Электронномикроскопический анализ морфофизиологического состояния бактерий в местах колонизации

можно, и специфическая ассоциация микроорганизмов, которые нашли себе нишу для сохранения и жизнедеятельности. Не исключено также, что такой симбиоз способствует прорастанию семян, росту проростков и формированию стебля.

Выводы

1. Сканирующая электронная микроскопия является эффективным методом изучения структуры поверхности семян.

2. Поверхность сухих семян повилики японской колонизирована грибами и бактериями.

ЛИТЕРАТУРА

1. Использование видов рода повилика (Cuscuta L.) в медицине и биотехнологии [Текст]/Н.Ю.Леусова, Э.В.Некрасов//Бюл. физиол. и патол. дыхания.-2004.-Вып.-19.-С.87-93.

2. My cotrophy in a vascular stem parasite Cuscuta reflexa [Text]/A.N.Khalid, S.H.Iqbal//Mycorrhiza.-1996.-Vol.6.-P.69-71.

3. Mycorrhizal stimulation of plant parasitism [Text]/I.R.Sanders, R.T.Koide, D.L.Shunway//Can. J. Bot.-1993.-Vol.71.-P.1143-1146.

П

УДК 57.086.3:579.23+579.22

В.М.Катола, Т.Б.Макеева, О.В.Римкевич, Ю.В.Комогорцева,

И. С. Литвиненко, В.И.Радомская, С.М.Радомский

ЭЛЕКТРОННОМИКРОСКОПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ

БАКТЕРИЙ В МЕСТАХ КОЛОНИЗАЦИИ

АмурКНИИ АмурНЦ ДВО РАН

РЕЗЮМЕ

Комбинированная просвечивающая и сканирующая электронная микроскопия образцов, подготовленных по специальной методике, позволяет обнаружить и анализировать микро- и субмикро-скопическое разнообразие бактерий в их нативном состоянии, взаимосвязи и структуру популяций, особенности биокосного взаимодействия и прочность адгезии клеток в различных объектах окружающей среды. Доминирующей морфологической формой изменчивости бактерий в местах заселения являются различные варианты L-форм. Переход бактерий из одного морфотипа в качественно другой осуществляется через нитеобразова-ние.

SUMMARY

V.M.Katola, T.B.Makeeva, Yu.V.Komogortseva, I.S.Litvinenko, V.I.Radomskaya, S.M.Radomski

ELECTRONMICROSCOPIC ANALYSIS OF MORPHOPHYSIOLOGIC STATE OF BACTERIA IN COLONIZATION AREAS

Combined transmission and scanning electronic microscopy of samples prepared with special methods, allows determining and analyzing micro- and submicroscopic variety of bacteria in their native state, population structure and interaction, biococnic interaction and cell adhesion strength in different environment. L-form variants are dominating morphological forms of bacteria variability. Transition of bacteria from one morphotype into another is engineered through filament formation.

Изучение поведения микроорганизмов в естественной обстановке представляет большой приклад-

ной и теоретический интерес. Это позволяет, во-первых, лучше понять особенности их жизнестойкости, распространения и изменчивости; во-вторых, осмыслить патогенез и рецидивы острых и хронических заболеваний с явным либо предполагаемым участием микроорганизмов, их распознание, лечение и профилактику. В первую очередь это касается микросообществ, заселяющих отходы рудодобычи, в которых они подвергаются постоянному стрессу и вынуждены изменять свои морфологические, биохимические и другие свойства.

В связи с изложенным задача настоящей работы -без выделения бактерий в культуры получить информацию о разнообразии их форм в объектах окружающей среды с помощью комбинированной электронной микроскопии, сочетающей высокое разрешение и объемность изображений с различными методиками приготовления образцов.

