СПОСОБ ФИКСАЦИИ ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗЦА
HISTOLOGICAL SAMPLE FIXATION TECHNIQUE

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии, и может использоваться для фиксации гистологического образца, полученного при подготовке к гистологическому исследованию, во время тканевой толстоигольной биопсии.
Известны следующие способы фиксации гистологических образцов, полученных при подготовке к гистологическому исследованию, во время тканевой толстоигольной биопсии
1. Укладка каждого образца в отдельную емкость (пробирку), где образец свободно находится в формалине. (Does site specific labeling of sextant biopsy cores predict the site of extracapsular extension in radical prostatectomysurgical specimen? / S.S. Taneja, D.F. Penson, A. Epelbaum et al. // J. Urol. - 1999. - Vol.162. - P. 1352-1357).
2. Укладка нескольких образцов предварительно окрашенных
красками разного цвета в одну пробирку (Allen, E.A.Repeat biopsy strategies for men with atypical diagnoses on initial prostate needle biopsy / E.A.Allen, H.Kahane, J.I.Epstein // Urology. - 1998. - Vol.52, №5. - P. 803-807).
3. Использование микрокассет с множеством нумерованных отделений, в каждое из которых укладывается образец. Затем кассету помещают в фиксирующий раствор. (Use and rationale of a multicompartment microcassette for site-specific biopsies of the prostate in a consecutive cohort of men / M.E. Laniado, I. McMullen, M.M. Walker, A. Patel // Prostate Cancer and Prostatic Diseases. - 2003. - Vol.6. - P. 50-52).
4. Укладка образца на сгиб бумажного контейнера между двумя слоями бумаги или другого пористого материала, с последующим помещением бумажного контейнера в фиксирующий раствор. (Humphrey P. A. Adenocarcinoma of the prostate I. Tissue sampling considerations / P.A.Humphrey, P.J.Walther // Am. J.Clin. Pathol. - 1993. - Vol.99. - P. 746-759) (Усовершенствование методики исследования толстоигольных биоптатов предстательной железы / А.И.Урбанский, А.Б.Маркочев, А.Ю.Плеханов и др. // Архив патологии. - 2005. - №2. - С.50).
5. Укладка образцов в кассеты с поролоновыми пластинами, выполненными из нейлона. Образец вытягивается на нижней пластине и фиксируется между двумя пластинами. (Optimized preembedding method improves the histologic yield of prostatic core needle biopsies / H.Rogatsch, T.Mairinger, W.Hominger et al. // Prostate. - 2000. - Vol.42 - P. 124-129).
Каждый из перечисленных способов по данным литературы (Individual prostate biopsy core embedding facilitates maximal tissue representation / J.Kao, M.Upton, P.Zhang, S.Rose // J.Urol. - 2002. - Vol.168. - P. 496-499) (Guidelines for processing and reporting of prostatic needle biopsies / Th. H. van der Kwast, C.Lopes, C.Santonja // J.Clin. Pathol. - 2003. - Vol.56. - P. 336-340) (Усовершенствование методики исследования толстоигольных биоптатов предстательной железы / А.И.Урбанский, А.Б.Маркочев, А.Ю.Плеханов и др. // Архив патологии. - 2005. - №2. - С.50) и по мнению авторов заявляемого способа не лишен недостатков. При использовании емкостей с фиксирующим раствором, где образец не удерживается во время фиксации между двумя плоскостями (емкости с фиксирующим раствором, микрокассеты без поролона), образец скручивается в сложную фигуру в трехмерном пространстве. В таком виде образец помещается в парафиновый блок, а при его нарезке срезы получаются непротяженными, малоинформативными, а часть ткани теряется. Таким образом, снижается выявляемость искомого заболевания (опухоли) и становится невозможной оценка протяженности и локализации опухоли. Зачастую образцы, получаемые при биопсии, фрагментированы. При данных способах фиксации возможна потеря мелких фрагментов, а также невозможно установить, в каком порядке фрагменты следовали друг за другом в исследуемом органе.
