ПОЛУЧЕНИЕ 3-ФУКОЗИЛЛАКТОЗЫ И α-1,3-ФУКОЗИЛТРАНСФЕРАЗНЫХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ПРЕВРАЩЕНИЯ ЛАКТОЗЫ

1. Способ получения α-1,3-фукозиллактозы, причем способ предусматривает стадии:
a) обеспечения полипептида с α-1,3-фукозилтрансферазной активностью и со способностью использовать лактозу в качестве акцепторного субстрата, где указанный полипептид содержит:
i) аминокислотную последовательность, кодирующую консервативный домен связывания GDP-фукозы [Y/W/L/H/F/M]X[T/S/C][E/Q/D/A][K/R] (SEQ ID NO 33);
ii) аминокислотную последовательность, кодирующую консервативный домен [K/D][L/K/M]XXX[F/Y] (SEQ ID NO 34), и
iii) где в N-концевой области дополнительно присутствует консервативный мотив [N/H]XDPAXLD (SEQ ID NO 35), если домен из ii) соответствует DM[A/S]VSF (SEQ ID NO 36);
где X может представлять собой любую отдельную аминокислоту; и
где С-конец указанного полипептида содержит 100 аминокислот или меньше, начиная от первой аминокислоты домена связывания GDP-фукозы;
b) приведения полипептида с α-1,3-фукозилтрансферазной активностью из стадии а) в контакт со смесью, содержащей GDP-фукозу в качестве донорного субстрата и лактозу в качестве акцепторного субстрата, в условиях, при которых полипептид катализирует перенос остатка фукозы с донорного субстрата на акцепторный субстрат,
за счет чего получают α-1,3-фукозиллактозу;
c) необязательно отделения указанной α-1,3-фукозиллактозы.
2. Способ по п.1, где указанный полипептид обеспечивается в бесклеточной системе.
3. Способ по п.1, где указанный полипептид продуцируется клеткой, содержащей полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид.
4. Способ по любому из пп.1 или 3, где указанная GDP-фукоза и/или лактоза обеспечиваются клеткой, продуцирующей указанные GDP-фукозу и/или лактозу.
5. Способ по любому из пп.1, 3 или 4, причем способ предусматривает стадии:
i) обеспечения клетки, генетически модифицированной для продуцирования α-1,3-фукозиллактозы, при этом указанная клетка содержит по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент для синтеза α-1,3-фукозиллактозы,
при этом указанная клетка обеспечивает экспрессию указанного полипептида с α-1,3-фукозилтрансферазной активностью и со способностью использовать лактозу в качестве акцепторного субстрата;
ii) культивирования клетки в среде в условиях, допускающих продуцирование α-1,3-фукозиллактозы,
iii) предпочтительно отделения α-1,3-фукозиллактозы из системы культивирования.
6. Способ по п.3, причем способ предусматривает стадии:
а) обеспечения клетки-хозяина, экспрессирующей указанный полипептид с α-1,3-фукозилтрансферазной активностью и со способностью использовать лактозу в качестве акцепторного субстрата;
b) выращивания указанной клетки-хозяина в условиях подходящих питательных сред, допускающих продуцирование α-1,3-фукозиллактозы и допускающих экспрессию указанного полипептида с α-1,3-фукозилтрансферазной активностью;
c) обеспечения одновременно со стадией b) или следующим шагом после нее донорного субстрата GDP-фукозы и акцепторного субстрата лактозы, с тем чтобы полипептид α-1,3-фукозилтрансферазы катализировал перенос остатка фукозы с GDP-фукозы на лактозу, за счет чего получают α-1,3-фукозиллактозу;
d) необязательно отделения указанной α-1,3-фукозиллактозы из клетки-хозяина или среды для ее выращивания.
7. Способ по любому из пп.5 или 6, где клетку-хозяина трансформируют или трансфицируют для экспрессии экзогенного полипептида с α-1,3-фукозилтрансферазной активностью и со способностью использовать лактозу в качестве акцепторного субстрата.
