СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ БИОЦИДНЫМ ДЕЙСТВИЕМ
AGENT POSSESSING BIOCIDAL ACTION

Изобретение относится к области медицины, а именно к новым лекарственным композициям, обладающим биоцидным, в частности, антимикробным и антивирусным действием.
По данным ВОЗ около 80% населения земного шара заражены различными типами вируса простого герпеса (ВПГ). Одним из наиболее тяжелых и социально значимых заболеваний, вызываемых ВПГ, является герпетическое поражение области гениталий, вызываемое преимущественно ВПГ 2-го типа. По данным на 2015 год, ВПГ-2 заражено более 410 миллионов человек в возрасте от 15 до 50 лет. Герпетические поражения не только снижают качество жизни больных, но и значительно нарушают барьерную функцию эпителиев, что в сочетании с рядом других патогенетических механизмов увеличивает риск заражения ВИЧ (Freeman Е.Е. et al., AIDS. 2006, Jan 2; 20(1):73-83; Freedman E., Mindel A., J. HIV Ther., 2004, Feb; 9(1):4-8).
Установлено, что важную роль в подавлении активности ВПГ играют естественные киллеры (NK клетки), а нарушение их функций или таксиса в область поражения, приводит к усилению активности ВПГ и увеличению количества рецидивов (Orange J.S., Microbes Infect., 2002, 4:1545-1558; Murugin V. et al., Clin. Vaccine Immunol., 2011, Sep; 18(9): 1410-1415). Помимо NK клеток, значительное участие в борьбе с ВПГ принимают Т-лимфоциты, в частности цитотоксические CD8+ Т-клетки. В моделях in vivo показано, что отсутствие CD8+ Т-клеток значительно усугубляет течение инфекционного процесса (Chayavichitsilp P. et al., Pediatr. Rev., 2009, 30:119-130). У больных с нарушением функции CD8+ Т-клеток наблюдаются значительно более тяжелые герпетические поражения и значительно повышена частота рецидивов заболевания (Whitley R.J., Roizman В., Lancet, 2001, 357:1513-1518).
В настоящий момент не существует лекарственных препаратов, способных полностью элиминировать ВПГ из организма больного. Вирус сохраняется в регионарных нервных узлах, а в моменты рецидивов, которые могут проявляться шесть и более раз в году, перемещается в область эпителиев, где вступает в фазу репликации, протекающую, как правило, с образованием везикулярной сыпи и изъязвлений (Летяева О.И. и др., РМЖ. 2015. №28. С. 1701-1704). При этом, часто наблюдаются сочетанные герпетическая и бактериальная инфекции.
В этой связи поиск новых подходов к терапии данного заболевания остается чрезвычайно актуальной проблемой. Это связано с разнообразием клинических проявлений, а также развитием резистентности вируса к существующим лекарственным средствам.
Наиболее распространенными препаратами для лечения ВПГ являются синтетические ациклические нуклеозиды, нарушающие репликацию ДНК вируса, такие как ацикловир (Elion, G.B. et.al., PNAS, 1977, 74:5716-5720). Основным недостатком такой терапии является ее низкая эффективность вне стадии обострения (Семенова Т.Б., РМЖ. 2002. №20. С. 924-930).
Известно применение для лечения ВПГ соединений пептидной природы - аллоферонов, в частности, препарата аллокин-альфа (http://go.mail.ru/), который является ближайшим аналогом заявляемого изобретения. Аллокин-альфа является синтетическим олигопептидом, имеющим структуру биоактивного пептида насекомых - аллоферона 1. Он в настоящий момент является единственным препаратом из класса аллоферонов, зарегистрированным в России и используемым по данным показаниям (RU 2172322, 2001; Регистрационное свидетельство №002829/01 от 22.09.2003 г.). Это линейный олигопептид с молекулярной массой 1265,3 Да, состоящий из 13 аминокислотных остатков с последовательностью:
2
NH-His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly-COOH
Терапевтическая активность препарата изучена, в частности, в моделях in vivo. Проведены эксперименты по изучению его противовирусного действия в отношении наиболее опасной разновидности герпесвируса - вируса простого герпеса человека 2-го типа (ВПГ-2). На модели генитального герпеса у самцов кроликов, вызванного поверхностным заражением ВПГ-2, показано, что местное нанесение аллоферона значительно сокращает продолжительность эпизода первичного генитального герпеса и снижает вирусную нагрузку на организм. Сходные данные получены с использованием модели ВПГ-2 на морских свинках. Показано достоверное снижение средней продолжительности заболевания, а также снижение частоты выделения вируса из очагов поражения.
