СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ВЫСОКОЙ СТЕПЕНИ ФРАГМЕНТАЦИИ ДНК И НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ В ПАРЕ
METHOD FOR PREDICTION OF HIGH DEGREE OF DNA FRAGMENTATION AND MISCARRIAGE IN A PAIR

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к андрологии, и может быть использовано для установления повреждения ДНК сперматозоидов химической природы.
Учащение обращений в центры планирования семьи и рост общего процента семей, страдающих бесплодием, являются тревожными знаками для перспективы будущего нации. «Критерий настороженности», установленный ВОЗ, или доля бесплодных семей, составляет 15% от общего количества. В Российской Федерации этот показатель еще больше и составляет 17%. По мнению экспертов в области демографии для прекращения процесса депопуляции в Российской Федерации необходимо, чтобы суммарный коэффициент рождаемости на одну женщину репродуктивного возраста составлял 2,1, который в настоящее время равен 1,62 [1,2].
Устранение сложившегося дисбаланса неразрывно связано с необходимостью решения проблемы патологии репродуктивной системы, к которой относится не только бесплодие, но и невынашивание беременности (Корякин, Акопян, 1995). С медицинской точки зрения уникальность этих патологических состояний связана с тем, что они являются результатом взаимодействия мужского и женского факторов -двух половых партнеров, состояние здоровья каждого из которых оказывает свое влияние на результат - появление на свет здорового потомства. Причины и механизмы невынашивания беременности остаются малоизученными, о чем свидетельствует значительная доля невынашивания с неизвестной причиной (до 40%) (Милованов, 1999). Вместе с тем, если материнские и плодовые факторы изучаются достаточно интенсивно, то оценке вклада мужского фактора как причины репродуктивных потерь и невынашивания беременности посвящен весьма ограниченный круг исследований.
Анализируя репродуктивные потери, связанные с мужским фактором, Артифексова [3] в своей работе делает следующие выводы: во-первых, морфофункциональные нарушения сперматозоидов, нередко не выявляемые при стандартном исследовании эякулята, сопровождаются после оплодотворения достоверно большей эмбриональной смертностью и увеличением процента аномалий внутриутробного развития. В связи с этим значение сперматозоидов не только в доставке генетического материала к яйцеклетке и индукции формирования зиготы, но и в поддержании развития зародыша на протяжении первых этапов беременности. Во-вторых, патозооспермия у отцов может стать причиной дисгинезии гонад у плодов, так, что репродуктивные проблемы сохраняются и в последующем поколении. И последнее, делается акцент на то, что требуется более активное обязательное включение мужчин в программу прегравидарной подготовки, так как, анализируя результативность применения стимулирующей сперматогенез терапии, которая широко используется в настоящее время, следует отметить, что разнообразные стимулирующие лечебные воздействия на гаметогенез у мужчин так же сопровождаются, несмотря на положительную динамику показателей спермограмм, увеличением числа спонтанных абортов, что может быть связано с ультраструктурными повреждениями сперматозоидов.
Так, наиболее частым ультраструктурным изменением сперматозоидов является фрагментация ядерной ДНК, представленная одно-двухцепочечными разрывами молекулы ДНК. Известно, что фрагментация ДНК сперматозоидов оказывает влияние на ранние этапы эмбриогенеза (оплодотворение, дробление с образованием бластоцисты), что определяет частоту наступления беременности в циклах ЭКО/ИКСИ [3].
Многие авторы считают, что повреждения ДНК сперматозоидов могут служить диагностическим маркером негативного отцовского эффекта в преимплантационный период развития человека [4-8]. Ряд исследований [2,3,9] показали прямую зависимость между высоким процентом повреждений ДНК сперматозоидов и частотой спонтанных абортов. Вместе с этим при наличии фрагментации ДНК сперматозоидов выше 30% прогнозируется практически нулевая вероятность оплодтворения in vitro и при ВМИ (внутриматочная инсеминация) [2]. Michel L. Eisenberg и соавт., проанализировав потерю одноплодной беременности в 98 парах с позиции мужского фактора (количество и концентрация сперматозоидов, их подвижность и морфология, а также индекс фрагментации ДНК сперматозоидов), пришли к выводу, что стандартные показатели спермограммы мало связаны с риском невынашивания беременности на популяционном уровне. Вместе с этим индекс ДНК фрагментации сперматозоидов >30% показал статистически значимую связь с невынашиванием беременности.
