Способ первичной фармакологической оценки специфической антигипоксической активности препарата
METHOD FOR PRIMARY PHARMACOLOGICAL ESTIMATION OF SPECIFIC ANTI-HYPOXIC ACTIVITY OF MEDICATION

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и может быть использовано для фармакологической оценки антигипоксической активности новых препаратов среди вновь синтезируемых веществ.
Известны способы первичной фармакологической оценки антигипоксической активности на моделях гипоксической гипоксии. В основе этих методов лежит снижение концентрации кислорода в гермообъеме. Снижение концентрации кислорода достигается различными путями, при этом активность антигипоксического действия определяется по времени жизни животных в экспериментальных условиях или по количеству выживших животных.
Известный способ первичной фармакологической оценки специфической антигипоксической активности на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме заключается в том, что животных контрольной и опытной групп (обычно мышей) по одиночке помещают в стеклянные банки одинакового объема, которые герметично закрывают. По мере потребления кислорода животными его концентрация в сосуде снижается, что приводит к их гибели. Сравнивая время выживания животных в контрольной и опытной группах, судят об антигипоксической активности испытуемого препарата, который предварительно вводят животным экспериментальной группы. («Методические рекомендации по экспериментальному изучению препаратов, предлагаемых для клинического изучения в качестве антигипоксических средств» ФК МЗ СССР под редакцией Л.Д. Лукьяновой. – М., 1990 - С. 10). Основным недостатком метода является его экономическая затратность и высокая трудоемкость, а также нарушение этических норм работы с позвоночными животными. В процессе поиска и отбора эффективных антигипоксических средств необходимо проводить многочисленные эксперименты, которые требуют огромного количества животных. Введение лекарственного вещества или контрольного раствора каждому животному внутрь или внутрибрюшинно требуют профессиональных навыков экспериментатора и затрат времени.
Техническим результатом изобретения является упрощение и удешевление способа, а также соблюдение этических норм работы с позвоночными животными.
Сущность способа первичной специфической фармакологической оценки антигипоксической активности препарата на модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме состоит в том, что в качестве животных используют дождевых червей, гермообъем заполняют кипяченой водопроводной водой комнатной температуры в контрольной группе и раствором исследуемого препарата, приготовленного на такой же воде, - в опытной, и выдерживают при температуре 24°С в течение 20 часов, а об антигипоксической активности препарата судят по количеству выживших особей в контрольной и опытной группах.
Дождевые черви потребляют незначительное количество кислорода, поэтому даже небольшое количество воздуха в сосуде обеспечивает им длительное выживание. Например, объем 10 мл воздуха обеспечит выживание дождевого червя в течение 10 суток и более (Вызова Ю.Б. О влиянии напряжения кислорода на интенсивность дыхания у дождевых червей) // Журн. эвол, биохим. и физиол., 1967. Т. 3. №1. С. 74-75). Для червей неблагоприятным фактором является высыхание их покровов в воздушной среде, в то время как в водной среде в открытом сосуде они могут жить довольно долго (Roots B.J. 1956. The water relations of earthworms. II. Resistance to dessication and immersion and bahaviour when submerged and when allowed a choice of environment // J. Exp. Boil. Vol. 33. No. 1. P. 20-44).
Способ осуществляется следующим образом. Отбирают половозрелых дождевых червей вида Eisenia felida andrei (красный калифорнийский червь) одинакового размера и по одному помещают в контейнеры для забора крови без антикоагулянта объемом 5 мл. Контейнеры в контрольной группе заполняют кипяченой водопроводной водой комнатной температуры. В опытной группе контейнеры с червями заполняют раствором изучаемого вещества, приготовленного на такой же воде. Концентрацию растворов исследуемых веществ устанавливают опытным путем по методу В.Б. Прозоровского (Прозоровский В.Б., Прозоровский М.П., Демченко В.М. Экспресс метод определения средней дозы и ее ошибки // Фармакол. и токсикология. - 1978. - №4. - С. 497-502). Контейнеры закрывают пробками и помещают в термостат при температуре 24°С. Это температура является верхним пределом оптимального температурного режима жизнедеятельности этого вида червей (Dominguez J. 2004. State-of-the Art and New Perspectiveson Vermicomposting Research. CRC Press. USA. 456 p). Время содержания червей в термостате составляет 20 часов. Это время определялось опытным путем. За этот период в контрольных опытах погибало в среднем 80% особей. Таким образом, черви могли использовать только небольшое количество кислорода, содержащегося в 5 мл воды в растворенном виде, учитывая их возможность кожного дыхания. Через 20 часов контрольные и опытные контейнеры вынимают из термостата, содержимое их выливают в чашки Петри и определяют количество выживших особей по их подвижности. Оценку антигипоксической активности препарата производят путем сравнения количества выживших биологических объектов в опытной и контрольной группах.
