Влияние аминопиридинового и индольного производных адамантана на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека in vitro

Вестник СамГУ — Естественнонаучная серия. 2008. №2(61).

УДК 547.583+616.12

347

ВЛИЯНИЕ АМИНОПИРИДИНОВОГО И ИНДОЛЬНОГО ПРОИЗВОДНЫХ АДАМАНТАНА НА ИНДУЦИРОВАННУЮ АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА in vitro

© 2008 Н.А.Кленова1 А.К.Корнева, М.Т.Генгин2 В.А.Ермохин3

Изучено влияние двух производных адамантана с разными по свойствам заместителями на агрегацию тромбоцитов человека in vitro. Установлено, что аминопиридиновое производное более выраженно проявляет свойства синер-гиста АДФ и в меньшей степени усиливает проведение сигнала другими агрегантами. Индольное же производное является синергистом и серотони-на, и адреналина с менее выраженным влиянием на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов. При этом оба исследуемых соединения не способны проводить сигнал активации через плазматическую мембрану тромбоцитов самостоятельно.

Производные адамантана как физиологически активные вещества находят широкое применение с 70-х годов XX века. Биологическая активность производных адамантана обусловлена симметрией и объемностью пространственного строения, значительной липофильностью жесткого углеводородного каркаса адамантана, что позволяет им легко проникать через биологические мембраны [1]. Поэтому модификация органических соединений с помощью адамантильного радикала значительно изменяет их биологическую активность, нередко усиливая ее. На данный момент синтезировано более 1000 новых производных адамантана. Фармакологическое изучение показало наличие среди них веществ, обладающих выраженной психотропной, иммунотропной, противовирусной, курареподобной, антикаталептической, противоаллергической активностями, а также соединений, влияющих на ферментативную систему печени [6]. Амиды адамантанкарбоновых кислот проявляют антибактериальную активность [5]. Есть данные об антиагрегационной способности производных адамантана по отношению к различным путям агрегации тромбоцитов [10].

Показано влияние модифицированных адамантильных и амидных фрагментов амидов ^[(адамантоил-1)-фенил]-антраниловой кислоты на серото-ниновые (5 - НТ2) рецепторы тромбоцитов человека: снижение их АДФ-и серотонин-индуцированной агрегации [3]. Кроме того, известно, что сродство к данным рецепторам обусловлено наличием объемного адамантильного

1 Кленова Наталья Анатольевна, кафедра биохимии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г.Самара, ул.Акад. Павлова, 1.

2Корнева Анна Константиновна, Генгин Михаил Трофимович, кафедра биохимии Пензенского государственного педагогического университета им. В.Г. Белинского, 440026, Россия, г. Пенза, ул. Лермонтова, 37.

3Ермохин Владимир Анатольевич, кафедра органической химии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.

заместителя. Была предположена биологическая активность ряда 1-адаман-танкарбоксамидов в качестве антагонистов 5-НТ2 рецептора тромбоцитов. Высокоспецифическое сродство к изучаемым рецепторам и мощный ан-тиагрегационный эффект были подтверждены и in vitro, и in vivo для (S)-N-1- [2- (4-флуорофенил)этил]пирролидин-3-ил- 1-адамантанкарбоксамид гидрохлорид гидрата (10-(S), Y-39241) [10].

Ряд синтезированных адамантильных производных гетерофункциональных соединений проявил свойства антагонистов и синергистов серотонина [4].

Целью данной работы является исследование возможных механизмов влияния некоторых соединений на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека.

1. Материал и методика исследования

По результатам предыдущих экспериментов [4] для дальнейшего исследования были отобраны два соединения, проявляющие синергистические серотонину свойства, но с разными характерами заместителей (рис. 1).

N-(1 -адамантилацетил)-4-аминопиридин

2. Н 2 ЧГ)^

н

N-(1 -адамантанкарбоксамидоэтил)индол

Рис. 1. Исследуемые соединения

Индуцируемая агрегация тромбоцитов исследована фотометрическим методом Борна [2]. Принцип метода основан на регистрации снижения оптической плотности исследуемой плазмы после введения в нее тромбоцитагрегирующего агента. Происходит склеивание тромбоцитов, образующиеся агрегаты постепенно оседают, и проба плазмы становится более прозрачной.

Кровь, взятую из локтевой вены, стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия (9:1). Богатую тромбоцитами плазму получали центрифугированием цитрат-ной крови при 1000 g в течение 10 минут. Плазму разбавляли 0,154 М раствором хлорида натрия, рН 7,2 до достижения оптической плотности пробы 0,4-0,6 ед. (стандартизация плазмы). Плазму разливали в кюветы по 2 мл. Изучаемые соединения растворяли в 96% этиловом спирте. В качестве агрегирующего агента использовали растворенный в 0,154 М физ. растворе (рН 7,2), 5-гидрокситрипта-мин креатин сульфат и АДФ в конечной концентрации 1  10-5 М. В эксперименте в качестве агреганта использовался также адреналина гидрохлорид в концентрации 0,1%. Конечные концентрации всех соединений составляли 0,099 мг/мл. Оптическую плотность измеряли против контроля на СФ-46 при длине волны 600 нм, кювета 10 мм (в контрольную пробу добавляли спирт вместо раствора вещества) в течение 30 минут. Об интенсивности агрегации судили по изменению оптической

плотности, которое выражали в условных единицах: АА30 (изменение оптической плотности за 30 минут) Х1000 = х у.е.

Полученные данные анализировали для установления значений их достоверности согласно критерию Стьюдента. Данные считали достоверными при уровне значимости р < 0,05 [9].

2. Результаты исследования и их обсуждение

Серотонин является слабым агрегантом, и индуцированная серотонином агрегация тромбоцитов протекает с меньшей скоростью, чем в эксперименте с АДФ и адреналином [7]. Активация тромбоцитов серотонином осуществляется за счет регуляции цАМФ-зависимых путей и не связана с трансмембранным потоком Са2+ внутрь клетки, высвобождением АДФ и образованием продуктов метаболизма ара-хидоновой кислоты. Исследование серотонин-индуцированной агрегации тромбоцитов человека под действием производных адамантана показало, что оба вещества достоверно способны усиливать агрегацию [4]. Однако интенсивнее в этом отношении действие индольного производного адамантана (табл. 1).

Таблица 1

Влияние производных адамантана на серотонин-индуцированную

агрегацию

№ Пробы Интенсивность

п/п агрегации, у. е.

1 Опыт 45,0+2,3*

Контроль 37,0 ± 2,9

2 Опыт 47,0+ 1,6*"

Контроль 33,0± 3,4

Примечание: уровни достоверности результатов * — < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001 к контролю.

В данном случае влияние веществ на скорость агрегации тромбоцитов может быть обусловлено их способностью увеличивать сродство серотонина к рецепторам (синергисты) или изменять свойства плазматической мембраны тромбоцита. Возможно, эти соединения способны сами проводить сигнал, связываясь с рецепторами на мембране (агонисты серотонина). Чтобы проверить это предположение, мы поставили эксперимент с веществами без индуцирования агрегации (табл. 2).

Таблица 2

Влияние производных адамантана на неиндуцированную агрегацию

№ Пробы Интенсивность

п/п агрегации, у. е.

1 Опыт 46,0 ± 3,5

Контроль 43,0 ± 4,1

2 Опыт 30,0 ± 4,6

Контроль 29,0 ± 6,2

Как видно из данных таблицы, оба вещества не способны сами индуцировать

агрегацию тромбоцитов, скорость агрегации в опытных пробах не отличается от таковой в контрольных. Значит, вещества не способны самостоятельно проводить сигнал, а влияют на сродство серотонина к своему рецептору, лишь усиливая проведение сигнала (табл. 1).

