ХИМЕРНЫЙ ИММУНОГЛОБУЛИНОВЫЙ ПРЕПАРАТ, ОБЛАДАЮЩИЙ СПЕЦИФИЧЕСКИМ ПРОТИВОВИРУСНЫМ ИЛИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ
CHIMERIC IMMUNOGLOBULIN PREPARATION WITH SPECIFIC ANTIVIRAL OR ANTIBACTERIAL EFFECT

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии и может быть использовано для получения специфического иммуноглобулинового препарата, предназначенного для лечения и профилактики иммунодефицитных состояний, бактериальных или вирусных инфекций человека и животных.
В настоящее время разработаны и используются только препараты иммуноглобулина из сыворотки крови человека. Современные коммерческие препараты сывороточного иммуноглобулина содержат в основном иммуноглобулины класса G (85-93%) и лишь 1-3% иммуноглобулинов других классов.
В ряде стран выпускаются и успешно применяются в клинике препараты, обогащенные иммуноглобулинами класса A и M (IgA и IgM) как для внутримышечного, так и для внутривенного введения, однако, несмотря на широкое медицинское и ветеринарное применение препаратов иммуноглобулинов как гомологических, так и гетерологических, в настоящее время отсутствуют препараты секреторных иммуноглобулинов, предназначенные для лечебного и профилактического применения, позволяющие широко варьировать пути введения такого препарата.
Секреторные IgA и IgM являются классами иммуноглобулинов, обеспечивающими защиту организма от инфекционных агентов непосредственно в воротах их проникновения - в коже и на слизистых оболочках [1]. При этом в условиях локализованного на слизистых оболочках инфекционного процесса основную роль в защите организма играет выделяющийся в секретах слизистых антиген-специфический секреторный иммуноглобулин. Отличием секреторных иммуноглобулинов от сывороточных иммуноглобулинов является способность проникать через неповрежденные слизистые оболочки и кожные покровы и длительно сохраняться в секретируемых жидкостях. Антиген-специфический секреторный IgA (S-IgA) способен агглютинировать микробные тела, связывать токсины [2] и регулировать функциональную активность иммунокомпетентных клеток в очаге воспаления [3], препятствуя генерализации инфекционного процесса и развитию системного иммунного ответа. Специфический S-IgA вырабатывается как на бактериальные [4], так и на вирусные [5, 6, 7] антигены. Причем на моделях вирусных инфекций показано, что S-IgA способен не только взаимодействовать с вирионами на поверхности слизистых, но и проникать внутрь инфицированных клеток, блокируя там репликацию вирусов.
Большой клинический интерес представляет препарат специфического поликлонального человеческого S-IgA, однако сложность подбора доноров для его получения резко ограничивают разработку и его практическое применение. Поэтому особый интерес для промышленного производства представляют препараты гетерологического S-IgA.
Известен препарат для лечения рассеянного склероза, в котором в качестве активного компонента используют молозиво от беременного скота, иммунизированного вирусом кори и/или вирусом Onderstepoort [8]. Недостатком данного препарата является то, что его получают из малодоступного источника, а также то, что он предназначен исключительно для внутреннего (орального) применения.
Наиболее близким к заявляемому препарату - прототипом, является иммуноглобулиновый препарат [9], обладающий противовирусным или антибактериальным действием, содержащий S-IgA с чистотой не менее 99,0%, выделенный из молока и/или молозива иммунизированных копытных животных, стабилизатор и фармацевтически пригодный наполнитель при следующем содержании компонентов, мас. %: S-IgA - 6,0-12,0;стабилизатор - 1,0-4,0; наполнитель - остальное.
Недостатками данного препарата является то, что используемый иммуноглобулин является гетерологическим белком, к которому в организме развивается иммунный ответ с образованием антииммуноглобулиновых антител. При необходимости длительного введения гетерологического препарата эффективность его снижается до нуля и повторный курс введения такого препарата может привести к развитию иммунокомплексных осложнений, таких как анафилактический шок, сывороточная болезнь, иммунокомплексный артрит, геморрагический васкулит.
