Влияние холодового стресса на функциональную активность перитонеальных макрофагов в условиях блокады опиатных рецепторов

2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue

Экспериментальные модели Experimental models

после адоптивного переноса клеток и иммунизации у мышей-реципиентов получали селезенки и определяли в них число АОК и ИГОК.

Результаты. Добавление ВРАБЭ индуцировало иммунный ответ в смешанных культурах: прирост числа АОК для культуры с В2-клетками составил 478±190/106 клеток, а числа ИГОК — 3745±2565/106 клеток. Для культуры с В1-лимфоцитами соответствующие показатели составили для АОК 345±186/106, а для ИГОК — 13133±6023/106 клеток. Внесение в верхнюю камеру Вконтр в культуре с В2-лимфоцитами приводило к увеличению прироста АОК и ИГОК ~ в 2 раза. Добавление Вreg значительного влияние на прирост АОК и ИГОК не оказывало. На культуру, содержащую В1-клетки, Вконтр и Вreg действовали по-другому. Внесение в верхнюю камеру Вконтр почти не влияло на образование АОК и ИГОК, индуцированных ВРАБЭ. В то же время добавление в верхнюю камеру Breg уменьшало в смешанной культуре с В1-лимфоцитами прирост АОК с 344±185/106 до значения 201±94/106 и ИГОК -с 13133±6023/106 до 7045±1924/106 клеток.

Таким образом, Вreg угнетали индуцированный ВРА-БЭ специфический и поликлональный иммунный ответ в культурах с В1-лимфоцитами. Очевидно, что это угнетение в значительной степени обусловлено выделяемым Вreg-клетками IL-10.

Для исследования влияния Breg на иммунный ответ на ВРАБЭ in vivo была использована модель адоптивного переноса. Оказалось, что Breg, перенесенные одновременно с введением ТЗ АГ конгенной линии мышей CBA/N, способствовали снижению прироста числа АОК на 31%. Это свидетельствует о том, что in vivo Breg могут угнетать первичный специфический ответ на ТЗ АГ. Вконтр не оказывали такого влияния на иммунный ответ. Таким образом, данные in vivo о влиянии Breg на иммунный ответ согласуются с результатами исследований, полученными в модельной системе in vitro.

Заключение. Установлено, что Breg оказывают угнетающее действие на образование АТ-продуцентов на ТЗ АГ (ВРАБЭ) в модельной системе in vitro и при адоптивном переносе in vivo.

ВЛИЯНИЕ МП-5 И МП-6 НА МИКРОБИЦИДНУЮ АКТИВНОСТЬ И ПРОДУКЦИЮ IL-1 ß И IL-10 ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМИ МАКРОФАГАМИ ПРИ СТРЕССЕ

Гаврилова Т.В.4, Гейн C.B.1, 3, Никитина A.A.3, Гейн О.Н.6, Черешнева М.В.2, Черешнев В.А.2, Кирилина Е.А.4

1ФГБУН«Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН, Пермь, Россия

2 ФГБУН «Институт иммунологии и физиологии» УрО РАН, Екатеринбург, Россия

3 ФГБОУВПО «Пермский государственный научно-исследовательский университет», Пермь, Россия

4 ФГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет им. академика Е.А. Вагнера», Пермь, Россия

5 ФГБУН «Институт биоорганической химии им.

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН, Пермь, Россия

6 ФГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия», Пермь, Россия

Введение. Миелопептиды - группа короткоцепочных биорегуляторных молекул пептидной природы, обладающая широким спектром иммунорегуляторной активности за счет возможного направленного влияния отдель-

ных пептидных фракций на различные звенья иммунной системы.

Цель. Исследовать влияние миелопептидов МП-5 и МП-6 на продукцию активных форм кислорода, IL-ip и IL-10 перитонеальными макрофагами мышей на фоне иммобилизационного стресса in vivo.

Материалы и методы. Эксперименты в системе in vivo выполнены на мышах-самцах породы Swiss, массой 17-22 г. В качестве стрессорного воздействия использовался 2-часовой иммобилизационный стресс. МП-5 или МП-6 вводили внутрибрюшинно за 30 минут до начала стресса в дозе 40 мкг/кг. Оценку продукции активных форм кислорода перитонеальными клетками производили с помощью реакции люминолзависимой хемилю-минесценции. Для оценки продукции цитокинов пери-тонеальные макрофаги культивировали в 24-луночных планшетах 106 клеток в 1 мл полной культуральной среды. Количественное определение IL-ip и IL-10 проводили с помощью наборов (R&D, США).

