METHOD FOR DIAGNOSING SPERMATOGENESIS DISORDERS BY DETERMINING ITS CYTOLOGICAL PROFILE
Способ диагностики нарушений сперматогенеза путем определения его цитологического профиля

Изобретение относится к медицине, а именно к гистологии, и может быть использовано в диагностике нарушений сперматогенеза различной этиологии, включая идиопатическое бесплодие.
Нарушения сперматогенеза - до настоящего времени сложная проблема как для клиницистов-андрологов, так и для специалистов морфологического профиля.
Известен способ диагностики бесплодия, который включает исследование эякулята на содержание металлов [Поляков В.М., Лепехова С.А. Способ диагностики мужского бесплодия. Патент на изобретение №2247371]. При обнаружении наличия ртути или обнаружение свинца >3,15 мкг/л устанавливают интоксикационную форму бесплодия.
Наряду с этим известным также является способ диагностики ранних нарушений репродуктивной функции у мужчин [Тарасова М.Н, Чистякова Г.Н., Ремизова И.И., Газиева И.Л., 2011 г]. При обнаружении в сыворотке крови цитокинов IL-8, IL-10 и 1RA методом иммуноферментного анализа и вычисления диагностического индекса диагностируют ранние нарушения репродуктивной функции у мужчин. Использование способа позволяет повысить точность диагностики у мужчин с нормальными показателями сперматограммы. Недостатками перечисленных способов является то, что они базируются не на морфологических, а на биохимических показателях. эякулята, сыворотки крови и требуют специального оборудования.
Известен способ оценки фертильности у мужчин [Артефексов СБ., Сергеев М.Ю., Седышева И.В., 2007 г.], который заключается в изучении количества активно подвижных и морфологически сохранных сперматозоидов, после их предварительной сепарации методом всплытия и центрифугирования в градиенте концентрации. Недостатком данного метода является то, что в качестве индикатора фертильности используются особенности морфологического строения зрелых сперматозоидов, в то время как ранние фазы сперматогенеза а также процесс дифференцировки сперматогенных клеток остается вне поля зрения исследователя.
Работ посвященных морфометрическому анализу сперматогенеза крайне мало [Лысенко А.И., Кирпатовский И.Д., 1991; Дубова Е.А. и соавт., 2012;]
Известен способ диагностики гипосперматогенеза и атрофии сперматогенных клеток яичка путем проведения морфометрического анализа биоптата путем определения индекса сперматогенеза, являющийся отношением числа всех сперматогенных клеток к числу сустентоцитов (клеток Сертоли) в 30 поперечных срезов извитых семенных канальцев [А.Ф.Астраханцев, Соловьев А.А., 2001].
Он включает в себя:
1. Биопсию яичка (по показаниям).
2. Морфометрическое изучение биоптата, включающее в себя подсчет сустентоцитов на 30 поперечных срезах семенных канальцев гистологического препарата. В тех же канальцах производят подсчет общего количества сперматогенных клеток.
3. Индекс сперматогенеза рассчитывают как соотношение сустентоциты/клетки сперматогенеза. Оценка результата производится по таким признакам как: снижение индекса сперматогенеза до 10-90%, снижение индекса сперматогенеза более 90%, при этом в 1 случае диагностируется гипосперматогенез, во 2 случае диагностируют атрофию сперматогенных клеток яичка.
Общим существенным признаком аналога и заявленного способа является выявление нарушения сперматогенеза у бесплодных мужчин.
Однако при аналоговом способе диагностики нарушений сперматогенеза учитывают суммарное количество клеток сперматогенеза, без учета их степени дифференцировки, и их отношение ко всем сустентоцитам подсчитанным на 30 поперечных срезах семенных канальцев гистологического препарата.
Общим существенным признаком прототипа и заявляемого способа является выполнение подсчета сперматогенных клеток на гистологическом срезе.
Однако прототипный метод неточен, т.к. не дает информации о количественном соотношении сперматогенных клеток различной степени дифференцировки в процессе различных фаз сперматогенеза: размножения, роста, созревания и формирования.
Техническим результатом изобретения является усовершенствование способа диагностики нарушений сперматогенеза путем введения дополнительных процедур цитоморфологического анализа и введения дополнительных критериев оценки результатов, что обеспечит повышение качества диагностики.
Поставленная задача решается тем, что в способе, включающем проведение системного цитоморфологического анализа, в основу положены современные представления о цикличности развития сперматогенных клеток. При этом под циклом развития сперматогенных клеток следует понимать полную серию морфологических изменений, наблюдающихся между появлением двух одинаковых сочетаний сперматогенных клеток в одном участке семенного канальца. Часть цикла, характеризующаяся определенным сочетанием сперматогенных клеток (клеточная ассоциация) и определенным этапом развития сперматид, носит название стадии цикла сперматогенеза. Количество стадий развития сперматогенных клеток у каждого биологического вида строго специфично и имеет свою неповторимость. У человека таких стадий 6 [Rupert P. Amann., 2008].
