Исследование структур тимуса и иммунобиохимических показателей крови после применения полиоксидония и цеолитсодержащего трепела

ОРЛОВ ФЕДОР ВИТАЛЬЕВИЧ родился в 1964 г. Окончил Чувашский государственный университет. Главный врач ГУЗ «Психоневрологический диспансер». Научные интересы: диагностика и лечение головной боли, мануальная терапия, пограничные психические расс. ройства. Автор около 30 научных публикаций.

ГОЛЕНКОВ АНДРЕЙ ВАСИЛЬЕВИЧ родился в 1960 г. Окончил Астраханский государственный медицинский институт. Доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой психиатрии и медицинской психологии Чувашского государственного университета. Научные интересы: эпидемиологические и социокультурные исследования в психиатрии и наркологии. Автор более 220 научных публикаций, в том числе трех монографий.________________________

УДК 611.438-018

Г.Ю. СТРУЧКО, Л.М. МЕРКУЛОВА, Т.В. АГАФОНКИНА

ИССЛЕДОВАНИЕ СТРУКТУР ТИМУСА И ИММУНОБИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВИ ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПОЛИОКСИДОНИЯ И ЦЕОЛИТСОДЕРЖАЩЕГО ТРЕПЕЛА

Стремительное развитие иммунологии и лабораторных технологий позволило прийти к выводу, что практически все заболевания в той или иной степени связаны с нарушением различных звеньев иммунного ответа. Современная патология характеризуется наличием двух взаимосвязанных и взаимообусловленных процессов, а именно: ростом числа хронических инфекционных заболеваний, вызываемых условно-патогенными или оппортунистическими микробами, и снижением иммунологической реактивности населения. Справиться с этими процессами, назначая только антибактериальную терапию, практически невозможно. В связи с этим в последнее десятилетие возрос интерес врачей к препаратам, воздействующим на иммунитет.

Среди препаратов с иммуностимулирующими свойствами можно выделить 3 основные группы, которые применяются в практическом здравоохранении [10]: 1) препараты микробного происхождения (Пирогенал, Продигио-зан, Рибомунил и др.); 2) препараты эндогенного происхождения: препараты тимуса (Т-активин, Тималин, Тимопоэтин, Тимостимулин и др.), препараты костно-мозгового происхождения (Миелопид), цитокины (Реаферон, Мол-грамостин и др.); 3) химически чистые, синтетические препараты: лечебные препараты с выявленными иммуномодулирующими свойствами (Диуцифон), аналоги веществ эндогенного происхождения (Ликопид, Тимоген), собственно синтетические препараты (Полиоксидоний и др.).

В институте иммунологии М3 РФ был впервые разработан и внедрен в практику новый синтетический иммуностимулятор - полиоксидоний, высокая клиническая эффективность которого была показана в комплексной терапии больных с хирургическими заболеваниями, бронхо-легочной патологией, урогенитальной инфекцией и при других патологических состояниях [8].

Полиоксидоний (ПО) обладает сложным и многогранным эффектом на иммунную систему. Так как развитие любого иммунного ответа начинается с клеток моноцитарно-макрофагальной системы и так как цитокины, продуцируемые макрофагами, обладают плейотропным эффектом, то усиление их функциональной активности под влиянием ПО ведет к активации и клеточного, и гуморального иммунитета. Помимо иммуномодулирующего, ПО обладает выраженным детоксицирующим, антиоксидантным и мембраностабилизирующим эффектом. Совокупность этих свойств делают ПО незаменимым препаратом в комплексном лечении и профилактике острых и хронических инфекционных заболеваний бактериальной, грибковой и вирусной этиологии [15].

Кроме того, в последние годы в фармацевтической промышленности появилось большое количество препаратов, относящихся к группе биологически активных добавок (БАД). Среди БАД преобладают препараты, включающие в свой состав минеральные и растительные компоненты. Столь широкий интерес к БАД связан, прежде всего, с изменением характера питания современного человека. Оно стало богаче вкусовыми ощущениями, но менее сбалансированным по составу, дефицитным по пищевым волокнам и микроэлементам. Как известно, клетчатка необходима организму для регуляции усвоения питательных веществ в кишечнике, синтеза в нем витаминов, нормального пассажа пищи, а также поддержания процесса дезинтоксикации. Микроэлементы являются неотъемлемым компонентом поддержания нормального обмена веществ человека.