С другой стороны, известно, что в основе повреждающего действия ксенобиотиков, например триклозана, на организм человека лежит их способность индуцировать окислительный стресс, приводящий к нарушению клеточного энергетического и ионного гомеостаза, в том числе за счет повреждения митохондрий, изменения активности кальциевых и калиевых ионных каналов, стимуляции высвобождения кальция из внутриклеточных депо. Альтерация клеточных структур при этом может приобретать необратимый характер и индуцировать элиминацию клеток механизмами некроза и апоптоза. Повреждение ДНК клеток следует рассматривать, как неполную форму апоптоза. Влияние триклозана на повреждение ДНК клеток - способность вызывать фрагментацию ДНК, в том числе сперматозоидов, показано в работах (Martinez-Paz и соавт., 2013, Gao и соавт., 2015, Jurewicz и соавт., 2017).
Наиболее близким к предлагаемому является способ диагностики бесплодия и/или невынашивания беременности, включающий определение содержания триклозана в образцах мочи методом хроматографии с масс-спектрометрией, который широко используется в эпидемиологических и научных исследованиях (Jurewicz J., Radwan М., Wielgomas В.,  P., Klimowska A., Radwan P., Hanke W. Environmental levels of triclosan and male fertility. Environ. Sci. Pollut. Res. 2017; Dec 7. [Epub ahead of print]. https://doi.org/10.1007/s11356-017-0866-5).
Однако, данный метод имеет существенный недостаток, так как не оценивает прямое действие репротоксиканта на качество сперматозоидов, о чем в своих работах указывают ряд исследователей (Zhu W., et al., 2016; Den Hond, et al., 2015).
Способ диагностики мужской инфертильности и/или субфертильности (снижение стандартных показателей спермы: количество, подвижность и морфология сперматозоидов), связанных с повышенной концентрацией триклозана в семенной жидкости, измеренной с помощью метода газовой хроматографии с масс-спектрометрией, был предложен нами ранее (патент на изобретение №2675856 от 25 декабря 2018 г).
Задачей заявляемого решения является разработка способа диагностики бесплодия и/или невынашивания беременности методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием и вычисление точки разделения (cut-off) для концентрации триклозана в семенной жидкости с целью оценки риска высокого уровня фрагментации ДНК сперматозоидов. Нормативным значением степени фрагментации ДНК сперматозоидов обще принято считать 15% и менее (низкий риск нарушения фертильности и вынашивания беременности).
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение точности дифференциальной диагностики идиопатической и химической природы фрагментации ДНК сперматозоидов.
Технический результат достигается тем, что способ диагностики химической природы фрагментации ДНК сперматозоидов включает исследование семенной жидкости на триклозан.
Отличие способа заключается в том, что проводят определение концентрации триклозана в семенной жидкости и при обнаружении эндокринного дизраптора в концентрации ≥0,11 нг/мл при фрагментации ДНК сперматозоидов ≥15% делается заключение о химической природе повреждения генетического материала с высоким риском невынашивания беременности как при естественном зачатии, так и в программах ВРТ.
Проведенный анализ специальной и патентной литературы показал, что предлагаемый способ не имеет аналогичных решений по диагностике химической природы фрагментации ДНК сперматозоидов, связанной с содержанием триклозана в семенной жидкости ≥0,11 нг/мл. Следовательно, предлагаемое техническое решение соотвествует критерию изобретения "новизна".
Авторами заявляемого способа впервые проведено исследование эякулята на наличие и количественное содержание триклозана в семенной жидкости с вычислением точки разделения по концентрации эндокринного дизраптора с целью прогноза высокого риска фрагментации ДНК сперматозоидов и невынашивания беременности в супружескоцй паре.
Данный способ предназначен для использования в сфере здравоохранения и может быть применен с целью диагностики фрагментации ДНК сперматозоидов химической природы в андрологических, эндокринологических отделениях, клиниках и медицинских центрах репродуктивного здоровья.
Таким образом, предлагаемый "Способ диагностики мужского бесплодия и/или невынашивания беременности" соответствует критериям "изобретательский уровень" и "промышленная применимость".
Предлагаемый способ заключается в том, что у мужчин, обследуемых по поводу бесплодия и/или невынашивания беременности в браке, в образцах эякулята определяют концентрацию триклозана методом газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием с последующим сравнением, полученного результата с разработанной нами точки разделения (cut-off).
С целью разработки cut-off для концентрации триклозана в семенной жидкости нами был проведен ROC- анализ клинической базы пациентов (n=51), обратившихся в клинику по лечению бесплодия, в ходе которого была определена точка разделения (cut-off) для концентрации триклозана в семенной жидкости у мужчин с фрагментацией ДНК сперматозоидов <15% и ≥15% (высокий риск нарушения фертильности и вынашивания беременности в браке).
