Противовирусная активность сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей при экспериментальном клещевом энцефалите: связь структуры и функции

УДК 616.831-002-085.281.8:577.144:582.272

противовирусная активность сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей при экспериментальном клещевом энцефалите: связь структуры и функции

И.Д. Макаренкова1, Г.Н. Леонова1, О.С. Майстровская1, Т.Н. Звягинцева2, Т.И. Имбс2, С.П. Ермакова2, Н.Н. Беседнова1

1 НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН

Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, фукоиданы, эксперимент.

Проведено сравнительное изучение противовирусной активности сульфатированных полисахаридов - фукоиданов из бурых водорослей Laminaria japonica, Laminaria cichorioides, Fucus evanescens и Costaría costata на культуре клеток СПЭВ, инфицированных вирусом клещевого энцефалита. Установлено, что фукоиданы обладают вирулицидным действием в отношении высокопатогенного штамма вируса клещевого энцефалита, а также способностью подавлять адсорбцию и репликацию вируса на ранних стадиях развития инфекции in vitro.

Невысокая эффективность традиционных методов терапии клещевого энцефалита (КЭ) и способность вируса длительное время сохраняться в клетках центральной нервной системы даже после адекватного лечения острых форм заболевания диктует необходимость поиска новых препаратов, не только способствующих регуляции функций иммунной системы, но и избирательно воздействующих на процессы репликации вируса.

В настоящее время ведется интенсивная работа по созданию и изучению нового класса иммунобиологических препаратов - модификаторов функций врожденного иммунитета при инфекционных заболеваниях [7, 11]. Большой интерес в рамках этого направления представляют сульфатированные полисахариды - фу-коиданы из бурых водорослей, содержащие уникальные химические соединения и обладающие выраженной иммуномодулирующей, противовирусной, антикоагу-лянтной, противовоспалительной, противоопухолевой и антибактериальной активностью [1-3, 9, 14].

Согласно данным литературы и нашим исследованиям, фукоиданы являются агонистами системы врожденного иммунитета, а также обладают выраженной противовирусной активностью в отношении возбудителей иммунодефицита человека, простого герпеса, цитомегалии, гриппа птиц и геморрагической лихорадки с почечным синдромом [1, 3, 4, 10, 12, 13]. Кроме того, в ряде работ установлено, что противовирусное действие фукоиданов зависит от метода экстрагирования, структуры, молекулярной массы, степени сульфатирования и моносахаридного состава [9, 12].

Цель настоящей работы - сравнительный анализ противовирусной активности сульфатированных полисахаридов из различных видов бурых водорослей в отношении вируса клещевого энцефалита in vitro.

Макаренкова Илона Дамировна - канд. мед. наук, ведущий научный сотрудник лаборатории иммунологии НИИЭМ СО РАМН; e-mail: ilona_m@mail.ru

Материал и методы. В работе использовали штамм Primorye-73 вируса КЭ дальневосточного субтипа, выделенный из мозга пациента, умершего от очаговой формы инфекции (инфекционный титр 107 ТЦИД50/0,2 мл). Клетки культивировали на перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) в 24-луночных пластиковых панелях с ростовой средой (равное соотношение сред 199 и RPMI), с добавлением 10 % сыворотки эмбрионов коров и 100 ЕД/мл гентамицина. Поддерживающая среда содержала 1 % эмбриональной сыворотки.

Выделение и изучение химического состава и структуры фукоиданов из бурых водорослей проведено в ТИБОХ ДВО РАН:

1. Фукоидан из Laminaria japonica - частично ацетилированный галактофукан (Fuc:Gal:Man:Rha -1:0,3:0,1:0,06), сульфатированный преимущественно по положению С-4 остатков фукозы [14];

2. Фукоидан из Laminaria cichorioides - высоко-сульфатированный 1^3-а-Ь-фукан (Fuc:Gal:Man -1:0,09:0,08); соотношение фукозы и сульфатов - 1:1,7 [14];

3. Фукоидан из Fucus evanescens - частично ацетилированный ^ЗЦ^^-Ь-фукан (Fuc:Gal:Xyl:Man -1:0,12:0,14:0,11), сульфатированный преимущественно по С-2 положению остатков фукозы; соотношение фукозы и сульфатов - 1:0,9 [8, 14].

4. Фукоидан из Costaria costata - частично ацетилированный галактофукан (Fuc:Gal:Man:Rha -1:0,29:0,08:0,06), сульфатированный преимущественно по С-4 положению остатков фукозы и, в меньшей степени, по С-2 положению остатков фукозы и галактозы [2].

