Исследование возможностей новых сверхразветвлённых полимеров в качестве псевдостационарных фаз в электрокинетической хроматографии при определении белков

Е. А. Бессонова, Н. А. Поликарпов, Л. А. Карцова, В. Е. Потолицына

ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ НОВЫХ СВЕРХРАЗВЕТВЛЁННЫХ ПОЛИМЕРОВ В КАЧЕСТВЕ ПСЕВДОСТАЦИОНАРНЫХ ФАЗ В ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ БЕЛКОВ*

Введение. В 1984 г. японским химиком Терабе был предложен метод мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), позволяющий, наряду с заряженными определять и нейтральные аналиты благодаря наличию в составе рабочего буфера псев-достационарной фазы (ПСФ).

В качестве последних обычно используются поверхностно-активные вещества (ПАВ) различной природы (ионные, неионные, цвиттерионные и смешанные), а также микроэмульсии (1991 г., Ватараи) [1, 2].

В последние годы отмечается повышенный интерес к дендритным полимерам в связи с выявлением возможностей их использования в качестве стационарных и псевдо-стационарных фаз в методах разделения [3-11].

Дендритные полимеры представляют собой высокоструктурированные и сверхраз-ветвлённые трёхмерные макромолекулы с молекулярной массой ~ 10-103 кДа. Они состоят из полифункционального ядра, радиально-симметричных слоёв повторяющихся фрагментов (или генераций) и множества терминальных групп, которые определяют физические и химические свойства полимера [3].

Дендримеры имеют сходную с мицеллами внутреннюю и внешнюю топологию. Их можно рассматривать как мономолекулярные мицеллы. Фундаментальное отличие состоит в том, что структура мицелл динамична, а дендримеров — статична и все терминальные группы ковалентно связаны с ядром. В отличие от мицелл дендримеры стабильны в широком диапазоне экспериментальных условий. Модификация терминальных групп даёт возможность контролировать растворимость, реакционную способность, адгезию к поверхности, увеличивать биосовместимость, изменять комплексообразующие свойства [4, 5]. Внутримолекулярные полости (гидрофильные или гидрофобные) обеспечивают им способность образовывать комплексы включения типа «гость-хозяин» с аналитами различной природы [12, 13].

Первое сообщение о применении полиамидоаминового дендримера в качестве псев-достационарной фазы в составе рабочего буфера (5-10 мМ) в ЭКХ опубликовано в 1992 г. [14].

В данной работе изучено влияние новых сверхразветвлённых полимеров — водорастворимые олигосахаридные производные сверхразветвлённого полиэтиленимина, различающиеся степенью функционализации, массой ядра и гидрофильностью в качестве псевдостационарных фаз в ЭКХ на селективность разделения модельной смеси белков (лизоцим, миоглобин, инсулин и альбумин), являющихся диагностическими маркёрами различных заболеваний: инфаркт миокарда, сахарный диабет, микроальбуминурия.

Эксперимент. Материалы. Для приготовления буферных растворов в ЭКХ использовали дистиллированную воду, гидроксид натрия (ч.д.а., «Химреактив»), соляная кислота (х.ч., «Реахим»), диметилсульфоксид (ч.д.а., “Sigma”), дигидрофосфат

* Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 11-03-91331-а.

© Е. А. Бессонова, Н. А. Поликарпов, Л. А. Карцова, В. Е. Потолицына, 2011

натрия (х.ч., «Реахим»); фосфорная кислота (х.ч., «Реахим»); борная кислота (х.ч., «Реахим»), лизоцим (куриный) (х.ч., “Sigma-A1drich”), миоглобин (конских скелетных мышц) (95-100 %, “Sigma-Aldrich”), инсулин (свиной) “Sigma-Aldrich”, альбумин (человека) (96-99 %) “Sigma-Aldrich”.

Водорастворимые дендримеры с терминальными олигосахоридными группами РЕ1-А (5 и 25 кДа), РЕ1-В (5 и 25 кДа) и РЕ1-С (5 и 25 кДа).

