Нокаут гена плакофиллина-2 при помощи системы crispr/cas9

нокаут гена плакофиллина-2 при помощи системы crispr/cas9

А.А. Худяков 1, Д.А. Костина1, А.А. Костарева1, А.Б. Малашичева12

1 Северо-Западный федеральный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова, Санкт-Петербург, Россия

2 Санкт-Петербургский государственный университет, Санкт-Петербург, Россия

Plakophilin-2 gene knockout using CRISPR/Cas9 system.

A.A. Khudiakov \ D.A. Kostina \ A.A. Kostareva \ A.B. Malashicheva 12

1 Federal V.A. Almazov North West Medical Research Centre, Saint-Petersburg, Russia

2 Staint-Petersburg State University, Saint-Petersburg, Russia

Использование системы CRiSPR/Cas9 открывает широкие перспективы для манипуляций с геномом. Одним из применений этой системы является создание клеточных линий, нокаутных по тому или иному гену. Этот подход позволяет обнаружить неизвестные ранее функции гена и воспроизвести эффект патогенных мутаций. Целью настоящего исследование являлось создание системы для нокаута гена плакофиллина-2 и оценка её пригодности для изучения функционального эффекта нокаута.

Ключевые слова: плакофиллин-2, нокаут, сигнальный путь Wnt, CRiSPR, Cas9, гид-РНК.

CRiSPR/Cas9 technology opens up broad prospects for genome manipulations. Generation of gene knockout cell lines is one of the applications of this system. This approach allows to reveal previously unknown gene functions and to reproduce the effect of pathogenic mutations. The purpose of this study was to generate plakofilin-2 gene knockout system and assess its suitability for the study of the functional effect of this knockout.

Keywords: plakophilin-2, knockout, Wnt signaling, CRiSPR, Cas9, guide RNA.

Введение

Мутации гена плакофиллина-2 (PKP2) являются одной из причин аритмогенной кардиомиопатии — заболевания, характеризующегося замещением миокарда соединительной и жировой тканью, что приводит к нарушению сократительной функции сердца [1]. В основе этого процесса лежит нарушение сигнальных путей, ответственных за дифференцировку и пролиферацию клеток. Одним из этих путей является сигнальный путь Wnt. Ранее было показано, что недостаточность плакофиллина-2 в результате мутации или искусственно вызванного нокдауна гена PKP2 приводит к снижению активности сигнального пути Wnt [2, 3]. Введение же PKP2 дикого типа, напротив, повышает активность этого сигнального пути [4, 5]. В совокупности, эти данные позволяют говорить о том, что уровень PKP2 способен регулировать активность сигнального пути Wnt.

Целью настоящей работы являлось создание и тестирование системы нокаута гена PKP2 с использованием методики CRiSPR/Cas9, получившей широкое распространение в последнее время.

Система CRiSPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) ii типа представляет собой систему распознавания ДНК-мишеней у бактерий и архей [6—8]. Центральным компонентом системы является нуклеаза Cas9, направляемая одноцепочечной РНК. Созданные на основе Cas9 системы геномного редактирования включают Cas9 Streptococcus pyogenes и гид-РНК, распознающие участок ДНК длиной 20 п.о. с расположенным неподалёку PAM-сайтом, в районе которого осуществляется двуцепочечный разрыв ДНК [9]. Двуцепочечные разрывы ДНК репарируются двумя основными механизмами — гомологичной рекомбинацией в присутствии донорной цепи ДНК, содержащей участки, гомологичные повреждённой матрице, и негомологичным соединением концов ДНК, приводящим к образованию точечных мутаций в месте соединения и

выпадению участков ДНК в случае множественных разрывов [10]. Таким образом, открываются широкие возможности для проведения различных манипуляций с геномом, в частности, на основе системы CRiSPR/ Cas9 созданы системы внесения и коррекции мутаций, генного нокаута, активации и ингибирования транскрипции, визуализации отдельных участков ДНК [10—14].