Среди большого числа потребляемых БАД особое внимание уделяется природным веществам, входящим в состав цеолитов. Среди отечественных препаратов наиболее изучены "Литовит" (г. Новосибирск) и "Полисорб" (г. Челябинск). Сходными свойствами обладает и цеолитсодержащий трепел, добываемый в п. Первомайский Алатырского района Чувашии (несмотря на то, что официально фармацевтической промышленностью ему пока еще не присвоена характеристика БАД).

Применение цеолитсодержащих препаратов, как показали экспериментальные работы, приводит к повышению стрессоустойчивости, выведению из организма тяжелых металлов, оказывает иммуномодулирующий, антианеми-ческий и антигистаминный эффекты, нормализует липидный, белковый и минеральный обмены [1].

Установлено, что пероральное использование трепела оказывает выраженный энтеросорбционный и дезинтоксикационный эффекты, защищая пе-

чень от токсического повреждения [6]. Достаточно наглядно показана возможность применения трепела как одного из компонентов лечения гнойносептических заболеваний [2]. Положительные результаты получены при применении трепела в практике кожных заболеваний [13] и у больных с функциональными и органическими расстройствами ЖКТ [14, 17].

В литературе стали появляться данные о положительном влиянии трепела на иммунную систему животных и человека [6,7]. Однако полноценного изучения путей и звеньев воздействия трепела на иммунореактивность организма не проводилось. Кроме того, остаются еще не до конца выясненными вопросы о токсических дозах препарата и их проявлениях, возможностях отдаленных последствий применения препарата и вероятности развития онкологических заболеваний.

Исходя из этого, целью настоящей работы явилось изучение морфофункционального состояния тимуса и иммунобиохимических показателей крови на фоне применения полиоксидония и цеолитсодержащего трепела.

Материал и методы исследования. Эксперименты проведены на 60 белых беспородных крысах-самцах массой 170-300 г. Все процедуры по уходу осуществлялись по нормам и правилам обращения с лабораторными животными.

Животные были разделены на 4 группы: 1-я - интактные; 2-я -животные, в ежедневный рацион которых в течение 3 недель вводился цеолитсодержащий трепел из расчета 5% от общей массы корма; 3-я - животные с внутримышечным введением полиоксидония из расчета 0,1 мг/кг 2 раза в неделю в течение 3 недель (доза адекватна человеческой лечебной, исходя из соотношения средней массы крысы и человека); 4-я - контрольная группа животных с внутримышечным введением физиологического раствора (ФР) по 0,5 мл 2 раза в неделю в течение 3 недель.

Объектом исследования служили тимус и кровь, которые забирались через 3 недели после начала эксперимента. Криостатные срезы тимуса обрабатывались следующими методами:

-люминесцентно-гистохимическим методом Фалька-Хилларпа [22] - для избирательного выявления катехоламинов и серотонина в биоаминсодержащих структурах тимуса;

-люминесцентно-гистохимическим методом Кросса, Эвена, Роста [21] -с целью идентификации гистаминсодержащих структур тимуса. Уровень биоаминов определяли с помощью микроскопа ЛЮМАМ-4 с использованием спектрофлуориметрической насадки ФМЭЛ-1А. Достоверность полученных результатов определялась по критерию Стьюдента;

- окраской гематоксилином-эозином - в качестве общегистологической окраски с последующей морфометрией коркового и мозгового вещества тимуса [16];

- окраской полихромным толуидиновым синим по Унна - для качественной и количественной характеристики тучных клеток тимуса [9, 18].

Показатели крови подсчитывались с помощью автоматического гематологического анализатора “Sysmex” (США). Мазки крови, окрашенные по методу Романовского-Гимза, использовались для изучения лейкоформулы. Концентрацию иммуноглобулинов в крови определяли методом радиальной иммунодиффузии по Манчини [12]. Кроме того, определяли активность системы комплемента, фагоцитарную реакцию нейтрофилов с латексом, уровень циркулирующих иммунных комплексов. Биохимические показатели крови определялись на автоматическом биохимическом анализаторе «Dimension AR» (США).

