Питательная среда для дифференциации парагемолитических вибрионов
NUTRIENT MEDIUM FOR DIFFERENTIATION OF PARAHEMOLYTIC VIBRIOS

Предполагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно является питательной средой, которая может быть использована в лабораторной практике для определения патогенных свойств вибрионов в тесте Канагава при диагностике пищевых токсикоинфекций, раневых инфекций и септицимий бактериальной природы.
В тесте Канагава используют среду Вагатцума, которая предназначалась только для определения патогенности V. parahaemolyticus. В настоящее время существует более 11 патогенных видов парагемолитических вибрионов (ПГВ), из которых только часть может быть тестирована на среде Вагатцума. В связи с этим возникла необходимость в создании унифицированной питательной среды для всех видов патогенных ПГВ при использовании в тестировании на наличие гемолитического токсина в тесте Канагава.
Известна питательная среда для выделения и идентификации ПГВ (1) следующего состава: пептон, агар микробиологический, сахароза, бромтимоловый синий с добавлением калия карбоната, калия сульфита, желчи КРС, экстракта дрожжевого сухого и смеси алкилсульфатов, а в качестве идентифицирующей добавки используют натрий хлорид.
Недостатком известной среды является невозможность ее использования для дифференциации среды в тесте Канагава
Наиболее близкой к предлагаемой питательной среде для определения патогенности парагемолитических вибрионов в тесте Канагава является среда Вагатцума (2) состоящая из:
Пептон ферментативный
10,0 г
Натрия хлорид
70,0 г
Маннит
10,0 г
Калия гидрофосфат
5,0 г
Дрожжевой экстракт
3,0 г
Кристаллический фиолетовы
0,001 г
Агар микробиологический
15,0 г
Эритроциты отмытые
20,0
рН 8,0.
Однако данная среда является импортным препаратом. При этом высокое содержание натрия хлорид - 7% ограничивает прорастание в данной среде ряда патогенных вибрионов -V. mimicus,V. damsela,V. hollisae, V. vulnificus, V. harveyi. Наличие в среде маннита в качестве углеводного компонента ухудшает условия культивирования V. damsela, V. hollisae, V. vulnificus, V. harveyi.
Таким образом, среда Вагатцума не может быть в полной мере использована для идентификации патогенных свойств всей группы ПГВ. В связи с необходимостью стандартизации и унификации бактериологических исследований материала на наличие инфекционных патогенов, повышения эффективности среды и использования отечественных препаратов появилась потребность в новой питательной среде.
Недостатком среды является ее высокая себестоимость, невозможность использования для всех видов патогенных ПГВ - V. parahaemolyticus, V. alginolyticus и в первую очередь - V. damsela, V. vulnificus, V. harveyi, V. hollisae.
Технической задачей предполагаемого изобретения является создание новой дифференциальной питательной среды СГВ для определения патогенности ПГВ путем усиления гемолитической активности в тесте Канагава.
Поставленная задача достигается тем, что в известной питательной среде для дифференциации парагемолитических вибрионов, включающей питательную основу из пептона, агара микробиологического, натрия хлорид, маннит, калий гидрофосфат, эритроциты, отличие заключается в том, что среда дополнительно включает стимулятор роста гемофильных микробов, глюкозу, натрия карбонат, метиленовый фиолетовый, а питательная основа представляет собой ферментативный перевар мяса при следующих количественных соотношениях компонентов, г/л:
Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 20,0±2,0
Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 5,0±0,5
Агар микробиологический - 15,0±2,0
Глюкоза
5,0±1,0
Маннит
5,0±1,0
Натрия хлорид
50,0±2,0
Натрия карбонат
1,5±0,2
Калия гидрофосфат
5,0±0,5
Метиленовый фиолетовый
0,002±0,0005
Эритроциты отмытые
50±1,0
при рН 8,0.
Способ приготовления питательной среды осуществляют по следующей технологии.
Питательная среда компануется из реагентов отечественного производства: ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - производитель ООО НИЦФ г. Санкт-Петербург;
стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - СРГМ ФБУН ГНЦ ПМБ П. Оболенск, Московская обл. и т.д.
Вышеуказанные реагенты заливают 950 мл дистиллированной воды и доводят до кипения, расплавляют при тщательном перемешивании, стерилизуют, охлаждают до 45-50°С, вносят эритроциты. Реакция среды 8,0. Готовую среду разливают в чашки Петри.
Методические указания МУК 4.2.2046.06 предусматривают необходимость анализа всех видов патогенных парагемолитических вибрионов -V. parahaemolyticus, V. mimicus, V. hollisae, V. damsela, V. vulnificus, V. harveyi, V.metscnicovii, V. cincinnatiensis, V. fluvialis, V. furnissii, V. alginolyticus (3).
