ИНОКУЛЯТ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПРЯМОЙ ИНОКУЛЯЦИИ МОЛОЧНОГО СУБСТРАТА Bifidobacterium animalis lactis И СОДЕРЖАЩИЙ L-ЦИСТЕИН, И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
INOCULATE USED FOR DIRECT INOCULATION OF LACTIC SUBSTRATUM Bifidobacterium animalis lactis AND CONTAINING L-CYSTEIN, AND ITS USE

Область техники
Настоящее изобретение относится к гранулам цистеина и их применению в качестве активатора роста Bifidobactehum animalis ssp. lactis.
Уровень техники
Рынок пробиотиков в области молочных продуктов находится в состоянии постоянного роста. При получении продуктов, содержащих повышенные количества штаммов пробиотиков при одновременном придании им желательных органолептических свойств, производители молочной продукции сталкиваются с проблемами, связанными со смешанной ферментацией, в которой используют как так называемые технические или технологические, так и пробиотические микроорганизмы.
На практике штаммы, называемые пробиотическими, представляют собой виды, которые медленно растут на молочном субстрате (продолжительность клеточного цикла от 1 до 2 ч для Bifidobacterium), технологические микроорганизмы получают из йогуртовых культур, отличающихся сравнительно быстрым ростом (продолжительность клеточного цикла от 15 до 30 мин для S.thermophilus и L.bulgaricus).
6
7
8
Удовлетворительного компромисса между ростом технологических и пробиотических микроорганизмов трудно достичь, и большинство производителей предпочитают улучшение органолептических свойств повышению количества пробиотиков: обычно наблюдаемое количество пробиотиков составляет 10-10КОЕ/г ферментированного продукта. В настоящее время большинство санитарно-гигиенических исследований с использованием пробиотиков выполняют на продуктах, содержащих не менее 10 КОЕ/г пробиотических штаммов.
Поиск соединений, являющихся активаторами роста пробиотиков, основан на углубленных исследованиях штамма на его потребности в питательных веществах и способности молочного субстрата к удовлетворению указанной потребности. С другой стороны, необходимо убедиться, что указанные соединения не оказывают негативного действия и не стимулируют рост технологических штаммов, имеют качество, удовлетворительное для пищевых продуктов, и не ухудшают органолептических свойств продукта.
Однако количество соединений-активаторов, которое необходимо использовать для обеспечения стимулирующего действия и которое удовлетворяет указанным требованиям, обычно является очень небольшим по отношению к количеству молочного субстрата. Подобные дозы (обычно менее 100 мг/л) и допустимые отклонения несовместимы с системами дозирования и ввода, применяемыми при изготовлении молочных субстратов, что делает промышленное применение подобных соединений проблематичным.
Проблема еще более усложняется, когда применяемые технологические штаммы должны функционировать в симбиозе нескольких штаммов молочнокислых бактерий, как в случае ферментированного молока, для получения которого помимо ферментации молока под действием пробиотиков применяют симбиотическую ферментацию микроорганизмами S.thermophilus и L.bulgaricus.
Из уровня техники известны различные методики определения условий, благоприятствующих росту пробиотиков. Однако большинство указанных тестов проводили на чистых культурах пробиотических бактерий без учета возможного присутствия и деятельности других штаммов молочнокислых бактерий в ходе производства продукта в промышленном масштабе.
Одно из решений данной проблемы описано в заявке на патент Франции FR 0507529, поданной компанией Compagnie Gervais Danone 15 июля 2005 г. В указанной заявке в качестве активатора бифидобактерий предложено применять серосодержащую аминокислоту.
В настоящей заявке предложено дальнейшее усовершенствование этого изобретения, которое специально адаптировано для штамма Bifidobacterium animalis ssp.lactis. Соответственно в настоящей заявке на изобретение предложен инокулят, который позволяет избежать описанных выше проблем, существующих в уровне техники, и обеспечивает простую, надежную и эффективную активацию и/или стимуляцию В. animalis lactis в ходе промышленного изготовления ферментированного молочного продукта, имеющего пробиотическую ценность, предназначенного для употребления человеком, в частности, ферментированного молочного продукта, в котором, помимо ферментации под действием пробиотика В. animalis lactis, применяют симбиотическую ферментацию под действием S.thermophilus и L.bulgaricus.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к усовершенствованному инокуляту Bifidobacterium animalis ssp. lactis, к применению указанного инокулята и к ферментированным молочным продуктам, полученным при помощи указанного инокулята. Инокулят согласно настоящему изобретению специально приспособлен для прямой инокуляции молочного субстрата по меньшей мере одним штаммом В. animalis lactis на для превращения указанного субстрата в ферментированный молочный продукт, пригодный для употребления человеком, в частности, в молочный продукт, обладающий пробиотической ценностью, содержащий по меньшей мере один штамм В. animalis lactis.
2
2
2
Инокулят содержит в форме смеси или комбинации замороженные гранулы и/или лиофилизат(ы), в состав которых входят особая форма L-цистеина и по меньшей мере один штамм В. animalis lactis. Авторы настоящего изобретения выбрали особую форму L-цистеина, а именно L-цистеин, гранулы и/или лиофилизат(ы), полученные на основе которого после замораживания и/или растворения обладают значением pH не менее 4. Примером подходящего L-цистеина является L-цистеин, обычно называемый основной формой цистеина (формулу которого можно представить следующим образом: HSCHCH(NH)COH). Данная особая форма цистеина является более эффективной, чем другие обычно применяемые формы цистеина (обычно цистеин-HCl в форме моногидрата гидрохлорида цистеина). Несмотря на слабую растворимость данной особой формы L-цистеина, выбранной авторами настоящего изобретения, последним удалось получить инокулят в форме замороженных гранул и/или лиофилизата (лиофилизатов), в которых клетки В.animalis lactis и указанная особая форма L-цистеина скомбинированы или объединены без ущерба для физиологического состояния и/или метаболизма В.animalis lactis.
В так называемом "объединенном (совмещенном)" варианте реализации инокулята согласно настоящему изобретению по меньшей мере одна гранула или лиофилизат инокулята одновременно содержит клетки В.animalis lactis и указанную особую форму L-цистеина.
В так называемом "комбинированном" варианте реализации часть гранул или один из лиофилизатов содержит особую форму L-цистеина согласно настоящему изобретению, а другая часть гранул или другой лиофилизат - клетки В.animalis lactis.
7
8
Таким образом, в настоящем изобретении предложена «комбинированная» или «объединенная» форма инокулята В.animalis lactis, содержащего цистеин в качестве активатора. Следует отметить, что инокулят согласно настоящему изобретению позволяет получить популяцию указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В.animalis lactis, если таковых несколько), численность которой не падает ниже 5·10 КОЕ, предпочтительно не ниже 10 КОЕ на один грамм ферментированного продукта в течение по меньшей мере 20 дней, предпочтительно в течение по меньшей мере 30 дней хранения указанного продукта при температуре от 4 до 11°С (см. фиг.8 и 9).
Инокулят согласно настоящему изобретению специально приспособлен для производства ферментированного молока с высокой пробиотической ценностью, поскольку он позволяет поддерживать очень высокое содержание В.animalis lactis в ходе хранения указанного продукта в условиях охлаждения и также благодаря тому, что он содержит в качестве активатора конкретную форму L-цистеина в таких дозах, которые не оказывают негативного влияния ни на симбиоз S.Thermophilus и L.bulgaricus, ни на органолептические качества ферментированного молока.
Краткое описание Фигур
Настоящая заявка на патент содержит ссылки на следующие фигуры:
Фиг.1 - принципиальная схема:
- «комбинированного» варианта реализации, согласно которому предложено получать комбинацию из гранул по меньшей мере одного пробиотического микроорганизма и гранул цистеина, которые затем, возможно, смешивают;
- «совмещенного» варианта реализации, согласно которому предложено получать гранулы, которых совместно содержат по меньшей мере один пробиотический микроорганизм и цистеин.
Фиг.2 - принципиальная схема получения гранул согласно «совмещенному» варианту реализации (цистеин-HCl + по меньшей мере один пробиотический микроорганизм): микроорганизм Bifidobacterium animalis lactis, штамм I-2494 или ВВ12 в форме гранул, совместно содержащих пробиотический микроорганизм и цистеин, причем последний в данном случае представляет собой цистеин-HCl.
Фиг.3 - изменение во времени значения pH молочной смеси, инокулированной:
- гранулами Bifidobacterium animalis lactis штамма 1-2494 (контрольный эксперимент, нижняя кривая), либо
- гранулами, совместно содержащими Bifidobacterium animalis lactis штамма 1-2494 и цистеин-HCl (верхняя кривая).
Показано ухудшение физиологического состояния пробиотика Bifidobacterium animalis lactis при его введении в состав гранул совместно с цистеином-HCl (композиция, полученная по «совмещенному» варианту, содержащая цистеин-HCl).
Фиг.4 - принципиальная схема получения гранул по «совмещенному» варианту (основный цистеин + по меньшей мере один пробиотический микроорганизм): микроорганизм Bifidobacterium animalis lactis штамма 1-2494 или ВВ12 в форме гранул, совместно содержащих пробиотический микроорганизм и цистеин, причем последний в данном случае представляет собой основный цистеин.
Фиг.5 - изменение во времени значения pH молочной смеси, инокулированной:
- гранулами Bifidobacterium animalis lactis штамма I-2494 (контрольный эксперимент, нижняя кривая), либо
- гранулами, совместно содержащими Bifidobacterium animalis lactis штамма 1-2494 и основный цистеин (кривая сверху).
Показано, что выбор основного цистеина для введения в состав гранул, полученных по «совмещенному» варианту (Bifidobacterium animalis lactis + цистеин), обеспечивает отсутствие негативного влияния на физиологическое состояние указанного пробиотика.
Фиг.6-9: сравнение молочных смесей,
- инокулированных замороженными гранулами технологических микроорганизмов (смесь гранул S.thermophilus 1-1630, L.bulgaricus 1-1632 и L.bulgaricus I-1519) и замороженными гранулами пробиотического микроорганизма Bifidobacterium animalis lactis (штамма ВВ12 или 1-2494) в количестве 0,5 г/л, и
- в которые добавлен основный цистеин в форме гранул, отличных от гранул пробиотического микроорганизма (комбинированное решение G4), или в форме, включенной в гранулы пробиотического микроорганизма (совмещенный вариант G4I) в сравнении с контрольной смесью, в которую вместо цистеина добавили воду.
Фиг.6 и 7 - изменение pH в зависимости от времени (в часах).
Фиг.8 и 9 - изменение количества биомассы (в КОЕ/мл) в зависимости от времени (в сутках) в ходе хранения ферментированного молочного продукта при 10°С.
