СИСТЕМА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЙ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

Предлагаемая полезная модель относится к области научных исследований и может быть использована в биологии, медицине и пр. для микроскопического изучения действия экспериментальных стимулов на свойства биологических объектов. Система была разработана сотрудниками Института физиологии им. И.П.Павлова РАН при проведении фотометрических исследований переживающих срезов мозга лабораторных животных.
При постановке экспериментов на биологических объектах во время их исследований на молекулярно-клеточном уровне нередко возникает необходимость зависимого от времени сканирования объектов. В области биохимических исследований эта задача обычно решается с использованием планшетных сканеров или сканирующих зондовых микроскопов, имеющих достаточно узкий диапазон возможностей программирования перемещений. Однако, для исследований гетерогенных биологических препаратов таких, например, как переживающие срезы мозга эти устройства неприемлемы, поскольку в пределах одного препарата могут располагаться морфологически или функционально различные участки, дающие принципиально разные ответы на экспериментальные воздействия.
Такие задачи в лабораторных условиях, как правило, решаются ручным перемещением препарата, при котором в центр поля зрения микроскопа выставляются поочередно выбранные предварительно интересующие исследователя зоны. Такое позиционирование препарата требует значительного времени для проведения каждого цикла сканирования. При исследовании реакций живых или переживающих объектов на экспериментальные воздействия цикл сканирования одних и тех же выбранных зон необходимо повторять многократно для выявления кинетики процесса. Описанный ручной способ не позволяет безошибочно воспроизводить режим сканирования при последующих циклах, ограничивает количество выбираемых зон и усложняет и замедляет процесс. В частности, повторное позиционирование на выбранных зонах может происходить с ошибками, поскольку экспериментатору приходится держать в памяти несколько морфологических ориентиров для каждой из зон препарата.
Для усовершенствования процесса перемещения препарата систему позиционирования было предложено дополнить манипуляторами перемещений и выносной координатной сеткой с нанесенной на ней индивидуальными реперами текущего эксперимента [1], [2]. Однако это решение не позволило получить существенного улучшения результата, так как по-прежнему ограничивало точность и скорость позиционирования.
Использование известных автоматизированных устройств [3], [4], [5] также не решило задачу оперативного и многопланового проведения исследовательских работ с биологическими объектами. Так, кинематическое устройство для прецизионного перемещения объекта [3] достаточно точно для задач микроскопии, но не обладает возможностью для программного перемещения, а также контроля и коррекции ошибки позиционирования.
Устройство для перемещений объекта [4], обеспечивающее высокую точность микроперемещений за счет демпфирования затухающих колебаний, обладает малым диапазоном перемещений и решает скорее задачи коррекции вибраций, силы трения и пр. в нанотехнологических измерениях неровных поверхностей и туннельной микроскопии, но не позволяет перемещаться между несколькими микрообъектами.
Устройство для перемещения зонда сканирующего микроскопа-нанолитографа в поле грубого X-Y позиционера [5], предназначенное для повышения точности и линейности позиционирования зонда на большой площади поверхности образца за счет использования взаимодополняющих грубой и точной систем X-Y перемещений, обладает избыточной технологической сложностью и высокой ценой для решаемых физиологических задач.
Из известных решений по технической сущности и назначению наиболее близким аналогом к предлагаемому устройству является система, описанная в [1]. Система для молекулярно-клеточных исследований биологических объектов, выбранная за прототип заявляемой полезной модели, содержит контактный микроскоп с осветительной системой, фотометр, вход которого соединен с оптическим каналом микроскопа, а выход с компьютером, препаратоводитель, выполненный с возможностью перемещения по осям X-Y, и установленную в препаратоводителе инкубационную камеру с размещенным в ней исследуемым объектом. Для определения и запоминания зоны исследования предусмотрена выносная координатная сетка с нанесенными на ней реперными точками.
Описанная система работает следующим образом.
Инкубационная камера, в корпусе которой фиксируется исследуемый биообъект, устанавливается и крепится на столике препаратоводителя. Движение столика по оси X производится возвратно-поступательно по дуге окружности между двумя выбранными точками, перемещение по радиальной оси Y - за счет регулирования положения верхней оптической части микроскопа его штатным винтом. Грубое позиционирование по X производится манипулятором по вынесенной координатной сетке с предварительно нанесенными на ней реперными точками текущего эксперимента. Точное позиционирование осуществляется под визуальным контролем через окуляр микроскопа на ограниченном количестве запомненных экспериментатором исследуемых участках. Освещение ксеноновой лампой, имеющей ультрафиолетовую составляющую для возбуждения флуоресценции специфического красителя, производится в постоянном режиме, при этом предъявляются требования к минимизации времени возбуждения флуоресценции и ее детекции. Между циклами измерений объектив, через который происходит освещение, устанавливается в нейтральное положение, в котором отсутствует исследуемый объект.
