Способ получения гипериммунной сыворотки, содержащей гетерологичные иммуноглобулины против лихорадки Эбола
METHOD FOR PRODUCTION OF HYPERIMMUNE SERUM CONTAINING HETEROLOGIC IMMUNOGLOBULINES AGAINST EBOLA FEVER

Изобретение относится к способу получения гипериммунной сыворотки для производства лечебного иммуноглобулина против лихорадки Эбола и может быть использовано в медицине для экстренной профилактики лихорадки Эбола.
6-7
В настоящее время лечение лихорадки Эбола сводится к симптоматической терапии. Одной из наиболее часто применяемых при лечении лихорадки Эбола процедур является плазмоферез, который используется для снижения вирусной нагрузки на организм. В связи с тем, что инкубационный период заболевания лихорадкой Эбола очень короткий, а вызываемая вирусемия достигает значений 10 вирусных частиц на 1 мл крови, иммунный ответ у заболевшего не успевает полноценно ответить и справиться с заболеванием. Введение больному специфических иммуноглобулинов или сыворотки реконвалесцента позволяет частично восполнить гуморальный ответ организма и рекомендовано ВОЗ для лечения лихорадки Эбола (WHO. Use of Convalescent Whole Blood or Plasma Collected from Patients Recovered from Ebola Virus Disease for Transfusion, as an Empirical Treatment during Outbreaks / Interim Guidance for National Health Authorities and Blood Transfusion Services. Version 1.0 September 2014, available http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/135591/1/WHO_HIS_SDS_2014.8_eng.pdf).
Известен способ получения гетерологических иммуноглобулинов против вирусных инфекций Марбург и Эбола, включающий иммунизацию животных-продуцентов вирусными антигенами, приготовленными из органов инфицированных животных, периодический забор крови у животных-продуцентов с последующим выделением сыворотки, спиртовое осаждение фракции глобулинов из сыворотки крови при отрицательных температурах и последующую очистку глобулинов (патент РФ №2089217, МПК А61К 39/295, опубл. 10.09.1997 г.). В качестве животных-продуцентов используют овец или коз, а забор крови у этих животных осуществляют при достижении активности индекса нейтрализации 2,0 lg и более в реакции биологической нейтрализации на лабораторных животных при инфицировании животных-продуцентов вирусом Марбург и активности индекса нейтрализации 2,75 lg и более при инфицировании животных-продуцентов вирусом Эбола.
Известен способ получения иммуноглобулина из гипериммунной лошадиной сыворотки, содержащей антитела к вирусу Эбола (патент РФ №2130318, МПК А61К 39/42, опубл. 20.05.1999 г.). Забор крови от продуцента осуществляют на 28-42 сутки после 3-ей и последующих иммунизаций (с учетом грунд-иммунизации) лошадей нативным вируссодержащим материалом, когда антитела достигают максимального уровня. Выделение иммуноглобулина Эбола проводят методом спиртового фракционирования на холоду по Кону.
Однако для формирования у животных пула нейтрализующих антител используется живой вирус Эбола в виде культуральной вируссодержащей жидкости или гомогената печени зараженных вирусом Эбола морских свинок. Использование живого вируса Эбола, относящегося к I группе патогенности по классификации Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Санитарно-эпидемиологические правила, СП 1.3.3118-13 БЕЗОПАСНОСТЬ РАБОТЫ С МИКРООРГАНИЗМАМИ I-II ГРУПП ПАТОГЕННОСТИ (ОПАСНОСТИ), требует использования вивария для содержания зараженных животных, оборудованного сложнейшими инженерно-техническими системами. Кроме этого, использование живого вируса Эбола в качестве антигена для иммунизации связано с его получением в препаративных количествах, и также как и содержание иммунизированных животных, требует проведение работ в максимально защищенных лабораториях. Такого рода работы с точки зрения биобезопасности связаны с высоким риском заражения для персонала лаборатории.
