РАЗРАБОТКА ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ИНГИБИТОРОВ КОРОНАВИРУСА SARS-COV-2

РАЗРАБОТКА

ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ИНГИБИТОРОВ КОРОНАВИРУСА SARS-COV-2

Аннотация. С помощью компьютерного скрининга низкомолекулярных химических соединений, имитирующих фармакофорные свойства ингибитора Х77, выполнена оценка их потенциальной антивирусной активности и идентифицированы молекулы, перспективные для создания новых эффективных препаратов для терапии СОУЮ-19. Ключевые слова: СОУЮ-19, компьютерный скрининг, компьютерное молекулярное моделирование, протеаза БАИБ-СоУ-2, фолдинг белка.

Вспышка коронавирусной инфекции, вызванная вирусом 8АК.8-СоУ-2 (возбудитель СОУГО-19),- причина серьезной обеспокоенности мирового сообщества в силу постоянно увеличивающегося числа инфицированных людей и значительного географического распространения. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) по состоянию на 25.06.2020 г. сообщила о более чем 9,4 млн подтвержденных случаев заражения и более 480 тыс. смертей. В настоящее время предпринимаются многочисленные попытки создать эффективную противовирусную вакцину и найти новые терапевтические средства против заболевания. Стадию разработки и тестирования в мире проходят более 150 препаратов. Большинство из них - уже существующие, и ученые выясняют, могут ли они воздействовать на вирус. ВОЗ начала клиническое исследование самых перспективных лекарств против СОУГО-19, получившее название «Солидарность». Работы ведутся по трем основным направлениям.

Антивирусные препараты - в их числе ремдеси-вир, авиган/фавипиравир, калетра/ритонавир+ло-пинавир, которые влияют на способность вируса к репликации в теле (предотвращают его проникновение в клетки легких или препятствуют размножению внутри клетки). Они применяются при лечении

обычного гриппа, гепатита С, а также ВИЧ-инфекции, лихорадки Эбола и, что немаловажно, атипичной пневмонии (SARS) и ближневосточного респираторного синдрома (MERS), возбудителями которых также являются коронавирусы.

Иммуномодуляторы - например, хлорохин, гидроксихлорохин, интерферон бета, дексамета-зон - используют для ограничения чрезмерной реакции иммунной системы, которая сама по себе может стать опасной для жизни. Такие препараты, к примеру, применяют при лечении артрита или воспалительных заболеваний кишечника.

Антитела, способные бороться с вирусом и взятые из крови переболевших (реконвалесцентная плазма) либо созданные в лаборатории - Леронлимаб, антитела, первоначально разработанные против MERS.

В последнее десятилетие в процессе создания новых лекарственных препаратов важную роль играют методы компьютерного молекулярного моделирования, позволяющие сократить сроки разработки и существенно уменьшить финансовые расходы. Значительные успехи достигнуты с помощью методов компьютерной химии при разработке новых ингибиторов ВИЧ-1, белка M2 и нейраминидазы вируса гриппа, протеазы коронавируса SARS-CoV, тимидинкиназы вируса герпеса, вируса гепатита С и протеиназы риновируса человека.

Светлана Бабицкая,

директор Института биоорганической химии НАН Беларуси, кандидат химических наук

Александр Андрианов,

главный научный сотрудник Института биоорганической химии НАН Беларуси, доктор химических наук

Александр Тузиков,

генеральный директор Объединенного института проблем информатики НАН Беларуси, член-корреспондент

На сегодняшний день имеется следующий алгоритм создания новых лекарственных средств (рис. 1).

