Клетка как химический реактор: аррениусовская зависимость ДМСО- индуцируемой кинетики гибели инфузории Spirostomum ambigua от температуры

Клетка как химический реактор: аррениусовская зависимость ДМСО-индуцируемой кинетики гибели инфузории Spirostomum ambigua от

температуры

Ковалева А.А.

(1)Российский Университет Дружбы Народов, медицинский факультет,

(2)ГНИИ "Биоэффект", (З)Учебно-исследовательский центр "Живое вещество"

Обнаружено, что зависимость частоты процесса лиганд-индуцируемой гибели инфузории S. ambigua от температуры линеаризуется в аррениусовских координатах [Сыроешкин А.В. и др., 2001]. Оказалось, что измеряемая величина энергии активации ДМСО (диметилсульфоксид)-индуцируемой гибели является кажущейся, так как зависит от концентрации. Было обнаружено, что использование представлений о живой клетке как мультиферментном многофазном химическом реакторе позволяет описать взаимодействие S. ambigua с ДМСО как по механизму кооперативности Хилла, так и при применении уравнения изотермы адсорбции Фрейндлиха. По условиям линеаризации зависимостей времени жизни клетки от концентрации ДМСО при различных значениях температуры определен показатель степени n=9 при концентрации ДМСО в кинетическом уравнении, описывающем кинетику ДМСО-индуцируемой гибели. Определены истинные значения условной энергии активации процесса ДМСО-индуцируемой гибели S. ambigua. (Ea составила 200 кДж/моль).

Введение

Для описания кинетики развития клеточных популяции под действием ингибиторов и промоторов, при культивировании в ферментерах, при развитии раковых опухолей [1-4] успешно используется аппарат химической кинетики. С нашей точки зрения основа удачного применения квазихимических моделей состоит в адекватности представлений клетки как полиферментного химического реактора. В соответствии с этим деление клетки или ее

гибель есть интегральное отражение усиления или прекращения тех или иных ферментативных химических процессов. В предыдущей работе (Сыроешкин А.В. и др. Дормантные формы клеток и споры: кинетическая теория клеточных превращений, 2001. Исследовано в России) мы обосновали возможность такого подхода, как теоретически, так и при исследовании кинетики гибели инфузорий. Для инфузории S. ambigua обнаружено образование в процессе лиганд-индуцируемой гибели промежуточного состояния, эквивалентного комплексу фермента с субстратами/продуктами реакции, а также выявлена значительная зависимость кинетики гибели от температуры. В настоящей работе мы предприняли дальнейшее изучения кинетики лиганд-индуцируемой клеточной гибели S. ambigua для решения двух задач. Первая задача заключалась в поиске универсального физико-химического параметра, характеризующего ответа одноклеточной тест-модели на воздействие токсических соединений. В качестве таких параметров могут использованы энергия активации и предэкспоненциальный множитель в уравнении Аррениуса. Для этой задачи оптимально использование S. ambigua, который широко применяется как тест культура для токикологических и фармакологических исследований [5-9]. Вторая задача заключалась в дальнейшем развитии представлений о клетке, как квазихимическом полиферментном реакторе. В качестве лиганда, обладающего биологической активностью был выбран ДМСО (диметилсульфоксид). ДМСО как токсический агент действует по многим механизмам, влияя на все ферментные системы клетки и как лиганд, и как модификатор водных растворов и мембран микрофаз, изменяющий их вязкость и диэлектрическую проницаемость. Таким образом, выявление механизма действия ДМСО на клетку в целом с использованием аппарата химической кинетики является многоплановой задачей при оценке интегральной токсичности.

Методы

Spirostomum ambigua O.F.MÜller, 1786 (использовался штамм проф. Леонидова, ГНИИ "Биоэффект") - одна из наиболее широко распространённых спиральноресничных инфузорий (Spirostomidae, Heterotricha, Ciliophora), классический объект исследований в биологии клетки и при биоиндикации. В природных условиях сапротроф-детритофаг, часто обнаруживается в сильно загрязнённых и крайне микроанаэробных точках. Имеет лентовидную, несколько дорзо-вентрально уплощенную форму тела, около 1 мм длиной, соотношение длины тела к его ширине примерно 1 : 1 0, макронуклеус четковидный, ротовой аппарат доходит до задней трети тела. Будучи потревоженным, клетка даёт мгновенный ответ, сокращаясь по своей длине в 2-3 раза. Параметры сокращения зависят от температуры

[10]. Используемый штамм культивировали при концентрации 30-50 клеток/мл при температуре 20-24 оС. Штамм характеризовался высокой подвижностью как в горизонтальном, так и вертикальном направлении.

Установка для исследования температурной зависимости кинетики гибели состояла из следующих частей. 96-луночный планшет для иммуноферменьного анализа был размещен на твердотельном термостате фирмы "Биоком" (Москва). Контроль за стационарным значением температуры и однородностью нагрева по всей площади планшета осуществлялся с помощью безинерционного четырехканального электротермометра Т4К производства НПФ "ДНК-Технология" (Москва). Наблюдение за поведением инфузории вели визуально, либо с помощью бинокуляра, либо с помощью видеоприставки к бинокуляру (Фонд биологических исследований, Москва), соединенной с монитором. Для освещения использовали маломощные лампы (~ 1 0 Вт) дневного света.

