СОЗДАНИЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СЛИТОГО БЕЛКА (КОМПЛЕКСА Г-КСФ И ЛАКТОФЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА) С ЛИЗИРУЕМОЙ СВЯЗЬЮ

_МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ И КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ_

УДК 577.21:57.089.3:591.3

СОЗДАНИЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СЛИТОГО БЕЛКА

С ЛИЗИРУЕМОЙ СВЯЗЬЮ

Езерский В.А., Колоскова Е.М., Шевченко В.Г., Рябых В.П.

ВНИИ физиологии, биохимии и питания животных, Боровск Калужская обл., Российская Федерация

При получении трансгенных животных, продуцирующих с молоком биологически активные вещества человека фармакологического назначения может происходить нарушение тканеспецифической экспрессии трансгена и попадание этих высокоактивных веществ в кровь плодов, что может приводить к их гибели или к возникновению заболеваний у родившихся животных. Целью исследований было создание конструкции, экспрессирующей гранулоцит-колониестимулирующего фактора человека (hGCSF) в молочной железе млекопитающих в неактивной форме. Была создана конструкция, в которой структурный ген hGCSF слит с геном лактоферрина человека hLF. Для создания новой рекомбинантной плаз-миды, содержащей hGCSF, слитый с hLF, были сконструированы праймеры к гену hGCSF, содержащие уникальный сайт рестрикции для Bsu36I и нуклеотидную последовательность, обеспечивающую синтез аминокислотной последовательности, специфически гидролизуемой бактериальной протеазой (в прямом праймере). Из ранее полученной плазмиды pßLgGCSFcmvEGFP был амплифицирован фрагмент ДНК, содержащий ген hGCSF, который был проклонирован в промежуточный вектор pTZ57R/T. Из трансформированных клеток E. coli TG1 были выделены и наработаны клоны, содержащие pTZ57R/GCSF. Из pTZ57R/GCSF с помощью рестриктазы Bsu36I (EcoSil) выделили ген hGCSF с фрагментом, обеспечивающим формирование аминокислотной последовательности для бактериальной IgA-протеазы. Плазмиду pas1Lf обработали рестриктазой Bsu36I (EcoSiI) и дефосфорилировали щелочной фосфатазой. Фрагмент GCSF/Bsu36I лигировали с подготовленной плазмидой pas1Lf/Bsu36I/AlPh, после чего провели трансформирование клеток E.coli TG1. Выросшие на селективной среде клоны были проверены методом ПЦР-анализа на наличие генов hGCSF и hLF. Выбранный клон был дополнительно подвергнут рестриктному анализу. Плазмида pas1Lf/GCSF предназначается для получения трансгенных животных, продуцирующих в молоко регуляторные белки человека в неактивном состоянии, которые могут быть выделены в активной форме после обработки слитого белка бактериальной протеазой.

Ключевые слова: трансгенные животные, слитый белок, гранулоцит-колониестимули-рующий фактор человека, лактоферрин человека

Проблемы биологии продуктивных животных, 2015, 4: 5-17

Введение

Создание экспрессирующих генно-инженерных конструкций для получения трансгенных животных, продуцирующих с молоком биологически активные вещества лекарственного назначения, - одно из наиболее успешно развиваемых направлений биотехнологии (Lee, Boer, i994; Houdebine, i995; Wall et al.,i996; Niemann, Kues, 2000; Soler et al., 2006; Castro et al., 20i0; Houdebine, 2009; Moura et al., 20ii; Максименко и др., 2013).

Принципиальная возможность получения трансгенных животных, продуцирующих с молоком биологически активные вещества белковой природы, обусловлена механизмом тка-неспецифической экспрессии генов основных белков молока (а^-казеина, Р-казеина и Р-лактоглобулина крупного рогатого скота, Р-казеина козы и Р-лактоглобулина овцы, кислых белков молочной сыворотки (WAP) грызунов (мышь, крыса, кролик), которые обычно используются в качестве промоторов при создании генно-инженерных конструкций (Gordon et al, 1987; Simons et al., 1988; Ebert et al., 1991; Wall et al., 1991; Maga, Murray, 1995).

При получении биологически активных веществ (БАВ) человека фармакологического назначения с молоком животных наибольший интерес представляют цитокины и другие ре-гуляторные высокоактивные белки и пептиды. Это самые дорогостоящие лекарственные вещества. (Lee, Boer, 1994; Wall et al., 1996) Однако при нарушении тканеспецифической экспрессии трансгена происходит попадание этих высокоактивных веществ в кровь плодов, что приводит к возникновению разных видов заболеваний, аналогичных полицитемии и некоторым видам лейкоза, и вызывает гибель этих плодов или болезни у рождённых потомков.

Так, тяжёлая форма эритроцитоза наблюдалась у мышей, трансгенных по гену человеческого эритропоэтина (ЭПО) под собственным промотором (Semenza et al., 1989). При неспецифической экспрессии гена человеческого ЭПО и значительном увеличении его концентрации в крови, у трансгенных мышей наблюдались легочная недостаточность, эритроцитоз и значительное уменьшение сроков жизни мышей - основателей трансгенной линии (Kim et al., 2007).

У трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком гранулоцит-колониестимулирующий фактор человека (чГКСФ), также было отмечено, что высокий уровень экспрессии чГКСФ приводил к проявлению тератогенного эффекта и размножались только линии трансгенных кроликов с низким уровнем экспрессии трансгена (Прокофьев и др., 2002, 2003).

