ТЕСТ-СИСТЕМА "КАРДИОБСЖК" ДЛЯ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕРДЕЧНОГО БЕЛКА, СВЯЗЫВАЮЩЕГО ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ В ОБРАЗЦЕ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ ДЛЯ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ИНФАРКТА МИОКАРДА

Полезная модель относится к устройствам для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты для экспресс-диагностики инфаркта миокарда и может быть использовано в биотехнологии, иммунологии и здравоохранении.
Заявляемая тест-система предназначена для одностадийного выявления in vitro сердечного белка, связывающего жирные кислоты (сБСЖК) в цельной венозной крови. Она служит вспомогательным средством при постановке диагноза острого коронарного синдрома (ОКС) и предназначен для использования специалистами здравоохранения.
Сердечный БСЖК - кардиоспецифический цитоплазматический низкомолекулярный белок (15 кДа), в большом количестве содержащийся в кардиомиоцитах, осуществляет связывание и транспортировку жирных кислот внутри клетки и при некрозе миокарда быстро попадает в кровоток.
Впервые предложение использовать сБСЖК в качестве маркера ОКС было предложено немецким ученым J.Glatz и соавт. около 10 лет назад. Достоинством сБСЖК является высокая кардиоспецифичность вследствие максимальной концентрации сБСЖК именно в ткани миокарда. Единственная мышца, в которой имеется относительно большое количество сБСЖК, - это диафрагма (примерно 25% от содержания в ткани миокарда). В скелетной мускулатуре сБСЖК представлен в незначительном количестве.
Сердечный БСЖК является ранним маркером некроза миокарда, он обладает сходной с миоглобином кинетикой, однако имеет большую специфичность. Диагностически значимое повышение уровня сБСЖК наблюдается через 1 час от начала болевого синдрома. Уровень сБСЖК в крови достигает максимальных значений через 6 часов после повреждения миокарда и возвращается к нормальному значению через 12-16 ч. Количество сБСЖК в крови увеличивается пропорционально обширности и глубине зоны инфаркта, и достигает уровня более 200-300 нг/мл при верхней границе нормы 15 нг/мл. Таким образом, кардиомаркер сБСЖК является наиболее ранним из всех маркеров некроза миокарда, что особенно актуально учитывая стремительность событий, развивающихся при ОКС и высокий уровень неблагоприятных исходов именно первые его сутки. Тест-система по определению сБСЖК оказывает существенную помощь в диагностике ОКС, особенно в ситуациях с нетипичной клинической картиной и отсутствием значимых диагностических изменений электрокардиограммы. Кроме того, повышение уровня сБСЖК является предиктором неблагоприятный событий у больных с ОКС (инфаркт миокарда и сердечно-сосудистая смерть) в течение 1 года.
Определение содержания сБСЖК в крови больных с подозрением на ОКС с целью раннего выявления некроза миокарда рекомендовано решением ежегодного конгресса Европейского кардиологического общества в 2000 г.
Известно устройство для хроматографического анализа для обнаружения аналита в образце (патент РФ №2124729, МПК G01N 33/53, опубл. 10.01.1999 г.) / Устройство включает в себя: (1) по меньшей мере, два строго плоских противоблока, один из которых содержит на своей поверхности хроматографическую среду; и (2) средство для установки противоблоков друг против друга и приложения туда давления, достаточного для переноса жидкости с одного противоблока на другой в направлении строго перпендикулярном к противоблоку с целью нанесения образца на хроматографическую среду для обнаружения и/или определения вслед за тем аналита. Устройство может также включать: (1) по меньшей мере три строго плоских противоблока, отличающихся тем, что один из них содержит на своей поверхности хроматографическую среду, имеющую первый и второй концы; (2) средство для установки противоблоков друг против друга, по меньшей мере, в двух различных комбинациях и приложения туда давления, достаточного для переноса жидкости с одного противоблока к другому в направлении строго перпендикулярном к противоблокам так, что образец прикладывается к хроматографической среде и перетекает через нее от первого конца ко второму концу для обнаружения и/или определения аналита на хроматографической среде; и (3) по меньшей мере один аппликатор и один абсорбер, локализованные на одном из противоблоков и расположенные таким образом, что когда противоблок с аппликатором и абсорбером на нем устанавливается напротив противоблока, содержащего хроматографическую среду, на последнюю наносится вторая жидкость, которая перетекает через нее от второго конца к первому, вследствие чего направление движения потока через хроматографическую среду изменяется на обратное, с целью обнаружения и/или определения аналита, осуществляемого после реверса потока через хроматографическую среду.