В каждую из лунок планшета вносили по 300 мкл раствора ДМСО или дистиллированной воды. Далее в каждую из лунок отсаживали (без барбатирования) по одной инфузории S. ambigua стеклянной пипеткой с диаметром носика более 1 мм. Время жизни клетки рассчитывали как интервал от момента посадки до гибели клетки. Гибель клетки констатировали, либо по разрыву мембраны с выходом содержимого протоплазмы наружу, либо по обездвиживанию с отсутствием сократительной реакции на механическое раздражение. Для каждой концентрации токсиканта время жизни (tl) как среднее из 4-7 измерений. Относительная ошибка измерения времени жизни не превышала 1 6%. Для контроля дрейфа, температуру раствора рассчитывали как среднее между значениями на момент посадки инфузории в лунку планшета и на момент гибели по данным 2 датчиков электротермометра. Относительная ошибка измерения температуры не превышала 8%. На всем использованном интервале температур и времени инкубации не было отмечено ни гибели, ни угнетения активности, ни морфологических изменений клеток штамма в дистиллированной воде.

Результаты и их обсуждение

В предыдущей работе (Сыроешкин А.В. и др. Дормантные формы клеток и споры: кинетическая теория клеточных превращений, 2001. Исследовано в России) нами была показана аррениусовская зависимость кинетики гибели S.ambigua от температуры при действии 10% ДМСО. Оказалось, что линейный характер зависимости ln(zL) от (1/T) сохраняется и при других значениях концентрации ДМСО (рис. 1). Однако Ea является функцией концентрации токсиканта (табл. 1).

-6,5в -7,0

-8,0

34,27 ± 0,64 oC 5% DMSO

30,25 ± 0,23 °С#

3,24 3,26 3,28 3,30 1000/T, K-1

3,33 3,36 3,39 3,42 3,45 1/T, K-1

-4,0

-4,5-

Я -5,0'

-5,5

7,5% DMSO

\ 26,43 ± 0,04 °С 1

•

20,18 ± 0,15 °С\в

3,32 3,36 3,40

1/T, K-1

-4,0

-4,5

3,34 3,36 3,38 3,40 3,42 1/T, K-1

Рисунок 1. Зависимость времени жизни S. ambigua от температуры в аррениусовских координатах при различных концентрациях ДМСО. Рядом с крайними точками на графике указаны значения температуры в шкале Цельсия и относительная ошибка измерения температуры с учетом дрейфа в ходе наблюдения.

Таблица 1. Зависимость наблюдаемого значения энергии активации для процесса ДМСО-индуцированной гибели S. ambigua от концентрации токсиканта в среде.

№ Концентрация DMSO, % Кажущаяся энергия активации процесса гибели, obsEa (кДж/моль)*

1 5 292

2 7,5 173

3 8,5 222

4 10 157

<0,04

Следует подчеркнуть, что показатель В при экспоненте в уравнении Аррениуса k=Aexp(-B/T) определен как В=Ea/R для химических реакций в газовой фазе и используется в настоящем изложении условно, как привычная всем величина для определения степени зависимости скорости процесса от температуры. Зависимость наблюдаемой величины как Ea от [ДМСО] легко объяснить при использовании решения кинетической схемы гибели инфузории. В соответствии с кинетической квазиферментативной схемой клеточных превращений (см. предыдущую работу Сыроешкин А.В. и др., 2001, в данном журнале) препарат будет связываться с клеткой мишенью по следующей кинетической схеме (с1):

быстро

С (cell)+nL -

Kp

fm, медленно

Решение этой схемы для наблюдаемой константы скорости образования устойчивой формы:

fm Ct

obs

sf = Jm

K

p Ln

a

А выражение для периода "полужизни" будет иметь следующий вид:

Кр

1 + -

ьп

^ = _ (2), где a=const и зависит от числа условных

а/т центров связывания ДМСО на одной клетке. Из

этого уравнения видно, что в кроме частоты процесса гибели /т от температуры зависит и Кр, а, следовательно, концентрация токсиканта сложным образом войдет в показатель угла наклона при аррениусовской линеаризации.

Следует отметить, что уравнение (2) идентично уравнению Хилла (3) [11], представляющее собою решение кинетической схемы (с2), которое можно вывести как из формального уравнения элементарной химической реакции у=кС, так и с помощью уравнения адсорбции Фрейндлиха Г~(1/С)п, используя михаэлисовское приближение, то есть, при условии, что кС1и<<к. и ксаЛ<<к+8:

п8

V к+ ке&

Е ЕЯп............................... Е + пР

к.

Утах

= , где К=кЛ+ (3),

1 + К /рг

Из уравнения (2) следует, что зависимость от Ь'п должна быть прямой.

