Эффекты влияния сочетанного действия физико-химических факторов на эколого-физиологические реакции высшего водного растения Ceratophyllum demersum

УДК 574.24

ЭФФЕКТЫ ВЛИЯНИЯ СОЧЕТАННОГО ДЕЙСТВИЯ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ CERATOPHYLLUM DEMERSUM

© 2016

Макурина Ольга Николаевна, доктор биологических наук, профессор кафедры «Биохимия, биотехнология и биоинженерия» Самарский государственный университет, Самара (Россия) Розенцвет Ольга Анатольевна, доктор биологических наук, главный научный сотрудник

Лаборатории экологической биохимии Институт экологии Волжского бассейна РАН, Тольятти (Россия) Розина Светлана Алексеевна, аспирант Самарский государственный университет, Самара (Россия) Аннотация. Цель: исследование эколого-физиологических реакций высшего водного погруженного растения Ceratophyllum demersum на сочетанное действие антропогенных факторов химической и физической природы. Методы: модельный эксперимент в лабораторных условиях. Водные растения C. demersum подвергали воздействия сочетания 100 мкМоль/л ионов свинца (в составе ацетата свинца) и 1% раствора катионных СПАВ при температуре воды +36°С на протяжении 72 часов. Также изучали последействие факторов через 120 часов после снятия воздействия исследованных факторов. Сочетанное влияние факторов оценивали по морфологическим признакам, изменению ферментативной активности тканей (каталазной, пероксидазной, аскорбинатоксидазной и полифено-локсидазной) и изменению содержания малонового диальдегида. Результаты: были обнаружены явления хлороза и частичное опадение листьев, появление пленки на листьях и стеблях макрофита и поверхности воды, усиливающиеся с увеличением длительности эксперимента. Влияние сочетания факторов привело к развитию окислительного стресса и повышению активности ферментов антиоксидантной системы. Исследование последействия антропогенных факторов показало недостаточность 120 часов для полного восстановления макрофитов. Научная новизна: впервые исследовано сочетанное действие физического и химических факторов на организм водных растений, оценено последействие, выявлены специфические защитные реакции C. demersum, связанные с изменением активности работы антиоксидантной системы и аскорбинатоксидазной и полифенолоксидазной активностью. Практическая значимость: результаты исследования могут найти применение в разработке технологий фиторемедиации сточных вод с участием водных растений.

Ключевые слова: Ceratophyllum demersum, водные растения, температура, катионные поверхностно-активные вещества, тяжелые металлы, сочетанное действие факторов, каталаза, пероксидаза, аскорбинатоксидаза, полифено-локсидаза, малоновый диальдегид.

EFFECRS OR A COMBINARION OF PHYSICAL AND CHEMIKAL FACTORS ON ECOLOGICAL AND PHYSIOLOGICAL RESPONSES OF HIGHER AQUATIC PLANTS CERATOPHYLLUM DEMERSUM

© 2016

Makurina Olga Nikolaevna, doctor of biological sciences, professor of «Biochemistry, Biotechnology and Bioengineering» Samara State University, Samara (Russia) Rozentsvet Olga Anatolievna, doctor of biological sciences, chief researcher, Laboratory of environmental biochemistry Institute of Ecology of the Volga River Basin of the RAS, Togliatti (Russia) Rozina Svetlana Alekseevna, postgraduate student Samara State University, Samara (Russia) Abstract. Objective: research ecological and physiological responses of higher aquatic plants submerged Ceratophyllum demersum on the combined effect of anthropogenic factors of chemical and physical nature. Methods: The model experiment in the laboratory. Aquatic plants C. demersum were affected coupling 100 mmol / l lead ions (consisting of lead acetate), and 1% solution of cationic surfactants at a water temperature + 36 ° C for 72 hours. Also we studied aftereffects factors for 120 hours. The combined influence of factors assessed by change of enzymatic activity in tissues of aquatic weeds (catalase, peroxidase, ascorbate oxidase, polyphenol oxidase) and content of malondialdehyde. Results: were discovered phenomenon of leaf chlorosis, partial defoliation, the appearance on leaves and stems of macrophytes and surface water surfactants, increases with increasing duration of the experiment. Effect of a combination of factors has led to development of oxidative stress and increase of activity of antioxidant enzymes. Research aftereffects of anthropogenic factors showed failure of 120 hours for a full recovery of macrophytes. Scientific novelty: for the first time investigated combined effect of physical and chemical factors on water plant, rated aftereffect, identified specific defensive reactions C. demersum, associated with changes in the activity of the antioxidant system and the work and ascorbate oxidase, polyphenol oxidase. Practical value: the results of research can be applied to change the technology of phytoremediation of wastewater with aquatic plants.

