Использование магнитных наночастиц оксида железа сферической и кубической форм для доставки доксорубицина в клетки линии карциномы молочной железы мыши 4Т1

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МАГНИТНЫХ НАНОЧАСТИЦ ОКСИДА ЖЕЛЕЗА СФЕРИЧЕСКОЙ И КУБИЧЕСКОЙ ФОРМ ДЛЯ ДОСТАВКИ ДОКСОРУБИЦИНА В КЛЕТКИ ЛИНИИ КАРЦИНОМЫ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ МЫШИ 4Т1

Т. Р. Низамов1 А. С. Гаранина1,2, В. И. Уварова1,2, В. А. Науменко1, И. В. Щетинин3, А. Г. Савченко1

1 Лаборатория биомедицинских наноматериалов, Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС», Москва

2 Лаборатория тканеспецифических лигандов, Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Москва

3 Кафедра физического материаловедения, Национальный исследовательский технологический университет «МИСиС», Москва

4 Российский химико-технологический университет имени Д. И. Менделеева, Москва

Магнитные наночастицы (МНЧ) все больше привлекают внимание в качестве перспективного материала для разработки эффективных систем противоопухолевой терапии и диагностики. Целью работы было исследование влияния формы магнитного ядра наночастиц (НЧ) оксида железа на эффективность доставки доксорубицина в клетки линии 4T1. Наночастицы сферической (СНЧ) и кубической (КНЧ) форм синтезировали методом термического разложения олеата железа (III), что позволило эффективно контролировать их форму и размер. Затем НЧ гидрофилизировали посредством использования Pluronic F-127. В полученные средства доставки загружали доксорубицин в среде натрий-фосфатного буфера. Загрузка составила 15,22% для СНЧ и 15,44% для КНЧ. IC50 для незагруженного доксорубицина оказалась равной 1 мкМ, в то время как для СНЧ и КНЧ с препаратом — 6,4 мкМ и 5,5 мкМ соответственно. В протестированном диапазоне концентраций от 1,77 мг/л до 227,2 мг/л цитотоксичность у НЧ без препарата не выявлена. Согласно данным динамики накопления доксорубицина, в клетках 4T1 активнее всего идет накопление свободного препарата — он локализуется в клеточном ядре. В то же время доксорубицин, загруженный в НЧ, накапливается менее интенсивно и первоначально локализуется в везикулах вокруг ядра, обнаруживаясь в самом ядре лишь после 2 ч совместной инкубации. Противоопухолевый препарат, загруженный в КНЧ, несколько более активно доставляется на ранних сроках инкубации с клетками по сравнению со СНЧ, однако данная разница не существенна.

Ключевые слова: наночастицы оксида железа, форма наночастиц, цитотоксичность, адресная доставка, доксорубицин

Финансирование: работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ, соглашение № 14.578.21.0201 (уникальный идентификатор RFMEFI57816X0201).

Сх] Для корреспонденции: Тимур Радикович Низамов

Ленинский пр-т, д. 4, г Москва, 119049; nizamov.timur@gmail.com

Статья получена: 28.08.2018 Статья принята к печати: 20.09.2018

DOI: 10.24075/vrgmu.2018.085

THE USE OF IRON OXIDE MAGNETIC NANOSPHERES AND NANOCUBES FOR TARGETED DOXORUBICIN DELIVERY INTO 4T1 MOUSE BREAST CARCINOMA CELLS

Nizamov TR1 H, Garanina AS1,2, Uvarova VI1,2, Naumenko VA1, Schetinin IV3, Savchenko AG1

1 Laboratory of Biomedical Nanomaterials, National University of Science and Technology MISiS, Moscow

2 Laboratory of Tissue-Specific Ligands, Faculty of Chemistry, Lomonosov Moscow State University, Moscow

3 Department of Physical Materials Science, National University of Science and Technology MISiS, Moscow

4 D. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow

Magnetic nanoparticles (MNP) are attracting increasing attention as promising materials for the treatment and diagnosis of cancer. The aim of this work was to explore the effect of the magnetic core shape of iron oxide nanoparticles (NP) on the efficacy of doxorubicin delivery into 4T1 cells. Nanospheres (NS) and nanocubes (NC) were synthesized by thermal decomposition of iron (III) oleate. This method of synthesis enables control over the NP shape and size. The NP were hydrophilized using Pluronic F-127. The obtained particles were doped with doxorubicin in a sodium phosphate buffer. The weight fractions of doxorubicin in the NS and NC were 15.22% and 15.44%, respectively. The IC50 of free doxorubicin was 1 pM. The IC50 of doxorubicin-loaded NS and NC were 6.4 pM and 5.5 pM, respectively. Unloaded NP did not exhibit any toxicity towards the cells at a studied range of concentrations between 1.77 mg/l and 227.2 mg/l. Free doxorubicin demonstrated more vigorous accumulation dynamics in 4T1 cells with a tendency to localize in cell nucleus, whereas doxorubicin loaded onto iron oxide NP was mainly accumulated in the vesicles surrounding the nucleus and was able to enter it only after being incubated with the cells for 2 h. We conclude that doxorubicin loaded onto cubic-shaped NP is delivered into the cell nucleus a little bit more effectively at early incubation stages in comparison with nanospheres, but the difference is insignificant. Keywords: iron oxide nanoparticles, nanoparticle shape, cytotoxicity, drug delivery, doxorubicin Funding: this work was supported by the Project 14.578.21.0201 (ID RFMEFI57816X0201).

Correspondence should be addressed: Timur R. Nizamov Leninsky prospect 4, Moscow, 119049; nizamov.timur@gmail.com

Received: 28.08.2018 Accepted: 20.09.2018

DOI: 10.24075/brsmu.2018.085

Магнитные наночастицы (МНЧ), и НЧ оксида железа в частности, в последнее время привлекают все больше внимания в качестве перспективного материала для разработки эффективных систем противоопухолевой терапии и диагностики. Это связано с тем, что современный уровень развития науки и технологий позволяет синтезировать МНЧ с заранее заданными функциональными свойствами, а также контролируемо химически модифицировать их поверхность для последующей адресной доставки лекарств и МРТ-диагностики [1-5]. Благодаря хорошим контрастным свойствам МНЧ средства доставки лекарств на их основе могут использоваться для исследования процессов распределения лекарственных препаратов в ткани-мишени в реальном времени, а также для оценки эффективности терапии [6]. Прочие средства доставки, такие как полимерные НЧ, липосомы, мицеллы и др., не проявляют контрастные свойства, что исключает их применение для исследования распределения in vivo. В то же время и у самих МНЧ есть целый ряд недостатков: токсичность, невысокая агрегационная стабильность и, как правило, низкая способность к образованию стабильных ковалентных связей с модификаторами поверхности. Для снижения токсичности и повышения агрегативной стабильности поверхность НЧ покрывают биосовместимой полимерной оболочкой. Применением такого подхода можно добиться высоких контрастных свойств наряду с хорошей агрегативной стабильностью, низкой токсичностью и возможностью иммобилизировать на поверхности этих НЧ необходимые компоненты: лиганды, лекарственные средства, векторы и др. Отдельно следует отметить новый перспективный метод получения средств доставки на основе МНЧ, в котором сначала НЧ оксида железа синтезируют методом термического разложения олеата железа (III) в присутствии стабилизатора (олеиновой кислоты) в среде, а затем выполняют фазовый перенос полученных НЧ в воду посредством Pluronic F-127 — блок-сополимера полиэтиленгликоля с полипропиленгликолем, обладающего поверхностно-активными свойствами. В образовавшейся полимерной оболочке присутствуют гидрофобные сайты, которые можно использовать для доставки гидрофобных лекарств [7-9].

