Характеристика иммунного гомеостаза и эпителиально-стромальных взаимоотношений в слизистой оболочке бронхов практически здоровых лиц

тивность фагоцитарных реакций у животных, получающих антиоксидант на фоне хронического лучевого воздействия, повышается: фагоцитарное число составило 37,5±2,86, фагоцитарный индекс составил 3,4±0,24, однако этот уровень не достигает контрольных показателей.

Выводы

1. При хроническом лучевом воздействии зарегистрировано нарушение иммунорегуляторных взаимоотношений с угнетением Т-звена иммунитета (за счет снижения популяций СД4 и 0-лимфоцитов), угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов и нарушение продукции антител.

2. При применении препарата ТВ-103 (производного пиримидина) отмечен иммуномодулирующий эффект: возрастает эффективность фагоцитарных реакций, повышается уровень выработки антител, снижается степень нарушения иммунорегуляции.

3. Полученные результаты открывают перспективы использования антиоксиданта - производного пиримидина ТВ-103 в качестве протекторного и иммуномодулирующего средства для защиты организма от реакций свободнорадикального окисления на фоне общего лучевого воздействия в онкологии, а также при неблагоприятных воздействиях окружающей среды.

Литература

1. Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Клебанов Г.И. и др. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 1999. №2. С. 45-49.

2. Немцова Е.Р., Сергеева Т.В., Безбородова Е.А. и др. // Российский онкологический журнал. 2003. №5. С. 48-53.

3. Коненков В.И., Труфакин В.А. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2002. №3. С. 312-316.

УДК 611.23 - 018.73 612.017]: 616 - 002]: 616 - 022.361

Т.Ф. Боровская, Э.Х. Курпас, A.B. Волков, С.Н. Гориславец

ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУННОГО ГОМЕОСТАЗА И ЭПИТЕЛИАЛЬНО-СТРОМАЛЬНЫХ ВЗАИМООТНОШЕНИЙ В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ БРОНХОВ ПРАКТИЧЕСКИ ЗДОРОВЫХ ЛИЦ

Хабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства; 301 Окружной клинический военный госпиталь, г. Хабаровск

В основе патогенеза различных воспалительных заболеваний и, в частности, в формировании местного иммунного ответа органов дыхания лежит миграция иммунных клеток в слизистую оболочку дыхательных путей и легочную паренхиму и развитие местной воспалительной реакции [1], а рекрутизация отдельных пулов клеток и последующее ремоделирование дыхательных путей происходит вследствие ци-токинопосредованных реакций [7, 9, 13]. Известно также, что рекрутизация и трансэпителиальная миграция иммуноцитов при воспалении происходит под влиянием соответствующих хемоаттрактантов, в том числе цитокинов [ 11 ]. В физиологических условиях, при отсутствии такого градиента, движение клеток носит беспорядочный характер и называется "спонтанной миграцией" [12].

В связи с этим значение иммунных клеток и их продуцентов в сохранении структуры пограничных тканей, и в том числе слизистых оболочек дыхательных путей, трудно переоценить, а знание состава им-мунокомпетентных клеток слизистых оболочек и уровня секретируемых ими цитокинов при физиологических условиях позволит правильно оценить степень выраженности местного воспаления и адекватно регулировать локальный иммунный ответ с целью ликвидации воспаления и восстановления структурного гомеостаза

Материалы и методы

Исследовали показатели системного и местного иммунитета, уровень ІЬ-6, ІБ-4, С-СБР, 'ПчтР-а, ЮТ-у в супернатанте лимфоцитов СОКБ от 12 пациентов,

госпитализированных в стационар по поводу удаления инородного тела бронха (группа практически здоровых лиц). Фенотип иммуноцитов определяли методом иммунофлюоресценции в трех биологических средах: периферической крови, бронхиальных смывах и слизистой оболочке крупных бронхов (СОКБ). Уровень пролиферативной активности клеток эпителия и собственной пластинки СОКБ изучали двумя методами: авторадиографии с 3Н-тимидином и иммуногистохимии с PCNA.

