Клинические приложения проточной цитометрии

© Л. Л. Ахмалтдинова, 2015 УДК 616-71

Л. Л. Ахмалтдинова

КЛИНИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

Лаборатория коллективного пользования Карагандинского государственного медицинского университета

Принцип проточной цитометрии состоит в оптическом анализе клеток или их частей в гидродинамическом потоке. Наиболее востребованным применением цитометрии на данный момент является диагностика онкогемато-логии, в иммунологии — анализ малых субпопуляций, таких как Т-гед, Тх1/Тх2, а/у-Т-лимфоциты. Разрабатываются методы измерения функционального состояния клетки: внутриклеточной продукции цитокинов, маркеры активации, молекул адгезии, определения маркеров пролиферации. Созданы аллергологические тесты, основанные на активации и дегрануляции базофилов. Есть тесты диагностики инфекционной патологии (ВИЧ, туберкулез), а также тесты диагностики сепсиса: экспрессия НЬД-Эк на моноцитах и маркер СЭ64 на нейтрофилах. Все большее применение находит метод в трансплантологии. Исследование процессов апоптоза, некроза, аутофагии, ДНК-анализ в научно-исследовательских целях также актуальны.

Ключевые слова: лабораторная диагностика, клиническая иммунология, проточная цитометрия

Проточная цитометрия - относительно новая, но уже популярная технология, применяется в различных областях, таких как клинические: иммунология, онкология, онкогемато-логия, трансплантология, общая гематология, диагностическое типирование клеток и др.; общебиологические: микробиология, морская биология, промышленная биотехнология; исследовательские: клеточная кинетика, клеточная энзимология, клеточная физиология, генетика и др. Постоянно увеличиваются возможности анализа различных параметров клеток, их морфологии, функциональные возможности автоматизации и ускорения анализа. Этому способствует модификация и совершенствование технических возможностей новой аппаратуры и повышение их доступности, постоянно совершенствующаяся реагентная база.

Принцип проточной цитометрии состоит в оптическом анализе клеток или их частей в гидродинамически узконаправленном потоке, который пересекает сфокусированный лазерный пучок.

При этом возможен одновременный мультипараметрический анализ физических и/ или химических особенностей до тысячи частиц в секунду. Оптические сигналы фиксируются системой фотоумножителей и зеркал. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют:

•рассеяние света под малыми углами (от 1 до 10°) (данная характеристика используется для определения размеров клеток);

•рассеяние света под углом 90° (позволяет судить о соотношении ядро/ цитоплазма, а также о неоднородности и гра-

нулярности клеток);

•интенсивность флуоресцентных сигналов (возможно нескольких флуоресцентных красителей).

Для полноценного анализа необходимы гомогенные суспензии изолированных клеток или частиц, а также достаточное количество клеток или ядер.

Для устранения эффектов, связанных с возможной агрегацией клеток, необходимо использовать всю доступную информацию, например, данные по рассеянию света в объеме и отношение площади пика к его ширине. Полученные данные должны быть записаны, проанализированы математически и представлены в виде гистограмм.

Преимущества метода: а) возможность высокой автоматизации метода; б) высокая скорость анализа; в) анализ большого количества клеток (до 108 клеток); г) использование статистических и математических моделей, которые увеличивают возможности анализа результатов; д) измерение параметров малых субпопуляций и редко встречающихся частиц; е) объективное измерение интенсивности флуоресценции; ж) технические возможности современных приборов позволяют на одном образце проанализировать несколько субпопуляций клеток по набору морфологических характеристик и флуоресценции нескольких видов моноклональных антител; з) возможность осуществлять сортинг клеток по определенным параметрам [8, 9, 39].

Минусы метода: а) необходимость дорогостоящей и современной аппаратуры; б) высокая стоимость реактивов; в) необходимость

подбора/анализа многоцветных панелей требует значительного опыта и знаний операторов; г) нет алгоритма превращения массива данных в диагноз; д) дефицит стандартных алгоритмов оценки маркеров, подбора панелей, интерпретации.

Основной задачей проточной цитомет-рии в медицине является иммунофенотипиро-вание нормальных и патологических иммуно-компетентных клеток крови. Анализируя картину поверхностных дифференцировочных маркеров, можно определить популяцию и субпопуляцию клеток, стадию их дифференци-ровки и активации; функцию клеток и их взаимодействие с другими клетками, что позволяет использовать эту информацию для диагностики в различных областях медицины [27, 31, 37].

Онкогематология. Наиболее востребованным и важным применением цитометрии на данный момент является диагностика онко-гематологии. Сегодня проточно -цитометрический анализ дает возможность с высокой степенью эффективности диагностировать, прогнозировать и проводить мониторинг в ходе заболевания. В настоящее время с помощью моноклональных антител идентифицировано около 350 поверхностных антигенов лейкоцитов, из них в клинической практике можно использовать не более 15%, но они позволили значительно расширить представление об опухолевой трансформации и возможности ее фиксации. Анализируя картину поверхностных дифференцировочных маркеров, можно определить популяцию и субпопуляцию измененных клеток, линейность, кло-нальность, стадию дифференцировки и активации, что является принципиальным для диагностики острых и хронических лейкозов.

