Особенности внутриклеточного метаболизма моноцитов периферической крови при хроническом воспалении придатков матки

© ОКЛАДНИКОВА Е.В., БУЛЫГИН Г.В., ГРЕБЕННИКОВА В.В.

ОСОБЕННОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО МЕТАБОЛИЗМА МОНОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ ВОСПАЛЕНИИ ПРИДАТКОВ МАТКИ

Е.В. Окладникова, Г.В.Булыгин, В.В.Гребенникова Красноярский государственный медицинский университет им. проф.

В.Ф.Войно-Ясенецкого, ректор - д.м.н., проф. И.П.Артюхов; кафедра клинической иммунологии, зав. - д.м.н., проф. Н.И.Камзалакова; кафедра фармакологии с курсами клинической фармакологии, фармтехнологии и ПО,

зав. - д.м.н., проф. В.В.Гребенникова.

Резюме. Впервые биолюминесцентным методом определена активность ряда внутриклеточных дегидрогеназ моноцитов периферической крови, характеризующих состояние основных метаболических путей клетки при хроническом воспалительном процессе на примере хронического неспецифического воспаления придатков матки. При обострении и ремиссии воспалительного процесса выявлено изменение активности ферментов цикла трикарбоновых кислот и гликолиза в моноцитах, приводящее к ограничению фагоцитарной активности клеток, что способствует персистенции хронического воспаления.

Ключевые слова: моноцит, метаболический статус, дегидрогеназы,

хроническое воспаление.

Окладникова Евгения Владимировна - старший преподаватель каф. фармакологии с курсами клинической фармакологии, фармтехнологии и ПО КрасГМУ; e-mail - okladdm@yandex.ru, тел. - 8 (391) 2-283-666.

Булыгин Геннадий Викторович - д.м.н., проф. КрасГМУ, кафедра клинической иммунологии; тел. - 8(391)220-15-52.

Гребенникова Валентина Владимировна - д.м.н., проф. зав. каф. фармакологии с курсами клинической фармакологии, фармтехнологии и ПО КрасГМУ, тел. 8 (391) 2-283-666.

Среди вопросов современной медицины, имеющих принципиально важное научно-практическое значение, на одном из первых мест стоят вопросы о причинах хронизации воспалительного процесса. Актуальность изучения этой темы для практической медицины связана с тем, что резкое нарастание хронизации инфекционно-воспалительных заболеваний является наиболее характерной чертой последних десятилетий. Длительно текущие, с периодическими обострениями, хронические воспалительные процессы приводят к потере трудоспособности во время обострения заболевания, ранней инвалидизации, изменению в психоэмоциональной сфере больного, снижением его социальной адаптации [3,7].

Доказано участие иммунной системы в развитии, течении и исходах воспаления. Важная роль в реализации иммунных механизмов отводится мононуклеарным фагоцитам, участвующим в клеточно-опосредованном ответе и контролирующим межклеточные кооперации при воспалении. Полноценная реализация иммунного ответа определяется функциональной активностью иммунокомпетентных клеток, которая, в свою очередь, зависит от метаболических процессов, протекающих в клетке [1,3,11]. Активность внутриклеточных ферментов является объективным показателем пластических и энергетических процессов в клетке и может использоваться в диагностических и прогностических целях при самых различных физиологических и патологических состояниях. Ряд современных исследований выявили высокую информативность показателей активности дегидрогеназ, занимающих ключевые позиции в метаболизме клетки -пентозофосфатного пути, гликолиза, цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) - для оценки метаболизма лимфоцитов при различных заболеваниях [1,5,8,10,13]. По данным литературы, исследования активности внутриклеточных ферментов

моноцитов, в том числе и при хронических воспалительных процессах, немногочисленны [2,6,9].

Целью исследования явилась оценка метаболической активности моноцитов периферической крови при обострении и в ремиссию хронического воспаления.

