МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНА АРИЛОКСИАЛКАНОАТДИОКСИГЕНАЗЫ (AAD-12) В РАСТЕНИЯХ
MATERIALS AND METHODS FOR DETECTING THE GENE OF ARILOXYALCANOADYOXYGENASE (AAD-12) IN PLANTS

Перекрестная ссылка на родственную заявку
Эта заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США с серийным № 61/548543, поданной 18 октября 2011.
Предпосылки создания изобретения
Соя является важной культурой и является основным пищевым ресурсом во многих регионах мира. Методы биотехнологии были применены к сое для улучшения агротехнических характеристик и качества продукта. Примеры агротехнических характеристик, привнесенных в растения сои, включают устойчивость к гербицидам и устойчивость к насекомым.
Ген aad-12 (происходящий из Delftia acidovorans) кодирует белок арилоксиалканоатдиоксигеназу (AAD-12). Этот ген придает устойчивость к 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоте, например, и гербицидам на основе пиридилоксиацетата. Сам ген aad-12 для привнесения устойчивости к гербицидам в растения обсуждался в WO 2007/053482.
На экспрессию гетерологичных или чужеродных генов (трансгенов) в растениях оказывает влияние то, что чужеродный ген вставлен в хромосоме. Это могло бы объясняться, например, структурой хроматина (например, гетерохроматина) или близким к месту интеграции соседством регулирующих транскрипцию элементов (например, энхансеров) (Weising et al, Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988). Таким образом, один и тот же ген в одном и том же типе трансгенного растения (или другом организме) может демонстрировать широкую вариацию уровня экспрессии среди различных трансформантов. Могут также существовать различия в пространственных или временных картинах экспрессии. Например, различия в относительной экспрессии трансгена в различных тканях растения могут не соответствовать картинам, ожидаемым исходя из регулирующих транскрипцию элементов, присутствующих в генной конструкции, введенной в растение.
Соответственно, большое число трансформантов часто создают и подвергают скринингу для идентификации трансформанта, который экспрессирует представляющий интерес введенный ген на удовлетворительном уровне для конкретной цели. Для промышленных целей обычно создают от сотен до тысяч различных трансформантов и осуществляют скрининг этих трансформантов для отбора одного трансформанта, который характеризуется желаемыми уровнями и картинами экспрессии трансгена. Трансформант, который характеризуется желаемыми уровнями и/или картинами экспрессии трансгена, применим для интрогрессии трансгена в другие генетические окружения с помощью полового скрещивания растений из разных линий, используя обычные способы селекции. У потомства от таких скрещиваний сохраняются характеристики экспрессии трансгена первоначального трансформанта. Эта стратегия используется для обеспечения надежной экспрессии гена в ряде сортов, которые хорошо адаптированы к местным условиям роста.
Было бы полезным обеспечить возможность обнаружения присутствия трансгена и/или геномной ДНК конкретного растения для определения того, содержит ли потомство от полового скрещивания представляющий интерес трансген и/или геномную ДНК. Кроме того, способ обнаружения присутствия трансгена и/или геномной ДНК в конкретном растении был бы полезен при выполнении предписаний, требующих предпродажное разрешение на продукты, получаемые из рекомбинантных сельскохозяйственных культур, и их маркировку.
Возможным является обнаружение присутствия трансгена с помощью любого хорошо известного способа обнаружения нуклеиновой кислоты. Примеры включают полимеразную цепную реакцию (ПЦР) или гибридизацию ДНК с использованием зондов для нуклеиновой кислоты. Эти способы обнаружения, как правило, сосредоточены на часто используемых генетических элементах, таких как промоторы, терминаторы, гены-маркеры или другие обычно используемые генетические элементы. Такие способы не могут быть применимы для определения различий между различными трансформантами, в частности, теми, которые созданы с использованием одной и той же ДНК-конструкции, за исключением случая, когда известна последовательность хромосомной ДНК, расположенная рядом со вставленной ДНК («фланкирующая ДНК»).
Также важно обеспечить возможность определения зиготности трансгенного объекта в растениях с целью селекции, интрогрессии характерного признака и чистоты семян. По причинам регуляции и качества семян также является полезным обеспечение возможности быстрого обнаружения присутствия смешанных событий вставки гена aad-12 (намеченных или ненамеченных) в материале растений сои.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к обнаружению события вставки гена aad-12 в биологических образцах. Настоящее изобретение обеспечивает способы идентификации созданных с помощью генной инженерии растений, имеющих геномную ДНК (гДНК), содержащую один или более событий aad-12. Способы анализа, описанные в этом патенте, являются специфическими в отношении гена aad-12, не событийно-специфическими, и предназначены для обнаружения и необязательно определения зиготности по любому событию вставки гена aad-12. Настоящее изобретение обеспечивает возможность определения примеси ненамеченных событий вставки aad-12 относительно характерной вставки aad-12 посредством анализа числа копий трансгена.
Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения обеспечиваются анализы для обнаружения присутствия трансгена aad-12 в биологическом образце (из сои, например). Эти анализы могут быть основаны на последовательности ДНК рекомбинантной конструкции, вставленной в геном сои. Также обеспечиваются наборы и условия, применимые при проведении анализов.
Рассматриваемое изобретение также относится к последовательностям нуклеиновой кислоты, применимым для клонирования и анализа последовательностей ДНК, относящихся к гену aad-12. Некоторые варианты осуществления этого аспекта настоящего изобретения обеспечивают геноспецифические праймеры для обнаружения aad-12 и ампликоны, созданные в процессе ПЦР с использованием наборов этих геноспецифических праймеров. Таким образом, эти и другие связанные процедуры могут использоваться для идентификации растений, содержащих ген aad-12.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Геноспецифический анализ для события 416 вставки aad-12. Темные верхние группировки точек представляют собой данные флуоресценции из образцов сои, гомозиготных по aad-12. Находящиеся в середине, более светлые группировки точек представляют собой данные флуоресценции из образцов сои, гемизиготных по aad-12. Нижние группировки точек представляют собой данные флуоресценции из образцов сои дикого типа, негативных по событию вставки aad-12.
Фиг. 2. Геноспецифический анализ для события 4406 вставки aad-12. Темные верхние группировки точек представляют собой данные флуоресценции из образцов сои, гомозиготных по aad-12. Находящиеся в середине, более светлые группировки точек представляют собой данные флуоресценции из образцов сои, гемизиготных по aad-12. Нижние группировки точек представляют собой данные флуоресценции из образцов сои дикого типа, негативных по событию вставки aad-12.
Подробное описание настоящего изобретения
Введение и интеграция трансгена в геном растения включает случайные события (отсюда название «событие» для конкретной вставки, которая экспрессируется), и в случае многих методов трансформации, таких как трансформация с использованием Agrobacterium, трансформация с использованием «генной пушки» и WHISKERS, непредсказуемо, где произойдет вставка трансгена в геном растения.
По меньшей мере 2500 семян линии сои, включающих одно такое событие вставки гена aad-12, pDAB4472-1606, было депонировано и сделано общедоступным без ограничения (но с условием патентных прав) в Американской коллекции типовых культур (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110. Этот депозит был назван депозитом в ATCC с № PTA-11028 с датой депонирования 10 июня 2010. Этот депозит был создан и будет храниться в соответствии с Будапештским соглашением и по его условиям в отношении депонирований семян для целей процедур выдачи патентов. Этот депозит будет храниться без ограничения в депозитарии ATCC, который является публичным депозитарием, в течение периода, составляющего 30 лет, или пяти лет после самого последнего запроса, или в течение времени действия патента, того, который длиннее, и будет заменяться, если он станет нежизнеспособным во время этого периода.
Определения и примеры в описании представлены, чтобы помочь описать настоящее изобретение и направлять специалистов в данной области техники на осуществление настоящего изобретения. Если не указано иное, термины следует понимать в соответствии с их общепринятым употреблением обычными специалистами в релевантной области техники.
«Биологический образец» может включать любой органический материал, происходящий из клеток или ткани сои, в том числе стеблей, корней, листьев, цветков или частей цветков, семян или семянок, и т.п., который содержит обнаруживаемое количество нуклеотидной последовательности, соответствующей такому органическому материалу.
«Зонд» представляет собой выделенную нуклеиновую кислоту, к которой прикреплена обычная обнаруживаемая метка или «репортерная» молекула, например радиоактивный изотоп, флуорофор, лиганд, хемилюминесцентный агент или фермент. Такой зонд комплементарен цепи, являющейся мишенью нуклеиновой кислоты, в случае настоящего изобретения, цепи рекомбинантной ДНК, кодирующей ген aad-12. Зонды в соответствии с настоящим изобретением включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также полиамиды и другие материалы зондов, которые специфически связываются с являющейся мишенью последовательностью ДНК, и такое связывание может быть использовано для обнаружения присутствия этой являющейся мишенью последовательности ДНК.