Методика

Тест-объектами избраны бактерии многолетних отходов золотодобычи (ОЗ), загрязненные ртутью в пределах 10-100 г/т, и горные выработки в зоне «вечной мерзлоты». Эти геохимические аномалии отличаются от известных природных сред своим строением, круговоротом элементов и геохимическим составом. В ряде случаев для сравнения исследовали медно-никелевую и домашнюю пыль, почвы, речную и водопроводную воду.

Чтобы сохранить бактерии в нативной форме, применяли два метода подготовки образцов - метод отпечатков и отмывание рыхлого материала. Препараты-отпечатки готовили с помощью устройства, заявленного на патент изобретение №20044124979 (026925) от 16.08.2004, что позволяло исследовать пространственное расположение, соотношения и форму клеток. Отмывание техногенных проб прово-

дили в двух вариантах: а - в первом варианте их на протяжение 24 часов выдерживали, не взбалтывая, в 0,5%-ном растворе натрия хлорида или стерильной водопроводной воде. В раствор переходили бактерии, слабо связанные с поверхностью минералов; б - во втором варианте пробы отмывали на качалке от 5 до 180 минут теми же растворами. При этом отделялись (возможно, только частично) бактерии, находящиеся в порах и микротрещинах минералов. Оба варианта позволяли определить степень сродства клеток к минералам и прочность адгезии. Отстоявшуюся жидкость наносили на объектные столики в объеме 0,1 мл, потом ее сливали, центрифугировали и удаляли, а к осадку добавляли 1-2 мл 0,5%-ного раствора натрия хлорида. На объектные столики наносили 0,1 мл этой взвеси, на сеточки с формваровой подложкой - капли поменьше. Сочетание метода отпечатков с отмыванием техногенных образцов исключало артефакты и искажения и обеспечивало должную визуализацию многообразия бактерий в нативном состоянии, в том числе фильтрующиеся формы, а также изыскание критериев для дифференциации таксонов.

Воду из рек Амура и Зеи и городской водопроводной сети наносили непосредственно на объектные столики в объеме 0,1 мл.

Одновременно проводили эксперименты с коллекционными штаммами Bacillus subtilis L2, Escherichia coli 0147 и Micrococcus luteus 4698 с целью изучения их морфологической трансформации при воздействии ОЗ. При этом взвесь каждого вида бактерий в количестве 500 млн. м. т. вносили в колбы объемом 250 мл, содержащие мясо-пептонный бульон и стерильные образцы ОЗ в соотношении Т:Ж=1:5. Контролем служили эти же культуры, но выращенные только на одном мясо-пептонном бульоне. Инкубацию бактерий осуществляли при комнатной температуре на протяжение 18 часов.

Чтобы доказать, что в многолетних отходах рудо-добычи имеются все необходимые для роста и развития микроорганизмам вещества, на примере проб ОЗ стандартными методами определяли содержания (%) углерода, азота, фосфора и гумуса [8], а атомноадсорбционным спектрофотометром фирмы «HITACHI» (Япония) - концентрацию (г/т) водорастворимых и подвижных микроэлементов.

Все препараты подсушивали, напыляли в вакуумной установке ВУП-4 углеродом для создания токопроводящего покрытия и просматривали в электронных микроскопах: двух сканирующих (СЭМ) LEO 1420 (Германия) с энергодисперсионным спектрометром и JEOL jsm-35C (Япония) и просвечивающем (ПЭМ) TESLA BS 500 с ускоряющим напряжением 60 кВ.

Результаты и обсуждение

В изучаемых многолетних отходах золотодобычи колонизацию и рост микроорганизмов удовлетворяют источники энергии и питания: Сорг. - 2,17 %, N -0,037%, P - 0,24%, гумус - 3,74% и водорастворимые элементы (г/т) Mn - 21,03, Zn - 1,67, Ni - 0,92, Fe -0,63, Co - 0,30, Cu - 0,13, Cr - 0,025, Pb - 0,23 и Cd -

0,017. Углекислота и органические кислоты, которые появляются при разложении аутохтонного и привносимого органического вещества, поддерживают водную кислотность на уровне рН 4,5. Однако поступление питательных веществ в микробную клетку в ОЗ по разным причинам может быть затруднено. Кроме того, на распространение тех или иных видов, их ад-гезивность, особенности изменчивости, способы защиты от хищников или других неблагоприятных агентов могут влиять, например, прямые и косвенные действия токсических элементов, высокие концентрации ионов, тяжелых минералов, присутствие сорбентов (глин каолинитовой группы, гидрослюд, монтмориллонита), высыхание экотопа и другие факторы. Таким образом, из изложенного становиться ясно, что в отходах золотодобычи способны существовать лишь адаптированные к ним металлотолерантные и олиготрофные популяции как сапрофитов, так и патогенов.

Просмотр препаратов в ПЭМ показал, что в техногенных средах (ОЗ и горные выработки из зоны вечной мерзлоты) встречаются разнообразные мор-фотипы бактерий: а) свободные палочки; б) кокковидные формы; в) различной длины и ширины нитевидные элементы; г) отдельные клетки и нити, сцепленные с плотными частицами; д) разные субмикро-скопические варианты.

Свободные бактериальные клетки, находящиеся в

ОЗ, в большинстве представлены прямыми или слегка изогнутыми палочками размером 2-5*0,5-2 мкм, с ровными или закругленными концами (полюсами), четкими или нечеткими контурами, неоднородной цитоплазмой с различной электронной плотностью. Мелкие клетки объединялись в пары и группы, соприкасаясь друг с другом боковыми поверхностями. Особо обращало внимание то, что с минералами взаимодействовали и прочно прилипали к ним своей боковой поверхностью либо одним из полюсов только отдельные клетки, причем разных таксонов. Это значит, что в техногенной системе необязательно, чтобы вся популяция одновременно связывалась с минералами - достаточно определенных клеток, входящих в нее. Выборочную адгезию бактерий in situ объяснить однозначно сложно. Может, это исключительно индивидуальная функция клеток, а возможно, один из способов, который помогает им под прикрытием минералов избегать или смягчать пагубное действие стрессоров. Ясно лишь, что адгезия обусловлена взаимодействием простых и сложных минералов со специфическими структурами поверхности бактерий.

Кроме длинных широких нитей, образованных однотипными клетками, несколько реже встречались бесструктурные тонкие прямые, изогнутые или ветвистые нити, похожие на гифы. Довольно часто они плотно охватывались бесформенными, крупными образованиями, неотличимыми от минерального ад-сорбата. Но самый сложный состав наблюдался у субмикроскопических структур - они состояли из смеси нитей, палочек, сферических клеток и кольцевидных форм с прерывистой клеточной стенкой.

Морфотипы, находящиеся в пробах поверхностных горных выработок, несколько отличались от предыдущих. Во-первых, среди свободных клеток было много особей, содержащих в цитоплазме и на полюсах плотные гранулы, 1-2 и даже больше вакуолей; во-вторых, здесь около 60% клеток адсорбировали электронноплотные частицы на клеточной стенке, полюсе или сами прикреплялись к поверхности крупных минеральных образований. В поле зрения чаще попадали тонкие нити, сцепленные с минералами, и клетки, у которых отслаивался поверхностный слой клеточной стенки. У отдельных бактерий ингибировалось размножение, о чем свидетельствовали парные неразделившиеся клетки и длиные нити той же структуры, что и исходные формы. Кокковидные клетки встречались редко, а из субмикроскопических элементов выделялись только палочки размером 0,85^0,14 мкм и меньше.