Для тестирования полученной в ходе работы системы нокаута PKP2 использовалась линия клеток HEK 293Т. Для оценки влияния нокаута PKP2 на активность сигнального пути Wnt использовались линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК), направленных к дифференцировке в кардиомиоциты.

Материал и методы

Культивирование линии клеток HEK 293T

Клетки линии HEK 293Т культивировали на среде, содержащей DMEM, 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 50 МЕ/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (все Life Technologies, США).

Получение и дифференцировка иПСК

Подробно процесс получения, характеристики и дифференцировки иПСК описан ранее [5]. иПСК получали путём репрограммирования мультипотентных мезенхимных стромальных клеток жировой ткани, используя Cyto Tune 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Life Technologies, США) согласно рекомендациям производителя. Дифференцировку иПСК осуществляли методом сокультивирования их с клеточной линией END-2, согласно описанной ранее методике [15].

Конструирование векторов и их доставка

Для экспрессии Cas9 и гид-РНК использовали векторы pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) и lentiCRiSPRv2, любезно предоставленные Feng Zhang (плазмиды

e-mail: amalashicheva@gmail.com

Addgene #48138 и #52961 соответственно) [16, 17]. Последовательности гид-РНК подбирали при помощи CRiSPR design tool (http://crispr.mit.edu/). Последовательности олигонуклеотидов указаны в табл. 1. Синтезированные олигонуклеотиды клонировали в векторы по сайтам рестрикции BsmBi, наличие вставки проверяли путём секвенирования участка полученной плазмиды. В качестве контроля использовали соответствующие векторы, не несущие последовательности гид-РНК.

Доставку векторов осуществляли при помощи кальций-фосфатной трансфекции или лентивирус-ной трансдукции. Продукцию лентивирусных частиц осуществляли согласно протоколу, разработанному в лаборатории Д. Троно (http://http://tcf.epfl.ch). Селекцию пуромицином в конечной концентрации 2 мкг/мл осуществляли в течение 5 сут.

Клеточный сортинг

Сортировку клеток проводили на проточном сортирующем цитофлуориметре BD FACS Aria 3 (BD, США) на базе ресурсного центра СПбГУ «Развитие молекулярных и клеточных технологий».

Выделение РНК из клеток и проведение

реакции обратной транскрипции

РНК из клеток выделяли реагентом ExtractRNA (Евроген, Россия) и обрабатывали ДНКазой i (ThermoScientific, США). Реакцию обратной транскрипции проводили при помощи набора MMLV RT kit (Евроген, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя.

Таблица. Последовательности олигонуклеотидов, использовавшихся в работе

Назначение олигонуклеотида Последовательность

Гид-РНК 1 CACCGCCAGACATACTACTCGCTCG

Гид-РНК 1, комплементарный AAACCGAGCGAGTAGTATGTCTGGC

Гид-РНК 2 CACCGCAAGTCGGTCATACCGAAGA

Гид-РНК 2, комплементарный AAACTCTTCGGTATGACCGACTTGC

Полуколичественная и количественная ПЦР, РКР2, прямой GCTGCTTCCGTCCTTCTGTA

Полуколичественная и количественная ПЦР, РКР2, обратный GGAGTGGTAGGCTTTGGCA

Полуколичественная ПЦР, GAPDH, прямой CAAGGTCATCCATGACAACTTTG

Полуколичественная ПЦР, GAPDH, обратный GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG

Количественная ПЦР, AXIN2, прямой AGTGTGAGGTCCACGGAAAC

Количественная ПЦР, AXIN2, обратный CTGGTGCAAAGACATAGCCA

Количественная ПЦР, SOX2, прямой AACCCCAAGATGCACAACTC

Количественная ПЦР, SOX2, обратный GCTTAGCCTCGTCGATGAAC

Количественная ПЦР, 18S, прямой GTAACCCGTTGAACCCCATT

Количественная ПЦР, 18S, обратный CCATCCAATCGGTAGTAGCG

Полуколичественная ПЦР

Полуколичественную ПЦР проводили с использованием Taq-полимеразы (Силекс, Россия) согласно рекомендациям производителя. В качестве рефе-ренсного гена использовали GAPDH.

