ДОСТАВКА ГЕНОВ, ОПОСРЕДОВАННАЯ НАНОЧАСТИЦАМИ, ГЕНОМНАЯ КОРРЕКЦИЯ И ЛИГАНД-НАПРАВЛЕННАЯ МОДИФИКАЦИЯ В РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ
GENE DELIVERY, MEDIATED BY NANOPARTICLES, GENE CORRECTION AND LIGAND-DIRECTED MODIFICATION IN VARIOUS CELL POPULATIONS

Перекрестные ссылки на родственные заявки
Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно 35 U.S. C. § 119 на основании предварительной заявки США No. 61/881072, поданной 23 сентября 2013, которая включена в настоящее описание посредством ссылки полностью.
Подтверждение правительственных прав
Настоящее изобретение было осуществлено при поддержке правительства США под R01 AG030637, при спонсорской поддержке Национального института здоровья. Правительство США имеет определенные права на изобретение.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Область техники
Настоящее изобретение в общем относится к применению наночастиц для трансфекции клеток. В частности, настоящее изобретение относится к наночастицам с покрытием и с полиплексным ядром для внутриклеточной доставки полинуклеотидов для модификации экспрессии генов.
Предшествующая информация
Внесение полинуклеотидов в клетки для изменения экспрессии генов требует соответствующей упаковки полинуклеотидов для защиты их от разрушения до поступления в клетки, и для прямой доставки в соответствующий субклеточный компартмент. Эффективность изменения экспрессии также может зависеть от временных рамок высвобождения полинуклеотидов из упаковки после поступления в клетку. Доступные методики на основе наночастиц для модификации экспрессии генов страдают от низкого уровня клеточной трансфекции и ограниченной эффективности при трансфекции, по меньшей мере, частично из-за их ограничений в удовлетворении вышеуказанных требований. Следовательно, желательно получить агент для трансфекции на основе наночастиц и способ его применения, который удовлетворяет всем указанным требованиям, чтобы усилить эффективность.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Преодолеваются недостатки предшествующей области техники и обеспечиваются дополнительные преимущества посредством предоставления, в одном аспекте, наночастиц. Наночастица включают ядро полиплекс и покрытие из диоксида кремния на ядре полиплексе, и полиплекс включает анионный полимер, катионный полимер, катионный полипептид и полинуклеотид. В другом аспекте наночастица также может включать полимер, прикрепленный к наружной поверхности оболочки из диоксида кремния.
Также обеспечивают способ модификации внутриклеточных полинуклеотидов. Способ включает контактирование клетки с наночастицей, которая включает ядро полиплекс и покрытие из диоксида кремния на ядре полиплексе, и полиплекс включает анионный полимер, катионный полимер, катионный полипептид и полинуклеотид. В другом аспекте, наночастица также может включать полимер, прикрепленный к наружной поверхности покрытия из диоксида кремния.
Дополнительные характеристики и преимущества реализуют посредством методик по настоящему изобретению. Указанные и другие объекты, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания различных аспектов изобретения, принимаемых в сочетании с сопутствующими чертежами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Один или более аспектов настоящего изобретения в особенности указаны и четко заявлены как примеры в формуле изобретения в заключении спецификации. Вышеуказанные и другие задачи, характеристики и преимущества изобретения очевидны из следующего подробного описания в сочетании с сопутствующими чертежами, в которых:
Фиг. 1A-1B являются диаграммами некоторых вариантов осуществления наночастиц и их компонентов в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения;
Фиг. 2A представляет собой диаграмму, как наночастицы могут быть произведены в соответствии с аспектом настоящего изобретения;
Фиг. 2B представляет собой диаграмму средств, которыми клетка может потреблять и обрабатывать наночастицы внутриклеточно в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения;
Фиг. 3 представляет собой график, иллюстрирующий эффекты на комплексообразование полиплекса включения различных соотношений различных заряженных полимеров и полинуклеотидов в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения;
Фиг. 4 представляет собой график, иллюстрирующий эффекты на комплексообразование полиплекса включения различных соотношений различных заряженных полимеров и полинуклеотидов, с или без включения анионного полимера в полиплекс, в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения;
Фиг. 5 представляет собой график, иллюстрирующий дестабилизирующий эффект на полиплекс включения увеличивающихся количеств анионного полимера в присутствии или отсутствии катионных полипептидов в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения;
Фиг. 6 представляет собой график, иллюстрирующий размеры наночастиц, обладающих различными слоями в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения;
Фиг. 7 представляет собой микрофотографии клеток, трансфицированных различными наночастицами, демонстрирующие клеточное потребление и субклеточную локализацию наночастиц после трансфекции в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения;
Фиг. 8 представляет собой микрофотографии клеток, трансфицированных наночастицами, показывающие продолжительность удержания наночастиц в клетках после трансфекции в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения;
Фиг. 9A-B представляют собой микрофотографии, показывающие клеточное потребление наночастиц, обладающих слоем полимеров, прикрепленных снаружи покрытия из диоксида кремния на полиплексе в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения;
Фиг. 10 представляет собой диаграмму пептидов TALEN, кодируемых нуклеиновой кислотой, включенной в наночастицы, которые вызывают выключение экспрессии склеростина в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения;
Фиг. 11A-11C представляют собой графики, иллюстрирующие эффекты трансфекции клеток различными количествами наночастиц, которые нацелены на экспрессию склеростина, на экспрессию склеростина и β-катенина в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения;
Фиг. 12A-12F представляют собой графики, иллюстрирующие эффекты трансфекции клеток различными количествами наночастиц, которые нацелены на экспрессию склеростина на уровне экспрессии различных клеточных сигнальных пептидов в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения;
Фиг. 13 представляет собой микрофотографию, демонстрирующую эффекты трансфекции клеток наночастицами, которые нацелены на экспрессию склеростина, на экспрессию гена репортера ко-трансфицируемого гена, который отвечает на факторы транскрипции, чью активность ингибируют склеростин-опосредованная передача сигнала в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения;
Фиг. 14A-14C представляют собой микрофотографии, демонстрирующие эффекты трансфекции клеток наночастицами, которые нацелены на экспрессию склеростина, на минерализацию в соответствии с одним аспектом настоящего изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Аспекты настоящего изобретения и определенные характеристики, преимущества и их подробности, объяснены более полно ниже со ссылками на неограничивающие варианты осуществления изобретения, проиллюстрированные в сопутствующих чертежах. Описание хорошо известных материалов, производственных приспособлений, методик обработки и др. пропущено, так как нет необходимости освещать изобретение в деталях. Необходимо понимать, что подробное описание и специфические примеры, с указанием вариантов осуществления изобретения, даны только для иллюстрации и не в качестве ограничения. Различные замены, добавления и/или схемы в рамках и/или объеме лежащие в основе концепции изобретения очевидны специалисту в области техники из настоящего описания.