Имеются сообщения о негативном влиянии экспрессии трансгена бутилхолинэстера-зы на продуктивность трансгенных коз (Baldassarre et al., 2011). Поэтому получение трансгенных животных, продуцирующих с молоком высокоактивные БАВ человека, связано с большими трудностями. Попадание этих БАВ в кровь плодов может происходить из-за несовершенства генно-инженерной конструкции («подтекание промотора»), когда тканеспецифи-ческая экспрессия трансгена в молочной железе не является абсолютной и трансген экспрес-сирует в небольших количествах и в клетках других желез. В некоторых случаях даже при использовании удачно созданной конструкции, особенно, при высоком уровне экспрессии трансгена, также может происходить попадание продуктов экспрессии трансгена в кровь плода, т.к. в этом случае экспрессия трансгена может происходить в клетках секреторного эпителия слюнных желез, которые имеют общее происхождение с клетками секреторного эпителия молочной железы.

Исходя из этих фактов, исследователи пытаются найти пути, предотвращающие попадание высокоактивных БАВ человека — продуктов экспрессии трансгена — в кровь плодов и рождённого потомства. Одним из таких путей в настоящее время считается экспрессия трансгеном целевого БАВ в молоко в неактивной форме. В этом случае попадание этого БАВ в кровь не вызовет гибели плода. Предполагается, что экспрессия трансгеном БАВ в неактивной форме может быть достигнута за счёт использования генно-инженерных конструкций, в которых структурный ген целевого БАВ слит с геном какого-то другого, нейтрального белка. В результате экспрессии слившихся трансгенов в молоко продуцируется химерный белковый комплекс, в котором целевой белок, благодаря связи с другим белком, находится в неактивной форме и поэтому не должен оказывать отрицательного влияния на здоровье плода и рождённого животного при попадании этого белкового комплекса в кровь. Для того, чтобы выделить целевой белок из молока в активной форме, необходимо при создании генно-инженерной конструкции между генами, кодирующими эти слитые белки, вставить неболь-

шой участок ДНК, который экспрессировал бы пептид, расщепляемый с помощью соответствующей пептидазы.

Технология слитых белков широко используется во многих прокариотических и эука-риотических экспрессирующих системах для выделения и очистки рекомбинантных белков, что достигается путем присоединения к ним различных фрагментов, которые облегчают процесс выделения целевого белка методом аффинной хроматографии (Pohlner et al., 1993; Pompejus еt al., 1993). Дальнейшие исследования показали, что основные принципы этой технологии могут быть использованы при получении трансгенных животных, продуцирующих БАВ человека с молоком. Например, была создана генно-инженерная конструкция, в которой ген человеческого эритропоэтина (ЭПО) был слит с геном Р-лактоглобулина крупного рогатого скота. Получены трансгенные мыши и кролики, продуцирующие в молоко белковый комплекс, состоящий из ЭПО человека и Р-лактоглобулина КРС, который не оказывал существенного влияния на гематокрит животных продуцентов, что свидетельствует о неактивном состоянии ЭПО человека в этом комплексе. После выделения из молока этого белкового комплекса была получена активная форма ЭПО путем гидролиза специально введенной аминокислотной последовательности, соединяющей два белка, специфической бактериальной протеазой (Korhonen et al., 1997).

Ранее в нашей лаборатории была создана генно-инженерная конструкция, включающая нуклеотидные последовательности гена гранулоцит-колониестимулирующего фактора человека под контролем регуляторных последовательностей гена Р-лактоглобулина крупного рогатого скота (fiLgGCSF) (Езерский и др., 2007), проведены ее испытания в условиях in vitro и in vivo (Тевкин и др., 2010). В последующем в эту конструкцию был внесен репор-тёрный экспрессирующий ген зелёного флуоресцентного белка под цитомегаловирусным промотором (fiLgGCSFcmvEGFP) для изучения интеграции трансгена на различных стадиях онтогенеза у лабораторных и сельскохозяйственных животных. С использованием этой конструкции были получены трансгенные кролики, в молоке у которых содержался грануло-цит-колониестимулирующий фактор человека (hGCSF), при отсутствии его в крови трансгенных кроликов. Однако концентрация hGCSF в молоке этих животных была невысокой (неопубликованные данные). Не исключено, что причиной низкого содержания hGCSF в молоке трансгенных кроликов могло быть проявление тератогенного эффекта, в результате которого размножались только линии трансгенных кроликов с низким уровнем экспрессии трансгена, как было отмечено ранее (Прокофьев и др. 2002, 2003).

Исходя из вышеизложенного, целью исследований было создание генно-инженерной конструкции, экспрессирующей Г-КСФ человека в молочной железе млекопитающих в неактивной форме, в которой структурный ген гранулоцит-колониестимулирующего фактора человека, слит с геном лактоферрина человека с помощью лизируемой связи.

Объекты и методы исследований

За основу конструкции брали плазмиду pas1Lf (Езерский и др., 2004), содержащую 5'и 3'фланкирующие области гена а^-казеина крупного рогатого скота длиной 3017 и 1580 п.н. соответственно и кДНК лактоферрина человека размером 2100 п.н. Ген hGCSF размером 1220 п.н. выделяли из плазмиды pfiLgGCSFcmvEGFP.

Использовали следующие ферменты и реактивы (Fermentas): FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase, 1 ед/мкл; рестриктазы SphI (Pael), BamHI, Bsu15I(C/aI), Bsu36I (Eco81I) (10 ед/мкл); 10Х Buffer Y+/ Tango, 10Х Buffer O; T4 DNA Ligase (5 ед/мкл), 10Х T4 DNA Ligase Buffer. Амплификат клонировали в промежуточный вектор pTZ57R/T (набор Thermo Scientific InsTAclone PCR Cloning Kit (Fermentas)). Выделение плазмидной ДНК проводили по методике и с реагентами набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas) .

Полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) при получени амплификатов и анализе ДНК клонов проводили на амплификаторе ДНК «Терцик» (ООО ДНК-Технология, Москва). Для

отбора положительных клонов после лигирования и трансформации применяли метод ПЦР-амплификации и рестриктного картирования. Отобранные клоны были использованы для наработки и очистки плазмидной ДНК. Временные и температурные параметры ПЦР были подобраны в зависимости от структуры праймеров.

Расщепление плазмидной ДНК рестриктазами и лигирование проводили стандартными методами

Компетентные клетки бактериального штамма E. coli TG1 готовили следующим образом: лиофилизированную культуру E. coli засеивали на ЛБ-агар; с помощью петли несколько колоний переносили в 10 мл ЛБ, получив ночную анаэробную культуру (37оС). Свежей ночной культурой засеивали 25 мл ЛБ и выращивали в течение 3-4 ч на шейкере при 37оС.

Трансформацию компетентных клеток E.coli TG1 проводили по методике и с реагентами набора Transform-Aid Bacterial Transformation Kit (Fermentas). На конечном этапе брали 5(6) мкл лигазной смеси из 50(60) мкл клеточной суспензии в буфере Т(АВ). Трансформированные клетки высевали на твердую селективную среду, содержащую ампициллин (чашки Петри с ЛБ, Ам+) по 10, 15 и 25 мкл. Выросшие клоны пересеивали на чашки Петри с ЛБ, Ам +. ДНК из клонов для ПЦР-анализа выделяли с помощью лизирующей смеси с протеиназой К, инкубировали при 50оС и инактивировали протеиназу К при 90оС по 15 мин.

ПЦР-амплификат hGCSF, рестриктированные плазмидные ДНК после препаративного электрофореза выделяли из агарозного геля (АГ) с помощью набора Gene JET Gel Extraction Kit (Fermentas). ДНК снимали элюирующим буфером из набора (10 мМ Трис-HCl, pH 8,5).

Качество и количество выделенных плазмид и фрагментов оценивали визуально в УФ свете после электрофореза образцов в АГ. Электрофорез проводили в горизонтальном агарозном геле, содержащем бромистый этидий, с применением ><0,5 Трис-боратного буфера (ТВЕ), рН 8,0 с бромистым этидием, используя набор оборудования фирмы Hoeffer (USA). Размер ДНК в АГ оценивали используя в качестве стандарта DNA Ladder Mix (Fermentas).

Результаты и обсуждение

Выбор составных частей конструкции. Существует множество протеаз с различной специфичностью, которые могут быть использованы для разделения слитых белков. Нами была выбрана бактериальная протеаза, специфичная для IgAI человека. Выбор IgA протеазы был обусловлен тем, что она не содержится в тканях млекопитающих; тем самым уменьшается риск расщепления слитого белка и превращения его в активную форму в организме животного-продуцента. Источником IgA протеаз могут быть различные виды патогенных бактерий (напр., рода Neisseria, в частности, Neisseria gonorrhoea и Neisseria meningititis, или рода Haemophilus - Haemophilus influenzae и Haemophilus aegyptious), которые развиваются на слизистых оболочках различных органов человека и выделяют протеазы, специфичные для IgAI человека (IgA-протеазы или игазы).

По данным ряда авторов (Pohlner et al., 1987, 1992; Wood et al., 1991), IgA-протеаза расщепляет следующие последовательности распознавания:

1. Pro-Ala-Pro-|-Ser-Pro

2. Pro-Pro-|-Ser-Pro

3. Pro-Pro-|-Ala-Pro

4. Pro-Pro-|-Thr-Pro

Символ (-|- ) обозначает точку расщепление пептида IgA-протеазой. Таким образом, для специфического расщепления последовательности IgA-протеазой в переходную область слитого белка необходимо ввести последовательности расщепления Pro-|-X-Pro, где Х - преимущественно аминокислоты серин, треонин и аланин (Ser, Thr, Ala). С учетом того, что

последовательность зрелого G-CSF человека начинается с аминокислот Thr(+l) и Pro(+2) (положения аминокислот +1 и +2) предпочтительными вариантами для создания последовательности расщепления являются следующие: в положении -1 и -2 - Pro-Pro, в положении от -3 до -l — последовательность аминокислот Arg-Pro-Pro, в положении от -4 до -l — последовательность Pro-Arg-Pro-Pro или в положении от -5 до -l — последовательность Ala-Pro-Arg-Pro-Pro. В особенно предпочтительном варианте последовательность содержит в положении от -6 до -l следующие аминокислоты: Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.

Методика получения IgA-протеазы из Neisseria gonorrhoea MS11 в аутентичном штамме бактерий и в грамотрицательных клетках хозяина и клонирование последовательности, кодирующей IgA-протеазу, была подробно изложена (Pohlner et al., 1987). В настоящее время для исследовательских целей чаще всего используется коммерчески доступная рекомби-нантная IgA-протеаза фирмы MoBiTec GmbH (Германия).

Исходя из вышеизложенного, при создании генно-инженерной конструкции, экспрес-сирующей химерный комплекс белков, для соединения белков между собой была выбрана нуклеотидная последовательность, кодирующая следующие аминокислоты: Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro.

В качестве второго белка, входящего в этот комплекс, был выбран лактоферрин человека (hLf). Выбор гена hLf в качестве компонента для слияния обусловлен следующими причинами: 1) лактоферрин даже в очень высоких концентрациях нетоксичен для животного-продуцента; 2) в нашей лаборатории разработана и используется собственная ИФА тест-система для оценки количества hLf в молоке трансгенных животных (Езерский и др., 2012); 3) имеется возможность получения достаточного количества собственных поликлональных антител против hLf, которые необходимы для выделения и очистки слитого белка hLF/hGCSF методом аффинной хроматографии; 4) лактоферрин также является ценным БАВ фармакологического назначения.

