РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МОДИФИЦИРОВАННОЙ ДНК С ЗАМКНУТЫМИ КОНЦАМИ (зкДНК)

1. Невирусный бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК), содержащий:
по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ITR), при этом по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует по меньшей мере одну молекулу для редактирования гена.
2. зкДНК-вектор по п. 1, отличающийся тем, что по меньшей мере одну молекулу для редактирования гена выбирают из нуклеазы, направляющей РНК (нРНК), направляющей ДНК (нДНК) и РНК-активатора.
3. зкДНК-вектор по п. 2, отличающийся тем, что по меньшей мере одна молекула для редактирования гена представляет собой нуклеазу.
4. зкДНК-вектор по п. 3, отличающийся тем, что указанная нуклеаза представляет собой последовательность-специфическую нуклеазу.
5. зкДНК-вектор по п. 4, отличающийся тем, что указанную последовательность-специфическую нуклеазу выбирают из направляемой нуклеиновой кислотой нуклеазы, нуклеазы цинкового пальца (ZFN), мегануклеазы, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), или megaTAL.
6. зкДНК-вектор по п. 5, отличающийся тем, что указанная последовательность-специфическая нуклеаза представляет собой направляемую нуклеиновой кислотой нуклеазу, выбранную из редактора одиночных оснований, РНК-направляемой нуклеазы и ДНК-направляемой нуклеазы.
7. зкДНК-вектор по п. 2 или 6, отличающийся тем, что по меньшей мере одна молекула для редактирования гена представляет собой нРНК или нДНК.
8. зкДНК-вектор по пп. 2, 6 или 7, отличающийся тем, что по меньшей мере одна молекула для редактирования гена представляет собой РНК-активатор.
9. зкДНК по любому из пп. 6-8, отличающаяся тем, что указанная направляемая нуклеиновой кислотой нуклеаза представляет собой нуклеазу CRISPR.
10. зкДНК-вектор по п. 9, отличающийся тем, что указанная нуклеаза CRISPR представляет собой нуклеазу Cas.
11. зкДНК-вектор по п. 10, отличающийся тем, что указанную нуклеазу Cas выбирают из Cas9, никующей Cas9 (nCas9) и деактивированной Cas (dCas).
12. зкДНК-вектор по п. 11, отличающийся тем, что указанная nCas9 содержит мутацию в домене HNH или RuVc Cas.
13. зкДНК-вектор по п. 11, отличающийся тем, что указанная нуклеаза Cas представляет собой деактивированную нуклеазу Cas (dCas), образующую комплекс с нРНК, нацеленой на промоторную область гена-мишени.
14. зкДНК-вектор по п. 13, дополнительно содержащий эффекторный домен KRAB.
15. зкДНК-вектор по п. 13 или 14, отличающийся тем, что указанная dCas слита с гетерологичным доменом активации транскрипции, который может быть направлен в область промотора.
16. зкДНК-вектор по п. 15, отличающийся тем, что слияние указанной dCas направляют в область промотора гена-мишени посредством направляющей РНК, которая рекрутирует дополнительные домены трансактивации для усиления экспрессии гена-мишени.
S. pyogenes
17. зкДНК-вектор по любому из пп. 13-16, отличающийся тем, что указанная dCas представляет собой dCas9 .
18. зкДНК-вектор по любому из пп. 7-17, отличающийся тем, что указанная последовательность направляющей РНК нацелена на промотор гена-мишени, а CRISPR заглушает ген-мишень (система CRISPRi).
19. зкДНК-вектор по любому из пп. 7-17, отличающийся тем, что указанная последовательность направляющей РНК нацелена на сайт старта транскрипции гена-мишени и активирует ген-мишень (система CRISPRa).
20. зкДНК-вектор по любому из пп. 6-19, отличающийся тем, что указанная по меньшей мере одна молекула для редактирования гена содержит первую направляющую РНК и вторую направляющую РНК.
21. зкДНК-вектор по любому из пп. 7-20, отличающийся тем, что указанная нРНК нацелена на акцепторный сайт сплайсинга или донорный сайт сплайсинга.
22. зкДНК-вектор по п. 21, отличающийся тем, что нацеливание на указанный акцепторный или донорный сайт сплайсинга приводит к негомологичному присоединению концов (NHEJ) и коррекции дефектного гена.
23. зкДНК-вектор по любому из пп. 7-22, отличающийся тем, что указанный вектор кодирует множество копий одной последовательности направляющей РНК.
24. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-23, отличающийся тем, что первая гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит первую регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует нуклеазу.
25. зкДНК-вектор по п. 24, отличающийся тем, что указанная первая регуляторная последовательность содержит промотор.
26. зкДНК-вектор по п. 25, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой CAG, Pol III, U6 или H1.
27. зкДНК-вектор по любому из пп. 24-26, отличающийся тем, что указанная первая регуляторная последовательность содержит модулятор.
28. зкДНК-вектор по п. 27, отличающийся тем, что модулятор выбирают из энхансера и репрессора.
29. зкДНК-вектор по любому из пп. 24-28, отличающийся тем, что указанная первая гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит последовательность интрона перед нуклеотидной последовательностью, которая кодирует нуклеазу, при этом указанная последовательность интрона содержит сайт расщепления нуклеазой.
30. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-29, отличающийся тем, что указанная вторая гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит вторую регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует направляющую РНК.
31. зкДНК-вектор по п. 30, отличающийся тем, что указанная вторая регуляторная последовательность содержит промотор.
32. зкДНК-вектор по п. 31, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой CAG, Pol III, U6 или H1.
33. зкДНК-вектор по любому из пп. 30-32, отличающийся тем, что указанная вторая регуляторная последовательность содержит модулятор.
34. зкДНК-вектор по п. 33, отличающийся тем, что указанный модулятор выбирают из энхансера и репрессора.
35. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-34, отличающийся тем, что третья гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит третью регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует РНК-активатор.
36. зкДНК-вектор по п. 35, отличающийся тем, что указанная третья регуляторная последовательность содержит промотор.
37. зкДНК-вектор по п. 36, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой CAG, Pol III, U6 или H1.
38. зкДНК-вектор по любому из пп. 35-37, отличающийся тем, что указанная третья регуляторная последовательность содержит модулятор.
39. зкДНК-вектор по п. 38, отличающийся тем, что указанный модулятор выбирают из энхансера и репрессора.
40. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-39, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор содержит 5'-гомологичное плечо и 3'-гомологичное плечо по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
41. зкДНК-вектор по п. 40, отличающийся тем, что каждое из указанного 5'-гомологичного плеча и указанного 3'-гомологичного плеча состоит из приблизительно от 250 до 2000 п.о.
42. зкДНК-вектор по п. 40 или 41, отличающийся тем, что указанное 5'-гомологичное плечо и/или указанное 3'-гомологичное плечо проксимально к ITR.
43. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-42, отличающийся тем, что по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность расположена между указанным 5'-гомологичным плечом и указанным 3'-гомологичным плечом.
44. зкДНК-вектор по п. 43, отличающийся тем, что по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, которая расположена между указанным 5'-гомологичным плечом и указанным 3'-гомологичным плечом, содержит ген-мишень.
45. зкДНК-вектор по п. 40-44, отличающийся тем, что (зкДНК-вектор) по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, которая кодирует молекулу для редактирования гена, не расположена между указанным 5'-гомологичным плечом и указанным 3'-гомологичным плечом.
46. зкДНК-вектор по п. 45, отличающийся тем, что ни одна из указанных гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих молекулы для редактирования генов, не расположена между указанным 5'-гомологичным плечом и указанным 3'-гомологичным плечом.
47. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-46, содержащий первый сайт рестрикции эндонуклеазой перед 5'-гомологичным плечом и/или второй сайт рестрикции эндонуклеазой после 3'-гомологичного плеча.
48. зкДНК-вектор по п. 47, отличающийся тем, что указанный первый сайт рестрикции эндонуклеазой и указанный второй сайт рестрикции эндонуклеазой представляют собой одинаковые сайты рестрикции эндонуклеазой.
49. зкДНК-вектор по п. 47 или 48, отличающийся тем, что по меньшей мере один сайт рестрикции эндонуклеазой расщепляется эндонуклеазой, которая также кодируется в указанном зкДНК-векторе.
50. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-49, отличающийся тем, что он дополнительно содержит один или несколько сайтов поли(А).
51. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-50, содержащий по меньшей мере что-то одно из регуляторного элемента трансгена и сайта поли(А), расположенных после указанного 3'-гомологичного плеча и близко к нему и/или перед указанным 5'-гомологичным плечом и близко к нему.
52. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-51, содержащий 2А и сайт маркера селекции перед и близко к указанному 3''-гомологичному плечу.
53. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-52, отличающийся тем, что указанное 5'-гомологичное плечо гомологично нуклеотидной последовательности, расположенной перед сайтом расщепления нуклеазой в хромосоме.
