СПОСОБ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ АНТИГЕНОВ ЭНТЕРОВИРУСОВ В ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ
INSTANT DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR ENTEROVIRUS ANTIGENS IN CEREBROSPINAL FLUID

Изобретение относится к области медицины, а именно к вирусологии, и может найти применение в инфекционных стационарах, вирусологических лабораториях и центрах для диагностики энтеровирусной инфекции (ЭВИ).
За последние годы накопился обширный материал о роли энтеровирусов в инфекционной патологии человека. Они широко распространены повсеместно, вызывают различные по клиническим проявлениям и степени тяжести заболевания, представляя серьезную проблему для здравоохранения во многих странах мира. В структуре заболеваемости энтеровирусной инфекцией 32% составляют энтеровирусные менингиты, которые регистрируются в 43 субъектах Российской Федерации - 3223 случая (2,2 на 100 тыс. населения), при этом около 90% заболеваний приходится на детей до 17 лет. Среди энтеровирусов, патогенных для человека, выделяют 23 типа вируса Коксаки А, 6 типов Коксаки В, 31 тип вирусов ECHO - enteric cytophatogenic orphans - кишечные цитопатогенные вирусы. Источником инфекции является больной человек или носитель, который может быть заразен в течение нескольких недель и месяцев. Основной механизм передачи инфекции фекально-оральный с пищевым путем передачи, возможен и аспирационный механизм передачи, через воздушно-капельный путь. Инкубационный период длится от 2 до 10 дней.
Обычно для подтверждения диагноза ЭВИ вирус выделяют в культуре клеток, наиболее часто выделяют вирус из кала, отделяемого носоглотки и мазков из зева. Из цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) при поражении центральной нервной системы (ЦНС) энтеровирусы выделяют значительно реже, важно вирусы выделить в начале заболевания.
Современные методы диагностики показали, что инфицированность людей энтеровирусными инфекциями достигает 35-37%.
Для диагностики ЭВИ широко используется полимеразная цепная реакция (ПЦР), обладающая весьма высокой чувствительностью. Однако нередко количество вирусного материала в исследуемых образцах может быть ниже детектируемого ПЦР (например, вследствие несоблюдения условий хранения или транспортировки клинического материала). Для определения низких количеств вирусной РНК в пробах применяется гнездовая модификация ПЦР, позволяющая повысить чувствительность в 10000 раз (1. Medical virology: The practical Approach Series / Ed. by U. Desselberger. - Oxford Univ.: IRL Press, 1995. - 214 p.; 2. Taylor M.J., Godfrey E., Baczko R. et al. // J. Gen. Virol. - 1991. - V.72, N 1. - P.83-88).
Однако это может привести к значительному увеличению частоты ложноположительных результатов вследствие кросс-контаминации (из пробирки в пробирку). Этот недостаток существенно ограничивает область применения метода гнездовой ПЦР, делая его слишком рискованным для проведения рутинных исследований, а отсутствие соответствующего оборудования или возможности проводить данные исследования полностью исключает его использование.
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ иммунологической экспресс-диагностики энтеровирусных инфекций (патент №2034025). Сущность его заключается в проведении реакции связывания комплемента со специфическими сыворотками и спектрофотометрическому учету лизиса эритроцитов в зависимости от уровня освободившейся из них каталазы. Проведение данного метода предполагает обследование образцов фекальных масс больного, подвергшихся обработке с помощью питательной среды 199, внесением 0,05 г стрептомицина сульфата, 100000 ед бензилпенициллиновой натриевой соли, термостатирования и двукратного ценрифугирования при 1500 и 3000 об/мин. На этапе учета реакции используется ортофенилендиамин, а при постановке контролей - вероналово-мединаловый буфер. Все используемые в реакции поли- или моновалентные иммунные сыворотки к энтеровирусам различных типов готовятся в одном разведении 1:10. После добавления комплемента в проводимую реакцию исследуемые образцы термостатируют при 37°С в течение 60 мин.
Использование этого способа в настоящее время ограничено в связи с приказом №322 МЗ РФ от 21.10.2002 о запрете к применению диагностических препаратов, содержащие в качестве хромогена (субстрата) ортофенилендиамин (ОФД), который является высокоактивным канцерогеном, опасным для здоровья людей и требующим специальной технологии утилизации, и приказом МЗ и Соц. развития №706Н от 23.08.10 о специальных условиях хранения сильнодействующих лекарственных препаратов. Кроме того, приготовление иммунных сывороток к энтеровирусам различных типов в одном разведении 1:10 и 60-минутное термостатирование при 37°С существенно снижает точность определения энтеровирусного антигена в фекалиях, а определение антигена энтеровируса в ликворе делает применение данного способа невозможным, а только обнаружение в ЦСЖ возбудителя или его антигенов является «золотым» стандартом для этиологической расшифровки заболевания (СП 3.1.1.2343-08).
Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении точности и экспрессивности диагностики за счет использования в качестве биологического материала цереброспинальной жидкости и определения в нем антигенов энтеровирусов при нейроинфекциях.
Этот результат достигается тем, что наряду с определением антигенов в биологическом материале модифицированной реакцией связывания комплемента в качестве биологического материала используют цереброспинальную жидкость, в нее вносят гемолитическую сыворотку, затем исследуемые образцы выдерживают 12-16 часов при t4ºC, после чего проводят количественное определение оксидазных ферментов посредством 0,05% тетраметилбензидина и при наличии антигена в исследуемом материале диагностируют энтеровирусную инфекцию.
Авторами впервые предложен эффективный лабораторный экспресс-способ этиологической диагностики нейроинфекций. Метод имеет ряд отличий и преимуществ. Обнаружение энтеровирусных антигенов в ЦСЖ позволяет по одной пробе провести раннюю этиологическую диагностику нейроинфекций с определением серотипа энтеровируса. Способ обеспечивает его проведение в любом стационаре, оснащенном лабораторией ИФА, что экономит время диагностики при доставке ликвора с соблюдением «холодовой» цепи в специализированные лаборатории.
Авторы решили эту задачу, заявляя способ экспресс-диагностики антигенов энтеровирусов в цереброспинальной жидкости при нейроинфекциях с помощью модифицированной реакции связывания комплемента с последующим количественным учетом энтеровирусных антигенов.
Предлагаемый нами способ базируется на оригинальной модификации, заключающейся в том, что за его основу была принята не стандартная реакция связи вируса с антителами, закрепленными на твердой матрице, а высокочувствительная разновидность реакции сорбции комплемента на иммунный комплекс, образующийся в жидкой фазе реакции. Данный комплекс образуется между антителами диагностической сыворотки к энтеровирусу и соответствующим антигеном, присутствующим в экстракте фекалий, крови или ликворе больного. Остаток не сорбированного на комплекс комплемента учитывался при помощи спектрофотометрической аппаратуры. Цифровой учет остаточного комплемента стал возможным благодаря тому, что при лизисе эритроцитов, которые являются основой визуального тестирования результатов РСК, в жидкостную фазу реакции выходит группа оксидазных ферментов, таких как пероксидаза мембран, различные оксидазы и гемоглобин, находящиеся во внутренней структуре эритроцитов. Эти ферменты достаточно легко определяются с помощью оптического тестирования после контакта их с 0.05% тетраметилбензидина. Учет результатов проводится на любом иммуноферментном анализаторе с использованием длины волны, равной 495 нм. Данный принцип задействован и в классическом твердофазном иммуноферментном тесте, где пероксидаза конъюгирована с тестирующим белком (например, антиглобулин). Использовать данные ферменты в нативном виде при лизисе эритроцитов барана (например, гемоглобин), являющихся одним из основных компонентов РСК нам не представлялось возможным, так как проводимые опыты показывали чрезвычайно малую величину оптической плотности, не дающую возможность калибровочно дифференцировать титры антител. Внесение в лизат эритроцитов раствора стандартного 0.05% препарата тетраметилбензидина резко увеличивает показатель оптической плотности, что создавало условия для точного учета минимальных концентраций антител и калибровки проводимой реакции. Точный подбор концентрации эритроцитов в гемолитической системе, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, показал, что для создания оптической плотности в пределах 0,300-0,500 оптических единиц (длина волны 495 нм) необходимо использовать 0,1% взвесь эритроцитов барана.
Сущность способа заключается в следующем.
Если биологический материал ЦСЖ, требующий исследования, содержал энтеровирусные частицы, то при проведении реакции, т.е. добавлении к испытуемому материалу стандартных диагностических сывороток и комплемента, образовывался комплекс антиген + антитела + белки системы комплемента и после добавления гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, начинался лизис эритроцитов и выход в раствор оксидазных ферментов, концентрация которых была незначительна, а добавление 0.05% тетраметилбензидина и перекиси водорода давала низкий цифровой показатель экстинции. Если ликвор не содержал антигены энтеровирусов, то при аналогичном проведении исследования комплекса не образовывалось и после добавления гемолитической системы происходил лизис эритроцитов барана, сопровождавшийся массивным выходом оксидазных ферментов, а, следовательно, после добавления 0.05% тетраметилбензидина величина экстинции резко увеличивалась.
