Устройство и способ обнаружения антигенов групп крови при помощи неполного антитела
APPARATUS AND METHOD OF DETECTING ANTIGENS OF BLOOD GROUPS BY INCOMPLETE ANTIBODY

Область изобретения
Изобретение относится к устройствам и способам определения антигенов групп крови при помощи неполного антитела, в частности для одновременного определения антигенов групп крови.
Предшествующий уровень техники
В способах серологической диагностики групп крови, как правило, обнаруживают параметры, которые являются важными, особенно в связи с переливаниями крови или гемолитическим заболеванием новорожденных. Они включают в том числе обнаружение антигенов на поверхности эритроцитов, которые являются характерными для групп крови. Дополнительные важные системы антигенов также обнаружены на тромбоцитах, гранулоцитах и лимфоцитах, которые аналогично играют роль в переливаниях крови и/или трансплантации.
Известно, что для определения антигенов групп крови эритроциты тестируемого лица (донора или реципиента) вносят вместе с реагентами, которые содержат антитела, специфичные для групп крови. Тесты обычно представляют собой жидкие тесты, в которых тестируемую партию готовят путем смешивания содержащего эритроциты образца с образцом, содержащим антитела, направленные против специфической характеристики группы крови. Тестируемую партию затем инкубируют в течение определенного периода времени и в определенных условиях и после завершения инкубации или непосредственно после стадии центрифугирования партию проверяют визуально или при помощи оптических способов в отношении возможной агглютинации или адсорбции на эритроцитах. Преобладающим измерением по конечной точке в серологии групп крови продолжает оставаться гемагглютинация. Антитела, которые способны приводить к прямой агглютинации, в серологии групп крови также называют полными антителами. Антитела, которые не способны приводить к прямой агглютинации эритроцитов, в серологии групп крови по аналогии называют неполными антителами.
Одновременное определение антигенов групп крови с использованием формата теста с латеральным потоком известно в WO 2005/005991. В примерах в WO 2005/005991 раскрыто определение антигенов групп крови при помощи антител IgM, которые представляют собой полные антитела и способны приводить к прямой гемагглютинации. Тем не менее, в описании указанной заявки WO не раскрыто определение антигенов групп крови с использованием неполного антитела при помощи тестового устройства с латеральным потоком.
Тестовые устройства с латеральным потоком в настоящее время широко используются в качестве тестов для экспресс-анализа, например, в качестве тестов на беременность, определения инфекционных маркеров или в качестве анализа на наличие наркотических веществ. Конструкция тестового устройства с латеральным потоком состоит из твердого носителя, к которому прикреплена рабочая зона для тестируемого образца, разделительной мембраны, к которой прикреплены связывающие элементы, например захватывающие антитела или антигены, и на которой могут быть обнаружены реакции связывания, и абсорбирующей области, которая дает возможность тестируемому образцу протекать через разделительную мембрану.
Тестирующие мембраны обычных тестовых устройств с латеральным потоком, как правило, описаны как имеющие разделение, подобное хроматографическому. Аналит в образце специфически связывается со связывающими элементами, фиксированными на мембране, которые, как правило, расположены как индикаторные зоны в полосах, расположенных одна позади другой или одна выше другой. Связывающий комплекс делают видимым за счет индикаторных частиц, которые, как правило, уже присутствуют в конструкции в высушенной форме в подушечке, высвобождающей конъюгат. Подушечку, высвобождающую конъюгат, как правило, располагают между рабочей зоной и мембраной. Предварительно покрытые окрашенные индикаторные частицы покрыты, например антителом, направленным против искомого аналита.
Наиболее важные характеристики групп крови, которые в настоящее время стандартно должны выявляться в тестах, проводимых до переливания крови, у пациентов и у доноров, представляют собой: A, B, D, C, E, c, e, Cw, K, k, Jka, Jkb, Fya, Fyb, M, N, S, s, P1, Lea, Leb, Kpa, Kpb, Lua, Lub. Примеры тестируемых антигенов или эпитопов антигенов представляют собой антигены или эпитопы антигенов системы группы крови ABO, системы Rh, системы Келл, системы Льюиса-Hh, системы Даффи-Кидда, MNS, системы Лютерана и системы P, систем групп крови Диего, Yt, Сцианна, Домбрака, Колтона, Чидо/Роджерса, Гербича, Кромера, Кнопса, Ландштейнера-Винера, Xg, Kx, Индиана, Ok, Raph, Джона Мильтона Хагена, Ланжерейса, Sid, FORS, JR и/или LAN, в частности A1, A2, AB, B, D, C, c, E, e, Cw, K, k, M, N, S, s, Jka, Jkb, Fya, Fyb, Kpa, Kpb, Jsa, Jsb, Lea, Leb, Lua, Lub, P1, I, H, Xga, U, Vw, Wra, Lan, Vel, Dia и/или Mia.
Из-за своего общего отрицательного поверхностного заряда и таким образом создаваемого зета-потенциала эритроциты обладают естественным статистическим минимальным расстоянием приблизительно 300 ангстрем между клетками. Это минимальное расстояние может перекрываться антителами класса IgM в физиологической среде из-за размера молекулы, но естественным образом не антителами класса IgG. Последнее означает, что, как правило, только антитела класса IgM доступны в серологии групп крови для прямого определения по конечной точке путем гемагглютинации. Антитела, способные приводить к прямой агглютинации, в серологии групп крови также называют полными антителами (большинство антител IgM представляют собой полные антитела).
В соответствии с предшествующим уровнем техники группы крови, как правило, не могут быть обнаружены при помощи антител IgG путем прямой гемагглютинации. Антитела, которые не способны приводить к прямой агглютинации эритроцитов, по аналогии называют в серологии групп крови неполными антителами (большинство антител IgG представляют собой неполные антитела).
Последнее приводит к ситуации, заключающейся в том, что необходимо работать с так называемыми различными фазами и временами реакции и температурами в зависимости от того, доступны ли для обнаружения конкретного свойства групп крови (моноклональные) IgM или, с другой стороны, моноклональные IgG или поликлональные антитела, что приводит к усложнению согласованных или гомологизированных рабочих процедур.
При условии доступности антител IgM прямое определение путем гемагглютинации в качестве конечной точки часто возможно без добавления дополнительных антител или усилителей, или протеолитических ферментов и без инкубации (немедленное центрифугирование). Для широко используемой гелевой технологии инкубация не требуется для осуществления такого теста; реакционную смесь, включающую тестируемые эритроциты и реагент на основе антитела просто пипетируют в рабочие зоны гелевой карты и центрифугируют в течение 9-10 минут в нейтральной физиологической среде, то есть физиологической среде, которая не содержит антитела (например DG Gel Neutral Card от Diagnostic Grifols). В еще одном варианте той же самой технологии специфические для групп крови антитела класса IgM уже введены в гелевую матрицу. Тестируемые эритроциты затем просто должны быть пипетированы в рабочие зоны гелевой карты (например DG Gel ABO RH (2D) от Diagnostic Grifols).
Если антитело, доступное для определения конкретной характеристики группы крови, не относится к классу IgM, тогда требуется изменение технологии/фазы для того, чтобы обеспечить возможность гемагглютинации в качестве конечной точки. Это справедливо, например, для следующих из вышеупомянутых характеристик, для которых отсутствуют в продаже антитела IgM в соответствии с предшествующим уровнем техники: k, Fya, Kpa, Kpb и Lua. Аналогично интерес представляют следующие дополнительные характеристики, такие как Dia, Jsa, Jsb, Coa, Cob, Wra, Xga. В продаже отсутствуют моноклональные антитела IgM для обнаружения любого из этих антигенов.
Поскольку антитела IgG, как правило, не способны преодолеть расстояние между двумя эритроцитами вследствие естественного отталкивания, реакция с антигенспецифическим антителом IgG может позволить достичь только сенсибилизации (то есть связывания антитела, но не гемагглютинации, таким образом, без диагностической конечной точки) клеток, который являются положительными в отношении конкретного антигена, без видимой конечной точки гемагглютинации, которая, в свою очередь, необходима для простого визуального диагностического обнаружения: если, например, эритроцит, который несет характеристику группы крови Duffy (Fya) инкубируют с антителом против Fya класса IgG, то возникает реакция антитело-антиген (сенсибилизация), но она не приводит к видимой конечной точке гемагглютинации. Для достижения последней сенсибилизированные клетки дополнительно следует инкубировать со специфическим для класса антителом (в данном случае антителом против IgG), при помощи которого клетки, сенсибилизированные антителами IgG, могут быть связаны, и может возникать конечная точка гемагглютинации (непрямой тест Кумбса). Для гелевой технологии, которую широко используют для этой цели, требуется время инкубации 10-15 минут при 37°C для данного теста с последующим центрифугированием в течение 9-10 минут в карте с антителом против человеческого глобулина или карте Кумбса (например DG Gel Coombs Card от Diagnostic Grifols).
В технологии с трубками, которая также широко используется, инкубирование перед центрифугированием в течение приблизительно 20 секунд не требуется в случае немедленного центрифугирования. Для непрямого теста Кумбса инкубирование сначала осуществляют в течение от 15 до 60 минут при 37°C со специфическим для групп крови неполным антителом, после чего требуется множество стадий отмывания до добавления реагента на основе антитела против человеческого глобулина, и центрифугирование затем осуществляют в течение 20 секунд.
Таким образом, существует потребность в устройстве и способе определения связанных с клетками аналитов, в частности антигенов групп крови, для которых отсутствуют стандартизированные антитела IgM, в частности в продаже отсутствуют антитела IgM. Кроме того, существует потребность в устройстве и способе одновременного определения по меньшей мере двух связанных с клетками аналитов, где стандартизированное антитело IgM, такое как имеющееся в продаже антитело, имеется только для одного из двух связанных с клетками аналитов, так что определение обоих аналитов в предшествующем уровне техники требует замены фазы или изменение технологии.
Краткое изложение сущности изобретения
Техническая проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит в том, чтобы получить устройство, способное определять антигены групп крови (где указанные антигены групп крови и есть связанные с клетками крови аналиты) с получением конечной точки реакции в виде гемагглютинации (в одностадийном способе) для тех типов групп крови, для которых на рынке нет доступных полных антител, с помощью неполных антител.
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предложено устройство для определения связанного с клетками аналита в жидком образце, включающее разделительную матрицу, имеющую по меньшей мере одну индикаторную зону, отличающееся тем, что индикаторная зона содержит первое антитело, направленное против связанного с клетками аналита, или его фрагмент, и связывающий элемент, направленный против первого антитела, где первое антитело представляет собой неполное антитело.
В соответствии с предпочтительным воплощением устройство включает мембрану (2), имеющую рабочую зону (5) для нанесения жидкого образца, по меньшей мере одну индикаторную зону, способную взаимодействовать со связанным с клетками аналитом, и по меньшей мере одну абсорбирующую область (3), которая абсорбирует жидкость после ее прохождения через индикаторную зону, где индикаторная зона расположена между рабочей зоной (5) и абсорбирующей областью (3), отличающуюся тем, что индикаторная зона содержит первое антитело, направленное против связанного с клетками аналита, или его фрагмент, и связывающий элемент, направленный против первого антитела, где первое антитело представляет собой неполное антитело.
В соответствии с еще одним предпочтительным воплощением устройство содержит трубки, заполненные гелевым материалом. Гелевую технологию используют для определения реакции агглютинации эритроцитов. Гелевая колонка действует в качестве фильтра, который замедляет или останавливает миграцию агглютинированных эритроцитов относительно неагглютинированных эритроцитов и таким образом осуществляет разделение. В соответствии с изобретением индикаторная зона геля содержит антитело, направленное против связанного с клетками аналита, или его фрагмент, и связывающий элемент, направленный против первого антитела, где первое антитело представляет собой неполное антитело.
В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предложено устройство для одновременного определения первого и второго связанного с клетками аналита в жидком образце, включающее мембрану (2), имеющую рабочую зону (5) для нанесения жидкого образца, по меньшей мере две индикаторные зоны, которые способны взаимодействовать со связанными с клетками аналитами, и по меньшей мере одну абсорбирующую область (3), которая абсорбирует жидкость после ее прохождения через индикаторную зону, где индикаторные зоны расположены между рабочей зоной (5) и по меньшей мере одной абсорбирующей областью (3), отличающееся тем, что (i) первая индикаторная зона содержит первое антитело, направленное против первого связанного с клетками аналита, или его фрагмент, и связывающий элемент, направленный против первого антитела, где первое антитело представляет собой неполное антитело, и (ii) вторая индикаторная зона (a) содержит первое антитело, направленное против второго связанного с клетками аналита, где первое антитело представляет собой полное антитело; или (б) содержит первое антитело, направленное против второго связанного с клетками аналита, где первое антитело представляет собой неполное антитело, и связывающий элемент, направленный против этого антитела.
Неожиданно авторы настоящей заявки на изобретение обнаружили, что путем нанесения первого неполного антитела и второго антитела, направленного против первого антитела, вместе в индикаторную зону, можно конфигурировать устройство, имеющее разделительную матрицу, предпочтительно в форме мембраны тестирующего устройства с латеральным потоком или в виде гелевой матрицы, таким образом, что возможно определять связанный с клетками аналит при помощи неполного антитела в качестве первого антитела. В результате возможно прежде всего определять связанный с клетками аналит, для которого отсутствуют стандартизированные, такие как имеющиеся в продаже, антитела типа IgM, с использованием разделительной матрицы, такой как тестирующее устройство с латеральным потоком.
Таким образом, технический результат настоящего изобретения состоит в том, что предложенные заявителем устройства позволяют определять антигены групп крови (связанные с клетками аналиты) в образце крови по конечной точке гемагглютинации при использовании неполного антитела, направленного против этого аналита, и связывающего элемента, направленного против указанного антитела. Эти устройства впервые обеспечивают определение антигенов групп крови, для которых нет доступных полных антител, путем прямой гемагглютинации в рамках одной единственной гомогенной стадии способа анализа. Кроме того, эти устройства также впервые обеспечивают, в рамках одного и того же гомогенного метода анализа, параллельное определение разных антигенов с помощью полных и неполных антител.
Это приводит к значительному укорочению времени, требующегося для определения таких аналитов, которые ранее можно было в общем определять только при помощи непрямого теста Кумбса, который требует дополнительной стадии инкубирования. Способ по изобретению также является неожиданным для специалиста в данной области техники, поскольку он мог бы предполагать, что, например, при использовании молекул против IgG в качестве второго антитела, они были бы нейтрализованы неспецифическими в отношении аналита молекулами IgG, присутствующими в цельной крови в высокой концентрации.
Таким образом, в предшествующем уровне техники невозможно было одновременно определять два антигена групп крови (то есть в одном устройстве с латеральным потоком или в одной гелевой карте, имеющей множество гелевых трубок для определения множества параметров), где первый определяют при помощи антитела IgG, и второй определяют при помощи антитела IgM, без необходимости проведения изменения технологии или фазы. Таким образом, в настоящем изобретении предложено преимущество одновременного определения с использованием единичного устройства с латеральным потоком, для которого требуется только единичная однородная стадия способа без отличающихся сред и различных инкубаций.
В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения предложен способ изготовления вышеприведенных устройств, включающий нанесение первого антитела, направленного против связанного с клетками аналита, или его фрагмента, и второго антитела, направленного против первого антитела, или его фрагмента, где первое антитело представляет собой неполное антитело.
В соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения предложен способ определения по меньшей мере одного связанного с клетками аналита, включающий нанесение первого антитела, направленного против связанного с клетками аналита, или его фрагмента, и связывающего элемента, направленного против первого антитела, в индикаторную зону, где первое антитело представляет собой неполное антитело.
В соответствии с пятым аспектом изобретения предложено применение устройств по изобретению для анализа крови, в частности для определения антигенов групп крови или эпитопов антигена.
Подробное описание изобретения
Определения
В связи с настоящим изобретением следующие выражения должны иметь значения, приведенные ниже:
Выражение "полное антитело" обозначает антитело, которое приводит к агглютинации эритроцитов в физиологической среде. Полные антитела включают антитела IgM или их фрагменты, при условии, что эти фрагменты все еще способны к агглютинации. Антитела IgM могут быть моноклональными или поликлональными.
Выражение "неполное антитело" обозначает антитело, которое при инкубировании с эритроцитами не приводит к их агглютинации. Неполные антитела включают антитела IgG, антитела IgA, антитела IgD и антитела IgE, включающие их подклассы или фрагменты антител, при условии, что фрагменты все еще способны связываться со вторым антителом, направленным против полноразмерного антитела. Эти антитела могут быть моноклональными или поликлональными. Способы продукции антител различных классов известны специалистам в данной области техники.
Выражение "связанный с клетками аналит" обозначает любую молекулу, которая естественным образом связана с поверхностью клетки, предпочтительно человеческой клетки, в частности эритроцита. Эти молекулы включают, например рецепторы или антигены групп крови, причем антигены групп крови являются предпочтительными.
Выражение "антиген группы крови" включает антигены системы групп крови ABO, системы Rh, системы Келл, системы Льюиса-Hh, системы Даффи-Кидда, MNS, системы Лютерана и системы P, систем групп крови Диего, Yt, Сцианна, Домбрака, Колтона, Чидо/Роджерса, Гербича, Кромера, Кнопса, Ландштейнера-Винера, Xg, Kx, Индиана, Ok, Raph, Джона Мильтона Хагена, Ланжерейса, Sid, FORS, JR и/или LAN, в частности A1, A2, AB, B, D, C, c, E, e, Cw, K, k, M, N, S, s, Jka, Jkb, Fya, Fyb, Kpa, Kpb, Jsa, Jsb, Lea, Leb, Lua, Lub, P1, I, H, Xga, U, Vw, Wra, Lan, Vel, Dia и/или Mia.
Изготовление устройства с латеральным потоком
Способ, подходящий в принципе для изготовления устройства с латеральным потоком, описан в DE 10330982 A1 и WO 2005/005986, но с изменениями, указанными ниже. Описание DE 10330982 A1 и WO 2005/005986 включено в данное описание путем ссылки.
Способ изготовления устройства по изобретению включает нанесение первого антитела, направленного против связанного с клетками аналита, или его фрагмента, и связывающего элемента, направленного против первого антитела, в индикаторную зону, где первое антитело представляет собой неполное антитело. Первое антитело, направленное против связанного с клетками аналита, и связывающий элемент, направленный против первого антитела, могут быть нанесены на мембрану в области индикаторной зоны вместе или отдельно друг от друга. При их нанесении отдельно друг от друга предпочтительно, чтобы стадию сушки осуществляли после нанесения первого антитела до нанесения связывающего элемента. Концентрацию первого антитела определяют эмпирически, и она зависит от аффинности в отношении связанного с клетками аналита. Концентрация связывающего элемента может быть оптимизирована при помощи серий тестов на основе концентрации первого антитела и его свойств.
