Способ инактивации культурального ротавируса человека
Method of human culture rotavirus inactivation

Изобретение относится к медицинской вирусологии и биотехнологии и касается способа инактивации культурального ротавируса человека группы А для использования при получении диагностических и вакцинных препаратов.
Ротавирусный гастроэнтерит относится к острым инфекционным заболеваниям, широко распространённым во всех странах мира, в том числе в Российской Федерации и вызывает более половины всех кишечных расстройств у детей первых двух лет жизни, поэтому разработка вакцин против ротавирусной инфекции является приоритетной.
Известны живые ротавирусные вакцины, но они сохраняют некоторый уровень остаточной патогенности, хотя и очень низкий, и у детей, особенно с дефектной иммунной системой, они могут вызывать тяжелые формы заболевания. Серьезной проблемой живых вакцин может быть также их биологическая нестабильность при хранении.
Трудности, возникающие при получении и использовании живых вакцин, удается преодолевать в случае использования инактивированных (убитых) ротавирусных вакцин. Риск заражения при вакцинации инактивированной вакциной практически отсутствует. Инактивированные вакцины отвечают требованиям инфекционной безопасности, отсутствия поствакцинальных последствий обеспечивают стабильность иммуногенного начала, сохранение полноценности антигенных белков и химической чистоты вакцинного препарата. Инактивация при этом должна быть направлена на вирусный геном и, по возможности, не затрагивать белковый каркас вирусной частицы.
При разработке инактивированной ротавирусной вакцины большое значение имеет способ инактивации ротавируса, который должен обеспечить необратимое повреждение его репликативного механизма при полном сохранении исходной антигенной структуры. Особенно важен подбор способа инактивации ротавируса человека, трудно поддающегося культивированию и более чувствительного к разрушению.
Существуют способы инактивации вирусного антигена химические и физические.
При химической инактивации вирусов используют разные химические препараты, в том числе формалин (RU 2078816), β-пропиолактон (RU 2537183), димер этиленимина (SU 594771) и другие. Однако надежное подавление инфекционности нередко сопровождается существенным снижением других видов биологической активности, в том числе иммуногенности. В ряде случаев требуется нейтрализация инактивирующих агентов. Кроме того, все инактивирующие агенты, в той или иной степени, вызывают изменения как в нуклеиновой кислоте, так и в белковой оболочке (Сергеев В.А., Сергеев Е.А., Непоклонов В.А., Алипер Т.И. Вирусы и вирусные вакцины. М.: Библионика, 2007. – С.206-216, http://bookre.org/reader?file=1483804&pg=207).
К физическим способам инактивации вирусных антигенов относят воздействие повышенной температурой (прогревание) (Земсков М.В., Соколов М.И., Земсков В.М. Основы общей микробиологии, вирусологии и иммунологии.- М., Колос.- 1972.- С. 117), гамма-лучами (Сергеев В.А., Сергеев Е.А., Непоклонов В.А., Алипер Т.И. Вирусы и вирусные вакцины. М.: Библионика, 2007. – С.216-217,  http://bookre.org/reader?file=1483804&pg=216).
Тепловая обработка и воздействие инфракрасными лучами на вируссодержащую жидкость не всегда приводят к полной инактивации вирусных патогенов, при этом также происходит частичная инактивация иммуногенных белков.
Большой проникающей способностью обладают гамма-лучи. Инфекционность вирусов при воздействии гамма-лучами теряется быстрее, чем антигенность за счет различных повреждений нуклеиновых кислот, но при этом все-таки сохраняется возможность повреждения белковой оболочки (Сергеев В.А., Сергеев Е.А., Непоклонов В.А., Алипер Т.И. Вирусы и вирусные вакцины. 2007. – С.216, http://bookre.org/reader?file=1483804&pg=216).
К физическим способам инактивации вирусных антигенов относится также воздействие ультрафиолетовыми лучами (Сергеев В.А., Сергеев Е.А., Непоклонов В.А., Алипер Т.И. Вирусы и вирусные вакцины. М.: Библионика, 2007. – С.217, http://bookre.org/reader?file=1483804&pg=217.