Фиг.6 и 8 - данные, полученные для пробиотического микроорганизма Bifidobacterium animalis lactis штамма ВВ12:
- молочная смесь ВВ12 Т - молочная смесь, на которую произведен посев смеси гранул технологических микроорганизмов и контрольных гранул микроорганизма Bifidobacterium ВВ12 (вместо цистеина гранулы содержат воду) в количестве 0,5 г/л;
- молочная смесь ВВ12 G4 - молочная смесь, на которую произведен посев аналогично посеву на молочную смесь ВВ12 Т, т.е. смеси гранул технологических микроорганизмов и контрольных гранул микроорганизма Bifidobacterium ВВ12 в количестве 0,5 г/л с дополнительным добавлением основного цистеина в форме замороженных гранул, отличных от гранул пробиотика, с получением концентрации цистеина в смеси, равной 7,5 мг/л;
- молочная смесь ВВ12 G4I - молочная смесь, на которую произведен посев смеси гранул технологических микроорганизмов и гранул, полученных по совмещенному варианту, содержащих микроорганизм Bifidobacterium BB12 в количестве 0,5 г/л, причем указанные гранулы пробиотика содержат основный цистеин, с получением концентрации цистеина в смеси, равной 7,5 мг/л.
Фиг.7 и 9: данные для пробиотического микроорганизма Bifidobacterium animalis lactis штамма I-2494:
- молочная смесь I-2494 Т - молочная смесь, на которую произведен посев смеси гранул технологических микроорганизмов и контрольных гранул микроорганизма Bifidobacterium I-2494 (вместо цистеина гранулы содержат воду) в количестве 0,5 г/л;
- молочная смесь I-2494 G4 - молочная смесь, на которую произведен посев аналогично посеву на молочную смесь I-2494 Т, т.е. смеси гранул технологических микроорганизмов и контрольных гранул микроорганизма Bifidobacterium I-2494 в количестве 0,5 г/л с дополнительным введением основного цистеина в форме замороженных гранул, отличных от гранул пробиотика, с получением концентрации цистеина в смеси, равной 7,5 мг/л;
- молочная смесь I-2494 G4I - молочная смесь, на которую произведен посев смеси гранул технологических микроорганизмов и гранул, полученных по «совмещенному» варианту, содержащих микроорганизм Bifidobacterium I-2494 в количестве 0,5 г/л, причем указанные гранулы пробиотика содержат основный цистеин, с получением концентрации цистеина в смеси, равной 7,5 мг/л.
Подробное описание изобретения
Некоторые определения
В настоящей заявке все термины использованы в смысле и в значении, которые они обычно имеют в области молочной и/или пищевой промышленности. Так, в случае упоминания "молочной ферментации" речь идет о молочнокислой ферментации, результатом которой является подкисление вследствие образования молочной кислоты, которое может сопровождаться образованием других кислот, двуокиси углерода и различных веществ, в том числе экзополисахаридов (EPS) и веществ, обладающих запахом, в том числе диацетила и ацетальдегида. Под "молочнокислым микроорганизмом" (лактобактерией) понимают живой или жизнеспособный микроорганизм или штамм микроорганизма, способный осуществлять указанную молочнокислую ферментацию на молочном субстрате. Термин "ферментированное молоко" имеет значение, обычно используемое в молочной промышленности, т.е. продукты, предназначенные для употребления животными, в частности человеком, и являющиеся результатом молочнокислой ферментации молочного субстрата. Подобные продукты могут содержать другие ингредиенты, в том числе фрукты, растения, сахара, ароматизаторы и т.д.
Название "ферментированное молоко" соответствует строгим официальным нормам. Так, можно обратиться к Codex Alimentarius (Свод Правил производства и распространения пищевых продуктов, подготовленный Комиссией по Codex Alimentarius при ФАО и ВОЗ, опубликованный Информационным отделом ФАО и доступный в сети Интернет по адресу http://codexalimentarius.net; см., в частности, том 12 Codex Alimentarius "Терминология для молока и молочных продуктов" и стандарту "CODEX STAN А-11(а)-1975", содержание которых включено в настоящее описание путем ссылки). В частности, можно обратиться к Постановлению Правительства Франции №88-1203 от 30 декабря 1988 г., касающееся ферментированного молока и йогуртов (яуртов), опубликованному в Journal Officiel de la République Française 31 декабря 1988 г. Содержание указанного Постановления включено в настоящее описание путем ссылки.
Таким образом, в настоящей заявке термин "ферментированное молоко" относится к продукту, приготовленному с использованием молочного субстрата, подвергнутого обработке, по меньшей мере эквивалентной пастеризации, на который произведен посев микроорганизмов, т.е. который инокулировали микроорганизмами, принадлежащими к виду, характерному для каждого продукта. При этом недопустимо свертывание "ферментированного молока" путями, отличными от путей, являющихся следствием активности применяемых микроорганизмов.
"Ферментированное молоко" не подвергают никаким видам обработки, позволяющим извлечь составной элемент используемого молочного субстрата, в частности, отделению сгустка. К "ферментированному молоку" могут быть добавлены один или несколько экстрактов душистых веществ, один или несколько природных ароматизаторов, а также один или несколько сахаров, других специальных пищевых продуктов, придающих особый вкус, или злаков в количестве не более 30% от массы готового продукта. Введение в состав подобных продуктов заменителей жиров и/или белков немолочного происхождения недопустимо. Количество свободной молочной кислоты, содержащейся в ферментированном молоке при продаже потребителю, не должно быть меньше 0,6 г на 100 г; содержание дополнительных белковых веществ по отношению к доли молока не должно быть ниже, чем у обычного молока.
Термин "молочный субстрат" в настоящей заявке обозначает "молоко" в смысле, обычно используемом в молочной промышленности, т.е. субстрат, содержащий только молоко и/или составные части молока и имеющий такой состав, что молочная ферментация подобного молочного субстрата штаммами по меньшей мере одной молочной бактерии, в том числе S.thermophilus и/или L.bulgaricus, приводит к получению продукта, пригодного для питания человека, в частности, субстрата, соответствующего термину "ферментированное молоко". Таким образом, термин "молочный субстрат" охватывает молоко животного происхождения во всех формах и во всех вариантах состава, в том числе обезжиренное или не обезжиренное, сгущенное или обычное, подвергнутое или не подвергнутое ультрафильтрации, свежее или нет, порошковое или обычное, восстановленное или невосстановленное, модифицированное или немодифицированное, обогащенное или не обогащенное какими-либо составляющими, изготовленное с добавками технологических агентов или агентов, улучшающих его качество, в том числе вкусовых добавок, ароматизаторов, сахаров и т.д., или изготовленное без добавления таковых молоко. Например, молочный субстрат, предназначенный для изготовления ферментированного молока, может содержать обезжиренное молоко, сливки и порошок обезжиренного молока (см. пример 1 ниже).
Однако значение термина "молочный субстрат" не включает в себя "питательную среду". На практике термин "питательная среда" означает среду, предназначенную для ускорения или стимуляции роста молочнокислых бактерий и/или и получения с ее применением инокулята молочнокислых бактерий, тогда как термин "молочный субстрат" означает среду, предназначенную для превращения путем ферментации с получением продукта, предназначенного для употребления человеком. Так, многочисленные соединения, которые могут быть добавлены в питательную среду с целью стимуляции или ускорения роста молочнокислых бактерий и/или, нельзя добавить в молочный субстрат при получении ферментированного молока или йогурта.
Указанное применимо к следующим соединениям:
- многочисленные поверхностно-активные вещества, и/или эмульгаторы, и/или солюбилизирующие агенты, и/или моющие средства, в том числе полиоксиэтиленсорбитан-20-моноолеат (также известный под названиями полисорбат-80 или твин-80);
- кислоты наподобие лимонной и уксусной;
- экстракты мяса;
- растительные пептоны;
- глицерофосфаты.
Наиболее часто используемые кисломолочные микроорганизмы включают следующие кисломолочнокислые бактерии:
- Streptococcus thermophilus (например, штамм 1-1630, доступный в CNCM);
- Lactobacillus delbrueckii ssp.bulgahcus, или Lactobacillus bulgaricus (например, штаммы 1-1519 и 1-1632, доступные в CNCM);
- Pediococcus acidilacti;
- Leuconostoc, в том числе Leuconostoc cremoris, Leiconostoc dextranicum и Leuconostoc lactis;
- Lactobacillus, в том числе Lactobacillus acidophilus (например, штамм I-0967, доступный в CNCM), Lactobacillus casei (например, штамм I-518, доступный в CNCM), Lactobacillus helveticus и Lactobacillus delbrueckii ssp.lactis (например, штамм I-2843, доступный в CNCM);
- Lactococcus, в том числе Lactococcus cremoris, Lactococcus lactis ssp. lactis (например, штамм I-1631, доступный в CNCM) и Lactococcus lactis ssp. lactis разновидности diacetylactis (например, штамм I-2806, доступный в CNCM);
- Bifidobactehum, в том числе Bifidobactehum animalis lactis (например, штамм I-52494, доступный в CNCM, или штамм, поставляемый на рынок компанией Chr. Hansen под маркой ВВ12), Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum и BifidobacteriLim infantis.
Пробиотические молочнокислые бактерии определяют как живые молочнокислые бактерии, которые при употреблении в достаточных количествах оказывают благоприятное действие на организм человека, помимо их исходной питательной ценности (официальное определение Всемирной организации здравоохранения). Пробиотические молочнокислые бактерии включают в себя, в частности, следующие молочнокислые бактерии:
- Lactobacillus, в том числе Lactobacillus acidophilus (например, штамм I-0967, доступный в CNCM), Lactobacillus casei (например, штамм I-518, доступный в CNCM), Lactobacillus helveticus и Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis (например, штамм I-2843, доступный в CNCM);
- Bifidobacterium, в том числе Bifidobacterium animalis lactis (например, штамм I-202494, доступный в CNCM, или штамм, поставляемый на рынок компанией Chr. Hansen под маркой ВВ12), Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum и Bifidobacterium infantis.
Пробиотические молочнокислые бактерии - это не просто пищевые добавки, которые достаточно в большем количестве добавить в молочный продукт. Они представляют собой живые бактерии, которые осуществляют молочнокислую ферментацию, и на их метаболизм влияют условия, в которых они находятся в ходе изготовления ферментированного молочного продукта и затем в ходе хранения ферментированного молочного продукта до истечения срока годности. Срок хранения зависит от срока консервации (годности), установленного текущим законодательством. Для свежих ферментированных молочных продуктов, в том числе ферментированного молока, срок годности составляет 30 дней с даты изготовления.
