Гемостимулирующие свойства гранулоцитарного колониестимулирующего фактора

24 БИОТЕРАПИЯ

УДК 616.155.343:612.119

I. V Morozova1, E. M. Treshalina2

HEMOSTIMULATING PROPERTIES OF GRANULOCYTE COLONY STIMULATING FACTOR

1 The Moscow Medical Sechenov Academy 2 N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow

ABSTRACT

The current review describes the basic characteristics of hemopoietic colony stimulating growth factor (G-CSF), and its recombinant preparations. The G-CSF’s hemostimulating properties in vitro and in vivo are discussed in detail. The main properties of G-CSF efficacy are: the increasing of the neutrophil number in peripheral blood due to ejection of cells from spleen and bone marrow, the acceleration of maturation and differentiation of neutrophil precursors, the enhancement of neutrophil functional activity. Based on the ability of G-SCF preparations to stimulate granulocy-topoiesis, to diminish neutropenia period and to reduce the number of infectious complications G-CSM is suggested to be a potential target for therapeutic implication.

Key words: hemopoietic growth factor, G-CSF, hemostimulating properties, granulocytopoiesis, side effects, clinical implication.

И. В. Морозова1, E. М. Трещалина2

ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ГРАНУЛОЦИТАРИОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА

1 Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова

2 ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва

РЕЗЮМЕ

В обзоре представлены основные сведения о биологических свойствах гемопоэтического гранулоцитарного колониестимулирующего фактора роста Г-КСФ и рекомбинантных препаратах, созданных на его основе. Рассмотрены гемостимулирующие свойства Г-КСФ in vitro и in vivo. Перечислены основные показатели эффективности гемостимулирующего действия препарата: увеличение количества нейтрофилов в периферической крови за счет выброса из депо, ускорение созревания и дифференцировки клеток — предшественниц нейтрофилов, усиление функциональной активности зрелых нейтрофилов. Приведены показания к применению в клинической практике для стимуляции гранулоцитопоэза, сокращения длительности нейтропении и снижения частоты инфекционных осложнений.

Ключевые слова: гемопоэтический фактор роста, Г-КСФ, гемостимулирующие свойства, гранулоцитопоэз, побочные эффекты, клиническое применение.

ВВЕДЕНИЕ

Гемопоэз — процесс формирования клеточных элементов крови, происходящий под контролем гемо-поэтических факторов роста (гемоцитокинов или гематогормонов), которые регулируют пролиферацию ранних предшественников, дифференцировку комми-тированных и функциональную активность зрелых клеток крови.

Первые представления о том, что в крови присутствуют факторы, влияющие на кроветворение, относятся к 1906 г., когда P. Carnot и C. Deflandre индуцировали гемопоэз у кроликов, вводя им плазму животных с анемией, вызванной острой кровопотерей. Спустя полвека две группы ученых — D. Pluznik и L. Sachs в США, T. Bradley и D. Metcalf в Австралии — независимо друг от друга разработали полу-

твердую культуральную агаровую систему, в которой кроветворные клетки-предшественницы давали рост колоний в присутствии определенных веществ. Последние получили название колониестимулирующих факторов (КСФ). Дальнейшее их изучение на культуральных моделях ex vivo позволило выделить различные виды КСФ: гранулоцитарный (Г-КСФ), грануло-цитарно-макрофагальный (ГМ-КСФ), макрофагаль-ный (М-КСФ), а также интерлейкин-3 (ИЛ-3) [1]. Все гемоцитокины представляют собой гликопептиды, которые связываются со специфическими рецепторами на плазмолемме клеток крови и действуют в малых концентрациях.