Еще одним важным фактором, влияющим на взаимодействие средства доставки с биологическими системами наряду с химическим составом ядра и состоянием поверхности НЧ, является ее геометрия. Имеющиеся противоречивые данные по поглощению и цитотоксичности ряда наноматериалов показывают, что влияние формы НЧ на их поведение в живых организмах заранее предсказать трудно. Так, в одном исследовании было продемонстрировано большее повреждение ДНК углеродными нанотрубками по сравнению с менее токсичными НЧ сажи сферической формы на первичных фибробластах эмбриона мыши [10]. Авторы предположили, что данный эффект был вызван удлиненной формой нанотрубок с аспект-фактором (соотношением длины к ширине), равным 625. В другой работе наностержни оксида цинка с аспект-фактором 3 оказались менее токсичными, чем наносферы из того же материала, по отношению к клеткам остеосаркомы человека (MG-63) [11]. Еще в одной из работ был показан некоторый рост цитотоксичности и случаев захвата частиц клетками наряду с ростом аспект-фактора НЧ оксида кремния на клетках меланомы человека A375 [12]. Изучались также влияние формы НЧ серебра на рост дрожжей S. cerevisiae и интенсивность их захвата клетками [13]. Серебряные нанопластины оказались более

токсичными, чем наносферы, нанокубы и наностержни. Авторы предположили, что описанный эффект был обусловлен преобладанием на поверхности нанопластин химически более активных {111} граней, увеличивающих их цитостатическое воздействие на клетки дрожжей. В следующей работе у золотых наносфер — по сравнению с наностержнями золота — были выявлены более активное поглощение НЧ и высокая токсичность по отношению к эпителиальным клеткам MDCK II [14]. В то же время нет данных о влиянии формы МНЧ, в частности оксида железа, на клетки и адресную доставку лекарств.

Доксорубицин является широко известным препаратом для лечения рака с антипролиферативным действием. Он активно используется в клинической практике уже более 40 лет. Однако его применение ограничено низкой селективностью и высокой токсичностью по отношению к неопухолевым клеткам организма. К примеру, наиболее опасными побочными эффектами препарата являются кардиомиопатия и сердечная недостаточность [15]. Таким образом, существует необходимость разработки новых средств доставки препарата, которые помогли бы устранить вышеописанные недостатки. Одним из решений данной проблемы может явиться использование средств доставки лекарств на основе уже упоминавшегося Pluronic F-127 [9]. Доксорубицин способен адсорбироваться на поверхности НЧ, стабилизированных поверхностно-активными веществами, благодаря наличию у них гидрофобных сайтов и далее высвобождаться вследствие механического воздействия на МНЧ, вызванного броуновской релаксацией во внешнем магнитном поле или в кислой среде лизосом после захвата НЧ клетками [16].

В настоящей работе выполнено исследование влияния сферической и кубической форм НЧ оксида железа, модифицированных Pluronic F-127 и загруженных доксорубицином, на взаимодействие с клетками линии 4T1 (карцинома молочной железы мыши), а именно: цитотоксичность МНЧ, эффективность доставки лекарственного препарата в указанные опухолевые клетки и его распределение внутри них.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Pluronic F-127 (Sigma Aldrich; США), деионизированная вода, толуол, хч (Компонент-реактив; Россия), хлорид железа (III), 97% (Sigma Aldrich; США), олеиновая кислота, >99% (Roth; Германия), олеат натрия, 95% (Roth; Германия), соляная кислота, хч (СигмаТек; Россия), феррозин, > 97% (Sigma Aldrich; США), ацетат аммония,

> 98% (Sigma Aldrich; США), аскорбиновая кислота, >99% (Sigma Aldrich; США), доксорубицина гидрохлорид,

> 98% (Glentham; Великобритания), таблетки натрий-фосфатного буфера, Biotechnology Grade (Amresco; США,), изопропанол, хч (СигмаТек; Россия), 1-октадецен, > 95% (Sigma Aldrich; США), этанол, > 95% (Sigma Aldrich; США), гексан, хч (СигмаТек; Россия), MTS (Promega; США), диметилсульфоксид, > 99% (Sigma Aldrich; США), стандарт ICP по железу (Sigma Aldrich; США).

Получение средств доставки лекарств и загрузка доксорубицина

Получение сферических и кубических наночастиц

Сферические НЧ получали высокотемпературным термическим разложением олеата железа в соответствии

(с минимальными изменениями) с ранее описанным методом [17, 18]. 100 ммоль олеата натрия и 33 ммоль безводного хлорида железа (III) растворяли в смеси 66,7 мл этанола, 50 мл воды и 116 мл гексана при интенсивном перемешивании. Полученный раствор нагревали до 70 °C и продолжали перемешивание в этих условиях в течение 4 ч. Затем отделяли органическую фазу и выпаривали растворитель на роторном испарителе до получения коричневого воскоподобного комплекса олеата железа (III). 2,2 ммоль полученного олеата железа и 12 ммоль олеиновой кислоты растворяли в 10 мл 1-октадецена. Затем смесь нагревали до 320 °C в атмосфере аргона при интенсивном перемешивании. Скорость нагрева составляла 3,3 °С/мин. Систему выдерживали при температуре 320 °С 60 мин, после чего ее охлаждали до комнатной температуры и далее разбавляли в пять раз изопропанолом. Наночастицы собирали неодимовым магнитом и три раза промывали изопропанолом. Осадок редиспергировали в толуоле путем обработки ультразвуком.

