АКТИВИРОВАННАЯ ЛЕЙКОЦИТАРНАЯ КОМПОЗИЦИЯ
ACTIVATED LEUKOCYTE COMPOSITION

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[1] Данная заявка объявляет приоритет заявки под серийным номером 61/209298, поданной 5 марта 2009 г. и озаглавленной «Активированная лейкоцитарная композиция», и заявки под серийным номером 61/211587, поданной 1 апреля 2009 г. и озаглавленной «Активированная лейкоцитарная композиция для сосудистой недостаточности», раскрытие которых приведено в настоящем тексте в качестве ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[2] Процесс заживления ран вовлекает участие белых клеток крови, также известных как лейкоциты. Лейкоциты включают лимфоциты, гранулоциты и моноциты. Существуют три основных типа лимфоцитов: T-клетки, B-клетки и натуральные клетки киллеры. T-клетки и B-клетки играют важную роль в распознавании антигенов в организме (Parkin, 2001). Натуральные клетки киллеры (НК) идентифицируют инфицированные клетки по изменениям уровней главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) и уничтожают инфицированные клетки (Moretta, 2008). Участие лимфоцитов в процессе заживления во многом связано с выработкой ими цитокинов и факторов роста (Keen, 2008). В коже был описан новый класс гамма-дельта-T-клеток (Jameson, 2002. Havran, 2005). Среди различных типов гранулоцитов значимыми являются нейтрофилы, базофилы и эозинофилы. Моноциты дифференцируются в макрофаги, которые несут ответственность за разрушение остатков органических веществ тканей или проникающих чужеродных веществ. Макрофаги также вырабатывают молекулы, которые контролируют воспаление и заживление (Riches, 1996).
[3] Процесс заживления ран происходит в три перекрывающиеся фазы (Li, 2007; Broughton, 2006; Tsirogianni, 2006; Singer, 1999; Martin, 1997). Первая фаза представляет собой стадию воспаления. Она характеризуется привлечением нейтрофилов, а затем моноцитов, в область раны, где они убивают и фагоцитируют бактерии (Agaiby, 1999).
[4] Вторая фаза заживления раны, известная как пролиферативная фаза, включает в себя формирование новой грануляционной ткани. Фибробласты пролиферируют и мигрируют в раневое пространство и синтезируют коллаген и другие компоненты внеклеточного матрикса (Greiling, 1997). В то же время происходит ангиогенез, обеспечивая метаболически активную новую грануляционную ткань питательными веществами и кислородом (Tonnesen, 2000). Кератиноциты из интактного эпидермиса начинают мигрировать через временную матрицу и размножаться, что приводит к образованию новой эпителиальной ткани (Kim, 1992).
[5] Ремоделирование является третьей, заключительной фазой в заживлении ран. Эта фаза характеризуется дифференциацией фибробластов в миофибробласты, которые сокращаются и приводят края раны ближе друг к другу (Tomasek, 2002). Ремоделирование коллагеновых волокон посредством деградации и повторного синтеза позволяет ране набрать силу вследствие переориентации волокон коллагена (процесс надежно контролируется факторами роста) (Werner, 2003).
[6] Проблема лечения ран нередко усугубляется у пациентов с многочисленными патологиями, такими как диабет, ишемическая болезнь сердца и гипертензия. Эти заболевания имеют общий эффект обострения сосудистых осложнений из-за различных физиологических состояний. Осложнения ран могут привести к повышенной заболеваемости и смертности (Doshi, 2008).
[7] Обычные методы лечения ран включают хирургическую обработку, терапию антибиотиками и наложение различных повязок (Могап, 2008; Fonder, 2008). Раны, устойчивые к традиционной терапии, также называются рефрактерными ранами. Эти раны приводят к снижению качества жизни и могут приводить к росту заболеваемости и смертности. Таким образом, продолжает существовать необходимость в композициях и способах эффективного заживления ран.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[8] Один из аспектов настоящего изобретения относится к способу изготовления активированной лейкоцитарной композиции (АЛК), полученной из крови (например, получаемой или полученной из образца цельной крови). Способ включает этапы, при которых лейкоциты, которые могут быть получены из образцов цельной человеческой крови, подвергаются первой инкубации в течение периода времени и при температуре, позволяющей лейкоцитам становиться активированными, что в предпочтительных вариантах составляет приблизительно от 8 часов до приблизительно 20 часов, при комнатной температуре. После инкубации лейкоциты контактируют с физиологически приемлемым водным раствором, таким, как, например, стерильная дистиллированная вода, чтобы инициировать гипоосмотический шок, с последующим контактом лейкоцитов в состоянии шока с физиологически приемлемым солевым раствором для восстановления изотоничности. Данная активированная лейкоцитарная композиция (АЛК) может быть использована терапевтически. Тем не менее, в некоторых вариантах, отдельно, и по существу параллельно с первой инкубацией лейкоцитов, образец плазмы, который может быть получен из того же или из другого образца цельной крови (например, от того же или от другого человека), контактирует с коагулянтом при температуре приблизительно равной 37°C одновременно с лейкоцитарной инкубацией, которая, в предпочтительных вариантах, составляет приблизительно от 8 часов до 20 часов, с последующим отделением сыворотки от коагулированного образца плазмы. Лейкоциты ресуспендируют в сыворотке, собранной из образцов коагулированной плазмы, формируя таким образом АЛК. После первой инкубации лейкоциты могут быть дополнительно подвергнуты второй инкубации в течение приблизительно от 60 до 120 минут при температуре приблизительно равной 37°C.
[9] Другой аспект настоящего изобретения относится к АЛК, полученной из крови. Активированная лейкоцитарная композиция настоящего изобретения включает в себя, с точки зрения популяции лейкоцитов присутствующих в ней, приблизительно от 40% до 90% гранулоцитов, приблизительно от 5% до 20% моноцитов и приблизительно от 5% до 30% лимфоцитов, от общего количества лейкоцитов в АЛК. Как показано на рабочих примерах, изобретаемые АЛК также могут характеризоваться и отличаться от известных композиций с точки зрения минимального выхода лейкоцитов (относительно образца цельной крови), жизнеспособности лейкоцитов, а также минимальных уровней активации гранулоцитов, например, как указано CD lib. АЛК может дополнительно содержать остаточные уровни тромбоцитов (в количестве приблизительно равном 46,8+/-39,2 (103/мкл)), и эритроцитов (в количестве приблизительно равном 0,1+/-0,06 (106/мкл)) АЛК. Популяция лимфоцитов может включать приблизительно от 7% до 25% В-клеток (CD 19+), приблизительно от 20% до 30% клеток натуральных киллеров (CD3-/CD56+), приблизительно от 40% до 60% T-клеток (CD3+), приблизительно от 0,1% до приблизительно 30% клеток НКТ CD3+/CD56+, приблизительно от 8% до приблизительно 20% T-хелперов (CD4+/CD3+), и приблизительно от 20% до приблизительно 30% клеток CD8+/CD3+. Клетки могут быть суспендированы в носителе, таком как сыворотка (которая может быть аутологической или аллогенной по отношению к реципиенту), или в других физиологически приемлемых изонормальных жидкостях, подходящих для хранения и введения клеток, как, например, раствор, используемый для восстановления изотоничности.
