СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕКТИНА ИЗ КОРЫ ЛИСТВЕННИЦЫ, ОБЛАДАЮЩЕГО МЕМБРАНОСТАБИЛИЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ И СПОСОБНОСТЬЮ ВОССТАНАВЛИВАТЬ ИОНЫ СЕРЕБРА, НАНОБИОКОМПОЗИТЫ СЕРЕБРА, СТАБИЛИЗИРОВАННЫЕ ПЕКТИНОМ
METHOD OF OBTAINING PECTINE FROM LARCH BARK HAVING MEMBRANE STABILISING ACTIVITY AND CAPACITY TO REDUCE SILVER IONS OF SILVER NANOBIOCOMPOSITE STABILISED WITH PECTINE

Изобретение относится к химии природных полисахаридов и нанобиокомпозитов на их основе, а именно к способам получения пектиновых полисахаридов из древесных отходов и изучению их свойств. Оно может быть использовано в деревоперерабатывающей, фармацевтической, химической, медицинской, пищевой и других отраслях промышленности, поскольку касается способа получения пектиновых полисахаридов из коры лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и/или коры лиственницы Гмелина (даурской) [Larix gmelinii Rupr. (Rupr.)] и изучения свойств получаемого продукта - это восстанавливающая способность пектина по отношению к ионам благородных металлов, например серебра, и его способность образовывать нанобиокомпозиты. Кроме того, показана мембраностабилизирующая активность полученных пектиновых полисахаридов.
Пектиновые полисахариды могут быть получены из различных растительных источников и различными методами. Так для выделения пектиновых полисахаридов используют надземную часть свежесобранного растительного сырья [патент RU 2176515, патент RU 2149642], а также биомассу культивируемых тканей растений [патент RU 2175843]. Недостатками первых двух методов является то, что при использовании свежесобранного сырья ограничено время его переработки, а недостатком третьего метода является необходимость культивации тканей растений, т.е. специальная технология подготовки сырья - выращивание культуры тканей из ограниченного круга пектинсодержащих растений, на что требуются дополнительные расходы.
По выбору исходного сырья для извлечения пектина близким к заявляемому является объект - кора лиственницы сибирской, используемый в работе: [Ефремов А.А., Кондратюк Т.А. Химия растительного сырья, 2008, № 4, С.171-176].
Недостатками этого способа является то, что в качестве исходного сырья для получения пектиновых веществ использована кора только одного вида лиственницы - лиственницы сибирской, и для выделения пектинов применен метод гидролиз-экстракции с использованием сильного кислотного агента - соляной кислоты, что, как известно, приводит к деструкции получаемого продукта - нарушению нативности структуры пектина и, как следствие, к изменению его биологических свойств.
Наиболее близким к заявляемому изобретению по методу извлечения является способ получения полисахаридов, обладающих иммуностимулирующим действием [патент RU 2176515]. Суть этого патента заключается в следующем: сырье - свежесобранные пресноводные цветковые растения или предварительно измельченная свежая надземная часть высших растений обрабатывается формалином для удаления пигмента, выдерживается в подкисленной воде при рН 3,8-4,2 и 45-52°С, затем осуществляется экстракция пектиновых полисахаридов водным раствором оксалата аммония. Экстракт концентрируется и обрабатывается 96% этиловым спиртом. Полученный целевой продукт отфильтровывается и высушивается лиофильно.
Недостатками этого способа является то, что он распространяется только на свежесобранное растительное сырье, а также на первой стадии обработки сырья используется формалин, который в настоящее время внесен в список канцерогенных веществ, и при изготовлении продукта для внутреннего приема человеком требует дополнительного анализа на его наличие в конечном продукте.
Задачи предлагаемого изобретения.
1. Расширение сырьевой базы для получения пектиновых полисахаридов за счет использования отходов деревоперерабатывающей промышленности: коры лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и/или коры лиственницы даурской (Гмелина) (Larix gmelinii Rupr. (Rupr.)).
2. Разработка нового способа выделения пектиновых полисахаридов, лишенных вышеуказанных недостатков
3. Определение свойств (химических и биологических) получаемого продукта.