Под технологическим микроорганизмом, бактерией или штаммом в настоящей заявке понимают микроорганизм, бактерию или штамм, оказывающий влияние на структуру и/или консистенцию ферментированного молочного продукта в противоположность микроорганизмам, бактериям или штаммам, имеющим прежде всего пробиотическую функцию. Например, ферментированное молоко может быть изготовлено путем симбиотической ферментации L.bulgaricus - S.thermophilus при одновременном использовании по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis в качестве пробиотического штамма. В данном случае технологическими штаммами являются штаммы S.thermophilus и L.bulgaricus.
Задачи и объекты изобретения
Настоящее изобретение относится к инокуляту, специально адаптированному для прямой инокуляции молочного субстрата по меньшей мере одним штаммом Bifidobacterium animalis ssp. lactis с превращением указанного молочного субстрата в ферментированный молочный продукт, пригодный для употребления человеком и имеющий пробиотическую ценность, а также к применению указанного инокулята в производстве таких молочных продуктов. В частности, инокулят согласно настоящему изобретению подходит для производства ферментированного молочного продукта, получаемого путем ферментации молочного субстрата пробиотиком В.animalis lactis и симбиотической системой S.thermophilus - L.bulgaricus. Подобный продукт содержит по меньшей мере один штамм S.thermophilus, по меньшей мере один штамм L.bulgaricus и по меньшей мере один штамм В.animalis lactis в живой форме.
Инокулят согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один штамм В.animalis lactis.
Инокулят согласно настоящему изобретению содержит особую форму цистеина, а именно L-цистеин, имеющий такую форму, что гранулы и/или лиофилизат(ы), полученные с использованием указанной формы L-цистеина, имеют такой состав, что pH раствора, полученного путем:
2
размораживания (оттаивания) указанной по меньшей мере одной гранулы и/или растворения (ре-солюбилизации) указанного по меньшей мере одного лиофилизата в отношении, составляющем от 1 до 2 г лиофилизата на 8-10 мл HO, составляет не менее 4.
2
2
2
2
2
2
Указанное значение pH предпочтительно не превосходит 8. Для этого предпочтительным является выбор цистеина в такой форме, которая обеспечивает, чтобы pH содержащего его раствора составлял более 4. Например, раствор, содержащий 1,25 г указанной формы цистеина на 50 мл воды, обладает значением pH от 4,5 до 5,5. Примером такой формы цистеина является L-цистеин, обычно называемый основным цистеином (или L-цистеином в основной форме). Формулу L-цистеина можно представить следующим образом: HSCHCH(NH)COH. Основный цистеин отличается от цистеина-HCl и не является ни гидрохлоридом цистеина, ни моногидратом гидрохлорида цистеина. Выбор указанной особой формы цистеина является результатом выбора среди различных доступных форм цистеина. Указанная особая форма цистеина усваивается В.animalis lactis и является активатором роста B.animalis lactis на молочном субстрате. Такой цистеин пригоден для употребления человеком. Он соответствует законодательным актам, касающимся ферментированных молочных продуктов, предназначенных для употребления человеком. Кроме того, такая особая форма цистеина позволяет стимулировать рост или по меньшей мере метаболизм В.animalis lactis и не оказывает влияния на метаболизм других молочнокислых бактерий, не являющихся пробиотиками, в частности, на ферментацию молока, осуществляемую симбиотической системой S.thermophilus - L.bulgaricus. Помимо всех указанных свойств указанная особая форма цистеина позволяет получать так называемый объединенный инокулят, содержащий совместно указанный по меньшей мере один штамм В.animalis lactis и цистеин в одной и той же физической структуре при отсутствии негативного влияния на рост или по меньшей мере на метаболизм указанного штамма В.animalis lactis. В наиболее предпочтительном случае инокулят согласно настоящему изобретению не содержит цистеин в кислой форме, такой как цистеин-HCl (гидрохлорид L-цистеина формулы HSCHCH(NH)COH·HCl).
2
2
2
Инокулят согласно настоящему изобретению представлен в конкретной физической форме. Он может иметь форму по меньшей мере одной замороженной гранулы и/или по меньшей мере одного лиофилизата. Подобная конкретная форма инокулята особенно подходит для прямого посева (прямой инокуляции). Выбор упомянутой конкретной формы цистеина позволяет получать инокулят в указанной конкрентной физической форме, являющейся особенно активной. Выбор конкретой формы L-цистеина согласно настоящему изобретению позволяет смешивать между собой указанный по меньшей мере один штамм В.animalis lactis и указанный цистеин с получением замороженных гранул и/или по меньшей мере одного лиофилизата, совместно содержащих указанный штамм В.animalis lactis и указанный цистеин внутри одной и той же гранулы и/или одного и того же лиофилизата при отсутствии негативного влияния на рост или по меньшей мере на метаболизм указанного штамма В.animalis lactis. Подобные результаты невозможно получить при использовании цистеина в кислой форме, например, такого как цистеин-HCl (гидрохлорид L-цистеина формулы HSCHCH(NH)COH·HCl) вместо основного L-цистеина.
Таким образом, авторами настоящего изобретения предложены замороженная гранула или лиофилизат, совместно содержащие клетки указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis и указанную особую форму L-цистеина. Подобные замороженная гранула или лиофилизат могут быть названы инокулятом В.animalis lactis, объединенным с активатором. Подобные замороженная гранула или лиофилизат являются предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения.
Другой путь, отличный от объединения с активатором, состоит не в введении активатора и одну гранулу или в один лиофилизат совместно со штаммом В. animalis lactis, а в получении раздельных замороженных гранул или лиофилизатов.
Возможно, например, получение и комбинирование между собой в форме смеси или сочетания («набора составных частей»):
- замороженных гранул, содержащих клетки указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis, и других замороженных гранул, содержащих указанную особую форму L-цистеина (с получением «комбинированных» гранул в отличие от «объединенных»);
- лиофилизата, содержащего клетки указанного по меньшей мере одного штамма S.animalis lactis, и другого лиофилизата, содержащего указанную особую форму L-цистеина (с получением «комбинированного» лиофилизата в отличие от);
- замороженных гранул, содержащих клетки указанного по меньшей мере одного штамма B.animalis lactis, и лиофилизата, содержащего указанную особую форму L-цистеина либо наоборот (комбинация гранул или лиофилизата (ов));
- сочетания подобных вариантов реализации.
Подобные инокуляты являются прямой альтернативой замороженным гранулам «совмещенного» варианта или лиофилизатам «совмещенного» варианта, поскольку они сочетают средства согласно настоящему изобретению в различных физических формах между собой. В настоящем описании подобные инокуляты называются "комбинированными" и являются объектом настоящей заявки.
На фиг.1 показаны способ изготовления гранул «совмещенного» варианта и способ изготовления комбинированных гранул согласно настоящему изобретению.
Технический результат настоящего изобретения достигается благодаря использованию конкретной формы цистеина (предпочтительно, основного L-цистеина) в сочетании с созданием особой физической формы (замороженные гранулы и/или лиофилизат(ы)), специально адаптированной для прямой инокуляции.
Кроме того, инокулят согласно настоящему изобретению специально адаптирован для стимуляции роста штаммов В.animalis lactis. Он может не подходить для стимуляции роста других видов или родов пробиотических бактерий.
Для стимуляции роста штаммов В.animalis lactis необходим активатор роста, оказывающий положительное влияние на рост или по меньшей мере на метаболизм В.animalis lactis при отсутствии негативного или пагубного влияния на консистенцию, структуру, а также санитарные и вкусовые качества получаемого ферментированного молочного продукта. Данная проблема является особенно трудноразрешимой в случае получения ферментированных молочных продуктов, которые, помимо В.animalis lactis, требуют использования других молочнокислых бактерий. В самом деле, все виды используемых молочнокислых бактерий не обязательно характеризуются одинаковым метаболизмом, и условия, благоприятные для одного вида или рода, не обязательно являются благоприятными для другого вида или рода. Поэтому нахождение условий ферментации молока, подходящих для совокупности используемых штаммов, может быть затруднительным. К данному факту добавляется тот факт, что для успешного получения качественных и удовлетворяющих санитарным нормам ферментированных молочных продуктов ферментация молока должна соответствовать особым ограничениям по кинетике образования кислот. Для ограничения риска различного рода заражения желательным является как можно более быстрое достижение значения pH, равного 5,5. Однако высокая скорость образования кислот является препятствием для быстрого роста и/или нормального метаболизма В.animalis lactis.
Случай ферментированного молока, получаемого путем ферментации под действием S.thermophilus и L.bulgaricus при одновременной ферментации пробиотиком В.animalis lactis, является особенно трудным, поскольку, помимо ферментации В.animalis lactis, необходимо проведение симбиотической ферментации молока, при которой используют по меньшей мере один штамм Streptococcus thermophilus и по меньшей мере один штамм Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. B.animalis lactis является видом, медленно растущим на молочном субстрате (продолжительность клеточного цикла порядка 1-2 ч), тогда как технологические микроорганизмы S.thermophilus и L.bulgaricus отличаются большой скоростью роста (продолжительность клеточного цикла порядка 15-30 мин). В подобных обстоятельствах поддержание совокупности параметров на должном уровне является особенно сложным.
Инокулят согласно настоящему изобретению специально адаптирован для того, чтобы он не оказывал негативного влияния на ферментацию, осуществляемую технологическими штаммами молочнокислых бактерий, в частности, на симбиотическую ферментацию под действием Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. В частности, инокулят согласно настоящему изобретению специально приспособлен для применения в производстве ферментированного молока, содержащего по меньшей мере один штамм В.animalis lactis в качестве пробиотического штамма и получаемого путем ферментации молочного субстрата по меньшей мере одним штаммом Streptococcus thermophilus и по меньшей мере одним штаммом Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, помимо ферментации, осуществляемой В.animalis lactis.
Инокулят согласно настоящему изобретению соответствует различным ограничениям и позволяет получать ферментированный молочный продукт с высокой пробиотической ценностью, обладающий исключительным качеством.
Несмотря на тот факт, что инокулят согласно настоящему изобретению оптимизирован для особенно сложного случая симбиотической ферментации под действием S.thermophilus и L.bulgaricus при одновременной ферментации В.animalis lactis, очевидно, что его можно применять в менее сложных случаях, например, в ферментации молочного субстрата с использованием только одного рода или вида молочнокислых бактерий, отличных от В.animalis lactis, помимо указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis, или при использовании только В.animalis lactis.
