Современное состояние проблемы ЭДТА-ассоциированной псевдотромбоцитопении, значение в патогенезе полиморфизма в гене тромбоцитарного рецептора к фибриногену

современное состояние проблемы эдта-ассоциированной псевдотромбоцитопении, значение в патогенезе полиморфизма в гене тромбоцитарного рецептора к фибриногену

А.С. Поляков, Е.В. Гончарова, С.Г. Бологов, Д.К. Жоголев, С.В. Бондарчук, Я.А. Носков, О.Р. Петрова, С.В. Воронин, С.Н. Колюбаева Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова, Санкт-Петербург, Россия

Current state of EDTA-associated pseudothrombocytopenia, importance in the pathogenesis of polymorphism in the gene of platelet receptor for fibrinogen

A.S. Polyakov, E.V. Goncharova, S.G. Bologov, D.K. Zhogolev, S.V. Bondarchuk, YaA. Noskov,

O.R. Petrova, S.V. Voronin, S.N. Kolubaeva

S.M. Kirov Military Medical Academy, Saint Petersburg, Russia

ЭДТА-ассоциированная псевдотромбоцитопения является лабораторным феноменом, связанным с широким внедрением в лабораторную практику гематологических анализаторов и унифицированных методов консервирования проб крови. Высокая частота псевдотромбоцитопении среди здоровых лиц (до 20%) и среди пациентов с различными патологическими состояниями (до 50%) при недостаточном контроле полученных результатов может явиться причиной большого количества лабораторных и диагностических ошибок. В настоящее время нет достоверных данных о клиническом значении псевдотромбоцитопе-нии. Выявление ЭДТА-псевдотромбоцитопении основано на сопоставлении данных автоматизированного гематологического анализа с результатами микроскопического подсчета количества тромбоцитов или автоматизированных исследований с применением альтернативных антикоагулянтов.

В ограниченном исследовании (п = 19) у 12 пациентов (63,2%) с ЭДТА-ассоциированной псевдотромбоцитопени-ей было выявлено наличие гаметической мутации в гене тромбоцитарного рецептора к фибриногену (полиморфизм ТС гена интегрина !Т9Б3-Ь:1 565). Определение роли генетических факторов в этиопатогенезе ЭДТА-ассоцииро-ванной псевдотромбоцитопении может послужить основой к коренному пересмотру существующих представлений о клиническом значении этого феномена.

Ключевые слова: псевдотромбоцитопения, ЭДТА, гли-копротеин, интегрин бета-3, !Т9Б3-Ь:1 565, фибриноген, тромбофилия, тромбоцит, псевдолейкоцитоз.

введение

Псевдотромбоцитопения (ПТП) представляет собой феномен ложного определения пониженного количества тромбоцитов в пробах периферической крови in vitro, т.е. при отсутствии истинного снижения количества тромбоцитов в циркулирующей крови. Основной причиной таких лабораторных расхождений является иммуноопосредованное образование тромбоцитарных агрегатов или, реже, лейкоцитарно-тромбоцитарных агрегатов и адгезии тромбоцитов на поверхности эритроцитов в присутствии стабилизирующего пробы крови антикоагулянта — дикалиевой, трикалиевоей, динатриевой солей этилендиамин-тетрауксусной кислоты (этилендиаминтетраацетат, ЭДТА, EDTA, K2EDTA, K3EDTA Na2EDTA).

Выявление феномена ЭДТА-ассоциированной агрегации тромбоцитов находится за пределами технических возможностей современных автоматических гематологических анализаторов и, в связи с повсеместным применением такого оборудования в клинических лабораториях, обуславливает значительное число лабораторных ошибок.

e-mail: doctorpolyakov@gmail.com

EDTA-associated pseudothrombocytopenia a laboratory phenomen associated with the widespread introduction into laboratory practice of hematology analyzers and standardized methods for blood samples preserving. High frequency pseudothrombocytopenia among healthy individuals (20%) and among patients with various pathological conditions (50%), and lack of control of the results, can cause a large amount of laboratory and diagnostic errors. Currently there is no reliable data on the clinical value pseudothrombocytopenia. Identify EDTA-pseudothrombocytopenia based on a comparison of the data automated hematological analysis with the results of microscopic examination platelets count or automated studies using alternative anticoagulants. Detection of somatic mutations in the platelet fibrinogen receptor gene (integrin gene polymorphism ITGB3-b: 1565 T>C) in a limited study — 63.2% (12 patients surveyed from 19) may serve as the beginning of a new direction in understanding the etiopathogenesis and clinical significance of pseudothrombocytopenia.

