СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) ПРИ КЛОСТРИДИОЗАХ ЖИВОТНЫХ
METHOD FOR OBTAINING AN ERYTHROCYTE DIAGNOSTICUM FOR THE INDIRECT HEMAGGLUTINATION REACTION (IHAR) WITH CLOSTRIDIOSIS OF ANIMALS

Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) относится к методам лабораторной диагностики анаэробной энтеротоксемии (клостридиоза) сельскохозяйственных животных и может быть использован в ветеринарной медицине.
Анаэробная энтеротоксемия - остропротекающая болезнь животных различных видов (овец, телят, поросят, пушных зверей, птиц и др.) первых дней жизни, характеризующаяся общим токсикозом организма с признаками поражения нервной системы и желудочно-кишечного тракта, возникающая в результате интенсивного размножения в кишечнике различных типов Cl. perfringens и всасывания образовавшихся при этом токсинов [1, 15-17].
Возбудитель болезни - Cl. perfringens, который по выделению токсинов подразделяют на шесть типов: А, В, С, D, Е и F, которые отличаются друг от друга антигенной структурой вырабатываемых ими токсинов. У ягнят анаэробную энтеротоксемию вызывает возбудитель типов В, D; у телят -типы А, С, D; у поросят - в основном тип С, реже другие [2-4, 12-14].
На сегодняшний день диагноз на инфекционную энтеротоксемию животных ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований [5, 11].
Диагноз на инфекционную энтеротоксемию животных считают установленным в случае:
- обнаружения токсина в фильтрате содержимого тонкого отдела кишечника биологическим методом и определения его типа в реакции нейтрализации с типоспецифическими сыворотками;
- выделения из содержимого тонкого отдела кишечника культуры, продуцирующей токсин, тип которого установлен в реакции нейтрализации с типоспецифическими сыворотками, с характерными для данного возбудителя свойствами.
Недостатками лабораторного метода являются:
- трудоемкость и длительность исследований, требующая для постановки диагноза до 8 рабочих дней [10];
- высокая себестоимость исследования (дороговизна питательных сред, реактивов, затраты на приобретение и содержание лабораторных животных).
Так же в настоящее время для диагностики многих инфекционных заболеваний применяют серологические методы (РСК, РДП, РНГА, ИФА и др.), позволяющие по титрам специфических антител в сыворотке крови выявлять больных животных, а также определять напряженность иммунитета у вакцинированных животных. Известны способы получения эритроцитарных диагностикумов, используемых для серологической диагностики различных инфекционных заболеваний, таких как сальмонеллез, микоплазмоз, эшерихиоз [6-8]. В доступных источниках научно-технической литературы не обнаружена информация о способе приготовления эритроцитарного диагностикума для выявления антител к Cl. perfringens.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения иммуноферментной тест-системы для определения специфических антител к четырем серотипам Cl. perfringens (А, В, С, D) [9]. Однако недостатками метода ИФА являются трудоемкость, длительность процедуры проведения реакции, необходимость приобретения дорогостоящего оборудования.
Технический результат, на достижение которого направлено изобретение, заключается в разработке реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) для определения специфических антител к бактериям Cl. perfringens, обладающей высокой специфичностью и чувствительностью, позволяющей одновременно определять специфические антитела к пяти серотипам Cl. perfringens (А, В, С, D, Е) и по их титрам достоверно диагностировать анаэробную энтеротоксемию среди невакцинированного поголовья и контролировать напряженность поствакцинального иммунитета у вакцинированных животных.
Для достижения названного технического результата разработан набор препаратов для постановки РНГА, содержащий специфический эритроцитарный антиген, изготовленный путем сенсибилизации формалинизированных и танизированных эритроцитов барана смесью анатоксинов пяти штаммов Cl. perfringens №28 (тип A), LD-1 (тип В), №392 (тип С), №213 (тип D), №342 (тип Е), полученных из культуральной среды путем осаждения сульфатом аммония инактивированных формалином токсинов при температуре 37°С (анатоксинов) и соматическими антигенами, полученными путем воздействия на штаммы Cl. perfringens №28, LD-1, №392, №213, №342 ультразвуком на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 кГц ± 500 Гц в течение 10 мин при температуре 4°С, а также контрольную положительную сыворотку, полученную к антигенам Cl. perfringens №28, LD-1, №392, №213, №342 с активностью в РНГА 1:256 и контрольную отрицательную сыворотку.
