Влияние экстрактов слоевищ лишайников на биологические свойства микобактерий туберкулеза

психофизиологическими отклонениями // Автореф. дисс. ... д. п. н. - М., 2011. - 28 с.

9. Токаева Л. К., Павленкович С. С., Спиридонова Е. А. Оценка адаптационного потенциала студентов педагогического вуза с различным уровнем тревожности // Сборник научных статей и тезисов XII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке». - М.: РУДН, 2011.- С. 395.

10. Яковлева А. П., Колосова О. Н., Шиц И. В., Николаева Е. Н. Психофизиологические особенности адаптации женщин репродуктивного возраста в условиях Севера // Материалы II Международной междисциплинарной конференции «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций», 22-29 июня 2012 г., Бодрум, Турция. - С. 205-207.

11. Николаева Е. Н., Колосова О. Н. Влияние

психофизиологического напряжения на состояние неспе-

цифических адаптивных реакций организма студентов // Материалы I физиологов СНГ. Сочи. - 2005.

12. Кершенгольц Б. М., Петрова П. Г., Колосова О.

Н., Кершенгольц Е. Б. Здоровье человека на Севере:

физиологические и биохимические реакции организма на экотоксиканты, пути их оптимизации // Наука и образование. - № 4. - 2003. - С. 63-74.

13. Выходцева Ж. В., Колосова О. Н. Влияние

иммуномодулятора “Эпсорин” на состояние иммунология ескойреактивности у больных со злокачественными новообразованиями челюстно-лицевой области в послеоперационном периоде // Вестник ЯГУ. - 2010. - № 1. - С. 47-52.

УДК: 616-002.5

Н. Г. Павлов, Б. М. Кершенгольц, Г. В. Филиппова, М. М. Шашурин

ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТОВ СЛОЕВИЩ ЛИШАЙНИКОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА

Исследовано антибактериальное действие водно-спиртовых экстрактов лишайников из родов цетрарии (Cetraria) и кладонии (Cladonia) на микобактерии туберкулеза. Предэкстракционная механохимическая обработка сухих слоевищ лишайников позволяет выделять более полный спектр биоактивных веществ, увеличивая их антибактериальную активность in vitro по отношению к чувствительным и устойчивым к противотуберкулезным препаратам штаммам микобактерий туберкулеза (эффект сохраняется до разведения 1:8), по сравнению с классическими приемами экстрагирования действующих веществ из растительного сырья. Использование механохимического экстракта лишайников в лечении экспериментального туберкулеза резко снижает тяжесть его течения у мышей, зараженных клиническим штаммом № 238 с множественной лекарственной устойчивостью.

Ключевые слова: лекарственные растения, лишайники, усниновая кислота, механохимия, туберкулез, микобактерии туберкулеза, экспериментальный туберкулез

ПАВЛОВ Николай Герасимович - к. в. н., старший научный сотрудник бактериологической лаборатории ГБУ РС (Я) НПЦ «Фтизиатрия».

E-mail: png_74@mail.ru

КЕРШЕНГОЛЬЦ Борис Моисеевич - д. б. н., профессор, зав. лабораторией экологической, медицинской биохимии, биотехнологий и радиационной биологии ИБПК СО РАН.

ФИЛИППОВА Галина Валерьевна - к. б. н., старший научный сотрудник ИБПК СО РАН.

E-mail: nureeva@yandex.ru

ШАШУРИН Михаил Михайлович - к. б. н., научный сотрудник ИБПК СО РАН.

N. G. Pavlov, B. M. Kerschengoltz, G. V. Philippova, M. M. Shashurin

The effect of Lichen Thallus extracts on biological properties of Mycobacterium tuberculosis

Antibacterial action of hydroalcoholic extracts of Cetraria and Cladonia lichens on Mycobacterium tuberculosis has been studied. Mechanochemical preextraction processing of dry lichen thalli, compared to classical methods of extracting active substances from plant raw material, enables to egest a larger spectrum of bioactive matters from lichens. The processing enlarges their antibacterial activity in vitro against drug-susceptible and resistant strains of Mycobacterium tuberculosis (the effect is preserved till 1:8 dilution), if to compare with classical extraction methods of plant materials active matters. The use of the mechanochemical lichen essence in treatment of experimental tuberculosis strongly reduces the disease progression of mice infected with a multidrug resistance clinical strain No. 238.

