Штамм Lactobacillus fermentum U-21, продуцирующий комплекс биологически активных веществ, осуществляющих нейтрализацию супероксид-аниона, индуцируемого химическими агентами
LACTOBACILLUS FERMENTUM U-21 STRAIN, WHICH PRODUCES COMPLEX OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES WHICH NEUTRALIZE SUPEROXIDE ANION INDUCED BY CHEMICAL AGENTS

Область техники
Изобретение относится к фармакологии, медицине и косметологии, в частности, может быть использовано для предотвращения негативных последствий, вызванных воздействием химических веществ - продуцентов супероксид-аниона, в том числе гербицидов, в частности параквата, а также для профилактики и в комплексном лечении состояний, обусловленных окислительным стрессом (симптомы паркинсонизма) и касается штамма Lactobacillus, способного синтезировать комплекс антиоксидантов, обладающих высокой активностью в отношении супероксид-аниона, продуцируемого паракватом.
Уровень техники
Пробиотические микроорганизмы - представители нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных. Микробном играет в жизнедеятельности организма огромную роль - совокупность населяющих его микроорганизмов (преимущественно бактерий) образуют сбалансированное, стабильное сообщество, непосредственно и многосторонне влияющее на здоровье и развитие организма. Бактерии, составляющие кишечную микробиоту, выполняют многочисленные функции: подавляют патогенную микрофлору, участвуют в переваривании пищи, выделяют ряд биологически активных веществ, проявляет иммуномодулирующие свойства. (Role of the normal gut microbiota. Jandhyala S.M., Talukdar R., et. al // World J Gastroenterol 2015 August 7; 21(29): 8787-8803; Gut microbiota and gastrointestinal health: current concepts and future directions. Aziz Q,  J et. al. // Neurogastroenterol Motil (2013) 25:4-15; Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology. Krishnan S., Alden N., Lee K. // Current Opinion in Biotechnology 2015, 36. P:137-145; The gut microbiota and host health: a new clinical frontier. Marchesi J.R., Adams D.H, et. al // Gut 2015; Sep. 2 P: 1-10)
Ряд пробиотических компонентов микрофлоры кишечника обладает антиоксидантными (Probiotics and Oxidative Stress T. Kullisaar. E Songisepp and M. Zilmer. University of Tartu, Bio-competence Centre of Healthy Dairy products LCC, Estonia, 2012), антимутагенными и противоопухолевыми свойствами (Effects of Lactobacillus strains on cancer cell proliferation and oxidative stress in vitro. S.S. Choi, Y. Kim, K.S. Han, S. You, S. Oh and S.H. Kim. Letters in Applied Microbiology 42 (2006) 452-458). В частности, лактобациллы являются продуцентами аминокислот, витаминов и многих других биологически активных веществ, в том числе - антиоксидантов.
+2
+2
1
12
Способность отдельных штаммов пробиотических бактерий снижать окислительный стресс доказана in vitro и in vivo. Антиокислительный эффект пробиотиков обусловлен способностью этих бактерий продуцировать антиоксидантные энзимы (супероксидисмутаза, тиоредоксин, глутатион), хелатирующие свободные ионы Fe и Cu соединения, витамины (B, B и другие) и короткоцепочечные жирные кислоты, модулировать видовой состав КМ и т.д (Bacillus amyloliquefaciens SC06 alleviates the oxidative stress of IPEC-1 via modulating Nrf2/Keap1 signaling pathway and decreasing ROS production. Wang Y, Wu Y, Wang Y, Fu A, Gong L, Li W, Li Y. // AppI Microbiol Biotechnol. 2017 Apr; 101(7):3015-3026).
Тиоредоксины - семейство маленьких белков, представленный во всех организмах от архей до человека ([Thioredoxin and glutaredoxin systems. Holmgren A. J Biol Chem. 1989. 264 (24): 13963-6). Они участвуют во многих важных биологических процессах, включая определение окислительно-восстановительного потенциала клетки и передачу сигнала, является важнейшим антиоксидантом, протектором против свободно радикального повреждения клеточных структур. Ряд экспериментальных работ подтверждают роль тиоредоксиновой системы в защите от окислительного стресса у лактобацилл и близких к ним грам-положительных микроорганизмов. Мутанты Lactococcus lactis с делецией гена тиоредоксина резко замедляют рост в присутствии перекиси водорода, диамида, параквата (5-20 mM) (Two Lactococcus lactis thioredoxin paralogues play different roles in responses to arsenate and oxidative stress. Efler P, Kilstrup M, Johnsen S, Svensson B,  P. // Microbiology. 2015 Mar; 161(Pt 3):528-38). Мутант Lactobacillus casei с делецией гена тиоредоксин редуктазы снижал скорость роста в анаэробных условиях и был нежизнеспособен в аэробных условиях (Roles of thioredoxin and thioredoxin reductase in the resistance to oxidative stress in Lactobacillus casei. Serata M, Iino T, Yasuda E, Sako T. // Microbiology. 2012 Apr; 158(Pt 4):953-62). Суперпродукция тиоредоксин редуктазы у Lactobacillus plantarum WCFS1 увеличивает устойчивость бактерий к окислительному стрессу (Thioredoxin reductase is a key factor in the oxidative stress response of Lactobacillus plantarum WCFS1. Serrano L.M., Molenaar D., Wels M., Teusink В., Bron P.A., de Vos W.M., Smid E.J. // Microb Cell Fact. 2007 Aug 28; 6:29.). Сохранение оптимального для клетки уровня восстановленного тиоредоксина является важным условием ее жизнеспособности. В последнее время, развитие многих системных заболеваний, помимо генетических и экологических факторов, связывают с изменением антиоксидантного статуса организма. Оксидативный стресс, воспаление и абиотические факторы во многих случаях индуцируют развитие таких заболеваний, как БП, Б Альгеймера, Хатингтона, др.