Количественная ПЦР в режиме реального

времени

Для проведения ПЦР в режиме реального времени использовали смесь qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия) в сочетании с праймерами из базы данных Primer Depot (http://primerdepot.nci.nih.gov/). Для расчета относительной экспрессии (количества) гена использовали AACt метод, в качестве рефе-ренсного гена использовали последовательность, кодирующую 18S РНК. Последовательности прайме-ров приведены в табл. 1.

Электрофорез в полиакриламидном геле

и вестерн блоттинг

Электрофорез в полиакриламидном геле проводили в модификации Лэммли [18]. Далее белки переносили на мембрану и выявляли при помощи первичных антигенспецифичных антител и вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой (BioRad, США).

Оценка активности сигнального пути Wnt

Для оценки активности канонического сигнального пути Wnt использовали лентивирусный вектор на основе плазмиды 7TFC (Addgene 24307) [19] и набор Luciferase Assay System (Promega, США).

Результаты

Для создания системы нокаута гена PKP2 на основе CRiSPR/Cas9 была использована стратегия вырезания первого экзона, а также про-моторной области гена. Такой подход позволяет эффективно заблокировать транскрипцию гена. Последовательность и расположение промотор-ной области гена PKP2 были получены из базы данных эукариотических промоторов (http://epd. vital-it.ch/). Подбор последовательностей гид-РНК осуществлялся при помощи программного обеспечения CRiSPR design tool (http://crispr.mit.edu/), что позволило одновременно провести анализ внецелевой активности гид-РНК. Были подобраны две гид-РНК, комплементарно связывающиеся с участками геномной ДНК ниже по течению по отношению к промотору и выше по течению по отношению к 3' концу первого экзона (рис. 1). Значение скоринг-функции, указывающей на количество неспецифических мишеней гид-РНК, составило 98, неспецифические мишени в кодирующих областях генома отсутствовали.

Для проверки системы была осуществлена транс-фекция клеток линии HEK 293Т полученными векторами. Спустя пять суток экспрессия PKP2 в клетках, трансфицированных Cas9 и двумя гид-РНК, была снижена по сравнению с контролем (рис. 2).

Чтобы усилить эффект генного нокдауна, транс-фицированные клетки были отсортированы по сигналу GFP (рис. 3А). GFP-позитивные клетки демон-

стрировали заметное снижение экспрессии РКР2 на уровне мРНК по сравнению с контролем (рис. 3Б). Также наблюдалось заметное снижение уровня пла-кофиллина-2 в клетках (рис. 3В). Тем не менее, среди GFP-позитивных клеток наблюдалась остаточная экспрессия РКР2, свидетельствуя о том, что часть клеток продолжала экспрессировать РКР2. Для достижения полного нокаута РКР2 был осуществлён клональный рассев GFP-позитивных клеток. Пять из 11 клонов были отобраны для последующего анализа экспрессии РКР2 на уровне мРНК. В результате, был выявлен клон, не экспрессирующий РКР2 на уровне мРНК (рис. 3Г).

Таким образом, было подтверждено эффективное действие двух использовавшихся гид-РНК.

Для доставки Cas9 и гид-РНК в иПСК использовался лентивирусный вектор lentiCRiSPRv2, несущий устойчивость к пуромицину, что позволило отобрать трансдуцированные иПСК по устойчивости к этому антибиотику. После селекции иПСК были дифференцированы в направлении кардиомиоцитов. Анализ экспрессии РКР2 на седьмые сутки диффе-ренцировки не выявил её существенного изменения в дифференцирующихся иПСК, трансдуцированных Cas9 и гид-РНК (рис 4А). Также в ходе диффе-ренцировки иПСК, трансдуцированных Cas9 и гид-РНК, и контролем не было выявлено достоверных различий в активности люциферазного репортера (рис. 4Б) и повышении экспрессии генов AXIN2 и SOX2 (рис. 4В, Г), являющихся генами-мишенями сигнального пути Wnt.