При статистической обработке полученных данных (ROC- анализ) была определена площадь под ROC - кривой, которая соответствует взаимосвязи прогноза высого риска нарушения фертильности и вынашивания беременности в браке и концентрации триклозана в семенной жидкости у мужчин и составила 0,839±0,071 с 95% ДИ: 0,699-0,979 (р=0,001) (приложение №1).
Пороговое значение концентрации триклозана в точке cut-off составило 0,11 нг/мл. При концентрации триклозана в семенной жидкости равном или превышающем данное значение прогнозировался высокий риск бесплодия (патозооспермии). Чувствительность и специфичность метода составила 85% и 77% соответственно.
Сущность заявляемого способа диагностики бесплодия и/или невынашивания беременности поясняется примерами из клинической практики.
Клинические примеры (таблица 1):
1. Пациент М., 35 л. Клинический диагноз: Бесплодие, вторичное (2 года), невынашивание беременности, идиопатическая форма. Тератозооспермия. Фрагментация ДНК сперматозоидов - 32%. Триклозан семенной жидкости 0,80 нг/мл (концентрация триклозана > cut-off).
2. Пациент П., 31 г. Клинический диагноз: Бесплодие, вторичное (6 лет), невынашивание беременности, токсическая форма. Тератозооспермия. Фрагментация ДНК сперматозоидов - 29%. Триклозан семенной жидкости 0,18 нг/мл (концентрация триклозана > cut-off).
3. Пациент П., 36 г. Клинический диагноз: Прегравидарная подготовка. Тератозооспермия. Фрагментация ДНК сперматозоидов - 5%. Триклозан семенной жидкости 0,05 нг/мл (концентрация триклозана < cut-off).
4. Пациент А., 31 г. Клинический диагноз: Донор спермы. Нормозооспермия. Фрагментация ДНК сперматозоидов - 9%. Триклозан семенной жидкости 0,0 нг/мл (концентрация триклозана < cut-off).
Во всех приведенных клинических случаях, связанных с бесплодием или невынашиванием беременности в паре, андрологические, гормональные и другие методы диагностики не выявили причины высокой фрагментации ДНК сперматозоидов, другими словами, до определения концентрации триклозана в семенной жидкости у данных пациентов констатировалась идиопатическая форма повреждения генетического материала гамет и невынашивания беременности в паре.
Литература
1. Демография для практических работников: метод, рек. для специалистов органов исполнительной власти субъектов Рос. Федерации / под ред. Л.Л. Рыбаковского. - Москва: Экон-информ, 2014. - 254 с.
2. Бесплодный брак. Версии и контраверсии / под ред. В.Е. Радзинского. - Москва: ГЭОТАР-Медиа, 2018. - 404 с.
3. Артифексова, А.А. Патогенетические аспекты мужской субфебрильности как причины репродуктивных потерь / А.А. Артифексова // Пробл. репродукции. - 1999. - Т. 5, №6. - С. 37-41.
4. Morris, I.D. The spectrum of DNA damage in human sperm assessed by single cell gel electrophoresis (Comet assay) and its relationship to fertilization and embryo development / I.D. Morris, S. Ilott, L. Dixon [et al.] // Hum Reprod. - 2002. - Vol. 17. - P. 990-998.
5. Tomsu, M. Embryo quality and IVF treatment outcomes may correlate with different sperm comet assay parameters / M. Tomsu, V. Sharma, D. Miller //Hum Reprod. - 2002. - Vol. 17, №7. - P. 1856-1862.
6. Filatov M.V. Relationship between abnormal sperm chromatin packing and IVF results / M.V. Filatov, E.V. Semenova, O.A. Vorob'eva O.A. [et al.] // Mol Hum Reprod. - 1999. - Vol. 5. - P. 825-830.
7. Host, E. The role of DNA strand breaks in human spermatozoa used for IVF and ICSI / E. Host, S. Lindenberg, S. Smidt-Jensen // Acta Obstet Gynecol Scand. - 2000. - Vol. 79. - P. 559-563.
8. Larson, K.L. Sperm chromatin structure assay parameters as predictors of failed pregnancy following assisted reproductive techniques / K.L. Larson, C.J. DeJonge, A.M. Barnes [et al.] // Hum Reprod. - 2000. - Vol. 15, №8. - P. 1717-1722.
9. Zini, A. Potential adverse effect of sperm DNA damage on embryo quality after ICSI / A. Zini, J. Meriano, K. Kader [et al.] // Hum Reprod. -2005. - Vol. 20, №12. - P. 3476-3480.