ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК

Полезная модель относится к области медицины, но также может быть использована в ветеринарии и биологии.
Известна экспериментальная тест-система для исследования клеток, взятая за аналог и представляющая собой стандартный иммунологический планшет (например, 96 луночный планшет для ИФА производитель - «Coming-Costar Co», США) в лунках которого иммобилизованы антитела, специфичные к поверхностным антигенам клеток. (См. А.В.Шишкин «Иммунологические биочипы для исследования клеток. Собственный опыт разработки. Некоторые новые подходы к проведению анализа» LAP Lambert Academic Publishing & Co. KG-2010-с.81-87). Данная тест- система позволяет определять поверхностные антигены клеток. В процессе проведения анализа в лунки планшета вносят суспензию клеток, осуществляют инкубацию (в ходе которой клетки оседают на дно лунок), а затем осуществляют отмывку. При этом клетки, имеющие на своей поверхности определяемые антигены, оказываются специфически связанными, с иммобилизованными антителами на дне лунок, а неспецифически связавшиеся клетки удаляются при отмывке. Далее определяют плотность связывания клеток в области тестовых участков, и, исходя из ее значений, рассчитывают содержание в исследуемом образце клеток, имеющих соответствующие поверхностные антигены. При необходимости может выполняться выполнение окрашивания и морфологического исследования связанных клеток. Также возможно проведение и других дополнительных исследований с использованием микроскопии.
Недостатком данной тест-системы является то, что использование стандартных 96- луночных планшетов требует большого объема исследуемой клеточной суспензии. При этом количество клеток также должно быть велико (для того, чтобы осажденные клетки покрыли всю поверхность дна используемых лунок). Отчасти эта проблема может быть решена за счет использования планшетов с малым объемом лунок.
При отмывке лунок планшета от не связавшихся клеток буферным раствором с использованием автоматической многоканальной пипетки (или иных подобных устройств) возникают турбулентные потоки жидкости, вызывающие отрыв значительной части клеток, специфически связанных с антителами. Как правило, связанные клетки остаются только в центральной части лунок. Ситуация осложняется тем, что на практике приходится выполнять несколько отмывок всех используемых лунок планшета для удаления неспецифически связанных клеток. При этом далеко не всегда удается добиться равномерной плотности заполнения оставшимися клетками даже центральных частей лунок. Это осложняет считывание и оценку результата анализа, а также значительно снижает точность результатов.
Из планшета не может быть приготовлен удобный для работы долговременный препарат для микроскопического исследования клеток.
Наличие высоких стенок лунок препятствует проведению микроскопического исследования клеток, связавшихся на дне планшета с использованием прямого (не инвертированного) микроскопа, поскольку при этом могут быть использованы только те объективы, фокусное расстояние которых больше, чем глубина лунок планшета. При использовании инвертированного микроскопа проведению микроскопического исследования на большом увеличении с использованием короткофокусных объективов препятствует значительная толщина дна лунок.
Известна тест-система для исследвания клеток, представляющая собой биочип, позволяющий определять поверхностные антигены клеток (см. А.В.Шишкин, И.И.Шмырев, С.А.Кузнецова, Н.Г.Овчинина, А.А.Бутылин, Ф.И.Атауллаханов, А.И.Воробьев «Иммунологические биочипы для параллельного определения поверхностных антигенов и морфологического исследования клеток», Биологические мембраны, 2008, том 25, №4, с 277-284), взятый в качестве прототипа. Биочип представляет собой твердую прозрачную пластиковую пластинку, где в строго определенных тестовых участках (пятнах) иммобилизованы антитела, каждое из которых специфично к определенному клеточному поверхностному антигену. В процессе проведения анализа биочип, находящийся в емкости, инкубируют с суспензией клеток, а затем осуществляют отмывку. При этом клетки, имеющие на своей поверхности определяемые антигены, оказываются специфически связанными с иммобилизованными антителами в области тестовых участков, а неспецифически связавшиеся клетки удаляются при отмывке. Определяют плотность связывания клеток в области тестовых участков, и, исходя из ее значений, рассчитывают содержание в исследуемом образце клеток, имеющих соответствующие поверхностные антигены. Кроме того, может проводиться окрашивание и морфологическое исследование связавшихся клеток, а также проведение иных дополнительных исследований с использованием микроскопии.
Недостатком данной тест системы является необходимость приведения в контакт с клеточной суспензией всей поверхности биочипа. При этом для получения адекватных результатов она должна быть полностью покрыта осевшими клетками. Поскольку значительную часть поверхности биочипа составляют фоновые участки, не содержащие иммобилизованных антител, способных взаимодействовать с поверхностными антигенами, использование данной тест-системы не обеспечивает максимально экономного расхода клеточной суспензии, что требует использования большего количества биологического (клинического материала), чем это было бы принципиально возможно.
По той же причине расход красителей или иных реагентов, необходимых для проведения дополнительных исследований связанных с биочипом клеток, оказывается значительно выше, чем это минимально возможно теоретически.
Задачей заявленной полезной модели является сокращение расхода исследуемого биологического (клинического) материала.
Поставленная задача решается за счет того, что согласно полезной модели, тест-система для исследования клеток, содержащая подложку, имеющую тестовые участки с иммобилизованными молекулами веществ, способных связываться с поверхностными молекулами клеток, снабжена герметично фиксируемой на поверхности подложки съемной пластиной, имеющей отверстия расположенные таким образом, что при установке пластины образуются лунки, на дне которых находятся тестовые участи, при этом тест-система снабжена съемным приспособлением, предназначенным для заполнения лунок жидкостью.
Форма и размеры поперечных сечений отверстий съемной пластины соответствуют форме и размерам тестовых и контрольных участков подложки.
Тест-система снабжена съемной рамой, фиксирующей съемную пластину.
Подложка закреплена на пластине из прозрачного материала.
Съемное приспособление, предназначенное для заполнения лунок жидкостью, выполнено в виде емкости с одним или несколькими отверстиями на дне и установленной с возможностью перемещения над лунками по поверхности съемной пластины.
Съемное приспособление, предназначенное для заполнения лунок жидкостью, выполнено в виде устройства, обеспечивающего всасывание или выталкивание жидкости и имеющего несколько наконечников.
Тест-система имеет один или несколько контрольных участков, расположенных на подложке, при этом съемная пластина, дополнительно снабжена одним или несколькими отверстиями, расположенными таким образом, что при ее установке на подложку образуются одна или несколько лунок, на дне которых находятся данные контрольные участи.
Тест-система имеет разметку, обозначающую границы тестовых и контрольных участков.
Тест-система имеет сигнальный участок, указывающий порядок расположения тестовых и контрольных участков.
Съемная пластина выполнена из эластичного материала
Съемная пластина снабжена рукояткой.
Съемная пластина имеет клейкое покрытие.
Тест-система снабжена съемной крышкой для закрытия лунок.
Тест-система снабжена приспособлением, прижимающим емкость к съемной пластинке.
Поверхность стенок отверстий съемной пластины имеют большую гидрофильность (смачиваемость), по сравнению с другими участками ее поверхности
Тест-система имеет маркировку, позволяющую идентифицировать тестовые или контрольные участки.