Настоящее описание обеспечивает, отчасти, многослойные наночастицы для трансфекции клеток агентами для модификации экспрессии генов. Обеспечивают наночастицы, созданные с улучшенной стабильностью в сыворотке, направленной доставкой в специфические типы клеток, большей ядерной специфичностью и компартмент-специфичным распаковыванием, улучшенной способностью поддерживать значительный уровень нагрузки на начальных стадиях интернализации, и способностью поддерживать высвобождение нагрузки в различные временные периоды после интернализации, и способы их применения.
В одном аспекте комплексы полинуклеотидов с полимерами, или полиплексы, созданные путем конденсации катионных полимеров и полинуклеотидов в присутствии анионных полимеров, могут опосредовать увеличенную эффективность трансфекции относительно конъюгатов полинуклеотида-катионного полимера. Посредством такого процесса можно получить больше частиц и увеличить общую площадь поверхности наночастиц, подвергаемых потреблению клетками, улучшенный электростатический репульсовый элемент также может играть роль в высвобождении нуклеиновых кислот посредством указанной методики. Неожиданно, в противоположность более быстрой дезагрегации нуклеотидов из полиплексов наночастиц, которые включают анионные полимеры на основе существующей литературы, в одном аспекте настоящего изобретения, включение анионного полимера в ядро полиплекс наночастиц может увеличивать продолжительность внутриклеточного удержания наночастиц и высвобождения агентов, которые влияют на экспрессию генов, или иным образом регулируют клеточную функцию, или нагрузки.
В другом аспекте присутствие катионного полипептида в наночастицах может опосредовать стабильность, субклеточное распределение и высвобождение нагрузки. В качестве одного примера, фрагменты N-конца гистоновых пептидов, называемые обычно как гистоновые терминальные пептиды, в различных полиплексах не только способны депротеинироваться различными модификациями гистонов, такими как в случае ацетилирования, опосредованного гистон-ацетилтрансферазой, но также могут опосредовать специфическую распаковку в ядре в виде компонентов полиплексов. Их транспортировка может зависеть от альтернативных эндоцитозных путей с использованием ретроградного транспорта через Гольджи и эндоплазматический ретикулум, и природа гистонов, существующих внутри ядра, предполагает врожденную ядерную локализацию последовательности на гистоновых терминальных пептидах. В одном аспекте настоящего изобретения включение гистонового терминального пептида может обеспечивать ядерную локализацию наночастиц и приводить к опосредованному ферментами высвобождению из них полинуклеотидной нагрузки.
В другом аспекте покрытия из диоксида кремния могут изолировать свою нагрузку до и во время исходного потребления клеткой. Обычно используемые полиплексы, состоящие из поли(этиленимина) и ДНК, имеют тенденцию высвобождать большую часть (~90%) их нагрузки во время интернализации в клетки, а оставшаяся часть нагрузки остается связанной с его катионным полимерным наноносителем. При транзиторной стабилизации слоев диоксида кремния, можно наблюдать большую эффективность внутриклеточной доставки, несмотря на сниженную вероятность клеточного потребления. В другом аспекте настоящего изобретения покрытие полиплекса наночастиц покрытием из диоксида кремния может герметизировать полиплекс, стабилизируя его до высвобождения при обработке в предназначенном субклеточном отделе.
В другом аспекте настоящего изобретения эффективность трансфекции может быть дополнительно увеличена путем добавления другого слоя катионного полимера, делая эффективность доставки почти на два порядка величины больше, чем для полиплекса без покрытия или покрытого диоксидом кремния, предположительно из-за анионной природы олигомерного диоксида кремния покрытия, отталкивающего клетки. В дополнительном аспекте полиплексы, покрытые диоксидом кремния, и их дополнительно покрытые производные, являются стабильными в сыворотке и подходят для экспериментов in vivo в отличие от конъюгатов катионного полимера/нуклеиновой кислоты, как таковых.
Фиг. 1A-1B демонстрируют компоненты наночастиц в соответствии с настоящим изобретением. В соответствии с настоящим изобретением ядро полиплекс наночастиц может включать полинуклеотид, анионный полимер, катионный полимер, и катионный полипептид. Покрытие из диоксида кремния может затем наноситься на ядро полиплекс, и затем полимеры могут быть прикреплены к наружной поверхности оболочки из диоксида кремния. Полинуклеотидом может быть вектор ДНК для запуска внутриклеточной экспрессии последовательности нуклеиновой кислоты, которую он содержит. Однако наночастица также может включать другие типы полинуклеотидов, такие как линейная ДНК или различные типы РНК, включая dsДНК, ssДНК, мРНК, siРНК, или CRISPR РНК последовательности, или другие, или любые комбинации вышеуказанного. Наночастица также может включать, в добавление к или вместо любого из вышеуказанных примеров полинуклеотидов, нуклеиновые кислоты пептидов, другие заряженные или полярные мелкие молекулы между 50 и 1000 Да, или альтернативно, между 200 и 10 кДа, по размеру, такие как циклические нуклеотиды, такие как цАМФ, ДНК-оригами, аптамеры, заряженные полипептиды, белки или белковые фрагменты между 2 и 100 кДа, пептоиды, фосфорилированные или сульфатированные составляющие, анионно модифицированные составляющие, и мультимерные или олигомерные комбинации вышеуказанного. Обычный специалист понимает, что любое из вышеперечисленного или их любая комбинация включены в настоящее изобретение.
