ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ О-АЦЕТИЛИРОВАННОГО ГАНГЛИОЗИДА GD2 ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
USE OF THE ANTI-O-ACETYLATED GANGLIOSIDE GD2 ANTIBODY FOR IMPROVING THE THERAPEUTIC POTENTIAL OF DRUGS

Настоящая заявка на патент испрашивает приоритет Европейской патентной заявки №16002576.3, поданной 5 декабря 2016 г., которая включена в данный текст посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим противораковый агент и антитело, распознающее особую О-ацетилированную форму ганглиозида GD2 (а именно, ганглиозид OAcGD2), улучшающее захват противоракового агента раковыми клетками, а также к их применениям в способах лечения, профилактики и/или управления конкретными видами рака, характеризующимися клетками, экспрессирующими ганглиозид OAcGD2.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Доставка противораковых агентов в клетки является центральным аспектом терапевтических методов борьбы с раком. Биохимические свойства противораковых агентов зависят от их молекулярной массы, рН окружающей среды, а также от их липофильного в сравнении с гидрофильным профиля.
Пересечение клеточной мембраны, являющейся отрицательно заряженной, представляет собой первую стадию доставки противораковых агентов к клеткам. В настоящее время точно установлено, что в опухолях животных возникает градиент рН. Ввиду того, что противораковые агенты в водной среде являются ионизируемыми, кислый внеклеточный рН в опухолевых клетках по-разному модулирует активность слабоосновных или кислотных противораковых агентов (MAHONEY et al., Biochemical Pharmacology, vol. 66, р: 1207-1218, 2003). В растворе большинство противораковых агентов присутствуют как в неионизированной, так и в ионизированной формах. Неионизированные противораковые агенты обычно являются более жирорастворимыми и могут с легкостью диффундировать через клеточную мембрану. Ионизированные противораковые агенты напротив имеют низкую жирорастворимость и не способны проникать через липидную мембрану без паразитирования переносчика, обычно используемого для физиологических субстратов. Данный механизм захвата ионов может впоследствии изменять аккумуляцию лекарственных средств, и таким образом в значительной степени модулировать эффективность химиотерапии.
Способность преодолевать биологические барьеры, которые встречаются при переносе противоракового агента в раковые клетки и опухоли, необходимо сбалансировать со степенью токсичности. Среди общепринятых противораковых агентов, алкилирующие агенты, антиметаболиты или противоопухолевые антибиотики непосредственно повреждают или затрагивают ДНК или РНК для предотвращения роста и размножения противораковых клеток. Другие лекарственные средства, такие как ингибиторы топоизомераз или митотические ингибиторы, специфически нацелены на ферменты, задействованные в клеточном цикле. Дифференцирующие агенты или гормоны также используются либо для способствования переходу раковых клеток в нормальные клетки, либо для замедления развития рака. Практически все противораковые агенты являются токсичными, а химиотерапия вызывает значительные и зачастую опасные побочные эффекты, включая сильную тошноту, подавление деятельности костного мозга и иммуносупрессию.
Кроме того, подвергание воздействию стандартных противораковых агентов может привести к неблагоприятному исходу химиотерапии и прогрессированию опухоли даже при введении комбинаций противораковых агентов. Данный феномен часто является следствием уже существующих клеток-предшественников или новых появляющихся лекарственно-устойчивых клонов. Более того, противораковые агенты могут вызывать серьезные побочные эффекты, такие как поражение сердца или нервов, или еще более значительно, могут повысить риск повторного рака через несколько лет после приема лекарств.
В последние годы способность РНК-интерференции к сайленсингу генов-мишеней с высокой эффективностью и специфичностью применяли для разработки лекарств, направленных на РНК в клетках человека (BARATA et al., Cancer Treatment Reviews, vol. 50, p: 35-47, 2016). Виды терапии на основе РНК, разработанные для лечения рака, основываются на применении молекул двуцепочечных синтетических коротких РНК (микроРНК) или синтетических ДНК/РНК-подобных олигонуклеотидов (АСО-антисмысловой олигонуклеотид - от англ. "antisense oligonucleotide"). Перенос данных молекул через клеточную мембрану раковых клеток является довольно проблематичным из-за их отрицательного заряда. Этот недостаток можно устранить, проведя химические модификации структуры олигонуклеотидов и/или используя системы доставки, включающие вирусные векторы, биологически совместимые катионные полимеры и сополимеры, неорганические наночастицы, ателоколлаген и липосомы. Однако данные системы доставки оказывают влияние на фармакокинетические процессы терапии на основе микро-РНК и также могут обладать токсичностью. Более того, системы доставки часто требуют оптимизацию параметров для каждого типа клеток.
Таким образом, существует необходимость в новых композициях и способах устранения барьеров при захвате лекарств раковыми клетками и опухолями для улучшения их терапевтического потенциала, а также для снижения их побочных эффектов, таких как токсичность.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения ранее продемонстрировали, что мышиное терапевтическое антитело, специфически нацеленное на О-ацетилированную форму ганглиозида GD2 (то есть, ганглиозид OAcGD2) демонстрирует положительный эффект при лечении форм рака, экспрессирующих ганглиозид OAcGD2 (ЕР 2076542 В1).
В ходе работы авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что данное антитело, помимо своей противораковой активности, эффективно для лечения рака при применении в качестве вспомогательного средства для другого противоракового агента. В частности, было выявлено синергетическое действие комбинированного лечения антителом, специфически нацеленным на ганглиозид OAcGD2, и различными противораковыми агентами на формы рака, экспрессирующие ганглиозид OAcGD2, что сделало возможным снижение дозировки и, следовательно, токсических побочных эффектов от противораковых агентов.
Следовательно, настоящее изобретение относится к композиции для доставки противоракового агента в клетку, экспрессирующую ганглиозид OAcGD2, содержащей: (i) по меньшей мере один противораковый агент и (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или его производное, при этом указанное по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, способствует захвату указанного по меньшей мере одного противоракового агента клеткой, и направлению его активности. Итак, указанное по меньшей мере одно антитело, его функциональный фрагмент или его производное, распознающее ганглиозид OAcGD2, является специфичным для указанного ганглиозида.
В соответствии с одним из вариантов осуществления изобретения, указанное по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или его производное содержит
a) полипептид вариабельной области легкой цепи (VL), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и
b) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
Кроме того, в определенном варианте осуществления изобретения, указанный по меньшей мере один противораковый агент выбран из группы, содержащей или состоящей из противораковых агентов, таких как алкилирующие агенты, антиметаболиты, противоопухолевые антитела, противоопухолевые антибиотики, ингибиторы топоизомераз, митотические ингибиторы, ингибиторы тирозинкиназы, кортикостероиды, гормоны или гормоноподобные лекарственные средства, цитокины, аналоги нуклеозидов, нуклеиновые кислоты, такие как молекулы двухцепочечных синтетических коротких РНК (микро-РНК) синтетические ДНК/РНК-подобные олигонуклеотиды (АСО).
Указанный по меньшей мере один противораковый агент может быть не способен самостоятельно пересечь клеточную мембрану раковых клеток.
Указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон.
Еще одна задача настоящего изобретения - предложить антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное для применения в селективной доставке в клетку, экспрессирующую ганглиозид OAcGD2, противоракового агента для лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2.
Еще одна задача настоящего изобретения - предложить способ доставки противоракового агента в клетку, экспрессирующую ганглиозид OAcGD2, включающий приведение указанной раковой клетки в контакт с по меньшей мере одним антителом, распознающим ганглиозид OAcGD2, в количестве и концентрации, эффективных для усиления захвата противоракового агента клеткой, при этом указанное антитело вызывает дефекты проницаемости в клеточной мембране, такие как порообразование.
Еще одна задача настоящего изобретения - предложить способ профилактики и/или лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей (i) по меньшей мере один противораковый агент и (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное и факультативно (iii) фармацевтически приемлемый носитель.
Еще одна задача настоящего изобретения - предложить способ повышения чувствительности к противораковому агенту у пациента, страдающего раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей: (i) по меньшей мере один противораковый агент, (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное и факультативно (iii) фармацевтически приемлемый носитель.
Еще одна задача настоящего изобретения - предложить способ профилактики или отсрочки развития рака, устойчивого к противораковому агенту, у пациента, страдающего раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей: (i) по меньшей мере один противораковый агент, (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное и факультативно (iii) фармацевтически приемлемый носитель.
Еще одна задача настоящего изобретения - предложить способ идентификации синергетической комбинации (i) по меньшей мере одного противоракового агента и (ii) по меньшей мере одного антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, его функционального фрагмента или производного, подходящий для профилактики и/или лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2.
Еще одна задача настоящего изобретения - предложить новое применение антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, его функционального фрагмента или производного для усиления клеточного захвата противоракового агента в клетку, экспрессирующую ганглиозид OAcGD2.
Наконец, настоящее изобретение относится к набору, содержащему: (i) по меньшей мере один противораковый агент, (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное и факультативно (iii) фармацевтически приемлемый носитель.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фигура 1: сканирующая электронная микроскопия была проведена на клеточных линиях нейробластомы и первичных клетках глиобластомы, инкубированных с 40 мкг/мл моноклональных антител (mAb) 8В6 к OAcGD2 в течение 30 минут. Необработанные (или обработанные изотипически сходным мышиным IgG3 отрицательного контроля) клетки IMR5 (панель A), LAN-1 (панель С) и DUASOII (панель Е) имеют общую непрерывную круглую форму, в то время как в мембране клеток IMR5 (панель В), LAN-1 (панель D) и DUASOII (панель F), обработанных mAb 8В6 к OAcGD2, обнаруживаются поры. Увеличение является соответственно 2,5-тысячекратным (К X) (панели А, В, С, D и F) и 2,0-КХ (панель Е).
Фигура 2: измерение диаметра и поверхности клеток и пор было проведено на клеточных линиях нейробластомы и первичных клетках глиобластомы, инкубированных с 40 мкг/мл mAb 8В6 к OAcGD2 в течение 30 минут: клетки IMR5 (панель A), LAN-1 (панели В и С) и DUASOII (панели D и Е). Увеличение составляет соответственно 5,02 КХ (панель А), 4,5 К X (панели В и С) и 7,5 К X (панели D и Е).
Фигура 3: Интернализация фторурацила (5-FU), Цисплатина и доксорубицина в клетки нейробластомы. Клетки LAN-1 обрабатывали 5-FU (1,52 мкм) - панель А или Цисплатином (1,52 мкм)- панель В или доксорубицином (4,7 мкм) - панели С и D с комбинациями изотипически сходного мышиного IgG3 отрицательного контроля (40 мкг/мл) или mAb 8В6 к OAcGD2, mAb c8B6.14b к OAcGD2, mAb c8B6.15b к OAcGD2 (40 мкг/мл). Противораковые агенты и mAb инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Клетки нейробластомы фиксировали 4% параформальдегидом (ПФА) перед сбором методом сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS- от англ. - fluorescence-activated cell sorting). Положительный контроль проводили обработкой фиксированных клеток LAN-1 0.05% сапонином в комбинации с противораковыми агентами в течение 30 минут. Введение противораковых агентов в клетки опухоли оценивали проточной цитометрией (возбуждение лазером с длиной волны 535 нм), а результаты выражены в процентном содержании клеток, содержащих введенный противораковый агент, на всю популяцию клеток.