Кроме того, секреторный компонент, содержащийся в большинстве S-IgA животного происхождения, является слабо гликозилированным, в то время как показано, что большая часть антибактериальной активности секреторного иммуноглобулина связана с возможностью сорбции им микроорганизмов и эта способность в высокой степени зависит от количества гликозидных остатков. Человеческий секреторный компонент по этому показателю значительно превосходит аналоги животного происхождения, в частности, бычий секреторный компонент - в 2,5 раза [10].
Задачей изобретения является создание высокоочищенного иммуноглобулинового препарата на основе S-IgA, со сниженной иммуногенностью и реактогенностью и более широким спектром терапевтической эффективности, пригодного для перорального, парентерального и местного применения.
Технический результат: снижение иммуногенности и реактогенности и расширение спектра терапевтической эффективности.
Поставленная задача решается заявляемым иммуноглобулиновым препаратом, содержащим химерный S-IgA с чистотой не менее 98-99,0%, выделенный из молока и/или молозива иммунизированных коров.
Химерный S-IgA представляет собой бычий, частично гуманизированный S-IgA, полученный путем замены бычьего секреторного компонента на человеческий донорский или рекомбинантный компонент.
50
50
Базовый препарат (субстанция) содержит 6-12% химерного S-IgA, имеет величину pH 4-8, антикомплементарную активность не менее 10 мг белка, не активирующих 2 CH, защищает в >70% от соответствующих инфекций при заражении макроорганизма в дозах >10 ИД, является ареактогенным при внутривенном введении, может содержать стабилизирующие добавки в общей концентрации не более 4%.
Предлагаемый препарат, в силу сниженной иммуногенности, имеет существенные преимущества по сравнению с прототипом за счет расширения спектра терапевтической эффективности при применении для лечения бактериальных респираторных инфекций, среди которых особое место занимают пневмококки (Sp. pneumoniae) и палочка инфлюэнцы (Haemophilus influenzae).
На базе субстанции могут выпускаться различные лекарственные формы для парентерального, перорального и местного применения
Способ получения предлагаемого препарата заключается в следующем.
1. Иммунизация животных
50
50
Беременных коров иммунизируют 2-х кратно живой или синтетической вакциной: 1-ю иммунизацию проводят за 40 дней до отела (для создания бустер-иммунитета) в дозе 0,1 ИД, при этом половину дозы вводят внутримышечно, а половину - в ткань вымени; 2-ю иммунизацию (разрешающую) проводят за 10 дней до отела в дозе 10 ИД внутримышечно.
2. Выделение иммуноглобулиновой фракции молозива известным методом [11]
Молозиво и молоко начинают собирать через 2-3 дня после родов. Жир удаляют центрифугированием, водную фазу подкисляют 1 н уксусной кислотой до pH 4,6 для осаждения казеина. Далее проводят очистку препарата от балластных веществ и агрегированного иммуноглобулина. Для этого глобулиновую фракцию осаждают путем добавления сульфата аммония до конечной концентрации 27% при постоянном перемешивании с последующим центрифугированием при 12000 g в течение 10 мин. при 4°C. Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде и диализуют в течение суток 50 объемами (V) дистиллированной воды. Образовавшийся преципитат осаждают центрифугированием при 12000 g в течение 10 мин. при 4°C и отбрасывают, а супернатант диализуют в течение суток 50 V 0,1 М ацетатного буфера с pH 4,5.
3. Деградация белковых примесей методом [11]
К полученному раствору добавляют пепсин из расчета 1 часть фермента на 50 частей содержащегося белка, инкубируют в течение суток при 37°C. Протеолиз прекращают повышением pH до 8.
4. Отщепление секреторного компонента трипсином и получение препарата, содержащего димерный иммуноглобулин А методом [12]
Для расщепления секреторного компонента, находящегося в составе секреторных иммуноглобулинов после инактивации пепсина, к реакционной смеси добавляют трипсин до конечного соотношения 1 часть трипсина на 100 частей белка. Через 2 часа трипсинизацию останавливают добавлением двойного количества ингибитора трипсина.