Keywords: Ceratophyllum demersum, water plants, temperature, cationic surfactants, heavy metals, the combined effect of factors, catalase, peroxidase, ascorbate oxidase, polyphenol oxidase, malondialdehyde.

Современное состояние гидросферы характеризуется наличием водных объектов с повышенным содержанием органических и неорганических загрязнений [1-3]. Среди неорганических загрязнений наиболее опасными считают тяжелые металлы, а соединения свинца представляют особую угрозу в связи с длительным периодом выведения из живых организмов [4, 5]. Особую тревогу вызывают катионные синтетические поверхностные активные вещества (СПАВ), устойчивые в биодеградации и приводящие к негативным изменениям в водных экосистемах [6]. Кроме того, следует учитывать, что большое количество сточных вод таких предприятий как ТЭС, АЭС, ТЭЦ, ГРЭС часто не только загрязнены тяжёлыми металлами и СПАВ, но имеют повышенную

температуру, что приводит к локальному повышению температуры воды до 28-32°С в местах сброса [1]. В условиях медленного водообмена, характерного для водохранилищ, указанные загрязнения становятся причиной развития водорослей и ухудшения качества воды источников питьевого водоснабжения. Следует отметить, что загрязнение соединениями свинца и катионными СПАВ характерно не только для водохранилищ, но и для речных экосистем. Поэтому важно знать ответные реакции гидробионтов, включая водные растения, на влияние химических, физических факторов, а также их сочетания. Одним из диагностических показателей состояния водных растений может быть окислительно-восстановительный статус, который регистрируется с помощью

ферментов антиоксидантной системы и накопления конечных продуктов перекисного окисления липидов. В связи с этим целью настоящей работы стало изучение эколого-физиологических реакций высшего водного погруженного растения Ceratophyllum demersum на соче-танное действие физического и химических факторов.

Объект и методика исследования

Объектом исследования был выбран пресноводный макрофит роголистник погруженный (Ceratophyllum demersum L.), который является растением-концентратором тяжёлых металлов и часто используется в лабораторных исследованиях из-за высоких показателей роста и хорошей приспособленности к искусственным условиям выращивания. Фрагменты растений длиной до 50 мм, считая от точки роста, помещали в стеклянные емкости с отфильтрованной водопроводной водой объемом 1 дм3 и выдерживали при температуре воды +20°С (контроль) и постоянной интенсивности светового потока, создаваемой люминесцентными лампами, фотопериод 18 ч. Опытные растения инкубировали в присутствии РЬ(СНзСОО)2 в концентрации 100 мкМоль/л и 1% раствора СПАВ при температуре воды +36°С. Используемые в исследованиях катионные СПАВ входят в состав моющих средств вместе с бутилфенилом метилпропионалем, D-лимоненом, линалоолом, бен-зилсалицилатом. Согласно литературным данным, концентрация бутилфенила метилпропионаля, D-лимонена, линалоола, бензилсалицилата не превышает 0,01% в составе средств бытовой химии, вещества почти нерастворимы в воде и обладают выраженным антимикробным и антиоксидантным действием [7-9].

Продолжительность воздействия сочетания факторов составила 72 часа. На 12 и 72 час эксперимента часть растений из каждой группы отбирали на исследования, а другую часть переносили в чистую отфильтрованную воду для реабилитации длительностью 120 часов, затем проводили измерения биохимических показателей.

Методы исследования. В тканях исследованных растений определяли содержание малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты [10]. Определение пероксидазной активности осуществляли по методу, основанному на определении скорости реакции окисления бензидина до образования продукта окисления определенной концентрации [11]. Исследование ка-талазной активности проводили по методу, основанному на определении скорости реакции по снижению концентрации перекиси водорода, образующей жёлто-окрашенное соединение с молибдатом аммония [12]. Аскобинатоксидазную активность определяли по методу, , основанному на свойстве аскорбиновой кислоты поглощать свет с максимумом при длине волны 265 нм. Об активности фермента судили по уменьшению величины оптической плотности, учитывая, что степень окисления аскорбиновой кислоты пропорциональна количеству фермента [11]. Определение полифенолоксидазной активности осуществляли спектрофотометрическим методом, основанном на измерении оптической плотности продуктов реакции, образовавшихся при окислении пирокатехина за определенный промежуток времени [11]. Содержание водорастворимых белков определяли с помощью Coomassie brilliant blue [13] и выражали ферментативную активность в удельных единицах на 1 г белка.