Недостатком прототипа, как указывалось выше, является значительная продолжительность и сложность проведения исследований биологических объектов на молекулярно-клеточном уровне при недостаточной точности получаемых результатов.
Заявляемое устройство позволяет получить новый по сравнению с прототипом технический результат, заключающийся в сокращении времени и упрощении процедуры проведения исследований на молекулярно-клеточном уровне при одновременном увеличении точности получаемых данных. Для достижения указанного технического результата используется следующая совокупность существенных признаков:
Система для исследований биологических объектов, (содержащая, так же как прототип, контактный микроскоп с осветительной системой, фотометр, вход которого соединен с оптическим каналом микроскопа, а выход с компьютером, препаратоводитель, выполненный с возможностью перемещения по осям X-Y, и установленную в препаратоводителе инкубационную камеру с размещенным в ней исследуемым объектом,) в отличие от прототипа, дополнительно снабжена подключенной к компьютеру фотокамерой, смонтированной на микроскопе через второй оптический канал, механизмами перемещений в виде шаговых двигателей, соединенными кинематически с препаратоводителем, при этом входы механизмов перемещения подключены через контроллер к выходам персонального компьютера, снабженного программой, включающей формирование траектории перемещений и остановок, видео захвата и сравнения изображений, а также управления шаговыми двигателями с поддержкой регулирования скорости и шага перемещения.
Сущность предлагаемой полезной модели заключается в обеспечении возможности циклического перемещения биологического объекта или набора объектов под объективом микроскопа для последовательного позиционирования его (их) микроучастков на фокальной плоскости микроскопа в точках ее пересечения с оптической осью, единой для детектирующих и освещающих приборов.
При этом скорость и шаг перемещения между участками, задержки на них и задержки между повторяющимися циклами сканирования, а также точное воспроизведение траектории сканирования при всех циклах обеспечиваются повторяющейся последовательностью из набора базовых команд, заложенных в программном обеспечении системы и передаваемых на механизмы перемещения. В свою очередь фотокамера обеспечивает контроль точности позиционирования и, в случае необходимости, его автоматическую коррекцию через программный модуль координатной подстройки положения объекта.
Все перечисленное в целом позволяет с минимальной и фиксированной задержкой регистрировать молекулярно-клеточные процессы в нескольких зонах нескольких биологических объектов путем многократного повторения траектории сканирования; производить автоматизированное сканирование как по разным зонам одного объекта, отличающимся морфологически и (или) функционально, так и по идентичным зонам разных объектов, являющихся, например, пробами тканей из различных экспериментальных серий; контролировать позиционирование посредством on-line фотографирования микроучастков с параллельной программной коррекцией набегающей ошибки методом сравнения полученного кадра с опорным.
Сравнение предлагаемого устройства с прототипом показало, что поставленная задача - сокращение времени и упрощение процедуры проведения исследований биологических объектов при одновременном увеличении точности получаемых данных решается в результате новой совокупности признаков, что доказывает соответствие заявляемой полезной модели критерию патентоспособности «новизна».
Сущность технического решения поясняется чертежом, где на фиг.1 изображена блок-схема заявляемой системы.
В соответствии с представленной схемой система содержит: микроскоп 1 с контактным объективом 2, узел освещения или возбуждения флуоресценции 3, узел фотометрии 4, фотокамеру 5, персональный компьютер 6 с программным обеспечением, 2-х осевой контроллер 7 для управления шаговыми двигателями 8, 9, микровинты 10, инкубационную камеру 11, установленную на препаратоводителе с двумя подвижными в ортогональных направлениях плоскостями 12 и 13.
Предлагаемая система работает следующим образом.
