ВАКЦИНАЦИЯ МЕНИНГОКОККОВЫМИ КОНЪЮГАТАМИ
MENINGOCOCCAL CONJUGATE VACCINATION

Все цитируемые здесь документы включены в настоящее описание во всей полноте посредством ссылки.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к вакцинам против Neisseria meningitidis. В частности, оно относится к вакцинам на основе конъюгированных капсульных сахаридов из множества серогрупп менингококков.
Предшествующий уровень техники изобретения
На основании различий капсульных полисахаридов микроорганизмов было выделено двенадцать серогрупп N.meningitidis (А, В, С, Н, I, К, L, 29E, W135, X, Y и Z). Группа А включает в себя патогены, чаще всего вызывающие эпидемические заболевания в странах, расположенных южнее Сахары. Патогены серогрупп В и С ответственны за подавляющее большинство случаев заболевания в США и большей части развитых стран. За остальные случаи заболевания в США и развитых странах ответственны патогены серогрупп W135 и Y.
Тетравалентная вакцина на основе капсульных полисахаридов против менингококков серогрупп А, С, Y и W135 известна долгие годы [1, 2]. Хотя эта вакцина эффективна у подростков и взрослых, она индуцирует слабый иммунный ответ и короткий срок защиты и не может быть использована у младенцев [например, ссылка 3], поскольку полисахариды являются Т-независимыми антигенами, которые индуцируют слабый иммунный ответ, который не может быть усилен с помощью вторичной иммунизации. В этой вакцине полисахариды неконъюгированы [4].
Конъюгированные вакцины против серогруппы С были одобрены для введения человеку и включают в себя Menjugate™ [5], Meningitec™ и NeisVac-C™. Известны смеси конъюгатов серогрупп А+С [6-8] и смеси конъюгатов серогрупп A+C+W135+Y [9-13].
Хотя менингококковые конъюгаты хорошо известны, они до сих пор не встроены в существующие педиатрические схемы иммунизации, которые в развитых странах, как правило, предусматривают введение вакцины против гепатита В при рождении и, начиная с 2 месяцев, вакцины против дифтерии/столбняка/коклюша (D-T-P), конъюгата Н.influenzae типа b (Hib), инактивированного полиовируса и пневмококковых конъюгатов.
Однако при введении конъюгированных вакцин в существующие схемы иммунизации следует решать проблему индуцируемой носителем супрессии эпитопов (или так называемой "супрессии носителем"), особенно супрессии, возникающей в результате прайминга носителем. "Супрессия носителем" представляет собой явление, при котором предварительная иммунизация животного белком-носителем предотвращает последующее индуцирование у него иммунного ответа против нового антигенного эпитопа, содержащегося в этом носителе [14].
Как сообщалось в ссылке 15, если несколько антигенов вакцины содержат одинаковый белковый компонент (используемый в качестве иммуногена и/или белка-носителя в составе конъюгата), существует возможность возникновения между этими антигенами интерференции. Описанный в ссылке 15 иммунный ответ на антиген, конъюгированный с носителем в виде столбнячного анатоксина (Tt), подавлялся предсуществующим иммунитетом против Tt.
В ссылке 16 описан неблагоприятный результат сочетания вакцины D-T-P с конъюгированной вакциной против Hib при использовании носителя в составе конъюгата Hib, совпадающего со столбнячным антигеном вакцины D-T-P.
Авторы пришли к заключению, что такое явление "супрессии носителем", возникающее вследствие интерференции, создаваемой общим белком-носителем, должно приниматься во внимание при введении вакцин, содержащих множество конъюгатов.
В отличие от ссылок 15 и 16 в ссылке 17 сообщалось, что прайминг столбнячным анатоксином не оказывал отрицательного влияния на иммунный ответ на вводимый далее конъюгат Hib-Tt, а супрессия наблюдалась у пациентов, получивших антитела против Tt от матери. Однако в ссылке 18 сообщалось об эффекте "супрессии эпитопов" в отношении пептидного конъюгата на основе Tt у пациентов, имеющих существующие антитела против Tt в результате противостолбнячной вакцинации.
В ссылке 19 высказано предположение о том, что конъюгат, содержащий в качестве носителя CRM197 (детоксифицированный мутант дифтерийного токсина), может оказаться неэффективным у детей, которые ранее не получали дифтерийный токсин в виде части вакцины (например, в виде части вакцины D-T-P или D-T). Эта работа получила дальнейшее развитие в ссылке 20, в которой было отмечено сохранение эффекта прайминга носителем в результате иммунизации D-T при дальнейшей иммунизации конъюгатами Hib.
Авторы ссылки 21 обнаружили, что предварительная иммунизация белком-носителем в виде дифтерийного или столбнячного анатоксина снижала рост содержания антител против Hib после последующей иммунизации капсульным сахаридом Hib, конъюгированным с указанными носителями, причем влияние оказывалось в равной мере на содержание и lgG1, и lgG2. Также подавлялись ответы на несущие элементы конъюгатов. Кроме того, наблюдалась более общая эпитопнеспецифичная супрессия, поскольку наблюдалось влияние предварительной иммунизации одним конъюгатом на иммунные ответы как на несущие, так и на сахаридные элементы второго конъюгата, вводимого четыре недели спустя.
В ссылке 22 описано использование различных белков-носителей в одной мультивалентной вакцине на основе пневмококковых конъюгатов, причем множество носителей использовалось во избежание супрессии носителем. Авторы предположили, что они использовали максимальную нагрузку белка-носителя, которая может применяться в составе мультивалентной конъюгированной вакцины без индуцирования отрицательной интерференции. В ссылке 23 сообщалось, что вакцины на основе пневмококковых конъюгатов, содержащие смешанные белки-носители, помимо антипневмококкового ответа, индуцируют побочные бустерные реакции на носители.
В ходе описанного в ссылке 24 исследования возможности введения реиммунизирующих доз противодифтерийной и противостолбнячной вакцин с моновалентными менингококковыми конъюгатами серогруппы С выяснили, что титры антител против менингококкового конъюгата были снижены, если носителем являлся столбнячный анатоксин, а пациент ранее был иммунизирован содержащей столбнячный анатоксин вакциной.
Наконец, в ссылке 25 сообщалось, что "предварительный контакт с белком-носителем может либо усилить, либо подавить гуморальный ответ на полисахариды, введенные в составе сахаридно-белковых конъюгатов". Конъюгаты, использованные в соответствии со ссылкой 25, содержали в качестве белка-носителя столбнячный анатоксин или мутант CRM197.
Таким образом, ситуация, касающаяся прайминга и/или супрессии носителем, запутана, и остается неясным, будет ли иммунизирующее действие какого-либо конкретного конъюгата подвергаться отрицательному влиянию эффекта супрессии носителем или положительному влиянию усиления в результате прайминга носителем. До тех пор, пока эта проблема не решена, вакцины на основе менингококковых конъюгатов не могут быть встроены или добавлены к существующим педиатрическим схемам иммунизации. Кроме того, поскольку менингококковые конъюгаты должны вводиться в виде тетравалентных смесей (т.е. четырех различных конъюгатов), риск возникновения супрессии носителем повышается еще больше.
Помимо проблемы прайминга носителем, оказывающего отрицательное влияние на иммунные ответы против конъюгатов сахаридов, возможна и обратная ситуация, т.е. иммунизация конъюгатом может оказывать отрицательное влияние на иммунные ответы против носителя [26].
Раскрытие изобретения
В ссылке 27 высказано предположение о том, что с супрессией носителем в вакцинах на основе менингококковых конъюгатов следует бороться путем использования более одного типа белка-носителя. В частности, в ссылке 27 высказано предположение, что в качестве белка-носителя для менингококковых конъюгатов должен использоваться белок D H.influenzae, причем альтернативой может также являться столбнячный анатоксин (Tt). Во избежание супрессии эпитопов в качестве альтернативного носителя в ссылке 28 также указан белок D. Аналогично, в ссылке 29 высказано предположение о том, что во избежание супрессии эпитопов в мультивалентных конъюгированных вакцинах в качестве носителя должны использоваться фимбрии Bordetella pertussis. Напротив, было выяснено, что дифтерийный анатоксин (Dt) и его производные могут быть использованы в качестве безопасного носителя для конъюгатов менингококковых сахаридов, даже если одновременно вводят множество менингококковых конъюгатов. Ни в одном из моновалентных менингококковых конъюгатов серогруппы С, исследованных в соответствии со ссылкой 22, не использовали носитель в виде Dt.
Более того, в ссылке 27 также содержится предположение о том, что вакцины на основе менингококковых конъюгатов должны вводиться одновременно с вакцинами D-T-P-Hib (см., например, пример 3) с тем, чтобы отсутствовал предварительный контакт с белком-носителем из менингококковых конъюгатов. Напротив, теперь выяснено, что менингококковые конъюгаты могут быть введены пациентам, даже если они уже получали белок-носитель либо в качестве ранее введенного иммуногена (например, при иммунизации D-T-P или D-T), либо в качестве ранее введенного белка-носителя (например, в составе конъюгата Hib или вакцины на основе пневмококковых конъюгатов). В более раннем исследовании индуцируемой носителем супрессии эпитопов в моновалентных вакцинах на основе конъюгатов серогруппы С [24] внимания эффекту какого-либо предшествующего введения конъюгатов не уделялось.
Отличаясь от ссылки 27, данные о способности пациента формировать иммунный ответ на менингококковый конъюгат, даже если он уже получал отличный конъюгат, также контрастируют и с ссылкой 21.
Таким образом, изобретение относится к способу иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, предусматривающему стадию введения пациенту композиции, содержащей, по меньшей мере, два из: (а) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы А и (ii) дифтерийного анатоксина или его производного; (b) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы С и (ii) дифтерийного анатоксина или его производного; (с) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы W135 и (ii) дифтерийного анатоксина или его производного; и (d) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы Y и (ii) дифтерийного анатоксина или его производного, причем пациент предварительно иммунизирован (а) дифтерийным анатоксином или его производным и/или (b) конъюгатом (i) капсульного сахарида микроорганизма, отличного от N.meningitidis, и (ii) дифтерийного анатоксина или его производного.
