Исследование процесса гидролиза панцирных отходов вареной креветки с использованием протосубтилина

УДК 663.053

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССА ГИДРОЛИЗА ПАНЦИРНЫХ ОТХОДОВ ВАРЕНОЙ КРЕВЕТКИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРОТОСУБТИЛИНА

М. В. Самсонов, М. Л. Винокур, М. П. Андреев

STUDY OF THE HYDROLYSIS PROCESS OF CRUSTACEAN WASTE OF BOILED SHRIMPS USING PROTOSUBTILIN

M. V. Samsonov, M. L. Vinokur, M. P. Andreev

Протеолиз панцирьсодержащих отходов (ПСО) ракообразных представляет собой сложный гетерогенный процесс, связанный с неоднородным распределением белка в структуре клеточной и бесклеточной эпителиальной ткани. В статье представлены исследования по переходу в гидролизат продуктов протеолиза ПСО северной розовой креветки Pandalus borealis. Белковые азотсодержащие вещества переходили в гидролизат как в растворенном, так и суспензированном виде. Гидролиз проводили с использованием относительно недорогого ферментного препарата микробиологического

происхождения протосубтилина нейтрального.

Изучался также протеолиз панцирных отходов с предварительно удаленным эпителиальным клеточным слоем. Процесс протеолиза продолжался четыре часа при постоянной температуре 37 о С без доступа освещения. У ПСО с предварительно удаленным клеточным эпителием наблюдалось заметное снижение выхода извлекаемых белоксодержащих компонентов в сравнении с отходами, содержащими указанный слой. С использованием метода визуального оптического наблюдения подтвержден переход в гидролизат значительного количества эпителиальной клеточной ткани в суспензированном виде. Измельчение в большей степени повлияло на изменение интенсивности протеолиза ПСО, в состав которых входит эптелиальный клеточный слой. После 3,5 часов ферментативного гидролиза как измельченных, так и неизмельченных ПСО с предварительно удаленным эпителиальным клеточным слоем наблюдалось резкое увеличение интенсивности перехода азотсодержащих белковых веществ (белки, пептиды, аминокислоты) в бульон. С течением времени наблюдались самопроизвольная интенсификация и процесс депротеинизации верхних слоев кутикулы, в результате диффузионного накопления в них достаточного количества ферментного препарата - протосубтилина Г3х.

ферментативный гидролиз, протеин, протосубтилин, азот, динамика, расщепление

Proteolysis of crustacean waste (CRP) of shellfish is a complex heterogeneous process associated with a nonuniform protein distribution in the structure of cellular and acellular epithelial tissue. The article presents studies on the transition to the hydrolyzate of proteolysis products of crustacean waste of the North pink shrimp

Pandalus borealis. Protein nitrogen-bearinging substances passed into the hydrolyzate in both dissolved and suspended form. The hydrolysis was conducted using a relatively inexpensive enzyme preparation of microbiological origin, neutral protosubtilin.

We were also studying proteolysis of crustacean waste with a previously removed epithelial cell layer. The proteolysis process lasted 4 hours, at a constant temperature of 37 ° C without access to lighting. The crustacean waste with pre-removed cell epithelium showed a noticeable decrease in the yield of extracted protein-containing components in comparison with the wastes containing this layer. Using the method of visual optical observation, a significant amount of epithelial cell tissue was transferred to the hydrolyzate in a suspended form. Grinding to a greater extent affected the change in the intensity of proteolysis of the crustacean waste, which includes the epithelial cell layer. After 3.5 hours of enzymatic hydrolysis of both ground and ungrounded crustacean waste, with a previously removed epithelial cell layer, a sharp increase in the intensity of the transition of nitrogen-containing protein substances (proteins, peptides, amino acids) to the broth was observed. With the course of time, spontaneous intensification and the process of deproteinization of the upper layers of the cuticle were observed, as a result of the diffusion accumulation in them of a sufficient quantity of the enzyme preparation - protosubtilin G3H.

enzymatic hydrolysis, protein, protosubtilin, nitrogen, dynamics, splitting

ВВЕДЕНИЕ

На сегодняшний день рядом авторов разработаны ферментативные способы выделения из панцирных отходов ракообразных белковых продуктов, характеризующихся различной степенью обезжиривания, в частности каротинопротеинов. «Каротинопротеин» используется как общеродовое понятие для группы достаточно обезжиренной пищевой и кормовой белковой продукции с высоким содержанием каротиноидов [1, 2].

