Способ выявления токсигенных штаммов О1 Vibrio cholerae "гаитянской" группы методом ПЦР в режиме реального времени по конечной точке
METHOD FOR DETECTING TOXIGENIC STRAINS OF O1 VIBRIO CHOLERAE OF "HAITIAN" GROUP BY PCR IN REAL TIME ON END POINT

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и генетической инженерии и может быть использовано в лабораторной диагностике при выявлении токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae «гаитянской» группы.
Возбудитель холеры в ходе седьмой эпидемии постоянно изменяется. За последние десятилетия зарегистрировано последовательное появление новых генетических вариантов препандемических штаммов: Матлабского, Мозамбикского и измененных вариантов Эльтор и, наконец, Гаитянского (1, 2). Последний вариант токсигенного возбудителя холеры O1, обозначенный как «гаитянский тип» вызвал несколько крупных вспышек, унесших тысячи жизней - эпидемию на о. Гаити и эпидемию в Йемене (3, 4). Для «гаитянского типа» характерен ряд генетических изменений: структурные изменения в суперинтегроне, VSP-2, SXT, а также единичные нуклеотидные замены в генах ctxB, приводящих к появлению новой уникальной аллели ctxB7, tcpA, rtxA, и rstB2. Самым тревожным фактом является то, что штаммы «гаитянского типа» обладают повышенной вирулентностью (4), что отчасти объясняет большое число смертных случаев, вызываемых возбудителем данного типа. Поэтому так важны методы выявления токсигенных штаммов O1 «гаитянской» группы.
Известен способ выявления токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae «гаитянской» группы (4), заключающийся в проведении секвенирования исследуемой токсигенной культуры O1 Vibrio cholerae с последующим биоинформационным анализом, при этом в случае выявления в геноме исследуемой культуры уникальных генетических маркеров, прежде всего мутации ctxB7, делают вывод о ее принадлежности к токсигенным штаммам O1 «гаитянской» группы (5).
Однако данный метод крайне трудозатратен, длителен, требует использования крайне дорогостоящего оборудования и импортных реагентов - комплекта приборов для выделения и подготовки ДНК к секвенированию, секвенатора и программного обеспечения для последующего биоинформационного анализа по сложным алгоритмам.
Наиболее близким к предполагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ обнаружения токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae «гаитянской» группы путем выявления нового генетического варианта ctxB7 с помощью мутант-аллель-специфичной ПЦР (6), заключающейся в том, что из исследуемого штамма выделяют ДНК, которую одновременно исследуют в нескольких реакциях с двумя различными парами праймеров, причем в каждой смеси один праймер Rv-cla является универсальным, а второй уникальным, при этом реакцию с парой праймеров ctxB-F3/Rv-cla проводят при температуре отжига 56°С, а реакцию с парой праймеров ctxB-F4/Rv-cla проводят при температуре отжига 60°С. Продукты амплификации исследуют с помощью электрофореза в геле агарозы в присутствии маркеров молекулярного веса. Токсигенные штаммы O1 «гаитянской» группы, имеющие аллель ctxB7, образуют амплификат массой 191 пар нуклеотидов с парой праймеров ctxB-F3/Rv-cla, и не дают амплификации с праймерами ctxB-F4/Rv-cla.
Недостатком прототипа является то, что для его осуществления реакцию амплификации с каждой из праймеров проводят при своей температуре отжига (56°С и 60°С), требуя использования двух амплификаторов или последовательной постановки ПЦР при использовании одного амплификатора.
Кроме того, необходимость учета результатов реакции с помощью электрофореза, требует дополнительного времени, наличия сложного оборудования, а именно: печи для плавления агарозы, прибора для проведения электрофореза, источника тока, трансиллюминатора, регистрирующей аппаратуры и набора расходных материалов (маркеров молекулярного веса, агарозы, буферов) и средств защиты персонала.
При этом в соответствии с действующими нормативными документами (7) для учета результатов реакции амплификации нуклеиновых кислот методом электрофореза необходима отдельная рабочая зона (4-1) которая должна быть расположена изолировано от других помещений для предотвращения контаминации продуктами амплификации через воздушный поток. Дополнительной трудностью при проведении работ по использованию электрофореза является необходимость проведения комплекса мероприятий по дегазации образовавшихся отходов (гели и буферы), содержащих крайне опасный интеркалирующий агент - бромистый этидий.
Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка нового, в режиме реального времени, эффективного по трудозатратам и достоверного способа выявления токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae «гаитянской» группы с помощью ПЦР в формате учета результатов по конечной точке.
