Фракционирование пуриновых производныхв изучении энергетического обмена

ХИМИЯ

Вестн. Ом. ун-та. 2017. № 1. С. 65-70.

УДК 577.11:536.7:61

П.П. Золин, В.Д. Конвай, А.А. Домрачев

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ ПУРИНОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ В ИЗУЧЕНИИ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО ОБМЕНА

Описан метод фракционирования пуриновых производных (нуклеозидди- и трифос-фатов, нуклеозидмонофосфатов, азотистых оснований, урата) и его применение для изучения энергетического обмена в животных тканях.

Ключевые слова: энергетический обмен, пуриновые нуклеозидтрифосфаты, нуклео-зиддифосфаты, нуклеозидмонофосфаты, азотистые основания, урат.

Постановка проблемы

Одним из наиболее продуктивных методических подходов для изучения энергетического обмена в норме и патологии является измерение включения радиоактивно меченных метаболических предшественников в пуриновые мононуклеотиды, нуклеозиды и основания. Как правило, одновременно измеряют и их содержание в тканях.

Давно стало понятно, что нельзя ориентироваться только на какие-то отдельные пуриновые производные. Например, даже такой часто используемый показатель, как содержание аденозинтрифосфата (АТФ), не коррелирует в печени с энергетическим зарядом, потенциалом фосфорилирова-ния, а также с устойчивостью печени к ишемии и способностью ее к последующему восстановлению функций [1]. Аналогичная ситуация с АТФ наблюдается и в других жизненно важных органах [2].

Помимо концентрации АТФ в тканях, на роль универсального индикатора состояния энергетического обмена предлагались содержание адено-зинмонофосфата (АМФ), скорость синтеза АМФ de novo, суммарное содержание адениновых мононуклеотидов, энергетический заряд, скорость восстановления энергетического заряда, скорость ресинтеза АТФ, скорость ре-синтеза всей суммы адениннуклеотидов, отсутствие деградации пула аде-ниннуклеотидов в восстановительном периоде, - многие из них сразу показали себя недостаточно информативными [3].

Малое содержание какого-либо нуклеотида в ткани вовсе не означает, что в него будет включаться так же мало метки предшественника. Так, в работе [4] было установлено, что скорость включения 14С-гипоксантина в гуанозинтрифосфат (ГТФ) изолированных крысиных сердец составляет в нормоксических условиях 25 % от его включения в АТФ, а после ишемии - 27 %, и это при том, что содержание ГТФ составляет только 4 % от содержания АТФ. После инкубации человеческих или овечьих эритроцитов с 14С-гипоксантином радиоактивность АТФ и ГТФ составляет всего лишь около 2 % от радиоактивности инозинмонофосфата (ИМФ) [5], хотя известно, что содержание ИМФ в тканях намного ниже, чем АТФ и ГТФ.

Пуриновые производные, имеющиеся в животных тканях, исчисляются десятками, так что раздельное определение всех их (и измерение включения в них меченых предшественников) - процедура трудоемкая и долгая. Но самое главное - из-за высокой лабильности многих нуклео-зидфосфатов возможно их частичное разрушение в процессе анализа, если это будет длительное селективное определение всех имеющихся в ткани пуриновых производных. Неконтролируемое частичное разрушение анализируемого вещества делает бессмысленным весь анализ. Кроме того, при использовании метода высокоэффективной жидкостной хроматографии

© П.П. Золин, В.Д. Конвай, А.А. Домрачев, 2017

количеств разделяемых пуриновых производных не всегда хватает для измерения радиоактивности включившихся в них меченых предшественников. Исходя из всего вышесказанного, исследователи обычно изучают включение меченого предшественника лишь в некоторые, выбранные ими пурино-вые производные, а не во все многочисленные метаболиты, в которые метка может включаться через известные биохимические реакции. Ясно, что при таком подходе вне поля зрения исследователя остаются неожиданные и подчас самые интересные факты.

