ИТТЕРБИЕВЫЕ КОМПЛЕКСЫ ТЕТРАПИРАЗОЛИЛПОРФИРИНОВ КАК ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МЕТКИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ
YTTERBIUM TETRAPYRAZOLYL PORPHYRIN COMPLEXES AS FLUORESCENT TAGS TO DIAGNOSE MALIGNANT GROWTHS

Изобретение относится к химии металлоорганических комплексов, в частности к иттербиевым комплексам порфиринов (ИКП), которые могут быть использованы в экспериментальной онкологии, а именно при изучении малигнизации тканей у экспериментальных животных, что основано на способности соединений порфиринового ряда избирательно накапливаться в злокачественных клетках и затем люминесцировать при освещении светом определенной длины волны.
2
2
5/2
7/2
Известно [Соловьев К.Н., Цвирко М.П., Качура Т.Ф. / Внутримолекулярная миграция энергии в комплексах лантаноидов с порфиринами // Оптика и спектр. 1976. Т.40. №4. С.684-690], что комплексы порфиринов с иттербием обладают люминесценцией в ближней ИК-области спектра (960-1040 нм), соответствующей переходам F→F. В этой связи подобные ИКП представляют интерес для решения медицинских задач. Спектры люминесценции биологических объектов регистрируют в ближней ИК-области спектра (900-1050 нм). Здесь в области «терапевтического окна» практически отсутствует фоновая люминесценция биообъектов. Для иона иттербия характерна интенсивная узколинейчатая люминесценция и, в отличие от свободных оснований порфиринов, для ИКП практически отсутствует фотодинамический эффект и обусловленная им фототоксичность [Таубер А.Ю., Нижник А.Н., Миронов А.Ф., Гайдук М.И., Григорьянц В.В. / Фоофизическая активность порфириновых сенсибилизаторов в водных растворах // Биофизика. 1989. Т.34. №3. С.364-367].
В патенте США [Mody T.D., Galanter J. / Патент США №7112671, кл. МПК С07D 487/22, НКИ 540/145, опубл. 26.09.06] синтезированы водорастворимые металлокомплексы тексафиринов (расширенные порфирины с 5 атомами азота) с рядом лантаноидных элементов. В патенте США [Sessler J.L, Gregory W.H., Mody T.D. / Патент США №5994535, кл. МПК С07D 487/22, НПК 540/472, опубл. 30.11.1999]. Gd - комплексы тексафиринов использовали для ФДТ и ЯМР-томографии, а также испытывали их in vivo в дозе 10 мг/кг веса мышей и in vitro на культуре клеток. Вещества селективно накапливались в опухоли, и через 7 дней ее облучали.
В выложенной заявке ФРГ [Niedball U., Gries H., Conrad J. At al. / Заявка ФРГ №3809671, кл. МПК С07D 487/22, выложена 28.09.89] металлокомплексы порфиринов с лантаноидами, синтезированные на основе производных тетрафенилпорфирина и содержащие различные органические основания, аминокислоты или амиды аминокислот, предлагаются для ЯМР, рентгеновской, фото- и радиодиагностики и терапии.
Наиболее близким техническим решением, выбранным авторами за прототип, является патент РФ [Румянцева В.Д., Миронов А.Ф., Сапронова Е.В. и др. / Способ изучения малигнизации тканей у экспериментальных животных // Патент РФ №1621720, кл. МПК G01N 33/52, от 29.04.88], где в качестве контрастных веществ использованы иттербиевые комплексы 2,4-диметоксигематопорфирина IX, тетрасульфофенилпорфирина и 5,10,15,20-тетракис(4-карбоксифенил) порфирина. Недостатками этих комплексов являются относительно низкое время жизни люминесценции данных ИКП (не более 10 мкс), невысокая интенсивность люминенсценции и, как следствие, высокая доза (50 мг/кг веса) вводимого животным металлокомплекса порфирина.
Техническим результатом изобретения является создание новых соединений, используемых в качестве флуоресцентных меток для диагностики злокачественных новообразований, которые позволяют увеличить времена жизни и интенсивность люминесценции ИКП, снизить дозы вводимого препарата при сохранении высоких значений коэффициента контраста (отношение содержания порфирина в опухоли к содержанию порфирина в соседней здоровой ткани).
