Способ дооперационного прогнозирования риска рецидива у больных раком эндометрия Т1 стадии
METHOD FOR PREOPERATIVE PREDICTION OF THE RISK OF RECURRENCE IN PATIENTS WITH STAGE T1 ENDOMETRIAL CANCER

Изобретение относится к онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для дооперационного прогнозирования риска рецидива у больных раком эндометрия Т1 стадии.
Рак эндометрия (РЭ) является наиболее распространенным гинекологическим раком. Более чем в 65% случаев рак эндометрия выявляется на 1 клинической стадии процесса, при этом пятилетняя выживаемость составляет 90%, однако при поражении лимфатических узлов пятилетняя выживаемость не превышает 50%. [1, 2]. По данным ряда авторов пятилетняя безрецидивная выживаемость больных РЭ зависит от глубины инвазии миометрия и составляет 80% при прорастании опухолью менее половины толщины миометрия и 65% при прорастании опухолью более половины толщины миометрия [3, 4]. В результате анализа 113 больных раком эндометрия I стадии, у которых после проведения различных видов противоопухолевой терапии возникли рецидивы и метастазы было обнаружено, что метастазирование чаще всего возникает в виде очагов в одном органе (48,2%), в нескольких органах (22,1%), в виде рецидивов (21,2%) и метастазов в лимфатических узлах (14,2%). Среди органных метастазов преобладают метастазы в культе влагалища (26,8%), по брюшине (8,8%), в костях (8,0%) и в легких (6,2%). Установлено, что локализация метастазов зависит от наличия инвазии рака в миометрии и от его расположения в полости матки [5]. Более 80% рецидивов возникает в первые 2 года после радикального лечения [6]. Причины и сроки возникновения поздних рецидивов не определены и достаточно не изучены, но, скорее всего, зависят от биологических особенностей опухоли.
Одним из основных причин возникновения рецидивов и метастазов являются циркулирующие опухолевые клетки (ЦОК). Наличие ЦОК не всегда сопровождается формированием метастазов, по-видимому, потому, что не все опухолевые клетки, попавшие в циркуляцию, обладают необходимыми для этого свойствами. ЦОК - гетерогенная популяция: часть клеток являются стволовыми опухолевыми клетками, часть опухолевых клеток находятся в состоянии ЕМТ (epithelial-mesenchymaltransition), и большая часть ЦОК не имеют признаков стволовости и ЕМТ [7, 8]. Недавние исследования показали, что наличие в крови ЦОК с признаком стволовости и ЕМТ и ЦОК без признаков стволовости с признаком ЕМТ снижает общую и безметастатическую выживаемость у больных раком молочной железы [9]. Adams et al. в 2014 году впервые описал атипичные гибридные опухолевые клетки (circulating cancer-associated macrophage-like cells, CAML) в крови пациентов с раком молочной и поджелудочной железы [10]. Данные клетки одновременно экспрессируют на своей поверхности как CD45, характерный для всех видов лейкоцитов человека, так и ЕрСАМ - молекулы клеточной адгезии эпителия, обнаруживающейся у большинства раковых эпителиальных клеток [11]. Многими авторами ставится прямая зависимость между концентрацией гибридных клеток и неблагоприятностью прогноза для пациента. Однако, несмотря на значительное повышение количества CD45+EpCAM+ клеток на поздних стадиях заболевания, их присутствие отмечается и на более ранних этапах прогрессирования рака [12]. Описано обнаружение данных клеток задолго до появления метастазов, что потенциально делает их предвестником скорого распространения опухоли [13]. Поэтому в качестве маркеров для прогнозирования рецидивов рака эндометрия целесообразно использование уровня различных популяций ЦОК включая атипичные/гибридные клетки.
