Способ определения ванкомицина В и его родственных примесей
METHOD FOR DETERMINATION OF VANCOMYCIN B AND ITS RELATED IMPURITIES

Настоящее изобретение относится к фармации, химии, медицине, биологии, а именно, к определению ванкомицина и его примесей.
Уровень техники
Ванкомицин относится к группе гликопептидов, которые, в результате уникального механизма воздействия на большинство грамположительных микроорганизмов, таких как стафилококки и стрептококки, значительно осложняют появление возможности развития резистентности. В настоящее время препараты ванкомицина широко применяются при лечении менингита, сепсиса, пневмонии, остеомиелите, бактериального эндокардита и энтероколита [1]. Для производства лекарственных средств этот гликопептидный антибиотик используется в форме соли ванкомицина гидрохлорида.
Из уровня техники известно определение основного компонента ванкомицина методом жидкостной хроматографии с применением градиентной программой рассчитанной на 40 минут, что является достаточно длительным процессом для рутинного анализа и влечет за собой больший расход дорогостоящих реагентов [2].
В одном из текущих изданий международной фармакопеи известен способ определения примесей ванкомицина с применением ультраэффективной жидкостной хроматографии (далее - УЭЖХ), мелкозернистого сорбента и градиентного режима элюирования в течение 37 минут, а с учетом возврата на исходные условия и уравновешивания хроматографической колонки - в течение 45 минут [3]. Таким образом, представленный метод УЭЖХ нуждается в оптимизации временных ресурсов.
В другом известном способе количественного определения ванкомицина В с применением ВЭЖХ время хроматографирования сократилось до 35 минут [4]. Хроматографическое разделение проводится с применением ацетонитрила, метанола и фосфатного буфера по градиентной программе. Основными недостатками данного способа являются длительная продолжительность анализа, высокие расходы органических растворителей.
Способ определения ванкомицина с использованием УЭЖХ был описан в работе [5] для мониторинга терапевтических препаратов в человеческой сыворотке. Однако представленный способ не обеспечивает приемлемого разделения для определения примесей ванкомицина в лекарственной субстанции.
В альтернативном способе [6] определения ванкомицина В элюирование ванкомицина составляет около 7 мин, где была использована подвижная фаза с высоким содержанием органических растворителей, таких как метанол-ацетонитрил-0,1% раствор фосфорной кислоты в соотношении 25:72:3 соответственно, где водная фаза элюента со значением рН 5,7. К недостаткам способа относится, то, что из-за наличия сложной структуры ванкомицина, в вышеописанных условиях могут образовываться примеси, затрудняющие количественное определение ванкомицина В.
В связи с этим технической задачей является разработка простого, эффективного, высокочувствительного способа определения ванкомицина В и его родственных примесей с применением УЭЖХ для оптимизации временных и материальных затрат при проведения испытаний с последующей оценкой разделительной способности хроматографической системы.
Описание сущности изобретения
Технической задачей является разработка эффективного, высокочувствительного способа определения ванкомицина В и его родственных примесей с применением ультраэффективной жидкостной хроматографии (далее - УЭЖХ) для оптимизации временных и материальных затрат при проведения испытаний с последующей оценкой разделительной способности хроматографической системы.
Техническим результатом заявленного технического решения является высокая чувствительность, эффективность, сокращение времени для анализа, снижение расхода дорогостоящих реагентов без потери чувствительности и эффективности хроматографического разделения родственных примесей ванкомицина.
Технический результат предлагаемого технического решения достигается за счет:
- ультраэффективной жидкостной хроматографии (далее - УЭЖХ) с использованиением в качестве стационарной фазы мелкодисперсного сорбента менее 3 мкм;
- использования подвижной фазы определенного качественного и количественного состава при ее низкой скорости;
- проведения хроматографического разделения в изократическом режиме элюирования.