Морфологический подсчет бластных клеток остается рутинным методом. Предварительный морфологический подсчет облегчает задачу подбора реагентов для цитометрии и позволяет сделать анализ дешевле. Однако цитометрический анализ позволяет увеличить эффективность и точность диагностики.

В настоящее время целями проточной цитометрии в онкогематологии являются: диагностическое иммунофенотипирование лейкозов и лимфом; выявление терапевтических мишеней (Сй20, Сй52) и ответа на терапию моноклональными антителами; документирование прогрессии или рецидива; выявление таких осложнений, как вторичные лимфомы и лейкозы; оценка прогноза (пролиферативный индекс, выявление прогностических маркеров

Zap70); мониторинг терапии путем выявления минимальной остаточной болезни [4, 6, 20, 30, 38].

Кроме диагностики онкогематологии, уже существуют приложения для анализа солидных опухолей как в виде мигрирующих отдельных клеток для диагностики активности метастазирования, так и анализа функциональной активности клеток опухоли после гомогенизации [17, 44].

Клиническая иммунология. С появлением более 20 лет назад проточной цитомет-рии значительно расширились возможности изучения всех показателей иммунного статуса, и клиническая иммунология получила серьезный бонус для развития. На данный момент с помощью цитометрии возможен количественный анализ субпопуляций. Подсчет основных субпопуляций клеточного иммунитета и маркеров активации на данный момент является рутинным методом. Все более востребованным становится анализ малых субпопуляций, таких как Т-регуляторные клетки, количество субпопуляций Тх 1 и 2 типа, альфа и гамма Т-лимфоциты, которые играют роль в развитии аутоиммунных и аллергических заболеваний, а также могут дать прогноз развития хронического воспалительного/инфекционного заболевания [7, 9, 10, 11, 14].

Для оценки иммунного статуса при имму-нофенотипировании лимфоцитов наряду с основными популяциями в ряде случаев целесообразно расширить анализ за счет малых субпопуляций лимфоцитов и пулов активированных клеток. Технические и методические возможности для этого постоянно расширяются и совершенствуются. Так, если ранее для определения Т-цитотоксических лимфоцитов считалось достаточным использовать только один маркер CD8, то согласно современным представлениям необходимо одновременное исследование четырех маркеров: CD8, CD4, CD3 и CD45. Реализация такого подхода возможна только при использовании многоцветного ци-тометрического анализа [5, 10].

Проточная цитометрия не ограничивается количественными характеристиками. Разрабатываются методы измерения функционального состояния клетки. Оценка функциональной активности лимфоцитов имеет важное значение, так как часто при многих заболеваниях и вторичных иммунодефицитах наблюдается нормальное количественное содержание этих клеток, но их функции зачастую угнетены /увеличены/ в значительной степени, и это может являться определяющим звеном в

патогенезе того или иного заболевания. Наиболее часто используют оценку внутриклеточной продукции цитокинов различными клеточными популяциями, маркеры активации: CD25 (рецептор интерлейкина-2), CD38, CD69, CD71 (трансферриновый рецептор), CD122, анти-HLA-DR, молекул адгезии - CD11a, CD11b, CD11c, CD18, CD54, CD59, дендритных клеток - CD11c+,CD123+, определение маркеров пролиферативной активности клеток (Ki-67, pCna, Cyclin D3). Важно, что с помощью цитометрии можно исследовать как поверхностные, так и внутриклеточные маркеры и сигнальные молекулы [15, 19, 20, 28].

Есть множество подходов по изучению характеристик фагоцитоза в проточной цитометрии. Наиболее просто изучить поглотительную способность, которую можно измерить по флуоресценции меченых микроорганизмов или частиц латекса. Преимуществом метода является способность оценить избирательную поглотительную активность для нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов. Другим подходом является измерение экспрессии молекул адгезии CD11b, CD18, CD62L, измерение мобилизации внутриклеточного кальция с помощью красителей Indo 1, Fluo3, Fura2, образования активных форм кислорода по реакции дихлор-флюоресцина или дигидроданида с перекисью водорода [12, 13].

К оценке функциональной активности можно отнести измерение процессинга белков и презентации их пептидов на поверхности моноцитов. Для этого есть опыт использования меченного флуорохромами бычьего альбумина. Нарушение процессинга белков на поверхности моноцитов является диагностическим признаком некоторых первичных иммуно-дефицитов (синдром «голых лимфоцитов», синдром Чедиака-Хигаси) [23].

