СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕЛЬТАМЕТРИНА И ЛЯМБДА-ЦИГАЛОТРИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ
METHOD OF DETECTING DELTAMETHRIN AND LAMBDA-CYHALOTHRIN IN BIOLOGICAL MATERIAL

Изобретение относится к биологии, экологии, токсикологической и санитарной химии, а именно к способам определения дельтаметрина и лямбда-цигалотрина в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, ветеринарных и экологических лабораториях. Способ относится к числу массовых.
Известен способ определения органических веществ в биологическом материале путем измельчения биологического объекта, неоднократного настаивания с этанолом (каждый раз в течение суток), объединения вытяжек, сгущения объединенного извлечения, осаждения в нем белков абсолютным этанолом, фильтрования, упаривания фильтрата до густоты сиропа и разбавления водой с последующей экстракцией анализируемых соединений сначала из кислого, а затем из щелочного растворов (Швайкова М.Д. Токсикологическая химия. - М.: Медицина, 1975. - С.119-123).
Способ трудоемок, требует значительных затрат времени на его осуществление, характеризуется низкой степенью извлечения дельтаметрина и лямбда-цигалотрина.
Известен способ определения лямбда-цигалотрина ((R,S)-альфа-циано-3-феноксибензил-(±;цис)-3-[(2)-2-хлоро-3,3,3,-тритрифторпропенил]-2,2-диметилциклопропанкарбоксилата) в биологическом материале (ткани трупной печени человека), заключающийся в том, что биологическую пробу измельчают, настаивают по 1 часу с порциями диоксана, каждая из которых в 2 раза по массе превышает количество биоматериала, отдельные извлечения объединяют, объединенное извлечение упаривают в токе воздуха, доводят до определенного объема диоксаном, часть извлечения наносят на хроматографическую пластину с гидроксилированным сорбентом («Силуфол» UV-254), хроматографируют, используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан-хлороформ, взятых в соотношении 1:1 по объему, хроматограмму проявляют в УФ-свете, анализируемое вещество элюируют из сорбента ацетонитрилом, часть элюата наносят на хроматографическую пластину с обращеннофазовым сорбентом (пластина «Силуфол» UV-254, обработанная вазелиновым маслом), хроматографируют, используя в качестве подвижной фазы систему растворителей диоксан-вода, взятых в соотношении 8:2 по объему, хроматограмму проявляют в УФ-свете, анализируемые вещества элюируют из сорбента этанолом, а элюат фотометрируют (Шорманов В.К., Чигарёва Е.Н. Особенности изолирования лямбда-цигалотрина из биологического материала // Судебно-медицинская экспертиза. - 2006. - Т.49, №4. - С.35-37).
Наиболее близким является способ определения дельтаметрина ((S)-альфа-циано-3-феноксибензил-(1R,цис)-3-(2,2-дибромвинил)-2,2диметил-циклопропанкарбоксилата) в биологическом материале (ткани трупной печени человека), состоящий в том, что биологическую пробу измельчают, дважды по 1 часу настаивают с порциями диоксана, каждая из которых в два раза по массе превышает количество биоматериала, отдельные извлечения объединяют, объединенное извлечение упаривают в токе воздуха до получения сухого остатка, остаток растворяют в определенном количестве системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных отношениях 150:50:1, вводят полученный раствор в колонку, заполненную силикагелем L 40/100 µ, и осуществляют хроматографирование, используя подвижную фазу гексан-диоксан-пропанол-2 (150:50:1 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюат испаряют, остаток растворяют в хлороформе, полученный раствор наносят на хроматографическую пластину с гидроксилированным сорбентом (пластина «Силуфол» UV-254), хроматографируют, используя в качестве подвижной фазы систему растворителей гексан-хлороформ, взятых в объемном отношении 5:5, хроматограмму проявляют в УФ-свете, анализируемое вещество элюируют из сорбента этанолом с последующим фотометрированием элюата (Шорманов В.К., Чигарёва Е.Н. Сипливая Л.Е., Павлова О.Н. Сравнительное изучение особенностей изолирования дельтаметрина из биологического материала // Всероссийский съезд фармацевтических работников: сборник материалов съезда (6-7 июля 2005 г., г.Сочи). - Сочи, 2005. - С.165-166).
Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью (открываемый минимум составляет 40 мкг в хроматографируемой пробе и 2 мг в 100 г биологического материала) и малой селективностью определения (данный способ не позволяет определять дельтаметрин в присутствии лямбда-цигалотрина, и наоборот).
