ПРОИЗВОДСТВО ОЛИГОСАХАРИДОВ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО МОЛОКА В МИКРООРГАНИЗМАХ-ХОЗЯЕВАХ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ ИМПОРТОМ/ЭКСПОРТОМ

1. Способ производства целевого олигосахарида генетически модифицированной клеткой микроорганизма-хозяина, включающий стадии, при которых
получают генетически модифицированную клетку микроорганизма-хозяина, которая:
содержит по меньшей мере одну рекомбинантную гликозилтрансферазу,
имеет модифицированную экспрессию или активность по меньшей мере одного эндогенного белка, осуществляющего экспорт сахара, так что экспрессия или активность белка, осуществляющего экспорт сахара, либо (i) повышена, либо (ii) понижена или инактивирована по сравнению с генетически не модифицированной клеткой-хозяином, так что (i) экспорт олигосахарида в среду либо снижен, либо отсутствует или (ii) транспорт целевого олигосахарида усилен, соответственно, по сравнению с генетически не модифицированной клеткой-хозяином,
культивируют клетку-хозяина в среде в условиях, обеспечивающих производство целевого олигосахарида, где целевой олигосахарид транспортируется в среду, и
получают целевой олигосахарид из среды.
2. Способ по п. 1 или 2, где олигосахарид представляет собой олигосахарид человеческого молока, содержащий в качестве основного трисахарида лакто-N-триозу II (LNT-II; GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc).
3. Способ по п. 1 или 2, где олигосахарид выбран из группы, состоящей из: лакто-N-триозы II, лакто-N-тетраозы, лакто-N-неотетраозы, лакто-N-фукопентаозы I, лакто-N-фукопентаозы II, лакто-N-фукопентаозы III, лакто-N-фукопентаозы V, лакто-N-дифукозилгексаозы I, лакто-N-дифукозилгексаозы II, лакто-N-сиалилпентаозы LSTa, LSTb, LSTc, дисиалиллакто-N-тетраозы, дисиалиллакто-N-неотетраозы.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клетка-хозяин
содержит по меньшей мере одну гомологичную или гетерологичную нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок, обеспечивающий экспорт целевого олигосахарида в культуральную среду, где указанная клетка-хозяин была модифицирована таким образом, что гомологичная или гетерологичная нуклеиновокислотная последовательность сверхэкспрессируется; и/или
имеет делецию, разрушение, уменьшение экспрессии или инактивацию по меньшей мере одной эндогенной нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей белок экспортер, который осуществляет экспорт предшественников целевого олигосахарида из клетки-хозяина; и/или
имеет сверхэкспрессию по меньшей мере одной гомологичной или гетерологичной последовательности, кодирующей белок, опосредующий импорт предшественника целевого олигосахарида в указанную клетку-хозяина, где предшественник крупнее дисахарида.
5. Способ по п. 4, в котором указанный белок, обеспечивающий экспорт целевого олигосахарида, относится к классу вторичных активных переносчиков.
6. Способ по любому из пп. 4 или 5, где указанный белок, обеспечивающий экспорт целевого олигосахарида, осуществляет экспорт олигосахарида, содержащего в качестве основного трисахарида по меньшей мере три группировки, предпочтительно, лакто-N-триозу II (LNT-II; GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc).
7. Способ по любому из пп. 4-6, где указанная по меньшей мере одна нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая белок, обеспечивающий экспорт целевого олигосахарида, представляет собой эндогенную или рекомбинантную нуклеиновую кислоту.
8. Способ по любому из пп. 4-7, где указанная нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая белок, обеспечивающий экспорт целевого олигосахарида, происходит из бактерии, архебактерии, растения, дрожжей или животного.
9. Способ по любому из пп. 4-7, где указанная по меньшей мере одна нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая белок, обеспечивающий экспорт целевого олигосахарида, представляет собой ген, выбранный из группы, состоящей из yebQ и yjhB из Escherichia coli, proP из Mannheimia succiniciproducens и setA из Cedecea neteri или их функциональных фрагментов.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где указанная рекомбинантная гликозилтрансфераза выбрана из по меньшей мере одного из следующего: галактозилтрансферазы, сиалилтрансферазы, N-ацетилглюкозаминилтрансферазы и фукозилтрансферазы, и предпочтительно, выбрана из по меньшей мере одного из следующего: β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, β-1,3-галактозилтрансферазы, β-1,4-галактозилтрансферазы, β-1,6-галактозилтрансферазы, α-2,3-сиалилтрансферазы, α-2,6-сиалилтрансферазы, α-1,2-фукозилтрансферазы или α-1,3-фукозилтрансферазы.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клетка-хозяин содержит в качестве гликозилтрансфераз: (i) β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу и (ii) β-1,3-галактозилтрансферазу или β-1,4-галактозилтрансферазу.
12. Способ по любому из пп. 10 или 11, где указанная β-1,3-N-ацетилглкозаминилтрансфераза относится к классу IgtA из Neisseria meningitides или PmnagT из Pasteurella multocida, или их вариантам.
13. Способ по любому из пп. 11 или 12, где β-1,3-галактозилтрансфераза, образующая лакто-N-тетраозу, представляет собой WbdO или ее функциональный вариант.
14. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором, где применимо, в генетически модифицированной клетке-хозяине осуществлена инактивация или делеция эндогенных генов β-галактозидазы и глюкозамин-6-фосфат-дезаминазы и где указанная генетически модифицированная клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую функциональный белок лактозопермеазы.
15. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором генетически модифицированная клетка-хозяин обладает повышенной способностью продуцировать УДФ-N-ацетилглюкозамин и УДФ-галактозу или ГДФ-фукозу или ЦМФ-N-ацетилнейраминовую кислоту по сравнению с генетически не модифицированной клеткой-хозяином, где предпочтительно указанная повышенная способность продуцировать УДФ-N-ацетилглюкозамин и УДФ-галактозу включает сверхэкспрессию одного или более чем одного гена, кодирующего белки, обладающие активностью: L-глутамин:D-фруктозо-6-фосфат-аминотрансферазы, N-ацетилглюкозамин-1-фосфатуридилтрансферазы/глюкозамин-1-фосфатацетилтрансферазы, фосфоглюкозаминмутазы, UDP-галактозо-4-эпимеразы, фосфоглюкомутазы, глюкозо-1-фосфатуридилилтрансферазы.
16. Способ по любому из пп. 14 или 15, где указанную генетически модифицированную клетку-хозяина культивируют в присутствии глюкозы, сахарозы, глицерина или их комбинации, но не при добавлении или не в присутствии N-ацетилглюкозамина или галактозы или их комбинации.
17. Способ по любому из предшествующих пунктов, где целевой олигосахарид представляет собой лакто-N-триозу II, которая образуется в результате полной ферментации из простого источника углерода в клетке-хозяине под действием экспрессируемых гетерологичных гликозилтрансфераз β-1,4-галактозилтрансферазы и β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы.
18. Генетически модифицированная клетка микроорганизма-хозяина для производства целевого олигосахарида, где олигосахарид в качестве основного трисахарида содержит лакто-N-триозу II (LNT-II; GlcNAc(β1-3)Gal(β1-4)Gluc), где клетка-хозяин:
содержит по меньшей мере одну рекомбинантную гликозилтрансферазу, предпочтительно, гликозилтрансфераза выбрана из галактозилтрансферазы, сиалилтрансферазы и N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, и
имеет модифицированную экспрессию или активность по меньшей мере одного эндогенного белка, транспортирующего сахар, так что экспрессия или активность эндогенного белка, транспортирующего сахар, функционально инактивирована в плане экспорта предшественника целевого олигосахарида.
19. Клетка микроорганизма-хозяина по п. 18, содержащая в качестве гликозилтрансфераз (i) гетерологичную экспрессируемую β-1,3-N-ацетилглюкозаминилтрансферазу и (ii) гетерологичную экспрессируемую β-1,3-галактозилтрансферазу или гетерологичную экспрессируемую β-1,4-галактозилтрансферазу.
20. Клетка микроорганизма-хозяина по п. 18 или 19, дополнительно
содержащая по меньшей мере одну гомологичную или гетерологичную нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок, обеспечивающий экспорт олигосахарида в культуральную среду, в которой культивируют клетку-хозяина, где указанный белок, обеспечивающий экспорт целевого олигосахарида, относится к классу вторичных активных переносчиков, и где указанная гомологичная или гетерологичная нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая белок, обеспечивающий экспорт целевого олигосахарида, сверхэкспрессируется или находится под контролем последовательности промотора, обеспечивающей сверхэкспрессию указанной нуклеиновокислотной последовательности; и/или
имеющая делецию, разрушение, уменьшение экспрессии или инактивацию по меньшей мере одной эндогенной нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей белок экспортер, который осуществляет экспорт предшественников целевого олигосахарида из клетки-хозяина; и/или
имеющая сверхэкспрессию по меньшей мере одной гомологичной или гетерологичной нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей белок, опосредующий импорт предшественника целевого олигосахарида в указанную клетку-хозяина, где предшественник крупнее дисахарида.
21. Клетка микроорганизма-хозяина по п. 20, где указанная нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая белок, обеспечивающий экспорт целевого олигосахарида, происходит из бактерии, архебактерии, растения, дрожжей или животного.
22. Клетка микроорганизма-хозяина по п. 20 или 21, где указанная по меньшей мере одна нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая белок, обеспечивающий экспорт целевого олигосахарида, представляет собой эндогенную или рекомбинантную нуклеиновокислотную последовательность.
23. Клетка микроорганизма-хозяина по любому из пп. 20-22, где указанная по меньшей мере одна нуклеиновокислотная последовательность, кодирующая белок, обеспечивающий экспорт целевого олигосахарида, представляет собой ген, выбранный из группы, состоящей из yebQ и yjhB из Escherichia coli, proP из Mannheimia succiniciproducens и setA из Cedecea neteri или их функциональных фрагментов, а целевой олигосахарид предпочтительно представляет собой лакто-N-триозу II.
24. Клетка микроорганизма-хозяина по любому из пп. 21-23, где целевой олигосахарид представляет собой лакто-N-тетраозу, предшественник представляет собой лакто-N-триозу II, и где у клетки-хозяина осуществлена делеция, разрушение или инактивация по меньшей мере одной нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей белок экспортер, способный осуществлять экспорт лакто-N-триозы II из клетки-хозяина, предпочтительно, белок, обеспечивающий экспорт лакто-N-тетраозы, выбран из YebQ из Escherichia coli BL21(DE3), SpoVB из Bacillus amyloliquefaciens, YabM из Erwinia pyrilfolia, Bcr из E. coli MG1655, YdeA из E. coli MG1655, ProP2 из Haemophilus parainfluenzae, SetA из Pectobacterium carotovorum, FucP из E. coli MG1655, MdeA из Staphylococcus aureus Bmb9393, ImrA из Lactococcus lactis, SetA из Pseudomonas sp. MT-1 и SetA из Beauveria bassiana D1-5.