ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ДОМЕНЫ GFRAL И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Способ обнаружения активности пептида GDF15, предусматривающий:
(i)
(а) обеспечение клетки, которая экспрессирует рецепторную киназу клеточной поверхности;
(b) приведение клетки в контакт с пептидом GDF15 и растворимым GFRAL, где растворимый GFRAL содержит внеклеточный домен GFRAL, содержащий домены D2 и D3; и
(c) обнаружение биологического ответа в приведенной в контакт клетке; или
(ii)
(a) обеспечение клетки, которая экспрессирует рецепторную киназу клеточной поверхности и внеклеточный домен GFRAL, содержащий домены D2 и D3;
(b) приведение клетки в контакт с пептидом GDF15 и
(c) обнаружение биологического ответа в приведенной в контакт клетке.
2. Способ по п. 1, где внеклеточный домен GFRAL не имеет домена D1.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором обеспечивают клетку, которая экспрессирует рецепторную киназу клеточной поверхности и внеклеточный домен GFRAL, где:
(i) внеклеточный домен GFRAL представляет собой растворимый внеклеточный домен GFRAL, или
(ii) внеклеточный домен GFRAL прикреплен к клеточной поверхности с помощью связующего звена.
4. Способ по п. 3, где связующее звено:
(i) представляет собой трансмембранный домен GFRAL или его функциональный фрагмент;
(ii) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18 или ее функциональный вариант;
(iii) представляет собой гетерологичный трансмембранный домен, слитый с внеклеточным доменом GFRAL;
(iv) представляет собой гликофосфатидилинозитол (GPI);
(v) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:19 или ее функциональный вариант, SEQ ID NO:20 или ее функциональный вариант или SEQ ID NO:21 или ее функциональный вариант;
(vi) представляет собой встроенную в мембрану последовательность;
(vii) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:22 или ее функциональный вариант или SEQ ID NO:23 или ее функциональный вариант; или
(viii) представляет собой встроенную в мембрану жирную кислоту.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где внеклеточный домен GFRAL дополнительно содержит сигнальный пептид.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где внеклеточный домен GFRAL помечен аффинной меткой, выбранной из метки на основе белка-предшественника бета-амилоида, гистидиновой метки, метки FLAG и метки myc.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где внеклеточный домен GFRAL:
(i) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1 или ее функциональный вариант;
(ii) характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1;
(iii) характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1;
(iv) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2 или ее функциональный вариант;
(v) характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2;
(vi) характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2;
(vii) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3 или ее функциональный вариант или
(viii) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:25 или ее функциональный вариант.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где пептид GDF15 или его функциональный вариант:
(i) содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, 14, 15, 16 или 17 или ее функциональный вариант;
(ii) характеризуются по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:13; или
(iii) характеризуются по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:13.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где пептид GDF15:
(i) помечен аффинной меткой, выбранной из метки на основе белка-предшественника бета-амилоида, гистидиновой метки, метки FLAG и метки myc;
(ii) слит с сывороточным альбумином человека, сывороточным альбумином мыши, константной областью иммуноглобулина или альфа-1-антитрипсином;
(iii) конъюгирован с жирной кислотой;
(iv) имеет пегилированный компонент и/или
(v) имеет гликозилированный компонент.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где рецепторная киназа клеточной поверхности представляет собой: (i) эндогенную рецепторную киназу клеточной поверхности;
(ii) экзогенную рецепторную киназу клеточной поверхности и/или
(iii) рецепторную тирозинкиназу RET.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где клетка не экспрессирует:
(i) эндогенный GFRAL;
(ii) полноразмерный GFRAL и/или
(iii) эндогенный GDF15.
12. Способ по любому из пп. 1-11, где клетка представляет собой клетку с нокаутом (KO) по GDF15, содержащую нефункциональный ген GDF15.