Основным контролем для исследуемых биологических проб было их обследование без добавления стандартных коммерческих диагностикумов, содержащих антитела. Если в испытуемом материале присутствовал антиген энтеровируса, и в опытной пробе происходило образование комплекса, который и ограничивал выход оксидазных ферментов, то в контрольной группе, из-за отсутствия антигенов, находящихся в диагностикумах, такой комплекс не образовывался и препятствий для массового выхода оксидазных ферментов не наблюдалось, а соответственно величина экстинции всегда была больше.
При отсутствии вирусного материала в ликворе в обоих случаях не происходило образование комплексов и величины экстинции практически не отличались друг от друга.
Педлагаемый способ осуществляется следующим образом.
Полученный в лаборатории ликвор разводился физиологическим раствором в разведении 1:5, затем вносились в 96-луночные полистироловые панели, выпускаемые производством "Биополимер" (Россия) в объеме 0,05 мл. Количество лунок, занимаемых для проведения опыта соответствовало числу используемых стандартных диагностических сывороток, изготовляемые Московским институтом полиомиелита и вирусных энцефалитов МЗ и соц. Развития РФ. Сыворотки в основном опыте разводились соответственно титру, указанному в инструкции, и добавлялись в объеме 0,05 мл. В каждую из этих лунок вносилось дополнительно по 4 дозы комплемента, находящихся в объеме 0,05 мл. При такой постановке исследования для каждого материала дополнительно ставились следующие контроли:
- контроль физ. р-ра, внесенный в объеме 0,4 мл;
- контроль комплемента, включающий в себя 0,1 мл физ. р-ра и 0,1 мл комплемента;
- контроль для системы выявления не сорбированного комплемента, куда вносились 0,2 мл физ. р-ра и 0,2 мл гемолитической системы;
- контроль ликвора, который вносился в объеме 0,05 мл с добавлением 0,05 мл физ. р-ра;
- контроли для каждой из участвующих в опыте диагностической сыворотке, куда вносилось по 0,05 мл физ. р-ра и 0,05 мл данной сыворотки.
2
4
После контакта данной смеси инградиентов, проходившей в течение 120 минут при 37ºС, для осуществления дальнейшего хода реакции, во все лунки, где проходит опыт по группоспецифическому типированию и контроли к нему, вносится система для выявления свободного комплемента. Такая система приготавливалась ex terpore и состояла из оттитрованных эритроцитов барана, так как каждая партия сильно разнилась от предыдущей, и процентное соотношение выбиралось, исходя из 300-500 единиц оптической плотности и гемолитической сыворотки в разведении 1:300. Реакция экпозировалась при +4ºС в течение 12-16 часов для осуществления лизиса и осаждения не гемолизированных эритроцитов. По истечении 12-16 часов из надосадочной жидкости, образовавшейся после оседания эритроцитов, во всех опытных и контрольных лунках отбиралось по 50 мкл для проведения заключительного этапа - цифровой дифференцировки наличия вируса в группоспецифическом этапе определения. Отобранная жидкость помещалась в отдельные полистироловые панели, куда добавлялось по 50 мкл 0.05% тетраметилбензидина для учета не сорбированного на эритроциты барана комплемента. Через 10 минут реакция останавливалась путем добавления 0,1 мл 1 нормальной HSO.
Учет реакции проводился сразу после добавления кислоты, так как не исключалась возможность дальнейшего продолжения гемолиза в контрольных и опытных образцах, влекущего за собой изменение цветности реакции, а, следовательно, и изменения достоверности полученных результатов. Опыт учитывался на любом иммуноферментном анализаторе. Полученные результаты расшифровывались в сопоставлении всех контролей с исследуемым материалом. Наименьшее цифровое значение, выявляемое в одной из лунок, где находился обследуемый материал и определенная сыворотка, констатировал присутствие у больного антигена энтеровирусов соответствующего типа.
Таким образом, в течение одних суток, без использования тканевых культур, оказалось возможным обнаруживать антигены энтеровирусов в ликворе больных с определением его серопринадлежности.