«Праймеры» представляют собой выделенные нуклеиновые кислоты, которые подвергаются отжигу с комплементарной цепью ДНК-мишени при гибридизации нуклеиновой кислоты с образованием гибрида между праймером и цепью ДНК-мишени, а затем подвергаются удлинению по цепи ДНК-мишени с помощью полимеразы, например, ДНК-полимеразы. Пары праймеров по настоящему изобретению относятся к их применению для амплификации являющейся мишенью последовательности нуклеиновой кислоты, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или других традиционных способов амплификации нуклеиновой кислоты.
Длина зондов и праймеров, как правило, составляет от 11 до 30 нуклеотидов или более. В некоторых случаях длина зондов и праймеров может составлять более 30 нуклеотидов. Независимо от размера зонды и праймеры могут специфически гибридизоваться с последовательностью-мишенью при высокой жесткости условий гибридизации. Предпочтительно, зонды и праймеры в соответствии с настоящим изобретением полностью сходны по последовательности с последовательностью-мишенью, хотя могут быть разработаны с использованием традиционных способов зонды, которые отличаются от последовательности-мишени и которые сохраняют способность к гибридизации с последовательностями-мишенями.
Используемый в описании термин «потомство» обозначает потомка любого поколения родительского растения, которое включает (или содержит) событие aad-12.
Трансгенное «событие» создают путем трансформации клеток растения с гетерологичной ДНК, т.е. конструкцией нуклеиновой кислоты, которая включает представляющий интерес трансген, регенерации популяции растений, являющейся следствием вставки трансгена в геном растения, и отбора конкретного растения, характеризующегося вставкой в конкретное место в геноме. Термин «событие» относится к первоначальному трансформанту и потомству трансформанта, которое включает гетерологичную ДНК. Термин «событие» также относится к потомству, полученному в результате полового скрещивания растений из разных линий - трансформанта с другим сортом, который включает геномную/трансгенную ДНК. Даже после возвратного скрещивания с родительской формой вставленная трансгенная ДНК и фланкирующая геномная ДНК (геномная/трансгенная ДНК) трансформированного родителя присутствует у потомства от скрещивания в том же самом месте в хромосоме. Термин «событие» также относится к ДНК первоначального трансформанта и его потомства, включающей вставленную ДНК и фланкирующую геномную последовательность, расположенную непосредственно рядом со вставленной ДНК, которая, как ожидают, будет передаваться потомству, которое получает вставленную ДНК, включающую представляющий интерес трансген, в результате полового скрещивания одной родительской линии, которая включает вставленную ДНК (например, первоначального трансформанта и потомства, являющегося следствием самоопыления), и родительской линии, которая не содержит вставленную ДНК.
Как обсуждалось выше, один аспект настоящего изобретения относится к идентификации трансгена aad-12. В настоящее изобретение включены имеющие отношение к ПЦР праймеры и ампликоны. В соответствии с рассматриваемым изобретением аналитические методы с использованием ПЦР, используя ампликоны, которые охватывают вставленную ДНК, могут быть использованы для обнаружения или идентификации превращаемых в источник прибыли сортов или линий трансгенных растений, происходящих из запатентованного трансгенного растения, содержащего событие aad-12. Таким образом, в различных вариантах осуществления настоящего изобретения обеспечиваются праймеры, включающие SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 или различные их комбинации, и зонды, включающие SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6 или обе SEQ ID NO:3 и 6.
Методы обнаружения, описываемые в настоящем документе, применимы, вместе с селекцией растений, для идентификации растений-потомков, содержащих событие aad-12, после скрещивания родительского растения, содержащего указанное событие, с другой линией растения в попытках передать одну или более дополнительных характеристик, представляющих интерес, этим потомкам. Эти методы анализа с использованием ПЦР приносят пользу программам по селекции растений, а также контролю качества, особенно в случае превращаемых в источник прибыли трансгенных семян, и могут также помочь в регистрации продукта и контроле продукта.
Квалифицированный в данной области техники специалист также признает, что можно разработать праймеры и зонды, которые гибридизуются в диапазоне стандартных условий гибридизации и/или ПЦР, включая условия, где праймер или зонд не полностью комплементарны представленной в качестве примера последовательности. Т.е. может допускаться некоторая степень несоответствия. Например, в случае праймера длиной приблизительно 20 нуклеотидов, обычно не требуется гибридизации одного или двух, или настолько много нуклеотидов с противоположной цепью, если несоответствующее основание является внутренним или находится на конце праймера, который противоположен ампликону. Ниже приведены различные соответствующие условия гибридизации. Кроме того, синтетические аналоги нуклеотидов, такие как инозин, также могут быть использованы в зондах. Могут также использоваться зонды на основе пептидонуклеиновой кислоты (ПНК), а также ДНК- и РНК-зонды.
