ПРИМЕНЕНИЕ ВАРИАНТОВ НАТРИЙУРЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА ТИПА С ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОСТЕОАРТРИТА
USE OF OPTIONS OF NATRIURETIC PEPTIDE OF TYPE C FOR TREATMENT OF OSTEOARTHRITIS

Область изобретения
[0001]
Описание относится к применению вариантов натрийуретического пептида типа C (CNP) для лечения остеоартрита, для облегчения одного или нескольких симптомов остеоартрита и для лечения нарушений, имеющих остеоартритный компонент.
Уровень техники для изобретения
[0002]
Остеоартрит (OA) представляет собой дегенеративное заболевание суставов. Он представляет собой наиболее распространенное заболевание суставов, поражающее, по оценкам, 10% мужчин и 18% женщин в возрасте более шестидесяти лет. Действительно, OA является одной из лидирующих причин боли и инвалидности у пожилых. Он представляет собой комплексное заболевание, которое не имеет одной причины, но скорее является конечной точкой для множества предрасполагающих факторов, включая травму суставов, возраст и ожирение. Наиболее распространенными патологическими изменениями суставов при OA являются деградация суставного хряща, воспаление синовиальной оболочки, увеличение толщины субхондральной кости, и развитие остеофитов. Современные способы фармацевтической терапии для OA нацелены на воспалительные аспекты заболевания, но не нацелены на лежащие в основе дегенерацию или измененную архитектуру сустава. Эти противовоспалительные лекарственные средства обеспечивают только временное облегчение боли. Считают, что в отличие от этого, способы лечения, которые могут уменьшать или обращать дегенерацию сустава, оказывают более длительные и благоприятные эффекты применительно к боли и подвижности пациента. Соответственно, существует необходимость в лекарственных средствах, уменьшающих дегенерацию сустава и/или восстанавливающих структуру суставного хряща и сустава у пациентов с OA.
[0003]
Натрийуретический пептид типа C (CNP) (No. доступа в GenBank NP_077720, для белка-предшественника CNP, NPPC) представляет собой небольшой, одноцепочечный пептид с широко распространенной экспрессией - наиболее выраженной в центральной нервной системе, репродуктивном тракте, костях и эндотелии кровеносных сосудов. CNP связывается с двумя различными рецепторами: рецептором натрийуретического пептида B (NPR-B) и рецептором натрийуретического пептида C (NPR-C). NPR-B является членом мультигенного семейства связанных с мембраной гуанилилциклаз и образует вторичный мессенджер циклический монофосфат гуанозина (цГМФ) при активации посредством связывания CNP. В отличие от этого, NPR-C не имеет никаких внутриклеточных передающих сигналы доменов и вместо этого функционирует для выведения натрийуретических пептидов из внеклеточного пространства. Таким образом, когда CNP связывается с NPR-C, рецептор интернализуется и доставляет CNP в лизосому, где он деградирует, таким образом, уменьшая эффективную внеклеточную концентрацию CNP.
[0004]
CNP первоначально продуцируется с гена предшественника натрийуретического пептида C (NPPC) в форме пре-про-полипептида из 126-аминокислот. При удалении сигнального пептида образуется про-CNP, и при дальнейшем расщеплении эндопротеазой фурином образуется биологически активный пептид из 53-аминокислот (CNP-53), который секретируется и далее процессируется с образованием зрелого пептида из 22-аминокислот (CNP-22). CNP-53 и CNP-22 отличаются по своему распределению, где CNP-53 преимущественно обнаруживают в тканях, в то время как CNP-22 преимущественно обнаруживают в плазме и спинномозговой жидкости. Преобладающая форма CNP в хряще в настоящее время неизвестна. Как CNP-53, так и CNP-22 связываются с NPR-B со сходной кинетикой и оба индуцируют продукцию цГМФ зависимым от дозы образом. Нижестоящая передача сигналов, опосредованная цГМФ, влияет на широкий ряд биологических процессов, включая эндохондральное окостенение. Соответственно, увеличенные или уменьшенные уровни любого из компонентов в этом пути могут приводить к измененному росту кости или хряща. Например, нокаут либо CNP, либо NPR-B в моделях на мышах приводит к наличию у животных карликового фенотипа с укороченными длинными костями и позвонками. Кроме того, мутации в NPR-B человека, блокирующие передачу сигналов CNP, приводят к карликовости. В отличие от этого, для мышей, модифицированных для продукции увеличенных уровней CNP, показаны удлиненные длинные кости и позвонки.
[0005]
Терапевтический потенциал CNP ограничен его коротким временем полужизни. CNP выводится посредством двух механизмов: 1) посредством действия связанной с мембраной нейтральной эндопептидазы (NEP), которая быстро осуществляет деградацию CNP, и 2) посредством связывания с NPR-C, который направляет CNP в лизосомы, где он подвергается деградации. Эти два механизма выведения являются ответственными за короткое время полужизни CNP (~2,6 мин.). Для увеличения концентрации CNP выше уровней, как правило, обнаруживаемых в плазме человека (~5 пМ), являлась необходимой непрерывная инфузия, что сильно ограничивает его терапевтический потенциал. Для преодоления этого, разработаны варианты CNP с более длительными периодами времени. Принимая во внимание их потенциальную роль в стимуляции роста хряща, варианты CNP представляют новый класс лекарственных средств для обеспечения более длительного облегчения для пациентов с OA.
Сущность описания
[0006]
Настоящее описание относится к использованию вариантов CNP для лечения первичного или вторичного остеоартрита или одного или нескольких ассоциированных с остеоартритом симптома(симптомов). В настоящем описании описано, что введение вариантов CNP может приводить к улучшению диапазона подвижности пораженных суставов и к замедлению или уменьшению ассоциированного с остеоартритом повреждения хряща, кальцификации хряща или субхондральной кости у подвергнутых лечению животных. В различных вариантах осуществления, вариант CNP представляет собой Gly-CNP-37 или Pro-Gly-CNP-37.
[0007]
В различных вариантах осуществления, настоящее описание относится к способу лечения первичного или вторичного остеоартрита или одного или нескольких ассоциированных с остеоартритом симптома(симптомов), включающему введение варианта CNP или композиции, содержащей вариант CNP, нуждающемуся в этом субъекту, где посредством введения лечат первичный или вторичный остеоартрит или указанный один или несколько симптом(симптомов) заболевания. Настоящее описание относится также к способу увеличения роста хряща, кальцифицированного хряща или субхондральной кости у субъекта, включающему введение варианта CNP или композиции, содержащей вариант CNP, нуждающемуся в этом субъекту. Описание относится также к способу замедления, предотвращения или ингибирования ассоциированной с остеоартритом дегенерации хряща, кальцифицированного хряща или субхондральной кости, включающему введение варианта CNP или композиции, содержащей вариант CNP, нуждающемуся в этом субъекту. Кроме того, настоящее описание относится к способу увеличения диапазона подвижности или уменьшения тугоподвижности сустава, пораженного остеоартритом, включающему введение варианта CNP нуждающемуся в этом субъекту. Кроме того, настоящее описание относится к способу уменьшения роста остеофитов в суставе, пораженном остеоартритом, включающему введение варианта CNP субъекту, имеющему остеоартрит.
[0008]
В различных вариантах осуществления, вариант CNP выбран из группы, состоящей из:
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 1);
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CNP-37) (SEQ ID NO: 2);
GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CNP53) (SEQ ID NO: 3); PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-CNP53) (SEQ ID NO: 4); MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-CNP53) (SEQ ID NO: 5); DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-53(M48N)] (SEQ ID NO: 6); LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-52) (SEQ ID NO: 7); RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-51) (SEQ ID NO: 8); VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP- 50) (SEQ ID NO: 9);
DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-49) (SEQ ID NO: 10);
TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-48) (SEQ ID NO: 11); KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-47) (SEQ ID NO: 12); SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-46) (SEQ ID NO: 13); RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-45) (SEQ ID NO: 14);
AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-44) (SEQ ID NO: 15);
AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-43) (SEQ ID NO: 16);
WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-42) (SEQ ID NO: 17);
ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-41) (SEQ ID NO: 18);
RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-40) (SEQ ID NO: 19);
LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-39) (SEQ ID NO: 20);
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-38) (SEQ ID NO: 21); QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-37) (SEQ ID NO: 22); EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-36) (SEQ ID NO: 23); HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-35) (SEQ ID NO: 24); PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-34) (SEQ ID NO: 25); NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-33) (SEQ ID NO: 26); ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-32) (SEQ ID NO: 27) ; RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-31) (SEQ ID NO: 28); KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-30) (SEQ ID NO: 29); YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-29) (SEQ ID NO: 30); KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-28) (SEQ ID NO: 31); GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-27) (SEQ ID NO: 32); ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-26) (SEQ ID NO: 33); NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-25) (SEQ ID NO: 34);
KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-24) (SEQ ID NO: 35);
KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-23) (SEQ ID NO: 36);
LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-21) (SEQ ID NO: 38);
SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-20) (SEQ ID NO: 39);
KGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP- 19) (SEQ ID NO: 40);
GCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-18) (SEQ ID NO: 41);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-37(M32N)] (SEQ ID NO: 43);
PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-CNP-37) (SEQ ID NO: 44);
MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-CNP-37) (SEQ ID NO: 45);
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP-37(M32N)] (SEQ ID NO: 46); MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-Gly-CNP-37) (SEQ ID NO: 47); GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (HSA-CNP-27) (SEQ ID NO: 48); GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [HSA-CNP-27(M22N)] (SEQ ID NO: 49);
PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-HSA-CNP-27) (SEQ ID NO: 50);
MGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-HSA-CNP-27) (SEQ ID NO: 51); GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 52); GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP-27(K4,5,9R, M22N)] (SEQ ID NO: 53); PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Pro-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 54); MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Met-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 55);
PEGIK-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEG1K-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 56);
PEGIK-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC [PEG1K-CNP-27(K4,5,9R, M22N)] (SEQ ID NO: 57);
PEG1K-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEG1K-Pro-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 58);
PEG1K-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEG1K-Met-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 59);
PE012-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEO12-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 60);
PE012-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC [PEO12-CNP-27(K4,5,9R, M22N)] (SEQ ID NO: 61);
PEO12-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEO12-Pro-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 62);
PEO12-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEO12-Met-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 63);
PEO24-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEO24-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 64);
PEO24-GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC [PEO24-CNP-27(K4,5,9R, M22N)] (SEQ ID NO: 65);
PEO24-PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEO24-Pro-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 66); and
PEO24-MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [PEO24-Met-CNP-27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 67).
[0009]
В различных вариантах осуществления, увеличение роста хряща, кальцифицированного хряща или субхондральной кости или замедление дегенерации хряща, кальцифицированного хрящ или субхондральной кости наблюдают в колене, плече, локте, пальце, руке, запястье, бедрах, шее, лодыжке, позвоночнике субъекта и/или пояснице субъекта. В различных вариантах осуществления, разрушение или рост хряща анализируют по гибели/потере хондроцитов, потере протеогликана (ПГ) и потере или фибрилляции коллагена.
[0010]
Настоящее описание относится также к способу увеличения диапазона подвижности в суставе у субъекта с остеоартритом, включающему введение варианта CNP нуждающемуся в этом субъекту. В различных вариантах осуществления, вариант CNP увеличивает диапазон подвижности, как измерено по сгибанию в тазобедренном суставе, разгибанию в тазобедренном суставе, отведению бедра, приведению бедра, сгибанию в коленном суставе или разгибанию в коленном суставе, на 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% или 75%. Предусмотрено также, что введение варианта CNP улучшает симптомы артрита, включая остеоартрит, как оценено по различным шкалам для пациента и боли, таких как шкалы, описанные более подробно в подробном описании. В различных вариантах осуществления, вариант CNP представляет собой Gly-CNP-37 или Pro-Gly-CNP-37.
[0011]
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу предотвращения, ингибирования или замедления роста или формирования остеофитов у млекопитающего, включающему введение варианта CNP нуждающемуся в этом субъекту. В различных вариантах осуществления, формирование или рост остеофитов ассоциированы с остеоартритом у субъекта. Формирование или рост остеофитов, и предотвращение или ингибирование их формирования или роста, можно определять посредством физического измерения размера остеофита с течением времени и на протяжении режима лечения вариантом CNP. В различных вариантах осуществления, вариант CNP представляет собой Gly-CNP-37 или Pro-Gly-CNP-37.
[0012]
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу предотвращения, ингибирования или замедления аномального роста субхондральной или эпифизарной губчатой кости у млекопитающего, включающий введение варианта CNP нуждающемуся в этом субъекту. В одном аспекте аномальный рост субхондральной или эпифизарной кости проявляется утолщением кости. В другом аспекте аномальный рост субхондральной или эпифизарной губчатой кости ассоциирован с остеоартритом, остеопорозом или остеосклерозом. В различных вариантах осуществления, вариант CNP представляет собой Gly-CNP-37 или Pro-Gly-CNP-37.
[0013]
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу предотвращения, ингибирования или замедления синовиального воспаления (т.е., синовита) у млекопитающего, включающему введение варианта CNP нуждающемуся в этом субъекту. В одном аспекте синовиальное воспаление проявляется по меньшей мере инфильтрацией мононуклеарных клеток в пораженный сустав. В другом аспекте синовиальное воспаление ассоциировано с остеоартритом. В различных вариантах осуществления, вариант CNP представляет собой Gly-CNP-37 или Pro-Gly-CNP-37.
[0014]
В одном варианте осуществления, вариант CNP вводят внутрисуставным способом. Предусматривают также, что вариант CNP вводят другими способами. Иллюстративные способы введения включают, но без ограничения, подкожное, внутрисуставное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, внутримышечное, внутрикожное, внутрибрюшинное, внутримышечное, внутрикожное, интратекальное, местное, чрескожное или трансмукозальное введение.
[0015]
В другом варианте осуществления, вариант CNP вводят в ответ на травму или повреждение сустава. В следующем варианте осуществления вариант CNP вводят в пределах месяца после травмы или повреждения сустава. В другом варианте осуществления вариант CNP вводят в пределах недели после травмы или повреждения сустава. В других вариантах осуществления вариант CNP вводят после возникновения дегенерации хряща.
[0016]
В различных вариантах осуществления, настоящее описание относится к способу оценки эффекта варианта CNP на уровень по меньшей мере одного ассоциированного с хрящом биомаркера у субъекта, имеющего остеоартрит, включающему анализ уровня по меньшей мере одного ассоциированного с хрящом биомаркера в биологическом образце от субъекта, имеющего остеоартрит, которому вводили пептид или вариант CNP. В одном варианте осуществления, вариант CNP вводят субъекту до анализа уровня по меньшей мере одного ассоциированного с хрящом биомаркера.
[0017]
В различных вариантах осуществления, настоящее описание относится к способу лечения остеоартрита или одного или нескольких ассоциированных с остеоартритом симптома(симптомов), или проявления(проявлений), включающему введение варианта CNP субъекту, где субъект идентифицирован как имеющий увеличенные уровни по меньшей мере одного ассоциированного с хрящом биомаркера. В различных вариантах осуществления, по меньшей мере один ассоциированный с хрящом биомаркер выбран из группы, состоящей из CNP, цГМФ, пропептидов коллагена типа II и их фрагментов, коллагена типа II и их фрагментов, синдекана-3, аннексина VI, ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA), пропептидов проколлагена типа I (PINP) и их фрагментов, коллагена типа I и его фрагментов и хондроитинсульфата аггрекана.
[0018]
В различных вариантах осуществления, настоящее описание относится к использованию композиции, содержащей вариант CNP. В одном варианте осуществления, композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель. В одном варианте осуществления, композиция представляет собой лиофилизированный состав, полученный из состава, содержащего буфер на основе лимонной кислоты/цитрата или буфер на основе уксусной кислоты/ацетата, имеющий pH от приблизительно 4 до приблизительно 6.
[0019]
Настоящее описание относится также к способу лечения, как описано в настоящем описании, дополнительно включающему введение второго средства. В различных вариантах осуществления, второе средство выбрано из группы, состоящей из противовоспалительного средства, NSAID, кортикостероида и гиалуроновой кислоты.
[0020]
5
12
В различных вариантах осуществления, варианты CNP, используемые в способах, могут являться присоединенными к гидрофобной кислоте, или могут являться присоединенными к одной или нескольким гидрофобным кислотам. Неограничивающие примеры гидрофобных кислот включают имеющие прямую или разветвленную цепь, насыщенные или ненасыщенные C-C карбоновые кислоты (например, пентановую кислоту, гептановую кислоту и т.д.) и природные жирные кислоты. Гидрофобные кислоты могут являться присоединенными к N-концу, C-концу, и/или боковой цепи одного или нескольких аминокислотных остатков. В одном варианте осуществления, гидрофобная кислота является конъюгированной с N-концом.
[0021]
В другом варианте осуществления, варианты CNP, используемые в способах, представляют собой химерные или слитые белки, содержащие вариант CNP и отщепляемый пептид или белок, или пептидную метку. Иллюстративные отщепляемые белки или пептиды включают, но без ограничения, гистидиновые (например, гекса-His) метки; TAF12: фактор транскрипции TAF12 человека; KSI: кетостероид-изомеразу; MBP: связывающий мальтозу белок; β-Gal: β-галактозидазу; GST: глутатион-S-трансферазу; Trx: тиоредоксин; CBD: связывающий хитин домен; BMPM: мутантный BMP-2, SUMO, CAT, TrpE, белок A стафилококка, белки стрептококка, связывающий крахмал белок, связывающий целлюлозу домен эндоглюканазы A, связывающий целлюлозу домен экзоглюканазы Cex, связывающий биотин домен, recA, Flag, c-Myc, поли(His), поли(Arg), поли(Asp), поли(Gln), поли(Phe), поли(Cys), зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок, желтый флуоресцентный белок, голубой флуоресцентный белок, биотин, авидин, стрептавидин, эпитопы антител и их фрагменты.
[0022]
В различных вариантах осуществления, вариант CNP может представлять собой мономер или димер. В родственных вариантах осуществления мономеры из димерных вариантов CNP могут являться присоединенными N-концом к N-концу через линкер или без линкера, N-концом к C-концу через линкер или без линкера, или C-концом к C-концу через линкер или без линкера.
[0023]
В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, варианты CNP могут иметь по существу такую же или лучшую биологическую активность, чем CNP-22 дикого типа. Например, варианты CNP могут сохранять по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более активности CNP-22 дикого типа, или могут иметь большую активность, чем CNP-22, например, применительно к взаимодействию с NPR-B для стимуляции образования цГМФ. Альтернативно или дополнительно, варианты CNP могут сохранять по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более активности CNP-22 дикого типа, или могут иметь большую активность, чем CNP-22, применительно к регуляции роста эндохондральной кости и активности хондроцитов, включая, но без ограничения, пролиферацию хондроцитов, дифференцировку хондроцитов, ингибирование пути передачи сигналов активируемой митогеном протеинкиназы (MAP)/киназы MEK (Raf-1) и стимуляции эндохондрального окостенения. В любом из вариантов осуществления, описанных в настоящем описании, варианты CNP могут содержать аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более идентичную аминокислотам 6-22 или 1-22 CNP-22 дикого типа.
[0024]
В различных вариантах осуществления, варианты CNP могут, необязательно, иметь конъюгацию(конъюгации) или удлинение(удлинения), например, на N- и/или C-конце, для облегчения нацеливания на хрящ, уменьшения выведения почками, и/или увеличения устойчивости к деградации NEP. Такие конъюгация(конъюгации) или удлинение(удлинения) могут содержать молекулы или последовательности, сформированные или происходящие, например, из полиAsp, полиGlu, нацеленных на хрящ пептидов, сиалопротеина, PEG, углеводов, гидрофобных кислот, NPPC или не относящихся к CNP (поли)пептидов, или их комбинаций.
[0025]
Кроме того, предусматривают, что варианты CNP можно конъюгировать с гидрофобной полимерной или неполимерной группой, например, такой как гептановая кислота, пентановая кислота или жирные кислоты. Гидрофобная группа может являться конъюгированной с боковой цепью аминокислотного остатка, включая, но без ограничения, лизин, серин, цистеин или треонин, или может являться присоединенной к N-концу и/или C-концу варианта CNP.
[0026]
В различных вариантах осуществления, варианты CNP, которые можно использовать в этих способах, имеют pI в диапазоне от приблизительно 8 до приблизительно 10,5 или от приблизительно 8,5 до приблизительно 10.
[0027]
В различных вариантах осуществления, настоящее описание относится к использованию фармацевтической композиции, содержащей вариант CNP, необязательно, другое биологически активное средство, и необязательно, фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель. В различных вариантах осуществления, композиции представляют собой стерильные фармацевтические композиции, пригодные для парентерального введения. В некоторых вариантах осуществления, композиции содержат по существу чистый вариант CNP, например, по меньшей мере приблизительно на 90% или 95% чистый. В некоторых вариантах осуществления, композиции содержат менее, чем приблизительно 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или 0,5% загрязняющих примесей, таких как другие белки человека, белки свиньи, или CNP-53, или их фрагменты (отличные от желательного варианта CNP). В конкретных вариантах осуществления, стерильную композицию вводят субъекту для лечения или предотвращения любого из отвечающих на CNP состояний или нарушений, описанных в настоящем описании.
[0028]
in
vivo
Варианты CNP, которые можно использовать по настоящему изобретению, преимущественным образом сохраняют активность CNP и имеют увеличенное время полужизни в сыворотке. Сохранение активности CNP можно показать, например, как сохранение желательного биологического эффекта , или сохранение по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или по меньшей мере приблизительно 100% стимулирующей цГМФ активности CNP-22, в такой же концентрации (например, 1 мкМ пептида CNP или более ED80). В некоторых вариантах осуществления, для вариантов CNP показано увеличение времени полужизни в сыворотке по меньшей мере приблизительно в 1,5 раза, 2 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз, 15 раз, 20 раз, 25 раз, 30 раз, 35 раз или 40 раз по сравнению с CNP-22.
[0029]
В родственных вариантах осуществления, варианты CNP, описанные в настоящем описании, имеют увеличенную устойчивость к NEP и имеют увеличенное время полужизни по сравнению с CNP-22 дикого типа. В одном варианте осуществления, время полужизни вариантов CNP увеличено приблизительно на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или приблизительно 100% по сравнению с CNP-22 дикого типа.
[0030]
in
vitro
in
vivo
in
vivo
in
vitro
in
vivo
in
vivo
in
vivo
В конкретных вариантах осуществления, варианты CNP, описанные в настоящем описании для использования в этих способах, увеличивают продукцию цГМФ , увеличивают продукцию цГМФ , увеличивают  уровень одного или нескольких биомаркеров, ассоциированных с формированием или ростом хряща или кости, увеличивают устойчивость к расщеплению NEP , увеличивают время полужизни в плазме или сыворотке , увеличивают биодоступность , или увеличивают рост или регенерацию хряща , или вызывают комбинацию таких увеличений, приблизительно в 1,5 раза, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 2,5 раза, приблизительно в 3 раза, приблизительно в 3,5 раза, приблизительно в 4 раза, приблизительно в 4,5 раза, или приблизительно в 5 раз или более по сравнению с CNP-22 дикого типа.
[0031]
В различных вариантах осуществления, варианты CNP описанные в настоящем описании, вводят в дозе в диапазоне от приблизительно 5 или 10 нмоль/кг до приблизительно 300 нмоль/кг, или от приблизительно 20 нмоль/кг до приблизительно 200 нмоль/кг. В некоторых вариантах осуществления, варианты CNP вводят в дозе приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 или 2000 нмоль/кг, или в другой дозе, которую считает подходящей лечащий врач. В других вариантах осуществления, варианты CNP вводят в дозе приблизительно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750 или 800 мкг/кг, или приблизительно в 1 мг/кг, 1,25 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2 мг/кг или в другой дозе, которую считает подходящей лечащий врач.
[0032]
В различных вариантах осуществления, варианты CNP вводят в однократной дозе или в множественных дозах. Множественные дозы можно вводить ежесуточно, или в множественных дозах на протяжении курса лечения. В различных вариантах осуществления, предусматривают, что вариант CNP вводят в однократной дозе или в множественных дозах, ежесуточно, каждые вторые сутки, каждые 3 суток, 2 раза в неделю, 3 раза в неделю, раз в неделю, раз в две недели, каждые 3 недели, раз в месяц, каждые 6 недель, каждые 2 месяца, каждые 3 месяца или как считает подходящим лечащий врач.
[0033]
В конкретных вариантах осуществления, введение варианта CNP корректируют, чтобы обеспечивать периоды профилактического или терапевтического лечения с последующим периодом восстановления. Например, вариант CNP можно вводить внутрисуставным, подкожным, внутривенным или другим способом ежесуточно или несколько раз в неделю в течение некоторого периода времени, с последующим периодом без лечения, затем цикл повторяют. В некоторых вариантах осуществления, начальный период лечения (например, введение варианта CNP ежесуточно или несколько раз в неделю) длится в течение 3 суток, 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель, 5 недель, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель или 12 недель. В родственном варианте осуществления, период без лечения длится в течение 3 суток, 1 недели, 2 недель, 3 недель или 4 недель. В конкретных вариантах осуществления, режим дозирования варианта CNP представляет собой следующий: ежесуточно в течение 3 суток с последующими 3 сутками без лечения; или ежесуточно или несколько раз в неделю в течение 1 недели с последующими 3 сутками или 1 неделей без лечения; или ежесуточно или несколько раз в неделю в течение 2 недель с последующими 1 или 2 неделями без лечения; или ежесуточно или несколько раз в неделю в течение 3 недель с последующими 1, 2 или 3 неделями без лечения; или ежесуточно или несколько раз в неделю в течение 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 недель с последующими 1, 2, 3 или 4 неделями без лечения.
[0034]
В дополнительных вариантах осуществления, настоящее описание относится к способу лечения остеоартрита или нарушения, имеющего ассоциированный с остеоартритом симптом, включающему введение варианта CNP субъекту и мониторирование уровня по меньшей мере одного ассоциированного с хрящом биомаркера у субъекта (например, в биологическом образце от субъекта), где увеличение или уменьшение уровня ассоциированного с хрящом биомаркера указывает на терапевтический эффект варианта CNP на субъекта. В некоторых вариантах осуществления, когда уровень биомаркера увеличивается в ассоциации с формированием или ростом хряща, кальцифицированного хряща или субхондральной кости, увеличение уровня этого биомаркера указывает на терапевтический эффект варианта CNP на субъекта. В других вариантах осуществления, когда уровень биомаркера уменьшается в ассоциации с формированием или ростом хряща, кальцифицированного хряща или субхондральной кости, уменьшение уровня этого биомаркера указывает на терапевтический эффект варианта CNP на субъекта.
[0035]
В следующих вариантах осуществления, терапевтический способ дополнительно включает коррекцию количества (или дозы) или частоты введения варианта CNP, где:
(i) количество (или дозу) или частоту введения варианта CNP увеличивают, если уровень по меньшей мере одного ассоциированного с хрящом биомаркера ниже целевого уровня, где уровень биомаркера увеличивается в ассоциации с формированием или ростом хряща; или
(ii) количество (или дозу) или частоту введения варианта CNP уменьшают, если уровень по меньшей мере одного ассоциированного с хрящом биомаркера выше целевого уровня, где уровень биомаркера увеличивается в ассоциации с формированием или ростом хряща; или
(iii) количество (или дозу) или частоту введения варианта CNP увеличивают, если уровень по меньшей мере одного ассоциированного с хрящом биомаркера выше целевого уровня, где уровень биомаркера уменьшается в ассоциации с формированием или ростом хряща; или
(iv) количество (или дозу) или частоту введения варианта CNP уменьшают, если уровень по меньшей мере одного ассоциированного с хрящом биомаркера ниже целевого уровня, где уровень биомаркера уменьшается в ассоциации с формированием или ростом хряща.
[0036]
Предусматривают, что целевой уровень биомаркера относится к уровню или диапазону уровней биомаркера, ассоциированному с терапевтическим эффектом у субъекта и/или благоприятным эффектом при облегчении или смягчении симптомов нарушения или состояния. В конкретных вариантах осуществления, уровень биомаркера выше или ниже целевого уровня может являться вредным для субъекта.
[0037]
in
vivo
В других вариантах осуществления, настоящее описание относится к способу оценки эффекта введения варианта CNP на формирование или рост хряща, кальцифицированного хряща или субхондральной кости. В одном варианте осуществления, способ относится к анализу или измерению уровня по меньшей мере одного ассоциированного с хрящом биомаркера у субъекта, которому вводили вариант CNP для оценки эффекта варианта CNP на формирование и рост хряща, кальцифицированного хряща или субхондральной кости . В родственном варианте осуществления, увеличение уровня по меньшей мере одного ассоциированного с хрящом биомаркера может указывать на то, что введение варианта CNP оказывает положительный эффект на формирование или рост хряща, кальцифицированного хряща или субхондральной кости и является полезным лечением остеоартрита и других относящихся к хрящу заболеваний или нарушений, ассоциированных с уменьшенной активностью CNP. Иллюстративные ассоциированные с хрящом биомаркеры включают, но без ограничения, CNP (например, эндогенный уровень CNP-22 или CNP-53), цГМФ, пропептиды коллагена типа II и их фрагменты, коллаген типа II и их фрагменты, синдекан-3, аннексин VI, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), пропептиды проколлагена типа I (PINP) и их фрагменты, коллаген типа I и его фрагменты и хондроитинсульфат аггрекан.
[0038]
В следующих вариантах осуществления, настоящее описание относится к способу оценки эффекта варианта CNP на уровень по меньшей мере одного ассоциированного с хрящом биомаркера у субъекта, включающему анализ или измерение уровня ассоциированного с хрящом биомаркера в биологическом образце от субъекта, которому вводили вариант CNP. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение варианта CNP субъекту до анализа или измерения уровня ассоциированного с хрящом биомаркера.
[0039]
В некоторых вариантах осуществления способов (например, терапевтических, диагностических и аналитических способов), относящихся к ассоциированным с хрящом биомаркерам, вариант CNP представляет собой Gly-CNP-37, также обозначаемый как Gly-CNP-37, или любой из пептидов и вариантов CNP, описанных в настоящем описании, включая варианты CNP, показанные в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления таких способов, пептид или вариант CNP не представляет собой CNP-22 или CNP-53. В конкретном варианте осуществления, вариант CNP представляет собой Pro-Gly-CNP-37.
[0040]
Предусмотрено такжеиспользование любого из предшествующих вариантов CNP, описанных в настоящем описании, в получении лекарственного средства для лечения остеоартрита и симптомов или других физиологических проявлений, описанных в настоящем описании, ассоциированных с остеоартритом. Предусмотрены также шприцы, например, одноразовые или предварительно заполненные шприцы, стерильные герметично закрытые контейнеры, например, ампулы, бутыль, сосуд и/или наборы или упаковки, содержащие любой из вышеуказанных пептидов или полипептидов, необязательно, с соответствующими инструкциями для применения.
[0041]
Понятно, что каждый признак, описанный в настоящем описании, представляет собой неограничивающий, иллюстративный пример любого из аспектов описания и, как таковой, предназначен для комбинации с любым другим признаком, описанным в настоящем описании. Например, когда признаки описаны такими фразами, как «один вариант осуществления», «конкретные варианты осуществления», «некоторые варианты осуществления», «дополнительный вариант осуществления», «конкретные иллюстративные варианты осуществления» и/или «другой вариант осуществления», каждый из этих признаков можно комбинировать с любым другим признаком или признаками, описанными в настоящем описании, без необходимости перечислять каждую возможную комбинацию. Когда описаны примеры значений, попадающих в пределы диапазонов, любые из этих примеров предусмотрены в качестве возможных конечных точек диапазона, предусмотрены все без исключения числовые значения между этими конечными точками, и предусмотрены все без исключения комбинации верхних и нижних конечных точек.
Краткое описание чертежей
[0042]
На фигуре 1 проиллюстрировано, что для введения Gly-CNP-37 в низкой (35,5 мкг) или высокой дозе (110 мкг) показано значимое уменьшение дегенерации хряща в большеберцовой кости. *p≤0,05, ANOVA, по сравнению с носителем.
[0043]
На фигуре 2 показано, что отношение глубины улучшалось в группах, подвергнутых лечению Gly-CNP-37. *p≤0,05, ANOVA, по сравнению с носителем.
[0044]
Фигура 3 представляет собой график, показывающий, что ширина хряща, пораженного какой-либо дегенерацией, улучшалась в группах, подвергнутых лечению Gly-CNP-37. *p≤0,05, ANOVA, по сравнению с носителем.
[0045]
На фигуре 4 проиллюстрировано, что для подвергнутых лечению Gly-CNP-37 животных показано более, чем 50% улучшение значительной дегенерации хряща большеберцовой кости.
[0046]
На фигуре 5 показано, что Gly-CNP-37 при 110 мкг значимо уменьшал общий показатель для суставов (без включения бедренной кости). *p≤0,05, ANOVA, по сравнению с носителем.
[0047]
Фигура 6 представляет собой график, показывающий общий показатель для суставов для животных, подвергнутых лечению Gly-CNP-37, когда показатель для бедренной кости включен в расчет.
[0048]
Фигура 7 представляет собой график, иллюстрирующий медиальную и латеральную толщину пластины роста у подвергнутых лечению Gly-CNP-37 и не подвергнутых лечению контрольных животных. *p≤0,05, ANOVA, по сравнению с носителем.
[0049]
Фигура 8 представляет собой график, представляющий данные из фигуры 7, в которых латеральную толщину вычитали из медиальной толщины для определения отличий между ними двумя. *p≤0,05, ANOVA, по сравнению с носителем.
[0050]
На фигуре 9 представлено прогрессирование показателя походки у подвергнутых лечению Gly-CNP-37 или не подвергнутых лечению контрольных крыс. *p≤0,05, ANOVA, по сравнению с носителем.
[0051]
Фигура 10 представляет собой график, представляющий площадь под кривой (AUC) для показателя походки из фигуры 9. Все значения имеют p≤0,05, ANOVA, по сравнению с носителем.
[0052]
На фигуре 11 показаны измерения общей ширины дегенерации хряща для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 или Gly-CNP-37. *p≤0,05, ANOVA, по сравнению с носителем.
[0053]
На фигуре 12 показаны измерения ширины значительной дегенерации хряща для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 или Gly-CNP-37. †p<0,05, t-критерий по сравнению с SC носителем.
