Ишемический инсульт: обмен пуриновых соединений в спинномозговой жидкости

НЕВРОЛОГИЯ

Ишемический инсульт: обмен пуриновых соединений в спинномозговой жидкости

Ю.В.Тихонов1, Р.Р.Биктимеров1, Р.Т.Тогузов1, А.Ю.Волков1, С.Н.Савенков1, В.В.Рязанцев2, М.К.Бодыхов2, В.Н.Федоров2, В.И.Скворцова2

Российский государственный медицинский университет, учебно-научный комплекс лабораторной диагностики, Москва

Циркуляторная гипоксия (ишемия) всегда приводит к повреждению клеток нервной ткани и, соответственно, к снижению их функциональной активности. Кроме того, церебральные инсульты индуцируют каскад метаболических реакций в окружающих тканях, включая оксидативный стресс, возникающий в результате протекающих свободнорадикальных процессов, что играет одну из основных ролей в патогенезе церебральной ишемии. Анализ пуриновых компонентов в спинномозговой жидкости выявил активацию их катаболизма при ишемическом инсульте. Активность ксантиноксида-зы при этом существенно возрастает, что приводит к накоплению мочевой кислоты, роль образования которой при инсульте обсуждается.

Ключевые слова: спинномозговая жидкость, инсульт, пуриновые соединения

Ischemic stroke: metabolism of purine compounds in cerebrospinal fluid

Yu.V.Tikhonov1, R.R.Biktimerov1, R.T.Toguzov1, A.Yu.Volkov1, S.N.Savenkov1, V.V.Ryazantsev2, M.K.Bodykhov2, V.N.Fedorov2, V.I.Skvortsova2

"Russian State Medical University, Educational Scientific Complex of Laboratory Diagnostics, Mоscow (Head of the Complex - Prof. R.T.Toguzov);

2Russian State Medical University, Departmentof Fundamental and Clinical Neurology of MBF, Moscow

Cerebral hypoxia and ischemia always leads to brain cell damage and loss of brain cell function. Besides cerebral stroke induces the cascade of metabolic events in surrounding tissue, including free-radical-mediated oxidative damage that plays key role in the pathogenesis of cerebral ischemia. The analysis of purine compounds in a cerebrospinal fluid. has revealed their activation of the catabolism at an acute ischemic stroke. Activity of xanthine oxidase thus essentially increases, that leads to accumulation of a uric acid which role of formation at an acute ischemic stroke is discussed. Key words: cerebrospinal fluid, stroke, purine compounds

Развитие представлений о причинах и механизмах повреждения ткани мозга на фоне острого нарушения мозгового кровообращения и фокальной ишемии мозга определяет основные стратегические направления терапии ишемиче-ского инсульта. Циркуляторная гипоксия (ишемия) всегда приводит к повреждению клеток нервной ткани и, соответственно, к снижению их функциональной активности [1].

Для корреспонденции:

Тихонов Юрий Владимирович, доктор биологических наук, главный научный сотрудник учебно-научного комплекса лабораторной диагностики Российского государственного медицинского университета Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1А Телефон: (495) 434-0727

Статья поступила 28.01.2008 г., принята к печати 9.11.2008 г.

Существует тесная связь между пуриновым метаболизмом в церебральных структурах и функциональной активностью нейронов, а также глиальных элементов при ишемии мозга [2]. В любом случае ишемия мозга сопровождается местной воспалительной реакцией, развитием оксидативного стресса и резким снижением синтеза аденозинтрифосфор-ной кислоты (АТР) [3].

