ПРИМЕНЕНИЕ ТВЕРДОЙ МИНЕРАЛЬНОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ПЛОДОРОДИЯ ВОЗДЕЛЫВАЕМЫХ ПОЧВ ИЛИ ПОЧВ ПАСТБИЩ
USING SOLID MINERAL COMPOSITION TO INCREASE FERTILITY OF CULTIVATED SOIL OR GRASSLAND SOIL

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к сельскому хозяйству и, более конкретно, к удобрениям, используемым, в частности, в земледелии, садоводстве и лесоводстве.
Предшествующий уровень техники
В этой области хорошо известно применение органических или минеральных композиций, которые вносят на поверхность возделываемых почв с целью повышения их плодородия.
Так, большая часть композиций из органических или минеральных удобрений известна и применяется в течение длительного времени в земледелии, садоводстве и лесоводстве.
Чтобы быть плодородной, почва должна обладать оптимальным равновесием между органическими и минеральными компонентами.
В настоящее время не существует показателей, позволяющих однозначно оценить плодородие почвы.
Однако измерение биологической активности животных организмов, растительных организмов и микроорганизмов, содержащихся в почве, все шире учитывается для определения способности почвы к восстановлению, которая взаимосвязана с плодородием почвы. Например, можно упомянуть определение плодородия почвы на основании измерения выработки углекислого газа репрезентативным образцом.
Согласно другим исследованиям качество почвы, а следовательно, ее плодородие связано по меньшей мере частично с ферментативной активностью почвы, которая, в частности, отражает ее микробную деятельность.
Изучение влияния способов внесения удобрений на микрофлору и на ферментативную активность почвы является классическим подходом применительно к органическим удобрениям (компост, навоз, навозная жижа, солома, зеленые удобрения…), поскольку такие материалы представляют собой прямой источник питательных элементов, то есть углерода и азота для микроорганизмов, обитающих в почве.
Некоторые исследования показывают, что микрофлора в пахотных почвах количественно и качественно беднее, чем в соответствующих исходных лесных почвах.
Изучение микрофлоры почвы можно проводить различными способами, включая полную экстракцию посредством фумигации-экстракции, измерение полной респираторной или минерализующей активности почвы, проточную цитометрию, экстракцию и культуру всей оживляемой микрофлоры, анализ маркеров, специфических для некоторых популяций, таких как жирные кислоты, стеролы, такие как эргостерол, анализ метаболических профилей на микропланшетах, анализ ферментативной активности почвенных экстрактов или более новые методики, такие как экстракция всех нуклеиновых кислот из почвы (метагеном), затем специфическая амплификация генов, кодирующих рибосомальные РНК (16S для бактерий или 18S для грибов), методом ПЦР (полимеразной цепной реакции), с последующим анализом амплифицированных фрагментов посредством ДГГЭ (денатурирующего градиентного гель-электрофореза).
В предшествующем уровне техники обычно считалось, что ферментативная активность может являться важным показателем биологической активности почвы в связи с тем, что ферментативные реакции участвуют в динамике кругооборота питательных элементов и в переносе энергии к многоклеточным растительным организмам.
Общеизвестно, что ферментативные реакции тесно связаны с плодородием почвы, поскольку ферментативные реакции реализуют преобразование форм некоторых питательных веществ, не трансформирующихся в ходе обмена веществ, в формы, которые могут напрямую усваиваться растениями и микробной биомассой. Более конкретно, ферменты почвы участвуют в деградации и в синтезе органических материалов, важных для роста растений, которые не синтезируются самими растениями.
Иными словами, ферментативная активность отражает интенсивность и природу биохимических процессов, проходящих в почве. По этой причине ферментативная активность является индикатором биологической способности почвы к проведению биохимических процессов, которые важны для поддержания ее плодородия.
При удобрении почв добавление экзогенного органического материала (навозной жижи, компоста, навоза, ила) способствует кратко- и среднесрочному биоразнообразию, но состав микрофлоры, видимо, стремится к возврату к первоначальному равновесному составу после периода продолжительностью несколько недель или месяцев после внесения органических удобрений. Существует много работ, посвященных изучению микрофлоры и динамики деградации внесенных в почву органических веществ или связанных с илом, полученным из богатых тяжелыми металлами органических городских отходов.
Гораздо меньше работ посвящено изучению влияния минеральных удобрений на микрофлору и на ферментативную активность почвы. Существующие исследования главным образом направлены на азотные удобрения, на влияние тяжелых металлов, на последствия накопления доз микроэлементов в пахотных почвах из-за интенсивного и частого внесения удобрений, как в случае меди, которую активно применяли и продолжают применять в фитосанитарных препаратах, в частности, для виноградников. Можно также упомянуть некоторые работы, касающиеся внесения минеральных соединений, таких как гипс и ферригидрит, влияние которого оценивали на популяциях метанобразующих бактерий в почве рисовых полей.
Так, в современном уровне техники существует постоянная потребность в композициях, предназначенных для поддержания или повышения плодородия почв, которые обладают благоприятным влиянием на ферментативную активность почв.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является применение твердой минеральной композиции, имеющей следующую формулу (I):
Карбонат кальция
от 4,58 до 77,8%
Доломит
от 3,85 до 69,29%
Хлорид натрия
от 5,7 до 12,4%
Лигносульфат
от 4,25 до 8,49%
Сульфат калия
от 0,37 до 2,44%
Окись магния
от 0,01 до 0,07%
Элементарная сера
от 0,009 до 0,066%
причем приведенное выше процентное содержание представляет собой массовый процент каждого из соединений от общей массы сухого вещества минеральной композиции для повышения плодородия почвы за счет увеличения по меньшей мере одного вида ферментативной активности, имеющегося в почве, выбранного из числа активности (i) фосфатазы, (ii) β-ксилозидазы, (iii) α-глюкозидазы и (iv) β-глюкозидазы.
Описание фигур
Фигура 1 иллюстрирует результаты измерения ферментативной активности в различных почвах. На фигурах 1А - 1G показаны данные измерения различной ферментативной активности почвы с растительным покровом и земляными червями, соответственно, в отсутствие минеральной композиции формулы (I) (левый столбик) и с обработкой минеральной композицией формулы (I) (правый столбик),. На оси ординат отложена ферментативная активность в единицах активности на грамм сухой почвы в час. На фигуре 1А показаны результаты измерения общей ферментативной активности. На фигуре 1В показаны результаты измерения ферментативной активности кислой фосфатазы. На фигуре 1C показаны результаты измерения ферментативной активности щелочной фосфатазы. На фигуре 1D показаны результаты измерения ферментативной активности β-глюкозидазы. На фигуре 1Е показаны результаты измерения ферментативной активности β-ксилозидазы. На фигуре IF показаны результаты измерения ферментативной активности α-глюкозидазы. На фигуре 1G показаны результаты измерения ферментативной активности N-ацетилглюкозаминидазы.
На фигуре 2А показан круг корреляции измеренной ферментативной активности.
На фигуре 2В показана проекция объектов (различных образцов) на оси 1 и оси 2 фигуры 2А.
На фигуре 3 показано изображение геля денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ). Левая дорожка: почва без растительного покрова и без земляных червей. Правая дорожка: та же почва, обработанная минеральной композицией формулы (I).
На фигуре 4 показано изображение геля денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ). Левая дорожка: почва без растительного покрова и без земляных червей. Средняя дорожка: почва с растительным покровом и без земляных червей. Правая дорожка: та же почва с растительным покровом и без земляных червей, обработанная минеральной композицией формулы (I).
На фигуре 5 показано изображение геля денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ). Левая дорожка: почва без растительного покрова и без земляных червей. Средняя дорожка: почва без растительного покрова и с земляными червями. Правая дорожка: та же почва без растительного покрова и с земляными червями, обработанная минеральной композицией формулы (I).