Фигура 4: интернализация доксорубицина в меланому (клетки М21), рак молочной железы (клетки MDA-MB-231), мелкоклеточный рак легкого (клетки Н524), клетки саркомы Юинга (клетки ТС71) и клетки глиобластомы (DuGan). Клетки обрабатывали противораковыми агентами размером 0,26 мкм (за исключением MDA-MB-231, 0,18 мкм) с комбинациями изотипически сходного мышиного IgG3 отрицательного контроля (40 мкг/мл) или mAb 8В6 к OAcGD2 (40 мкг/мл). Противораковые агенты и mAb инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Клетки опухоли фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) перед сбором методом сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS- от англ. - fluorescence-activated cell sorting). Положительный контроль проводили обработкой фиксированных клеток опухоли LAN-1 0,05% сапонином в комбинации с противораковыми агентами в течение 30 минут. Введение противораковых агентов в меланому (М21)- панель А, рак молочной железы (MDA-MB-231)- панель В, мелкоклеточный рак легкого (Н524)- панель С, клетки саркомы Юинга (ТС71) панель D и клетки глиобластомы (DuGan)- панель Е оценивали проточной цитометрией (возбуждение лазером с длиной волны 535 нм), а результаты выражены в процентном содержании клеток, содержащих введенный противораковый агент, на всю популяцию клеток.
5
Фигура 5: усиление противоопухолевой активности химиотерапии посредством mAb 8В6 к OAcGD2 в экспериментальной мышиной модели метастаз в печени при нейробластоме in vivo. Мышей (n=10/группа) инокулпровали 2.5×10 клеток мышиной нейробластомы NXS2 посредством инъекций внутривенной терапии. Лечение mAb 8В6 начали проводить на третьи сутки после инокуляции клеток опухоли дважды в неделю в течение трех последующих недель (суммарная доза =150 мкг, А-С). Все химиотерапевтическое лечение начинали проводить на 10 сутки после инокуляции опухоли. Панель А: изотретиноин вводили по 10 мг/кг перорально, пять раз в неделю на протяжении двух недель. Панель В: топотекан вводили посредством инъекций внутривенной терапии по 0,36 мг/кг пять раз в неделю в течение недели. Панель С: доксорубицин вводили посредством инъекций внутривенной терапии по 1 мг/кг пять раз в неделю в течение двух недель. Мышей подвергали эвтаназии через 28 дней после инокуляции. Противоопухолевую эффективность оценивали, определяя массу печени на свежем образце в сравнении с мышами, которых лечили только вспомогательным средством. Масса печени является индикатором степени метастазирования опухоли в печень. Ось у начинается при 0,8 г., что соответствует средней массе нормальной печени. Данные представлены в виде стандартной ошибки средней ± (SEM - от англ. standard error of mean).
Фигура 6: системная переносимость mAb 8В6 к OAcGD2 в комбинациях с изотретиноином (панель А), топотеканом (панель В) и доксорубицином (панель С). Средний вес группы мышей (n=10), представленной на фигуре 6 в 0 сутки был определен как 100% вес. Вес в каждой группе на период лечения оставался стабильным. Δ, мыши, которых лечили mAb 8В6, ο, мыши, которых лечили противораковым агентом; , мыши, которых лечили химиотерапевтическим лекарственным средством плюс mAb 8В6.
R
R
Фигура 7: mAb 8В6 к OAcGD2 преодолевает опухолевую резистентность не чувствительных к темозоломиду клеток мультиформной глиобластомы-10 (GBM-10 TMZ) пациента в мышиной модели ксенотрансплантата глиобластомы in vivo. Клетки GBM-10 вводили в мышей подкожно на 0 сутки. Затем мышей разделили на 2 группы: первая группа мышей получала Темозоломид (TMZ) посредством внутрибрюшинного введения в однократной дозе в количестве 0,05 мг/мышь в сутки 12, 22 и 32, при этом второй группе мышей не проводили лечение. Объем опухоли (панель А) контролировали. Экспрессию OAcGD2 оценивали в клетках GBM-10, выделенных как из мышей, которых лечили Темозоломидом, так и мышей, которым не давали лечение (панель В). Уровень резистентности к TMZ затем определяли с использованием метода лимитирующего разведения и выразили в виде концентрации раковых стволовых клеток глиобластомы (GSC - от англ. - glioblastoma cancer stem cells) в опухолевом ксенотрансплантате. Влияние монотерапии (8В6 или TMZ) и комбинации двух агентов (TMZ+8В6) на жизнеспособность GSC сравнили в клетках GBM-10, выделенных из мышей, которым не давали лечение (панель С, GBM-10 CTL (TMZs)) и ксенотрансплантатах рецидивирующей GBM-10 (панель D, GBM-10 TMZ).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В соответствии с первым аспектом, настоящее изобретение относится к способу доставки противоракового агента в клетку, экспрессирующую ганглиозид OAcGD2, включающему приведение указанной клетки в контакт с по меньшей мере одним антителом, распознающим ганглиозид OAcGD2, его функциональным фрагментом или производным, в количестве и концентрации, эффективных для улучшения захвата противоракового агента клеткой, при этом антитело приводит к появлению дефектов в клеточной мембране, таких как порообразование.
Предпочтительно, указанное по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, представляет собой мультимерное антитело.
Фактически авторы настоящего изобретения установили, что антитела, распознающие ганглиозид OAcGD2 и одновременно обладающие свойствами мультимеризации (например, антитело 8В6 IgG3, обладающее агрегационными свойствами, и химеризированное антитело 8В6, содержащее константную область химеризированного IgG1, обладающую мультимеризационными свойствами (а именно, образование гексамеров)) индуцируют проникновение противоракового агента, в то время как антитело, не обладающее такими мультимеризационными свойствами (например, химеризированное анттитело 8В6, содержащее константную область IgG1), не влияет на такое проникновение. Соответственно, представляется, что свойства как связывания ганглиозида OAcGD2, так и мультимеризации, необходимы для образования пор в клеточной мембране клеток, экспрессирующих ганглиозид OAcGD2. В контексте настоящего документа термин «мультимерное антитело» может относиться к димеру, тримеру, квадримеру, или к агрегату.
В целях настоящего изобретения, термины «клеточная мембрана», «цитоплазматическая мембрана», «наружная клеточная мембрана» и «плазматическая мембрана» эквивалентны и могут использоваться индифферентно.
Термин «доставка противоракового агента в клетку» относится к высвобождению противоракового агента внутри клетки таким образом, чтобы данный противораковый агент смог достичь своей внутриклеточной мишени.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, клетка, экспрессирующая ганглиозид OAcGD2, представляет собой клетку опухоли, раковую клетку, раковую стволовую клетку или гиперпролиферативную клетку, содержащую ганглиозид OAcGD2, прикрепленный к клеточной мембране. Термин «раковые стволовые клетки» имеет общее значение в области техники и относится к субпопуляции раковых клеток (обнаруженных в солидных опухолях и гематологических формах рака), обладающей характеристиками, относящимися к нормальным стволовым клеткам, в частности, способностью образовывать все типы клеток, обнаруженные в конкретном образце рака. Они имеют способность к самообновлению, дифференцировке во множество линий дифференцировки раковых клеток и экстенсивной пролиферации. Они могут инициировать новую опухоль только с небольшим количеством раковых стволовых клеток и проявляют резистентность к традиционной терапии, включающей химиотерапию и радиотерпию. Раковые стволовые клетки были обнаружены в самых разных формах рака, включая, в том числе, лейкемию, включающую острый миелоидный лейкоз и острый лимфоидный лейкоз, рак молочной железы, глиому, включающую глиобластому, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, рак простаты, рак легкого, рак печени, рак мочевого пузыря или рак желудочно-кишечного тракта. Наблюдались различные маркеры в качестве идентифицирующих раковые стволовые клетки среди основной массы раковых клеток, при этом такие маркеры варьируют и зависят от типа рака. Примеры маркеров, которые могут быть использованы для идентификации раковых стволовых клеток, включают, в частности, CD34, CD38, CD19, рецептор интерлейкина-3 α (CD123), CD33, CD44, CD44v6, CD47, CD24, молекула клеточной адгезии эпителия ЕрСАМ, (эпителиальный специфический антиген ESA), Lin, CD133, А2В5, SSEA-1 (стадиеспецифический эмбриональный антиген-1), CD166, CD26, CD200, α2β1, Sca, CD45, молекулы Pecam, альдегиддегидрогеназа (ALDH), ALDH1, Oct4, ABCG2, рецептор CXCR4, альфа-фетопротеин (AFP), эпителиальный мембранный антиген (ЕМА), инсулиноподобный фактор роста 1 (IGF-IR).
Термин «захват противоракового агента клеткой» относится к контакту и интернализации/проникновению противоракового агента в клетку-мишень, такую как опухолевая клетка, раковая клетка, раковая стволовая клетка или гиперпролиферативная клетка. На сегодняшний день точно установлено, что пересечение клеточной мембраны является первой лимитирующей стадией для противоракового агента для достижения его внутриклеточной мишени.
Термин «дефекты» относится к локальной пертурбации клеточной мембраны, которая вызывает временную деформацию клетки, приводящую к повышению проницаемости клеточной мембраны. Например, локальное впячивание или выпячивание клеточной мембраны может быть результатом связывания по меньшей мере одного антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, его функционального фрагмента или производного с клеткой, экспрессирующей ганглиозид OAcGD. Другими словами, кратковременное повышение проницаемости в клеточной мембране клетки, экспрессирующей ганглиозид OAcGD2, происходит только в присутствии по меньшей мере одного антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, его функционального фрагмента или производного. Данные дефекты могут быть настолько кратковременными, что клеточная мембрана может вернуться в свою исходную конформацию.
Термин «порообразование» относится к физической модификации или разрушению глицерофосфолипидного бислоя, приводящим к образованию отверстий в клеточной мембране. Это приводит к временному повышению проницаемости клеточных мембран и может также сыграть роль в эндоцитозе внеклеточных молекул. Порообразование обеспечивает возможность входа молекулы из внеклеточного отсека во внутриклеточный отсек. Количество и диаметр пор зависят от нескольких параметров, таких как тип клетки, состав клеточной мембраны, количество и продолжительность контакта антитела с клеткой. Размер пор определяет размер агентов, которые можно доставить в цитоплазму клетки, используя способ по изобретению. Сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) и атомно-силовую микроскопию (АСМ) можно использовать для оценки размера пор (ZHAO et al, Journal of Drug Targeting, 16:1, 18-25, 2008).
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, средний диаметр поры мембраны составляет от примерно 1 нм до примерно 100 нм, предпочтительно от примерно 1 нм до примерно 50 нм, и наиболее предпочтительно от примерно 1 нм и примерно 10 нм.
Толщина липидных бислойных клеточных мембран составляет от 4 до 10 нм. Следовательно, средний диаметр пор в некоторых случаях может быть значительно превосходить толщину мембраны.
В соответствии со всеми вариантами осуществления изобретения, антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или его производное, создает на клеточной мембране неселективные поры. Под «неселективными порами» следует понимать поры, обеспечивающие возможность диффундирования незаряженных или заряженных молекул, таких как ионизированный противораковый агент, через фосфолипидный бислой клеточной мембраны. Размер пор является значимым критерием при выборе незаряженных или заряженных соединений, которые пересекают клеточную мембрану.