Иммунофенотипирование клеток крови, бронхиальных смывов и СОКБ проводили в соответствии со стандартизованным методом иммунофлюоресценции [8]. Для проведения иммунофлюоресцентного анализа количественного состава и определения уровня цитокинов в супернатанте иммунных клеток клеточную суспензию лимфоцитов СОКБ получали по методике С.Л. Нестерчук и др. [-4]. Образцы анализировали на проточном цитофлюориметре “FACScan” фирмы “Beckton Dickinson” (США). Для идентификации иммунных клеток пользовались моноклональными антителами фирмы “Caltag” (Burlingame, СА), применяемыми как для клинических, так и для исследовательских целей.

Инкубацию лимфоцитов для получения супернатанта клеток проводили в соответствии с модификацией, предложенной А.А.Останиным с соавт [5]. Определение уровня IL-4, IL-6, TNF-a, INF-y, G-CSF в супернатанте лимфоцитов СОКБ проводили с помощью наборов реактивов “R&D Diagnostics Inc.” (USA) методом ИФА по приложенной стандартизованной методике. Проведение методики и учет результатов производили с помощью ридера “Ultra Microplate Reader ELX 808ju” (Biotek instruments inc.). Расчеты уровня цитокинов проводили путем построения калибровочной кривой с помощью компьютерной про-

I, ' граммы и выражали в иг/мл.

Материалом для иммуногистохимического и авторадиографического исследования служила ткань СОКБ, полученная методом щипковой биопсии в области долевого бронха справа. Иммуногистохимия имеет своей целью установление локализации антигенов в различных компонентах тканей, типах клеток и клеточных структурах. С целью определения фенотипа иммунных (CD45RO (OPD4), CD45RO (UCHL1), НАМ 56, CD68 (PG-M1), NK1, CD20cy (В cell), Plasma cell, IgG (A57H), IgA (6E2C1) и IgM) и пролиферирующих (Proliferating Cell Nuclear Antigen — PCNA- PC 10) клеток био-птаты фиксировали в 10% нейтральном формалине (pH 6,8-7,2) в течение 24 ч. Обезвоживание тканей, приготовление блоков, срезов и их фиксацию на предметных стеклах проводили в соответствии с рекомендациями [3, 6].

С целью погашения неспецифического окрашивания и для подавления эндогенной активности перок-сидазы использовали блокирующий реагент фирмы "DAKXX", код S2001, иЗ% раствор перекиси водорода. Инкубацию со специфическими антителами и выявление продукта реакции проводили согласно стандартным протоколам LSAB с использованием наборов компании "DAKO" (КО 690 LOT 107-2). При необходимости проводили окрашивание срезов ядер-

Резюме

Изучали показатели системного и местного иммунного ответа. Выявлено, что популяционный состав иммунных клеток в различных биологических средах (периферической крови, бронхиальных смывах и слизистой оболочке крупных бронхов) имеет значимые отличия. Показатели цитокинового профиля (IL-6, IL-4, G-CSF, TNF-a , INF-y ) в супернатанте лимфоцитов слизистой оболочки бронхов здоровых лиц при воздействии ФГА не увеличивались. Изучение топологии иммунных клеток методом иммуногистохимии показало, что в клетках собственной пластинки доля содержания иммуноцитов выше, чем в эпителиальном слое, а их спектр шире - дополнительно регистрируется наличие субпопуляций Natural killer cell-like (NK1), HAM56, Plasma Cell (VS38c), IgG (A57H), IgM.

T.F. Borovskaya, E.H. Kurpas, A.V. Volkov,

S.N. Gorislavets

IMMUNE HOMEOSTASIS AND EPITHELIAL -STROMAL INTERRELATIONS AT THE BRONCHI MUCOUS OF HEALTHY PERSONS

Khabarovsk subsidiary of state organization Far eastern research center of respiratory pathology and physiology Siberian Branch of Russian Academy of Medical Sciences - Mother and child care institute;

301 Regional clinical military hospital, Khabarovsk

Summary

Local and system immune response indexes examined Revealed, that population content of immune cells in the different biological substances (peripheral blood, bronchi lavage fluid and bronchi mucous) has marked differences. Cytokine profile indexes (IL-6, IL-4, G-CSF, TNF-a , INF-y) in the healthy persons bronchi mucous lymphocyte supernatant did not change with incubation’s conditions changes. Immune cells topology investigation by immunohistochemistry method revealed that the content of lymphocytes higher among the cells of lamina propna in comparison with epithelial layer, and their spectrum is more wide - additional subpopulations of natural killer cell-like (NK-1), HAM56, Plasma Cell (VS38c), IgG (A57H) and IgM were registered.