Исследования различных аспектов коронави-руса, включая эпидемиологию и секвенирование генома, показали, что геном коронавируса БАЯБ-СоУ-2 представляет собой положительно смысловую, однонитевую РНК и состоит из ~ 30 тыс. нуклеоти-дов, а его ген репликазы кодирует два перекрывающихся полипротеина рр1а и рр1аЬ, необходимых для репликации вируса и транскрипции. Затем эти два полипротеина обрабатываются цистеиновыми протеазами, а именно папаиноподобной протеазой РЬрго и 3-химотрипсиноподобной протеазой ЗСЬрго (также известной как основная протеаза Мрго), необходимой для созревания вируса и обеспечения его инфективности. Основная протеаза, вырезанная за счет собственной аутолитической активности из перекрывающихся полипротеинов рр1а и рр1аЬ, «переваривает» их в не менее чем 11 консервативных сайтах, что свидетельствует о ее чрезвычайно важной функциональной роли в жизненном цикле вируса и делает крайне привлекательной мишенью

для разработки эффективных противовирусных препаратов.

Начиная с 25 марта 2020 г., когда в Банк данных белков была депонирована структура основной про-теазы вируса SARS-CoV-2 в комплексе с высокоаффинным лигандом X77 [1], представляющим собой мощный нековалентный ингибитор как SARS-CoV, MERS-CoV, так и SARS-COV-2, ученые Института биоорганической химии НАН Беларуси и Объединенного института проблем информатики провели первоначальные исследования и выполнили суперкомпьютерное моделирование, по результатам которого получили ряд перспективных соединений с точки зрения противовирусной активности для создания лекарств. Результаты этой работы опубликованы в статьях [2, 3].

В недавних исследованиях основная протеаза SARS-CoV-2 была использована в качестве мишени для скрининга клинически одобренных лекарств как потенциальных ингибиторов вируса в надежде обнаружить препараты, эффективные против COVID-19. Так как профили их безопасности хорошо

Идентификация мишени

Поисн соединения-лидера

МОДифиКЭ ЦИЯ сое ди н е н ия -л и д е за

С

Клинические

испытания

Доклинические испытания

Химический синтез

Лекарственн ый препарат

Рис. 1. Алгоритм создания новых лекарственных средств

Рис.2. Рентгеноструктурный комплекс основной протеазы коронавируса (код в Protein Data Bank: 6W63) с ингибитором Х77

Рис.3. Мощный нековалентный ингибитор широкого спектра действия X77

документированы, подход, сочетающий в себе структурный дизайн лекарств с методами виртуального скрининга и молекулярного моделирования, может существенно облегчить и ускорить процесс обнаружения противовирусных соединений с клиническим потенциалом с целью их перепрофилирования для лечения пациентов, инфицированных коронави-русом нового типа. Однако, принимая во внимание возможные серьезные мутации вируса БАЯБ-СоУ-2, чрезвычайно актуальными также являются исследования по разработке новых противовирусных органических соединений, способных блокировать функционально важные сайты белков вируса.

Определение методом рентгеноструктурного анализа пространственной структуры основной протеазы БАКБ-СОУ-2 высокого разрешения создало предпосылки не только для понимания функции и механизма действия фермента, но и разработки новых эффективных ингибиторов коронавируса на основе прямых методов компьютерного конструирования лекарств, использующих данные о структуре молекулярной мишени. Нами была поставлена задача осуществить виртуальный скрининг 9 молекулярных библиотек веб-сервера РЬагшй, содержащих более 1 млрд структур химических соединений, и с помощью методов молекулярного моделирования провести оценку потенциальной нейтрализующей активности идентифицированных молекул.

С помощью компьютерного скрининга низкомолекулярных химических соединений, имитирующих фармакофорные свойства ингибитора Х77, выполнена оценка их потенциальной антивирусной активности и идентифицированы молекулы, перспективные для создания новых эффективных препаратов для терапии СОУГО-19.

Рис.4. Химические структуры молекул-лидеров по результатам скрининга

Проведенные исследования включали следующие этапы:

построение модели фармакофора, описывающей совокупность структурно-функциональных свойств ингибитора Х77, обеспечивающих специфичность его взаимодействий с активным сайтом основной протеазы 8АЯ8-СоУ-2;

виртуальный скрининг молекулярных библиотек веб-сервера Pharmit [4], позволяющего проводить интерактивное исследование химического пространства с целью поиска потенциальных лекарств на основе сходства фармакофорных моделей с высокоаффинными лигандами белка-мишени;

