Кислые эфиры гинзенозидов в суспензионной культуре клеток Panax japonicus var. Repens

ПРОБЛЕМЫ ЭКОЛОГИИ И РАЦИОНАЛЬНОГО ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ

УДК 577.13+576.535.2

Д. В. Кочкин, А. М. Носов

КИСЛЫЕ ЭФИРЫ ГИНЗЕНОЗИДОВ В СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК PANAX JAPONICUS VAR. REPENS

Впервые с помощью ВЭЖХ-УФ-анализа показано накопление кислых нестабильных эфиров основных гинзенозидов в суспензионной культуре клеток Panax japonicus var. repens. На основании данных хроматографии доказано наличие малонил-гинзенозида Rb 1 в биомассе культуры клеток in vitro данного вида женьшеня.

Ключевые слова: культура клеток in vitro, ВЭЖХ, Panax japonicus, мало-нил-гинзенозиды, малонил-гинзенозид Rb1.

Введение. Более полувека прошло с момента открытия гинзенозидов - тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда - основных биологически активных веществ женьшеня (род Panax L.). За это время достигнуты немалые успехи в изучении накопления этих соединений in vivo и in vitro. Так, из различных представителей рода выделены и охарактеризованы более 150 индивидуальных гинзенозидов, многие из которых являются либо минорными соединениями, либо нестабильными ацильными производными мажорных компонентов [1]. Более того, благодаря совершенствованию методов практической фитохимии существующие представления о композиционном составе нативных гликозидов женьшеня постоянно приходится пересматривать. Например, еще 20 лет назад в литературе бытовало мнение, что кислые эфиры основных гинзенозидов являются минорными компонентами гликозидной фракции корней женьшеня [2]. В настоящее время установлено, что более 50 % от суммы гинзенозидов в интактном корне Panax ginseng C. A. Mey. могут составлять нестабильные эфиры гинзенозидов (прежде всего Rbi) с малоновой кислотой [3].

Несомненные успехи в изучении гинзенозидов в растениях женьшеня in vivo резко контрастируют с достижениями в исследовании этих природных соединений в культурах клеток in vitro. Особенно остро существующая асимметрия данных по химии женьшеня in vivo и in vitro проявляется в свете того, что многие виды рода Panax давно являются классическими объектами различного рода биотехнологий [4]. Подавляющее число работ, посвященных культурам клеток разных видов женьшеня, ограничиваются рассмотрением различных аспектов накопления в условиях in vitro только семи основных нейтральных гинзенозидов (на рис. 1 обозначены как Rgi, Re, Rf, Rbi, Rc, Rb2 и Rd), коммерческие стандартные образцы которых легко доступны [5, 6].

© Кочкин Д. В., Носов А. М., 2011.

Между тем, возможность формирования в различных системах клеток и тканей растений in vitro сложного паттерна гинзенозидов, весьма характерного для интактного растения женьшеня, остается обойденной вниманием исследователей. При этом следует заметить, вопрос об образовании минорных и нестабильных гинзенозидов в условиях стерильной культуры имеет не только фундаментальное, но и вполне конкретное практическое значение. Доказательством этому служат опубликованные в последнее десятилетие работы по молекулярной медицине женьшеня, основной вывод которых заключается в том, что многие уникальные терапевтические свойства этого растения определяются именно минорными и нестабильными гинзенозидами [7].

Цель настоящей работы заключалась в изучении возможности накопления в суспензионной культуре клеток Panax japonicus C. A. Mey. var. repens Maxim. ацилированных производных нейтральных гинзенозидов.

Рис. 1. Структурные формулы основных тритерпеновых гликозидов растений рода Panax L. ППД: 20^)-протопанаксадиол; ППТ: 20^)-протопанаксатриол; Glc: fî-D-glucopyranosyl; Ara(f): a-D-arabinofuranosyl; Rha: a-L-rhamnopyranosyl; Xyl: fî-D-xylopyranosyl; GluA: fî-D-glucuronopyranosyl

Условия эксперимента. Объектом исследования служила суспензионная культура клеток Panax japonicus C. A. Mey. var. repens Maxim., зарегистрированная во Всероссийской коллекции культур клеток высших растений (РККК ВР) под № 62. Условия выращивания культуры описаны ранее [8]. Для хроматографического анализа использовали воздушно-сухую биомассу культуры на 21 сутки роста.

В качестве стандартных образцов использовали гинзенозиды Rg1, Re, Rb1, Rc, Rb2, Rb3 (Sigma, США) и Ro (ТИБОХ ДВО РАН, Россия) и гипенозид XVII (Gyp 17, получен в нашей лаборатории).

ВЭЖХ проводили на приборе Perkin Elmer Series 200 (PerkinElmer, США), укомплектованном вакуумным дегазатором, бинарным градиентным насосом, автоматическим инжектором и спектрофотометрическим детектором. Сбор и анализ данных проводили с помощью программы TotalChrom (PerkinElmer, США). Разделение гинзенозидов осуществляли на колонке Hypersil BDS C18 (250x4,6 мм, 5 мкм, Thermo Hypersil-Keystone Inc., США) при 25°С, скорости потока элюента 1 мл/мин и детектировании при длине волны 207 нм. Элюирование аналитов с колонки осуществляли в градиентном режиме смесью ацетонитрил - вода с добавлением различных модификаторов (KH2PO4, H3PO4). Состав подвижной фазы (ацетонитрил, % по объему) менялся в соответствии со следующими условиями:

система 1 - 0 мин 15 %, 5 мин 18 %, 17 мин 21 %, 32 мин 27 %, 57 мин 37 %, 64 мин 45 %, 69 мин 55 %, 71 мин 90 %, 76 мин 90 %;

система 2 - 0 мин 28 %, 2,5 мин 29 %, 13,5 мин 34 %, 24,5 мин 39 %, 29,5 мин 43 %, 30 мин 90 %, 32,5 мин 90 %.

Наличие нестабильных эфиров гинзенозидов определяли с помощью обработки щелочью спиртового экстракта биомассы клеток с известным профилем ВЭЖХ. Использовали 5 мМ раствор KOH в этаноле, обработку проводили в течение 10 мин при комнатной температуре. После завершения омыления раствор нейтрализовали ледяной уксусной кислотой (контроль pH по универсальной индикаторной бумаге, Реахим, Россия) и использовали для ВЭЖХ.

Подготовка проб для анализа. 20 мг воздушно-сухой биомассы культуры клеток экстрагировали смесью метанол : вода (95:5 по объему) в течение 30 мин под действием ультразвука (УЗВ YX 3560, GXET LTD, КНР) при комнатной температуре. Затем полученный экстракт центрифугировали 6 мин при 3900 g (Микроцентрифуга МЦФ, Россия). Суперна-тант фильтровали через нейлоновой фильтр с порами 0,2 мкм (Acrodisc, Германия). Полученную пробу использовали для ВЭЖХ.

Смесь кислых гинзенозидов получали путем грубого фракционирования спиртового экстракта биомассы культуры клеток. Для этого 10 г спиртового экстракта, полученного по общепринятой методике [9] из 500 г биомассы, растворяли в минимальном объеме воды и наносили на колонку, содержащую 150 г крупнопористого сорбента Extrelut (Merck, Германия). Для извлечения неполярных и слабополярных нейтральных гинзенозидов колонку промывали 300 мл н-бутанола. Оставшиеся на колонке полярные (в том числе кислые) соединения смывали 250 мл этанола. Полученную фракцию упаривали под вакуумом при 40°С и использовали для хроматографического анализа.

Результаты и обсуждение. ВЭЖХ-профиль спиртового экстракта из биомассы культуры клеток Panax japonicus var. repens, полученный при элюировании подвижной фазой с нейтральным pH (ацетонитрил - вода), представлен на рис.2. Сопоставление времен удерживания обнаруженных на хроматограмме пиков и доступных стандартных образцов гин-зенозидов позволило заключить, что в спиртовом экстракте биомассы P. japonicus присутствуют девять основных нейтральных гинзенозидов (Re, Rgi, Rf, Rbi, Rc, Rb2, Rb3, Rd и Gyp XVII). Кроме того, среди компонентов хроматографического паттерна также обнаруживались четыре сильно уширенных и плохо разрешенных пика, максимумы которых были зафиксированы на 28,4; 34,9; 35,7 и 40,0 минутах анализа (на рис. 2 обозначены как М 1, М2, М3 и М 4, соответственно).

Элюирование подвижной фазой, составленной из ацетонитрила и 8 мМ водного раствора KH2PO4 (pH 4,82), позволило придать данным пикам симметричную форму и добиться их удовлетворительного разрешения (рис. 3, I). Кроме того, использование в качестве модификатора подвижной фазы 8 мМ раствора фосфорной кислоты (pH 2,11) привело к существенному изменению хроматографической картины (рис. 3, II). В данных условиях

наблюдали исчезновение описанных пиков из обычной области их элюирования слабокислым растворителем (12-20 мин, система 2) и одновременное увеличение количества пиков, выходивших из колонки после гинзенозида Rbi (21,5-31 мин, система 2).

Описанные факты свидетельствуют, что пики М1-М4 соответствуют соединениям, сродство которых к стационарной обращенной фазе существенно зависит от кислотности подвижной фазы. Согласно опубликованным в периодической печати данным, среди всего многообразия гликозидов женьшеня только две группы соединений характеризуются подобным хро-матографическим поведением [10]. Оба этих структурных класса обычно характеризуют как «кислые» гинзенозиды («acidic» ginsenosides). В соответствии с расположением карбоксильной группы в той или иной части молекулы среди кислых гинзенозидов выделяют:

1) гликозиды олеаноловой кислоты со свободной карбоксильной группой агликона и/или глюкуроновой кислоты;

2) сложноэфирные конъюгаты нейтральных гинзенозидов с двухосновной малоновой кислотой.

Сопоставление хроматографической подвижности соединения М1 и стандарта гинзенозида Ro, имеющего свободную карбоксильную группу в остатке глюкуроновой кислоты, показало, что данные соединения идентичны. Кроме того, порядок элюирования соединений М2—М4 позволяет, опираясь на данные литературы [11, 12], высказать предположение о том, что эти пики соответствуют малонильным эфирам гинзенозидов Rb1, Rc и Rd.

Рис. 2. ВЭЖХ-профиль спиртового экстракта биомассы P. japonicus var. repens, подвижная фаза с нейтральным pH, система 1. Обозначение пиков: (1) Rg1, (2) Re, (3) М1, (4) М2, (5) М3, (6) Rf, (7) М4, (8) Rb1,

(9) Rc, (10) Rb2, (11) Rb3, (12) Rd, (13) Gyp XVII

Рис. 3. ВЭЖХ-профиль спиртового экстракта биомассы P. japonicus var. repens, подвижная фаза с pH 4,8 (I) и 2,1 (II), система 2. Обозначение пиков: (1) М1, (2) М2, (3) М3, (4) М4, (5) Rb1, (6) Rc, (7) Rb2, (8) Rb3,

(9) Rd, (10) Gyp XVII

В ряде публикаций для обнаружения в экстрактах различных образцов женьшеня ацильных производных гинзенозидов был предложен косвенный метод [10], основанный на крайней нестабильности данных соединений, чувствительных к любым экстремальным воздействиям (умеренное нагревание или мягкий щелочной гидролиз).

В наших экспериментах по обработке спиртового экстракта биомассы Р. japonicus раствором щелочи было показано исчезновение из ВЭЖХ-профиля соединений М2-М4, в то же время наблюдалось увеличение площадей пиков гинзенозидов Rbl, Rc и Rd. Эти результаты можно рассматривать в качестве косвенных доказательств того, что пики М2-М4 соответствуют восприимчивым к нуклеофильной атаке конъюгатам нейтральных гинзенозидов. А это, в свою очередь, подтверждает высказанное ранее предположение.

Более точное подтверждение принадлежности данных ацильных производных к тем или иным нейтральным гинзенозидам предполагает их получение в индивидуальном виде. Однако среди компонентов М2-М4 только М2 содержался в биомассе в количествах, достаточных для препаративного выделения. Существенные различия полярности нейтральных и кислых гинзенозидов определяют особенности их распределения в гетерогенных системах, таких как несмешивающиеся органический растворитель и вода. Использование этого свойства гликозидов дало возможность с помощью системы н-бутанол - вода получить из суммы гликозидов культуры клеток Р. japonicus фракцию, обогащенную кислыми гликозидами, ВЭЖХ-профиль которой приведен на рис. 4, I.

Представленная хроматограмма свидетельствует, что из исходной смеси гинзенозидов в данной фракции присутствовали только гинзенозид Я и компоненты М2 и М3, причем М2 являлся мажорным компонентом. Мягкий щелочной гидролиз данной фракции (рис. 4, II) приводил к образованию в качестве основного продукта соединения, идентичного по удерживанию стандарту гинзенозида ЯЬ1.

Рис. 4. ВЭЖХ-профиль фракции кислых гликозидов из биомассы Р. ]арвтсш var. герет, до (I) и после (II) обработки спиртовым раствором щелочи, подвижная фаза с рН 4,8, система 2. Обозначение пиков: (1) R0, (2) М2, (3) М3, (4) Rb1

Выводы. Изложенные результаты показывают, что компонент M1 является кислым производным гинзенозида Rbi, который легко разрушается в щелочных условиях. В настоящее время в природе известно только одно соединение, соответствующее этому описанию - малонильный эфир гинзенозида Rb1 [1].

В заключение следует заметить, что сообщений о возможности образования малониль-ных эфиров гинзенозидов в культуре клеток in vitro в открытой печати не обнаружено. Таким образом, впервые с помощью ВЭЖХ-УФ-анализа показано накопление кислых нестабильных эфиров основных гинзенозидов в суспензионной культуре клеток Panax japonicus. При этом, на основе данных хроматографии и масс-спектрометрии высокого разрешения доказано наличие малонил-гинзенозида Rb1 в биомассе культуры клеток in vitro данного вида женьшеня.