Исследование цитокинов, интерфероно-вого статуса востребовано в исследовательских целях в большей степени, чем в диагностических. Так известно, что ТИ1-цитокины (называемые также цитокинами 1 типа) и Th2-цитокины (цитокины 2 типа) относятся к группам цитокинов, продуцируемых двумя различными субпопуляциями CD4+ Т-клеток, Th1 клетки обеспечивают запуск клеточно-опосредованного эффекторного ответа. Th2-лимфоциты - основные клетки, участвующие в регуляции развития В-клеток и усиливающие гуморальный ответ, такой как продукция антител, преимущественно IgE, В-клетками. Различные профили цитокинов соответствуют различным функциям эффекторов иммунной

системы. Некоторые полученные данные свидетельствуют о том, что метод проточной ци-тометрии, наряду с общепринятым методом оценки продукции цитокинов методом иммуно-ферментного анализа, позволяет адекватно оценить синтез и продукцию цитокинов на уровне клетки и открывает новые возможности в оценке изменений в цитокиновой сети при различных патологиях. Определение количества клеток с внутриклеточной и мембранной формами этого цитокина и сопоставление данных проточной цитометрии с данными, полученными методом ИФА, могут характеризовать состояние хронического заболевания в настоящий момент и в комплексе с другими диагностическими исследованиями определить тактику ведения пациентов [2, 26].

Аллергология. Возможность фиксации активации клеток в ответ на специфические стимулы позволило создать аллергологические тесты, основанные на активации и дегрануля-ции базофилов в ответ на аллергены in vitro. Тесты патогенетически обоснованы, заменили ручные, трудоемкие, маловоспроизводимые тесты дегрануляции базофилов. Тесты дегра-нуляции еще не вошли в широкую клиническую практику, в большей степени из-за стоимости, однако по мере развития технологий это будет возможно [16, 40].

Инфекционные болезни. Перечисленные выше подходы можно использовать и в диагностике инфекционной патологии. Наиболее распространен пример ВИЧ, с которого, собственно, и началось широкое клиническое внедрение проточной цитометрии. Контроль за содержанием CD4 лимфоцитов является важным терапевтическим и прогностическим маркером развития СПИДа [22].

Кроме того есть работы, которые позволяют изучать IFN+ лимфоциты в ответ на стимуляцию микобактериями туберкулеза (или, возможно, другими инфекционными агентами). Это может иметь диагностическое значение, хотя клинически значимых цитометрических тестов еще не предложено [29].

Выделим отдельно диагностику сепсиса. Есть как минимум два маркера активации, которые используют в диагностике сепсиса. Это экспрессия HLA-DR на моноцитах. В норме экспрессия HLA-DR на моноцитах составляет 70100%. При снижении до 30% и менее экспрессии HLA-DR на моноцитах у больных с сепсисом авторы отмечали фатальный исход в более чем 85% случаев. При значениях экспрессии HLA-DR на моноцитах 40% или более летальность составила 12% [34, 35, 41]. Приме-

нение этого маркера у новорожденных не дало результата вследствие особенности иммунного ответа новорожденных. Для быстрой диагностики сепсиса новорожденных обнаружен маркер CD64 на нейтрофилах, повышение которого определяется при тяжелых инфекциях у детей [25, 36].

Отдельно стоит остановится на технологии MHC-тетрамеров. В основе этой технологии лежит создание тетрамеров главного комплекса гистосоместимости, с помощью которого можно визуализировать антиген-специфические CD4 (МНС II) или CD8-лимфоциты (MHCI). С помощью этого метода можно количественно анализировать специцический клеточный иммунитет против конкретных антигенов. Ранее это было возможно только при помощи in vivo тестов. Есть проблемы подбора гаплотипа MHC, однако этот метод уже сейчас используется для изучения иммунного ответа на антигены, а также может использоваться в изучении ответа на вирусную инфекцию (гепатит, ВИЧ, цито-мегаловирус) или трансплантат [29].

Трансплантология. Трансплантология-еще одна область, в которой проточная цито-метрия находит свое применение. При трансплантации костного мозга с помощью поточной цитометрии можно оценить качество трансплантата и количество стволовых клеток в нем. При трансплантации солидных органов существуют методики подбора реципиента и донора, основанные на наличии предшествующих антител к HLA донора, которые существенно усугубляют исход трансплантации -CrossMatch. Анализ перекрестной совместимости с помощью проточной цитометрии - это более чувствительный метод по сравнению с цитотоксическими тестами перекрестной совместимости. Он позволяет определить специфичные антитела IgG к HLA класса I и/или II донора. Он также выявляет не связывающие комплемент антитела, которые могут остаться незамеченными при цитотоксической пробе перекрестной совместимости, а также антитела в крайне низком титре. При проведении этой пробы сыворотку пациента инкубируют с лимфоцитами донора. Затем клетки окрашивают флуоресцентными красителями, которые выявляют человеческие антитела IgG на Т- и В-клетках. Далее клетки анализируют на проточном цитометре на наличие антител к HLA-антигенам донора [32, 33].

Научные медико-биологические исследования. Исследование процессов апоптоза, некроза, аутофагии и механизмов их

регуляции в научно-исследовательских целях так же актуально. Для этих целей можно использовать наборы для детекции таких факторов, как АРО2.7 - антиген (также называемый 7А6), который появляется на мембране митохондрий апоптозных клеток. Annexin V - на ранней стадии апоптоза целостность клеточной мембраны сохраняется, однако происходит перестройка ее фосфолипидных компонентов, и на поверхности клетки появляется фосфати-дилсерин. Аннексин V способен связываться с фосфатидилсерином в присутствии кальция. Одновременное окрашивание аннексином V-FITC и PI (или 7-AAD) позволяет отделить погибшие клетки (двойное окрашивание) от клеток, только что вступивших на путь апоптоза. Каспаза-3 - один из основных участников передачи апоптозного сигнала от Fas-рецептора.