Известен «Способ прогнозирования развития рецидива при раке тела матки» [15] (патент RU 2250077 С2, А61В 10/00, G01N 33/573, G01N 33/574, опубл. 20.04.2005), в котором проводят биохимическое исследование ткани злокачественной опухоли и эндометрия, при этом до и после проведения комплексного лечения определяют активности катепсина Д и кислото-стабильных ингибиторов, рассчитывают коэффициент соотношения катепсина Д и кислотостабильных ингибиторов и при уровне коэффициента, превышающем показатели, характерные для ткани интактного эндометрия, более чем в 2,4-2,8 раза, прогнозируют развитие рецидива рака эндометрия в срок до 6 месяцев.
PTEN
CYP1B1
PTEN
CYP1B1
Известен «Способ прогнозирования рецидивов рака тела матки на основании уровня экспрессии генов PTEN и CYP1B1» [16] (Патент на изобретение RU 2605302 С1, 20.12.2016. Заявка №2015148301/10 от 10.11.2015.) В способе выделяют тотальной РНК из тканевых проб матки с помощью метода гуанидин-тиоционат-фенол-хлороформной экстракции, получение кДНК с помощью реакции обратной транскрипции на матрице выделенной РНК и последующую амплификацию в режиме реального времени (RT-PCR) в присутствии красителя EvaGreen, отличающийся тем, что используют высокоспецифичные праймеры для генов PTEN, CYP1B1 и АСТВ, анализируют первичные данные и вычисляют коэффициент относительной экспрессии К, сравнивают полученные значения К с прогностическим коэффициентом экспрессии и при значениях K=1,55±0,16 и K=0,94±0,12 прогнозируют отсутствие рецидивов, а при значениях K=0,76±0,14 и K=1,34±0,20 прогнозируют развитие рецидивов.
Наиболее близким к предлагаемому является «Способ определения эффективности лечения рака тела матки» [14] (см. патент RU 2424806 С1, МПК A61K 31/513, А61Р 35/00, А61В 17/00, A61N 5/10, опубл. 27.07.2011). Способ включал полихимиотерапию, хирургическое удаление опухоли и лучевую терапию, причем через 1,5-2 недели после окончания лечения в суточной моче больных определяюли уровень кортизола и тетрагидро-11-дезоксикортизола, определяли коэффициент соотношения тетрагидро-11-дезоксикортизола к кортизолу и при величине соотношения менее двух прогнозировали длительность безрецидивного периода пять и более лет, а при соотношении более двух - развитие рецидива в ближайшие два года.
Недостатком существующих способов является то, что все они основаны на исследовании операционного материала опухолевой ткани и не дают возможности оценить риск рецидива РЭ до начала лечения. Также, обладают недостаточной чувствительностью и специфичностью.
Предлагаемый способ является новым, так как включает исследование количества различных популяций циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), в том числе атипичных/гибридных форм клеток в крови у больных раком эндометрия до операции и последующий расчет диагностического показателя, который ранее не использовался для заявленной в способе цели.
Новый технический результат - снижение инвазивности и повышение точности способа.
Для достижения нового технического результата в способе дооперационного прогнозирования риска рецидива у больных раком эндометрия Т1 стадии, включающем исследование биологической жидкости пациента, в дооперационном периоде исследуют венозную кровь в крови методом многоцветной проточной цитометрии с помощью меченных различными флуорохромами моноклональных антител к EpCam, CD45, CD44, CD24, N-Cadherin и ядерого красителя NucBlue Live cell stain ready probes reagent и определяют количество Epcam+CD45- клеток/мл крови (X1), количество ЦОК с фенотипом Epcam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ (клеток/мл)(Х2), количество стволовых ЦОК без экспрессии Epcam на мембране с фенотипом Epcam(m)-CD45-CD44+CD24- (клеток/мл) (X3); количество атипичных/гибридных форм ЦОК с фенотипом Epcam+CD45+ клеток/мл (Х4),количество ЦОК выражают в единицах клеток/мл крови, далее рассчитывают значение уравнения регрессии Υ по формуле:
Υ=ΕΧΡ(-2,368-0,008*(Χ1)+0,413*(Χ2)+0,005*(Χ3)+0,000189*(Χ4))/(1+ΕΧΡ(-2,368-
0,008*(Х1)+0,413*(Х2)+0,005*(Х3)+0,000189*(Х4))), где
X1 - количество Epcam+CD45- клеток/мл крови;
Х2 - количество ЦОК с фенотипом Epcam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ (клеток/мл);
Х3 - количество стволовых ЦОК без экспрессии Epcam на мембране с фенотипом Epcam(m)-CD45-CD44+CD24- (клеток/мл);
Х4- количество атипичных/гибридных форм ЦОК с фенотипом Epcam+CD45+ клеток/мл. и при Υ≥0,5 определяют высокий, а при Υ<0,5 определяют низкий риск рецидива ракам эндометрия.