2. Подбор праймеров для создания слитого гена. Для создания новой рекомбинантной плазмиды, содержащей ген hGCSF, слитого с геном hLF через сайт для бактериальной IgA протеазы, с помощью компьютерной программы Vector NTI 9 провели анализ сайтов рестрикции плазмиды pas1Lf, промежуточной плазмиды для клонирования амплификатов pTZ57R/T и гена hGCSF. Предметом анализа был выбор уникальных сайтов рестрикции в последней четверти последовательности кДНК гена hLF, и отсутствие этих же сайтов в клонируемой последовательности гена hGCSF и остальной части плазмиды pas1Lf. Было обнаружено два подходящих сайта — BsmI (3790) и Bsu36I (Eco81I по каталогу Fermentas) (4238), если считать от начала фрагмента 5^1-кДн^^3^1. В качестве уникального сайта был выбран сайт для рестриктазы Bsu36I.

Поиск наличия сайтов рестрикции для Bsu36I в последовательности гена hGCSF по записи AF388025 в GenBank показал наличие трёх сайтов рестрикции в точках: 79, 2209 и 3812. В нужной нам последовательности, соответствующей созревшему белку (фрагмент размером 1220 п.н. — от точки 2306 до точки 3525, включая стоп кодон), сайт для рестриктазы Bsu36I не был обнаружен.

С помощью программы Vector NTI 9, переведя нуклеотидную последовательность в аминокислотную, убедились в отсутствии аминокислотных последовательностей, распознаваемых бактериальной IgA-протеазой в синтезированных белках hLF и hGCSF.

Были подобраны праймеры для амплификации нужного фрагмента гена hGCSF таким образом, чтобы после получения слитого гена hLF и hGCSF сохранялась рамка считывания. При этом в состав прямого и обратного праймеров включили сайты для рестриктазы Bsu36I (Eco81I), а в состав прямого праймера включили ДНК последовательность, обеспечивающую формирование аминокислотной последовательности, распознаваемой бактериальной IgA-протеазой после синтеза рекомбинантного белка (рис. 1).

Рис. 1. Структура прямого и обратного праймеров к гену hGCSF. Белые боксы -дополнительно введенные последовательности с сайтами рестрикции для Bsu361 (прописные буквы) и часть ДНК последовательности, обеспечивающей формирование аминокислотного участка (внутренняя рамка), распознаваемого бактериальной ^Л-протеазой после синтеза рекомбинантного белка. Черные боксы - последовательности, соответствующие 5'- и 3 '-концам гена hGCSF (курсив). Первые шесть нуклеотидов начала последовательности ГКСФ - конец для сайта узнавания ^Л протеазой. Приведена аминокислотная последовательность гидролизуемого IgA-протеазой фрагмента (отсчет от места гидролиза или начала белка hGCSF).

3. Подбор условий ПЦР для праймеров ОСЕ1401 и ОСЕ1402. Из ранее созданной в лаборатории плазмиды pвLgGСSFcmvEGFP с помощью подобранных праймеров был ампли-фицирован фрагмент ДНК, содержащий ген hGCSF. Были подобраны следующие условия для проведения амплификации: денатурация ДНК при 94оС - 45 с, отжиг праймеров при 64оС — 1 мин, синтез при 72оС - 1 мин 30 с, элонгация при 72оС — 2 мин, всего 26 циклов.

Размер амплифицированного участка составил около 1200 п.н., что соответствовало ожидаемой величине фрагмента. Состав реакционной смеси для проведения препаративной амплификации фрагмента:

Компоненты мкл/20 мкл смеси

1 Taq buf, х10 2

2 dNTP, х10 1,5

3 GCE1401 (3 пмоль/мкл) 1

4 GCE1402 (3 пмоль/мкл) 1

5 H2O 12,7

6 TaqPol (5 ед/мкл) 0,3

7 pßLgGCSFcmvEGFP, 0,5 нг/мкл 1

Амплификат выделяли методом препаративного электрофореза (рис. 2А) и концентрировали (рис. 2Б). Концентрация фрагмента составила около 60 нг/мкл.

123 4 5678 12 Рис. 2. Препаративный электрофорез ам-

плификата фрагмента hGCSF, ограниченного праймерами GCE1401- GCE1402 0,8% агарозный гель, х 0,5ТБЕ А) Дор. 1-7 - ПЦР- амплификат; дор.8 -маркер размеров ДНК Б) Дор.1 - маркер размеров ДНК; дор.2 -выделенный и очищенный амплификат.

4. Получение плазмиды pTZ/GCSF. Амплификат был проклонирован в промежуточный вектор pTZ57R/T по инструкции к набору Thermo Scientific InsTAclone PCR Cloning Kit (Fermentas). В результате трансформации компетентных клеток E.coli TG1, выполненной c помощью компонентов того же набора, получили клоны, выросшие на селективной среде с

ампициллином.

Для препаративного выделения плазмидной ДНК с целью определения клонов, содержащих pTZ/GCSF методом ПЦР, полученные клоны рассеивали на селективной среде. Все клоны содержали фрагмент нужного размера (около 1220 п.н.). После наработки клона №3 из бактериальной массы была выделена рекомбинантная плазмида pTZ/GCSF, содержащая искомый фрагмент. Из этой плазмиды с помощью рестриктазы Bsu36I (£со811) был вырезан ген hGCSF с фрагментом, обеспечивающим формирование аминокислотной последовательности для бактериальной ^А-протеазы (рис. 3). Схема создания промежуточной плазмиды pTZ/GCSF и получения фрагмента GCSF/Bsu36I приведена на рис. 6.