Результаты собственных исследований. Применение полиоксидония (ПО) и цеолитсодержащего трепела (ЦТ) приводит к изменению цитоархитектоники тимуса, а также к изменению функционирования его биоаминсодержащих структур, причем действие этих препаратов различно. Кроме того, использование ПО и ЦТ сказывается на иммунобиохимических и гематологических показателях крови крыс.

Добавление ЦТ в корм крыс приводит к незначительному увеличению люминесцирующих гранулярных клеток и изменению концентрации биоаминов в них.

Если в норме дендритные макрофаги премедуллярного и субкапсулярно-го рядов располагаются компактно, образуя правильный овал вокруг светлозеленого мозгового вещества с единичными люминесцирующими клетками внутри, то использование ЦТ несколько изменяет морфологию тимуса. Пре-медуллярные клетки располагаются хаотически скоплениями вокруг темного мозгового вещества, плохо дифференцируясь от субкапсулярных. Значительно увеличивается количество внутримозговых гранулярных клеток. Количество клеток в поле зрения увеличивается на 50% по сравнению с интактными животными в основном за счет субкапсулярных и внутримозговых клеток.

В премедуллярных и субкапсулярных клетках достоверно повышается уровень серотонина (на 27 и 48% соответственно) на фоне неизмененного содержания гистамина и катехоламинов (рис. 1). Это приводит к некоторому увеличению соотношения (СТ+ГСТ)/КА - 2,65 и 2,54 против 2,2 и 2,47 у ин-тактных животных. В тимоцитах коркового и мозгового вещества отмечается достоверное снижение уровня гистамина на 24 и 29% соответственно (рис. 2).

Количество тучных клеток, выявляемое люминесцентно-гистохимическими методами, уменьшается. В основном это дегранулированные формы клеток. Уровень биогенных аминов в них снижается. Вокруг клеток выявляется большое количество гранул, выброс которых приводит к росту серотонина и катехоламинов в лимфоцитах микроокружения тучных клеток.

Применение синтетического иммуномодулятора «Полиоксидоний» вызывает более выраженные изменения со стороны биоаминной системы тимуса, хотя морфологическая картина тимусной дольки схожа с предыдущей группой. В премедуллярных клетках уровень серотонина возрастает на 45%,

катехоламинов - на 17%, в то время как концентрация гистамина снижается на 65% (рис. 1). Аналогичные изменения происходят в субкапсулярных клетках и тимоцитах коркового и мозгового вещества (рис. 2). Содержание всех биоаминов в тучных клетках достоверно снижается. Такое перераспределение медиаторов приводит к уменьшению соотношения (СТ+ГСТ)/КА, которое в лимфоцитах коркового вещества становится равным 1,9, мозгового вещества - 2,02, микроокружения тучных клеток - 2,07, в то время как у ин-тактных животных оно составляет 2,75; 2,86; и 3,26 соответственно.

Исследование морфологии тучных клеток с помощью окраски поли-хромным толуидиновым синим показало, что во всех изучаемых группах в этот период исследования достоверных изменений по сравнению с нормой не выявлено. Большая часть клеток (около 35%) - слабо дегранулированные тучные клетки (Т-2) с ргметахромазией. Остальные формы клеток (Т-0, Т-1 и Т-3) распределяются равномерно - по 20%.

Окраска срезов тимуса гематоксилином-эозином и проведение морфо-метрии долек выявили следующее: применение ЦТ и ПО приводит к незначительному уменьшению размеров коркового и мозгового вещества и понижению средней массы тимуса на 20 и 11% соответственно.

В общем анализе крови количество эритроцитов и гематокрит несколько снижаются через 3 недели кормления ЦТ. Параллельно этому снижается и количество тромбоцитов (на 12%) и увеличивается абсолютное содержание лимфоцитов Fia 12% (табл. 1). После 3-недельного введения ПО отмечается лишь достоверное увеличение количества лейкоцитов на 35%.

Использование ЦТ приводит к изменению некоторых параметров иммунограммы: уменьшается количество JgG почти в 2 раза и повышается активность системы комплемента на 27%. Изолированное применение ПО сказывается лишь на синтезе всех трех классов иммуноглобулинов, количество которых достоверно повышается, особенно содержание JgA.