РКР2

->

1 промотор экзон 1 интоон I экзон2I

<х> <х>

Cas9 + Гид-РНК 1 Cas9 + Гид-РНК 2

Рис. 1. Схема расположения двуцепочечных разрывов в гене PKP2

Рис. 2. Экспрессия РКР2 спустя 5 сут. после трансфекции клеток линии НЕК 293Т векторами, несущими Саэ9 и гид-РНК к участкам РКР2 и в контроле

А

Б

Specimen 001 post sort sample!

о 10 10 10 ю

OFP-A

В

1 2

плакофиллин-2 Р-актин

1.5

£ 0.5' О

о

X I-

О

0.0'

Г

РКР2

р = 0.009

Контроль Cas9 + гид РНК

РКР2 GAPDH

Рис. 3.

Усиление нокдауна PKP2 в клетках HEK 293Т путём клеточного сортинга и отбора клонов: А — результат обогащения популяции GFP-позитивных клеток с помощью клеточного сортинга; Б — экспрессия PKP2 на уровне мРНК в GFP-позитивных клетках и в контроле; В — уровень плакофиллина-2 в GFP-позитивных клетках (дорожка 1) и в контроле (дорожка 2); Г — экспрессия PKP2 на уровне мРНК в контроле (дорожка 1) и отдельном клоне HEK 293Т (дорожка 2), дорожка 3 — негативный контроль

А

РКР2

Контроль Cas9 + гид РНК

Б

1ис-активность

л ь

о

вз _ s л

ё 82 «5 Q.

К О) it

? i1

и о

Контроль Cas9 + гид РНК

В

AXIN2

Г

О 5-

m

ц

S

а>

0

1

л

s

IS

о о

X

SOX2

Контроль Cas9 + гид РНК

Контроль Cas9 + гид РНК

Рис 4.

Экспрессия PKP2 и активность сигнального пути Wnt на 7 сут. дифференцировки иПСК, трансдуцированных Cas9 и гид-РНК к участкам PKP2, и в контроле: А — экспрессия PKP2 на уровне мРНК; Б — активность люциферазного репортера; В — экспрессия AXIN2 на уровне мРНК; Г — экспрессия SOX2 на уровне мРНК

Обсуждение

Системы нокаута генов на основе CRiSPR/Cas9 успешно применяются на различных клеточных линиях и модельных животных [10, 20—23]. Подход, при котором имеет место нарушение транскрипции гена, имеет преимущество перед методами воздействия на РНК, поскольку позволяет более точно и в течение длительного периода времени моделировать эффект нарушения гена, вызванный мутацией.

Применение полученной нами системы CRiSPR/ Cas9, направленной на ген PKP2, в режиме нокдауна успешно снижало экспрессию PKP2 в клетках линии HEK 293Т, однако для достижения значительного снижения экспрессии PKP2 требовалось применение клеточного сортинга, а для достижения полного нокаута — клональный рассев предварительно отсортированных клеток с последующим скринингом.

Применение системы на линиях иПСК не приводило к эффекту нокдауна PKP2, что могло являться следствием повреждения лишь одного аллеля PKP2 или низкой эффективности использовавшихся гид-РНК в этих клетках. Возможно, для повышения эффективности системы требуется тестирование большего количества гид-РНК и клональный рассев

ЛИТЕРАТУРА:

1. Gerull B., Heuser A., Wichter Т. et al. Mutations in the desmosomal protein plakophilin-2 are common in arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy. Nat. Genet. 2004; 36: 1162-4.