Изучено действие ультрафиолетового облучения на инфекционность ротавируса обезьяны SA11 9 (Смирнов Ю.А. Действие ультрафиолетового облучения на РНК-содержащие вирусы. Автореф. дисс. на соиск. уч. степени д.м.н. – Москва, 1993. – С. 4, 40 http://earthpapers.net/preview/424125/a#?page=1). Показано, что коротковолновое ультрафиолетовое облучение (УФ) оказывает необратимое повреждающее воздействие на геномный аппарат и наиболее мягкое воздействие на белки капсида ротавируса обезьяны SA11 без изменения первичной и вторичной структуры белка.
Ротавирус человека более чувствителен к разрушительному воздействию, нежели обезьяний. Для его инактивации необходим более мягкий способ инактивации, который должен обеспечить необратимое повреждение его репликативного механизма при полном сохранении исходной антигенной структуры.
Целью предлагаемого изобретения является способ инактивации культурального ротавируса человека, обеспечивающий 100% инактивацию инфекционных свойств ротавируса, не изменяющий белковую структуру и сохраняющий его иммуногенные свойства.
Поставленной цели достигают воздействием ультрафиолетового излучения определенной длины волны и экспозиции на ротавирус человека группы А с проведением предварительного высокоскоростного центрифугирования ротавирусной суспензии для удаления компонентов клеточного детрита и обеспечения эффективности инактивации вирусной РНК.
Суспензию ротавируса человека группы А получают путем последовательных пассажей на культуре перевиваемых клеток СПЭВ (культура клеток почки эмбриона свиньи) по общепринятой методике (Вирусология. Методы /под ред. Б.Мейхи.- М., Мир; 1988.- С.207). Монослой клеток СПЭВ выращивают на среде 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (КРС), отмывают 3-х кратно раствором Хенкса. Культуральный ротавирус человека группы А в отдельном флаконе обрабатывают раствором трипсина (20 мкг/мл). На отмытый клеточный монослой в течение 10 минут наслаивают активированный трипсином ротавирус человека. Добавляют поддерживающую среду во флаконы до первоначального объёма и выдерживают при 37ºС в течение 10 сут. Накопление вирусов в культуре клеток оценивают по цитопатогенному действию (ЦПД) – количеству разрушенных клеток монослоя к общему первоначальному количеству клеток, которое в процентном выражении должно быть равно 100% через 24-36 час от начала заражения. Проводят трехкратное замораживание с последующим оттаиванием ротавирусной суспензии и центрифугируют при 5000 g в течение 30 мин.
Проводят контроль полученной суспензии электронно-микроскопическим методом для подтверждения типичной морфологии ротавирусных частиц и прямым подсчетом частиц в 1 мл культуральной жидкости.
В электронно-микроскопических препаратах видны икосаэдрические частицы размером 60-75 нм, отдельные и в виде скоплений, с уникальной для ротавируса структурой: внешний капсид в виде тонкой пленки, внутренний – с рисунком, похожим на спицы колеса и сердцевиной 30-40 нм. Капсомеры, формирующие внутренний капсид, образуют четкую структуру из пента- и гексомеров.
8
9
При прямом подсчете ротавирусных вирионов в препарате в пересчете в 1 мл количество вирионов составляет 10- 10 частиц.
Ротавирусная суспензия, полученная по вышеуказанной методике, содержит остаточные компоненты клеточного детрита, что затрудняет проведение полноценной инактивации ротавирусов.
Для очистки от клеточного детрита и посторонних примесей ротавирусную суспензию дополнительно подвергают высокоскоростному центрифугированию при 40000 g в течение 5 мин. Для дальнейшей работы используют надосадочную жидкость, содержащую вирус.
Вируссодержащую жидкость помещают в кювету из кварцевого стекла размером 20 мм × 200 мм. Кювету последовательно размещают на расстояниях от 1 м до 0,01 м от поверхности лампы бактерицидного облучателя ОБН-75 УХЛ4, генерирующей длину волны 253,7 нм.
