МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ MELK И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST MELK AND ITS USE

Область техники
Настоящее изобретение относится к моноклональным антителам против MELK, способам диагностирования MELK-ассоциированных заболеваний с использованием указанных антител, способам обнаружения белка MELK, способам определения эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK, способам скрининга субъектов, у которых ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект и диагностическим реагентам, содержащим указанные антитела.
Уровень техники
MELK, а именно материнская эмбриональная киназа с лейциновой молнией (эталонная последовательность: NO: доступа GenBank: NM_014791.3; SEQ ID NO: 21), идентифицировали некоторое время назад в качестве нового члена семейства серин-треониновых киназ snf1/AMPK, который вовлечен в эмбриональное развитие млекопитающих (Heyer BS et al., Dev Dyn. 1999 Aug, 215(4): 344-51 (NPL 1). Показано, что этот ген играет важную роль в регенерации стволовых клеток (Nakano I et al., J Cell Biol. 2005 Aug 1, 170(3): 413-27 (NPL 2)), прохождении клеточного цикла (Blot J et al., Dev Biol. 2002 Jan 15, 241(2): 327-38 (NPL 3); Seong HA et al., Biochem J. 2002 Feb 1, 361(Pt 3): 597-604 (NPL 4)) и сплайсинге предшественника мРНК (Vulsteke V et al., J Biol Chem. 2004 Mar 5, 279(10): 8642-7. Epub 2003 Dec 29 (NPL 5)).
Кроме того, определение профиля генной экспрессии с использованием кДНК микрочипов для всего генома, содержащего 23040 генов, показало, что MELK подвержен повышающей регуляции в злокачественной опухоли молочной железы (Lin ML et al., Breast Cancer Res. 2007, 9 (1): R17 (NPL 6); WO 2006/016525 (PTL 1); и WO 2008/023841 (PTL 2)). Фактически, MELK подвержен повышающей регуляции в клетках нескольких злокачественных опухолей, например, в клетках злокачественной опухоли легких, клетках злокачественной опухоли мочевого пузыря, клетках лимфомы, клетках злокачественной опухоли шейки матки и т. п. (см. WO 2004/031413 (PTL 3); WO 2007/013665 (PTL 4); и WO 2006/085684 (PTL 5)). Анализ нозерн-блоттинга нескольких тканей и линий клеток злокачественных опухолей человека подтвердил, что, несмотря на то, что MELK сверхэкспрессирован на значительно повышенном уровне в большинстве злокачественных опухолей молочной железы и линий клеток злокачественных опухолей молочной железы, он не экспрессирован в нормальных жизненно важных органах (сердце, печень, легкое и почка) (WO 2006/016525 (PTL 1)). Кроме того, показано, что супрессия экспрессии MELK посредством миРНК ведет к значительному ингибированию пролиферации клеток злокачественной опухоли молочной железы человека (PTL 1) и что низкомолекулярный ингибитор против MELK уменьшает размер ксенотрансплантата злокачественной опухоли молочной железы мыши (Chung S et al., Oncotarget. 2012 Dec, 3(12): 1629-1640 (NPL 7); Chung S et al., Oncotarget. 2016 Feb 24, 7(14): 18171-18182 (NPL 8)).
Следовательно, MELK полагают подходящей мишенью для средства против злокачественной опухоли, и можно предсказывать, что моноклональное антитело против MELK будет полезно в качестве диагностического средства при терапии. В дополнение к примерам успешного клинического применения моноклональных антител, таких как диагностическое средство трастузумаб, диагностическое средство ритуксимаб и диагностическое средство бевацизумаб, против злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной лимфомы и злокачественной опухоли ободочной кишки, идет разработка нескольких моноклональных антител против других молекулярных мишеней, и оценка их диагностических эффектов. С точки зрения эффективного выбора пациента для терапевтических средств, эти диагностические средства предположительно ведут к более эффективным способам лечения.
Список цитируемой литературы
[Патентная литература]
[PTL 1] WO 2006/016525
[PTL 2] WO 2008/023841
[PTL 3] WO 2004/031413
[PTL 4] WO 2007/013665
[PTL 5] WO 2006/085684
[Непатентная литература]
[NPL 1] Heyer BS et al., Dev Dyn. 1999 Aug, 215(4): 344-51
[NPL 2] Nakano I et al., J Cell Biol. 2005 Aug 1, 170(3): 413-27
[NPL 3] Blot J et al., Dev Biol. 2002 Jan 15, 241(2): 327-38
[NPL 4] Seong HA et al., Biochem J. 2002 Feb 1, 361(Pt 3): 597-604
[NPL 5] Vulsteke V et al., J Biol Chem. 2004 Mar 5, 279(10): 8642-7. Epub 2003 Dec 29
[NPL 6] Lin ML et al., Breast Cancer Res. 2007, 9(1): R17
[NPL 7] Chung S et al., Oncotarget. 2012 Dec, 3(12): 1629-1640
[NPL 8] Chung S et al., Oncotarget. 2016 Feb 24, 7(14): 18171-18182
Описание изобретения
[Проблемы, решаемые с помощью изобретения]
Для диагностических средств при лечении опухоли важно использовать лекарственные средства, направленные на молекулярные мишени, чтобы обнаруживать клеточные белки, которые сверхэкспрессированы в большинстве частей целевой опухоли и не экспрессированы или экспрессированы только в минимальной степени в нормальных тканях. Однако трудно обнаруживать белки, экспрессированные в опухолях, специфически и с высокой чувствительностью, а также сложно получать антитела против таких белков. Например, в отношении MELK, который считают мишенью для средств против злокачественной опухоли, на рынке существует несколько антител. Однако когда авторы настоящего изобретения окрашивали MELK-экспрессирующие клетки с использованием коммерчески доступных антител, которые они получали, положительный сигнал (ложный положительный) иногда наблюдали в клетках, в которых уровень экспрессии MELK был низким. Такие антитела, имеющие недостаточную иммунологическую специфичность, вызывают беспокойство, будучи неспособными четко обнаруживать различия в уровнях экспрессии MELK с использованием силы реакции антитела в качестве индикатора. Следовательно, проблема, решаемая с помощью настоящего изобретения, состоит в том, чтобы предоставить антитела, которые связываются с MELK специфически и с высокой чувствительностью.
[Средство решения проблем]
Авторы настоящего изобретения искали антитело, которое специфически связывается с MELK среди моноклональных антител, получаемых путем иммунизации мышей антигеном MELK, и добились успеха, идентифицировав клон, который может специфически связываться с белком MELK, принудительно экспрессируемым на клетках, и может специфически обнаруживать эндогенный белок MELK, экспрессируемый в клетках и тканях, с хорошей чувствительностью.
В частности, настоящее изобретение относится к следующему:
[1] антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые могут связываться с белком MELK или его частичным пептидом, и которые содержат одну или обе из:
вариабельную область тяжелой цепи, содержащую:
CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1;
CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и
CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, и
вариабельную область легкой цепи, содержащую:
CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;
CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и
CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;
[2] антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по [1], которые содержат одну или обе из вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и вариабельной области легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8;
[3] антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по [1] или [2], которые специфически распознают полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9;
[4] антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые конкурируют с антителом по любому из [1]-[3] за специфическое связывание с MELK;
[5] антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из [1]-[4], которые конъюгируют с аффинной меткой, ферментативной меткой, радиоизотопной меткой или флуоресцентной меткой;
[6] полинуклеотид, кодирующий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из [1]-[5];
[7] реагент, содержащий антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из [1]-[5], где реагент предназначен для диагностирования MELK-ассоциированного заболевания, для определения эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK или для скрининга субъекта, у которого ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект;
[8] способ диагностирования MELK-ассоциированного заболевания или предрасположенности к развитию указанного заболевания у субъекта, включающий стадии:
(a) контакта образца, выделенного у указанного субъекта, с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из [1]-[5];
(b) обнаружения белка MELK в указанном образце посредством обнаружения связывания указанного образца с указанным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом; и
(c) сравнения уровня белка MELK в указанном образце с контролем, где это указывает на то, что указанный субъект страдает от или имеет риск развития указанного заболевания, когда уровень белка MELK высок по сравнению с контролем;
[9] реагент по [7] или способ по [8], где указанное MELK-ассоциированное заболевание представляет собой злокачественную опухоль, при которой экспрессирован MELK, или эндометриоз;
[10] реагент или способ по [9], где указанную злокачественную опухоль выбирают из группы, состоящей из злокачественной опухоли молочной железы, злокачественной опухоли мочевого пузыря, злокачественной опухоли шейки матки, холангиоцеллюлярной злокачественной опухоли, хронического миелоцитарного лейкоза (CML), злокачественной опухоли толстой кишки, злокачественной опухоли пищевода, злокачественной опухоли желудка, злокачественной опухоли печени, немелкоклеточной злокачественной опухоли легких (NSCLC), лимфомы, остеосаркомы, злокачественной опухоли яичников, злокачественной опухоли поджелудочной железы, злокачественной опухоли предстательной железы, злокачественной опухоли почки и мелкоклеточной злокачественной опухоли легких (SCLC);
[11] способ обнаружения белка MELK в образце, включающий стадии:
(a) контакта образца, выделенного у субъекта, с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из [1]-[5]; и
(b) обнаружения белка MELK в указанном образце посредством обнаружения связывания указанного образца с указанным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом;
[12] способ определения эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK у субъекта, включающий стадии:
(a) контакта образца, выделенного у субъекта, с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из [1]-[5];
(b) обнаружения белка MELK в указанном образце посредством обнаружения связывания указанного образца с указанным антителом или его антигенсвязывающим фрагментом; и
(c) сравнения уровня белка MELK в указанном образце с уровнем экспрессии перед введением лекарственного средства, в котором, когда указанный уровень белка MELK низок по сравнению с перед введением лекарственного средства, это указывает на то, что имел место эффект лекарственного средства у указанного субъекта;
[13] способ скрининга субъекта, у которого ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект, включающий стадии:
(a) контакта образца, выделенного у указанного субъекта, с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из [1]-[5];
(b) обнаружения белка MELK в указанном образце посредством обнаружения связывания указанного образца с указанным антителом или антигенсвязывающим фрагментом; и
(c) сравнения уровня белка MELK в указанном образце с контролем, в котором, когда уровень белка MELK сравним с контролем или выше него, это указывает на то, что терапевтический эффект с использованием ингибитора MELK высок у указанного субъекта;
[14] способ по любому из [8]-[13], в котором указанный образец представляет собой клетку или ткань, выделенную у указанного субъекта; и
[15] способ получения антитела, который может связываться с белком MELK или с его частичным пептидом, включающий стадии:
(a) культивирования клетки, содержащей вектор со вставленным полинуклеотидом по [6]; и
(b) извлечения указанного антитела из клеточной культуры или среды для культивирования.
Настоящее изобретение дополнительно относится к:
[16] способ обнаружения маркера для диагностирования MELK-ассоциированного заболевания или предрасположенности к развитию указанного заболевания, включающий стадии:
(a) контакта образца, выделенного у субъекта, с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из [1]-[5]; и
(b) обнаружение белка MELK в указанном образце в качестве указанного маркера посредством обнаружения связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с указанным образцом;
[17] антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из [1]-[5] для использования в диагностировании MELK-ассоциированного заболевания или предрасположенности к развитию указанного заболевания;
[18] использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из [1]-[5] при изготовлении реагента для диагностирования MELK-ассоциированного заболевания или предрасположенности к развитию указанного заболевания;
[19] способ обнаружения маркера эффекта лекарственного средства для ингибитора MELK, включающий стадии:
(a) контакта образца, выделенного у субъекта, с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из [1]-[5]; и
(b) обнаружения белка MELK в указанном образце в качестве указанного маркера посредством обнаружения связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с указанным образцом;
[20] антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из [1]-[5] для использования при определении эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK;
[21] использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из [1]-[5] при изготовлении реагента для определения эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK;
[22] способ обнаружения маркера восприимчивости к лечению ингибитором MELK, включающий стадии:
(a) контакта образца, выделенного у субъекта, с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по любому из [1]-[5]; и
(b) обнаружения белка MELK в указанном образце в качестве указанного маркера посредством обнаружения связывания указанного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с указанным образцом;
[23] антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из [1]-[5] для использования в скрининге субъекта, у которого ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект; и
[24] использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из [1]-[5] при изготовлении реагента для скрининга субъекта, у которого ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект.
