Способ определения степени риска внутриутробной инфекции плода у женщин, перенесших грипп A(H1N1) в период беременности
METHOD FOR DETERMINING A RISK OF INTRAUTERINE FETUS INFECTION IN FEMALES SUFFERING INFLUENZA A(H1N1) IN PREGNANCY

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням, акушерству и касается лабораторной диагностики угрозы внутриутробной инфекции плода, с целью выбора тактики ведения беременности и новорожденного для снижения риска развития внутриутробной инфекции.
Несмотря на значительный успех в области профилактики и лечения гриппа, на сегодняшний день грипп расценен как самое массовое заболевание человека (Nair Н и соавт., 2011). Заболеваемость гриппом, вне пандемий, характеризуется ежегодными подъемами с выраженным сезонным характером (О.И. Киселев и соавт., 2013). Один из наиболее опасных в наши дни - вирус гриппа A(H1N1). В Россию пандемия пришла осенью 2009 года, всего было зарегистрировано более 2500 пациентов (Л.В. Колобухина, 2012). В последующие годы вирус возвращается в популяцию в период с ноября по февраль, приводя к росту летальности, как от гриппа, так и от ассоциированных с ним пневмоний и других осложнений. В период эпидемии женщины, инфицированные вирусом гриппа во время беременности, являются группой риска развития тяжелых форм заболевания. Большое количество исследований, проведенных в период последней пандемии гриппа, свидетельствуют о том, что беременные по сравнению с небеременными женщинами того же возраста имеют повышенный риск смертельного исхода и тяжелого течения при инфицировании гриппом A(H1N1) (Van Kerkhove M.D. и соавт., 2010). Показано, что беременные, больные гриппом, требуют госпитализации в 4 раза чаще, чем небеременные; более 8% госпитализированных беременных (преимущественно в третьем триместре заболевания) требуют проведения интенсивной терапии; показатель летальности от гриппа среди пациенток в третьем триместре беременности максимален и достигает 16,9%; преждевременные роды у беременных с гриппом наблюдаются в 3 раза чаще, а перинатальная смертность в 5 раз выше (Малышев Н.А., Эсауленко Е.В., 2015).
Тем не менее, отсутствуют надежные прогностические лабораторные тесты по исходам беременности, а также неизвестны способы определения риска развития внутриутробной инфекции (ВУИ) плода у беременных, перенесших грипп A(H1N1).
Аналог: Профили функционирования врожденного иммунитета у беременных с хронической фетоплацентарной недостаточностью. Автореферат. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Колесникова Екатерина Викторовна. 14.03.09 - кпиническая иммунология, аллергология. Москва, 2013 г.
Автор предлагает исследование изменений врожденного иммунитета на системном уровне (периферическая кровь), который включает определение содержания натуральных киллеров (NK-клеток) методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител к CD3-CD16-CD-56+("Beckman Coulter", США); оценку фагоцитарной функции нейтрофильных гранулоцитов по числу активных фагоцитов (% ФАН, ФАН абс), их поглотительной и переваривающей способности; исследование оксидазной биоцидности нейтрофильных гранулоцитов в спонтанном и стимулированном NBT-тесте (% ФПК, СЦИ, КМ); иммунофенотипирование нейтрофильных гранулоцитов (НГ) проводят иммунофлюорисцентным методом с использованием моноклональных антител к CD16+, CD11b+, CD95+, CD25+ (ООО «Сорбент», Москва) с учетом результатов на микроскопе «Люмам- 8»; определение концентрации цитокинов - ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-4, ИНФ-гамма, ИНФ-альфа, а также компонентов комплемента С3, 4, 53а, С5а, С1 - ингибитор проводят методом ИФА с использованием тест-систем ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург) на анализаторе «ASCENT» (Финляндия). У новорожденных, рожденных от беременных основных клинических групп, оценивают содержание цитокинов (ИЛ1-бетта, ИЛ-6,8, РАИЛ-1) в периферической крови на 1-2 сутки жизни. Методика статистического анализа включает расчет средней величины с вычислением средней арифметической М, средней ошибки m и вероятности различий р с использованием компьютерной программы SPS Statistics 17,0. Сравнение средних двух выборок производят с помощью критерия Стьюдента. Достоверными считаются различия в 95% (р<0,01). Оценка содержания цитокинов как связующего звена между иммунитетом, гомеостазом, гемопоэзмом, ангиогенезом и резистентностью организма (А.С. Симбирцев, 2004), показала значительное возрастание уровня содержания ИЛ-1 бета, ИЛ-6 и ИЛ-8 у новорожденных от матерей с различными вариантами течения хронической фетоплацентарной недостаточности (хФПН), относительно нормы новорожденных, выраженность которой определялась наличием внутриутробной инфекции (ВУИ) (максимальное возрастание ИЛ-8), СЗРП (максимальное возрастание ИЛ-6). При оценке цитокинового профиля выявляю, что при всех вариантах течения хФПН наблюдается снижение концентрации цитокинов: ИНФ-гамма, ИЛ-4, ИЛ-10, РАИЛ-1 и резкое увеличение содержания ИЛ-8.