Фракции пуриновых производных

Выход из описанного затруднения видится в замене селективных методов определения каждого отдельного вещества групповыми методами, которые бы охватывали своей совокупностью все макроэргические пуриннуклеотиды, а также их метаболиты. Такие попытки хотя и редко, но предпринимались. Так, в работе [6] было предложено определение тканевого содержания и радиоактивности суммарных пулов адениновых производных (АТФ + аденозиндифосфат (АДФ) + АМФ + аденозин + аденин), гуанино-вых производных (ГТФ + гуанозиндифосфат (ГДФ) + ГМФ + гуанозин + гуанин) и производных гипоксантина (инозинтрифосфат + инозиндифосфат + ИМФ + инозин + гипо-ксантина) без предварительного определения каждого отдельного вещества. Очевидно, можно группировать пуриновые производные не только по их азотистому основанию, но и по наличию в их молекуле пентозы и остатков фосфорной кислоты. Тогда можно выделить пять уровней строения кислотоэкс-трагируемых пуриновых производных:

1. Нуклеозидтрифосфаты: АТФ, ГТФ, инозинтрифосфат и т. д.

2. Нуклеозиддифосфаты: АДФ, ГДФ, ино-зиндифосфат и т. д.

3. Нуклеозидмонофосфаты: АМФ, гуано-зинмонофосфат, ИМФ, ксантозинмонофос-фат, аденилосукцинат и т. д.

4. Нуклеозиды: аденозин, гуанозин, инозин, ксантозин и т. д.

5. Азотистые основания: аденин, гуанин, гипоксантин, ксантин, мочевая кислота и т. д.

Перечисленные уровни отражают химическое строение пуриновых производных, но для нас главный интерес представляет их роль в метаболизме, прежде всего в энергетическом обмене. Поэтому в работе [2] мы выделили более крупные, чем уровни, структуры, которые назвали гомеостатическими системами пуриновых производных (ГСПП):

I. Нуклеозидди- и трифосфаты (НДТФ);

II. Нуклеозидмонофосфаты (НМФ);

III. Нуклеозиды и азотистые основания (НАО).

Приведем соображения, обосновывающие адекватность выделенных ГСПП физиологическим и патофизиологическим реалиям:

а) По своему метаболическому и энергетическому значению компоненты каждой ГСПП сходны между собой и, наоборот, качественно отличны от компонентов других ГСПП. Так, НДТФ обладают макроэргиче-скими свойствами (плюсовое энергетическое значение), что в основном и определяет их метаболические функции. НМФ имеют нулевое энергетическое значение, т. е. они не являются макроэргами, но способны легко становиться ими, поскольку это не сопряжено с затратами дополнительных макроэргических связей. А для реутилизации НАО требуются дополнительные энергозатраты (отрицательное энергетическое значение).

б) Метаболические реакции внутри каждой ГСПП биологически второстепенны по сравнению с «трансгомеостатными» реакциями (превращениями, начинающимися с одной ГСПП и заканчивающимися в другой) и протекают, как правило, быстрее. Например, в организме человека за сутки АДФ превращается в АТФ в количестве примерно 60 кг (и, разумеется, столько же превращается обратно) [7]. Взаимопревращения АТФ с АМФ и АДФ с АМФ происходят гораздо менее интенсивно.

в) Анализируя литературные данные, мы обратили внимание на то, что «трансгомео-статные» ферменты, как правило, гораздо более специфичны, чем ферменты, катализирующие реакции (в том числе и между уровнями) внутри каждой ГСПП.

г) И наконец, наиболее убедительное подтверждение объективности, неискусственности выделенных нами ГСПП состоит в том, что реакции вида

Нуклеозид ^ НДФ и НДФ ^ Нуклеозид в живой природе отсутствуют, тогда как, казалось бы, равнозначные им реакции Пуриновое основание ^ НМФ и НТФ ^ НМФ широко распространены во многих клетках. Иными словами, «перепрыгивание» через уровень пуриновых производных в природе возможно, но только если при этом не происходит «перепрыгивания» через ГСПП.

Для количественного изучения включения меченых предшественников в каждую ГСПП мы использовали принцип фракционного осаждения, обеспечивающий необходимую быстроту, простоту и дешевизну методик группового определения. При этом из животной ткани выделяются три фракции -НДТФ, НМФ и НАО, соответствующие трем вышеописанным ГСПП.

Известно много методов осаждения пу-риновых производных ионами различных

металлов. В работе [8] нами приведена библиография (22 литературных источника) по дифференциальному осаждению фосфори-лированных пуриновых производных ионами бария, а в работе [2] суммированы 48 литературных источников по осаждению пуринов другими металлами. Приводим отработанную нами методику выделения из ткани фракций пуриновых производных при помощи ионов бария и ртути.