Предлагаемая реакция непрямой гемагглютинации высоко чувствительна и специфична, экспрессивна, не требует дорогостоящего оборудования, проста в постановке. Реакцию можно поставить даже в условиях животноводческих комплексов, что немаловажно, когда необходимо быстро поставить диагноз.
Способ получения эритроцитарного диагностикума для РНГА включает в себя:
- получение антигенов и анатоксинов Cl. perfringens;
- сенсибилизация эритроцитов смесью антигенов и анатоксинов;
- получение контрольных положительной и отрицательной сывороток.
Заявляемый способ иллюстрируется примерами получения эритроцитарного антигенного диагностикума.
Пример 1. Получение антигенов, необходимых для сенсибилизации эритроцитов, из производственных штаммов Cl. perfringens №28 (тип A), LD-1 (тип В), №392 (тип С), №213 (тип D), №342 (тип Е). Получают два вида антигена - анатоксин и соматический антиген.
1.1. Получение анатоксинов.
3
Анатоксины Cl. perfringens типов А, В, С, D, Е получают путем посева штаммов на мясо-печеночно-казеиновую среду под вазелиновым маслом. Посевы инкубируют в течение 8-12 ч при температуре 37-38°С. При этом концентрация токсинов в культуры достигает до 4-5 Dlm/см. Для превращения токсинов в анатоксин в культуру добавляют формалин до 0,5%-ной конечной концентрации и выдерживают при температуре 37-38°С в течение 10 суток. Затем после удаления вазелинового масла культуру центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 30 минут. Осадок, представлявший собой бактериальные клетки Cl. perfringens, удаляют, а анатоксин (надосадочную жидкость) используют для сенсибилизации эритроцитов. Очистку и концентрирование анатоксина проводят методом осаждения его сульфатом аммония путем добавления его до 50% к общему объему (в конечной концентрации). Далее смесь центрифугируют при 2000 об/мин в течение 30 минут, затем осадок ресуспендируют дистиллированной водой в соотношении 1:10. Полученный анатоксин диализируют против дистиллированной воды в течение 24 ч.
1.2. Получение соматического антигена.
Штаммы Cl. perfringens типов А, В, С, D, Е высевают на мясопептонный агар с добавлением 2% глюкозы и 15% крови барана. Получают суточную культуру посредством культивирования в анаэростате при температуре 37°С. Выросшую культуру смывают 0,85% изотоническим раствором хлористого натрия. Бактериальную взвесь трижды отмывают стерильным физиологическим раствором для освобождения от компонентов питательной среды путем центрифугирования при 2000 об/мин в течение 30 минут. Осадок микробных клеток разводят стерильным физиологическим раствором до получения взвеси 20 млрд. микробных клеток в 1 мл по стандарту мутности им. Л.А. Тарасевича. Микробные клетки разрушают ультразвуком на дезинтеграторе «Bandelin GM3100» при частоте 20 кГц ± 500 Гц в течение 10 минут при температуре 4°С. Затем суспензию центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 минут. Осадок удаляют, надосадочную жидкость используют в качестве антигена для сенсибилизации эритроцитов барана.
В антигенах, приготовленных 1 и 2 способами, измеряют концентрацию белка с помощью спектрофотометра по методу Лоури. Концентрацию белка доводят до 0,4-0,5 мг/мл фосфатно-солевым буферным раствором (рН 6,4).
Пример 2. Подготовка эритроцитов к нагрузке антигенного комплекса.
2.1. В качестве клеточной основы для приготовления диагностикума используют эритроциты барана. Кровь у баранов-доноров отбирают из яремной вены, дефибринируют по общепринятой методике и разводят ее 1:1 фосфатно-солевым буферным раствором (рН 6,4).
