СИСТЕМА И СПОСОБ СБОРА ОБРАЗЦА НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ
SYSTEM AND METHOD OF COLLECTING A NUCLEIC ACID SAMPLE

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА TO СВЯЗАННЫЕ ЗАЯВКИ
По этой заявке испрашивают приоритет предварительной заявки США с серийным № 62/082,830, озаглавленной «BIOMOLECULE EXTRACTION SYSTEM», поданной 21 ноября 2014 года, которая, таким образом, включена посредством ссылки в полном объеме.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Существующие системы и способы сбора, экстрагирования и обнаружения нуклеиновой кислоты из биологических образцов для тестирования типично являются сложными, требуют нескольких стадий с участием технически обученного персонала и не оптимизированы для обработки образцов с большими объемами или для предотвращения перекрестной контаминации при обработке образца и стабилизации для отгрузки.
Различные текучие вещества организма, такие как кровь, плазма, сыворотка, цереброспинальное текучее вещество (CSF), плевральный выпот, асцит, моча и т. д., содержат короткоцепочечные фрагменты нуклеиновых кислот (NA), а именно, бесклеточные нуклеиновые кислоты (cfNA) или циркулирующие нуклеиновые кислоты (cNA). Измененные нуклеиновые кислоты, происходящие эндогенно из опухоли или «экзогенно» из плода или патогенной инфекции внутри организма, могут присутствовать в виде cfNA в периферической крови в очень низких концентрациях и могут быть поддающимися обнаружению и, кроме того, отличимыми от нормальной cfNA организма-хозяина. Экстрагирование достаточного количества этой cfNA из плазмы или сыворотки для тестирования требует обработки относительно большого объема текучего вещества, что влечет за собой неизбежные технические проблемы в клинических диагностических условиях. Соответственно, в данной области существует потребность в новых способах, чтобы решать такие проблемы.
Такие образцовые способы обнаружения, например, туберкулеза, описаны в рассматриваемой опубликованной заявке PCT WO2012135815, поданной автором изобретения в этой заявке, и включены в настоящий документ посредством ссылки. Однако такое тестирование может быть наиболее полезным в регионах мира, где отсутствует быстрый доступ к дорогостоящему технологическому оборудованию, используемому в анализе образцов. Соответственно, в данной области существует потребность в системе и способе сбора, которые позволят захватывать нуклеиновую кислоту в достаточных количествах из биологических образцов большого объема, чтобы проводить последующий анализ, чтобы предотвращать контаминацию из среды и от операторов и чтобы сохранять и отгружать нуклеиновую кислоту с тем, чтобы нуклеиновую кислоту можно было собирать в месте оказания медицинской помощи с использованием относительно не дорогостоящего оборудования и затем отгружать в стабилизированной форме в центральное местоположение для дальнейшей обработки и анализа.
Известны различные способы экстрагирования, подходящие для выделения циркулирующей ДНК или РНК из больших объемов биологических жидкостей, такие как те, которые описаны, например, в QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook (2-е издание, 02, 2011, Qiagen), и усовершенствованный способ экстрагирования на центрифужной колонке, описанный в патенте США № 8685742, на основании технологических принципов из патента США № 5234809 (технология Boom). В патенте США № 5346994 описана технология способа экстрагирования органической жидкости с использованием фенола-хлороформа. Оба эти способа можно использовать для экстрагирования из большого объема, например, из образцов плазмы или сыворотки, но органические реактивы токсичны, что ограничивает их использование. Для обеих указанных выше технологий нужна высокоскоростная центрифуга (>10000 g), несмотря на элюирование или преципитацию, для получения экстрагированной NA для последующего применения.
Также в патентах США №№ 7897378 и 8158349 описаны устройства и способ очистки или выделения нуклеиновых кислот из более крупных объемов образцов, включая системы, которые содержат пару взаимодействующих полых тел, через которые образцы пропускают в сосуд для сбора, причем нуклеиновые кислоты связаны со связывающим материалом в одном из полых тел. Полое тело, содержащее задержанный образец, переносят в первый принимающий сосуд для промывания, затем очищенные или выделенные нуклеиновые кислоты элюируют и собирают во второй принимающий сосуд для дальнейшего анализа. Также необходима высокоскоростная центрифуга для элюирования связанных нуклеиновых кислот из твердофазной матрицы.
В патенте США № 5234809 (Boom), например, включенном в настоящий документ посредством ссылки, раскрыт способ выделения нуклеиновых кислот, который подходит для множества различных использований. Здесь описан способ выделения нуклеиновых кислот из исходных материалов, содержащих нуклеиновые кислоты, посредством инкубации указанного исходного материала с хаотропным буфером и ДНК-связывающей твердой фазой. Хаотропные буферы, в случае необходимости, обеспечивают как лизис исходного материала, так и связывание нуклеиновых кислот с твердой фазой.
Новая система экстрагирования биологических молекул впервые описана заявителем в предварительной патентной заявке США с серийным № 61/827,244 и заявке PCT с серийным № US14/39320 («исходные заявки»), обе они включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте. Исходные заявки раскрывают изобретения, связанные со способами и системами обработки биологического образца, а именно лизирования, связывания, промывания, стабилизации и элюирования биологических молекул биологического образца. Один из вариантов осуществления включает систему для сбора образца нуклеиновой кислоты, система содержит вместилище, которое образует внутренний объем, съемную крышку для вместилища и имеет соединительный интерфейс в соединении по текучей среде с соединительным портом образца в крышке, фильтровальную колонку, адаптированную для съемного прикрепления к соединительному интерфейсу крышки вместилища, контейнер для сбора образца и контейнер для отгрузки. Раскрыты различные другие компоненты системы. В исходных заявках также раскрыт способ сбора образца нуклеиновой кислоты, способ включает стадии: (a) предоставление системы сбора, описанной в настоящем документе; (b) сбор объема образец-содержащего текучего вещества в контейнере для сбора образца; (c) соединение контейнера для сбора образца со вместилищем через порт сбора образца; (d) пропускание объема образец-содержащего текучего вещества из контейнера для сбора образца через фильтровальную колонку, тем самым собирая образец на подложке и собирая остаток во вместилище; (e) размещение контейнера для отгрузки открытым концом поверх фильтровальной колонки, зацепление фильтровальной колонки с контейнером для отгрузки и открепление фильтровальной колонки от крышки вместилища и (f) временное запечатывание контейнера для отгрузки с использованием съемной крышки. Раскрытые способы, в частности, можно использовать для обработки собранной нуклеиновой кислоты в минимально оборудованных медицинских учреждениях, таких как небольшие, удаленные и/или периферийные клиники, и отгрузки собранных образцов в более хорошо оборудованную центральную лабораторию для дальнейшего анализа собранных образцов для обнаружения заболевания, например, для обнаружения латентного туберкулеза.
Поскольку молекулярные технологии быстро развиваются, обнаружение биологических маркеров циркулирующих бесклеточных нуклеиновых кислот (NA), включая бесклеточную ДНК и бесклеточную РНК (cfDNA и cfRNA), соответственно, или вместе (cfNA или cNA) в плазме, сыворотке и других текучих веществах организма возникает в качестве менее инвазивного средства для диагностирования и прогнозирования пренатальных генетических аномалий, злокачественных опухолей, отторжения при трансплантации солидных органов и инфекционных заболеваний, таких как туберкулез, по раннему обнаружению. Однако из-за чрезвычайно низкого относительного содержания в текучих веществах организма, cfNA в качестве клинического анализируемого вещества все еще сталкивается с различными техническими проблемами, которые влияют на качество, количество образца и, следовательно, конечные диагностические результаты. Технические проблемы включают: 1) сбор/транспортировку образца, 2) обработку образца и 3) потенциальную возможность использования cfRNA для мониторинга состояния заболевания.
Проблемы сбора/транспортировки образца
Наиболее доступными источниками cfNA являются плазма или сыворотка (вместе PS) периферической крови. Концентрации cfNA в плазме нормальных индивидуумов очень низки, в диапазоне 1,8-44 нг/мл или приблизительно 500-10000 геномных эквивалентов/мл (гэ/мл). Следовое количество cfNA опухолевого происхождения или циркулирующей опухолевой NA (ctNA) в PS, если присутствует, может составлять лишь от одной до нескольких сотен копий на мл или приблизительно 0,005-0,01% от общей cfNA (4). Для того чтобы собирать достаточно целевой ctNA часто необходим большой объем PS, т. е. 1-5 мл. Кроме того, высвобождение даже небольшой процентной доли клеточной ДНК или РНК из крови будет вызывать сложности при последующем анализе целевой cfNA. Для того чтобы предотвращать разрушение cfNA и высвобождение геномной NA (gNA) из клеток крови, отделение PS от клеток крови типично должно проходить в течение 2 часов, 2-4 часов или в течение 7 часов после флеботомии, исходя из различных протоколов. Для отделения обычно нужна 1 стадия или 2 стадии центрифугирования при 1000-2000 g в течение 10 минут и необязательно 5000-16000 g. Отделение сыворотки посредством простого центрифугирования после свертывания крови может быть более легким, но может вносить предсказуемую степень лизиса клеток из-за свертывания, что может незначительно влиять на конечный анализ. Хотя концентрации целевой ctDNA в плазме и сыворотке приблизительно одинаковы, отмечено, что сыворотка содержит более крупные фрагменты gDNA, возможно высвобожденные из клеток крови во время свертывания.
TM
Другой проблемой при сборе образцов является температура. PS после отделения от клеток крови типично нужно хранить при -20°C (в течение короткого времени) или -80°C (в течение длительного времени). Места сбора образцов, такие как места флеботомии, не всегда находятся в непосредственной близости от средств молекулярной диагностики. Таким образом, типично нужно поддерживать криосохранение замороженной PS во время транспортировки. Новые устройства сбора крови, Cell-Free DNA BCT (BCT) и Cell-Free RNA BCT, разработаны в Streck Inc. (NE). Они предотвращают высвобождение клеточной ДНК и РНК и стабилизируют cfDNA и cfRNA в крови при температуре окружающей среды в течение вплоть до 7 суток и 2 суток, соответственно. Технология BCT частично решает проблемы задержки разделения и условий транспортировки. Однако, она все же сталкивается с трудностями при обработке образцов, подлежащей осуществлению в средствах молекулярной диагностики, как описано ниже.
