Способ получения микрокапсулированного энзимспорина
METHOD FOR PRODUCING MICROCAPSULATED ENZYMESPORIN

Изобретение относится к области биотехнологии и ветеринарной медицине и может быть использовано, в частности, для получения микрокапсулированных пробиотических препаратов.
В настоящее время часто применяется микрокапсулирование биологически активных веществ, в том числе и пробиотиков. Микрокапсуляция пробиотиков предохраняет их разрушение в кислой среде желудка и обеспечивает непосредственное поступление в кишечник, где они активно размножаются и оказывают положительное действие на обмен веществ как на местном уровне, так и на метаболизм в целом. В этой связи разработка новых способов микрокапсулирования пробиотических препаратов является актуальной задачей.
Существует способ получения микрокапсулированных форм лактобактерий, характеризующийся тем, что лиофилизированную культуру микроорганизмов диспергируют в водной суспензии сополимера акриловой и метакриловой кислот. Полученную суспензию впрыскивают в жидкий сверхлегкий парафин, минеральные масла, легкие растительные масла, содержащие 0,1-0,5% стеарата алюминия и 3-7% ПЭГ-400 (полиэтиленгликоля), гомогенизируют до образования эмульсии с частицами желаемого размера и оставляют при постоянном нагревании и перемешивании 100-300 об/мин до формирования микрокапсул (Патент РФ №2171672, 2000 г., авт В.А. Быков и др.). Недостатком указанного способа является многоэтапность и длительность процесса.
Известен способ получения микрокапсул, содержащих живые микроорганизмы, который характеризуется тем, что лиофилизированную культуру микроорганизмов диспергируют в 30-50% водном растворе поливинилпирролидона в соотношении 1:1-1:15 по массе при перемешивании до образования устойчивой взвеси. Затем прибавляют 10-30%-ный водный раствор танина и перемешивают до образования капсул (Патент РФ №2220716, 2014 г., авт. Д.В. Сомов, А.И. Воронкова, Т.В. Максимова). Недостатком данного способа является длительность процесса микрокапсулирования и относительно большие потери микроорганизмов в ходе данного процесса.
Существует способ инкапсуляции лактобифадола в оболочку из натрий карбоксиметилцеллюлозы, который заключается в том, что лактобифадол смешивают с диоксаном, или диметилсульфоксидом, или диметилформамидом. Затем полученную смесь вносят в раствор натрий-карбоксиметилцеллюлозы в серном эфире в присутствии препарата Е472 с при перемешивании 1000 об/сек. При этом лактобифадол и натрий карбоксиметилцеллюлозу берут в массовом соотношении 1:3, затем добавляют 1,0 мл дистиллированной воды и полученную суспензию отфильтровывают и сушат. Процесс получения микрокапсул лактобифадола осуществляют при 25°С в течение 20 мин (Патент РФ №2545742, 2015 г., авт. А.А. Кролевец, И.А. Богачев).
Известен способ инкапсуляции интестевита, принцип которого заключается в том, что 100 г пробиотика интестевита растворяют в 1 мл диоксана, или диметилсульфоксида, или диметилформамида, диспергируют полученную смесь в растворе натрий карбоксиметилцеллюлозы в ацетоне, содержащий 300 мл указанного полимера, в присутствии 0,01 препарата Е472 с при перемешивании. Затем приливают 1 мл дистиллированной воды и полученную суспензию отфильтровывают и сушат (Патент РФ №2544169, 2015 г., авт. О.Б. Сеин, Д.В. Трубников, А.А. Кролевец, А.Г. Николаенко).
Известен способ получения нанокапсул пробиотиков в альгинате натрия, характеризующийся тем, что в качестве оболочки капсул используется альгинат натрия, который осаждают из суспензии в бензоле в присутствии сложного эфира глицерина с одной-двумя молекулами пищевых жирных кислот и одной-двумя молекулами лимонной кислоты путем добавления гексана в качестве осадителя. При этом массовое соотношение пробиотика и альгината натрия составляет 1:3 или 5:1 (Патент РФ №2595830, 2016 г., авт. А.А. Кролевец, О.Б. Сеин, И.А. Богачев).
