Патогенетическая метафилактика камнеобразования у больных с билатеральным рецидивирующим нефролитиазом

тановлено, что использование ПЦР-метода позволяет выявлять энтеропатогены в материале более 65 % больных, в том числе значительно (в 2,5 раза) увеличивая в сравнении с классическими методами частоту детекции бактериальных возбудителей. Показано, что значительно чаще, чем в качестве моновозбудителя, обнаружение Shigella spp. и Campylobacter spp. имеет место в ассоциациях бактериальных энтеропатогенов, а Salmonella spp. — в составе бактериально-вирусных ассоциаций. В материале пациентов с синдромом колита существенно чаще, чем у больных без колита, обнаруживается Shigella spp., в том числе в составе ассоциаций различных энтеропатогенов.

Ключевые слова: острые диареи, ПЦР-метод, синдром колита, ассоциации энтеропатогенов

SUMMARY

Е. А. Kozhukhova, V. D. Ioaschenko, I. V. Gorbova

Acute diarrhea agent detection for infection verification in adult patients

The paper presents the results of acute intestinal infectionanalysis in 262 adult patients with a moderate course of the disease. The PCR method has been found to be useful in detection of enteropathogenes in the feces of 65 % of the adult patients and to increase frequency of the bacterial pathogene detection. The percentage of cases positive for Shigella spp. or Campylobacter spp. in association with other bacterial agents and that for Salmonella spp. in combination with different viral agents is significantly higher than the percentage of cases with the mentioned bacteria detected as mono agents. The percentage of cases positive for Shigella spp. as the only agent or in combination with other enteropathogenes is significantly higher provided the colitis syndrome availability.

Key words: acute diarrhea, PCR-method, colitis syndrome, acute diarrhea agent association.

© Коллектив авторов, 2013 г. УДК [616.613-003.7-002.193]-084

М. И. Горбачев, С. Б. Ланда,

С. Х. Аль-Шукри, Ю. В. Эмануэль,

В. Я. Дубинский, В. Л. Эмануэль

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ МЕТА-ФИЛАКТИКА КАМНЕОБРАЗО-ВАНИЯ У БОЛЬНЫХ С БИЛАТЕРАЛЬНЫМ РЕЦИДИВИРУЮЩИМ НЕФРОЛИТИАЗОМ

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова; Петербургский институт ядерной физики НИЦ «Курчатовский институт»

ВВЕДЕНИЕ

Мочекаменная болезнь (МКБ) является важной проблемой во всех странах мира [1]. Больные МКБ составляют 30 — 40 % всего контингента урологических стационаров. Первичное и рецидивирующее камнеобразование является одним из наиболее значимых и в медико-демографическом отношении заболеваний.

Образование МКБ связано с физико-химическими процессами, при которых в результате превышения концентрации солей над порогом их растворимости в почечном фильтрате начинается образование кристаллов в почечных канальцах (лоханках) и их постепенный рост [6].

Таким образом, необходимо констатировать, что в настоящее время отсутствует единая система вторичной профилактики (метафилактики) камне-образования у больных, страдающих нефролити-азом.

Целью исследования явилось изучение биофизических различий биохимических форм БТХ при уролитиазе.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на биопробах 130 пациентов с уролитиазом, верифицированном в клинике урологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И. П. Павлова. Группу сравнения составил 51 человек без уролитиаза сопоставимого возраста и полового состава.

Выделение и очистка БТХ из мочи проводились модифицированным методом Тамма и Хорсвалла [7]. Исследование форм БТХ проводилось методом динамического светорассеяния на лазерном корреляционном спекрометре ЛКС («Интокс», Россия).

Исследование динамики разборки комплекса БТХ до мономеров проведено по изменению структурно-оптических характеристик раствора БТХ при воздействии гуанидингидрохлорида в концентрации 6 М через 5, 30, 60, 120, и 240 мин. Аналогичная технология использована при изучении влияния рН, концентрации одновалентных катионов и мочевины на взаимные переходы форм БТХ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

У здоровых лиц выделено три группы гистограмм распределения частиц БТХ по размерам. Основной вклад в светорассеяние в пробах здоровых лиц вносят частицы со средним гидродинамическим радиусом (И^ 97,9±4,93 нм, которые рассматриваются в предшествующих исследованиях как форма БТХ Т&НЕ(7). Их вклад в светорассеяние составляет 97,3±2,6 %. Согласно С. Л. ОЦукг е! а1. (1971),

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

I й'в'аг. С

такой гидродинамический радиус имеют частицы с ММ порядка 7 — 9 МD. Кроме основного пика, на гистограмме присутствуют пик частиц с Rh 368±35,0 нм с вкладом в светорассеяние в 2,6±0,93 %, что характерно для частиц около 400 нм, которые соответствуют форме БТХ Т&НЕ(28) [4].