13. Способ по любому из пп. 1-12, где биологический ответ:
(i) индуцируется при образовании тройного комплекса из пептида GDF15, растворимого GFRAL или внеклеточного домена GFRAL и рецепторной киназы клеточной поверхности;
(ii) не индуцируется в клетке, приведенной в контакт с пептидом GDF15 в отсутствие растворимого GFRAL; и/или
(iii) представляет собой увеличение или уменьшение экспрессии или активности белка в клетке по сравнению с экспрессией или активностью того же белка в контрольной клетке, которую не приводят в контакт с пептидом GDF15 и/или растворимым GFRAL.
14. Способ по любому из пп. 1-13, где биологический ответ представляет собой увеличение или уменьшение экспрессии или активности внутриклеточного белка в одном или нескольких из путей RET-ERK, RET-AKT, протеинкиназы C, JAK/STAT, JNK, p38 и RAC1.
15. Способ по п. 14, где рецепторная киназа клеточной поверхности представляет собой рецепторную тирозинкиназу RET, и белок представляет собой
(i) внутриклеточный белок в пути RET-ERK, выбранный из ERK1, ERK2, SHC1, FRS2, GRB2, GAB1, GAB2, SOS, SHANK3, GRB7, GRB10, JAK1, JAK2, RAF, RAS, MEK1, MEK2, RSK1, RSK2, RSK3, MNK1, MNK2, MSK1 и MSK2 или любых их последующих мишеней; или
(ii) внутриклеточный белок в пути RET-AKT, выбранный из AKT1, AKT2, AKT3, SRC, SHC1, GRB2, CBL, GAB1, GAB2, SHANK3, JAK1, JAK2, RAS, PI3K, PDK1, YAP, BAD, каспазы-9, FoxO1, FoxO3, FoxO4, IKK-альфа, CREB, MDM2, MLK3, ASK1, p21Cip1, p27Kip1, GSK3-альфа, GSK3-бета и mTOR или любых их последующих мишеней.
16. Способ по любому из пп. 1-15, где биологический ответ представляет собой увеличение или уменьшение фосфорилирования протеинкиназы в клетке по сравнению с фосфорилированием той же протеинкиназы в контрольной клетке, которую не приводят в контакт с пептидом GDF15 и/или растворимым GFRAL.
17. Способ по п. 16, где:
(i) протеинкиназа представляет собой рецепторную киназу клеточной поверхности;
(ii) протеинкиназа и/или рецепторная киназа клеточной поверхности представляют собой рецепторную тирозинкиназу RET; или
(iii) протеинкиназа представляет собой внутриклеточную протеинкиназу, где внутриклеточная протеинкиназа прямо или опосредованно фосфорилируется рецепторной киназой клеточной поверхности.
18. Способ по п. 16 или 17, где протеинкиназа представляет собой:
(i) внутриклеточную протеинкиназу в пути RET-ERK, выбранную из ERK1, ERK2, JAK1, JAK2, RAF, MEK1, MEK2, RSK1, RSK2, RSK3, MNK1, MNK2, MSK1 и MSK2 или любых их последующих мишеней; или
(ii) внутриклеточную протеинкиназу в пути RET-AKT, выбранную из AKT1, AKT2, AKT3, SRC, JAK1, JAK2, PI3K, PDK1, MLK3, ASK1, GSK3-альфа, GSK3-бета и mTOR или любых их последующих мишеней.
19. Выделенная и модифицированная клетка для обнаружения активности пептида GDF15, где клетка экспрессирует внеклеточный домен GFRAL, содержащий домены D2 и D3, и рецепторную киназу клеточной поверхности.
20. Клетка по п. 19, где внеклеточный домен GFRAL не имеет домена D1.
21. Клетка по п. 19 или 20, где внеклеточный домен GFRAL:
(i) представляет собой растворимый внеклеточный домен GFRAL или
(ii) прикреплен к клеточной поверхности с помощью связующего звена.