Использование микроорганизмов, являющихся естественными симбионтами человека, в качестве источника антиоксидантов (АО), имеет ряд преимуществ перед другими способами повышения антиоксидантного статуса организма, в частности их относительная безвредность и физиологичность по сравнению с химическими препаратами. Они широко используются в функциональных пищевых продуктах, биологически активных добавках, лекарственных средствах. Пробиотики, и лактобациллы в частности, все чаще используются в комбинированном лечении начальных стадий различных заболеваний, таких как язвенный колит, синдром воспаленного кишечника, аллергические заболевания. Существует большой интерес к пробиотикам, синтезирующим биологически активные вещества, в том числе антиоксиданты. Для комплексного решения проблем, связанных с оксидативным стрессом, воспалением и дисбактериозом, предложено использование нескольких штаммов Lactobacillus, обладающих антиоксидантным действием (Antioxidant properties of potentially probiotic bacteria: in vitro and in vivo activities. A. Amaretti, M. di Nunzio, A. Pompei et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013. 97. P. 809-81), а так же проявляющих иммуногенные свойства (И.А. Федорова, В.Н. Даниленко. // Успехи соврем, биол. 2014, Т. 134. №2. С. 99-110).
Существует ряд патентов на пробиотические организмы с антиоксидантной активностью: Probiotic bacteria having antioxidant activity and use thereof, Mogna, G.; Strozzi, GP.; Mogna L., US 20140065116 A1, 2014; Lactobacilli with Anti-Oxidant Action. Grompone G., Degivry M-C, Legrain-Raspaud S., Chambaud I., Bourdet-Sicard R. US 20130171117 A1, 2013; Human lactobacillus casei gr x 12 with antioxidant function and application thereof. Ruixia G. Dong. L, CN 103343107 (A), 2013; A Novel lactobacillus plantarum, composition with antibacterial and antioxidant activity comprising the same and use of thereof. Ki K.S., Kyung CH. W. // KR 20120023480 (A) 2012; KR 101197203 2012; Method of treatment using Lactobacillus fermentum ME-3. Kullisaar Т., Zilmer M. SG11201504787V (А), 2015). Описанные в них штаммы являются ближайшим аналогом изобретения.
Метагеномные исследования видового состава кишечной микробиоты (КМ) пациентов с различными заболеваниями (например, диабет, аутизм, болезнь Паркинсона (БП)) подтверждают, что она терпит количественные и качественные изменения, если за норму брать микробиоту здоровых людей (Analysis of gut microbiota in patients with Parkinson's disease. Petrov, V.A. et al. // Bull. Exp. Biol. Med. 2017. 162, 734-737; Functional implications of microbial and viral gut metagenome changes in early stage  Parkinson's disease patients. Bedarf, J.R. et al. // Genome Med. 2017. 9; Gut microbiota are related to Parkinson's disease and clinical phenotype. Scheperjans, F. et al. // Mov. Disord. 2015. 30, 350-358). Обнаруживаются корреляции между видовым составом КМ и различными аспектами нарушений здоровья. Например, при БП от состава микробиоты зависят такие проявления, как эмоционально-аффективные нарушения, обонятельная дисфункция, время толстокишечного транзита и другие (Correlation between emotional-affective disorders and gut microbiota composition in patients with Parkinson's disease. Alifirova, V.M. et al. // Vetn Ross Akad Nauk. 2016. 71, 427-435; Кострюкова и др., 2016; More than constipation - bowel symptoms in Parkinson's disease and their connection to gut microbiota. Mertsalmi, Т.H. et al. // Eur. J. Neurol. 2017. 24, 1375-1383). Наибольшее внимание заслуживает работа Сампсона и др. опубликованная в 2016, в которой была продемонстрирована способность "патологической микробиоты" полученной от людей с БП и пересаженной стерильным мышам, вызвать у последних моторные нарушения характерные для БП (Gut Microbiota Regulate Motor Deficits and Neuroinflammation in a Model of Parkinson's Disease. Sampson TR, Debelius JW. et al. Cell. 2016 Dec 1; 167(6): 1469-1480).