CD95 (Fas или APO1) - трансмембранный гликопротеин, принадлежащий к семейству фактора некроза опухолей. Связывание этой молекулы с Fas-лигандом приводит к индукции программируемой клеточной гибели. CD95 представлен на CD4+, CD8+, B-лимфоцитах. При активации клеток экспрессия этой молекулы увеличивается.

Антиапоптотические и проапоптические факторы (Bcl-xL и Bcl-2, ВахиВа^ - эти факторы способны ингибировать или активировать процессы, ведущие к клеточной гибели [1, 19, 43, 44].

В последние десятилетия шквал исследований касался системы врожденного иммунитета, в том числе системы рецепторов TLR. В 2011 г. за открытие в этой области была присуждена Нобелевская премия. Широкий спектр лигандов TLR и представленность этих рецепторов на многих клетках способствуют вовлечению TLR в патогенез многих заболеваний. Дефекты в системе TLR могут приводить к развитию тяжелых инфекционных заболеваний (сепсис, менингит), аутоиммунных заболеваний, атеросклероза, аллергопатологии. К основным подобным методам относится и проточная цитометрия, которая способна изучить низкую экспрессию толл-подобных рецепторов на отдельных популяциях иммунокомпетент-ных и дендритных клетках [3, 24].

Анализ ДНК и клеточного цикла является узкоспецифическим, но достаточно распространенным в цитометрии. ДНК-гистограммы позволяют различить клетки, находящиеся в G1-, S- и G2/ М-фазах клеточного цикла, а также идентифицировать фазы, нефиксируемые ранее. Из ДНК-гистограмм можно получить два рода данных. Во-первых, идентифицировать

клетки с аномальным содержанием ДНК, так называемые анеуплоидные клетки. Во-вторых, определить долю клеток, находящихся в S-фазе, и оценить степень пролиферации. Есть работы, позволяющие проводит кариотипиро-вание методом проточной цитометрии и идентифицировать сложные для идентификации человека хромосомы (например Y) [21].

ЛИТЕРАТУРА

1 Видершайн Г. Я. Апоптоз, методы и протоколы //Биохимия. - 2005. - №5. - С. 736790.

2 Зурочка А. В. Цитометрический анализ субпопуляций Т-хелперов (TH1, TH2, TREG, TH17, Т-хелперы активированные) /А. В. Зурочка, С. В. Хайдуков //Медицинская иммунология. - 2011. - №1. - С. 7-16.

3 Ковальчук Л. В. Рецепторы врожденного иммунитета: подходы к количественной и функциональной оценке TLR человека /Л. В. Ковальчук, М. В. Хореева //Иммунопатология и клиническая иммунология. - 2008. - №4. - C. 223-227.

4 Купрышина Н. А. Проточная цитометрия в онкогематологии. Часть 2. Основы и нововведения в диагностике острых лейкозов /Н. А. Купрышина, Н. Н. Тупицын // Онкогематология. - 2012. - №4. - С. 349-354.

5 Пащенков М. В. Выявление и характе-ризация цитолитических CD8+- и CD4+- T-клеток /М. В. Пащенков, Н. Е. Муругина, В. В. Муругин, Б. В. Пинегин //Иммунология. - 2010. - № 1. - С. 4-12.

6 Тупицын Н. Н. Проточная цитометрия в онкогематологии. Часть I. Основы и нововведения в диагностике острых лейкозов /Н. Н. Тупицын, Л. Ю. Гривцова, Н. А. Купрышина // Онкогематология. - 2012. - №1. - С. 42-47.

7 Хайдуков С. В. Подходы к стандартизации метода проточной цитометрии для имму-нофенотипирования. Настройка цитометров и подготовка протоколов для анализа // Медицинская иммунология. - 2007. - №6. - С. 569-574.

8 Хайдуков С. В. Проточная цитометрия как современный метод анализа в биологии и медицине /С. В. Хайдуков, А. В. Зурочка // Медицинская иммунология. - 2007. - №4-5. -С. 373-378.

9 Хайдуков С. В. Расширение возможностей метода проточной цитометрии для клини-ко-иммунологической практики /С. В. Хайдуков, А. В. Зурочка //Медицинская иммунология. - 2008 - №1. - С. 5-12.

10 Хайдуков С. В. Основные и малые популяции лимфоцитов периферической крови

человека и их нормативные значения (методом многоцветного цитометрического анализа) /С. В. Хайдуков, А. В. Зурочка, А. То-толян Арег, В. А. Черешнев //Медицинская иммунология. - 2009. - №2-3. - С. 227-238.

11 Хайдуков С. В. Многоцветный цитометрический анализ идентификация Т-клеток и их субпопуляций по экспрессии aß-Tcr и yö-Tcr /С. В. Хайдуков, А. В. Зурочка, В. А. Черешнев //Медицинская иммунология. - 2008. -№2-3. - С. 115-124.

