СПОСОБ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА IN VITRO ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ БАКТЕРИЙ И ГРИБОВ У ПАЦИЕНТА
METHOD FOR EXPRESS ANALYSIS IN VITRO OF ANTIBIOTIC SENSITIVITY OF BACTERIA AND FUNGI IN PATIENT

Изобретение относится к области медицины, а именно касается клинико-лабораторной диагностики, и может быть применимо, например, для экспресс-анализа чувствительности патогенной микрофлоры к назначаемой антибактериальной терапии при сепсисе.
В настоящее время по причине антибиотикорезистентности погибает до 700000 человек в год (1). По мнению экспертов, если ситуация с применением антибиотиков не изменится, то к 2050 году антимикробная резистентность станет причиной 10 миллионов смертей ежегодно и превысит смертность от онкологических заболеваний (2).  Стартовая антибактериальная терапия сепсиса является эмпирической, учитывающей локализацию первичного очага инфекции, характер вероятных возбудителей заболевания, а также ретроспективный анализ микробной флоры и ее чувствительности к антибиотикам для каждого конкретного лечебного учреждения или отделения. Определение возбудителя и изучение его чувствительности к антибактериальным химиопрепаратам являются важнейшим этапом лечения больных с сепсисом, так как именно использование соответствующих антибиотиков является при прочих равных условиях залогом окончательного излечения больного.
.
К сожалению возможности бактериологической службы, не всегда позволяют получить эти сведения в короткое время. Это особо актуально в связи с применением эмпирического подхода к назначению стартовой и последующей антибактериальной терапии в условиях широкого распространения антибиотикорезистентности у бактерий. Стандартные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (дискодиффузионный метод и метод серийных разведений), были разработаны в середине 60-х – начале 70-х годов и с тех пор не претерпели существенных изменений (3,4,5,6) Среди методов ускоренного определения возбудителя гнойно-воспалительных заболеваний наибольшее распространение получили усовершенствованная прямая бактериоскопия, серологические реакции, газовая хроматография, полимеразная цепная реакция. Однако эти методы ранней идентификации возбудителя с определением его чувствительности к антибиотикам имеют ряд ограничений, в частности, относительно высокую стоимость анализаторов и используемых материалов/реагентов. Кроме того, в клинической практике инфекция чаще протекает с участием ассоциации различных видов микробов, поэтому этиологически достоверно указать все виды микроорганизмов на этапе экспресс-диагностики и определить экспресс-анализ их антибиотикочувствительности часто затруднительно.
Наиболее близким к заявленному изобретению является способ экспресс-анализа in vitro чувствительности к антибиотикам грамотрицательных бактерий у пациента (7), включающий отбор образца биологической жидкости, содержащей грамотрицательные бактерии; определение минимальной концентрации общего эндотоксина (общего LPS) методом активированных частиц путем внесения в лунку планшета 100 мкл (1%) буферного раствора, 100 мкл биологической жидкости и 20 мкл диагностикума МАЧ - Endotox spp., с последующим титрованием методом двукратного разведения и инкубацией полученной смеси при 37°С в течение 5 мин; добавление к 100 мкл образца биологической жидкости 100 мкл тестируемого (ых) антибиотика (ов) в количестве 1/5000 частей от его/их разовой расчетной дозы на 1 мл образца биологической жидкости и 20 мкл диагностикума МАЧ -Endotox spp. и инкубацию смеси в течение 30 минут, сравнение результатов реакций с последующим определением чувствительности бактерий к антибиотику исходя из максимального (2-3 кратного) увеличения уровня липополисахарида в исследуемой смеси по сравнению с минимальной концентрации общего эндотоксина.
Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала способов экспресс-анализа in vitro чувствительности к антибиотикам бактерий, а также грибов у пациента.
Техническим результатом является быстрое определение чувствительности  бактериальной и грибковой инфекции к антибиотикам.
Технический результат достигается тем, что в способе экспресс-анализа in vitro чувствительности к антибиотикам бактерий и грибов у пациента осуществляют забор крови у пациента, проводят инкубацию смеси крови с раствором антибиотика при температуре 37 °С в течение 30 минут, определяют содержание анализируемого вещества в крови, сравнивают результаты исследования и определяют чувствительность бактерий к антибиотику. При этом кровь забирают в количестве по 1 мл в две стерильные пробирки с антикоагулянтом, затем в первую пробирку вводят 50 мкл 0,9% стерильного раствора NaCl, а во вторую 50 мкл свежеприготовленного раствора разовой дозы антибиотика, разведенного на 100 мл растворителя для антибиотика, в качестве анализируемого вещества используют пресепсин, определяют его содержание в крови первой и второй пробирок с использованием диагностикума на иммунохемилюминесцентном анализаторе, а чувствительность бактерий и грибов к антибиотику определяют по снижению содержания пресепсина во второй пробирке на 10% и более по сравнению с содержанием пресепсина в первой пробирке.