У больных уролитиазом, кроме олигомеров Т&НЕ(7) с Rh = 105,2±1,96 нм, вклад которых в рассеяние составляет 41,1±2,36 %, присутствует значительное число олигомеров Т&НЕ(28) с Rh = 402±10,6 нм, вклад в рассеяние которых составляет 58,2±1,94 %. Однако среди больных уролитиазом выделена еще одна группа, в которой регистрируются крупные конгломераты, имеющие размер от 1500 нм, которые рассматриваются нами как агрегаты «свободной» формы БТХ Т&НЕ(28)Б с минеральными микрокристаллами (Т&НЕ(28)А). Такой тип распределения форм наблюдался у каждого 3-го больного уролитиазом. Результаты исследования взаимных переходов различных олигомерных форм БТХ показаны на рисунке. Для подтверждения такой схемы нами проведена модуляция этих форм БТХ под влиянием гидрохлорида гуанидина, приводящая к диссоциации белковых комплексов до мономеров. В первично монодисперсном образце мочи 97±2,6 % составляют частицы с Rh в 97,6±3,71 нм, а после добавления гидрохлорида гуанидина через 5 мин содержание этих частиц падает более чем в 10 раз — до 7,5±2,36 %, а вместо них регистрируются частицы с Rh =50,7±2,68 нм с вкладом в 92,5±2,68 %. После двух часов действия гидрохлорида гуанидина наблюдается заметное увеличение вклада в рассеяние частиц размером 5,03±0,05 нм в 17,6±3,8 %, через 3 часа -до 75,1±3,75 % и достигает практически полного (98,1±1,35) через 4 часа. Эти частицы можно отнести к мономерам БТХ, так как дальнейших изменений структурно-оптических характеристик не происходит.

Зависимость перехода формы Т&НЕ(7) в Т&НЕ(28) от ионной силы, катионного состава, рН и концентрации мочевины окружающего раствора оценивалась по убыли вклада в светорассеяние формы Т&НЕ(7).

Кривая имеет вид типичной «пороговой кривой» с точкой перегиба при концентрации 250 мМ для натрия и аммония и 150 мМ для калия. До этой концентрации образование формы Т&НЕ(28) идет медленно, а при достижении порога концентрации резко ускоряется.

У больных уролитиазом с преобладанием формы Т&НЕ(28)Б сказать что-нибудь о пороге образования формы Т&НЕ(28) невозможно, так как уже при 15 мМ концентрации натрия в образце остается менее 50 % формы Т&НЕ(7). В среде калия количество формы Т&НЕ(7) не превышает 12 % даже при 15 мМ.

Еще сильнее эта тенденция выражена в случае преобладания формы Т&НЕ(28)А. В натриевой среде 10 %-й уровень формы Т&НЕ(7) наблюдается при 40 мМ, в среде аммония - при 15 мМ, а в среде калия даже при 15 мМ вклад формы Т&НЕ(7) составляет не более 2 %.

Переход из формы Т&НЕ(7) в форму Т&НЕ(28) происходит и при увеличении кислотности раствора. Для нормального БТХ кривые зависимости количества формы Т&НЕ(7) от рН, так же как и в случае с одновалентными катионами, носят ярко выраженный пороговый характер. Резкое уменьшение содержания формы Т&НЕ(7) происходит при рН менее 4, т. е. вблизи изоэлектрической точки нормального БТХ. 10 %-й предел достигается при рН 3,5-4,0.

В случае, когда у обследуемого преобладает форма Т&НЕ(28)Б, кривая становится беспороговой уже при концентрации №С1, равной 150 мМ. При более низкой концентрации №С1 порог наблюдается в диапазоне рН 8,0-8,7. 10 %-й предел при этих концентрациях соли достигается при рН, близкой к 5. При концентрации соли 150 мМ 10 %-й предел наблюдается при рН = 6,2, а вблизи физиологического максимума - при рН близким к 7. При дальнейшем увеличении концентрации соли 10 %-й предел достигается при все более щелочных рН. При концентрации №С1 450 мМ 10 %-й предел достигается при рН = 8,7, а при 600 мМ №С1 - при рН=10.

В случае преобладания формы Т&НЕ(28)А пороговая кривая наблюдается только при концентрации соли 15 мМ. При этом точка перегиба находится при рН = 9,5, а 10 %-й предел достигается при рН = 6,5. Уже при концентрации соли 50мМ кривая становится беспороговой.

