Производное гидрокортизона в качестве средства для лечения болезни Альцгеймера
HYDROCORTISONE DERIVATIVE FOR ALZHEIMER'S DISEASE TREATMENT

Изобретение относится к области медицины, в частности к средствам для лечения нейродегенеративных заболеваний, а именно к средству для лечения болезни Альцгеймера.
Болезнь Альцгеймера (БА) является распространенным нейродегенеративным заболеванием, связанным с накоплением нейротоксических пептидов бета-амилоидов (Аβ), расположенных внутри мембран нейронов или внеклеточно, - в растворимой форме либо в бляшках, обычно служащих гистологическим маркером БА [Benilova I, Karran Е, De Strooper В. The toxic Aβ oligomer and Alzheimer's disease: an emperor in need of clothes // Nat Neurosci., 2012, 29;15(3):349-57]. Одними из важных свойств пептидов Аβ являются их способность образовывать фибриллярные агрегаты и их нейротоксичность, которая связана с повреждением синапсов, дисфункцией нейронов и, в конечном счете, их гибелью [Mucke L, Masliah Е, Yu GQ, Mallory M, et al. High-level neuronal expression of abeta 1-42 in wild-type human amyloid protein precursor transgenic mice: synaptotoxicity without plaque formation // J Neurosci., 2000, 20(11):4050-4058; Brouillette J, Caillierez R, Zommer N, et al. Neurotoxicity and memory deficits induced by soluble low-molecular-weight amyloid-pi-42 oligomers are revealed in vivo by using a novel animal model // J Neurosci., 2012; 32(23):7852-7861].
Гибель нейронов, запускаемая Аβ, вызывает высвобождение цитозольных белков, некоторые из которых могут связывать Аβ и влиять на их функцию. Одним из таких белков является гликолитический фермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД), который помимо своей роли в энергетическом метаболизме клеток выполняет и другие функции, включая участие в последних стадиях апоптоза [Sirover MA, Pleiotropic effects of moonlighting glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in cancer progression, invasiveness, and metastases // Cancer Metastasis Rev., 2018; 37(4):665-676]. Окисленные молекулы ГАФД, связываясь через остатки Cys-148, формируют агрегаты в клетках, подвергшихся окислительному стрессу, приводя их к гибели [Nakajima Т, Kinoshita Т, Nashimoto A, et al. Randomized controlled trial of adjuvant uracil-tegafur versus surgery alone for serosa-negative, locally advanced gastric cancer // Br J Surg., 2007; 94(12): 1468-1476; Lazarev VF, Nikotina AD, Semenyuk PI, et al., Small molecules preventing GAPDH aggregation are therapeutically applicable in cell and rat models of oxidative stress // Free Radic Biol Med., 2016; 92:29-38]. Обнаружено, что ГАФД связывает мутантные полипептиды, например, мутантный хантингтин, и образует с ними агрегаты, нерастворимые в додецил сульфате натрия. Причем процесс формирования таких агрегатов катализируется тканевой трансглутаминазой (tTG) [Guzhova IV, Lazarev VF, Kaznacheeva AV, at al., Novel mechanism of Hsp70 chaperone-mediated prevention of polyglutamine aggregates in a cellular model of huntington disease // Hum Mol Genet. 2011; 20(20):3953-3963].
Было показано, что эти агрегаты накапливаются внеклеточно и являются более токсичными, чем компоненты, из которых они состоят - полиглутамин и ГАФД [Mikhaylova ER, Lazarev VF, Nikotina AD, et al., Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase augments the intercellular transmission and toxicity of polyglutamine aggregates in a cell model of Huntington disease // J Neurochem., 2016; 136(5):1052-1063]. Сообщалось также, что образование агрегатов, состоящих из ГАФД и Аβ, вызывает гибель нервных клеток in vitro и в гиппокампе трансгенных мышей. Было показано, что агрегаты образуются внутри нервных клеток при случайном образовании комплексов из неупорядоченной массы ГАФД с Аβ 1-40 [Itakura М, Nakajima Н, Kubo Т, et al. Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase Aggregates Accelerate Amyloid-β Amyloidogenesis in Alzheimer Disease // J Biol Chem. 2015; 290(43):26072-26087].
По нашим неопубликованным данным количество нерастворимых в додецил сульфате натрия агрегатов Аβ-ГАФД во внеклеточном матриксе и в образцах спинномозговой жидкости, взятых у пациентов с БА, пропорционально тяжести стадии патологии.
Таким образом, ГАФД является привлекательной мишенью для создания лекарства против БА. Известны ГАФД-связывающие вещества, которые имеют потенциал для лечения БА, это такие малые молекулы как NMC, NAC, GSH, deprenyl, hydroxynonenal, пептид GAI (GAPDH aggregation inhibitor peptide) [Chernorizov KA, Elkina JL, Semenyuk PI, et al., Novel inhibitors of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: covalent modification of NAD-binding site by aromatic thiols // Biochemistry (Mosc)., 2010,75(12): 1444-9; Guzhova IV, Lazarev VF, Kaznacheeva AV, at al., Novel mechanism of Hsp70 chaperone-mediated prevention of polyglutamine aggregates in a cellular model of huntington disease // Hum Mol Genet. 2011; 20(20):3953-3963; Itakura M, Nakajima H, Semi Y, et al., Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase aggregation inhibitor peptide: A potential therapeutic strategy against oxidative stress-induced cell death // Biochem Biophys Res Commun., 2015; 467(2):373-376] Однако до сих пор не было показано влияние ГАФД-связывающих веществ на развитие БА.
