СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ КОЛЛАГЕНАЗЫ
METHOD FOR PREPARING IMMOBILISED COLLAGENASE

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве.
Известны многочисленные методы иммобилизации различных ферментов, включая коллагеназу. Ближайшим аналогом предлагаемого технического решения является метод иммобилизации ферментов путем их включения в различные полимеры (Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. Экологические основы биотехнологии. - М: ГОУ ВПО МГУЛ, 2006, С.164-180). Основным недостатком этих способов является использование преимущественно синтетических полимеров, которые невозможно применять в пищевой и медицинской промышленности. Размер частиц получаемых иммобилизованных ферментов сравнительно велик и обычно составляет 100-200 мкм, что не позволяет использовать их в виде истинных растворов, необходимых в медицинской практике.
Задача, решаемая данным изобретением, заключается в получении иммобилизованной коллагеназы на пищевой карбоксиметилцеллюлозе - носителе природного типа. Заявляемое техническое решение дает возможность получать частицы иммобилизованной коллагеназы размером в тысячи раз меньше. Химические процессы, в которых участвуют ферменты, протекают на межфазных поверхностях раствор - субстрат (коллаген), при этом фермент адсорбируется на поверхности субстрата. Уменьшение размеров частиц иммобилизованного фермента (коллагеназы) резко увеличивает его доступность в сферу реакции, следовательно, увеличивает скорость ферментативного процесса, а часто и возможность осуществления самого процесса. Применение пищевой карбоксиметилцеллюлозы для получения иммобилизованной коллагеназы в заявленном техническом решении позволяет получать на ее основе биодобавки, биокатализаторы для самых различных целей, включая пищевую, медицинскую и сельскохозяйственную отрасли промышленности.
Техническая сущность заявленного решения заключается в получении иммобилизованной коллагеназы на природном носителе карбоксиметилцеллюлозе, использование которой позволяет проводить ферментативные реакции с большими скоростями не только в растворах, но и на твердых субстратах, что является важным при их использовании в пищевой промышленности, медицине и сельском хозяйстве.
Для выполнения поставленной задачи используется способ получения иммобилизованной коллагеназы, заключающийся в растворении носителя в подщелоченной дистиллированной воде с добавлением к раствору фермента с коллагеназной активностью не ниже 750-1000 ед./мг, отличающийся тем, что в качестве носителя используют пищевую карбоксиметилцеллюлозу, в качестве фермента - фермент с коллагеназной активностью, выделенный из панкреаса крабов или микроорганизмов Clostridium histolyticum в виде порошка; иммобилизацию проводят в подщелоченной дистиллированной воде с рН 9,5-10 в присутствии 1-1,5%-ного раствора поверхностно-активного вещества при помощи интенсивного перемешивания со скоростью 3000-5000 об/мин в течение 40 мин, после чего охлаждают образовавшуюся эмульсию до 5-10°С, уменьшают ее рН до 3-3,5, оставляют на сутки в холодильнике, отделяют выпавшие частицы из раствора, неоднократно добавляют к оставшимся частицам ацетатный буфер с рН 4-4,5 при перемешивании, затем выпавшие частицы отделяют и высушивают. Коллагеназную активность определяют в соответствии с классическим методом определения коллагеназной активности по гидролизу бычьего коллагена (Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. Коллаген: получение, свойства и применение. - М. ГОУ ВПО МГУЛ, 2007. - С.265-305).
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. К 50 мл подщелоченной до рН 10 дистиллированной воды добавляют 10 г пищевой карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), реакционную смесь перемешивают до максимального растворения КМЦ. Полученный раствор фильтруют и добавляют к фильтрату 1 г коллагеназы, полученной из панкреаса крабов активностью 800 ед/мг, и 5 мл 1%-ного раствора твин-40. Раствор интенсивно перемешивают с помощью вибротуракса со скоростью 3000 об/мин в течение 40 мин, образовавшуюся эмульсию охлаждают до 5-10°С, подкисляют соляной кислотой до рН 3-3,5 и помещают на сутки в холодильник, подвергая смесь перемешиванию с помощью вибротуракса через каждые 3-3,5 часа. Спустя сутки раствор вновь перемешивают, полученные частицы отделяют от реакционной массы центрифугированием со скоростью 5000 об/мин, после чего отделившийся раствор сливают, а к оставшимся частицам добавляют 2-3 раза по 10 мл ацетатного буфера с рН 4-4,5, каждый раз подвергая реакционную массу перемешиванию вибротураксом, снова центрифугируют и сливают отделившийся раствор. Оставшуюся массу переносят в колбы или пенициллиновые флаконы и высушивают на сублимационной сушке. Выход полученных частиц составляет 80%, активность нейтральной коллагеназы составляет 750-800 ед./мг. Размер частиц иммобилизованной коллагеназы равен 100- 120 нм.
Пример 2. Опыт проводят аналогично примеру 1, но вместо фермента из панкреаса крабов берут микробную коллагеназу, выделенную из Clostridium histolyticum с коллагеназной активностью 1000 ед./мг, в качестве поверхностно-активного вещества в смесь добавляют 5 мл 1%-ного раствора твин-20, процесс ведут при скорости перемешивания 5000 об/мин. Выход частиц вместе с включенным в них ферментом составляет 75%, активность коллагеназы равна 750 ед./мг, размер частиц - 120-150 нм.
Таким образом, изобретение позволяет получать иммобилизованную коллагеназу на природном носителе карбоксиметилцеллюлозе, которая может быть использована в пищевой и медицинской промышленности, а также в сельском хозяйстве.