При приведении в контакт с клеткой, экспрессирующей ганглиозид OAcGD2, при подходящих условиях, антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное, обладает способностью индуцировать проникновение противоракового агента в клетку в части или во всех клетках популяции заданной клеточной культуры, приводя к образованию пор в клеточной мембране. Под «проникновением в клетку» имеется в виду прохождение противоракового агента из внешней среды во внутриклеточную среду в условиях, значительно более благоприятных, чем пассивная диффузия.
Данное открытие дает абсолютно новый подход в лечении рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2. Производя неселективные поры в раковых клетках, антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное значительно улучшают проницаемость раковых клеток для противораковых агентов. Это может привести не только к повышению их терапевтического эффекта, но и также к снижению их сопутствующих потенциальных побочных эффектов.
При реализации in vitro и/или ex vivo, способ по изобретению осуществляют в целях лекарственного скрининга. Следовательно, способ in vitro и/или ex vivo доставки противоракового агента в клетку, предпочтительно опухолевую клетку, экспрессирующую ганглиозид OAcGD2, подходит для скрининга синергетических комбинаций противораковых агентов и антител, распознающих ганглиозид OAcGD2, их функционального фрагмента или производного.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к композиции для доставки противоракового агента в клетку, предпочтительно опухолевую клетку, экспрессирующую ганглиозид OAcGD2, содержащей: (i) по меньшей мере один противораковый агент, (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное, где указанное по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, усиливает захват указанного по меньшей мере одного противоракового агента клеткой, предпочтительно опухолевой клеткой.
При реализации in vivo, способ по изобретению осуществляют в терапевтических целях. Следовательно, способ in vivo доставки противоракового агента в клетку, предпочтительно опухолевую клетку, экспрессирующую ганглиозид OAcGD2, подходит для лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей: (i) по меньшей мере один противораковый агент, (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное, и факультативно (iii) фармацевтически приемлемый носитель для применения в способе лечения и/или профилактики рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2.
Настоящее изобретение также относится к антителу, распознающему ганглиозид OAcGD2, его функциональному фрагменту или производному, для применения в селективной доставке в клетку, экспрессирующую ганглиозид OAcGD2, по меньшей мере одного противоракового агента для лечения и/или профилактики рака.
Настоящее изобретение также относится к способу профилактики и/или лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, содержащей: (i) по меньшей мере один противораковый агент, (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное, и факультативно (iii) фармацевтически приемлемый носитель.
Термины «способ для лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2» или «способ лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2» эквивалентны и относятся к лечению, реверсии, ослаблению, облегчению, минимизации, подавлению или остановке вредного воздействия рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, или прогрессии рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, или ослабления прогрессии рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2. Предпочтительно такое лечение также приводит к регрессии роста опухоли или распространения метастаз, т.е. к уменьшению размера измеряемой опухоли. Наиболее предпочтительно, такое лечение приводит к полной регрессии опухоли.
Термин «рак, экспрессирующий ганглиозид OAcGD2», относится к раку, имеющему клетки, экспрессирующие на своей поверхности О-ацетилированную форму ганглиозида GD2. Как правило, данные клетки экспрессируют на своей клеточной поверхности более 1000 молекул ганглиозида OAcGD2, предпочтительно более 10000 и, более предпочтительно, более 50000 молекул ганглиозида OAcGD2. Данные формы рака, экспрессирующие ганглиозид OAcGD2, выбраны из группы, содержащей или состоящей из нейробластомы, глиомы, ретинобластомы, опухолей семейства Юинга, саркомы (т.е. рабдомиосаркомы, остеосаркомы, лейомиосаркомы, липосаркомы и фибросаркомы), мелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, меланомы, метастатического рака почки, рака головы и шеи, гематологических форм рака (т.е. лейкемии, лимфомы Ходжкина, Неходжкинской лимфомы и миеломы). В более широком смысле, термин «рак, экспрессирующий ганглиозид OAcGD2», относится к раку, презентирующему более 10% клеток, экспрессирующих ганглиозид OAcGD2, предпочтительно более 15%, и еще более предпочтительно - более 20%. Предпочтительно, указанные клетки представляют собой раковые стволовые клетки (CSC). Термин «лечение» рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, относится к введению композиции, содержащей: (i) по меньшей мере один противораковый агент, (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное, и факультативно (iii) фармацевтически приемлемый носитель для разрушения опухоли или разрушения раковых клеток, экспрессирующих на своей поверхности ганглиозид OAcGD2.
Термин «профилактика» рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, относится к введению композиции, содержащей: (i) по меньшей мере один противораковый агент, (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное, и факультативно (iii) фармацевтически приемлемый носитель для снижения роста опухоли или для препятствования распространению метастаз или даже для блокировки повторного появления опухоли. Предпочтительно результатом профилактики может быть предотвращение распространения метастаз, если лечение проводят субъекту, уже страдающему от рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, до наступления рецидива. Наиболее предпочтительно, еще одним результатом профилактики может быть предотвращение повторного возникновения опухоли у субъекта, которого уже подвергали лечению от рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2.
В контексте настоящего документа термин «пациент» относится к любым млекопитающим, включая людей. Не предполагается, что термин может быть ограничен определенным возрастом или полом. Таким образом, данный термин охватывает взрослых и новорожденных субъектов, а также детей, мужского или женского пола.
Термин «противораковый агент» относится к химическому, физическому или биологическому агенту или соединению с антипролиферативными, антионкогенными и/или канцеростатическими свойствами, которые можно использовать для ингибирования роста, пролиферации и/или развития опухоли. Предпочтительно, данный противораковый агент обладает активностью против рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2.
Указанный по меньшей мере один противораковый агент может быть выбран из группы, содержащей или состоящей из противоракового агента, такого как алкилирующие агенты, антиметаболиты, противоопухолевые антитела, противоопухолевые антибиотики, ингибиторы топоизомераз, митотические ингибиторы, ингибиторы тирозинкиназы, кортикостероиды, гормоны или гормоноподобные лекарства, цитокины, нуклеозидные аналоги, нуклеиновые кислоты, такие как молекулы двуцепочечных синтетических коротких РНК (микро-РНК) или синтетические ДНК/РНК-подобные олигонуклеотиды (АСО).
Указанный по меньшей мере один противораковый агент может быть не способен пересечь клеточную мембрану раковых клеток самостоятельно.
Во всех вариантах осуществления изобретения указанный противораковый агент имеет стерическое препятствие, соответствующее размеру поры в диапазоне от примерно 1 нм до примерно 2 мкм, таким образом, что он может пересекать клеточную мембрану через пору, являющуюся результатом приведения клетки в контакт с антителом, распознающим ганглиозид OAcGD2, его функциональным фрагментом или производным.
В некоторых вариантах осуществления противораковый агент может быть встроен в биосовместимые и биоразлагаемые наночастицы. Это особенно целесообразно, когда противораковый агент представляет собой нуклеиновую кислоту, такую как молекулы двуцепочечных синтетических коротких РНК (микро-РНК) или синтетические ДНК/РНК-подобные олигонуклеотиды (АСО) или которкий полипептид для их защиты от расщепления нуклеазами или протеазами.
В данном случае тип наночастиц может быть подобран специалистом в данной области, исходя из их размера, также их физико-химических и фармакокинетических характеристик. Например, микроРНК успешно доставляли в раковые клетки, используя наночастицы оксида железа в животной модели аденокарциномы желудка (HIRAKI et al., Molecular Therapy-Nucleic Acids (2015) 4, e231), и наночастицы карбонат-апатита в животной модели колоректальной аденокарциномы (SUN et al., 2014, Mol Cell Biochem, vol. 390, pp 19-30). Распределение наночастиц по размерам можно измерить, используя различные технологии, такие как атомно-силовая микроскопия (АСМ), трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) и динамическое рассеяние света (ДРС). Например, размер одной частицы оксида железа составлял 10-60 нм, а у наночастиц карбонат-апатита - 70-80 нм и вплоть до 200-300 нм, если они образуют агрегат.
Наночастицы можно также использовать для противораковых агентов, применяемых в химиотерапии, которые равномерно распределяются по телу пациента и которые не могут отличать раковые клетки от здоровых.
На протяжении последних лет значительные усилия были направлены на сверхмалые неорганические наночастицы (СМНЧ) для терапии рака. Размер ядра у золотых СМНЧ составляет от 1 до 3 нм.
Размер наночастиц и сверхмалых наночастиц совместим с размером пор, наблюдаемых в клеточной мембране раковых клеток, экспрессирующих ганглиозид OAcGD2, при инкубировании с антителом, распознающим ганглиозид OAcGD2.
В некоторых вариантах осуществления изобретения противораковые агенты не встроены в наночастицы. В данном случае противораковые агенты в растворе являются несферическими, динамическими (переворачивающимися) и сольватируемыми. Таким образом, видимый размер динамического, гидратируемого, сольватируемого противоракового агента можно определить, используя диффузионные свойства противоракового агента. Динамическое рассеяние света (ДРС) считается лучшим способом вычисления гидродинамического радиуса (Rh), который определяют как радиус эквивалентной твердой сферы, диффундирующей с той же скоростью, что и рассматриваемая молекула. Rh указывает на видимый размер динамической гидратируемой/сольватируемой молекулы. Rh, как правило, рассчитывают, исходя из коэффициента диффузии, с использованием уравнения Стокса - Эйнштейна. Радиус инерции (Rg), определяемый как среднее взвешенное расстояние от ядра молекулы до каждого массового элемента в молекуле, представляет собой еще один параметр, позволяющий определить размер молекулы. Однако, возможно получить Rg для молекул, используя другие методики, такие как малоугловое рассеяние нейтронов (SANS) и малоугловое рентгеновское рассеяние (SAXS) или из рентгеновских структур высокого разрешения.
Кроме того, может быть целесообразным охарактеризовать противораковый агент, образующий часть композиции для применения в лечении рака, по его молекулярной массе.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 100 Дальтон до 200000 Дальтон.
Под «молекулярной массой» следует понимать среднюю массу молекулы, вычисленную путем суммирования атомных масс атомов в молекулярной формуле, характеризующей указанную молекулу. Слова «масса» и «вес» в настоящем изобретении используются взаимозаменяемо. Под «атомной массой» следует понимать среднее взвешенное масс изотопов, обнаруженных в типичном земном образце элемента, описанного в периодической таблице Менделеева.
a
2
12
-27
-3
23
-1
-1
-1
-1
Определение Дальтон можно найти в Зеленой Книге, Green Book (ИЮПАК, Зеленая книга, Третье издание, «Величины, Единицы и Символы в физической химии», 2007; IUPAC, Green book,Third Edition, "Quantities, Units and Symbols in physical chemistry", 2007). Дальтон, символ Да, используют в качестве альтернативного названия для унифицированной атомной единицы массы, символ и. Дальтон относится к массе изотопа углерод-12 и характеризуется как 1/12 массы атома углерода-12 (m(С)/12 приблизительно ≈1.666 538 782 (83) ×10 кг = 10/Na (кг), где Na представляет собой постоянную Авогадро, равную 6,022 14Х 10 моль). Таким образом, из этого следует, что молярная масса углерода-12 составляет ровно 12 г/моль. Из этого следует, что молярные массы численно идентичны атомным массам, когда они выражены в единицах СИ г/моль (экв. г моль). В качестве примера, молярная масса воды (HO) составляет 18 г моль, а ее молекулярная масса составляет 18 Да. Дальтон можно комбинировать с приставками системы СИ для выражения масс больших молекул в килодальтон (кДа) или мегадальтон (МДа). Например, противораковый агент с молярной массой 200000 г мольимеет молекулярную массу 200000 Да, что может быть также охарактеризовано как 200 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления изобретения, противораковый агент композиций по изобретению имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 кДа до 15 кДа, более предпочтительно - от 11 кДа до 14 кДа, наиболее предпочтительно - от 12 кДа до 13 кДа. Наиболее предпочтительно, противораковый агент композиций по изобретению имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 кДа до 13 кДа.
