СПОСОБ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ
ERYTHROCYTE RESISTANCE ASSESSMENT METHOD

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к биохимии, и может быть использовано для оценки состояния эритроцитов при лечении и контроле за эффективностью проводимых лечебных мероприятий у больных соматическими заболеваниями.
Устойчивость эритроцитов зависит от их энергетических ресурсов, которые обеспечиваются процессом гликолиза. Этот процесс характеризуется постоянством внутреннего метаболического состава промежуточных, в основном фосфорсодержащих продуктов, обеспечивающих целостность клеток. Основным органическим фосфатом в эритроците является 2,3-дифосфоглицерат (до 70-80%), концентрация которого зависит от неорганического фосфата, являющегося кофактором гликолитических процессов в эритроцитах. Соотношение этих продуктов (2,3-дифосфоглицерата и неорганического фосфата) влияет на сохранение целостности эритроцита.
Известен способ оценки осмотической стойкости эритроцитов путем определения степени гемолиза эритроцитов в забуференных гипертонических растворах хлорида натрия, в процентах (Лабораторные методы исследования в клинике. Под редакцией В.В.Меньшикова. М.: Медицина, 1987. С.119).
К недостаткам данного способа следует отнести его низкую воспроизводимость, связанную с установлением условий начального и 100%-ного гемолиза, а также длительность определения устойчивости эритроцитов.
Наиболее близким к предлагаемому является способ определения состояния мембран эритроцитов (патент №2296992 РФ, МПК G01№ 33/48, G01N 33/52 /Кузнецова Э.Э., Горохова В.Г., Горохов А.Г., Рунович А.А. - опубл.: 10.04.2007. Бюл. №10).
Сущность известного способа заключается в том, что в качестве оценочного критерия используют величину суммарной оптической плотности супернатанта, изменение которой, по сравнению с аналогичными показателями доноров, в 1,5 и более раза свидетельствует о метаболических нарушениях в мембранах эритроцитов, обусловленных их повреждением.
Известный способ позволяет установить наличие или отсутствие повреждений в мембранах эритроцитов. Однако данный способ не позволяет оценить энергетическую устойчивость эритроцитов,
Задачей заявляемого технического решения является разработка способа определения устойчивости эритроцитов.
Техническим результатом предлагаемого способа является оценка энергетической устойчивости эритроцитов.
Технический результат достигается тем, что способ оценки устойчивости эритроцитов включает взятие пробы крови, выделение эритроцитов и определение их спектральных характеристик.
31
Отличительные приемы заявляемого способа заключаются в проведении ЯМР- спектроскопии на фосфорных ядрах. Для этого выделенные эритроциты отмывают в натрий-калиевом буфере, снимают Р-ЯМР спектры взвеси эритроцитов и по величинам пиков определяют содержание 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ) и неорганического фосфата (НФ) в процентах.
эу
эу
Отличительной особенностью заявленного способа является и то, что на основании полученных величин по формуле П=2,3-ДФГ/НФ определяют показатель энергетической устойчивости эритроцитов (П).
эу
эу
эу
эу
Авторами заявленного способа установлено, что величина П позволяет оценить наличие или отсутствие изменений в процессе гликолиза в эритроцитах. Так, П доноров равен 4,38±0,29; величина П меньше 4,0 свидетельствует о нарушении энергетической устойчивости эритроцитов; у больных воспалительными заболеваниями толстой кишки величина П составляет 3,38±0,23 (р<0,05), что указывает на выраженные изменения обменных процессов в эритроцитах.
Проведенный с прототипом сопоставительный анализ показал, что предлагаемый способ отличается от известного вышеперечисленными приемами, следовательно, соответствует критерию «новизна».
Сравнения заявленного технического решения не только с прототипом, но и с другими техническими решениями в биохимии не позволило выявить в них признаки, отличающие заявленное решение не только от способа-прототипа, но и от других аналогичных технических решений.
В доступной литературе авторами не выявлено способа оценки энергетической устойчивости эритроцитов по соотношению содержания 2,3-дифосфоглицерата к неорганическому фосфату.
Клинические наблюдения и проведенный анализ полученных результатов позволил авторам заявляемого способа установить нарушения энергетической устойчивости эритроцитов. Это позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».
Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине, а именно в биохимии. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами, следовательно, предлагаемое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».
31
Заявляемый способ осуществляют следующим образом. Утром, натощак, из локтевой вены забирают кровь в пробирку, содержащую 3.8% раствора цитрата натрия. Пробу крови центрифугируют, отделяют жидкую часть от форменных элементов крови. Выделенные эритроциты отмывают натрий-калиевым (NaKCl) буферным раствором (рН-7.36) при температуре 2-3 С° с трехкратным центрифугированием при 2000 об/мин в течение 15 мин. Спектры ЯМР взвеси эритроцитов записывают на ЯМР-спектрометре DRX-500, фирма Bruker (Германия) при условиях: ширина импульса 10 мс, время задержки импульса 1-2 с, время накопления спектра 30 мин. Для Р- спектров использована частота 202.46 МГц. Накопление и обработку спектров производят по программе XMIN-NMR. Version 3.1. (Кручинина М.В., Курилович С.А., Поруликова И.В., Шакиров И.И. ж. Гепатология, 2003, №2, с.28-33).
После обработки полученных спектров по размерам пиков устанавливают процентное содержание неорганического фосфата и 2,3- дифосфоглицерата.
Оценку энергетической устойчивости эритроцитов рассчитывают по формуле
,
эу
где П - показатель энергетической устойчивости эритроцитов,
2,3 ДФГ - содержание 2,3-дифосфоглицерата, в %,
НФ - содержание неорганического фосфата, в %.
ЭУ,
ЭУ
И при величине Правной 4,0 и больше, устанавливают энергетическую устойчивость эритроцитов, а при величине П, меньшей 4,0, оценивают снижение энергетической устойчивости эритроцитов.
Предложенный способ поясняется примерами конкретного выполнения.
Пример №1. Больная К., история болезни №43164. Диагноз: болезнь Крона.
31
Эу
В результате проведения ЯМР-спектроскопии пробы крови больной К. получены фосфорные (Р)-ЯМР спектры взвеси эритроцитов: НФ=21,87%; 2,3-ДФГ=45,89%. По вышеприведенной формуле установлена величина П, равная 2,09. У больной К. установлено нарушение энергетической устойчивости эритроцитов.
Пример №2. Больной А., история болезни №26776. Диагноз: Неспецифический язвенный колит, впервые выявленный.
31
ЭУ
Р- ЯМР спектры: НФ=26,44%; ДФГ=47,31%; П=1,78.
ЭУ
Полученный показатель П свидетельствует о нарушении устойчивости красных клеток крови.
Пример №3. Больная С., история болезни №26309. Диагноз: Неспецифический язвенный колит, хроническое рецидивирующее течение.
31
ЭУ
Р-ЯМР спектры: НФ=33,48%; ДФГ=32,02%; П=0,95. Энергетическая устойчивость эритроцитов оценена как сниженная.
31
ЭУ
Пример №4. Донор Б. Проведена ЯМР-спектроскопия пробы крови. Получены фосфорные (Р)-ЯМР спектры взвеси эритроцитов: НФ=12,35%; 2,3-ДФГ=55,10%. По формуле рассчитана величина П=4,46. Показатель энергетической устойчивости эритроцитов свидетельствует о нормальном протекании в них процесса гликолиза.
Пример №5. Больной Г., Диагноз: болезнь Крона.
31
ЭУ
Фосфорные (Р)-ЯМР спектры взвеси эритроцитов при поступлении: НФ=23,31%; 2,3-ДФГ=47,87%. П=2,05.
ЭУ
После проведенного курса лечения фосфорные спектры пробы крови этого больного: НФ=12,06%; 2,3-ДФГ=50,90%. П=4,22.
ЭУ
Из данного примера видно, что под воздействием лечения показатель энергетической устойчивости эритроцитов увеличился более чем в 2 раза. В данном примере П является критерием эффективности проведенной медикаментозной терапии.
31
Авторами заявляемого способа проведено исследование Р-ЯМР-спектров образцов крови 31-го больного воспалительными заболеваниями кишечника (ВЗК) и 9-ти доноров. Сравнительные результаты представлены в нижеприведенной таблице.
<sup>31</sup>Р-ЯМР спектры взвеси эритроцитов обследуемых групп
Обследуемые
НФ (%)
2,3-ДФГ (%)
П<sub>эу</sub>
Больные ВЗК n=31
19,29±1,25 р<0,05
50,76±1,61 р<0,02
3,38±0,23 <0,05
Доноры n=9
13,3±0,94
55,36±1,01
4,38±0,29
Полученные сравнительные данные свидетельствуют о достоверном снижении показателя энергетической устойчивости эритроцитов у больных ВЗК, т.е. о нарушении процесса гликолиза в них.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет оценить энергетическую устойчивость эритроцитов, показатель которой может быть использован как для оценки эффективности проводимого лечения, так и для динамического контроля за состоянием пациента в отдаленные сроки после выписки из стационара.