Обеспечиваются композиции для обнаружения присутствия события pDAB4472-1606. Эти композиции включают событийно-специфические праймеры, такие как SEQ ID NO:1 и/или SEQ ID NO:2, и праймеры, которые гибридизуются с ДНК, характерной для генома дикого типа растений, которые не содержат событие pDAB4472-1606 (SEQ ID NO:4 и/или SEQ ID NO:5). Анализ с использованием ПЦР показал, что линии сои, содержащие событие pDAB4472-1606, можно идентифицировать путем анализа ампликонов, созданных в процессе ПЦР с использованием наборов этих событийно-специфических праймеров (SEQ ID NO:1 и 2). Эти и другие связанные процедуры могут быть использованы для однозначной идентификации этих линий сои, содержащих событие pDAB4472-1606. Таким образом, ампликоны, получаемые в процессе ПЦР из таких праймеров, могут использоваться для идентификации линий сои, содержащих событие pDAB4472-1606, и образуют другой вариант осуществления раскрытого изобретения.
Настоящее изобретение также включает способы обнаружения присутствия ДНК, в образце, который включает материал растения, содержащий ген aad-12. Такие способы могут включать: (a) приведение образца, включающего ДНК, в контакт с набором праймеров, который, при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с использованием ДНК, порождает ампликон, который идентифицирует последовательность aad-12 внутри образца; (b) выполнение реакции амплификации нуклеиновой кислоты, создавая тем самым этот ампликон; и (c) обнаружение ампликона.
Дополнительные способы обнаружения по настоящему изобретению включают способ обнаружения присутствия ДНК, в образце, соответствующей кодирующей последовательности aad-12, где указанный способ включает: (a) приведение образца, включающего ДНК, в контакт с зондом, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации с ДНК из материала растения, содержащего событие aad-12 и который не гибридизуется в жестких условиях гибридизации с ДНК из материала контрольного растения (растения, которое не содержит событие aad-12; (b) подвергание образца и зонда жестким условиям гибридизации; и (c) обнаружение гибридизации зонда с ДНК.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечиваются способы определения зиготности потомства от скрещивания с растениями, содержащими событие pDAB4472-1606. Эти способы могут включать приведение образца, включающего ДНК сои, в контакт с набором праймеров, описанным в настоящем документе. Эти праймеры, при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с использованием геномной ДНК из растения, содержащего событие pDAB4472-1606, порождают первый ампликон, который идентифицирует растение как растение, содержащее событие pDAB4472-1606. Эти способы дополнительно включают выполнение реакции амплификации нуклеиновой кислоты, в силу чего образуется первый ампликон; обнаружение первого ампликона; и приведение образца, включающего ДНК сои, в контакт с другим набором праймеров, который при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с использованием геномной ДНК из растений сои порождает второй ампликон, включающий природную геномную ДНК сои, гомологичную области генома сои. Этот способ может также дополнительно включать выполнение реакции амплификации нуклеиновой кислоты с образованием второго ампликона, обнаружение второго ампликона и сравнение первого и второго ампликонов в образце. Присутствие обоих ампликонов в образце указывает, что образец является гетерозиготным по событию pDAB4472-1606.
nd
«Зонд» представляет собой выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, к которой прикреплена обычная обнаруживаемая метка или «репортерная» молекула (такая как радиоактивный изотоп, лиганд, хемилюминесцентный агент или фермент). Зонды, описанные в настоящем документе, включают SEQ ID NO:3 и/или 6. Зонды в соответствии с настоящим изобретением включают не только дезоксирибонуклеиновые или рибонуклеиновые кислоты, но также полиамиды и другие материалы зондов, которые специфически связываются с являющейся мишенью последовательностью ДНК и могут использоваться для обнаружения присутствия этой являющейся мишенью последовательности ДНК. Способы приготовления и использования зондов и праймеров описаны, например, в Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