Однако данное устройство имеет достаточной сложную конструкцию, включает в себя источник повышенного давления для обеспечения прохождения жидкого образца вдоль пористых его элементов, а также не содержит компонентов для обеспечения обнаружения сБСЖК в образцах крови.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является тест-система для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты для экспресс-диагностики инфаркта миокарда (патент Китая №1704757, МПК G01N 33/558, опубл. 07.12.2005 г.), содержащая иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены фильтрационная подушка для нанесения исследуемого образца крови, подушка для нанесения конъюгата, пористая мембрана и абсорбционная подушка, причем подушка для нанесения конъюгата пропитана конъюгатом частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, на пористой мембране, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела и контрольная полоса, содержащая адсорбированные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши. Кардиомаркер сБСЖК присутствует в крови здоровых людей. Индивидуальная норма содержания белка варьирует от 5 до 15 нг/мл. Диагностически значение (уровень патологических значений) сБСЖК варьирует от 10 до 20 нг/мл. В результате таких особенностей белка возникает неспецифическое выявления маркера.
В этой связи предлагаемый в прототипе иммунохроматографический тест позволяет выявлять сБСЖК в количестве 5 нг/мл, т.е. обладает слишком высокой чувствительностью, что приводит к появлению большого количества ложноположительных результатов и, как следствие, к низкой специфичности и низкой точности теста, что позволяет применять их лишь в качестве ориентировочного теста.
Техническим результатом предлагаемой полезной модели является снижение количества ложноположительных результатов путем повышения специфичности и точности теста.
Указанный технический результат достигается тем, что в тест-системе для иммунохроматографического определения сердечного белка, связывающего жирные кислоты для экспресс-диагностики инфаркта миокарда, содержащем иммунологическую планшету с окном для внесения образца и окном для просмотра результатов, внутри которой размещена подложка для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены фильтрационная подушка для нанесения исследуемого образца крови, подушка для нанесения конъюгата, пористая мембрана и абсорбционная подушка, причем подушка для нанесения конъюгата пропитана конъюгатом частиц коллоидного золота с первыми моноклональными мышиными антителами, специфичными к сердечному белку, связывающему жирные кислоты, на пористой мембране, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы тестовая полоса, содержащая адсорбированные вторые моноклональные мышиные антитела и контрольная полоса, содержащая адсорбированные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши, согласно полезной модели, на пористой мембране, поперек последней сформирована конкурирующая полоса, расположенная вдоль края подушки для нанесения конъюгата и содержащая слой адсорбированных первых моноклональных мышиных антител, специфичных к сердечному белку, связывающему жирные кислоты.
2
Подушка для нанесения конъюгата выполнена из целлюлоза или стеклянного микроволокна, или полиэфирного микроволокна с размером пор 20-25 мкм и абсорбционной емкостью не менее 55 мг/см.
2
Фильтрационная подушка выполнена из пористого материала полисульфона с толщиной слоя 600-650 мкм и объемом пор 55-57 мкл/см.
Пористая мембрана выполнена из нитроцеллюлозы, или полиэфирсульфона, или нейлона с толщиной слоя 125-155 мкм и
Абсорбционная подушка выполнена из пористого материала хлопкового пуха, или стеклоцеллюлозного волокна с толщиной слоя 400-450 мкм.
Подложка для ламинирования выполнена из полистирола или акрилового адгезивного материала с толщиной слоя 230-270 мкм.
Указанные технические характеристики элементов тест-системы позволяют надежно функционировать, снижать количество ложноположительных результатов путем повышения специфичности и точности теста.
На фиг.1 приведена схема внешнего вида тест системы, выполненной в виде иммунологической планшеты, а на фиг.2 - схема расположения внутренних элементов тест-системы в иммунологической планшете.