В противоположность ПЭМ сканирующая электронная микроскопия предоставила очень ценную информацию как раз о субмикроскопических структурах. В препаратах-отпечатках с ОЗ и одновременно в надосадочном растворе и центрифугате даже при 5-минутном отмывании образцов были обнаружены и визуализированы: 1) шаровые клетки диаметром

0,4-0,6 мкм. Слипаясь друг с другом, они формировали крупные конгломераты, а из них - бесформенные комплексы размером от десятков до сотен микрометров (рис. 1а). В единичных случаях конгломераты адсорбировали кристаллы. Но что особенно бросалось в глаза, так это способы репродукции клеток: вместо поперечного деления они размножались почкованием, неравномерным бинарным или комбинированным делением. Такое атипичное деление клеток считается одним из ведущих признаков Ь-трансформации бактерий [4, 6, 7]; 2) свободноле-жащие сферические клетки диаметром 0,15-0,3 мкм, сходные по форме и размерам с элементарными (ре-

продуктивными) телами L-форм бактерий и микоплазм; 3) различные нити толщиною 0,2-0,3 мкм и длиною до 1 мкм; 4) палочковидные клетки; 5) «псевдопалочки» - при малых увеличения они выглядят как таковые, при увеличениях в 10000-15000 раз представляют собою цепочку из мелких круглых или овальных пузырьков; 6) редкие формы из переплетающихся коротких тонких или толстых ветвистых нитей (рис. 1б), которые отличаются относительно слабой плотностью и напоминают мицелий. Таким образом, нами впервые в загрязненных ртутью отходах золотодобычи обнаружено одно из морфологических проявлений изменчивости бактерий, а именно L-формы. Сравнительный анализ всех визуализированных морфотипов показал, что различные варианты L-форм (конгломераты, комплексы и элементарные тела) занимают доминирующее положение.

Существование in vitro и in vivo бактерий с дефектной клеточной стенкой или без нее давно известно и хорошо изучено [4, 6, 7]. Прямая визуализация L-конгломератов, их комплексов, субмикронных шаровидных и отчасти палочковидных клеток и элементарных тел, осуществленная нами в препаратах, приготовленных разными методами, свидетельствует о том, что они образовались в ОЗ и длительно там существовали. L-трансформацию бактерий в процессе 5-минутного отмывания проб мы исключаем. Так, фильтрующиеся формы молочнокислых палочек были обнаружены в 4-часовой культуре [3], на средах с сывороткой крови и пенициллином L-колонии Escherichia coli и Neisseria gonorrhoeae появлялись через 24-48 часов, Salmonella typhi murium и S. enteritidis - через 2-3 дня, Staphylococcus aureus -через 4-6 дней, Proteus vulgarus - на протяжении 7-12 дней [6]. Путем целенаправленных экспериментов мы установили, что в присутствии ОЗ в культуре Bac. subtilis L2 уже в первые сутки появляются группы

йт* Mag = 1.11 К X Detector = SE1 WD= 17 mm ЕНТ = 20.00 kV м

А

№ Mag = 3.80 К X Detector = SE1 WD= 10 mm ЕНТ = 15.00 kV

а б

Рис. 1. Сканирующая электронная микроскопия препаратов-отпечатков из отходов золотодобычи: а - множественные, различной величины и конфигурации конгломераты Ь-форм бактерий, отпочковывающие элементарные тельца. Увеличение х 1110; б - крупный конгломерат Ь-форм, сцепленный со структурой из тонких переплетающихся нитей, предположительно, микоплазмами. Вверху конгломерат, на поверхности которого почкуются дочерние клетки. Увеличение х 3800.

сферопластов диаметром до 10 мкм. Их клеточная стенка местами была отслоенной, а сами они соединялись друг с другом тонкими и широкими тяжами. Вместе со сферопластами обнаруживались субмик-роскопические шаровые клетки, элементарные тела и палочки. В культуре E. тН О147 наряду с родительскими клетками встречались нитевидные формы, большие Ь-образования и элементарные тела, в культуре M. luteus 4698 Ь-формы представляли конгломераты, элементарные тела и палочки. Таким образом, можно уверенно утверждать, что индукция Ь-форм бактерий в токсичной геологической среде не случайная находка, а закономерное явление, и что в Ь-формы переходят как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии. Более того, в несменяемой питательной среде, содержащей ОЗ, без искусственной аэрации Ь-формы Bac. subtШs, E. тН и M. luteus сохранялись на протяжении 5-ти месяцев. То есть, проявляли высокую механическую устойчивость. Выделялась и другая крайность: ни один из вариантов Ь-форм коллекционных штаммов, в отличие от бактериальных клеток т &1Ш, не прилипал к минералам.