В зависимости от применения можно использовать варьирующие условия гибридизации для достижения варьирующих степеней селективности зонда к последовательности-мишени. Для применений, в случае которых требуется высокая степень селективности, будут обычно использоваться относительно жесткие условия для образования гибридов, например, будут выбираться условия относительно низкой концентрации соли и/или высокой температуры, например, обеспечиваемые путем использования от приблизительно 0,02 M до приблизительно 0,15 M NaCl при температурах, составляющих от приблизительно 50°C до приблизительно 70°C. Жесткие условия, например, могли бы включать отмывку фильтра, подвергнутого гибридизации, по меньшей мере дважды с использованием буфера для отмывки с высокой степенью жесткости (0,2× SSC, 0,1% SDS, 65°C). Соответствующие условия жесткости, которые поддерживают гибридизацию ДНК, например, 6,0× хлорид натрия/цитрат натрия (SSC) приблизительно при 45°C, с последующей отмывкой 2,0× SSC при 50°C, известны квалифицированным в данной области техники специалистам. Например, концентрация соли на стадии отмывки может быть выбрана от низкой степени жесткости приблизительно 2,0× SSC при 50°C до высокой степени жесткости приблизительно 0,2× SSC при 50°C. Кроме того, температура на стадии отмывки может быть увеличена от условий низкой степени жесткости при комнатной температуре, приблизительно 22°C, до условий высокой степени жесткости приблизительно при 65°C. Можно варьировать и температуру, и концентрацию соли, или либо температуру, либо концентрацию соли можно удерживать на постоянном уровне при изменении другой переменной. При таких селективных условиях допускается небольшое несоответствие, или вообще не допускается, между зондом и матрицей или цепью-мишенью. Обнаружение последовательностей ДНК посредством гибридизации хорошо известно квалифицированным в данной области техники специалистам, и наставления в патентах США №№ 4965188 и 5176995 являются примерами анализов с использованием методов гибридизации. В конкретном варианте осуществления праймер или зонд, описанные в настоящем документе, будут специфически гибридизоваться с геномной ДНК, содержащей событие pDAB4472-1606. Гибридизацию зонда или праймера с ДНК, содержащей событие pDAB4472-1606, можно обнаружить любым рядом способов, известных квалифицированным в данной области техники специалистам, они могут включать, но не ограничиваясь ими, флуоресцентные метки, радиоактивные метки, метки на основе антитела и хемилюминесцентные метки.
Что касается амплификации являющейся мишенью последовательности нуклеиновой кислоты (например, с помощью ПЦР), используя конкретную пару праймеров для амплификации, «жесткими условиями» являются условия, которые делают возможной гибридизацию пары праймеров только с являющейся мишенью последовательностью нуклеиновой кислоты, с которой праймер, имеющий соответствующую последовательность дикого типа (или ее комплемент), будет связываться, и предпочтительно порождение уникального продукта амплификации, ампликона. Термин «специфический в отношении (последовательности-мишени)» означает, что зонд или праймер гибридизуются в жестких условиях гибридизации только с последовательностью-мишенью в образце, включающем последовательность-мишень.
Как используется в описании, «амплифицированная ДНК» или «ампликон» относятся к продукту амплификации последовательности нуклеиновой кислоты-мишени, которая является частью нуклеиновой кислоты-матрицы. Например, для определения того, содержит ли растение сои, являющееся результатом полового скрещивания, событие pDAB4472-1606 в своей геномной ДНК, ДНК, экстрагированную из образца ткани растения сои, можно подвергнуть способу амплификации нуклеиновой кислоты, используя пару праймеров, описанную в настоящем документе, с образованием ампликона, который идентифицирует присутствие события pDAB4472-1606. Длина ампликона может находиться в области объединенной длины пары праймеров плюс одна пара нуклеотидных оснований, и/или объединенной длины пары праймеров плюс приблизительно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499 или 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000 или более пар нуклеотидных оснований (плюс или минус любой из инкрементов, перечисленных выше). Использование термина «ампликон», в частности, исключает димеры праймеров, которые могут быть образованы в тепловой реакции амплификации ДНК.
Амплификацию нуклеиновой кислоты можно выполнить с помощью любого из различных способов амплификации нуклеиновой кислоты, известных в данной области техники, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Множество способов амплификации известно в данной области техники и описано, между прочим, в патенте США № 4683195 и в патенте США № 4683202. Способы амплификации с помощью ПЦР были разработаны для амплификации вплоть до 22 т.п.о. геномной ДНК. Эти способы, а также другие способы, известные в области амплификации ДНК, могут быть использованы при осуществлении на практике настоящего изобретения. Последовательность вставленной гетерологичной трансгенной ДНК из рассматриваемого события сои можно проверить (и внести исправления в случае необходимости) посредством амплификации таких последовательностей данного события, используя праймеры, происходящие из последовательностей, представленных в описании, с последующим стандартным секвенированием ДНК - ампликона, образованного в процессе ПЦР, или клонированной ДНК. Ампликон, образуемый с помощью этих способов, можно обнаружить с использованием множества методов. Электрофорез в агарозном геле и окрашивание бромидом этидия является широко распространенным, хорошо известным способом обнаружения ДНК-ампликонов.
