Полипептиды актиний, их взаимодействие с биологическими мишенями

Вестник ДВО РАН. 2014. № 1

УДК 577.112+577.122

М.М. МОНАСТЫРНАЯ, Е.В. ЛЕЙЧЕНКО, И.Н. ГЛАДКИХ, Е.А. ЗЕЛЕПУГА, В.М. ТАБАКМАХЕР, О.В. СИНЦОВА, Р.С. КАЛИНА, А.Н. КВЕТКИНА, Э.П. КОЗЛОВСКАЯ

Полипептиды актиний, их взаимодействие с биологическими мишенями

Приводятся краткие сведения о результатах изучения биологически активных полипептидов, продуцируемых ядовитыми морскими кишечнополостными актиниями: анемонотоксинов, пептидных APETx2-подобных и пороформирующих токсинов, полипептидов Кунитц-типа. Описывается их взаимодействие с биологическими мишенями.

Ключевые слова: актиния, анемонотоксины, актинопорины, APETx2-подобные токсины, ингибиторы Ку-нитц-типа, ионные каналы, цитоплазматические мембраны, сериновые протеиназы.

Sea anemone polypeptides, interaction with biological targets. M.M. MONASTYRNAYA, E.V. LEYCHENKO, I.N. GLADKIKH, E.A. ZELEPUGA, V.M. TABAKMAKHER, O.V. SINTSOVA, P.S. KALINA, A.N. KVETKINA, E.P. KOZLOVSKAYA (G.B. Elyakov Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

The results of the study of biologically active polypeptides produced by certain poisonous marine cnidarians, sea anemones: anemonotoxins, APETx2-like peptide toxins, pore-forming toxins, Kunitz-type polypeptides, as well as of their interaction with biological targets are presented in this paper.

Key words: sea anemone, anemonotoxins, actinoporns, APETx2-like toxins, Kunitz-type inhibitors, ion channels, cytoplasmic membranes, serine proteinases.

На протяжении последних 30 лет основным объектом исследований лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН являются биологически активные полипептиды, продуцируемые ядовитыми морскими гидробионтами актиниями (тип Coelenterata, класс Anthozoa). Эти ядовитые организмы, изучение которых началось в начале прошлого столетия, представлены сегодня несколькими десятками видов, обитающих преимущественно в тропических и субтропических регионах Мирового океана [57].

Актинии - это сидячие животные, прикрепляющиеся к твердому грунту. Для охоты и/или защиты от хищников они используют специализированные жалящие органеллы не-матоцисты, локализованные в клетках щупалец, которые имеют сложную анатомическую структуру, позволяющую впрыскивать ядовитый секрет в тело проплывающего мимо организма-мишени. Продуцируемые актиниями яды представляют собой сложные смеси биологически активных соединений, среди которых для исследователей наибольший интерес представляют нейротоксины, пороформирующие токсины (актинопорины), а также ингибиторы протеиназ. Эти белковые токсичные компоненты ядовитого секрета работают в синергизме и выполняют важную роль в морском биоценозе. Являясь уникальными по

*МОНАСТЫРНАЯ Маргарита Михайловна - доктор химических наук, ведущий научный сотрудник, ЛЕЙЧЕНКО Елена Владимировна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник, ГЛАДКИХ Ирина Николаевна - кандидат химических наук, старший научный сотрудник, ЗЕЛЕПУГА Елена Александровна - кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник, ТАБАКМАХЕР Валентин Михайлович - младший научный сотрудник, СИНЦОВА Оксана Владимировна - аспирант, КОЗЛОВСКАЯ Эмма Павловна - доктор химических наук, заведующая лабораторией (Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН, Владивосток), КАЛИНА Римма Сергеевна - студентка, КВЕТКИНА Александра Николаевна - студентка (Дальневосточный федеральный университет, Владивосток). *E-mail: rita1950@mail.ru

Работа выполнена при финансовой поддержке программы ДВО РАН «Дальний Восток» (проект № 14-Ш-В-05-102).

специфичности и эффективности действия молекулами, они способны влиять на различные физиологические процессы в организме жертвы или потенциального хищника [57].

В 1980 г. в рамках государственной программы «Нервный импульс» в лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН было начато изучение структуры и механизма действия анемонотоксинов - потенциальных молекулярных инструментов исследования процессов, связанных с передачей нервных импульсов. К этому времени уже было установлено, что в процессах восприятия, обработки и передачи сигналов по нервам, а также других стимулов основную роль играет перенос ионов (Na+, K+, Са2+, С1-) потенциалчувствитель-ными ионными каналами - сложными белковыми структурами, пронизывающими электровозбудимые мембраны нервных и мышечных клеток, которые специфически активируются деполяризацией клеточной мембраны. Были открыты натриевые (Navs), калиевые (Ks), кальциевые (Cavs) каналы (каждое семейство каналов имеет ряд изоформ, разных у биологических видов и в разных частях нервной системы); разработаны электрофизиологические методы изучения проходящих через них токов (проводимости каналов); установлена аминокислотная последовательность Na -канала [51], предложена гипотетическая модель 3Б-структуры натриевого канала (кристаллическая структура канала Na Ab бактерии Arcobacter butzleri впервые была установлена лишь в 2011 г. [52]), что позволило получить представление о том, как работают Na -каналы. В огромной степени этому способствовало изучение структуры и функции природных токсинов, в том числе пептидной и полипептидной природы, обнаруженных в ядах пресмыкающихся, членистоногих, морских моллюсков (конусов), актиний [45]. Было показано, что модификация ионных каналов белковыми токсинами изменяет их функциональную активность и что одним их богатейших и перспективных источников таких токсинов являются актинии.

В результате 30-летних исследований в лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН были найдены новые источники биологически активных полипептидов среди актиний, выделено несколько десятков новых полипептидов, установлена структура и биологическая активность большинства из них, изучена нуклеотидная последовательность кодирующих их генов, проведен биоинформационный и структурно-функциональный анализ полипептидов с целью дальнейшего конструирования новых потенциальных фармакологических препаратов направленного действия.

1. Нейротоксины Radianthus

1.1. Анемонотоксины структурного типа 2

Во время 11-й и 12-й морских экспедиций НИС «Профессор Богоров» в Индийский океан (1979-1981 гг.) обнаружено несколько видов актиний, проявляющих высокую токсичность для млекопитающих. Один из наиболее широко распространенных в тропиках видов актиний, Radianthus macrodactylus (современное название Heteractis crispa), был собран в количествах, позволивших в дальнейшем провести широкомасштабное исследование структуры и функций биологически активных полипептидов, продуцируемых этим видом.

Методами гидрофобной хроматографии на полихроме-1, ионообменной хроматографии на Bio-Rex 70 и SP-Sephadex C-25, обращенно-фазовой ВЭЖХ на Silasorb C18 выделено в индивидуальном состоянии пять высокотоксичных анемонотоксинов RTX-I - RTX-V (молекулярная масса около 5 кДа). Значения летальных доз токсинов для млекопитающих варьировали от 3000 (RTX-I) до 40 и 25 мкг/кг (RTX-IV и RTX-III, соответственно).

Методами структурной химии белка были установлены аминокислотные последовательности пяти анемонотоксинов RTX-I - RTX-V [4-6, 8] (рис. 1).

