ХОНДРОИТИН ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В МЕДИЦИНЕ
CHONDROITIN FOR APPLICATION IN MEDICINE

Настоящее изобретение относится к фармацевтическим, нутрицевтическим и космецевтическим композициям или медицинским устройствам, содержащим несульфатированный хондроитин в качестве активного ингредиента.
Предшествующий уровень техники
Хондроитин, метаболический предшественник хондроитинсульфата, представляет собой природный линейный полисахарид, образованный чередующимися остатками N-ацетил-D-галактозамина β-1:4 и D-глюкуроната β-1:3. У позвоночных хондроитин сульфатирован региоселективно по гидроксилам в положении 4 или 6 N-ацетил-D-галактозамина и, в некоторых случаях, по гидроксилам в положении 2 или 3 глюкуроновой кислоты (Sugahara et al., J. Biol. Chem., 1996, 271: 26745-54). Молекулярная масса (MW) хондроитина, и степень и сайты сульфатирования зависят от вида, возраста и типа ткани (Kuettner et al., Eds., в Articular cartilage and osteoarthritis, NY, Raven Press, 1992; Volpi Ed., в Chondroitin sulfate: structure, role and pharmacological activity, S. Diego, California Academic Press - Elsevier Inc, 2006).
Хондроитинсульфат, представляющий собой полисахаридную часть протеогликанов (GAG - гликозаминогликан) различных семейств, связан с сериновым остатком корового белка через тетрасахарид GlcA-Gal-Gal-Xyl. Как и у большинства мембранных белков, биосинтез корового белка GAG начинается в цитозоле, и далее этот полипептид транслоцируется в эндоплазматический ретикулум. Синтез тетрасахаридов начинается в просвете эндоплазматического ретикулума и завершается в аппарате Гольджи, где начинается полимеризация/сульфатирование хондроитинсульфата. Полимеризация осуществляется благодаря согласованному, хорошо организованному действию мультиферментной системы, ассоциированной с мембраной, при этом GalNAc-трансфераза и GlcA-трансфераза поочередно добавляют два остатка сахара на нередуцирующий конец растущей цепи протеогликана, что приводит к образованию цепей хондроитина размером примерно 70 кДа. Сульфатирование полимера осуществляется в аппарате Гольджи; в частности, сульфатирование по положению 6 происходит в медиальном отделе/транс-отделе аппарата Гольджи, тогда как сульфатирование по положению 4 происходит в транс-отделе. Исследованиями, проведенными с препаратами микросом, (Sugumaran and Silbert, J. Biol. Chem. 1990, Oct 25, 265(30): 18284-8) было продемонстрировано, что процесс сульфатирования начинается только через 30 секунд после начала процесса полимеризации хондроитина; в процессе сульфатирования донорным субстратом сульфатной группы является ФАФС (3'-фосфоаденозин-5'-фосфосульфат), образование которого катализируется АТФ(аденозинтрифосфат)-сульфурилазой и АФС(аденилилсульфат)-киназой.
Реакция активации Сахаров и сульфата происходит в цитозоле; активированные формы затем транспортируются в эндоплазматический ретикулум и аппарат Гольджи, где они используются для синтеза хондроитинсульфата.
GAG во внеклеточном матриксе принимают очень объемные конформации, образуя пористые гели, к которым притягиваются катионы и вода. За счет этого GAG способствуют гидратации и увеличению объема тканей, делая матрикс подходящим для того, чтобы он выдерживал даже большие силы сжатия.
Хондроитинсульфат имеется не только у позвоночных, но также и у данио-рерио, нематод и насекомых. Некоторые бактерии также продуцируют сопоставимые с хондроитином полимеры в качестве компонентов их капсул. В отличие от позвоночных, эти полисахариды не находятся в виде протеогликанов и не являются сульфатированными, но образуют ассоциаты с липидными компонентами поверхности бактерий или высвобождаются в культуральную среду (Whitfield, Ann. Rev. Biochem. 2006, 75: 39-68; De Angelis, Glycobiol, 12: 9R-16R).
Хондроитинсульфат, полученный экстракцией из различных животных источников, таких как свиной хрящ, плавник акулы и хрящ рыб из подгруппы костистых, используется в качестве нутрицевтического и в качестве хондропротекторного и антиревматического лекарственного средства в лечении остеоартрита межберцового сочленения колена и при остеоартрите суставного хряща (Kuettner KE et al., Eds., в Articular cartilage and osteoarthritis, NY, Raven Press, 1992; Simánek V et al., 2005, 149: 51-56; Goerres GW et al., J. Clinical Densitometry, 2005, 8: 484-487; Altman RD et al., Osteoarthritis and Cartilage, 2005, 13: 13-19; Chan PS, et al., Osteoarthritis and Cartilage, 2005, 13: 387-394; Chou MM, et al., Exp. Biol. Med. 2005, 230: 255-262; Clegg DO, et al., New England J. of Medicine, 2006, 23: 795-808; Roman-Blas et al., Osteoarthritis and Cartilage, 2006, 14: 839-848; Maheu E et al., Osteoarthritis and Cartilage, 2006, 14: 303-322; Fotini N et al., Biomed. Chromatogr. 2006, 20: 539-550; Lagnaoui R et al., Thérapie, 2006, 61: 341-346; Volpi N Ed. в Chondroitin sulfate: structure, role and pharmacological activity, S. Diego, California Academic Press - Elsevier Inc, 2006; Zhang W et al., Ann. Rheum. Dis. 2007, 66: 377-38). Другими областями терапии, в которых применяют хондроитинсульфат, являются терапии интерстициального цистита (Nickel et al., BJU Int., 2009, 103: 56-60; Cervigni et al., Int. Urogynecol. J. Pelvic Floor Dysfunction. 2008, 19: 943-947) и синовита (Hochberg and Clegg, Osteoarthritis and Cartilage, 2008, 16 supp. 3: S22-S24; Moller, Osteoarthritis and Cartilage, 2009, 17 supp. 1: S32-S33).
Однако, хондроитин, промежуточное соединение метаболизма, невозможно выделить в значительных количествах из животных источников. Способы получения хондроитина из микроорганизмов или посредством ферментативного синтеза были разработаны только в последнее время.
Получение хондроитина с использованием сконструированного штамма Е. coli K4, описанного в WO 2010136435, представляет особый интерес; указанный штамм продуцирует полисахарид K4, хондроитин, который содержит остатки β-фруктофуранозы в положении С3 глюкуроновой кислоты. Эти остатки можно легко удалить с использованием регулируемого кислотного гидролиза вследствие низкой стабильности гликозидной связи, посредством которой фруктоза связана с цепью хондроитина. Разработку штамма выполняли с целью улучшения процессивности всего ферментного комплекса, ответственного за синтез полисахарида K4, путем вставки нескольких копий аутологичного гена Rah, который действует в качестве положительного регулятора транскрипции кластера генов, ответственных за синтез вещества капсулы. С использованием этого микроорганизма и комплексной стратегии, основанной на оптимизации трехстадийного способа ферментации (периодический режим → периодическая подпитка → в режиме микрофильтрации) получают выходы хондроитина более 8 г/л. Высокие выходы продукта, простота способа дальнейшей очистки, низкая себестоимость способа в целом и слабое воздействие на окружающую среду делают способ, описанный в WO 2010136435, превосходящим все описанные ранее стратегии ферментации (Rodriguez et al., Eur. J. Biochem., 1988, 177: 117-124; Manzoni et al., Biotechnology Letters, 1996, 18: 383-386; WO 01/02597 A1; US 6288044; US 6777398; US 2005266460; WO 0180810; EP 1282684; EP 1832662; US 20030104601; US 20050164984; US 20070015249; US 20030109693; EP 1950308; WO 2007145197; WO 2007069693; WO 2007058252; WO 2007058252; WO 2007023867; US 7273729; JP 2004024208; US 20060052335; US 20060057697; US 7232676; US 20070059805). He так давно в US 2011244520 A1 был описан ряд разработанных сконструированных микроорганизмов, которые продуцируют хондроитин в концентрациях, сравнимых с таковыми из WO 2010136435.
Что касается ферментативного синтеза хондроитина, то в US 2005266460, WO 0180810, ЕР 1282684, ЕР 1832662, US 20030104601 и US 20050164984 раскрыто применение хондроитинсинтетазы из Pasteurella multocida, фермента, который катализирует синтез хондроитина из соответствующих уридин-дифосфо-сахаров (UDP sugars). В частности, в этих документах описываются последовательность нуклеотидного сегмента, кодирующего этот фермент, конструирование и применение рекомбинантов (в экспрессирующих системах прокариот и эукариот), которые его экспрессируют, и получение модифицированного хондроитина различных размеров с использованием указанных рекомбинантов. Во всех этих документах отсутствует экспериментальное подтверждение заявленных способов получения; в частности, нигде не приводятся подробные данные о методах ферментации, используемых для получения ферментов, и о выходах хондроитина. В US 20070015249 и US 20030109693 описывается получение хондроитинсинтетазы из Е. coli K4 и ее применение для получения хондроитина in vitro. Получение фермента, кодируемого геном kfoC участка II кластера Е. coli K4, отвечающего за биосинтез капсульного антигена, характеризуется следующими стадиями: амплификация kfoC, клонирование этого гена в вектор pTrcHis и его экспрессия в коммерческом штамме Е. coli ТОР. В этих двух документах также заявлены природные или искусственные белки с мутациями, которые могут индуцировать незначительные структурные модификации в хондроитинсинтетазе без изменения ее каталитической функции. В этих документах также отсутствуют данные о выходах в способах получения, касающихся получения хондроитинсинтетазы и ферментативного получения хондроитина in vitro из соответствующих UDP-сахаров.
В ЕР 1950308, WO 2007145197, WO 2007069693, WO 2007058252, WO 2007058252 и WO 2007023867 описываются способы синтеза хондроитина и производных in vitro, где используют хондроитинсинтетазу из штамма Е. coli K4 и его мутантов, которая имеет только одну из двух трансферазных активностей.
В US 7273729, JP 2004024208, US 20060052335, US 20060057697 и US 7232676 описывается применение хондроитинсинтетазы человека, фермента, который катализирует синтез хондроитина из соответствующих UDP-сахаров. В этих документах заявлены: структура хондроитинсинтетазы человека; экспрессирующий вектор, который содержит соответствующую ферменту последовательность; экспрессия указанного вектора в эукариотических клетках и способ синтеза полисахаридной цепи хондроитина.
В US 20070059805 заявлены: структура хондроитинсинтетазы человека; экспрессирующий вектор, содержащий соответствующую ферменту последовательность; экспрессия указанного вектора в эукариотических клетках и способ синтеза полисахаридной цепи хондроитина.
Во всех процитированных выше документах хондроитин рассматривается как промежуточное соединение для синтеза хондроитинсульфата, без указания присущих ему биологических свойств. В некоторых из них упоминается о возможности использования хондроитина в композициях, состав которых приведен только в общих чертах, как в случае US 20110244520 (пункт формулы изобретения 63) и WO 0180810 (пункт формулы изобретения 73); в этом последнем документе на страницах 4-5 утверждается, что полимеры хондроитина являются «грубо говоря, более инертными, чем аналогичная молекула НА (гиалуроновая кислота)». Kujawa MJ и др. (Developmental Biology, 1985, 114, 504-518 и 519-528) описывают, что гиалуроновая кислота и, пусть и менее эффективно, хондроитин, стимулируют in vitro хондрогенез стадии 24 мезенхимальных клеток из конечностей цыпленка в культуре (через 4,5 суток после оплодотворения). Этот эффект наблюдается только тогда, когда указанные полисахариды ковалентно связаны с поверхностями, на которых клетки культивируют, тогда как никаких эффектов не наблюдают, когда такие молекулы находятся в растворе. Невозможно связать какие-либо терапевтические применения с такими исследованиями, касающимися процесса эмбриогенеза (ambyogenesis) в жестких условиях в экспериментальной модели, которая, как правило, не может быть общеприменимой.
В WO 2012/032151 также описываются гибридные совместные комплексы между гиалуроновой кислотой и хондроитином. Последний предлагается только в качестве реологического эксципиента для уменьшения вязкости, и никакого фармакологического эффекта не описывается.
Определения
Зачастую термин «хондроитин» необоснованно используют для обозначения хондроитинсульфата; поэтому для ясности эти два термина «хондроитин» и «хондроитинсульфат» далее будут использоваться отдельно. Термин «хондроитин» означает несульфатированный полисахарид, обозначаемый буквой С, тогда как термин «хондроитинсульфат» означает разнообразно сульфатированный полисахарид, обозначаемый буквами CS.
Описание изобретения
В то время как применение хондроитинсульфата в области медицины подробно задокументировано, никаких данных относительно применений хондроитина пока не предоставлено. В настоящее время известно, что хондроитин обладает рядом важных биологических активностей, которые делают его полезным для различных применений не только в области терапии, но также и в области эстетической медицины, нутрицевтических и космецевтических средств.
Экспериментальные модели и клинические испытания продемонстрировали, что хондроитин взаимодействует с биологическими системами многофакторным образом, вызывая биологические ответы в клетках, тканях и во всем организме, ответы, которые являются новыми или более сильными, чем таковые при использовании хондроитинсульфата.
Хотя хондроитин представляет собой промежуточное соединение метаболизма в биосинтезе хондроитинсульфата, указанная молекула как таковая не присутствует в тканях, потому что она уже «заякорена» на стадии биосинтеза к сериновому остатку корового белка посредством тетрасахарида GlcA-Gal-Gal-Xyl, на котором растет цепь, образованная в результате повторения дисахаридных единиц N-ацетил-D-галактозамина β-1:4 и D-глюкуроната β-1:3. Процесс удлинения цепи и ее последующее сульфатирование происходят почти одновременно.
Поэтому присутствие свободного хондроитина в организме после его экзогенного введения представляет собой новое метаболическое состояние, обуславливающее ряд многофакторных биологических ответов.