В других вариантах осуществления изобретения противораковый агент композиций по изобретению имеет молекулярную массу в диапазоне от 80 кДа до 200 кДа, более предпочтительно - от 100 кДа до 180 кДа, еще более предпочтительно - от 120 кДа до 160 кДа. Наиболее предпочтительно, противораковый агент композиций по изобретению имеет молекулярную массу в диапазоне от 150 кДа до 200 кДа.
В других вариантах осуществления изобретения противораковый агент композиций по изобретению имеет молекулярную массу в диапазоне от 120 Дальтон до 800 Дальтон, более предпочтительно - от 150 Дальтон до 600 Дальтон, еще более предпочтительно - от 250 Дальтон до 550 Дальтон. Наиболее предпочтительно, противораковый агент композиций по изобретению имеет молекулярную массу в диапазоне от 120 Дальтон до 550 Дальтон.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления изобретения, указанный по меньшей мере один противораковый агент выбран из группы противораковых агентов, содержащей или состоящей из противоопухолевых антибиотиков, таких как антрациклины, ингибиторов топоизомераз, таких как камптотецины, алкилирующих агентов, таких как имидазотетразины или циклофосфамид, пренольных липидов, антиметаболитов, таких какдиазины и солей переходных металлов.
Антрациклины являются одними из самых эффективных классов лекарственных средств в лечении рака. Появившиеся в 50-х годах, данные молекулы сначала были обнаружены у почвенной бактерии Streptomyces peucetius. Антрациклины имеют жесткую планарную тетрациклической структуру с примыкающими фрагментами хинона и гидрохинона, короткой боковой цепью с карбонильной группой в С-13, и аминосахаром даунозамином, присоединенным по гликозидной связи к С-7 тетрациклического кольца. Антрациклины проникают в клетку посредством пассивной диффузии и способны взаимодействовать с комплексом топоизомераза-ДНК, ингибируя тем самым клеточный рост. Несмотря на эффективную активность в уничтожении раковых клеток, только некоторые из них были одобрены для медицинского применения, такие как даунорубицин, доксорубицин, идарубицин, эпирубицин, валрубицин, митоксантрон или пиксантрон. Более того, их клиническая польза ограничена кумулятивной дозозависимой кардиотоксичностью, что может привести к необратимой сердечной недостаточности. Предпочтительно, антрациклин, используемый в композиции по изобретению, выбран из группы, содержащей или состоящей из даунорубицина, доксорубицина, идарубицина, валрубицина и других их производных. Наиболее предпочтительно, антрациклин, используемый в композиции по изобретению, представляет собой доксорубицин или одно из его производных.
Во всех вариантах осуществления композиция по настоящему изобретению содержит терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного противоракового агента и терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, его функционального фрагмента или производного.
В контексте настоящего документа термин «терапевтически эффективное количество» направлен на охватывание любого количества, которое достигнет желаемого терапевтического или биологического эффекта. Терапевтический эффект зависит от рассматриваемой формы рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2 или желаемого биологического эффекта. Терапевтический эффект как таковой может представлять собой снижение тяжести симптомов, ассоциированных с раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2 и/или ингибирование (частичное или полное) прогрессирования рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2. Количество, необходимое для получения терапевтического ответа, может быть определено, исходя из формы рака, возраста, состояния здоровья, габаритов и пола пациента.
2
2
2
2
2
2
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, доксорубицин или одно из его производных можно вводить в дозе, составляющей от 40 мг/м до 60 мг/м для взрослого субъекта в течение 1-3 суток, каждые 3 или 4 недели. Максимальная суммарная доза доксорубицина или одного из его производных не должна превышать 600 мг/м. Для ребенка дозу снижают до диапазона от 25 мг/м до 30 мг/м. (MATTHAY et al., N Engl J Med, 1999, vol. 341, pp. 1165-1173). Для того, чтобы перевести дозу в мг/м в дозу в мг/кг для человека, нужно просто поделить на 37 (NAIR and JACOB, J Basic Clin Pharm., 2016, vol. 7(2):pp. 27-31).
Дозы, приведенные здесь, предназначены для взрослых людей и/или их детей, но их можно скорректировать в соответствии размерами других млекопитающих, исходя из массы или размеров на квадратный метр.
Камптотецины представляют собой гетероциклические соединения, содержащие планарную пентациклическую структуру, включающую пирроло[3,4-бета]- хинолиновый фрагмент (кольца А, В и С), конденсированный пиридоновый фрагмент (кольцо D) и один хиральный центр в положении 20 в альфа-гидроксилактоновой группе с (S)-конфигурацией (кольцо Е). Данные хинолиновые алкалоиды были изначально выделены из азиатского дерева Camptotheca acuminate, Топотекан и иринотекан представляют собой два единственных лекарственных средства- производных кампотецинов, одобренных для их применения в лечении рака. Предпочтительно, кампотецин, применяемый в композиции по изобретению, выбран из группы, содержащей или состоящей из топотекана, иринотекана, рубитекана и других производных. Наиболее предпочтительно, кампотецин, применяемый в композиции по изобретению, представляет собой топотекан, иринотекан или одно из их производных.
2
2
2
2
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, топотекан или одно из его производных можно вводить взрослому субъекту в начальной дозе, равной 1,5 мг/м в течение 5 суток, каждые 3 недели и затем в дозе, составляющей от 1 мг/м до 1,5 мг/м в течение 5 суток, каждые 3 недели. Данную дозу снижают для ребенка до 0,75 мг/м, в течение 5 суток, каждые 28 дней (DI GIANNATALE и др. Фаза II исследования темозоломида в комбинации с топотеканом (ТОТЕМ) при рецидивирующей или рефрактерной нейробластоме: Европейская инновационная терапия для детей с раком - Международное общество детской онкологии (SIOP)-Европейское изучение нейробластомы и Reza Rahbar,Carlos Rodriguez-Galindo.John G. Meara,Edward R. Smith,Antonio R. Perez-Atayde. 2 декабря 2013 Springer Science & Business Media) (DI GIANNATALE et al. Phase II study of temozolomide in combination with topotecan (TOTEM) in relapsed or refractory neuroblastoma: a European Innovative Therapies for Children with Cancer-SIOP-European Neuroblastomastudy and Reza Rahbar,Carlos Rodriguez-Galindo, John G. Meara, Edward R. Smith, Antonio R. Perez-Atayde. 2  2013 Springer Science & Business Media).
2
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения, иринотекан или одно из его производных можно вводить взрослому субъекту по 340-350 мг/м посредством внутривенной инфузии продолжительностью 90 минут, каждые 3 недели (FRIEDMAN и др., J. Clin. Oncol., т. 27(28), с:4733-4740, 2009).
Дозы, приведенные здесь, предназначены для взрослых людей и/или их детей, но их можно скорректировать в соответствии с размерами других млекопитающих, исходя из массы или размеров на квадратный метр.
Имидазотетразины представляют собой класс гетероциклических соединений, содержащих орто-конденсированные имидазольные и тетразиновые кольца. Среди данных соединений темозоломид (Temodar, Temodal, TMZ) был одобрен для лечения недавно диагностированной мультиформной глиобластомы (ГБМ), а также для рефрактерной атипической астроцитомы. Для приведения в действие данное пролекарство необходимо активировать. Несмотря на явное преимущество для сегмента пациентов, страдающих от глиобластомы, TMZ также индуцирует прогрессивный рост опухоли, ассоциированный с появлением устойчивости к TMZ. Предпочтительно, имидазотетразин, используемый в композиции по изобретению, представляет собой темозоломид или одно из его производных.
2
2
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, темозоломид или одно из его производных можно вводить в дозе, составляющей от 75 мг/м до 200 мг/м для взрослого субъекта в течение одних суток.
Дозы, приведенные здесь, предназначены для людей, но их можно скорректировать в соответствии с размерами других млекопитающих, исходя из массы или размеров на квадратный метр.
Пренольные липиды синтезируют из пятиугле родных предшественников, изопентенил-дифосфата и диметилаллил-дифосфата, которые получают главным образом через биосинтез мевалоновой кислоты. Ввиду того, что простые изопреноиды (линейные спирты, дифосфаты и т.д.) образуются путем последовательного присоединения С5 звеньев, их удобно классифицировать таким образом, с подклассом политерпенов для тех структур, которые содержат более 40 атомов углерода (т.е. более 8 изопреноидных звеньев). Например, витамин А и его производные, а также фитановая кислота и продукт ее окисления пристановая кислота классифицируются как С20 изопреноиды (содержат 20 атомов углерода). Каротиноиды являются важными простыми изопреноидами, функционирующими в качестве антиоксидантов и предшественников витамина А. Еще одним примером биологически значимого класса молекул являются хиноны и гидрохиноны, которые содержат изопреноидный хвост, присоединенный к хиноидному ядру неизопреноидного происхождения. Витамины Е и K, а также убихиноны, являются примерами данного класса. Среди пренольных липидов ретиноиды представляют собой природные и синтетические производные витамина А. В нескольких исследованиях сообщается об их применении в качестве мощных индукторов дифференцировки или индуктора апоптоза клеток опухоли для лечения рака, такого как острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Например, производные витамина А включают ретиноевую кислоту (РК), полностью транс-ретиноевую кислоту (ПТРК), 9-цис РК, гидроксифенилпируват-редуктазу (4-HPPR), 13-цис РК и синтетические аналоги ретиноевой кислоты, такие как AM 580. Недавно было обнаружено, что 13-цис РК полезна при лечении нейробластомы высокого риска после трансплантации костного мозга (Matthay et al., N Engl J Med; 341:1165-1173, 1999). Предпочтительно, пренольный липид, применяемый в композиции по изобретению, выбран из группы, содержащей или состоящей из ПТРК, 9-цис РК и 13-цис РК. Наиболее предпочтительно, пренольный липид, применяемый в композиции по изобретению, представляет собой 13-цис РК, также именуемую изотретиноином.
2
2
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, изотретиноин можно вводить в дозе, составляющей от 80 мг/м до 160 мг/м для взрослого субъекта (YU et al., N Engl J Med., 2010, vol. 363(14): pp. 1324-1334).
Дозы, приведенные здесь, предназначены для людей, но их можно скорректировать в зависимости от размеров других млекопитающих, а также детей, в соответствии с массой или размерами на квадратный метр.