Изобретение также относится к применению, по меньшей мере, двух из: (а) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы А и (ii) дифтерийного анатоксина или его производного; (b) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы С и (ii) дифтерийного анатоксина или его производного; (с) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы W135 и (ii) дифтерийного анатоксина или его производного; и (d) конъюгата (i) капсульного сахарида N.meningitidis серогруппы Y и (ii) дифтерийного анатоксина или его производного, в производстве лекарственного препарата для иммунизации пациента против заболевания, вызываемого Neisseria meningitidis, причем пациент предварительно иммунизирован (а) дифтерийным анатоксином или его производным и/или (b) конъюгатом (i) капсульного сахарида микроорганизма, отличного от N.meningitidis, и (ii) дифтерийного анатоксина или его производного.
Заболевание, вызываемое менингококками, предпочтительно, представляет собой менингит, более предпочтительно, бактериальный менингит и, наиболее предпочтительно, менингит, вызываемый менингококками. Таким образом, изобретение может обеспечивать защиту от менингококковых инфекций, вызывающих менингит.
Если предварительно иммунизировавший антиген является производным дифтерийного анатоксина, это производное предпочтительно сохраняет иммунную перекрестную реактивность с Dt, а предпочтительно представляет собой CRM197.
Предварительно иммунизированный пациент
Подлежащий иммунизации пациент предварительно иммунизирован: (а) дифтерийным анатоксином или его производным; и/или (b) конъюгатом (i) капсульного сахарида микроорганизма, отличного от Neisseria meningitidis, и (ii) дифтерийного анатоксина или его производного. В типичной предварительной иммунизации используют антиген дифтерийного анатоксина; конъюгат капсульного сахарида Hib, содержащий носитель в виде дифтерийного анатоксина или CRM197; и/или конъюгат пневмококкового капсульного сахарида, содержащий носитель в виде дифтерийного анатоксина или CRM197.
Пациент получал, по меньшей мере, одну (например, 1, 2, 3 или более) дозу преиммунизирующего(их) антигена(ов), и указанную дозу (или первую из множества доз) вводили пациенту, по меньшей мере, за шесть (например, за 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 36, 48, 60, 120, 180, 240, 300 или более) месяцев до иммунизации менингококковыми конъюгатами по изобретению. В предпочтительной группе пациентов предварительная иммунизация имела место в течение 3 лет после рождения, например в течение 2 лет после рождения, в течение 1 года после рождения, в течение 6 месяцев после рождения или даже в течение 3 месяцев, 2 месяцев или 1 месяца после рождения.
Подлежащий в соответствии с изобретением иммунизации пациент, как правило, является человеком. Человек, как правило, находится в возрасте, по меньшей мере, 1 месяца, например, по меньшей мере, 2 месяцев, по меньшей мере, 3 месяцев, по меньшей мере, 4 месяцев, по меньшей мере, 6 месяцев, по меньшей мере, 2 лет, по меньшей мере, 5 лет, по меньшей мере, 11 лет, по меньшей мере, 17 лет, по меньшей мере, 40 лет, по меньшей мере, 55 лет и т.д. В предпочтительную выборку пациентов входят пациенты в возрасте, по меньшей мере, 6 месяцев. Другая предпочтительная выборка пациентов входит в возрастную группу 2-55 лет, а другая предпочтительная выборка пациентов входит в возрастную группу 11-55 лет. В еще одну предпочтительную выборку пациентов входят пациенты в возрасте менее 11 лет, например в возрасте 2-11 лет. Однако во всех случаях независимо от возраста пациент предварительно иммунизирован, как описано в настоящем описании.
Если преиммунизационный антиген представляет собой дифтерийный анатоксин, пациент, как правило, получил анатоксин в виде антигена 'D' в ходе предварительной иммунизации D-T-P или D-T. Такие иммунизации, как правило, проводят у новорожденных детей в возрасте 2, 3 и 4 месяцев. Если для иммунизации используют противококлюшную вакцину, эта вакцина может представлять собой цельноклеточную, или клеточную, противококлюшную вакцину ('Pw'), но предпочтительно представляет собой бесклеточную противококлюшную вакцину ('Ра'). Преиммунизационные вакцины Ра, как правило, содержат один, два или три из следующих широко известных и хорошо охарактеризованных антигенов В. pertussis: (1) коклюшного анатоксина ('РТ'), детоксифицированного либо химическими средствами, либо с помощью сайт-специфического мутагенеза, например мутанта 9K/129G [30]; (2) волокнистого гемагглютинина ('FHA'); (3) пертактина (также известного как белок внешней мембраны массой 69 килодальтон). Бесклеточные противококлюшные вакцины также могут содержать агглютиноген-2 и/или агглютиноген-3. Антиген Т', используемый в предварительной иммунизации D-T-P, как правило, представляет собой столбнячный анатоксин.
Если преиммунизационный антиген представляет собой дифтерийный анатоксин, пациент также мог получить или, альтернативно, получил анатоксин в виде белка-носителя в составе белково-сахаридного конъюгата. Такие конъюгаты включают в себя конъюгат Hib 'PRP-D' [см. таблицу 14-7 из ссылки 32], например, продукт ProHIBIT™.
Если преиммунизационный антиген представляет собой CRM197, пациент, как правило, предварительно иммунизирован конъюгатом Hib и/или мультивалентным пневмококковым конъюгатом. Такую иммунизацию, как правило, проводят у новорожденных детей в возрасте 2, 3 и 4 месяцев. Конъюгаты Hib, в которых в качестве носителя используют CRM197, включают в себя конъюгаты 'НЬОС' [таблица 14-7 из ссылки 32], например продукт HibTITER™. Пневмококковые конъюгаты, в которых в качестве носителя используют CRM197, включают в себя 7-валентные смеси PCV7, например вакцину PrevNar™ [31]. Пациент также может быть предварительно иммунизирован менингококковым конъюгатом серогруппы С ('MenC'). Конъюгаты MenC, в которых в качестве носителя используют CRM197, включают в себя Meninvact™/Menjugate™ [5] и Meningitec™. Однако, предпочтительно, чтобы пациент был предварительно иммунизирован конъюгатом Hib и/или пневмококковым конъюгатом, а не конъюгатом MenC. Если пациент был предварительно иммунизирован конъюгатом MenC, то вводимая в соответствии с изобретением вакцина может содержать или не содержать конъюгат серогруппы С.
Если предварительная иммунизация проведена конъюгированным антигеном, пациент почти неизбежно также получил и малое количество свободного дифтерийного анатоксина (или его производного) в результате низкой загрязненности конъюгата (например, вызванной гидролизом конъюгата при хранении), но это малое количество, как правило, таково, что обеспечивает значимый иммунный ответ.
Дифтерийный анатоксин представляет собой широко известный и хорошо охарактеризованный белок [см., например, главу 13 из ссылки 32], который может быть получен путем обработки АДФ-рибозилирующего экзотоксина Corynebacterium diphtheriae инактивирующим химическим реагентом, таким как формалин или формальдегид. CRM197 широко известен и хорошо охарактеризован [33-36] и широко используется в качестве носителя в составе конъюгированных сахаридных вакцин. CRM197 и Dt содержат множество общих эпитопов носителя.
Результатом предварительной иммунизации является контакт иммунной системы пациента с преиммунизирующими антигенами. Для предварительной иммунизации дифтерийным анатоксином (Dt) это, как правило, означает, что у пациента индуцируется гуморальный ответ против Dt (как правило, с получением титра антител против Dt>0,01 МЕ/мл) и появляются В- и/или Т-лимфоциты памяти, специфичные в отношении Dt, т.е. предварительная иммунизация Dt, как правило, обеспечивает индукцию у пациента иммунного ответа против Dt при вторичной иммунизации. Предварительная иммунизация, в которой Dt (или его производное) является носителем сахарида в составе конъюгата, индуцирует ответ против сахарида, и у пациента появляются В- и/или Т-лимфоциты памяти, специфичные в отношении сахарида, т.е. предварительная иммунизация, как правило, обеспечивает индукцию у пациента иммунного ответа против сахарида при вторичной иммунизации. Предпочтительно, предварительная иммунизация обеспечивает индукцию у пациента защитного иммунитета, например, против дифтерии.
Таким образом, подлежащие в соответствии с изобретением иммунизации пациенты отличаются от пациентов вообще тем, что они являются членами подгруппы общей популяции, чья иммунная система уже выработала иммунный ответ на преиммунизационные антигены таким образом, что иммунизация в соответствии с изобретением менингококковым конъюгатом, содержащим носитель в виде дифтерийного анатоксина (или его производного), индуцирует в этой подгруппе иммунный ответ, отличный от такового у пациентов, у которых иммунный ответ на преиммунизационные антигены ранее не индуцировался. Предпочтительными являются пациенты, предварительно иммунизированные Dt (или его производным), использованным в качестве носителя в составе конъюгата (особенно конъюгата Hib). Особенно предпочтительные пациенты предварительно иммунизированы Dt (или его производным), использованным в качестве носителя в составе конъюгата, а также Dt в качестве неконъюгированного иммуногена.
Помимо предварительной иммунизации дифтерийным анатоксином (или его производным) в конъюгированной или неконъюгированной формах пациент может быть предварительно иммунизирован другими антигенами. Такие антигены включают в себя без ограничения коклюшный(ые) антиген(ы) - см. выше; столбнячный анатоксин - см. выше; Haemophilus influenzae типа В - см. выше; поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg); полиовирус, такой как вакцина на основе инактивированного полиовируса (IPV); Streptococcus pneumoniae - см. выше; вирус гриппа; BCG; антигены вируса гепатита А; вирус кори; вирус эпидемического паротита; вирус краснухи; вирус ветряной оспы; и т.д.