В биохимическом анализе крови через 3 недели после приема ЦТ отмечается достоверное уменьшение холестерина, щелочной фосфагазы и связанного кальция, а также некоторое увеличение общего белка крови. После введения ПО отмечается обратная картина: увеличение холестерина, щелочной фосфатазы и кальция, а также снижение мочевины крови (табл. 2).

Обсуждение результатов исследования. Исходя из данных комплексного исследования тимуса и крови, можно сделать вывод, что применение как синтетического препарата полиоксидония, так и природного цеолитсодержащего трепела приводит к модуляции иммунной системы. Кроме того, следует отметить, что ПО обладает более выраженным и полит-ропным действием. Можно предположить как непосредственное действие препарата на синтез и секрецию биоаминов дендритными макрофагами, так и опосредованное — через изменение уровня глюкокортикоидов в

Норма

всештонілії т гистамин  катехоламины

Рис. 1. Интенсивность свечения биоаминов в премедуллярных клеток в норме и после введения ФР, ПО и ЦТ

140 120 100 80 60 40 20 0

Норма

ЦТ

: псеротонин гистамин  катехоламины

Рис. 2. Интенсивность свечения биоаминов в тимоцитах коркового вещества в норме и после введения ФР, ПО и ЦТ

Ни

Таблица 1

Показатели общего анализа крови у интактных животных, через 3 недели после введения ЦТ и ПО

Показатели крови Норма ЦТ ПО

Эритроциты (• 1012/л) 6,63±0,27 5,46+0.2* 6,22±0,16

Гемоглобин (г/л) 118.1+5,0 104,0±4,2 114,43+3,56

Тромбоциты (•109/л) 707,9т5,1 ^т22,9±34,4* 652,43+36,3

Лейкоциты (•109/л) 5,8±0,6 7,08±1,1 8,87+1,07*

Эозинофилы (%) 4,45+0,9 1,6±1,0 2,1+0,2*

П/я нейтрофилы <%) 3,27±0,9 1,8+0,4 2,0+0,33

С/я нейтрофилы (%) 22,45±2,64 17,8+3,5 17,54±2,5

Лимфоциты (%) 66,9+2.8 75,9+ -1,1* 74,1 ±3,5

Моноциты (%) 5,9±0,69 6,6+1,0 5,2±0,55

* -Р<0,01

Таблица 2

Биохимические показатели крови у интактных животных, через 3 недели после введения ЦТ и ПО

Показатели крови Норма ЦТ ПО

Мочевина (ммоль/л) 7,4±0,5 9,7±0,94 4.о8+0,46*

Креатинин (мкмоль/л) 60,1±4,78 74,9±3,94 81,8+5,49

Мочевая кислота (мкмоль/л) 413,5±42,01 378,0+55,82 536,8±50,6

Холестерин (ммоль/л) 1.88+0,11 1,59+0,05* 2.4+0.04*

Щелочная фосфатаза (Ед/л) 349,7+17,04 258,8+36,9* 523,4±20,9*

Кальций (ммоль/л) 2,47+0,09 2,3±0,03 2,56±0,25

Общий белок (г/л) 72,0±4,02 78,8±2,96 75,6+2,16

*-Р<0,01

крови. Вероятно, перераспределение биоаминов и в тимоцитах, и в иммуно-цитах периферической крови - один из механизмов иммуномодулирующего действия ПО. Кроме того, известно, что ПО, взаимодействуя с мононуклеа-рами периферической крови, нормализует синтез ИЛ-1 и, тем самым, подавляет синтез и выделение гипоталамусом кортикотропин-релизинг гормона, что приводит к уменьшению глюкокортикоидов в крови [24, 25].

Нами выявлена прямая корреляционная зависимость между уменьшением соотношения (СТ+ГСТ)/КА в тимоцитах коркового и мозгового вещества после спленэктомии на фоне введения ПО и увеличением уровня ^А, ^М, активности системы комплемента и фагоцитоза.

