Анализ метилирования промоторного участка гена PDLIM4 при раке предстательной железы

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ КАЗАНСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО УНИВЕРСИТЕТА Том 150, кн. 2 Естественные науки 2008

УДК 577.218

АНАЛИЗ МЕТИЛИРОВАНИЯ ПРОМОТОРНОГО УЧАСТКА ГЕНА PDLIM4 ПРИ РАКЕ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

И.И. Ибрагимова, А.Н. Фаттахова Аннотация

Рак предстательной железы является одной из главной причин смертности среди мужчин от злокачественных опухолей. Успешное лечение рака простаты зависит от ранних сроков диагностики, а также точности прогноза. Однако раннее обнаружение опухоли затруднено вследствие бессимптомного протекания болезни. Очевидно, что наряду с существующими, необходима разработка новых методов ранней диагностики.

Было показано, что нарушения в работе генов-супрессоров опухолевого роста могут приводить к прогрессии развития заболевания. Наряду с нарушениями генетического аппарата клетки, непосредственно затрагивающими последовательность ДНК, существуют нарушения эпигенетической природы, не меняющие последовательность ДНК, однако приводящие к нарушению транскрипции генов. Одним из таких изменений является абберантное гиперметилирование CpG-островков, ассоциированных с 5'-регуля-торными районами многих генов.

В данной работе был проведен анализ метилирования промоторного участка гена PDLIM4. Данный ген был идентифицирован как потенциальный ген-супрессор опухолевого роста. С помощью методов бисульфитной ПЦР, секвенирования и метил-специ-фичной ПЦР в реальном времени было изучено метилирование CpG-островков промо-торной области гена PDLIM4 в клеточных линиях рака предстательной железы (LNCaP, MDA PCa 2b, DU 145, PC-3), в опухолевых образцах и в нормальной ткани простаты.

В ходе исследований было показано, что CpG-островки промоторной области гена PDLIM4 метилированы во всех клеточных линиях рака предстательной железы, но не-метилированы в нормальной ткани. Было также установлено, что в образцах аденокарциномы частота метилирования выше (78%), чем в образцах ДНК, выделенной из предстательной железы пациентов с диагнозом простатическая интерэпителиальная неопла-зия (19%). На основании полученных результатов можно сделать вывод, что метилирование промоторной области гена PDLIM4 может быть рассмотрено как потенциальный биомаркер рака предстательной железы.

Ключевые слова: рак простаты, метилирование, PDLIM4, биомаркер.

Введение

Рак предстательной железы (РПЖ) является одной из главной причин смертности среди мужчин от злокачественных новообразований. По оценкам Национального Института Рака, США, (National Cancer Institute, USA) в 2006 г. было зарегистрировано 234460 новых случаев развития данной патологии. В США РПЖ является наиболее распространенной злокачественной опухолью и занимает третье место (после рака легкого и рака толстой кишки) по смертности среди мужчин старше 55 лет от онкологических заболеваний [1]. Успешное лечение карциномы предстательной железы зависит от ранней диагностики и

точности прогноза, но ранняя диагностика крайне затруднена вследствие бессимптомного протекания болезни. В настоящее время для диагностики опухолей простаты используются следующие методы: ректальное пальцевое обследование простаты, определение уровня простатического специфического антигена (ПСА) в плазме крови [2] и биопсия простаты [3], однако перечисленные методы не всегда эффективны [4]. Очевидно, что необходима разработка новых высокочувствительных неинвазивных методов ранней диагностики РПЖ.

На данный момент представления о генетической природе развития онкологических заболеваний основаны на факте существования генов, нормальная функция которых связана с подавлением опухолевого роста [5]. Такие гены были названы генами-супрессорами опухолевого роста [6-8]. Нарушения в работе этих генов приводят к возникновению и прогрессии развития злокачественных новообразований, а восстановление функции - к существенному замедлению пролиферации, а иногда и реверсии заболевания. В многостадийном процессе развития злокачественных опухолей нарушение функций клеточных генов может происходить не только в результате генетических событий (точечные мутации, делеции, дупликации и реарранжировка генов), но и в результате эпигенетических изменений, не связанных с нарушением последовательности ДНК [9]. Одним из таких изменений является абберантное гиперметилирование CpG-островков, ассоциированных с 5'-регуляторными районами многих генов. Данный процесс представляет собой присоединение метильной группы к цитозину, входящему в состав CpG-динуклеотида, с образованием метилцитозина, следствием чего является невозможность узнавания факторами транскрипции метилированной последовательности регуляторного участка, что приводит к значительному снижению уровня, вплоть до полного отсутствия, транскрипции гена [5, 10, 11].