Ответ на вопрос о том, что же влияет на олигоме-ризацию БТХ - осмоляльность или суммарный заряд одновалентных катионов, получен при изучении влияния разных концентраций мочевины на переход Т&НЕ(7) в Т&НЕ(28)Б. Оказалось, что мочевина не оказывает влияния ни в случае, когда БТХ выделен у здорового человека, ни в случае БТХ при уролитиазе.

Основную протекторную функцию в моче несут формы Т&НЕ(7) и Т&НЕ(28). У здоровых людей в норме, когда концентрация солей в моче невысока и рН мочи находится в физиологическом интервале, БТХ существует в виде формы Т&НЕ(7). При повышении концентрации солей (т. е. ионной силы) или сильном снижении рН в моче происходит переход Т&НЕ(7)Т&НЕ(28). За счет повышенной жесткости форма Т&НЕ(28) существует в растворе в виде микрофибрил, которые образуют коллоидные структуры типа микрозоля, препятствующие агрегации микрокристаллов [2, 3, 8]. Если концентрация катионов в моче снижается, происходит обратный переход Т&НЕ(28)—Т&НЕ(7) и система

возвращается в исходное состояние. Таким образом, можно заключить, что биофизическая система здоровых людей, в основе которой находится БТХ, имеет некий «запас прочности», препятствующий образованию олигомерной формы Т&НЕ(28) до пороговой концентрации в 250 — 300 мМ и рН, близкой к 4. Этот порог, скорее всего, обеспечивается сильным отрицательным зарядом на поверхности данной формы, который возникает из-за высокого содержания сиаловых кислот в молекуле нормального БТХ. При превышении порога начинается массовое образование формы Т&НЕ(28) (рисунок).

У больных уролитиазом данные «защитные механизмы», препятствующие агрегации формы Т&НЕ(7), оказываются минимальными или исчерпанными, и образование формы Т&НЕ(28) начинается уже в физиологическом интервале значений рН и ионной силы мочи. Скорее всего, данный феномен связан с тем, что у больных уролитиазом имеется «биологический дефект» БТХ, возникающий на посттрансляционном уровне и связанный с де-сиалированием БТХ и преобладанием форм, собранных из мономеров с низким поверхностным зарядом. Захват кристаллов солей мицеллами Т&НЕ(28) приводит к образованию устойчивых макрочастиц геля, выступающих центрами кристаллизации и образования конкрементов.

По совокупности полученных данных предложен следующий диагностический алгоритм. Пробу мочи разделяют на два одинаковых образца и к одному из них добавляют реагент для идентификации БТХ, в качестве которого используют специфичные антитела к БТХ, вступающие с ним в имунно-афинную реакцию, и белок А из Staphilococcus aureus, иммобилизованный на ага-розных микросферах. Белок А неспецифически связывает иммуноглобулины за F-домен тяжелых цепей, которые, в свою очередь, специфически связывают БТХ. Эту пробу мочи со специфическими антителами к БТХ центрифугируют для осаждения всех форм БТХ. Далее с помощью метода динамического светорассеяния получают гистограммы распределения частиц по размерам в обоих образцах. Путем сравнения гистограмм распределения обоих проб идентифицируют олиго-мерные формы БТХ: T&H(7) в диапазоне Rh 90-110 нм, T&H(28)F в диапазоне Rh370-500 нм и T& Н(28)А в диапазоне Rh 1500-5000 нм по наличию соответствующих пиков на гистограмме нативной мочи (т. е. в образце, оставленном без воздействий) и одновременному отсутствию данных пиков на гистограмме супернатанта другого образца. Вычисляют вклад в суммарное рассеяние (в %) олигомер-ных форм БТХ путем расчета площадей под

ччя  т

ЙМ-Шш

Формы белка Тамма — Хорсфалла и их взаимные переходы

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

Ф}

. <! № С

соответствующими пиками по отношению к суммарной площади всех пиков на гистограмме.

Выявленное нами преобладание при уролитиа-зе формы T&HE(28), наличие свободной T&HE(28)F и связанной с неорганическими компонентами T&HE(28)A послужило основанием для расчета диагностических критериев уролитиаза: соотношение вкладов в рассеяние форм T&HE(28)A/T&H(7) (коэффициент C,) и T&HE(28)F/T&H(7) (коэффициент С2). ROC-анализ позволяет установить величины решающего порога (cut off) для этих коэффициентов.

Исходя из величин решающего порога, уроли-тиаз диагностируют следующим образом:

— при Cj<0,1 и С2<1,81 констатируют отсутствие заболевания;

— при C <1,5 и С2 >1,81 диагностируют группу риска развития уролитиаза;

— при соотношении C(>1,5 и любом значении С2 диагностируют наличие уролитиаза.