Пресепсин (sCD14-ST) представляет собой фрагмент гликопротеина CD14 после взаимодействия макрофагов с грамположительными, грамотрицательными бактериями и грибами (8). Пресепсин широко используется для диагностики сепсиса (9). Уровни пресепсина значительно выше у пациентов с сепсисом, нежели у пациентов с ССВО (синдром системного воспалительного ответа) или у практически здоровых людей (10,11).
Антибактериальные и антимикотические препараты вызывают или гибель микроорганизма или прекращение его размножения, что проявляется в бактерицидном или бактериостатическом механизме их действия. Прекращение размножения микрорганизмов или их гибель сокращает продукцию пресепсина макрофагами.
Изобретение осуществляют следующим образом.
На первом этапе проводят забор в 2 пробирки с антикоагулянтом, предпочтительно с ЭДТА или с гепарином, по 1 мл исследуемой крови.
Затем готовят пробы для определения содержания в них пресепсина. В 1-ю пробирку, служащую контролем, добавляют 50 мкл 0,9% стерильного раствора NaCl, а во 2-ю пробирку – 50 мкл свежеприготовленного раствора разовой дозы антибактериального или антигрибкового препарата, разведенного на 100 мл  стерильного раствора NaCl или в специальном растворителе, предназначенном для препарата, запланированного для эмпирической антибактериальной или антимикотической терапии.
В качестве исследуемых препаратов могут быть использованы любые антибиотики, к которым чувствительны бактерии и грибы, в частности ванкомицин, линезолид, текопланин, меропенем, имепенем, дорипенем, эртапенем, гентамицин, амикацин, ампициллин/сульбактам, цефаперазон/сульбактам, цефтриаксон, цефепим, пефлоксацин, ципрофлаксацин, моксифлоксацин, офлоксацин, левофлаксацин, полимиксин В, амоксициллин/клавунат, линкомицин, цефуроксим, рифампицин, тобрамицин, азитромицин, кларитромицин, флуконазол, кетоконазол, интраконазол, вориконазол, каспофунгин, а также  другие антибактериальные и антимикотические препараты.
о
Через 30 минут после инкубации полученной смеси при 37С определяют содержание пресепсина в крови 1-й и 2-й пробирок. Содержание пресепсина определяют с использованием диагностикума (тест-системы) на иммунохемилюминесцентном анализаторе. В частности, используют диагностикум PATHFAST™ Presepsin для in vitro диагностики на анализаторе PATHFAST™.
Процедура проведения анализа основана на методе хемилюминесцентного иммуноферментного анализа. Диагностикум представляет собой картридж, в который упакованы все необходимые для проведения тестирования компоненты. Картридж с реагентами состоит из лунок, заполненными реагентами для тестирования, в которые вносят пробы. После загрузки картриджа в диагностический анализатор количественный результат может быть получен через 17 минут. В ходе проведения процедуры поликлональные антитела к пресепсину, связанные со щелочной фосфатазой, и моноклональные антитела к пресепсину на магнитных частицах смешиваются с пробой. Пресепсин из пробы связывается с антителами к нему, образуя иммунокомплекс с мечеными ферментом антителами и антителами на магнитных частицах. После удаления несвязавшегося материала к иммунному комплексу добавляется хемилюминесцентный субстрат. После короткой инкубации под воздействием ферментной реакции в смеси начинается люминесценция, интенсивность которой зависит от концентрации пресепсина в пробе. Расчет результата проводится по стандартной калибровочной кривой.
При сравнении результатов снижение содержания пресепсина в крови больного на 10% и более относительно значений в 1-й (контрольной) пробирке определяется как чувствительность микроорганизма или грибкового возбудителя к запланированному для применения у пациента с сепсисом антибактериального или антимикотического препарата. Критерий чувствительности бактерий или грибов к исследуемому препарату - снижение in vitro содержания пресепсина в крови больного на 10% и более относительно значений в контроле. При исследовании нескольких препаратов для антибактериальной или антимикотической терапии при выявленной высокой чувствительности к ним бактерий и грибов возможно использование комбинации препаратов для достижения максимально быстрого терапевтического эффекта с учетом активности патологического процесса, а также противопоказаний к назначению препаратов, индивидуальной непереносимости или аллергологического анамнеза.
Пример 1. Больная М. 35 лет. Диагноз: состояние кесарева сечения. Гнойный метроэндометрит. Сепсис. Операция: экстирпация матки с придатками, санация и дренирование брюшной полости.
