Факультативно-анаэробные и аэробные бактерии - деструкторы органического вещества, выделенные из донных отложений содово-соленых озер Забайкалья и Монголии

Исследования физико-химического состава показали, что воды Буксэхена являются холодными слабощелочными. Температура воды в разных выходах изменялась незначительно в пределах 3,1- 3,9°С. Вода этого источника является менее щелочной, чем воды Аллы и Ку-чигера. Значение pH меняется от 7,5 до 8,2, Концентрация гидрокарбонатов постоянна во всех выходах и составила 54,9 мг/дм3; карбонат-ионы не были обнаружены, что характерно для вод с невысокой щелочностью. В пробах был зафиксирован кислород, его содержание составило 9,05 мг/дм3. В анионном составе ведущим является также кремний. Его концентрация оказалась наименьшей среди трех исследованных источников. Содержание хлоридов в водах также является существенным (38,34-40,83 мг/дм3) (табл. 5).

По показателю общей жесткости вода мягкая, ее значение составило 0,86-1,06 мг*экв/дм'\ В отличие от предыдущих источников жесткость представлена и кальцием, и магнием. Количество этих ионов особо не отличалось в разных точках отборах и составило 13,30-14,95 мг/дм3 и 2,05-2,38 мг/дм3 соответственно. Содержание остальных компонентов незначительно.

Таким образом, исследования показали, несмотря на то, что источники находятся на территории одной Байкальской гидроминеральной области, которая характеризуется азотными и метановыми терминами, по своим физико-химическим показателям воды источника Бук-сэхен отличаются от вод Аллы и Кучигера.

Источники Аллы и Кучигера.

по химическому составу относятся к термальным слабощелочным и холодным слабощелочным. Характерной особенностью анионного состава является высокое содержание кремния. Исследования проводились в рамках проекта МОиН РФ РНП НОЦ «Байкал», договора с Минэкономразвития РБ и интеграционного проекта СО ГАН №24.

Литература

1. Борисекко ИМ., ЗаманаЛ.В. Минеральные воды Бурятской АССР,-Улан-Удэ: Бурят, кн. изд-во, 1978 - 162 с.

2. Ульзетуева И.Д. Геоэкологические основы использования минеральных источников и озер Юго-Западного Забайкалья: автореф.....канд. дис. - Улан-Удэ, 2006. - 22 с.

3. Чернявский М.К. Термальные источники ООПТ Бурятии, используемые как объекты рекреаиии и бальнеологии // Вопросы сохранения уникальных природных объектов и территорий Республики Бурятия, материалы регион. Науч.-практ. конф. - Улан-Удэ: Изд-во БГУ, 2003,-0.113-121.

4. Аверкин Ю.А, Динамика отложения компонентов из гидротермального раствора при выкипании COj Н Геохимия. -1987. 11. -С. 1580-1585.

5. А лек и н O.A.. Семенов А.Д., Скопинцев Б.А. Руководство по химическому анализу вод суши. - J1,: Гидроме-тсоиздат, 1973.- 269 с.

6. Барабанов Л.Н„ Дислер В.Н. Азотные термы СССР I отв. ред. л-р геол.-мин. наук. В.В.Иванов. - М: Геомин-водЦНИИ КиФ,1968.-120с.

7. Басков Е.А., Суриков С.Н. Гидротермы Земли. - Л.: Недра, 1989. - 245 с.

8. Герхардт Ф. и др. (под ред.). Методы общей бактериологии: в Э т, - М.: Мир, 1983.

9. Голлербах М.М., Косинская Е.К., В,И. Полянский. Определитель пресноводных водорослей СССР. Вып. 2. С и незеленые водоросли. - М.: Советская наука, 1953. -652 с.

10. Брянская A.B., Намсараев Б,Б. Цианобакгерии гидротерм Бурятии И Сохранение биологического разнообразия геотермальных рефугиев Байкальской Сибири: материалы конф, - Иркутск: СИФИБР СО РАН, 2000. - С, 17-18.