8. Способ по любому из пп.3-7, отличающийся тем, что GDP-фукозу и/или лактозу обеспечивают за счет фермента, одновременно экспрессируемого в клетке-хозяине, или за счет метаболизма клетки-хозяина.
9. Способ по любому из пп.1-8, дополнительно предусматривающий очистку α-1,3-фукозиллактозы.
10. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанный полипептид выбран из группы, состоящей из:
i) любой из SEQ ID NO 6, 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 28, 30 или 32 из прилагаемого перечня последовательностей;
ii) аминокислотной последовательности, характеризующейся 87% или большей идентичностью последовательности с полноразмерной аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO 2, 20 или 22;
iii) аминокислотной последовательности, характеризующейся 80% или большей идентичностью последовательности с полноразмерной аминокислотной последовательностью под любым из SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 16, 28, 30 или 32;
iv) фрагмента аминокислотной последовательности, показанной под SEQ ID NO 2, 20 или 22, где указанный фрагмент содержит по меньшей мере 45 смежных аминокислот из нее;
v) фрагмента аминокислотной последовательности, показанной под любым из SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 16, 28, 30 или 32, где указанный фрагмент содержит по меньшей мере 10 смежных аминокислот из нее и характеризуется лактозосвязывающей α-1,3-фукозилтрансферазной активностью;
при этом необязательно указанный полипептид дополнительно модифицирован с помощью N-концевого и/или C-концевого аминокислотного участка.
11. Способ по любому из предыдущих пунктов, причем способ дополнительно предусматривает по меньшей мере одну из следующих стадий:
i) добавление в среду для культивирования лактозной подпитки, содержащей по меньшей мере 50, более предпочтительно по меньшей мере 75, более предпочтительно по меньшей мере 100, более предпочтительно по меньшей мере 120, более предпочтительно по меньшей мере 150 грамм лактозы на начальный объем реактора, предпочтительно в непрерывном режиме и предпочтительно так, чтобы конечный объем среды для культивирования в не более чем три раза, предпочтительно в не более чем два раза, более предпочтительно менее чем в 2 раза превышал объем среды для культивирования перед добавлением указанной лактозной подпитки;
ii) добавление лактозной подпитки в непрерывном режиме в среду для культивирования на протяжении 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней в форме подпитывающего раствора;
iii) добавление лактозной подпитки в непрерывном режиме в среду для культивирования на протяжении 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней в форме подпитывающего раствора, и где концентрация указанного подпитывающего раствора лактозы составляет 50 г/л, предпочтительно 75 г/л, более предпочтительно 100 г/л, более предпочтительно 125 г/л, более предпочтительно 150 г/л, более предпочтительно 175 г/л, более предпочтительно 200 г/л, более предпочтительно 225 г/л, более предпочтительно 250 г/л, более предпочтительно 275 г/л, более предпочтительно 300 г/л, более предпочтительно 325 г/л, более предпочтительно 350 г/л, более предпочтительно 375 г/л, более предпочтительно 400 г/л, более предпочтительно 450 г/л, более предпочтительно 500 г/л, еще более предпочтительно 550 г/л, наиболее предпочтительно 600 г/л, и где предпочтительно pH указанного раствора составляет от 3 до 7, и где предпочтительно температуру указанного подпиточного раствора поддерживают от 20°C до 80°C;
iv) при этом указанный способ приводит к концентрации 3-фукозиллактозы, составляющей по меньшей мере 50 г/л, предпочтительно по меньшей мере 75 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 90 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 100 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 125 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 150 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 175 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 200 г/л в конечном объеме указанной среды для культивирования.
12. Способ по любому из пп.3-11, где указанная клетка выбрана из группы, состоящей из клеток микроорганизма, растения или животного, при этом предпочтительно указанный микроорганизм представляет собой бактерию, гриб или дрожжи, при этом предпочтительно указанное растение представляет собой растение риса, хлопчатника, рапса, сои, маиса или кукурузы, при этом предпочтительно указанное животное представляет собой насекомое, рыбу, птицу или млекопитающее, отличное от человека; при этом предпочтительно клетка представляет собой клетку Escherichia coli.
