Влияние водного экстракта табака сигарет на выброс миелопероксидазы лейкоцитами и экспрессию цитокинов у курильщиков с ХОБЛ

3. Аллергологи и иммунология. Национальное руководство. Краткое издание/ под ред. Р.М.Хаитова, Н.И. Ильиной.-М.: ГЭОТАР-Медиа, 2012.-640с.

4. Новиков П.Д., Новикова Н.Д. Диагностика аллергии в реакции выброса миелопероксидазы под влиянием аллергена //Иммунопатология, аллергология, инфектология - 2002; №1: 63-68.

5. Титова Н.Д. Применение реакции выброса миелопероксидазы гранулоцитами для диагностики аллергии к пищевым добавкам //Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - №2. - С.42-45.

6. Трансбуккальный метод диагностики аллергии по увеличению пероксидазной активности в слюне / Д. К. Новиков [и др.]. 2015; №4: 35-43.

7. Щурок И.Н. Повышение пероксидазной активности в носовом лаваже и слюне у пациентов с аллергическим ринитом //Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2017. - №2. P.82-86.

8. König, K., Klemens, C., Eder, K. et al. Cytokine profiles in nasal fluid of patients with seasonal or persistent allergic rhinitis. Allergy Asthma Clin Immunol. 2015. P.11-26

УДК 616.24-007

ВЛИЯНИЕ ВОДНОГО ЭКСТРАКТА ТАБАКА СИГАРЕТ НА ВЫБРОС МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ ЛЕЙКОЦИТАМИ И ЭКСПРЕССИЮ ЦИТОКИНОВ У КУРИЛЬЩИКОВ С ХОБЛ

Научный руководитель:к.м.н., доцент Ищенко О.В., д.м.н., проф. Новиков Д.К

УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет»

Беларусь, 210023, Витебск, пр-т Фрунзе, 27.

tatyana. gordievich@gmail.com - Юпатова Татьяна Геннадьевна

Резюме. В результате исследования выявлена гиперчувствительность лейкоцитов к табаку, проведена оценка воспалительного ответа у курильщиков с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) и курильщиков с нормальной легочной функцией. Установлено, что нейтрофилы курильщиков с ХОБЛ и курильщиков с нормальной легочной функцией реагировали на водный экстракт табака увеличением активности МПО. Максимальный прирост МПО выявлен у 8 из 12 пациентов. У 40% здоровых курильщиков активность МПО была выше 250%. В этих группах выявлен прирост ФНОа. Уровень ИЛ-lß увеличился у каждого курильщика с ХОБЛ и здорового курильщика. Реакция выброса МПО нейтрофилами может использоваться для диагностики гиперчувствительности нейтрофилов к табаку у пациентов с ХОБЛ и здоровых курильщиков, а также выявлять группу риска по развитию обструктивного заболевания. Ключевые слова: хроническая обструктивная болезнь легких, водный экстракт табака, нейтрофилы, миелопероксидаза, ФНОа, ИЛ-lß, ИЛ-2, ИЛ-4.

INFLUENCE OF WATER CIGARETTE TOBACCO EXTRACTION ON MYELOPEROXIDASE EMISSION BY LEUKOCYTES AND EXPRESSION OF CYTOKINS IN SMOKERS WITH COPD

Yupatova T. G., Candidate of Medicine, assistant professor Ishchenko O. V., Doctor of Medicine, professor, Novikov D. K.

Vitebsk state medical University, 27, Frunze Ave., Vitebsk, 210023, Republic of Belarus Abstract. This study is devoted to the hypersensitivity of leukocytes to extract of tobacco and assessing the inflammatory response in smokers with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and smokers with normal pulmonary function. The MPO release from neutrophils occurred during the incubation of leukocytes with extract of tobacco in patients with COPD and healthy smokers. The maximum MPO level was found in 8 from 12 patients. 40% of healthy smokers had MPO activity above 250%. In these groups, an increase in TNFa was revealed. The level of IL-lß increased in every smoker with COPD and a healthy smoker. The reaction of MPO release to neutrophils can be used for diagnosis of the neutrophils hypersensitivity to extract of tobacco in patients with COPD and healthy smokers, and to identify the risk group for the development of obstructive disease.