К 100 мл разведенной крови добавляют 20% раствор формалина порциями в возрастающих объемах через каждые 15 мин: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. Смесь инкубируют в водяной бане, тщательно перемешивая после каждого внесения. Затем смесь центрифугируют при 1500 об/мин в течение 15 мин, трижды отмывают фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2) и готовят 3% взвесь эритроцитов. Эритроцитарную суспензию отстаивают при температуре (4±2)°С в течение 2 суток.
2.2. Для последующей модификации поверхности эритроцитов к полученной суспензии добавляют равный объем раствора танина (1:20000) в физиологическом растворе. Смесь инкубируют при температуре (37±1)°С на магнитной мешалке в течение 20 минут, эритроциты осаждают центрифугированием при 1500 об/мин. Осадок эритроцитов трижды отмывают фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2) и ресуспендируют в этом же растворе до 3% концентрации эритроцитов.
2.3. Для сенсибилизации эритроцитов используют смесь анатоксинов и соматических антигенов пяти серотипов Cl. perfringens (А, В, С, D, Е), соединенных в равных объемах. К 3% взвеси танизированных эритроцитов добавляют равный объем композиционной смеси антигена. Суспензию инкубируют в водяной бане при температуре (37±1)°С при непрерывном помешивании в течение 2-х часов. Затем сенсибилизированные эритроциты центрифугированием при 1500 об/мин отмывают трижды фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2) и ресуспендируют в этом же растворе до 3% концентрации. Полученный эритроцитарный диагностикум консервируют формалином до 1% конечной концентрации.
Пример 3. Получение контрольных сывороток.
3.1. Для получения положительной контрольной сыворотки к антигенам Cl. perfringens типов А, В, С, D, Е используют десять кроликов живой массой 3,0-3,5 кг. Для гипериммунизации композиционную смесь антигенов вводят в краевую вену уха трижды с интервалом 4 дня. На первом этапе объем вводимой смеси составляет 0,5 мл, затем 1 мл и 2 мл. Через семь дней после иммунизации берут кровь для проверки титров и специфичности присутствующих антител.
3.2. Отрицательную контрольную сыворотку получают от кроликов в возрасте от полугода до года, после выдерживания их в карантине в течение 30 дней. Предварительно сыворотку крови исследуют в ИФА на содержание специфических антител.
Пример 4. Определение активности и специфичности эритроцитарного антигенного диагностикума.
4.1. Для определения активности и специфичности проводят постановку РНГА с контрольными сыворотками (положительной и отрицательной к Cl. perfringens) и гетерологическими (гипериммунные сыворотки к Escherichia coli, Moraxella bovis). Реакцию ставят в круглодонных планшетах для иммунологических реакций с объемом 200 мкл.
Контрольные сыворотки разводят с 1:8 до 1:1024. В качестве разбавителя используют 0,15 М фосфатно-буферный физиологический раствор рН 7,2-7,4. Проведены испытание трех серий эритроцитарного клостридиозного диагностикума в РНГА, результаты которых приведены в таблице 1.
Из таблицы видно, что с положительной клостридиозной сывороткой диагностикум реагирует на четыре креста до разведения 1:128, на три креста 1:256, на один крест 1:512. С гетерологичными сыворотками сомнительная реакция на два креста наблюдается в разведении 1:8. С отрицательной сывороткой и фосфатно-солевым буферным раствором (рН 7,2) наблюдается отрицательная реакция во всех разведениях.
Пример 5. Иллюстрация применения РНГА.
Ампулу с эритроцитарным антигеном тщательно встряхивают до получения однородной взвеси, вскрывают и разводят антиген в соотношении 1:2 разбавителем. В качестве разбавителя используют 0,15 М фосфатно-буферный физиологический раствор рН 7,2-7,4.