TAQMAN (PE Applied Biosystems, Foster City, Calif.) представляет собой способ обнаружения и количественного определения присутствия последовательности ДНК. В кратком изложении, разрабатывают олигонуклеотидный зонд FRET, который гибридизуется с представляющей интерес последовательностью (например, геном aad-12 или геном, присущим геному сои). Зонд FRET и используемые в ПЦР праймеры включают в рабочие циклы в присутствии термостабильной полимеразы и dNTP. Во время специфической амплификации ДНК-полимераза Taq освобождает и отделяет флуоресцентную составляющую от гасящей составляющей в зонде FRET. Флуоресцентный сигнал указывает на присутствие представляющей интерес последовательности вследствие успешной амплификации и гибридизации. Были также описаны молекулярные маяки для использования для обнаружения последовательностей, и их можно использовать в соответствии с рассматриваемым изобретением.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения обеспечиваются способы обнаружения присутствия ДНК, соответствующей событию pDAB4472-1606, в биологическом образце. Эти способы включают: (a) приведение биологического образца в контакт с зондом, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации с геномной ДНК из растения сои, содержащего событие pDAB4472-1606, и не гибридизуется в жестких условиях гибридизации с ДНК из контрольного растения сои; (b) подвергание биологического образца и зонда жестким условиям гибридизации; и (c) обнаружение гибридизации зонда с ДНК, содержащей событие pDAB4472-1606, где обнаружение такой гибридизации служит признаком присутствия ДНК, соответствующей событию pDAB4472-1606, в геноме растения. Предпочтительно, зонд представляет собой SEQ ID NO:3.
Тем не менее другим аспектом настоящего изобретения является способ определения зиготности в потомстве растений сои, содержащих событие pDAB4472-1606. Способ включает (a) приведение биологического образца в контакт с парой праймеров с SEQ ID NO:1 и 2, которая при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с использованием геномной ДНК из биологического образца, содержащего геномную ДНК из биологического образца от растения сои, содержащего событие pDAB4472-1606, порождает первый ампликон, который идентифицирует присутствие гена aad-12 в геномной ДНК биологического образца; (b) выполнение реакции амплификации нуклеиновой кислоты; (c) обнаружение образованного первого ампликона (используя SEQ ID NO:3 в качестве меченого зонда); (d) приведение того же образца в контакт с парой праймеров с SEQ ID NO:4 и 5, которая при использовании в реакции амплификации нуклеиновой кислоты с использованием биологического образца, содержащего геномную ДНК растений сои, порождает из комбинации праймеров ампликон, который идентифицирует геномную ДНК сои дикого типа, гомологичную области вставки трансгена, определяемой как событие pDAB4472-1606, в геноме сои; (e) выполнение реакции амплификации нуклеиновой кислоты и (f) обнаружение образованного второго ампликона (используя SEQ ID NO:6 в качестве зонда для обнаружения); причем: (a) обнаружение обоих ампликонов означает, что образец сои является гетерозиготным по событию pDAB4472-1606; (b) обнаружение только указанного первого ампликона (определяющего присутствие гена aad-12) означает, что биологический образец является гомозиготным по событию pDAB4472-1606; и (c) обнаружение только указанного второго ампликона свидетельствует об отсутствии события pDAB4472-1606 в биологическом образце. Обнаружение ампликонов можно осуществить, используя меченые зонды (например, SEQ ID NO:3 и 6). Как обсуждалось выше, зонды можно пометить обычной обнаруживаемой меткой или «репортерной» молекулой, например, радиоактивным изотопом, флуоресцентной меткой, лигандом, хемилюминесцентным агентом или ферментом. В некоторых вариантах осуществления зонды метят флуоресцентными метками, которые позволяют отличить ампликон, содержащий ген aad-12, от ампликона, не содержащего ген aad-12 (например, комбинациями флуорофор/гаситель, такими как 6-карбоксифлуоресцеин (FAM) или тетрахлорфлуоресцеин (TET) в комбинации с гасителями, такими как тетраметилродамин (TAMRA) или дигидроциклопирролоиндол-трипептид (MGB).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения специфический в отношении гена aad-12 анализ можно объединить в пары с событийно-специфической ПЦР, такой как та, которая описана в находящейся одновременно на рассмотрении предварительной заявке на патент США с серийным № 61/548533, поданной 18 октября 2011 (№ дела патентного поверенного DAS.160P; MATERIALS AND METHODS FOR DETECTING THE ARYLOXYALKANOATE DIOXYGENASE GENE (AAD-12) CONTAINING EVENT pDAB4472-1606 IN PLANTS; Изобретатели: Chandra Channabasavaradhya и Andrew Greenwald; которая тем самым включена посредством ссылки в ее полном объеме). Этот вариант осуществления может быть использован для определения того, существуют ли смешанные события вставки aad-12 в одном и том растении и является ли событие, обнаруживаемое с помощью событийно-специфического анализа, гемизиготным или гомозиготным. В этом варианте осуществления выполняют геноспецифический анализ и устанавливают число копий гена на основе интенсивностей флуоресцентных сигналов, порождаемых в ходе геноспецифического анализа. Его затем сравнивают в таковым, полученным в известном событийно-специфическом анализе зиготности. Если определение числа копий гена aad-12 основывается на интенсивности, схожей с таковой, определяемой с помощью событийно-специфического анализа, то считают, что образец имеет только намеченное событие вставки aad-12. Если число копий, определенное с помощью геноспецифического анализа, больше числа копий, определенного с помощью событийно-специфического анализа, то считают, что исследуемый образец имеет дополнительные копии гена aad-12 помимо намеченного события, и поэтому свидетельствует о возможной примеси других событий вставки гена aad-12. Эта схема может также быть использована для обнаружения случаев примесей, которые содержат идентичные элементы гена, отличные от гена aad-12, такие как последовательности промотора или селектируемого маркера, или любые другие идентичные последовательности, присущие всем событиям. Последний из названых подходов может быть применим для определения зиготности и/или примеси трансгенных событий различных характерных признаков, но со схожими элементами в генной кассете.
