Способ получения наночастиц ферригидрита
METHOD OF PRODUCING FERRIHYDRITE NANOPARTICLES

Изобретение относится к способу получения наночастиц оксигидроксидов железа в культуре аэробных гетеротрофных бактерий при выращивании на среде, содержащей раствор минеральных солей, включая сернокислое железо, и органической кислоты.
Синтезируемые наночастицы ферригидрита предлагаются для использования в биологических исследованиях, для развития новых методов в растениеводстве, повышения урожайности сельcкохозяйственных культур, для использования в качестве стимуляторов роста, усилителей действия фунгицидных и бактерицидных препаратов, при биоремедиации загрязненных почв, в качестве перспективного материала для создания новых типов катализаторов и сорбентов, а также биомедицинских приложений.
Известен способ получения наночастиц ферригидрита [US20170274371 A1, МПК B01J47/018, опубл. 2017.09.28], основанный на осаждении двухлинейчатого ферригидрита щелочью из водного раствора, содержащего катионы трехвалентного железа, галогенид-анионы и промотор образования двухлинейчатого ферригидрита. В качестве промоторов используются различные органические соединения (спиртов, полиолов, полисахаридов и др.). Недостаток способа в том, что ферригидрит получается в виде суспензии, т.е. наночастицы имеют низкую седиментационную устойчивость. Суспензия содержит не израсходованные в процессе синтеза ионы щелочных металлов, анионы галогенидов и соединения-промоторы. Суспензия наночастиц в таком состоянии применима, согласно патенту, для очистки вод, загрязненных соединениями серы. Все эти признаки получаемой суспензии ограничивают область их применения.
Thiobacillus ferrooxidans
Thiobacillus termoferrooxidans.
Известен способ получения гидроксида и оксида трехвалентного железа с помощью окисления железа бактериями [WO 2004/033732, МПК C22B3/18, опубл. 2004.04.22]. Способ включает последовательное окисление и растворение элементарного железа или железосодержащего сырья слабым раствором серной кислоты, содержащим бактерии, способные окислять Fe(II) до Fe(III), осаждение образовавшейся суспензии гидроксида и оксида железа, отделение осадка, его промывку и последующую обработку (сушка, отжиг) и выделение в виде пригодном для практического использования. Отличительный признак этого способа, представляющий прямой интерес для заявленного изобретения состоит в использовании для окисления ионов двухвалентного железа в кислой среде бактерий  или Недостаток способа для получения гидроксида железа в том, что целевой продукт синтезируется в кислой среде (pH ниже 2 ед.). Это не позволяет выделить его (в частности, ферригидрит) в виде наночастиц и водного золя.
Klebsiella oxytoca
Известен способ получения наночастиц ферригидрита [RU 2457074 C1, МПК В22А9/24, опубл. 27.07.2012 Бюл. № 21], по которому наночастицы ферригидрита синтезируются в культуре бактерий , выделенных из сапропеля озера Боровое Красноярского края. Культивирование ведут в течение 7-10 дней до образования осадка. Осадок, включающий наночастицы ферригидрита, отделяют от культуральной жидкости центрифугированием, дезинтегрируют ультразвуком и отмывают дистиллированной водой. Далее очистку наночастиц ведут при определенных условиях (инкубирование в 20%-ном растворе NaOH в течение 1 часа, промывка в дистиллированной воде до нейтрального значения рН).
Недостатки этого способа получения наночастиц ферригидрита:
Klebsiella oxytoca
По этому способу наночастицы ферригидрита синтезируются в культуре факультативной анаэробной бактерии Klebsiella oxytoca, выделенной из сапропеля озера Боровое Красноярского края. Недостатки этого способа в том, что он видоспецифичен в отношении вида бактерий, в культуре которых синтезируются наночастицы ферригидрита. Культивирование бактерий , известных представителей условно-патогенной микрофлоры человека, в микроаэрофильных/анаэробных условиях при соблюдении стерильности на питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт, требует соблюдения жестких технологических и конструктивных требований. Продолжительность процесса синтеза наночастиц в микроаэрофильных условиях составляет 7-10 дней. В целом это усложняет технологию получения, удорожает целевой продукт и препятствует масштабированию процесса.
Leptothrix
Известен способ получения наночастиц ферригидрита и лепидокрокита в культурах бактерий рода [US 2012/0315437 A1 Int.Cl. C12N 1/21, US Cl. 428/141, опубл. 2012.12.13 (W02011074586 A1, МПК C12P3/00) (прототип)]. Способ включает культивирование аэробных бактерий в минеральной среде, содержащей источники железа в виде сульфата и крупных частиц чистого железа, источники органического углерода и азота, а также неорганические соединения фосфора, кремния, магния и кальция, и их выделение в виде агрегатов.
Недостатки получения наночастиц ферригидрита по этому способу.
Leptothrix
Leptothrix
Основным источником ионов железа для синтезируемых в культуре бактерий  оксидов железа служат кусочки чистого железа. Скорость роста бактерий и образования оксидов железа при использовании нерастворимого источника железа низкая. В результате процесс получения оксидов железа (в частности, ферригидрита)составляетот 4 до 35 дней. Длительный процесс получения наночастиц ферригидрита и лепидокрокита в культурах бактерий снижает его технологичность. Включение в состав питательной среды ионной формы железа (FeSO4), концентрация которой составляет всего 0,58 - 2,8 мг/л, не имеет существенного значения для образования оксидов железа.
Leptothrix
Получаемые в культурах бактерий оксиды железа находятся в виде агрегатов (микро- и нанотрубок, стержней, капсул и др.) от субмикронных (0,3 мкм) до микронных (3 - 200 мкм) размеров. Агрегаты образованы наночастицами ферригирита с размерами 3-5 нм и лепидокрокита с размерами 30-50 нм. Однако перевести первичные наночастицы из агрегатов в коллоидное состояние сложно, во многих случаях это практически не решенная задача, что ограничивает возможности этого способа для получения наночастиц ферригидрита.
Leptothrix
Оксиды железа, получаемые по способу, предложенному в прототипе, представлены ферригидритом и лепидокрокитом. При этом сведения об условиях культивирования бактерий, которые необходимо поддерживать в культуре бактерий для получения либо ферригидрита, либо лепидокрокита не описаны.
Leptothrix,
К недостаткам прототипа относится также необходимость культивирования бактерий рода продуцирующих оксиды металлов, на богатой питательной среде. Среда включает источник углерода в форме глюкозы или фруктозы, мелассы и др., а источник азота в форме кукурузного, дрожжевого или мясного экстрактов, пептона, соевой муки и т.д. Необходимость культивирования бактерий на богатой среде выдвигает повышенные требования к технологии процесса, в части приготовления и соблюдения стерильности.
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа получения наночастиц ферригидрита, в виде устойчивого коллоидного раствора.
4*
2
Технический результат достигается тем, что в способе получения наночастиц ферригидрита, включающем культивирование аэробных бактерий в минеральной среде, содержащей сульфат железа, очистку и выделение полученного ферригидрита, новым является то, что в состав минеральной среды вводят FeSO7HO - 2,5-10,0 г/л и добавку лимонной кислоты - 1,5-8,0 г/л, а очистку и выделение наночастиц в виде золя ведут отмывкой осадка водой, очисткой от липидов и белков путем диспергирования отмытого водой осадка в ацетоне с помощью ультразвука, выдержки, центрифугирования, отмывки осадка от ацетона, его последующего диспергирования в дистиллированной воде, щелочного гидролиза в 0,5-1%-ном растворе NaOH, отмывки дисперсной фазы водой до pH 7,7-8,3, диспергирования осадка ультразвуком, центрифугирования и удаления осадка.
3
6
6
7
2
А также тем, что в состав минеральной среды включают соль Co(CHO) (0,1 - 0,5 г/л).
2
4
3*
2
А также тем, что в состав минеральной среды включают соль Al(SO)18НО (0,5 - 2,5 г/л).
2
3*
2
А также тем, что в состав минеральной среды включают соль NaSiO9НО (1,5 - 6,0 г/л).
4*
2
Таким образом, заявляемый способ получения наночастиц ферригидрита отличается от прототипа тем, что в состав минеральной среды вводят FeSO7HO - 2,5-10,0 г/л и добавку лимонной кислоты - 1,5-8,0 г/л, а очистку и выделение наночастиц в виде золя ведут отмывкой осадка водой, очисткой от липидов и белков путем диспергирования отмытого водой осадка в ацетоне с помощью ультразвука, выдержки, центрифугирования, отмывки осадка от ацетона, его последующего диспергирования в дистиллированной воде, щелочного гидролиза в 0,5-1 %-ном растворе NaOH, отмывки дисперсной фазы водой до pH 7,7-8,3, диспергирования осадка ультразвуком, центрифугирования и удаления осадка.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, не выявлены в других технических решениях при изучении данных и смежных областей техники и, следовательно, обеспечивают заявляемому решению соответствие критерию «изобретательский уровень».
Изобретение поясняется чертежами:
Pseudomonas moorei RW10(T)AM293566.
На фиг.1 представлено концентрирование частиц ферригидрита на экзополимерной матрице в культуральной жидкости и клетки бактерий
Delftia tsuruhatensis T7
На фиг.2 представлен вид биореактора с культурой в стационарной фазе роста (нижний слой - осадок, содержащий наночастицы ферригидрита, верхний слой - культуральная жидкость с бактериями).
Pseudomonas moorei RW10(T)
Delftia tsuruhatensis T7
На фиг.3 представлена дифрактограмма ферригидрита, синтезируемого в культурах  и на среде с сернокислым железом (II) и лимонной кислотой.
Delftia tsuruhatensis T7
На фиг.4 дано распределение по размерам наночастиц ферригидрита, синтезированного в культуре аэробных бактерий  (определено методом динамического рассеяния света).
Pseudomonas moorei RW10(T)
Delftia tsuruhatensis T7
На фиг.5 представлена дифрактограмма ферригидрита, синтезированного в культурах  и на среде с сернокислым железом (II), лимонной кислотой и допантом (алюминий).
На фиг.6 представлены дисперсные структуры золей наночастиц ферригидрита допированного кобальтом (1), кремнием (2), алюминием (3) и ферригидритом без допантов (4), определенные методом динамического рассеяния света.
На фиг.7 представлено изображение агрегатов наночастиц ферригидрита, допированного кобальтом (атомно-силовая микроскопия в полуконтактной моде золя на пирографите).
Pseudomonas,
Delftia,
Acinetobacter
Bacillus
Delftia и Pseudomonas
Синтез наночастиц ферригидрита проводится в культуре аэробных гетеротрофных бактерий рода  или, предпочтительно родов , использующих в качестве источника углерода и энергии лимонную кислоту.
Используемые для получения наночастиц ферригидрита бактерии не относятся к патогенным или условно-патогенным видами и растут на простой минеральной среде. В связи с этим жесткие требования к соблюдению стерильности процесса отпадают, что повышает технологичность заявленного способа.
Скорость роста аэробных бактерий выше, чем анаэробных, поэтому длительность процесса культивирования и сопряженного образования наночастиц ферригидрита уменьшается до 24-72 часов.
Pseudomonas,
Delfti,
Acinetobacter
Bacillus
Аэробные бактерии рода  и не образуют массивные капсулы, а выделяют в культуральную жидкость экзополисахариды, на которые осаждаются синтезируемые наночастицы (фиг. 1). Благодаря этому сокращается число стадий очистки, и, соответственно, длительность процесса выделения наночастиц в золи.
