ЖИВАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПТИЦ
LIVE VACCINE FOR AVIAN DISEASES

Настоящее изобретение относится к способу получения композиции вакцины, используемой для лечения путем местного введения вирусных заболеваний птиц и, в частности, инфекционного птичьего бронхита.
Инфекционный птичий бронхит является острым и инфекционным заболеванием, которое поражает домашнюю птицу главным образом респираторными симптомами. Вирус инфекционного птичьего бронхита (или VBI) относится к роду Coronavirus, семейство Coronaviridae, подкласс Nidovirales. Этот вирус с одноцепочечной РНК обладает высокой эволюционной способностью, и вирусные частицы могут выживать в течение одного месяца во внешней среде.
VBI поражает домашнюю птицу любого возраста, и его мишенью являются не только дыхательные пути. Действительно, VBI реплицируется прежде всего в трахее, затем может распространяться по всему телу зараженной птицы, затрагивая различные внутренние органы.
Заболеваемость возросла, и смертность может варьировать в зависимости от птицефермы, условий выращивания, а также участков вторичного бактериального заражения.
Клинические признаки относятся к:
- респираторным (кашель, трахеальные хрипы, опухший синус, конъюнктивит);
- репродуктивным (уменьшение кладки яиц, кладка яиц с тонкой, деформированной или цветной скорлупой),
- почечным: интенсивная жажда и т.д.
VBI передается главным образом респираторным путем или аэрозолями. Вирулентные вещества состоят из выделений из носа и испражнений. Передача является горизонтальной, прямой (от больных птиц к восприимчивым птицам) или непрямой (через воду, оборудование и т.д.).
VBI является чувствительным к большей части дезинфицирующих средств, но лучшим сдерживающим средством является вакцинация в сочетании с применением биозащитных мер (меры по обеззараживанию, дезинфекции и т.д.).
Вакцинация заключается в прививке подлежащей защите особи некоторого количества убитого патогена (инактивированная вакцина) или патогена с ослабленной вирулентностью (живая ослабленная вакцина) для получения биологического ответа у хозяина, защищая его от будущего заражения.
Живые вакцины главным образом являются достаточно эффективными для того, чтобы не использовать адъювантов.
TM
Адъювантом вакцины является эксципиент, усиливающий биологический ответ против антигена, с которым он ассоциирован. Например, можно назвать гидроксид алюминия, масляные адъюванты, выпускаемые под наименованием Montanide фирмой SEPPIC. Эти адъюванты имеют различную природу. Они могут представлять собой липосомы, эмульсии, содержащие по меньшей мере одну масляную фазу и по меньшей мере одну водную фазу, типа адъювантов, называемых адъювантами Freund, или чаще - их минеральные соли, нерастворимые в воде. Из минеральных солей, используемых в качестве адъювантов в композициях вакцин, можно назвать, например, гидроксид алюминия, нитрат церия, сульфат цинка, гидроксид коллоидного железа или хлорид кальция. Гидроксид алюминия является наиболее часто используемым адъювантом. Эти минеральные соли, используемые в качестве адъювантов в композициях вакцин, описаны, в частности, в статье Rajesh K. Gupta et al “Adjuvants, balance between toxicity and adjevanticity”, Vaccine, том 11, издание 3, 1993, стр.993-306.
Вакцины можно вводить путем инъекции (подкожная или внутримышечная инъекция) или местным путем (например, массовая вакцинация распылением, добавление в питьевую воду для контакта с клювом и ноздрями и глазоносовым комплексом).
Вакцинация путем инъекции, даже если она оказывается эффективной, имеет недостаток, заключающийся в том, что она не адаптирована к экономическому контексту выращивания домашней птицы (высокая стоимость рабочих), а также вызывает стресс у вакцинированной птицы, который в случае несушек может вызвать затруднения в кладке в результате физической травмы, вызванной инъекцией.
Использование эффективных адъювантов в композициях вакцин и в композициях вакцин, предназначенных для профилактики инфекционного бронхита, позволяет:
- повышать интенсивность защитного ответа, позволяющего обеспечивать наилучший уровень защиты;
- продлевать продолжительность защиты, которую дает доза вакцины, обеспечивая более длительную защиту животных на фермах в течение всего периода их роста;
- обеспечивать достаточную защиту при однократной обработке, тогда как в отсутствие этих усилителей иммунного ответа была необходима двукратная обработка. В этом случае выигрыш заключается в количестве доз инъекций (разделенном на два), в обработке животных (рабочие) и стрессе, вызываемом обработкой животных (также уменьшенном в два раза);
- получать при использовании меньшей дозы антигена эффективность, эквивалентную той, которую дает полная доза, используемая без адъюванта. Таким образом, комплекс по производству вакцин при той же производительности может производить большее количество доз вакцин. Также существующая упаковка может быть предложена для вакцинации большего числа животных.