Диазины представляют собой органические соединения, содержащие пятичленное гетероциклическое соединение с пятью атомами азота и двумя атомами азота в положениях 1 и 2 (Пиридазины), 1 и 3 (Пиримидины) или 1 и 4 (Пиразины). Предпочтительно, диазин, применяемый в композиции по изобретению, выбран из группы пиримидинов и производных пиримидинов, содержащей или состоящих из тиогуанина, флударабина, кладрибина, цитарабина, гемцитабина, 6-Меркаптопурина, 5-фтороурацила (5-ФУ) и родственных соединений. Наиболее предпочтительно, диазин, применяемый в композиции по изобретению, представляет собой 5-ФУ или флударабин.
2
2
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, 5-ФУ можно вводить в дозе, составляющей от 350 мг/м до 400 мг/м для взрослого субъекта в течение 4-5 суток, каждые 4 недели.
2
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, флударабин можно вводить в пероральной дозе, составляющей 40 мг/м в сутки, 5 суток подряд, каждые 28 суток. Дозы, приведенные здесь, предназначены для людей, но их можно скорректировать в зависимости от размеров других млекопитающих, а также детей, в соответствии с массой или размером на квадратный метр.
ИЮПАК характеризует переходные металлы как любой элемент с незаполненной подоболочкой или который может образовывать стабильные ионы только с незаполненной подоболочкой d. Переходными металлами являются сорок химических элементов от 21 до 30, от 39 до 48, от 71 до 80 и от 103 до 112 в периодической таблице элементов. Предпочтительно, переходный металл, применяемый в композиции по изобретению, выбран из группы, содержащей или состоящей из цисплатина, оксалиплатина, эптаплатина, лобаплатина, недаплатина, карбоплатина, ипроплатина, сатраплатина, тетраплатина, дициклоплатина (DCP), PLD-147, JM118, JM126, JM335 и других производных. Наиболее предпочтительно, переходный металл, применяемый в композиции по изобретению, представляет собой карбоплатин или цисплатин.
2
2
2
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, цисплатин можно вводить взрослому субъекту в дозе, составляющей от 50 мг/м до 100 мг/м каждые 3 или 4 недели. Доза составляет 60 мг/м для ребенка, каждые 28 суток.
2
2
2
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, карбоплатин можно вводить в дозе, составляющей от 300 мг/м до 400 мг/м для взрослого субъекта, каждые 3 или 4 недели. Доза составляет 200 мг/м для ребенка, каждый 21 день (Kohler et al., European Journal of Cancer (2013) 49, 3671-3679).
Дозы, приведенные здесь, предназначены для взрослых людей и/или их детей, но их можно скорректировать в зависимости от размеров других млекопитающих, в соответствии с массой или размерами на квадратный метр.
Соединения азотистого иприта представляют собой соединения, имеющие две бета-галогеналкильных группы, связанных с атомом азота. Среди данного класса соединений циклофосфамид используется для лечения различных видов рака.
2
2
2
2
2
2
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, циклофосфамид можно вводить взрослому субъекту в дозе, составляющей от 400 мг/м до 1800 мг/м, поделенной на 2-5 суток; можно вводить повторно с интервалами 2-4 недели для интермиттирующей терапии, и от 60 мг/м до 120 мг/м в сутки для непрерывной ежесуточной терапии. Доза для ребенка составляет от 1,5 мг/м до 3 мг/м в сутки в течение 5 суток.
Дозы, приведенные здесь, предназначены для взрослых людей и/или их детей, но их можно скорректировать в зависимости от размеров других млекопитающих, в соответствии с массой или размерами на квадратный метр.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, когда композицию, содержащую по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное, применяют для профилактики и/или лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, выбранного из группы, содержащей или состоящей из нейробластомы, глиомы, ретинобластомы, опухолей семейства Юинга, саркомы (т.е. рабдомиосаркомы, остеосаркомы, лейомиосаркомы, липосаркомы и фибросаркомы), мелкоклеточного рака легкого, рака молочной железы, меланомы, метастатического рака почки, рака головы и шеи и гематологических форм рака (т.е. лейкемии, лимфомы Ходжкина, неходжкинских лимфом и миеломы), указанный по меньшей мере один противораковый агент выбран из группы, содержащей или состоящей из циклофосфамида, доксорубицина, топотекана, иринотекана, темозоломида (ТМЗ), ретиноевой кислоты (РК), 5-фтороурацила (5-ФУ), флударабина, карбоплатина и цисплатина.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения, когда композицию, содержащую по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное, применяют для профилактики и/или лечения нейробластомы, указанный противораковый агент представляет собой темозоломид, топотекан, иринотекан, флударабин, циклофосфамид или их смесь.
В соответствии с данным предпочтительным вариантом осуществления изобретения, известно, что каждый из компонентов (т.е. антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2 и противораковый агент), заявленных в комбинации в качестве лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, по отдельности обладает терапевтической активностью в отношении одной и той же болезни или сопутствующих состояний. Комбинирование антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, и противоракового агента приводит к неожиданному техническому эффекту, т.е. синергизму.
В соответствии с определенным вариантом осуществления изобретения, указанное по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное содержит:
a) полипептид вариабельной области легкой цепи (VL), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; и
b) вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
Термин «вариабельная область» относится к доменам тяжелой (VH) и легкой цепи (VL), которая задействована в связывании антитела с антигеном.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, полипептид вариабельной области легкой цепи (VL) представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
Предпочтительно, полипептид вариабельной области легкой цепи (VL) выбран из группы, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения, полипептид вариабельной области легкой цепи (VL) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40.
Предпочтительно, полипептид вариабельной области легкой цепи (VL) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения, полипептид вариабельной области тяжелой цепи (VH) представляет собой аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 8.
Предпочтительно, полипептид вариабельной области тяжелой цепи (VH) выбран из группы, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO: 11.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения, полипептид вариабельной области тяжелой цепи (VH) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, и SEQ ID NO: 51.
Предпочтительно, полипептид вариабельной области тяжелой цепи (VH) имеет аминокислотную последовательность, выбранную из группы, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, и SEQ ID NO: 50.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения, полипептид вариабельной области легкой цепи (VL) представляет собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.
В соответствии с еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения, полипептид вариабельной области тяжелой цепи (VH) представляет собой аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 13.
Еще более предпочтительно, указанное по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное, содержит:
a) полипептид вариабельной области легкой цепи (VL), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; и
b) вариабельную область тяжелой цепи (VH), имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15.
Определяющие комплементарность участки (CDR) вариабельной области тяжелой цепи (VH) имеют аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18, а определяющие комплементарность участки вариабельной области легкой цепи (VL) имеют аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 21.
В соответствии с еще одним конкретным вариантом осуществления изобретения, указанное по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное, содержит:
a) тяжелую цепь, содержащую три определяющих комплементарность участка (CDR) тяжелой цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18, и каркасную последовательность из тяжелой цепи иммуноглобулина, и
b) легкую цепь, содержащую три определяющих комплементарность участка (CDR) легкой цепи с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO: 21, и каркасную последовательность легкой цепи иммуноглобулина из легкой цепи иммуноглобулина.
Участки, определяющие комплементарность (CDR) встречаются соответственно у аминокислотных остатков 26-35 (CDR1_VH), 50-68 (CDR2_VH), 99-108 (CDR3_VH) последовательности SEQ ID NO: 15 и у аминокислотных остатков 24-39 (CDR1_VL), 54-60 (CDR2_VL), 94-102 (CDR3_VL) последовательности SEQ ID NO: 14.
Приписывание аминокислот каждому CDR происходит в соответствии с хорошо известными системами нумерации, включая системы IMGT, Kabat и Chothia (IMGT, Международная Информационная Система по Иммуногенетике (The International Immunogenetics Information System); LEFRANC и др., Исследование нуклеиновых кислот, т.27, с: 209-212, 1999 (LEFRANC et al., Nucleic Acids Research, vol. 27, p: 209-212, 1999); KABAT, Последовательности белков, являющихся объектом иммунологии, 5-е издание. Департамент здравоохранения и социального обеспечения США, Национальные институты здравоохранения, публикация NIH, No91-3242, 991; CLOTHIA & LESK, J Mol Biol., с. 196(4), c:901-917, 1987).
A
A
A
5
6
7
7
Термин «антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2» относится к равновесной константе ассоциации (K) антитела для ганглиозида OAcGD2, составляющей более 2×10 М при 25°С, предпочтительно K, равной или менее 2×10 М, более предпочтительно K равной или менее 1×10 М или даже 2×10 М. Такая аффинность может быть измерена способами, доступными из уровня техники, например, анализ Скэтчарда, конкурентный ИФА, анализ BIACORE или анализ кинетического исключения (Kinexa).
A
A
A
5
4
Согласно настоящему изобретению, антитело, применяемое в композициях по изобретению, не специфично к ганглиозиду GD2. Равновесная константа ассоциации (K) антитела, применяемого в композиции по изобретению, по меньшей мере в 10 раз слабее, более предпочтительно, по меньшей мере в 100 раз слабее для ганглиозида GD2, чем для ганглиозида OAcGD2. Предпочтительно, равновесная константа ассоциации (K) антитела для ганглиозида GD2 составляет менее 10 М при 25°С, предпочтительно K составляет менее 10 М для ганглиозида GD2.
Термин «функциональный фрагмент» относится к фрагментам антитела, которые специфически связываются с ганглиозидом OAcGD2. Такие фрагменты могут быть без труда идентифицированы специалистом и включают, к примеру, одноцепочечный вариабельный (scFv, от англ. - single-chain variable fragment) фрагмент, Fab фрагмент (например, путем расщепления папаином), Fab' фрагмент (например, путем расщепления пепсином и частичного восстановления), F(ab')2 фрагмент (например, путем расщепления пепсином), Facb (например, путем расщепления плазмином), и также Fv и Fd (например, путем расщепления пепсином и частичного восстановления и реагрегации) фрагменты, которые охватываются изобретением.
Такие фрагменты могут быть получены путем ферментативного расщепления, синтетической или рекомбинантной методики с использованием способа, хорошо известного в уровне техники, такого как описанный в STANWORTH и др. (Руководство по экспериментальной иммунологии, т. 1, глава 8, Blackwell Scientific Publications, 1978) (STANWORTH et al (Handbook of Experimental Immunology, vol. 1, chapter 8, Blackwell Scientific Publications, 1978)). Антитела можно также получать в различных процессированных формах, с применением генов антител, где один или более стоп-кодонов были введены выше сайта естественной остановки. Например, комбинированный ген, кодирующий участок тяжелой цепи F(ab')2, может быть сконструирован с возможностью включения ДНК-последовательностей, кодирующих домен СН1 и/или шарнирную область тяжелой цепи. Различные участки антител можно объединять химическим путем посредством общепринятых методик, или можно получать в виде непрерывного белка с использованием методик генной инженерии.
Данные фрагменты включают по меньшей мере вариабельные области тяжелой и легкой цепей, описанных выше.
Данные фрагменты могут быть растворимыми, но также могут быть закреплены в клеточной мембране в виде одноцепочечной вариабельной области химерного антигенного рецептора (CAR).
