Применение панели локусов тандемных повторов переменной копийности для типирования штаммов сохiеllа вurnетii

НАЦИОНАЛЬНЫЕ ПРИОРИТЕТЫ РОССИИ. 2011. № 2 (5). СПЕЦИАЛЬНЫЙ ВЫПУСК

наиболее близка, но не идентична R.canadiensis (85 % сходства).

Анализ фрагментов гена 16S rRNA, полученных с праймерами к микроорганизмам пор. Rickettsiales, выявил значительное их разнообразие в клещах I.per-sulcatus. Структура гена 16S rRNA трех образцов из Прибайкалья была идентична Candidatus R. tarasevichae. Еще 4 образца были идентифицированы как бактерии рода Pseudomonas. Анализ 3 фрагментов гена 16S rRNA от клещей, отловленных в Монголии, позволил идентифицировать два из них как Ehrlichia muris и один -как риккетсиеподобный микроорганизм Montezuma (Медянников, 2004).

Обсуждение. В настоящей работе впервые выявлена циркуляция микроорганизмов порядка Ricket-tsiales на территории Монголии, охарактеризовано их видовое разнообразие. Также получена новая ин-

формация о распространенности и структуре населения риккетсий в Прибайкалье. В ходе исследований было установлено, что порядка 70 % клещей рода Dermacentor и 25 % клещей LpersukaШs в Прибайкалье и Монголии заражены риккетсиями и родственными им микроорганизмами. Ранее в ряде исследований было показано, что любой из обнаруженных нами микроорганизмов способен инфицировать человека и вызывать заболевания различной степени тяжести. Поэтому при проведении профилактических, диагностических и лечебных мероприятий в отношении клещевых инфекций в Прибайкалье и Монголии необходимо принимать в расчет возможность заражения человека этими микроорганизмами.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 08-04-90206-Монг_а.

ПРИМЕНЕНИЕ ПАНЕЛИ ЛОКУСОВ ТАНДЕМНЫХ ПОВТОРОВ ПЕРЕМЕННОЙ КОПИЙНОСТИ ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ШТАММОВ COXIELLA BURNETII

Ю.А. Панферова, Н.К. Токаревич

ФБУН «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера», Санкт-Петербург

Метод мультилокусного анализа тандемных повторов переменной копийности (MLVA) применяется в мировой практике для типирования штаммов С. burnetii с целью мониторинга за циркуляцией отдельных генотипов патогена на определенной территории и возможности установления источника инфекции. В настоящее время создание баз данных с учетом территориальной распространенности генотипов С. burnetii является достаточно острой проблемой в связи с существованием энзоотических очагов коксиеллезной инфекции на территории России и республик бывшего СССР, а также в связи с возможностью проникновения «новых» генотипов (в том числе обладающих высокой патогенно-стью) из удаленных регионов.

Целью данного исследования являлся анализ распределения аллелей локусов, содержащих тандемные повторы переменной копийности, и выбор панели ло-кусов, позволяющих дифференцировать штаммы различного географического происхождения как возможного инструмента для молекулярно-эпидемиологиче-ского мониторинга Ку-лихорадки в очагах.

Материалы и методы. Было исследовано 11 штаммов C.burnetii коллекции штаммов НИИ ЭМ им. Пастера. Штаммы были выделены на территории России (группа штаммов Луга, в том числе Ixodes-3, Cimex-2, Жел-тогорлая мышь; штаммы Ленинград-2, Вологда-2, Уфа-1), Казахстана (Казахстанский-4, Чередов), МНР (Монголия-1), Западной Европы (Henzerling) в период с 1945 по 1987 г., а также штамм М44 (аттенуиро-ванный вариант штамма Грита, применяющийся в России в качестве живой вакцины Ку-лихорадки). В качестве референса был выбран штамм Henzerling; в настоящее время полная последовательность данного штам-

ма опубликована, поэтому длины локусов VNTR для него были рассчитаны с помощью базы данных тандемных повторов прокариот (http://mimsatellites.u-psud.fr). Выделение ДНК проводили методом лизиса с использованием гуанидинизотиацианата с последующей ну-клеосорбцией. Для проведения амплификации использовали термоциклер MyCycler (BioRad) в режимах, обеспечивающих специфичность реакции для каждой пары праймеров.

Для проведения анализа было выбрано 7 локусов мини- и микросателлитных тандемных повторов различной длины мотива (единицы повтора), копийности и локализации в геноме (характеристика локусов представлена в табл. 1).