Обнаружено, что хондроитин стимулирует клеточный рост, в частности, рост хондроцитов, способствуя поддержанию этого типа клеток, обладает противовоспалительной и антибактериальной активностью и стимулирует заживление ран. Кроме того, хондроитин может выгодно заменять хондроитинсульфат или другие гликозаминогликаны при практических применениях, типичных для последних, например при вискосапплементарной терапии, репарации хрящевой ткани, в области офтальмологии, в лечении суставного заболевания и в процедурах биоревитализации кожи с использованием интрадермальных микроинъекций. Также было обнаружено, что хондроитин усиливает активность противоопухолевых активных составляющих и полезен в лечении различных расстройств, таких как остеоартрит, интерстициальный цистит и расстройства респираторной системы. Хондроитин также полезен в растворах для перитонеального диализа и в качестве структурного компонента каркасов для роста тканей.
Таким образом, данное изобретение относится к фармацевтическим, нутрицевтическим и космецевтическим композициям или медицинским устройствам, содержащим несульфатированный хондроитин в качестве активного ингредиента.
Возможно, что хондроитин может быть объединен с другими активными ингредиентами, такими как гиалуроновая кислота, противовоспалительные средства, противоопухолевые лекарственные средства, муколитические и антибактериальные средства.
Пути и дозы введения будут зависеть от типа подвергаемого лечению состояния и могут быть установлены экспертами на основе доклинических и клинических исследований с использованием известных методологий. В общем, эти дозы, по существу, не будут аналогичны тем, которые в настоящее время используются в тех же целях для хондроитинсульфата. Указанные дозы могут составлять, например, от 0,1 до 200 мг/кг перорально и от 0,01 до 20 мг/кг для инъекции, тогда как композиции для местного применения могут содержать хондроитин в концентрациях, изменяющихся от 0,01 до 80% по массе. На основе хондроитина могут быть изготовлены композиции, подходящие для перорального, инъекционного или местного введения. Примеры этих форм введения включают капсулы, таблетки, глазные капли, гели, кремы, растворы или суспензии, распадающиеся в полости рта порошки, спреи и сиропы.
Инъекционное, пероральное или местное введение хондроитина, даже в очень высоких дозах, не вызывает неблагоприятных реакций, которые могут ставить под сомнение его применение. Токсикологические характеристики хондроитина, приведенные в Таблице 1, демонстрируют его безопасность.
Подробное описание изобретения
Экспериментальные данные, формирующие основу для применений, к которым относится данное изобретение, суммированы ниже. Дополнительные сведения приведены в примерах.
Стимуляция клеточного роста
2
Присутствие хондроитина сильно стимулирует рост многочисленных типов клеток, таких как кератиноциты, фибробласты и, в частности, хондроциты. Применен комплексный феноменологический подход, четко продемонстрированный в экспериментах in vitro, которые имитируют процесс заживления ран. Эксперименты по заживлению ран проводят с использованием оптической микроскопии с функцией цейтраферной съемки, метода, который дает возможность проводить мониторинг поведения клеток в течение длительных периодов времени (2-4 суток) в отношении адгезии, пролиферации и подвижности в среде, воспроизводящей оптимальные условия для клеточного роста (атмосфера с 5% (об./об.) CO во влажном воздухе и температура 37±0,1°С). Культуру выращивают до состояния конфлюентности и в ней делают разрез (рану); затем оценивают скорость заживления в течение некоторого периода времени посредством определения изменения в области раны. Качественный и количественный анализ показывает, что для заживления ран в присутствии хондроитина требуется менее чем 20 ч, в то время как в присутствии хондроитинсульфата рана не заживает полностью даже спустя 70 ч; в тех же условиях контрольная рана (среда без добавления полисахарида) затягивается через 40 ч. В каждых экспериментальных условиях С (хондроитин) демонстрирует способность уменьшать время заживления приблизительно в два раза. Этот результат представляет собой важный показатель заживления открытых ран, соответственно, показатель снижения типичных осложнений, относящихся к инфекциям, сепсису и т.д.
Стимуляция роста хондроцитов и поддержание типа клеток Эксперимент на первичных культурах хондроцитов человека, выделенных из образцов хряща здоровых людей, полученных во время ринопластических операций, демонстрирует, что присутствие хондроитина в культуральной среде не только стимулирует клеточный рост, но также оказывает специфическое действие в поддержании клеток хондроцитарного типа. В случае хондроцитов наблюдается процесс дифференцировки клеток, которые по мере прохождения фаз роста приобретают вид, все в большей степени морфологически похожий на фибробласты. Этому типу поведения препятствует присутствие хондроитина в культуральной среде. Исследование влияния хондроитина на пролиферацию хондроцитов, проведенное с использованием микроскопии с функцией цейтраферной видеосъемки, показывает, что рост клеток, обработанных хондроитином, происходит лучше, чем рост необработанных клеток и клеток, обработанных хондроитинсульфатом.
Фенотипический анализ, включающий иммуногистохимические тесты на хондроцитах человека, растущих в присутствии хондроитина или хондроитинсульфата, показывает, что после 4 суток обработки все различные культуры (необработанные клетки, клетки, обработанные хондроитином, и клетки, обработанные хондроитинсульфатом) демонстрируют сильный положительный ответ на коллаген II типа, специфический маркер на клетки хондроцитарного типа, но это состояние поддерживается в течение более длительных периодов времени (7 и 10 суток) только в клетках, обработанных хондроитином.
Выполненный в режиме реального времени ПЦР (полимеразная цепная реакция)-анализ генной экспрессии главных специфических маркеров дифференцировки (β-актина, аггрекана, коллагена II типа, коллагена I типа и sox9) в хондроцитах человека, растущих в присутствии хондроитина или хондроитинсульфата, показывает, что: а) обработка хондроитином приводит к изменению экспрессии анализируемых генов дифференцировки и генов матрикса (аггрекана, коллагена I типа, коллагена II типа и sox9) в зависимости от различного времени анализа (4, 7 и 10 суток); б) если хондроциты во второй фазе роста обрабатывают хондроитином, они демонстрируют высокие уровни экспрессии коллагена II типа, тогда как, если их обрабатывают хондроитинсульфатом, они обнаруживают высокие уровни экспрессии коллагена I типа совместно с очевидным морфологическим изменением в сторону фибробластного типа; в) клетки в третьей фазе роста демонстрируют более низкий ответ на обработку хондроитином или хондроитинсульфатом, хотя сохранение эффекта экспрессии коллагена II типа в присутствии хондроитина наблюдается четко, демонстрируя поддержание хондроцитарного фенотипа даже на поздних фазах роста.
Эти результаты представляют значительный интерес в плане применения при конструировании тканей, демонстрируя, что рост хондроцитов, полученных посредством трансплантации в присутствии хондроитина, дает возможность клеткам амплифицироваться в течение некоторого периода времени с поддержанием хондроцитарного фенотипа и, следовательно, характеристик образуемой ткани. Этот результат также важен с точки зрения фармакологии для применения хондроитина при всех расстройствах, при которых хондроцитарный фенотип и оптимальный метаболизм играют стратегическую роль в излечении данного расстройства.
Противовоспалительная активность
Применение хондроитинсульфата в лечении остеоартрита (OA) в течение десятилетий основывалось на той гипотезе, что с возрастом уменьшается его содержание у пациентов, страдающих от OA, и что продукт, вводимый в связи с этим, обладает функцией восполнения ослабленной способности к биосинтезу протеогликанов и синовиальной жидкости. Недавние исследования механизмов действия хондроитинсульфата в лечении OA изменили эту гипотезу механизма действия, продемонстрировав, что хондроитинсульфат активно вовлечен в ослабление воспалительного состояния, лежащего в основе прогрессирования OA и ревматоидного артрита. В частности, было продемонстрировано, что в результате повторных травм суставов (хрящевой ткани, синовиальной жидкости, субхондральной кости) провоспалительные медиаторы, которые играют решающую роль в патогенезе данного расстройства, высвобождаются во внеклеточный матрикс. Они включают интерлейкин 1b (IL-1β) и фактор некроза опухоли a (TNF-α). В частности, IL-1B связывается в хондроцитах с мембранными рецепторами и активирует сигнальные пути посредством киназ, таких как ERK-1/2 (extracellular signal regulated kinase, внеклеточная сигнал-регулируемая киназа-1/2) и МАРК (митоген-активируемая протеинкиназа) р38, которые в свою очередь активируют воспалительные пути в этой клетке. В частности, исследования in vitro продемонстрировали, что хондроитинсульфат ингибирует фосфорилирование и активацию ERK-1/2 и МАРК р38, соответственно ослабляя транслокацию NF-kB (нуклеарный фактор каппа В), что поддерживает противовоспалительное действие хондроитинсульфата (Du Souich, P., et al., J. Cellular and Molecular Medicine, 2009, 13: 1451-1463). В более свежем исследовании, выполненном на хондроцитах человека, выделенных из хряща коленного сустава и амплифицированных в лабораторных условиях, Calamia и др. (Calamia V. et al., Arthritis Res. Ther., 2010, 12(4): R138) исследовали эффект добавления IL-1b, провоспалительного цитокина (Fernandes JC, et al., Biorheology, 2002, 39: 237-246), и было оценено модулирование двух маркеров, вовлеченных в проявление воспалительного состояния, шаперонина GRP78 (регулируемый глюкозой белок 78) и фермента супероксиддисмутазы (SOD-2).
Сравнительное исследование хондроитина и хондроитинсульфата продемонстрировало, что хотя хондроитин представляет собой молекулу, в природе не присутствующую в организме, он способен активировать in vitro, на клеточных системах типа хондроцитов, процессы передачи сигнала такого же типа, как и процессы, которые предполагаются для хондроитинсульфата, но значительно более мощные. Экспериментальные результаты демонстрируют, что: а) экспрессия GRP78 положительно модулируется в результате обработки хондроитином в значительно большей степени, чем хондроитинсульфатом; б) процесс активации SOD-2, индуцированный IL-1β (симптом сильного окислительного стресса), эффективно ослабляется в результате предварительной обработки хондроитином, в то время как предварительная обработка хондроитинсульфатом является неэффективной.
Таким образом, хондроитин представляет собой лекарственное средство, полезное в лечении расстройств, при которых воспалительный компонент является результатом или причинным фактором расстройства, как в случае OA и ревматоидного артрита.
Антибактериальная активность
Недавно было продемонстрировано, что у пациентов, страдающих от OA, введение антибиотика тримоксазола для лечения сопутствующей инфекции мочевыводящих путей также оказывает эффект значительного облегчения симптомов OA. Это открытие привело к появлению гипотезы о том, что действие хондроитинсульфата в лечении OA также может быть связано, по меньшей мере до некоторой степени, с возможной антимикробной активностью. Эта гипотеза была подтверждена двумя исследованиями (Rozin АР, Clin. Rheumatol., 2009, Oct 28(10): 1221-3; Sprecher H. et al., Clin. Exp. Rheumatol., 2008, 26(3): 509-510), которые демонстрируют антибактериальную активность продуктов, содержащих хондроитинсульфат, в отношении Escherichia coli.
Сравнительное исследование хондроитина и хондроитинсульфата продемонстрировало, что хотя хондроитин присутствует в капсуле некоторых микроорганизмов в по-разному модифицированных формах (например, в фруктозилированной форме), он способен ингибировать рост патогенных энтеробактерий. В частности, было продемонстрировано выраженное действие на Escherichia coli и Enterococcus faecalis.
Этот вид активности вносит вклад в эффективность хондроитина при различных показаниях, таких как: а) заживление ран, поскольку присутствие хондроитина наряду со стимулированием заживления ран предупреждает риск инфекции открытых тканей; б) OA, поскольку измененная интестинальная/фекальная микрофлора оказывает неблагоприятные эффекты, вызывающие прогрессирование расстройства, как продемонстрировано в литературе; таким образом, антибактериальный эффект является вспомогательным фактором предупреждения усугубления расстройства; в) интерстициальный цистит, поскольку области, в которых происходит застой жидкостей, могут представлять собой области, предпочтительные для бактериальной инфильтрации и инфекций.
Стимуляция заживления ран
Благодаря своим многочисленным взаимодействиям с клеточными системами, хондроитин обладает существенной способностью ускорять процессы репарации тканей. Способность хондроитина или хондроитинсульфата при местных применениях ускорять процесс заживления оценивали с использованием общепризнанной экспериментальной модели мини-свиней. На спине животного хирургическим путем создавали раны и лечение осуществляли путем медленного закапывания водного раствора соединений в рану дважды в сутки и наложения марлевой повязки, которую затем использовали для того, чтобы закрыть рану. Это исследование продолжали в течение 6 недель.
Дерматологическая оценка заживления ран продемонстрировала, что качество процесса заживления улучшалось в присутствии хондроитина, нежели хондроитинсульфата, поскольку первый действовал быстрее, и его действие характеризовалось качественно лучшим внешним видом краев раны и окружающей ткани.
В случае лечения хондроитином гистопатологическая оценка показала более низкое содержание грануляционной ткани и значительно более слабые симптомы воспаления, чем при лечении хондроитинсульфатом.
Гистологическая оценка продемонстрировала, что в случае лечения хондроитином организация коллагеновых волокон была аналогична таковой у нормальной ткани, указывая на улучшенный процесс заживления ран.
Лечение суставных расстройств
Регенерирующая способность хондроитина на клеточном уровне, реологические свойства указанного полисахарида и его специфическое действие на клетки хондроцитарного типа создают основу для применения этого соединения в лечении суставного заболевания. Оценка терапевтического потенциала хондроитина в лечении суставного заболевания, выполненного на собаке, экспериментальной модели, у которой ортопедические проблемы дегенеративного или воспалительного характера, ассоциированные с дегенеративным суставным заболеванием (DJD), имеют, в частности, рецидивную форму как в молодом, так и в старческом возрасте, продемонстрировала, что пероральное введение хондроитина в течение 6 месяцев в дозе 15 мг/кг/сутки более эффективно, чем введение хондроитинсульфата, и значительно улучшает клиническую картину, с хорошей регрессией заболевания.