Недостатками описанных в литературе способов, когда образец удерживается между двумя плоскостями и помещается в фиксирующий раствор (бумажные контейнеры, кассеты с поролоном), является, по мнению авторов заявляемого способа, во-первых, искусственное растяжение образца относительно его изначальной длины, что делает невозможным измерение реальной протяженности очага искомого заболевания (опухоли) в образце, во-вторых, при использовании контейнера с поролоном образец оказывается извит в одной плоскости. Такие образцы неудобно помещать в парафиновый блок, так как для получения информативных срезов плоскость, в которой извит образец, должна полностью совпадать с плоскостью срезов микротома.
В качестве прототипа по наиболее близкой технической сущности нами выбран способ, предложенный коллективом авторов и описанный в Human Pathology (Optimized preembedding method improves the histologic yield of prostatic core needle biopsies / H.Rogatsch, T.Mairinger, W.Hominger et al. // Prostate. - 2000. - Vol.42 - P. 124-129). Способ заключается в том, что перед фиксацией образцы, взятые из предстательной железы, после биопсии вытягивают и помещают в биопсийные кассеты между двумя поролоновыми пластинами, выполненными из нейлона. Образцы складывают в 6 контейнеров. Далее кассеты помещают в контейнеры с 10% формалином.
Недостатком прототипа, по мнению авторов заявляемого способа, является, во-первых, искусственное растяжение образца относительно его изначальной длины, что делает невозможным измерение реальной протяженности очага искомого заболевания (опухоли) в образце, во вторых, при использовании контейнера с поролоном образец оказывается извит в одной плоскости, в третьих, в случаях получения фрагментированных образцов врачу неудобно укладывать их в контейнер, что увеличивает длительность процедуры. Такие образцы неудобно помещать в парафиновый блок, так как для получения информативных срезов плоскость, в которой извит образец, должна полностью совпадать с плоскостью срезов микротома.
Задачей изобретения является повышение информативности срезов гистологических образцов, а также повышение удобства размещения фрагментированных гистологических образцов между двумя пластинами.
Техническим результатом изобретения является получение гистологического образца правильной цилиндрической формы и сохранение его длины, то есть отсутствие растяжения гистологического образца.
Технический результат достигается тем, что гистологический образец, полученный при тканевой толстоигольной биопсии при подготовке к гистологическому исследованию, размещают между двумя пластинами с последующей фиксацией в фиксирующем растворе, причем гистологический образец размещают в канавках, выполненных на одной из пластин, глубина и ширина канавок равны диаметру биопсийной иглы, а их длина - длине паза биопсийной иглы. Перед помещением пластин в фиксирующий раствор их дополнительно скрепляют.
Способ осуществляется следующим образом:
Во время биопсии гистологический образец (нами выполнялась биопсия предстательной железы) помещают в канавки стеклянной пластины следующим образом: биопсийную иглу с гистологическим образцом пазом вниз помещают в соответствующую канавку и сдвигают иглу в сторону, таким образом, что ровно уложенный образец остается в канавке. Затем гистологические образцы покрывают поролоновой пластиной, выполненной из нейлона, смоченной в фиксирующем растворе, сверху накрывают предметным стеклом. Затем нижнюю пластину и предметное стекло стягивают резинкой и помещают в фиксирующий раствор (10% забуференный раствор формалина). Все образцы укладывают, начиная с канавки №1, которая обозначена соответствующей цифрой, согласно следующей схеме:
1 Базальная часть правой доли
2 Средняя часть правой доли
3 Апекальная часть правой доли
4 Базальная часть левой доли
5 Средняя часть левой доли
6 Апекальная часть левой доли
7 Базально-латеральная часть правой доли
8 Средне-латеральная часть правой доли
9 Апекально-латеральная часть правой доли
10 Базально-латеральная часть левой доли
11 Средне-латеральная часть левой доли
12 Апекально-латеральная часть левой доли.
Контейнер с биоптатами проведен через гистологическую проводку после фиксации в 10% забуференном растворе формалина в течение 12 часов.
Нами изготовлена стеклянная пластина 75×19×5 мм; ширина пластины (19 мм) соответствует длине паза биопсийной иглы, на пластине выполнены 12 канавок глубиной и шириной 1 мм, что соответствует диаметру биопсийной иглы. Канавки расположены через равные промежутки параллельно меньшей стороне пластины. Первая канавка обозначена выгравированной цифрой 1. Покрывающая поролоновая пластина, выполненная из нейлона, состоит из трех биопсийных прокладок (Biooptica, Италия). Предметное стекло, которым покрываются обе пластины, имеет стандартный размер 76х26х1,1 мм (БиоВитрум, Россия). Вся конструкция скреплялась латексным кольцевым хомутом.