Пациент может быть предварительно иммунизирован или неиммунизирован одним или несколькими менингококковыми конъюгатами. В соответствии с одними предпочтительными вариантами выполнения на момент первичного введения менингококкового конъюгата пациенты уже предварительно иммунизированы Dt (или его производным). В соответствии с другими вариантами выполнения менингококковый конъюгат вводят пациенту, предварительно иммунизированному как (i) Dt или его производным, так и (ii) менингококковым конъюгатом.
Конъюгаты
В соответствии с изобретением пациентов иммунизируют конъюгированными сахаридами. Конъюгирование применяют для повышения иммуногенности сахаридов, поскольку оно позволяет перевести их из разряда Т-независимых антигенов в разряд Т-зависимых антигенов, обеспечивая таким образом прайминг с созданием иммунной памяти. Конъюгирование особенно применимо для создания педиатрических вакцин [например, ссылка 37] и представляет собой хорошо известный метод [обзор приводится, например, в ссылках 38-46].
Композиция, используемая в соответствии с изобретением, содержит, по меньшей мере, два менингококковых конъюгата, причем каждый конъюгат содержит белок-носитель в виде дифтерийного анатоксина (или его производного) и капсульный сахарид. Капсульные сахариды выбирают из серогрупп менингококков А, С, W135 и Y таким образом, что композиции содержат сахариды из 2, 3 или всех 4 из этих четырех серогрупп. Конкретные композиции содержат сахариды из серогрупп А и С; серогрупп А и W135; серогрупп А и Y; серогрупп С и W135; серогрупп С и Y; серогрупп W135 и Y; серогрупп А и С и W135; серогрупп А и С и Y; серогрупп А и W135 и Y; серогрупп С и W135 и Y; серогрупп А и С и W135 и Y. Наиболее предпочтительными являются композиции, содержащие сахариды всех четырех серогрупп.
Капсульные сахариды каждой из этих четырех серогрупп подробно описаны. Капсульный сахарид менингококка серогруппы А представляет собой гомополимер (α1→6)-связанного N-ацетил-D-маннозамин-1-фосфата с частичным 0-ацетилированием по положениям С3 и С4. Ацетильные группы могут быть заменены блокирующими группами во избежание гидролиза [47], но такие модифицированные сахариды по-прежнему будут являться сахаридами серогруппы А для целей настоящего изобретения. Капсульный сахарид серогруппы С представляет собой гомополимер (α2→9)-связанной сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты, или 'NeuNAc'). Большинство штаммов серогруппы С содержат O-ацетильные группы в положениях С-7 и/или С-8 остатков сиаловой кислоты, но примерно у 15% клинических штаммов эти O-ацетильные группы отсутствуют [48, 49]. Структура сахарида записывается как →9)-Neu p NAc 7/8 ОАс-(α2→. Сахарид серогруппы W135 представляет собой полимер, состоящий из дисахаридных звеньев сиаловая кислота - галактоза. Как и сахарид серогруппы С, он характеризуется вариабельным O-ацетилированием, но в положениях 7 и 9 сиаловой кислоты [50]. Его структура записывается как →4)-D-Neup5Ac(7/90Ac)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→. Сахарид серогруппы Y схож с сахаридом серогруппы W135 за исключением того, что его дисахаридное повторяющееся звено содержит глюкозу вместо галактозы. Как и сахарид серогруппы W135, он характеризуется вариабельным O-ацетилированием в положениях 7 и 9 сиаловой кислоты [50]. Структура сахарида серогруппы Y записывается как →4)-D-Neup5Ac(7/90Ac)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→.
Сахариды, используемые в соответствии с изобретением, могут быть O-ацетилированными, как описано выше (например, характеризоваться таким же профилем O-ацетилирования, что и нативные капсульные сахариды), или они могут быть частично или полностью дез-O-ацетилированными по одному или нескольким положениям сахаридных циклов, или они могут быть гипер-O-ацетилированными по сравнению с нативными капсульными сахаридами.
2
2
Сахариды, используемые в соответствии с изобретением, предпочтительно короче, чем нативные капсульные сахариды, содержащиеся в бактериях. Таким образом, сахариды предпочтительно деполимеризованы, причем деполимеризация происходит после очистки, но до конъюгирования. Деполимеризация уменьшает длину цепи сахаридов. Предпочтительный метод деполимеризации предусматривает использование пероксида водорода [9]. Пероксид водорода добавляют к сахариду (например, с получением конечной концентрации HO 1%) и смесь затем инкубируют (например, примерно при 55°С) до тех пор, пока не достигается желаемый уровень сокращения длины цепи. Другой метод деполимеризации предусматривает кислотный гидролиз [10]. Специалистам в данной области техники известны и другие методы полимеризации. Сахариды, используемые для получения конъюгатов для применения в соответствии с изобретение, могут быть получены в соответствии с любым из этих методов деполимеризации. Деполимеризация может быть использована для обеспечения оптимальной длины цепи для иммуногенности и/или для уменьшения длины цепи для облегчения физического манипулирования сахаридами.
197
+
Типичными белками-носителями для использования в конъюгатах являются бактериальные токсины или анатоксины, такие как дифтерийный токсин (или его мутант CRM) и столбнячный токсин. Другие известные белки-носители включают в себя белок внешней мембраны N.meningitidis, синтетические пептиды, белки теплового шока, белки возбудителя коклюша, цитокины, лимфокины, гормоны, факторы роста, искусственные белки, содержащие множественные эпитопы человеческих CD4 Т-клеток из антигенов различных патогенов, белок D H.influenzae, поверхностный белок PspA пневмококков, железосвязывающие белки, токсин А или В С.difficile и т.д. Однако в соответствии с изобретением менингококковые конъюгаты содержат белок-носитель в виде дифтерийного анатоксина (или его производного, такого как CRM197). Предпочтительным является ковалентное конъюгирование.
В композициях может быть использовано более одного белка-носителя. Так, различные белки-носители могут быть использованы для сахаридов различных серогрупп, например сахариды серогруппы А могут быть конъюгированы с CRM197, тогда как сахариды серогруппы С может быть конъюгированы с дифтерийным анатоксином. Также более одного белка-носителя может быть использовано для каждого конкретного сахаридного антигена, например, сахариды серогруппы А могут быть подразделены на две группы, причем некоторые из них конъюгированы с CRM197, а другие конъюгированы с дифтерийным анатоксином. Однако, вообще, предпочтительно использовать одинаковый белок-носитель для всех менингококковых сахаридов в композиции, а более предпочтительно, для всех сахаридов (т.е. включая любые неменингококковые конъюгаты, которые могут присутствовать). Предпочтительно, чтобы композиции по изобретению не содержали никакого белка-носителя в виде столбнячного анатоксина. Если композиция содержит белок-носитель в виде дифтерийного анатоксина, предпочтительно, чтобы он не содержал никакого белка-носителя в виде CRM197.
Один белок-носитель может нести более одного сахаридного антигена [51]. Например, один белок-носитель может быть конъюгирован с сахаридами серогрупп А и С. Для достижения этой цели сахариды могут быть смешаны перед проведением реакции конъюгирования. Однако, как правило, для каждой серогруппы предпочтительно получать отдельные конъюгаты. Конъюгаты предпочтительно смешивают с получением по существу отношения 1:1:1:1 (в расчете на массу сахарида), например значения массы сахаридов каждой серогруппы колеблются в пределах ±10% друг от друга. Обычное количество менингококкового антигена на серогруппу в композиции составляет от 1 мкг до 20 мкг, например от 2 до 10 мкг на серогруппу, или около 4 мкг. Альтернативно отношению 1:1:1:1 может использоваться двойная доза сахарида серогруппы А (2:1:1:1).
Предпочтительными являются конъюгаты с массовым отношением сахарид: белок от 1:15 (т.е. с избытком белка) до 15:1 (т.е. с избытком сахарида), предпочтительно от 1:10 до 10:1, более предпочтительно от 1:5 до 5:1. Избыток белка-носителя предпочтителен. Предпочтительными являются конъюгаты с отношением сахарид: белок около 1:12 или около 1:6 или около 1:3, особенно если носитель представляет собой Dt. Наиболее предпочтительным является отношение 1:3.
Конъюгаты могут быть использованы в сочетании со свободным белком-носителем [52]. Однако, если данный белок-носитель находится как в связанной, так и в конъюгированной формах в составе композиции по изобретению, количество неконъюгированной формы составляет предпочтительно не более 5% от общего количества белка-носителя в составе композиции в целом, а более предпочтительно составляет не более 2% по массе. Аналогично, масса неконъюгированного сахарида предпочтительно составляет не более 15% от общей массы сахарида.
Может использоваться любая подходящая реакция конъюгирования с применением по необходимости любого подходящего линкера.
Как правило, перед конъюгированием сахарид активируют или функционализируют. Активация может быть проведена, например, с помощью цианилирующих агентов, таких как CDAP (например, тетрафторборат 1-циано-4-диметиламинопиридиния [53, 54 и т.д.]). В других подходящих методиках используют карбодиимиды, гидразиды, активные сложные эфиры, норборан, п-нитробензойную кислоту, N-гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC, TSTU; см. также введение в ссылке 44).
4
12
Связи через линкерную группу могут быть установлены в соответствии с любой известной методикой, например в соответствии с методиками, описанными в ссылках 55 и 56. Образование одного типа связи предусматривает восстановительное аминирование полисахарида, связывание полученной аминогруппы с одним концом адипатной линкерной группы с последующим связыванием белка с другим концом адипатной линкерной группы [42, 57, 58]. Другие линкеры включают в себя β-пропионамидо [59], нитрофенилэтиламин [60], галогенацилгалогениды [61], гликозидные связи [62], 6-аминокапроновую кислоту [63], ADH [64], радикалы C-C [65] и т.д. Альтернативно использованию линкера может использоваться непосредственная связь. Образование непосредственных связей с белком может предусматривать окисление полисахарида с последующим восстановительным аминированием с белком, как описано, например, в ссылках 66 и 67.