Поставленная задача достигается тем, что: в способе выявления токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae "гаитянской" группы методом ПЦР в режиме реального времени по конечной точке, включающем выделение хромосомной ДНК из исследуемого штамма, постановку мультиплексной ПЦР со специфическими праймерами и последующим учетом реакции амплификации, последнюю проводят с исследуемой ДНК путем конструирования праймеров:
в присутствии двух олигонуклетидных зондов:
при этом анализ продуктов амплификации по конечной точке проводят в ПЦР детекторе, размещают пробирки в соответствующие гнезда, учитывают результаты амплификации визуально на мониторе компьютера по данным каналов FAM и HEX, где отражен уровень флюоресценции свечения, причем по каналу FAM в качестве фона (внутренний контроль) выбран ДНК штамма O1 Vibrio cholerae 19191 и положительный результат определяют по длине синей полосы, которая отражает уровень флюоресценции в опытных пробах, превышающий более чем 2,5 раза длину полосы негативной (фоновой) пробы, подтверждая правильность выделения ДНК и отсутствие ингибиторов в пробах, а по каналу HEX в качестве негативного фонового контроля используют ДНК штаммов O1 Vibrio cholerae 5879 и результат считают положительным, если уровень флюоресценции исследуемой пробы зеленая полоса превышает фон (негативного контроля) более 2,5, то фиксируют в данной пробе токсигенный штамм "гаитянской" группы.
При этом ПРЦ проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит: праймеры 1055- 1, 1095- 2 и зонды 1095 ZW и 1095 ZH каждый по 1,0 мкМ, 1,5 мМ Mg- буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 0,25 ед. ДНК полимеразы, исследуемое ДНК- 25 нг, оставшейся объем - вода.
Кроме того ПЦР реакции проходят с соблюдением режимов:
- денатурация 95°С - 2 мил. (1 цикл)
- 35 циклов: - денатурация 95°С - 20с;
- отжиг при 65°С - 20 с;
- синтез при 72°С - 20 с;
- синтез при 72°С -3 мл. (1 цикл).
Обоснование выбора праймеров и олигонуклеотидных зондов.
Важнейшим этапом при разработке ПЦР, обеспечивающим получение корректного результата, является правильный подбор мишеней для посадки праймеров и зондов. С помощью комплекса программного обеспечения, разработанного во ФКУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора (г. Ростов-на-Дону), был проанализированы нуклеотидные последовательности холерного вибриона.
Первый этап работы состоял в попарном сравнении с помощью программы GeneExpert всех INDEL-маркеров в открытых рамках считывания в геномах штаммов, обусловивших эпидемические осложнения по холере на о. Гаити и имеющих «гаитянский» вариант гена ctxB7. Это позволило оставить для дальнейшего анализа только стабильные INDEL-полиморфизмы, которые были одинаковы у всех изученных гаитянских штаммов.
Второй этап работы заключался в сравнительном анализе INDEL-маркеров, отобранных на первом этапе, с аналогичными маркерами токсигенных штаммов холерного вибриона, выделенных до 2010 года. Это позволило установить, что делеция 8-нуклеотидов в гене VCA1095 расположенном на малой хромосоме и кодирующим chemotaxis protein CheA присутствует у всех «гаитянских» и отсутствует у всех «диких» токсигенных (ctxAB+) штаммов.
На третьем этапе работы с помощью авторской программы PrimerM нами были сконструированы праймеры 1095-1, 1095-2 и зонды 1095ZW, 1095ZH.
При этом зонд 1095ZW сконструирован так, что отжигается только на ДНК гена VCA1095 токсигенных штаммов O1, а зонд 1095ZH отжигается только на делетированной ДНК, характерной для штаммов O1 «гаитянской» группы. Для регистрации результатов реакции зонды 1095ZW и 1095ZH на 5'-конце мечены соответственно FAM и HEX, а на 3'-конце гасителем BHQ1.
Объектом защиты настоящего изобретения является набор праймеров и зондов для выявления токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae O1 «гаитянской» группы с помощью ПЦР в формате реального времени с учетом по конечной точке. При этом дизайн праймеров и зондов делает ненужным использование внутреннего контроля- при отсутствии ингибитора происходит гидролиз одного из двух зондов, таким образом, при появлении положительного сигнала по каналу HEX регистрируют наличие штамма O1 Vibrio cholerae 01 «гаитянской» группы, положительный сигнал по каналу FAM свидетельствует о корректном выделении ДНК.
Способ осуществляется следующим образом.
Перед постановкой ПЦР проводят предварительную подготовку материала (выделение ДНК). Массу бактерий, сформировавших колонию или газон на плотной питательной среде, стерильной палочкой перемещают в микропробирку объемом 1,5 мл, содержащую 200 мкл дистиллированной воды, после чего выделяют ДНК как принято (6).
