УСТРОЙСТВО ДЛЯ ВИТРИФИКАЦИИ ООЦИТОВ И ЭМБРИОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

Криоконсервация эмбрионов широко используется как в промышленном скотоводстве в технологии трансплантации эмбрионов, так и для сохранения генетического потенциала исчезающих и редких пород. Объектами криоконсервации являются ооциты и эмбрионы не только коров, но и других сельскохозяйственных животных (свиньи, овцы, лошади). Методы криоконсервации широко применяются при работе с ооцитами и эмбрионами человека в клиниках, занимающихся экстракорпоральным оплодотворением. При этом эмбрионы коров нередко являются модельными объектами для апробации методик, разрабатываемых для эмбрионов человека (Kuwayama et al., 2005; Huang et al., 2007).
В настоящее время в целях криоконсервации все большее распространение получает метод витрификации, основанный на сверхбыстром охлаждении объекта, предварительно обработанного в растворах с высокой концентрацией криопротекторов. Признается, что витрификация является более щадящим и, соответственно, более эффективным по сравнению с программируемым медленным замораживанием методом криоконсервации, особенно при работе с такими высоко чувствительными к низким температурам объектами, как ооциты и получаемыми in vitro эмбрионы крупного рогатого скота.
Возможность проведения витрификации определяют три важнейших фактора:
1. Достижение максимально возможной скорости охлаждения объекта, порядка 15000-30000°C/мин.
2. Использование среды с высокой вязкостью, которая определяется концентрацией и свойствами отдельных веществ-криопротекторов (CP). Чем выше концентрация CP в среде, тем выше температура перехода в стекловидное тело (the glass transition temperature, Tg), за счет чего снижается возможность возникновения ядер льда (the chance of ice nucleation) и кристаллизации. Различные CP обладают различной способностью к проникновению через клеточные мембраны, цитотоксичностью, Tg.
3. Минимальный объем витрифицируемого объекта, менее 1 мкл.
Ультрабыстрое охлаждение и последующее отогревание основывается на прямом контакте объекта в минимальном объеме раствора криопротекторов с жидким азотом на этапе витрификации и со средой на этапе отогревания. Для достижения этих целей было разработано несколько моделей носителей с открытой поверхностью, из которых наиболее широко применяются устройства Cryotop, Cryoleaf™, криопетли, сеточки для электронной микроскопии, полусоломинки (hemi-straw, HS) (Saragusty, Arav, 2011), которые позволяют контролировать нанесение капли минимального объема (1 мкл и меньше). Кроме того при использовании этих носителей достигается очень высокая скорость охлаждения за счет прямого контакта объекта с жидким азотом и высокая скорость нагревания, так как объект после извлечения из жидкого азота прямо погружается в раствор для отогревания. В свою очередь, использование минимальных объемов в сочетании с максимальной скоростью охлаждения позволяет снизить концентрацию криопротекторов в растворе витрификации и, соответственно, их цитотоксическое воздействие на эмбрионы. В целом показатели выживаемости эмбрионов при использовании разных носителей с открытой поверхностью получаются схожими, нет какого-то носителя, который давал бы достоверно лучшие результаты, чем остальные (Elnahas et al., 2010). Поэтому выбор носителя для витрификации зачастую зависит от его доступности, стоимости и удобства применения в условиях конкретной лаборатории. Cryotop, Cryoleaf™, криопетли изготовляются фирмами-производителями. Они доступны для покупки, однако их стоимость очень высока. Модель полусоломинки (hemi-straw, HS) с контейнером была предложена Vanderzwalmen et al. (2000), а затем использовалась в нескольких модификациях (Liebermann, Tucker, 2002, 2004; Rao et al., 2012). При этом для изготовления системы HS использовались соломинки, разработанные и применяемые для криоконсервации биологического материала, то есть не токсичные, пригодные для использования в условиях сверх низких температур, не дорогие и вполне доступные.