Кубические НЧ синтезировали методом (с минимальными изменениями) высокотемпературного термического разложения олеата железа (III) [19]. 33 мл раствора, содержащего 4 ммоль комплекса олеата железа, 1,3 ммоль олеата натрия и 1,3 ммоль олеиновой кислоты, помещали в трехгорлую колбу с обратным холодильником на 100 мл. Далее систему грели при 140 °С в течение 60 мин для удаления следов воды, затем нагревали со скоростью 4 °С/мин до температуры кипения и выдержали при данной температуре в течение 30 мин. Все процедуры выполняли в атмосфере аргона. Полученный раствор охлаждали до комнатной температуры и выделяли НЧ путем разбавления раствора 320 мл изопропанола и последующей магнитной декантации. Продукт трижды промывали изопропанолом и редиспергировали в толуоле.

Приготовление феррозинового теста

Фазовый перенос наночастиц в воду с помощью Pluronic F-127

Фазовый перенос полученных НЧ оксида железа в воду выполняли с помощью неионного поверхностно-активного вещества Р!игоп1о Р-127 по описанной методике (с некоторыми изменениями) [20, 21]. 15 мл раствора НЧ в толуоле с концентрацией по оксиду железа 1 мг/мл смешивали с таким же объемом раствора Р!игоп1о Р-127 с концентрацией С = 25 мг/мл в воде. Систему интенсивно перемешивали в течение ночи. Полученную эмульсию разделяли путем центрифугирования при малой скорости вращения (1000 д) и собирали водную фазу. Затем водную фазу снова центрифугировали при большой скорости вращения (12 000 д) для осаждения НЧ магнетита. Наконец, осадок повторно диспергировали в деионизированной воде при интенсивной обработке ультразвуком. Раствор разбавляли до С = 0,32 мг/мл по оксиду железа.

Загрузка доксорубицина в наночастицы оксида железа, покрытые Pluronic F-127

0,2 мл водного раствора доксорубицина с концентрацией 5 мг/мл и 0,2 мл натрий-фосфатного буфера, концентрированного в пять раз относительно изотонического, с рН = 7,4, добавляли к 10 мл полученного водного раствора НЧ и перемешивали на магнитной мешалке в течение суток при комнатной температуре. Общая концентрация доксорубицина в растворе с НЧ после добавления Собщ(докс) = 96,0 мг/л. Затем раствор центрифугировали до осаждения всех НЧ. Собранные НЧ редиспергировали в натрий-фосфатном буфере при энергичном перемешивании на шейкере.

Определение характеристик полученных магнитных наночастиц

385,4 мг ацетата аммония, 3,2 мг феррозина и 352,2 мг аскорбиновой кислоты взвесили и растворили в 1 мл деионизированной воды. Полученный раствор в дальнейшем использовали для спектрофотометрического измерения концентрации железа.

• »

*Лг

10 11 12 13 14 15 16 17 18 Диаметр

1Б f ^ 18 нм

10 100 Размер

100 нм

Просвечивающая электронная микроскопия

Морфологию и размер частиц оценивали с использованием 200 киловаттного просвечивающего электронного микроскопа иЕ01_ иЕМ-2100Р дЕ01_; Япония), ток 0,8 А.

2А

Aw

12 13 14 1

Диаметр

МЩЦт. Л;д v

„^21 нм I k^ ^i/*

2Б 21 нм t 1 \

10 100 Размер

нм

Рис. 1. Микрофотографии полученных образцов СНЧ (1) и КНЧ (2) оксида железа. Представлены также гистограммы распределения по размерам и их средний гидродинамический размер

1

20

5

0

1000

Образцы готовили путем нанесения 1-2 мкл раствора на медную сетку (d = 3,05 мм), покрытую формваром, и высушивания на воздухе.

Фотонная корреляционная спектроскопия

Гидродинамический диаметр НЧ и их дзета-потенциал измеряли с помощью оборудования Zetasizer Nano ZS (Malvern; Германия). Объем измеренного раствора НЧ варьировался от 1 до 2 мл.

Вибромагнетометрия

Измерение магнитных свойств проводили с использованием системы измерения физических свойств Quantum Design (PPMS, Германия) с вибрирующим образцовым магнитометром. Условия измерения были следующими: от -30 до 30 кЭ. Диапазон измерения: амплитуда колебаний — 2 мм; частота — 40 Гц; чувствительность прибора — 10-6 э.м.е.

Рентгеноструктурный анализ

Кристаллическую структуру МНЧ исследовали с помощью дифрактометра ДРОН-4 (ЛНПО «Буревестник»; Россия) от 20° до 120° из диапазона углов дифракции 20 с шагом 0,1° и трехсекундным временем экспозиции (излучение CoKa при \ = 0,179 нм, напряжение — 40 кВ, ток — 30 мА).

Спектрофотометрия

1. Измерение концентрации доксорубицина и его загрузки в средства доставки. 600 мкл раствора доксорубицина добавляли в две лунки 96-луночного планшета (по 300 мкл на лунку). Поглощение раствора измеряли при \ = 495 нм на спектрофотометре Multiskan GO (Thermo Scientific; США). Концентрацию рассчитывали по построенной калибровочной кривой доксорубицина с точками 1,0; 2,5; 5,0; 10,0; 25,0; 50 мкг/мл. Загрузку доксорубицина рассчитывали путем измерения остаточной концентрации препарата в супернатанте (Сост(докс)) после центрифугирования, которую вычитывали из исходной концентрации Собщ(докс) в растворе. Далее массовую загрузку рассчитывали по формуле и = 100% • С (докс)/(С (докс) + С(НЧ)), где

Сзаг(докс) — концентрация загруженного доксорубицина в мг/л; С(НЧ) — концентрация НЧ, равная 308 мг/л.

2. Измерение концентрации железа. Из стандарта ICP по железу готовили серию растворов с концентрациями 0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1; 1,5; 2 мг/мл. 100 мкл образца с неизвестной концентрацией железа растворяли в 400 мкл концентрированной соляной кислоты в течение 2 ч. Далее раствор разбавляли в 100 раз деионизированной водой и 400 мкл полученного раствора смешивали с 200 мкл деионизированной воды и 40 мкл феррозинового теста. Через 5 мин по 300 мкл полученного раствора помещали в две лунки 96-луночного планшета и измеряли поглощение при \ = 560 нм на спектрофотометре Thermo Scientific Multiskan GO в режиме фотометрии. По данным поглощения определяли концентрацию железа.

Культивирование клеток

Клетки линии 4T1 (ATCC CRL-2539™, США) карциномы молочной железы мыши культивировали в среде RPMI-1640 (Gibco) с 2 мМ L-глутамина (Gibco) и 10%-й фетальной бычьей сывороткой (Gibco) при 37 °C и 5% CO2.

