СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ С РЕАКЦИЯМИ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА В ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОМ ПРОЦЕССЕ
AGENT FOR TREATING DISEASES WITH DELAYED HYPERSENSITIVITY RESPONSES IN PATHOGENIC PROCESS

Изобретение относится к области медицины и фармацевтической промышленности, в частности к препаратам на основе дрожжевой РНК, влияющих либо на гуморальный (Th2), либо на клеточный (Th1) иммунный ответ.
По традиционным представлениям иммуноактивные соединения разделяются на иммуностимуляторы и иммунодепрессоры. Однако современные знания о патогенезе многих заболеваний, связанных с нарушением межклональных взаимоотношений за счет расстройства Th1/Th2 регуляторных влияний и баланса соответствующих цитокинов, выдвигают требования к поиску препаратов, проявляющих при первичном скрининге in vivo на интактных животных, разнонаправленное влияние на интегральные показатели - антителообразование и реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) или оказывающие влияние либо только на Th2, либо только на Th1 иммунитет.
В клинической практике для лечения заболеваний с реакциями ГЗТ в патогенетическом процессе (туберкулез, проказа, шистосомоз, саркоидоз и болезнь Крона) особенно ценны препараты, стимулирующие Th2 и одновременно подавляющие Th1 иммунный ответ.
Однако лечебных препаратов с такими свойствами практически нет.
Целью настоящего изобретения является создание эффективного препарата для лечения заболеваний с реакциями ГЗТ в патогенетическом процессе с использованием доступных и недорогих компонентов.
Цель достигается тем, что в качестве такого препарата используется легко проникающий через биологические мембраны мылкий амфифильный комплекс высокополимерной РНК Saccharomyces cerevisiae с олеиновой кислотой при следующем соотношении компонентов: высокополимерная РНК - 80-90%, олеиновая кислота - 10-20% (предлагаемое рыночное название - Виталанг-2).
Пример осуществления предлагаемого способа
Животные
В работе использовали здоровых половозрелых животных - мышей гибридов CBF1 обоего пола, 10-12 недельного возраста, массой тела 22-23 г, полученных из экспериментально-биологической клиники лабораторных животных СО РАМН (Новосибирск). До и в период эксперимента контрольные и опытные животные содержались в виварии в одинаковых условиях: стандартных пластиковых клетках с мелкой древесной стружкой (не более 10 особей) на стандартном рационе, в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей [1]. Все исследования проводили в одно и то же время суток (утром).
Препарат Виталанг-2
Виталанг-2 получали по способу [2], стерилизовали по методу [3], растворяли в день проведения эксперимента в воде для инъекций, встряхивая суспензию 15-30 мин до полного растворения РНК.
Оценку иммуноактивных свойств Виталанга-2 проводили в соответствии с методическими материалами [4] и методическими рекомендациями [5].
Выделение органов, тканей и клеток выполняли по стандартным методикам [6].
8
Гуморальный иммунный ответ на эритроциты барана (ЭБ) (число IgM- и IgG-антителообразующих клеток (АОК) в селезенке) оценивали на пике ответа, свойственного данному генотипу, по количеству локальных зон гемолиза после внутривенного введения 2·10 ЭБ [7-9]. Все процедуры с клетками проводили на льду.
8
Для определения числа IgM-AOK инкубационную смесь, состоящую из клеток селезенки, ЭБ и комплемента, помещали в стеклянные камеры и инкубировали 1,5 ч при 37°C. Виталанг-2 в различных дозах в объеме 0,5 мл вводили внутрибрюшинно один раз в сутки ежедневно в течение 5 дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель препарата (воду). В день последнего введения препарата животных иммунизировали внутривенно ЭБ в дозе (4·10/мл). Количество IgM-AOK в селезенке мышей оценивали на 4-е сутки после иммунизации по количеству зон локального гемолиза в полужидкой среде модифицированным методом [9]. Результаты выражали в абсолютном количестве IgM-AOK в селезенке.
Для определения числа IgG-AOK добавляли антисыворотку против IgG мыши и инкубировали в термостате 2 ч. Зоны гемолиза подсчитывали под бинокулярной лупой (увеличение - ×42). Виталанг-2 в различных дозах в объеме 0,5 мл вводили внутрибрюшинно один раз в сутки ежедневно в течение 5 дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель препарата (воду). В день последнего введения препарата проводили первичную иммунизацию 0,1% ЭБ в объеме 0,5 мл внутривенно. Количество IgG-AOK в селезенке (первичный иммунный ответ) определяли на 9-е сутки после иммунизации. Для определения количества IgG-AOK в селезенке (вторичный иммунный ответ) через 30 дней после первичной иммунизации проводили вторичную иммунизацию 2% ЭБ внутривенно. Количество IgG-AOK определяли в селезенке на пике иммунного ответа (на 5-е сутки после вторичной иммунизации) методом локального гемолиза [9]. Клетки селезенки инкубировали 2 ч при 39°C в камерах с ЭБ, комплементом морской свинки и кроличьей антисывороткой против мышиного IgG (разведение в 2000 раз). Зоны гемолиза подсчитывали под увеличением - ×42. Результаты выражали в абсолютном количестве IgG-AOK в селезенке.