2
2
Вирусосодержащие пробы, числом 28 проб, с культуральным ротовирусом человека, подвергали действию УФС-излучения разными дозами от 0,04 Дж/м до 355 Дж/м. Конечную дозу, полученную каждой пробой с культуральным ротавирусом, рассчитывали по формуле:
H = E * КПД
* К
* К
* S
* t
ист
.
бак
.
погл
.
о
.
п
.
, где
H – доза облучения за время t на единицу площади;
2
E – мощность источника излучения Вт/м,
ист.
КПД  – КПД источника излучения,
бак.
К  – коэффициент бактерицидного потока,
погл.
К  – коэффициент поглощения лучей материалом кюветы,
о.п.
S  – площадь облучаемой поверхности,
t  – экспозиция действия,
2
при этом Е (мощность источника излучения Вт/м) при изменении расстояния от источника излучения до облучаемой пробы изменяется согласно Закону обратных квадратов (таблица 1).
Действие УФ облучения на ротавирус человека проверяют на клетках СПЭВ, используя универсальное биологическое свойство вирусов, т.н. «культуральное» – вызывать ЦПД на чувствительных к нему перевиваемых клетках млекопитающих. Инактивированный вирус такое свойство теряет в результате повреждения генетического аппарата. Монослой перевиваемых клеток СПЭВ заражают облученной вируссодержащей жидкостью и культивируют по вышеуказанной методике. Параллельно ставят контроль 1 – заражают клетки СПЭВ культуральным ротавирусом по той же методике; контроль 2 – культура клеток СПЭВ в поддерживающей среде, предварительно трижды отмытая раствором Хенкса и выращивают при таких же условиях.
По способности или отсутствию способности ротавируса вызывать ЦПД оценивают полноту инактивации, выражаемую в процентах площади разрушенного монослоя по отношению к первоначальному монослою до заражения. Срок наблюдения – 10 дней. При заражении инактивированным вирусом нарушения монослоя не происходит, клетки продолжают делиться до образования плотного монослоя. Отсутствие ЦПД (0% разрушенных клеток монослоя от общего количества клеток) в течение срока наблюдения 36 часов от начала заражения и последующем наблюдении за культурой клеток в течение 10 суток является подтверждением полноты инактивации ротавируса и утраты им репродуктивных свойств в культуре клеток. Динамика изменения культуральных свойств облученного ротавируса представлена в таблице №1. Во избежание загроможденности таблицы в табличный материал не включены данные по промежуточным показателям экспозиции облучения (3 мин, 7 мин) внутри каждой группы расстояний, т.к. эти данные укладываются в общую логику событий.
Таблица 1.
Зависимость культуральных свойств ротавируса в пробах от полученных доз, в зависимости от изменяемых параметров облучения (расстояния до источника излучения и времени обработки).
Расстояние от источника УФ до кюветы с вирусом, м
1
0,5
0,25
0,125
0,06
0,03
0,015
0,01
Экспозиция действия УФ, мин
5
10
5
10
5
10
5
10
5
10
5
10
5
10
5
10
Полученная доза, Дж/м<sup>2</sup>
0,03
0,1
0,17
0,35
0,7
1,4
2,8
5,6
11,1
22,4
44,5
89
178
355
712
1423
Величина ЦПД, % площади разрушенного монослоя
100
100
100
100
80
60
40
30
15
10
3
1
0
0
0
0
2
Установлено, что воздействие УФ излучения длиной волны 253,7 нм на ротавирус при получении дозы 178 Дж/м (обеспечиваемой соответствующими этой дозе величинами времени и расстояния) необратимо лишает ротавирус человека способности к размножению на культуре перевиваемых клеток и к разрушению клеточного монослоя клеток СПЭВ.
2
Минимальная повреждающая биологическая доза при изучении культуральных свойств 178 Дж/м рассчитывается по формуле (см. выше).
2
Данная минимальная повреждающая биологическая доза физического фактора УФС излучения также может быть достигнута изменениями параметров: расстояние до источника УФ, время экспозиции и должна составлять не менее 178 Дж/м (таблица 2).
Таблица 2.
2
Культуральные свойства ротавируса, обработанного дозой УФС178 Дж/м, полученной разными способами.