В онкологии наиболее широкое применение нашел Г-КСФ. В организме этот фактор вырабатывается клетками стромы костного мозга, эндотелиоцитами, макрофагами, эпителиальными клетками тимуса. Он ускоряет созревание и дифференцировку предшественников нейтрофилов, выход зрелых нейтрофилов в периферическую кровь из костного мозга, а также усиливает функциональную активность зрелых нейтрофилов. Рецептор Г-КСФ, получивший название CD114, состоит из одной полипептидной цепи, внеклеточная часть которой отвечает за специфическое связывание с лигандом, а внутриклеточная — за формирование и передачу сигналов пролиферации и дифференцировки. После взаимодействия лиганда с рецептором происходит фос-форилирование тирозиновых оснований внутриклеточной части рецептора с помощью тирозинкиназы, что обеспечивает дальнейшее распространение сигнала в клетке [1, 17]. Гемостимулирующее действие фактора иллюстрируют результаты опыта, выполненного с очищенным нативным человеческим Г-КСФ. Мышам подкожно вводили по 2,5 мкг Г-КСФ ежедневно в течение 15 дней. Уже через 2 ч после первой инъекции Г-КСФ число нейтрофилов в периферической крови мышей увеличивалось и к последнему введению достигало 8-кратного уровня. При этом в селезенке наблюдалось увеличение всех типов клеток — предшественниц нейтрофилов: миелобластов, промиелоцитов и метамиелоцитов. Нормализация количества нейтрофилов происходила через 48 ч после окончания курса введения препарата [16].

Препараты Г-КСФ нашли широкое применение в клинике в качестве стимуляторов кроветворения благодаря разработке генно-инженерных технологий. В настоящее время выпускаются рекомбинантные препараты: ленограстим или граноцит (Chugai pharmaceutical Co., Япония; «Рон Пуленк Рорер», Франция) и филграстим или нейпоген (Amgen, США; Hoffman La Roche, Швейцария). Ленограстим — гли-козилированный Г-КСФ является более близким природному фактору благодаря наличию в его структуре углеводного остатка, получен из культуры клеток яичника китайского хомячка. Филграстим — негликози-лированный Г-КСФ, высокоочищенный протеин, состоящий из 175 аминокислот, вырабатывается генно-модифицированным лабораторным штаммом бактерии Escherichia coli.

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТОВ РЕКОМБИНАНТНОГО Г-КСФ

Гемостимулирующие свойства филграстима

В исследованиях in vitro на культуре гемопоэтичес-ких клеток было установлено, что филграстим повышает адгезивные свойства нейтрофилов, усиливая экспрессию адгезивных рецепторов интегринов CD11b и LAM-

1. Важно, что Г-КСФ увеличивает адгезивные свойства нейтрофилов, не влияя на их агрегацию, что способствует адекватному выполнению их функции [14, 17]. В эксперименте с бактериальным пептидом N-формил-мети-онил-лейцил-фенилаланином (N-FMLP) было показано, что Г-КСФ усиливает N-FMLP-индуцированный хемотаксис, фагоцитоз и продукцию активных форм кислорода. Это объясняется тем, что под действием Г-КСФ в цитоплазме нейтрофилов увеличивается синтез белка и содержание ионов кальция, а также повышается активность NADPH-оксидазы [8, 11, 15, 23].

Гемостимулирующие свойства филграстима детально изучены в экспериментах на здоровых животных. Было показано, что препарат быстро дозозависимо увеличивает количество нейтрофилов в периферической крови, укорачивая время их созревания с 4 до 1 сут, но не влияет на время пребывания их в кровотоке [16, 20]. В клетках костного мозга филграстим вызывает увеличение числа митозов, запуская покоящиеся полипотентные стволовые клетки в G^S-фазе клеточного цикла [1].

Гемостимулирующие свойства филграстима изучены на мышах при депрессии кроветворения противоопухолевым цитостатиком циклофосфамидом (ЦФ). Мышам, получившим ЦФ в однократной дозе 100 мг/кг (день 0), вводили филграстим подкожно в течение 5 дней (1—5-й день) в ежедневной дозе 100 мкг/кг. В качестве контрольной группы использованы мыши, получавшие только ЦФ. Показано, что в группе ЦФ количество нейтрофилов было значительно снижено, ослаблен фагоцитоз и уменьшена продукция супероксид-анион-радикала; к норме эти показатели вернулись лишь к 8-му дню опыта. В группе ЦФ+филграстим на 3-й день опыта была усилена функциональная активность нейтрофилов, что свидетельствует о прямом влиянии Г-КСФ на зрелые клетки, а на 4-й день наблюдали увеличение содержания нейтрофилов в периферической крови [22].