[10] Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу стимуляции заживления ран, который включает введение или нанесение АЛК на рану другим способом.
[11] Раскрытое изобретение достигает нескольких неожиданных результатов по сравнению, по меньшей мере, с одной известной композицией для заживления ран, содержащей лейкоциты. Как продемонстрировано в рабочих примерах настоящего изобретения, эти результаты включают повышение выхода и жизнеспособности лейкоцитов и более высокий процент активированных гранулоцитов. Также полагают, что описанное изобретение включает неожиданно более высокий процент активированных моноцитов и сравнительно более высокий процент Т-клеток CD4 по сравнению с Т-клетками CD8.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[12] Фиг. 1 схематически изображает первую часть репрезентативной системы для производства АЛК композиций по настоящему изобретению, включающая мешки A-C (Комплект-1), представляющие мешки или контейнеры для хранения крови, где мешок A содержит эритроцитарную массу, собранную у донора; мешок В содержит плазму, а мешок С содержит лейкоциты (которые после первоначального отделения от цельной крови образуют слой, который обычно называется лейкоцитная пленка).
[13] Фиг. 2 схематически изображает вторую часть репрезентативной системы для производства АЛК композиций по настоящему изобретению, включающая комплект из 7 мешков, после того, как из системы удален мешок А с эритроцитами, а мешки В и С из фиг. 1 соединены с мешками 1-5 (Комплект 2).
[14] Фиг. 3А и 3В являются графиками, иллюстрирующими общие тенденции экспрессии как CD62L, так и CD42b, которые являются индикаторами активации клеток.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[15] Кровь определяется здесь как цельная кровь или любая из ее составных частей (например, плазма, лейкоциты, тромбоциты или эритроциты). Количества тромбоцитов и эритроцитов, которые могут присутствовать в АЛК настоящего изобретения, могут быть ниже, чем количество, которое присутствует в цельной крови.
[16] Термин "приблизительно", как используется здесь в связи с любыми значениями (включая нижние и верхние пределы числовых диапазонов), как имеющий какое-либо значение допустимого диапазона отклонения от +/-0,5% до +/-20% (и значения между ними, например,±1%, ±1,5%, ±2%, ±2,5%, ±3%, ±3,5%, ±4%, ±4,5%, ±5%, ±5,5%, ±6%, ±6,5%, ±7%, ±7,5%, ±8%, ±8,5%, ±9%, ±9,5%, ±10%, ±10,5%, ±11%, ±11,5%, ±12%, ±12,5%, ±13, ±13,5%, ±14%, ±14,5%, ±15%, ±15,5%, ±16%, ±16,5%, ±17%, ±17,5%, ±18%, ±18,5%, ±19%, ±19,5% и ±20%).
[17] Исходные материалы для производства изобретаемых АЛК могут быть получены из нескольких источников. Цельная кровь или один или несколько ее компонентов (например, лейкоциты и плазма) могут быть получены из аутологических или аллогенных источников. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения образец крови, отобранный у пациента, которого в конечном итоге будут лечить АЛК, называется в этом документе аутологичным образцом или источником крови. В вариантах, в которых источник(и), т.е. кровь или ее компоненты, получены от индивидуумов, которые не являются планируемыми реципиентами АЛК, который(е) называется(ются) аллогенным образцом или источником крови, эти исходные материалы могут быть просто получены из банка крови. Образцы могут быть исследованы банком крови на группу крови и резус фактор (ABO, Rh), нерегулярные антитела к антигенам эритроцитов и заболеваниям, передающимся через переливание крови. В частности, исследование может быть проведено с использованием анализатора крови Abbott PRISM с антителами против: гепатитов B и C, ВИЧ-1/2, ЧТЛВ и сифилиса (HCV, HbsAg, anti-HIV ½ 0+; и anti-HTLV I/II). Образцы можно также обследовать на ВИЧ, ВГС и ВГВ молекулярными методами (тестирование нуклеиновых кислот - ТНК). Молекулярный скрининг может быть выполнен с использованием коммерчески доступных инструментов, например, системы TIGRIS (Chiron).
[18] В указанных вариантах с участием аллогенных источников образцы могут быть получены от доноров с тем же типом крови, как предполагаемый реципиент АЛК. Альтернативно, как дополнительно изложено здесь, образцы плазмы могут быть получены от доноров крови АВ+, лейкоциты могут быть получены от пациентов с группой крови 0-. Пациенты с группой крови АВ+ являются универсальными донорами плазмы, а пациенты с группой крови 0 - являются универсальными донорами лейкоцитов. Независимо от источника, вся необходимая обработка образца(ов) может быть проведена без необходимости в использовании высокоспециализированного оборудования.

[19] Предпочтительный способ получения АЛК композиции настоящего изобретения в настоящее время описан со ссылкой на Фиг. 1 и 2, которые отображают систему, содержащую два комплекта взаимосвязанных стерильных инфузионных мешков. Система герметизирована таким образом, что воздействия внешней среды отсутствуют. В частности, трубки, связывающие два комплекта, соединяются в одну систему, с использованием стерильного соединительного устройства (например, TSCD-II, номер по каталогу МЕ-203АН, производитель Тегито). В частности, для обеспечения соблюдения стандартов стерильности соединение(сварка) и разрезание трубок осуществляются при помощи специальных пластин, предварительно нагретых до приблизительно 300°C. Такая высокая температура повышает стерильность процедуры сварки. Для дальнейшего обеспечения стерильности сварка может быть осуществлена в боксе биологической безопасности класса 100 внутри области локализации класса 100000.
[20] Как продемонстрировано на Фиг. 1 и 2, система содержит два стерильных комплекта мешков. Комплект 1, включающий мешки A, B и С, является стандартным, коммерчески доступным комплектом из трех мешков, обычно используемых для переливания крови. Образец крови человека, как правило, в объеме приблизительно от 400 мл до приблизительно 550 мл, собирают в банк крови через венепункцию и помещают в мешок A, а затем фракционируют на составные части с использованием стандартных способов в мешках A, B и C. Например, мешок A, содержащий образец крови, центрифугируют. После центрифугирования компоненты крови разделяются, например, с использованием экстрактора компонентов крови производства Baxter. Лейкоцитную пленку, содержащую лейкоциты, помещают в мешок C, плазму помещают в мешок B, а эритроциты остаются в мешке A. Таким образом, в результате этого процесса мешок A содержит эритроцитарную массу; мешок В содержит плазму; и мешок C содержит лейкоцитную пленку, содержащую лейкоциты (и, возможно, остаточную плазму и эритроциты). Кроме того, компоненты крови могут быть отделены от цельной крови с помощью способа афереза, известного в данной области техники.