Материалы и методы Обследованы 72 женщины с хроническим неспецифическим воспалением придатков матки (ХНВПМ). В 1-ю группу вошли 36 женщин с ХНВПМ в фазу обострения, 2-ю группу составили 36 женщин с ХНВПМ в фазу клинической

ремиссии. Диагноз подтверждался данными бимануального гинекологического исследования, УЗИ. Для исключения воспалительного процесса, вызванного специфической микрофлорой, всем женщинам было проведено обследование на инфекции, передаваемые половым путем и бактериальный посев из цервикального канала. Средний возраст обследованных женщин составил 26,69±0,87 лет в группе ХНВПМ в фазе обострения и 26,19±0,72 лет в группе ХНВПМ в фазе ремиссии. У большинства женщин 1-й и 2-й группы давность заболевания составила 4-5 лет - 18 (50%) и 21 (58,33%) человек соответственно. Периодичность обострений была не менее двух раз в течение года.

Группой контроля (3-я группа) служили 35 практически здоровых женщин той же возрастной (26,94±0,83) категории. В состав контрольной группы не включались женщины, имеющие в анамнезе хроническую патологию, заболевания с иммунопатологическими механизмами патогенеза (аллергические и системные заболевания и др.) и переболевшие какими-либо острыми бактериальными и вирусными заболеваниями в течение 2-х месяцев до момента обследования.

Исследование активности внутриклеточных ферментов моноцитов в 1-й и 2-й группах проводилось на 2-4 сутки от начала обострения заболевания. Взятие крови выполнялось из локтевой вены утром натощак в объеме 15 мл.

Для изучения метаболических параметров моноцитов вначале из периферической крови по Л.Боуиш (1968) выделялись мононуклеарные клетки, а затем из их взвеси - моноциты, по методу Т.В. Михеенко [4], в нашей модификации. Активность НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ определялась

биолюминесцентным методом с бактериальной люцеферазой по методу А.А.Савченко, Л.Н. Сунцовой [5]. Исследовали активность следующих ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-

фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), НАД- и НАДФ-зависимой малатдегидрогеназ (НАДМДГ, НАДФМДГ), НАД- и НАДФ-зависимой глутаматдегидрогеназ (НАДГДГ, НАДФГДГ), НАД- и НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ, НАДФИЦДГ). Энзиматическую активность ферментов выражали в ферментативных единицах (1Е=1 мкмоль/мин) на 10000клеток.

Для всех данных определялись: среднее арифметическое значение величин (М), ошибка среднего арифметического (ш). Оценка учетных признаков по критерию Шапиро-Уилка показал отсутствие их нормального распределения. Оценка достоверности различий средних проводилась с использованием непараметрических критериев (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни).

Результаты и обсуждение

На основании проведенных исследований нами выявлены следующие особенности метаболизма моноцитов при обострении хронического воспалительного процесса в придатках матки (табл.1). В моноцитах периферической крови больных отмечалось снижение активности реакций гликолиза; это подтверждалось изменением показателей следующих ферментов - Г3ФДГ, Г6ФДГ и ЛДГ. Известно, что Г3ФДГ является ферментом, контролирующим поток субстратов с липидного обмена на окислительновосстановительные реакции гликолиза. Снижение активности Г3ФДГ в моноцитах свидетельствует об уменьшении поступления продуктов липидного катаболизма на гликолиз, а также предполагает снижение работы глицерофосфатного шунта в клетках, обеспечивающего ЦТК водородом [8]. Объединение потока субстратов по гликолизу могло происходить и за счет повышения их оттока на другие процессы клетки - пентозофосфатный путь (ПФП), являющийся основным конкурентом гликолиза за глюкозо-6-фосфат (10). Наблюдаемое уменьшение активности ЛДГ, катализирующего окисление

лактата, приводит к накоплению последнего в моноцитах и, как следствие, также снижает интенсивность субстратного потока по гликолизу.

