СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО

1. Способ культивирования клетки млекопитающего, при этом способ включает:
перфузионное культивирование клетки млекопитающего, содержащей кодирующую рекомбинантный белок нуклеиновую кислоту, в условиях, достаточных для получения рекомбинантного белка, где
перфузионное культивирование предусматривает культивирование в жидкой среде, содержащей полоксамер-188 в концентрации 1,8 г/л или в концентрации более 1,8 г/л, и где полоксамер-188 присутствует в среде, и/или его добавляют к среде перед стадией культивирования, и/или его добавляют к среде во время стадии культивирования.
2. Способ по п. 1, где среда дополнительно содержит пеногаситель, при этом соотношение пеногасителя (г/л) и полоксамера-188 (г/л) в среде составляет от приблизительно 0,5% до приблизительно 6,0% в жидкой среде.
3. Способ по п. 1, где способ включает добавление полоксамера-188 к среде перед стадией культивирования и/или добавление полоксамера-188 к среде во время стадии культивирования с обеспечением в среде концентрации полоксамера-188, составляющей 1,8 г/л, или концентрации, составляющей более 1,8 г/л.
4. Способ по п. 1, где полоксамер-188 присутствует в среде.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где способ включает обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде с течением времени.
6. Способ по п. 5, где основанием для повышения концентрации полоксамера-188 в среде с течением времени является плотность жизнеспособных клеток в среде.
7. Способ по п. 6, где способ включает:
6
6
обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде до более 1,8 г/л, когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет от приблизительно 35×10 клеток/мл до приблизительно 60×10 клеток/мл;
6
6
обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде до более 3,0 г/л, когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет от приблизительно 60×10 клеток/мл до приблизительно 90×10 клеток/мл; и
6
обеспечение повышения концентрации полоксамера-188 в среде до более 6,0 г/л, когда плотность жизнеспособных клеток в среде составляет более 90×10 клеток/мл.
8. Способ по пп. 1-7, где перфузионное культивирование включает:
обеспечение сосуда, содержащего клетки млекопитающего, помещенные в первую жидкую среду;
инкубирование сосуда при перемешивании и в течение периода культивирования, составляющего по меньшей мере приблизительно 7 дней, при температуре от приблизительно 32°C до приблизительно 40°C; и
спустя первые 48-96 часов периода культивирования удаление первого объема первой жидкой среды и добавление к первой жидкой среде второго объема второй жидкой среды непрерывным или периодическим способом, где первый и второй объемы являются приблизительно равными.
9. Способ по п. 8, где вторая жидкая среда содержит полоксамер-188 в более высокой концентрации, чем таковая в первой жидкой среде.
10. Способ по п. 8, где первая жидкая среда содержит полоксамер-188 в концентрации 1,8 г/л или в концентрации менее 1,8 г/л, а вторая жидкая среда содержит полоксамер-188 в концентрации более 1,8 г/л.
11. Способ по любому из пп. 8-10, дополнительно включающий
осуществление сбора рекомбинантного белка из клеток млекопитающего, из первой жидкой среды, или второй жидкой среды, или любой их комбинации.
12. Способ культивирования клетки млекопитающего, при этом способ включает:
обеспечение системы культивирования, содержащей сосуд, жидкую среду, помещенную в сосуд, и барботер, помещенный в сосуд, содержащий множество пор, предназначенных для распределения газа через барботер в жидкую среду; и
перфузионное культивирование клетки млекопитающего, содержащей кодирующую рекомбинантный белок нуклеиновую кислоту, в системе культивирования в условиях и при скорости газового потока, достаточных для получения рекомбинантного белка в системе, где среда содержит полоксамер-188 в концентрации, которую выбирают на основании одного или нескольких факторов, выбранных из группы, состоящей из размера пор, типа пор, скорости газового потока, плотности жизнеспособных клеток в среде и маркеров, связанных с клеточным стрессом.
13. Способ по п. 12, где достижение выбранной концентрации полоксамера-188 обеспечивают путем добавления полоксамера-188 к среде перед стадией культивирования и/или добавления полоксамера-188 к среде во время стадии культивирования.
14. Способ по п. 12, где способ включает осуществление выбора на основании типа пор и размера пор:
концентрации полоксамера-188 от приблизительно 2,3 г/л до приблизительно 3,3 г/л, в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от приблизительно 750 мкм до приблизительно 1,5 мм;
концентрации полоксамера-188 от приблизительно 3,3 г/л до приблизительно 4,3 г/л, в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от приблизительно 250 мкм до приблизительно 750 мкм;
концентрации полоксамера-188 более 4,3 г/л, в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате перфорации, и размера пор, составляющего от приблизительно 1 мкм до приблизительно 250 мкм;
концентрации полоксамера-188 от приблизительно 1,8 г/л до приблизительно 3,3 г/л, в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате спекания, и размера пор, составляющего более 150 мкм; или
концентрации полоксамера-188 более 4,5 г/л, в случае типа пор, относящегося к поре, полученной в результате спекания, и размера пор, составляющего от приблизительно 1 мкм до приблизительно 80 мкм.
15. Способ по любому из пп. 12-14, где перфузионное культивирование включает:
инкубирование системы культивирования, содержащей первую жидкую среду, при перемешивании и в течение периода культивирования, составляющего по меньшей мере приблизительно 7 дней, при температуре от приблизительно 32°C до приблизительно 40°C; и
спустя первые 48-96 часов периода культивирования удаление первого объема первой жидкой среды и добавление к первой жидкой среде второго объема второй жидкой среды непрерывным или периодическим способом.
16. Способ по п. 15, где вторая среда содержит полоксамер-188 в выбранной концентрации.
17. Способ по п. 15 или 16, дополнительно включающий
осуществление сбора рекомбинантного белка из внутренней части клеток млекопитающего, из первой жидкой среды, или второй жидкой среды, или любой их комбинации.
18. Способ по п. 8, где первая жидкая среда и/или вторая жидкая среда выбраны из группы, состоящей из жидкой культуральной среды с определенным химическим составом, жидкой культуральной среды, не содержащей сыворотку, жидкой культуральной среды, содержащей сыворотку, жидкой культуральной среды, не содержащей компонентов животного происхождения, и среды, не содержащей белков.
19. Способ по любому из пп. 1-18, где клетка млекопитающего представляет собой клетку яичника китайского хомячка (CHO), клетку эмбриональной почки человека (HEK), клетку NSO, клетку почки новорожденного хомячка (BHK), клетку PerC6, клетку Vero или линию клеток HT-1080.
20. Способ по любому из пп. 1-19, где рекомбинантный белок представляет собой иммуноглобулин, фермент, фактор роста, фрагмент белка или сконструированный белок.