Люминесценция комплексов dapi-днк при разных ионных силах раствора

УДК 577.323.2

Вестник СПбГУ. Сер. 4. Т. 1 (59). 2014. Вып. 4

В. М. Бакулев, З. В. Ревегук, Чжан Цюши, Н. А. Касьяненко

ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ КОМПЛЕКСОВ DAPI-ДНК ПРИ РАЗНЫХ ИОННЫХ СИЛАХ РАСТВОРА*

Санкт-Петербургский государственный университет, Российская Федерация, 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7—9

При малых ионных силах формы кривых люминесцентного титрования DAPI с добавлением ДНК значительно различаются при разных длинах волн возбуждения и регистрации: S-образная форма при возбуждении в максимуме спектра поглощения DAPI и колоколооб-разная форма при возбуждении на длинноволновом крае поглощения DAPI. При этом максимум спектра люминесценции DAPI при добавлении ДНК в раствор сначала испытывает значительный батохромный сдвиг, а при дальнейшем добавлении ДНК максимум люминесценции становится более коротковолновым, чем максимум спектра свободного DAPI. Эти данные свидетельствуют о наличии двух типов связывания лиганда с ДНК при малых ионных силах. Из изучения люминесцентного титрования DAPI от концентрации NaCl сделан вывод, что при больших ионных силах присутствует только один тип связывания данного лиганда с ДНК. Сравнение спектров возбуждения и поглощения DAPI свидетельствует в пользу интеркаляционного взаимодействия лиганда с ДНК в этих условиях. Определены константа взаимодействия и число мест связывания при интеркаляции DAPI в ДНК. Библиогр. 14 назв. Ил. 4.

Ключевые слова: ДНК, лиганд, люминесценция.

V. M. Bakulev, Z. V. Reveguk, Zhang Qiushi, N. A. Kasyanenko

LUMINESCENCE OF DAPI-DNA COMPLEXES AT VARIOUS IONIC STRENGTHS

St. Petersburg State University, 7—9, Universitetskaya nab., St. Petersburg, 199034, Russian Federation

At low ionic strength, the curve shape for luminescence titration of DAPI though adding DNA will vary significantly if different excitation and emission wavelengths are used: an ordinary S-shaped curve upon excitation at the absorption maximum of DAPI and bell-shaped curve upon excitation at a long-wavelength absorption edge. Upon DNA addition to a DAPI solution, the maximum of DAPI luminescence spectrum initially experienced significant bathochromic shift, with the further DNA addition the luminescence maximum becomes shorter than that of free DAPI. These data suggest the presence of two types of DNA binding sites to the DAPI molecule at low ionic strength. From the study of luminescent titration of DAPI-DNA solutions by NaCl additions, we conclude that only one kind of binding site prevails at high ionic strength. Comparison of DAPI excitation and absorption spectra demonstrates intercalative ligand-DNA interaction under these conditions. A binding constant and a number of nucleotides per molecule of dye by intercalative mode are calculated. Refs 14. Figs 4.

Keywords: DNA, ligand, luminescence.

Введение. Флуоресцирующий краситель 4/,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), синтезированный как антипаразитарное лекарственное средство [1], нашёл широкое применение в биохимии, гистологии и цитологии в качестве маркера для определения ДНК-содержащих биоструктур [2]. DAPI считается классическим лигандом, связывающимся с ДНК по малой бороздке и обладающим А-Т специфичностью [3, 4]. Однако были предложены и другие альтернативные способы связывания лигандов, такие как ин-теркаляция [5] и внешнее связывание по сахарофосфатной цепи ДНК [6]. Несмотря на

* Работа поддержана грантами РФФИ (13-03-01192A) и СПбГУ (11.38.644.2013).