[0054]
На фигуре 13 показаны средние показатели остеофитов медиальной большеберцовой кости для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 или Gly-CNP-37. †p<0,05, t-критерий, по сравнению с SC носителем.
[0055]
На фигуре 14 показана средняя толщина пластины роста микрометрах для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 или Gly-CNP-37. *p≤0,05, ANOVA, по сравнению с носителем. †p<0,05, t-критерий по сравнению с SC носителем.
[0056]
На фигуре 15 показан средний общий показатель для суставов (минус бедренная кость) для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 или Gly-CNP-37. *p≤0,05, ANOVA, по сравнению с носителем. †p<0,05, t-критерий по сравнению с SC носителем.
[0057]
На фигуре 16 показаны средние показатели синовита для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 или Gly-CNP-37.
[0058]
На фигуре 17 показано среднее изменение массы тела для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 или Gly-CNP-37. *p≤0,05, ANOVA, по сравнению с носителем.
[0059]
На фигуре 18 показаны средние показатели походки для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 или Gly-CNP-37. Значения имеют p<0,05, t-критерий по сравнению с SC носителем.
[0060]
На фигуре 19 показана зависимость от времени средней концентрации в плазме Pro-Gly-CNP-37 у животных после введения Pro-Gly-CNP-37 внутрисуставным или подкожным способом для каждой группы исследования. Для каждой линии соответствующий номер группы исследования представлен непосредственно выше соответствующей кривой данных.
[0061]
На фигуре 20 показана средняя общая ширина дегенерации хряща большеберцовой кости для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 (как внутрисуставному («IA»), так и подкожному («SC»)) в модели остеоартрита на поздних стадиях (проведение лечения начинают через двадцать одни сутки после хирургического вмешательства, данные собирают на сутки сорок).
[0062]
На фигуре 21 показана средняя ширина значительной дегенерации хряща большеберцовой кости для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 (как внутрисуставному («IA»), так и подкожному («SC»)) в модели остеоартрита на поздних стадиях (проведение лечения начинают через двадцать одни сутки после хирургического вмешательства, данные собирают на сутки сорок).
[0063]
На фигуре 22 показаны средние показатели дегенерации хряща большеберцовой кости, для каждой из трех зон и общий, для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 (как внутрисуставному («IA»), так и подкожному («SC»)) в модели остеоартрита на поздних стадиях (проведение лечения начинают через двадцать одни сутки после хирургического вмешательства). *p<0,05, критерий K-W (апостериорный критерий Данна), по сравнению с соответствующим контролем IA или SC носителем (сутки 40). †p<0,05, критерий M-W, по сравнению с IA носителем (сутки 40). ‡p<0,05, критерий M-W, по сравнению с SC носителем (сутки 40).
[0064]
На фигуре 23 показано среднее отношение глубины дегенерации хряща большеберцовой кости, для каждой из трех зон и средний, для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 (как внутрисуставному («IA», так и подкожному («SC»)) в модели остеоартрита на поздних стадиях (проведение лечения начинают через двадцать одни сутки после хирургического вмешательства). *p<0,05, критерий K-W (апостериорный критерий Данна) по сравнению с соответствующим контролем IA или SC носителем (сутки 40). †p<0,05, критерий M-W, по сравнению с IA носителем (сутки 40). ‡p<0,05, критерий M-W, по сравнению с SC носителем (сутки 40).
[0065]
На фигуре 24 показан общий показатель для суставов с бедренной костью, для каждой из трех зон и средний, для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 (как внутрисуставному («IA»), так и подкожному («SC»)) в модели остеоартрита на поздних стадиях (проведение лечения начинают через двадцать одни сутки после хирургического вмешательства). †p<0,05, критерий M-W, по сравнению с IA носителем (сутки 40). ‡p<0,05, критерий M-W, по сравнению с SC носителем (сутки 40).
[0066]
На фигуре 25 показан общий показатель для суставов без бедренной кости, для каждой из трех зон и средний, для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 (как внутрисуставному («IA»), так и подкожному («SC»)) в модели остеоартрита на поздних стадиях (проведение лечения начинают через двадцать одни сутки после хирургического вмешательства). †p<0,05, критерий M-W, по сравнению с IA носителем (сутки 40). ‡p<0,05, критерий M-W, по сравнению с SC носителем (сутки 40).
[0067]
На фигуре 26 показан показатель для остеофитов для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 (как внутрисуставному («IA»), так и подкожному («SC»)) в модели остеоартрита на поздних стадиях (проведение лечения начинают через двадцать одни сутки после хирургического вмешательства, данные собирают на сутки сорок).
[0068]
На фигуре 27 показано изменение массы тела для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 (как внутрисуставному («IA»), так и подкожному («SC»)) в модели остеоартрита на поздних стадиях (проведение лечения начинают через двадцать одни сутки после хирургического вмешательства). *p<0,05, критерий K-W (апостериорный критерий Данна), по сравнению с соответствующим контролем IA или SC носителем (сутки 40). †p<0,05, критерий M-W, по сравнению с IA носителем (сутки 40).
Подробное описание
[0069]
Настоящее описание относится к способам использования вариантов CNP для лечения остеоартрита, одного или нескольких симптомов остеоартрита и других нарушений, имеющих ассоциированный с остеоартритом симптом или компонент.
A. Определения
[0070]
Если не указано иное, следующие термины, используемые в этой заявке, включая описание и формулу изобретения, имеют определения, приведенные ниже.
[0071]
Термин «около» или «приблизительно» означает приемлемую ошибку конкретного значения, как определено специалистом в данной области, которая частично зависит от того, как значение измеряют или определяют. В конкретных вариантах осуществления, термин «около» или «приблизительно» означает в пределах 1, 2, 3 или 4 стандартных отклонений. В конкретных вариантах осуществления, термин «около» или «приблизительно» означает в пределах 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% или 0,05% данного значения или диапазона. Во всех случаях, когда термин «около» или «приблизительно» предшествует первому числовому значению в серии из двух или более числовых значений, понятно, что термин «около» или «приблизительно» применим к каждому из числовых значений в этих сериях.
[0072]
rd
th
nd
th
et
al.
Определение стандартных химических терминов можно обнаружить в справочных изданиях, включая Carey and Sundberg, Advanced Organic Chemistry, 3 Edition, Vols. A and B (Plenum Press, New York 1992). В практическом осуществлении настоящего описания можно использовать, если не указано иное, конкретные общепринятые способы синтетической органической химии, масс-спектрометрии, препаративной и аналитической хроматографии, химии белка, биохимии, технологии рекомбинантной ДНК и фармакологии, в пределах компетенции специалистов в данной области. См., например, T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., 4 Edition, 2004); Sambrook, , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.); Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990).
[0073]
Полноесодержаниевсех публикаций, патентов и патентных заявок, процитированных в настоящем описании, либо выше, либо ниже, таким образом, приведено в качестве ссылки.
[0074]
«Полипептид» и «белок» относятся к полимеру, состоящему из аминокислотных остатков, их родственных природных структурных вариантов и синтетических неприродных аналогов, связанных пептидными связями или изостерами пептидной связи. Синтетические полипептиды можно синтезировать, например, с использованием автоматического синтезатора полипептидов. Термины «полипептид» и «белок» не являются ограниченными минимальной длиной продукта.
[0075]
Общепринятое обозначение используют в настоящем описании для описания полипептидных последовательностей: левый конец полипептидной последовательности представляет собой амино-конец; правый конец полипептидной последовательности представляет собой карбокси-конец.
[0076]
«Консервативная замена» относится к замене аминокислоты в полипептиде на функционально, структурно или химически сходную природную или неприродную аминокислоту. В одном варианте осуществления, каждая из следующих групп содержит природные аминокислоты, являющиеся консервативными заменами друг для друга:
(1) аланин (A), серин (S), треонин (T);
(2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);
(3) аспарагин (N), глутамин (Q);
(4) аргинин (R), лизин (K);
(5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V); и
(6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).
[0077]
В другом варианте осуществления, каждая из следующих групп содержит природные аминокислоты, являющиеся консервативными заменами друг для друга:
(1) глицин (G), аланин (A);
(2) аспарагиновая кислота (D), глутаминовая кислота (E);
(3) аспарагин (N), глутамин (Q);
(4) аргинин (R), лизин (K);
(5) изолейцин (I), лейцин (L), метионин (M), валин (V), аланин (A);
(6) фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); и
(7) серин (S), треонин (T), цистеин (C).
[0078]
В следующем варианте осуществления, аминокислоты можно группировать, как указано ниже.
(1) гидрофобные: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) кислые: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, влияющие на ориентацию остова: Gly, Pro; и
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe, His.
[0079]
В одном варианте осуществления, варианты CNP, описанные в настоящем описании, которые можно использовать в способах, получены рекомбинантными способами, с использованием полинуклеотида, кодирующего вариант CNP. Варианты CNP, экспрессированные посредством таких полинуклеотидов, можно получать способами, включающими выращивание клеток-хозяев в культуральной среде в условиях, подходящих для экспрессии полинуклеотида, кодирующего вариант CNP, и выделение продукта экспрессии из клеток-хозяев или культуральной среды. Фактические продукты экспрессии могут немного отличаться от кодированного белкового продукта в зависимости от какого-либо пост-трансляционного процессинга.
[0080]
«Полинуклеотид» относится к полимеру, состоящему из нуклеотидных единиц. Полинуклеотиды включают природные биополимеры (применительно к типу молекулы, но необязательно, к последовательности биополимера), такие как дезоксирибонуклеиновая кислота («ДНК») и рибонуклеиновая кислота («РНК»), так же как аналоги нуклеиновой кислоты. «кДНК» относится к ДНК, являющейся комплементарной или идентичной мРНК, либо в одноцепочечной, либо в двухцепочечной форме.
[0081]
«Последовательность для контроля экспрессии» относится к нуклеотидной последовательности, которая регулирует экспрессию нуклеотидной последовательности, функционально связанной с ней. «Функционально связанный» относится к функциональной взаимосвязи между двумя частями, в которой активность одной части (например, способность регулировать транскрипцию) приводит к действию другой части (например, транскрипции последовательности). Последовательности для контроля экспрессии могут включать, в качестве неограничивающих примеров, последовательности промоторов (например, индуцируемых или конститутивных), 3'UTR, энхансеров, терминаторов транскрипции, инициирующего кодона (т.е., ATG), сигналов сплайсинга для интронов и стоп-кодонов.
[0082]
«Рекомбинантный полинуклеотид» относится к полинуклеотиду, имеющему последовательности, в природе не соединенные вместе. Амплифицированный или собранный рекомбинантный полинуклеотид можно включать в подходящий вектор, и вектор можно использовать для трансформации подходящей клетки-хозяина. Клетку-хозяина, содержащую рекомбинантный полинуклеотид, обозначают как «рекомбинантную клетку-хозяина». Затем ген экспрессируют в рекомбинантной клетке-хозяине для получения, например, «рекомбинантного полипептида». Рекомбинантный полинуклеотид может также выполнять некодирующую функцию (например, служить промотором, точкой начала репликации, участком связывания рибосомы и т.д.).
[0083]
«Химера», как применяют в настоящем описании, относится к полинуклеотиду или полипептиду, содержащему по меньшей мере две гетерологичные полинуклеотидные или полипептидные последовательности (т.е. происходящие из различных источников или не ассоциированные друг с другом в форме природной последовательности), которые напрямую или опосредовано соединены или связаны вместе с использованием способов, общеизвестных в данной области, например, рекомбинантной экспрессии или химического сшивания. В одном варианте осуществления, гетерологичная последовательность может содержать белок или пептид, напрямую или опосредовано связанный с вариантом CNP, включая белки или пептиды, которые поддаются отщеплению от варианта CNP. В родственных вариантах осуществления, варианты CNP представляют собой химеры, как описано в настоящем описании.
[0084]
В конкретных вариантах осуществления, химеры включают слитые с CNP белки, содержащие поддающиеся отщеплению белок-носитель или пептидную метку. Термин «поддающийся отщеплению белок-носитель» или «поддающаяся отщеплению пептидная метка» относится к пептидной или полипептидной последовательности, которую можно сливать, напрямую или опосредовано, через линкер, с гетерологичной полипептидной последовательностью, и которая поддается удалению от гетерологичной последовательности с использованием средства, которое отщепляет или отделяет поддающийся отщеплению пептид или полипептид от гетерологичного полипептида или белка. В некоторых вариантах осуществления, поддающиеся отщеплению белок-носитель или пептидная метка улучшают образование, очистку и/или детекцию слитого белка или гетерологичного полипептида. Иллюстративные поддающиеся отщеплению белки-носители и пептидные метки включают, но без ограничения, фактор транскрипции TAF12 человека (TAF12), кетостероид-изомеразу (KSI), связывающий мальтозу белок (MBP), β-галактозидазу (β-Gal), глутатион-S-трансферазу (GST), тиоредоксин (Trx), связывающий хитин домен (CBD), мутантный BMP-2 (BMPM), SUMO, CAT, TrpE, белок A стафилококка, белки стрептококка, связывающий крахмал белок, связывающий целлюлозу домен эндоглюканазы A, связывающий целлюлозу домен экзоглюканазы Cex, связывающий биотин домен, recA, FLAG, c-Myc, поли(His), поли(Arg), поли(Asp), поли(Gln), поли(Phe), поли(Cys), зеленый флуоресцентный белок, красный флуоресцентный белок, желтый флуоресцентный белок, голубой флуоресцентный белок, биотин, авидин, стрептавидин, эпитопы антител и их фрагменты.
[0085]
nd
Под «диапазоном подвижности» понимают полный потенциал движения сустава, как правило, его диапазон сгибания и/или разгибания. Диапазон подвижности, как правило, измеряют с использованием угломера и представляют в градусах дуги. Любой способ измерения, известный специалистам в данной области, можно использовать для измерения диапазона подвижности сустава субъекта. Один из иллюстративных способов измерения диапазона подвижности сустава представлен, например, в Norkin, C.C. and White D.J., Measurement of joint motion: a guide to goniometry (F.A. Davis Company, 2 ed. Philadelphia) (1995).
[0086]
Под «тугоподвижностью суставов» понимают чувство затруднения при движении сустава или очевидную потерю диапазона подвижности сустава
[0087]
«Отщепляющее средство» представляет собой средство, которое можно использовать для отщепления или отделения, например, поддающегося отщеплению пептида или полипептида от гетерологичного полипептида или белка. Отщепляющие средства включают, но без ограничения, палладий, бромид цианогена (CNBr), муравьиную кислоту, гидроксиламин, клострипаин, тромбин, химотрипсин, трипсин, трипсиноподобные протеазы, карбоксипептидазу, энтерокиназу (энтеропептидазу), протеазу Kex 2, протеазу Omp T, протеазу фактор Xa, субтилизин, proTEV, протеазу SUMO, протеазу V8, протеазу HIV, протеазу риновируса, протеазу фурилизин, протеазы IgA, протеазу Pace человека, коллагеназу, протеазу Nia, протеазу вируса полиомиелита 2Apro, протеазу вируса полиомиелита 3C, гененазу, фурин, эластазу, протеиназу K, пепсин, реннин (химозин), аспарагиновые протеазы микроорганизмов, папаин, кальпаин, химопапаин, фицин (фикаин), бромелаин (бромелазу), катепсин B, каспазы, термолизин, эндопротеазу Arg-C, эндопротеазу Glu-C, эндопротеазу Lys-C, калликреин и плазмин.
[0088]
Термины «идентичная» и процент «идентичности», в контексте двух или более полинуклеотидных или полипептидных последовательностей, относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют указанный процент нуклеотидов или аминокислотных остатков, которые являются одинаковыми, при сравнении и выравнивании для максимального соответствия.
[0089]
Фраза «в основном гомологичный» или «в основном идентичный», в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов, как правило, относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, имеющим по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 98% идентичность нуклеотидов или аминокислотных остатков, при глобальном выравнивании.
[0090]
Глобальное выравнивание последовательностей для сравнения проводят с использованием программы EMBOSS Needle (например, как реализовано посредством EMBL-EBI через веб-интерфейс) с использованием параметров по умолчанию (для белка: матрица=BLOSUM62, открытие пропуска=10, продление пропуска=0,5, формат вывода=пара, штраф за делецию на конце=ложь, открытие концевого пропуска=10, продление концевого пропуска=0,5; для нуклеотидов, матрица=DNAfull, открытие пропуска=10, продление пропуска=0,5, формат вывода=пара, штраф за делецию на конце=ложь, открытие концевого пропуска=10, продление концевого пропуска=0,5).
[0091]
Дополнительным признаком того, что две последовательности нуклеиновой кислоты или два полипептида являются в основном гомологичными или идентичными, является то, что полипептид, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, обладает перекрестной иммунологической реакционной способностью с полипептидом, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, как описано ниже. Таким образом, полипептид, как правило, является в основном идентичным второму полипептиду, например, когда два полипептида отличаются только консервативными заменами. Другим признаком того, что две последовательности нуклеиновой кислоты являются в основном идентичными, является то, что эти две молекулы гибридизуются друг с другом в строгих условиях, как описано в настоящем описании.
[0092]
«В основном чистый» или «выделенный» означает, что целевое вещество является преобладающим присутствующим веществом (т.е., на основании молярности, более распространенным, чем любое другое индивидуальное макромолекулярное вещество в композиции), и в основном очищенная фракция представляет собой композицию, где целевое вещество составляет по меньшей мере приблизительно 50% (на основании молярности) из всех присутствующих макромолекулярных веществ. В различных вариантах осуществления, представляющее интерес вещество составляет по меньшей мере приблизительно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% из макромолекулярных веществ, присутствующих в композиции, на молярной или массовой основе. Целевое вещество является очищенным «в основном до гомогенности», если загрязняющие макромолекулярные вещества невозможно детектировать в композиции посредством общепринятых способов детекции. Молекулы растворителя, малые молекулы (<500 Дальтон), стабилизаторы (например, BSA) и элементарные ионы не рассматривают как макромолекулярные вещества для целей этого определения. В одном варианте осуществления, соединения по этому описанию являются в основном чистыми или выделенными. В другом варианте осуществления, соединения по этому описанию являются в основном чистыми или выделенными применительно к макромолекулярным исходным материалам, используемым при их получении. В другом варианте осуществления, фармацевтические композиции по этому описанию содержат в основном чистый или выделенный вариант CNP, смешанный с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми наполнителями, носителями или разбавителями, и необязательно, с другим биологически активным средством.
[0093]
«Дикий тип» (wt) представляет собой термин, относящийся к природной форме, включая последовательность, полинуклеотид, полипептид или белок в видах. Форму дикого типа отличают от мутантной формы полинуклеотида, полипептида или белка, возникающей в результате генетической мутации(мутаций).
[0094]
В одном варианте осуществления, первый полипептид, являющийся «аналогом» или «вариантом», или «производным» второго полипептида, представляет собой полипептид, имеющий по меньшей мере приблизительно 50%, 60% или 70% идентичности последовательности, но менее, чем 100% идентичности последовательности, с вторым полипептидом. Такие аналоги, варианты или производные могут содержать неприродные аминокислотные остатки, включая, без ограничения, гомоаргинин, орнитин, пеницилламин и норвалин, так же как природные аминокислотные остатки. Такие аналоги, варианты или производные могут также содержать один или множество D-аминокислотных остатков, и могут также содержать пептидомиметики или изостеры пептидной связи, такие как непептидные связи между двумя или более остатками аминокислот или пептидомиметиков. В другом варианте осуществления, первый полипептид является «аналогом», «вариантом» или «производным» второго полипептида, если первый полипептид не является известным продуктом расщепления второго полипептида, или не является известным предшественником второго полипептида, даже если первый полипептид имеет 100% идентичность последовательности с вторым полипептидом или имеет последовательность дикого типа.
[0095]
В одном варианте осуществления, термин «происходит из», как применяют в настоящем описании, относится к полипептидной или пептидной последовательности, которая основана на полипептидной или пептидной последовательности дикого типа или природной, и может иметь одну или несколько делеций, добавлений и/или замен с использованием природных аминокислот, неприродных аминокислот или пептидомиметиков. В одном варианте осуществления, производная последовательность разделяет по меньшей мере приблизительно 40%, 50%, 60% или 70%, но менее, чем 100%, идентичности последовательности с последовательностью дикого типа или природной. В другом варианте осуществления, производное может представлять собой фрагмент полипептида, где фрагмент является в основном идентичным (например, по меньшей мере приблизительно на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичным) полипептиду дикого типа на протяжении длины по меньшей мере приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 аминокислот. В другом вариант осуществления, полипептид «происходит из» полипептида дикого типа, если он имеет группу (например, полимера, например, такого как PEG), непосредственно или опосредовано присоединенную к нему, которая не присутствует на полипептиде дикого типа, даже если оба полипептида разделяют 100% идентичность их аминокислотной последовательности.
[0096]
Полипептид-предшественникнатрийуретического пептида C (NPPC) представляет собой одноцепочечный пре-про-полипептид из 126-аминокислот, и как описано ниже, после процессинга в конечном счете образует CNP-22 дикого типа (wtCNP-22). Удаление сигнального пептида из NPPC образует про-CNP, и дальнейшее расщепление эндопротеазой фурином образует активный пептид из 53 аминокислот (CNP-53), который секретируется и снова расщепляется с образованием зрелого пептида из 22-аминокислот (CNP, или CNP-22). В одном варианте осуществления, «вариант CNP» является по меньшей мере приблизительно на 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% идентичным NPPC дикого типа на протяжении такого же количества аминокислотных остатков.
[0097]
Термин «эффективное количество» обозначает количество, достаточное для получения желательного результата применительно к состоянию здоровья, патологии или заболеванию субъекта, или для диагностической цели. Желательный результат может включать субъективное или объективное улучшение у реципиента дозирования. «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству средства, эффективному для оказания намеченного благоприятного эффекта на состояние здоровья. Понятно, что конкретные уровень дозы и частота дозирования для любого конкретного пациента могут меняться и могут зависеть от множества факторов, включая активность конкретного используемого соединения; биодоступность, метаболичскую стабильность, скорость выведения и длительность действия этого соединения; способ и время введения соединения; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и диету пациента; и тяжесть конкретного состояния.
[0098]
«Лечение» относится к профилактическому лечению или терапевтическому лечению, или диагностическому лечению. В конкретных вариантах осуществления, «лечение» относится к введению соединения или композиции субъекту для терапевтических, профилактических или диагностических целей.
[0099]
«Профилактическое» лечение представляет собой лечение, которому подвергают субъекта, у которого не проявляются признаки заболевания или проявляются только ранние признаки заболевания, с целью уменьшения риска развития патологии. Соединения или композиции по этому описанию можно вводить в качестве профилактического лечения для уменьшения вероятности развития патологии или для минимизации тяжести патологии, если она развилась.
[0100]
«Терапевтическое» лечение представляет собой лечение, которому подвергают субъекта, у которого проявляются признаки или симптомы патологии, с целью уменьшения или прекращения этих признаков или симптомов. Признаки или симптомы могут являться биохимическими, клеточными, гистологическими, функциональными или физическими, субъективными или объективными. Соединения по этому описанию можно также вводить в качестве терапевтического лечения или для диагностики.
[0101]
«Диагностика» означает идентификацию присутствия, степени и/или природы патологического состояния. Диагностические способы отличаются по их специфичности и избирательности. В то время как конкретный диагностический способ может не обеспечивать доказательной диагностики состояния, он является подходящим, если способ обеспечивает положительные показатели, помогающие в диагностике. Диагностическое лечение представляет собой введение соединения по этому описанию, чтобы способствовать диагностике у субъекта.
[0102]
in
vivo
ex
vivo
«Ассоциированный с хрящом биомаркер» или «ассоциированный с хрящом маркер» относится к фактору роста, ферменту, белку, нуклеиновой кислоте или другим поддающимся детекции биологическим веществу или группе, уровень которых увеличивается или уменьшается в ассоциации, например, с обновлением хряща, формированием хряща и/или ростом хряща. Такие биомаркеры можно измерять до, во время и/или после введения варианта CNP, как описано в настоящем описании. Иллюстративные ассоциированные с хрящом биомаркеры включают, но без ограничения, CNP, цГМФ, пропептиды коллагена типа II и их фрагменты, коллаген типа II и его фрагменты, пропептиды коллагена типа I и их фрагменты, коллаген типа I и его фрагменты, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), хондроитинсульфат аггрекан, синдекан-3 и аннексин VI. Ассоциированные с хрящом биомаркеры можно измерять в любом подходящем биологическом образце, включая, но без ограничения, ткани, кровь, сыворотку, плазму, спинномозговую жидкость, синовиальную жидкость и мочу. В некоторых вариантах осуществления, биомаркеры измеряют в крови, плазме или сыворотке от животных, подвергающихся исследованию эффективности/фармакодинамики , и/или в кондиционированной среде при исследованиях .
[0103]
В конкретных вариантах осуществления, уровень по меньшей мере одного ассоциированного с хрящом биомаркера измеряют, и количество или частоту введения варианта CNP, введенного субъекту, могут корректировать в соответствии с измеренным уровнем биомаркера. В некоторых вариантах осуществления, уровень биомаркера составляет «ниже целевого уровня» или «выше целевого уровня». Целевой уровень биомаркера представляет собой уровень или диапазон уровней биомаркера, при котором терапевтический эффект наблюдают у субъекта, которому вводят вариант CNP. В конкретных вариантах осуществления, целевой уровень биомаркера для субъекта, имеющего остеоартрит, представляет собой уровень или диапазон уровней биомаркера, наблюдаемый у нормального, не пораженного субъекта. В различных вариантах осуществления, чтобы показать терапевтический эффект, целевой уровень биомаркера не обязательно должен быть эквивалентным уровню или диапазону уровней биомаркера, наблюдаемому у нормального субъекта, но может лежать в пределах, например, 100%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% или 5% от «нормального» уровня или диапазона уровней биомаркера, наблюдаемого у не пораженного субъекта.
[0104]
Например, если уровень биомаркера увеличивается в ассоциации с формированием или ростом хряща, целевой уровень биомаркера, указывающий на терапевтический эффект, может быть выше, чем уровень биомаркера у пациентов, страдающих остеоартритом, которым не вводили вариант CNP, и может, необязательно, быть более низким, чем «нормальный» уровень(уровни), приблизительно равным «нормальному» уровню(уровням), или более высоким, чем «нормальный» уровень(уровни) биомаркера у субъектов, не страдающих этим нарушением. В одном варианте осуществления, если уровень биомаркера ниже целевого уровня, это указывает на неадекватный терапевтический эффект, который может требовать увеличения количества или частоты введения вводимого варианта CNP. В родственном варианте осуществления, если уровень биомаркера выше целевого уровня, это показывает, что введено больше варианта CNP, чем необходимо, что может требовать уменьшения количества или частоты введения вводимого варианта CNP.
[0105]
В качестве другого примера, если уровень биомаркера уменьшается в ассоциации с формированием или ростом хряща, целевой уровень биомаркера, указывающий на терапевтический эффект, может быть более низким, чем уровень биомаркера у пациентов, страдающих остеоартритом, которым не вводили вариант CNP, и может, необязательно, быть более высоким, чем «нормальный» уровень (уровни), приблизительно равным «нормальному» уровню(уровням), или более низким, чем «нормальный» уровень(уровни) биомаркера у субъектов, не страдающих этим нарушением. В таком случае, можно использовать перевод вышеуказанных коррекций в количество и частоту введения варианта CNP.
[0106]
«Фармацевтическая композиция» относится к композиции, пригодной для фармацевтического использования у субъекта-животного, включая человека и млекопитающих. Фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество варианта CNP, необязательно, другое биологически активное средство, и необязательно, фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или разбавитель. В одном варианте осуществления, фармацевтическая композиция включает композицию, содержащую активный ингредиент(ы) и инертный ингредиент(ы), составляющие носитель, так же как любой продукт, возникающий, напрямую или опосредовано, в результате комбинации, комплексообразования или агрегации любых двух или более из ингредиентов, или в результате диссоциации одного или нескольких из ингредиентов, или в результате других типов реакций или взаимодействий одного или нескольких из ингредиентов. Соответственно, фармацевтические композиции по настоящему описанию включают любую композицию, полученную посредством смешивания соединения по этому описанию и фармацевтически приемлемого наполнителя, носителя или разбавителя.
[0107]
«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к любому из стандартных фармацевтических носителей, буферов и т.п., таких как раствор фосфатно-солевого буфера, 5% водный раствор декстрозы и эмульсии (например, эмульсии масло/вода или вода/масло). Неограничивающие примеры наполнителей включают адъюванты, связующие вещества, наполнители, разбавители, дезинтегрирующие средства, эмульгаторы, увлажняющие средства, смазывающие средства, вещества, способствующее скольжению, подсластители, придающие вкус средства и окрашивающие средства. Пригодные фармацевтические носители, наполнители и разбавители описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995). Предпочтительные фармацевтические носители зависят от намеченного способа введения действующего вещества. Типичные способы введения включают энтеральный (например, пероральный) или парентеральный (например, подкожную, внутримышечную, внутривенную или внутрибрюшинную инъекцию; или местное, чрескожное или трансмукозальное введение).
[0108]
«Фармацевтически приемлемая соль» представляет собой соль, которую можно составлять в соединение для фармацевтического использования, включая, но без ограничения, соли металлов (например, натрия, калия, магния, кальция и т.д.) и соли аммиака или органических аминов.
[0109]
Под «фармацевтически приемлемым» или «фармакологически приемлемым» понимают материал, который не является биологически или иным образом нежелательным, т.е., материал можно вводить индивидууму без вызова каких-либо нежелательных биологических эффектов или без взаимодействия неблагоприятным образом с любым из компонентов композиции, в которой он содержится, или с любым из компонентов, присутствующих на теле или в организме индивидуума.
[0110]
Термин «единичная дозированная форма» относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для субъектов - людей и животных, где каждая единица содержит предопределенное количество соединения по этому описанию, рассчитанное как количество, достаточное для получения желательного эффекта, необязательно, в ассоциации с a фармацевтически приемлемым наполнителем, разбавителем, носителем или связующим. Спецификации для новых единичных дозированных форм по настоящему описанию зависят от конкретного используемого соединения и эффекта, подлежащего достижению, и фармакодинамики, ассоциированной с каждым соединением в хозяине.
[0111] «
Физиологические условия» относятся к условиям в организме животного (например, человека). Физиологические условия включают, но без ограничения, температуру тела и водное окружение из физиологической ионной силы, pH и ферментов.
[0112]
Как применяют в настоящем описании, термин «субъект» включает человека и не относящихся к человеку млекопитающих, и не относящихся к млекопитающим животных, до той степени, что композиции, описанные в настоящем описании, являются полезными при введении таким не относящимся к человеку видам. Примеры млекопитающих включают, но без ограничения, любого члена класса млекопитающих: человека, не относящихся к человеку приматов, таких как шимпанзе и другие виды человекообразных и не человекообразных обезьян; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, лошади, овцы, козы, свиньи; домашних животных, таких как кролики, собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как крысы, мыши и морские свинки, и т.п. Примеры не относящихся к млекопитающим животных включают, но без ограничения, позвоночных, таких как птицы и рыбы. Термин не указывает конкретный возраст или пол.
[0113]
3
2
2
n
2
m
3
2
2
p
2
m
n
Термины «полиэтиленгликоль», «PEG», «полиэтиленоксид» и «PEO» используют в настоящем описании взаимозаменяемо, если не указано иное. Вариант CNP, конъюгированный через аминогруппу с полимером «PEOn» с определенным количеством n, в общем имеет формулу: CH- [-O-CHCH-]-C(=O)- NHR, где n представляет собой количество звеньев этиленоксида, и R обозначает остальную часть пептида. Полимер «PEOn», необязательно, может иметь группу алкилена, (CH), где m представляет собой целое число от 1 до 5, между атомом углерода карбонила и повторяющимися звеньями этиленоксида. Такой полимер «PEOn» (например, PEO12 или PEO24) является монодисперсным, т.е., представляет собой один дискретный полимер с конкретной молекулярной массой. Подобным образом, вариант CNP, конъюгированный через аминогруппу с полимером «PEGnK», ассоциированным с определенным количеством nK, в общем, имеет формулу: CH- [-O-CHCH-]-C(=O)- NHR, где p представляет собой целое число больше 1. Полимер «PEGnK» также необязательно может иметь группу алкилена, (CH), где m представляет собой целое число от 1 до 5, между атомом углерода карбонила и повторяющимися звеньями этиленоксида. Однако такой полимер «PEGnK» (например, PEG1K, PEG2K, PEG5K или PEG20K) является полидисперсным, т.е., содержит смесь полимеров, имеющих распределение по молекулярным массам, где количество nK обозначает среднечисловую молекулярную массу полимера (M) в килодальтонах. Например, «PEG2K», конъюгированный с вариантом CNP, обозначает полидисперсный полимер PEG, имеющий среднечисловую молекулярную массу приблизительно 2 кДа.
[0114]
Когда указан диапазон масс полимера (например, PEG) (например, в единицах кДа), диапазон относится к диапазону среднечисловых молекулярных масс полимеров, а не к диапазону молекулярных масс множества полимеров в полидисперсной смеси, если конкретно не указано иное.
[0115]
Термин «галоген», «галогенид», или «гало» относится к фтору, хлору, брому и/или иоду.
[0116]
1-20
1-15
1-12
1-10
1-6
3-20
3-15
3-12
3-10
3-6
1-6
3-6
1-6
Термин «алкил» относится к линейному или разветвленному насыщенному моновалентному углеводородному радикалу, где алкил, необязательно, может являться замещенным одним или несколькими заместителями Q, как описано в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления, алкил представляет собой линейный насыщенный моновалентный углеводородный радикал, имеющий от 1 до 20 (C), от 1 до 15 (C), от 1 до 12 (C), от 1 до 10 (C) или от 1 до 6 (C) атомов углерода, или разветвленный насыщенный моновалентный углеводородный радикал, имеющий от 3 до 20 (C), от 3 до 15 (C), от 3 до 12 (C), 3 to 10 (C), или от 3 до 6 (C) атомов углерода. Как применяют в настоящем описании, линейные C и разветвленные C алкильные группы также называют «низшим алкилом». Примеры алкильных групп включают, но без ограничения, метил, этил, пропил (включая все изомерные формы, включая н-пропил и изопропил), бутил (включая все изомерные формы, включая н-бутил, изобутил, втор-бутил и трет-бутил), пентил (включая все изомерные формы), и гексил (включая все изомерные формы). Например, C алкил относится к линейному насыщенному моновалентному углеводородному радикалу, имеющему от 1 до 6 атомов углерода, или к разветвленному насыщенному моновалентному углеводородному радикалу, имеющему от 3 до 6 атомов углерода.