Проблемы с обработкой образцов
Клинические применения тестирования cfNA также затруднены обработкой образца, т. е. эффективным экстрагированием, обогащением и извлечением следовой хрупкой cfNA из большого объема одних и тех же текучих веществ. Экстрагирование и очистка нуклеиновой кислоты от биологических материалов в целом основаны на двух подходах: органическое экстрагирование и твердофазная абсорбция. Органическое экстрагирование, а именно способ с гуанидина тиоцианатом-фенолом/хлороформом, можно применять для биологических жидкостей больших объемов, таких как PS, но оно не пригодно для использования в клинической лаборатории из-за токсичности реактивов и множества стадий ручной обработки. Твердофазное экстрагирование, на основании технологии Boom, постепенно развилось в два основных формата: технологии с колонкой (или центрифужной колонкой) и магнитными бусами. Базовый принцип состоит в том, что высоко концентрированные хаотропные средства нарушают вторичные и третичные структуры белков и липидных комплексов, инактивируют ферменты, включая ДНК- и РНК-нуклеазы, и высвобождают нуклеиновые кислоты из связанных микроструктур (лизирование). Добавление спирта в лизат облегчает связывание свободных нуклеиновых кислот с матрицей абсорбента (связывание). В формате колонки (центрифужной колонки) связывающую лизат смесь добавляют в микроколонку и пропускают через пористую матрицу (т. е. мембрану из диоксида кремния) посредством центрифугирования или вакуума. ДНК или РНК в смеси абсорбируют на матрице и удаляют остаток (отходы). Затем типично осуществляют 1-2 стадии промывания для того, чтобы удалять остаточный загрязнитель (промывание). Наконец, связанные нуклеиновые кислоты высвобождают из матрицы и собирают в новую пробирку посредством центрифугирования (элюирование). Автоматизация работы центрифужной колонки не является легкой; однако в последнее время разработан автоматизированный прибор (QIAcube, Qiagen) в частности, для центрифужных колонок. Обработка образца с использованием центрифужной колонки типично требует повторения центрифугирования от четырех до пяти раз, например, с использованием высокоскоростной настольной центрифуги. С использованием вакуумного аппарата центрифугирование можно уменьшать до одной стадии (элюирование), но все равно необходимо множество пипетирований. Центрифужные колонки в целом разрабатывают для того, чтобы обрабатывать образцы небольшого объема, часто <300 мкл. Для экстрагирования cfDNA или ctDNA плода из крови матери широко используют популярный набор QIAamp DNA Blood Mini Kit (DBM, Qiagen). Полагают, что объемная емкость центрифужных колонок ограничивает их использование при экстрагировании cfNA в исследованиях, где нужна чувствительность.
Другой специально разработанный набор для экстрагирования cfNA представляет собой Qiagen QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit (набор Q-CNA), который содержит промежуточную пробирку, как описано в патенте США № 8685742, содержание которого включено, таким образом, посредством ссылки. Набор Q-CNA отличается несколькими преимуществами: 1) он обладает расширяемой емкостью для объема образца (1-5 мл), 2) в нем задействован вакуум и, в частности, 3) его формулируют для извлечения коротких фрагментов cfNA в PS. В недавнем жестком сравнительном исследовании обнаружено, что извлечение короткой ДНК (115 п. о. и 461 п. о.) с использованием набора Q-CNA составляет 3-4 раза больше такового с использованием набора Qiagen's DBM (24). Хотя набор Q-CNA получил растущую популярность для экстрагирования cfNA для применения в количественной ПЦР (qPCR), цифровой ПЦР (dPCR) и секвенировании следующего поколения (NGS) при диагностировании опухолей и неинвазивных пренатальных тестах (NIPT), все еще сохраняется несколько проблем, которые препятствуют его широкому использованию в клинической обстановке: 1) множество повторных стадий пипетирования порождает вопрос о возможном ошибочном пипетировании и перекрестной контаминации; 2) Q-CNA выполнен с возможностью использования с вакуумным манифольдом QIAvac™ 24 Plus (Qiagen), работающим от вакуумного насоса, так что при работе на пробирки с образцами воздействует воздух и перемежающееся отрицательное давление; следовательно, может происходить контаминация из окружающей среды; 3) кроме того, нестабильная скорость потока и случайные засорения пористой мембраны из диоксида кремния связывающей лизат смесью могут вызывать неравномерный поток и/или могут полностью блокировать сквозной поток; 4) наконец, для того, чтобы элюировать связанную твердой фазой CNA, все еще не избежать высокоскоростного центрифугирования. Таким образом, все указанные выше способы требуют определенного оборудования и подачи электричества.
Технология магнитных бус (MB), покрытых диоксидом кремния, основана на том же принципе и имеет схожие стадии, как описано выше. В отличие от колоночного формата, в котором абсорбент фиксируют в колонке, магнитные бусы диспергируют в лизате и собирают с использованием магнитного поля. Операция обработки MB относительно легка из-за автоматизации. Несколько производителей предоставляют множество моделей, приспособленных к конкретным нуждам, но большинство из них имеют объемную емкость образца, ограниченную 1 мл.
Таким образом, сохраняется потребность в системах и способах, которые направлены на одну или несколько приведенных выше проблем и которые улучшают и предусматривают альтернативные варианты осуществления систем сбора, описанных в исходных заявках.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Один аспект изобретения содержит систему для сбора биологических молекул. В одном из вариантов осуществления система содержит сборочный узел экстрактора, который содержит верхнюю крышку, ядро экстрактора, адаптер ядра экстрактора, корпус экстрактора, имеющий внутренний объем, и нижнее кольцо крышки. Верхнюю крышку адаптируют для съемного закрепления на корпусе экстрактора с использованием нижнего кольца крышки, верхняя крышка имеет внутреннюю сторону, обращенную ко внутреннему объему корпуса экстрактора, и внешнюю сторону, обращенную от корпуса экстрактора. Верхняя крышка содержит соединительный порт образца, который обеспечивает сообщение между внутренней стороной и внешней стороной, крышка не имеет других отверстий, осуществляющих сообщение между внутренней стороной и внешней стороной. Соединительный порт образца содержит первый блокировочный компонент для разъемного блокирования соединительного порта образца со взаимодействующим вторым блокировочным компонентом. Внутренняя сторона крышки содержит соединительный интерфейс в соединении по текучей среде с соединительным портом образца. Ядро экстрактора адаптируют для съемного прикрепления к соединительному интерфейсу верхней крышки и оно имеет открытый конец выше по потоку, открытый конец ниже по потоку и внутренний проход между ними, который содержит подложку для сбора биологических молекул. Корпус экстрактора имеет первый открытый конец, выполненный с возможностью сопряжения с верхней крышкой, и второй конец, который содержит отверстие, выполненное с возможностью принимать адаптер ядра экстрактора. Адаптер ядра экстрактора имеет открытый конец выше по потоку для сопряжения с концом ниже по потоку у ядра экстрактора, выступ ниже по потоку, выполненное с возможностью выступать через отверстие в корпус экстрактора, открытый конец ниже по потоку, и внутренний проход между открытым концом выше по потоку и открытым концом ниже по потоку.
Система дополнительно может содержать шприц, который содержит второй блокировочный компонент, адаптированный для соединения с первым блокировочным компонентом порта сбора образца в верхней крышке, и контейнер для отгрузки, который образует объем, адаптированный для того, чтобы вмещать ядро экстрактора. Контейнер для отгрузки адаптируют для разъемного зацепления ядра экстрактора для его открепления от соединительного интерфейса верхней крышки, контейнер для отгрузки дополнительно содержит съемную крышку для временного закупоривания ядра экстрактора внутри контейнера для отгрузки.
Система сбора дополнительно может содержать один или несколько буферов реактивов для обработки образца, например, лизирующий буфер, связывающий буфер, промывающий буфер и элюирующий буфер, или контейнеры для сбора отходов, один или несколько из этих контейнеров включают гибкий контейнер, который имеет расширяемый объем. Например, гибкий контейнер может представлять собой пластмассовый мешок, который дополнительно может иметь один или несколько элементов жесткости, встроенных в мешок для обеспечения структурной прочности для мешка, таких как элементы жесткости, которые обеспечивают достаточную структуру, чтобы позволять гибкому контейнеру оставаться в вертикальном положении при заполнении или частичном заполнении жидкостью. В частности, один или несколько гибких контейнеров могут содержать контейнер для обработки образца, который имеет герметизирующую крышку и отверстие в крышке такого размера, чтобы принимать отрезок трубки, вставленный через герметизирующую крышку, в соединении по текучей среде со внутренней частью гибкого контейнера. Отрезок трубки, вставленный через герметизирующую крышку гибкого контейнера, может иметь первый конец, расположенный внутри гибкого контейнера, и второй конец, который содержит первый блокировочный компонент, адаптированный для соединения со вторым блокировочным компонентом шприца. Отверстие в герметизирующей крышке дополнительно может быть такого размера, чтобы принимать конец ниже по потоку у экстрактора адаптер.
Система сбора дополнительно может содержать отталкивающее средство. Процессы элюирования известного уровня техники для абсорбированных нуклеиновых кислот из пористой подложки требуют сначала добавления небольшого объема элюирующего буфера на подложку, чтобы высвобождать связанные нуклеиновые кислоты из подложки, и сбор элюата через высокоскоростное центрифугирование или продувание воздухом. Для высокоскоростного центрифугирования нужна дорогостоящая центрифуга и подача электричества. Продувание воздухом может вызывать значительную потерю образца. Способ, который включает сначала добавление элюирующего буфера на подложку и затем введение гидрофобного отталкивающего текучего вещества в ядро экстрактора, ведет к тому, что большинство водного элюирующего буфера с высвобожденными нуклеиновыми кислотами будет вынесено из пористой подложки с тем, чтобы их можно было легко собирать.