Для анализа вирулицидного действия фукоиданы в концентрации 100, 500 и 1000 мкг/мл соединяли с вируссодержащим материалом (в соотношении 1:1) и инкубировали в течение 1 часа при температуре 23-25 °С. Далее 10-кратными разведениями экспериментальных проб заражали монослой культуры клеток СПЭВ и инкубировали 1 час в термостате при 37 °С. Затем инокулят сливали, клетки однократно отмывали, добавляли поддерживающую среду и инкубировали в течение 5 суток при 37 °С в СО2-инкубаторе.

Протективное действие препаратов изучали на культуре клеток СПЭВ, в которую вносили фукоиданы (в концентрации 100, 500 и 1000 мкг/мл) и инкубировали в течение 1 часа при температуре 37 °С. Затем клеточный монослой однократно отмывали, вносили 10-кратные разведения вируса КЭ и для контакта

Оригинальные исследования

45

Таблица 1

Вирулицидное действие фукоиданов

Фукоиданы Концентрация препарата, мкг/мл Титр вируса КЭ (Д, lg ТЦИД50/мл)1

M±m Me±SD

L. japonica 1000 0,6±0,3 1,0±0,5

500 1,6±03 2,0±0,5

100 3,3±0,3 3,0±0,5

L. cichorioides 1000 3,0±0,6 3,0±1,0

500 3,3±0,3 3,0±0,5

100 5,3±0,32 5,0±0,52

F. evanescens 1000 2,0±0,6 2,0±1,0

500 1,6±0,3 2,0±0,5

100 2,3±0,3 2,0±0,5

C. costata 1000 2,0±0,6 2,0±1,0

500 2,3±0,3 2,0±0,5

100 2,3±0,3 2,0±0,5

Контроль - 6,3±0,3 6,0±0,5

1 Здесь и в табл. 2: М±т - средняя арифметическая и стандартная ошибка средней арифметической; Ме±8Б - медиана и среднее квадратичное отклонение от средней арифметической.

2 Только по данной концентрации статистически значимой разницы по сравнению с контролем не получено.

Таблица 2

Протективное действие фукоиданов

Фукоиданы Концентрация препарата, мкг/мл Титр вируса КЭ (Д, lg ТЦИД50/мл)1

M±m Me±SD

L. japonica 1000 2,0±0,5 2,0±1,0

500 2,3±03 2,0±0,5

100 4,0±0,5 4,0±1,0

L. cichorioides 1000 3,3±0,3 3,0±0,5

500 3,3±0,3 3,0±0,5

100 4,0±0,5 4,0±1,0

F. evanescens 1000 3,3±0,3 3,0±0,5

500 2,0±0,0 2,0±0,0

100 3,3±0,3 3,0±0,5

C. costata 1000 3,6±0,3 4,0±0,5

500 4,0±0,0 4,0±0,0

100 4,3±0,3 4,0±0,5

Контроль - 6,3±0,3 6,0±0,5

1 Разница с контролем по всем концентрациям фукоиданов статистически значима.

помещали на 1 час в термостат при температуре 37 °С. После инкубации инокулят сливали, клетки однократно отмывали от вируса, вносили поддерживающую среду. Планшеты с экспериментальными пробами помещали в 5 % СО2-инкубатор на 5 суток.

При проведении экспериментов параллельно заражали монослой клеток СПЭВ 10-кратным разведением вируса (контроль опыта). Противовирусный эффект препаратов рассчитывали по соотношению инфекционной активности возбудителя в опытных и контрольных образцах. Для получения статистически достоверных результатов эксперименты проводили трижды. Критерием оценки эффективности

вирусингибирующего действия препаратов in vitro, согласно требованиям Фармгоскомитета РФ, являлся показатель снижения инфекционного титра вируса (Д), который должен составлять не менее 1,78 lg [6].

Статистический анализ полученных данных проводили с использованием прикладного пакета Statistica 7.

Результаты исследования. Сравнительное изучение эффективности показало, что все образцы обладали противовирусной активностью, но в разной степени подавляли цитопатогенное действие вируса КЭ. При предварительной экспозиции с фукоиданом из L. japónica во всех концентрацях и из L. cichorioides в концентрациях 1000 и 500 мкг/мл титр вируса снижался (фукоидан из L. cichorioides в концентрации 100 мкг/мл практически не оказывал вирусингибирующего действия). При предварительной экспозиции вируса с фукоиданами из F. evanescens и C. costata было установлено, что препараты во всех концентрациях способствовали снижению титра вируса в среднем на 4 lg (табл. 1).