Продолжая с фиг. 1A, в одном аспекте изобретения катионный полимер в полиплексе может быть полипептидом, содержащим катионные аминокислоты, и может быть, например, поли(аргинином), поли(лизином), поли(гистидином), поли(орнитином), поли(цитруллином), или полипептидом, который включает любую комбинацию более чем одного из вышеуказанного. Наночастицы также могут включать, в добавление к или вместо любого из вышеперечисленных примеров катионных полимеров, поли(этиленимин), поли(аспартамид), полипептоиды, полиэфир, функционализированный заряд, катионный полисахарид, ацетилированный аминосахар, хитозан, или вариант или варианты, которые могут включать любую комбинацию более чем одного из вышеуказанного в линейной или разветвленной формах.
В одном примере катионный полимер может включать поли(аргинин), такой как поли(L-аргинин). Катионный полимер в полиплексе может иметь молекулярную массу между 1 кДа и 200 кДа. Катионный полимер в полиплексе также может иметь молекулярную массу между 10 кДа и 100 кДа. Катионный полимер в полиплексе также может иметь молекулярную массу между 15 кДа и 50 кДа. В одном примере, катионный полимер включает поли(L-аргинин) с молекулярной массой приблизительно 29 кДа, как представлено в SEQ ID NO: 1 (PLR). В другом примере, катионный полимер может включать линейный поли(этиленимин) с молекулярной массой 25 кДа (PEI). В другом примере, катионный полимер может включать разветвленный поли(этиленимин) с молекулярной массой 10 кДа. В другом примере, катионный полимер может включать разветвленный поли(этиленимин) с молекулярной массой 70 кДа. В другом примере, катионный полимер может включать D-изомер поли(аргинина) или любого из вышеуказанных полимеров, таких как полипептиды, которые могут быть особенно преимущественными, так как полимеры, такие как полипептиды, содержащие D-изомер, могут быть менее подверженными разрушению в клетке и, следовательно, оказывают длительный эффект на высвобождение нагрузки и его скорость в течение времени.
Продолжая с фиг. 1A, в дополнительном аспекте изобретения, анионный полимер в полиплексе может быть полипептидом, содержащим анионные аминокислоты, и может быть, например, поли-глутаминовой кислотой или поли-аспарагиновой кислотой, или полипептидом, который включает любую комбинацию вышеперечисленного. Наночастицы также могут включать в добавление к или вместо любых из вышеперечисленных примеров анионных полимеров, гликозаминогликан, гликопротеин, полисахарид, поли(маннуроновую кислоту), поли(гулуроновую кислоту), гепарин, гепаринсульфат, хондроитин, хондроитинсульфат, кератан, кератансульфат, аггрекан, поли(глюкозамин), или анионный полимер, который включает любую комбинацию вышеперечисленного. В одном примере анионный полимер может включать поли-глутаминовую кислоту. Анионный полимер в полиплексе может иметь молекулярную массу между 1 кДа и 200 кДа. Анионный полимер в полиплексе также может иметь молекулярную массу между 10 кДа и 100 кДа. Анионный полимер в полиплексе также может иметь молекулярную массу между 15 кДа и 50 кДа. В одном примере анионным полимером является поли(глутаминовая кислота) с молекулярной массой приблизительно 15 кДа. Полимеры, состоящие из или включающие D-изомер глутаминовой кислоты, могут быть особенно предпочтительными, так как они могут быть менее подверженными разрушению в клетке, следовательно, имеют пролонгированный эффект на высвобождение нагрузки и его скорость в течение времени. Например, анионный полимер в полиплексе может иметь последовательность, представленную SEQ ID NO: 2 (PDGA). В другом примере анионный полимер может включать D-изомер любого изомера любого из вышеуказанных полимеров или полипептидов, которые могут быть особенно предпочтительными, так как полимеры, такие как полипептиды, содержащие D-изомер, могут быть менее подверженными разрушению в клетке и, следовательно, имеют пролонгированный эффект на высвобождение нагрузки и его скорость с течением времени.
Продолжая с фиг. 1A, в другом аспекте изобретения катионным пептидом в ядре полиплексе наночастиц может быть фрагмент гистонового пептида, такого как белки H1, H2, H3, или H4. Фрагмент может включать аминокислоты, чья последовательность соответствует N-концу гистонового белка. Например, фрагмент может включать до первых 5 (SEQ ID NO: 9), 10 (SEQ ID NO: 10), 15 (SEQ ID NO: 11), 20 (SEQ ID NO 12), 25 (SEQ ID NO: 13) или более N-концевых аминокислот гистонового белка. Фрагмент также может быть амидированным на его C-конце. Фрагмент также может быть модифицирован таким образом, что один или более лизиновых остатков являются метилированными, один или более гистидиновых, лизиновых, аргининовых или других комплементарных остатков являются ацетилированными или подверженными ацетилированию, как субстрат гистон ацетилтрансферазы или ацетил CoA, или любая комбинация из вышеуказанного. Например, катионный пептид в полиплекс комплексе наночастиц может иметь последовательность, как представлено SEQ ID NO: 3, которая включает первые 25 аминокислот человеческого гистонового белка 3, амидированного на его C-конце, и три-метилированного на лизине 4 в соответствии с настоящим изобретением (HTP).
В другом варианте осуществления изобретения наночастицы могут включать или содержать, в добавление к или вместо любого из вышеуказанных катионных полипептидов, последовательность ядерной локализации. Катионный полипептид может включать последовательность ядерной локализации на его N- или C-конце. Последовательность ядерной локализации может включать субстрат импортина или кариоферина, или может иметь или содержать последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 8. В другом варианте осуществления изобретения наночастицы могут включать, в добавление к или вместо любого из вышеуказанных катионных полипептидов, сигнал митохондриальной локализации или пептидный фрагмент mtHSP70.
Продолжая с фиг. 1B, в другом аспекте изобретения наночастицы могут включать обратимое покрытие, которое обеспечивает стабильность ядру полиплексу перед интернализацией в клетку или ее отделы, предотвращая преждевременное разрушение или дестабилизацию. Например, покрытие из диоксида кремния может быть нанесено на ядро полиплекс. В другом примере, фосфат кальция или гидроксиапатит может быть нанесен на ядро полиплекс. В другом примере, разветвленный катионный полимер, полипептид или пептоид могут быть нанесены на ядро полиплекс, с избытком анионного заряда. Покрытие, такое как покрытие из диоксида кремния, может защищать полиплекс от разрушения до воздействия эндосомального микроокружения.