2
Предпочтительная методика конъюгирования предусматривает введение аминогрупп в сахарид (например, путем замены концевых групп =O на -NH) с последующими образованием производного диэфира адипиновой кислоты (например, диэфира N-гидроксисукцинимида адипиновой кислоты) и взаимодействием с белком-носителем.
В одной предпочтительной методике конъюгирования сахарид взаимодействует с дигидразидом адипиновой кислоты. Что касается сахарида серогруппы А, на этой стадии также может быть добавлен карбодиимид. По завершении реакции добавляют цианоборгидрид натрия. Производное сахарида может затем быть выделено, например, путем ультрафильтрации. Производное сахарида затем смешивают с белком-носителем (например, с дифтерийным анатоксином) и добавляют карбодиимид. По завершении реакции может быть выделен конъюгат. С дальнейшими подробностями этого метода конъюгирования можно ознакомиться в ссылке 10. Конъюгаты, получаемые в соответствии с этой методикой, например конъюгаты, содержащие носитель-дифтерийный анатоксин и адипатный линкер, являются предпочтительными конъюгатами для использования для целей настоящего изобретения.
Предпочтительно конъюгаты получают по отдельности и затем смешивают. После смешивания концентрация смешанных конъюгатов может быть доведена, например, с помощью апирогенного фосфатно-буферного раствора. Перед смешиванием каждый конъюгат предпочтительно содержит не более 15 мкг носителя.
Результатом введения менингококковых конъюгатов по изобретению предпочтительно является то, что на введенный сахарид каждой серогруппы у пациента развивается сывороточный бактерицидный гуморальный (SBA) ответ с повышением SBA титра (по сравнению с предварительно иммунизированным пациентом до получения смешанных менингококковых конъюгатов), который, по меньшей мере, в 4 раза больше и предпочтительно в 8 раз больше. SBA тест является стандартным анализом коррелирующих параметров для определения уровня защиты от менингококков. Более подробно серологические коррелирующие параметры менингококковых вакцин обсуждаются в ссылке 68.
Дополнительные антигенные компоненты композиций, применяемые в соответствии с изобретением
Помимо менингококковых конъюгатов, композиции, применимые в соответствии с изобретением, могут при необходимости содержать 1, 2 или 3 из следующих дополнительных антигенов:
1. Конъюгированный капсульный сахарид S. pneumoniae [например, глава 23 ссылки 32; ссылки 69-71].
Предпочтительным является включение в состав сахаридов более одного серотипа S. pneumoniae. Например, широко используются смеси полисахаридов 23 различных серотипов, а также конъюгированные вакцины на основе полисахаридов 5-11 различных серотипов [72]. Например, PrevNar™ [31] содержит антигены семи серотипов (4, 6В, 9V, 14, 18С, 19F и 23F), причем каждый сахарид индивидуально конъюгирован с CRM197 восстановительным аминированием в концентрации 2 мкг каждого сахарида на дозу объемом 0,5 мл (4 мкг серотипа 6 В) и конъюгаты адсорбированы на адъюванте на основе фосфата алюминия. Если для применения в соответствии с изобретением в композицию включены пневмококковые конъюгаты, композиция предпочтительно содержит, по меньшей мере, серотипы 6В, 14, 19F и 23F.
2. Конъюгированный капсульный сахарид Н.influenzae типа В [например, глава 14 ссылки 32].
Белком-носителем для конъюгата может являться CRM197, Dt, столбнячный анатоксин или комплекс внешней мембраны N.meningitidis. Сахаридный остаток конъюгата может представлять собой полисахарид (например, полноразмерный полирибозилрибитолфосфат (PRP)), но предпочтительно деполимеризовать капсульные полисахариды с образованием олигосахаридов (например, с М.м. ~1-~5 кДа). Предпочтительный конъюгат Hib содержит олигосахарид, ковалентно связанный с CRM197 через адипатный линкер [73, 74]. Введение антигена Hib предпочтительно приводит к созданию концентрации анти-PRP антитела, составляющей >0,15 мкг/мл и, более предпочтительно, >1 мкг/мл. Если композиция содержит сахаридный антиген Hib, она также предпочтительно не содержит адъювант на основе гидроксида алюминия. Если композиция содержит адъювант на основе фосфата алюминия, антиген Hib может быть адсорбирован на адъювант [75] или может оставаться неадсорбированным [27]. Предотвращение адсорбции может быть достигнуто путем выбора нужного значения рН во время смешивания антигена/адъюванта, адъюванта с подходящей точкой нулевого заряда и подходящего порядка смешивания для разнообразных антигенов в композицию [76].
3. Белковый антиген Neisseria meningitidis серогруппы В [например, ссылка 77].
Композиция может содержать один или несколько из указанных дополнительных антигенов.
Такие антигены могут быть адсорбированы или не адсорбированы на соли алюминия.
Если дифтерийный антиген включен в состав смеси, также предпочтительным является включение в состав столбнячного антигена и коклюшных антигенов. Аналогично, если присутствует столбнячный антиген, также предпочтительным является включение в состав дифтерийных и коклюшных антигенов. Аналогично, если присутствует коклюшный антиген, также предпочтительным является включение в состав дифтерийных и столбнячных антигенов.
Если менингококковые конъюгаты вводят в виде многократных доз, ни одна, некоторые или все дозы могут содержать указанные дополнительные антигены.
Композиции, содержащие менингококковые конъюгаты, предпочтительно не содержат столбнячный анатоксин. Предпочтительно они не содержат коклюшные антигены. Предпочтительно они не содержат поверхностный антиген вируса гепатита В. Предпочтительно они не содержат полиовирус. Композиция предпочтительно содержит не более 50 мкг дифтерийного анатоксина на один менингококковый конъюгат и более предпочтительно не более 50 мкг дифтерийного анатоксина на все объединенные менингококковые конъюгаты.
Состав вакцины
Композиция, применимая в соответствии с изобретением, как правило, содержит фармацевтически приемлемый носитель. Такие носители включают в себя любой носитель, который сам по себе не индуцирует выработку антител, вредных для субъекта, получающего композицию. Подходящие носители, как правило, представляют собой крупные медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот, сахароза, трегалоза, лактоза, и агрегаты липидов (такие как масляные капли или липосомы). Такие носители хорошо известны средним специалистам в данной области техники. Вакцины также могут содержать разбавители, такие как вода, солевой раствор, глицерин и т.д. Кроме того, могут содержаться вспомогательные вещества, такие как увлажняющие вещества или эмульгаторы, рН-буферные вещества и т.п. Типичный носитель представляет собой стерильный апирогенный фосфатно-буферный физиологический раствор. С подробным обсуждением фармацевтически приемлемых носителей и наполнителей можно ознакомиться в ссылке 78.
Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, могут содержать антимикробное вещество, особенно если они упакованы в форму, содержащую множество доз.
Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, могут содержать поверхностно-активное вещество, например, Tween (полисорбат), такой как Tween 80. Поверхностно-активные вещества, как правило, содержатся в низких концентрациях, например <0,01%.
Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, могут содержать соли натрия (например, хлорид натрия и/или фосфат натрия). Эти соли могут быть использованы для обеспечения изотоничности. Типичная концентрация NaCl составляет 10±2 мг/мл, например 8,8 мг/мл. Типичная концентрация фосфата натрия составляет 1,2 мг/мл.
Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, как правило, содержат буфер, например фосфатный буфер.
Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, могут содержать сахарный спирт (например, маннит) или дисахарид (например, сахарозу или трегалозу), например, в концентрации около 15-30 мг/мл (например, 25 мг/мл), особенно, если композиции подлежат лиофилизации или если они содержат вещество, восстановленное из лиофилизированного вещества. Однако предпочтительные композиции не лиофилизированы, т.е. все менингококковые конъюгаты находятся в водной форме от стадии упаковки до стадии введения.
Как правило, композиции вводят пациенту непосредственно. Непосредственная доставка может быть осуществлена с помощью парентеральной инъекции (например, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно или в интерстициальное пространство ткани) или путем ректального, перорального, вагинального, местного, чрескожного, интраназального, глазного, ушного, легочного или иного чресслизистого введения. Предпочтительным является внутримышечное введение (например, в бедро или плечо). Инъекция может быть проведена с помощью иглы (например, иглы для подкожных инъекций), но альтернативно может быть применена безыгольная инъекция. Типичная доза при внутримышечном введении составляет 0,5 мл.
Менингококковые конъюгаты множества серогрупп вводят в смеси в составе единой композиции. Композиция может быть введена в виде однократной дозы или может быть введена более одного раза по схеме многократного дозирования. Многократные введения могут быть использованы в ходе первичной иммунизации и/или в ходе вторичной иммунизации. За выполнением протокола первичной иммунизации может следовать протокол вторичной иммунизации менингококковыми конъюгатами. Надлежащие временные промежутки между первично иммунизирующими дозами (например, 4-16 недель) и между первичной и вторичной иммунизациями могут быть определены в соответствии с рутинными методиками. Конъюгаты могут быть удобно введены одновременно с другими вакцинами, например одновременно с вакциной D-T-P или одновременно с вакциной на основе пневмококковых конъюгатов, или одновременно с вакциной против гриппа, или одновременно с вакциной MMR или MMRV. Эти вакцины, как правило, вводят раздельно, но в течение одного посещения врача.