Применение фукоиданов в разных концентрациях также вело к статистически и биологически (Д>2 lg) значимому подавлению цитопатического действия и накопления вируса, но в меньшей степени, чем при изучении вирулицидного эффекта препаратов. Так, предварительная обработка клеток СПЭВ фукоиданом из L. japonica в концентрации 1000 и 500 мкг/мл способствовала их защите от цитодеструктивного действия, снижая титр вируса в среднем на 4 lg, а в концентрации 100 мкг/мл - на 2 lg по сравнению с контролем. Предварительная обработка клеток фукоиданом из L. cichorioides в концентрации 1000 и 500 мкг/мл способствовала снижению титра вируса на 3 lg, а в концентрации 100 кг/мл - на 2 lg, тогда как предварительная экспозиция клеток СПЭВ с фукоиданом из F. evanescens в концентрации 1000 и 100 мкг/мл снижала титр вируса на 3 lg, а в дозе 500 мкг/мл - на 4 lg. При исследовании протективного действия фукоидана из водоросли C. costata установлено, что препарат во всех исследуемых концентрациях подавлял цитопатическое действие вируса КЭ на 2 lg (табл. 2).

Обсуждение полученных данных. Изучение противовирусного действия сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей L. japonica, L. cichorioides, F. evanescens и C. costata на культуре клеток СПЭВ, инфицированных высокопатогенным штаммом вируса КЭ, показало, что фукоиданы обладают вирулицид-ным и протективным действием при использовании этой чувствительной к вирусу модели. Тем не менее следует отметить, что наибольшим противовирусным действием в отношении вируса КЭ обладают частично ацетилированные, с низким содержанием сульфатов фукоиданы из F. evanescens, L. japonica и C. costata, тогда как высокосульфатированный фукоидан из L. cichorioides обладал менее выраженной противовирусной активностью. По-видимому, проявление биологической активности фукоиданов определяется не только степенью сульфатирования, но может зависеть и от содержания фрагментов определенной структуры. Так,

фукоиданы из L. japonica и C. costata являются галак-тофуканами [2, 14]. Фукоиданы из F. evanescens и L. ci-chorioides представляют собой практически чистые a-L-фуканы, но различаются по содержанию моносахаридов и структуре главной цепи молекул. Основным элементом молекулы частично ацетилированного фу-коидана из F. evanescens является последовательность, построенная из чередующихся 1^3- и 1^4-связанных остатков a-L-фукопиранозы, а главная цепь фукоидана из L. cichorioides построена только из 1^3 связанных остатков a-L-фукопиранозы [8, 14]. Возможно, высокая степень сульфатирования, отсутствие ацетатов и 1^4-связанных остатков a-L-фукопиранозы уменьшают антивирусное действие фукоидана из L. cichorioides.

Известно, что клеточными рецепторами для вируса КЭ являются гликопротеины, гепарансульфаты и ла-мининсвязывающий белок, а за адсорбцию и последующую репликацию вируса отвечает экспонированный на поверхности вирионов гликопротеин Е [5]. Одним из важнейших требований к противовирусным препаратам является создание защиты от цитодеструктивного действия. Мы предполагаем, что сульфатированные полисахариды, так же как и гепарансульфаты, могут являться одними из ко-рецепторов для вируса КЭ, в связи с чем противовирусная активность фукоиданов может быть обусловлена ингибированием адсорбции и последующей репликации вирусов в клетках за счет конкурентного лиганд-рецепторного взаимодействия с гликопротеином вируса, что препятствует слиянию клеточной и вирусной мембран и способствует созданию защиты клеток.

Кроме того, ранее нами было показано, что суль-фатированные полисахариды являются активаторами системы врожденного иммунитета, о чем свидетельствует увеличение экспрессии поверхностных адгезивных, антигенпредставляющих, костимулирующих молекул и толл-подобных рецепторов на дендритных клетках. В свою очередь повышение синтеза и секреции провос-палительных и регуляторного цитокинов способствует активации нейтрофилов, макрофагов и натуральных киллеров, усилению фагоцитоза, пролиферации лимфоцитов и увеличению синтеза интерферона-^ натуральными киллерами, тем самым обеспечивая их участие в антиинфекционной защите организма [1, 3].