Биоревитализация кожи
Биоревитализация кожи посредством интрадермальных микроинъекций растворов гиалуроновой кислоты является одним из наиболее распространенных косметических уходов за кожей. Рациональным обоснованием является то, что введение этого полисахарида в дерму вызывает комплексные биологические ответы, опосредуемые множественными активностями, связанными с клеточной передачей сигнала, которые приводят к реактивации метаболизма ткани. Было обнаружено, что интрадермальные микроинъекции хондроитина обладают биоревитализирующими действиями, превосходящими таковые гиалуроновой кислоты. По 2 мл раствора хондроитина в концентрации 20 или 60 мг/мл вводили микроинъекцией с двухнедельными интервалами в течение 6 месяцев. Другую группу субъектов обрабатывали аналогичным образом, используя 2 мл раствора (20 мг/мл) гиалуроновой кислоты. В начале и в конце исследования были проведены инструментальные измерения трансэпидермальной потери воды (TEWL), консистенции ткани и шероховатости кожи. В течение некоторого периода времени доктор и пациент также независимо оценивали общий внешний вид. Это исследование демонстрирует, что хондроитин в той же концентрации, что и гиалуроновая кислота (20 мг/мл), обладает более ранним и более продолжительным биоревитализирующим действием, тогда как в более высокой концентрации (60 мг/мл) биоревитализирующее действие хондроитина гораздо больше усиливается, достигая превосходных результатов после второй обработки.
Усиление активности противоопухолевых лекарственных средств
Хондроитин резко усиливает апоптотическое действие гемцитабина (GEM) и митомицина-С (ММС), двух противоопухолевых средств, которые полезны при внутрипузырной терапии опухолей мочевого пузыря без инвазии в мышечный слой. В исследовании in vitro, выполненном на линиях клеток рака мочевого пузыря человека НТ-1376, оценивали способность ингибировать рост и апоптотическое/некротическое действие различных комбинаций GEM или МСС с хондроитином или хондроитинсульфатом. Это исследование демонстрирует, что: а) комбинация противоопухолевого средства и хондроитина или хондроитинсульфата оказывает сильное влияние на ингибирование роста опухолевых клеток; б) синергические действия различаются в зависимости от использованного противоопухолевого средства; в) синергизм комбинации полисахарид-GEM приводит главным образом к тому, что клетки подвергаются апоптозу, тогда как синергизм комбинации ММС-полисахарид приводит к тому, что клетки подвергаются некрозу; г) синергические эффекты хондроитина значительно превышают эффекты хондроитинсульфата; д) синергические комбинации хондроитина с GEM или ММС могут представлять собой перспективный терапевтический подход в области лечения поверхностных опухолей мочевого пузыря.
Вискосапплементарная терапия и репарация хрящевой ткани
Благодаря специфичности своего действия в отношении стимулирования хондроцитов и поддержания их клеточного типа с течением времени, хондроитин представляет собой эффективный агент вискосапплементарной терапии и репарации поврежденной хрящевой ткани. Обоснованность такого терапевтического применения хондроитина была доказана путем сравнения эффективности комбинации гиалуроновой кислоты и хондроитина в лечении суставных заболеваний, связанных с поражением хрящевого компонента сустава, с эффективностью традиционного лечения, основанного на применении только гиалуроновой кислоты. Исследование, проведенное на добровольцах, страдающих от тяжелого повреждения коленного сустава с поражением хрящевого компонента, с выраженными непроходящими воспалительными симптомами, опуханием и болью, продемонстрировало, что присутствие хондроитина обеспечивает превосходный уровень восстановления сустава с репарацией хрящевого компонента и общее улучшение с течением времени в патологической картине болевых симптомов. Однако такие хорошие результаты не наблюдаются при традиционной вискосапплементарной терапии с использованием только гиалуроновой кислоты.
Лечение интерстициального цистита
Применение гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфата в лечении интерстициального цистита является известным фактом (D. Porru et al., Urol. Int. 1997, 59: 26-29; Curtis et al., BUJI, 2008, 103: 56-60; M. Cervigni, Int. Urogynecol., 2008, 19: 943-947; D. Porru et al., Reviews on Recent Clinical Trials, 2008, 3:00-00; DE 102006060953). С учетом структурных аналогий с этими полисахаридами и стимулирующего действия хондроитина в отношении клеток и тканей, проводили сравнительное исследование эффективности комбинаций гиалуроновой кислоты и хондроитина или хондроитинсульфата в лечении интерстициального цистита.
Добровольцы с подтвержденным диагнозом интерстициального цистита получали лечение в виде инстилляций раствора гиалуроновой кислоты и хондроитина или гиалуроновой кислоты и хондроитинсульфата в мочевой пузырь через катетер. Такую обработку повторяли один раз в неделю в течение 6 недель и затем один раз в месяц в течение следующих 5 месяцев. В начале лечения и в конце исследования проводили цистоскопию с растяжением мочевого пузыря для контроля состояния эпителиальной ткани и проводили биопсию стенки мочевого пузыря для установления воспалительного состояния. В ходе исследования оценивали уродинамику (императивность, частоту и ноктурию) и наличие жжения и боли в мочевом пузыре. Сравнение данных цистоскопии, проведенной до и после лечения, свидетельствовало о повсеместном, более успешном разрешении патологического состояния у пациентов, получавших лечение комбинациями гиалуроновая кислота/хондроитин, и этот факт подтверждали посредством гистологической оценки биоптатов стенки мочевого пузыря, которая демонстрировала более успешное разрешение воспалительного процесса, и посредством клинических данных, которые демонстрировали более полное, более быстрое разрешение патологического состояния в плане как уродинамики, так и остаточной боли.
Применение в офтальмических композициях
Благодаря своей биосовместимости, ранозаживляющему действию, способности к гидратации, умеренному антимикробному действию, оптимальной вязкости водных растворов, которые его содержат, и возможности тепловой стерилизации без изменений реологических свойств хондроитин можно использовать в изготовлении глазных препаратов, таких как глазные капли и мази, в комбинации с другими активными ингредиентами. Улучшенными характеристиками глазных капель, изготовленных с использованием хондроитина в качестве реологически-терапевтического компонента, являются: а) оптимальная вязкость при отсутствии какого-либо слипания при изготовлении; б) однородное, более гомогенное распределение глазных капель по всем частям роговой оболочки; в) более высокая стабильность слезной пленки; г) улучшенная адгезия к роговично-конъюнктивальным клеткам; д) реэпителизация роговичной поверхности, противовоспалительное и дезинфицирующее действие на нее; е) нормализация поверхностного натяжения; ж) более продолжительное время нахождения в роговой оболочке; з) возможность проведения повторных нанесений в течение дня для восстановления надлежащих условий слезообразования.
Исследование пациентов, страдающих от сухости глаз, в котором сравнивали два глазных препарата, традиционный на основе гиалуроновой кислоты и препарат на основе хондроитина, оба в концентрации 3% (масс/об.) в физиологическом растворе, с терапевтическим циклом, включающим нанесение 4 раза в сутки в течение 30 суток, показало, что глазные капли на основе хондроитина дают наилучшие оценочные показатели как в случае клинической оценки, так и субъективной оценки подвергаемого лечению пациента.
Применение в перитонеальном диализе
Физико-химические свойства и способность хондроитина регенерировать ткани создают основу для его нового применения в области перитонеального диализа. Диализный раствор состоит главным образом из Сахаров (раствора глюкозы), к которому добавлены разные соли. Существуют три различные концентрации (1,36%, 2,27% и 3,86%): чем выше концентрация, тем больше количество извлекаемых жидкостей. Ввиду этого, в случае более значительного удерживания жидкостей будет показано применение растворов с высокой концентрацией, в то время как в случае дегидратации растворы с более низкой концентрацией будут более подходящими.
Если лечение невозможно оптимизировать, необходимо тщательно проанализировать возможность перехода на гемодиализ.
Перитонеальный диализ имеет много преимуществ по сравнению с гемодиализом, поскольку он накладывает меньше ограничений на режим питания и жизнедеятельность, оказывает меньше неблагоприятных эффектов на динамику кровообращения, при нем лучше сохраняется остаточная функция почки и легче происходит реабилитация. Однако в последние годы в случаях длительного перитонеального диализа выявлен ряд недостатков, связанных с ухудшением функции брюшины, с недостаточным удалением воды и метаболических шлаков в процессе проведения диализа. Считается, что такое ухудшение функции брюшины связано с высокими концентрациями глюкозы, присутствующей в качестве осмотического агента в жидкостях для перитонеального диализа, что вызывает процесс гликозилирования белков и образования активных форм кислорода (ROS). Несмотря на актуальность данной проблемы и предложенные многочисленные композиционные инновации, все еще не разработаны стратегии, которые надлежащим образом минимизируют функциональное повреждение перитонеальной мембраны, ассоциированное с длительным перитонеальным диализом (US 2010286085, WO 9801141, US 5955450, US 5597805I, WO 9314796, JP 1151462).
Обнаружено, что применение хондроитина в композициях для перитонеального диализа в качестве осмотического агента с защитным действием, представляет собой хорошее решение для сведения к минимуму описанных выше проблем вследствие способности этого полисахарида стимулировать регенерацию мезотелия брюшины, предотвращая фибротические процессы.
Лечение расстройств респираторной системы
Хондроитин можно использовать для лечения расстройств орофарингеального и легочного аппарата различных этиологии, таких как стоматит, тонзиллит, ларингит, фарингит, кашель и бронхит, благодаря его реологическим и биологическим свойствам, таким как способность удерживать воду, что стимулирует гидратацию тканей, его пленкообразующее действие и способность к адгезии к слизистым оболочкам, его способность осуществлять биологическую стимуляцию клеток и тканей и его противовоспалительное и антибактериальное действие. Для этих применений могут быть изготовлены комбинации на основе хондроитина вместе с болеутоляющими и муколитическими агентами в разных фармацевтических формах, таких как сиропы, таблетки, распадающиеся в полости рта порошки и спреи.
Хондроитин в качестве нутрицевтического и космецевтического средства
Ввиду наличия упомянутых выше биологических активностей (особенно противовоспалительной и антибактериальной активности) и полного отсутствия у него токсичности, хондроитин применяется, возможно вместе с другими соединениями, в композиции нутрицевтических и космецевтических средств, которые используются, в частности, для биоревитализации клеток и тканей.
Каркасы для роста тканей
Хондроитин можно использовать в качестве структурного элемента при конструировании каркасов для 3D-роста клеточных систем с целью применения в области регенеративной медицины.
Следующие далее примеры описывают изобретение более подробно.
ПРИМЕР 1. Активация роста кератиноцитов
2
2
2
Клетки HaCat, иммортализованную клеточную линию человеческих кератиноцитов, используют в качестве модельной системы. Клетки HaCat растят и амплифицируют в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) + 1% раствора Pen-Strep (пенициллин-стрептомицин) (10000 единиц пенициллина-G/мл и 10 мг стрептомицина/мл в физиологическом растворе) в инкубаторе для клеточных культур (37°С, 5% СО во влажном воздухе). Эксперименты по заживлению ран проводят с использованием оптической микроскопии с функцией цейтраферной съемки, метода, который дает возможность проводить мониторинг поведения клеток в течение длительных периодов времени (2-4 суток) в отношении адгезии, пролиферации и подвижности. Система состоит из инвертированного оптического микроскопа (Zeiss Axiovert 200), термостатической бани (LAUDA Ecoline), CO-микроинкубатора с геометрией, пригодной для размещения планшетов различных размеров (от 6 до 96 лунок) и блок управления для вывода газов (воздуха и CO). Этот прибор также оснащен цифровой видеокамерой и управляющим двигателем, что позволяет инкубатору перемещаться вдоль направлений x, y и z, так чтобы изображения, выбранные оператором, можно было записать и получить в заданных интервалах.
2
Собранная таким образом система обеспечивает поддержание клеток в среде, которая воспроизводит оптимальные условия для клеточного роста (атмосфера 5% (об./об.) CO во влажном воздухе и температура 37±0,1°С), и проводить мониторинг в ходе всего эксперимента. Кроме того, система оснащена программным обеспечением, что дает возможность осуществлять точный анализ изображений. В частности, оборудование оснащено автоматизированным программным обеспечением, которое позволяет оценивать заживление ран в тестах по ранозаживлению и получать данные о скоростях заживления и скоростях миграции клеток, являющихся важными параметрами для оценки биоревитализирующего действия веществ, которые могут ускорять или подавлять заживление ран in vitro.
3
2
2
5
Стандартная методика для теста по ранозаживлению состоит в следующем: а) в каждую лунку 12-луночного планшета добавляют по 100 мкл раствора коллагена в СНСООН в концентрации 0,1 мг/мл для усиления адгезии клеток к подложке и оптимизации направленности миграции клеток, оставляя планшет открытым под ламинарным потоком в вытяжном шкафу до тех пор, пока кислота полностью не испарится; б) в качестве культуральной среды используют DMEM с 2% FBS и в лунки добавляют хондроитин или хондроитинсульфат либо гиалуроновую кислоту, причем последние используют в качестве систем сравнения, в конечных концентрациях от 0,1 до 1% (масс/об).; ничего не добавляют к культуральной среде в две из 12 лунок, которые выступают в качестве контролей; в) в каждую лунку высевают порцию суспензии клеток HaCat (1,8×10) для получения полной конфлюентности после инкубации в течение 2 суток (37°С, 5% СО во влажном воздухе); г) используя стерильный наконечник, делают разрез (рану) длиной примерно 1 мм в конфлюентном слое, имеющемся в каждой лунке; д) 12-луночный планшет размещают в инкубаторе предметного столика установки для проведения микроскопии с функцией цейтраферной видеосъемки; е) эксперимент начинается только тогда, когда окружающие условия идеально подходят для поддержания клеток in vitro и для хорошего воспроизведения изображений (37°С±0,1, 5% СО и отсутствие конденсата); ж) для каждой лунки выбирают 4-5 полей наблюдения разреза и затем начинают эксперимент, который продолжается в среднем в течение 72-96 ч; з) в течение этого периода времени прибор регистрирует закрытие различных разрезов, представленных во всех выбранных полях наблюдения, с временным интервалом 1 ч; и) вслед за тестом по ранозаживлению проводят качественный и количественный анализ заживления ран с использованием программного обеспечения, в котором автоматически измеряется площадь разреза в динамике для каждого выбранного поля; к) результаты в динамике приводятся в форме изображений, которые дают возможность качественного наблюдения за заживлением ран и количественного выражения в виде процента заживления [((площадь на момент времени ноль-площадь на момент времени 1)/площадь на момент времени ноль)×100].