Решение задачи достигают тем, что к известной прописи среды - прототипа содержащий агар, маннит, калия гидрофосфат, добавляют более питательный ферментативный перевар мяса, для активизации гемолитической активности - стимулятор роста гемофильных микробов, глюкозу и менее токсичный ингибитор метиловый фиолетовый, а так же для оптимизации роста всех видов ПГВ - снижают навеску натрия хлорида до 50 г/л. После варки, стерилизации среды, охлаждения до 45-50% вносят 5% отмытых эритроцитов крови человека.
-7
Чувствительность искомой среды в отношении 4 тест-штаммов ПГВ составляла 10, показатель прорастания повышался до 30-70%. При этом показатель прорастания этой среды для всех видов патогенных ПГВ составляли от 35 до 80%. Эффективность получения результатов теста Канагава в отношении всех видов патогенных ПГВ бала высокой и стабильной.
Таким образом, состав среды СГВ:
1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 20,0±2,0,
2. Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 5,0±0,5,
3. Агар микробиологический - 15,0±2,0,
4. Глюкоза - 5,0±1,0,
5. Маннит - 5,0±1,0,
6. Натрия хлорид - 50,0±2,0,
7. Натрия карбонат - 1,5±0,2,
8. Калия гидрофосфат - 5,0±0,5,
9. Метиловый фиолетовый - 0,002±0,0005,
10. Эритроциты отмытые - 50±1,
при рН 8,0.
Контроль среды проводят в соответствии с Методическими указаниями (3, 4) с использованием тест-штаммов: V. parahaemolyticus, а так же V. mimicus,V. damsel,V. vulnificus по основным биологическим показателям для этой группы питательных сред - чувствительность, показатель прорастания, дифференцирующие свойства - размер зоны гемолиза в тесте Канагава.
Питательная среда состоит из сухих компонентов и после регистрации будет выпускаться в виде сухого препарата-изделия медицинского назначения с последующим освоением производства.
Ниже представлены результаты сравнительных испытаний различных комбинаций состава предлагаемой среды (СГВ) как в рамках нормированных показателей, так и за их пределами (примеры 1-5, таблицы 1-5). Также даны результаты проверки дифференцирующих свойств среды СГВ и сред сравнения в отношении представителей всех основных видов патогенных ПГВ.
Пример 1
Для приготовления среды используют вышеуказанные препараты в следующих максимальных концентрациях (г):
1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 22,0,
2. Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 5,5,
3. Агар микробиологический - 17,0,
4. Глюкоза - 6,0,
5. Маннит - 6,0,
6. Натрия хлорид - 52,0,
7. Натрия карбонат - 1,7,
8. Калия гидрофосфат - 5,5,
9. Метиловый фиолетовый - 0,0025,
10. Эритроциты отмытые – 51,
пПри рН 8,2
Данные реагенты заливают 950 мл дистиллированной воды и доводят до кипения, расплавляют при тщательном перемешивании, стерилизуют, охлаждают до (45-50)°С вносят эритроциты. Реакция среды 8,2. Готовую среду разливают в чашки Петри.
Таким образом, предлагаемая среда обеспечивает более высокую в сравнении с прототипом ростовую активность тест-штаммов при требуемом уровне дифференцирующих свойств вибрионов (обязательное наличие роста на чашках при посеве всех тест-штаммов ПГВ - из 10 м.к. и не менее 30% при посеве 100 м.к., образование зон лизиса вокруг колоний Канагава - положительных ПГВ и отсутствие зон лизиса вокруг Канагава - отрицательного штамма).
Пример 2
Для приготовления среды используют вышеуказанные препараты в средних концентрациях (г):
1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 20,0,
2. Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 5,0,
3. Агар микробиологический - 15,0,
4. Глюкоза - 5,0,
5. Маннит - 5,0,
6. Натрия хлорид - 50,0,
7. Натрия карбонат - 1,5,
8. Калия гидрофосфат - 5,0,
9. Метиловый фиолетовый - 0,002,
10. Эритроциты отмытые – 50,
при рН 8,2.
Данные реагенты заливают 950 мл дистиллированной воды и доводят до кипения, расплавляют при тщательном перемешивании, стерилизуют, охлаждают до 45-50°С вносят эритроциты. Реакция среды 8,2. Готовую среду разливают в чашки Петри.
Вывод: предлагаемая среда обеспечивает более высокую в сравнении с прототипом ростовую активность тест-штаммов при требуемом уровне дифференцирующих свойств вибрионов (обязательное наличие роста на чашках при посеве всех тест-штаммов ПГВ - из 10 м.к. и не менее 30% при посеве 100 м.к., образование зон лизиса вокруг колоний Канагава - положительных ПГВ и отсутствие зон лизиса вокруг Канагава - отрицательного штамма). Пример 3
Для приготовления среды используют вышеуказанные препараты в минимальных концентрациях (г):
1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 18,0,
2. Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 4,5,
3. Агар микробиологический - 13,0,
4. Глюкоза - 4,0,
5. Маннит - 4,0,
6. Натрия хлорид - 48,0,
7. Натрия карбонат - 1,3,
8. Калия гидрофосфат - 4,5,
9. Метиловый фиолетовый - 0,0015,
10. Эритроциты отмытые - 49,
при рН 8,0.