Расстояние от источника УФ до кюветы с вирусом, м
0,06
0,03
0,015
Экспозиция действия УФ, мин
79,4
20
5
Полученная доза, Дж/м<sup>2</sup>
178
178
178
Величина ЦПД, % площади разрушенного монослоя
0
0
0
2
С целью подтверждения стойкого нарушения и отсутствия реверсии патогенных свойств по отношению к культуре клеток инактивированного ротавируса проводят три последовательных заражения клеток СПЭВ по вышеуказанной методике инактивированным вирусом и культуральным (контроль 1) с контролем культуры клеток в поддерживающей среде, предварительно трижды отмытой раствором Хенкса (контроль 2) при одинаковых условиях выращивания. Результаты контроля отсутствия проявлений инфекционности инактивированных ротавирусов человека по отношению к культуре клеток приведены в таблице 3. Отсутствие реверсии инфекционных свойств продемонстрировано на примере пробы ротавируса, получившей минимальную повреждающую биологическую дозу 178 Дж/м.
Таблица 3.
Цитопатогенное действие на культуру клеток СПЭВ, зараженную инактивированным и культуральным ротавирусом
Последовательныезаражения ротавируса
Цитопатогенное действие на культуру клеток СПЭВ(в %)
инактивированного УФ ротавируса
культурального ротавируса(<i>контроль 1</i>)
Культура клеток СПЭВ в поддерживающей среде(<i>контроль 2</i>)
1 заражение
0
100
0
2 заражение
0
100
0
3 заражение
0
100
0
В последовательных (1,2,3) заражениях культуры клеток инактивированным ротавирусом отсутствуют признаки повреждения монослоя клеток. Клетки СПЭВ после заражения инактивированным ротавирусом продолжают делиться до образования плотного монослоя в течение всего срока наблюдения (10 дней), так же, как и в контроле 2 (незараженная культура клеток), что свидетельствует о полной необратимой инактивации вирусных частиц.
2
Таким образом, инактивированный дозой 178 Дж/м УФ-излучения ротавирус не проявляет инфекционных свойств на культуре клеток СПЭВ в течение нескольких заражений (не реплицируется, не разрушает клетку, не изменяет структуру монослоя клеток), что свидетельствует о стойкой необратимой утрате ротавирусом репродуктивной способности.
Способность инактивированного УФ-излучением штамма ротавируса человека образовывать в организме млекопитающих нейтрализующие антитела проверяли в эксперименте на белых лабораторных мышах (9 голов) с 5-кратной иммунизацией инактивированным вирусом в дозе 0,2 мл, чередуя внутримышечное заражение и пероральное, с последующим забором крови у иммунизированных животных. В контрольной группе (5 голов) иммунизацию в таком же режиме проводили поддерживающей средой 199 без сыворотки. Уровень антител к ротавирусу человека определяли следующим образом:
- в реакции непрямой гемагглютинации – РНГА – эритроцитарным диагностикумом определяли рабочую дозу антигена в АЕ (агглютинирующих единицах);
- в реакции торможения непрямой гемагглютинации – РТНГА –установленной рабочей дозой определяли титр антител сывороток иммунизированных животных (Иммунологическая диагностика вирусных инфекций /под ред. Т.В. Перадзе, П. Халонена. – М.: Медицина, 1985.- С. 108; Эпиднадзор за ротавирусными заболеваниями. Методические рекомендации. Утв. Гокомсанэпиднадзором России 28.11.1994).
Для уточнения количественной характеристики гуморального звена иммунного ответа организма на введение вируса, иммунизацию лабораторных животных проводили тремя антигенными препаратами:
2
ИКР 1 – культуральный ротавирус, обработанный минимальной повреждающей биологической дозой УФ излучения 178 Дж/м, 5 мин;
2
ИКР 2 – инактивированный культуральный ротавирус, обработанный дозой 355 Дж/м, 10 мин;
2
ИКР 3 – инактивированный культуральный ротавирус, обработанный дозой 712 Дж/м, 5 мин.