Результаты демонстрируют, что хондроитин ускоряет процесс заживления уже в концентрации 0,1 (масс/об.), тогда как хондроитинсульфат его замедляет. Эти данные подтверждаются более четко для концентрации 1% (масс/об.). Качественный и количественный анализ заживления ран показывает, что в присутствии хондроитина рана заживает менее чем за 20 ч, в то время как контрольная рана затягивается только через 40 ч, а в случае хондроитинсульфата рана не заживает полностью даже спустя 70 ч.
ПРИМЕР 2. Тест на пролиферацию хондроцитов
2
6
2
Первичные культуры хондроцитов человека, выделенные из образцов хрящей здоровых людей, полученных в ходе ринопластических операций, использовали в качестве модельной системы. Фрагменты ткани, только что извлеченной в операционной, погружали в раствор 0,9%-ного (масс/масс.) NaCl и быстро переносили в лабораторию для выделения хондроцитов. При работе в стерильных условиях под ламинарным потоком в вытяжном шкафу образец ткани переносили в чашку Петри, где его разрезали на мелкие кусочки, используя стерильные микропинцеты и скальпели. Затем кусочки хряща погружали в 0,01 М фосфатный буфер рН 7,4 (PBS - забуференный фосфатом физиологический раствор), содержащий коллагеназу 1 типа (3 мг/мл), диспазу (4 мг/мл) и гентамицин (5 мкл/мл из раствора с концентрацией 80 мг/мл) для обеспечения стерильности в процессе ферментативного расщепления. Кусочки оставляли инкубироваться в течение ночи в пробирке фирмы Falcon при 37°С, с перемешиванием. Через 16-18 ч раствор фильтровали через 70 мкм фильтр, перенося части, прилипшие к стенкам пробирки фирмы Falcon, на фильтр и промывая 7-8 мл DMEM с 10% FBS. Фильтрат центрифугировали при 1500 об./мин в течение 7 мин, супернатант удаляли и осадок после центрифугирования суспендировали в 10 мл DMEM с 10% FBS, содержащей фунгизон (5 мкл/мл из раствора с концентрацией 80 мг/мл) и гентамицин (5 мкл/мл из раствора с концентрацией 80 мг/мл). Полученную таким образом клеточную суспензию высевали в колбу с площадью 25 см и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО, меняя среду каждые 2 или 3 дня до достижения полной конфлюентности клеточной культуры. Клетки, имеющие характерные внешние признаки хондроцитов (небольшие разбухшие клетки слегка удлиненной формы), открепляли со дна колбы, подсчитывали и снова инкубировали в свежей порции среды. Из 0,4 г хряща обычно получали примерно 2×10 клеток во второй фазе роста. Знание числа циклов роста, которым данная культура была предварительно подвергнута, является принципиально важным для первичных клеток; в особенности в случае хондроцитов, где наблюдается процесс дифференцировки клеток по мере прохождения фаз роста, и клетки все в большей степени приобретают вид, морфологически подобный фибробластам. По этой причине полное исследование проводят, используя первичные культуры хондроцитов во 2-4-й фазе роста.
3
Влияние хондроитина на пролиферацию хондроцитов оценивали с использованием микроскопии с функцией цейтраферной видеосъемки, как описано в Примере 1. Данное исследование проводили в сравнении с хондроцитами, стимулированными хондроитинсульфатом, используя нестимулированные хондроциты в качестве контрольной системы. По 20×10 клеток высевали в каждую лунку 24-луночного планшета. Клетки обрабатывали хондроитином или хондроитинсульфатом с содержанием эндотоксина не более 0,1 EU (эндотоксиновых единиц)/мг в концентрации 1% (масс/об.) в DMEM с 10% FBS; в случае контролей клетки высевали в DMEM с 10% FBS. Эксперименты проводили в трех повторах и анализировали в общей сложности в течение периода времени в интервале от 96 до 120 ч. Анализ изображений, проведенный с использованием аналитического программного обеспечения Image Pro-plus 5.1, позволил получить путем подсчета вручную точное число клеток за промежутки времени, предварительно заданные оператором, для построения кривой роста в зависимости от времени. Анализ данных (Таблица 2) указывает на то, что рост клеток, обработанных хондроитином, осуществлялся более успешно, чем рост необработанных клеток и клеток, обработанных хондроитинсульфатом.
Таблица 2. Число хондроцитов, инкубированных в присутствии хондроитина или хондроитинсульфата в концентрации 1% (масс/об.), как функция от времени.
ПРИМЕР 3. Фенотипический анализ с использованием иммуногистохимических тестов на хондроцитах человека, растущих в присутствии хондроитина или сульфатированного хондроитина
Оценку хондроцитарного фенотипа клеток, только что выделенных из образцов хрящевой ткани человека и через 4, 7 и 10 суток роста в среде, содержащей хондроитин или хондроитинсульфат, проводили с помощью иммуногистохимических тестов, применяя набор Envision+(DaKo), в котором используется антитело к коллагену II типа, считающемуся специфическим маркером дифференцировки хондроцитов (Stokes et al., Biochem. J., 2001, 360: 461-470). После 4 суток обработки все различные культуры (необработанные клетки, клетки, обработанные хондроитином, и клетки, обработанные хондроитинсульфатом) демонстрируют сильный положительный ответ на коллаген II типа, но это состояние поддерживается в течение более длительных периодов времени (7 и 10 суток) только в клетках, обработанных хондроитином.
ПРИМЕР 4. Анализ генной экспрессии основных специфических маркеров дифференцировки в хондроцитах человека, растущих в присутствии хондроитина или хондроитинсульфата, выполненный с применением ПЦР в режиме реального времени
4
Для оценки биологических действий хондроитина на культуры хондроцитов человека определяли экспрессию набора генов, считающихся ключом к установлению фенотипа, и подходящих маркеров для оценки качества генерированной ткани. Исследование проводили на хондроцитах, полученных из человеческого хряща, как изложено в примере 2, при этом клетки росли в присутствии хондроитина или хондроитинсульфата. С использованием стандартной методики в каждую лунку 24-луночного планшета высевали по 5×10 клеток. Хондроциты растили в DMEM, содержащей 1% (масс/об.) хондроитина или хондроитинсульфата (содержание эндотоксина не более 0,1 EU/мг). Клетки стимулировали в течение 4, 7 и 10 суток (Ishak et al., International J. of Pediatric Otorhinolaryngology, 2011, 75: 835-840), после чего экстрагировали РНК (рибонуклеиновая кислота), используя реагент тризол, как описано в руководстве по применению набора (Life Technologies Ltd, Milan, Italy). Также, одновременно с выделением РНК, проводили качественный морфологический анализ клеточной культуры в различные моменты времени, рассматривая соответствующие образцы на 4-е, 7-е и 10-е сутки под оптическим микроскопом. Высеянные клетки рассматривали под микроскопом в эти три разных момента времени и изображения, наилучшим образом отображающие условия клеточного роста, получали, используя установку для микроскопии с функцией цейтраферной видеосъемки. После экстракции РНК осуществляли обратную транскрипцию с использованием суммарно 1 мкг РНК и затем, применяя ПЦР в режиме реального времени, амплификацию генов, которые представляют собой специфические маркеры для хондроцитов (Таблица 3).
Таблица 3. Олиго-последовательности, использованные для исследования, с применением ПЦР в режиме реального времени, экспрессии основных специфических маркеров дифференцировки в хондроцитах человека, стимулированных сульфатированным и несульфатированным хондроитином.
Гены, связанные с образованием матрикса, такие как гены аггрекана, коллагена I типа, коллагена II типа, и ген Sox9, экспрессия которого тесно коррелирует с экспрессией коллагена II типа, анализировали в качестве специфических маркеров для дифференцировки и определения характеристик хондроцитов (Akiyama Н., Mod. Rheumatol., 2008, 18(3): 213-9; Yang et al., J. of Orthopaedic Res. 2011).
Генную экспрессию указанных маркеров на хондроцитах человека, культивированных на основной среде (контроль) и с обработкой хондроитином (С) или обработкой хондроитинсульфатом (CS), анализировали на клеточных культурах во второй и третьей фазах роста.
В Таблице 4 показаны значения уровней генной экспрессии через 4, 7 и 10 суток по сравнению с контролем и генами домашнего хозяйства, которые позволяют стандартизировать экспрессию (метод ΔΔct) (Pfaffl MW., Nucleic Acids Res., 2001, May 1; 29(9): e45). Результаты анализа генной экспрессии приведены в виде среднего значения по меньшей мере 3 независимых экспериментов для тестов, выполненных в присутствии С или CS, на клетках, находящихся в фазах 2 и 3.
В фазе роста 2 уровень экспрессии аггрекана был ниже, чем в контроле, спустя 4 суток после высевания клеток, обработанных С, в то же время уровень экспрессии данного гена в среднем был немного выше у клеток, обработанных CS. Наблюдаемая разница между образцами, обработанными CS, и контролем была незначительной, но была существенной между образцами, обработанными CS, и образцами, обработанными С. Данные по кратковременной экспрессии согласовывались с данными об усиленной пролиферации хондроцитов в присутствии С, что может объяснить задержку экспрессии и, вследствие этого, синтеза аггрекана. Через 7 суток наблюдали значительное усиление экспрессии аггрекана в образцах, обработанных С (1,66±0,22), по сравнению с контролем и слабую отрицательную регуляцию для образцов, обработанных CS. Отрицательная регуляция сохранялась, становясь значительной через 10 суток инкубации, тогда как в то же самое время уровни экспрессии аггрекана клетками, обработанными С, были такими же, как в контролях.
Наблюдение в экспериментах с использованием цейтраферной съемки обработанных и необработанных образцов указывало на изменение фенотипа в сторону фибробластного типа по мере развития культуры (и на последующих стадиях), и очевидное морфологическое изменение было подтверждено с использованием специфического маркера, коллагена I типа. Как показано в Таблице 4, после инкубации в течение 4 суток обе обработки (С и CS) приводят к незначительному усилению экспрессии коллагена I типа; однако через 7 суток это усиление становится существенным для клеток, обработанных CS, в отличие от клеток, обработанных С, которые фактически демонстрировали статистически значимое снижение на 30% после длительных периодов инкубации. И морфологический анализ, и оценка экспрессии коллагена I типа подтвердили, что хондроцитарный фенотип лучше сохранялся в присутствии С, чем CS (Chiu L.H. et al., J. Cell. Physiol., 2011, 226: 1981-1988).
Также анализировали Sox9 и коллаген II типа; последний считается самым важным специфическим маркером клеток хондроцитарного типа, особенно при иммуногистохимическом типировании. Экспрессию гена Sox-9 анализировали в связи с тем, что Sox-9 недавно был классифицирован в качестве транскрипционного фактора, который положительно регулирует синтез коллагена II типа и играет критическую роль в хондрогенезе (Yang et al., Journal of Orthopaedic Research, August 2011).
Аналогичное поведение наблюдали для 2 обработок (С и CS) в отношении активации Sox9 в сравнении с контролем после 4 суток инкубации. С течением времени (7 и 10 суток) хондроитин способствовал поддержанию высоких уровней экспрессии по сравнению с контролем, хотя и с более низким уровнем значимости, чем при коротких периодах времени, в то время как CS демонстрировал отрицательную регуляцию через 10 суток.
И наконец, главный маркер хондроцитов, коллаген II типа, был сильно активирован во все проанализированные моменты времени культивирования для обработок с использованием С, и было продемонстрировано значительное возрастание его уровня после коротких периодов времени для клеток, обработанных с использованием CS, которое спадало по мере увеличения времени инкубации, по существу возвращаясь к контрольным величинам.
Для панели генов, для которых проводили сравнительный анализ, продемонстрировано, что обработка С способствует более продолжительному поддержанию фенотипа, модулируя выработку аггрекана, возможно связанным со стадией пролиферации, которая предшествует стадии синтеза внеклеточного матрикса (Ishak M.F. et al, Journal of Pediatric Otorhinolaryngology, 2011, 75: 835-840). Анализ хондроцитов в третьей фазе роста под оптическим микроскопом через несколько суток (4 суток) после высевания продемонстрировал, что имели место пролиферация и формирование матрикса. В эти моменты времени экспрессия гена аггрекана в присутствии С оставалась по-прежнему низкой, но затем усиливалась по сравнению с контролем через 7 суток, последовательно вместе с возрастанием плотности клеток (Roughley et al., European Cells and Materials, 2006, 11: 1-7). Поведение в присутствии CS было аналогичным вплоть до 7 суток инкубации, но через 10 суток наблюдали очевидную отрицательную регуляцию, которая была значительной при сравнении с величинами экспрессии для образцов, обработанных С. В том случае, когда хондроциты находились в присутствии С, уровень экспрессии коллагена I типа был ниже, чем в контроле для всех периодов инкубации. Результаты для среды, содержащей CS, были разными; это представлено усилением экспрессии коллагена I типа через 7 суток. Одновременно, для образцов, обработанных CS, наблюдали отрицательную регуляцию коллагена II типа в первые 4 суток роста, которая затем трансформировалась в сверхэкспрессию по сравнению с контролем (примерно двукратную) через 7 суток и впоследствии, с колеблющейся тенденцией, в дальнейшую отрицательную регуляцию через 10 суток. Спустя 4 суток после высевания образцы, обработанные С, уже демонстрировали высокий уровень экспрессии коллагена II типа по сравнению с контролем, и это модулирование стойко выдерживалось на 7 и 10 сутки, что подтверждает роль этой молекулы в поддержании хондроцитарного фенотипа в течение более продолжительного периода времени, включая последующие высевания.