На рисунках представлены данные в виде средних значений и стандартных отклонений от среднего. Достоверность отличий оценивали с помощью коэффициента Стьюдента в доверительном интервале p<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

В ходе эксперимента по влиянию Pb(C^COO^ + СПАВ + повышенная температура были обнаружены явления хлороза листьев, частичное опадение листьев, появление пленки на листьях и стеблях макрофита и поверхности воды. Ранее было показано, что хлороз был характерным признаком растений при воздействии ионов свинца, а опадение листьев и пленка на их поверхно-

сти - при воздействии СПАВ. Как видно влияние сочетания исследованных факторов физического и химических факторов привело к морфологическим изменениям растений C. demersum, характерным для эффектов влияния ионов свинца (хлороз) и катионных СПАВ. Важно отметить, что степень выраженности морфологических повреждений была меньше, чем в случае токсического действия поллютантов по отдельности или в комбинации ионы свинца + раствор катионных СПАВ [14, 15]. Во-видимому, при повышении температуры кроме увеличения растворимости поллютантов, увеличивается степень их взаимодействия друг с другом, отчасти нейтрализующая токсические эффекты.

Через 12 часов эксперимента содержание малонового диальдегида (МДА) в тканях растений опытной группы было ниже контроля в 1,3 раза (рисунок 1), пе-роксидазная и аскорбинатоксидазная активность - ниже в 3,3 раза (рисунок 2, 3), а полифенолоксидазная активность - выше в 5 раз (рисунок 3). Вероятно, повышение полифенолоксидазной активности - защитная реакция макрофита на образование плёнок на границе раздела сред (вода-воздух, вода-макрофит), препятствующих дыханию [161.

0.45

Инкубация Реабилитация

Контроль 12 часов 72 часа

Время влияния

Рисунок 1. Динамика содержания малонового диаль-дегида в тканях C. demersum в условиях инкубации при повышенной температуре (+36°С) с добавлением 100 мкМоль/л ионов свинца и 1% раствора катионных СПАВ с последующей реабилитацией; * - степень достоверности р<0,05 Figure 1. Dynamics of malondialdehyde in C. demersum tissues in conditions of incubation at an elevated temperature (+ 36 ° C) supplemented with 100 mmol / l lead ions, and 1% cationic surfactants, followed by rehabilitation; * -_The reliability of p <0.05

i Инкубация Реабилитация

Контроль 12 часов 72 часа Время влияния

Контроль 12 часов 72 часа Время влияния

Рисунок 2. Динамика каталазной (а) и пероксидаз-ной (б) активности в тканях C. demersum в условиях инкубации при повышенной температуре (+36°С) с добавлением 100 мкМоль/л ионов свинца и 1% раствора моющего средства с последующей реабилитацией; * -степень достоверности р<0,05 Figure 2. Dynamics catalase (a) and peroxidase (b) activity in the tissues of C. demersum under incubation at elevated temperature (+ 36 ° C) supplemented with 100 mmol / l lead ions, and 1% cationic surfactants, followed by rehabilitation; * - The reliability of p <0.05

При увеличении времени инкубации до 72 часов содержание МДА в 1,5 раза превышало показатель контрольной группы растений. Повышение каталазной ак-

тивности в 1,5 раза на фоне снижения пероксидазной в 2 раза отражает адаптационные возможности растения по ликвидации окислительного стресса, который в случае влияния сочетания факторов развивался гораздо позже, чем при индивидуальном действии факторов [14, 15].

В период последействия влияния сочетанного действия физического и химических факторов в тканях растений опытной группы содержание МДА в 2,8 раза было выше, чем в тканях растений контрольной группы, ката-лазная активность была ниже в 5 раз, пероксидазная - в 1,3 раза, что указывает на остаточные явления окислительного стресса, вызванного действием ионов свинца и повышенной температуры.

Аскорбинатоксидазная и полифенолоксидазная активность в 1,8 раза и 4 раза соответственно были выше значений показателей контрольной группы растений. Сходные данные были получены в эксперименте с влиянием 1% раствора моющего средства при повышенной температуре (+36°С) [14], что указывает на преобладание эффектов их влияния. Согласно литературным данным, повышение каталазной, пероксидазной и аскорби-натоксидазной активности является для растительной клетки сигналом, запускающим ответные реакции организма на действие неблагоприятных факторов [17].

Рисунок 3. Динамика полифенолоксидазной (а) и аскорбинатоксидазной (б) активности в тканях C. demersum в условиях инкубации при повышенной температуре (+36°С) с добавлением 100 мкМоль/л ионов свинца и 1% раствора моющего средства с последующей реабилитацией; * - степень достоверности р<0,05 Figure 3. Dynamics polyphenol oxidase (a) and ascorbate oxidase (b) activity in the tissues of C. demersum under incubation at elevated temperature (+ 36 ° C) supplemented with 100 mmol / l lead ions, and 1% cationic surfactants, followed by rehabilitation; * - The reliability of p <0.05