7
8
7
8
Одним из преимуществ инокулята согласно настоящему изобретению является то, что он позволяет получить популяцию указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В.animalis lactis, если таковых несколько), размер которой существенно превосходит размер популяции, которую можно получить в тех же условиях с использованием обычного инокулята того же штамма В.animalis lactis, не содержащего активатора роста, а также размер популяции, которую можно получить в тех же условиях с использованием инокулята того же штамма В.animalis lactis, содержащего в качестве активатора роста цистеин-HCl. Так, инокулят согласно настоящему изобретению позволяет получить популяцию указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В. animalis lactis, если таковых несколько), размер которой по завершении ферментации составляет по меньшей мере 5·10КОЕ на 1 г ферментированного продукта, предпочтительно по меньшей мере 10КОЕ на 1 г ферментированного продукта. Особым преимуществом инокулята согласно настоящему изобретению является возможность получения популяции указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В.animalis lactis, если таковых несколько), размер которой не падает ниже 5·10 КОЕ на один грамм ферментированного продукта по истечении по меньшей мере 20 дней, предпочтительно по истечении по меньшей мере 30 дней хранения указанного ферментированного продукта при температуре от 4 до 11°С, предпочтительно при температуре от 4 до 10°С, более предпочтительно при температуре от 4 до 9°С. Наибольшим преимуществом инокулята согласно настоящему изобретению является возможность получения популяции указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В.animalis lactis, если таковых несколько), размер которой не падает ниже 10 КОЕ на один грамм ферментированного продукта по истечении по меньшей мере 20 дней, предпочтительно по истечении по меньшей мере 30 дней хранения указанного ферментированного продукта при температуре от 4 до 11°С, предпочтительно при температуре от 4 до 10°С, более предпочтительно при температуре от 4 до 9°С (см. фиг.8 и 9, на которых показано сохранение размера популяции В.animalis lactis в ферментированном молоке (S.thermophilus - L.bulgaricus + В.animalis lactis)), изготовленном при помощи инокулята согласно настоящему изобретению, после 30 дней хранения по сравнению с контрольными образцами ферментированного молока, размер популяции В.animalis lactis в которых быстро падает начиная с 21-го дня.
Другим преимуществом инокулята согласно настоящему изобретению является то, что он имеет форму, пригодную для применения в промышленности. В самом деле, инокулят согласно настоящему изобретению имеет усовершенствованную форму, позволяющую применять его особым, надежным и простым способом в рамках промышленного производства ферментированного молочного продукта. Дозы активаторов роста и допустимые отклонения часто трудно определить при помощи систем дозирования и ввода, используемых при изготовлении ферментированных молочных продуктов в производственных условиях. Например, избыток активатора, благоприятный для пробиотического штамма, обычно очень негативно сказывается на качестве полученного ферментированного молочного продукта: он может придавать ему непрятный вкус (например, вкус серы при избыточном добавлении цистеина), оказывать негативное или пагубное влияние на ферментацию под действием технологических штаммов (что имеет место, например, при использовании избытка цистеина в случае S.thermophilus). Контроль количества добавляемого активатора также представляет интерес с точки зрения санитарии, поскольку указанный контроль позволяет ограничить вмешательство человека, а также модификацию и усовершенствование технологических узлов, санитарное качество которых должно быть абсолютным. Контроль количества добавляемого активатора, естественно, представляет также экономический интерес. Таким образом, оказывается возможной ситуация, при которой специалист в данной области техники располагает пригодным активатором роста, но при его применении в производственных условиях он сталкивается с трудностями, поскольку с учетом указанных фактов контроль количества добавляемого активатора оказывается сложным. Инокулят согласно настоящему изобретению очень просто применять в промышленном масштабе, и он позволяет надежно и просто контролировать применяемое количество активатора. Таким образом, инокулят согласно настоящему изобретению легче применять; он позволяет эффективно и надежно изготавливать в производственных условиях ферментированные молочные продукты, обладающие исключительными характеристиками консистенции, структуры и вкуса и содержащие пробиотик В.animalis lactis в особенно большом количестве.
Инокулят согласно настоящему изобретению является результатом труднодостижимого компромисса, в частности, между: необходимостью сохранения исключительных характеристик для потребителя (структуры, консистенции, санитарных и вкусовых качеств) ферментированного молочного продукта; желанием повысить содержание В.animalis lactis с тем, чтобы усилить пробиотические свойства продукта; желанием получить инокулят в усовершенствованной форме, специально приспособленной для прямого посева и позволяющей контролировать добавляемое количество активатора простым путем при соблюдении требований безопасности.
Инокулят согласно настоящему изобретению позволяет решить указанные задачи.
Инокулят согласно настоящему изобретению содержит в форме смеси или комбинации (набора составных частей):
- по меньшей мере один штамм B.animalis lactis и
- L-цистеин в свободной форме (т.е. L-цистеин, не связанный с другими аминокислотами пептидной связью), который, кроме того, имеет такую форму, что он позволяет получать такие гранулы и/или лиофилизат(ы), что pH раствора, полученного в результате:
- оттаивания указанной по меньшей мере одной гранулы; и/или
2
- растворения указанного по меньшей мере одного лиофилизата в отношении, составляющем от 1 до 2 г лиофилизата на 8-10 мл HO, составляет не менее 4.
2
2
2
Указанное значение pH предпочтительно не превосходит pH 8. Для решения указанных задач предпочтительным является выбор свободного L-цистеина в такой форме, что при его введении в раствор pH последнего составляет более 4. Например, раствор, содержащий 1,25 г указанной формы цистеина на 50 мл воды, обладает значением pH от 4,5 до 5,5. Предпочтительным примером такой формы цистеина является L-цистеин, обычно называемый основным цистеином (или L-цистеином в основной форме). Формулу основного L-цистеина можно представить в виде HSCHCH(NH)COH.
Количества особой формы L-цистеина согласно настоящему изобретению и клеток В.animalis lactis, содержащиеся в инокуляте согласно настоящему изобретению, распределены внутри твердых физических структур, а именно замороженных гранул и/или по меньшей мере одного лиофилизата.
Указанные цистеин и по меньшей мере один штамм В.animalis lactis могут совместно входить в состав одной и той же твердой физической структуры или входить в состав различных твердых структур. Последние могут быть изготовлены отдельно и входить в состав набора либо находиться в смеси. Соответственно может быть получена смесь из какой-либо одной физической структуры, содержащей совместно особую форму L-цистеина согласно настоящему изобретению и клетки В.animalis lactis с различными другими или такими же твердыми структурами.
Таким образом, указанные цистеин и по меньшей мере один штамм B.animalis lactis могут представлять собой:
- совокупность замороженных гранул объединенного состава и/или лиофилизат объединенного состава и/или
- раздельную систему в виде «набора» отдельных замороженных гранул разного состава и/или разных лиофилизат(ов).
Таким образом, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения указанная особая форма L-цистеина полностью или ее часть и клетки В.animalis lactis полностью или их часть могут совместно входить в состав одних и тех же замороженных гранул или одного и того же лиофилизата. Инокулят согласно настоящему изобретению в таком случае содержит по меньшей мере одну гранулу и/или лиофилизат, совместно содержащий особую форму L-цистеина согласно настоящему изобретению и клетки В.animalis lactis. Предпочтительно особая форма L-цистеина полностью и клетки В.animalis lactis полностью содержатся в гранулах объединенного состава или в одном лиофилизате.
Особая форма L-цистеина согласно настоящему изобретению полностью или частично и клетки В.animalis lactis полностью или частично могут быть физически разделены и при этом входить в состав набора, включающего различные замороженные гранулы и/или различные лиофилизаты. В таком случае инокулят согласно настоящему изобретению содержит либо по меньшей мере две замороженные гранулы, либо по меньшей мере два различных лиофилизата, либо по меньшей мере одну замороженную гранулу и по меньшей мере один лиофилизат, в состав каждого из которых входит либо особая форма цистеина согласно настоящему изобретению, либо клетки В.animalis lactis, причем для каждой из указанных пар физических структур (гранула + гранула, лиофилизат + другой лиофилизат или гранула + лиофилизат) одна из двух указанных физических структур содержит только указанную особую форму L-цистеина или ее часть и не содержит клеток В.animalis lactis, а другая физическая структура содержит клетки В.animalis lactis и не содержит указанной особой формы L-цистеина.
Соответственно общее количество особой формы L-цистеина согласно настоящему изобретению и общее количество клеток В. animalis lactis, содержащихся в инокуляте, могут содержаться в различных гранулах и/или различных лиофилизате или лиофилизатах или образовывать таковые.
Инокулят согласно настоящему изобретению, таким образом, может включать в себя или состоять из следующих элементов:
а) замороженных гранул, содержащих особую форму L-цистеина согласно настоящему изобретению и клетки В. animalis lactis;
б) лиофилизата, содержащего особую форму L-цистеина согласно настоящему изобретению и клетки В.animalis lactis;
в) замороженных гранул, содержащих особую форму L-цистеина согласно настоящему изобретению, но не содержащих клеток В.animalis lactis, и замороженных гранул, содержащих клетки В.animalis lactis, но не содержащих особой формы L-цистеина согласно настоящему изобретению;
г) лиофилизата, содержащего особую форму L-цистеина согласно настоящему изобретению, но не содержащего клеток В.animalis lactis, и лиофилизата, содержащего клетки В.animalis lactis, но не содержащего особой формы L-цистеина согласно настоящему изобретению;
д) замороженных гранул, содержащих особую форму L-цистеина согласно настоящему изобретению, но не содержащую клеток В.animalis lactis, и лиофилизата, содержащего клетки В.animalis lactis, но не содержащего особой формы L-цистеина согласно настоящему изобретению;
е) лиофилизата, содержащего особую форму L-цистеина согласно настоящему изобретению, но не содержащего клеток В.animalis lactis, и замороженных гранул, содержащих клетки В.animalis lactis, но не содержащих особой формы L-цистеина согласно настоящему изобретению;
ж) смеси по меньшей мере двух описанных составов.
2
2
2
Инокулят согласно настоящему изобретению содержит цистеин в так называемой свободной форме (т.е. не связанной с другими аминокислотами пептидной связью), что является результатом специального выбора, сделанного авторами настоящего изобретения. В самом деле, указанный цистеин в свободной форме представляет собой свободный L-цистеин, который, кроме того, имеет форму, позволяющую получить такие гранулы и/или по меньшей мере один лиофилизат, что pH раствора, полученного после: оттаивания указанных гранул (например, путем их помещения на водяную баню при 37°С на 3 мин при ручном перемешивании), и/или растворения указанных лиофилизата или лиофилизатов в отношении, составляющем от 1 до 2 г лиофилизата на 8-10 мл воды (например, растворения в воде в течение 30 мин при 25°С при перемешивании магнитной мешалкой), составляет не менее 4. При этом предпочтительным является выбор цистеина в такой форме, при которой pH раствора, состоящего из 1-1,5 г подобного цистеина и 50-100 мл воды, составляет не менее 4. Примером пригодного цистеина является цистеин, обычно называемый основным цистеином, формулу которого можно представить следующим образом: HSCHCH(NH)COH. Примером непригодного цистеина является цистеин-HCl (гидрохлорид цистеина или моногидрат гидрохлорида цистеина).