Подводя итоги, это исследование в целом демонстрирует, что: а) обработка с использованием С обуславливает изменение в экспрессии проанализированных генов дифференцировки и генов матрикса (аггрекана, коллагена I типа, коллагена II типа и Sox9) для различных рассмотренных времен анализа (4, 7 и 10 суток);
б) хондроциты во второй фазе роста, если они обработаны С, демонстрируют высокие уровни экспрессии коллагена II типа, в то время как, если они обработаны CS, то они демонстрируют высокие уровни экспрессии коллагена I типа, сопровождаемые очевидным морфологическим изменением в фибробластном фенотипе;
в) клетки в третьей фазе роста дают более низкий ответ на обработку С или CS, несмотря на очевидное сохранение эффекта экспрессии коллагена II типа в присутствии С, демонстрируя, что хондроцитарный фенотип поддерживается даже на поздних фазах роста.
ПРИМЕР 5. Молекулярные рациональные обоснования противовоспалительного действия хондроитина
Цель данного исследования заключалась в оценке влияния хондроитина или хондроитинсульфата на экспрессию генов GRP78 и SOD-2 в хондроцитах человека после обработки провоспалительным цитокином IL-1β.
В данном исследовании использовали выделенные из назального хряща хондроциты человека, обработанные IL-1β, провоспалительным цитокином, который действует в качестве медиатора в активации биологических механизмов, лежащих в основе начала OA. В частности, оценивали модулирование двух маркеров, вовлеченных в проявление воспалительного состояния, шаперонина GRP78 и фермента супероксиддисмутазы (SOD-2).
4
В стандартном эксперименте в каждую лунку 24-луночного планшета высевали по 10 клеток и через 5 суток, по достижении конфлюентности, клетки подвергали голоданию в течение 24 часов (инкубация в DMEM с 0,5% FBS). Затем клетки обрабатывали в течение 2 ч хондроитином (С) или хондроитинсульфатом (CS) в концентрации 1% (масс/об.) (содержание эндотоксина не более 0,1 EU/мг) в DMEM без FBS; контроль выдерживали в тех же условиях, но без добавления С или CS. Затем к культурам добавляли IL-1β в концентрации 10 нг/мл. Через 24 часа инкубации клетки извлекали и из них экстрагировали РНК, используя реагент тризол, как описано в руководстве по применению набора (Life Technologies Ltd, Milan, Italy).
Затем осуществляли обратную транскрипцию (ОТ) с использованием суммарно 1 мкг РНК, амплифицируя референсные гены (GRP78 и SOD-2) посредством ПЦР в режиме реального времени, как описано Calamia V и др. (Calamia V, et. al., Arthritis Res. Ther. 2010, 12(4): R138).
В Таблице 5 показаны результаты ОТ-ПЦР-анализов, относящихся к экспрессии двух выбранных маркерных генов, по сравнению с отрицательным контролем, состоящим из хондроцитов, не обработанных С, CS или IL-1β, и положительным контролем, состоящим из хондроцитов, обработанных только одним IL-1β. Экспрессия GRP78 возрастала в два раза при обработке только одним IL-1β (положительный контроль), примерно в три раза по сравнению с отрицательным контролем при обработке комбинацией CS+IL-1β и примерно в десять раз при обработке комбинацией C+IL-1β. Несмотря на то, что экспрессия этого гена является показателем активного воспалительного механизма, было продемонстрировано, что белок, который он кодирует, расположенный в эндоплазматическом ретикулуме, представляет собой аутоантиген ревматоидного артрита (расстройства с аутоиммунной подоплекой) и отвечает за стимуляцию моноцитами синтеза цитокинов, модулируя тем самым противовоспалительный ответ организма.
Что касается экспрессии SOD-2 (Таблица 5), результаты демонстрируют значительную эквивалентность генной экспрессии в случае комбинации IL-1β+CS и IL-1β, но существенное снижение в случае комбинации IL-1β+C.
Показатели генной экспрессии подтверждены данными по экспрессии белков, полученными в вестерн-блоттинге с использованием денситометрического анализа зон белков GRP78 и SOD2, в сравнении с экспрессией конститутивного гена тубулина (Таблица 6).
§
Таблица 5. Изменения показателей экспрессии генов GRP78 и SOD-2 в хондроцитах человека после обработки IL-1β, комбинацией IL-1β+хондроитинсульфат (IL-1β+CS) и комбинацией IL-1β+хондроитин (IL-1β+C) по сравнению с показателем экспрессии в необработанных клетках, принятым за 1 (отрицательный контроль). Генную экспрессию оценивают в анализе с использованием ПЦР в режиме реального времени (n=3, *р<0,05 IL-1β+CS в сравнении с положительным контролем, р<0,01 IL-1β+C в сравнении с IL-1β+CS и положительным контролем).
Таблица 6. Показатели экспрессии белков GRP78 и SOD-2 в хондроцитах человека после обработки IL-1β, комбинацией IL-1β+хондроитинсульфат (IL-1β+CS) и комбинацией IL-1β+хондроитин (IL-1β+C), полученные на основании денситометрического анализа вестерн-блотов, анализа, проведенного в трех (n=3) независимых экспериментах, *р для блотов в сравнении с конститутивно экспрессированным тубулином (*р<0,05 IL-1β+C в сравнении с IL-1β+CS и положительным контролем).
Кратко, результаты эксперимента демонстрируют, что: а) экспрессия GRP78, индуцированная IL-1β, положительно модулируется в результате предварительной обработки с использованием С в значительно большей степени, чем в результате предварительной обработки с использованием CS; б) процесс активации SOD-2, индуцированный IL-1β (симптом сильного окислительного стресса), эффективно ослабляется в результате предварительной обработки хондроитином, в то время как предварительная обработка хондроитинсульфатом является неэффективной.
ПРИМЕР 6. Хондроитин в качестве антибактериального средства
2
3
4
Изучали антибактериальную активность хондроитина (С) и хондроитинсульфата (CS) в отношении роста Escherichia coli с номером в АТСС (Американская коллекция типовых культур) 25922 и Enterococcus faecalis с номером в АТСС 19433 на твердой среде in vitro. Исследовали концентрации С или CS в диапазоне от 40 мкг/мл до 40 мг/мл как конечные концентрации в среде. Бульон с сердечно-мозговым экстрактом (Oxoid) использовали в качестве культуральной среды для Е. coli с номером в АТСС 25922 и М17 (Oxoid) для Е. faecalis с номером в АТСС 19433; рН и осмолярность обеих сред подводили до одних и тех же значений перед отвердеванием в результате добавления агара и охлаждения. В качестве инокулята в чашки вносили по 100 мкл бактериальной суспензии, содержащей 10, 10 или 10 бактерий/мл. Инокулированные чашки инкубировали в шейкерах на воздухе при 37°С в течение 16 ч. Затем подсчитывали число колоний на контрольных чашках, в которых отсутствовали изучаемые вещества, и на чашках с различными концентрациями С и CS. Данные для этих двух микроорганизмов, полученные в экспериментах, проведенных в трех повторах для каждого из условий, показаны в Таблицах 7 и 8.
Результаты демонстрируют, что влияние С оказывается более существенным, чем влияние CS, для всех концентраций, но сильный эффект первого проявлялся, в частности, тогда, когда добавляли С в концентрации 40 мг/мл, достигая наивысшей точки, выражающейся в полном ингибировании роста Е. coli, и верхнего порога чувствительности к ингибированию, которое уже является сильным в концентрациях, в 10 раз более высоких.
Таблица 7. Ингибирование клеточного роста штамма Escherichia coli с номером в АТСС 25922 на чашке в присутствии CS и С.
Таблица 8. Ингибирование клеточного роста штамма Enterococcus faecalis с номером в АТСС 19433 на чашке в присутствии CS и С.
Штамм Enterococcus в целом оказался менее чувствительным; однако, в присутствии максимальной концентрации тестируемых веществ он показывал фактор ингибирования 7,4 при использовании CS, но фактор 50 при использовании С.Эти результаты демонстрируют эффективность С в качестве антибактериального средства.
ПРИМЕР 7. Исследования токсичности хондроитина
Исследование острой токсичности. Это исследование проводили на двух животных моделях, мышах и крысах, которым хондроитин вводили перорально (п/о) или внутривенно (в/в). Для каждого эксперимента животных (мышей или крыс Sprague Dawley) разделяли на 5 групп по 20 особей (10 самцов и 10 самок), которые получали п/о или в/в хондроитин в дозах в диапазоне 250-2000 мг/кг при пероральном введении и 20-160 мг/кг при внутривенном введении; вводимый объем составлял 10 мл/кг при п/о введении и 5 мл/кг при в/в введении. В Таблице 9 показан план исследования.
Таблица 9. План исследования для оценки острой токсичности хондроитина, вводимого мыши и крысе в виде разовой пероральной или внутривенной дозы.
50
В процессе обработки животных исследовали каждые 24 ч в течение 40 суток и не наблюдали никаких признаков токсичности или летальности. В конце обработки животных умерщвляли и проводили полную аутопсию. Величины LD для обоих типов животных составляли более 2000 мг/кг при п/о введении и 160 мг/кг при в/в введении. В целом данное исследование демонстрирует, что хондроитин является нетоксичным в дозах, используемых при введении в условиях острого эксперимента.
Исследование подострой токсичности. Это исследование проводили на крысах путем перорального (п/о) и внутримышечного (в/м) введения хондроитина. В каждом из двух исследований животных (крыс Sprague Dawley) разделяли на 4 группы, состоящие из 15 самцов и 15 самок; хондроитин в концентрации 50, 100 и 200 мг/кг, соответственно, вводили первым 3 группам, а четвертой группе - только носитель; вводимый объем составлял 10 мл/кг при п/о введении и 5 мл/кг при в/м введении. Ежедневное введение осуществляли в течение 30 суток. Используемые дозы составляют вплоть до 20-кратной терапевтической дозы для человека. Ежедневно проводили мониторинг общего состояния здоровья и поведения обработанных животных, а оценку изменения массы, гематологического статуса и анализ мочи выполняли каждые 5 суток. На протяжении всего периода обработки не зарегистрировано ни одного случая смерти, и животные не демонстрировали никаких значительных изменений в поведении или аномальных изменений массы. Аналогично, для химико-клинических параметров не было показано каких-либо статистически значимых изменений по сравнению с контрольными животными. В конце исследования всех животных умерщвляли и проводили аутопсию и гистопатологический анализ основных органов (легких, сердца, печени, яичников, матки, семенников, почек и питуитарной железы). Ни одна из этих оценок не показала никаких значительных различий между животными, обработанными хондроитином, и контрольными животными, которые получали только носитель. В целом, данное исследование демонстрирует, что хондроитин является нетоксичным в дозах, используемых при введении в условиях подострого эксперимента.
Исследование хронической токсичности. Это исследование проводили на крысах (Sprague Dawley), которых обрабатывали один раз в сутки в течение 26 недель хондроитином, вводимым п/о (через желудочный зонд) в дозах в диапазоне от 50 до 200 мг/кг. Ежедневно проводили мониторинг общего состояния здоровья и поведения обработанных животных, а оценку изменения массы, гематологического статуса и анализ мочи выполняли каждые 7 суток. На протяжении всего периода обработки не зарегистрировано ни одного случая смерти, и животные не демонстрировали никаких значительных изменений в поведении или аномальных изменений массы. Аналогично, для химико-клинических параметров не было показано каких-либо статистически значимых изменений по сравнению с контрольными животными. В конце исследования всех животных умерщвляли и проводили аутопсию и гистопатологический анализ основных органов (легких, сердца, печени, яичников, матки, семенников, почек, питуитарной железы, лимфатических узлов и желудочно-кишечного тракта). Ни одна из этих оценок не показала никаких значительных различий между животными, обработанными хондроитином, и контрольными животными, которые получали только носитель. В целом, данное исследование демонстрирует, что хондроитин является нетоксичным в дозах, используемых при введении в условиях хронического эксперимента.
ПРИМЕР 8. Исследования мутагенности и генотоксичности
Исследования мутагенности хондроитина проводили на разных моделях мутагенности и генотоксичности in vitro и in vivo (Sirtori С, File CONDRAL, Vol. IV - Reproductive Toxicity and Mutagenesis; Slater E. et al., Rapid detection of mutagens and carcinogens, Cancer Res. 1971, 31: 970-973).
Тест in vitro, тест Эймса. Данный тест выполняли с активацией метаболизма и без нее на 5 штаммах Salmonella typhimurium. Хондроитин тестировали в концентрациях от 2,0 мкг/чашка до 2,0 мг/чашка. Анализ обратной мутации, возникающей при разных дозах и в контроле, не демонстрировал каких-либо значительных различий в числе гистидиновых ревертантов в каждой группе. Данное исследование демонстрирует, что хондроитин и метаболиты, которые могут образовываться из него, не индуцируют специфической точечной/обратной мутации в протестированных штаммах Salmonella typhimurium.
Тест in vitro, тест на наличие хромосомных аберраций. Тест на наличие хромосомных аберраций проводили на лимфоцитах человека в двух разных экспериментах с активацией метаболизма и без нее. План исследования приведен в Таблице 10.
Таблица 10. План эксперимента при тестировании наличия хромосомных аберраций для оценки мутагенности хондроитина.
Две культуры анализировали параллельно в каждом из двух экспериментов. Дозы хондроитина, тестируемые в диапазоне от 1,6 до 5,0 мкг/мл, были выбраны, как описано в рекомендациях OECD (Organisation for Economic Co-operation and Development - Организация экономического сотрудничества и развития) №473 от 21 июля 1997 года. Не наблюдали никакого значительного увеличения числа клеток, несущих хромосомные аберрации, в двойном независимом исследовании даже при самых высоких тестированных концентрациях хондроитина.
Тест in vitro, тест на репарацию ДНК. Тест на изменение ДНК проводили, используя штамм Escherichia coli, чувствительный к действию мутагенных веществ. В данном исследовании в качестве положительного контроля использовали митомицин С, а в качестве отрицательного контроля пенициллин G. Тестирование хондроитина проводили с активацией и без активации метаболизма в концентрациях, описанных Slater и др. (Slater Е. et al., Rapid detection of mutagens and carcinogens, Cancer Res. 1971, 31: 970-973, 1971). Результаты демонстрируют, что даже в самых высоких дозах хондроитин не взаимодействует с ДНК и не изменяет ДНК.
Тесты in vitro, микроядерный тест. Используя мышь в качестве экспериментальной модели, хондроитин вводили при проведении раннего микроядерного теста в дозах от 20 до 80 мг/кг внутрибрюшинно (в/б) 5 группам мышей Swiss (по 5 животных на группу). Введение выполняли дважды с интервалом 24 ч, используя триэтаноламин в качестве положительного контроля. Через 6 ч после второго введения животных умерщвляли и готовили образцы костного мозга, как описано в RCC-CCR Study 105303, 2007. Частоту встречаемости клеток с микроядрами определяли в общей сложности на 2000 эритроцитах от каждого животного. В данном исследовании не наблюдали никакой значимой разницы между группами, подвергнутыми обработке, и контролем, который получал только носитель. В целом, эти данные демонстрируют, что хондроитин может считаться немутагенным по результатам раннего микроядерного теста.
ПРИМЕР 9. Исследования канцерогенности
Гистопатологическое изучение в подостром и хроническом экспериментах, проведенных на крысе (пример 6), продемонстрировало полное отсутствие возможной неопластической дегенерации во всех основных органах. В частности, в хроническом исследовании даже в самых высоких дозах было продемонстрировано полное отсутствие симптомов раздражения желудочно-кишечного тракта, которое в перспективе, как правило, предвещает развитие возможных опухолей, таких как карцинома желудочно-кишечного тракта. Аналогично этому, важно учитывать то, что гидролитический катаболизм хондроитина не отличается от катаболизма хондроитинсульфата, и полученные олигосахариды и сахара представляют собой химические вещества, естественным образом присутствующие в организме.
ПРИМЕР 10. Исследование токсичности в отношении репродуктивной системы
Исследование репродуктивной функции и репродуктивной способности. Токсикологическое исследование возможных эффектов хондроитина на репродуктивную функцию мужских особей и репродуктивную способность женских особей проводили на 200 крысах Wistar (160 самок и 40 самцов), рандомизированных на четыре группы, каждая из которых состояла из 40 самок и 10 самцов, и обрабатываемых хондроитином в дозе 0, 50, 100 или 200 мг/кг. Каждую группу самок крыс в свою очередь подразделяли на две подгруппы из 20 животных; первая подгруппа получала продукт один раз в сутки, начиная с 14-х суток до начала периода спаривания и вплоть до 19-х суток беременности, а вторая подгруппа получала его до 21-х суток после рождения. Всех самцов обрабатывали хондроитином в течение 60 суток до спаривания и во время беременности самок. Использованный протокол соответствует рекомендациям Директивы Европейского экономического сообщества (EEC) 85/571. Результаты не показали какой-либо статистически значимой разницы между контролем и тремя группами, подвергнутыми обработке, или в пределах каждой группы между двумя подгруппами самок и контролем. Гистопатологический анализ потомства, умерщвленного на 21-е сутки после рождения, не показал каких-либо различий между контролем и подвергнутыми обработке животными, демонстрируя полное отсутствие отклонений от нормы. На основании этих результатов можно сделать вывод, что пероральное введение хондроитина один раз в сутки в течение 60 суток, даже в дозе 200 мг/кг, не оказывает никакого эффекта на репродуктивную функцию самцов крыс; аналогично, не обнаружено никакого влияния на репродуктивную способность самок, подвергнутых обработке хондроитином, вводимым один раз в сутки в дозе вплоть до 200 мг/кг в течение 15 суток перед спариванием и вплоть до 21-х суток лактации.
Эмбриофетальное развитие. Исследование фетальной токсичности проводили на 50 беременных новозеландских крысах в возрасте 5 месяцев, рандомизированных на 4 группы из 12 индивидуумов, обрабатываемых в/м хондроитином в дозах 0, 25, 50 и 100 мг/кг один раз в сутки, начиная от 6-х и до 27-х суток беременности. На 28-е сутки плоды извлекали посредством кесарева сечения и проводили их полное гистопатологическое тестирование. В процессе обработки оценивали следующие параметры: увеличение массы тела беременных мышей, количество желтых тел и имплантаций, наличие живорожденных плодов, среднюю массу, пол живорожденных плодов, количество резорбций и количество мертворожденных плодов. Результаты не показали какой-либо статистически значимой разницы между подвергнутыми обработке группами и контрольной группой, которая получала в/м обработку только носителем. Не наблюдали никаких внешних изменений или изменений скелетного аппарата или внутренних органов у плодов в этих 4 группах. Общая оценка данных приводит к заключению, что хондроитин не проявляет тератогенной активности даже в максимальной тестируемой дозе 100 мг/кг.
Постнатальное развитие. Исследование постнатальной токсичности проводили на 48 самках крыс Wistar, обрабатываемых перорально, начиная с 15-х суток беременности вплоть до конца периода лактации, а именно, в течение 21 суток послеродового периода. Животных разделяли на четыре группы, которые получали хондроитин в концентрации 0, 50, 100 или 200 мг/кг п/о каждые сутки. В конце периода лактации всех самок умерщвляли и оценивали морфологию и скелетные и висцеральные дефекты потомства. Параметрами, наблюдаемыми в динамике, были масса тела лактирующих самок и количество, пол и масса рожденных крыс. Результаты не показали какой-либо разницы между подвергнутыми лечению группами или между подвергнутыми лечению группами и контрольной группой. В процессе лактации никаких отклонений от нормы в развитии потомства не наблюдали. Можно сделать вывод, что хондроитин не оказывает никаких тератогенних эффектов на крыс после введения пероральных доз 50, 100 и 200 мг/кг/сутки начиная с 15-х суток беременности вплоть до конца периода лактации.
ПРИМЕР 11. Сенсибилизация
Активность хондроитина в отношении системной и кожной сенсибилизации оценивали на морской свинке.
Системная сенсибилизация и анафилаксия. Тест хондроитин-индуцированной гиперсенсибилизации проводили на 6 морских свинках, как изложено ниже. Шесть животных сенсибилизировали внутримышечной инъекцией 100 мкг овальбумина + 5 мг хондроитина в 100 мкл физиологического раствора, забуференного до рН 6,8. Сыворотку крови получали через 10 суток после сенсибилизации животных. Других 24 морских свинок обрабатывали интрадермально гипериммунной сывороткой от предварительно сенсибилизированных животных и разделяли на 4 группы по 6 особей (группа А: отрицательный контроль; группа В: тест-группа с хондроитином в концентрации 0,5 мг/мл; группа С: тест-группа с хондроитином в концентрации 50 мг/мл; группа D: положительный контроль). Через 3 ч после интрадермальной инъекции гиперсенсибилизированной сыворотки четыре группы животных обрабатывали в/в, как приведено ниже: группа А: 1 мл раствора, содержащего 0,9% NaCl + 0,2% голубого раствора Эванса; группа В: 1 мл раствора, содержащего хондроитин в концентрации 0,5 мг/мл + 0,2% голубого раствора Эванса; группа С: 1 мл раствора, содержащего хондроитин в концентрации 50 мг/мл + 0,2% голубого раствора Эванса; группа D: 1 мл раствора, содержащего овальбумин в концентрации 0,1 мг/мл + 0,2% голубого раствора Эванса. Через 24 ч после в/в инъекции антигена овальбумина и голубого раствора Эванса все животные в группе D демонстрировали экссудацию маркера голубого раствора Эванса в том участке кожи, куда вводили гипериммунную сыворотку. Однако хондроитин не индуцировал анафилактические реакции или реакции гиперчувствительности ни у одного из обработанных животных.
Кожная сенсибилизация. Тест хондроитин-индуцированной кожной гиперсенсибилизации проводили на морских свинках, как изложено ниже. Сенсибилизировали 20 животных, используя интрадермальную инъекцию 5,0 мг хондроитина в 0,1 мл 0,9%-ного NaCl с адъювантом Фрейнда и без него. 10 животных из контрольной группы получали 0,1 мл инъекции 0,9%-ного NaCl с адъювантом Фрейнда и без него. Индуцирование сенсибилизации завершали через 7 суток, применяя 0,5 мл раствора хондроитина в концентрации 50 мг/мл в участки кожи сенсибилизированных животных, куда предварительно вводили инъекции. Для контрольной группы применяли 0,5 мл 0,9%-ного раствора NaCl. Через 21 сутки всех животных обрабатывали 0,5 мл 50%-ного раствора хондроитина на левой стороне брюшной полости и 0,5 мл 50%-ного раствора NaCl на правой стороне брюшной полости. Никакого признака кожной сенсибилизации у обработанных животных не обнаружено.
ПРИМЕР 12. Заживление ран
Мини-свинью (животное массой 25-28 кг), модель, обоснованность использования которой для изучения заживления ран является общепризнанной, использовали в качестве экспериментальной модели для оценки способности хондроитина ускорять процесс репарации пораженной кожной ткани. Действуя под общим наркозом, со спины животных сбривали шерсть и выбритую поверхность тщательно промывали 10%-ным раствором комплекса йод-поливинилпирролидон и затем изопропиловым спиртом. На выбритых дезинфицированных спинах животных создавали 12 ран эллиптической формы, по шесть с каждой стороны, длиной 20 мм и шириной 6 мм. Раны простирались до самого подкожного жира, примерно на 4 см от средней линии спины, причем более длинная сторона раны была параллельна линии позвоночника. Затем разрезы сшивали двумя швами, чтобы закрыть кожную поверхность. Примерно через 7 суток удаляли поверхностные швы. Раны покрывали неприлипающей повязкой, фиксированной липким пластырем, и тело животных защищали эластичным бинтом. Отбирали восемь животных и разделяли на две группы по 4 особи, проводили местную обработку хондроитином (первая группа) или хондроитинсульфатом (вторая группа), как описано в протоколе, приведенном в Таблице 11. Начиная с головы животного, первые две раны на обеих сторонах обрабатывали только носителем, состоящим из 2,5 мл физиологического раствора, вторые две на обеих сторонах обрабатывали 2,5 мл раствора хондроитина в концентрации 30 мг/мл в физиологическом растворе (первая группа) или 2,5 мл раствора хондроитинсульфата в концентрации 30 мг/мл в физиологическом растворе (вторая группа) и третьи две на обеих сторонах обрабатывали 2,5 мл раствора хондроитина в концентрации 60 мг/мл в физиологическом растворе (первая группа) или 2,5 мл раствора хондроитинсульфата в концентрации 60 мг/мл в физиологическом растворе (вторая группа). Обработку выполняли путем медленного закапывания водного раствора в рану дважды в сутки и наложения марлевой повязки, которую затем использовали для того, чтобы закрыть рану, чтобы активный ингредиент оставался in situ в течение более длительного срока. Данное исследование продолжали в течение 6 недель, после чего животных умерщвляли. Через 4 недели проводили биопсию с глубины примерно 4 мм, одновременно у умерщвленных животных удаляли целиком поверхности 12 ран на спине для гистологических тестов. На обработанных животных проводили следующие оценочные тесты:
а) оценка через 4 и 6 недель 4 дерматологами, которые независимо определяли качество раны (цвет, текстуру, края, деформацию) и внешний вид окружающей ткани по 5-бальной шкале;
б) патологическая оценка по шкале от 1 до 3, выполненная двумя ветеринарными врачами на ткани, извлеченной после умерщвления животных, для оценки наличия аномальных гистопатологических ситуаций (количество грануляционной ткани и воспалительный ответ, с баллом 3 для оптимального заживления до 1 для непроходящих воспалительных симптомов и избыточной грануляционной ткани);
в) гистологический анализ 4-недельных биоптатов и ткани, извлеченной после умерщвления животных, проводимый двумя гистологами, работающими независимо, которые оценивали организацию коллагена по 3-балльной шкале.
Организации коллагеновых волокон, аналогичных нормальной модели, но меньших, чем в обычной дерме (наилучшее заживление), присваивали 3 балла, промежуточному расположению переплетения волокон присваивали 2 балла, а нескольким волокнам, расположенным в параллельных пучках или на плоскости, присваивали 1 балл.
Таблица 11. План исследования для оценки эффективности хондроитина по сравнению с хондроитинсульфатом в заживлении ран. Каждая группа состояла из 4 животных. Первую группу обрабатывали хондроитином (С), а вторую хондроитинсульфатом (CS).
В Таблице 12 показаны оценки качества раны.