[0117]
Термин «алкокси» относится к-O-алкильной группе. В конкретных вариантах осуществления, алкокси-группа может, необязательно, являться замещенной одним или несколькими заместителями Q, как описано в настоящем описании.
[0118]
Термин «галоалкил» относится к алкильной группе, замещенной одним или несколькими атомами галогена. В конкретных вариантах осуществления, галоалкильная группа замещена одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью или шестью атомами галогена. В конкретных вариантах осуществления, галоалкильная группа, необязательно, может являться замещенной одним или несколькими дополнительными заместителями Q, как описано в настоящем описании.
[0119]
3-20
3-15
3-12
3-10
3-7
Термин «циклоалкил» относится к циклическому насыщенному связанному мостиком и/или не связанному мостиком моновалентному углеводородному радикалу, который, необязательно, может быть замещен одним или несколькими заместителями Q, как описано в настоящем описании. В конкретных вариантах осуществления, циклоалкил имеет от 3 до 20 (C), от 3 до 15 (C), от 3 до 12 (C), от 3 до 10 (C) или от 3 до 7 (C) атомов углерода. Примеры циклоалкильных групп включают, но без ограничения, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, декалинил и адамантил.
[0120]
Термин «гетероциклил» или «гетероциклический» относится к моноциклической неароматической кольцевой системе или к полициклической кольцевой системе, которая содержит по меньшей мере один неароматический цикл, где один или несколько атомов неароматического цикла являются гетероатомами, независимо выбранными из O, S или N, и остальные атомы неароматического цикла являются атомами углерода. В конкретных вариантах осуществления, гетероциклил или гетероциклическая группа имеет от 3 до 20, от 3 до 15, от 3 до 10, от 3 до 8, от 4 до 7 или от 5 до 6 атомов в цикле. В конкретных вариантах осуществления, гетероциклил представляет собой моноциклическую, бициклическую, трициклическую или тетрациклическую кольцевую систему, которая может включать конденсированную или связанную мостиком кольцевую систему, и в которой атомы азота или серы, необязательно, могут являться окисленными, атомы азота, необязательно, могут являться кватернизованными, и некоторые циклы могут быть частично или полностью насыщенными или ароматическими. Гетероциклил может являться присоединенным к основной структуре по любому гетероатому или атому углерода, что приводит к созданию стабильного соединения. Примеры гетероциклических групп включают, но без ограничения, акридинил, азепинил, бензимидазолил, бензиндолил, бензоизоксазолил, бензизоксазинил, бензодиоксанил, бензодиоксолил, бензофуранонил, бензофуранил, бензонафтофуранил, бензопиранонил, бензопиранил, бензотетрагидрофуранил, бензотетрагидротиенил, бензотиадиазолил, бензотиазолил, бензотиофенил, бензотриазолил, бензотиопиранил, бензоксазинил, бензоксазолил, бензотиазолил, β-карболинил, карбазолил, хроманил, хромонил, циннолинил, кумаринил, декагидроизохинолинил, дибензофуранил, дигидробензизотиазинил, дигидробензизоксазинил, дигидрофурил, дигидропиранил, диоксоланил, дигидропиразинил, дигидропиридинил, дигидропиразолил, дигидропиримидинил, дигидропирролил, диоксоланил, 1,4-дитианил, фуранонил, фуранил, имидазолидинил, имидазолинил, имидазолил, имидазопиридинил, имидазотиазолил, индазолил, индолинил, индолизинил, индолил, изобензотетрагидрофуранил, изобензотетрагидротиенил, изобензотиенил, изохроманил, изокумаринил, изоиндолинил, изоиндолил, изохинолинил, изотиазолидинил, изотиазолил, изоксазолидинил, изоксазолил, морфолинил, нафтиридинил, октагидроиндолил, октагидроизоиндолил, оксадиазолил, оксазолидинонил, оксазолидинил, оксазолопиридинил, оксазолил, оксиранил, перимидинил, фенантридинил, фенатролинил, фенарсазинил, феназинил, фенотиазинил, феноксазинил, фталазинил, пиперазинил, пиперидинил, 4-пиперидонил, птеридинил, пуринил, пиразинил, пиразолидинил, пиразолил, пиридазинил, пиридинил, пиридопиридинил, пиримидинил, пирролидинил, пирролинил, пирролил, хиназолинил, хинолинил, хиноксалинил, хинуклидинил, тетрагидрофурил, тетрагидрофуранил, тетрагидроизохинолинил, тетрагидропиранил, тетрагидротиенил, тетразолил, тиадиазолопиримидинил, тиадиазолил, тиаморфолинил, тиазолидинил, тиазолил, тиенил, триазинил, триазолил и 1,3,5-тритианил. В конкретных вариантах осуществления, гетероциклическая группа, необязательно, может являться замещенной одним или несколькими заместителями Q, как описано в настоящем описании.
[0121]
6-20
6-15
6-10
Термин «арил» относится к моноциклической ароматической группе или полициклической моновалентной ароматической группе, которая содержит по меньшей мере один ароматический углеводородный цикл. В конкретных вариантах осуществления, арил имеет от 6 до 20 (C), от 6 до 15 (C), или от 6 до 10 (C) атомов в цикле. Примеры арильных групп включают, но без ограничения, фенил, нафтил, флуоренил, азуленил, антрил, фенантрил, пиренил, бифенил и терфенил. Арил также относится к бициклическим или трициклическим углеродным циклам, где по меньшей мере один из циклов является ароматическим, а другие могут быть насыщенными, частично ненасыщенными или ароматическими, например, дигидронафтил, инденил, инданил и тетрагидронафтил (тетралинил). В конкретных вариантах осуществления, арильная группа может, необязательно, являться замещенной одним или несколькими заместителями Q, как описано в настоящем описании.
[0122]
Термин «гетероарил» относится к моноциклической ароматической группе или к полициклической ароматической группе, которая содержит по меньшей мере один ароматический цикл, где по меньшей мере один ароматический цикл содержит один или несколько гетероатомов, независимо выбранных из O, S и N. Каждый цикл гетероарильной группы может содержать один или два атома O, один или два атома S, и/или от одного до четырех атомов N, при условии, что общее количество гетероатомов в каждом цикле равно четырем или менее, и каждый цикл содержит по меньшей мере один атом углерода. Гетероарил может быть присоединен к основной структуре по любому гетероатому или атому углерода, что приводит к созданию стабильного соединения. В конкретных вариантах осуществления, гетероарил имеет от 5 до 20, от 5 до 15 или от 5 до 10 атомов в цикле. Примеры моноциклических гетероарильных групп включают, но без ограничения, пирролил, пиразолил, пиразолинил, имидазолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил, тиадиазолил, изотиазолил, фуранил, тиенил, оксадиазолил, пиридил, пиразинил, пиримидинил, пиридазинил и триазинил. Примеры бициклических гетероарильных групп включают, но без ограничения, индолил, бензотиазолил, бензоксазолил, бензотиенил, хинолинил, тетрагидроизохинолинил, изохинолинил, бензимидазолил, бензопиранил, индолизинил, бензофуранил, изобензофуранил, хромонил, кумаринил, циннолинил, хиноксалинил, индазолил, пуринил, пирролопиридинил, фуропиридинил, тиенопиридинил, дигидроизоиндолил и тетрагидрохинолинил. Примеры трициклических гетероарильных групп включают, но без ограничения, карбазолил, бензиндолил, фенантроллинил, акридинил, фенантридинил и ксантенил. В конкретных вариантах осуществления, гетероарильная группа, необязательно, может являться замещенной одним или несколькими заместителями Q, как описано в настоящем описании.
[0123]
1-6
1-6
1-6
3-7
6-14
2
2
2
2
2
2
1-6
3-7
6-14
e
e
f
g
e
f
g
e
e
e
f
g
e
f
g
e
e
f
g
f
g
f
g
e
f
e
f
e
f
g
e
h
f
g
e
f
e
f
e
f
g
e
f
g
e
e
e
f
g
e
f
g
h
f
g
Термин «необязательно замещенный» означает, что группа, включая алкил, алкокси, галоалкил, циклоалкил, гетероциклил, арил и гетероарил, может являться замещенной одним или несколькими заместителями Q (в одном варианте осуществления, одним, двумя, тремя или четырьмя заместителями Q), где каждый Q независимо выбран из группы, состоящей из циано, гало, оксо, нитро, C алкила, C алкокси, гало-Cалкила, C циклоалкила, гетероциклила, C арила, гетероарила, -C(O)R, -C(O)OR, -C(O)NRR, -C(NR)NRR, -OR, -OC(O)R, -OC(O)OR, -OC(O)NRR, -OC(=NR)NRR, -OS(O)R, -OS(O)R, -OS(O)NRR, -OS(O)NRR, -NRR, -NRC(O)R, -NRC(O)OR, -NRC(O)NRR, -NRC(=NR)NRR, -NRS(O)R, -NRS(O)R, -NRS(O)NRR, -NRS(O)NRR, -SR, -S(O)R, -S(O)R и -S(O)NRR, где каждый R, R, R и R независимо представляет собой водород, C алкил, C циклоалкил, гетероциклил, C арил, или гетероарил; или R и R, вместе с атомом N, с которым они связаны, формируют гетероциклил.
B. Варианты CNP
[0124]
Использование CNP22 в качестве лекарственного средства ограничено его коротким временем полужизни в плазме (J. Clin. Endocrinol. Metab., 78: 1428-35 (1994)). В плазме человека, концентрация CNP22 как правило, является менее, чем пяти пикомолярной. CNP22 подвергается деградации и выведению из кровотока посредством NEP и NPR-C у человека (Growth Hormone & IGF Res., 16: S6-S14). Во всех исследованиях у человека и животных с использованием системного вводимого CNP22, непрерывную инфузию использовали для увеличения концентрации CNP22 у субъектов. Пептид CNP, имеющий более длительное время полужизни и по меньшей мере сходный уровень функциональности, может обеспечивать преимущества для терапевтических способов на основе CNP. Варианты CNP описаны также в родственных выданных патентах: Патенте США No. 8377884; Патенте США No. 8198242; и Патенте США No. 8598121. Полное содержание каждого из процитированных патентов, таким образом, конкретно приведено в настоящем описании в качестве ссылки.
[0125]
in
vitro
in
vivo
in
vivo
in
vitro
in
vivo
ex
vivo
in
vivo
Настоящее описание относится к вариантам CNP, которые имеют уменьшенную аффинность к NEP и/или NPR-C, и уменьшенную чувствительность к расщеплению посредством NEP и/или выведению посредством NPR-C, но которые имеют по существу сходную или лучшую функциональность, чем CNP22 дикого типа. Уменьшенная чувствительность вариантов CNP к расщеплению посредством NEP и/или к выведению посредством NPR-C может увеличивать время полужизни вариантов в плазме или в сыворотке, таким образом, увеличивая возможность распределения вариантов к тканям и участкам - мишеням и оказания желательных фармакологических эффектов. В конкретных вариантах осуществления, варианты CNP, описанные в настоящем описании, имеют уменьшенную чувствительность к расщеплению посредством NEP и/или к выведению посредством NPR-C  или  по меньшей мере приблизительно в 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза или 5 раз по сравнению с wtCNP22, и имеют увеличенное время полужизни в плазме или сыворотке  по меньшей мере приблизительно в 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза или 5 раз по сравнению с wtCNP22, в то же время сохраняя по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% функциональности wtCNP22, или имея по меньшей мере приблизительно в 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 3,5 раза, 4 раза, 4,5 раза или 5 раз большую функциональность, чем wtCNP22. Функциональность CNP можно оценивать применительно, например, к уровню одного или нескольких биомаркеров (например, цГМФ), ассоциированных с формированием или ростом хряща, в исследовании  или . Кроме того, функциональность CNP можно оценивать посредством предотвращения остеоартритной дегенерации хряща в исследовании  или  и т.д.
[0126]
Природные субстраты NEP являются небольшими, и натрийуретические пептиды (от приблизительно 2,2 до приблизительно 3,2 кДа) являются самыми крупными из природных субстратов NEP. В соответствии с рентгенографическими кристаллографическими анализами, активный участок NEP глубоко погружен внутрь центральной полости, что эффективно ограничивает размер молекул субстрата до не более, чем приблизительно 3 кДа (Oefner et al., J. Mol. Biol., 296: 341-349 (2000)). На основании исследования передачи сигналов NPR-B, варианты CNP-22, такие CNP-17 (сохраняющий только циклический домен, Cys6-Cys22, CNP22) и CNP-53 (CNP-22 с удлинением из 31 аминокислот на N-конце), еще могут связывать и активировать NPR-B, подобно 2,2 кДа wtCNP-22. Соответственно, настоящее описание относится к вариантам CNP, конъюгированным с природным (например, пептидным) и/или синтетическим (например, PEG) полимером на N-конце и/или C-конце CNP22 или его вариантов, которые имеют увеличенную устойчивость к NEP, но сохраняют способность связывать и активировать рецептор для передачи сигналов NPR-B.
[0127]
В одном варианте осуществления, настоящее описание относится к вариантам CNP, представленным общей формулой:
где: каждый из (x) и (z) независимо представляет собой природный полимер (например, пептидную последовательность, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту) и/или синтетический полимер (например, PEG), как описано в настоящем описании, так что общая масса варианта CNP характеризуется диапазонами, в общем описанными в настоящем описании, например, в диапазоне от приблизительно 2,6 кДа или 2,8 кДа до приблизительно 6 или 7 кДа. В одном варианте осуществления, остатки от Cys6 до Cys22 формируют циклическую часть. В одном варианте осуществления, (x) и/или (z) содержат удлинение из аминокислот, происходящих из NPPC или не относящегося к CNP полипептида (например, ANP, BNP, IgG и т.д.), где удлинение содержит 1-40, 1-35, 1-31, 5-35, 5-31 или 5-15 аминокислот. В другом варианте осуществления, варианты CNP содержат одну или несколько модификаций и/или замен с использованием другой природной аминокислоты, пептидомиметика и/или изостеры пептидной связи в одном или нескольких из следующих положений CNP22: Gly1, Lys4, Gly5, Cys6, Phe7, Gly8, Leu9, Lys10, Leu11, Ile14, Gly15, Ser16, Met17, Gly19, Leu20 и Gly21.
[0128]
В другом варианте осуществления, варианты CNP, имеющие общую массу, характеризующуюся диапазонами, в общем описанными в настоящем описании, например, от приблизительно 2,6 кДа или 2,8 кДа до приблизительно 6 или 7 кДа, разработанные для увеличения устойчивости к деградации NEP, представлены следующей общей формулой:
где: (x) представляет собой синтетическую или природную полимерную группу, или их комбинацию, где неограничивающий пример синтетической полимерной группы представляет собой PEG (или PEO), и неограничивающий пример природной полимерной группы представляет собой аминокислотную последовательность, содержащую от 1 до 35 аминокислот и происходящую из NPPC или его вариантов с заменами и/или делециями, ANP, BNP, или других не относящихся к CNP (поли)пептидов, например, таких как сывороточный альбумин, IgG, богатые гистидином гликопротеины, фибронектин, фибриноген, содержащие цинковые пальцы полипептиды, остеокрин или фактор роста фибробластов 2 (FGF2);
(z) может отсутствовать или может представлять собой синтетическую или природную полимерную группу, или их комбинацию, где неограничивающий пример синтетической полимерной группы представляет собой PEG, и неограничивающий пример природной полимерной группы представляет собой аминокислотную последовательность, происходящую из натрийуретического полипептида (например, NPPC, CNP, ANP или BNP) или полипептида, не являющегося натрийуретическим (например, сывороточного альбумина или IgG); и
(b) и (h) независимо могут представлять собой Lys дикого типа в этом положении или могут быть заменены с использованием консервативной аминокислотной замены или любой природной или неприродной аминокислоты, или пептидомиметика, не имеющих реакционноспособного первичного амина на боковой цепи, включая, но без ограничения, Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Glu или Ser. В одном варианте осуществления, (b) представляет собой Arg. В другом варианте осуществления, для улучшения устойчивости к NEP, (b) не представляет собой Gly.
[0129]
В другом варианте осуществления, (h) не представляет собой Arg. Неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей, происходящих из NPPC или его вариантов, включают: Arg,
Glu-Arg;
Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 133);
Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 134);
Gly-Ala-Asn-Pro-Arg (SEQ ID NO: 135);
Gly-Ala-Asn-Gln-Gln (SEQ ID NO: 136);
Gly-Ala-Asn-Ser-Ser (SEQ ID NO: 137);
Gly-Ala-Asn-Arg-Gln (SEQ ID NO: 138);
Gly-Ala-Asn-Arg-Met (SEQ ID NO: 139);
Gly-Ala-Asn-Arg-Thr (SEQ ID NO: 140);
Gly-Ala-Asn-Arg-Ser (SEQ ID NO: 141);
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala (SEQ ID NO: 142);
Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg (SEQ ID NO: 143);
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg (SEQ ID NO: 144);
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 145);
Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 146);
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Lys-Lys (SEQ ID NO: 147); и
Asp-Leu-Arg-Val-Asp-Thr-Lys-Ser-Arg-Ala-Ala-Trp-Ala-Arg-Leu-Leu-Gln-Glu-His-Pro-Asn-Ala-Arg-Lys-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asn-Arg-Arg (SEQ ID NO: 148). Неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей, происходящих из не относящихся к CNP полипептидов, например, таких как ANP, BNP, сывороточный альбумин и IgG, включают: Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser (SEQ ID NO: 149);
Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 150);
Ser-Pro-Lys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 151);
Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 152);
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 153);
Lys-Val-Leu-Arg-Arg-His (SEQ ID NO: 154);
Gly-Gln-His-Lys-Asp-Asp-Asn-Pro-Asn-Leu-Pro-Arg (SEQ ID NO: 155);
Gly-Val-Pro-Gln-Val-Ser-Thr-Ser-Thr (SEQ ID NO: 156);
Gly-Glu-Arg-Ala-Phe-Lys-Ala-Trp-Ala-Val-Ala-Arg-Leu-Ser-Gln (SEQ ID NO: 157); и
Gly-Gln-Pro-Arg-Glu-Pro-Gln-Val-Tyr-Thr-Leu-Pro-Pro-Ser (SEQ ID NO: 158).
[0130]
В одном варианте осуществления, N-концевая (x) группа и/или C-концевая (z) группа любых вариантов CNP, имеющих группу (x) и/или (z), как описано в настоящем описании, независимо содержат аминокислотную последовательность, содержащую небольшое количество, если они вообще присутствуют, кислых природных или неприродных аминокислот (например, Asp или Glu). В другом варианте осуществления, (x) и/или (z) являются обогащенными основными природными или неприродными аминокислотами (например, Lys, Arg или His) для сохранения щелочного pI, сходного с pI CNP22 (pI 8,9). В одном варианте осуществления, pI вариантов CNP лежит в диапазоне от приблизительно 8 до приблизительно 10,5, что разработано таким образом, что варианты CNP более легко могут диффундировать через внеклеточный матрикс, окружающий хондроциты пораженных остеоартритом суставов. В более узких вариантах осуществления, pI вариантов CNP составляет от приблизительно 8,5 до приблизительно 10,5, или от приблизительно 8,5 до приблизительно 10, или от приблизительно 9 до приблизительно 10.
[0131]
В другом варианте осуществления, (x) и/или (z) являются обогащенными полярными природными или неприродными аминокислотами, что разработано для увеличения растворимости в воде. В другом варианте осуществления, (x) и/или (z) содержат небольшое количество, если они вообще присутствуют, гидрофобных природных или неприродных аминокислот (например, Ala, Val, Leu, Ile или Met).
[0132]
В следующем варианте осуществления, N-концевые варианты CNP оканчиваются на по меньшей мере один остаток глицина, что разработано для увеличения времени полужизни в сыворотке. В родственном варианте осуществления, для предотвращения формирования пироглутамина, N-конец вариантов CNP оканчивается на остаток глицина, если в ином случае он может оканчиваться на глутамин. В одном варианте осуществления, группа (x) содержит аминокислотное удлинение, N-конец которого оканчивается по меньшей мере на один остаток глицина. В другом варианте осуществления, (x) и/или (z) не содержит двух соседних основных природных или неприродных аминокислот (например, Lys-Lys или Arg-Arg), что разработано для уменьшения чувствительности к расщеплению протеазой фурином. В одном варианте осуществления, (x) не содержит двух соседних основных аминокислот, непосредственно предшествующих положению, соответствующему Gly1 из CNP22.
[0133]
В другом варианте осуществления, группа (x) и/или группа (z) вариантов CNP содержит аминокислотную последовательность, происходящую из NPPC (например, происходящую из CNP53). В одном варианте осуществления, (x) содержит аминокислотную последовательность, происходящую из N-концевого хвоста ANP или BNP. В другом варианте осуществления, (z) содержит аминокислотную последовательность, происходящую из C-концевого хвоста ANP или BNP. В следующем варианте осуществления, (x) и/или (z) содержат аминокислотную последовательность, происходящую из полипептида, не являющегося натрийуретическим, например, такого как IgG, человеческий сывороточный альбумин (HSA), богатые гистидином гликопротеины, фибронектин, фибриноген, содержащие цинковые пальцы полипептиды, FGF-2 и нацеленные на кости белки (например, остеокрин, остеопонтин, остеокальцин и сиалопротеин).
[0134]
В любом варианте осуществления, описанном в настоящем описании, в котором CNP22 или его вариант могут иметь N-концевую группу (x) и/или C-концевую группу (z), (x) и/или (z) независимо могут содержать аминокислотную последовательность, происходящую из функционального домена морфогенетического белка кости (BMP). N-концевое и/или C-концевое аминокислотное удлинение, происходящее из функционального домена BMP, может увеличивать устойчивость к NEP, и таким образом, время полужизни в сыворотке варианта CNP, посредством увеличения общей массы варианта CNP до охарактеризованных диапазонов, в общем описанных в настоящем описании, например, диапазона от приблизительно 2,6 кДа или 2,8 кДа до приблизительно 6 или 7 кДа. Кроме того, поскольку конкретные BMP являются факторами роста и цитокинами, которые индуцируют формирование кости и хряща, фрагмент, происходящий из функционального домена BMP, может стимулировать рост хондроцитов, хряща или кости посредством механизма, отличного от активации гуанилилциклазной функции NPR-B циклическим доменом CNP22 или его вариантом. Неограничивающие примеры BMP, стимулирующих формирование и развитие кости, формирование и развитие хряща и/или дифференцировку остеобластов, включают BMP1, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7 и BMP8a. В одном варианте осуществления, N-конец и/или C-конец CNP22 или его варианта независимо конъюгированы с аминокислотной последовательностью, происходящей из последних 140 аминокислот в C-концевой части BMP1, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7 или BMP8a.
[0135]
В одном варианте осуществления, варианты CNP содержат аминокислотное удлинение на N-конце и/или C-конце CNP22 или CNP17, включая, но без ограничения: DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-53) (SEQ ID NO: 6);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-37, аналог BL) (SEQ ID NO: 22);
AAWARLLQEHPNAGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CA) (SEQ ID NO: 68); AAWARLLQEHPNARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CB) (SEQ ID NO: 69); DLRVDTKSRAAWARGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CC) (SEQ ID NO: 70); RGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 71);
ERGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 72);
GANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 73);
GANRRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 74);
GANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 75);
GANSSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 76);
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 48); и
SPKMVQGSG-CNP17-KVLRRH (аналог CD) (CNP17, имеющий N-концевой и C-концевой хвосты, происходящие из BNP) (SEQ ID NO: 77).
[0136]
В другом варианте осуществления, варианты CNP имеют замену K4R в положении 4 CNP22. Неограничивающие примеры вариантов CNP(K4R) включают: GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог AY) (SEQ ID NO: 52); GANPRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CI) (SEQ ID NO: 78);
RGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог AZ) (SEQ ID NO: 79);
ERGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог BA) (SEQ ID NO: 80);
GANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CH) (SEQ ID NO: 81); и
GANSSGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CG) (SEQ ID NO: 82).
[0137]
В следующих вариантах осуществления, варианты CNP представляют собой химеры, содержащие CNP22 или его вариант, имеющий добавление (добавления), делецию (делеции) и/или замену (замены) аминокислот, и пептидный фрагмент, происходящий из полипептида или белка, отличного от CNP, или полноразмерный полипептид или белок, отличный от CNP, на N-конце пептида CNP, где CNP22 или его вариант, необязательно, может иметь N-концевое аминокислотное удлинение из одного или нескольких аминокислотных остатков. В конкретных вариантах осуществления, химеры CNP содержат CNP22 или его вариант, который имеет N-концевое аминокислотное удлинение из одного или нескольких аминокислотных остатков. В конкретных вариантах осуществления, химеры CNP содержат остатки лизин-лизин (KK) или остатки GANKK, непосредственно предшествующие первому положению CNP22 (Gly в случае CNP22) или его варианта. В других вариантах осуществления, химеры CNP содержат один или два остатка, отличных от остатков лизин-лизин, непосредственно предшествующих первому положению CNP22 или его варианта. Неограничивающие примеры остатков, которые могут непосредственно предшествовать первому положению CNP22 или его варианта, включают KP, PK, PR, PQ, QK, QQ, RR, SS, GANKP, GANPK, GANPR, GANPQ, GANQK, GANQQ, GANRR и GANSS.
[0138]
В другом варианте осуществления, варианты CNP представляют собой химеры, содержащие CNP22 и N-концевой пептидный фрагмент, включая, но без ограничения: GHHSHEQHPHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CQ) (химера фрагмент богатого гистидином гликопротеина (HRGP) - CNP22) (SEQ ID NO: 83); GAHHPHEHDTHGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CR) (химера фрагмент HRGP - CNP22) (SEQ ID NO: 84);
GHHSHEQHPHGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CX) (химера фрагмент HRGP - CNP22) (SEQ ID NO: 85);
1
GQPREPQVYTLPPSGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CF) (химера фрагмент IgG(Fc) - CNP22) (SEQ ID NO: 86);
GQHKDDNPNLPRGANPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CY) (химера фрагмент человеческого сывороточного альбумина (HSA) - CNP22) (SEQ ID NO: 87);
GERAFKAWAVARLSQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CE) (химера фрагмент HSA - CNP22) (SEQ ID NO: 88);
FGIPMDRIGRNPRGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CZ) (химера фрагмент остеокрина «NPR C ингибитор» - CNP22) (SEQ ID NO: 89); и GKRTGQYKLGSKTGPGPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог DA) (химера фрагмент FGF2 «связывающий гепарин домен» - CNP22) (SEQ ID NO: 90).
[0139]
1
В другом варианте осуществления, варианты CNP представляют собой химеры, содержащие N-концевой пептидный фрагмент и CNP22, в котором Lys4 в CNP22 заменен аргинином («CNP22(K4R)»), включая, но без ограничения: GQPREPQVYTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CK) (химера фрагмент IgG(Fc) - CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 91);
GVPQVSTSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CL) (химера фрагмент HSA - CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 92);
GQPSSSSQSTGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CM) (химера фрагмент фибронектина CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 93);
GQTHSSGTQSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CN) (химера фрагмент фибриногена - CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 94);
GSTGQWHSESGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CO) (химера фрагмент фибриногена - CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 95); и GSSSSSSSSSGANQQGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CP) (химера фрагмент с цинковыми пальцами - CNP22(K4R)) (SEQ ID NO: 96).
[0140]
Химеры, содержащие IgG и CNP22 или его вариант, разработаны, среди прочего, для увеличения устойчивости к деградации посредством NEP и уменьшения связывания с сывороточным альбумином. Химеры CNP, содержащие поверхностный фрагмент HSA, разработаны, среди прочего, для уменьшения иммуногенности и уменьшения связывания с сывороточным альбумином. Химеры HRGP-CNP22 и HRGP-CNP22(K4R), содержащие катионную, богатую гистидином нелизиновую неаргининовую последовательность на N-конце, разработаны, среди прочего, для увеличения стабильности к протеазам. Химеры, содержащие фрагмент остеокрина, разработаны для высвобождения при расщеплении протеазой (например, фурином) фрагмента остеокрина в пластинах роста кости, где фрагмент может ингибировать рецептор выведения NPR-C. Применительно к химерам, содержащим связывающий гепарин фрагмент FGF2, связывание гепарина с фрагментом предназначено для защиты химер от деградации, таким образом, для обеспечения более длительного времени полужизни в сыворотке. Химеры, содержащие фрагмент фибронектина, фибриногена или цинкового пальца, разработаны для уменьшения связывания с сывороточным альбумином, наряду с другими признаками.
[0141]
Безнамерения быть связанными с теорией, предполагают, что вариант CNP с молекулярной массой от приблизительно 2,6 или 2,8 кДа до приблизительно 6 или 7 кДа, который имеет увеличенную устойчивость к деградации посредством NEP и имеет сходную или повышенную функциональность (например, связывание с NPR-B и стимуляцию передачи сигналов цГМФ) по сравнению с wtCNP22, может являться более эффективным, если он тесно не связан с белками плазмы, такими как сывороточный альбумин. Вариант CNP, который тесно не связан с белками плазмы (например, сывороточным альбумином), может более эффективно диффундировать через хрящ, достигая хондроцитов в пораженных остеоартритом суставах, и связывать и активировать NPR-B для передачи сигналов цГМФ. В одном варианте осуществления, варианты CNP, разработанные для уменьшения связывания с белками плазмы (например, с сывороточным альбумином) представляют собой химеры, содержащие CNP22 или его вариант и пептидный фрагмент из IgG. В другом варианте осуществления, варианты CNP, разработанные для уменьшения связывания с белками плазмы, представляют собой химеры, содержащие CNP22 или CNP22(K4R) и фрагмент из полипептида (например, IgG, HSA, фибронектина, фибриногена, содержащего цинковые пальцы полипептида и т.д.). В другом варианте осуществления, варианты CNP, разработанные для уменьшения связывания с белками плазмы, содержат CNP22 или его вариант, конъюгированный с гидрофильным или водорастворимым полимером. В одном варианте осуществления, гидрофильный или водорастворимый полимер представляет собой PEG (или PEO). В другом варианте осуществления, гидрофильный или водорастворимый полимер (например, PEG) функционализируют одной или несколькими функциональными группами, которые придают отрицательный заряд полимеру в физиологических условиях, например, такими как карбоксильная, сульфатная или фосфатная группы или их сочетание.
[0142]
В следующем варианте осуществления, варианты CNP по настоящему описанию, включают укороченные пептиды CNP, лежащие в диапазоне от CNP-17 (hCNP-17) человека до CNP-53 (hCNP-53) человека, и имеющие аминокислотные последовательности дикого типа, происходящие из hCNP-53. Такие укороченные пептиды CNP включают: DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-53) (SEQ ID NO: 6);
LRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-52) (SEQ ID NO: 7);
RVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-51) (SEQ ID NO: 8);
VDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP- 50) (SEQ ID NO: 9);
DTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-49) (SEQ ID NO: 10);
TKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-48) (SEQ ID NO: 11); KSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-47) (SEQ ID NO: 12); SRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-46) (SEQ ID NO: 13); RAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-45) (SEQ ID NO: 14);
AAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-44) (SEQ ID NO: 15);
AWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-43) (SEQ ID NO: 16);
WARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-42) (SEQ ID NO: 17);
ARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-41) (SEQ ID NO: 18);
RLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-40) (SEQ ID NO: 19) ;
LLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-39) (SEQ ID NO: 20);
LQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-38) (SEQ ID NO: 21); QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-37) (SEQ ID NO: 22); EHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-36) (SEQ ID NO: 23); HPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-35) (SEQ ID NO: 24); PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-34) (SEQ ID NO: 25); NARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-33) (SEQ ID NO: 26); ARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-32) (SEQ ID NO: 27); RKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-31) (SEQ ID NO: 28); KYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-30) (SEQ ID NO: 29); YKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-29) (SEQ ID NO: 30); KGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-28) (SEQ ID NO: 31); GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-27) (SEQ ID NO: 32); ANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-26) (SEQ ID NO: 33);
NKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-25) (SEQ ID NO: 34);
KKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-24) (SEQ ID NO: 35);
KGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-23) (SEQ ID NO: 36);
GLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-22) (SEQ ID NO: 37);
LSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-21) (SEQ ID NO: 38);
SKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-20) (SEQ ID NO: 39);
KGCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-19) (SEQ ID NO: 40);
GCFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-18) (SEQ ID NO: 41); и
CFGLKLDRIGSMSGLGC (CNP-17) (SEQ ID NO: 42).
[0143]
В конкретных вариантах осуществления, варианты CNP не включают CNP-17, CNP-22 или CNP-53.
[0144]
5
12
В другом варианте осуществления, укороченные пептиды CNP в диапазоне от hCNP-17 до hCNP-53 могут содержать добавление(добавления), делецию(делеции) и/или замену(замены) аминокислот природной или неприродной аминокислотой(аминокислотами) или пептидомиметиком(пептидомиметиками) (например, изостером(изостерами) пептидной связи, как описано в настоящем описании, в любом одном или нескольких положениях аминокислот в конкретных укороченных пептидах CNP. В другом варианте осуществления, укороченные пептиды CNP, имеющие последовательности дикого типа или добавление(добавления), делецию(делеции) и/или замену(замены) аминокислот, могут быть конъюгированы на N-конце, C-конце и/или внутреннем участке(участках) с любой из групп, описанных в настоящем описании, включая, но без ограничения, нацеленные на синовиальную оболочку или хрящ группы (например, бисфосфонаты, нацеленные на кость или хрящ пептидные последовательности (например, полиAsp, полиGlu), пептидные последовательности, происходящие из нацеленных на кость доменов белков кости (например, остеопонтина, остеокальцина, сиалопротеина)), пептидные последовательности, происходящие из функциональных доменов морфогенетических белков кости (например, BMP2, BMP3, BMP5, BMP7, BMP8a), пептидные последовательности, происходящие из натрийуретических полипептидов (например, NPPC, ANP, BNP), пептидные последовательности, происходящие из полипептидов ненатрийуретического происхождения (например, сывороточного альбумина, IgG, богатых гистидином гликопротеинов, фибронектина, фибриногена, содержащих цинковые пальцы полипептидов, FGF-2, остеокрина), группы, уменьшающие выведение почками (например, отрицательно заряженные группы PEG), гидрофильные полимеры (например, PEG), углеводы (например, углеводы, узнаваемые рецепторами на поверхности клеток в пораженных остеоартритом суставах), гидрофобные кислоты (например, C-C карбоновые кислоты, природные жирные кислоты), фосфолипиды и их комбинации. В одном варианте осуществления, укороченные пептиды CNP, имеющие последовательности дикого типа или добавление (добавления), делецию (делеции) и/или замену(замены) аминокислот, и необязательно, конъюгированные с одной или несколькими группами на N-конце, C-конце и/или внутреннем участке(участках), имеют общую массу, характеризующуюся диапазонами, в общем описанными в настоящем описании, например, от приблизительно 2,6 кДа или 2,8 кДа до приблизительно 6 или 7 кДа.