Способ осуществляют следующим образом.
Для прогнозирования риска рецидива у больных раком эндометрия Т1 стадии выполняют гистологическое исследование опухоли с определением степени ее дифференцировки после диагностической гистероскопии. Затем перед операцией проводят забор венозной крови в вакуумную пробирку с К3ЭДТА. способе дооперационного прогнозирования риска рецидива у больных раком эндометрия Т1 стадии, включающем исследование биологической жидкости пациента, в дооперационном периоде исследуют венозную кровь в крови методом многоцветной проточной цитометрии с помощью меченных различными флуорохромами моноклональных антител к EpCam, CD45, CD44, CD24, N-Cadherin и ядерого красителя NucBlue Live cell stain ready probes reagent и определяют количество Epcam+CD45- клеток/мл крови (X1), количество ЦОК с фенотипом Epcam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ (клеток/мл)(Х2), количество стволовых ЦОК без экспрессии Epcam на мембране с фенотипом Epcam(m)-CD45-CD44+CD24- (клеток/мл) (Х3); количество атипичных/гибридных форм ЦОК с фенотипом Epcam+CD45+ клеток/мл (Х4),количество ЦОК выражают в единицах клеток/мл крови, далее рассчитывают значение уравнения регрессии Υ по формуле:
Υ=ΕΧΡ(-2,368-0,008 *(Х1)+0,413 *(Х2)+0,005 *(Х3)+0,000189*(Х4))/(1+ЕХР(-2,368-
0,008*(Х1)+0,413*(Х2)+0,005*(Х3)+0,000189*(Х4))), где
X1 - количество Epcam+CD45- клеток/мл крови;
Х2 - количество ЦОК с фенотипом Epcam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin клеток/мл);
Х3 - количество стволовых ЦОК без экспрессии Epcam на мембране с фенотипом Epcam(m)-CD45-CD44+CD24- (клеток/мл);
Х4 - количество атипичных/гибридных форм ЦОК с фенотипом Epcam+CD45+ клеток/мл.
и при Υ≥0,5 определяют высокий, а при Υ<0,5 определяют низкий риск рецидива ракам эндометрия.
Чувствительность и специфичность довольно высоки: 87,5% и 96,7% соответственно.
Сущность предлагаемого способа иллюстрируется следующими клиническими примерами.