Определяемый аналит предпочтительно представляет собой антиген группы крови. Первое антитело особенно предпочтительно направлено против связанного с клетками аналита, выбранного из антигенов групп крови A, B, AB, D, C, E, c, e, Cw, K, k, Jka, Jkb, Fya, Fyb, M, N, S, s, P1, Kpa, Kpb, Lua, Lub, Lea, Leb, Mia, Dia, Jsa, Jsb, Coa, Cob, Wra и Xga, особенно предпочтительно против k, S, Fya, Kpa, Kpb, Lua, Lea, Leb, Mia, Lua, Lub, Dia, Jsa, Jsb, Coa, Cob, Wra и Xga. Первое антитело в этом случае представляет собой неполное антитело, предпочтительно антитело IgG или IgA, особенно предпочтительно антитело IgG. Например, могут быть использованы следующие антитела: антитело против Fya: клон P3TIM (Merck Millipore, VL); антитело против S: клон P3S13JS123 (Diagast, сер. 78007); антитело против k: клон P3A118OL67 (Merck Millipore, FA); и антитело против D: клон ESD-1 (Alba Bioscience).
Связывающий элемент предпочтительно выбран из антитела, направленного против первого антитела, или его фрагмента, и лектина или его фрагмента. Антитело, направленное против первого антитела, особенно предпочтительно представляет собой антитело против IgG. Антитела против IgG имеются в продаже, особенно предпочтительные представляют собой клон MS-278 (Merck Millipore) и в качестве поликлонального антитела, например, монотип или антитело против IgG и против человеческого глобулина (Medion Grifols Diagnostics). Когда первое антитело представляет собой антитело IgA, тогда второе антитело представляет собой антитело против IgA. Антитела против IgA имеются в продаже. Антитела против IgG или против IgA могут иметь тип IgM или IgG, причем моноклональное антитело класса IgM против IgG является предпочтительным. Предпочтительные лектины представляют собой белок A и белок G.
Когда изготавливают устройство для одновременного определения первого и второго связанного с клетками аналита в соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения, тогда (i) первая индикаторная зона содержит первое антитело, направленное против первого связанного с клетками аналита, или его фрагмент, и связывающий элемент, направленный против первого антитела, где первое антитело представляет собой неполное антитело, и
(ii) вторая индикаторная зона содержит (а) первое антитело, направленное против второго связанного с клетками аналита, где первое антитело представляет собой полное антитело; или (б) первое антитело, направленное против второго связанного с клетками аналита, где первое антитело является неполным, и связывающий элемент, направленный против этого антитела.
Первый связанный с клетками аналит предпочтительно выбран из антигенов групп крови k, Fya, Kpa, Kpb, Lua, Lub, Mia, Dia, Jsa, Jsb, Coa, Cob, Wra, Xga и S, и второй связанный с клетками аналит предпочтительно выбран из A, B, AB, C, D, E, c, e, Cw, K, Lea, Leb, Jka, Jkb, Fyb, P1 и s.
Первое антитело, направленное против второго связанного с клетками аналита, в соответствии с альтернативой (а) представляет собой полное антитело, в частности антитело IgM, которое приводит к прямой гемагглютинации. Первое антитело, направленное против второго связанного с клетками аналита, в соответствии с альтернативой (б) представляет собой неполное антитело, предпочтительно первое антитело в соответствии с альтернативой (б) представляет собой антитело IgG или IgA. Связывающий элемент, направленный против первого антитела, в соответствии с альтернативой (б) дает возможность для определения путем гемагглютинации. Связывающий элемент предпочтительно представляет собой антитело IgG или IgM. Альтернативно, также может быть использован лектин, такой как белок A или белок G.
Мембрана устройства, используемого в соответствии с изобретением, представляет собой пористую мембрану. Предпочтительные материалы для мембраны представляют собой, например, нитроцеллюлозу (например, UniSart от Sartorius, HiFlow от Millipore, Whatman, AE99 или FF85/100 от Whatman Schleicher & Schuell), полиэтилен (Lateral Flo от Porex Corporation) или нейлон (Novylon от CUNO). Мембрана предпочтительно имеет самый большой возможный размер пор, поскольку высокая пористость мембраны облегчает проникновение в частности определяемых клеточных компонентов образца, например эритроцитов, в пористую структуру. Применение абсорбирующих мембран является особенно благоприятным. Тем не менее, устройство по изобретению не ограничивается этими свойствами. Предпочтение отдается любым мембранам, имеющим высокую скорость капиллярного потока, где скорость капиллярного потока представляет собой время [с], которое требуется для того, чтобы раствор краски покрыл расстояние 40 мм на данной мембране. Мембраны, для которых скорость капиллярного потока составляет < 100, являются особенно предпочтительными.