[0145]
В следующем варианте осуществления, варианты CNP являются производными CNP37, которые представляют собой QEHPNARKYKGANKK-CNP22 (SEQ ID NO: 22). Варианты CNP37 могут содержать добавление(добавления), делецию (делеции) и/или замену (замены) аминокислот природной или неприродной аминокислотой (аминокислотами) или пептидомиметиком (пептидомиметиками) (например, изостером (изостерами) пептидной связи) в любом одном или нескольких из 37 положений в CNP37. Неограничивающие примеры замен, которые можно выполнять в CNP37, на основе нумерации CNP22, включают K4R, G5S, GSR, G8S, K10R, G15S, S16Q, M17N, G19R и их комбинации. В одном варианте осуществления, производные CNP37 содержат замену Met17 на природную (например, аспарагин) или неприродную аминокислоту или пептидомиметик, разработанную, отчасти, чтобы избежать окисления атома серы метионина. В другом варианте осуществления, варианты CNP37 содержат замену(замены) Lys8, Lys10, Lys14 и/или Lys15 (на основе нумерации с N-конца CNP37) на неосновную природную или неприродную аминокислоту(аминокислоты) или пептидомиметик(и), разработанную, отчасти, для уменьшения связывания альбумина.
[0146]
5
12
Дополнительно или альтернативно добавлению (добавлениям), делеции (делециям) и/или замене (заменам) аминокислот, производные CNP37 могут являться конъюгированными на N-конце, C-конце и/или внутреннем участке с любой из групп, описанных в настоящем описании, включая, но без ограничения, нацеленные на кость или хрящ группы (например, нацеленные на кость пептидные домены), группы, уменьшающие выведение почками (например, отрицательно заряженные группы PEG), гидрофильные полимеры (например, PEG), аминокислотные последовательности, содержащие одну или несколько аминокислот (например, фрагмент «ингибитора NPR-C» остеокрина), углеводы (например, углеводы, узнаваемые рецепторами на поверхности клеток в пластинах роста кости), гидрофобные кислоты (например, C-C карбоновые кислоты и природные жирные кислоты) и их комбинации.
[0147]
in
vivo
В одном варианте осуществления, варианты CNP представляют собой модифицированные пептиды CNP37, имеющие мутацию(мутации)/замену(замены) в участке расщепления фурином (подчеркнут), разработанные для улучшения устойчивости  к протеазе фурину, и/или содержащие глицин (подчеркнут) на N-конце, что разработано для улучшения стабильности в плазме и предотвращения образования пироглутамина. Такие варианты CNP37 включают, но без ограничения: GQEHPNARKYKGANPKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CS) (SEQ ID NO: 97);
GQEHPNARKYKGANQKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CT) (SEQ ID NO: 98);
GQEHPNARKYKGANQQGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CU) (SEQ ID NO: 99); GQEHPNARKYKGANKPGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (аналог CW) (SEQ ID NO: 100);
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-CNP37, аналог DB) (SEQ ID NO: 2); и
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-CNP37) (SEQ ID NO: 1).
[0148]
В следующем варианте осуществления, варианты CNP по этому описанию включают пептиды CNP и их варианты, которые можно получать способом слияния белков, описанным в настоящем описании. Неограничивающие примеры вариантов CNP, которые можно получать способом слияния белков, описанным в настоящем описании, с использованием химического или протеолитического расщепления или саморасщепления белков, включают: GDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-wtCNP53) (SEQ ID NO: 3);
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO: 2); QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (wtCNP37) (SEQ ID NO: 22);
GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (фрагмент HSA - wtCNP27) (SEQ ID NO: 48);
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 52); DLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP53(M48N)] (SEQ ID NO: 6);
GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [Gly-CNP37(M32N)] (SEQ IS NO: 46);
QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP37(M32N)] (SEQ ID NO: 43);
GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSNSGLGC [HSA-CNP27(M22N)] (SEQ ID NO: 49);
GANRRGLSRGCFGLKLDRIGSNSGLGC [CNP27(K4,5,9R, M22N)] (SEQ ID NO: 53); PDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-wtCNP53) (SEQ ID NO: 4);
PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO: 1);
PQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-wtCNP37) (SEQ ID NO: 44);
PNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (wtCNP34) (SEQ ID NO: 25);
P-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Pro-HSA-wtCNP27) (SEQ ID NO: 50);
PGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Pro-CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 54); MDLRVDTKSRAAWARLLQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-wtCNP53) (SEQ ID NO: 5);
MGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-Gly-wtCNP37) (SEQ ID NO: 47);
MQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-wtCNP37) (SEQ ID NO: 45);
M-GHKSEVAHRFK-GANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (Met-HSA-wtCNP27) (SEQ ID NO: 51);
MGANRRGLSRGCFGLKLDRIGSMSGLGC [Met-CNP27(K4,5,9R)] (SEQ ID NO: 55).
[0149]
Другие варианты CNP, включающие укороченные пептиды CNP в диапазоне от hCNP-17 до hCNP-53 и имеющие последовательности дикого типа или добавление (добавления), делецию (делеции) и/или замену (замены) аминокислот, также можно получать способом слияния белков, описанным в настоящем описании, при условии, что предполагаемый участок химического или протеолитического расщепления слитого белка не присутствует в аминокислотной последовательности самого целевого варианта CNP. В качестве неограничивающего примера, способ слияния белков, описанный в настоящем описании, можно использовать для получения укороченного wtCNP34 с использованием расщепления муравьиной кислотой.
[0150]
В дополнительных вариантах осуществления, для любого из пептидов CNP и вариантов CNP, описанных в настоящем описании, которые имеют остаток(остатки) аспарагина (Asn/N) и/или остаток(остатки) глутамина (Gln/Q), независимо от того, имеют ли они последовательность дикого типа или последовательность из неприродных аминокислот, любой остаток(остатки) Asn и/или любой остаток(остатки) Gln независимо может быть заменен любыми другими природными или неприродными аминокислотами, включая консервативные замены, такие как Asn на Gln. Такая замена(замены) отчасти разработаны для того, чтобы минимизировать или избежать возможного дезамидирования аспарагина и/или глутамина. Неограничивающие примеры пептидов и вариантов CNP, в которых любой остаток(остатки) Asn и/или любой остаток (остатки) Gln независимо могут быть заменены любыми другими природными или неприродными аминокислотами, включая консервативные замены, такие как Asn на Gln, включают wtCNP34, wtCNP37, Gly-wtCNP37, Pro-wtCNP37, Pro-Gly-wtCNP37, GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO: 48), Pro-GHKSEVAHRFK-wtCNP27 (SEQ ID NO: 50), PEO12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 101) и PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 102). В конкретных вариантах осуществления, остаток аспарагина пептидов CNP и вариантов CNP, описанных в настоящем описании, не заменен глутамином, аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой. В конкретных вариантах осуществления, остаток глутамина пептидов CNP и вариантов CNP, описанных в настоящем описании не заменен аспарагином, аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой.
[0151]
В качестве неограничивающего примера остатки аспарагина 7 и/или 15 в Pro-Gly-wtCNP37 (PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC) (SEQ ID NO: 1) независимо могут быть заменены любыми другими природными или неприродными аминокислотами, включая глутамин, чтобы избежать любого потенциального дезамидирования остатка (остатков) аспарагина до аспарагиновой кислоты или изоаспарагиновой кислоты. В конкретных вариантах осуществления, остатки аспарагина 7 и/или 15 в Pro-Gly-wtCNP37 не заменены глутамином, аспарагиновой кислотой или глутаминовой кислотой.
[0152]
Однако следует понимать, что настоящее описание охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько вплоть до всех остатков, чувствительных к дезамидированию или подобной дезамидированию реакции (например, изомеризации), могут быть превращены в другой остаток(остатки) посредством дезамидирования или подобной дезамидированию реакции в любой степени вплоть до 100% превращения на подвергаемый превращению остаток. В конкретных вариантах осуществления, описание охватывает варианты CNP, в которых: (1) любой один или несколько, вплоть до всех, остатков аспарагина (Asn/N) могут быть превращены в аспарагиновую кислоту или аспартат и/или в изоаспарагиновую кислоту, или изоаспартат посредством дезамидирования вплоть до приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток; (2) любой один или несколько, вплоть до всех, остатков глутамина (Gln/Q) могут быть превращены в глутаминовую кислоту или глутамат, и/или в изоглутаминовую кислоту, или изоглутамат посредством дезамидирования вплоть до приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток; (3) любой один или несколько, вплоть до всех, остатков аспарагиновой кислоты или аспартата (Asp/D) могут быть превращены в изоаспарагиновую кислоту или изоаспартат посредством подобной дезамидированию реакции (также называемой изомеризацией) вплоть до приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток; (4) любой один или несколько, вплоть до всех, остатков глутаминовой кислоты или глутамата (Glu/E) могут быть превращены в изоглутаминовую кислоту или изоглутамат посредством подобной дезамидированию реакции (также называемой изомеризацией) вплоть до приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток; или (5) присутствует комбинация вышеуказанного.
[0153]
В качестве неограничивающего примера, это описание охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько, вплоть до всех, остатков аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и/или глутаминовой кислоты в Pro-Gly-wtCNP37 [PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO: 1) могут быть превращены в (1) аспарагиновую кислоту/аспартат и/или изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, (2) глутаминовую кислоту/глутамат и/или изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, (3) изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат и/или (4) изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, соответственно, посредством дезамидирования или подобной дезамидированию реакции, вплоть до приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток, как описано выше.
[0154]
Вкачестве следующего примера, это описание охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько, вплоть до всех остатков аспарагина и/или аспарагиновой кислоты в Pro-Gly-wtCNP37 [PGQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO: 1) могут быть превращены в (1) аспарагиновую кислоту/аспартат и/или изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, и/или (2) изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, соответственно, посредством дезамидирования или подобной дезамидированию реакции, вплоть до приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток.
[0155]
В качестве другого примера, настоящее описание охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько, вплоть до всех остатков аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и/или глутаминовой кислоты в Gly-wtCNP37 [GQEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO: 2) могут быть превращены в (1) аспарагиновую кислоту/аспартат и/или изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, (2) глутаминовую кислоту/глутамат и/или изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, (3) изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, и/или (4) изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, соответственно, посредством дезамидирования или подобной дезамидированию реакции, вплоть до приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток.
[0156]
В качестве другого примера, это описание охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько, вплоть до всех остатков аспарагина, глутамина, аспарагиновой кислоты и/или глутаминовой кислоты в wtCNP37 [QEHPNARKYKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC] (SEQ ID NO: 22) могут быть превращены в (1) аспарагиновую кислоту/аспартат и/или изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, (2) глутаминовую кислоту/глутамат и/или изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, (3) изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат и/или (4) изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, соответственно, посредством дезамидирования или подобной дезамидированию реакции, вплоть до приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток.
[0157]
В качестве следующего примера, настоящее описание охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько, вплоть до всех остатков аспарагина, аспарагиновой кислоты и/или глутаминовой кислоты в химере HSA-wtCNP27, GHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 48), могут быть превращены в (1) аспарагиновую кислоту/аспартат и/или изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, (2) изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат и/или (3) изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, соответственно, посредством дезамидирования или подобной дезамидированию реакции, вплоть до приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток.
[0158]
В качестве следующего примера, это описание охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько, вплоть до всех остатков аспарагина, аспарагиновой кислоты и/или глутаминовой кислоты в химере Pro-HSA-wtCNP27, PGHKSEVAHRFKGANKKGLSKGCFGLKLDRIGSMSGLGC (SEQ ID NO: 50), могут быть превращены в (1) аспарагиновую кислоту/аспартат и/или изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат, (2) изоаспарагиновую кислоту/изоаспартат и/или (3) изоглутаминовую кислоту/изоглутамат, соответственно, посредством дезамидирования или подобной дезамидированию реакции, вплоть до приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на подвергаемый превращению остаток.
[0159]
Кроме того, настоящее описание охватывает варианты CNP, в которых любой один или несколько, вплоть до всех остатков метионина (Met/M) могут быть окислены до любой химически возможной окисленной формы (например, сульфоксида и/или сульфона), вплоть до приблизительно 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% превращения на окисленный остаток.
[0160]
В другом варианте осуществления, варианты CNP содержат CNP22 или его варианты, конъюгированные на N-конце и/или C-конце с группой(группами), облегчающими транслокацию вариантов через клеточную мембрану или клеточный барьер. В одном варианте осуществления, варианты CNP конъюгированы на N-конце и/или C-конце с пептидной последовательностью(последовательностями), облегчающими транспорт вариантов через клеточную мембрану или клеточный барьер, включая транспорт посредством активных транспортеров пептидов.
[0161]
В следующем варианте осуществления, N-конец и/или C-конец CNP22 или его варианта конъюгированы с химическими группами, например, такими как природные и/или синтетические полимеры, для увеличения общей массы модифицированного пептида CNP до диапазонов, в общем описанных в настоящем описании, например, диапазона от приблизительно 2,6 или 2,8 кДа до приблизительно 6 или 7 кДа. В одном варианте осуществления, химические группы представляют собой биосовместимые гидрофильные или водорастворимые природные (например, пептиды, углеводы) или синтетические (например, PEG (или PEO)) полимеры.
[0162]
В конкретном варианте осуществления, N-конец и/или C-конец CNP22 или его варианта конъюгированы с полимерами PEG (или PEO) с получением общей массы, характеризующейся диапазонами, в общем описанными в настоящем описании, например, от приблизительно 2,6 или 2,8 кДа до приблизительно 6 или 7 кДа. Пегилирование CNP22 или его варианта разработано, среди прочего, для уменьшения иммуногенности и улучшения времени полужизни посредством уменьшения выведения почками и увеличения устойчивости к протеазам. Группа PEG может являться присоединенной к N- и/или C-концу CNP22 или любого варианта, описанного в настоящем описании, включая, но без ограничения, CNP-17 (циклизованную Cys6-Cys22 часть CNP22), CNP37 и варианты CNP17, CNP22 или CNP37, имеющие N- и/или C-концевые аминокислотное удлинение(удлинения), аминокислотную замену(замены) и/или аминокислотную делецию(делеции). В одном варианте осуществления, остатки Lys4 и/или Lys10 в CNP17, CNP22 или CNP37, или их вариантах заменены природной или неприродной аминокислотой (например, Arg, Gly, Ser, Gln, Glu или Cit) или пептидомиметиком, не содержащими реакционноспособного первичного амина на боковой цепи, чтобы препятствовать любому потенциальному пегилированию этих остатков лизина. В одном варианте осуществления, остатки Lys4 и/или Lys10 пептидов CNP заменены на Arg. В другом варианте осуществления, остаток Lys10 не заменен на Arg.
[0163]
В следующем варианте осуществления, варианты CNP (включая CNP22 и его варианты), имеющие группу PEG (или PEO) и аминокислотное удлинение на N-конце, содержат аргинин в положении, непосредственно предшествующем положению, соответствующему Gly1 в CNP22. Такие пегилированные варианты CNP разработаны для увеличения устойчивости к деградации посредством NEP, уменьшения связывания с сывороточным альбумином и увеличения функциональной активности CNP (например, активации передачи сигналов цГМФ). Неограничивающие примеры пегилированных вариантов CNP включают PEO24-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 102), PEO12-GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 101), PEO24-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO: 103), PEO12-GANRR-CNP22 (SEQ ID NO: 104), PEO24-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 105), PEO12-GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 106), PEO24-GANPR-CNP22 (SEQ ID NO: 107), PEO12-GANPR-CNP22 (SEQ ID NO: 108), PEO24-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO: 109), PEO12-GANQQ-CNP22 (SEQ ID NO: 110), PEO24-ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 111), PEO12-ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 112), PEO24-ER-CNP22 (SEQ ID NO: 113), PEO12-ER-CNP22 (SEQ ID NO: 114), PEO24-R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 115), PEO12-R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 116), PEO24-R-CNP22 (SEQ ID NO: 117) и PEO12-R-CNP22 (SEQ ID NO: 118), где PEO24 представляет собой монодисперсный полимер PEG 1,2 кДа, и PEO12 представляет собой монодисперсный полимер PEG 0,6 кДа. В одном варианте осуществления, полимер PEG (или PEO) конъюгирован с N-концом вариантов CNP.
[0164]
Настоящее описание относится к использованию гидрофильных или водорастворимых полимеров (например, PEG), которые могут меняться по типу (например, гомополимер или сополимер; случайный, чередующийся или блок-сополимер; линейный или разветвленный; монодисперсный или полидисперсный), связи (например, поддающаяся гидролизу или стабильная связь, например, такая как амидная, иминная, аминальная, алкиленовая или сложноэфирная связь), участку конъюгации (например, на N-конце и/или C-конце, предпочтительно, ни в одном из остатков в циклизованной области CNP (соответствующей остаткам 6-22 в CNP22)) и длине (например, от приблизительно 0,2, 0,4 или 0,6 кДа до приблизительно 2, 3, 4 или 5 кДа). Гидрофильный или водорастворимый полимер можно конъюгировать с пептидом CNP посредством химических реакций на основе N-гидроксисукцинимида (NHS) или химических реакций на основе альдегида, или других химических реакций, как известно в данной области. Такие варианты CNP можно получать с использованием, например, wtCNP22 (2,2 кДа), CNP17, сохраняющего только циклизованную область (остатки 6-22) из wtCNP22, вариантов CNP, имеющих аминокислотное удлинение на N-конце и/или C-конце CNP22 или CNP17, или вариантов, имеющих аминокислотные замены, добавления и/или делеции, например, таких как GANRR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 119), GANPR-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 78), R-CNP22 (SEQ ID NO: 71), R-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 79), ER-CNP22 (SEQ ID NO: 72) и ER-CNP22(K4R) (SEQ ID NO: 80). В одном варианте осуществления, варианты PEG-CNP, имеющие общую массу, характеризующуюся диапазонами, в общем описанными в настоящем описании, например, от приблизительно 2,6 или 2,8 кДа до приблизительно 6 или 7 кДа, содержат монодисперсную линейную группу PEG (или PEO), конъюгированную на N-конце и/или C-конце посредством химических реакций на основе NHS или альдегида, или разветвленную на два плеча или три плеча группу PEG, конъюгированную на N-конце и/или C-конце посредством химических реакций на основе NHS. Настоящее описание относится также к отрицательно заряженным вариантам PEG-CNP, разработанным для уменьшения выведения почками, включая, но без ограничения, карбоксилированные, сульфатированные и фосфорилированные соединения (Caliceti, Adv. Drug Deliv. Rev., 55: 1261-77 (2003); Perlman, J. Clin. Endo. Metab., 88: 3227-35 (2003); Pitkin, Antimicrob. Ag. Chemo., 29: 440-444 (1986); Vehaskari, Kidney Intl, 22: 127-135 (1982)). В одном варианте осуществления, группа PEG (или PEO) содержит карбоксильную группу(группы), сульфатную группу(группы) и/или фосфатную группу(группы).
[0165]
В другом варианте осуществления, группы PEG (или PEO), конъюгированные с N-концом, C-концом и/или внутренним участком(участками) вариантов CNP, описанных в настоящем описании, содержат одну или несколько функциональных групп, которые положительно заряжены в физиологических условиях. Такие группы PEG разработаны, среди прочего, для улучшения распределения таких пегилированных вариантов CNP в тканях хряща. В одном варианте осуществления, такие группы PEG содержат одну или несколько первичных, вторичных или третичных аминогрупп, групп четвертичного аммония и/или других аминосодержащих групп (например, мочевины).
[0166]
2
2
n
В одном варианте осуществления, это описание охватывает CNP22 или его варианты, конъюгированные посредством химических реакций на основе NHS или альдегида с PEG (или PEO) формулы (CHCHO), где n представляет собой целое число от приблизительно 6 до приблизительно 100, и полимер PEG имеет массу от приблизительно 0,3 кДа до приблизительно 5 кДа. В другом варианте осуществления, n представляет собой целое число от приблизительно 12 до приблизительно 50, и полимер PEG имеет массу от приблизительно 0,6 кДа до приблизительно 2,5 кДа. В другом варианте осуществления, n составляет от приблизительно 12 до приблизительно 24, и полимер PEG имеет массу от приблизительно 0,6 кДа до приблизительно 1,2 кДа. В другом варианте осуществления, концевая гидроксильная группа полимера PEG кэпирована с использованием нереакционноспособной группы. В конкретном варианте осуществления, кэпирующая конец группа представляет собой алкильную группу, например, группу низшего алкила, такую как метил.
[0167]
В следующем варианте осуществления, настоящее описание относится к вариантам CNP, имеющим одну или несколько пептидных связей или изостеров пептидной связи, которые имеют уменьшенную чувствительность к расщеплению пептидазами, включая нейтральную эндопептидазу (NEP). NEP представляет собой связанную с мембраной зависимую от цинка эндопептидазу, которая расщепляет пептидную связь субстрата на амино-конце крупных гидрофобных остатков. Таким образом, модификация пептидной связи в участке расщепления NEP до неприродной пептидной или непептидной связи может предотвращать или уменьшать эффективность расщепления NEP.
[0168]
in
vitro
Опубликовано, что в случае ANP и CNP, расщепление под действием NEP сначала происходит по связи Cys6-Phe7 в циклизованной области, затем в других участках в остальной части структур. Опубликовано, что в случае BNP, расщепление сначала происходит на N-конце пептида, затем в циклической структуре. Хотя первичным участком расщепления NEP в CNP, как опубликовано, является связь Cys6-Phe7, когда wtCNP22 подвергали воздействию расщепления NEP в течение 2,5 минут , все возможные участки неожиданно являлись гидролизованными, при этом немного более лабильными являлись пептидные связи Cys6-Phe7 и Gly8-Leu9.
[0169]
Субстратная специфичность NEP в первую очередь определяется двумя связывающими субстрат подучастками, S1' и S2' (Oefner et al., J. Mol. Biol. 296:341-349 (2000)). Участок S1' принимает большой гидрофобный остаток P1', в котором N-концевая пептидная связь подвергается гидролизу (например, Phe, Leu, Ile, и Met). Для участка S2', как правило, предпочтительным является меньший остаток, названный P2' (например, Gly или Ser). В случае CNP, опубликовано, что Phe7 является предпочтительным остатком P1' для участка S1' NEP, в то время как Gly8 является предпочтительным остатком P2' для участка S2'. Поскольку эти два подучастка могут вместе вмещать только определенный общий размер боковых цепей, любое увеличение общего размера остатков P1'-P2' CNP потенциально может нарушать связывание NEP. Например, добавление атома хлорида в 3-положении ароматического кольца Phe7 P1' (т.е., 3-Cl-Phe7) потенциально может модифицировать (например, дестабилизировать) взаимодействия между CNP и участками расщепления NEP, например, в подучастке S1'. Добавление группы третичного бутила к меньшему остатку Gly8 P2' (т.е., tBu-Gly8) потенциально может нарушать взаимодействие между CNP и подучастком S2'.
[0170]
Соответственно, в одном варианте осуществления, варианты CNP по этому описанию включают CNP, имеющий увеличенный размер остатков P1'-P2', таких как Phe7-Gly8, чтобы мешать узнаванию субстрата в активном участке, таким образом, уменьшая чувствительность к расщеплению NEP. Группами природных аминокислот, неприродных аминокислот и/или пептидомиметиков замещают один или несколько больших гидрофобных остатков P1', включая, но без ограничения, Phe7, Leu9, Leu11, Ile14, Met17 и Leu20, и/или один или несколько меньших остатков P2', включая, но без ограничения, Cys6, Gly8, Gly15, Ser16 и Gly19.
[0171]
Настоящееописание относится к вариантам CNP, содержащим по меньшей мере одну модифицированную аминокислоту и/или по меньшей мере одну модифицированную пептидную связь, по меньшей мере один остаток, вовлеченный в узнавание субстрата и/или расщепление посредством NEP, где модифицированные аминокислоты и модифицированные пептидные связи могут представлять собой природные аминокислоты, неприродные аминокислоты, пептидомиметики и/или изостеры пептидной связи. В одном варианте осуществления, участок расщепления NEP на CNP между Cys6 и Phe7 является модифицированным. В родственном варианте осуществления, пептидная связь(-C(═O)-NH-) между Cys6 и Phe7 заменена на один из следующих изостеров пептидной связи:
2
-CH-NH-,
-C(═O)-N(R)-, где амидная группа является алкилированной с использованием любой из следующих групп R: метил, этил, н-пропил, изопропил, циклопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, или трет-бутил,
2
-C(═O)-NH-CH-,
2
-CH-S-,
2
n
-CH-S(O)-, где n представляет собой 1 или 2,
2
2
-CH-CH-,
-CH═CH-,
2
-C(═O)-CH-,
-CH(CN)-NH-,
2
-CH(OH)-CH-,
-O-C(═ O)-NH- или
-NHC(═ O)NH-.
[0172]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
В другом варианте осуществления, варианты CNP представлены формулой: (x)-Gly-Leu-Ser-Lys-Gly-(b)-(c)- (d)-Leu-Lys-Leu-Asp-Arg-Ile-Gly-Ser-Met-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-(z) (SEQ ID NO: 120), где: (x) и (z) независимо могут отсутствовать или могут быть выбраны из группы, состоящей из синтетических нацеленных на кость соединений например, таких как бисфосфонаты; аминокислотных последовательностей, которые можно использовать для нацеливания на сустав или хрящ, например, такой как полиAsp и полиGlu; аминокислотных последовательностей, происходящих из нацеленных на кость доменов белков, например, таких как остеопонтин, остеокальцин и сиалопротеин (Wang et al., Adv. Drug Delivery Rev., 57: 1049-76 (2005)); полимерных и неполимерных молекул, уменьшающих выведение почками, например, таких как отрицательно заряженные PEG; и природных полимеров (например, полимеров, содержащих аминокислоты, жирные кислоты и/или углеводы) и синтетических полимеров (например, PEG), увеличивающих устойчивость варианта CNP к деградации NEP посредством увеличения общей массы варианта CNP до диапазонов, в общем описанных в настоящем описании, например, от приблизительно 2,6 или 2,8 кДа до приблизительно 6 или 7 кДа;
(b) и (c) могут представлять собой Cys6 и Phe7 дикого типа, другую природную аминокислоту или неприродную аминокислоту, или могут содержать изостер пептидной связи, как описано в настоящем описании, для увеличения устойчивости к расщеплению NEP; и
(d) могут представлять собой Gly8 дикого типа, или могут представлять собой более крупные или неприродные (например, t-Bu-Gly) аминокислоту или пептидомиметик для уменьшения связывания с NEP.
[0173]
В одном варианте осуществления, такие варианты CNP содержат по меньшей мере одну модифицированную аминокислоту в (b), (c) и/или (d).
[0174]
Другие пептидные связи в CNP можно расщеплять, даже если CNP22 или его вариант имеет устойчивую к NEP пептидную связь или изостер пептидной связи в Cys6-Phe7, включая связи Gly8-Leu9, Lys10-Leu11, Arg13-Ile14, Ser16-Met17 и Gly19-Leu20. Таким образом, это описание охватывает варианты CNP, имеющие изостер (изостеры) пептидной связи в одном или нескольких других участках расщепления NEP в дополнение к связи Cys6-Phe7, где изостеры пептидной связи включают изостеры, описанные в настоящем описании.
[0175]
В другом варианте осуществления, это описание охватывает варианты CNP, имеющие аналог цистеина в положении Cys6 и/или Cys22, включая, но без ограничения, гомоцистеин, пеницилламин, 2-меркаптопропионовую кислоту и 3-меркаптопропионовую кислоту. В одном варианте осуществления, такие варианты CNP имеют циклический домен, образованный дисульфидной связью между Cys6 дикого типа или аналогом и Cys22 или аналогом. В другом варианте осуществления, один или несколько остатков CNP22 или его варианта, вплоть до всех остатков, заменены D-аминокислотой. Замена L-аминокислоты D-аминокислотой по существу перемещает боковую цепь примерно на 120 градусов от ее исходного положения, таким образом, потенциально нарушая связывание пептида CNP с NEP. В конкретном варианте осуществления, L-Phe в положении Phe7 заменен его D-энантиомером, D-Phe.
[0176]
В другом варианте осуществления, бета-аминокислотой, например, такой как 3-амино-2-фенилпропионовая кислота (или 2-фенил-бета-аланин), заменяют альфа-аминокислоту Phe7 дикого типа. Использование бета-аминокислоты эффективно увеличивает длину пептидного остова на одну единицу метилена. Устойчивость к протеазам может являться результатом изменения конформации субстрата или увеличения расстояния между боковыми цепями аминокислот.
[0177]
Неограничивающие примеры вариантов CNP22, имеющих неприродную альфа-аминокислоту, бета-аминокислоту или изостер пептидной связи, включают:
2
GLSKGC(CHNH)FGLKLDRIGSMSGLGC (аналог A) (SEQ ID NO: 121);
GLSKGC-(N-Me-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (аналог B) (SEQ ID NO: 122);
GLSKGC-(D-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (аналог E) (SEQ ID NO: 123);
GLSKGCF-(tBu-Gly)-LKLDRIGSMSGLGC (аналог F) (SEQ ID NO: 124);
GLSKGC-(3-Cl-Phe)-GLKLDRIGSMSGLGC (аналог G) (SEQ ID NO: 125); и
2
GLSKGC-[NHCHCH(Ph)CO]-GLKLDRIGSMSGLGC (аналог H, сформированный с использованием 3-амино-2-фенилпропионовой кислоты) (SEQ ID NO: 126).
[0178]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
В следующем варианте осуществления, варианты CNP имеют общую массу, характеризующуюся диапазонами, в общем описанными в настоящем описании, например, от приблизительно 2,6 или 2,8 кДа до приблизительно 6 или 7 кДа, что разработано для увеличения устойчивости к деградации посредством NEP, и представлены формулой: (x)-Gly-Leu-Ser-(a)-Gly-(b)-(c)- -(d)-(e)-(f)-(g)-Asp-Arg-(h)-Gly-Ser-(i)-Ser-Gly-(j)-Gly-Cys-(z) (SEQ ID NO: 127), где:
(x) и (z) независимо могут отсутствовать или могут быть выбраны из группы, состоящей из синтетических нацеленных на кость соединений, например, таких как бисфосфонаты; аминокислотных последовательностей, которые можно использовать для нацеливания на кость или хрящ, например, таких как полиAsp и полиGlu; аминокислотных последовательностей, происходящих из нацеленных на кость доменов белков кости, например, таких как остеопонтин, остеокальцин и сиалопротеин; полимерных и неполимерных групп, уменьшающих выведение почками, например, таких как отрицательно заряженные PEG; полимеров, содержащих, например, аминокислоты, гидрофобные кислоты и/или углеводы; и синтетических гидрофильных полимеров, например, таких как PEG;
(a) может представлять собой Lys дикого типа в этом положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или природной или неприродной аминокислоты, или пептидомиметика, не имеющих реакционноспособного первичного амина на боковой цепи, включая, но без ограничения, Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Ser или Glu, где в одном варианте осуществления (a) представляет собой Arg;
2
(b) выбран из группы, состоящей из Cys и изостеров пептидной связи между Cys6 и Phe7 например, таких как Cys-CH-NH;
1-6
1-6
1-6
3-10
6-14
(c) выбран из группы, состоящей из L-Phe; D-Phe; 3-амино-2-фенилпропионовой кислоты; N-алкилированных производных Phe, где N-алкильная группа представляет собой метил, этил, н-пропил, изопропил, циклопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, или трет-бутил; и аналогов Phe, где одно или несколько орто-, мета- и/или пара-положений бензольного цикла аналога Phe замещены одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидроксила, циано, прямого или разветвленного C алкила, прямого или разветвленного C алкокси, прямого или разветвленного гало-C алкила, C циклоалкила, гетероциклила, C арила и гетероарила (примеры включают, но без ограничения, тирозин, 3-хлорфенилаланин, 2,3-хлорфенилаланин, 3-хлор-5-фторфенилаланин, 2-хлор-6-фтор-3-метилфенилаланин), или где бензольный цикл аналога Phe может быть заменен другой арильной группой (неограничивающие примеры включают 1- и 2-нафтилаланин) или гетероарильной группой (неограничивающие примеры включают пиридилаланин, тиенилаланин и фурилаланин);
(d) выбран из группы, состоящей из Gly, трет-бутил-Gly (tBu-Gly), Thr, Ser, Val и Asn;
(e) выбран из группы, состоящей из Leu, Ser, Thr и изостеров пептидной связи, например, таких как N-Me-Leu;
(f) может представлять собой Lys дикого типа в этом положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или природной или неприродной аминокислоты, или пептидомиметика, не имеющих реакционноспособного первичного амина на боковой цепи, включая, но без ограничения, Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Ser или Glu, где в одном варианте осуществления (f) не представляет собой Arg;
(g) выбран из группы, состоящей из Leu и изостеров пептидной связи, например, таких как N-Me-Leu;
(h) выбран из группы, состоящей из Ile, tBu-Gly, и изостеров пептидной связи, например, таких как N-Me-Ile;
(i) выбран из группы, состоящей из Met, Val, Asn, бета-Cl-Ala, 2-аминомасляной кислоты (Abu) и 2-аминоизомасляной кислоты (Aib); и
(j) выбран из группы, состоящей из Leu, норлейцина (Nle), гомолейцина (Hleu), Val, трет-бутил-Ala (tBu-Ala), Ser, Thr, Arg и изостеров пептидной связи, например, таких как N-Me-Leu.