Недостатки: данный способ основан на проведении исследования у новорожденных, что не позволяет прогнозировать риск развития ВУИ в период беременности и своевременно корректировать тактику ведения беременности для профилактики последующего ВУИ новорожденного. Способ неспецифичен для вируса гриппа, а касается преимущественно хронической патологии беременных, в связи с этим риск осложнений у матери и ребенка в случае перенесенной острой вирусной инфекции не определяется. Кроме того, данный способ базируется на оценке состояния большого количества иммунологических показателей, что делает его трудоемким и дорогостоящим.
Ближайший аналог: Способ лабораторной диагностики внутриутробной инфекции, патент №2286568, РФ.
Изобретение относится к области медицины и касается способа лабораторной диагностики внутриутробной инфекции (ВУИ), позволяющего прогнозировать развитие данной патологии в течение беременности.
Сущность изобретения заключается в определении в сыворотке крови концентрации интерлейкина 8 (ИЛ-8), интерферонов α.TIF; и γ.TIF; (ИНФ-α.TIF; ИНФ-γ.TIF) методом иммуноферментного анализа. На основании математической обработки полученных результатов исследования методом дискриминантного анализа сформировано правило лабораторной диагностики внутриутробной инфекции у беременных, которое заключается в определении диагностического индекса (D) по формуле:
D=Xl*Kl+X2*K2+X3*K3+X4*K4+const, где значения X соответствуют иммунологическим параметрам:
X1 - интерлейкина 8, пг/мл; Х2 - уровень интерферона γ.TIF; пг/мл; Х3 - количество интерферона α.TIF; пг/мл; Х4 - количество церрулоплазмина, мг/дл; К1=0,05; К2=0,01; К3=0,01; К4=0,03 и const=3,32.
При D<0 делают заключение об отсутствии лабораторных признаков внутриутробной инфекции. При D>0 диагностируют наличие лабораторных признаков развития данной патологии. Предлагаемый способ дает вероятность правильной классификации (специфичность метода) относительно ВУИ вообще - 100,0% для нормы, для патологии (информативность метода) - 81,8,0%
Недостатки: предложенный способ позволяет прогнозировать ВУИ при физиологическом течении беременности, вне связи с развитием острой вирусной инфекции, которой является грипп. Иммунологические показатели, предложенные в данном способе, на фоне острого инфекционного заболевания существенно изменяются и их использование в течение гриппа с прогностической целью становится невозможным. В то время как грипп имеет доказанные особенности в отношении неблагополучного течения и исхода родов, данный способ не позволяет оценить особенности влияния вируса гриппа при беременности. Способ неспецифичен для вируса гриппа A(H1N1).
Задачи:
1. прогнозировать здоровье новорожденных детей у женщин, болеющих во время беременности гриппом A(H1N1);
2. выявить степень риска развития внутриутробной инфекции новорожденных, связанную с перенесенным гриппом A(H1N1) при беременности;
3. снизить летальность, послеродовые осложнения у матери и ребенка;
4. сократить срок пребывания в родильном доме.
Технический результат: предлагаемый способ позволяет обеспечить прогнозирование риска возникновения внутриутробной инфекции плода и выделить среди беременных по степени тяжести группы риска развития ВУИ новорожденных, сократить осложнения, летальность, срок пребывания в стационаре матери и ребенка, на основе вычисления по формуле коэффициента степени риска (КСР) внутриутробной инфекции (ВУИ), основанном на определении концентрации интерлейкина-4 (IL-4) и интерферона-гамма, с учетом срока беременности.