Известен способ получения рекомбинантных гуманизированных антител, обладающих нейтрализующей активностью в отношении вируса Эбола (Olinger GG Jr, Pettitt J., Kim D., et al. Delayed treatment of Ebola virus infection with plant derived monoclonal antibodies provides protection in rhesus macaques // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2012; 109:18030-5; Pettitt J., Zeitlin L., Kim K, et al. Therapeutic intervention of Ebola virus infection in rhesus macaques with the MB-003 monoclonal antibody cocktail // Sci. Transl. Med. 2013; 5:199). Например, американской биотехнологической фирмой Марр Biopharmaceutical Inc. (США) разработан препарат ZMapp, который представляет собой композицию трех гуманизированных моноклональных антител, которые производиться в листьях табака (род Nicotiana). Для получения препарата гены, кодирующие химерные моноклональные антитела, были вставлены в вектора, которыми были заражены растения табака. Препарат ZMapp был использован в составе комплексной терапии для лечения людей во время эпидемии лихорадки Эбола в странах северо-западной Африки в 2014-2016 годах.
Однако недостатком такого способа получения рекомбинантных гуманизированных антител является долгий срок получения препарата (несколько месяцев, пока растет растение: Pollack, Andrew (8 August 2014). "In Ebola outbreak, who should get experimental drug?". The New York Times), необходимость строгого выполнения условий выращивания в условиях оранжереи при определенной температуре и освещенности и низкий выход препарата при наработке (из 18 растений можно получить 1 лечебную дозу для человека).
Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ получения иммуноглобулинов против вируса Эбола (патент Китая № CN 104829710, МПК А61К 39/42, опубл. 12.08.2015 г.) путем иммунизации лошадей либо 1) ДНК-препаратом, включающим в свой состав ген, кодирующий GP белок эболавируса Заир, либо 2) ДНК-препаратом, включающим в свой состав ген, кодирующий GP белок эболавируса Судан, либо 3) ДНК-препаратом, включающим в свой состав ген, кодирующий GP белок эболавируса Кот-д’Ивуар, либо 4) смесью перечисленных препаратов в соотношении 1:1:1. Для получения гипериммунной сыворотки против одного из видов эболавируса (эболавируса Заир, эболавируса Судан или эболавируса Кот-д’Ивуар) первую иммунизацию лошадей проводят дозой 1 мг ДНК-препарата, содержащего GP ген любого из указанных эболавирусов; вторую - дозой 1 мг ДНК-препарата, содержащего GP ген любого из указанных эболавирусов; третью - дозой 2 мг ДНК-препарата, содержащего GP ген любого из указанных эболавирусов; и четвертую - дозой 3 мг ДНК-препарата, содержащего GP ген любого из указанных эболавирусов. Для получения гипериммунной сыворотки против 3 видов эболавируса (эболавируса Заир, эболавируса Судан или эболавируса Кот-д’Ивуар) первую иммунизацию лошадей проводят дозой 9 мг смеси ДНК-препаратов, содержащих GP ген каждого из указанных эболавирусов, в пропорции 1:1:1 (по 3 мг каждого ДНК-препарата); вторую - дозой 18 мг смеси ДНК-препаратов, содержащих GP ген каждого из указанных эболавирусов, в пропорции 1:1:1 (по 6 мг каждого ДНК-препарата); третью - дозой 36 мг смеси ДНК-препаратов, содержащих GP ген каждого из указанных эболавирусов, в пропорции 1:1:1 (по 12 мг каждого ДНК-препарата); и четвертую - дозой 72 мг смеси ДНК-препаратов, содержащих GP ген каждого из указанных эболавирусов, в пропорции 1:1:1 (по 24 мг каждого ДНК-препарата). Авторы заявляют также о возможности использования в схемах получения гипериммунных сывороток на лошадях еще 2 препаратов: субъединичной вакцины на основе белка GP эболавирусов Заир, Судан или Кот-д’Ивуар и препаратов на основе вирусоподобных частиц (ВПЧ), сформированных на основе белков GP и VP40 указанных эболавирусов. Гипериммунные сыворотки могут быть получены с использованием как субъединичных вакцин, так и ВПЧ, по схемам, описанным выше для ДНК-препаратов. Кроме этого, авторы заявляют о возможности использования комбинированных схем получения гипериммунных сывороток на лошадях с использованием всех 3 препаратов (ДНК-препараты, субъединичные вакцины и ВПЧ) как против каждого их эболавирусов (эболавирус Заир, Судан или Кот-д’Ивуар) так и против всех 3 видов эболавирусов вместе.