Отличительным существенным признаком заявляемого способа является:
Гистологический образец, полученный при тканевой толстоигольной биопсии при подготовке к гистологическому исследованию, размещают в выполненных на пластине канавках, глубина и ширина которых соответствуют диаметру биопсийной иглы, а длина - длине паза биопсийной иглы.
Причинно-следственная связь между отличительным существенным признаком и достигаемым результатом:
Размещение гистологического образца в выполненных на пластине канавках, глубина и ширина которых соответствуют диаметру биопсийной иглы, а длина - длине паза биопсийной иглы, обеспечивает:
- придание образцу правильной цилиндрической формы, что исключает возможность деформации и скручивания образца под действием фиксирующего раствора и облегчает его нарезку на микротоме;
- сохранение длины образца, полученного при биопсии, что дает возможность измерить реальные размеры патологического очага и повышает информативность исследования.
Отличительный существенный признак является новым и позволяет получить гистологические образцы правильной цилиндрической формы и сохранить длину гистологического образца, полученного при биопсии, что повышает информативность срезов гистологических образцов, удобство размещения фрагментированных гистологических образцов между двумя пластинами.
Для иллюстрации заявляемого способа приводим пример фиксации гистологического образца, полученного при тканевой толстоигольной биопсии предстательной железы при подготовке к гистологическому исследованию. Нами была изготовлена стеклянная пластина размером 75×19×5 мм. На пластине параллельно меньшей ее стороне через равные промежутки были выполнены 12 канавок размером 1×1 мм. Первая канавка обозначена выгравированной цифрой 1, взяты поролоновая пластина, выполненная из нейлона размером 75×25×1 мм и аналогичного размера предметное стекло. Вся конструкция скреплялась.
20 апреля 2007 года с 13:30 до 13:50 в отделение урологии по истории болезни №7164/07 была выполнена операция №217 по цистоскопическому операционному журналу, начатому 27.02.07 - биопсия. Биопсия выполнена под местным обезболиванием иглой TruGuide пружинной биопсийной системой Magnum фирмы С.R. BARD Inc., США, Германия. ТРУЗИ контроль осуществлялся на аппарате SHIMATSU с ректальным датчиком и адаптером для биопсии.
После получения материала каждый столбик укладывался в канавку на стекле, начиная с маркированной цифрой 1, забор столбиков осуществлялся согласно направлению на гистологическое исследование. Столбики в канавки укладывались следующим образом. Открытая игла пазом вниз (содержащим образец) опускалась в очередную канавку и затем смещалась в направлении следующей свободной канавки, при этом образец оставался внутри канавки. Затем все стекло со стороны заполненных канавок покрывалось поролоновой пластиной, выполненной из нейлона, пропитанной 10% забуференным раствором формалина, на эту пластину укладывалось аналогичного размера предметное стекло. Вся конструкция скреплялась резинкой и опускалась в 10% забуференный раствор формалина.
21 апреля 2007 года в отделение патоморфологии с прозектурой ФГУ ЦНИРРИ Росздрава направлен материал мультифокальной биопсии пациента П., 67 лет. В сопроводительном направлении указана дата биопсии (20.04.2007), уровень ПСА сыворотки крови (7,01 нг/мл), а также протокол забора биоптатов (12 образцов ткани в виде столбиков: 6 стандартных - основания, средняя часть и верхушка каждой доли предстательной железы, пронумерованных от 1 до 6, начиная с основания правой и заканчивая верхушкой левой доли; 6 латеральных - базально-латеральная часть, среднелатеральная часть, апекально-латеральная каждой доли предстательной железы, пронумерованных от 7 до 12, начиная с основания правой и заканчивая верхушкой левой доли). В качестве фиксатора использован 10% забуференный раствор формалина. Материал зарегистрирован под номером Б-230255-230266 (12 микропрепаратов).
В полученном контейнере представлены тканевые биоптаты в виде столбика:
1 (Базальная часть правой доли). Столбик ткани предстательной железы, фиксированный в формалине, длиною 19×1×1 мм.