Каждой группе животных проводили 5-кратную иммунизацию дозой 0,2 мл соответствующего антигена, чередуя внутримышечное и пероральное введение с последующим забором крови. Контрольная группа 1 животных иммунизировалась в таком же режиме неинактивированным культуральным ротавирусом. Контрольная группа 2 иммунизировалась поддерживающей средой 199 без сыворотки.
Результаты иммунизации представлены в таблице 4.
Таблица 4.
Средние титры противоротавирусных антител сывороток лабораторных животных, иммунизированных инактивированным ротавирусом, инактивированным разными дозами УФ излучения и неинактивированным культуральным ротавирусом.
Титры антител к ротавирусу человека группы Ау иммунизированных животных
Кратность введения
1-кратное
2-кратное
3-кратное
4-кратное
5-кратное
Группа, иммунизированная ИКР-1
1/20-1/40
1/80
1/80-1/160
1/160-1/320
1/320
Группа, иммунизированная ИКР-2
1/10
1/10
1/20
1/20
1/20
Группа, иммунизированная ИКР-3
1/10
1/10
1/10
1/20
1/10
Контрольная группа 1
1/40
1/80
1/80-1/160
1/320
1/320-1/640
Контрольная группа 2
0
0
0
0
0
2
Установлено, что ротавирус, обработанный УФ изучением с минимальной повреждающей биологической дозой 178 Дж/м при иммунизации лабораторных животных способен формировать в организме нейтрализующие противоротавирусные антитела на уровне, приближающимся к таковым при иммунизации неинактивированным культуральным ротавирусом.
2
2
Установлено, что иммунизация лабораторных животных культуральным ротавирусом, обработанным высокими дозами УФ излучения (355 Дж/м - 712 Дж/м) вызывают ненапряжённый и нестойкий иммунный ответ по сравнению с иммунным ответом на ротавирус с обработкой минимальной дозой, что связано по всей видимости с глубокой деструкцией вирусной частицы, и возможным образованием токсических эндогенных белков.
2
Установлено, что доза излучения УФС лучей 178 Дж/м является дозой инактивации культурального ротавируса группы А, в результате которой происходит утрата инфекционных свойств ротавируса в отношении чувствительной к нему культуре клеток с сохранением антигенных и иммуногенных свойств.
Морфологию, геномную идентичность инактивированного ротавируса человека проверяют методом электрофореза РНК вируса и электронной микроскопией.
Электрофорез РНК. Электрофорез РНК штаммов ротавируса проводят в 8 % разделяющем полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ) в системе Лемли в течение 10 час, сила тока 11 мА, с последующим окрашиванием 0.2 % раствором азотнокислого серебра.
Электронная микроскопия. Электронную микроскопию проводят методом негативного контрастирования, используя 0,5 % уранилацетат. Сетки с препаратом просматривают при инструментальном увеличении 85000 раз.
Перечень фигур с краткими пояснениями
Фиг. 1. Электрофореграмма РНК ротавируса человека группы А до УФ облучения (А) и после (Б). Представлен результат электрофореза РНК ротавируса человека группы А в полиакриламидном геле (ЭФ в ПААГ). У инактивированного ротавируса (Б) по сравнению с культуральным (А) не изменена молекулярная масса фрагментов РНК, скорость движения фрагментов и не нарушен характер распределения 11 фрагментов РНК ротавируса группы А: 4-2-3-2 в пределах штаммовой вариабельности.
Фиг. 2. Ротавирус человека группы А до УФ облучения (А) и после (Б). Электронная микроскопия. Негативное контрастирование. Увеличение в 430000 раз. Морфология вирионов инактивированного УФ облучением штамма ротавируса (Б) соответствует морфологии вирионов ротавируса до облучения (А), относящихся к роду Rotavirus семейства Reoviridae (тонкий внешний капсид, внутренний капсид в виде колеса, сердцевина 30-40 нм, капсомеры уложены в виде гексомеров).
Предлагаемым способом инактивированы 3 адаптированных к росту на культуре клеток штамма ротавируса человека группы А, депонированных в Государственной коллекции вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России (номера депонентов ГКВ №№ 2727, 2728, 2729).