Результаты. Уставновлено, что иммобилизационный стресс не влиял на спонтанную продукцию активных форм кислорода. Миелопептид МП-5 стимулировал спонтанную продукцию активных форм кислорода макрофагами, в то время как статистически значимых эффектов МП-6 на спонтанную ЛЗХЛ зарегистрировано не было. При анализе стимулированной ЛЗХЛ было установлено, что стресс угнетал продукцию активных форм кислорода в зимозан-стимулированных культурах, а МП-5 отменял эффект стресса. В группах животных, подвергнутых стессу на фоне введения МП-6, наблюдалось усиление продукции активных форм кислорода по сравнению с контрольной группой и с группой животных, подвергнутых стрессу. В дальнейшем мы оценивали влияние МП-5 и МП-6 при стрессе на продукцию IL-ip и IL-10. Стресс угнетал зимозан-ин-дуцированную продукцию IL-ip, предварительное введение мышам МП-5 и МП-6 стресс-индуцированное угнетение IL-ip отменяло. На продукцию IL-10 стресс влияния не оказывал, в то же время наблюдалось выраженное снижение спонтанной и стимулированной продукции IL-10 в группе животных, подвергнутых стрессу на фоне введения МП-5.

Заключение. Таким образом, миелопептиды МП-5 и МП-6 оказывают модулирующее действие на функции стимулированных зимозаном перитонеальных макрофагов, отменяя стресс-индуцированное угнетение продукции активных форм кислорода и IL-ip. В общем полученные нами данные указывают на перспективность дальнейшего исследования иммуномодулирующих эффектов МП-5,6 и других отдельных миелопептидов.

Работа поддержана грантом РФФИ !6-44-590!56-р-а.

ВЛИЯНИЕ ХОЛОДОВОГО СТРЕССА НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ В УСЛОВИЯХ БЛОКАДЫ ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ

Гейн С.В.1 2, Шаравьева И.Л.1

1 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

2 Пермский государственный научно-исследовательский университет, Пермь, Россия

Введение. Холодовой стресс — стрессорное воздействие, вызванное низкой температурой окружающей

«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017

Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya

среды. Хорошо известно, что переохлаждение вызывает характерный для любого стресса гормональный сдвиг, ухудшает двигательные и когнитивные функции, модулирует продукцию IL-ip, TNFa, IL-6, IL-10. Роль опио-идных пептидов в регуляции функций клеток иммунной системы при стрессе заслуживает особого внимания, поскольку секретируемые при стрессе в периферическую кровь опиоидные пептиды, оказывают стресс-протективный, обезболивающий и иммунорегулятор-ный эффекты.

Цель и задачи. Исследовать влияние блокады опиат-ных рецепторов на уровень кортикостерона в плазме крови, продукцию активных форм кислорода, IL-ip, TNFa, IL-10 перитонеальными макрофагами при остром холо-довом стрессе у мышей in vivo.

Материалы и методы. Эксперимент выполнен на белых мышах самцах массой тела 20-22 г. Мыши подвергались острому переохлаждению при -20 °С в течение 10 или 60 минут. Антагонист опиатных рецепторов налок-сона гидрохлорид вводили в дозе 0,2 мг/кг подкожно за 20 мин до стресса. Через 1 час после окончания стрес-сорного воздействия мышей выводили из эксперимента методом декапитации под эфирным наркозом. Оценку продукции активных форм кислорода перитонеальными макрофагами осуществляли с использованием реакции люминолзависимой хемилюминесценции. Для определения продукции цитокинов перитонеальные макрофаги культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной фетальной сыворотки, 100 ЕД/мл гентамицина, в 24-луночных планшетах, содержащих 2,5 х 106 клеток на лунку. Через 24 часа супернатанты собирали в пробирки «Эппендорф», замораживали и хранили при -20 °С. Определение концентрации цитокинов в супернатантах клеточных культур проводили с использованием иммуноферментных тест-систем R&D (США). Концентрацию кортикосте-рона в плазме крови определяли иммуноферментным методом с использованием тест-систем Enzo (США). Статистическая обработка результатов проведена с использованием двухфакторного дисперсионного анализа и LSD-критерия для межгруппового сравнения. Все данные на рисунках представлены в виде средней и ее стандартной ошибки.

