СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАРАЖЕННОСТИ ЗЕРНА СПОРООБРАЗУЮЩИМИ БАКТЕРИЯМИ-ВОЗБУДИТЕЛЯМИ "КАРТОФЕЛЬНОЙ" БОЛЕЗНИ ХЛЕБА
METHOD FOR DETERMINATION OF GRAINS CONTAMINATION WITH SPORE-FORMING BACTERIA CAUSING BREAD "POTATO" DISEASE

Изобретение относится к способам диагностики и микробиологическому контролю зерна.
Наличие альфа-амилазы и способность к разжижению крахмала присущи Bacillus subtilis и некоторыми другим видам спорообразующих бактерий рода Bacillus, объединенным в группу возбудителей «картофельной» болезни хлеба (СБГКП) [1]. Альфа-амилаза относится к индуцируемым ферментам: она отсутствует в покоящихся спорах и синтезируется бактериями при росте на средах, содержащих крахмал как единственный источник углеводов [2].
Основные проявления «картофельной» болезни: липкость и заминаемость мякиша, запах, образование слизистых нитей - являются следствием гидролиза крахмала хлеба альфа-амилазой СБГКП и накопления низкомолекулярных декстринов и сахаров [3].
Эта способность спорообразующих бактерий давно известна. Bacillus subtilis даже является источником получения в промышленном масштабе бактериальной альфа-амилазы, находящей широкое применение в различных отраслях пищевой промышленности.
Существующие методы контроля возбудителей «картофельной» болезни хлеба можно разделить на микробиологические, технологические и биохимические (ферментные).
Микробиологический метод. Посев пастеризованных смывов с продукта на агаризованные среды. Продолжительность анализа 50-75 ч. Метод позволяет определить количество спор бактерий, однако не учитывает их ферментную активность, поэтому полученные результаты не всегда совпадают с интенсивностью заболевания хлеба. Не применим для большинства предприятий, не оснащенных микробиологическими лабораториями.
Существуют примерные микробиологические нормы для муки. При наличии в 1 г до 200 спор мука считается нормальной, при содержании от 200 до 1000 спор мука относится к сомнительной. Мука, содержащая более 1000 спор в 1 г, считается опасной, так как может приводить к возникновению «картофельной» болезни хлеба [4].
Технологический метод. Основан на проведении в лабораторных условиях пробного помола и выпечки хлеба, с последующей его инкубацией при 37°C в течение 36 ч. Оценка проявлений «картофельной» болезни в хлебе - органолептическая. Продолжительность метода составляет несколько суток, т.к. включает в себя выполнение помола, лабораторной пробной выпечки и 36 ч инкубации выпеченного хлеба. Технологический метод наиболее трудоемкий, длительный и основан на субъективной оценке проявлений «картофельной» болезни в хлебе [5].
Ферментный метод, разработанный ВНИИХП, основан на измерении зон просветления на фотопленке, образующихся под действием протеолитических ферментов спорообразующих бактерий, накопившихся в пастеризованных экстрактах муки. Необходим помол зерна, продолжительность анализа примерно 10-12 ч. В методе отсутствует достоверная количественная оценка, он не учитывает основной повреждающий фактор - активность альфа-амилаз спорообразующих бактерий, вызывающих декстринизацию крахмала мякиша [6].
Использование рассмотренных методов или затруднительно в производственных условиях, или не обеспечивает точной оценки зараженности зерна СБГКП. Отсюда вытекает необходимость разработки метода контроля зараженности зерна СБГКП, отвечающего следующим требованиям: сокращение времени проведения анализа, простота выполнения, возможность использования в производственных условиях.
Наиболее близким решением является микробиологический метод, в котором для выявления степени зараженности зерна возбудителями «картофельной» болезни хлеба производят посев пастеризованного смыва с пробы зерна на твердые питательные среды и дальнейшую его инкубацию в термостате при 37°C в течение 48-70 часов, с последующим подсчетом выросших колоний СБГКП [4] (прототип).
Однако известный способ имеет следующие недостатки: полный цикл по выявлению «картофельной» болезни занимает 50-75 часов, необходимо микробиологическое оборудование и квалифицированный персонал, хотя способ позволяет определить количество спорообразующих бактерий, однако не учитывает их ферментную активность.
Имеется заявка на патент с регистрационным №2013117848, в которой описан метод определения «картофельной» болезни в муке и хлебе с помощью разжижающей активности бактериальной альфа-амилазы, накапливающейся в выпеченном хлебе и определяемой на приборе типа ПЧП-3, с последующим расчетом по формуле.
Целью заявляемого изобретения является создание способа предпомольного выявления зараженности зерна возбудителями «картофельной» болезни хлеба и оценки риска возникновения болезни в хлебопекарной продукции, по смыву с зерна, тем самым сокращая время и повышая эффективность анализа в мукомольной и хлебопекарной промышленности.
Указанная цель достигается тем, что заявленный способ основывается на способности бактериальной альфа-амилазы гидролизовать крахмал до декстринов, что сопровождается падением вязкости крахмального клейстера, и включает приготовление водного смыва бактерий с пробы зерна, фильтрацию и пастеризацию смыва для уничтожения вегетативных форм бактерий, инокуляцию срезов хлеба пастеризованными смывами с зерна и увлажнение контрольных срезов хлеба стерильной водой, инкубирование их при 40°C в течение 12 ч, экстрацию бактериальной альфа-амилазы из срезов хлеба с последующей фильтрацией и определение разжижающей активности альфа-амилазы в хлебных экстрактах по скорости разжижения крахмала, с последующим расчетом величины РА в процентах.
Данный способ дает возможность определять разжижающую активность бактериальной альфа-амилазы, например, на приборе ГТЧП-3, предназначенном для определения числа падения (ПЧП), которым оснащено большинство предприятий системы хлебопродуктов.
Сопоставительный анализ заявляемого решения с прототипом показал, что заявляемый способ отличается от известного тем, что после пастеризации смывов с зерна ими инокулируют срезы хлеба, параллельно проводят увлажнение контрольных срезов хлеба стерильной водой, все срезы выдерживают в термостате 12 часов при t=40°C, готовят экстракты из этих срезов и проверяют с помощью прибора ПЧП-3 суммарную амилолитическую разжижающую активность по скорости разжижения картофельного крахмала бактериальной альфа-амилазой, являющуюся интегральным показателем численности и физиологической активности популяции спорообразующих бактерий, вызывающих «картофельную» болезнь хлеба. Таким образом, разжижающая активность является объективным количественным показателем, точнее характеризующим зараженность зерна возбудителями «картофельной» болезни в сравнении с известным микробиологическим методом - прототипом, поскольку отражает как количество возбудителей, так и их физиологическую активность. На наш взгляд, способ является новым и промышленно применимым, а выявленные отличия -  существенными.
Способ иллюстрируется рисунком, на котором изображена схема основных этапов определения разжижающей активности бактериальной альфа-амилазы в смывах с зерна, где обозначено:
1. Формирование лабораторной пробы зерна.
2. Приготовление водного смыва бактерий с зерна.
3. Фильтрация и пастеризация смывов.
4. Заражение срезов хлеба пастеризованными смывами с зерна. Увлажнение контрольных срезов хлеба водой.
5. Накопительная культура спорообразующих бактерий зерна на срезах хлеба (инкубация).
6. Экстракция бактериальной альфа-амилазы из срезов хлеба (контрольного и зараженного). Гомогенизация, фильтрация.
7. Измерение разжижающей активности бактериальной альфа-амилазы в экстрактах хлеба по падению вязкости крахмала на приборе ПЧП.
8. Расчет показателя разжижающей активности бактериальной альфа-амилазы по формуле.
Способ осуществляется следующим образом:
После формирования лабораторной пробы берут навеску зерна 10 г и готовят водный смыв. Смывы фильтруют через ватный тампон, и помещают в водяную баню для пастеризации в течение установленного времени. По завершении пастеризации колбы со смывом охлаждают в емкости с ледяной водой.
Поперечные срезы пшеничного батона, освобожденные от корки, являются субстратом для накопления бактериальной альфа-амилазы в количестве, достаточном для определения РА. Срезы помещают в обеззараженные чашки Петри. На разные срезы хлеба равномерно вносят или пастеризованный смыв зерна (опытный, зараженный вариант), или воду (контрольный вариант).
Закрытые чашки Петри помещают в термостат, предварительно нагретый до 40°C, и выдерживают в нем в течение 12 часов.
Инкубированные срезы хлеба гомогенизируют с дистиллированной водой в блендере. Полученный гомогенат переносят в колбу и дают отстояться до сформирования осадка измельченного хлеба. Просветлевшую надосадочную жидкость фильтруют, стараясь не затронуть осадок. Фильтрат не должен содержать плотных включений, в последнем случае его подвергают вторичному фильтрованию. В фильтрате определяют ЧП, например, с помощью прибора ПЧП-3.
При работе на приборе ПЧП следует пользоваться общими указаниями, изложенными в инструкции к прибору и в ГОСТ 27676-88. Использование в способе серийно выпускаемого прибора ПЧП-3 обеспечивает ему промышленную применимость и не требует разработки новых средств контроля.
В нужное количество вискозиметрических пробирок (по 2 на каждое определение) взвешивают картофельный крахмал, который является субстратом для деятельности альфа-амилазы. Определяют ЧП в 2 пробирках с крахмалом для проверки состояния прибора и качества крахмала.
Полученные экстракты разбавляют водой до необходимой концентрации, и вносят в 2 пробирки с крахмалом. Установленным образом определяют ЧП крахмала с внесенными экстрактами.
к
зар
По завершении определения ЧП испытатель располагает следующими исходными величинами для расчета РА бактериальной альфа-амилазы: ЧП экстракта контрольного среза хлеба, увлажненного водой, (ЧП) и ЧП экстракта опытного среза хлеба, инокулированного смывом с зерна (ЧП).
к
Находят разницу ЧП экстрактов контрольного и опытного срезов хлеба и выражают ее в процентах от ЧП, вычитая из последней величины 60 с - время нагрева вискозиметрических пробирок с крахмалом в ПЧП. 60 с автоматически вычитается и в числителе формулы, при расчете разницы величин ЧП. Отрезок времени, оставшийся после вычитания из ЧП 60 с, более тесно связан со скоростью разжижения крахмала под действием альфа-амилазы бактерий.
РА рассчитывают по следующей формуле:
<mrow><mi>P</mi><mi>A</mi><mo>=</mo><mfrac><mrow><mi>Ч</mi><msub><mi>П</mi><mi>к</mi></msub><mo>−</mo><mi>Ч</mi><msub><mi>П</mi><mrow><mi>з</mi><mi>а</mi><mi>р</mi></mrow></msub></mrow><mrow><mi>Ч</mi><msub><mi>П</mi><mi>к</mi></msub><mo>−</mo><mn>60</mn><mi>с</mi></mrow></mfrac><mo>⋅</mo><mn>100</mn><mi>%</mi></mrow>
где
PA - разжижающая активность, %;
К
ЧП - число падения крахмала с экстрактом из срезов хлеба, увлажненных стерильной водой, с;
зар
ЧП - число падения крахмала с экстрактом из срезов хлеба, инокулированных смывами с зерна, с.
Вычисления проводят до первого десятичного знака с последующим округлением до целого числа. При определении РА в двух повторностях допустимые относительные расхождения между ЧП двух параллельных определений не должны превышать 15% от средней арифметической величины. В случае превышения этого значения производят третье дополнительное определение.
Таким образом, РА характеризует относительное снижение вязкости крахмального клейстера под действием альфа-амилазы спорообразующих бактерий, накопившейся в срезах хлеба, инокулированных смывами с зерна, выраженное в % от ЧП срезов хлеба, увлажненных стерильной водой.
Величина РА может колебаться в пределах от 0 до 95-97%, она имеет сильную зависимость от количества спорообразующих бактерий-возбудителей «картофельной» болезни, находящихся в зерновой массе, и от их ферментной активности. Она тесно связана с органолептическими признаками «картофельной» болезни хлеба.
Во избежание развития в хлебе «картофельной» болезни, величина разжижающей активности бактериальной альфа-амилазы (РА) в партиях зерна пшеницы, предназначенных для выработки хлебопекарной муки, не должна превышать нижеприведенных значений:
Таблица
Нормативы вискозиметрического показателя активности бактериальной альфа-амилазы в зерне (РА), исключающие заболевание хлеба «картофельной» болезнью
Разжижающая активность в зерне, %, не более
Время заболевания хлеба «картофельной» болезнью, ч
3
90
20
72
43
48
67
36
80
24
С учетом неравномерного распределения спорообразующих бактерий в зерне и возможного вторичного загрязнения муки спорообразующими бактериями при ее выработке на мукомольных заводах рекомендуется использовать партии зерна с РА не более 43%.
Таким образом, использование заявляемого способа дает возможность обнаруживать «картофельную» болезнь хлеба на 20-30 ч ранее появления ее первых органолептических признаков в пробных лабораторных выпечках хлеба, выявлять зараженность возбудителями и возможность развития «картофельной» болезни хлеба еще до помола, по смывам с зерна, и позволяет использовать нормативы разжижающей активности бактериальной альфа-амилазы как количественный показатель при формировании безопасных смесей для хлебопекарных помолов пшеницы.
Источники информации
1. Мирзоева А.В. Бактерии группы сенной и картофельной палочек. - М.: АН СССР, 1959. - 175 с.
2. Фениксова Р.Ф. Биохимические основы получения и применения ферментных препаратов. Уч. пособие «Техническая биохимия». - М.: Высшая школа, 1973. - С.375-453.
3. Афанасьев О.В. Микробиологический контроль хлебопекарного производства. - М.: Пишепромиздат, 1976. - С.52-59.
4. Мишустин Е.М., Трисвятский Л.А. Микробы и зерно. - М.: Изд-во АН СССР, 1963. - 292 с.
5. Методы выявления и предупреждения картофельной болезни хлеба / А.П. Демчук, И.М. Ройтер. - М.: Москва, 1970.
6. Инструкция по предупреждению картофельной болезни хлеба / Поландова Р.Д., Богатырева Т.Г., Сидорова О.Ф. и др. - М.: Минсельхозпрод РФ, 1998. - 31 с. (№1100/2451-98-115).