Аспекты изучения диффузного аксонального повреждения: возможность использования структурных компонентов нервной ткани в качестве биомаркеров при его диагностике

Обзоры

Аспекты изучения диффузного аксонального повреждения: возможность использования структурных компонентов нервной ткани в качестве биомаркеров при его диагностике

^ А.Н. Шай, М.В. Федулова, Ю.Е. Квачева, С.В. Шигеев, А.В. Ковалев

ФГБУ "Российский центр судебно-медицинской экспертизы "МЗ РФ, Москва

В статье с целью ретроспективного анализа взглядов на диффузное аксональное повреждение (ДАП) проанализированы данные литературы. Особое внимание уделено клеточному патогенетическому механизму возникновения ДАП. Рассмотрены основные клеточные компоненты, наличие и/или повышение уровня которых в сыворотке крови помогает в диагностике ДАП. Отмечено, что диагностическое значение имеют не только уровень компонентов аксона, но и маркеры элиминирующего процесса.

Ключевые слова: диффузное аксональное повреждение, иммуногистохимия, биомаркеры, т-белки, воспалительные цитокины.

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) является одной из основных причин смерти среди трудоспособного населения и главной причиной инвалидизации лиц моложе 35 лет. Наибольшее количество ЧМТ наблюдается в экономически развитых странах со значительным количеством транспорта и автоматизированным производством. Так, в США частота встречаемости ЧМТ составляет от 180 до 250 случаев на 100 тыс. населения в год, а в Европе — приблизительно 235 случаев на 100 тыс. населения в год; при этом примерно 1600 тыс. пациентов госпитализируются в стационар, не менее 66 тыс. из них погибают [1].

По определению Всемирной организации здравоохранения, тяжелая ЧМТ — это хроническое заболевание с наличием стойких, необратимых последствий, требующее длительного периода реабилитации, наблюдения и лечения, зачастую приводящее к инвалидизации [2, 3].

Контактная информация: Шай Алиса Николаевна, shay@rc-sme.ru

Отдельную группу ЧМТ составляют травмы с тяжелой мозговой симптоматикой, которые при секционном исследовании практически не сопровождаются макроскопическими признаками повреждения структур черепа и ткани мозга, такими как переломы костей, гематомы различной локализации, ушибы мозга и прочее. В ряде случаев выявляются лишь мелкие периваскулярные кровоизлияния в белом веществе мозга, преимущественно в мозолистом теле, внутренней и наружной капсулах мозга, структурах ствола мозга. Подобные повреждения выделены в отдельную группу, получившую название диффузное аксональное повреждение (ДАП).

Причиной повреждения аксонов служит их перерастяжение с разрывом клеточного аппарата, вызванное смещением мозговых структур относительно друг друга, что зачастую происходит при травмах с ротационным механизмом. К таким травмам относятся прежде всего полученные при дорожно-транспортных происшествиях, спортивные

Диффузное аксональное повреждение

травмы, особенно повторяющиеся. Частота развития ДАП при тяжелых ЧМТ составляет 28-55%, летальность - от 47 до 70% [4].

Интерес к указанной патологии возник давно в связи с тем, что при вскрытии выявлялось несоответствие между макроскопической картиной морфологических изменений головного мозга и тяжелой мозговой симптоматикой. Впервые подобные случаи были описаны A. Boirel еще в 1677 г., затем A. Littre в 1705 г. и J.L. Petit в 1774 г. В 1835 г. J.P. Gama обосновал вибрационную теорию подобных повреждений головного мозга при травме. Однако приоритет в описании патоморфологической картины принадлежит S.J. Strich [5]. В 1956 г. она описала морфологическую картину 5 случаев ЧМТ, когда пострадавшие в дорожно-транспортном происшествии находились в коме с грубыми очаговыми неврологическими нарушениями. При исследовании трупов этих лиц морфологические проявления ЧМТ были минимальными. Только у одного пострадавшего имелся перелом черепа; макроскопически оболочки и вещество мозга выглядели почти неизмененными. Определялись лишь различной давности кровоизлияния в мозолистом теле и, реже, в верхних ножках мозжечка, иногда встречались бурые кисты в семиовальном центре, подкорковых ядрах и перивен-трикулярном веществе. Гистологическая картина в этих случаях была очень яркой: повсюду в белом веществе выявлялась диффузная дегенерация нервных волокон, что очень походило на валлеровское перерождение. Такая картина наблюдалась в обоих полушариях (асимметрично), в стволе и мозолистом теле.

