Способ выявления эффективного криопротектора по цитохимическому показателю содержания лейкоцитарной щелочной фосфатазы аутокрови
METHOD FOR IDENTIFYING AN EFFECTIVE CRYOPROTECTOR BY CYTOCHEMICAL INDEX OF THE CONTENT OF LEUKOCYTE ALKALINE PHOSPHATASE OF AUTOLOGOUS BLOOD

Изобретение относится к медицине, а именно лабораторной диагностике, и может быть использовано для выявления эффективного криопротектора по цитохимическому показателю содержания лейкоцитарной щелочной фосфатазы (ЛЩФ*(* Лейкоцитарная щелочная фосфатаза - фермент, участвующий в транспорте фосфора через мембрану лейкоцитов и являющийся показателем фосфорно-кальциевого обмена. Уровень этого фермента в лейкоцитах служит доказательством патологического процесса в тканях организма при отсутствии симптомов или их смазанности.)) в аутокрови на доклиническом этапе трансфузионной терапии и предупреждения посттрансфузионных осложнений криопротекторного генеза. Для осуществления способа у пациента эксфузируют порцию свежей аутокрови, стабилизируют раствором цитрата натрия, делят на равные части, в контрольную пробу (КП) добавки криопротекторов не вносят, в опытные пробы (ОП) вносят по одной равной дозе тестируемых криопротекторов, перемешивают при плюс 37°C в течение 4 ч, капли приготовленных биологических жидкостей (ПБЖ) из ОП и КП наносят в объеме 4 мкл на предметные стекла, делают мазки, готовят препараты для выявления ЛЩФ в с/я нейтрофилах по методике азосочетания Кеплоу**(** Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е.А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.; справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В.В. Меньшикова Москва "Медицина" 1987 г.), клетки микроскопируют в проходящем свете, проводят сравнительное исследование среднего цитохимического коэффициента (СЦК) ЩФ для с/я нейтрофилов в ОП и КП; тестируемый криопротектор оценивают как эффективный для конкретного пациента и пригодным к использованию (НКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЛЩФ ОП, равных значениям СЦК ЛЩФ КП; тестируемый криопротектор оценивают как неэффективный для конкретного пациента и непригодный к использованию (НКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЛЩФ ОП, отличных от таковых СЦК КП. Способ прост и доступен врачу по клинической лабораторной диагностике. Использование способа позволяет на доклиническом этапе трансфузионной терапии определить in vitro эффективность криопротектора и его пригодность в качестве добавки в рецепты криоконсервантов для живых клеток, исключающих посттрансфузионные осложнения криопротекторного генеза.
Уровень техники.
В современной клинической медицине посттрансфузионные реакции и осложнения рассматривают как один из универсальных механизмов патогенеза различных заболеваний, характеризующихся накоплением в тканях организма избытка токсических продуктов обмена веществ или клеточного реагирования, маркерами которых служат качественные и полуколичественные характеристики определенных цитохимических ферментативных реакций в лейкоцитах крови до и после смешивания с криопротекторами. Эти процессы могут развиваться сразу после внутривенных инъекций по типу яркой многосимптомной реакции, либо по типу скрытно и медленно развивающихся симптомов посттрансфузионных осложнений (Цитохимия замороженной клетки / Обозная Э.И., Пушкарь Н.С., Маркова О.П., Панков Е.Я. - Киев: Наук. Думка, 1981. - 176 с.). Поэтому возникает проблема раннего выявления признаков вредного влияния токсичных криопротекторов на организм и предупреждения посттрансфузионных осложнений протекторного генеза.
Известные методы биологического и биохимического исследования сыворотки крови (определение концентрации молекул средней массы, продуктов перекисного окисления липидов, билирубина и т.д.) имеют ряд недостатков:
- необходимость вводить криопротектор или гемоконсервант на его основе в периферическую вену больного, то есть производить инвазивную манипуляцию, которая может быть сопряжена с техническими трудностями, осложнениями технического характера или непереносимостью субъектом лекарственного препарата;
необходимость использования лабораторных животных и специальной биохимической лаборатории, оснащенной сложным оборудованием и реактивами, что делает анализы не всегда доступными и дорогими как для лечебно-профилактических учреждений, так и для пациентов.
Эти недостатки ограничивают количество и частоту необходимых исследований.
На основании предложенных в литературе лабораторных модификаций для оценки полноценности ядерных клеток крови на этапах низкотемпературного консервирования и прогнозирования предполагаемых результатов криогемотрансфузионной терапии широко используются технологии качественной и полуколичественной оценки цитохимических показателей активаторов жизненно важных клеточных ферментов в периферической крови пациентов.