2 (Средняя часть правой доли). Столбик ткани предстательной железы, фиксированный в формалине, длиною 19×1×1 мм.
3 (Апекальная часть правой доли). Столбик ткани предстательной железы, фиксированный в формалине, длиною 19×1×1 мм.
4 (Базальная часть левой доли). Столбик ткани предстательной железы, фиксированный в формалине, длиною 19×1×1 мм.
5 (Средняя часть левой доли). Столбик ткани предстательной железы, фиксированный в формалине, длиною 19×1×1 мм.
6 (Апекальная часть левой доли). Столбик ткани предстательной железы, фиксированный в формалине, длиною 19×1×1 мм.
7 (Базально-латеральная часть правой доли). Столбик ткани предстательной железы, фиксированный в формалине, длиною 19×1×1 мм.
8 (Средне-латеральная часть правой доли). Столбик ткани предстательной железы, фиксированный в формалине, длиною 19×1×1 мм.
9 (Апекально-латеральная часть правой доли). Столбик ткани предстательной железы, фиксированный в формалине, длиною 19×1×1 мм.
10 (Базально-латеральная часть левой доли). Столбик ткани предстательной железы, фиксированный в формалине, длиною 19×1×1 мм.
11 (Средне-латеральная часть левой доли). Столбик ткани предстательной железы, фиксированный в формалине, длиною 19×1×1 мм.
12 (Апекально-латеральная часть левой доли). Столбик ткани предстательной железы, фиксированный в формалине, длиною 19×1×1 мм.
Контейнер с биоптатами после фиксации в 10% забуференном растворе формалина в течение 12 часов проведен через следующую гистологическую проводку:
Изопропиловый спирт - 180 мин.
Изопропиловый спирт - 180 мин.
Изопропиловый спирт - 180 мин.
Изопропиловый спирт - 180 мин.
Изопропиловый спирт - 180 мин.
Изопропиловый спирт - 180 мин.
Пропитывание парафином (PARAPLAST PLUS, McCormick, температура плавления 56°С) в термостате при температуре 58°С 30 мин.
Пропитывание парафином (PARAPLAST PLUS, McCormick, температура плавления 56°С) в термостате при температуре 58°С 30 мин.
Пропитывание парафином (PARAPLAST PLUS, McCormick, температура плавления 56°С) в термостате при температуре 58°С 60 мин.
Далее формировались парафиновые (PARAPLAST PLUS, McCormick, температура плавления 56°С) блоки (12 шт.) с использованием заливочных ванночек (LEICA) и одноразовых пластиковых кассет (Plastic Embedding Device, Bio Cassette, Italy). С каждого парафинового блока получали по 5 гистологических срезов, располагавшихся на 1 предметном стекле (MENZEL-GLASER, SuperFrost, 76×26 мм), с использованием роторного микротома (LEICA RM4125) и одноразовых съемных лезвий LEICA DB 80L (Low profile). Полученные срезы в течение 12 часов подсушивались и расправлялись в термостате при температуре 37°С.
Окраска срезов:
Депарафинизация в ксилоле - 5 мин.
Депарафинизация в ксилоле - 5 мин.
Обезжиривание в спирте 96° - 3-5 мин.
Промывка в теплой водопроводной воде 3-5 мин.
Окраска гематоксилином Майера - 1 мин.
Промывка в теплой водопроводной воде 3-5 мин.
Докраска эозином 3 сек - 1 мин.
Промывка в воде 2 сек.
Обезвоживание в 96° спирте - 15-20 сек.
Карбоксилол - 1 мин.
Ксилол - 2 мин.
Ксилол - 2 мин.
Заключение в бальзам и закрытие окрашенного среза покровным стеклом (MENZEL-GLASER, 24×50 мм).
Микроскопия осуществлялась на световом микроскопе LEICA DMLS с окулярами НС PLAN s 10×/22/ и объективами N PLAN 2,5×; 5,0×; 10×; 20×; 40×.
Результат микроскопии:
Микропрепараты Б-230255-230266 (4)
1 (Базальная часть правой доли). Столбик ткани предстательной железы (фиксированный в формалине, L=19 мм) с фокусом аденокарциномы (протяженность ~ 1,0 мм): сумма Глисона 6 (3+3).