[0179]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
В другом варианте осуществления, варианты CNP имеют общую массу, характеризующуюся диапазонами, в общем описанными в настоящем описании, например, от приблизительно 2,6 или 2,8 кДа до приблизительно 6 или 7 кДа, что разработано для увеличения устойчивости к расщеплению NEP, и представлены формулой: (x)-Gly-Leu-Ser-(a)-Gly-(b)-(c)-(d)-(e)-(f)-(g)-Asp-Arg-(h)-(i)-Ser-(j)-Ser-Gly-(k)-Gly-Cys-(z) (SEQ ID NO: 128), где:
(x) и (z) независимо могут отсутствовать или могут быть выбраны из группы, состоящей из синтетических нацеленных на кость соединений, например, таких как бисфосфонаты; аминокислотных последовательностей, которые можно использовать для нацеливания на кость или хрящ, например, таких как полиAsp и полиGlu; аминокислотных последовательностей, происходящих из нацеленных на кость доменов белков кости и их производных, например, таких как последовательности слитых белков или пептидов остеопонтина, остеокальцина, сиалопротеина и т.д.; групп, уменьшающих выведение почками, включая, но без ограничения, гидрофильные или водорастворимые полимеры, например, такие как заряженные молекулы PEG; и групп, содержащих, например, PEG, аминокислоты, углеводы и/или гидрофобные кислоты;
(a) может представлять собой Lys дикого типа в этом положении или может быть заменен с использованием консервативной аминокислотной замены или природной или неприродной аминокислоты, или пептидомиметика, не имеющих реакционноспособного первичного амина на боковой цепи, включая, но без ограничения, Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин, цитруллин (Cit), Gln, Ser, или Glu, где в одном варианте осуществления (a) представляет собой Arg;
2
(b) выбран из группы, состоящей из Cys и изостеров пептидной связи между Cys6 и Phe7, например, таких как Cys-CH-NH;
1-6
1-6
1-6
3-10
6-14
(c) выбран из группы, состоящей из L-Phe; D-Phe; 3-амино-2-фенилпропионовой кислоты; N-алкилированных производных Phe, где N-алкильная группа представляет собой метил, этил, н-пропил, изопропил, циклопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил или трет-бутил; и аналогов Phe, где одно или несколько орто-, мета- и/или пара-положений бензольного цикла аналога Phe замещены одним или несколькими заместителями, выбранными из группы, состоящей из галогена, гидроксила, циано, прямого или разветвленного C алкила, прямого или разветвленного C алкокси, прямого или разветвленного гало-C алкила, C циклоалкила, C арила, гетероциклила и гетероарила (примеры включают, но без ограничения, тирозин, 3-хлорфенилаланин, 2,3-хлорфенилаланин, 3-хлор-5-фтор-фенилаланин, 2-хлор-6-фтор-3-метилфенилаланин), или где бензольный цикл аналога Phe может быть заменен другой арильной группой (неограничивающие примеры включают 1- и 2-нафтилаланин) или гетероарильной группой (неограничивающие примеры включают пиридилаланин, тиенилаланин и фурилаланин);
(d) выбран из группы, состоящей из Gly, трет-бутил-Gly, Thr, Ser, Val и Asn;
(e) выбран из группы, состоящей из Leu, Ser, Thr и изостеров пептидной связи, например, таких как N-Me-Leu;
(f) выбран из группы, состоящей из Lys, Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцина, цитруллина (Cit), Gln и Ser;
(g) выбран из группы, состоящей из Leu, Asn и изостеров пептидной связи, например, таких как N-Me-Leu;
(h) выбран из группы, состоящей из Ile, трет-бутил-Gly (tBu-Gly), Asn и изостеров пептидной связи, например, таких как N-Me-Ile;
(i) выбран из группы, состоящей из Gly, Arg, Ser и Asn;
(j) выбран из группы, состоящей из Met, Val, Asn, бета-Cl-Ala, 2-аминомасляной кислоты (Abu) и 2-аминоизомасляной кислоты (Aib); и
(k) выбран из группы, состоящей из Leu, норлейцина (Nle), гомолейцина (Hleu), Val, трет-бутил-Ala (tBu-Ala), Arg, Thr, Ser и изостеров пептидной связи, например, таких как N-Me-Leu.
[0180]
Для улучшения доставки вариантов CNP в участки-мишени при связанных с суставами нарушениях (например, остеоартрите), варианты CNP можно присоединять (например, на N-конце и/или C-конце) к нацеленным на кость или хрящ группам. Неограничивающие примеры нацеленных на кость или хрящ групп включают бисфосфонаты; гидроксиапатит; глюкозамин; коллаген (например, коллаген типа X); полиAsp; полиGlu; и аминокислотные последовательности, происходящие из нацеленных на кость доменов белков кости, например, таких как остеокрин, остеопонтин, остеокальцин и сиалопротеин.
[0181]
Помимо меньшей чувствительности к расщеплению NEP, варианты CNP потенциально имеют уменьшенную аффинность к рецептору выведения NPR-C, в то же время сохраняя функциональность CNP. Помимо опосредованной NEP деградации, на время полужизни CNP22 влияет рецептор выведения, NPR-C, который разделяет 58% гомологии последовательности с внеклеточным связывающим пептиды доменом NPR-B. CNP22 прочно связывается не только с NPR-B (аффинность 7-30 пМ), но также с NPR-C (11-140 пМ) (Bennett, B. D. et al., J. Biol. Chem., 266: 23060-67 (1991); Koller, K. J. & Goeddel, D. V., Circulation, 86: 1081-88 (1992); Suga, S. et al., Endocrinology, 130: 229-39 (1992)). Даже несмотря на то, что еще не опубликована кристаллическая структура NPR-B, гомология последовательностей, так же как сходство между кристаллическими структурами NPR-C и NPR-A (He, X.-L. et al., Science, 293(5535): 1657-62 (2001); Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279(27): 28625-31 (2004); He, X.-L., J. Mol. Biol., 361(4): 698-714 (2006)), позволяет предполагать, что NPR-B, вероятно, имеет сходную общую структурную укладку.
[0182]
Поэтому была построена модель гомологии NPR-B на основе базирующегося на структуре выравнивания последовательностей и кристаллографических структур следующих родственных систем: CNP, связанный с NPR-C, ANP, связанный с NPR-A, и ANP, связанный с NPR-C (He, X.-L. et al., Science, 293(5535): 1657-62 (2001); Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279(27): 28625-31 (2004); He, X.-L., J. Mol. Biol., 361(4): 698-714 (2006)). На основании наблюдений, что рецептор, по-видимому, определяет конформацию связанного пептида, и что NPR-B наиболее близко напоминает NPR-A, применительно к первичной структуре и функциональным свойствам, модель гомологии NPR-B/CNP была построена с использованием в качестве модели кристаллической структуры NPR-A/ANP. Опубликованные сигнальные данные о вариантах CNP (Патент США No. 5434133 и Публикация патентной заявки США No. 2004/0138134 A1) и функциональных вариантах ANP, которые больше не связываются с NPR-C (Cunningham, EMBO 13(11) 2508-15, 1994), использовали для уточнения и интерпретации модели NPR-B/CNP.
[0183]
Настоящее описание относится к вариантам CNP, разработанным для улучшения избирательности NPR-B на основе базирующейся на гомологии структурной модели комплекса NPR-B/CNP. Сочетая экспериментальные и компьютерные структурные данные о натрийуретических пептидах, связанных с различными рецепторами, с опубликованными данными о функциональности, получены варианты CNP, которые продолжают связываться с NPR-B, но потенциально могут иметь уменьшенную аффинность к рецептору выведения NPR-C. Например, NPR-C имеет уникальную вставку в структуре петли в участке связывания пептида, помещающую остатки петли ближе к таким остаткам пептида, как Gly8 (или ANP Gly9) CNP, по сравнению с соответствующими остатками петли в NPR-A и NPR-B. Более ранние исследования показали, что мутация G9T в ANP вносит вклад в уменьшение аффинности к NPR-C, таким образом, улучшая избирательность к NPR-A (Cunningham, EMBO J., 13(11): 2508-15 (1994)). Соответственно, получены варианты CNP для замены соответствующего остатка Gly8 на более крупный остаток (Ser, Val, Thr или Asn) для нарушения связывания CNP с NPR-C без влияния на его связывание с NPR-B. Кроме того, одну или несколько мутаций вводили на C-конце CNP, охватывающем Gly15 - Gly21, который предположительно взаимодействует со специфическими для рецептора остатками, на основании подробных структурных анализов комплексов рецептор/пептид. Например, мутация G19R в CNP22 не приводит к значительной потере активности передачи сигналов NPR-B. Однако, эту мутацию невозможно смоделировать в доступной кристаллической структуре NPR-C/CNP без изменения конформаций соседних остатков. Эти наблюдения позволяют предполагать, что мутация G19R может избирательно нарушать связывание CNP с конкретным рецептором, таким как NPR-C.
[0184]
В одном варианте осуществления, варианты CNP имеют замену(замены) в одном или нескольких участках Gly в положениях 1, 5, 8, 15, 19 и 21, для уменьшения конформационной гибкости и таким образом, увеличения специфичности к рецептору. Сравнительные анализы кристаллических структур ANP, связанного с NPR-C и NPR-A (Ogawa, H. et al., J. Biol. Chem., 279: 28625-31 (2004); He, X.-L., J. Mol. Biol., 361: 698-714 (2006)) показывают, что конформационная гибкость ANP может играть важную роль в определении рецепторной избирательности.
[0185]
В одном варианте осуществления, функциональные варианты CNP с потенциально уменьшенной аффинностью к NPR-C имеют одну или несколько из следующих аминокислотных замен: G1R, G1E, GSR, G5Q, G5S, F7Y, G8T, G8S, G8V, G8N, L9S, L9T, K10Cit, K10Q, K10S, I14N, G15R, G15S, G15N, G15Cit, S16Q, M17V, M17N, G19S, G19R, G19N, L20V, L20R, L20T, L20S, G21S, G21T и G21R. В одном варианте осуществления, варианты CNP имеют многоточечные замены в положениях 1, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17, 19, 20 и/или 21, и необязательно, могут иметь модификации в любом другом положении в пептидной последовательности варианта.
[0186]
В следующем варианте осуществления, варианты CNP, описанные в настоящем описании, могут быть конъюгированы с группами до достижения общей массы, характеризуемой диапазонами, в общем описанными в настоящем описании, например, от приблизительно 2,6 или 2,8 кДа до приблизительно 6 или 7 кДа, на N-конце, C-конце и/или внутреннем участке, для облегчения нацеливания на сустав/хрящ, уменьшения выведения посредством NPR-C и почек, увеличения устойчивости к деградации посредством NEP, и/или улучшения функциональности CNP. В одном варианте осуществления, варианты CNP не являются конъюгированными с полимерной группой в участке в циклической области (соответствующей Cys6 - Cys22 в CNP22). Неограничивающие примеры полимерных или неполимерных групп, которые могут быть конъюгированы с вариантами CNP, включают синтетические нацеленные на кость соединения, например, такие как бисфосфонаты; нацеленные на кость/хрящ пептидные последовательности, например, такие как полиAsp и полиGlu; пептидные последовательности, происходящие из нацеленных на кость доменов белков кости, например, таких как остеопонтин, остеокальцин и сиалопротеин; пептидные последовательности, происходящие из функциональных доменов морфогенетических белков кости например, таких как BMP2, BMP3, BMP5, BMP7, и BMP8a; пептидные последовательности, происходящие из полипептидов ненатрийуретического происхождения, например, такие как NPPC, ANP, и BNP; другие природные полимерные или неполимерные группы, например, такие как углеводы, жирные кислоты и фосфолипиды; биосовместимые синтетические гидрофильные полимеры, например, такие как PEG (или PEO); гидрофобные полимерные или неполимерные группы например, такие как гептановая кислота и пентановая кислота; и их комбинации.
[0187]
in
vitro
in
vivo
in
vitro
in
vivo
in
vitro
in
vivo
Варианты CNP, описанные в настоящем описании, могут иметь по существу сходную или лучшую функциональную активность по сравнению с CNP22, например, применительно к стимуляции продукции и передачи сигналов цГМФ. В одном варианте осуществления, варианты CNP стимулируют продукцию цГМФ  или  на уровне, составляющем по меньшей мере приблизительно 50% от уровня цГМФ, продуцируемого при такой же концентрации wtCNP22 (например, 1 мкМ). В конкретных вариантах осуществления, варианты CNP сохраняют по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, или 100% стимулирующей цГМФ активности CNP22 дикого типа  или . В другом варианте осуществления, варианты CNP имеют улучшенную активность стимуляции цГМФ по сравнению с CNP22. В конкретных вариантах осуществления, варианты CNP  или  симулируют продукцию по меньшей мере приблизительно 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 250%, 300%, 350%, 400%, 450%, 500% или более от уровня цГМФ, продуцируемого при такой же концентрации wtCNP22 (например, 1 мкМ).
C. Синтез и очистка вариантов CNP
[0188]
В некоторых вариантах осуществления, варианты CNP, которые можно использовать в настоящем описании, получают посредством рекомбинантной экспрессии, с использованием конкретных способов, известных в данной области в конкретных вариантах осуществления. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II, D. N. Glover, Ed. (1985); и Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
[0189]
В конкретных вариантах осуществления, варианты CNP получают рекомбинантным способом, включающим культивирование в среде клетки-хозяина, содержащей первый полинуклеотид, кодирующий полипептид варианта CNP, связанный со вторым полинуклеотидом, кодирующим поддающийся отщеплению пептид или белок, в условиях, которые приводят к экспрессии слитого полипептида, кодируемого полинуклеотидами, где слитый полипептид содержит полипептид варианта CNP, непосредственно связанный с поддающимся отщеплению пептидом или белком, или связанный с ним опосредованно через линкер. В некоторых вариантах осуществления, клетку-хозяина трансформируют экспрессирующим вектором, содержащим полинуклеотид, кодирующий полипептид варианта CNP, связанный с полинуклеотидом, кодирующим поддающийся отщеплению пептид или белок. В конкретных вариантах осуществления, слитый полипептид экспрессируется в виде растворимого белка или в виде тельца включения. Экспрессируемый слитый полипептид можно выделять из клетки-хозяина или культуральной среды, и выделенный слитый полипептид можно приводить в контакт с расщепляющим средством для высвобождения варианта CNP.
[0190]
Способы получения вариантов CNP описаны в Патентах США 8198242, 8377884 и 8598121, содержание которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки herein incorporated by reference.
D. Химически модифицированные варианты CNP
[0191]
Химическая модификация вариантов CNP потенциально может влиять на преимущественные свойства модифицированных пептидов CNP, таких как увеличенные стабильность и время полужизни, и уменьшенная иммуногенность (общее обсуждение химической модификации терапевтических белков см. в Pharmazie, 57(1): 5-29 (2002)). В дополнение к пегилированию, способами гликозилирования и другой химической дериватизации, например, модификации посредством фосфорилирования, амидирования, карбоксилирования, ацетилирования, метилирования и получения кислотно-аддитивных солей, амидов, сложных эфиров и N-ацильных производных, также можно маскировать потенциально иммуногенные области и/или протеолитически чувствительные области (Science, 303: 480-482 (2004)).
[0192]
Примеры химических модификаций включают, без ограничения, способ добавления полимера от Bednarsaki и способ перекрестного сшивания от Altus Corporation для улучшения стабильности и устойчивости к протеазам, и уменьшения иммуногенности. Bednarsaki показал, что добавление полимера может улучшать термостабильность белка (J. Am. Chem. Soc., 114(1): 378-380 (1992)), и в Altus Corporation обнаружено, что перекрестное сшивание глутаральдегидом может улучшать стабильность фермента.
[0193]
Химическую модификацию полипептидов можно проводить неспецифическим образом (что приводит к получению смесей дериватизированных молекул) или сайт-специфическим образом (например, на основе дериватизации, направленной на реакционную способность макромолекулы дикого типа и/или сайт-специфической модификации с использованием комбинации сайт-направленного мутагенеза и химической модификации) или, альтернативно, с использованием способов лигирования экспрессированных белков (Curr. Opin. Biotechnol., 13(4): 297-303 (2002)).
Пегилированные варианты CNP
[0194]
in
vivo
В одном варианте осуществления, для увеличенной стабильности варианты CNP (включая варианты, имеющие добавления, замены и/или делеции аминокислот) конъюгируют с гидрофильными природными или синтетическими полимерами. В одном варианте осуществления, гидрофильные полимеры являются водорастворимыми, так что конъюгированные с ними пептиды CNP не выпадают в осадок в водной (например, физиологической) среде. Кроме того, гидрофильные полимеры являются биосовместимыми, т.е., не вызывают повреждения, токсичности или иммунологической реакции . Гидрофильные полимеры могут являться разветвленными или неразветвленными. В одном варианте осуществления, гидрофильные полимеры не являются разветвленными.
[0195]
Возможны различные участки конъюгации варианта CNP с гидрофильным полимером, включая, но без ограничения: (1) только на N-конце; (2) только на C-конце; (3) только на внутреннем участке (например, Lys4); (4) на обоих концах: N-конце и C-конце; (5) на N-конце и внутреннем участке; и (6) на C-конце и на внутреннем участке. В одном варианте осуществления, варианты CNP конъюгированы с гидрофильным полимером только на N-конце. В другом варианте осуществления, конъюгацию осуществляют только на внутреннем участке (например, Lys4). В другом варианте осуществления, конъюгацию осуществляют на N-конце и внутреннем участке (например, Lys4). В другом варианте осуществления, для улучшения функциональности, варианты CNP не являются конъюгированными с гидрофильным полимером на участке (например, Lys10) в циклическом домене (соответствующем Cys6 - Cys22 в CNP-22). Если конъюгация с гидрофильным полимером основана на образовании связи с реакционноспособной первичной аминогруппой на варианте CNP, конъюгацию на внутреннем участке (например, Lys4 и/или Lys10) можно предотвращать посредством замены Lys4 и/или Lys10 на природную или неприродную аминокислоту или пептидомиметик, которые не содержат реакционноспособной первичной аминогруппы в боковой цепи, например, такие как, Gly, Ser, Arg, Asn, Gln, Asp, Glu или цитруллин (Cit). В конкретном варианте осуществления, Lys4 и/или Lys10 заменен на Arg. В другом варианте осуществления, Lys10 не заменен на Arg.
[0196]
1
10
Неограничивающие примеры гидрофильных полимеров включают полимеры, сформированные из несущих карбоновую кислоту мономеров (например, метакриловой кислоты (MA) и акриловой кислоты (AA)), поливиниловые спирты, полимеры, сформированные из несущих гидроксил мономеров (например, гидроксиэтилметакрилата (HEMA), гидроксипропилметакрилата (HPMA), гидроксипропилметакриламида и 3-триметилсилилпропилметакрилата (TMSPMA)), полиалкиленоксиды, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поли(этиленгликоль) (PEG), поли(пропиленгликоль), моно-C-C алкокси-PEG (например, монометокси-PEG), трезилмонометокси-PEG, арилокси-PEG, акрилат PEG (PEGA), метакрилат PEG, пропиональдегид PEG, бис-сукцинимидилкарбонат PEG, сополимеры 2-метакрилоилоксиэтилфосфорилхолина (MPC) и N-винилпирролидона (VP), гидроксифункциональный поли(N-винилпирролидон) (PVP), SIS-PEG (SIS представляет собой блок-сополимер полистирол-полиизобутилен-полистирол), полистирол-PEG, полиизобутилен PEG, PCL-PEG (PCL представляет собой поликапролактон), PLA-PEG (PLA представляет собой полимолочную кислоту), PMMA-PEG (PMMA представляет собой поли(метилметакрилат)), PDMS-PEG (PDMS представляет собой полидиметилоксанон), PVDF-PEG (PVDF представляет собой поливинилиденфторид), поверхностно-активные вещества ПЛЮРОНИК™ (сополимер полипропиленоксид-полиэтиленгликоль), поли(тетраметиленгликоль), поли(L-лизин-g-этиленгликоль) (PLL-g-PEG), поли(L-лизин-g-гиалуроновая кислота) (PLL-g-HA), поли(L-лизин-g-фосфорилхолин) (PLL-g-PC), поли(L-лизин-g-винилпирролидон) (PLL-g-PVP), поли(этилимин-g-этиленгликоль) (PEI-g-PEG), поли(этилимин-g-гиалуроновая кислота) (PEI-g-HA), поли(этилимин-g-фосфорилхолин) (PEI-g-PC), поли(этилимин-g-винилпирролидон) (PEI-g-PVP), сополимер PLL-HA, сополимер PLL-PC, сополимер PLL-PVP, сополимер PEI-PEG, сополимер PEI-HA, сополимер PEI-PC, сополимер PEI-PVP, целлюлозу и ее производные (например, гидроксиэтилцеллюлозу), декстран, декстрины, гиалуроновую кислоту и ее производные (например, гиалуронат натрия), эластин, хитозан, акрилсульфат, акрилсульфонат, акрилсульфамат, метакрилсульфат, метакрилсульфонат, метакрилсульфамат, их полимеры и сополимеры, и полимеры и сополимеры их комбинаций.
[0197]
1
10
В конкретном варианте осуществления, гидрофильный полимер представляет собой поли(этиленгликоль) (PEG), также называемый поли(этиленоксидом) (PEO). Как применяют в настоящем описании, термин «PEG» или «PEO» охватывает все формы PEG, разветвленные и неразветвленные, которые можно использовать для дериватизации полипептидов, включая, без ограничения, моно-(C-C) алкокси-PEG и арилокси-PEG.
[0198]
2
2
n
В одном варианте осуществления, конъюгаты PEG-CNP содержат полимер PEG (или PEO) формулы (CHCHO), где n представляет собой целое число от приблизительно 6 до приблизительно 100, и полимер PEG имеет молекулярную массу от приблизительно 0,3 кДа до приблизительно 5 кДа. В другом варианте осуществления, n представляет собой целое число от приблизительно 12 до приблизительно 50, и полимер PEG имеет молекулярную массу от приблизительно 0,6 кДа до приблизительно 2,5 кДа. В другом варианте осуществления, n представляет собой от приблизительно 12 до приблизительно 24, и полимер PEG имеет молекулярную массу от приблизительно 0,6 кДа до приблизительно 1,2 кДа. В следующем варианте осуществления, концевая гидроксильная группа полимера PEG кэпирована не реакционноспособной группой. В конкретном варианте осуществления, концевая кэпирующая группа представляет собой алкильную группу, например, низшую алкильную группу, такую как метил, так что полимер PEG заканчивается алкоксигруппой. В одном варианте осуществления, полимер PEG не является разветвленным. В другом варианте осуществления, CNP-22 или его варианты конъюгированы с полимером PEG только на N-конце.
[0199]
w
n
w
n
w
n
n
PEG и PEO потенциально включают молекулы с распределением по молекулярным массам, т.е., потенциально они являются полидисперсными, в зависимости от способа, которым они получены. Распределение по размеру/массе полимерного препарата можно охарактеризовать статистически с использованием среднемассовой молекулярной массы (M) и среднечисловой молекулярной массы (M), отношение которых называют индексом полидисперсности (M/M). M и M можно измерять посредством масс-спектроскопии. Варианты PEG-CNP, конъюгированные с группой PEG, большей, чем 1,5 кДа, могут иметь диапазон молекулярных масс вследствие полидисперсной природы исходной молекулы PEG. Например, в случае mPEG2K (Sunbright ME-020HS, NOF Co.), молекулярные массы молекул PEG распределены в диапазоне от приблизительно 1,5 кДа до приблизительно 3 кДа, с индексом полидисперсности 1,036. В отличие от этого, PEG, конъюгированные с CNP-22 или его вариантами с использованием реагентов MS(PEG) (n=4, 8, 12 или 24, обозначенных, например, «PEO12» или «PEO24») от Pierce Biotechnology (Rockford, Illinois), являются монодисперсными, имеющими дискретную длину цепи и определенную молекулярную массу.
[0200]
1
10
Способы получения полипептидов, содержащих группу PEG, известны в данной области (см., например, Патент США 5824784). Способы получения пегилированных пептидов CNP обычно включают стадии (a) реакции CNP-22 или его варианта с реагентом для пегилирования в условиях, подходящих для присоединения PEG к пептиду CNP (например, на N-конце), и (b) получения продукта(продуктов) реакции. Поскольку пегилирование пептида CNP может значительно изменять его связывание с NPR-B, в зависимости от размера группы PEG и локализации пегилирования, можно использовать разные виды PEG и условия реакции пегилирования. Химические способы, которые можно использовать для пегилирования пептида CNP, включают ацилирование реакционноспособного первичного амина(аминов) пептида с использованием сложного NHS эфира метокси-PEG (O-[(N-сукцинимидилоксикарбонил)-метил]-O'-метилполиэтиленгликоль). Ацилирование с использованием метокси-PEG-NHS или метокси-PEG-SPA приводит к образованию амидной связи, которая устраняет любой заряд исходного первичного амина. PEG-варианты CNP, обозначаемые символами «PEO12» или «PEO24», так же как обозначаемые символами «PEG1K», «PEG2K», «PEG5K» или «PEG20K», пегилируют посредством реакции первичной аминогруппы в пептиде с активированным сложным NHS эфиром, кэпированным на метокси-конце реагентом PEG. PEG-варианты CNP также можно получать другими способами, например, посредством восстановительного аминирования, в которое вовлечены первичная аминогруппа в пептиде и альдегид PEG, например, такой как пропионовый альдегид PEG, или его моно-C-C алкокси- или арилокси-производные (см. Патент США 5252714).
[0201]
.
Solid
Phase
Peptide
Synthesis:
a
Practical
Approach
В отличие от синтеза белка в рибосомах, синтез синтетического пептида происходит от C-конца к N-концу. Соответственно, использование Boc-PEG (содержащего трет- бутилоксикарбонил (Boc)) является одним из способов присоединения PEG к C-концу пептида (R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85(14): 2149-2154 (1963)).Альтернативно, можно использовать химические реакции с использованием Fmoc (флуоренилметоксикарбонила) (E. Atherton and R.C. Sheppard, , IRL Press (Oxford, England (1989))
[0202]
in
vitro
in
vivo
in
vitro
in
vivo
Способы получения вариантов PEG-CNP обеспечивают по существу гомогенную смесь конъюгатов полимер-белок. После очистки, препараты дискретных PEG-CNP препараты становятся достаточно очищенными для тестирования биологических свойств  и . Природу и степень пегилирования можно определять с использованием, например, анализов PAGE и HPLC. В конкретных вариантах осуществления, по меньшей мере приблизительно 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или 99% вариантов CNP являются монопегилированными на N-конце. Чтобы оптимизировать благоприятные эффекты пегилирования на биологические свойства CNP, длину полимера, конформацию (например, разветвленный или линейный), и/или функционализацию (например, добавление отрицательно заряженной группы) группы PEG можно менять. Пегилированные варианты CNP тестируют по устойчивости к NEP, фармакокинетике и биологической активности (например, способности связываться с NPR-B и стимулировать образование цГМФ). Пегилированные варианты CNP, для которых показана улучшенная устойчивость к NEP и по меньшей мере приблизительно 50% от активности стимуляции цГМФ для CNP-22, можно дополнительно тестировать, например,  в модели ахондроплазии на основе клеток хондросаркомы крыс и  в модели мышиной ахондроплазии у животных.
E. Способы применения вариантов CNP, фармацевтических композиций вариантов CNP и способы введения
Способы применения вариантов CNP
[0203]
Как описано в примерах ниже, эксперименты, описанные в настоящем описании, обеспечивают доказательство того, что варианты CNP, описанные в настоящем описании, можно использовать в лечении остеоартрита. Соответственно, один вариант осуществления изобретения включает введение варианта CNP субъекту, у которого диагностирован остеоартрит. В результате скорость дегенерации хряща у субъекта можно уменьшать, и в некоторых случаях, можно обращать (т.е., можно индуцировать регенерацию хряща). Соответственно, можно улучшать различные симптомы и биомаркеры, ассоциированные с остеоартритом. В примерах проиллюстрирована польза Gly-CNP-37 и Pro-Gly-CNP-37, хотя другие варианты, описанные в настоящем описании, также можно тестировать по эффективности и использовать сходным образом. Примечательно, что для Gly-CNP-37 и Pro-Gly-CNP-37, показаны признаки сильно улучшенного роста хряща, подвижности и двигательных навыков и значительно уменьшенной дегенерации хряща.
[0204]
Остеоартрит можно диагностировать на основании сообщений пациентов о признаках и симптомах, как описано выше, так же как медицинской визуализации для определения повреждения хряща в конкретном суставе. Способы визуализации включают рентгенографию, магнитно-резонансную томографию (MRI), оптическую когерентную томографию (OCT) и ультразвуковое исследование (US) (Gold et al., Bone J. 51:278-88, 2012). Визуализация часто может детектировать сужение суставов, остеофиты и субхондральные кисты в области сустава, утончение суставного хряща, дегенеративные изменения субхондрального костного мозга и костного шва. В различных вариантах осуществления, введение вариантов CNP, как предусмотрено в настоящем описании, улучшает один или несколько симптомов остеоартрита, как описано в настоящем описании, включая дегенерацию хряща, рост хряща, подвижность пациента, сужение суставов, остеофиты и субхондральные кисты в области сустава, утончение суставного хряща, дегенеративные изменения субхондрального костного мозга и костного шва, так же как другие, известные специалистам в данной области.
[0205]
В конкретных случаях, остеоартрит разделяют на первичный и вторичный остеоартрит (Stacy et al., Primary Osteoarthritis Imaging, 2012). Первичный артрит относится к идиопатическому феномену, часто возникающему у пожилых индивидуумов и в ранее интактных суставах, без очевидного инициирующего фактора. Вторичный остеоартрит может относится к дегенеративному заболеванию синовиальных суставов, возникающему в результате некоторого предрасполагающего состояния, обычно, травмы, отрицательно влияющей на суставной хрящ и/или субхондральную кость пораженных суставов. Вторичный остеоартрит может возникать у относительно молодых индивидуумов. Лечение как первичного, так и вторичного остеоартрита предусмотрено в настоящем описании.
[0206]
Тяжесть артрита можно оценивать в баллах по индексу выраженности остеоартрита университетов Западного Онтарио и МакМастера (WOMAC) (Kirkley et al., N Engl J Med 359:1097-1107, 2008), короткой форме-36 (SF-36) индекса физического здоровья (Ware et al., Med Care 30:473-483, 1992) и шкале собственной эффективности при артрите (ASES) (Lorig et al., Arthritis Rheum 32:37-44, 1989). С использованием радиографии тяжесть можно оценивать по модифицированной классификации Келлгрена-Лоуренса (Kellgren et al., Ann Rheum Dis 1957; 16:494-502; Blackburn et al., J Rheumatol; 21:675-679, 1994).
[0207]
Остеоартрит может поражать хрящ в суставах, включая, но без ограничения, колено, плечо, локоть, палец, руку, запястье, бедра, лодыжку, шею, позвоночник и/или поясницу. Симптомы остеоартрита включают боль в суставах, тугоподвижность суставов, разбухание сустава, уменьшение диапазона подвижности и слабость или онемение рук и ног, если артрит присутствует в позвоночнике. В настоящее время существует неудовлетворенная необходимость в новых эффективных способах лечения остеоартрита. Показано, что благодаря стимуляции продукции матрикса и роста и дифференцировки хондроцитов, варианты CNP, описанные в настоящем описании, можно использовать для противодействия нежелательным эффектам FGF-2 и увеличения синтеза матрикса у субъектов, страдающих от артрита, включая остеоартрит, таким образом, для лечения артрита, включая остеоартрит.
[0208]
В различных вариантах осуществления, разрушение или рост хряща анализируют по гибели/потере хондроцитов, потере протеогликана (ПГ), и потере или фибрилляции коллагена. Разрушение хряща и улучшение после лечения также можно оценивать посредством измерения уровней по меньшей мере одного специфического для хряща биомаркера, как описано в настоящем описании. Улучшение подвижности можно мониторировать посредством любой из шкал подвижности и оценки, описанных в настоящем описании и известны в данной области.
[0209]
Лечение остеоартрита часто включает облегчение боли с использованием противовоспалительных средств, таких как аспирин, NSAID, включая напроксен или ибупрофен, ацетаминофен, глюкокортикоиды, стероиды и гиалуроновую кислоту. Формы артрита от умеренных до тяжелых можно также лечить с использованием хирургии для замены пораженного сустава или удаления некоторого количества хряща, который может вызывать боль (Kirkey et al., N Engl J Med 359:1097-1107, 2008). Вариант CNP в настоящем описании можно вводить с проведением другого лечения, общепринятого для лечения остеоартрита, как описано в настоящем описании или как известно лечащему врачу.
Фармацевтические композиции вариантов CNP
[0210]
В дополнительных вариантах осуществления, описание относится к использованию фармацевтических композиций, содержащих вариант CNP и один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей, носителей и/или разбавителей. В конкретных вариантах осуществления, композиции дополнительно содержат одно или несколько других биологически активных средств (например, ингибиторов протеаз, рецепторных тирозинкиназ и/или рецептора выведения NPR-C).
[0211]
В некоторых вариантах осуществления, композиции содержат желательный вариант CNP с чистотой по меньшей мере приблизительно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%. В конкретных вариантах осуществления, композиции содержат менее, чем приблизительно 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или 0,5% макромолекулярных загрязняющих примесей, таких как другие белки млекопитающих (например, человека) и другие варианты CNP.
[0212]
th
Неограничивающие примеры наполнителей, носителей и разбавителей включают связующие, жидкости, буферы, средства для придания изотоничности, добавки, стабилизаторы, консерванты, солюбилизаторы, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы, увлажняющие средства, адъюванты и т.д. Композиции могут содержать жидкости (например, воду, этанол); разбавители с различным буферным содержимым (например, Трис-HCl, фосфатные, ацетатные буферы, цитратные буферы), pH и ионной силой; детергенты и солюбилизирующие средства (например, полисорбат 20, полисорбат 80); антиоксиданты (например, метионин, аскорбиновую кислоту, метабисульфит натрия); консерванты (например, тимеросол, бензиловый спирт, м-крезол); и придающие объем средства (например, лактозу, маннит, сахарозу). Использование наполнителей, разбавителей и носителей в составлении фармацевтических композиций известно в данной области; см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18 Edition, pages 1435-1712, Mack Publishing Co. (Easton, Pennsylvania (1990)), полное содержание которой приведено в настоящем описании в качестве ссылки.
