Перфориновый потенциал эффекторных клеток у онкологических больных

А. А. Борунова1, Г. З. Чкадуа2, Т. Н. Заботина1, З. Г. Кадагидзе1

ПЕРФОРИНОВЫЙ ПОТЕНЦИАЛ ЭФФЕКТОРНЫХ КЛЕТОК У ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва 2НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

Целью данной работы было изучение перфоринового потенциала эффекторных клеток у онкологических больных, получавших вакцину на основе аутологичных дендритных клеток. Проведено исследование лимфоцитов периферической крови больных с диссеминированной меланомой (п=6). В качестве контроля исследовали лимфоциты периферической крови доноров (п=6). Кровь для исследования получали до лечения и через 2 нед после каждого введения вакцины (6 введений). Было выявлено, что после применения аутологичной вакцины нормализуется NK-клеточный пул, в 3 раза и более увеличивается исходно сниженная экспрессия перфорина в CD45-лимфоцитах, преимущественно за счет популяции CD8+-перфорин+. Таким образом, применение аутологичной вакцины на основе дендритных клеток приводит к активации эффекторного звена иммунитета.

Ключевые слова: перфорин, CD8, CD16, эффекторные клетки.

В настоящее время показано, что большинство опухолей избегает механизмов иммунологического контроля. При прогрессировании заболевания опухолевые клетки не только остаются незамеченными для иммунных клеток, но и способны подавлять противоопухолевый иммунный ответ организма. Доказано, что на фоне злокачественной опухоли развивается анергия потенциальных клеток-эффекторов [1]. В связи с этим уделяется все больше внимания разработке методов искусственной стимуляции специфического иммунного ответа. Особое место среди методов противоопухолевой иммунотерапии занимает вакцинотерапия.

Одним из основных механизмов реализации цитотокси-ческой функции эффекторных клеток является экзоцитоз литических гранул (содержащих перфорин и гранзимы), которые взаимодействуют с цитоплазматической мембраной клеток-мишеней [3; 6; 7]. Показано, что снижение количества перфорина в эффекторных клетках приводит к нарушению их цитотоксической функции [5]. Это объясняет важность исследования содержания перфорина в эффекторных клетках во время биотерапии злокачественных опухолей. В ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН в рамках I фазы клинических испытаний проводится изучение механизмов действия аутологичной вакцины на основе дендритных клеток. Цель данной работы — изучение перфоринового потенциала эффекторных клеток у онкологических больных на фоне вакцинотерапии.

Материал и методы

Больным вводили вакцину на основе аутологичных дендритных клеток с фенотипом CD83+CD80+CD54+CD86+HLA-

© Борунова А. А., Чкадуа Г. З., Заботина Т. Н., Кадагидзе З. Г., 2005 УДК 616-006-053:616-097

Dr+++, нагруженных опухолевыми антигенами больного. Дендритные клетки для вакцины получали из моноцитов периферической крови, культивируемых в присутствии ростовых факторов. Источником антигенов служил опухолевый материал, полученный от больного [2].

Проведено исследование лимфоцитов периферической крови больных с диссеминированной меланомой (n=6). В качестве контроля исследовали лимфоциты периферической крови доноров (n=6). Вакцину вводили по следующей схеме: первые 3 введения каждые 2 нед, последующие 3 введения ежемесячно. Кровь для исследования получали до лечения и через 2 нед после каждого введения вакцины (перед очередным введением). Всем больным проведено не менее 6 вакцинаций.

Исследование иммунофенотипа мононуклеаров периферической крови проводили с использованием моноклональных антител к поверхностным антигенам CD8, CD16, конъюгированных с флюоресцеина изотиоцианатом (FITC, «Becton Dickinson»). Уровень внутриклеточного перфорина оценивали по связыванию с антителами к человеческому перфорину (anti-human perforin R-phycoerythrin). В качестве контроля использовали соответствующие изотипоспецифические сыворотки, меченные флюоресцеина изотиоцианатом и фикоэрит-рином. Мононуклеары выделяли по стандартной методике на градиенте плотности фиколл — верографин. Окрашивание поверхностных антигенов проводили в соответствии с протоколом прямого иммунофлюорсцентного окрашивания моно-нуклеарных клеток («BD Biosciences»), окрашивание перфорина — в соответствии с протоколом внутриклеточного окрашивания с растворами «FIX & PERM» («BD Biosciences»). Исследование иммунофенотипа периферических лимфоцитов проводили на проточном цитофлюориметре «FACScan» («Becton Dickinson», США) с использованием программного обеспечения «Lysis II». Калибровку проточного цитофлюори-метра осуществляли с помощью коммерческих наборов «CaliBRITETM Beads» («Becton Dickinson»).