Key words: chronic obstructive pulmonary disease, myeloperoxidase, extract of tobacco, hypersensitivity Введение. Основным патогенетическим фактором развития хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ) является вдыхание токсикантов. Токсиканты, включая сигаретный дым, действуют, в первую очередь, на эпителий слизистой оболочки бронхов и клетки врожденного иммунитета (дендритные, макрофаги, нейтрофилы) через Toll -рецепторы, это приводит к выделению группы провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, хемокинов и др.) [1]. В развитии обструктивных заболеваний важную роль играют МПО, металлопротеазы, элластаза, катепсин G, протеиназа-3, лактоферрин, простагландины, тромбоксан, интерлейкин-8 (ИЛ-8), фактор некроза опухоли - а (ФНОа) и др. МПО, ИЛ-8, лейкотриен В4 используют в качестве маркеров активации нейтрофилов [2].

В предыдущих исследованиях мы показали, что у лиц с хронической бронхолегочной патологией после инкубации с токсикантами происходит дегрануляция нейтрофилов и выброс МПО [2].

Целью настоящего исследования было изучить влияние водного экстракта табака сигарет на выброс миелопероксидазы лейкоцитами и экспрессию цитокинов у курильщиков с ХОБЛ.

Методика. Исследование проведено на базе пульмонологического отделения УЗ «ВОКБ» и кафедры клинической иммунологии и аллергологии с курсом ФПК и ПК УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет» в 2017 году. Обследованы 12 курящих мужчин с верифицированным диагнозом ХОБЛ, II-III степени тяжести (критерии GOLD), средний возраст составил 59,3±3,1 лет, ОФВ1 49±12,5%. Контрольную группу составили курящие мужчины n=10, с нормальной легочной функцией - ОФВ1 102±12,4%, средний возраст 56,3±5,1 лет. Пациенты были однородны по полу и возрасту. Перед проведением исследования все участники заполнили добровольное информированное согласие. Пациенты за 12 часов до тестирования не употребляли алкоголь, продукты с кофеином, никотин, исключали продукты с высоким гликемическим индексом. Противоаллергические лекарственные средства

отменяли за 3 дня - антигистаминные (АГ) и глюкокортикостероиды (ГКС), и за 7 дней - АГ II поколения. Исследование было одобрено комитетом по этике Витебского государственного медицинского университета. Постановка реакции выброса миелопероксидазы

Известно, что под влиянием аллергенов лейкоциты больных аллергическими заболеваниями выделяют МПО [3]. Этот метод был принят за основу. В реакции использовали водный экстракт табака сигарет. Приготовление образцов экстракта табака сигарет.

Приготовление водного экстракта табака сигарет проводили по методике Т.М. Petro с соавторами [4] с небольшими изменениями. Для приготовления экстракта табака использовали табак одной сигареты 0,87 г марки «Kent №8» (British-American Tobacco Holding, Великобритания) с содержанием никотина 0,7 мг/сигарета и 10,0 мл стерильного физиологического раствора натрия хлорида 0,9% на фосфатно-солевом буфере (ФСБ). Сигарету измельчали, заливали стерильным физиологическим раствором, настаивали 24 часа при комнатной температуре. После чего смесь центрифугировали 10 мин при 1500 об/мин (450*g). Супернатант собирали и повторно центрифугировали 1 час при 7000*g. Затем суспензию фильтровали через бумажные и стеклянные стерильные фильтры диаметром 0,2 мкм pH раствора доводили до 7,4. Непосредственно перед постановкой реакции маточный раствор разводили 1:100 физиологическим раствором хлорида натрия 0,9% на ФСБ.