Key words: medicinal plants, lichens, usnic acid, mechanochemistry, tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, experimental tuberculosis.

Проблема лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза (МБТ) стала в настоящее время одной из наиболее актуальных во фтизиатрии и практическом здравоохранении [1, 2]. Наличие лекарственной устойчивости МБТ существенно снижает эффективность лечения у больных туберкулезом легких, приводит к появлению хронических и неизлечимых форм, а в ряде случаев к летальным исходам [3] и остропрогрессирующим формам туберкулеза [1, 4].

В связи с этим, несмотря на успехи химии в синтезе лекарственных веществ, в медицине наметились тенденции более широкого использования лекарственных растений. В частности, вызывает интерес исследование лишайников как перспективных лекарственных средств природного происхождения.

Известно об использовании лишайников в качестве антибиотического средства. Их противомикробная активность в отношении стафилококков, стрептококков, кислотоустойчивых микроорганизмов, грибов, простейших и вирусов характеризуется наличием в слоевищах лишайниковых кислот, прежде всего, присутствием в них усниновой кислоты и её производных [5, 6, 7].

Однако, несмотря на положительный опыт

использования лишайников во многих разделах

клинической медицины, в доступной литературе

имеются немногочисленные сообщения о применении данного растения во фтизиатрии [7, 8]. Вероятно, это связано с тем, что известные методы выделения биоактивных веществ из слоевищ лишайников не дают желаемого результата.

Целью нашего исследования было экспериментально установить степень антибактериального действия двух экстрактов лишайников, отличающихся по методу выделения комплекса биологически активных веществ (БАВ), на микобактерии туберкулеза.

Лишайники из родов цетрарии (Се1таг1а} и кладонии (С1айоп1а) - лекарственные растения, используе-

мые в народной медицине для лечения многих заболеваний. Широко распространены в лесной и тундровой зонах, а также в высокогорных районах. Заготовляют слоевища лишайников на протяжении всего летнего периода [9, 10].

В исследовании использовались два варианта экстракта из смеси слоевищ лишайников:

Экстракт № 1 - 40 % водно-спиртовый экстракт. Измельченные слоевища лишайников подвергались экстракции 40 %-м водно-спиртовым раствором, в соотношении 1:20, экстракция проводилась в течение 10 дней.

Экстракт № 2 - механохимический экстракт. Слоевища лишайников подвергались механохимической обработке на экспериментальной установке АГО-2 в присутствии щелочи натрия в массовом соотношении 1:20 при 1500 об/мин., далее проводилась экстракция 40 %-м водно-спиртовым раствором в соотношении 1:20 в течение 10 дней. Лимонной кислотой рН экстракта доводили до 7,0.

Предэкстракционная обработка сухих слоевищ лишайников с помощью механохимической технологии с добавлением сухой щелочи позволяет выделять более полную группу БАВ, благодаря переходу плохо растворимых в воде и водноспиртовых смесях ароматических фенолов в хорошо растворимые феноляты. Этим обеспечивается максимальное извлечение всего структурного спектра действующих веществ, что не позволяет формироваться реакции устойчивости микроорганизмов к данному антибиотическому комплексу.

Воздействие различных концентраций 40 %-х

водно-спиртовых экстрактов лишайников № 1 и № 2 изучали на клинических штаммах МБТ: № 691, чувствительный к противотуберкулезным препаратам (ПТП); № 742, устойчивый к стрептомицину в концентрации 25 мкг/мл, изониазиду в концентрации 1 мкг/мл, рифампицину 80 мкг/мл. Определение активности антибактериального действия испытуе-мых экстрактов лишайника проводили методом

серийного разведения их на плотных питательных средах в соотношении от 1:1 до 1:512. В качестве питательной среды применяли питательные яичные среды для выращивания МБТ - Финн-2 (Ф-2). Посев в пробирки с питательной средой осуществляли путем внесения суспензии культур МБТ, приготовленных по оптическому стандарту мутности -500 млн. микробных тел/мл в количестве 0,2 мл в каждую пробирку.