Термин «химерные антигенные рецепторы (CAR)» в контексте данного документа относится к искусственному гибридному полипептиду, содержащему по меньшей мере один антигенсвязывающий домен антитела и по меньшей мере один сигнальный домен эффекторной клетки. Такие CAR охватывают рекомбинантные рецепторы, которые прививают искусственную специфичность конкретной эффекторной клетке иммунитета (например, Т-клетки, NK-клетки и NKT- клетки). CAR могут быть использованы для придания специфичности монокпонального антитела Т-клетке без рестрикции по главному комплексу гистосовместимости МНС, эксплуатируя таким образом антигенсвязывающие свойства моноклональных антител. При экспрессии в Т-клетках CAR распознают непроцессированные антигены независимо от экспрессии антигена главного комплекса гистосовместимости, что не свойственно нормальным Т-клеточным рецепторам (TCR), обходя, таким образом, два главных механизма ускользания опухоли, понижающую регуляцию экспрессии лейкоцитарного антигена человека (HLA) или протеосомальный процессинг антигена. Связывание CAR с конкретным антигеном вызывает иммунный ответ.
В определенных аспектах CAR содержат эктодомен, трансмембранный домен и эндодомен. В данном изобретении структура может быть мультимерной, такой как диатело или также мультимерной (например, многоцепочечный химерный антигенный рецептор, описанный в международной патентной заявке РСТ WO 2016/016343).
n
n
n
n
n
n
n
Эктодомен соответствует антигенсвязывающему домену и спейсерному домену (стволовой участок). Антигенсвязывающий домен представляет собой предпочтительно одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv- от англ. 'single-chain variable fragment'). Такой scFv представляет собой фрагмент генетически сконструированного антитела, который обычно состоит из тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина или его частей, таких как VH и VL, соединенных гибким пептидным линкером, как описано, например, в PLUCKTHUN (Фармакология моноклональных антител, т. 113, Rosenburg и Moore под ред, Springer-Verlag, Нью-Йорк, с: 269-315, 1994 (The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, p:269-315, 1994)). Гибкий пептидный линкер может представлять собой пептид из 6-40 аминокислотных остатков. Применение малых аминокислот, таких как аланин и глицин, полезно при создании гибкого линкера. Типичные гибкие линкеры включают полимеры глицина (G)n, полимеры на основе глицин-серина, такие как, например, (GS), GSGGS (SEQ ID NO: 22), GGGS (SEQ ID NO: 23) и GGGGS (SEQ ID NO: 24), где n представляет собой целое число, равное по меньшей мере одному, полимеры на основе глицин-аланина или глицин-серина или другие гибкие линкеры, известные в уровне техники. В качестве примера используемых полимеров можно привести GGGGSGGGGSGGGGS ((G4S)3; SEQ ID NO: 25), GSTSGSGKPGSGEGSTKG (CD19 линкер; SEQ ID NO: 26), GGSSRSSSSGGGGSGGGG (18-звенный; SEQ ID NO: 27), GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS ((G4S)4; SEQ ID NO: 28), KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 29), EGKSSGSGSESKST (SEQ ID NO:30), GSAGSAAGSGEF (SEQ ID NO: 31), GGGGGGGG (SEQ ID NO: 32) или GGGGGG (SEQ ID NO: 33). Наконец, данные scFv фрагменты можно получить способами, хорошо известными специалисту из уровня техники, такие как описанные GILLILAND и др. (Тканевые Антигены, т. 47, с. 1-20, 1996) (Tissue Antigens, vol. 47, pp. 1-20, 1996). Термин «стволовой участок» также обозначаемый как «спейсер или шарнирный участок» в контексте настоящего документа относится к любому олиго- или полипептиду, который выполняет функцию связывания трансмембранного домена с эктодоменом. В частности, стволовой участок используется для обеспечения большей гибкости и доступности для эктодомена. Спейсерные элементы играют преимущественно структурную роль в CAR. Спейсер физически отделяет нацеливающий фрагмент от Т-клеточной мембраны. Требуемое оптимальное расстояние, вероятно, различно для каждого антигена. Для обеспечения эффективного доступа к мишени спейсер оказывается необходим, когда CAR связывает эпитоп, расположенный близко к мембране клетки-мишени, или когда антиген является комплексным по размеру и статусу гликозилирования. Спейсеры человеческого IgG (шарнир-СН2-СН3) обычно используются ввиду их стабилизирующего действия на экспрессию CAR, но взаимодействие между Fc доменом спейсерной области и Fc-гамма рецепторами (FcgR) на миелоидных клетках может привести к индуцированной активацией клеточной смерти Т-клеток, и ограниченной персистенции in-vivo. Это можно преодолеть путем делеции или модифицирования областей константного домена тяжелой цепи (СН)2, необходимых для связывания FcgR, улучшая тем самым персистенцию CAR Т-клеток и противоопухолевую активность in-vivo в доклинических моделях. Другие широко используемые шарнирные участки включают участки, происходящие из CD28 или CD8 или других усеченных фрагментов спейсеров IgG человека. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, CAR содержит стволовой участок между эктодоменом и трансмембранным доменом. Стволовой участок может содержать до 300 аминокислот, предпочтительно от 10 до 100 аминокислот и наиболее предпочтительно от 25 до 50 аминокислот. Стволовой участок может происходить из всей или части молекулы природного происхождения, как например, часть внеклеточной области CD8, CD4 или CD28 или из всей или части константной области антитела. В альтернативном варианте данный стволовой участок может представлять собой искусственную последовательность.
Трансмембранный домен представляет собой якорный домен мембраны и также линкер между эктодоменом и эндодоменом. Данный трансмембранный домен может представлять собой шарнирный участок человеческого IgG4Fc, Fc-фрагмент, трансмембранный домен CD4, трансмембранный домен Т-клеточного рецептора или другие трансмембранный домены из других трансмембранных сигнальных белков человека, таких как CD16, дзета-цепь Т-клеточного рецептора (СD3дзета), CD28 и CD8 или рецептор эритропоэтина, и их мутантные формы. Предпочтительно данный трансмембранный домен представляет собой трансмембранный домен Т-клеточного рецептора. Предпочтительно, данный трансмембранный домен Т-клеточного рецептора происходит от трансмембранного белка, способного образовывать комплекс с Т-клеточным рецептором для антигена (TCR). Предпочтительно, данный трансмембранный домен Т-клеточного рецептора содержит часть или целое одного или более из следующего: дзета-цепь TCR (СD3дзета), CD28, OX40/CD134, 4-1BB/CD137/TNFRSF9, , ICOS/CD278, ILRB/CD122, IL-2RG/CD132, CD27, DAP10 и CD40.
Эндодомен представляет собой домен внутриклеточной сигнализации, ответственный за передачу сигнала внутри клетки с последующим связыванием эктодомена с антигеном-мишенью, что приводит к активации иммуноцита. Другими словами, домен внутриклеточной сигнализации ответственен за активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, в которой экспрессируется химерный рецептор. Термин «эффекторная функция» относится к специализированной функции Т-клетки, которая может представлять собой цитолитическую активность или хелперную активность, включая секрецию цитокинов. Таким образом, термин «домен внутриклеточной сигнализации» относится к части белка, которая преобразует сигнал эффекторной функции и адресует клетке для выполнения специализированной функции. Хотя обычно используется весь домен внутриклеточной сигнализации, во многих случаях нет необходимости использовать внутриклеточный полипептид целиком. В случае, если усеченная часть домена внутриклеточной сигнализации может найти применение, такую усеченную часть можно использовать вместо целой цепи при условии, что она преобразует сигнал эффекторной функции. Таким образом, подразумевается, что термин «домен внутриклеточной сигнализации» включает любую усеченную часть домена внутриклеточной сигнализации, достаточную для преобразования сигнала эффекторной функции.
Предпочтительные примеры домена сигнальной трансдукции для применения в многоцепочечном CAR могут представлять собой цитоплазматические последовательности Fc-рецептора или Т-клеточного рецептора и корецепторы, которые действуют совместно для инициирования сигнальной трансдукции с последующим вовлечением рецептора антигена, а также любое производное или вариант данных последовательностей и любую синтетическую последовательность, обладающую такой же функциональной возможностью. Домен сигнальной трансдукции включает два различных класса цитоплазматической сигнальной последовательности: те, которые инициируют антиген-зависимую первичную активацию, и те, которые, которые действуют антиген-независимым образом для обеспечения вторичного или костимулирующего сигнала. Первичная цитоплазматическая сигнальная последовательность может включать сигнальные мотивы, известные как активирующие мотивы иммунорецепторов на основе тирозина (ITAM). ITAM представляют собой четко определенные сигнальные мотивы, обнаруженные в цитоплазматическом хвосте множества рецепторов, которые выполняют функцию сайтов связывания для тирозинкиназ класса syk/zap70. Примеры ITAM, используемых в изобретении, могут включать в качестве неограничивающих примеров ITAM, происходящие из дзета-цепи TCR, FcRгамма, FcRбета, FcRэпсилон, СD3гамма, СD3дельта, CD3 СD3эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, домен сигнальной трансдукции многоцепочечного CAR может включать сигнальный домен СО3дзета или цитоплазматический домен бета или гамма-цепей высокоаффинного Fc рецептора для IgE.
В определенном варианте осуществления изобретения домен сигнальной трансдукции многоцепочечного CAR по настоящему изобретению включает костимулирующую сигнальную молекулу. Костимулирующая молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, отличную от антигенных рецепторов или их лигандов, которая необходима для эффективного иммунного ответа.
Термин «костимулирующий лиганд» относится к молекуле на антигенпрезентирующей клетке, которая специфически связывает когнатную костимулирующую молекулу на Т-клетке, обеспечивая тем самым сигнал, который, вдобавок к первичному сигналу, предусмотренному, например, связыванием комплекса TCR/CD3 с нагруженной пептидом молекулой МНС, опосредует Т-клеточный ответ, включая, в том числе, активацию пролиферации, дифференцировку и тому подобное. Костимулирующий лиганд может включать, в том числе, CD7, В7-1 (CD80), В7-2 (CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, индуцибельный костимулирующий лиганд (ICOS-L), молекулу межклеточной адгезии (ICAM, CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, М1СВ, HVEM, рецептор лимфотоксина бета, 3/TR6, ILT3, ILT4), агонист или антитело, которое связывает Toll-подобный рецептор и лиганд, который специфически связывается с В7-Н3. Костимулирующий лиганд также охватывает, в том числе, антитело, которое специфически связывается с костимулирующей молекулой, присутствующей на Т-клетке, такой как, в частности, CD27, CD28, 4-IBB, ОХ40, CD30, CD40, PD-1, индуцибельный Т-клеточный костимулятор ICOS, DAP-10, функционально-связанный антиген лимфоцитов-1 (LFA-1), CD2, CD7, LTGHT, NKG2C, В7-Н3, лиганд, который специфически связывается с CD83.
«Костимулирующая молекула» относится к когнатному партнеру по связыванию на Т-кпетке, который специфически связывается с костимулирующим лигандом, опосредуя тем самым костимулирующий ответ клеткой, среди прочего включающий в себя пролиферацию. Костимулирующие молекулы включают, в частности, молекулу главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I, В- и Т-лимфоцитарный аттенюатор (BTLA) и лиганд Toll-подобных рецепторов. Примеры костимулирующих молекул включают CD27, CD28, CD8, 4-1ВВ (CD137), ОХ40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, DAP-10, функционально связанный антиген-1 лимфоцитов (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, В7-Н3 и лиганд, который специфически связывается с CD83 и тому подобное.