В дополнение к вышеуказанному, другие цели и признаки настоящего изобретения будут более полно видны после прочтения следующего подробного описания в сочетании с сопроводительными фиг. и примерами. Однако следует понимать, что и вышеуказанное краткое изложение настоящего изобретения и следующее подробное описание относятся к образцовым вариантам осуществления и не ограничивают настоящее изобретение или другие альтернативные варианты осуществления настоящего изобретения. В частности, хотя настоящее изобретение описано в настоящем описании со ссылкой на множество конкретных вариантов осуществления, следует принимать во внимание, что описание является иллюстративным для настоящего изобретения и не составлено в качестве ограничения настоящего изобретения. Различные модификации и применения могут прийти на ум специалистам в данной области, не отступая от сущности и объема настоящего изобретения, как описано с помощью приложенной формулы изобретения. Аналогичным образом, другие цели, признаки, эффекты и преимущества настоящего изобретения будут видны из этого краткого изложения и определенных вариантов осуществления, описанных далее, и будут легче видны специалистам в данной области. Такие цели, признаки, эффекты и преимущества будут видны из вышеприведенного в сочетании с сопроводительными примерами, данными, фиг. и всеми обоснованными выводами, которые можно сделать из них, отдельно или с учетом источников, включенных в настоящее описание.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена микрофотография, показывающая специфичность антитела против MELK (OTSMAb01) при иммуногистохимическом окрашивании с использованием клеточной линии для принудительно экспрессирующей системы. В результате иммуногистохимического окрашивания с использованием антитела против MELK (OTSMAb01), специфическое окрашивание наблюдали в парафиновом срезе, полученном из принудительно экспрессирующей MELK клеточной линии (MELK/293T), но окрашивание не наблюдали в клеточной линии со введенным пустым вектором (Mock/293T), который использовали в качестве отрицательного контроля. С другой стороны, даже с использованием коммерчески доступных антител (MELK(N449)pAb (Bioworld Technology) и MELK(HPA017214)pAb (Sigma-Aldrich)), иммуногистохимическое окрашивание показывало, что, несмотря на то, что специфическое окрашивание наблюдали в MELK/293T, в Mock окрашивание отсутствовало. Кроме того, график под изображениями представляет собой график, на котором нанесены вычисления доли (%)MELK-положительных клеток среди определенного числа клеток с принудительной экспрессией, как видели по результатам иммуногистохимического окрашивания.
На фиг. 2A: фиг. 2A и 2B представляют собой изображения, показывающие результат вестерн-блоттинга с использованием OTSMAb01, который показывает экспрессию MELK в клеточных линиях различных типов с различными уровнями экспрессии MELK. PK-45P, BT-549, MDA-MB-231 и A549 представляют собой клеточные линии с высокой экспрессией MELK, а MCF-7, Hep G2 и HT-29 представляют собой клеточные линии с низкой экспрессией MELK.
На фиг. 2B представлено продолжение фиг. 2A.
На фиг. 3A: фиг. 3A и 3B представляют собой микрофотографии, показывающие специфичность антитела против MELK (OTSMAb01) при иммуногистохимическом окрашивании с использованием MELK-экспрессирующих клеточных линий. В верхней части представлены результаты иммуногистохимического окрашивания антителом против MELK по настоящему изобретению (OTSMAb01), где окрашивание обнаруживали в парафиновых срезах, полученных из клеточных линий с высокой экспрессией MELK, таких как PK-45P, BT-549, MDA-MB-231 и A549, тогда как едва ли находили какое-либо окрашивание в клеточных линиях с низкой экспрессией MELK, таких как MCF-7, Hep G2 и HT-29. С другой стороны, в средней части и нижней части, где представлены результаты окрашивания коммерчески доступными антителами (MELK(N449)pAb и MELK(HPA017214)pAb), окрашивание наблюдали как в клеточных линиях с высокой экспрессией MELK, так и в клеточных линиях с низкой экспрессией MELK. Анализ с использованием клеточных линий показывал, что, по сравнению с коммерчески доступными антителами, антитело против MELK по настоящему изобретению (OTSMAb01) имело высокую специфичность при иммуногистохимическом окрашивании. Кроме того, графики под изображениями представляют собой графики, на которые нанесены вычисления доли (%)MELK-положительных клеток в каждой из клеточных линий, как показывали результаты иммуногистохимического окрашивания.
На фиг. 3B представлено продолжение для фиг. 3A.
На фиг. 4 представлена корреляция между экспрессией в клинических образцах злокачественной опухоли молочной железы с 1 до 3 при иммуногистохимическом окрашивании и полуколичественной RT-ПЦР. A: MELK-положительную находку наблюдали для всех образцов злокачественной опухоли молочной железы посредством иммуногистохимического окрашивания с использованием антитела против MELK по настоящему изобретению (OTSMAb01). С другой стороны, образцы нормальной груди едва ли были окрашены. B: по результатам иммуногистохимического окрашивания вычисляли долю числа MELK-положительных клеток среди опухолевых клеток и строили график. C: Результаты, полученные с использованием анализа экспрессии посредством RT-ПЦР для тех же клинических случаев, коррелировали с иммуногистохимическим окрашиванием. Анализ с использованием клинических образцов выявлял высокую специфичность антитела против MELK по настоящему изобретению (OTSMAb01) при иммуногистохимическом окрашивании.
[Вариант осуществления изобретения]
Подробное описание
Несмотря на то, что любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем описании, можно использовать при практической реализации или тестировании вариантов осуществления настоящего изобретения, предпочтительные способы, устройства и материалы описаны далее. Однако прежде, чем описать представленные материалы и способы, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными размерами, геометрическими формами, измерениями, материалами, способами, протоколами и т. д., описанными в настоящем описании, поскольку они могут варьировать в соответствии со стандартными экспериментами и оптимизацией. Также следует понимать, что терминология, используемая в описании, служит лишь цели описания конкретных версий или вариантов осуществления и не предназначена для того, чтобы ограничивать объем настоящего изобретения, который ограничен только приложенной формулой изобретения.
Настоящее изобретение предусматривает моноклональные антитела против MELK, которые могут специфически связываться с белком MELK или его частичными пептидами. Настоящее изобретение предоставляет доказательство того, что моноклональные антитела против MELK по настоящему изобретению имеют высокую специфичность при обнаружении белка MELK посредством иммуногистохимического окрашивания.
Моноклональное антитело против MELK по настоящему изобретению (OTSMAb01) по меньшей мере имеет следующие аминокислотные последовательности в вариабельных областях:
OTSMAb01, аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (исключая сигнальную последовательность):
EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGNTIYDPKFQGKASVTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTSHHYSAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 7)
OTSMAb01, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (исключая сигнальную последовательность):
DVVMTQTPLSLPVSLRDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLIISRVEAEDLGVYFCSQSTYVPLTFGAGTKLELKRAD (SEQ ID NO: 8)
Антитела по настоящему изобретению также можно получать посредством рекомбинантных способов с использованием ДНК, кодирующей вышеуказанные аминокислотные последовательности.
Антитела по настоящему изобретению получали из нескольких антителопродуцирующих гибридом, которые получали посредством иммунизации мышей и проведения скрининга и отбора антител, которые обладают способностью связываться с MELK, и которые показаны как положительные в принудительно экспрессирующих клетках (положительные контрольные клетки) и как отрицательные в отрицательных контрольных клетках с помощью способа иммуноокрашивания. Среди отобранных антител, выбирали антитело, которое показано как положительное в эндогенных MELK-экспрессирующих клетках (положительные контрольные клетки) и дополнительно как отрицательное в отрицательных контрольных клетках. Когда взаимодействие с MELK не так сильно, антитела со слабой способностью к связыванию будут активны, приблизительно как и фон. Следовательно, посредством проведения иммуноокрашивания с использованием клеточных линий, у которых предварительно определяли количество эндогенной экспрессии MELK, и последующего проведения скрининга возможно выбирать антитело, которое обладает сильной способностью к связыванию с мишенью MELK.
Антитела по настоящему изобретению специфически связываются с MELK. Следовательно, антитела по настоящему изобретению можно использовать в качестве инструмента для обнаружения MELK или клеток или тканей, в которых экспрессирован MELK. Кроме того, антитела по настоящему изобретению можно использовать в качестве меченого тела, конъюгированного с меткой, которая позволяет обнаруживать антитело, и указанное меченое тело является более предпочтительным, например, при обнаружении клеток злокачественной опухоли и тканей злокачественной опухоли, которые экспрессируют MELK, например, злокачественной опухоли ободочной кишки. В качестве меток, которые конъюгируют с антителом по настоящему изобретению, достаточно того, чтобы метка позволяла обнаруживать антитело, связанное с MELK, и метки включают аффинные метки (например, биотин, авидин и подобные), ферментативные метки (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и подобные), флуоресцентные метки (например, FITC, родамин и подобные) и т. д.
При использовании антитела по настоящему изобретению в качестве диагностического средства для выбора пациентов для лечения злокачественных опухолей, антитело по настоящему изобретению можно использовать как оно есть, или его можно превращать в композицию, подходящую для различных типов использования.
I. Определения
Форму единственного числа, как используют в настоящем описании, подразумевают «по меньшей мере один», пока иное не указано конкретно.
Термины «выделенный» и «очищенный», используемые в отношении вещества (например, пептида, антитела, полинуклеотида или подобного), указывают, что вещество по существу не содержит по меньшей мере одно вещество, которое, кроме него, может содержаться в природном источнике. Таким образом, выделенное или очищенное антитело относится к антителу, которое по существу не содержит другой клеточный материал, например, углевод, липид и другие контаминирующие белки из клеточного или тканевого источника, из которого извлекают антитело. В предпочтительном варианте осуществления антитела по настоящему изобретению являются выделенными или очищенными.
Термины «полипептид» и «белок» используют взаимозаменяемо в настоящем описании, и они относятся к полимерам аминокислотных остатков. Эти термины также применяют к не встречаемым в природе аминокислотным полимерам, содержащим один или несколько не встречаемых в природе аминокислотных остатков, в дополнение ко встречаемым в природе аминокислотным полимерам. Не встречаемые в природе аминокислоты включают аналоги аминокислот, миметики аминокислот и подобное.
Термины «полинуклеотид», «олигонуклеотид» и «нуклеиновая кислота» используют взаимозаменяемо в настоящем описании, и они относятся к полимерам нуклеотидов.
Если не указано иное, термин «MELK-ассоциированное заболевание» относится к злокачественной опухоли, экспрессирующей MELK, или эндометриозу.
Если не указано иное, термин «злокачественная опухоль» относится к злокачественной опухоли, которая чрезмерно экспрессирует ген MELK, и примеры включают злокачественную опухоль молочной железы, злокачественную опухоль мочевого пузыря, злокачественную опухоль шейки матки, холангиоцеллюлярную злокачественную опухоль, хронический миелоцитарный лейкоз (CML), злокачественную опухоль толстой кишки, злокачественную опухоль пищевода, злокачественную опухоль желудка, злокачественную опухоль печени, немелкоклеточную злокачественную опухоль легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, злокачественную опухоль яичников, злокачественную опухоль поджелудочной железы, злокачественную опухоль предстательной железы, злокачественную опухоль почки, мелкоклеточную злокачественную опухоль легких (SCLC) и подобное, но не ограничены этим.
Термин «антитело», как используют в настоящем описании, предназначен включать иммуноглобулины и их фрагменты, обладающие специфической реакционной способностью в отношении обозначенного белка или его пептидов. Антитела могут включать те, которые слиты с другими белками или метками, и фрагменты антител. Кроме того, в настоящем описании, «антитело» используют в его самом широком смысле, и в частности, до тех пор, пока оно обладает желаемой биологической активностью, оно включает интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, полиспецифические антитела, выполненные из по меньшей мере двух интактных антител (например, биспецифические антитела), и фрагменты антител. «Антитело» относится ко всем классам (например, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM).
2
«Фрагмент антитела» представляет собой часть интактного антитела и в целом содержит одну или несколько антигенсвязывающих областей или вариабельных областей интактного антитела. Следовательно, в настоящем изобретении, фрагмент антитела может содержать одну или несколько антигенсвязывающих частей интактного антитела. Термины «антигенсвязывающая часть» или «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, как используют в настоящем описании, относятся к одному или нескольким иммунологически-активным фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, MELK). Показано, что антигенсвязывающую функцию антитела можно реализовать с помощью фрагментов полноразмерного антитела. Примеры фрагментов антител включают фрагменты Fab, Fab', F(ab') и Fv, линейные антитела, а также одноцепочечные молекулы антител. Независимо от структуры, фрагменты антител связываются с тем же антигеном, что и антиген, распознаваемый интактным антителом. Термин «фрагмент антитела» также включает синтетические полипептиды, которые связываются с конкретным антигеном, или генетически сконструированные полипептиды, например, полипептиды, состоящие из вариабельной области легкой цепи, «Fv» фрагменты, состоящие из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, рекомбинантные одноцепочечные полипептидные молекулы, где вариабельные области легкой цепи и тяжелой цепи связывают с помощью пептидного линкера («scFv белки»), а также минимальные распознающие единицы, состоящие из аминокислотных остатков, имитирующих гипервариабельные области.
Если не указано иное, все технические термины и научные термины, используемые в настоящем описании, имеет те же значения, что и термины, обычно понятные среднему специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение.
В настоящем изобретении, специфическое связывание между белком MELK и антителом можно оценивать, например, посредством конкуренции между антителами. В частности, используя антитело по настоящему изобретению в качестве эталонного антитела, например, антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7, и вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, можно оценивать специфичность рассматриваемого антитела. Репрезентативным эталонным антителом является OTSMAb01. Когда рассматриваемое антитело конкурирует с реакцией антиген-антитело между эталонным антителом и белком MELK человека, можно верифицировать, что рассматриваемое антитело обладает специфичностью, эквивалентной эталонному антителу. Например, когда эталонное антитело и белок MELK вступают в реакцию в присутствии рассматриваемого антитела и когда связывание эталонного антитела в отношении количества эталонного антитела, которое связывается с белком MELK в отсутствие рассматриваемого антитела, снижается на 10%, 20%, 30% или 40%, более предпочтительно 50% или больше, можно считать, что между антителами имеет место конкуренция. Для того чтобы оценивать конкуренцию между антителами, не только белок MELK, но также его частичные пептиды можно использовать до тех пор, пока эталонное антитело связывается с пептидом. Предпочтительные частичные пептиды представляют собой, например, частичный пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
II. Получение антител
В настоящем изобретении используют моноклональные антитела против MELK. Антитела предоставляют с помощью способов, хорошо известных в данной области.
