Влияние биназы на форболмиристатацетатиндуцированный апоптоз в гранулоцитах и моноцитах венозной крови человека

Влияние биназы на форболмиристатацетат-индуцированный апоптоз в гранулоцитах и моноцитах венозной крови человека

В.А. Миронов 1, Ф.В. Ширшиков 1, Н.В. Калачева 1, Г.В. Черепнев 2

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань

2 Казанская государственная медицинская академия, Казань

Effect of binase on phorbol myristate acetate-induced apoptosis of human peripheral blood granulocytes and monocytes

V.A. Mironov1, F.V. Shirshikov1, N.V. Kalacheva 1, G.V. Cherepnev2

1 Kazan (Volga region) State University, Kazan

2 Kazan State Medical Academy, Kazan

Изучено влияние нетоксичной (40 мкг/мл) и токсичной (400 мкг/мл) концентраций биназы (РНКазы Bacillus intermedius) на развитие форбол-миристатацетат(ФМА)-индуцированного апоптоза в гранулоцитах и моноцитах крови человека in vitro методом лазерной проточной цитофлуори-метрии. Конечный эффект биназы зависит от субпопуля-ционной принадлежности клеток-мишеней и концентрации препарата. B гранулоцитах биназа в концентрации 400 мкг/ мл выраженно активирует ФМА-индуцированный апоптоз. В моноцитах в концентрации 40 мкг/мл биназа проявляет протекторный эффект, увеличивая долю жизнеспособных клеток и замедляя переход клеток из фазы раннего в фазу позднего ФМА-индуцированного апоптоза.

Ключевые слова: биназа, гранулоциты, моноциты, форболмиристат-ацетат, апоптоз, проточная цитометрия.

Effect of binase (RNAse of Bacillus intermedius) on phorbol myristate acetate-(PMA)-induced apoptosis of human peripheral blood granulocytes and monocytes was studied in vitro by flow cytometry. Both toxic (400ug/ml) and nontoxic (40 ug/ml) binase concentrations were tested. The binase end-point effect was dependent on the target cell population and the binase concentration. In a granulocyte subset, the 400 ug/ml concentration resulted in strongly pronounced stimulation of PMA-induced apoptosis. In a monocyte subset, the 40 ug/ml concentration developed a protective effect as judged by an increase in a percantage of viable cell subset and by slowing-down cells transtion from an early to late PMA-induced apoptotic phase.

Key words: binase, granulocytes, monocytes, phorbol myristate acetate, apoptosis, flow cytometry.

В течение последнего десятилетия общая фармакология апоптоза становится областью пристального внимания, а понимание возможностей медикаментозного контроля апоптоза приобретает растущее значение для фармацевтической промышленности [1].

Восстановление чувствительности клеток к индукции апоптоза имеет терапевтическое значение при неоплазиях, лимфопролиферации и аутоиммунных болезнях. Напротив, если ведущим компонентом патологического процесса является клеточная гибель (ишемия тканей, нейродегенерация, депрессия гемо-поэза, ВИЧ-инфекция, ожоговая болезнь и др.), то патогенетически обосновано подавление апоптоза. Учитывая социальное значение апоптоз-зависимых заболеваний, фармакологи и клиницисты считают приоритетным поиск соединений с направленным воздействием на программированную клеточную гибель [2, 3].

Объект настоящего исследования — РНКаза Bacillus intermedius (биназа), которая обладает целым рядом биологических эффектов, в том числе, способностью избирательно подавлять рост некоторых линий онкотрансформированных клеток, переводя их на путь апоптоза [4]. Кроме того, нами показано, что биназа в зависимости от концентрации избирательно модулирует пероксид-индуцированый апоптоз в моноцитах крови человека [5]. В продолжение этих исследований мы изучили влияние биназы на развитие форболмиристатацетат-индуцированного апоптоза в моноцитах и гранулоцитах крови человека.

e-mail: : rizvanov@gmail.com

Материал и методы

РНКаза Bacillus intermedius (биназа) — катионный белок с молекулярной массой 12,3 кДа, изоэлектри-ческой точкой pI 8,9 и максимальной каталитической активностью при рН 8,5. В работе использовали гомогенный препарат РНКазы, полученный по методу [6].

Апоптоз моноцитов и гранулоцитов крови человека исследовали методом лазерной проточной цитометрии с помощью флуорохромов — мероциа-нина 540 (МС-540) (Sigma) и TO-PRO-3 дийодида (Invitrogen). Индуктором апоптоза служил форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА).

Выделение суспензии лейкоцитов венозной крови. Лейкоциты выделяли из венозной крови здоровых доноров добровольцев, от которых было получено информированное согласие. Протокол исследования одобрен этическим комитетом ГАУЗ РКБ-2 МЗ РТ. Гепаринизированную венозную кровь отстаивали в течение 30 мин при 37°С, отбирали слой сыворотки с лейкоцитами и отмывали клетки центрифугированием (200 g, 10 мин). Полученный осадок лейкоцитов ресуспензировали в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) до конечной концентрации 106 клеток/мл и раскапывали по 250 мкл в пробирки для проточной цитометрии (Falcon 352054, BD).

Подготовка клеточных проб для анализа ФМА-индуцированного апоптоза. В опытные пробы вносили раствор биназы в фосфатно-солевом буфере (конечная концентрация 400 и 40 мкг/мл), инкубировали 30 мин и добавляли ФМА (конечная

концентрация 10-7 М). В контрольные пробы вместо биназы и ФМА вносили фосфатно-солевой буфер в эквивалентном объеме. Клетки инкубировали 3 ч в СО2-инкубаторе при 37°C и 100% влажности. После инкубации клетки дважды промывали в фосфатносолевом буфере центрифугированием при 250 g в течение 5 минут, ресуспензировали в 500 мкл буфера и вносили флуорохромы МС540 и TO-PRO-3 дийодид. Пробы инкубировали 10 минут в атмосфере 5% СО2 при 37°C и анализировали на проточном цитофлуориметре.

Определение экспрессии фосфатидилсерина и проницаемости цитоплазматической мембраны методом проточной цитометрии. Цитометрический анализ субпопуляций лейкоцитов проводили на проточном лазерном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickinson, USA), оснащенном двумя лазерами с длиной волны 488 нм и 635 нм. Экспрессию фосфатидилсерина (ФС) и проницаемость плазматической мембраны на уровне отдельной клетки оценивали по модифицированному протоколу [7]. В суспензию, содержащую 106 клеток/мл, за 10 мин перед цито-метрическим анализом вносили ФС-связывающий флуорохром МС-540 в конечной концентрации 0,2 мкг/мл. Для оценки проницаемости плазматической мембраны в клеточную суспензию одновременно с MC-540 вносили TO-PRO-3-йодид в конечной концентрации 0,2 мкМ. МС540 связывается с остатками фосфатидилсерина, экспонированного на мембране апоптозных клеток. ДНК-тропный флуорохром TO-PRO-3 через поврежденную цитоплазматическую мембрану проникает внутрь клетки и окрашивает ДНК. Моноцитарную и гранулоцитарную субпопуляции выделяли по показателям прямого (FSC, диаметр клетки) и бокового (SSC, гранулярность клетки) светорассеяния. После исключения дебри-са и выделения моноцитарного и гранулоцитарного гейтов, определяли долю: 1) интактных клеток [фенотип MC540(-)TO-PRO-3(-)]; 2) клеток на ранней стадии апоптоза [фенотип MC540( + )TO-PRO-3(-)]; 3) клеток на поздней стадии апоптоза [фенотип MC540( + )TO-PRO-3( + )]; 4) некротических клеток [фенотип MC540(-)TO-PRO-3( + )].

Статистический анализ. На каждый вариант опыта просчитывали не менее 25000 клеточных событий. Измерения проводили в программе CellQuest Pro (BD Biosciences), статистический анализ полученных результатов выполняли по критерию Колмогорова-Смирнова и критерию х2 с коррекцией Yates в пакете прикладных программ STATISTICA 6.0.

Результаты

Форболовые эфиры, в их числе и ФМА, являются модуляторами активности протеинкиназы С (ПКС), которая регулирует пролиферацию, дифференциров-ку и апоптоз ряда клеток [8]. В связи с этим мы исследовали влияние биназы на ФМА-индуцированный апоптоз в моноцитах и гранулоцитах периферической крови человека. Согласно схеме, принятой нами ранее, эксперименты проводились с двумя концентрациями биназы: 40 мкг/мл (Bi-40) — нетоксичная и 400 мкг/мл (Bi-400) — токсичная [9].

При действии биназы в концентрации 40 мкг/ мл распределение моноцитов по стадиям апоптоза не отличается от контрольного (рис. 1Б, В). В концентрации 400 мкг/мл биназа стимулирует апоптоз, не меняя существенно соотношение между ранним

и поздним апоптозом по сравнению с контролем (рис. 1В). ФМА индуцирует апоптоз моноцитов (рис. 1А, Б, В). В концентрации 40 мкг/мл биназа тормозит переход клеток из фазы раннего в фазу позднего ФМА-индуцированного апоптоза, вызывая двукратное увеличение доли клеток в раннем апоптозе по сравнению с ФМА (13,2% против 6,4%, Р < 0,01) и 1,5-кратное уменьшение доли клеток в стадии позднего апоптоза (21,3% против 31,9%, р < 0,01). Доля жизнеспособных клеток для варианта ФМА + Вн40 также увеличивается. Суммарный (ранняя + поздняя стадия) ФМА-индуцированный апоптоз больше, чем (ФМА + Вн40)-индуцированный апоптоз. Биназа в токсичной концентрации (400 мкг/мл) усиливает ФМА-индуцированный апоптоз в моноцитарной фракции лейкоцитов (рис. 1Б, В). Однако это усиление скорее всего является результатом простого суммирования двух апоптогенных эффектов, обусловленных независимым действием биназы и ФМА. Поэтому, логично говорить об аддитивном влиянии биназы в концентрации 400 мкг/мл на ФМА-индуцированный апоптоз в моноцитах.

Рис. 1. Влияние биназы на ФМА-индуцированный апоптоз в моноцитах.

* - р < 0,01 по сравнению с контролем;

** - р < 0,01 по сравнению с ФMA

Рис. 2. Влияние биназы на ФМА-индуцированный апоптоз в гранулоцитах.

* - р < 0,01 по сравнению с контролем;

** - р < 0,01 по сравнению с ФMA

В гранулоцитах Вн40 и Вн400 не модифицируют структуру стадийного распределения клеток при спонтанном апоптозе (рис. 2). ФМА увеличивает долю клеток в фазе позднего апоптоза по сравнению с контролем (6,4% против 3,4%). Вн40 умеренно стимулирует апоптогенный эффект ФМА, преимущественно на ранней стадии апоптоза (рис. 2Б). Комбинация Вн400 + ФМА вызывает драматическое увеличение клеток в фазе позднего апоптоза (рис. 2В), а доля интактных клеток выраженно сокращается (6,2% против 92,6%, Р < 0,01). При раздельном действии на гранулоциты биназа и ФМА незначительно повышают количество апоптотиче-ских клеток, а их совместное действие намного превышает эффект от простого суммирования изолированного влияния каждого в отдельности, т.е. имеет место синергизм действия Вн400 и ФМА.

Результаты влияния биназы на ФМА-индуцированный апоптоз моноцитов и гранулоцитов обобщены в схеме на рис. 3.

Обсуждение

Рибонуклеазы, как важнейшие ферменты, участники клеточного метаболизма, являются традиционными объектами исследования молекулярной

биологии. Вместе с тем, в мире широко изучаются биологические эффекты экзогенных рибонуклеаз, которые не перестают удивлять своим многообразием и неоднозначностью проявления. На сегодняшний день известен целый ряд эффектов этих ферментов (противовирусный, противоопухолевый, апоптоген-ный, иммуносупрессорный и другие) [4, 10, 11], в связи с чем рибонуклеазы привлекают к себе внимание исследователей как потенциальные терапевтические препараты нового поколения. Молекулярные механизмы многих из перечисленных эффектов до конца не ясны и интенсивно исследуются. Однако уже сейчас очевидно, что действие рибонуклеаз на клетки избирательно и индивидуально, и зависит как от типа клетки-мишени, так и от используемого фермента.

Результаты, полученные в настоящей работе, не являются исключением. Они показали, что биназа различным образом действует на ФМА-индуцированный апоптоз моноцитов и гранулоцитов. Конечный эффект биназы зависит от субпопуляци-онной принадлежности клеток-мишеней и концентрации фермента (рис. 3).

Биназа в концентрации 400 мкг/мл выраженно активирует ФМА-индуцированный апоптоз грану-лоцитов, проявляя синергизм действия с ФМА. Поскольку проапоптогенное действие ФМА реализуется через активацию ПКС, то биназа может представлять интерес в качестве позитивного модификатора ПКС-опосредованного апоптогенного эффекта.

В моноцитах биназа в концентрации 40 мкг/мл проявляет протекторное и апоптоз-модулирующее действие в отношении развития ФМА-инду-цированного апоптоза. Эти эффекты биназы (протекторный и апоптоз-модулирующий) отмечались нами и ранее. При изучении влияния биназы на апоптоз субпопуляций лейкоцитов крови человека нами было установлено, что биназа избирательно активирует апоптоз моноцитов крови человека и не влияет на программированную клеточную гибель лимфоцитов и гранулоцитов. В условиях окислительного стресса Вн40 увеличивает субпопуляцию жизнеспособных моноцитов и меняет динамику пероксид-индуцированного апоптоза, повышая долю моноцитов в стадии раннего апоптоза [9]. Таким образом, оба эффекта биназы наблюдаются в моноцитах независимо от индуктора апоптоза. Более того, аналогичные результаты нами были получены и с перитонеальными макрофагами крысы [12]. В этой работе показано, что в условиях индуцированного окислительного стресса биназа защищает от некроза перитонеальные макрофаги, смещая клеточный ответ в сторону апоптоза. Сходство обнаруженных эффектов у моноцитов и макрофагов и их независимость от индуктора апоптоза позволяют предположить, что, вероятнее всего, эти эффекты обусловлены особенностями взаимодействия бина-зы с мембраной моноцита [12].

Полученные результаты в очередной раз демонстрируют избирательность действия биназы в отношении клеток-мишеней и обосновывают апоптоз-модифицирующий потенциал биназы в фагоцитах человека. Исследование механизмов избирательности действия и апоптоз-модулирующего эффекта биназы заслуживает продолжения.

Рис. 3. Обобщенная схема апоптоз-модулирующих эффектов биназы в гранулоцитах и моноцитах человека in vitro

Благодарности

Авторы выражают благодарность администрации ГАУЗ РКБ-2 МЗ РТ за возможность выполнения экспериментальных исследований.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Kinloch R.A., Theherne J.M., Furness L.M. The pharmacology of apoptosis. Trends in Pharmacological Sciences 1999; 20: 35—42.

2. Cameron R.G., Feuer G. Apoptosis and its modulation by Drugs. Heidelberg: Spinger-Verlag; 2000.

3. Chandrashekhar Y., Sen S. Gene therapy and pharmaceutical modulation of apoptosis. Cardiol. Clin. 2001; 19: 173—90.

4. Makarov A.A., Kolchinsky A., Ilinskaya O.N. Binase and other microbial RNases as potential anticancer agents. BioEssays 2008; 30(8): 781-90.

5. Миронов В.А., Ширшиков Ф.В., Калачева Н.В и др. Избирательное действие биназы на апоптоз субпопуляций лейкоцитов крови человека. Фундаментальные исследования 2012; 9(1): 53-9.

6. Голубенко И. А., Балабан Н.П., Лещинская И.Б. Рибонуклеаза Bacillus intermedius7P. Очистка хроматографией на фосфоцеллю-лозе и некоторые характеристики гомогенного фермента. Биохимия 1979; 44: 640-8.

7. Mower D.A., Peckhman D.W. Decreased membrane phospholipid packing and decreased cell size preceede DNA cleavage in mature B cell apoptosis. J.Immunol. 1994; 152: 4832-48.

8. Mussashi М., Ota S, Shiroshita N. The role of protein kinase C isoforms in cell proliferation and apoptosis. J.Hematol. 2000; 72(1): 12-9.

9. Миронов В.А., Ширшиков Ф.В., Калачева Н.В и др. Избирательное действие биназы на апоптоз субпопуляций лейкоцитов крови человека. Фундаментальные исследования 2012; 9(1): 53-9.

10. Fang E.F., Ng T.B. Ribonucleases of different origins with a wide spectrum of medicinal applications. Biochim. Biophys. Acta . 2011; 1815(1): 65-74.

11. Шкляева О.А., Миронова Н.Л., Малкова Е.М. и др. Онко-супрессивное действие РНКазы А и ДНКазы I. Докл. РАН. 2008; 420(1): 134-8.

12. Миронов В.А., Филиппов А.В., Ширшиков Ф.В. и др. Влияние биназы на некроз и апоптоз макрофагов в модели оксидативно-го стресса. Ученые записки Казанского Университета. В печати.

Поступила 27.08.2012