Интенсивность депротеинизации и соизвлечения каротиноидов значительным образом зависит от степени доступности белкового субстрата для действия протеолитических ферментов. Степень доступности белка связана с характером его распределения в структуре обрабатываемого материала, а также величины удельной поверхности последнего и может изменяться на протяжении всего процесса ферментолиза [3, 4]. С учетом имеющихся представлений о неоднородности распределения белков и кароитиноидов в структуре панцирей ракообразных, а также наличия так называемых «норовых каналов», способных облегчать диффузию фермента в ПСО, может быть сделано предположение об изменяющемся с течением времени характере протеолиза [4, 5]. Одним из способов интенсификации протеолиза является механическая обработка ПСО, при которой происходит не только изменение удельной поверхности обрабатываемого материала, но и полное или частичное разрушение связи клеточного слоя с эндокутикулой [6]. Так, в работе ряда авторов показано положительное влияние степени измельчения на интенсивность и степень депротеинизации ПСО [7].

Одним из направлений совершенствования технологии извлечения белков из ПСО является поиск возможности использования для этих целей достаточно недорогих мультикомпонентных ферментных препаратов микробиологического

происхождения [10, 11]. Ранее было приведено сравнение выхода и состава каротинопротеина, получаемого из ПСО при использовании ферментов животного происхождения, с мультикомпонентным ферментным препаратом протосубтилин Г3х, выделяемым культурами Вас. subtilis, в состав которого входит комплекс ферментов (щелочные протеиназы, альфа-амилаза, бета-глюканаза, ксиланаза и целлюлаза) [12]. В работе Немцева был предложен процесс получения белковой пасты (с содержанием жира более 4 %) из панцирей ракообразных с использованием протосубтилина Г3х.

Целью работы было установление возможных различий в динамике гидролиза ПСО целых и измельченных, с предварительным удалением клеточного эпителиального слоя и без, на примере использования протосубтилина Г3х.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве объекта исследований использовались варено-мороженные панцирные отходы северной креветки, с частично удаленным эпителиальным слоем и дефростированные на воздухе (белково-минеральный субстрат). Химический состав ПСО - белок 11,2 %, липиды 5,5 (в том числе 0,98 % каротиноидов), минеральные вещества 5,2, влага - 74, хитин - 4,2 %.

Для проведения протеолиза использовался ферментативный препарат микробиологического происхождения - протосубтилин Г3х, фирмы «СибБиоФарм», представлявший гигроскопичный однородный порошок светло-бежевого цвета, растворимый в воде, с протеолитической активностью 70 ед./г.

Удаление клеточного слоя осуществлялось механическим способом. Измельчение ПСО производилось в куттере Pimak 5 к. Суспензирование проводилось при температуре 21 0С не более 5 мин.

Процесс протеолиза продолжался четыре часа, при температуре 37 оС в термостате, концентрация фермента составила 0,05 % от массы сырья.

Массовая доля влаги определялась по ГОСТ 13496.3-92 (ИСО 6496-83), сущность метода заключается в высушивании до постоянной массы при температуре 100-1050 С в течение не менее трех часов.

Для определения динамики перехода азотсодержащих веществ в бульон использовался ГОСТ Р 54607.7-2016. Отбор и подготовка проб осуществлялись по ГОСТ 26313 и ГОСТ 26671.

Определение массовой доли хитина производилось посредством последовательного выдерживания ПСО в концентрированных растворах кислоты, щелочи, с дальнейшей промывкой, сушкой и расчетом массовой доли осадка. Степень конверсии белка в субстрат определялась по формуле (1):

а= С/Со ,

где С - концентрация азота содержащих веществ при протеолизе за время ^ Со - максимальная концентрация азотсодержащих веществ.

Для анализа полученных данных кинетических кривых было использовано топохимическое уравнение Аврами-Колмогорова-Ерофеева (2):

1п

где а - степень конверсии; К - коэффицент, зависящий от скорости; t - время протеолиза; n - кинетический параметр.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Первый этап гидролиза образцов панцирных отходов, содержащих клеточный слой, независимо от того, использовалось ли предварительное измельчение или нет, соответствовал 3-3,5 ч и характеризовался интенсивным накоплением общего азота. Известно, что общий азот способен переходить в гидролизаты как в растворенном, так и в суспензированном виде. Сравнительная оптическая оценка образцов с различным характером обработки позволила косвенно зафиксировать поэтапный переход продуктов ферментативного гидролиза (липиды, каротиноиды, азотсодержащие вещества с различной молекулярной массой) в бульон. На протяжении почти всей первой фазы гидролиза в обоих случаях наблюдалось помутнение бульона, что подтверждает значительный переход белка в суспензированном виде. Также к концу начальной фазы наблюдалось изменение цвета, свидетельствующее о накоплении значительного количества каротиноидов.