Другой аспект изобретения включает способ сбора образца биологических молекул. Способ включает стадии предоставления системы для сбора биологических молекул, как рассмотрено в настоящем документе, затем сбора объема образец-содержащего текучего вещества в шприц, соединения шприца со сборочным узлом для экстрагирования через порт сбора образца и соединения конца ниже по потоку у экстрактора адаптер с герметизирующей крышкой контейнера для обработки образца; и пропускания объема образец-содержащего текучего вещества из шприца через ядро экстрактора, тем самым собирая образец на подложке и собирая остальную часть в контейнере для обработки образца. Стадию пропускания объема образец-содержащего текучего вещества из шприца через ядро экстрактора необязательно можно повторять один или несколько раз, и способ также может содержать необязательно выполнение одной или нескольких стадий промывания. Способ дополнительно может включать стадии, после сбора образца на подложке ядра для экстрагирования, элюирования регидратированного образца посредством отталкивающего средства; или размещения контейнера для отгрузки открытым концом поверх ядра для экстрагирования, введения в зацепление ядра для экстрагирования с контейнером для отгрузки, открепления ядра для экстрагирования от верхней крышки и временного закупоривания контейнера для отгрузки с использованием съемной крышки. Таким образом, система может устранять потребность в специальном оборудовании и электричестве для обработки образца, что делает ее более подходящей для использования в сельских или удаленных местах оказания медицинской помощи (POC). Контейнер для отгрузки затем можно транспортировать в условиях окружающей среды без контролируемого климата и после этого способ дополнительно может включать обработку биологических молекул, собранных в ядре для экстрагирования, для обнаружения заболевания или инфекционных патогенов, таких как скрытые инфекции, например, туберкулез, и, в частности, латентный туберкулез.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1A изображен вид в перспективе сбоку образцовой крышки вместилища.
На фиг. 1B изображен вид в поперечном разрезе образцовой крышки вместилища с фиг. 1A.
На фиг. 2 изображена образцовая фильтровальная колонка.
На фиг. 3 изображено сечение образцовой фильтровальной колонки/ядра для экстрагирования с фиг. 2.
На фиг. 4 представлен разборный вид фильтровальной колонки с фиг. 2 и крышки вместилища с фиг. 1A-1B, который показывает, как они сопрягаются друг с другом, что идентично тому, как ядро для экстрагирования с фиг. 9A-9B сопрягается с верхней крышкой с фиг. 8A-8C.
На фиг. 5 изображена крышка вместилища с фиг. 1A-1B, прикрепленная к образцовому вместилищу.
На фиг. 6A изображена нижняя часть образцового контейнера для отгрузки по новому варианту осуществления.
На фиг. 6B проиллюстрировано, как образцовый контейнер для отгрузки с фиг. 6A садится поверх образцовой фильтровальной колонки или ядра экстрактора для отвинчивания их от образцовой крышки вместилища или верхней крышки.
На фиг. 6C представлено изображение сечения верхней части образцового контейнера для отгрузки.
На фиг. 6D представлено изображение сечения нижней части образцового контейнера для отгрузки с фиг. 6A, закупоренной посредством верхней части образцового контейнера для отгрузки с фиг. 6C.
На фиг. 6E представлен вид в перспективе закупоренного контейнера для отгрузки с фиг. 6D.
На фиг. 7A проиллюстрирован образцовый шприц, используемый в образцовой системе экстрагирования.
На фиг. 7B проиллюстрирован образцовый сборочный узел экстрактора, используемый в образцовой системе экстрагирования.
На фиг. 7C и 7D проиллюстрирован вид в перспективе сверху и вид в продольном сечении, соответственно, образцового пластмассового мешка для обработки образца/содержащего реактив для использования в образцовой системе экстрагирования.
На фиг. 8A-8C проиллюстрирован вид в перспективе сверху, вид сбоку и вид в перспективе снизу, соответственно, образцовой верхней крышки образцового сборочного узла экстрактора.
На фиг. 9A-9C проиллюстрирован вид в перспективе сверху, вид в продольном сечении и вид в перспективе снизу, соответственно, образцового ядра экстрактора.
На фиг. 10A-1°C проиллюстрирован вид в перспективе сверху, вид сбоку и вид в перспективе снизу, соответственно, образцового адаптера ядра для экстрагирования.
На фиг. 11A-11C проиллюстрирован вид в перспективе сверху, вид сбоку и вид в перспективе снизу, соответственно, образцового корпуса экстрактора.
На фиг. 12A-12C проиллюстрирован вид в перспективе сверху, вид в продольном разрезе и вид в перспективе снизу, соответственно, образцового нижнего кольца крышки.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Системы, раскрытые в исходных заявках
Образцовая система, описанная в исходных заявках, содержит вместилище, такое как вместилище 400 с фиг. 5, которое образует внутренний объем. Несмотря на то, что показано с образцовой геометрией, изобретение не ограничено каким-либо конкретным размером и геометрической формой вместилища. Как рассмотрено в настоящем документе далее, в усовершенствованном варианте осуществления вместилище может содержать гибкий мешок, такой как показано на фиг. 7C и 7D. Вариант осуществления, описанный в исходной заявке, имеет съемную крышку 101, такую как образцовый вариант осуществления, изображенный на фиг. 1A-1C, который имеет внутреннюю сторону 107, обращенную ко внутреннему объему вместилища, и внешнюю сторону, обращенную от внутреннего объема. На фиг. 1A представлена внешняя сторона крышки. Крышка имеет порт 105 сапуна, такой как обхватываемое люэровское скользящее соединение, обеспечивающее сообщение между внутренней стороной и внешней стороной через проход, и соединительный порт 103 образца, обеспечивающий сообщение между внутренней стороной и внешней стороной, через проход. В усовершенствовании относительно системы из исходной заявки, рассмотренном в настоящем документе далее, верхняя крышка 900 по существу идентична верхней крышке 101, но без порта 105 сапуна. Соединительный порт образца содержит первый блокировочный компонент, такой как люэровское блокирующее соединение 120, для разъемного блокирования соединительного порта образца на взаимодействующем втором блокировочном компоненте контейнера для переноса образца (не показано), такого как шприц. Оба порта 120 и 105 можно легко открывать или закрывать крышками или пробками с люэровской посадкой (не показано). Когда прикладывают давление сверху вниз к поршню шприца, соединенному с портом 120, чтобы заставлять жидкость двигаться, порт 105 открывают для того, чтобы сделать возможным выход вытесненного воздуха из вместилища 400. Когда вакуум используют для того, чтобы заставлять жидкость двигаться из соединенного источника (которым все еще может быть шприц), порт 105 соединяют с источником вакуума. Внутренняя сторона крышки содержит соединительный интерфейс 108 в соединении по текучей среде с соединительным портом 103 образца. Крышка может быть резьбовой со внутренней резьбой 110 для навинчивания на вместилище, имеющее наружную резьбу (не показано), несмотря на то, что можно использовать любое функциональное соединение между крышкой и вместилищем. Как рассмотрено в настоящем документе далее, для усовершенствования системы используют гибкие контейнеры 7C и 7D с расширяемым объемом вместо жесткого, нерасширяемого контейнера 400, что устраняет необходимость порта 105 сапуна.
Фильтровальную колонку с матрицей для твердофазного экстрагирования внутри, такой как силикагелевая мембрана, спеченная пористая стеклянная фритта или стекловолоконная фильтровальная бумага, такую как образцовая фильтровальная колонка 200, изображенная на фиг. 2 и 3, адаптируют для съемного прикрепления к соединительному интерфейсу крышки вместилища. Например, как показано на фиг. 1B, соединительный интерфейс 108 может иметь внутреннюю резьбу 109, которую сопрягают с наружной резьбой 220 на фильтровальной колонке 200. Фильтровальная колонка имеет открытые концы 202 и 204 и внутренний проход 206 между ними, содержащий подложку 212 для сбора нуклеиновой кислоты. Фильтровальную колонку также можно обозначать как «полое тело», поскольку ее конструируют для того, чтобы пропускать текучее вещество через нее без задерживания текучего вещества в ней таким путем, которым текучее вещество задерживают в сосуде или вместилище. Подложка 212 фильтровальной колонки может быть смежной с пористой фриттой 214, а удерживающее кольцо 210 может создавать фрикционное зацепление с внутренней частью колонки, чтобы удерживать подложку и фритту в положении, смежном с шейкой фильтровальной колонки. Ядро 300 для экстрагирования, описанное более подробно в настоящем документе далее, может быть по существу идентичным фильтровальной колонке 200, по меньшей мере в отношении наружной резьбы, которую сопрягают с соединительным интерфейсом верхней крышки, и в отношении подложки, фритты и удерживающего кольца.
2
Подложка 212 может содержать колоночную связывающую матрицу, которая содержит твердую матрицу, которая позволяет текучему веществу проходить через матрицу. В определенных аспектах матрица является высоко пористой с тем, чтобы максимизировать площадь поверхности, экспонируемой для буферных растворов, и, тем самым, максимизировать связывающую способность матрицы. Матрицу можно выполнять из различных материалов. В определенных конкретных вариантах осуществления, связывающая матрица может представлять собой материал диоксида кремния (сформированный, в первую очередь, из SiO), такой как стеклянное волокно, бусы из диоксида кремния, силикагель, спеченная пористая стеклянная фритта и т. д. Известны многие коммерческие поставщики матриц из диоксида кремния, таких как, например, стекловолокные фильтры типа GF/A, GF/B, GF/C, GF/D и GF/F, производимые в Whatman (NJ). Известно, что такие фильтры, в частности, используют в очистке молекул нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления можно применять различные твердые матрицы, такие как ионообменные, аффинные матрицы и матрицы с модифицированной поверхностью, подходящие для определенного экстрагирования и разделения биологических молекул. Связывающая матрица может представлять собой какой-либо материал, в который можно встраивать частицы или волокна материала, связывающего нуклеиновые кислоты. Материал матрицы в целом проникаем для жидкостей с тем, чтобы образец мог проходить через матрицу, нуклеиновые кислоты контактировали и связывались с материалом, связывающим нуклеиновые кислоты, и другие компоненты образца могли покидать матрицу. Связывающая матрица может содержать какой-либо несущий материал, известный в данной области, включая материалы, выбранные из группы, состоящей из кремнийсодержащих материалов, силикагеля, стекла, цеолита, оксида алюминия, диоксида титана, диоксида циркония, каолина, гелеобразного диоксида кремния, магнитных частиц, спеченной пористой стеклянной фритты и керамики или полимерных несущих материалов. Материал, связывающий нуклеиновые кислоты, может представляют собой любой материал, с которым связываются (типично нековалентно) нуклеиновые кислоты в определенных условиях, тогда как другие вещества в образце в этих условиях не связываются. Связывание нуклеиновых кислот типично обратимо, так что нуклеиновые кислоты можно впоследствии снова элюировать из материала посредством изменения условий.