Keywords: pseudothrombocytopenia, EDTA, glycoprotein, integrin, integrin beta-3, ITGB3-b:1565, thrombophilia, platelet, pseudoleukocytosis.

Первые гематологические счетчики с кондукто-метрическим методом определения числа клеточных элементов получили распространение во второй половине 1950-х гг. [1]. Длительный поиск консервирующих реагентов, позволяющих сохранять и доставлять пробы крови в жидком виде при минимальном влиянии на морфологические и цитохимические особенности клеточных элементов, в итоге привел к широкому внедрению в лабораторную практику почти идеального консерванта — ЭДТА. Основной механизм антикоагулянтного действия ЭДТА состоит в связывании ионов кальция, снижении его концентрации в сыворотке, и, тем самым, ингибировании процесса свертывания крови [2]. Соответствие солей ЭДТА большинству заявленных производителями гематологических анализаторов требований, возможность применения стандартных протоколов приготовления и окраски мазков для микроскопии привели к их повсеместному внедрению и утверждению их в 1993 г. Международным советом по стандартизации в гематологии в качестве антикоагулянта выбора [3]. Единственным широко известным недостатком

солей ЭДТА долгое время считался осмотический эффект, при длительной инкубации (порядка 24 ч.) приводящий к увеличению объема (MCV) эритроцитов [4]. Менее известным недостатком применения ЭДТА является осмотический эффект «набухания» тромбоцитов, приводящий к увеличению их объема (MPV), а также к другим качественным изменениям в пробах крови [5, 6].

Впервые ЭДТА-ассоциированную тромбоцитопе-нию описали E. Gowland и соавт. (1969), которые выявили 2 случая псевдотромбоцитопении и обосновали связь этого феномена с использованием ЭДТА [7]. Термин «псевдотромбоцитопения» (англ. pseudothrombocytopenia, PTCP) был предложен в 1973 г. [8]. Крупные агрегаты тромбоцитов могут быть ошибочно распознаны анализатором как лейкоциты, что, помимо ложного снижения количества тромбоцитов, может привести и к одновременному псевдолейкоцитозу [9, 10] (рис. 1, собственные данные).

Распространенность феномена

В 1975 г. M.J. Mant [11] а затем R. Manthorpe в 1981 г. [12] первыми изучили частоту встречаемости данного явления, которая, по их данным, составила 0,3 и 1,2%, соответственно. С накоплением новых данных, распространенность ПТП стала представляться более актуальной проблемой. По результатам более поздних работ на долю ЭДТА-за-висимой ПТП приходилось уже от 0,09 до 10% от всех выполненных гемограмм вне зависимости от показаний. Распространенность среди госпитализированных пациентов оказалась выше, чем среди амбулаторных [13—17].

При анализе результатов лабораторных исследований в группе пациентов, обследуемых в связи с уже обнаруженной тромбоцитопенией, частота ПТП была гораздо выше и достигала 15—25% [18, 19]. Соотношение выявляемости среди женщин и мужчин составляло приблизительно 3:2 [20].

В отечественных публикациях данных о распространенности ЭДТА-ассоциированной ПТП нет. Специалисты нашего коллектива, С.В. Бондарчук и М.А. Михалева, в 2015 г. представили данные диспансерного наблюдения за 175 здоровыми лицами мужского пола в возрасте 18—23 лет (на момент начала наблюдения). Было проанализировано 1225

гемограмм, выполненных в течение 7 лет обучения в медицинском ВУЗе (2008—2015 гг.). Изучение ПТП не являлось целью этой работы, однако было установлено, что значительное снижение уровня тромбоцитов при скрининговых исследованиях при помощи гематологического анализатора было выявлено в 28,57% всех проб крови [21]. Имеющиеся у нас данные о последующем стационарном обследовании по поводу тромбоцитопении 32 лиц (68%) из этой группы позволяют предположить, что 75% из них имели ПТП, то есть ориентировочная частота ее выявления во всей группе наблюдения составила 21,4%.