Данные реагенты заливают 950 мл дистиллированной воды и доводят до кипения, расплавляют при тщательном перемешивании, стерилизуют, охлаждают до 45-50°С вносят эритроциты. Реакция среды 8,0. Готовую среду разливают в чашки Петри.
Следовательно, предлагаемая среда обеспечивает более высокую в сравнении с прототипом ростовую активность тест-штаммов при требуемом уровне дифференцирующих свойств вибрионов (обязательное наличие роста на чашках при посеве всех тест-штаммов ПГВ - из 10 м.к. и не менее 30% при посеве 100 м.к., образование зон лизиса вокруг колоний Канагава - положительных ПГВ и отсутствие зон лизиса вокруг Канагава - отрицательного штамма).
Пример 4
Для приготовления среды используют вышеуказанные препараты ниже минимальной концентрации (г):
1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 15,0,
2. Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 4,0,
3. Агар микробиологический - 12,0,
4. Глюкоза - 3,0,
5. Маннит - 3,0,
6. Натрия хлорид - 45,0,
7. Натрия карбонат - 1,2,
8. Калия гидрофосфат - 4,0,
9. Метиловый фиолетовый - 0,001,
10. Эритроциты отмытые – 45,
при рН 8,0.
Данные реагенты заливают 950 мл дистиллированной воды и доводят до кипения, расплавляют при тщательном перемешивании, стерилизуют, охлаждают до 45-50°С вносят эритроциты. Реакция среды 8,0. Готовую среду разливают в чашки Петри.
Пример 5
Для приготовления среды используют вышеуказанные препараты выше максимальной концентрации (г):
1. Ферментативный перевар мяса (ГМФ - бульон) - 25,0,
2. Стимулятор роста гемофильных микробов (СРГМ) - 6,0,
3. Агар микробиологический - 18,0,
4. Глюкоза - 7,0,
5. Маннит - 7,0,
6. Натрия хлорид - 60,0,
7. Натрия карбонат - 2,0,
8. Калия гидрофосфат - 6,0,
9. Метиловый фиолетовый - 0,003,
10. Эритроциты отмытые – 52,
при рН 8,0
Данные реагенты заливают 950 мл дистиллированной воды и доводят до кипения, расплавляют при тщательном перемешивании, стерилизуют, охлаждают до 45-50°С вносят эритроциты. Реакция среды 8,0. Готовую среду разливают в чашки Петри.
Таким образом, представленные данные указывают на высокую эффективность среды СГВ в рамках нормированного показателя состава. Ее чувствительность и показатель прорастания полностью соответствует существующим нормативным требованиям и в отличие от среды сравнения, обеспечивает высокие ростовые свойства и гемолитическую активность всех испытанных тест-штаммов.
Пример 6
Оптимальный вариант искомой среды СГВ прошел испытания в отношении тест-штаммов основных видов патогенных ПГВ. Приготовление и контроль среды проводили с методическими подходами, использованными в вышеописанных примерах. Культуры контрольных штаммов вибрионов готовили по методике идентичной при подготовке тест-штаммов.
Результаты проведенного испытания представлены таблице 6.
Исходя из представленных материалов и по результатам сравнительных испытаний предложенная композиция СГВ соответствует среде прототип Вагацума по ростовым и дифференцирующим показателям в отношении V. parahaemolyticus, и значительно превосходит в отношении других видов ПГВ. Полученные данные позволяют характеризовать новый препарат как дифференциальную среду, соответствующую современным требованиям к средам данного назначения. Особым преимуществом данного препарата можно считать ее эффективность при определении ее гемолитической активности в отношении всех групп ПГВ, что позволяет использовать ее при диагностике различных заболеваний, вызываемых ПГВ. Дополнительным преимуществом можно считать возможность ее изготовления из отечественных компонентов, и за счет этого низкую себестоимость (300-350 руб/л).
Государственная регистрация среды включена в сетевой график внедрения результатов НИР ФКУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора.
Источники информации
1. Патент на изобретения №2711914 от 23.01.2020. «Питательная среда для выделения и идентификации парагемолитических вибрионов».
2. Патент на изобретения №2711914 от 23.01.2020. «Питательная среда для выделения и идентификации парагемолитических вибрионов».
3. Методы контроля бактериологических питательных сред МУК 4.2.2316-08, М., - 2008
4. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителя чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза МУ 3.3.2.2124-06, М., - 2007.
5. Методы выявления и определения парагемолитических вибрионов в рыбе, не рыбных объектах промысла, продуктах вырабатываемых из них, в воде поверхностных водоемов и других объектах. МУК 4.2.2046-06, М., - 2006.
6. Лабораторная диагностика заболеваний, вызываемых парагемолитическими и другими патогенными для человека вибрионами. МУК 4.2.1793-03, М., - 2003.
7. Приказ №535 от 22 апреля 1985 г «Об унификации микробиологических методов исследований применяемых в клиниках - диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений».