СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭШЕРИХИОЗНОГО АНАТОКСИНА
METHOD FOR PRODUCING COLIBACILLOSIS ANATOXIN

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для создания вакцинных препаратов против колибактериоза животных.
Важным звеном в системе мероприятий по профилактике колибактериоза, возбудителем которого является патогенная Escherichia coli, служит иммунизация животных специфическими вакцинами. При этом установлено, что наиболее эффективными являются те вакцины, которые в своем составе содержат инактивированные экзотоксины возбудителя (Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных / М.К.Пирожков // Дисс. док. вет. наук. - Москва, 2002. - 298 с.). В настоящее время все известные вакцины включают только два вида токсинов патогенных эшерихий: термолабильный (LT) и термостабильный (ST), хотя нами установлено, что часто (в 21,5% случаев) в развитии патологического процесса у молодняка животных играет шигаподобный (STX) токсин (Терехов В.И. и др. Антигенный состав и патогенные свойства штаммов E.coli, изолированных от телят и поросят в Краснодарском крае // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные, 2008, - №4. - С.6-8). Поэтому включение в состав специфического препарата для профилактики колибактериоза данного вида токсина также необходимо.
Известна вакцина Коли-Вак против эшерихиоза животных (патент РФ на изобретение №2043771, 1995 г.). Вакцина включает различные антигены эшерихий: соматические - 078, 0141; белковые адгезивные - К88, К99, 987Р, F41; капсульные полисахаридные - К80, К87, ТЛ, ТС-анатоксины. Авторы считают, что компоненты вакцины обеспечивают в крови иммунизированных животных синтез специфических антител, ингибирующих основные процессы развития колиинфекции - колонизацию возбудителя в кишечнике животных и нейтрализацию эндо- и энтеротоксинов. Однако в составе данной вакцины отсутствует шигаподобный анатоксин и технология производства очень сложна. Необходимо выращивать отдельные штаммы эшерихий, выделять из них нужные компоненты, обрабатывать их, затем смешивать в определенном соотношении.
Известен способ получения вакцины против эшерихиоза телят (патент РФ на изобретение №2070819, 1996). Данный способ предусматривает культивирование токсигенных штаммов Е. coli на среде Хоттингера в течение 5-7 дней, микробную массу отделяют от токсина на фильтрах со стерилизующими пластинами, далее токсин инактивируют в фильтрате формалином в 0,3-0,4%-ной концентрации при 37°С в течение 10-12 дней, затем полученный анатоксин осаждают 10%-ным раствором алюмокалиевых квасцов из расчета 1% на весь объем, после оттаивания в течение 2-3 дней надосадочную жидкость удаляют, полученный комплексный анатоксин смешивают в равных пропорциях с антигеном, полученным из штаммов эшерихии после выращивания суточных бульонных культур при 37°С в течение двух суток и смыва микробной массы физраствором, содержащим 0,3-0,4% формалина с доведением до концентрации 50-60 млрд. микробных тел в 1 мл добавлением к смыву перекиси водорода до содержания ее до 0,15-0,25%, причем смесь анатоксина и антигена разбавляют стерильной дистиллированной водой до концентрации 5 млрд. микробных тел.
При данном способе получения вакцины сырье получают путем культивирования токсигенных штаммов эшерихий на среде Хоттингера в течение 5-7 дней. Однако по данным Пирожкова (Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных / М.К.Пирожков // Дисс. док. вет. наук - Москва, 2002. - 298 с.) в бульоне Хоттингера достаточно высокий уровень свободных аминокислот, что препятствует синтезу факторов адгезии и токсинов. Использование алюмокалиевых квасцов, перекиси водорода в вакцине может вызывать у привитых животных поствакцинальные осложнения. Многочисленные технологические приемы, используемые при получении вакцины, усложняют технологию изготовления и стоимость конечной продукции.
Известен способ получения колибактериозного анатоксина (патент РФ на изобретение №2270857, 2006), который предусматривает выращивание кишечной палочки в течение 24 ч на синтетической питательной среде с использованием лимонной кислоты, хлористого натрия, сернокислого магния, фосфорнокислого калия двухзамещенного, сернокислого железа, аспарагина, глюкозы и глицерина. В полученную биомассу добавляют 0,6%-ный формалин для детоксикации токсинов кишечной палочки и отделяют ее фильтрацией. После чего проводят сорбцию инактивированного колибактериозного анатоксина на геле гидрата окиси алюминия.
Известен способ получения эшерихиозного анатоксина (патент РФ на изобретение №2213575, 2003 г., прототип), заключающийся в выдерживании односуточных мясопептонных бульонных культур E.coli серотипов 0141:К88ас; 0138:К88ас; 0139:К88ас в присутствии 0,4% формалина при температуре 37-38°С в течение 25 суток и пропускании через фильтр Сальникова.
Однако авторы не сообщают какие именно токсины или токсин продуцировали отобранные ими эпизоотические штаммы Escherichia coli, а следовательно, применение данного препарата ограничено каким-либо одним хозяйством.
Техническим результатом изобретения является повышение эффективности специфической профилактики в отношении основных факторов патогенности Escherichia coli - термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов и расширение применения специфического препарата.