Пример. Отобрали 20 половозрелых дождевых червей одинакового размера и по одному поместили в контейнеры для забора крови объемом 5 мл. 10 контейнеров заполнили 0,004% раствором соединения πQ1968, приготовленным на кипяченой водопроводной воде комнатной температуры, закрыли пробками, поместили в штатив. 10 контейнеров (контрольная группа) заполнили кипяченой водопроводной водой комнатной температуры, закрыли пробками, поместили в штатив. Оба штатива поставили в термостат при температуре 24°С на 20 часов. Через 20 часов извлекли штативы с контейнерами из термостата. Содержимое контейнеров опытной и контрольной групп вылили в разные чашки Петри. Установили, что в опытной группе из 10 червей проявили подвижность 7 особей, а в контрольной группе 2 особи. Для увеличения доказательности различий повторили такой опыт четыре раза. В общей сложности в опыте из 40 червей выжило 29 особей, а в контрольной группе из 40 особей выжило 9. При статистической обработке контрольных и опытных данных устанавливаем, что степень достоверности различий составляет <0,001.
Всего было проведено 3 группы исследований, в которых оценивалась антигипоксическая активность мексидола, химического соединения под шифром πQ1968, изученных Е.О. Марковой (Маркова Е.О. Антигипоксантные свойства новых комплексных соединений аскорбиновой кислоты: Дис…канд. биолог. наук. Смоленск. 2013 - 162 с.), и соединения πQ1981, изученного Д.В. Сосиным (Сосин Д.В. Селенсодержащие металлокомплексные соединения при острой экзогенной гипоксии: Дис…докт. мед. наук. Санкт-Петербург. 2015 - 312 с.).
Результаты исследований этих соединений на антигипоксическую активность с использованием дождевых червей представлены в таблице: выживаемость дождевых червей в растворах с исследуемыми веществами в условиях гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме.
Математическую обработку данных проводили методом оценки статистических различий частностей случайных событий (Петри А. Наглядная медицинская статистика: учеб. пособие / А. Петри, К. Сэбин; пер. с анг. Под ред. В.П. Леонова. - 3-е изд., перераб. и доп. - М., ГЭОТАР-Медиа, 2015. - 216. с.: ил.). Для получения достоверных данных о различии выживаемости животных в различных группах следует использовать в каждой группе не менее 40 червей. Из таблицы следует, что результаты изучения антигипоксической активности исследуемых препаратов полностью соответствуют данным, полученным ранее на позвоночных животных (мышах) в условиях модели гипоксии с гиперкапнией в гермообъеме. Специфическая антигипоксическая активность выявлена у мексидола и соединения πQ1968 и не установлена у соединения πQ1981. Также в наших опытах мексидол показал (по количеству выживших особей) меньшую активность, чем πQ1968.
Предлагаемый способ обеспечивает следующие преимущества:
1. Вместо позвоночных животных (мышей и крыс) для этих целей можно использовать червей, что представляет высокий экономический эффект. Стоимость одной мышки в настоящее время составляет 380 рублей, одной крысы 650 рублей, а стоимость одного червя составляет 2 рубля.
2. Можно одновременно проводить опыт с несколькими десятками животных, что актуально при проведении скрининга лекарственных веществ.
3. Трудоемкость процесса минимальна в связи с тем, что нет необходимости вводить животным внутрь или внутрибрюшинно растворы исследуемых веществ или контрольные растворы. При этом исключаются технические ошибки, которые возможны при проведении данных манипуляций.
4. Для исследования необходимо меньшее количество исследуемого вещества, что очень важно при исследовании новых синтезированных веществ. Расход вещества при работе на дождевых червях примерно в десять раз меньше, чем при работе на позвоночных животных.
5. В соответствии с международными этическими нормами работы с лабораторными животными («Европейская Конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях», Страсбург, 18 марта 1896 г.) замена позвоночных животных на беспозвоночных является несомненным преимуществом.
Таким образом, исследования антигипоксической активности химических соединений на дождевых червях позволяет проводить объективный первичный отбор перспективных антигипоксических средств при малых экономических затратах и малой трудоемкости эксперимента, небольшом количестве исследуемого вещества и в соответствии с рекомендациями по соблюдению этических норм по работе с животными.