В другой серии опытов на мышах с индуцированной ЦФ лейкопенией также продемонстрировано восстановление картины крови после введения филграс-тима, связанное с усилением пролиферации и диффе-ренцировки КОЕ-ГМ и незрелых гранулоцитов. Авторы получили значительное сокращение периода острого снижения количества нейтрофилов после ЦФ при применении филграстима [10].

Изучение кинетики нейтрофилов под влиянием филграстима выполнено на мышах, которым внутривенно вводили 3Н-тимидин. Отмечены укорочение времени митозов и ускорение превращения миелоцитов в метамиелоциты с увеличением количества предшественни-

ков нейтрофилов в 7,6 раза. При этом выход меченых клеток в периферическую кровь ускорился в 2,6 раза. В группе мышей, получивших филграстим, количество вновь образованных нейтрофилов было в 20 раз больше, чем в контрольной группе без препарата [18, 20].

Влияние филграстима на функциональную активность нейтрофилов изучали у здоровых добровольцев, которым подкожно вводили препарат в разовой дозе

0,5 мкг/кг ежедневно в течение 6 дней. Вторая группа не получала филграстим и служила контролем. В течение часа после 1-й инъекции филграстима в периферической крови наблюдалась транзиторная нейтропения, а затем в течение 6-8 ч количество нейтрофилов возрастало в 2-10 раз по сравнению с контролем. В период транзиторной нейтропении оставшиеся в кровотоке нейтрофилы обладали повышенной функциональной активностью (подвижность, хемотаксис, фагоцитоз, генерация супероксид-анион-радикала). Функциональная активность нейтрофилов, появившихся в периферической крови после транзиторной нейтропе-нии, была стабильной [9].

Эффективность филграстима доказана при широком мультицентровом клиническом изучении у больных различными видами нейтропении. Оказалось, что гемостимулирующее действие препарата при цитоток-сической миелосупрессии характеризуется существенным увеличением количества нейтрофилов в периферической крови в 1-е сутки после введения с небольшим повышением содержания моноцитов. При тяжелой хронической нейтропении (врожденной, периодической и злокачественной) после применения нейпогена помимо указанных эффектов наблюдали также небольшое увеличение количества эозинофилов и базофилов [4].

Применение филграстима позволило также значительно снизить частоту проявления, тяжесть и продолжительность нейтропении и фебрильной нейтропении у больных, получающих химиотерапию или миелоаб-лативную терапию с последующей пересадкой костного мозга. Благодаря филграстиму снижается риск развития инфекционных осложнений, а следовательно, уменьшаются потребность в антибиотиках и время пребывания больного в стационаре. Однако, учитывая отсутствие достаточного количества данных о возможности филграстима увеличивать продолжительность жизни при проведении химиотерапии, Американское общество клинических онкологов, опираясь на результаты контролированных клинических исследований, рекомендует использовать его при риске развития фебрильной нейтропении 40 % и более [2-4].

Другим показанием к применению филграстима является активация аутологичных клеток — предшественниц гемопоэза, что заменяет пересадку костного мозга или дополняет ее. Эти клетки предварительно забирают у больного и вводят ему после миелосупрес-сивного лечения для ускорения восстановления кроветворения. Комбинация препаратов Г-КСФ с антибиотиками, в частности с цефодизимом, позволяет увеличить выживаемость больных, получающих высо-кодозную миелосупрессивную химиотерапию [19].

Побочные эффекты филграстима

При лечении препаратами Г-КСФ часто наблюдается боль в костях и мышцах. Реже встречаются расстройства мочеиспускания в виде слабой или умеренной дизурии, иногда — преходящее снижение артериального давления. В некоторых случаях отмечено обратимое дозозависимое повышение лактатдегидро-геназы, щелочной фосфатазы, сывороточной мочевой кислоты и гамма-глутамилтрансферазы. Возможны аллергические реакции.

