СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО РАСТИТЕЛЬНОГО ЭКСТРАКТА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОВИРУСНОЙ И АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
METHOD FOR OBTAINING DRY PLANT EXTRACT WITH ANTI-VIRAL AND ANTIOXIDANT ACTIVITY

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к лекарственным растительным средствам, обладающим противовирусной активностью в отношении РНК-содержащего вируса (вируса гриппа А) и антиоксидантной активностью.
Nitraria schoberi
Известно противовирусное средство на основе экстракта культуры «бородатых корней» («hairy roots») селитрянки Шобера ( L.) [патент РФ № 2615376, МПК A61K 36/77, B01D 11/02, A61P 31/12, опубл. 04.04.2017], представляющее собой сухой растительный экстракт, содержащий сухие экстрактивные вещества в количестве не менее 42.7 %, суммарные белки в количестве не менее 28±6 мг/г, полисахариды в количестве не менее 205±17 мг/г, фенольные соединения в количестве не менее 9±1 мг/г, флавоноиды в количестве не более 5 мг/г. Изобретение обеспечивает расширение сырьевой базы для изготовления противовирусных средств и ассортимента противовирусных средств в отношении вируса гриппа А субтипов Н3N2 и Н5N1.
Недостатком данного изобретения является то, что технология получения «бородатых корней» предполагает дополнительные финансовые вложения для биотехнологического получения сырья, что приводит к значительному удорожанию продукта. Кроме того, биомасса корней, полученная биотехнологическим путем, уступает биомассе растений, произрастающих в природе, особенно это относится к древесным и кустарниковым породам, способным к ежегодному самовозобновлению биомассы, необходимой для получения готового продукта.
Sorbaria sorbifolia
Технической задачей является разработка способа получения сухого растительного экстракта из соцветий , обладающего антиоксидантной и противовирусной активностью.
Sorbaria sorbifolia
Sorbaria sorbifolia
Техническим результатом заявляемого изобретения является обеспечение условий для процесса экстрагирования имеющихся в соцветиях  веществ и соединений, сохранения состава и количества экстрагируемых веществ и получения сухого растительного экстракта из соцветий , обладающего антиоксидантной активностью, противовирусной активностью в отношении РНК-содержащего вируса гриппа А.
Sorbaria sorbifolia
Решение поставленной задачи достигается тем, что в способе получения сухого растительного экстракта, обладающего противовирусной и антиоксидантной активностью, включающем измельчение растительного сырья, экстрагирование этанолом, объединение и охлаждение полученных фильтратов, концентрирование в бытовом дегидраторе и сушке в сушильном шкафу с последующим хранением в темноте при комнатной температуре и влажности воздуха  30-60 %, отличающимся тем, что производят измельчение соцветий  до размера частиц диаметром 20-30 мм, с последующим экстрагированием 70 %-ным этанолом трижды при температуре 60°С в соотношении сырье:растворитель 1:20 для первой экстракции в течение 4 ч, 1:15 для второй  экстракции в течение 2 ч, 1:15 для третьей экстракции в течение 2 ч, охлаждением объединенных полученных фильтратов до комнатной температуры и сушкой до остаточной влажности 5 %.
Sorbaria sorbifolia
На фиг. 1 представлен дифференциальный спектр поглощения комплексов раствора спиртового сухого экстракта из соцветий   (1) и рутина (2) с 2 % раствором алюминия хлорида.
Sorbaria sorbifolia
На фиг. 2 представлена ВЭЖХ – хроматограмма гидролизата сухого экстракта из соцветий  при 370 нм: 1 – кверцетин, 2 – кемпферол, 3 – изокверцитрин; остальные вещества – не идентифицированные компоненты. По горизонтали – время удерживания, по вертикали – сигнал детектора, единица оптической плотности.
Пример осуществления приведен ниже.