1 2 3 4 5 6 7

-ЗОООпн -

-ЮООпн-

— Б

Рис. 3. Препаративный электрофорез плазмиды pTZ/GCSF, обработанной рестриктазой Bsu361 (Eco811). 0,8% агарозный гель, *0,5ТБЕ. А) дор. 1-6 - рестриктная смесь; дор. 7 — маркер размеров ДНК;

Б) дор.1 - маркер размеров ДНК; дор. 2 - выделенный и очищенный фрагмент GCSF/Bsu361.

5. Получение плазмиды pas1Lf/GCSF. Плазмиду pas1Lf обрабатывали рестриктазой Bsu36I (Eco81I), после чего дефосфорилировали щелочной фосфатазой. Фрагмент GCSF/Bsu36I лигировали с плазмидой pas1Lf/Bsu36I/AlPh по протоколу «sticky-end ligation» руководства Transform-Aid Bacterial Transformation Kit. В результате трансформации компетентных клеток E.coli TG1, выполненной с использованием указанного набора, получили множество клонов, выросших на селективной среде, содержащей ампициллин.

Методом ПЦР-анализа были отобраны клоны, содержащие hGCSF нужного размера (рис. 4). При использовании праймеров GCE1401-GCE1402 получили ожидаемые амплифика-ты размером около 1200 п.н.. При использовании праймеров Lf10 (прямого) и GCE1402 (обратного) получили ожидаемые амплификаты размером около 2000 п.н. (рис. 5).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32

ЗОООпн ЮООпн

Рис. 4. ПЦР-анализ клонов E.coli TG1, трансформированных pas1Lf/GCSF, на наличие вставки hGCSF. 0,8% агарозный гель, *0,5ТБЕ.

Дор. 1-13 - клоны 1-13; дор.14 - pTZ/GCSF (положительный контроль); дор.15, 30 — маркер размеров ДНК; дор.16 - Н2О; дор.17-29, 31,32 — клоны 14-26, 27,28 соответственно.

Рис. 5. ПЦР-анализ hGCSF-положительных клонов E.coli TG1, трансформированных pas1Lf/GCSF, с использованием праймеров Lf10 и GCE1402.

0,8% агарозный гель, *0,5ТБЕ Дор.1-14 - клоны 2-4, 8-10, 14, 16, 17, 19-21, 23,28. Дор.15 — маркер размеров ДНК; дор.16 - Н2О

Рис. 6. Схема получения промежуточной плазмиды pTZ/GCSF, фрагмента GCSF/ Вт361, плазмиды pas1Lf/GCSF и генно-инженерной конструкции as1Lf/GCSF (рядом с обозначением фрагментов указан размер - количество пар нуклеотидов).

Был проведен рестриктный анализ полученной плазмиды pas1Lf/GCSF (рис. 7).

Ферменты Ожидаемый результат

рестрикции

Полученный результат

BamHI, SphI

ClaI

Eco81I

3000+ 8300

11300

1200+10100

3000+ 8300

11300

1200 + 10100

Рис. 7. Рестриктный анализ pas1Lf/GCSF.

0,8% агарозный гель, *0,5ТБЕ

Дор. 1 - pas1Lf/GCSF

Дор. 2 - pas1Lf/GCSF+ BamH1 + Sph1

Дор. 3 - pas1Lf/GCSF+ ао1

Дор. 4 - pas1Lf/GCSF+ Eco811

Дор. 5 - маркер размеров ДНК.

Таким образом, в результате проведенных исследований создана плазмида pas1Lf/GCSF, содержащая ген лактоферрина человека, слитый с геном hGCSF через последовательность, которая должна формировать сайт распознавания для бактериальной ^А-протеазы в аминокислотной последовательности, соединяющей синтезируемые белки.

Линейная конструкция as1Lf/GCSF может быть вырезана из pas1Lf/GCSF рестрикта-зами SphI (PaeI) и BamHI и использована для получения трансгенных животных, продуцирующих высокоактивные регуляторные белки в молоко в неактивном состоянии. Это позволит преодолеть тератогенный эффект продукта экспрессии трансгена, увеличить его продукцию в составе молока и конечный выход целевого белка на этапе выделения и очистки его методом аффинной хроматографии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Езерский В.А., Иванова Л.Б., Шевченко В.Г. Получение плазмиды, содержащей структурный ген лактоферрина человека под контролем регуляторных элементов гена a^-казеина быка // Научные труды ВНИИФБиП. — 2004. - T. 43. — С. 52-67.

2. Езерский В.А., Иванова Л.Б., Шевченко В.Г. Создание генно-инженерной конструкции, содержащей структурный ген GCSF человека под контролем регуляторных элементов гена р-лактоглобулина крупного рогатого скота // Проблемы биологии продуктивных животных. — 2007. — № 1. — С. 123-131.

3. Езерский В.А., Колоскова Е., Трубицина Т.П., Шевченко В.Г., Рябых В.П. Тест-система для определения лактоферрина человека в молоке кроликов с интегрированной в геном конструкцией as1-Cn-hLf // Проблемы биологии продуктивных животных. — 2012. —№ 4. — С. 108-115.

4. Максименко О.Г., Дейкин А.В., Ходарович Ю.М., Георгиев П.Г. Использование трансгенных животных в биотехнологии: перспективы и проблемы // Acta naturae. — 2013. — Т. 5. — № 1.— С. 33-47.