Кроме того, ишемия нервной ткани способствует превращению ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу, вероятно, вследствие увеличения внутриклеточного Са2+ и активации протеаз [4]. Это вызывает двоякий эффект: ксантиноксидазная реакция приводит к накоплению мочевой кислоты в соответствующей среде (конечному продукту катаболизма аденилатов и гуанилатов) и, одновремен-

но, эта реакция является главным источником активных форм кислорода в процессе ишемического воздействия [5]. В модельных экспериментах in vitro было показано, что физиологические концентрации мочевой кислоты защищают клетки гиппокампа от метаболических повреждений при ишемии [6]. В то же время многими авторами ставится под сомнение утверждение о том, что мочевая кислота обладает нейропротективными свойствами [7].

Церебральные инсульты индуцируют каскад метаболических реакций в окружающих тканях, включая оксидативный стресс, возникающий в результате протекающих свободно-радикальных процессов, что играет одну из основных ролей в патогенезе церебральной ишемии [5].

Целью работы явилось исследование пуринового состава спинномозговой жидкости и содержания в ней молибдена как кофактора ксантиноксидазы (ксантиндегидрогеназы) у пациентов с ишемическими инсультами с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и атомно-абсорбционного спектрофотометра.

Пациенты и методы

Обследовано 27 пациентов (15 мужчин и 12 женщин) с ишемическим инсультом в каротидной системе, средний возраст составил 67,6 ± 8,2 года. Все пациенты поступили в неврологическую клинику и были обследованы в течение первых 12 часов от начала развития инсульта. У 14 больных диагностирован инсульт в системе левой внутренней сонной артерии, у 13 - в системе правой внутренней артерии. В соответствии с критериями TOAST у 12 больных диагностирован атеротромботический патогенетический вариант инсульта, у 15 - кардиоэмболический. На момент поступления в клинику средний балл по шкале NIH составил 14,5 ± 4,2.

Все пациенты получали максимально унифицированную терапию в соответствии с рекомендациями Европейской инициативной группы по лечению и профилактике инсульта (EUSI, 2003). Тромболитическая терапия пациентам, включенным в исследование, не проводилась.

Для получения референтных значений исследуемых показателей обмена пуриновых соединений использовалась спинномозговая жидкость 21 пациента без патологии нервной системы (10 мужчин и 11 женщин; средний возраст 63,8 ± 5,7 года), взятая при проведении спинномозговой анестезии по поводу плановых хирургических вмешательств.

Получение кислоторастворимой фракции

Люмбальная пункция осуществлялась по стандартной методике в асептических условиях под местной анестезией 2-3 мл 0,5% раствора новокаина.

Извлечение кислоторастворимых продуктов из СМЖ проводили методом экстракции хлорной кислотой с последующим осаждением хлората калия раствором КОН [8].

В ходе люмбальной пункции отбиралось 1,0-2,0 мл лик-вора в пробирки Vacuette с добавлением 1 N HCIO4 (соотношение ликвор/хлорная кислота соблюдали 1 : 1). Полученный раствор нейтрализовали 1 М раствором КОН (Lachema) до рН 6,7-7,0. Коротким центрифугированием отделяли осадок KCI (5 мин, 6000 об/мин) и полученный супернатант хранили до проведения анализа при -20°С в морозильной камере.

Определение пуриновых соединений в спинномозговой жидкости (СМЖ) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Работу проводили на хроматографической системе «Shimadzu» (Япония), включающей в себя: спектрофотометри-ческий детектор «Shimadzu SPD-10 Avp», системный контролер «Shimadzu SCL-10Avp», два модуля подачи растворителя «Shimadzu LC-10ADvp» и программное обеспечение «Shimadzu CLASS-VP» Chromatography Data System Version 6.1 для анализа и идентификации хроматографических пиков.

Хроматографическое разделение проводили при комнатной температуре (20°С) на колонке (4,6 х 250 мм) «Altex, Ultrasphere ODS» (США), зернением 5 мкм, с использованием предколонки Guard-Pak ^-Bondapak C18, при длине волны детектора 254 нм.