Sorbaria sorbifolia
Для осуществления способа получения сухого растительного экстракта, обладающего противовирусной и антиоксидантной активностью, соцветия  измельчали до размера частиц диаметром 20–30 мм, трижды экстрагировали с 70 %-ным этанолом при температуре 60°С в течение 8 ч., используя соотношение сырье:растворитель 1:20 для первой экстракции в течение 4 ч., 1:15 для второй  экстракции и 1:15 третьей экстракции по 2 ч. каждая. Полученные фильтраты объединяли и охлаждали до комнатной температуры. После охлаждения объединенные фильтраты концентрировали с использованием бытового дегидратора для удаления растворителя и затем подвергали сушке в сушильном шкафу до остаточной влажности 5 %. Сухие экстракты упаковывали в пробирки типа эппендорф с плотно закрывающейся крышкой и хранили в темноте при комнатной температуре и влажности воздуха  30-60%.
Sorbaria sorbifolia
Сухой экстракт из соцветий , приготовленный указанным способом,прошел экспериментальное исследование в лаборатории экспериментальной вирусологии Санкт-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, лаборатории Фитохимии Центрального сибирского ботанического сада СО РАН и лаборатории Гербарий Томского государственного университета.
Расчет процентного выхода экстрактивных веществ к массе сырья (Y, %) проводили по формуле:
X – масса полученного сухого экстракта, г;
m – масса абсолютно сухого сырья, загруженного в колбу для экстракции растворителем.
Sorbaria sorbifolia
Выход экстрактивных веществ в экстракте из соцветий  составил 43.80 % при массе абсолютно сухого сырья 5 г.
Sorbaria sorbifolia
Доказательство противовирусной активности в отношении вируса гриппа А сухого экстракта из соцветий приведено ниже.
4
2
2
Вирус гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) культивировали в клетках MDCK (ATCC CCL-34). Клетки рассевали в 96-луночныe планшеты в количестве 10 кл/лунку и объеме 100 мкл/лунку полной среды MEM. Инкубацию проводили в течение 24 ч в CO-инкубаторе при 36°С в атмосфере 5 % CO. Непосредственно перед экспериментом клетки промывали средой МЕМ, дальнейшие манипуляции проводили в бессывороточной среде.
Sorbaria sorbifolia
Sorbaria sorbifolia
Sorbaria sorbifolia
Sorbaria sorbifolia
2
2
50
2
50
2
50
Предварительно изучили цитопатическое действие сухого экстракта из соцветий  путем оценки жизнеспособности клеток при помощи реакции восстановления тетразолиевого красителя МТТ (3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетразолия бромид) клетками в культуре, интенсивность которой отражает степень жизнеспособности клеток в результате восстановления красителя митохондриальными и частично цитоплазматическими дегидрогеназами. Сухой экстракт из соцветий  растворяли в среде для культивирования клеток до концентраций 43.7–300 мкг/мл, затем вносили в лунки планшета в объеме 200 мкл и инкубировали в течение 72 ч. при 37ºС в атмосфере 5 % СО. По истечении срока инкубации клетки промывали средой MEM и в лунки планшетов добавляли по 100 мкл раствора (концентрация 0.5 мг/мл) 3-(4,5-диметилтиазолил-2) 2,5-дифенилтетразолия бромида на среде для клеток. Клетки инкубировали при 37°С в атмосфере 5 % СО в течение 2 ч. и промывали в течение 5 мин физиологическим раствором. Осадок растворяли в 100 мкл диметилсульфоксида на лунку, после чего оптическую плотность измеряли с помощью планшетного анализатора Multiscan FC (Thermo Scientific) при длине волны 540 нм. На основании полученных данных рассчитывали 50 % цитотоксическую концентрацию (СС), т.е. концентрацию соединения, снижающую оптическую плотность в лунках вдвое по сравнению с контрольными клетками без добавления раствора экстракта из соцветий . Параллельно сухой экстракт из соцветий  растворяли в среде для культивирования клеток до диапазона концентраций 43.7–300 мкг/мл, затем в объеме 100 мкл вносили в лунки планшетов с монослоем клеток MDCK. Планшеты с клетками инкубировали в атмосфере 5 % CO при 36°С в течение 1 часа. После этого в лунки вносили по 0.1 мл вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) (m.o.i. 0.01 TCID на клетку) в среде альфа-МЕМ и инкубировали в течение 72 ч. в атмосфере 5 % CO при 37°С. По истечении срока инкубации клетки промывали средой MEM и проводили анализ жизнеспособности клеток, как описано выше. На основании полученных данных рассчитывали значение 50 % ингибирующей концентрации (IC) – той концентрации соединения, которая приводила к 50 % снижению цитодеструктивного действия вируса гриппа А.