На фигуре 6 показано изображение геля денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ). Левая дорожка: почва без растительного покрова и без земляных червей. Средняя дорожка: почва с растительным покровом и с земляными червями. Правая дорожка: та же почва с растительным покровом и с земляными червями, обработанная минеральной композицией формулы (I).
На фигуре 7 показана дендрограмма, иллюстрирующая сходство профилей популяций бактерий, обнаруженных в разных исследованных почвах, на основании профилей полос миграции при ДГГЭ, показанных на фигурах 3-6.
На фигуре 8 показано изображение геля денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ). Дорожка "S": почва без растительного покрова и без земляных червей. Дорожка "S+V": почва "S" без растительного покрова и с земляными червями. Дорожка "S+M": почва "S", обработанная минеральной композицией формулы (I). Дорожка "S+P": почва "S" с растительным покровом и без земляных червей. Дорожка "S+V+M": почва "S+V", обработанная минеральной композицией формулы (I). Дорожка "S+V+P": почва "S" с растительным покровом и с земляными червями. Дорожка "S+P+M": почва "S+P", обработанная минеральной композицией формулы (I). Дорожка "S+V+P+M": почва "S+V+P", обработанная минеральной композицией формулы (I).
На фигуре 9 показана филогенетическая реконструкция раздела ТМ7 на основании р-ДНК 16S по методу ближайшего связывания, включающая группы бактерий, секвенированные на базе некоторых полос миграции в геле ДГГЭ, изображенном на фигуре 8, и родственные последовательности, которые были получены из банка данных.
На фигуре 10 изображено влияние минеральной композиции формулы (I), на образование растительной биомассы. По оси ординат: результаты измерения образования растительной биомассы в граммах сухого веса. На фигуре 10А показано сравнение образования растительной биомассы (i) в почве с растительным покровом и без земляных червей (левый столбик) и (ii) в той же почве, обработанной минеральной композицией формулы (I). На фигуре 10В показано сравнение образования растительной биомассы (i) в почве с растительным покровом и с земляными червями (левый столбик) и (ii) в той же почве, обработанной минеральной композицией формулы (I).
Подробное описание изобретения
Было показано, что добавление специфичной для почвы минеральной композиции по изобретению приводит к значительному изменению в профиле ферментативной активности почвы и повышает ее плодородие.
Более конкретно, было показано, что добавление специфичной для почвы минеральной композиции по изобретению приводит к увеличению активности некоторых ферментов, таких как фосфатаза, β-ксилозидаза, α-глюкозидаза и β-глюкозидаза, которые известны как критически важные для плодородия.
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению твердой минеральной композиции, имеющей следующую формулу (I):
Карбонат кальция
от 4,58 до 77,8%
Доломит
от 3,85 до 69,29%
Хлорид натрия
от 5,7 до 12,4%
Лигносульфат
от 4,25 до 8,49%
Сульфат калия
от 0,37 до 2,44%
Окись магния
от 0,01 до 0,07%
Элементарная сера
от 0,009 до 0,066%
причем приведенное выше процентное содержание представляет собой массовый процент каждого из соединений от общей массы сухого вещества минеральной композиции для повышения плодородия почвы за счет увеличения по меньшей мере одного вида ферментативной активности, имеющегося в почве, выбранного из числа активности (i) щелочной фосфатазы, (ii) β-ксилозидазы, (iii) α-глюкозидазы и (iv) β-глюкозидазы.
Предпочтительно выше твердая минеральная композиция также включает комбинацию одного или нескольких дополнительных соединений, выбранных из числа бикарбоната натрия, сульфата железа, сульфата магния, окиси цинка, иодида калия, сульфата меди и борной кислоты.
Более предпочтительно, выше одно или несколько дополнительных соединений присутствуют в минеральной композиции в следующих количествах:
от 0,007 до 0,158% бикарбоната натрия,
от 0,0009 до 0,0434% сульфата железа,
от 0,004 до 0,040% сульфата магния,
от 0,0006 до 0,0040% окиси цинка,
от 0,0004 до 0,0032% иодида калия,
от 0,0002 до 0,0040% сульфата меди,
от 0,0006 до 0,0040% борной кислоты,
причем приведенное выше процентное содержание представляет собой массовый процент каждого из соединений от общей массы сухого вещества минеральной композиции.
Предпочтительная минеральная композиция для применения по изобретению имеет следующий состав:
- 45,78% карбоната кальция,
- 38,49% доломита,
- 9,52% хлорида натрия,
- 5,66% лигносульфата,
- 0,49% сульфата калия,
- 0,014 окиси магния,
- 0,015% элементарной серы и
- соответствующие количества соединения или сочетания по меньшей мере двух соединений, выбранных из числа бикарбоната натрия, сульфата железа, сульфата магния, окиси цинка, иодида калия, сульфата меди и борной кислоты так, чтобы минеральная композиция содержала 100% компонентов по массе, причем приведенное выше процентное содержание представляет собой массовый процент каждого из соединений от общей массы сухого вещества минеральной композиции.
2
Предпочтительно для удобрения почвы минеральную композицию формулы (I) вносят в количестве по меньшей мере от 0,01 до 0,10 кг/м.
2
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение также относится к способу удобрения почвы, включающему по меньшей мере один этап, во время которого минеральную композицию формулы (I) добавляют к почве в количестве по меньшей мере от 0,02 до 0,04 кг/м.
Как правило, минеральную композицию формулы (I), которая является твердой композицией, которая предпочтительно имеет форму гранул, вносят в удобряемую почву простым разбрасыванием над обрабатываемой почвой,
Фосфатаза, которая катализирует гидролиз фосфорно-эфирных связей, вызывает высвобождение неорганического фосфата, который затем может быть использован растениями в качестве метаболита. Обычно считается, что этот фермент играет важную роль в метаболических циклах фосфата и оказывает влияние на рост растений. Таким образом, чем выше активность фосфатазы почвы, в частности активность щелочной фосфатазы почвы, тем сильнее способность такой почвы стимулировать рост растений, даже если содержание неорганического фосфата в почве снижено.
β-ксилозидаза, участвующая в гидролизе ксилана (гемицеллюлозы), позволяет обеспечить почвенную микрофлору питательными веществами, которые, будучи минерализованными, ассимилируются растением. Действие β-ксилозидазы происходит на последних этапах деградации ксилана, который является одним из основных компонентов стенки растительных клеток и который обнаруживается в растительных остатках, имеющихся в почвах.
Активность β-глюкозидазы считается индикатором качества почв. Активность β-глюкозидазы, участвующей в гидролизе целлюлозы, важна для плодородия почвы, поскольку целлюлоза является количественно наиболее распространенным соединением, присутствующим в почвах. β-глюкозидаза играет важную роль в почвах, так как этот фермент отвечает за гидролиз различных β-глюкозидов, присутствующих в разлагающихся растительных отходах, которые находятся в почвах. Деградация целлюлозы считается одним из основных процессов цикла углерода в почве. Микробная деградации целлюлозы в почве является комплексным процессом, в котором участвуют по меньшей мере три типа ферментов, соответственно эндо-β-1,4-глюканазы, экзо-β-1,4-глюканазы и β-1,4-глюкозидазы. Под действием β-1,4-глюкозидазы происходит гидролиз продуктов деградации целлюлозы, таких как дисахарид (целлобиоза) на молекулы глюкозы, которые могут напрямую ассимилироваться микроорганизмами почвы. Таким образом, деградация целлюлозы, содержащейся в почвах, может быть полной только в присутствии активности β-глюкозидазы. Активность β-глюкозидазы считается индикатором обновления (оборота) растительной биомассы.
Деятельность α-глюкозидазы гидролизует олигосахариды, образовавшиеся в результате деградации крахмала, присутствующего в разлагающихся растительных остатках в почве, при этом образуется D-глюкоза в качестве конечного продукта, которая может напрямую ассимилироваться микроорганизмами почвы.
Для целей настоящего изобретения под «почвой» более конкретно подразумевают возделываемую почву или почву пастбищ (лугов).
Возделываемые почвы включают пахотные почвы, которые используются во всех отраслях растениеводства, включая садоводство, лесоводство и виноградарство.
Почвы пастбищ включают невозделываемые почвы, которые, в частности, используются для обеспечения свежего или высушенного растительного материала для кормления животных, более конкретно, для кормления скота.
В целом, почвы обычно включают сочетание минеральных элементов и органических элементов, содержащих различные соотношения песка, глин(ы), ила(ов), известняка любого размера, гумуса, органических остатков, микроорганизмов, воздуха и воды.
Для целей настоящего изобретения под «ферментативной активностью» подразумевают каталитическую активность преобразования данного соединения субстрата в конечный продукт каталитической реакции.
Измерение ферментативной активности видов ферментов (i) фосфатаза, (ii) β-ксилозидаза, (iii) α-глюкозидаза и β-глюкозидаза может проводиться любым подходящим способом, хорошо известным специалисту в этой области.
Предпочтительно небольшой образец почвы переводят во взвешенное состояние в соответствующем объеме дистиллированной воды для получения первичного экстракта, который затем используют для специальных ферментатных анализов.
Ферментные анализы могут проводиться традиционным способом, инкубацией аликвоты первичного экстракта подлежащей тестированию земли вместе с субстратом ферментативной активности в течение определенного периода времени, затем, после остановки ферментативной реакции, количественным определением продукта каталитической реакции, обычно с помощью спектрофотометра.
Для примера, можно применять следующие субстраты:
- для активности фосфатазы: соль 4-нитрофенил ди- или три-фосфат,
- для активности β-глюкозидазы: 4-нитрофенил β-D-глюкопиранозид,
- для активности β-ксилозидазы: 4-нитрофенил β-ксилозид, и
- для активности α-глюкозидазы: 4-нитрофенил α-глюкозид.
Для тестирования активности N-ацетил-глюкозаминидазы можно использовать 4-нитрофенил N-ацетил-β-D-глюкозаминид.
При применении выше субстратов количественный анализ конечного продукта каталитической реакции выполняется спектрофотометрией с определением оптической плотности (O.D.) при длине волны 405 нанометров.
Было показано, что добавление минеральной композиции формулы (I) к почве (i), имеющей растительный покров в отсутствие земляных червей, или к почве (ii), имеющей растительный покров и земляных червей, вызывает значительное повышение активности щелочной фосфатазы. Так, было показано, что при добавлении минеральной композиции формулы (I) к описанному выше типу почвы (i) активность щелочной фосфатазы становится в десять раз выше по сравнению с активностью щелочной фосфатазы, определенной у типа почвы (i), лишенного композиции формулы (I). Применительно к описанному выше типу почвы (ii) активность щелочной фосфатазы обычно увеличивается по меньшей мере вдвое по сравнению с активностью фосфатазы, определенной у типа почвы (ii), обладающего тем же составом, но лишенного минеральной композиции формулы (I).
Было также показано, что добавление минеральной композиции формулы (I) к почве (i), имеющей растительный покров в отсутствие земляных червей, к почве (ii), имеющей растительный покров и земляных червей, или к почве (iii), не имеющей растительного покрова, но имеющей земляных червей, вызывает значительное повышение активности β-ксилозидазы. Так, было показано, что при добавлении минеральной композиции формулы (I) к типу почвы (i) активность β-ксилозидазы становится по меньшей мере в три раза выше по сравнению с активностью β-ксилозидазы, определенной у типа почвы (i), лишенного минеральной композиции формулы (I). Также было показано, что активность β-ксилозидазы, определенная у типа почвы (ii) после добавления минеральной композиции формулы (I), по меньшей мере вдвое выше активности β-ксилозидазы, определенной у типа почвы (ii), лишенного минеральной композиции формулы (I). У описанного выше типа почвы (iii) активность β-ксилозидазы обычно увеличивается по меньшей мере в пять раз по сравнению с активностью β-ксилозидазы, определенной у типа почвы (iii), лишенного минеральной композиции формулы (I).
Было также показано, что добавление минеральной композиции формулы (I) к почве (i), имеющей растительный покров и не имеющей земляных червей, к почве (ii), имеющей растительный покров и земляных червей, или к почве (iii), не имеющей растительного покрова, но имеющей земляных червей, вызывает значительное повышение активности α-глюкозидазы, которая в четыре раза выше активности α-глюкозидазы, определенной у типа почвы (i), (ii), (iii), лишенного минеральной композиции формулы (I).
Было также показано, что добавление минеральной композиции формулы (I) к почве (ii), имеющей растительный покров и земляных червей, вызывает значительное повышение активности β-глюкозидазы, которая по меньшей мере в полтора раза выше активности β-глюкозидазы, определенной у типа почвы (ii), лишенного минеральной композиции формулы (I).
Применительно к фигуре 2В, было показано, что композиция формулы (I) оказывает статистически значимое влияние на повышение определенной выше ферментативной активности (i) - (iv) вне зависимости от типа обрабатываемой почвы.
Без привязки к какой бы то ни было теории заявитель считает, что увеличение ферментативного потенциала почвы в результате добавления композиции формулы (I) позволяет улучшить теллуровые процессы минерализации органических веществ.
Как описано выше, минеральная композиция формулы (I) с позиции ферментативной активности в основном вызывает повышение видов ферментативной активности, называемых «малыми», принимая во внимание их количественное отношение к общей ферментативной активности почвы, таких как активность β-ксилозидазы, α-глюкозидазы или щелочной фосфатазы. При этом следует помнить, что минеральная композиция формулы (I) также вызывает повышение видов ферментативной активности, называемых «большими», принимая во внимание их количественное отношение к общей ферментативной активности почвы, таких как активность β-глюкозидазы.
Без привязки к какой бы то ни было теории заявитель считает, что минеральная композиция формулы (I) вызывает «восстановление баланса» ферментативного профиля почвы повышением некоторых видов ферментативной активности, не приводя к одновременному значительному снижению других видов ферментативной активности.
Кроме того, результаты, полученные по изобретению, показывают, что влияние композиции формулы (I) на ферментативную активность варьирует в зависимости от типов почвы, к которой прибавляли состав, что доказывает, что влияние этого состава на ферментативную активность зависит от качественного и/или количественного состава живых организмов, в частности организмов флоры и фауны в обрабатываемой почве, включая микроорганизмы, более конкретно бактериальные и грибные микроорганизмы. Эти результаты показывают, что минеральная композиция формулы (I) оказывает стимулирующий эффект на биологическую активность почв.
Как показано на примерах, повышение, наблюдающееся для каждого из видов ферментативной активности (i) щелочной фосфатазы, (ii) β-ксилозидазы, (iii) α-глюкозидазы и (iv) β-глюкозидазы в типах почвы (i), (ii) и (iii) в присутствии минеральной композиции формулы (I), не означает, что добавление композиции формулы (I) вызывает общее повышение ферментативной активности обработанных почв. Таким образом, показано, что общая ферментативная активность почвы, обработанной минеральной композицией формулы (I), по существу идентична общей ферментативной активности той же почвы, которая не была обработана минеральной композицией формулы (I). Общую ферментативную активность почвы можно определить количественным анализом неспецифического деградации субстрата диацетата флуоресцеина (FDA).