Впервые было показано, что нейротоксины Radianthus принадлежат к новому 2-му типу так называемых длинных анемонотоксинов, имеющих общий анцестральный ген, значительно дивергировавший в ходе эволюции [45], проявляют высокую специфичность

Рис. 1. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей анемонотоксинов 1-го и 2-го структурных типов ATX-II и ATX-V (Swiss-Prot, P01528.1, P01529.1) из Anemonia sulcata, AP-A и AP-B (Swiss-Prot, P01530.1, P01531.1) из Anthopleura xanthogrammica, AP-C (Swiss-Prot, P01532.1) из Anthopleura elegantissima, RTX-I - RTX-V из Heteractis crispa, Sh-I (Swiss-Prot, P19651.1) из Stichodactyla helianthus, Rp-II (Swiss-Prot, P01534.1) из Radianthus paumotensis. На сером фоне показаны идентичные аминокислотные остатки в последовательностях анемонотоксинов 1-го и 2-го структурных типов

связывания с Nay-каналами электровозбудимых мембран. Большинство анемонотоксинов структурного типа 1 (из актиний семейства Actiniidae) содержит 47 аминокислотных остатков (а.о.) [34], в то время как анемонотоксины 2-го типа (из актиний семейства Sti-chodactylidae) - 48 а.о. Представители обоих типов имеют одинаковое расположение трех дисульфидных связей (рис. 2 А, см. вклейку) [6].

Как видно из рис. 1, высокая степень гомологии (до 98 %) аминокислотных последовательностей наблюдается в пределах каждого типа нейротоксинов, в то время как между представителями разных типов она не превышает 40 %. Характерная особенность анемонотоксинов 2-го структурного типа - отсутствие одного N-концевого остатка и наличие 3-4 основных С-концевых остатков. В последовательностях анемонотоксинов этого типа содержится больше заряженных и ароматических остатков, что обусловливает их большее сродство к своим мишеням - NaV-каналам различных типов.

В сотрудничестве с австралийским ученым Р. Нортоном методом спектроскопии ЯМР Н1 впервые была определена пространственная структура самого токсичного анемоноток-сина RTX-III [39]. Установлено, что вторичная структура анемонотоксинов актиний представляет собой уникальный жесткий ßßßß-фолд, обнаруженный только у этих соединений (рис. 2Б, В). Считается, что именно эта структура обеспечивает высокую конформацион-ную стабильность, рН- и термоустойчивость анемонотоксинов актиний.

Первое систематическое исследование структурно-функциональных взаимоотношений анемонотоксинов 2-го типа было проведено с наиболее токсичным представителем нейротоксинов Radianthus - RTX-III. В экспериментах использовали химическую модификацию аминогрупп Lys и Arg, N-концевого глицина, карбоксильных групп восьми заряженных а. о., включая С-концевой лизин, а также остатков триптофана и сульфгидрильных групп [15-17]. Полученные данные позволили установить отсутствие в последовательности RTX-III остатка, абсолютно необходимого для функциональной активности полипептида. Это не противоречит классической концепции взаимодействия активного центра молекулы анемонотоксина (с остатком аргинина13 в качестве центра связывания) с №+-каналом [33]. Было показано, что разрушение дисульфидных связей приводит к полному падению активности RTX-III, связанному с изменением пространственной структуры, а для проявления функциональной активности анемонотоксина важно наличие про-тонированных карбоксильных и аминогрупп. Результаты изменения активности RTX-III после модификации заряженных а.о. молекулы свидетельствовали о том, что его взаимодействие с потенциалчувствительным №+-каналом в большой степени определяется электростатическими силами и носит многоточечный характер, при котором блокирование

одних функционально важных остатков не мешает токсину связываться с каналом другими функционально значимыми остатками [16, 17].

Согласно данным электрофизиологических исследований, RTX-III замедляет фазу ре-поляризации потенциала действия мышечных и нервных волокон и таким образом инги-бирует процесс инактивации Nay-каналов [2]. При этом, как было показано позднее [47], анемонотоксин взаимодействует с сайтом-3 канала, аминокислотные остатки которого локализованы на наружной поверхности Nay-канала и не принадлежат его воротному механизму, который локализован во внутриклеточном сегменте поры и отвечает за инактивацию канала. Таким образом, показано, что эффект замедления кинетики инактивации Nay-канала токсином RTX-III (рис. 2Г) обусловлен аллостерическим взаимодействием аминокислотных остатков полипептида и канала [23], что недавно подтверждено расчетными данными, показавшими появление межмолекулярных гидрофобных контактов, стабилизирующих образующийся белок-белковый комплекс RTX-III-Nay-канал. Визуализацию значительных гидрофобных областей на поверхности молекулы RTX-III отражает рис. 2В.

1.2. АРЕТх2-подобные токсины

Из этанольного экстракта нематоцистов H. crispa методами многостадийной жидкостной хроматографии выделен пептидный токсин (рис. 3), названный n-AnmTX Hcr 1b-1 [13]. Токсин проявлял высокую летальность на крабах и умеренную - на млекопитающих. Его молекулярная масса составила, согласно данным МАЛДИ ТОФ МС спектрометрии, 4537 Да.

Рис. 3. Профиль элюции токсина п-AnmTX Hcr 1b-1 на различных стадиях выделения: А - на полихроме-1, Б -на Cellulose CM-32, В - на Biogel P-6, Г - на BioRex 70, Д - ВЭЖХ на колонке Jupiter C5, Е - ВЭЖХ на колонке Vydac C18

Аминокислотная последовательность, состоящая из 39 N-концевых аминокислотных остатков, была установлена деградацией полипептидной цепи по методу Эдмана, а два оставшихся C-концевых остатка были определены с помощью МАЛДИ масс-спектроме-трического анализа пептида, частично фрагментированного экзопротеиназой CPY. Таким образом, токсин п-AnmTX Hcr 1b-1 состоит из 41 аминокислотного остатка: GTPCKCHGYIGVYWFMLAGCPNGYGYNLSCPYFLGICCVDR. Поиск гомологов токсина из других видов актиний с помощью алгоритма BLAST показал, что п-AnmTX Hcr 1b-1 относится к группе APETx2-подобных пептидов-гомологов актиний, таких как APETx2 из Anthopleura elegantissima, представляющих собой токсин-модулятор протончувствительного натриевого канала ASIC3, APETx1 из A. elegantissima - токсин-модулятор Ку11.1-канала (HERG), BcIV и BcV из Bunadasoma caissarum - селективные ингибиторы калиевых каналов Kv31 и Kv3 BgK - ингибитор калиевых каналов KVj р KVj 2, KVj 3 (Shaker-типа), BсgII и BсgIII из Bunadasoma cangicum -токсины с неизвестными мишенями. Несмотря на умеренную гомологию аминокислотных последовательностей, все APETx2-подобные токсины имеют общие структурные мотивы (рис. 4).

ТГ-AnmTX НСГ lb-1 GTPCKCHGYIGVYWFMLAG-CPNGYGYNLSCPYFLGICCVDR

Вед III 31.

APETxl

APETx2

Neurotoxin

Beg III 28,

Beg III 29,

BcV

16

78 21

GT,

YWEl

IGYB

GTTCYCGSTLGIYWFAVSS-CPSGRGYTGHCGYFLGLCC... 48.8% GTTCYCGKTIGIYWFGTKT-CPSNRGYTGSCGYFLGICCYPVD 53.7%

|SCRYFLG|CCBP^D 48.8% " 48.8% 48.8%

GVSCKCGSKKGVYWFGQITGCPGGHGYKGSCSYVLG... 46.3%

GTTCKCGSTLGIYWFAVTS-CPPGRGYTTHCGYF... 41.5%

BCIV GLPCDCHGHTGTYWLNYYSKCPKGYGYTGRCRYLVGSCCYK

GVPCKCGSKKGVYWFGQITGCPGGHGYKGSCNYLLGK.