В качестве контроля производили посевы МБТ, разведенные в физиологическом растворе в концентрациях, соответствующих опытным образцам. Засевали по 4 пробирки с каждого серийно разведенного варианта опытных образцов.

Эффективность антибактериального действия экстрактов лишайника определяли сроками появления первичного, интенсивного и массивного роста культур МБТ.

Определение специфической активности экстрактов проводили в соответствии с методами экспериментальной химиотерапии [11] на 24 беспородных белых мышах массой 13 ^ 16 г,

полученных из вивария Якутской республиканской ветеринарно-испытательной лаборатории. Мышей заражали введением под кожу спины взвеси (0,1мг бактериальной массы в 0,5 мл физиологического раствора) трехнедельной культуры клинического штамма МБТ № 238 с множественной лекарственной устойчивостью. Изучаемые экстракты вводили мышам внутрь со дня их заражения.

Все экспериментальные животные были разделены на следующие группы по 6 особей в каждой группе: 1-я группа - интактные животные; 2-я

- зараженные животные, не получавшие лечение (контроль); 3-я группа - зараженные животные, получавшие экстракт лишайников № 1; 4-я группа

- зараженные животные, получавшие экстракт лишайников № 2. Продолжительность эксперимента составляла 2,5 месяца, выживших к этому сроку животных умерщвляли.

Эффективность влияния экстрактов на туберкулезный процесс у экспериментальных животных оценивали по показателям тяжести течения туберкулезного процесса: динамике массы тела

животных, летальности, бактериологическим данным (высеваемость МБТ из легких, селезенки).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием критериев Стьюдента и Фишера, критерия знаков (z) и вычислением величины отклонения выборочного показателя от его генерального параметра или статистической ошибки [12].

Результаты исследований in vitro представлены в табл. 1 и 2.

Из табл. 1 видно, что антибактериальное действие экстракта № 1 на клинический штамм № 691, чувствительный к ПТП, зависит от концентрации действующих веществ. Так, в концентрациях 1:1, 1:2, 1:4 рост микобактерий на средах отсутствовал, что говорит о полном подавлении роста МБТ (бактерицидное действие). В концентрации 1:8 происходит

Таблица 1

Антибактериальное действие экстрактов лишайников на клинический штамм M. tuberculosis № 691, чувствительный к ПТП

Серийные концентрации экстрактов лишаиников Начальный рост МБТ (в днях) Контроль - 4-й день Интенсивный рост МБТ (в днях) Контроль - 8-й день Массивность роста МБТ (в колониеобразующих единицах) Контроль - «+»

Экстракт №1 Экстракт №2 Экстракт №1 Экстракт №2 Экстракт №1 Экстракт №2

1:1

1:2

1:4

1:8 10* 17* 17** 21** До 50** До 10**

1:16 6*** 10* 12*** 14* До 100* До 100*

1:32 6*** 10* 12*** 14* + До 100*

1:64 6*** 6*** 10*** 12*** + +

1:128 6*** 6*** 10*** 10*** + +

1:256 6*** 6*** 10*** 10*** + +

1:512 6*** 6*** 10*** 10*** + +

«-» - отсутствие роста;

«+» - сплошной рост колоний по всей среде; * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р>0,05

Таблица 2

Антибактериальное действие экстрактов лишайников на клинический штамм МБТ № 742 с множественной лекарственной устойчивостью к ПТП

Серийные концентрации экстрактов лишайников Начальный рост МБТ (в днях) Контроль - 6-й день Интенсивный рост МБТ (в днях) Контроль - 10-й день Массивность роста МБТ (в колониеобразующих единицах) Контроль - «+»