ным красителем, обезвоживали в спиртах и заключали в канадский бальзам.

Для определения показателей клеточного деления СОКБ биоптаты обрабатывали согласно принятой в ЦНИЛ Дальневосточного государственного медицинского университета методике [10]. Обработку радиоавтографов осуществляли по общепринятым методикам [2].

Результаты и обсуждение

При исследовании популяционного и субпопуля-ционного состава иммунных клеток в различных биологических средах практически здоровых лиц (табл. 1) в периферической крови выявлен достоверно высокий уровень СОЗ+ клеток, представляющих собой пул зрелых Т-лимфоцитов, СВА+ клеток, характеризующих субпопуляции зрелых Т-хелперов и моноцитов, С05+ клеток, характеризующих попу-

Сравнительная характеристика показателей системного и местного иммунитета СОКБ у здоровых лиц, %

Показатель Периферическая кровь, n-12 Бронхиальные смывы, п=12 СОКБ, п-12 Достоверность

р Pi Р2

CD3+ 50,06+4,21 33,61 ±4,56 33,55+4,21 <0,02 <0,02 >0,05

CD22+ 27,67+3,15 32,33±4,34 24,53+3,51 >0,05 >0,05 >0,05

CD4+ 39,33+3,76 26,35±3,50 29,26++3,14 <0,02 <0,05 >0,05

CD8+ 32,17+3,76 21,56+2,81 23,73+3,86 >0,05 >0,05 >0,05

CD25+ 29,58+3,64 24,62±4,42 24,70+4,01 >0,05 >0,05 >0,05

CD 16+ 20,86±3,72 24,90+4,36 26,06+3,60 >0,05 >0,05 >0,05

HLA-DR+ 30,52±2,34 21,96+4,90 25,21±3,41 >0,05 >0,05 >0,05

IRI 1,31+0,12 1,23+0,08 1,32+0,16 >0,05 >0,05 >0,05

CD7+ 44,47±5,96 . 17,33+2,36 29,20+1,23 <0,001 <0,02 <0,001

CD5+ 35,98±5,16 12,82±3,77 18,41 ±3,77 <0,002 <0,05 >0,05

CD45+ 20,92±3,80 20,47+1,89 20,03±3,45 >0,05 >0,05 >0,05

CD38+ 31,39+3,71 28,37±4,26 17,01 ±2,48 <0,05 <0,005 <0,05

CDllb+ 23,86±4,98 22,93±6,01 13,41±2,71 >0,05 >0,05 <0,05

CD14+ 24,17+3,60 21,14+4,73 26,91±1,61 >0,05 >0,05 >0,05

CD50+ 19,20±4,12 17,34±2,46 16,65±2,52 >0,05 >0,05 >0,05

CD71 + 28,77+3,51 17,30+3,03 21,68±2,89 >0,05 >0,05 >0,05

CD95+ 28,00+4,53 16,06±3,83 14,35±5,56 >0,05 >0,05 >0,05

lgM+ 39,20±5,04 22,74±4,66 - >0,05

IgG+ 35,29±3,90 33,58±5,38 27,72±2,42 >0,05 >0,05 >0,05

CD45RA+ 33,24+5,37 22,91 ±3,54 22,56±2,87 >0,05 >0,05 >0,05

CD18+ 19,40±2,66 24,20+3,44 17,70±3,11 >0,05 >0,05 >0,05

Примечания, р — достоверность различий между показателями в периферической крови и в бронхиальных смывах в группах сравнения; р, — достоверность различий между показателями в периферической крови и в СОКБ в группе сравнения; р2 — достоверность различий между показателями в бронхиальных смывах и в СОКБ в группе сравнения.