Т.Н.Митыпова, Л.П, Козырева, З.Б. Намсараев, Б. Б. Намсараев

г. Улан-Удэ

Факультативно-анаэробные и аэробные бактерии - деструкторы органического вещества, выделенные из донных отложений содово-соленых озер Забайкалья и Монголии*

The facultative-anaerobic and aerobic halo- and alkalitolerant bacteria from bottom sediments of the Transbaikalye and Mongolia saline and soda lakes were isolated and described. The isolates have wide metabolic activities and play important role in destruction of organic matter in ecosystem of s oda lakes. The cultures determined by molecular-genetic methods are related to known species bacteria from extremal ecosystem and new genera and species

' Работа выполнена при поддержке грантов Президиума РАН «Происхождение и эволюция биосферы», Президиума СО РАН № 24, УрО и СО РАН «Микробные сообщества кстремапьных экосистем» и Минобразования науки РНП. 2.1.1.4566.

132

Исследуемые озера Забайкалья и Монголии представляют собой интерес в связи с наличием большого разнообразия микроорганизмов, относящихся к различным функциональным группам, среди которых важное место занимают гидролитические бактерии. В донных отложениях содовых озер аэробные и анаэробные бактерии осуществляют гидролиз высокомолекулярных биологических полимеров - белков, жиров, углеводов, целлюлозы, деструкцию летучих жирных кислот.

Целью данной работы было выделение и изучение представителей основных функциональных групп бактерий-деструкторов органического вещества.

Методы

Выделение культур аэробных органотрофных бактерий проводили на минеральной среде, описанной ранее (Митыпова и др., 2005) с добавлением пептона, дрожжевого экстракта (ДЭ) и глюкозы в суммарной концентрации 5% и на РПА. Значения рН и солености в средах культивирования устанавливали соотношениями NaHCCb, Na 2СО3 и NaCI в соответствии с гидрохимией озер.

Выделение чистых культур включало три этапа: 1) получение накопительной культуры; 2) выделение чистой культуры из изолированных колоний на агаризованной среде; 3) очистка культуры от сопутствующих организмов путем многократного пересева с жидкой на агаризо-ванную среду с последующим выделением колоний. Чистоту культуры контролировали микро-скопированием и по однородности колоний.Чистые культуры поддерживались на минеральной среде с дрожжевым экстрактом (ДЭ) (5г/л).

Морфотипы бактерий, размеры, подвижность и спорообразование изучали микроскопирова-нием образцов с помощью светового микроскопа AxioStar Plus (Kart Zeiss) в фазовом контрасте и на окрашенных препаратах при 100-кратном увеличении объектива (общее увеличение 1000).

Эколого-физиологические, биохимические характеристики и ферментативную активность выделенных изолятов исследовали по стандартным методикам

Спорообразование у бактерий выявляли: 1) прогреванием до 80°С в течение 10 минут, и последующим посевом на питательную среду; 2) окрашиванием спор по методике Пешкова; 3) фотографированием старых культур.

Состав оснований ДНК определен на основании анализа кривых плавления ДНК в Институте микробиологии им. Виноградского РАН (г. Москва) Секвенирование генов I6S-PHK проведено в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г. Пущино) и Лимнологическом институте СО РАН (г. Иркутск).

Результаты

Из донных отложений и микробных матов содово-соленых озер Забайкалья и Монголии аэробно были выделены 50 культур бактерий-деструкторов органического вещества (ОВ). Детальные исследования были проведены с 32 изолятами. Отбор производился с учетом доминирующего роста и эколого-физиологических особенностей штаммов. В выборку было включено: 18 изолятов из оз. Соленое, 3 - Алгинское, 2 - Нухэ-Нур, 2 - Безымянное, 4 - Долон Давст Ну-ур и 3 - Хилганта.

Морфологическая характеристика культу. На агаризованных средах изоляты образовывали круглые, реже концентрические или амебовидные колонии от неокрашенных до пигментированных: светло-желтых, желтых, оранжевых и ярко-красных. Размеры колоний варьировали от 1 до 5-6 мм, за исключением штаммов Д4 и ХЗ, образующих колоний диаметром 12 и 17 мм, соответственно.

Края колоний в основном ровные, но у некоторых ветвистые и слегка волнистые. Профиль колоний изолятов выпуклый, или каплевидный и плоский, встречаются колонии вросшие в агар.