Напротив, повышение плодородия почвы, обработанной композицией формулы (I), в результате специфического повышения ферментативной активности (i) - (iv) иллюстрируется тем фактом, что добавление композиции формулы (I) вызывает увеличение образования надземной и подземной растительной биомассы по меньшей мере в 1,5 раза по сравнению с таковой идентичной почвы, которая не была обработана композицией формулы (I). Таким образом, было показано, что добавление композиции формулы (I) к почве (i), имеющей растительное покрытие в отсутствие земляных червей, вызывает увеличение образования надземной и подземной растительной биомассы по меньшей мере в 1,5 раза в пересчете на сухой вес растительной биомассы после сбора урожая. Также было показано, что добавление композиции формулы (I) к почве (ii), имеющей растительное покрытие и имеющей земляных червей, вызывает увеличение образования надземной и подземной растительной биомассы по меньшей мере вдвое в пересчете на сухой вес биомассы после сбора урожая.
В целом, заявитель наблюдал, что улучшение качества почв, которое достигается добавлением минеральной композиции формулы (I), иллюстрируется увеличением надземной и подземной растительной биомассы при выращивании большинства растений, так называемых культур «для крупного сельскохозяйственного производства» и овощных культур, а также при лесоводстве и в виноградарстве.
Кроме того, на примерах показано, что минеральная композиция формулы (I) также приводит к изменению профиля бактериальных популяций, присутствующих в почве.
Изучение профилей бактериальных популяций путем анализа рибосомальной ДНК 16S методом ДГГЭ (денатурирующий градиентный гель-электрофорез) выявило, что добавление композиции формулы (I) вне зависимости от изучаемого типа почвы приводило (i) к увеличению относительной численности некоторых бактериальных таксонов, которая проявлялась на электрофоретическом геле увеличением относительной плотности окраски одной или нескольких полос миграции и (ii) к уменьшению относительной численности других бактериальных таксонов, которая проявлялась снижением относительной плотности окраски одной или нескольких других полос миграции.
Так, результаты, приведенные в примерах, показывают, что минеральная композиция формулы (I) вызывает значительные выявляемые изменения в соотношениях численности различных бактериальных таксонов по сравнению с почвами, которые не были обработаны минеральной композицией формулы (I).
Как показано на примерах, при сравнении профилей полос миграции, соответствующих фрагментам 16S рДНК, полученных методом ДГГЭ, было показано, что минеральная композиция формулы (I) вызывает наиболее заметные изменения в профилях бактериальных популяций в почвах, в которых имеются комплексные условия флоры и фауны, более конкретно, в почвах, имеющих растительный покров и/или земляных червей, при этом влияние композиции формулы (I) увеличивается по мере усиления комплексности условий обрабатываемой почвы.
Было также проведено секвенирование фрагментов 16S рДНК, соответствующих некоторым полосам, преобладавшим в ДГГЭ, которые были обнаружены, соответственно, в каждой из разных почв, различающихся по биологической комплексности, не обработанных или обработанных минеральной композицией формулы (I). Затем на основании данных о последовательности было определено филогенетическое родство соответствующих основных бактерий. Поскольку многие теллуровые бактерии невозможно культивировать и, следовательно, невозможно идентифицировать, сравнение наших последовательностей и опубликованных данных не всегда приводило к таксономической идентификации. Однако результаты показывают, что в почве (i), имеющей растительный покров без земляных червей, и в почве (iii), не имеющей растительного покрова, но имеющей земляных червей, минеральная композиция формулы (I) способствует преобладанию бактериальных популяций, родственных бактериям раздела ТМ7, которые были обнаружены в ризосфере и в торфяниках. Обычно из анализа после секвенирования 16S рДНК следует, что добавление минеральной композиции формулы (I) вызывает большие изменения в относительной численности бактериальных таксонов, благоприятствуя развитию некоторых из них и замедляя развитие других, включая развитие бактериальных таксонов, преобладающих в идентичной почве, но не обработанной композицией формулы (I). В любом случае, минеральная композиция формулы (I) выбывает изменения профиля бактериальных популяций, масштаб которых возрастает по мере увеличения биологической комплексности почвы. Для примера, можно наблюдать все более масштабные изменения профиля бактериальных популяций, вызванных композицией формулы (I), при сравнении почвы, не имеющей никакого растительного покрова и не имеющей земляных червей, с почвой, имеющей растительный покров и земляных червей.
Так, результаты примеров показывают, что действие минеральной композиции формулы (I) варьирует как количественно, так и качественно в зависимости от типа связанных с теллуром условий, более конкретно, в зависимости от присутствия или отсутствия растительного покрова, и/или в зависимости от присутствия или отсутствия земляных червей.
Обычно изменения профиля ферментативной активности и профиля бактериальных популяций в результате добавления минеральной композиции формулы (I) являются индикаторами повышения плодородия почвы, которое проявляется увеличением, наблюдаемым в образовании надземной и подземной растительной биомассы.
Кроме того, настоящее изобретение будет проиллюстрировано следующими примерами.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
А. Материалы и методы
A.1. Материалы
Почва - это почва сельскохозяйственного использования, взятая в окрестностях Тарденуа (регион Пикардия, Франция) пылевато-глинистого типа. Образцы почвы отбирали произвольно. После этого почву высушивали при температуре окружающей среды, а затем просевали через сито с размером ячеек 2 мм.
Растением, использованным для создания растительного покрова почвы, является райграс, относящийся к широко представленным в продаже видам. Можно использовать райграс, выпускаемый в продажу компанией Jardiland (Лонь, Франция).
Земляными червями, использованными в этих экспериментах, были глубоко проникающие в землю черви, относящиеся к виду Nicodrilus giardi (также называемому Allolobophora terrestris или Aporrectodea terrestris).
Минеральную композицию формулы (I) добавляли в количестве, соответствующем 200 кг/га в каждый экспериментальный образец земли за исключением контрольных образцов.
А.2. Приготовление контрольных образцов земли и экспериментальных образцов
Образцы представляли собой пластиковые контейнеры, каждый из которых содержал 1 кг сухой земли. Землю увлажняли до ее полевой влагоемкости.
В определенные контейнеры добавляли червей из расчета 6 г биомассы/кг сухой земли.
Для посева в определенных контейнерах использовали один грамм семян райграса.
Червей помещали в контейнеры, когда проростки райграса достигали высоты около 5 см.
Опыт был заложен в трех повторностях (или сериях), каждая из которых соответствовала 8 вариантам, то есть общее количество образцов составляло 24.
Образцы находились при температуре окружающей среды (от 20 до 23°С) в течение 1,5 месяцев. После этого периода райграс (надземную и подземную корневую части) собирали и затем помещали в сушильный шкаф для определения его сухого веса. Из каждого контейнера отбирали две партии образцов для проведения биохимического и молекулярного анализа.
А.3. Ферментные анализы
Один грамм почвы суспендировали в 5 мл дистиллированной воды при 4°С. Эта суспензия являлась первичным экстрактом для ферментных количественных анализов.
1. Количественный анализ гетерозидаз (PNP)
Приготовление реактивов:
2
3
- NaCO: 2 г растворяли в 100 мл дистиллированной воды.
- Ферментный субстрат: 80 мг субстрата растворяли в 10 мл дистиллированной воды.
- Соль 4-нитрофенил ди(три)фосфат (PNP-фосфат). Этот субстрат позволяет определять активность ферментов фосфатаз, участвующих в минерализации органического фосфата.
- 4-нитрофенил β-D-глюкопиранозид (PNP-β-глюкозид). Гидролиз этого субстрата позволяет количественно определить активность β-глюкозидазы, участвующей в последних этапах деградации целлюлозы.
- 4-нитрофенил N-ацетил-β-D-глюкозаминид (PNP-N-ацетил-β-D-глюкозаминид).
Хитин является субстратом, широко распространенным в почвах, он происходит из кутикул членистоногих и входит в состав мембран большинства грибов. Деградация этого субстрата хитиназами и N-ацетил-глюкозаминидазой является этапом, предваряющим высвобождение аминосахаров, одновременно участвующих в циклах углерода и азота.