Кроме отходов золотодобычи элементы Ь-форм визуализированы нами в почвах, осевшей медноникелевой и домашней пыли, водопроводной и речной воде (рис. 2), в организме человека [2]. Они характеризовались однотипностью, встречались одновременно и полностью соответствовали тем структурным элементам, которые описаны на периферии и в центре Ь-колоний [6, 7]. Это и побудило нас изыскивать способ их дифференцировки, для чего были проанализированы полосы энергодисперсионных спектров. Оказалось, что в разных точках Ь-конгломерата или комплекса содержится (%) один и тот же набор макро- и микроэлементов, в основном Бе - 14,38-59,57; № - 9,84-14,34; 8 - 6,30-7,12; 81 -1,40-4,53. Но могут быть С1 - 28,38-54,25; А1 - 2,192,26; Р - 0,95-1,53; Са - 0,50-2,49, реже - 2,48; К -

0,99; Мп - 0,25; Сг - 0,11; Т1 - 0,11 и Со - 0,07, тогда

как следы золота и других тяжелых металлов не обнаружены. В случаях, когда Ь-формы происходят от одного штамма, их спектрограммы совпадали.

Наблюдая за полиморфизмом бактерий в естественной среде и организме человека, мы все больше убеждались в том, что закономерности и механизмы его развития связаны с неоднородностью клеток популяции, их дифференциацией по степени стойкости к физическим, химическим и биологическим факторам и способностью к адекватным ответным реакциям на раздражитель. По нашему мнению клетки, сохраняющие морфологию в неблагоприятных условиях, относятся к высокоустойчивой части популяции, не имеющей количественного превосходства. Наоборот, преобладают менее резистентные клетки, которые по мере ухудшения условий существования трансформируются в формы, дающие шанс на выживание. В зависимости от силы и экспозиции раздражения (в отходах рудодобычи это происходит, вероятно, в период смены увлажнения экотопа высыханием) и с учетом индивидуальной устойчивости на первом этапе одни из таких клеток преобразуются в нити, другие - в сферопласты и т. д. Очевидно, в объектах окружающей среды и организме человека механизм нитеобразования сходен и обусловлен нарушением координации между ростом и размножением клеток. Размеры нитей и их эволюция также связаны с неоднородностью микробных клеток. На следующем этапе нити обязательно полностью или частично сегментируются на неравномерные фрагменты, в среднем 0,25 мкм. Сегментированные нити распадаются на палочковидные клетки, тогда как несегмен-тированные нити либо части их становятся источником других вариантов: а) элементарных тел - они отпочковываются на поверхности нити, одном полюсе либо образуются внутри цитоплазмы с выходом через клеточную стенку за ее пределы; б) шаровидных клеток, которые формируются на одном полюсе и здесь же объединяются в конгломераты и огромные Ь-тела; в) комбинированного образование шаровид-

%

kft'

,^m. Mag = 5.50 К X Detector = SE1 WD= 15 mm EHT = 15.00 kV . Mag= 12.00 К X Detector = SE1 WD= 9 mm EHT = 15.00 kV

а б

Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия Ь-форм бактерий: а - конгломерат на почвенной частице, клетки которого делятся различными способами. Увеличение х 12000; б - различной величины и формы конгломераты в речной (р. Амур) воде, отпочковывающие дочерние клетки. Увеличение х 5500.