Обеспечиваются наборы для обнаружения aad-12 в растениях и биологических образцах, происходящих от них, в которых используются праймеры, выбираемые из SEQ ID NO:1, 2, 4 и/или 5, и зонды, выбираемые из SEQ ID NO:3 и 6. Ампликон, образуемый при использовании указанного набора, идентифицирует биологический образец как образец, содержащий событие aad-12, в случае гибридизации ампликона с зондом, включающим SEQ ID NO:3. Этот набор может быть предоставлен в качестве средства для специфического обнаружения присутствия события вставки aad-12 в растениях (или биологических образцах, происходящих из них), или набор может быть предоставлен в качестве средства для определения многообразия различных трансгенных событий из любого ряда различных биологических образцов. В последнем случае, т.е. в случае набора для определения многообразия различных трансгенных событий, в наборе могут быть предоставлены зонды или праймеры в форме микрочипа, или любого сорта чипа, который дает пользователю указанного набора возможность установить различия между трансгенными и нетрансгенными образцами, зиготность трансгенных событий и даже присутствие или отсутствие событий, или разрешенных, или неразрешенных для коммерциализации. Обнаружение или количественная оценка присутствия или отсутствия определенных событий, используя такие наборы, можно осуществлять флуорометрическим, колориметрическим, изотопным или хемилюминесцентным способом.
Все патенты, заявки на патенты, предварительные заявки и публикации, на которые ссылаются в описании или которые в описании приведены, включены посредством ссылки в их полном объеме, если они не расходятся с точно выраженными наставлениями этого описания.
Следующие примеры включены с целью иллюстрации процедур для осуществления на практике настоящего изобретения и для демонстрации некоторых предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения. Эти примеры не должны рассматриваться как ограничение. Квалифицированные в данной области техники специалисты должны понимать, что методы, описанные в следующих примерах, представляют собой конкретные подходы, использованные для иллюстрации предпочтительных способов для его осуществления на практике. Однако квалифицированные в данной области техники специалисты должны, с учетом описания настоящего изобретения, понимать, что множество изменений может быть внесено в эти конкретные варианты осуществления при получении, тем не менее, подобных или схожих результатов без отступления от сущности и объема настоящего изобретения. Если не указано иное, все проценты являются процентами по массе, и все пропорции в смесях растворителей являются пропорциями по объему, если не указано иное.
ПРИМЕРЫ
Был разработан событийно-специфический анализ TAQMAN ASSAY для обнаружения присутствия MGB-зонда для гена aad-12 в сое и для определения состояния зиготности растений в популяциях для селекции. Для специфического обнаружения гена aad-12 в сое ДНК-фрагмент размером 59 п.о. амплифицировали, используя два геноспецифических праймера. Амплификацию этого продукта ПЦР определяли с помощью мишень-специфического MGB-зонда, содержащего репортерную группу FAM на своем 5’-конце. Специфичность этого способа обнаружения Taqman в отношении гена aad-12 в сое проверяли на фоне событий варьирующих уровней зиготности сои и нетрансгенной сои в формате дублирования с использованием соеспецифического эндогенного контрольного гена, GWS116.
