Проточная цитометрия в диагностике сепсиса у детей 1-го года жизни с врожденными пороками сердца, оперированных в условиях искусственного кровообращения

тарной недостаточности при невынашивании беременности: Автореф. дис ... канд. мед. наук. Томск; 2011.

REFERENCES

1. Karpishchenko A.I. Medical laboratory technology. St. Petersburg: Intermedika; 1998; vol. 1: 298—306.

2. Mamendolieva N.M., Shishchenko V.M., Fursova Z.K., Levantovs-kaya I.N. Features of the enzymatic activity of leukocytes in women with recurrent pregnancy loss and history. 1996; 3: 30—3.

3. Sidel'nikova V. Habitual loss of pregnancy. Moscow: Triada-X; 2005.

4. Sinichikhin S.P., Lechieva E.U Prognostichekoe value determination before the birth of the enzymatic activity of lymphocytes in pregnant women. Vestnikgosudarstvennogo meditsinskogo universiteta. 2008; 2: 68—70.

5. Sinichikhin S.P., Cherkasov N.S., Kokolina V.F. A method of predicting the state of infants. Patent № 2265850.

6. Sinichikhin S.P., Sinichikhin M.E., Navzurova E.U., Lechieva E.V., Pakhilova E.V. Possibilities of using immunological and morphological methods of research in obstetrics and perinatology. Dalne-vostochnyy gosudarstvennyy meditsinskiy universitet. 2008; 3: 37— 41.

7. Khundiryakova N.V., Zakharchenko M.V., Zakharchenko A.V., Vishnevskiy E.L., Myuller M.N. еt al. Succinate dehydrogenase activity in peripheral blood lymphocytes as an indicator of the state of the body and the way to control treatment. Pushchino: Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences. 2007.

8. Chabanova E. B. Clinical and laboratory effects of succinic acid and bioflavonoids in the treatment of placental insufficiency in miscarriage: Diss. Tomsk; 2011.

Поступила 29.11.13 Received 29.11.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014

УДК 616.94-053.2-02:616.12-007.2-053.1-089]-076.5

Субботовская А.И., Кривошапкина А.А., Шилова А.Н., Струнин О.В., Козырева В.С., Ефимов А.А., Корнилов И.А.

ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ В ДИАГНОСТИКЕ СЕПСИСА У ДЕТЕЙ 1-ГО ГОДА ЖИЗНИ С ВРОЖДЕННЫМИ ПОРОКАМИ СЕРДЦА, ОПЕРИРОВАННЫХ В УСЛОВИЯХ ИСКУССТВЕННОГО КРОВООБРАЩЕНИЯ

ФГБУ "Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. акад. Е.Н. Мешалкина" Минздрава России, 630050, Новосибирск

Цель исследования — оценить чувствительность и специфичность CD64-индекса и относительного количества HLA-DR+моноцитов в диагностике сепсиса у детей 1-го года жизни после оперативной коррекции врожденных пороков сердца в условиях искусственного кровообращения (ИК). Для определения CD64-индекса использовали набор Leuko64 (Beckman Coulter, США); относительное количество HLA-DR+моноцитов измеряли с помощью комбинации моно-клональных антител CD14-APC, HLA-DR-PacificBlue, CD45-KrOr на проточном цитофлюориметре Navios (Beckman Coulter, США). В результате проведенного исследования выявили: CD64-индекс в группе с сепсисом (подтвержденным или предполагаемым) составил 2,29 (1,96:3,32), что статистически значимо выше (p=0,001), нежели в группе без сепсиса. Статистически значимых различий концентрации С-реактивного белка в сыворотке крови (p=0,123), абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови (p=0,128), относительного количества HLA-DR+^оноцитов (р=0,789) не обнаружили. Показано, что значение СD64-индекса более 2 повышает риск развития сепсиса в 9,4 раза и может быть использовано в качестве диагностического критерия сепсиса (AUC=0,895) c чувствительностью 80% и специфичностью 90%. Отрицательная прогностическая значимость CD64-индекса и содержания прокальцитонина в отношении развития сепсиса у детей 1-го года жизни, оперированных в условиях ИК, составила 74 и 76%%, положительная — 77 и 64% соответственно.

Ключевые слова: сепсис; CD64; прокальцитонин; HLA-DR^-моноциты; врожденные пороки сердца. A.I. Subbotovskaya, A.A. Krivoshapkina, A.N. Shilova, O.V. Strunin, V.S. Kozyreva, A.A. Efimov, I.A. Kornilov

THE FLOW CYTOMETRY IN DIAGNOSTIC OF SEPSIS IN CHILDREN OF FIRST YEAR OF LIFE WITH CONGENITAL HEART DISEASE AND OPERATED IN CONDITIONS OF ARTIFICIAL CIRCULATION

The study was organized to evaluate sensitivity and .specificity of CD64 index and relative amount of HLA-DR+ monocytes in diagnostic of sepsis in children offirst year of life after surgery correction if congenital heart disease in conditions of artificial circulation. To detect CD64 index the kit Leuko64 (Beckman Coulter, USA) was applied. The relative amount of HLA-DR+ monocytes was measured by flow cytofluorimeter Navios (Beckman Coulter, USA) using combination of monoclonal antibodies CD14-APC, HLA-DR-PacificBlue, CD45-KrOr. The results of study established that CD64 index in the group with confirmed or supposed sepsis consisted 2.29 (1.96:3.32) that statistically is reliably higher (p=0.001) than in group without sepsis. The study established no statistically reliable differences in concentration of C-reactive protein in blood serum (p-0.123), absolute amount of leukocytes in peripheral blood (p=0.128), relative amount of HLA-DR+ monocytes (p=0.789). It is demonstrated that value of CD64 index higher than 2.00 increases the risk of development of sepsis up to 9.4 times and can be used as a diagnostic criterion of sepsis (AUC=0.895) with sensitivity up to 80% and specificity up to 90%. The negative prognostic significance of CD64 index and content ofprocalcitonin in relation to development of sepsis in children of first year of life operated in conditions of artificial circulation amounted to 74%% and 76%% and 77% and 64%% in case of positive prognostic significance correspondingly.

Keywords: sepsis; CD64; procalcitonin; HLA-DR+ monocytes; congenital heart disease.

Для корреспонденции:

Субботовская Анна Игоревна, мл. науч. сотр. Адрес: 630050, Новосибирск, ул. Речкуновская, 15. E-mail: asubbotovskaya@gmail.com

В настоящее время для ранней диагностики септического процесса используют такие лабораторные показатели, как концентрация С-реактивного белка (СРБ), интерлейкина-6, прокальцитонина в сыворотке, а также показатели лейкоцитарного состава, определение и характеристику его субпопуляций [1—4], в том числе оценку количества HLA-DR+-моноцитов в периферической крови [5, 6]. Также активно изучают вопрос об оценке экспрессии FcyRl (CD64) нейтро-филов для ранней диагностики сепсиса у разных категорий больных [7].

В физиологических условиях для молекулы CD64 характерны высокая степень экспрессии на мембранах моноцитов и низкая степень экспрессии на нейтрофилах и лимфоцитах. При развитии септического процесса уровень экспрессии CD64 на нейтрофилах резко увеличивается, при этом экспрессия CD64 на моноцитах и лимфоцитах практически не изменяется. Результаты недавних исследований показали, что вариабельность экспрессии FcyRI-рецепторов (CD64) на нейтрофилах является новым маркером бактериального сепсиса. Ряд работ продемонстрировали возможность его применения в качестве раннего дифференциального критерия между сепсисом и инфекционным процессом у взрослых [7—12], новорожденных [13—17] и детей [18, 19].

В связи с этим цель исследования — оценка чувствительности, специфичности и прогностической значимости CD64-индекса в диагностике сепсиса, а также относительного количества HLA-DR+-моноцитов у детей 1-го года жизни, оперированных по поводу врожденных пороков сердца (ВПС) в условиях искусственного кровообращения (ИК).

Материалы и методы. Исследование провели в ФГБУ "Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения им. акад. Е.Н. Мешалкина" на базе детского отделения реанимации и интенсивной терапии с мая 2013 по сентябрь 2013 г. В исследовании приняли участие 36 детей 1-го года жизни: из них 20 до 1 года (28 сут < возраст < 1 года) и 16 новорожденных. Все дети были прооперированы в связи с различными ВПС в условиях ИК и находились на лечении в отделении реанимации и интенсивной терапии.

Для определения CD64-индекса, количества HLA-DR+-моноцитов, прокальцитонина и СРБ забирали цельную ЭДТА-стабилизированную венозную кровь при возникновении подозрения на сепсис (1—2-е сутки после операции). Абсолютное количество лейкоцитов определяли с использованием гематологического анализатора KX21N (Sysmex, Япония). Содержание прокальцитонина (PCT) определяли полуколичественным иммунохроматографическим методом на тест-полосках Brahms PCT-Q (Thermo Scientific, Германия). Концентрацию СРБ измеряли на автоматическом биохимическом анализаторе AU680 (Beckman Coulter, США). Относительное количество HLA-DR+-моноцитов

определяли с использованием комбинации моноклональ-ных антител CD14-APC, HLA-DR-PacificBlue, CD45-Krür (Beckman Coulter, США) на проточном цитофлюориметре Navios (Beckman Coulter, США).

CD64-индекс на нейтрофилах определяли согласно рекомендациям производителя к тест-системе Leuko64 (Beckman Coulter, США) на проточном цитофлюориметре Navios (Beckman Coulter, США). В состав набора Leuko64 входят комбинация моноклональных антител CD64-FITC и CD163-PE, а также калибровочные частицы с известной интенсивностью флюоресценции. Подсчет CD64-индекса производили с использованием специализированного программного обеспечения QuantiCALC Leuko64 (Trillium Diagnostics, США). Схема последовательного гейтирования и анализа представлена на рис. 1.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием стандартного пакета программ SPSS v.20.0. Для всех имеющихся выборок данных проверяли гипотезу нормальности распределения по критерию Шапиро—Вилка. Для данных, распределенных непараметрически, вычисляли средневыборочные характеристики: М — медиану, 25-й и 75-й квартили (Q25:Q75). Для оценки достоверности различий выборок, не подчиняющихся нормальному распределению, использовали критерий Манна—Уитни для независимых выборок. Для сравнения качественных показателей применяли критерий %2. С помощью ROC-анализа оценивали пригодность интервальных показателей в качестве дихотомического классификатора. В качестве интервального показателя выбирали точку на ROC-кривой с наибольшей суммой чувствительности и специфичности. Различия считали достоверными при p<0,05.

Результаты и обсуждение. В исследовании участвовали 36 детей, прооперированных в связи с ВПС. У 16 из них развился сепсис, в том числе у 3 диагноз подтверждался положительной гемокультурой, у 9 зафиксировали SIRS, у 8 — другие инфекционные осложнения без генерализации процесса (пневмонии, медиастиниты и др.), у 3 послеоперационный период протекал без осложнений. В дальнейшем для статистического анализа исследуемую выборку больных разделили на две группы: 1-я — в течение послеоперационного периода сепсис не развился, 2-я — зафиксировано развитие сепсиса.

В результате проведенного исследования выявили, что CD64-индекс в группе с сепсисом (подтвержденным или предполагаемым) составил 2,29 (1,96:3,32), что статистически значимо выше (p=0,001), нежели в группе без сепсиса. Статистически значимых различий концентрации СРБ в сыворотке крови (p=0,123), абсолютного количества лейкоцитов в периферической крови (p=0,128), относительного количества HLA-DR+-моноцитов (р=0,789) не обнаружили (табл. 1).

Рис. 1. Схема анализа CD64-индекса на проточном цитофлюориметре Navios.

1B

Таблица 1

Сравнительный анализ лабораторных показателей, используемых в диагностике сепсиса, у детей 1-го года жизни с сепсисом и без сепсиса, М

Показатель Без сепсиса Сепсис

(п=20) (n=16) р

СЭ64-индекс 1,23 2,29 0,001

СРБ, мг/л 27,08 41,01 0,123

(13,18: 42,08) (22,24:

91,51)

Лейкоциты, кл/мл 12,05 13,5 0,404

ЫЬА-ЭК+-моноциты, % 32,5 25,0 0,789

Таблица 2

Полуколичественный метод оценки уровня РСТ и его значение в качестве предиктора развития сепсиса

PCT, мкг/л Без сепсиса(n=20) Сепсис (n=16) Показатель

Менее 2 13 (65) 4 (25) 1 1 5, ;

p = 0,019

Более 2 7 (35) 12 (75) OR = 5,6

Примечание. В скобках указан процент.

Особенности используемой тест-системы для определения содержания РСТ позволяют определить следующие диапазоны его концентрации: менее 0,5 мкг/л — низкая вероятность развития сепсиса; 0,5—2 мкг/л — развитие сепсиса маловероятно; 2—10 мкг/л — существует вероятность системной инфекции; более чем 10 мкг/л — высокая вероятность тяжелого сепсиса или септического шока. Исходя из предложенной производителем интерпретации результатов, мы разделили исследуемую выборку больных на две группы: РСТ менее 2 мкг/л — развитие сепсиса маловероятно; РСТ более 2 мкг/л — высокая вероятность наличия сепсиса. Результаты проведенного исследования показали, что у детей 1-го года жизни уровень РСТ более 2 мкг/л в послеоперационном периоде увеличивает риск развития сепсиса в 5,6 раза (X2 = 5,7; />=0,019; ОК = 5,6 (1,3—23,9)) (табл. 2). С учетом полуколичественного метода определения уровня РСТ оценка чувствительности и специфичности данного показателя невозможна. При этом отрицательная прогностическая значимость определения концентрации РСТ составила 76%, положительная — 63%.

Для оценки возможности использования изучаемых параметров в диагностике сепсиса у детей 1-го года жизни после хирургической коррекции ВПС провели ЯОС-анализ (рис. 2). Площадь под кривой (ЛИС) для СБ64-индекса составила 0,895, что свидетельствует о возможности использования этого лабораторного теста для диагностики сепсиса.

HLADR_ mono CD64 индекс_0 CRP_ 0 Лейкоциты Опорная линия

0,2 0,4 0,6 0,8 1-Специфичность

Рис. 2. ЯОС-кривая лабораторных показателей у детей 1-го года жизни после хирургической коррекции ВПС с сепсисом.

При этом значение СБ64-индекса больше 2 повышает риск развития сепсиса в 9,4 раза (ОК=9,4 (1,92—46,35)) с чувствительностью 80% и специфичностью 90% (табл. 3). Отрицательная прогностическая значимость составила 74%, положительная — 77%.

При оценке относительного количества НЬЛ-ВЯ+-моноцитов выявили, что достоверной разницы между группами нет (р=0,789), однако его средний уровень в обеих группах очень низкий, а в группе с сепсисом достигает критических значений. Известно, что у детей, перенесших ИК, относительное количество НЬЛ-ОЯ+-моноцитов в периферической крови снижается [20]. Согласно другим работам, если относительное количество НЬЛ-БЯ+-моноцитов менее 30% (в нашем случае 25%) — это является ранним прогностическим критерием смертности у детей с септическими состояниями [6].

В результате проведенного ЯОС-анализа выявили, что все изучаемые параметры (СРБ, лейкоциты, НЬЛ-ОЯ+-моноциты) не могут быть использованы для постановки диагноза сепсиса (ЛИС статистически значимо не отличается от 0,5), что также соответствует данным, полученным в исследованиях у детей 1-го года жизни на базе мультидисципли-нарных отделений интенсивной терапии [5, 6].

Таким образом, повышение содержания СРБ, абсолютного количества лейкоцитов и снижение относительного количества НЬЛ-ОЯ+-моноцитов в послеоперационном периоде носит неспецифический характер и в большей степени ассоциировано с особенностями иммунного ответа у детей после кардиохирургического вмешательств в условиях ИК.