В свою очередь, значительный переход белка в суспензированном виде, скорее всего, обусловлен отщеплением небольших кусочков эпителия от поверхности его бесклеточной части (табл. 1).

Таблица 1. Внешний вид профильтрованного гидролизата в зависимости

от механической обработки при ферментативном гидролизе

Table 1. Dependence of outer appearance of the filtered hydrolyzate on mechanical

processing under enzymatic hydrolysis_

Наименование образцов Время гидролиза, ч

1 2 3 4

ПСО неиз- Помутнение Увеличение мут- Увеличение Преобладание

мельченные с бульона с жел- ности, преобла- мутности бу- оранжевого

клеточным товатым оттен- дание желтого льона, появле- оттенка

слоем (ПСОНИ) ком оттенка ние оранжевого оттенка

ПСО неиз- Незначительное Незначительное Появление Преобладание

мельченные помутнение увеличение желтоватого желтого

без клеточного слоя (ПСОбксни) бульона мутности оттенка оттенка

ПСО измель- Значительное Увеличение мут- Преобладание Бульон пол-

ченные с кле- помутнение ности, преобла- оранжевого ностью стал

точным слоем бульона с жел- дание желто- оттенка оранжевым

(ПСОи) товатым оттенком оранжевого оттенка

ПСО измель- Незначительное Увеличение мут- Преобладание Изменений не

ченные без помутнение ности бульона, желтого наблюдается

клеточного слоя бульона появление жел- оттенка

(ПСОбкси) товатого оттенка

Для образцов с удаленным эпителиальным клеточным слоем, независимо от использования предварительного измельчения, незаметна разница в характере перехода азотсодержащих веществ (АВ) в бульон в течение первых

3,5 ч (рис. 1). Таким образом, можно предположить, что влияние измельчения на степень и скорость депротеинизации ПСОБКСИ на начальном этапе связано, скорее всего, с ослаблением связи указанного слоя с поверхностью панциря за счет трения о рабочий орган измельчителя. Изменение площади удельной поверхности бесклеточной основы панциря, по всей видимости, не должно оказывать влияние на динамику депротеинизации.

После 3,5 ч для обоих случаев незначительно ускоряется процесс депротеинизации, что свидетельствует о возможном проникновении протеолитических ферментов через норовые каналы к белоксодержащим слоям экзокутикулы. То есть в течение первых 3,5 ч ферментолиз ПСО мог носить диффузионный характер, а после - кинетический или диффузионно-кинетический. Симпсоном и Хардом показана эффективность многократной обработки ПСО ферментами микробиологического и животного происхождения с целью повышения выхода каротинопротеина [7, 8]. Одна из возможных причин наблюдаемого явления может быть связана с уменьшением вязкости гидролизуемой массы и, как следствие, лучшей диффузией ферментов через «норовые каналы» панциря. Немцевым также отмечалась возможность рессорбции белков компонентом из гидролизата обратно в панцирь [9].

Рис. 1. Динамика перехода АВ в бульон при ферментативном гидролизе Fig. 1. Dynamics of transition of nitrogen containing substances to the broth under enzymatic hydrolysis

Для ПСО бесклеточного слоя измельченных (ПСОБКСИ) и неизмельченных (ПСОбкши) наблюдается схожая динамика накопления азотсодержащих веществ в бульоне. В интервале от 3,5 до 4,5 ч для обоих случаев заметно ускорение

процесса депротеинизации, что может быть обусловлено интенсивным распространением фермента по внутренним слоям панциря, с последующим частичным гидролизом аморфного белка верхнего слоя экзокутиколы (рис. 1).

Дальнейшие исследования были направлены на проверку гипотезы о неоднородности протеолиза ПСО с предварительно удаленным клеточным слоем в аспекте превалирования диффузионного или кинетического характера рассматриваемого процесса. С этой целью для интервалов 60-180 мин и 190-270 мин данные зависимости коэффициента конверсии от времени были аппроксимированы в виде линейно-логарифмического представления уравнения (формула 2).

Для каждого из рассматриваемых случаев были получены приемлемые коэффициенты корреляции и установлены кинетические параметры (рис. 2, 3).