В предпочтительном воплощении изобретения уплотнитель расположен на пористой мембране ниже, относительно направления потока, рабочей зоны устройства по изобретению. Используют двух- или трехмерные уплотнители, которые расположены на пористой мембране и при помощи которых создают отделение рабочей зоны с образцом от оставшейся поверхности пористой мембраны. В соответствии с изобретением уплотнитель действует прежде всего в качестве жидкого барьера и дает возможность для направленного распределения жидкости образца и тестирующих реагентов в пористой мембране. В соответствии с изобретением уплотнитель дополнительно герметизирует рабочую зону с образцом для того, чтобы предотвращать нежелательное проникновение жидкости в другие области устройства с латеральным потоком.
Предпочтительные воплощения уплотнителя представляют собой форму паутины либо желоба или воронки. Уплотнитель нарезают из материала, используемого для изготовления уплотнителя. В случае формы воронки или желоба уплотнитель изготавливают с внутренним отверстием, предпочтительные варианты формы которого представляют собой круглую, квадратную или прямоугольную форму, в случае формы воронки - конической частью в сторону обратной стороны (сторона контакта с мембраной) уплотнителя. Предпочтительные материалы для уплотнителя представляют собой материалы, которые не абсорбируют воду (гидрофобные). В конкретном воплощении материалы покрывают с одной стороны адгезивной пленкой, например чувствительной к давлению или самоклеящейся акрилатной адгезивной основой. Таким образом, уплотнитель может быть связан непосредственно с поверхностью пористой мембраны. Альтернативно, уплотнитель может быть связан, например связан адгезивно с кожухом латерального потока, где кожух латерального потока в данном воплощении прижимает уплотнитель к поверхности пористой мембраны и, таким образом, достигаются функции уплотнителя.
Предпочтительные материалы для образования двухмерных уплотнителей представляют собой любую форму липкой ленты или клейкой фольги (например, Tesa 4124 от Beiersdorf AG, ARcare 7815 от Adhesives Research). Предпочтительные материалы для образования трехмерных уплотнителей представляют собой гибкие эластомерные материалы с закрытыми порами или гибкие силиконовые материалы с различной толщиной материала, предпочтительно 3-5 мм (например, пористый каучук EPDM140 от Pitzner, силиконовый каучук или твердый каучук, твердость 40 градусов или меньше, от Castan).
В еще одном предпочтительном воплощении на одной мембране расположено множество уплотнителей, состоящих из одного кусочка, например, с 20 отдельными углублениями (форма желоба).
В результате этой конструкции устройство по изобретению способно абсорбировать жидкие образцы, которые содержат клетки, такие как цельная кровь, таким образом, без отфильтровывания клеток. Кроме того, уплотнитель дает возможность для нанесения больших объемов образцов на пористую мембрану (рабочую зону) без переполнения. Таким образом, уплотнитель поддерживает использование абсорбирующих свойств пористой мембраны. Кроме того, уплотнитель обеспечивает направленный поток образца. Тем не менее, устройство по изобретению может хорошо функционировать с уплотнителем или без него.
2
Для абсорбирующей области (абсорбирующей подушечки) устройства по изобретению предпочтение отдается механически стабильным материалам, предпочтительно обладающим способностью к поглощению воды 20-30 г/100 см (например Millipore). Контакт между абсорбирующей подушечкой и мембраной с латеральным потоком устройства по изобретению создается путем давления и перекрывания с пористой мембраной. Точное расположение абсорбирующей подушечки на мембране достигают путем адгезионного связывания абсорбирующей подушечки с подложкой, несущей мембрану с латеральным потоком.
В еще одном воплощении компоненты устройства по изобретению прикрепляют к несущему листу или подложке для целей механического закрепления. Тем не менее, устройство по изобретению может функционировать с подложкой или без нее. Предпочтение отдается механически стабильным материалам, которые не абсорбируют воду, предпочтительно имеющим толщину 100 мкм или больше, которые покрыты с одной стороны или с обеих сторон адгезивной пленкой, например чувствительной к давлению или самоклеящейся акрилатной адгезивной основой (например, 0,005" полиэфир W/GL-187, G&L). Пористая мембрана и абсорбирующая подушечка закреплены на подложке. В случае подложки, которая является клейкой с обеих сторон, клейкую вторую сторону используют для прикрепления блока к дополнительным поверхностям, например, внутри кожуха с латеральным потоком.