Наиболее важным с морфологической точки зрения было обнаружение так называемых ретрагированных (аксональных) шаров, служащих, по мнению автора, прямым свидетельством механического повреждения аксонов, так как при разрыве нервного волокна аксоплазма вытекает из концов поврежденных отростков и происходит булавовидное их утолщение. Позд-

нее S.J. Strich описала еще 15 подобных случаев, практически не отличавшихся от первой группы. На основании результатов проведенных исследований автор пришла к выводу, что повреждения аксонов нейронов возникают в момент травмы головы, и предложила рассматривать диффузную аксональную дегенерацию как следствие травматического повреждения аксонов, вызванного ротацией головного мозга [6].

Большое значение в изучении проблемы ДАП при травме головы имеют работы группы ученых Пенсильванского университета [4]. Данные исследований, проведенных на приматах с помощью специального устройства, воспроизводившего различные виды движений головы при травмах, во многом способствовали уточнению патогенеза ДАП. В своих опытах авторы полностью исключили такие осложнения церебральной травмы, как отек головного мозга, внутричерепная гипертензия, ано-ксия, сосудистые нарушения, и при этом определили морфологическую картину ДАП, описанную S.J. Strich. Тем самым они доказали именно травматическую природу аксонального повреждения. Исследователи также предсказали возможность соче-танных повреждений мозга, а именно очаговых и диффузных, причем в клинической картине посттравматические церебральные реакции могут накладываться на морфологический субстрат, утяжеляя состояние пострадавшего и ухудшая прогноз.

J.H. Adams et al. на секционном и экспериментальном материале определили три характерных патологических изменения структур мозга при ДАП: 1) местные (фокальные) повреждения в мозолистом теле; 2) местные повреждения в одном или обоих дорсолатеральных квадрантах ростральных отделов ствола мозга; 3) диффузные изменения аксонов.

В дальнейшем при исследовании поврежденного аксона с помощью электронной микроскопии были выделены полный (аксонотомия) и неполный (внутреннее ак-сональное повреждение) разрывы аксона.

Обзоры

В месте разрыва аксона содержимое клетки — аксоплазма — изливается и скапливается в виде небольших пузырьков (так называемые аксональные шары). Аксо-нальный транспорт продолжается до момента разрыва в цитоскелете клеток, что приводит к накоплению продуктов транспорта в аксоне и последующему отеку. Через 24 ч после ДАП в дистальных отрезках нервных волокон намечаются дегенеративные изменения осевого цилиндра и мякот-ной оболочки, которые неуклонно возрастают, вызывая некроз волокна [4].

Неполный разрыв аксона может восстановиться, что будет способствовать благоприятному исходу, или может перейти во вторичную аксонотомию, что приведет к ретроградной транснейрональной и каскадной валлеровской дегенерации с потерей функции. Вторичный механизм повреждения включает нарушение функции ионных каналов, демиелинизацию, нарушение функций митохондрий, цитоток-сичность, изменения глиально-аксональ-ных муфт, действие оксида азота и появление антител к ганглиозиду.

Избирательное аксональное повреждение может произойти при соматическом или дендритическом повреждении. Аксоны зачастую отходят на значительное расстояние от исходного нейрона и могут повреждаться при различных соматических патологиях. Как показали эксперименты, аксональное повреждение ассоциируется с различными нарушениями, включающими увеличение проницаемости аксональной мембраны, негативные внутриклеточные каскадные реакции, дисфункцию аксо-нального транспорта и нарастающую дегенерацию. Физическая деформация, энергетический дефицит, ацидоз и нейровоспа-лительные нарушения служат причиной активации ионных каналов, приводящей к патологическому увеличению интраак-сонального транспорта №+ и Са2+. Увеличенный натриевый транспорт снижает АТФазную активность (АТФ — аденозин-

трифосфат), нарушает реверсную деятельность градиентзависимых ионных каналов.