В другом аспекте наночастицы могут включать слой полимеров, прикрепленных к или электростатически связанных с наружной поверхностью покрытого полиплекса, например, к или с наружной поверхностью покрытия из диоксида кремния. Такие наружные полимеры могут служить для предотвращения отталкивания клеткой покрытых полиплексов так, чтобы обеспечить контакт с и потребление клеткой. Наружный полимерный слой также может служить для обеспечения интернализации специфическими типами клеток, так, если наружно прикрепленный полимер является или имитирует лиганд к рецептору, экспрессируемому типом клеток, трансфекция которых желательна. Полимер в полимерном слое, прикрепленном к наружной поверхности покрытия на полиплексе, может иметь размер между 0,1 и 20 кДа, или может иметь размер 40 или 50 кДа.
Примеры полимеров, включающих полимерный слой, прикрепленный к наружной поверхности покрытого ядра полиплекса, включают таковые, представленные SEQ ID NO: 4, которые представляет собой приблизительно 10 кДа поли(аргинин) полимер, и SEQ ID NO: 5, который является человеческим белком вазоактивного эндотелиального фактора роста, в соответствии с настоящим изобретением. В другом примере полимер, включающий слой, прикрепленный к наружной поверхности покрытого ядра полиплекса, может включать якорный субстрат от 1 до 25 повторяющихся анионных или катионных компонентов на N-конце, C-конце, 5', или 3' конце полимера, полипептида или полинуклеотида для обеспечения электростатической конъюгации нацеливающего компонента, содержащегося в полимере, полипептиде или полинуклеотиде с покрытым ядром полиплексом. В другом примере полимер, включающий слой, прикрепленный к наружной поверхности покрытого ядра полиплекса, может включать полимер, полипептид или полинуклеотидную последовательность, которая имеет комплементарность пары оснований или связывающую афинность к компоненту связывания последовательности аминокислот для связывания дополнительных слоев, которые могут быть добавлены на него.
В другом аспекте настоящего изобретения, проиллюстрированного на фиг. 2A, создают катионный полиплекс, затем его покрывают покрытием из диоксида кремния. Ядра полиплекса наночастиц могут быть получены посредством электростатических взаимодействий, приводящих к конденсации. Могут быть созданы два раствора равного объема, один с pH-неотрегулированным 40 мM HEPES (pH -5,5) в комбинации с 0,1% масс./об. катионного полимера и катионного полипептида в воде, и другие с 30 мM Tris-HCl (pH ~7,4) в комбинации с 0,1% масс./об. анионного полимера и полинуклеотида в воде. В одном варианте осуществления изобретения катионный полимер включает SEQ ID NO: 1, анионный полимер включает SEQ ID NO: 2, и катионный полипептид включает SEQ ID NO: 3. Такие растворы могут быть смешаны посредством добавления катионного раствора к анионному по каплям без перемешивания. После 30 минут инкубации при комнатной температуре, 200 мкл раствора, содержащего 10 мкг нуклеиновых кислот в полиплексах, может быть добавлено по каплям к 45 мM раствора силиката натрия (Sigma) в Tris-HCl (pH=7,4) и инкубации в течение между 8 и 24 часами при комнатной температуре. Полиплексы, покрытые диоксидом кремния, могут быть выделены посредством центрифугирования с 300 кДа Nanosep фильтра (Pall, Port Washington, NY) при 3000 g с целью отделения комплексов от несвязанных видов диоксида кремния и полимеров. Наночастицы могут дополнительно быть ресуспендированы в растворе, содержащем полимер, для прикрепления к наружной поверхности покрытия из диоксида кремния. Например, они могут быть ресуспендированы в растворе, включающем полимер, представленный SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 при 0,1% масс./об. в течение одного часа. Затем наночастицы могут быть снова центрифугированы перед ресуспендированием в трансфекционной среде. Такой пример является только одним примером получения наночастиц в соответствии с настоящим изобретением.
Фиг. 2B представляет собой диаграмму контакта клетки с наночастицами в соответствии с настоящим изобретением, приводящего к клеточной интернализации наночастиц, например, посредством кавеола-опосредованного эндоцитоза или макропиноцитоза. Наночастицы могут дополнительно транспортироваться через Гольджи и эндоплазматический ретикулум или быть пропущены через лизосомальные пути, приводя к потере покрытия, такого как покрытие из диоксида кремния, и воздействия на ядро полиплекс. Ядро полиплекс может дополнительно быть транслоцировано в ядро клетки, где ферментативная обработка может разрушать катионный полимер, например, посредством активности аргиназ, или иным образом обеспечить распаковку ядра полиплекса, например, посредством ацетилирования гистонового терминального пептида в полиплексе, приводя к высвобождению полинуклеотидов, таких как плазмидная ДНК, из полиплексового ядра в соответствии с настоящим изобретением. Другие стадии внутриклеточной обработки, модифицирующие составляющие наночастицы и его ядро полиплекс или его оболочку или полимерный слой, прикрепленный к покрытию, могут также осуществляться в соответствии с настоящим изобретением.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение включает оптимизированные соотношения анионных и катионных полимеров, катионных полипептидов и полинуклеотидов для комплексообразования ядра полиплекса, как части наночастиц. В одном примере плазмидную ДНК флуоресцентно метили бромидом этидия (40 нг EtBr/мкг ДНК) до добавления различных полимерных составляющих в молярных [I(положительный)]:[I(отрицательный)] соотношениях [амин (n)]: [фосфат (p) + карбоксилат (c)], или c:p в случае добавления поли(D-глутаминовой кислоты) (PDGA; SEQ ID NO: 2). Добавление линейного поли(этиленимина) (PEI, 25 кДа) сравнивали с добавлением поли(L-аргинина) (PLR, 29 кДа; SEQ ID NO: 1) независимо, а также в сочетании с H3K4(Me3) гистоновым терминальным пептидом (HTP; SEQ ID NO: 3), с целью количественной оценки сходного поведения комплексообразования между двумя полимерами, как части бинарного комплекса (т.е., PEI + ДНК или PEI + ДНК) или тройных комплексов (HTP + PEI + ДНК или HTP + PLR + ДНК). Когда катионный полимер и катионный полипептид присутствуют оба, относительное молярное соотношение каждого из компонентов составляет 60%:40%, соответственно. Фильтр Zeiss и спектрофотометр использовали для стимуляции EtBr-меченной ДНК при 510 нм для излучения при 595 нм, и результаты сравнивали среди различных композиций с несвязанным EtBr в качестве отрицательного контроля.