Термин «его производное» относится к аминокислотной последовательности, имеющей процент идентичности, составляющий по меньшей мере 90%, предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно, по меньшей мере 98% (т.е. что соответствует примерно 12, 6 и 2 аминокислотным заменам соответственно) с аминокислотной последовательностью, выбранной в группе, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 51, предпочтительно по меньшей мере 99% (т.е. что соответствует примерно 1 аминокислотной замене).
Что касается последовательностей участков, определяющих комплементарность (CDR), термин «его производное» относится к аминокислотной последовательности с процентом идентичности по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90% (т.е. что соответствует примерно 2 и 1 аминокислотным заменам соответственно) с аминокислотной последовательностью, выбранной в группе, содержащей или состоящей из SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, и SEQ ID NO: 21.
Такие производные могут быть без труда идентифицированы специалистом с учетом его экспертных знаний и изучения данной заявки. Также следует понимать, что природные аминокислоты могут быть заменены химически модифицированными аминокислотами. Как правило, такие химически модифицированные аминокислоты повышают время полужизни полипептида.
В контексте данного документа «процент идентичности» между двумя аминокислотными последовательностями обозначает процентное содержание идентичных аминокислот между двумя последовательностями, подлежащими сравнению, полученное оптимальным выравниванием указанных последовательностей, причем данное процентное содержание является чисто статистическим, и различия между данными двумя последовательностями распределены случайным образом по последовательностям аминокислот. В контексте данного документа «наилучшее выравнивание» или «оптимальное выравнивание» означает выравнивание, для которого определенный процент идентичности (см. ниже) является наивысшим. Сравнение последовательностей между двумя аминокислотами обычно осуществляется путем сравнения данных последовательностей, которые были предварительно выровнены в соответствии с наиболее оптимальным выравниванием; данное сравнение осуществляют на участках сравнения для идентификации и сравнения локальных областей сходства. Наряду с ручным методом, наиболее оптимальное выравнивание последовательностей для проведения сравнения может быть осуществлено с использованием алгоритма поиска локальной гомологии, разработанного Smith и Waterman (Ad. Арр. Math., т. 2, с:482, 1981), с использованием алгоритма поиска общей гомологии, разработанного Neddleman и Wunsch (J. Mol. Biol., т. 48, c:443, 1970), способа поиска сходства, разработанного Pearson и Lipmolan (Proc. Natl. Acad. Sci. США, т. 85, c:2444, 1988), используя программное обеспечение, в котором применяются такие алгоритмы (GAP, BESTFIT, BLAST Р, BLAST N, FASTA, T FAST А в пакете ПО Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI США), используя алгоритмы множественного выравнивания последовательностей MUSCLE (Edgar, Robert С, Nucleic Acids Research, т. 32, c:1792, 2004). Для получения наилучшего выравнивания, может быть предпочтительным применение программного обеспечения BLAST с матрицей BLOSUM 62. Процент идентичности между двумя последовательностями аминокислот определяют, сравнивая две данных оптимально выровненных последовательности, причем аминокислотные последовательности способны заключать в себе присоединения и делеции относительно эталонной последовательности для получения оптимального выравнивания между двумя данными последовательностями. Процент идентичности вычисляют, определяя число идентичных позиции между данными двумя последовательностями, и разделив данное число на общее число сравненных позиций, и умножив результат на 100 для получения процента идентичности между двумя данными последовательностями.
Антитело, применяемое в композициях по изобретению, произведено рекомбинантным путем.
Антитело, применяемое в композициях по изобретению, может или не может быть гликозилировано, хотя гликозилированные антитела являются предпочтительными. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, антитело, применяемое в композициях по изобретению, может быть низкофукозилированным.
Антитело, применяемое в композициях по изобретению, может представлять собой иммуноконьюгат.
В контексте настоящего документа термин «иммуноконьюгат» относится к конъюгатной молекуле, содержащей по меньшей мере одно антитело, его функциональный фрагмент или производное, связанной со второй молекулой, предпочтительно иммуномодулирующим агентом, цитотоксическим агентом или радиоизотопом. Такой иммуноконьюгат может представлять собой конъюгаты антитело-лекарственное средство (ADC), иммуноцитокины (ICK) или конъюгаты меченых изотопами антител (ARC, от англ. - Antibody Radio Conjugates). В данном документе эта вторая молекула может представлять собой антитело, обладающее специфичностью связывания в отношении другого антигена, при этом образованный иммуноконьюгат представляет собой биспецифическое антитело, такое как BiTE (биспецифические рекрутеры Т-клеток). Указанное антитело или его фрагмент образует комплекс или ковалентно связано (например, гибридный белок) с указанной второй молекулой. Предпочтительно указанное антитело или его фрагмент присоединены к указанной второй молекуле ковалентной связью. Данная вторая молекула может представлять собой протеин или гликопротеин, способный специфически взаимодействовать с сахаридами с образованием нековалентных связей, например лектины.
Антитело, применяемое в композициях по изобретению, может представлять собой биспецифическое или мультиспецифическое антитело. Несколько форматов, такие как иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом (DVD), биспецифические рекрутеры Т-клеток (BiTE), диатела, четырехвалентные тандемные антитела (TandAb), перенацеливающиеся молекулы с двойной аффинностью (DART) являются подходящим форматом антитела, применяемого в композициях (WEIDLE и др., Геномика и протеомика рака, 2013, том 10, с. 1-18 (WEIDLE et al., Cancer Genomics & Proteomics, 2013, vol. 10, pp. 1-18)).
Предпочтительно, когда пациент является человеком, антитела, применяемые в лечении рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, представляют собой человеческие или гуманизированные (с привитым CDR) версии антител; хотя можно использовать и мышиные версии антител. При многократных курсах лечения менее вероятно, что гуманизированное антитело IgG выработает опосредованный IgG иммунный ответ у пациентов.
Во всех вариантах осуществления изобретения композиция по изобретению содержит терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного противоракового агента и терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, его функционального фрагмента или производного.
2
2
2
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, антитело, его функциональный фрагмент или производное можно вводить путем инъекций в дозе, составляющей от 2 до 2000 мг/м субъекта, предпочтительно в дозе, составляющей от 5 до 1000 мг/м и наиболее предпочтительно в дозе, составляющей от 10 до 500 мг/м.
Дозы, приведенные в данном документе, предназначены для людей, но могут быть скорректированы в соответствии с размером других млекопитающих, а также детей, исходя из массы или размеров на квадратный метр.
В контексте настоящего документа термин «терапевтически эффективное количество» предназначен для охватывания любого количества, которое достигнет желаемого терапевтического или биологического эффекта. Терапевтический эффект зависит от рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, подлежащего лучению, или от желаемого биологического эффекта. Терапевтический эффект как таковой может представлять собой снижение тяжести симптомов, ассоциированных с раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2 и/или ингибирование (частичное или полное) прогрессии рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2. Количество, необходимое для того, чтобы вызвать терапевтический ответ, можно определить, исходя из формы рака, возраста, состояния здоровья, размеров и пола пациента.
Оптимальные дозы можно также определить, исходя из мониторинга ответа пациента на лечение.
В определенных вариантах осуществления изобретения композиция также содержит фармацевтически приемлемый носитель для применения в терапии.
Выражение «фармацевтически приемлемый» относится к соединениям и композициям, которые являются физиологически переносимыми и, как правило, не дают аллергических или похожих нежелательных реакций, таких как расстройство желудка, головокружение и тому подобное при введении человеку. Предпочтительно, в контексте данного документа выражение «фармацевтически приемлемый» означает одобренный надзорным органом федерального или регионального правительства или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения на животных и, в особенности на человеке.
Термин «носитель» относится к растворителю, адъюванту, наполнителю или инертному веществу, с которым вводят соединение. Такими фармацевтическими носителями могут быть стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное.
Указанная композиция может находиться в любой лекарственной форме, подходящей для введения пациенту, включая, но не ограничиваясь этим, растворы, суспензии, лиофилизированные порошки, капсулы и таблетки. Способ введения композиции по настоящему изобретению предпочтительно является парентеральным; в контексте данного документа термин «парентеральный» включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, внутрибрюшинное, ректальное, вагинальное, через слизистую, интратекальное, внутричерепное или внутриопухолевое введение. Таким образом, фармацевтическая композиция содержит носители, которые являются фармацевтически приемлемыми для препарата, предназначенного для инъекции. В частности, это могут быть изотонические, стерильные, солевые растворы (фосфат натрия или динатрия, хлорид натрия, калия, кальция или магния и т.или смеси таких солей) или сухие, особенно лиофилизированные композиции, которые при добавлении в зависимости от случая, стерилизованной воды или физиологического раствора позволяют создать инъекционные растворы. Подходящие фармацевтические носители описаны E.W. Martin в Remington's Pharmaceutical Sciences.
Наиболее предпочтительно, композиция находится в любой лекарственной форме, подходящей для внутривенного введения пациенту.
Антитело, функциональный фрагмент или производное по изобретению могут быть солюбилизированы в буфере или воде или включены в эмульсии, микроэмульсии, гидрогели (например, гидрогели на основе триблок-сополимеров PLGA-PEG-PLGA), в микросферы, наносферы, в микрочастицы, наночастицы (например, поли (молочно-согликолевая кислота), микрочастицы (например, полимолочная кислота (PLA); поли (лактид-согликолевая кислота)) (PLGA); полиглутаматные микросферы, наносферы, микрочастицы или наночастицы), в липосомы или другие галеновые препараты. Во всех случаях препарат должен быть стерильным и жидким в случае допустимой возможности введения через шприц. Он должен быть стабильным в условиях производства и хранения и должен быть защищен от загрязняющего воздействия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки.
Дисперсии также могут быть приготовлены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, а также в их смесях и маслах. При обычных условиях хранения и применения данные препараты содержат консервант для предотвращения роста микроорганизмов.
Антитело, функциональный фрагмент или производное по изобретению могут быть включены в состав композиции в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают соли присоединения кислоты (образованные с помощью свободных аминогрупп белка), которые образуются с неорганическими кислотами, такими как, например, соляная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная, миндальная и тому подобное. Соли, образованные с использованием свободных карбоксильных групп, также могут быть получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин, прокаин и тому подобное.
Носитель может также представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и тому подобное), их подходящие смеси и растительные масла. Антитела по изобретению также могут быть модифицированы, например, пегилированием, чтобы повысить биодоступность.
Подходящую текучесть можно поддерживать, например, используя покрытие, такое как лецитин, поддерживая требуемый размер частиц в случае дисперсии и используя поверхностно-активные вещества. Предотвратить действие микроорганизмов можно различными антибактериальными и противогрибковыми агентами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой, тимеросалом и тому подобным. Во многих случаях предпочтительным будет включение изотонических агентов, например сахара или хлорида натрия.
Пролонгированную абсорбцию композиций для инъекций можно осуществить путем использования в композициях агентов, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия, желатина, полиолов и ковалентных и нековалентных соединений, увеличивающих период полураспада.
Существует множество причин нестабильности или деградации пептидов, включая гидролиз и денатурацию. Гидрофобное взаимодействие может вызывать скопление молекул вместе (то есть агрегацию). Можно добавить стабилизаторы для уменьшения или предотвращения таких проблем.