Ни один адъювант не был описан или не использовался до сегодняшнего дня при применении технологии вакцинации путем местного введения с использованием живых вакцин.
Существует необходимость в разработке разбавителей, которые также обладают функцией адъюванта для улучшения иммунного ответа, такого как описан выше. Эти композиции называются Dilants Adjuvants (DA).
Основная трудность, встречающаяся при разработке DA - это способность указанного разбавителя-адъюванта (DA) сохранять живую вакцину живой для того, чтобы она сохраняла свои иммуногенные свойства.
Важный элемент разработки адъювантов для живых вакцин заключается в специфической способности адъювантов не убивать живые микроорганизмы, являющиеся вакцинными антигенами, при введении их в контакт до инъекции. DA представлены на рынке (например, токоферолацетат фирмы Intervet, содержащийся в Diluvac Forte) и рекомендованы для некоторых живых вакцин.
Кроме того, живая вакцина известна из французской заявки на патент FR 2385401.
Тем не менее эту живую вакцину не готовят с адъювантами. До настоящего времени считалось, что наибольший иммунный ответ можно получить при использовании живой вакцины, например, повышая содержание вируса или используя более иммуногенный штамм.
По настоящему изобретению был найден способ получения вакцины с живым вирусом, который отличается тем, что живую вакцину получают при помощи адъюванта типа эмульсии с непрерывной водной фазой, например, эмульсии или микроэмульсии вода-в-масле.
Неожиданно было обнаружено, что использование эмульсии масло-в-воде (Н/Е) в качестве «разбавителя» для живых вакцин положительно влияет на серологический и иммунный ответ у привитых животных. В этой эмульсии масло-в-воде внешняя водная фаза позволяет вакцине (главным образом, лиофилизированной) легко растворяться.
Другой аспект изобретения заключается в том, что использование эмульсии масло-в-воде в качестве разбавителя адъюванта для живых вакцин вызывает очень высокий серологический ответ у молодых животных, еще обладающих материнским иммунитетом. Этот неожиданный эффект может быть вызван защитным действием эмульсии на живой вирус против нейтрализации антителами, имеющимися у животного.
Цель настоящего изобретения заключается в исправлении всех или части недостатков предшествующего уровня техники, указанных выше.
Поэтому объектом настоящего изобретения является способ получения вакцинной композиции, используемой в лечении путем местного введения вирусного заболевания птиц, включающий по меньшей мере одну стадию:
а) смешивание вакцины, содержащей по меньшей мере один живой вирус, выбранный из вируса, относящегося к одному или нескольким штаммам указанной болезни птиц, с разбавителем-адъювантом (DA) непосредственно перед применением, отличающийся тем, что указанный разбавитель-адъювант является эмульсией с непрерывной водной фазой типа масло-в-воде или микроэмульсией типа масло-в-воде.
Под вирусным заболеванием птиц понимают:
- вирусные респираторные заболевания, такие как, например, инфекционный ларинготрахеит, инфекционный птичий бронхит, герпесвирус голубей, ринотрахеит индейки;
- вирусные заболевания пищеварительного тракта, такие как, например, чума уток, вирусный гепатит уток, гепаднавирус птиц;
- вирусные заболевания кожи, например птичья оспа;
- вирусные заболевания нервной системы, такие как, например, птичий энцефаломиелит, энцефалопатит лошадиный восточный, лихорадка западного Нила, бешенство, вирусный энцефаломиелит овец;
- распространенные вирусные заболевания, такие как, например, птичья псевдочума (болезнь Ньюкасла), болезнь Марека, болезнь Гамборо, птичья чума, птичий лейкоз, инфекционная анемия цыплят, болезнь Derszy, болезнь «тонкоскорлупного яйца».
Под разбавителем понимают вещество, предназначенное для введения в другое вещество для понижения его титра, его насыщенности или его процентного содержания.