Задача настоящей полезной модели - создание более надежного и удобного в использовании устройства для витрификации ооцитов и ранних эмбрионов млекопитающих.
ПРОТОТИП ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ
Прототипом нашей модели устройства для витрификации полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота являлась система полусоломинок, HS.
1. Модель полусоломинки (hemi-straw, HS) была предложена Vanderzwalmen et al. (2000), и в авторском варианте она действительно готовилась путем продольного среза протяженностью около одного сантиметра соломинки для криоконсервации объемом 0,25 мл (mini straw) с ее открытого конца (Vanderzwalmen et al., 2003). Полученная в результате среза открытая внутренняя поверхность полусоломинки позволяла размещать ооциты или эмбрионы в минимальном количестве (0,3 мкл) раствора для витрификации (vitrification solution, VS). Полусоломинку с находящимися на конце эмбрионами в VS немедленно опускали в жидкий азот. Затем при помощи пинцетов HS помещали в находящуюся в жидком азоте соломинку объемом 0,5 мл (medium straw), как в контейнер, и закрывали ее пробкой. Для отогревания эмбрионов HS под азотом при помощи пинцетов вытаскивали из соломинки-контейнера и ее конец с эмбрионом тут же помещали в раствор для отогревания.
2. В варианте Liebermann, Tucker (2002, 2004) открытый конец соломинки на 0,25 мл обрезали острым скальпелем наискосок таким образом, чтобы получился срез протяженностью около 1 см. Ооциты или эмбрионы в минимальном объеме VS помещают на самый кончик открытой внутренней поверхности среза соломинки. Соломинка с эмбрионом на конце среза немедленно опускается вертикально в жидкий азот и помещается в просвет находящейся в жидком азоте соломинки на 0,5 мл, как в контейнер. Соломинка, служащая контейнером, закрывается ее маркированной цветом затычкой (plug).
3. Rao et al. (2012) готовили носитель-полусоломинку также путем косого среза протяженностью около 1 см открытого конца соломинки на 0,25 мл. Эту соломинку вводили в среднюю соломинку на 0,5 мл с наружным диаметром 2,8 мм таким образом, что открытый конец HS мог двигаться внутрь и наружу этого чехла во время витрификации и нагревания. Судя по приведенной в работе фотографии, фиксация носителя в просвете соломинки на 0,5 мл достигалась за счет расплющивания небольшого участка полусоломинки, хотя описание не приводится.
СУЩНОСТЬ ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ
Устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих готовили из соломинок объемом 0,25 (mini straws) и 0,5 мл (medium straws), разработанных и применяемых для криоконсервации и хранения биологического материала в жидком азоте, и стандартных затычек (plugs; разного цвета для маркировки) к соломинкам на 0,25 мл.
Порядок изготовления устройства для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих
1. Соломинку на 0,25 мл с открытого конца закрывают ее стандартной затычкой. При этом узкая часть затычки плотно входит в просвет соломинки примерно на 0,5 см, а широкая часть выступает за пределы соломинки примерно на 4 см и в дальнейшем служит ручкой при работе с устройством.
2. Держа в одной руке ручку-затычку, лезвием безопасной бритвы делают косой срез соломинки протяженностью около 1 см таким образом, чтобы отрезалась примерно половина соломинки. Отрезанную часть соломинки с фильтром выбрасывают. Внутренняя поверхность кончика среза оставшейся полусоломинки в дальнейшем служит для размещения эмбриона в минимальном количестве среды витрификации.
3. Вблизи затычки инъекционной иглой со шприцом на 1 мл прокалывают стенки полусоломинки насквозь. Шприц в данном случае служит удобной ручкой для инъекционной иглы.
4. На расстоянии 1-2 см от затычки полусоломинку расплющивают в поперечном направлении для образования блока фиксации. При использовании запаивателя CAS SNT-200 в режиме 0,5 стенки соломинки расплющиваются на небольшом протяжении, но ее просвет не запаивается.
5. При использовании носитель-полусоломинка с витрифицированным эмбрионом непосредственно в жидком азоте вставляется в соломинку на 0,5 мл и фиксируется в ней за счет узла фиксации - расплющенного участка. Таким образом, соломинка на 0,5 мл выполняет роль защитного чехла для носителя-полусоломинки.
6. В собранном виде модель представляет собой устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих.
Перечень фигур:
На рисунке 1 изображена схема устройства для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих.
На рисунке 2 изображены исходные материалы для сборки устройства для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих и устройство в сборе.
Схема проведения витрификации полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота при использовании устройства для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих
1. Ванночку с жидким азотом помещают на столе рядом со стереомикроскопом.
2. На дно ванночки помещают соломинку на 0,5 мл, которая будет использована в качестве защитного чехла, и гоблет диаметром 13 мм (goblet; стандартный пластиковый цилиндр диаметром 9-13 мм, используемый для размещения соломинок при хранении в жидком азоте).
3. В жидкий азот помещают анатомический пинцет, оставляя его ручку выше уровня азота у края ванночки.
4. Эмбрион эквилибрируют в растворах с разной концентрацией криопротекторов в соответствии с принятым протоколом.
5. Эмбрион выдерживают в витрификационном растворе (vitrification solution, VS) в течение 20-30 секунд
6. Берут подготовленный носитель-полусоломинку, используя в качестве ручки наружную часть затычки.
7. Под стереомикроскопом эмбрион в минимальном количестве VS помещают на самый кончик среза на внутреннюю поверхность полусоломинки.
8. Незамедлительно кончик полусоломинки с эмбрионом в микрокапле VS опускают в жидкий азот.
9. При медленном покачивании продолжают опускать носитель вертикально в жидкий азот до уровня затычки.
10. При помощи пинцета берут соломинку на 0,5 мл, находящуюся в жидком азоте, и удерживают ее ниже уровня азота.
11. Носитель с эмбрионом вводят в просвет соломинки-чехла до упора ручки-затычки в верхний край соломинки-чехла.
12. Носитель-полусоломинку в защитном чехле, т.е. устройство для витрификации, с витрифицированным эмбрионом под азотом помещают в гоблет.
13. Для хранения гоблет размещают в жидком азоте в канистре в сосуде Дьюара.
Схема проведения отогревания эмбрионов, витрифицированных при использовании устройства для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих
1. Ванночку с жидким азотом помещают на столе рядом со стереомикроскопом.
2. В ванночку с жидким азотом помещают 2 анатомических пинцета, оставляя их ручки выше уровня азота у края ванночки.
3. Устройство с витрифицированным эмбрионом, хранящимся в сосуде Дьюара, вместе с гоблетом переносят в жидком азоте и помещают в ванночку с жидким азотом.
4. При помощи пинцета устройство извлекают из гоблета, удерживая его ниже уровня жидкого азота.
5. Удерживая пробку-затычку одним пинцетом, извлекают соломинку-носитель из соломинки-чехла, которую придерживают вторым пинцетом.
6. Сохраняя соломинку-носитель под жидким азотом, переводят ее в вертикальное положение ручкой-затычкой вверх.
7. Не торопясь поднимают носитель вертикально, сохраняя только его нижний кончик с витрифицированным эмбрионом ниже уровня жидкого азота.
8. Быстро извлекают носитель из жидкого азота полностью и незамедлительно опускают его кончик с витрифицированным эмбрионом в чашку Петри, содержащую 3 мл среды отогревания TS при температуре 39°C.
9. При легком покачивании носителя эмбрион высвобождается в среду TS. В среде TS эмбрион выдерживают в течение 1 минуты.
10. Эмбрион проводят через систему растворов для разбавления и отмывания от криопротекторов в соответствии с принятым протоколом.
11. Отогретые эмбрионы помещают в предварительно эквилибрированную среду mSOF на культивирование. Через 24 и 48 часов в возрасте 8 и 9 D определяют количество живых эмбрионов, а также достигших стадии вылупляющейся и вылупившейся бластоцисты.
ПРИМЕР ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УСТРОЙСТВА ДЛЯ ВИТРИФИКАЦИИ ПОЛУЧЕННЫХ IN VITRO ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
РАБОЧИЕ РАСТВОРЫ
Среды были приготовлены на основе маточных растворов компонентов [Whittingham, 1971], хранящихся при 4 или -20°C. Перед использованием во все рабочие среды и растворы был добавлен гентамицин в количестве 40-50 мкг/мл. Дозревание ооцитов проводили в среде 199 с добавлением 0.66 мМ Na пирувата, 1 мМ L-глутамина, 0.6 мМ L-цистеина, 5 ЕД/мл гонадотропина хорионического, 5 мкг/мл фолликулостимулирующего гормона, 1 мкг/мл эстрадиола-17β и 10% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (FCS). Манипуляции с ооцитами, сперматозоидами и эмбрионами на воздухе проводили в модифицированной среде TALP-HEPES [Bavister, Yanagimachi, 1977] (ТН). Для оплодотворения использовали модифицированную среду TALP-Fert [Parrish et al., 1986, 1988] (TF). Приготовленные среды ТН и TF хранили при -20°C. Аликвоты сред размораживали однократно и использовали в течение недели. Аликвоты растворов РНЕ [penicillamine, hypotaurine, epinephrine; Bavister, 1989] и гепарина хранились при -20°C и размораживались непосредственно перед использованием. Культивирование эмбрионов проводили в среде mSOF [Tervit et al., 1972].
РАСТВОРЫ ДЛЯ ВИТРИФИКАЦИИ И ОТОГРЕВАНИЯ ЭМБРИОНОВ
Базовый раствор для проведения витрификации эмбрионов составляла среда ТН с добавлением 20% FCS, обозначение ТН20.
1. Раствор для эквилибрации эмбрионов (equilibration solution, ES) состоял из ТН20 с добавлением 7,5% этиленгликоля (EG) и 7,5% DMSO.
2. Раствор для витрификации эмбрионов VS состоял из ТН20 с добавлением 15% EG, 15% DMSO и 0,5 М сахарозы.
3. Раствор для отогревания эмбрионов (thawing solution, TS) состоял из ТН20 с добавлением 1 М сахарозы.
4. Раствором для разбавления 1 (dilution solution 1, DS1) являлась среда ТН20, содержащая 0,5 М сахарозы
5. Раствором для разбавления 2 (DS2) являлась среда ТН20, содержащая 0,25 М сахарозы.
6. В качестве раствора для отмывания (washing solution, WS) использовалась базовая среда ТН20.
ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА IN VITRO
2
2
2
2
2
Яичники крупного рогатого скота получали на мясокомбинате и доставляли в лабораторию при температуре 26-30°C в течение 3-5 часов. Дозревание ооцитов проводили в CO-инкубаторе при температуре 38.5°C в течение 22-23 часов. Для оплодотворения использовали криоконсервированное семя быка. Для выделения фракции подвижных сперматозоидов, свободных от семенной плазмы и компонентов сред разбавления и криоконсервации семени, использовали метод swim up. Совместное инкубирование ооцитов и сперматозоидов проводили в течение 18-20 часов в CO-инкубаторе при температуре 38,5°C. Полученные зиготы были освобождены от клеток кумулюса на Vortex в растворе гиалуронидазы и поставлены на культивирование в среде mSOF в атмосфере 5,6% CO, 5,7% O, 88,7% N в течение 7-12 дней. День постановки на оплодотворение считали нулевым (D 0).
ПРОВЕДЕНИЕ ВИТРИФИКАЦИИ ПОЛУЧЕННЫХ IN VITRO ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Ванночку с жидким азотом помещали на столе рядом со стереомикроскопом. Для витрификации эмбрионы в возрасте 7 дней на стадии бластоцисты и расширенной бластоцисты последовательно проводили через растворы при комнатной температуре:
1. Отмывание 1 (WS) 3-5 минут
2. Отмывание 2 (WS) 3-5 минут
3. Эквилибрация (ES) 3-5 минут
4. Витрификация (VS) 20-30 секунд
Эмбрион в минимальном объеме VS помещали на кончик носителя и тут же опускали его в жидкий азот. При медленном покачивании продолжали опускать носитель вертикально в жидкий азот до уровня затычки. При этом жидкий азот заполняет полусоломинку, вытесняя воздух, который выходит через отверстия, сделанные иглой в стенках полусоломинки под затычкой. Затем носитель помещали в находящуюся в жидком азоте соломинку-защитный чехол, удерживая ее пинцетом. Полученный комплекс для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих с витрифицированным эмбрионом крупного рогатого скота помещали в гоблет и переносили для хранения в сосуд Дьюара.
ОТОГРЕВАНИЕ ВЕРИФИЦИРОВАННЫХ ЭМБРИОНОВ
Гоблет с устройством для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих с витрифицированным эмбрионом крупного рогатого скота извлекали из сосуда Дьюара и в термосе с жидким азотом переносили в ванночку с жидким азотом, находящуюся на столе рядом со стереомикроскопом. Непосредственно в жидком азоте при помощи пинцетов снимали защитный чехол с полу соломинки-носителя. Удерживая за пробку-затычку, полусоломинку-носитель медленно поднимали вертикально, оставляя только его кончик с верифицированным эмбрионом ниже уровня жидкого азота. При этом просвет соломинки освобождается от жидкого азота и заполняется воздухом, который входит через отверстия в стенках под затычкой, тогда как верифицированный эмбрион все еще находится в жидком азоте. Затем быстро извлекали носитель из жидкого азота полностью, и незамедлительно опускали его кончик с витрифицированным эмбрионом в чашку Петри, содержащую 3 мл среды отогревания TS при температуре 39°C. В этом растворе эмбрион выдерживали в течение 1 минуты, после чего последовательно проводили через растворы для разбавления и отмывания от криопротекторов при комнатной температуре. Общая схема отогревания верифицированных эмбрионов крупного рогатого скота:
1. Отогревание (TS) 1 минута
2. Разбавление 1 (DS1) 3-5 минут
3. Разбавление 2 (DS2) 3-5 минут
4. Отмывание 1 (WS) 3-5 минут
5. Отмывание 2 (WS) 3-5 минут
Отогретые эмбрионы помещали в предварительно эквилибрированную среду mSOF на культивирование. Через 24 и 48 часов в возрасте 8 и 9 D, соответственно, определяли количество живых эмбрионов, а также достигших стадии вылупляющейся и вылупившейся бластоцисты.
ПРИМЕРЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УСТРОЙСТВА ДЛЯ ВИТРИФИКАЦИИ ПОЛУЧЕННЫХ IN VITRO ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
Пример 1. Для апробации устройства вначале была проведена витрификация и отогревание бластоцист без помещения верифицированных эмбрионов на хранение в сосуд Дьюара. Отобрали 6 расширенных семидневных бластоцист хорошего качества и витрифицировали их, помещая по одной на полусоломинку-носитель. После выдержки в жидком азоте в течение 10-15 мин эмбрионы провели через систему растворов для отогревания и отмывания и поставили на культивирование в среде mSOF. Через 24 часа культивирования из 6 верифицированных бластоцист живыми были 4 (66,7%), из них 3 бластоцисты вышли из блестящей оболочки, еще одна находилась на стадии вылупления. Таким образом, процедуру витрификации и отогревания успешно перенесли 2/3 эмбрионов, при этом все выжившие эмбрионы при культивировании развивались нормально.
Пример 2. В следующем опыте для витрификации отобрали 6 эмбрионов в возрасте 7 суток: 3 на стадии расширенной бластоцисты, 1 на стадии бластоцисты, 2 на стадии ранней бластоцисты. Так как все эмбрионы были одного возраста, можно предположить, что их качество убывало от стадии расширенной до стадии ранней бластоцисты. Эмбрионы после витрификации и хранения в течение трех дней в жидком азоте были отогреты и поставлены на культивирование. Через 24 часа живыми были все 6 эмбрионов (100%). Более того, к этому времени все эмбрионы достигли стадии вылупляющейся бластоцисты, в том числе 1 бластоциста вышла из блестящей оболочки. В возрасте 9 суток живыми оставалось 5 эмбрионов (83,3%), в том числе 2 бластоцисты вышли из блестящей оболочки, остальные 3 эмбриона остановились в развитии на стадии вылупляющейся бластоцисты.
Пример 3. В последующих 2-х опытах было витрифицировано 15 бластоцист, которые были отогреты после хранения в жидком азоте от 4 до 11 дней. Через 24 часа после отогревания живыми были 100% витрифицированных бластоцист (15/15). В возрасте 9 суток 86,7% эмбрионов (13/15) оставались живыми, из них 69% бластоцист (9/13) достигли стадии вышедшей из блестящей оболочки бластоцисты.
Таким образом, при использовании разработанного устройства для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих эмбрионы в процессе витрификации, хранения в жидком азоте и отогревания не теряются. Через 24 часа после отогревания и постановки на культивирование живыми оказываются до 100% полученных in vitro витрифицированных эмбрионов крупного рогатого скота. При последующем культивировании около 61% выживших эмбрионов достигают стадии вылупившейся из блестящей оболочки бластоцисты.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих является простым в изготовлении и удобным при использовании. Для изготовления устройства используются соломинки объемом 0,25 (a French mini straw) и 0,5 мл (a French medium straw), применяемые для хранения биологического материала в жидком азоте, и стандартные затычки (plugs, разного цвета для маркировки) к соломинкам объемом 0,25 мл. Стандартная затычка к соломинке объемом 0,25 мл узкой частью, длина которой составляет около 6 мм, плотно входит и очень крепко удерживается в просвете соломинки. Выступающая часть затычки прочная, имеет длину около 4 см, диаметр 3 мм. Благодаря этому наружная часть затычки представляет собой удобную ручку, как при изготовлении носителя, так и на всех этапах витрификации и отогревания эмбрионов, включая погружение и извлечение носителя из жидкого азота. Цельно пластиковая затычка примерно в 3 раза тяжелее полой соломинки (0,3 г против 0,1 г, соответственно), а плотность ее материала превышает плотность жидкого азота (охлажденная затычка погружается на дно емкости с жидким азотом). Вследствие этого затычка, располагаясь на верху, препятствует всплыванию всего устройства в жидком азоте при его размещении на хранение в гоблете. Сочетание разных цветов затычки и гоблета может выполнять роль быстро различимых маркеров.
Сквозные отверстия, сделанные в стенках носителя под затычкой, позволяют жидкому азоту беспрепятственно заполнять весь объем полусоломинки на этапе витрификации при погружении носителя с эмбрионом вертикально в жидкий азот, что позволяет снизить ее плавучесть в жидком азоте. Эти же отверстия обеспечивают быстрое, спокойное (без турбулентности) и полное вытекание жидкого азота из просвета полусоломинки при ее извлечении ручкой-затычкой вверх вертикально из жидкого азота на этапе отогревания. Получить полное вытекание жидкого азота из полусоломинки на этом этапе очень важно, так как затем кончик носителя с эмбрионом должен быть моментально перемещен из под азота в чашку Петри с раствором для отогревания при 39°C.
На этапе витрификации носитель под жидким азотом мягко входит в соломинку на 0,5 мл до упора внешней широкой части затычки полусоломинки в края соломинки-чехла. При этом расплющенный участок носителя, упираясь изнутри в стенки соломинки-чехла большего диаметра, выполняет роль фиксатора и удерживает носитель в ее просвете. При использовании даже простейшего запаивателя легко подобрать режим, который обеспечивает однотипное расплющивание стенок носителя-полусоломинки, необходимое и достаточное для фиксации в соломинке-чехле.
Использование соломинки на 0,5 мл в качестве чехла позволяет надежно защитить носитель с верифицированным эмбрионом, размещенным на открытой поверхности, от возможных случайных механических воздействий.
Для хранения эмбрионов устройство для витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих размещается в сосудах с жидким азотом аналогично обычным соломинкам при криоконсервации биологического материала, занимая при этом минимальный объем.
Литература
Bavister B.D. A consistently successful procedure for in vitro fertilization of golden hamster eggs. Gamete Res. 1989; 23: 139-158.
Bavister B.D., Yanagimachi R. The effects of sperm extract and energy sources on the motility and acrosome reaction of hamster sperm in vitro. Biol. Reprod. 1977; 16: 228-237.
Elnahas K., Palapelas V., Diedrich K., Al-Hasani S. Vitrification of human oocytes and different development stages of embryos: An overview. Middle East Fertil. Soci. J. 2010; 15: 2-9.
Huang J., Chung J-T., Tan S.L., Chian R-C. High survival and hatching rates following vitrification of embryos at blastocyst stage: a bovine model study. Reprod. Biomed. Online. 2007; 14: 464-470.
Kuwayama M., Vajta G., Kato O., Leibo S.P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reprod. Biomed. Online. 2005; 11: 300-308.
Liebermann J., Tucker M.J. Effect of carrier system on the yield of human oocytes and embryos as assessed by survival and developmental potential after vitrification. Reproduction. 2002; 124: 483-489.
Liebermann J., Tucker M.J. Vitrifying and warming of human oocytes, embryos, and blastocysts. From: Methods in Molecular Biology, vol. 254: Germ Cell Protocols, Volume 2: Molecular Embryo Analysis, Live Imaging, Transgenesis, and Cloning. Edited by: H. Schatten © Humana Press Inc., Totowa, NJ. 2004, pp.345-364.
Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Leibfried-Rutledge M.L. et al. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen. Theriogenology. 1986; 25: 591-600.
Parrish J.J., Susko-Parrish J.L., Winer M.A., First N.L. Capacitation of bovine sperm by heparin. Biol. Reprod. 1988; 38: 1171-1180.
Rao B.S., Mahesh Y.U., Charan K.V., Suman K., Sekhar N., Shivaji S. Effect of vitrification on meiotic maturation and expression of genes in immature goat cumulus oocyte complexes. Cryobiology. 2012; 64: 176-184.
Saragusty J., Arav A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification. Reproduction. 2011; 141: 1-19.
Tervit H.R., Whittingham D.G., Rowson L.E.A. Successful culture in vitro of sheep and cattle ova. J. Reprod. Fertil. 1972; 30: 493-497.
Vanderzwalmen P., Bertin G., Debauche C.H., Standaert V., Schoysman R. In vitro survival of metaphase II oocytes and blastocysts after vitrification in an Hemi Straw (HS) system. Fertil. Steril. 2000; 74 (Suppl.): 215-216.
Vanderzwalmen P., Bertin G., Debauche Ch., Standaert V., Bollen N., van Roosendaal E., Vandervorst M., Schoysman R., Zech N. Vitrification of human blastocysts with the Hemi-Straw carrier: application of assisted hatching after thawing. Hum. Reprod. 2003; 18: 1504-1511.
Whittingham D.G. Culture of mouse ova. J. Reprod. Fertil. 1971;. Suppl. 14:7-21.