Результаты проведенного исследования показали, что для диагностики сепсиса у детей 1-го года жизни возможно использовать такие показатели, как содержание РСТ и СБ64-

Таблица 3

Характеристики ЯОС-кривой. Прогностическая роль исследуемых показателей в качестве предикторов сепсиса у детей

1-го года жизни

Показатель Точка отсечения AUC

СЭ64-индекс Более 2 0,895

90

СРБ, мг/л Ns 0,720 (0,488—0,952) 0,096 N8 Ns

ЫЬА-ЭИ+-моноциты, % Ns 0,617 (0,370—0,864) 0,356 N8 Ns

Лейкоциты, -109/л Ns 0,488 (0,212—0,763) 0,921 N8 Ns

Примечание. ДИ — доверительный интервал; ОШ — отношение шансов.

индекс. В то же время мы установили, что положительная прогностическая значимость уровня PCT у обследуемых пациентов на 13% ниже, чем СЬб4-индекса. Это логично объясняется физиологически повышенным уровнем PCT у новорожденных [22, 23], а также неспецифическим повышением в ответ на хирургическое вмешательство в условиях ИК [21].

В пользу использования СБ64-индекса в качестве основного раннего маркера сепсиса у детей 1-го года жизни после коррекции ВПС в условиях ИК говорят очень высокая скорость его определения (менее 60 мин) и минимальный объем забираемой крови (50 мкл ЭДТА-стабилизированной цельной крови), что очень актуально в данном случае в связи с послеоперационными кровотечениями, ассоциированными как с нарушениями гемостаза, так и с приемом антикоагулянтов.

Выводы. 1. У детей 1-го года жизни с ВПС в послеоперационном периоде повышение содержания СРБ, абсолютного количества лейкоцитов и снижение уровня HLA-DR+-моноцитов носит неспецифический характер и не может быть использовано для постановки диагноза сепсиса.

2. Значение СD64-индекса более 2 повышает риск развития сепсиса в 9,4 раза и может быть использовано в качестве диагностического критерия сепсиса (AUC=0,895) c чувствительностью 80% и специфичностью 90%.

3. Отрицательная прогностическая значимость CD64-индекса и содержания PCT в отношении развития сепсиса у детей 1-го года жизни, оперированных в условиях ИК, составила 74 и 76%, положительная — 77 и 64% соответственно.

ЛИТЕ РА Т У РА / REFERENCES

1. Rey C., Los Arcos M., Concha A., Medina A., Pietro S., Martinez P. et al. Procalcitonin and C-reactive protein as markers of systemic inflammatory response syndrome severity in critically ill children. Intensive Care Med. 2007; 33: 477—84.

2. Ng P.C., Lam H.S. Diagnostical markers for neonatal sepsis. Curr. Opin. Pediatr. 2006; 18: 125—31.

3. Enguix A., Rey C., Concha A., Medina A., Coto D., Diequez M.A. Comparison of procalcitonin with C-reactive protein and serum amyloid for the early diagnosis of bacterial sepsis in critically ill neonates and children. Intensive Care Med. 2001; 27: 211—5.

4. Bhandari V., Wang C., Rinder C., Rinder H. Hematologic profile of sepsis in neonates: neutrophil CD64 as a diagnostic marker. Pediatrics. 2008; 121 (1): 129—34.

5. Kanakoudi-Tsakalidou F., Debonera F., Drossou-Agakidou V., Sarafi-dis K., Tzimouli V., Taparkou A. et al. Flow cytometric measurement of HLA-DR expression on circulating monocytes in healthy and sick neonates using monocyte negative selection. Clin. Exp. Immunol. 2001; 123(3): 402—7.

6. Genel F., Atlihan F., Ozsu E., Ozbek E. Monocyte HLA-DR expression as predictor of poor outcome in neonates with late onset neonatal sepsis. J. Infect. 2010; 60 (3): 224—8.

7. Livaditi O., Kotanidou A., Psarra A., Dimopoulou I., Sotiropoulou C., Augustatou K. et al. Neutrophil CD64 expression and serum IL-8:sensitive early markers of severity and outcome in sepsis. Cytokine. 2006; 36: 283—90.

8. Davis B.H., Olsen S. H., Ahmad E., Bigelow N.C. Neutrophil CD64 is an improved indicator of infection or sepsis in emergency department patients. Arch. Pathol. Lab. Med. 2006; 130: 654—61.