Осуществление изобретения
Сокращение времени анализа в ходе разработки и при мониторинге содержания основных компонентов и их примесей в лекарственных препаратах - является наиболее востребованным критерием при совершенствовании аналитических методик. В связи с тем, что ультраэффективная жидкостная хроматография (далее - УЭЖХ) зарекомендовала себя как наиболее быстрый и эффективный способ определения действующих веществ, специалисты все чаще прибегают к использованию УЭЖХ для эффективного и скоростного проведения анализа соединений химического и биологического происхождения.
В качестве объекта исследований использовали ванкомицин гидрохлорид (Ванкомицин В) в форме порошка и лиофилизата для приготовления раствора для инъекций и приема внутрь с действующим сроком годности.
Ванкомицин В для приготовления испытуемого раствора, может быть использован в форме порошка или лиофилизата ванкомицина гидрохлорида.
Проведение пробоподготовки заключается в изготовлении испытуемого водного раствора с концентрацией ванкомицина 0,2%, фильтрации полученного раствора через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и переносе раствора в хроматографические виалы с дальнейшим помещением в автоматический пробоотборник хроматографа.
Для наилучшего разделения была использована двухкомпонентная подвижная фаза в виде композиции, представляющая собой две фазы смешанные в эффективном соотношении 75:25, где фаза А (компонент А) в виде композиции, состоящей из буферного раствора и тетрагидрофурана в объемном количественном соотношении 99:1; и где фаза Б (компонент Б), в виде композиции, состоящей из буферного раствора, ацетонитрила и тетрагидрофурана в объемном количественном соотношении 70:1:29.
Буферный раствор представляет собой раствор триэтиламина в очищенной воде, в эффективном объемном соотношении 1: 500 соответственно, со значением рН 3,2, доведенным с помощью концентрированной фосфорной кислоты.
Ванкомицин В представляет собой активный компонент трициклического гликопептидного антибиотика ванкомицина, продуцируемого ферментацией штамма Amycolatopsis orientalis. Для производства лекарственных средств ванкомицин используется в форме соли ванкомицина гидрохлорида.
Ванкомицин обладает структурой
с наличием различных функциональных групп, таких как карбокси-, гидрокси-, амино-, амидные, которые ответственны за ионизацию ванкомицина при различных значения рН. Таким образом, значение рН буферного раствора, может оказывать значительное влияние на устойчивость ванкомицина.
Значение рН буферного раствора и растворителя в диапазоне 2,5-5,5 обеспечивает наиболее эффективное разделение ванкомицина и его примесей, а значение рН буфера более 5,5 приводит к быстрому разложению ванкомицина гидрохлорида, что может привести к искажению результатов анализа.
Вышеописанный эффект вызван наличием различных функциональных групп ванкомицина гидрохлорида, которые обуславливают возможные процессы деградации ванкомицина, а именно: дезамидирования, гидролиза, эпимеризации. При переходе рН подвижной фазы от 2 до 5,5 увеличиваются времена удерживания пиков примесей ванкомицина за счет образования водородных связей и гидрофобных взаимодействий между гидроксильными и амидными группами ванкомицина В и его примесей. Буферный раствор со значением рН 3,2 может обеспечивать оптимальные условия для стабильности ванкомицина и разделения его примесей за наиболее короткое время хроматографирования.
Испытания проводили на жидкостном хроматографе, позволяющем работать в режиме ультраэффективной жидкостной хроматографии (далее - УЭЖХ) и оборудованном следующими модулями: градиентным четырехканальным насосом, обладающим возможностью производить смешение четырех различных элюентов с максимальной скоростью потока 5 мл/мин (максимальное давление 1200 бар), диодно-матричным детектором (с диапазоном длин волн 190-640 нм), термостатируемым колоночным отделением. Отличительной чертой УЭЖХ является использование сорбентов с размером частиц от 1,5 до 3 мкм, а также низкой скорости подвижной фазы и небольшой объем ввода пробы. Благодаря особенностям УЭЖХ позволяет значительно уменьшить время анализа и повысить эффективность хроматографического разделения.