В соответствии с современными представлениями, большая часть патологических процессов в организме и развитие многих «возрастных» заболеваний, в частности Болезни Паркинсона, связано с воздействием активных форм кислорода (АФК), образующихся в процессе жизнедеятельности клетки и свободнорадикального окисления (СРО) биомолекул - белков, липидов, нуклеиновых кислот (Oxidants, antioxidants and the current incurability of metastatic cancers. Watson J. // Open Biol 2013, 3 120-144). В небольших количествах АФК образуются, как побочный продукт внутри клеток, при естественном метаболизме кислорода, при осуществлении клеточного дыхания митохондриями. Однако при повреждении митохондрий количество АФК резко возрастает. Состояние оксидативного стресса может быть индуцировано негативными факторами внешней среды, такими, как гербициды, продукты неполного сгорания и другие, ведущие к образованию в организме избыточного количества активных форм кислорода (АФК), радикалов и других агрессивных частиц.
Повышение уровня активных форм кислорода (АФК) в мозгу связано, в первую очередь, с метаболизмом дофамина, нарушением работы митохондрий и нейровсопалением обусловленном активацией микроглий, астроцитов и других клеток мозга (Aging and Parkinson's Disease: Inflammaging, Neuroinflammation and Biological Remodelling As Key Factors in Pathogenesis. Calabrese, V. et al.. // Free Radio. Biol. Med. 2017. 115, 80-91). Экспериментально доказано, что в ответ на окислительный стресс в микроглий появляются и накапливаются медиаторы воспаления. Выработка цитокинов, в свою очередь, провоцирует выработку активных форм кислорода. Т.е. окислительный стресс и воспаление могут быть и пусковым и усиливающим фактором друг для друга (Oxidizing stress in patogeneza of neurodegenerate diseases: possibilities of therapy. Vasenina E.E., Levin O.S.// Современная терапия в психиатрии и неврологии (СТПН) 2013, 3-4, рр. 39-46).
Кроме того, нейровсопаление может быть результатом проникновения эндотоксинов в проток крови; липополисахарид (ЛПС), основной компонент клеточной стенки грамотрицательных бактерий, вызывает воспаление и гибель нейронов черной субстанции.
Такие токсические вещества как ЛПС, паракват и другие используются в моделях изучения БП, так как их введение модельным животным вызывает те же изменения, что наблюдаются при БП. Причиной попадания эндотоксинов в кровь может стать нарушенный кишечный барьер (КБ), нормальное функционирование которого, в первую очередь зависит от деятельности кишечной микробиоты (The role of oxidative stress in parkinson's disease. Dias, V., Junn, E., Mouradian, M.M. // Journal of Parkinson's Disease. 2013. 3, 461-491).
Избыток активных форм кислорода и других оксидантов в цитозоле нейрона приводит к необратимой олигомеризации α-синуклеинов, образованию так называемых телец Леви и гибели нейрона (Role of cytochrome с in α-synuclein radical formation: implications of α-synuclein in neuronal death in Maneb- and paraquat-induced model of Parkinson's disease. Kumar A, Ganini D, Mason RP. // Mol Neurodegener. 2016 Nov 24; 11(1):70). Многие исследования указывают на определяющую роль митохондриальных нарушений в развитии PD (Similar patterns of mitochondrial vulnerability and rescue induced by genetic modification of alpha-synuclein, parkin, and DJ-1 in Caenorhabditis elegans. Ved R., Saha S., Westlund В., et. al // J Biol Chem. 2005 Dec 30; 280(52):42655-42668; Mfn2 protects dopaminergic neurons exposed to paraquat both in vitro and in vivo: Implications for idiopathic Parkinson's disease. Zhao F, Wang W, Wang C, Siedlak SL, Fujioka H, Tang B, Zhu X. // Biochim Biophys Acta. 2017 Jun; 1863(6):1359-1370; Pharmacological manipulations of autophagy modulate paraquat-induced cytotoxicity in PC12 cells. Zhou Q1, Zhang H1, Wu Q1, Shi J1, Zhou S1. Int J Biochem Mol Biol. 2017 Jun 15; 8(2):13-22)
Сегодня известно, что агрегация альфа синуклеинов у людей с БП наблюдается не только в центральной нервной системе (ЦНС), но и в энтеральной нервной системе (ЭНС) (Holmqvist et al., 2014). Дофаминергические нейроны составляют 14-20% энтеральных нейронов верхнего отдела ЖКТ и 1-6% всех энтеральных нейронов нижних его отделов (Anlauf, 2003). Энтеральные глиальные клетки являются другой потенциальной мишенью БП (Clairembault, 2015). По некоторым данным, поражение ЭНЦ является первичным и предшествует появлению нарушений в ЦНС (Colonic biopsies to assess the neuropathology of Parkinson's disease and its relationship with symptoms. Lebouvier, T. et al. // PLoS One. 2010. 5, 1-9; Activity-dependent secretion of alpha-synuclein by enteric neurons. Paillusson, S., Clairembault, Т., Biraud, M., Neunlist, M. & Derkinderen, P. II J. Neurochem. 2013. 125, 512-517; Mind the gut: Secretion of α-synuclein by enteric neurons. Grathwohl, S. A., Steiner, J. A., Britschgi, M. & Brundin, P. // Journal of Neurochemistry 2013. 125, 487-490).