Для оценки потенциальной возможности применения данного метода генотипирования без выделения чистой культуры коксиелл было проведено исследование MLVA органов белых мышей на 7-й день после инфекции (внутрибрюшинное заражение суспензией штаммов Вологда-2 и Чередов, 2х107 кл). Проведен анализ тотальной ДНК, выделенной из суспензии почек и селезенки, после подтверждения наличия в пробах ДНК C.burnetii методом ПЦР с видоспецифичными праймерами.

Путем анализа парных аллельных отличий локу-сов VNTR с помощью метода «объединения ближайших соседей» была создана дендрограмма; родство между штаммами было установлено путем вычисления коэффициента сходства (UPGMA). Для оценки дискрими-нативной способности было также проведено сравнение кластеризации штаммов коксиелл при исследовании их методом MLVA и методом мультилокусного сиквенс-типирования, проведенного для тех же штаммов ранее (Glazunova O., Roux V., et al., 2005).

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ В ДИАГНОСТИКЕ И ТИПИРОВАНИИ ПАТОГЕНОВ

Таблица 1

Характеристика локусов VNTR

Номер локуса Название локуса Размер мотива

1 Cbu1941_ms36 9 474-601

2 Cbu1471_ms34 6 227-1600

3 Cbu0988_ms07 126 734-1112

4 Cbu1316_ms12 126 570-1200

5 Cbu1941_ms20 18 384-528

6 Cbu0831_ms26 9 109-244

7 Cbu0259_ms24 7 204-344

Результаты и обсуждение. Был выявлен генетический полиморфизм всех исследованных локусов, содержащих тандемные повторы переменной копийно-сти, причем степень полиморфизма отдельных локусов различалась. Во всех случаях длина амплифицирован-ных локусов референс-штамма НешегНтп? соответствовала рассчитанной с помощью анализа базы данных. Продукты ПЦР локуса 4 были получены только для 4 штаммов даже при варьирующих параметрах амплификации, возможно, из-за наличия мутаций в точках связывания праймеров ряда штаммов, поэтому из дальнейшего анализа он был исключен.

Коэффициент сходства между исследованными штаммами варьировал от 0,33 до 1,0. Штаммы, выделенные на территории России, за исключением штамма Ленинград-2, а также штаммы Монголия-1 и Казах-станский-4 образуют единую группу (VNTR-тип 1). Размеры всех исследованных локусов У№ГО в пределах этой группы были одинаковы, и коэффициент сходства для нее составил 1,0. Наибольшая степень сходства этой группы отмечена с западноевропейским штаммом Неп-zerling, представляющим отдельную ветвь (У№ГО-тип 2) на основании оценки генетического сходства штаммов. Коэффициент сходства этих двух групп составил 0,833. Вместе со штаммом М-44, который по профилям локусов У№ГО также представляет несколько обособленную ветвь (У№Ш-тип 3), эти две группы объединяются в кластер с коэффициентом сходства 0,5. Второй кластер представлен штаммами Ленинград-2 и Чередов, представляющими отдельные филогенетические ветви (VNTR-типы 4 и 5 соответственно) с коэффициентом сходства 0,167. Между двумя кластерами не выявлено сходства, что свидетельствует о генетической удаленности этих групп штаммов.

При исследовании органов зараженных коксиел-лами белых мышей профили УМГО совпадали с про-

филями, характерными для профилей чистых культур штаммов Вологда-2 и Чередов, неспецифического отжига праймеров не выявлено.

Генотипические группы, кластеризуемые с помощью MLVA, сравнивались c исследованными ранее сик-венс-типами, выделяемыми на основании анализа нук-леотидных последовательностей межгенных спейсеров. Исследованные штаммы представляют 5 VNTR-типов (в составе 2 кластеров) и 5 сиквенс-типов (в составе 2 мо-нофилетических групп), распределение штаммов при этом совпадает.

Учитывая, что для сиквенс-типов отмечалась ассоциация с географическим источником штаммов и изолятов (Glazunova O., Roux V., et al., 2005) и что в исследованиях западноевропейских и американских штаммов коксиелл с помощью MLVA также показана ассоциация профилей с географическим источником, можно предположить, что выявление в достаточно однородной по данным маркерам популяции С. burnetii, циркулирующей на территории России, штаммов с сильно отличающимися генотипическими свойствами может быть связано с проникновением таких штаммов из удаленных энзоотических районов. Так, штаммы Ленин-град-2 и Чередов отличаются от других исследованных штаммов по всем изученным генотипическим маркерам и входят в один кластер. Этот факт говорит в пользу предположения о происхождении этих штаммов из одного географического региона и о завозном характере вспышки, в ходе которой был выделен штамм Ленинград-2.

Таким образом, была проведена дискриминация штаммов коксиелл на генотипические кластеры с помощью метода MLVA. Панель из шести локусов тан-демных повторов позволяет с высокой долей вероятности установить источник происхождения штаммов C.burnetii.