Прекурсором для синтеза ферригидрита служит соль двухвалентного сернокислого железа в растворе лимонной кислоты. Эта форма прекурсора ферригидрита технологичнее, чем используемая по прототипу трудно растворимая соль цитрата железа. Для получения наночастиц ферригидрита допированного кобальтом, алюминием или кремнием в питательную среду включаются прекурсоры - растворимые соли кобальта, алюминия или кремния.
Лимонная кислота, включенная в состав питательной среды как источник углерода и энергии, служит одновременно стабилизатором для образующихся на начальном этапе наночастиц и способствует высокой устойчивости золей, которая сохраняется на протяжении  4-12 месяцев.
Pseudomonas, Delftia, Acinetobacter
Bacillus.
Заявляемый способ опробован с культурами бактерий родов  и
Acinetobacter
Pseudomonas moorei RW10(T) AM293566,
Delftia tsuruhatensis T7, Delftia lacustris DSM 21246
Bacillus aryabhattai B8W22(T) EF114313
Бактерии, кроме , были выделены из образцов почв на селективной среде, содержащей лимонную кислоту, в качестве источника углерода. Все штаммы были получены в монокультуре и определены до вида в Институте экологии и генетики микроорганизмов (ИГЭМ УРО РАН, г. Пермь). Видовая принадлежность была определена по результатам секвенирования как  по уровню сходства 98,9% и как с уровнями сходства 99,344% и 99,345%, соответственно, и как с уровнем сходства 100%.
Pseudomonas moorei RW10(T) AM293566.
Штамм  Аэробные гетеротрофные, грамм-отрицательные, не образующие споры клетки, подвижные, имеют форму прямых или изогнутых палочек, не продуцируют флюоресцирующий пигмент, растут на минеральных средах при оптимальной температуре 30°С в строго аэробных условиях, утилизируют органические соединения широкого спектра.
Delftia tsuruhatensis T7
Delftia lacustris DSM 21246
Delftia
ифилогенетическиблизкородственныештаммы. Аэробные, грамм-отрицательные бактерии, короткие подвижные палочки, 0,7-12×2,4-4,0 μm, клетки не продуцируют водорастворимые или флюоресцирующие пигменты, оптимум роста 35°С, растут в широком диапазоне рН от 5 до 9. Микроорганизмы рода могут использовать широкий ряд соединений в качестве источников углерода.
Bacillus aryabhattai B8W22(T) EF114313.
Аэробные граммположительные палочки, подвижные, образуют не более одной эндоспоры, спорообразование не подавляется наличием кислорода, растут на цитратно-солевой среде с образованием щелочной реакции.
Acinetobacter calcoaceticus ВКПМ В-4833
Штамм, выделенный из бурого угля, получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ). Аэробы, используют кислород как конечный акцептор электронов, грамм-отрицательные, неподвижные палочки обычно парные, в стационарной фазе роста образуют коккообразные формы, спор не образуют, растут на простых средах, не нуждаются в факторах роста.
2
4
2
4
4 *
2
3
4
4*
2
Для получения наночастиц бактерии культивировали в периодическом режиме на питательной среде следующего состава (в г/л): NHSO - 0,28; KSO- 0,05; MgSO7HO- 0,05; HPO- 0,32; FeSO7HO - 2,5-10,0 г/л; лимонная кислота - 1,5-8,0 г/л. Соли растворяли в дистиллированной воде, рН среды доводили до 6,0 - 6,7 ед.
Пример 1.
2
4
2
4
4 *
2
3
4
4*
2
Для получения наночастиц ферригидрита, аэробные бактерии культивировали в периодическом режиме на питательной среде следующего состава (в г/л): NHSO - 0,28; KSO- 0,05; MgSO7HO- 0,05; HPO- 0,32; FeSO7HO - 2,5 г/л; лимонной кислоты - 1,5 г/л. Соли растворяли в дистиллированной воде, рН среды доводили до 6,0 - 6,7 ед.
