КЛЕТКА

1. T-клетка, которая совместно экспрессирует первый химерный антигенный рецептор (CAR) и второй CAR на клеточной поверхности, каждый CAR содержит:
(i) антигенсвязывающий домен;
(ii) спейсер;
(iii) трансмембранный домен; и
(iv) эндодомен;
в которой антигенсвязывающие домены первого и второго CAR связываются с различными антигенами и в которой один из первого или второго CAR представляет собой активирующий CAR, который содержит активирующий эндодомен, и другой CAR представляет собой ингибирующий CAR, который содержит включаемый лигированием ингибирующий эндодомен.
2. T-клетка по п.1, в которой спейсеры первого и второго CAR достаточно различны для того, чтобы предотвращать образование перекрестных пар, но достаточно схожи, чтобы вызывать совместную локализацию CAR на мембране T-клетки.
3. T-клетка по п.2, в которой спейсеры первого и второго CAR являются ортологичными.
4. T-клетка по п.1, в которой первый и второй спейсеры достаточно различны, чтобы предотвращать образование перекрестных пар первого и второго CAR, но достаточно схожи, чтобы вызывать совместную локализацию первого и второго CAR после лигирования.
5. T-клетка по п.4, в которой один из первого или второго CAR представляет собой активирующий CAR, который содержит активирующий эндодомен, и другой CAR представляет собой ингибирующий CAR, который содержит включаемый лигированием ингибирующий эндодомен, этот ингибирующий CAR незначительно ингибирует активацию T-клеток с помощью активирующего CAR в отсутствие лигирования ингибирующего CAR, но ингибирует активацию T-клеток с помощью активирующего CAR, когда ингибирующий CAR лигирован.
6. T-клетка по п.5, в которой включаемый лигированием ингибирующий эндодомен содержит по меньшей мере часть фосфатазы.
7. T-клетка по п.6, в которой включаемый лигированием ингибирующий эндодомен содержит весь PTPN6 или его часть.
8. T-клетка по п.5, в которой включаемый лигированием ингибирующий эндодомен содержит по меньшей мере один ITIM-домен.
9. T-клетка по п.8, в которой активность включаемого лигированием ингибирующего эндодомена усиливают посредством коэкспрессии слитного белка PTPN6-CD45 или -CD148.
10. T-клетка по любому из пп. 5-9, в которой CAR, который содержит активирующий эндодомен, содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD33, и CAR, который содержит включаемый лигированием ингибирующий эндодомен, содержит антигенсвязывающий домен, который связывает CD34.
11. T-клетка, которая содержит больше чем два CAR, как определено в предшествующих пунктах., так что ее специфично стимулирует клетка, такая как T-клетка, несущая отличающий паттерн из больше чем двух антигенов.
12. Последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует как первый, так и второй химерные антигенные рецепторы (CAR) как определено в любом из пп. 1-11.
13. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.12, которая имеет следующую структуру:
AgB1-спейсер1-TM1-эндо1-коэкспр-AbB2-спейсер2-TM2-эндо2
в которой
AgB1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающий домен первого CAR;
спейсер1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер первого CAR;
TM1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует трансмембранный домен первого CAR;
эндо1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен первого CAR;
коэкспр представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая делает возможной коэкспрессию обоих CAR;
AgB2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающий домен второго CAR;
спейсер2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер второго CAR;
TM2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует трансмембранный домен второго CAR;
эндо2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен второго CAR;
эта последовательность нуклеиновой кислоты, когда ее экспрессируют в T-клетке, кодирует полипептид, который расщепляют в сайте расщепления так, что первый и второй CAR совместно экспрессируют на поверхности T-клеток.
14. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.13, в которой коэкспр кодирует последовательность, которая содержит саморасщепляющийся пептид.
15. Последовательность нуклеиновой кислоты по п.13 или 14, в которой альтернативные кодоны используют в области последовательности, которая кодирует те же или схожие аминокислотные последовательности, во избежание гомологичной рекомбинации.
16. Набор, который содержит
(i) первую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует первый химерный антигенный рецептор (CAR), как определено в любом из пп. 1-11, эта последовательность нуклеиновой кислоты имеет следующую структуру:
AgB1-спейсер1-TM1-эндо1
в которой
AgB1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающий домен первого CAR;
спейсер1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер первого CAR;
TM1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует трансмембранный домен первого CAR;
эндо1 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен первого CAR; и
(ii) вторую последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует второй химерный антигенный рецептор (CAR), как определено в любом из пп. 1-11, эта последовательность нуклеиновой кислоты имеет следующую структуру:
AgB2-спейсер2-TM2-эндо2
AgB2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует антигенсвязывающий домен второго CAR;
спейсер2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует спейсер второго CAR;
TM2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует трансмембранный домен второго CAR;
эндо2 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует эндодомен второго CAR.
17. Набор, который содержит первый вектор, который содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, как определено в п.16; и второй вектор, который содержит первую последовательность нуклеиновой кислоты, как определено в п.16.
18. Набор по п.17, в котором векторы представляют собой интегрирующие вирусные векторы или транспозоны.
19. Вектор, который содержит последовательность нуклеиновой кислоты по любому из пп. 12-15.
20. Ретровирусный вектор или лентивирусный вектор или транспозон по п.19.
21. Способ получения T-клетки по любому из пп. 1-11, который включает стадию введения последовательности нуклеиновой кислоты по любому из пп. 12-15; первой последовательности нуклеиновой кислоты и второй последовательности нуклеиновой кислоты, как определено в п.16; и/или первого вектора и второго вектора, как определено в п.17, или вектора по п.19 или 20, в T-клетку.
22. Способ по п.21, в котором T-клетку получают из образца, выделенного у субъекта.
23. Фармацевтическая композиция, которая содержит множествл T-клеток по любому из пп. 1-11.
24. Способ лечения и/или предотвращения заболевания, который включает стадию введения фармацевтической композиции по п.23 субъекту.
25. Способ по п.24, который включает следующие стадии:
(i) выделение образца, содержащего T-клетки, у субъекта;
(ii) трансдукция или трансфекция T-клеток с использованием последовательности нуклеиновой кислоты по любому из пп. 12-15; первой последовательности нуклеиновой кислоты и второй последовательности нуклеиновой кислоты, как определено в п.16; первого вектора и второго вектора, как определено в п.17 или 18, или вектора по п.19 или 20; и
(iii) введение T-клеток из (ii) субъекту.
26. Способ по п.24 или 25, в котором заболевание представляет собой злокачественную опухоль.
27. Фармацевтическая композиция по п.23 для использования в лечении и/или предотвращении заболевания.
28. Использование T-клетки по любому из пп. 1-11 в изготовлении лекарственного средства для лечения и/или предотвращения заболевания.
29. Естественная киллерная (NK) клетка, которая совместно экспрессирует первый химерный антигенный рецептор (CAR) и второй CAR на клеточной поверхности, каждый CAR содержит:
(i) антигенсвязывающий домен;
(ii) спейсер;
(iii) трансмембранный домен; и
(iv) эндодомен;
в которой антигенсвязывающие домены первого и второго CAR связываются с различными антигенами и в которой один из первого или второго CAR представляет собой активирующий CAR, который содержит активирующий эндодомен, и другой CAR представляет собой ингибирующий CAR, который содержит включаемый лигированием ингибирующий эндодомен.
30. Клеточная композиция, которая содержит экспрессирующие CAR T-клетки по п.1 и/или экспрессирующие CAR естественные киллерные клеткы по п.29, полученные трансдукцией образца крови ex vivo нуклеиновой кислотой, кодирующей первый и второй CAR.