Использование заявленной полезной модели позволяет значительно уменьшить расход исследуемого биологического (клинического) материала. При этом также сокращается расход реактивов, используемых для проведения дополнительных исследований клеток. Конструкция тест системы обеспечивает удобство работы. За счет возможности отделения съемной пластины с отверстиями сохраняется возможность приготовления долговременного препарата. Кроме того, уменьшается (по сравнению с аналогом) воздействие на связавшиеся клетки турбулентных потоков жидкости при проведении отмывки. Наличие у съемной пластины выступа (рукоятки) облегчает ее отделение от подложки. Выполнение съемной пластины из эластичного материала обеспечивает герметизацию контакта с перемещаемой по ее поверхности емкостью. Наличие клейкого покрытия обеспечивает надежную фиксацию съемной пластины к подложке и обеспечивает герметизацию этого соединения. Соответствие формы и размеров поперечных сечений отверстий съемной пластины форме и размерам тестовых участков и контрольных обеспечивает минимальный расход используемой клеточной суспензии. Наличие съемной крышки предотвращает испарение жидкости из лунок. При этом съемная крышка может быть конструктивно объединена с перемещаемой емкостью, что обеспечивает удобство использования устройства. Наличие съемной прижимающей рамы обеспечивает надежную фиксацию съемной пластины с отверстиями к подложке. Для повышения удобства использования тест-системы она может быть конструктивно объединена с рамой, обеспечивающей прижатие к ней съемной крышки и перемещаемой емкости. Возможность исходного закрепления подложки на прозрачной пластине (например, на покровном стекле или платформе снабженной выемкой для размещения подложки) делает работу с тест-системой более удобной, а также в последующем значительно упрощает процесс приготовления долговременного препарата для микроскопических исследований. Благодаря наличию такой пластины становится значительно более удобным размещение подложки на предметном столике микроскопа.
Наличие контрольных участков дает возможность оценить специфичность связывания клеток, качество отмывки биочипа от несвязавшихся клеток, максимально возможную при данных условиях плотность связывания клеток и другие параметры.
Наличие разметки, обозначающей границы тестовых и контрольных участков тест-системы облегчает выполнение считывания и оценки результата в неавтоматизированном или частично автоматизированном режиме, а также дает возможность проверки адекватности обработки результатов при возникновении такой необходимости. Этому также способствует наличие маркировки, позволяющей идентифицировать тестовые или контрольные участки.
Наличие сигнального участка, указывающего порядок расположения тестовых и контрольных участков, необходимо для автоматизированного определения начала или конца последовательности считывания результата. Кроме того, это дополнительно облегчает процесс считывания результата в неавтоматизированном режиме.
Более высокая гидрофильность поверхности стенок отверстий съемной пластины, по сравнению с другими участками ее поверхности способствует качественному заполнению лунок жидкостью (клеточной суспензией), что совершенно необходимо для получения в последующем адекватных результатов анализа.
Описание полезной модели поясняется чертежом, на котором изображено:
на фиг.1 представлен вид сбоку в разрезе тест-системы с установленным приспособлением для заполнения лунок.
на фиг.2 представлен вид сверху тест-системы с установленным приспособлением для заполнения лунок.
на фиг.3 представлен разрез А-А на фиг.2
на фиг.4 представлено приспособление 1-го типа, предназначенное для удаления жидкости из лунок (в разрезе)
на фиг.5 представлено приспособление 2-го типа, предназначенное для удаления жидкости из лунок (в разрезе)
Тест система содержит прозрачную подложку 1 (фиг.1), которая размещена в выемке 2 плоской прозрачной пластины 3. При этом поверхность подложки 1 располагается на одном уровне с остальными участками верхней поверхности прозрачной пластины 3. Надежную фиксацию подложки 1 в выемке 2 и герметизацию этого соединения обеспечивает прозрачное клейкое покрытие (на чертеже не обозначено). Подложка 1 имеет рабочую область 4 (фиг.2), содержащую тестовые участки 5 с иммобилизованными антителами или иными веществами, способными связываться с поверхностными молекулами клеток. На подложке имеется сигнальный (реперный) участок 6, указывающий на порядок считывания результата при его осуществлении в автоматизированном режиме. Кроме того, имеются