[21] Мешок A затем отсоединяют от комплекта, состоящего из трех мешков. Как показано на Фиг.2, мешки B и C затем присоединяют к сделанным на заказ инфузионным мешкам 1-5 (Комплект-2) для формирования системы, которая используется для изготовления активированной лейкоцитарной композиции. Как описано выше, сваривание осуществляется со стерильным соединительным устройством. Мешок 1 содержит первый водный раствор (например, 200 мл стерильной дистиллированной воды), используемый с целью подвергнуть клетки лейкоцитной пленки гипоосмотическому шоку. Это служит для лизиса остаточных эритроцитов, которые могут присутствовать. Мешок 2 содержит второй раствор (например, 20 мл буферизованного раствора хлорида натрия (8,91% NaCl, фармакопея США), или любой другой физиологически приемлемый раствор, содержащий неорганические ионы, органические осмолиты такие, как сахароза, или какие-либо их комбинации, например, раствор лактата Рингера (по Хартману)), который служит для восстановления лейкоцитами изотоничности после гипоосмотического шока. Когда раствор хлорида натрия добавляют к 200 мл дистиллированной воды, она становится 0,9% раствором хлорида натрия. Мешок 3 содержит третий раствор (например, приблизительно 60 мл буферизованного раствора хлорида кальция (1,17% CaCl дигидрат, фармакопея США)), который влияет на коагуляцию плазмы в мешке В и на облегчение разделения на тромбоциты и сыворотку. Мешок 4 и мешок 5, каждый, содержит стерильный отфильтрованный воздух, приблизительно 60 мл и 500 мл, соответственно. Комплект упаковывают как единый блок и стерилизуют с применением пара высокого давления, что значительно снижает риск развития вторичной инфекции для пациента.
[22] Лейкоциты затем переносят из мешка С в мешок 4 (или мешок 5) и инкубируют, предпочтительно в вертикальном положении, чтобы дать им возможность активироваться. Для целей настоящего изобретения активация клеток определяется как процесс, при котором клеткам (лейкоцитам) предоставляют возможность стать активированными, а точнее, как переход от покоя к функционально активному состоянию, которое сопровождается синтезом биологически активных веществ или перемещением предварительно синтезированных веществ из цитоплазмы в клеточную мембрану, или их высвобождением из клеток. Эти вещества могут включать белки или полипептиды, липиды, сахара, кислородные радикалы и другие биохимические фрагменты, которые функционируют как молекулы адгезии, цитокины, факторы роста, ферменты, факторы транскрипции и рецепторы клеточной сигнализации и медиаторы. При обнаружении и идентификации внутри клеток или на клеточной поверхности эти молекулы называют маркерами активации.
[23] В некоторых вариантах лейкоциты инкубируют, просто оставляя их стоять при комнатной температуре. Для целей настоящего изобретения комнатная температура относится к температуре в диапазоне приблизительно от 12°C до приблизительно 28°C, а в некоторых вариантах приблизительно от 16°C до приблизительно 25°C. Период времени инкубации может изменяться в зависимости от температуры. Время инкубации будет ниже при повышенных температурах. Инкубационное время, необходимое для активации лейкоцитов, будет приблизительно обратно пропорционально температуре, при которой проводится инкубация. Например, в вариантах, где лейкоциты оставляют стоять при комнатной температуре, время инкубации обычно составляет приблизительно от 90 минут, и от более 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 часов до приблизительно 20  часов. В предпочтительных вариантах инкубационное время колеблется от приблизительно 8 до приблизительно 20 часов. В более предпочтительном варианте инкубация лейкоцитов происходит при температуре приблизительно от 18°C до 24°C в течение приблизительно от 8 часов до 12 часов. В других вариантах инкубация лейкоцитов включает их экспозицию к воздействию тепла, например, при температуре выше комнатной и примерно до 37°C. Срок инкубации при повышенной температуре обычно составляет от 5 часов до приблизительно 24 часов.
[24] Обращаясь снова к Фиг.2, лейкоциты из мешка C перемещают в мешок 4, который, как правило, меньше, чем мешок C (например, приблизительно 250 мл - приблизительно 500 мл). Также клетки могут быть перемещены в другой мешок объемом 500 мл (мешок 5). Чтобы предоставить возможность для активации лейкоцитов, мешок 4 (или мешок 5) помещают в вертикальное положение и инкубируют в течение приблизительно от 8 часов до приблизительно 20 часов при комнатной температуре.
[25] После инкубации лейкоциты подвергают гипоосмотическому шоку, который лизирует эритроциты. В предпочтительных вариантах гипоосмотический шок осуществляют немедленно (то есть, после завершения предыдущего этапа без какого-либо промежуточного этапа или ненужной задержки, как правило, меньше чем 2 минуты). Гипоосмотический шок может быть инициирован перемещением дистиллированной воды из мешка 1 в мешок 4 (или мешок 5), содержащий лейкоциты. Обработку с помощью гипоосмотического шока, как правило, проводят в течение приблизительно 45 секунд. Вслед за этим этапом и, желательно, сразу же после него, восстанавливают изотоничность лейкоцитов путем перемещения раствора хлорида натрия из мешка 2 в мешок 4 (или мешок 5). Отношение объема раствора хлорида натрия к клеточной суспензии в воде составляет, как правило, приблизительно 1:10. Содержимое мешка 4 затем переносят в мешок 1 (или оставляют в мешке 5), который больше по объему, чем мешок 4. Как описано выше, эта композиция в патентоспособных способах может быть использована терапевтически.
2
2
2
[26] Предпочтительный вариант включает, по меньшей мере, один дополнительный этап. Таким образом, в отдельном этапе, который может быть проведен одновременно с лейкоцитарной инкубацией, плазму разделяют на тромбоциты и сыворотку с помощью коагулянта, такого как СаСl, с последующим центрифугированием. Таким образом, в этом типичном варианте СаСl из мешка 3 переносят в мешок B. Мешок B, который теперь содержит композицию плазмы и СаСl, как правило, предоставляют возможность коагулировать при температуре приблизительно равной 37°C. Плазма остается в контакте с коагулянтом по существу такой же период времени, в течение которого инкубируют лейкоциты.
[27] После гипоосмотического шока и восстановления изотоничности лейкоцитов и последующего перемещения содержимого мешка 4 в мешок 1 (или оставления в мешке 5), и после коагуляции плазмы в мешке B всю систему, состоящую из 7 мешков, центрифугируют. В предпочтительных вариантах центрифугирование проводят сразу же после того, как лейкоциты перемещают в мешок 1 (или оставляют в мешке 5), чтобы не подвергать клетки воздействию гемолизата. После центрифугирования надосадочную жидкость из мешка 1 (или мешка 5) перемещают в мешок C, а лейкоцитарный осадок, сформированный в мешке 1 (или мешке 5) в результате центрифугирования, ресуспендируют в приблизительно от 20 мл до приблизительно 50 мл сыворотки из мешка B.