Для получения указанного технического результата в ряду заявляемых веществ в отличие от прототипа предлагается заменить производные гематопорфирина IX и тетрафенилпорфирина на замещенные тетрапиразолилпорфирины. Для этого на первом этапе осуществляли синтез замещенных тетрапиразолилпорфиринов по методам Адлера [Сырбу С.А., Агеева Т.А., Семейкин А.С., Койфман О.И. / Синтез мезофенилзамещенных порфиринов как исходных соединений для получения порфиринсодержащих полимеров // Изв. АН. Серия химич. 2007. №4. С.680-703] и Линсея [Lindsey J.S., MacCrum K.A., Tyhonas J.S., Chuang Y.-Y. / Investigation of a synthesis of mesо-porphyrin employing high concentration conditions and electron transport chain for aerobic oxidation // J. Org. Chem. 1994. V.59. P.579-587] исходя из пиразолкарбальдегидов и пиррола. На втором этапе синтеза проводили введение иона иттербия в различные тетрапиразолилпорфирины аналогично соединениям, описанным в прототипе.
Реализация данного изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1.
Цинковый комплекс 5,10,15,20-тетра(1-N-(п-фторфенил)-3(о-хлорфенил)пиразол-4-ил)порфирина.
2
4
1.5 г (5 ммоль) 1-N-(п-фторфенил)-3(о-хлорфенил)-4-пиразолкарбальдегида растворяли при перемешивании в 50 мл пропионовой кислоты. Нагревали реакционную смесь почти до кипения, добавляли 1 г ацетата цинка, затем 0.483 мл (5 ммоль) пиррола. Перемешивали при кипячении 3 ч. Затем реакционную смесь выливали в воду, нейтрализовали содой. Экстрагировали хлороформом, промывали водой, сушили над NaSO. После удаления растворителя цинковый комплекс очищали методом флэш-хроматографии на сухой колонке, элюировали хлороформом.
5,10,15,20-тетра(1-N-(п-фторфенил)-3(о-хлорфенил)пиразол-4-ил)порфирин.
2
4
макс
3
80
46
12
4
4
-3
1
Цинковый комплекс 5,10,15,20-тетра(1-N-(п-фторфенил)-3(о-хлорфенил)пиразол-4-ил)порфирина растворяли в ТГФ (тетрагидрофуран) при перемешивании, добавляли 5 мл концентрированной HCI, перемешивали 1.5 ч. Затем нейтрализовали водным аммиаком, промывали водой, сушили над NaSO, упаривали. Заливали 15 мл метанола, нерастворившийся осадок отфильтровывали, перекристаллизовывали из системы ТГФ/гептан. Выход 220 мг (12%). Электронный спектр, λ, нм (10): 427.0 (290.9), 523.9 (17.86), 559.0 (11.0), 597.0 (5.98), 658.6 (7.65). Спектр H-ЯМР, (δ, м.д.), (CDCl): 9.15 (8H, с, β-Н), 8.75 (4Н, с, pyrazole-H), 6.55-8.14 (32H, м, Ar-H), -1.8 (2H, с, NH). Найдено: масс-спектр, m/z: 1392.706. Вычислено: для CHNFClм.м. 1393.
Иттербиевый комплекс 5,10,15,20-тетра(1N-(п-фторфенил)-3(о-хлорфенил) пиразол-4-ил)порфирина.
макс.
-1
28 мг (0.02 ммоль) свободного основания порфирина и 30 (0.08 ммоль) мг ацетилацетоната иттербия суспендируют в 15 мл 1,2,4-трихлорбензола и кипятят в токе аргона 5 ч. После охлаждения реакционную массу пропускают через столбик оксида алюминия, тщательно промывают петролейным эфиром для удаления 1,2,4-трихлорбензола, а затем окрашенную зону элюируют при нагревании смесью хлороформ-изопропанол (3:1). Растворители удаляют при пониженном давлении и остаток хроматографируют на пластинках с силикагелем 5/40 мкм, отбирая менее подвижную малиновую зону иттербиевого комплекса. Выход 14.6 мг (42%). Электронный спектр поглощения, λ, нм: 425, 557, 596. ИК-спектр, v, см: 1551 и 1594 (acac).
Пример 2.
5,10,15,20-тетра(1-N-(п-метилфенил)-3(п-фторфенил)пиразол-4-ил)порфирин.