Исследование цитотоксичности МТS-тестом

Клетки высаживали в лунки 96-луночного планшета (1215 тыс./лунка) за 24 ч до внесения частиц. Загруженные и не загруженные лекарственным препаратом наночастицы, а также свободный доксорубицин разводили в натрий-фосфатном буфере и добавляли в культуральную среду с клетками в различных концентрациях. В качестве отрицательного контроля в лунки добавляли натрий-фосфатный буфер. В качестве положительного контроля в среду культивирования вносили диметилсульфоксид из расчета 20 мкл реагента на 100 мкл среды. После 48 ч инкубации в термостате с тестируемыми НЧ и контрольными веществами при 37 °С и 5% CO2 количество жизнеспособных клеток в каждой из лунок определяли с использованием раствора MTS. Для этого культуральную среду из лунок заменяли на раствор MTS в свежей среде из расчета 20 мкл MTS на 100 мкл среды и инкубировали 4 ч в темноте при 37 °C и 5% CO2. Затем планшеты устанавливали на 5 мин. на постоянный магнит, из каждой лунки отбирали полученный раствор и помещали

6000

4000

2000

0

20

40

60 80 2G

Рис. 2. Данные рентгеноструктурного анализа для образцов СНЧ

100

120

его в новый планшет для предотвращения попадания в исследуемую смесь НЧ. Данные оптической плотности итогового раствора снимали на спектрофотометре при \ = 490 нм. Построение гистограмм выживаемости клеток и вычисление величин стандартного отклонения проводили в программе Microsoft Office Excel 2007.

Исследование динамики накопления свободного и загруженного в наночастицы доксорубицина в клетках

Клетки сажали на стекла в чашках Петри в концентрации 120-150 тыс./чашка. Через 24 ч в культуральную среду с клетками вносили свободный доксорубицин либо доксорубицин, загруженный в СНЧ или КНЧ, в концентрации 50 мкг/мл (по доксорубицину). В качестве контроля использовали клетки, инкубировавшиеся в среде. Через 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч и 24 ч после со-культивирования с исследуемыми образцами клетки фиксировали 3,7% формалином в натрий-фосфатном буфере (pH 7,2-7,4; Gibco) в течение 15 мин. Полученные препараты анализировали на флуоресцентном микроскопе EVOS с объективом LplanFL PH2 x60 (Life technologies; США). Обработку полученных изображений и измерение интенсивности флуоресценции проводили в программе ImageJ 1.52а (Wayne Rasband (NIH); США). Для статистического анализа данных использовали однофакторный ANOVA-тест. Значения р < 0,05 считали статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Полученные методом термического разложения НЧ оксида железа исследовали с помощью ПЭМ (рис. 1). Согласно гистограмме распределения размеров, средний размер НЧ магнетита, полученных по методике для СНЧ, оказался равным 15 нм (рис. 1-1А). Синтезированные НЧ ожидаемо получились сферической формы. По данным измерения гидродинамического размера, средний размер СНЧ в толуоле составил около 18 нм (рис. 1-1Б).

Образцы, синтезированные по протоколу получения кубических НЧ, также охарактеризовали с использованием ПЭМ (рис. 1-2). В этом случае средний размер НЧ магнетита оказался равным 16 нм (рис. 1-2А). Синтезированные НЧ, как и ожидалось, оказались кубической формы. Средний

гидродинамический размер КНЧ составил около 21 нм (рис. 1-2Б).

По данным РСА, положение пиков и их интенсивность указывают на наличие у СНЧ структуры обратной шпинели, характерной для магнетита (рис. 2-1). Аналогичная структура и у КНЧ (рис. 2-2). Более полные данные указаны в таблице.

По данным измерения магнитных свойств полученных образцов, у СНЧ намагниченность насыщения Ms составила 50,5 э.м.е./г, а коэрцитивная сила Нс = 20,5 Э (рис. 3-1). Сопоставимые магнитные свойства и у КНЧ: намагниченность насыщения — 60,5 э.м.е./г; коэрцитивная сила — 20,0 Э (рис. 3-2).

Средний гидродинамический диаметр НЧ после фазового переноса из толуола в воду с использованием Р1игопю Р-127 вырос до 43 нм для СНЧ (рис. 4-1) и до 50 нм для КНЧ (рис. 4-2), а дзета-потенциал для них соответственно составил -10 мВ и -15,1 мВ. После процедуры загрузки доксорубицина средний размер СНЧ составил около 68 нм (рис. 4-3), а дзета-потенциал стал положительным — +21,1 мВ. Аналогичная ситуация наблюдалась и в случае КНЧ: гидродинамический диаметр в среднем стал равным 78 нм (рис. 4-4), а дзета-потенциал — +22,0 мВ. Расчет загрузки доксорубицина для СНЧ: концентрация препарата в супернатанте Сост(докс) составила 40,7 мг/л, следовательно Сзаг(докс) = Собщ(докс) -Сост(докс) = 96,0 - 40,7=55,3 мг/л. Тогда загрузка по массе ш(СНЧ) = 100% • Сзаг(докс)/(Сзаг(докс) + С(НЧ)) = 100% • 55,3/ (55,3 + 308) = 15,22%. Расчет загрузки доксорубицина для КНЧ: Сст(докс) = 39,2 мг/л, тогда С^докс) = С^окс) -Сост(докс) = 96,0 - 39,2 = 56,2 мг/л. В этом случае загрузка помассе ы(КНЧ) = 100% • Сзаг(докс)/(Сзаг(докс) + С(НЧ)) = 100% • 56,2/(56,2 + 308) = 15,44% для КНЧ.

В ходе исследования выявили, что как СНЧ, так и КНЧ не оказывают токсического влияния на клетки линии 4Т1 во всем диапазоне тестируемых концентраций (рис. 5А). Инкубация клеток с аналогичными концентрациями СНЧ и КНЧ, загруженных доксорубицином, привела к снижению количества жизнеспособных клеток в популяции. 1С50 (концентрация, при которой наблюдается 50% смертность клеток) для КНЧ с доксорубицином (КНЧ-Докс) составила 21 мг/л по оксиду железа и 5,5 мкМ по доксорубицину. Для СНЧ с доксорубицином (СНЧ-Докс) — 25 мг/л и 6,4 мкМ соответственно. 1С50 чистого доксорубицина составила порядка 1 мкМ (рис. 5Б). Следовательно, загруженные

Рис. 3. Кривая намагничивания образцов СНЧ

доксорубицином КНЧ оказали несколько более выраженное противоопухолевое действие, чем СНЧ-Докс. Однако эта разница несущественна. Наибольшую гибель клеток вызвал свободный доксорубицин.