Сущностью изобретения является определение в сыворотке крови беременной концентрации интерлейкина-4 и интерферона-гамма методом иммуноферментного анализа в острый период заболевания гриппом, и по уровню интерлейкина-4 (IL4), интерферона-гамма (IFN-γ) в сыворотке и по числу недель беременности в момент взятия пробы вычисляют по формуле коэффициент степени риска (КСР) внутриутробной инфекции (ВУИ):
КСР=НБ×IFN-γ/IL4, где
НБ - неделя беременности, в момент взятия пробы;
IFN-γ - уровень IFN-γ в сыворотке крови, ед.изм. - OD;
IL4 - уровень IL4 в сыворотке крови, ед.изм. - OD.
При КСР, соответствующем диапазону 0,6-7,0 выявляют низкую степень риска ВУИ, при КСР в диапазоне 7,1-17,3 - среднюю степень риска, а при КСР 17,4 - высокую степень риска развития ВУИ у новорожденного.
Способ апробирован в течение 1 года у беременных, находящихся на стационарном лечении в условиях ГБУЗ «СКИБ» г. Краснодара. При этом исследование проведено на 90 беременных, больных гриппом A(H1N1).
Способ осуществляют следующим образом:
Количественное определение цитокинов (интерлейкина-4, интерферона-гамма) проводят в сыворотке венозной крови беременной, взятой в период разгара заболевания гриппом, утром натощак путем пункции локтевой вены сухой острой короткой иглой с широким просветом (без шприца). Для получения сыворотки кровь оставляют при комнатной температуре на 15 минут, затем тонкой стеклянной палочкой отделяют сгусток от стенок пробирки и центрифугируют 10-15 мин при 3000 об/мин. Сразу после центрифугирования отделяют сыворотку от сгустка. Анализ проводят иммуноферментным методом с помощью наборов «Вектор-Бест». Наборы представляют собой комплекты, основными реагентами которых являются моноклональные антитела к цитокинам, сорбированные на поверхности лунок разборного полистирольного планшета, коньюгаты поликлональных антител с биотипом и калибровочные образцы, содержащие цитокины в известных концентрациях.
На первой стадии анализа исследуемые контрольные образцы сыворотки крови инкубируют в лунках с иммобилизованными антителами. Имеющиеся в образцах цитокины связываются с иммобилизованными антителами. Не связавшийся материал удаляют отмывкой фосфатно-солевым буферным раствором с твином. Связавшиеся молекулы цитокинов взаимодействуют с коньюгатом №1 (антитела с биотином). Несвязавшийся коньюгат №1 удаляют отмывкой. На третьей стадии связавшийся коньюгат №1 взаимодействует при инкубации с коньюгатом №2 (стрептавидин с пероксидазой хрена). После третьей отмывки количество связавшегося коньюгата №2 определяют цветной реакцией с использованием субстрата пероксидазы хрена - перекиси водорода и хромогена - тетраметилбензидина. Реакцию останавливают добавлением раствора стоп-реагента - 0,1 н НCl и измеряют оптическую плотность растворов в лунках при длине волны 492 нм /620 нм. Интенсивность окрашивания раствора в лунке пропорциональна количеству содержащихся в образце цитокинов. Все этапы реакции проходят в термостатируемых условиях на шейкерах-инкубаторах ST-3. Учет реакции, построение калибровочных графиков и определение концентрации цитокинов приводят в фотометре вертикального сканирования ANTHOS 2010 с помощью программного обеспечения ADAP Software, версия 2.0.
Примеры:
1. Беременная Н., 27 лет, находилась на госпитализации в ГБУЗ «СКИБ» с диагнозом - грипп A(H1N1), средней тяжести. Диагноз подтвержден методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Беременность 2 недели. При лабораторном исследовании сыворотки крови были выявлены: уровень интерлейкина-4 - 0,134 OD, уровень интерферона-гамма - 0,038 OD. Коэффициент степени риска (КСР) рассчитанный по формуле: КСР=НБ×IFN-γ/IL4, КСР составил: 0,6. Согласно уровню КСР, больная отнесена к низкой степени риска развития ВУИ. Исход родов: Срочные роды. Ребенок здоров. Отсутствует ВУИ или угроза ВУИ. Новорожденный оценен по шкале Апгар 8 баллов.