22. Клетка по п. 21, где связующее звено:
(i) представляет собой трансмембранный домен GFRAL или его функциональный фрагмент;
(ii) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:18 или ее функциональный вариант;
(iii) представляет собой гетерологичный трансмембранный домен, слитый с внеклеточным доменом GFRAL;
(iv) представляет собой гликофосфатидилинозитол (GPI);
(v) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:19 или ее функциональный вариант, SEQ ID NO:20 или ее функциональный вариант или SEQ ID NO:21 или ее функциональный вариант;
(vi) представляет собой встроенную в мембрану последовательность;
(vii) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:22 или ее функциональный вариант или SEQ ID NO:23 или ее функциональный вариант; или
(viii) представляет собой встроенную в мембрану жирную кислоту.
23. Клетка по любому из пп. 19-22, где внеклеточный домен GFRAL дополнительно содержит сигнальный пептид.
24. Клетка по любому из пп. 19-23, где внеклеточный домен GFRAL помечен аффинной меткой, выбранной из метки на основе белка-предшественника бета-амилоида, гистидиновой метки, метки FLAG и метки myc.
25. Клетка по любому из пп. 19-24, где внеклеточный домен GFRAL:
(i) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1 или ее функциональный вариант;
(ii) характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1;
(iii) характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1;
(iv) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2 или ее функциональный вариант;
(v) характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2;
(vi) характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2;
(vii) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3 или ее функциональный вариант или
(viii) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:25 или ее функциональный вариант.
26. Клетка по любому из пп. 19-25, где рецепторная киназа клеточной поверхности представляет собой: (i) эндогенную рецепторную киназу клеточной поверхности;
(ii) экзогенную рецепторную киназу клеточной поверхности и/или
(iii) рецепторную тирозинкиназу RET.
27. Клетка по любому из пп. 19-26, где клетка не экспрессирует:
(i) эндогенный GFRAL;
(ii) полноразмерный GFRAL и/или
(iii) эндогенный GDF15.
28. Клетка по любому из пп. 19-27, где клетка представляет собой клетку с нокаутом (KO) по GDF15, содержащую нефункциональный ген GDF15.
29. Клетка по любому из пп. 19-28, где клетка выбрана из клетки млекопитающего, клетки человека, клетки MCF7, клетки SH-SY5Y и клетки с KO по HEK293A-GDF15.
30. Набор для определения активности пептида GDF15, где набор содержит клетку по любому из пп. 19-29 для приведения в контакт с пептидом GDF15 и средство обнаружения биологического ответа в приведенной в контакт клетке.
31. Растворимый GFRAL, содержащий внеклеточный домен GFRAL, содержащий домены D2 и D3.
32. Растворимый GFRAL по п. 31, где внеклеточный домен GFRAL не имеет домена D1.
33. Растворимый GFRAL по п. 31 или 32, где внеклеточный домен GFRAL дополнительно содержит сигнальный пептид.
34. Растворимый GFRAL по любому из пп. 31-33, где внеклеточный домен GFRAL помечен аффинной меткой, выбранной из метки на основе белка-предшественника бета-амилоида, гистидиновой метки, метки FLAG и метки myc.
35. Растворимый GFRAL по любому из пп. 31-34, где внеклеточный домен GFRAL:
(i) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1 или ее функциональный вариант;
(ii) характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1;
(iii) характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1;
(iv) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2 или ее функциональный вариант;
(v) характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2;
(vi) характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2;
(vii) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3 или ее функциональный вариант или
(viii) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:25 или ее функциональный вариант.
36. Способ идентификации средства, способного модулировать активность GDF15, где способ предусматривает:
(a) приведение клетки по любому из пп. 19-29 в контакт со средством и пептидом GDF15 и
(b) обнаружение биологического ответа в приведенной в контакт клетке,
где определяют, что средство модулирует активность GDF15, если биологический ответ в приведенной в контакт клетке увеличивается или уменьшается по сравнению с биологическим ответом в клетке, приведенной в контакт с пептидом GDF15 в отсутствие средства.