Ход реакции

Забор периферической венозной крови проводили утром, натощак на вторые сутки поступления в стационар в пробирку с гепарином (20 ЕД/1мл). Кровь отстаивали в узких пробирках до момента четкого отделения эритроцитов от плазмы. Забирали плазму с лейкоцитами, центрифугировали при 1000 об/мин 5 мин. Плазму удаляли. К осадку лейкоцитов добавляли теплый (370С) лизирующий эритроциты раствор хлористого аммония (0,84%) до 8-10 мл. Ресуспензировали и снова центрифугировали. Затем полученную суспензию отмывали не менее трех раз стерильным физиологическим раствором на фосфатном буфере, содержащим 0,2% глюкозу и 0,0025% CaCb.

В пробирки типа Эппендорф вносили 0,1 мл (100 мкл) водного экстракта табака сигарет. Их концентрации были испытаны с лейкоцитами доноров так, что не влияли на выброс МПО в 8 случаях из 10. Добавляли равный объем лейкосуспензии. Пробы дублировали. Параллельно ставили холостые пробы лейкосуспензии каждого пациента со стерильным физиологическим раствором (отрицательный контроль). Смесь инкубировали 45 мин при 37°С., центрифугировали на планшеточной центрифуге в течение 10 мин при 1500 об/мин. Из каждой пробирки осторожно (чтобы не поднять клетки) забирали 100 мкл надосадочной жидкости и переносили в лунку (под тем же номером) плоскодонной планшеты для ИФА. Вносили проявляющий раствор. Инкубировали при комнатной температуре в течение 15-25 мин до появления выраженного окрашивания синего цвета. Реакцию останавливали внесением 100 мкл 4% серной кислоты, цвет раствора изменялся на желтый. Оценку реакции проводили на фотометре при длине волны 450 нм. Тест системы для определения ФНОа, ИЛ-1@, ИЛ-2, ИЛ-4

Уровни ФНОа и ИЛ-1Р, ИЛ-2, ИЛ-4 в надосадочной жидкости определяли методом ИФА с использованием набора Вектор-Бест, Россия.

Обработку результатов проводили при помощи пакета анализа данных программы «Statistica 10», «MS Excel». Для оценки данных применяли методы параметрической статистики, представлены в виде среднего значения (М) и среднего квадратичного отклонения (s), непараметрической статистики, представлены в виде (Ме) с указанием нижнего 25-й (LQ) и верхнего 75-й квартилей (UQ). Для анализа статистических различий в двух зависимых группах по количественному признаку применялись параметрический метод t-критерий Стьюдента для зависимых групп и непараметрический критерий Вилкоксона. Для сравнения двух независимых групп по количественному признаку применялся непараметрический критерий Манна-Уитни. Результаты исследования и их обсуждение.

При анализе результатов исследования нами установлено, что при инкубации лейкоцитов курильщиков с ХОБЛ с водным экстрактом табака сигарет происходит дегрануляция нейтрофилов с выбросом МПО (табл.1). Прирост активности МПО (процент от контрольных величин) у 8 из 12 пациентов был максимальным и составил 293(274;351)%. С помощью ROC-анализа мы рассчитали оптимальный порог процента прироста активности МПО при оптимальных чувствительности Se и специфичности Sp. Для теста с использованием водного экстракта табака сигарет оптимальный порог прироста, обеспечивающий Se50% и Sp90% равен 286% AUC 0,591. В надосадочной жидкости нами не было выявлено динамики ИЛ -2 и ИЛ-4. У пациентов с приростом МПО также обнаружено достоверное увеличение уровня ФНОа (р=0,00009). У 4 пациентов прирост активности МПО составил 43(30;55)%, уровень ФНОа в данной группе достоверно не изменился (p=0,15). Уровень ИЛ-1Р после инкубации резко увеличился у всех курильщиков с ХОБЛ (p=0,0000001).

