СИНТЕЗ СИАЛИРОВАННЫХ СОЕДИНЕНИЙ IN VIVO

1. Способ получения сиалированного соединения в микроорганизме, причем способ предусматривает:
культивирование микроорганизма в культуральной среде, при этом указанная культуральная среда необязательно содержит экзогенный предшественник,
где указанный микроорганизм содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую фосфатазу, по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую N-ацетилманнозаминэпимеразу, и по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую синтазу сиаловой кислоты, и
где указанный микроорганизм неспособен: i) превращать N-ацетилглюкозамин-6-P в глюкозамин-6-P, ii) превращать N-ацетилглюкозамин в N-ацетилглюкозамин-6-P и iii) превращать N-ацетилнейраминат в N-ацетилманнозамин; и
модулирование в указанном микроорганизме экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид HAD-подобной фосфатазы, где указанный полипептид HAD-подобной фосфатазы содержит:
по меньшей мере один из следующих мотивов:
мотив 1: hDxDx[TV] (SEQ ID NO: 73) или
мотив 2: [GSTDE][DSEN]x(1-2)[hP]x(1-2)[DGTS] (SEQ ID NO: 74, 75, 76, 77),
где h означает гидрофобную аминокислоту (A, I, L, M, F, V, P, G), и x может представлять собой любую отличную аминокислоту;
или гомолог или производное под любым из SEQ ID NO: 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52, 54, 55 или 57, на по меньшей мере 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичные всей последовательности указанного полипептида.
2. Способ по п. 1, где указанный HAD-подобный полипептид содержит любую из SEQ ID NO: 43, 44, 45, 47, 48, 50, 51, 52, 54, 55 или 57.
3. Способ по п. 1, где указанная модулируемая экспрессия осуществляется в результате введения и экспрессии в микроорганизме нуклеиновой кислоты, кодирующей HAD-подобный полипептид.
4. Способ по п. 1, где указанная модулируемая экспрессия осуществляется в результате действия конститутивного промотора.
5. Способ по любому из предыдущих пунктов, где указанное сиалированное соединение выбрано из группы, состоящей из N-ацетилнейраминовой кислоты, сиалированного олигосахарида, сиалированного липида, сиалированного белка, сиалированного агликона.
6. Способ по предыдущему пункту, где указанное сиалированное соединение представляет собой сиалированный олигосахарид.
7. Способ по п. 6, где указанный сиалированный олигосахарид представляет собой сиалиллактозу.
8. Способ по п. 6, где указанный сиалированный олигосахарид представляет собой дисиалил-лакто-N-тетраозу.
9. Способ по п. 5, где указанное сиалированное соединение представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где указанное сиалированное соединение представляет собой сиалированную лакто-N-триозу, лакто-N-тетраозу или лакто-N-неотетраозу, и где указанный микроорганизм дополнительно предусматривает активность галактозилтрансферазы (EC 2.4.1.38).
11. Способ по п. 10, где указанный микроорганизм неспособен экспрессировать гены, кодирующие UDP-сахарную гидролазу и галактозо-1-фосфатуридилилтрансферазу.
12. Способ по любому из пп. 1-11, где указанный микроорганизм продуцирует на 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2% меньше внеклеточного N-ацетилглюкозамина, чем сиалированного соединения.
13. Способ получения сиалированного олигосахарида, предусматривающий:
a) культивирование микроорганизма в соответствии со способом по любому из пп. 1-12, и где указанный микроорганизм продуцирует внутри себя активированный N-ацетилнейраминат в качестве донорного субстрата для сиалилтрансферазы; и
b) культивирование указанного микроорганизма в культуральной среде, содержащей экзогенный предшественник, выбранный из группы, состоящей из лактозы, N-ацетиллактозамина, лакто-N-биозы, галактозы, бета-галактозида и альфа-галактозида, такой как без ограничения глоботриоза (Gal-альфа-1,4Gal-бета-1,4Glc)галактоза, где происходит активный захват в микроорганизм указанного экзогенного предшественника, и где указанный экзогенный предшественник представляет собой акцепторный субстрат для указанной сиалилтрансферазы для получения сиалированного олигосахарида.
14. Способ по п. 1, где любое одно или более из указанной N-ацетилманнозаминэпимеразы и синтазы сиаловой кислоты сверхэкспрессируется в микроорганизме.
15. Способ по п. 1, где любое одно или более из указанной N-ацетилманнозаминэпимеразы и синтазы сиаловой кислоты вводится и экспрессируется в микроорганизме.
16. Способ по любому из пп. 1-15, где указанный микроорганизм представляет собой бактерию, предпочтительно штамм Escherichia coli, более предпочтительно штамм Escherichia coli, который представляет собой штамм K12, еще более предпочтительно штамм Escherichia coli K12 представляет собой Escherichia coli MG1655.
17. Способ по любому из пп. 1-15, где указанный микроорганизм представляет собой дрожжевой гриб.
18. Микроорганизм, получаемый с помощью способа по любому из пп. 1-17, где указанный микроорганизм содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую HAD-подобный полипептид.
19. Микроорганизм, предназначенный для получения сиалированных соединений, где указанный микроорганизм содержит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую фосфатазу, по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую N-ацетилманнозаминэпимеразу, и по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту, кодирующую синтазу сиаловой кислоты; и
где указанный микроорганизм неспособен: i) превращать N-ацетилглюкозамин-6-P в глюкозамин-6-P, ii) превращать N-ацетил-глюкозамин в N-ацетилглюкозамин-6-P и iii) превращать N-ацетилнейраминат в N-ацетилманнозамин; характеризующийся тем, что
указанный микроорганизм предусматривает модулируемую экспрессию нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид HAD-подобной фосфатазы, как определено в п. 1 или 2.
20. Конструкция, содержащая:
(i) нуклеиновую кислоту, кодирующую HAD-подобный полипептид, как определено в п. 1 или 2;
(ii) одну или более контрольных последовательностей, способных управлять экспрессией последовательности нуклеиновой кислоты (a); и необязательно
(iii) последовательность терминации транскрипции.
21. Конструкция по п. 20, где одна из указанных контрольных последовательностей представляет собой конститутивный промотор.
22. Применение конструкции по п. 20 или 21 в способе получения сиалированных соединений.
23. Сиалированное соединение, полученное в соответствии со способом по любому из пп. 1-17, где указанное сиалированное соединение добавлено к пищевому составу, кормовому составу, фармацевтическому составу, косметическому составу или агрохимическому составу.