Реактивы

(1) Хлорная кислота (НСЮ4) 6 %. Использование хлорной кислоты меньших концентраций неудобно, так как требует большего объемно-весового соотношении с экстрагируемой тканью и/или двукратной экстракции. Использование хлорной кислоты имеет преимущество перед другими способами кислотной экстракции в том, что она легко затем удаляется в виде перхлората калия, в то время как, например, для удаления три-хлоруксусной кислоты требуется длительная процедура с серным эфиром. Кроме того, в условиях экстракции при 0 °С лабильные фосфоэфиры лучше сохраняются в 6 % НСЮ4, нежели в 10 % трихлоруксусной кислоте [8].

(2) Гидроксид калия (КОН) 30 %.

(3) Соляная кислота (HCl): 0,5 %.

(4) Гидроксид натрия (NaOH): а) 10 %, б) 0,05 %.

(5) Метанол (СН3ОН) - предварительно перегоняется и хранится в плотно закрытой посуде. Использование его имеет преимущество перед часто применяемым этанолом в связи с лучшими водоотнимающими свойствами метанола, недостатком же его является токсичность.

(6) Фенолфталеин - 1 % раствор в метаноле или в этаноле.

(7) Барий-метанольная смесь. Заранее готовили 25 % водный раствор ацетата бария, непосредственно перед использованием 35 мл этого раствора доводили метанолом до 1 л и тщательно перемешивали.

(8) Ацетат бария 25 % водный раствор.

(9) Носитель урата - 0,024 % раствор мочевой кислоты в горячей воде, подщелоченной гидроксидом натрия.

(10) Ацетат ртути 0,1 М раствор в 5 % уксусной кислоте.

(11) Жидкость для промывания осадка урата ртути. Ее приготовление: к 1 л 0,01 М ацетата ртути в 1 % уксусной кислоте добавляли 10 мг мочевой кислоты, растворенной в воде. Смесь выдерживали в течение часа при 80-90 °С, отстаивали в течение ночи, осадок урата отфильтровывали.

(12) Хлорид натрия 0,5 М раствор в 1 % уксусной кислоте.

Приготовление хлорнокислого экстракта ткани

Для выделения фракций НДТФ, НМФ и НАО достаточно 200 мг животной ткани,

прижизненно замороженной в жидком азоте. Вся методика выполняется на холоде. Не оттаивая, быстро гомогенизировали ткань в холодной 6 % НCЮ4 (1), взятой в соотношении 100 мг ткани на 0,4 мл 6 % НС104. Гомогенат центрифугировали в течение 5 мин при 1000 g и 0 °С. Супернатант сразу же нейтрализовали раствором КОН (2) до рН = 7 по универсальной индикаторной тест-полоске, выдерживали 15 мин при 0 °С и осадок перхлората калия отделяли центрифугированием при вышеописанных условиях.

Хлорнокислая экстракция позволяет избавиться от кислотонерастворимых полимеров (главным образом, нуклеиновых кислот), которые остаются в тканевом осадке. Кроме того, при работе с некоторыми тканями бывает необходимо очистить хлорнокислый экстракт от веществ полисахаридной природы, способных удерживать часть фос-фоэфиров в коллоидной суспензии, что препятствует их четкому отделению от нефосфо-рилированной фракции. Так, скажем, работая с печенью, всегда приходится избавляться от гликогена. Для удаления полисахаридов нейтрализованный хлорнокислый экстракт смешивали с равным объемом холодного метанола, выдерживали на холоде 15 мин и образовавшиеся хлопья отделяли центрифугированием. Критерием необходимости этой процедуры может служить наличие осадка после центрифугирования: если он образуется хотя бы в одной из нескольких проб исследуемой ткани, то для данной ткани удаление полисахаридов является обязательным. Другие способы удаления полисахаридов, и в частности адсорбция на сульфиде ртути, нежелательны, поскольку связаны с внесением в экстракт дополнительных реактивов. Кроме того, на сульфиде ртути может сорбироваться часть мононук-леотидов, что приведет к заниженным результатам [8].

Выделение фосфоэфиров из хлорнокислого экстракта

Готовый хлорнокислый экстракт смешивали с тремя объемами холодной смеси (7), добавляли 1 каплю 1 % спиртового раствора фенолфталеина (6). Цвет смеси доводили сначала 10 % раствором (4а), затем 0,05 % раствором (4б) гидроксида натрия до чуть заметного розоватого (что соответствует рН = 8,2), выдерживали смесь в течение 15 мин при 0 °С и центрифугировали 5 мин при 1000 g. При этом бариевые соли фос-фоэфиров выпадают в осадок. Для обеспечения полноты осаждения можно использовать описываемые некоторыми авторами соотношения между барием и фосфором, но это требует предварительного определения общего содержания фосфора в экстракте. Проще контролировать полноту осаждения

фосфоэфиров, внося после центрифугирования в супернатант 1 каплю 25 % раствора ацетата бария. Если дополнительного осадка не образуется, значит осаждение было полным. Если же он образовался, следует добавить барий-метанольной смеси (7) и процедуру осаждения фосфоэфиров повторить. После полного осаждения в надосадочной жидкости остается фракция НАО, а осадок содержит сумму фракций НДТФ и НМФ.