В настоящее время для лечения БА используется два класса фармацевтических препаратов: ингибиторы холинэстеразы (донепезил, (арисепт), ривастигмин и галантамин) и антагонист рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA) мемантин (наменда). Но все зарегистрированные препараты дают только ограниченный по времени и симптоматический эффект и не могут остановить или существенно замедлить разрушительное течение болезни.
Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, было создание лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера.
Технический результат был получен в результате обнаружения того факта, что известное вещество, связывающее ГАФД, - 21-гемисукцинат гидрокортизона (RX624) способен селективно ингибировать формирование комплекса ГАФД-Аβ в межклеточном пространстве и повышает в 2 раза эффективность в анализе водного лабиринта Морриса у трансгенных мышей с моделированной болезнью Альцгеймера.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:
На Фиг. 1 представлена структурная формула производного гидрокортизона - 21-гемисукцината гидрокортизона (RX624).
На Фиг. 2 представлен анализ функции памяти мышей с использованием водного лабиринта Морриса. По оси абсцисс - группы мышей (наивные животные - животные, которые не получали терапию; ДМСО - животные, которые получали инъекции ДМСО; RX624 - животные, которые получали инъекции RX624), по оси ординат - время поиска платформы в секундах.
На Фиг. 3 представлены результаты анализа количества агрегатов в гиппокампе мышей. Идентификация агрегатов проводилась с использованием антител против ГАФД, либо против Аβ.
На Фиг. 4 представлены результаты количественного анализа интенсивности окраски дот-блотов, представленных на Фиг. 3.
Сущность и промышленная применимость настоящего изобретения поясняются следующими примерами:
Пример 1. Животная модель болезни Альцгеймера
В качестве животной модели БА были использованы трансгенные мыши линии 5xFAD (ЦКП ФГБУН ИФАВ РАН, Черноголовка, Россия), патологический фенотип которых включает:
- амилоидные отложения, нейродегенерация, нарушения памяти;
- накопление внутриклеточного Аβ и выраженную гибель нейронов.
Эта линия содержит тройную мутацию в гене, кодирующем АРР белок и двойную мутацию в гене пресенилина, обнаруживаемые при наследственных формах БА, и воспроизводит основные признаки амилоидоза характерного для БА и используется как модель А(342-индуцированной нейродегенирации и формирования амилоидных бляшек.
Пример 2. Водный лабиринт Морриса.
Нарушение памяти у мышей оценивали с использованием водного лабиринта Морриса диаметром 1,5 м (OpenScience, Россия) на 180-й день после инъекции мышам 5xFAD. Оценивалось время, необходимое экспериментальным животным, чтобы найти затопленную платформу.
Пример 3. Влияние производного гидрокортизона на развитие Б А Недавно было продемонстрировано, что производное гидрокортизона, RX624 (Фиг. 1), предотвращает агрегацию окисленного ГАФД и снижает токсичность внеклеточных комплексов фермента с протяженными полиглутаминовыми трактами [Lazarev VF, Mikhaylova ER, Dutysheva EA, et al., A hydrocortisone derivative binds to GAPDH and reduces the toxicity of extracellular polyglutamine-containing aggregates // Biochem Biophys Res Commun. 2017, 487(3):723-727]. Чтобы проверить, может ли препарат быть эффективным на животных моделях БА, были использованы мыши дикого типа и трансгенные мыши 5xFAD. Мыши были поделены на три группы: (1) без какой-либо обработки, (2) обработанные 100 мкл ДМСО в качестве растворителя и (3) обработанные 100 мкл ГАФД-связывающего производного гидрокортизона RX624, разведенного из расчета 1 мг вещества на 1 кг веса животного. Лечение мышей начиналось в возрасте 2.5 месяца и продолжалось следующие 5 месяцев с одной инъекцией в неделю. Через две недели после последней инъекции функцию памяти мышей оценивали с использованием водного лабиринта Морриса. Мыши 5xFAD, обработанные RX624, продемонстрировали значительное восстановление памяти: время поиска платформы было таким же, как у мышей дикого типа (22,7±4,4 против 26,2±6,6 с), и было значительно снижено по сравнению с необработанными мышами 5xFAD (46,2±12,4 с) (Фиг. 2). Затем мы изолировали гиппокампы от животных трех групп и анализировали их методом ловушки на фильтре (filter trap assay). Нерастворимые в додецил сульфате натрия агрегаты, содержащие как Аβ, так и ГАФД, были обнаружены у контрольных животных, тогда как гиппокампы мышей, обработанных RX624, были полностью свободны от агрегирующего материала (Фиг. 3, 4). Это говорит о том, что производное гидрокортизона селективно ингибирует формирование экзогенного комплекса ГАФД-Аβ и может быть использовано при производстве лекарственного средства для лечения болезни Альцгеймера.
Представленные результаты, свидетельствуют о том, что RX624 блокирует формирование комплекса ГАФД-Аβ в гиппокампе и предотвращает дисфункцию памяти у мышей с генетически обусловленной БА (Фиг. 2-4).