Ген PDLIM4 был идентифицирован как потенциальный ген-супрессор опухолевого роста, участвующий в поддержании нормального клеточного роста. Было установлено, что продукт данного гена модулирует работу нитей актина, а также ассоциирован с цитоскелетом клетки [12].

В данной работе представлены результаты по определению статуса метилирования CpG-островков промоторного участка гена PDLIM4 в клеточных линиях LNCaP, MDA PCa 2b, DU 145, PC-3, в опухолях и нормальных тканях предстательной железы.

1. Материалы и методы

Клеточные линии и клинический материал. В данной работе использовались 2 типа клеточных лини - андроген-независимые клеточные линии PC-3 и DU 145, полученные из метастазов в кости и в головной мозг соответственно; и андроген-зависимые LNCaP и MDA PCa 2b, полученные из метастазов в лимфатические узлы и кости.

Образцы рака предстательной железы и морфологически нормальных тканей были получены в Центральном раковом госпитале Фокс Чейз, США (Fox Chase Cancer Center Hospital, USA). Было проанализировано 36 образцов ДНК, выделенной из опухолей пациентов с диагнозом аденокарцинома и 21 образец ДНК из ткани простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН). Выделе-

ние ДНК проводили по стандартной методике с фенол-хлороформной экстракцией и последующей преципитацией ДНК спиртом.

Бисульфитная модификация ДНК. Данный метод основан на способности иона гидросульфита взаимодействовать с цитозином, с превращением последнего в урацил, таким образом, при бисульфитной модификации ДНК все неметилированные цитозины конвертируются в урацил с последующей заменой на тимин, в то время как метилированные цитозины в составе CpG островков остаются неизменными.

1 мкг выделенной ДНК денатурировали 0.2 М гидроксидом натрия 10 мин при 37 °С, затем модифицировали гидрохиноном и бисульфитом натрия в течение 16-18 ч при 50 °С. Модифицированную ДНК очищали с использованием набора Wizard DNA Clean-Up system (Promega, Madison, WI), с последующей обработкой 0.3 М гидроксидом натрия и осаждением ДНК спиртом.

ПЦР и секвенирование ДНК. Полученную после бисульфитной модификации ДНК амплифицировали с использованием праймеров (forward 5'-TGTTAGTYGGGTTTATGAGGA-3', reverse 5'-AGTGGGGATAGGGGRGGG-3', где Y и R - это цитозин или тимин), при следующих условиях (95 °С - 1 мин, спец. Т - 1 мин, 72 °С - 1 мин)*38 циклов, с понижением специальной температуры на 1 градус в диапазоне 59, 58, 57 °С с целью уменьшения неспецифического связывания праймеров.

Продукты амплификации визуализировались в 2%-ном агарозном геле с последующей очисткой ДНК из агарозного геля при помощи набора Qiagen (Gel extraction kit, Maryland, CA). Полученную ДНК секвенировали на автоматическом секвенаторе (модель 377XL, Applied Biosystems) с использованием праймеров, специфичных для гена PDLIM4.

Метил-специфичная ПЦР в реальном времени. Анализ метилирования промоторного участка гена PDLIM4 проводился с использованием количественного метода метил-специфичной ПЦР в реальном времени. 3 мкл бисуль-фитно-модифицированной ДНК амплифицировали с использованием локус-специфичных ПЦР праймеров и олигонуклеотидной пробы (forward: 5'-GTTGGGTTTGGGTTCGCGG-3', reverse: 5'-GTCGGGGTTGAGGGCG GG-3', проба: 5'-AAGGTTCGAGTAGGATTTAGG-3'). Условия реакции были следующими: 95 °С - 10 мин, (95 °С -15 с, 60 °С - 1 мин, 72 °С - 15 с)*50 циклов. В качестве гена-референса использовался ген белка Р-актина.

Уровень метилирования высчитывался как натуральный логарифм от процентного отношения количества метилированных алеллей изучаемого гена к количеству метилированных алеллей Р-актина плюс единица. При этом аллель считается метилированным при значении отношения количества метилированных алеллей изучаемого гена к количеству метилированных алеллей Р-актина более 5%.