Разбавитель-адъювант для вакцины для местного применения (DAVAVL) должен:
- сохранять вакцину живой после восстановления в течение определенного периода;
- обеспечивать получение формулы (вакцинная композиция), легко распыляемой (“sprayable”) и увлажняющей, для слизистых оболочек (гидрофильной природы) в целях эффективной и легко проводимой обработки;
- существенно улучшать иммунную эффективность антигена по сравнению с таковой антигена, используемого без адъюванта, не вызывая при этом побочного действия.
К тому же способы осуществления изобретения могут иметь одну или несколько из следующих характеристик:
- способ, такой как определен выше, отличающийся тем, что указанный вирус, содержащийся в указанной вакцине, относится к одному или нескольким штаммам VBI (вирус инфекционного бронхита);
- способ, такой как определен выше, отличающийся тем, что указанный вирус, содержащийся в указанной вакцине, является вирусом Ньюкасла;
- способ, такой как определен выше, отличающийся тем, что указанный вирус, содержащийся в указанной вакцине, относится к одному или нескольким штаммам VBI (вирус инфекционного бронхита), вирусу болезни Ньюкасла или смеси этих вирусов.
Болезнь Ньюкасла, называемая также «псевдочумой птиц», «пневмоэнцефалитом птиц» или «болезнью Ranikhet», является зоонозом птиц вирусного происхождения.
Заболеваемость и смертность в значительной степени изменяются в зависимости от вирулентности штамма, иммунитета и состояния животного и других экологических факторов.
Вирус болезни Ньюкасла является вирусом семейства Paramyxoviridés вида Rubulavirus.
Это вирус с одной цепочкой РНК (в отличие от гриппа, который имеет восемь цепочек), называемый одноцепочечным. Вирусы с РНК часто и легко мутируют, что может сделать фармацевтические и вакцинные стратегии более сложными и трудными.
Оболочка диаметром от 150 до 300 нм имеет два типа гликопротеиновых спикул. Она характеризуется:
- гликопротеином HN, обладающим гемагглютинирующей и нейрамидазной активностями, обеспечивая прикрепление вириона к мембранным рецепторам на поверхности клетки и его раздевание;
- гликопротеином F, который обеспечивает слияние между оболочкой вируса и клеточной мембраной.
Культивирование вируса легко осуществляется в эмбриональных куриных яйцах или in vitro (на фибробластах эмбрионов цыпленка или на почечных клетках цыпленка). Вирус очень устойчив при комнатной температуре, он остается инфекционным:
- в течение длительного времени (несколько месяцев) в помете;
- от 2 до 3 месяцев на полу в курятнике;
- от 7 до 8 месяцев на загрязненной скорлупе,
- 2 года и более на сыром замороженном скелете.
Как и в отношении гриппа, штаммы классифицируют по их вирулентности, различая:
- велогенные штаммы (высоковирулентные, вызывающие смертность, приближающуюся или достигающую 100%, с атакой системной или по меньшей мере висцеральной или нервной системы, связанной или не связанной с респираторными нарушениями),
- мезогенные штаммы (средней вирулентности), вызывающие респираторное заболевание с нарушениями нервной системы, при которых смертность достигает 50% у молодых птиц,
- лентогенные штаммы (со слабой вирулентностью, несмертельные, вызывающие некоторые респираторные нарушения и в ряде случаев не вызывающие никакого симптома). Например, это штаммы Hitchner B1 и La Sota.
Источники вируса связаны с органами, являющимися мишенью для вируса, которые изменяются в зависимости от вирусного штамма, состояния и иммунной истории зараженной птицы, которая экспрессирует вирус в:
- бронхиальных секретах и фекалиях,
- всех частях скелета.
Вирусы экссекретируются, начиная с инкубации и в течение изменяющегося периода во время выздоровления, от нескольких дней до двух недель, иногда дольше.
Для борьбы с вирусом существуют меры предосторожности и предупреждения, которые могут применяться птицеводом, заключающиеся, например, в карантине инфицированных животных, в эвтаназии инфицированных животных, в мерах гигиены, в дезинфекции и регулярной уборке помещений традиционными дезинфицирующими средствами.
Вакцинация также является средством профилактики.
Объектом изобретения также является:
- способ, такой как указано выше, отличающийся тем, что разбавитель-адъювант (DA) содержит масляный адъювант, водную фазу, по меньшей мере одну двухвалентную неорганическую соль и по меньшей мере одну комплексообразующую добавку;
- способ, такой как указан выше, отличающийся тем, что вирус, содержащийся в указанной живой вакцине, лиофилизуют до стадии а).