Исследование динамики накопления свободного доксорубицина в клетках, а также загруженного на КНЧ и СНЧ, выявило, что уже через 15 мин совместной инкубации в клетках обнаруживался небольшой сигнал флуоресценции доксорубицина. Через 30 мин со-культивирования интенсивность флуоресценции свободного противоопухолевого препарата в клетках становилась сопоставима с таковой от доксорубицина, доставленного в клетки посредством КНЧ. Однако свободный Докс накапливался преимущественно в ядрах клеток, в то время как доксорубицин, загруженный на КНЧ, визуализировался в везикулах, располагающихся в околоядерной области (рис. 6А, Г, Л). Интенсивность флуоресценции в клетках доксорубицина, доставленного с помощью СНЧ, была достоверно ниже, чем от КНЧ-Докс и Докс (рис. 6Ж). Данная тенденция сохранялась и после 45 мин совместной инкубации клеток линии 4Т1 со свободным и загруженным в НЧ противоопухолевым препаратом. Впоследствии интенсивность флуоресценции доксорубицина, доставленного в клетки на КНЧ или СНЧ, существенно не отличалась. Однако накопление свободного доксорубицина было значительно более выраженным, чем загруженного на НЧ. Стоит также отметить, что противоопухолевый препарат обнаруживался преимущественно в ядрах клеток только лишь после 2 ч совместной инкубации клеток с КНЧ-Докс и СНЧ-Докс. Таким образом, мы показали, что эффективность проникновения свободного доксорубицина в клетки выше, чем препарата, загруженного в НЧ. Также было установлено, что КНЧ активнее проникают в клетки по сравнению со СНЧ. Однако впоследствии эта разница становится менее выраженной.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Синтез МНЧ методом высокотемпературного разложения олеата железа (III) позволяет получать в препаративных количествах стабильные золи монодисперсных НЧ оксида железа контролируемых размера и формы: сферической [17, 18], кубической [19] и др. [22]. При этом исходный комплекс олеата железа (III) разлагается при высокой

температуре в процессе синтеза, а сам комплекс частично восстанавливается компонентами среды до Fe (II) с образованием НЧ оксида железа переменного состава между магнетитом (Fe3O4) и маггемитом (y-Fe2O3). Оба оксида железа обладают ферримагнитными свойствами. Конечный размер и форма НЧ определяются наличием в реакционной среде стабилизаторов, таких как олеиновая кислота и олеат натрия. Они способны выборочно адсорбироваться на гранях {111} растущих НЧ и определять их конечную геометрию. Также из-за адсорбции этих стабилизаторов поверхность синтезированных НЧ оказывается гидрофобной, что является принципиально важным для последующего создания средств доставки гидрофобных лекарств, подобных доксорубицину.

В ходе работы получены образцы кубической и сферической форм, стабилизированные Pluronic F-127 (рис. 1). Согласно результатам структурных (рис. 2) и магнитных исследований (рис. 3), данные образцы представляют собой оксид железа со структурой обратной шпинели. Из-за несовпадения размеров НЧ по данным ПЭМ с областью когерентного рассеяния (ОКР) можно сделать вывод, что образцы получились поликристалличными (табл. 1). Коэрцитивная сила у обоих образцов >0, следовательно, они являются ферримагнетиками.

Полученные образцы стабильны как в гидрофобной среде (рис. 1-1 Б, рис. 1-2Б), так и после фазового переноса в воду с Pluronic F-127 (рис. 4-1, рис. 4-2). Специфика этого процесса заключается в том, что в структуре данного полимера присутствует гидрофобный сайт полипропиленгликоля, благодаря которому он адсорбируется на гидрофобной поверхности НЧ, и два гидрофильных терминальных участка полиэтиленгликоля, которые оказываются расположенными «снаружи» после адсорбции. В итоге у НЧ после переноса в воду имеются гидрофобные сайты, куда можно загружать гидрофобные лекарственные препараты, и гидрофильная оболочка, существенно повышающая растворимость этих НЧ в водных средах. Увеличение гидродинамического размера НЧ в водном растворе также связано с этим процессом адсорбции стабилизатора.

Механизм загрузки доксорубицина в полимерную оболочку НЧ состоит в том, что сам по себе препарат плохо растворяется в воде, поэтому обычно в клинической практике используют его гидрохлорид. Загрузку препарата проводят в среде натрий-фосфатного буфера, где происходит

Диаметр

Рис. 4. Гидродинамический диаметр НЧ после фазового переноса в воду: СНЧ до (1) и после (3) загрузки доксорубицина; КНЧ до (2) и после (4) загрузки доксорубицина

депротонирование его молекулы, что приводит к образованию кристаллов его основания, малорастворимого в воде. Если же в такой среде присутствуют НЧ с гидрофобными сайтами, то депротонированный доксорубицин может там адсорбироваться. По этой причине и наблюдается некоторое возрастание гидродинамического диаметра НЧ после загрузки, а также перезарядка их поверхности (рис. 4-3, рис. 4-4). В дальнейшем загруженный доксорубицин может протонироваться в более кислой среде лизосом клеток (рН 4,5-5) и высвобождаться из полимерной оболочки НЧ [16].

Вопрос влияния формы МНЧ на биологические системы актуален в связи с тем, что в последнее время появился ряд публикаций, в которых продемонстрированы преимущества несферических НЧ для гипертермии и МРТ-диагностики. Так, в ряде исследований показано [23, 24], что МНЧ кубической формы, а также «октоподы» [25] обладают большими значениями SAR по сравнению со сферическими МНЧ и поэтому могут найти применение в терапии посредством магнитной гипертермии. Кроме того, МНЧ кубической формы демонстрируют большие значения Т2-релаксивности по сравнению с аналогичными НЧ сферической формы [26]. В связи с этим мы провели сравнительный анализ влияния КНЧ и СНЧ на клетки, а также эффективности доставки противоопухолевого

препарата, загруженного на данные частицы, в клетки карциномы молочной железы мыши.

Выявлено, что в концентрациях вплоть до 227 мг/л синтезированные НЧ обеих форм не оказывают токсического влияния на клетки. Загруженные доксорубицином КНЧ вызывают несколько более выраженную гибель опухолевых клеток по сравнению с СНЧ. Это может быть связано с тем, что КНЧ быстрее проникают в клетки, чем СНЧ. Однако данная разница несущественна. Свободный противоопухолевый препарат обладает значительно более выраженным цитотоксическим эффектом и активнее накапливается в ядрах клеток. Причиной этого может быть то, что свободный доксорубицин проникает в клетки посредством диффузии, тогда как загруженный на НЧ лекарственный препарат попадает в клетки из-за эндоцитоза, что требует больше времени. Еще следует отметить, что НЧ, несущие доксорубицин, сначала обнаруживаются в составе внутриклеточных везикул, предположительно лизосом, в которых впоследствии происходит протонирование лекарственного препарата. Только после этого он может высвобождаться из НЧ и транспортироваться в ядра клеток [27]. Таким образом, доксорубицин, загруженный в НЧ, обладает меньшей противоопухолевой активностью, однако в дальнейшем,