Связывание АДФ со специфическими рецепторами плазматической мембраны ингибирует активность аденилатциклазы, снижая уровень цАМФ в цитоплазме, что стимулирует высвобождение арахидоновой кислоты и образование тромбок-сана А2, который известен как ионофор Са2+. При добавлении в пробы АДФ светопропускание суспензии тромбоцитов начинает сразу же уменьшаться. Путь активации тромбоцитов АДФ существенно отличается от пути активации серо-тонином, однако исследование влияния веществ на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека показало почти те же результаты, что и в опыте с серотониновой активацией, но здесь более активно аминопиридиновое производное (табл. 3).

Таблица 3

Влияние производных адамантана на АДФ-индуцированную агрегацию

№ Пробы Интенсивность

п/п агрегации, у. е.

1 Опыт 62,0 + 3,2"

Контроль 47,0+3,6

2 Опыт 63,0 ±2, 8*

Контроль 46,0 ± 6,3

Примечание: уровни достоверности результатов * — < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001 к контролю.

Поскольку оба вещества способны влиять на функционирование рецепторов для АДФ, мы предположили возможность синергизма исследуемых соединений к рецепторам адреналина. Это предположение основано на том, что рецепторы для обоих этих агрегантов проводят сигнал посредством G-белков, и пути активации тромбоцита под влиянием и адреналина, и АДФ сходятся на стадии увеличения проницаемости плазматической мембраны к ионам Са2+. Предполагается, что эффект адреналина связан с модуляцией мембран при его взаимодействии с а-адренорецепторами и изменением ее проницаемости к ионам Са2+. Адрена-лин-индуцированное изменение оптической плотности проб наблюдается через 30 с после его добавления [7]. Действительно, этот эксперимент показал, что вещества достоверно являются синергистами и адреналина (табл. 4).

Индольное производное нельзя назвать агонистом серотониновых рецепторов (хотя есть сходство структур молекул исследуемого производного и самого серо-тонина), что подтверждается результатами эксперимента без добавления агреган-тов (табл. 2). Следовательно, индольное производное не способно конкурировать за какие-либо рецепторы мембраны тромбоцитов (аналогичное можно сказать и об аминопиридиновом производном). Поскольку вещества достоверно усиливают серотонин-индуцированную агрегацию тромбоцитов, оправдано предположение об их способности изменять сродство серотонина к рецептору, изменяя его конфор-мацию за счет изменения структуры плазматической мембраны. Тем более это вероятно, если принять во внимание мембранотропность адамантанового ядра и канальное строение серотониновых рецепторов. Под влиянием соединений усилива-

Таблица 4

Влияние производных адамантана на индуцированную адреналином

агрегацию

№ Пробы Интенсивность

п/п агрегации, у. е.

1 Опыт 49,0+5,1*

Контроль 34,0 ± 4,6

2 Опыт 46,0± 1,2*"

Контроль 29,0 ± 4,5

Примечание: уровни достоверности результатов * — < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001 к контролю.

ется и адреналин-индуцированная агрегация тромбоцитов. Поскольку рецепторы для АДФ и для адреналина являются гликопротеинами, и их строение более сложно и менее зависит от ориентации фосфолипидных слоев мембраны, здесь более вероятен механизм модуляции функционирования самого рецептора, в результате чего активация G-белков происходит эффективнее. Интересным и перспективным является выяснение причин подобного влияния данных производных адамантана на индуцированную агрегацию тромбоцитов человека.

Выводы

1) ^(1-адамантилацетил)-4-аминопиридин и 3-(1-адамантанкарбоксамидо-этил)индол способны усиливать АДФ-, серотонин- и адреналин-индуциро-ванную агрегацию тромбоцитов человека in vitro.

2) ^(1-адамантилацетил)-4-аминопиридин наиболее активно действует на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека, что позволяет говорить о нем как о синергисте рецепторов для АДФ.

3) Менее выраженная активность ^(1-адамантилацетил)-4-аминопиридина по отношению к другим агрегантам может быть объяснена его способностью модифицировать функционирование плазматической мембраны тромбоцитов человека вследствие высокой мембранотропности адамантана.

