ЖИДКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ НАКОПЛЕНИЯ ВЫСОКОАКТИВНЫХ МЕТАБОЛИТОВ ШТАММОМ BACILLUS PUMILUS "ПАШКОВ", ОБЛАДАЮЩИХ ИНГИБИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ В ОТНОШЕНИИ БАКТЕРИЙ, ГРИБОВ И ВИРУСОВ
FLUID NUTRIENT MEDIUM FOR HIGH-ACTIVITY METABOLITE COLLECTION BY BACILLUS PUMILUS 'PASHKOV' STRAIN SHOWING INHIBITORY ACTION ON BACTERIA, FUNGI AND VIRUSES

Изобретение относится к области микробиологии, в частности к питательным средам для получения высокоактивных метаболитов, обладающих бактерицидным действием в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий, фунгистатическим действием в отношении дрожжевых грибов и противовирусным действием в отношении энтеровирусов.
Известна синтетическая питательная среда №9, используемая в производстве споровых пробиотиков, содержащая железо (II) сернокислое 7-водное; магний сернокислый 7-водный; хлористый марганец; кальций хлористый; пептон сухой ферментативный для бактериологических целей - 5,0; глюкоза - 10,0; дрожжевой экстракт - 3,0 (ФСП 4205042435-05).
К недостаткам данной питательной среды следует отнести недостаточное влияние на выработку БАВ В.pumilus «Пашков», обладающих ингибирующими свойствами в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий.
Известна синтетическая питательная среда №5, так же применяемая при производстве споровых пробиотиков, содержащая калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный; аммоний сернокислый двузамещенный; натрий лимоннокислый 5,5-водный; медь сернокислая 5-водная - 0,005; цинк сернокислый 7-водный; железо (II) сернокислое 7-водное; кальций хлористый; марганец (II) сернокислый 5-водный; магний сернокислый 7-водный; пептон сухой ферментативный для бактериологических целей (ФСП 4205042435-05).
К недостаткам данной питательной среды следует отнести слабое влияние на выработку БАВ В.pumilus «Пашков», обладающих ингибирующими свойствами в отношении условно-патогенных и патогенных бактерий.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является разработка новой жидкой питательной среды для культивирования штамма Bacillus pumilus «Пашков» с целью получения высокоактивных метаболитов, обладающих бактерицидным действием, а также ингибирующих другие микробы.
2
4
2
4
2
2
Для решения указанной задачи разработана питательная среда для выращивания штамма Bacillus pumilus «Пашков», содержащая при рН 7,3±0,2 железо (II) сернокислое 7-водное, магний сернокислый 7-водный, хлористый марганец, кальций хлористый, калий фосфорно-кислый однозамещенный 3-водный (KHPO·3HO), цитрат аммония (NHOOCC(OH)(CHCOOH)), триптон, дрожжевой экстракт, лактозу и глицерин при следующем содержании указанных компонентов на 1 литр дистиллированной воды:
железо (II) сернокислое 7-водное - 0,01 г
магний сернокислый 7-водный - 0,1 г
хлористый марганец - 0,01 г
кальций хлористый - 0,08 г
калий фосфорно-кислый однозамещенный 3-водный - 0,3 г
цитрат аммония - 2,0 г
триптон - 5 г
дрожжевой экстракт - 7,0 г
лактоза - 10 г
глицерин - 40 мл.
Питательную среду готовят следующим образом.
2
4
2
4
2
2
Пример 1. Для приготовления заявленной жидкой питательной среды берут 1 литр дистиллированной воды. Последовательно вносят соли: железо (II) сернокислое 7-водное - 0,01 г; магний сернокислый 7-водный - 0,1 г; хлористый марганец - 0,01 г; кальций хлористый - 0,08 г; калий фосфорнокислый однозамещенный 3-водный (KHPO·3HO) - 0,3 г; цитрат аммония (NHOOCC(OH)(CHCOOH)) - 2,0 г/л. Каждую соль размешивают до полного растворения. Затем добавляют триптон - 5 г/л, лактозу 10 г/л, дрожжевой экстракт - 7 г/л и глицерин - 40 мл. Доводят рН среды до 7,3±0,2. После приготовления среду стерилизуют при 1 атм (121°С) 20 мин.
Готовая жидкая среда темно-желтого цвета, не содержит посторонних включений, рН среды до 7,3±0,2.
Пример 2. Влияние новой жидкой питательной среды на выработку БАВ, обладающих ингибирующими свойствами в отношении бактерий и дрожжевых грибов.