Оборудование. Изучение свойств дендримеров в качестве псевдостационарной фазы проводили с использованием системы высокоэффективного капиллярного электрофореза «Нанофор 01» (ИАнП РАН, Госреестр № 22828-02) со спектрофотометрическим детектором (рабочая длина волны 214 нм), рН-термомилливольтметр MFpH-03 (ООО «НП ЦЭЗ») с комбинированным рН-электродом «Вольта-рН-3014» (ООО «Потенциал»), в кварцевых капиллярах с внешним полиимидным покрытием. Общая длина 45 см; внешний диаметр — 360 мкм внутренний — 50 мкм. Обработка результатов проводилась с помощью программного обеспечения «Мультихром для Windows, версия 1.5» (ООО «Амперсенд», г. Москва).

Подготовка кварцевого капилляра к работе. Кварцевый капилляр промывали 1М раствором ^ОН в течение 30 мин, затем водой (15 мин), 0,1М раствором НС1 (30 мин), водой (15 мин).

Условия электрофоретического анализа. Рабочее напряжение 20 кВ. Спекто-рофотометрическое детектирование осуществляли при \ = 214 нм. Ввод пробы - гидродинамический, 0,05 атм. Воздушное термостатирование капилляра проводилось при 20 °С. В качестве маркёра ЭОП использовался 3 % раствор диметилсульфоксида в соответствующем рабочем электролите. Перед началом работы и между опытами капилляр промывали дистиллированной водой 5 мин, водным раствором щёлочи в течение 5 мин, снова водой и рабочим электролитом (5 мин). По окончании работы проводилась промывка капилляра дистиллированной водой в течение 5 мин.

Результаты и их обсуждение. Основные проблемы, возникающие при электрофоретическом определении пептидов и белков, заключаются в их необратимой адсорбции на стенках кварцевого капилляра и электростатическом взаимодействии заряженных функциональных групп биополимеров с заряженными группами сорбента, что приводит к невоспроизводимости параметров миграции, нестабильности базовой линии и снижению продолжительности «жизни» капилляра.

Одним из возможных решений проблем является введение в состав буферного электролита различных модификаторов.

Мы исследовали возможности новых водорастворимых олигосахаридных производных сверхразветвлённого полиэтиленимина (РЕ1-Ма1) с различной массой ядра 5 и 25 кДа и степенью модификации мальтозой, что обусловливает различие и по гидро-фильности и заряду, в качестве псевдостационарной фазы в ЭКХ.

На рис. 1 используемые дендритные полимеры обозначены как РЕ1-Ма1-А (В, С). А имеет наибольшее число мальтозных фрагментов, С — наименьшее.

Наличие терминальных мальтозных групп и внутренних третичных и вторичных амино-групп, обеспечивает различный заряд сверхразветвлённого полимера в зависимости от значения рН буферного раствора, что было показано в специальных экспериментах (рис. 2) [15].

Было изучено влияние сверхразветвлённого полиэтиленимина в качестве ПСФ на параметры миграции белков — альбумина, лизоцима, миоглобина, инсулина — при различных значениях рН рабочего буфера:

1) pH = 2,5: молекулы белков и полимеров находятся в катионной форме;

NH„

^T^MoHTho

HO

Рис. 1. Синтез сверхразветвлённого мальтозилированного полиэтиленимина (Mal-PEI) с различной степенью замещения

2) pH = 8,5: молекулы белков — в анионной форме, а полимеров — в катионной;

3) pH = 10,2: молекулы белков и полимеров находятся в анионной форме.

Значения рН рабочего буфера выбирались в соответствии со значениями изоэлек-трических точек (pI) определяемых белков (см. таблицу).

При использовании боратного буфера (pH = 8,5) в качестве рабочего электролита основный белок лизоцим (pI = 11,0) заряжен положительно и сильно сорбируется стенками кварцевого капилляра. Поэтому влияние сверхразветвлённого полимера изучалось на модельной смеси трёх белков: Рис. 2. Зависимость заряда PEI-Mal-В

миоглобина, альбумина и инсулина. от рН

pH

Молекулярные массы и значения изоэлектрической точки определяемых белков

Миоглобин Инсулин Лизоцим Альбумин

Мг, г/моль 17800 5808 14300 66241

pi 7,0 5,5 11,0 4,7

1,45 я 1,40Ц 1,35 1,30

§ 1,25'

я 1,20

я ’

н

Ц 1’15'