2. Результаты и обсуждение

Ранее было показано, что абберантное метилирование CpG островков про-моторной части генов-супрессоров опухолевого роста подавляет их транскрипцию [13-17]. Целью нашего исследования являлся анализ метилирования CpG островков промоторного участка гена PDLIM4 в клеточных линиях рака пред-

стательной железы, в образцах тканей РПЖ, ПИН и в нормальной ткани с последующей оценкой диагностической ценности изучаемого гена.

Продукты генов PDLIM4, ALP, CLP-36 входят в состав семейства PDZ-LIM белков, участвующих в функционировании цитоскелета мышечных и немышечных клеток. Актиновый цитоскелет (АЦ) в мышечных клетках играет роль сократительного аппарата, в то время как в немышечных клетках он участвует в многочисленных процессах таких, как движение клетки, изменение ее формы, деление и т. д. В организации АЦ принимает участие большое количество белков, которые способны взаимодействовать с участниками различных сигнальных путей. Было высказано предположение, что PDZ-LIM белки выступают в качестве посредников между сигнальными молекулами и АЦ, что может быть объяснено строением этих белков, которые содержат в себе один МН2-терминальный PDZ-домен (ответственный за связь с АЦ) и один COOH-терминальный LIM-домен (способный взаимодействовать с киназами) [12].

Было показано, что благодаря белок-белковым взаимодействиям PDLIM4 способен модулировать активность TRIP6 (транскрипционного коактиватора v-rel/ядерного фактора-кВ) [18, 19] и белка PTP-BL, участвующего в FAS-моду-лируемом апоптозе [20]. Таким образом, PDLIM4 участвует в регуляции апоп-тоза по FAS/NF-кВ пути. Было также показано, что восстановление экспрессии изучаемого гена в опухолевых клетках кишечника приводит к уменьшению пролиферации и снижению способности клонообразования, а также более чем двукратному увеличению частоты апоптоза, вызванного ультрафиолетовым облучением [21]. Учитывая, что PDLIM4 проявляет проапоптические функции, подавление экспрессии данного гена может способствовать ускорению роста раковых клеток. В связи с этим представляется интересным изучить паттерн метилирования гена PDLIM4 при раке предстательной железы.

На начальном этапе работы с помощью метода бисульфитного секвениро-вания ДНК был проведен анализ метилирования промоторного участка гена PDLIM4 в четырех клеточных линиях рака предстательной железы (LNCaP, MDA PCa 2b, DU 145, PC-3) и в трех образцах ДНК, выделенной из нормальной ткани простаты. Для этого была проведена бисульфитная конверсия образцов ДНК перечисленных выше клеточных линий и тканей. Далее полученная ДНК была амплифицирована, и продукты амплификации визуализировались в 2% агарозном геле (рис. 1).

Далее продукты амплификации сиквенировали. На рис. 2 схематично представлен исследуемый участок, а также приведены хроматограммы сиквенса участка CpG-островка, входящего в состав промотора гена PDLIM4, в клетках клеточных линий рака предстательной железы (LNCaP и MDA PCa 2b) и нормальной ткани предстательной железы.

Было установлено, что промоторная область гена PDLIM4 метилирована во всех 4-х клеточных линиях рака простаты, в то время как в нормальной ткани метилирование не было обнаружено, что позволяет сделать вывод, что первичная природа подавления экспрессии данного гена может быть эпигенетической, то есть является следствием гиперметилирования CpG-островков, входящих в состав промотора.

1 2 3 4 5 6

400 п.н,-

300 п.н,-

Рис. 1. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации бисульфит-модифи-цированной ДНК в агарозном геле, где 1 - ЬМСаР, 2 - МБЛ РСа 2Ь, 3 - БИ 145, 4 -РС-3, 5 и 6 - ДНК, выделенная из нормальной ткани предстательной железы. Размер продукта - 358 п. н.

Далее нами было проанализировано 36 образцов опухолей предстательной железы и 21 образец простатической интерэпителиальной неоплазии. Методом метил-специфичной ПЦР в реальном времени была проведена количественная оценка уровня метилирования СрО островков промотора гена РБЫМ4 в исследуемых образцах (рис. 3).