Поставленная задача достигается тем, что способ получения эшерихиозного анатоксина предусматривает культивирование эпизоотических штаммов Escherichia coli на питательном бульоне, инактивацию культур путем добавления формалина до концентрации не более 0,4%, стерилизующее фильтрование, фасовку и укупоривание. При этом ключевое значение имеет то, что отбирают штаммы Escherichia coli, обладающие генами термолабильного, термостабильного и шигатодобного токсинов. Каждый штамм раздельно культивируют при температуре 37°С в течение 6-7 дней с ежедневным двукратным перемешиванием, затем осуществляют инактивацию культур формалином при температуре 37°С в течение 14 суток с ежедневным двукратным перемешиванием, после чего отбирают и смешивают культуры в равных соотношениях, отделяют бактериальную массу с помощью стерилизующей фильтрации и получают комплексный препарат, содержащий 3 вида токсинов.
Новизна заявляемого предложения состоит в том, что в качестве антигена используют инактивированные формалином термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины, полученные в процессе культивирования токсигенных Escherichia coli.
Способ обеспечивает получение безвредной, высокоиммуногенной и более специфичной вакцины для защиты животных от колибактериоза.
В патентной и научно-технической литературе не обнаружены аналогичные заявляемой совокупности признаков, позволяющие получить технический результат, который ранее не достигался известными средствами, что позволяет судить об изобретательском уровне и новизне заявляемого предложения.
Пример конкретного осуществления способа получения эшерихиозного анатоксина.
Для получения эшерихиозного анатоксина первоначально среди эпизоотических штаммов Escherichia coli провели отбор тех из них, которые обладают генами термолабильного, термостабильного и шигаподобного токсинов. Для этого использовали тест-системы «АмплиСенс E.coli-tox» (Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии МЗ РФ, г.Москва). Подтверждение токсинообразования на искусственной питательной среде осуществляли с помощью биотеста на инфузориях-стилонихиях (пат. РФ 2262529, 2005). При наличии в культуральной среде экзотоксинов количество погибших инфузорий должно быть не менее 70-80%, в то время как количество погибших инфузорий в контрольной пробе, не содержащей токсин, не должно превышать 5%.
Отобранные штаммы по отдельности засевали в пробирки с 10 мл питательного бульона для накопления токсинов кишечной палочки, в состав которой входят кислотный гидролизат крови (9-11%), аутолизат пекарских дрожжей (9-11%), пептон (0,9-1,1%), нария хлорид (0,4-0,6%), двузамещенный фосфорнокислый натрий (0,05-0,15%) и калия хлорид (0,01-0,03%) (пат. РФ №2342425, 2008), после чего их поместили в термостат и культивировали при 37°С в течение 6-8 ч до появления легкой мути, свидетельствующей о росте микроорганизмов. Затем полученные культуры переносили в колбы с 200-300 мл аналогичного питательного бульона и инкубировали при 37°С в течение:  продуцирующие термолабильный и термостабильный - 6 суток, а продуцирующие шигаподобный токсин - 7 суток. Ежедневно 2 раза в сутки колбы встряхивали. Перед окончанием инкубирования из каждой колбы отобрали по 10 мл культуральной жидкости, центрифугировали при 10 тыс.об/мин в течение 30 мин и определяли методом биотестирования на инфузориях наличия токсинов.
При наличии токсинов в оставшиеся культуры добавили формалин до концентрации 0,3-0,4%. Инактивацию культур проводили в течение 14 суток при температуре 37°С с ежедневным двукратным перемешиванием. После завершения инактивации равные объемы культур объединяли, получив, таким образом, комплексный препарат, содержащий вида 3 антигенов. С помощью стерилизующей фильтрации отделили микробную массу от среды культивирования. Готовый препарат в асептических условиях расфасовывали в стерильные флаконы и укупоривали. Полученный эшерихиозный анатоксин проверяли на стерильность, безвредность и протективную активность.
При контрольных высевах анатоксина на МПА, МПБ, среду Китт-Тароцци, Сабуро, Эндо рост бактериальной и грибной флоры отсутствовал, что свидетельствовало о стерильности препарата.
При внутрибрюшинном введении анатоксина в дозе 0,3 мл белым мышам массой 20-22 г, угнетения и гибели их в течение 10 дней не отмечали, что является показателем безвредности препарата.
50
Испытание протективных свойств эшерихиозного анатоксина провели на белых мышах массой 20-22 г. Для этого животным анатоксин ввели подкожно двукратно с интервалом в 7 дней в дозе 0,1+0,1 мл. Заражение подопытных мышей провели спустя 7 дней после последнего введения анатоксина. Для заражения использовали фильтрат бульонных культур токсигенных E.coli, продуцирующих термолабильный, термостабильный и шигаподобный токсины в дозе 2 LD. В качестве контроля использовали интактных (невакцинированных) мышей и мышей, дважды иммунизированных вакциной Коли-Вак.
Результаты испытания протективных свойств эшерихиозного анатоксина отражены в таблице.
Таблица
Эффективность эшерихиозного анатоксина при экспериментальном заражении белых мышей
Группа
Доза, мл
Количеств животных
Заражающая доза, мл
Результаты
пало
выжило
Опытная, иммунизировалась эшерихиозным анатоксином
0,1+0,1
10
0,05
0
10
Контрольная, иммунизировалась вакциной Коли-Вак
0,1+0,1
10
0,05
4
6
Контрольная, не иммунизовалась
-
10
0,05
10
0
Из данных таблицы видно, что после иммунизации животных препаратом, полученным по заявляемому способу, у них в 100% случаев формируется специфическая невосприимчивость к патогенному действию токсинов кишечной палочки, в то время как после иммунизации мышей вакциной Коли-Вак выжило только 60% животных, а все не иммунизированные животные погибли. Следовательно, эшерихиозный анатоксин обладает выраженным защитным действием в отношении токсинов кишечной палочки и может использоваться как специфический биопрепарат для профилактики колибактериоза.