Клетки 18 изолятов представлены палочками, размеры которых варьируют в пределах от 0.29-0.43 х 1.43-1.7 мкм до 0.71-0.86 х 2.43-3.14 мкм; 4 - овальными клетками (0.71-1.14 х 1.141,86 мкм) и одного изолята (JI1K) - изогнутыми палочками 0.57 х 2.57-5 мкм. Клетки 9 изолятов являлись кокками диаметром от 0.76 до 1.29 мкм. У 12 культур выявлено спорообразование. Размеры спор составляют от 0.57 х 0.86 мкм до 0.86 х 1.14 мкм (рис.1).

Эколого-физиологическая характеристика культур

По отношению к рН среды все органотрофы являются факультативными алкапофилами, среди сапрофитов преобладали алкалотолерантные бактерии (табл. ¡).

Выделенные культуры росли на среде без NaCI, однако большинство культур хорошо росло при содержании NaCI от 5 и до 100 г/л, что позволяет отнести выделенные культуры к галото-

133

лерантным. У некоторых изолятов наблюдался рост при концентрации NaCI до 200 г/л. В основном оптимум роста культур находился в пределах NaCI 15-75 г/л. По отношению к температуре выделенные микроорганизмы являлись мезофилами с оптимальным ростом в пределах 25-40°С, за исключением культуры Al, рост которой был отмечен до 55°С, проявляя термотолерантные свойства. Выделенные культуры по отношению к кислороду являются факультативно-анаэробными бактериями, за исключением строго аэробных культур Ski и Nu.

% -

PO V!

Ж ЛГ

И.о. - не определено

Рис. 1. Фотографии культур: а) Д2; б) ЦЗ; в) Ski; г) К5; д) 10а; е) 17п; ж) 34; з) и) J11К: к) Кб; л) Nu; м) Д1; н) С4К линейка 5 мкм

Таблица 1

Эколого-физиологические свойства культур

Культура Пределы рн Оптимум pH Пределы ЫаС1,г/л Оптимум ИаС1,г/л КОН-тест Морфотип клеток Размеры клеток, мкм