В качестве элюента использовалась трехкомпонентная смесь: 60 мМ KH2PO4 (Prolabo, Франция), 1 мМ тетрабути-ламмоний фосфата (Sigma-Aldrich, США), 2,5% ацетонитри-ла, доведенного до pH 5,09 1М КОН и 1М H3PO4 (Рго^Ьо, Франция). Объемная скорость элюирования составляла 0,8 мл/мин. В качестве стандартов использовали калибровочные растворы смесей пуринов в концентрации 0,125, 0,25, 0,5, 1,0 и 2,0 нг/мкл (Sigma, США).

Определение молибдена в СМЖ методом атомной абсорбции

Определение Мо2+ проводилось на атомно-абсорбцион-ном спектрофотометре АА-6650 фирмы Shimadzu (Япония) и состояло из этапов пробоподготовки, приготовления стандартных растворов, калибровки и измерения.

Пробоподготовка проводилась методом «мокрого» озоле-ния в автоклаве с СВЧ нагревом. В тефлоновый автоклав помещали 0,5 мл исследуемого образца и добавляли 1 мл HNO3 и 0,5 мл Н2О2 (30%). Автоклав устанавливался в СВЧ систему, аналогичную системе фирмы СЕМ (США).

Концентрация Мо2+ в рабочих калибровочных растворах составила 0,01; 0,05; 0,1 ррм. Рабочие растворы использовались в течение 5 дней.

Калибровка выполнялась непосредственно перед каждой серией измерений после прогрева аппаратуры и лампы с полым катодом до рабочих параметров. Используемая резонансная линия Мо2+ - 313,3 нм, ширина щели - 0,2 нм, объем рабочего автодозатора - 15 мкл. Значения концентраций Мо2+ в калибровочных растворах были введены в программу калибровки компьютера для построения аппроксимированной калибровочной кривой.

Измерения содержания Мо2+ в исследуемых образцах проводились при тех же установленных параметрах длины волны, ширине щели, объеме рабочего автодозатора и рекомендованных фирмой-изготовителем параметрах лампы.

Результаты исследования и их обсуждение

Известно, что в качестве маркеров гипоксии центральной нервной системы могут выступать продукты деградации пуриновых нуклеотидов, которые аккумулируются как в ЦНС, так и в спинномозговой жидкости [9]. По полученным нами данным, у пациентов с ишемическим инсультом в спинномозговой жидкости зарегистрировано значительное увеличение количества продуктов катаболизма пуринов (табл. 1).

Ю.В.Тихонов и др. / Вестник РГМУ, 2009, №1, с. 40-43

Таблица 1. Пуриновые соединения в спинномозговой жидко-

сти: контроль (п = 21), ишемический инсульт (п = 27), нг/мкл

Наименование пуринов Контроль, Инсульт,

р ± а р ± а

АМФ 5,796 ± 1,352 0,377 ± 0,264

p < 0,001 р < 0,001

ГМФ 0, 718 ± 0,023 0,289 ± 0,265

p < 0,005

ИМФ 1,587 ± 0,153 7,221 ± 0,936

р < 0,005

Аденозин 0,597 ± 0,124 0,153 ± 0,056

p < 0,005 р < 0,05

Инозин 0,372 ± 0,172 0,187 ± 0,022

Гипоксантин 0,278 ± 0,072 4,171 ± 0,237

р < 0,001

Ксантин 1,604 ± 0,082 10,576 ± 3,669

p < 0,001 р < 0,001

Мочевая кислота 0,154 ± 0,015 4,737 ± 0,984

p < 0,001 р < 0,001

АТР

Таблица 2. Содержание молибдена в спинномозговой жидко-

сти (мг/л) в контрольной группе и при ишемическом инсульте

- среднее значение, а - квадратичное отклонение)

Контрольная группа Инсульт

р = 0,0177; а = 0,0055 р = 0,0531; а = 0,0016

0,0126 0,0426

0,0230 0,0318

0,0180 0,0588

0,0168 0,0786

0,0182 0,0536

SAH__6

SAM

-5'-АМР --Аденозин

Ii

-ИМР

3

2 4 - Инозин-4—Gyp

UA

UA 5

Xar

Â 5

^уклеозид-транспорте^

экто-3

АТР—*-АМР —Аденозин

Так, накопление мочевой кислоты сопровождалось резким повышением содержания ксантина, а также гипоксантина, что характерно для активации ксантиноксидазы.