Недостатком данного препарата является инъекционный способ введения и недостаточно высокая эффективность, особенно в случае сочетанных инфекций, вследствие отсутствия прямого действия на вирусы и микроорганизмы.
Задачей, решаемой авторами, являлось создание более эффективного препарата для лечения ВПГ, в том числе для лечения ВПГ, осложненного бактериальной инфекцией.
2
2
2
10
2
Было найдено, что поставленная выше задача решается путем создания средства для наружного применения, содержащего смесь пептидов - аллоферона1 - HN-His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly-СООН (1) и аналога индолицидина - HN-(CH)-CO-Ile-Leu-Pro-D-Phe-Lys-D-Phe-Pro-D-Phe-D-Phe-Pro-D-Phe-Arg-Arg-NH (2) в массовом соотношении от 1:2 до 2:1, а также вспомогательные вещества. Оптимальные результаты достигаются при массовом соотношении вышеуказанных пептидов 1:1.
Композицию получают смешением ингредиентов между собой.
Особенностями предлагаемой композиции является найденное эффективное сочетание пептидного биоцидного препарата (2) широкого спектра действия и пептида (1), обладающего иммуномодулирующей активностью и стимулирующего NK-клетки и цитотоксические Т-лимфоциты.
Получение лекарственного препарата осуществляли по стандартным технологиям создания лекарственных форм фармпрепаратов местного применения, используя в качестве активного ингредиента фармацевтически подходящую соль пептида органического или неорганического происхождения, не вызывающую нежелательных местных и системных побочных эффектов. В качестве вспомогательных веществ - соответствующие добавки, обеспечивающие определенную структурную вязкость, обладающие псевдопластическими, пластическими и тиксотропными свойствами, обеспечивая оптимизацию биодоступности активных ингредиентов.
Пептиды для создания лекарственного средства получали с использованием технологии последовательного наращивания пептидной цепи на полимерном носителе с определением подлинности и чистоты полученного продукта методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и масс-спектрометрии.
На базе вышеуказанных пептидов получен препарат в форме геля для местного применения, обладающий биоцидной активностью. Гель имеет следующий состав (% масс): пептиды - 0,02-0,2; служебные добавки (вспомогательные вещества) - 99,98-99,8. В качестве служебных добавок в состав геля могут входить карбопол, аллантион, феноксиэтанол, этиленгексилглицерин, гидроксид натрия, гиалуронат натрия, лавандовое или касторовое масло, спирт, глицерин дистиллированный, кармелоза натрия, лимонная кислота, альфа-токоферола ацетат, бензойная кислота, ароматизаторы и др. В результате получают прозрачный гомогенный гель для наружного и местного применения, свободный от посторонних частиц.
Заявляемый препарат, как показали проведенные эксперименты, наиболее перспективен для наружного лечения заболеваний кожи и слизистых, инфицированных бактериями, грибами, вирусами герпеса и папиллома-вирусной инфекции, в частности, инфекционно-воспалительных заболеваниях половых органов, для профилактики инфекционно-воспалительных осложнений в акушерстве и гинекологии и т.п. заболеваний.
Промышленная применимость изобретения иллюстрируется следующими примерами.
2
Пример 1. Синтез пептида NH-His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly-COOH (1)
В качестве временной защитной группировки использовали трет-бутилоксикарбонильную группировку. В качестве постоянных защитных групп использовали динитрофенильную на гистидине и бензиловый эфир на серине. Синтез проводили на РАМ-полимере с емкостью 0.8 мМол/г. Пептидную цепь далее наращивали с С-конца по программе, приведенной в таблице 1.