Рис. 4. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей АРЕТх2-подобных пептидных токсинов: п-AnmTX Hcr 1b-1 из H. crispa, Bcg III 31.16, Bcg III 28.78 и Bcg III 29.21 из B. cangicum (P86461, P86462 и P86464); BcV из B. caissarum (P84919 и P86470); APETx1 - токсин-модулятор Ку11.1-канала (HERG) (P61541) и APETx2 - токсин-модулятор ASIC3 канала (P61542) из A. elegantissima. Выделены несовпадающие с последовательностью п-AnmTX Hcr 1b-1 а.о. Темно-серым цветом показаны различающиеся а.о. в последовательности функционально родственного полипептидного токсина APETx2. Подчеркнуты функционально значимые заряженные а.о. п-AnmTX Hcr 1b-1 и APETx2

Установлено, что токсин п-AnmTX Hcr 1b-1 имеет с APETx2 не только структурное, но и функциональное подобие: оба токсина оказывают ингибирующее действие на каналы ASIC3, экспрессированные в ооцитах лягушки Xenopus laevis. Показано, что при аппликации пептида и изменении рН среды проходящий через каналы ток значительно уменьшается (рис. 5А) [13]. Однако измеренная ингибирующая активность п-AnmTX Hcr 1b-1 (IC50 5,5 ± 1,0 мкМ) оказалась ниже, чем активность токсина APETx2, которая зависела также и от субъединичного состава протончувствительного канала (IC50 колебалась от 63 нМ для гомомерного ASIC3-канала до 2 мкМ для гетеромерных ASIC1a-ASIC3-каналов). Испытание анальгетической активности п-AnmTX Hcr 1b-1 на «кислотной» модели in vivo показало, что препарат токсина (в дозе 12,5 мкг/100 мкл физраствора) снижает порог болевой чувствительности экспериментальных животных. Интересно, что п-AnmTX Hcr 1b-1 показывает анальгетический эффект, сравнимый с действием анальгина (рис. 5В), при этом его эффективная доза была в 80 раз ниже [19].

Более низкую ингибирующую активность токсина п-AnmTX Hcr 1b-1 можно объяснить отсутствием в его структуре заряженных аминокислотных остатков (рис. 4), имеющихся у APETx2, которые, согласно методу компьютерного моделирования, функционально значимы для связывания с различными субъединицами ASICs каналов. Информация о структуре и функции нового представителя пептидных APETx2-подобных токсинов актиний может иметь важное значение для поиска новых типов ASICs каналов, их сравнительного

А рН 4 0 Токсин 40 MiW В

;с}. нм

Рис. 5. Измерение ингибирующей (анальгетической) активности п-AnmTX Hcr 1b-1. А — записи токов через мембрану с экспрессированными ASIC3 каналами человека, вызванных изменением рН буфера до значения 4,0. Б - кривая изменения величины пикового компонента тока по сравнению с контролем от концентрации токсина (по результатам 3 независимых измерений). Непрерывная линия - аппроксимационная кривая при свободном значении коэффициента Хилла (nHill), равном 0,74 ± 0,09, прерывистая - при nHill = 1. В - анальгетический эффект п-AnmTX Hcr 1b-1 («кислотная» модель). Ось абсцисс - количество корчей у животного за 15-минутный период времени с момента инъекции раствора уксусной кислоты. Ось ординат: 1 - контрольная группа животных с предварительной инъекцией анальгина; 2 - контрольная группа животных, инъецированных 1%-м раствором кислоты; 3 - экспериментальная группа животных, инъецированных 1%-м раствором кислоты после предварительной инъекции п-AnmTX Hcr 1b-1; 4 - контрольная группа животных, инъецированных равным объемом физраствора. Результаты, обработанные по правилам вариационной статистики, представлены как средние значения, полученные из 6 независимых экспериментов ± среднеквадратичное отклонение. Достоверность различий вычислена t-критерием Стьюдента, достоверным считается значение при p < 0,05

исследования, а также установления топографии активных центров связывания с пептидными лигандами.

Проведенные нами исследования нейротоксинов Radianthus (Heteractis) внесли значительный вклад в токсинологию. В настоящее время редкая публикация, посвященная нейротоксинам ядовитых морских кишечнополостных, не цитирует данные по их структурно-функциональным взаимоотношениям, полученные в лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН. Поскольку упомянутые выше токсины H. crispa оказались эффективными модификаторами некоторых типов и подтипов ионных Nay-каналов (дисфункции которых связаны с рядом серьезных заболеваний - каналопатий), можно считать их базисными структурами для создания in silico «дизайнерских» молекул с желаемой селективностью и видоспецифичностью, которые, будучи полученными генно-инженерными методами, помогут создать на их основе потенциальные лекарства, способные направленно регулировать активность этих каналов.

2. а-Пороформирующие токсины

К настоящему времени из 40 видов актиний выделено и охарактеризовано немногим более двух десятков индивидуальных актинопоринов, которые принадлежат к семейству а-пороформирующих токсинов (а-ПФТ) [30]. Литическое действие а-ПФТ связано с их способностью формировать поры в цитоплазматических мембранах эукари-

от, содержащих сфингомиелин, что обусловливает многие фармакологические эффекты данных полипептидов [57].

Методами гидрофобной хроматографии (полихром-1), гель-фильтрации (акрилекс П-4), ионообменной хроматографии (Cellulose CM-32), ионообменной и обращенно-фазовой HPLC (Ultropac TSK CM-3SW и Silasorb C , соответственно) из актинии H. crispa нами выделено четыре индивидуальных актинопорина - RTX-A, RTX-G, RTX-S, RTX-SII (17-19 кДа) [44, 49]), из Oulactis orientalis - два актинопорина - Or-A и Or-G (17 кДа) [10]), а также два низкомолекулярных цитолизина - RmI и RmII (6 кДа) [9]. Было установлено, что цитолитическая активность RTX-A, -G, -S и -SII на 2-3 порядка выше активности низкомолекулярных цитолизинов [48]. Гемолитическая активность высокомолекулярных актинопоринов Heteractis (1,0 X 104-5,0 X 104 ГЕ/мг) и актинопоринов Oulactis (3,2 X 103, 3,3 X 103 ГЕ/мг) ингибируется экзогенным сфингомиелином, активность низкомолекулярных цитолизинов (1,0 X 103, 1, 3 X 103 ГЕ/мг) - фосфатидилхолином [9].

Аминокислотная последовательность нативных актинопоринов RTX-A, RTX-SII, Or-A и Or-G (рис. 6) была установлена сочетанием методов структурной химии белка и молекулярной биологии [11, 41, 44]. Последовательности актинопоринов Heteractis и Oulactis, а также всех известных на сегодняшний день представителей семейства a-ПФТ актиний имеют высокую степень структурной гомологии [48]. Интересной структурной особенностью актинопоринов Or-A и Or-G являются укороченные N-концевые фрагменты.

Ог-В RTX-A RrX-SII Eqtll

Or-G RTX-A RTX-SII Eqtll

Рис. 6. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей Or-A, Or-G (Swiss-Prot, Q5I4B8, Q5I2B1) из O. orientalis; RTX-A, RTX-SII (Swiss-Prot, P58691, P0C1F8.1) из H. crispa; EqtlI (код Genbank, P17723) из Actinia equina. На сером фоне показаны идентичные а.о. Выравнивание выполнено с помощью программы CLUSTALW

Методами молекулярной биологии с применением прямых и вырожденных праймеров и техники быстрой амплификации кДНК концов (3\ 5,-RACE) установлены нуклеотид-ные последовательности генов, кодирующих 25 высокогомологичных изоформ актинопоринов Heteractis с N-концевым остатком Ser (рис. 7), принадлежащих к мультигенному семейству Hct-S [26, 27], которые образуют комбинаторную библиотеку а-ПФТ актинии H. crispa. Степень идентичности структур новых представителей актинопоринов и ранее выделенных нативных изоформ RTX-A и RTX-SII составляет от 89 до 99 %.