Наиболее опасным побочным эффектом препаратов Г-КСФ является снижение количества нейтрофи-лов в периферической крови на 50 %, которое наступает в течение первых 2 суток после отмены препарата. Это связано с опустошением селезенки и коллапсом в костном мозге. В эти сутки риск развития инфекции возрастает. Количество нейтрофилов восстанавливается к 5-7-м суткам [4, 8].

Препараты Г-КСФ вводят не ранее чем через 24 ч после цитотоксической химиотерапии, т. к. быстро делящиеся миелоидные клетки высокочувствительны к миелосупрессивной терапии. Кроме того, поскольку выраженность побочных эффектов имеет дозозависимый характер, избегают превышения рекомендованных доз [4, 21].

Пролонгированные препараты рекомбинантного Г-КСФ

Изучение фармакокинетики рекомбинантного Г-КСФ на примере филграстима показало, что препарат быстро выводится из организма, поэтому для достижения клинически значимого результата необходимы многократные инъекции. Для пролонгирования действия одной дозы разработана иммобилизованная на полиэтиленгликоле (ПЭГ) так называемая пэгилиро-ванная форма филграстима (пегфилграстим, 80/01). В иммобилизованном препарате ПЭГ присоединяется ковалентной связью к К-концевому пептиду молекулы, увеличивая ее размер. Это замедляет почечный клиренс, в результате чего время циркуляции в крови пролонгированного препарата в сравнении с непро-лонгированным увеличивается с 3,5—3,8 до 42 ч. После одной инъекции 80/01 высокий уровень нейтрофилов поддерживается в крови в течение 5 дней у мышей и 9 дней у человека. Возможность поддержания оптимальной концентрации в крови при однократном введении 80/01 за цикл химиотерапии снижает риск развития побочных эффектов [5].

Выведение рекомбинантного Г-КСФ из организма обусловлено еще и нейтрофильным клиренсом. В условиях замедления почечного клиренса этот механизм приобретает ведущее значение для 80/01. Продукция нейтрофилов в ответ на введение пэгилированной формы филграстима обеспечивает своеобразный контроль концентрации, обратную связь, позволяющую с определенной скоростью выводить вещество из организма [12].

Гемостимулирующая активность 80/01 и филграс-тима сопоставима, а кинетика нейтрофилов и механизм стимуляции в обоих случаях одинаковы [5, 12].

Как и филграстим, SD/01 связывается с теми же рецепторами и проявляет способность повышать уровень нейтрофилов в периферической крови, мобилизовывать клетки-предшественницы и сокращать период нейтропении, вызванной миелосупрессивной химиотерапией. SD/01, так же как и филграстим, увеличивает синтез ДНК в клетках — предшественницах нейтрофилов, их пролиферативную активность, ускоряет время созревания нейтрофилов и выход их из костного мозга в периферическую кровь. Период полужизни нейтрофилов в периферической крови при применении пегфилграстима так же, как и при применении филграстима, существенно не меняется [5].

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЛГРАСТИМА С ДРУГИМИ МИЕЛОЦИТОКИНАМИ

Филграстим и ленограстим

В опытах in vitro на колониях нейтрофилов было показано, что по сравнению с филграстимом аффинитет связывания со специфическим рецептором у лено-грастима в 3 раза выше. Высказано предположение о том, что это, возможно, определяет более высокую активность ленограстима. Количественное соотношение активности препаратов, выраженной в биологических единицах (БЕ) на 1 мкг вещества, составляет 1,26 в пользу ленограстима. Это означает, что в 1 мкг ленограстима содержится в 1,26 раза больше активного белка. Таким образом, ленограстим почти на 27 % активнее филграстима. Кроме того, филграстим менее стабильный и быстрее разрушается. Показано, что для одинаковой стимуляции роста колоний концентрация ленограстима должна быть в 16 раз меньше, чем для филграстима. Влияние ленограстима на продукцию активных форм кислорода также более выражено [6].