А

I КНЧ  СНЧ

ф ф

3

ш

*

.а ш

140 120 100 80 60 40 20 0

Б

Контроль 1,77 3,55 7,10 14,20 28,40 56,80 113,60 227,20 Концентрация наночастиц по оксиду железа

КНЧ-Докс  СНЧ-Докс  Докс

е и

3 ш

и ж

л Ш

140 120 100 80 60 40 20 0

Контроль 0,46 0,92 1,84 3,67 7,34 14,7 Концентрация по доксорубицину

29,4

58,7

Рис. 5. Оценка цитотоксичности НЧ на клетках линии 4Т1. Гистограмма выживаемости клеток после 48 ч культивирования с КНЧ и СНЧ (А); после 48 ч сокультивирования с КНЧ-Докс, СНЧ-Докс и свободным доксорубицином (Докс) (Б). МТБ-тест. Результаты представлены как средние значения ±БО. * p < 0,05; ** p < 0,01. Количество живых клеток, инкубировавшихся с натрий-фосфатным буфером, был принят за 100%

30 мин

2 ч

6 ч

о ^

0

ч

1

т

X

о ^

0

ч

1

т

X

о

Г Д Е

Ж З И

Л

I Доке б КНЧ-Докс  СНЧ-Докс

90

е

с; с 80

и 70

ци

н е 60

ц

с е 50

р

о 40

л 30

ос 20

т

и с 10

н

0) I 0

ггь, I1 ГГТп

5 мин 1 ч 2 ч Время инкубации

Рис. 6. Динамика накопления свободного и загруженного на НЧ доксорубицина в клетках линии 4Т1. Флуоресцентная микроскопия (А—К); гистограмма зависимости интенсивности флуоресценции доксорубицина в клетках от продолжительности инкубации клеток с Докс, КНЧ-Докс и СНЧ-Докс (Л). Результаты представлены как средние значения ±БО. * p < 0,05; ** p < 0,01

после дополнительных модификаций (связывания специфических лигандов с поверхностью НЧ), такую систему можно использовать для адресной доставки противоопухолевого препарата [28].

ВЫВОДЫ

В результате проведенной работы выявлено, что эффективность доставки свободного доксорубицина в опухолевые клетки линии 4Т1 выше, чем загруженного в СНЧ или КНЧ. В свободном виде препарат быстро проникает в клетку в результате диффузии и аккумулируется в клеточном ядре. В случае же загрузки в НЧ оксида железа он попадает в клетку путем эндоцитоза и аккумулируется

в везикулах, откуда уже постепенно высвобождается во внутриклеточную среду. Неполное высвобождение ведет к тому, что 1С50 загруженного доксорубицина существенно меньше, чем у свободного препарата. Несмотря на то что КНЧ показали несколько более эффективную доставку противоопухолевого препарата в клетки по сравнению с СНЧ, достоверного различия между ними не выявлено.

Таблица. Результаты рентгеноструктурных исследований образцов СНЧ и КНЧ

Фаза ЭПЭМ, нм ОКР, нм Период решетки, нм

СНЧ Ре304 (100%) 11-17 6 ± 1 0,8373 ± 0,0004

КНЧ Ре304 (100%) 13-20 6 ± 1 0,8378 ± 0,0004

4 ч

6 ч

24 ч

Литература

1. Ling D, Hyeon T. Chemical design of biocompatible iron oxide nanoparticles for medical applications. Small. 2013; 9 (9-10): 1450-66. D0l:10.1002/smll.201202111.

2. Majewski P, Thierry B. Functionalized Magnetite Nanoparticles — Synthesis, Properties, and Bio-Applications. Crit Rev Solid State Mater Sci. 2007; 32 (3-4): 203-15.D0I:10.1080/10408430701776680.

3. Xie J, Huang J, Li X, Sun S, Chen X. Iron oxide nanoparticle platform for biomedical applications. Curr Med Chem. 2009; 16 (10): 1278-94. D0I:10.2174/092986709787846604.

4. Oh JK, Park JM. Iron oxide-based superparamagnetic polymeric nanomaterials: Design, preparation, and biomedical application. Prog Polym Sci. 2011; 36 (1): 168-89. DOI:10.1016/j. progpolymsci.2010.08.005.

5. Laurent S, Forge D, Port M, Roch A, Robic C, Vander Elst L et al. Magnetic iron oxide nanoparticles: Synthesis, stabilization, vectorization, physicochemical characterizations and biological applications. Chem Rev. 2008; 108 (6): 2064-110. D0I:10.1021/ cr068445e.

6. Lin JJ, Chen JS, Huang SJ, Ko JH, Wang YM, Chen TL et al. Folic acid-Pluronic F127 magnetic nanoparticle clusters for combined targeting, diagnosis, and therapy applications. Biomaterials. 2009; 30 (28): 5114-24. D0I:10.1016/j.biomaterials.2009.06.004.

7. Andhariya N, Chudasama B, Mehta RV, Upadhyay RV. Biodegradable thermoresponsive polymeric magnetic nanoparticles: A new drug delivery platform for doxorubicin. J Nanoparticle Res. 2011; 13 (4): 1677-88. D0I:10.1007/s11051-010-9921-6.

8. Tavano L, Vivacqua M, Carito V, Muzzalupo R, Caroleo MC, Nicoletta F. Doxorubicin loaded magneto-niosomes for targeted drug delivery. Colloids Surfaces B Biointerfaces. 2013; (102): 803-7. D0I:10.1016/j.colsurfb.2012.09.019.

9. Jain TK, Foy SP, Erokwu B, Dimitrijevic S, Flask CA, Labhasetwar V. Magnetic resonance imaging of multifunctional pluronic stabilized iron-oxide nanoparticles in tumor-bearing mice. Biomaterials. 2009; 30 (35): 6748-56. D0I:10.1016/j.biomaterials.2009.08.042.

10. Yang H, Liu C, Yang D, Zhang H, Xi Z. Comparative study of cytotoxicity, oxidative stress and genotoxicity induced by four typical nanomaterials: The role of particle size, shape and composition. J Appl Toxicol. 2009; 29 (1): 69-78. D0I:10.1002/ jat.1385.

11. Nair S, Sasidharan A, Divya Rani VV, Menon D, Nair S, Manzoor K et al. Role of size scale of Zn0 nanoparticles and microparticles on toxicity toward bacteria and osteoblast cancer cells. J Mater Sci Mater Med. 2009; 20 (1): 235-41. D0I:10.1007/s10856-008-3548-5.

12. Huang X, Teng X, Chen D, Tang F, He J. The effect of the shape of mesoporous silica nanoparticles on cellular uptake and cell function. Biomaterials. 2010; 31 (3):438-48. D0I:10.1016/j. biomaterials.2009.09.060.