AI 8.6-10 9 0-100 0 + Палочки 0,29 х 1,57-2,7 спора = 0,57

A3 6.5-11 9-10 0-200 75 + овальные палочки 0,86-1 х 1,14-1,7 споровые

A4 8-1Í 9,5 0-200 30-100 + Палочки 0,71-0,86 х 2,43

Д1 6-10 8 0-100 30 + Палочки 0,43 х 2,14

Д2 5,5-10,5 8 0-140 30-50 — Палочки 0,71 х 3,2-3,5 споровые

ДЗ 7-9,5 8,8 0-75 30 — Палочки 0,43 х 1,86-2 спора = 0,57 х 0,86

Д4 7-9,5 8,8 5-180 50 — Палочки 0,57 х 1,7-2,85 споровые

KI 7,5-10 8,7 5-180 75-100 - Палочки 0,43 х 1,14-1,43

КЗ 6,5-10,5 8.8 0-200 50 - Кокки а= 1,29

К4 7,5-10 8,8 0-180 100 Палочки 0,43 x1,43-1,7

К5 6,5-11.5 10 0-200 30-75 - Кокки <1= 1-1,14

Кб 5.8-11 8,5 0-200 75-100 + овальные палочки 0,71-0,86 х 1,43-1,86

К7 7,5-11 9,5 0-180 30 + Кокки

К8 6,5-11 9 0-200 50-75 + Кокки (1 =0,76- 0,86

XI 7-9.5 8,7 0-100 5-50(15) Палочки 0,43 х 1,7 споровые

ХЗ 7-11 8,5-9,5 0-100 30 — Палочки 0,43 х 1,43-2,14 споровые

Х4 7,5-10 9 0-100 100 + Кокки <1 = 0,86

17п 7-10,5 8,8 0-100 75 + овальные палочки 0,86-1,14 х 1,86-3,43

2а 7,5-10,5 9,2 0-160 50-75 Палочки 0,57x2,71 спора = 0,71x1

134

Sa 7-Г0 9,3 о-юо (5-50 - овальные папочки 1,14 х (,57-1,86 споровые

10а 6-10,5 9,3 0-100 15-50 Палочки 0,71 х 2,43 спора^0,86 к 1,14

CIK 7,5-10,5 8,6 0-100 30-50 - Палочки 0,71 х 2,85

СЖ 6,5-9,5 7,5 0-200 30 Кокки 0=1

С4К 6-10 8-8,5 0-200 15 - Кокки d = 0,76-0,86

32 7,5-11 9,5-10 0-200 15-30 + Кокки d = 0,86-1

34 7-10 8,5-9 0-100 50 + Палочки 0,57-3,6 спора = 1x1,14

SKI 6,5-11 7,7 0-75 30 + Палочки 0,29-0,43 х 1,71-3,86

N2 6-10 8,5-9 0-100 0-50 - Кокки d =0,7

Mu 6,5-10 7.6 0-7,5 0,5-1,5 + Палочки 0,4-0,5 х 1,1-1,7

Биохимическая характеристика культур. Культуры обладали широкой метаболической активностью и росли на всех протестированных субстратах: крахмале, пептоне, твине, ацетате, лактате, аминокислотах (аспарагине, цистеине и глутаминовой кислоте). Все культуры хорошо росли на среде с ДЭ в качестве единственного источника углерода и энергии, почти все изоля-ты росли на среде с пептоном, кроме одной - Al. 17 выделенных культур проявляли способность к фиксации молекулярного азота.

Сероводород из белок-содержащих субстратов образует только 11 культур. Изоляты используют для роста арабинозу, рамнозу, рафинозу, маннит, фруктозу, глюкозу, инозит, лактозу, сорбит и дульцит, слабый рост отмечен на ксилозе, сахарозе,, маннозе, инозите. У всех культур рост отсутствовал на галактозе. Большинство изолятов газ и кислоту из Сахаров не образуют, но у некоторых культур наблюдалось кислотообразование из протестированных углеводов.

Ферментативная активность культур. Определена ферментативная активность у выделенных культур. 18 изолятов проявили амилолитические свойства. Колонии амилолитических бактерий в диаметре составляют 1.5 - 4.0 мм. При этом минимальные зоны гидролиза крахмала составляют 1-2 мм; средние зоны - 4-5 мм и максимальную зону просветления проявил толят 34-7 мм. Соотношения диаметра колонии к диаметру зоны гидролиза варьируют от 0,1 до 0,43, Казеиназной активностью обладают только 5 изолятов, хотя на среде с пептоном отмечен рост у всех изолятов, кроме изолята Al. Разжижать желатину способны только 5 культур. 6 изолятов проявили липазную активность с зоной гидролиза Твина 80 от 5 до 14 мм. Эндоцел-люлазной активностью обладают 3 изолята: Д2, XI и ХЗ. Каталазная активность выявлена у 21 изолята; оксидазная активность у 19. Генотипическая характеристика культур. Для 12 изолятов было определено процентное содержание ГЦ (гуанин+цитозин) в ДНК. Изоляты тестировались в 3 группы по низкому, среднему и высокому содержанию ГЦ в ДНК. Низкий уровень ГЦ отмечен у изолятов Ski и XI (29,8 и 31,5 мол. % соответственно). Высокое содержание ГЦ отмечено у двух изолятов - Х4 (50,4 мол. %) и С2К (70,4 мол. %), Промежуточное положение занимали культуры с содержанием ГЦ в пределах от 36,1 до 44,4 мол. % (С4К, ДЗ, 34, КЗ, К4, ЦЗ,С1К, Nu).

Неполный сиквенс гена 16S рРНК у 6 изолятов для 4 показал сходство на уровне 98-100% с валидно описанными видами: 100 % сходство между штаммом К5 и Bacillus saliphilus, 99% сходства изолята 17п с Halomonas desideraia, 99 % сходства изолята Кб с Nal о топ os axialensis. и 98 % сходства изолята Д1 с Oceanbacillus iheyensis. Изоляты Nu и Ski показали сходство с близкородственными последовательностями на уровне 89 % (Hongiella mannitofivorans) и 92% (Algoriphagus sp.10.1), что позволяет отнести их к новым родам семейства Flexibactericeae, к группе Cytop haga-F la vobacter i um-В actero i des.