контрольные участки 7, предназначенные для оценки качества отмывки подложки 1 от неспецифически связавшихся клеток. Они не содержат иммобилизованных молекул антител или иных веществ, способных связываться с поверхностными молекулами исследуемых клеток. Поскольку в участках 7 не должно оставаться связанных клеток после качественно проведенной отмывки, они также выполняют роль участков отрицательного контроля. Для удобства их идентификации участки 7 отличаются от остальных контрольных участков и тестовых участков 5 своей формой и размерами. Возможно исполнение тест-системы с одним контрольным участком 7, но наличие нескольких таких участков дает возможность оценить качество отмывки подложки 1 от не связавшихся клеток в разных ее участках. При наличии нескольких контрольных участков 7 расход клеточной суспензии возрастает незначительно, но существенно повышается точность получаемых результатов. На подложке 1 также находится участок 8 положительного контроля, в котором могут связываться все типы исследуемых клеток. (Если тест-система предназначена для исследования лейкоцитов, то в участке 8 могут быть иммобилизованы, например, антитела, специфичные к антигену CD45, имеющемуся на поверхности всех лейкоцитов). Данный участок используется для оценки максимально возможной плотности связывания клеток. Тест-система также содержит контрольный участок 9, предназначенный для оценки загрязненности исследуемой клеточной суспензии клетками других типов. (Если тест-система предназначена для исследования лейкоцитов, то в участке 9 могут быть иммобилизованы, антитела, специфичные, например, к антигену CD41, имеющемуся на поверхности тромбоцитов, которые в данном случае являются нежелательной примесью). Для оценки адекватности условий отмывки служит контрольный участок 10, который обеспечивает прочность связывания клеток заведомо большую, чем в области участков отрицательного контроля 7, но заведомо меньшую, чем в области тестовых участков 5. При этом в области участка 10 должны связываться клетки всех исследуемых типов. (Если тест-система предназначена для исследования лейкоцитов, то в участке 10 могут быть иммобилизованы, например, антитела, специфичные к антигену CD45, имеющемуся на поверхности всех лейкоцитов. Но меньшая прочность связывания клеток по сравнению с контрольным участком 8 обеспечивается, например, за счет использования антител с меньшей аффинностью или за счет значительно меньшего количества молекул данных антител, иммобилизуемых на единице площади поверхности).
Тест-система содержит также контрольные участки, предназначенные для оценки специфичности связывания клеток и других параметров (в качестве отдельных позиций данные участки на чертеже не обозначены).
На подложке 1 нанесена разметка 11, обозначающая границы рабочей области 4, тестовых участков 5, контрольных участков 7, 8, 9, 10 и реперного участка 6. Для того, чтобы не изменять свойств поверхности рабочей области 4 подложки 1, разметка 11 нанесена на противоположной стороне прозрачной подложки 1 (фиг.1). Там же нанесена маркировка (на чертеже не обозначена), позволяющая идентифицировать тестовые или контрольные участки.
На поверхности, образованной подложкой 1 и краями прозрачной пластины 3, размещена съемная пластина 12, имеющая отверстия 13, расположенные над тестовыми участками 5 (фиг.2) и контрольными участками 7-10. При этом образуются лунки (емкости) 14 (фиг.1), дно которых образовано вышеуказанными участками 5, 7-10 (фиг.2) поверхности подложки 1. Поверхность боковых стенок 15 (фиг.1) лунок 14 является более гидрофильной по сравнению с другими участками свободной поверхности съемной пластины 12. Надежное закрепление съемной пластины 12 на поверхности подложки 1 и прозрачной пластины 3 и герметизацию данного соединения обеспечивает клейкое покрытие (на чертеже не обозначено). При этом прочность данного соединения такова, что при приложении некоторого усилия съемная пластина 12 может быть отделена от поверхности подложки 1 и прозрачной пластины 3, когда в этом возникает необходимость. Для удобства выполнения этой манипуляции съемная пластина 12 имеет выступ 16, который позволяет захватить ее пинцетом. Съемная пластина 12 выполнена из эластичного материала. Материал съемной пластины 12 и материал клейкого покрытия обладают достаточной инертностью по отношению к исследуемым клеткам, нерастворимы и не выделяют (например, в процессе деполимеризации) вещества, способные оказывать влияние на результат анализа за счет взаимодействия с молекулами веществ биологического происхождения.