В одном из вариантов осуществления колонка 200 может быть схожа по геометрии с колонкой Mobicol, доступной в Boca Scientific (FL), или может представлять собой специально модифицированную или специально изготовленную ее версию. Конструкцию с такой геометрией можно центрифугировать в микроцентрифуге, и она легко допускает обработку образцов с большим объемом с использованием шприца. Пористая фритта 214 может содержать инертную пластмассу с размером пор 10-90 мкм. Твердая матрица для экстрагирования (подложка) может содержать фильтровальную бумагу GF/D (Whatman, NJ), например, выполненную выбиванием дисков из фильтровальной бумаги, которые помещаются внутри диаметра колонки. Два или больше слоев фильтровальных дисков можно помещать поверх фритты. Упорное кольцо (Ring-Store, WA), такое как кольцо, выполненное из PTFE (например, Teflon) или пластмассы, такой как полиэтилен (PE) или полипропилен (PP), можно помещать поверх фильтровальных дисков (как видно на фиг. 2) для того, чтобы предотвращать движение фильтровальных дисков. Схожие внутренние компоненты присутствуют в ядре 300 для экстрагирования.
Открыватель и контейнер для отгрузки, такой как образцовый контейнер 650, изображенный в полностью собранной конфигурации на фиг. 6E, содержит нижнюю часть 600 и сопрягаемую верхнюю часть 610. Взаимодействие нижней части и верхней части образует объем, адаптированный для того, чтобы вмещать фильтровальную колонку для отгрузки. Нижняя часть 600 контейнера для отгрузки имеет открытый верх, и его адаптируют для разъемного зацепления с фильтровальной колонкой для открепления ее от соединительного интерфейса крышки вместилища. Например, фильтровальная колонка может иметь язычок 222, показанный на фиг. 2, или 362, показанный на фиг. 6B, или ядро 300 для экстрагирования может иметь язычок 360, как показано на фиг. 9C, любой из которых выполнен с возможностью зацепления с помощью выреза 602 с фиг. 6A. Закрытый контейнер для отгрузки герметизируют от окружающей среды для того, чтобы препятствовать контаминации и влаге, которые могут вызывать ускоренное разрушение (гидролиз) нуклеиновой кислоты, в частности РНК. Закрытый контейнер для отгрузки дополнительно может содержать предварительно упакованный десикант, который создает или поддерживает состояние сухости (десикации), такой как гранулярная или зернистая форма силикагеля, в нем, такой как десикант 612, изображенный в верхней части контейнера на фиг. 6C и 6D. Местоположение десиканта также может быть в нижней части контейнера, и оно не ограничено каким-либо конкретным местоположением или конфигурацией. Десикант может содержать любой подходящий материал, известный в данной области, для обеспечения и поддержания десикации, такой как, но не ограничиваясь этим, монтмориллонитовая глина, хлорид лития, активированный оксид алюминия, щелочной алюмосиликат, брикеты DQ11, силикагель, молекулярное сито, сульфат кальция или оксид кальция. Десикант может содержать индикатор влаги, который постепенно меняет свой цвет, когда он переходит из безводного (сухого) в гидратированное (влажное) состояние, такой как известно для некоторых силикагелей.
Несмотря на то, что показано с соединительным портом образца, выступающим из внешней стороны крышки с люэровским блокирующим соединением, изобретение не ограничено ни блокировочным соединением какого-либо конкретного типа, ни соединительным портом образца какой-либо конкретной конфигурации. Хотя предпочтительным является блокировочное зацепление некоторого типа между соединительным портом образца и контейнером образца, может быть предусмотрено обратимое блокировочное зацепление любого типа. Контейнер для переноса образца не показан, но может представлять собой стандартный шприц со взаимодействующим люэровским блокирующим соединением. В образцовом способе, следовательно, шприц соединяют с крышкой вместилища, и поршень шприца нажимают, чтобы проталкивать раствор, содержащий нуклеиновую кислоту, в присутствии связывающих реактивов, таких как хаотропные реактивы и спирт, для прохождения через фильтровальную колонку. Нуклеиновую кислоту, таким образом, удерживают на фильтре 212, тогда как фильтрат проходит во вместилище 400. Как указано выше, в варианте осуществления с жестким вместилищем 400 и портом 105 сапуна, поршень шприца можно нажимать вручную при открытом порте 105 или источник вакуума можно прикреплять к порту 105 так, что вакуум вызывает вдавливание поршня шприца по мере выхода раствора из шприца.
2
Хаотропные реактивы хорошо известны в данной области в качестве веществ, которые меняют вторичную, третичную и/или четвертичную структуру белков или нуклеиновых кислот, но не влияют по меньшей мере на их первичную структуру. Примерами являются гуанидин тиоцианат, гуанидин гидрохлорид, NaI, KI, тиоцианат натрия или комбинации этих веществ. Хаотропные реактивы нарушают упорядоченную структуру жидкой воды и вызывают связывание ДНК или РНК из этого водного раствора со стеклянной поверхностью. При некоторых условиях, включение спирта, такого как этанол или изопропиловый спирт, облегчает связывание NA с поверхностью. Вещества, такие как NaCl, KCl или CaCl, могут присутствовать в растворе для того, чтобы изменять ионную силу. Свойство ДНК и РНК связываться в хаотропных условиях со стеклянными поверхностями используют для того, чтобы выделять их из раствора, содержащего другие биологические материалы. После стадии связывания можно применять промывающие и очищающие буферы для того, чтобы удалять загрязнители. Связывание со стеклянной поверхностью обратимо, например, если концентрацию хаотропных реактивов уменьшают или хаотропные реактивы полностью удаляют, ДНК или РНК можно снова элюировать. Элюирующий буфер может представлять собой чистую воду без ДНКазы/РНКазы или буфер, содержащий Tris ((гидроксиметил)аминометан) и EDTA (этилендиаминтетрауксусную кислоту) в низких концентрациях, типично, 5-10 мМ и 50-100 мкМ, соответственно. Обычно, объем элюирующего буфера (EB) находится в диапазоне 50-200 мкл.
В способах известного уровня техники типично собирают элюат из фильтровальной колонки с использованием высокоскоростного центрифугирования. Для того чтобы извлечь элюат из пористой матрицы, насколько это возможно, часто необходима высокоскоростная центрифуга, т. е. имеющая относительную центробежную силу (RCF) > 10000 g. Альтернативно, в некоторых случаях можно применять продувание воздухом, однако извлекают только часть водного раствора. В одном вариант осуществления способа сбора по настоящему изобретению, гидрофобное отталкивающее средство применяют для того, чтобы собирать элюат вручную без необходимости электричества и оборудования. Подходящие гидрофобные отталкивающие средства предпочтительно имеют следующие характеристики: высокая гидрофобность, низкая вязкость, низкая удельная плотность (т. е. < 1, ниже чем плотность воды), низкое поверхностное натяжение и высокая растекаемость, несмешиваемость с водной фазой, летучесть, совместимость с обыкновенными пластмассами (или по меньшей мере с пластмассами, используемыми в системе, описанной в настоящем документе), химическая инертность и нетоксичность. К удивлению, обнаружено, что группа полидиметилсилоксанов (PDMS, силиконовое масло или силиконовая жидкость) отвечает всем этим требованиям. Вязкость полидиметилсилоксана зависит от его полимеризации, т. е. чем ниже полимеризация, тем ниже вязкость. PDMS представляют собой превосходные отталкивающие средства.
В образцовом способе, когда части 101 и 200 собирают и соединяют, как показано на фиг. 4, или когда части 410, 500, 900 и 800 сборочного узла 10 для экстрагирования собирают, как показано на фиг. 7B, после сбора образца, небольшой объем элюирующего буфера, например, 50-200 мкл, добавляют на пористую подложку через порт 103, и водный EB быстро абсорбируют в пористую матрицу. После этого, объем PDMS, например, от 0,2 до 1 мл, вводят вертикально с помощью шприца, соединенного плотно с портом 103. Гидрофобный PDMS имеет меньшую плотность, чем водный EB. Следовательно, в процессе медленной инъекции, водный EB, в том числе следовое количество, прикрепленное к поверхности пористой матрицы, вымещают с помощью PDMS и элюируют из выпуска 204 под действием гравитации. Кроме того, иглу можно прикреплять к выпуску 204 с тем, чтобы элюат можно было собирать более точно. Гидрофобный PDMS заставляет водный элюат формировать единую часть под дном пробирки для сбора, которая отделена четкой границей с верхним слоем PDMS, в силу его очень низкого поверхностного натяжения. Подходящие PDMS с низкой вязкостью включают чистые силиконовые жидкости PSF-5, 10 и 20 сСт, поставляемые Clearco Products Co., Inc. (PA).
Исходные заявки раскрывают вариант осуществления системы сбора, который дополнительно содержит вакуумную камеру (не показано). В усовершенствованиях новых вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, избегают необходимости вакуумной камеры и порта сапуна на верхней крышке, тем самым минимизируя общее количество оборудования, необходимого для того, чтобы обрабатывать образец.
Дополнительные подробности о новом варианте осуществления
Образцовый экстрактор биологических молекул по настоящему изобретению используют для обогащения и экстрагирования биологических молекул из больших объемов текучих веществ, содержащих биологические молекулы, в частности, макромолекулы, такие как нуклеиновые кислоты, белки, липиды, полисахариды. Экстрагирование основано на твердофазном экстрагировании (SPE). В целом, SPE включает подвижную систему (жидкую фазу) с целевыми биологическими молекулами и стационарную фазу (твердую фазу), содержащую поверхность, которая содержит функциональные группы с высокой аффинностью к целевым молекулам. В типичном процессе жидкая фаза, приводимая в движение положительным или отрицательным давлением или просто гравитацией, проходит через пористую твердую матрицу, которая содержит поверхность с функциональными группами, а целевые биологические молекулы абсорбируются или связываются с функциональными группами, часто обратимо, и их элюируют из матрицы на последующей стадии.