к'

/_

ляции всех Т-лкмфоцитов и субпопуляцию В-кле-ток по сравнению с их уровнем в бронхиальных смывах и в СОКБ. Число СВ38+, характеризующее субпопуляции тимоцитов, активированных Т- и плазматических клеток, в СОКБ было достоверно ниже в сравнении с данным показателем в периферической крови и бронхиальных смывах, а уровень СВ7+-клеток, характеризующих все Т-клетки и КК-клет-ки, был достоверно отличным во всех сравниваемых группах. При этом наиболее высокое их значение регистрировали в периферической крови, а низкое — в бронхиальных смывах. Исследование уровня цитокинов в супернатанте лимфоцитов СОКБ показало (табл. 2), что в физиологических условиях при стимуляции лимфоцитов ФГА усиления секреции 1Ь-6,1Ь-4, С-СБР, Т№-а, ШБ-у не происходит. При этом уровни спонтанной секреции 1Р-6 и Т^-а были в 1,24 раза выше (р<0,02 и р<0,001 соответственно), чем стимулированной ФГА. Концентрации 1Б-4, С-СБР и ЮТ-у сохранялись на прежнем уровне при изменении условий инкубации. По-видимому, в физиологических условиях секреция цитокинов стабильна и регулируется воздействием одного или совокупностью нескольких продуцентов иммун-

ных клеток, что, возможно, является одним из факторов сохранения структурного гомеостаза слизистой оболочки.

При определении фенотипа и топографии иммуно-цитов СОКБ методом иммуногистохимии выявлено, что в эпителиальном слое слизистой оболочки бронхов практически здоровых лиц локализуется значительно меньшее число клеточных популяций (табл. 3) (CD45RO, Т Cell (OPD4), CD45RO, Т Cell (UCHL1), CD20cy, В Cell (L26), CD68 (PG-M1), IgA (6E2C1)), чем в собственной пластинке. Содержание Т-лимфоцитов хелперов/индукторов (CD45RO, Т Cell (OPD4)) в эпителии было в 4 раза меньше, чем в собственной пластинке, 'Г-лимфоцитов/цитотоксических (CD45RO, Т Cell (UCHL1)) - в 4,4 раза, В-иммуно-бластов (CD20cy В Cell (L26)) — в 5 раз, неактивированных макрофагов (CD68 (PG-M1)) — в И раз и в 1,8 раза IgA-клеток (6Е2С1). При этом NK1 (Natural killer cell-like), НАМ56 (активированные макрофаги), Plasma Cell (VS38c), IgG (A57H), IgM-клетки в эпителии не регистрировали.

Физиологическую регенерацию изучают по состоянию пролиферации клеточных популяций, которую можно исследовать несколькими методами. Прове-

Уровень дитокинов в супернатанте лимфоцитов СОКБ спонтанной и стимулированной ФГА у практически здоровых лиц

Показатель Спонтанный, п=12 Стимулировании й ФГА, п-12 Р

IL-6 25,5± 1,52 20,50+1,06 <0,02

IL-4 7,50+0,25 7,00±1,32 >0,05

G-CSF 2,36+0,21 2,01±0,13 >0,05

TNF- а 261,85± 1,48 212,95±2,38 <0,001

INF-y 243,60±6,05 239,25±2,26 >0,05

Примечание, р — достоверность различий между показателями уровня цитокипов спонтанного и стимулированного ФГА.

Таблица 3

Показатели морфометрии клеточных элементов эпителиального слоя и собственной пластинки СОКБ здоровых лиц, выявленные методом иммуногистохимии, %

Показатель Эпителий, n-12 Строма, n-12 P

CD45RO, Т Cell (OPD4) 5,90+0,59 23,75±1,19 <0,001

CD45RO, Т Cell (UCHL1) 4,31±0,46 19,05±0,63 <0,001

CD20cy, В Cell (L26) 1,12+0,24 5,69+0,18 <0,001

Natural killer cell-like (NK1) 0 0,94+0,30 -

HAM56 0 2,50+0,23 -

CD68(PG-M1) 0,26+0,16 2,85+0,22 <0,001

Plasma Cell (VS38c) 0 2,93+0,25 -

IgM 0 0,27+0,05 -

IgG (A57H) 0 0,16±0,03 -

IgA (6E2C1) 1,44+0,24 2,66±0,24 <0,01

Примечание, р — достоверность между показателями числа иммунных клеток в эпителиальном слое и собственной пластинке ' СОКБ.