54. зкДНК-вектор по любому из пп. 40-53, отличающийся тем, что указанное 3'-гомологичное плечо гомологично нуклеотидной последовательности, расположенной после сайта расщепления нуклеазой в хромосоме.
55. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-54, содержащий гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую энхансер гомологичной рекомбинации.
56. зкДНК-вектор по п. 55, отличающийся тем, что энхансер гомологичной рекомбинации выбирают из вышерасположенной последовательности позднего энхансера полиА-сигнала SV40, раннего энхансерного элемента цитомегаловируса, энхансера RSV и энхансера CMV.
57. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-56, отличающийся тем, что по меньшей мере один ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения (terminal resolution site) и Rep-связывающий сайт.
58. зкДНК-вектор по пп. 1-57, отличающийся тем, что указанные фланкирующие ITR являются симметричными или асимметричными.
59. зкДНК-вектор по п. 58, отличающийся тем, что указанные фланкирующие ITR являются асимметричными, при этом по меньшей мере один из указанных ITR изменен по сравнению с последовательностью ITR AAV дикого типа путем делеции, добавления или замены, которые влияют на общую трехмерную конформацию указанного ITR.
60. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-59, отличающийся тем, что по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность представляет собой кДНК.
61. зкДНК-вектор по пп. 1-60, отличающийся тем, что один или несколько из указанных фланкирующих ITR получены из серотипа AAV, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12.
62. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-61, отличающийся тем, что один или несколько из указанных ITR являются синтетическими.
63. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-62, отличающийся тем, что один или несколько из указанных ITR не являются ITR дикого типа.
64. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-63, отличающийся тем, что один или несколько (оба) из указанных ITR модифицированы путем делеции, вставки и/или замены по меньшей мере в одной из областей ITR, выбранных из A, A', B, B', C, C', D и D'.
65. зкДНК-вектор по п. 64, отличающийся тем, что указанная делеция, вставка и/или замена приводит к удалению всей или части структуры стебель-петля, обычно образуемой областями A, A', B, B', C или C'.
66. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-58 или 56-65, отличающийся тем, что указанные ITR являются симметричными.
67. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-58, 60, 61 и 66, отличающийся тем, что указанные ITR относятся к дикому типу.
68. зкДНК-вектор по любому из пп. 1-66, отличающийся тем, что оба ITR изменяют таким образом, чтобы это приводило к общей трехмерной симметрии, когда указанные ITR инвертированы друг относительно друга.
69. зкДНК-вектор по п. 68, отличающийся тем, что указанное изменение представляет собой делецию, вставку и/или замену в областях ITR, выбранных из A, A', B, B', C, C', D и D'.
70. Способ редактирования генома, включающий:
контактирование клетки с системой редактирования генов, при этом один или несколько компонентов указанной системы редактирования генов доставляют в клетку путем контактирования клетки с невирусным бескапсидным ДНК-вектором с замкнутыми концами (зкДНК), содержащим по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ITR), причем по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует по меньшей мере одну молекулу для редактирования гена.
71. Способ по п. 70, отличающийся тем, что по меньшей мере одну молекулу для редактирования гена, выбирают из нуклеазы, направляющей РНК (нРНК), направляющей ДНК (нДНК) и РНК-активатора.
72. Способ по п. 71, отличающийся тем, что по меньшей мере одна молекула для редактирования гена представляет собой нуклеазу.
73. Способ по п. 72, отличающийся тем, что указанная нуклеаза представляет собой последовательность-специфическую нуклеазу.
74. Способ по п. 73, отличающийся тем, что указанную последовательность-специфическую нуклеазу выбирают из нуклеазы, направляемой нуклеиновой кислотой, нуклеазы цинкового пальца (ZFN), мегануклеазы, эффекторной нуклеазы, подобной активатору транскрипции (TALEN), или мегаТАЛ (megaTAL).
75. Способ по п. 73, отличающийся тем, что указанная последовательность-специфическая нуклеаза представляет собой направляемую нуклеиновой кислотой нуклеазу, выбранную из редактора одиночных оснований, РНК-направляемой нуклеазы и ДНК-направляемой нуклеазы.
76. Способ по п. 70 или 75, отличающийся тем, что по меньшей мере одна молекула для редактирования гена представляет собой нРНК или нДНК.
77. Способ по пп. 70, 75 или 76, отличающийся тем, что по меньшей мере одна молекула для редактирования гена представляет собой РНК-активатор.
78. Способ по любому из пп. 74-77, отличающийся тем, что указанная направляемая нуклеиновой кислотой нуклеаза представляет собой нуклеазу CRISPR.
79. Способ по п. 78, отличающийся тем, что указанная нуклеаза CRISPR представляет собой нуклеазу Cas.
80. Способ по п. 79, отличающийся тем, что указанную нуклеазу Cas выбирают из Cas9, никующей cas9 (nCas9) и деактивированной Cas (dCas).
81. Способ по п. 80, отличающийся тем, что указанная nCas9 содержит мутацию в домене HNH или RuVc Cas.
82. Способ по п. 80, отличающийся тем, что указанная нуклеаза Cas представляет собой деактивированную нуклеазу Cas (dCas), которая образует комплекс с нРНК, нацеленной на промоторную область гена-мишени.
83. Способ по п. 82, дополнительно включающий эффекторный домен KRAB.
84. Способ по п. 82 или 83, отличающийся тем, что dCas сливают с гетерологичным доменом активации транскрипции, который может быть направлен в область промотора.
85. Способ по п. 84, отличающийся тем, что слияние dCas направлено в область промотора гена-мишени посредством направляющей РНК, которая рекрутирует дополнительные домены трансактивации для усиления экспрессии гена-мишени.
S. pyogenes
86. Способ по любому из пп. 82-85, отличающийся тем, что указанная dCas представляет собой dCas9 .
87. Способ по любому из пп. 78-86, отличающийся тем, что указанная последовательность направляющей РНК нацелена на указанный промотор гена-мишени, а CRISPR заглушает указанный ген-мишень (система CRISPRi).
88. Способ по любому из пп. 78-86, отличающийся тем, что указанная последовательность направляющей РНК направлена на сайт начала транскрипции гена-мишени и активирует указанный ген-мишень (система CRISPRa).
89. Способ по любому из пп. 76-88, отличающийся тем, что по меньшей мере одна молекула для редактирования гена содержит первую направляющую РНК и вторую направляющую РНК.
90. Способ по любому из пп. 76-89, отличающийся тем, что указанная нРНК нацелена на акцепторный сайт сплайсинга или донорный сайт сплайсинга.
91. Способ по п. 22, отличающийся тем, что нацеливание на указанный акцепторный сайт сплайсинга или донорный сайт сплайсинга вызывает негомологичное присоединение концов (NHEJ) и коррекцию дефектного гена.
92. Способ по пп. 76-91, отличающийся тем, что указанный вектор кодирует множество копий одной последовательности направляющей РНК.
93. Способ по любому из пп. 70-92, отличающийся тем, что первая гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит первую регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей нуклеазу.
94. Способ по п. 93, отличающийся тем, что указанная первая регуляторная последовательность содержит промотор.
95. Способ по п. 94, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой CAG, Pol III, U6 или H1.
96. Способ по любому из пп. 93-95, отличающийся тем, что указанная первая регуляторная последовательность содержит модулятор.
97. Способ по п. 96, отличающийся тем, что указанный модулятор выбирают из энхансера и репрессора.
98. Способ по любому из пп. 93-97, отличающийся тем, что указанная первая гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит последовательность интрона перед указанной нуклеотидной последовательностью, которая кодирует нуклеазу, при этом указанная последовательность интрона содержит сайт расщепления нуклеазой.
99. Способ по любому из пп. 70-98, отличающийся тем, что вторая гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит вторую регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует направляющую РНК.
100. Способ по п. 99, отличающийся тем, что указанная вторая регуляторная последовательность содержит промотор.
101. Способ по п. 100, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой CAG, Pol III, U6 или H1.
102. Способ по любому из пп. 99-101, отличающийся тем, что указанная вторая регуляторная последовательность содержит модулятор.
103. Способ по п. 102, отличающийся тем, что указанный модулятор выбирают из энхансера и репрессора.
104. Способ по любому из пп. 70-103, отличающийся тем, что третья гетерологичная нуклеотидная последовательность содержит третью регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует РНК-активатор.
105. Способ по п. 104, отличающийся тем, что указанная третья регуляторная последовательность содержит промотор.
106. Способ по п. 105, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой CAG, Pol III, U6 или H1.
107. Способ по пп. 104-106, отличающийся тем, что указанная третья регуляторная последовательность содержит модулятор.
108. Способ по п. 107, отличающийся тем, что указанный модулятор выбирают из энхансера и репрессора.
109. Способ по любому из пп. 70-108, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор содержит 5'-гомологичное плечо и 3'-гомологичное плечо по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты-мишени.
110. Способ по п. 109, отличающийся тем, что указанное 5'-гомологичное плечо и указанное 3'-гомологичное плечо состоят из приблизительно от 250 до 2000 п.о.
111. Способ по п. 109 или 110, отличающийся тем, что указанное 5'-гомологичное плечо и/или указанное 3'-гомологичное плечо проксимальны к ITR.
112. Способ по любому из пп. 109-111, отличающийся тем, что по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность расположена между указанным 5'-гомологичным плечом и указанным 3'-гомологичным плечом.
113. Способ по п. 112, отличающийся тем, что по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, которая расположена между указанным 5'-гомологичным плечом и указанным 3'-гомологичным плечом, содержит ген-мишень.
114. Способ по любому из пп. 109-113, отличающийся тем, что указанная (зкДНК-вектора) по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность, которая кодирует молекулу для редактирования гена, не расположена между указанным 5'-гомологичным плечом и указанным 3'-гомологичным плечом.
115. Способ по п. 114, отличающийся тем, что ни одна из указаннных гетерологичных нуклеотидных последовательностей, кодирующих молекулы для редактирования генов, не расположена между указанным 5'-гомологичным плечом и указанным 3'-гомологичным плечом.
116. Способ по любому из пп. 109-115, включающий первый сайт рестрикции эндонуклеазой, расположенный перед указанным 5'-гомологичным плечом и/или второй сайт рестрикции эндонуклеазой после указанного 3'-гомологичного плеча.
117. Способ по п. 116, отличающийся тем, что указанный первый сайт рестрикции эндонуклеазой и указанный второй сайт рестрикции эндонуклеазой являются одинаковыми сайтами рестрикции эндонуклеазой.
118. Способ по п. 116 или 117, отличающийся тем, что по меньшей мере один сайт рестрикции эндонуклеазой расщепляют эндонуклеазой, которая также кодируется указанным зкДНК-вектором.
119. Способ по любому из пп. 109-118, отличающийся тем, что дополнительно содержит один или несколько сайтов поли(А).
120. Способ по любому из пп. 109-119, содержащий по меньшей мере что-то одно из регуляторного элемента трансгена и сайта поли(А) после 3'-гомологичного плеча и близко к нему, и/или перед 5'-гомологичным плечом и близко к нему.
121. Способ по любому из пп. 109-120, содержащий 2А и сайт маркера селекции перед 3'-гомологичным плечом и близко к нему.
122. Способ по любому из пп. 109-121, отличающийся тем, что указанное 5'-гомологичное плечо гомологично нуклеотидной последовательности, расположенной перед сайтом расщепления нуклеазой в хромосоме.
123. Способ по любому из пп. 109-122, отличающийся тем, что 3'-гомологичное плечо гомологично нуклеотидной последовательности, расположенной после сайта расщепления нуклеазой в хромосоме.
124. Способ по любому из пп. 109-123, включающий гетерологичную нуклеотидную последовательность, кодирующую энхансер гомологичной рекомбинации.
125. Способ по п. 124, отличающийся тем, что указанный энхансер гомологичной рекомбинации выбирают из вышерасположенной последовательности позднего энхансера полиА-сигнала SV40, раннего энхансерного элемента цитомегаловируса, энхансера RSV и энхансера CMV.
126. Способ по любому из пп. 70-125, отличающийся тем, что по меньшей мере один ITR содержит функциональный сайт концевого разрешения и Rep-связывающий сайт.
127. Способ по любому из пп. 70-126, отличающийся тем, что указанные фланкирующие ITR являются симметричными или асимметричными.
128. Способ по п. 127, отличающийся тем, что указаннные фланкирующие ITR являются асимметричными, причем по меньшей мере один из указанных ITR изменен по сравнению с последовательностью ITR AAV дикого типа посредством делеции, добавления или замены, которые влияют на общую трехмерную конформацию указанного ITR.
129. Способ по любому из пп. 70-128, отличающийся тем, что по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность представляет собой кДНК.
130. Способ по любому из пп. 70-129, отличающийся тем, что один или несколько из указанных фланкирующих ITR получены из серотипа AAV, выбранного из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12.
131. Способ по любому из пп. 70-130, отличающийся тем, что один или несколько из указанных ITR являются синтетическими.
132. Способ по любому из пп. 70-131, отличающийся тем, что один или несколько из указанных ITR не являются ITR дикого типа.
133. Способ по любому из пп. 70-132, отличающийся тем, что один или несколько (оба) из указанных ITR модифицируют путем делеции, вставки и/или замены в по меньшей мере одной из областей указанного ITR, выбранных из A, A', B, B', С, С', D и D'.
134. Способ по п. 133, отличающийся тем, что указанная делеция, вставка и/или замена приводит к удалению всей или части структуры стебель-петля, обычно образуемой указанными областями A, A', B, B', C или C'.
135. Способ по любому из пп. 70-127 или 129-134, отличающийся тем, что указанные ITR являются симметричными.
136. Способ по любому из пп. 70-127 или 129-130, отличающийся тем, что указанные ITR относятся к дикому типу.
137. Способ по любому из пп. 70-136, отличающийся тем, что оба ITR изменяют таким образом, чтобы это приводило к общей трехмерной симметрии, когда указанные ITR инвертированы друг относительно друга.
138. Способ по п. 137, отличающийся тем, что указанное изменение представляет собой делецию, вставку и/или замену в областях указанного ITR, выбранных из A, A', B, B', C, C', D и D'.
139. Способ по любому из пп. 70-138, отличающийся тем, что указанная контактирующая клетка представляет собой эукариотическую клетку.
140. Способ по любому из пп. 84-139, отличающийся тем, что указанная нуклеаза CRISPR кодон-оптимизирована для экспрессии в эукариотической клетке.
141. Способ по любому из пп. 84-140, отличающийся тем, что указанный белок Cas кодон-оптимизирован для экспрессии в эукариотической клетке.
142. Способ редактирования генома, включающий введение в клетку эффективного количества невирусной бескапсидной ДНК с замкнутыми концами (зкДНК-вектор) по любому из пп. 1-69 в подходящих условиях и в течение времени, достаточного для редактирования гена-мишени.
143. Способ по любому из пп. 113-142, отличающийся тем, что указанный ген-мишень представляет собой ген, нацеливание на который осуществляется с помощью одной или нескольких последовательностей направляющих РНК, а редактирование - путем гомологичной репарации (HDR) в присутствии донорной матрицы HDR.
144. Способ по любому из пп. 142-143, отличающийся тем, что нацеливание на указанный ген-мишень осуществляют с использованием одной последовательности направляющей РНК, и указанный ген-мишень редактируют путем негомологичного присоединения концов (NHEJ).
in vivo
145. Способ по любому из пп. 70-144, отличающийся тем, что указанный способ осуществляют  для коррекции однонуклеотидного полиморфизма (SNP), ассоциированного с заболеванием.
146. Способ по п. 145, отличающийся тем, что указанное заболевание включает серповидноклеточную анемию, наследственный гемохроматоз или рак, наследственную слепоту.
147. Способ по любому из пп. 70-146, отличающийся тем, что по меньшей мере 2 различных белка Cas присутствуют в указанном зкДНК-векторе, и при этом один из указанных белков Cas является каталитически неактивным (Cas-i), и при этом указанная направляющая РНК, связанная с Cas-I, нацелена на промотор указанной клетки-мишени, и при этом указанная ДНК, кодирующая Cas-I, находится под контролем индуцибельного промотора, так что он может отключать экспрессию указанного гена-мишени в желаемое время.
148. Способ редактирования одиночной пары нуклеотидных оснований в гене-мишени в клетке, включающий контактирование клетки с системой редактирования генов CRISPR/Cas, при этом один или несколько компонентов системы редактирования генов CRISPR/Cas доставляются в указанную клетку путем контактирования указанной клетки с композицией невирусного бескапсидного ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК), и
при этом указанный белок Cas, экспрессируемый из указанного зкДНК-вектора, каталитически неактивен и слит с фрагментом редактирования основания,
при этом указанный способ осуществляют в условиях и в течение периода времени, достаточного для модуляции экспрессии указанного гена-мишени.
149. Способ по п. 148, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1-69.
150. Способ по п. 148, отличающийся тем, что указанный фрагмент для редактирования основания содержит специфичную к одноцепочечным участкам цитидиндеаминазу, ингибитор урацилгликозилазы или тРНК-аденозиндеаминазу.
151. Способ по п. 148, отличающийся тем, что указанный каталитически неактивный белок Cas представляет собой dCas9.
+
152. Способ по любому из пп. 70-151, отличающийся тем, что указанная клетка представляет собой Т-клетку или CD34.