5. Прокофьев М.И., Городецкий С.И., Косоруков В.С., Мезина М.Н., Юткин Е.В., Елагин В.В., Пиню-гина М.Н.. Получение человеческого гранулоцитарного колониестимулирующего фактора с молоком трансгенных животных // Российский биотерапевтический журнал. — 2002. — Т. 3. — № 1. — С. 49-55.

6. Прокофьев М.И., Городецкий С.И., Мезина М.Н., Юткин Е.В., Косоруков В.С., Букреев Ю.М., Ан-типова Т.А., Пинюгина М.Н., Карелина Т.К., Звездин А.В., Краевой С.А. Создание трансгенных кроликов, продуцирующих с молоком человеческий гранулоцитарный колониестимулирующий фактор // Сельскохозяйственная биология. — 2003. — № 6. — С. 49-54.

7. Тевкин С.И., Трубицина Т.П., Езерский В.А., Рябых В.П. Развитие in vitro и интеграция трансгена в геном предимплантационных эмбрионов кролика после микроинъекции различных генно-инженерных конструкций // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2010. - № 3.- С. 86-95.

8. Тевкин С.И, Трубицина Т.П., Шишиморова М.С., Езерский В.А., Рябых В.П.. Частота интеграции трансгена и жизнеспособность кроличьих зигот, микроинъецированных разными генно-инженерными конструкциями // Технологии живых систем. - 2010. - № 7. - С. 42-49.

9. Baldassarre H., Deslauriers J., Neveu N., Bordignon V. Detection of endoplasmic reticulum stress markers and production enhancement treatments in transgenic goats expressing recombinant human butyrylcholinesterase // Transgenic Res. - 2011. - Vol. 20. - No. 6. - P. 1265-72.

10. Bosze Z., Hiripi L., Carnwath J.W., Niemann H. The transgenic rabbit as model for human diseases and as a source of biologically active recombinant proteins // Transgenic Research. - 2003. - Vol. 12. - P. 541553.

11. Castro F.O., Toledo J.R., Sánchez O., Rodríguez L. All roads lead to milk: Transgenic and non-transgenic approaches for expression of recombinant proteins in the mammary gland // Acta Scientiae Veterinariae. -2010. - Vol. 38. - Suppl 2. - P. 615-626.

12. Ebert R.M., Selgrath J.P., DiTullio P., Denman J., Smith T.E., Vitale J.A., Gordon K. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression // Bio/Technology. - 1991. - Vol. 9. - P. 835-842.

13. Gordon K.E., Lee J.A.,Vitale A.E., Smith H., Hennighausen L. Production of human Tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk // Bio/Technolology. - 1987. - Vol. 5. - P. 1183-1189.

14. Houdebine L.M. The production of pharmaceutical proteins from the milk of transgenic animals // Reprod. Nutr. Develop. - 1995. - Vol. 35. - P. 609-617.

15. Houdebine L.M. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals // Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 32. - P. 107-121.

16. Kim M.O., Kim S.H., Shin M.J., Lee D.B., Kim T.W., Kim K.S., Ha J.H., Lee S., Park Y.B., Kim S.J., Ryoo Z.Y. Human erythropoietin induces lung failure and erythrocytosis in transgenic mice // Mol Cells. -2007. - Vol. 23. - No. 1. - P. 17-22.

17. Korhonen V.P, Tolvanen M., Hyttinen J.M., Uusi-Oukari M., Sinervirta R., Alhonen L., Jauhiainen M., Jänne O.A., Jänne J. Expression of bovine beta-lactoglobulin/human erythropoietin fusion protein in the milk of transgenic mice and rabbits // Eur. J. Biochem. - 1997. - Vol. 245. - No. 2. - P. 482-489.

18. Lee S.H., de Boer H.A. Production of biomedical protein in the milk of transgenic dairy cows: state of the art // J. Controlled Release. - 1994. - Vol. 29. - P. 213-218.

19. Maga E.A., Murray J.D. Mammary gland expression of transgenes and the potential for altering the properties of milk // Biotechnology. - 1995. - Vol. 13. - P. 1452-1457.

20. Moura R.R., Melo L.M., and Freitas V.J.F. Production of recombinant proteins in milk of transgenic and non-transgenic goats // Braz. Arch. Biol. Technol. - 2011. - Vol. 54. - No. 5. - P. 927-938.

21. Niemann H., Kues W.A. Transgenic livestock: premises and promises // Anim. Reprod. Sci. - 2000. - Vol. 66. - P. 277-293.

22. Pohlner J., Halter R., Beyreuther K., Meyer T.F. Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease // Nature. - 1987. - Vol. 325. - No. 6103. - P. 458-62.

23. Pohlner J., Klauser T., Kuttler E., Halter R. Sequence-specific cleavage of protein fusions using a recombinant Neisseria type 2 IgA protease // Biotechnology (N.Y).-1992. - Vol. 10. - No. 7. - P. 799-804.

24. Pohlner J., Krämer J., Meyer T.F. A plasmid system for high-level expression and in vitro processing of recombinant proteins // Gene. - 1993. - Vol. 130. - No. 1. - P. 121-126.

25. Pompejus M., Friedrich K., Teufel M., Fritz H.J. High-yield production of bacteriorhodopsin via expression of a synthetic gene in Escherichia coli // Eur. J. Biochem. - 1993. - Vol. 211. - No. 1-2. - P. 27-35.

26. Semenza G.L., Traystman M.D., Gearhart J.D., Antonarakis S.E. Polycythemia in transgenic mice expressing the human erythropoietin gene // Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). - 1989. - Vol. 86. - No. 7. - P. 23012305.

27. Simons J.P.,Wilmut I. Clark A.J., Archibald A.L., Bishop J.O. Gene transfer into sheep // Bio/Technology. - 1988. - Vol. 6. - P. 179-186.

28. Soler E., Thepot D., Rival-Gervier S., Jolivet G., Houdebine L.-M. Preparation of recombinant proteins in milk to improve human and animal health // Reprod. Nutr. Dev. - 2006. - Vol. 46. - P. 579-588.

29. Wall R.J., Pursel V.G., Shamay A., Hennighausen. High-level synthesis of a heterologus milk protein in the mammary glands of transgenic swine // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - Vol. 88. - P. 1696 -1704.

30. Wood S.G., Burton J. Synthetic Peptide Substrates for the Immunoglobulin Al Protease from Neisseria gonorrhoeae (Type 2) // Infection and immunity. - 1991. - Vol. 59. - No. 5. - P. 1818-1822.

31. Zabetian M., Tahmoorespur M., Hosseini Kh. The application of transgenic rabbits in agriculture and biomedicin // Journal of Animal and Veterinary Advances. - 2011. - Vol. 10. - No. 6. - P. 780-790.

REFERENCES

1. Baldassarre H., Deslauriers J., Neveu N., Bordignon V. Detection of endoplasmic reticulum stress markers and production enhancement treatments in transgenic goats expressing recombinant human butyrylcholinesterase. Transgenic Research. 2011, 20(6):1265-72.

2. Bosze Z., Hiripi L., Carnwath J.W. & Niemann H. The transgenic rabbit as model for human diseases and as a source of biologically active recombinant proteins. Transgenic Research. 2003, 12: 541-553.

3. Castro F.O., Toledo J.R., Sánchez O., Rodríguez L. All roads lead to milk: Transgenic and non-transgenic approaches for expression of recombinant proteins in the mammary gland. Acta Scientiae Veterinariae. 2010, 38(Supl 2): 615-626.

4. Ebert R.M., Selgrath J.P., DiTullio P., Denman J., Smith T.E.Vitale J.A.,Gordon K. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression. Bio/Technology. 1991, 9: 835-842.

5. Ezerskii V.A., Ivanova L.B., Shevchenko V.G. [Construction of plazmide, containing structural gene of human lactoferrin under control of regulatory elements of bovine as1-casein gene]. Nauchnye trudy VNIIFBiP - Proc. Inst. of Animal Physiology, Biochemistry & Nutrition. 2004, 43: 52-67. (In Russian).

6. Ezerskii V.A., Ivanova L.B., Shevchenko V.G. [Formation of gene-engineering construction with structural gene of human granulocyte colony stimulating factor under control of regulatory elements of bovine ß-lactoglobulin]. Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology. 2007, 1: 123-131. (In Russian).

7. Ezerskii V.A., Koloskova E., Trubitsina T.P., Shevchenko V.G., Ryabykh V.P. [Determination of human lactoferrin in milk of transgenic rabbit with integrated construction as1-Cn-hLf]. Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology. 2012, 4: 108-115. (In Russian).

8. Gordon K.E., Lee J.A.,Vitale A.E., Smith H., Hennighausen L. Production of human Tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk. Bio/Technolology. 1987, 5: 1183-1189.

9. Houdebine L.M. The production of pharmaceutical proteins from the milk of transgenic animals. Reprod. Nutr. Develop. 1995, 35: 609-617.

10. Houdebine L.M. Production of pharmaceutical proteins by transgenic animals. Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 2009, 32: 107-121.

11. Kim M.O., Kim S.H., Shin M.J., Lee D.B., Kim T.W., Kim K.S., Ha J.H., Lee S., Park Y.B., Kim S.J., Ryoo Z.Y. Human erythropoietin induces lung failure and erythrocytosis in transgenic mice. Mol Cells. 2007, 23(1): 17-22.

12. Korhonen V.P, Tolvanen M., Hyttinen J.M., Uusi-Oukari M., Sinervirta R., Alhonen L., Jauhiainen M., Jänne O.A., Jänne J. Expression of bovine beta-lactoglobulin/human erythropoietin fusion protein in the milk of transgenic mice and rabbits. Eur. J. Biochem. 1997, 245(2): 482-489.

13. Lee S.H. and de Boer H.A. Production of biomedical protein in the milk of transgenic dairy cows: state of theart. J. Controlled Release. 1994, 29: 213-218.

14. Maga E.A., Murray J.D. Mammary gland expression of transgenes and the potential for altering the properties of milk. Biotechnology. 1995, 13: 1452-1457.

15. Maksimenko O. G., A. V. Deikin, Yu. M. Khodarovich, P. G. Georgiev. Acta naturae, 2013, 5(1): 33-47.

16. Moura R.R., Melo L.M., Freitas V.J.F. Production of recombinant proteins in milk of transgenic and non-transgenic goats. Braz. Arch. Biol. Technol. 2011, 54(5): 927-938.

17. Niemann H., Kues W.A. Transgenic livestock: premises and promises. Anim. Reprod. Sci. 2000, 66: 277-293.

18. PohlnerJ., Halter R., Beyreuther K., Meyer T.F. Gene structure and extracellular secretion of Neisseria gonorrhoeae IgA protease. Nature. 1987, 325(6103): 458-62.

19. Pohlner J., Klauser T., Kuttler E., Halter R. Sequence-specific cleavage of protein fusions using a recombinant Neisseria type 2 IgA protease. Protease. Biotechnology (N.Y). 1992. - 10(7): 799-804.