Согласно модели пространственной 3Б-струкгуры актинопорина RTX-A, построенной методами гомологичного моделирования, пространственная форма полипептидной цепи молекулы состоит из двенадцати антипараллельных р-тяжей и представляет собой р-сэнд-вичевую структуру с двумя короткими а-спиралями (рис. 8 А, см. вклейку). N-концевая а-спираль (16-25 а.о.) принадлежит амфифильному фрагменту (1-28 а.о.), который соединен с белковым p-кором подвижной и высокозаряженной петлей SRK/KRK, С-концевая а-спираль - высококонсервативному ароматическому кластеру

104-FSVPYD YNWYSNWWNVRIYKGKRRADQRMYEEL YY-138, так называемому РОС-сайту связывания [46], а.о. которого (согласно расчетным данным -это тирозины 113, 133, 137, 138, а также аргинин 53) участвуют на первом этапе порообразования в связывании с мембранным интерфейсом за счет возникновения прочных

Рис. 7. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей актинопоринов семейства Нй-З. Выделены функционально значимые фрагменты последовательностей, М-концевой

водородных связей, ионного и от одного до трех С-Н...п-взаимодействий с фосфорилхо-линовыми головками мембранного сфингомиелина (СМ) и/или фосфатидилхолина (ФХ) (рис. 8Б, см. вклейку) [50].

Вслед за этим происходят конформационные перестройки М-концевого фрагмента (рис. 8В), затрагивающие петлю ЗЯК/КИК, которая, подобно шарниру, разворачивает его и переводит в водно-липидный интерфейс мембраны. Этот процесс сопровождается удлинением а-спирали и завершается ее включением в мембрану, где М-концевые фрагменты четырех молекул формируют функциональную пору (рис. 8Г) [46].

Для актинопоринов мультигенного семейства Нй-8 характерна высокая консервативность остатков, входящих в РОС-сайт связывания, а также ряд замен а.о. в области функционально значимого М-концевого фрагмента молекул (рис. 7), определяющего величину их пороформирующей активности. Во всех последовательностях актинопоринов Ие(егасШ' присутствует трипептид 143А^в1уА8р145, так называемый ЯвО-мотив, который, как известно, является сайтом связывания ряда внеклеточных адгезивных белков с мембранными рецепторами, интегринами [55].

Нами показано, что оплодотворенные яйцеклетки морского ежа Б^оп^1осеп1гои ШеттесИш, в мембранах которых отсутствует сфингомиелин, устойчивы к действию ЯТХ-А, в то время как незрелые яйцеклетки после прединкубации с актинопорином не

способны к оплодотворению [48, 50]. Ранее методом дифференциальной сканирующей калориметрии было установлено, что действие ЯТХ-А на эритроцитарную мембрану вызывает реорганизацию ряда мембранных белков и вымывание из мембраны актина - одного из основных белков цитоскелета [53], который, как известно [35], прочно связан с мембранными интегринами. Полученные нами данные свидетельствуют о способности ЯвО-мотива актинопорина взаимодействовать с внеклеточным доменом интегрина, что приводит к разрыву связи интегрин-актин, а в случае неоплодотворенной яйцеклетки - к ее неспособности взаимодействовать со сперматозоидом. Показано, что процесс оплодотворения запускается связыванием ЯвО-мотива поверхностных белков головки сперматозоида с сайтом связывания интегрина, локализованным между его внеклеточными а- и Р-субъединицами [58], что инициирует дальнейшую дифференцировку и развитие яйцеклетки (рис. 9).

Рис. 9. Взаимодействие актинопорина ЯТХ-А и спермиев морского ежа & ШегшесИш с яйцеклетками ежа. А -схема процесса оплодотворения яйцеклетки. Б - действие ЯТХ-А на оплодотворенную яйцеклетку. В - действие ЯТХ-А на неоплодотворенную яйцеклетку, ингибирующее процесс оплодотворения [50]

Изучено противоопухолевое действие ЯТХ-А по отношению к опухолевым клеткам линий ИеЬа, ТНР-1, МОА-МБ-231 и 8МИ-С4 [36], мембраны которых, как известно, содержат интегрины. Обнаруженный нами эффект можно объяснить не только пороформирую-щим действием актинопорина, но и сопровождающим его белок-белковым взаимодействием полипептида с этими мембранными рецепторами. Это согласуется с литературными данными, свидетельствующими об антиопухолевой активности ЯвО-содержащих пептидов и полипептидов, специфически взаимодействующих с мембранными интегринами опухолевых клеток [43].

Нами исследован также механизм мембранолитического действия актинопоринов на биологические (эритроциты млекопитающих, яйцеклетки морского ежа) и модельные мембраны (липосомы и бислойные липидные мембраны различного липидного состава). Показано, что актинопорины формируют в мембранах ионные каналы - поры диаметром около 1-2 нм (рис. 10), селективные для катионов [10, 14, 20].

К настоящему времени выполнена экспрессия и охарактеризованы рекомбинантные актинопорины гИе1-83, гИе1-85 и гИс1-86 [26, 27], гемолитическая активность которых составляет 1,0 X 10-3, 1,0 X 10-3 и 3,3 X 10-4 ГЕ/мг белка, соответственно.

Данные о первичной структуре актинопоринов Ие(егас^А' и результаты, полученные при их биохимических и биофизических исследованиях, позволили высказать гипотезу об

Рис. 10. Проводимость БЛМ, индуцированная актинопоринами H. crispa и O. orientalis. Запись тока через БЛМ: А - в присутствии RTX-A, Б - в присутствии Or-A и Or-G при мембранном потенциале 40 мВ

альтернативном взаимодействии актинопоринов (в отсутствие сфингомиелина в мембране) с интегринами, белковыми рецепторами мембран, что хорошо объясняет проявляемые ПФТ фармакологические эффекты (антиопухолевый, антипаразитарный, кардиотропный) [18]. Согласно литературным данным, актинопорины представляют собой привлекательный объект для конструирования и биотехнологического получения на их основе фармакологических агентов, которые способны проявлять антиопухолевое, антипаразитарное, антимикробное действие на клетки-мишени без повреждения здоровых клеток [32, 56].

3. Полифункциональные ингибиторы протеиназ семейства Кунитца

В последние годы проводимые в лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН интенсивные комплексные исследования полипептидов актиний нацелены главным образом на их прикладное использование в будущем. В частности, было установлено, что огромное количество полипептидов, продуцируемых актинией H. crispa, структурно гомологичны ингибиторам протеиназ семейства Кунитца. Оказалось, что некоторые из них способны модифицировать болевой ваниллоидный TRPV1 рецептор и потенциалзависи-мые калиевые каналы некоторых типов (KVs).

Комбинацией традиционных методов очистки белков (гидрофобная хроматография на полихроме 1, гель-фильтрация на биогеле P-4, ионообменная хроматография на SP-Sepha-dex G-25 и обращенно-фазовая ВЭЖХ на колонке Nucleosil C18) из актинии H. crispa нами выделены новые нативные полипептиды Jn-IV, InhVJ, HCPR1, HCPR2, APHC1, APHC2 и APHC3, из тропической актинии Heteractis magnifica - три новых ингибитора сериновых протеиназ (HMI1, HMI2 и HMI3). После алкилирования, трипсинолиза и секвенирования полученных пептидов по методу Эдмана была определена полная аминокислотная последовательность полипептидов Jn-IV [7], InhVJ [37], APHC1, APHC2, APHC3 [1, 12, 31] и частичная - полипептидов HCPR1, HCPR2 [22], HMI1, HMI2 и HMI3 [21] (рис. 11).

Полипептиды имеют от одной до нескольких точечных замен в аминокислотных последовательностях, и по высокой степени гомологии, консервативному расположению остатков цистеина, значениям молекулярных масс (около 6 кДа) и наличию трипсининги-бирующей активности они были отнесены к семейству ингибиторов сериновых протеиназ Кунитц-типа. Помимо трипсинингибирующей активности полипептиды APHC1, APHC2 и APHC3 проявляли анальгетическое действие в экспериментах in vivo [1, 12, 31].