Образцовые приемы получения антител, используемые в настоящем изобретении, описаны далее.
(i) Моноклональные антитела
Моноклональные антитела получают из по существу гомогенной популяции антител. А именно, индивидуальные антитела, образующие популяцию, представляют собой одно и то же, за исключением природных мутаций, которые могут существовать в минимальных количествах. Таким образом, модификатор «моноклональное» обозначает характеристику антитела не являться смесью с другими антителами.
Например, моноклональные антитела можно получать с использованием гибридомного способа, который первые описан в Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), или способа рекомбинантной ДНК (US 4816567).
В гибридомном способе мышей или других подходящих животных-хозяев, например, хомяков и подобных, иммунизируют полипептидом MELK (белком MELK или его частичным полипептидом), и индуцируют лимфоциты, которые продуцируют или которые могут продуцировать антитела, которые специфически связываются с полипептидом MELK. Альтернативно, лимфоциты можно иммунизировать in vitro полипептидом MELK. После этого, лимфоциты сливают с миеломными клетками, используя подходящие средства для слияния, такие как полиэтиленгликоль, чтобы получать гибридомы (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, стр. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Полученные гибридомы высевают в подходящую среду для культивирования, которая предпочтительно содержит одно или несколько веществ, которые ингибируют пролиферацию или выживаемость родительских миеломных клеток, которые не слиты, и растят в этой среде. Например, когда родительские миеломные клетки, не содержат фермент гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазу (HGPRT или HPRT), среда для культивирования гибридом обычно может содержать гипоксантин, аминоптерин и тимидин (среда HAT), эти вещества ингибируют пролиферацию HGPRT-дефицитных клеток.
Предпочтительные миеломные клетки представляют собой те, которые эффективно сливаются, способствуют стабильному продуцированию антител на высоком уровне отобранными антителопродуцирующими клетками, а также чувствительны к средам, таким как среда HAT. Предпочтительные линии миеломных клеток включают линии миеломных клеток мышей, например, те, которые получены из опухолей MOPC-21 и MPC-11 мыши, которые доступны в Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, а также клетки SP-2 и клетки X63-Ag8-653, которые доступны в American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. В отношении получения моноклональных антител человека описаны линии миеломных клеток человека и линии гетеромиеломных клеток мыши-человека (Kozbor, J. Immunol., 133: 300 1 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, стр. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
Среду для культивирования, в которой пролиферируют гибридомы, анализируют на продуцирование моноклональных антител против антигена. Предпочтительно, специфичность связывания моноклонального антитела, продуцируемого гибридомами, определяют с помощью способов иммунопреципитации или анализов связывания in vitro, таких как радиоиммунологический анализ (RIA) или твердофазный иммуносорбентный анализ (ELISA).
Аффинность связывания моноклонального антитела можно определять, например, посредством 3D анализа Скетчарда согласно Munson et al., Anal Biochem. 107: 220-39 (1980).
После идентификации гибридом, которые продуцируют антитело с желаемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, этот клон можно субклонировать с использованием предельного разведения и размножать стандартными способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, стр. 59-103 (Academic Press, 1986)). Примеры сред для культивирования, подходящих для этой цели, включают среду D-MEM и среду RPMI1640. Кроме того, также in vivo можно выращивать гибридомы, такие как асцитные новообразования внутри животных.
Моноклональные антитела, секретируемые субклонами, можно очищать до однородности. Например, разделение и очистку антител можно осуществлять в соответствии со способами разделения и способами очистки, используемыми для белков в целом. Например, антитело можно отделять и выделять надлежащим образом из среды, асцита или сыворотки посредством надлежащего отбора и комбинированного использования колоночной хроматографии, такой как аффинная хроматография, фильтрования, ультрафильтрования, высаливания, диализа, SDS-электрофореза в полиакриламидном геле и электрофореза с изоэлектрическим фокусированием (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), но без ограничения этим. Колонку с белком A и колонку с белком G можно использовать в качестве аффинной колонки. Образцовые колонки с белком A, подлежащие использованию, включают, например, Hyper D, POROS и Sepharose F.F. (Pharmacia).
Помимо аффинной хроматографии, образцовая хроматография включает, например, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрацию, хроматографию с обращенными фазами, адсорбционную хроматографию и подобное (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, ред. Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996)). Хроматографические процедуры можно осуществлять посредством жидкофазной хроматографии, такой как HPLC и FPLC.
ДНК, кодирующую моноклональные антитела, можно легко выделять с использованием стандартных процедур (например, с использованием олигонуклеотидного зонда, который может специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела мыши) и секвенировать. Гибридомы можно использовать в качестве предпочтительного источника для получения такой ДНК. После выделения ДНК, синтеза моноклональных антител в рекомбинантных клетках-хозяевах можно достигать, помещая ДНК в экспрессирующий вектор(ы) и перенося его в клетки-хозяева, такие как клетки E.coli, клетки COS обезьяны, клетки яичника китайского хомяка (CHO), миеломные клетки и подобные, которые не продуцирует белки иммуноглобулинов с помощью других способов. Обзор, касающийся рекомбинантной экспрессии ДНК, кодирующей антитела, в бактериальных клетках, включает Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) и Pluckthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992).
Другой способ получения специфического антитела или фрагмента антитела, которое проявляет реакционную способность в отношении MELK, состоит в скрининге экспрессионной библиотеки, кодирующей гены иммуноглобулинов или их части, экспрессируемые в бактериях, используя белок MELK или его частичный пептид. Например, в бактериях возможно экспрессировать полный Fab фрагмент, VH область и Fv-область, используя фаговую экспрессионную библиотеку. См., например, Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989); Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); и McCafferty et al., Nature 348: 552-554 (1990). Например, посредством скрининга такой библиотеки с использованием пептида MELK, возможно идентифицировать фрагменты иммуноглобулинов, обладающие реакционной способностью в отношении MELK. Альтернативно, мышей SCID-hu (доступны в GenPharm) также можно использовать для получения антител или их фрагментов.
В дополнительном варианте осуществления антитело или его фрагмент также можно выделять из фаговой библиотеки антител, полученной с использованием приемов, описанных в McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) и Marks et al., J Mol Biol, 222: 581-597 (1991), где, соответственно, описано выделение антител мыши и антител человека с использованием фаговых библиотек. Последующие публикации описывают получение высокоаффинных (в нМ диапазоне) антител человека посредством перетасовки цепей (Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783 (1992)), а также комбинаторной инфекции и рекомбинации in vivo в качестве стратегии для конструирования чрезвычайно больших фаговых библиотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993)). Следовательно, эти приемы представляют собой средства, которые можно осуществлять в качестве альтернатив для стандартных приемов с гибридомами моноклональных антител, для выделения моноклональных антител.
Настоящее изобретение предусматривает антитела, подходящие для диагностирования MELK-ассоциированных заболеваний, для определения эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK и для скрининга субъектов, у которых ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект. В настоящем изобретении преуспели в создании клона моноклонального антитела мыши (OTSMAb01), которое может обнаруживать белок MELK с высокой специфичностью при иммуногистохимическом окрашивании. Когда этот клон антитела использовали при иммуногистохимическом окрашивании клинических образцов злокачественной опухоли молочной железы, было доказано, что имела место положительная находка в образцах злокачественной опухоли молочной железы, но почти не было окрашивания в образцах нормальной груди. Кроме того, когда использовали коммерчески доступные антитела против MELK, окрашивание наблюдали в образцах, полученных среди клеточных линий с высокой экспрессией MELK и клеточных линий с низкой экспрессией MELK, тогда как при использовании антитела против MELK по настоящему изобретению обнаружено, что специфическое окрашивание наблюдали в образцах, полученных из клеточных линий с высокой экспрессией MELK. Следовательно, антитело по настоящему изобретению с такой высокой антигенной специфичностью можно использовать при отборе пациентов с высоким уровнем экспрессии MELK, а также при отборе пациентов, у которых лечение с использованием ингибиторов MELK вероятно является эффективным.
Аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи (V области H цепи) и вариабельной области легкой цепи (V области L цепи) клона моноклонального антитела мыши против MELK по настоящему изобретению (OTSMAb01) представлены в SEQ ID NO: 7 и 8, соответственно.
CDR (определяющие комплементарность области), содержащиеся в вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, можно определять в соответствии со способами, хорошо известными в данной области. Например, в целом для определения CDR используют способ, описанный в Kabat et al. (Kabat E. A. et al., (1991) Sequence of Proteins of Immunological Interest. 5-е изд.) или Chothia et al. (Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196; 901-917). CDR 1, 2 и 3 вариабельной области тяжелой цепи клона моноклонального антитела мыши против MELK (OTSMAb01) по настоящему изобретению, как определяют в соответствии с определением Kabat представлены в SEQ ID NO: 1, 2 и 3, соответственно, и CDR 1, 2 и 3 вариабельной области легкой цепи клона представлены в SEQ ID NO: 4, 5 и 6, соответственно.
Следовательно, настоящее изобретение предусматривает:
антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат одну или обе из вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи и которые могут связываться с белком MELK или его частичным пептидом,
где вариабельная область тяжелой цепи содержит:
CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1;
CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и
CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3;
где вариабельная область легкой цепи содержит:
CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;
CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и
CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В настоящем изобретении, частичный пептид белка MELK, с которым антитело по настоящему изобретению связывается, предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, соответствующую положениям 264-601 (SEQ ID NO: 9) белка MELK (SEQ ID NO: 22), и состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотной последовательности из SEQ ID NO: 22. Более предпочтительно, частичный пептид белка MELK в настоящем изобретении может состоять из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
Пример вариабельной области тяжелой цепи, содержащей описанные выше «CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3», представляет собой вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7. Пример вариабельной области легкой цепи, содержащей описанные выше «CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6», представляет собой вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
Следовательно, в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат одну или обе из вариабельной области тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и вариабельной область легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8.
Антитела по настоящему изобретению можно получать стандартными способами. Например, антитело можно получать в соответствии со стандартными приемами генной рекомбинации, вставляя в подходящий вектор полинуклеотид, кодирующий полипептид антитела, вводя указанный вектор в организм-хозяин и заставляя организм-хозяин продуцировать антитела (например, см. Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-75).
Нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего вариабельную область (V область) антитела по настоящему изобретению, можно получать из аминокислотной последовательности V области антитела по настоящему изобретению. В качестве нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL) клона антитела по настоящему изобретению, можно использовать, например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 10 и 11, соответственно. Полинуклеотид, кодирующий V область антитела по настоящему изобретению, можно синтезировать на основе информации о последовательности с использованием стандартных способов, таких как приемы твердофазного синтеза (Beaucage SL & Iyer RP, Tetrahedron (1992) 48, 2223-311; Matthes et al., EMBO J (1984) 3, 801-5) и приемы синтеза олигонуклеотидов (Jones et al., Nature (1986) 321, 522-5).
Полинуклеотид, кодирующий V область антитела, вставляют в экспрессирующий вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий константную (C) область антитела.
Для того чтобы получать антитело, используемое в настоящем изобретении, полинуклеотид, кодирующий указанное антитело (ген антитела), вставляют в экспрессирующий вектор с тем, чтобы экспрессировать ген антитела под управлением факторов регуляции экспрессии (например, энхансеры, промоторы). Клетки-хозяева трансформируют с использованием указанного экспрессирующего вектора для того, чтобы экспрессировать антитело.
При экспрессии генов антител, полинуклеотид, кодирующий H цепь антитела, и полинуклеотид, кодирующий L цепь, можно вставлять в различные экспрессирующие векторы, и после этого получаемыми рекомбинантными экспрессирующими векторами совместно трансфицируют клетку-хозяина. Альтернативно, полинуклеотид, кодирующий H цепь антитела, и полинуклеотид, кодирующий L цепь, можно вставлять в один и тот же экспрессирующий вектор вместе, и после этого получаемым рекомбинантным экспрессирующим вектором трансфицируют клетку-хозяина (например, WO 94/11523).
Гены антител можно экспрессировать известными способами. В случае экспрессии в клетках млекопитающих, стандартный эффективный промотор, ген антитела, подлежащий экспрессии, и сигнал поли(А) (расположенный ниже по направлению считывания от 3'-конца гена антитела) можно функционально связывать. Например, систему предраннего промотора/энхансера цитомегаловируса человека можно использовать в качестве эффективной системы промотора/энхансера.
Другие системы промоторов/энхансеров, например, те, которые происходят из вирусов (например, ретровирусов, вирусов полиомы, аденовирусов и вируса обезьян 40 (SV40)), а также те, которые происходят из клеток млекопитающих (например, фактор элонгации человека 1α (HEF1α)) можно использовать для того, чтобы экспрессировать антитело в настоящем изобретении.
При использовании системы промотора/энхансера SV40, экспрессию гена можно легко выполнять с использованием способа из Mulligan et al. (Nature (1979) 277, 108-14). При использовании системы промотора/энхансера HEF1α, экспрессию гена можно легко выполнять с использованием способа из Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).