о 1,10 1,05

^ ^ ^

^ 1

—— -”1

• М-И  И-А аА-М —

_1———1

6

5

и-

,3

* 21

Инсул Альбу Миогл

ин мин

обин

0

2

8

10

0

2

8

10

Рис. 3. Графики зависимости селективности разделения (а) и эффективности (б) при разделении белков в ЭКХ от концентрации полимера PEI-Mal Л25 в боратном буферном электролите (pH = 8,5):

М — миоглобин, И — инсулин, А — альбумин

а 1

^ 1 я 1 я

Щ 1

Ц

41 31

§3 1

я 1 я

я 1

н 1 и

Щ -I Щ

о 1

__1 Ь-——Г к

— _ г

к—

♦♦— г “

М-И ] И-А А -М

«- - 1 1 — 1

10

12

Рис. 4. Зависимость селективности разделения белков в ЭКХ от концентрации полимера РЕ1-Ма1 Л5 в боратном буферном электролите

0

2

Введение в состав буферного электролита полимера РЕ1-Ма1 А25 (сверхразветвлён-ный полиэтиленимин с массой ядра 25 кДа) приводит к увеличению эффективности, селективности разделения при незначительном увеличении скорости электроосмоти-ческого потока (рис. 3). Поскольку существенных различий в параметрах миграции аналитов при использовании полимеров различных генераций (А5 и А25) не было обнаружено (рис. 3, 4), в дальнейшем для детальных исследований взят РЕ1-Ма1 25 кДа, содержащий большее число терминальных функциональных групп.

Однако введение в состав буферного электролита более гидрофобного полимера РЕ1-Ма1 В25 привело к заметному увеличению параметров миграции белков и уменьшению эффективности

С использованием дендритного полимера РЕ1-Ма1 С25, содержащего наименьшее число мальтозных фрагментов, в качестве ПСФ — ни один белок не был обнаружен, что можно объяснить следующим обстоятельством: при pH = 8,5 увеличивается положительный заряд полимеров от А к С. Это приводит к усилению электростатических взаимодействий между положительно заряженными аммониевыми группами полиэти-ленимина и отрицательно заряженными силанольными — на стенках кварцевого капилляра; ЭОП подавляется, а взаимодействия полимера с отрицательно заряженными молекулами аналитов возрастают.

Рис. 5. Зависимость времени миграции белков

Рис. 6. Зависимость эффективности белков в ЭКХ от концентрации полимера РЕ1-Ма1 А25 в борат-ном буферном электролите

К тому же после проведения электрофоретических анализов требуется длительная промывка капилляра.

При использовании буферных электролитов с pH = 10,2 и 2,5 молекулы белков и полимера имеют одноимённые заряды, возможные взаимодействия между ними обусловлены наличием водородных связей. Обнаружено, что присутствие полимера в составе рабочего буфера в этих условиях улучшает эффективность (для полимера А, рис. 6) и увеличивает селективность разделения (для полимера В, рис. 7). Дендритный полимер РЕ1-Ма1 С в этих условиях «не работает».

Обнаружено, что дендритный полимер выполняет двойную функцию: «работает» в качестве псевдостационарной фазы и модификатора поверхности кварцевого капилляра (рис. 8). Это, в свою очередь, препятствует адсорбции белков на стенках капилляра, увеличивая воспроизводимость параметров миграции при pH = 10,2, а при pH = 8,5 - приводит к сильной адсорбции белков на модифицированных стенках капилляра за счёт электростатических взаимодействий.

1,70 “1,60 И 1,50 §1,40 ^1,30 (3 1,20

Я 1,10 ^1,00

0,90

°0,80

0 0,5 1 1,5 2 2,5 3

1 1 1 1 1 \ 1 1 1 1 1 1 1 1

* л 1 1 1 1 1

Т 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1 1 1 “ “ 1 1

* Л-М- * А-М  И-А * м-и-

1 1 1 1 1 А. 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Рис. 7. Зависимость селективности разделения белков в ЭКХ от концентрации полимера PEI-Mal В25 в боратном буферном электролите (pH = = 10,2):

Л — лизоцим, М — миоглобин, А — альбумин, И — инсулин

а б

с с

Рис. 8. Электрофореграмма разделения модельной смеси белков (лизоцим, миоглобин, инсулин, альбумин) без добавки полимера PEI-Mal Л25 (а), после использования добавки полимера РЕ1-Ма1 Л25 (б):