В примере 1 приведены результаты обследования ликвора, направленного на энтеровирусную диагностику, от больного С.А. (8 лет) с предварительным диагнозом "серозный менингит" неясной этиологии.
Пример 1
Результат обнаружения энтеровирусного антигена в ликворе методом модифицированной реакции связывания комплемента
25.02.2012
Анализ №22
Планшет №1
Диагностические моноспецифические сыворотки
ЦСЖ*
Контроли моноспецифических сывороток*
ECHO 6
0,110
0,502
ECHO 11
0,516
0,473
ECHO 30
0,485
0,489
Полиомиелит I типа
0,469
0,503
Полимиелит II типа
0,491
0,489
Полиомиелит III типа
0,483
0,498
энтеро 68-типа
0,501
0,506
энтеро 69-типа
0,500
0,499
энтеро 70-типа
0,503
0,520
энтеро 71-типа
0,489
0,489
Коксаки В 1-6
0,521
0,506
Контроль комплемента
0,466
Контроль гемолитической системы
0,112
Контроль обследуемого материала
0,491
* Цифровой уровень антител указан в единицах оптической плотности
Лабораторный диагноз: "серозный менингит", этиологически связанный с энтеровирусом ECHO 6 типа.
В примере 2 приведены результаты обследования ЦСЖ, направленных на энтеровирусную диагностику, от больной М.А. (6 лет) с предварительным диагнозом "полинейропатия".
Пример 2
Результат обнаружения энтеровирусного антигена в ЦСЖ методом модифицированной реакции связывания комплемента
14.02.2012
Анализ №42
Планшет №4
Диагностические моноспецифические сыворотки
ЦСЖ
Контроли моноспецифических сывороток*
ECHO 6
0,510
0,502
ECHO 11
0,526
0,573
ECHO 30
0,489
0,490
Полиомиелит I типа
0,569
0,603
Полимиелит II типа
0,531
0,589
Полиомиелит III типа
0,483
0,491
энтеро 68-типа
0,531
0,536
энтеро 69-типа
0,508
0,529
энтеро 70-типа
0,203
0,520
энтеро 71-типа
0,477
0,489
Коксаки В 1-6
0,495
0,481
Контроль комплемента
0,458
Контроль гемолитической системы
0,108
Контроль обследуемого
0,531
материала
Лабораторный диагноз: "полинейропатия" энтеровирусной этиологии, поставленный по обнаружению энтеровирусного антигена (энтеро 70-типа) в ликворе.
В примере 3 приведены результаты обследования ЦСЖ, направленных на энтеровирусную диагностику, от больной Ш.Е. (14 лет) с предварительным диагнозом "неврит лицевого нерва".
14.03.2012 Анализ №72 Планшет №2
Пример 3
Результат обнаружения энтеровирусного антигена ЦСЖ методом модифицированной реакции связывания комплемента
14.03.2012
Анализ №72
Планшет №2
Диагностические моноспецифические сыворотки
ЦСЖ*
Контроли моноспецифических сывороток*
ECHO 6
0,511
0,502
ECHO 11
0,426
0,475
ECHO 30
0,490
0,500
Полиомиелит I типа
0,479
0,503
Полимиелит II типа
0,431
0,489
Полиомиелит III типа
0,493
0,497
энтеро 68-типа
0,089
0,536
энтеро 69-типа
0,508
0,537
энтеро 70-типа
0,493
0,490
энтеро 71-типа
0,497
0,501
Коксаки В 1-6
0,503
0,531
Контроль комплемента
0,460
Контроль гемолитической системы
0,129
Контроль обследуемого материала
0,431
Лабораторный диагноз: "неврит лицевого нерва", вызванный энтеро 68-типа, поставленный по обнаружению энтеровирусного антигена в ликворе.
Способ имеет большую медико-социальную значимость, отличается простотой и доступностью, не требует дорогостоящих тест-систем и оборудования. Основным значением данного способа является возможность точного обнаружения проникновение вируса в ЦНС, что дает возможность в дальнейшем прогнозировать не только течение болезни, но и ее исход.
Предлагаемый авторами способ определения антигенов энтеровирусов в ликворе при нейроинфекциях может стать не только общедоступным но и экспрессным, поскольку специфические диагностические сыворотки отечественного производства в пересчете на одно исследование не являются затратными и обеспеченность ими доступна любой вирусологической лабораторией, занимающейся иммуноферментным анализом, проведение которого налажено во всех регионах России.