СПОСОБ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОГО ОТБОРА МИКРОБНЫХ АНТАГОНИСТОВ ПРОТИВ ПАТОГЕНОВ
METHOD OF HIGHLY EFFICIENT SELECTION OF MICROBIAL ANTAGONIZERS AGAINST PATHOGENS

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее раскрытие относится к высокоэффективным способам скрининга биологических образцов. Более конкретно, данное раскрытие относится к одновременной идентификации микроорганизмов, обладающих биоконтролирующей активностью, включая микроорганизмы, пригодные для улучшения здоровья растений, животных и человека, в частности те, которые обладают антагонистической активностью против патогенов растений.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Инфекции патогенами, такие, как грибковые инфекции растений и животных, вызывают значительные потери продуктивной способности по всему миру. Например, среди наиболее важных биотических агентов, вызывающих серьезные потери и повреждения продуктов сельского хозяйства, находится большое количество вредителей растений, включая вредных насекомых, растений-паразитов, грибков и бактериальных патогенов. Во всем мире болезни, вызываемые патогенами сельскохозяйственных культур, вызывают потери, оцененные, приблизительно, в 12%, и предполагаемые послеуборочные потери из-за порчи продуктов питания составляют от 10% до 50%. Только в Соединенных Штатах эти цифры, предположительно, составляют, соответственно 12% и 9%. Различные болезни, вызываемые патогенами, передающимися с семенами или передающимися с почвой, часто вызывают тяжелые экономические потери в земледельческом и плодоовощном производствах. Помимо сельского хозяйства болезни, вызванные патогенами, могут приводить к разрушению целых растительных насаждений на болотах, в лесах или в других природных окружениях, наряду с другими растительными системами.
Для борьбы и контроля за патогенами растений применяется ряд различных стратегий. Помимо хорошей агрономической и культурной практики, растениеводы часто сильно полагаются на применение химических пестицидов. Действительно, химические пестициды против патогенов хорошо известны в области техники, к которой относится данное изобретение, и они интенсивно использовались многие годы в промышленном производстве растений и животных. Способы профилактического и/или терапевтического лечения грибковых и бактериальных инфекций у животных и растений, в целом, включают применение противогрибковых и противобактериальных агрохимических продуктов. Однако широкое применение химических веществ в сельском хозяйстве явилось предметом возрастающей общественной обеспокоенности и внимания из-за потенциально вредных воздействий на окружающую среду и здоровье человека. Действительно, несмотря на все выгоды пестицидов, часто сообщается о том, что агрохимические продукты часто поражают нецелевые организмы, такие, как человек, крупный рогатый скот, дикую природу и другие живые организмы. Другие проблемы, связанные с использованием пестицидов, включая появление патогенов, резистентных к пестицидам, привело к постепенному устранению и снятию с производства некоторых имеющихся пестицидов. В добавление к вышеуказанным проблемам распространение болезней, вызываемых патогенами растений, в природных экосистемах может препятствовать успешному применению химических веществ из-за масштаба, в котором придется использовать такие применения. В последние десятилетия повышенная обеспокоенность в отношении влияния применения пестицидов на окружающую среду и здоровье человека привела к усилиям по снижению зависимости от химического контроля нежелательных вредителей. В добавление, в настоящее время существуют строгие положения по применению химических пестицидов и определенное политическое давление, имеющее целью удалить наиболее опасные химические вещества с рынка. В результате возрастает нерасположение некоторых химических компаний к разработке и тестированию новых химических соединений из-за соображений, связанных с процессом регистрации и стоимостью.
В связи с этим совершенно очевидно что имеется потребность в разработке не-химических альтернативных способов контроля болезней растений, вызванных патогенами. Например, возрастает уверенность в том, что биологических контроль патогенов растений является жизнеспособной альтернативой защиты от болезней растений. В частности, использование биологически активных агентов в контроле вредителей растений и болезней, вызванных патогенами, стал особенно важным для сертифицированных органических растениеводов, которым может не понадобиться использование синтетических химических веществ для защиты растений от вредителей.
В качестве биоконтролирующих агентов сообщалось о нескольких микроорганизмах, антагонистичных по отношению к патогенам растений. За последние десятилетия было опубликовано большое количество документов, относящихся к использованию композиций, содержащих различные штаммы дрожжей или другие микроорганизмы против патогенов растений. Способы заражения растений микробными антагонистами использовались с хорошими результатами против некоторых распространенных грибковых патогенов нескольких посевных культур. Например, микробные антагонисты использовались для подавления табачной мозаики, корневой и напенной гнили хвойных, каштановой тли, тристецы цитрусовых и корончатого галла некоторых посевов. Во многих примерах посевные семена, покрытые микробными антагонистами, продемонстрировали сниженное инфицирование патогенами и повышенный рост растений. В добавление, некоторые послеуборочные грибковые заболевания могут контролироваться путем использования антагонистических грибков и бактерий. Примером послеуборочного биоконтроля является угнетение коричневой гнили персиков при хранении, которое может быть достигнуто в имитированных коммерческих условиях путем внедрения антагонистической бактерии Bacillus subtilis в воск, используемый в упаковочном процессе.
К сожалению, для большинства патогенов в настоящее время отсутствуют эффективные технологии биоконтроля. Хотя концепция биологического контроля является привлекательной, остается критическая потребность в новых микроорганизмах, имеющих новые способности к биоконтролю. До некоторой степени эта потребность в первую очередь обусловливается стремительным появлением новых штаммов патогенов, резистентных к химическим пестицидам, или ограничением использований агрохимических пестицидов. В добавление, существуют различные барьеры широкомасштабного внедрения применений контроля вредителей, включая наличие сложных смесей патогенов в природном окружении. Более того, в течение своего жизненного цикла растения, микроорганизмы и патогены взаимодействуют друг с другом при помощи большого разнообразия способов. Эти сложные взаимодействия могут оказывать значительное влияние на развитие каждого из этих организмов различными путями. Вдобавок, патогены растений, в особенности, грибковые патогены, очень разнообразны, и их патогенность различна у различных растений-хозяев. Более того, коммерческое использование и применение агентов биологического контроля развивалось медленно, в основном, из-за различного поведения в различных условиях окружения в полевых условиях. Таким образом, в то время, как концепция биологического контроля является привлекательной, технология применялась только в ограниченных случаях.
Для того, чтобы преодолеть обсуждаемые выше проблемы и ограничения, и с целью перенесения технологии биоконтроля в поле и коммерциализации биоконтролирующих агентов, важно разрабатывать новые составы биоконтролирующих микроорганизмов с большей степенью стабильности и выживаемости. Для этой цели важно проводить поиск новых и новейших биоконтролирующих микроорганизмов с различными механизмами действия. Действительно, поскольку биологический контроль основывается на микроорганизмах, следует идентифицировать дополнительные микроорганизмы с подходящими биохимическими и физиологическими характеристиками для выполнения этой задачи.
30
6
8
В ответ на давление создавать более коммерчески жизнеспособные биоконтролирующие решения многие лаборатории, как в академических учреждениях, так и в промышленности, инвестируют значительные ресурсы в идентификацию и оценку новых микроорганизмов-кандидатов, которые потенциально пригодны для применений биоконтроля в коммерческом масштабе. Микроорганизмы представляют собой наибольший компонент живой природы и, как это общепризнанно, представляют собой единый наибольший источник эволюционного и биохимического разнообразия на планете. Действительно, общее количество микробных клеток на Земле по оценке составляет, по меньшей мере, 10. Только прокариоты представляют собой наибольшую часть индивидуальных организмов, включающих от 10 до 10 отдельных генетических видов. Однако через ограничение существующих скрининговых способов эти природные ресурсы с огромным биоразнообразием остаются в значительной степени неиспользованным резервуаром новых видов, генов, ферментных активностей и соединений с потенциалами коммерческого использования. В настоящее время первичный скрининговый этап типично представляется собой первую лимитирующую стадию в обнаружении биоконтролирующих способностей микроорганизмов. Доступные в настоящее время способы для скрининга коммерчески жизнеспособных микробных антагонистов остаются в значительной степени неизмененными с момента возникновения сферы деятельности и поэтому часто не могут эффективно применяться к этим недостаточно изученным ресурсам. В таких скринингах обычно собирают большое количество микроорганизмов-кандидатов из природных сред и затем подвергают различным селекционным методикам, которые часто являются трудоемкими, интенсивными и/или достаточно медленными.
Ввиду вышеизложенного существует большая потребность в улучшении скорости открытия и применения решений биоконтроля. В частности, необходимы новые способы, способствующие быстрой и эффективной идентификации микроорганизмов с биоконтролирующей активностью против широкого диапазона патогенов. Один аспект настоящего изобретения предоставляет высокоэффективный скрининговый способ в качестве решения этой давно ощущавшейся проблемы, предоставляющий процесс для быстрого и эффективного доступа к генетическому разнообразию популяций микроорганизма и, тем самым, идентифицирующий новейшие микроорганизмы коммерческого интереса.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Один аспект настоящего раскрытия относится к способу отбора микроорганизма, обладающего антагонистической активностью против патогена. Данный способ включает (a) предоставление мультитестовой платформы и множества микробных образцов, где мультитестовая платформа содержит одну или более твердых микробных ростовых сред, содержащих диспергированную популяцию патогена; (б) отдельное и одновременное приведение каждого их микробных образцов в контакт с диспергированной популяцией патогена (в) ко-культивирование микробных образцов с диспергированной популяцией патогена для оценки ответа патогена на каждый из микробных образцов; и (г) отбор одного или более микробных образцов, содержащих микроорганизм, имеющий антагонистическую активность против патогена.
Выполнения способов отбора в соответствии с этим аспектом может включать одну или более из следующих характеристик. В определенных вариантах воплощения множество микробных образцов содержит, по меньшей мере, 12, 24, 48, 96, 200, 384, 400, 500, 1000 или 1500 микробных образцов. В некоторых вариантах воплощения один или более микробных образцов могут быть изолированными культурами микроорганизмов. В некоторых других вариантах воплощения, по меньшей мере, один из микробных образцов может быть смесью двух или более изолированных микроорганизмов. В еще некоторых других вариантах воплощения один или более микробных образцов могут быть получены напрямую из природной среды.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения данного аспекта патоген может быть патогеном растений. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения патогеном растений является грибок. В некоторых других особенно предпочтительных вариантах воплощения патоген растений может быть избран из группы, состоящей из Colletotrichum sp., Fusarium sp., Gibberella sp., Monographella sp. и Stagnospora sp. В еще некоторых других особенно предпочтительных вариантах воплощения патоген растений может быть избран из группы, состоящей из Colletotrichum graminicola, Fusarium graminearum, Gibberella zeae, Monographella nivalis и Stagnospora nodurum.
В определенных вариантах воплощения диспергированная популяция патогена содержит клети патогена, формирующие клеточный слой на поверхности твердой микробной ростовой среды. В некоторых других вариантах воплощения диспергированная популяция патогена содержит клетки патогена, которые смешаны с упомянутой твердой микробной ростовой средой и, тем самым, инкорпорированы в твердую микробную ростовую среду перед застыванием среды.
В определенных вариантах воплощения раскрываемых здесь способов отбора мультитестовая платформа может включать многокамерное устройство, которое содержит одну или более отдельных камер. Каждая из камер способна действовать как резервуар для твердой микробной ростовой среды. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения мультитестовая платформа может содержать либо (a) один или более углублений, каждое углубление способно действовать в качестве резервуара для твердой микробной ростовой среды, содержащей ограниченную популяцию патогена; либо (б) углубление, способное действовать в качестве резервуара для твердой микробной ростовой среды; где углубление разделено на две или более отдельных камер, и один или более встроенных разделяющих элементов конструкции для разделения углубления на отдельные камеры. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения данного аспекта, по меньшей мере, одна из камер или углублений мультитестовой платформы отличается от других камер или углублений путем содержания диспергированной популяции другого патогена. В некоторых других предпочтительных вариантах воплощения ко-культивирование каждого из указанных микробных образцов с указанной диспергированной популяцией патогена производится в отдельных камерах мультитестовой платформы. В еще других предпочтительных вариантах воплощения мультитестовая платформа может быть форматом, отобранным из группы, состоящей из микропланшета, микротитровального планшета, многолуночной пластинки, чашки Петри, лотка, предметного стекла или тестовой пробирки.
В соответствии с определенными вариантами воплощения оценка ответа указанного патогена на каждый их указанных микробных образцов включает определение наличия зоны подавления роста, диаметра зоны подавления роста, выработки химического соединения, изменения в морфологии и/или физиологии патогена или комбинацию любого из этого.
В некоторых других вариантах воплощения выполнение раскрываемых здесь способов может далее включать этап рассортировки каждого из микробных образцов на субпопуляции клеток перед или одновременно с контактированием микробных образцов с диспергированной популяцией патогена. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения этап рассортировки может включать проточную цитометрическую методику клеточной сортировки (FACS).
В еще некоторых других вариантах воплощения раскрываемые здесь способы по изобретению могут далее включать этап определения таксономической классификации микроорганизма. Этап определения таксономической классификации может включать (a) гибридизацию зонда нуклеиновой кислоты с молекулой нуклеиновой кислоты избранного микроорганизма, (б) амплификацию молекулы нуклеиновой кислоты избранного микроорганизма, (в) иммунодетекцию молекулы избранного микроорганизма, (г) секвенирование молекулы нуклеиновой кислоты, полученной из указанного избранного микроорганизма, или (д) комбинацию двух или более из них.
Также предоставляются в соответствии с другим аспектом настоящего раскрытия изолированные микроорганизмы, которые отбираются способом в соответствии со скрининговыми способами настоящего изобретения, где избранные микроорганизмы обладают антагонистической активностью против патогена.
Эти и другие объекты и характеристики изобретения станут более полно явными из дальнейшего детального описания изобретения и пунктов формулы изобретения.
ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее раскрытие относится к высокоэффективным способам скрининга биологических образцов для идентификации микроорганизмов, имеющих ценности в качестве биоконтролирующих агентов. Выполнения раскрываемых здесь способов могут включать использование мультитестовых платформ для быстрой и одновременной идентификации микроорганизмов, имеющих биоконтролирующую активность, включая микроорганизмы, пригодные в улучшении здоровья растений, животных и человека. В частности, настоящее изобретение предоставляет способы скрининга, пригодные для скрининга микроорганизмов для их потенциальных применений в борьбе с болезнями, вызванными патогенами растений. Раскрытие также предоставляет микроорганизмы, имеющие биоконтролирующую активность, которая идентифицируется при помощи раскрываемых здесь скрининговых способов.
Хотя некоторые особенно предпочтительные варианты воплощения настоящего изобретения включают отбор микроорганизмов, имеющих биоконтролирующие способности против распространенных фитопатогенов, следует понимать, что настоящее изобретение также охватывает отбор микроорганизмов, имеющих одну или более из широкого диапазона других биоконтролирующих активностей, включая, но не ограничиваясь, бактерицидной, фунгицидной, гербицидной, инсектицидной, нематоцидной и подобным. Далее подразумевается, что настоящее изобретение охватывает отбор микроорганизма из любых источников.
Все упомянутые в этом описании публикации и заявки на патенты включены в настоящую заявку посредством ссылки в той же степени, как если бы о каждой индивидуальной публикации или заявке на патент было конкретно и индивидуально указано то, то она включена в настоящую заявку посредством ссылки. Источники информации включают, например, статьи в научных журналах, патентные документы, руководства и браузер-неактивные адреса страниц во Всемирной паутине. Ссылка на такие информационные источники делается исключительно в целях предоставления указания на общее состояние области техники на время подачи заявки. В то время, как на содержания и учения каждого и всех из информационных источников можно полагаться и использовать специалисту в области техники для приготовления и использования вариантов воплощения изобретения, любое обсуждение и комментарии в конкретном источнике информации никоим образом не должны считаться как принятие того, что такой комментарий считается общепринятым в качестве общего мнения в области техники.
Если не было определено иным образом, все термины области техники, изображения условными знаками и другие научные и технические термины или терминология, используемые здесь, предназначены иметь значение, обычно понимаемое специалистом в области техники, к которому имеет отношение данное изобретение. Многие из методик и процедур, описываемых здесь, или на которые делается ссылка, хорошо понимаются и широко используются с применением традиционной методологии специалистом в области техники. Следующие термины определяются для целей изобретения, как описано здесь. В некоторых случаях термины с обычно понимаемыми значениями определяются здесь для четкости и/или для справочного материала, и включение здесь таких определений не должно обязательно истолковываться как значительное отличие от того, что обычно понимается в области техники.
Единичные формы (английских) артиклей "a", "an", и "the" включают множественные ссылки, если только контекст ясно указывает на противное. Так, например, ссылка на "a host cell" (клетка хозяина) включает множественное число таких клеток хозяина, и ссылка на "a stress" (стресс) является ссылкой на один или более стрессов и их эквивалентов, известных специалисту в области техники, и так далее.
Антибиотик: Для целей настоящего раскрытия термины «антибиотик», «антимикробный агент» и «антипатогенный агент» используются взаимозаменяемо для ссылки на любое вещество, соединение или композицию, способную ингибировать или отменять рост микроорганизма. Антибиотики могут продуцироваться любым одним или более из следующего: 1) микроорганизмом, 2) синтетическим процессом, или 3) полусинтетическим процессом. Как таковой, антибиотик может быть микроорганизмом, который секретирует летучее органическое соединение. Более того, антибиотик может быть летучим органическим соединением, секретируемым микроорганизмом.
В данном контексте термины «антагонистические микроорганизмы» и «микробные антагонисты» используются взаимозаменяемо для ссылки на микроорганизмы, которые действуют для предотвращения, подавления, лечения или контроля развития патогена или патогенного заболевания в растении, животном или человеке. Например, антагонистический микроорганизм может действовать, чтобы предотвратить, подавить, лечить или контролировать предуборочное или послеуборочное заболевание в растениях, включая их плоды и другие, собираемые в качестве урожая, части. Как раскрывается более детально здесь в ином месте, антагонистическая активность микроорганизмов по отношению к патогенам может быть достигнута разнообразными механизмами. Например, антагонистический микроорганизм может ингибировать развитие контролируемого субъекта путем продукции и выделения определенных биоактивных материалов, например, антибиотиков, которые обладают избирательной токсичностью и/или деструктивным действием против контролируемого субъекта путем предоставления угнетающего или конкурентного механизма. Как таковые, антагонистические(й) микроорганизм(ы), как подразумевается, охватывают археи, бактерии, микроскопические водоросли, грибки (включая плесень и виды дрожжей), микоплазмы, микроспоровые, нанобактерии, оомицеты и простейшие. В некоторые случаях антагонистический(е) микроорганизм(ы) могут быть антагонистическими по отношению к, например, патогену растений, который сам по себе может являться бактерией, грибком или другим типом микроорганизмов.
Бактерицидный: Термин «бактерицидный» в данном контексте относится к способности композиции или вещества повышать смертность или ингибировать скорость роста бактерий.
Биологический контроль: термин «биологические контроль» и его сокращенная форма «биоконтроль» в данном контексте определяется как контроль патогена, такого, как, например, грибок, насекомое или любой другой нежелательный организм путем использования другого организма или его производного. В большинстве случаев биологический контроль является ингибированием роста, инфекции или репродукции одного организма с использованием другого организма. Примером известного механизма использования биологического контроля является использование микроорганизмов, контролирующих корневую гниль, путем конкурирования грибка за пространство на поверхности корня, или микроорганизмов, которые либо ингибируют рост, либо убивают патоген. «Растение-хозяин» в контексте биологического контроля является растением, восприимчивым к болезни, вызываемой патогеном. В контексте изолирования микроорганизма, такого, как виды грибков, из их природной среды «растение-хозяин» - это растение, которое поддерживает рост грибка, например, растение того рода, для которого грибок является эндофитом.
Хромогенное соединение: В данном контексте термины «хромогенное соединение» и «хромогенный субстрат» относятся к любому соединению, пригодному для использования в системах детекции, из-за их характеристик абсорбировать или эмитировать свет. Термин подразумевает охват любых продуктов ферментного расщепления, как растворимых, так и нерастворимых, которые могут определяться как визуально, так и с помощью оптического оборудования. Под обозначение «хромогенные» включены все ферментные субстраты, которые продуцируют конечный продукт, который может определяться по изменению цвета. Это включает, но не ограничивается, любым цветом, как используется в традиционном смысле «цветов», таких, как индиго, синий, красный, желтый, зеленый, оранжевый, коричневый, и т.п., наряду с флуорохромными или флуорогенными соединениями, которые испускают цвета, определяемые флуоресценцией, (например, желто-зеленый у флуоресцеина или красный у родамина, и т.п.). Подразумевается, что такие другие индикаторы, как красящие (например, pH) и люминогенные соединения охватываются данным определением.
Композиция: «Композиция» предназначена обозначать комбинацию активного агента и другого соединения, носителя или композиции, инертной (например, определяемый агент или ярлык или жидкий носитель) или активной, такой, как пестицид.
Культура, изолированная культура, биологически чистая культура и обогащенная культура. В данном контексте изолированный штамм микроба - это штамм, который был удален из своей природной среды. «Чистые культуры» или «изолированные культуры» - это культуры, в которых присутствуют микроорганизмы только одного штамма определенного рода или вида. Это отличается от «смешанных культур», в которых присутствуют культуры более одного рода и/или вида микроорганизма. В некоторых вариантах воплощения микроорганизмы и культуры не являются генно-инженерными продуктами, в то время, как в других вариантах воплощения микроорганизмы и культуры являются генно-инженерными продуктами.
Как таковой, термин «изолированный» не обязательно отражает уровень, до которого микроб был очищен. «В значительной степени чистая культура» штамма микроба относится к культуре, которая в значительной степени не содержит другие микробы, отличные от желательного штамма или штаммов микробов. Другими словами, в значительной степени чистая культура штамма микроба в значительной степени свободна от других контаминантов, которые могут включать микробные контаминанты, наряду с нежелательными химическими контаминантами. Далее в данном контексте «биологически чистый» штамм предназначен означать штамм, отделенный от материалов, с которыми он обычно связан в природе. Обратите внимание, что штамм, ассоциированный с другими штаммами, или с соединениями и материалами, с которыми он обычно не находится в природе, все еще определяется как «биологически чистый». Монокультура определенного штамма, конечно, «биологически чистая». В данном контексте термин «обогащенная культура» изолированного микробного штамма относится к микробной культуре, которая содержит более, чем 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% изолированного штамма.
Культивирование: Термин «культивирование» в данном контексте относится к воспроизведению организмов на или в средах различных видов.
Эффективное количество: «Эффективное количество» в данном контексте - это количество, достаточное для вызывания полезных или желательных результатов. Эффективное количество может быть введено в одном или более введений. В терминах лечения ингибирования или защиты эффективное количество - это количество, достаточное, чтобы улучшить, стабилизировать, обратить, замедлить или отложить прогрессирование таргетных инфекционных или болезненных состояний.
Фунгицидный: В данном контексте «фунгицидный» относится к способности композиции или вещества снижать скорость роста грибков или увеличивать смертность грибков.
«Высокоэффективный» (ВЭ), как в высокоэффективном скрининге (ВЭС), относится к процессу, разработанному с целью выполнения большого количества анализов, включая анализ(ы) на большом количестве клеток, предпочтительно, автоматизированным или полу-автоматизированным способом. Насколько большое это количество - это будет зависеть от контекста конкретного анализа, однако для примера по скринингу генетических отличий желательно исследовать миллион клеток. В других контекстах ВЭС может считаться, по меньшей мере, как сотни и тысячи анализов или скринингов за день, однако также скрининг значительно более низких количеств клеток все еще считается высокоэффективным в контексте данного изобретения. Термин «высокоэффективный» также охватывает «ультра высокоэффективный» (УВЭ). «Многопараметрический» (МП) относится к вариации ВЭС, в которой количество и качество информации является высшим приоритетом, иногда за счет пропускной способности, однако все еще имеющей дело с большим количеством анализов. Термин «высокоэффективный» в контексте данного изобретения также охватывает много параметров, и, таким образом, ВЭС также относится к «многопараметрическому скринингу» (МПС).
Микробный образец: Термин «микробный образец» в настоящем описании и пунктах формулы изобретения используется в самом широком смысле. Он означает включение как биологических образцов, так и образцов окружающей среды, содержащих микробы, и образцы, приготовленные из них. Образцы окружающей среды включают материалы, происходящие из, например, опасных отходов, материала поверхности, почвы, воды, ила, сточных вод и промышленных образцов, наряду с материалами, полученными при переработке пищевых и молочных продуктов, аппаратуры, оборудования, одноразовых и неодноразовых предметов. Биологические образцы могут происходить из растений, человека или животного, включая грибки, людей, жидкость или ткань, пищевые продукты и ингредиенты, такие, как молочные продукты, овощи, мясо и мясные субпродукты, клеточные культуры, организмы и отходы. Однако не подразумевается, что тип образца, применимый в данном изобретении, будет ограниченным.
Являясь биологическим или происходящим из окружающей среды, микробный образец, предположительно содержащий антагонистические микроорганизмы, может быть или может не быть вначале подвергнут воздействию способов обогащения для создания «изолированной культуры», «биологически чистой культуры», «обогащенной культуры» микроорганизмов. Под «способами обогащения» или «обогатительной обработкой» настоящее изобретение рассматривает (i) традиционные методики для изолирования конкретного исследуемого микроорганизма от других микроорганизмов методами жидкой, твердой, полужидкой или любой другой культуральной среды и/или методики, и (ii) новые методики для изолирования конкретных микроорганизмов от других микроорганизмов. Не подразумевается, что настоящее изобретение будет ограничено только один этапом обогащения или типом методов обогащения. Например, в рамках настоящего изобретения находится то, что, после того, как образец подвергнут традиционным методам обогащения, получаемый в результате препарат подвергается дальнейшей очистке так, что в итоге получаются чистые или в значительной степени чистые культуры штамма изучаемого вида. Эта чистая культура затем может анализироваться при помощи настоящего изобретения.
Микроорганизм: В данном контексте термин «микроорганизм» используется для ссылки на любой вид или тип микроорганизма, включая, но не ограничиваясь, археями, бактериями, микроскопическими водорослями, грибками (включая плесень и виды дрожжей), микоплазмами, микроспоровыми, нанобактериями, оомицетами и простейшими. Как таковой, термин охватывает отдельные клетки (например, одноклеточные микроорганизмы) или множество клеток (например, многоклеточные микроорганизмы). «Популяция микроорганизмов» таким образом может относиться к множеству клеток единичного микроорганизма или к множеству клеток двух или более различных микроорганизмов, например, смеси грибковых клеток и бактериальных клеток.
Микробная ростовая среда: В данном контексте термины «микробная ростовая среда» и «культуральная среда» и «среда» относятся к любому субстрату для роста и репродукции микроорганизмов. «Среда» может использоваться в ссылке на твердую среду в чашке, которая поддерживает рост микроорганизмов. Также определением охватываются полужидкие и жидкие ростовые системы, включая те, которые инкорпорируют живые организмы хозяина, наряду с любым типом ростовой среды. Выражение «твердая микробная ростовая среда» или «полужидкая микробная ростовая среда» используются здесь взаимозаменяемо и относятся к ростовой среде, которая позволяет микроорганизмам образовывать колонии на своей поверхности, такой, как среда вида геля или в форме геля, гель при этом является коллоидной системой, в которой пористая сеть взаимосвязанных частиц охватывает объем жидкой среды. Далее понимается, что гель в большинстве своем жидкий по составу и тем самым демонстрирует плотности, схожие с плотностями определенной жидкости, однако имеет структурное сцепление твердого вещества. Предпочтительно, твердая или полужидкая микробная ростовая среда в данном контексте готовится путем добавления к жидкой микробной ростовой среде достаточного количества вещества, которое при нагревании плавится и отвердевает тогда, когда вновь охлаждается, такого, как желатин или агар. Следует понимать, что пористая сеть взаимосвязанных частиц в среде будет позволять питательным веществам и антимикробным агентам диффундировать через среду и становиться доступными для микроорганизмов.