При экспрессии в E. coli, стандартный эффективный промотор, сигнальную последовательность для секреции антитела, представляющего интерес, и ген антитела можно функционально связывать. В качестве промоторов можно использовать промотор lacZ или промотор araB. При использовании промотора lacZ, экспрессию гена можно осуществлять с использованием способа из Ward et al. (Nature (1989) 341, 544-6.; FASBE J. (1992) 6, 2422-7), а при использовании промотора araB экспрессию гена можно осуществлять с использованием способа из Better et al. (Science (1988) 240, 1041-3).
В отношении сигнальной последовательности для секреции антитела, когда предполагают секрецию антитела, представляющего интерес, в периплазматическое пространство E. coli, можно использовать сигнальную последовательность pelB (Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-83). Антитело, секретируемое в периплазматическое пространство, выделяют и затем повторно укладывают с тем, чтобы антитело приобретала подходящую стерическую структуру.
Можно использовать сайт начала репликации, происходящий из вирусов (например, SV40, вирусов полиомы, аденовирусов, папилломавирусов коровы (BPV)), или подобное. Для того чтобы увеличивать число копий гена в системе клетки-хозяина, экспрессирующий вектор может дополнительно содержать маркерные гены отбора, такие как ген аминогликозидфосфотрансферазы (APH), ген тимидинкиназы (TK), ген гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (Ecogpt) E. coli и ген дигидрофолатредуктазы (dhfr). В отношении продуцирования антитела, используемого в настоящем изобретении, можно использовать произвольную экспрессирующую систему, включая системы эукариотических и прокариотических клеток. Эукариотические клетки включают стабильные клеточные линии животных (например, млекопитающих, насекомых, плесени и грибов, а также дрожжей). Прокариотические клетки включают бактериальные клетки, такие как клетки E. coli. Предпочтительно антитело, используемое в настоящем изобретении, экспрессируют в клетках млекопитающих, таких как клетки CHO, клетки COS, миеломные клетки, клетки BHK, клетки Vero и клетки HeLa.
Затем трансформированные клетки-хозяева культивируют in vitro или in vivo, и продуцируют антитело, представляющее интерес. Клетки-хозяева можно культивировать с использованием любых известных способов. Среды для культивирования, которые можно использовать в настоящем описании, могут представлять собой среды DMEM, MEM, RPMI1640 или IMDM. Среды для культивирования могут содержать добавки сыворотки, например, эмбриональную телячью сыворотку (FCS).
В дополнение к указанным выше клеткам-хозяевам, можно использовать трансгенных животных в качестве организмов-хозяев при получении рекомбинантных антител. Например, ген антитела вставляют в предусмотренное место в гене, кодирующем белок, который в природе продуцируется в материнском молоке животного (например, β-казеин); и получают слитый ген. Фрагмент ДНК, содержащий слитый ген со вставленным геном антитела, инъецируют в эмбрион не относящегося к человеку животного, и затем этот эмбрион вводят самке животного. Самка животного с эмбрионом внутри рождает трансгенное не относящееся к человеку животное. Антитело, представляющее интерес, секретируется в материнское молоко указанного трансгенного не относящегося к человеку животного или его потомка. Для того чтобы увеличивать количество материнского молока, содержащего указанное антитело, подходящий гормон можно вводить указанному трансгенному животному (Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
Антитело, экспрессируемое и получаемое, как указано выше, можно выделять из клеток или из организма животного-хозяина и можно очищать. Выделение и очистку антитела, как используют в настоящем изобретении, можно осуществлять с использованием аффинных колонок. Другие стандартно используемые способы также можно использовать для выделения и очистки антител, и, следовательно, способы конкретно не ограничены. Например, различные хроматографию, фильтрование, ультрафильтрование, высаливание и диализ можно использовать отдельно или в комбинации для того, чтобы выделять и очищать антитело, представляющее интерес (Antibodies A Laboratory Manual, Ed. Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
(ii) Фрагменты антител
2
2
Разработаны различные приемы для получения фрагментов антител. Стандартно эти фрагменты получали через протеолитическое расщепление интактных антител (например, см. Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Однако такие фрагменты теперь можно получать непосредственно, используя рекомбинантные клетки-хозяева. Например, фрагменты антител можно выделять из фаговых библиотек антител. Альтернативно, F(ab') фрагмент можно формировать посредством прямого извлечения Fab'-SH фрагмента из E. coli и химического сопряжения (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). Другой подход состоит в непосредственном выделении F(ab') фрагмента из клеточной культуры рекомбинантного организма-хозяина. Другие приемы для получения фрагмента антитела будут видны специалисты в данной области. В другом варианте осуществления оптимальное антитело представляет собой одноцепочечный Fv фрагмент (scFv). См. WO 93/16185; US 5571894; и US 5587458. Например, фрагмент антитела может представлять собой «линейное антитело», как описано, например, в US 5641870. Такие линейные фрагменты антител могут быть моноспецифическими или биспецифическими.
(iii) Меченые антитела
Антитело по настоящему изобретению необязательно конъюгируют с аффинной меткой, ферментативной меткой, радиоизотопной меткой, флуоресцентной меткой или хемилюминесцентной меткой. Например, присутствие метки, которая присутствует в злокачественной опухоли, которая экспрессирует MELK, и которая поддается обнаружению, делает возможным определение присутствия или отсутствия злокачественной опухоли или опухоли у субъекта, подлежащего диагностированию. Дополнительно, возможно определять отягощение заболевания посредством локализации метки внутри злокачественной опухоли.
Метки, пригодные для использования, включают, например, флуоресцентные метки, такие как флуоресцеин и родамин; и ферментативные метки, такие как люцифераза. Используемую поддающуюся обнаружению метку/метку для обнаружения можно выбирать на основе используемого способа визуализации. Конъюгат между такой меткой и антителом можно получать с использованием протоколов и приемов, известных в данной области. В настоящем изобретении, антитело по изобретению можно конъюгировать с желаемой меткой прямо перед использованием или можно предоставлять в виде антитела, конъюгированного с меткой.
Конъюгат между антителом и меткой можно получать с использованием различных бифункциональных средств для сопряжения белков, таких как N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфира (например, диметиладипимидат HCL), активные сложные эфиры (например, дисукцинимидилсуберат), альдегиды (например, глутаральдегид), соединения бис-азидов (например, бис-(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (например, бис-(п-диазонийбензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (например, толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные фторсоединения (например, 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Альтернативно, слитый белок, содержащий антитело и метку, можно получать, например, посредством рекомбинантных способов или синтеза пептидов. Подходящие примеры таких слитых белков включают слитые белки между белковыми метками, такими как ECFP, EYFP или EGFP, и антителом.
III. Диагностирование MELK-ассоциированных заболеваний, скрининг субъектов, у которых ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект (диагностирование перед лечением) или определение эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK (диагностирование после лечения).
MELK можно использовать в качестве диагностического маркера для MELK-ассоциированных заболеваний, и также в качестве маркера для оценки восприимчивости заболеваний к ингибитору MELK и лекарственного эффекта указанного ингибитора MELK. Следовательно, антитела по настоящему изобретению можно использовать в качестве реагента для обнаружения маркера для диагностирования MELK-ассоциированных заболеваний, таких как злокачественная опухоль, для скрининга субъектов, у которых ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект, или для определения эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK.
Более конкретно, белок MELK в образце, выделенному у субъекта, можно обнаруживать с использованием антитела по настоящему изобретению для того, чтобы осуществлять диагностирование MELK-ассоциированных заболеваний, скрининг субъектов, у которых ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект, или определение эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK. Следовательно, настоящее изобретение предусматривает способы диагностирования MELK-ассоциированного заболевания или предрасположенности к развитию заболевания у субъекта, способы скрининга субъекта, у которого ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект, и способы определения эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK, посредством обнаружения белка MELK в образце, выделенном у субъекта, используя антитело по настоящему изобретению. Эти способы включают следующие стадии:
(a) контакта образца, выделенного у субъекта, с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению;
(b) обнаружения белка MELK в образце посредством обнаружения связывания образца с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом; и
(c) сравнения уровня белка MELK в образце с контролем.
В типичном варианте осуществления, указанный выше образец представляет собой клетку или ткань, выделенную у указанного выше субъекта, предпочтительно, ткань, выделенную у указанного субъекта. Следовательно, обычно каждый из способов по настоящему изобретению проводят in vitro для образцов, выделенных у субъектов. Известны способы выделения тканей и клеток у субъектов с использованием таких приемов, как биопсия и взятие крови. Также возможно использовать биологические образцы, удаленные у субъектов через медицинские процедуры, проводимые для лечения (хирургические вмешательства и подобные). Клетки и ткани, выделенные у субъекта, можно подходящим образом обрабатывать перед контактом с антителом. Например, образцы ткани, получаемые у субъекта, в целом можно превращать в срезы после заморозки, дополнительно фиксировать, используя спирт, формалин и подобное, и использовать в качестве образцов для иммуногистологического анализа. Альтернативно, после фиксации образцов ткани, культивируемых клеток и подобного с помощью формалина и подобного, можно получать срезы для иммуногистологического анализа посредством заливания парафином.
Связывание антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению с образцом, а именно связывание с белком антигена в образце, можно обнаруживать способом, известным специалистам в данной области. Более конкретно, после контакта антитела по настоящему изобретению с указанным образцом, посредством удаления антител, которые не связаны с белком MELK в образце, с помощью промывания, и обнаружения антитела, остающегося в образце, можно обнаруживать связывание антитела по настоящему изобретению и белка MELK в образце. В этот момент, когда антитело метят непосредственно, присутствие антитела по настоящему изобретению, связанного с белком MELK, можно обнаруживать посредством обнаружения метки. Когда метка представляет собой поддающуюся обнаружению метку, такую как ферменты, флуоресцентные вещества, люминесцентные вещества и частицы, такие метки можно легко обнаруживать. В дополнение к ним, когда антитело по настоящему изобретению метят (аффинно метят) с использованием аффинного вещества (связывающего вещества), такого как биотин, присутствие антитела можно захватывать с использованием партнера связывания, такого как меченый авидин. Альтернативно, когда антитело по настоящему изобретению не метят непосредственно, антитело по настоящему изобретению можно обнаруживать с использованием связывающего реагента против антитела. Например, белок A или антитело против антитела, после мечения, можно использовать в качестве антителосвязывающего реагента для того, чтобы обнаруживать антитело по настоящему изобретению.
При диагностировании MELK-ассоциированных заболеваний, в указанной выше стадии (c), когда уровень белка MELK высок по сравнению с контрольным уровнем (нормальный контрольный уровень, предпочтительно уровень экспрессии белка MELK в образце, выделенном у здорового субъекта, который не страдает MELK-ассоциированным заболеванием), это указывает на то, что субъект страдает MELK-ассоциированным заболеванием или имеет риск его развития.
Кроме того, при скрининге субъекта, у которого ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект, в указанной выше стадии (c), когда уровень белка MELK эквивалентен или выше по сравнению с контрольным уровнем (предпочтительно, уровнем экспрессии белка MELK в ткани субъекта, у которого диагностировали наличие MELK-ассоциированного заболевания), это указывает на то, что терапевтический эффект ингибитора MELK у субъекта высок.
С другой стороны, при определении эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK, в указанной выше стадии (c), когда уровень белка MELK низок по сравнению с контрольным уровнем (предпочтительно, уровнем экспрессии белка MELK в образце, выделенном у субъекта перед введением лекарственного средства), это указывает на то, что у субъекта имел место эффект лекарственного средства.
Пациенты, у которых показано наличие MELK-ассоциированного заболевания посредством диагностического способа по настоящему изобретению, могут стать субъектами лечения ингибитором MELK. Следовательно, после диагностического способа по настоящему изобретению, ингибитор MELK можно вводить пациентам, у которых показано наличие MELK-ассоциированного заболевания. Альтернативно, ингибитор MELK также можно вводить пациентам, у которых показано наличие возможности получения высокого терапевтического эффекта ингибитора MELK после скрининга. Кроме того, когда показывают, что ингибитор MELK имел терапевтический эффект у пациентов, которым вводили ингибитор MELK, ингибитор MELK можно вводить тем же пациентам непрерывно.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к способам лечения MELK-ассоциированных заболеваний, которые включают стадию идентификации одного из пациентов, выбранных из группы ниже, с помощью способов по настоящему изобретению и введения ингибитора MELK указанному пациенту:
пациенту, у которого показано наличие MELK-ассоциированного заболевания посредством диагностических способов по настоящему изобретению;
пациенту, у которого показано наличие возможности получить высокий терапевтический эффект ингибитора MELK; и
пациенту, которому вводили ингибитор MELK и у которого показано наличие полученного терапевтического эффекта ингибитора.
В настоящем изобретении известные соединения можно использовать в качестве ингибитора MELK, вводимого пациентам. Например, существуют различные известные соединения, которые ингибируют действие фермента MELK (WO 2012/016082; WO 2013/109388; Oncotarget. 2012, 3: 1629-1640; Oncotarget. 2016; 7: 17652-17664).
В контексте настоящего изобретения контрольный уровень, измеряемый с использованием биологического образца, о котором известно, что он не страдает MELK-ассоциированным заболеванием (например, незлокачественного), называют «нормальным контрольным уровнем». Когда уровень белка MELK в образце, выделенном у субъекта, высок по сравнению с нормальным контрольным уровнем, у субъекта можно диагностировать наличие MELK-ассоциированного заболевания, подлежащего лечению.