В ходе исследований было выявлено, что колонки с размером частиц сорбента 1,8 мкм и 2.6 мкм демонстрируют наилучшее значение эффективности из ряда альтернативных хроматографических колонок классификации USP (L1) при определении ванкомицина и его примесей. Выбранные колонки Kinetex С18 (2.6 мкм, 4.6×50 мм), Nucleodur С18 isis (1.8 мкм, 4.6×50 мм), содержащие частицы небольшого размера 1,8 мкл и 2.6 мкм, что обеспечивает наилучшее разделение примесей ванкомицина, а равномерное распределение частиц по размеру обуславливает меньшее противодавление колонок, что позволяет использовать их в системе ультраэффективной хроматографии.
Изократическая хроматография значительно упрощает анализ, а также исключает дополнительные временные затраты, необходимые для перехода к стартовому составу компонентов подвижной фазы и уравновешиванию сорбента после разделения. Изократический режим хроматографирования характеризуется постоянным составом подвижной фазы в процессе всего анализа, что наилучшим образом влияет на воспроизводимость заявленного способа.
При разработке заявленного способа с использованием ультраэффективной хроматографии был выбран изократический режим элюирования ванкомицина, который обуславливает техническую простоту исполнения и высокую воспроизводимость заявленного способа.
Условия хроматографирования:
Объем вводимой пробы: 2 мкл.
Скорость потока двух компонентной подвижной фазы: от 0,35 мл/мин до 0,5 мл/мин, в зависимости от геометрии и размера частиц сорбента колонок.
Температура колонки: 20°C
Длина волны детектора: 280 нм
Краткое описание чертежей и иных материалов (Приложения 1-9)
Фиг. 1. Хроматограмма испытуемого раствора, приготовленного из лиофилизата ванкомицина гидрохлорида, полученная способом определения ванкомицина и его родственных примесей на колонке Kinetex С18.
Фиг. 2. Хроматограмма испытуемого раствора, приготовленного из порошка ванкомицина гидрохлорида, полученная способом определения ванкомицина и его родственных примесей на колонке Kinetex С18.
Фиг. 3. Хроматограмма испытуемого раствора, приготовленного из порошка ванкомицина гидрохлорида, полученная способом определения ванкомицина и его родственных примесей с применением колонки Nucleodur С18.
Фиг. 4. Хроматограмма раствора для проверки пригодности, полученная способом определения ванкомицина и его родственных примесей с применением колонки Kinetex С18.
Фиг. 5. Хроматограмма раствора для проверки пригодности, полученная способом определения ванкомицина и его родственных примесей с применением колонки Nucleodur С18.
Фиг. 6. Хроматограмма раствора для проверки пригодности, полученная способом определения ванкомицина и его родственных примесей с применением колонки Zorbax Eclipse Plus С18.
Фиг. 7. Зависимость площади пика (S) ванкомицина В от концентрации (С).
Фиг. 8. Хроматограмма раствора для проверки пригодности, полученная с применением ВЭЖХ.
Фиг. 9. Хроматограмма испытуемого раствора, приготовленного из лиофилизата ванкомицина гидрохлорида, полученная с применением ВЭЖХ.
Высокоэффективная жидкостная хроматография (далее - ВЭЖХ).
Возможность осуществления заявленного способа раскрыта в следующих примерах.
Пример 1. Для определения ванкомицина В и его родственных примесей в лиофилизате готовят испытуемый раствор, содержащий препарат ванкомицина в виде лиофилизата.
Для приготовления испытуемого раствора берут 40 мг содержимого флакона лиофилизата ванкомицина и помещают в мерную колбу вместимостью 20 мл, растворяют в очищенной воде. Затем доводят объем раствора до метки тем же растворителем, перемешивают и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Полученный раствор переносят в хроматографические виалы, где концентрация раствора составляет 0,2% и помещают их в автоматический пробоотборник хроматографа.
Приготовление буферного раствора с рН 3.2 осуществляют следующим образом: 2 мл триэтиламина помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, прибавляют 950 мл воды, доводят рН раствора до значения 3.2 с помощью концентрированной фосфорной кислоты, доводят объем раствора до метки водой и перемешивают.
Для приготовления компонента А подвижной фазы смешивают буферный раствор с рН 3.2 и тетрагидрофуран в объемном соотношении 99:1 и дегазируют любым способом известным специалисту из данной области техники.
Для приготовления компонента Б подвижной фазы смешивают буферный раствор с рН 3.2, тетрагидрофуран и ацетонитрил в объемном соотношении 70:1:29 и дегазируют любым способом известным специалисту из данной области техники.
Для получения подвижной фазы смешивают компонент А и компонент Б в соотношении 75:25.
Хроматографические условия:
Колонка: Kinetex С18, 50×4.6 мм, 2.6 мкм
Объем вводимой пробы: 2 мкл;
Скорость потока подвижной фазы: 0,5 мл/мин;
Температура колонки: 20°C;
Температура автосамплера: 5°C;
Детектор: Ультрафиолетовый детектор с длиной волны 280 нм.
Хроматографируют по 2 мкл растворы в следующей последовательности: растворитель в виде очищенной воды, раствор подвижной фазы, испытуемый раствор. На Фиг. 1 представлена типичная хроматограмма испытуемого раствора.
Содержание ванкомицина В по данным фармакопейных статей должно составлять не менее 80,0-91,0%, а суммарное количество примесей - не более 9,0%.
i
i
i
Содержание ванкомицина В, единичных примесей, а также суммы всех примесей рассчитывают методом внутренней нормализации, который характеризуется тем, что процентное содержание ванкомицина В, либо содержание единичной примеси (X) в испытуемом образце рассчитывают путем определения площади пика ванкомицина В, либо площади единичной примеси (S) как часть от общей площади всех присутствующих на хроматограмме пиков (ΣS) за исключением пиков, соответствующих растворителю и подвижной фазе. Таким образом, при расчете процентного содержания ванкомицина В используют следующую формулу:
Данным примером подтверждено, что заявленный технический результат в заявленном способе достигается. Рассчитанное методом внутренней нормализации процентное содержание ванкомицина В и суммарное содержание его примесей составляет 92,1% и 7,9% соответственно, что удовлетворяет требованиям фармакопейных документов.
Пример 2. Определение ванкомицина В и его родственных примесей в порошке ванкомицина гидрохлорида проводят способом, описанным в примере 1.
Данным примером подтверждено, что заявленный технический результат в заявленном способе достигается. Рассчитанное методом внутренней нормализации процентное содержание ванкомицина В и суммарное содержание всех примесей составляет 93,85% и 6,15% соответственно, что удовлетворяет требованиям фармакопейных документов.
Времена удерживания пика ванкомицина В на типичной хроматограмме испытуемого раствора ванкомицина гидрохлорида в форме лиофилизата (Фиг. 1) и в форме порошка (Фиг. 2) совпадают (табл. 1).
Приведенный пример демонстрирует сопоставимость результатов, что подтверждает возможность реализации заявленного способа для определения ванкомицина В и его родственных примесей в различных лекарственных формах ванкомицина гидрохлорида.
Пример 3. Определение ванкомицина В и его родственных примесей в порошке ванкомицина гидрохлорида проводят способом, описанным в примере 1, с использованием колонки Nucleodur С18 isis (4.6×50 мм) с размером частиц сорбента 1,8 мкм при скорости потока подвижной фазы 0,35 мл/мин (Фиг. 3).
Данным примером подтверждено, что заявленный технический результат в заявленном способе достигается. Рассчитанное методом внутренней нормализации процентное содержание ванкомицина В и суммарное содержание всех примесей составляет 93,56% и 6,44% соответственно, что удовлетворяет требованиям фармакопейных документов и совпадает с данными, полученными на колонке с размером частиц 2,6 мкм (табл. 2).
Приведенные примеры продемонстрировали сопоставимость полученных результатов, что подтверждает возможность реализации заявленного способа для определения ванкомицина В и его родственных примесей с использованием хроматографических колонок с различным размером частиц сорбента.
Пример 4. Возможность использования колонок с наилучшим размером частиц сорбента в заявленном способе определения ванкомицина и его суммарных примесей УЭЖХ, подтверждена в результате анализа нескольких сорбентов, что дает возможность использования различных хроматографических колонок с учетом их геометрии и изменения скорости элюента.
Для проверки разрешающей способности заявленного способа в качестве объекта исследований использовали раствор ванкомицина и его продуктов деградации для проверки пригодности хроматографической системы, для приготовления которого был взят стандартный образец ванкомицина гидрохлорида квалификации USP RS с валидной на момент проведения испытаний серией.
При приготовлении раствора ванкомицина и его продуктов деструкции для проверки пригодности хроматографической системы (далее - РППХС), используют стандартный образец ванкомицина гидрохлорида, который растворяют в очищенной воде для получения раствора с концентрацией 0,5 мг/мл. Полученный раствор выдерживают в сушильном шкафу при температуре 65°C в течение 48 часов. Разложенный раствор ванкомицина фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и переносят в хроматографические виалы с дальнейшим помещением в автоматический пробоотборник хроматографа.
В ходе исследования был выбран ряд хроматографических колонок, позволяющих проводить анализ методом УЭЖХ, а именно: Kinetex С18 (2.6 мкм, 4.6×50 мм), Nucleodur С18 isis, (1.8 мкм, 4.6×50 мм), Zorbax RRHD Eclipse Plus CI8 (1.8 мкм, 2.1×50 мм). В результате испытаний было обнаружено, что профиль всех хроматограмм достаточно близок друг к другу, а пики примесей хорошо разделены и симметричны (Фиг. 4-6).
По фармакопейной статье, хроматографические условия считаются пригодными, если на хроматограмме РППХС разрешение между пиком ванкомицина В и пиком его ближайшей примеси составляет не менее 1,5, а фактор асимметрии пика ванкомицина находится в пределах 0,8-1,5.
Хроматографические параметры рассмотренных колонок Kinetex С18 (2.6 мкм, 4.6×50 мм) и Nucleodur С18 isis (1,8 мкм, 4.6×50 мм), обладают наилучшей разрешающей способностью в приведенных условиях (табл. 3) и могут быть рекомендованы для проведения анализа методом УЭЖХ ванкомицина и его примесей.
Пример 5. Линейность способа в аналитической области подтверждается линейной зависимостью площади пика исследуемого вещества от его концентрации в растворе (Фиг. 7). В разработанном способе, аналитическая область содержания примесей ванкомицина соответствует диапазону значений их концентраций 0,0001%-0,02%. Исследование проводилось на примере ванкомицина В в концентрациях, характерных для примесей в испытуемом растворе.
Полученные данные обрабатывали методом наименьших квадратов, который заключается в нахождении коэффициентов а, b и коэффициента корреляции r линейной модели:
Y=b*х+а,
где коэффициент х - обозначает концентрацию ванкомицина В, у - площадь пика ванкомицина В, b - угловой коэффициент модели, а - свободный член.
В результате расчетов коэффициент корреляции составил величину 0,999, что доказывает линейность заявленной методики по фармакопейной статье.
Пример 6. Заявленный способ определения ванкомицина и его родственных примесей сравнивали с методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ).
Условия хроматографирования способом ВЭЖХ:
Хроматографическая колонка: LiChrospher RP-18 (5 мкм, 4.6×250 мм)
Объем вводимой пробы: 20 мкл.
Скорость потока подвижной фазы: 2 мл/мин.
Длина волны детектора: 280 нм
Подвижная фаза А: смесь буферного раствора, тетрагидрофурана и ацетонитрила в объемном соотношении 92:1:7.
Подвижная фаза В: смесь буферного раствора, тетрагидрофурана и ацетонитрила в объемном соотношении 70:1:29.
Элюирование проводилось по градиентной программе, приведенной в таблице 4.
Для сравнения способов определения родственных примесей ванкомицина было проведено хроматографирование РПХХС по заявленному способу УЭЖХ (Фиг. 4) и по способу с применением ВЭЖХ (Фиг. 8). В качестве критериев приемлемости исследуемых методик были выбраны следующие параметры:
- фактор асимметрии пика ванкомицина В;
- эффективность хроматографической колонки, рассчитанной по пику ванкомицина В и измеряемая числом теоретических тарелок (ч.т.т.);
- разрешение между пиком ванкомицина В и ближайшем к нему пиком примеси.
Результаты хроматографирования предложенным методом ультраэффективной хроматографии сопоставимы с результатами, полученными при использовании обычной ВЭЖХ (табл. 5).
При использовании предлагаемого способа определения примесей ванкомицина время анализа сокращается в три раза по сравнению с альтернативной методикой. Таким образом, время, необходимое для анализа примесей ванкомицина в заданных условиях составило 10 минут.
Благодаря более низкой скорости подвижной фазы разработанный способ требует меньшего расхода элюента, а переход к изократическому режиму элюирования упрощает проведение анализа. Предложенные условия хроматографирования с использованием метода УЭЖХ позволяют оценить возможное содержание родственных примесей в лекарственном средстве ванкомицина, что подтверждается соответствием критериев приемлемости (таб. 5) при тестировании хроматографической системы с известной методикой ВЭЖХ.
Пример 7. Для подтверждения возможности промышленного применения предлагаемого изобретения была доказана его правильность путем сравнения полученных результатов с методикой ВЭЖХ (табл.6), ранее прошедшей процесс валидации. Для оценки пригодности разработанной методики при определении Ванкомицина В и родственных примесей анализировали 2 мг/мл водный раствор лекарственного препарата в форме лиофилизата. На Фиг. 9 представлена типичная хроматограмма испытуемого раствора с применение ВЭЖХ.
Содержание Ванкомицина В, максимальной единичной примеси и суммы всех примесей рассчитывали методом внутренней нормализации. В качестве критерия приемлемости при определении примесей ванкомицина дополнительно рассчитывали среднее стандартное отклонение (RSD) площади и времени удерживания пика ванкомицина В.
При использовании заявленного способа с применением УЭЖХ значение суммы примесей больше, чем по методу обычной хроматографии, что свидетельствует о более высокой чувствительность разработанной методики. Все полученные результаты при использовании заявленного способа определения ванкомицина В и его родственных примесей не только сопоставимы с результатами известных способов, но и демонстрируют то, что заявленный способ является более эффективным и чувствительным.
Представленные примеры не ограничивают объем притязаний настоящего изобретения и служат только для цели иллюстрации и раскрытия заявленного способа.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры, подтверждают эффективное разделение ванкомицина и его родственных примесей, чувствительность заявленного способа при сокращении времени проведения анализа.
Таким образом, поставленная техническая задача, а именно, разработка эффективного и чувствительного способа для определения ванкомицина и его родственных примесей в различных лекарственных формах достигнута, что подтверждается приведенными примерами.
Применение в фармации, химии, медицине, биологии заявленного способа является эффективным.
Список литературы:
[1] - Mara Lambert. IDSA Guidelines on the Treatment of MRSA Infections in Adults and Children. American Family Physician. 2011. 84
[2] - British Pharmacopoeia (BP). Monographs: Medicinal and Pharmaceutical Substances. 2009
[3] - European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) 10.5th Edition
[4] - The United States Pharmacopeia National Formulary (USP) 2020 USP 43 - NF 38.
[5] - Yu. Cao; J. Yu; Yu. Chen; J. Zhang; X. Wu; Y. Zhang; G. Li. Development and Validation of a New Ultra-Performance Liquid Chromatographic Method for Vancomycin Assay in Serum and Its Application to Therapeutic Drug Monitoring. Therapeutic Drug Monitoring, 2014. 36(2). 175-181.
[6] - K. Nirmala, R.R. Raju. Determination of vancomycin by using RP-HPLC method in pharmaceutical preparations. Int. J. Res. Ayurveda Pharm. 2013. 4(1).16-119.