Предпочтительно ни одно из соединений, используемых при получении инокулята согласно настоящему изобретению, не имеет форму гидрохлорида.
2
2
2
2
2
2
2
2
Содержащаяся в инокуляте особая форма L-цистеина согласно настоящему изобретению не является кислой формой цистеина, в том числе гидрохлоридом L-цистеина (HSCHCH(NH)COH·HCl) или моногидратом гидрохлорида L-цистеина (HSCHCH(NH)COH·HCl·HO). Моногидрат гидрохлорида L-цистеина не является особой формой цистеина согласно настоящему изобретению, поскольку раствор, содержащий 1,0 г моногидрата гидрохлорида цистеина на 100 мл HO, имеет pH, равный 1,5-2,0. Таким образом, оттаивание замороженных гранул или растворение лиофилизата, которые могли бы быть получены из цистеина, не являющегося особой формой цистеина согласно настоящему изобретению, дало бы раствор со слишком низким значением pH, в частности, со значением pH менее 4, обычно менее 3,5. Большинство сильнокислых форм цистеина представляют собой цистеин в форме солей, в том числе гидрохлорид цистеина или моногидрат гидрохлорида цистеина. Ион или ионы, входящие в состав указанной соли, оказываются включенными в состав замороженной гранулы или лиофилизата. Присутствие подобных иона или ионов иногда может служить показателем использования цистеина в сочетании с молекулой кислоты (которые обычно применяют для повышения его растворимости). Например, подобное имеет место в случае ионов хлора, содержащихся в гидрохлориде L-цистеина или в моногидрате гидрохлорида цистеина. В самом деле, в случае использования кислого цистеина в виде гидрохлорида L-цистеина или моногидрата гидрохлорида L-цистеина можно констатировать, что гранула или лиофилизат содержат большое количество хлорид-ионов (Cl) с учетом того, что моногидрат гидрохлорида L-цистеина содержит более 19% хлорид-ионов, в то время как основный L-цистеин обычно содержит менее 0,05%, в частности, менее 0,04% хлорид-ионов. Высокое содержание хлоридов в грануле или лиофилизате может являться косвенным показателем использования цистеина, не являющегося основным цистеином. Так, форма цистеина, используемая в инокуляте согласно настоящему изобретению, обычно содержит менее 60 мкг ионов хлора на один грамм гранул с содержанием сухих веществ, равным 16-17%.
В силу указанных причин основным критерием является pH. В самом деле, измерение pH является прямым критерием присутствия особой формы цистеина согласно настоящему изобретению: pH размороженных гранул или растворенного лиофилизата в таком случае равно по меньшей мере 4. Обычно он составляет не менее 5, например между 5 и 6,5. Указанное значение pH предпочтительно не превосходит 8.
Значение pH, равное по меньшей мере 4 и не превышающее 8, не является стрессовым для B.animalis lactis. Соответственно последние можно смешивать с раствором цистеина, не подвергая их стрессу, и вводить в состав замороженных гранул или лиофилизата, в которых цистеин и клетки В.animalis lactis объединены в одной твердой физической структуре (смешаны). Полученный таким образом инокулят В.animalis lactis содержит клетки В.animalis lactis, находящиеся в хорошем физиологическом и/или метаболическом состоянии и дающие быстрый отклик на активацию цистеином. Замороженная гранула или лиофилизат «объединенного» состава согласно настоящему изобретению, совместно содержащие клетки В.animalis lactis и особую форму L-цистеина согласно настоящему изобретению, таким образом, представляют собой особым образом усовершенствованный инокулят В.animalis lactis, поскольку таким путем удается вводить активатор В.animalis lactis в содержащую его структуру при отсутствии отрицательного влияния на физиологическое состояние и/или метаболизм клеток В.animalis lactis.
Выбор особой формы L-цистеина согласно настоящему изобретению позволяет получать гранулы и/или лиофилизат, являющиеся более эффективными, чем гранулы и/или лиофилизаты, полученные с использованием сильнокислого L-цистеина, в том числе гидрохлорида L-цистеина. Указанный выбор также позволяет эффективно вводить цистеин внутрь гранул или лиофилизата, содержащих клетки В.animalis lactis. В самом деле, при использовании цистеина в сильнокислой форме, в том числе гидрохлорида L-цистеина для получения замороженной гранулы или лиофилизата, совместно содержащих цистеин-HCl и клетки В.animalis lactis, полученные гранула или лиофилизат объединенного состава являются малоэффективными в качестве инокулята В.animalis lactis no сравнению со сходными гранулой или лиофилизатом, полученными на основе особой формы L-цистеина согласно настоящему изобретению.
Таким образом, в предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения инокулят согласно настоящему изобретению не содержит сильнокислых форм цистеина, в частности гидрохлорида L-цистеина, и/или не получен на основе подобного цистеина.
Инокулят согласно настоящему изобретению может не содержать цистин. Согласно настоящему изобретению предпочтительно не добавлять цистин в инокулят. Однако в нем могут быть найдены следы цистина, который может образоваться, например, в результате окисления цистеина, содержащегося в инокуляте.
Указанная особая форма L-цистеина согласно настоящему изобретению предпочтительно присутствует в инокуляте в количестве, составляющем:
14
10
- от 1 г на 1·10 КОЕ указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В. animalis lactis, если таковых несколько), до 1 г на 3,5·10 КОЕ указанного по меньшей мере одного штамма B.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В.animalis lactis, если таковых несколько), и/или в количестве, составляющем:
- от 0,01 мг на один миллиард КОЕ указанного по меньшей мере одного штамма B.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В.animalis lactis, если таковых несколько);
- до 30 мг на один миллиард КОЕ указанного по меньшей мере одного штамма B.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В.animalis lactis, если таковых несколько).
2
2
2
В настоящей заявке все массовые величины для цистеина рассчитаны исходя из цистеина формулы HSCHCH(NH)COH.
Более предпочтительно, указанная особая форма L-цистеина согласно настоящему изобретению присутствует в указанном инокуляте в количестве, составляющем:
14
10
- от 1 г на 0,2·10 КОЕ указанного по меньшей мере одного штамма B.animalis lactis (или всех применяемых штаммов B.animalis lactis, если таковых несколько), до 1 г на 10·10 КОЕ указанного по меньшей мере одного штамма B.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В.animalis lactis, если таковых несколько), и/или в количестве, составляющем:
- от 0,05 мг на один миллиард КОЕ указанного по меньшей мере одного штамма B.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В.animalis lactis, если таковых несколько);
- до 10 мг на один миллиард КОЕ указанного по меньшей мере одного штамма B.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В.animalis lactis, если таковых несколько).
9
11
Согласно особому варианту реализации настоящего изобретения указанная особая форма L-цистеина согласно настоящему изобретению предпочтительно присутствует в указанном инокуляте в количестве, составляющем от 4,90 до 144 мг на 5·10-5·10 КОЕ указанного по меньшей мере одного штамма В. animalis lactis.
9
11
Предпочтительно указанная особая форма L-цистеина согласно настоящему изобретению присутствует в указанном инокуляте в количестве, составляющем от 25 до 50 мг, более предпочтительно от 30 до 40 мг, еще более предпочтительно от 31 до 39 мг, например, примерно 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 или 39 мг, еще более предпочтительно 35-37 мг, например, примерно 35, 36 или 37 мг, наиболее предпочтительно примерно 36,9 мг на 5·10-5·10 КОЕ указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis.
9
11
10
11
10
11
10
10
Количество В. animalis lactis предпочтительно составляет 5·10-5·10 КОЕ, более предпочтительно 2·10-5·10 КОЕ, еще более предпочтительно 2·10-1·10 КОЕ, еще более предпочтительно 2·10-7·10 КОЕ.
9
11
Один грамм гранул, соответствующих настоящему изобретению и содержащих 16-17% сухих веществ (при сушке при 105°С в течение 40 мин), предпочтительно содержит 5·10-5·10 КОЕ указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis. Один грамм гранул, соответствующих настоящему изобретению и содержащих 16-17% сухих веществ (при сушке при 105°С в течение 40 мин), предпочтительно содержит 4,90-144 мг указанной особой формы L-цистеина согласно настоящему изобретению, предпочтительно основного L-цистеина.
9
11
Количество лиофилизата согласно настоящему изобретению, равное от 160 до 170 мг, предпочтительно содержит 5·10-5·10 КОЕ указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis. Количество лиофилизата согласно настоящему изобретению, равное от 160 до 170 мг, предпочтительно содержит 4,90-144 мг указанной особой формы L-цистеина согласно настоящему изобретению.
Для подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) В.animalis lactis возможно использование любых способов, которые сочтет подходящими специалист в данной области техники, например, способа подсчета бифидобактерий, описанного в Grand et al. 2003 (Eur. Food Res. Technol. 217: 90-92). Предпочтительнее применять метод, описанный в S.N.Thitaram, G.R.Siragusa and A.Hinton, 2005 (Jr Letters In Applied Microbiology, Volume 41, Page 355 - October 2005; "Bifidobacterium-selective isolation and enumeration from chicken caeca by a modified oligosaccharide antibiotic-selective agar medium").
Для определения количества цистеина, содержащегося в жидкости, возможно использование любого способа, который сочтет подходящим специалист в данной области техники, например, газовой хроматографии, сопряженной с масс-спектрометрией, или высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием. Возможно также определение количества цистеина при помощи анализатора аминокислот наподобие L-8800 High Speed Amino Acid Analyzer (компания Hitachi High Technologies).
Желательно, чтобы инокулят согласно настоящему изобретению содержал не более 0,5 мас.% дрожжей, экстракта дрожжей или автолизата дрожжей. Инокулят согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит не более 0,5 мас.% дрожжей, экстракта дрожжей или автолизата дрожжей. Более предпочтительно указанный инокулят не содержит дрожжей, экстракта дрожжей или автолизата дрожжей.
Преимуществом настоящего изобретения является тот факт, что оно позволяет получить очень активный инокулят В.animalis lactis, образующий стабильную во времени популяцию В.animalis lactis (в ходе хранения ферментированного молочного продукта при температуре холодильника) без необходимости использования консерванта в инокуляте и его добавления в молочный субстрат или в ферментированный молочный продукт. Благодаря применению настоящего изобретения популяция В.animalis lactis в ферментированном молочном продукте находится в особенно благоприятном физиологическом и/или метаболическом состоянии, что обеспечивает поддержание ее высокой численности.
Инокулят согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один штамм В.animalis lactis, например, штамм I-2494 или штамм ВВ12 компании Chr.Hansen. Разумеется, инокулят согласно настоящему изобретению может содержать несколько штаммов В.animalis lactis, например, штамм 1-2494 и штамм ВВ12 компании Chr.Hansen.