Живые вакцины хранят главным образом лиофилизированными, и суспендируют непосредственно перед использованием в водной фазе. Восстановленную таким образом вакцину следует использовать в течение нескольких часов после добавления разбавителя.
- Способ, такой как определен выше, отличающийся тем, что указанный разбавитель-адъювант является эмульсией типа масло-в-воде, содержащей на 100% своей массы:
от 50% до 97% воды, более предпочтительно от 70% до 97% воды и еще более предпочтительно от 80% до 97% воды;
от 1% до 45% масляного адъюванта, более предпочтительно от 1% до 30% масляного адъюванта и еще более предпочтительно от 2% до 10% масляного адъюванта;
от 0,1% до 10% по меньшей мере одной двухвалентной неорганической соли, более предпочтительно от 0,1% до 8% и еще более предпочтительно от 0,2% до 3%;
от 0,1% до 10% по меньшей мере одного комплексообразующего агента, более предпочтительно от 0,1% до 8% и еще более предпочтительно от 0,2% до 3%.
- Способ, такой как определен выше, отличающийся тем, что указанный разбавитель-адъювант является микроэмульсией типа масло-в-воде, содержащей на 100% своей массы:
от 50% до 97% воды, более предпочтительно от 70% до 97% воды и еще более предпочтительно от 80% до 97% воды;
от 1% до 45% масляного адъюванта, более предпочтительно от 1% до 30% масляного адъюванта и еще более предпочтительно от 2% до 10% масляного адъюванта;
от 0,1% до 10% по меньшей мере одной двухвалентной неорганической соли, более предпочтительно от 0,1% до 8% и еще более предпочтительно от 0,2% до 3%;
от 0,1% до 10% по меньшей мере одного комплексообразующего агента, более предпочтительно от 0,1% до 8% и еще более предпочтительно от 0,2% до 3%.
- Способ, такой как определен выше, отличающийся тем, что указанный масляный адъювант содержит на 100% своей массы:
от 40% до 95% по меньшей мере одного минерального масла, более предпочтительно от 50% до 95% по меньшей мере одного минерального масла и еще более предпочтительно от 50% до 90% по меньшей мере одного минерального масла;
от 5% до 60% по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества, более предпочтительно от 5% до 50% по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества и еще более предпочтительно от 10% до 50% по меньшей мере одного поверхностно-активного вещества.
- Способ, такой как определен выше, отличающийся тем, что указанную по меньшей мере одну двухвалентную неорганическую соль выбирают из глюконата марганца, глюконата кальция, аспартата кальция, глюконата цинка, глюконата железа, хлорида кальция.
- Способ, такой как определен выше, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один комплексообразующий агент выбирают из этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA), глюконата натрия, глюконата калия и полиакрилата натрия.
Минеральные масла, используемые для получения масляных адъювантов, выбирают из группы, состоящей из минеральных масел, углеводородов, полученных путем перегонки нефти и осуществления последующих стадий обработки, таких как, например, стадии десульфуризации, дезасфальтизации, экстракции ароматических соединений, экстракции восков и других стадий конечной обработки (например, можно назвать масла типа MARCOL 52, MARCOL 82, DRAKEOL 5 и DRAKEOL 6, и т.д.).
Поверхностно-активные вещества, присутствующие в масляных адъювантах, являются поверхностно-активными эмульгаторами, имеющими гидрофильный характер, отличающийся величиной HLB от 8 до 19, более предпочтительно от 8 до 15.
Такое поверхностно-активное вещество может состоять из алкилполигликозида или смеси алкилполигликозидов; сапонинов; лецитинов; полиоксиэтилированных алканолов; полимеров, содержащих полиоксиэтиленовые и полиоксипропиленовые блоки; сложных эфиров, полученных путем конденсации жирной кислоты, преимущественно жирной кислоты, жидкой при 25°С, с сахаром, сорбитолом, маннитолом или глицерином. Указанный сахар может состоять из глюкозы или сахарозы, или преимущественно маннитола. В качестве предпочтительных сложных эфиров можно назвать сложные эфиры жирных кислот, такие как, например, олефиновой кислоты, стеариновой кислоты, пальмитиновой кислоты, лауриновой кислоты и сорбитола или маннитола, полученных этерификацией жирной кислоты с сорбитолом или маннитолом или этерификацией с продуктами, полученными ангидризацией полигидроксилированной цепочки сорбитола или маннитола, которая циклизуется в положении 1-4 или в положении 2-6. В качестве особо предпочтительных сложных эфиров маннитола можно назвать олеаты маннитола, олеаты маннитана, этоксилированные олеаты маннитола с 5-10 молями, или 15-20 молями этиленоксида, этоксилированные олеаты маннитана с 5-10 молями или 15 молями, или 20 молями этиленоксида. Также могут использоваться производные сложных эфиров сахара, полиэтиленгликоля, сорбитола или глицерина. Другими типами предпочтительных поверхностно-активных веществ являются этоксилированные растительные масла, такие как, например, этоксилированные кукурузные масла, содержащее от 3 молей до 40 молей этиленоксида, этоксилированные рапсовые масла, содержащее от 3 молей до 40 молей этиленоксида, этоксилированные касторовые масла, содержащее от 3 молей до 60 молей оксида этилена.
ПРИМЕРЫ
Совместимость формул адъювантов с жизнеспособностью лиофилизированных вакцин связано с композицией этой формулы адъювантов и с ее используемым количеством. Выбор комбинированных биосовместимых компонентов в количествах, обеспечивающих успешное применение и адъювантную способность, осуществлялся, затем оценивался в протоколах количественных исследований. Жизнеспособность вакцин с адъювантами (и, следовательно, совместимость рецептур с живыми вакцинами) является хорошей у вакцин, проявивших эффективность, превышающую эффективность коммерческого образца.
Повышение эффективности выражается для птицеводов в более высокой зоотехнической эффективности, более низкой стоимости обработки и выигрыше во времени. В настоящее время при обработке местным путем не используют адъюванты, являющиеся стимуляторами эффективности.
А. Выявление в случае инфекционного бронхита
а) Продукты, являющиеся объектами исследования
Полученные различные разбавители-адъюванты
Таблица 1
DA1
DA2
DA3
DA4
DA5
DA6
DA7
DA8
DA9
DA10
DA11
Вода
83%
83%
86%
86%
86%
83%
89%
89%
86%
98%
75%
Адъювант:
масло Marcol 52
5%
5%
5%
5%
5%
5%
5%
5%
5%
0%
15%
этоксилированный олеат маннитана HLB=12
5%
5%
2%
2%
5%
5%
2%
2%
5%
0%
10%
Агент:
комплексообразующая добавка EDTA
0%
0%
0%
0%
2%
0%
2%
0%
2%
0%
0%
полиакрилат натрия
5%
0%
5%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
2%
0%
Минеральная соль:
глюконат марганца
2%
2%
2%
2%
2%
2%
2%
2%
0%
0%
0%
глюконат кальция
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
0%
2%
0%
0%
Физическая форма разбавителя-адъюванта
m H/E
m H/E
H/E
H/E
m H/E
m H/E
H/E
H/E
m H/E
-
H/E
- m H/E: микроэмульсии Н/Е- Н/Е: эмульсия Н/Е
Полученные различные вакцинные композиции
Используемый антиген: вирус линии Н-120 вируса В1, экстрагированный из эмбриональных яиц цыплят, не содержащих патогенов (SPF) с эффективным титром инфективности Ig 7.0 EID50/мл.
Каждую экспериментальную вакцину (от VA1 до VA11, содержащая соответственно разбавитель-адъювант DA1-DA11) получают путем добавления:
- примерно 5% антигена (соответствующего лиофилизату антигена, описанного выше) и
- примерно 95% экспериментального разбавителя-адъюванта (DA1-DA11).
b) Измерения эффективности на цыпленке
Экспериментальный протокол
3
b1) Эффективность каждой из вакцинных композиций (VA1-VA11) была определена по группам из 10 цыплят, получавшим 100 мкл вакцины в каждую ноздрю (введение интраназальное 0,2 см вакцины одному животному).
Таким образом, цыплята группы i получают прививку вакцины VAi, где i принимает значения от 1 до 11. Цыплята, используемые в рамках этого эксперимента, выведены на ферме, их возраст 22 дня, являются серонегативными в отношении инфекционного бронхита BI штамма Highsex brunes.