153. Способ по любому из пп. 70-152, отличающийся тем, что указанный ген-мишень кодирует белок программируемой смерти (PD1), цитотоксический антиген 4, ассоциированный с Т-лимфоцитом (CTLA4), или фактор некроза опухоли-α (TNF-α).
154. Способ по любому из пп. 70-153, дополнительно включающий введение указанных продуцируемых клеток нуждающемуся в этом субъекту.
155. Способ по п. 154, отличающийся тем, что указанный нуждающийся в этом субъект имеет генетическое заболевание, вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, рак или аутоиммунное заболевание.
156. Способ модулирования экспрессии двух или более генов-мишеней в клетке, включающий: введение в клетку:
первой композиции, содержащей вектор, который содержит: фланкирующие последовательности концевых повторов (TR) и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере две направляющие РНК, комплементарные двум или более генам-мишеням, при этом указанный вектор представляет собой невирусный бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК),
второй композиции, содержащей вектор, который содержит: фланкирующие последовательности концевых повторов (TR) и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере две каталитически неактивные ДНК-эндонуклеазы, каждая из которых ассоциирована с направляющей РНК и связывается с двумя или более генами-мишенями, при этом указанный вектор представляет собой невирусный бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК), и
третьей композицией, содержащей вектор, который содержит: фланкирующие последовательности концевых повторов (TR) и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере два белка или домена регулятора транскрипции, при это указаанный вектор представляет собой невирусный бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК), и
при этом указанные по меньшей мере две направляющие РНК, указанные по меньшей мере две каталитически неактивные РНК-направляемые эндонуклеазы и указанные по меньшей мере два белка или домена регулятора транскрипции экспрессируются в указанной клетке,
при этом два или более комплексов ко-локализации образуются между направляющей РНК, каталитически неактивной РНК-направляемой эндонуклеазой, белком или доменом регулятора транскрипции и геном-мишенью, и
при этом указанный белок или домен регулятора транскрипции регулирует экспрессию указанных по меньшей мере двух генов-мишеней.
157. Способ по п. 156, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор указанной первой композиции представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1-69, указанный зкДНК-вектор указанной второй композиции представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1-69, и указанная третья композиция представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1-69.
158. Способ вставки последовательности нуклеиновой кислоты ген безопасной гавани геномав ген безопасной гавани (safe harbor gene) генома, включающий: контактирование клетки с (i) системой редактирования генов и (ii) матрицей гомологично направляемой репарации, имеющей гомологию с геном безопасной гавани генома, и содержащей последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок, представляющий интерес,
при этом один или несколько компонентов указанной системы редактирования генов доставляют в клетку путем контактирования указанной клетки с композицией невирусного бескапсидного ДНК-вектора с замкнутыми концами (зкДНК), при этом указанная композиция нуклеиновой кислоты зкДНК-вектора содержит по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ITR), причем по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует по меньшей мере одну молекулу для редактирования гена, и
при этом указанный способ осуществляют в условиях и в течение времени, достаточных для вставки указанной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный представляющий интерес белок, в указанный ген безопасной гавани генома.
159. Способ по п. 158, отличающийся тем, что указанный зкДНК-вектор представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1-69.
160. Способ по п. 158, отличающийся тем, что указанный ген безопасной гавани генома содержит активный интрон, расположенный близко к по меньшей мере одной известной кодирующей последовательности, экспрессирующей белки с высоким уровнем экспрессии.
161. Способ по п. 158, отличающийся тем, что указанный ген безопасной гавани генома содержит сайт, расположенный в или вблизи любого из гена альбумина, гена CCR5, локуса AAVS1, или поблизости от них.
162. Способ по любому из пп. 158-161, отличающийся тем, что указанный представляющий интерес белок является рецептором, токсином, гормоном, ферментом или белком клеточной поверхности.
163. Способ по п. 162, отличающийся тем, что указанный представляющий интерес белок представляет собой секретируемый белок.
164. Способ по п. 163, отличающийся тем, что указанный представляющий интерес белок содержит фактор VIII (FVIII) или фактор IX (FIX).
in vivo
165. Способ по п. 164, отличающийся тем, что указанный способ осуществляют  для лечения гемофилии А или гемофилии В.
166. Способ вставки донорной последовательности в предварительно определенный сайт вставки на хромосоме в клетке-хозяине, включающий: введение в клетку-хозяина указанного зкДНК-вектора по пп. 1-69, при этом указанную донорную последовательность вставляют в указанную хромосому по месту указанного сайта вставки или рядом с ним путем гомологичной рекомбинации.