5. Выделение димерного иммуноглобулина А
Полученную смесь подвергают гель-фильтрации с использованием Сефакрила S300, уравновешенного трис-буфером (0,1 М трис-HCl с pH 7,0, 10 мМ ЭДТА и 1 М NaCl). Чистоту S-IgA-фракции оценивают в Вестерн-блоте в невосстанавливающих условиях с помощью антител против α-цепей бычьего иммуноглобулина А (анти-α) и антител против бычьего секреторного компонента (анти-SC). Детектируемая полоса должна соответствовать по миграции димерному IgA, специфически связываться с анти-α быка антителами при отсутствии реакции с анти-SC-антителами. При неудовлетворительных результатах разделения проводят повторную гель-фильтрацию с большим разрешением колонки. Полученный фильтрат, представляющий собой димерный IgA, концентрируют и диализируют против 50 V фосфатно-солевого буфера pH 7,2.
6. Реассоциация S-IgA с использованием человеческого рекомбинантного или донорского секреторного компонента
К полученному димерному IgA добавляют в эквимолярном соотношении рекомбинантный или донорский человеческий секреторный компонент (5:1 вес/вес) и инкубируют 2 часа при комнатной температуре в фосфатном буфере при общем содержании белка около 1%. Выделение химерного S-IgA производят гель-фильтрацией с использованием Сефакрила S300, уравновешенного трис-буфером (0,1 М трис-HCl с pH 7,0, 10 мМ ЭДТА и 1 M NaCl).
Выход целевого продукта по белку составляет 3-5 г из 1 л молозива.
Препарат тестируют на специфическую активность путем установления титра специфических антител в реакциях непрямой гемагглютинации, реакции торможения гемолиза, иммуноферментным и радиоиммунным, в реакциях нейтрализации на клеточных культурах и модельных животных и другими методами.
Конечная форма препарата может быть либо жидкая, либо лиофилизированная. Для получения жидкой формы концентрацию белка доводят до 6-12%, устанавливают величину pH 4,0-8,0, вводят стабилизаторы, выбранные из группы глицин, никотинамид, глюкоза, далее иммуноглобулин подвергают стерилизующей фильтрации и разливают по флаконам, а для получения сухой формы препарат после розлива по флаконам лиофилизируют.
Определяющим существенным отличием заявляемого препарата, по сравнению с прототипом, является то, что в качестве иммуноглобулина используют химерный S-IgA, что позволяет снизить иммуногенность и реактогенность препарата, расширить спектр терапевтической эффективности, снизить риск развития иммунокомплексных осложнений, увеличить срок применения, повысить сорбционную и агглютинирующую активность препарата в отношении микроорганизмов. При этом препарат так же, как и прототип, обладает низкой антикомплементарной активностью (АКА), отсутствием агрегатов, низким содержанием фрагментов и стабильностью указанных показателей при хранении.
Заявляемый препарат имеет следующие показатели качества.
50
1. Специфическая активность (по реакции нейтрализации in vitro и in vivo): защищает в >70% от соответствующих инфекций при заражении макроорганизма в дозах ≥10 ИД.
50
2. Антикомплементарная активность: не менее 10 мг белка, не активирующих 2 CH.
3. Препарат при вестерн-блоте в невосстанавливающих условиях образует 1 полосу, которая по миграции соответствуют sIgA, дает положительную реакцию с анти-α быка и с анти-SC человека антителами.
4. Количество иммунологически неактивных примесей: 0-1%.
5. Содержание фрагментов: не более 10% в конце срока хранения.
6. Стабильность при хранении: 2 года при хранении в темном месте при температуре +4 - +6°С.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного получения заявляемого препарата.
Пример 1. Получение сухого химерного противооспенного S-IgA.