С другой стороны:
- группа из 10 цыплят (группа 12), или положительная контрольная группа, получает тем же путем коммерческую вакцину от инфекционного бронхита. Эта коммерческая вакцина содержит только воду в качестве разбавителя и не содержит ни адъюванта, ни масла, ни поверхностно-активного вещества.
В качестве положительного контроля использовали коммерческую вакцину, выпускаемую фирмой FGI “ARRIAH”; IB штамм Н-120, серия 211.
- в группе из 10 цыплят (группа 13), или отрицательной контрольной группе, вакцинацию не проводили.
У каждого цыпленка из каждой группы брали кровь через 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 дней после начала вакцинации для количественного определения содержания образовавшихся антител.
Испытание на вирулентность
b2)
Через 56 дней со дня первой вакцинации защита, вызванная вакцинами, оценивалась путем испытания на вирулентность: с этой целью инфицировали животных определенным количеством патогена (используя патогенный штамм М-41 вируса IB в дозе 6,46 CD50 или Ig 6,3 EID 50).
Интенсивность вызванного заболевания оценивали путем измерения:
1) кумулятивной интенсивности в баллах по каждому животному в течение 7 дней после инфицирования по шкале оценок (1 балл: затрудненное дыхание; 2 балла: затрудненное дыхание и трахеальные затруднения; 3 балла: дыхательная недостаточность, отечность головы, выделения, общие симптомы). Чем дольше и интенсивнее болеет группа, тем этот счет будет больше;
2) суммы дней, в течение которых наблюдали симптомы в группе: это наблюдение показывает способность животных справиться с болезнью;
3) среднее число баллов с типовым отклонением по группе, позволяющее оценивать однородность группы;
4) отсроченное начало болезни: некоторые виды обработки замедляют появление симптомов, но в ущерб способности справиться с болезнью;
5) количество заболевших животных.
Эти оценки делает ветеринар, должным образом квалифицированный и прошедший подготовку в рамках экспетиментального протокола, обычно применяемого для оценки свойств вакцин от IB.
Результаты экспериментов
Титры антител
Совокупность результатов приведена в таблице II.
Группа непривитых животных (группа 13) по существу не индуцирует антитела (примерно 1 с типовой погрешностью примерно 0,2), что означает, что во время испытания заражения вирусом не произошло, подтверждая, таким образом, другие результаты.
Коммерческая вакцина (группа 12) приводит к титрам, превышающим 3, через 28 дней с типовой погрешностью примерно 0,2, начиная с 14 дня после вакцинации, которая сохраняется в течение 56 дней.
В группах 1, 3, 5, 7, 9 титры антител превышают 3 (до 4), через 21 день и в продолжение всего испытания с типовыми погрешностями примерно 0,2.
Эти группы демонстрируют существенно более высокие результаты по сравнению с коммерческой вакциной (в таблице обозначено Р).
Другие группы демонстрируют ответ на подобном или более низком уровне по сравнению с коммерческой вакциной.
Р определяет значимость результатов, т.е. вероятность случайности, которая позволяет установить, являются ли расхождения значимыми.
P<0,01: значимая разница по сравнению с коммерческой вакциной.
P<0,001: очень значимая разница по сравнению с коммерческой вакциной.