Итак, наличие формы T&H(28)A уже вполне определенно характерно для уролитиаза, так как содержат макромолекулярные соединений органического матрикса — БТХ T&HE(28) и неорганического лиган-да (чаще всего оксалат кальция). Эти макромолекулы, переходя в состояние геля, становятся центром кристаллизации солей и образования конкрементов с последующей их верификацией инструментальными методами и развития клиники мочекаменной болезни. Свойства динамической биофизической системы «золь — гель», состоящей из форм БТХ T&HE, могут индивидуально долгое время сохранять свойства «золя», способствуя выведению значительного количества микрокристаллов в форме БТХ T&HE(28)A. Частое увеличение концентрации солей щавелевой кислоты, в том числе при увеличении осмоляльности мочи, а также приближение рН мочи к изоэлектри-ческой точке БТХ приводит к сдвигу системы в зону «геля» с последующим запуском процесса кристаллизации и образования конгломератов в мочевых путях. Диагностическая эффективность метода составила 98 %.

Таким образом, сочетание специфической биохимической и высокочувствительной биофизической технологии позволяет выявлять наличие биологического дефекта системы саногенеза, т. е. условия для патологического кристаллообразования.

ЛИТЕРАТУРА

1. Coe F. L., Evan A., Worcester E. Kidney stone disease // J. Clin. Invest. - 2005. - Vol. 115. - № 10. - Р. 2598-2608.

2. GroverP. K. et al. Inhibition of growth and aggregation of calcium oxalate crystals in vitro: A comparison of four human proteins // Eur. J. Biochem. - 1998. - № 253. - Р. 637-644.

3. Hess B., Nakagawa Y., Coe F. L. Inhibition of calcium oxalate monohydrate crystal aggregation by urine proteins // Am. J. Physiol. - 1989. - № 26. - Р. 99- 106.

4. Maxfild M., Wolins W. A molecular abnormality of urinary mucoprotein in cystic fibrosis of the pancreas // J. Clin. Invest. -1962. - № 41. - Р. 455-462.

5. Olivkr С. J. et al. Determination of the Diffusion Coefficient and Molecular Weight of Tamm-Horsfall Glycoprotein by Intensity Fluctuation Spectroscopy // BIOPOLYMERS. - 1971. -Vol. 10. - № 9. - Р. 1731- 1733.

6. Parks J. H., Coward M., Coe F. L. Correspondence between stone formation and urine supersaturation in nephrolithiasis // Kidney Int. - 1997. - Vol. 51. - P. 894-900.

7. Tamm I., HorsfallF. L. Jr. Characterization and separation of an inhibitor of viral hemagglutination present in urine // Proc. Soc. Exp. Biol.. - 1950. - № 74. - Р. 108.

8. Worcester E. M. Urinary calcium oxalate crystal growth inhibitors // J. Am. Soc. Nephrol. - 1994. - № 5. - Р. 46-53.

РЕЗЮМЕ

М. И. Горбачев, С. Б. Ланда, С. Х. Аль-Шукри, Ю. В. Эмануэль, В. Я. Дубинский, В. Л. Эмануэль

Патогенетическая метафилактика камнеобразования у больных с билатеральным рецидивирующим нефроли-тиазом

Проведено исследование взаимосвязи наличия различных олигомерных форм белка Тамма-Хорсфалла в моче у 51 здорового и 130 больных уролитиазом с физико-химическими процессами мочеобразования. Верификация форм белка Тамма-Хорсфалла проводилась биофизическим методом динамического светорассеивания. Модификация форм белка проводилась при воздействии гуанидингид-рохлорида, а также в модельных условиях при изменении pH, концентрации одновалентных катионов и мочевины. Разработан эффективный диагностический алгоритм оценки структурно-оптических характеристик мочи для ранней диагностики уролитиаза.

Ключевые слова: белок Тамма-Хорсфалла, динамическое светорассеивание, лазерный корреляционный спектрометр, биофизика, ионная сила, рН.

SUMMARY

M. I. Gorbachev, S. B. Landa, S. H. Al-Shukry, U. A. Emanuel, V. J. Dubinsky, V. L. Emanuel

Pathogenetic metaphylaxis of stone formation in the patients with bilateral relapsing nephrolithiasis

Correlation between the presence of different forms of Tamm-Horsfall was studied in the urine of 51 healthy people and 130 patients with urolithiasis with physical and chemical processes of urine formation. Verification of Tamm-Horsfall protein forms was carried out by biophysical means of dynamic light scattering. Modification of the protein forms was conducted under the effect of guanidine hydrochloride as well as in the model settings at the time of changes in the pH and concentration of monovalent cations and urea. An efficient algorithm for diagnostic assessment of structural and optical properties of urine for early diagnosis of urolithiasis was developed.

Key words: Tamm-Horsfall protein, dynamic light scattering, laser correlation spectrometer, biophysics, ionic strength, pH.