3
макс
3
84
58
12
4
1
В 420 мл хлороформа растворяли 1.171 г (4.2 ммоль) 1-N-п-метилфенил-3(п-фторфенил)-4-пиразолкарбальдегида, 0.30 мл (4.2 ммоль) пиррола, 3.15 мл CHOH при перемешивании. Реакционную смесь барботировали аргоном в течение всего времени реакции, добавляли 0.176 мл (1.40 ммоль) эфирата трехфтористого бора. Перемешивали 1 ч при комнатной температуре, затем 1 ч при кипячении. Добавляли 0.775 г (3.15 ммоль) п-хлоранила, перемешивали 1 ч при нагревании. После удаления растворителя порфирин очищали методом флэш-хроматографии на сухой колонке на оксиде алюминия, элюировали хлороформом. Выход 140 мг (10.2%). Электронный спектр, λ, нм (отношение интенсивностей): 428.8 (0.53), 522.0 (0.048), 559.6 (0.03), 596.6 (0.02), 655.0 (0.01). Спектр H-ЯМР, (CDCl, δ, м.д.): 9.02 (8Н, с, β-Н), 8.73 (4Н, с, pyrazole-H), 6.43-8.01 (32Н, м, Ar-Н), 2.03 (12Н, с, Me-Н), -1.8 (2Н, с, NH). Найдено: масс-спектр, m/z: 1311.879. Вычислено: для CHNF м.м. 1312.
Иттербиевый комплекс 5,10,15,20-тетра(1-N-(п-метилфенил)-3(п-фторфенил)пиразол-4-ил)порфирина.
макс
-1
30 мг (0.023 ммоль) порфирина, 35 (0.09 ммоль) мг ацетилацетоната иттербия суспендируют в 20 мл 1,2,4-трихлорбензола и кипятят в токе азота 7 часов. Реакционную массу пропускают через столбик оксида алюминия, оставшийся трихлорбензол вымывают петролейным эфиром. Растворители упаривают на роторном испарителе и остаток хроматографируют на пластинках с силикагелем в хлороформе. Иттербиевый комплекс порфирина отделяют, элюируют с силикагеля и перекристаллизовывают из смеси хлороформ-метанол (1:7). Электронный спектр λ, нм: 426, 520, 558, 597. ИК-спектр, v, см: 1550 и 1596 (асас).
Пример 3.
5,10,15,20-тетра(1-N-фенил-3(м-метоксифенил)пиразол-4-ил)порфирин.
3
макс
3
3
-3
1
В 750 мл хлороформа растворяли 2.08 г (7.5 ммоль) 1-N-фенил-3(м-метоксифенил)-4-пиразолкарбальдегида, 0.52 мл (7.5 ммоль) пиррола, 5.62 мл CHOH при перемешивании. Реакционную смесь барботировали аргоном в течение всего времени реакции, добавляли 0.315 мл (2.5 ммоль) эфирата трехфтористого бора. Перемешивали 1 ч при комнатной температуре, затем 1 ч при кипячении. Добавляли 1.38 г (5.6 ммоль) п-хлоранила, перемешивали 1 ч при нагревании. После удаления растворителя порфирин очищали методом флэш-хроматографии на сухой колонке на оксиде алюминия, элюировали хлороформом. Перекристаллизовывали из системы ТГФ/гептан (1:2). Выход 410 мг (17%). Электронный спектр, λ, нм (10): 428.0 (208.4), 522.1 (13.58), 558.4 (6.74), 595.7 (4.45), 652.4 (2.24). Спектр H-ЯМР, (δ, м.д.), (CDCl): 9.0 (8H, с, β-Н), 8.63 (4Н, с, pyrazole-H), 6.45-8.1 (36Н, м, Ar-Н), 3.0-3.3 (12Н, м, -OCH), -1.8 (2Н, с, NH).
Иттербиевый комплекс 5,10,15,20-тетра(1-N-фенил-3(м-метоксифенил)пиразол-4-ил)порфирина.
-1
25 мг (0.019 ммоль) порфирина, 35 (0.09 ммоль) мг ацетилацетоната иттербия суспендируют в 5 мл 1,2,4-трихлорбензола и кипятят в токе азота 7 часов. Реакционную массу пропускают через столбик оксида алюминия, оставшийся трихлорбензол вымывают петролейным эфиром. Растворители упаривают на роторном испарителе и остаток хроматографируют на пластинках с силикагелем в хлороформе. Иттербиевый комплекс порфирина отделяют, элюируют с силикагеля и перекристаллизовывают из смеси хлороформ-метанол (1:7). Электронный спектр λ макс, нм: 431, 557, 594.6. ИК-спектр, v, см: 1551 и 1598 (асас).