Одним из центральных энергопродуцирующих процессов в клетках является ЦТК. Интенсивность реакций начального этапа ЦТК определяется активностью НАДИЦДГ, катализирующей превращение изоцитрата в кетоглутарат [9,13]. При обострении ХНВПМ нами было зарегестрировано достоверное снижение в моноцитах периферической крови активности НАДИЦДГ в совокупности с уменьшением активности НАДФИЦДГ, регулирующего вспомогательную НАДФ-зависимую реакцию, что отражает уменьшение субстратного потока начальных этапов цикла Кребса. Важное значение в работе ЦТК отводится НАД- и НАДФГДГ, которые осуществляют связь цикла с аминокислотным обменом [13]. Выявленное нами уменьшение активности НАДГДГ и НАДФГДГ свидетельствуют о торможении окислительного дезаминирования глутамата и превращения его в кетоглутарат, являющегося субстратом ЦТК. Интенсивность реакций заключительного этапа ЦТК в моноцитах при обострении ХНВПМ практически не отличается от аналогичных показателей группы контроля (уровень НАДМДГ). В то же время, повышение активности НАДФМДГ позволяет сделать вывод о том, что отток субстратов с цикла по пути малат-пируват с восстановлением НАДФ+ до НАДФ-Н у больных достоверно выше. Последний может выступать в роли кофактора для НАД(Ф)-зависимых ферментов, а также необходим для синтеза нуклеиновых кислот, жирных кислот, стероидов [14].

Изменения внутриклеточного метаболизма моноцитов в фазу ремиссии ХНВПМ заключались в еще более выраженном повышении активности Г6ФДГ и снижение активности Г3ФДГ по сравнению с активностью этих ферментов в моноцитах при обострении ХНВПМ и группой контроля, что свидетельствует об еще большем обеднении гликолиза субстратами. Возможно, этот дефицит несколько компенсируется возросшей активностью ЛДГ с наработкой пирувата за счет окисления лактата. В стадию ремиссии в моноцитах периферической крови наблюдается усугубление субстратного дефицита в ЦТК (по сравнению с

1-й группой) на его начальных этапах (снижение активности НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ). Можно предположить, что этот недостаток субстратов компенсируется дополнительным поступлением в цикл Кребса продуктов с аминокислотного обмена за счет повышения активности НАДГДГ и НАДФГДГ. Достоверно более высокой, по сравнению с контрольной группой, остается активность НАДФМДГ, что свидетельствует об активном удалении малата с ЦТК по пути малат - пируват - ацетил-КоА и далее, вероятно, на свободные жирные кислоты, так как низкая активность НАДИЦДГ подтверждает отсутствие активного насыщения цикла субстратами с гликолиза [12].

Таким образом, состояние метаболизма в моноцитах при обострении ХНВПМ можно оценить как энергетический дефицит, что влечет за собой ограничение гуморальной и фагоцитарной активности иммунокомпетентных клеток, подтверждаемое данными нашего исследования. Вероятно, в результате этого не происходит полной санации очага воспаления, что приводит к переходу фазы обострения воспалительного процесса в фазу ремиссии, а не к выздоровлению. Изменения состояния метаболизма в моноцитах при ремиссии воспалительного процесса заключалось в еще большем снижении активности ферментов ЦТК по сравнению с фазой обострения. Все это наряду с остающейся низкой активностью гликолиза может приводить к сохранению энергодефицита в моноцитах в ремиссию ХНВПМ, что способствует персистенции хронического воспаления в организме.

INTRACELLULAR METABOLISM OF MONOCYTES IN PERIFERIAL BLOOD DURING THE ACUTE PHASE AND CHRONIC INFLAMMATION

REMISSION E.V. Okladnikova, G.V. Buligin, V.V. Grebennikova Krasnoyarsk State Medical University named after Prof. V.F. Voyno-Yasenetsky

Abstract. Using bioluminescent method we detected the activity of several intracellular dehydrogeneses in the monocytes which characterize the status of major

metabolic pathways in the cell during chronic inflammation on the example of chronic nonspecific inflammation of the adnexa. We found out changes in enzymes’ activity in citric acid cycle and glycolosys in monocytes during the acute phase and remission. It resulted into a phagocytes activity restriction that caused chronic persistence of inflammatory lesion.