Фиг. 3 представляет собой график, демонстрирующий эффекты варьирования соотношения анионных или катионных полимеров или полипептидов к полинуклеотидам. Ось X показывает соотношение заряженного полимера к фосфату и ось Y показывает относительную флуоресценцию после комбинации указанных составляющих. Уменьшение относительной флуоресценции показывает замену EtBr из ДНК и образование полиплекса. Соотношения катионного полимера или катионного полимера и катионного полипептида, к ДНК приблизительно 5:1 и выше демонстрировали приблизительно 40% снижение флуоресценции, показывающее комплексообразование ДНК и полимеров в полиплексах. Добавление PDGA в отсутствие катионных полимеров или катионных полипептидов не влияло на комплексообразование.
После комплексообразования полиплексов PLR-HTP-ДНК, PEI-HTP-ДНК, PLR-ДНК и PEI-ДНК и определения, что PDGA не обладает способностью вызывать комплексообразование полинуклеотидов, влияние PDGA на кинетику образования было установлено путем сравнения [5,5(положительный)]:[1(отрицательный)] и [10(положительный)]:[1(отрицательный)] молярных соотношений [амин (n)]: [фосфат (p)] и [амин (n)]: [фосфат (p) + карбоксилат (c)] на эффективность комплексообразования с целью определения эффектов избытка катионных и равновесных соотношений заряда на комплексообразование наночастиц. Ожидали, что включение карбоксилатных групп из PDGA оказывает эффект на общую кинетику образования, сравнимую с включением фосфатных групп из ДНК. Относительную флуоресценцию сравнивали с ДНК без добавления полимеров или полипептидов или EtBr в отсутствие ДНК в качестве контроля.
Фиг. 4 демонстрирует эффект добавления PDGA к катионным полимерам и катионным полипептидам на кинетику комплексообразования полиплекса. ДНК образовывала комплексы с HTP, PLR или PEI, с или без добавления PDGA. Показаны эксперименты с использованием молярных соотношений катионного полимера (PLR или PEI) к молярным соотношениям полинуклеотида и катионного полимера 5,5:1 (как показано в столбиках, меченных n/p=5,5) (PLR или PEI) относительно полиинуклеотид плюс анионный полимер 5,5:1 и 10:1 (как показано в столбиках, меченных n/(p+2c)=5,5 или 10), с или без добавления HTP. Добавление PDGA не нарушало кинетики комплексообразования в любых исследуемых молярных соотношениях.
Также определяли эффекты включения катионного полимера и катионного полипептида на дестабилизацию полиплекса, как показано на фиг. 5. Полиплексовые наночастицы ДНК и катионных полипептидов (PLR с или без HTP, или PEI с HTP) с молярными соотношениями [(PDGA) карбоксилат(c):(ДНК) фосфат(p)], варьирующими от 0 до 100, образовывали комплекс, как описано, по сравнению с ДНК или EtBr отдельно в качестве контроля, и определяли эффекты дестабилизации (как показано повышенной флуоресценцией). В отсутствие HTP добавление PDGA не приводило к дестабилизации полиплекса. Однако в присутствии HTP добавление молярных соотношений PDGA к ДНК 20 и выше приводило к дестабилизации полиплекса. Полученные результаты демонстрируют неожиданный синергический эффект катионного полипептида и анионного полимера на дестабилизацию комплекса. Включение катионного полипептида и/или включение катионных составляющих различных молекулярных масс или размеров в ядро полиплекс наночастиц может полезно усиливать способность катионного полимера запускать диссоциацию и высвобождение полинуклеотидной нагрузки из полиплекса и других его составляющих.
Динамическое рассеяние света (BRAND) использовали для определения гидродинамических радиусов наночастиц на различных стадиях образования. Наночастицы, содержащие ядра полиплекса с плазмидной ДНК, PLR, PDGA, и HTP, в молярном соотношении [амид]: [(фосфат)] 5,5:1, образовывали комплексы, как описано. Некоторые ядра полиплексы дополнительно покрывают покрытием из диоксида кремния, как описано. И некоторые полиплексы, покрытые диоксидом кремния, дополнительно покрывали катионным полимером (SEQ ID NO: 4), как описано. 30-60 минут измерений получали после исходного образования ядра третичных комплексов, покрытия ядер диоксидом кремния и покрытия катионным полимером ядер, покрытых диоксидом кремния. Фиг. 6 представляет собой график, показывающий диаметры наночастиц. Непокрытые ядра полиплекс и ядра полиплекс, покрытые диоксидом кремния, имели приблизительно 70-150 нм в диаметре в среднем. В других вариантах осуществления изобретения ядра полиплекс и ядра полиплекс, покрытые диоксидом кремния, могут находиться в диапазоне 100-170 нм в среднем диаметре. Добавление покрытия катионного полимера на покрытие из диоксида кремния давало наночастицы со средним диаметром приблизительно 170 нм. В других вариантах осуществления изобретения покрытые диоксидом кремния ядра полиплекс с дополнительным слоем катионного полимера, прикрепленным к наружному слою диоксида кремния, находились в диапазоне приблизительно 80-200 нм в среднем диаметре.
Также определяли клеточное потребление наночастиц. Флуоресцеин изотиоцианат (FITC) ковалентно конъюгировал с аминами PEI (25 кДа линейный) и PLR (29 кДа) так, что молярное соотношение аминов к FITC составило 100:1. Реакцию проводили в темноте при комнатной температуре в течение четырех часов в равных объемах воды и DMSO. С целью установления конъюгации 0,05% масс./об. 500 мкл раствора каждого флуоресцентно модифицированного полимера центрифугировали в 10 кДа Nanosep фильтре и интенсивность флуоресценции элюата (485 погл./520 изл.) сравнивали с нефильтрованным раствором полимера а также водой. Плазмиду mCherry (Addgene) включали в наночастицы для возможности определения флуоресценции экспрессии, запущенной плазмидой.