Приготовление 0,15 М фосфатно-буферного физиологического раствора. В мерную колбу на 1 л вносят 20,4 г химически чистого безводного однозамещенного фосфорнокислого калия, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят водой до метки 1 л (раствор А). В другую мерную колбу на 1 л вносят 26,7 химически чистого двузамещенного фосфорнокислого натрия двуводного, растворяют в небольшом количестве воды и доводят водой до метки 1 л (раствор Б). Растворы А и Б можно хранить при температуре 4-6°С в течение месяца.
Для приготовления буфера к 24 мл раствора А добавляют 76 мл раствора Б и вносят 0,85 г. химически чистого хлористого натрия. С помощью рН-метра проверяют рН буфера и при необходимости доводят рН до 7,2-7,4 растворами А или Б.
Постановка реакции.
РНГА ставят с использованием микропанелей с U-образными лунками наборов для микротитрования Такачи или Титертек. В лунки микропанели с помощью многоканальной пипетки вносят по 0,05 мл разбавителя. В первые лунки одноканальной пипеткой вносят исследуемые сыворотки в количестве 0,05 мл и последовательными переносами получают двукратные разведения сывороток от 1:2 до 1:256. Затем во все лунки вносят по 0,025 мл 1%-ной взвеси эритроцитарного антигена. Панель осторожно встряхивают и оставляют при комнатной температуре на 6 ч. Одновременно с постановкой РНГА ставят контроли: контроль на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитарного антигена в разбавителе. В 4-6 лунок микропанели вносят по 0,05 мл разбавителя, затем по 0,025 мл 1%-ной взвеси эритроцитарного антигена; контроль на отсутствие агглютинации эритроцитарного антигена отрицательной сывороткой крупного рогатого скота. В ряд лунок микропанели вносят по 0,05 мл разбавителя, в первую лунку вносят 0,05 мл отрицательной сыворотки и титруют как исследуемые сыворотки, затем в каждую лунку вносят по 0,025 мл 1-%-ной взвеси эритроцитарного антигена; контроль на активность эритроцитарного антигена со специфической сывороткой крупного рогатого скота. В ряд лунок микропанели вносят по 0,05 мл разбавителя, в первую лунку вносят 0,05 мл специфической сыворотки и титруют как исследуемые сыворотки, 0,025 мл 1%-ной взвеси эритроцитарного антигена.
Учет реакции.
Реакцию учитывают через 2-2,5 ч. За титр в РНГА принимают наивысшее разведение сыворотки, дающее четкую агглютинацию (зонт).
Учет реакции проводят только при условии четких результатов, полученных в контролях.
Контроль реакции.
В контрольных лунках на спонтанную агглютинацию эритроциты должны сесть в виде пуговицы или плотного кольца.
Титр отрицательной сыворотки не должен превышать 1:4.
Титр специфической сыворотки должен быть не ниже 1:128.
Результаты РНГА с испытуемыми сыворотками оценивают по титрам: положительные - 1:16 и выше, сомнительные - 1:8, отрицательные - 1:4, 1:2 и нулевые.
Пример 6. Испытание РНГА в производственных условиях.
При производственном испытании эффективности набора были использованы образцы крови крупного рогатого скота, доставленных из различных в эпизоотическом отношении по клостридиозам скотоводческих хозяйств Республики Татарстан. При этом исследовались сыворотки крови от больных, не вакцинированных и здоровых, вакцинированных животных из неблагополучных по клостридиозам хозяйств, а также от интактных животных из благополучных хозяйств. Результаты исследования сывороток крови представлены в таблице 2.
Из таблицы видно, что РНГА обладает высокой специфичностью. Она позволяет определить специфические антитела к бактериям Cl. perfringens у 96,9% здоровых вакцинированных животных и 92,7% больных анаэробной энтеротоксемией животных.
В то же время установлено, что компоненты набора не реагируют с сыворотками крови, полученными от интактных животных из благополучных по анаэробной энтеротоксемии хозяйств.
Таким образом, РНГА позволяет по титрам специфических антител в сыворотке крови выявлять больных животных среди невакцинированного поголовья, а также определить напряженность иммунитета у вакцинированных животных.