Кроме того одновременно с подготовкой проб исследуемого материала готовят фоновые контрольные пробы, для этого из штаммов 19191 и 5879 выделяют ДНК в соответствии с методическими указаниями (7). С полученной ДНК далее проводят мультиплексную реакцию амплификации с праймерами 1095-1 и 1095-2 и зондами 1095ZWh 1095ZH.
Условия проведения реакции амлификации в формате реального времени с учетом по конечной точке.
Амплификация проводится в амплификаторе, например, Терцик (производства НПФ ДНК-технология), по следующей схеме: денатурация при 95°С - 2 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 65°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с; синтез при 72°С - 3 мин (1 цикл), хранение при 10°С.
Инкубационная смесь объемом 25 мкл содержит: 1,5 мМ Mg-буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ каждого из праймеров и зондов, 25 нг ДНК - матрицы, 0,25 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода.
Анализ продуктов амплификации по конечной точке проводится в ПЦР-детекторе Джин (ТУ 9443-005-46482062-2993). Для этого пробирки помещают в соответствующие гнезда детектора, учет проводят по каналам FAM и HEX согласно инструкции производителя.
Сущность изобретения поясняется следующими примерами
Пример 1.
Выявление и учет по конечной точке методом ПЦР токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae "гаитянской" группы на анализе четырех культур: С-582, 1069, К-9, Л-3225 с использованием в качестве фона ДНК из штаммов O1 Vibrio cholerae 19191(внутренний контроль) и 5879 "гаитянская" группа.(негативный контроль).
Все штаммы взяты из коллекции ФКУЗ Ростовского - на - Дону противочумного института Роспотребнадзора.
Первым этапом способа проводят выделения ДНК: из исследуемой культуры и из штаммов 1991 и 5879 в соответствии с методическими указаниями (7).
Основным этапом является постановка ПЦР с выделенной ДНК в автоматическом амплификаторе с использованием предложенных праймеров и зондов ПЦР проводят по следующей схеме: денатурация при 95°С - 2 мин (1 цикл); затем 35 циклов; денатурация при 95°С- 20 с, отжиг при 65°С - 20 с, синтез при 72°С -20 с,; синтез при 72°С - 3 мин (1 цикл), хранение при 10°С.Инкубационная смесь объемом 25 мкл содержала: 1,5 мМ Mg-буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ каждого из праймеров и зондов, 25 нг ДНК - матрицы, 0,25 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода.
Результат ПЦР учитывают в реальном времени. Анализ продуктов амплификации по конечной точке проводили в ПЦР-детекторе Джин (ТУ 9443-005-46482062-2993). Для этого пробирки помещают в соответствующие гнезда детектора, учет проводят по каналам FAM (внутренний контроль) и HEX (опыт) согласно инструкции производителя. В качестве негативного (фонового) контроля по каналу FAM (внутренний контроль), доказывающего правильность выделения ДНК и отсутствия ингибиторов в пробах, использовали ДНК из штамма O1 Vibrio cholerae 19191.
Положительным считается результат, при котором уровень флюоресценции (см. рис. 1) в опытной пробе - синие полосы превышают по длине полосы негативных фоновых проб более чем в 2,5 раза, что доказывает правильность выделения ДНК и отсутствие ингибиторов в пробах.
По каналу HEX в качестве негативного фонового контроля используют ДНК штамма O1 Vibrio cholerae 5879. Положительным результатом считают (см. рис. 2), если уровень флюоресценции исследуемой пробы превышает фон (негативного контроля) от 2,5 и более раз, то фиксируют в данной пробе тогсигенный штамм "гаитянской" группы, что подтверждает зеленая полоса. Учет проведен по каналу HEX указывающую детекцию делеции размером 8-нуклеотидов в гене VCA1095, характерной для штаммов «гаитянской» группы.
Данные, представленные на Рис 2, свидетельствуют о правильности выделения ДНК из штаммов №№1-3 - штаммы С-582, 1069 и К-9, поскольку по каналу FAM с ними зарегистрирован положительный результат (превышение флюоресценцции над фоном в 7-8 раз). Данные, представленные на Рис 2, показывают положительный результат у культуры №4- штамм Л-3225 (превышение флюоресценции над фоном в 8 раз) по каналу HEX, что указывает на нее как на представителя «гаитянской» группы.
Вывод: полученный результат свидетельствует, что к «гаитянской» группе относится только штамм O1 Vibrio cholerae Л-3225, выделенный в Москве в 2010 году, поскольку только с ним зарегистрирован положительный результат по каналу HEX. Положительный результат со штаммами С-582, 1069 и К-9 по каналу FAM свидетельствует об отсутствии ингибиторов в этих препаратах ДНК.