<b>Таблица II</b><b>Результаты по титрам антител в группах 1-13 до испытания на вирулентность в течение 56 дней</b>
Дни после вакцинации
До вакцинации
7
14
21
28
35
42
49
56
Группа 1
2,11±0,13
1,40±0,23
2,31±0,13
2,65±0,07
2,89±0,13
3,19±0,13
3,99±0,04 (P<0,001**)
4,01±0,04 (P<0,001)
3,76±0,08 (P<0,001)
Группа 2
1,46±0,27
1,18±0,25
2,42±0,12
2,60±0,14
3,22±0,17
3,23±0,14
3,21±0,15
3,24±0,13
3,15±0,16
Группа 3
2,11±0,13
1,40±0,23
2,31±0,13
2,65±0,07
2,89±0,13
3,19±0,13
3,99±0,04 (P<0,001**)
4,01±0,04 (P<0,001)
3,76±0,08 (P<0,001)
Группа 4
2,08±0,23
1,39±0,29
2,48±0,15
2,74±0,2
2,55±0,44
3,03±0,18
3,10±0,14
3,11±0,19
3,68±0,11 (P<0,001)
Группа 5
1,68±0,32
1,85±0,22
2,61±0,17
3,24±0,17
3,64±0,10 (P≤0,01)
3,72±0,10 (P<0,02)
3,70±0,11 (P<0,001)
3,48±0,14
3,22±0,16
Группа 6
1,40±0,27
0,68±0,25
2,55±0,18
2,97±0,21
2,90±0,20
3,05±0,12
3,01±0,13
2,92±0,15
2,82±0,17
Группа 7
1,91±0,29
1,44±0,22
2,84±0,14
2,90±0,17
3,24±0,20
3,90±0,05 (P<0,001)
3,90±0,05 (P<0,001)
3,69±0,08 (P<0,01)
3,46±0,1 (P<0,01)
Группа 8
1,60±0,25
1,91±0,14
2,77±0,19
3,11±0,22
3,28±0,21
3,38±0,17
3,23±0,19 (P<0,01)
3,20±0,14
3,06±0,17
Группа 9
1,62±0,22
1,75±0,20
2,81±0,23
3,43±0,16
3,74±0,32 (P≤0,01)
3,82±0,15 (P<0,02)
3,75±0,19 (P<0,001)
3,48±0,14
3,22±0,16
Группа 10
1,97±0,10
1,33±0,18
2,62±0,12
2,91±0,12
3,14±0,11
3,09±0,15
3,08±0,14
2,85±0,13
2,63±0,14
Группа 11
1,11±0,13
1,54±0,08
2,32±0,23
3,01±0,11
3,04±0,21
3,11±0,12
3,12±0,19
2,52±0,23
2,53±0,54
Группа 12, коммерческая вакцина
1,72±0,21
1,42±0,29
2,58±0,18
2,81±0,17
3,15±0,14
3,27±0,13
3,09±0,10
3,11±0,15
3,07±0,04
Группа 13, непривитые животные
1,65±0,26
0,50±0,21
1,00±0,22
0,44±0,23
0,79±0,20
0,80±0,21
0,76±0,18
0,58±0,24
0,38±0,21
Испытание на вирулентность
<b>Таблица III</b><b>Результаты испытания на вирулентность в группах 1-13,</b><b>являющиеся показателем сопротивляемости вирусу</b>
Группа
Число цыплят
Сумма баллов
Общее число дней проявления клинических симптомов
Среднее число баллов/цыпленок±типовая погрешность
Средняя задержка появления симптомов ±типовая погрешность
Пропорция, вызывающая заболевание
1
10
2
2
0,20±0,38
0,20±0,42
0,40
2
10
32
11
3,2±0,71
3,39±2,84
0,80
3
10
2
3
0,20±0,11
0,20±0,32
0,10
4
10
34
33
3,40±2,80
3,30±2,75
0,90
5
10
5
5
0,50±0,70
1,00±0,71
0,30
6
10
13
12
1,30±0,28
1,90±0,88
0,60
7
10
3
3
0,30±0,48
0,30±0,48
0,30
8
10
12
11
1,20±0,88
1,10±0,88
0,70
9
10
2
2
0,20±0,42
0,20±0,42
0,30
10
10
12
11
1,20±1,23
1,10±1,29
0,70
11
10
8
8
0,80±1,03
0,80±1,03
0,50
12, коммерческая вакцина
9
22
21
2,44±1,94
2,33±1,73
0,50
13, контрольная отрицательная группа
12
109
83
9,08±1,83
6,92±1,44
1,00
Непривитая контрольная группа (группа 13) демонстрирует очень высокие показатели интенсивности проявления симптомов (примерно 9 по одному цыпленку при 100% животных с большим количеством дней болезни и задержкой появления симптомов болезни, составляющей примерно 7 дней). Эти результаты подтверждают правильность испытания на вирулентность.
Использование коммерческой вакцины (группа 12) существенно уменьшает все эти параметры, тем не менее при этом 50% цыплят заболевают только с двухдневной задержкой, но с умеренными симптомами (сумма 22 балла) и болеют в течение относительно короткого периода (в сумме только 21 день).
Группы 1, 3, 5, 7, 9 демонстрируют очень низкие суммарные показатели (0,2-0,5) в течение коротких периодов (в сумме от 2 до 5 дней) без существенной задержки появления симптомов заболевания и с защитой по меньшей мере 60% популяции в каждой группе.
Другие группы демонстрируют показатели, являющиеся промежуточными между коммерческой вакциной и группами 1, 3, 5, 7, 9, но с защитой не более 50% популяции.