Известен способ получения нанокапсул пробиотиков в альгинате натрия, который характеризуется тем, что в качестве оболочки используется альгинат натрия, а в качестве ядра - пробиотики, которые осаждают из суспензии в гексане в присутствии сложного эфира глицерина с одной-двумя молекулами пищевых жирных кислот и одной-двумя молекулами лимонной кислоты путем добавления хладона - 112 в качестве осадителя, при этом массовое соотношение пробиотика: альгината натрия составляет 1:1 (Патент РФ №2715743, 2019 г., авт. А.А. Кролевец).
Общим недостатком способов микрокапсулирования пробиотиков, представленных в патентах №2545742, №2544169, №2595830, №2715743, является использование в технологическом процессе веществ (ацетон, бензол, гексан, диоксан, диметилсульфоксид, диметилформамид, серный эфир), обладающих токсичностью и оказывающих отрицательное действие на жизнеспособность пробиотических бактерий.
В качестве прототипа выбран способ микрокапсуляции энзимспорина (Патент РФ №2689164, 2018 г., авт. Трубников Д.В., Сеин О.Б., Горобец А.Ю., Трубникова Е.А.). Сущность данного способа заключается в том, что 1,0 г пробиотика энзимспорина диспергируют в суспензию 3,0 г альгината натрия в 100 мл дистиллированной воды при перемешивании 800-1000 об/мин. Затем проводят осаждение путем добавления 100 мл 50%-ного ацетона в присутствии 25 мл 0,2 М раствора хлорида кальция при постоянном перемешивании в течение 15-20 мин. Отвержденные микрокапсулы фильтруют на фильтре Шотта и высушивают при 30-35°С.
Недостатком способа, взятого за прототип, является:
- использование гексана в качестве осадителя, который оказывает отрицательное влияние на жизнеспособность пробиотических бактерий;
- получение микрокапсул с большим различием в размерах (80-150 мкм), что оказывает отрицательное влияние на биологические свойства изготовленного препарата.
Технической задачей изобретения является повышение биологической устойчивости микрокапсулированного препарата к кислой среде желудка, снижение потерь пробиотических бактерий в процессе микрокапсулирования, получение микрокапсул более стабильных размеров.
Решение технической задачи достигается тем, что в 50 мл очищенной воды вносят 5,0 г пробиотика энзимспорина и 4,0 г активированного угля и смешивают до однородного состояния. В полученную суспензию добавляют равное количество 5%-ного раствора альгината натрия, перемешивают и с использованием специального устройства-дозатора авторской конструкции (Патент РФ №194572. -2019 г., авт. О.Б. Сеин и др.) диспергируют с высоты 20-25 см в 150-200 мл в 0,2 М раствор кальция хлорида. Процесс диспергирования проводят при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 50-60 об/мин в течение 20-25 мин до образования постоянных взвесей. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяют фильтрованием и помещают в 0,4-0,5%-ный раствор хитозана, в котором и выдерживают 50-60 мин. Полученные микрокапсулы отделяют на фильтре Шотта, промывают очищенной водой и высушивают при 30-35°С. Выход готовых капсул составляет 94,0%. Размеры микрокапсул составляют 0,55-0,75 мм.
Отличительной особенностью разработанного способа получения микрокапсул пробиотика энзимспорина является:
- применение для диспергирования суспензии, включающей энзимспорин, активированный уголь и альгинат натрия; специального устройства-дозатора, имеющего 8 капельниц, что позволяет получать микрокапсулы более стабильных размеров и ускоряет процесс микрокапсулирования;
- использование дополнительной обработки сформировавшихся микрокапсул энзимспорина в 0,4-0,5%-ном растворе хитозана, что повышает устойчивость микрокапсул из альгината натрия в кислой среде желудка.
9
Применяемый в способе пробиотик энзимспорин (компания «Албиотех», Россия), представляет собой консорциум бактерий рода Bacillus, содержание жизнеспособных спор в препарате не менее 5-10 КОЕ/г.Используется энзимспорин для снижения у животных уровня колонизации кишечника условно патогенными микроорганизмами, нормализации биоценоза кишечника, повышения усвоения питательных веществ кормов.
Альгинат натрия относится к полисахаридам, широко используется в медицине. В пищевой промышленности он применяется в виде добавки Е401, как загуститель и стабилизатор. Получают альгинат натрия из бурых или красных водорослей.
Хитозан является производным линейного полисахарида, получают его из хитина ракообразных. Благодаря своей катионной природе, хитозан способен образовывать полиэлектролитные комплексы с анионными полимерами, что широко используется в технологии капсулирования.