12 A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils /D. M. Lowe, N. Bangani, M. R. Mehta, D. M. Lang et al. //Tuberculosis (Edinb). - 2013. - V. 93(2). -P. 167-178.

13 A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry /B. J. Gu, C. Sun, S. Fuller, K. K. Skarratt et al. //Cytometry A. - 2014. - V. 85(4). - P. 313-321.

14 Analysis of TH1 and TH2 cells by intracellular cytokine detection with flow cytometry in patients with ovarian cancer /Y. Aoki, I. Tsuneki, M. Sasaki, M. Watanabe et al. //Gynecol. Obstet. Invest. - 2000. - V. 50(3). - P. 207-211.

15 Bacher P. New technologies for monitoring human antigen - specific T-cells and regulatory T-cells by flow - cytometry /P. Bacher, A. Scheffold //Curr. Opin. Pharmacol. - 2015. - V. 23. - P. 17-24.

16 Basophil activation tests: time for a reconsideration /a. P. Uyttebroek, V. Sabato, M. A. Faber, N. Cop et al. //Expert. Rev. Clin. Immunol. -2014. - V. 10. - P. 123-129.

17 Broersen L. H. Clinical application of circulating tumor cells in breast cancer /L. H. Broersen, G. W. van Pelt, R. A. Tollenaar, W. E. Mesker //Cell Oncol. - 2014. - V. 37(1). - P. 9-15.

18 Caspase - independent Apoptosis /J. Xie, M. Zhang, Y. P. Song, K. Hu et al. // Zhongguo Shi Yan Xue Ye XueZaZhi. - 2012. - V. 20(1). - P. 107-111.

19 Characteristics of yö T-cell subsets induced from peripheral blood mononuclear cells of HIV/AIDS patients in vitro /W. W. Chen, X. L. Wu, W. M. Nie et al. //Xi Bao Yu Fen ZiMian Yi XueZaZhi. - 2012. - V. 28(3). - P. 285-287.

20 Chattopadhyay P. Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons /P. Chattopadhyay, M. Roederer //Methods. - 2012. - V. 57 (3). - P. 251-258.

21 Chromosomes in the flow to simplify genome analysis /J. Dolezel, J. Vrana, J. Safar, J. Bartos et al. //Funct. Integr. Genomics. - 2012. -

V. 12(3). - P. 397-416.

22 Cytometry, immunology, and HIV infection: three decades of strong interactions /A. Cos-sarizza, S. De Biasi, L. Gibellini, E. Bianchini et al. //Cytometry A. - 2013. - V. 83(8). - P. 680691.

23 Edwards B. S. Flow Cytometry: Impact on Early Drug Discovery /B. S. Edwards, L. A. Sklar // J. Biomol. Screen. - 2015. - V. 7(5). - P. 527-534.

24 Expression of Toll-Like Receptors in Human Retinal and Choroidal Vascular Endothelial Cells /E. A. Stewart, R. Wei, M. J. Branch, L. E. Sidney et al. //Exp. Eye Res. - 2015. - Jun. 16.

25 Farias M. G. Neutrophil CD64 expression as an important diagnostic marker of infection and sepsis in hospital patients /M. G. Farias, N. P. de Lucena, S. Dal Bo, S. M. de Castro //J. Immunol. Methods. - 2014. - V. 1 (414). - P. 65-68.

26 Flow cytometry applications for the analysis of chemokine receptor expression and function /A. Anselmo, C. Mazzon, E. M. Borroni, R. Bonecchi, et al. //Cytometry A. - 2014. - V. 85(4). - P. 292-301.

27 Green R. Development, history, and future of automated cell counters /R. Green, S. Wachsmann-Hogiu //Clin. Lab. Med. - 2015. - V. 35 (1). - P. 1-10.

28 How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches /J. Pirrello, M. Bourdon, C. Cheniclet, M. Bourge et al. // Cytometry A. - 2014. - V. 85 (2). - P. 115-125.

29 Immune response to mycobacterial infection: lessons from flow cytometry /N. Rovina, M. Panagiotou, K. Pontikis, M. Kyriakopoulou et al. // Clin. Dev. Immunol. - 2013. - Published online 464039.

30 Jonas B. A. MDS prognostic scoring systems - past, present, and future /B. A. Jonas, P. L. Greenberg //Best Pract. Res. Clin. Haematol. -2015. - V. 28 (1). - P. 3-13.

31 Krause D. S. Flow cytometry for hematopoietic cells /D. S. Krause, M. E. Delelys, F. I. Pref-fer //Methods Mol. Biol. - 2014. - V. 1109. - P. 2346.

32 Lobashevsky A. L. Methodological aspects of anti - human leukocyte antigen antibody analysis in solid organ transplantation //World J. Transplant. - 2014. - V. 4(3). - P. 153-167.

33 Modified flow cytometry crossmatch detecting alloantibody - related cytotoxicity as a way to distinguish lytic antibodies from harmless in allo-sensitised kidney recipients /M. Zielinski, H. Zielinska, G. Moszkowska, A. Dgbska-Slizien et al. //Transplant. Proc. - 2013. - V. 45(1). - P. 88-94.