Предлагаемый способ диагностики осуществляется следующим образом. Биопсия яичка производится открытым способом по показаниям. Биоптат " размеров 0,5 см (или фрагмент ткани 1×1 см, полученный при секционном исследовании) фиксируется в жидкости Буэна, обезвоживается в спиртах восходящей крепости, заливается в парафин. Гистологические среза толщиной 5-7 мкм окрашиваются гематоксилином и эозином.
Микроскопическое исследование осуществляется с помощью микроскопа «Axioskop 40» при общем увеличении оптической системы × 400.
Методика диагностического определения цитологического профиля сперматогенеза проводится следующим образом.
1. На поперечном срезе извитого семенного канальца (или на его сегменте) проводится определение каждой из 6 типичных клеточных ассоциаций, составляющих цикл сперматогенеза.
2. Производится подсчет количества сустентоцитов, входящих в эту клеточную ассоциацию.
3. В этой же ассоциации производят дифференцированный подсчет сперматогенных клеток, соответствующей стадии цикла. Дифференцированный подсчет заключается в количественном определении сперматогенных клеток (сперматогоний, сперматоцитов I-II порядков и сперматид) в каждой клеточной ассоциации.
4. Рассчитывается соотношение каждого типа сперматогенных клеток по отношению к сустентоцитам.
5. Для каждой из 6 типов клеточных ассоциации производят подсчет не менее чем в 5 полях зрения.
6. Проводят статистическую обработку результатов: определяется взвешенное среднее (М) и ошибка взвешенного среднего (m) [Балинова B.C. Статистика в вопросах и ответах: Учеб пособие. - М.: ТК. Велби, Изд-во Проспект, 2004. - 344 с]. Результаты заносят в стандартную таблицу и сравнивают с цитологическим профилем сперматогенеза в половых железах здоровых мужчин (Таблица №1).
Оценка результатов осуществляется по следующим признакам.
1. Снижение количества ранних и поздних сперматид во всех 6 клеточных ассоциациях более 5% свидетельствует о нарушении стадии формирования.
2. Уменьшение количества сперматогенных клеток входящих в 6 клеточную ассоциацию указывает на нарушение сперматогенеза на стадии созревания.
3. Снижение числа первичных сперматоцитов на I-V стадиях цикла позволяет констатировать нарушение сперматогенеза на стадии роста.
4. Уменьшение количества сперматогоний определенное на всех VI стадиях цикла указывает на нарушении стадии размножения.
Определение цитологического профиля сперматогенеза в каждой из 6 клеточных ассоциаций, составляющих цикла развития сперматогенных клеток, обеспечивает комплексность оценки, объективизирует исследование, позволяет оценить цикл развития сперматогенных клеток в целом.
Количественные изменения сперматогенных клеток на различных этапах их дифференцировки позволяют определить нарушения сперматогенеза на различных его стадиях (размножения, роста, созревания и формирования), увеличивают информативность исследования, повышают достоверность и качество диагностики.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
Дубова Е.А., Овчинников Р.И., Попова А.Ю., Павлов К.А., Щеголев А.И. Морфологическая характеристика биоптатов яичка при бесплодии. Архив патологии. 2012. T. 74 - N 6. - С. 8-12.
Лысенко А.И., Кирпатовский И.Д. Анализ морфологических классификаций повреждения яичка при мужском бесплодии. // Арх. Патологии. - 1991. - Т. 53, 12. - С. 63-67.
Поляков В.М., Лепехова С.А. Способ диагностики мужского бесплодия. Патент на изобретение №2247371, 2005 г.
Тарасова М.Н., Чистякова Г.Н., Ремизова И.И., Газиева И.А. Способ диагностики ранних нарушений репродуктивной функции у мужчин. Патент на изобретение №2413949, 2011 г.
Артефексов С.Б., Сергеев М.Ю., Седышева И.В. Способ оценки фертильности мужчин. Патент на изобретение №2360247, 2007 г. Астраханцев А.Ф., Соловьев А.А. Способ диагностики гипосперматогенеза и атрофии яичка. Патент на изобретение №2199117, 2003 г. - прототип. Rupert P. Amann. The Cycle of the Seminiferous Epithelium in Humans: A Need to
Revisit ?// J. of Andrology. Vol. 29, No. 5. September/October 2008. p. 469-487. Балинова B.C. Статистика в вопросах и ответах: Учеб пособие. - М.: ТК. Велби, Изд-во Проспект, 2004. - 344 с).