СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ВЫСОКОМУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР

1. Способ амплификации целевых локусов в образце нуклеиновой кислоты, включающий:
(a) приведение образца нуклеиновой кислоты, содержащего целевые локусы, в контакт с библиотекой тестовых праймеров, содержащее по меньшей мере 1000 разных тестовых праймеров, с целью получения реакционной смеси в одном реакционном объеме; при этом указанные праймеры не включают молекулярные инверсионные зонды (MIPs);
(b) помещение реакционной смеси в условия реакции удлинения праймеров с целью получения амплифицированных продуктов, содержащих целевые ампликоны, при этом оновременно амплифицируют по меньшей мере 10000 разных целевых локусов; и при этом (i) менее чем 20% амплифицированных продуктов представлено димерами тестовых праймеров, (ii) по меньшей мере 80% амплифицированных продуктов представлено целевыми ампликонами, и (iii) амплифицируется по меньшей мере 80% целевых локусов; и
(c) секвенирование амплифицированных продуцтов;
при этом метод не включает использование микроматрицы.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что амплифицируют по меньшей мере 5000 разных целевых локусов.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрация каждого тестового праймера составляет менее 20 нМ; и при этом продолжительность этапа отжига в условиях реакции составляет более 10 минут.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что библиотека праймеров содержит по меньшей мере 1000 пар праймеров, при этом каждая пара праймеров включает прямой праймер и обратный праймер, которые гибридизуются с одним и тем же целевым локусом; при этом длина целевого ампликона составялет менее 100 нуклеотидов.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестовые праймеры содержат 5′-область, являющуюся специфической в отношении целевого локуса, внутреннюю область, не являющуюся специфической в отношении целевого локуса и образующую петлевую структуру, и 3′-область, являющуюся специфической в отношении того же целевого локуса.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что тестовые праймеры выбирают из библиотеки кандидатных праймеров по меньшей мере отчасти на основании способности указанных кандидатных праймеров образовывать димеры праймеров.
7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образец содержит материнскую ДНК от беременной матери плода и плодную ДНК; при этом способ включает определение присутствия или отсутствия хромосомных аномалий плода на основе данных секвенирования.
8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанные целевые локусы представлены в геноме человека, или что указанные целевые локусы содержат однонуклеотидные полиморфизмы человека.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образец нуклеиновой кислоты содержит ДНК опухоли, трансплантата или плода.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образец нуклеиновой кислоты содержит ДНК из одной клетки.
11. Библиотека тестовых праймеров, содержащая по меньшей мере 1000 разных тестовых праймеров в одном реакционном объеме, которые способны одновременно амплифицировать путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) по меньшей мере 1000 разных целевых локусов с уцелью получения амплифицированных продуктов, включающих целевые ампликоны, при этом (i) менее чем 20% амплифицированных продуктов представлено димерами тестовых праймеров, (ii) по меньшей мере 80% амплифицированных продуктов представлено целевыми ампликонами, и (iii) амплифицируется по меньшей мере 80% целевых локусов; при этом библиотека не включает использование микроматрицы.
12. Библиотека по п. 11, отличающаяся тем, что диапазон содержания гунанин-цтозина (GC) среди различных тестовых праймеров из библитеки составляет менее чем 30%, при этом диапазон темератур плавления среди различных тестовых праймеров из библитеки составляет менее чем 20°C, и при этом диапазон длин среди различных целевых ампликонов составляет менее чем 50 нуклеотидов.
13. Библиотека по п. 11, отличающаяся тем, что указанная библиотека тестовых праймеров выбрана из библиотеки кандидатных праймеров с использованием способа по п. 14.
14. Способ выбора тестовых праймеров из библиотеки кандидатных праймеров, включающий:
(a) вычисление на компьютере балла нежелательности для по меньшей мере 90% возможных комбинаций двух кандидатных праймеров из библиотеки, при этом каждый балл нежелательности основан по меньшей мере отчасти на вероятности образования димеров между двумя кандидатными праймерами;
(b) удаление из библиотеки кандидатных праймеров кандидатного праймера, который входит в состав наибольшего числа комбинаций двух кандидатных праймеров с баллом нежелательности выше первого минимального порога;
(c) в том случае, если кандидатный праймер, удаленный на этапе (b) представляет собой член пары праймеров, удаление другого члена указанной пары праймеров из библиотеки кандидатных праймеров; и
(d) необязательно повторение этапов (b) и (с), что обеспечивает отбор библиотеки тестовых праймеров.
15. Способ по п. 14, дополнительно включающий:
(i) дальнейшее снижение количества кандидатных праймеров, остающихся в библиотеке, путем снижения первого минимального порога, используемого на этапе (b) до более низкого второго минимального порога и повторение этапов (b) и (с) до тех пор, пока все баллы нежелательности для комбинаций кандидатных праймеров, остающихся в библиотеке, не сравняются со вторым минимальным порогом или не опустятся ниже второго минимального порога, или до тех пор, пока количество кандидатных праймеров, остающихся в библиотеке, не снизится до требуемого количества.
(ii) повышение количества кандидатных праймеров, остающихся в библиотеке, путем повышения первого минимального порога, используемого на этапе (b) до более высокого второго минимального порога и повторение этапов (b) и (с) до тех пор, пока все баллы нежелательности для комбинаций кандидатных праймеров, остающихся в библиотеке, не сравняются со вторым минимальным порогом или не опустятся ниже второго минимального порога, или до тех пор, пока количество кандидатных праймеров, остающихся в библиотеке, не снизится до требуемого количества.
16. Способ по п. 14, дополнительно включающий, до этапа (b), удаление из библиотеки пары праймеров, дающих целевой ампликон, который перекрывается с целевым ампликоном, получаемым с помощью другой пары праймеров.
17. Способ по п. 14, отличающийся тем, что баллы нежелательности основаны по меньшей мере отчасти на одном или нескольких параметрах, выбранных из группы, состоящей из степени гетерозиготности целевого локуса, распространенности заболевания, связанной с полиморфизмом или мутацией в целевом локусе, пенетрантности заболевания, связанной с полиморфизмом или мутацией в целевом локусе, специфичности кандидатного праймера в отношении целевого локуса, размера кандидатного праймера, температуры плавления целевого ампликона, содержания GC в целевом ампликоне, эффективности амплификации целевого ампликона и размера целевого ампликона.
18. Способ по п. 14, включающий выбор библиотеки по меньшей мере из 1000 различных тестовых праймеров и использование по меньшей мере 1000 из выбранных тестовых праймеров, одновременно амплифицирующих по меньшей мере 1000 различных целевых локусов.