Мышиные остеобласты MC3T3 культивировали на полистироловых T-75 тканевых культуральных пластиковых колбах (Corning, CA, USA). Среду Игл, модифицированную Дульбекко, дополненную 10% эмбриональной бычьей сывороткой (Thermo Fisher Scientific, VA, USA), использовали для остеобластов вместе с 1% пенициллином/стрептомицином (Invitrogen, NY, USA). Ксиленол оранжевый добавляли к культуральной среде с дня 15 по день 25 после начала культивирования клеток. В день 25 клетки фиксировали и оценивали в отношении минерализации. Для доставки плазмиды mCherry с использованием FITC-модифицированных наночастиц, остеобласты сеяли по 1000 клеток/ячейку в 96-луночные планшеты и позволяли приклеиться в течение 12-16 часов в DMEM без антибиотиков, содержащей 10% FBS. Непосредственно перед трансфекцией среду заменяли равными объемами OptiMEM-суспендированных наночастиц и DMEM, содержащей 10% FBS.
Все комплексы метили FITC и подвергали количественному наблюдению интенсивности флуоресценции (488/520 погл./изл.) до трансфекции. Остеобласты из 96-луночных планшетов (1000 клеток/ячейку) трансфицировали 200 нг плазмид в тройных экземплярах для каждого бинарного (плазмидного и катионного полимера), третичного (плазмидного и катионного полимера, плюс анионный полимер или катионный полипептид), и четвертичного (плазмидный, катионный полимер, анионный полимер и катионный полипептид) комплекса, а также его покрытого диоксидом кремния аналога, с 1 контрольной и 8 экспериментальными группами (n=3) в общем. 5% сыворотку использовали с целью изучения эффектов сыворотки в отношении внеклеточных свойств агрегации.
Через 30 часов после трансфекции бимодальная флуоресцентная визуализация позволяла одновременно наблюдать FITC-меченные наночастицы (488 погл./520 изл.) и экспрессию гена mCherry, которая за это отвечала (633 погл./680 изл.). Минимум 20 клеток наблюдали в различных положениях в каждой ячейке и получали характерные изображения. ImageJ использовали для обработки наложенных изображений и комбинации фазы-контраста каналов, 488/520 и 633/680.
Микрофотографии, демонстрирующие клеточное потребление, показаны на фиг. 7. Круги на фиг. 7 показывают, где очевидны высокие уровни ядерной локализации. Покрытые диоксидом кремния бинарные наночастицы продемонстрировали свойства быстрого высвобождения (т.е., ядерная локализация не была очевидна в образцах ДНК-PLR + диоксид кремния). Включение PDGA в ядра полиплекс вызывало длительное высвобождение плазмиды в клеточном ядре. Такой эффект PDGA, вызывающий длительное высвобождение, был неожиданным в свете литературы, предполагающей противоположное: что включение катионных полимеров будет ускорять и укорачивать продолжительность, диссоциации полинуклеотидной нагрузки из других полиплексовых составляющих. Добавление HTP также вызывало выраженную ядерную локализацию.
Дополнительное покрытие наночастиц, покрытых диоксидом кремния (ДНК-HTP-PDGA-PLR+Si), поли(аргинином) (SEQ ID NO: 4) делает наночастицы стабильными в сыворотке и вызывает длительное удержание нагрузки наночастиц в клетках. Фиг. 8. представляет собой микрофотографии, демонстрирующие клеточное потребление и удержание покрытых диоксидом кремния FITC-конъюгированных ядер полиплекс, к которым был добавлен дополнительный слой поли(L-аргинина) (SEQ ID NO: 4), мышиными остеобластами MC3T3, в соответствии с настоящим изобретением. В отличие от наночастиц, покрытых диоксидом кремния, показанных на фиг. 7, отсутствие агрегации наночастиц, содержащих дополнительный слой катионных полимеров на внешней стороне диоксида кремния, наблюдали на фиг. 8, демонстрируя, что такие наночастицы остаются стабильными в сыворотке. Более того, наблюдали, что такие наночастицы демонстрируют длительное удержание в клеточном ядре, так что флуоресценция количественно достигает пика в течение приблизительно 1,5 дней и определяемая флуоресценция сохраняется в течение 14 дней.
Покрытие полиплексовых ядер, покрытых диоксидом кремния, полимерами, специфически предназначенное для связывания определенных клеточных типов, может дополнительно усиливать потребление. Лиганды, ассоциирующие клеточные рецепторы с поверхностью наночастиц, могут усиливать афинность наночастиц к клеткам, которые экспрессируют такие рецепторы и увеличивают трансфекцию таких клеток. В качестве одного примера в соответствии с настоящим изобретением, полиплексы, покрытые диоксидом кремния, покрывали VEGF (SEQ ID NO: 5), высокоафинным лигандом к рецепторам VEGF, которые экспрессируются на высоком уровне человеческими эндотелиальными клетками пупочной вены (HUVEC). HUVEC инкубировали с покрытыми диоксидом кремния FITC-конъюгированными полиплексами с поли(L-аргинином) (SEQ ID NO: 4) или человеческим VEGF (SEQ ID NO: 5), прикрепленным к наружной поверхности покрытия из диоксида кремния, в течение 40 мин до промывки дважды PBS, затем ресуспендировали в DMEM (10% FBS). Клетки визуализировали через 4 часа. После такого короткого периода инкубации наблюдали только низкий уровень трансфекции наночастицами, содержащими слой поли(L-аргинина), прикрепленный к наружной поверхности диоксида кремния (фиг. 9A), тогда как покрытие VEGF вместо поли(L-аргинина) приводило к достоверно большей клеточной интернализации в указанной четырехчасовой временной точке. Специалист в области техники понимает, что по существу любые другие типы клеток могут также быть трансфицированы наночастицами в соответствии с настоящим изобретением, и что слой полимеров может быть прикреплен к наружному слою ядер полиплекса, покрытых диоксидом кремния, для обеспечения или иного влияния на этот эффект. Такой специалист также понимает, что другие средства контакта клеток с наночастицами для формирования таких исходов, такие как и/п, в/в, в/м или п/к или другие инъекции или трансдермальное введение или посредством суппозитория или проглатывания или пероральной или назальной ингаляции, человеком или животным, или контакта с эксплантированной тканью или клетками или стволовыми клетками, также включают в настоящее изобретение.