In vivo ленограстим обладает большей активностью, чем филграстим, что было показано в экспериментах на мышах и крысах [13]. Мобилизация клеток-предшест-венниц под влиянием ленограстима в дозе 10 мкг/кг позволяет получать на 27 % больше CD34+-клеток, чем при введении филграстима в той же дозе. Однако при использовании препаратов в эквивалентных по БЕ дозах различий в активности не наблюдается [6].

Филграстим и молграмостим

Молграмостим (рекомбинантный ГМ-КСФ, лейко-макс) оказывает влияние не только на нейтрофилы, но и на макрофаги. Действие молграстима на нейтро-филы сходно с филграстимом. Он так же, как и фил-грастим, увеличивает количество нейтрофилов в крови, усиливает их выход из костного мозга и из депо, фагоцитоз и окислительный метаболизм. В отличие от филграстима, под влиянием которого нейтрофилы выходят как в циркулирующую кровь, так и пополняют пул клеток, занимающих маргинальное положение и способных мигрировать в очаг воспаления, после молграмостима нейтрофилы слабее мигрируют в очаг воспаления [7].

Кроме того, молграмостим влияет на количество Fc-рецепторов для связывания с антителами, усилива-

ет антителозависимую клеточную цитотоксичность, реализуя таким образом ингибирующее действие на опухоль.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значение нейтрофилов в цепи защитных реакций организма огромно. Снижение их содержания в крови резко повышает риск развития инфекции. Поэтому при нейтропении задача первостепенной важности — повысить уровень нейтрофилов в периферической крови. Благодаря филграстиму, пэгфилграстиму, лено-грастиму и молграмостиму, а также использованию этих препаратов в комбинации с антибактериальными средствами можно снизить риск инфекционных осложнений при миелосупрессивной химиотерапии или пересадках костного мозга.

Создание рекомбинантного Г-КСФ позволило широко применять его в клинике, осуществлять мобилизацию и забор клеток — предшественниц нейтрофи-лов, что открыло новый путь лечения нейтропений. Этот метод заменяет пересадку костного мозга или дополняет ее. Применение препаратов рекомбинантного Г-КСФ у больных с тяжелой врожденной, периодической или злокачественной нейтропенией позволяет быстрее достигнуть ремиссии. Открытие Г-КСФ и получение его в рекомбинантной и иммобилизованной формах значительно облегчили борьбу с нейтропенией и сделали ее более целенаправленной и результативной [2, 3].

ЛИТЕРАТУРА

1. Владимирская Е. Б. Биологические основы противоопухолевой терапии. — М., 2001. — С. 33-49.

2. Птушкин В В. Гемопоэтические факторы роста: биологические основы функционирования и клиническое применение // Материалы второй ежегодной Российской онкологической конференции «Современные тенденции развития лекарственной терапии опухолей», 1998.

3. Птушкин В В. Совершенствование методов поддерживающей терапии при проведении цитостатичес-кого лечения // Современная онкология. — 2002. — Т. 4, № 2.

4. Справочник Видаль. — М.: Изд-во «Астро-ФармСервис», 1999.

5. Brian I., Lord Woolford Lorna B., Molineux G. Kinetics of neutrophil production in normal and neutropenic animals during the response to filgrastim (r-metHu G-CSF) or Filgrastim SD/01 (PEG-r-metHu G-CSF) // Clin. Cancer Res. — 2001. — Vol. 7. — P. 2085-2090.

6. Françoise M.-C. Granulocyte colony-stimulating factors: how different are they? // Anti-cancer Drugs. — 2001. — Vol. 12. — P. 185-191.

7. Hattori K., Orita T. et al. Comparative study of the effects of granulocyte colony-stimulating factor and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor on generation and mobilization of neutrophils in cyclophosphamide-treated neutropenic mice // In vivo. — 1996. — Vol. 10, No. 3. — P. 319-327.