20. Pohlner J., Krämer J., Meyer T.F. A plasmid system for high-level expression and in vitro processing of recombinant proteins. Gene. 1993, 130(1): 121-126.

21. Pompejus M., Friedrich K., Teufel M., Fritz H.J. High-yield production of bacteriorhodopsin via expression of a synthetic gene in Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 1993, 211(1-2): 27-35.

22. Prokof'ev M.I., Gorodetskii S.I., Kosorukov V.S., Mezina M.N., Yutkin E.V., Elagin V.V., Pinyugina M.N. Rossiiskii bioterapevticheskiii zhurnal - Russian Bio-Therapeutic Journal. 2002, 3(1): 49-55. (In Russian).

23. Prokof'ev M.I., Gorodetskii S.I., Mezina M.N., Yutkin E.V., Kosorukov V.S., Bukreev Yu.M., Antipova T.A., Pinyugina M.N., Karelina T.K., Zvezdin A.V., Kraevoi S.A. Sel'skoe khosyaistvo za rubezhom - Agriculture Abroad. 2003, 6: 49-54. (In Russian).

24. Semenza G.L., Traystman M.D., Gearhart J.D., Antonarakis S.E. Polycythemia in transgenic mice expressing the human erythropoietin gene. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA). 1989, 86(7): 2301-2305.

25. Simons J.P.,Wilmut I. Clark A.J., Archibald A.L., Bishop J.O. Gene transfer into sheep. Bio/Technology. 1988, 6: 179-186.

26. Soler E., Thepot D., Rival-Gervier S., Jolivet G., Houdebine L.-M. Preparation of recombinant proteins in milk to improve human and animal health. Reprod. Nutr. Dev. 2006, 46: 579-588.

27. Tevkin S.I., Trubitsina T.P., Ezerskii V.A., Ryabykh V.P. [In vitro development and frequency jf transgene integration into genome of rabbit's preimplantation embryos microinjected by various gene-engineering constructions]. Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology. 2010, 3: 86-95. (In Russian).

28. Tevkin S.I, Trubitsina T.P., Shishimorova M.S., Ezerskii V.A., Ryabykh V.P. [Frequency of integration of a transgene and viability of the rabbit zygotes, microinjection by different genno-engineering designs]. Tekhnologii zhivykh system - Technologies of Live Systems. 2010, 7: 42-49. (In Russian).

29. Wall R.J., Pursel V.G., Shamay A., Hennighausen. High-level synthesis of a heterologus milk protein in the mammary glands of transgenic swine. Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88:1696 -1704.

30. Wood S.G., Burton J. Synthetic Peptide Substrates for the Immunoglobulin Al Protease from Neisseria gonorrhoeae (Type 2). Infection and Immunity. 1991, 59(5): 1818-1822.

31. Zabetian M., Tahmoorespur M., Hosseini Kh. The application of transgenic rabbits in agriculture and bio-medicine. Journal of animal and veterinary advances. Journal of Animal and Veterinary Advances. 2011, 10(6): 780-790.

Creating gene-engineering construction for fused protein (complex of human G-CSF and lactoferrin) with lysed bond

Ezerskii V.A., Koloskova E.M., Shevchenko V.G., Ryabykh V.P.

Institute of Animal Physiology, Biochemistry and Nutrition, Borovsk, Kaluga oblast, Russian Federation

ABSTRACT. After the creation of genetically engineered pharmacologic substances for human, a violation of tissue-specific expression of the transgene can occur, and getting these highly active substances in the blood of the fetus, which can lead to their death or to the emergence of various kinds of disease in offspring. The aim was to create a genetically engineered construction expressing in an inactive form a human granulocyte colony stimulating factor (hGCSF) in the mammary gland of mammals. The construction was created in which the structural human gene hGCSF is fused to the gene of human lactoferrin hLF. To create a new recombinant plasmid containing the gene hGCSF fused to hLF, the primers were constructed to hGCSF, containing a unique Bsu36I restriction site and a nucleotide sequence enabling the synthesis of amino acid sequences specifically hydrolyzable by bacterial protease (in forward primer). From the previously obtained plasmid pfíLgGSSFcmvEGFP, DNA-fragment containing gene hGCSF was amplified and cloned into an intermediate vector pTZ57R/T. From transformed E. coli TG1 cells, the clones containing pTZ57R/GSSF were isolated. From pTZ57R/GSSF using a restriction enzyme Bsu36I (Eco81I), hGCSF gene fragment was allocated, providing formation amino acid sequences for bacterial IgA-protease. The plasmid was treated with restriction enzyme PaslLf Bsu36I (Eco81I) and dephosphorylated with alkaline phosphatase. Fragment of GCSF/Bsu36I was ligated with plasmid pas1Lf/Bsu36I/AlPh, then transforming cells E. coli TG1 were made. Grown on selective medium, the clones were verified by PCR-analysis for the presence of genes hGCSF and hLF. The selected clone was further subjected to restriction analysis. Plasmid pas1Lf/GCSF is intended for production of transgenic animals that produce in milk the human regulatory proteins in an active form, which can be isolated after treatment by bacterial protease.

Keywords: transgenic animals, fused protein, asl-casein, lactoferrin, human granulocyte colony-stimulating factor

Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology, 2015, 4: 5-17

Поступило в редакцию: 20.07.2015 Получено после доработки: 17.09.2015

Езерский Вадим Аркадьевич, н.с., ez.vadim@yandex.ru; Колоскова Елена Михайловна, к.б.н., с.н.с., eleko@km.ru; Шевченко Вилорий Григорьевич, к.б.н., с.н.с.; Рябых Владимир Павлович, д.б.н., проф., зав. лаб., vlt03@kaluga.ru