Выделение гДНК
Геномную ДНК экстрагировали, используя набор Qiagen DNeasy 96 Plant Kit. Свежие листовые диски, 8 на каждый образец, использовали для экстракции гДНК, используя модифицированный протокол для набора Qiagen DNeasy 96 Plant Kit. гДНК подвергали количественному анализу способом с использованием красителя PicoGreen в соответствии с инструкциями поставщика (Molecular Probes, Eugene, OR). Образцы разводили не содержащей ДНКазу водой, приводя к концентрации, составляющей 1,2 нг/мкл, для цели этого исследования.
Анализ Taqman и результаты
Были разработаны специфические праймеры и зонды для Taqman для обнаружения гена aad-12 в сое посредством анализа Taqman. Эти реагенты могут быть использованы в условиях, перечисленных ниже, для обнаружения гена aad-12 в сое. В таблице 1 перечислены последовательности праймеров и зондов, которые были разработаны специально для обнаружения гена aad-12 в сое.
Таблица 1Используемые в ПЦР праймеры и зонды
Реакция с использованием событийно-специфической мишени
Название
Описание
Последовательность 5'→3'
D-SbAAD12-F
Прямой праймер
SEQ ID NO:15'-CCACAGTCACTGGTGTTCACCTT-3'
D-SbAAD12-R
Обратный праймер
SEQ ID NO:25'-CATGGAGGGCAGCGAAAC-3'
D-SbAAD12-FAM
Зонд
SEQ ID NO:35'-FAM-CCACACTTGACGATGCT-MGBNFQ-3'
Реакция с использованием контрольной системы GWS116
Название
Описание
Последовательность 5'→3'
D-SbIC-G116-F
Прямой праймер
SEQ ID NO:45'-GTAATATGGGCTCAGAGGAATGGT-3'
D-SbIC-G116-R
Обратный праймер
SEQ ID NO:55'-ATGGAGAAGAACATTGGAATTGC-3'
D-G116-VIC
Зонд
SEQ ID NO:65'-VIC-CCGGTACCATCTGGTC-MGBNFQ-3'
В таблице 2 перечислены многочисленные условия для ПЦР. Смесь пипетировали в 384-луночный планшет и амплифицировали, используя следующие условия: i) 50°C в течение 2 мин, ii) 95°C в течение 10 мин, iii) 95°C в течение 15 сек, iv) 60°C в течение 60 сек, iv) повторять стадии iii-iv в течение 35 циклов, v) хранить при 4°C. ПЦР в режиме реального времени выполняли в BIO-RAD ICYCLER™ и в термоциклере ABI Gene Amp PCR System 9700. Анализ данных был основан на определении порога для циклов (Ct), который представляет собой число циклов ПЦР, когда определение флуоресценции достигает заданного значения. Значение Ct рассчитывается автоматически с помощью программного обеспечения iCycler.
Стандартный способ определения ΔΔCt использовали для расчетов зиготности (см. Фиг. 1). Сначала рассчитывали значения ΔCt, которые представляют собой разницу между значениями Ct для событийно-специфической системы и контрольной системы каждого образца. Затем рассчитывали значения ΔΔCt, которые представляют собой разницу между значением ΔCt для каждого неизвестного образца и значением ΔCt контроля для гемизиготности (или средним значением в случае использования более чем одного контроля для гемизиготности). Зиготность (число копий) каждого неизвестного образца можно рассчитать, используя следующую формулу:
Число копий в неизвестном образце = 2 ΔΔCt
Образцы с необработанным числом копий приблизительно 1 будут гемизиготными, 2 будут гомозиготными, и 0 будут пустыми.
Таблица 2Реакционная смесь для специфического в отношении гена aad-12 анализа Taqman в сое
Компонент
Концентрация
Объем
Вода
-
2,48 мкл
Исходная смесь для экспрессии гена Taqman
2×
5 мкл
D-SbAAD12-F
100 мкМ
0,07 мкл
D-SbAAD12-R
100 мкМ
0,07 мкл
D-SbIC-G116-F
100 мкМ
0,07 мкл
D-SbIC-G116-R
100 мкМ
0,07 мкл
D-G116-VIC
100 мкМ
0,02 мкл
D-AAD12-FAM
100 мкМ
0,02 мкл
Поливинилпирролидон (PVP)
10%
0,1 мкл
Геномная ДНК в качестве матрицы
неразбавленная
2 мкл
Способ обнаружения Taqman для гена aad-12 в сое был проверен на фоне гомозиготных, гемизиготных и пустых образцов в формате дублирования с использованием специфических для сои дикого типа праймеров в качестве контрольного гена. Этот анализ специфически обнаруживал ген aad-12 в сое и не порождал или не увеличивал какие-либо ложноположительные результаты из контролей. Геноспецифические праймеры и зонды могут быть использованы для обнаружения гена aad-12 в сое, и эти условия и реагенты применимы для исследований зиготности.