Бактериальные инфекции способны поражать различные отделы организма, и, соответственно, композиции могут быть приготовлены в различных формах. Например, композиции могут быть приготовлены в виде препаратов для инъекций либо в форме истинных растворов, либо суспензий. Также могут быть приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед введением (например, лиофилизированная композиция). Может быть приготовлена композиция для местного введения, например, в виде мази, крема или порошка. Может быть приготовлена композиция для перорального введения, например, в форме таблетки или капсулы или в виде сиропа (при необходимости дополненного корригентами). Может быть приготовлена композиция для легочного введения, например, в форме ингалятора, содержащего мелкодисперсный порошок или аэрозоль. Может быть приготовлена композиция в форме суппозитория или пессария. Может быть приготовлена композиция для назального, ушного или глазного введения, например, в форме аэрозоля, капель, геля или порошка [например, ссылки 79 и 80]. Однако, как правило, менингококковые конъюгаты включают в состав препаратов для внутримышечных инъекций.
Композиции, применяемые в соответствии с изобретением, могут содержать или не содержать адъювант вакцины. Адъюванты, которые могут быть использованы в композициях по изобретению, включают в себя без ограничения:
А. Минералсодержащие композиции
Минералсодержащие композиции, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, содержат минеральные соли, такие как соли алюминия и соли кальция. Изобретение предусматривает использование минеральных солей, таких как гидроксиды (например, оксигидроксиды), фосфаты (например, гидроксифосфаты, ортофосфаты), сульфаты и т.д. [см., например, главы 8 и 9 ссылки 81], или смесей различных минеральных соединений, причем указанные соединения принимают любую подходящую форму (например, геля, кристаллического вещества, аморфного вещества и т.д.) и причем адсорбция является предпочтительной. Минералсодержащие композиции также могут быть приготовлены в форме частиц солей металлов [82].
Особенно предпочтительны фосфаты алюминия, а типичный адъювант представляет собой аморфный гидроксифосфат алюминия с молярным отношением
4
3+
3+
PO/Al, составляющим от 0,84 до 0,92, содержащийся в концентрации около 0,6 мг Al/мл. Может быть использована адсорбция на малом количестве фосфата алюминия, например, от 50 до 100 мкг Al на конъюгат на дозу. Если в композиции содержатся конъюгаты сахаридов множества видов бактерий, адсорбция всех конъюгатов необязательна.
В. Масляные эмульсии
Композиции в форме масляной эмульсии, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, содержат эмульсии сквалена-воды, такие как MF59 [глава 10 ссылки 81; см. также ссылку 83] (5% сквалена, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85, приготовленные в виде субмикронных частиц с помощью микрофлуидизатора). Также могут быть использованы полный адъювант Фройнда (CFA) и неполный адъювант Фройнда (IFA).
С. Сапонинсодержащие составы [глава 22 ссылки 81]
В качестве адъювантов в соответствии с изобретением также могут быть использованы сапонинсодержащие составы. Сапонины представляют собой разнородную группу стероидных гликозидов и тритерпеноидных гликозидов, которые содержатся в коре, листьях, стеблях, корнях и даже цветках широкого круга видов растений. В качестве адъюванта был хорошо исследован сапонин из коры мыльного дерева Quillaia saponaria Molina. Сапонин также может быть промышленно получен из Smilax ornata (сарсапарели), Gypsophilla paniculata (гипсофилы ползучей) и Saponaria officianalis (мыльного корня). Сапонинсодержащие адъювантные составы включают в себя очищенные составы, такие как QS21, равно как и липидные составы, такие как ISCOM. QS21 распространяется на рынке под наименованием Stimulon™.
Сапонинсодержащие композиции очищали по методу ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ. С помощью этих методов были выделены конкретные очищенные фракции, включая QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B и QH-C. Предпочтительно, сапонин представляет собой QS21. Методика получения QS21 описана в ссылке 84. Сапонинсодержащие составы также могут содержать стерин, такой как холестерин [85].
Сочетания сапонинов и холестеринов может быть использовано для формирования уникальных частиц, называемых иммуностимулирующими комплексами (ISCOM) [глава 23 ссылки 81]. ISCOM, как правило, также содержат фосфолипид, такой как фосфатидилэтаноламин или фосфатидилхолин. Для получения ISCOM может быть использован любой известный сапонин. Предпочтительно, ISCOM содержит один или несколько из QuilA, QHA и QHC. ISCOM более подробно описаны в ссылках 85-87. При необходимости ISCOM могут не содержать дополнительных поверхностно-активных веществ [88]. С обзором разработки адъювантов на основе сапонинов можно ознакомиться в ссылках 89 и 90.
D. Виросомы и вирусоподобные частицы
Виросомы и вирусоподобные частицы (VLP) также могут быть использованы в качестве адъювантов в соответствии с изобретением. Эти структуры, как правило, содержат один или несколько вирусных белков, при необходимости объединенных или включенных в композицию с фосфолипидом. Как правило, они не патогенны, не способны к репликации и не содержат каких-либо частей нативного вирусного генома. Вирусные белки могут быть получены в соответствии с рекомбинантными методиками или выделены из цельных вирусов. Такие вирусные белки, пригодные для использования в получении виросом или VLP, включают в себя белки, полученные из вируса гриппа (такие как НА или NA), вируса гепатита В (такие как коровые или капсидные белки), вируса гепатита Е, вируса кори, вируса Синдбис, ротавируса, вируса ящура, ретровируса, вируса Норуолк, вируса папилломы человека, ВИЧ, РНК-фагов, Qβ-фага (такие как белки оболочки), GA-фага, fr-фага, фага АР205 и Ту (такие как белок р1 ретротранспозона Ту). VLP более подробно обсуждаются в ссылках 91-96. Виросомы более подробно обсуждаются, например, в ссылке 97.
Е. Бактериальные или микробные производные
Адъюванты, пригодные для использования в соответствии с изобретением, включают в себя бактериальные или микробные производные, такие как нетоксичные производные энтеробактериального липополисахарида (LPS), производные липида А, иммуностимулирующие олигонуклеотиды и АДФ-рибозилирующие токсины и их обезвреженные производные.
Нетоксичные производные LPS включают в себя монофосфорил-липид А (MPL) и 3-O-дезацилированный MPL (3dMPL). 3dMPL представляет собой смесь 3-дез-O-ацилированного монофосфорил-липида А с 4, 5 или 6 ацилированными цепями. Предпочтительная форма 3-дез-O-ацилированного монофосфорил-липида А в виде "мелких частиц" описана в ссылке 98. Такие "мелкие частицы" 3dMPL достаточно малы для того, чтобы стерильно фильтроваться через мембрану с размером ячеи 0,22 мкм [98]. Другие нетоксичные производные LPS включают в себя миметики монофосфориллипида А, такие как производные аминоалкилглюкозаминидфосфата, например RC-529 [99, 100].
Производные липида А включают в себя производные липида А из Escherichia coli, такие как ОМ-174. ОМ-174 описан, например, в ссылках 101 и 102.
Иммуностимулирующие олигонуклеотиды, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя нуклеотидные последовательности, содержащие мотив CpG (динуклеотидную последовательность, состоящую из неметилированного цитозина, связанного фосфатной связью с гуанозином). Также был продемонстрирован иммуностимулирующий эффект двухцепочечных РНК и олигонуклеотидов, содержащих палиндромные или поли(dG) последовательности.
CpG могут содержать нуклеотидные модификации/аналоги, такие как фосфоротиоатные модификации, и могут быть двухцепочечными или одноцепочечными. В ссылках 103, 104 и 105 описаны возможные аналогичные замены, например замена гуанозина 2'-дезокси-7-дезазагуанозином. Адъювантный эффект олигонуклеотидов CpG более подробно обсуждается в ссылках 106-111.
Последовательность CpG, такая как мотив GTCGTT или TTCGTT, может быть направлена на TLR9 [112]. Последовательность CpG, такая как CpG-A ODN, может специфично индуцировать Th1-зависимый иммунный ответ, или последовательность CpG, такая как CpG-B ODN, может более специфично индуцировать В-клеточный ответ. CpG-A и CpG-B ODN обсуждаются в ссылках 113-115. Предпочтительно, CpG представляет собой CpG-A ODN.
Олигонуклеотид CpG предпочтительно конструируют таким образом, что 5'-конец доступен для распознавания рецептора. При необходимости две олигонуклеотидные последовательности CpG могут быть соединены своими 3'-концами с образованием "иммуномеров". См., например, ссылки 112 и 116-118.
В качестве адъювантов в соответствии с изобретением могут быть использованы бактериальные АДФ-рибозилирующие токсины и их детоксифицированные производные. Белок предпочтительно происходит из E.coli (из термолабильного энтеротоксина Е.coli "LT"), возбудителя холеры ("СТ") или возбудителя коклюша ("РТ"). Использование детоксифицированных АДФ-рибозилирующих токсинов в качестве мукозальных адъювантов описано в ссылке 119, а в качестве парентеральных адъювантов - в ссылке 120. Токсин или анатоксин предпочтительно находятся в виде голотоксина, содержащего как субъединицу А, так и субъединицу В. Субъединица А предпочтительно содержит детоксифицирующую мутацию; субъединица В предпочтительно не содержит мутаций. Предпочтительно, адъювант представляет собой детоксифицированный мутант LT, такой как LT-K63, LT-R72 и LT-G192. Использование АДФ-рибозилирующих токсинов и их детоксифицированных производных, в частности LT-K63 и LT-R72, в качестве адъювантов описано в ссылках 121-128. Численные обозначения аминокислотных замен предпочтительно основаны на результатах выравнивания субъединиц А и В АДФ-рибозилирующих токсинов, приведенных в ссылке 129, конкретно включенного в настоящее описание посредством ссылки во всей своей полноте.
F. Иммуномодуляторы человека
Иммуномодуляторы человека, пригодные для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [130] и т.д.) [131], интерфероны (например, γ-интерферон), макрофагальный колониестимулирующий фактор и фактор некроза опухоли.
G. Биоадгезивные и мукоадгезивные вещества
Биоадгезивные и мукоадгезивные вещества также могут быть использованы в качестве адъювантов в соответствии с изобретением. Подходящие биоадгезивные вещества включают в себя микросферы эстерифицированной гиалуроновой кислоты [132] или мукоадгезивные вещества, такие как сшитые производные полиакриловой кислоты, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, полисахариды и карбоксиметилцеллюлозу. В качестве адъювантов в соответствии с изобретением также могут быть использованы хитозан и его производные [133].
Н. Микрочастицы
В качестве адъювантов в соответствии с изобретением также могут быть использованы микрочастицы. Предпочтительными являются микрочастицы (т.е. частица ~100 нм - ~150 мкм в диаметре, более предпочтительно ~200 нм - ~30 мкм в диаметре и наиболее предпочтительно ~500 нм - ~10 мкм в диаметре), образованные биоразлагаемыми и нетоксичными веществами (например, поли(α-гидроксикислотой), полигидроксимасляной кислотой, сложным полиортоэфиром, полиангидридом, поликапролактоном и т.д.), причем предпочтительным является поли(лактидсогликолид), при необходимости обработанный с образованием отрицательно заряженной поверхности (например, SDS) или положительно заряженной поверхности (например, катионным поверхностно-активным веществом, таким как СТАВ).
I. Липосомы (главы 13 и 14 ссылки 81)
Примеры липосомных составов, пригодных для использования в качестве адъювантов, описаны в ссылках 134-136.
J. Составы на основе полиоксиэтиленовых эфиров и сложных полиоксиэтиленовых эфиров
Адъюванты, пригодные для использования в соответствии с изобретением, включают в себя полиоксиэтиленовые эфиры и сложные полиоксиэтиленовые эфиры [137]. Такие составы дополнительно включают в себя поверхностно-активные полиоксиэтиленсорбитановые сложные эфиры в сочетании с октоксинолом [138], равно как и поверхностно-активные полиоксиэтиленалкильные эфиры или сложные эфиры в сочетании, по меньшей мере, с одним дополнительным неионогенным поверхностно-активным веществом, таким как октоксинол [139]. Предпочтительные полиоксиэтиленовые эфиры выбирают из следующей группы: полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (лаурет-9), полиоксиэтилен-9-стеариловый эфир, полиоксиэтилен-8-стеариловый эфир, полиоксиэтилен-4-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-35-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-23-лауриловый эфир.
К. Мурамилпептиды
Примеры мурамилпептидов, пригодных для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя N-ацетилмурамил-L-треонил-О-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-O-изоглутамин (нор-MDP) и N-ацетилмурамил-1-аланил-O-изоглутаминил-L-аланин-2-(1',2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин МТР-РЕ).
L. Полифосфазен (РСРР)
РСРР составы описаны, например, в ссылках 140 и 141.
М. Имидазохинолоновые соединения
Примеры имидазохинолоновых соединений, пригодных для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя Imiquamod и его гомологи (например, "Resiquimod 3M"), более подробно описанные в ссылках 142 и 143.
N. Тиосемикарбазоновые соединения
Примеры тиосемикарбазоновых соединений, равно как и методы получения, производства и скрининга соединений, пригодных для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя таковые, описанные в ссылке 144. Тиосемикарбазоны особенно применимы для стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови человека для продукции цитокинов, таких как TNF-α.
О. Триптантриновые соединения
Примеры триптантриновых соединений, равно как и методы получения, производства и скрининга соединений, пригодных для использования в качестве адъювантов в соответствии с изобретением, включают в себя таковые, описанные в ссылке 145. Триптантриновые соединения особенно применимы для стимуляции мононуклеарных клеток периферической крови человека для продукции цитокинов, таких как TNF-α.
Изобретение также может предусматривать использование сочетаний компонентов одного или нескольких адъювантов, описанных выше. Например, в соответствии с изобретением могут быть использованы следующие адъювантные композиции: (1) сапонин и эмульсия "масло-в-воде" [146]; (2) сапонин (например, QS21)+нетоксичное производное LPS (например, 3dMPL) [147]; (3) сапонин (например, QS21)+нетоксичное производное LPS (например, 3dMPL)+холестерин; (4) сапонин (например, QS21)+3dMPL+IL-12 (при необходимости+стерин) [148]; (5) сочетания 3dMPL, например, с QS21 и/или эмульсиями "масло-в-воде" [149]; (6) SAF, содержащий 10% сквалан, 0,4% Tween 80™, 5% Pluronic-блоксополимер L121 и thr-MDP, либо микрофлуидизированный в субмикронную эмульсию, либо встряхиваемый до образования эмульсии с большим размером частиц; (7) адъювантная система Ribi™ (RAS) (Ribi Immunochem), содержащая 2% сквален, 0,2% Tween 80 и один или несколько компонентов бактериальной клеточной стенки, выбранных из группы, состоящей из монофосфориллипида A (MPL), димиколата трегалозы (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно, MPL+CWS (Detox™); (8) одна или несколько минеральных солей (таких как соль алюминия) + нетоксичное производное LPS (такое как 3dMPL); и (9) одна или несколько минеральных солей (таких как соль алюминия) + иммуностимулирующий олигонуклеотид (такой как нуклеотидная последовательность, содержащая мотив CpG).
Другие вещества, действующие как иммуностимулирующие агенты, описаны в главе 7 ссылки 81.
Особенно предпочтительным является использование адъюванта на основе гидроксида алюминия или фосфата алюминия, и конъюгаты, как правило, адсорбированы на этих солях [например, примеры 7 и 8 ссылки 9; пример J ссылки 10]. Также возможно смешивание с солями алюминия без адсорбции [27, 76]. Другим предпочтительным адъювантом является фосфат кальция. Конъюгаты могут быть смешаны (и при необходимости адсорбированы) с адъювантами по отдельности, а затем конъюгаты могут быть смешаны вместе, или конъюгаты могут быть смешаны вместе, а затем смешаны с адъювантом.
Значение рН композиций, используемых в соответствии с изобретением, предпочтительно составляет от 6 до 8, предпочтительно, около 7. Стабильное значение рН может поддерживаться путем использования буфера. Если композиция содержит гидроксид алюминия, предпочтительно использовать гистидиновый буфер [150]. Композиция может быть стерильной и/или апирогенной. Композиции могут быть изотоничны по отношению к физиологическим средам человека.
Композиции могут содержать консервант (например, тиомерсал, 2-феноксиэтанол) или могут не содержать консервантов. Предпочтительные композиции по изобретению не содержат каких-либо ртутьсодержащих веществ, например они не содержат тиомерсал.
Во избежание интерференции между антигенами, особенно конъюгированными антигенами, в состав может быть включен полианионный полимер, такой как поли-L-глутаминовая кислота [151].
Композиции могут содержаться в ампулах, или они могут содержаться в шприц-тюбиках. Шприцы могут поставляться с иглами или без них. Шприц должен содержать разовую дозу композиции, тогда как ампула может содержать разовую дозу или многократные дозы. Композиции для инъекций, как правило, представляют собой жидкие растворы или суспензии. Альтернативно, они могут поставляться в твердой форме (например, лиофилизированной) для растворения или суспендирования в жидких носителях перед введением.
Композиции могут быть упакованы в разовые дозированные формы или в многократные дозированные формы. Для многократных дозированных форм ампулы предпочтительны по сравнению со шприц-тюбиками. Объемы эффективных доз могут быть определены в соответствии с рутинными процедурами, но типичная доза композиции для введения человеку имеет объем 0,5 мл.
Если композиция должна быть приготовлена экстемпорально перед использованием (например, если компонент находится в лиофилизированной форме) и поставляется в виде набора, набор может содержать две ампулы, либо он может содержать один шприц-тюбик и одну ампулу, причем содержимое шприца используют для реактивации содержимого ампулы перед инъекцией. В композициях, содержащих капсульный сахарид серогруппы А, указанный сахарид серогруппы А может быть лиофилизирован, тогда как сахарид(ы) другой(их) серогруппы(серогрупп) может(могут) находиться в жидкой форме.
Композиции должны содержать иммунологически эффективное количество менингококковых конъюгатов, а также при необходимости любых других компонентов. Под термином "иммунологически эффективное количество" подразумевается, что введение такого количества субъекту либо однократной дозой, либо в качестве части курса индуцирует у пациентов протективный иммунный ответ против менингококков. Это количество варьирует в зависимости от состояния здоровья и физического состояния подлежащего лечению субъекта, возраста, таксономической группы подлежащего лечению субъекта (например, нечеловекообразный примат, примат и т.д.), способности иммунной системы субъекта синтезировать антитела, желаемой степени защиты, состава вакцины, суждения лечащего врача о клинической ситуации и других влияющих факторов. Ожидается, что количество будет разниться в относительно широких пределах, которые могут быть определены в соответствии с рутинными процедурами, а типичное количество каждого менингококкового антигена на дозу составляет от 1 мкг до 20 мкг на серогруппу (в расчете на сахарид), например от 2 до 10 мкг на серогруппу. Предпочтительной является доза около 4 мкг на серогруппу (т.е. всего 16 мкг в тетравалентной вакцине).
Общее количество белка-носителя в композиции предпочтительно не превышает 100 мкг/доза, например оно составляет ≤90 мкг/доза, ≤80 мкг/доза, ≤70 мкг/доза, ≤60 мкг/доза, ≤50 мкг/доза и т.д. Общее количество белка-носителя в композиции, как правило, составляет, по меньшей мере, 10 мкг/доза.
Общие определения
Термин "содержащий" охватывает термин "включающий в себя", равно как и "состоящий из", например композиция, "содержащая" Х, может состоять исключительно из Х или может включать в себя что-либо отличное, например X+Y.
Термин "около" применительно к численному значению х означает, например, х ±10%.
Словосочетание "по существу" не исключает значения "полностью" или "абсолютно", например композиция, "по существу не содержащая" Y, может абсолютно не содержать Y. При необходимости словосочетание "по существу" может быть опущено из определения по изобретению.
Варианты осуществления изобретения
Отсутствие супрессии носителем при использовании тетравалентной смеси конъюгатов A/C/W135/Y
Смеси менингококковых конъюгатов серогрупп А+С, C+W+Y или A+C+W+Y могут быть приготовлены, как описано в ссылках 9 и 10. При желании они могут быть смешаны с адъювантами на основе гидроксида алюминия или фосфата алюминия, что также описано в ссылках 9 и 10. Эти вакцины содержат в качестве белка-носителя либо CRM197, либо дифтерийный анатоксин (Dt), ковалентно связанные с сахаридами.
Пациентов, прошедших педиатрическую вакцинацию D-T-P (либо D-T-Pa, либо D-T-Pw), включая получавших вакцины, содержащие D-T-P и другие антигены (например, тетравалентную вакцину D-T-P-Hib, тетравалентную вакцину D-T-P-HBsAg, пентавалентную вакцину D-T-P-Hib-HBsAg, гексавалентную вакцину D-T-P-Hib-HBsAg-IPV и т.д.), отбирали для введения смеси конъюгатов, содержащих в виде носителя Dt. Эта тетравалентная смесь конъюгатов иммуногенна у людей [9, 11, 13].
Пациентов, прошедших педиатрическую вакцинацию Hib (либо в виде моновалентной вакцины против Hib, с D-T-Pa или D-T-Pw или без них; либо в виде части комбинированной вакцины, такой как тетравалентная вакцина D-T-P-Hib, пентавалентная вакцина D-T-P-Hib-HBsAg, гексавалентная вакцина D-T-P-Hib-HBsAg-IPV и т.д.), отбирали для введения смеси конъюгатов, содержащих в виде носителя CRM197.
Отбирали контрольную группу пациентов для введения одной из двух смесей конъюгатов. Контрольные пациенты ранее не получали ни дифтерийного анатоксина, ни CRM197 ни в виде отдельных антигенов, ни в виде белков-носителей в составе конъюгатов.
Оценивали способность тетравалентных конъюгатов индуцировать у пациентов иммунный ответ. Результаты свидетельствовали о супрессии носителем, если в испытуемых группах наблюдались значительно ослабленные иммунные ответы против менингококков по сравнению с таковыми у контрольных пациентов и, в частности, если конъюгаты не могли индуцировать у пациентов SBA ответ приемлемой силы.
В ходе клинического испытания V59P2, проведенного в Финляндии и Германии на 620 субъектах в возрасте 12-16 месяцев, были испытаны пять препаратов. В вакцинах использовались CRM197 в качестве носителя и фосфат алюминия в качестве адъюванта [10]. Дозы сахарида каждой серогруппы, выраженные как мкг сахарида на 0,5 мл дозы, принимали следующие значения:
Группа
MenA
MenC
MenW135
MenY
1
10
10
10
10
2
0
10
10
10
3
10
5
5
5
4
5
5
5
5
5
2,5
2,5
2,5
2,5
Субъекты получали инъекцию в нулевой момент времени, а 25% субъектов затем получали вторую дозу вакцины через 4 недели.
Образцы сыворотки пациентов собирали через 1 месяц после введения вакцины и исследовали в анализе SBA против N.meningitidis каждой серогруппы с использованием человеческого комплемента. Оценивали рост титра SBA относительно показателей сывороток в нулевой момент времени с критериями, составляющими ≥1:4 и ≥1:8. Также для каждой серогруппы измеряли титры антител против капсульных сахаридов (GMT). Результаты приведены ниже в таблице 1.
Таким образом, и тривалентная, и тетравалентная вакцины проявляли иммуногенность у детей от 1 до 2 лет. Конъюгаты демонстрируют иммуногенность при дозах сахаридов 2,5 мкг на конъюгат. Иммунный ответ может быть усилен вторичной иммунизацией с большим ростом титра SBA после введения второй дозы. В этом испытании супрессии носителем не наблюдалось.
Отсутствие супрессии ответов против Dt
Результаты исследования, проводимого в Бельгии с 1999 года [26], свидетельствуют о нарушении противостолбнячного иммунитета у младенцев, продолжающемся в раннем детстве, после введения первичного курса вакцины против Hib, конъюгированной со столбнячным анатоксином. Таким образом, белок-носитель конъюгата оказал отрицательное иммунное воздействие. Напротив, обратный эффект наблюдался в исследовании вакцин на основе пневмококковых конъюгатов [152]. Возможность отрицательного влияния введения менингококковых конъюгатов на противодифтерийный иммунитет [153] исследовали с использованием конъюгата менингококкового сахарида серогруппы С с CRM197 в качестве носителя (Menjugate™).
Детей разделяли на пять групп, которые в течение первого года жизни иммунизировали следующим образом: (1) четырьмя дозами Menjugate™; (2) тремя дозами Menjugate™ и одной дозой бивалентной смеси неконъюгированных А/С; (3) тремя дозами вакцины на основе HbsAg, а затем одной дозой Menjugate™; (4) тремя дозами вакцины на основе HbsAg, а затем одной дозой бивалентной смеси неконъюгированных А/С; (5) контрольные, не получавшие менингококковых вакцин. Все дети получали три дозы противодифтерийной вакцины в течение первых четырех месяцев жизни, но не проходили предшкольную вторичную иммунизацию против дифтерии.
Пациенты получали одну дозу Menjugate™ в возрасте 4 лет, и образцы крови забирали до и после (-30 суток) этого введения Menjugate™. Содержание антител против возбудителя дифтерии измеряли по методу ELISA и оценивали среднее геометрическое концентраций. Также оценивали процент субъектов с содержанием антител ≥0,1 МЕ/мл. Результаты были следующими:
Группа
До вакцинации
После вакцинации
GMC
% ≥0,1
GMC
% ≥0,1
1
0,35
94%
9,00
100%
2
0,18
87%
8,55
100%
3
0,20
81%
2,82
100%
4
0,10
51%
4,55
99%
Исходные значения титров антител против Dt были выше у пациентов, ранее получивших Menjugate™, чем у не получавших его пациентов (например, сравните группы 1 и 4). Линейно-регрессионный анализ позволил выявить значимую линейную зависимость между количеством ранее введенных доз Menjugate™ (4, 3, 1 и 0 для групп 1, 2, 3 и 4 соответственно) и (а) титрами антител против Dt до вакцинации и (b) титрами антител против Dt после вакцинации.
Таким образом, существует улучшенная сохранность иммунитета против дифтерии в возрасте 4 лет у детей, получивших в младенчестве четыре дозы Menjugate™. Кроме того, существует тенденция к усилению гуморальных ответов против Dt после вторичной иммунизации Menjugate™ пациентов, получивших в младенчестве, по меньшей мере, три дозы Menjugate™. Иммунологической интерференции между менингококковыми конъюгатами и иммунитетом против дифтерии не наблюдалось.
Интерференции между бивалентной смесью конъюгатов А/С и DTP не наблюдается
В Нигере смесь капсульных сахаридов серогрупп А и С [8] вводили младенцам (в возрасте 5-11 недель) [154], которые ранее не получали вакцину DTP. Детям вводили либо неконъюгированные сахариды (50 мкг сахарида каждой серогруппы), либо конъюгированные с Dt сахариды без адъюванта (4 мкг каждого) в соответствии с шестью различными схемами:
(1) Четыре введения конъюгатов: 6 недель, 10 недель, 14 недель, 9 месяцев.
(2) Три введения конъюгатов: 6 недель, 10 недель, 14 недель.
(3) Два введения конъюгатов: 14 недель, 9 месяцев.
(4) Одно введение конъюгатов: 14 недель.
(5) Одно введение конъюгатов: 9 месяцев.
(6) Одно введение конъюгатов: 9 месяцев.
Детям вводили вакцину DTP и пероральную полиовакцину на 6, 10 и 14 недели со вторичной иммунизацией на 9 месяц, и одновременно с этими одобренными вакцинами вводили вакцины на основе менингококковых сахаридов. Для оценки вторичных ответов детям также вводили неконъюгированную вакцину на 24 месяц.
Сывороточные бактерицидные гуморальные ответы измеряли на 18 неделе (т.е. через 4 недели после третьей вакцинации DTP/полиовакциной), на 10 месяц (т.е. через 1 месяц после ревакцинации DTP/полиовакциной на 9 месяц) и через 1 неделю после введения неконъюгированного вещества на 24 месяц. Процент пациентов, у которых наблюдалось ≥128-кратное увеличение SBA титров, принимал следующие значения:
%
18 недель
10 месяцев
24ј месяцев
Схема
MenA
MenC
MenA
MenC
MenA
MenC
(1)
56
84
89
73
100
95
(2)
56
86
6
9
96
82
(3)
68
64
85
85
100
95
(4)
61
57
4
8
100
93
(5)
3
7
62
26
100
99
(6)
2
2
5
11
97
52
Различия гуморальных ответов на дифтерийный анатоксин между шестью группами отсутствовали [8].
Таким образом, интерференции в результате использования дифтерийного анатоксина и как протективного антигена, и как носителя в составе конъюгатов не наблюдалось. Например, пациенты из группы 5 получали дифтерийный анатоксин в составе вакцины DTP на 6, 10 и 14 недели до получения первой дозы менингококкового конъюгата, но наблюдавшийся у них на 24 месяц SBA ответ против менингококкового сахарида составлял >99%.
Отсутствие отрицательного влияния на противодифтерийные ответы
Как указано выше, у пациентов, получавших вакцины на основе менингококковых конъюгатов одновременно с вакцинами DTP, ослабления иммунных ответов против дифтерийного анатоксина не наблюдалось. В ходе другого исследования менингококковые конъюгаты и DTP вводили в разное время. По выполнении схемы введения трех доз DTP на 2, 3 и 4 месяц жизни следовало однократное введение бивалентной вакцины А/С либо с конъюгированными с Dt сахаридами, либо с неконъюгированными сахаридами. Иммунные ответы против дифтерийного анатоксина измеряли по методу ElISA, и GM титров принимали следующие значения:
Антигены
Перед иммунизацией
После иммунизации
Конъюгированные
0,05
21,2
Неконъюгированные
0,06
0,06
Неконъюгированные сахариды не вызывали никакого ответа против Dt (что неудивительно), а введение конъюгированных сахаридов приводило к сильному ответу против DT. Таким образом, введение этих конъюгатов может создать иммунитет против дифтерии у наивных пациентов или может занять место вторичной иммунизации Dt.
Следует понимать, что изобретение описано выше исключительно в качестве примера и могут быть сделаны модификации, подпадающие под объем и сущность изобретения.
Таблица 1
Результаты испытания V59P2
Группа
А
С
W135
Y
GMT (1 месяц после 1 дозы)
1
3,9
6,4
7,1
8,9
2
2
6,1
8,3
8,5
3
5,7
5,2
6,9
12
4
3,8
4,5
7,0
9,6
5
3,9
5,3
7,0
12
GMT (1 месяц после 2 доз)
1
27
89
22
37
2
2
80
20
57
3
29
76
28
58
4
14
47
20
35
5
17
71
23
52
% пациентов с SBA ≥1:4 (1 месяц после 1 дозы)
1
33
56
57
58
2
0
57
60
61
3
55
49
53
70
4
37
42
54
64
5
40
51
57
67
% пациентов с SBA ≥1:4 (1 месяц после 2 доз)
1
100
100
96
96
2
0
100
73
92
3
91
96
95
95
4
84
96
88
96
5
80
100
80
92
% пациентов с SBA ≥1:8 (1 месяц после 1 дозы)
1
25
44
46
48
2
0
40
50
49
3
39
34
45
64
4
23
30
44
51
5
26
35
40
60
% пациентов с SBA ≥1:8 (месяц после 2 доз)
1
92
100
85
93
2
0
100
64
92
3
87
96
95
82
4
60
92
77
92
5
72
92
72
88
Ссылки
(содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки)
[1] Armand et al. (1982) J. Biol. Stand. 10:335-339.
[2] Cadoz et al. (1985) Vaccine 3:340-342.
[3] MMWR (1997) 46(RR-5) 1-10.
[4] Baklaic et al. (1983) Infect. Immun. 42:599-604.
[5] Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49.
[6] Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691-8.
[7] Lieberman et al. (1996) JAMA 275:1499-503.
[8] WO 2005/000345.
[9] WO 02/058737.
[10] WO 03/007985.
[11] Rennels et al. (2002) Pediatr Infect Dis J 21:978-979.
[12] WO 2004/013400.
[13] Campbell et al. (2002) J Infect Dis 186:1848-1851.
[14] Herzenberg et al. (1980) Nature 285: 664-667.
[15] Schutze et al. (1985) J Immunol 135:2319-2322.
[16] Dagan et al. (1998) Infect Immun 66:2093-2098.
[17] Barington et al. (1994) Infect Immun 62:9-14.
[18] Di John et al. (1989) Lancet 2(8677): 1415-8.
[19] Granoff et al. (1993) Vaccine Suppll: S46-51.
[20] Granoff et al. (1994) JAMA 272:1116-1121.
[21] Barington et al. (1993) Infect Immun 61:432-438.
[22] Патент Австралии №748716 (выданный по WO 98/51339).
[23] Olander et al. (2001) Vaccine 20:336-341.
[24] Burrage et al. (2002) Infect Immun 70:4946-4954.
[25] Peeters et al. (1999) Infect Immun 59:3504-3510.
[26] Hoppenbrouwers et al. (1999) Vaccine 17:2588-98.
[27] WO 02/00249.
[28] WO 00/56360.
[29] Reddm et al. (2001) FEMS Immunol Med Microbiol 31:153-162.
[30] Podda et al. (1991) Vaccine 9:741-745.
[31] Darkes & Plosker (2002) Paediatr Drugs 4:609-630.
[32] Vaccines. (eds. Plotkin & Orenstein). 4th edition, 2004, ISBN: 0-7216-9688-0.
[33] Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1-70.
[34] Анонимное сообщение (Jan 2002) Research Disclosure, 453077.
[35] Anderson (1983) Infect Immun 39(1):233-238.
[36] Anderson et al. (1985) J din Invest 76(1):52-59.
[37] Ramsay et al. (2001) Lancet 357(9251): 195-196.
[38] Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppi 2:S28-36.
[39] Buttery & Moxon (2000) JR Coll Physicians Lond 34:163-168.
[40] Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-33, vii.
[41] Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567.
[42] Европейский патент №0477508.
[43] Патент США №5,306,492.
[44] WO 98/42721.
[45] Dick et al. in Conjugate Vaccines (eds. Cruse et al.) Karger, Basel, 1989, 10:48-114.
[46] Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) ISBN:0123423368.
[47] WO 03/080678.
[48] Glode et al. (1979) J Infect Dis 139:52-56.
[49] WO 94/05325; Патент США №5,425,946.
[50] Заявка на выдачу патента Великобритании №0323103.2.
[51] WO 99/42130.
[52] WO 96/40242.
[53] Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198.
[54] WO 95/08348.
[55] Патент США №4,882,317.
[56] Патент США №4,695,624.
[57] Porro et al. (1985) Mol Immunol 22:907-919.
[58] EP-A-0208375.
[59] WO 00/10599.
[60] Gever et al. Med. Microbiol. Immunol, 165: 171-288 (1979).
[61] Патент США №4,057,685.
[62] Патенты США №№4,673,574; 4,761,283; 4,808,700.
[63] Патент США №4,459,286.
[64] Патент США №4,965,338.
[65] Патент США №4,663,160.
[66] Патент США №4,761,283.
[67] Патент США №4,356,170.
[68] Balmer & Borrow (2004) Expert Rev Vaccines 3:77-87.
[69] Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332.
[70] Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v.
[71] Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.
[72] Zielen et al. (2000) Infect. Immun. 68:1435-1440.
[73] Kanra et al. (1999) The Turkish Journal of Paediatrics 42:421-427.
[74] Ravenscroft et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103: 35-47.
[75] WO 97/00697.
[76] WO 96/37222; US patent 6,333,036.
[77] WO 2004/032958.
[78] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th ed. ISBN: 0683306472.
[79] Almeida & Alpar (1996) J. Drug Targeting 3:455-467.
[80] Agarwal & Mishra (1999) Indian J Exp Biol 37:6-16.
[81] Vaccine Design… (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.
[82] WO 00/23105.
[83] WO 90/14837.
[84] Патент США №5,057,540.
[85] WO 96/33739.
[86] ЕР-А-0109942.
[87] WO 96/11711.
[88] WO 00/07621.
[89] Barr et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271.
[90] Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338.
[91] Niikura et al. (2002) Virology 293:273-280.
[92] Lenz et al. (2001) J Immunol 166:5346-5355.
[93] Pinto et al. (2003) J Infect Dis 188:327-338.
[94] Gerber et al. (2001) Virol 75:4752-4760.
[95] WO 03/024480.
[96] WO 03/024481.
[97] Gluck et al. (2002) Vaccine 20:B10-B16.
[98] EP-A-0689454.
[99] Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.
[100] Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229.
[101] Meraldi et al. (2003) Vaccine 21:2485-2491.
[102] Pajak et al. (2003) Vaccine 21:836-842.
[103] Kandimalla et al. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400.
[104] WO 02/26757.
[105] WO 99/62923.
[106] Krieg (2003) Nature Medicine 9:831-835.
[107] McCluskie et al. (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185.
[108] WO 98/40100.
[109] Патент США №6,207,646.
[110] Патент США №6,239,116.
[111] Патент США №6,429,199.
[112] Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3):654-658.
[113] Blackwell et al. (2003) J Immunol 170:4061-4068.
[114] Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65.
[115] WO 01/95935.
[116] Kandimalla et al. (2003) BBRC 306:948-953.
[117] Bhagat et al. (2003) BBRC 300:853-861.
[118] WO 03/035836.
[119] WO 95/17211.
[120] WO 98/42375.
[121] Beignon et al. (2002) Infect Immun 70:3012-3019.
[122] Pizza et al. (2001) Vaccine 19:2534-2541.
[123] Pizza et al. (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461.
[124] Scharton-Kersten et al. (2000) Infect Immun 68:5306-5313.
[125] Ryan et al. (1999) Infect Immun 67:6270-6280.
[126] Partidos et al. (1999) Immunol Lett 67:209-216.
[127] Peppoloni et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2:285-293.
[128] Pine et al. (2002) J Control Release 85:263-270.
[129] Domenighini et al. (1995) Mol Microbiol 15:1165-1167.
[130] WO 99/40936.
[131] WO 99/44636.
[132] Singh et al] (2001) J Cont Release 70:267-276.
[133] WO 99/27960.
[134] Патент США №6,090,406.
[135] Патент США №5,916,588.
[136] ЕР-А-0626169.
[137] WO 99/52549.
[138] WO 01/21207.
[139] WO 01/21152.
[140] Andrianov et al. (1998) Biomaterials 19:109-115.
[141] Payne et al. (1998) Adv Drug Delivery Review 31:185-196.
[142] Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571-577.
[143] Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218.
[144] WO 04/60308.
[145] WO 04/64759.
[146] WO 99/11241.
[147] WO 94/00153.
[148] WO 98/57659.
[149] Заявки на выдачу Европейского патента №№0835318, 0735898 and 0761231.
[150] WO 03/009869.
[151] WO 2004/110480.
[152] Olander et al. (2002) Vaccine 20:336-41.
[153] McVernon et al. (2003) Vaccine 21:2573-9.
[154] Chippaux et al. (2004) Vaccine 22:3303-11.