отбор соединений, удовлетворяющих «правилу пяти» Липинского, накладывающему на молекулу, взаимодействующую с заданной молекулярной мишенью, условия подобия лекарству, в соответствии с которым потенциальный препарат должен обладать молекулярной массой менее 500 Да, иметь липофильность (logP - коэффициент распределения вещества на границе раздела вода - октанол) менее 5, иметь менее 5 атомов-доноров водородной связи и суммарно не более 10 атомов азота и кислорода;

молекулярный докинг отобранных соединений с основной протеазой 8АЯ8-СоУ-2;

расчет величин констант диссоциации комплексов лиганд - основная протеаза и свободной энергии связывания с последующей идентификацией молекул, перспективных для разработки эффективных противовирусных препаратов. Виртуальный скрининг молекулярных библиотек

веб-сервера РЬагшй позволил идентифицировать 24 соединения, согласующихся с построенной моделью фармакофора ингибитора Х77 и прошедших через «фильтр» Липинского. В результате оценки противовирусной активности этих соединений были выделены 5 молекул-лидеров, эффективно взаимодействующих с МРго БАКБ-СоУ-2 и характеризующихся низкими значениями свободной энергии связывания.

Анализ структурных комплексов идентифицированных соединений с основной протеазой баяб-

Рис.5. Молекулярный докинг идентифицированных соединений с основной протеазой БДКБ-СоУ-2

СоУ-2 свидетельствует о наличии большого числа межмолекулярных взаимодействий, в которые вовлечены аминокислотные остатки фермента, входящие в его активный центр.

Эффективность межмолекулярных взаимодействий обнаруженных соединений с МРго 8АКБ-СоУ-2 подтверждают низкие значения варьирующие в интервале от 0,006 мкМ до 2,56 мкМ, и величин свободной энергии связывания (ДС < -7,9 ккал/ моль), что свидетельствует об их высоком сродстве с активным центром фермента. Анализ величин К И ДС, рассчитанных для соединений I -V, показывает, что, с учетом погрешностей расчетов, они сопоставимы с соответствующими параметрами, предсказанными с помощью идентичного вычислительного протокола для контрольного ингибитора МРго БАЯБ-Со^2 Х77.

Таким образом, обнаруженные соединения образуют широкую сеть межмолекулярных контактов с функционально важными остатками МРго БАЯБ-СоУ2 и проявляют высокое сродство к каталитическому

Лиганд I II III IV V X77

К,1, (мкмоль) 0,039 0,157 2, 0 2,65 0,057

ДвВ0С2, (ккал/моль) -11.65 -10.50 -9,64 -8,07 -7,90 -10,21

ДИРМ73, (ккал/моль) -80,1 -96,6 -90,7 -71,4 -53.78 -62,8

ЛбММ/Жд4, (ккал/моль) -27,18 ± 6,53 -47.66 ± 4,33 -33,56 ± 5,88 -39,21 ± 3,83 -35 ± 3,71 -41,70 ± 4,28

Таблица. Значения константы диссоциации и энергии связывания комплексов идентифицированных соединений и Х77 с основной протеазой БДКБ-СоУ-2, рассчитанные методами молекулярного докинга1,2, квантовой химии3, молекулярной

динамики4

сайту фермента в соответствии с низкими значениями К и свободной энергии связывания, рассчитанными для их комплексов с белком MPro. Среди найденных молекул наиболее перспективный «компьютерный профиль» имеет соединение I (К = 0,006 мкмоль, ДО = - 11,65 ккал/моль), образующее три водородных связи с MPro, один солевой мостик и большое число ван-дер-ваальсовых контактов, а также участвующее в п-п взаимодействии с остатком His-41, входящим в состав каталитической диады фермента. Поэтому это соединение является первоочередным кандидатом для тестирования на противовирусную активность.