Методом Диксона определены константы ингибирования сериновых протеиназ полипептидом InhVJ. Показано, что InhVJ является высокоспецифичным ингибитором, поскольку связывается только с двумя сериновыми протеиназами, трипсином (с K = 7,38 х 10-8 М) и а-химотрипсином (с K. = 9,93 х 10-7 М) [37].

Для выяснения молекулярного механизма взаимодействия InhVJ с сериновыми про-теиназами методами компьютерного моделирования

Jn-IV gsi с lepkwgp

InhVJ gsi lepkwgp

aphcl gsi f- lepkwgp

арнс2 gsi *** lepkwgp

арнсз gsi С lepkwgp

hcpr1 rgi sepkwgp

hcpr2 rgi lepkwgp

hmil gsi - lepkwgp

hmi2 gsi lepkwgp

hmi3 rgi lepkwgp

Р1

TAYFPRFYFDSETGK|TPFIYG'

TAYFPRFYFDSETGKCTPFIYG

TñYFPRFYFDSETGKlTVFIYG'

TAYFRRFYFDSETGKCTPFIYGi

TAYFPRFYFNSETGKlTPFIYG'

KñjSLRRFYYDSETGEBLPF

KARIRRFYYDSETGKy

KAGIRRFYFDSET

TAYFPRFYFDS

karirrfyydsetgk|tpfiyg

|egnsyvdeklha|rai|ra e gngnnfet lhaIraiIra e gngnnfet lraIraiIra e gngnnfet lraIraiIra |e gngnnfet lra|rgi |ra

Рис. 11. Множественное выравнивание полной аминокислотной последовательности полипептидов Jn-IV, InhVJ, APHC1, APHC2, APHC3 и частичной - HCPR1, HCPR2, HMI1, HMI2 и HMI3. На сером фоне показаны а.о. цистеина

и определены функционально значимые а.о. реакционного центра и сайта слабых взаимодействий молекулы InhVJ, принимающие участие в связывании.

Установлено, что в каноническом механизме взаимодействия InhVJ с трипсином и а-химотрипсином участвует также аминокислотный остаток Glu45, локализованный рядом с сайтом слабых взаимодействий, который вносит значительный отрицательный вклад в энергию комплексообразования и дополнительно стабилизирует образующийся комплекс. Анализ механизма взаимодействия, проведенный с помощью программы МОЕ, показал, что процесс комплексообразования управляется ван-дер-ваальсовыми, гидрофобными и электростатическими взаимодействиями, а комплекс стабилизируется водородными связями [37].

Методами молекулярной биологии при помощи техники быстрой амплификации кДНК концов (3\ 5'-RACE) с использованием прямых и обратных вырожденных прай-меров установлены нуклеотидные последовательности 33 генов, кодирующих высокогомологичные аминокислотные последовательности с N-концевым остатком глицина, которые представляют собой мультигенное семейство зрелых полипептидов Кунитц-типа, названных нами HCGS-полипептидами [28], которые так же, как и актинопорины семейства Hct-S, образуют комбинаторную библиотеку Кунитц-полипептидов актинии H. crispa (рис. 13).

Все выведенные аминокислотные последовательности имеют высокую степень гомологии (до 98 %) с последовательностями известных нативных ингибиторов сериновых про-теиназ Кунитц-типа как из H. crispa, так и из других видов актиний. Последовательность нативного полипептида InhVJ оказалась аналогична последовательности HCGS 1.27. Но, в отличие от большинства выведенных последовательностей (рис. 13), в P1 позиции реакционного центра молекул нативных ингибиторов InhVJ, Jn-IV, APHC1, APHC2 и APHC3 локализован остаток треонина. Для установления функциональной специализации представителей библиотеки был проведен структурно-функциональный и филогенетический анализ HCGS-полипептидов, а также всех известных ингибиторов Кунитц-типа из других видов актиний. Построено их NJ-филогенетическое дерево (рис. 14А, см. вклейку), методом гомологичного моделирования построены высокоточные модели пространственных структур, рассчитан молекулярный электростатический потенциал (МЭП) и построены эквипотенциальные поверхности, представляющие собой трехмерную визуализацию МЭП (рис. 14B), который является важной характеристикой белковой молекулы и определяет ее специфичность и кинетику молекулярного связывания с мишенью [42].

Как видно из рис. 14, последовательности нативных полипептидов APHC1, APHC2, APHC3, InhVJ, Jn-IV, образуют совместно с несколькими выведенными последовательностями отдельный кластер, названный нами анальгетическим. На основании проведенного

Рис. 13. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей HCGS-полипептидов актинии H. crispa. SHPI-I и SHPI-II - нативные ингибиторы Кунитц-типа из актинии Stihodactyla helianthus. Звездочками показано местоположение функционально значимых а.о. полипептидов, реактивного центра (12-17 а.о.), сайта слабых взаимодействий (33-38 а.о.) и а.о. в Р1 положении реактивного центра

структурно-функционального и филогенетического анализа высказано предположение, что все ИС08-полипептиды произошли от одного гена-предшественника и эволюционировали вследствие тандемной дупликации генов с последующей адаптивной дивергенцией Р1 остатка реактивного центра, которая привела к сохранению функциональной специализации одних и диверсификации других представителей комбинаторной библиотеки. Благодаря этому некоторые полипептиды анальгетического кластера стали полифункциональными и помимо ингибирующей активности по отношению к сериновым протеиназам приобрели способность оказывать блокирующее действие на болевой ТКРУ1-рецептор [42].

Для установления механизма взаимодействия входящих в состав комбинаторной библиотеки ИСв8-полипептидов с сериновыми протеиназами методами молекулярного докинга и биоинформационного анализа изучены теоретические 3Б-структуры комплексов ряда представителей комбинаторной библиотеки с трипсином, а-химотрипсином,

эластазой нейтрофилов человека (hnE) и катепсином G (CG) (рис. 15-17, см. вклейку) [25, 38, 59].

Так, для одного из полипептидов комбинаторной библиотеки (HCGS2.23) показано, что он образует устойчивые комплексы с трипсином (Kd порядка 10-12 М) не только с участием канонической петли, но и по альтернативному типу связывания, т.е. с участием концевой a-спирали молекулы полипептида (рис. 15) [38], при котором происходит экранирование области активного сайта, но нет непосредственного взаимодействия с каталитической триадой фермента. Данная стратегия обеспечивает еще большее расширение специфичности действия ингибиторов Кунитц-типа.

Следует отметить, что, несмотря на множество мишеней и разнообразие механизмов ингибирования, большинство ингибиторов протеиназ связывается именно с активным центром протеиназ. По-видимому, данная стратегия обеспечивает высокую эффективность ингибирования, поскольку родственные протеиназы имеют обычно высокую степень гомологии именно в области активного центра, и субстратоподобное взаимодействие обеспечивает возможность ингибирования целого ряда протеиназ, тем самым оказывая влияние на множество биологических процессов.

Расчетные данные, полученные при моделировании (молекулярный докинг) комплексов полипептидов APHC1-APHC3 из анальгетического кластера (рис. 14) [1, 12, 31] с болевым TRPV1 рецептором, показали, что во взаимодействие с этими полипептидами вступают две (или более) субъединицы рецептора (рис. 18) [3].