[28] В еще одном этапе предпочтительного варианта осуществления настоящего изобретения активированные лейкоциты могут быть инкубированы в упомянутой выше коагулированной плазме до того, как сделана финальная композиция. Как правило, этот второй период инкубации проводят в течение 1-2 часов при температуре 37°C.
[29] В других вариантах композиция АЛК может быть получена из меньших объемов образцов крови, с соразмерным снижением объемов всех растворов и с использованием мешков меньшего размера. Кроме того, использование мешков различных размеров приводит к получению различных композиций АЛК. Даже в этих вариантах, в качестве исходных материалов могут быть использованы аллогенные или аутологичные образцы крови. Использование меньших объемов предоставляет клиницисту возможность выполнять сбор крови автономно, без использования внешнего банка крови, например, в чрезвычайных ситуациях, при лечении пациентов со здоровой во всем остальном иммунной системой, но страдающих от некоторых типов травматических ран (например, на поле боя и в боевых условиях). В этих вариантах тестирование на заразные болезни и антигены может не проводиться. Однако, в таких случаях пациенты с рефрактерными ранами не являются клинически приемлемыми донорами крови для эффективного изготовления АЛК. Если возникает такая ситуация, АЛК будет производиться от аллогенных доноров с помощью средств, описанных здесь.
[30] АЛК настоящего изобретения включают лейкоциты, например гранулоциты, моноциты и лимфоциты. Гранулоциты включают нейтрофилы, эозинофилы и базофилы. В самом широком смысле популяция лейкоцитов АЛК, как правило, содержит приблизительно от 40% до приблизительно 90% гранулоцитов, приблизительно от 5% до приблизительно 20% моноцитов и приблизительно от 5% до приблизительно 30% лимфоцитов. Конкретное количество клеток может отличаться в зависимости от применяемых техник анализа. Если анализ проводят с использованием ФАКС (например, используя анализ точечной диаграммы рассеивания света под углом по сравнению с прямым рассеиванием), композиция лейкоцитов обычно содержит приблизительно от 55% до приблизительно 80% гранулоцитов, приблизительно от 5% до приблизительно 15% моноцитов и приблизительно от 5% до приблизительно 30% лимфоцитов, а в некоторых вариантах составляет приблизительно 58-76% гранулоцитов; приблизительно 5-11% моноцитов и приблизительно 9-23% лимфоцитов. Если анализ проводят с использованием анализатора Cell Dyn, композиция лейкоцитов обычно содержит: приблизительно от 50% до приблизительно 90% гранулоцитов; приблизительно от 5% до приблизительно 15% моноцитов; и приблизительно от 10% до приблизительно 25% лимфоцитов. Субпопуляция лимфоцитов в АЛК может поддерживать следующие клетки в общих пределах следующим образом: приблизительно от 7% до приблизительно 25% B-клеток (CD19+); приблизительно от 20% до приблизительно 30% НК клеток (CD3-/CD56+), приблизительно от 40% до приблизительно 60% T-клеток (CD3+), приблизительно от 0,1% до приблизительно 30% клеток НКТ CD3+/CD56+, приблизительно от 8% до приблизительно 20% клеток T-хелперов (CD4+/CD3+), и приблизительно от 20% до приблизительно 30% клеток CD8+/CD3+. В предпочтительных вариантах субпопуляция лимфоцитов обогащается, по меньшей мере, 9% CD56+ клеток (CD3-/CD56+; CD3+/CD56+; CD3+/CD56+/CD8+), количество Т-лимфоцитов хелперов (CD4+/CD3+) снижается до менее чем 20% и/или соотношение клеток Т-хелперов к Т-супрессорам (CD4+/CD3+: CD8+/CD3+) составляет меньше чем 0,8.
[31] Пациенты, страдающие от ран, могут быть с физиологическими осложнениями или здоровыми во всем остальном. Например, в связи с уже ослабленными метаболическими системами пациенты с сахарным диабетом и другими медицинскими осложнениями являются кандидатами на АЛК, произведенную из гетерологичной крови, поскольку свои собственные лейкоциты могут не быть оптимальными для данной процедуры. Тем не менее, здоровые во всем остальном пациенты, как в примере пациентов с травмами, также являются хорошими кандидатами для АЛК композиций настоящего изобретения.
[32] Настоящее изобретение пригодно для стимулирования заживления при множестве типов ран. Хотя на практике изобретение может быть использовано в сочетании с другими способами лечения, оно не требует использования дополнительных способов для достижения эффективного заживления ран. Изобретатели предлагают применение АЛК для любого типа раны и не предвидят никаких ограничений типов ран, которые можно лечить. Легкость нанесения, например, при помощи стандартного шприца или аналогичного устройства для применения делает изобретаемые композиции АЛК безопасными и простыми в использовании.
[33] Раны, которые поддаются лечению изобретением, как правило, представляют собой проколы, порезы или разрывы живых тканей. Раны кожи могут проникать внутрь эпидермиса, дермы или, в случае раны на всю толщину кожи, она может проникать в подкожные ткани. Таким образом, типичные образцы ран, которые поддаются лечению композициями и способами настоящего изобретения, включают декубитальные язвы или пролежни, диабетические язвы, глубокие раны грудины, например, после операции на открытом сердце (к большой подкожной вене после коронарной реваскуляризации и отбора большой подкожной вены), а также послеоперационные раны после абдоминального хирургического вмешательства и любого другого вида хирургического вмешательства. Другие раны, возникающие в результате травмы, как, например, от огнестрельного оружия, ножевые раны, или раны от воздействия любого другого объекта, способного вызвать разрез или разрыв кожи. Раны полости рта (например, зубов), а также раны, которые возникают как побочный эффект лечения или как симптом различных патологий (например, язвы, связанные с саркомой Капоши), а также внутренние раны (например, анальные трещины и раны или повреждения желудочно-кишечного тракта, такие как язвы в желудке или кишечнике) также могут поддаваться лечению с помощью настоящего изобретения.
[34] АЛК может также быть использована для лечения любых ран, осложненных сосудистой недостаточностью. Сосудистая недостаточность, для целей настоящего изобретения, относится к недостаточной циркуляции крови в результате недостаточной перфузии в пораженных областях. Такая недостаточность может быть вызвана травмой (например, повреждение сосудистой сети, прилегающей к костному перелому), или различными патологиями (например, сахарный диабет и атеросклероз). В любом случае сосудистая недостаточность, индуцированная травмой или болезнью, уменьшает вероятность эффективного заживления ран. Для улучшении результатов заживления ран у этих пациентов может быть пригодна АЛК, и ее следует вводить в соответствии со способами, описанными в настоящем документе. Кроме того, алгоритмы лечения не должны быть ограничены тяжестью и типом раны или степенью сосудистой недостаточности. АЛК может быть более эффективной у пациентов с наиболее тяжелыми ранами и сосудистой недостаточностью.