Пример 1. Больная Л., 62 года, постменопауза 8 лет, обратилась в НИИ онкологии Томского ТИМЦ в 2019 г. с жалобами на кровянистые выделения из половых органов в течение 1 месяца на фоне менопаузы, дискомфорт внизу живота. В анамнезе миома матки в течение нескольких лет, лечение не проводилось. Беременностей - 3, роды - 1, аборты - 2 19.03.19 - гистероскопия, РДВ. Заключение ПАО:1984-86к/19 (5534-35/19) Аденокарцинома эндометрия умеренной степени дифференцировки (ICD-O code 8140/3), с участками с секреторными изменениями, с наличием единичных папиллярных структур. Проведено комплексное обследование. УЗИ ОМТ, ОБП 09.04.19: более вероятно наличие субмукозных узлов. Серозометра. Объемное образование шейки матки с вовлечением ц/канала и тела матки. Рентгенография органов грудной клетки: очаговых и инфильтративных изменений не выявлено. Перед оперативным лечением была взята венозная кровь для дооперационного прогнозирования риска рецидива у больных раком эндометрия. В результате проведения многоцветной проточной цитометрии в крови больной РЭ были выявлены следующие ЦОК: Epcam+CD45- =370 клеток/мл; Epcam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+ =10 клеток/мл; стволовые ЦОК без экспрессии Ерсат на мембране (признаком эпителиально-мезенхимального перехода) с фенотипом Epcam(m)-CD45-CD44+CD24- =60 клеток/мл; Epcam(m)-CD45-CD44+CD24-Ncadherin+ =10 клеток/мл и атипичные/гибридные формы ЦОК с фенотипом Epcam+CD45+ =34860клеток/мл. Риск развития рецидива оценивался по формуле: Y=EXP(-2,368-0,008*(390)+0,413*(10)+0,005*(60)+0,000189*(34860))/(1+ЕХР(-2,368-0,008*(390)+0,413*(10)+0,005*(60)+0,000189*(34860)))=0,996
По результатам исследования больная была отнесена к группе с высоким риском рецидива.
23.04.2019 больной была проведена лапароскопия, экстирпация матки с придатками, тазовая лимфаденэктомия. Гистологическое исследование операционного материала - Аденокарцинома эндометрия (ICD-O code 8140/3) умеренной степени дифференцировки, с участками муцинозной карциномы, с инвазией в миометрий менее 1/2 толщины стенки матки, без распространения на внутренний зев. Без метастатического поражения лимфоузлов (исследовано 8 л/узлов). Множественные лейомиомы матки. (ICD-O code 8890/0). Хронический цервицит. В яичниках, маточных трубах - возрастные изменения. T1aN0M0 grade2.
В июне 2020 г. впервые выявлено на УЗИ ОМТ объемное солидной структуры образование полости малого таза 16x12x18 мм. Динамически наблюдалась. Данное образование увеличилось до 19x13x18 мм. Status Genitalis Наружные п/органы развиты правильно, оволосение по женскому типу, паховые ЛУ не увеличены. Матка удалена. Влагалище емкое, рожавшей, заканчивается слепо рубец без особенностей. Придатки удалены. 26.08.2020 выполнено удаление образования в малом тазу. Гистология 21062-70/20 (ИГХ№921/20): Повторные серийные срезы со всех фрагментов, с наличием в единичных фрагментах замурованных железистоподобных структур и дискретно расположенных опухолевых клеток, позитивных на Multi-Cytokeratin (клон АЕ1/АЕ3, Leica). Учитывая рецидивный характер опухоли, больной в плане комбинированного лечения проведен курс лучевой терапии (ДГТ) в СОД 46 Гр.
Пример 2. Больная К, 64 года, рак эндометрия T1NxM0, стадия I, менопауза 10 лет, обратилась в НИИ онкологии Томского ТИМЦ в 2020 г. с жалобами на кровянистые выделения из половых органов и боли внизу живота. В анамнезе миома матки. Беременности 3, роды 1, аборты 2. Status Genitalis: Наружные п/органы развиты правильно по женскому типу. Матка кзади, по средней линии, не увеличена, поверхность ровная. Влагалище узкое Шейка матки отклонена кзади, субконической формы, не эрозирована. Придатки не пальпируются. По результатам пересмотра микропрепаратов (928-29к/20) -умеренно дифференцированная эндометриоидная аденокарцинома (8380/3). Больная прошла догоспитальное обследование. 25.02.2020 Больная с диагнозом Рак эндометрия TINxM0, стадия I госпитализировалась для хирургического лечения - лапароскопия, экстирпация матки с придатками, двусторонняя аднексэктомия, двусторонняя лимфодиссекция. Перед операцией (27.02.2020) была взята венозная кровь для дооперационного прогнозирования риска рецидива у больных раком эндометрия. В результате проведения многоцветной проточной цитометрии в крови больной РЭ были выявлены атипичные/гибридные Epcam+CD45+ клетки в количестве 10 клеток/мл. Риск развития рецидива оценивался по формуле:
Y=EXP(-2,368-0,008*(0)+0,413*(0)+0,005*(0)+0,000189*(10))/(1+ЕХР(-2,368-0,008*(0)+0,413*(0)+0,005*(0)+0,000189*(10)))=0,085
По результатам исследования данная больная была отнесена к группе с низким риском рецидива.