В ходе анализа было установлено, что в случае карциномы предстательной железы метилированными были 28 образцов, что составило 78% от общего числа опухолей. В случае ПИН было метилировано 4 образца (19%). Такие результаты, по-видимому, связаны с тем, что ПИН, хотя и имеет большое количество общих иммунофенотипических и цитологических черт с карциномой, а также связана с ней территориально, все же не является предшественником развития рака. Высказывается мнение, что они обе вызываются одинаковыми этиологическими факторами, но наличие ПИН недостаточно и необязательно для возникновения карциномы [25]. Обнаруженный нами факт сниженной частоты метилирования в образцах ПИН по сравнению с метилированием при аденокарциноме (19% против 78%) свидетельствует о том, что ген РБЫМ4 специфично метилирован при РПЖ, и о потенциальной возможности его использования в ранней диагностики аденокарциномы простаты.

Таким образом, в ходе проделанной работы были получены следующие результаты. С помощью методов бисульфитных модификаций и ПЦР был проведен анализ метилирования промоторного участка гена РБЫМ4 в клеточных линиях РПЖ и в нормальной ткани. Было установлено, что СрО-островки, входящие в состав промотора гена РБЫМ4, метилированы во всех клеточных линиях РПЖ и неметилированы в нормальной ткани. С использованием высокочувствительного метода метил-специфичной ПЦР в реальном времени мы показали, что промоторная область гена РБЫМ4 гиперметилирована в образцах опухолей предстательной железы.

В случае аденокарциномы метилирование было обнаружено в 78% образцов ДНК, а в случае ПИН - в 19%, что свидетельствует о возможности создания новых скрининговых методов ранней диагностики рака простаты, основанных на выявлении гиперметилирования промоторной области гена РБЫМ4.

Summary

I.I. Ibragimova, A.N. Fattahova. Methylation of PDLIM4 Gene in Prostate Cancer.

Prostate cancer is the most commonly detected cancer and the third leading cause of cancer death among men in the developed world. Although the molecular basis of prostate cancer initiation and progression is still poorly understood, malfunction of tumor-suppressor genes is known to contribute to cancer formation. The epigenetic alteration of aberrant DNA methyla-tion of CpG islands in the promoter region is a common mechanism causing malfunction of tumor-suppressor genes in cancer cells.

In this study we examined the methylation status of PDLIM4 gene, which was identified as potential tumor-suppressor gene. The methylation status of the promoter CpG islands of PDLIM4 was validated by means of bisulfite PCR, sequencing, and real-time quantitative MSP methods in the cell lines, primary prostate tumor and normal prostate DNA.

To date, our data has revealed greater hypermethylation of PDLIM4 promoter 78% (28/36) in primary prostate cancer compared to 19% (4/21) in prostate intraepithelial neoplasia. Our results suggest that PDLIM4 promoter hypermethylation is a good potential diagnostic DNA marker in human prostate cancer.

Key words: prostate cancer; methylation; PDLIM4; biomarker.

Литература

1. Jemal A. et al. Cancer statistics, 2007 // CA Cancer J. Clin. - 2007. - V. 57, No 1. -P. 43-66.

2. Linn M.M., Ball R.A., Maradiegue A. Prostate-specific antigen screening: friend or foe? // Urol Nurs. - 2007. - V. 27, No 6. - P. 481-489.

3. Al-Ghamdi A.M. et al., Extended pattern prostate biopsy does not minimize the volume-grade bias in prostate cancer detection // J. Urol. - 2008. - V. 179, No 4. - P. 1332-1334

4. Franke S. et al. Screening for prostate cancer // Lancet. - 2003. - V. 361, No 9363. -P. 1122-1128.

5. Baylin S.B., Herman J.G. DNA hypermethylation in tumorigenesis: epigenetics joins genetics // Trends Genet. - 2000. - V. 16, No 4. - P. 168-174.

6. Parekh D.J. et al. Biomarkers for prostate cancer detection // J. Urol. - 2007. - V. 178, No 6. - P. 2252-2259.

7. Robertson K.D. DNA methylation and human disease // Nat. Rev. Genet. - 2005. - V. 6, No 8. - P. 597-610.

8. Sidransky D. Emerging molecular markers of cancer // Nat. Rev. Cancer. - 2002. - V. 2, No 3. - P. 210-219.

9. Jones P.A., Baylin S.B. The fundamental role of epigenetic events in cancer // Nat. Rev. Genet. - 2002. - V. 3, No 6. - P. 415-428.

10. LairdP.W. The power and the promise of DNA methylation markers // Nat. Rev. Cancer. -2003. - V. 3, No 4. - P. 253-266.