50
50
2
2
Беременных коров иммунизировали 2-х кратно живой осповакциной. 1-я иммунизация проводилась за 40 дней до отела, 2-я иммунизация - за 10 дней до отела. 1-я иммунизация (примирование) использовалась для создания бустер-иммунитета, проводилась в дозе 0,1 ИД, при этом половина вводилась внутримышечно, половина - в ткань вымени. 2-я иммунизация (разрешающая) проводилась в дозе 10 ИД внутримышечно. Молозиво и молоко начинали собирать через 2-3 дня после родов. Жир удаляли центрифугированием при 20000 об./мин. в течение 2 ч. Водную фазу подкисляли 1 н уксусной кислотой до pH 4,6 для осаждения казеина. Глобулиновую фракцию осаждали путем добавления сульфата аммония до конечной концентрации 27% при постоянном перемешивании с последующим центрифугированием при 12000 g в течение 10 мин. при 4°C. Полученный осадок растворяли в дистиллированной воде и диализировали в течение суток 50 объемами дистиллированной воды. Образовавшийся преципитат осаждали центрифугированием при 12000 g в течение 10 мин. при 4°C, супернатант диализировали в течение суток 50 объемами 0,1 М ацетатного буфера с pH 4,5 и доводили концентрацию белка до 25 мг/мл. К полученному раствору добавляли пепсин из расчета 1 часть фермента на 50 частей содержащегося белка, инкубировали в течение суток при 37°C, после чего раствор оттитровали добавлением 1 н NaOH до pH 8. К той же смеси добавляли трипсин до конечного соотношения 1 часть трипсина на 100 частей белка. Через 2 часа добавили двойное количество ингибитора трипсина. 50 мл полученной смеси подвергли гель-фильтрации на 2-х тандемно расположенных колонках 5×90 см, заполненных Сефакрилом S300, уравновешенным трис-буфером (0,1 М трис-HCl с pH 7,0, 10 мМ ЭДТА и 1 М NaCl). Вытесняющий раствор подавали в восходящем направлении при помощи перистальтического насоса со скоростью 2,54 мл/см/ч. Исключенный объем собирался аликвотами по 25 мл. Целевые фракции (по данным иммунодиффузии с анти-α-антителами) выходили с 1400 мл по 1650 мл эффлюента. Отобранные аликвоты концентрировали до содержания белка 25 мг/мл и дважды очищали гель-фильтрацией на 2-х тандемно расположенных колонках 2,5×90 см, заполненных Сефакрилом S300, уравновешенным трис-буфером (0,1 М трис-HCl с pH 7,0, 10 мМ ЭДТА и 1 М NaCl) при скорости подачи эффлюента 4,41 мл/см/ч. Целевые фракции (с 350 до 500 мл вытесненного объема) концентрировали и диализировали против 50 объемов фосфатно-солевого буфера pH 7,2.
К полученному димерному IgA добавили рекомбинантный человеческий секреторный компонент в соотношении 5:1 (вес/вес) соответственно, доведя фосфатным буфером раствор до общего содержания белка 1% и выдержали 2 часа при комнатной температуре. После реассоциации провели повторную гель-фильтрацию на колонках 2,5×90 см как было описано выше.
Выход целевого продукта составил около 3 г на 1 л сырья. Концентрацию белка довели до 12% с помощью диафильтрации против 0,1 М фосфатного буфера, pH установили до величины 4,5±0,4, ввели стабилизатор глицин в количестве 25 г/л, полученный раствор иммуноглобулина подвергли стерилизующей фильтрации. Полученный препарат разлили по флаконам и лиофилизировали.
Пример 2. Препарат жидкого химерного противооспенного S-IgA для внутривенного введения.
Препарат химерного S-IgA получали аналогично примеру 1, за исключением того, что к полученному димерному IgA добавили донорский человеческий секреторный компонент в соотношении 5:1 (вес/вес) соответственно, концентрацию белка довели до 6,0%, устанавили величину pH 4,0-8,0, ввели глицин в количестве 22,5 г/л и никотинамид в количестве 7,5 г/л в качестве стабилизаторов, далее иммуноглобулин подвергли стерилизующей фильтрации и разлили по флаконам.
Пример 3. Препарат сухого химерного противооспенного S-IgA для инъекций.
Препарат химерного S-IgA получали аналогично примеру 1, за исключением того, что концентрацию белка доводили до 10%, а в качестве стабилизаторов использовали глюкозу в количестве 20 г/л и глицин в количестве 20 г/л. Полученный препарат разлили по флаконам и лиофилизировали.
Пример 4. Получение жидкого химерного антистафилококкового S-IgA.