Линеаризация при п=9 зависимости времени жизни от концентрации ДМСО приведена на

рисунке 2 (А). Условия подбора параметра п были следующие:

1) прямые должны отсекать на оси ординат отрезки тТ (О численно равные 1/о/т, то есть зависимость тТ от температуры (тТ (Т)) должна линеаризоваться в аррениусовских координатах (рис. 2, В);

2) прямые при разных температурах должны пересекать ось абцисс в точке имеющей координаты, равные, в соответствии с уравнением (2), -Кр, причем Кр должна изменяться в зависимости от температуры по уравнению Кр= ехр^Л^/ЯТ);

3) значение п=9 является минимальным значением п, удовлетворяющим приведенным ниже условиям; при п>9 данные линеаризуются с меньшей достоверностью.

B

-5 0 5 10

1/[DMSO]n, M-n

3,36 3,38 3,40 3,42 1000/T, K-1

Рисунок 2. Зависимость времени жизни S. ambigua от концентрациях ДМСО при различных значениях температуры (A). На правом графике (B) представлена зависимость в аррениусовских координатах параметра TT=afm, полученного путем экстраполяции зависимостей tL ([DMSO]) к х=о (А).

t, oC

Рисунок 3. Зависимость константы равновесия связывания с ДМСО S. ambigua (схема с1) температуры. На вставке представлена линеаризация зависимости и указано уравнение прямой. Параметр Kp получен путем экстраполяции зависимости tL ([DMSO]) (рис. 2, A) к у=о.

Выполнение последнего условия подбора n показано на рис. 3. Согласно изобаре Вант-Гоффа величина ЛИ для процесса связывания ДМСО с клеткой (схема с1) составила 34±7 кДж/моль (рис. 3, определена из значения тангенса угла наклона прямой на вставке), что указывает на адсорбционный характер процесса. Из рисунка 2 (A) можно определить истинное значение энергии активации процесса гибели клетки, "насыщенной" ДМСО:

C-Ln -DC. Ea - составляет 200 кДж/моль.

Следует отметить, что подобные значения энергии активации получены для конформационных переходов NADH-убихинон оксидоредуктазы [12] - олигомерного фермента дыхательной цепи, состоящего из более чем 40 субъединиц. Это совпадение еще раз подтверждает правомочность редукционного рассмотрения клетки как полиферментной системы. Значение n=9 следует, с нашей точки зрения, рассматривать не столько как показатель кооперативности при условном связывании лиганда, сколько как отражение количества метаболических, транспортных и иных фунцкиональных комплексов, изменение фунцкионирования которых при "насыщении" клетки ДМСО приводит к ее гибели.

Литература

1. Ершов Ю.А. Квазихимические модели роста биологических популяций под действием ингибиторов и промоторов// Ж. физ. химии. - 1998. - Т. 72. - №3 - С. 553-559.

2. Варфоломеев С.Д., Калюжный С.В. Биотехнология. Кинетические основы микробиологических процессов, М., 1990.

3. Emanuel N.M. Kinetics and free-radical mechanisms of ageing and carcinogenesis// IARC Sci. Publ. -1985 - V. 58. P. 127-150.

4. Emanuel N.M. Kinetics and the free-radical mechanisms of tumor growth// Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1973. - V. 222. - P. 1010-1030.

5. Nalecz-Jawecki G., Sawicki J. Spirotox--a new tool for testing the toxicity of volatile compounds// Chemosphere. - 1999 - V. 38. - No. 14 -P. 3211-3218.

6. Nalecz-Jawecki G., Sawicki J. Toxicity of inorganic compounds in the Spirotox test: a miniaturized version of the Spirostomum ambiguum test// Arch. Environ. Contam. Toxicol. -1998. - V. 34. No.1. -P. 1-5.

7. Nalecz-Jawecki G., Rudz B., Sawicki J. Evaluation of toxicity of medical devices using Spirotox and Microtox tests: I. Toxicity of selected toxicants in various diluents// J. Biomed. Mater. Res. - 1997. -V. 35. No.1. P. 101-105.

8. Dikstein S., Hawkes R.B. Metabolically regulated cyclical contractures in microinjected Spirostomum: a pharmacological study// Experientia. - 1976 - V. 32. No.8. - P. 1029-1031.

9. Applewhite PB Drugs affecting sensitivity to stimuli in the plant Mimosa and the protozoan Spirostomum// Physiol. Behav. - 1972 - V. 9. No. 5. P. 869-871.

10. Hawkes R.B., Holberton D.V. Myonemal contraction of Spirostomum. III. The thermal dependence of contraction, relaxation and excitation-contraction coupling// J. Cell. Physiol. 1975. V. 87. No.2. - P. 253-263.

11. Келети Т. Основы ферментативной кинетики. - М.: Мир, 1990. - 350 с.

12. Maklashina E.O., Sled' V.D., Vinogradov AD. Hysteresis behavior of complex I from bovine heart mitochondria: kinetic andthermodynamic parameters of retarded reverse transition from the inactive toactive state // Biokhimiia. - 1994. -V. 59. - Вып. 7. - P. 946-957.