13. Xiong Y, Brunson M, Huh J, Huang A, Coster A, Wendt K et al. The role of surface chemistry on the toxicity of Ag nanoparticles. Small. 2013; 9 (15): 2628-38. D0I:10.1002/smll.201202476.

14. Tarantola M, Pietuch A, Schneider D, Rother J, Sunnick E, Rosman C et al. Toxicity of gold-nanoparticles: Synergistic effects of shape and surface functionalization on micromotility of epithelial cells. Nanotoxicology. 2011; 5 (2): 254-68. D0I:10.3109 /17435390.2010.528847.

15. Tacar 0, Sriamornsak P, Dass CR. Doxorubicin: An update on anticancer molecular action, toxicity and novel drug delivery

systems. J Pharm Pharmacol. 2013; 65 (2): 157-70. D0l:10.1111/ j.2042-7158.2012.01567.x.

16. Gautier J, Munnier E, Paillard A, Hervé K, Douziech-Eyrolles L, Soucé M et al. A pharmaceutical study of doxorubicin-loaded PEGylated nanoparticles for magnetic drug targeting. Int J Pharm. 2012; 423 (1): 16-25. D0I:10.1016/j.ijpharm.2011.06.010.

17. Yu WW, Falkner JC, Yavuz CT, Colvin VL. Synthesis of monodisperse iron oxide nanocrystals by thermal decomposition of iron carboxylate salts. Chem Commun. 2004; (20): 2306-7. D0I:10.1039/b409601k.

18. Park J, An K, Hwang Y, Park JG, Noh HJ, Kim JY et al. Ultra-large-scale syntheses of monodisperse nanocrystals. Nat Mater. 2004; 3 (12): 891-5. D0I:10.1038/nmat1251.

19. Hai HT, Yang HT, Kura H, Hasegawa D, Ogata Y, Takahashi M et al. Size control and characterization of wustite (core)/spinel (shell) nanocubes obtained by decomposition of iron oleate complex. J Colloid Interface Sci. 2010; 346 (1): 37-42. D0I:10.1016/j. jcis.2010.02.025.

20. Simon T, Boca S, Biro D, Baldeck P, Astilean S. Gold-Pluronic core-shell nanoparticles: Synthesis, characterization and biological evaluation. J Nanoparticle Res. 2013; 15 (4): 1578. D0I:10.1007/ s11051-013-1578-5.

21. Gonzales M, Krishnan KM. Phase transfer of highly monodisperse iron oxide nanocrystals with Pluronic F127 for biomedical applications. J Magn Magn Mater. 2007; 311 (1): 59-62. D0I:10.1016/j.jmmm.2006.10.1150.

22. Zhou Z, Zhu X, Wu D, Chen Q, Huang D, Sun C et al. Anisotropic shaped iron oxide nanostructures: Controlled synthesis and proton relaxation shortening effects. Chem Mater. 2015; 27 (9): 3505-15. D0I:10.1021/acs.chemmater.5b00944.

23. Kolosnjaj-Tabi J, Di Corato R, Lartigue L, Marangon I, Guardia P, Silva AKA et al. Heat-Generating Iron 0xide Nanocubes: Subtle "Destructurators" of the Tumoral Microenvironment. ACS Nano. 2014; 8 (5): 4268-83. D0I:10.1021/nn405356r.

24. Guardia P, Di Corato R, Lartigue L, Wilhelm C, Espinosa A, Garcia-Hernandez M et al. Water Soluble Iron 0xide Nanocubes with High Values of Specific Absorption Rate for Cancer Cell Hyperthermia Treatment. ACS nano. 2012; 6 (4): 3080-91. D0I:10.1021/nn2048137.

25. Nemati Z, Alonso J, Martinez LM, Khurshid H, Garaio E, Garcia JA et al. Enhanced Magnetic Hyperthermia in Iron 0xide Nano-0ctopods: Size and Anisotropy Effects. J Phys Chem C. 2016; 120 (15): 8370-9. D0I:10.1021/acs.jpcc.6b01426.

26. Lee N, Kim H, Choi SH, Park M, Kim D, Kim H-C et al. Magnetosome-like ferrimagnetic iron oxide nanocubes for highly sensitive MRI of single cells and transplanted pancreatic islets. Proc Natl Acad Sci. 2011; 108 (7): 2662-7. D0I:10.1073/ pnas.1016409108.

27. Nizamov TR, Garanina AS, Grebennikov IS, Zhironkina 0A, Strelkova 0S, Alieva IB et al. Effect of Iron 0xide Nanoparticle Shape on Doxorubicin Drug Delivery Toward LNCaP and PC-3 Cell Lines. BioNanoScience. 2018; 8 (1): 394-406. D0I:10.1007/ s12668-018-0502-y.

28. Kievit FM, Wang FY, Fang C, Mok H, Wang K, Silber JR et al. Doxorubicin loaded iron oxide nanoparticles overcome multidrug resistance in cancer in vitro. J Control Release. 2011; 152 (1): 76-83. D0I:10.1016/j.jconrel.2011.01.024.

References

1. Ling D, Hyeon T. Chemical design of biocompatible iron oxide nanoparticles for medical applications. Small. 2013; 9 (9-10): 1450-66. D0l:10.1002/smll.201202111.

2. Majewski P, Thierry B. Functionalized Magnetite Nanoparticles — Synthesis, Properties, and Bio-Applications. Crit Rev Solid State Mater Sci. 2007; 32 (3-4): 203-15.D0I:10.1080/10408430701776680.

3. Xie J, Huang J, Li X, Sun S, Chen X. Iron oxide nanoparticle platform for biomedical applications. Curr Med Chem. 2009; 16

(10): 1278-94. D0I:10.2174/092986709787846604.

4. Oh JK, Park JM. Iron oxide-based superparamagnetic polymeric nanomaterials: Design, preparation, and biomedical application. Prog Polym Sci. 2011; 36 (1): 168-89. DOI:10.1016/j. progpolymsci.2010.08.005.

5. Laurent S, Forge D, Port M, Roch A, Robic C, Vander Elst L et al. Magnetic iron oxide nanoparticles: Synthesis, stabilization, vectorization, physicochemical characterizations and biological

applications. Chem Rev. 2008; 108 (6): 2064-110. D0l:10.1021/ cr068445e.

6. Lin JJ, Chen JS, Huang SJ, Ko JH, Wang YM, Chen TL et al. Folic 18. acid-Pluronic F127 magnetic nanoparticle clusters for combined targeting, diagnosis, and therapy applications. Biomaterials. 2009;

30 (28): 5114-24. D0I:10.1016/j.biomaterials.2009.06.004. 19.

7. Andhariya N, Chudasama B, Mehta RV, Upadhyay RV. Biodegradable thermoresponsive polymeric magnetic nanoparticles: A new drug delivery platform for doxorubicin. J Nanoparticle Res. 2011; 13 (4): 1677-88. D0I:10.1007/s11051-010-9921-6.