Анализ межмолекулярных контактов в предложенной модели пространственной структуры комплекса APHC1-TRPV1 позволил выявить функционально значимые для образования комплекса и модуляции ингибиторной активности анальгетических полипептидов аминокислотные остатки и структурные элементы: а.о. Thr14, Tyr16, Phe17, Val31, Glu38 и Arg/His48 (рис. 19, см. вклейку). Эти результаты коррелируют с ранее полученными данными в экспериментах in vivo [31]. Установлено, что помимо указанных аминокислотных остатков в образовании комплекса APHC1-TRPV1 принимают участие также Gly1, Glu6 и Arg51 [3].

На основании анализа полученной структурной модели комплекса APHC1-TRPV1 мы предложили гипотезу, объясняющую блокирующее действие анальгетического полипептида его связыванием с внутриклеточными доменами TRPV1, которое препятствует свободному открытию и закрытию рецептора, что приводит к увеличению времени его релаксации и ~35%-му ингибированию функциональной активности [3]. Это предположение не противоречит экспериментальным данным, которые свидетельствуют о медленном возрастании развития анальгетического эффекта под действием полипептида [1]. Таким образом, отдельные представители комбинаторной библиотеки H. crispa обладают противовоспалительным действием и могут стать перспективными моделями для разработки селективных противовоспалительных препаратов направленного действия.

Необходимо отметить, что помимо комбинаторной библиотеки HCGS-полипептидов у актинии H. crispa обнаружена также библиотека HCRG-полипептидов, насчитывающая 33 представителя Кунитц-полипептидов с N-концевым аргинином и лизином в положении Р1 реактивного сайта [28]. Они обладают, согласно расчетным и экспериментальным данным, более высокой, чем HCGS-полипептиды, трипсинингибирующей активностью. Методами молекулярной биологии получено также 6 аминокислотных последовательностей HCTX-полипептидов Кунитц-типа [28], токсичных по отношению к Ку-каналам, высокогомологичных нативному ингибитору калиевых каналов SHTX III из актинии Stichodactyla haddoni [40].

Поскольку HCGS-полипептиды анальгетической группы имеют очень высокую степень идентичности остатков в положениях, функционально значимых для взаимодействия с TRPV1 рецептором, можно предположить, что они также полифункциональны. Однако оказалось, что, в отличие от других представителей анальгетического кластера [37], поли-

Рис. 20. Записи токов: А - на различных типах каналов, Б - на TRPV1 рецепторе (конфигурация клетки «whole-cell») в электрофизиологическом исследовании ингибиторной активности InhVJ (10 мкМ) при проведении контрольных измерений токов, вызываемых модуляторами каналов, капсаицином CAP (2 мкМ) и капсазепином CZP (10 мкМ). Горизонтальной линией показан нулевой уровень токов, звездочками - стационарные токи после приложения 50 мкМ ингибитора. Отмечается отсутствие модулирующей активности при аппликации InhVJ [31]

пептид InhVJ не проявлял модулирующее действие при электрофизиологическом тестировании на TRPV1 рецепторе и Ку-каналах различных типов (рис. 20) [31].

С целью дальнейшего структурно-функционального исследования ингибиторов Ку-нитц-типа актинии H. crispa были получены рекомбинантные аналоги нативного полипептида InhVJ [29] и двух HCGS-полипептидов комбинаторной библиотеки: HCGS 1.10 и HCGS 1.36 [24, 54] - представителей анальгетического кластера филогенетического дерева (рис. 14), обеспечивающих, согласно расчетным данным, специфичность взаимодействия с сериновыми протеиназами и TRPV1 рецептором. С помощью МАЛДИ ТОФ МС спектрометрии была определена чистота и молекулярная масса рекомбинантов. Нативный InhVJ и его рекомбинантная форма совпали по хроматографической подвижности, значениям молекулярных масс (6117,23 Да) и констант ингибирования трипсина (0,73 х 10-9 М) [29]. Полученные данные свидетельствуют о функциональной активности rInhVJ. Определены Ki полипептидов rHCGS 1.10 и rHCGS 1.36, величины которых соответствуют Ki нативного InhVJ.

Таким образом, нашими многолетними исследованиями показано, что актиния H. crispa является богатым и перспективным источником новых разнообразных полипептидов. Продолжение этих исследований открывает большие перспективы обнаружения новых нейротоксинов и полифункциональных полипептидов Кунитц-типа. Разработанные методы получения рекомбинантных полипептидов Кунитц-типа актинии позволят использовать их в качестве инструмента исследования функциональной активности протеолитиче-ских ферментов, болевого TRPV1 рецептора, ионных Kv-каналов, а также разработки на их основе лекарственных препаратов нового поколения.

Авторы выражают благодарность бывшим сотрудникам лаборатории химии пептидов ТИБОХ ДВО РАН Т.А. Зыковой, Е.И. Вожжовой, В.М. Махнырю, Т.В. Швец, О.В. Апаликовой, Н.Н. Кофановой, А.Н. Филитову, С. А. Захарову, А.П. Ильиной, В.Е. Чаусовой, Е.С. Ткачевой, а также другим сотрудникам института: М.П. Исаевой,

Г.Н. Лихацкой, К.В. Гузеву, Т.И. Вакориной, С.Н. Федорову, С.А. Дышловому, О.В. Черникову, П.С. Дмитренку, С. А. Анастюку, О.Н. Кривошапко - за их значительный вклад в исследование полипептидов актиний.

ЛИТЕРАТУРА

1. Андреев Я.А., Козлов С.А., Козловская Э.П., Гришин Е.В. Анальгетическое действие пептидного ингибитора TRPVl-рецептора в моделях тепловой стимуляции боли // Докл. АН. 2009. Т. 424, № 5. С. 424-691.

2. Байдан Л.В., Козловская Э.П., Тишин С.М. Действие анемонотоксина на нервно-мышечную передачу в скелетных и гладких мышцах // Докл. АН СССР. 1981. Т. 259, № 4. С. 1000-1002.

3. Зелепуга Е.А., Табакмахер В.М., Чаусова В.Е., Монастырная М.М., Исаева М.П., Козловская Э.П. Взаимодействие полипептидов Кунитц-типа актинии Heteractis crispa с болевым ваниллоидным рецептором ТRPV1: in silico исследование // Биоорган. химия. 2012. T. 38, № 2. С. 185-198.

4. Зыкова Т. А., Козловская Э.П. Аминокислотная последовательность нейротоксина I из актинии Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. 1989. Т. 15, № 10. С. 1301-1306.

5. Зыкова Т.А., Винокуров Л.М., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность нейротоксина III из актинии Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. 1985. Т. 11, № 3. С. 302-310.

6. Зыкова Т.А., Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность нейротоксинов IV и V из актинии Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. 1988. Т. 14, № 11. С. 1489-1494.

7. Зыкова Т.А., Винокуров Л.М., Маркова Л.Ф. Козловская Э.П., Еляков Г.Б. Аминокислотная последовательность трипсинового ингибитора II из Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. 1985. T. 11, № 3. C. 293-301.

8. Зыкова Т. А., Козловская Э.П. Дисульфидные связи в нейротоксине III из актинии Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. 1989. Т. 15, № 7. С. 904-907.

9. Зыкова T.A., Монастырная M.M., Апаликова O.B., Швец Т.В., Козловская Э.П. Низкомолекулярные цитолизины и ингибиторы трипсина из актинии Radianthus macrodactylus. Выделение и частичная характеристика // Биоорган. химия. 1998. Т. 24. С. 509-516.

10. Ильина А.П., Монастырная М.М., Сокотун И.Н., Егоров Ц.А., Назаренко Ю.А., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П. Актинопорины из актинии Японского моря Oulactis orientalis: выделение и частичная характеристика // Биоорган. химия. 2005. Т. 31, № 1. С. 39-48.

11. Ильина А.П., Монастырная М.М., Исаева М.П., Гузев К.В., Рассказов В.А., Козловская Э.П. Первичная структура актинопоринов актинии Oulactis orientalis // Биоорган. химия. 2005. Т. 31, № 4. C. 357-362.