0.09

0.03 -0.02 o.oi -I о

60 70 SO 90 100 110 120 130 140 150 160 170 ISO 190 lot

♦ псо БКСИ к = 0.9067 п= 0.76

Рис. 2. Линеаризованные кинетики для ПСОБКСи

в интервале от 60 до 180 мин протеолиза Fig. 2. Linearized kinetics for the crustacean waste without the cell layer (unground (A) and crushed (B)) in the interval from 60 to 180 minutes of proteolysis

0.06

- г

0.01

180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280

Int

♦ псо БКСНИ К= 0.91 П= =0.72

Рис. 3. Линеаризованные кинетики для ПСОБКСИ

в интервале от 190 до 270 минут протеолиза Fig. 3. Linearized kinetics for the crustacean waste without the cell layer (unground (A) and crushed (B)) in the interval from 190 to 270 minutes of proteolysis

При значении n~0,5 гидролиз приобретает диффузионный характер, соответственно, при возрастании 0,5 <n <1 возрастает влияние кинетических процессов до равнозначного значения. С увеличением параметра «n» возрастает вклад кинетических факторов в характер гидролиза.

Таблица 2. Значение кинетических параметров

Table 2. The value of kinetic parameters

Наименование образцов Кинетический параметр Преобладающий характер гидролиза

Интервал от 60 до 180 мин

ПСОбски 0,76 Кинетический

псобскни От 60 до 100 мин

0,57 Диффузионный

От 100 до 180 мин

0,67 Диффузионный

Интервал от 190 до 270 мин

ПСОбскни 0,72 Диффузионный

псобски 0,85 Кинетический

К концу процесса депротеинизации (на интервале 190-270 мин) наблюдается усиление влияния кинетических процессов как для ПСОБСКНИ, так и ПСОбски.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Показано, что основная масса белка, вероятно, переходит в гидролизат в виде суспензированных кусочков отслоившегося от бесклеточной основы панциря клеточного эпителия.

Подтверждена гипотеза о том, что протеолиз белкового субстрата бесклеточной основы панциря может происходить с преобладанием как диффузионного, так и кинетического характера на различных этапах гидролиза.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Немцев, С. В. Получение низкомолекулярного водорастворимого хитозана / С. В. Немцев // Биотехнология. - 2001. - №6 - С. 37-42.

2. Balogun, L. C. Replacement of fish meal with chemically preserved shrimp head in the diets of African catfish, Clarias gariepinus / L. C Balogun // Journal of Food Agriculture and Environment. - 2004. - V. 38, No 3. - P. 79-83.

3. Афанасьев, Ю. И. Атлас микроскопического и ультрамикроскопического строения клеток тканей и органов / Ю. И. Афанасьев, Е. Ф. Котовский. - Москва: Биология, 1970. - 400 с.

4. Купина, Н. М. Использование отходов от разделки крабов / Н. М. Купина // Рыбное хозяйство. - 2007. - № 4. - С. 50-57.

5. Ferrer, J. Acid hydrolysis of shrimp-shell wastes and the production of single cell protein from the hydrolysate / J. Ferrer, G. Paez, Z. Marmol, E. Ramones, H. Garcia, C.F. Forster // Journal of Food. - 1996. - V. 35, No 2. - P. 55-60.

6. Бахолдина, Л. П. Исследования технологических характеристик и процессов обработки антарктического криля / Л. П. Бахолдина // Сборник трудов АтлантНИРО. - 2008. - №3. - С. 27 - 35.

7. Simpson, B. K. The use of proteolytic enzymes to extract Carotenoproteins from shrimp wastes / B.K. Simpson // Journal of Applied Biochemistry. - 1985. - V. 44, No 1. - P. 212 - 222.

8. Немцев, С. В. Комплексная технология хитина и хитозана из панциря ракообразных / С. В. Немцев. - Москва: Изд-во «ВНИРО», 2006. - 107 с.

9. Holanda, H. D. Recovery of components from shrimp (Xiphopenaeus kroyeri) processing waste by enzymatic hydrolysis / H.D. Holanda, F.M. Netto // Journal of Food Agriculture and Environment. - 2006. - V.17, No 5. - Р. 298 - 303.

10. Armenta, E. Amino acid profile and enhancement of the enzymatic hydrolysis of fermented shrimp carotenoproteins/ E. Armenta, I. Guerrero-Legarreta // Journal of Food Chemistry. - 2009. - V.112, No 2. - Р. 310-315.

11. Dey, S. S., Dora K. C. Optimization of the production of shrimp waste protein hydrolysate using microbial proteases adopting response surface methodology / S.S. Dey, K. C. Dora // Journal of Food Science and Technology. - 2014. - V. 51, No 1. - Р. 16-24.