Сведения о патогенезе псевдотромбоцитопении

Этиопатогенез ЭДТА-зависимой ПТП на сегодняшний день до конца не ясен. Считается, что основным механизмом агрегации тромбоцитов является взаимодействие некоторых антител со скрытым в физиологических условиях эпитопом рецептора тромбоцитов к фибриногену комплекса гликопротеина IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), играющего важную роль в активации агрегации тромбоцитов (рис. 2).

Неустановленный участок (эпитоп) этого мембранного белка, который экспрессируется на молекуле гликопротеина IIb, in vivo за счет достаточного содержания ионов кальция находится в комплексе с гликопротеином IIIa (GPIIb/IIIa). In vitro ЭДТА, как хелатор, связывает ионы Ca2+ и вызывает диссоциацию комплекса гликопротеина, тем самым препятствуя агрегации тромбоцитов и свертыванию крови. При ПТП изменение конфигурации белков после помещения пробы крови в пробирку с ЭДТА приводит к тому, что этот неустановленный эпитоп на молекуле GPIIb становится доступным для взаимодействия с антителами (рис. 3).

Длительное время предполагали, что взаимодействующие с активизированным эпитопом рецептора антитела относятся преимущественно к классу IgG [23]. В настоящее время считается, что взаимодействующие антитела преимущественно представлены IgM и IgG, в более редких случаях — IgA или сочетаниями различных классов иммуноглобулинов. Агрегация тромбоцитов чаще происходит при температуре 4—20°С, что может свидетельствовать о термозависимости антител, однако описаны случаи ЭДТА-зависимой агрегации и при температуре 37°С [24].

Рис. 1. Тромбоцитарные агрегаты в мазках крови при добавлении ЭДТА: А — большие агрегаты из 100 тромбоцитов;

Б — небольшие агрегаты тромбоцитов, соответствующие по размеру лейкоцитам. Ув.: А х400, Б х1000

А

Б

Рис. 2. Схема гликопротеинового комплекса ОР!!!а/!!Ь (А) и аллельные варианты белка ОР!!!а (Б), по [22] с изм.

А

Б

Рис. 3. Структура гликопротеинового комплекса ОР!!!а/!!Ь до взаимодействия с ЭДТА

Связывание антител с антигеном в конечном итоге приводит к агрегации тромбоцитов. Феномен обнаруживается уже в течение первых 5 мин. после помещения пробы крови в пробирку с ЭДТА, а с течением времени количество и размер агрегатов увеличиваются. Реакция, как правило, обратима. При восстановлении концентрации Са2 + и добавлении гепарина, механизм антикоагулянтного действия которого не зависит от кальция, целостность комплекса ОР!!Ь/!!!а восстанавливается [23—25].

В настоящее время в абсолютном большинстве лабораторий для гематологических тестов используют преимущественно калиевые соли ЭДТА (К2ЭД-ТА, К3ЭДТА), так как они обеспечивают большую стабильность размера клеток крови и не разбавляют образец. Нарушение технологии производства, а также условий хранения пробирок может привести к неравномерному распределению реагента по стенкам или образованию крупных кристаллов ЭДТА, что может способствовать образованию сгустков или фибриновых нитей в части пробы крови. Натриевая соль ЭДТА (1\1а2ЭДТА) хуже растворяется в крови, вследствие чего при ее использовании чаще образуются сгустки [26].

Клиническое значение псевдотромбоцитопении

Изучение феномена ПТП представляется необходимым, прежде всего, для определения его клинического значения. Согласно большинству публикаций, ЭДТА-ассоциированная ПТП не имеет клинических проявлений и является случайной находкой в результате рутинного анализа гемограмм.

Большинство исследователей опровергают зависимость ПТП от наличия какого-либо заболевания или патологического состояния, так как этот лабораторный феномен одинаково часто выявляется как среди больных, так и среди здоровых лиц [27], а некоторыми специалистами даже расценивается как «лабораторная болезнь» [28]. В проспективных наблюдениях при попытке найти взаимосвязь ПТП с теми или иными заболеваниями и патологическими состояниями исследователи, как правило, приходили к выводу о «физиологичности» данного феномена. Согласно данным итальянских исследователей, наблюдавших 112 пациентов с доказанной ЭДТА-зависимой ПТП в течение десяти лет, не было получено различий, свидетельствующих о возможной зависимости этого феномена от пола, возраста, наличия или возникновения в процессе наблюдения сопутствующих заболеваний, патологии гемостаза (тромбозы, геморрагии) или приёма определённых лекарственных препаратов [25].

Тем не менее, в литературе появляются данные о различии в частоте обнаружения этого феномена у пациентов с разной патологией, что не позволяет полностью исключить клиническую или даже диагностическую значимость ПТП. Так, например, имеются сведения о более высокой смертности от онкологических заболеваний в группе пациентов с ПТП [29]. Кроме того, частота выявления ПТП в пробах крови со сниженным количеством тромбоцитов в 1,5—2 раза превышает обнаружение феномена при популя-ционных обследованиях [16, 19].

По мнению М.Н. Зениной с соавт. (2016) из РосНИИГТ (неопубликованные данные), в Санкт-Петербурге частота выявления ЭДТА-зависимой ПТП среди всех пациентов гематологического профиля может достигать 20—30%, а среди пациентов отделений сосудистой хирургии с тромботическими и тромбоэмболическими осложнениями — 50%, причем выраженность феномена зависит от фазы тромботического процесса и состава проводимой терапии.

Однако наши наблюдения за пациентами клиники с онкогематологическими, кардиологическими и ревматологическими заболеваниями, а также за 34 пациентами с тромбоцитопенией, особенностями профессиональной деятельности которых является

постоянный контакт с токсичными химикатами, не выявили заметных различий в частоте обнаружения у них ПТП по сравнению со здоровыми лицами.

Особое внимание следует уделять не только ПТП, но и проблеме возможной недооценки тромбоцитоза [1]. Так, при миелопролиферативных заболеваниях (МПН) рассматриваемый феномен может привести к отсутствию или уменьшению степени тромбоци-тоза, что может явиться причиной затруднений при первичной диагностике или при контроле эффективности циторедуктивной терапии. Патологические состояния, обычно сопровождающиеся вторичным симптоматическим тромбоцитозом, в число которых входят онкологические, аутоиммунные и многие другие заболевания, при ПТП могут быть вовсе не выявлены.

Низкая информированность практикующих врачей о проблемах, связанных с феноменом ПТП, приводит к необоснованному направлению пациентов с тромбоцитопенией на специализированное дообследование, непрофильной загруженности амбулаторных гематологических кабинетов, и, как следствие, к снижению доступности гематологической помощи пациентам с заболеваниями крови.

Проблемы диагностики и направления ее

совершенствования

Важность своевременного выявления или исключения ЭДТА-зависимой ПТП сомнению не подлежит. Согласно существующим рекомендациям, любое необъяснимое ранее выявленным заболеванием или патологическим состоянием снижение уровня тромбоцитов требует исключения ПТП.

Важнейшим и в настоящее время наиболее эффективным этапом диагностики ПТП остается микроскопическое исследование мазка крови при выявлении снижения количества тромбоцитов на гематологическим анализаторе и сопоставление полученных результатов с клиническими данными. Подсчет количества тромбоцитов в камере Горяева или (предпочтительно) по методу Фонио в большинстве случаев позволяет обнаружить или исключить агрегацию тромбоцитов и другие артефакты.

Основным недостатком микроскопических методов анализа остается необходимость дополнительного вовлечения в исследование персонала лаборатории и, следовательно, значительное увеличение трудозатрат. Поэтому большинство работ по преодолению проблем, связанных с ПТП, посвящено модификациям существующих методик забора, стабилизации и обработки проб крови. Предлагаемая диагностика ПТП заключается в изменении температурных условий или использовании других антикоагулянтов, в присутствии которых тромбо-цитарные агрегаты не образуются и определяется нормальное количество тромбоцитов. Так, например, Я. Мап^огре в 1981 г. применил в качестве антикоагулянта цитрат глюкозы (ДСй) [12]. В 2012 г. было замечено предотвращение агрегации и даже диссоциация уже образованных агрегатов в присутствии канамицина [24], однако критический анализ данного феномена показал, что антикоагулянтная активность канамицина, по-видимому, обусловлена присутствующим в растворе антибиотика цитратом натрия [30].