При положительном нингидриновом тесте повторяли цикл, начиная с п. 3.
По завершении синтеза пептидил-полимер обрабатывали 5 мл 50% трифторуксусной кислоты в хлористом метилене, промывали 5 мл хлористого метилена и извлекали из сосуда. Промывали на фильтре трижды по 5 мл изопропилового спирта и трижды по 5 мл абсолютного эфира. Высушивали полученный пептидил-полимер в вакуум-эксикаторе над пятиокисью фосфора до постоянного веса, обрабатывали 5% 2-меркаптоэтанолом в диметил-формамиде и проводили финальное деблокирование с одновременным отщеплением от полимера жидким фтористым водородом по программе, приведенной в таблице 2.
2
Полученный грубый продукт подвергали очистке обращенно-фазовой хроматографией на колонке С18 NovaPack 19×300 мм в градиенте 5-50% ацетонитрила в 0.1% трифторуксусной кислоте, отбирая фракции, содержащие целевой продукт. Содержание основного вещества - пептида NH-His-Gly-Val-Ser-Gly-His-Gly-Gln-His-Gly-Val-His-Gly-COOH - по данным оптической плотности, составляло не менее 99%. Аминокислотный состав пептида и молекулярная масса соответствовали теоретическим.
2
2
10
2
Пример 2. Синтез биоцидного пептида HN-(CH)-CO-Ile-Leu-Pro-D-Phe-Lys-D-Phe-Pro-D-Phe-D-Phe-Pro-D-Phe-Arg-Arg-NH (2)
Синтез, деблокирование и очистку пептида (2) осуществляли тем же способом, что и пептида в примере 1. Для защиты -функции аргинина использовали нитрогруппу, ε-аминогруппы лизина - хлоркарбобензокси-группу. Для синтеза пептида в реакционный сосуд загружали 0.2 г N-трет-бутилоксикарбонил--нитро-аргинин-метил-бензгидриламинополимера в 10 мл диметилформамида. Содержание производного аргинина составляло 1.0 ммол/г полимера.
2
2
10
2
По завершении сборки полипептидной цепи проводили финальное деблокирование защищенного пептидил-полимера с одновременным отщеплением пептида от полимера жидким фтористым водородом. При очистке использовали градиент ацетонитрила 10-90% в 0,1% тритфоруксусной кислоте. Содержание основного вещества - пептида HN-(CH)-CO-Ile-Leu-Pro-D-Phe-Lys-D-Phe-Pro-D-Phe-D-Phe-Pro-D-Phe-Arg-Arg-NH - по данным оптической плотности, составляло не менее 99%. Аминокислотный состав пептида и молекулярная масса соответствовали теоретическим.
Пример 3. Получение геля для профилактики и лечения заболеваний кожи и слизистых
Для приготовления геля используют химический реактор с мешалкой. В смеситель загружают компоненты геля согласно рецептуре (мас. %): карбопол (1,5-2,0%), дистиллированную воду, раствор NaOH (1,5-2,0%), перемешивают, выдерживают в течение 30 мин. Затем титруют раствором лимонной кислоты до pH 6 и порционно при перемешивании вводят водный раствор пептидов, содержащий консерванты, в качестве которых используют метилпарабен в количестве 0,01-0,2 мас. % и пропилпарабен в количестве 0,002-0,01 мас. %. В полученную смесь вводят глицерин в количестве 1,5-2,5 мас. %. Систему перемешивают в течение 10 мин и измеряют величину pH. Полученный однородный гель оставляют в покое для созревания на одни сутки. Затем гель вновь перемешивают и однородную массу фасуют в тару (тюбики).
В результате получают прозрачный гомогенный гель для наружного (местного) применения, свободный от посторонних частиц. Гель имеет следующий состав (% масс): пептиды - 0,02-0,2; служебные добавки - 99,98-99,8. Характеристика полученных гелевых препаратов, содержащих пептиды, приведена в таблице 3.
