СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ РИСКА РАЗВИТИЯ ОТДАЛЕННЫХ МЕТАСТАЗОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ОБОДОЧНОЙ КИШКИ
METHOD FOR DISTANT METASTASES DEVELOPMENT RISK DEGREE DETERMINATION FOR PATIENTS WITH COLON CANCER

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, касается способов определения степени риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки.
Проблема развития и прогрессирования рака ободочной кишки в последнее время не теряет своей актуальности, поскольку наблюдается неуклонный рост заболеваемости данной патологией в течение последних лет. Несмотря на современный прорыв в диагностике и лечении опухолей ободочной кишки отмечается высокий процент больных с диссеминированным процессом, качество и продолжительность жизни которых оставляет желать лучшего. В этой связи для рака ободочной кишки необходим поиск новых маркеров для прогнозирования отдаленного метастазирования, что позволит своевременно и эффективно скорректировать тактику проводимой терапии, следствием чего будет служить улучшение качества и увеличение продолжительности жизни данных больных.
Объективных и надежных критериев оценки риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки в литературе представлено немного. Более того, большинство представленных исследований относятся к объединенному раку ободочной и прямой кишки в единый колоретальный рак.
Поиски молекулярных факторов прогноза течения рака толстой кишки позволили на клеточных линиях рака толстой кишки у экспериментальных животных (PRob и REGb) выявить, что эндотелии-1 является фактором выживания и способен in vitro защищать клетки рака толстой кишки против FasL-индуцированного апоптоза [1]. Кроме того, частота выявления и уровень растворимого Fas-антигена (sFas) - ингибитора апоптоза в сыворотке крови больных раком толстой кишки - выше, чем у практически здоровых людей [2]. Отмечена тенденция к повышению содержания sFas в сыворотке крови больных раком толстой кишки с метастазами в регионарных лимфатических узлах и печени, что позволяет обсуждать роль Fas/FasL-системы как возможную мишень противоопухолевой терапии у больных колоректальным раком.
Исследования S. Hayashi et al. указывают на корреляционную связь между содержанием сериновой протеазы - активатора плазминогена урокиназного типа (uPA) и метастазами рака толстой кишки в печень [3]. Авторы исследовали эффективность генной терапии колоректального рака с помощью tPA с использованием модели печеночного метастаза рака толстой кишки у мышей. Полученные результаты позволили авторам предположить, что трансдукция гена tPA в клетки рака толстой кишки полезна с точки зрения ингибирования метастазирования в печень [2].
Изучение экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) при колоректальном раке показало, что интенсивность экспрессии ангиогенного фактора связана с прогрессией этого новообразования. Также при исследовании больных раком толстой кишки с регионарными метастазами в лимфоузлах доказано, что у большинства из них (73,4%) безрецидивный период достоверно (р<0,0001) выше при отсутствии экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) и низком индексе SPF (S-phase fraction - фракции клеток в S-фазе клеточного цикла) в опухоли [2]. Также, в дополнение к прогностической значимости VEGF, в исследовании показано, что блокирование VEGF-рецептора-2 ингибирует рост метастазов колоректального рака в печени [4].
Наиболее близкой к заявляемому способу является модель, предложенная Сидоренко Ю.С. и др., не смотря на то, что она разработана для рака прямой, а не ободочной кишки. Для осуществления данного способа радиоиммунным методом в ткани опухолевой и перифокальной зоны определяют содержание пролактина и тестостерона. При уровнях пролактина 692,0 нг/г ткани и тестостерона 48,0 нг/г ткани в опухоли и уровне тестостерона 42,0 нг/г ткани в перифокальной зоне прогнозируют развитие метастазов в печени через 3 месяца. При уровнях пролактина 160-390 нг/г ткани и тестостерона 20-40 нг/г ткани в опухоли и уровне тестостерона 24-26 нг/г ткани в перифокальной зоне прогнозируют развитие метастазов через 29-43 месяца. Применение способа позволяет прогнозировать развитие метастазов у больных раком прямой кишки на этапе первичного хирургического лечения, что дает возможность выделить группы больных с высоким риском быстрого развития метастазов с целью своевременного проведения адекватных лечебных мероприятий [5].
Недостатками этого способа являются:
- отсутствие чувствительности и специфичности предлагаемого метода, что не позволяет оценить практическую значимость и эффективность применения способа;
- ограничения, связанные с тем, что данный способ разработан для рака прямой кишки и не проведены аналогичные исследования для рака ободочной кишки;
- трудности осуществления радиоиммунного метода для определения изучаемых показателей.