[0213]
Например, носители включают, без ограничения, разбавители, связующие и адъюванты, так же как имплантируемые носители, и инертные нетоксичные твердые или жидкие наполнители и инкапсулирующие материалы, которые не взаимодействуют с активным ингредиентом(ингредиентами). Неограничивающие примеры носителей включают фосфатно-солевой буфер, физиологический солевой раствор, воду и эмульсии (например, эмульсии масло/вода). Носитель может представлять собой растворитель или диспергирующую среду, содержащую, например, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), растительное масло и их смеси.
[0214]
В некоторых вариантах осуществления, композиции представляют собой жидкие составы. В конкретных вариантах осуществления, составы содержат вариант CNP в диапазоне концентраций от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 20 мг/мл, или от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 20 мг/мл, или от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 20 мг/мл, или от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл, или от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл, или от приблизительно 1 мг/мл до приблизительно 10 мг/мл.
[0215]
В следующих вариантах осуществления, композиции содержат буферный раствор или забуферивающее средство для поддержания pH содержащего CNP раствора или суспензии в желательном диапазоне. Неограничивающие примеры буферных растворов включают фосфатно-солевой буфер, забуференный трис солевой раствор, и забуференный солевой раствор Хенка. Забуферивающие средства включают, без ограничения, ацетат натрия, фосфат натрия и цитрат натрия. Можно использовать также смеси забуферивающих средств. В конкретных вариантах осуществления, забуферивающее средство представляет собой уксусную кислоту/ацетат или лимонную кислоту/цитрат. Количество забуферивающего средства, подходящее для композиции, частично зависит от конкретного используемого буфера и желательного pH раствора или суспензии. Например, ацетат является более эффективным для pH буфером при pH 5, чем при pH 6, так что можно использовать меньше ацетата в растворе при pH 5, чем при pH 6. В некоторых вариантах осуществления, забуферивающее средство имеет концентрацию приблизительно 10 мМ±5 мМ. В конкретных вариантах осуществления, pH композиции составляет от приблизительно pH 3 до приблизительно pH 7,5, или от приблизительно pH 3,5 до приблизительно pH 7, или от приблизительно pH 3,5 до приблизительно pH 6,5, или от приблизительно pH 4 до приблизительно pH 6, или от приблизительно pH 4 до приблизительно pH 5, или приблизительно pH 5,0±1,0.
[0216]
В других вариантах осуществления, композиции содержат средство для коррекции изотоничности, чтобы сделать раствор или суспензию изотоничными и более подходящими для инъекции. Неограничивающие примеры средств для придания изотоничности включают NaCl, декстрозу, глюкозу, глицерин, сорбит, ксилит и этанол. В конкретных вариантах осуществления, средство для придания изотоничности представляет собой NaCl. В конкретных вариантах осуществления, NaCl присутствует в концентрации приблизительно в 160±20 мМ или приблизительно 140 мМ±20 мМ, или приблизительно 120±20 мМ, или приблизительно 100 мМ±20 мМ, или приблизительно 80 мМ±20 мМ, или приблизительно 60 мМ±20 мМ.
[0217]
В различных вариантах осуществления, композиции содержат консервант. Консерванты включают, но без ограничения, м-крезол и бензиловый спирт. В конкретных вариантах осуществления, консервант присутствует в концентрации приблизительно 0,4%±0,2% или приблизительно 1%±0,5%, или приблизительно 1,5%±0,5%, или приблизительно 2,0%±0,5%.
[0218]
В различных вариантах осуществления, композиции содержат антиадсорбент (например, чтобы уменьшить адсорбцию варианта CNP на стекле или пластике). Антиадсорбенты включают, без ограничения, бензиловый спирт, полисорбат 20 и полисорбат 80. В конкретных вариантах осуществления, антиадсорбент присутствует в концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,5% или от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5%, или от приблизительно 0,1% до приблизительно 1%, или от приблизительно 0,5% до приблизительно 1%, или от приблизительно 0,5% до приблизительно 1,5%, или от приблизительно 0,5% до приблизительно 2%, или от приблизительно 1% до приблизительно 2%.
[0219]
В различных вариантах осуществления, композиции содержат стабилизатор. Неограничивающие примеры стабилизаторов включают глицерин, глицерол, тиоглицерин, метионин, и аскорбиновую кислоту и ее соли. В некоторых вариантах осуществления, когда стабилизатор представляет собой тиоглицерин или аскорбиновую кислоту или ее соли, стабилизатор присутствует в концентрации от приблизительно 0,1% до приблизительно 1%. В других вариантах осуществления, когда стабилизатор представляет собой метионин, стабилизатор присутствует в концентрации от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5%, или от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,2%. В других вариантах осуществления, когда стабилизатор представляет собой глицерин, стабилизатор присутствует в концентрации от приблизительно 5% до приблизительно 100% (неразбавленный).
[0220]
В различных вариантах осуществления, композиции содержат антиоксидант. Иллюстративные антиоксиданты включают, без ограничения, метионин и аскорбиновую кислоту. В конкретных вариантах осуществления, молярное отношение антиоксиданта к варианту CNP составляет от приблизительно 0,1:1 до приблизительно 15:1, или от приблизительно 1:1 до приблизительно 15:1, или от приблизительно 0,5:1 до приблизительно 10:1, или от приблизительно 1:1 до приблизительно 10:1 или от приблизительно 3:1 до приблизительно 10:1.
[0221]
Remington
s
Pharmaceutical
Sciences
th
В композициях можно использоватьфармацевтически приемлемые соли, включая, без ограничения, соли неорганических кислот (например, гидрохлорид, гидробромид, фосфат, сульфат), соли органических кислот (например, ацетат, пропионат, малонат, бензоат, мезилат, тозилат), и соли аминов (например, изопропиламин, триметиламин, дициклогексиламин, диэтаноламин). Подробное обсуждение фармацевтически приемлемых солей можно обнаружить в ', 18 Edition, Mack Publishing Company, (Easton, Pennsylvania (1990)).
[0222]
Фармацевтические композиции можно вводить в различных формах, таких как таблетки, капсулы, гранулы, порошки, растворы, суспензии, эмульсии, мази и чрескожные пластыри. Лекарственные формы композиций можно подбирать для желательного способа введения композиций. Для перорального введения, композиции могут принимать форму, например, таблетки или капсулы (включая мягкие желатиновые капсулы), или могут находиться, например, в водном или неводном растворе, суспензии или сиропе. Таблетки и капсулы для перорального введения могут включать один или несколько общепринятых наполнителей, разбавителей и носителей, таких как маннит, лактоза, глюкоза, сахароза, крахмал, кукурузный крахмал, сахарин натрия, тальк, целлюлоза, карбонат магния и смазывающие средства (например, стеарат магния, стеарилфумарат натрия). Если желательно, придающие вкус средства, окрашивающие средства и/или подсластители можно добавлять в твердые и жидкие составы. Другие необязательные ингредиенты для пероральных составов включают, без ограничения, консерванты, суспендирующие средства и загустители. Пероральные составы также могут иметь кишечно-растворимое покрытие, чтобы защитить CNP от кислой среды в желудке. Способы получения твердых и жидких лекарственных форм известны или очевидны для специалистов в данной области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, процитированный выше).
[0223]
Составы для парентерального введения можно получать, например, в виде жидких растворов или суспензий, в виде твердых форм, подходящих для растворения или суспендирования в жидкой среде перед инъекцией, или в виде эмульсий. Например, стерильные пригодные для инъекции растворы и суспензии можно составлять согласно способам, известным в данной области с использованием подходящих разбавителей, носителей, растворителей (например, забуференного водного раствора, раствора Рингера, изотонического раствора хлорида натрия), диспергирующих средств, увлажняющих средств, эмульгаторов, суспендирующих средств и т.п. Кроме того, можно использовать стерильные жирные масла, жирные сложные эфиры, полиолы и/или другие неактивные ингредиенты. В качестве дополнительных примеров, составы для парентерального введения включают водные стерильные пригодные для инъекции растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, которые делают состав изотоничным крови намеченного реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут содержать суспендирующие средства и загустители.
[0224]
Иллюстративные составы CNP описаны в Патентах США 8198242 и 8598121. Настоящее описание относится к использованию составов CNP, имеющих pH в диапазоне от приблизительно 4 до приблизительно 6.
[0225]
В различных вариантах осуществления, можно получать составы вариантов CNP в фармацевтических носителях для введения субъектам, пораженным остеоартритом или симптомами остеоартрита. В некоторых вариантах осуществления, жидкие составы вариантов CNP получают в соответствии с любыми комбинациями ингредиентов, и их количества или концентрации описаны ниже:
Класс ингредиента
Ингредиент
Диапазон концентраций
Активный ингредиент
Вариант CNP
10 мг/мл ± 9,9 мг/мл
Забуферивающее средство
Уксусная кислота/ацетат
10 мМ ± 5 мМ, или pH 5±1
Забуферивающее средство
Лимонная кислота/цитрат
10 мМ ± 5 мМ, или pH 5±1
Средство для коррекции изотоничности
NaCl
140 мМ ± 20 мМ
Средство для коррекции изотоничности
Сахароза
10% ± 5%
Консервант
м-крезол
0,4% ± 0,1% или 0,2%
Консервант/антиадсорбент
Бензиловый спирт
1,5% ± 0,5%
Стабилизатор
Глицерин (глицерол)
5% - 100% (неразбавленный)<sup>1</sup>
Стабилизатор
Метионин
0,01% - 0,2%
Стабилизатор
Аскорбиновая кислота/ соль аскорбат
0,1% - 1%
Стабилизатор
Тиоглицерин
0,1% - 1%
Антиадсорбент
Полисорбат 20
0,001% - 0,5%
Полисорбат 80
0,001% - 0,5%
Бензиловый спирт
0,5% - 1,5%
1
Глицерин используют для минимизации или предотвращения вызванного водой гидролиза, дезамидирования, изомеризации или расщепления вариантов CNP. Для лиофилизированных составов, NaCl можно заменять 4-6% или 6-20% маннитом или сахарозой.
[0226]
Композиции, содержащие вариант CNP, могут также представлять собой лиофилизированные составы. В конкретных вариантах осуществления, лиофилизированные составы содержат буфер и придающее объем средство, и необязательно, антиоксидант. Иллюстративные буферы включают, без ограничения, ацетатные буферы и цитратные буферы. Иллюстративные придающие объем средства включают, без ограничения, маннит, сахарозу, декстран, лактоза, трегалозу и повидон (PVP K24). В конкретных вариантах осуществления, маннит присутствует в количестве от приблизительно 3% до приблизительно 10% или от приблизительно 4% до приблизительно 8%, или от приблизительно 4% до приблизительно 6%. В конкретных вариантах осуществления, сахароза присутствует в количестве от приблизительно 6% до приблизительно 20%, или от приблизительно 6% до приблизительно 15%, или от приблизительно 8% до приблизительно 12%.
[0227]
В различных вариантах осуществления, лиофилизированные составы вариантов CNP получают из составов, полученных в соответствии с любыми комбинациями ингредиентов, и их количества или концентрации описаны ниже:
Класс ингредиента
Ингредиент
Диапазон концентраций
Активный ингредиент
Вариант CNP
10 мг/мл ± 9,9 мг/мл
Забуферивающее средство
Уксусная кислота/ацетат
10 мМ ± 5 мМ, или pH 5±1
Забуферивающее средство
Лимонная кислота/цитрат
10 мМ ± 5 мМ, или pH 5±1
Средство для коррекции изотоничности/придающее объем средство
Сорбит
5% ± 3%
Средство для коррекции изотоничности/придающее объем средство
Маннит
5% ± 3%
Средство для коррекции изотоничности/придающее объем средство
Сахароза
10% ± 5%
Консервант
м-крезол
0,4% ± 0,2%
Консервант/антиадсорбент
Бензиловый спирт
1,5% ± 0,5%
Стабилизатор
Глицерин (глицерол)
5% - 100% (неразбавленный)<sup>1</sup>
Стабилизатор
Метионин
0,01% - 0,2%
Стабилизатор
Аскорбиновая кислота/соль аскорбат
0,1% - 1%
Стабилизатор
Тиоглицерин
0,1% - 1%
Антиадсорбент
Полисорбат 20
0,001% - 0,5%
Полисорбат 80
0,001% - 0,5%
Бензиловый спирт
0,5% - 1,5%
1
Глицерин используют для минимизации или предотвращения вызванного водой гидролиза, дезамидирования, изомеризации или расщепления вариантов CNP.
[0228]
В различных вариантах осуществления, состав, содержащий вариант CNP, имеет pH приблизительно 3-7 или приблизительно 3-6, или приблизительно 3,5-6,5, или приблизительно 4-6, или приблизительно 4-5, или приблизительно 4,5-5,5. В некоторых вариантах осуществления, в случае pH 4-5,5, подходящим забуферивающим средством является уксусная кислота/ацетат (например, ацетат натрия), и в случае pH 5,5-6 подходящим забуферивающим средством является лимонная кислота/цитрат. Лимонная кислота/цитрат (например, цитрат натрия) также является подходящим забуферивающим средством в диапазоне pH 3-6 или pH 4-6. В конкретных вариантах осуществления, забуферивающее средство имеет концентрацию в составе приблизительно в 2-50 мМ или приблизительно в 2-40 мМ, или приблизительно в 2-30 мМ, или приблизительно в 5-30 мМ, или приблизительно в 2-20 мМ, или приблизительно в 5-20 мМ, или приблизительно в 5-15 мМ.
[0229]
Чтобы минимизировать или исключить дезамидирование варианта CNP, можно получать состав варианта в фармацевтически приемлемых органических сорастворителях, таких как глицерин, этанол и пропиленгликоль. Поскольку дезамидирование происходит в результате гидролиза, то замена воды органическим сорастворителем минимизирует контакт варианта CNP с водой. Концентрация одного или нескольких органических растворителей в системе органических-водных растворителей может составлять, например, от приблизительно 10% до приблизительно 99%, или приблизительно 100%, если воду не используют.
[0230]
Также, чтобы минимизировать или избежать дезамидирование варианта CNP, воду можно удалить из состава посредством лиофилизации. В некоторых вариантах осуществления, лиофилизированные составы содержат любые комбинации следующих компонентов: буфер: ацетат натрия и уксусная кислота, или цитрат натрия и лимонная кислота; средство для придания изотоничности /придающее объем средство: маннит (например, 3-10%, 2-8% или 4-6%); сахароза (например, 6-20%, 5-15% или 8-12%); антиоксиданты: метионин и/или аскорбиновая кислота с молярным отношением каждого антиоксиданта к варианту CNP от приблизительно 0,1:1 до приблизительно 1:1 или от приблизительно 0,5:1 до приблизительно 5:1, или от приблизительно 1:1 до приблизительно 15:1, или от приблизительно 1:1 до приблизительно 10:1, или от приблизительно 3:1 до приблизительно 10:1.
[0231]
Дезамидирование также можно минимизировать или исключать посредством хранения композиции CNP (например, жидкого состава или лиофилизированного состава) при более низкой температуре, такой как приблизительно 5°C, 0°C, -10°C, -20°C, -30°C, -40°C, -50°C, -60°C, -70°C, -80°C, -90°C или -100°C.
[0232]
Чтобы минимизировать или избегать окисления поддающихся окислению остатков (например, метионина) в варианте CNP, можно получать состав варианта с одним или несколькими антиоксидантами. Иллюстративные антиоксиданты включают, но без ограничения, метионин, аскорбиновую кислоту и тиоглицерин. Окисление, например, остатков метионина также можно минимизировать или предотвращать посредством удаления кислорода из жидкой среды (если препарат жидкий) продувкой азотом или аргоном и/или посредством удаления кислорода из контейнера или упаковки продувкой азотом или аргоном.
[0233]
В некоторых вариантах осуществления, для минимизации или предотвращения адсорбции (например, адсорбции варианта CNP на пластике или стекле), к составу CNP добавляют полисорбат 20, полисорбат 80 или бензиловый спирт, или их комбинацию. В конкретных вариантах осуществления, каждый из антиадсорбента(антиадсорбентов) присутствует в концентрации от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,5% или от приблизительно 0,01% до приблизительно 0,5%, или от приблизительно 0,1% до приблизительно 1%, или от приблизительно 0,5% до приблизительно 1%, или от приблизительно 0,5% до приблизительно 1,5%, или от приблизительно 0,5% до приблизительно 2%, или от приблизительно 1% до приблизительно 2%. Иллюстративный диапазон(ы) антиадсорбента(антиадсорбентов) в составе включают, без ограничения, от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,5% полисорбата 20, от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,5% полисорбата 80, и/или от приблизительно 0,5% до приблизительно 1,5% бензилового спирта.
[0234]
В конкретных вариантах осуществления, жидкий состав CNP содержит, или лиофилизированный состав CNP получен из состава, который содержит, (1) буфер уксусная кислота/ацетат (например, ацетат натрия), имеющий концентрацию приблизительно 30 мМ±5 или 10 мМ забуферивающего средства и pH приблизительно 4±0,5 или 1, и (2) бензиловый спирт (например, в качестве консерванта и/или антиадсорбента) в концентрации приблизительно 1%±0,5%, и необязательно (3) сахарозу в концентрации приблизительно 10%±5%.
[0235]
Настоящее описание также относится к наборам, содержащим, например, бутыли, флаконы, ампулы, пробирки, картриджи и/или шприцы, которые содержат жидкий (например, стерильный пригодный для инъекций) состав или твердый (например, лиофилизированный) состав. Наборы также могут содержать фармацевтически приемлемые связующие или носители (например, растворители, растворы и/или буферы) для разведения твердого (например, лиофилизированного) состава для получения раствора или суспензии для введения (например, посредством инъекции), включая, без ограничения, для разведения лиофилизированного состава в шприце для инъекции или для разбавления концентрата до более низкой концентрации. Кроме того, инъекционные растворы и суспензии для немедленного применения можно получать, например, из стерильного порошка, гранул или таблеток, содержащих композицию, содержащую CNP-. Наборы также могут включать дозирующие устройства, такие как аэрозольные или инъекционные дозирующие устройства, ручки-инжекторы, автоинжекторы, безыгольные инжекторы, шприцы и/или иглы.
[0236]
В качестве неограничивающего примера набор моет включать шприцы, имеющие одну камеру или двойные камеры. В случае однокамерных шприцов одна камера может содержать жидкий состав CNP, готовый для инъекции или твердый (например, лиофилизированный) состав CNP, или жидкий состав варианта CNP в относительно небольшом количестве подходящей системы растворителей (например, в глицерине), который можно разводить с получением раствора или суспензии для инъекции. В случае двухкамерных шприцов одна камера может содержать фармацевтически приемлемые связующее или носитель (например, систему растворителей, раствор или буфер), а другая камера может содержать твердый (например, лиофилизованный) состав CNP или жидкий состав варианта CNP в относительно небольшом количестве подходящей системы растворителей (например, в глицерине), которые можно разводить с получением раствора или суспензии, с использованием связующего или носителя из первой камеры, для инъекции.
[0237]
В качестве следующего примера, набор может включать одно или несколько из ручек-инжекторов или автоинжекторных устройств и двухкамерных картриджей. Одна камера картриджа может содержать фармацевтически приемлемые связующее или носитель (например, систему растворителей, раствор или буфер), а другая камера может содержать твердый (например, лиофилизованный) состав CNP или жидкий состав варианта CNP в относительно небольшом количестве подходящей системы растворителей (например, в глицерине), которые можно разводить с получением раствора или суспензии, с использованием связующего или носителя из первой камеры, для инъекции. Картридж может содержать некоторое количество варианта CNP, которое является достаточным для дозирования в течение желательного периода времени (например, 1 сутки, 2 суток, 3 суток, 1 неделя, 2 недели, 3 недели, 4 недели и т.д.). Ручку-инжектор или автоинжектор можно настраивать для введения желательного количества состава CNP из картриджа.
[0238]
Кроме того, фармацевтические композиции, содержащие вариант CNP, можно составлять в форме системы для замедленного высвобождения, контролируемого высвобождения или длительного высвобождения для поддержания относительно постоянного уровня дозы в течение желательного периода времени, такого как 1 неделя, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца или 3 месяца. Составы для замедленного высвобождения, контролируемого высвобождения или длительного высвобождения можно получать с использованием, например, биоразлагаемых полимерных систем {которые могут включать, например, гидрофильные полимеры [например, полилактид, полигликолид, поли(лактид-гликолид)]}, и могут принимать форму, например, микрочастиц, микросфер или липосом, как известно в данной области.
Дозы и частота дозирования
[0239]
Как применяют в настоящем описании, термин «терапевтически эффективное количество» действующего вещества (например, варианта CNP) относится к количеству, обеспечивающему терапевтическое преимущество для пациента. Количество можно менять от одного индивидуума к другому, и оно может зависеть от ряда факторов, включая общее физическое состояние пациента. Терапевтически эффективное количество варианта CNP легко может определить специалист в данной области, с использованием общедоступных материалов и способов. Например, количество варианта CNP, используемого для терапии, должно обеспечивать подходящую скорость обращения дегенерации хряща или увеличивать рост хряща.
[0240]
Частоту дозирования для конкретного индивидуумаможно менять в зависимости от различных факторов, включая нарушение, подвергаемое лечению, и состояние и ответ индивидуума на терапию. В конкретных вариантах осуществления, фармацевтическую композицию, содержащую вариант CNP, вводят субъекту приблизительно один раз в сутки, один раз в двое суток, один раз в трое суток или один раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, один раз в каждые две недели или раз в месяц.
[0241]
50
50
50
50
Варианты CNP, предусмотренные для использования в настоящем описании, можно вводить пациентам в терапевтически эффективных дозах для лечения, облегчения или предотвращения остеоартрита и других состояний, имеющих ассоциированный с остеоартритом симптом. Безопасность и терапевтическую эффективность вариантов CNP можно определять стандартными фармакологическими способами в культурах клеток или на экспериментальных животных, например, такими как определение LD (дозы, летальной для 50% популяции) и ED (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Отношение между дозами токсического и терапевтического эффектов представляет собой терапевтический индекс, и его можно выражать как отношение LD /ED. Обычно предпочтительны действующие вещества, имеющие высокий терапевтический индекс.
[0242]
50
Данные, полученные в анализах на культурах клеток и в исследованиях на животных, можно использовать для определения диапазона доз для использования для человека. Обычно дозы лежат в диапазоне циркулирующих концентраций, которые включают ED, с небольшой или минимальной токсичностью. Дозу можно менять в пределах этого диапазона, в зависимости от используемой формы дозирования и используемого способа введения. Терапевтически эффективную дозу можно определять на основании анализов в культурах клеток и исследований на животных.
[0243]
В конкретных вариантах осуществления, варианты CNP, описанные в настоящем описании, вводят в дозе в диапазоне от приблизительно 5 или 10 нмоль/кг до приблизительно 300 нмоль/кг, или от приблизительно 20 нмоль/кг до приблизительно 200 нмоль/кг. В некоторых вариантах осуществления, варианты CNP вводят в дозе приблизительно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 125, 130, 140, 150, 160, 170, 175, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750 или 2000 нмоль/кг, или в другой дозе, которую считает подходящей лечащий врач. В других вариантах осуществления, варианты CNP вводят в дозе приблизительно 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 мкг/кг, или приблизительно 1, 1,25, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 мг/кг, или в другой дозе, которую считает подходящей лечащий врач. Дозы вариантов CNP, описанных в настоящем описании, можно вводить в соответствии с частотой дозирования/частотой введения, описанной в настоящем описании, включая, без ограничения, введение ежесуточно, 2 или 3 раза в неделю, раз в неделю, каждые 2 недели, каждые 3 недели, раз в месяц и т.д.
[0244]
Частоту дозирования/введения варианта CNP для конкретного субъекта можно менять в зависимости от различных факторов, включая нарушение, подвергаемое лечению, и состояние и ответ субъекта на терапию. Вариант CNP можно вводить в однократной дозе или в множественных дозах на введение. В конкретных вариантах осуществления, вариант CNP вводят, в однократной дозе или в множественных дозах, ежесуточно, каждые вторые сутки, каждые 3 суток, 2 раза в неделю, 3 раза в неделю, раза в неделю, раз в две недели, каждые 3 недели, раз в месяц, каждые 6 недели, каждые 2 месяца, каждые 3 месяца, или как считает подходящим лечащий врач.
[0245]
В некоторых вариантах осуществления, вариант CNP вводят таким образом, чтобы обеспечить периоды роста (например, хондрогенез), с последующим периодом восстановления. Например, вариант CNP можно вводить внутривенным, подкожным, внутрисуставным или другим способом ежесуточно или несколько раз в неделю в течение некоторого периода времени, с последующим периодом без лечения, затем цикл повторяют. В некоторых вариантах осуществления, начальный период лечения (например, введение варианта CNP ежесуточно или несколько раз в неделю) составляет 3 суток, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недели, 6 недель, 7 недель, 8 недель, 9 недель, 10 недель, 11 недель или 12 недель. В родственном варианте осуществления, период без лечения длится в течение 3 суток, 1 недели, 2 недель, 3 недель или 4 недель. В конкретных вариантах осуществления, режим дозирования варианта CNP представляет собой: ежесуточно в течение 3 суток с последующими 3 сутками без лечения; или ежесуточно или несколько раз в неделю в течение 1 недели с последующими 3 сутками или 1 неделей без лечения; или ежесуточно или несколько раз в неделю в течение 2 недель с последующими 1 или 2 неделями без лечения; или ежесуточно или несколько раз в неделю в течение 3 недель с последующими 1, 2 или 3 неделями без лечения; или ежесуточно или несколько раз в неделю в течение 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 недель с последующими 1, 2, 3 или 4 неделями без лечения.
Способы введения
[0246]
Варианты CNP или содержащие их фармацевтические композиции можно вводить субъектам различными способами, например, такими как подкожный посредством инъекции, внутрисуставной, внутривенный, внутриартериальный, внутрибрюшинный, внутримышечный, внутрикожный или интратекальный. В одном варианте осуществления, варианты CNP вводят посредством однократной подкожной, внутрисуставной, внутривенной, внутриартериальной, внутрибрюшинной, внутримышечной, внутрикожной или интратекальной инъекции один раз в сутки, один раз в каждые вторые сутки, один раз в каждые трое суток или один раз в неделю.
[0247]
Варианты CNP можно также вводить посредством прямой инъекции в участок или рядом с участком заболевания. Кроме того, варианты CNP можно вводить посредством имплантации депо в намеченный участок действия (например, в область аномального или подверженного дегенерации сустава или хряща). Альтернативно, варианты CNP можно вводить подъязычно под язык (например, подъязычная таблетка) или посредством ингаляции в легкие (например, ингалятор или аэрозольный спрей), посредством доставки в носовую полость (например, интраназальный спрей), посредством доставки в глаз (например, глазные капли) или посредством чрескожной доставки (например, посредством пластыря на коже). Варианты CNP можно также вводить перорально в форме микросфер, микрокапсул, липосом (незаряженных или заряженных (например, катионных)), полимерных микрочастиц (например, полиамиды, полилактид, полигликолид, поли(лактид-гликолид)), микроэмульсий и т.п.
[0248]
Следующим способом введения является введение посредством осмотического насоса (например, насоса Alzet) или мини-насоса (например, осмотического мини-наноса Alzet), который обеспечивает возможность контролируемой, непрерывной и/или замедленной доставки варианта CNP или фармацевтической композиции в течение предопределенного периода. Осмотический насос или мини-насос можно имплантировать подкожно или рядом с намеченным участком (например, длинные кости конечностей, эпифизы и т.д.).
[0249]
Специалисту в данной области понятно, что варианты CNP или их композиции можно также вводить другими способами. Определение наиболее эффективного способа введения вариантов CNP или их композиций находится в компетенции специалиста в данной области.
[0250]
Варианты CNP можно вводить в форме фармацевтических составов, пригодных, например, для перорального (включая буккальное и подъязычное), ректального, назального, местного, легочного, вагинального или парентерального (включая внутримышечное, внутриартериальное, интратекальное, подкожное, внутрисуставное и внутривенное) введения, или в форме, подходящей для введения посредством ингаляции или инсуффляции. В зависимости от предполагаемого способа введения, фармацевтические составы могут находиться в форме твердых, полутвердых или жидких лекарственных форм, таких как таблетки, суппозитории, пилюли, капсулы, порошки, жидкости, суспензии, эмульсии, кремы, мази, лосьоны и т.п. Составы можно предоставлять в единичной дозированной форме, подходящей для однократного введения точной дозы. Составы содержат эффективное количество варианта CNP, и один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей, носителей и/или разбавителей, и необязательно, одно или несколько других биологически активных средств.
Комбинированная терапия
[0251]
В одном варианте осуществления, вариант CNP можно использовать в комбинации с одним или несколькими другими действующими веществами, которые можно использовать для лечения, облегчения или предотвращения остеоартрита. Другое действующее вещество(вещества) может усиливать эффекты варианта CNP и/или оказывать другие фармакологические эффекты в дополнение к эффектам варианта CNP. Неограничивающие примеры действующих веществ, которые можно использовать в комбинации с вариантами CNP, описанными в настоящем описании, являются другие натрийуретические пептиды (например, BNP) и ингибиторы (например, антагонисты) пептидаз и протеаз (например, NEP и фурина), NPR-C и тирозинкиназы (например, FGFR-3). Примеры ингибиторов NEP включают, без ограничения, тиорфан и кандоксатрил. Совместное использование ингибитора NPR-C также может продлевать время полужизни варианта CNP посредством ингибирования выведения варианта посредством NPR-C.
[0252]
Вариант CNP можно вводить в комбинации с противовоспалительными средствами или обезболивающими, такими как противовоспалительное средство, NSAID, кортикостероид и гиалуроновая кислота.
[0253]
Чтобы достичь соответствующего терапевтического исхода при комбинированной терапии, обычно можно вводить субъекту композицию CNP и другое лекарственное средство (средства) в общем количестве, эффективном для получения желательного терапевтического исхода (например, восстановленного хряща или уменьшенной дегенерации хряща). Этот способ может включать введение композиции CNP и другого лекарственного средства(средств) одновременно. Одновременное введение можно осуществлять посредством введения одной композиции или фармакологического состава белка, который содержит как вариант CNP, так и другое лекарственное средство(средства). Альтернативно, другое лекарственное средство(средства) можно принимать отдельно приблизительно в то же время, что и фармакологический состав (например, таблетку, инъекцию или напиток) варианта CNP. Вариант CNP можно также составлять в форме пищевого продукта, такого как шоколадное пирожное, блины или торты, подходящие для приема в пищу.
[0254]
В других альтернативных вариантах, введение варианта CNP можно осуществлять до или после введения другого лекарственного средства(средств) с интервалами в диапазоне от минут до часов. В вариантах осуществления, в которых другое лекарственное средство(средства) и композицию CNP вводят отдельно, обычно необходимо гарантировать, чтобы вариант CNP и другое лекарственное средство(средства) были введены в подходящее время друг относительно друга, так чтобы как вариант CNP, так и другое лекарственное средство(средства) могли оказывать, синергически или аддитивно, благоприятный эффект на пациента. Например, можно вводить композицию CNP в пределах приблизительно 0,5-6 часов (до или после) от другого лекарственного средства(средств). В одном варианте осуществления, композицию CNP вводят в пределах приблизительно 1 часа (до или после) от другого лекарственного средства(средств).
Идентификация и мониторирование популяций пациентов
[0255]
Можно разрабатывать способы для идентификации субъектов, подходящих для терапииCNP. Например, подходящих пациентов можно идентифицировать с использованием анализа аспирации суставов/синовиальной жидкости, рентгенографии и/или способов MRI. Можно разрабатывать также способы для определения того, является ли данный пациент отвечающим на терапию CNP. Например, в случае лечения остеоартрита, можно измерять показатели роста, такие как измерения роста хряща и оценка подвижности.
[0256]
in
vitro
ex
vivo
in
vivo
Одним из маркеров передачи сигнала CNP является цГМФ (циклический гуанозин-3',5'-монофосфат). Уровень этой молекулы внутриклеточной передачи сигналов увеличивается после того, как CNP связывает и активирует его родственный рецептор NPR-B. Увеличенные уровни цГМФ можно измерять в экстрактах культур клеток () после воздействия CNP, в кондиционированной среде в исследованиях эксплантатов костей () после воздействия CNP, и в плазме () в пределах нескольких минут после введения CNP подкожно, внутривенно или другими способами введения, известными в данной области.
[0257]
Специфические для хрящааналиты (или ассоциированные с хрящом маркеры) также можно измерять, чтобы оценить эффективность CNP. Например, фрагменты расщепленного коллагена типа II являются специфическим для хряща маркером обновления хряща. Коллаген типа II является главным органическим составляющим хряща, и фрагменты коллагена типа II (расщепленный коллаген) высвобождаются в кровоток, и затем выводятся в мочу после обновления хряща. Обновление хряща предшествует образованию новой кости.
[0258]
in
vivo
ex
vivo
Другие потенциальные биомаркеры формирования и роста или дегенерации хрящавключают хондроитинсульфат аггрекан (специфический для хряща маркер обновления хряща), пропептиды коллагена типа II (специфический для хряща маркер формирования хряща, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), хондроитинсульфат аггрекан, синдекан-3 и аннексин VI. Ассоциированные с хрящом биомаркеры можно измерять, например, в сыворотке при исследованиях эффективности/фармакодинамики  и в кондиционированной среде при исследованиях , с использованием коммерчески доступных наборов.
[0259]
in
vivo
В одном варианте осуществления, уровень по меньшей мере одного ассоциированного с хрящом биомаркера анализируют или измеряют у субъекта, которому вводили вариант CNP, для мониторирования эффектов варианта CNP на формирование и рост хряща . Например, увеличение уровня по меньшей мере одного ассоциированного с костью или хрящом биомаркера может указывать на то, что введение варианта CNP оказывает положительный эффект на рост костей и является применимым лечением дисплазий скелета и других ассоциированных с костью или хрящом заболеваний или нарушений, ассоциированных с уменьшенной активностью CNP. Иллюстративные ассоциированные с хрящом биомаркеры включают, но без ограничения, CNP (например, эндогенный уровень CNP), цГМФ, пропептиды коллагена типа II и их фрагменты, коллаген типа II и его фрагменты, пропептиды коллагена типа I и их фрагменты, коллаген типа I и его фрагменты, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), хондроитинсульфат аггрекан, синдекан-3 и аннексин VI.
