СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ
MUSCULAR TISSUE REGENERATION STIMULATION METHOD

Изобретение относится к экспериментальной медицине и биотехнологии и предназначено для стимуляции регенерации мышечной ткани в эксперименте.
Известно, что процесс регенерации мышечной ткани стимулируют несколькими способами: посредством внутриклеточной регенерации (гипертрофии при усилении функциональной нагрузки); посредством митотического деления миоцитов при их повреждении (репаративная регенерация); посредством дифференцировки из камбиальных элементов - малодифференцированных полипатентных клеток фибробластического ряда и миофибробластов (структурная регенерация). Миобласты размножаются и формируют многоядерный симпласт, в котором синтезируются миофибриллы и дифференцируются поперечно-полосатые мышечные волокна. Пересадка мышечной ткани, несмотря на ее денервацию, часто приводит к необратимой утрате мышечной структуры трансплантата и заканчивается его фиброзированием (Lesault P.F. Macrophages improve survival, proliferation and migration of engrafted myogenic precursor cell into MDX skeletal muscle / P.F. Lesault, M. Theret, M. Magnan et al. // PLoS One. - 2012. - V.7, №10. - P. 46698.). Получены положительные результаты при использовании гидрогелей для усиления регенерации тканей при плохо заживающих ранах (Чернецкая, Ю.Г. Аппликационная лекарственная форма гидрогелевой матрицы для лечения ран и ожогов // Человек и лекарство: Тез. докл. XI Рос. нац. конгр. - М., 2004. - С. 848).
Механизм действия клеточного аутотрансплантата связан со способностью стволовых, мезенхимальных и других незрелых клеток проявлять пролиферативную активность в направлении поврежденных тканей, а также индуцировать пролиферативную активность камбиальных клеток в зоне повреждения. СфероГЕЛЬ относится к классу биополимерных имплантатов и предназначен для восполнения объемов мягких тканей за счет стимуляции жизнеспособных клеток (в том числе камбиальных) синтезировать собственный внеклеточный матрикс, содержащий «медиаторы регенерации». СфероГель может быть также использован как депо, способное удерживать биологические активные вещества, клеточные комплексы.
Существующие техники коррекции дефектов мышечной ткани (мышечная аутопластика, аллопластика, ксенопластика, генная терапия) являются трудоемкими, травматичными и сопряжены с осложнениями (Булякова Н.В. Морфофункциональные особенности тимуса и мышечных регенератов при воздействии лазерного излучения и аллопластики мышечной ткани взрослого животного в область мышечной травмы / Н.В. Булякова, B.C. Азарова // Известия РАН. Серия биологическая. - 2009. - №1. - С. 18-26).
Известен способ хирургического лечения длительно незаживающих ран и трофических язв (патент РФ 2388418, опубл.: 10.05.2010 г., бюл. №56). Применяют инъекции диспергированного биоматериала Аллоплант для инфильтрирования полости раны, причем инъекции осуществляют в 5-15 точек по 2-3 мл в каждую, помещают в обработанную раневую полость обезжиренный и предварительно импрегнированный в физиологическом растворе с антибиотиком биоматериал Аллоплант. Фиксируют биоматериал Аллоплант на коже по краю раны аллосухожильными нитями с дополнительными подузловыми подкладками. Метод сложен в применении, многокомпанентен, применим только для ран с некротическими массами. Наличие антибиотика в комплексе повышает риск иммунных реакций на введение комплексного препарата и снижение местной иммунобиологической резистентности ткани.
Известен способ стимуляции репаративного остеогенеза при замещении дефектов кости, возникших в результате травмы или после резекции кости. Способ включает инъекционную имплантацию в зону костного повреждения культивированных аутологичных костно-мозговых стромальных клеток-предшественников. При этом имплантацию клеток проводят в период завершения воспаления в зоне костного повреждения и начала естественного остеогенеза, 3-5 раз с интервалом в 2-3 дня (патент РФ №2373883, опубл.: 27.11.2009 г., бюл. №33). Недостатками данного способа является сложность технологии приготовления взвеси аутологичных костно-мозговых стромальных клеток-предшественников, что требует дополнительных затрат в связи с необходимостью использования соответствующего оборудования и дорогостоящих сред.
Достаточно близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ восстановления запирательного аппарата прямой кишки (патент РФ №2405573, опубл.: 10.12.2010 г., бюл. №34). Для коррекции поврежденых мышечных структур запирательного аппарата прямой кишки клеточную массу аутологичного костно-мозгового пунктата вводят в виде инъекций в мягкие ткани параанальной области и вокруг прямой кишки, затем после каждого введения воздействуют на эти области двуполярным симметричным флюктуирующим током курсом из 10 ежедневных процедур. Способ малотравматичен, исключает иммунные реакции и прост в исполнении, однако не обеспечивает длительного нахождения в зоне поврежденных мышечных структур аутологичных костно-мозговых стромальных клеток-предшественников, а следовательно, и их индукционного воздействия на «спящие» стволовые клетки.
Наиболее близким к предлагаемому способу является способ стимуляции регенерации хрящевой, костной, а также мышечной тканей (патент РФ №2527701, опубл. 10.09.2014, Бюл. №25), осуществляемый в эксперименте. Лабораторному животному осуществляют введение в область раневого дефекта средства, стимулирующего регенерацию в том числе и мышечной ткани. Средство представляет собой смесь водных растворов рекомбинантного интерферона бета и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 в соотношении 1:4 соответственно. Средство позволяет повысить эффективность лечения при травмах опорно-двигательного аппарата, восстановить ткани области травмы (в том числе и мышечную), снизить частоту гнойно-воспалительных осложнений. Недостатками способа являются сложность приготовления смеси препаратов и высокая стоимость интерферона бета.
Таким образом, существует потребность в способе стимуляции регенерации мышечной ткани, лишенном всех вышеуказанных недостатков.
Техническим результатом настоящего изобретения является простота, повышение эффективности лечения при травматическом поражении мышечной ткани, повышение эффективности аутомиелотерапии, снижение травматичности метода и вероятности иммунной реакции на введение препаратов.
Этот технический результат достигается тем, что в предлагаемом способе стимуляции регенерации мышечной ткани в эксперименте, включающем введение лабораторному животному в область раневого дефекта мышечной ткани средства, стимулирующего регенерацию мышечной ткани, используют средство, представляющее собой клеточно-гелевый комплекс (Фиг. 1), состоящий из клеточной массы костного мозга и биодеградируемого гетерогенного гидрогеля СфероГЕЛЬ медиум, причем соотношение объема вносимой клеточной массы и объема гидрогеля СфероГЕЛЬ составляет 1:1.
Способ осуществляют следующим образом.
В решении поставленной задачи использовали половозрелых крыс линии Вистар массой 200-220 г. После разреза кожных покровов на заднебоковой поверхности бедра производили линейный разрез кожи 6-7 мм, выделялась задняя группа мышц бедра (Фиг. 2). Затем на брюшко мышцы в средней трети наносили дефект длиной 4-5 мм и глубиной 5 мм (Фиг. 3). Биодеградируемый гетерогенный имплантируемый гидрогель СфероГЕЛЪ медиум, предварительно импрегнированный клетками костного мозга, помещали в дефект мышцы. Экспериментальным путем нами были получены данные о наиболее эффективном соотношении объема клеточной массы костного мозга к объему гидрогеля СфероГЕЛЬ - оно составляет 1:1. При меньших объемах костного мозга регенеративные процессы проходили медленнее, при больших - не происходило адекватной адгезии клеток костного мозга на гранулах СфероГЕЛЬ и часть клеток погибала. Также экспериментально был выбран из всей линейки СфероГЕЛЬ гидрогель СфероГЕЛЬ медиум, плотность и свойства гранул которого оптимальны для клеточной адгезии.
Костный мозг получали от крыс той же линии, насыщение гранул СфероГЕЛЬ проводили неотцентрифугированной массой костного мозга в стерильных условиях в течение 30 минут. Объем клеточно-гелевого комплекса соответствовал объему дефекта. Затем рану укрывали мышечной фасцией с целью избежать дислокации трансплантата.
Так, нами приведены сравнительные микрофотографии гистологических срезов дефекта через 3 недели (Фиг. 4), 6 недель (Фиг. 5) и 12 недель (Фиг. 6) после нанесения дефекта у животных, которым вводили клеточно-гелевый комплекс, состоящий из клеточной массы костного мозга и биодеградируемого гетерогенного гидрогеля СфероГЕЛЬ медиум (1, 2), и контрольной группы животных (3, 4).
Гистологические исследования показали высокий уровень процессов регенерации, сопровождающийся полным восстановлением мышечной ткани со всеми ее компонентами и минимальным развитием соединительнотканных изменений как в близкие, так и в отдаленные сроки. Таким образом, предлагаемый способ прост, высокоэффективен при лечении травматического поражения мышечной ткани, позволяет повысить эффективность аутомиелотерапии, снизить травматичность лечения и вероятность иммунной реакции на введение препаратов.