Образцовая система устройства экстрактора имеет следующие признаки: 1) закрытая система по существу свободна от контаминации; 2) выполнена с возможностью портативной или ручной работы в процессе экстрагирования, включая способность работать без приборов и работать без электричества; 3) выполнена с возможностью обработки биологических текучих веществ больших объемов, например, 1-5 мл, и обогащения вплоть до 100-кратного для молекул с низким относительным содержанием, таких как бесклеточные циркулирующие нуклеиновые кислоты из фрагментированных ДНК и РНК злокачественных опухолей, патогенов, таких как TB (туберкулезной бациллы), и ДНК плода, в плазме, сыворотке и других текучих веществах организма; 4) выполнена с возможностью стабилизировать молекулы, такие как нуклеиновые кислоты, в частности, соединения РНК, чтобы делать возможной транспортировку образца при условиях окружающей среды; 5) выполнена с возможностью элюировать экстрагированные нуклеиновые кислоты без центрифугирования; 6) выполнена с возможностью обработки образца, свободной от патогенов, в устройстве для того, чтобы получать образец для последующего применения, в случае нуклеиновых кислот, например, ПЦР, количественной ПЦР (qPCR), цифровой ПЦР (dPCR), микрочипов и секвенирования следующего поколения NGS).
Образцовая система экстрагирования, как изображено на фиг. 7A-7D, содержит сборочный узел 10 экстрактора (фиг. 7B), предпочтительно пластмассовый, набор из нескольких мешков для обработки образца/содержащих реактивы (фиг. 7C, 7D), предпочтительно пластмассовых, и защитный контейнер для открепления и транспортировки ядра для экстрагирования (фиг. 6A-6F как рассмотрено подробно выше). Систему дополнительно адаптируют для использования с одним или несколькими шприцами для ее работы или она может содержать их (фиг. 7A).
Образцовый сборочный узел 10 экстрактора имеет пять компонентов: (1) верхняя крышка 900 (фиг. 8A-8C); (2) ядро 300 для экстрагирования (фиг. 9A-9C) (по существу то же, что «фильтровальная колонка», упомянутая в раскрытии исходных заявок); (3) адаптер 410 ядра для экстрагирования (фиг. 10A-10C), идущий из ядра для экстрагирования; (4) корпус 500 экстрактора (фиг. 11A-11C); и (5) нижнее кольцо 800 крышки (фиг. 12A-12C). Верхняя крышка, как изображено на фиг. 8A-8C, имеет блокировочный соединитель 902 (такой как охватывающий соединитель люэровского блокирующего соединения) снаружи сверху нее, который адаптируют для соединения с пластмассовым одноразовым шприцом. Верхняя крышка 900, кроме того, выполнена с возможностью отсоединяемо принимать ядро 300 для экстрагирования (например, с использованием винтового соединения) на принимающем элементе 910 ядра для экстрагирования, расположенном на внутренней стороне верхней крышки. Верхняя крышка 900 по существу идентична съемной крышке 101, проиллюстрированной на фиг. 1A-1C и описанной в исходных заявках, за исключением того, что верхняя крышка 900 не имеет порта сапуна и других отверстий в крышке, обеспечивающих сообщение между внутренней и внешней поверхностью крышки, которые отличны от порта 902 образца. Таким образом, верхняя крышка 900 в целом идентична в продольном сечении крышке 101 на фиг. 1B, за исключением отсутствия порта 105 сапуна.
Ядро для экстрагирования, как изображено на фиг. 9A-9C, имеет два соединителя: соединитель 310 выше по потоку для соединения с принимающим элементом 910 верхней крышки 900 с тем, чтобы ядро для экстрагирования находилось в соединении по текучей среде с каналом, определяемым охватывающим блокировочным соединителем 902 на верхней крышке, и соединитель 320 ниже по потоку (такой как обхватываемый соединитель люэровского скользящего соединения), выполненный с возможностью соединения с адаптером 410. Ядро 300 для экстрагирования содержит фиксированную пористую твердую матрицу 340 абсорбента внутри. Как показано на фиг. 9B, в одном из вариантов осуществления упорное кольцо 330 располагает матрицу 340 абсорбента поверх пористой фритты 350. Внешняя поверхность ядра для экстрагирования имеет один или несколько элементов, таких как язычки 360 и щели 364, расположенные между язычками, для зацепления с сопрягаемым набором язычков и щелей, чтобы предоставлять механизм для приема крутящего момента, прикладываемого для того, чтобы поворачивать ядро 300 для экстрагирования, чтобы откреплять его от принимающего элемента 910 в верхней крышке 900. Например, как показано в схематическом варианте осуществления, представленном на фиг. 6A и 6B, защитный контейнер 600 имеет одну щель 602 для приема язычка 362 на ядре 300 для экстрагирования. Понятно, что вместо одного язычка и сопрягаемой щели, каждое из защитного контейнера 600 и ядра 300 для экстрагирования может иметь множество зацепляемых язычков и щелей, которые сконструированы для зацепления друг с другом, например, множество равномерно разнесенных язычков 360, изображенных на фиг. 9A и 9C.
Адаптер 410, как изображено на фиг. 10A-10C, адаптируют для работы в качестве расширения ядра для экстрагирования, когда его соединитель выше по потоку (такой как охватывающий соединитель 420 люэровского скользящего соединения) прикрепляют к соединителю 320 ниже по потоку ядра для экстрагирования. Адаптер дополнительно содержит расширенный соединитель 430 ниже по потоку, такой как охватывающий соединитель расширенного люэровского блокирующего соединения, идущий от корпуса экстрактора. Корпус 500 экстрактора, как изображено на фиг. 11A-11C, представляет собой трубчатый контейнер. Когда ядро 300 для экстрагирования прочно прикреплено к внутренней части 910 верхней крышки 900, с адаптером 410, прикрепленным к соединителю 320 ниже по потоку экстрактора 300, группа собранных компонентов выполнена с возможностью введения в и сопряжения с корпусом 500 экстрактора, причем у адаптера расширенный соединитель 430 ниже по потоку (т. е. охватывающий конец люэровского блокирующего соединения) проходит через отверстие 530 в дне корпуса экстрактора так, что соединитель 430 выходит наружу из корпуса 500 экстрактора, как показано на фиг. 7B. Внутренняя часть дна корпуса экстрактора отличается круглой кромкой 540, которую сопрягают с круглой кромкой 440 на дне адаптера.
Альтернативно, с минимальными модификациями, обхватываемый соединитель люэровского блокирующего соединения может заменять охватывающий конец люэровского блокирующего соединения адаптера 410. Изобретение не ограничено соединителями люэровского блокирующего соединения или охватываемыми или охватывающими соединителями в указанных местоположениях. В каждом случае можно использовать соединители отличающихся типов, и специалисты в данной области могут принимать во внимание то, что охватываемые и охватывающие соединители можно заменять друг на друга на всем протяжении, с минимальными модификациями. В некоторых вариантах осуществления внутренняя круглая кромка дна корпуса экстрактора и круглая кромка дна адаптера могут иметь один или несколько элементов, например, таких как стыковочный фланец(фланцы), зуб(зубцы) и/или выступ(выступы), друг напротив друга, которые препятствуют вращательному движению адаптера относительно корпуса экстрактора при зацеплении (не показано на фиг. 10A-1°C или 11A-11C). На стенке внешней части корпуса экстрактора круглая кромка 550 может служить в качестве стопора для зацепления корпуса экстрактора с верхней крышкой и нижним кольцом крышки, как дополнительно описано далее. Нижнее кольцо крышки, как изображено на фиг. 12A-12C, содержит охватывающее винтовое крепление на его внутренней стенке, и его адаптируют для пропускания поверх корпуса экстрактора со дна, чтобы зацеплять кромку 550 на внешней стенке корпуса экстрактора со внутренней поверхностью 850 кольца 800 крышки и зацеплять охватываемую винтовую нарезку 960 верхней крышки охватывающими винтовыми креплениями 860 для того, чтобы минимизировать или устранять утечки жидкости, когда весь сборочный узел, как описано в настоящем документе, прочно соединяют вместе и происходит процесс экстрагирования.
Набор из контейнеров для обработки образца/реактивов/сбора отходов дополнительно может быть предоставлен, как изображено на фиг. 7C и 7D. Мешки содержат различные реактивы, например, лизирующий буфер (LB), связывающий буфер (BB), промывающий буфер (WB), очищающий буфер (CB), элюирующий буфер (EB) и отталкивающее текучее вещество (RF), как дополнительно описано в настоящем документе. Емкость контейнеров может варьировать от 50 мл до 2 мл, в зависимости от количества реактива, необходимого для операций. Контейнеры типично являются гибкими, такими как мешки, выполненные из полиэтилена (PE), полипропилена (PP), поливинилхлорида (PVC), и/или этилвинилацетата (EVA). Репрезентативный контейнер для реактива/обработки образца приведен в качестве примера с помощью мешка LB (фиг. 7C и 7D). Мешок LB имеет емкость приблизительно 50 мл и имеет форму круглой колонки. Внутренняя стенка мешка содержит четыре жесткие кромки 706, которые помогают предоставлять больше структуры, чтобы позволять гибкому мешку оставаться в положении вертикально стоя при обработке образца. Образцовый мешок имеет круглую герметизирующую крышку 702 с каналом 704 трубки на крышке так, что трубку 708 можно вставлять в соединении по текучей среде со внутренней частью мешка. Другой конец трубки может содержать соединитель (не показано), такой как охватывающий соединитель люэровского блокирующего соединения, который можно непосредственно соединять со шприцом (таким как шприц с люэровским блокирующим соединением), чтобы принимать жидкий образец, такой как плазма, сыворотка или другие биологические жидкости, с помощью шприцевой инъекции. Мешок LB содержит предварительно загруженный лизирующий буфер. Биологическую жидкость смешивают с лизирующим буфером в мешке, а также можно инкубировать, на водяной бане или термоблоке, чтобы ускорять высвобождение нуклеиновых кислот из других биологических комплексов. Круглая форма мешка LB входит в широко используемые 50 мл пробирки для кронштейнов центрифуги или термоблоков. По завершении процесса лизиса связывающий буфер переносят из мешка BB в мешок LB, через втягивание шприцом из мешка BB и инъекцию в мешок LB. После смешивания посредством повторного втягивания и введения шприцом из мешка LB, смесь лизата и связывающего буфера втягивают в шприц и затем шприц соединяют с соединителем 970 (например, с охватывающим соединителем люэровского блокирующего соединения) сверху верхней крышки 900 сборочного узла 10 экстрактора, и охватывающий соединитель люэровского блокирующего соединения дна сборочного узла экстрактора (т. е. соединитель 470 ниже по потоку адаптера 410) затем соединяют с мешком LB, как, например, через охватываемый-охватываемый адаптер люэровского блокирующего соединения (не показано). Посредством нажатия на поршень шприца, смесь вводят в экстрактор, пропуская через твердую матрицу абсорбента, причем любая не захваченная жидкость течет назад в мешок LB. Целевые молекулы, в этом случае, фрагментированную короткую ДНК или РНК, абсорбируют на поверхности твердой матрицы.