Цеолитсодержащий трепел также обладает иммунокоррегирующим действием. Доказательством этому служит, во-первых, перераспределение биогенных аминов в структурах тимуса, особенно в тимоцитах, в сторону абсолютного уменьшения гистамина и относительного увеличения серотонина и катехоламинов. Соотношение (СТ+ГСТ)/КА в тимоцитах коркового вещества и микроокружения тучных клеток достоверно снижается, что косвенно указывает на иммуностимулирующее действие ЦТ. Известно, что серотонин увеличивает в крови число Т-супрессоров и уменьшает выработку и В-лимфоцитами, активирует миграцию супрессоров в костный мозг, а также контролирует скорость пролиферации иммунокомпетентных клеток [4]. Кроме того, лимфоциты, а именно Т-супрессоры, содержат на своей мембране Н2-рецепторы, поэтому гистамин, воздействуя на них, активирует супрессивную активность [23]. Катехоламины, напротив, активируют иммунокомпе-тентные клетки за счет стимуляции генной транскрипции и увеличения синтеза РНК. Они также повышают хелперный эффект Т-лимфоцитов, стимулируют антителообразование, влияют на розеткообразование, скорость созревания гепарина и дегрануляцию тучных клеток [5,11].

Во-вторых, морфологическая картина тимуса также свидетельствует об активации иммунопролиферативных процессов: увеличивается количество долек с неправильно полигональной формой, количество люминесцирующих дендритных макрофагов возрастает за счет субкапсулярных и внутримозго-вых клеток.

Возможно, благодаря этим изменениям в тимусе или за счет непосредственного действия ЦТ на клетки периферической крови мы наблюдаем рост количества лимфоцитов и активацию системы комплемента и некоторое увеличение фагоцитарной активности нейтрофилов.

Помимо положительного влияния на иммунную систему, нами также отмечено повышение уровня общего белка крови, что можно связать либо с увеличением синтетической функции печени, либо с повышением аппетита животных, которые съедали корма в 1,5-2 раза больше контрольной группы. Незначительное повышение мочевой кислоты и креатинина, вероятно, явля-

ется компенсаторной реакцией на белковую нагрузку, чтобы сохранить азотистое равновесие организма. Также следует отметить снижение уровня холестерина и кальция, что, по нашему мнению, связано с энтеросорбционным действием ЦТ. Изменение биохимических показателей крови также может быть связано с влиянием ЦТ на гормональную функцию надпочечников и увеличением уровня дегидроэгшандростерона, обладающего анаболическим действием и оказывающим адаптогенное влияние [3,20].

Литература

1. Бородин Ю.И. Морфофункциональная оценка воздействия биологически активной добавки «Литовит» на органы и системы организма. Новосибирск, 1999. 78 с.

2. Газымов М.М. Трепел как один из компонентов в комплексном лечении гнойносептических заболеваний // Прикладное применение трепелов: Сборник статей. Чебоксары, 1999. С. 38-41.

3. Гончарова Н.Д. Гормональная регуляция надпочечниковых желез у человека и обезьян при гемобластозах и в процессе старения // Бюл. эксп. биол. и мед. 1997. Т. 124, № 8. С. 207-210.

4. Девойно Л.В., Ильюченок Р.Ю. Моноаминергические системы в регуляции иммунной реакции. Новосибирск: Наука. Сиб. отд-ние, 1983. 120 с.

5. Девойно Л.В. Биогенные амины в регуляции иммунных реакций // Химия и биология иммунорегуляторов. Рига: Зинатне, 1985. С. 206-221.

6. Иванова M.JI. Цеолитсодержащий трепел Первомайского месторождения как энтеросорбент в эксперименте // Прикладное применение трепелов: Сборник статей. Чебоксары, 1999. С. 26-33.

7. Иванов Г.И. Изучение возможности использования цеолитсодержащего трепела Шуйского участка Алатырского месторождения Чувашской Республики в свиноводстве // Прикладное применение трепелов: Сборник статей. Чебоксары, 199q. С. 56-69.

8. Коррекция иммунодефицитных состояний с помощью иммуномодулятора полиокси-доний / Петров Р.В., Хаитов P.M., Мастернак Т.Б. и др. // Аллергология, астма и клин, иммунология. 2000. №9. С. 3-7.

9. Линдлер Д.П., Поверий И.А., Розкин М.Я.. Ефимов B.C. Морфометрический анализ популяции тучных клеток//Архив патологии. 1980. №6. С. 60-64.