Задачей настоящего изобретения является повышение чувствительности и селективности определения.
Поставленная цель достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) измельчают, дважды по 1 часу настаивают с порциями диоксана, каждая из которых в два раза по массе превышает количество биоматериала, отдельные извлечения объединяют, фильтруют, фильтрат упаривают в токе воздуха до незначительного объема, разбавляют в 5 раз водой, экстрагируют этилацетатом дважды, экстракты объединяют, растворитель испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (150:50:1 по объему), хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 µ с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (150:5:1 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемые вещества, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и хроматографируют методом ВЭЖХ с применением обращеннофазового сорбента «Nova Pack С-18», подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектора на основе фотодиодной матрицы.
Способ осуществляется следующим образом: биологическую ткань, содержащую дельтаметрин и лямбда-цигалотрин, измельчают, дважды по 1 часу настаивают с порциями диоксана, каждая из которых в два раза по массе превышает количество биоматериала, отдельные извлечения объединяют, фильтруют, фильтрат упаривают до незначительного объема, разбавляют в 5 раз водой, экстрагируют этилацетатом дважды, этилацетатные экстракты объединяют, растворитель испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (150:50:1 по объему) хроматографируют в колонке с силикагелем L 40/100 µ с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (150:5:1 по объему), фракции элюата, содержащие анализируемые вещества, объединяют, элюент испаряют, остаток растворяют в смеси растворителей ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и хроматографируют методом ВЭЖХ с применением обращеннофазового сорбента «Nova Pack С-18», подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектора на основе фотодиодной матрицы.
Пример 1
Определение дельтаметрина в ткани печени
К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 10 мг дельтаметрина ((S)-альфа-циано-3-феноксибензил-(1R,цис)-3-(2,2-дибромвинил)-2,2-диметилциклопропанкарбоксилата), тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 г диоксана и выдерживают 60 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, фильтр дополнительно промывают 10 г диоксана. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают в токе воздуха при комнатной температуре до объема менее 4 мл, доводят до 4 мл диоксаном, переносят в делительную воронку, добавляют 16 мл воды, 20 мл этилацетата и экстрагируют путем встряхивания содержимого воронки в течение 4 минут (около 120 встряхиваний). Процесс экстракции повторяют дважды. Извлечения объединяют в выпарительной чашке, растворитель испаряют из экстракта в токе воздуха при комнатной температуре, остаток растворяют в 3-4 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных отношениях 150:50:1. Полученный раствор вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 µ. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку прибавляют элюент - систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных отношениях 150:50:1. Выходящий из колонки элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 14 по 25 включительно объединяют в выпарительной чашке, элюент испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, остаток растворяют в 20 мл ацетонитрила, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки водой. 20 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Alliance» фирмы «Waters».
Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной обращеннофазовым сорбентом «Nova Pack С-18» с применением подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектора на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны, равной 276 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 6,115 мин (объемом удерживания 6115 мкл) соответствует дельтаметрину.
Количественное содержание дельтаметрина определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в ткань печени.
Построение калибровочного графика
В ряд мерных колб вместимостью 100 мл вносят 1,25; 2,5; 5,0; 12,5; 25,0; 37,5; 50,0 мл 0,002% раствора дельтаметрина в ацетонитриле, добавляют соответственно 78,75; 77,5; 75; 67,5; 55,0; 42,5; 30,0 мл ацетонитрила и доводят до метки водой. 20 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной обращеннофазовым сорбентом «Nova Pack С-18», используя подвижную фазу ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектор на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны, равной 276 нм. По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади хроматографического пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,005-0,2 мкг. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:
6
S=5,01025·10·C-727,
где S - площадь хроматографического пика,
С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг.
Результаты количественного определения дельтаметрина представлены в таблице 1.