7
8
Клеточный иммунитет оценивали по степени выраженности реакции ГЗТ: измеряли величину отека лапки после введения разрешающей дозы ЭБ сенсибилизированным животным; сенсибилизирующая доза - 2,5·10 ЭБ/мышь внутрибрюшинно, разрешающая доза - 5·10 ЭБ/мышь под подошвенный апоневроз задней лапки на 4 сут, контроль - контралатеральная лапка, в которую вводили среду в том же объеме. Виталанг-2 в различных дозах в объеме 0,5 мл вводили внутрибрюшинно один раз в сутки ежедневно в течение 5 дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель препарата (воду). Для оценки влияния препарата на сенсибилизацию в день последнего введения Виталанга-2 мышей сенсибилизировали внутрибрюшинным введением 0,25% ЭБ в объеме 0,5 мл, на 4-е сутки после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена под подошвенный апоневроз правой задней лапки (50% ЭБ в объеме 50 мкл). В контралатеральную лапку вводили растворитель в том же объеме. Для оценки влияния препарата на эффекторную фазу Виталанг-2 вводили в день проведения сенсибилизации и далее в течение 4-х дней. Контрольным животным в таком же объеме и режиме вводили растворитель препарата (воду). Реакцию ГЗТ оценивали по методике локальной ГЗТ [10]. Учет реакции производили через 24 часа после введения разрешающей дозы ЭБ, величину отека оценивали штангенциркулем. Результаты выражали в процентах.
Статистическую обработку данных по числу АОК, имеющему распределение, отличное от нормального, проводили по непараметрическому критерию U Манна-Уитни [11].
Результаты исследований
В табл.1 представлены данные о влиянии препарата Виталанг-2, введенного в индуктивную фазу первичного гуморального иммунного ответа, на количество IgM-AOK в селезенке мышей. Как видно из таблицы, введение Виталанга-2 в индуктивную фазу первичного гуморального иммунного ответа достоверно увеличивает в селезенке количество АОК, синтезирующих IgM антитела. В табл.2 представлены данные о влиянии препарата Виталанг-2, введенного в индуктивную фазу первичного и вторичного гуморального иммунного ответа, на количество IgG-AOK в селезенке мышей. Как видно из таблицы, введение Виталанга-2 в индуктивную фазу иммунного ответа (перед первичной иммунизацией) достоверно стимулирует вторичный гуморальный иммунный ответ.
В табл.3 представлены данные о влиянии препарата Виталанг-2, введенного в индуктивную и эффекторные фазы развития реакции ГЗТ, на выраженность клеточного иммунного ответа. Как видно из таблицы, Виталанг-2 оказывает иммунодепрессивное действие на выраженность клеточного иммунного ответа (дозозависимое подавление эффекторной фазы реакции ГЗТ и выраженное подавление фазы сенсибилизации в дозе 100 и 200 мг/кг).
Оценивая полученные результаты, следует отметить, что препарат Виталанг-2 оказывает разнонаправленное влияние на гуморальный и клеточный иммунный ответ: стимулирует антителообразование (Th2 ответ) и подавляет Th1 ответ. Перспективно проведение испытаний данного препарата для лечения заболеваний с реакциями ГЗТ в патогенетическом процессе (туберкулез, проказа, шистосомоз, саркоидоз и болезнь Крона). Терапевтическая доза - 50 мг/кг массы тела животного или человека.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (Государственный контракт №16.512.11.2018 от 11.02.2011).
Источники информации
1. Европейская конвенция по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях. Страсбург, 1986.
2. Патент RU 2403288 C1, 10.11.2010.
3. Патент RU 2397988 C1, 27.08.2010.
4. Методические материалы по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств. М., 1984.
5. Методические рекомендации по оценке иммунотоксических свойств фармакологических средств. М., 1992.
6. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П.; Под ред. Новицкого В.В. Методы культуры ткани в гематологии - Томск: Издательство Томского университета, 1992. - 272 с.
7. Jerne N.K., Nordin A.A. Plaque formation in agar by single antibody-producing cells. // Science. - 1963. - Vol.140. - P.405.
8. Sterzl J., Riha I. Detection of cells producing 7S antibodies by the plaque technique. // Nature. - 1965. - V.208. - P.858-859.
9. Cunningham A.J., Szenberg A. Further improvements in the plaque technique for detecting single antibody-forming cells. // Immunol. - 1968. - V.14. - P.599-600.
10. Yoshikai Y., Miake S., Matsumoto T., Nomoto K., Takeya T. Effect of stimulation and blocade of mononuclear phagocyte system on the delayed footpad rection to SRBC in mice. // Immunology. - 1979. - Vol.8. - P.577-583.
11. Гублер E.B. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. Л., 1978. с.68-91.
Таблица 1
Влияние препарата Виталанг-2 на первичный (IgM-АОК) гуморальный иммунный ответ на Т-зависимый антиген у мышей CBF1 (n=5 в каждой группе)
Группы
Число IgM-АОК /селезенку
Контроль
13703
Виталанг-2:
10 мг/кг
14134
50 мг/кг
35723*
100 мг/кг
28989*
200 мг/кг
29762*
*p<0,05 относительно контроля
Таблица 2
Влияние препарата Виталанг-2 на количество IgG-AOK при первичном и вторичном гуморальном иммунном ответе у мышей CBF1 (n=5 в каждой группе)
Группы
Число IgG-АОК (первичный ответ)/селезенку
Число IgG-АОК (вторичный ответ)/селезенку
Контроль
1924
863535
Виталанг-2:
0,5 мг/кг
1471
813651
50 мг/кг
1237
903383
100 мг/кг
1731
1038565*
200 мг/кг
1934
927254
*p<0,05 относительно контроля
Таблица 3
Влияние препарата Виталанг-2 на клеточный иммунный ответ (реакцию ГЗТ) у мышей CBF1 (n=5 в каждой группе)
Группы
Введение препарата до сенсибилизации (%)
Введение препарата после сенсибилизации (%)
Контроль
34,4
44.3
Виталанг-2:
10 мг/кг
31,8 -8%
37,8 -15%
50 мг/кг
37,7 +9%
38,2 -14%
100 мг/кг
25,2 -27%
29,8 -33%
200 мг/кг
23,1 -33%
26,7 -40%