Технический результат достигается за счет использования последовательных экстракций многотоннажного отхода деревоперерабатывающей промышленности - лиственничной коры для освобождения ее от липидов и фенольных веществ, затем от танинов и в результате получается суммарная фракция пектиновых полисахаридов с выходом до 12%. Неоспоримым достоинством и преимуществом предлагаемого способа является то, что он позволяет получать ценный продукт для фармацевтической, медицинской, пищевой и других видов промышленности из бросового сырья - лиственничной коры, являющейся отходом при заготовке древесины. Кроме того, нами показано, что выделенные таким образом пектиновые полисахариды обладают мембраностабилизирующей активностью. Установлено, что пектин обладает свойством восстановителя ионов благородных металлов, в частности Ag(0), до нуль-валентного состояния с образованием устойчивой фазы металлического серебра с размерами частиц 3-27 нм, в результате чего образуется нанобиокомпозит, где пектин одновременно играет роль стабилизатора металлических частиц в наноразмерном состоянии.
Решение поставленных задач достигается следующим образом.
В качестве сырья для получения пектиновых полисахаридов используют многотоннажный отход деревоперерабатывающей промышленности - кору лиственницы сибирской {Larix sibirica Ledeb.) или кору лиственницы Гмелина (даурской) (Larix gmelinii Rupr. (Rupr.)), а также их смесь. Сырье обрабатывают последовательно этилацетатом для освобождения от липидных и фенольных соединений, затем водой для освобождения от танинов, далее для разрушения протопектина выдерживают в подкисленной щавелевой кислотой воде при рН 3,8-4,2 при температуре 45-52°С в течение 3-4 часов. Экстракцию пектиновых полисахаридов осуществляют водным раствором оксалата аммония, экстракт концентрируют, полисахариды осаждают 96%-ным этиловым спиртом, сушку целевого продукта ведут лиофильно.
Нами впервые доказано, что пектину, выделенному из коры лиственницы, свойственна мембраностабилизирующая активность, а также способность играть роль восстановителя ионов серебра, при этом результатом является образование нанобиокомпозитов, состоящих из наноразмерных частиц серебра, которые стабилизированы аморфной полисахаридной матрицей пектина.
Изучение мембраностабилизирующей активности пектиновых полисахаридов осуществлялось с помощью метода цейтрафферной компьютерной видеосъемки микроскопических объектов [ДАН, 2003, Т.389, № 2, С.283-285] с использованием в качестве мембранной модели изолированные из клеток растений вакуоли. На фиг.1 проиллюстрированы результаты экспериментов по влиянию пектина, выделенного из коры лиственницы посредством предлагаемого способа, на стабильность структуры мембран и их барьерные свойства. Результаты свидетельствуют о том, что период полураспада фракции изолированных вакуолей при действии водного раствора пектина с концентрацией 0,66 мг/мл увеличивается в 2,5 раза по сравнению с контролем. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что пектину свойственна мембраностабилизирующая активность.
3
На примере исследования редокс-реакций пектина из коры лиственницы с AgNO установлено, что пектин восстанавливает Ag(I) до Ag(0). Кроме того, обнаружено, что в результирующих продуктах он является стабилизирующей матрицей частиц металлического серебра и их размер находится в диапазоне 3-27 нм.
Для получения наноразмерных металлических (Ag) частиц мы использовали методику, описанную в патенте [RU 2278669 "Средство, обладающее антимикробной активностью"]. Вместо арабиногалактана - полисахарида, полученного из древесины лиственницы, мы использовали выделенный из коры лиственницы по предлагаемому выше способу пектин. К 5% водному раствору пектина при интенсивном перемешивании добавляли водные растворы с содержанием нитрата серебра от 0,0058 до 0,294 моль/л и оставляли при комнатной температуре в течение 20-40 мин. После этого рН раствора доводили до 10-12. Для этого применяли 30% раствор гидроксида натрия. Полученные смеси выдерживали при температуре 20-90°С в течение 5-60 мин. Раствор фильтровали, и целевой продукт выделяли высаживанием фильтрата в этанол. Полученный осадок отфильтровывали и сушили в вакууме. В полученных образцах определяли по методу Фольгарда содержание серебра, которое варьировалось в зависимости от взятого количества нитрата серебра и условий реакции от 1,3 до 36,91% по массе.