Кроме того, инокулят согласно настоящему изобретению может содержать по меньшей мере один другой штамм молочнокислых бактерий, отличный от В.animalis lactis. Указанный по меньшей мере один другой штамм молочный бактерий может входить в состав физической структуры, отличающейся от структуры, содержащей клетки В.animalis lactis. Указанная отличающаяся физическая структура, например, может представлять собой твердую структуру наподобие замороженных гранул или лиофилизата, смешанных с гранулами и/или лиофилизатом В.animalis lactis и особой формы L-цистеина согласно настоящему изобретению или находящихся отдельно от последних и входящих в состав набора. Указанный по меньшей мере один другой штамм молочнокислых бактерий может, например, иметь форму замороженных гранул или лиофилизата, отличных от гранул или лиофилизата (лиофилизатов), содержащих В.animalis lactis и особую форму цистеина согласно настоящему изобретению. Указанный по меньшей мере один другой штамм молочнокислых бактерий может представлять собой штамм Bifidobacterium или штамм другого рода бактерий. Штамм другого рода бактерий может представлять собой штамм, обладающий пробиотической активностью, например, по меньшей мере один штамм, выбранный из штаммов Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus casei. Он также может представлять собой технологический штамм, в том числе S.thermophilus и/или L.bulgaricus. Инокулят согласно настоящему изобретению преимущественно содержит, помимо гранулы(гранул) и/или лиофилизата (лиофилизатов) В.animalis lactis и особой формы L-цистеина, инокулят S.thermophilus и L.bulgaricus, например, в форме замороженных гранулы или гранул и/или лиофилизата или лиофилизатов, приспособленных для прямого посева. Инокулят согласно настоящему изобретению предпочтительно содержит несколько штаммов, отличных от В.animalis lactis, например, по меньшей мере два, по меньшей мере три или по меньшей мере четыре штамма, отличных от В.animalis lactis. Указанными другие штаммы предпочтительно представляют собой по меньшей мере один штамм S.thermophilus (например, штамм I-1630, доступный в CNCM) и по меньшей мере два штамма L.bulgaricus (например, штаммы I-1632 и I-1519, доступные в CNCM). Подобный инокулят может представлять собой смесь или комбинацию, состоящие из замороженных гранул и/или по меньшей мере одного лиофилизата, содержащих В.animalis lactis и особую форму L-цистеина согласно настоящему изобретению, и замороженных гранул и/или по меньшей мере одного лиофилизата, содержащих S.thermophilus и/или L.bulgaricus. Подобная система специально приспособлена для прямого посева на молочный субстрат с целью превращения его в ферментированный молочный продукт с высокой пробиотической ценностью, сохраняющий последнюю в ходе хранения в холодильнике, путем симбиотической молочнокислой ферментации под действием S.thermophilus - L.bulgaricus и ферментации под действием В.animalis lactis.
2
Настоящая заявка также относится отдельно к одной смешанной грануле согласно настоящему изобретению как таковой и отдельно к смешанному лиофилизату согласно настоящему изобретению. Как указано и описано выше и/или в ниже в разделе Примеры, одна смешанная гранула или смешанный лиофилизат согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один штамм В.animalis lactis и особую форму L-цистеина согласно настоящему изобретению в указанных дозах и/или отношениях. Предпочтительно подобные гранула или лиофилизат не содержат цистеина в сильнокислой форме наподобие гидрохлорида L-цистеина. Таким образом, настоящая заявка относится к замороженной грануле, содержащей по меньшей мере один штамм В.animalis lactis и L-цистеин, не связанный с другими аминокислотами пептидной связью, причем указанный L-цистеин имеет такую форму, что pH раствора, полученного в результате оттаивания указанных гранулы или гранул, составляет не менее 4, обычно более 5. Настоящая заявка также относится к лиофилизату, содержащему по меньшей мере один штамм В.animalis lactis и L-цистеин, не связанный с другими аминокислотами пептидной связью, причем указанный L-цистеин имеет такую форму, что pH раствора, полученного при растворении указанных лиофилизата или лиофилизатов в количестве, составляющем от 1 до 2 г лиофилизата на 8-10 мл HO, составляет не менее 4, обычно более 5. Значение pH гранулы или лиофилизата (pH раствора, полученного в результате оттаивания гранулы или растворения лиофилизата), составляет менее 8.
Настоящее изобретение также относится к способам применения инокулята согласно настоящему изобретению. В частности, настоящее изобретение относится к его применению в молочнокислой ферментации, и, более конкретно, к применению в изготовлении ферментированных молочных продуктов, предназначенных для употребления человеком.
Таким образом, настоящее изобретение относится к любому способу, в котором применяют по меньшей мере один инокулят, и/или по меньшей мере одна гранулу или по меньшей мере один лиофилизат согласно настоящему изобретению.
9
11
10
11
10
10
10
10
В частности, объектом настоящего изобретения является способ стимуляции роста и/или метаболизма В.animalis lactis на молочном субстрате, в котором применяют по меньшей мере один инокулят, и/или по меньшей мере одну гранулу, и/или по меньшей мере один лиофилизат согласно настоящему изобретению. Преимуществом подобного способа стимуляции является высокая эффективность стимуляции В.animalis lactis. Как показано выше и проиллюстрировано ниже, способ стимуляции согласно настоящему изобретению позволяет получить популяцию В.animalis lactis, метаболизм и/или рост которой обеспечивает сохранение живых клеток В.animalis lactis с течением времени. Для реализации данного способа указанный инокулят вносят в дозах и/или отношениях, указанных выше и/или описанных в приведенных ниже примерах и чертежах. Указанные инокулят, и/или гранулы, и/или лиофилизат согласно настоящему изобретению преимущественно вносят в количествах, при которых молочный субстрат содержит: от 5 до 20 мг цистеина на 1 л молочного субстрата, предпочтительно 6-15 мг/л, более предпочтительно 7-11 мг/л; от 10 до 10 КОЕ В.animalis lactis на 1 л субстрата, предпочтительно 0,4·10-1·10 КОЕ B.animalis lactis, более предпочтительно 0,4·10-1,2·10 КОЕ В.animalis lactis, наиболее предпочтительно 0,4·10-1·10 КОЕ В.animalis lactis. Инокулированный субстрат предпочтительно поддерживают в температурных и атмосферных условиях, благоприятных для метаболизма В.animalis lactis, например, при температуре от 37°С до 42°С в закрытом сосуде.
11
10
11
10
10
10
10
Объектом настоящего изобретения также является способ получения ферментированного молочного продукта, предпочтительно, молочного продукта, получаемого путем кисломолочной ферментации, причем в последнем случае, помимо процесса ферментации, осуществляемого В.animalis lactis, происходит по меньшей мере один процесс симбиотической ферментации под действием S.thermophilus-L.bulgaricus. Способ согласно настоящему изобретению предусматривает использование по меньшей мере одного инокулята, и/или по меньшей мере одной гранулы, и/или по меньшей мере одного лиофилизата согласно настоящему изобретению Полученный ферментированный молочный продукт представляет собой ферментированный молочный продукт с высокой пробиотической ценностью, поскольку он содержит В.animalis lactis в большом количестве и сохраняет высокое содержание последних в ходе хранения в холодильнике. Такой способ обладает преимуществом очень эффективной активации и/или стимуляции В.animalis lactis. Кроме того, его преимуществом является отсутствие отрицательного влияния на симбиоз S.thermophilus и L.bulgahcus. Как показано выше и проиллюстрировано ниже, способ стимуляции согласно настоящему изобретению позволяет получить популяцию В.animalis lactis, метаболизм и/или рост которой обеспечивает сохранение живых клеток В.animalis lactis с течением времени. Для реализации данного способа указанный инокулят вносят в дозах и/или отношениях, указанных выше и/или описанных в следующих ниже примерах и чертежах. Указанные инокулят, и/или гранулы, и/или лиофилизат согласно настоящему изобретению преимущественно вносят в количествах, при которых молочный субстрат содержит: от 5 до 20 мг цистеина на 1 л молочного субстрата, предпочтительно 6-15 мг/л, более предпочтительно 7-11 мг/л; от 10° до 10 КОЕ В.animalis lactis на 1 л субстрата, предпочтительно 0,4·10-1·10 КОЕ В.animalis lactis, более предпочтительно 0,4·10-1,2·10 КОЕ В.animalis lactis, наиболее предпочтительно 0,4·10-1,1·10 КОЕ В.animalis lactis.
Примерами доз, подходящих для внесения на 1 л молочного субстрата, являются дозы смешанных гранул согласно настоящему изобретению, равные 0,05-1 г, например, примерно 0,2 г.
Инокулированный субстрат предпочтительно поддерживают в атмосферных и температурных условиях, благоприятных для метаболизма В.animalis lactis, например, при температуре от 37°С до 42°С в закрытом сосуде. Указанный по меньшей мере один штамм В.animalis lactis играет роль пробиотического штамма. В силу данного требования необходимо обеспечить возможность осуществления молочнокислой ферментации молочного субстрата указанным по меньшей мере одним штаммом В.animalis lactis. Поэтому указанный по меньшей мере один штамм B.animalis lactis являются не простой добавкой к субстрату или продукту не в качестве простой добавки, без которой условия, позволяющие осуществлять молочнокислую ферментацию, не поддерживались бы.
Способ получения ферментированного молочного продукта преимущественно может включать в себя применение по меньшей мере еще одного штамма, отличного от указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis. Указанный другой штамм предпочтительно представляет собой штамм молочнокислых бактерий. Функцией последнего, в частности, является осуществление молочнокислой ферментации. Поэтому его инокулируют на молочный субстрат таким образом, чтобы обеспечить возможность осуществления молочнокислой ферментации, т.е. в момент времени и в количествах, обеспечивающих эффективное осуществление молочнокислой ферментации. Способ ферментации согласно настоящему изобретению, таким образом, соответствует смешанной ферментации, осуществляемой указанным по меньшей мере одним штаммом молочнокислых бактерий и указанным по меньшей мере одним штаммом В.animalis lactis, и не является обычным процессом молочной ферментации, при котором В.animalis lactis добавляют как обычную добавку при отсутствии заметного ферментативного действия. Указанные по меньшей мере один штамм молочнокислых бактерий и по меньшей мере один штамм B.animalis lactis, таким образом, совместно вносятся в молочный субстрат. Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения способ получения может также не являться двухстадийным: добавление указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis и, возможно, других штаммов молочнокислых бактерий можно осуществлять одновременно или на по меньшей мере одной стадии технологического процесса, а именно в начале процесса, благодаря чему нет необходимости в ожидании и контроле достижения определенной стадии ферментации, осуществляемой одним из штаммов, с целью принятия решения о добавлении еще по меньшей мере одного штамма.