12. Козлов С.А., Андреев Я.А., Мурашев А.Н., Скобцов Д.И., Дьяченко И.А., Гришин Е.В. Новые полипептидные компоненты с анальгетической активностью из морской анемоны Heteractis crispa // Биоорган. химия. 2009. Т. 35, № 6. С. 789-798.

13. Козлов С.А., Осмаков Д.И., Андреев Я.А., Кошелев С.Г., Гладких И.Н., Монастырная М.М., Козловская Э.П., Гришин Е.В. Полипептидный токсин из морской анемоны, ингибирующий протончувствительный канал ASIC3 // Биоорган. химия. 2012. Т. 38, № 6. С. 653-659.

14. Козловская Э.П., Иванов А.С., Мольнар А.А., Григорьев П.А., Монастырная М.М., Халилов Э.М., Еляков Г.Б. Ионные каналы в мембранах, индуцированные гемолизином из актинии Radianthus macrodactylus // Докл. АН СССР. 1984. Т. 277, № 6. С. 1491-1493.

15. Махнырь В.М., Козловская Э.П. Модификация нейротоксина из актинии Radianthus macrodactylus уксусным ангидридом // Биоорган. химия. 1989. Т. 15, № 4. С. 465-470.

16. Махнырь В.М., Козловская Э.П. Модификация нейротоксина RTX-III из морской актинии Radianthus macrodactylus // Биоорган. химия. 1990. Т. 16, № 5. С. 643-648.

17. Махнырь B.M., Козловская Э.П. Необычный результат модификации анемонотоксина RTX-III малоновым альдегидом // Химия природ. соединений. 1989. № 3. С. 383-387.

18. Монастырная М. М. Мембраноактивные токсины актиний: характеристика, структура, механизм действия. Saarbrücken, Germany: Palmarium Acad. Publishing GmbH & Co, 2013. 310 c. - https://www.palmari-um-publishing.ru/extern/listprojects

19. Полипептид из морской анемоны Heteractis crispa, обладающий анальгетическим действием: пат. 2475497 Российская Федерация / Э.П. Козловская, М.М. Монастырная, И.Н. Гладких, В.М. Табакмахер, О.Н. Кривошапко, С.А. Козлов, Д.И. Осмаков, Я.А. Андреев, С.Г. Кошелев, Е.В. Гришин. ТИБОХ ДВО РАН; ИБХ РАН. Опубл. 20.02.2013, Бюл. № 5.

20. Руднев В.С., Лихацкая Г.Н., Козловская Э.П., Монастырная М.М., Еляков Г.Б. Влияние гемолизина из морской актинии Radianthus macrodactylus на проводимость липидных мембран // Биол. мембраны. 1984. Т. 1, № 10. С. 1019-1024.

21. Синцова О.В., Гладких И.Н., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Ингибитор семейства Кунитца из Heteractis magnifica, потенциальный блокатор болевого ваниллоидного рецептора (TRPV1) // Материалы V Междунар. науч.-практ. конф. «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», Санкт-Петербург, 14-15 ноября 2013 г. СПб.: Политехн. ун-т, 2013. С. 88-93.

22. Синцова О.В., Гладких И.Н., Лейченко Е.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Новые ингибиторы протеиназ Кунитц-типа из тропических актиний рода Heteractis // Материалы I Межрегион. молодежной школы-

конф. «Актуальные проблемы биологических наук», Владивосток, 13-18 мая 2013 г. Владивосток: Русский остров, 2013. С. 276-278.

23. Сорокина З.А., Чижмаков И.В., Еляков Г.Б., Козловская Э.П., Вожжова Е.И. Исследование механизма инактивации быстрых натриевых каналов с помощью нейротоксина из актинии Radianthus macrodactylus и различных химических реагентов // Физиол. журн. 1984. Т. 30, № 5. С. 571-579.

24. Табакмахер В.М., Зелепуга Е.А., Гладких И.Н., Синцова О.В., Монастырная М.М., Козловская Э.П. Анальгетические полипептиды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa: прогнозирование и получение новых представителей методами генной инженерии // Материалы конф. молодых ученых «Взгляд в будущее», Владивосток, 14 ноября 2013 г. Владивосток: ДВО РАН, 2013. С. 52-65.

25. Табакмахер В.М., Гладких И.Н., Монастырная М.М., Зелепуга Е.А. Теоретические пространственные модели молекулярного комплекса полипептида HCGS-2.23 из актинии Heteractis crispa с трипсином // Материалы Междунар. заочной науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы биологии, химии, физики», Новосибирск, 27 дек. 2011 г. Новосибирск: ЭКОР-книга, 2011. С. 107-114.

26. Ткачева Е.С. Гетерологичная экспрессия, выделение и очистка рекомбинантного белка Hct-A3 актинии Heteractis crispa // Материалы Междунар. заоч. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы биологии, химии, физики», Новосибирск, 27 дек. 2011 г. Новосибирск: ЭКОР-книга, 2011. С. 17-22.

27. Ткачева Е.С., Лейченко Е.В., Монастырная М.М., Исаева М.П., Зелепуга Е.А., Анастюк С.Д., Дмитре-нок П.С., Козловская Э.П. Новые актинопорины из актинии Heteractis crispa: клонирование и функциональная экспрессия // Биохимия. 2011. Т. 10. С. 1387-1397.

28. Чаусова В. Е. Полипептиды Кунитц-типа актинии Heteractis crispa: структура, функция и причины многообразия изоформ: дис. ... канд. хим. наук / Тихоокеан. ин-т биоорган. химии ДВО РАН. Владивосток, 2012. 128 с.

29. Чаусова В.Е., Табакмахер В.М. Функциональная экспрессия ингибитора сериновых протеиназ Кунитц-типа InhVJ из тропической актинии Heteractis crispa // Материалы Междунар. заочной научно-практ. конф. «Актуальные проблемы биологии, химии, физики», Новосибирск, 27 дек. 2011 г. Новосибирск: ЭКОР-книга, 2011. С. 49-53.

30. Anderluh G., Macek P. Cytolytic peptide and protein toxins from sea anemones (Anthozoa: Actiniaria) // Toxi-con. 2002. Vol. 40. P. 111-124.

31. Andreev Y.A., Kozlov S.A., Koshelev S.G., Ivanova E.A., Monastyrnaya M.M., Kozlovskaya E.P., Grishin E.V. Analgesic compound from sea anemone Heteractis crispa is the first polypeptide inhibitor of vanilloid receptor 1 (TRPV1) // J. Biol. Chem. 2008. Vol. 283, N 35. P. 23914-23921.

32. Avila A.D., Mateo de Acosta C., Lage A. A carcinoembryonic antigen-directed immunotoxin built by linking a monoclonal antibody to a hemolytic toxin // Int. J. Cancer. 1988. Vol. 42. P. 568-571.

33. Barhanin J., Hugues M., Schweitz H., Vincent J.-P., Lazdunski M. Structure-function relationships of sea anemone toxin II from Anemonia sulcata // J. Biol. Chem. 1981. Vol. 256, N 11. P. 5764-5769.

34. Bosmans F., Tytgat J. Sea anemone venom as a source of insecticidal peptides acting on voltage-gated Na+ channels // Toxicon. 2007. Vol. 49, N 4. P. 550-560.

35. Burke R.D., Murray G., Rise M., Wang D. Integrins on eggs: the beta C subunit is essential for formation of the cortical actin cytoskeleton in sea urchin eggs // Develop. Biol. 2004. Vol. 265, N 1. P. 53-60.