[35] В целом, аппликация активированной лейкоцитарной композиции осуществляется с помощью одной или нескольких инъекций АЛК непосредственно в рану или в ткани, окружающие рану. АЛК может быть непосредственно нанесена на открытую рану.
[36] Для инъекции в рану предпочтительно использовать шприц Луер-Лок или любой другой коммерчески доступный тип шприца, который имеет запирающий механизм между шприцем и иглой. Биологическое пространство раны, в частности пролежня, часто ограничено. При введении инъекции в рану существует риск давления, которое вызывает разъединение шприца от иглы. Использование шприца с закрепляющим механизмом устраняет этот риск.
[37] Если инъекция в ткани раны не представляется возможной, АЛК может быть непосредственно нанесена в полость раны. Аппликация таким способом может быть выполнена с использованием непосредственного нанесения с помощью шприца или трубок.
[38] АЛК может быть нанесена на рану или вокруг раны с помощью повязки. Сухие перевязочные материалы включают марлю и бинты, неклейкие сетки, мембраны и пленки, пены и тканевые клеи. Влагоудерживающие барьерные перевязочные материалы включают пасты, кремы и мази, непроницаемые или полупроницаемые мембраны или пленки, гидроколлоиды, гидрогели и комбинацию этих продуктов. Биологически активные перевязочные материалы включают антимикробные повязки, интерактивные повязки, однокомпонентные биологические повязки и комбинированные продукты. В некоторых вариантах рану тампонируют стерильной марлей, смоченной в АЛК. Перевязочный материал, например, такой как стерильные марлевые прокладки, может быть пропитан такой композицией, как раствор лактата Рингера (по Хартману), альгинатсодержащая повязка, полиуретановый перевязочный материал или повязка из карбоксиметилцеллюлозы применяются для покрытия ран с последующим применением сухой повязки. Если рана субъекта чрезвычайно инфицирована, то могут быть применены повязки с серебром, такие как Silverlon. Выбор послеинъекционной повязки основан на решении врача. Коммерческая доступность, история предыдущего клинического успеха и толерантность пациента - все это является факторами, которые необходимо учитывать при выборе повязки на рану. Перевязку можно периодически удалять, например, обычно, примерно через 24 часа, для того, чтобы орошать рану, например, стерильной водой и мылом.
[39] В другом варианте композиция может быть помещена на физиологически инертный и/или рассасывающийся матрикс или каркас (например, коллаген) и вставлена в рану с помощью прессования (тампонады). Это обеспечивает продолжительную доставку АЛК к месту, которая обеспечивает преимущества для пациента тем, что клетки имеют более длительный период нахождения на месте.
[40] АЛК композиции могут быть введены в рану один или несколько раз, например, через 4 недели, как только врач определяет, будет ли необходима повторная аппликация. Факторы, которые могут быть приняты во внимание, включают увеличенные размеры раны (ширина, длина и глубина), наличие нагноения, гипертермии или любого другого признака или симптома, указывающего на неподдающуюся лечению инфекцию, такую, при которой обосновано повторное лечение. В дополнение к повторной терапии, в любой момент, который врач сочтет подходящим, может быть назначено направление на хирургическую обработку.
2
[41] АЛК может быть использована в сочетании с любым другим традиционным лечением ран, таким как согревание (терапевтическое тепло), электростимуляция, магнетизм, лазерная фототерапия, циклоидальная вибрационная терапия и ультразвук. Она также может быть использована с биологической терапией, такой как личинкотерапия, заменители кожи, культура кератиноцитов (Epicel, Genzyme biosurgery), замена кожи человека (Dermagraft, Smith and Nephew Inc.), подвергнутая обработке дерма, полученная от трупа (Alloderm, Life Cell Corporation), двухслойный эквивалент кожи (Apligraf, Organogenesis Inc.), TransCyte (Smith and Nephew Inc.), факторы роста (PDGF (фактор роста тромбоцитов) в настоящее время является единственным фактором роста, лицензированным для наружного применения), и фибриновый герметик (клей). В некоторых вариантах АЛК используется в сочетании с вакуумной терапией (система VAC), которая является коммерчески доступной терапией ран производства KCI. VAC способствует заживлению ран путем воздействия на рану отрицательного давления. В этих вариантах АЛК предпочтительно наносят на рану перед проведением VAC терапии. В других вариантах АЛК используется в сочетании с гипербарической терапией (Thackham, 2008). Например, АЛК может быть нанесена на рану незадолго до того, как пациент получит гипербарическую терапию. АЛК может быть также использована в сочетании с низкоэнергетической ударно-волновой терапией (например, импульсы приблизительно равные 0,1 мДж/мм; 5 Гц) на каждый сантиметр длины раны). См., например, Dumfarth, et al., Ann. Thorac. Surg. 86:1909-13 (2008).
[42] После лечения раны можно оценить измерением длины, ширины и высоты. Как правило, рана считается излеченной, когда все измерения этих параметров незначительны. АЛК также может обеспечить обезболивающий эффект.
[43] Активированная лейкоцитарная композиция особенно пригодна для лечения ран, включая диабетические язвы стопы и декубитальные язвы. Декубитальные язвы являются пролежневыми язвами, вызванными затруднением кровотока, как правило, из-за длительного давления на отдельную область (Berlowitz, 2007). Декубитальные язвы вызывают заболеваемость и смертность у пожилых людей. По крайней мере, 48% пролежневых язв IV степени остаются незажившими после одного года лечения (Girouard, 2008). Пациенты, страдающие от декубитальных язв, также часто имеют сопутствующие патологии, такие как диабет и гипертония. Эти патологии еще больше осложняют успешное лечение декубитальных язв.
[44] В одном из вариантов для лечения декубитальных язв композиция аспирируется в стерильный шприц любого размера, используя иглы 18-го калибра (18G). Аспирация проводится медленно, чтобы минимизировать повреждение клеток. Хотя размер шприца и иглы не являются ограничением, игла большого калибра является предпочтительной для аспирации. Это облегчает перемещение и уменьшает повреждение клеток.
[45] Аппликация активированной лейкоцитарной композиции на язву включает инъекционное введение композиции в рану. Может быть использован весь образец из шприца и, если на основании клинических параметров будет установлена необходимость, врач может выбрать введение дополнительной АЛК.