2. Беременная И., 26 лет, находилась на госпитализации в ГБУЗ «СКИБ» с диагнозом - грипп A(H1N1), средней тяжести. Диагноз подтвержден методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Беременность 18 недель. При лабораторном исследовании сыворотки крови были выявлены: уровень интерлейкина-4 - 0,15 OD, а уровень интерферона-гамма - 0,058 OD. Коэффициент степени риска (КСР) рассчитанный по формуле: КСР=НБ×IFN-γ/IL4, составил: 7,0. Согласно уровню КСР, больная отнесена к средней степени риска развития ВУИ. Исход родов: Срочные роды. Отсутствие ВУИ или угрозы ВУИ. Новорожденный оценен по шкале Апгар 9 баллов.
3. Пациентка М., 28 лет, находилась на госпитализации в ГБУЗ «СКИБ» с диагнозом - грипп A(H1N1), средней тяжести. Диагноз гриппа подтвержден методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Беременность 17 недель. При лабораторном исследовании сыворотки крови были выявлены: уровень интерлейкина-4 - 0,107 OD, а уровень интерферона-гамма - 0,045 OD. Коэффициент степени риска (КСР) рассчитан по формуле: КСР=НБ×IFN-γ/IL4, КСР составил: 7,1. Согласно уровню КСР, больная отнесена к средней степени риска развития ВУИ. Исход родов: Срочные роды. ВУИ, острая интранатальная асфиксия. Новорожденный оценен по шкале Апгар 7 баллов.
4. Пациентка Л., 31 год, находилась на госпитализации в ГБУЗ «СКИБ» с диагнозом - грипп A(H1N1), средней тяжести. Диагноз гриппа подтвержден методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Беременность 35 недель. При лабораторном исследовании сыворотки крови были выявлены: уровень интерлейкина-4 - 0,073 OD, а уровень интерферона-гамма - 0,036 OD. Коэффициент степени риска (КСР) рассчитан по формуле: КСР=НБ×IFN-γ / IL4, КСР составил: 17,3. Согласно уровню КСР, больная отнесена к средней степени риска развития ВУИ. Исход родов: Срочные роды. Отсутствие ВУИ или угрозы ВУИ. Новорожденный оценен по шкале Апгар 7 баллов.
5. Беременная Д., 32 года, находилась на госпитализации в ГБУЗ «СКИБ» с диагнозом - грипп A(H1N1), средней тяжести. Диагноз гриппа подтвержден методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Сопутствующий диагноз: анемия беременных. Беременность 36 недель. При лабораторном исследовании сыворотки крови были выявлены: уровень интерлейкина-4 - 0,095 OD, а уровень интерферона-гамма 0.046 OD. Коэффициент степени риска (КСР) рассчитан по формуле: КСР=НБ×IFN-γ/IL4, КСР составил: 17,4. Согласно уровню КСР, больная отнесена к высокой степени риска развития ВУИ. Исход родов: Срочные роды. ВУИ. Асфиксия при рождении. Внутриутробная гипотрофия 2. Группа риска ВУИ. Новорожденный оценен по шкале Апгар 7 баллов.
6. Беременная И., 31 год, находилась на госпитализации в ГБУЗ «СКИБ» с диагнозом - грипп A(HINI), средней тяжести. Диагноз гриппа подтвержден методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Сопутствующий диагноз: анемия беременных. Беременность 38 недель. При лабораторном исследовании сыворотки крови были выявлены: уровень интерлейкина-4 - 0,119 OD, а уровень интерферона-гамма - 0,082 OD. Коэффициент степени риска (КСР) рассчитан по формуле: КСР=НБ×IFN-γ/IL4, КСР составил: 26,2. Согласно уровню КСР, больная отнесена к высокой степени риска развития ВУИ. Исход родов: Группа риска по ВУИ. Интранатальная асфиксия. Новорожденный оценен по шкале Апгар 7 баллов.