В результате концентрация наночастиц ферригидрита в полученном коллоидном растворе составила 0,4 г/л.
Пример 2
2
4
2
4
4 *
2
3
4
4*
2
Во втором примере, для получения наночастиц ферригидрита, аэробные бактерии культивировали в периодическом режиме на питательной среде следующего состава (в г/л): NHSO - 0,28; KSO- 0,05; MgSO7HO- 0,05; HPO- 0,32; FeSO7HO - 6,0 г/л; лимонной кислоты - 5,0 г/л. Соли растворяли в дистиллированной воде, рН среды доводили до 6,0 - 6,7 ед.
В результате концентрация наночастиц ферригидрита в полученном коллоидном растворе составила 2,8 г/л.
Пример 3
2
4
2
4
4 *
2
3
4
4*
2
В третьем примере, для получения наночастиц ферригидрита, аэробные бактерии культивировали в периодическом режиме на питательной среде следующего состава (в г/л): NHSO - 0,28; KSO- 0,05; MgSO7HO- 0,05; HPO- 0,32; FeSO7HO - 10,0 г/л; лимонной кислоты - 8,0 г/л. Соли растворяли в дистиллированной воде, рН среды доводили до 6,0 - 6,7 ед.
В результате концентрация наночастиц ферригидрита в полученном коллоидном растворе составила 5,0 г/л.
Из приведенных выше примеров видно, что концентрация синтезированных в культурах бактерий наночастиц составляла от 0,4 до 5 г/л, в зависимости от заданной концентрации сульфата железа и лимонной кислоты.
Во всех приведенных выше примерах осуществления заявляемого способа получения наночастиц ферригидрита, золи наночастиц ферригидрита имеют достаточно высокую седиментационную устойчивость, которая сохранялась в течение 4-12 месяцев. Однако, введение допантов оказывает существенное влияние на устойчивость золей и их дисперсную структуру.
3
6
6
7
2
2
4
3*
2
2
3*
2
Синтез наночастиц допированного ферригидрита испытан на трех вариантах модификации питательной среды. В среду указанного выше состава вносили с водорастворимыми солями: 1) ионы кобальта в виде Co(CHO)(0,1-0,5 г/л), 2) ионы алюминия в виде Al(SO)18НО (0,5-2,5 г/л) и 3) ионы кремния в виде NaSiO9НО (1,5-6,0 г/л).
Микроорганизмы культивировали в периодическом режиме в биореакторах объемом 0,25-5,0 л с аэрацией и механическим перемешиванием, стабилизацией температуры 30±2,0°С. В процессе роста бактерий рН культуры повышается до 9,2-9,5 ед. Продолжительность процессов составляла 24-72 часа в зависимости от концентрации инокулята и питательной среды. В стационарной фазе роста культуры в реакторах образуется темнокоричневый осадок (Фиг. 2), содержащий наночастицы ферригидрита. Наличие наночастиц ферригидрита подтверждает рентгенофазовый анализ наночастиц, выделенных из культур и очищенных от бактерий и внеклеточных продуктов метаболизма (фиг. 3). Приведенная дифрактограмма показывает рефлексы характерные для 6-линейчатого ферригидрита (межплоскостные расстояния 2,516; 2,27; 1,993; 1,69; 1,51 и 1,48), а также гетита (4,3). Размер (гидродинамический диаметр) образующихся в культурах аэробных бактерий названных выше штаммов составляет 2-10 нм (Фиг. 4). Это также подтверждает, что золи образуются наночастицами ферригидрита, размер которых составляет 2-7 нм [Jambor J.L., Dutrizac J.E. Chem. Rev.,1998, v. 98, No. 7, p. 2549-2586]. Методика культивирования бактерий всех тестированных видов на указанных питательных средах была неизменной.