34 Monneret G. Monocyte HLA-DR in sepsis: shall we stop following the flow? /G. Monneret, F. Venet //Crit. Care. - 2014. - V. 18 (1). - P. 102.

35 Monocytic HLA-DR expression in intensive care patients: interest for prognosis and secondary infection prediction /A. C. Lukaszewicz, M. Grienay, M. Resche-Rigon, R. Pirracchio et al. //Crit. Care Med. - 2009. - V. 37 (10). - P. 2746-2752.

36 Neutrophil CD64 as a diagnostic marker of sepsis in neonates /S. Elawady, S. K. Botros, A. E. Sorour, E. A. Ghany et al. //J. Investig. Med. -2014. - V. 62(3). - P. 644-649.

37 Overview of clinical flow cytometry data analysis: recent advances and future challenges /C. E. Pedreira, E. S. Costa, Q. Lecrevisse, J. J. van Dongen et al. //Trends Biotechnol. - 2013. - V. 31 (7). - P. 415-425.

38 Pati H. P. Flow cytometry in hematological disorders //Jain. Indian J. Pediatr. - 2013. - V. 80 (9). - P. 772-778.

39 Shapiro H. M. Practical Flow Cytometry. -N.Y., 1985. - 353 p.

40 Song W. J. Recent applications of baso-phil activation tests in the diagnosis of drug hyper-sensitivity /W. J. Song, Y. S. Chang //Asia Pac. Allergy. - 2013. - V. 3(4). - P. 266-280.

41 Venet F. Clinical review: flow cytometry perspectives in the ICU - from diagnosis of infection to monitoring of injury - induced immune dysfunctions / F. Venet, A. Lepape, G Monneret //Crit. Care. - 2011. - V. 15 (5). - P. 231.

42 Warnes G. Flow cytometric assays for the study of autophagy //Methods. - 2015. - V. 82. -P. 21-28.

43 Wlodkowic D. Cytometry of apoptosis. Historical perspective and new advances /D. Wlod-kowic, J. Skommer, Z. Darzynkiewicz //Exp. Oncol. - 2012. - V. 34 (3). - P. 255-262.

44 Woo J. Recent advancements of flow cytometry: new applications in hematology and oncology /J. Woo, A. Baumann, V. Arguello //Expert Rev. Mol. Diagn. - 2014. - V. 14(1). - P. 67-81.

REFERENCES

1 Vidershain G. Ya. Apoptosis, methods and worksheets //Biochemistry. - 2005. - №5. - P. 736 -790.

2 Zurochka A. V. Cytometric analyses of T-helpers (TH1, TH2, TREG, TH17, T-helpers activated) subpopulations /A. V. Zurochka, S. V. Haydu-kov //Medical immunology. - 2011. - №1. - P. 716.

3 Kovalchuk L. V. Receptors of inborn immunity: approaches to the quantitative and functional assessment of TLR of the person /L. V. Kovalchuk, M. V. Horeeva //Immunopathology and clinical immunology. - 2008. - №4. - P. 223-227.

4 Kupryshina N. A. Flow cytometry in oncohe-matology. Part 2. Basic concepts and innovations in the diagnostics of acute leukemia /N. A. Kupryshina, N. N. Tupytsin //Oncohematology. - 2012. -№4. - P. 349-354.

5 Pashenkov M. V. Detection and characterization of cytolytic CD8+- and CD4+- T-cells /M. V. Pashenkov, N. E. Murugina, V. V. Murugin, B. V. Pinegin //Immunology. - 2010. - №1. - P. 4-12.

6 Tupytsin N. N. Flow cytometry in oncohema-tology. Part 1. Basic concepts and innovations in the diagnostics of acute leukemia /N. N. Tupytsin, L. Yu. Gryvtsova, N. A. Kupryshina // Oncohematology. - 2012. - №1. - P. 42-47.

7 Haydukov S. V. Approaches and standardization method of the flow cytometry for immunophe-notyping. Cytometers reset and preparation of the worksheets for analyses //Medical immunology. -2007. - №6. - P. 569-574.

8 Haydukov S. V. Flow cytometry as a modern analysis method in biology and medicine /S. V. Haydukov, A. V. Zurochka //Medical immunology. - 2007. - №4-5. - P. 373-378.

9 Haydukov S. V. Enhancement of approach of the flow cytometry for clinical and immunological practice /S. V. Haydukov, A. V. Zurochka //Medical immunology. -2008. - №1. - P. 5-12.

10 Haydukov S. V. Basic and small lymphocyte peripheral human blood populations and their standard values /S. V. Haydukov, A. V. Zurochka, A. Totolyan Areg, V. A. Chereshnev //Medical im-munology.-2009. -№2-3. -P. 227-238.

11 Haydukov S. V. Multicolor cytometric analysis of T-cells identification and their subpopulations expressing ap-Tcr and Y^-Tcr /S. V. Haydukov, A. V. Zurochka, A. Totolyan Areg, V. A. Chereshnev //Medical immunology. - 2008. - №2 -3. - P. 115-124.