Таблица 12. Дерматологическая, гистопатологическая и гистологическая оценка ран после обработки хондроитином (С) и хондроитинсульфатом (CS): а-б) через 4 и 6 недель 4 дерматолога независимо определяли качество раны (цвет, текстуру, края и деформацию) и внешний вид окружающей ткани по 5-бальной шкале, в которой 5 представляет собой превосходное качество; в) гистопатологическая оценка по шкале от 1 до 3 выполнялась двумя ветеринарными врачами на ткани, извлеченной после умерщвления животных, для оценки наличия аномальных гистопатологических ситуаций (количество грануляционной ткани и воспалительный ответ, при этом 3 указывает на оптимальное заживление, а 1 указывает на непроходящие воспалительные симптомы и избыточную грануляционную ткань); г/д) гистологический анализ 4-недельных биоптатов и тканей, извлеченных после умерщвления животных, проводился двумя гистологами, работающими независимо, которые оценивали организацию коллагена по 3-балльной шкале, при этом 3 соответствует организации коллагеновых волокон, аналогичных нормальной модели, но меньших, чем в обычной дерме (наилучшее заживление), 2 соответствует промежуточному расположению переплетения волокон, а 1 соответствует нескольким волокнам, расположенным в параллельных пучках или на плоскости.
Дерматологическая оценка заживления ран продемонстрировала существенно более высокое качество процесса заживления ран в присутствии хондроитина, который был более быстрым и характеризовался качественно более хорошим внешним видом краев раны и окружающей ткани.
В случае лечения хондроитином гистопатологическая оценка показала более низкое содержание грануляционной ткани и очень ограниченное количество воспалительных симптомов.
Гистологическая оценка продемонстрировала, что в случае лечения хондроитином организация коллагеновых волокон была практически аналогична таковой у нормальной ткани, указывая на улучшенный процесс заживления раны.
ПРИМЕР 13. Терапевтический потенциал хондроитина в лечении суставного заболевания
Терапевтический потенциал хондроитина в лечении суставного заболевания оценивали на собаке, экспериментальной модели, у которой ортопедические проблемы дегенеративного или воспалительного характера, ассоциированные с дегенеративным суставным заболеванием (DJD), имеют, в частности, рецидивную форму как в молодом, так и в старческом возрасте.
Исследование проводили на 90 животных со средней массой 30±10 кг, средним возрастом примерно 8 лет, разных пород, как самцах, так и самках, при этом все они страдали от DJD плеча, бедра и/или коленного сустава, рандомизированных на три группы по 30 животных, которых обрабатывали хондроитином в дозе 15 мг/кг/сутки (группа С), хондроитинсульфатом в дозе 15 мг/кг/сутки (группа CS) или крахмалом в дозе 15 мг/кг/сутки (группа, получающая плацебо). Животные получали суточную дозу со своим кормом. Для всех животных, включенных в это исследование, предварительно проводили обследование с помощью рентгеновских лучей и ряда диагностических тестов для DJD. Животные не получали каких-либо фармакологических лечений в течение трех недель, предшествующих исследованию, и в ходе исследования не получали каких-либо обработок дополнительно к тестируемым. Исследование продолжали в течение 6 месяцев; в процессе обработки, животных, за которыми ухаживали их владельцы, обследовали три ветеринарных врача, которые независимо оценивали состояние животных. Каждый месяц владельцы животных и три ветеринарных врача вносили отметки в опросник, присваивая балл по шкале от 1 до 5 для набора параметров. Один раз в месяц владельцы оценивали, по шкале от 1 до 5, хромоту животного, его готовность к игре, толерантность к нагрузке и поведение, указывающее на наличие болевых симптомов. Один раз в месяц ветеринарные врачи оценивали, по шкале от 1 до 5, регрессию заболевания, характеристику типа и степени суставного заболевания и боль у животного и способность ее купировать. В конце исследования контролировали течение заболевания, используя обследование с помощью рентгеновских лучей и набор диагностических тестов для DJD. На основании опросников и конечных клинических оценок три ветеринарных врача выставляли средний общий балл в отношении регрессии заболевания в трех группах животных по шкале от 1 до 10, где значения от 3 до 1 указывают на увеличение ухудшения клинических симптомов с начала данного испытания, а увеличение значений от 3 до 10 указывает на постепенное изменение в сторону полного излечения. Контрольная группа имела средний балл 2,5±1,3, CS группа 5,3±2,3 и С группа 8,5±2,1. В целом, испытание на собаках, страдающих от DJD, указывает на то, что пероральная обработка хондроитином в суточной дозе 15 мг/кг в течение 6 месяцев значительно улучшает клинические симптомы с хорошей регрессией заболевания.
ПРИМЕР 14. Процедуры биоревитализации кожи, включающие интрадермальные микроинъекции хондроитина
Активность в отношении биоревитализации кожи в результате микроинъекций хондроитина оценивали путем сравнения с аналогичными процедурами обработки на основе гиалуроновой кислоты. В данном испытании принимали участие 60 добровольцев в возрасте от 50 до 70 лет, которые получали процедуру эстетической биоревитализации кожи, включающую в себя три цикла микроинъекцией с двухнедельными интервалами в течение 6 месяцев по 2 мл апирогенного, стерильного раствора хондроитина (MW 35 кДа) в концентрации 20 мг/мл (С-20) или 60 мг/мл (С-60), при этом в качестве положительного эталона использовали аналогичный традиционный цикл обработки 2 мл гиалуроновой кислоты (1200 кДа) в концентрации 20 мг/мл (НА-20). Добровольцы не получали аналогичных процедур обработки или процедур химического пилинга в течение 5 месяцев непосредственно перед данным исследованием. В течение 6-месячного периода обработки все участвующие добровольцы использовали один и тот же увлажняющий крем, который наносили утром и вечером. Инструментальные измерения TEWL (трансэпидермальной потери воды) и оценку текстуры ткани и силиконовой реплики поверхности кожи проводили в одной и той же лаборатории в начале исследования и через 6 месяцев для документального описания шероховатости кожи. Через 0, 2, 4 и 6 месяцев косметолог, который проводил данное лечение, и пациент независимо вносили отметки в опросник для оценки общего эстетического состояния по шкале от 1 до 5, где 1 указывает на то, что данная обработка не давала никакого результата, а 5 указывает на полный успех. На основании этих оценок, вместе с инструментальными данными, получали общую оценку полученного результата. В Таблице 13 показаны средние значения полученных результатов.
Таблица 13. В данном испытании принимали участие 60 добровольцев в возрасте от 50 до 70 лет, которые получали процедуру эстетической биоревитализации кожи, включающую в себя три цикла микроинъекцией с двухнедельными интервалами в течение 6 месяцев по 2 мл апирогенного, стерильного раствора хондроитина (MW 35 кДа) в концентрации 20 мг/мл (С-20) или 60 мг/мл (С-60), используя в качестве положительного эталона аналогичный традиционный цикл обработки 2 мл гиалуроновой кислоты (1200 кДа) в концентрации 20 мг/мл (НА-20). Через 0, 2, 4 и 6 месяцев косметолог, который проводил данное лечение, и пациент независимо вносили отметки в опросник для оценки общего эстетического состояния по шкале от 1 до 5, где 1 указывает на то, что данная обработка не давала никакого результата, а 5 указывает на полный успех. Инструментальные измерения TEWL (трансэпидермальной потери воды), оценку текстуры ткани и силиконовой реплики поверхности кожи проводили в одной и той же лаборатории в начале исследования и через 6 месяцев для документального описания шероховатости кожи. И снова оценку выставляли с учетом мнения дерматолога, который оценивал данные методом сравнения и присваивал балл общему результату по шкале от 1 до 5. Каждое число представляет собой среднее значение для 10 исследованных случаев.
Видно, что хондроитин в той же концентрации, что и гиалуроновая кислота, обладает более ранним и более продолжительным биоревитализирующим действием (НА-20 по сравнению с С-20), тогда как в более высоких концентрациях (С-60), биоревитализирующее действие гораздо больше усиливается согласно оценкам доктора и пациента и инструментальным результатам, достигая превосходных результатов начиная со второй обработки.
ПРИМЕР 15. Хондроитин в качестве агента, усиливающего активность противоопухолевых активных ингредиентов
Исследовали способность хондроитина (С) и хондроитинсульфата (CS) усиливать апоптотическое действие гемцитабина (GEM) и митомицина-С (ММС), двух противоопухолевых средств, используемых при внутрипузырной терапии опухолей мочевого пузыря без инвазии в мышечный слой. В качестве системной модели использовали линии клеток рака мочевого пузыря человека НТ-1376, оценивая способность различных комбинаций GEM или МСС и С или CS ингибировать рост.
2
50
50
3
Линию клеток рака мочевого пузыря человека НТ-1376 (Американская коллекция типовых тканевых культур, Rockville, MD) культивировали в DMEM, дополненной 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сывороткой (FBS), 20 мМ 4,2-гидроксиэтил-1-пиперазинил-этансульфоновой кислотой (HEPES), пенициллином (100 ед./мл), стрептомицином (100 пг/мл), 1% (масс/об.) L-глутамината натрия и 1% (масс/об.) пирувата. Клетки культивировали в увлажненной атмосфере, содержащей 95% воздуха/5% СО, при 37°С. Чтобы исследовать синергизм между С или CS и ММС или GEM в отношении ингибирования роста НТ-1376, клетки высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 6×10 клеток/лунка. Через 24 часа инкубации при 37°С клетки обрабатывали, используя различные концентрации С или CS либо GEM или ММС и составленных на их основе комбинаций полисахарид-противоопухолевое средство. Оценка синергизма полисахарида и противоопухолевого средства основывалась на выполненном после 72 часов обработки анализе кривых зависимости количества выживших клеток от концентрации противоопухолевого средства, выполненном с использованием компьютерной программы Calcusyn (Biosoft, Ferguson, МО). Значения показателя аддитивности (Cl) менее 1, равные 1 и более 1 указывают соответственно на синергизм, аддитивность и антагонизм во взаимодействии полисахарида и противоопухолевого средства. Конкретный вклад различных ингредиентов С, CS, GEM и ММС в цитотоксичность различных комбинаций определяли, рассчитывая фактор потенцирования (PF), определяемый как соотношение между значениями IC (концентрация, вызывающая 50%-ное ингибирование роста) для С, CS, GEM или ММС, взятых по отдельности, и IC для комбинаций C/GEM, С/ММС, CS/GEM и CS/MMC; более высокое значение PF указывает на более высокую цитотоксичность.
2
2
4
Для оценки количества апоптотических или некротических клеток использовали проточную цитометрию. В качестве маркера использовали флуоресцеин-изотиоцианат (аннексии V-FITC) вместе с иодидом пропидия (PI); апоптотические клетки были аннексин-V-FITC-положительными и PI-отрицательными, а некротические клетки были аннексин-V-FITC-положительными и PI-положительными. Клетки метили, инкубируя их с аннексин-V-FITC (Diagnostics Med Systems) и PI (Sigma) в буфере для связывания (10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМ MgCl, 2,5 мМ CaCl) в течение 10 мин при температуре окружающей среды и затем промывая и ресуспендируя клеточный материал в том же буфере. Апоптотические и некротические клетки анализировали с использованием проточной цитометрии (FACScan, Becton-Dickinson), набирая в среднем 2×10 событий для одного образца, при этом определения выполняли в трех повторах в трех отдельных экспериментах.
50
Влияние С, CS, GEM или ММС, взятых по отдельности, на рост НТ-1376 оценивали через 48 и 72 ч после начала обработки. Все продукты вызывали ингибирование роста, зависимое от времени и дозы. Через 72 ч, в случае концентрации 12 мг/мл, значение IC составляло 2 мг/мл для С, 12 мг/мл для CS, 18 мкг/мл для ММС и 0,5 мкг/мл для GEM. В указанных концентрациях цитотоксический эффект был умеренным, и клеточный рост возобновлялся, если тестируемый продукт удаляли из среды.
50
50
Синергический эффект комбинации полисахарид-противоопухолевое средство в отношении ингибирования роста НТ-1376 оценивали на основании этих результатов. В частности, исследовали ингибирование роста, индуцированное через 72 ч различными концентрациями С или CS в комбинации с ММС или GEM, используя Calcusyn в качестве программного обеспечения для анализа данных. Комбинация С или CS с ММС обладает сильным синергическим эффектом, когда используется избыток полисахарида по отношению к ММС, при этом значения IC составляют 0,1 и 0,4 для С и CS соответственно, что указывает на то, что синергический эффект С превышает таковой у CS. Другое поведение наблюдали тогда, когда С или CS был объединен с GEM; в этом случае отмечалось синергическое взаимодействие, когда использовали избыток GEM по отношению к полисахариду. Работая в соотношениях, которые обеспечивают синергическое взаимодействие (полисахарида меньше, чем противоопухолевого средства), получали значения IC, равные 0,2 и 0,7 для С и CS, соответственно, снова подтверждая, что синергический эффект С превышает таковой у CS.
Синергическая комбинация С или CS и GEM характеризовалась важным апоптотическим действием, которое не наблюдали, когда активные ингредиенты использовали по отдельности, как показано в Таблице 14.
Таблица 14. Оцененное с использованием клеточного сортера состояние клеток НТ-1376, обработанных в течение 48 ч С или CS в концентрации 0,04 мкг/мл и GEM в концентрации 0,15 мкг/мл, по отдельности или в комбинации полисахарид-GEM.
Другое поведение наблюдали в случае синергических комбинаций С или CS с ММС (избыток полисахарида по отношению к противоопухолевому средству). В этом случае, как показано в Таблице 15, использование комбинации полисахарид-противоопухолевое средство приводило к диссеминированному некрозу клеток, который был самым значительным в случае синергической комбинации С-ММС.
Таблица 15. Оцененное с использованием клеточного сортера состояние клеток НТ-1376, обработанных в течение 48 ч С или CS в концентрации 5,7 мкг/мл и ММС в концентрации 1,7 мкг/мл, по отдельности или в комбинации полисахарид-ММС.
Данное исследование в целом демонстрирует, что: а) комбинация противоопухолевого средства и С или CS оказывает сильное влияние на ингибирование роста опухолевых клеток; б) синергические действия различаются в зависимости от использованного противоопухолевого средства; в) синергизм комбинации полисахарид-GEM приводит главным образом к тому, что клетки подвергаются апоптозу, тогда как синергизм комбинации ММС-полисахарид приводит к тому, что клетки подвергаются некрозу; г) синергические эффекты С значительно превышают эффекты CS; д) синергические комбинации С с GEM или ММС могут представлять собой перспективный терапевтический подход в области лечения поверхностных опухолей мочевого пузыря.