Ферментацию молочного субстрата проводят при температуре, благоприятной для применяемых штаммов, которая обычно составляет от 36°С до 42°С. Данный процесс обычно проводят до достижения значения pH, равного 4,2-4,8.
Способ получения ферментированного молочного продукта согласно настоящему изобретению может включать дополнительно по меньшей мере еще одну стадию, например, по меньшей мере одну стадию, выбранную из известных стадий получения данного ферментированного молочного продукта. Например, возможно осуществление по меньшей мере одной стадии, выбранной из следующих стадий:
- приготовления молочного субстрата;
- термообработки молочного субстрата (эквивалентной по меньшей мере пастеризации, например, при 95°С в течение 5 мин);
- по меньшей мере одной инокуляции молочного субстрата;
- осуществления по меньшей мере одного процесса молочной ферментации инокулированного субстрата в условиях, благоприятных для инокулированных штаммов (обычно до достижения значения pH, равного 4,2-4,8);
- возможного добавления ароматизаторов, фруктов, подсластителей, красителей и консервантов;
- возможного перемешивания, в том числе после охлаждения;
- упаковки ферментированного продукта, например, в герметичные емкости;
- хранения ферментированного молочного продукта в охлаждаемой среде.
7
8
7
8
Инокулят согласно настоящему изобретению позволяет получить популяцию указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В.animalis lactis, если таковых несколько), размер которой в конце ферментации составляет по меньшей мере 5·10 КОЕ на один грамм ферментированного продукта, предпочтительно по меньшей мере 10 КОЕ на один грамм ферментированного продукта. Следует отметить, что преимуществом инокулята согласно настоящему изобретению является то, что он позволяет получить популяцию указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В.animalis lactis, если таковых несколько), размер которой не падает ниже 5·10 КОЕ на один грамм ферментированного продукта по истечении по меньшей мере 20 дней, предпочтительно по истечении по меньшей мере 30 дней хранения указанного ферментированного продукта при температуре от 4 до 11°С, предпочтительно от 4 до 10°С, более предпочтительно от 4 до 9°С. Следует также отметить, что особым преимуществом инокулята согласно настоящему изобретению является то, что он позволяет получить популяцию указанного по меньшей мере одного штамма В.animalis lactis (или всех применяемых штаммов В.animalis lactis, если таковых несколько), размер которой не падает ниже 10 КОЕ на один грамм ферментированного продукта по истечении по меньшей мере 20 дней, предпочтительно по истечении по меньшей мере 30 дней хранения указанного ферментированного продукта при температуре от 4 до 11°С, предпочтительно от 4 до 10°С, более предпочтительно от 4 до 9°С (см. фиг.8 и 9, на которых показано сохранение популяции B.animalis lactis в ферментированном молоке, полученном с применением инокулята согласно настоящему изобретению (S.thermophilus - L.bulgaricus + В.animalis lactis) no истечении по меньшей мере 30 дней хранения указанного молока при 10°С по сравнению с контрольными образцами ферментированного молока, размер популяции в которых резко падает начиная с 21-го дня).
В настоящей заявке под массой ферментированного молочного продукта понимают массовую долю молока указанного продукта.
Настоящая заявка также относится к ферментированному молочному продукту как таковому. Подобный продукт отличается размером популяции В.animalis lactis, который находится на уровне, превышающем размеры популяций В.animalis lactis в продуктах, известных в уровне техники, даже по истечении 20 дней, предпочтительно по истечении 30 дней хранения указанного ферментированного продукта при температуре от 4 до 11°С, предпочтительно от 4 до 10°С, более предпочтительно от 4 до 9°С. Поэтому состав такого продукта существенно отличается от продуктов, известных в уровне техники. Таким образом, настоящая заявка относится к ферментированному молочному продукту, полученному путем кисломолочной ферментации молочного субстрата с применением по меньшей мере одного инокулята согласно настоящему изобретению до достижения значения pH, обычно лежащего между 4,2 и 4,8. Указанный инокулят предпочтительно имеет форму смешанных замороженных гранул и/или смешанного лиофилизата согласно настоящему изобретению (инокулята, в котором особая форма L-цистеина и микроорганизм В.animalis lactis входит входят в состав одной физической структуры). Такой инокулят преимущественно также может содержать по меньшей мере один штамм S.thermophilus и/или по меньшей мере один штамм L.bulgaricus.
В настоящей заявке сокращение CNCM означает Национальную коллекцию культур микроорганизмов (CNCM, Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, F-75724 PARIS CEDEX 15). Штаммы, хранящиеся в CNCM, имеют номер, начинающийся с буквы I, например, "I-2494" (штамм В.animalis lactis), " I-1630" (штамм S.thermophilus), "I-1632" или "I-1519" (штаммы L.bulgaricus).
Термин "содержащий", синонимом которого является термин "включающий в себя", представляет собой открытый термин и не исключает присутствия одного или нескольких элементов, одной или нескольких составных частей или дополнительных стадий способов, которые не обозначены в явном виде, в то время как термин "состоящий из" является закрытым термином, который исключает наличие любых других дополнительных элементов, стадий или составных частей, не обозначенных в явном виде. Термин "состоящий по существу из" является частично открытым термином, который не исключает наличия одного или нескольких элементов, одной или нескольких составных частей или дополнительных стадий, при условии, что указанные элементы, составные части или дополнительные стадии не затрагивают основные признаки изобретения. Поэтому термин "содержащий" или "включающий в себя", "содержать" или "включать в себя" охватывает термины "состоящий из" или "состоять из", а также " состоящий по существу из".
Содержание всех документов, печатных работ или публикаций, которые цитируются в настоящей заявке, включено в настоящее описание путем ссылки.
Следующие ниже примеры приведены исключительно в иллюстративных целях и никоим образом не ограничивают настоящее изобретение.
Примеры
Пример 1. Цистеин-HCl является непригодным для применения в изготовлении "совмещенных" гранул, совместно содержащих цистеин и В. animalis lactis.
Материалы и методы:
В настоящем примере следовали схеме изготовления гранул, показанной на фиг.2.
В настоящем примере использовали следующие пробиотические штаммы:
- Bifidobacterium animalis lactis штамма ВВ12, коммерчески доступного от компании Chr. Hansen A/S, Херсхольм (Hoersholm), Дания;
- Bifidobacterium animalis lactis штамма I-2494, доступного в CNCM (дата поступления в CNCM 20 июня 2000 г.). См. публикацию WO 02/02800 от 4 июля 2001 г. (компания Compagnie Gervais Danone) и национальные и региональные аналоги указанной заявки, в частности, в отношении аналогов указанной заявки для США следует сделать ссылку на патент США №7008785 В2. При необходимости штаммы перед использованием оттаивали.
2
3
7
2
2
2
Используемый цистеин представлял собой цистеин-HCl, который обычно применяют в качестве добавки цистеина вследствие его очень хорошей растворимости (примерно 110 г на 100 г HO при 20°С). Цистеин-HCl представлял собой моногидрат гидрохлорида цистеина (или моногидрат моногидрохлорида (R)-2-амино-3-меркаптопропионовой кислоты). Формула этого цистеина CHNOS·HCl·HO (или L-цистеин HCl·HO). Номер CAS подобного цистеина 7048-04-6; его молярная масса составляет 175,63. Цистеин-HCl можно приобрести в компании Ajinomoto Aminoscience LLC, Raleigh NC 27610, США.
Способ получения гранул (см. фиг.2):
50 г каждого штамма В. animalis lactis смешивали с:
- 15 г цистеина-HCl при концентрации последнего 325 г/л (смешанные гранулы G4I Cys-HCl), либо с:
- 15 г воды (контрольные гранулы I-2494 Т и ВВ12 Т).
Смесь получали при перемешивании с целью лучшего смешивания с раствором цистеина-HCl (или воды в случае контрольных образцов).
Формирование замороженных гранул проводили путем вливания смеси по каплям в жидкий азот. Приспособление, на которое подавали смесь, в состав которого входили несколько игл шприца, соединенных трубками с перистальтическим насосом, обеспечивало спадание капель, образовавшихся на выходе из игл, в изотермическую емкость, наполненную жидким азотом. Подобным путем получали замороженные гранулы пробиотического микроорганизма G4I Cys-HCl (гранулы В.animalis lactis 1-2494 или ВВ12, содержащие цистеин-HCl) и контрольные гранулы, содержащие воду вместо цистеина-HCl.
Приготовление молочных смесей (молочных субстратов).
Молочная смесь состояла из следующих ингредиентов: обезжиренного молока жирностью 0%, сливок жирностью 40% и порошка обезжиренного молока с содержанием белков 33%. Вначале все ингредиенты соединяли между собой для получения стандартизованных значений содержания белка, равного 4,4%, жирности, равной 3,5%, и содержания сухих веществ, равного 15,8%, путем перемешивания смеси в течение 60 мин примерно при 750 об/мин при помощи мешалки HEIDOLPH с целью гидратации белков. Контроль однородности выполняли при помощи инфракрасного детектора MILKOSAN FT 120 компании FOSS. Ниже приведен пример количеств каждого ингредиента, необходимых для получения целевых характеристик молока.
Таблица 1
Ингредиенты
в %
Обезжиренное молоко, 0% жирн.
87,5
Сливки, 40% жирн.
8,7
Белки обезжиренного молока, 33%
3,8
Всего
100
Затем молоко нагревали при температуре от 50°С до 60°С для максимально полного плавления глобул жира. По достижении заданной температуры 10 л молока гомогенизировали в установке MICROFLUIDIZIER. Подобная обработка обеспечивала дробление глобул жира в результате пропускания молока через капилляры решетки под давлением 350 бар. Подготавливали водяную баню компании MEMMERT и настраивали ее на 103°С. Молоко помещали в 8 бутылок объемом 1 л; количество молока, разливаемого в каждую бутылку, точно взвешивали. Бутылки погружали до нижнего края горлышка в водяную баню при температуре 103°С на 35 мин, затем в ту же баню при температуре 95°С на 10 мин. Бутылки охлаждали на бане с проточной холодной водой, затем хранили в холодильнике при 4°С в течение 12-24 ч перед использованием.
Инокуляция молочных смесей:
Бутылки с молоком извлекали из холодильника за 45 мин до инокуляции микроорганизмами и помещали на водяную баню при температуре ферментации (37°С). Использовали четыре различных варианта инокуляции молочных смесей:
- гранулами I-2494 G41 Cys-HCl;
- контрольными гранулами I-2494 Т;
- гранулами ВВ12 G41 Cys-HCl;
- контрольными гранулами ВВ 12 Т.
При каждой операции инокуляции количество посеянного инокулята составляло 0,2 г на 1 л молочной смеси. Бутылки снова погружали в водяную баню (37°С) и следили за изменением pH с течением времени (при помощи установки CINAC компании YSEBAERT).