- 4-нитрофенил β-ксилозид (PNP-β-D-ксилозид) был гидролизован β-ксилозидазой, участвующей в последних этапах деградации ксилана, одного из основных компонентов растительной клеточной стенки.
- 4-нитрофенил α-глюкозид (PNP-α-D-глюкозид). α-глюкозидаза, которая гидролизует этот субстрат, является одним из ферментов, участвующих в деградации крахмала.
Растворы хранили при 4°С в пузырьках из темного стекла.
2
4
2
- Фосфатный буфер рН 5: 24,3 мл лимонной кислоты 0,1 М добавляли к 25,7 мл NaHPO, 12 HO (0,2 М).
- Боратный буфер рН 9: 10 мл HCl 0,1 М добавляли к 90 мл бората натрия 0,1 М
Буферные растворы хранили при 4°С
Анализ на микропланшетах:
Анализы проводили в микропланшетах. Для каждого фермента (кислая фосфатаза, щелочная фосфатаза, β-глюкозидаза, α-глюкозидаза и β-ксилозидаза) готовили одну холостую пробу, три контрольных субстрата, три контрольных фермента и три пробы для анализа.
- Холостая проба: - 100 мкл дистиллированной воды
- 25 мкл буфера Мак-Ильвена рН 5 или 9 в зависимости от анализируемого фермента.
- Контрольный субстрат: - 50 мкл дистиллированной воды
- 25 мкл фосфатного буфера рН 5 или боратного буфера рН 9 для щелочной фосфатазы
- 50 мкл субстрата PNP.
- Контрольный фермент: 50 мкл дистиллированной воды
- 25 мкл буфера Мак-Ильвена рН 5 или 9
- 50 мкл раствора фермента (земля).
- Проба для анализа - 50 мкл субстрата PNP
- 25 мкл буфера Мак-Ильвена рН 5 или 9
- 50 мкл раствора фермента (земля).
Анализ проводили в микроплашете с коническим дном. Планшет инкубировали в течение 2 часов в шкафу при 37°С при перемешивании.
2
3
После инкубации в каждую лунку добавляли 75 мкл 2% NаCO.
2
3
Затем микропланшет центрифугировали при 2500 об/мин, в течение 10 мин. Из каждой лунки 50 мкл надосадочной жидкости переносили в лунки другого планшета, в которые предварительно добавляли 250 мкл 2% NаCO. После перемешивания проводили спектрофотометрический анализ при 405 нм по сравнению с холостой пробой.
На базе стандартного ряда, который был составлен заранее, отношение между оптической плотностью (OD) и количеством фенола задавалось следующей формулой:
Х (мкг фенола) = расч. OD × 1,14,
где расч. OD = OD пробы для анализа - (OD контр. субстрата + OD контр. фермента).
Ферментативную активность определяли по количеству высвободившегося фенола /г почвы/ час.
2. Анализ микробной активности с помощью FDA (диацетата флуоресцеина)
Приготовление реактивов
- FDA: из 0,3 г PDA, растворенного в 10 мл ацетона, готовили аликвоты в стеклянных пузырьках по 1 мл в пузырьке. Этот раствор, который хранили при -20°С, являлся исходным раствором.
Перед использованием исходный раствор разводили в соотношении 1:10.
2
4
2
- Фосфатный буфер рН 7: 6,5 мл лимонной кислоты 0,1 М + 43,6 мл NaHPO, 12 HO (0,2 М).
Анализ на микропланшетах:
Анализы проводили в микропланшетах. Для каждого анализа готовили одну холостую пробу, три контрольных субстрата, три контрольных фермента и три пробы для анализа.
2
- Холостая проба: 150 мкл НО
- 50 мкл фосфатного буфера рН 7
2
- Контрольный фермент: 50 мкл НО
- 50 мкл буфера Мак-Ильвена рН 7
- 50 мкл раствора почвы.
2
- Контрольный субстрат: 100 мкл HO
- 50 мкл фосфатного буфера рН 7
- 50 мкл FDA (разведенный раствор).
- Проба для анализа - 100 мкл раствора почвы
- 50 мкл буфера Мак-Ильвена рН 7
- 50 мкл FDA.
Микропланшет инкубировали при 37°С на 2 часа, после чего центрифугировали в течение 10 минут при 2500 об/мин.
Из каждой лунки 100 мкл надосадочной жидкости переносили в лунки второго планшета с круглым дном, в которые предварительно добавляли 100 мкл ледяного буфера Мак-Ильвена рН 7 (4°С) и проводили спектрофотометрический анализ при 490 нм по сравнению с холостой пробой.
Для FDA ферментативную активность выражали в количестве флуоресцеина /г почвы /час.
Определение стандартного ряда дало возможность установить соотношение между оптической плотностью (OD) и количеством флуоресцеина (мкг) в виде следующей формулы:
Х (мкг флуоресцеина) = расч. OD·0,086.
3. Молекулярные анализы
Для секвенирования генов 16S рибосомальной ДНК, специфичных для преобладающих и/или представляющих интерес бактериальных популяций в разных образцах почвы, ДНК экстрагировали из образцов почвы и хранили в спирте.
3.1. Экстрагирование ДНК из почвы
Способ, выбранный для экстрагирования ДНК из почвы, основан на применении буфера ЦТАБ (СТАВ) (Цетил-триметил-аммоний бромид). В пробирки, содержащие керамические, кварцевые и стеклянные шарики (Lysing Matrix E, MP Biomedicals) и 1000 мкл экстрагирующего буфера ЦТАБ (СТАВ), добавляли 500 мг каждого из 24 образцов почвы (8 вариантов: S, S+P, S+M, S+V, S+V+P, S+P+M, S+V+M, S+V+M+P × 3 повторности). Лизис клеток проводили с помощью гомогенизатора типа FastPrep-24 (MP Biomedicals) в течение 45 с при 6,5 м/с. Затем образцы инкубировали на водяной бане при 65°С в течение 1 часа. Экстрагирование и очистку нуклеиновых кислот проводили смесью фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (24:24:1) и хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) в сочетании с трубками для заключения гелевой фазы (VWR). Затем ДНК осаждали с помощью ПЭГ, осадок промывали 70% этанолом и добавляли 50 мкл буфера ЕВ (трис HCl). ДНК, экстрагированную в 3 повторностях, объединяли для каждого из 8 образцов с целью получения ДНК в количестве, достаточном для последующих реакций. Затем проводили количественный анализ ДНК и оценивали ее чистоту (отсутствие гуминовой кислоты, протеинов) с помощью спектрофотометра (Nanodrop).
3.2. ПЦР амплификация фрагментов бактериальной 16S рДНК
2
Полимеразные цепные реакции проводили с использованием термоциклера типа ТС-3000 (Techne) с универсальными бактериальными праймерами. Для каждой реакции использовали 0,25 микромоль каждого праймера, 10 мкл ПЦР буфера 10Х, 1,5 миллимоля MgCl, 0,2 миллимоля дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфатов), 6 Ед. ДНК полимеразы Taq (Invitrogen), 15-80 нг матрицы ДНК и воду до объема 100 мкл. Праймерами, использованными для ПЦР, были 518r (5'-АТТ АСС GCG GCT GCT GG-3' - последовательность №1) и GC-338f (5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAC TCC TAC GGG AGG CAG CAG-3' - последовательность №2); они точно амплифицировали вариабельную область V3 16S рибосомальной ДНК, сохранившуюся у бактерий (около 200 pb). Последовательность, богатая GC (GC-шпилька), присоединенная к 5' концу праймера GC-338f, препятствовала полной денатурации двойной цепочки ДНК во время разделения фрагментов ПЦР с помощью ДГГЭ. ПЦР-амплификацию проводили с первоначальной денатурации при 94°С в течение 5 минут, после чего выполняли 32 цикла: 1) денатурация при 94°С в течение 30 с, 2) гибридизация при 54°С в течение 45 с и 3) удлинение при 72°С в течение 1 мин 30 с. Амплификацию заканчивали завершающим удлинением при 72°С в течение 20 мин.