Первый субстрат ксантиноксидазы - азотистое основание гипоксантин может образоваться только из инозина под действием пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ). Гистохимическими методами было показано, что ПНФ-азная активность связана с глиальными клетками (астроглией и микроглией), которые и принимают участие в регуляции метаболизма пуриновых нук-леозидов в ЦНС [10]. Второй субстрат ксантиноксидазы - ксан-тин образуется либо из гипоксантина в той же ксантиноксидаз-ной реакции, либо из гуанина под действием гуаниндезамина-зы. В любом случае пуриновый катаболизм завершается образованием мочевой кислоты - конечного продукта распада пуринов в организме человека (см.рисунок).

Вопрос об усилении образования мочевой кислоты в нервной ткани при ишемических повреждениях нейронов заслуживает особого внимания и активно обсуждается в научной литературе, потому что возрастающая активность ксантиноксидазы является, по мнению многих авторов, одним из главных источников активных форм кислорода, вызывающих повреждение клеток [1]. С другой стороны, сама мочевая кислота обладает выраженной антиоксидантной активностью, защищая нейроны [6]. Эту амбивалентность функционирования ксантиноксидазы, приводящую к усилению образования активных форм кислорода в клетках мозга при ишемии и, одновременно, продуцирующую своего рода протектор от них, необходимо учитывать при решении вопросов о локализации ее активности в нервных или глиальных клетках, а также эндотелии сосудов.

В прямом соответствии с положением о катаболизме пуринов при ишемии мозга мы наблюдали расщепление адено-зинмонофосфата (AMP). Но вместо накопления аденозина хроматографический анализ выявил возрастание уровней инозинмонофосфата (IMP). Это свидетельствует о преобла-

Внеклеточное пространство

Рисунок. Обмен пуринов: 1 - АМР-дезаминаза; 2 -аденозинде-заминаза; 3'-5'-нуклеотидаза; 4 - пуриннуклеозидфосфорила-за; 5 - ксантиноксидаза; 6-гидролазы.

дании АМР-дезаминазной, а не 5'-нуклеотидазной реакции (см. рисунок). Это может иметь особое значение, поскольку образование инозина из аденозина или IMP зависит от локализации этих двух ферментов и распределения их активности в нейронах или глиальных элементах мозга. Конечно, образование аденозина выглядит более объяснимо при ишемии, потому что его физиологическая функция больше, чем у инозина, связана с вазодилатацией, хотя в некоторых работах было показано, что АМР-дезаминазная активность в аст-роцитах в 3 раза превышала активность в нейронах мозга [11]. Оба эти нуклеозида обладают рядом сигнальных функций (нейромодуляции, регуляции церебрального кровотока, уменьшения зоны ишемии), что позволяет обсуждать их роль и участие в физиологических механизмах в нервной ткани, особенно при гипоксических воздействиях [12, 13].

Таким образом, все изменения в пуриновом метаболизме при ишемическом инсульте в спинномозговой жидкости связаны с повреждением клеток тканей мозга и в то же время направлены на восстановление их функциональной активности под воздействием гипоксии. Понимание этого может дать импульс для разработки новых направлений терапии ишемического инсульта.

Литература

1. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Мартынов М.Ю., Камчатнов П.Р. Церебральный инсульт: проблемы и решения // Вестн. РГМУ. - 2006. - №4. - С.28-32.

2. Van Os S., De Abreu R., Hopman J. et al. Purine and pyrimidine metabolism and electrocortical brain activity during hypoxemia in near-term lambs // Pediatric Res. - 2004. - V.55. - P.1018-1025.