Рентгенографический фазовый анализ (дифрактометр Дрон-3.0, Cu Кα) полученных образцов свидетельствует, что они представляют собой смесь рентгеноаморфной и кристаллической фаз. На дифракционной картине рентгеноаморфной фазы, соответствующей исходному пектину (фиг.2а), в интервале углов 2θ от 8 до 60Е наблюдается широкое гало с максимумом интенсивности при d~0.46 нм. При введении серебра на дифрактограммах продуктов реакции на фоне широкого отражения пектина появляются достаточно интенсивные, но уширенные линии, характерные для металлического серебра (фиг.2б). Расчет параметра элементарной ячейки серебра показывает, что в данных образцах его величина меньше, чем для массивного серебра, и меняется от 0.4036 до 0.4050 нм (∀0.0008 нм). При этом средние размеры областей когерентного рассеяния (ОКР), рассчитанные по формуле Селякова-Шеррара [Липсон Г., Стилл Г. Интерпретация порошковых рентгенограмм. - М.: Мир, 1972, 384 с.], находятся в области 3 нм. Полученные данные свидетельствуют о наличии в составе образцов наноразмерных (от 3 до 27 нм) частиц Ag(0), стабилизированных аморфной фазой - пектином.
Анализ полученных образцов посредством применения просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) (прибор LEO 906E) свидетельствует о том, что полученные нанобиокомпозиты состоят из изолированных частиц нуль-валентного серебра, некоторые из которых представлены в глобулярной форме. Их размер находится в интервале от 3 до 27 нм с преобладанием (до 80%) в области 8-9 нм.
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет выделить из отхода деревоперерабатывающей промышленности - коры лиственницы сибирской и/или лиственницы Гмелина пектиновые полисахариды, обладающие мембраностабилизирующими свойствами, а также проявляющие способность восстанавливать ионы благородных металлов до нуль-валентного состояния и при этом одновременно служащие стабилизирующей аморфной матрицей получаемых при этом нанобиокомпозитов.
Ниже приведены примеры получения пектина и экспериментального подтверждения его мембраностабилизирующих и восстанавливающих металлы свойств, а также его способности образовывать нанобиокомпозиты.
Пример 1.
Кору лиственницы сибирской {Larix sibirica Ledeb.) (100 г - а.с.н.) помещают в круглодонную колбу, снабженную мешалкой, обратным холодильником, термометром, заливают этилацетатом (гидромодуль 1:5-10) и помещают на водяную баню. Ведут экстракцию при температуре 60-70°С в течение 3 часов. Экстракт отфильтровывают с использованием вакуума. Процесс повторяют дважды. Далее проэкстрагированную этилацетатом кору заливают водой и выдерживают при перемешивании и при температуре 45-52°С в течение 3 часов. Водный экстракт отфильтровывают. Процесс повторяют дважды. Освобожденную таким образом от фенольных соединений, низкомолекулярных углеводов и танинов кору обрабатывают водным раствором щавелевой кислоты (рН 3,8-4,2) в соотношении сырье: раствор 1:7-10 при температуре 45-52°С в течение 3-4 часов. Экстракцию пектиновых полисахаридов проводят дважды 0,5-0,7% раствором оксалата аммония в соотношении 1: 8-12 при температуре 60-70°С в течение 3-5 часов. Далее экстракт концентрируют, осаждают 96% этанолом в соотношении экстракт-спирт 1:3-4, фильтруют, полученный осадок - пектиновые полисахариды, лиофильно высушивают. Выход целевого продукта - до 10% от а.с.н. исходного сырья.
Пример 2.
В качестве исходного сырья используют кору лиственницы Гмелина (даурской) (Larix gmelinii Rupr. (Rupr.)). Далее обработку осуществляют так же, как описано в примере 1. Выход целевого продукта - до 12% от а.с.н.
Пример 3.
В качестве сырья используют смесь коры лиственницы сибирской (Larix sibirica Ledeb.) и коры лиственницы Гмелина (даурской) (Larix gmelinii Rupr. (Rupr.)) - отход деревоперерабатывающего предприятия. Далее обработку осуществляют, как описано в примере 1. Выход целевого продукта - до 10% от а.с.н.
Характеристика целевого продукта - пектина из коры лиственницы приведена в таблице 1.
Пример 4.