Тест-система имеет приспособление для заполнения лунок 14 клеточной суспензией. Данное приспособление содержит подвижную пластину 17, имеющую выемку 18 на дне которой находится отверстие 19. При этом при установке подвижной пластины 17 на поверхность съемной пластины 12 образуется емкость 20. Подвижная пластина 17 прижата к съемной пластине 12 с помощью съемной прижимающей рамы 21 (фиг.3). При этом возможно перемещение подвижной пластины 17 по поверхности съемной пластины 12 вдоль одной оси. Герметизация контакта подвижной пластины 17 со съемной пластиной 12 обеспечивается за счет их прижатия друг к другу и эластичности пластины 12. Для более удобного перемещения подвижной пластины 17 по поверхности съемной пластины 12 служит выступ (рукоятка) 22 (фиг.1). Подвижная пластина 17 также играет роль крышки, закрывающей лунки 14 и предотвращающей испарение из них жидкости.
Прижимающая рама 21 имеет отверстие 23 (фиг.1, 3), в пределах проекции которого расположена рабочая область 4 (фиг.2) подложки 1. Подвижная пластина 17 выполнена из прозрачного материала. Это дает возможность при необходимости осуществлять наблюдение за процессом осаждения исследуемых клеток на дно лунок 14 с помощью микроскопа или отслеживать данный процесс с помощью иных оптических устройств.
Для удаления жидкости из лунок 14 после завершения инкубации тест-системы с клеточной суспензией возможно использование дополнительных приспособлений 2 типов: приспособления 24 (фиг.4) или приспособления 25 (фиг.5).
Приспособление 1-го типа 24 (фиг.4) имеет корпус 26, в котором находится пневматическая камера 27, с которой сообщаются трубки 28 и патрубок 29, снабженный эластичным уплотнительным покрытием. Трубки 28 имеют такой диаметр и расположены таким образом, что могут свободно входить в лунки 14 тест-системы. Патрубок 29 предназначен для соединения с автоматической пипеткой (дозатором). С помощью автоматической пипетки осуществляется изменение давления в пневматической камере 27. За счет этого происходит всасывание жидкости в трубки 28 или ее выталкивание из них. Длина трубок 28 такова, что при их вхождении в лунки 14 они не касаются дна. Это необходимо для того, чтобы исключить повреждение поверхности тестовых участков 5 и контрольных участков 7-10 подложки 1. При установке данного приспособления на тест-систему, его корпус 26 упирается в прижимающую раму 21 и ограничивает глубину погружения трубок 28 в лунки 14.
Приспособление 2-го типа 25 (фиг.5) имеет корпус 30, трубки 31, которые могут быть введены в лунки 14 тест-системы. В трубках 31 размещены поршни 32, за счет перемещения которых обеспечивается всасывание или выталкивание жидкости. Поршни 32 с помощью штоков 33 соединены с пластиной 34, которая подвижно закреплена в раме 35, соединенной с корпусом 30. Движение пластины 34 возможно вдоль одной оси. Пластина 34 крепится к стержню 36, который соединен с пружиной 37. На стержне 36 крепится рукоятка 38. Пружина 37 установлена таким образом, что при отсутствии давления на рукоятку 38 отводит стержень 36 (а вместе с ним пластину 34, штоки 33 и поршни 32) в крайнее положение. При этом происходит всасывание жидкости в трубки 31, если они были помещены в жидкость. При надавливании на рукоятку 38 и обратном ходе стержня 36 происходит выталкивание жидкости из трубок 31. Приспособление оснащено механизмом 39, регулирующим расстояние, на которое может быть перемещен стержень 36. За счет этого обеспечивается регуляция объема жидкости, набираемой в трубки 31. Длина трубок 31 такова, что при их вхождении в лунки 14 они не касаются их дна. При установке данного приспособления на тест-систему, его корпус 30 упирается в прижимающую раму 21 и ограничивает глубину погружения трубок 31 в лунки 14.
Приспособление 1-го типа имеет более простую конструкцию, но приспособление 2-го типа обеспечивает более точное дозирование забираемого объема жидкости.
Данные приспособления целесообразно использовать для работы с тест- системами, объем лунок 14 которых превышает 3 мкл. В некоторых случаях целесообразно использовать приспособления 24 или 25 для заполнения лунок 14 тест-системы. В этих случаях приспособление, содержащее подвижную пластину 17, емкость 20 и прижимающую раму 21, для заполнения лунок 14 не используется, а пластина 17 выполняет только роль крышки, закрывающей лунки.
