АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ ЭНДОЛИЗИНОВ И ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА В ФОРМЕ ГЕЛЯ ИЛИ СПРЕЯ С ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ANTIBACTERIAL COMPOSITION BASED ON ENDOLYSINS AND DRUGS IN FORM OF GEL OR SPRAY, USING IT

Изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтической промышленности, и касается лекарственных форм (ЛФ) в виде геля и спрея, содержащих рекомбинантные эндолизины, относящиеся к классам мурамидаз и пептидаз, и способа их получения.
В настоящее время развитие инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), представляет серьезную проблему как в Российской Федерации, так и за рубежом. Большую значимость имеют хирургические инфекции (до 230 случаев на 1000 операций), основными возбудителями которых являются грамотрицательные бактерии, среди которых чаще встречаются Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacte spp.и Pseudomonas aeruginosa. Данные возбудители вызывают гнойно-септические осложнения, которые могут развиваться даже при должном уходе за хирургическими ранами.
Кроме того, наблюдается тенденция к увеличению количества полирезистентных возбудителей, что делает антибиотикотерапию неэффективной.
Известно множество способов борьбы с бактериальными инфекциями, среди которых набирает популярность фаготерапия в связи с высокой эффективностью бактериофагов в отношении антибиотикорезистентных возбудителей. Несмотря на это, фаготерапия обладает несколькими недостатками, среди которых:
узкий спектр литической активности;
трудоемкость технологии получения (их сложно выделять из бактериальных культур с требуемой степенью чистоты);
необходимость постоянного определения и нормирования их фармакокинетических характеристик;
культивирование необходимо проводить на близких к патогену видах и штаммах, для которых отсутствуют эффективные стандартные протоколы культивирования, и применяются высокие требования к безопасности;
умеренные бактериофаги могут переносить гены бактериальных токсинов;
низкое, но вероятное появление к ним устойчивости;
иммуногенность, которая снижает эффективность их повторного применения.
Вышеперечисленных недостатков лишены эндолизины - ферменты, которые синтезируются и способствуют лизису бактериальной клетки в конце репродуктивного цикла бактериофага, разрушая клеточную стенку.
Эндолизины подразделяются на несколько классов, определяющих места их действия на пептидогликан, а именно:
1. Мурамидазы:
a. Лизоцим-подобные ферменты
b. Литические трансгликозилазы;
2. N-ацетил-β-D-глюкозоаминидазы;
3. N-ацетилмурамоил-L-аланин-амидазы;
4. пептидазы.
Эндолизины получают биотехнологическим путем, используя штаммы-продуценты, содержащие плазмиду, которая несет ген, кодирующий эндолизин.
После культивирования и выделения продукта путем ультразвукового разрушения клеток следует стадия хроматографической очистки при низких температурах (+4°С) методом металл-хелатной аффинной хроматографии с последующей гель-эксклюзионной хроматографией с добавлением на конечных стадиях стабилизирующих веществ (150 мМ NaCl), что позволяем получать активные стабильные препараты белков.
Рекомбинантные эндолизины, в отличие от бактериофагов, обладают широким спектром действия. Так, установлено, что рекомбинантный эндолизин бактериофага ECD7 обладает литической активностью в отношении штаммов Campylobacter jejuni, Enterobacter spp., Acinetobacter baumannii, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica и Klebsiella pneumoniae, в то время как бактериофаг ECD7 активен только в отношении Е. Coli.
Кроме того, установлено, что при применении эндолизинов в составе ЛФ в виде геля и спрея не наблюдается образования антител к рекомбинантным эндолизинам, что говорит о возможности многократного применения данных препаратов без снижения эффективности.
Исходя из вышеприведенных фактов можно сделать вывод о том, что рекомбинантные эндолизины обладают рядом преимуществ перед бактериофагами, а именно:
Широкий спектр литической активности в отношении антибиотикорезистентных возбудителей раневых инфекций;
Отсутствие иммунного ответа при применении;
Простота производства и контроля качества. Известна антибактериальная композиция, содержащая ковалентно сшитые литический фермент бактериофага (эндолизин) КРР10 и модифицированный фрагмент миелоидного антимикробного пептида овцы SMAP-29, проявляющая активность в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa (патент РФ №2703043).
Известен эндолизин OBPgpLYS, обладающий широким спектром действия на грамотрицательные бактерии, эффективность которого повышается при использовании совместно с ЭДТА, который усиливает проницаемость наружной мембраны бактерий (патент США №8846865).
Известен эндолизин EL188, проявляющий активность в отношении бактерий Pseudomonas aeruginosa, при этом активность проявляется только в присутствии веществ, повышающих проницаемость наружных мембран (WO2015071437).
Отличием настоящего изобретения от представленных выше является возможность включения в состав антибактериальной композиции как одного, так и коктейля рекомбинантных эндолизинов, относящихся к классам мурамидаз и пептидаз, что позволяет расширить спектр литической активности полученной композиции, а также разработка составов двух готовых лекарственных форм в виде геля и спрея для местного применения в терапии или профилактике раневых и госпитальных инфекций, вызванных антибиотикорезистентными возбудителями.
Задачей настоящего изобретения является разработка составов двух готовых лекарственных форм, а именно геля и спрея, содержащих в качестве активной фармацевтической субстанции рекомбинантные эндолизины, относящиеся к классу мурамидаз и пептидаз, с индивидуальной концентрацией каждого эндолизина 100-10000 мкг на мл лекарственной формы, для лечения или профилактики раневых и госпитальных инфекций.
Техническим результатом заявленного изобретения является тот факт, что впервые в мире были разработаны составы геля и спрея для местного применения для терапии или профилактики инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи на основе одного или более рекомбинантного эндолизина, обладающие необходимой антибактериальной активностью и местным механизмом действия при лечении раневых и госпитальных инфекций. Это в дальнейшем послужит основой для создания нового метода антибактериальной терапии для лечения инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, в том числе вызванных лекарственно-устойчивыми штаммами бактерий.
Доклинические испытания заявляемых лекарственных форм, проведенные на лабораторных животных (мышах и кроликах), подтверждают безопасность и эффективность разработанных составов. При применении в полости абсцесса заявляемые лекарственные формы не иммуногенны, не оказывают токсического и раздражающего действия и обладают необходимым терапевтическим эффектом, что подтверждается достоверным увеличением продолжительности жизни опытных групп животных по сравнению с контрольными. Кроме того, рекомбинантные эндолизины, в отличие от бактериофагов, обладают широким спектром действия, не влияя на представителей нормофлоры ЖКТ, что предполагает создание нового подхода к антибактериальной терапии и профилактике гнойно-септических послеоперационных осложнений и внебольничных раневых инфекций, вызванных полирезистентными возбудителями.
Таким образом, технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении местного антибактериального действия композиций путем нанесения их на раневую поверхность или введения в полость абсцесса.
Для достижения поставленной задачи биотехнологическим путем с использованием специализированных штаммов-продуцентов, последующей очисткой, которая проводилась при низких температурах (+4°С) методом металл-хелатной аффинной хроматографии с последующей гель-эксклюзионной хроматографией с добавлением на конечных стадиях стабилизирующих веществ (150 мМ NaCl), что позволяло получать активные стабильные препараты белков, и лиофилизацией были получены субстанции рекомбинантных эндолизинов, относящихся к классам мурамидаз и пептидаз, подобраны вспомогательные компоненты и сконструированы готовые лекарственные формы - гель и спрей, обладающие антибактериальной активностью, сохраняющейся после введения в полость абсцесса, что было подтверждено в ходе испытаний на инфекционной модели на лабораторных животных.
При разработке геля и спрея на основе рекомбинантных эндолизинов бактериофагов использовались микробиологические, молекулярно-генетические, биотехнологические методы и процедуры доклинических испытаний.
Сущность заявляемого изобретения заключается в следующем. Предлагаются две антибактериальные композиции в виде геля и спрея, которые содержат смесь рекомбинантных эндолизинов, относящихся к классам мурамидаз и пептидаз, с индивидуальной концентрацией каждого эндолизина 100-10000 мкг на мл ЛФ.