Таким образом, широкий биологический спектр действия сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей, а также полученные нами результаты открывают перспективу для изучения фукоиданов в качестве потенциальных модификаторов биологического ответа при вирусных инфекциях и для дальнейшего их применения в комплексном лечении наряду с официнальными препаратами. References

1. Zaporozhec T.S. Cellular and molecular mechanisms of immunomodulatory activity of biopolymers for marine aquatic: dissertation. Vladivostok, 2006. 352 p.

2. Imbs T.I., Shevchenko N.M., Suhoverhov S.V. et al. Effect of harvest season on the composition and structural characteristics of the polysaccharides for the brown alga Costaria costata, Himi-

japrirodnyh soedinenij. 2009. No. 6. P. 661-665.

3. Makarenkova I.D., Ahmatova N.K., Semenova I.B. et.al. Cytokine production by dendritic cells in the bone marrow of mouses under exposed to sulfated polysaccharides from the marine brown algae, GMEI. 2010. No. 5. P. 34-39.

4. Makarenkova I. D., Derjabin P. G., Lvov D. K. et.al. Antiviral activity of sulfated polysaccharide from the brown alga Laminaria japonica to infection of cell cultures by the virus influenza A avian (H5N1), Vopr. virusol. 2010. No. 1. P. 41-45.

5. Romanova L.Ju., Gmyl L.V. Loktev V.B. et.al. The change of the antigenic structure of the surface glycoprotein E virus of tickborne encephalitis and their adaptation to ticks and mammals, Vopr. virusol. 2006. No. 6. P. 31-34.

6. The manual for experimental (preclinical) studies of new pharmacological substance / ed. R.U. Habrieva. M.: Medicina, 2005. 832 p.

7. Semenov B.F. Zverev V.V. The concept of a rapid immunological protection from pathogens, Zhurn. mikrobiol. 2007. No. 4. P.93-100.

8. Anastyuk S.D., Shevchenko N.M., Nazarenko E.L. et al. Structural analysis of fucoidan from brown algae Fucus evanescens by MALDI-TOF and tandem ESI mass-spectrometry, Carbohydr. Res. 2009. Vol. 344. P. 779-787.

9. Berteau O., Mullou B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide, Glycobiology. 2003. Vol. 13, No. 6. P. 29-40.

10. Cumashi A., Ushakova N.A., Preobrazhenskaya M.E., et al. A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, anti-angiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds, Glycobiology. 2007. Vol. 17, No. 5. P. 541-552.

11. Gearing A.J. Targeting toll-like receptors for drug development: a summary of commercial approaches, Immunol. Cell. Biol. 2007. Vol. 85, No. 6. P. 490-494.

12. Mandal P., Mateu C.G., Chattopadhyay K. et al. Structural features and antiviral activity of sulphated fucans from the brown seaweed Cysto-seira indica, Antivir. Chem. Chemother. 2007. Vol. 18, No. 3. P. 153-162.

13. Zhu W., Chiu L.C., Ooi V.E. et al. Antiviral property and mode of action of a sulphated polysaccharide from Sargassum patents against herpes simplex virus type 2, Int. J. Antimicrob. Agents. 2004. Vol. 24, No. 3. P. 279-283.

14. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Chizhov A.O. et al. Water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Distribution, structure, and their dependence on the developmental conditions, J. Exp. Marine Biol. Ecol. 2003. Vol. 294, No. 1. P. 1-13.

Поступила в редакцию 23.03.2011.

antiviral effect of brown algae-derived sulphated polysaccharides in case of experimental tick-borne encephalitis: tying structure and function

I.D. Makarenkova1, G.N. Leonova1, O.S. Maystrovskaya1, T.N. Zvyagintseva2, T.I. Imbs2, S.P. Ermakova2, N.N. Besednova1 1 Research Institute of Epidemiology and Microbiology of the Siberian Brach of Russian Academy of Medical Sciences

Summary - The authors have conducted comparable studies of antiviral effect of sulphated polysac-charides - fucoidans derived from brown algae Laminaria japonica, Laminaria cichorioides, Fucus eva-nescens and Costaria costata on the SPEV biocytoculture infected with tick-borne encephalitis virus. As reported, the fucoidans are known for virucidal effect against the high pathogenic strain of tick-borne encephalitis virus and capacity of suppressing virus adsorption and replication at early disease stages in vitro. Key words: tick-borne encephalitis virus, fucoidans, experiment.

Pacific Medical Journal, 2012, No. 1, p. 44-46.