Использование мешков или других контейнеров гибкого объема в качестве контейнеров для сбора обеспечивает определенные преимущества, включая способность использовать не вентилируемую крышку на системе сбора. Поскольку мешки имеют гибкий объем, достаточный объем можно резервировать в мешках для того, чтобы вмещать небольшие количества воздуха (например, 1-5 мл), специально введенные в шприц, чтобы повторять каждый объем жидкости, пропущенной через экстрактор. Это небольшое количество воздуха помогает приводить в движение воздух из остаточной жидкости в пористой матрице после того, как сначала выгружают жидкость в шприце. Таким образом, можно разрабатывать мешки для сбора или другие контейнеры гибкого объема с достаточным количеством зарезервированного объема, чтобы вмещать не просто какое-либо ожидаемое количество жидкости, подлежащей добавлению в мешок во время обработки, но также какое-либо ожидаемое количество дополнительного воздуха, введенного во время ожидаемого числа стадий введения шприцом во время всей обработки. Кроме того, контейнеры гибкого объема предусматривают систему соединенного шприца-экстрактора-контейнера, в которой три части (шприц, экстрактор и контейнер гибкого объема) формируют закрытое соединение без связи с окружающей средой. Когда шприц толкает или втягивает жидкость в гибкий контейнер или из него, объем гибкого контейнера изменяется, без необходимости распределять жидкость или воздух за пределами закрытой системы или втягивать внешний воздух в закрытую систему. Таким образом, эта компоновка закрытой системы лучше минимизирует или предотвращает контаминацию по сравнению с открытой системой. Система также позволяет жидкостям течь в двух направлениях, так что процесс экстрагирования можно повторять множество раз, чтобы достигать максимальной эффективности.
Несмотря на контроль скорости потока и, через повторное втягивание и введение несколько раз (2-10 раз), целевые молекулы имеют множество возможностей взаимодействия с матрицей абсорбента, что максимизирует извлечение коротких нуклеиновых кислот из большого объема лизата. После завершения процесса экстрагирования, мешок LB открепляют от сборочного узла для экстрагирования (например, от необязательного охватываемого-охватываемого адаптера люэровского блокирующего соединения). Адаптер на сборочном узле для экстрагирования последовательно соединяют с мешком промывающего буфера и мешком очищающего буфера, повторяя втягивание и введение с использованием нового меньшего шприца (объем промывающего и очищающего буферов значительно меньше, чем смесь образца и связывающего и лизирующего буферов, приблизительно несколько миллилитров). Также повторное втягивание и введение промывающего буфера и очищающего буфера через экстрактор может помогать более эффективно удалять загрязнители из матрицы абсорбента, чтобы минимизировать возможность различных таких загрязнителей значительно влиять на последующее применение.
По завершении экстрагирования, промывания и очистки, ядро для экстрагирования готово для удаления из сборочного узла экстрактора через следующие стадии: (1) открепление охватываемого-охватываемого адаптера люэровского блокирующего соединения от расширенного соединителя 470, выступающего из сборочного узла 10 для экстрагирования; (2) отвинчивание нижнего кольца 800 крышки; (3) удаление верхней крышки 900 с корпуса 500 экстрактора; (4a) открепление ядра 300 для экстрагирования от принимающего элемента 910 верхней крышки 900 с защитным контейнером 600 и закупоривание защитного контейнера (как описано более подробно в исходных заявках) крышкой 610; (4b) альтернативно добавление элюирующего буфера посредством пипетирования и затем введение отталкивающего текучего вещества (RF) через впускной порт верхней крышки 900 для незамедлительного элюирования. Таким образом, ядро для экстрагирования с экстрагированными нуклеиновыми кислотами на его матрице абсорбента готово для незамедлительного выполнения стадий элюирования в последующем применении или для хранения или транспортировки в условиях окружающей среды.
Способ, включающий обработку отталкивающим текучим веществом, как описано в настоящем документе, можно использовать для извлечения биологических молекул из подложки любого типа в системе фильтрования или сбора любого типа, без ограничения системами, описанными в настоящем документе, хотя следует понимать, что способ может быть особенно полезен для использования в соединении с какими-либо из систем, описанных в настоящем документе, включая те, что раскрыты в исходных заявках, а также новые варианты осуществления.
Ядро для экстрагирования можно предпочтительно выполнять с возможностью вмещать широко используемый 96-луночный формат с тем, чтобы стадию элюирования можно было выполнять при высокопропускной обработке.
Ядро для экстрагирования содержит пластмассовую пористую фритту, слой матрицы абсорбента и пластмассовое упорное кольцо или другую пластмассовую пористую фритту. Пластмассовую фритту и пластмассовое упорное кольцо используют для того, чтобы фиксировать матрицу абсорбента в ее положении в ядре для экстрагирования и позволять жидкостям течь через матрицу абсорбента, как дополнительно описано в отношении системы, раскрытой в исходных заявках.
Кроме того, ядро 300 для экстрагирования по существу идентично фильтровальной колонке 200 в отношении их фильтровальных компонентов и в отношении их верхней части, которая соединяется с крышкой 101 вместилища/верхней крышкой 900, но ядро для экстрагирования имеет соединитель 320 ниже по потоку, который длиннее, чем открытый конец 204 фильтровальной колонки 200, и ядро 300 для экстрагирования в целом имеет такие размеры, чтобы входить в корпус 500 сборочного узла для экстрагирования и соединяться с адаптером 410. Тогда как внутренние компоненты фильтра располагают около конца ниже по потоку фильтровальной колонки 200, внутренние компоненты фильтра располагают продольно около середины ядра 300 для экстрагирования, чтобы предоставлять пространство для удлиненного соединителя ниже по потоку для соединения с адаптером 410, и чтобы конец 430 ниже по потоку адаптера 410 выступал через отверстие 530 в корпусе 500 для экстрагирования. Однако ядро для экстрагирования и фильтровальная колонка не ограничены какими-либо конкретными размерами, геометрическими формами или другой геометрией.
В отношении всех компонентов, описанных в настоящем документе, следует понимать, что признаки сопрягаемых поверхностей, такие как блокировочная арматура или резьба, изображены только на определенных фиг., чтобы подчеркнуть их, и могут быть не изображены на других для простоты. Кроме того, несмотря на то, что определенные образцовые типы признаков сопрягаемых поверхностей описаны в настоящем документе в отношении определенных компонентов, следует понимать, что изобретение не ограничено признаками сопрягаемых поверхностей конкретных рассмотренных типов, а также не ограничено присутствием или отсутствием признаков сопрягаемых поверхностей в отношении конкретных компонентов. Соответственно, у компонентов, имеющих определенные изображенные признаки сопрягаемых поверхностей, могут быть предусмотрены признаки сопрягаемых поверхностей других типов или признаки сопрягаемых поверхностей могут быть не предусмотрены вовсе, и другие компоненты, изображенные без признаков сопрягаемых поверхностей, могут относиться к признаку сопрягаемых поверхностей любого типа, известного в данной области.
Дополнительные признаки
Матрица абсорбента
Рассматривали и тестировали зависимость скорости потока от материалов абсорбента и размера пор. Доступно несколько матриц абсорбента, включая мембраны из диоксида кремния, стекловолоконную бумагу и спеченную пористую стеклянную фритту. В целом, большая площадь поверхности таких материалов из диоксида кремния обеспечивает достаточно мест связывания (абсорбции) (вплоть до 100 мкг NA). Небольшое количество cfNA (часто меньше чем 100 мкг) мало подходит для того, чтобы насыщать связывающую поверхность; однако связывающая поверхность может оказывать эффект на скорость абсорбции cfNA, являясь причиной неполного экстрагирования или недопустимой скорости потока или даже высокого давления. Увеличенный размер пор матрицы абсорбента имеет обратную корреляцию с площадью поверхности и прямую со скоростью потока. Пористая стеклянная фритта с размером пор 10-50 мкм обеспечивает хороший поток текучего вещества, а также прочное связывание для коротких нуклеиновых кислот. Эта высокая скорость потока допускает повторное прохождение образца через нее, таким образом значительно увеличивая эффективность экстрагирования. Кроме того, предварительная обработка поверхности абсорбентов может увеличивать экстрагирование cfNA.
Экстрагирование с избирательностью по размеру
Хорошо известно, что cfDNA, происходящая из опухоли или плода, в целом более фрагментирована, т. е. короче, чем cfDNA из нормальных тканей и материнского происхождения. Геномная ДНК, высвобождаемая из клеток крови во время сбора образца, хранения/транспортировки и обработки значительно влияет на популяцию cfDNA и, следовательно, чувствительность обнаружения целевой cfNA. Однако возможно избирательное удаление длинной ДНК из текучих веществ организма перед экстрагированием cfNA. С использованием слабых анионообменных магнитных бус длинную ДНК (>1000 п. о.) успешно удаляли из мочи, что значительно повышало часть фрагментированной cfDNA в конечных экстрактах. Также сообщалось об экстрагировании gDNA из крови с использованием анионообменной матрицы. Таким образом, дополнительный экстрактор, как описано в настоящем документе, содержащий анионообменную матрицу, можно использовать для удаления основной части длинной ДНК перед экстрагированием cfNA в определенных совместимых условиях. Функциональные анионообменные матрицы, такие как карбоксилированные или DEAE-конъюгированные бусы, смолы и/или фильтровальная бумага доступны на рынке для осуществления этой стадии.
