Молекулярно-биологические технологии в диагностике и дифференцированном подходе к лечению эндометриоза

8-й Международный научный конгресс «Оперативная гинекология — новые технологии» 8-th International Scientific Congress "Operative Gynecology-Advanced Technologies" 20-22 October 2016, Saint Petersburg

молекулярно-биологические технологии в диагностике и дифференцированном подходе к лечению эндометриоза

© н.в. Ермолова1, н.А. друккер2, т.н. Погорелова3, к.в. слесарева4, л.Р. томай5, И.в. Маркарьян6, с.А. трушина7

1-6 ФГБУ «РНИИАП» Минздрава России, Россия, г. Ростов-на-Дону; 7 ГБОУ ВПО «РГМУ» Минздрава России, Россия, г Ростов-на-Дону

Актуальность

Эндометриоз является одной из самых загадочных болезней женского организма, разносторонней по клиническим проявлениям, труд-нодиагностируемой и часто с драматическими последствиями (Адамян Л.В. и соавт., 2010; Simoens S. et al., 2012).

Основой в патогенезе развития эндометриоза является повреждение биологических молекул (липидов, мембран клеток, белков) высокореакционными соединениями кислорода (Супрун С.В. и др., 2011). По данным исследований последних лет было установлено, что среди клеточных регуляторов, определяющих уровень образования свободных радикалов кислорода, важное место занимает биологически активные пептиды, к которым относится мелатонин (МТ) (Чернышова И.В., 2013; Tamura H. et al., 2009). МТ является регулятором репродуктивной и иммунной систем, синхронизирует сезонные и циркадные биоритмы, оказывает цитотоксический и седативный эффекты, а также противоопухолевое и антиоксидант-ное действие (Reiter R.J. et al., 2005). Каталаза (оксидоредуктаза-КАТ) — гемосодержащий фермент, локализована в пероксисомах клеток и цитоплазме, расщепляет пероксид водорода на воду и кислород. Таким образом, актуальность дальнейшего исследования МТ и ферментов антиок-сидантной системы в патогенезе наружного гени-тального эндометриоза (НГЭ) несомненна. Еще одним приоритетным направлением в изучении нГЭ является исследование белкового состава пе-ритонельной жидкости с помощью протеомных технологий, направленных на определение совокупности экспрессируемых геномом белков.

Целью исследования явилось определение мо-лекулярно-биологической роли МТ и ферментов антиоксидантной системы в формировании, про-грессировании и диагностике нГЭ у пациенток репродуктивного возраста, а также протеомный анализ для углубления представлений о молекулярных механизмах развития эндометриоза, его прогнозировании и ранней диагностике.

Материалы и методы исследования

Обследовано 88 женщин, находившихся в гинекологическом отделении ФГБУ «РНИИАП» МЗ РФ в период с 2012 по 2014 г. Из них 63

с эндометриозом и 25 пациенток контрольной группы без него. В ходе проведения нашего исследования сформированы 3 клинические группы: I группу составили 25 пациенток с I—II стадиями НГЭ согласно классификации Американского общества фертильности (r-AFS) (1996), во II группу включены — 38 больных с III-IV стадиями. III группа контрольная — 25 женщин без эндоме-триоза.

Использованы следующие методы исследования: клинический (сбор анамнеза), биохимический, эндоскопический. Определение уровня 6-сульфатоксимелатонина в утренней порции мочи пациенток осуществлялось методом иммуно-ферментного анализа (ELISA), реактивами фирмы BUHLMANN (Германия). Активность каталазы определяли в сыворотке крови и перитонеаль-ной жидкости тест-системами ABfrontier (США), Cloud-Clone Corp. (США). Все анализы проведены на многофункциональном счетчике для иммуно-ферментных исследований с программным обеспечением Victor (Finland). Протеомный анализ перитонеальной жидкости проводили с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле (приборы Protein IEF Cell и Protean II xi Multi-Cell, Bio-Rad, США) с последующим окрашиванием белков ионами серебра. идентификацию белков после их трипсинолиза проводили методом времяпролетной масс-спектрометрии на масс-спектрометре Autoflex II (Bruker, Германия) с использованием программы Mascot MS Search (Matrix Science, США) и баз данных NCBI и Swiss-Prot. Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета программ Office 2010, Statistica 10.01.

С целью лечения нГЭ, с учетом теоретической значимости проведенных исследований, в клиническом протоколе после проведения хирургического лечения в зависимости от поставленных пациенткой задач (реализация репродуктивной функции) назначалось: при бесплодии у пациенток с I—II стадиями НГЭ — КОК с преимущественным антипролиферативным действием геста-генного компонента (диеногест) в непрерывном режиме на 3 месяца и МТ (3 мг); с III-IV стадиями НГЭ — а-ГнРГ на 3-6 месяцев с последующим переходом на приём диеногест 2 мг на 3-6 месяцев и МТ (3 мг) под УЗИ-контролем. При болевом

СТАТЬИ

9

синдроме больным назначался диеногест (2 мг), МТ (3 мг). При этом алгоритме лечения наступление беременности отмечено у 42 % пациенток с бесплодием.

Результаты и их обсуждение

Уровень 6-сульфатоксимелатонина, основного метаболита МТ, в моче у пациенток с I—II стадиями НГЭ оказался статистически значимо сниженным на 8,9 % относительно данных у пациенток контрольной группы (р < 0,05). На основании этих данных предложен способ диагностики I—II стадий НГЭ (Патент № 2592240 от 28.06.2016 г.). Уровень 6-сульфатоксимелатонина свидетельствует об уменьшении влияния МТ на процессы антиоксидантной защиты, снижении иммунных и противоопухолевых механизмов у пациенток с НГЭ. Активность каталазы в сыворотке крови пациенток с I—II стадией эндометриоза статистически значимо повышена относительно данных контрольной группы (р < 0,014). Увеличение этого показателя составило 4 % по отношению к контролю, это отражает состояние ферментативной активности важнейшего антиоксидантного энзима на системном уровне, что можно расценивать компенсаторной реакцией организма женщины.

В перитонеальной жидкости статистически значимое отличие от контроля нами обнаружено при исследовании активности каталазы при III-IV стадиях заболевания. Так, активность ка-талазы пациенток с выраженными формами НГЭ в 1,5 раза превышает контрольные значения (р < 0,001). Высокая активность каталазы в сыворотке крови и перитонеальной жидкости обеспечивает нейтрализацию в этих условиях пероксида водорода (H2O2).

Исследование белкового спектра перитонеаль-ной жидкости и сыворотки крови выполнялось в два этапа. На первом этапе проводили протеом-ный анализ перитонеальной жидкости женщин с НГЭ III-IV стадий и пациенток контрольной группы, учитывая особую роль процессов, происходящих на локальном уровне. В результате выявлены белки отличия: аполипопротеин А-IV, глобулин, связывающий половые гормоны (ГСПГ), присутствие которых имеет место только при НГЭ. Аполипопротеин A-IV — основной структурный компонент липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и хиломикронов. Он является мощным активатором лецитинхолестеринацил-трансферазы и липопротеинлипазы, ферментов, имеющих большое значение в метаболизме ли-попротеинов (Spaulding H.L. et al., 2003). Аполи-попротеин A-IV также обладает антиоксидантной активностью, ингибируя перекисное окисление липидов (Wong W.M. et al., 2007). Индукция экспрессии аполипопротеина A-IV может быть одним

из механизмов, который лежит в основе повышения уровня ЛПВП, обладающих противовоспалительными свойствами (Колесникова Л.В. и др., 2011). Указанный белок участвует в регуляции внутриклеточного баланса окисленного/восстановленного глутатиона и модуляции редокс-за-висимого апоптоза путем стимуляции активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы ^раиЫ^ НХ. et а1., 2003). Главной функцией ГСПГ является транспорт стероидных гормонов (эстрогенов и андрогенов) и регуляция их биодоступности для тканей-мишеней (Hаmmond G.L., 2001). Гиперэкспрессия межклеточного ГСПГ в эндометрио-идной ткани является результатом формирования эстроген-преобладающей среды, так как эстрогены усиливают его синтез. Связанный с ГСПГ эстроген защищен от катаболизма и доступен для эндометриальных клеток, что способствует развитию эндометриоза (Misao R. et а1., 1995). Таким образом, повышенное содержание при изучаемом заболевании ГСПГ, играющего роль своеобразного депо стероидных гормонов в перитонеальной жидкости, создает условия для локальной гипер-эстрогении (Адамян Л.В. и др., 2006). В этих условиях становится возможным усиление пролифе-ративного потенциала клеток эндометриоидных гетеротопий.

На втором этапе методом иммуноферментного анализа нами были определены количественные показатели белков отличия, обнаруженных у пациенток с эндометриозом и контрольной группы, как в перитонеальной жидкости, так и в сыворотке крови. В сыворотке крови при 1-11 стадиях эндометриоза содержание ГСПГ на 74 % и содержание Апо-АГУ на 15 % превышают аналогичные величины в контрольной группе. При ГГГ-ГУ стадиях заболевания в сыворотке крови на 52 % повышен уровень ГСПГ и на 12 % — уровень Апо-АГУ по сравнению с величинами в контрольной группе. В перитонеальной жидкости при Г-ГГ и ГГГ-ГУ стадиях эндометриоза имеет место повышение содержания Апо-АГУ на 28 и 24 % соответственно по сравнению с уровнем в контрольной группе. Аналогичная направленность изменений характерна и для ГСПГ, содержание которого в пери-тонеальной жидкости повышено на 29 и 41 % соответственно при Г-ГГ и ГГГ-ГУ стадиях эндоме-триоза. По результатам исследования разработан информативный способ диагностики Г-ГГ стадий НГЭ (Патент № 2571291 от 15.08.2014 г.).

Выводы

на основании выявленных молекулярно-кле-точных нарушений определена необходимость использования МТ как специфического антиокси-данта для гидроксидрадикала с целью предупреждения его инициирующего действия на перекисное

8-й Международный научный конгресс «Оперативная гинекология — новые технологии» 8-th International Scientific Congress "Operative Gynecology-Advanced Technologies" 20-22 October 2016, Saint Petersburg

окисление липидов и для купирования болевого синдрома. НГЭ I—II стадии характеризуется достоверным снижением уровня МТ (6-СОМТ) относительно данных группы контроля и значений, полученных при III-IV стадиях заболевания, что может быть использовано в диагностике ранних стадий эндометриоза. Выявленные с помощью протеомного анализа белки, экспрессия которых увеличивается при нГЭ, предложены в качестве информативных маркеров данного заболевания, что открывает возможности для неинвазив-ной диагностики эндометриоза. Для пациенток с III-IV стадиями нГЭ первостепенное значение имеет назначение аГнРГ в течение 3-6 месяцев, а для долгосрочной терапии препаратом выбора является диеногест 2 мг.

литература

1. Адамян Л.В., Кулаков В.И., Андреева Е.Н. Эндометриозы: руководство для врачей. М.: Медицина, 2006. 416 с.

2. Адамян Л.В. Состояние ооцит-фолликулярной системы яичников женщин с эндометриозом / Л.В. Адамян, Л.Ф. Курило, К.Н. Арсланян, И.Ю. Шуляк // Международный конгресс по репродуктивной медицине, 4-й. Проблемы репродукции. - 2010. - С. 164-165.

3. Колесникова Л.В., Ермолова Н.В., Линде В.А. и др. Влияние модификации гормонального и липидного статуса на формирование наружного генитального эндометриоза. Журн. акуш. и женск. бол. 2011; Спецвыпуск: 47-48.

4. Супрун С.В., Лебедько О.А., Козлов В.К. Активация сво-боднорадикального окисления как фактор риска повреж-

дения клеточных мембран эритроцитов при осложненном течении беременности. Таврический медико-биологический вестник. 2011. Том 14, № 3. Ч. 1(55). С. 231-234.

5. Чернышова И.В., Сандакова Е.А., Шутов А.А. Состояние серотонинтранспортной системы у больных генитальным эндометриозом. Уральский медицинский журнал. 2013. № 4. С. 70-75.

6. Hаmmond G.L. Diverse roles for sex hormone-binding globulin in reproduction [Text] / G.L. Hаmmond // Biol. Reprod. 2001. Vol. 85, № 3. P. 431-441.

7. Misao R., Hori M., Ichigo S. et al. Levels of sex hormone-binding globulin (SHBG) and corticosteroid-binding globulin (CBG) messenger ribonucleic acid (mRNAs) in ovarian endometriosis. Reprod Nutr Dev. 1995; 35(2):155-165.

8. Reiter R.J., Tan D.X., Maldonado M.D. Melatonin as an antioxidant: physiology versus pharmacology. J Pineal Res. 2005. Vol. 39. P. 215-6.

9. Simoens S. The burden of endometriosis: costs and quality of life of women with endometriosis and treated in referral centres / S. Simoens, G. Dunselman, C. Dirksen et а!. // Hum. Reprod. 2012. Vol. 27, № 5. Р. 1292-1299.

10. Spaulding H.L., Delvin E., Lambert M. et al. Apo A-IV: an update on regulation and physiologic functions. Biochim Biophys Acta. 2003;1631(2):177-187.

11. Tamura H., Nakamura Y., Korkmaz A., Manchester L.C., Dun-Xian Tan D.X., Norihiro Sugino N., Reiter R.J. Melatonin and the ovary: physiological and pathophysiological implications Fertil Steril. 2009. Vol. 92, № 1. P. 328-335.

12. Wong WM, Gerry AB, Putt W. et al. Common variants of apoli-poprotein A-IV differ in their ability to inhibit low density lipoprotein oxidation. Atherosclerosis. 2007;192(2):266-274.