37. Способ идентификации средства, способного модулировать активность GDF15, предусматривающий:
(а) обеспечение клетки, которая экспрессирует рецепторную киназу клеточной поверхности;
(b) приведение клетки в контакт с пептидом GDF15 и растворимым GFRAL, где растворимый GFRAL содержит внеклеточный домен GFRAL, содержащий домены D2 и D3, и не содержит домен D1;
(c) приведение клетки в контакт со средством и
(d) обнаружение биологического ответа в приведенной в контакт клетке,
где определяют, что средство:
(i) модулирует или увеличивает активность GDF15, если биологический ответ в приведенной в контакт клетке увеличивается в присутствии пептида GDF15, растворимого GFRAL и средства по сравнению с биологическим ответом в клетке, приведенной в контакт с пептидом GDF15 и растворимым GFRAL в отсутствие средства; или
(ii) модулирует или уменьшает активность GDF15, если биологический ответ в приведенной в контакт клетке уменьшается в присутствии пептида GDF15, растворимого GFRAL и средства по сравнению с биологическим ответом в клетке, приведенной в контакт с пептидом GDF15 и растворимым GFRAL в отсутствие средства.
38. Способ по п. 37, где внеклеточный домен GFRAL помечен аффинной меткой, выбранной из метки на основе белка-предшественника бета-амилоида, гистидиновой метки, метки FLAG и метки myc.
39. Способ по п. 37 или 38, где внеклеточный домен GFRAL:
(i) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:1 или ее функциональный вариант;
(ii) характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1;
(iii) характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:1;
(iv) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:2 или ее функциональный вариант;
(v) характеризуется по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2;
(vi) характеризуется по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:2;
(vii) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:3 или ее функциональный вариант или
(viii) содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:25 или ее функциональный вариант.
40. Способ по любому из пп. 36-39, где средство представляет собой антитело, выбранное из антитела к GDF15 и антитела к GFRAL.
41. Способ по любому из пп. 36-40, где биологический ответ представляет собой увеличение или уменьшение уровня экспрессии, активности или фосфорилирования внутриклеточного белка в одном или нескольких из путей RET-ERK, RET-AKT, протеинкиназы C, JAK/STAT, JNK, p38 и RAC1.
42. Способ по п. 41, где внутриклеточный белок задействован в пути RET-ERK и выбран из ERK, SHC1, FRS2, GRB2, GAB1, GAB2, SOS, SHANK3, GRB7, GRB10, JAK1, JAK2, RAF, RAS, MEK1, MEK2, RSK1, RSK2, RSK3, MNK1, MNK2, MSK1 и MSK2.
43. Способ по п. 41, где внутриклеточный белок задействован в пути RET-AKT и выбран из AKT, SRC, SHC1, GRB2, CBL, GAB1, GAB2, SHANK3, JAK1, JAK2, RAS, PI3K, PDK1, YAP, BAD, каспазы-9, FoxO1, FoxO3, FoxO4, IKK-альфа, CREB, MDM2, MLK3, ASK1, p21Cip1, p27Kip1, GSK3-альфа, GSK3-бета и mTOR.
44. Способ по любому из пп. 36-43, где пептид GDF15 или его функциональный вариант:
(i) содержат аминокислотную последовательность под SEQ ID NO:13, 14, 15, 16 или 17 или ее функциональный вариант;
(ii) характеризуются по меньшей мере 80% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:13; или
(iii) характеризуются по меньшей мере 90% идентичностью аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO:13.
45. Способ по любому из пп. 36-44, где пептид GDF15:
(i) помечен аффинной меткой, выбранной из метки на основе белка-предшественника бета-амилоида, гистидиновой метки, метки FLAG и метки myc;
(ii) слит с сывороточным альбумином человека, сывороточным альбумином мыши, константной областью иммуноглобулина или альфа-1-антитрипсином;
(iii) конъюгирован с жирной кислотой;
(iv) имеет пегилированный компонент и/или
(v) имеет гликозилированный компонент.