Разделение НДТФ и НМФ

Задача следующего этапа методики -разделение НДТФ и НМФ. Для этого осадок фосфорилированных производных, полученный на предыдущем этапе, растворяли в 12 мл 0,5 % HCl (3), добавляли 0,05 мл 25 % водного раствора ацетата бария (8) и 1 каплю 1% спиртового раствора фенолфталеина (6). Цвет смеси доводили сначала 10 % раствором (4а), затем 0,05 % раствором (4б) гидрок-сида натрия до чуть заметного розоватого окрашивания (что соответствует рН = 8,2), выдерживали смесь в течение 15 мин при 0 °С и центрифугировали 5 мин при 1000 g. Полноту осаждения фосфоэфиров контролировали внесением в супернатант 1 капли 25 % раствора ацетата бария (8). Если супернатант при этом мутнел, процедуру осаждения повторяли, стараясь, однако, не создавать переизбытков ионов бария. Полученный таким образом осадок заключает в себе НДТФ, а в растворе остаются НМФ. Осадок НДТФ растворяли в 1 или 2 мл 0,5 % HCl (3).

Затем из растворов всех трех фракций (НДТФ, НМФ и НАО) удаляли ионы бария. Для этого вносили в них несколько капель раствора сульфата натрия, близкого к насыщенному, перемешивали, центрифугировали и проверяли полноту осаждения бария внесением 1 капли сульфата натрия.

Проведенное нами на различных животных тканях изучение спектров выделенных фракций в ближней ультрафиолетовой области выявило наличие у фракций НДТФ и НМФ нерезко выраженного одиночного пика оптической плотности в области 260 нм, что согласуется с известным фактом преобладания адениновых производных в этих фракциях. Поэтому содержание НДТФ и НМФ целесообразно выражать в единицах оптической плотности при 260 нм (измерения должны проводиться при рН 6-7) в пересчете на единицу сырой массы ткани. Можно использовать поправку на поглощение примесей при 290 нм или дифференциальную фотометрию до и после удаления пуриновых производных активированным углем или другим способом. Спектрофотометрические профили фракции НАО более сложны и вариабельны, поэтому содержание НАО мы вычисляли как частное от деления суммы оптических плотностей при 250, 260, 270, 280, 290 на пять с пересчетом на единицу массы

и вычитанием примесного поглощения при 300 нм.

Выделение урата

Выделение урата (мочевой кислоты) из фракции НАО имеет смысл проводить далеко не всегда. Во-первых, оно может быть связано с необходимостью учета видовых особенностей при изучении метаболизма пуринов у человека и животных. Известно, что уратоксидаза (уриказа), катализирующая превращение мочевой кислоты в аллантоин, имеется у всех млекопитающих, включая доступных лабораторных животных. В организме же человека, а также шимпанзе, гориллы, орангутана и гиббона уриказная активность полностью отсутствует, что объясняется ее исчезновением у общего предка пяти перечисленных видов после его дивергенции от обезьян Старого Света [9]. Поэтому содержание урата в биологических жидкостях и тканях доступных лабораторных животных намного ниже, чем у человека.

Во-вторых, содержание мочевой кислоты существенно колеблется в различных тканях одного организма. В тех тканях, в которых ксантиноксидаза и уриказа малоактивны, обычно можно ограничиться определением включения меченого предшественника во фракцию НАО и не выделять из нее урат. Разумеется, решение этого вопроса прежде всего зависит от задач исследования.