Отметим, что влияние индивидуальных ксенобиотиков и повышенной температуры приводило уже через 12 часов воздействия к развитию окислительного стресса. Полученные нами данные указывают на более широкие адаптационные возможности макрофита по отношению к действию комплекса факторов и более длительный период устойчивости. В условиях повышенной температуры воды растворимость соединений свинца повышается, его поступление в ткани и органы макрофита увеличивается, но степень хлороза листьев была гораздо менее выражена, чем при индивидуальном действии этого химического фактора [15]. Вероятно, поступлению ионов свинца в ткани растения препятствовала плёнка, образуемая катионными СПАВ на поверхности организма растений. В целом в эксперименте преобладают негативные эффекты, вызванные катионными СПАВ: образование плёнок на границе раздела сред, препятствующих дыханию растения [16]. Снятие нагрузки, вызванной действием поллютантов в исследуемых концентрациях и повышенной температуры, не приводило к полному восстановлению окислительных процессов через 120 часов реабилитации.

Выводы исследования. Сочетанное действие факторов Pb(CH3COO)2 + СПАВ + повышенная температура оказывало меньший негативный эффект на C. demersu по сравнению с влиянием отдельных факторов, поскольку

индивидуальное действие катионных СПАВ приводило к гибели растений. Кратковременное (12 часов) воздействие указанных факторов компенсировалось действием антиоксидантных ферментов, а более длительное воздействие приводило преобладанию окислительных процессов. Реабилитационные процессы в тканях водных макрофитов C. demersum возможны, но занимают более длительный период, чем исследованный в данной работе.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Брагинский Л.П. Принципы классификации и некоторые механизмы структурно-функциональных перестроек пресноводных экосистем в условиях антропогенного пресса // Гидробиол. журн. 1998. Т.34. №6. С.72-94.

2. Долгоносов Б.М. Проблемы обеспечения качества воды в природно-техническом комплексе водоснабжения // Инженерная экология. 2003. № 5. С. 2-4.

3. Вишневецкий В.Ю., Вишневецкий Ю.М. Анализ воздействия загрязняющих веществ на поверхностные водные объекты // Известия Южного федерального университета. Технические науки. 2009. №7. Т. 96. С. 135139.

4. Zeng L.S., Liao M., Chen C.L., Huang C.Y. Effects of lead contamination on soil microbial activity and rice physiological indices in soil Pb rice (Oryza sativa L.) // Chemosphere. 2006. Vol. 65. P. 567-574.

5. Филенко О.Ф., Михеева И.В. Основы водной токсикологии. М.: Колос, 2007. 140 с.

6. Rosen M.J., Li F., Morall S.W., Versteeg D.J. The relationship between the interfacial properties of surfactants and their toxicity to aquatic organisms // Environ. Sci. Technol. 2001. Vol. 35. №5. P. 954-959.

7. Самусенко А.Л. Влияние отдельных компонентов эфирных масел на окисление цитраля // Химия растительного сырья. 2012. №.4. С. 131-136.

8. Степаненко И.С., Сяткин С.В., Акулина И.В. Антимикробная активность (+)-лимонена и его производного (+)-1,2-оксида лимонена // Вестник Чувашского университета. 2014. №2. С.368-374.

9. Тырков А.Г., Сухенко Л.Т., Акмаев Э.Р. Исследование химического состава и антимикробной активности экстрактивных веществ из семян Robinia Pseudoacacia L. // Химия растительного сырья. 2012. №2. С. 119-123.

10. Лукаткин А.С., Голованова В.С. Интенсивность перекисного окисления липидов в охлажденных листьях теплолюбивых растений // Физиология растений. 1988. Т. 35. Вып. 4. С. 773-780.

11. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П. и др. Методы биохимического исследования растений. Л.: Агропромиздат, 1987. С. 42-43.

12. Королюк М.А., Иванова Л.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности каталазы // Лаб. дело. 1988. № 1. С. 16-19.

13. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.

14. Розина С.А. Сравнение эффектов воздействия катионных синтетических поверхностно-активных веществ, температурного стресса и их сочетанного воздействия на ферментативную активность тканей высшего водного растения Ceratophyllum demersum // Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования. Материалы международной научно-практической конференции. Курск, 2013. С.276 - 283.

15. Розина С.А. Сравнение эффектов воздействия ионов свинца, температурного стресса и их сочетанно-го воздействия на ферментативную активность тканей высшего водного растения Ceratophyllum demersum // Теоретические и прикладные проблемы современной науки и образования. Материалы международной научно-практической конференции. Курск, 2013. С.283 - 292.

16. Hanke G., Bowsher C., Jones M.N. et al. Proteoliposomes and plant transport proteins // J. Exp. Bot. 1999. Vol. 50. No. 341. P. 1715-1726.

17. De Tullio M.C., Mike Guether, Raffaella Balestrini. Ascorbate oxidase is the potential conductor of a symphony of signaling pathways // Plant Signaling & Behavior; March 2013. Vol. 8 (3) P. 23-26.