проведённые ранее многочисленные исследования взаимодействия DAPI с природными биополимерами (ДНК, РНК) и их различными синтетическими аналогами (олиго- и по-линуклеотидами), дискуссия о типах и силе связывания DAPI с ДНК при разных условиях среды продолжается и в настоящее время [7-10]. Рассматриваются также новые типы связывания, например, интеркаляционные сшивки двух цепей ДНК [7]. Важными характеристиками взаимодействия ДНК—лиганд являются константа связывания, определяющая силу взаимодействия лиганда с полимером, и число мест связывания (сайтов), определяющее специфичность лиганда. В нашей работе показано, что при малых ионных силах раствора при взаимодействии DAPI с ДНК в люминесценции проявляются два типа связывания, а при больших ионных силах (ц ^ 1,0 м/л) присутствует только один (интеркаляционный) тип связывания. В этом случае возможно определение константы и числа мест связывания флуоресцентным методом.

Материалы и методы. В работе использовали коммерческий препарат ДНК тимуса телёнка («Sigma») с молекулярной массой 11 • 106 Да, определённой вискозимет-рически, и 4', 6-diamidino-2-phenylindole («Serva»). Спектрофотометрические и люминесцентные измерения растворов проводились на флуоресцентном спектрофотометре «Hitachi-850». Спектры возбуждения и испускания люминесценции корректировались на спектральную чувствительность прибора.

Результаты и обсуждение. Исследование взаимодействия DAPI с ДНК обычно проводится в нейтральных или слабокислых (рН « 5) водных растворах малой ионной силы. Считается, что в этих условиях основным типом взаимодействия является связывание молекулы DAPI по малой бороздке ДНК с AT-богатыми регионами. Константа связывания (Kb) и число мест (сайтов) связывания (n) по малой бороздке определяется при построении линейного графика Скатчарда с использованием данных флуоресцентного титрования в приближении один лиганд — один сайт связывания [11, 12]. Несмотря на простоту и наглядность получения искомых параметров, этот способ имеет существенный недостаток. Для построения графика Скатчарда необходимо точно знать интенсивность люминесценции раствора при полном (предельном) связывании лиганда, т. е. при очень низких соотношениях DAPI/ДНК (г). В эксперименте это условие часто не выполняется, как, например, изображено на рис. 1 (см. кривую при возбуждении в области максимума первой полосы поглощения свободного DAPI — I(340/460)).

В простом случае перехода между двумя спектральными формами, соответствующими связанному и свободному состояниям лиганда, кривая титрования имеет S-об-разную форму и определяется четырьмя параметрами (Kb, n, Ir=0, Ir=TO), которые можно рассчитать итерационным методом. Фактически необходимо определить только три параметра, так как при данных условиях значение 1Г=Ж, должно совпадать с интенсивностью раствора DAPI без добавления ДНК. Однако по экспериментальной зависимости интенсивности люминесценции при Хвозб. = 340 нм и Хрег. = 460 нм от г, представленной на рисунке, не удалось численно рассчитать значения Kb и n. Чаще всего причиной такой неудачи является неправильный выбор теоретической модели. В данном случае предполагалось наличие только одного типа связывания и, соответственно, одновременное сосуществование в растворе только двух спектральных форм: свободных и связанных с ДНК молекул DAPI. Но из колоколообразного вида кривой люминесцентного титрования при возбуждении на длинноволновом крае первой полосы поглощения DAPI (\возб. = 420 нм), также изображённой на рисунке, следует наличие в растворе ещё одной спектральной формы DAPI в области 0,05 < г < 5. Как видно на рис. 2, при добавлении ДНК в раствор максимум спектра люминесценции DAPI сначала испытывает значительный батохромный сдвиг (спектр при г = 0,3), а при дальнейшем

700600500-

~ 4006

° 300. 3

1-1 200 100

0

0,01

0,1

10

DAPI/ДНК

0,0

Рис. 1. Люминесцентное титрование водных растворов БАР1 с добавлением ДНК при двух длинах волн возбуждения (340 и 420 нм) и двух длинах волн регистрации (460 и 560 нм):

концентрация DAPI сохраняется постоянной, СОАР1 = 5 • 10-6 М/л, рН = 7,0, 0,005М фосфатный буфер

1

т

с О

0,3

0,2

0,1

0,0

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

г \х10

> / \ * /''

250 300 350

400 450 500 Длина волны, нм

3000

2000

й £

к !=

<И

. 3

1000 Е

550 600

Рис. 2. Спектры поглощения и люминесценции (Хвозб. = 340 нм) водных растворов БАР1-ДНК при разных значениях г:

сплошные линии относятся к раствору DAPI без ДНК, штриховые линии для г = 0,3 и точечные линии для г = 0,05

0

добавлении ДНК максимум люминесценции становится более коротковолновым, чем максимум спектра свободного БАИ (спектр при г = 0,05).