Иммунизацию беременных коров проводили адсорбированным стафилококковым анатоксином двукратно: в первый раз за 2 мес.до отела в дозе 0,5 мл подкожно, во второй - за 10-14 дней до отела в дозе 2,0 мл. При этом 2-е введение проводили следующим образом: 1,75 мл подкожно и 0,25 мл в ткань вымени. Молоко и молозиво начинали собирать через 2-3 дня после отела.
Препарат химерного антистафилококкового S-IgA получали аналогично примеру 2. Полученный жидкий препарат для внутривенного введения обладал антитоксической активностью 40 МЕ/мл.
Пример 5. Сравнительная характеристика препаратов бычьего антипневмококкового S-IgA и химерного (бычьего частично гуманизированного) антипневмококкового S-IgA (на примере экспериментальной пневмококковой инфекции у мышей).
Иммунное антипневмокковое молозиво получали путем двукратной иммунизации беременных коров антипневмококковой вакциной Пневмовакс 23: в первый раз за 2 мес. до отела в дозе 0,1 мл в полном адъюванте Фрейнда подкожно, во второй - за 10-14 дней до отела в дозе 2,0 мл. При этом 2-е введение проводили следующим образом: 1,75 мл в полном адъюванте Фрейнда подкожно и 0,25 мл без адъюванта в ткань вымени. Молоко и молозиво начинали собирать через 2-3 дня после отела.
Препарат химерного (бычьего частично гуманизированного) антипневмококкового S-IgA получали аналогично примеру 1, а бычьего антипневмококкового S-IgA также аналогично примеру 1, но без обработки трипсином и без стадии конъюгации с человеческим рекомбинантным секреторным компонентом. После обработки пепсином смесь оттитровали добавлением 1н NaOH до pH 7,0. Очистку иммуноглобулина проводили аналогично примеру 1.
Эксперимент провели на 3-х группах мышей-самок C57BL/6J в возрасте 8 недель, по 25 животных в каждой группе, которые получали интраназально в течение 2 месяцев с интервалом в 2 дня испытуемый препарат в дозе 150 мкг в 50 мкл физраствора на мышь: 1-я группа - химерный (бычий частично гуманизированный) антипневмококковый S-IgA; 2-я группа - бычий антипневмококковый S-IgA и 3-я (контрольная) группа - получала аналогичный (по белку) раствор бычьего сывороточного альбумина. На следующие сутки после 20-го введения препаратов по 5 животных в каждой группе забивали для определения анти-IgA антител в бронхальвеолярном секрете, а остальных животных заражали интраназально культурой пневмококов S. pneumoniae штамма Р303 (серотип 6А). После заражения введение иммуноглобулиновых препаратов продолжалось в том же режиме.
Штамм S. pneumoniae P303 (серотип 6А), прекультивировали на кровяном агаре в течение ночи при температуре 37°C. Затем колонии переносили на бульон Тодда-Хьюитта (Difco, Detroit, MI, USA) с добавлением 0,5% дрожжевого экстракта и культивировали без перемешивания до достижения оптической плотности культуры 0,4 ОЕ при длине волны 600 нм, добавляли глицерин до 20% и отобранные аликвоты хранили при температуре -80°C до использования.
6
Мышей заражали S. pneumoniae путем введения по 5×10 КОЭ/мышь в 10 мкл физраствора в одну ноздрю с помощью микропипетки. Кривую выживания животных отслеживали в течение 10 дней.
На 6 сутки в контрольной 3-й группе погибли все животные, на 10-е сутки в 1-й группе летальность составила 7 животных (25%), во 2-й группе 11 животных (45%). При этом в бронхоальвеолярном лаваже во 2-й группе обнаруживались антитела против бычьих α-цепей иммуноглобулинов в количестве 5,8±0,5 мкг/мл. В 1-й группе и в контрольной группе анти-α антител не выявлялось. Таким образом, величина защитного действия сравниваемых иммуноглобулиновых препаратов коррелировала с анти-α иммунным ответом на слизистых оболочках дыхательных путей.