Экстракт №1 Экстракт №2 Экстракт №1 Экстракт №2 Экстракт №1 Экстракт №2

1:1 _ _ _ _ _ _

1:2 _ _ _ _ _ _

1:4 _ _ _ _ _ _

1:8 17** _ 21** _ До 10** _

1:16 12* 13* 17* 17* До 50** До 20**

1:32 * * * 8 10*** 13*** 17* До 100* До 100*

1:64 * * * 8 10*** 13*** 14*** > 100* > 100*

1:128 * * * 6 8*** 13*** 13*** + +

1:256 * * * 6 8*** 10*** 13*** + +

1:512 * * * 6 8*** 10*** 13*** + +

«-» - отсутствие роста;

«+» - сплошной рост колоний по всей среде; * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р>0,05

задержка начального и интенсивного роста МБТ на 6 (р<0,05) и 9 дней (р<0,01), соответственно по сравнению с контрольным посевом. Кроме того, наблюдалось частичное подавление роста МБТ до 50 колониеобразующих единиц (КОЕ) при сплошном росте колоний по всей среде в контроле. Следовательно, исследуемый экстракт в концентрации 1:8 оказывает умеренное бактериоста-тическое действие на МБТ. Уменьшение роста до 100 КОЕ в варианте с разведением 1:16 позволяет предположить, что экстракт № 1 в данной концентрации оказывает на МБТ слабое бактерио-статическое действие. Дальнейшие концентрации в диапазоне 1:32 ^ 1:512 статистически достоверно не влияют (р>0,05) как на сроки начального и интенсивного роста, так и на массивность МБТ. В этих концентрациях экстракт утрачивает свое антибактериальное действие на биологические свойства МБТ.

Экстракт № 2 в концентрациях 1:1, 1:2, 1:4 оказывает выраженное бактерицидное действие на МБТ. В концентрации 1:8 отмечали бактерио-статическое действие, которое проявлялось задержкой начального роста на 13 дней (р<0,05), интенсивного роста также на 13 дней (р<0,01) и скудного роста до 10 КОЕ по сравнению с контрольным посевом. Слабое бактериостатическое действие оказывают концентрации 1:16, 1:32 с задержкой начального и интенсивного роста на 6 дней (р<0,05) и ростом до 100 КОЕ по сравнению с контролем. Дальнейшие концентрации от 1:64 до 1:512 существенно не влияют на размножение и рост МБТ (табл.1).

Проведенные исследования показали, что два варианта опытных экстрактов в концентрациях 1:1, 1:2, 1:4 оказывают бактерицидное действие на клинический штамм МБТ № 691, чувствительный к ПТП. Концентрация 1:8 обладает умеренным бактериостатическим действием на МБТ. Концентрации 1:16 и 1:32 - слабыми бактериостатическими свойствами. Малые концентрации 1:64 ^ 1:512 теряют свою антибактериальную активность.

Из данных, представленных в табл. 2, следует, что антибактериальное действие экстракта № 1

на клинический штамм № 742 с множественной лекарственной устойчивостью к ПТП также зависит от концентрации действующих веществ. Концентрации 1:1, 1:2, 1:4 оказывают бактерицидное действие. При внесении данного экстракта в питательную среду в концентрации 1:8 отмечали задержку начального и интенсивного роста МБТ на 11 дней (р<0,01), скудный рост до 10 колоний по сравнению с контрольным посевом. Следовательно, исследуемый экстракт в данной концентрации оказывает выраженное бактериостатическое действие на МБТ. Концентрация 1:16 оказывает умеренное бактерио-статическое действие. Это проявлялось задержкой начального роста на 6 дней (р<0,05) и интенсивного роста на 7 дней (р<0,05), уменьшением роста до 50 КОЕ. Концентрации 1:32, 1:64 обладают

слабым бактериостатическим действием (массивность роста до 100 и >100 КОЕ, соответственно). Дальнейшее уменьшение концентрации экстракта № 1 в

питательной среде не влияет на рост МБТ.