Независимо от вида бактерий и состава питательной среды образованный в культуре гель осаждали на центрифуге в течение 2-х минут при 1000 об/мин, заливали дистиллированной водой в отношении 1:10, перемешивали и снова осаждали на центрифуге, супернатант сливали. Отмывку водой проводили до получения прозрачного супернатанта. При этом удаляются бактерии, соли и часть водорастворимых метаболитов.
На следующем этапе для выделения наночастиц ферригидрита в виде золей проводили очистку от липидов и белков. Для удаления липидов, отмытый водой осадок диспергировали в ацетоне с помощью ультразвука, выдерживали в течение 30 мин, центрифугировали и удаляли супернатант, содержащий ацетон, осадок отмывали от ацетона. Очищенный от липидов осадок диспергировали в дистиллированной воде.
Для удаления белков и других органических соединений в золь вносили NaOH до получения 0,5-1% раствора. Через 1-12 часов дисперсную фазу, осажденную щелочным гидролизом, отмывали дистиллированной водой до установления рН 7,7 - 8,3 ед. После удаления органических соединений осадок наночастиц диспергировали ультразвуком и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 30 мин, осадок удаляли. Полученный таким образом золь наночастиц ферригидрита сохранял седиментационную устойчивость в течение 4-12 месяцев. Изменение вида бактерий, указанных вариаций состава среды не оказывало влияние на методику выделения золей и их состояния.
Качественно рост бактерий испытанных видов на основной и модифицированных средах был идентичен относительно длительности процесса, накопления наночастиц и их фазового состояния. Наблюдаемые различия не имеют принципиального значения и состоят в следующем. Концентрация синтезированных в культурах бактерий наночастиц не зависела от введения в среду солей, которые служили источниками допирующих элементов.
Bacillus aryabhattai B8W22(T) и Acinetobacter calcoaceticus
Продолжительность процесса с бактериями выше в среднем на 15-20%. Введение в питательную среду допантов (Co, Al и Si) стабилизировало синтез 2-линейчатого ферригидрита, препятствуя росту кристаллизации, образованию гетита и других минералогических фаз. Для примера приведена дифрактограмма наночастиц ферригидрита допированного кобальтом, которую характеризуют только два рефлекса с межплоскостными расстояниями 2,516 и 1,48 (Фиг. 5). Это подтверждает синтез и выделение из культур бактерий 2-линейчатого ферригидрита.
Во всех вариантах испытания заявляемого способа золи наночастиц ферригидрита имели достаточно высокую седиментационную устойчивость, которая сохранялась в течение 4-12 месяцев. Однако, введение допантов оказывало влияние на устойчивость золей и их дисперсную структуру. Золи чистого ферригидрита были устойчивы в течение 4-6 месяцев. Золи наночастиц ферригидрита, допированного кремнием, сохраняли седиментационную устойчивостью в течение более длительного времени (до 12 месяцев).
Влияние допирующих элементов на дисперсную структуру образующихся золей демонстрирует Фиг.6. Наиболее узкое распределение имели наночастицы ферригидрита допированные кобальтом (модальное значение диметра - 8,72 нм), более широкое распределение, с такой же модой, получено при допировании кремнием. Допирование алюминием привело к сдвигу к более крупным агрегатам (мода 18,17-21,04 нм с долей более 53%). Наиболее крупные агрегаты получены с наночастицами чистого ферригидрита (мода 28,2-32,7 нм с долей 46,5%). При этом все распределения лежат в нанометровом диапазоне (до 80 нм).
-
Одновременно со стабилизацией ферригидрита допирование кобальтом приводит к анизотропии нанокристаллов, в связи с этим их агрегаты в коллоидном растворе принимают характерную форму с отношением длина/ширина ~1/4 (Фиг.7). Размеры индивидуальных и агрегированных наночастиц ферригидрита, их форма, образование линейных и других структур и наличие различных допирующих элементов представляет практический интерес для различных приложений сорбенты ионов тяжелых металлов, озона и др., катализаторы деградации токсичных соединений и др.