ных клеток, элементарных тел и палочек. Элементарные тела являются конечным этапом превращений бактериальной клетки. По данным литературы [4, 6, 7] они отличаются устойчивостью к стрессу, способны длительно персистировать в окружащей среде или реверсировать в исходный тип. Образование нитей из крупных Ь-формирований либо шаровидных клеток, как это имеет место в Ь-колониях бактерий, нами не отмечено. К сожалению, не удалось проследить за трансформацией сферопластов- в объектах среды они встречались редко. Однако главный вывод можно все-таки сделать: все морфотипы бактерий, за исключением элементарных тел, так или иначе размножаются, поэтому в природной обстановке бактериальная популяция всегда имеет возможность сохраниться.

Морфологические преобразования бактерий взаимосвязаны и каждый вариант отражает переход клеток из одного состояния в качественно новое, несущее информацию: а) о качестве среды обитания и ее динамике; б) о реакциях отдельных клеток, их групп на бактериальный стресс; в) о переходе большей части популяции в «покоящееся» состояние; г) об адаптивных потенциях популяции в целом. Состоянию «покоя» наиболее соответствуют Ь-формы бактерий, которым присущи замедленный метаболизм и низкая ферментативная активность [6, 7].

Факторы, индуцирующие морфофизиологические изменения бактерий и их диапазон в окружающей среде, многочисленны и не всегда могут быть конкретизированы. Вызвать Ь-трансформацию бактерий способны продукты деградации органического вещества, многие аминокислоты, антибиотические агенты, синергидные либо антагонистические эффекты водорастворимых и подвижных токсикантов Аб, Си, Сг, Со, N1, РЬ, И§, Бе и др. Кстати, именно экстрагированные из отходов золотодобычи рудные элементы изменяют структуру клеточной стенке грибов рода PEMaLLШM [1].

Выводы

1. Комбинированная просвечивающая и сканирующая электронная микроскопия препаратов-

отпечатков, промывных вод рыхлого материала и их осадков позволяет выявить микро- и субмикроскопи-ческое разнообразие бактерий в различных объектах окружающей среды, взаимосвязи и структуру популяций, особенности биокосного взаимодействия и адгезии клеток друг с другом и минералами.

2. Доминирующей морфологической формой изменчивости бактерий в местах заселения являются Ь-формы. В большинстве случаев переход в Ь-формы осуществляется через приостановку деления клеток и образование нитевидных структур.

3. Эффективными модификаторами морфофизиологического состояния бактерий и индукторами Ь-трансформации являются техногенные отходы ру-додобычи.

ЛИТЕРАТУРА

1. Реакция структур клеточной стенки грибов из

рода PENICILLIUM на стрессорную среду

[Текст]/В.М.Катола//Бюл. физиол. и патол. дыхания.-2004.-Вып.16.-С.12-15.

2. Техника взятия материала из небольших по площади или труднодоступных участков тела человека для изучения микроорганизмов [Текст]/ В.М.Катола, Э.В.Хмелькова, Т.Б.Макеева//Там же.-2004.-Вып.18.-С.64-68.

3. О фильтрующихся формах молочнокислых палочек [Текст]/З. А.Канунникова//Микробиология.-

1954.-Т.23, №6.-С.641-647.

4. Ь-формы бактерий [Текст]/С.В.Покровский, Л.Н.Кац, Г.Я.Каган.-М.: Медицина, 1981.-236 с.

5. Действие тяжелых металлов на микроорганизмы [Текст]/О.Ю.Сенцова, В.Н.Максимов//Успехи микробиологии.-1985.-Т.20.-С.227-252.

6. Биология Ь-форм бактерий [Текст]/ В.Д.Тимаков, Г.Я.Каган.-М.: Медгиз, 1961.-233 с.

7. Ь-формы бактерий и семейство Мусор1аБша1а-сеае в патологии [Текст]/В.Д.Тимаков, Г.Я.Каган.-М.: Медицина, 1973.-391 с.

8. Вода. Контроль химической, бактериальной и

радиационной безопасности по международным стандартам: энциклопед. справочник [Текст]/

Г.С.Фомин.-М.: Протектор, 1995.-624 с.

п