Результаты
Как для В.animalis lactis I-2494, так и для В.animalis lactis BB12 наблюдали ухудшение физиологического состояния пробиотика вследствие присутствия цистеина-HCl в гранулах (физиологическое время = время, необходимое для того, чтобы бактерии снизили pH на 0,08 единиц pH). Описанные результаты показаны на фиг.3 (I-2494 G4I по сравнению с I-2494 Т). Добавление цистеина-HCl сильно влияло на активность пробиотика В.animalis lactis (активность увеличивалось). Цистеин-HCl оказался неудовлетворительным источником цистеина для изготовления гранул объединенного состава, содержащих В.animalis lactis и цистеин в одной грануле (гранулах) и предназначенных для изготовления ферментированных молочных продуктов с высокой пробиотической ценностью. «Совмещенный» вариант реализации (гранулы, совместно содержащие В.animalis lactis и цистеин) не может быть реализован с использованием цистеина-HCl, поскольку последний делает пробиотический микроорганизм неспособным к нормальной метаболической деятельности.
2
Из описанных результатов видно, что pH раствора цистеина-HCl составляет менее 3,5; в частности, pH раствора 1 г цистеина-HCl в 100 мл HO составляет 1,5-2,0 и что пробиотик В.animalis lactis является очень чувствительным к низким pH даже при снижении времени контакта. Таким образом, возникает задача поиска источника цистеина, усваиваемого В.animalis lactis, пригодного для употребления человеком и обладающего в растворе значением pH, не являющимся стрессовым для В.animalis lactis.
Пример 2. Выбор основного L-цистеина позволяет добиться получения очень эффективных "совмещенных" гранул, несмотря на проблемы, связанные с низкой растворимостью подобной формы цистеина.
3
7
2
Выполняли последовательность операций, сходную с описанной в примере 1, за исключением того, что вместо цистеина-HCl был выбран основный L-цистеин (L-цистеин, CHNOS, номер CAS 52-90-4, молярная масса 121,16).
2
2
Основный L-цистеин можно приобрести, например, в компании Ajinomoto Aminoscience LLC, Raleigh NC 27610, США. Растворимость основного цистеина при 20°С составляет 16 г на 100 г НО. Значение pH раствора, содержащего 1,15 г основного цистеина на 50 мл HO, составляет от 4,5 до 5,5.
Готовили маточный раствор основного цистеина концентрацией 160 г/л и смешивали 3 г указанного маточного раствора с 10 г микроорганизма В. animalis lactis (В. animalis lactis штамма I-2494 или ВВ12). Из смеси получали замороженные гранулы (1-2494 G4I Cys-base и ВВ12 G4I Cys-base), как описано выше в примере 1. Контрольные гранулы I-2494 Т и ВВ12 Т получали с использованием 3 г воды вместо основного цистеина. Схема получения указанных гранул показана на фиг.4.
Выполняли четыре операции инокуляции, при каждой из которых количество посеянного инокулята составляло 0,2 г/л, как и в описанном выше примере 1.
10
3
7
2
Таким образом, количество основного цистеина в гранулах G4I составляло (160×3)/(3+10)=36,92 мг основного цистеина на один грамм замороженных гранул G4I. В данном эксперименте содержание В. animalis lactis составляло примерно 2·10 КОЕ на один грамм замороженных гранул G4I или G4 (I-2494 или ВВ12). Количество цистеина CHNOS на единицу размера колонии микроорганизма В.animalis lactis составляло 1,85 мг на один миллиард КОЕ. Масса основного цистеина, добавляемого в молочную смесь с гранулами G4I, инокулированными в количестве 0,2 г/л, составила 0,2×36,92=7,384 мг цистеина на один литр молочной смеси.
Результаты инкубации смесей при 37°С показывают, что выбор основного цистеина позволяет в значительной степени избежать ухудшения физиологического состояния используемого пробиотического микроорганизма. Данные результаты показаны на фиг.5 (штамм I-2494).
Совмещенный вариант реализации "гранулы объединенного состава с цистеином" ((гранулы, содержащие В.animalis lactis и цистеин) может быть реализован с использованием основного L-цистеина, поскольку в этом случае В.animalis lactis сохраняет нормальную метаболическую активность.
Пример 3. Сравнение характеристик, полученных для совмещенной системы G4I Cys-base, комбинированной системы G4 (включающей раздельные гранулы цистеина и гранулы пробиотического микроорганизма), и контрольной системы (гранулы Т, не содержащие цистеина).
В данном примере использовали гранулы микроорганизма В.animalis lactis, полученные согласно примеру 2, а именно:
- гранулы ВВ 12 Т (контрольные гранулы, содержащие В.animalis lactis BB12 и воду);
3
7
2
- гранулы BB12 G4I (гранулы объединенного состава, содержащие В.animalis lactis BB12 и основный L-цистеин в количестве примерно 1,85 мг L-цистеина CHNOS на один миллиард КОЕ пробиотического микроорганизма);
- гранулы I-2494 Т (контрольные гранулы, содержащие В.animalis lactis I-2494 и воду);
3
7
2
- гранулы I-2494 G4I (гранулы объединенного состава, содержащие В.animalis lactis I-2494 и основный L-цистеин в количестве примерно 1,85 мг L-цистеина CHNOS на один миллиард КОЕ пробиотического микроорганизма).
6
5
В настоящем примере также использовали технологические микроорганизмы, которые представляли собой микроорганизмы S.thermophilus и Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus. Используемые технологические микроорганизмы представляли собой смесь трех технологических штаммов, а именно штамма I-1630 S.thermophilus и штаммов I-1632 и I-1519 L.bulgaricus (штаммы, доступные в CNCM). Технологические микроорганизмы вносили в форме замороженных гранул и инокулировали в молочную смесь в количестве примерно 1·10 КОЕ S.thermophilus I-1630 и примерно 2,7-10 КОЕ L.bulgaricus (примерно 5% штамма I-1632 и 95% штамма I-1519) на один грамм молочного субстрата.
Готовили шесть молочных смесей, как описано в примере 1, которые инокулировали следующим образом:
- смесь ВВ12 Т и смесь I-2494 Т (контрольные смеси) - инокулировали смесью гранул технологических микроорганизмов и гранул ВВ12 Т или 1-2494 Т соответственно (гранул, содержащих пробиотик В.animalis lactis и не содержащих цистеина);
- смесь ВВ12 G4 и смесь I-2494 G4 (смеси по «комбинированному способу») инокулировали аналогично контрольным, за исключением того, что в них также добавляли замороженные гранулы цистеина;
- смесь ВВ12 G4I и смесь I-2494 G4I: (смеси объединенного состава) инокулировали смесью гранул технологических микроорганизмов и гранул ВВ12 G4I или I-2494 G4I соответственно (гранул В.animalis lactis, содержащих цистеин в форме объединенного состава).
При каждой операции инокуляции количество посеянного инокулята составляло 0,5 г смеси гранул на 1 л (0,3 г/л технологических микроорганизмов и 0,2 г/л замороженных гранул пробиотического микроорганизма В.animalis lactis).
В смесь G4 гранулы цистеина вносили таким образом, чтобы концентрация цистеина в смеси составила 7,5 мг/л, т.е. в смеси находилось количество цистеина, сравнимое с внесенным с гранулами G4I (вычисленное значение равно 7,384 мг/л цистеина; см. пример 2 выше). Шесть инокулированных смесей помещали на инкубацию при 37°С, как описано в примере 1. Бутылки охлаждали и хранили при 20°С. Затем сгусток извлекали из бутылок вручную. Сгусток расфасовывали в стаканчики объемом 125 мл, которые запечатывали на термосварочной машине DNV-100-25 PPV-A компании FESTO. Продукты хранили в холодной камере при 10°С в течение всего времени эксперимента.
При хранении молочного продукта при 10°С в ходе ферментации измеряли значение pH и следили за развитием биомассы (в КОЕ/мл в зависимости от истекшего времени в днях). Результаты показаны на фиг.6-9.
Результаты для штамма ВВ12 В.animalis lactis оказались по сущесту близкими к результатам для штамма I-2494. Из фиг.6 и 7 (изменение pH в зависимости от времени в часах) видно, что присутствие цистеина вызывает изменение значения Vmax по сравнению с контрольной смесью. Таким образом, можно заметить действие цистеина на кинетику образования кислот под действием В.animalis lactis. Также видно, что смесь G4I (основный L-цистеин, «введенный» в гранулы В.animalis lactis) характеризуется кинетикой, по существу идентичной кинетике смеси G4 (гранулы основного L-цистеина отдельно от гранул В.animalis lactis). Это указывает на преимущество введения активатора роста. В приведенных ниже таблицах 2 и 3 представлены значения некоторых кинетических параметров образования кислот, показанных на фиг.6 и 7.
На фиг.8 и 9 показана динамика популяции клеток пробиотического микроорганизма В.animalis lactis штамма ВВ12 (фиг.8) и штамма I-2494 (фиг.9) в ходе хранения ферментированного молочного продукта (симбиоз S.thermophilus - L.bulgaricus, помимо В.animalis lactis) при температуре 10°С. Данные кривые развития популяции клеток подтверждают результаты, которые наблюдали при изучении кинетики образования кислот, представленной на фиг.6 и 7. Присутствие L-цистеина в значительной степени стимулирует популяцию клеток пробиотика; интеграция основного L-цистеина для каждого из двух представленных штаммов В.animalis lactis оказалась проведенной успешно.
Так, при сравнении с "комбинированной" системой G4 (гранулы пробиотического микроорганизма В.animalis lactis + отдельные гранулы основного L-цистеина) гранулы G4I «объединенного состава», содержащие основный L-цистеин, являются столь же эффективными: они позволяют осуществлять симбиотическую молочную ферментацию (S.thermophilus + L.bulgaricus), обеспечивающую по меньшей мере столь же высокое качество, и вырастить популяцию клеток пробиотического микроорганизма В.animalis lactis практически сравнимого размера, столь же долго сохраняющуюся с течением времени при хранении ферментированного молока. Таким образом, выбор основного L-цистеина позволил добиться успешной интеграции активатора роста, специфичного для В.animalis lactis.
Гранулы G4I объединенного состава, содержащие пробиотический микроорганизм В.animalis lactis и основный L-цистеин, и "комбинированные" гранулы G4 (гранулы основного L-цистеина и отдельно гранулы пробиотика), являются гораздо более эффективными, чем контрольная система, не содержащая цистеин (гранулы Т): они позволяют осуществлять симбиотическую кисломолочную ферментацию (S.thermophilus + L.bulgaricus), обеспечивающую по меньшей мере столь же высокое качество и позволяющую получить популяцию клеток пробиотического микроорганизма В.animalis lactis существенно большего размера, гораздо дольше сохраняющуюся с течением времени при хранении ферментированного молока.