[0260]
В различных вариантах осуществления, биомаркеры измеряют посредством получения биологического образца от субъекта, которому будут вводить, которому вводят или которому вводили вариант CNP. Биомаркеры можно измерять с использованием способов, известных в данной области, включая, но без ограничения, Вестерн-блоттинг, твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и анализ ферментативной активности. Биологический образец может представлять собой кровь, сыворотку, мочу или другие биологические жидкости.
[0261]
Дополнительные аспекты и детали описания будут очевидны на основании следующих примеров, которые предназначены для иллюстрации, а не для ограничения.
F. Примеры
Пример 1
Модель остеоартрита на крысах
[0262]
Односторонний медиальный разрыв мениска у крыс массой 275-300 грамм приводит к быстро прогрессирующей дегенерации хряща - характеризующейся потерей хондроцитов и протеогликана, фибрилляцией, формированием остеофита и клонированием хондроцитов. Эту модель осуществляют посредством рассечения медиальной коллатеральной связки непосредственно ниже ее присоединения к мениску, так что когда суставную щель открывают, мениск отгибают к бедренной кости. Мениск разрезают в его самой узкой точке (вдали от мелких костей), стараясь не повредить поверхность большеберцовой кости и убеждаясь, что полученное рассечение образует отдельные, свободно подвижные переднюю и заднюю половины мениска.
[0263]
Возникают прогрессирующие дегенеративные изменения хряща, и после 3-6 недель после хирургического вмешательства, дегенерация хряща большеберцовой кости может быть фокально тяжелой на внешней 1/3 большеберцовой кости, с дегенеративными изменениями меньшей тяжести в средней и внутренней 1/3. Остеофиты в конечном счете являются довольно большими (в медиальной большеберцовой кости) и прогрессивно увеличиваются в размере. Модель является прогрессирующей и приводит к полной потере хряща (до истончения кости) за 12 месяцев практически у всех крыс, с очагами, целесообразным образом согласованными. У крыс регистрировали нагрузку на лапу непосредственно после хирургического вмешательства, и анализ походки позволял предполагать небольшие изменения нагрузки на прооперированное колено, если они вообще присутствовали. Из-за быстрого прогрессирования дегенерации хряща, защитные эффекты не всегда являются очевидными для внешней 1/3 хряща большеберцовой кости, хотя зональный анализ может выявлять эффекты лечения в средней и внутренней 1/3. Значительные изменения субхондральной и эпифизарной кости возникают в медиальной большеберцовой кости, расположенной ниже областей наибольшей тяжести повреждений. По диапазону и типу они лежат в диапазоне от увеличивающейся базофилии кальцифицированного слоя хряща с небольшими трещинами в субхондральной кости до явного разрушения суставного хряща в областях резорбции кости в эпифизе с окружающим склерозом кости. Таким образом, эта модель обеспечивает возможность оценки не только хондропротективных эффектов средств, но также активности защиты кости. Модель имеет относительно короткую длительность, и животные очень хорошо согласуются по их ответу на хирургическое вмешательство.
[0264]
Эту модель на крысах использовали для определения эффекта вариантов CNP на замедление или репарацию повреждения хряща при остеоартрите, где CNP вводят в ответ на повреждение или травму сустава. В этой модели разрыв вносили в мениск, чтобы спровоцировать повреждение сустава, приводящее к дегенерации хряща и остеоартриту (Janusz et al., Osteoarthritis Cartilage, 10:785-791, 2002). Самцам крыс Lewis проводили одностороннюю медиальную менискэктомию на сутки 0; введение контрольного носителя или варианта Gly-CNP-37 CNP начинали на сутки 7; и животных подвергали эвтаназии на сутки 29 для гистопатологического анализа поврежденных суставов. Gly-CNP-37 (предоставленный при 0,71 или 2,2 мг/мл в контрольном носителе) или контрольный носитель отдельно вводили посредством внутрисуставных (IA) инъекций три раза в неделю (M, W, F) в течение 3 недель. Терапевтическую эффективность оценивали посредством анализа походки и гистопаталогического исследования гибели хондроцитов/дегенерации хряща в колене.
Хирургия
[0265]
В частности, подвергаемых хирургическому вмешательству животных подвергали анестезии с использованием изофлурана, и область правого колена и голени подготавливали для хирургии. Для разрыва мениска, надрез кожи выполняли над медиальной проекцией колена, и медиальную коллатеральную связку надрезали после обнажения посредством тупого отделения. Медиальный мениск разрезали на всю толщину для имитации полного разрыва, и рану закрывали. Через девяносто минут (90 мин) после хирургического вмешательства, животных лечили с использованием дозы ацетаминофена (100 мг/кг, PO) в 1% CMC (2 мл/кг, 50 мг/мл). Последующую дозу вводили через 24 часа после хирургического вмешательства (по необходимости).
Гистопатология
[0266]
Для гистопатологического анализа прооперированные суставы собирали от подвергнутых эвтаназии крыс. Через 4-6 суток в декальцификаторе 5% муравьиной кислоте, прооперированные суставы разрезают на приблизительно равные половины в фронтальной плоскости и погружают в парафин. Срезы нарезали из каждого прооперированного правого колена с шагом приблизительно 160 мкм и окрашивали толуидиновым синим. Для оценки эффектов Gly-CNP-37 на развитие остеоартрита, следующие параметры измеряли или оценивали в баллах для каждого из обработанных суставов и по сравнению с обработанными носителем контрольными суставами: дегенерация хряща, глубина поражения, ширина поражения, повреждение кальцифицированного слоя хряща и толщину/склероз субхондральной кости, медиальной большеберцовой субхондральной/эпифизарной губчатой кости, толщина остеофита, повреждение коллагена, толщина пластины роста и репарация медиальной коллатеральной связки/синовиума.
[0267]
Для некоторых параметров (где отмечено), местные различия в плато большеберцовой кости принимают во внимание посредством деления каждого среза на три зоны (1-наружняя, 2-средняя, 3-внутренняя).
[0268]
Данные анализировали с использованием t-критерия Стьюдента или U-критерия Манна-Уитни (непараметрического). При необходимости, данные можно также дополнительно анализировать для всех групп, с использованием однофакторного анализа переменных (1-однофакторного ANOVA) или критерия Крускала-Уоллиса (непараметрического), вместе с подходящим апостериорным тестированием множественного сравнения. Статистические тесты приводят к конкретным заключениям относительно нормальности данных и однородность дисперсии, и дополнительный анализ может являться необходимым, если тестирование привело к несоответствию этим заключениям. Значимость для всех тестов устанавливали на p<0,05.
Общая дегенерация хряща медиальной большеберцовой и бедренной кости
[0269]
Общую дегенерацию хряща определяли для каждого сустава посредством оценки гибели/потери хондроцитов, потери протеогликана (ПГ) и потери или фибрилляции коллагена, и оценивали в баллах, как представлено в таблице 1.
ТАБЛИЦА 1: Критерии гистопатологической оценки для дегенерации хряща
БАЛЛ
КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ
0
Отсутствие дегенерации.
1
Минимальная дегенерация, в пределах того, что зона 5-10% матрикса выглядит нежизнеспособной в результате значительной потери хондроцитов (более 50% от нормальной плотности клеток).
Потеря ПГ обычно присутствует в этих областях потери клеток, и потеря коллагеновой матрицы может присутствовать.
2
Слабая дегенерация, в пределах того, что зона 11-25% матрикса выглядит нежизнеспособной в результате значительной потери хондроцитов (более 50% от нормальной плотности клеток).
Потеря ПГ обычно присутствует в этих областях потери клеток, и потеря коллагеновой матрицы может присутствовать.
3
Умеренная дегенерация, в пределах того, что зона 26-50% матрикса выглядит нежизнеспособной в результате значительной потери хондроцитов (более 50% от нормальной плотности клеток).
Потеря ПГ обычно присутствует в этих областях потери клеток, и потеря коллагеновой матрицы может присутствовать.
4
Заметная дегенерация, в пределах того, что зона 51-75% матрикса выглядит нежизнеспособной в результате значительной потери хондроцитов (более 50% от нормальной плотности клеток).Потеря ПГ обычно присутствует в этих областях потери клеток, и потеря коллагеновой матрицы может присутствовать.
5
Тяжелая дегенерация, в пределах того, что зона 76-100% матрикса выглядит нежизнеспособной в результате значительной потери хондроцитов (более 50% от нормальной плотности клеток).
Потеря ПГ обычно присутствует в этих областях потери клеток, и потеря коллагеновой матрицы может присутствовать.
[0270]
Суммарнуюдегенерацию хрящадля трех зон рассчитывали в дополнение к выражению данных для каждой зоны. Для крыс, подвергнутых лечению с использованием Gly-CNP-37 в низкой (35,5 мкг/дозу) или высокой дозе (110 мкг/дозу), показано значимое уменьшение дегенерации хряща в большеберцовой кости (Фигура 1) по сравнению с контрольными крысами без лечения.
Глубина и ширина повреждения медиальной большеберцовой кости
[0271]
Глубину любого типа повреждения (глубину повреждения) и глубину до границы кальцификации (общую глубину) измеряли посредством оптического микрометра в области наибольшей тяжести повреждения в каждой из трех зон плато большеберцовой кости. По трем измерениям, отношение глубины рассчитывали для каждого сустава посредством деления глубины повреждения на общую глубину. Общая глубина до границы кальцификации может служить средним показателем толщины хряща в каждой из трех зон для сравнения анаболиков при измерении в средней точке зоны. На фигуре 2 показано, что отношение глубины улучшалось в группах, подвергнутых лечению Gly-CNP-37 по сравнению с контролем после обработки носителем. Ширина хряща, пораженного любой дегенерацией (потерей клеток, потерей протеогликана или повреждением коллагена), как измерено посредством оптического микрометра, также улучшалась в группах, подвергнутых лечению CNP (Фигура 3). Это измерение простирается от возникновения остеофита с соседней дегенерацией хряща (наружная 1/3) через поверхность до точки, где тангенциальный слой и лежащий ниже хрящ выглядят гистологически нормальными.
[0272]
Значительную дегенерацию хряща определяют как потерю хондроцитов и протеогликана, простирающуюся более, чем на 50% толщины хряща, как измерено посредством оптического микрометра. Как правило, в этой модели разрушение коллагена является слабым (определенным как ~25% глубины) или большим, однако потеря хондроцитов и протеогликана является значительной и простирается по меньшей мере на 50% или более глубины хряща, что является показателем областей, в которых произошли постоянные структурные изменения. Ширину прооперированных суставов, для которых показана значительная дегенерация хряща, измеряли у подвергнутых лечению Gly-CNP-37 животных и в контроле после обработки носителем для оценки способности вариантов CNP к уменьшению значительной дегенерации. Как показано на фигуре 4, в контроле после обработки носителем показано от небольшого уменьшения до отсутствия уменьшения ширины дегенерации, в то время как для ширины у подвергнутых лечению Gly-CNP-37 животных показано более, чем 50% улучшение для значительной дегенерации хряща большеберцовой кости.
Повреждение кальцифицированного слоя хряща и субхондральной кости
[0273]
Повреждение кальцифицированного слоя хряща и субхондральной кости оценивали в баллах с использованием критериев в таблице 2.
ТАБЛИЦА 2: Критерии гистопатологической оценки для повреждения слоя хряща и субхондральной кости.
БАЛЛ
КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ
0
Без изменений.
1
Увеличенная базофилия на границе кальцификации, отсутствие фрагментации границы кальцификации, отсутствие изменений костного мозга или, если присутствуют, минимальные и фокальные изменения, поражение менее 10% линейной ширины границы кальцификации.
2
Увеличенная базофилия на границе кальцификации, от минимальной до слабой фокальной фрагментации кальцифицированного хряща на границе кальцификации поражает приблизительно 1-10% линейной ширины границы кальцификации, мезенхимальное изменение костного мозга затрагивает вплоть до 1/4 общей площади, но, как правило, ограничено субхондральной областью под повреждением, отсутствие разрушения хряща в эпифизарной кости.
3
Увеличенная базофилия на границе кальцификации, от слабой до умеренной фокальной или мультифокальной фрагментации или потери кальцифицированного хряща/субхондральной кости (мультифокальной) поражает 11-25% линейной ширины границы кальцификации, мезенхимальное изменение костного мозга затрагивает вплоть до 3/4 общей площади, могут быть очевидны области хондрогенеза костного мозга с фокальным разрушением суставного хряща в эпифизарной кости глубиной менее 200 мкм.
4
Увеличенная базофилия на границе кальцификации, от заметной до тяжелой фрагментации и/или потеря кальцифицированного хряща/субхондральной кости поражает 26-50% линейной ширины границы кальцификации, мезенхимальное изменение костного мозга затрагивает вплоть до 3/4 площади, и суставной хрящ может быть разрушен в эпифизе до глубины 200-350 мкм или менее от границы кальцификации.
5
Увеличенная базофилия на границе кальцификации, от заметной до тяжелой фрагментации и/или потеря кальцифицированного хряща/субхондральной кости поражает более 50% ширины границы кальцификации, мезенхимальное изменение костного мозга затрагивает вплоть до 3/4 площади, и суставной хрящ может быть разрушен в эпифизе до глубины более 350 мкм от границы кальцификации.
[0274]
Лечение с использованием Gly-CNP-37 в более высокой дозе (110 мкг/дозу) уменьшало повреждение кальцифицированного хряща и субхондральной кости от показателя приблизительно 2,4 у животных, подвергнутых воздействию носителя, до 1,3 у животных, подвергнутых лечению Gly-CNP-37. Лечение с использованием Gly-CNP-37 в более низкой дозе (35,5 мкг/дозу) также уменьшало повреждение кальцифицированного хряща и субхондральной кости, но до меньшей степени, чем для более высокой дозы.
Утолщение большеберцовой кости, толщина остеофита и общий показатель для суставов
[0275]
Утолщение/склерозмедиальной большеберцовой кости субхондральной/эпифизарной губчатой кости оценивали в баллах на основании критериев, показанных в таблице 3, с использованием сравнения с латеральной большеберцовой костью и/или нормальной левой медиальной большеберцовой костью.
ТАБЛИЦА 3: Гистопатологическая оценка в баллах утолщения кости
БАЛЛ
КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ
0
Нормальная, отсутствие поддающихся наблюдению отличий толщины субхондральной или эпифизарной губчатой кости для медиальной по сравнению с латеральной.
1
5-10% увеличение толщины субхондральной или эпифизарной губчатой кости для медиальной по сравнению с латеральной.
2
11-25% увеличение толщины субхондральной или эпифизарной губчатой кости для медиальной по сравнению с латеральной.
3
26-50% увеличение толщины субхондральной или эпифизарной губчатой кости для медиальной по сравнению с латеральной, явное уменьшение пространства костного мозга в наружных ¾ медиальной большеберцовой кости.
4
51-75% увеличение толщины субхондральной или эпифизарной губчатой кости для медиальной по сравнению с латеральной, как правило, наличие очень небольшого пространства костного мозга в наружных ¾ медиальной большеберцовой кости, пространство костного мозга остается рядом с крестообразными связками.
5
76-100% толщины субхондральной или эпифизарной губчатой кости для медиальной по сравнению с латеральной, как правило, наличие очень небольшого пространства костного мозга, оставшегося в медиальной большеберцовой кости.
[0276]
Для лечения с использованием with Gly-CNP-37 в обеих дозах показано поддающееся наблюдению уменьшение утолщения/склероза в медиальной большеберцовой субхондральной/эпифизарной губчатой кости по сравнению с контролем, подвергнутым обработке носителем, хотя для результатов не показано значимости, установленной в настоящем исследовании.
[0277]
Толщину остеофита (от границы кальцификации до самой дальней точки по направлению к синовиальной оболочки) измеряли с использованием оптического микрометра. Показатели относили к наибольшему остеофиту на каждом срезе (как правило, обнаруженному на большеберцовой кости), в соответствии с критериями в таблице 4.
ТАБЛИЦА 4: Оценка в баллах толщины остеофита
БАЛЛ
КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ
0
Менее 200 мкм.
1
Маленький, 200-299 мкм.
2
Средний, 300-399 мкм.
3
Большой, 400-499 мкм.
4
Очень большой, 500-599 мкм.
5
Очень большой, ≥600 мкм.
[0278]
Лечение с использованием Gly-CNP-37 в высокой дозе (110 мкг/дозу) уменьшало измерение остеофита большеберцовой кости приблизительно на 24% (p <0,05) и уменьшало показатель для остеофита большеберцовой кости приблизительно на 34% (p <0,05). Остеофиты представляют собой наросты на кости, возникающие в суставах при OA. Данные показателей для остеофитов показывают, что варианты CNP являются способными уменьшать рост остеофитов, т.е., кости. Это наблюдение является удивительным и неожиданным, принимая во внимание известную роль CNP и вариантов CNP для стимуляции роста кости.
[0279] «
Общие показатели для суставов» рассчитывали для каждого сустава посредством суммирования показателей для каждой из трех зон для дегенерации хряща большеберцовой и бедренной кости и показателя для остеофитов (общий показатель для суставов с бедренной костью), и посредством суммирования показателей для каждой из трех зон только для дегенерации хряща большеберцовой кости и показателя для остеофитов (общий показатель для суставов без бедренной кости). Как показано на фигуре 5, Gly-CNP-37 при 110 мкг/дозу значимо уменьшал общий показатель для суставов без бедренной кости. Показано также лечение с использованием Gly-CNP-37 в более низкой дозе 35,5 мкг/дозу, и оно улучшало общий показатель для суставов без бедренной кости, хотя и в меньшей степени по сравнению с более высокой дозой. При включении показателя для бедренной кости (Фигура 6), результаты показывают, что Gly-CNP-37 уменьшает общий показатель для суставов в обеих дозах, но не до значимого уровня.
[0280]
Разрушение коллагена, толщина пластины роста, и репарация связок/синовиума
[0281]
Разрушение коллагена на протяжении плато медиальной большеберцовой кости (наиболее серьезно пораженной части из двух половин) оценивали посредством измерения общей толщины следующего с использованием оптического микрометра и следующих параметры: любое разрушение (фибрилляция в диапазоне от поверхностной до полной потери толщины); тяжелое разрушение (полная или почти полная потеря коллагена до границы кальцификации, >90% толщины); заметное разрушение (простирается через 61-90% толщины хряща); умеренное разрушение (простирается через 31-60% толщины хряща); слабое разрушение (простирается через 11-30% толщины хряща); и минимальное разрушение (очень поверхностное, поражающее только верхние 10%).
[0282]
Лечение с использованием Gly-CNP-37 как в более низкой, так и в более высокой дозах приводило к наличию меньших областей с тяжелой, заметной и умеренной дегенерацией по сравнению с контролем без лечения.
[0283]
Толщинупластины роста измеряли во всех коленях с медиальной и латеральной стороны (2 измерения/сустав) приблизительно в средней точке медиальной и латеральной хрящевой пластины роста (принимая нетангенциальную область среза) с использованием оптического микрометра. Введение Gly-CNP-37 в дозе 110 мкг значимо уменьшало медиальную толщину пластина роста. Для Gly-CNP-37 в дозе 35,5 мкг показано уменьшение медиальной толщины, но не значимое уменьшение по статистическому анализу (Фигура 7). Проводили также дифференциальный анализ, в котором латеральную толщину вычитали из медиальной для определения отличий между ними двумя. На фигуре 8 показано, что с использованием этого анализа, Gly-CNP-37 в более высокой дозе значимо уменьшал толщину пластины роста, в то время как более низкая доза уменьшала толщину пластины роста, но не до той же степени, как более высокая доза.
[0284]
Репарациюмедиальной коллатеральной связки/синовиума также анализировали посредством измерения толщины репарации медиального синовиума/коллатеральной связки в нетангенциальной области среза с использованием оптического микрометра. Это измерение не показало каких-либо отличий между группами лечения.
Анализ походки
[0285]
Анализ походки проводили посредством нанесения чернил на вентральную поверхность лапы и документации нагрузки на лапу во время движения (отпечатки лап) через бумагу. Задние лапы крыс помещали в чернила, и затем крыс помещали на бумагу и позволяли проходить полную длину. Походку оценивали в баллах визуально с использованием критериев в таблице 5 (описания относятся к пораженной заболеванием/поврежденной лапе).
ТАБЛИЦА 5: Критерии оценки в баллах при анализе походки
БАЛЛ
КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ
0
Нормальная, окрашивание чернилами приблизительно эквивалентное нормальной лапе.
1
Очень слабая хромота/боль=уменьшение площади окрашивания чернилами по сравнению с нормальной лапой, однако нет полностью отсутствующих областей или структур.
2
Слабая хромота/боль=отпечаток простирается до конца или почти до конца структуры «узора». Если нормальная лапа имеет очень слабое окрашивание пятки (крыса ходит в основном на пальцах/подушечке стопы), тогда немного более слабое окрашивание.
3
Умеренная хромота/боль=пальцы и полная подушечка стопы, простирается до верха «узора» лапы. Если нормальная лапа имеет очень слабое окрашивание пятки (крыса ходит в основном на пальцах/подушечке стопы), тогда пальцы с небольшой частью подушечки стопы.
4
Заметная хромота/боль=пальцы и частичная подушечка стопы, отсутствие пятки или задней лапы. Если нормальная лапа имеет очень слабое окрашивание пятки (крыса ходит в основном на пальцах/подушечке стопы), тогда только пальцы.
5
Тяжелая хромота/боль=только пальцы, отсутствие подушечки стопы, отсутствие пятки. Если нормальная лапа имеет очень слабое окрашивание пятки (крыса ходит в основном на пальцах/подушечке стопы), тогда частичные пальцы или неспецифические отпечатки.
6
Скачки или волочение лапы, отсутствие явных отпечатков лапы.
[0286]
Для подвергнутых лечению Gly-CNP-37 животных, при любой из более высокой или более низкой дозы, показано улучшение подвижности и походки приблизительно от суток 15 до суток 28 исследования (Фигура 9). Рассчитывали также площадь под кривой (AUC) для показателя походки. На фигуре 10 показано, что Gly-CNP-37 в более низкой дозе уменьшал показатель походки в большей степени, чем CNP в более высокой дозе, где показатель походки являлся более низким для обеих подвергнутых лечению популяций по сравнению с контролем без лечения.
[0287]
Результаты, представленные в этом примере 1, показывают, что лечение остеоартрита с использованием вариантов CNP, таких как Gly-CNP-37, в короткий период времени после травмы, оказывает благоприятные эффекты на симптомы остеоартрита, включая дегенерацию хряща и подвижность пораженных субъектов.
Пример 2
[0288]
Дополнительные исследования на крысах проводили с использованием модели на крысах и экспериментальных способов из примера 1 для исследования использования второго варианта CNP, Pro-Gly-CNP-37, при лечении остеоартрита и для его сравнения с Gly-CNP-37.
ТАБЛИЦА 6: Дизайн исследования и группы
Группа
No. самцов
Лечение
Способ дозирования
Режим дозирования
Уровень дозы
Концентрация (мг/мл)
Объем дозы
1
12
Носитель
IA
TIWx3W
0 мкг
0
50 мкл
2
12
Pro-Gly-CNP-37
IA
TIWx3W
10,5 мкг
0,21
50 мкл
3
12
Pro-Gly-CNP-37
IA
TIWx3W
35,5 мкг
0,71
50 мкл
4
12
Pro-Gly-CNP-37
IA
TIWx3W
105 мкг
2,1
50 мкл
5
12
Gly-CNP-37
IA
TIWx3W
105 мкг
2,1
50 мкл
6
15
Носитель
SC
QDx3W
0 мкг/кг
0
0,83 мл/кг
7
15
Pro-Gly-CNP-37
SC
QDx3W
150 мкг/кг
0,18
0,83 мл/кг
[0289]
Как обобщено в таблице 6, группы крыс обрабатывали с использованием носителя, Pro-Gly-CNP-37 или Gly-CNP-37. Способ дозирования представлял собой внутрисуставной (IA) или подкожный (SC). Расписание дозирования представляло собой либо внутрисуставное введение три раза в неделю (M, W и F) в течение 3 недель (TIWx3W) или подкожное введение один раз в сутки в течение приблизительно 3 недель (QDx3W). Крыс подвергали хирургическому вмешательству на сутки исследования 0; группы 1-5 подвергали хирургическому вмешательству приблизительно за 1 неделю до групп 6-7 (т.е., исследование проводили ступенчатым способом). Инъекции IA вводили в фиксированной дозе, в то время как инъекции SC вводили в данной доз не массу на основании наиболее недавно зарегистрированной массы тела. Для всех крыс, массу тела измеряли перед дозированием. Для 300-граммовой крысы, режим IA дозирования раза в неделю для низкого, среднего и высокого уровней являлся приблизительно эквивалентным 15, 50 и 150 мкг/кг/сутки, соответственно. Крыс подвергали эвтаназии на сутки 25 после последней дозы, и их суставы собирали для гистопатологического анализа и оценки в баллах.
Фармакокинетика и фармакодинамика в плазме
[0290]
Оценивали фармакокинетические(PK) и фармакодинамические (PD) свойства вариантов CNP. Для анализа PK/PD, отбор крови по расписанию проводили для 3 крыс/группу/временную точку следующим образом: через 15, 30, 60 и 120 минут после дозирования для групп IA, и через 5, 15, 30, 60 и 120 минут после дозирования для групп SC. После отбора крови, жидкость синовиального лаважа (SLF, ~50 мкл/колено) собирали из левого (нормального) и правого (прооперированного) колена каждой крысы.
Гистопатология и иммуногистохимия
[0291]
Колени сохраняли для гистопатологического и иммуногистохимического (IHC) анализа. Первичная конечная точка представляла собой гистопатологическое исследование гибели хондроцитов и дегенерации хряща в колене, включая IHC по ядерному антигену пролиферирующих клеток (PCNA). Различные гистопатологические признаки измеряли и оценивали в баллах, как описано выше в примере 1, в частности, см. критерии оценки в баллах в таблицах 1-5.
[0292]
Общую ширину хряща большеберцовой кости, пораженного какой-либо дегенерацией (потерей клеток, потерей протеогликана или разрушением коллагена) измеряли посредством оптического микрометра. Как показано на фигуре 11, Pro-Gly-CNP-37, введенный IA в средней и высокой дозах, значимо уменьшал общую ширину дегенерации хряща приблизительно на 26% и 32%, соответственно. Таким образом, для IA доз 35,5 мкг и 105 мкг достигнута статистическая значимость для ширины дегенерации хряща большеберцовой кости.
[0293]
Эффект вариантов CNP на значительную дегенерацию хряща, как определено по потере хондроцитов и протеогликана, простирающейся более чем на 50% толщины хряща, измеряли на плато большеберцовой кости посредством оптического микрометра. Зависимое от дозы уменьшение значительной дегенерации хряща наблюдали для Pro-Gly-CNP-37, доставляемого внутрисуставным способом (Фигура 12), с 32% уменьшением ширины, наблюдаемым с использованием дозы 35,5 мкг IA, и 36% уменьшением, наблюдаемым с использованием дозы 105 мкг IA. Статистически значимое уменьшение наблюдали для 150 мкг/кг Pro-Gly-CNP-37, вводимого подкожно ежесуточно в течение трех недель (42% уменьшение ширины).
[0294]
Толщину остеофита (от границы кальцификации до самой дальней точки по направлению к синовиальной оболочки) измеряли с использованием оптического микрометра. Тенденцию ответа в зависимости от дозы для показателя остеофитов медиальной большеберцовой кости наблюдали для Pro-Gly-CNP-37, вводимого IA способом (Фигура 13), с 15% уменьшением, наблюдаемым при 35,5 мкг IA, и 14% уменьшением, наблюдаемым при 105 мкг IA. Кроме того, статистически значимое уменьшение (p<0,05 по t-критерию) на 26% наблюдали для Pro-Gly-CNP-37, вводимого подкожно. Уменьшения показателя остеофитов показали, что варианты CNP являются способными уменьшать аномальный рост кости (остеофиты) в суставах с OA. И снова, это наблюдение является удивительным и неожиданным, поскольку показано, что CNP и варианты CNP стимулируют рост длинной кости.
[0295]
Толщину пластины роста измеряли для каждой из групп. Медиальная и латеральная толщина пластины роста была значимо большей у животных, подвергнутых лечению IA как 35,5 мкг IA, так и 105 мкг IA Pro-Gly-CNP-37 (Фигура 14). Кроме того, медиальная и латеральная толщина пластины роста также была значимо большей у животных, подвергнутых лечению SC с использованием Pro-Gly-CNP-37, по сравнению с носителем.
[0296]
Общие показатели для суставов (без бедренной кости) рассчитывали посредством суммирования показателей для каждой из трех зон большеберцовой кости дегенерация хряща и показателя остеофитов. Как видно на фигуре 15, значимое уменьшение тяжести показателя для суставов наблюдали для IA введения 35,5 и 105 мкг Pro-Gly-CNP-37, а также для 105 мкг Gly-CNP-37. Значимое уменьшение общего показателя для суставов (минус бедренная кость) наблюдали также для Pro-Gly-CNP-37, введенного SC.
[0297]
На фигуре 16 показаны показатели синовита. Синовиальное воспаление (в основном инфильтрацию мононуклеарных клеток, сконцентрированную на медиальной стороне) оценивали в баллах с использованием критериев в таблице 7.
ТАБЛИЦА 7: Оценка в баллах воспаления синовиальной оболочки
БАЛЛ
КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ
0
Нормальная синовиальная оболочка.
0,5
Самый минимальный синовит (как правило, фокальный или рассеянный минимальный диффузный).
1
Минимальный синовит (как правило, фокальный или рассеянный минимальный диффузный).
2
Слабый синовит (от мультифокального до конфлюэнтных областей слабой инфильтрации мононуклеарных клеток).
3
Умеренный синовит (конфлюэнтные области умеренной инфильтрации мононуклеарных клеток).
4
Заметный синовит (конфлюэнтные области заметной инфильтрации мононуклеарных клеток).
5
Тяжелый синовит (конфлюэнтные области тяжелой инфильтрации мононуклеарных клеток).
[0298]
Не наблюдали значимого увеличения тяжести показателей синовита среди всех групп дозирования. Уровень эндотоксина был ниже предела количественного определения (<0,5 ед./мл) во всех составах, за исключением состава Gly-CNP-37 (0,78 ед./мл).
[0299]
На фигуре 17 показано среднее изменение массы тела (в граммах) от суток -4 до 25 для различных групп. Значимое уменьшение увеличения массы тела наблюдали для Pro-Gly-CNP-37, вводимого IA как при 35,5, так и при 105 мкг/дозу, и вводимого SC при дозе 150 мкг/кг/сутки.
[0300]
На фигуре 18 показаны показатели анализа походки для групп. Показатель походки был значимо уменьшен (48%) для Pro-Gly-CNP-37, вводимого подкожно, по сравнению с носителем на сутки 8.
[0301]
1/2
На фигуре 19 и в таблице 8 показана фармакокинетика в плазме для животных, подвергнутых лечению с использованием Pro-Gly-CNP-37 (группы 2, 3 и 4 (IA введение) и группа 7 (SC введение)). В индивидуальных образцах плазмы анализировали уровни Pro-Gly-SNP-37, и профили средней концентрации в зависимости от времени анализировали с использованием некомпартментной модели для внесосудистого введения в программном обеспечении Phoenix WinNonlin. Данные для каждой группы наносили на график и помечали (над каждой линией) соответствующим номером группы на фигуре 19. Pro-Gly-CNP-37 быстро появлялся в системном кровотоке после инъекций как IA, так и SC. Воздействие инъекций IA (группы 2, 3 и 4), как правило, являлось пропорциональным дозе, без заметного изменения t и CL. Хотя воздействие было сходным с самой низкой из исследованных доз IA, инъекции SC один раз в сутки (группа 7), по-видимому, обеспечивали ответ, сходный по эффективности с инъекциями IA двух наиболее высоких доз, вводимыми три раза/неделю.
ТАБЛИЦА 8: Фармакокинетика вариантов CNP
Группа
С<sub>макс.</sub> (нг/мл)
AUC<sub>last</sub>(нг-мин/мл)
Т<sub>макс.</sub> (мин)
t<sub>1/2</sub> (мин)
CL (мл/мин)
2
33,8
1719
15
27,0
5,77
3
110
5939
15
34,9
5,36
4
357
8827
15
38,1
9,19
7
28,4
980
15
23,8
121
[0302]
Данные показывают, что внутрисуставное лечение с использованием Pro-Gly-CNP-37 (35,5 и 105 мкг) или Gly-CNP-37 (105 мкг) оказывало значимые благоприятные эффекты на гистопатологические повреждения при индуцированном медиальным разрывом мениска остеоартритом у крыс.
[0303]
Подкожное лечение один раз в сутки с использованием 150 мкг/кг/сутки Pro-Gly-CNP-37 обеспечивало сходную или лучшую эффективность, чем внутрисуставное лечение. В общем, в исследованиях показано доказательство хондропротективных эффектов.
Пример 3
[0304]
Модель остеоартрита на поздних стадиях использовали для оценки эффективности Pro-Gly-CNP-37 при ранее развившемся остеоартрите (т.е., первичном остеоартрите). Как описано выше в примерах 1 и 2, остеоартрит индуцировали в задних лапах крыс посредством разрезания мениска. Однако, в отличие от примеров 1 и 2, очагу патологии позволяли прогрессировать в течение трех недель перед IA или SC лечением с использованием Pro-Gly-CNP-37, таким образом стимулируя предсуществующий OA (т.е., первичный остеоартрит). Общий дизайн исследования описан в таблице 9. В частности, самцов крыс Lewis подвергали хирургической операции одностороннего медиального разрыва мениска на сутки исследования 0; введение контрольного носителя или Pro-Gly-CNP-37 начинали на сутки исследования 21; и животных подвергали эвтаназии во временных точках по расписанию после последней дозы на сутки исследования 22 (группы 1-4) или сутки исследования 40 (группы 5-11). Исследованные первичные конечные точки включали гистопатологическое исследование гибели хондроцитов/дегенерации хряща в колене.