Одним из перспективных направлений диагностики представляется возвращение в лабораторную

практику применявшегося еще с 1930-х гг. сульфата магния [30, 31]. Механизм антикоагулянтного действия магния основан на природном антагонизме с ионами кальция, который препятствует стимулированному тромбином накоплению кальция в тромбоцитах, а также уменьшению высвобождения из тромбоцитов p-тромбоглобулина и тромбоксана В2 [32]. Кроме того, изменение в присутствии магния физических свойств и проницаемости мембраны затрудняет связывание фибриногена с комплексом GPIIb/IIIa. Образующийся в присутствии магния аденозин 3'5'-циклический монофосфат (cyclic AMP) в итоге приводит к торможению фосфори-лирования P47 и мобилизации внутриклеточного кальция [33].

Имеются доказательства комплексного антикоагулянтного действия препаратов магния не только in vitro, но и in vivo, например, показана эффективность их применения как системных антикоагулянтов у кардиологических пациентов [34, 35].

P. Schuff-Werner с соавт. (2013) при изучении возможности использования сульфата магния как альтернативного антикоагулянта в рутинной лабораторной практике получили хорошие результаты [30]. Кроме того, было показано подавление агрегации тромбоцитов в том числе и при стимуляции агонистами агрегации: коллагеном, тромбином АДФ, арахидоновой кислотой. Произведенные в интересах исследования в ограниченном количестве, фабричные пробирки с сульфатом магния с 2013 г. стали коммерчески доступными в Европейском союзе [30].

G. Lippi и M. Plebani в 2012 г. предложили алгоритм выявления и диагностические критерии псев-дотромбоцитопении: снижение уровня тромбоцитов менее 100х109/л без явной клинической причины, уменьшение выраженности снижения тромбоцитов при нагревании проб крови до 37°C, отсутствие отрицательной динамики снижения уровня тромбоцитов при хранении образца в пробирке с ЭДТА, обнаружение тромбоцитарных агрегатов при микроскопии мазков крови, превалирование результатов ручного подсчета тромбоцитов над результатами автоматизированного анализа, отсутствие признаков нарушения структуры или функциональной активности тромбоцитов [36].

Любое первичное выявление тромбоцитопении должно быть основанием для подозрений на ПТП. Во всех случаях необходима микроскопическая оценка мазков крови, а при выявлении тромбоцитарных агрегатов — повторный анализ со стабилизацией пробы крови цитратом натрия и ускоренной доставкой в лабораторию. Однако, по некоторым сведениям, не менее чем в 15—20% случаев ЭДТА-индуци-рованной тромбоцитопении агрегация наблюдается и в присутствии цитрата [25], что обосновывает необходимость обязательного микроскопического контроля и подсчета тромбоцитов опытным персоналом во всех случаях.

Важно отметить, что соблюдение всеми участниками процесса лабораторного обследования пациента имеющихся методических рекомендаций и нормативных требований, определяющих необходимость подтверждения и контроля качества получения результатов анализа, практически гарантированно позволяет избежать досадных ошибок в определении количества тромбоцитов [26, 37].

Значение полиморфизма в гене тромбоцитарного

рецептора к фибриногену в патогенезе

псевдотромбоцитопении: клинические наблюдения

Сведений о наличии наследственной предрасположенности или выявлении цитогенетических маркеров ЭДТА-ассоциированной ПТП в опубликованной литературе нет. Вместе с тем, техническая возможность определения некоторых вариантов полиморфизма гена тромбоцитарного рецептора (интегрина) к фибриногену во многих лабораториях существует. Методика выявления таких наследственных точечных мутаций, которые называются также однонукле-отидными полиморфизмами (ОНП), используется при скрининговых генетических обследованиях пациентов из групп риска тромботических и тромбоэм-болических осложнений. По сложившейся практике, выявление полиморфизма А1/А2(1565Т>С) в гене интегрина рассматривается как предиктор повышенной способности тромбоцитов к агрегации. Считается, что у носителей этой гаметической мутации в различной степени повышен риск развития ранней ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, понижена чувствительность к лечению антиагрегант-ными препаратами. При беременности мутация расценивается как фактор риска развития фетоплацен-тарной недостаточности, невынашивания, гестозов, патологии плода и др. [38, 39].

В феврале 2016 г. нами впервые было выявлено 2 случая стойкой ЭДТА-ассоциированной тромбоци-топении, ассоциированной с наличием мутации ОНП в гене тромбоцитарного рецептора к фибриногену. Ввиду ряда клинически значимых различий между этими пациентами, приводим сведения об обоих.

Пациент1

Мужчина, 61 г., выявленные заболевания: ише-мическая болезнь сердца в варианте стенокардии напряжения, артериальная гипертензия I степени, двусторонняя паховая грыжа. При плановом обследовании было обнаружено бессимптомное снижение уровня тромбоцитов до 30х109/л, других изменений в анализе крови не наблюдалось. При микроскопическом подсчете по Фонио количество эритроцитов составило 169х109/л. Была диагностирована ЭДТА-зависимая ПТП. При молекулярно-генетиче-ском исследовании полиморфизма гена интегрина (ITGB3-b:1565 Т>С) был обнаружен генотип ТС.

Пациент 2

Мужчина, 18 лет, соматически здоров. При плановом диспансерном обследовании было выявлено бессимптомное снижение уровня тромбоцитов до 101х109/л, других изменений не наблюдалось. При микроскопическом подсчете по Фонио количество эритроцитов составило 185х109/л. Была диагностирована ЭДТА-зависимая ПТП. При молекулярно-ге-нетическом исследовании полиморфизма гена ин-тегрина (ITGB3-b:1565 Т>С) также был обнаружен генотип ТС.

По состоянию на июнь 2016 г. у нас есть данные о 19 пациентах различного профиля (5 пациен-

ЛИТЕРАТУРА:

1. Кишкун А.А., Гузовский А.Л. Лабораторные информационные системы и экономические аспекты деятельности лаборатории: практическое руководство. М: Лабора; 2007.

тов гематологического отделения с подозрением на тромбоцитопению, 10 пациенток женской консультации и клиники акушерства и гинекологии, 4 пациента хирургических отделений) с ЭДТА-ассоциированной ПТП, которым было проведено молекулярно-генети-ческое исследование полиморфизма гена интегрина (ITGB3-b:1565 T>C). Генотип TC был выявлен у 12 обследованных (63,2%).

Ввиду малого числа наблюдений, сделать обоснованные выводы о значении полиморфизма в гене тромбоцитарного рецептора к фибриногену (ITGB3-b:1565 T>C) в патогенезе феномена псевдотромбоцитопении пока не представляется возможным. Накопление материала будет продолжено.

Выводы

1. ЭДТА-ассоциированная ПТП представляет собой актуальную проблему современной медицины. Частота ее выявления при обследовании здоровых лиц может достигать 20%, при обследовании пациентов с различными заболеваниями и патологическими состояниями — 50%. Данный феномен может также являться причиной недооценки повышенного количества тромбоцитов при миелопролифератив-ных новообразованиях и вторичных тромбоцитозах.

2. Выявление феномена ЭДТА-ассоциированной тромбоцитопении в настоящее время не может рассматриваться как симптом или предиктор развития тех или иных заболеваний или патологических состояний, однако целесообразно продолжать диспансерное динамическое наблюдение за такими пациентами.

3. Высокая частота ошибочной интерпретации лабораторных данных на аналитическом и постаналитическом этапах лабораторной диагностики является следствием переоценки эффективности автоматизированных гематологических анализаторов и пренебрежения сотрудниками лабораторных подразделений методами подтверждения и контроля качества выполняемых тестов. Микроскопический подсчет тромбоцитов в мазке крови в настоящее время остается наиболее эффективным и доступным методом выявления ПТП.

4. Представленные данные о выявлении полиморфизма TC в гене тромбоцитарного рецептора к фибриногену (ITGB3-b:1565 T>C) у 63,2% пациентов из ограниченной группы пациентов с ЭДТА-ассоциированной ПТП (n = 19) пока не дают возможности сделать обоснованный вывод о значении этого генетического маркера в патогенезе феномена псев-дотромбоцитопении, но должны послужить сигналом к продолжению работы в данном направлении. Для получения статистически значимых результатов целесообразно выполнение генетического исследования всем пациентам с ПТП.