Инкубационная камера 11, в корпусе которой, как и в прототипе, размещается и фиксируется исследуемый биообъект, устанавливается и крепится на столике препаратоводителя 12,13. Оптический свет по штатной оптической схеме микроскопа 1 проходит через УФ фильтр и контактным объективом 2 фокусируется на выбранную микрозону, лежащего в инкубационной камере 11 биологического препарата, а свет флуоресценции также через контактный микроскоп, распределяется по двум оптическим каналам регистрации: фотометр 4 и фотокамеру 5. Фотокамера 5, подключенная к компьютеру 6 через программу видео-захвата, позволяет наблюдать на мониторе компьютера 6 процесс оптической фокусировки, юстировки света и обеспечивать визуальный контроль позиционирования на выбранной зоне. Изменение положения препарата относительно оптической системы, а именно последовательное «подведение» зон в центр поля зрения, осуществляется перемещением подвижных плоскостей препаратоводителя 12 и 13 за счет работы шаговых двигателей 8 и 9, соединенных с микровинтами 10 препаратоводителя. Управление шаговыми двигателями 8,9 осуществляется через 2-х осевой контроллер 7, подключенный к компьютеру 6 через программу управления. Цикл измерений следует за выбором всех зон исследуемого препарата (ов) и программным запоминанием их координат. Зоны выбираются по контрастным реперным точкам координатной сетки. После выбора зон задается траектория (последовательность) перемещений между выбранными точками, или программа сама предлагает оптимизированную траекторию. Первый цикл основных измерений осуществляется по выбранной траектории с автоматизированными фазами регистрации фотометром 4 и фотокамерой 5 с заданными минимальными задержками, обеспечивающими плавный переход между зонами и минимизацию времени засветки каждой зоны. Фотокадры, сделанные в первый проход, служат опорными кадрами для программного расчета и коррекции кинематической набегающей ошибки позиционирования.
Последующие циклы измерений состоят из сканирования выбранных зон, в соответствии со следующим алгоритмом:
- программа управления контроллером, базируясь на выбранной траектории движения препаратоводителя, посылает соответствующие команды через контроллер на шаговые двигатели 8,9. Происходит смещение по осям X и Y;
- управление передается программе захвата фотоизображений, которая делает один кадр текущей зоны. Управление передается в основную программу, где опорный кадр сравнивается с текущим и рассчитывается ошибка позиционирования;
- с учетом рассчитанной ошибки позиционирования программа управления контроллером осуществляет микрокоррекцию положения препаратоводителя, с сохранением расчетных координат выбранной траектории;
- управление передается на программу, получающую данные от фотометра: делается фотометрическое измерение флуоресценции.
После этого цикл измерений продолжается переходом к следующей выбранной зоне.
После сканирования всех зон осуществляется пауза между циклами, в ходе которой объектив находится в нейтральной позиции, не допускающей засветки исследуемых зон. Каждый последующий цикл начинается с автоматического выставления под объектив первой (стартовой) зоны цикла. Такое автоматизированное сканирование зон обеспечивает скорость и точность измерений, что позволяет увеличить количество исследуемых областей препарата или количество препаратов, исследуемых одновременно.
Заявляемая полезная модель была создана в процессе проведения фотометрической оценки уровня связанного кальция на переживающих срезах мозга лабораторных животных в ответ на предъявление тестирующих реагентов, таких, как агонисты или антагонисты рецепторов нервных клеток.
Отличие предлагаемой системы от известных аналогов заключается, прежде всего, в том, что при задачах исследования микроучастков мозга (например, участков лежащих в разных зонах гиппокампа) их анализ проходит автоматически и покрывает макроповерхность одного или нескольких срезов лежащих рядом. Как показали проведенные лабораторные исследования, использование предлагаемой системы сокращает каждый цикл измерений в 5-10 раз, что в свою очередь позволяет при прежних затратах времени в 5-10 раз увеличить объем получаемых данных, а также упрощает статистическую их обработку, что, безусловно, актуально при современных темпах и объемах исследований.
В перспективе система может быть реализована в заводском исполнении и внедрена в научных и медицинских учреждениях, занимающихся микроскопическими исследованиями и проводящих гистологические анализы.
Источники информации:
[1] Семенов Д.Г. Двухкамерная подвижная инкубационная система для контактной микроскопии срезов мозга. Рос. физиол. журн. им. И.М.Сеченова 1999, 85(8): С.1121-1125.
[2] Semenov DG, Samoilov МО, Zielonka Р, Lazarewicz JW. Responses to reversible anoxia of intracellular free and bound Ca(2+) in rat cortical slices. Resuscitation: 2000; 44(3):C.207-14
[3] Заявка RU на изобретение №93026360, MПK H02N 2/00
[4] Патент RU №2359364, МПК H01L 41/00, В82В 1/00
[5] Патент RU №2181212, МПК G02B 21/32