В качестве гидрофильного гелеобразователя предлагается использовать полимеры из группы производных целлюлозы: гидроксиэтилцеллюлозу или гидроксиметилпропилцеллюлозу, или натрий-карбоксиметилцеллюлозу, или метилцеллюлозу, или гидроксипропилцеллюлозу в диапазоне концентраций от 0,5 до 3,0%. Для повышения стабильности структуры геля и увеличения биоадгезивных свойств предлагается введение полиэтиленгликоля 1500 (ПЭГ 1500) или полиэтиленгликоля 3000 в диапазоне концентраций от 0,5 до 5,0%. В качестве растворителя предлагается подходящий буферный раствор с рН 7,0-8,0 при следующем соотношении компонентов на 100 г, масс. %:
Смесь рекомбинантных эндолизинов
0,03-0,15%
Гелеобразователь - производное целлюлозы
0,5-3,0%
ПЭГ 1500 или 3000
0,5-5,0%
Буферный раствор с рН=7,0-8,0
91,85-98,97%
В состав спрея предлагается включить Полоксамер 338 или Полоксамер 407, полиэтиленгликоль 1500 или полиэтиленгликоль 3000, а также растворитель - буферный раствор с рН 7,0-8,0 при следующем соотношении компонентов на 100 г, масс. %:
Пример состава спрея:
Смесь рекомбинантных эндолизинов
0,03-0,15%
Полоксамер 338 или 407
0,75-3,0%
ПЭГ 1500 или 3000
0,75-3,0%
Буферый раствор с рН=7,0-8,0
93,85-98,47%
Использование концентраций вспомогательных веществ (ВВ) ниже предложенных не обеспечивает потребительских и технологических свойств ЛФ, а использование более высоких концентраций таковых приводит к снижению литической активности эндолизинов.
Предлагается также способ приготовления приведенных выше антибактериальных композиций, в котором сначала сухие вспомогательные вещества растворяют в 20 ммоль/л Трис-HCl буфере с рН=7,5, нагретом до 50°С, и стерилизуют автоклавированием при 120°С в течение 12 минут, а затем в полученную основу вводят концентрированные растворы рекомбинантных эндолизинов при постоянном перемешивании.
В связи с поставленной задачей был разработан алгоритм по созданию новых препаратов на основе рекомбинантных эндолизинов, включающий следующие этапы:
1. Оценка эффективности фармацевтических субстанций эндолизинов на культурах восприимчивых бактерий in vitro,
2. Разработка составов и технологии лекарственных форм эндолизинов, определение показателей качества ГЛС,
3. Проверка действия разработанных лекарственных средств (ЛС) на животной модели,
4. Исследование иммуногенности эндолизинов,
5. оценка эффективности фармацевтических субстанций эндолизинов на патогенных штаммах бактерий in vitro,
6. Исследование влияния эндолизинов на представителей нормофлоры in vitro и in vivo,
7. Разработка технологии получения лекарственных средств в виде геля и спрея,
8. Доклинические испытания лекарственных форм в виде геля и спрея на основе коктейля рекомбинантных эндолизинов на лабораторных животных (кроликах), подтверждающие наличие терапевтического эффекта.
1. Оценка эффективности фармацевтических субстанций эндолизинов на культурах восприимчивых бактерий in vitro.
Для проведения исследования было отобрано по 20 штаммов бактерий Salmonella enterica, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli и Campilobacter jejuni, по 10 штаммов Acinetobacter baumannii и Enterobacter spp., а также штамм Fusobacterium necrophorum. Исследование проводили по разработанной ранее методике [Antonova N.P., BalabanyanV.Y., Tkachuk А.P., Makarov V.V., Gushchin V.A. Physical and chemical properties of recombinant KPP10 phage lysins and their antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa. // Bulletin of Russian State Medical University. - 2018. - no. 1. - P. 21-27. Doi: 10.24075/brsmu.2018.010] с небольшими модификациями. Методики представлены далее:
-1
-2
Суспензии бактериальных клеток штаммов К. Pneumoniae, P. Aeruginosa, Е. Coli, S. Enterica, A. Baumannii, Enterobacter spp. Готовили из ночных бульонных культур, полученных в мясопептонном бульоне (МПБ) в объеме 4,5-5 мл. Ночные культуры разбавляли свежим МПБ и подращивали при +37°С в термостате ТС-1/80 СПУ (ОАО «Смоленское СКТБ СПУ», Россия) до достижения мутности по МакФарланду равной 0,5 единиц. Измерение мутности осуществляли при помощи денситометра Densi-La-Meter II (ErbaLachemas.r.o., Чехия). Полученные культуры центрифугировали в объеме 1 мл при 6000×g в течение 10 минут, надосадочную жидкость удаляли. Осадок ресуспендировали в PBS до достижения мутности по МакФарланду равной 0,5 единиц. Суспензию бактериальных клеток разбавляли в 100 раз при помощи 20 мМ Трис-HCl буфера при рН=7,5, получая рабочую суспензию, которую использовали в течение не более 30 минут для определения чувствительности к эндолизинам. Рабочую суспензию бактериальных клеток в объеме 100 мкл смешивали с рабочим раствором эндолизина в объеме 100 мкл в стерильном плоскодонном 96-луночном полистироловом планшете (Eppendorf, Германия). Планшеты с исследуемыми образцами суспензий бактерий и эндолизинов инкубировали при +37°С в течение 30 минут с непрерывным шутеллированием при 200 rpm на шейкере ShakerS-3 (ELMI, Латвия). После инкубирования из образцов готовили десятикратные разведения в PBS. Из разведений 10 и 10 образцы в объеме 100 мкл наносили на поверхность агара Мюллера-Хинтона (HiMedia, Индия) в чашках Петри и растирали стеклянным шпателем Дригальского до полного высыхания на поверхности питательной среды. Чашки инкубировали при +37°С в течение ночи, после чего проводили подсчет колоний. Оценку чувствительности штаммов бактерий проводили в сравнении с контрольными образцами, содержащими 20 мМТрис-HCl буфера при рН=7,5 вместо рабочего раствора эндолизина. Исследование опытных и контрольных образцов проводили в двух независимых повторностях.
2
-1
-2
Суспензии бактериальных клеток штаммов С.Jejuni готовили из су точных культур, полученных на поверхности колумбийского агара (Conda, Испания) с добавлением 10% стерильной дефибринированной крови в чашках Петри при инкубировании в СО-инкубаторе NB-203 (N-BIOTEK, Корея) при +37°С и содержании в атмосфере углекислого газа 5%. Культуры с плотной питательной среды суспендировали в 20 мМ Трис-HCl буфер при рН=7,5 до достижения мутности по МакФарланду равной 0,5 единиц. Суспензию бактериальных клеток разбавляли в 100 раз при помощи 20 мМ Трис-HCl буфера, получая рабочую суспензию, которую использовали в течение не более 30 минут для определения чувствительности к эндолизинам. Рабочую суспензию бактериальных клеток в объеме 100 мкл смешивали с рабочим раствором эндолизина в объеме 100 мкл в стерильном плоскодонном 96-луночном полистироловом планшете (Eppendorf, Германия). Планшеты с исследуемыми образцами суспензий бактерий и эндолизинов инкубировали при +37°С и содержании в атмосфере углекислого газа 5% в течение 30 минут с непрерывным шутеллированием при 200 rpm. После инкубирования из образцов готовили десятикратные разведения в PBS. Из разведений 10 и 10 образцы в объеме 100 мкл наносили на поверхность кровяного агара (КА) (основа ГРМ-агар, ГНЦ ПМБ, Россия) с добавлением 5% стерильной дефибринированной крови в чашках Петри и растирали стеклянным шпателем Дригальского до полного высыхания на поверхности питательной среды. Чашки инкубировали при +37°С и содержании в атмосфере углекислого газа 5% в течение двух суток, после чего проводили подсчет колоний. Оценку чувствительности штаммов бактерий проводили в сравнении с контрольными образцами, содержащими 20 мМ Трис-HCl буфера при рН=7,5 вместо рабочего раствора эндолизина. Исследование опытных и контрольных образцов проводили в двух независимых повторностях.
Суспензии бактериальных клеток штамма F. Necrophorum готовили из двухсуточных культур, полученных на поверхности колумбийского агара (Conda, Испания) с добавлением 10% стерильной дефибринированной крови в чашках Петри при инкубировании в анаэробной станции (испытуемая культура является анаэробным микроорганизмом) Bactron 300-2 (Sheldon Manufacturing Inc., США) при +37°С и содержании в атмосфере углекислого газа 10%, водорода 10%, азота 80%). Культуру смывали в 1,5 мл 20 мМ Трис-HCl буфера при рН=7,5 и ресуспендировали до получения однородной мутности. Перед использованием Трис-HCl буфер был прогрет при температуре +80°С в течение 10 минут с последующим охлаждением в холодной воде. Данная манипуляция использовалась для того, чтобы минимизировать наличие кислорода в буфере. Культуру с чашки смывали в 1,5 мл 20 мМ Трис-HCl буфера при рН=7,5 и ресуспендировали до получения однородной мутности. В последующем по 100 мкл полученной суспензии на буфере переносили в контрольные и опытные пробирки. Каждый эндолизин и контроль делался в двух повторах. В контрольные пробирки добавляли по 100 мкл трис буфера, в опытные 100 мкл каждого эндолизина или их смеси соответственно.