8. Tavano L, Vivacqua M, Carito V, Muzzalupo R, Caroleo MC, 20. Nicoletta F. Doxorubicin loaded magneto-niosomes for targeted

drug delivery. Colloids Surfaces B Biointerfaces. 2013; (102): 803-7. D0I:10.1016/j.colsurfb.2012.09.019.

9. Jain TK, Foy SP, Erokwu B, Dimitrijevic S, Flask CA, Labhasetwar 21. V. Magnetic resonance imaging of multifunctional pluronic stabilized iron-oxide nanoparticles in tumor-bearing mice. Biomaterials. 2009; 30 (35): 6748-56. D0I:10.1016/j.biomaterials.2009.08.042.

10. Yang H, Liu C, Yang D, Zhang H, Xi Z. Comparative study 22. of cytotoxicity, oxidative stress and genotoxicity induced by

four typical nanomaterials: The role of particle size, shape and composition. J Appl Toxicol. 2009; 29 (1): 69-78. D0I:10.1002/ jat.1385. 23.

11. Nair S, Sasidharan A, Divya Rani VV, Menon D, Nair S, Manzoor K et al. Role of size scale of Zn0 nanoparticles and microparticles on toxicity toward bacteria and osteoblast cancer cells. J Mater

Sci Mater Med. 2009; 20 (1): 235-41. D0I:10.1007/s10856-008- 24. 3548-5.

12. Huang X, Teng X, Chen D, Tang F, He J. The effect of the shape of mesoporous silica nanoparticles on cellular uptake and cell function. Biomaterials. 2010; 31 (3):438-48. D01:10.1016/j. biomaterials.2009.09.060. 25.

13. Xiong Y, Brunson M, Huh J, Huang A, Coster A, Wendt K et al. The role of surface chemistry on the toxicity of Ag nanoparticles. Small. 2013; 9 (15): 2628-38. D0I:10.1002/smll.201202476.

14. Tarantola M, Pietuch A, Schneider D, Rother J, Sunnick E, 26. Rosman C et al. Toxicity of gold-nanoparticles: Synergistic effects of shape and surface functionalization on micromotility of epithelial cells. Nanotoxicology. 2011; 5 (2): 254-68. D0I:10.3109 /17435390.2010.528847.

15. Tacar 0, Sriamornsak P, Dass CR. Doxorubicin: An update on 27. anticancer molecular action, toxicity and novel drug delivery systems. J Pharm Pharmacol. 2013; 65 (2): 157-70. D0I:10.1111/ j.2042-7158.2012.01567.x.

16. Gautier J, Munnier E, Paillard A, Hervé K, Douziech-Eyrolles L, Soucé M et al. A pharmaceutical study of doxorubicin-loaded 28. PEGylated nanoparticles for magnetic drug targeting. Int J Pharm. 2012; 423 (1): 16-25. D0I:10.1016/j.ijpharm.2011.06.010.

17. Yu WW, Falkner JC, Yavuz CT, Colvin VL. Synthesis of monodisperse iron oxide nanocrystals by thermal decomposition

of iron carboxylate salts. Chem Commun. 2004; (20): 2306-7. D0l:10.1039/b409601k.

Park J, An K, Hwang Y, Park JG, Noh HJ, Kim JY et al. Ultra-large-scale syntheses of monodisperse nanocrystals. Nat Mater. 2004; 3 (12): 891-5. D0I:10.1038/nmat1251. Hai HT, Yang HT, Kura H, Hasegawa D, Ogata Y, Takahashi M et al. Size control and characterization of wustite (core)/spinel (shell) nanocubes obtained by decomposition of iron oleate complex. J Colloid Interface Sci. 2010; 346 (1): 37-42. D0I:10.1016/j. jcis.2010.02.025.

Simon T, Boca S, Biro D, Baldeck P, Astilean S. Gold-Pluronic core-shell nanoparticles: Synthesis, characterization and biological evaluation. J Nanoparticle Res. 2013; 15 (4): 1578. D0I:10.1007/ s11051-013-1578-5.

Gonzales M, Krishnan KM. Phase transfer of highly monodisperse iron oxide nanocrystals with Pluronic F127 for biomedical applications. J Magn Magn Mater. 2007; 311 (1): 59-62. D0I:10.1016/j.jmmm.2006.10.1150.

Zhou Z, Zhu X, Wu D, Chen Q, Huang D, Sun C et al. Anisotropic shaped iron oxide nanostructures: Controlled synthesis and proton relaxation shortening effects. Chem Mater. 2015; 27 (9): 3505-15. D0I:10.1021/acs.chemmater.5b00944. Kolosnjaj-Tabi J, Di Corato R, Lartigue L, Marangon I, Guardia P, Silva AKA et al. Heat-Generating Iron 0xide Nanocubes: Subtle "Destructurators" of the Tumoral Microenvironment. ACS Nano. 2014; 8 (5): 4268-83. D0I:10.1021/nn405356r. Guardia P, Di Corato R, Lartigue L, Wilhelm C, Espinosa A, Garcia-Hernandez M et al. Water Soluble Iron 0xide Nanocubes with High Values of Specific Absorption Rate for Cancer Cell Hyperthermia Treatment. ACS nano. 2012; 6 (4): 3080-91. D0I:10.1021/nn2048137.

Nemati Z, Alonso J, Martinez LM, Khurshid H, Garaio E, Garcia JA et al. Enhanced Magnetic Hyperthermia in Iron 0xide Nano-0ctopods: Size and Anisotropy Effects. J Phys Chem C. 2016; 120 (15): 8370-9. D0I:10.1021/acs.jpcc.6b01426. Lee N, Kim H, Choi SH, Park M, Kim D, Kim H-C et al. Magnetosome-like ferrimagnetic iron oxide nanocubes for highly sensitive MRI of single cells and transplanted pancreatic islets. Proc Natl Acad Sci. 2011; 108 (7): 2662-7. D0I:10.1073/ pnas.1016409108.

Nizamov TR, Garanina AS, Grebennikov IS, Zhironkina 0A, Strelkova 0S, Alieva IB et al. Effect of Iron 0xide Nanoparticle Shape on Doxorubicin Drug Delivery Toward LNCaP and PC-3 Cell Lines. BioNanoScience. 2018; 8 (1): 394-406. D0I:10.1007/ s12668-018-0502-y.

Kievit FM, Wang FY, Fang C, Mok H, Wang K, Silber JR et al. Doxorubicin loaded iron oxide nanoparticles overcome multidrug resistance in cancer in vitro. J Control Release. 2011; 152 (1): 76-83. D0I:10.1016/j.jconrel.2011.01.024.