12. Самсонов, М. В. Сравнительный анализ выделения астаксантина из панцирных отходов ракообразных с использованием ферментных препаратов трипсин, химотрипсин, протосубтилин / М. В. Самсонов, М. Л. Винокур, М. П. Андреев // Известия КГТУ. - 2017. - №44. - С. 143-150.

REFERENCES

1. Nemtsev S. V. Poluchenie nizkomolekuljarnogo vodorastvorimogo hitozana [Preparation of low molecular water-soluble chitosan]. Biotechnology, 2001, no 6, pp. 37-42.

2. Balogun L. C. Replacement of fish meal with chemically preserved shrimp head in the diets of African catfish, Clarias gariepinus. Journal of Food Agriculture and Environment. 2004, vol. 38, no 3, pp. 79-83.

3. Afanasiev Y. I. Atlas mikroskopicheskogo i ul'tramikroskopicheskogo stroenija kletok tkanej i organov [Atlas of the microscopic and submicroscopic structure of cells, tissues and organs]. Journal of Biologija, 1970, 400 p.

4. Kupina N. M. Ispol'zovanie othodov ot razdelki krabov [Use of waste from cutting]. Fisheries, 2007, vol. 4, pp. 50-57.

5. Ferrer J., Paez, G., Marmol Z., Ramones E., Garcia H., Forster C.F. Acid hydrolysis of shrimp-shell wastes and the production of single cell protein from the hydrolysate. Journal of Food. 1996, vol. 35, no. 2, pp. 55-60.

6. Baholdina L. P. Issledovanija tehnologicheskih harakteristik i processov obrabotki antarkticheskogo krilja [Study of technological characteristics and procedures of processing Antarctic krill]. Journal of AtlantNIRO, 2008, vol. 3, pp. 27-35.

7. Simpson B.K. The use of proteolytic enzymes to extract Carotenoproteins from shrimp wastes. Journal of Applied Biochemistry. 1985, vol. 44, no. 1, pp. 212-222.

8. Nemtsev S. V. Kompleksnaja tehnologija hitina i hitozana iz pancirja ra-koobraznyh [Complex technology of chitin and chitosan from the shell of crustaceans]. Moscow, Izd. tsentr "VNIRO", 2006, 107 p.

9. Holanda H. D. Recovery of components from shrimp (Xiphopenaeus kroyeri) processing waste by enzymatic hydrolysis. Journal of Food Agriculture and Environment. 2006, vol. 17, no. 5, pp. 298-303.

10. Armenta E. Amino acid profile and enhancement of the enzymatic hydrolysis of fermented shrimp carotenoproteins. Journal of Food Chemistry. 2009, vol. 112, no. 2, pp. 310-315.

11. Dey S. S. Optimization of the production of shrimp waste protein hydrolysate using microbial proteases adopting response surface methodology. Journal of Food Science and Technology. 2014, vol. 51, no. 1, pp. 16-24.

12. Samsonov M. V. Sravnitelnii analiz videleniya astaksantina iz pancirnih othodov rakoobraznih s ispolzovaniem fermentnih preparatov tripsin himotripsin protosubtilin [Comparative analysis of astaxanthin release from crustacean waste with the use of enzyme preparations such as trypsin, chymotrypsin, protosubtilin]. Journal of the proceedings of KSTU, 2017, vol. 44, pp. 143-150.

ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ

Самсонов Максим Вячеславович - Калининградский государственный технический университет; аспирант кафедры «Технология продуктов питания»;

E-mail: Samsonov-Sk@ya.ru

Samsonov Maxim Vyacheslavovich - Kaliningrad State Technical University;

Postgraduate student of the Department of food products technology;

E-mail: Samsonov-Sk@ya.ru

Винокур Михаил Леонидович - Калининградский государственный технический университет; кандидат технических наук, доцент кафедры «Технология продуктов

питания»; E-mail: VinokurML@mail.ru

Vinokur Michail Leonidovich - Kaliningrad State Technical University;

PhD., Associate Professor of the Department of food products technology;

E-mail: VinokurML@mail.ru

Андреев Михаил Павлович - Калининградский государственный технический университет; доктор технических наук, профессор, старший научный сотрудник;

E-mail: andreev@atlant.baltnet.ru

Andreev Mikhail Pavlovich - Kaliningrad State Technical University;

Doctor of technical Sciences, Professor, senior researcher;

E-mail: andreev@atlant.baltnet.ru