Таким образом, дополнительный экстрактор можно выполнять с использованием другой матрицы и другой системы реактивов. Например, для того, чтобы удалять клеточную ДНК большого размера из текучего вещества организма, анионообменный экстрактор можно сконструировать следующим образом, со ссылкой на фиг. 9A-9C: после размещения пластмассовой пористой фритты 350 в ядро 300 для экстрагирования, 200 мкл бус DEAE Sephadex A-50 (GE Healthcare Life Science) в буферной суспензии (50%) загружают на первую фритту вместо матрицы 340 абсорбента, и вторую фритту помещают поверх слоя бус DEAE Sephadex вместо кольца 330, тем самым фиксируя бусы между двумя фриттами. Остальные компоненты системы экстрагирования собирают, как описано ранее. pH буфер и соль предпочтительно сначала добавляют в лизат текучего вещества организма, чтобы устанавливать желаемый pH и солевые условия (известные в данной области), при которых большая ДНК в лизате будет плотно связываться с бусами, но маленькая ДНК не будет. Таким образом, текучее вещество, которое проходит через экстрактор, как выполнено выше, и которое собирают в мешок для сбора, будет иметь меньше молекул клеточной ДНК большого размера, чем до такого экстрагирования. Затем в мешке для сбора текучее вещество смешивают с дополнительным связывающим буфером и пропускают через второй экстрактор, который имеет матрицу из диоксида кремния, как описано выше. Теперь связывающий буфер подготовлен для небольших ДНК. Таким образом, подходящий набор для такого процесса может содержать первый экстрактор, выполненный с первой матрицей для удаления клеточных ДНК большого размера, и второй экстрактор, выполненный со второй матрицей для удерживания желаемого образца биологических молекул для отгрузки и анализа.
Сбор образца
В соответствии с лизирующим контейнером, описанным в исходных заявках, в целом, мешок LB может содержать предварительно сформулированные реактивы для лизиса, которые могут содержать, например, по меньшей мере: неионный детергент, такой как Triton X-100 или BJ58, или комбинацию неионного детергента с анионным детергент, таким как лауроилсаркозинат натрия, протеазу, такую как протеиназу K, соль или хаотропное средство, такое как хлорид лития, гуанидин, гуанидина тиоцианат, мочевина, восстанавливающее средство, такое как дитиотреитол (DTT), хелатор, такой как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), и буфер, такой как трис(гидроксиметил)аминометан (Tris). Общеизвестно, что гуанидин и гуанидин тиоцианат обладают сильной активностью, ингибирующей ДНКазу и РНКазу, в молярной концентрации. Лизирующие реактивы могут быть в растворе или в сухой форме (дегидроатированной), например, посредством лиофилизации или распылительного нанесения в лизирующем контейнере.
Образцы, в форме водных текучих веществ, таких как кровь, плазма, сыворотка, мокрота, слюна, моча, цереброспинальная жидкость (CSF), плевральный выпот, перитонеальная жидкость, синовиальная жидкость и т. д., можно непосредственно или в дополнительной воде добавлять в LB. Когда водное текучее вещество добавляют в LB, текучее вещество образца смешивают с лизирующим раствором или регидратируют высушенные лизирующие реактивы, для того, чтобы формировать полную смесь образца и лизирующего буфера. Предпочтительными образцами являются плазма или сыворотка, а предпочтительные объемы собираемой плазмы или сыворотки находятся в диапазоне 1-20 мл, более предпочтительно по меньшей мере 2 мл, даже более предпочтительно 2-10 мл и наиболее предпочтительно 2-5 мл.
Другие образцы в форме с высокой вязкостью или в полутвердых и твердых формах, таких как гной, клеточные суспензии и ткани, можно добавлять в LB с дополнительной водой в количестве, необходимом для того, чтобы регидратировать высушенные лизирующие реактивы, чтобы поддерживать оптимальное соотношение объема образца и лизирующего раствора.
В предпочтительном варианте осуществления после экстрагирования собранный образец дополнительно можно обрабатывать посредством промывания и смывания, как описано выше и в исходных заявках и каким-либо образом, известным в данной области.
Несмотря на то, что показан язычок на фильтровальной колонке и стыкуемый вырез на контейнере для отгрузки, может быть предусмотрен какой-либо элемент, расположенный на фильтровальной колонке, адаптированный для разъемного зацепления посредством взаимодействующего второго элемента, расположенного на контейнере для отгрузки, и способного передавать достаточное усилие на фильтровальную колонку, чтобы отвинчивать ее от ее резьбового соединения с крышкой вместилища. Аналогичным образом, несмотря на то, что показано резьбовое соединение между фильтровальной колонкой и крышкой вместилища, можно использовать блокировочное соединение какого-либо типа, а соответствующие элементы такой системы могут использовать взаимодействие какого-либо типа между контейнером для отгрузки и фильтровальной колонкой для того, чтобы откреплять фильтровальную колонку от крышки, предпочтительно стерильным образом.
Фильтровальные колонки могут иметь такие размеры, чтобы помещаться в держатель образцов (не показано) для приема множества фильтровальных колонок, и могут быть адаптированы для того, чтобы помещаться в центрифуге для центрифугирования множества фильтровальных колонок вместе за один раз, например, но не ограничиваясь этим, размер, приспособленный для того, чтобы подходить к 96-луночному формату для полуавтоматических или полностью автоматических обработки и манипуляций.
Систему сбора можно продавать в качестве части набора, содержащего один или несколько материалов, необходимых для того, чтобы осуществлять тест конкретного типа, например, но не ограничиваясь этим, следующее: средство для извлечения образца текучего вещества у пациента (такого как игла и шприц для взятия крови, сыворотки, плазмы или других текучих веществ организма), контейнеры для обработки образца/реактивов/сбора отходов, включая контейнеры, содержащие реактивы (например, лизирующий буфер (LB), связывающий буфер (BB), промывающий буфер (WB) и очищающий буфер (CB), элюирующий буфер (EB) и отталкивающее текучее вещество (RF)), как дополнительно описано в настоящем документе, средство переноса образца (такое как шприц), сборочный узел экстрактора, как рассмотрено в настоящем документе, и контейнер для отгрузки, как рассмотрено в настоящем документе.
В других вариантах осуществления различные части, упомянутые выше, можно продавать отдельно. В идеале, для тестов большинства типов и, в частности, для способа обнаружения туберкулеза, упомянутого в настоящем документе, все части, которые касаются образца или текучего вещества, содержащего образец, от момента, когда его извлекают у пациента, до осаждения нуклеиновой кислоты на подложке в фильтровальной колонке, должны быть стерильными или не контаминированными нуклеиновой кислотой из каких-либо других источников, например, от оператора или из среды, и не должны быть контаминированными повсеместно существующими ДНКазами и РНКазами, которые быстро разрушают нуклеиновую кислоту. Различные контейнеры, шприцы и вместилища, как рассмотрено в настоящем документе, могут представлять собой стандартные компоненты, хорошо известные в лабораторной/медицинской области. Однако инновационная крышка вместилища с соединенной фильтровальной колонкой специально предназначена для этой конкретной системы сбора.
Таким образом, другой аспект усовершенствования может включать стерильную съемную крышку для вместилища, крышка имеет внутреннюю сторону, обращенную ко внутреннему объему вместилища, и внешнюю сторону, противоположную внутренней стороне, крышка не содержит порт сапуна, обеспечивающий сообщение между внутренней стороной и внешней стороной, и соединительный порт образца, обеспечивающий сообщение между внутренней стороной и внешней стороной, соединительный порт образца содержит первый блокировочный компонент для разъемного блокирования соединительного порта образца на взаимодействующем втором блокировочном компоненте, внутренняя сторона крышки содержит соединительный интерфейс в соединении по текучей среде с соединительным портом образца. Описанную выше съемную крышку можно продавать отдельно или, в другом варианте осуществления, вместе со стерильной фильтровальной колонкой, как рассмотрено в настоящем документе, съемно прикрепленной к соединительному интерфейсу крышки вместилища.
Все части системы, описанные в настоящем документе, можно создавать с помощью какого-либо известного в данной области способа, например, с помощью литья термопластмассы под давлением. Предпочтительные термопластмассы включают полиэтилен (PE), полипропилен (PP) и полиэтилентерефталат (PET), но изобретение не ограничено каким-либо конкретным материалом или способом для конструирования.
Образцовый способ использования системы, рассмотренный в настоящем документе, можно осуществлять следующим образом.
(a) сбор объема образец-содержащего текучего вещества, которое можно обрабатывать и инкубировать с использованием лизирующего буфера и связывающего буфера с хаотропными средствами, солями и осаждающим средством, таким как спирт, в мешке LB для того, чтобы высвобождать нуклеиновые кислоты из комплексов, клеток или других частиц в биологическом образце, и извлечение неочищенного лизата из мешка LB с использованием шприца;
(b) соединение шприца, содержащего неочищенный лизат, с концом выше по потоку у сборочного узла экстрактора и мешка LB с концом ниже по потоку у сборочного узла экстрактора;
(c) пропускание объема образец-содержащего текучего вещества из шприца через сборочный узел экстрактора, тем самым собирая нуклеиновую кислоту из образца неочищенного лизата на подложке и собирая остальное в мешок LB;
(d) промывание матрицы фильтра со связанной нуклеиновой кислотой в колонке с использованием промывающих буферов;
(e) дегидратация (и также одновременно дополнительно промывание и обессоливание) матрицы со связанной нуклеиновой кислотой посредством пропускания объема растворителя через колонку, предпочтительно с использованием 100% этанола или ацетона;
(f) размещение нижней части контейнера для отгрузки на фильтровальной колонке, зацепление фильтровальной колонки и контейнера для отгрузки и открепление фильтровальной колонки от крышки вместилища;
(g) временное закупоривание контейнера для отгрузки посредством сопряжения верхней части контейнера для отгрузки и нижней части контейнера для отгрузки, закупоренный контейнер для отгрузки предпочтительно содержит карман с абсорбентом влаги (десикантом), таким как гранулярный или зернистый силикагель.