Гистологическое исследование операционного материала (№5814-40/2020) Эндометриоидная аденокарцинома умеренной степени дифференцировки (FIG02) с очагами муцинозного строения с инвазией не более 1/2 толщи миометрия. В лимфатических узлах "справа" - 5 лимфоузлов, липоматоз стромы. "Слева"- 2 лимфатических узла - без метастатического поражения.
Согласно стандарту комбинированного лечения больная получила курс адъювантной лучевой терапии в СОД: 42 Гр. Осложнение: лучевой цистит. Больная наблюдается по апрель 2021 г. без признаков рецидива и метастазов.
Способ основан на дооперационном исследовании крови методом многоцветной проточной цитометрии и анализе данных клинических исследований тридцати трех историй болезни пациентов, проходивших лечение в гинекологическом отделении НИИ онкологии Томского НИМЦ с диагнозом рак эндометрия I стадии. Средний возраст больных 57,8±1,1 лет. Всем больным было выполнено оперативное лечение в объеме тотальной гистерэктомии с билатеральной сальпингоовариоэктомией и тазовой лимфодиссекции.
Для построения модели дооперационного прогноза риска рецидива был применен метод логистической регрессии.
Количественные показатели были проверены как предикторы в модели логистической регрессии дооперационного прогнозирования риска рецидивов. По результатам разработанной модели были определены предикторы, которые можно использовать для дооперационного прогнозирования риска рецидива у больных РЭ, такие как общее количество Epcam+CD45- клеток, ЦОК без признаков стволовости с признаком ЕМТ (Epcam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+), стволовые ЦОК без экспрессии Ерсат на мембране (признаком эпителиально-мезенхимального перехода) с фенотипом Epcam(m)-CD45-CD44+CD24- и атипичные/гибридные формы ЦОК с фенотипом Epcam+CD45+ (Таблица 1).
С помощью ROC-анализа был оценен вклад выявленных показателей, которыми явились общее количество Epcam+CD45- клеток, ЦОК без признаков стволовости с признаком ЕМТ (Epcam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+), стволовые ЦОК без экспрессии Epcam на мембране (признаком эпителиально-мезенхимального перехода) с фенотипом Epcam(m)-CD45-CD44+CD24- и атипичные/гибридные формы ЦОК с фенотипом Epcam+CD45+ в развитие рецидива рака эндометрия (таблица 2). Наибольшее значение площади под ROC-кривой (AUC) составило 0,923 для показателя количества ЦОК с фенотипом Epcam+CD45-CD44-CD24-Ncadherin+, что говорит об очень хорошем качестве данного предиктора (Таблица 2).
Таким образом, предлагаемый способ позволяет с большей точностью и информативностью прогнозировать риск развития рецидива при раке эндометрия, что является крайне необходимым для определения тактики ведения и создания персонализированного подхода при лечении таких пациенток. Получены достоверные числовые показатели, характеризующие степень риска возникновения рецидива у конкретной больной, отражающие прогноз течения онкологического заболевания.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:
1. Coronado ΡJ, Rychlik A, Martinez-Maestre MA, Baquedano L, Fasero M, Garcia-Arreza A. Role of lymphadenectomy in intermediate-risk endometrial cancer: a matched-pair study. J Gynecol Oncol. 2018; 29:el. doi: 10.3802/jgo.2018.29el. et al
2. Morice P, Leary A, Creutzberg C, Abu-Rustum N, Darai E. Endometrial cancer. Lancet. 2016 Mar 12;387(10023): 1094-1108. doi: 10.1016/S0140-6736(15)00130-0. Epub 2015 Sep 6. PMID: 26354523.