Пример 2
Определение лямбда-цигалотрина в ткани печени
К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 10 мг лямбда-цигалотрина ((R,S)-альфа-циано-3-феноксибензил-(±;цис)-3-[(Z)-2-хлоро-3,3,3,-тритрифторпропенил]-2,2-диметилциклопропанкарбоксилата), тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемое вещество, заливают 20 г диоксана и выдерживают 60 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, фильтр дополнительно промывают 10 г диоксана. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают в токе воздуха при комнатной температуре до объема менее 4 мл, доводят до 4 мл диоксаном, переносят в делительную воронку, добавляют 16 мл воды, 20 мл этилацетата и экстрагируют путем встряхивания содержимого воронки в течение 4 минут (около 120 встряхиваний). Процесс экстракции повторяют дважды. Извлечения объединяют в выпарительной чашке, растворитель испаряют из экстракта в токе воздуха при комнатной температуре, остаток растворяют в 3-4 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных отношениях 150:50:1. Полученный раствор вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 µ. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку вносят систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных отношениях 150:50:1. Выходящий из колонки элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 14 по 25 включительно объединяют в выпарительной чашке, элюент испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, остаток растворяют в 20 мл ацетонитрила, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки водой. 20 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Alliance» фирмы «Waters».
Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной обращеннофазовым сорбентом «Nova Pack С-18» с применением подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектора на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны равной 276 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 5,737 мин (объемом удерживания 5737 мкл) соответствует лямбда-цигалотрину.
Количественное содержание лямбда-цигалотрина определяют, исходя из площади хроматографического пика, по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в ткань печени.
Построение калибровочного графика
В ряд мерных колб вместимостью 100 мл вносят 1,25; 2,5; 5,0; 12,5; 25,0; 37,5; 50,0 мл 0,002% раствора лямбда-цигалотрина в ацетонитриле, добавляют соответственно 78,75; 77,5; 75; 67,5; 55,0; 42,5; 30,0 мл ацетонитрила и доводят до метки водой. 20 мкл каждого из полученных растворов вводят в хроматограф. Хроматографирование осуществляют на колонке размером 150×3,9 мм, заполненной обращеннофазовым сорбентом «Nova Pack С-18», используя подвижную фазу ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектор на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны, равной 276 нм.
По результатам измерений на хроматографе строят график зависимости площади хроматографического пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 0,005-0,2 мкг.
Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:
7
S=8,72105·10·C+948,
где S - площадь хроматографического пика,
С - концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, мкг.
Результаты количественного определения лямбда-цигалотрина представлены в таблице 2.
Пример 3
Определение дельтаметрина и лямбда-цигалотрина в ткани печени при совместном присутствии
К 10 г мелкоизмельченной ткани печени прибавляют 10 мг дельтаметрина ((S)-альфа-циано-3-феноксибензил-(1R,цис)-3-(2,2-дибромвинил)-2,2диметилциклопропанкарбоксилата) и 10 мг лямбда-цигалотрина ((R,S)-альфа-циано-3-феноксибензил-(±;цис)-3-[(Z)-2-хлоро-3,3,3,-тритрифтор-пропенил]-2,2-диметилциклопропанкарбоксилата), тщательно перемешивают биологическую ткань с веществами и оставляют на сутки при температуре 18-20°С. По истечении указанного времени биологический объект, содержащий анализируемые вещества, заливают 20 г диоксана и выдерживают 60 минут при периодическом перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в указанных условиях. Отдельные вытяжки объединяют, фильтруют через бумажный фильтр, фильтр дополнительно промывают 10 г диоксана. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают в токе воздуха при комнатной температуре до объема менее 4 мл, доводят до 4 мл диоксаном, переносят в делительную воронку, добавляют 16 мл воды, 20 мл этилацетата и экстрагируют путем встряхивания содержимого воронки в течение 4 минут (около 120 встряхиваний). Процесс экстракции повторяют дважды. Извлечения объединяют в выпарительной чашке, растворитель испаряют из экстракта в токе воздуха при комнатной температуре, остаток растворяют в 3-4 мл системы растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных отношениях 150:50:1. Полученный раствор вносят в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 µ. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку вносят систему растворителей гексан-диоксан-пропанол-2, взятых в объемных отношениях 150:50:1. Выходящий из колонки элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 14 по 25 включительно объединяют в выпарительной чашке, элюент испаряют в токе воздуха при комнатной температуре, остаток растворяют в 20 мл ацетонитрила, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки водой. 20 мкл полученного раствора вводят в хроматограф типа «Alliance» фирмы «Waters».
Хроматографируют методом ВЭЖХ. Процесс хроматографирования осуществляют в колонке размером 150×3,9 мм, заполненной обращеннофазовым сорбентом «Nova Pack С-18» с применением подвижной фазы ацетонитрил-0,025 М раствор дигидрофосфата калия (4:1 по объему) и детектора на основе фотодиодной матрицы. Скорость подачи элюента составляет 1 мл/мин при температуре колонки 20°С. Оптическую плотность регистрируют при длине волны, равной 276 нм. Пик на хроматограмме с временем удерживания 6,115 мин (объемом удерживания 6115 мкл) соответствует дельтаметрину. Пик на хроматограмме с временем удерживания 5,737 мин (объемом удерживания 5737 мкл) соответствует лямбда-цигалотрину.