Известен метод цитохимического обнаружения ЛЩФ для оценки нормальных и патологических процессов (Цитохимия костного мозга при криоконсервировании: Атлас / Обозная Э.И., Панков Е.Я.; Отв. Ред. А.М. Белоус; АН УССР. Ин-т пробл. Криобиологии и криомедицины. - Киев: Наук. Думка, 1989. - 256 с.).
За прототип предлагаемого изобретения выбран способ, позволяющий выявить содержание ЛЩФ в высушенных мазках донорской крови (Архагов Ю.Ф. Изменение морфологии и функционально-метаболической активности лейкоцитов в процессе хранения донорской крови и под влиянием различных лучей: Автореф. дис.… канд. мед. наук. М., 2003. - 155 с.). Основным недостатком способа-прототипа является отсутствие сравнительных исследований СЦК лейкоцитов на ЛЩФ в мазках проб венозной крови, смешанных с 15% раствором гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины (15% ГМБТОЭМ), 3,3% раствором Глицерола (3,3% Гл), 10% раствором диметилсульфоксида (10% ДМСО), гемоконсервантом Тромбокриодмац (ТКД) или гемоконсервантом на основе 55% раствора диметилацетамида (ДМАЦ) с 5% раствором гидроксиэтилкрахмал (ГЭК) (55% ДМАЦ + 5% ГЭК), с таковыми значениями СЦК КП. Вместе с тем, определение эффективного криопротектора на этапе, предшествующем криогемотрансфузионной терапии, очень важен для больного, так как позволяет снизить риск посттрансфузионных осложнений криопротекторного генеза.
Целью изобретения является устранение отмеченного недостатка и создание такого способа, который бы позволял in vitro выявлять для конкретного больного эффективный криопротектор или гемоконсервант на его основе на этапе, предшествующем плановой трансфузии криоконсервированного компонента крови.
Раскрытие изобретения.
Техническим результатом изобретения является доступность, простота выявления эффективного криопротектора на доклиническом этапе криогемотрансфузионной терапии.
Технический результат в заявляемом способе выявления эффективного криопротектора по цитохимическим показателям содержания ЛЩФ аутокрови достигается тем, что, как и в способе-прототипе, анализ содержания ЛЩФ в с/я нейтрофилах осуществляют по методике азосочетания Кеплоу.
Новым в способе является то, что определение эффективного криопротектора проводят путем сравнительных исследований СЦК ОП на ЛЩФ для 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Гл, 10% ДМСО, гемоконсерванта ТКД или комбинированного гемоконсервантом на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК, со значениями СЦК КП. При этом: тестируемый криопротектор оценивают как эффективный для конкретного пациента и пригодным к использованию (ПКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЛЩФ ОП, равных значениям СЦК ЛЩФ КП; тестируемый криопротектор оценивают как неэффективный для конкретного пациента и непригодный к использованию (НКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЛЩФ ОП, отличных от таковых СЦК КП.
Необходимое оборудование:
1. Система счетверенных контейнеров с интегрированным лейкоцитарным фильтром для получения лейкофильтрованных компонентов крови Leukotrap WB с пробоотборником для лабораторных исследований,
2. Предметные стекла,
3. Пробирки для крови на 20 мл с винтовой герметичной пробкой.
4. Световой микроскоп с проходящим светом,
5. Набор тест-доз различных криопротекторов или гемоконсервантов на их основе, разрешенных к клиническому применению МЗ России,
6. Набор реагентов для цитохимического определения ЩФ в лейкоцитах. Заявляемый способ имеет основное преимущество в сравнении с прототипом -
определение эффективного криопротектора реализуют путем сравнительных исследований значений СЦК ЛЩФ ОП аутологичной крови, смешанных с тест-дозами 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Гл, ТКД, 10% ДМСО или 55% ДМАЦ + 5% ГЭК, со значениями СЦК ЛЩФ КП.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом. У обследуемого натощак, до начала внутривенных трансфузий криоконсервированных компонентов крови (криогемотрансфузионной терапии) готовят в пробирках «линейку» из тест-доз с 15% ГМБТОЭМ; 3,3% Глицерола, гемоконсервантом ТКД, 10% ДМСО или комбинированным гемоконсервантом на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК по 1,5 мл в каждой; в пробоотборник эксфузируют 25 мл аутологичной венозной крови на стабилизирующем растворе цитрата натрия и фасуют с помощью дозаторной пипетки в 6 помеченных маркером пробирок по 4,0 мл в каждую; затем в пробирку №1 вносят 0,25 мл тест-дозы 15% ГМБТОЭМ, в пробирку №2 - 0,25 мл тест-дозы 3,3% Гл, в пробирку №3 - 0,25 мл тест-дозы ТКД, в пробирку №4 - 0,25 мл 10% ДМСО, в пробирку №5 - 0,25 мл гемоконсерванта на основе 55% ДМАЦ + 5% ГЭК, в пробирку №6 с КП аутокрови криопротектор не вносят; компоненты в пробирках №№1 - 6 герметизируют пробками, перемешивают на шейкере при температуре плюс 37°С в течение 4 ч; из каждой пробирки биопробы раскапывают с помощью дозаторной пипетки на чистые предметные стекла, готовят тонкие мазки, быстро высушивают, препарат на ЛЩФ готовят по методике азосочетания Кеплоу**(**Справочник по клиническим лабораторным методам исследования под ред. Е.