Полученные данные показывают, что иммунный ответ на длительное введение гетерологического иммуноглобулина существенно снижает клиническую эффективность препарата гетерологического S-IgA даже при местном его применении, а «маскировка» антигенных детерминант α-цепей гетерологического иммуноглобулина гомологичным секреторным компонентом в полученном химерном S-IgA, отменяет (или сильно замедляет) развитие иммунного ответа, направленного против гетерологических тяжелых цепей иммуноглобулина А. Данное преимущество заявляемого химерного S-IgA перед нативным гетерологическим S-IgA имеет большое значение при необходимости длительного многократного или повторного курсового введения иммуноглобулинового препарата, например, при решении задачи эрадикации антибиотикорезистентной патогенной резидентной микрофлоры дыхательных путей при таких заболеваниях, как хронические риносинуситы, хронический обструктивный бронхит, инфекционно-аллергическая бронхиальная астма, что значительно расширяет спектр возможного терапевтического применения предлагаемого препарата.
Таким образом, предложен химерный иммуноглобулиновый препарат, обладающий терапевтической активностью (действием) в отношении тех бактерий или вирусов, против которых проводилась иммунизация животных. Заявляемый препарат химерного (бычьего, частично гуманизированного) S-IgA, в отличие от всех прочих препаратов молока и/или молозива, можно применять парентерально, а не только внутрь, поэтому предлагаемый препарат можно применять, в том числе, при тех инфекциях, при которых традиционно вводят специфический сывороточный иммуноглобулин.
Разработанный специфический химерный иммуноглобулиновый препарат S-IgA обладает высокой активностью антител по отношению к бактериальной или вирусной инфекции, низкой антикомплементарной активностью, стабилен при хранении, пригоден для широкого использования в медицинской практике для лечения и профилактики иммунодефицитных состояний, бактериальных или вирусных инфекций человека и животных, при этом возможно длительное применение и применение повторными курсами.
Источники информации
1. Kerr М.A. The structure and function of human IgA. // Biochem. J. - 1990. - V. 271. - p. 1553-1559.
2. Jarvis G.A, Griffis J.M. Human IgAl blockade of IgG-initiated lysis of Neisseria meningitides is a function of antigen-binding fragment binding to polessaccharide capsule // J. Immunol. - 1991. - V. 147. - p. 1962-1967.
3. Kaetzel C.S., Robinson J.K., Chintalacharuvu K.R. et al. The polymeric immunoglobulin receptor (secretory component) mediates transport of immune complex across epithelial cells: a local defense function for IgA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - V. 88. - p. 8796-8800.
4. Glass M., Svennerholm A-M., Stoll B.J. et al. Protection against cholera in breast-fed children by antibodies in breast milk. // N. Engl. J. Med. - 1983. - V. 108. - p. 1389-1392.
5. Mazanec M.B., Nedrud J.G., Lamm M.E. Immunoglobulin A monoclonal antibodies protect against Sendai Virus. // J. Virol. - 1987. - V. 61. - p. 2624-2626.
6. Turner R.B., Kelsey D.K. Passive immunization for prevention of rotavirus illness in healthy infants. // J. Infect Dis. - 1987. -V. 156. - p. 158-166.
7. Renegar K.B., Small P.A. Immunoglobulin A mediation of murine nasal anti-influenza virus immunity. // J. Virol. - 1991. - V. 65. - p. 2146-2146.
8. Акцептованная заявка JP 443888, кл. A61K 39/42, опубл. 10.03.82.
9. Патент RU 2264229 C2, кл. A61K 39/395, оп. 20.11.2005.
10. Gustafsson A., Kacskovics I., Breimer M.E., et al. Carbohydrate phenotyping of human and animal milk glycoproteins // Glycoconjugate Journal. - 2005. - V. 22. - N 3. - p. 109-118.
11. Nielsen K. A Method for Preparation of IgA from Bovine Mammary Secretions // Can. J. Vet. Res. - 1986. - V. 50. - p. 227-231.
12. Beale D. Differences in fragmentation between bound and unbound bovine secretory component suggest a model for its interaction with polymeric immunoglobulin. // Biochem. J. - 1985. - V. 229. - p. 759-763.