СПОСОБ ХРОМОСОМНОЙ ИНТЕГРАЦИИ И ЗАМЕНЫ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК В Clostridia

1. Способ замены последовательности ДНК-мишени посредством гомологичной рекомбинации в Clostridia, включающий:
трансформацию указанного штамма вектором, содержащим:
ориджин репликации, позволяющий осуществлять его репликацию в Clostridia, и
замещающую кассету, содержащую первый маркерный ген, окруженный двумя последовательностями, гомологичными выбранным участкам около последовательности ДНК-мишени, позволяющими осуществлять рекомбинацию данной кассеты, и
второй маркерный ген,
селекцию штаммов с интегрированной в их геном указанной кассетой, которые экспрессируют первый маркерный ген,
селекцию штаммов с элиминированным указанным вектором, которые не экспрессируют второй маркерный ген.
2. Способ по п.1, где второй маркерный ген представляет собой ген устойчивости к антибиотику.
3. Способ по п.1, где второй маркерный ген представляет собой встречно-селектируемый маркер.
4. Способ по п.3, где встречно-селектируемый маркер представляет собой ген, который восстанавливает активность несущественного отсутствующего или делетированного гена.
5. Способ по п.4, где встречно-селектируемый маркер представляет собой ген upp.
6. Способ по п.1, где вектор содержит третий маркер, который дает возможность проведения негативной селекции штаммов с элиминированным указанным вектором.
7. Способ по п.1, где вектор элиминируется в результате переваривания эндонуклеазами.
8. Способ по п.7, где вектор несет последовательности ДНК, которые распознаются рестрикционными эндонуклеазами и которые вместе с тем отсутствуют в геноме используемого штамма Clostridium.
9. Способ по п.7 или 8, где используемый штамм Clostridium несет в своем геноме по меньшей мере одну эндонуклеазу, специфичную к рестрикционным сайтам, присутствующим в векторе, возможно экспрессируемую под контролем индуцибельного промотора.
10. Способ по п.1, где первый маркерный ген представляет собой ген устойчивости к антибиотику.
11. Способ по п.1, где первый маркерный ген окружен двумя рекомбиназными сайтами-мишенями.
12. Способ по п.11, где первый маркерный ген элиминируется под действием рекомбиназы после того, как произошел акт гомологичной рекомбинации.
13. Способ по любому из пп.11 или 12, где указанная рекомбиназа экспрессируется геном, доставляемым вторым вектором, введенным в этот штамм.
14. Способ по любому из пп.11 или 12, где указанные рекомбиназные сайты-мишени представляют собой FRT (Flippase Recognition Target)-последовательности (распознаваемые флиппазой последовательности-мишени), а указанная рекомбиназа представляет собой рекомбиназу FLP (флиппаза).
15. Способ по п.1, где указанные последовательности, гомологичные участкам около последовательности ДНК-мишени, содержат мутации, затрагивающие включительно до 10% пар оснований, используемых для рекомбинационного события.
16. Способ по п.1, где Clostridia, которые должны быть трансформированы, имеют делеции генов, кодирующих рестрикционные эндонуклеазы.
17. Способ по п.1, где Clostridia, которые должны быть трансформированы, имеют делеции генов, кодирующих ДНКазу.
18. Способ по п.1, где Clostridia, которые должны быть трансформированы, имеют делеции гена upp.
19. Способ по п.1, где штаммы Clostridium выбраны среди Clostridium acetobutylicum, Clostridium bejeirinckii, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, Clostridium butylicum, Clostridium butyricum, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium sporogenes, Clostridium thermocellum, Clostridium saccharolyticum (теперь Thermoanaerobacter saccharolyticum), Clostridium thermosulfurogenes (теперь Thermoanaerobacter thermosulfurigenes), Clostridium thermohydrosulfuricum (теперь Thermoanaerobacter ethanolicus).
20. Способ по п.19, где штаммом Clostridium является Clostridium acetobutylicum.