Результаты по исследованию антибактериального

Таблица 3

Действие экстрактов лишайников на течение экспериментального туберкулеза мышей

Группа n Исход Средняя продолжительность жизни погибших мышей, (в днях) Высеваемость микобактерий из органов, КОЕ*

мышей Выжило, %** Погибло, %**

Принимавшие экстракт № 1 6 50,0 50,0 37,0±9,5 >20

Принимавшие экстракт № 2 6 83,4 16,6 69,0±1,0 До 20

Контроль 6 - 100,0 40,5±10,5 >100

* - p<0,05; ** - p<0,001;

действия экстракта № 2 на клинический штамм № 742 с множественной лекарственной устойчивостью к ПТП показали, что бактерицидный эффект сохраняется в диапазоне концентраций 1:1 ^ 1:8.

Начиная с концентрации 1:16, происходит задержка начального и интенсивного роста МБТ на 7 дней (р<0,05), со скудным ростом до 20 КОЕ. Следовательно, экстракт в концентрации 1:16 оказывает выраженное бактериостатическое действие на МБТ.

Концентрация 1:32 обладает слабым бактерио-статическим действием. При этом наблюдалась задержка интенсивного роста на 7 дней (р<0,05) с массивностью роста до 100 КОЕ по сравнению с контрольным посевом (табл. 2).

Таким образом, исследования in vitro показали, что опытные образцы экстрактов лишайников № 1 и № 2 обладают различной степенью анти-

бактериальной активности на МБТ в зависимости от концентрации действующего вещества. Наиболее выраженным антибактериальным действием в отношении чувствительных и устойчивых к ПТП штаммам МБТ обладает экстракт № 2.

Основными показателями резистентности животного к туберкулезу являются срок выживаемости после инфицирования и степень патологических изменений легочной ткани.

Как показали исследования, у мышей 2-й группы (контроль), не получавших лечение, летальность к концу эксперимента составила 100 % (табл. 3). Из них 68 % животных погибли на 20-26 день, 32 % на 71-78 день. В целом средняя продолжительность жизни составила 40,5 дня, что говорит о высокой вирулентности использованной культуры МБТ.

Разница средних показателей потери массы тела исследуемых групп оказалась статистически недостоверной (р>0,05). Бактериологическое исследование органов животных показало, что из легких

и селезенки мышей высевается значительное (>100 колоний) количество МБТ. У мышей 3-й группы, получавших экстракт лишайника № 1 в

концентрации 1:8, летальность составила 50 %

(р<0,001), гибель наблюдалась в сроки от 26 до 56 дней. Средняя продолжительность жизни погибших мышей с момента заражения составила 37 дней. Из легких и селезенки мышей высевалось умеренное (>20 колоний) количество МБТ. У мышей 4-й группы, получавших экстракт лишайника № 2 в концентрации 1:8, летальность составила 16,6 % (р<0,001; к концу эксперимента погибла 1 мышь). Про до л-жительность жизни погибшей мыши составила 69 дней. Результаты бактериологических исследований органов животных показали, что из легких и селезенки мышей высевается скудное (до 20 колоний) количество МБТ.

Результаты исследований показали, что наиболее выраженным антибактериальным действием in vitro в отношении чувствительных и устойчивых к ПТП штаммам МБТ обладает экстракт смеси лишайников из родов цетрарии (Cetraria) и кладонии

(Cladonia), полученный при помощи механо-химической технологии на стадии измельчения слоевищ лишайников. Данный экстракт, обогащенный более широким спектром действующих

веществ, при использовании его в лечении экспериментального туберкулеза обладает выраженной

антимикобактериальной активностью, резко снижает тяжесть течения инфекции у мышей, зараженных МБТ.

Л и т е р а т у р а

1. Мишин В. Ю. Современная тактика комплексного лечения лекарственно-устойчивого туберкулеза легких // Борьба с туберкулезом на Крайнем Севере. - Якутск, 2000. - С.192-195.

2. Соколова Г. Б. Новые подходы к лечению лекарственно-резистентных форм туберкулеза // Химиотерапия туберкулеза. - 2000. - № 9. - С. 30-37.