В дальнейшем после внесения всех компонентов и ресуспендирования эппендорфы были помещены в анаэростат при 37°С на 30 минут. После окончания инкубирования по 100 мкл содержимого каждого эипендорфа переносили на чашку Петри с колумбийским агаром с 10% лошадиной кровью и шпателем или петлей втирали суспензию в агар. Чашки культивировали 48 часов при 37°С в анаэробной станции, после чего учитывали результат, проводя подсчет колоний.
Литическую активность эндолизинов определяли по формуле:
где X - литическая активность, %
А - среднее количество колоний в опыте, КОЕ
В - среднее количество колоний в контроле, КОЕ
II. Определение действия рекомбинантных эндолизинов на представителей нормофлоры in vitro и in vivo.
А. Культуры лактобацилл и бифидобактерий при выращивании в полужидких средах, разлитых высоким столбиком, образуют единичные характерные колонии, которые можно посчитать в пробирках ряда предельных десятикратных разведений, и по формуле количественно определить титр (КОЕ/мл) (МУК 4.2.999-00 Определение количества бифидобактерий в кисломолочных продуктах. - Сборник методических документов, необходимых для обеспечения Федерального Закона от 12 июня 2008 г. №88-ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - 79 с.). Это позволило оценить степень влияния изучаемых веществ на популяцию культур нормофлоры.
Б. Подготовка посевной культуры
Ампулы с лиофильно высушенными штаммами вскрывали в асептических условиях и регидратировали средой культивирования.
Для работы с бифидобактериями использовали среду для выращивания и выделения бифидобактерий, сухую, производства ГНЦ прикладной микробиологии г. Оболенск (БС), для лактобацилл - МРС-2, приготовленных в лаборатории питательных сред ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского но прилагаемым инструкциям.
-10
Для регидратации культур вносили 1 мл стерильной среды в ампулу, равномерно перемешивали содержимое круговыми движениями пипетки, отбирали полученную суспензию и вносили в первую пробирку ряда десятикратных разведений, содержащую 9 мл полужидких сред. Готовили предельные десятикратные разведения, перемешивая содержимое пробирок 12-15 раз пипетированием, избегая аэрации суспензии, и переносили 1 мл суспензии из предыдущей пробирки в последующую до 10. Посевы инкубировали 24 часа при температуре +37,5±1°С, получая при этом первую генерацию.
Выросшие посевы просматривали, выбирали пробирку с хорошо сформированными 100-150 колониями, перемешивали ее содержимое пипетированием и вносили 10% инокулята к объему среды (10 мл на 100 мл среды). Инкубировали 24 часа при температуре +37,5±1°С, получая при этом вторую генерацию.
Третью генерацию получали аналогично второй генерации.
На всех этапах работ проводили контроль отсутствия роста посторонней микрофлоры высевами на среды Сабуро и МПА.
Четвертую генерацию выращивали на поверхности агаризованных сред в анаэростате с созданием атмосферы при помощи газогенерирующих пакетов Анаэро. Микробиологической петлей снимали культуры и в стерильном физрастворе готовили суспензию по стандарту мутности 5 MakFarland. 2 мл переносили в 110 мл стерильного 20 мМ Трис-HCl буфера при рН=7,5, приготовленного в лаборатории питательных сред ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.
Разливали полученный материал по 12 стерильным пробиркам с пластиковыми пробками по 9 мл. Из оставшихся 2 мл суспензии готовили ряды десятикратных разведений для определения титра рабочего материала.
В приготовленные пробирки добавляли по 1 мл растворов эндолизинов с концентрацией 1 мг/мл, получали в суспензии концентрацию изучаемых веществ, равную 0,1 мг/мл (100 мкг/мл). Раствор каждого эндолизина готовили в объеме 11±0,1 мл, необходимом для изучения 11 штаммов.
Контролем являлся инокулят в объеме 9 мл с добавлением 1 мл 20 мМ Трис-HCl буфера.
Образцы выдерживали 30 минут при +37,5±1°С, далее отбирали по 1 мл для приготовления десятикратных рядов предельных разведений для определения воздействия эндолизинов на культуры и по 5 мл для определения титруемой кислотности.
Ряды десятикратных разведений инкубировали 48 часов при температуре +37,5±1°С. Предварительный подсчет выросших колоний проводили через 24 часа, окончательный - через 48 часов.
Исследования проводили в двойной повторности. Штаммы В. Longum OV-20, L. Helveticus NK-1 исследовали в 4х кратной повторности.
В. Определение титруемой кислотности
Титруемую кислотность измеряли в градусах Тернера (°Т). В соответствии с ГОСТ 3624 титруемая кислотность показывала количество кубических сантиметров децинормального (0,1 N) раствора щелочи, пошедших на нейтрализацию 100 мл или 100 г продукта в присутствии индикатора фенолфталеина [ОФС.1.7.2.0008.15 Определение концентрации микробных клеток. - Государственная фармакопея Российской Федерации, XIV издание]. Моментом окончания титрования считали появление слаборозового окрашивания, которое не исчезало в течение 1 минуты.
В тонкий стакан или колбу емкостью 100 мл пипеткой отбирали 10 мл хорошо перемешанного образца, добавляли 3 капли индикатора (1% раствор фенолфталеина на спирту), смесь перемешивали и титровали 0,1 N раствором гидроокиси натрия до появления слабо-розового окрашивания, неисчезающего в течение 1 минуты. Количество едкого натра, пошедшего на титрование, умножали на 10. Полученный результат выражал кислотность в
3
3
-10
Г. Определение количества колониеобразующих единиц Колониеобразующая единица, КОЕ - стандартный показатель, указывающий на число бактерий, образующих колонии в 1 мл среды. Готовили предельные десятикратные разведения. Для этого в первую пробирку с 9 см стерильной БС добавляли 1 см исследуемой суспензии и тщательно аккуратно перемешивали методом пипетирования 10-15 раз без образования пузырьков. Отбирали 1 мл полученной суспензии и переносили в следующую пробирку. Новой стерильной пипеткой перемешивали второе разведение, как описано ранее, и переносили 1 мл полученной суспензии в третью пробирку ряда. Так готовили разведения до 10. Посевы инкубировали при температуре +37±1°С в термостате 48 часов и проводили подсчеты характерных колоний в пробирках с единичными колониями каждые 24 часа. Результаты подсчета рассчитывали по формуле:
n-1
Х=а×10,
где X - число колониеобразующих единиц бактерий в 1 мл пробы;
а - число колоний в учитываемом разведении.
Д. Для оценки изменений состава нормофлоры при использовании эндолизинов проводили исследование на здоровых беспородных белых мышах массой 22-27 г. Эксперимент планировали с учетом «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологических лекарственных препаратов)» (Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Иммунобиологические лекарственные препараты). Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012-536 с.).
Испытания in vivo проводились с каждым из кандидатных эндолизинов на 5 опытных и 2 контрольных мышах. Препарат вводился внутрибрюшинно опытным мышам ежедневно в течение 5 дней по 0,5 мл эндолизина в день однократно, в концентрации 500 мкг (0,5 мг)/животное. Контрольной группе вводился буферный раствор (20 мМ Трис-HCl, рН=7,5). Перед введением эндолизинов на 5-ый и на 7 дней у каждой мыши отбирался кал и проводился бактериальный посев (оценка просветной микрофлоры). В конечной точке (спустя 2 дня после прекращения введения) животные умерщвлялись и проводился высев из отмытого под давлением с помощью шприца кишечника (оценка пристеночной микрофлоры). Микробиологические посевы проводили с учетом ОСТ 91500.11.0004-2003.
2. Разработка составов и технологии лекарственных форм эндолизинов, определение показателей качества ГЛС
В качестве эксципиентов для разработки лекарственных форм рассматривали полимеры, которые, согласно литературным данным, имеют высокую совместимость с иммунобиологическими субстанциями. В качестве гелеобразователя в технологии мягких лекарственных форм применяли гидроксиэтилцеллюлозу Natrosol 250 ННХ (ASHLAND). Производные целлюлозы являются наиболее индифферентными гелеобразователями, использующимися в лекарственных формах для всех видов применения, включая парентеральное. Гидроксиэтилцеллюлозы различных коммерческих марок отличают простота технологии, отсутствие необходимости нагревания, устойчивость к стерилизации, широкий диапазон вязкостей, нейтральное значение рН. Согласно предварительным исследованиям Natrosol 250 ННХ среди других гидроксиэтилцеллюлоз отличает повышенная мукоадгезия, за счет чего данная марка была выбрана как наиболее перспективная для разработки основы для гелей.