Эти данные являются достаточным основанием для констатации существования ещё одного типа связывания молекул БАР1 с ДНК с меньшей константой связывания и большим числом сайтов.

Формы кривых люминесцентного титрования можно объяснить следующим образом. При избытке ДНК в растворе (r ^ 1) молекулы DAPI полностью находятся в связанном с ДНК состоянии. Если возможны два типа связывания, то преимущество должен иметь тот, у которого больше Кь (сильное связывание). Если число сайтов такого типа невелико, то при уменьшении содержания ДНК в растворе появляются свободные молекулы красителя, которые могут связаться с другими сайтами, сродство к которым меньше. При дальнейшем увеличении r относительная концентрация молекул DAPI с сильным связыванием из-за малого числа мест связывания продолжает падать, доля молекул DAPI с более «слабым» связыванием сначала достигает насыщения (максимально возможное заполнение всех сайтов такого типа), а затем снижается в пользу роста доли свободных молекул.

Для определения типов связывания было проведено титрование растворов DAPI с ДНК путём увеличения ионной силы раствора (добавления соли NaCl) при r = 0,29, т. е. в области максимальной концентрации более «слабых» комплексов DAPI-ДНК (см. рис. 1). Известно, что электростатическое взаимодействие играет большую роль при связывании лиганда по бороздке, а также при внешнем связывании по сахарофос-фатной цепи ДНК, тогда как при интеркаляции основной вклад даёт стэкинг — взаимодействие между основаниями [10, 13]. Увеличение ионной силы раствора приводит к нейтрализации заряда на ДНК, и поэтому доля молекул DAPI, связанных по бороздке и по фосфатам цепи, должна уменьшаться. Кривые титрования растворов DAPI-ДНК (r = 0,29) добавлением NaCl представлены на рис. 3.

Как в поглощении, так и в люминесценции наблюдаются значительные изменения величины сигнала в области концентраций от 0,01 до 1М NaCl с тенденцией к выходу на плато. Характер кривых подобен переходу из одной спектральной формы в другую. Интенсивность люминесценции I(420/560) спектральной формы, дающей максимум при r = 0,29, падает практически до нуля, тогда как доля молекул DAPI с сильным взаимодействием увеличивается.

100 -

80-

з 60-

d

к !=

CU

. 3 Е

"1—........I

40-

20-

1E-6

"1—.........

"1—.........

-е-1

1E-5

1E-4

1E-3

0,01

0,1

[NaCl], M/л

0,12

0,10

0,08

0,06

0,04

т

s ^

с О

0,02

0,00

Рис. 3. Спектрофотометрическое (OD(340)) и люминесцентные (I(340/460) и I(420/560)) титрования водных растворов DAPI-ДНК (г = 0,29) с добавлением NaCl

0

При люминесцентном титровании раствора БАР1 в 1М МаС1 с добавлением ДНК при возбуждении 420 нм исчезает колоколообразная зависимость и кривая принимает такую же S-образную форму, как и при возбуждении при 340 нм. Таким образом, в растворах БАР1 при больших ионных силах с увеличением концентрации ДНК наблюдается переход между свободными молекулами красителя и связанными с ДНК по одному типу связывания. В отличие от титрования растворов БАР1 при низких ионных силах параметры кривой при Хвозб. = 340 нм (данные изображены на вставке рис. 4) легко рассчитываются численно за три итерации. Полученные значения константы и числа мест связывания: К = (3 ± 1) • 106 М-1, п = 0,022 ± 0,005. Данные параметры относятся к сильному типу связывания.