13. Клетка-хозяин, генетически модифицированная для продуцирования α-1,3-фукозиллактозы, где клетка-хозяин содержит по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую фермент, вовлеченный в синтез α-1,3-фукозиллактозы, при этом указанная клетка обеспечивает экспрессию полипептида с α-1,3-фукозилтрансферазной активностью и со способностью использовать лактозу в качестве акцепторного субстрата, где указанный полипептид содержит:
i) аминокислотную последовательность, кодирующую консервативный домен связывания GDP-фукозы [Y/W/L/H/F/M]X[T/S/C][E/Q/D/A][K/R] (SEQ ID NO 33);
ii) аминокислотную последовательность, кодирующую консервативный домен [K/D][L/K/M]XXX[F/Y] (SEQ ID NO 34), и
iii) где в N-концевой области дополнительно присутствует консервативный мотив [N/H]XDPAXLD (SEQ ID NO 35), если домен из ii) соответствует DM[A/S]VSF (SEQ ID NO 36);
где X может представлять собой любую отдельную аминокислоту; и
где С-конец указанного полипептида содержит 100 аминокислот или меньше, начиная от первой аминокислоты домена связывания GDP-фукозы.
14. Клетка по п.13, причем клетка-хозяин содержит i) последовательность, содержащую полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид с лактозосвязывающей α-1,3-фукозилтрансферазной активностью, где последовательность является последовательностью, чужеродной для клетки-хозяина, и где последовательность интегрируется в геном клетки-хозяина, или ii) вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид, где полинуклеотид функционально связан с контрольными последовательностями, распознаваемыми клеткой-хозяином, трансформированной с помощью вектора.
15. Клетка по любому из пп.13 или 14, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
i) любой из SEQ ID NO 6, 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 28, 30 или 32 из прилагаемого перечня последовательностей;
ii) аминокислотной последовательности, характеризующейся 87% или большей идентичностью последовательности с полноразмерной аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO 2, 20 или 22;
iii) аминокислотной последовательности, характеризующейся 80% или большей идентичностью последовательности с полноразмерной аминокислотной последовательностью под любым из SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 16, 28, 30 или 32;
iv) фрагмента аминокислотной последовательности, показанной под SEQ ID NO 2, 20 или 22, где указанный фрагмент содержит по меньшей мере 45 смежных аминокислот из нее;
v) фрагмента аминокислотной последовательности, показанной под любым из SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 16, 28, 30 или 32, где указанный фрагмент содержит по меньшей мере 10 смежных аминокислот из нее и характеризуется лактозосвязывающей α-1,3-фукозилтрансферазной активностью;
при этом необязательно указанный полипептид дополнительно модифицирован с помощью N-концевого и/или C-концевого аминокислотного участка.
16. Клетка по любому из пп.13, 14 или 15, где указанная клетка выбрана из группы, состоящей из клеток микроорганизма, растения или животного, при этом предпочтительно указанный микроорганизм представляет собой бактерию, гриб или дрожжи, при этом предпочтительно указанное растение представляет собой растение риса, хлопчатника, рапса, сои, маиса или кукурузы, при этом предпочтительно указанное животное представляет собой насекомое, рыбу, птицу или млекопитающее, отличное от человека; при этом предпочтительно клетка представляет собой клетку Escherichia coli.
17. Клетка-хозяин по любому из пп.13-16, характеризующаяся тем, что клетка-хозяин представляет собой клетку бактерии, предпочтительно штамма Escherichia coli, более предпочтительно штамма Escherichia coli, который является штаммом K12, еще более предпочтительно штамм Escherichia coli K12 представляет собой штамм Escherichia coli MG1655.
18. Клетка-хозяин по любому из пп.13-16, характеризующаяся тем, что клетка-хозяин представляет собой клетку дрожжей.
