затем всех животных внутримышечным (i.m.) путем заражали 0,2 мл (6,0 log10 EID50) штамма NDV Herts 33/56.
4.2.2. Биологическая безопасность
Кур держали в изоляторах под отрицательным давлением и с Hepa-фильтрованным входящим/выходящим воздухом, чтобы сохранить генетически модифицированные векторы и вирулентный вирус, которым заражали.
4.2.3. Тестируемые материалы
Агонист TLR21 птиц: X4-I-minG
Векторная вакцина: HVT-F-VP2, пассаж 6.
Материал для заражения: живой NDV Herts 33/56 при титре 9,6 log10 EID50 на мл.
Дозировка: 1 доза равна 0,2 мл. Агонист TLR21 инъецировали в количестве 0,1 мкг на дозу.
4.2.4. Тестируемые животные
Белая курица леггорн, не содержащая конкретного патогена, смешанной половой принадлежности, возрастом 1 день на момент начала эксперимента. Кур индивидуально нумеровали с помощью крыловой метки. 25 контрольных кур из группы 1 нумеровали с помощью меток разных цветов.
4.2.5. Пища и вода
ad libitum
Пища и вода были доступны животным .
4.2.6. Распределение по группам и дозировка
Группа
Количество
Векторная вакцина(0,2 мл s.c. в T=0)
s.c. инъекция 0,1 мл X4-I-minG (0,1 мкг/дозу) в различные моменты времени после вакцинации (p.v.)
1
25
нет
нет
2
25
нет
T=0
3
25
HVT-F-VP2
нет
4
25
HVT-F-VP2
T=0 (включено в вакцину)
5
25
HVT-F-VP2
T=1 дней p.v.
6
25
HVT-F-VP2
T=3 дней p.v.
7
25
HVT-F-VP2
T=6 дней p.v.
8
25
HVT-F-VP2
T=8 дней p.v.
9
25
HVT-F-VP2
T=10 дней p.v.
20 одновременно вылупившихся цыплят обескровливали в T=0
4.2.7. Вакцинация
Животных из групп 3-9 вакцинировали s.c. 0,2 мл векторной вакцины в основание шеи в возрасте 1 день. В группе 2 инъецировали только 0,1 мл агониста TLR21 в T=0.
В несколько моментов времени после вакцинации животным из групп 5-9 инъецировали 0,1 мл агониста TLR21 s.c. в основание шеи согласно таблице "Распределение по группам и дозировка". 25 контрольных животные из группы 1, имевших крыловые метки разных цветов, не вакцинировали.
4.2.8. Заражение
Через 2 недели после вакцинации всех оставшихся животных в каждой группе инфицировали посредством инъекции 0,2 мл живого NDV Herts 33/56 (6,0 log10 EID50 на курицу) i.m. в мышцу правой ноги.
4.2.9. Забор крови
Образцы крови для серологического анализа получали до вакцинации (T=0) из 20 вылупившихся одновременно цыплят посредством кровопускания и в T=2 недели после вакцинации из 5 выбранных случайным образом вакцинированных/получивших инъекцию птиц из всех групп вакцинированных/получивших инъекцию. После забора крови этих 40 животных (8 групп по 5 животных) исключали из эксперимента. Все образцы крови доставляли в лабораторию для обработки и анализа.
После забора крови, но до заражения, 25 невакцинированных контрольных животных случайным образом разделяли по 8 группам вакцинированных/получивших инъекцию животных, т.е. в каждую группу помещали по 3 контрольных животных (n=23/группу, оставшаяся группа с n=24), чтобы они служили в качестве индикаторов.
4.2.10. Наблюдение за клиническими признаками.
До заражения:
Специалист ежедневно наблюдал кур на наличие клинических признаков заболевания или других аномалий. Кур, демонстрировавших боль или дискомфорт, что считали не временным или что, вероятно, могло ухудшаться, умерщвляли по соображениям гуманного обращения с животными. Кур, которые умирали, или которых умерщвляли до заражения, не подвергали патологоанатомическому исследованию, т.к. не наблюдали высокой или неожиданной смертности.
После заражения:
В течение 14 дней после заражения всех кур во всех группах ежедневно оценивали на наличие клинических признаков инфекции NDV или смертности. Данные регистрировали по животным в специальных формах. Использовали следующую балльную систему:
0. Отсутствие клинических признаков болезни Ньюкасла.