Штамм В.pumilus «Пашков» выращивали методом периодического культивирования в течение 72 часов. О наличии биологически-активных веществ (БАВ) в культуральной жидкости В.pumilus «Пашков» судили по их влиянию на кинетику роста тест-культур с помощью микробиологического анализатора с планшетным фотометром «BIOSCREEN/iEMS-reader MF» (фирма «LabMetod», Финляндия). Задержка вступления тест-штаммов или дрожжевых грибов в стадию экспоненциального роста свидетельствовала о бактериостатическом (фунгистатическом) эффекте БАВ, а отсутствие роста более 18 часов оценивалось как бактерицидный (фунгицидный) эффект (табл.1, 2, 3).
Таблица 1
Показатели ингибирующего эффекта БАВ, синтезируемых при культивировании В.pumilus «Пашков» в отношении тест-штаммов условно-патогенных и патогенных бактерий
Тест-штаммы
Бактериостатический эффект (%)
S.aureus «Никифоров»
100
S.aureus «Филиппов»
100
S.xylosus 25
100
S.flexneri 337
100
S.sonnei 170
100
E.coli O157:H55
100
P.aeruginosa 9022
100
P.mirabilis 24a
100
P.vulgaris 177
100
* - задержка роста более 18 часов (бактерицидныйэффект).
Таблица 2
Характеристика ингибирующего эффекта БАВ, синтезируемых при культивировании В. pumilus «Пашков» в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa
№
Название штамма
БСЭ (%)
№
Название штамма
БСЭ (%)
1
170001
100*
22
170022
100*
2
170002
100*
23
170023
100*
3
170003
100*
24
170025 (Habs1)
100*
4
170004
100*
25
170026 (Habs2)
100*
5
170005
100*
26
170027 (Habs3)
100*
6
170006
100*
27
170028 (Habs4)
100*
7
170007
100*
28
170029 (Habs5)
100*
8
170008
100*
29
170030 (Habs6)
100*
9
170009
100*
30
170031 (Habs7)
100*
10
170010
100*
31
170032 (Habs8)
100*
11
170011
100*
32
170033 (Habs9)
100*
12
170012
100*
33
170034 (Habs10)
100*
13
170013
100*
34
170035 (Habs1)
100*
14
170014
100*
35
170036 (Habs12)
100*
15
170015
100*
36
170041 (Fisher1)
100*
16
170016
100*
37
170042 (Fisher2)
100*
17
170017
100*
38
170043 (Fisher3)
100*
18
170018
100*
39
170044 (Fisher4)
100*
19
170019
100*
40
170045 (Fisher5)
100*
20
170020
100*
41
170046 (Fisher6)
100*
21
170021
100*
42
170047 (Fisher7)
100*
* - задержка роста более 18 часов (бактерицидный эффект)
Таблица 3
Показатели активности БАВ, выделяемых при культивировании штамма В. pumilus «Пашков» в отношении клинических штаммов дрожжевых грибов
Название штамма дрожжевых грибов
Задержка роста грибов (фунгистатический эффект %)
C.albicans (№1)
94,6±8,4
C.albicans (№2)
92,2±7,4
C.haemuloni
91,7±6,6
C.tropicalis
89,5±8,1
Rhodotomla spp.
88,4±9,2
Debaryomyces hansenii
92,6±8,6
Таблицы 1, 2, 3 показывают, что БАВ, выделяемые при культивировании штамма В.pumilus «Пашков» на разработанной питательной среде, обладают бактерицидным действием в отношении 9 тест-штаммов бактерий, 42 клинических штаммов Р.aeruginosa и выраженным фунгистатическим эффектом в отношении 6 клинических штаммов дрожжевых грибов.
Пример 3. Влияние новой жидкой питательной среды на выработку БАВ, обладающих ингибирующими свойствами в отношении энтеровирусов.
Противовирусную активность культуральной жидкости определяли по лечебной и профилактической схемам воздействия в отношении вирусов полиомиелита I типа, ECHO 3, ECHO 6 и Коксаки В.
Лечебная схема.
50/0,5 мл
50/0,5 мл
2
На монослой клеток, выращенных в 24-луночных планшетах, после удаления ростовой среды и однократного промывания ФСБ вносили различные дозы энтеровирусов - от 100 ТЦДдо 12,5 ТЦД с последующей инкубацией в термостате с 5% СO при 37°С в течение часа. После удаления неадсорбировавшегося вируса монослой клеток дважды промывали ФСБ и вносили различные разведения КЖ В.pumilus «Пашков» от неразведенной до 1:640 в поддерживающей среде. Учет результатов проводили через 48 и 72 часа инкубации.