Таблица 1. Уровень МПО, ФНОа и ИЛ-1@ в надосадочной жидкости после инкубации лейкоцитов курильщиков с ХОБЛ

с водным экстрактом табака сигарет

Показатель ХОБЛ

Прирост активности МПО,%, Me

пациенты с приростом МПО

293

Уровень ФНОа, пг/мл, M±s до пробы после пробы до пробы после пробы

3,7±0,2 4,2±0,2 4,0±0,4 3,8±0,5

р=0,00009 р=0,15

Уровень ИЛ-lß, пг/мл, M±s ХОБЛ

до пробы после пробы

15,0±1,8 38,2±1,7

р=0,00000001

Примечание: * Расчет прироста МПО проводился по формуле: (ОП после пробы - ОП до пробы) / ОП до пробы * 100%, где ОП - оптическая плотность проб.

Лейкоциты здоровых курильщиков реагировали на водный экстракт табака сигарет увеличением активности МПО (табл.2). Прирост активности МПО у 4 человек составил более 250%, у данных участников также увеличился уровень ФНОа (р=0,009), у 6 человек прирост активности МПО составил менее 250%, уровень ФНОа у данных лиц снизился (р=0,01). Уровень ИЛ-1Р после инкубации с токсикантом увеличился у всех добровольцев ф=0,005). Динамики уровня ИЛ-2 и ИЛ-4 в надосадочной жидкости у здоровых курильщиков выявлено не было.

Таблица 2. Уровень МПО, ФНОа и ИЛ-1@ в надосадочной жидкости после инкубации лейкоцитов здоровых

Показатель Контрольная группа

Прирост активности МПО,%, M±s 164±85

курильщики с приростом МПО >250%

269±20 102±21

Уровень ФНОа, пг/мл, M±s до пробы после пробы до пробы после пробы

3,6±0,7 4,0±0,6 4,1±0,9 3,2±0,4

р=0,009 р=0,01

Уровень ИЛ lß, пг/мл, M±s Контрольная группа

до пробы после пробы

2,0

р=0,005

Заключение. Таким образом, после инкубации лейкоцитов курящих пациентов с ХОБЛ с водным экстрактом табака сигарет происходит дегрануляция нейтрофилов и выброс МПО. У 8 из 12 пациентов наблюдался максимальный прирост активности МПО. У 40% здоровых курильщиков прирост активности МПО был выше 250%. В данных группах наблюдалось увеличение уровня ФНОа. Уровень ИЛ-lß увеличился у всех пациентов с ХОБЛ и здоровых курильщиков. Не было выявлено динамики уровней ИЛ-2 и ИЛ-4 в надосадочной жидкости после инкубации с токсикантом. Полученные данные позволяют использовать реакцию выброса МПО для диагностики гиперчувствительности нейтрофилов к табаку у пациентов с ХОБЛ и здоровых курильщиков, а также выявлять группу риска по развитию обструктивного заболевания. Увеличение уровня провоспалительных цитокинов (ФНОа, ИЛ 1ß) в надосадочной жидкости после инкубации лейкоцитов с токсикантом подтверждает роль сигаретного дыма в развитии воспалительного ответа в организме курильщика. Литература

1. Новиков Д.К., Смирнова О.В. Иммунодефицитный и аутоиммунный фенотипы хронической обструктивной болезни легких. Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2014. - №2. - C.74-86.

2. Смирнова О.В. Индукция сигаретным дымом выброса миелопероксилазы лейкоцитами больных хроническими обструктивными заболеваниями легких. Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2015. - №1. - C.64-70.

3. Zhu A. et al. Sputum myeloperoxidase in chronic obstructive pulmonary disease. European Journal of Medical Research. -2014. N1. - P.12-19.

4. Smokeless tobacco extract decreases IL-12 productiofrom LPS-stimulated but increases IL-12 fromIFN-c-stimulated macrophages / T. M. Petro [et al.] // Int Immunopharmacol. - 2002. - № 5. - P. 345-355.