Болезнь Паркинсона (БП) является хроническим прогрессирующем нейродегенеративным расстройством протекающем без явных симптомов на начальных этапах. По данным ВОЗ, БП постигает 1-2% населения возрастом 60 лет и выше. Причиной является смерть дофаминовых нейронов. Характерным признаком для БП является нарушение фолдинга белка под названием альфа-синуклеин (α-syn), что приводит к формированию его нерастворимой формы с образованием Телец Леви. Среди факторов риска - экспозиция к пестицидам, генетические факторы (мутации в генах PINK1, PARKIN и α-syn или единичные полиморфизмы в гене LRRK2) и оксидативный стресс, провоцированный различными факторами (экология, воспаление) [Окислительный стресс в патогенезе нейродегенеративных заболеваний: возможности терапии. Васенина Е.Е., Левин О.С. // Современная терапия в психиатрии и неврологии. 2013. 3-4. с. 39-46].
Явные поведенческие изменения и тесты на PD могут быть использованы для диагностики заболевания, когда дегенерация допаминергических нейров достигает 60-80% и лечение уже не эффективно. Помимо выявляемых нарушений в работе ЦНС, для больных БП характерны серьезные нарушения со стороны желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и энтеральной нервной системы, которые включают в себя: изменение видового состава кишечной микробиоты (КМ), запоры, дисфагию, вздутие, боли в животе, избыточный бактериальный рост в тонкой кишке, нарушение эвакуации желудочного содержимого из желудка в двенадцатиперстную кишку, воспалительные заболевания кишечника, агрегация α-syn в нейронах блуждающего нерва и другие (Gut dysfunction in Parkinson's disease. Mukherjee A., Biswas A., Das S.K. // World J Gastroenterol. 2016 Jul 7; 22(25):5742-52). Многие из этих нарушений предшествуют появлению моторных симптомов БП, и при этом явно связанны с KM (Idiopathic Parkinson's disease: Possible routes by which vulnerable neuronal types may be subject to neuroinvasion by an unknown pathogen. Braak H.,  U., Gai W. P., Del Tredici KM J. Neural Transm. 2003. 110, 517-536). Для диагностики PD на ранних стадиях разрабатываются различные биохимические методы, определяются биоиндикаторы (Point-of-Care Devices Using Disease Biomarkers To Diagnose Neurodegenerative Disorders. Wei TY, Fu Y, Chang KH, Lin KJ, Lu YJ, Cheng CM. // Trends Biotechnol. 2017 Dec 11. pii: S0167-7799(17)30302-5). Хотя биомаркеры болезни, на сегодняшний день, отсутствуют, немоторные симптомы, в виде запоров, нарушения сна и обоняния, могут возникнут на ранней стадии болезни еще до появления моторных симптомов. А нейродегенеративный процесс может начаться еще за 2 десятка лет до проявления симптомов.
Методы профилактики PD на ранних стадиях могут включать различные подходы, в том числе антиоксидантную Tepannio (Neuroprotective effects of coenzyme Q10 on Paraquat-induced Parkinson's disease in experimental animals. Attia H.N., Maklad Y.A. // Behav. Pharmacol. 2018. 29, 79-86).
Поскольку окислительный стресс и нейровоспаление играют важную роль в разрушении дофаминергических нейронов в мозгу и развитии БП, сегодня активно ведется поиск антиоксидантов, способных оказать нейропротективный эффект (The role of oxidative stress in Parkinson's disease.. Review. Dias V, Junn E, Mouradian MM. // J Parkinsons Dis. 2013; 3(4):461-91). Применение пробиотиков, отобранных по их антиоксидантному потенциалу, является эффективной стратегией для уменьшения окислительного стресса, нейровоспаления а также укрепления КБ.
За рубежом опубликовано большое количество патентов, заявляющих интеллектуальную собственность на препараты-антиоксиданты в том числе и пробиотики для профилактического применения при нейродегенеративных расстройствах включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, и другие.