С другой стороны, контрольный уровень, измеряемый в биологическом образце, о котором известно, что он страдает MELK-ассоциированным заболеванием, (например, злокачественном), называют «патологическим контрольным уровнем (например, злокачественным контрольным уровнем)». Когда уровень белка MELK в образце, выделенном у субъекта перед лечением ингибитором MELK, эквивалентен или выше по сравнению с патологическим контрольным уровнем, у субъекта можно диагностировать получение высокого терапевтического эффекта с использованием ингибитора MELK.
Кроме того, когда уровень белка MELK в образце, выделенном у субъекта после лечения с использованием ингибитора MELK, ниже, чем патологический контрольный уровень у того же субъекта перед введением лекарственного средства, то можно диагностировать, что имел место эффект лекарственного средства посредством лечения, а именно, что субъект получал высокий терапевтический эффект с использованием ингибитора MELK.
В конкретном варианте осуществления нормальные клетки (или ткани), получаемые из непораженной области (например, незлокачественной области) органа, имеющего MELK-ассоциированное заболевание (например, злокачественную опухоль), подлежащее лечению, можно использовать в качестве нормального контроля. В другом варианте осуществления контрольный уровень можно определять с помощью статистических способов на основе результатов, получаемых посредством анализа уровней белка MELK, измеряемых предварительно в образцах, которые происходят от субъектов, у которых известно о состоянии заболевания (например, злокачественного или незлокачественного). Контрольный уровень дополнительно можно извлекать из базы данных о профилях экспрессии, получаемых из образцов (клеток или тканей), которые тестировали ранее. Когда образец, подлежащий оценке, представляет собой образец ткани, предпочтительно использовать в качестве контрольного образца образец, который происходит из той же ткани.
Кроме того, по одному из аспектов настоящего изобретения, уровень белка MELK в биологическом образце можно сравнивать с несколькими контрольными уровнями, измеряемыми для нескольких эталонных образцов. Предпочтительно использовать контрольные уровни, измеряемые по эталонным образцам, которые происходят из типа ткани, который схож с типом ткани биологического образца, полученного у субъекта. Кроме того, предпочтительно использовать стандартные значения уровня белка MELK в популяции, у которой известно о состоянии заболевания. Стандартное значение можно получать с использованием любых известных в данной области способов. Например, диапазон среднего значения в +/- 2 S.D. или среднего значения в +/- 3 S.D. можно использовать в качестве стандартного значения.
Уровень белка MELK в образце считают высоким, когда уровень составляет, например, на 10%, 25% или 50% выше, чем контрольный уровень или превосходит в 1,1 раза, превосходит в 1,5 раза, превосходит в 2,0 раза, превосходит в 5,0 раза, превосходит в 10,0 раз или больше по сравнению с контрольным уровнем. Уровень белка MELK в образце считают низким, когда уровень составляет, например, на 10%, 25% или 50% ниже, чем контрольный уровень или больше чем в 1,1 раза, больше чем в 1,5 раза, больше чем в 2,0 раза, больше чем в 5,0 раза, больше чем в 10,0 раза или больше ниже, чем контрольный уровень.
В типичном варианте осуществления, MELK-ассоциированное заболевание представляет собой злокачественную опухоль, которая экспрессирует MELK, или эндометриоз. Злокачественная опухоль, которая экспрессирует MELK, например, представляет собой злокачественную опухоль молочной железы, злокачественную опухоль мочевого пузыря, злокачественную опухоль шейки матки, холангиоцеллюлярную злокачественную опухоль, хронический миелоцитарный лейкоз (CML), злокачественную опухоль толстой кишки, злокачественную опухоль пищевода, злокачественную опухоль желудка, злокачественную опухоль печени, немелкоклеточную злокачественную опухоль легких (NSCLC), лимфому, остеосаркому, злокачественную опухоль яичников, злокачественную опухоль поджелудочной железы, злокачественную опухоль предстательной железы, злокачественную опухоль почки и мелкоклеточную злокачественную опухоль легких (SCLC), но без ограничения этим.
В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение предусматривает способы обнаружения диагностического маркера для MELK-ассоциированного заболевания или предрасположенности к развитию указанного заболевания, в том числе стадию обнаружения, в качестве указанного диагностического маркера, белка MELK в образце с использованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению. Выяснено, что экспрессия MELK усилена в клетках злокачественной опухоли определенных типов по сравнению с нормальными тканями. Следовательно, если возможно специфически обнаруживать уровень экспрессии MELK, то его можно использовать в качестве диагностического маркера для заболеваний, связанных с MELK. В контексте настоящего изобретения, диагностический маркер для MELK-ассоциированного заболевания или предрасположенности к развитию указанного заболевания представляет собой белок MELK в образце, выделенном у субъекта, который обнаруживают посредством связывания с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению, и отличается тем, что показывают, что указанный субъект страдает указанным заболеванием или имеет риск развития заболевания, когда уровень экспрессии MELK высок по сравнению с контрольным уровнем. Здесь указанный контрольный уровень представляет собой нормальный контрольный уровень, предпочтительно уровень экспрессии белка MELK в образце, выделенном у здорового субъекта, который не страдает MELK-ассоциированным заболеванием. В целом, предпочтительно контрольный уровень представляет собой уровень экспрессии в той же ткани, что и ткань, из которой происходят клетки злокачественной опухоли, в которой пытаются обнаруживать диагностический маркер.
Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам по настоящему изобретению для использования в диагностировании MELK-ассоциированного заболевания или предрасположенности к развитию указанного заболевания. Альтернативно, настоящее изобретение предусматривает использование антител или их антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению при изготовлении реагента для диагностирования MELK-ассоциированного заболевания или предрасположенности к развитию указанного заболевания.
Кроме того, настоящее изобретение предусматривает способы обнаружения маркера восприимчивости к лечению ингибитором MELK, способы включают стадию обнаружения белка MELK в образце в качестве указанного маркера восприимчивости, используя антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. Выяснено, что экспрессия MELK усилена конкретно в клетках злокачественной опухоли определенных типов и что пролиферацию таких клеток злокачественной опухоли подавляет ингибитор MELK (WO 2004/031413; WO 2006/016525; WO 2007/013665; WO 2008/023841). Другими словами, возможно предсказать восприимчивость к ингибитору MELK, используя экспрессию MELK в качестве показателя. Это обусловлено тем, что, если MELK экспрессирована на высоком уровне, то можно предполагать эффект супрессии клеточного роста с помощью ингибитора MELK. Следовательно, если возможно специфически обнаруживать уровень экспрессии MELK, это будет эффективно в качестве маркера восприимчивости к лечению ингибитором MELK. В контексте настоящего изобретения, маркер восприимчивости к лечению ингибитором MELK представляет собой белок MELK в образце, выделенном у субъекта, который обнаруживают посредством связывания с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению, и отличается тем, что показывают, что терапевтический эффект с использованием ингибитора MELK высок у субъекта, когда уровень экспрессии MELK эквивалентен или выше по сравнению с контрольным уровнем. Здесь указанный контрольный уровень предпочтительно представляет собой патологический контрольный уровень, другими словами, уровень экспрессии белка MELK в образце, выделенном из пораженной части субъекта, о котором известно, что он страдает MELK-ассоциированным заболеванием, особенно предпочтительно уровень экспрессии белка MELK в образце, выделенном перед лечением у субъекта, у которого ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению для использования в скрининге субъекта, у которого ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект. Альтернативно, настоящее изобретение предусматривает использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению при изготовлении реагента для скрининга субъекта, у которого ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект.
Настоящее изобретение также относится к способам обнаружения маркера эффекта лекарственного средства для ингибитора MELK, способы включают стадию обнаружения белка MELK в образце с использованием антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению в качестве указанного маркера эффекта лекарственного средства. Выяснено, что экспрессия MELK в частности усилена в клетках злокачественной опухоли определенных типов и что пролиферацию таких клеток злокачественной опухоли подавляет ингибитор MELK (WO 2004/031413; WO 2006/016525; WO 2007/013665; WO 2008/023841). Следовательно, ткани злокачественной опухоли, имеющие такие клетки злокачественной опухоли, можно уменьшать или уничтожать с помощью ингибитора MELK. Другими словами, возможно оценивать эффект лекарственного средства для ингибитора MELK у субъекта, имеющего такие клетки злокачественной опухоли, используя уровень экспрессии MELK в качестве показателя. Это обусловлено тем, что, если уровень экспрессии MELK в образце, выделенном из ткани, которая имеет MELK-положительные клетки злокачественной опухоли, снижают по сравнению с таковым в образце, выделенном перед лечением ингибитором MELK, то можно определять, что MELK-положительные клетки злокачественной опухоли снизились из-за ингибитора MELK. Следовательно, если возможно обнаруживать уровень экспрессии MELK специфически, это будет эффективно в качестве маркера эффекта лекарственного средства для ингибитора MELK. В контексте настоящего изобретения, маркер эффекта лекарственного средства для ингибитора MELK представляет собой белок MELK в образце, выделенном у субъекта, которому вводили ингибитор MELK, который обнаруживают посредством связывания с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению, и который отличается тем, что показывают, что имел место эффект лекарственного средства с помощью ингибитора MELK у указанного субъекта, когда уровень экспрессии MELK низок по сравнению с контрольным уровнем. Здесь указанный контрольный уровень предпочтительно представляет собой уровень экспрессии белка MELK в образце, выделенном из пораженной части указанного субъекта перед введением лекарственного средства.
Настоящее изобретение также относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам по настоящему изобретению для использования при определении эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK. Альтернативно, настоящее изобретение предусматривает использование антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению при изготовлении реагента для определения эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK.
IV. Реагенты или наборы для диагностирования MELK-ассоциированного заболевания, для скрининга субъектов, у которых ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект, или для определения эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK.
Настоящее изобретение предусматривает реагенты или наборы для диагностирования MELK-ассоциированного заболевания, для скрининга субъектов, у которых ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект, или для определения эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK. В частности, эти наборы содержат антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению в качестве реагента для обнаружения белка MELK. В одном из вариантов осуществления антитело для реагента или набора для диагноза по настоящему изобретению можно метить флуоресцентным веществом, люминесцентным веществом или радиоизотопом. Способы мечения антитела и обнаружения меченого антитела хорошо известны в данной области, и для настоящего изобретения можно использовать любые метки и способы.
Данные наборы могут включать комбинацию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению с другим реагентом обнаружения маркера. Данные наборы дополнительно могут включать реагенты положительного и отрицательного контроля в отношении MELK и вторичное антитело для обнаружения антитела по настоящему изобретению. Например, культуральные среды или образцы тканей из клеточных линий, которые, как известно, сильно экспрессируют MELK, будут полезны в качестве эффективных реагентов положительного контроля. Кроме того, например, образцы ткани, получаемые у здоровых субъектов или незлокачественные ткани будут полезны в качестве эффективных реагентов отрицательного контроля. Вторичные антитела для обнаружения антитела по настоящему изобретению предпочтительно метят флуоресцентным веществом, люминесцентным веществом, радиоизотопом или ферментом. Набор по настоящему изобретению дополнительно может включать другие материалы, желательные для пользователя с коммерческой точки зрения, в том числе буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и вкладыши в упаковку с инструкциями по использованию (например, документы, ленты, CD-ROM и подобное). Эти реагенты и подобное могут содержаться в меченом контейнере. Подходящие контейнеры включают бутылки, флаконы и пробирки. Контейнеры можно выполнять из различных материалов, таких как стекло и пластмасса.
В настоящем описании приведено подробное объяснение настоящего изобретения со ссылкой на его конкретные варианты осуществления. Однако следует понимать, что приведенное объяснение фактически представляет собой иллюстративное и объяснительное объяснение, и оно предназначено для того, чтобы объяснять настоящее изобретение и его предпочтительные варианты осуществления. Через стандартные эксперименты специалист в данной области легко выяснит, что в нем можно выполнять различные изменения и модификации, не отступая от сущности и объема настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение не ограничено приведенным объяснением, но предназначено быть определенным приложенной формулой изобретения и ее эквивалентами.
Ниже в настоящем описании настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на примеры. Тем не менее, хотя следующие материалы, способ и примеры могут служить для содействия среднему специалисту при создании и использовании определенных вариантов осуществления настоящего изобретения, они предназначены только для того, чтобы иллюстрировать аспекты настоящего изобретения и, таким образом, ни коим образом не ограничивают объем настоящего изобретения. Средний специалист в данной области может использовать способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, что описаны в настоящем описании, при практической реализации или тестировании настоящего изобретения.
Все документы известного уровня техники, цитируемые в настоящем описании, включены в настоящее описание по ссылке.
ПРИМЕРЫ
Ниже в настоящем описании настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на примеры, но его не стоит толковать в качестве ограниченного ими.