Если в связи с видовыми и тканевыми особенностями концентрация урата в изучаемой ткани низкая, то для его выделения фракцию НАО мы доводили при помощи упаривания (не выше 100 °С) до объемов 3 или 6 мл - в зависимости от концентрации урата. Затем прибавляли в объеме 1/3 от объема фракции НАО экстемпорально приготовленный носитель (9) - 0,024 % раствор мочевой кислоты в горячей воде, слегка подщелоченной гидроксидом натрия. Смесь пробы с носителем приливали капельно (со скоростью 1 мл в минуту) и при непрерывном помешивании стеклянной палочкой к 0,1 М раствору ацетата ртути в 5 % уксусной кислоте (10), находящемуся на кипящей водяной бане в объеме 1/4 от объема приливаемой смеси. Периодически помешивая, выдерживали на кипящей бане в течение 10 мин, затем быстро охлаждали в ледяной воде. Центрифугировали 10 мин при 1000 g. Супернатант (НАО) осторожно переливали в другую пробирку, отсутствие в нем урата проверяли, осаждая избыток ионов ртути сероводородом: если при пропускании сероводорода частицы осадка (сульфид ртути) появляются, значит осаждение урата было полным.

Осадок урата ртути, оставшийся в первой пробирке, диспергировали в нескольких миллилитрах промывной жидкости (11), центрифугировали, супернатант соединяли с фракцией НАО. Осадок растворяли в 8 мл

0,5 М раствора хлорида натрия в 1 % уксусной кислоте (12) и измеряли оптическую плотность раствора при 290 нм (максимум поглощения приходится на 284 нм, но при 290 нм минимизируются величины побочных абсорбций) против холостой пробы, представляющей собой раствор урата-носи-теля (1/3 объема) плюс вода (2/3 объема), обработанные идентично. Параллельно обрабатывали стандартные пробы, содержащие 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30; 0,35 и 0,40 мг мочевой кислоты, по результатам которых рассчитывали содержание урата в опытных пробах. Для радиоизотопных исследований пробы мочевой кислоты и НАО упаривали до небольшого объема, нейтрализовали и освобождали от ионов ртути пропусканием сероводорода. Черный осадок сульфида ртути отделяли центрифугированием. Полноту осаждения ртути проверяли повторным пропусканием сероводорода, а от избытка последнего избавлялись пропусканием атмосферного воздуха. В качестве источника сероводорода использовали реакцию Ке283 с полуконцентрированной соляной кислотой в аппарате Киппа или реакцию между Ма2Э и КН804.

Возможности применения метода

Вышеописанный метод фракционирования пуриновых производных был применен нами для изучения показателей энергетического обмена в постреанимационном периоде [10; 11]. Приведем вкратце полученные результаты по включению гипоксантина в различные фракции пуриновых мононуклео-тидов, которое отражает процессы его реутилизации. Последние имеют важное значение для поддержания пула макроэргов в клетке [10], а также для предотвращения вовлечения гипоксантина в ксантиноксидазную реакцию, приводящего к гиперпродукции свободных радикалов и повреждению клеточных структур [12].

Эксперименты были выполнены на беспородных белых крысах-самцах. Опытную группу животных под эфирным наркозом подвергали клинической смерти путем 6,5-минутной механической асфиксии с последующей реанимацией путем искусственного дыхания и непрямого массажа сердца. Животных группы «Контроль» подвергали не асфиксии, а лишь контрольным манипуляциям: наркозу, фиксации, интубации. У животных обеих групп через 30 мин после вышеуказанных манипуляций под эфирным наркозом прижизненно замораживали в жидком азоте пробы головного мозга, печени и сердца, после чего крыс забивали. За 25 мин до забоя всем крысам вводили в бедренную вену 14С-гипоксантин в дозе 740 ки-лобеккерелей / кг массы тела, растворенный в 0,9 % растворе №С1, который брали из расчета 2,5 мл / кг массы тела крыс. Из заморо-

женных тканей готовили хлорнокислый экстракт и выделяли из него фракции пурино-вых производных, как описано выше. Определяли радиоактивность выделенных фракций в сцинтилляционной жидкости Брея на счетчике СБС-2.

Обнаружено, что реутилизация гипо-ксантина в печени у крыс опытной группы серьезно нарушена: включение 14С-гипо-ксантина в НМФ снижено до уровня 60 % по сравнению с группой «Контроль». При этом включение 14С-гипоксантина в НДТФ составляет всего лишь 30 % от контрольного уровня. Включение же гипоксантиновой метки в НАО печени в опытной группе на 43 % превышает контрольный уровень. Все описанные различия статистически значимы по критерию Вилкоксона - Манна - Уитни. Изменения включения 14С-гипоксантина в урат печени были статистически незначимыми и составили: в контрольной группе 539 + 48, а в опытной группе 573 + 45 импульсов / сек. на грамм сырой массы печени (средняя арифметическая + ошибка средней арифметической).