3.3. Визуализация и количественный анализ продуктов ПЦР
Продукты ПЦР разделяли в 2% агарозном геле и окрашивали SYBR Safe (Invitrogen) в концентрации 1X. Визуализацию фрагментов ПЦР проводили с помощью УФ, а количественный анализ - с помощью количественного маркера размера типа SmartLadder (Eurogentec).
3.4. ДГГЭ
2
2
Анализ методом ДГГЭ (денатурирующим градиентным гель-электрофорезом) был проведен на Универсальной системе обнаружения мутаций DCode (Bio-Rad). Образцы продуктов ПЦР (100 мкл, то есть около 500 нг) разделяли в 8% полиакриламидном геле в ТАЕ 0,5Х (Трис-уксусная кислота-ЭДТА). Для получения полиакриламидного геля с линейным денатурирующим градиентом 30-70% смешивали 11,2 мл раствора 0% (акриламид 20 мл, ТАЕ 50Х 2 мл и НО до 100 мл) и 4,8 мл раствора 100% (акриламид 20 мл, ТАЕ 50Х 2 мл, формамид 40 мл, мочевина 42 г и НО до 100 мл) для получения раствора низкой концентрации (30%). Аналогично смешивали 4,8 мл раствора 0% и 11,2 мл раствора 100% для получения раствора высокой концентрации (70%). Электрофорез проводили при 60°С в течение 16 час при 75 В. По окончании электрофореза гель помещали в этидиум бромида и фотографировали в УФ. Представляющие интерес полосы вырезали.
3.5. Секвенирование полос, представляющих интерес
ДНК, содержащуюся в полосах, элюировали индивидуально, в 50 мкл сверхчистой воды в течение ночи при 4°С. Для реамплификации полос в индивидуальном порядке посредством ПЦР в соответствии с описанной выше процедурой использовали 2 мкл элюата. Для проверки присутствия единственной полосы в каждом из продуктов ПЦР продукты ПЦР разделяли в геле для ДГГЭ (градиент 30-50%) рядом с исходным образцом. Процедуру повторяли до получения одной полосы у каждого продукта ПЦР. Чистые продукты ПЦР секвенировали (Gexbyweb, Genome Express).
А.4. Статистический анализ профилей миграции полос при ДГГЭ
1. Графический и статистический анализ профилей
Dice
AB
A
B
A
B
AB
Получали фотографию геля и анализировали с помощью программного обеспечения Quantity One software v4.6.5 (Biorad), которое позволяло автоматически выявлять полосы на профиле ДГГЭ. Бинарную матрицу, представляющую полосы профиля, составляли следующим образом: присутствие полосы кодировалось '1', ее отсутствие кодировалось '0', применительно к полосам, которые можно было обнаружить во всех образцах того же геля. На основании этой бинарной матрицы была составлена матрица расстояний с применением коэффициента сходства. При этом был использован коэффициент Дайса (S=2N/(N+N), где N и N, соответственно, представляли число полос в образцах А и В, a N - число общих полос). Затем был проведен анализ матрицы расстояний методом группировки UPGMA (невзвешенная попарная группировка с математическим усреднением) и методом ближайшего связывания, что позволило построить на этом основании дендрограмму, графически описывающую расстояния между всеми различными образцами.
2. Молекулярный и филогенетический анализ последовательностей
Хроматограммы последовательностей были получены и визуализированы с помощью программного обеспечения Chromas LITE, версия 2.01, также позволяющего проводить корректировку последовательностей вручную. Последовательности сравнивали со всеми последовательностями, имеющимися в банках данных Национального центра биотехнологической информации, посредством анализа BLAST (программа для обнаружения сходства последовательностей белков путем их локального выравнивания), который устанавливал родство последовательностей с наибольшим показателем идентичности с исследуемыми последовательностями. Дополнительный анализ таксономического отнесения был проведен с помощью Ribosomal Database Project II Classifier (классификатора II проекта баз данных рибосомальных ДНК).
Затем полученные последовательности были выровнены с 47 репрезентативными последовательностями бактерий раздела ТМ7, 2 последовательностями ТМ6, 2 последовательностями группы I Termite и 2 последовательностями зеленых несернистых бактерий, доступными из баз данных Национального центра биотехнологической информации, с использованием программного обеспечения CLUSTALW. Выравнивание (140 pb) корректировали вручную с помощью программы SEA VIEW. В итоге было построено дерево по методу ближайшего связывания с помощью программного обеспечения MEGA4 с 1000 повторностями автоматического ввода.
В. Результаты
Пример 1: Влияние композиции формулы (I) на ферментативную активность почвы
Совокупность результатов измерений ферментативной активности приведена на фигуре 1, соответственно по: общей ферментативной активности (фигура 1А), активности кислой фосфатазы (фигура 1В), активности щелочной фосфатазы (фигура 1C), активности β-глюкозидазы (фигура 1D), активности β-ксилозидазы (фигура 1Е), активности α-глюкозидазы (фигура 1F) и активности N-ацетил-глюкозаминидазы (фигура 1G).
1. А/ В присутствии почвы
Вне зависимости от исследуемого фермента не было обнаружено существенного увеличения в почвах без растительного покрова и без земляных червей, обработанных и не обработанных минеральной композицией формулы (I). Аналогично, не было обнаружено отрицательного влияния.
1. В/ В присутствии почвы и райграса
На деградацию FDA (диацетата флуоресцеина) не оказало влияния присутствие минеральной композиции формулы (I). Активность кислой фосфатазы, β-глюкозидазы и N-ацетил-глюкозаминидазы в присутствии минеральной композиции формулы (I) была выше активности, измеренной в контроле. Однако по причине вариабельности наблюдаемые различия были несущественными с риском α 5%, наоборот, активность щелочной фосфатазы, β-ксилозидазы и α-глюкозидазы существенно возросла, при этом коэффициент увеличения составил 10, 4 и 4, соответственно.
Эти результаты показывают, что в присутствии растительного покрова:
1) имеет место влияние минеральной композиции формулы (I) на ферментативную активность почвы
2) это влияние отмечается применительно к ферментам, активность которых меньше по интенсивности.
1. С/ В присутствии почвы и земляных червей
-1
-1
При добавлении минеральной композиции формулы (I) к почве в присутствии земляных червей (lumbricus) было отмечено значительное повышение активности двух ферментов. Этими ферментами являются β-ксилозидаза, активность которой возросла в 6 раз, и α-глюкозидаза, которая с уровня активности в 25 в контроле переходит к 112 Ед. на г сухой почвы сек час. Активность других исследованных ферментов не изменилась.
1. D/ В присутствии земляных червей и райграса
В присутствии земляных червей и райграса минеральная композиция формулы (I) позволяет увеличить активность щелочной фосфатазы в 3 раза, активность β-глюкозидазы - в 1,5 раза, активность β-ксилозидазы - в 2,5 раза и активность α-глюкозидазы в 4 раза.
1. Е/ Анализ основных компонентов
Цель этого анализа заключается в статистическом подтверждении присутствия влияния минеральной композиции формулы (I) на ферментативную активность почвы в зависимости от различных исследованных вариантов (присутствие растений и/или земляных червей…).
Круг корреляции, представленный на фигуре 2А, показывает, что ось 1 представляет 35% всех отклонений, выявленных применительно к активности щелочной фосфатазы, α-глюкозидазы, β-ксилозидазы и применительно к деградации FDA. Ось 2, соответствующая 21% отклонений, в свою очередь, определяется активностью кислой фосфатазы, N-ацетил-глюкозаминидазы и β-глюкозидазы.