Микротитровальный планшет: В данном контексте термин «микротитровальный планшет» относится к пластинке с лунками либо резервуарами различных дизайнов, используемой в биологическом и химическом анализе. Он предназначен означать субстрат, имеющий один или множество дискретных камер, подходящих для содержания жидкости. Примерный микротитровальный планшет включает, например, «микропланшеты» «многолуночные планшеты» либо «n-луночные планшеты», где «n» является количеством лунок, включая, например, 8-, 12-, 16-, 24-, 96-, 384- или 1536-лунок. Микротитровальный планшет может иметь лунки с любой из форм поперечного сечения, включая, например, цилиндрические, квадратные, прямоугольные, многогранные, смыкающиеся формы, где дно лунок плоское, коническое, заостренное или круглое. Термины «микротитровальный планшет» призваны охватить стандартные микротитровальные планшеты и микропланшеты, обычно используемые в области техники и коммерчески доступные из множества источников научного снабжения, включая Corning (Corning, NY), BD Bioscience (Bedford, MA), Greiner Bio-One (Monroe, NC). Однако не подразумевается, что настоящее изобретение должно быть ограничено определенным типом формата. Например, в настоящем изобретении пригодны планшеты с 384, 96, 48, 24 и 12 лунками, однако могут использоваться планшеты с другими количествами лунок. Форма лунок не ограничена круглой или в значительной степени круглой лункой. Например, в настоящем изобретении могут использоваться преимущественно квадратные лунки, наряду с лунками, которые преимущественно прямоугольные, треугольные, овальные или неправильной формы. Сама форма самого микротитровального планшета также не ограничена любой конкретной формой, хотя он обычно в значительной степени плоский и, в общем, может быть прямоугольным или квадратным.
Мультиплексная и мультитестовая платформа: В данном контексте термин «мультитестовая платформа» подразумевает охватывать любые удобные способы содержания одной или более реакционных смесей, суспензий, или микробных ростовых сред. Как таковые, результаты ряда скрининговых событий могут быть собраны на одной поверхности, приводящей в результате к «мультитестовой платформе», имеющей или состоящей из множества элементов или частей, чтобы работать в более чем одном эксперименте. Подразумевается, что термин «мультитестовая платформа» охватывает микротитровальные планшеты, многолуночные планшеты, микрокарты, тестовые пробирки, чашки Петри, чашки Петри с внутренними разделителями для разделения пространства в чашке на две или более отдельных камер, каждая камера пригодная для содержания отдельной микробной ростовой среды. Термин «мультиплексный» в данном контексте подразумевает означать одновременное и отдельное проведение множества анализов на одной или более мультитестовых платформ. Мультиплексирование далее может включать одновременное проведение множества скрининговых событий в каждом из множества отдельных образцов. Например, количество анализируемых образцов может быть основано на количестве лунок в многолуночном планшете и количестве тестов, проводимых в каждой лунке. Например, в настоящем изобретении могут быть пригодными 24-луночные, 48-луночные, 96-луночные, 384-луночные или 1536- луночные микротитровальные планшеты, хотя специалисту в области техники ясно, что не каждая микротитровальная лунка должна содержать индивидуальный микробный штамм. В зависимости от размера микротитровального планшета и количества индивидуальных микроорганизмов в каждой лунке одновременно может проводиться очень большое количество тестов. Хотя мультиплексирование приводится в Примерах 3-4, в отношении к микротитровальным планшетам, будет понятно, что для мультиплексирования могут быть использованы и другие форматы.
Нематоцидный. Термин «нематоцидный» в данном контексте относится к композиции или веществу, которое повышает смертность или ингибирует скорость роста нематод.
Патоген: термин «патоген» в данном контексте относится к организму, такому, как водоросль, паукообразное, бактерия, грибок, насекомое, нематода, дрожжи, простейшее или вирус, способному вызывать заболевание или подавлять рост/выход продукции у растения или животного. Термин «фитопатоген» в данном контексте относится к патогенному организму, инфицирующему растение.
Трансгенный организм: В данном контексте «трансгенный организм» относится к организму, который содержит в своем геноме гетерологичный полинуклеотид. В целом, гетерологичный полинуклеотид стабильно интегрирован в геном таким образом, что полинуклеотид передается последующим поколениям. Гетерологичный полинуклеотид может быть интегрирован в геном сам по себе или как часть рекомбинантной экспрессионной кассеты. «Трансгенный» здесь используется для включения любой клетки, клеточной линии, каллуса, ткани, генотип которых был изменен наличием гетерологичной нуклеиновой кислоты. Термин трансгенный включает как те трансгены, которые первоначально были так изменены, так и те, что были созданы путем половых обменов или вегетативного размножения из первоначального трансгена. Термин трансгенный в данном контексте не охватывает изменение генома (хромосомное или внехромосомное) путем традиционных способов размножения растений или путем встречающихся в природе события, таких, как случайное перекрестное опыление, нерекомбинантная вирусная инфекция, нерекомбинантная бактериальная трансформация, нерекомбинантная транспозиция или спонтанные мутации.
Все публикации и заявки на патент, упомянутые в данном описании, здесь включены посредством ссылки в той же степени, как если бы о каждой индивидуальной публикации или заявке на патент было конкретно и индивидуально указано то, что она включена в настоящую заявку посредством ссылки.
Не делается никаких допущений о том, что любая ссылка составляет предшествующий уровень техники. Обсуждение ссылок констатирует то, что является утверждением их авторов, и заявитель оставляет за собой право оспаривать точность и применимость цитируемых документов. Следует ясно понимать, что, несмотря на то, что здесь делаются ссылки на ряд публикаций предшествующего уровня техники, эта ссылка не составляет допущение о том, что какой-либо из этих документов образует часть неспециального общего знания в области техники.
Обсуждение данных здесь общих способов предназначено только для иллюстративных целей. Другие альтернативные способы и варианты воплощения будут очевидны специалисту в области техники после рассмотрения данного раскрытия.
Механизмы биологического контроля
В целом, биологический контроль является результатом многих различных типов взаимодействий между микроорганизмами, патогенами и растениями - хозяевами. Однако на патогены часто оказывает воздействие наличие и/или активность других микроорганизмов, с которыми они сталкиваются [для обзора см. Heydari and Pessarakli, Journal of Biological Sciences, 10(4):273-290, 2010]. Для целей настоящего раскрытия термин «взаимодействие(я)» в данном контексте относится к прямым либо к непрямым взаимодействиям между, по меньшей мере, двумя клетками (или организмами). «Прямое взаимодействие» относится к физическому контакту между клетками или организмами. Примеры прямых взаимодействий включают прямой контакт клеточных стенок или мембран (в некоторых случаях обусловленный специфическими рецепторами) или даже слияние этих структур или вхождение одной клетки в другую, или взаимодействия через структуры клеточной поверхности, такие, как фимбрии. «Непрямое взаимодействие» относится к непрямому контакту между клетками, такими как метаболиты или сигнальными соединениями или нуклеиновыми кислотами или ферментами, либо другими молекулами, высвобождаемыми или секретируемыми одной клеткой в среду, где только метаболиты вступают в физический контакт с другой клеткой (или организмом). Далее, «межклеточное(ые) взаимодействие(я)» относится к взаимодействию между клетками или микроорганизмами одних и тех же видов, наряду с взаимодействиями между клетками или микроорганизмами различных видов, включая сложные сообщества, такие, как биопленки.
Антагонистическая активность биоконтролирующих микроорганизмов может быть прямой или непрямой. Прямой антагонизм является результатом физического контакта и/или высокой степени селективности в отношении патогена благодаря механизму(мам), проявляющемуся(имся) у микроорганизмов с активностью биоконтроля. В этом типе взаимодействия «гиперпаразитизм» облигатными паразитами патогена растений будет считаться наиболее прямым типом механизма, так как не будет требоваться активность никакого другого организма для проявления подавляющего действия. Другими словами, на патоген производится прямая атака специфическим биоконтролирующим агентом, который убивает его или его распространения. В отличие от этого непрямой антагонизм является результатом активностей, которые не включают нацеливание на патоген микроорганизма с биоконтролирующей активностью. Наиболее эффективные микроорганизмы с биоконтролирующей активностью, изученные к настоящему времени, по видимому, проявляют антагонистическую активность в отношении патогенов растений путем использования комбинаций нескольких способов действия. В некоторых случаях единичный грибковый патоген может быть атакован множественными гиперпаразитами. Например, Acremoniumalternatum, Acrodontium crateriforme, Ampelomycesquisqualis, Cladosporiumoxysporum и Gliocladiumvirens являются только некоторыми из грибков, которые способны паразитировать на патогенах настоящей мучнистой росы.
Многие микробы вырабатывают и высвобождают или секретируют одно или более соединений с антибиотической активностью. Было показано, что некоторые антибиотики, вырабатываемые микроорганизмами, особенно эффективны против патогенов растений и заболеваний, которые они вызывают. В целом, эффективный антибиотик должен вырабатываться в достаточных количествах (дозе) вблизи патогена. Было показано, что многие антибиотики особенно эффективны в подавлении и/или в антагонизме, направленном против роста целевого патогена в условиях in vitro и/или in situ. Было показано, что многие биоконтролирующие микроорганизмы продуцируют множественные антибиотики, которые могут угнетать один или более патогенов. Эта возможность продуцировать несколько антибиотиков приводит в результате к угнетению разнообразных микробных конкурентов и патогенов растений.
Многие микроорганизмы, активные в отношении биоконтроля, продуцируют другие метаболиты, способные интерферировать с ростом и активностями патогена. Среди этих метаболитов находятся литические ферменты, способные расщеплять полимерные соединения, включая хитин, белки, целлюлозу, гемицеллюлозу и ДНК. Например, было показано, что Lysobacter и Myxobacteria, которые вырабатывают литические ферменты, эффективны против некоторых грибков-патогенов растений (см., например, Bull et al., Plant Diseases, 86:889-896, 2002). В добавление к вышеупомянутым метаболитам другие микробные побочные продукты также могут играть важные роли в биоконтроле болезней растений (см., например, Phillips et al., Plant Physiol. 136:2887-2894, 2004). Например, цианистый водород (HCN) эффективно блокирует путь цитохром оксидазы и высоко токсичный для всех аэробных микроорганизмов в пикомолярных концентрациях. Продукция HCN определенными флуоресцентными Pseudomonas, как считается, эффективна против патогенов растений. В других исследованиях сообщалось о том, что органические летучие вещества также эффективны против некоторых фитопатогенов.
Методики для анализирования антагонистической активности микроорганизмов
За последние десятилетия был разработан и применен ряд тестов для обнаружения и разработки новых микроорганизмов, имеющих антагонистическую активность против патогенов. Общеупотребительные способы для анализа антагонистической активности микроорганизмов in vitro часто включают ручное размещение или нанесение полосками тестируемых микроорганизмов и целевого патогена рядом на агаровой ростовой среде. Например, методики двойной культуры (см, например, U.S. Pat. Appl. No. US20060029576; Sadfi et al., J. Plant Pathology, 83,101-118, 2001; Getha and Vikineswary, J. Industrial. Microbiol. Biotech., 28,303-310, 2002), способы дисков в агаре или способы цилиндров (см, например, Baniasadi et al., J. Agri. Biological. Sci. 4,146-151, 2009; Aghighi et al., Biotechnology, 3,90-97, 2004), ферментные анализы активных ферментов, продуцируемых микробными антагонистами (см, например, S. Pat. Appl. No. US20060029576; Sadfi et al., 2001, supra), были использованы с некоторым успехом во многих исследовательских лабораториях.
Однако сообщалось о нескольких ограничения, связанных с этими традиционными способами, которые в настоящее время используются в обнаружении и разработке новых микробных антагонистов. Например, эти способы были первоначально разработаны, скорее, для основной цели - анализа антагонистической активности микроорганизмов, чем для целей широкомасштабного скрининга. Поэтому отбор и/или идентификация потенциальных биоконтролирующих микроорганизмов путем использования этих традиционных анализов часто трудоемкая и интенсивная. В дополнение, количество штаммов, которые можно проанализировать количественно, низкое. Как правило, разработчик биоконтролирующего агента должен вначале разобраться с микробами-кандидатами, чтобы найти многообещающие микробы и затем разобраться среди многообещающих микробных кандидатов чтобы увидеть, как они влияют на другие аспекты физиологии патогена, а также как они взаимодействуют с другими патогенами, которые могут быть одновременно использованы. Способы анализа/скрининга с такой низкой пропускной способностью поэтому не пригодны для широкомасштабных скрининговых проектов. Действительно, из-за этих ограничений существовало очень мало систематических усилий по скринингу новых микробных антагонистов против патогенов и по использованию таких микроорганизмов для быстрой разработки биоконтролирующих агентов с коммерческими применениями.
На практике, когда требуется широкомасштабный скрининг, часто требуется тестировать микроорганизмы-кандидаты в различных условиях и против батареи различных видов патогенов, таким образом, количество образцов, которые следует протестировать, обычно составляет сотни, иногда даже достигает тысяч. Для улучшения скорости открытия и применения биоконтролирующих технологий необходимо разрабатывать и применять дополнительные способы для обнаружения микроорганизмов с улучшенными биоконтролирующими характеристиками в отношении широкого диапазона патогенов. Поскольку этап скрининга это, как правило, первый этап, ограничивающий скорость в открытии биоконтролирующих способностей микроорганизмов, ощущается сильная потребность для разработки быстрого и шкалируемого процесса для высокоэффективного скрининга антагонистических микроорганизмов коммерчески важных применений.