Результатом предлагаемого способа является получение микрокапсул энзимспорина в альгинате натрия с выходом микрокапсул 94%, имеющих стабильные размеры, устойчивых к кислой среде желудка и разрушающихся в щелочной среде кишечника с беспрепятственным поступлением содержимого капсул в его полость.
Пример получения микрокапсул энзимспорина. В 50 мл очищенной воды вносили 5,0 г пробиотика энзимспорина и 4,0 г активированного угля и смешивали до однородного состояния. В полученную суспензию добавляли равное количество 5%-ного раствора альгината натрия, перемешивали и с использованием специального устройства-дозатора диспергировали с высоты 20 см в 150 мл 0,2 М раствора кальция хлорида. Устройство для микрокапсулирования жидких веществ включает шприц-дозатор и капельницы, расположенные по кругу. Капельницы вмонтированы в капельницедержатель, выполненный в виде полихлорвиниловой трубки, имеющей форму кольца, который соединяется трубкой со шприцем-дозатором, обеспечивающим подачу микрокапсулируемого вещества в капельницедержатель, при этом капельницедержатель фиксируется внутри стакана гомогенизатора через боковое отверстие в верхней части стакана. Процесс диспергирования проводили при постоянном перемешивании со скоростью вращения мешалки 60 об/мин в течение 20 мин до образования постоянных взвесей. Сформировавшиеся микрокапсулы отделяли фильтрованием и помещали в 0,5%-ный раствор хитозана, в котором выдерживали их в течение 60 мин. Полученные микрокапсулы отделяли на фильтре Шотта, промывали очищенной водой и высушивали при 30-35°С. Полученные микрокапсулы представляют собой сферические частицы светло-желтого цвета размером от 0,55 до 0,75 мм. Выход готовых микрокапсул составил 94%.
Физико-химические свойства микрокапсул энзимоспорина, полученных с использованием разработанного способа и способа-прототипа, определяли в двух экспериментах.
Первый эксперимент был посвящен изучению влияния водной среды на структуру микрокапсул. Результаты эксперимента показали (табл. 1), что микрокапсулы энзимспорина, полученные разработанным способом и с использованием способа-протипа, после 60-минутного нахождения в очищенной воде сохраняли свою структуру. Однако, если микрокапсулы энзимспорина, полученные разработанным способом, органолептически определялись как плотные и упругие образования, то у микрокапсул, полученных с использованием способа-прототипа, оболочка была мягкой и набухшей.
Во втором эксперименте изучали влияние желудочной и кишечной среды на структуру микрокапсул. Эксперименты были проведены в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи РФ (М.: Науч. Центр экспертизы средств мед. применения, 2008. - Вып. 1. - 704 с.), согласно которым кишечнорастворимые лекарственные формы не должны распадаться в течение 60 минут в растворе кислоты хлористоводородной (0,1 М) и после промывания водой должны распадаться в растворе натрия гидрокарбоната (рН 7,5-8,0) в течение 60 мин.
В ходе проведенных исследований было установлено (табл. 2), что микрокапсулы, полученные по разработанному способу, сохраняли свою структуру как в физиологическом растворе, так и в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты. Микрокапсулы препарата-прототипа после контакта с хлористоводородной кислотой приобретали мягкую консистенцию, некоторые микрокапсулы подвергались частичному разрушению.
Бактериологические свойства полученного микрокапсулированного препарата и препарата-прототипа исследовали в ОБУ «Курская областная ветеринарная лаборатория». Для определения содержания пробиотических микроорганизмов, входящих в состав препаратов, использовали оптический метод (по стандартам мутности) и камеру Горяева. При анализе количества жизнеспособных клеток исследуемых микроорганизмов разрушали оболочку микрокапсул фосфатным буфером с рН 7,8-8,0. Затем культуру титровали и высевали пробиотические бактерии на питательную среду. В качестве контроля использовали стандартную культуру в соответствующих разведениях.
4
4
4
4
Результаты проведенных бактериологических исследований показали, что количество жизнеспособных бактерий в изготовленном препарате составляло 5,2⋅10-5,5⋅10 в 1 г, а в препарате-прототипе 4,0⋅10-4,8⋅10клеток.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанный способ позволяет получить микрокапсулированный пробиотический препарат энзимспорин с более выраженными биологическими свойствами по сравнению с препаратом-прототипом.