Пример 2.
ПЦР-анализ восьми культур токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae.
Условия проведения и учета реакции как в Примере 1.
Полученный результат, приведенный в таблице 2 свидетельствует, что к «гаитянской» группе относятся только штаммы O1 Vibrio cholerae 6878 и 3265/80, выделенные в Москве в 2012 и 2014 году, поскольку только с ними зарегистрирован положительный результат по каналу HEX. Положительный результат со штаммами И-1185, И-1184, 421, 473, 340 и 301 по каналу FAM свидетельствует об отсутствии ингибиторов в этих препаратах ДНК. Данный результат свидетельствует, что на территорию Российской Федерации происходят заносы как токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae «гаитянской» группы (штаммы 6878 и 3265/80), так и штаммы более ранних типов (И-1185, И-1184, 421, 473, 340 и 301).
Пример 3.
ПЦР-анализ девяти культур токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae.
Условия проведения и учета реакции как в Примере 1
Полученный результат, приведенный в таблице 3 свидетельствует, что к «гаитянской» группе относится только штаммы O1 Vibrio cholerae 36, 184, выделенные в Донецке в 2011 году, и 3265/80, выделен в Москве в 2005 году поскольку только с ними зарегистрирован положительный результат по каналу HEX. Положительный результат со штаммами 2566, 2635, 3519, 7923 и 81 по каналу FAM свидетельствует об отсутствии ингибиторов в этих препаратах ДНК. Данный результат свидетельствует о заносах как токсигенных штаммов O1 Vibrio cholerae «гаитянской» группы, так и штаммов более ранних типов.
Использование предполагаемого изобретения позволяет эффективно, достоверно и быстро за счет подбора праймеров и меченных зондов в мультиплексной ПЦР в формате реального времени с учетом результатов по конечной точке выявлять токсигенные штаммы O1 Vibrio cholerae «гаитянской» группы, что важно при проведении мониторинга за холерой и оперативной организации противоэпидемических мероприятий при выделении токсигенного штамма O1 Vibrio cholerae.
Источники информации
1. Safa A., Nair G.B., Kong R. Y. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010;(18):46-54.
2. Ghosh P., Sinha R., Samanta P., et al. Haitian Variant Vibrio cholerae O1 Strains Manifest Higher Virulence in Animal Models. Front. Microbiol. 2019;(10): 111.
3. Ghosh P, Naha A, Basak S, Ghosh S, Ramamurthy T, Koley H, Nandy RK, Shinoda S, Watanabe H, Mukhopadhyay AK. Haitian variant tcpA in Vibrio cholerae O1 El Tor strains in Kolkata, India // J Clin Microbiol. 2014 Mar; 52(3):1020-1. doi: 10.1128/JCM.03042-13.
4. Weill F.X., Domman D., Njamkepo E., et al. Genomic insights into the 2016-2017 cholera epidemic in Yemen. Nature. 2019 Jan; 565(7738):230-233.
5. Водопьянов А.С., Писанов P.В., Водопьянов C.O., Мишанькин Б.Н., Олейников И.П., Кругликов В.Д., Титова С.В. Молекулярная эпидемиология Vibrio cholerae - разработка алгоритма анализа данных полногеномного секвенирования. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2016;(3): 146-152.
6. Naha A., Pazhani G.P., Ganguly М., et al.Development and evaluation of a PCR assay for tracking the emergence and dissemination of Haitian variant ctxB in Vibrio cholerae O1 strains isolated from Kolkata, India. Journal of Clinical Microbiology 2012;50:1733-1736.
7. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности: Методические указания. МУ 1.3.2569-09. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2009. - 35 с.
1095-1
5'-CCATCAGTCTGCCTCTGACAC-3'
1095-2
5'-TTCGACAATCGTCAGTAGCG-3'
1095ZW
5'-/FAM/-TCAACTGGTCAAAGTGGCCGAT-/BHQ1/-3'
1095ZH
5'-/HEX/-TTGGATGGTCAAAGTGGCCGAT-/BHQ1/-3'
<110>     Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора.
<120>     «Способ  выявления токсигенных штаммов О1 Vibrio cholerae «гаитянской» группы  методом  ПЦР в режиме реального времени по конечной точке».
<400> 4
1095-1  ccatcagtctgcctctgacac   21
1095-2  ttcgacaatcgtcagtagcg   20
1095 ZW  /FAM/-  tcaactggtcaaagtggccgat-/BHQ1/    22
1095 ZH   /HEX/-  ttggatggtcaaagtggccgat-/BHQ/1     22
<130>   Заявка № 2019132777 от 15.10.2019 г.