[Материалы и способы]
Клеточная культура
2
2
2
2
2
2
2
Клеточную линию с принудительной экспрессией MELK (MELK/293T) получали посредством введения MELK-экспрессирующего вектора в линию эмбриональных клеток почки человека 293T, приобретенную в GenHunter, и клеточную линию со введенным пустым вектором (Mock/293T) получали в качестве отрицательного контроля. Клетки поддерживали в DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO. Клеточную линию злокачественной опухоли молочной железы человека MCF-7, которую приобретали в ATCC, поддерживали в MEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина/стрептомицина, заменимых аминокислот, пирувата натрия и инсулина при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO. Клеточную линию гепатомы человека Hep G2, которую приобретали в JCRB, поддерживали в DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO. Клеточную линию злокачественной опухоли поджелудочной железы человека PK-45P, полученную из Institute of Development, Ageing, and Cancer из Tohoku University, и клеточную линию злокачественной опухоли легкого человека A549, которую приобретали в Dainippon Pharma Co., Ltd., поддерживали в RPMI1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO. Клеточную линию злокачественной опухоли молочной железы человека BT-549, которую приобретали в ATCC, поддерживали в RPMI1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина/стрептомицина, HEPES, пирувата натрия и инсулина при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO. Клеточную линию злокачественной опухоли ободочной кишки человека HT-29, которую приобретали в ATCC, поддерживали в среде МакКоя 5A с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% CO. Клеточную линию злокачественной опухоли молочной железы человека MDA-MB-231, которую приобретали в ATCC, поддерживали в L-15 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина/стрептомицина при 37°C в увлажненной атмосфере без CO.
Клинические образцы
Образцы тканей, хирургически удаленные из злокачественных опухолей молочной железы (фиксированные формалином парафиновые срезы, замороженные ткани), а также клиническую информацию, соответствующую им, получали из Kanagawa Cancer Center после получения письменного информированного согласия.
Иммуногистохимическое окрашивание (IHC)
Фиксированные формалином парафиновые срезы MELK/293T, Mock/293T, MCF-7, Hep G2, HT-29, PK-45P, BT-549, MDA-MB-231, A549 и клинические образцы погружали три раза на три минуты в ксилол для депарафинизации и после этого регидратировали посредством их погружения в 100% этанол два раза на 1 минуту и затем каждый на 1 минуту в 90%, 70% и 50% этанол. Для активации антигенов срезы погружали в раствор для активации антигенов, pH 9 (Nichirei Biosciences Inc.) инкубировали при 125°C в течение 30 с. После инкубации их оставляли стоять в течение 20 минут при комнатной температуре и промывали в течение 5 минут под проточной водой. После их погружения в 3,0% водный пероксид водорода на 10 минут для того, чтобы осуществлять блокирование эндогенной пероксидазы, их промывали буфером для промывания (TBS-T (Takara Bio)) три раза в течение 5 минут. Кроме того, с целью блокирования неспецифических реакций, подходящее количество Protein Block Solution (Dako) капали на срезы и затем оставляли стоять в течение 10 минут. Первичные антитела (OTSMAb01, MELK(N449)pAb, MELK(HPA017214)pAb), соответственно, капали в подходящих количествах во влажной камере, оставляли стоять в течение 60 минут и затем промывали буфером для промывания три раза в течение 5 минут. Histofine Simple Stain MAX PO (Nichirei Biosciences Inc.) капали в подходящих количествах в качестве вторичного антитела во влажной камере и оставляли стоять в течение 30 минут. Затем их промывали буфером для промывания три раза в течение 5 минут. Хромогенную реакцию проводили с использованием раствора субстрата DAB (Nichirei Biosciences Inc.). Препараты срезов погружали на 20 с в гематоксилин (Dako) и промывали под проточной водой. Дегидратацию выполняли посредством их погружения в 50%, 70% и 90% этанол на 1 минуту, соответственно, и последующего их погружения два раза на 1 минуту в 100% этанол. Наконец, срезы погружали два раза на 3 минуты в ксилол для пропитки и закрывали с использованием Mount-Quick (DAIDO SANGYO).
RT-ПЦР
Клинические замороженные ткани (злокачественная опухоль молочной железы) разрушали посредством погружения замороженных тканевых срезов в реагент TRIzol (Invitrogen) и экстрагировали хлороформом. Приблизительный эквивалентный объем 70% этанола добавляли в полученный экстракт и общую РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy Mini (QIAGEN). Затем кДНК синтезировали из общей РНК с использованием обратной транскриптазы, SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen). Затем осуществляли реакцию ПЦР с использованием ExTaq (Takara Bio) и кДНК в качестве матрицы. MELK использовали в качестве целевого гена для анализа экспрессии, и β-актин в качестве гена домашнего хозяйства. MELK амплифицировали с использованием набора праймеров MELK-1F: 5'-ATGATCACCTCACGGCTA-3' (SEQ ID NO: 12), MELK-1R: 5'-AGGTGTTCTGCATAAGG-3' (SEQ ID NO: 13), а β-актин амплифицировали с использованием набора праймеров Fw β-актина: 5'-AGGATGCAGAAGGAGATCAC-3' (SEQ ID NO: 14), Re β-актина: 5'-AGAAAGGGTGTAACGCAACT-3' (SEQ ID NO: 15). Осуществляли электрофорез продукта ПЦР амплификации в агарозном геле и сравнивали уровни экспрессии гена MELK.
Вестерн-блоттинг
Белок экстрагировали из MCF-7, Hep G2, HT-29, PK-45P, BT-549, MDA-MB-231 и A549 с использованием RIPA Lysis Buffer. Целевые белки разделяли с использованием SDS электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Разделенные целевые белки переносили на нитроцеллюлозу (NC). После блокирования неспецифического связывания на поверхности мембраны с использованием блокирующего раствора Block-Ace (DS Pharma Biomedical), их инкубировали с тестовыми антителами, которые могут связываться с целевыми белками. После промывания избытка тестовых антител на мембране с использованием TBST Wash Buffer, их инкубировали с вторичным антителом, меченым пероксидазой (HRP), которое может связываться с тестовыми антителами, и затем избыток вторичных антител на мембране промывали с использованием буфера для промывания. Используя систему обнаружения вестерн-блоттинга ECL (GE Healthcare), создавали поддающуюся обнаружению хемилюминесценцию и осуществляли регистрацию с использованием пленки.
[Пример 1] Получение моноклонального антитела против MELK
(1) Получение гибридом, продуцирующих антитело против MELK
Анализ иммуногенной области белка MELK человека (SEQ ID NO: 22) показывал, что общая антигенная оценка сдвигается благоприятно в область аминокислот 264-601 (SEQ ID NO: 9), которая принимает длинную петлевую структуру, и что специфичность последовательности также благоприятна, что позволяет предсказывать высокую антигенность (Medical & Biological Laboratories Co, Ltd). Следовательно, чтобы продуцировать MELK-специфическое антитело, рекомбинантный белок с областью аминокислот 264-601 (SEQ ID NO: 9) из белка MELK человека (SEQ ID NO: 22), кодируемого геном MELK человека (SEQ ID NO: 21), использовали в качестве иммуногена. Начальную иммунизацию проводили посредством добавления 50 мкг антигенного пептида в адъювант Фрейнда, их эмульгирования и подкожной инъекции мыши Balb/c (Japan SLC, Inc.). Иммунизацию, начиная со второго раза, проводили посредством подкожной инъекции препарата, соответствующего количеству антигенного пептида 25 мкг, как получали аналогичным образом. Через трое суток после конечной иммунизации, у мыши в стерильных условиях получали спленоциты, которые сливали с миеломными клетками мыши SP2/0, используя способ с полиэтиленгликолем, в соответствии со стандартными способами.
(2) Отбор гибридомы, продуцирующей антитело против MELK
Антитело против MELK выбирали посредством иммуногистохимического окрашивания с использованием клеточной линии 293T, экспрессирующей полноразмерный белок MELK (SEQ ID NO: 22). А именно, после фиксации клеточной линии 293T, принудительно экспрессирующей полноразмерный белок MELK, в формалине и получения парафиновых срезов, гибридомы, демонстрирующие сильную реакцию с клеточной линией, принудительно экспрессирующей MELK (MELK/293T), отбирали посредством выполнения иммуноокрашивания.
Результаты иммуногистохимического окрашивания клона гибридомы OTSMAb01, у которого подтверждали продуцирование MELK-специфического антитела на высоком уровне, среди тестированных гибридом, представлены на фиг. 1. Как показано на изображениях и графике на фиг. 1, при окрашивании с использованием OTSMAb01, в парафиновом срезе, полученном из клеточной линии, принудительно экспрессирующей MELK (MELK/293T), наблюдали окрашивание, схожее с использованием коммерчески доступных поликлональных антител против MELK MELK(N449)pAb и MELK(HPA017214)pAb, что, другими словами, показывало, что доля MELK-положительных клеток высока. С другой стороны, окрашивание едва ли наблюдали в парафиновых срезах, полученных из клеточных линий со введенным пустым вектором (Mock/293T), который использовали в качестве отрицательного контроля, что показывает, что доля MELK-положительных клеток мала. Эти результаты показывали, что клон гибридомы OTSMAb01 можно использовать в качестве гибридомы, которая продуцирует антитело, которое специфически обнаруживает MELK при иммуногистохимическом окрашивании.
Этот клон гибридомы OTSMAb01 выбирали в качестве гибридомы для получения антитела для дальнейших экспериментов. Клон гибридомы OTSMAb01 культивировали в большом масштабе, и собирали культуральный раствор через 2-3 недели. Антитело очищали от культурального раствора с использованием колонки с белком A (GE Healthcare, NJ). В настоящем описании антитело по настоящему изобретению также обозначают как клон OTSMAb01.
[Пример 2] Оценка специфичности моноклонального антитела против MELK
Далее, используя различные клеточные линии с различными уровнями экспрессии MELK, оценивали специфичность OTSMAb01. А именно, посредством сравнения результатов иммуногистохимического окрашивания и вестерн-блоттинга с использованием OTSMAb01, оценивали, наблюдали ли окрашивание, соответствующее уровню экспрессии белка MELK.
Сначала эндогенные уровни экспрессии белка MELK в различных клеточных линиях, происходящих из тканей злокачественных опухолей человека, верифицировали посредством вестерн-блоттинга с использованием OTSMAb01. Как показано на фиг. 2, клеточная линия PK-45P, происходящая из злокачественной опухоли поджелудочной железы человека, клеточные линии BT-549 и MDA-MB-231, происходящие из злокачественной опухоли молочной железы человека, и клеточная линия A549, происходящая из злокачественной опухоли легких человека, представляли собой клеточные линии с высокой экспрессией MELK, и клеточная линия MCF-7, происходящая из злокачественной опухоли молочной железы человека, клеточная линия Hep G2, происходящая из гепатомы человека, и клеточная линия HT-29, происходящая из злокачественной опухоли ободочной кишки человека, представляли собой клеточные линии с низкой экспрессией MELK.
Затем проводили иммуногистохимическое окрашивание парафиновых срезов, полученных из этих клеточных линий, с использованием OTSMAb01 и коммерчески доступных поликлональных антител против MELK. Как показано на фиг. 3, при окрашивании с использованием OTSMAb01, окрашивание наблюдали в парафиновых срезах, полученных из клеточных линий PK-45P, BT-549, MDA-MB-231 и A549, которые верифицировали как высоко экспрессирующие MELK. Положительный сигнал обнаруживали в высокой доле клеток на этих парафиновых срезах. С другой стороны, на парафиновых срезах, полученных из MCF-7, Hep G2 и HT-29, которые представляют собой клеточные линии, имеющие низкие уровни экспрессии MELK, окрашивание почти отсутствовало, и едва ли обнаруживали какой-либо положительный сигнал.
С другой стороны, при окрашивании с использованием коммерчески доступных антител против MELK MELK(N449)pAb (Bioworld Technology) и MELK(HPA017214)pAb (Sigma-Aldrich), сигнал обнаруживали в высокой доле клеток во всех тестируемых клеточных линиях, независимо от уровня экспрессии эндогенного белка MELK. Следовательно, делали предположение о том, что результат обнаружения с использованием этих коммерчески доступных антител может включать ложноположительные сигналы.
Вышеуказанные результаты показывали, что антитело против MELK по настоящему изобретению (OTSMAb01) представляет собой эффективный инструмент для получения результатов обнаружения, которые коррелируют с уровнем экспрессии белка MELK в образце способом иммуногистохимического окрашивания, и выясняли, что оно обладает благоприятным признаком связывания с MELK с высокой специфичностью по сравнению с коммерчески доступными антителами против MELK.
[Пример 3] Обнаружение белка MELK в клинических образцах
Специфичность антитела против MELK по настоящему изобретению (OTSMAb01) при иммуногистохимическом окрашивании оценивали с использованием клинических образцов злокачественной опухоли молочной железы. На фиг. 4 представлен результат обнаружения экспрессии белка MELK и РНК в опухолевых и неопухолевых областях в клинических образцах злокачественной опухоли молочной железы с 1 до 3 с использованием иммуногистохимического окрашивания и полуколичественной RT-ПЦР, соответственно. Как показано на фиг. 4, клетки, окрашенные с использованием OTSMAb01, а именно MELK-положительные клетки, обнаруживали в опухолевых областях, где верифицировали экспрессию РНК MELK, но окрашивание почти не наблюдали в неопухолевых областях, где экспрессию РНК MELK не верифицировали, то есть не обнаруживали MELK-положительные клетки. Этот результат демонстрирует, что OTSMAb01 может специфически обнаруживать белок MELK даже в клинических образцах.
[Пример 4] Анализ аминокислотных последовательностей вариабельных областей моноклонального антитела против MELK
Анализировали аминокислотные последовательности вариабельных областей антитела против MELK по настоящему изобретению (OTSMAb01).