ПРИМЕР 16. Вискосапплементарная терапия и репарация хрящевой ткани
Цель этого исследования заключалась в оценке терапевтического потенциала комбинаций гиалуроновая кислота-хондроитин (НА-С) в случае суставного заболевания, ассоциированного с поражением хрящевого компонента сустава. Исследование проводили на 30 добровольцах, страдающих от тяжелого повреждения коленного сустава с поражением хрящевого компонента, с выраженными непроходящими воспалительными симптомами, опуханием и болью. Добровольцев обоих полов в возрасте от 25 до 45 лет рандомизировали на три группы по 10 человек; контрольную группу обрабатывали физиологическим раствором, группу НА гиалуроновой кислотой, а группу НА-С смесью гиалуроновой кислоты и хондроитина. Вискосапплементарную терапевтическую обработку выполняли 3 раза с интервалами в 2 месяца путем инъекции в сустав 2 мл стерильного, апирогенного раствора, состоящего из физиологического раствора (0,9%-ного NaCl) для контрольной группы, раствора гиалуроновой кислоты (1200 кДа; 20 мг/мл) для НА группы и раствора гиалуроновой кислоты (1200 кДа; 20 мг/мл) + хондроитина (20 мг/мл) для НА-С группы. До исследования и в конце 6 месяцев исследования добровольцев обследовали с помощью рентгеновских лучей и МРТ-сканирования сустава. Три врача-ортопеда независимо оценивали развитие патологических симптомов (боли, воспалительного состояния и опухания) и репарацию пораженного хряща в динамике (до обработки и через 3 и 6 месяцев) по шкале от 1 до 5 (где 1 соответствует отсутствию заживления, а 5 указывает на полную ремиссию патологических симптомов и полную репарацию поражения хрящевой ткани). В Таблице 16 показаны итоговые данные этого исследования. Указанные данные демонстрируют, что при вискосапплементарных терапевтических обработках хрящевого поражения присутствие хондроитина обеспечивает превосходный уровень репарации хрящевого компонента сустава и общее улучшение патологических симптомов с течением времени.
Таблица 16. Вискосапплементарную терапевтическую обработку выполняли 3 раза с интервалами в 2 месяца путем инъекции в сустав 2 мл стерильного, апирогенного раствора, состоящего из физиологического раствора (0,9%-ного NaCl) для контрольной группы, раствора гиалуроновой кислоты (1200 кДа; 20 мг/мл) для НА группы и раствора гиалуроновой кислоты (1200 кДа; 20 мг/мл) + хондроитина (20 мг/мл) для НА-С группы. Три врача-ортопеда независимо оценивали развитие патологических симптомов (боли, воспалительного состояния и опухания) и репарацию пораженнного хряща в динамике (до обработки и через 3 и 6 месяцев) по шкале от 1 до 5 (где 1 соответствует отсутствию заживления, а 5 указывает на полную ремиссию патологических симптомов и полную репарацию поражения хрящевой ткани). Приведенные значения представляют собой средную величину из 3 независимых оценок.
ПРИМЕР 17. Хондроитин в лечении интерстициального цистита
В данном исследовании принимали участие 10 женщин в возрасте от 35 до 60 лет с диагнозом неязвенного интерстициального цистита, подтвержденным на основании уродинамических, клинических и эндоскопических параметров, причем последние показывают наличие петехиального кровоизлияния при цистоскопии с растяжением мочевого пузыря. Субъектов рандомизировали на 2 группы по 5 индивидуумов; первую группу обрабатывали путем инстилляции в мочевой пузырь через катетер раствора (40 мл), содержащего 40 мг гиалуроновой кислоты MW 1800 кДа (НА) и 40 мг хондроитинсульфата (CS), а вторую обрабатывали раствором (40 мл), содержащим 40 мг гиалуроновой кислоты MW 1800 кДа (НА) и 40 мг хондроитина (С). Эту обработку повторяли еженедельно в течение 6 недель и затем ежемесячно в течение 5 месяцев. В начале обработки и в конце исследования выполняли цистоскопию с растяжением мочевого пузыря для контроля состояния эпителиальной ткани и проводили биопсию стенки мочевого пузыря для подтверждения воспалительного состояния. До обработки и через 2, 5 и 7 месяцев после обработки уролог вносил отметки в клиническую форму, по согласованию с пациентом, для количественной оценки уродинамики (императивности, частоты и ноктурии) и наличия жжения и боли в мочевом пузыре. Все параметры оценивали по шкале от 0 до 6, где 0 указывает на отсутствие патологических симптомов. В Таблице 17 показаны полученные данные.
Сравнение данных цистоскопии с растяжением мочевого пузыря, проведенной до и после лечения, свидетельствовало о повсеместном, более успешном разрешении патологического состояния у пациентов в группе НА-С по сравнению с группой HA-CS, и этот факт подтверждали посредством гистологической оценки биоптатов стенки мочевого пузыря, которые демонстрировали более успешное разрешение воспалительного процесса в группе НА-С по сравнению с группой HA-CS. Клинические данные, приведенные в Таблице 11, также согласуются с этой оценкой, демонстрируя более полное, более быстрое разрешение патологических симптомов для группы НА-С в плане как уродинамики, так и остаточной боли.
Таблица 17. 10 женщин-добровольцев, страдающих от неязвенного интерстициального цистита, рандомизировали на 2 группы по 5 индивидуумов; первую группу (НА-С) обрабатывали путем инстилляции в мочевой пузырь через катетер раствора (40 мл), содержащего 40 мг гиалуроновой кислоты MW 1800 кДа (НА) и 40 мг хондроитинсульфата (CS), а вторую группу (HA-CS) обрабатывали раствором (40 мл), содержащим 40 мг гиалуроновой кислоты MW 1800 кДа (НА) и 40 мг хондроитина (С). Эту обработку повторяли еженедельно в течение 6 недель и затем ежемесячно в течение 5 месяцев. До обработки и через 2, 5 и 7 месяцев после обработки уролог вносил отметки в клиническую форму, по согласованию с пациентом, для количественной оценки уродинамики (императивности, частоты и ноктурии) и наличия жжения и боли в мочевом пузыре. Все параметры оценивали по шкале от 0 до 6, где 0 указывает на отсутствие патологических симптомов. Все параметры оценивали по шкале от 0 до 6, где 0 указывает на отсутствие патологических симптомов.
ПРИМЕР 18. Глазные композиции
Сравнивали два глазных препарата: традиционный препарат на основе гиалуроновой кислоты и препарат на основе хондроитина, каждый в концентрации 3% (масс/об.) в физиологическом растворе NaCl при рН 7,4. Глазные капли готовили в упаковке для однократного применения со стерилизацией в автоклаве.
Исследование проводили на 30 добровольцах, страдающих от сухости глаз, которым вводили глазные капли 4 раза в сутки в течение 30 суток. Добровольцев обоих полов в возрасте от 45 до 60 лет рандомизировали на две группы по 15 субъектов и обрабатывали глазными каплями двух типов. Под медицинским наблюдением оценивали воспалительное состояние поверхности роговицы в начале и в конце лечения и регистрировали оценки подвергнутых лечению пациентов в отношении переносимости, продолжительности эффекта увлажнения и изменения зрения после применения. Для клинических оценок и оценок пациентами использовали шкалу от 1 до 5, где 5 представляет собой оптимальное разрешение патологического состояния и его последствий.
Как продемонстрировано экспериментальными результатами, приведенными в Таблице 18, глазные капли на основе хондроитина (С) дают наилучшие оценочные показатели как в случае клинической оценки, так и субъективной оценки, осуществляемой подвергаемыми лечению пациентами.
Таблица 18. Исследование проводили на 30 добровольцах обоих полов в возрасте от 45 до 60 лет, страдающих от сухости глаз. Добровольцев рандомизировали на две группы по 15 субъектов, которым вводили глазные капли 4 раза в сутки в течение 30 суток. Первую группу (НА) обрабатывали глазными каплями на основе гиалуроновой кислоты в концентрации 3% (масс/об.) в физиологическом растворе NaCl при рН 7,4. Вторую группу (С) обрабатывали глазными каплями на основе хондроитина в концентрации 3% (масс/об.) в физиологическом растворе NaCl при рН 7,4. Глазные капли готовили в упаковке для однократного применения со стерилизацией в автоклаве.
Под медицинским наблюдением оценивали воспалительное состояние поверхности роговицы в начале и в конце лечения и регистрировали оценки подвергнутых лечению пациентов в отношении переносимости, продолжительности эффекта увлажнения и изменения зрения после применения. Для клинических оценок и оценок пациентами использовали шкалу от 1 до 5, где 5 представляет собой оптимальное разрешение патологического состояния и его последствий.
ПРИМЕР 19. Защитное действие хондроитина в растворах для интраперитонеального диализа
Цель данного исследования заключалась в оценке перекисного повреждения перитонеальной мембраны, в зависимости от присутствия глюкозы, хондроитина или хондроитинсульфата в жидкостях для перитонеального диализа. Эффект перекисного окисления липидов ткани брюшины после повторных обработок путем перитонеального диализа оценивали, используя в качестве экспериментальной модели самцов крыс Wistar в возрасте 8 недель, обработанных 4 типами композиций: а) глюкоза -2,5% масс/об., хондроитинсульфат, MW 20-40 кДа - 0,1% масс/об., натрий -135,0 мэкв./л, магний - 1,5 мэкв./л, кальций - 4,0 мэкв./л, хлор - 105,5 мэкв./л, молочная кислота - 35,0 мэкв./л, рН 7,0-7,3, π-раствор/π-физиологический раствор 1,4-1,6; б) глюкоза - 2,5% масс/об., хондроитин, MW 20-40 кДа - 0,1% масс/об., натрий - 135,0 мэкв./л, магний - 1,5 мэкв./л, кальций - 4,0 мэкв./л, хлор - 105,5 мэкв./л, молочная кислота - 35,0 мэкв./л, рН 7,0-7,3, π-раствор/π-физиологический раствор 1,4-1,6; в) хондроитинсульфат, MW 20-40 кДа - 2,5% масс/об., натрий - 135,0 мэкв./л, магний - 1,5 мэкв./л, кальций - 4,0 мэкв./л, хлор - 105,5 мэкв./л, молочная кислота - 35,0 мэкв./л, рН 7,0-7,3, с добавлением NaCl до получения соотношения π-раствор/π-физиологический раствор в диапазоне 1,4-1,6; г) хондроитинсульфат, MW 20-40 кДа - 2,5% масс/об., натрий - 135,0 мэкв./л, магний - 1,5 мэкв./л, кальций - 4,0 мэкв./л, хлор - 105,5 мэкв./л, молочная кислота - 35,0 мэкв./л, рН 7,0-7,3, с добавлением NaCl до получения соотношения π-раствор/π-физиологический раствор в диапазоне 1,4-1,6; 40 животных рандомизировали на 4 группы по 10 особей и в брюшную полость каждого животного вводили инъекцией 15 мл раствора под эфирным наркозом в течение 10 последующих суток. В конце исследования извлекали брюшину умерщвленных животных и перекисное окисление липидов оценивали количественно в ткани методом с применением тиобарбитуровой кислоты (ТВА), используя набор для анализа OxiSelect TBARS (Cell Biolabs Inc.). Перекисное окисление липидов является хорошо известным механизмом клеточного повреждения. Пероксиды липидов представляют собой нестабильные индикаторы окислительного стресса клеток, которые при своем разложении образуют реакционно-способные соединения типа малонилдиальдегида (MDA), основного маркера перекисного окисления липидов. Используемый набор обеспечивает простую, воспроизводимую систему для анализа MDA, и, следовательно, окисления липидов, в образцах гомогенатов ткани на основании способности MDA образовывать комплекс 1:2 с тиобарбитуровой кислотой (TBARS - реакционно-способные соединения тиобарбитуровой кислоты), который может быть определен спектрофотометрически. Набор содержит стандарт MDA для использования в качестве положительного контроля и для калибровочных кривых. MDA, содержащийся в образцах, и стандарт MDA приводили во взаимодействие с ТВА, инкубируя в течение непродолжительного времени при 95°С, что приводит к образованию комплекса TBARS, определяемого количественно и спектрофотометрически путем сравнения со стандартной кривой. Свежеприготовленные образцы ткани брюшины промывали повторно раствором гепарина, содержащим PBS, для удаления гемоглобина, суспендировали (100 мг/мл) в PBS, содержащем 1х раствор бутилированного гидрокситолуола (ВНТ) (поставляемого в наборе для предотвращения дальнейшего окисления липидов при обработке образцов) и затем гомогенизировали на льду и центрифугировали при 10000 об./мин в течение 5 мин, собирая супернатант, в котором анализировали уровень TBARS. Принимая за 1 величину пероксидов липидов/г ткани при обработке раствором а), содержащим 2,5% (масс/об.) глюкозы и 0,1% (масс/об.) хондроитинсульфата, получали, что соответствующее значение при использовании раствора б), содержащего 2,5% (масс/об.) глюкозы и 0,1% (масс/об.) хондроитина, составляло 0,7, тогда как значение, полученное при использовании раствора в), содержащего 2,5% (масс/об.) хондроитинсульфата, составляло 0,5, а значение, полученное при использовании раствора г), содержащего 2,5% (масс/об.) хондроитина, составляло 0,1. Эти данные демонстрируют, что при интраперитонеальном диализе хондроитин можно использовать в качестве осмотического агента вместо глюкозы, с превосходными результатами с точки зрения защиты ткани брюшины от стресса, вызываемого перекисным окислением липидов при систематическом интраперитонеальном диализе; однако, аналогичный удовлетворительный результат не может быть получен при использовании хондроитинсульфата со сходными характеристиками по молекулярной массе.