В другом аспекте изобретения полинуклеотид, кодирующий нуклеазу, может быть включен в ядро наночастиц полиплекс. В качестве одного неограничивающего примера полинуклеотид, который кодирует и запускает экспрессию TALEN (нуклеазы эффектора подобного фактору транскрипции (Transcription Factor-Like Effector Nucleases)), может быть включен в наночастицы. Как нуклеазы цинковых пальцев, TALEN использует модулярный ДНК-связывающий фрагмент (TALE), который может быть модифицирован для внесения новых ДНК связывающих специфичностей и даже нуклеаз (TALEN). TALE состоит из множественных повторов вариабельных диостатков (RVD), который каждый специфически связывается с одним нуклеотидом. Наборы TALE делают посредством связывания RVD в специфическом порядке для обеспечения специфичности и афинности связывания с желаемыми последовательностями ДНК. В общем, такие инструменты для сплайсинга генома создают посредством сшивки неспецифических отщепляемых доменов, таких как нуклеазы FokI, с TALE. Доступны протоколы сборки TALEN, которые позволяют собрать такие повторяющиеся последовательности, включая метод компоновки с открытым исходным кодом, известный как Золотые ворота (Golden Gate).
В другом аспекте настоящего изобретения наночастицы могут быть созданы и использованы таким образом, чтобы регулировать экспрессию сигнальных молекул для изменения клеточной функции. Например, последовательности хромосомной ДНК могут быть удалены или изменены для получения клеточных или животных моделей патологических состояний или их лечения, или для лечения патологических состояний или улучшения состояния здоровья человека иным образом. Одним неограничивающим примером белка, чья экспрессия может быть модифицирована в соответствии с настоящим изобретением является склеростин (SOST). Связывание SOST с рецептором LRP5/6 ингибирует передачу сигнала Wnt, вероятно посредством систем обратной связи между Wnt3A, Wnt7B, WntlOA, склеростином, β-катенином, LEF1, и TCF1. Десупрессия таких каскадов посредством удаления склеростина может приводить к существенно увеличенной активности минерализации.
Остеопрогенитор (OPG) и RANKL также ожидаемо играют ответственную роль в делеции SOST, где RANKL экспрессирует сам себя как рецептор для обеспечения остеокластогенеза посредством связывания остеокласт-связанного RANK или ODF (фактора дифференцировки остеокластов), и OPG связывается антагонистически с RANKL. Следовательно, соотношение между OPG и RANKL является определяющим для взаимоотношений между образованием и резорбцией кости. Однако, отдельные культуры остеобластов взаимодействуют через другие формы паракринной передачи сигнала и такое соотношение должно больше отражать поведение измененных клеток в ко-культуре с остеокластами или in vivo.
В другом аспекте настоящего изобретения наночастицы могут быть созданы таким образом, чтобы позволить трансфекцию TALEN, которая может нарушить экспрессию SOST и, следовательно, создать фенотип высокой костной массы. В качестве одного примера TALEN могут быть созданы для специфического связывания с локусами в гене SOST и создавать двухцепочечные разрывы в геноме для прерывания транскрипции или трансляции и уменьшения экспрессии SOST. В качестве дополнительного примера наночастицы могут содержать плазмиды, которые кодируют два TALEN, которые создают двухцепочечные разрывы на обеих сторонах хромосомного локуса старт кодона для SOST. Восстановление эндогенной геномной ДНК после иссечения последовательности, кодирующей старт кодон, может приводить к транскрипции мРНК склеростина, не имеющей старт кодона, которая не может соответствующим образом транслироваться в белок SOST, таким образом подавляя экспрессию и активность. Диаграмма представления такой модели показана на фиг. 10, где "левый" TALEN и "правый" TALEN связываются с и отщепляют сайты на противоположных сторонах локуса старт кодона SOST. В качестве одного примера левый TALEN может иметь последовательность, представленную SEQ ID NO: 6, и правый TALEN может иметь последовательность, представленную SEQ ID NO: 7. Наночастицы могут включать плазмиду экспрессии, такую как pUC19 (Genbank Каталожный номер L09137 X02514), в которой нуклеотидная последовательность, которая кодирует правый или левый TALEN, например, таковая, представленная SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, были субклонированы так, чтобы запустить клеточную экспрессию кодируемого TALEN. Наночастицы также могут включать комбинации плазмид экспрессии, которые включают последовательности, которые кодируют левый и правый TALEN.
Наночастицы также могут включать другие последовательности TALEN, нацеленные на SOST или любой другой интересующий ген, и также могут включать другие векторы экспрессии, в соответствии с настоящим изобретением. Наночастицы могут включать другие типы полинуклеотидов или их аналоги, такие как варианты РНК или ДНК, включая мРНК, siРНК, миРНК, аптамеры, shРНК, AAV-полученные нуклеиновые кислоты, морфолино РНК, пептоид и пептидные нуклеиновые кислоты, кДНК, оригами ДНК, ДНК и РНК с синтетическими нуклеотидами, ДНК и РНК с заранее определенными вторичными структурами, последовательности CRISPR, и мультимеры и олигомеры, и любые комбинации вышеперечисленного, в соответствии с настоящим изобретением. В другом примере, наночастицы могут включать полинуклеотиды, чья последовательность может кодировать другие продукты, такие как любой белок или полипептид, чья экспрессия желательна. Специалист в области техники понимает, что вышепредставленные примеры находятся в соответствии с настоящим изобретением и могут быть охвачены его формулой изобретения.