Key words: monocyte, metabolic status, dehydrogenases, chronic inflammation

Литература

1. Булыгин Г.В., Камзалакова Н.И., Андрейчиков А.В.

Метаболические основы регуляции иммунного ответа. - Новосибирск: СО РАМН, 1999. - 346с.

2. Василькова В.В., Вишневецкая И.Ф. Ферментативная активность моноцитов крови больных лихорадкой Ку различных возрастных групп // Мед. иммунология. - 2006. - Т.8, №2-3. - С.252.

3. Иммунодефицитные состояния / Под ред. В. С. Смирнова, И.С.Фрейдлин. - СПб.: «Фолиант», 2000. - 568с.

4. Михеенко Т.В. Два метода получения обогащенной популяции моноцитов периферической крови // Лаб. дело. - 1987. - №10. - С.763-766.

5. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминисцентным методом // Лаб. дело. - 1989. - №11. - С.23-25.

6. Фролова О.Е. Морфофункциональная характеристика моноцитов. Значение исследования нуклеолярного аппарата (обзор литературы) // Клинич. лабор. диагностика. - 1998. - №10. - С.3-8.

7. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая иммунология. - М.: изд-во ВНИРО, 1995. - 219с.

8. Alteration of the NAD+/NADH ratio in CHO cells by stable transfection with human cytosolic glycerol-3-phosphate dehydrogenase: resistance to

oxidative stress / K.Hwang, D.W.Jeong, J.W.Lee et al. // Mol. Cells. - 1999. -Vol.9, №4. - P.429 - 435.

9. De-Halac I.N., Bacman S.R., de-Kremer R.D. Histoenzymology of oxidases and dehydrogenases in peripheral blood lymphocytes and monocytes for the study of mitochondrial oxidative phosphorylation // Histochem. J. -2000. - Vol.32, №3. - P.133-137.

10. Glucose-6-phosphate dehydrogenase modulates cytosolic redox status and contractile phenotype in adult cardiomyocytes / M.Jain, D.A.Brenner, L.Cui et al. // Circ. Res. - 2003. - Vol.93, №2. - P.9-16.

11. Burke B., Lewis C.E., McGee J.O'D The Macrophage. - Oxford University Press, 2002. - 676p.

12. Lysine residues 162 and 340 are involved in the catalysis and coenzyme binding of NADP(+)-dependet malic enzyme from pigeon / C.C.Kuo, L.C.Tsai, T.Y.Chin et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2000. - Vol.270, №3. - P. 821825.

13. Yoshino M., Murakami K. Role of glutamate dehydrogenase reaction in the control of citrate pool in yeast // Int. J. Biochem. - 1993. - Vol.25, №12. -P.1723-1729.

14. Zimmerle C.T., Alter G.M. Cooperativity in the mechanism of malate dehydrogenase // Biochemistry. - 1993. - Vol.32, №47. - P.12743-12749.

Таблица 1

Активность НАД

Показатели активности ферментов в исследуемых группах

Ферменты Контрольная группа

1 2 3

Г6ФДГ 0,92 1,13 Р1<0,01 2,12 Р1< 0,001 Р2< 0,001

Г3ФДГ 1,20 0,52 Р1<0,001 0,68 Р1<0,001 Р2<0,05

ЛДГ 0,30 0,14 Р1<0,001 0,34 Р2< 0,001

НАДИЦДГ 20,54 6,58 Р1<0,001 3,99 Р1<0,001 Р2< 0,001

НАДФИЦДГ 29,40 21,68 Р1<0,01 8,23 Р1<0,001 Р2< 0,001

НАДГДГ 1,21 0,30 Р1<0,001 0,80 Р1<0,05 Р2< 0,001

НАДФГДГ 0,18 0,08 Р1<0,001 0,15 Р2< 0,001

НАДМДГ 9,62 10,04 14,81 Р1<0,001 Р2< 0,001

НАДФМДГ 0,11 0,24 Р1<0,001 0,20 Р1<0,001