10. Лусс Л.В. Полиоксидоний в общеклинической практике // Аллергология, астма и клин, иммунология. 2000. №1. С. 33-41.

11. Любовцева Л.А. Люминесцентно-гистохимическое исследование аминосодержащих структур костного мозга, тимуса и крови при действии нейромедиаторов и антигенов. Чебоксары: Изд-во Чуваш, ун-та, 1993. 100 с.

12. Медицинские лабораторные технологии / Под ред. А.И. Карпищенко. СПб.: Изд-во «Интермедика», 1999. 653 с.

13. Немкаева P.M. Примеры использования пермаита в дерматологии // Прикладное применение трепелов: Сборник статей. Чебоксары, 1999. С. 41-45.

14. О состоянии больных с расстройствами желудочно-кишечного тракта, получавших пермаит / Черкасова ИВ. и dp II Прикладное применение трепелов: Сборник статей. Чебоксары, 1999. С. 45-51.

15. Пинегин Б.В. Полиоксидоний - новое поколение иммуномодуляторов с известной структурой и механизмом действия // Аллергология, астма и клин, иммунология. 2000. №1. С. 27-28

16. Ромейс Б. Микроскопическая техника. М.: Изд-во иностр. лит., 1954.

17. Семенова JI.С. Опыт применения пермаита при заболеваниях желудочно-кишечного тракта и желчевыводящих путей // Прикладное применение трепелов: Сборник статей. Чебоксары, 1999. С. 88-90.

18. Стручко Г.Ю., Петрова Н.А. Люминесцентно-гистохимическое исследование тучных клеток тимуса у крыс после введения растворимого антигена // Материалы конференции студенческого научного общества, посвященной юбилею Кубанской государственной мед. академии. Краснодар, 1995. С. 339-340.

19. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Основные принципы иммунокорригирующей терапии // Аллергология, астма и клин, иммунология. 2000. №1. С.9-15.

20. Bernton Е., Hoover !)., Galloway R., Popp К. Adaptation to chronic stress in military

trainees. Adrenal androgens, testosterone, glukocorticoids, IGF-1 and immune function // Ann. NY Acad. Sci., 1995. V. 135, № 6. P. 5-8. .

21. Cross S.A., Ewen S. W., Rost F. W. A study of methods available for cytochemical localization of histamine by fluorescence induced with o-phtaldehyde or acetaldehyde // T. Histochem. 1971. V.3, N. 6. P. 471-476.

22. falk B., Hillarp N.A., Thieme G., TorpA. Fluorescence of catecholamines and related compounds condensed with formaldehyde // J. Histochem. Cytochem. 1962. V. 10. P. 348-354.

23. Inage L., Wada N., Kildcawa Y., Inami M. Supressor T-lymphocyte dysfunction in MCNS: Role of the H2-histomine receptor-bearing supressor, T-lympho-cytes // Clin. Nephrol. 1990. V. 333, № 1. P. 20-24.

24. Shintani F., Kanba S., Nakai T. //J. Neurosci. 1993. V.13. P. 3574-3581.

25. Watanabe II, Sasaki S., Takebe K. Langerhans cells in mice with severe combined immunodeficiency (SCID)//Neurosci. Lett. 1991. V. 133. P. 7-10.

СТРУЧКО ГЛЕБ ЮРЬЕВИЧ родился в 1974 г. Окончил медицинский факультет Чувашского государственного университета в 1997 г., факультет иностранных языков Чувашского государственного педагогического университета в 2002 г. Доктор медицинских наук, доцент кафедры функциональной и лабораторной диагностики Чувашского государственного университета. Имеет 75 научных работ в области гистологии, иммунологии и физиологии.

МЕРКУЛОВА ЛАРИСА МИХАЙЛОВНВА родилась в 1940 г. Окончила Самарский медицинский институт. Заслуженный деятель науки ЧР, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой функциональной и лабораторной диагностики Чувашского государственного университета. Имеет более 170 научных работ в области радиобиологии, гистологии, физиологии и терапии.

АГАФОНКИНА ТАТЬЯНА ВСЕВОЛОДОВНА родилась в 1978 г. Окончила Чувашский государственный университет. Ассистент кафедры функциональной и лабораторной диагностики Чувашского университета. Имеет 7 научных работ в области гистологии.__________________________