Как изображено на фигуре 2В, проекция объектов на обеих осях показывает явное противостояние между обработками минеральной композицией формулы (I) и различными вариантами контроля. Следовательно, действительно имеет место влияние композиции формулы (I) на ферментный профиль исследованной почвы.
Результаты измерений ферментативной активности, представленные на фигурах 1А - 1G, более подробно описаны в таблице 1 в конце настоящего описания.
В таблице 1:
- "S" обозначает почву без растительного покрова и без земляных червей,
- "S+M" обозначает почву "S", обработанную минеральной композицией формулы (I),
- "S+V" обозначает почву без растительного покрова, но с земляными червями,
- "S+V+M" обозначает почву "S+V", обработанную минеральной композицией формулы (I),
- "S+P" обозначает почву с растительным покровом, но без земляных червей,
- "S+P+M" обозначает почву "S+P", обработанную минеральной композицией формулы (I),
- "S+V+P" обозначает почву с растительным покровом и с земляными червями, и
- "S+V+P+M" обозначает почву "S+V+P", обработанную минеральной композицией of формулы (I).
Это исследование позволило экспериментально показать, что добавление минеральной композиции формулы (I) дает возможность значительно увеличить образование растительной биомассы.
Было также показано, что добавление минеральной композиции формулы (I), позволяющей повысить ферментный потенциал почвы для оптимизации процесса минерализации органического вещества, также получило подтверждение, о чем свидетельствует анализ основных компонентов. При этом полученные результаты показывают, что положительный эффект минеральной композиции формулы (I) зависит от
1) рассматриваемого фермента. Так, два основных вида активности, то есть активность кислой фосфатазы и β-глюкозидазы, которые характерны для этой почвы, не относятся к ферментам, на которые в большей степени влияет минеральная композиция формулы (I). Действительно, такой благоприятный эффект отмечается применительно к "второстепенным" ферментам (второстепенные не в связи с их ролью в продуктивности почвы, а в связи с уровнем их активности), таким как β-ксилозидаза, α-глюкозидаза или щелочная фосфатаза. Это означает, что минеральная композиция формулы (I) позволяет «восстановить баланс» ферментного профиля почв, не вызывая какого-либо снижения других видов активности,
2) имеющихся вариантов. Действительно, в зависимости от исследуемого варианта (присутствие или отсутствие райграса /земляных червей) полученные результаты различаются. Следовательно, влияние минеральной композиции формулы (I) зависит от живых организмов (растений /животных). Этот результат убедительно указывает на то, что минеральная композиция формулы (I) действует как катализатор, стимулирующий некоторые виды биологической активности почвы.
Выявление изменений в ферментных профилях почвы, более конкретно, в циклах деградации сахаридов агрополимеров в связи с минеральной композицией формулы (I) поднимает вопрос о том, обусловлено ли такое изменение изменением микробных сообществ. Это является целью описанного ниже примера 2.
Пример 2: Влияние минеральной композиции формулы (I) на бактериальные популяции почвы
Провели сравнение результатов ДГГЭ анализа амплифицированных посредством ПЦР фрагментов гена 16S рРНК, полученных для 8 образцов, с целью визуализации изменений генетического разнообразия бактериальных сообществ после различных обработок. Визуальный осмотр профилей ДГГЭ выявил, что ряд бактериальных популяций не был существенно изменен в результате обработок почвы. Напротив, преобладающие микробные популяции, видимо, не всегда одинаковы в зависимости от обработки почвы.
А/ Влияние минерального раствора PRP в присутствии одной почвы
Результаты представлены на фигуре 3.
Добавление минеральной композиции формулы (I) вызывает изменения в структуре бактериальных сообществ по сравнению с вариантом одной почвы (профиль S). Популяции, преобладающие в варианте одной почвы (отмечено красным), больше не являются преобладающими в почве с добавлением композиции (I) (полосы исчезают или становятся светлее). Однако исчезновение /снижение интенсивности полос не всегда следует толковать как исчезновение соответствующих таксонов. Действительно, это может только отображать изменение относительной плотности среди популяций, при которой увеличение некоторых популяций может привести к тому, что другие окажутся ниже порога обнаружения методом ДГГЭ. В почве, к которой была добавлена композиция (I), преобладающей представлялась некая бактериальная популяция (помечено зеленым), хотя она уже присутствовала в варианте с одной почвой. Это может свидетельствовать либо о развитии этой популяции в присутствии композиции (I), или о регуляции популяций, которые преобладали в варианте с одной почвой. Эта последняя гипотеза, возможно, получит подтверждение тем фактом, что профиль является более однородным в плане интенсивности полос у образца почвы, обработанного композицией (I), которая, видимо, действует как модулятор.
В/ Влияние минерального состава PRP в присутствии райграса
Результаты представлены на фигуре 4.
В присутствии райграса (профиль S+P) структура бактериальных сообществ значительно изменяется по сравнению с вариантом с одной почвой. В числе преобладающих популяций можно наблюдать одну популяцию, значительно преобладающую (полоса 9), которая не определялась в варианте с одной почвой.
При добавлении композиции (I) в присутствии райграса эти преобладающие популяции больше не наблюдаются. Полоса Е, которая является самой интенсивной в этом профиле, соответствует популяции, которая могла оказаться активизированной в присутствии композиции (I) или которая стала преобладающей в результате регуляции тех популяций, которые преобладали в присутствии только райграса.
В этом случае также очевидно то, что композиция (I) выступает в роли модулятора для бактериальных сообществ, присутствующих в почве.
С/ Влияние минерального состава PRP в присутствии земляных червей
Результаты представлены на фигуре 5.
В присутствии земляных червей (профиль S+V) видимо также происходит изменение структуры бактериальных сообществ почвы. Несмотря на то, что значительное количество полос являются общими, относительная доля популяций значительно изменяется. Более конкретно, следует отметить присутствие трех преобладающих популяций в присутствии земляных червей (полосы 1, 4 и 7).
Добавление композиции (I) в присутствии червей приводит к совершенно иной структуре сообществ. Если обнаруживаются популяции, общие с популяциями профиля S+V, их относительная доля представляется измененной. Так, популяции, соответствующие полосам А и 6, преобладают в меньшей степени и, напротив, популяция, соответствующая полосе 3, начинает преобладать в присутствии композиции (I). Эта полоса 3 не соответствует полосе С, обнаруженной на профиле S+V (см. последовательности).
Хотя существуют интенсивные полосы и, следовательно, преобладающие группы, во всей совокупности профиля в присутствии композиции (I) можно констатировать, что влияние PRP проявляется в более выраженном разнообразии микробных популяций при относительно равномерной плотности. В этом случае также можно наблюдать модулирующее влияние композиции (I), даже в присутствии земляных червей.
D/ Влияние минерального состава PRP в присутствии райграса и земляных червей
Результаты представлены на фигуре 6.
Сочетание райграса и червей (профиль S+V+P) оказывает значительное влияние на бактериальные сообщества по сравнению с вариантом с одной почвой (профиль S). Популяции, соответствующие полосам D и 8, становятся преобладающими. Другая преобладающая популяция в сочетании черви/райграс соответствует полосе 8.
Добавление композиции (I) в присутствии райграса и червей сильно изменяет бактериальные сообщества. Популяции, соответствующие полосам D и 8, больше не являются преобладающими, а другая популяция (отмечено зеленым, последовательность не получали), по-видимому, оказывается напрямую активированной композицией (I) или получает преимущества в результате регуляции, оказываемой на другие популяции. В этом случае модулирующее влияние композиции (I), наблюдающееся для других вариантов опыта, менее выражено.