9. Qureshi S.S., Lewis S.M., Gant V.A., Treacher D., Davis B.H., Brown K.A. Increased distribution and expression of CD64 on blood

polymorphonuclear cells from patients with the systemic inflammatory response syndrome (SIRS). Clin. Exp. Immunol. 2006; 125: 258—65.

10. Davis B.H., Bigelow N.C. Comparison of neutrophil CD64 expression, manual myeloid immaturity counts, and automated hematol-ogy analyzer flags as indicators of infection or sepsis. Lab. Hematol. 2005; 11: 137—47.

11. Fischer G., Schneider E.M., Moldawer L.L., Karcher C., Barth E., Suger-Wiedeck H. et al. CD64 surface expression on neutrophils is transiently upregulated in patients with septic shock. Intensive Care Med. 2001; 27: 1848—52.

12. Nuutila J., Hohenthal U., Laitinen I., Kotilainen P., Rajamaki A., Nikoskelainen J. et al. Simultaneous quantitative analysis of Fcgam-maRI (CD64) expression on neutrophils and monocytes: a new, improved way to detect infections. J. Immunol. Methods. 2007; 328: 189—200.

13. Ng P.C., Li K., Wong R.P., Chui K.M., Wong E., Fok T.F. Neutrophil CD64 expression: a sensitive diagnostic marker for late-onset nosocomial infection in very low birthweight infants. Pediatr. Res. 2002; 51: 296—303.

14. Ng P.C., Li G., Chui K.M., Chu W.C., Li K., Wong R.P. et al. Neutro-phil CD64 is a sensitive diagnostic marker for early-onset neonatal infection. Pediatr. Res. 2004; 56: 796—803.

15. Layseca-Espinosa E., Perez-Gonzalez L.F., Torres-Montes A., Baranda L., de la Fuente H., Rosenstein Y. et al. Expression of CD64 as a potential marker of neonatal sepsis. Pediatr. Allergy Immunol. 2002; 13: 319—27.

16. Ng P.C., Li G., Chui K.M., Chu W.C., Li K., Wong R.P. et al. Quantitative measurement of monocyte HLA-DR expression in the identification of earlyonset neonatal infection. Biol. Neonate. 2006; 89: 75—81.

17. Bhandari V., Wang C., Rinder C., Rinder H. Hematologic profile of sepsis in neonates: neutrophil CD64 as a diagnostic marker. Pediatrics. 2008; 121: 129—34.

18. Fjaertoft G., Hakansson L., Ewald U., Foucard T., Venge P. Neutro-phils from term and preterm newborn infants express the high affinity Fc[gamma]-receptor I (CD64) during bacterial infections. Pediatr. Res. 1999; 45: 871—6.

19. Groselj-Grenc M., Ihan A., Pavcnik-Arnol M., Kopitar A.N., Gmein-er-Stopar T., Derganc M. Neutrophil and monocyte CD64 indexes, lipopolysaccharide-binding protein, procalcitonin and C-reactive protein in sepsis of critically ill neonates and children. Intensive Care Med. 2009; 35: 1950—8.

20. Струнин О.В., Горбатых Ю.Н., Шунькин А.В., Новикова М.А. Особенности ответа при коррекции врожденных пороков сердца у детей первого года жизни в условиях искусственного кровообращения. Патология кровообращения и кардиохирургия. 2009; 1: 55—8.

21. Davidson J., Tong S., Hauck A., Lawson D.S., Cruz E., Kaufman J. Kinetics of procalcitonin and C-reactive protein and the relationship to postoperative infection in young infants undergoing cardiovascular surgery. Pediatr. Res. 2013; 74 (4): 413—9.

22. Casado-Flores J., Blanco-Quiros A., Asensio J., Arranz E., Garrote J.A., Nieto M. Serum procalcitonon in children with suspected sepsis: a comparison with C-reactive protein and neutrophil count. Pedi-atr. Crit. Care Med. 2003; 4: 190—5.

23. Enguix A., Rey C., Concha A., Medina A., Coto D., Diequez M.A. Comparison of procalcitonin with C-reactive protein and serum amyloid for the early diagnosis of bacterial sepsis in critically ill neonates and children. Intensive Care Med. 2001; 27: 211—5.

Поступила 29.11.13 Received 29.11.13