/.

денное параллельное изучение процессов синтеза ДНК в эпителии и собственной пластинке СОКБ двумя методами выявило (табл. 4), что показатели индекса меченых ядер (ИМЯ) эпителия и клеток стро-мы, полученные методом иммуногистохимии с помощью РСКА, в 3,7 раза и в 3,3 раза выше (р<0,001 и р<0,02 соответственно) тех же показателей, полученных при использовании метода авторадиографии с ЗН-тимидином, что, по-видимому, связано с тем, что при изучении процессов синтеза ДНК методом авторадиографии с 3Н-тимидином ИМЯ характеризует число клеток, вступивших в Б-период, а при использовании метода иммуногистохимии с РС^ — число клеток, находящихся в С,, С2, Б и М-периодах клеточного цикла [6].

ИМЯ — число меченных определенным маркером клеток можно выявить обоими способами. ИМ — показатель интенсивности метки, характеризующий скорость синтеза ДНК опосредованно, через число зерен серебра над ядром, учитывается только при использовании метода авторадиографии и определяет два основных фактора: скорость репликации ДНК по длине единицы репликации — репликону и число реп-

Показатели синтеза ДНК в эпителиоцитах и строме СОКБ здоровых лиц, полученные разными методами

Показатель Методы Р

авторадиография с 3Н-тимидином, п-12 иммуногистохимия cPCNA, п=10

ИМЯ эпителия 2,06+0,16 7,58+0,34 <0,001

ИМ эпителия 8,52±0,24 - -

ИМЯ стромы 1,12±0,43 3,67±0,88 <0,02

ИМ стромы 3,75±0,84 - -

Примечание, р — достоверность между показателями клеточного деления методом авторадиографии и иммуногистохимии.

ликонов, участвующих в репродукции в течение изучаемого отрезка времени.

Применяемый в авторадиографических исследованиях критерий интенсивности синтеза ДНК, а именно среднее число зерен серебра на меченое ядро, полностью учитывает влияние обоих факторов. На основании изменения этого показателя судят о замедлении или ускорении прохождения клетками S-пери-ода, что и является одним из преимуществ метода авторадиографии с 3Н-тимидином. Достоинством же метода иммуногистохимии с PCNA являются более короткие сроки проведения методики (1 (2) сут против 10 (30) дн.).

Выводы

1 Характер распределения основных популяций клеток лимфоидного ряда в различных биологических средах (периферическая кровь, бронхиальные смывы и СОКБ) практически здоровых лиц имеет определенные различия.

2. Концентрации в супернатанте лимфоцитов СОКБ у практически здоровых лиц IL-4, G-CSF и INF-y сохранялись на прежнем уровне при изменении условий инкубации. При этом уровни спонтанной секреции IL-6 и TNF-oc были достоверно выше, чем стимулированной ФГА.

3. В эпителиальном слое СОКБ у лиц без патологии органов дыхания доля содержания иммуноцитов ниже (CD45RO (Т Cell-OPD4), CD45RO (Т Cell-UCHL1); CD20cy (В Cell-L26); CD68 (PG-M1); IgA (6E2C1)), чем в клетках собственной пластинки, а их спектр меньше. В эпителиальном слое неизмененной СОКБ субпопуляции Natural killer cell-like (NK1), HAM56, Plasma Cell (VS38c), IgG (A57H), IgM не определялись.

4. Использование методов авторадиографии с 3Н-тимидином и иммуногистохимии с PCNA для изучения процессов клеточного деления показало, что комплексное использование различных методических подходов позволяет более полно оценить процессы клеточной пролиферации эпителиальных тканей.

Работа выполнена при участии Регионального общественного Фонда содействия отечественной медицине.