Пример 4. Биоцидная активность гелей в отношении бактерий
6
Для определения антимикробной активности использовали метод радиальной диффузии в агарозных гелях (АГ). Формировали нижний слой АГ (10 mM фосфата натрия, 0.3 мг порошка гидролизата соевого бульона на мл 1% агарозы) и диспергировали на него около 4×10CFU в средне-логарифмической фазе роста.
Готовили серии образцов гелей с известной концентрацией пептидов, суспендируя гели, содержащие пептиды, в 0,01% уксусной кислоте с 0.1% человеческим сывороточным альбумином. 10 μl испытуемого образца наносили на нижний слой АГ. Через 3 часа после нанесения пептидов наносили верхний слой АГ (10 мл гидролизат соевого агара, 60 г/л). После ночи инкубации измеряли просветленные зоны с точностью до 0,1 мм. Активность образца выражали в относительных единицах 1 мм = 10 U. Определяли МИК, как значения отрезков на оси x линии регрессии значений диаметров зон, полученных при серийном разбавлении гелей, содержащих пептиды. Результаты испытаний биоцидной активности полученных гелей в пересчете на концентрацию пептида 2 приведены в таблице 4. Гель I биоцидной активностью по отношению к использованным штаммам микроорганизмов не обладал.
Пример 5. Противовирусная активность гелей в отношении вируса простого герпеса человека 2 типа в опытах in vivo
Для проведения эксперимента были сформированы 8 групп животных по 15 особей каждая:
группы 1-6 - инфицированы вирусом простого герпеса 2 типа с применением гелей I-VI (опытные группы 1-6);
группа 7 - инфицированы вирусом простого герпеса 2 типа с применением Ацикловира (контроль препарата)
группа 8 - инфицированы вирусом простого герпеса 2 типа без применения фармпрепаратов (контроль вируса)
2
Использовали вирус простого герпеса 2 типа штамм G (АТСС VR-734, США). Вирус культивировали в культуре клеток T-98G (глиобластома головного мозга человека), и адаптировали к организму мышей двумя последовательными интрацеребральными пассажами. Для подготовки итогового инфицирующего материала животных интрацеребрально заражали гомогенатом мозговой ткани от второго пассажа, через 4 суток мышей забивали, извлекали мозг, гомогенизировали, инфицировали им клетки Vero и инкубировали 48 часов при 37°С в 5% CO. В качестве инфицирующего материала использовали культуральную жидкость, в которой предварительно определяли инфекционный титр вируса.
В качестве препарата сравнения использовали препарат Зовиракс (Ацикловир в форме 5% мази, Glaxo Welcome).
6
50
Повреждение вагинального эпителия мышей осуществляли при помощи скарификатора для влагалищных мазков. Затем животных инфицировали вирусом в дозе 10 TCID в объеме 30 мкл. Исследуемые гели вводили мышам 1 и 2 групп в объеме 0,05 мл по лечебной схеме: через 1, 2, 3, 4 и 5 суток после заражения один раз в день.
Наблюдение за животными осуществляли в течение 18 дней, ежедневно фиксируя смертность. Об окончании смертности судили по отсутствию в группах мышей с признаками герпетического вагинита (выделения из влагалища) и его осложнений (пареза задних конечностей). На основании полученных показателей смертности в каждой группе рассчитывали процент смертности (отношение числа павших на момент контроля животных к общему числу зараженных животных в группе), индекс защиты (отношение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту смертности в контрольной группе) и среднюю продолжительность жизни животных (СПЖ).
Протективную активность гелей, содержащих пептиды, оценивали по снижению специфической смертности и увеличению продолжительности жизни животных по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения. Данные по протективной активности гелей приведены в таблице 5.
Результаты проведенных испытаний показали, что заявляемое средство обладает сочетанным антибактериальным и противовирусным действием и перспективно для лечения вагинальной герпесной инфекции, в том числе и осложненной бактериальным заражением.