3. Chamorro А., Obach V., Cervera A. et al. Prognostic significance of uric acid serum concentration in patients with acute ischemic stroke // Stroke. - 2002. -V.33. - P. 1048-1051.

4. Uemira Y., Miller J.M., Matson W.R., Beal M.F. Neurochemical analysis of focal ischemia in rats // Stroke. - 1991. - V. 22. - P. 1548-1553.

5. McCord J.M. Oxigen-derived free radicals in postischemic tissue injury // N. Engl. J. Med. - 1985. - V.312. - P.159-163.

6. Yu Z.F., Bruce-Keller A.J., Goodman Y., Mattson M.P. Uric acid protects neurons against excitotoxic and metabolic insults in cell culture, and against focal ischemic bran injury in vivo // J. Neurosci. Res. - 1998. - V.53. - P.613-625.

7. Kanellis J, Johnson R.J. Elevated uric acid and ischemic stroke: accumulating evidence that it is injurious and not neuroprotective // Stroke. - 2003. - V. 34. -P.1956-1957.

8. Riss T.L., Zorich N.L., Williams M.D., Richardson A. Comparison of the efficiency of nucleotide extraction by several procedures and the analysis of nucleotides

from extracts of liver and isolated hepatocytes by HPLC // J. Liquid Chromatogr. - 1980. - V.3. - P.133-158.

9. Harkness R.A., Lund R.J. Cerebrospinal fluid concentrations of hypoxanthine, xanthine, uridine and inosine: high concentration of the ATP metabolite, hypoxanthine after hypoxia // J. Clin. Pathol. - 1983. - V.36. - P.1-8.

10. Castellano B., Gonzales B., Finsen B.R., Zimmer J. Histochemical demonstration of Purine nucleoside phosphorylase (PNPase) in microglial and astroglial cells of adult rat brain // J. Histochem. Cytochem. - 1990. - V.38. - P.1535-1539.

11. Parkinson F.E., Xiong W. Stimulus- and cell-type-specific release of purines in cultured rat forebrain astrocytes and neurons // J. Neurochem. - 2004. - V.88. - P.1305-1312.

12. Parkinson F.E., Xiong W., Zamzov R. Astrocytes and neurons: different roles in regulating adenosine levels // Neurological Res. - 2005. - V.27. - P.153-160.

13. Shen H., Chen G., Harvey B.K. et al. Inosine reduces ischemic brain injury in rats // Stroke. - 2005. - V.36. - P.654-659.

Сведения об авторах:

Биктимеров Ренат Рафаилович, аспирант учебно-научного комплекса лабороторной диагностики Российского государственного медицинского университета

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 676-7961 Е-таН: uracil@yandex.ru

Тогузов Руслан Тимофеевич, профессор, заведующий учебно-научным комплексом лабораторной диагностики Российского государственного медицинского университета Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-5523 Е-таН: kld@rsmu.ru

Волков Андрей Юрьевич, старший научный сотрудник учебно-научного

комплекса лабораторной диагностики Российского

государственного медицинского университета

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1

Телефон: (495) 434-0727

Е-таН: microbalance@mail.ru

Савенков Сергей Николаевич, младший научный сотрудник учебно-научного комплекса лабораторной диагностики Российского государственного медицинского университета Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-0727 E-mail: savenkov@yandex.ru

Рязанцев Владимир Владимирович, врач анестезиолог-реаниматолог

Городской клинической больницы №1 им. Н.И.Пирогова

Адрес: 117049, Москва, Ленинский пр-т, 8, корп. 5

Телефон: (495) 954-8945

E-mail: vladimir1964r@gmail.com

Бодыхов Михаил Константинович, кандидат медицинских наук, ассистент кафедры фундаментальной и клинической неврологии МБФ Российского государственного медицинского университета Адрес: 129327, Москва, ул. Ленская, 15, корп. 3, ГКБ №20 Телефон: (495) 470-0792 E-mail: mkb-umka@yandex.ru