В качестве модификаторов вязкости спреев и мукоадгезивного компонента в их составе использовали полоксамеры - Kolliphor Р 338 и Kolliphor Р 407 (BASF). Полоксамеры обладают гидрофильными свойствами, что обусловлено наличием в составе молекулы двух гидрофильных хвостов. Применение гидрофильных полимеров удлиняет время удерживания лекарственной формы на слизистой оболочке, что ведет к постепенному высвобождению фармацевтической субстанции и улучшению переносимости пациентом. Кроме того, полоксамеры 338 и 407 обладают поверхностной активностью, что будет способствовать улучшению смачиваемости и распределению раствора по раневой поверхности и стабилизации капелек раствора в аэрозольной струе.
Для варьирования показателей стабильности, реологических и биоадгезивных свойств составов геля и спрея использовали полиэтиленгликоль с молекулярной массой 1500 (Химмед, Россия). Являясь осмотически активными эксципиентами, полиэтиленгликоли рекомендуются для введения в состав лекарственных форм, предназначенных для нанесения на раневую поверхность, так как будут способствовать оттоку гнойного содержимого и очистке раны.
А. Способ изготовления геля
В отвешенное и отмеренное количество Natrosol 250 НИХ и ПЭГ добавляют 20 мМ Трис-HCl (рН=7,5), предварительно термостатированный в течение 2 часов при температуре +50°С, термостатируют при температуре +50°С в течение 15 минут. Тщательно перемешивают. Полученную основу для геля стерилизуют при температуре +120°С в течение 12 мин. В простерилизованную основу для геля вводят эндолизины в виде концентрированных растворов с концентрацией 1-20 мг/мл. При изготовлении раствора вспомогательных веществ (ВВ) количество растворителя (Трис-HCl буфер) уменьшают на объем вводимых эндолизинов.
Б. Способ изготовления спрея
В отвешенное и отмеренное количество полоксамера и ПЭГ добавляют 20 мМ Трис-HCl (рН=7,5), предварительно термостатированный в течение 2 часов при температуре +50°С, термостатируют при температуре +50°С в течение 15 минут. Тщательно перемешивают. Полученную основу для спреев стерилизуют при температуре +120°С в течение 15 мин. В простерилизованную основу для спрея вводят эндолизины в виде концентрированных растворов с концентрацией 1-20 мг/мл. При изготовлении раствора вспомогательных веществ (ВВ) количество растворителя (Трис-HCl буфер) уменьшают на объем вводимых эндолизинов.
В. Определение технологических показателей
У изготовленных лекарственных форм определяли рН в соответствии с ОФС.1.2.1.0004.15 «Ионометрия». Вязкость геля определяли методом ротационной вискозиметрии на ротационном вискозиметре типа «цилиндр в цилиндре», а вязкость спрея - методом капиллярной вискозиметрии на вискозиметре Оствальда в соответствии с ОФС.1.2.1.0015.15 «Вязкость» и ОФС.1.2.1.0014.15 «Плотность».
Г. Определение мукоадгезии
Характеристики мукоадегизии лекарственных форм, применяемых на слизистых оболочках, определяют степень их таргетного воздействия на пораженный участок, время экспозиции на слизистой и терапевтическую эффективность лекарственной формы.
Биоадгезивные свойства изучали путем измерения силы отрыва и времени удерживания навески лекарственной формы на подложке, обработанной водным раствором муцина свиного желудка типа II с содержанием связанной салициловой кислоты 0,5% (SIGMA, Sigma-Aldrich, США, кат. Номер М 2378).
2
2
Оценку силы отрыва проводили при температуре +20°С с использованием рычажного механизма, представленного на фиг. 1. К нижней стороне подвижной части рычага (6) с закрепленной на нем стеклянной пластиной (1) и к неподвижной пластине (4), закрепленной на столешнице (5), прикреплялся в качестве подложки нетканый материал спанбонд (SPANLAB, Россия). На поверхность неподвижной пластины (4) наносился 20% (массо-объемная концентрация) водный раствор муцина свиного желудка типа II (3), на нижнюю часть пластины (1) - испытуемый образец массой 1,0 г (2), равномерно распределенный по площади рабочей поверхности (1820 мм) пластины (1) с помощью шпателя. На второе плечо рычага помещался груз (7). Сила отрыва рассчитывалась как произведение массы груза, при которой верхний рычаг (6) с закрепленной пластиной (1) отрывался от пластины (4), закрепленной на столешнице (5), на ускорение свободного падения (g=9,81 м/с).
Д. Определение литической активности
Для определения литической активности эндолизинов, отобранных в состав, использовались бактериальные штаммы, приведенные в Таблице 1.
Также при определении активности эндолизинов применяли тест-штамм Acinetobacter baumannii Ts 50-16.
600
Ночную культуру (1-2 мл) разбавляли и подращивали до оптической плотности OD=0,6 (экспоненциальная фаза роста бактерий). Полученную культуру (1 мл) осаждали центрифугированием (3000×g, 10 мин.), клетки ресуспендировали в таком же объеме PBS (мутность полученной суспензии соответствовала стандарту мутности МакФарланда 0,5). Бактериальную культуру разбавляли в 100 раз Трис-HCl буфером, данную суспензию использовали в течение 30 мин. После приготовления. В 96-луночном планшете готовили следующие смеси:
1. 100 мкл суспензии бактерий и 100 мкл ЛФ с необходимой концентрацией эндолизинов (опыт);
2. 100 мкл суспензии бактерий и 100 мкл раствора ВВ без добавления эндолизинов (контроль).
Полученные смеси инкубировали при 37°С в течение 30 мин при 200 rpm. Затем делали 10 и 100-кратные разведения в PBS и 100 мкл каждого разведения наносили на чашки Петри с агаризованной средой LB. Колонии на чашках подсчитывали после ночной инкубации при 37°С.
3. Проверка действия разработанных лекарственных средств (ЛС) на животной модели
А. Лабораторные животные
Для проведения опыта были использованы кролики породы «советская шиншилла» массой 2 кг. В опытах были использованы исключительно самки. Кролики являются стандартным объектом исследований эффективности ЛС, в особенности при воспроизведении раневой инфекции, вызванной Fusobacterium necrophorum. Для предварительного опыта было использовано 2 кролика: Кролик №1 после инфицирования подвергался лечению ЛС в форме геля, кролик №2 подвергался лечению ЛС в форме спрея. При проведении основного опыта было использовано 26 кроликов:
- опытная группа №1 состояла из 10 кроликов (№2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 17), которые подвергались лечению ЛС в форме геля с ДВ;
- контрольная группа №1, состоящая из 3 кроликов (№1, 14, 16) подвергалась обработке плацебо в форме геля;
- опытная группа №2 состояла из 10 кроликов (№11, 12, 13, 15, 18, 19, 21, 22, 24, 25), которые подвергались лечению ЛС в форме спрея с ДВ;
- контрольная группа №2 состояла из 3 кроликов (№20, 23, 26), которые подвергались обработке плацебо в форме спрея.
Кролики, используемые в научных целях, содержались в соответствии с руководством «Guide for the Care and Use of Laboratory Animals», а также с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского Союза от 22 сентября 2010 г по охране животных. В ходе опыта все животные были размещены в индивидуальных клетках- изоляторах. Все клетки были накрыты стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением и местом для поилки. В виварии поддерживаются стандартные условия микроклимата: относительная влажность воздуха 30-70%, температура воздуха 22-24°С, освещение естественное, освещенность -110 Люкс на расстоянии 1 метр от пола. Каждая клетка маркировалась, при этом на этикетке указано: номер животного, номер заражающего штамма, дата заражения, данные о дозе и способе введения испытуемых образцов средств. Животных кормили гранулированным экструдированным комбикормом для грызунов, соответствующим ГОСТ Р 50258-92 «Комбикорма полнорационные для лабораторных животных. Технические условия». Корм давали кроликам adlibitum. Воду давали adlibitum в стандартных бутылочках с закручивающимися крышками и стальными носиками-поилками. Используемая для поения вода соответствует СанПиН 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества». В качестве подстилки использовали стерильные древесные опилки. Уход за кроликами и манипуляции с ними проведены в соответствии с СОП, принятыми в организации исполнителе, и принципами гуманного обращения с животными.
Перед проведением опыта кролики содержались в виварии в течение 8 дней (животные прошли карантин до начала проведения испытаний) в соответствии с СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)». Животные подвергались ежедневному ветеринарному осмотру. За время проведенного карантинного содержания в ходе ежедневных осмотров не было обнаружено животных с отклонениями здоровья, которые могли повлиять на результаты проводимого эксперимента.