Определить способ взаимодействия БАР1 с ДНК также возможно из люминесцентных данных. На рис. 4 изображены спектры возбуждения БАР1 (Хрег. = 460 нм) при нескольких значениях г в той области, где основной вклад в люминесценцию дают связанные с ДНК молекулы лиганда. Видно, что при увеличении доли связанных молекул изменяется соотношение максимальных интенсивностей между первой (Хмакс. = 365 нм) и второй (Хмакс. = 265 нм) полосами спектра БАР1 в пользу второй полосы. На том же рисунке представлен спектр поглощения БАР1 (в единицах молярной экстинк-ции) при г = 0,05, полученный как разность между спектром поглощения раствора БАР1 с ДНК при г = 0,05 и раствором ДНК той же концентрации без БАР1. При таком значении г в растворе все ещё присутствует значительная доля свободных молекул красителя, однако при больших значениях г корректно произвести вычитание поглощения ДНК не удаётся. Тем не менее из сравнения спектров поглощения БАР1 в свободном состоянии (см. рис. 1) и в связанном (см. рис. 4) видно, что связывание БАР1 не увеличивает максимальный молярный коэффициент экстинкции в его второй полосе поглощения. Поэтому значительное увеличение интенсивности люминесценции

40000 -

з а а

I

^

т «

0 я а я

3

1

и Я

я

т £

15000-

1 1 1 1 1 г = 0,002 - Л 1г = 0,004 35 30 1 1 1 -

25 20 \ -

Мг = 0.008 15 \

10 \

\ г = 0,05,/ 'Л •'' / Л 7 '' \ Л с/ , А . я А / 5 0

1Е-3 0,01 0,1 1

А БЛРТ/ДНК -

\ У -

250 300 350 400

Длина волны, нм

450

4000

3500

3000

2500

2000

й

ГЛ

Б .¡Э Е

500

500

Рис. 4- Спектр поглощения (в единицах молярного коэффициента экстинкции) БАР1

при г = 0,05 и спектры возбуждения при разных значениях г (0,008, 0,004, 0,002): на вставке люминесцентное титрование при длине волны возбуждения 340 нм и длине волны регистрации 460 нм водных 1,0М NaCl растворов DAPI с добавлением ДНК; концентрация DAPI сохраняется постоянной

0

0

второй полосы в спектре возбуждения связанного с ДНК DAPI по сравнению с той же полосой в спектре поглощения может быть обусловлено переносом энергии возбуждения с соседних оснований ДНК на интеркалированный между ними лиганд. При интеркаляционном способе связывания перенос энергии возбуждения по экситонному механизму может осуществляться с соседних 2-3 оснований ДНК на молекулу лиганда [14, с. 79]. Разность между максимумами величины сигнала во вторых полосах спектра возбуждения и поглощения на длине волны 260 нм (максимум поглощения ДНК) в единицах молярного коэффициента экстинкции 2 • 104 л-моль_1-см_1, что примерно соответствует поглощению 2-3 оснований ДНК. Отсутствие тушения люминесценции при добавлении в раствор NaCl также свидетельствует в пользу связывания по типу интеркаляции, так как встроенные внутрь ДНК молекулы лиганда более защищены от влияния среды, чем связанные внешним образом [13].

Таким образом, по результатам сравнения спектров возбуждения и поглощения DAPI и из изучения люминесцентного титрования DAPI от ионной силы можно сделать вывод, что при больших ионных силах в водных растворах DAPI присутствует только интеркаляционный тип связывания данного лиганда с ДНК. Проявляющийся при малых ионных силах второй тип связывания вероятнее всего обусловлен взаимодействием молекул DAPI с ДНК по малой бороздке. Количество мест связывания на ДНК для такого взаимодействия гораздо больше (максимальная доля при r = 0,29 — один лиганд на 3 основания ДНК, см. рис. 1), чем при интеркаляции (n = 0,022 — один лиганд на 45 оснований ДНК). В этом смысле взаимодействие по малой бороздке можно считать основным типом связывания.