Нарушения аксолеммы обычно сопровождаются интервенцией Са2+ внутрь аксона. Са2+ является основным медиатором аксонального повреждения и дегенерации. Переизбыток кальция приводит к нарушению работы митохондрий с последующим увеличением проницаемости пор митохондриальной мембраны, пропускающих молекулы менее 1,5 кДа, что вызывает обезвоживание и необратимое повреждение митохондрий. Поврежденные митохондрии служат критерием субклеточных нарушений, ассоциированных с цитохро-мом С, расположенным в перимитохонд-риальном пространстве. Активация каль-цийактивируемых цистеинпротеаз и/или каспаз усугубляет дегенерацию аксональ-ного цитоскелета и повреждение органелл, что приводит к смерти аксона.

В последние 20 лет значительно изменились подходы к диагностике и прогнозированию исходов ДАП. Для оценки тяжести, динамики и прогнозирования исхода традиционно применяют шкалу комы Глазго [7]. Дополнительное диагностическое значение имеет компьютерная томография головного мозга [8]. Для диагностики и прогнозирования исходов ДАП используют ряд показателей, таких как объем очагов повреждения, сдавление желудочковой системы, смещение срединных структур, сдавление базаль-ных цистерн. Однако, учитывая минимальные повреждения ткани мозга при ДАП, значимость компьютерной томографии невелика вследствие низкой чувствительности и недостаточной специфичности. Для формирования общей картины повреждений предложены алгоритмы с применением вычислительной техники и программного обеспечения [9, 10].

Еще одним достаточно информативным методом как прижизненной, так и посмертной диагностики ДАП служит определение биомаркеров, появляющихся при травме головного мозга [7]. Целесообразность их использования обусловлена механизмами

Диффузное аксональное повреждение

повреждения клеток нервной ткани головного мозга. Для диагностики повреждения нейронов рассматривается большое количество биомаркеров, однако специфических, как, например, биомаркеры повреждения миокарда, не найдено [11, 12].

На сегодняшний день с целью диагностики и прогноза ДАП в периферической крови определяют уровень не только структурных составляющих клеток нервной системы (белок S-100p и глиальный фибриллярный кислый белок) и ферментов, находящихся в нейронах (нейронспецифи-ческая энолаза, креатинфосфокиназа, лак-татдегидрогеназа), но и различных продуктов деградации клеточных структур, возникающих в результате протеолиза (т-белки, а11-спектрин и продукты его деградации, амилоид-Р1-42, аполипопротеин Е), которые мы рассмотрим более подробно.

Белки $-100 являются кальцийсвязываю-щими белками с низкой молекулярной массой (до 20 кДа); они имеют 3 подтипа, состоящих из димерной комбинации а- и Р-цепей. Белок S-100p (РР; 10-12 кДа) является специфичным для ткани мозга. Он обнаруживается в цитоплазме астроцитов и шванновских клеток и служит диагностическим критерием для ДАП и ряда других патологий [7, 13-20].

Нейронспецифическая энолаза представляет собой гликолитический фермент с молекулярной массой 78 кДа. В функционально активном состоянии он состоит из трех субъединиц (а, Р и у). Специфической для нейронов изоформой является у—у Этот белок попадает во внеклеточное пространство лишь при патологических состояниях, сопровождающихся деструкцией нервных клеток.

Глиальный фибриллярный кислый белок — это белок цитоскелета, представляющий собой основной промежуточный филамент в зрелых астроцитах центральной нервной системы (ЦНС). Этот высокоспецифичный белок головного мозга не обнаружен за пределами нервной системы [21]. Его экспрессия тесно связана с астроцитарной

активацией, возникающей главным образом в результате воздействия цитокинов или гормонов. В зрелой ЦНС он сосредоточен в глиальных филаментах внутри протоплазматических астроцитов серого вещества и фиброзных астроцитов белого вещества и высвобождается во внеклеточное пространство в случае клеточной гибели. Определение содержания этого биомаркера в сыворотке крови является полезной методикой для диагностики различных типов повреждения мозгового вещества [22, 23].