Тест-система «КардиоБСЖК» для проведения ммунохроматографического анализа содержит иммунологическую планшету 1 с овальным окном 2 для внесения образца и прямоугольным окном 3 для просмотра результатов. Внутри иммунологической планшеты 1 размещена подложка 4 для ламинирования пористых материалов, на которой последовательно по длине и внахлестку расположены фильтрационная подушка 5 для нанесения исследуемого образца цельной венозной крови, подушка 6 для нанесения конъюгата, пористая мембрана 7 и абсорбционная подушка 8. Подушка 6 пропитана конъюгатом частиц коллоидного золота с моноклональными мышиными антителами F9, специфичными к БСЖК. На пористой мембране 7, поперек последней и параллельно друг другу, сформированы конкурирующая полоса 9, расположенная вдоль края подушки 6 и содержащая адсорбированные моноклональные мышиные антитела F9, специфичные к сБСЖК, тестовая полоса 10, содержащая адсорбированные моноклональные мышиные антитела F10 и контрольная полоса 11, содержащая адсорбированные кроличьи антитела против иммуноглобулинов мыши.
Конструкция иммунологической планшеты 1 обеспечивает контакт подушек 5 и 6, пористой мембраны 7 и абсорбционной подушки 8 друг с другом и позволяет образцу крови, свободно проходить все пористые материалы за счет действия капиллярных сил.
В таблице 1 приведена характеристика материалов, из которых изготовлены элементы тест-системы.
Таблица 1.Характеристика материалов тест-системы
Наименование элемента тест-системы
состав материалов
характеристики материалов
Подушка 6 для нанесения конъюгата
целлюлоза или стеклянное микроволокно; или полиэфирное микроволокно;
- размер пор 22 мкм;
- абсорбционная емкость 55 мг/см<sup>2</sup>;
- высвобождение конъюгата (спустя 90 сек) 89%;
Фильтрационная подушка 5
пористый материал из полисульфона
- толщина слоя 628 мкм;
- объем пор 56,8 мкл/см<sup>2</sup>;
Пористая мембрана 7
нитроцеллюлоза или полиэфирсуль-фон, или нейлон, или поливинилиденхлорид на полистирольной подложке
- толщина слоя мембраны 125-155 мкм;
- толщина подложки 100 мкм;
- скорость потока образца 110-165 сек/40 мм;
Абсорбционная подушка 8
пористый материал из хлопкового пуха, или стеклоцеллюлозное волокно
- толщина слоя 429 мкм;
- сухой вес 12,4 мг/см<sup>2</sup>;
Подложка 4 для ламинирования
белый полистирол или акриловый адгезивный материал.
- толщина подложки 254 мкм +/-10%;
Заявляемая тест-система «КардиоБСЖК» работает следующим образом.
Вносимый образец цельной крови через овальное окно 2 планшеты 1 впитывается фильтрационной подушкой 5 (фиг.1). Далее при прохождении через пористую подушку 6 под действием капиллярных сил сБСЖК образца крови взаимодействует с конъюгатом частиц коллоидного золота и первых моноклональных антител F9, нанесенным на подушку 6 (фиг.2). В результате образуется окрашенный иммунный комплекс антиген-антитело. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозной мембраны 7, пересекает конкурирующую полосу 9 и взаимодействует с нанесенными на ней адсорбированными моноклональными мышиными антителами F9, специфичными к сБСЖК. Функция данной полосы 9 - снижение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл за счет конкурентного связывания сБСЖК с моноклональными антителами F9, иммобилизованными на этой линии. Поскольку диагностически значимым считается повышение уровня сБСЖК в крови до 15 нг/мл, то уменьшение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл приводит к увеличению специфичности при сохранении необходимого уровня диагностической чувствительности. Далее иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозной мембраны 7, пересекает тестовую полосу 10 и взаимодействует с иммобилизованными на указанной тестовой полосе 10 вторыми моноклональными мышиными антителами F10. В результате при наличии сБСЖК в образце крови выше порогового значения тестовая полоса 10 окрашивается в пурпурный цвет. Это видно через прямоугольное окно 3 планшеты 1. Если образец крови не содержит сБСЖК в концентрации выше пороговой, тестовая полоса 10 остается не окрашенной. Далее не связавшийся на тестовой полосе 10 конъюгат движется далее вдоль нитроцеллюлозной мембраны 7 и неизбежно взаимодействуют с иммобилизованными на контрольной полосе 11 кроличьими антителами к иммуноглобулинам мыши. В результате контрольная полоса 11 также окрашивается в пурпурный цвет (вторая окрашенная полоса). Контрольная полоса 11 является внутренним контролем теста и, если анализ проведен правильно, должна проявляться всегда, независимо от присутствия сБСЖК в образце крови.