Литература

1. DannO., Bergen G., DemantE., VolzG. Trypanocide damidine des 2-phenyl-benzofurans, 2-phenyl-ubdens und 2-phenyl-indols // Justus Liebigs Ann. Chem. 1971. Vol. 749. Iss. 1. P. 68-89.

2. Kapuscinski J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe // Biotech. Histochem. 1995. Vol. 70, N 5. P. 220-233.

3. ManziniG., Barcellona M. L., AvitabileM., Quadrifoglio F. Interaction of diamidino-2-phenylindole (DAPI) with natural and synthetic nucleic acids // Nucleic Acids Res. 1983. Vol. 11, N 24. P. 8861-8876.

4. KubistaM., AkermanB., NordenB. Characterization of interaction between DNA and 4',6-diamidino-2-phenylindole by optical spectroscopy // Biochemistry. 1987. Vol. 26, N 14. P. 4545-4553.

5. Kapuscinski J., Skoczylas B. Fluorescent complexes of DNA with DAPI 4',6-diamidino-2-phenyl indo-le-2HCl or DCI 4',6-dicarboxyamide-2-phenyl indole // Nucleic Acids Res. 1978. Vol. 5, N 10. P. 3775-3799.

6. Barcellona M. L., Cardiel G., Gratton E. Time-resolved fluorescence of DAPI in solution and bound to polydeoxynucleotides // Biochem. Biophys. Res. Com. 1990. Vol. 170, N 1. P. 270-280.

7. Beccia M. R., BiverT., Pardini A. et al. The fluorophore 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) induces DNA folding in long double-stranded DNA // Chem. Asian J. 2012. Vol. 7. P. 1803-1810.

8. Williams A. K., DasilvaS. C., Bha,tta,A. et al. Determination of the drug-DNA binding modes using fluorescence-based assays // Anal. Biochem. 2012. Vol. 422. P. 66-73.

9. Banerjee D., PalS. K. Dynamics in the DNA recognition by DAPI: Exploration of the various binding modes // J. Phys. Chem. 2008. Vol. 112, N 3. P. 1016-1021.

10. Biancardi A., BiverT., Secco F., MenucciB. An investigation of the photophysical properties of minor groove bound and intercalated DAPI through quantum-mechanical and spectroscopic tools // Phys. Chem. Chem. Phys. 2013. Vol. 15, N 13. P. 4595-4603.

11. HealyE. F. Quantitative determination of DNA-ligand binding using fluorescence spectroscopy //J. Chem. Educ. 2007. Vol. 84, N 8. P. 1304-1307.

12. St. Edward's University (USA). Student Handout. Quantitative determination of DNA-ligand binding using fluorescence spectroscopy. URL: http://www.cs.stedwards.edu/chem/Chemistry/CHEM45/Sup-plement.pdf (дата обращения: 24.05.2014).

13. Sirajuddin M., Ali S., Badshah A. Drug-DNA interactions and their study by UV-Visible, fluorescence spectroscopies and cyclic voltametry //J. Photochem. Photobiol. (B). 2013. Vol. 124. P. 1-19.

14. ВекшинН.Л. Биофизика ДНК-актиномициновых нано-комплексов. Пущино: Фотон-век, 2009. 192 c.

Статья поступила в редакцию 1 июля 2014 г.

Контактная информация

Бакулев Владимир Михайлович — кандидат физико-математических наук; e-mail: vbakulev@inbox.ru

Ревегук Захар Вячеславович — аспирант; e-mail: anbit@rambler.ru Цюши Чжан — аспирантка; e-mail: zqsdxx@163.com

Касьяненко Нина Анатольевна — доктор физико-математических наук, профессор; e-mail: nkasyanenko@mail.ru

Bakulev Vladimir Mikhailovich — Candidate of Physics and Mathematics; e-mail: vbakulev@inbox.ru Reveguk Zakhar Viacheslavovich — post-graduate student; e-mail: anbit@rambler.ru Qiushi Zhang — post-graduate student; e-mail: zqsdxx@163.com Kasyanenko Nina Anatolievna — Doctor of Physics and Mathematics, Professor; e-mail: nkasyanenko@mail.ru