В последнее время были разработаны более новые скрининговые подходы в качестве попытки идентифицировать микробный антагонист с относительно более высокими пропускными способностями (см, например, Kawai et al., Biosci. Biotech. Biochem., 61,179-182, 1997). Однако, как обсуждается в деталях ниже, эти более новые подходы часто основываются на экспозиции целевого патогена либо к лизатам, свободным от микробных клеток, либо к свободным от клеток культуральным супернатантам, полученным от тестируемых микроорганизмов, выращиваемых в отсутствие патогена. Поэтому такие тесты in vitro часто не воспроизводят сложные, межвидовые взаимодействия в природных окружениях, где развитие болезней растений часто включает как растения, так и микробы, и взаимодействия, приводящие к биологическому контролю, часто имеют место на множественных уровнях ступеней развития (Bull et al, 2002, supra; Fitter and Garbaye, Plant Soil, 159:123-1321994; и Katska, Biol. Plant., 36:99-104, 1994).
Один аспект настоящего изобретения предоставляет высокоэффективные способы скрининга для быстрой и шкалируемой идентификации микроорганизмов, имеющих антагонистическую активность в отношении патогенов. В некоторых вариантах воплощения данного аспекта способы изобретения используют мультитестовую платформу (т.е. мультиплексные тестовые платформы) для эффективных и основанных на физиологии анализов антагонистической активности тестируемых микроорганизмов. В определенных вариантах воплощения тестируемые микроорганизмы приводят в прямой контакт с клетками целевого патогена, что может лучше воспроизвести сложные межвидовые взаимодействия в природных окружениях. Как обсуждалось выше, продукции и последующее высвобождение или секреция многих антипатогенных веществ или соединений антагонистичным микроорганизмом часто запускается сложными межвидовыми взаимодействиями между микроорганизмом и целевым патогеном. Стимуляция или индукция присутствием патогена часто требуется для продукции микробными антагонистами антибиотических соединений. Поэтому, в отличие от многих существующих скрининговых методик, которые часто основываются на экспозиции целевого патогена к лизатам, свободным от микробных клеток, или к свободным от клеток культуральным супернатантам, результаты тестирования способа в соответствии с настоящим изобретением помогают лучше воспроизвести природное межвидовое взаимодействие, т.е. тестируются только соединения и/или вещества, которые микроорганизмы продуцируют и секретируют в ответ на присутствие патогена.
В отличие от этого, многие существующие скриниговые методики требуют длительной инкубации целевого патогена со свободным от клеток лизатом микроорганизмов, у которых предполагается наличие антипатогенных активностей (см., например, Bonjar, Asian Journal of Plant Science, 2003). Эти методики обычно включают этап разрушения клеток, который необходим для высвобождения антипатогенных соединений из микробных клеток. Основной проблемой, связанной с этим подходом, является то, что свободный от клеток лизат часто содержит несметное число различных белков и других молекул, которые могут взаимодействовать друг с другом многими способами, которые могут быть антагонистическими либо синергетическими. Эти молекулы и соединения, когда присутствуют одновременно в тестируемой среде, могут воздействовать на другие физиологические аспекты и аспекты развития целевого патогена и тем самым воздействовать на результат тестирования.
Некоторые другие существующие скрининговые методики включают ко-культивирование микроорганизмов - кандидатов с клетками патогена в жидкой среде (см., например, Misaghi et al., Biocontrol Science and Technology, 1995), в которой, в общем, в мультиплексных анализах велик риск утечки, что может вызвать контаминацию между лунками. В добавление, в течение периода инкубации на протяжении нескольких часов или дней клетки в жидких культурах часто оседают на дно тестовых лунок и/или прикрепляются к клеткам или склеиваются с клетками, что приводит в результате к неоднородной суспензии клеток в лунках. Эта неоднородность может приводить к неоднородному ответу клеток патогена в лунке. Способы скрининга в соответствии с настоящим раскрытием, которые используют твердые и полужидкие ростовые среды, поэтому представляют собой значительное преимущество перед существующими скрининговыми методиками.
Как обсуждается в больших деталях ниже, антагонистические микроорганизмы могут анализироваться в комбинации, т.е. культуры изолированных штаммов могут быть смешаны перед тем, как подвергнуться анализу на антагонизм. Выполнение таких анализов особенно полезно в оценке взаимодействий множественных антагонистов in vivo. Например, в некоторых случаях определенные микробные комбинации вызывают вредные или антагонистические взаимодействия, в то время, как в других случаях, некоторые микробные комбинации действуют синергично для предоставления дополнительной пользы процедуре биоконтроля.
Поскольку стоимость часто является предметом рассмотрения в разработке новых микробных пестицидов и режимов лечения, способы скрининга в соответствии с настоящим раскрытием представляют значительную экономию времени и средств для обнаружения и разработки микробных пестицидов. Способность эффективно идентифицировать и характеризовать новые микробные кандидаты, наряду с удалением неудовлетворительных кандидатов в ранние сроки процесса обнаружения, может сэкономить сельскохозяйственным компаниям значительные затраты.
Источники микроорганизмов
Для выполнения способов настоящего изобретения первоначально предоставляется множество микроорганизмов, которые относятся к стартовой популяции микробных клеток, которые следует тестировать на способности к проявлению антагонистической активности в отношении развития целевого патогена. Стартовая популяция клеток может варьировать в зависимости от цели анализа.
Например, стартовая популяция микробных клеток в определенных вариантах воплощения настоящего раскрытия может быть из любой окружающей среды, в частности, из природных (например, не-лабораторных) окружений, в которых, в основном, обнаруживаются индивидуальные виды или штаммы микроорганизмов. Такие окружающие среды включают, например, океаны или другие массивы воды, включая пресноводные озера и пруды, реки, ручьи, соленые озера и грунтовые воды водоносного слоя, неводные земные окружающие среды, включая почвы, промышленные участки и созданные руками человека структуры, и биологические образцы, такие, как находящиеся на, внутри или в ассоциации с животными или растениями, включая гниющих животных или растений. В других вариантах воплощения стартовая популяция клеток может быть смесью микроорганизмов, обнаруживаемых в природных окружениях.
«Экстремальные» окружающие среды также могут служить источниками для микроорганизмов, которые могут быть использованы в качестве стартовых популяций клеток в раскрываемых здесь скрининговых способах; такие экстремальные окружающие среды включают регионы с высокой температурой (например, внутри или вблизи вулканов, в лаве или фумаролах, в местах подводной лавы, в горячих источниках или в определенных нагреваемых промышленных местах), с низкой температурой (например, вблизи полюсов или в морозильниках или в хранилищах на холоде) с экстремальной соленостью (например, определенные природные соленые источники, высыхающие моря или в местах загрязнения), и так далее.
Альтернативно, образец может быть композицией, созданной руками человек, такой как сельскохозяйственный состав или композиция, предназначенная для использования в приготовлении сельскохозяйственного состава. Подобным образом, могут тестироваться библиотеки мутантных или рекомбинантных микроорганизмов (например, организмов, получаемых при помощи технологий, таких как манипуляции с рекомбинантной ДНК, генетические манипуляции, мутагенез или селекция). Также могут тестироваться единичные штаммы или изоляты, обычно используемые в исследовании или в приготовлении аграрных, плодоовощных, фармацевтических или питательных композиций. Эти микроорганизмы могут быть индивидуальными изолятами или штаммами, выращиваемыми в изолированных культурах или обогащенных культурах, которые могут тестироваться с целью определения того, обладают ли они антагонистической активностью против патогенов. В принципе, может использоваться любая стартовая популяция клеток или микроорганизмов.
Стартовая популяция может первоначально выращиваться, например, в жидкой культуре для увеличения количества клеток. Например, если следует определить активность в отношении подавления патогена единичного спорового изолята грибка, единичный споровый изолят вначале необходимо вырастить, чтобы предоставить множество клеток, происходящих из него. Сходным образом, стартовая популяция может быть очищена или частично очищена с использованием способов, известных в области техники (например, путем фильтрации или центрифугировании, или при помощи клеточного сортера с флуоресцентной активацией) перед контактированием с популяцией целевых патогенов.
Примеры стартовых популяций микроорганизмов будут предоставлены далее здесь в иных местах, поскольку цель анализа определяет, с каких клеток следует начинать. Например, если цель - тестирование того, является ли определенный штамм гомогенный и стабильный, начинают с множества клеток данного штамма.
Стартовые клетки или микроорганизмы могут быть одного вида или смесью видов. Подобным образом, если стартовый микроорганизм является единичным видом, он может быть единичным штаммом (например, единичный клон или штамм) или он может быть смесью штаммов.
Как обсуждается выше, способы в соответствии с настоящим изобретением могут в принципе быть применены к отбору и идентификации антагонистических микроорганизмов против любых патогенов. Не подразумевается, что изобретение ограничивается как определенным родом, видом микроорганизма, так и группой патогенов или клеток. В добавление к распространенным микроорганизмам, диапазон клеточных типов, которые могут тестироваться с использованием способов и композиций настоящего изобретения, включает клетки, которые подвергаются сложным формам дифференцировки, нитеобразования, спорообразования, т.п. Действительно, также подразумевается, что настоящее изобретение найдет применение с клетками любого типа. Композиции и способы настоящего изобретения в особенности направлены в отношении некоторых из наиболее экономически важных микроорганизмов, наряду с видами патологического, промышленного, медицинского значений и значения для окружающей среды. Поскольку с использованием способов настоящего изобретения могут быть охарактеризованы различные клетки, не подразумевается, что выбор первичной среды для изолирования или культуральной среды ограничен конкретными формулировками.
Примеры видов патогенов, которые могут анализироваться в качестве целевых патогенов в соответствии со способами настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются, патогенами животных, такими, как Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, патогенными штаммами E. coli, Salmonella ssp., Klehsiella spp., Hafniaalvei, Haemophilusinfluenzae, Proteus spp. Serratia spp. Shigella spp. Vibrio spp., виды Bacillus, включая B. anthracis и B. cereus, Campylohacterjejuni, Yersinia spp. Clostridium perfringens, виды Enterococcal, такие как E. faecalis, Neisseria meningitides или N. gonhorrhea, Streptococcus ssp., включая S. pyogenes и S. pneumoniae, виды Staphylococcal, такие, как S. aureus, включая MRSA, Mycohacteriumtuherculosis, Enterohacter (например, Enterohacter cloacae) т.п. Дополнительно патогенные грибки, такие, как дрожжи, например, виды Candida, включая C. albicans, C. krusei и C. tropicalis, и нитчатые грибки, такие, как Aspergillusfumigatus или Penicilliummarneffei, включая дерматофиты, такие, как Trichophytonrubrum. Дополнительно, также могут анализироваться свободноживущие простейшие, такие как патогенные свободноживущие амебы или простейшие, несущие бактериальные патогены, такие, как Legionella.
Раскрываемые здесь способы особенно пригодны в идентификации микроорганизмов, которые имеют антагонистическую активность против вредителей растений и патогенов растений, в частности фитопатогенных грибков. Таким образом, могут быть применены способы по изобретению для скрининга антагонистических микроорганизмов, которые способны угнетать развитие патогенных болезней растений, вызванных широким спектром грибков. Способы настоящего изобретения являются предпочтительно микробными антагонистами против патогенных грибков, которые важны или интересны для сельского хозяйства, плодоовощеводства, растительной биомассы для получения молекул биотоплива и других химических веществ, и/или лесного хозяйства. Особый интерес имеют патогенные виды Pseudomonas (например, Pseudomonas solanacearum), Xylellafastidiosa; Ralstoniasolanacearum, Xanthomonascampestris, Erwiniaamylovora, виды Fusarium, виды Phytophthora (например, P. infestans), виды Botrytis, виды Leptosphaeria, мучнистые росы (Ascomycota) и ржавчинные грибы (Basidiomycota), и т.п.
Не имеющие ограничительного характера примеры искомых патогенов растений включают, например, Acremoniumstrictum, Agrobacteriumtumefaciens, Alternariaalternata, Alternariasolani, Aphanomyceseuteiches, Aspergillusfumigatus, Atheliarolfsii, Aureobasidiumpullulans, Bipolariszeicola, Botrytiscinerea, Calonectriakyotensis, Cephalosporiummaydis, Cercosporamedicaginis, Cercosporasojina, Colletotrichumcoccodes, Colletotrichumfragariae, Colletotrichumgraminicola, Conielladiplodiella, Coprinopsispsychromorbida, Corynesporacassiicola, Curvulariapallescens, Cylindrocladiumcrotalariae, Diplocarponearlianum, Diplodiagossyina, Diplodia spp., Epicoccumnigrum, Erysiphecichoracearum, Fusariumgraminearum, Fusariumoxysporum, Fusariumoxysporum f.sp. tuberosi, Fusariumproliferatumvar. proliferatum, Fusariumsolani, Fusariumverticillioides, Ganodermaboninense, Geotrichumcandidum, Glomerellatucumanensis, Guignardiabidwellii, Kabatiellazeae, Leptosphaerulinabriosiana, Leptotrochilamedicaginis, Macrophomina, Macrophominaphaseolina, Magnaporthegrisea, Magnaportheoryzae, Microsphaeramanshurica, Moniliniafructicola, Mycosphaerellafijiensis, Mycosphaerellafragariae, Nigrosporaoryzae, Ophiostomaulmi, Pectobacteriumcarotovorum, Pelliculariasasakii (Rhizoctoniasolani), Peronosporamanshurica, Phakopsorapachyrhizi, Phomafoveata, Phomamedicaginis, Phomopsislongicolla, Phytophthoracinnamomi, Phytophthoraerythroseptica, Phytophthorafragariae, Phytophthorainfestans, Phytophthoramedicaginis, Phytophthoramegasperma, Phytophthorapalmivora, Podosphaeraleucotricha, Pseudopezizamedicaginis, Pucciniagraminis subsp. Tritici (UG99), Pucciniasorghi, Pyriculariagrisea, Pyriculariaoryzae, Pythiumultimum, Rhizoctoniasolani, Rhizoctoniazeae, Rosellinia sp., Sclerotiniasclerotiorum, Sclerotininatrifoliorum, Sclerotiumrolfsii, Septoriaglycines, Septorialycopersici, Setomelanommaturcica, Sphaerothecamacularis, Spongosporasubterranea, Stemphylium sp, Synchytriumendobioticum, Thecaphora (Angiosorus), Thielaviopsis, Tilletiaindica, Trichodermaviride, Ustilagomaydis, Verticilliumalbo-atrum, Verticilliumdahliae, Verticilliumdahliae, Xanthomonasaxonopodis, Xanthomonasoryzae pv. oryzae.