8. Humphreys J. M., Rugman F. P., Davies J. M. et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutrophil function in vitro and in vivo following chemotherapy and autologous bone marrow transplantation // J. Clin. Lab. Immunol. — 1991. — Vol. 34, No. 2. — P. 55-61.

9. Itoh Y., Kuratsuji T., Tsunawaki S. et al. In vivo effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on normal neutrophil function and membrane effector molecule expression // Int. J. Hematol. — 1991.

— Vol. 54, No. 6. — P. 463-469.

10. Kabaya K., Kusaka M., Seki M. Effect of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on variations of morphologically identifiable bone marrow cells in myelosuppressed mice // In vivo. — 1994. — Vol.

8, No. 6. — P. 1033-1039.

11. Mansfield P. J., Hinkovska-Galcheva V., Shayman J. A., Boxer L. A. Granulocyte colony-stimulating factor primes NADPH oxidase in neutrophils through translocation of cytochrome b(558) by gelatinase-granule release // J. Lab. Clin. Med. — 2002. — Vol. 140, No. 1.

— P. 9-16.

12. Molineux G. The design and development of peg-filgrastim (PEG-rmetHuG-CSF, Neulasta) // Curr.Pharm.

— 2004. — Vol. 10, No. 11. — P.1235-1244.

13. Nohynek G. J., Plard J. P. et al. Comparison of the potency of glycosylated and nonglycosylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factors in neutropenic and nonneutropenic CD rats // Cancer Chemother. Pharmacol. — 1997. — Vol. 39, No. 3. — P. 259-266.

14. Okada Y., Kawagishi M., Kusaka M. Effect of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on human neutrophil adherence in vitro // Experientia. — 1990. — Vol. 15, No. 10. — P. 1050-1053.

15. Shimono N., Okada K., Takeda D. et al. Granulocyte colony-stimulating factor does not enhance phagocytosis or microbicidal activity of human mature

polymorphonuclear neutrophils in vitro // Clin. Diagn. Lab. Immunol. — 1994. — Vol. 1, No. 15. — P. 556.

16. Tamura M., Hattori K., Nomura H. et al. Induction of neutrophilic granulocytosis in mice by administration of purified human native granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1987. — Vol. 142, No. 2. — P. 454-460.

17. Tanimura M., Kobuchi H., Utsumi et al. Neutrophil priming by granulocyte colony stimulating factor and its modulation by protein kinase inhibitors // Biochem. Pharmacol. — 1992. — Vol. 25, No. 6. — P. 1045-1052.

18. Uchida T., Yamagiwa A. Kinetics of rG-CSF-induced neutrophilia in mice // Exp. Hematol. — 1992. — Vol. 20, No. 2. — P. 152.

19. Wakiyama H., Tsuru S. et al. Therapeutic effect of granulocyte colony-stimulating factor and cephem antibiotics against experimental infections in neutropenic mice induced by cyclophosphamide // Clin. Exp. Immunol. — 1993. — Vol. 92, No. 2. — P. 218-224.

20. Yamagiwa A. Granulocyte kinetics in neutrophilia induced by recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in mice // Fukushima J. Med. Sci. — 1991.

— Vol. 37, No. 1. — P. 1-11.

21. Yasui K., Tsuno T., Miyabayashi M. et al. Effects of high-dose granulocyte colony-stimulating factor on neutrophil functions // Br. J. Haematol. — 1996. — Vol. 92, No. 3. — P. 571-573.

22. Yoshida M. Nippon. In-vivo enhancement of neutrophil function by administration of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (rhG-CSF) in cyclophosphamide (CPA) treated mice // Hinyokika Gakkai Zasshi. — 1992. — Vol. 83, No. 4. — P. 518-527.

23. Yoshino T., Tamura M., Hattori K., Kawamura A. et al. Effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor on neutrophil function in normal rats // Int. J. Hematol. — 1991. — Vol. 54, No. 6. — P. 455-462.