ТАБЛИЦА 9: Дизайн и группы исследования остеоартрита на поздних стадиях
Группа
Прооперирована
Лечение
Уровень дозы
ROA
Окончание
1 и 6
Да
Носитель
0 мкг
IA
Сутки 22 или 41
7
Да
Pro-Gly-CNP-37
35,5 мкг
IA
Сутки 41
2 и 8
Да
Pro-Gly-CNP-37
105 мкг
IA
Сутки 22 или 41
3 и 9
Да
Носитель
0 мкг/кг
SC
Сутки 22 или 41
10
Да
Pro-Gly-CNP-37
50 мкг/кг
SC
Сутки 41
4
Да
Pro-Gly-CNP-37
150 мкг/кг
SC
Сутки 22 или 41
5
Нет
Нет
N/A
N/A
Сутки 41
[0305]
Все животные выжили до точек окончания исследования по расписанию. По окончанию исследования, крыс подвергали эвтаназии, и их колени собирали, фиксировали и получали срезы для гистопатологического анализа, и оценивали в баллах, как в таблицах 1-5 и 7. Обобщение результатов исследования представлено в таблице 10.
[0306]
Для лечения с использованием Pro-Gly-CNP-37 (35,5 или 105 мкг), дозированного IA, TIWx3W, и лечения с использованием Pro-Gly-CNP-37 (150 мкг/кг), дозированного SC, QDx3W, показан благоприятный эффект, от слабого до значительного, на индуцированный разрывом мениска остеоартрит на поздних стадиях, как определено посредством оценки гистопатологии колена. Результаты лечения IA с использованием Pro-Gly-CNP-37 являлись зависимыми от дозы.
[0307]
Параметрыартрита были в основном сходными среди контрольных групп с носителем, хотя тяжесть поражений являлась немного увеличенной в контроле SC по сравнению с контролем IA, за исключением синовита, который являлся уменьшенным у крыс, подвергнутых SC лечению. Увеличение массы тела являлось значимо увеличенным в контроле с SC носителем через 40 суток после хирургического вмешательства по сравнению с контролем IA.
ТАБЛИЦА 10: Обобщение клинических и гистопатологических данных
Группа
Лечение
Общая ширина CD большеберцовой кости (мкм)
Ширина значительной CD большеберцовой кости (мкм)
Общий показатель CD большеберцовой кости
Измерение остеофита (мкм)
Общий показатель для суставов с бедренной костью
1
Носитель IA, 1x(d21) сутки некропсии 22
1633,3 (195,88)
480,56 (113,89)
4,83 (0,76)
341,67 (24,25)
7,89 (0,99)
2
Pro-Gly-CNP-37 (105 мкг) IA, 1x(d21) сутки некропсии 22
1694,44 (134,83)
480,56 (92,64)
4,81 (0,49)
402,78 (25,61)
8,97 (0,64)
3
Носитель SC, 1x (d21) сутки некропсии 22
1577,78 (110,78)
569,44 (92,04)
5,39 (0,65)
375,00 (18,63)
9,36 (1,02)
4
Pro-Gly-CNP-37 (150 мкг/кг) SC, 1x (d21), сутки некропсии 22
1550,00 (109,80)
572,22 (58,95)
5,14 (0,34)
383,33 (23,96)
8,86 (0,62)
5
Нормальная, сутки некропсии 40
111,11†‡ (37,18)
0,00†‡ (0,00)
0,08†‡ (0,04)
0,00†‡ (0,00)
0,08†‡ (0,04)
6
Носитель IA, TIWx3W, сутки некропсии 40
1622,22 (107,88)
509,72 (57,79)
4,93 (0,43)
441,67 (15,56)
9,07 (0,65)
7
Pro-Gly-CNP-37 (35,5 мкг) IA, TIWx3W, сутки некропсии 40
1605,56 (71,38)
358,33 (71,38)
3,96 (0,46)
452,78 (22,74)
8,44 (0,60)
8
Pro-Gly-CNP-37 IA, TIWx3W, сутки некропсии 40
1200,00* (69,63)
313,89 (51,12)
3,43* (0,32)
423,61 (28,53)
7,38 (0,73)
9
Носитель SC, QDx3W, сутки некропсии 40
1741,67 (75,22)
526,39 (51,84)
5,06 (0,39)
472,22 (22,41)
9,75 (0,69)
10
Pro-Gly-CNP-37 (50 мкг) SC, QDx3W, сутки некропсии 40
1847,22 (46,14)
498,61 (60,18)
4,83 (0,41)
473,61 (0,41)
9,82 (0,73)
11
Pro-Gly-CNP-37 (150 мкг) SC, QDx3W, сутки некропсии 40
1375,00* (98,91)
443,06 (80,70)
4,43 (0,59)
444,44 (18,95)
9,03 (0,85)
CD=Дегенерация хряща, IA=Внутрисуставной, SC=Подкожный, TIWx3W=Три раза в неделю в течение трех недель, QDx3W=Один раз в сутки в течение приблизительно 3 недель (20 суток).
(SE)=Стандартная ошибка, показанная в скобках.
*p<0,05 ANOVA/критерий K-W (апостериорный критерий Даннетта/Данна) по сравнению с соответствующим контролем IA или SC носителем (сутки 40).
†p<0,05, t-критерий Стьюдента/критерий M-W по сравнению с IA носителем (сутки 40).
‡p<0,05 t-критерий Стьюдента/критерий M-W по сравнению с SC носителем (сутки 40).
[0308]
Крысы, подвергнутые лечению IA с использованием 35,5 мкг Pro-Gly-CNP-37, имеют значимо (на 31%) уменьшенные показатели дегенерации хряща зоны-2 большеберцовой кости по сравнению с контролем с IA носителем. Суммарные показатели дегенерации хряща большеберцовой кости и ширина значительной дегенерации хряща большеберцовой кости незначимо уменьшались на 20% и 30%, соответственно. Показатели дегенерации хряща зоны-3 медиальной большеберцовой кости и показатели дегенерации хряща зоны-1 бедренной кости значимо увеличивались, хотя повреждения, как правило, являлись минимальными или слабыми, когда присутствовали.
[0309]
Крысы, подвергнутые лечению IA с использованием 105 мкг Pro-Gly-CNP-37, имели значимо уменьшенное увеличение массы тела по сравнению с контролем с IA носителем. Лечение IA с использованием 105 мкг Pro-Gly-CNP-37 значимо уменьшало дегенерацию хряща зоны-2 медиальной большеберцовой кости (уменьшение на 44%), дегенерацию хряща зоны-3 медиальный большеберцовой кости (на 93%), суммарную дегенерацию хряща медиальной большеберцовой кости (на 31%), и общую ширину дегенерации хряща большеберцовой кости (на 28%) по сравнению с контролем с IA носителем. Ширину значительной дегенерации хряща большеберцовой кости незначимо (на 38%) уменьшали посредством лечения.
[0310]
Крысы, подвергнутые лечению SC с использованием 150 мкг/кг Pro-Gly-CNP-37, имели значимо уменьшенное увеличение массы тела по сравнению с контролем с SC носителем. Лечение с использованием 150 мкг/кг Pro-Gly-CNP-37 (SC) значимо уменьшало общую ширину дегенерации хряща большеберцовой кости (уменьшение на 22%) по сравнению с контролем с SC носителем. Ширину значительной дегенерации хряща большеберцовой кости незначимо (на 16%) уменьшали посредством лечения. Медиальную и латеральную толщину пластины роста значимо увеличивали посредством лечения, внося вклад в значимое уменьшение отличий между медиальной и латеральной толщиной.
[0311]
Как показано на фигуре 20, лечение Pro-Gly-CNP-37 при 105 мкг IA и при 150 мкг/кг SC приводило к уменьшению средней дегенерации хряща большеберцовой кости. Однако, значительную дегенерацию хряща большеберцовой кости уменьшали посредством лечения дозами IA, так же как самой высокой дозой SC (Фигура 21). Кроме того, Pro-Gly-CNP-37, введенный IA, приводил к статистически значимому уменьшению показателей дегенерации хряща медиальный большеберцовой кости (Фигура 22) и отношения глубины дегенерации хряща медиальный большеберцовой кости (Фигура 23).
[0312]
Как описано выше в примерах 1 и 2, общие показатели для суставов рассчитывали для каждого сустава (с бедренной костью и без) посредством гистопатологического анализа и оценки в баллах. Pro-Gly-CNP-37, введенный IA, приводил к 7% (35,5 мкг) и 19% (105 мкг) уменьшению показателей для суставов с бедренной костью и 11% (35,5 мкг) и 21% (105 мкг) уменьшению при расчете без бедренной кости (Фигуры 24 (с бедренной костью) и 25 (без бедренной кости). Для Pro-Gly-CNP-37, введенного SC, получали более умеренное уменьшение при самом высоком уровне дозы (150 мкг/кг) - 7% (с бедренной костью) и 10% (без бедренной кости)(Фигуры 24 и 25).
[0313]
Как видно на фигуре 26, лечение Pro-Gly-CNP-37 оказывало умеренные эффекты на показатель для остеофитов при всех дозах и способах введения. Как и для исследования остеоартрита на более ранних стадиях, описанного в примере 2, Pro-Gly-CNP-37, лечение приводило к уменьшению изменения массы тела у подвергнутых лечению животных (Фигура 27).
[0314]
Настоящее изобретение можно осуществлять в других конкретных формах без отклонения от объема изобретения. Любые ссылки на «изобретение» предназначены, чтобы относиться к иллюстративным вариантам осуществления изобретения, и их не следует рассматривать как относящиеся ко всем вариантам осуществления изобретения, если контекст не требует иного. Описанные варианты осуществления следует рассматривать во всех отношениях только как иллюстративные, а не ограничивающие; многочисленные варианты и модификации очевидны специалистам в данной области.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Biomarin Pharmaceutical Inc.
<120>  ПРИМЕНЕНИЕ ВАРИАНТОВ НАТРИЙУРЕТИЧЕСКОГО ПЕПТИДА ТИПА C ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ
ОСТЕОАРТРИТА
<130>  30610/49583
<150>  US 62/264682
<151>  2015-12-08
<160>  158
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  39
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Pro-Gly-CNP37
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Pro-Gly-wtCNP37
<400>  1
Pro Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys
1               5                   10                  15
Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
20                  25                  30
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  2
<211>  38
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Gly-CNP-37
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Gly-wtCNP37
<400>  2
Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20                  25                  30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  3
<211>  54
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Gly-CNP53
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Gly-wtCNP53
<400>  3
Gly Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys
20                  25                  30
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
35                  40                  45
Met Ser Gly Leu Gly Cys
50
<210>  4
<211>  54
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Pro-CNP53
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Pro-wtCNP53
<400>  4
Pro Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys
20                  25                  30
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
35                  40                  45
Met Ser Gly Leu Gly Cys
50
<210>  5
<211>  54
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Met-CNP53
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Met-wtCNP53
<400>  5
Met Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu
1               5                   10                  15
Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys
20                  25                  30
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
35                  40                  45
Met Ser Gly Leu Gly Cys
50
<210>  6
<211>  53
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-53(M48N)
<400>  6
Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu
1               5                   10                  15
Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly
20                  25                  30
Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Asn
35                  40                  45
Ser Gly Leu Gly Cys
50
<210>  7
<211>  52
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-52
<400>  7
Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln
1               5                   10                  15
Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu
20                  25                  30
Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser
35                  40                  45
Gly Leu Gly Cys
50
<210>  8
<211>  51
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-51
<400>  8
Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu
1               5                   10                  15
His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser
20                  25                  30
Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly
35                  40                  45
Leu Gly Cys
50
<210>  9
<211>  50
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-50
<400>  9
Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His
1               5                   10                  15
Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys
20                  25                  30
Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu
35                  40                  45
Gly Cys
50
<210>  10
<211>  49
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-49
<400>  10
Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro
1               5                   10                  15
Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly
20                  25                  30
Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly
35                  40                  45
Cys
<210>  11
<211>  48
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-48
<400>  11
Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn
1               5                   10                  15
Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys
20                  25                  30
Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35                  40                  45
<210>  12
<211>  47
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-47
<400>  12
Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala
1               5                   10                  15
Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe
20                  25                  30
Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35                  40                  45
<210>  13
<211>  46
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-46
<400>  13
Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg
1               5                   10                  15
Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly
20                  25                  30
Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35                  40                  45
<210>  14
<211>  45
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-45
<400>  14
Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys
1               5                   10                  15
Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu
20                  25                  30
Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35                  40                  45
<210>  15
<211>  44
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-44
<400>  15
Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr
1               5                   10                  15
Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys
20                  25                  30
Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35                  40
<210>  16
<211>  43
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-43
<400>  16
Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys
1               5                   10                  15
Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
20                  25                  30
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35                  40
<210>  17
<211>  42
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-42
<400>  17
Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly
1               5                   10                  15
Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp
20                  25                  30
Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35                  40
<210>  18
<211>  41
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-41
<400>  18
Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala
1               5                   10                  15
Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg
20                  25                  30
Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35                  40
<210>  19
<211>  40
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-40
<400>  19
Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn
1               5                   10                  15
Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile
20                  25                  30
Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35                  40
<210>  20
<211>  39
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-39
<400>  20
Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys
1               5                   10                  15
Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
20                  25                  30
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  21
<211>  38
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-38
<400>  21
Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20                  25                  30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  22
<211>  37
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-37
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  wtCNP37
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог BL
<400>  22
Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
20                  25                  30
Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  23
<211>  36
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-36
<400>  23
Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser
20                  25                  30
Gly Leu Gly Cys
35
<210>  24
<211>  35
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-35
<400>  24
His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser
1               5                   10                  15
Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly
20                  25                  30
Leu Gly Cys
35
<210>  25
<211>  34
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-34
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  wtCNP34
<400>  25
Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys
1               5                   10                  15
Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu
20                  25                  30
Gly Cys
<210>  26
<211>  33
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-33
<400>  26
Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly
1               5                   10                  15
Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly
20                  25                  30
Cys
<210>  27
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-32
<400>  27
Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys
1               5                   10                  15
Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25                  30
<210>  28
<211>  31
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-31
<400>  28
Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe
1               5                   10                  15
Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25                  30
<210>  29
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-30
<400>  29
Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly
1               5                   10                  15
Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25                  30
<210>  30
<211>  29
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-29
<400>  30
Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu
1               5                   10                  15
Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  31
<211>  28
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-28
<400>  31
Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys
1               5                   10                  15
Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  32
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-27
<400>  32
Gly Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  33
<211>  26
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-26
<400>  33
Ala Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp
1               5                   10                  15
Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  34
<211>  25
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-25
<400>  34
Asn Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg
1               5                   10                  15
Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  35
<211>  24
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-24
<400>  35
Lys Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile
1               5                   10                  15
Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  36
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-23
<400>  36
Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  37
<211>  22
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-22
<400>  37
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
1               5                   10                  15
Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  38
<211>  21
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-21
<400>  38
Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
1               5                   10                  15
Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  39
<211>  20
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-20
<400>  39
Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser
1               5                   10                  15
Gly Leu Gly Cys
20
<210>  40
<211>  19
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-19
<400>  40
Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly
1               5                   10                  15
Leu Gly Cys
<210>  41
<211>  18
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-18
<400>  41
Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu
1               5                   10                  15
Gly Cys
<210>  42
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-17
<400>  42
Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Cys
<210>  43
<211>  37
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-37(M32N)
<400>  43
Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Asn
20                  25                  30
Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  44
<211>  38
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Pro-CNP-37
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Pro-wtCNP37
<400>  44
Pro Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20                  25                  30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  45
<211>  38
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Met-CNP-37
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Met-wtCNP37
<400>  45
Met Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20                  25                  30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  46
<211>  38
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Gly-CNP-37(M32N)
<400>  46
Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20                  25                  30
Asn Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  47
<211>  39
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Met-Gly-CNP-37
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Met-Gly-wtCNP37
<400>  47
Met Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys
1               5                   10                  15
Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
20                  25                  30
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  48
<211>  38
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  HSA-CNP-27
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  HSA-wtCNP27
<400>  48
Gly His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Gly Ala Asn Lys Lys
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20                  25                  30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  49
<211>  38
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  HSA-CNP-27(M22N)
<400>  49
Gly His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Gly Ala Asn Lys Lys
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20                  25                  30
Asn Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  50
<211>  39
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Pro-HSA-CNP-27
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Pro-HSA-wtCNP27
<400>  50
Pro Gly His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Gly Ala Asn Lys
1               5                   10                  15
Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
20                  25                  30
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  51
<211>  39
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Met-HSA-CNP-27
<400>  51
Met Gly His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Gly Ala Asn Lys
1               5                   10                  15
Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
20                  25                  30
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  52
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-27(K4,5,9R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог AY
<400>  52
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  53
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP-27(K4,5,9R, M22N)
<400>  53
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Asn Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  54
<211>  28
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Pro-CNP-27(K4,5,9R)
<400>  54
Pro Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys
1               5                   10                  15
Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  55
<211>  28
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Met-CNP-27(K4,5,9R)
<400>  55
Met Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys
1               5                   10                  15
Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  56
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEG1K-CNP-27(K4,5,9R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEG1K
<400>  56
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  57
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEG1K-CNP-27(K4,5,9R, M22N)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEG1K
<400>  57
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Asn Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  58
<211>  28
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEG1K-Pro-CNP-27(K4,5,9R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEG1
<400>  58
Pro Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys
1               5                   10                  15
Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  59
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEG1K-Met-CNP-27(K4,5,9R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEG1K
<400>  59
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  60
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO12-CNP-27(K4,5,9R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO12
<400>  60
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  61
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO12-CNP-27(K4,5,9R, M22N)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO12
<400>  61
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Asn Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  62
<211>  28
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO12-Pro-CNP-27(K4,5,9R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO12
<400>  62
Pro Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys
1               5                   10                  15
Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  63
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO12-Met-CNP-27(K4,5,9R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO12
<400>  63
Pro Glu Met Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly
1               5                   10                  15
Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25                  30
<210>  64
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO24-CNP-27(K4,5,9R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO24
<400>  64
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  65
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO24-CNP-27(K4,5,9R, M22N)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO24
<400>  65
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Asn Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  66
<211>  28
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO24-Pro-CNP-27(K4,5,9R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO24
<400>  66
Pro Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys
1               5                   10                  15
Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  67
<211>  30
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO24-Met-CNP-27(K4,5,9R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO24
<400>  67
Pro Glu Met Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly
1               5                   10                  15
Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25                  30
<210>  68
<211>  35
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CA
<400>  68
Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Gly Leu Ser
1               5                   10                  15
Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly
20                  25                  30
Leu Gly Cys
35
<210>  69
<211>  36
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CB
<400>  69
Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser
20                  25                  30
Gly Leu Gly Cys
35
<210>  70
<211>  36
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CC
<400>  70
Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser
20                  25                  30
Gly Leu Gly Cys
35
<210>  71
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  R-CNP22
<400>  71
Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  72
<211>  24
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  ER-CNP22
<400>  72
Glu Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile
1               5                   10                  15
Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  73
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  73
Gly Ala Asn Gln Gln Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  74
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  74
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  75
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  75
Gly Ala Asn Pro Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  76
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  76
Gly Ala Asn Ser Ser Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  77
<211>  32
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CD
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  CNP17, имеющий N-концевой и C-концевой хвосты, происхдящие из BNP
<400>  77
Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp
1               5                   10                  15
Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys Lys Val Leu Arg Arg His
20                  25                  30
<210>  78
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CI
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  GANPR-CNP22(K4R)
<400>  78
Gly Ala Asn Pro Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  79
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог AZ
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  R-CNP22(K4R)
<400>  79
Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  80
<211>  24
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог BA
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  ER-CNP22(K4R)
<400>  80
Glu Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile
1               5                   10                  15
Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  81
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CH
<400>  81
Gly Ala Asn Gln Gln Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  82
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CG
<400>  82
Gly Ala Asn Ser Ser Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  83
<211>  37
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CQ
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  химера богатый гистидином фрагмент гликопротеина (HRGP) - CNP22
<400>  83
Gly His His Ser His Glu Gln His Pro His Gly Ala Asn Gln Gln Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
20                  25                  30
Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  84
<211>  38
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CR
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  химера фрагмент HRGP - CNP22
<400>  84
Gly Ala His His Pro His Glu His Asp Thr His Gly Ala Asn Gln Gln
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20                  25                  30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  85
<211>  37
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CX
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  химера фрагмент HRGP - CNP22
<400>  85
Gly His His Ser His Glu Gln His Pro His Gly Ala Asn Pro Arg Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
20                  25                  30
Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  86
<211>  36
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CF
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  химера фрагмент IgG1(Fc) - CNP22
<400>  86
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser
20                  25                  30
Gly Leu Gly Cys
35
<210>  87
<211>  39
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CY
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  химера фрагмент человеческого сывороточного альбумина (HSA) - CNP22
<400>  87
Gly Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Gly Ala Asn Pro
1               5                   10                  15
Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
20                  25                  30
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  88
<211>  37
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  химера фрагмент HSA - CNP22
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CE
<400>  88
Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
20                  25                  30
Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  89
<211>  35
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CZ
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  химера фрагмент остеокрина «ингибитор NPR C» - CNP22
<400>  89
Phe Gly Ile Pro Met Asp Arg Ile Gly Arg Asn Pro Arg Gly Leu Ser
1               5                   10                  15
Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly
20                  25                  30
Leu Gly Cys
35
<210>  90
<211>  40
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог DA
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  химера фрагмент FGF2 «связывающий гепарин домен» - CNP22
<400>  90
Gly Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly
1               5                   10                  15
Pro Lys Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile
20                  25                  30
Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
35                  40
<210>  91
<211>  37
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CK
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  химера фрагмент IgG1(Fc) - CNP22(K4R)
<400>  91
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Gly Ala Asn Gln Gln Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
20                  25                  30
Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  92
<211>  36
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CL
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  химера фрагмент HSA - CNP22(K4R)
<400>  92
Gly Val Pro Gln Val Ser Thr Ser Thr Gly Ala Asn Gln Gln Gly Leu
1               5                   10                  15
Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser
20                  25                  30
Gly Leu Gly Cys
35
<210>  93
<211>  37
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CM
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  химера фрагмент фибронектина - CNP22(K4R)
<400>  93
Gly Gln Pro Ser Ser Ser Ser Gln Ser Thr Gly Ala Asn Gln Gln Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
20                  25                  30
Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  94
<211>  37
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CN
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  химера фрагмент фибриногена - CNP22(K4R)
<400>  94
Gly Gln Thr His Ser Ser Gly Thr Gln Ser Gly Ala Asn Gln Gln Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
20                  25                  30
Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  95
<211>  37
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CO
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  химера фрагмент фибриногена - CNP22(K4R)
<400>  95
Gly Ser Thr Gly Gln Trp His Ser Glu Ser Gly Ala Asn Gln Gln Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
20                  25                  30
Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  96
<211>  37
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CP
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  химера фрагмент с цинковыми пальцами - CNP22(K4R)
<400>  96
Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala Asn Gln Gln Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
20                  25                  30
Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  97
<211>  38
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CS
<400>  97
Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Pro Lys
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20                  25                  30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  98
<211>  38
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CT
<400>  98
Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Gln Lys
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20                  25                  30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  99
<211>  38
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CU
<400>  99
Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Gln Gln
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20                  25                  30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  100
<211>  38
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог CW
<400>  100
Gly Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Pro
1               5                   10                  15
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
20                  25                  30
Met Ser Gly Leu Gly Cys
35
<210>  101
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO12-GANRR-CNP22(K4R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO12
<400>  101
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  102
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO24-GANRR-CNP22(K4R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO24
<400>  102
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  103
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO24-GANRR-CNP22
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO24
<400>  103
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  104
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO12-GANRR-CNP22
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO12
<400>  104
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  105
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO24-GANPR-CNP22(K4R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO24
<400>  105
Gly Ala Asn Pro Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  106
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO12-GANPR-CNP22(K4R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO12
<400>  106
Gly Ala Asn Pro Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  107
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO24-GANPR-CNP22
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO24
<400>  107
Gly Ala Asn Pro Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  108
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO12-GANPR-CNP22
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO12
<400>  108
Gly Ala Asn Pro Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  109
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO24-GANQQ-CNP22
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO24
<400>  109
Gly Ala Asn Gln Gln Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  110
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO12-GANQQ-CNP22
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO12
<400>  110
Gly Ala Asn Gln Gln Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  111
<211>  24
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO24-ER-CNP22(K4R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO24
<400>  111
Glu Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile
1               5                   10                  15
Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  112
<211>  24
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO12-ER-CNP22(K4R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO12
<400>  112
Glu Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile
1               5                   10                  15
Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  113
<211>  24
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO24-ER-CNP22
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO24
<400>  113
Glu Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile
1               5                   10                  15
Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  114
<211>  24
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO12-ER-CNP22
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO12
<400>  114
Glu Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile
1               5                   10                  15
Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  115
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO24-R-CNP22(K4R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO24
<400>  115
Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  116
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO12-R-CNP22(K4R)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO12
<400>  116
Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  117
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO24-R-CNP22
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO24
<400>  117
Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  118
<211>  25
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  PEO12-R-CNP22
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  PEO12
<400>  118
Pro Glu Arg Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg
1               5                   10                  15
Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  119
<211>  27
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  GANRR-CNP22(K4R)
<400>  119
Gly Ala Asn Arg Arg Gly Leu Ser Arg Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu
1               5                   10                  15
Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20                  25
<210>  120
<211>  22
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  N-конец может являться модифицированным посредством синтетического
нацеленного на кость соединения или отсутствовать
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Cys, или любую природную или неприродную
аминокислоту или изостеру пептидной связи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (6)..(7)
<223>  Пептидная связь
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой Phe, или любую природную или неприродную
аминокислоту или изостеру пептидной связи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой Gly или любую природную или неприродную
аминокислоту или пептидомиметик
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (22)..(22)
<223>  C-конец может являться модифицированным посредством синтетического
нацеленного на кость соединения или отсутствовать
<400>  120
Gly Leu Ser Lys Gly Xaa Xaa Xaa Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
1               5                   10                  15
Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  121
<211>  22
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог A
<220>
<221>  модифицированный остаток
<222>  (6)..(6)
<223>  CH2NH
<400>  121
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
1               5                   10                  15
Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  122
<211>  21
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог B
<220>
<221>  модифицированный остаток
<222>  (6)..(6)
<223>  N-метил-Phe
<400>  122
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
1               5                   10                  15
Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  123
<211>  21
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог E
<220>
<221>  модифицированный остаток
<222>  (6)..(6)
<223>  D-Phe
<400>  123
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
1               5                   10                  15
Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  124
<211>  23
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог F
<220>
<221>  модифицированный остаток
<222>  (7)..(7)
<223>  tBu-Gly
<400>  124
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Leu Tyr Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly
1               5                   10                  15
Ser Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  125
<211>  21
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог G
<220>
<221>  модифицированный остаток
<222>  (6)..(6)
<223>  3-Cl-Phe
<400>  125
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
1               5                   10                  15
Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  126
<211>  21
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<223>  Аналог H
<220>
<221>  модифицированный остаток
<222>  (6)..(6)
<223>  NHCH2CH(Ph)CO
<400>  126
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met
1               5                   10                  15
Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  127
<211>  22
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  N-конец может являться модифицированным посредством синтетического
нацеленного на кость соединения или отсутствовать
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой любую природную или неприродную аминокислоту
или пептидомиметик, не имеющие реакционноспособного первичного амина на
боковой цепи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Cys или изостеры пептидной связи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (6)..(7)
<223>  Пептидная связь
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой L-Phe; D-Phe; 3-амино-2-фенилпропионовую
кислоту; или N-алкилированные производные Phe
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой Gly, трет-бутил-Gly (tBu-Gly), Thr, Ser,
Val или Asn
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa представляет собой природную или неприродную аминокислоту или
пептидомиметик, не имеющие реакционноспособного первичного амина на
боковой цепи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa представляет собой Leu или изостеры пептидной связи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (12)..(12)
<223>  Xaa представляет собой Ile, tBu-Gly или изостеры пептидной связи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (14)..(14)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (17)..(17)
<223>  Xaa представляет собой Met, Val, Asn, бета-Cl-Ala, 2-аминомасляную
кислоту (Abu) или 2-аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (20)..(20)
<223>  Xaa представляет собой Leu, норлейцин (Nle), гомолейцин (Hleu), Val,
трет-бутил-Ala (tBu-Ala), Ser, Thr, Arg или изостеры пептидной связи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (22)..(22)
<223>  C-конец может являться модифицированным посредством синтетического
нацеленного на кость соединения или отсутствовать
<400>  127
Gly Leu Ser Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Arg Xaa Gly Ser
1               5                   10                  15
Xaa Ser Gly Xaa Gly Cys
20
<210>  128
<211>  22
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  N-конец может являться модифицированным посредством синтетического
нацеленного на кость соединения или отсутствовать
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой Lys, консервативную аминокислотную замену,
любую природную или неприродную аминокислоту или пептидомиметик, не
имеющие реакционноспособного первичного амина на боковой цепи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (6)..(6)
<223>  Xaa представляет собой Cys или изостеры пептидной связи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (6)..(7)
<223>  Пептидная связь
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (7)..(7)
<223>  Xaa представляет собой L-Phe; D-Phe; 3-амино-2-фенилпропионовую
кислоту; N-алкилированные производные Phe
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (8)..(8)
<223>  Xaa представляет собой Gly, трет-бутил-Gly, Thr, Ser, Val или Asn
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (9)..(9)
<223>  Xaa представляет собой Leu, Ser, Thr или изостеры пептидной связи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa представляет собой Lys, Arg, Gly, 6-гидроксинорлейцин,
цитруллин (Cit), Gln или Ser
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (11)..(11)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (14)..(14)
<223>  Xaa представляет собой Ile, трет-бутил-Gly (tBu-Gly), Asn или
изостеры пептидной связи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (15)..(15)
<223>  Xaa представляет собой Gly, Arg, Ser или Asn
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (17)..(17)
<223>  Xaa представляет собой Met, Val, Asn, бета-Cl-Ala, 2-аминомасляную
кислоту (Abu) или 2-аминоизомасляную кислоту (Aib)
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (20)..(20)
<223>  Xaa представляет собой Leu, норлейцин (Nle), гомолейцин (Hleu),
Val, трет-бутил-Ala (tBu-Ala), Arg, Thr, Ser и изостеры пептидной связи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (22)..(22)
<223>  C-конец может являться модифицированным посредством синтетического
нацеленного на кость соединения или отсутствовать
<400>  128
Gly Leu Ser Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Arg Xaa Xaa Ser
1               5                   10                  15
Xaa Ser Gly Xaa Gly Cys
20
<210>  129
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  N-конец представляет собой природный или синтетический полимер
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (17)..(17)
<223>  C-конец представляет собой природный или синтетический полимер
<400>  129
Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Cys
<210>  130
<211>  22
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  N-конец представляет собой природный или синтетический полимер
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (17)..(17)
<223>  C-конец представляет собой природный или синтетический полимер
<400>  130
Gly Leu Ser Lys Gly Cys Phe Gly Leu Lys Leu Asp Arg Ile Gly Ser
1               5                   10                  15
Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  131
<211>  17
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  N-конец представляет собой синтетическую или природную полимерную
группу, или их комбинацию
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой Lys или консервативную аминокислотную замену,
или любую природную или неприродную аминокислоту или пептидомиметик, не
имеющие реакционноспособного первичного амина на боковой цепи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (5)..(5)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (17)..(17)
<223>  C-конец представляет собой синтетическую или природную полимерную
группу, или их комбинацию
<400>  131
Cys Phe Gly Leu Xaa Leu Asp Arg Ile Gly Ser Met Ser Gly Leu Gly
1               5                   10                  15
Cys
<210>  132
<211>  22
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (1)..(1)
<223>  N-конец представляет собой синтетическую или природную полимерную
группу, или их комбинацию
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (4)..(4)
<223>  Xaa представляет собой Lys или консервативную аминокислотную замену,
или любую природную или неприродную аминокислоту или пептидомиметик, не
имеющие реакционноспособного первичного амина на боковой цепи
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (10)..(10)
<223>  Xaa может представлять собой любую природную аминокислоту
<220>
<221>  неопределенный признак
<222>  (22)..(22)
<223>  C-конец представляет собой синтетическую или природную полимерную
группу, или их комбинацию
<400>  132
Gly Leu Ser Xaa Gly Cys Phe Gly Leu Xaa Leu Asp Arg Ile Gly Ser
1               5                   10                  15
Met Ser Gly Leu Gly Cys
20
<210>  133
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  133
Gly Ala Asn Lys Lys
1               5
<210>  134
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  134
Gly Ala Asn Arg Arg
1               5
<210>  135
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  135
Gly Ala Asn Pro Arg
1               5
<210>  136
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  136
Gly Ala Asn Gln Gln
1               5
<210>  137
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  137
Gly Ala Asn Ser Ser
1               5
<210>  138
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  138
Gly Ala Asn Arg Gln
1               5
<210>  139
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  139
Gly Ala Asn Arg Met
1               5
<210>  140
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  140
Gly Ala Asn Arg Thr
1               5
<210>  141
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  141
Gly Ala Asn Arg Ser
1               5
<210>  142
<211>  13
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  142
Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala
1               5                   10
<210>  143
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  143
Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu Gln Glu His Pro Asn Ala Arg
1               5                   10
<210>  144
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  144
Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg
1               5                   10
<210>  145
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  145
Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys
1               5                   10                  15
<210>  146
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  146
Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Arg Arg
1               5                   10                  15
<210>  147
<211>  31
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  147
Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu
1               5                   10                  15
Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Lys Lys
20                  25                  30
<210>  148
<211>  31
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  148
Asp Leu Arg Val Asp Thr Lys Ser Arg Ala Ala Trp Ala Arg Leu Leu
1               5                   10                  15
Gln Glu His Pro Asn Ala Arg Lys Tyr Lys Gly Ala Asn Arg Arg
20                  25                  30
<210>  149
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  149
Ser Leu Arg Arg Ser Ser
1               5
<210>  150
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  150
Asn Ser Phe Arg Tyr
1               5
<210>  151
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  151
Ser Pro Lys Met Val Gln Gly Ser Gly
1               5
<210>  152
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  152
Met Val Gln Gly Ser Gly
1               5
<210>  153
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  153
Lys Val Leu Arg Arg Tyr
1               5
<210>  154
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  154
Lys Val Leu Arg Arg His
1               5
<210>  155
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  155
Gly Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg
1               5                   10
<210>  156
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  156
Gly Val Pro Gln Val Ser Thr Ser Thr
1               5
<210>  157
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  157
Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln
1               5                   10                  15
<210>  158
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Синтетический полипептид
<400>  158
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
1               5                   10
<---