У больной при поступлении взята кровь на бактериологическое исследование и проведено исследование чувствительности микрофлоры к планируемой антибактериальной терапии меропенемом и амикацином. При добавлении в кровь меропенема снижение уровня пресепсина по сравнению с контролем не отмечено, при  введении в пробирку с кровью амикацина через 30 минут определено снижение содержания пресепсина в крови с 3480 пкг/мл в контрольной пробирке до 2950 пкг/мл в пробирке с добавлением амикацина. Проведен дополнительный забор и исследование крови на чувствительность к тигециклину. Определено снижение пресепсина в крови по сравнению с контролем с 3516 до 3003 пкг/мл. Назначена комбинация амикацина и тигециклина.
Пример 2. Больная Н., 58 лет. Диагноз: Вирусно-бактериальная пневмония. Сепсис. Полиорганная недостаточность. При поступлении в стационар у больной взята кровь на бактериологическое исследование и проведение исследования на антибиотикочувствительность к левофлоксацину. При добавлении в кровь левофлоксацина через 30 минут содержание пресепсина в 1-й пробирке (контроль) составило 1429 пкг/мл, а во 2-й (с добавлением левофлоксацина) – 1205 пкг/мл. В течение 1 часа после поступления в стационар начата антибактериальная терапия левофлоксацином
Пример 3. Больная Ф., 33 лет. Диагноз: Острый миелобластный лейкоз, первая атака. Нозокомиальная пневмония. Грибковый сепсис.
В связи с тяжелой пневмонией больная получала в течение предшествующих 3-х дней антибактериальную терапию моксифлоксацином. При переводе в отделение реанимации и интенсивной терапии взята кровь на бактериальный посев и исследование на антибиотикочувствительность. Учитывая длительный анамнез заболевания, заподозрено развитие грибкового сепсиса на фоне длительной антибактериальной терапии. При исследовании чувствительности к флуконазолу при добавлении его в кровь больной in vitro отсутствовало снижение содержания пресепсина. При добавлении в кровь каспофунгина содержание пресепсина снизилось с 1095 до 883 пкг/мл. В течение 1 часа после постановки диагноза грибковый сепсис начата антимикотическая терапия каспофунгином при продолжающейся терапии моксифлоксацином.
Быстрое определение содержания пресепсина в крови первой и второй пробирок с использованием диагностикума на иммунохемилюминесцентном анализаторе, и, соответственно, чувствительности бактерий и грибов к антибиотику позволяют решить задачу изобретения с достижением заявленного технического результата.
Источники информации:
1. O’Neil J. Review on Antimicrobial Resistance. Available at: https://amr-review.org/sites/default/files/160518_Final%20paper_with%20cover.pdf. Accessed on 17 August 2017
2. Review on Antimicrobial Resistance. Antimicrobial Resistance: Tackling a Crisis for the Health and Wealth of Nations. 2014
3. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания МУК 4.2.1890-04). Утверждены и введены в действие Главным государственным  врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 04.03.2004. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2004, т.6, № 4, с. 306-359
4. Стратегия и тактика применения антимикробных средств в лечебных учреждениях России. Российские национальные рекомендации / под ред. В.С. Савельева, Б.Р. Гельфанда, С.В. Яковлева. – М.: ООО «Компания БОРГЕС», 2012 г., - 92 с.. Процитирована с.75-81
5. CLSI. Performance Standarts for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standart – Tenth Edition M02-A10. – Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standarts Institute; 2009
6. CLSI: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically Approved Standart – Eighth Edition M07-A8. – Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standarts Institute; 2009
7. Международная заявка WO/2015/115926, A61K 39/40, G01N 33/577, C12Q 1/18, дата публикации 06.08.2015.
8. K. Takeda and S. Akira, “Roles of Toll-like receptors in innate immune responses,” Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms, vol. 6, no. 9, p. 733–742, 2001
9. Liu B, Chen YX, Yin Q et al, Diagnostic value and prognostic evaluation of Presepsin for sepsis in an emergency department. Crit Care. 2013 Oct 20;17(5):R244.
10. Shirakawa K, Naitou K, Hirose J, Takahashi T, Furusako S. Establishment of one-step ELISA detecting Presepsin (sCD14-ST): a new marker for sepsis. Clin Chem Lab Med. 2010 Submitted for publication.
11. Yaegashi Y, Shirakawa K, Sato N, Suzuki Y, Kojika M, Imai S, Takahashi G, Miyata M, Furusako S, Endo S. Evaluation of a newly identified soluble CD14 subtype as a marker for sepsis. J Infect Chemother. 2005 Oct; 11(5): 234-8.