19. Клетка-хозяин по любому из пп.13-18, характеризующаяся тем, что полинуклеотид, кодирующий полипептид с лактозосвязывающей α-1,2-фукозилтрансферазной активностью, адаптирован к частоте использования кодонов в соответствующей клетке-хозяине.
20. Способ получения α-1,3-фукозиллактозы, предусматривающий стадии:
а) обеспечения клетки по любому из пп.13-19,
b) культивирования клетки в среде в условиях, допускающих продуцирование α-1,3-фукозилтрансферазы,
с) предпочтительно отделения α-1,3-фукозилтрансферазы из системы культивирования.
21. Применение клетки-хозяина по любому из пп.13-19 для получения α-1,3-фукозиллактозы.
22. Применение полипептида, указанного в способе по любому из пп.1 или 11, для получения α-1,3-фукозиллактозы.
23. Микроорганизм, гетерологично экспрессирующий полипептид лактозосвязывающей α-1,3-фукозилтрансферазы, где указанный полипептид содержит:
i) аминокислотную последовательность, кодирующую консервативный домен связывания GDP-фукозы [Y/W/L/H/F/M]X[T/S/C][E/Q/D/A][K/R] (SEQ ID NO 33);
ii) аминокислотную последовательность, кодирующую консервативный домен [K/D][L/K/M]XXX[F/Y] (SEQ ID NO 34), и
iii) где в N-концевой области дополнительно присутствует консервативный мотив [N/H]XDPAXLD (SEQ ID NO 35), если домен из ii) соответствует DM[A/S]VSF (SEQ ID NO 36);
где X может представлять собой любую отдельную аминокислоту; и
где С-конец указанного полипептида содержит 100 аминокислот или меньше, начиная от первой аминокислоты домена связывания GDP-фукозы.
24. Микроорганизм по п.23, где указанный полипептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:
i) любой из SEQ ID NO 6, 2, 4, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 22, 28, 30 или 32 из прилагаемого перечня последовательностей;
ii) аминокислотной последовательности, характеризующейся 87% или большей идентичностью последовательности с полноразмерной аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO 2, 20 или 22;
iii) аминокислотной последовательности, характеризующейся 80% или большей идентичностью последовательности с полноразмерной аминокислотной последовательностью под любым из SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 16, 28, 30 или 32;
iv) фрагмента аминокислотной последовательности, показанной под SEQ ID NO 2, 20 или 22, где указанный фрагмент содержит по меньшей мере 45 смежных аминокислот из нее;
v) фрагмента аминокислотной последовательности, показанной под любым из SEQ ID NO 6, 8, 10, 12, 14, 16, 28, 30 или 32, где указанный фрагмент содержит по меньшей мере 10 смежных аминокислот из нее и характеризуется лактозосвязывающей α-1,3-фукозилтрансферазной активностью;
при этом необязательно указанный полипептид дополнительно модифицирован с помощью N-концевого и/или C-концевого аминокислотного участка.
25. Применение микроорганизма по п.23 или 24 для получения α-1,3-фукозиллактозы.
26. Способ по любому из пп.1-11, 12 или 20, дополнительно предусматривающий стадию отделения указанной α-1,3-фукозиллактозы из клетки-хозяина или среды для ее выращивания.
27. Способ по любому из пп.1-11, 12, 20 или 26, где указанное отделение предусматривает по меньшей мере одну из следующих стадий: осветление, ультрафильтрацию, нанофильтрацию, обратный осмос, микрофильтрацию, обработку активированным углем или углеродом, высокопроизводительную фильтрацию с тангенциальным потоком, ультрафильтрацию с тангенциальным потоком, аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия и/или гель-фильтрацию, лигандообменную хроматографию.
28. Способ по любому из пп.1-11, 12, 20, 26 или 27, дополнительно предусматривающий очистку α-1,3-фукозиллактозы.