Изучали спектры люминесценции Yb-комплексов тетрапиразолилпорфиринов в диметилсульфоксиде и определяют по кинетике затухания время жизни новых ИКП и сравнивали их с веществами, описанными в прототипе.
Спектр интенсивности люминесценции и кинетика ее затухания для Yb-комплекса 5,10,15,20-тетра(1-N-(п-фторфенил)-3(о-хлорфенил) пиразол-4-ил)порфирина приведены на Фиг.1. и Фиг.2. Для сравнения там же представлены спектры люминесценции и кинетики затухания для ИКП, выбранных в качестве прототипа.
Как видно из Фиг.1, время жизни для Yb-комплекса 5,10,15,20-тетра(1-N-(п-фторфенил)-3(о-хлорфенил)пиразол-4-ил)порфирина составляет около 20 мкс, что значительно превосходит времена жизни ИКП, выбранных в качестве прототипов (11 мкс для Yb-2,4-диметоксигематопорфирина IX и 8 мкс для Yb-комплекса 5,10,15,20-тетракис(4-карбоксифенил)порфирина).
Эффективность данных соединений как флуоресцентных меток подтверждается испытаниями на животных. В связи с тем, что производные тетрапиразолилпорфиринов являются гидрофобными соединениями, то для их солюбилизации использовали фосфатидилхолиновые липосомы. Для этого 2 мг металлокомплекса и 20 мг яичного лецитина в 3 мл хлороформа и 2 мл этанола упаривают досуха на роторном испарителе. Добавляли 1 мл 0.9% раствора хлорида натрия и озвучивали на ультразвуковой бане в течение 20 минут.
s
Экспериментальным животным (мышкам) с химически индуцированной опухолью вводили иттербиевые комплексы тетрапиразолилпорфиринов в хвостовую вену в дозе 5 мг/кг веса. Через 24 часа облучали лазером малигнизированные и нормальные ткани, проводили измерение сигнала люминесценции в области 975 нм, а затем рассчитывали коэффициент контрастности по отношению индекса люминесценции малигнизированных и нормальных тканей. Максимальный коэффициент контраста Y составлял 49 через 24 час после введения препарата.
Преимущество предлагаемых тетрапиразолилпорфиринов по сравнению с соединениями, заявленными в прототипе, заключается в снижении дозы вводимых животным веществ, увеличении времени жизни люминесценции при сохранении высоких значений коэффициента контраста (табл.).
Соединение
Время жизни люминесценции (×10<sup>-6</sup>), с
Вводимая доза, мг/кг
Коэффициент контрастности
Yb-комплекс 5,10,15,20-тетра(1-N-(п-фторфенил)-3(о-хлорфенил)пиразол-4-ил)порфирина.
20
5
49
Yb-2,4-диметоксигематопорфирина IX
11
50
48
Литература
1.Соловьев К.Н., Цвирко М.П., Качура Т.Ф. / Внутримолекулярная миграция энергии в комплексах лантаноидов с порфиринами // Оптика и спектр. 1976. Т.40. №4. С.684-690.
2. Таубер А.Ю., Нижник А.Н., Миронов А.Ф., Гайдук М.И., Григорьянц В.В. / Фоофизическая активность порфириновых сенсибилизаторов в водных растворах // Биофизика. 1989. Т.34. №3. С.364-367.
3. Mody T.D., Galanter J. / Патент США №7112671, кл. МПК С07D 487/22, НКИ 540/145, опубл. 26.09.06.
4. Sessler J.L, Gregory W.H., Mody T.D. / Патент США №5994535, кл. МПК С07D 487/22, НПК 540/472, опубл. 30.11.1999.
5. Niedball U., Gries H., Conrad J. At al. / Заявка ФРГ №3809671, кл. МПК С07D 487/22, выложена 28.09.89.
6. Румянцева В.Д., Миронов А.Ф., Сапронова Е.В. и др. / Способ изучения малигнизации тканей у экспериментальных животных // Патент РФ №1621720, кл. МПК G01N 33/52 от 29.04.88.
7. Сырбу С.А., Агеева Т.А., Семейкин А.С., Койфман О.И. / Синтез мезо-фенилзамещенных порфиринов как исходных соединений для получения порфиринсодержащих полимеров // Изв. АН. Серия химич. 2007. №4. С.680-703.
8. Lindsey J.S., MacCrum K.A., Tyhonas J.S., Chuang Y.-Y. / Investigation of a synthesis of meso-porphyrin employing high concentration conditions and electron transport chain for aerobic oxidation // J. Org. Chem. 1994. V.59. P.579-587.