К недостаткам получения гипериммунной сыворотки способом-прототипом можно отнести сложность технологии получения гипериммунной сыворотки, т.к. в схеме вакцинации используется три ДНК-препарата или их смесь, что усложняет схему и увеличивает время иммунизации лошадей. Кроме того, для формирования у животного напряженного иммунного ответа, необходимо получить по 45 мг каждого ДНК-препарата, содержащего кодирующий GP-ген эболавируса, что приводит к увеличению затрат на производство гипериммунной сыворотки и, соответственно, лечебных иммуноглобулинов. По мнению заявителя, это связано с отсутствием коррекции гена GP для получения всех 3-х типов препаратов (ДНК-препарат, субъединичная вакцина и ВПЧ) в способе-прототипе. Известно, что экспрессия GP белка из клетки, в которой находится плазмида, существенно снижена по сравнению с экспрессией этого белка вирус-инфицированной клеткой. На повышение экспрессии GP белка эболавируса влияет замена 2-х аминокислот, находящихся непосредственно рядом с сайтом расщепления, в позициях D637A и Q638V. Особенностью получения ДНК-препарата и ВПЧ-препарата (используемых в предлагаемом заявителем способе иммунизации) является введение мутации D637L в сайте разрезания ТАСЕ-протеазы, что приводит к усилению отщепления GP с поверхности клеток [Escudero-Perez В., Volchkova V.A., Dolnik О. et al. Shed GP of Ebola virus triggers immune activation and increased vascular permeability // PLoS Pathog. 2014, 10(11):e1004509. doi: 10.1371/journal.ppat.l00450].
Техническим результатом предлагаемого изобретения является упрощение технологии получения гипериммунной сыворотки и сокращение затрат на ее получение.
9
Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения гипериммунной сыворотки, содержащей гетерологичные иммуноглобулины против лихорадки Эбола, включающем 4-кратную иммунизацию лошадей вирусными антигенными препаратами, не содержащими живой вирус Эбола, с последующим забором крови у животных- продуцентов и выделением гипериммунной сыворотки, согласно изобретения, в качестве вирусных антигенных препаратов используют ДНК-препарат, содержащий ген гликопротеина вируса Эбола, и ВПЧ-препарат, содержащий вирусоподобные частицы, включающие ген гликопротеина вируса Эбола, 3-кратное введение ДНК-препарата осуществляют внутримышечно по следующей схеме: 1-я иммунизация - введение ДНК-препарата в дозе 4 мг/животное на 0 сут, 2-я иммунизация - введение ДНК-препарата в дозе 4 мг/животное на 21-28 сут после 1-го введения препарата, 3-я иммунизация - введение ДНК-препарата в дозе 4 мг/животное на 21-28 сут после 2-го введения препарата, четвертую иммунизацию осуществляют подкожно введением ВПЧ-препарата в дозе 3×10 ВПЧ/животное на 56 сут после 3-го введения ДНК-препарата, позволяющие индуцировать у лощадей образование общих специфических антител в титрах не менее 1:75000 и образование нейтрализующих антител к вирусу Эбола в титрах не менее 1:640, а отбор крови для получения гипериммунной сыворотки, содержащей иммуноглобулины, проводят на 10-13-е сутки после иммунизации ВПЧ-препаратом. Общее время иммунизации (от 1-й иммунизации до забора крови) составляет 122 дня.
ДНК-препарат представляет собой ДНК-конструкцию phCMV-GP/D637L, содержащую ген гликопротеина вируса Эбола под контролем промотора цитомегаловируса, а вирусоподобные частицы ВПЧ-препарата получены из среды упаковочных клеток, трансфицированных репликоновой РНК вируса Кунджин, которая содержит ген гликопротеина вируса Эбола.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами. На фиг. 1 приведена физическая и генетическая карта плазмиды phCMV-GP/D637L. На фиг. 2 представлен вектор SP6KUNrep5-GP, используемый для получения репликоновой РНК. На фиг. 3 дана схема получения вирусоподобных частиц. На фиг. 4 приведена схема иммунизации лошадей для получения гипериммунной сыворотки, содержащей иммуноглобулины против вируса Эбола.