29. Способ по п.28, где указанная очистка указанной α-1,3-фукозиллактозы предусматривает по меньшей мере одну из следующих стадий: применение активированного угля или углерода, применение древесного угля, нанофильтрацию, ультрафильтрацию или ионный обмен, применение спиртов, применение водно-спиртовых смесей, кристаллизацию, выпаривание, осаждение, сушку, распылительную сушку или лиофилизацию.
30. Способ по любому из пп.1-11, 12, 20, 26-29, где полипептид получают в системе экспрессии на основе клетки грибов, дрожжей, бактерий, насекомых, животных и растений.
31. Способ по п.30, где клетка-хозяин представляет собой клетку бактерии, предпочтительно штамма Escherichia coli, более предпочтительно штамма Escherichia coli, который является штаммом K12, еще более предпочтительно штамм Escherichia coli K12 представляет собой штамм Escherichia coli MG1655.
32. Способ по п.30, где клетка-хозяин представляет собой клетку дрожжей.
33. Способ по любому из пп.1-11, 12, 20, 26-32, где концентрация лактозы в среде для культивирования находится в диапазоне от 50 до 150 г/л.
34. Способ по любому из пп.1-11, 12, 20, 26-33, где конечная концентрация 3-фукозиллактозы находится в диапазоне от 70 г/л до 200 г/л.
35. Способ по любому из пп.1-11, 12, 20, 26-34, где указанное получение приводит к отношению концентрации лактозы к концентрации 3-фукозиллактозы по окончанию ферментации, составляющему меньше чем 1:5.
36. Способ по любому из пп.1-11, 12, 20, 26-35, где указанное получение приводит к степени чистоты 3-фукозиллактозы по окончанию ферментации, составляющей 80% или больше.
37. Способ получения α-1,3-фукозиллактозы, причем способ предусматривает стадии:
а) обеспечения полипептида с α-1,3-фукозилтрансферазной активностью и со способностью использовать лактозу в качестве акцепторного субстрата;
b) приведения полипептида с α-1,3-фукозилтрансферазной активностью из стадии а) в контакт со смесью, содержащей GDP-фукозу в качестве донорного субстрата и лактозу в качестве акцепторного субстрата, в условиях, при которых полипептид катализирует перенос остатка фукозы с донорного субстрата на акцепторный субстрат,
за счет чего получают α-1,3-фукозиллактозу;
с) где указанный катализ приводит к отношению концентрации лактозы к концентрации 3-фукозиллактозы по окончанию ферментации, составляющему меньше чем 1:5,
d) необязательно отделения указанной α-1,3-фукозиллактозы.
38. Способ получения α-1,3-фукозиллактозы, причем способ предусматривает стадии:
а) обеспечения полипептида с α-1,3-фукозилтрансферазной активностью и со способностью использовать лактозу в качестве акцепторного субстрата;
b) приведения полипептида с α-1,3-фукозилтрансферазной активностью из стадии а) в контакт со смесью, содержащей GDP-фукозу в качестве донорного субстрата и лактозу в качестве акцепторного субстрата, в условиях, при которых полипептид катализирует перенос остатка фукозы с донорного субстрата на акцепторный субстрат,
за счет чего получают α-1,3-фукозиллактозу;
c) где указанный катализ приводит к степени чистоты 3-фукозиллактозы по окончанию ферментации, составляющей 80% или больше;
d) необязательно отделения указанной α-1,3-фукозиллактозы.