+2
1
12
Пробиотики с высокими антиоксидантными свойствами выступают в роли перспективных кандидатов для профилактики БП. Механизмы действия таких штаммов достаточно многообразны и включают в себя: хелатирование токсичных йонов железа (Fe), синтез ферментов-антиоксидантов (супероксиддисмутаза, глютатион), продукцию веществ с антиокислительными свойствами (витамины B и B, короткоцепочечные жирные кислоты), регуляцию внутренних систем сигнальной трансдукции эукариотических клеток и активацию транскрипции ферментов, нейтрализующих свободные радикалы (Nrf2-Keap1-ARE, NFκB, MAPK, PKC). На сегодняшний день, в странах зарубежья уже можно найти патенты заявляющие права на применение пробиотиков при БП (WO 2013190068 A1; US 20160199425 A1; WO 2011083354 A1; CN 102858948 В; US 9056123 B2; WO 2003002131 A1).
Аналоги разрабатываемого препарата на основе пробиотика/ов направленного/ых на снижение окислительного стресса в организме полностью отсутствуют в России.
Раскрытие сущности изобретения
Целью данного изобретения является представление штамма Lactobacillus fermentum U-21 с установленной последовательностью генома, обладающего антиоксидантными свойствами в отношении супероксид-аниона, продуцируемого паракватом.
Источник выделения штамма.
Штамм Lactobacillus fermentum U-21 выделен в 2010 г из фекалий здорового мужчины, жителя центрально-европейской части РФ (т.е. того географического района, где предполагается применять данный препарат-пробиотик), который на момент обследования был клинически здоров и не имел в анамнезе инфекционных и соматических заболеваний. Была проведена видовая идентификация по биохимическим, морфологическим и генетическим признакам, позже подтвержденная определением нуклеотидной последовательности его ДНК. Штамм L. fermentum U-21 был депонирован в международной коллекции ВКПМ (Москва) под номером В-12075 от 08.10.14., нуклеотидная последовательность генома депонирована в GenBank под номером WGS PNBB00000000.1.
Способ, условия и состав сред для размножения штамма.
Штамм культивировали на жидкой и агаризованной средах MRS (Himedia) в течении 24-48 час. Состав среды MRS на 1 литр в граммах: протеозопептон - 10,0; мясной экстракт - 10,0; дрожжевой экстракт - 5,0; глюкоза - 20,0; полисорбат 80 - 1,0; цитрат аммония - 2,0; ацетат натрия - 5,0; сульфат магния - 0,1; сульфат марганца - 0,05; фосфат калия двузамещенный - 2,0. рН (при 25°С) 6,5. Культивирование осуществляли в анаэробных условиях с использованием анаэростата и системы GasPak+. Температура инкубации 37°С.
Продуктивность штамма
9
В MRS бульоне продуктивность штамма через 24 часа достигала 10 КОЕ/мл.
Культурально-морфологические особенности штамма
Штамм L. fermentum U-21 при культивировании в течение 48 часов на поверхности агаризованной среды MRS образует образует шероховатые выпуклые колонии кремового оттенка диаметром до 5 мм. При культивировании в жидкой среде MRS в течение 18-24 ч происходит равномерное помутнение среды по всему ее объему с образованием осадка. При микроскопировании обнаруживаются одиночные грамположительные бесспоровые палочки правильной формы с округлыми концами, 2-5 мкм.
Характеристика свойств штамма
Штамм чувствителен к хлорамфениколу (30 мг на диске), рифампицину (5 мг), тетрациклину (30 мг), эритромицину (25 мг), линкомицину (15 мг). Чувствительность к антибиотикам определяли диско-диффузионным методом, измеряя зону ингибирования роста в см.
Штамм ферментирует различные сахара и спирты, фенотипически апатогеннен, т.е. не обладает гемолитической, протеазной, ДНК-азной, РНК-азной и казеиназной активностью.
Штамм охарактеризован в соответствии с требованиями по биобезопасности, опубликованными в Фармакопейной статье «Пробиотики для медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации (Государственный стандарт качества лекарственных средств). Штамм соответствует требованиям Продовольственной и Сельскохозяйственной Организации при ООН (Food and Agriculture organization of the United Nations, FAO) и ВОЗ (2002 г) и общих фармакопейных статей (ОФС) Министерства здравоохранения РФ (2016 год) (http://www.rosminzdrav.ru/docs/mzsr/regulation/81), определяющих основные требования к штаммам микроорганизмов, используемым в производстве пробиотиков для медицинского применения.
Механизм антиоксидантной активности штамма L. fermentum U-21 установлен с использованием валидированных тест-систем и согласуется с результатами секвенирования и биоинформационного анализа генома. Эти данные позволяют считать, что антиоксидантные свойства обусловлены продукцией ряда биологически-активных веществ в т.ч. тиоредоксина - одного из основных внутриклеточных антиоксидантов - и ферментов его метаболизма.
Технический результат
Штамм Lactobacillus fermentum U-21 способный синтезировать комплекс антиоксидантов, обладающих доказанной высокой антиоксидантной активностью, в частности в отношении супероксид-аниона а так же биоактивные материалы, полученные из его биомассы и среды культивирования, обладающие антиоксидантной активностью, в частности в отношении супероксид-аниона, может найти применение в фармакологии и медицине, в частности для сопроводительной терапии нейродегенеративных заболеваний, в частности синдрома паркинсонизма, индуцированных окислительным стрессом; в косметологии для для повышения антиоксидантного статуса организма и кожных покровов.