Литература

1. Боровская Т.Ф. Значение иммуноцитов в поддержании гомеостаза слизистых оболочек. Хабаровск, 2004. С. 21.

2. Епифанова О.И., Терских В.В., Захаров А.В. Радиоавтография. М.: Высшая школа, 1977. 246 с.

3. Завалишина Л.Э., Литвинова Л.В. // Архив пат. 1997. №4. С. 63-65.

4. Нестерчук С.Л., Сулейманова Н.С., Ткаченко

Э.Р. и др. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1994. №1. С. 68-71.

5. Останин A.A., Макагон А.В., Леплина О.Ю. и др. // Медицинская иммунология. 2001. Т. 3. №4. С. 515-524.

6. Рук-во по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / Под ред. С.В. Петрова и Н.Т. Райхлина. Казань, 2000. 288 с.

7. Система цитокинов. Теоретические и клинические аспекты / Под ред. В. А. Козлова, С.В. Сенникова. Новосибирск: Наука, 2004. С. 255-269.

8. Стандартизация методов иммунофенотипиро-вания клеток крови и костного мозга человека: Метод. рек. // Мед. иммунология. 1999. Т.1. №5. С. 21-43.

9. Система цитокинов и болезни органов дыхания / Под ред. Б.И. Гельцера, Е.В. Просековой. Владивосток: Дальнаука, 2005. 255 с.

10. Тимошин С.С., Панькова Т.Д., Титов М.И. // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1987. Т.104. №8. С. 229-230.

11. Фрейдлин И.С., Кузнецова С.А. // Медицинская иммунология. 1999. Т.1. №1-2. С.27-36.

12. Bona С., Bonilla F. Textbook of immunology. Amsterdam, 1996. 406 p.

13. KipsJ., Toumoy K.G., Pauwels R.A. // Eur.Respir. J. 2001. Vol. 17, P. 499-506.

УДК 612.017.2 :612.11:612.36

Т.Ф. Боровская, Е.В. Пичуева, Е.А. Левкова, Е.В. Мокрецова

КОМПЛЕКСНАЯ ОЦЕНКА ИММУННОГО ГОМЕОСТАЗА ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ ТОЛСТОЙ КИШКИ В НОРМЕ

Хабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН - НИИ охраны материнства и детства; Дальневосточный государственный медицинский университет, г. Хабаровск

Иммунная система представляет собой сложнейший механизм взаимодействия органов, тканей и отдельных иммунокомпетентных и дополнительных клеток, обеспечивающих устойчивый гомеостаз организма в различных условиях окружающей среды. Лимфоидные клетки интенсивно рециркулируют между лимфоидными органами и нелимфоидными тканями через лимфатические сосуды и кровь [10], осуществляя иммунный контроль в организме.

Лимфоидная ткань включена в структуру собственной пластинки слизистых оболочек, в том числе желудочно-кишечного тракта. Кишечно-ассоциированная лимфоидная ткань содержит не менее чем 50-60% всех лимфоцитов тела человека [2] и представлена диффузно распределенными в эпителии лимфоцитами, плазматическими клетками, фагоцитами, а также одиночными лимфоидными фолликулами, расположенными под эпителием в слизистой оболочке

и в подслизистой основе на всем протяжении пищеварительного тракта [7].

Под действием специфических (тканевых, бактериальных, вирусных и др.) и неспецифических мито-генов (в том числе растительных лектинов - конкана-валина А (КонА) и фитогемагглютинина (ФЕ А) бластогенеза возможна трансформация лимфоцитов в малодифференцированные клетки — пролимфоциты, лимфобласты. С помощью метода авторадиографии установлено, что большие и средние лимфоциты в метаболическом отношении щстйвнее малых лимфоцитов [3]. Процесс активаций лимфоцитов в прйсут-ствии митогенов расценивается как важный показатель функционального состояния Т- и В-клеточного звеньев иммунитета. Определенное соотношение количественного состава иммунокомпетентных клеток с их функциональной способностью позволяет сохранять тканевой гомеостаз того или иного органа и организма в целом.