50
50
50
50
Методы статистической обработки данных. Расчет значений 50 % цитотоксической концентрации (CC) и 50 % эффективной концентрации (IC) проводили при помощи пакета программ GraphPad Prism 6.01. За рабочую модель для анализа принимали 4-параметрическое уравнение логистической кривой (пункты меню «Нелинейная регрессия» – «логарифм ингибитора – ответ»). На основании полученных данных для каждого соединения и каждого вируса рассчитывали индекс селективности (SI) – отношение CC к IC. Все биохимические опыты проведены в трехкратной повторности. Статистическую обработку и сравнение результатов осуществляли стандартными методами с помощью пакета компьютерных программ «Statistica 6.0» (StatSoft Inc. 1984–2001).
Sorbaria sorbifolia
Доказательство антиоксидантной активности сухого экстракта из соцветий  приведено ниже.
Sorbaria sorbifolia
Для проведения анализа антиоксидантной активности и содержания флавоноидов сухой экстракт из соцветий  разводили в 70 %-ном этаноле в соотношении 1:1000. Способность образцов к улавливанию свободных радикалов определялась с использованием 1,1-дифенил-2-пикрилгидразила (DPPH). Для этого аликвоту экстракта объемом 2 мл (растворенного в 70 %-ном этаноле до концентраций в диапазоне 10–200 мкг/мл) смешивали с 3 мл раствора DPPH (62 мкг/мл в этаноле). После 30 мин инкубации в темноте при комнатной температуре оптическую плотность (D) измеряли при 517 нм против холостого образца. Активность по улавливанию свободных радикалов (X, %) рассчитывалась как процент ингибирования по следующей формуле:
, где
контроль
D – оптическая плотность контрольного раствора, содержащего все реагенты, кроме тестируемого экстракта;
образец
D – оптическая плотность образца.
50
Результаты выражали в IC, DPPH, определяемом как концентрация антиоксиданта, которая вызывает 50 % потерю DPPH в анализе активности по улавливанию радикалов DPPH. Растворы 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновой кислоты (тролокс) и аскорбиновой кислоты (2.5–50.0 мкг/мл) служили в качестве положительного контроля.
Дифференциальный УФ-спектр спиртового раствора экстракта в присутствии алюминия хлорида имеет максимумы поглощения в длинноволновой области при 270 нм и 405 нм, которые совпадают с максимумом поглощения рутина в комплексе с хлоридом алюминия (фиг. 1)
В мерную колбу помещают 0.1 мл экстракта, прибавляют 0.2 мл 2 % спиртового раствора алюминия хлорида и доводят раствор до метки 96 % этанолом. Через 40 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм на спектрофотометре СФ-56. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 0.1 мл экстракта, 1-2 капель 30 % раствора кислоты уксусной и доведенный 96 % этанолом до метки. Количественное содержание флавоноидов в пробе определяли по калибровочной кривой, построенной по рутину (не менее 99 %, «Sigma»).
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на абсолютно сухой экстракт в процентах (X, %) вычисляют по формуле:
Х = ,  где
γ – содержание флавоноидов в 1 мл испытуемого раствора, найденное по калибровочному графику, построенному по рутину (мг/кг);
1
V – объем экстракта (мл);
2
V – объем разведения навески (мл);
M – масса воздушно-сухого сырья (г);
W – потеря в массе при высушивании сырья в процентах;
3
V – объем экстракта, взятый на анализ (мл).
Sorbaria sorbifolia
Результаты экспериментов по определению показателей противовирусной активности в отношении вируса гриппа А(H1N1)  сухого экстракта из соцветий  (место сбора Участок ЦСБС СО РАН, г. Новосибирск):
50
• CС – 50 % цитотоксическая концентрация, приводящая к гибели 50 % клеток в культуре – более 300 мкг/мл;
50
• IC – 50% эффективная концентрация, которая снижает вирусную активность на 50 % по сравнению с контролем – менее 3 мкг/мл;
50
50
• SI – индекс селективности, отношение CC к IC – 100.