4) 3-(1-адамантанкарбоксамидоэтил)индол проявил себя как эффективный си-нергист серотониновых и адреналиновых рецепторов тромбоцитов человека, что вызывает интерес к дальнейшим исследованиям механизма его влияния на агрегацию тромбоцитов, поскольку и структура рецепторов, и биохимический механизм проведения сигнала через мембрану у этих агрегантов различны.

5) Влияние 3-(1-адамантанкарбоксамидоэтил)индола на АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов человека менее выражена, что подтверждает его структурное сходство с серотонином как причину усиления серотонин-инду-цированной агрегации.

Литература

[1] Багрий, Е.И. Адамантаны: получение, свойства, применение / Е.И. Багрий. -М.: Наука, 1989. - 264 с.

[2] Лабораторные методы исследования системы гемостаза / В.П. Балуда. -Томск, 1980. - 84 с.

[3] Даниленко, Г.И.Синтез и биологическая активность производных адаманта-на. ^(адамантоил-1)антраниловые кислоты / Г.И. Даниленко, М.А. Мохорт, Ф.П.Триус // Хим.-фарм. журн. - 1973. - №10. - С. 15-17.

[4] Ермохин, В.А. Синтез и биологическая активность адамантилпроизводных ге-терофункциональных ароматических аминов и азотсодержащих гетероциклов. автореф. дис. ...канд. хим. наук / В.А. Ермохин, Самара, 2007.

[5] Морозов, И.С. Фармакология адамантанов / И.С. Морозов, В.И. Петров, С.А. Сергеева. - Волгоград: Волгоградская мед. академия, 2001. - 320 с.

[6] РЖ Химия. - 2000. - 10. - 19029.

[7] Самаль, А.Б., Агрегация тромбоцитов: Методы изучения и механизмы / А.Б. Самаль, С.И. Черенкевич, Н.Ф.Хмара. - М.: Университетское, 1990. -104с.

[8] Сергеев, П. В. Физико-химические механизмы и гормональная регуляция свертывания крови / П.В. Сергеев, Р.Д. Сейфулла, А.И. Майский. - 1974.

[9] Фролов, Ю.П. Математические методы в биологии. ЭВМ и Программирование / Ю.П.Фролов. - Самара: Изд-во "Самарский университет", 1997. - 265 с.

[10] N-[1-(Phenylethyl)pyrrolidin-3-yl]-1-adamantanecarboxamides as Novel 5 - HT2 Receptor Antagonists / M.Fujio [et al.] // Bioorganic Med. Chem. Lett. - 2000. -V. 10. - P. 2457-2461.

Поступила в редакцию 4/ VII/2007; в окончательном варианте — 4/VII/2007.

BAU-HHne ciMUHcmupuduHoeoao u uHdcAbHcsc npcusecdHMX adaMaHmaHa

353

THE EFFECT OF AMINOPIRIDINES AND INDOLS OF ADAMANTANE DERIVATIVES ON INDUCED PLATELET AGGREGATION OF MAN in vitro

© 2008 N.A.Klenova4 A.K. Korneva, M.T.Gengin5 V.A. Ermokhin6

The effect of two adamantane derivative having different arylalkyl groups on platelet aggregation of man in vitro is studied. The property of aminopiridine derivative strongly express sinergistic to ADP is found. It substance strengthens realization of a signal caused by other aggregative substances more poorly. Indol derivative synergistically amplifies the effects of serotonin and adrenalin, but poorly effects on ADP-induced platelets aggregation. Despite this both facts studied substances can not forward signal through platelet membrane itself.

Paper received 4/VIZ/2007. Paper accepted 4/VZZ/2007.

4 Klenova Nataliya Anatolievna, Dept. of Biochemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russia.

5 Korneva Ann Konstantinovna, Gengin Mikhail Trofimovich, Dept. of Biochemistry, Penza State Pedagogical University by V.G. Belinsky, Penza, 440026, Russia.

6Ermokhin Vladimir Anatolievich, Dept. of Organic Chemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russia.