Определение мембраностабилизирующих свойств пектина коры лиственницы
Мембранотропную активность оценивают по изменению динамики разрушения изолированных вакуолей по сравнению с контролем. Для этого применяют компьютерную обработку серии телевизионных изображений, отражающих динамику процесса разрушений вакуолей, полученных с помощью экспериментальной установки, которая состоит из инвертированного микроскопа (Биолам П-1) с коллектором на 12 микроскопических образцов, телевизионной камеры (КТП-67), фиксатора телевизионного кадра на базе приборного интерфейса КАМАК, персонального компьютера (ПК) и программного обеспечения. Через телевизионную камеру и фиксатор кадра в заданный момент времени изображение фракций изолированных вакуолей заносится в память ПК. Серию изображений обрабатывают с помощью специальной программы и по полученным данным вычисляют период полураспада изолированных вакуолей относительно контроля по формуле
-1
Для проведения эксперимента вакуоли изолируют по методу [Саляев Р.К., Кузеванов В.Я., Озолина П.В. и др. // Физиология растений. 1982. Т.29. № 5. С.933-940] из клеток корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) в растворе, содержащем (мМ): 100 KCl, 5 ЭДТА, 15 HEPES / KOH, рН 8.3, аланин (до осмотической концентрации 1 Осм·кг), переносят в микрокамеры и помещают в коллектор.
-1
Инкубационный раствор содержит (мМ): 100 КС1, 15 HEPES / КОН, рН 7.3, аланин (до осмотической концентрации 1 Осм·кг).
Результаты по наличию мембранотропной активности, полученные с использованием растворов пектина коры лиственницы с различной концентрацией, проиллюстрированы на фиг.1 и свидетельствуют, что ему свойственна мембраностабилизирующая активность.
Получение нанобиокомпозитов пектина с частицами металлического серебра.
Пример 5
К 2 мл водного раствора с содержанием пектина 0,1 г прибавляют 2 мл водного раствора с содержанием нитрата серебра 0,05 г (0,147 моль/л) и полученную смесь в течение 20 мин перемешивают с использованием магнитной мешалки при комнатной температуре. Измеряют рН полученного раствора 2,85, затем посредством добавления по каплям 30% водного раствора NaOH доводят рН до 12 и полученный раствор нагревают на кипящей водяной бане 20 мин, охлаждают, добавляют 96% этанол в избытке, при этом образуется осадок - искомый нанобиокомпозит «Пектин - Ag(0)», который отфильтровывают и высушивают в вакууме. Выход - 86,67%.
Содержание серебра в полученном нанобиокомпозите, определенное по методу Фольгарда, составляет 23,88% по массе.
Пример 6
К 2 мл водного раствора с содержанием пектина 0,1 г прибавляют 2 мл водного раствора с содержанием нитрата серебра 0,1 г (0,294 моль/л) и полученную смесь в течение 20 мин перемешивают с использованием магнитной мешалки при комнатной температуре. Измеряют рН полученного раствора 2,95, затем посредством добавления по каплям 30% водного раствора гидроксида натрия доводят рН до 12 и полученный раствор нагревают на кипящей водяной бане 20 мин, охлаждают, добавляют 96% этанол в избытке, при этом образуется осадок - искомый нанобиокомпозит «Пектин - Ag(0)», который отфильтровывают и высушивают в вакууме. Выход - 78,33%. Содержание серебра в полученном нанобиокомпозите, определенное по методу Фольгарда, составляет 36,61% по массе.
Данные рентгеноструктурного анализа и ПЭМ нанобиокомпозита «Пектин - Ag(0) (23,88 мас.%)» представлены на фиг.2а, 2б и фиг.3 и свидетельствуют, что в состав образца входят частицы Ag(0), стабилизированные пектином, находящимся в аморфной фазе. Параметр элементарной ячейки серебра равен 0,40500 нм, размеры областей ОКР находятся в области 3 нм. Результаты ПЭМ (фиг.3) свидетельствуют, что частицы Ag(0) имеют сферическую форму, некоторые из них обладают глобулярным характером и их размер находится в области от 3 до 27 нм.
В табл. 1приведена характеристика пектиновых полисахпридов.
Таблица 1.
Характеристика пектиновых полисахаридов
Сырье
Выход, %*
Содержание, %*
белков
галактуроновой кислоты
Кора лиственницы сибирской
2-10
2-7
65-78
Кора лиственницы Гмелина
3,5-12
7-12
60-75
Кора смеси лиственниц сибирской и Гмелина
2 -10
2-10
60-70
* - диапазон данных представлен для пектиновых полисахаридов, выделенных из сырья, заготовленного в различное время года