ввод пробы — 5 с X 30 мбар, КЭ = 15 кВ; X = 214 нм; рабочий электролит — 75 мМ боратный буфер (pH = 10,2); 1 — лизоцим, 2 — миоглобин, 3 — инсулин, 4 — альбумин

Заключение. Таким образом, изучено влияние олигопроизводных сверхразветв-лённых полиэтилениминов на разделение модельной смеси белков (альбумин, миоглобин, лизоцим, инсулин) при различных значениях рН. Показано, что дендритные полимеры выполняют функцию как псевдостационарной фазы в ЭКХ, так и модификатора внутренних стенок кварцевого капилляра. Присутствие полимера в составе буферного электролита препятствует адсорбции белков на стенках капилляра, увеличивая воспроизводимость параметров миграции, улучшает эффективность в 2-5 раз в случае полимера А и увеличивает селективность разделения белков при использовании полимера В.

Таким образом, выявление свойств сверхразветвлённых полимеров может обеспечить создание новых селективных ПСФ для определения биологически активных соединений в ЭКХ.

1. Molina M., Silva M. Micellar electrokinetic chromatography: Current developments and future // Electrophoresis. 2002. Vol. 23. P. 3907-3921.

2. Terabe S. Capillary Separation: Micellar Electrokinetic Chromatography // Anal. Chem. 2009. Vol. 2. P. 99-120.

3. Seiler M. Hyperbranched polymers: phase behavior and new applications in the field of chemical engineering // Fluid Phase Equilibria. 2006. Vol. 241. P. 155-174.

4. Ozaki H., Terabe S., Ichihara A. Micellar electrokinetic chromatography using high-molecular surfactants use of butyl acrylate-butyl methacrylate-methacrylic acid copolymers sodium salts as pseudo-stationary phases // J. Chromatogr. (A). 1994. Vol. 680. P. 117-123.

5. Palmer C.P., Terabe S. A novel sulfate polymer as a pseudo-stationary phase for micellar electrokinetic chromatography // J. Microcol. Sep. 1996. Vol. 8. P. 115-121.

6. Palmer C.P., Terabe S. Micelle polymers as pseudostationary phases in MEKC: chromatographic performance and chemical selectivity // Anal. Chem. 1997. Vol. 69. P. 1852-1860.

7. Tanaka N., Fukutome T., Tanigawa T. et al. Structural selectivity provided by starburst dendrimers as pseudostationary phase in electrokinetic chromatography // J. Chromatogr. (A). 1995. Vol. 699. P. 331-341.

8. Tanaka N., Iwasaki. H., Fukutome T. et al. Starburst dendrimer-supported pseudostationary phases for electrokinetic chromatography // J. High Res. Chrom. 1997. Vol. 20. P. 529-538.

9. Haynes J. L., Shamsi S. A., Dey J., Warner I. M. Use of a new diaminobutane dendrimer in electrokinetic capillary chromatography // J. Liq. Chrom. & Rel. Technol. 1998. Vol. 21. N 5. P. 611-624.

10. Chao H. C., Hanson J. E. Dendritic polymers as bonded stationary phases in capillary electrochromatography. // J. Sep. Sci. 2002. Vol. 25. P. 345-350.

11. Njikang G., Gauthier M., Li J. Arborescent polystyrene-graft-poly(2-vinylpyridine) copolymers as unimolecular micelles: Solubilization studies // Polymer. 2008. Vol. 49. P. 1276-1284.

12. Kolhe P., Misra E., Kannan R. M. et al. Drug complexation, in vitro release and cellular entry of dendrimers and hyperbranched polymers // International J. of Pharmaceutics. 2003. Vol. 259. P. 143-160.

13. Klajnert B., Appelhans D., Komber H. et al. The influence of densely organized maltose shells on the biological properties of poly(propylene imine) dendrimers: new effects dependent on hydrogen bonding // Chem. Eur. J. 2008. Vol. 14. P. 7036-7041.

14. Tanaka N., Tanigawa T., Hosoya K. et al. Starburst dendrimers as carriers in electrokinetic chromatography // Chem. Lett. 1992. Vol. 21. P. 959.

15. Boye S., Polikarpov N., Appelhans D., Lederer A. An alternative route for dye*polymer complexation study via asymmetrical flow field-flow fractionation // J. Chrom. (A). 2010. Vol. 1217. P. 4841.

Статья поступила в редакцию 28 декабря 2010 г.