[46] Иглу 18G, используемую для аспирации, обменивают на иглу размером в пределах 22-35G. АЛК может быть введена путем инъекции в рану в различных местоположениях. В одном из вариантов инъекции вводят на расстоянии приблизительно от одного до приблизительно трех сантиметров друг от друга на протяжении всей длины раны. В каждое место инъекции вводят 0,1-0,3 мл АЛК.
[47] В другом варианте все содержимое шприца можно вводить в одно время в единственное место в пределах раны.
[48] Аспект(ы) настоящего изобретения будут описаны в соответствии со следующими неограничивающими примерами.
[49] Пример 1 - Анализ клеточной активации
[50] Активированная лейкоцитарная композиция, изготовленная в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения, была определена количественно с помощью анализа различных маркеров на клеточной поверхности. Увеличение агрегации тромбоцитов либо с моноцитами, либо с гранулоцитами является признаком активации моноцитов и гранулоцитов через экспрессию селектина P. CD62L является белком плазматической мембраны, который теряется во время активации и, следовательно, уменьшается при клеточной активации. CD42b является маркером активации тромбоцитов, вовлеченным в процесс коагуляции как фактор агрегации. Он взаимодействует с внеклеточным матриксом и с молекулами адгезии, а также используется в настоящем изобретении в качестве индикатора активации моноцитов и гранулоцитов.
[51] Для пробы в трех временных точках отбирают клетки: свежую лейкоцитную пленку (СвЛП); инкубированную лейкоцитную пленку (ИЛП); и финальную активированную лейкоцитарную композицию (ФП) (Таблица 1).
Таблица 1
Маркеры клеточной поверхности, свидетельствующие об активации лейкоцитов
% CD62L позитивных клеток
СвЛП
ИЛП
ФП
Моноциты
68
55
44
Гранулоциты
97
47
39
% CD42b позитивных клеток
Моноциты
26
74
92
Гранулоциты
3
15
39
[52] СвЛП отбирают сразу же после приготовления лейкоцитной пленки. ИЛП отбирают после первого периода инкубации и ФП отбирают из конечного продукта. В каждой точке времени, клетки помечают специфическими моноклональными антителами (аллофикоцианин (АФЦ), конъюгированный анти-CDH, фикоэритрин (ФЭ), конъюгированный анти-С042b и флуоресцеин-изотиоцианат (ФИТЦ), конъюгированный анти-СБ62b антителами), а затем анализируют при помощи ФАКС.
6
[53] Клетки из каждой временной точки промывают ФАКС красящим раствором (ФСБ, 2% нормальной мышиной сыворотки; 0,02% азида натрия), отбирают аликвоту и окрашивают в соответствии с протоколом окрашивания. Кратко, 0,5× (10/мкл) клеток инкубируют с соответствующими моноклональными антителами в течение 30 мин при комнатной температуре (КТ) или при температуре +4°C в темноте. После инкубации клеточную композицию обрабатывают буфером для лизиса эритроцитов, промывают, а затем, в заключение, ресуспендируют в ФСБ для восприимчивости к ФАКС. Для CD62L положительного (+) окрашивания, клеточную композицию инкубируют с анти-СЭ14 человека (АФЦ) и античеловеческими CD62L (ФИТЦ) антителами при температуре +4°C. Для окрашивания CD42b+, клеточную композицию инкубируют с античеловеческим ЭМ (АФЦ) и античеловеческим CD42b (ФЭ) при комнатной температуре (КТ). Отрицательную контрольную клеточную композицию инкубируют с античеловеческими CD 14 и контролируют соответствующий изотип в соответствующих условиях. Ассоциированное с клетками рассеивание света и флуоресценцию анализируют с использованием анализатора «ФАКС Калибур» (Becton Dickinson). Моноциты определяют как CD14-положительные клетки, а гранулоциты идентифицируют по их характерным свойствам рассеивания света. CD62L или CD42b позитивные клетки определяют как процент моноцитов и гранулоцитов с флуоресценцией больше, чем порог, установленный моноцитами и гранулоцитами, инкубированными с соответствующими антителами контроля изотипа.
[54] Как продемонстрировано на Фиг. 3А и 3В и в Таблице 1, результаты согласуются с ожиданием, что экспрессия CD62L будет уменьшаться по мере прогрессирования активации и уровень CD42b будет возрастать по мере прогрессирования активации. Эти данные демонстрируют, что лейкоциты становились активированными.
Пример 2 - АНАЛИЗ АКТИВИРОВАННОЙ ЛЕЙКОЦИТАРНОЙ КОМПОЗИЦИИ
[55] Таблицы 2 и 3 отображают клеточный состав конечной АЛК, как определено с помощью анализа анализатором Cell Dyn. Клетки анализируют после ресуспендирования активированных лейкоцитов в сыворотке. Жизнеспособные клетки окрашивают, используя изоляцию трипановым синим, и наблюдают под микроскопом.
Таблица 2
Состав активированной лейкоцитарной композиции
Тромбоциты (103/мкл)
Эритроциты (106/мкл)
Лейкоциты (103/мкл)
Концентрация в конечной АЛК
46,8
од
6,8
Стандартное отклонение
39,2
0,06
3,8
Таблица 3
Состав лейкоцитов в АЛК
Лейкоциты
Гранулоциты
Нейтрофилы,%
Базофилы, %
Эозинофилы, %
Моноциты, %
Лимфоциты, %
% в конечной АЛК
65,5
1,6
4,6
9,1
18,5
Стандартное отклонение
8,2
0,3
3
2,1
4,1
Диапазоны
52-78
1-2
1-9
6-12
13-24
[0056] Результаты исследования анализатором Cell Dyn, как продемонстрировано в Таблице 2, показывают, что АЛК содержит тромбоциты в количестве 46,8+/-39,2 (103/мкл), эритроциты в количестве 0,1+/-0,03 (106/мкл) и лейкоциты в количестве 6,8+/-3,8(103/мкл). На основе анализа Cell Dyn, было также установлено, что состав лейкоцитов АЛК (как показано в Таблице 3), содержит 52%-78% нейтрофилов, 1-2% базофилов, 1-9% эозинофилов, 6%-12% моноцитов, и 13%-24% лимфоцитов, с учетом стандартного отклонения. Диапазоны, отображенные в этих таблицах, представляют высокие и низкие результаты после выполнения 8 отдельных анализов с использованием анализатора Cell Dyn.
[57] Пример 3
[58] Сравнение предлагаемого способа и существующего уровня техники процесса.
[59] Чтобы выделить различные неожиданные преимущества, связанные с настоящим изобретением, его варианты сравнивают с процессом, описанным в патенте США 6146890, с Данон ("Данон").