Результаты. Установлено, что экспозиция мышей при -20 °С в течение 10 мин приводила к угнетению продукции АФК макрофагами, эффект нивелировался на фоне введения налоксона. В группе животных, подвергнутых 60 мин стрессу, напротив, наблюдалась налоксон-зависимая стимуляция продукции АФК. Оба варианта холодового стресса не оказывали значимого влияния на продукцию IL-ф. Продукция TNFa на фоне 60 мин охлаждения налоксон-зависимо стимулировалась как в спонтанных, так и в зимозан-сти-мулированных культурах. Продукция макрофагами IL-10 усиливалась независимо от продолжительности холодового воздействия, в условиях стимуляции и без нее, и отменялась на фоне блокады опиатных рецепторов.

Заключение. Таким образом, направленность действия острого холодового стресса на функции макрофагов зависела как от исследуемого параметра, так и времени воздействия, при этом блокада опиатных рецепторов существенно модифицировала иммунорегуляторные эффекты переохлаждения.

Работа поддержана грантом РФФИ № 14-04-96002-р-а.

ВЛИЯНИЕ СИСТЕМНОЙ БЛОКИРОВКИ TNF НА РОСТ И МЕТАСТАЗИРОВАНИЕ MCA 205 ФИБРОСАРКОМЫ IN VIVO

Гоголева В.С.1, 2, Атретханы К.-С. Н.1, 2,

Носенко М.А.1, 2, Недоспасов С.А.1, 2 3, Друцкая М.С.1, 2

1ФГБУН«Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН, Москва, Россия

2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия

3 Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия

Фактор некроза опухолей (TNF) — цитокин с широким спектром действия, выполняющий важную роль в иммунной регуляции и воспалении. На данный момент блокаторы TNF широко применяются в терапии аутоиммунных заболеваний (Drutskaya M.S. et al., 2010). Роль TNF в развитии опухолей неоднозначна (Balkwill F., 2009). Одной из функций TNF в опухолевом микроокружении является поддержание метастазирования. При этом 90% случаев смерти онкологических больных связано именно с возникновением метастазов, а не первичной опухолью (Lambert A.W et al., 2017). Изучение роли TNF в метастазировании актуально не только с точки зрения понимания молекулярных механизмов метастатического каскада, но может также иметь клиническое значение.

Цель. Исследование роста и метастазирования перевиваемой опухолевой линии МСА 205 фибросаркомы у мышей на фоне системной анти-TNF терапии.

Работу проводили на гуманизированных по TNF мышах, которым каждые три дня вводили блокаторы TNF инфликсимаб или этанерцепт, а контрольной группе — PBS. Опухолевые клетки МСА 205 фибросаркомы вводили через неделю после начала применения блокаторов TNF. Объем опухоли измеряли каждые 3-5 дней. В конце эксперимента проводили анализ различных популяций спленоцитов методом проточной цитофлуориметрии, оценивали уровень экспрессии генов в опухоли методом ПЦР в реальном времени, осуществляли иммуногистохи-мический анализ опухолевых образцов, а также изучали развитие миелоидных клеток in vitro на фоне нейтрализации TNF.

В ходе данной работы было обнаружено, что фармакологическая блокировка TNF приводит к замедлению роста опухолей у самок, что коррелирует с уменьшением накопления миелоидных супрессорных клеток, обладающих проопухолевой активностью (Atretkhany K.S. et al., 2016). Кроме того, мы обнаружили, что нейтрализация TNF влияет на развитие миелоидных клеток: при дифференцировке in vitro в присутствии блокаторов TNF моноцитарная популяция незрелых миелоидных клеток в большей степени подвержена клеточной смерти. Системная нейтрализация TNF у самцов не влияла на первичный рост опухоли, но на более позднем этапе предотвращала возникновение метастазов. При нейтрализации TNF происходило понижение экспрессии анги-огенных и супрессорных белков, таких как Hif1a, Vegfa, Fgf2 и Icam1, в опухолевых образцах. Иммуногистохими-ческий анализ показал, что нейтрализация TNF может приводить к подавлению ангиогенеза.

Таким образом, мы обнаружили, что TNF необходим для роста перевиваемой опухолевой линии MCA 205 фи-