В ходе проведения испытаний были использованы общие методы клинического исследования: осмотр, пальпация и термометрия. Проводили общее клиническое исследование: определение габитуса, исследование видимых слизистых оболочек, кожи, лимфатических узлов, измерение температуры тела, а также посистемные исследования органов дыхательного аппарата, сердечно-сосудистой системы, пищеварительного тракта, мочеполового аппарата и нервной системы.
Б. Оценка биохимических показателей крови
Биохимические показатели крови определяли на биохимическом анализаторе «ChemWell+» (США) с использованием реагентов фирмы «Витал» (Россия) в сыворотке крови без следов гемолиза. Оценивали следующие показатели: Аминотрансферазы (АлАТ и AcAT) оптимизированный энзиматический кинетический метод; общий белок -биуретовый метод.
В. Оценка гематологических показателей крови
Гематологические исследования цельной крови выполнялись на гематологическом анализаторе ВС-3200 (Myndrey). Принцип определения основан на методе импеданса, который заключается в определении количества и размера клеток в зависимости от изменения электрического сопротивления, когда частица (клетка) в токопроводящей жидкости проходит через маленькую апертуру. Каждая клетка при этом вызывает изменение импеданса проводящей суспензии клеток крови. Эти изменения регистрируются как увеличение напряжения между электродами. Количество импульсов определяет количество клеток. Амплитуда импульса пропорциональна объему клетки. Импульсы подсчитываются только в границах, которые находятся между заранее установленными нижними и верхними пределами (дискриминаторами).
Принцип измерения гемоглобина. Гемоглобин определяется в лизированном разведении 1:196 цианметгемоглобиновым методом. Реагент лизирует эритроциты, при этом высвобождается гемоглобин. Железо гемоглобина окисляется из двухвалентного в трехвалентное, формируя метгемоглобин, который реагирует с цианидом калия с образованием стабильного цианметгемоглобина или гемоглобинцианида. Затем концентрация данного продукта измеряется фотометрически.
Г. Инфекционная модель для оценки лечебной эффективности разработанных композиций
3
Обоснованием выбора бактериального агента - Fusobacterium necrophorum для воспроизведения раневой инфекции на лабораторных животных являются хорошо изученные характеристики штамма, чувствительность его к испытуемым ЛС, а также возможность получения контролируемой по срокам инфекции. Данный штамм используется рядом отечественных биопредприятий при контроле иммуногенной активности инактивированных вакцин против некробактериоза, в тесте серозащиты, в качестве штамма «пробойника». Подкожное введение суточной суспензии штамма F Necrophorum, активно растущего в среде Китта-Тароцци в концентрации 3 млрд. микробных клеток в объеме 1 см, вызывает гибель инфицированных животных в течении 10-14 дней. При этом запланированный период наблюдения за животными составлял 30 дней или до момента их гибели. Инъекция проводилась в область холки. Выбор данной локализации воспроизведения раневой инфекции был обусловлен тем, что животные таким образом не смогли бы сорвать резиновый дренаж, установленный для обеспечения оттока гнойных масс. Заражение всех животных проводилось единовременно с использованием одной и той же инфицирующей суспензии. Корректность проведения манипуляции подтверждалась образованием на месте инъекции абсцесса на 4-7 сутки. Лечение инфекции с образованием раневых и абсцедирующих процессов требует проведения оперативного вмешательства (ОВ) путем вскрытия абсцесса для удаления экссудата, обеспечения доступа кислорода, промывания раны и закладки лекарственного средства. Для удаления экссудата из раны оперативным путем делались два небольших надреза таким образом, чтобы один надрез находился ниже локализации второго. Данный подход позволял обеспечить отток экссудата. При проведении ОВ использовался пассивный тип дренирования, что объясняется локализацией абсцесса в неглубокой локализации (подкожной клетчатке). В качестве дренажа использовались небольшие полоски от стерильных латексных медицинских перчаток.
3
Д. Дозы, схема и способ введения испытуемого средства При проведении испытания ЛС каждая испытуемая форма вводилась животным после предварительного вскрытия абсцесса, установки активного дренажа, спринцевания полости абсцесса стерильным физиологическим раствором с целью промывания ее от гнойных масс. Гель вносился из шприца (без иглы) в раневой ход, отверстие которого располагается выше нижерасположенного отверстия. Данная манипуляция должна способствовать самопроизвольному оттоку гнойных масс, в отличие от случаев, когда оба оперативных отверстия оставались бы в одной горизонтальной плоскости. Аналогичный подход был использован при применении ЛС в форме спрея. Исключением являлось то, что спрей вносился в раневой канал более длительное время, чем гель. Важным условием при проведении опыта стала необходимость поддержания низкой температуры испытуемых форм ЛС. Так, шприцы и флаконы со спреем постоянно находились в термоконтейнере с хладоэлементами. Средства изымались из контейнера непосредственно перед их применением. Показателем того, что обе формы ЛС были успешно и корректно применены, свидетельствовало то, что из нисходящего раневого отверстия данная форма должна была вытекать в небольшом количестве. Это говорит о том, что раневой ход полностью заполнен ЛС. В обоих случаях, независимо от формы средства, объем ЛС на однократное применение на 1 голову составлял 5 см. Промывание раны и внесение новой дозы препарата проводилось дважды в день в течении 5 дней подряд. Таким образом, на каждое животное было подготовлено по 10 доз.
В течение исследования каждое животное осматривалось ежедневно. Осмотр включал в себя оценку общего поведения и общего состояния животных, термометрию, отбор образцов крови на клинический и биохимический анализы, а также на серологическую диагностику. Для оценки эффективности использования ЛС при лечении раневой инфекции были использованы следующие показатели: сохранность животных в группе; время гибели животных; внешний вид и активность животных; результаты биохимического анализа крови; результаты гематологического анализа крови. Кровь у кроликов отбиралась из краевой вены уха в объеме, необходимом для проведения исследования. Перед отбором крови ухо протиралось тампоном, смоченным ксилолом. Кровь для биохимических показателей и общий анализ крови брали до заражения, на 11 и 20 день после заражения.
Умерщвление животных, в случае необходимости, должно было осуществляться ответственным лицом в соответствии с требованиями, принятыми в лаборатории, путем декапитации после применения эфирного наркоза без причинения страданий животным в специальном помещении вивария. Трупы погибших кроликов извлекались из клеток сразу после обнаружения и констатации смерти ответственным лицом. Трупы осматривались визуально, после чего проводились их вскрытие и исследование возможных причин гибели. Лабораторная диагностика некробактериоза проводилась с целью подтверждения причины гибели животных, используемых в опыте. Так, для подтверждения причины гибели животных проводилось их незамедлительное вскрытие с целью определения типичных для некробактериоза патологоанатомических изменений, а также отбора секционного материала для выделения ранее введенного инфекционного агента. Так, высевы проводились из крови сердца и печени трупов в пробирки с МППБ под вазелиновым маслом с 0,2% глюкозы и для контроля в пробирки с МПА и МПБ. Засеянные среды инкубировались в термостате при температуре +37±1°С в аэробных условиях в течение 24 ч. Реализация данной работы проводилась согласно MP: «Лабораторные методы диагностики некробактериоза сельскохозяйственных животных» от 01.06.1987, а также «Методическим рекомендациям по диагностике, лечению и профилактике некробактериоза, пальцевого дерматита и болезней копытец крупного рогатого скота незаразной этиологии» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, 2017 г.
Макроскопическое исследование органов и тканей проводили согласно «Методическим указаниям по патоморфологической диагностике болезней животных, птиц и рыб в ветеринарных лабораториях». Вскрытие трупов павших и вынужденно убитых кроликов осуществляли методом полной эвисцерации. Непосредственное проведение вскрытия трупов проводили по схеме:
- наружный осмотр;
- внутренний осмотр;
- оценка полученных результатов.
Подопытных животных вскрывали в спинном положении. Оценку полученных результатов проводили в соответствии с методологией, описанной Жаровым А.В.
Доклинические испытания на лабораторных видах животных (кролики породы «советская шиншилла») проведены в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986) и статьей №11 Федерального закона от 12 апреля 2010 г. №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» (ред. От 04.06.2018).
Все этапы работы проведены в соответствии с нормативно-технической документацией:
- Санитарно-эпидемиологические правила СП 2.2.1.3218-14 "Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)" (утв. Постановлением Главного государственного санитарного врача РФ от 29 августа 2014 г. №51);
- Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с. (ФГБУ НЦЭСМП Министерства здравоохранения РФ);
- Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть вторая. - М.: Гриф и К, 2012. - 536 с. (ФГБУ НЦЭСМП Министерства здравоохранения РФ);
- Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том I. - М.: Гриф и К, 2013. - 328 с. (ФГБУ НЦЭСМП Министерства здравоохранения РФ);
- Руководство по экспертизе лекарственных средств. Том II. - М.: Гриф и К, 2013. - 280 с. (ФГБУ НЦЭСМП Министерства здравоохранения РФ);
- Федеральное руководство по использованию лекарственных средств (формулярная система). Выпуск XV. - М.: Эхо, 2013. - 1020 с;
- ГОСТ Р ИСО 20776-1-2010. Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro. Исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам;
- Клинические рекомендации: определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам Версия-2015-02, утвержденные на Расширенном совещании Межрегиональной ассоциации по клинической микробиологии и антимикробной химиотерапии (Москва, 22.05.2015 г.);
th
- Clinical and Laboratory Standards Institute (2006), Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 16 edn. Informational Supplement M100-S16, Wayne, PA;
- ISO/ТС 34/SC 9 - Микробиология;
- Carol Kilkenny, William J. Browne, Innes C. Cuthill, Michael Emerson and Douglas G. Altman. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J PharmacolPharmacother. 2010 Jul-Dec; 1(2): 94-99;
- Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских технологиях. Н.Н. Каркищенко и С.В. Грачев. Москва, 2010;
- ИСО/МЭК 17025-99 «Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий»;
- СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
4. Исследование иммуногенности эндолизинов
А. Получение кроличьей поликлональной антисыворотки к коктейлю эндолизинов.
Для получения кроличьей поликлональной антисыворотки к коктейлю эндолизинов был проведен цикл внутримышечных иммунизаций кроликов, состоящий из 4 инъекций соответствующим коктейлем. Для гарантированного иммунного ответа для иммунизации была взята высокая доза антигена (по 2-2,2 мг каждого эндолизина на одну иммунизацию). Содержимое флаконов с эндолизинами растворяли в 20 мМ Трис-HCl буфере (рН=7,5).
Иммунизация состояла из цикла внутримышечных инъекций АГ, смешанного с адъювантом Фрейнда, в четыре точки (в равном объеме в четыре лапы кролика) и проводилась по следующей схеме.
первая иммунизация: 1,2 мл АГ+1,2 мл полного адъюванта Фрейнда;
вторая иммунизация через 10 дней: 1,22 мл АГ+1,22 мл неполного адъюванта Фрейнда;
третья иммунизация через 20 дней: 0,51 мл АГ+0,6 мл неполного адъюванта Фрейнда;
четвертая иммунизация через 30 дней: 0,9 мл АГ+0,9 мл полного адъюванта Фрейнда;
забор крови через 37 дней. Полученная кроличья антисыворотка была проанализирована иммунохимическими методами (преципитация по Оухтерлони, иммуноэлектрофорез).
Б. Конструирование иммуноферментной тест-системы для определения антиэндолизиновых IgG-антител и проведение иммуноферментного анализа
Принципиальная схема проведения иммуноферментной реакции для выявления IgG-антител к эндолизинам состоит в следующем. В лунки полистиролового планшета сорбируют антиген (коктейль эндолизинов) в подобранной концентрации. После инкубации содержимое лунок вытряхивается и планшет промывается моющим раствором (5 циклов промывки, которые повторяются также после инкубации с исследуемыми образцами и с конъюгатом). Затем вносят исследуемый образец сыворотки крови, и в случае наличия в образце IgG-антител к эндолизинам они взаимодействуют с сорбированным антигеном. Несколько лунок обязательно отводят для внесения положительного и отрицательного контролей. В качестве положительного контроля используют сыворотку крови, заведомо содержащую антитела к эндолизинам (кроличью поликлональную антисыворотку к коктейлю эндолизинов в подобранном разведении). В качестве отрицательных контролей используют забуференный фосфатами физиологический раствор с твином (PBS-T), а также сыворотку крови, заведомо не содержащую антитела к эндолизинам (например, сыворотку крови интактного кролика). Дополнительным контролем специфичности иммуноферментной реакции служат «пустые» лунки, т.е. лунки, в которых не сорбировали антиген, в то время как остальные компоненты реакции внесены будут.Далее в лунки вносят конъюгат - реагент, представляющий собой либо антитела к IgG либо белок А стафилококка - Protein А (т.н. «стафилококковый реагент», способный взаимодействовать с IgG многих видов млекопитающих, в частности человека и кролика) в комплексе с ферментом пероксидазой. На заключительном этапе в лунки вносят субстрат (перекись водорода) вместе со свидетелем реакции тетраметилбензидином (ТМБ). Реакцию останавливают добавлением стон-реагента (кислоты) и замеряют оптическую плотность содержимого лунок на планшетном фотометре. В том случае, когда все компоненты реакции присутствуют (антиген, IgG-антитела, конъюгат и субстрат), в лунке развивается цветная реакция, интенсивность которой зависит от количества IgG-антител в исследуемом образце.
На первом этапе конструирования иммуноферментной тест-системы для выявления IgG-антител к эндолизинам был осуществлен подбор концентрации антигена (коктейля эндолизинов) для сорбции в лунках планшета. Для этого первоначально была осуществлена серия пробных сорбций каждого из эндолизинов в отдельности в различных концентрациях (от 100 мкг до 0,01 пг с кратностью, равной 10). Антигены (эндолизины) сорбировались в лунках полистиролового планшета, затем в лунки вносилась полученная кроличья антисыворотка к эндолизинам в разведениях от 1/5 до 1/10000 для установления необходимого разведения антисыворотки в качестве положительного контроля. Связавшиеся с антигеном IgG-антитела выявлялись с помощью конъюгата «Белок А-пероксидаза» (Protein А-Peroxidase, Sigma, США) или конъюгата аффинно-очищенных поликлональных козьих антител к иммуноглобулинам кролика с пероксидазой хрена («Polygoatanti-rabbitHR», Биалекса, Россия), а ферментная реакция с добавленным затем субстратом (ВСМ Diagnostics, США) ингибировалась кислотой (стоп-реагент). Регистрацию оптической плотности в лунках проводили при 450 нм против воздуха.
Подбор условий проведения иммуноферментной реакции включал также подбор разведения конъюгата, отработку условий инкубации при различных температурных режимах (от +35°С до +44°С), времени проведения реакции (от 30 до 90 минут), необходимости или отсутствии встряхивания.
Конъюгат «Белок А-пероксидаза» в количестве 1 мг (содержимое одного флакона) растворяли в 0,5 мл 0,01 М нитратного буфера (рН 6,4) с добавлением 0,5 мл глицерина (глицерин препятствует замораживанию реагента). Полученный раствор с концентрацией конъюгата 1 мг/мл хранили при температуре -20°С, периодически используя. Для подбора оптимального разведения конъюгата при проведении ИФА готовили его разведения в PBS-T в диапазоне 1/16000-1/128000. Конъюгат «Polygoatanti-rabbitHR» имелся в жидком виде с концентрацией 0,7 мг/мл. В исследованиях использовали другой диапазон разведения этого конъюгата в PBS-T - 1/2000-1/8000.
В. Исследования по выявлению антиэндолизиновых антител в крови кроликов после лечения коктейлем эндолизинов
Кровь для ИФА отбиралась до заражения на 14 и 19 день после начала лечения у кроликов из краевой вены уха в объеме, необходимом для проведения исследования. Перед отбором крови ухо протиралось тампоном, смоченным ксилолом.
5. Оценка эффективности фармацевтических субстанций эндолизинов на патогенных штаммах бактерий in vitro
С целью оценки эффективности фармацевтических субстанций эндолизинов и определения спектра их литической активности был отобран 121 штамм различных видов возбудителей, полученных из различных источников. Перечень использованных штаммов представлен в таблице 2.
В исследование было включено 5 кандидатных рекомбинантных эндолизинов бактериофагов ECD7, Am24, Ар22, Si3 и St11 - типичных представителей основных классов эндолизинов - мурамидаз и пептидаз. Как видно из результатов, представленных на фиг. 2, наиболее широким спектром литической активности обладали рекомбинантные эндолизины бактериофагов HCD7, Am24 и Ар22.
6. Исследование влияния эндолизинов на представителей нормофлоры in vitro и in vivo
Для исследования влияния на нормофлору были выбраны те же кандидатные эндолизины бактериофагов ECD7, Am24, Ар22, Si3 и St11.
Исследование нормофлоры in vitro показало, что минимальное угнетающее воздействие на популяцию В. Longum В379М оказал эндолизин LysSi3, незначительное снижение активности штамма В. Breve OV-12 выявлено после обработки популяции LysAM24 и LysECD7, что не превышает изменений активности культуры в контроле. Отмечено снижение количества жизнеспособных колониеобразующих единиц В. Infantis 73-15 под воздействием LysSi3 и снижение количества КОЕ/мл В. Bifidum 791, обработанных LysSt11. Отмечено снижение количества КОЕ В. Longum OV-20 после воздействия LysSi3.
Наибольшее угнетение роста выявлено для культуры L.helveticus NK-1 после воздействия эндолизинов LysSi3 в течение 30 минут.
Не отмечено влияния эндолизинов на В. Bifidum OV-19, В. Adolescentis ГО-13, L. Casei КНМ-12, L. Caisei К3Ш24.
Исследование in vivo выявило влияние следующих эндолизинов:
- EysSt11 повышал количество коагулазо-отрицательных стафилококков и снижал количество энтерококков в составе пристеночной микрофлоры к окончанию эксперимента, а также повышал титр грибов в просветной микрофлоре на пятый день эксперимента по сравнению с контрольной группой животных;
- LysSi3 снижал титр бактерий рода Enterococcus в просветной микрофлоре по сравнению с контрольной группой на пятый (Р<0,001) и седьмой (Р<0,05) дни эксперимента.
На фоне использования LysAM24. LysAP22 и EysECD7 не было выявлено статистически значимых изменений высеваемой просветной и пристеночной микрофлор.
7. Технология получения лекарственных средств в виде геля и спрея
Изготовление геля
Изготовление геля, содержащего коктейль из рекомбинантных эндолизинов, относящихся к классам мурамидаз и пептидаз, состоит из трех этапов.
Этап 1 - получение стерильной основы геля. В отвешенное и отмеренное количество ВВ (Natrosol 250 ННХ и ПЭГ 1500) добавляют необходимый объем 20 ммоль/л Трис-HCl буфера с рН=7,5, предварительно термостатированного в течение 2 часов при температуре +50°С, с учетом последующего введения концентрированных растворов эндолизинов. Термостатируют при температуре +50°С в течение 15 минут. Тщательно перемешивают. Полученную основу для геля стерилизуют при температуре +120°С в течение 12 мин.
Этап 2 - получение концентрированных растворов эндолизинов. К лиофилизированному белку добавляют необходимый объем стерильного 20 ммоль/л Трис-HCl буфера с рН=7,5 до получения концентрации 1-20 мг/мл, аккуратно перемешивают до полного растворения.
Этап 3 - получение лекарственного средства в виде геля. В простерилизованную и остывшую гелевую основу вводят необходимый объем концентрированных растворов эндолизинов до получения заданной концентрации, тщательно перемешивают.
Изготовление спрея
Изготовление спрея, содержащего коктейль из рекомбинантных эндолизинов, относящихся к классам мурамидаз и пептидаз, состоит из трех этапов.
Этап 1 - получение стерильной основы спрея. В отвешенное и отмеренное количество ВВ (Полоксамер 338 или 407и ПЭГ1500) добавляют необходимый объем 20 ммоль/л Трис-HCl буфера с рН=7,5, предварительно термостатированного в течение 2 часов при температуре +50°С, с учетом последующего введения концентрированных растворов эндолизинов. Термостатируют при температуре +50°С в течение 15 минут. Тщательно перемешивают. Полученную основу для геля стерилизуют при температуре +120°С в течение 12 мин.
Этап 2 - получение концентрированных растворов эндолизинов. К лиофилизированному белку добавляют необходимый объем стерильного 20 ммоль/л Трис-HCl буфера с рН=7,5 до получения концентрации 1-20 мг/мл, аккуратно перемешивают до полного растворения.
Этап 3 - получение лекарственного средства в виде геля. В простерилизованную и остывшую гелевую основу вводят необходимый объем концентрированных растворов эндолизинов до получения заданной концентрации, тщательно перемешивают.
Определение литической активности рекомбинантных эндолизинов в составе ЛС
Исследования литической активности эндолизинов в составе ЛФ проводились на образцах, содержащих коктейль из трех рекомбинантных эндолизинов бактериофагов ECD7, Am24 и Ар22 с индивидуальной концентрацией каждого эндолизина 150 мкг/мл, использовали штаммы бактерий, представленные в таблице 1. Результаты определения литической активности представлены в таблице 3.
8. Доклинические испытания лекарственных форм в виде геля и спрея на основе коктейля рекомбинантных эндолизинов на лабораторных животных (кроликах), подтверждающие наличие терапевтического эффекта
В исследование были включены две ЛФ, а именно гель и спрей на основе коктейля рекомбинантных эндолизинов бактериофагов ECD7, Am24 и Ар22 с индивидуальными концентрациями 150 мкг/мл.
Выживаемость кроликов опытных и контрольных групп Результаты определения выживаемости животных опытных и контрольных групп с момента инфицирования до гибели животных отражены в Таблице 4. День гибели животных определялся в зависимости от времени обнаружения павших кроликов. Так, в случае, если обнаружение произошло утром, при этом четко фиксировались трупное окоченение и низкая температура тушки, то датой падежа обозначался предыдущий день. В случае, если при утреннем осмотре тушка павшего кролика была теплой, и отсутствовало выраженное трупное окоченение, то временем гибели признавался текущий день.
Биохимические показатели крови (ACT, АЛТ, общий белок) кроликов опытных и контрольных групп
В таблице 5 представлены статистически обработанные данные по уровню ACT, АЛТ и общего белка у кроликов опытных и контрольных групп, показавшие статистически достоверные различия (р<0,05).
Статистически достоверное различие наблюдалось только у показателя АЛТ на 11 день после заражения кроликов при лечении гелем, остальные показатели, а также все показатели у группы, получавшей лечение спреем, статистически достоверных различий не показали.
Клинический анализ крови кроликов опытных и контрольных групп В таблице 6 представлены результаты клинического анализа крови кроликов опытных и контрольных групп, показавшие статистически достоверные различия.
Статистически достоверное различие наблюдалось только при изменении уровня сегментоядерных нейтрофилов на 11 день после заражения кроликов при лечении гелем. Остальные показатели, а также все показатели у группы, получавшей лечение спреем, статистически достоверных различий не показали.
Результаты термометрии кроликов и площади абсцессов на 9 и 12 дни после заражения.
Статистически обработанные данные по термометрии кроликов на протяжении всего периода проведения эксперимента отражены в таблице 7.
В Таблице 8 приведены средние значения площади абсцесса в объединенной (гель и спрей плацебо), контрольной и опытных группах до заражения, на день начала лечения, на 9 и 12 дни заражения.
Анализ данных по выживаемости опытных и контрольных кроликов со дня их инфицирования по день их гибели (включительно) позволяет свидетельствовать о том, что средняя продолжительность жизни кроликов контрольных групп составляет 13,67±0,82 дней, средняя продолжительность жизни кроликов опытной группы, подвергавшихся лечению с помощью ЛС в форме геля - 22±2,18 дня, средняя продолжительность жизни кроликов опытной группы, подвергавшихся лечению с помощью ЛС в форме спрея -20,44±2,24 дня. При сравнении между собой данных, полученных от животных при лечении гелем и спреем, достоверных различий не выявлено (р>0,05), хотя средние значения по данным группам животных различаются более чем на 1,5 дня.
Косвенным подтверждением большей эффективности геля с эндолизинами могут служить данные по площади абсцессов, сформировавшихся на животных: в группе, где использовался гель с эндолизинами, площадь абсцесса была достоверно больше до начала лечения и на 4 сутки лечения, что должно было привести животных к более быстрой гибели. Дополнительно у кроликов, получавших ЛС в форме геля была достоверно ниже температура тела на 9 день после инфицирования (3-4 день после начала лечения) по сравнению с контролем. Это может указывать на антибактериальные свойства испытуемого средства, препятствующие генерализации инфекции. Аналогичное явление было зафиксировано в группе кроликов, которым применяли ЛС в форме спрея, но лить на 12 день после заражения.
Статистически достоверное снижение уровня лейкоцитов на 11 день заражения (на следующей день после окончания лечения) в группе кроликов, которых лечили гелем с эндолизинами, по сравнению с контролем может свидетельствовать об эффективности местного бактерицидного действия, снижающего системную воспалительную реакцию.
Анализ иммуногенности эндолизинов в составе коктейля Анализ антисыворотки в реакции преципитации по Оухтерлони выявил наличие антител ко всем используемым эндолизинам. На фиг. 3 представлены результаты анализа. В центральной лунке антисыворотка (сыворотка крови кролика, иммунизированного коктейлем эндолизинов), периферические лунки содержат антигены (эндолизины LysAP22, LysAM24 и LysECD7). Линии преципитации свидетельствуют о реакции взаимодействия антиген (эндолизин)-антитело.
Анализ полученной кроличьей антисыворотки методом иммуноэлектрофореза подтвердил образование антител к каждому эндолизину коктейля (фиг. 4). Верхняя лунка и верхняя траншея - сыворотка крови человека и антисыворотка к белкам сыворотки крови человека, соответственно (для контроля проведения электрофореза), в остальные лунки внесен коктейль (смесь) или отдельные эндолизины, а в траншеях находится исследуемая кроличья антисыворотка. В случае лизина LysECD7 выявлено наличие двух линий преципитации, что говорит об образовании антител к двум отдельным эпитопам эндолизина.
Таким образом, с помощью внутримышечной иммунизации кролика-продуцента была получена поликлональная антисыворотка к коктейлю эндолизинов, содержащая антитела ко всем трем компонентам коктейля (LysAP22, LysAM24 и LysECD7).
Проведение иммуноферментного анализа
После серии экспериментов в качестве оптимальных условий проведения ИФА выбрано:
содержание каждого сорбированного эндолизина в лунке - 10-20 пг;
длительность сорбции антигена в лунках 18-20 ч;
температура сорбции+4 -+8°С;
температура проведения реакции+37°С;
разведение конъюгата «Белок А-пероксидаза» 1/64000;
разведение конъюгата «Poly goat anti-rabbit HR» 1/8000;
реакция проводится без встряхивания. Результаты исследования по выявлению антиэндолизиновых антител в крови кроликов после лечения коктейлем эндолизинов
В результате проведенных исследований были получены следующие результаты (Таблица 9). Выраженная цветная реакция развивается только в лунках с положительным контролем, причем даже в разведении 1/1600. В лунках с отрицательным контролем оптическая плотность около 0,3. В среднем около 0,3 была также оптическая плотность в лунках с сыворотками других животных, а около 0,35 оптическая плотность в лунках с интактной сывороткой кролика. В «пустых лунках» реакция не развивалась.
Учет результатов проводили с помощью подсчета cut-off. Чтобы отсечь возможные ложно-положительные результаты, нами было выбрано значение cut-off, равное удвоенной оптической плотности отрицательного контроля (буферный раствор). Оценка наличия антител к эндолизинам проводилась с использованием показателя - коэффициента позитивности, который представляет собой отношение оптической плотности образца к значению cut-off. Во всех исследуемых образцах сывороток крови наличие антител к эндолизинам не зафиксировано (Кп существенно меньше 1).
Наличие антител во всех образцах сывороток крови обследованных кроликов зафиксировано не было, что может свидетельствовать о том, что при использовании данных форм эндолизинов в эти сроки антитела не вырабатываются.
Примеры осуществления изобретения
Пример 1
Гель для местного лечения и профилактики послеоперационных гнойно-септических осложнений (ИСМП).
Состав геля на 100 мл: жидкая субстанция, содержащая рекомбинантный эндолизин бактериофага ECD7, относящийся к классу пептидаз, с индивидуальной концентрацией 20 мг/мл - 50 мл; Natrosol 250 ННХ (гидроксиэтилцеллюлоза) - 1,0 г; ПЭГ 1500-1,5 г; 20 ммоль/л Трис-HCl буфер с рН 7,5-50 мл.
Способ изготовления геля заключается в следующем: в отвешенное и отмеренное количество Natrosol 250 ННХ и ПЭГ добавляют 20 мМ Трис-HCl (pH=7,5), предварительно термостатированный в течение 2 часов при температуре +50°С, термостатируют при температуре +50°С в течение 15 минут. Тщательно перемешивают. Полученную основу для геля стерилизуют при температуре +120°С в течение 12 мин. В простерилизованную основу для геля вводят эндолизин в виде концентрированного раствора с концентрацией 20 мг/мл. Тщательно перемешивают.
Пример 2
Спрей для местного лечения и профилактики послеоперационных гнойно-септических осложнений (ИСМП).
Состав спрея на 100 мл: жидкая субстанция, содержащая рекомбинантный эндолизин бактериофага ECD7, относящийся к классу пептидаз, с индивидуальной концентрацией 1 мг/мл - 15 мл; жидкая субстанция, содержащая рекомбинантный эндолизин бактериофага Am24, относящийся к классу мурамидаз, с индивидуальной концентрацией 1 мг/мл - 15 мл; Kolliphor Р 338 (Полоксамер 338) - 1,0 г; ПЭГ 1500 - 1,0 г; 20 ммоль/л Трис-HCl буфер с рН 7,5-70 мл.
Способ изготовления спрея заключается в следующем: в отвешенное и отмеренное количество полоксамера и ПЭГ добавляют 20 мМ Трис-HCl (рН=7,5), предварительно термостатированный в течение 2 часов при температуре +50°С, термостатируют при температуре +50°С в течение 15 минут. Тщательно перемешивают. Полученную основу для спреев стерилизуют при температуре +120°С в течение 15 мин. В простерилизованную основу для спрея вводят эндолизин в виде концентрированного раствора с концентрацией 1 мг/мл. Тщательно перемешивают.
Пример 3
Гель для лечения и профилактики раневых инфекций (внебольничных).
Состав геля на 100 мл: жидкая субстанция, содержащая рекомбинантный эндолизин бактериофага ECD7, относящийся к классу пептидаз, с индивидуальной концентрацией 1 мг/мл - 10 мл; жидкая субстанция, содержащая рекомбинантный эндолизин бактериофага Am24, относящийся к классу мурамидаз, с индивидуальной концентрацией 1 мг/мл
- 10 мл; жидкая субстанция, содержащая рекомбинантный эндолизин бактериофага Ар22, относящийся к классу мурамидаз, с индивидуальной концентрацией 1 мг/мл - 10 мл; Natrosol 250 ННХ (гидроксиэтилцеллюлоза) -1,0 г; ПЭГ 1500 - 1,5 г; 20 ммоль/л Трис-HCl буфер с рН 7,5-70 мл.
Пример 4. Способ изготовления геля заключается в следующем: В отвешенное и отмеренное количество Natrosol 250 ННХ и ПЭГ добавляют 20 мМ Трис-HCl (рН=7,5), предварительно термостатированный в течение 2 часов при температуре +50°С, термостатируют при температуре +50°С в течение 15 минут. Тщательно перемешивают. Полученную основу для геля стерилизуют при температуре +120°С в течение 12 мин. В простерилизованную основу для геля вводят эндолизины в виде концентрированных растворов с концентрацией 1 мг/мл. Тщательно перемешивают.
Пример 5
Спрей для лечения и профилактики раневых инфекций (внебольничных).
Состав спрея на 100 мл: жидкая субстанция, содержащая рекомбинантный эндолизин бактериофага ECD7, относящийся к классу пептидаз, с индивидуальной концентрацией 1 мг/мл - 10 мл; жидкая субстанция, содержащая рекомбинантный эндолизин бактериофага Am24, относящийся к классу мурамидаз, с индивидуальной концентрацией 1 мг/мл - 10 мл; жидкая субстанция, содержащая рекомбинантный эндолизин бактериофага Ар22, относящийся к классу мурамидаз, с индивидуальной концентрацией 1 мг/мл - 10 мл; Kolliphor Р 407 (Полоксамер 407) - 1,0 г; ПЭГ 1500-1,0 г; 20 ммоль/л Трис-HCl буфер с рН 7,5-70 мл.
Пример 6
Способ изготовления спрея заключается в следующем: в отвешенное и отмеренное количество полоксамера и ПЭГ добавляют 20 мМ Трис-HCl (рН=7,5), предварительно термостатированный в течение 2 часов при температуре +50°С, термостатируют при температуре +50°С в течение 15 минут. Тщательно перемешивают. Полученную основу для спреев стерилизуют при температуре +120°С в течение 15 мин. В простерилизованную основу для спрея вводят эндолизины в виде концентрированных растворов с концентрацией 1 мг/мл. Тщательно перемешивают.
В результате проведенного исследования нами заявлено получение лекарственных форм рекомбинантных эндолизинов, относящихся к пептидогликангидролазам, принадлежащим к различным классам гидролаз, в виде геля и спрея. В оптимальных по технологии и физическим показателям (определенным в ГФ) заявляемых составах, содержащих один или более рекомбинантных эндолизинов, относящихся к классам мурамидаз и пептидаз, минимальная индивидуальная концентрация эндолизинов в ЛФ составляет 100-10000 мкг/мл.