12 A novel assay of antimycobacterial activity and phagocytosis by human neutrophils /D. M. Lowe, N. Bangani, M. R. Mehta, D. M. Lang et al. //Tuberculosis (Edinb). - 2013. - V. 93(2). - P. 167-178.

13 A quantitative method for measuring innate phagocytosis by human monocytes using real-time flow cytometry /B. J. Gu, C. Sun, S. Fuller, K. K. Skarratt et al. //Cytometry A. - 2014. - V. 85(4). -P. 313-321.

14 Analysis of TH1 and TH2 cells by intracellu-lar cytokine detection with flow cytometry in patients with ovarian cancer /Y. Aoki, I. Tsuneki, M. Sasaki, M. Watanabe et al. //Gynecol. Obstet. Invest. - 2000. - V. 50(3). - P. 207-211.

15 Bacher P. New technologies for monitoring human antigen - specific T-cells and regulatory T-cells by flow - cytometry /P. Bacher, A. Scheffold //Curr. Opin. Pharmacol. - 2015. - V. 23. - P. 17-24.

16 Basophil activation tests: time for a reconsideration /A. P. Uyttebroek, V. Sabato, M. A. Faber, N. Cop et al. //Expert. Rev. Clin. Immunol. -2014. - V. 10. - P. 123-129.

17 Broersen L. H. Clinical application of circulating tumor cells in breast cancer /L. H. Broersen, G. W. van Pelt, R. A. Tollenaar, W. E. Mesker // Cell Oncol. - 2014. - V. 37(1). - P. 9-15.

18 Caspase - independent Apoptosis /J. Xie, M. Zhang, Y. P. Song, K. Hu et al. //Zhongguo Shi Yan Xue Ye XueZaZhi. - 2012. - V. 20(1). - P. 107 -111.

19 Characteristics of yö T-cell subsets induced from peripheral blood mononuclear cells of HIV/ AIDS patients in vitro /W. W. Chen, X. L. Wu, W. M. Nie et al. //Xi Bao Yu Fen ZiMian Yi XueZaZhi. -2012. - V. 28(3). - P. 285-287.

20 Chattopadhyay P. Cytometry: Today's technology and tomorrow's horizons /P. Chattopadhyay, M. Roederer //Methods. - 2012. - V. 57(3). -P. 251-258.

21 Chromosomes in the flow to simplify genome analysis /J. Dolezel, J. Vrana, J. Safar, J. Bartos et al. //Funct. Integr. Genomics. - 2012. -V. 12(3). - P. 397-416.

22 Cytometry, immunology, and HIV infection: three decades of strong interactions /A. Cos-sarizza, S. De Biasi, L. Gibellini, E. Bianchini et al. //Cytometry A. - 2013. - V. 83(8). - P. 680691.

23 Edwards B. S. Flow Cytometry: Impact on Early Drug Discovery /B. S. Edwards, L. A. Sklar // J. Biomol. Screen. - 2015. - V. 7(5). - P. 527-534.

24 Expression of Toll-Like Receptors in Human Retinal and Choroidal Vascular Endothelial Cells /E. A. Stewart, R. Wei, M. J. Branch, L. E. Sidney et al. //Exp. Eye Res. - 2015. - Jun. 16.

25 Farias M. G. Neutrophil CD64 expression as an important diagnostic marker of infection and sepsis in hospital patients /M. G. Farias, N. P. de Lucena, S. Dal Bo, S. M. de Castro //J. Immunol. Methods. - 2014. - V. 1 (414). - P. 65-68.

26 Flow cytometry applications for the analysis of chemokine receptor expression and function /A. Anselmo, C. Mazzon, E. M. Borroni, R. Bonecchi, et al. //Cytometry A. - 2014. - V. 85(4). - P. 292301.

27 Green R. Development, history, and future of automated cell counters /R. Green, S. Wachs-mann-Hogiu //Clin. Lab. Med. - 2015. - V. 35 (1). - P. 1-10.

28 How fruit developmental biology makes use of flow cytometry approaches /J. Pirrello, M. Bourdon, C. Cheniclet, M. Bourge et al. // Cytometry A. - 2014. - V. 85 (2). - P. 115-125.

29 Immune response to mycobacterial infection: lessons from flow cytometry /N. Rovina, M. Panagiotou, K. Pontikis, M. Kyriakopoulou et al. // Clin. Dev. Immunol. - 2013. - Published online 464039.

30 Jonas B. A. MDS prognostic scoring sys-

tems - past, present, and future /B. A. Jonas, P. L. Greenberg //Best Pract. Res. Clin. Haematol. -2015. - V. 28 (1). - P. 3-13.

31 Krause D. S. Flow cytometry for hematopoietic cells /D. S. Krause, M. E. Delelys, F. I. Pref-fer //Methods Mol. Biol. - 2014. - V. 1109. - P. 23 -46.

32 Lobashevsky A. L. Methodological aspects of anti - human leukocyte antigen antibody analysis in solid organ transplantation //World J. Transplant. - 2014. - V. 4(3). - P. 153-167.