(h) альтернативно, вместо проведения стадий (f) и (g), без открепления фильтровальной колонки, взамен непосредственное добавление EB и затем введение RF с помощью шприца через впуск на верхней крышке 200 для того, чтобы собирать элюат непосредственно незамедлительно в другом контейнере;
(i) отгрузка контейнера элюата для обработки или незамедлительная обработка.
В отличие от молекул ДНК, которые относительно стабильны, молекулы РНК более восприимчивы к разрушению из-за способности 2′-гидроксильных групп, смежных с фосфодиэфирными связями в РНК, действовать в качестве внутримолекулярных нуклеофилов в гидролизе, катализируемом как основаниями, так и ферментами.
Стадия промывания (d) может включать обработку собранного образца на подложке посредством пропускания одного или нескольких объемов текучего вещества для обработки через фильтровальную колонку. Например, обработка может включать стабилизацию образца нуклеиновой кислоты для отгрузки, такую как промывание образца текучим веществом для промывания, таким как текучее вещество, содержащее этанол. В одном из вариантов осуществления, в котором контейнер для переноса образца содержит шприц, способ пропускания объема через фильтровальную колонку включает приложение давления вручную к поршню шприца. Когда готова для последующего анализа нуклеиновой кислоты, нуклеиновую кислоту, связанную с подложкой в фильтровальной колонке, высвобождают и элюируют из фильтровальной колонки, например, посредством добавления небольшого количества элюирующего буфера или чистой воды в фильтр (твердую матрицу) для того, чтобы высвобождать связанную нуклеиновую кислоту, и сбора элюата в другом небольшом контейнере посредством применения давления воздуха или центрифугирования, как известно в данной области, или, более предпочтительно, посредством применения давления текучего вещества (введение RF) через колонку, как описано в настоящем документе. После использования способа с давлением текучего вещества, описанного в настоящем документе, фильтровальную колонку все еще можно продувать воздухом или центрифугировать, при желании, для дополнительного сбора.
Без ограничения каким-либо конкретным использованием, указанная выше система сбора может быть особенно полезна применительно к способу обнаружения инфекционных патогенов, таких как туберкулез, как описано в настоящем документе далее. Однако система и способ могут быть особенно полезны применительно к какому-либо способу, в котором используют сбор cfNA для диагностирования, такого как способы для раннего диагностирования генетических нарушений плода, диагностирования опухолей и инфекций в глубоких тканях, например, LTBI. Вкратце, система и способ могут быть особенно полезны применительно к каким-либо способам на основании оценки NA материала, который содержит изменения в NA информации, отличные от организма-хозяина. Система и способы, описанные в настоящем документе, особенно полезны в областях, где важны экстрагирование и консервация. Обнаружение низких концентраций cfNA в крови требует образца относительно большого объема (2-5-10 мл), поскольку при добавлении реактивов общий объем легко достигает 20-50 мл, который представляет собой объем, с которым трудно обращаться или осуществлять автоматизацию с использованием предварительно существующих процессов. РНК влечет проблемы, связанные с ее стабильностью. Соответственно, способ и система, в частности, хорошо подходят для процессов, основанных на обнаружении низких концентраций cfNA, в частности, РНК, в текучих веществах организма.
ПРИМЕРЫ
Пример 1 - конструкция MOE устройства
Конструировали прототип фильтровальной колонки 200, как изображено на фиг. 2-4. Диск 212 абсорбционной матрицы подходящего размера вырубали из стекловолоконной фильтровальной бумаги GF/D (Whatman, NJ) и вставляли поверх инертного PP пористого фильтра 214, затем PP упорное кольцо 216 плотно помещали поверх диска 212 абсорбционной матрицы, чтобы фиксировать сборочный узел. Крышку 101 с блокирующим люэровским соединением на ее верхней части навинчивали и герметизировали на фильтровальной колонке. Затем крышку с собранной фильтровальной колонкой навинчивали и герметизировали в пустой 50 мл пластмассовой одноразовой пробирке для центрифуги. Устройство целиком, как описано выше, обозначают далее в настоящем документе как MOE (Manually Operated Extraction, экстрагирование с ручным управлением) устройство 400. Множество MOE фильтровальных устройств, используемых в следующих примерах, можно конструировать аналогичным образом.
Пример 2
Получение объединенной плазмы человека: свежую кровь, взятую у 10 здоровых доноров, центрифугировали на 4000 g в течение 20 минут. Фракцию плазмы удаляли из каждой пробирки для сбора крови и объединяли вместе в 50 мл пробирке для центрифуги. Объединенную плазму энергично перемешивали и замораживали при -20°C.
Пример 3
Экстрагирование cfDNA из объединенной плазмы: в этом примере, только MOE фильтровальную колонку использовали со следующими буферами и протоколом.
Буферы: лизирующий буфер (LB): содержит гуанидина тиоцианат (GITC), детергент Triton X-100, протеиназу K и EDTA.
Связывающий буфер (BB): содержит GITC и изопропанол (IPA), очень хорошо смешанные.
Промывающий буфер (WB): содержит Tris, EDTA, соль, этанол, pH 7,0.
Элюирующий буфер (EB): содержит Tris и EDTA, pH 7,5.
Протокол:
1. Лизис: взять 2 мл оттаявшей объединенной плазмы с помощью 10 мл шприца с длинной иглой в 50 мл пластмассовую пробирку для центрифуги, содержащую 2 мл LB, хорошо перемещать на вортексе, инкубировать при 60°C в термоблоке в течение 30 минут. Охлаждать при комнатной температуре.
2. Связывание: взять 16 мл BB в трубку лизата образца, перемешать их на вортексе, держать при комнатной температуре в течение 10 минут.
3. Связывание и экстрагирование: взять все содержимое в 50 мл пробирке для лизата в 30 мл шприц с люэровским блокирующим соединением с длинной иглой, продолжая до тех пор, пока не наберут приблизительно 5 мл воздуха в шприц, навинтить шприц с люэровским блокирующим соединением на охватывающий люэровский блокирующий соединитель на крышке собранного MOE устройства 400, которое прочно сидит в кронштейне. Нажимать на поршень шприца, пока все текучее вещество и воздух в шприце не пройдут через фильтровальную колонку. Отходы собирают в 50 мл трубку MOE устройства. Эта процедура может занимать 1-2 минуты. Отвинтить 30 мл шприц.
4. Взять 4 мл WB в 10 мл шприц с люэровским блокирующим соединением, нажать на поршень для того, чтобы сделать возможным прохождение WB через колонку. Отвинтить 10 мл шприц.
5. Взять 4 мл 100% этанола в 10 мл шприц, нажать поршень для того, чтобы сделать возможным прохождение этанола через колонку.
6. Отвинтить крышку MOE устройства с 50 мл пробирки для центрифуги и поместить на новую 50 мл пробирку. Позволить остатку этанола в колонке полностью высохнуть на воздухе.
Пример 4. Элюирование экстрагированной cfDNA с использованием 3 способов
В этом эксперименте сравнивали 3 способа элюирования. Двенадцать MOE устройств с извлеченной cfDNA из объединенной плазмы делили на 3 группы (n=4): a) элюирование посредством высокоскоростного центрифугирования (HC); b) элюирование посредством продувания воздухом (AP) и c) элюирование посредством отталкивающих текучих веществ (RF).
Эффективность извлечения сравнивали по элюированному объему и концентрации cfDNA в элюатах с помощью анализа qPCR для фрагментированной cfDNA конститутивного гена B2M.
Протокол HC экстрагирования: открепить фильтровальную колонку от крышки MOE устройства и поместить колонку в 1,5 мл центрифужную пробирку для сбора, добавить 100 мкл EB на матрицу, герметизировать колонку винтовой крышкой сверху, ждать высвобождения 10 мин. Затем пробирку для сбора центрифугировали на 12000 g в течение 3 мин.
Протокол AP экстрагирования: добавить 100 мкл EB на матрицу через впускной порт крышки в MOE устройстве посредством пипетирования и ждать 10 мин. Соединить 10 мл шприц с портом крышки, поместить фильтровальную колонку с крышкой на 1,5 мл пробирку для сбора и продувать колонку посредством повторного толкания и вытягивания поршня шприца. Пробирку для сбора центрифугировали для того, чтобы собирать продутый EB на дне пробирки.
Протокол RF экстрагирования: добавить EB, как описано в протоколе AP. После 10 мин 5 мл шприц с 0,5 мл RF (чистая силиконовая жидкость PSF-10 сСт, Clearco Products, PA) соединяли с портом крышки и колонку помещали на пробирку для сбора. Поршень медленно нажимали для того, чтобы выталкивать EB и RF. Формирование четкой границы раздела между слоем EB (снизу) и слоем RF происходило быстро без центрифугирования.
Количественное определение cfDNA в элюатах. 10 мкл элюатов удаляли в качестве эталона для анализа qPCR (SIBO qPCR mix, Occam Biolabs, Inc., DE). Остаточные элюаты осторожно удаляли из пробирок для сбора и взвешивали на цифровых весах с точностью 0,1 мг. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1.
Протокол
Идентификатор образца
Масса остаточного элюата (мг)
Протокол HC
HC-1
85,2
HC-2
83,4
HC-3
76,5
HC-4
81,7
Среднее (+/-SD)
81,7 (3,7)
Протокол AP
AP-1
68,5
AP-2
55,7
AP-3
72,8
AP-4
58,2
Среднее (+/-SD)
63,8 (8,2)
Протокол RF
RF-1
82,2
RF-2
74,1
RF-3
83,8
RF-4
76,7
Среднее (+/-SD)
79,2 (4,6)
Несмотря на то, что изобретение проиллюстрировано и описано в настоящем документе со ссылкой на конкретные варианты осуществления, изобретение не предназначено для ограничения приведенными подробностями. Наоборот, в подробностях можно создавать различные модификации в пределах объема и спектра эквивалентов формулы изобретения и не отступая от изобретения.