После трансфекции мышиных остеобластов MC3T3 наночастицами, созданными для выключения экспрессии SOST в соответствии с настоящим изобретением, анализы ELISA и количественную ПЦР в реальном времени (qPCR) проводили на лизате клеток и фракциях надосадочной жидкости. Фиг. 11A-11C представляют собой графики, демонстрирующие эффективность различных количеств (800 нг, 1600 нг, или 2500 нг) наночастиц (NP), содержащих плазмиды экспрессии, включающие последовательности нуклеотидов, которые кодируют левый (SEQ ID NO: 6) и правый (SEQ ID NO: 7) TALEN SOST, в соответствии с настоящим изобретением, в модуляции экспрессии SOST и экспрессии β-катенина в течение периода до более 20 дней после трансфекции. Для сравнения, другие клетки трансфицировали мРНК, кодирующей те же TALEN с использованием липофектамина, известного агента для клеточной трансфекции. Как показано на фиг. 11A-11C, внутриклеточный и внеклеточный уровень SOST подавлялись в течение, по меньшей мере, нескольких недель после трансфекции наночастицами в соответствии с настоящим изобретением, тогда как экспрессия β-катенина одновременно стимулировалась, подтверждая эффективность наночастиц в подавлении экспрессии и активности SOST.
кПЦР также проводили для определения, может ли подавление экспрессии SOST наночастицами в соответствии с настоящим изобретением оказывать нижележащие эффекты на другие компоненты соответствующих сигнальных каскадов. Клетки трансфицировали, как описано выше. Эффект в отношении экспрессии множества компонентов сигнального пути (SOST, β-катенина, TCF1, LEF1, Wnt3A, Wnt7B, WntlOb, OPG, и RANKL), через 5, 14, и 21 день после трансфекции различными количествами наночастиц, как указано, показан на фиг. 12A-12F. Для сравнения, другие клетки трансфицировали мРНК, кодирующей те же TALEN с использованием липофектамина. Результаты ПЦР в реальном времени показали большую стимуляцию Wnt отвечающих генов в клеточных линиях, трансфицированных наночастицами, доставляющими SOST TALENS по сравнению с SOST TALEN, доставляемыми липофектамином, в 2-6 раз, как ответ на выключение ингибитора передачи сигнала Wnt склеростина.
TCF/LEF-1-опосредованная транскрипция также может стимулироваться после выключения экспрессии SOST в соответствии с настоящим изобретением. Клетки MC3T3-El трансфицировали конструктами TOPflash и контрольным FOPflash плазмиды репортера люциферазы (Addgene# 12456 и 12457), которые содержат сайты связывания TCF/LEF-1. Клетки сеяли с плотностью 5000 клеток/ячейку в 8-луночные слайд-камеры labtek и трансфицировали 1 мкг плазмид TOPflash и FOPflash отдельно. Для контроля эффективности трансфекции использовали контрольную плазмиду Renilla (Promega). Фиг. 13 представляет собой микрофотографии, показывающие стимуляцию TCF/LEF-1-опосредованной транскрипции в течение 21 дня после трансфекции наночастицами, содержащими плазмиды, кодирующие SOST-направленные TALEN, в соответствии с настоящим изобретением, согласуясь со стимуляцией экспрессии TCF/LEF-1 и активностью после трансфекции наночастицами по изобретению.
Выключение экспрессии SOST в соответствии с настоящим изобретением также может увеличивать минерализацию в стромальных клетках костного мозга и остеобластах. Минерализацию оценивали количественно двумя отдельными методами, первый на основе сравнения с порогом визуализации меченных ксиленолом оранжевым живых культур с использованием MATLAB (Mathworks, Natick, MA), и второй посредством атомной абсорбционной спектроскопии (AAS). Для порога ксиленола оранжевого изображения и фазы и флуоресценции (с набором Texas Red Filter) получали в пяти соседних участках ячеек, и затем переносили в большее 8-битное изображение (4x, Nikon Ti-100). Фазовый канал вычитали из флуоресценции, и порог устанавливали до половины уровня между исходным и сигналом (-6 дБ). Количество пикселей выше порога подсчитывали и использовали для выражения процента минерализованной площади в каждой ячейке. Комбинация фазы и флуоресценции позволяет различить несвязанный ксиленол оранжевый, тогда как применение уровня децибел позволяло скорректировать варьирующийся уровень основы в каждом изображении.
Минерализацию также количественно оценивали посредством атомной абсорбции с помощью спектрометра атомной абсорбции (AA-Perkin Elmer, MA). Каждую ячейку получали путем добавления 0,5 мл 10% азотной кислоты и полученное содержание кальция измеряли относительно стандартной кривой и сравнивали между группами. Старались минимизировать наложение из-за осаждения ионизированного кальция с фосфатной фазой, поэтому к каждой ячейке добавляли большой избыток ионов калия и лантана.
Фиг. 14A-14C показывают эффекты трансфекции наночастицами в соответствии с настоящим изобретением на минерализацию после выключения SOST. Фиг. 14A представляет собой микрофотографию окрашивания минерализованной матрицы, образующейся через 25 дней после выключения SOST. Стромальные клетки показаны в панелях A-C, где панель A показывает контрольные клетки, панель B показывает клетки, трансфицированные липофектамином, и панель C показывает клетки, трансфицированные наночастицами, содержащими плазмиды, кодирующие SOST-направленные TALEN, как описано и в соответствии с настоящим изобретением.
Клетки остеобласты MC3T3-E1 показаны на панелях D-G, где панель D показывает контрольные клетки, и панели E-G показывают клетки, трансфицированные наночастицами, содержащими плазмиды, кодирующие SOST-направленные TALEN, как описано, в дозах 800 нг, 1600 нг, и 2500 нг, соответственно, в соответствии с настоящим изобретением. Фиг. 14B и 14C представляют собой графики, показывающие количественную оценку минерализации. Фиг. 14 A-C демонстрируют повышенную концентрацию кальция в стромальных клетках костного мозга и остеобластах после трансфекции SOST-нацеливающими TALEN посредством наночастиц в соответствии с настоящим изобретением, дополнительно подтверждая эффективность указанной методики модификации клеточной экспрессии и активности генов и нижележащих сигнальных путей.
Тогда как были описаны и отражены в настоящем описании несколько аспектов настоящего изобретения, альтернативные аспекты могут быть осуществлены специалистом в области техники для осуществления тех же задач. Соответственно, предназначено, чтобы приложенная формула изобретения охватывала все такие альтернативные аспекты, как попадающие в истинную сущность и объем изобретения.