3. Creasman WT, Morrow CP, Surgical pathologic spread patterns of endometrial cancer. A Gynecologic Oncology Group Study. Cancer. 1987 Oct 15; 60 (8 Suppl): 2035-41.
4. A.B. Налбандян, B.B. Кузнецов, B.M. Нечушкина. Факторы прогноза у больных раком тела матки. Вестник РОНЦ им. Η. Н. Блохина РАМН, т. 17, №3, 2006. С. 30-32.
5. Литвинова Т.М. Рак эндометрия I стадии: рецидивы и метастазы //Вестник Витебского государственного медицинского университета. 2005. Т. 4. №3. С.45-51.
6. Кузнецов В.В., Нечушкина В.М. Хирургическое лечения рака тела матки. Практ.онкология 2004; (17): 25-32
7. Кайгородова Е.В. Циркулирующие опухолевые клетки: клиническое значение при раке молочной железы (обзор литературы). Вестник РАМН. 2017; 72 (6):450-457. doi: 10.15690/vramn833
8. Kaigorodova, E.V.; Tarabanovskaya, N.A.; Staheeva, M.N.; Savelieva, О. E.; Tashireva, L. Α.; Denisov, Ε. V.; Perelmuter V. M. Effect of minor and major surgical injury on the level of different populations of circulating tumor cells in the blood of breast cancer patients. Neoplasma.2017;64(3):437-443. doi: 10.4149/neo_2017_315.
9. Kaigorodova E.V., Tarabanovskaya N.A., Surkova P.V., Zelchan R.V., Garbukov E.Yu. The presence of various populations of circulating tumor cells in the blood of breast cancer patients before treatment: association with five-year metastasis-free survival. Siberian Journal of Oncology. 2020; 19(6): 57-65. - doi: 10.21294/1814-4861-2020-19-6-57-65.
10. Adams DL, Martin SS, Alpaugh RK, et al. Circulating giant macrophages as a potential biomarker of solid tumors. Proc Natl Acad Sci USA 2014; 111:3514-9.
11. Huang L, Yang Y, Yang F, Liu S, Zhu Z, Lei Ζ and Guo J: Functions of EpCAM in physiological processes and diseases (Review). Int J Mol Med 42: 1771-1785,2018
12. Sutton, Thomas L.; Walker, Brett S.; Wong, Melissa H. (2019). Circulating Hybrid Cells Join the Fray of Circulating Cellular Biomarkers. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology, (), S2352345X1930089X-. doi:10.1016/j.jcmgh.2019.07.002
13. Manjunath, Y.; Porciani, D.; Mitchem, J.B.; Suvilesh, K.N.; Avella, D.M.; Kimchi, E.T.; Staveley-O’Carroll, K.F.; Burke, D.H.; Li, G.; Kaifi, J.T. Tumor-Cell-Macrophage Fusion Cells as Liquid Biomarkers and Tumor Enhancers in Cancer. Int. J. Mol. Sci. 2020, 21,1872. https://doi.org/10.3390/ijms21051872
14. патент RU 2424806 C1, МПК A61K 31/513, A61P 35/00, A61B 17/00, A61N 5/10, опубл. 27.07.2011
15. патент RU 2250077 C2, A61B 10/00, G01N 33/573, G01N 33/574, опубл. 20.04.2005
16. Патент на изобретение RU 2605302 C1, 20.12.2016. Заявка №2015148301/10 от 10.11.2015. Способ прогнозирования рецидивов рака тела матки на основании уровня экспрессии генов PTEN и CYP1B1. Кит О.И., Водолажский Д.И., Кутилин Д.С., Моисеенко Т.И., Никитин И.С., Франциянц Е.М. Патент на изобретение RU 2605302 С1, 20.12.2016. Заявка №2015148301/10 от 10.11.2015
Таблица 1 Определение статистически значимых предикторов предсказательной модели
Таблица 2 Определение силы статистически значимых предикторов предсказательной модели методом ROC-анализа