Краткое описание чертежей
Рисунок 1. Снижение индуцированной паракватом люминесценции стандартными антиоксидантами (тролоксом, липоевой кислотой и глютатионом (в концентрациях 1,5 мМ, 4,5 мМ и 3 мМ соответственно) и культуральной жидкостью штамма L. fermenutm U-21.
Рисунок 2. Продолжительность жизни C. elegans в 50 мМ растворе параквата в присутствии разных видов лактобацилл в качестве корма по сравнению со стандартным кормом (E.coli ор50).
Рисунок 3. Подавление активности DPPH радикала клетками и бесклеточными экстрактами штаммов лактобацилл.
Осуществление изобретения
Выбор штамма
Штамм был отобран из коллекции штаммов лактобацилл (Отбор бактерий-симбионтов рода Lactobacillus и Bifidobacterium по их способности синтезировать гамма-аминомасляную кислоту - один из подходов в получении психобиотиков Юнее, Р.А., Полуэктова Е.У., Дьячкова М.С., Козловский Ю.Е., Орлова B.C., Даниленко В.Н. // Вестник Российского университета дружбы народов. Серия: Экология и безопасность жизнедеятельности. 2016. - №4 - С. 67-79) в 2 этапа.
1. 89 штаммов 7-ми видов лактобацилл были исследованы с помощью биолюминесцентной тест-системы, где окисление индуцировалось паракватом. Было отобрано 17 штаммов проявивших максимальную антиоксидантную активность (Примеры 1, 2).
2. Полученные 17 штаммов были проверены на способность снимать паракват-индуцируемый окислительный стресс in vivo на валидированной модели С. elegans. На данном этапе отобранный штамм Lactobacillus fermentum U-21 по антиоксидантной активности значительно превосходил остальные штаммы (Пример 3).
Антиоксидантная активность штамма
1. Антиоксидантная активность штамма была проверена с помощью биолюминесцентной тест системы, основанной на генно-инженерных штаммах E.coli, несущих lux гены, находящиеся под контролем промоторов каталазы и супероксиддисмутазы. Исследовалась культуральная жидкость штаммов. Сначала к культуре штамма E.coli MG1655 добавляли добавляли культуральную жидкость штаммов лактобацилл, затем паракват, являющийся сильнейшим индуктором оксидативного стресса, обусловленного продукцией супероксид-аниона, что значительно увеличивало люминесценцию. Контролем служили стандартные антиоксиданты (липоевая кислота, глютатион). Определяли изменения индуцированной люминесценции в присутствии культуральных жидкостей и в контроле. Культуральная жидкость штамма Lactobacillus fermentum U-21 снижала индуцированную паракватом люминесценцию на 19,5% (максимальные значения для исследованных проб) (Пример 2).
2. Антиоксидантная активность была исследована in vivo на модели свободноживущей почвенной нематоды Caenorhabditis elegans, обработанной раствором параквата (50 мМоль). Штамм L. fermentum U-21 увеличивал продолжительность жизни нематоды на 20-35% по сравнению с контрольными штаммами L.rhamnosus GG и E.coli ор50, а так же другими штаммами Lactobacillus (Пример 3).
3. Общая антиоксидантная активность штамма L. fermentum U-21 была исследована по способности нейтрализовать стабильный радикал DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил). Клетки штамма L. fermentum U-21 подавляли активность радикала в большей степени, чем клетки штамма L. fermentum 279, не проявлявшего антиоксидантных свойств в других тестах, и известного пробиотического штамма L. rhamnosus GG, характеризующегося в том числе антиоксидантной активностью. Наибольшие отличие демонстрировали бесклеточные экстракты штамма U-21 - их активность превосходила активность экстрактов других штаммов в 4-10 раз (Пример 4).
Продукты, синтезируемые штаммом:
При выращивании в питательном бульоне MRS патентуемый штамм синтезирует и секретирует в среду комплекс антиоксидантов, обладающий высокой антиоксидантной активностью в отношении параквата (супероксид-аниона).
Нуклеотидная последовательность ДНК штамма
Геном штамма был секвенирован с использованием технологий нового поколения на секвенаторе Illumina. Последовательность генома охарактеризована и депонирована в международную базу данных GenBank с номером WGS PNBB00000000.1.
Определение нуклеотидной последовательности ДНК штамма L. fermentum U-21 позволило подтвердить видовую принадлежность штамма, а также найти штаммоспецифичный маркер (ген кадмий-устойчивого белка, cadD). Данный ген присутствовал только у данного штамма по сравнению с 36 депонированными геномными последовательностями других штаммов того же вида. Этот ген был использован для создания пары штаммоспецифических праймеров (Пример 5).