Общую РНК экстрагировали из гибридомы OTSMAb01 с использованием набора RNeasy Mini (QIAGEN). Затем кДНК синтезировали из общей РНК, используя обратную транскриптазу Super Script II (Invitrogen). Праймеры для синтеза кДНК представляли собой следующее:
3'-праймер тяжелой цепи mIGCUniRv:
5'-CTGGGAAGGTGTGCACAC-3' (SEQ ID NO: 16)
3'-праймер легкой цепи mIGKRv2:
5'-GTTGTTCAAGAAGCACACGAC-3' (SEQ ID NO: 17)
Полимер dC добавляли к концу кДНК с использованием 5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (Invitrogen), и полинуклеотиды, кодирующие вариабельные области моноклонального антитела, амплифицировали с использованием Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen). Праймеры для амплификации представляют собой следующее. Нуклеотид «I» в последовательности праймера обозначает инозин.
5'-праймер тяжелой цепи и легкой цепи 5' RACE Abridged Anchor Primer:
5'-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3' (SEQ ID NO: 18);
3'-праймер тяжелой цепи mIGCUniRv2:
5'-TGGACAGGGATCCAGAGTTCC-3' (SEQ ID NO: 19); и
3'-праймер легкой цепи mIGKNesRv2:
5'-CAGATGTTAACTGCTCACTGGATGG-3' (SEQ ID NO: 20).
ПЦР продукты клонировали в вектор pGEM-T Easy (Promega). Области фрагментов вставки секвенировали для того, чтобы определять нуклеотидные последовательности вариабельных областей (за исключением сигнальных последовательностей) OTSMAb01.
Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи моноклонального антитела мыши определяли следующим образом:
OTSMAb01, аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (за исключением сигнальной последовательности):
EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGNTIYDPKFQGKASVTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCTSHHYSAMDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 7) (ее кодирует нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 10)
OTSMAb01, нуклеотидная последовательность вариабельной области тяжелой цепи:
5'-GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGT CAAGTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGT GAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATG GTAATACTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGTGTAACAGCAGACACA TCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTC TATTACTGTACTAGTCACCATTACTCTGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCA GTCACCGTCTCCTCA-3' (SEQ ID NO: 10)
OTSMAb01, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (за исключением сигнальной последовательности):
DVVMTQTPLSLPVSLRDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLIISRVEAEDLGVYFCSQSTYVPLTFGAGTKLELKRAD (SEQ ID NO: 8) (ее кодирует нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 11)
OTSMAb01, нуклеотидная последовательность вариабельной области легкой цепи:
5'-GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTAGAGATCA AGCCTCCATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTA TTTACATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAACTCCTGATCTACAAAGT TTCCAACCGATTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAG ATTTCACACTCATAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCT CTCAAAGTACATATGTTCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAAC GGGCTGAT-3' (SEQ ID NO: 11)
Последовательности CDR антитела по настоящему изобретению (OTSMAb01), которые определяли в соответствии с определением Kabat, представляют собой следующее:
CDR1 тяжелой цепи (CDR-H1): DYYMH (SEQ ID NO: 1);
CDR2 тяжелой цепи (CDR-H2): WIDPENGNTIYDPKFQG (SEQ ID NO: 2);
CDR3 тяжелой цепи (CDR-H3): HHYSAMDY (SEQ ID NO: 3);
CDR1 легкой цепи (CDR-L1): RSSQSLVHSNGNTYLH (SEQ ID NO: 4);
CDR2 легкой цепи (CDR-L2): KVSNRFS (SEQ ID NO: 5); и
CDR3 легкой цепи (CDR-L3): SQSTYVPLT (SEQ ID NO: 6).
Промышленная применимость
В настоящем изобретении преуспели в получении антител против MELK, способных обнаруживать белок MELK в образцах, выделенных у субъектов, таких как клинические образцы, с высокой специфичностью. Используя антитела против MELK по настоящему изобретению, можно обнаруживать белок MELK в образце с высокой чувствительностью и низким фоном. Следовательно, антитела по настоящему изобретению можно использовать при диагностировании MELK-ассоциированных заболеваний, таких как MELK-экспрессирующая злокачественная опухоль. Кроме того, поскольку антитела по настоящему изобретению могут обнаруживать MELK в соответствии с уровнем экспрессии MELK в образцах, их также можно использовать при скрининге субъектов, у которых ингибитор MELK имеет высокий терапевтический эффект (диагностирование перед лечением), и для определения эффекта лекарственного средства после лечения с использованием ингибитора MELK у субъектов (диагностирование после лечения).
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  ONCOTHERAPY SCIENCE, INC.
<120>  МОНОКЛОНАЛЬНОЕ АНТИТЕЛО ПРОТИВ MELK И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
<130>  ONC-A1606P
<150>  JP 2016-169085
<151>  2016-08-31
<160>  22
<170>  PatentIn версии 3.5
<210>  1
<211>  5
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH CDR1
<400>  1
Asp Tyr Tyr Met His
1               5
<210>  2
<211>  17
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH CDR2
<400>  2
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly
<210>  3
<211>  8
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VH CDR3
<400>  3
His His Tyr Ser Ala Met Asp Tyr
1               5
<210>  4
<211>  16
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL CDR1
<400>  4
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1               5                   10                  15
<210>  5
<211>  7
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL CDR2
<400>  5
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1               5
<210>  6
<211>  9
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  VL CDR
<400>  6
Ser Gln Ser Thr Tyr Val Pro Leu Thr
1               5
<210>  7
<211>  117
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариабельная область H-цепи
<400>  7
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Lys Ala Ser Val Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Ser His His Tyr Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  8
<211>  115
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Вариабельная область L-цепи
<400>  8
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Arg
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr Tyr Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105                 110
Arg Ala Asp
115
<210>  9
<211>  338
<212>  Белок
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Фрагмент MELK для иммуногена
<400>  9
Met Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Val Glu Trp Gln Ser Lys Asn Pro Phe
1               5                   10                  15
Ile His Leu Asp Asp Asp Cys Val Thr Glu Leu Ser Val His His Arg
20                  25                  30
Asn Asn Arg Gln Thr Met Glu Asp Leu Ile Ser Leu Trp Gln Tyr Asp
35                  40                  45
His Leu Thr Ala Thr Tyr Leu Leu Leu Leu Ala Lys Lys Ala Arg Gly
50                  55                  60
Lys Pro Val Arg Leu Arg Leu Ser Ser Phe Ser Cys Gly Gln Ala Ser
65                  70                  75                  80
Ala Thr Pro Phe Thr Asp Ile Lys Ser Asn Asn Trp Ser Leu Glu Asp
85                  90                  95
Val Thr Ala Ser Asp Lys Asn Tyr Val Ala Gly Leu Ile Asp Tyr Asp
100                 105                 110
Trp Cys Glu Asp Asp Leu Ser Thr Gly Ala Ala Thr Pro Arg Thr Ser
115                 120                 125
Gln Phe Thr Lys Tyr Trp Thr Glu Ser Asn Gly Val Glu Ser Lys Ser
130                 135                 140
Leu Thr Pro Ala Leu Cys Arg Thr Pro Ala Asn Lys Leu Lys Asn Lys
145                 150                 155                 160
Glu Asn Val Tyr Thr Pro Lys Ser Ala Val Lys Asn Glu Glu Tyr Phe
165                 170                 175
Met Phe Pro Glu Pro Lys Thr Pro Val Asn Lys Asn Gln His Lys Arg
180                 185                 190
Glu Ile Leu Thr Thr Pro Asn Arg Tyr Thr Thr Pro Ser Lys Ala Arg
195                 200                 205
Asn Gln Cys Leu Lys Glu Thr Pro Ile Lys Ile Pro Val Asn Ser Thr
210                 215                 220
Gly Thr Asp Lys Leu Met Thr Gly Val Ile Ser Pro Glu Arg Arg Cys
225                 230                 235                 240
Arg Ser Val Glu Leu Asp Leu Asn Gln Ala His Met Glu Glu Thr Pro
245                 250                 255
Lys Arg Lys Gly Ala Lys Val Phe Gly Ser Leu Glu Arg Gly Leu Asp
260                 265                 270
Lys Val Ile Thr Val Leu Thr Arg Ser Lys Arg Lys Gly Ser Ala Arg
275                 280                 285
Asp Gly Pro Arg Arg Leu Lys Leu His Tyr Asn Val Thr Thr Thr Arg
290                 295                 300
Leu Val Asn Pro Asp Gln Leu Leu Asn Glu Ile Met Ser Ile Leu Pro
305                 310                 315                 320
Lys Lys His Val Asp Phe Val Gln Lys Gly Tyr Thr Leu Lys Cys Gln
325                 330                 335
Thr Gln
<210>  10
<211>  351
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области H-цепи
<400>  10
gaggttcagc tgcagcagtc tggggctgag cttgtgaggc caggggcctt agtcaagttg     60
tcctgcaaag cttctggctt caacattaaa gactactata tgcactgggt gaagcagagg    120
cctgaacagg gcctggagtg gattggatgg attgatcctg agaatggtaa tactatatat    180
gacccgaagt tccagggcaa ggccagtgta acagcagaca catcctccaa cacagcctac    240
ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtac tagtcaccat    300
tactctgcta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc a             351
<210>  11
<211>  345
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  последовательность нуклеиновой кислоты вариабельной области L-цепи
<400>  11
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttagaga tcaagcctcc     60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg    120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaaa ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt    180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcataatc    240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaagtac atatgttccg    300
ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacggg ctgat                    345
<210>  12
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственно синтезированная последовательность прямого праймера для MELK
<400>  12
atgatcacct cacggcta                                                   18
<210>  13
<211>  17
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственно синтезированная последовательность обратного праймера для MELK
<400>  13
aggtgttctg cataagg                                                    17
<210>  14
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственно синтезированная последовательность прямого праймера
для бета-актина
<400>  14
aggatgcaga aggagatcac                                                 20
<210>  15
<211>  20
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственно синтезированная последовательность обратного праймера
для бета-актина
<400>  15
agaaagggtg taacgcaact                                                 20
<210>  16
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственно синтезированная последовательность 3'-праймера для VH
<400>  16
ctgggaaggt gtgcacac                                                   18
<210>  17
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственно синтезированная последовательность 3'-праймера для VL
<400>  17
gttgttcaag aagcacacga c                                               21
<210>  18
<211>  36
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственно синтезированная последовательность 5'-праймера для VH и VL
<220>
<221>  смешанные признаки
<222>  (24)..(25)
<223>  n представляет собой инозин
<220>
<221>  смешанные признаки
<222>  (29)..(30)
<223>  n представляет собой инозин
<220>
<221>  смешанные признаки
<222>  (34)..(35)
<223>  n представляет собой инозин
<400>  18
ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng                               36
<210>  19
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственно синтезированная последовательность 3'-праймера для VH
<400>  19
tggacaggga tccagagttc c                                               21
<210>  20
<211>  25
<212>  ДНК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Искусственно синтезированная последовательность 3'-праймера для VL
<400>  20
cagatgttaa ctgctcactg gatgg                                           25
<210>  21
<211>  2486
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  CDS
<222>  (185)..(2140)
<300>
<308>  № доступа Genbank NM_014791.3
<309>  2015-09-25
<313>  (1)..(2486)
<400>  21
gagatttgat tcccttggcg ggcggaagcg gccacaaccc ggcgatcgaa aagattctta     60
ggaacgccgt accagccgcg tctctcagga cagcaggccc ctgtccttct gtcgggcgcc    120
gctcagccgt gccctccgcc cctcaggttc tttttctaat tccaaataaa cttgcaagag    180