3. Васильева И. А. Химиотерапия полирезистентного туберкулеза // IV съезд научно-медицинской ассоциации фтизиатров: Сборник резюме. - Йошкар-Ола, 1999. - С. 78.

4. Иванова Л. А. Характеристика лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза у больных деструктивным туберкулезом легких в современных условиях // Новые технологии в диагностике и лечении туберкулеза различных органов и систем. - СПб., 1998. - Т. 2. -С. 156-160.

5. Блехер Л. Б., Колосова Т. И. Лечебное применение лекарственных растений. - СПБ: ТЦ «Северо-Запад» СПБО СФК, 1992. -378 с.

6. Ковалева В. Н., Зупанец И. А., Кисличенко В. С. Основы практической фитотерапии. - Харьков: Укр. ФА, 1999. - 304 с.

7. Сафонова М. Ю. Фармакогностическое и

фармакологическое изучение слоевищ цетрарии исландской - Се^аНа islandica (Ь.) Аск: Автореф. дис. ... канд. фарм. наук. - СПБ., 2002. - 21с.

8. Витовская М. Л., Виноградова Т. И., Заболотных Н. В., Сафонова М. Ю. Роль ислацета (экстракта из слоевищ цетра-рии исландской) в комплексной терапии экспериментального туберкулеза // Проблемы туберкулеза и болезней легких. - 2005. - № 11. - С.44-47.

9. Махлаюк В. П. Лекарственные средства в народной медицине. - Саратов: Приволжское книжное издательство, 1967. - 558 с.

10. Минаева В. Г. Лекарственные растения Сибири. -Новосибирск: Наука, 1991. - 431с.

11. Методы экспериментальной химиотерапии: практическое руководство / под ред. Г. Н. Першина. - М.: «Медицина», 1971. - 539 с.

12. Лакин Г. Ф. Биометрия. - М.: «Высшая школа», 1980. - 291 с.

УДК : 616-002.5:616-036.2

Е. Д. Савилов, М. К. Винокурова, В. А. Астафьев, Л. А. Степаненко, М. Н. Кондратьева

ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКАЯ СИТУАЦИЯ ПО ТУБЕРКУЛЕЗУ В РЕСПУБЛИКЕ САХА

По результатам комплексного эпидемиологического анализа за период с 2002 по 2011 гг. установлено, что в отношении туберкулеза в Республике Саха (Якутия) складывается достаточно сложная и неоднозначная эпидемиологическая ситуация. Обоснована необходимость ее комплексной оценки не только в масштабах республики, но и в отдельных районах с использованием метода интегральной оценки «по сумме занятых мест». Установлено, что в 14 районах из 35 эпидемиологическая ситуация неблагополучная, поэтому необходимо принять управленческие решения по адекватному планированию и улучшению качества противотуберкулезных мероприятий.

Ключевые слова: Республика Саха (Якутия), туберкулез, заболеваемость, распространенность, смертность, эпидемиологическая ситуация, интегральный показатель.

САВИЛОВ Евгений Дмитриевич - д. м. н., профессор, заведующий кафедрой ГОУ ДПО «Иркутская государственная медицинская академия последипломного образования»; г. н. с. ФБГУ «Научный центр проблем семьи и репродукции человека» СО РАМН.

ВИНОКУРОВА Мария Константиновна - д. м. н., заместитель директора по научной работе ГБУ РС

Научно-практический центр «Фтизиатрия».

E-mail: Mkvin61@mail.ru

АСТАФЬЕВ Виктор Александрович - д. м. н., профессор,

в. н. с. ФБГУ «Научный центр проблем семьи и репродукции человека» СО РАМН.

СТЕПАНЕНКО Лилия Александровна - н. с. ФБГУ «Научный центр проблем семьи и репродукции человека»

СО РАМН.

КОНДРАТЬЕВА Мария Николаевна - врач-статистик ГБУ РС (Я) Научно-практический центр «Фтизиатрия».