Количественное содержание дельтаметрина и лямбда-цигалотрина определяют, исходя из площадей хроматографических пиков, по уравнениям калибровочных графиков и пересчитывают на навески веществ, внесенных в ткань печени.
Схемы построения калибровочных графиков для определения дельтаметрина и лямбда-цигалотрина и уравнения этих графиков представлены выше в примерах 1 и 2.
Результаты количественного определения дельтаметрина и лямбда-цигалотрина при их совместном присутствии представлены в таблице 3.
Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 200 раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 10 раз - в ткани печени, характеризуется более высокой селективностью (позволяет, в отличие от прототипа, определять индивидуально дельтаметрин и лямбда-цигалотрин при их одновременном присутствии в биоматериале).
Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 4.
Таблица 1
Результаты определения дельтаметрина в ткани печени (n=5, Р=0,95)
№
Внесено дельтаметрина, мг в 10 г печени
Найдено
Метрологические характеристики
мг
%
1
10,00
7,228
72,28
<img file="00000001.tif" he="5" wi="21" img-content="undefined" img-format="tif" />
2
10,00
7,088
70,88
S=1,94
3
10,00
7,015
70,15
<img file="00000002.tif" he="5" wi="21" img-content="undefined" img-format="tif" />
4
10,00
6,910
69,10
<img file="00000003.tif" he="5" wi="21" img-content="undefined" img-format="tif" />
5
10,00
6,713
67,13
<img file="00000004.tif" he="5" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
Таблица 2
Результаты определения лямбда-цигалотрина в ткани печени (n=5, Р=0,95
№
Внесено лямбда-цигалотрина, мгв 10 г печени
Найдено
Метрологические характеристики
мг
%
1
10,00
5,589
55,89
<img file="00000005.tif" he="5" wi="22" img-content="undefined" img-format="tif" />
2
10,00
5,317
53,17
S=1,87
3
10,00
5,455
54,55
<img file="00000006.tif" he="5" wi="20" img-content="undefined" img-format="tif" />
4
10,00
5,756
57,56
<img file="00000007.tif" he="6" wi="22" img-content="undefined" img-format="tif" />
5
10,00
5,321
53,21
<img file="00000008.tif" he="5" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
Таблица 3
Результаты определения дельтаметрина и лямбда-цигалотрина при совместном присутствии в ткани печени (n=5, Р=0,95)
№
Внесено в 10 г печени
Найдено
дельтаметрина
лямбда-цигалотрина
мг
%
метрологические характеристики
мг
%
метрологические характеристики
дельтаметрина, мг
лямбда-цигалотрина, мг
1
10,00
10,00
7,312
73,12
<img file="00000009.tif" he="5" wi="22" img-content="undefined" img-format="tif" />
5,712
57,12
<img file="00000010.tif" he="5" wi="22" img-content="undefined" img-format="tif" />
2
10,00
10,00
7,109
71,09
S=1,83
5,425
54,25
S=1,84
3
10,00
10,00
6,809
68,09
<img file="00000011.tif" he="5" wi="20" img-content="undefined" img-format="tif" />
5,396
53,96
<img file="00000012.tif" he="5" wi="20" img-content="undefined" img-format="tif" />
4
10,00
10,00
7,115
71,15
<img file="00000013.tif" he="5" wi="21" img-content="undefined" img-format="tif" />
5,229
52,29
<img file="00000014.tif" he="5" wi="22" img-content="undefined" img-format="tif" />
5
10,00
10,00
7,009
70,09
<img file="00000015.tif" he="4" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
5,578
55,78
<img file="00000016.tif" he="4" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
Таблица 4
Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов
Показатели
Предлагаемый способ
Известный способ
1. Чувствительность (открываемый минимум) на примере дельтаметрина
а) в 100 г биоматериала
0,2 мг
2 мг
б) в хроматографируемой пробе
0,005 мкг
1,0 мкг
2. Селективность
Позволяет определять индивидуально дельтаметрин и лямбда-цигалотрин при их совместном присутствии в биологическом материале
Не позволяет определять индивидуально дельтаметрин и лямбда-цигалотрин при их совместном присутствии в биологическом материале