5. Возможное определение роли наследственной мутации в патогенезе ЭДТА-ассоциированной ПТП может послужить основой к коренному пересмотру существующих представлений о клиническом значении этого феномена.

2. Banfi G., Salvagno G.L., Lippi G. Nhe role of ethylendiamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin. Chem. Lab. Med. 2007; 45(5): 565-76.

3. England J.M., Rowan R.M., van Assendelft O.W. et al. Recommendations of the International Council for Standardization in Haematology for ethylenediaminetetraacetic acid anticoagulation of blood for blood cell counting and sizing. International Council for Standardization in Haematology: Expert Panel on Cytometry [editorial]. Am. J. Clin. Pathol. 1993; 100(4): 371-2.

4. Robinson N., Mangin P., Saugy M. Time and temperature dependant changes in red blood cell analytes used for testing recombinant erythropoietin abuse in sports. Clin. Lab. 2004; 50(5-6): 317-23.

5. McShine R.L., Sibinga S., Brozovic B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin. Lab. Haematol. 1990; 12(3): 277-85.

6. Banfi G., Salvagno G.L., Lippi G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin. Chem. Lab. Med. 2007; 45(5): 565-76.

7. Gowland E., Kay H., Spillman J.C. et al. Agglutination of platelets by a serum factor in the presence of EDTA. J. Clin. Pathol. 1969; 22: 460-4.

8. Shreiner D.P., Bell W.R. Pseudothrombocytopenia: manifestation of a new type of platelet agglutinin. Blood 1973; 42(4): 541-9.

9. Solanki D.L., Blackburn B.C. Spurious leukocytosis and thrombocytopenia. A dual phenomenon caused by clumping of platelets in vitro. JAMA 1983; 250(18): 2514-5.

10. Schrezenmeier H., Müller H., Gunsilius E. et al. Anticoagulant-induced pseudothrombocytopenia and pseudoleucocytosis. Thromb. Haemost. 1995; 73(3):506-13.

11. Mant M.J., Doery J.C., Gauldie J. et al. Pseudothrombocytopenia due to platelet aggregation and degranulation in blood collected in EDTA. Scand. J. Haematol. 1975; 15(3): 161-170.

12. Manthorpe R., Kofod B., Wiik A. et al. Pseudothrombocytopenia. In vitro studies on the underlying mechanism. Scand. J. Haematol. 1981; 26(5): 385-92.

13. Payne B.A., Pierre R.V. Pseudothrombocytopenia: a laboratory artifact with potentially serious consequences. Mayo Clin. Proc. 1984; 59(2): 123-5.

14. Vicari A., Banfi G., Bonini P.A. EDTA-dependent pseudothrombocytopaenia: a 12-month epidemiological study. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1988; 48(6): 537-42.

15. Garcia Suarez J., Calero M.A., Ricard M.F. et al. EDTA-dependent pseudothrombocytopenia in ambulatory patients: Clinical characteristics and role of new automated cell-counting in its detection. Am. J. Hematol. 1992; 39: 146-7.

16. Silvestri F., Virgolini L., Savignano C. et al. Incidence and diagnosis of EDTA-dependent pseudothrombocytopenia in a consecutive outpatient population referred for isolated thrombocytopenia. Vox Sang. 1995; 68(1): 35-9.

17. Bartels P.C., Schoorl M., Lombarts A.J. Screening for EDTA-dependent deviations in platelet counts and abnormalities in platelet distribution histograms in pseudothrombocytopenia. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1997; 57(7): 629-36.

18. Silvestri F., Virgolini L., Savignano C. et al. Incidence and diagnosis of EDTA-dependent pseudothrombocytopenia in a consecutive outpatient population referred for isolated thrombocytopenia. Vox Sang. 1995; 68(1): 35-9.

19. Manthorpe R., Kofod B., Wiik A. et al. Pseudothrombocytopenia. In vitro studies on the underlying mechanism. Scand. J. Haematol. 1981; 26(5): 385-92.

20. Püllen R., Briehl E. Pseudothrombocytopenia. Etiology, incidence and significance of a laboratory artefact. Med Klin (Munich). 1994; 89(4): 196-7.