2 (Средняя часть правой доли). Столбик ткани предстательной железы (фиксированный в формалине. L=19 мм) с фокусом аденокарциномы (протяженность ~ 3,0 мм): сумма Глисона 6 (3+3). Элементы ПИН тяжелой степени. Парапростатическая фиброзно-жировая ткань без опухолевых элементов.
3 (Апекальная часть правой доли). Столбик ткани предстательной железы (фиксированный в формалине, L=19 мм) без опухолевых элементов.
4 (Базальная часть левой доли). Столбик ткани предстательной железы (фиксированный в формалине, L=19 мм) без опухолевых элементов.
5 (Средняя часть левой доли). Столбик ткани предстательной железы (фиксированный в формалине, L=19 мм), парапростатическая фиброзно-жировая ткань без опухолевых элементов.
6 (Апекальная часть левой доли). Столбик ткани предстательной железы (фиксированный в формалине, L=19 мм) без опухолевых элементов.
7 (Базально-латеральная часть правой доли). Столбик ткани предстательной железы (фиксированный в формалине, L=19 мм) без опухолевых элементов.
8 (Средне-латеральная часть правой доли). Столбик ткани предстательной железы (фиксированный в формалине, L=19 мм) без опухолевых элементов.
9 (Апекально-латеральная часть правой доли). Столбик ткани предстательной железы (фиксированный в формалине, L=19 мм) без опухолевых элементов.
10 (Базально-латеральная часть левой доли). Столбик ткани предстательной железы (фиксированный в формалине, L=19 мм) без опухолевых элементов.
11 (Средне-латеральная часть левой доли). Столбик ткани предстательной железы (фиксированный в формалине, L=19 мм) с фокусом аденокарциномы (протяженность ~ 1,0 мм): сумма Глисона 6 (3+3). Элементы ПИН тяжелой степени.
12 (Апекально-латеральная часть левой доли). Столбик ткани предстательной железы (фиксированный в формалине, L=19 мм) с элементами ПИН тяжелой степени.
Для подтверждения эффективности разработанного нами способа нами проведено сравнение его с рутинным методом (аналогом), когда образцы, свободно плавая, фиксируются в формалине.
Проведено исследование на 80 пациентах с ПСА до 10,0 нг/мл и отсутствием изменений, подозрительных на предмет РПЖ при пальцевом ректальном исследовании.
Пациенты были случайным образом разделены на две равные группы, по 40 человек в каждой.
В первой группе образцы, согласно общепринятой методике, были оставлены для фиксации свободно плавающими в формалине в пробирке.
Во второй группе все образцы были фиксированы в соответствии с заявляемым нами способом.
Морфолог просматривал 3-4 среза каждого образца, фиксированного по заявляемому способу. При применении общепринятого метода количество срезов обычно оказывалось большим, а качество было худшим, в связи со сложной трехмерной формой образца. Таким образом технически не получался срез в единой плоскости.
Нами была сравнена выявляемость РПЖ в обеих группах. Выявляемость рака среди пациентов первой группы составила 30,0%, во второй группе - 45,0%. Это связано с тем, что заявляемый способ позволил повысить выявляемость мелких фокусов аденокарциномы (диаметром до 3 мм). В первой группе она была 20,2% среди общего количества полученных биоптатов, а во второй - 48,3% (р<0,05).
Также мы выполняли биопсии с фиксацией образцов способом-прототипом и провели сравнение с заявляемым способом.
При использовании способа-прототипа нами были получены гистологические образцы, взятые при биопсии предстательной железы, длиной 19 мм. При помещении образцов в контейнеры их длина достигала 25 мм и более, то есть образцы оказывались растянуты, причем степень растяжения различных гистологических структур предсказать невозможно, что затрудняет измерение реальной протяженности патологических очагов. В случае получения фрагментированных образцов имелись сложности с укладкой их в контейнер.
При использовании заявляемого способа нами получены 3-6 прямых не растянутых среза каждого столбика, что позволило оценить реальную протяженность патологических очагов, что, в свою очередь, повышает информативность срезов и улучшает стадирование заболеваний.
Таким образом, заявляемый способ позволяет повысить информативность срезов гистологических образцов за счет получения гистологических образцов правильной цилиндрической формы, с сохранением их длины, то есть предотвращением их растяжения, а также повысить удобство размещения фрагментированных гистологических образцов между двумя пластинами.