Результаты и обсуждение

При однопараметровом исследовании иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови больных диссеминированной меланомой до лечения было выявлено значительное снижение экспрессии антигена СБ16 (5—7%). В то же время число СВ16-лимфоцитов в донорской группе составляло 10—15%. Экспрессия антигена СБ8 до лечения была значительно повышена (35±5%). В донорской группе доля СБ8-лимфоцитов составила 25±5%. Цитотоксический потенциал эффекторных лимфоцитов оценивали по внутриклеточному содержанию перфорина. До вакцинотерапии СБ45-перфо-рин-положительных лимфоцитов было 10±5%, т. е. значительно меньше, чем в контрольной группе (25±5%).

В процессе вакцинотерапии экспрессия перфорина в лимфоцитах увеличилась в 3 раза и более. В результате содержание СБ45-перфорин-положительных лимфоцитов составило 35±5% (рис. 1). При субпопуляционном анализе эффектор-ного звена клеточного иммунитета было обнаружено, что до вакцинотерапии перфорин распределялся преимущественно в СБ16-лимфоцитах и незначительно — в СБ8-лимфоцитах. Так, до вакцинотерапии доля СБ16-перфорин-положитель-ных клеток составляла 70—80% от общего пула МК-клеток. У доноров уровень экспрессии перфорина в СБ16-лимфоци-тах был несколько выше и составлял 80—90%. На фоне лечения СБ16-перфорин-положительные МК-клетки полностью исчезли, а все СБ16-лимфоциты стали экспрессировать перфорин (рис. 2.А, 3.А). Увеличение экспрессии перфорина было также отмечено в СБ8-лимфоцитах. Так, до начала лечения перфорин экспрессировали лишь 10±5% СБ8-клеток. На фоне вакцинотерапии доля СБ8-перфорин-положитель-ных клеток возрастала до 55±5%. Следует отметить, что экспрессия перфорина в СБ8-лимфоцитах у доноров составила 40±5% (рис. 2.Б, 3.Б).

На фоне лечения при одинаковом числе СБ16-перфорин-положительных клеток зафиксировано увеличение интенсивности экспрессии внутриклеточного перфорина, а именно — степени насыщения клеток гранулами перфорина (рис. 4). Анализ экспрессии внутриклеточного перфорина проводили по методу Колмогорова—Смирнова. Этот метод позволяет проводить количественный анализ флюоресценции каждой из клеток, составляющих гистограмму (кривую). С этой целью использовали режим наложения 2 гистограмм в одной системе координат. Коэффициент различия гистограмм, отражающих экспрессию перфорина СБ16-клетками до начала лечения и после 6-й вакцинации, составил 99%.

Рисунок 1. Перфориновый профиль CD45-лимфоцитов.

А. — Экспрессия перфорина до лечения. Б. — Экспрессия перфорина на фоне лечения.

100

90

80

о4 70

о т е 60 50

я л о Д 40 30

20

10

0

А

CD16+P-^ CD16+P+

о

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0

Б

1

2

3

V CD8+P-п CD8+P+

Рисунок 2. Распределение перфорина в эффекторных клетках.

А. — CD16-лимфоциты. Б. — CD8-лимфоциты.

1. До лечения. 2. На фоне лечения. 3. Доноры.

14,3%

:: 4И“. * * ч

'1 '»/.   . 1,2%

А

14,5% 18,7%

к • * А !«' * , . -.-Г '’! V   . 21,2%

Б

Рисунок 3. Экспрессия перфорина в эффекторных клетках больного диссеминированной меланомой на фоне вакцинотерапии.

А. — CD16-лимфоциты. Б. — CD8-лимфоциты.

2

3

Рисунок 4. Экспрессия перфорина CD^-клетками на фоне лечения.

А. — Экспрессия перфорина до лечения. Б. — Экспрессия перфорина на фоне лечения.

В современной литературе активно обсуждается вопрос противостояния иммунокомпетентных и опухолевых клеток. Так, согласно работам M. Smyth и соавт., существует обратная корреляция между активностью естественных киллеров и метастазированием опухоли, а метастазирова-ние опухоли контролируется преимущественно перфорин-зависимой цитотоксичностью [5—8; 10]. В связи с этим в последнее время уделяется много внимания разработке биологических методов лечения онкологических заболеваний, подразумевающих стимуляцию специфического противоопухолевого иммунного ответа. Особое место среди биотерапевтических методов занимает вакцинотерапия дендритными клетками. Они считаются самыми мощными индукторами антигенспецифического иммунного ответа и все шире применяются клинически. Как показали результаты исследований на линиях мышей, иммунизация дендритными клетками, культивированными в присутствии опухолевых клеток, индуцирует противоопухолевый иммунный ответ, заключающийся в активации NK-клеток и специфических Т-лимфоцитов [4; 7; 9; 11].

На основании полученных данных можно сделать заключение о том, что применение аутологичной вакцины на основе дендритных клеток приводит к активации эффектор-

ного звена иммунитета, а перфориновый потенциал эффек-торных клеток на фоне вакцинотерапии может служить маркером активности зрелых дендритных клеток. Следует отметить, что у обследованных больных вакцинотерапия сопровождалась только стабилизацией процесса, это может объясняться несоизмеримостью клеточного иммунного ответа с объемом опухоли. Возможно, вакцинотерапия будет более эффективна на ранних стадиях заболевания.

ЛИТЕРА ТУРА

1. Фрейдлин И. С. Клетки и молекулы иммунной системы — мишени терапии // Матер. Европейской школы по онкологии «Иммунотерапия рака», г. Москва, 19—20 октября 1999 г. — С. 1—8.

2. Чкадуа Г. З., Заботина Т. Н., Буркова А. А. и др. Адаптирование методики культивирования дендритных клеток человека из моноцитов периферической крови для клинического применения // Рос. биотерапевтический журн. — 2002. — Т. 1, №3. — С. 56—62.

3. Groscurth P., Filgueira L. Killing mechanisms of cytotoxic T lymphocytes // News Physiol. Sci. — 1998. — Vol. 13, N 3. — P. 156—162.

4. Kim K. D., Kim J. K., Kim S. J. et al. Protective antitumor activity through dendritic cell immunization is mediated by NK cell as well as CTL activation // Arch. Pharm. Res. — 1999. — \bl. 22, N 4. — P. 340—347.

5. Rukavina D., Lascarin G., Rubesa G. et al. Age-related decline perforin expression in human cytotoxic T lymphocytes and natural killer cells // Blood. — 1998. — Vol. 92, N 7. — P. 2410—2420.

6. Smyth M. J., Thia K. Y.T., Cretney E. et al. Perforin is a major contributor to NK cell control of tumor metastasis // J. Immunol. — 1999. — Vol. 162. — P. 6658—6662.

7. Smyth M. J., Thia K. Y. T., Street S. E. A. et al. Differential tumor surveillance by natural killer (NK) and NKT cells // Exp. Med. —

2000. — Vol. 191, N 4. — P. 661—668.

8. Spaner D., Raju K., Radvanyi L. et al. A role for perforin in activation-induced cell death// J. Immunol. — 1998. — Vol. 160. — P. 2655—2664.

9. Terme M., Masurier C., Fernandez N. et al. Role of dendritic cells in the modulation of innate effectors of immunity // Pathol. Biol. (Paris). —

2001. — Vol. 49, N 6. — P. 475—457.

10. Zitvogel L. Dendritic and natural killer cells cooperate in the control/switch of innate immunity // J. Exp. Med. — 2002. — Vol. 195, N 3. — P. F9—F14.

11. Wu J., Lanier L. L. Natural killer cells and cancer //Adv. Cancer Res. — 2003. — Vol. 90. — P. 127—156.

Поступила 21.12.2004

A. A. Borunova1, G. Z. Chkadua2, T. N. Zabotina1, Z. G. Katagidze1

PERFORIN POTENTIAL OF EFFECTOR CELLS IN CANCER PATIENTS

1 Institute of Clinical Oncology, N. N. Blokhin RCRC RAMS, Moscow 2 Institute of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors, N. N. Blokhin RCRC RAMS, Moscow

The purpose of the study was to assess effector cell perforin potential in cancer patients receiving an autologous dendritic cell-based vaccine. We analyzed peripheral lymphocytes from patients with disseminated melanoma (n=6). Peripheral lymphocytes from normal donors (n=6) were used as control. Blood samples were harvested before treatment and at 2 weeks after every vaccine dose (6 administrations). Administration of the autologous vaccine led to normalization of the NK pool and a 3-fold or greater rise in initially decreased perforin expression in CD45 lymphocytes with the CD8+-perforin+ population mainly accounting for the rise. The autologous dendritic cell-based vaccine was therefore found to activate effectors of the immunity.

Key words: perforin, CD8, CD16, effector cells.