Таким образом, выделенные культуры микроорганизмов являются алкало- и галотолерант-нымн факультативно-анаэробными бактериями-деструкторами органического вещества, активно функционирующими в микробном сообществе содово-соленых озер Забайкалья и Монголии. Культуры, определенные с помощью молекулярно-генетических методов оказались как близкородственными с ранее известными обитателями экстремальных экосистем, так и представителями новых родов и видов.

135

Литература

1. Заварзин Г.Л., Жилина Т.Н., Кевбрин В.В. Алкалофильное микробное сообщество и его функциональное разнообразие И Микробиология. - 1999. - Т.68. - №5. - С, 579 -599.

2. Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхарда и др. - М.: Мир, 1984.- 264 с.

3. Митыпова Т.Н., Козырева Л.П., Намсараев Б.Б. Аэробные и анаэробные бактерии-деструкторы органического вещества в донных осадках содово-соленых озер Забайкалья // Вестник Бурятского университета. Сер. 2: Биология. Вып. 7,- Улан-Удэ: Изд-во БГУ, 2005,- С, 190-193

А.Г. Захарюк, Л.П. Козырева, Б.Е. Намсараев г. Улан-Удэ

Восстановление Fe3* накопительными культурами из донных отложений

содовых озер Забайкалья*

Microbial processes of iron reduction can proceed in alkaline environments (.bottom sediments of soda lakes)- This purpose prove to be true by a high abundance ofFe3' - reduction bacteria in the sediments and reduction of amorphous Fe1' by enrichment cultures from bottom samples of Transbaikalia soda lakes.

Железоредукция представляет собой один из наиболее энергетически выгодных процессов, в ходе которого бактерии способны осуществлять полную деструкцию органического вещества (Заварзина, 2001), Микроорганизмы, способные диссимиляционно восстанавливать Fe3+, т.е. использовать различные соединения окисного железа в качестве единственных или вспомогательных акцепторов электронов в процессах энергетического метаболизма, широко представлены в морских и пресных донных осадках, разнообразной термальной окружающей среде, включая горячие источники, гидротермы, а также в затопленных почвах (Lov!ey,1991). Эти бактерии участвуют в круговороте железа, углерода и других химических элементов в природе.

Железоредукторы представляют интерес и с биотехнологической точки зрения, так как для нескольких представителей этой физиологической группы микроорганизмов показана способность к восстановлению токсичных металлов и радионуклидов. Несмотря на то, что анаэробный цикл и процессы железоредукции - одна из наиболее интенсивно разрабатываемых в настоящее время областей микробиологии и биогеохимии, данные о распространении и выделении железо-восстанавливающих бактерий из щелочной окружающей среды, в том числе и из содовых озер мира, практически отсутствуют.

Цель настоящей работы - выявление микробного процесса восстановления железа в условиях содовых озер и накопительными культурами, полученными из проб донных осадков содовых озер Забайкалья.

Объекты и методы

Выявлен!, з микробного восстановления Fe3+ проводили в пробах донных осадков содовых озер Бурятии - Соленом, Белом, Нухэ-Нур, Алгинском и озер Агинского Бурятского автономного округа - Хилганте и Горбунке. Отбор проб донных отложений проводили в стерильные флаконы. Физико-химические параметры озер определяли стандартными методами. В полевых условиях для определения температуры использовали сенсорный термометр Prima (Сингапур), рН - портативный рН-метр (рНер2, Португалия) и кондуктометр TDS-4 (Сингапур) для определения минерализации. Концентрации карбонатов, гидрокарбонатов, сульфатов, хлоридов определены общепринятыми методами (Алекин, 1973) (табл.1).

Учет численности железоредуцирующих бактерий в природных пробах проводили методом предельных десятикратных разведений на жидкой бессульфатной минеральной среде без дополнительных восстановителей (Заварзин и др., 1996), содержащей 90 мМ аморфного Fe3+ и смесь возможных доноров электронов - пептона, сахарозы, лактата в суммарной концентрации 5%. рН среды доводили карбонат- бикарбонатным буфером в соответствии с рН озер.

Работа выполнена при поддержке грантов Президиума РАН «Происхождение и оволюция биосферы», Президиума СО РАН № 24, УрО и СО РАН «Микробные сообщества экстремальных экосистем» и Минобразования науки РНП. 2.1.1.4566.

136