В некоторых случаях после удаления жидкости в лунки 14 может быть внесены растворы меченных антител или иных реагентов.
Кроме того, приспособление 24 или 25 может быть использовано для дополнительного внесения в лунки 14 растворов различных реагентов (например, растворов меченных антител, в случае определения коэкспрессии антигенов), которое может быть осуществлено после удаления жидкости из лунок 14 (с помощью тех же приспособлений). Данная дополнительная манипуляция осуществляется только в тех случаях, когда этого требуют условия проведения анализа (эксперимента).
Тест-система работает следующим образом.
В емкость 20 подвижной пластины 17 пипеткой вносят необходимое количество клеточной суспензии. Перемещают пластину 17 по поверхности съемной пластины 12. При этом происходит заполнение лунок 14 клеточной суспензией из емкости 20. Затем устанавливают пластину 17 таким образом, чтобы она закрывала все лунки 14 и выполняла роль крышки. Осуществляют инкубацию тест системы с клеточной суспензией. При этом клетки оседают на дно лунок 14. Происходит взаимодействие осевших клеток с поверхностью подложки 1 в области тестовых участков 5 и контрольных участков 7-10. При этом происходит специфическое связывание клеток, имеющих на своей поверхности молекулы, способные взаимодействовать с молекулами веществ иммобилизованных в участках 5, 8-10 подложки 1. Клетки, не имеющие на своей поверхности данных молекул, связываются неспецифически с поверхностью этих участков со значительно меньшей прочностью. Для определения момента осаждения клеток (образования на дне лунок монослоя клеток) может быть использовано, например, микроскопическое исследование. В этом случае после заполнения лунок 14 тест систему размещают на предметном столике инвертированного микроскопа. Возможно также использование других способов оптической детекции.
После осаждения клеток снимают подвижную пластину 17 и прижимающую рамку 21. При необходимости жидкость из лунок удаляют с помощью приспособления 24 или приспособления 25. В ряде случаев эту манипуляцию не осуществляют. В некоторых других случаях после удаления жидкости из лунок 14 может осуществляться введение в них растворов реагентов (также с помощью приспособления 24 или 25) с последующим проведением инкубации и дальнейшим удалением жидкости.
Затем тест-систему помещают в емкость с изотоническим буферным раствором, аккуратно отделяют пинцетом съемную пластину 12. Осуществляют отмывку от неспецифически связавшихся клеток. Для этого подложку 1 (закрепленную на прозрачной пластине 3) ополаскивают буферным раствором или несколько раз погружают в емкость с буферным раствором и извлекают из нее. Контроль качества отмывки осуществляют, например, путем микроскопического исследования. При этом связанные клетки должны отсутствовать в области контрольных участков 7, но еще оставаться в области контрольного участка 10. Затем осуществляют считывание результата, для этого получают изображение всей рабочей области 4 подложки 1 (например, с использованием сканирования) или изображение каждого из участков 5, 7-10 по отдельности (например, путем микрофотографирования). Определяют плотность связывания клеток в данных участках (отношение количества связавшихся клеток к площади поверхности). Исходя из полученных значений может быть рассчитано содержание в исследуемой суспензии клеток, имеющих каждый из определяемых видов поверхностных молекул.
Перед проведением считывания результата может быть выполнена фиксация связанных клеток (например, путем обработки метанолом), в некоторых случаях может быть выполнено окрашивание цитологическими красителями или обработка реагентами для цитохимического исследования. Для обеспечения длительного сохранения морфологических характеристик связанных клеток и возможности проведения их многократного микроскопического исследования с использованием иммерсионных объективов может быть приготовлен долговременный препарат с использованием канадского бальзама или заменяющих его составов, применяемых при цитологических и гистологических исследованиях.
Использование данной тест системы позволяет не только оценивать содержание в исследуемой суспензии клеток, имеющих определяемые поверхностные молекулы, но и проводить разнообразные варианты дополнительных исследований (морфологическое, цитохимическое, иммуноцитохимическое и другие исследования) тех же самых клеток с использованием микроскопии.