21. Бондарчук С.В., Михалева М.А., Тыренко В.В. и др. Вариативные показатели гемограммы у курсантов и слушателей Военно-

медицинскои академии им. С.М. Кирова. Вестн. Росс. Воен. Мед. Акад. 2016; 2(54): 76-80.

22. Bussel J.B., Kunicki T.J., Michelson A.D. Platelets: new understanding of the platelet glycoproteins and their role in disease. Am. Soc. of Hematol. Educ. Program 2000: 222-38.

23. Fitzgerald L.A., Phillips D.R. Calcium regulation of the platelet membrane glycoprotein IIb-IIIa complex. J. Biol. Chem. 1985; 260(20): 11366-74.

24. Hyojin Chae, Myungshin Kim, Jihyang Lim et al. Novel method to dissociate platelet clumps in EDTA-dependent pseudothrombocytopenia based on the pathophysiological mechanism. Clin. Chem. Lab. Med. 2012; 50(8): 1387-91.

25. Bizzaro N. EDTA-dependent pseudothrombocytopenia: a clinical and epidemiological study of 112 cases, with 10-year follow-up. Am. J. Hematol. 1995; 50: 103-9.

26. Министерство здравоохранения и социального развития (РФ). Методические рекомендации. Гематологические анализаторы. Интерпретация анализа крови. M.; 21.03.2007; №2050-РХ, http://clinlabs.com/sites/default/files/content/dokument/ hemanalizator.pdf

27. Sweeney J.D., Holme S., Heaton W.A. et al. Pseudothrombocytopenia in plateletpheresis donors. Transfusion 1995; 35(1): 46-9.

28. Gschwandtner M.E., Siostrzonek P., Bodinger C. et al. Documented sudden onset of pseudothrombocytopenia. Ann. Hematol. 1997; 74(6): 283-5.

29. Ohashi-Fakuda N., Inokuchi R., Sato H. et al. Poorer Prognosis With ethylenediaminetetraacetic acid-dependent pseudothrombocytopenia. A single-center case control study. Medicine (Baltimore) 2015; 94(15): e674.

30. Schuff-Werner P., Steiner M., Fenger S. et al. Effective estimation of correct platelet counts in pseudothrombocytopenia using an alternative anticoagulant based on magnesium salt. Br. J. Haematol. 2013; 162(5): 684-92.

31. Lenhartz H., Meyer E. Mikroskopie und Chemie am Krankenbett. Berlin: Springer; 1934.

32. Hwang D.L., Yen C.F., Nadler J.L. Effect of extracellular magnesium on platelet activation and intracellular calcium mobilization. Am. J. Hypertens. 1992; 5(10): 700-6.

33. Sheu J.R., Hsiao G., Shen M.Y. et al. Mechanisms involved in the antiplatelet activity of magnesium in human platelets. Br. J. Haematol. 2002; 119(4): 1033-41.

34. Gries A., Bode C., Gross S. et al. The effect of intravenously administered magnesium on platelet function in patients after cardiac surgery. Anesth. Analg. 1999; 88(6): 1213-9.

35. Shechter M., Merz C.N., Paul-Labrador M. et al. Oral magnesium supplementation inhibits platelet-dependent thrombosis in patients with coronary artery disease. Am. J. Cardiol. 1999; 84(2): 152-6.

36. Lippi G., Plebani M. EDTA-dependent pseudothrombocytopenia: further insights and recommendations for prevention of a clinically threatening artifact. Clin. Chem. Lab. Med. 2012; 50(8): 1281-5.

37. Росстандарт (РФ). Контроль качества клинических лабораторных исследовании: национальныи стандарт Россиискои Федерации. 2010; ГОСТ Р 53133.2-2008.

38. Jeddi-Tehrani M., Torabi R. et al. Analysis of plasminogen activator inhibitor-1, integrin beta3, Beta fibrinogen, and methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms in Iranian women with recurrent pregnancy loss. Am. J. Reprod. Immunol. 2011; 66(2): 149-56.

39. Juárez-Velázquez R., Canto P., Canto-Cetina T. et al. Analysis of polymorphisms in genes (AGT, MTHFR, GPIIIa, and GSTP1) associated with hypertension, thrombophilia and oxidative stress in Mestizo and Amerindian populations of México. Dis. Markers 2010; 28(5): 32331.

Поступила: 20.07.2016