167. Способ получения генетически модифицированного животного, содержащего донорную последовательность, вставленную в предварительно определенный сайт вставки на хромосоме указанного животного, включающий: а) получение клетки с указанной донорной последовательностью, вставленной в указанный предварительно определенный сайт вставки на хромосоме по п. 167; и b) введение указанной клетки, полученной в а), животному-носителю для получения генетически модифицированного животного.
168. Способ по п. 167, отличающийся тем, что указанная клетка представляет собой зиготу или плюрипотентную стволовую клетку.
169. Генетически модифицированное животное, полученное способом по п. 168.
170. Генетически модифицированное животное по п. 169, отличающееся тем, что указанное животное представляет собой животное, не являющееся человеком.
171. Набор для вставки донорной последовательности в сайт вставки на хромосоме в клетке, включающий: а) первый невирусный бескапсидный ДНК-вектор с замкнутыми концами (зкДНК), содержащий:
два инвертированных терминальных повтора (ITR) AAV; и
первую нуклеотидную последовательность, содержащую 5'-гомологичное плечо, донорную последовательность и 3'-гомологичное плечо, при этом указанная донорная последовательность обладает функциональностью редактирования генов; и
(a) второй зкДНК-вектор, содержащий:
по меньшей мере один ITR AAV; и
нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере одну молекулу для редактирования гена,
при этом в указанном первом зкДНК-векторе указанное 5'-гомологичное плечо гомологично последовательности, расположенной перед сайтом расщепления для молекулы для редактирования гена на хромосоме, и указанное 3'-гомологичное плечо гомологично последовательности, расположенной после сайта расщепления для молекулы для редактирования гена на хромосоме; и при этом указанное 5'-гомологичное плечо или указанное 3'-гомологичное плечо проксимальны к указанному ITR.
172. Способ по п. 171, отличающийся тем, что указанная молекула для редактирования генов представляет собой нуклеазу.
173. Способ по п. 172, отличающийся тем, что указанная нуклеаза представляет собой последовательность-специфическую нуклеазу.
174. Способ по любому из пп. 171-173, отличающийся тем, что указанный первый зкДНК-вектор представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1, 40-56, 57-69.
175. Способ по любому из пп. 171-173, отличающийся тем, что указанный второй зкДНК-вектор представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1-39 или 57-69.
176. Способ вставки донорной последовательности в предварительно определенный сайт вставки в хромосому в клетке-хозяине, включающий:
введение в клетку-хозяина первого невирусного бескапсидного вектора с ДНК с замкнутыми концами (зкДНК), имеющего по меньшей мере один инвертированный концевой повтор (ITR), при этом указанный зкДНК-вектор содержит первую линейную нуклеиновую кислоту, содержащую 5'-гомологичное плечо, донорную последовательность и 3'-гомологичное плечо; и
введение в клетку-хозяина второго зкДНК-вектора, содержащего по меньшей мере одну гетерологичную нуклеотидную последовательность между фланкирующими инвертированными концевыми повторами (ITR), причем по меньшей мере одна гетерологичная нуклеотидная последовательность кодирует по меньшей мере одну молекулу для редактирования гена, которая расщепляет хромосому в указанном сайте вставки или рядом с ним, при этом указанная донорная последовательность вставляется в указанную хромосому в указанном сайте вставки или рядом с ним посредством гомологичной рекомбинации.
177. Способ по п. 176, отличающийся тем, что указанная молекула для редактирования гена, представляет собой нуклеазу.
178. Способ по п. 177, отличающийся тем, что указанная нуклеаза представляет собой последовательность-специфическую нуклеазу.
179. Способ по любому из пп. 176-178, отличающийся тем, что указанный первый зкДНК-вектор является зкДНК-вектором по любому из пп. 1, 40-56, 57-69.
180. Способ по любому из пп. 176-179, отличающийся тем, что указанный второй зкДНК-вектор представляет собой зкДНК-вектор по любому из пп. 1-39 или 57-69.
181. Способ по любому из пп. 179-180, отличающийся тем, что указанный второй зкДНК-вектор дополнительно содержит третью нуклеотидную последовательность, кодирующую направляющую последовательность, распознающую сайт вставки.
182. Клетка, содержащая зкДНК-вектор по любому из пп. 1-69.
183. Композиция, содержащая вектор по любому из пп. 1-69 и липид.
184. Композиция по п. 184, отличающаяся тем, что указанный липид представляет собой липидную наночастицу (LNP).
185. Набор, содержащий композицию по п. 183 или 184 или клетку по п. 182.