[60] Варианты воплощения изобретения
[61] Ссылаясь на Фиг. 1 и 2, сразу же после разделения цельной крови на ее основные компоненты, то есть на эритроциты, плазму и лейкоцитную пленку, лейкоцитную пленку перемещают из мешка С в мешок 4, и инкубируют в течение 12 часов ±2 часа при комнатной температуре. За этим этапом следует перемещение дистиллированной воды из мешка 1 в мешок 4 (или мешок 5) с целью проведения процедуры гипоосмотического шока (в результате чего получают гемолизат). Эту процедуру проводят приблизительно в течение 45 секунд. Сразу после этого буферизованный раствор хлорида натрия, содержащийся в мешке 2, перемещают в мешок 4 (или мешок 5) с целью восстановления изотоничности к лейкоцитной пленке (лейкоцитам).
[62] Одновременно с инкубацией лейкоцитной пленки, описанной выше, буферизованный раствор хлорида кальция из мешка 3 перемещают в мешок В, содержащий порцию плазмы, с целью обеспечения коагуляции плазмы. Этому процессу предоставляют возможность проходить в течение 12 часов ±2 часа, плюс дополнительный короткий срок, в течение которого лейкоциты подвергают гипоосмотическому шоку, а затем восстановлению изотоничности.
[63] Сразу же после восстановления изотоничности, весь комплект мешков центрифугируют (обычно, приблизительно от 8 до 10 минут), с последующим отделением клеток из гемолизата. При этом клетки подвергают воздействию гемолизата на минимальный период времени, т.е. приблизительно на 10 минут. После центрифугирования супернатант гемолизата из мешка 1 (или мешка 5) выбрасывают, и добавляют свежую среду в мешок 1 (или мешок 5), с последующей инкубацией в течение приблизительно 1-2 часов при температуре 37°C. После инкубации клетки подвергают этапу единственного промывания.
[64] Сравнительная (существующий уровень техники) процедура.
3
[65] В соответствии с учением Данон, лейкоцитную пленку подвергают гипоосмотическому шоку сразу после переработки цельной крови и разделения ее на 3 основных компонента, то есть, на эритроциты, плазму и лейкоцитную пленку. Таким образом, в резком контрасте с настоящим изобретением, процедура Данон не влечет за собой инкубации лейкоцитной пленки после выделения основных компонентов крови и перед тем, как лейкоцитную пленку подвергают гипоосмотическому шоку. Гипоосмотический шок проводят в то время как лейкоцитная пленка содержится в мешке РВ.
6
2
2
[66] В качестве отдельного этапа, и после гипоосмотического шока буферизованный раствор хлорида кальция перемещают из мешка РВ в мешок РВ, который содержит плазму, с последующей глубокой заморозкой плазмы в мешке РВ в течение 10 минут, а затем помещают его на водяную баню при температуре 37°C в течение дополнительного 30-минутного инкубационного периода. В течение этого времени фракции лейкоцитной пленки, которая была подвергнута гипоосмотическому шоку, предоставляют возможность отстояться, тогда как лейкоциты оставляют под воздействием гемолизата.
[67] После завершения указанного процесса коагуляции, который в общей сложности длится приблизительно 40 минут, всю систему мешков центрифугируют, и гемолизат выбрасывают. Таким образом, клетки подвергают воздействию гемолизата в течение, по меньшей мере, приблизительно 55 минут (то есть, период времени, в который входят 40-минутный период отстаивания, который совпадает с коагуляцией плазмы, и дополнительные 15 минут центрифугирования). В противоположность этому, в предлагаемом способе изобретения, лейкоциты центрифугируют сразу же в течение приблизительно 5 минут и, таким образом, подвергают гемолизату гораздо меньшее время, т.е. менее 10 минут.
3
7
[68] После того, как супернатант из мешка РВ выбрасывают, в него добавляют свежую среду, после чего перемещают всю суспензию обратно в РВ, который затем инкубируют на протяжении приблизительно 17 часов при температуре 37°C. После инкубации клетки промывают 3 раза. Напротив, в вариантах осуществления настоящего изобретения, инкубационный период проводят в коагулированной плазме в течение 1-2 часов, и промывают только один раз.
[69] До того, как проводят вышеупомянутую инкубацию, все предыдущие этапы осуществляют в мешках для переливания, которые представляют собой мешки, в которые осуществлялся сбор цельной крови. В противоположность этому, воплощения настоящего изобретения закрепляют использование инфузионных мешков, которые обычно используются для введения внутривенных растворов, таких как физиологический раствор.
[70] Процедура Данон была проведена 4 раза и полученные результаты сравнили с результатами, полученными в вариантах осуществления настоящего изобретения. Результаты, изложенные ниже, являются усредненными.
[71] РЕЗУЛЬТАТЫ.
[72] Общее количество белых кровяных телец (лейкоцитов), полученных из стандартной единицы крови, рассчитанное как конечная концентрация умноженная на конечный объем клеточной суспензии, определяют для каждой партии цельной крови. Усредненные результаты для 111 партий цельной крови, переработанной в соответствии со способом настоящего изобретения, и четыре партии, которые были переработаны в соответствии с процедурой, раскрытой в Данон, приведены в Таблице 4.
[73]
Таблица 4
Выход лейкоцитов на единицу крови (настоящее изобретение дало выход количества лейкоцитов ~ в 90 раз выше)
Количество партий
Лейкоциты, (×10<sup>6</sup>)
Средняя величина
Стандартное отклонение (СО)
Настоящее изобретение (n=111)
449
220
Данон (n=4)
5
4
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
Результаты показывают, что в результате способа настоящего изобретения из стандартной единицы крови (около 450 мл), получают общее число лейкоцитов приблизительно в 90 раз больше по сравнению с процедурой Данон. В общем, в результате настоящего способа получают выход лейкоцитов, по меньшей мере, приблизительно 100×10, 125×10, 150×10, 175×10, 200×10, 225×10, 250×10, 275×10, 300×10, 325×10, 350×10, 375×10, 400×10, 425×10, 450×10, 475×10, 500×10 или выше на стандартную единицу крови (в том числе все их поддиапазоны).
[74] Количество жизнеспособных клеток, содержащихся в общей популяции клеток, выраженное в процентах, измеряют способом изоляции трипановым синим. Клетки подсчитывают в гемоцитометре Newbauer после взвешивания в трипановом синем (в соотношении 1:1) для оценки количества клеток и процента жизнеспособности. Результаты представлены в Таблице 5.
[75]
Таблица 5
Процедура
Жизнеспособность (% живых клеток)
Средняя величина
Стандартное отклонение (СО)
Настоящее изобретение (n=111)
98%
0.02%
Данон (n=4)
77%
6%
Данные Таблицы 5 демонстрируют, что в дополнение к более низкому выходу (как показано в Таблице 4), процедура Данон привела к клеточной суспензии со значительно более низкой жизнеспособностью. То есть, почти на четверть (то есть, 23%) препарат состоял из мертвых лейкоцитов (более чем 10-кратное превышение процентного содержания мертвых клеток). В отличие от них, почти все лейкоциты, обработанные в соответствии со способом изобретения, были признаны жизнеспособными. В целом, патентоспособная АЛК может содержать, по меньшей мере, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или больше жизнеспособных лейкоцитов на основе общего количества этих клеток лейкоцитов в АЛК (включая все их поддиапазоны).