1. Наличие клинических признаков болезни Ньюкасла с такими неврологическими признаками, как: клонический спазм, мышечный тремор, кривошея, опистотонус или паралич ног или крыльев.
2. Смертность, вызываемая заражением NDV. В случае, когда животных умерщвляли по соображениям гуманного обращения с животными, это указывали в форме.
4.3. Результаты
Группа
Количество
Векторная вакцина(0,2 мл s.c. в T=0)
s.c. инъекция 0,1 мл X4-I-minG (0,1 мкг/дозу) в различные моменты времени после вакцинации (p.v.)
% выживших через 2 недели p.v.
1
20
-
нет
нет
2
20
-
T=0
нет
3
20
HVT-F-VP2
нет
20
4
20
HVT-F-VP2
T=0 (включено в вакцину)
35
5
20
HVT-F-VP2
T=1 день p.v.
20
6
20
HVT-F-VP2
T=3 дней p.v.
45
7
20
HVT-F-VP2
T=6 дней p.v.
30
8
20
HVT-F-VP2
T=8 дней p.v.
25
9
20
HVT-F-VP2
T=10 дней p.v.
10
4.4. Выводы:
Введение агониста TLR21 птиц одновременно или вскоре после введения вектора на основе герпесвируса птиц обеспечивало значительное усиление иммунного ответа против гетерологичного антигена, экспрессируемого и доставляемого вектором. Об этом свидетельствует процентная доля выживших после тяжелой провокационной инфекции NDV, заражение которой осуществляли достаточно рано, а именно через две недели, после вакцинации вектором.
В то время, как ни одна из выживших кур не являлась невакцинированной (группа 1) или той, которой вводили только агонист (группа 2), и выжило только 20% вакцинированных вектором (группа 3), выживаемость вакцинированных вектором и агонистом являлась, преимущественно, более высокой с 30, 35 и даже 45% выживших после заражения (группы 4, 6 и 7). Наличие 20% выживших в группе, которой вводили агонист через 2 дня p.v. (группа 5), вероятно, является результатом вариабельности в исследовании. Через 8 дней p.v. агонист больше не мог усиливать иммунный ответ на экспрессируемый вектором гетерологичный антиген (группа 9).
Таким образом, агонист в отдельности не мог индуцировать иммунитет. Кроме того, в столь раннее время после вакцинации векторная вакцина в отдельности вызывала лишь умеренный иммунитет против антигена NDV-F. Однако при комбинированном введении вектора и агониста можно достигать раннего развития иммунитета, приводящего к более чем в два раза более высокой выживаемости после заражения.
Пример 5: Дополнительное тестирование активности агониста TLR21 птиц
в отношении иммунитета, индуцируемого вектором на основе герпесвируса птиц
in vivo
Осуществляли дополнительное исследование на курицах, по существу, аналогичное описанному в примере 4, но с некоторыми модификациями: основное различие состояло в том, что все вакцинации включали использование вектора на основе герпесвируса птиц и олигодезоксинуклеотида в одной инокуляции, и, таким образом, их вводили одновременно (день 0).
Другие отклонения от протокола примера 4 состояли в использовании другого агониста TLR21 птиц, X4-pent (SEQ ID NO:4) (EC50=430 пМ), и том, что этот агонист тестировали в трех различных количествах/дозу.
5.1. Результаты
Группа
Количество
Векторная вакцина
Количество X4-pent
% выживших через 2 недели p.v.
1
20
нет
нет
нет
2
20
HVT-F-VP2
нет
нет
3
20
HVT-F-VP2
0,1 мкг
45
4
20
HVT-F-VP2
1,0 мкг
20
5
20
HVT-F-VP2
20 мкг
20
5.2. Выводы
И вновь, добавление агониста TLR21 птиц демонстрировало значительное усиление иммунного ответа против гетерологичного антигена, экспрессируемого и доставляемого вектором на основе герпесвируса птиц: через две недели после вакцинации до 45% вакцинированных, которым вводили векторную вакцину и агонист (группа 3), были защищены от тяжелой провокационной инфекции NDV. В то же время ни одна из невакцинированных кур не была защищена (группа 1), и выжило только 10% вакцинированных, которым вводили только векторную вакцину (группа 2).
Причем более высокие количества агониста на дозу (1 или 20 мкг - группы 4 и 5) не улучшали усиление иммунитета, т.к. оба обеспечивали меньшее усиление иммунитета, чем наименьшее количество 0,1 мкг на дозу для животного (группа 3).