Список литературы

1. Christensen, L.P. Ginsenosides chemistry, biosynthesis, analysis, and potential health effects / L.P. Christensen // Adv. Food Nutr.Res. - 2008. - V. 55. - P. 1-99.

2. Court, W.E. The principal active chemicals in Panax species / W.E. Court // Ginseng: The Genus Panax. [ed Court W.E.]. - New York : Harwood Academic Publishers, 2000. - P. 551-16.

3. Kite, G.C. Liquid chromatography/mass spectrometry of malonyl-ginsenosides in the authentication of ginseng / G.C. Kite, M.-J.R. Howes, C.J. Leon, M.S.J. Simmonds // Rapid Commun. Mass Spectrom. - 2003. - V. 17. -P. 238-244.

4. Wu, J. Production of ginseng and its bioactive components in plant cell culture: Current technological and applied aspects / J.Wu, J.J. Zhong // J. Biotechnol. - 1999. - V. 68. - P. 89-99.

5. Решетняк, О.В. Изменение состава и соотношения гинзенозидов в биомассе каллусной и суспензионной культуры клеток Panax japonicus var. repens / О.В. Решетняк, И.Е. Князьков, И.Н. Смоленская и др. // Биотехнология. - 2003. - № 2. - C. 69-75.

6. Kochan, E. Dynamics of ginsenoside biosynthesis in suspension culture of Panax quinquefolium / E. Kochan, А. Chmiel // Acta Physiol. Plant. - 2011. - V. 33. - P. 911-915.

7. Leung, K.W. Pharmacology of ginsenosides: a literature review / Leung, K.W., Wong A.S.T. // Chin. Med. -2010. - V. 5. - P. 20.

8. Смоленская, И.Н. Суспензионная культура клеток Panax japonicus var. repens 1. Параметры роста и цитогенетические характеристики / И.Н. Смоленская, С.Э. Заринянц, Ю.Н. Смирнова, и др. // Биотехнология. -2005. - № 5. - C. 21-28.

9. Qi, L.-W. Isolation and analysis of ginseng: advances and challenges / L.-W. Qi, Wang, C.-Z., Yuan, C.-S. // Nat. Prod. Rep. - 2011. - V. 28. - P. 467-495.

10. Fuzzati, N. Analysis methods of ginsenosides / N. Fuzzati // Journal of Chromatography B. - 2004. - V. 812.

- P. 119-133.

11. Hu, P. The retention behavior of ginsenosides in HPLC and its application to quality assessment of radix ginseng / P. Hu, G.-A. Luo, Q. Wang, Z.-Z. Zhao, W. Wang, Z.-H. Jiang // Arch Pharm. Res. - 2008. - V. 31. - P. 1265-1273.

12. Li, S.-L. Decocting-induced chemical transformations and global quality of Du-Shen-Tang, the decoction of ginseng evaluated by UPLC-Q-TOF-MS/MS based chemical profiling approach / S.-L. Li, S.-F. Lai, J.-Z. Song, C.-F. Qiao, X. Liu, Y.Z.H. Cai, B.-C. Cai, H.-X. Xu // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2010. - V. 53.

- P. 946-957.

Статья поступила в редакцию 15.10.11.

Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» (государственный контракт № 16.552.11.7050 от 29 июля 2011 г.) и Межгосударственной целевой программы ЕврАзЭС «Инновационные биотехнологии» (государственный контракт № 16.М04.12.0003) с использованием оборудования ЦКП «ЭБЭЭ» ФГБОУ ВПО «МарГТУ».

D. V. Kochkin, A. M. Nosov

GINSENOSIDES ACIS ESTERS IN SUSPENSION CULTURE OF PANAX JAPONICUS VAR. REPENS CELLS

Accumulation of acid unstable esters of the basic ginsenosides in suspension culture of Panax japonicus var. Repens cells is for the first time shown with the help of HPLC-hydrocarbon-analysis. On the basis of chromatography data malonyl- ginsenoside Rb1 presence in the biomass of cell culture in vitro of this kind of ginseng is proven.

Key words: cell culture in vitro, HPLC, Panax japonicas, malonyl- ginsenosides, malonyl- ginsenoside Rbt.

КОЧКИН Дмитрий Владимирович - научный сотрудник кафедры физиологии растений биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова. Область научных интересов - физиология растений.

E-mail: info@mail.bio.msu.ru

НОСОВ Александр Михайлович - доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии растений МГУ им. Ломоносова, зав. отделом биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Область научных интересов - биотехнология. Автор более 100 публикаций.

E-mail: amn@ippras.ru