Пример 3: Специфика влияния минеральной композиции формулы (I) на преобладающие бактериальные популяции
Анализ сходства в различных вариантах обработки проводили с учетом одновременно присутствия полос (следовательно, присутствия бактериальных сообществ) и их интенсивности (фигура 7).
Этот анализ мог включать два варианта обстановки:
1) влияние композиции (I) слабо выражено. В этом случае бактериальный профиль почвы без композиции (I) должен иметь значительное сходство с бактериальным профилем той же почвы, обработанной композицией (I). В этом случае на дендрограмме сходства, изображенной на фигуре 7, эти два варианта оказываются объединенными или расположенными недалеко друг от друга.
2) влияние композиции (I) очень значительно, тогда в этом случае бактериальные профили почв, обработанных композицией (I), должны иметь низкий коэффициент сходства с бактериальными профилями тех же почв, не прошедших обработку. В этом случае на дендрограмме сходства их соответствующие позиции находятся на относительном удалении друг от друга.
Анализ, графически представленный на фигуре 7, показывает, что почва (S) и вариант с одной почвой, обработанной композицией (I) (S+M), присутствуют на уровне одного кластера. Это означает, что внесение композиции (I) в почву без червей и без растений оказывает относительно умеренное влияние по сравнению с другими исследованными вариантами обработки.
Напротив, влияние композиции (I) явно выражено применительно к почве в присутствии земляных червей и райграса (S+V+P+M), поскольку этот вариант обработки сильно отличается от совокупности других вариантов обработки, особенно от варианта, включающего червей /растения без композиции (I) (S+V+P). Это также наблюдалось у почвы с райграсом (S+P), поскольку этот вариант относительно удален от почвы с райграсом и композицией (I) (S+P+M). Применительно к почве с земляными червями (S+V) в сравнении с почвой с земляными червями и композицией (I) (S+V+M) влияние также несомненно, хотя и менее выражено.
Пример 4: Идентифицирующий анализ секвенированием фрагментов 16S рДНК, соответствующих преобладающим популяциям бактерий
А/ Для секвенирования использовали гель ДГГЭ
Гель ДГГЭ, представленный на фигуре 8, имеет различные полосы, которые были собраны, очищены и затем секвенированы. Эти полосы были выбраны по причине их относительно высокой интенсивности в профиле. Следует отметить, что некоторые преобладающие полосы оказалось невозможно секвенировать в связи с очень большими трудностями с их очисткой.
В/ Сравнение последовательностей из лунок у почвы (S) / почва + PRP (S+M)
В почве, к которой была добавлена композиция (I) (S+M), одна бактериальная популяция является заметно преобладающей (полоса 15). Анализ BLAST приравнивает последовательность этой группы к последовательности некультивируемого, а значит морфологически неидентифицируемого бактериального таксона (номер доступа в Genbank: EF 157158, идентичность: 97%). Согласно классификатору RDPII (который доступен в Интернете по следующему адресу: «http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier") такая популяция может быть родственной разделу бактерий ТМ7 с процентом отнесения 91%. Этот раздел, который был недавно описан, включает членов, широко распространенных в окружающей среде. Так, в почве бактерии раздела ТМ7 были выявлены в ризосфере и в торфяниках.
С/ Сравнение последовательностей из лунок у почвы + райграс (S+P)/ почва + райграс + PRP (S+P+M)
Секвенирование 16S рДНК полосы 9 не позволило идентифицировать эту популяцию, значительно преобладающую в почве с райграсом. Действительно, самая близкая последовательность согласно анализу BLAST (номер доступа в Genbank EU 134275, идентичность 99%) соответствует неидентифицированному бактериальному клону, происходящему из почвы пастбищ (см. таблицу 2 ниже).
При добавлении композиции (I) в присутствии райграса полоса Е кажется наиболее интенсивной. Секвенирование 16S рДНК указывает на то, что самая близкая последовательность соответствует номеру доступа EU283406 (идентичность 98%, популяция происходит из активированного ила) (см. таблицу 2 в конце настоящего описания). Согласно классификатору RDPII такая популяция может быть родственной разделу бактерий ТМ7 с процентом отнесения 97%.
D/ Сравнение последовательностей из лунок у почвы + черви (S+V)/ почва + черви + PRP (S+V+M)
Применительно к почве с червями (S+V) молекулярный анализ и таксономическое отнесение показывают, что три популяции (полосы 1, 4, 7) родственны разделу бактерий ТМ7 (соответственные наиболее близкие последовательности: AN EU283406, идентичность 98%; AN AJ232811, идентичность 99% и AN AF269024, идентичность 99%) (таблица 2). Филогенетический анализ (фигура 2) подтверждает такую классификацию. Несмотря на родство с последовательностью DQ 828869 (идентичность 98%), происходящей из возделываемой почвы, популяцию С до настоящего времени не удалось связать с какой бы то ни было идентифицированной группой бактерий.
В присутствии червей + композиция (I) (S+V+M) были обнаружены популяции, общие с профилем S+V, но их соотношение, по видимости, меняется. Действительно, например, популяция, соответствующая полосе А (та же 1, раздел ТМ7), преобладает в меньшей степени в присутствии минеральной композиции PRP. С другой стороны, тогда как популяции, соответствующие полосам 1, 4 и 7, значительно преобладали в профиле S+E, преобладающими популяциями в профиле (S+E+M) являются те, которые соответствуют полосам 6 (самая близкая последовательность: AN AF269024, 99%, раздел ТМ7) и 3 (самая близкая последовательность: AN AY820689, идентичность 99%, раздел ТМ7).
Е/ Сравнение последовательностей из лунок у почвы + черви + райграс (S+V+PV почва + черви + райграс + PRP CS+V+P+M)
Интересно отметить, что в образце S+V+P популяция, соответствующая полосе D (преобладающей в профиле S+V+P), является той же (или очень близкой), что и популяции в полосах Е (преобладающей в профиле S+P+M), 1 (преобладающей в профиле S+V) и А (преобладающей в профиле S+V+M), то есть бактерии родственны разделу ТМ7. Другую преобладающую популяцию в сочетании черви/райграс (S+V+P), соответствующую полосе 8, не удалось молекулярно идентифицировать. Самой близкой последовательностью, обнаруженной анализом BLAST, действительно является неидентифицированный бактериальный клон, происходящий из почв, связанных с осинами (AN EF020305. идентичность 97%), и таксономическое отнесение RDPII не позволяет связать эту последовательность ни с каким разделом.
В образце с минеральным составом PRP (S+V+P+M) популяции, соответствующие полосам D и 8, больше не являются преобладающими, и другая популяция (самая интенсивная полоса), ДНК которой не удалось очистить, по-видимому, оказывается напрямую активированной минеральным раствором PRP или получает преимущества в результате регуляции, оказываемой на другие популяции.
Результаты анализов методами молекулярной биологии, приведенные в примерах, бесспорно показывают, что эти изменения ферментативной активности связаны с изменениями, происходящими в микробных сообществах. Таким образом, это подтверждает, что минеральная композиция формулы (I) обладает биологическим действием. Однако это биологическое действие зависит от организмов, таких как растения и черви, которые известны влиянием теллуровую микрофлору через сферы активности, которые они создают (ризосфера и дрилосфера). Следовательно, изменения в микробных сообществах являются результатом двойного процесса, (i) воздействия минеральной композиции формулы (I), с одной стороны, и (ii) процесса некоторых организмов, с другой стороны.
Пример 5: Влияние минеральной композиции формулы (I) на образование растительной биомассы
Результаты представлены на фигурах 10А и 10В.
Продукция райграса в присутствии минеральной композиции формулы (I) позволяет увеличить более чем вдвое сухой вес биомассы. В присутствии земляных червей отмечается та же тенденция.