Анализ нуклеоидной последовательности ДНК показал, что штамм не является генетически модифицированным и не содержит генов других организмов, а также не содержит генов лекарственной устойчивости, локализованных на мобильных генетических элемента. В геноме штамма были идентифицированы гены, определяющие синтез белков-антиоксидантов (Пример 6).
Примеры определения свойств штамма L. fermentum U-21 по настоящему изобретению.
Пример 1. Отбор штаммов лактобацилл. способных подавлять активность супероксид-аниона, на модели биолюминесценции.
2
Исследования антиоксидантной активности проводились на валидированной тест-системе (Lux-биосенсоры для детекции SOS-ответа, теплового шока и окислительного стресса. Котова В.Ю., Манухов И.В., Завильгельский Г.Б. // Биотехнология, 2009, №6, С 16-25). Тест-система представляет собой штамм Escherichia coli К12 MG1655, несущий гибридную плазмиду с генами-репортерами люциферин-люциферазного комплекса бактерии Photorhabdus luminescens, подстроенными под промотор гена супероксиддисмутазы (soxS) E.coli. В присутствии супероксид-аниона ⋅O- промотор активируется белком-оператором SoxR, что приводит к люминесценции культуры E.coli. Добавление антиоксидантов снижает уровень люминесценции; снижение уровня люминесценции количественно характеризует антиоксидантные свойства исследуемого раствора. Для индукции люминесценции использовали паракват в концентрации 2 mM. Паракват (метилвиологен) является сильнейшим индуктором оксидативного стресса; попадая в клетку он действует как редокс-циклический агент, посредством клеточных ферментов активно продуцирующий супероксид-анион (Pesticides exposure as etiological factors of Parkinson'sdisease and other neurodegenerative diseases-A mechanistic approach. Baltazar M.T., Dinis-Oliveira R.J., Bastos M.L., Tsatsakis A.M., Duarte J.A., Carvalho F. // Toxicology Letters. 2014. 230. 85-103). Исследовали антиоксидантные свойства супернатанта суточной культуры штаммов лактобацилл, а также растворов стандартных антиоксидантов.
7
Ночную культуру E.coli MG1655 разводили в LB-бульоне до концентрации 10 кл/мл и выращивали при 37°С в течение 2-3 ч. Аликвоты по 180 мкл вносили в лунки 96-луночного планшета, далее вносили по 10 мкл исследуемой пробы антиоксиданта и индуктора окислительного стресса (параквата). Инкубацию проводили при 37°С. Интенсивность биолюминесценции измеряли на планшетном люминометре Beckman coulter DTX880 через определенные интервалы времени. Для получения супернатанта суточные культуры лактобацилл, выросшие в жидкой среде MRS, осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 6000g.
В результате эксперимента были отобраны 17 штаммов лактобацилл, снижавших люминесценцию на 16-25% (Таблица 1).
Пример 2. Определение антиоксидантной активности штамма L. fermentum U-21 при помощи биолюминесцентной тест-системы.
Культуральная жидкость штамма Lactobacillus fermentum U-21 уменьшала индуцированную паракватом люминесценцию на 19% (максимальные значения для исследованных проб) (Рисунок 2). В ходе исследований штамм L. fermentum U-21 показал стабильные воспроизводимые результаты.
Пример 3. Влияние на продолжительность жизни нематоды Celegans в среде с паракватом.
Свободноживущая почвенная нематода Celegans - небольшой круглый червь, до 1 мм в длину, обладает хорошо охарактеризованными клеточными линиями и широко используется в лабораторных исследованиях. Благодаря высокой степени гомологии генов Celegans и других организмов, в том числе - человека, эта модель применима для исследования различных экологических факторов, фармацевтических субстанций, отравляющих веществ и механизмов их действия. Мы исследовали действие параквата на продолжительность жизни нематод и влияние штаммов лактобацилл на этот процесс. Все стандартные среды, материалы и манипуляции с нематодами проводили по стандартным методикам (Maintenance of С.elegans. Stiernagle Т. 2006, WormBook ed., doi/10.1895/wormbook. 1.101.1).
Синхронизированные стерильные яйца Celegans, полученные по стандартной методике, переносили на бактериальный газон, состоящий из смеси бактерий: стандартного для лабораторных условий штамма E.coli ор50 и исследуемого штамма лактобацилл и инкубировали в течение 3-х суток при 20°С. Полученные таким образом личинки стадии L4 осторожно переносили в буферный раствор и отмывали от налипших бактерий. В каждую лунку 96 луночной планшеты вносили аликвоты S-среды, 8-12 нематод и водный раствор индуктора оксидативного стресса - параквата. Наблюдения и подсчет активных нематод проводили каждые три часа до гибели 95% от их исходного количества. Исследования каждого штамма проводили при концентрациях параквата 0, 25 и 50 мМоль/литр и в сравнении с нематодами, выросшими в стандартных условиях. После статистической обработки строили график и вычисляли медианную продолжительность жизни нематод. Медианная продолжительность жизни нематод каждой экспериментальной группы сравнивалась с контрольной группой нематод, выращенных в стандартных условиях. Всего было исследовано 17 штаммов лактобацилл разных видов, отобранных с помощью lux-биосенсоров.