Результаты определяются визуально в течение 5-30 минут. При положительном результате тестирования появляются две окрашенные полосы - тестовая и контрольная. Интенсивность цвета контрольной и тестовой полос может быть различной.
При отрицательном результате появляется только одна полоса 11 - контрольная. Если контрольная полоса 11 не проявилась, результаты теста считаются недействительными.
Данные исследований, подтверждающие достижение технического результата. Являясь эффективным средством диагностирования, экспресс-тесты позволяют визуально в течение нескольких минут определить и оценить содержание антигенов.
Качество работы теста и, соответственно показатели чувствительности и специфичности, зависят от качества используемых в тесте моноклональных антител и индивидуальных особенностей исследуемого маркера. Как отмечалось выше, кардиомаркер сБСЖК присутствует в крови здоровых людей. Индивидуальная норма содержания белка варьирует от 5 до 15 нг/мл. Диагностически значение (уровень патологических значений) сБСЖК и варьирует от 10 до 20 нг/мл. В результате таких особенностей белка возникает неспецифическое выявления маркера.
В наиболее близком аналоге (прототипе) иммунохроматографический тест включает нанесение на мембрану 2 полос - тестовую и контрольную и она позволяет выявлять 5 нг/мл. Эта модель теста обладала высокой чувствительностью, что приводит к появлению большого количества ложноположительных результатов и, как следствие, к низкой специфичности и низкой точности теста.
Однако, при использовании теста для экспресс-диагностики высокая чувствительность не всегда необходима, что позволяет применять их лишь в качестве ориентировочного теста.
Так по результатам исследования на 150 пациентов с подозрением на некроз миокарда с использованием данной конструкции теста (прототипа заявляемого объекта) имеются следующие диагностические показатели, представленные в таблице 2.
Таблица 2.Данные диагностических показателей тест-системы-прототипа
Время, часы
1-3
3-6
6-12
Больше 12
Тест-прототип с нанесенными двумя полосами антител
Чувствительность
92
95
100
87
Специфичность
64
72
72
69
Точность
74
78
85
80
Диагностические показатели рассчитывались по формулам:
Чувствительность -
TPR=TP/(TP+FN);
Специфичность -
SPC=TN/(FP+TN);
Точность -
ACC=(TP+TN)/N,
где ТР достоверно положительный результат,
FN достоверно отрицательный результат,
FP ложноположительный результат
FN ложно отрицательный результат
N количество всех пациентов
Для устранения недостатков тест-системы прототипа была использована дополнительная (конкурирующая) полоса 9 (фиг.2), расположенная перед тестовой полосой 10. Функция данной полосы 9 - снижение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл за счет конкурентного связывания БСЖК с моноклональными антителами F9, иммобилизованными на этой полосе 9. Поскольку диагностически значимым считается повышение уровня БСЖК в крови до 15 нг/мл, то уменьшение аналитической чувствительности теста до 15 нг/мл приводит к увеличению специфичности при сохранении необходимого уровня диагностической чувствительности. Действительно, применение дополнительной конкурирующей полосы 9 позволило значительно уменьшить количество ложноположительных результатов, при этом, не увеличивая количество ложноотрицательных и, таким образом, при сохранении прежнего уровня диагностической чувствительности была увеличена специфичность и, как следствие, точность теста. В таблице 3 приведены данные диагностических показателей заявляемой тест-системы, которые подтверждают заявляемый технический результат.
Таблица 3.Данные диагностических показателей заявляемой тест-системы
Время, часы
1-3
3-6
6-12
Больше 12
Заявляемая тест система
Чувствительность
88
93
100
90
Специфичность
90
92
95
91
Точность
82
87
97
90