Новая техническая задача: повышение точности способа определения степени риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки.
3
3
3
Для решения поставленной задачи в способе определения степени риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки, включающем исследование ткани опухоли, причем в опухоли ободочной кишки, а также в неизмененной ткани определяют: химотрипсинподобную активность протеасом в опухоли, X1,⋅10 Ед/мг белка; химотрипсинподобную активность протеасом в неизмененной ткани, Х2,⋅10 Ед/мг белка; общую кальпаиновую активность в опухоли, Х3,⋅10 Ед/мг белка; общую кальпаиновую активность в неизмененной ткани, Х4,⋅10 Ед/мг белка; учитывают возраст пациентов Х5, после чего рассчитывают значения Y1 и Y2 по дискриминантным уравнениям:
Y1=0,039*X1+0,126*X2+0,775*X3-0,083*X4-0,040*X5-23,51;
Y2=0,015*X1+0,115*X2+0,509*X3-0,026*X4-0,026*X5-13,84,
3
где X1 - химотрипсинподобная активность протеасом в опухоли, ⋅10 Ед/мг белка;
3
Х2 - химотрипсинподобная активность протеасом в неизмененной ткани, ⋅10 Ед/мг белка;
3
Х3 - общая кальпаиновая активность в опухоли, ⋅10 Ед/мг белка;
3
Х4 - общая кальпаиновая активность в неизмененной ткани, ⋅10 Ед/мг белка;
Х5 - возраст пациентов;
и при Y1>Y2 у пациента определяют низкий, а при Y1<Y2 высокий риск развития отдаленных метастазов рака ободочной кишки, в случае, когда признаки объекта, предъявляемого для распознавания, удовлетворяют условию Y1=Y2, распознавание невозможно без привлечения дополнительной информации.
Чувствительность метода составляет 83%, специфичность - 96%. Результаты классификации представлены в таблице 1.
Способ осуществляют следующим образом.
Для оценки риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки проводят определение активности следующих молекулярных параметров: кальпаинов, химотрипсинподобной активности протеасом, в опухоли ободочной кишки и неизмененной ткани. Для этого образцы опухоли ободочной кишки и неизмененной ткани, взятые при хирургическом вмешательстве, гомогенизируют до порошкообразного состояния в жидком азоте. Химотрипсинподобную активность протеасом и активность кальпаинов оценивают по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma, США) [6]. Образовавшийся продукт регистрируют на флуориметре «Hitachi-850» (Япония) при длине волны возбуждения 380 нм и эмиссии 440 нм. Для оценки активности примесных протеаз применяют специфический ингибитор протеасом - MG132 и специфический ингибитор кальпаинов - ALLN. За единицу активности протеасом и кальпаинов принимают количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль Suc-LLVY-AMC в течение 1 мин. Удельную активность протеасом и кальпаинов выражают в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяют по методу Лоури.
Такой подход к оценке риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки обусловлен рядом предпосылок:
Согласно проведенным исследованиям гиперэкспрессия α4 - субъединицы протеасом связана с метастатическим поражением печени при колоректальном раке. Таким образом, α4 - субъединица, возможно, играет важную роль в прогрессии колоректального рака и является потенциальной уникальной мишенью при разработке препаратов для его таргетной терапии [7].
При колоректальном раке наблюдается незначительное изменение содержания 20S пула протеасом в опухоли по сравнению с прилежащей нормальной тканью, что протекает на фоне высокой активности ферментативного комплекса в опухоли [8]. Выявлено, что повышение активности протеасом при раке толстой кишки связано с изменением субъединичного состава ядра протеасом [9].
2+
Было показано, что при полипозе толстой кишки и при колоректальном раке увеличивается активность и экспрессия кальпаина-2 (m-кальпаина) [10]. Исследование m-кальпаина, который участвует в патогенезе КРР и его ингибиторов, кальпастатина и HMWCaMBP (high-molecular-weight calmodulin-binding - высокомолекулярный кальмодулин связывающий белок) в опухолевых образцах, показало, что активность и экспрессия m-кальпаина, определенная методом Вестерн-блоттнинг, была значительно выше в аденокарциноме толстой кишки по сравнению с нормальной слизистой толстой кишки. Обнаруженный факт был подтвержден с помощью иммуногистохимического исследования, которое показало сильное окрашивание цитоплазмы в опухолевых клетках кишки с антителами к m-кальпаину. Пониженная экспрессия ингибиторов кальпаина (кальпастатина и HMWCaMBP) параллельно повышалась с активностью и экспрессией кальпаинов в аденокарциноме толстой кишки, что подтверждает участие Са-зависимых протеаз в развитии опухолей толстой кишки [10].