Пример 1. Описание состава препаратов, используемых для иммунизации лошадей и получения гипериммунной сыворотки, содержащей гетерологичные иммуноглобулины против лихорадки Эбола
Для первых 3-х иммунизаций используется ДНК-конструкция - phCMV-GP/D637L (Escudero-Perez В et al., PLoS Pathog 2014 10, Reynard O. et al. // J.Infect. Dis. 2011, 204 Suppl 3:s 1060-5), содержащая GP-ген вируса Эбола. Эта ДНК содержит ген гликопротеина вируса Эбола под контролем промотора цитомегаловируса. Введенная мутация (D637L) в сайте разрезания ТАСЕ-протеазы (фиг. 1) приводит к усилению отщепления GP с поверхности клеток, уменьшая присутствие GP на поверхности клеток и тем самым уменьшая цитопатогенный эффект.
9
Для четвертой иммунизации используется ВПЧ-препарат (Reynard О. et al. // J.Infect. Dis. 2011, 204 Suppl 3:s1060-5; Pyankov O.V. et al. // J.Infect. Dis. 2015, 212 Suppl 2:s368-71) в дозе 3×10 ВПЧ/животное. ВПЧ получены из среды упаковочных клеток, трансфицированных репликоновой РНК вируса Куинджи, которая содержит ген гликопротеина (GP/D637L) вируса Эбола. Для получения репликоновой РНК использовали вектор SP6KUNrep5-GP, представленный схематично на фиг. 2 и содержащий следующие элементы: SP6 - промотор РНК полимеразы; 5'UTR, 3'UTR - нетранслируемые области вируса Кунджин; GP/D637L - ген гликопротеина вируса Эбола; Stop - стоп-кодон; IRES - внутренний сайт посадки рибосомы ЕМС вируса; KUN NSPs - неструктурные белки NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5 вируса Кунджин; С20 - первые 20 аминокислот белка сердцевины вируса Кунджин; Е22 - последние 22 аминокислоты Е белка вируса Кунджин; FMDV2A - 2А-автопротеаза вируса FMDV; HDVr - антигеномный рибозим вируса гепатита дельта; рА - сигнал полиаденилирования вируса SV40. Получение ВПЧ частиц проводили по схеме, представленной на фиг. 3.
Пример 2. Способ иммунизации лошадей для получения гипериммунной сыворотки, содержащей гетерологичные иммуноглобулины против лихорадки Эбола
Гипериммунную сыворотку получают после 3 циклов иммунизации животного ДНК-препаратом, содержащей ген, кодирующий гликопротеин (ГП, GP) вируса Эбола и однократной вакцинацией вирусоподобными частицами (ВПЧ), на основе вируса Кунджин, также содержащими ген, кодирующий гликопротеин вируса Эбола [1]. Схема иммунизации лошадей для получения препарата лечебных иммуноглобулинов приведена на фиг. 4.
Для первых 3-х иммунизаций используется ДНК-конструкция - phCMV-GP/D637L (Escudero-Perez В., Volchkova V.A., Dolnik О. et al. Shed GP of Ebola virus triggers immune activation and increased vascular permeability // PLoS Pathog. 2014, 10(11):e1004509. doi: 10.1371/journal.ppat.l004509), содержащая GP-ген вируса Эбола. Эта ДНК содержит ген гликопротеина вируса Эбола под контролем промотора цитомегаловируса. ДНК-препарат вводится внутримышечно в дозе 4 мг/лошадь. Для стимулирования иммунного ответа препарат вводится по следующей схеме: 1-я иммунизация - на 0 сут, 2-я иммунизация - на 21-28 сут после 1-го введения препарата, 3-я иммунизация - на 21-28 сут после 2-го введения препарата.
9
Через 56 сут после последнего, 3-го введения ДНК-препарата лошадям подкожно вводится ВПЧ-препарат [Reynard О. et al. // J.Infect. Dis. 2011, 204 Suppl 3:s1060-5; Pyankov O.V., Bodnev S.A., Pyankova O.G. et al. A Kunjin Replicon Virus-like Particle Vaccine Provides Protection Against Ebola Virus Infection in Nonhuman Primates // J. Infect. Dis. 2015, 212 Suppl 2:S368-71.] в дозе 3×10 ВПЧ/животное. Отбор крови у лошади в объеме 5-15 л проводится на 10-13-е сутки после введения ВПЧ-препарата (см. схему на фиг. 4). Из крови получают плазму или сыворотку, которая используется для получения лечебных иммуноглобулинов.