Источники информации
1. Куриленко А.Н. Бактериальные и вирусные болезни молодняка сельскохозяйственных животных / А.Н. Куриленко, В.Л. Крупальник, Н.В. Пименов. – М.: КолосС, 2006. - 296 с.
2. Салимов В.А. Некоторые особенности патологоанатомической диагностики анаэробной энтеротоксемии телят, вызванной Cl. perfringens типа А / В.А. Салимов, Н.П. Салимова // Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях: мат. науч. - практ. конф. - Воронеж, 2002. - С. 527-528.
3. Спиридонов Г.Н. Инфекционная энтеротоксемия молодняка сельскохозяйственных животных в регионе Среднего Поволжья и Предуралья. / Г.Н. Спиридонов, А.Ф. Махмутов, М.Т. Хурамшина, А.Г. Спиридонов // Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири: мат. науч. - практ. конф. - Краснообск, 2010. - С. 134-139.
4. Ургуев К.Р. Клостридиозы животных / К.Р. Ургуев // - М.: Россельхозиздат, 1987. - 183 с.
5. Хаиров С.Г. Изыскание способа индикации Clostridium perfringens / С.Г. Хаиров, Д.М. Рамазанова, Ю.С. Салихов, П.М. Кабахов, Ф.И. Исаев // Вестник ветеринарии - №48 (1/2009) - С. 48-50.
6. Патент РФ №2257581 от 25.08.2003 на изобретение «Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагнации (РНГА) при сальмонеллезах животных», Опубл.: 27.07.2005, Бюл. №21.
7. Патент РФ №2342155 от 25.04.2007 на изобретение «Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при микоплазмозе крупного рогатого скота», Опубл.: 27.12.2008, Бюл. №36.
8. Патент РФ №2449290 от 03.08.2009 на изобретение «Способ получения эритроцитарного антигенного диагностикума», Опубл.: 27.04.2012, Бюл. №12.
9. Патент РФ №2625031 от 11.08.2016 «Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики анаэробной энтеротоксемии животных и контроля напряженности поствакцинального иммунитета», Опубл.: 11.07.2017 Бюл. №20.
10. Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции. Справочник. Под редакцией Б.И. Антонова, М.: Агропромиздат, 1986. -352 с.
11. Методические указания по лабораторной диагностике инфекционной энтеротоксемии животных и анаэробной дизентерии ягнят. Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции. Справочник. / Под ред. Б.И. Антонова, 1986.
12. Ceci L. Haemorrhagic bowel syndrome in dairy cattle: possible role of Clostridium perfringens type A in the disease complex / L. Ceci, P. Paradies, M. Sasanelly, D. de Caprariis, F. Guarda//J. Vet. Med. - 2006. - 53 - P. 518-523.
13. Gurjar A. Characterization of Toxin Plasmids in Clostridium perfringens type С isolates / A. Gurjar, J. Li, B.A. McClane // Infection and Immunity. - 2010. -78. - 11 - P. 4860-4869.
14. Kazuaki M. Enterotoxigenic Clostridium perfringens: Detection and Identification / M. Kazuaki, L. Jihong, B.A. McClane // Microbes Environ. - Vol. 27, №4, 2012. - P. 343-349.
15. Mauricio A. Navarro. Mechanisms of Action and Cell Death Associated with Clostridium perfringens Toxins / Mauricio A. Navarro, Bruce A. McClane, Francisco A. Uzal // Toxins (Basel) - 2018 May 22; 10(5).
16. Shrestha A. Enterotoxic Clostridia: Clostridiun perfringens Enteric Diseases / A. Shrestha, F.A. Uzal, B.A. McClane // Microbiology Spectrum - 2018 Sep; 6(5).
17. Van Kruiningen H.J. Clostridial abomasal disease in Connecticut dairy calves / H.J. Van Kruiningen, C.A. Nyaoke, I.F. Sidor, J.J. Fabis, L.S. Hinckley, K.A. Lindell // CVJ. - 2009. - 50 - P. 857-860.