β-катенин представляет собой многофункциональный белок, который является структурным элементом клеточной адгезии и сигнальным компонентом Wnt-пути, регулирующий эмбриогенез и канцерогенез при КРР. Показана роль ингибиторов кальпаинов Gas2 и кальпастатина в контроле уровня, функции и локализации β-катенина через эндогенную регуляцию кальпаина [11].
Информативность отобранных критериев подтверждена также наличием значимых различий в активности протеасом и кальпаинов в опухоли ободочной кишки и неизмененной ткани, выявленных при исследовании 46 пациентов (средний возраст 58,7±11,6 лет) с морфологически верифицированным диагнозом рак ободочной кишки T1-4N0-3M0-1, которым было проведено хирургическое лечение.
Оценка риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки проводилась на основании показателей состояния протеолитических систем (активность тотального пула протеасом, пулов 26S и 20S, активность кальпаинов в опухоли ободочной кишки и неизмененной ткани, субъединичный состав протеасом), клинико-морфологических данных (возраст пациентов, стадия Т, наличие метастазов в регионарных лимфоузлах, наличие отдаленных метастазов, степень дифференцировки опухоли). Общее количество пациентов, включенных в анализ, составило 33 человека.
Классификацию проводили для групп 1 - развитие отдаленных метастазов, 0 - отдаленные метастазы не развивались.
3
3
3
3
Дискриминантный анализ включал следующие этапы: первичный отбор признаков для построения модели, набор обучающей выборки (группы пациентов, у которых регистрируются отобранные признаки), отбор информативных признаков и формирование на их основе группы дифференциальных функций, проверка качества полученной модели. Наиболее значимые прогностические показатели представлены в таблице 1: X1 - химотрипсинподобная активность протеасом в опухоли, ⋅10 Ед/мг белка; Х2 - химотрипсинподобная активность протеасом в неизмененной ткани, ⋅10 Ед/мг белка; Х3 - общая кальпаиновая активность в опухоли, ⋅10 Ед/мг белка; Х4 - общая кальпаиновая активность в неизмененной ткани, ⋅10 Ед/мг белка; Х5 - возраст пациентов;
Чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели составили соответственно 83% и 96%.
Клинические примеры.
Пример 1. Больная Л., 74 года, поступила в торако-абдоминальное отделение Томского НИИ онкологии 18.06.2012 с жалобами на боли в области живота, отсутствие аппетита, диспепсические расстройства. Пациентке была проведена видеоколоноскопия с биопсией из слизистой оболочки для верификации диагноза. Гистологическое заключение: аденокарцинома ободочной кишки умеренной степени гистологической дифференцировки. Для определения риска развития отдаленных метастазов у данной пациентки была использована разработанная математическая модель оценки риска развития отдаленных метастазов. При исследовании получены следующие значения показателей Х1-Х5:
3
X1=30⋅10 Ед/мг белка;
3
Х2=17⋅10 Ед/мг белка;
3
Х3=53⋅10 Ед/мг белка;
3
Х4=77⋅10 Ед/мг белка;
Х5=74 года.
На первом этапе проводился расчет дискриминантных функций Y1 и Y2 с учетом показателей у данной больной.
Y1=0,039*30+0,126*17+0,775*53-0,083*77-0,040*74-23,51=11,526;
Y2=0,015*30+0,115*17+0,509*53-0,026*77-0,026*74-13,84=11,616.
При расчете дискриминантных функций выяснилось, что Y1<Y2. Таким образом, пациентка была отнесена к группе «высокий риск развития отдаленных метастазов» с уровнем значимости р<0,05, что означает высокий риск развития отдаленных метастазов у данной пациентки.
Дальнейшее наблюдение за пациенткой показало, что 16.09.2014 у данной пациентки обнаружены отдаленные метастазы рака ободочной кишки в печень.
Пример 2. Больной А., 55 лет, поступил в торако-абдоминальное отделение Томского НИИ онкологии 28.03.2013 с жалобами на боли в области живота, отсутствие аппетита, диспепсические расстройства. Пациенту было проведено обследоване согласно предлагаемому способу: видеоколоноскопия с биопсией из слизистой оболочки для верификации диагноза. Гистологическое заключение: аденокарцинома ободочной кишки высокой степени гистологической дифференцировки.
При исследовании получены следующие значения показателей Х1-Х5:
3
X1=77⋅10 Ед/мг белка;
3
Х2=71⋅10 Ед/мг белка;
3
Х3=54⋅10 Ед/мг белка;
3
Х4=21⋅10 Ед/мг белка;
Х5=55 лет.
Для определения риска развития отдаленных метастазов у данного пациента была использована разработанная математическая модель оценки риска развития отдаленных метастазов.
Y1=0,039*77+0,126*71+0,775*54-0,083*21-0,040*55-23,51=26,35;
Y2=0,015*77+0,115*71+0,509*54-0,026*21-0,026*55-13,84=20,96.
При расчете дискриминантных функций выяснилось, что Y1>Y2. Таким образом, пациент был отнесен к группе «риск развития отдаленных метастазов менее 5%» с уровнем значимости р<0,05, что означает низкий риск развития отдаленных метастазов у данного пациента.
До настоящего времени развития отдаленных метастазов рака ободочной кишки у данного пациента не установлено.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет объективизировать критерии риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки, а также с высокой долей чувствительности и специфичности прогнозировать у них развитие отдаленных метастазов, что в свою очередь позволяет планировать адекватный объем наблюдения и лечения в послеоперационном периоде терапии рака ободочной кишки.
Таблица 1. Характеристики информативных показателей, включенных в математическую модель определения риска развития отдаленных метастазов у больных раком ободочной кишки.
Примечание: Wilks Lambda - величина, отвечающая за выполнение условий о правомерности включения показателя в модель и значимости различий значений дискриминантной функции в группах, что является необходимым условием при создании модели; P-level - уровень значимости.
Источники информации
1. Endothelin receptor blockade potentiates FasL-induced apoptosis in rat colon carcinoma cells / L.P. Eberl, O. Valdenaire, V. Saintgiorgio et al. // Int. J. Cancer. - 2000. - Vol. 86. - P. 182-187.
2. Колоректальный рак. Опухолевые маркеры и молекулярно-генетические методы диагностики [текст] / Н.Е. Кушлинский, В.А. Исаков, В.В. Делекторская и др. // Сибирский онкологический журнал. - 2004. - №2-3 (10-11). - С. 134-148.
3. High cyclin Е and low p27/kipl expressions are potentially poor prognostic factors in lung adenocarcinoma patients / H. Hayashi, N. Ogawa, N. Ishiwa et al. // Lung Cancer. - 2001. - Vol. 34. - P. 59-65.
4. Bruns, C.J. Vascular endothelial growth factor is an in vivo survival factor for tumor endothelium in a murine model of colorectal carcinoma liver metastases / C.J. Bruns, W. Liu, D.W. Davis // Cancer. - 2000. - Vol. 89, №3. - P. 488-499.
5. Патент РФ 2420742, МПК G01N 33/74. Способ прогнозирования развития метастазов у больных раком прямой кишки / Ю.С. Сидоренко [и др.]; заявитель и патентообладатель Федеральное Государственное учреждение «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи». - 2009148565/15; заявл. 25.12.2009; опубл. 10.06.2011.
6. 26 S proteasome-mediated production of an authentic major histocompatibility class I-restricted epitope from an intact protein substrate / Ben-Shahar S., Komlosh A., Nadav E. et al. // The J of Biol. Chem. - 1999. - Vol. 274. - №. 31. - P. 21963-21972.
7. High expression of proteasome subunit PSMA7 in colorectal cancer is significantly correlated with liver metastasis / XT. Hu, W. Chen, D. Wang et al. // Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. - 2008. - Vol. 30 (7). - P. 515-518.
8. Scaled-down purification protocol to access proteomic analysis of 20S proteasome from human tissue samples: comparison of normal and tumor colorectal cells / M. Ducoux-Petit, S. Uttenweiler-Joseph, F. Brichory et al. // J Proteome Res. - 2008. - Vol. 7(7). - P. 2852-2859.
9. Increased proteasome subunit protein expression and proteasome activity in colon cancer relate to an enhanced activation of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) / A. Arlt, I. Bauer, C. Schafmayer et al. // Oncogene. - 2009. - Vol. 28. - P. 3983-3996.
10. Overexpression of m-calpain in human colorectal adenocarcinomas / A. Lakshmikuttyamma, P. Selvakumar, R. Kanthan et al. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. - 2004. - Vol. 13, №. 10. - P. 1604-1609.
11. The calpain system is involved in the constitutive regulation of beta-catenin signaling functions / R. Benetti, T. Copetti, S. Dell'Orso et al. // J Biol Chem. 2005. - Vol. 10, №280 (23). - P. 22070-22080.