11. Laird P.W. Cancer epigenetics // Hum. Mol. Genet. - 2005. - V. 14, No 1. - P. R65-R76.

12. Vallenius T. et al. The PDZ-LIM protein RIL modulates actin stress fiber turnover and enhances the association of alpha-actinin with F-actin // Exp. Cell Res. - 2004. - V. 293, No 1. - P. 117-128.

13. Cairns P. et al. Molecular detection of prostate cancer in urine by GSTP1 hypermethylation // Clin. Cancer Res. - 2001. - V. 7, No 9. - P. 2727-2730.

14. Jeronimo C. et al. Quantitation of GSTP1 methylation in non-neoplastic prostatic tissue and organ-confined prostate adenocarcinoma // J. Natl. Cancer Inst. - 2001. - V. 93, No 22. - P. 1747-1752.

15. Kang G.H. et al. Aberrant CpG island hypermethylation of multiple genes in prostate cancer and prostatic intraepithelial neoplasia // J. Pathol. - 2004. - V. 202, No 2. -P. 233-240.

16. Merlo A. et al. 5' CpG island methylation is associated with transcriptional silencing of the tumour suppressor p16/CDKN2/MTS1 in human cancers // Nat. Med. - 1995. - V. 1, No 7. - P. 686-692.

17. Yegnasubramanian S. et al. Hypermethylation of CpG islands in primary and metastatic human prostate cancer // Cancer Res. - 2004. - V. 64, No 6. - P. 1975-1986.

18. Cuppen E. et al. The zyxin-related protein TRIP6 interacts with PDZ motifs in the adaptor protein RIL and the protein tyrosine phosphatase PTP-BL // Eur. J. Cell Biol. - 2000. -V. 79, No 4. - P. 283-293.

19. Zhao M.K. et al. LIM domain-containing protein trip6 can act as a coactivator for the v-Rel transcription factor // Gene Expr. - 1999. - V. 8, No 4. - P. 207-217.

20. Sato T. et al. FAP-1: a protein tyrosine phosphatase that associates with Fas // Science. -1995. - V. 268, No 5209. - P. 411-415.

21. Boumber Y.A. et al. RIL, a LIM gene on 5q31, is silenced by methylation in cancer and sensitizes cancer cells to apoptosis // Cancer Res. - 2007. - V. 67, No 5. - P. 1997-2005.

22. Пожарский К.М. и др. Патоморфологическая характеристика и особенности карциномы предстательной железы. Значение простатической интраэпителиальной неоплазии // Практ. онкология. - 2001. - Т. 2, № 6. - С. 17-23.

Поступила в редакцию 10.03.08

Ибрагимова Ильсия Ильшатовна - аспирант кафедры биохимии Казанского государственного университета.

Фаттахова Альфия Нурлимановна - кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии Казанского государственного университета.

E-mail: afattakh@rambler.ru

ХАТА АТС

- 461 п.н. - 103 п.н. I

1111III1111IIIIII  III  ІIIIIIII  ІІІІІІІІ111

35Э п.н.

__________________________________'і

'ПС-СЯС ГП С я Т Т Т Я Б 0~Г~С С "Г С ГВ— Б- С ~Т“ С — В'ГГС—СИ_Н_С6С СС—ГІГ

і І

ГС^С Гт^С^П Т'Т'ТТГСТС^СТГС ГС СТГС т т ссянссссссс

шішмміїмммішшмтшмм

і___4

!•_______________________________________>1____________________________________і'____________________і_

Т СЛБТПССПГТТП сстт—їгг^ї—С С С С Г Т—Б Т 7—I—С П П 7—пппппг

шДййДл/уШЛ/У)АДОАЛмдт№\АМ^лалЛлд,

Рис. 2. Схематичное изображение расположения Срв динуклеотидов в исследуемом участке и хроматограммы сиквенсов продуктов ПЦР, полученных при амплификации бисульфит-модифицированной ДНК промоторного участка гена РБЫМ4 в клеточных линиях опухоли предстательной железы ЬМСаР (а), МБЛ РСа 2Ь (б) и нормальной ткани (в). Стрелками отмечено присутствие цитозина (С) в Срв-динуклеотидах в клеточных линиях опухоли предстательной железы и тимина (Т) - в нормальной ткани

Рис. 3. Количественный анализ метилирования промоторного участка гена РБЫМ4 в образцах РПЖ и ПИН. Метилирование было показано для 78% РПЖ

а

б

в