Сравнение построенных методами молекулярного моделирования структурных комплексов идентифицированных соединений с основной протеа-зой SARS-CoV-2 свидетельствует о наличии эффективных межмолекулярных взаимодействий, приводящих к блокаде каталитического сайта фермента. По данным молекулярного докинга, комплексы этих соединений с основной протеазой SARS-CoV-2 демонстрируют низкие значения констант диссоциации и свободной энергии связывания. Обнаруженные в базах данных соединения полностью удовлетворяют «правилу пяти» Липинского и формируют перспективные базовые структуры для разработки эффективных лекарственных препаратов для терапии коронавирусной инфекции нового типа.

Дальнейшие работы предполагают реализацию следующих этапов создания потенциальных лекарственных препаратов для терапии COVID-19:

синтез идентифицированных соединений,

тестирование их на противовирусную активность in vitro;

оптимизация соединения-лидера с целью улучшения его противовирусных свойств, фармакокине-тических и токсикологических характеристик. Очевидно, что на данных стадиях, помимо компетенций специалистов в области биоинформатики, потребуется подключение химиков-органиков, фармакологов, токсикологов и дополнительное финансирование, в том числе и на материальную базу под эти работы.

В 2016 г. ряд разработчиков применили нейронную сеть к созданию новых лекарственных препаратов. Использование технологий генеративных нейронных состязательных сетей, обученных «придумывать» молекулярные структуры, может в разы сокращать время и стоимость поиска веществ, потенциально обладающих лечебными свойствами.

На данный момент в базе органических молекул несколько сотен миллионов веществ, и только доля процента из них применяется в медицине. Исследо-

ватели идут дальше и ставят цель - создать новые молекулы с заранее заданными свойствами и заставить глубокие нейронные сети «вообразить» новые структуры молекул, удовлетворяющих определенным требованиям. Для обучения нейронной сети требуется одинаковая длина описания (вектора). Решает эту задачу фингерпринт - «отпечаток пальца» молекулы. Он содержит в себе всю информацию о ней. Нейронная сеть улавливает какие-то закономерности, не очевидные человеческому разуму, и, применяя их к другим молекулам, активность которых еще не известна, предсказывает, насколько та или иная из них активна в лечении определенной болезни. Возможно, такому подходу принадлежит будущее фармацевтики.

В НАН Беларуси с мая 2020 г. формируется Комплексный план научных исследований по борьбе с коронавирусом, в который ученые ИБОХ предложили ряд перспективных проектов в дополнение к представленному. Среди них:

пептидная технология профилизации антител у больных коронавирусной инфекцией в отношении отдельных антигенных детерминант SARS-CoV-2 (совместно с РНПЦ эпидемиологии и микробиологии Минздрава Республики Беларусь);

идентификация полиморфных вариантов факторов вирулентности SARS-CoV-2 и синтетическое получение их фрагментов (совместно с РНПЦ эпидемиологии и микробиологии Минздрава);

получение высокоочищенных рекомбинантных ферментов и структурных белков вируса SARS-CoV-2 для скрининговых исследований потенциальных противовирусных средств и для использования при разработке тест-систем, основанных на детекции антител;

фолдинг, стабильность и модификации белков SARS-Cov-2: in silico и in vitro анализ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Банк данных белков, код 6w63 // http://www.rcsb.org/structure/6W63.

2. Андрианов А.М., Корноушенко Ю.В., Карпенко А.Д., Тузиков А.В. Идентификация потенциальных ингибиторов коронавируса SARS-CoV-2 методами виртуального скрининга и молекулярного моделирования // Доклады НАН Беларуси. 2020. Vol. 64. №3. P. 308-316.

3. Andrianov A.M., Kornoushenko YuV., Karpenko A.D., Bosko I.P., Tuzikov A.V. Computational discovery of small drug-like compounds as potential inhibitors of SARS-CoV-2 main protease. 2020. Preprint ChemRxiv // http://chemrxiv.org/articles/.

4. Pharmit // http://pharmit.csb.pitt.edu.

frMSiib http://innosfera.by/2020/07/covid-19

Авторы выражают благодарность кандидату химических наук Ю.В. Корноушенко, А.Д. Карпенко и И.П. Босько за участие в работе по скринингу и идентификации потенциальных ингибиторов SARS-CoV-2.