В еще одном воплощении устройство по изобретению с подложкой или без нее, на которую прикрепляют компоненты устройства по изобретению, встроено в кожух, причем компоненты мембраны таким образом прижимаются друг к другу и кожух поддерживает функцию уплотнителя. Тем не менее, в этом случае устройство по изобретению может функционировать в равной степени хорошо с кожухом или без него.
Способы определения
Способ осуществляют путем нанесения жидкого образца. Жидкий образец предпочтительно состоит из крови или составляющих элементов крови, в частности, предпочтительно, цельной крови, концентрата эритроцитов, свернувшейся крови или тестируемой жидкости, такой как контрольная кровь. В этом случае образец может быть разбавлен буфером перед его нанесением.
Изобретение более подробно будет объяснено ниже при помощи графических материалов и примеров, не ограничивающих его объем.
Фиг. 1 в качестве примера представляет собой перспективный вид устройства по изобретению для тестов с латеральным потоком для одновременного определения антигенов групп крови. В данном примере устройство состоит из подложки 1, пористой мембраны 2, абсорбирующей подушечки 3 и уплотнителя 4, который является двухмерным в форме паутины или трехмерным в форме желоба. Пористую мембрану 2 таким образом фиксируют на подложке 1 при помощи чувствительной к давлению или самоклеящейся акрилатной адгезивной основы. Абсорбирующую подушечку 3 аналогичным образом фиксируют на подложке 1 таким образом, что некоторая часть абсорбирующей подушечки 3 перекрывается с пористой мембраной 2. Уплотнитель 4, закрепленный на верхней стороне пористой мембраны 2, отделяет рабочую зону 5 от оставшейся части мембранной поверхности и дает возможность для направленного распределения жидкости образца и тестирующих реагентов внутри пористой мембраны 2. Область индикаторной зоны 6 расположена между рабочей зоной 5 и областью пористой мембраны 2, которая находится в контакте с абсорбирующей подушечкой 3.
На Фиг. 2 показано успешное одновременное определение антигенов групп крови Jka, Jkb, Fya, Fyb, S, s, k и P1. Донор представляет собой Jka-Jkb+Fya-Fyb+S-s+k+P1+. Образец таким образом наносили в рабочую зону, расположенную в середине. Образец течет как через индикаторные зоны, расположенные слева от рабочей зоны, так и через индикаторные зоны, расположенные справа от рабочей зоны.
На Фиг. 3 показано сравнение, с одной стороны, способа по изобретению с первым антителом IgG, направленным против антигенов групп крови D, Fya и k, и вторым антителом против IgG, направленным против первого антитела, и, с другой стороны, сравнительного способа без второго антитела. С правой стороны антитело против IgG наносят три раза в качестве дополнительного отрицательного контроля. На Фиг. 3a показан используемый план нанесения. На Фиг. 3b-3e показаны результаты эксперимента, которые получены с использованием образцов от различных доноров.
Примеры
Пример 1: Определение группы крови
Изготовление тестирующих полосок:
Тестирующие полоски состоят из рабочей зоны, расположенной в центре мембраны, а также двух областей индикаторной зоны и двух абсорбирующих областей на равных расстояниях с обеих сторон от центральной рабочей зоны. Мембраны типа Millipore HiFlow Plus 065 режут на полоски размером 19 x 48 мм (ширина/длина; x/y) для 8-10-полосного дизайна и адгезивно прикрепляют к подложке (например от G&L). Две абсорбирующие подушечки (Millipore) размером 19 x 17 мм и перекрывающиеся с мембраной на 7 мм адгезивно связывают с концами мембраны, дистально относительно рабочей зоны. Полосы длиной 6 мм (каждая по 0,6 мкл) растворов различных антител, специфических в отношении группы крови, наносят на области индикаторной зоны, таким образом, чтобы отступить на две линейные дорожки, с использованием диспенсера, например AD3200 (Biodot): антитело против Jka: клон P3HT7 (Diagast, сер. 78003); антитело против Jkb: клон P3 143 (Diagast, сер. 78004); антитело против Fya: клон P3TIM + антитело против IgG клон MS278 (Merck Millipore, VL+JZ); антитело против Fyb: клон SpA264LBg1 (Merck Millipore, FF); антитело против S: клон P3S13JS123 + антитело против IgG клон MS278 (Diagast, сер. 78007 + Merck Millipore, JZ); антитело против s: клон P3BER (Merck Millipore, FE); антитело против P1: клон P3MON2 (Merck Millipore, VN); антитело против k: клон P3A118OL67 + антитело против IgG клон MS278 (Merck Millipore, FA+JZ). Все антитела сконцентрированы приблизительно в 10 раз перед приготовлением.