36. Fedorov S.N., Dyshlovoy S.F., Monastyrnaya M.M., Shubina L.K., Leychenko E.V, Kozlovskaya E.P., Jin Jun-O, Kwak J.-Y., Bode A.M., Dong Z., Stonik V.A. The anticancer effects of actinoporin RTX-A from the sea anemone Heteractis crispa (= Radianthus macrodactylus) // Toxicon. 2010. Vol. 55, N 4. P. 811-817.

37. Gladkikh I.N., Monastyrnaya M.M., Leychenko E.V., Zelepuga E.A., Chausova V.E., Isaeva M.P., Anas-tyuk S.D., Andreev Y.A., Peigneur S., Tytgat J., Kozlovskaya E.P. A typical Reactive Center Kunitz-Type Inhibitor from the Sea Anemone Heteractis crispa // Mar. Drugs. 2012. Vol. 10, N 7. P. 1545-1565.

38. Gladkikh I.N., Leychenko E.V., Monastyrnaya M.M., Chausova V.E., Isaeva M.P., Zelepuga E.A., Likhats-kaya G.N., Kozlovskaya E.P. Multifunctional group of P1 Thr Kunitz-type inhibitors from the sea anemone Heteractis crispa // Thes. Reps 9th IST Asia Pacific meeting «Animal, Plant and Microbial Toxins», Vladivostok, Russia, 4-8 sept. 2011. Владивосток: Дальнаука, 2011. P. 49.

39. Hinds M.G., Norton R.S. Solution structure of the eukaryotic pore-forming cytolysin equinatoxin II: implications for pore formation // J. Protein Chem. 1993. Vol. 12, N 3. P. 371-78.

40. Honma T., Kawahata S., Ishida M., Nagai H., Nagashima Y., Shiomi K. Novel peptide toxins from the sea anemone Stichodactyla haddoni // Peptides. 2008. Vol. 4. P. 536-544.

41. Il'ina A.P., Lipkin A^., Barsova E3., Issaeva M.P., Leychenko E.V., Gusev K.V., Monastyrnaya M.M., Lukyanov SA., Kozlovskaya E.P. Amino acid sequence of RTX-A's isoform actinoporin from the sea anemone Radianthus macrodactylus // Toxicon. 2006. Vol. 47. P. 517-520.

42. Isaeva M.P., Chausova V.E., Zelepuga E.A., Guzev K.V., Tabakmakher V.M., Monastyrnaya M.M., Kozlov-skaya E.P. A New Multigene Superfamily of Kunitz-Type Protease Inhibitors from Sea Anemone Heteractis crispa // Peptides. 2012. Vol. 34. P. 88-97.

43. Janssen M.L., Oyen W.J., Dijkgraaf I., Massuger L.F., Frielink C., Edwards D.S., Rajopadhye M., Boonstra H., Corstens F.H., Boerman O.C. Comparison of a monomeric and dimeric radiolabeled RGD-peptide for tumor targeting // Cancer Res. 2002. Vol. 62. P. 6146-6151.

44. Klyshko E.V., Issaeva M.P., Monastyrnaya M.M., Il'ina A.P., Guzev K.V., Vakorina T.I., Dmitrenok P.S., Zykova T.A., Kozlovskaya E.P. Isolation, properties and partial amino acid sequence of a new actinoporin from the sea anemone Radianthus macrodactylus // Toxicon. 2004. Vol. 44. P. 315-324.

45. Lewis R.J., Garcia M.L. Therapeutic potential of venom peptides // Nat. Rev. Drug Discov. 2003. Vol. 2, N 10. P. 790-802.

46. Mancheno J.M., Martin-Benito J., Martinez M., Gavilanes J.G., Hermoso J.A. Crystal and electron microscopy structures of sticholysin II actinoporin reveal insights into the mechanism of membrane pore formation // Structure. 2003. Vol. 11. P. 1-20.

47. Messerli S.M., Greenberg R.M. Cnidarian toxins acting on voltage-gated ion channels // Mar. Drugs. 2006. Vol. 4. P. 70-81.

48. Monastyrnaya M.M., Leychenko E.V., Issaeva M.P., Likhatskaya G.N., Zelepuga E.A., Kostina E.B., Trifonov E.A., Nurminski E.A., Kozlovskaya E.P. Actinoporins from the sea anemones, tropical Radianthus macrodactylus and northern Oulactis orientalis: comparative analysis of structure-function relationships // Toxicon. 2010. Vol. 56. P. 1299-1314.

49. Monastyrnaya M.M., Zykova T. A., Apalikova O.V., Shwets T.V., Kozlovskaya E.P. Biologically active polypeptides from the tropical sea anemone Radianthus macrodactylus // Toxicon. 2002. Vol. 40. P. 1197-1217.

50. Monastyrnaya M.M., Zelepuga E.A., Leychenko E.V., Likchatskaya G.N., Agafonova I.G., Fedorov S.N., Kozlovskaya E.P. Sea anemone actinoporin interaction with membranes: why and how? // Thes. Reps 9th IST Asia Pacific meet. «Animal, Plant and Microbial Toxins», Vladivostok, Russia, 4-8 sept. 2011. Владивосток: Дальнаука, 2011. P. 75.

51. Noda M., Shimizu S., Tanabe T., Takai T., Kayano T., Ikeda T., Takahashi H., Nakayama H., Kanaoka Y., Minamina N., Kangawa K., Matsuo H., Raftery M.A., Hirose T., Inayama S., Hayashida H., Miyata T., Numa S. Primary structure of Electrophorus electricus sodium channel deduced from cDNA sequence // Nature. 1984. Vol. 312. P. 121-127.

52. Payandeh J., Scheuer T., Zheng N., Catterall W.A. The crystal structure of a voltage-gated sodium channel // Nature. 2011. Vol. 475. P. 353-358.

53. Shnyrov V.L., Monastyrnaya M.M., Zhadan G.G., Kuznetsova S.M., Kozlovskaya E.P. Calorimetric study of interaction of toxin from Radianthus macrodactylus with erythrocyte membrane // Biochem. Int. 1992. Vol. 26. P. 219-229.

54. Tabakmakher V.M., Gladkikh I.N., Zelepuga E.A., Monastyrnaya M.M., Osmakov D.I., Kozlovskaya E.P. New recombinant Kunitz-type polypeptides of sea anemone Heteractis crispa // Thes. Reps of 2th Int. Symp. on Life Sciences, Vladivostok, Russia, 4-9 sept. 2013. Владивосток: Дальнаука, 2013. P. 78.

55. Takagi J. Molecular Environment of Integrins. Structural basis for ligand recognition by RGD (Arg-Gly-Asp)-dependent integrins // Biochem. Soc. Transactions. 2004. Vol. 32. P. 403-406.

56. Tejuca M., Anderluh G., Dalla Serra M. Sea anemone cytolysins as toxic component of immunotoxins // Toxicon. 2009. Vol. 54. P. 1206-1214.

57. Turk T., Kem W.R. The phylum Cnidaria and investigations of its toxins and venoms until 1990 // Toxicon. 2009. Vol. 54. P. 1031-1037.

58. Yue L.M., Zhang L., He Y.P., Zhang J.H., Zheng J., He Y.F., Zheng Y., Zhang J., Zhang L. Reorganization of cytoskeletal proteins of mouse oocytes mediated by integrins // Science in China. Ser. C-Life Science. 2004. Vol. 47. P. 540-544.

59. Zelepuga EA., Tabakmakher V.M., Monastyrnaya M.M., Lukyanov P. A., Kozlovskaya E.P. In silico investigation of interaction between human neutrophil elastase and sea anemone Heteractis crispa Kunitz polypeptide // Proc. of the 5th intern. conf. «Bioinformatics and biomedical engineering». Wuhan, China, 10-12 may 2011. Wuhan: Institute of Electrical and Electronics Engineers (IEEE), 2011. P. 1-4. -http://ieeexplore.ieee.org/xpl/articleDetails.jsp?arnum-ber=5780140.