Пример 3. Изучение эффективности иммуноглобулинов, полученных заявляемым способом из гипериммунной сыворотки лошадей
Из плазмы или сыворотки крови иммунизированных лошадей получают иммуноглобулины для лечения лихорадки Эбола. Для получения лечебных иммуноглобулинов проводят 3 стадии очистки: осаждение гамма-глобулиновой фракции по Кону этанолом при температурах ниже 0°C, после этого очистка гамма-глобулинов с использованием капролоновой кислоты и очистка с помощью ионообменной хроматографии и затем - концентрирование. Методы очистки подробно описаны в литературе и широко используются исследователями (Cohn Е., Edsall Т. Interactions between organic solvents and dipolar ions estimated from solubility ratios // In: Proteins, amino acids and peptides. - Eds. Cohn E, Edsall J. - New York. - 1943. - P. 196-216; Пономарева H.A., Нечаева А.С. Гамма-глобулин. - M. - 1965, 179 с.; Роит А. Иммунология. - М.: Мир. - 2000, 592 с.; Русанов В.М., Скобелев Л.И. Фракционирование белков плзмы в производстве препаратов крови М.: Медицина. - 1983, 224 с.; Очистка и стандартизация препаратов крови человека. Сб. трудов. МНИИВС им. И.И. Мечникова М. - 1980; Eketorp R. Affinity chromatography in industrial ethanol fractionation of human plasma // In: Methods of plasma proteins fractionation. - Ed. Curling J. - NewYork. - 1980. - P. 175-188; J.R. Harris. Blood separation and plasma fractionation. - ed., Wiley-hiss, New York, NY, 1991, 497 pp.). Конечный препарат содержит гамма-глобулины в количестве 140 г/л препарата со степенью очистки не менее 90% и неспецифические примеси: альбумин <13 мг/л, IgA<14,6 мг/л, IgM<17 мг/л, капролат <0,17 г/л, полиэтилен гликоль (ПЭГ)<0,16 г/л. Препарат представляет собой 10%-ный раствор иммуноглобулинов гипериммунной сыворотки крови лошади.
Исследования препарата иммуноглобулина на наличие антител к вирусу Эбола проводилось методом иммунноферментного анализа (ИФА) и в реакции нейтрализации вируса Эбола на культуре клеток Vero. Конечный препарат характеризуется титром антител в ИФА не менее 1:75000 и титром вируснейтрализующих антител не менее чем 1:640.
Лечебную эффективность полученных антител проверяли в экспериментах на обезьянах (Cercopithecus aethiops) весом 5-6 кг, зараженных вирусом Эбола штамм Mayinga в дозе 1000 БОЕ/животное. Лечение инфицированных приматов начинали через 24 часа после заражения и вводили препарат в течение 5 дней. Препарат иммуноглобулинов, полученных из гипериммунной сыворотки заявляемым способом, вводили один раз в день внутривенно в объеме 20 мл. Контрольным животным, которые также, как и животные опытной группы, были заражены вирусом Эбола в дозе 1000 БОЕ/животное, по аналогичной схеме вводили физиологический раствор. Наблюдение за животными осуществляли в течение 32 дней. У контрольных животных появление клинических признаков заболевание в виде повышения температуры тела, лихорадки, потери активности, отказа от еды было зарегистрировано на 4-5 сут после заражения и на 8-9-е сутки после заражения контрольные животные, не получавшие иммуноглобулин, погибли. У опытных животных, получавших иммуноглобулин, изготовленный из гипериммунной сыворотки по заявляемому способу, клинические признаки заболевания в виде повышения температуры тела, лихорадки, потери активности, отказа от еды были зарегистрированы на 6-7 сут после заражения и регистрировались на протяжении 3-4 дней, после чего исчезали. Все животные, получавшие иммуноглобулин, остались живы.
Таким образом, показана максимально высокая терапевтическая эффективность (100%) в исследовании на обезьянах, зараженных вирусом Эбола в дозе 1000 БОЕ по схеме внутривенного применения препарата, содержащего гамма-глобулиновую фракцию в количестве 140 г/л препарата, в экстренно-профилактической схеме применения - в течение 5 суток, начиная через сутки после заражения. Достижение технического результата подтверждается примерами 1-3 реализации изобретения, а именно упрощается технология получения гипериммунной сыворотки за счет использования в схеме иммунизации всего 2 препарата (вместо 3-х препаратов в прототипе) и сокращаются затраты на получение гипериммунной сыворотки, полученной заявляемым способом (количественное содержание используемых для иммунизации препаратов по сравнению со способом-прототипом сокращается в несколько раз).