2. Chen S.N., Gurha P., Lombardi R. et al. The hippo pathway is activated and is a causal mechanism for adipogenesis in arrhythmogenic cardiomyopathy. Circ. Res. 2014; 114: 454-68.

3. Kim C., Wong J., Wen J. et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature 2013; 494: 105-10.

4. Chen X., Bonne S., Hatzfeld M. et al. Protein binding and functional characterization of plakophilin 2. Evidence for its diverse roles in desmosomes and beta-catenin signaling. J. Biol. Chem. 2002; 277: 10512-22.

5. Худяков А.А., Костина Д.А., Костарева А.А. и др. Влияние мутаций в гене плакофиллина-2 на активность канонического сигнального пути Wnt. Цитология 2015; 57: 868-75.

6. Bhaya D., Davison M., Barrangou R. CRISPR-Cas systems in bacteria and archaea: Versatile small RNAs for adaptive defense and regulation. Annu. Rev. Genet. 2011; 45: 273-97.

7. Terns M.P, Terns R.M. CRISPR-based adaptive immune systems. Curr. Opin. Microbiol. 2011; 14: 321-7.

8. Wiedenheft B., Sternberg S.H., Doudna J.A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea. Nature 2012; 482: 331-8.

9. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012; 337: 816-821.

10. Cong L., Ran F.A., Cox D. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013; 339: 819-23.

11. Mali P., Yang L., Esvelt K.M. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 2013; 339: 823-6.

иПСК. Также перпективным является одновременное использование нескольких гид-РНК, комплементарных участкам первого экзона гена, что в сочетании с нуклеазной активностью Cas9 вызывает точечные мутации в первом экзоне и блок транскрипции в результате сдвига рамки считывания.

Несмотря на отсутствие снижения экспрессии PKP2 на 7 день дифференцировки иПСК, трансду-цированных Cas9 и гид-РНК, по сравнению с контролем, наблюдались некоторые изменения активности сигнального пути Wnt. Это указывает на то, что даже небольшие изменения экспрессии PKP2 могут вызывать изменения активности этого сигнального пути.

Таким образом, система генного нокаута на основе CRISPR/Cas9 применима для моделирования эффекта мутаций, приводящих к нарушению экспрессии гена. Ограничениями этой системы является необходимость подбора гид-РНК и обогащения популяции клеток, экспрессирующих Cas9 и гид-РНК. Идентификация оптимального набора гид-РНК для нокаута конкретного гена в сочетании с высокоэффективными методами доставки векторов и последующей селекцией клеток позволит рутинно использовать технологию CRISPR/Cas9 для создания клеточных моделей.

12. Bikard D., Jiang W., Samai P. et al. Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Res. 2013; 41: 7429-37.

13. Cheng A.W., Wang H., Yang H. et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell. Res. 2013; 23: 1163-71.

14. Chen B., Gilbert L.A., Cimini B.A. et al. Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system. Cell 2013; 155: 1479-91.

15. Mummery C., Ward-van Oostwaard D. et al. Differentiation of human embryonic stem cells to cardiomyocytes: role of coculture with visceral endoderm-like cells. Circulation 2003; 107: 2733-40.

16. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 2013; 8: 2281-308.

17. Sanjana N.E., Shalem O., Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat. Met. 2014; 11: 783-4.

18. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227: 680-5.

19. Fuerer C., Nusse R. Lentiviral Vectors to Probe and Manipulate the Wnt Signaling Pathway. PLoS ONE. 2010; 5(2): e9370.

20. Chang N., Sun C., Gao L. et al. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in Zebrafish embryos. Cell. Res. 2013; 23: 465-72.

21. Cho S.W., Kim S., Kim J.M. et al. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat. Biotechnol. 2013; 31: 230-2.

22. Friedland A.E., Tzur Y.B., Esvelt K.M. et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nat. Methods. 2013; 10: 741-3.

23. Li D., Qiu Z., Shao Y. et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nat. Biotechnol. 2013; 31:681-3.

Поступила: 12.03.2016