[76] Экспрессию CD11b маркера активации на гранулоцитах измеряют с помощью проточной цитометрии, и представляют в виде процента от CD11b положительных клеток в популяции гранулоцитов (CD15-положительные клетки). Клетки, отобранные из конечного продукта, совместно окрашивают с анти-CD11b, конъюгированным с флуоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ), и анти-CD15, конъюгированным с фикоэритрином (ФЭ), и анализируют с помощью проточного цитометра «ФАКС Калибур» (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Сан-Хосе, Калифорния, США). Анализируют CD11b экспрессию на гранулоцитах в клетках из 81 партии конечного продукта, произведенного в соответствии с предлагаемым способом, и из 3 партий конечного продукта, произведенного в соответствии с процедурой Данон.
[77]
Таблица 6
Экспрессия CD11b на гранулоцитах
Процедура
% гранулоцитов, экспрессирующих маркер активации CD lib
Средняя величина
СО (Стандартное отклонение)
Настоящее изобретение (n=81)
84,6
6,2
Данон (n=3)
46,9
9,2
Как показывают данные, содержащиеся в Таблице 6, предлагаемый способ изобретения обеспечивает почти в два раза выше выход активированных гранулоцитов в процентном соотношении по сравнению с процедурой Данон. В целом, АЛК настоящего изобретения могут содержать, по меньшей мере, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85% или выше, CD11b(+) гранулоцитов, по отношению к общей популяции гранулоцитов в АЛК (включая все их поддиапазоны).
[78] Результаты сравнительных экспериментов показывают, что настоящее раскрытие изобретения достигает, по меньшей мере, 3 неожиданных результатов по сравнению с процессом, раскрытым в работе Данон, а именно больший выход жизнеспособных лейкоцитов, более высокий процент жизнеспособных клеток, а также более высокий уровень активации гранулоцитов, как демонстрирует более высокая экспрессия маркера активации CD11b. Эти увеличения являются существенными и неожиданными.
[79] Список публикаций, цитируемых в заявке
[80] J.Li, et al., Pathophysiology of Acute Wound Healing. Clinical Dermatol. 2007 Jan-Feb; 25(1):9-18.
[81] G.Broughton 2nd, et al., Wound Healing: An Overview. Plast Reconstr Surg. 2006 Jun; 117(7 Suppl):le-S-32e-S.
[82] AK Tsirogianni, et al., Wound Healing: Immunological Aspects. Injury. 2006 Apr; 37 Suppl 1:S5-12. Epub 2006
[83] AJ Singer, et al., Cutaneous Wound Healing. New Eng. J. Med. 1999; 341(10):738-46.
[84] P. Martin, Wound Healing - Aiming For Perfect Skin Regeneration. Science 1997; 276(5309):75-81.
[85] AD Agaiby, et al., Immuno-Inflammatory Cell Dynamics During Cutaneous Wound Healing. J. Anat. 1999 Nov; 195 (Pt 4): 531-42.
[86] DWH Riches, Macrophage Involvement In Wound Repair, Remodeling and brosis. In The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair, (1996) lnd edn (ed. Clark RAF), pp.95±141. New York, London: Plenum Press.
[87] D.Greiling, et al., Fibronectin Provides a Conduit for Fibroblast Transmigration from Collagenous Stroma into Fibrin Clot Provisional Matrix. J. Cell. Sci. 1997;110:861-70
[88] MG Tonnesen, et al., Angiogenesis In Wound Healing. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2000; 5(1):40-6.
[89] JP Kim, et al., Mechanisms of Human Keratinocyte Migration on Fibronectin: Unique Role of RGD Site and Integrins. J. Cell. Physiol. 1992; 151:443-50.
[90] JJ Tomasek et al., Myofibroblasts and Mechano-Regulation of Connective Tissue Remodelling. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. (2002) 3:349-363
[91] S Werner, et al., Regulation of Wound Healing by Growth Factors and Cytokines. Physiol Rev. 2003 Jul; 83(3):835-70.
[92] D.A.Keen, Review of Research Examining the Regulatory Role of Lymphocytes in Normal Wound Healing. J. Wound Care. 2008
[93] J Jameson, et al., A Role for Skin - T Cells in Wound Repair. Science 296: 747-749, 1992.
[94] WL Havran, et al., Epithelial Cells and Their Neighbors. III. Interactions Between Intraepithelial Lymphocytes and Neighboring Epithelial Cells. Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol. 2005 Oct; 289 (4):G627-30.
[95] J Parkin, et al., An Overview of the Immune System. Lancet. 2001; 357:1777-1789.
[96] A Moretta, et al., Human NK Cells: From HLA Class I - Specific Killer Ig-like Receptors to the Therapy of Acute Leukemias. Immunol. Rev. 2008 Aug; 224:58-69.
[97] BM Doshi, et al., Wound Healing From a Cellular Stress Response Perspective. Cell Stress Chaperones. 2008 Dec; 13 (4):393-9.
[98] GJ Moran, et al., Antimicrobial Prophylaxis for Wounds and Procedures in the Emergency Department. Infect. Dis. Clin. North Am. 2008.
[99] MA Fonder, et al., Treating the Chronic Wound: A Practical Approach to the Care of Nonhealing Wounds and Wound Care Dressings. J. Am. Acad. Dermatol. 2008 Feb; 58 (2): 185-206.
[100] JA Thackham, et al., The Use of Hyperbaric Oxygen Therapy to Treat Chronic Wounds: A Review. Wound Repair Regen. 2008, 1998 May-Jun;16(3):321-30.
[101] DR Berlowitz, et al., Are all pressure ulcers the result of deep tissue injury? A Review of the Literature. Ostomy Wound Manage. 2007 Oct; 53 (10):34-8.
[102] K.Girouard, et al., The symptom of pain with pressure ulcers: a review of the literature. Ostomy Wound Manage. 2008 May; 54(5):30-40, 32.
[103] Все публикации, цитируемые в спецификации, включая как патентные публикации, так и непатентные публикации, указывают на уровень квалификации специалистов в той области техники, к которой это изобретение принадлежит. Все эти публикации включены в данный документ в качестве ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация была специально и индивидуально указана включенной в качестве ссылки.
[104] Хотя настоящее изобретение было описано со ссылкой на конкретные варианты, следует понимать, что эти варианты являются лишь иллюстрацией принципов и применения настоящего изобретения. Поэтому следует понимать, что могут быть сделаны многочисленные изменения в иллюстративных воплощениях и что могут быть разработаны другие схемы без отступления от сущности и объема настоящего изобретения, как определено прилагаемой формулой изобретения.