В присутствии параквата продолжительность жизни нематод сокращается с 10-15 суток до 20-45 часов. Все исследованные 17 штаммов, кроме L. fermentum U-21, изменяли медианную продолжительность жизни в диапазоне 3-7%, что близко к статистической погрешности. Штамм L. fermentum U21 в серии опытов продлевал ее на 16-24% относительно контрольных групп (Рис. 2).
Пример 4. Определение общей антиоксидантной активности по способности нейтрализовать радикал DPPH.
Была исследована общая антиоксидантная активность лизата штамма L. fermentum U-21 по способности нейтрализовать стабильный радикал DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил):
DPPH* + АО → DPPH-H + АО*,
где АО - антиоксидант, АО* - его окисленная форма. В результате восстановления DPPH антиоксидантом снижается пурпурно-синяя окраска DPPH в метаноле, реакция контролируется по изменению оптической плотности спектрофотометрическим методом.
9
Бактериальную культуру промывали натрий-фосфатным буфером и ресуспендировали в том же буфере, доводили OD600 до 1 (10 КОЕ). Для получения лизата клетки разрушали ультразвуком (Vibra-Cell, Sonic and Materials INC, USA) при 80% амплитуде 5 мин в ледяной бане. Дебрис удаляли центрифигированием 10 тыс g 10 мин. 500 мкл лизата смешивали с равным объемом свежеприготовленного раствора 0,2 mM DPPH (Aldrich) в метаноле, инкубировали 30 мин при комнатной температуре и определяли OD517. Контроль - раствор DPPH с фосфатным буфером вместо бактерий. Антиоксидантную активность рассчитывали по формуле
Антиоксидантная активность (scavenging activity) (%) =
= [1 - (Аобразца/Аконтроля)] × 100
(Antioxidant activity of various oral Lactobacillus strains. Chooruk et al. IIJ Appl Microbiol. 2017. doi: 10.1111/jam.l3482).
Бесклеточные лизаты штамма L. fermentum U-21 подавляли активность радикала в большей степени, чем клетки штамма L. fermentum 279, не проявлявшего антиоксидантных свойств в опытах с люминисцентными биосенсорами и Celegans, и известного пробиотического штамма L. rhamnosus GG в 4-10 раз (Рис. 3).
Пример 5. Штаммоспецифичные праймеры.
Ниже приведена нуклеотидная последовательность уникального для штамма L. fermentum U-21 гена cadD; выделены нуклеотидные последовательности праймеров:
Прямой праймер L. ferm. U-21-F
Обратный праймер L. ferm. U-21-R
Размер ПЦР-фрагмента - 267 пн.
Данная пара праймеров может быть использована для идентификации штамма.
Пример 6. Идентификация генов, кодирующих белки-антиоксиданты. в геноме штамма.
Поиск генов, кодирующих белки с антиоксидантными свойствами, показал, что геном штамма не содержит генов супероксиддисмутазы, каталазы, синтеза глютатиона, а также его метаболизма (глютатион редуктазы и глютатион пероксидазы). Геном содержит 4 гена тиоредоксина (из них 3 определяют белки с каноническим для тиоредоксина активным сайтом WCGDC), гены тиол-пероксидазы, тиоредоксин редуктазы и пероксидероксина. Эти гены составляют тиоредоксиновую систему, являющуюся основной защитой от окислительного стресса. Работа системы осуществляется посредством дисульфидредуктазной активности, регуляции дитиол/дисульфидного баланса. Тиоредоксин поставляет электроны тиол-зависимой пероксидазе, взаимодействующей с реактивными формами кислорода. Окисленная форма тиоредоксина восстанавливается ферментом тиоредоксин редуктазой. Кроме того, L. fermentum имеет еще одну тиол-пероксидазу - пероксидероксин (субъединицу С щелочной гидропероксид редуктазы); его восстановление осуществляет субъединица F щелочной гидропероксид редуктазы (The thioredoxin antioxidant system. Lu J, Holmgren A. // Free Radic Biol Med. 2014. 66:75-87).
В геноме идентифицирован также специфический для штамма оперон, состоящий из генов, кодирующих предполагаемую гем-зависимую пероксидазу, MFS (Major Facilitator Superfamily) транспортер и феррохелатазу (конечный фермент ситеза гема). Этот оперон является крайне редким у L. fermentum и обнаруживается только у 3-х из 36 штаммов этого вида из GenBank. Гены, составляющие оперон, могут участвовать в синтезе гема и гем-зависимых ферментов антиоксидантной защиты бактериальной клетки (Таблица 2).