33 Modified flow cytometry crossmatch detecting alloantibody - related cytotoxicity as a way to distinguish lytic antibodies from harmless in allosensitised kidney recipients /M. Zielinski, H. Zielinska, G. Moszkowska, A. Dgbska-Slizien et al. //Transplant. Proc. - 2013. - V. 45(1). - P. 8894.

34 Monneret G. Monocyte HLA-DR in sepsis: shall we stop following the flow? /G. Monneret, F. Venet //Crit. Care. - 2014. - V. 18 (1). - P. 102.

35 Monocytic HLA-DR expression in intensive care patients: interest for prognosis and secondary infection prediction /A. C. Lukaszewicz, M. Grienay, M. Resche-Rigon, R. Pirracchio et al. // Crit. Care Med. - 2009. - V. 37 (10). - P. 27462752.

36 Neutrophil CD64 as a diagnostic marker of sepsis in neonates /S. Elawady, S. K. Botros, A. E. Sorour, E. A. Ghany et al. //J. Investig. Med. -2014. - V. 62(3). - P. 644-649.

37 Overview of clinical flow cytometry data

L. L. Akhmaltdinova

CLINICAL APPLICATIONS OF FLOW CYTOMETRY Share laboratory of Karaganda state medical university

analysis: recent advances and future challenges / C. E. Pedreira, E. S. Costa, Q. Lecrevisse, J. J. van Dongen et al. //Trends Biotechnol. - 2013. - V. 31 (7). - P. 415-425.

38 Pati H. P. Flow cytometry in hematological disorders //Jain. Indian J. Pediatr. - 2013. - V. 80 (9). - P. 772-778.

39 Shapiro H. M. Practical Flow Cytometry. -N.Y., 1985. - 353 p.

40 Song W. J. Recent applications of basophil activation tests in the diagnosis of drug hypersen-sitivity /W. J. Song, Y. S. Chang //Asia Pac. Allergy. - 2013. - V. 3(4). - P. 266-280.

41 Venet F. Clinical review: flow cytometry perspectives in the ICU - from diagnosis of infection to monitoring of injury - induced immune dysfunctions / F. Venet, A. Lepape, G Monneret //Crit. Care. - 2011. - V. 15 (5). - P. 231.

42 Warnes G. Flow cytometric assays for the study of autophagy //Methods. - 2015. - V. 82. -P. 21-28.

43 Wlodkowic D. Cytometry of apoptosis. Historical perspective and new advances /D. Wlod-kowic, J. Skommer, Z. Darzynkiewicz //Exp. Oncol. - 2012. - V. 34 (3). - P. 255-262.

44 Woo J. Recent advancements of flow cytometry: new applications in hematology and oncology /J. Woo, A. Baumann, V. Arguello //Expert Rev. Mol. Diagn. - 2014. - V. 14(1). - P. 67-81.

Поступила 25.08.2015 г.

Principle of flow cytometry is in optical analysis of cells or their parts in hydrodynamic flow. Today the most widespread application of cytometry is the oncohematology diagnostics. Analysis of small-size subpopulations, such asT-reg, Тх1/Тх2, a/Y-T-lymphocytes becomes more and more actual in immunology. Methods of cell functional status measurement are developed: intracellular production of cytokines, agitation markers, adhesion molecules, definition of proliferation markers. Allergological tests, based upon activation and degranulation of basocytes are created. There are tests for diagnostics of infectious pathology (HIV, tuberculosis). There are tests for sepsis diagnostics: expression of HLA-DR in monocytes and CD64 marker in neutrophils. The method becomes more and more popular in transplantology. Research of apoptosis, necrosis, autophagy processes, DNA-analysis for scientific and research aims is still popular.

Keywords: laboratory diagnostics, clinical immunology, flow cytometry

Л. Л. Ахмалтдинова

AFblHMbI ЦИТОМЕТРИЯНЫЦ КЛИНИКАЛЫК КОЛДАНЫЛУЛАРЫ K,араFанды мемлекеттк медициналык университет,i

Арынды цитометрия устанымы жасушаларды немесе олардыч белктерш гидродинамикалык арында оптикалык талдауда жатыр. Каз1рп уакытта цитометрияныч еч талап еттген колданылуы онкогематологияныч диагностикасы болып табылады. Иммунологияда T-reg, Тх1/Тх2, a/Y-Т-лимфоциттерi сиякты шарын косалкы популяцияларды талдаудыч талап етшу1 арта тусуде. Цитокиндерд1ч жасуша 1шк1 енд1р1с1, белсендену маркерлер1, адгезия молекулалары, пролиферация маркерлер1н аныктау сиякты жасушалардыч функционалдык жардайын елшеу эд1стер1 эз1рленуде. Базофилдерд1 белсендету мен туй1рш1кс1здетуге непзделген аллергологиялык сынактар жасалран. Инфекциялык патологияны (АКТК, туберкулез) диагностикалау сынактары бар. Сепсист диагностикалау сынактары бар: моноциттердеп HLA-DR экспрессиясы жэне нейтрофилдердеп CD64 маркер1. 6д1с трансплантологияда кеч1нен колданысын табуда.

Клтсездер: лабораториялык диагностикасы, арынды цитометрия, клиникалык иммунологиясы