Спектрин и продукты его деградации. Не-

эритроидный аП-спектрин имеет молекулярную массу 280 кДа и является основным компонентом цитоскелета корковых нейронов и субстратом для кальцийак-тивируемых цистеиновых протеиназ, таких как кальпаин и капсаза-3. Этот белок обнаруживается преимущественно в пре-синаптических окончаниях или в субак-солемном компартменте аксонов. Уровень а11-спектрина в крови и ликворе после тяжелой ЧМТ достигает пика на 2-3-и сутки после травмы, а значительное повышение уровня сохраняется по крайней мере до 5 сут с момента травмы [24, 25].

Расщепленный т-белок. Микротубуло-ассоциированные т-белки первично локализуются в аксональном компартменте. Функционально они участвуют в формировании пучков из аксональных микротубул, которые являются важным структурным элементом аксонального цитоскелета и играют важную роль в аксоплазматическом токе белков между терминалями аксонов и телом нейрона. Повреждение ткани мозга приводит к протеолитическому расщеплению шести изоформ белка. Диагностическим критерием тяжелой ЧМТ служит повышение уровня расщепленного т-белка приблизительно в 40 тыс. раз в первые 24 ч после травмы [26, 27].

Амилоид-Р142. Предшественники амилоида — это хорошо изученные белки клеточной адгезии, обнаруживаемые в больших количествах в синаптических мембранах.

Обзоры

После ЧМТ продукты их расщепления и активированная капсаза-3 вместе с другими протеолитическими ферментами выявляются в аксонах и теле нейрона [28].

Аполипопротеин Е — белок, первично синтезируемый в ЦНС. Он является ней-ропротективным агентом, действует как антиоксидант, противовоспалительный фактор с нейротропными свойствами и представлен тремя изоформами (ароЕ2, ароЕ3, ароЕ4).

Убиквитин-С-терминальные гидролазы — это хорошо изученные нейронально-специфические белки, которые кодируются геном PGP9.5 и являются высокоспецифичным маркером повреждения и гибели нейронов [29—31].

Воспалительные цитокины. Содержание S-100p и пяти цитокинов (интерлейкин-1р (ИЛ-1Р), фактор некроза опухоли а, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10) нарастает в течение 24 ч после травмы, а затем прогрессирующе снижается, при этом степень повышения уровня ИЛ-ф коррелирует с исходами ЧМТ

Еще одним потенциальным биомаркером повреждения головного мозга является фрагментированная форма NMDA-ре-цептора (подтип NR2A/2B).

Таким образом, мы рассмотрели структурные компоненты нейронов и клеток нейроглии, внутриклеточные ферменты,

которые могут потенциально использоваться для диагностики ЧМТ, в том числе для выявления пациентов с более тяжелой травмой, чем это представляется клинически, для оценки динамики восстановления и эффективности лечебных мероприятий. Определение биомаркеров также имеет значение при других заболеваниях ЦНС, связанных с повреждением нейронов [32—36]. Особую актуальность оно приобретает при исследовании секционного материала в сложных диагностических случаях, когда макроскопические признаки травмы отсутствуют или выражены минимально, а характерные микроскопические признаки еще не успели сформироваться. Иммуногистохимические методы исследования на сегодняшний день широко применяются в патологической анатомии для различных целей, осуществляются попытки использования их и в судебно-медицинской гистологии, поэтому определение биологических маркеров, перечисленных выше, было бы целесообразно адаптировать к судебно-медицинскому материалу и затем ввести новый метод в повседневную практику в целях диагностики ДАП.

Со списком литературы вы можете ознакомиться на нашем сайте www.atmosphere-ph.ru

Structural Components of Neural Tissue as Biomarkers for the Diagnosis of Diffuse Axonal Injury A.N. Shay, M.V. Fedulova, Yu.E. Kvacheva, S.V. Shigeev, and A.V. Kovalev

Literature review includes retrospective analysis of views on diffuse axonal injury (DAI). Particular attention is paid to cellular pathogenetic mechanisms of DAI. The presence of some basic cell components in serum or increase of their serum levels can help in diagnosing of DAI. Not only the level of axon components, but also markers of eliminating process have diagnostic value.

Key words: diffuse axonal injury, immunohistochemistry, biomarkers, t proteins, inflammatory cytokines.