В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения способы изобретения пригодны для скрининга антагонистических микроорганизмов против патогенов растений Aspergillu fumigatus, Botrytiscinerea, Cerposporabetae, Curvularia spp., Ganodermaboninense, Geotrichumcandidum, Mycosphaerellafijiensis, Phytophthorapalmivora, Phytophthoraramorum, Pythiumultimum, Rhizoctoniasolani, Rhizopus spp., Schizophyllum spp., Sclerotiniasclerotiorum, Verticilliumdahliae или Xanthomonasaxonopodis. В особенно предпочтительном варианте воплощения способы по изобретению могут быть использованы для идентификации микробных антагонистов, которые способны угнетать развитие нескольких патогенов растений, имеющих коммерческую значимость, включая Colletotrichumgraminicola, Fusariumgraminearum, Gibberellazeae, Monographellanivalis и Stagnosporanodurum.
Как только популяция микробных клеток была приведена в контакт с твердой микробной ростовой средой, содержащей патогенные клетки, микробная ростовая среда инкубируется с целью обеспечить ко-культивирование микробных клеток и патогена. Используемая среда может содержать один или более из следующего: питательные вещества, минералы, другие соединения, такие, как химические индукторы или ингибиторы клеточных процессов, соединения, участвующие в дыхательном метаболизме (например, акцепторы электронов) или в метаболизме клеточной энергии, или трансдукции, антибиотики или токсины, белки или пептиды, углеводы или нуклеиновые кислоты, соединения, которые могут влиять на клеточное взаимодействие или адгезию, субстраты ферментов, репортерные молекулы, т.п. Предпочтительно, среда является гомогенной, хотя для некоторых применений также предусмотрена ростовая среда, включающая градиенты одного или более ингредиентов среды вдоль ростовой поверхности. Например, может использоваться двумерный градиент двух наиболее важных ингредиентов в ростовой среде для тестирования того, что антагонистический штамм стабилен в диапазоне условий, с которым он сталкивается в течение роста. Также градиент может использоваться для определения концентрации сигнальных соединений, которые содействуют межклеточному взаимодействию между, например, микробным антагонистом и патогеном.
Ростовая среда может быть твердой или полужидкой. Например, может быть использована простая агаровая среда, подходящая для поддержания клеточной жизнеспособности, роста, клеточного деления и/или дифференцировки. Может быть адаптирован уровень рН в зависимости от тестируемых микроорганизмов и патогенов. Такие среды хорошо известны в области техники. Среда также может быть такой, которая обеспечивает селективный рост одного или более видов микроорганизмов или индуцирует определенные изменения (например, образование спор или начало развития).
Как раскрывается далее в деталях ниже, могут быть использованы разнообразные методики, известные в области техники, для оценки эффекта, полученного в результате контакта между патогеном и каждым из образцов микроба-кандидата. Соответственно, условия инкубации (и ростовая среда) также могут варьировать в зависимости от микроорганизмов и фенотипических характеристик, которые следует анализировать. Так, избранная(ые) температура(ы) инкубации может(гут) варьировать, период(ы) инкубации может(гут) варьировать, влажность может варьировать, могут использоваться аэробные или анаэробные условия (например, для факультативных анаэробов требуются анаэробные условия) и т.п. Предпочтительно, когда инкубируются бактерии, время инкубации составляет, по меньшей мере, приблизительно, 20 минут, что обеспечивает образование микро-колоний, содержащих, например, в среднем, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более клеток на микро-колонию. Периоды инкубации могут находиться в диапазоне от 20 минут до нескольких часов, приблизительно, до восьми часов.
Мультитестовая платформа: В данном контексте термин «мультитестовая платформа» подразумевает охватывать любые удобные способы содержания одной или более реакционных смесей, суспензий, или микробных ростовых сред. Как таковые, результаты ряда скрининговых событий могут быть собраны на одной поверхности, приводящей в результате к «мультитестовой платформе», имеющей или состоящей из множества элементов или частей, чтобы работать в более чем одном эксперименте. Подразумевается, что термин «мультитестовая платформа» охватывает микротитровальные планшеты, многолуночные планшеты, микрокарты, тестовые пробирки, чашки Петри, чашки Петри с внутренними разделителями для разделения пространства в чашке на две или более отдельных камер, каждая камера пригодная для содержания отдельной микробной ростовой среды. Несмотря на то, что можно рассматривать много пригодных дизайнов, мультитестовая платформа в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно в форме закрытого или открытого контейнера, такого, как, микропланшет, микротитровальный планшет, многолуночный планшет, чашка Петри, лоток, предметное стекло и тестовая пробирка.
В некоторых вариантах воплощения мультитестовая платформа в соответствии с настоящим изобретением может, в частности, быть изготовленной из пластикового/полимерного субстрата, такого, как поливинилхлоридный субстрат, полиэтиленовый субстрат, полипропиленовый субстрат, поликарбонатный субстрат, акрилнитрил бутадиен стироловый субстрат, полиметилметакрилатный субстрат или полистироловый субстрат, из стеклянного субстрата или из металлического субстрата.
Для целей настоящего раскрытия термин «микротитровальный планшет» относится к планшету с резервуарами или лунками различных дизайнов, как он используется в биологическом или химическом анализе. Он подразумевает означать субстрат, имеющий одну или множество дискретных камер, подходящих для содержания жидкости. Примерные микротитровальные планшеты включают, например, «микропланшеты» «многолуночные планшеты» либо «n-луночные планшеты», где «n» является количеством лунок, включая, например, 8-, 12-, 16-, 24-, 96-, 384- или 1536-лунок. Микротитровальный планшет может иметь лунки с любой из форм поперечного сечения, включая, например, цилиндрические, квадратные, прямоугольные, многогранные, смыкающиеся формы, где дно лунок плоское, коническое, заостренное или круглое. Термины «микротитровальный планшет» призваны охватить стандартные микротитровальные планшеты и микропланшеты, обычно используемые в области техники и коммерчески доступные из множества источников научного снабжения, включая Corning (Corning, NY), BD Bioscience (Bedford, MA), Greiner Bio-One (Monroe, NC). Однако не подразумевается, что настоящее изобретение должно быть ограничено определенным типом формата. Например, в настоящем изобретении пригодны планшеты с 384, 96, 48, 24 и 12 лунками, однако могут использоваться планшеты с другими количествами лунок. Форма лунок не ограничена круглой или в значительной степени круглой лункой. Например, в настоящем изобретении могут использоваться преимущественно квадратные лунки, наряду с лунками, которые преимущественно прямоугольные, треугольные, овальные или неправильной формы. Форма самого микротитровального планшета сама по себе также не ограничена любой конкретной формой, хотя он обычно в значительной степени плоский и, в общем, может быть прямоугольным или квадратным.
Мультитестовая платформа в соответствии с некоторыми вариантами воплощения изобретения может иметь, по меньшей мере 3 камеры, по меньшей мере 4, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 6, по меньшей мере, 7, по меньшей мере, 8, по меньшей мере, 9; по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 40, по меньшей мере, 60, или, по меньшей мере, 90 камер.
Далее, в мультитестовой платформе в соответствии с некоторыми вариантами воплощения каждая камера может, в соответствии с определенными вариантами воплощения, быть разделенной на, по меньшей мере, 3 углубления, по меньшей мере, 4, по меньшей мере, 5, по меньшей мере, 6, по меньшей мере, 7, по меньшей мере, 8, по меньшей мере, 9; по меньшей мере, 10, по меньшей мере, 15, по меньшей мере, 20, по меньшей мере, 40, по меньшей мере, 60 или, по меньшей мере, 90 углублений.
Термин «мультиплексный» в данном контексте подразумевает означать одновременное и отдельное проведение множества анализов на одной или более мультитестовых платформ. Мультиплексирование далее может включать одновременное проведение множества скрининговых событий в каждом из множества отдельных образцов. Например, количество анализируемых образцов может быть основано на количестве лунок в многолуночном планшете и количестве тестов, проводимых в каждой лунке. Не имеющее ограничительного характера приведение примеров таких многолуночных планшетов включает 24-луночные, 48- луночные, 96- луночные, 384- луночные или 1536- луночные микротитровальные планшеты, которые могут быть пригодными в настоящем изобретении, хотя специалисту в области техники ясно, что не каждая микротитровальная лунка должна содержать индивидуальный микробный штамм. В зависимости от размера микротитровального планшета и количества индивидуальных микроорганизмов в каждой лунке одновременно может проводиться очень большое количество тестов. Хотя мультиплексирование приводится в Примерах 3-4 в отношении к микротитровальным планшетам, будет понятно, что для мультиплексирования могут быть использованы и другие форматы.
Систематический скрининг может проводиться либо вручную, либо с помощью технологий, включая многоканальные пипеточные дозаторы, технологии, связанные с микротитровальными планшетами (т.е. 96-луночными или 384-луночными планшетами), и роботами. Предполагается, что роботы могут использоваться для скрининга микроорганизмов, используя способ в соответствии с настоящим изобретением с целью обнаружения тех микроорганизмов, которые обладают новыми и более эффективными биоконтролирующими способностями. Существует много преимуществ в использовании роботической технологии, включая масштабируемость, высокую эффективность, постоянные и долгосрочные эксплуатационные характеристики, высокую надежность, эффективность затрат и сниженный уровень ошибок. Таим образом, скрининг роботами имеет дополнительное существенное преимущество над существующими ручными способами, так как он может быть использован в необычных физических и химических условиях (например, анаэробных, восстанавливающих или окисляющих атмосферах, или при обращении с токсическими или опасными химическими соединениями, включая радионуклиды, токсические летучие органические соединения). При обработке патогенов такие соображения очень важны, поскольку роботические системы способны работать в экстремальных и вредных условиях, где может быть небезопасными или нежелательным использовать работников - людей.
Скрининг может использовать любые подходящие аналитические способы. Они могут состоять из спектроскопических анализов (включая колориметрические анализы и измерения биомассы путем измерений оптической плотности), флуориметрию, электрофоретические способы, хроматографию (включая высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), жидкостную экспресс-хроматографию белков (ЖЭХБ), газовую хроматографию (ГХ), газовую хроматографию с масс-спектроскопией (ГХ/МС)), атомно-абсорбционную спектроскопию, индуктивно связанную плазму и анализы, использующие радиоактивные соединения и радионуклиды.
Использование скрининговых способов изобретения
Раскрываемые здесь высокоэффективные скрининговые способы могут использоваться для разнообразных скрининговых целей. В одном конкретном не имеющем ограничительного характера пояснении примером большое количество микроорганизмов - кандидатов может быть собрано и впоследствии подвергнуто скрининговой процедуре, в которой микроорганизмы тестируются на свои потенциальные способности быть антагонистами в отношении единичного целевого патогена с целью идентификации микроорганизмов, способных ингибировать или предотвращать развитие целевого исследуемого патогена.
Альтернативно, в другом не имеющем ограничительного характера пояснении примером также рассматривается, что скрининговые способы в соответствии с настоящим раскрытием могут быть использованы в обратной скрининговой стратегии, в которой проводится скрининг единичного микроба или панели предопределенных панелей микробов против большого количества патогенов с целью идентификации патогенов, чье развитие или патогенная активность ингибируется или предотвращается предопределенным микробом(ами). Таким образом, обратный скрининг настоящего изобретения производит отбор скорее, для, чем против, целевых патогенов.
В еще другом, не имеющем ограничительного характера, пояснении примером антагонистические микроорганизмы могут быть протестированы в комбинации, т.е. культуры изолированных штаммов могут быть смешаны перед тем, как быть подвергнутыми анализу на антагонизм. Выполнение таких способов особенно полезно при оценке взаимодействий in vivo множественных антагонистов. Например, в некоторых случаях определенные микробные комбинации вызывают вредные или антагонистические взаимодействия, в то время как в других случаях некоторые микробные взаимодействия действуют синергично для предоставления дополнительной выгоды процедуре биоконтроля.
Способы, раскрываемые в данном изобретении, также могут быть использованы для идентификации физиологических условий для повышенного биологического контроля. Экстенсивный скрининг является критическим, так как в процессе биоконтроля должны быть использованы микроорганизмы с наилучшими активностями биоконтроля для конкретного применения и условий с целью реализации полного экономического, эффективного для окружающей среды потенциала биологического контроля. Применение микроорганизмов с самыми высокими эффективностями прямо транслируется в более низкие затраты на биоконтроль. В добавление, открытие новых или более эффективных систем, используя данное изобретение, позволит применять новые стратегии к ситуациям, которые в настоящее время считаются неподдающимися биоконтролю.
В добавление, как обсуждается более детально ниже, специалисту в области техники будет сразу ясно, что с помощью скрининговых способов изобретения могут одновременно тестироваться широкие диапазоны условий скрининга, микроорганизмов, патогенов и их комбинаций, тем самым обеспечивая быстрое и удобное расширение масштаба скринингового процесса. В целом, легко доступны разнообразные автоматизированные, масштабируемые технологии, использующие форматы многолуночного микротитровального планшета, и они могут быть использованы для расширения масштабов скрининговых способов в соответствии с настоящим изобретением. Следующие примеры существующих автоматических технологий предлагаются путем иллюстрации, и никоим образом не путем ограничения.
Быстрый сбор скрининговых данных может быть проведен и впоследствии рассчитан при помощи роботов, тем самым способствуя быстрому применению подходящих микробных организмов в полевых условиях для применений биоконтроля. Роботический скрининг предоставляет общее решение для обнаружения лучших наборов микробных штаммов для данного патогена, растения-хозяина и /или условия роста. Для эффективных применений биоконтроля после того, как будут охарактеризованы популяции патогена, растение-хозяин и условия участка, может быть создана библиотека, которая может быть индексирована по патогенам первостепенного приоритета и затем перекрестно проиндексирована по условиям окружающей среды участка и протестированным условиям. Затем могут стать доступными наилучшие микробные антагонисты для тестирования с помощью роботической автоматизации в условиях, которые имитируют актуальные условия на участке, включая ко-патогенные смеси, для дальнейшего определения наилучших микроорганизмов и условий в библиотеке для применений биоконтроля на конкретном участке.
Если известны условия участка, включая химию и микробную экологию, скрининги с помощью робота могут быть полезными для идентификации дополнений, необходимых для повышения либо природной микробной флоры, либо добавленных антагонистических штаммов для оптимальной эффективности биоконтроля. Микробные изоляты из окружающей среды, полученные из целевого природного окружения, могут быть подвергнуты скринингу, и затем можно будет провести поиск родственных организмов в базе данных. Знание о том, как ведут себя родственные микробные штаммы, может быть использовано, чтобы «перескочить» к определению первоначальных рабочих параметров для изолятов из окружающей среды. Скрининги с помощью робота могут затем быть использованы для настройки рабочих параметров для конкретных условий участка и либо антагонистические микроорганизмы могут быть повторно введены, либо условия участка могут быть изменены для улучшения эффективности биоконтроля.
В скриниговые способы настоящего изобретения могут быть инкорпорированы многочисленные роботические системы, включая рельсовую систему с роботическим(и) манипулятором(и), такую, как Tecan Robotic Assay Composer (Tecan, N.C) или трехосевой объемный роботический манипулятор, такой, как Zymate Microplate Management System (Zymark Corp., Mass.). Предпочтительный вариант воплощения настоящего изобретения включает BioMek FX P - контролируемую компьютером роботическую рабочую станцию.
Данные, генерируемые высокоэффективным скринингом в соответствии с настоящим изобретением (например, ростовые характеристики, характеристики ростового взаимодействия, урожай семян, масса семян, урожайность растения и тяжесть инвазии) могут быть проанализированы с использованием компьютеризированных систем. Например, эффект взаимодействия микроб - патоген может быть оценен компьютеризированным «ридером» или сканнером, и количественная оценка ингибирования роста или связывания зонда с индивидуальным микробным образцом на тестовой платформе могут быть выполнены с использованием компьютерных алгоритмов. Подобным образом, может использоваться ридер для детекции наличия (или отсутствия) роста клеток в оцениваемых культурах. Такой анализ тестов может быть отнесен к «автоматической детекции» в том, что данные собираются автоматизированной считывающей системой.
Для примеров, где используются методики молекулярного мечения для оценки и/или детекции антагонистического воздействия микробных антагонистов на развитие патогенов, метки (например, гибридизационные метки), которые испускают определяемые электромагнитные волны или частицы, испускаемые свет (например, флуоресценцию или люминесценцию) или радиоактивность, могут быть определены чувствительными камерами, конфокальными сканнерами, устройствами для анализа изображения, радиоактивной пленкой или PhosphorImager, которые захватывают сигналы (такие, как цветное изображение) из матрицы. Компьютер с программным обеспечением анализа изображения затем производит детекцию данного изображения и анализирует интенсивность сигнала для каждой локализации микробного образца (пятна) в мультитестовой платформе. Затем происходит сравнение сигналов между пятнами на единичной тестовой платформе или между тестовыми платформами (такими, как единичная платформа, которая последовательно зондируется многими различными молекулами-зондами).
Компьютерный алгоритм также может быть использован для сравнения между пятнами на единичной тестовой платформе или на множественных тестовых платформах. В добавление, данные из скрининга могут храниться в форме, читаемой компьютером.
В добавление, автоматизированные ридеры (сканнеры) могут контролироваться компьютером и программироваться программным обеспечением для управления индивидуальными компонентами ридера (например, механическими компонентами, такими, как моторы, компонентами анализа такими, как интерпретация сигнала и вычитание фона). Необязательно также может предоставляться программное обеспечение для контроля графического пользовательского интерфейса и одной или более систем для сортировки, категоризации, хранения, анализирования или обработки иным образом вывода данных ридера.
Путем примера, для того, чтобы в соответствии с данным изобретением «читать» результат мультитестовой платформы, которая была анализирована с микробными образцами, способными к подавлению развития патогена (например, схема ингибирования), тестовая платформа может быть помещена внутри (или сверху, или снизу, и т.п., в зависимости от расположения детекторной системы) ридера, и определяемый сигнал, служащий индикатором способности подавлять тестируемого микробного образца, может быть обнаружен ридером. Те пятна, при которых микробный образец угнетал рост патогена, продуцируют определяемый сигнал, служащий индикатором способности подавлять рост. Эти определяемые сигналы могут быть связаны с сигналом, идентифицирующим пятно, определяющим участок комплекса. Ридер собирает информацию от каждого из пятен, ассоциирует ее с сигналом, идентифицирующим пятно, и распознает пятна с определяемым сигналом как такие, которые отличаются от пятен, не продуцирующих подобный сигнал. Определенные ридеры также способны определять непосредственные уровни сигнала, между полным отсутствием сигнала и высоким сигналом, так что делается возможным количественное определение сигналов на индивидуальных пятнах.
Определенные ридеры могут использоваться для сбора данных из тестовой платформы данного изобретения, «читающей» матрицу в соответствии с данным изобретением, которая была подвергнута анализу с определяемым зондом для получения в результате связывания (например, схема связывания). Те пятна, на которых зонд связался с иммобилизированным полипептидным или полинуклеотидным образцом, предоставляют обнаруживаемый сигнал, например, в форме электромагнитного излучения, который затем может быть определен ридером.
Определенные другие ридеры, которые могут использоваться для сбора данных из мультитестовых платформ в соответствии с данным изобретением, особенно тех, которые зондировались с применением молекулы, меченной флуоресцеином, будут включать источник света для эмиссии оптического излучения. Длина волны света возбуждения обычно будет в ультрафиолетовом диапазоне или в диапазоне видимого света, однако в некоторых ситуациях она может быть расширена в инфракрасный диапазон. Светоделитель может направлять луч возбуждения, испускаемый ридером, на линзу объектива, которая, например, может быть смонтирована таким образом, что может двигаться в x, y и z направлениях в зависимости от поверхности субстрата матрицы. Линза объектива фокусирует свет возбуждения на матрицу и, более конкретно, на цели (микробные клетки) на матрице. Свет длин волн, более длинных, чем свет возбуждения, эмитируется из адресов на матрице, которые содержат молекулы зонда, меченные флуоресцеином (т.е. те адреса, которые содержат клетку, с которой связывается зонд).
В определенных вариантах воплощения изобретения мультитестовая платформа может быть передвижным способом размещена на ридере после того, как она будет прочитана, так, что сама мультитестовая платформа двигается, в то время как ридер проводит детекцию информации с каждого пятна. Альтернативно, мультитестовая платформа в ридере может быть стационарной, в то время как система детекции ридера двигается от края до края, или вверх, или вокруг мультитестовой платформы для детекции информации от пятен матрицы. Ридеры матрицы со специфическим движущимся форматом известны и описаны, например, в U.S. Pat. No. 5922617. Примеры способов для генерирования сигналов для фокусирования хранения оптических данных и отслеживания также известны (см., для примера, U.S. Pat. No. 5461599).
В некоторых предпочтительных вариантах воплощения способ изобретения далее включает этап разделения каждого из микробных образов на популяции единичных клеток перед или одновременно с контактированием микробных образцов с популяцией патогена. В некоторых предпочтительных вариантах воплощения этап разделения содержит серийные разведения микробных образцов. В некоторых других предпочтительных вариантах воплощения этап разделения содержит использование сортирования клеток методом проточной цитофлуориметрии (FACS), в котором гетерогенная смесь микробных клеток может быть физически разделена на две или более субпопуляций клеток, с высоким уровнем чистоты, для дальнейшего анализа. Сортированные клетки затем могут быть изолированы, наращены и далее обогащены с помощью FACS, лимитирующих разведений или других методик очистки клеток, известных в области техники, перед или одновременно с контактированием с патогеном. Разнообразные методики FACS хорошо известные в области техники, которые могут быть использованы в высокоэффективном формате, тем самым могут быть полезными дл способов настоящего изобретения.
Способы для оценки и/или детекции антагонистической активности микробных антагонистов против развития патогена
Разнообразные методики, известные в области техники, могут быть использованы для оценки эффекта, явившегося результатом контакта между патогеном и каждым из образцов микроба-кандидата, и такие, как способы для оценки продукции и/или секреции определенных химических соединений, соединений дистанционных микроб-микробных взаимодействий или метаболитов. В одном аспекте продукция определенных химических соединений может быть оценена ферментными, флуорогенными и/или хромогенными анализами, известными в области техники. В контексте настоящего изобретения термин «хромогенный субстрат» или «хромогенное вещество» или «хромоген» используется взаимозаменяемо в отношении предшественника биохимического пигмента. Также следует понимать, что, в частности, хромоген может быть субстратом, веществом или соединением, которое, будучи метаболизировано микробом, продуцирует характеристический цвет или пигмент, который пригодный в качестве средства детекции и/или идентификации микроба. Путем примера, Trichoderma, антагонист грибков, который продуцирует ряд ферментов, направленных против клеточных стенок патогенных грибков. Ферментный анализ может быть использован в высокоэффективном формате для целей детекции продукции антибиотика микробными образцами, содержащими микроб Trichoderma. Другие, не имеющие ограничительного характера примеры ферментов, продуцируемых микробными антагонистами, для которых легко доступны ферментные анализы для использования в высокоэффективном формате, включают хитиназу (Bacillus spp., Sadfi et al., 2001, supra) и специфическую протеазу (Rhizobium leguminosarum, U.S. Pat. Appl. No. US US20060029576). В другом примере патогены, которые получают генно-инженерным способом с целью продуцирования зеленого флуоресцентного белка (ЗФБ) или «маркерного» соединения, которое легко выявляется и/или количественно определяется в ответ на взаимодействие с биоконтролирующими микробами, могут быть включены в высокоэффективный формат, так, что интерференцию микробных образцов с ростом патогена можно было бы легко выявить и/или количественно определить.
Другой аспект настоящего изобретения предоставляет способы, где, по меньшей мере, культивированный штамм микроорганизма, называемый репортерным штаммом, добавляется в среду, так, что по росту или генетическому ответу репортерного штамма выявляется продукция микробными образцами, по меньшей мере, одного соединения.
В некоторых специфических примерах раскрываемых способов клетки изолируются из сложных природных сообществ и анализируются в индивидуальных камерах, например, в лунках микротитровальной чашки или резервуара. В определенных вариантах воплощения клетки разделены таким образом, что, в среднем, только, приблизительно, одна или несколько клеток размещены в каждом резервуаре, например, путем клеточной сортировки способом проточной цитометрии (FACS) или разведения. Индивидуальные камеры, (например, лунки микротитровальной чашки) содержат среды, подходящие для микробного роста, такие как картофельный декстрозный агар или другие среды, которые могут содержать добавленные соединения, которые могут поддерживать рост микроорганизмов. Ростовые камеры (например, микротитровальные чашки) инкубируются в течение времени, достаточного для обеспечения роста микроорганизма-кандидата, и обнаруживается и может быть количественно оценено воздействие микробного роста на развитие патогена. Клеточный рост может быть обнаружен и/или количественно определен, например, с использованием изменений в флуоресценции или рассеяния света. Путем примера, проточная цитометрия или микроскопия могут служить средствами детекции таких сигналов флуоресценции и рассеяния света.
Когда в качестве средств обнаружения/количественного определения клеток используется прямое микроскопирование, клетки вначале могут быть помещены в или на клеточные матрицы. Такие клеточные микроматрицы могут создаваться путем использования процедуры создания клеточных микроматриц, которая хорошо известна в области техники и включает помещение клеток в двумерные матрицы на матричный субстрат, такой, как фильтр или поликарбонат, стекло или какой-нибудь другой материал.
Избранные микробные клетки могут далее охарактеризовываться. Например, таксономия избранных микробных клеток может быть идентифицирована с использованием гибридизации зондов нуклеиновой кислоты с нуклеиновыми кислотами, содержащимися в избранных клетках, с использованием молекул-зондов, меченных меткой, такой, как флуоресцентная метка или другая химическая или физическая метка. Микробные клетки альтернативно могут быть идентифицированы при помощи процедуры для получения генных последовательностей из очень малого числа клеток, суспендированных при низких плотностях в жидкой среде. Эта процедура генного секвенирования также может быть использована для идентификации клеток, содержащих специфические гены.
Способы для таксономической идентификации
После того, как микроорганизм отобран путем скрининговых способов, раскрываемых данным изобретением, часто полезно его таксономически идентифицировать. Специалисту в области техники будет ясно, что таксономическая классификация изолятов микроорганизмов может быть определена разнообразными методиками, включая, но не ограничиваясь, (1) гибридизацией зонда нуклеиновых кислот с молекулой нуклеиновой кислоты указанных микробных изолятов; (2) амплификацией молекулы нуклеиновой кислоты указанных микробных изолятов; (3) иммунодетекцией молекулы указанных микробных изолятов; (4) секвенированием молекулы нуклеиновой кислоты, происходящей из указанных микробных изолятов; или комбинацией двух или более из этих методик.
Поэтому идентификация организма может охватывать до нескольких различных уровней анализа, и каждый анализ может основываться на различных характеристиках организма. Такие анализы могут включать анализ, основанный на нуклеиновых кислотах (например, анализ индивидуальных специфических генов, как их наличия, так и их точной последовательности, или экспрессии определенного гена или семейства генов), анализ, основанный на белках (например, на функциональном уровне, используя прямые или непрямые ферментные тесты, или на структурном уровне, используя методики иммунодетекции), и так далее.
Перед выполнением интенсивного молекулярного анализа изолированных культур может быть полезным подтвердить, что микробная культура произошла из единичной клетки, и поэтому является чистой культурой (кроме тех случаев, когда, как обсуждается в ином месте в этом раскрытии, микроорганизмы намеренно смешиваются). Микроорганизмы часто можно различить на основе прямого микроскопического анализа (если все клетки в образце при исследовании выглядят одинаково), характеристик окрашивания, простого молекулярного анализа (такого, как определение простого полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ)), и так далее. В определенных вариантах воплощения изобретения, однако, не является абсолютно необходимым выполнять такие этапы подтверждения чистоты, так как смешанные микробные культуры станут явными в последующем анализе.
a. Анализ, основанный на нуклеиновых кислотах: В определенных вариантах воплощения изобретения способы, предоставляемые для идентификации микроорганизмов, включают амплификацию и секвенирование генов из очень маленького количества клеток. Предоставляемые процедуры поэтому преодолевают проблемы концентрирования клеток и их ДНК из разбавленных суспензий. Предоставляемые процедуры могут быть использованы для идентификации клеток путем секвенирования генов или для идентификации клеток, которые имеют специфические гены или семейства генов.
Термин «амплификация нуклеиновой кислоты», в основном, относится к методикам, которые увеличивают количество копий молекулы нуклеиновой кислоты в образце или препарате. Методики, пригодные для амплификации, хорошо известны в области техники. Примером амплификации нуклеиновой кислоты является полимеразная цепная реакция (ПЦР), в которой биологический образец, отобранный от субъекта, контактируется с парой олигонуклеотидных праймеров в условиях, обеспечивающих гибридизацию праймеров с матрицей нуклеиновой кислоты в образце. Праймеры удлиняются в подходящих условиях, диссоциируются от матрицы и затем вновь отжигаются, удлиняются и диссоциируются для амплификации количества копий нуклеиновой кислоты. Другие примеры методик амплификации in vitro включают амплификацию с замещением цепей, изотермическую амплификацию без транскрипции, амплификацию репарационной цепной реакцией, лигазную цепную реакцию; амплификацию лигазной цепной реакцией с заполнением гэпа; сопряженную детекцию лигазы и ПЦР; и амплификацию без транскрипции РНК.
В добавление к иллюстративным примерным предоставляемым здесь праймерам, также были созданы праймеры, и постоянно создаются новые праймеры для индивидуальных видов или филогенетических групп микроорганизмов. Такие узконаправленные праймеры могут быть использованы с описываемыми здесь способами для конкретного скрининга и/или идентификации только исследуемых микроорганизмов.
Способы для приготовления и использования праймеров нуклеиновых кислот описаны, например, в Sambrook et al. (In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989), Ausubel et al. (ed.) (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998). Аплификационные пары праймеров могут быть получены из известной последовательности, например, путем использования компьютерных программ, предназначенных для этой цели, таких, как Primer (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, Mass.). Обычному специалисту в области техники будет ясно, что специфичность конкретного зонда или праймера увеличивается с его длиной. Так, например, праймер, содержащий 30 последовательных нуклеотидов рРНК-кодирующего нуклеотида или его флангирующий участок, будет отжигаться к таргетной последовательности с более высокой специфичностью, чем соответствующий праймер из только 15 нуклеотидов. Так, с целью получения большей специфичности, могут быть отобраны зонды и праймеры, которые содержат, по меньшей мере, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 или более последовательных нуклеотидов таргетной нуклеотидной последовательности, такой, как 16S рРНК.
Распространенные методики для приготовления нуклеиновых кислот, пригодных для применений нуклеиновых кислот (например, ПЦР) включают экстракцию фенолом/хлороформом или использование одного из многих наборов для экстракции ДНК, которые имеются на рынке. Другой путь состоит в том, что ДНК может быть амплифицирована путем добавления клеток напрямую в реакционную смесь амплификации нуклеиновых кислот и опоре на денатурационный этап амплификации для лизирования клеток и высвобождения ДНК.
Продукт реакций амплификации нуклеиновых кислот может далее быть охарактеризован одной или более из стандартных методик, которые хорошо известны в области техники, включая электрофорез, характеристики расщепления рестрикционными эндонуклеазами, гибридизацией или сшиванием олигонуклеотидов и/или секвенированием нуклеиновых кислот. Когда для целей клеточной идентификации используются методы гибридизации, могут быть пригодными разнообразные способы мечения зондов, включая мечение флуоресцеином, радиоактивное мечение и не-радиоактивное мечение.
b. Анализ, основанный на белках: В добавление к анализу нуклеиновых кислот микроорганизмы, отбираемые с использованием способов настоящего изобретения, могут быть напрямую охарактеризованы и идентифицированы на основе присутствия (или отсутствия) специфических белков. Такой анализ может быть основан на активности специфического белка, например, путем ферментного анализа или ответа ко-культивируемых организмов, или через простое присутствие специфического белка (который, например, может быть определен путем использования иммунологических способов, таких как окрашивание иммунофлуоресцентными антителами in situ).
Ферментные анализы: Путем примера, флуоресцентные или хромогенные аналоги субстрата могут быть включены в ростовую среду (например, культуры микротитровального планшета) с последующей инкубацией и скринингом продуктов реакции, тем самым идентифицируя культуры на основе их ферментных активностей.
Ответ ко-культивирования: В некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения активность фермента, носимого микробным изолятом, может быть проанализирована на основе ответа (или степени ответа) ко-культивируемого организма (такого, как репортерный организм).
Также могут быть использованы разнообразные способы для идентификации микроорганизмов, отобранных и изолированных из источника окружающей среды, путем связывания, по меньшей мере, одного антитела или молекулы, происходящей из антитела, с молекулой, или более конкретно, эпитопом молекулы микроорганизма.
Белковые антитела против микроорганизма могут быть получены с использованием стандартных методик, описанных в ряде учебников, включая Harlow and Lane (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988). Определение того, что конкретный агент связывается в значительной степени только с белком желательного микроорганизма, может быть легко выполнено с использованием рутинных процедур или адаптируя рутинные процедуры. Один подходящий тест in vitro использует методику вестерн-блоттинга (описанную во многих стандартных учебниках, включая Harlow and Lane (Antibodies, A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1988)).
Более короткие фрагменты антител (молекул происходящих из антител, например, FAb, Fv и одноцепочечных Fv (SCFv)) также могут служить специфическими связывающими агентами. Способы приготовления этих фрагментов являются рутинными.
Детекция антител, которые связываются с клетками на матрице данного изобретения, может быть выполнена путем использования стандартных методик, например, ИФА анализов предоставляющих сигналы, которые можно выявить, например, флуоресцентный или люминесцентный сигнал.
Обсуждение общих способов, предоставленных здесь, предназначено только для иллюстративных целей. Другие альтернативные способы и варианты воплощения будут очевидными для специалиста в области техники после обзора данного раскрытия. Следующие примеры предлагаются для того, чтобы проиллюстрировать, но не ограничить, данное изобретение.
Был описан ряд вариантов воплощения изобретения. Тем не менее, будет понятно, что элементы описанных здесь вариантов воплощения могут быть скомбинированы для образования новых вариантов воплощения, и могут быть выполнены различные модификации без отступления от сущности и объема изобретения. Соответственно, другие варианты воплощения, альтернативы и варианты находятся в рамках изобретения и заявляются здесь. Заголовки в применениях являются исключительно для удобства читателя, и никоим образом не ограничивают объем изобретения или его вариантов воплощения.
Все публикации и заявки на патент, упомянутые в этом описании, здесь включены посредством ссылки в той же степени, как если бы о каждой индивидуальной публикации или заявке на патент было конкретно и индивидуально указано то, что она включена в настоящую заявку посредством ссылки.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1: Изолирование микроорганизма из образцов окружающей среды
-1
-2
-3
-4
-5
-6
-7
Изолирование бактерий: Для изолирований бактерий каждую часть образца, состоящую из грунта, растительной ткани или обоих добавляли в 20 мл стерильного забуференного фосфатами физраствора (ЗФФр) и обрабатывали ультразвуком на льду в течение двух 1-минутных интервалов при 8 ваттах с использованием Fisher Scientific Sonic Dismembrator. Полученную в результате суспензию разводили до концентраций 10, 10, 10, 10, 10, 10 и 10 и 100 мкл каждого 10-кратного разведения распределяли по поверхности культуральных чашек, содержащих микробную ростовую среду, отвержденную агаром и 100 мг/л циклогексимида для ингибирования грибкового роста. Предпочтительной ростовой средой была общая, неселективная среда, такая, как R2A [Reasoner et al., Appl. Environ. Microbiol. 38 (2):229-236)], или среда, используемая с намерением таргетинга специфических типов микробов, таких, как способных расти в отсутствие азота. Культуральные чашки инкубировали до 7 дней и изолированные колонии отбирали в жидкую ростовую среду и позволяли расти до видимой мутности. Чистые культуры изолятов группировали на матрице в 96-луночных планшетах, чтобы обеспечить перенос шпилечным инструментом в планшеты анализа биоконтроля.
Изолирование грибков: Образцы окружающей среды раздельно помещали на поверхность 6% (в/о) NaCl агара и инкубировали в течение 7-10 дней при 28°C. После образования зрелых колоний споры из единичных конидиофоров точечно инокулировали в картофельную декстрозную агаровую среду (КДА) и выращивали при 28°C как описано выше. Чашки осматривали ежедневно на наличие контаминантов и повторно изолировали для чистоты культуры. После того, как чистые колонии стали зрелыми, споры были точечно инокулированы в стандартную среду, включающей солодово-пептонный агар, дрожжевой агар Чапека и агар Чапека для идентификации видов Aspergillus с использованием стандартных морфологических способов.
TM

Изолирование эндофитов: Растительные образцы были разрезаны на сегменты в 5-10 см, погружены в 70% этанол на 20 секунд и быстро обожжены для стерилизации. Были приготовлены до трех видов агаровых чашек с различными селективными свойствами (водный агар; 0,1x КДА; и АСГ (анаэробная среда Гифу) богатых питательными веществами сред с добавкой гентамицина]. Растительные тканевые слои систематически и асептически удалялись, начиная с самого наружного слоя (кора). Поместите 3-5 см кусок тканевого слоя (внутренней стороной вниз) на чашку с ростовой средой. Принадлежности стерилизовались между слоями путем погружения в этиловый спирт и прожигания. Последующий слой растительной ткани (наружная сердцевина и внутренняя сердцевина) удалялись и помещались на чашку с ростовой средой (обычно равномерно распределенные на одной и той же чашке). После того, как каждый слой ткани был помещен на чашку на каждый тип ростовой среды, чашки оборачивались в Parafilm и переносились в 16-литровую камеру Sterilite с добавлением небольшого кусочка шарика от моли или нафталина (~5 мг) для предотвращения роста клещей. Обычно, проводили мониторинг роста эндофитов через 3 дня и, затем, каждый день до 45 дней.
ПРИМЕР 2: Рост и приготовление патогена
600
Исследуемый патоген использовался для инокуляции 500-мл флакона, содержащего 6,0 г смеси картофельного декстрозного бульона (КДБ) и 250 мл воды MilliQ, с последующей инкубацией на шейкере и сбора по достижению высокой мутности (ОП≈1,0). Эта инкубация для бактериальных культур занимала обычно только одну ночь, однако для некоторых грибковых изолятов длилась до двух недель.
600
600
В случае грибковых патогенов мицелий, формировавшихся в жидкой культуре, обычно требовалось гомогенизировать и профильтровать перед добавлением в среду КДА с целью обеспечения равномерной концентрации по всему объему анализа или чашке. Двадцать миллилитров вышеупомянутой культуры добавляли в 50-мл пробирку Falcon вместе с 20-30 стерильными 4-мм стеклянными шариками с последующими повторными перемешиваниями на вортексе (1 мин. или более) с тем, чтобы разбить мицелий на маленькие кусочки. Гомогенизированная культура затем пропускалась через стерильный клеточный фильтр с размером пор 40 мкм в стерильную 50-мл пробирку Falcon для удаления больших скоплений. Иногда требовалось центрифугирование при низкой скорости для облегчения фильтрации. ОП получаемого в результате фильтрата определялась путем использования спектрофотометра и доводилась до ОП=0,05 с использованием стерильного КДБ. При работе с бактериальными патогенами этап гомогенизирования, как правило, пропускался.
ПРИМЕР 3: Приготовления чашек с патогеном для высокоэффективных анализов на антагонизм
TM
600
В основном, требовалось пятьсот миллилитров ростовой среды для, приблизительно, 30 чашек для анализа биоконтроля, которые были достаточны для скрининга ~2800 изолятов. Данный рецепт был масштабирован в сторону уменьшения в соответствие с более маленькими скринингами, так как чашки для анализа предпочтительно использовать в тот же день, когда они были приготовлены. Двенадцать грамм КДБ и 10 г агара было добавлено в 1-литровый флакон вместе с большим магнитным элементом магнитной мешалки с последующим доведением объема до 500 мл при помощи воды MilliQ. Затем флакон автоклавировали и ~15 мл КДА распределяли на чашках с одной лункой OmniTray (Nalge Nunc International, Rochester, NY), убеждаясь в том, что покрывается все дно чашки. Чашкам давали остыть, предпочтительно, в ламинарном боксе с тем, чтобы поддерживалась стерильность и снижалась конденсация. В каждую чашку наливали один миллилитр суспензии клеток патогена при ОП 0,05. Для равномерного покрытия поверхности агара клетками патогена использовались либо стерильные шарики, либо распределитель клеток в форме хоккейной клюшки. Чашкам давали высохнуть тщательно в ламинарном боксе с крышками снятыми перед тем, как переходить к следующему этапу.
При необходимости клетки патогена смешивались с теплой средой КДА перед застыванием среды и, тем самым, они равномерно инкорпорировались в ростовую среду.
ПРИМЕР 4: Высокоэффективные анализы на антагонизм
Для переноса изолятов из 96-луночных бактериальных культуральных планшетов в планшеты анализа биоконтроля использовался стерильный шпилечный инструмент. Закрытые тестовые планшеты затем оборачивали в ParafilmTM и инкубировали при комнатной температуре. Большинство бактериальных изолятов должны были формировать колонии после 1-2 ночей, хотя иногда для некоторых бактериальных изолятов для того, чтобы стать видимыми, это занимало 3 ночи или дольше. Планшеты исследовали ежедневно и отмечались микробные образцы, которые, как оказывалось, ингибировали рост патогена в своей непосредственной близости. Микробное ингибирование роста патогена могло наблюдаться как чистая зона, окружающая микробную колонию. Изредка слабый ингибитор демонстрировал некоторую биоконтролирующую активность вначале, однако, в конечном счете, оказывался покрытым патогеном. Сильный микробный ингибитор, однако, демонстрировал в значительной степени большую зону просветления вокруг свой колонии неограниченно.
Всего был проведен скрининг, приблизительно, 3500 микробных изолятов на их способность угнетать развитие нескольких патогенов растений, включая Colletotrichumgraminicola, Fusariumgraminearum, Gibberellazeae, Monographellanivalis и Stagnosporanodurum. Таблица 1 является кратким итогом количества микроорганизмов-кандидатов, отобранных за их антагонистические способности при тестировании с каждым из шести распространенных фитопатогенов. Микроорганизм-кандидат, имеющий позитивную биоконтролирующую активность, далее оценивался путем индивидуального точечного или штрихового нанесения культуры микробного изолята на отдельные тестовые чашки. Дополнительно, изоляты, продемонстрировавшие высокую подвижность на КДА, которая может интерферировать с данным анализом, также в дальнейшем оценивались отдельно.
Таблица 1
Патоген
Количество отобранных микроорганизмов-кандидатов
Fusariumgraminearum NRRL 5883
109
Monographellanivalis ATCC MYA-3968
642
Gibberellazeae ATCC 16106
196
Stagnosporanodurum ATCC 26369
587
Colletotrichumgraminicola ATCC 34167
426
ПРИМЕР 5: Высокоэффективный скрининг предварительно отсортированных микробных клеток
Этот Пример описывает детали тестов на антагонизм, которые далее включают этап сортировки каждого из микробных образцов до единичных клеток или субпопуляций клеток перед или одновременно с контактированием микробных образцов с популяцией патогена.
В некоторых экспериментах этап сортировки выполнялся с использованием методики сортировки клеток с помощью проточной цитометрии (FACS), при которой гетерогенная смесь микробных клеток физически разделялась на субпопуляции клеток с высокой степенью чистоты перед дальнейшим анализом на антагонистическую активность.
Чашки с патогеном были приготовлены путем первоначального забора грибкового мицелия, разбитого шариками, отдельных клеток или спор целевого исследуемого патогена и пропускания их через нейлоновый фильтр с размером пор 70 мкм. Концентрация клеток в фильтрате была затем доведена до ОП600 равной, приблизительно, 0,01. 250 мкл фильтрата распределяли по однолуночному микротитровальному планшету (такому, как “Nunc OmniTray”), содержащему соответствующую агаровую микробную ростовую среду. Затем планшетам с патогенам давали высохнуть в предварительно простерилизованном биобезопасном шкафу до тех пор, пока на поверхности агара не оставалось никакой остаточной жидкости. В некоторых примерах суспензия могла быть напрямую введена в агаровую ростовую среду, пока она была в расплавленном состоянии, т.е. перед затвердеванием агаровой ростовой среды.
Были взяты аликвоты экстрактов грунта и ризоферы из образцов окружающей среды и доведены до подходящих концентраций и чистоты для употребления в этапе сортировки с использованием методики FACS. С применением системы сортировки клеток "BD FACSAriaTM” (BD Biosciences, Bedford, MA) отдельные клетки сортировались непосредственно в чашки с патогенном, и им давали проинкубироваться при соответствующей температуре и продолжительности с тем, чтобы обеспечить визуальную детекцию ростов как целевого патогена, так и микробных колоний, полученных из отсортированных единичных клеток. Как правило, микробные штаммы, способные ингибировать данный целевой патоген, могли быть определены как те, что соответствовали микробным колониям, демонстрировавшим зону ингибирования роста, окружающую микробные колонии.
В некоторых других экспериментах вместо использования методики прямой сортировки клеток FACS также были приготовлены чашки с патогеном, как описано выше, используя стандартные чашки Петри вместо OmniTrays, с 100 мкл фильтрата суспензии, распределенными по поверхности агара, вместо 250 мкл. В этих примерах клеточная суспензия из окружающей среды была обычно разведена до концентрации 1 КОЕ/мкл и 100 мкл были распределены на поверхности высушенной чашки с патогеном. Появлялись зоны просветления, какие видны на чашках, отсортированных при помощи FACS.
ПРИМЕР 6: Биологический контроль Fusariumgraminearum, агента-возбудителя фузариоза растений пшеницы, выращиваемых в условии ростовой камеры.
9
6
Несколько микроорганизмов-кандидатов, отобранных из теста со-культивирования на микротитровальном планшете в соответствии с способом скрининга, описанным в Примере 4, далее были исследованы на их способность снижать заболеваемость фузариозом Fusarium (ФФ) у яровой пшеницы. Два грамма зерен пшеницы чувствительного культурного сорта пшеницы (Hank, WestBred, Bozeman, MT) были посеяны в 1-литровые горшки, содержащие пастеризованный грунт. Для каждого из микроорганизмов-кандидатов было приготовлено шестнадцать горшков-реплик и расставлено полностью случайным образом. Контроли, как правило, включали (1) инфицированные семена, (2) неинфицированные семена, и (3) семена, инфицированные и впоследствии обработанные различными сопоставительными химическими фунгицидами, такими, как Banner MaxxTM (Syngenta). Микробные антагонисты выращивались в подходящей среде, и клеточные осадки затем были ресуспендированы в соответствующем буферном растворе. Как правило, концентрация микробной суспензии доводилась до 10 кое на горшок, и суспензия вносилась во время посева. В некоторых других экспериментах семена покрывались микробными антагонистами перед посевом. Посевам затем давали прорастать и расти под флуоресцентным светом с фотопериодом в 14 часов до наступления цветения. Отдельно выращивались клетки грибка - патогена Fusariumgraminearum NRRL 5883 на среде КДА в течение пяти дней при постоянном освещении для индукции образования конидиальных спор. Конидии собирали, наливая стерильную воду (0,05% Tween 20) на чашки с последующим соскабливанием стерильным шпателем. В период цветения (обычно на стадии по шкале Фикеса 10.5.1) головки пшеницы инфицировали спорами F. graminearum путем распыления конидиальной суспензии 10 кое/мл на головки до насыщения. Помещение увлажнялось опрыскивателем - туманообразователем до 95% относительной влажности (ОВ) в течение 48 часов. После полного развития посевов пшеницы части растений собирали, и собирали данные для следующих показателей: (1) общее число головок пшеницы, (2) тяжесть инфекции, (3) общее количество зерен, (4) общая масса зерен, (5) содержание микотоксина дезоксиниваленола (ДОН). Результаты выявили, что несколько микробных антагонистов, отобранных в соответствии со способами настоящего изобретения, значительно снижали инвазию растений пшеницы F. graminearum по сравнению с необработанным контролем, выращиваемым в тех же условиях. По меньшей мере, один пример таких микробов, защита растений пшеницы от инвазии Fusarium за счет эффекта антагонизма, был статистически сопоставимым с защитой, вызванной коммерческим химическим фунгицидом.
ПРИМЕР 7: Филогенетическая характеристика отобранных микроорганизмов
Данный пример предоставляет один способ для идентификации организмов, отобранных из высокоэффективных скрининговых способов настоящего изобретения. В целом, целевые молекулы нуклеиновых кислот амплифицированные из культивируемых организмов, могут быть секвенированы с использованием известных методик, и полученные в результате последовательности могли быть сравнены с известными последовательностями целевого гена из известных организмов. Эти последовательности затем могли быть размещены на филогенетическом древе для установления родства изолированного организма с известными и/или ранее культивируемыми микробными видами.
Получение информации о последовательности 16S, ITS-5.8S рДНК: Свежие культуры целевых микроорганизмов выращивали на подходящей среде и использовали в качестве источника ДНК. Микробную биомассу собирали путем прочесывания кончиком пипетки по поверхности растущей микробной популяции. Биомассу переносили в 100 мкл стриповую пробирку для ПЦР, содержащую 50 мкл 100 мМ Tris, pH 8,0. Биомассу гомогенизировали путем неоднократного пипетирования вверх-вниз. Аликвоты микробного гомогената в 2 мкл затем смешивались с 2 мкл 2x лизирующего буфера, состоящего из 100 мМ Tris HCL, pH 8,0, 2 мМ ЭДТА, 1% ДДС и 20 мкл/мл протеиназы K (Goldenberger et al., 1995, PCR Methods Appl. 4:368-370). Реакция лизиса выполнялась в индивидуальном термоциклере PTC-200 (MJ-Research, MA, USA) следующим образом: 55°C в течение 60 минут с последующими 10 минутами при 95°C. Аликвоты в 2 мкл продукта лизиса использовали в качестве источника матричной ДНК для амплификации ПЦР. Для бактериальных видов последовательность 16S была амплифицирована путем ПЦР с использованием праймеров M13-27 16s Bac (5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’, SEQ ID NO: 1) и M13-1492 16s Bac (5’-CAGGAAACAGCTATGACCGGTTACCTTGTTACGACTT-3’, SEQ ID NO: 2).
Для эукариотических видов последовательность 16S была амплифицирована путем ПЦР с использованием праймеров M13-Euk1195R (5’-CAGGAAACAGCTATGACCGGGCATCACAGACCTG-3’, SEQ ID NO: 3) и M13-Euk515F (5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’, SES ID NO: 4). Последовательность ITS рДНК была амплифицирована путем ПЦР с использованием праймеров M13-ITS1 (5’-TGTAAAACGACGGCCAGTTTCGTAGGTGAACCTGCGG-3’, SEQ ID NO: 5) и M13-ITS4 (5’-CAGGAAACAGCTATGACCTCCTCCGCTTATTGATATGC-3’, SEQ ID NO: 6).
Каждая ПЦР смесь была приготовлена в объеме 50 мкл и состояла из 2 мкл ДНК из реакции лизиса грибка, 0,5 мкл прямого праймера и 0,5 мкл обратного праймера, 5 мкл 10% Tween-20 и 42 мкл Platinum PCR SuperMix (Invitrogen, CA, USA). ПЦР проводилась на индивидуальном термоциклере PTC-200 (MJ-Research, MA, USA) следующим образом: 94°C в течение 10 минут с последующими 30 циклами по 94°C в течение 30 секунд, 52°C в течение 30 секунд и 72°C в течение 1 минуты, 15 секунд, с последующим циклом при 72°C в течение 10 минут. Аликвоты ПЦР продукта в 10 мкл, разведенные в 10 мкл ddH2O, прогоняли на предварительно отлитом 1,0% агарозном геле E-Gel 96 с этидиум бромидом (Invitrogen, CA, USA) в течение 10 минут, используя в качестве источника энергии Mother E-Base (Invitrogen, CA, USA). Изображение геля было получено путем УФ флуоресцентной визуализации с использованием системы ChemiImager Ready system (Alpha Innotech, Calif.). Наличие 400-500 пар оснований ПЦР продукта подтверждали гель-электрофорезом. Остающиеся 40 мкл ПЦР продукта очищали с использованием 6 мкл очищающей смеси ExoSAP-IT (USB, OH, USA). Реакция очистки проводилась на индивидуальном термоциклере PTC-200 (MJ-Research, MA, USA): 30 минут при 37°C с последующими 30 минутами при 80°C. Очищенные продукты замораживали и передавали на ПЦР секвенирование. Секвенирование выполнялось в прямом и обратном направлениях примирования Институтом Дж. Крейга Вентера в Сан Диего, Калифорния, с использованием технологий 454.
Для филогенетической реконструкции проводили выравнивание нуклеотидных последовательностей в BioEdit (расположенном во Всемирной паутине) с последующим уточнением вручную. Филогенетические древа конструировали в PHYML (расположенном во Всемирной паутине) с использованием максимального правдоподобия, модели замены HKY и установок по умолчанию. Ответвленную поддержку получали путем самонастройки (100 реплик).
ПРИМЕР 8: Выращивание и хранение микробных антагонистов
Грибковые антагонисты: Для хранения изолированного грибка в качестве чистой культуры было использовано несколько способов, один их которых был методикой фильтровальной бумаги. Грибку давали вырасти на КДА, и затем он разрезался на маленькие квадраты, которые помещался во флаконы, содержащие 15% глицерина, и хранили при -70°C. Грибок также хранился идентичным способом при 4°C с использованием дистиллированной воды вместо глицерина. Однако одним из предпочтительных способов хранения было хранение на зараженном стерильном семени ячменя при -80°C.
Бактериальные антагонисты: Изолированные бактерии хранились в качестве чистых культур. Бактериальные колонии переносили во флаконы, содержащие бульонную жидкую среду R2A (BD DifcoTM) и давали вырасти при 30°C при встряхивании при 250 об./мин. в течение двух дней. Культуру затем переносили во флаконы, содержащие 15% глицерина, и хранили при -80°C.
Был описан ряд вариантов воплощения изобретения. Тем не менее, будет понятно, что элементы описанных здесь вариантов воплощения могут быть скомбинированы для образования новых вариантов воплощения, и могут быть выполнены различные модификации без отступления от сущности и объема изобретения. Соответственно, другие варианты воплощения, альтернативы и варианты находятся в рамках изобретения и заявляются здесь.
Заголовки в применениях являются исключительно для удобства читателя, и никоим образом не ограничивают объем изобретения или его вариантов воплощения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