gact atg aaa gat tat gat gaa ctt ctc aaa tat tat gaa tta cat gaa     229
Met Lys Asp Tyr Asp Glu Leu Leu Lys Tyr Tyr Glu Leu His Glu
1               5                   10                  15
act att ggg aca ggt ggc ttt gca aag gtc aaa ctt gcc tgc cat atc      277
Thr Ile Gly Thr Gly Gly Phe Ala Lys Val Lys Leu Ala Cys His Ile
20                  25                  30
ctt act gga gag atg gta gct ata aaa atc atg gat aaa aac aca cta      325
Leu Thr Gly Glu Met Val Ala Ile Lys Ile Met Asp Lys Asn Thr Leu
35                  40                  45
ggg agt gat ttg ccc cgg atc aaa acg gag att gag gcc ttg aag aac      373
Gly Ser Asp Leu Pro Arg Ile Lys Thr Glu Ile Glu Ala Leu Lys Asn
50                  55                  60
ctg aga cat cag cat ata tgt caa ctc tac cat gtg cta gag aca gcc      421
Leu Arg His Gln His Ile Cys Gln Leu Tyr His Val Leu Glu Thr Ala
65                  70                  75
aac aaa ata ttc atg gtt ctt gag tac tgc cct gga gga gag ctg ttt      469
Asn Lys Ile Phe Met Val Leu Glu Tyr Cys Pro Gly Gly Glu Leu Phe
80                  85                  90                  95
gac tat ata att tcc cag gat cgc ctg tca gaa gag gag acc cgg gtt      517
Asp Tyr Ile Ile Ser Gln Asp Arg Leu Ser Glu Glu Glu Thr Arg Val
100                 105                 110
gtc ttc cgt cag ata gta tct gct gtt gct tat gtg cac agc cag ggc      565
Val Phe Arg Gln Ile Val Ser Ala Val Ala Tyr Val His Ser Gln Gly
115                 120                 125
tat gct cac agg gac ctc aag cca gaa aat ttg ctg ttt gat gaa tat      613
Tyr Ala His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Phe Asp Glu Tyr
130                 135                 140
cat aaa tta aag ctg att gac ttt ggt ctc tgt gca aaa ccc aag ggt      661
His Lys Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Leu Cys Ala Lys Pro Lys Gly
145                 150                 155
aac aag gat tac cat cta cag aca tgc tgt ggg agt ctg gct tat gca      709
Asn Lys Asp Tyr His Leu Gln Thr Cys Cys Gly Ser Leu Ala Tyr Ala
160                 165                 170                 175
gca cct gag tta ata caa ggc aaa tca tat ctt gga tca gag gca gat      757
Ala Pro Glu Leu Ile Gln Gly Lys Ser Tyr Leu Gly Ser Glu Ala Asp
180                 185                 190
gtt tgg agc atg ggc ata ctg tta tat gtt ctt atg tgt gga ttt cta      805
Val Trp Ser Met Gly Ile Leu Leu Tyr Val Leu Met Cys Gly Phe Leu
195                 200                 205
cca ttt gat gat gat aat gta atg gct tta tac aag aag att atg aga      853
Pro Phe Asp Asp Asp Asn Val Met Ala Leu Tyr Lys Lys Ile Met Arg
210                 215                 220
gga aaa tat gat gtt ccc aag tgg ctc tct ccc agt agc att ctg ctt      901
Gly Lys Tyr Asp Val Pro Lys Trp Leu Ser Pro Ser Ser Ile Leu Leu
225                 230                 235
ctt caa caa atg ctg cag gtg gac cca aag aaa cgg att tct atg aaa      949
Leu Gln Gln Met Leu Gln Val Asp Pro Lys Lys Arg Ile Ser Met Lys
240                 245                 250                 255
aat cta ttg aac cat ccc tgg atc atg caa gat tac aac tat cct gtt      997
Asn Leu Leu Asn His Pro Trp Ile Met Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Val
260                 265                 270
gag tgg caa agc aag aat cct ttt att cac ctc gat gat gat tgc gta     1045
Glu Trp Gln Ser Lys Asn Pro Phe Ile His Leu Asp Asp Asp Cys Val
275                 280                 285
aca gaa ctt tct gta cat cac aga aac aac agg caa aca atg gag gat     1093
Thr Glu Leu Ser Val His His Arg Asn Asn Arg Gln Thr Met Glu Asp
290                 295                 300
tta att tca ctg tgg cag tat gat cac ctc acg gct acc tat ctt ctg     1141
Leu Ile Ser Leu Trp Gln Tyr Asp His Leu Thr Ala Thr Tyr Leu Leu
305                 310                 315
ctt cta gcc aag aag gct cgg gga aaa cca gtt cgt tta agg ctt tct     1189
Leu Leu Ala Lys Lys Ala Arg Gly Lys Pro Val Arg Leu Arg Leu Ser
320                 325                 330                 335
tct ttc tcc tgt gga caa gcc agt gct acc cca ttc aca gac atc aag     1237
Ser Phe Ser Cys Gly Gln Ala Ser Ala Thr Pro Phe Thr Asp Ile Lys
340                 345                 350
tca aat aat tgg agt ctg gaa gat gtg acc gca agt gat aaa aat tat     1285
Ser Asn Asn Trp Ser Leu Glu Asp Val Thr Ala Ser Asp Lys Asn Tyr
355                 360                 365
gtg gcg gga tta ata gac tat gat tgg tgt gaa gat gat tta tca aca     1333
Val Ala Gly Leu Ile Asp Tyr Asp Trp Cys Glu Asp Asp Leu Ser Thr
370                 375                 380
ggt gct gct act ccc cga aca tca cag ttt acc aag tac tgg aca gaa     1381
Gly Ala Ala Thr Pro Arg Thr Ser Gln Phe Thr Lys Tyr Trp Thr Glu
385                 390                 395
tca aat ggg gtg gaa tct aaa tca tta act cca gcc tta tgc aga aca     1429
Ser Asn Gly Val Glu Ser Lys Ser Leu Thr Pro Ala Leu Cys Arg Thr
400                 405                 410                 415
cct gca aat aaa tta aag aac aaa gaa aat gta tat act cct aag tct     1477
Pro Ala Asn Lys Leu Lys Asn Lys Glu Asn Val Tyr Thr Pro Lys Ser
420                 425                 430
gct gta aag aat gaa gag tac ttt atg ttt cct gag cca aag act cca     1525
Ala Val Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Met Phe Pro Glu Pro Lys Thr Pro
435                 440                 445
gtt aat aag aac cag cat aag aga gaa ata ctc act acg cca aat cgt     1573
Val Asn Lys Asn Gln His Lys Arg Glu Ile Leu Thr Thr Pro Asn Arg
450                 455                 460
tac act aca ccc tca aaa gct aga aac cag tgc ctg aaa gaa act cca     1621
Tyr Thr Thr Pro Ser Lys Ala Arg Asn Gln Cys Leu Lys Glu Thr Pro
465                 470                 475
att aaa ata cca gta aat tca aca gga aca gac aag tta atg aca ggt     1669
Ile Lys Ile Pro Val Asn Ser Thr Gly Thr Asp Lys Leu Met Thr Gly
480                 485                 490                 495
gtc att agc cct gag agg cgg tgc cgc tca gtg gaa ttg gat ctc aac     1717
Val Ile Ser Pro Glu Arg Arg Cys Arg Ser Val Glu Leu Asp Leu Asn
500                 505                 510
caa gca cat atg gag gag act cca aaa aga aag gga gcc aaa gtg ttt     1765
Gln Ala His Met Glu Glu Thr Pro Lys Arg Lys Gly Ala Lys Val Phe
515                 520                 525
ggg agc ctt gaa agg ggg ttg gat aag gtt atc act gtg ctc acc agg     1813
Gly Ser Leu Glu Arg Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Leu Thr Arg
530                 535                 540
agc aaa agg aag ggt tct gcc aga gac ggg ccc aga aga cta aag ctt     1861
Ser Lys Arg Lys Gly Ser Ala Arg Asp Gly Pro Arg Arg Leu Lys Leu
545                 550                 555
cac tat aac gtg act aca act aga tta gtg aat cca gat caa ctg ttg     1909
His Tyr Asn Val Thr Thr Thr Arg Leu Val Asn Pro Asp Gln Leu Leu
560                 565                 570                 575
aat gaa ata atg tct att ctt cca aag aag cat gtt gac ttt gta caa     1957
Asn Glu Ile Met Ser Ile Leu Pro Lys Lys His Val Asp Phe Val Gln
580                 585                 590
aag ggt tat aca ctg aag tgt caa aca cag tca gat ttt ggg aaa gtg     2005
Lys Gly Tyr Thr Leu Lys Cys Gln Thr Gln Ser Asp Phe Gly Lys Val
595                 600                 605
aca atg caa ttt gaa tta gaa gtg tgc cag ctt caa aaa ccc gat gtg     2053
Thr Met Gln Phe Glu Leu Glu Val Cys Gln Leu Gln Lys Pro Asp Val
610                 615                 620
gtg ggt atc agg agg cag cgg ctt aag ggc gat gcc tgg gtt tac aaa     2101
Val Gly Ile Arg Arg Gln Arg Leu Lys Gly Asp Ala Trp Val Tyr Lys
625                 630                 635
aga tta gtg gaa gac atc cta tct agc tgc aag gta taa ttgatggatt      2150
Arg Leu Val Glu Asp Ile Leu Ser Ser Cys Lys Val
640                 645                 650
cttccatcct gccggatgag tgtgggtgtg atacagccta cataaagact gttatgatcg   2210
ctttgatttt aaagttcatt ggaactacca acttgtttct aaagagctat cttaagacca   2270
atatctcttt gtttttaaac aaaagatatt attttgtgta tgaatctaaa tcaagcccat   2330
ctgtcattat gttactgtct tttttaatca tgtggttttg tatattaata attgttgact   2390
ttcttagatt cacttccata tgtgaatgta agctcttaac tatgtctctt tgtaatgtgt   2450
aatttctttc tgaaataaaa ccatttgtga atatag                             2486
<210>  22
<211>  651
<212>  Белок
<213>  Homo sapiens
<400>  22
Met Lys Asp Tyr Asp Glu Leu Leu Lys Tyr Tyr Glu Leu His Glu Thr
1               5                   10                  15
Ile Gly Thr Gly Gly Phe Ala Lys Val Lys Leu Ala Cys His Ile Leu
20                  25                  30
Thr Gly Glu Met Val Ala Ile Lys Ile Met Asp Lys Asn Thr Leu Gly
35                  40                  45
Ser Asp Leu Pro Arg Ile Lys Thr Glu Ile Glu Ala Leu Lys Asn Leu
50                  55                  60
Arg His Gln His Ile Cys Gln Leu Tyr His Val Leu Glu Thr Ala Asn
65                  70                  75                  80
Lys Ile Phe Met Val Leu Glu Tyr Cys Pro Gly Gly Glu Leu Phe Asp
85                  90                  95
Tyr Ile Ile Ser Gln Asp Arg Leu Ser Glu Glu Glu Thr Arg Val Val
100                 105                 110
Phe Arg Gln Ile Val Ser Ala Val Ala Tyr Val His Ser Gln Gly Tyr
115                 120                 125
Ala His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Phe Asp Glu Tyr His
130                 135                 140
Lys Leu Lys Leu Ile Asp Phe Gly Leu Cys Ala Lys Pro Lys Gly Asn
145                 150                 155                 160
Lys Asp Tyr His Leu Gln Thr Cys Cys Gly Ser Leu Ala Tyr Ala Ala
165                 170                 175
Pro Glu Leu Ile Gln Gly Lys Ser Tyr Leu Gly Ser Glu Ala Asp Val
180                 185                 190
Trp Ser Met Gly Ile Leu Leu Tyr Val Leu Met Cys Gly Phe Leu Pro
195                 200                 205
Phe Asp Asp Asp Asn Val Met Ala Leu Tyr Lys Lys Ile Met Arg Gly
210                 215                 220
Lys Tyr Asp Val Pro Lys Trp Leu Ser Pro Ser Ser Ile Leu Leu Leu
225                 230                 235                 240
Gln Gln Met Leu Gln Val Asp Pro Lys Lys Arg Ile Ser Met Lys Asn
245                 250                 255
Leu Leu Asn His Pro Trp Ile Met Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Val Glu
260                 265                 270
Trp Gln Ser Lys Asn Pro Phe Ile His Leu Asp Asp Asp Cys Val Thr
275                 280                 285
Glu Leu Ser Val His His Arg Asn Asn Arg Gln Thr Met Glu Asp Leu
290                 295                 300
Ile Ser Leu Trp Gln Tyr Asp His Leu Thr Ala Thr Tyr Leu Leu Leu
305                 310                 315                 320
Leu Ala Lys Lys Ala Arg Gly Lys Pro Val Arg Leu Arg Leu Ser Ser
325                 330                 335
Phe Ser Cys Gly Gln Ala Ser Ala Thr Pro Phe Thr Asp Ile Lys Ser
340                 345                 350
Asn Asn Trp Ser Leu Glu Asp Val Thr Ala Ser Asp Lys Asn Tyr Val
355                 360                 365
Ala Gly Leu Ile Asp Tyr Asp Trp Cys Glu Asp Asp Leu Ser Thr Gly
370                 375                 380
Ala Ala Thr Pro Arg Thr Ser Gln Phe Thr Lys Tyr Trp Thr Glu Ser
385                 390                 395                 400
Asn Gly Val Glu Ser Lys Ser Leu Thr Pro Ala Leu Cys Arg Thr Pro
405                 410                 415
Ala Asn Lys Leu Lys Asn Lys Glu Asn Val Tyr Thr Pro Lys Ser Ala
420                 425                 430
Val Lys Asn Glu Glu Tyr Phe Met Phe Pro Glu Pro Lys Thr Pro Val
435                 440                 445
Asn Lys Asn Gln His Lys Arg Glu Ile Leu Thr Thr Pro Asn Arg Tyr
450                 455                 460
Thr Thr Pro Ser Lys Ala Arg Asn Gln Cys Leu Lys Glu Thr Pro Ile
465                 470                 475                 480
Lys Ile Pro Val Asn Ser Thr Gly Thr Asp Lys Leu Met Thr Gly Val
485                 490                 495
Ile Ser Pro Glu Arg Arg Cys Arg Ser Val Glu Leu Asp Leu Asn Gln
500                 505                 510
Ala His Met Glu Glu Thr Pro Lys Arg Lys Gly Ala Lys Val Phe Gly
515                 520                 525
Ser Leu Glu Arg Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Leu Thr Arg Ser
530                 535                 540
Lys Arg Lys Gly Ser Ala Arg Asp Gly Pro Arg Arg Leu Lys Leu His
545                 550                 555                 560
Tyr Asn Val Thr Thr Thr Arg Leu Val Asn Pro Asp Gln Leu Leu Asn
565                 570                 575
Glu Ile Met Ser Ile Leu Pro Lys Lys His Val Asp Phe Val Gln Lys
580                 585                 590
Gly Tyr Thr Leu Lys Cys Gln Thr Gln Ser Asp Phe Gly Lys Val Thr
595                 600                 605
Met Gln Phe Glu Leu Glu Val Cys Gln Leu Gln Lys Pro Asp Val Val
610                 615                 620
Gly Ile Arg Arg Gln Arg Leu Lys Gly Asp Ala Trp Val Tyr Lys Arg
625                 630                 635                 640
Leu Val Glu Asp Ile Leu Ser Ser Cys Lys Val
645                 650
<---