Федоров Владимир Николаевич, врач-невролог НИИ инсульта Российского государственного медицинского университета Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-5523 E-mail: fedorovVN@rosminzdrav.ru

Скворцова Вероника Игоревна, член-корреспондент РАМН, профессор, директор НИИ инсульта Российского государственного медицинского университета, заведующая кафедрой фундаментальной и клинической неврологии МБФ Российского государственного медицинского университета Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 471-3720

ИЗ жизни УНИВЕРСИТЕТА

Московскому факультету РГМУ - 10 лет

В июне 2008 г. Московскому факультету РГМУ исполнилось 10 лет. За годы работы он стал лидером региональной подготовки врачей в России: в практическом здравоохранении г. Москвы в настоящее время трудится более 700 его выпускников. В 1998 г., когда открылся факультет, была создана уникальная единая структура на принципах корпоративного взаимодействия городского здравоохранения (Департамент здравоохранения Москвы) и вуза (РГМУ), которая курирует студентов от момента подачи заявления в университет до выхода на рабочее место в поликлиники г. Москвы. Выпускники Московского факультета являются важной составляющей в реализации кадровых задач, поставленных Правительством Москвы в городской целевой программе «Столичное здравоохранение» и в рамках национального проекта «Здоровье».

Руководит факультетом с первого дня его основания заслуженный врач РФ, профессор Л.И.Ильенко. Координация деятельности Московского факультета осуществляется также ректором РГМУ академиком РАМН, профессором В.В.Володиным, президентом РГМУ академиком РАМН, профессором Г.И.Сторожаковым, проректорами по учебной работе профессорами А..И.Феди-ным и В.Г.Владимировым, а также постоянно действующей рабочей группой по подготовке врачебных кадров для г. Москвы.

Контингент обучающихся на факультете составляет около 1600 человек, включая студентов, слушателей подготовительного отделения и прикомандированных интернов. Подготовка студентов проводится по двум специальностям: «Педиатрия» и «Лечебное дело», существует дневная и вечерняя форма обучения. Основные преимущества учебного плана для студентов Московского факультета заключаются в увеличении поликлинической подготовки на всех клинических кафедрах, в преподавании клинических дисциплин по факультетскому и госпитальному принципу, акценте на профилактическое здравоохранение. В настоящее время на Московском факультете успешно действуют 13 кафедр, которые располагаются в крупнейших лечебных учреждениях г. Москвы.

В мае 2001 г. был создан Ученый совет Московского факультета РГМУ. Московский факультет активно участвует в общественной жизни Университета. Большое внимание деканат факультета уделяет воспитательной работе со студентами. С этой целью в 2006 г. был создан отдел методической и воспитательной работы под руководством Н.М.Филичкиной. Создан Студенческий совет, принимающий активное участие в управлении факультетом.

По окончании обучения в вузе выпускники не расстаются с Московским факультетом. По предложению Департамента здравоохранения при деканате образован отдел последипломного образования. Силами профессоров РГМУ (Г.И.Сторожа-ков, И.И.Чукаева, О.А.Кисляк) создана некоммерческая организация «Центр поддержки врачей первичного звена здравоохранения Москвы». В задачи Центра входит последипломное обучение и непрерывное профессиональное развитие специалистов, проведение круглых столов и комплексных лекций по актуальным вопросам медицины, консультации молодых врачей по профессиональным и юридическим вопросам, защита от синдрома «профессионального выгорания».

Качество подготовки наших выпускников высоко оценивается руководителями практического здравоохранения. Московский факультет РГМУ растет и развивается. У нас есть все основания полагать, что ежегодно лечебно-профилактические учреждения Москвы будут пополняться нашими выпускниками, которые составят в будущем элиту московского здравоохранения.

Декан Московского факультета Л.И. Ильенко