А. Кост. Москва "Медицина" 1975 г.; справочник "Лабораторные методы исследования в клинике" под ред. проф. В.В. Меньшикова Москва "Медицина" 1987 г.). Для выявления ЛЩФ используют комплект реагентов заводского приготовления, с/я нейтрофилы микроскопируют в проходящем свете, проводят сравнительное исследование СЦК ЛЩФ, выявленных в сегментоядерных нейтрофилах ОП и КП. О пригодности тестируемых криопротекторов к использованию в планируемых криогемотрансфузиях судят по соответствию значений СЦК ОП к величине СЦК ЛЩФ КП; тестируемый криопротектор оценивают как эффективный для конкретного пациента и пригодным к использованию (ПКИ) с лечебной целью при значениях СЦК ЩФ ОП, равных значениям СЦК ЛЩФ КП; тестируемый криопротектор оценивают как неэффективный для конкретного пациента и НКИ с лечебной целью при значениях СЦК ЩФ ОП, отличных от значений СЦК ЛЩФ КП. Способ прост и доступен врачу по клинической лабораторной диагностике современного онкогематологического центра. Использование способа позволяет выявить in vitro эффективный криопротектор на доклиническом этапе криогемотрансфузионной терапии и исключить внутривенную инфузию непригодного для конкретного больного криопротектора.
Необходимое оборудование: предметные стекла, пробирки для крови на 5 и 20 мл с винтовой герметичной пробкой, световой микроскоп с проходящим светом, набор тест-доз различных криопротекторов или гемоконсервантов на их основе, разрешенных к клиническому применению МЗ России, набор реагентов для цитохимического определения ЩФ в лейкоцитах in vitro диагностики производства РФ.
В качестве иллюстрации работоспособности заявляемого способа выявления эффективного криопротектора по цитохимическому показателю содержания ЛЩФ в аутокрови приводим 3 примера (Табл. 1), которые подтверждают практическое применение данного способа.
Пример №1. Результаты исследования крови донора П-ва показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальным является комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК (СЦК ОП с/я нейтрофилов составляет 1,28 против 1,28 в КП. Заключение: ПКИ является комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК, а НКИ являются 3,3% Глицерол, 15% ГМБТОЭМ, ТКД или 10% ДМСО, которые несут риски посттрансфузионных осложнений.
Пример №2. Результаты исследования крови донора Н-н показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальным является комбинированный криопротектор, содержащий 55% ДМАЦ + 5% ГЭК у которого СЦК ОП с/я нейтрофилов составляет 1,26, в ОП - также 1,26. Заключение: ПКИ является криопротектор на основе 55% ДМАЦ + 5% ГЭК, а НКИ являются 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Глицерол, ТКД и 10% ДМСО, которые несут риски посттрансфузионных осложнений.
Пример №3. Результаты исследования крови донора С-ва показывают, что из числа исследованных тест-доз криопротекторов оптимальным является комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК (СЦК с/я нейтрофилов в ОП составляет 1,29 против 1,29 в КП). Заключение: ПКИ является криопротектор комбинированный криопротектор на основе 55% ДМАЦ и 5% ГЭК, а НКИ являются 15% ГМБТОЭМ, 3,3% Глицерол, ТКД, 10%) ДМСО, которые несут риски посттрансфузионных осложнений.
Представленные примеры иллюстрируют применимость предлагаемого способа выявления эффективного криопротектора по содержанию щелочной фосфатазы в лейкоцитах консервированной крови. Способ дешев и может быть внедрен в практику медицинских центров, использующих трансфузии криоконсервированных компонентов крови или костного мозга.
Таким образом, благодаря использованию более чувствительного способа выявления эффективного криопротектора по содержанию ЩФ в лейкоцитах консервированной крови удается снизить риски планируемой криогемотрансфузионной терапии криопротекторного генеза.
Предлагаемое изобретение отвечает критериям «новизна» и «изобретательский уровень», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников патентной и научно-технической литературы, которые бы порочили новизну предлагаемого способа, равно как и известных способов с существенными признаками предлагаемого технического решения. Техническим результатом использования является возможность проведения индивидуального скрининга криопротекторов на доклиническом этапе их применения.