39. Способ получения 3-фукозиллактозы, предусматривающий по меньшей мере одну из следующих стадий:
i) добавление в среду для культивирования лактозной подпитки, содержащей по меньшей мере 50, более предпочтительно по меньшей мере 75, более предпочтительно по меньшей мере 100, более предпочтительно по меньшей мере 120, более предпочтительно по меньшей мере 150 грамм лактозы на начальный объем реактора, предпочтительно в непрерывном режиме и предпочтительно так, чтобы конечный объем среды для культивирования в не более чем три раза, предпочтительно в не более чем два раза, более предпочтительно менее чем в 2 раза превышал объем среды для культивирования перед добавлением указанной лактозной подпитки;
ii) добавление лактозной подпитки в непрерывном режиме в среду для культивирования на протяжении 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней в форме подпитывающего раствора;
iii) добавление лактозной подпитки в непрерывном режиме в среду для культивирования на протяжении 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней в форме подпитывающего раствора, и где концентрация указанного подпитывающего раствора лактозы составляет 50 г/л, предпочтительно 75 г/л, более предпочтительно 100 г/л, более предпочтительно 125 г/л, более предпочтительно 150 г/л, более предпочтительно 175 г/л, более предпочтительно 200 г/л, более предпочтительно 225 г/л, более предпочтительно 250 г/л, более предпочтительно 275 г/л, более предпочтительно 300 г/л, более предпочтительно 325 г/л, более предпочтительно 350 г/л, более предпочтительно 375 г/л, более предпочтительно 400 г/л, более предпочтительно 450 г/л, более предпочтительно 500 г/л, еще более предпочтительно 550 г/л, наиболее предпочтительно 600 г/л, и где предпочтительно pH указанного раствора составляет от 3 до 7, и где предпочтительно температуру указанного подпиточного раствора поддерживают от 20°C до 80°C;
при этом указанный способ приводит к концентрации 3-фукозиллактозы, составляющей по меньшей мере 50 г/л, предпочтительно по меньшей мере 75 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 90 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 100 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 125 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 150 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 175 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 200 г/л в конечном объеме указанной среды для культивирования, и предпочтительно к отношению концентрации лактозы к концентрации 3FL меньше 1:5, более предпочтительно 1:10, даже более предпочтительно 1:20, наиболее предпочтительно 1:40 в конечном объеме указанной культуры.
40. Способ получения 3-фукозиллактозы, предусматривающий по меньшей мере одну из следующих стадий:
i) добавление в среду для культивирования лактозной подпитки, содержащей по меньшей мере 50, более предпочтительно по меньшей мере 75, более предпочтительно по меньшей мере 100, более предпочтительно по меньшей мере 120, более предпочтительно по меньшей мере 150 грамм лактозы на начальный объем реактора, предпочтительно в непрерывном режиме и предпочтительно так, чтобы конечный объем среды для культивирования в не более чем три раза, предпочтительно в не более чем два раза, более предпочтительно менее чем в 2 раза превышал объем среды для культивирования перед добавлением указанной лактозной подпитки;
ii) добавление лактозной подпитки в непрерывном режиме в среду для культивирования на протяжении 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней в форме подпитывающего раствора;
iii) добавление лактозной подпитки в непрерывном режиме в среду для культивирования на протяжении 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней в форме подпитывающего раствора, и где концентрация указанного подпитывающего раствора лактозы составляет 50 г/л, предпочтительно 75 г/л, более предпочтительно 100 г/л, более предпочтительно 125 г/л, более предпочтительно 150 г/л, более предпочтительно 175 г/л, более предпочтительно 200 г/л, более предпочтительно 225 г/л, более предпочтительно 250 г/л, более предпочтительно 275 г/л, более предпочтительно 300 г/л, более предпочтительно 325 г/л, более предпочтительно 350 г/л, более предпочтительно 375 г/л, более предпочтительно 400 г/л, более предпочтительно 450 г/л, более предпочтительно 500 г/л, еще более предпочтительно 550 г/л, наиболее предпочтительно 600 г/л, и где предпочтительно pH указанного раствора составляет от 3 до 7, и где предпочтительно температуру указанного подпиточного раствора поддерживают от 20°C до 80°C;
при этом указанный способ приводит к концентрации 3-фукозиллактозы, составляющей по меньшей мере 50 г/л, предпочтительно по меньшей мере 75 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 90 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 100 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 125 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 150 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 175 г/л, более предпочтительно по меньшей мере 200 г/л в конечном объеме указанной среды для культивирования, и предпочтительно к степени чистоты 3FL, составляющей 80% или больше, в конечном объеме указанной культуры.