Включение 14С-гипоксантина в НМФ головного мозга крыс в опытной группе статистически значимо возрастает и в 2,5 раза превышает контроль, а включение в НДТФ составляет лишь 113 % от контрольного уровня. Включение 14С-гипоксантина в НАО мозга в опытной группе (205,4 + 25,1 импульсов / сек. на грамм мозга) более чем вдвое превышает контрольный уровень (100,8 + 29,6 импульсов / сек. на грамм мозга), и это различие статистически значимо.

В сердце животных опытной группы реутилизация гипоксантина в НМФ снижается до 74 % от контрольного уровня. Включение же 14С-гипоксантина в НДТФ вообще падает против контроля в 6,4 раза. Включение метки в НАО сердца в опытной группе составляет по отношению к контролю 81 %.

Таким образом, фракционирование пу-риновых производных позволило выявить существенные нарушения реутилизации ги-поксантина в наиболее жизненно важных органах в постреанимационном периоде.

Методические подходы, описанные в настоящей работе, могут быть использованы также для тестирования новых способов фармакологического воздействия на энергетический обмен. Так, одним из перспективных направлений коррекции нарушений метаболизма пуриновых нуклеотидов при энергодефицитных состояниях является введение в организм D-рибозы [11; 13]. Выделение фосфоэфиров из хлорнокислого экстракта при помощи барий-метанольной смеси (7), как описано выше, и растворение осадка в 0,5 % HCl (3) дает возможность определения в полученном растворе суммарного количества кислоторастворимых фосфопентоз, что

представляет интерес при изучении влияния

на организм экзогенной D-рибозы.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Marubayashi S., Dohi K., Ezaki H. et al. Preservation of ischemic rat liver mitochondrial function and liver viability with CoQ-ю // Surgery. 1982. Vol. 91, № 6. P. 631-637.

[2] Золин П. П., Конвай В. Д. Методологические и методические подходы к изучению пуринового обмена при энергодефицитных состояниях / Ом. мед. ин-т. Омск, 1993. 34 с. Деп. в ГЦНМБ № 23470 от 15.07.1993.

[3] Биленко М. В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. М.: Медицина, 1989. 368 с.

[4] Harmsen E., de Tombe P.P., de Jong J. W, Achterberg P.W. Enhanced ATP and GTP synthesis from hypoxanthine or inosine after myocardial ischemia // Am. J. Physiol. 1984. Vol. 246 (Heart Circ. Physiol. Vol. 15), № 1. P. H37-H43.

[5] Snyder F.F., Henderson J.F. Alternative pathways of deoxyadenosine and adenosine metabolism // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248, № 16. P. 5899-5904.

[6] Pizzichini M., Di Stefano A., Leoncini R. et al. Free purines and nucleotides in rat liver // Ital. J. Bio-chem. 1989. Vol. 38, № 2. P. 132-133.

[7] Биологическая химия / под ред. чл.-корр. РАМН С.Е. Северина. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2011. 624 с.

[8] Золин П. П., Конвай В. Д. Метод изучения обмена пентоз при гипоксических состояниях / Ом. мед. ин-т. Омск, 1991. 19 с. Деп. в ВИНИТИ № 4705-В91.

[9] Friedman T. B., Polanco G. E., Appold J. C., Mayle J. E. On the loss of uricolytic activity during primate evolution. I: Silencing of urate oxidase in a hominoid ancestor // Comp. Biochem, Physiol. 1985. B81, № 3. P. 653-659.

[10] Zolin P. P., Conway V. D. Disturbances of hypoxanthine metabolism in the liver of resuscitated rats // Bul. Exper. Biol. 1997. Vol. 124, № 6. P. 11801182.

[11] Zolin P.P., Conway V.D. Postresuscitation purine metabolism disorder and its correction by ribose // Pathophysiology. 1998. Vol. 5, № S1. P. 215.

[12] Конвай В.Д., Золин П.П., Воронов О.Э. Новые данные в пользу ксантиноксидазной гипотезы гиперпродукции свободных радикалов // Структурно-функциональные механизмы патологических и компенсаторно-восстановительных реакций. Омск, 1994. С. 29-32.

[13] Chigrinski E. A., Conway V. D. Protective effect of D-ribose against inhibition of rats testes function at excessive exercise // Журнал стресс-физиологии и биохимии. Vol. 7, № 3. P. 242-249.