Соответствующие показатели для препарата сравнения ремантадина составили: СС50=62 мкг/мл, IC50= 9 мкг/мл, SI=7. Таким образом, описанный экстракт является намного менее токсичным и более активным противовирусным средством по сравнению с ремантадином, используемым в клинической практике для лечения гриппа.
Sorbaria sorbifolia
50
50
50
Результат оценки антиоксидантной активности сухого экстракта из соцветий :  IC– концентрация антиоксиданта, которая вызывает 50 % потерю DPPH в анализе активности по улавливанию радикалов DPPH – 33.26±0.10 мкг/мл. Стандартные вещества: тролокс IC 7.47±0.01 мкг/мл и аскорбиновая кислота IC 8.69±0.16 мкг/мл.
Sorbaria sorbifolia
Содержание суммы флавоноидов в сухом экстракте из соцветий  11.56 ±0.39 %.
Дополнительно проведен анализ состава и содержания свободных агликонов, содержащихся в экстракте после гидролиза методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. К 0.5 мл извлечения прибавляли равный объем HCl (2 н), нагревали на кипящей водяной бане в течение 2 часов. После охлаждения гидролизат разбавляли бидистиллированной водой до 5 мл и пропускали через концентрирующий патрон Диапак. Агликоны смывали 5 мл 96 %-ного этанола и пропускали через мембранный фильтр с диаметром пор 0.45 мкм. Далее проводили хроматографический анализ, на аналитической ВЭЖХ-системе, состоящей из жидкостного хроматографа «Agilent 1200» (США) с диодно-матричным детектором, автосамплером и системой для сбора и обработки хроматографических данных ChemStation. Колонка Zorbax SB-C18, 4.6×150 мм, 5 мкм. Разделение проводили в градиентных условиях: в подвижной фазе содержание метанола в водном растворе ортофосфорной кислоты (0.1 %) изменялось от 45 до 48 % за 18 минут. Детектирование осуществляли при длине волны λ = 254, 270, 290, 340, 360 и 370 нм.
Sorbaria sorbifolia
Количественное определение индивидуальных компонентов в образцах сухого экстракта из соцветий  проводили по методу внешнего стандарта при λ = 370 нм. Для приготовления стандартных образцов использовали кверцетин, кемпферол, лютеолин («Sigma-Аldrich»), апигенин («Fluka»). Стандартные растворы готовили в концентрации 10 мкг/мл.
x
Содержание индивидуальных компонентов (С) вычисляли по формуле (мг/г от массы воздушно-сухого сырья):
ст
С – концентрация стандартного вещества, мкг/мл;
1
S – площадь пика компонента в анализируемой пробе, е.о.п.,
2
S – площадь пика стандартного вещества, е.о.п.,
1
V – объем элюата после вымывания фенольных соединений с концентрирующего патрона, мл;
2
V – общий объем экстракта, мл;
3
V – объём экстракта, взятый на анализ, мл;
М – масса навески, г;
1000 – пересчетный коэффициент.
Относительное стандартное отклонение повторяемости при определении фенольных компонентов составляет σr,отн = 0.011, относительное стандартное отклонение по времени удерживания у метода ВЭЖХ= 0.0018.
Sorbaria sorbifolia
R
max
R
max
В результате анализа содержания агликонов в сухом экстракте из соцветий   обнаружены флавоноловые агликоны – кверцетин, кемпферол и изокверцитрин. Флавоны лютеолин (t, мин = 8.0; λ, нм = 255, 355) и апигенин (t, мин = 12.8; λ, нм = 270, 340) выявлены не были. Наибольшее содержание в соцветиях кверцетина и его гликозидов (таблица 1, фиг. 2).
Sorbaria sorbifolia
Таблица 1. Состав и содержание агликонов флавоноидов в гидролизате сухого экстракта из соцветий
№пика*
Соединение
Спектральная характеристика λ<sub>max</sub>, нм
Время удерживания
Содержание флавоноидовмг/г
1
кверцетин
255, 372
6.8
13.68
2
кемпферол
265, 368
11.7
10.65
3
изорамнетин
255, 370
12.5
2.52
Примечание: *№ пика в таблице соответствует номеру пика на фиг. 2.