Антитело против Jka наносят слева от рабочей зоны в положении x = 3 мм/y = 9 мм - y = 15. Три других антитела (антитело против Jkb, антитело против Fya и антитело против Fyb) наносят несколько раз с интервалами x = 2,5 мм параллельно положению антитела против Jka. Антитело против S наносят справа от рабочей зоны в положении x = 3 мм/y = 34 мм – y = 40. Три других антитела (антитело против s, антитело против k и антитело против P1) наносят несколько раз с интервалами x = 2,5 мм относительно положения антитела против S.
3
0
Валидирующее специфическое антитело против эритроцитов (Val = контроль в процессе; фракция кроличьего антитела IgG против человеческих эритроцитов (RBC), Rockland, 209-4139) наносят в виде точки с отступом x = 2,5 мм/y = 3 мм относительно последней полосы в сериях специфических для групп крови антител. Контрольную точку (Ctl = отрицательный контроль; содержит все составляющие различных композиций антитела за исключением антитела) наносят с отступом y = 3 мм относительно точки Val. Все растворы антитела содержат 1% BSA (бычий сывороточный альбумин) и 9,4% раствор APP3 [32,4% (масс./об.) дигидрат D(+)-трегалозы, 0,055% (об./об.) Генапол PF10, 21,8% (об./об.) метанол, буфер PPB: 15 мМ буфер фосфата калия/10 мМ NaCl/0,05% (масс./об.) NaN]. Антитела разводят в 0,07M буфере Tris (гидроксиметиламинометан)/HCl, имеющем pH 7, за исключением антитела против P1, которое разводят в 0,01 M цитратном буфере, имеющем pH 4, следующим образом: антитело против Jka 1:5, антитело против Jkb 1:5, антитело против Fya 1:5 + антитело против IgG 1:25, антитело против S 1:5 + 1:100, антитело против s (небольшое) 1:16,7, антитело против k 1:10 + антитело против IgG 1:100, антитело против P1 1:10 и антитело против RBC 1:10. После нанесения антител мембраны сушат в течение 1 часа при 45 C запаивают вместе с уплотнителем в поликарбонатный кожух (Medion Grifols Diagnostics AG).
Схема теста:
Образцы крови могут быть отобраны в пробирки, содержащие обычные антикоагулянты (например EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота), CPDA-1 (цитрат-фосфат-декстроза-аденин), ACD (цитратный антикоагулянт с декстрозой), цитрат) или в нативной форме.
В пробирке 1 каплю (50 мкл) цельной крови с антикоагулянтом смешивают с 4 каплями (200 мкл) разбавителя F (Medion Grifols Diagnostics), или 1 каплю осадка эритроцитов смешивают с 8 каплями (400 мкл) разбавителя F, или 2 капли (100 мкл) клеток коагулированной крови смешивают с 2 каплями разбавителя F.
Две капли (100 мкл) полученной в результате суспензии наносят в рабочую зону описанной тестирующей конструкции. Через 30 секунд 6 капель (300 мкл) разбавителя F наносят в рабочую зону. Через 5 минут результаты считывают и регистрируют.
Результат:
Тест является валидным в том случае, если антитело против валидационной точки RBC (val) демонстрирует ясно положительный сигнал (красная точка) и контрольная точка (ctl) указывает на отрицательный результат. Присутствие красной полосы указывает на то, что тестируемый образец крови является положительным для конкретной характеристики группы крови. Отсутствие полосы в соответствующем положении в рабочей зоне свидетельствует о том, что тестируемый образец крови является отрицательным для соответствующей характеристики группы крови.
На Фиг. 2 показано успешное одновременное определение антигенов групп крови Jka, Jkb, Fya, Fyb, S, s, k и P1. Донор представляет собой Jka-Jkb+Fya-Fyb+S-s+k+P1+.
Пример 2: Определение группы крови при помощи способа по изобретению и сравнительный пример
Тестирующую полоску изготавливают по аналогии с примером 1. В качестве антител использовали: антитело против D, клон ESD-1 (Alba), человеческий IgG; антитело против k (cellano), клон P3A118OL67 (Millipore), человеческий IgG; антитело против Fya, клон P3TIM (Millipore), человеческий IgG, и в качестве второго антитела: антитело против IgG, клон MS278 (Millipore), мышиный IgM.
На Фиг. 3a показан используемый план нанесения. На Фиг. 3b-3e показаны результаты эксперимента, полученные с использованием образцов от различных доноров. Ясно видно, что только определение при помощи первого антитела класса IgG, направленного против антигена группы крови, и второго антитела, направленного против этого первого антитела, приводит к четко обнаруживаемой полосе, тогда как определение с использованием первого антитела класса IgG не приводит к четко распознаваемой полосе. С правой стороны антитело против IgG наносят три раза в качестве дополнительного отрицательного контроля. На Фиг. 3b-3e показано, что никакие полосы не были получены в случае этого отрицательного контроля.