Профилактическая схема.
2
50/0,5 мл
50/0,5 мл
На монослой клеток, выращенных в 24-луночных планшетах, после удаления ростовой среды и однократного промывания ФСБ вносили различные разведения КЖ В.pumilus «Пашков» от неразведенной до 1:640 в поддерживающей среде с последующей инкубацией в термостате с 5% СO при 37°С в течение 24 часов. Затем КЖ удаляли, вносили различные дозы вируса от 100 ТЦД до 12,5 ТЦД и помещали в инкубатор на 1 ч при 37°С. Затем клетки дважды промывали ФСБ, вносили поддерживающую среду и продолжали инкубировать в течение 72 часов.
50
Противовирусную активность в обеих схемах оценивали по цитопатогенному действию вируса (ЦПД). Разведение КЖ, вызывающее ингибирование вирусного ЦПД на 50% по отношению к контролю, принимали за ингибирующую дозу (ИД) (табл.4, 5).
Таблица 4
Эффективность лечебного действия КЖ штамма B. pumilus «Пашков» в отношении энтеровирусов в зависимости от разведения препарата и дозы вирусов в опытах in vitro
Вирусы
Время наблюдения (час)
Разведение препарата, обеспечивающее 100% защитный эффект
Доза вируса в log ТЦД<sub>50/0,5 мл</sub>
100
50
25
12,5
Polio-1
48
1:80
1:160
1:640
1:640
72
1:80
1:80
1:640
1:640
ЕСНО 3
48
1:40
1:40
1:640
1:640
72
1:40
1:40
1:160
1:320
ECHO 6
48
1:40
1:640
1:640
1:640
72
1:40
1:160
1:160
1:640
Сох В (1-6)
48
1:80
1:80
1:40
1:40
72
1:80
1:80
1:40
1:40
50/0,5 мл
50/0,5 мл
Из результатов, представленных в табл.4, следует, что лечебный эффект КЖ B.pumilus «Пашков» в отношении вируса полиомиелита типа I четко зависит от дозы вируса. При дозах вируса 12,5-25,0 lg ТЦД 100% защита инфицированных клеток после обработки КЖ проявлялась при максимально исследованном разведении 1:640 и сохранялась в течение 72 ч. При заражении культуры клеток высокими дозами вируса 50-100 ТЦД полная защита клеток наступала при обработке КЖ в разведениях 1:160-1:80 соответственно, а частичная защита сохранялась при разведениях препарата 1:320-1:160 соответственно в течение 48 часов наблюдения.
Полученные результаты свидетельствуют, что наиболее эффективное лечебное действие КЖ проявлялось в отношении вируса полиомиелита I типа и ECHO 6 и менее в отношении вируса Коксаки В (1-6).
Таблица 5
Эффективность профилактического действия КЖ в отношении энтеровирусов в зависимости от разведения препарата и дозы вирусов в опытах in vitro
Вирусы
Время учета (час)
Разведение препарата, обеспечивающее 100% профилактический эффект
Доза вируса в log ТЦД<sub>50/0,5 мл</sub>
100
50
25
12,5
Polio-1
48
1:40
1:160
1:160
1:640
72
1:40
1:160
1:160
1:640
ЕСНО 3
48
0
1:160
1:640
1:640
72
0
1:160
1:640
1:640
ECHO 6
48
0
1:20
1:640
1:640
72
0
1:20
1:640
1:640
Сох В (1-6)
48
0
1:20
1:640
1:640
72
0
1:20
1:320
1:640
Результаты, представленные в табл.5, показывают профилактический эффект КЖ В.pumilus «Пашков», зависящий от дозы вируса, концентрации препарата, вида вируса и наиболее выраженный в отношении вируса полиомиелита I типа.
2
4
2
4
2
2
Пример 4. Исходные данные состава среды (г/л) рН 7,3±0,2: железо (II) сернокислое 7-водное - 0,01 г/л; магний сернокислый 7-водный - 0,1 г/л; хлористый марганец - 0,01 г/л; кальций хлористый - 0,08 г/л; калий фосфорно-кислый однозамещенный 3-водный (KHPO·3HO) - 0,3 г/л; цитрат аммония (NHOOCC(OH)(CHCOOH)) - 2,0 г/л; триптон - 5 г/л; дрожжевой экстракт - 7,0 г/л; лактоза - 10 г/л; глицерин - 40 мл/л.