Стабилизаторы включают циклодекстрин и его производные (см. Патент США №5,730,969). Для стабилизации конечного препарата можно также добавить подходящие консерванты, такие как сахароза, маннит, сорбит, трегалоза, декстран и глицерин. В состав препарата можно включать стабилизатор, выбранный из ионных и неионных поверхностно-активных веществ, D-глюкозы, D-галактозы, D-ксилозы, D-галактуроновой кислоты, трегалозы, декстранов, гидроксиэтилкрахмалов и их смесей. Добавление соли щелочного металла или хлорида магния может стабилизировать пептид. Пептид также можно стабилизировать путем приведения его в контакт с сахаридом, выбранным из группы, состоящей из декстрана, хондроитина, серной кислоты, крахмала, гликогена, декстрина и соли альгиновой кислоты. Другие сахара, которые можно добавлять, включают моносахариды, дисахариды, сахарные спирты и их смеси (например, глюкоза, манноза, галактоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, лактоза, маннит, ксилит). Полиолы могут стабилизировать пептид и являются смешиваемыми с водой или водорастворимыми. Подходящими полиолами могут быть многоатомные спирты, моносахариды и дисахариды, включая маннит, глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль, триметилгликоль, винилпирролидон, глюкозу, фруктозу, арабинозу, маннозу, мальтозу, сахарозу и их полимеры. Кроме того, пептиды можно стабилизировать различными наполнителями, включая сывороточный альбумин, аминокислоты, гепарин, жирные кислоты и фосфолипиды, поверхностно-активные вещества, металлы, полиолы, восстановители, хелатирующие металлы агенты, поливинилпирролидон, гидролизованный желатин и сульфат аммония.
Во всех вариантах осуществления изобретения указанный по меньшей мере один противораковый агент, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон, и по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или его производное, можно вводить по отдельности, одновременно или последовательно.
В определенных вариантах осуществления изобретения, указанный по меньшей мере один противораковый агент, вводимый отдельно, одновременно или последовательно с по меньшей мере одним антителом, распознающим ганглиозид OAcGD2, его функциональным фрагментом или производным, имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 кДа до 15 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления изобретения, указанный по меньшей мере один противораковый агент, вводимый отдельно, одновременно или последовательно с по меньшей мере одним антителом, распознающим ганглиозид OAcGD2, его функциональным фрагментом или производным, имеет молекулярную массу в диапазоне от 80 кДа до 200 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления, по меньшей мере один противораковый агент, вводимый отдельно, одновременно или последовательно с по меньшей мере одним антителом, распознающим ганглиозид OAcGD2, его функциональным фрагментом или производным, имеет молекулярную массу в диапазоне от 120 до 800 Дальтон.
Например, по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное можно вводить перед введением по меньшей мере одного противоракового агента, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон. Способ и последовательность введения направлены на получение максимальной эффективности комбинации; для каждого введения возможна различная продолжительность, варьирующаяся от быстрого общего введения до непрерывной инфузии. Как следствие, комбинация по меньшей мере одного противоракового агента, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон, и по меньшей мере одного антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, его функционального фрагмента или его производного, не ограничиваются комбинациями, полученными их физическим объединением, но также комбинациями, которые обеспечивают возможность раздельного введения, которое может быть одновременным или последовательным.
В определенных вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция также содержит второй, третий, четвертый, n-й противораковый агент, включая, но не ограничиваясь ими, алкилирующие агенты, антиметаболиты, противоопухолевые антитела, противоопухолевые антибиотики, ингибиторы топоизомераз, митотические ингибиторы, ингибиторы тирозинкиназы, кортикостероиды, гормоны или гормоноподобные лекарственные средства, цитокины, аналоги нуклеозидов и др.
Примеры других противораковых агентов, которые можно комбинировать с композицией, содержащей: (i) по меньшей мере, один противораковый агент с молекулярной массой в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон, (ii) по меньшей мере, одно антитело, распознающее OAcGD2 ганглиозид, его функциональный фрагмент или производное и, факультативно, (iii) фармацевтически приемлемый носитель для применения в способе лечения и/или профилактики рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, вводимых отдельно или в тех же композициях, включают, но не ограничиваются ими:
(a) алкилирующие агенты: мехлорамин, хлорамбуцил, ифосфамид, мелфалан и тому подобное,
(b) антиметаболиты: 6-меркаптопурин (6-МП), капецитабин, цитарабин, флоксуридин, флударабин, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат, пеметрексед и тому подобное,
(c) противоопухолевые антибиотики: актиномицин-D, блеомицин, митомицин-С, митоксантрон и тому подобное,
(d) ингибиторы топоизомераз: этопозид (VP-16), тенипозид и тому подобное,
(e) митотические ингибиторы: паклитаксел, доцетаксел и тому подобное,
(f) ингибиторы тирозинкиназы: иматиниб, гефининиб, сунитиниб и тому подобное,
(g) кортикостероиды: преднизон, метилпреднизон, дексаметазон и тому подобное,
(h) гормоны или гормоноподобные лекарственные средства: фулвестрант, тамоксифен, торемифен, анастрозол, экземестан, летрозол, мегестрол ацетат, эстрогены, бикалутамид, флутамид, нилутамид, лейпролид, госерелин и тому подобное,
(i) цитокин: растворимый малый белок приблизительно 5-20 кДа, который высвобождается одной популяцией клеток (например, примированными Т-лимфоцитами) при контакте со специфическими антигенами и действует как межклеточный медиатор между клетками. Примеры цитокинов включают лимфокины, монокины, интерлейкины и несколько родственных сигнальных молекул, таких как фактор некроза опухоли (TNF, от англ. "tumor necrosis factor") и интерфероны,
(j) нуклеозидные аналоги: кладрибин, флударабин, пентостатин и тому подобное.
В определенных вариантах осуществления изобретения фармацевтическая композиция также содержит второй, третий, четвертый, n-й противораковый агент, включая, но не ограничиваясь этим, нуклеиновые кислоты, такие как молекулы двуцепочечной синтетической короткой РНК (микроРНК) или синтетические ДНК/РНК-подобные олигонуклеотиды (АСО). МикроРНК (миРНК) представляют собой эндогенные одноцепочечные некодирующие РНК в диапазоне от 16 до 25 нуклеотидов, участвующие в посттранскрипционном ослаблении трансляции мРНК. Их дерегуляция часто наблюдается при многих заболеваниях, включая рак. Важность семейства mir-34 и кластера mir-17-92 была установлена как для онкогенеза, так и для метастазирования при нейробластоме, при этом сверхэкспрессия mir-184 снижает рост опухоли нейробластомы (Chu and Lee, 2012, Intech, MicroRNA target signatures in Advanced stage Neuroblastoma, Neuroblastoma - Present and future, Prof. Hiroyuki Shimada, IBSN 978-953-307-016-2, гл. 13, с 271-286). Таким образом, посредством разработки различных типов малых одноцепочечных или двуцепочечных, химически синтезированных и оптимизированных нуклеиновых кислот (из примерно 22 нуклеотидов), таких как имитаторы или агомиры микро-РНК, которые усиливают активность микро-РНК, ингибиторы или антагомиры микро-РНК, которые разрушают отдельные молекулы микро-РНК, возможно контролировать специфическую активность микро-РНК или строго регулировать клеточные уровни микро-РНК в клетках. Такие короткие синтезированные химическим путем нуклеиновые кислоты, нацеленные на микро-РНК, задействованные в раке, экспрессирующем ганглиозид OAcGD2, можно использовать в композициях согласно изобретению.
Второй аспект настоящего изобретения относится к способу повышения эффективности лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, включающему противораковый агент, при этом указанный способ включает введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, содержащей: (i) по меньшей мере один противораковый агент, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон, (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или его производное, и, факультативно (iii) фармацевтически приемлемый носитель.
В определенных вариантах осуществления в композиции, применяемой в способе повышения эффективности лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 кДа до 15 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления изобретения, в композиции, применяемой в способе повышения эффективности лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 80 кДа до 200 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления изобретения, в композиции, применяемой в способе повышения эффективности лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 120 до 800 Дальтон.
Выражение «повышение эффективности лечения» относится к увеличению количества смертей раковых клеток, полученному способом по изобретению, по сравнению с лечением посредством одного противоракового агента.
Эффективность противораковых агентов, имеющих молекулярную массу в диапазоне от 100 Дальтон до 200000 дальтон, может быть значительно улучшена, если при проведении противораковой терапии их вводить в комбинации с по меньшей мере одним антителом, распознающим ганглиозид OAcGD2, его функциональным фрагментом или его производным, обладающим механизмом действия, отличным от механизма противораковых агентов, имеющих молекулярную массу в диапазоне от 100 Дальтон до 200000 Дальтон.
Повышенную эффективность комбинации по изобретению можно продемонстрировать путем определения терапевтического синергизма. Четкое и общепринятое определение «синергизма» заключается в следующем: синергизм представляет больший эффект для лекарств в комбинации, чем простой аддитивный эффект, ожидаемый от знания эффектов каждого лекарства по отдельности. Возможным благоприятным исходом для синергизма может быть повышение эффективности терапевтического эффекта. Предпочтительно рак, экспрессирующий ганглиозид OAcGD2, лечится более эффективно при использовании композиции по изобретению.
1
2
1
2
1,2
1
2
1
1,2
2
1,2
x
1
x
1
2
x
2
a
x
1
x
1
2
x
Эффективность комбинации по меньшей мере одного противоракового агента, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон, и по меньшей мере одного антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, его функционального фрагмента или его производного, можно интерпретировать, исходя из измеренных экспериментальных данных, с использованием методики комбинаторного индекса (CI), разработанной Chou и Talalay (Chou ТС, Pharmacol Rev 58: 621-681, 2006). Вкратце, для комбинации двух лекарственных средств (D) и (D) при комбинаторном соотношении (D):(D)=P:Q, в комбинации, (D)=(D)+(D), получаем (D)=(D) X [P/(P+Q)] и (D)=(D) X [Q/(P+Q)]. Уравнение комбинаторного индекса CI=[(D)/(D)]+[(D)/(D)] указывает на то, что для данного эффекта (F) для ингибирования системы х %, Dx, комбинированный аддитивный эффект для суммы дробных доз каждого лекарственного средства, (D)/(D) и (D)/(D) 2, должен быть равен единице. CI=1, это указывает на аддитивный эффект, CI меньше 1, это указывает на синергетический эффект, и CI больше 1, это указывает на антагонистический эффект.
Эффективность комбинаций в отношении солидных опухолей также можно определить экспериментально, например, сравнивая размер опухоли до и после лечения. Предпочтительно комбинации по меньшей мере одного противоракового агента, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон, и по меньшей мере одного антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, его функционального фрагмента или производного, как описано в настоящем документе, эффективны, когда размер опухоли уменьшается по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90%, 100% и более предпочтительно, по меньшей мере на 50-70%.
Эффективность комбинаций в отношении солидных опухолей также можно определить, например, отслеживая количество раковых клеток, инфильтрацию раковых клеток в периферических органах или метастазирование опухолей.
Эффективность терапии рака также можно измерить, оценивая продолжительность выживания пациента, страдающего раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, продолжительность выживания без прогрессирования (PFS, от англ. "progression free survival"), скорость отклика (RR, от англ. "response rate"), продолжительность отклика и/или качество жизни.
В предпочтительных вариантах осуществления, указанный по меньшей мере один противораковый агент, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 100 Дальтон до 200000 Дальтон композиции по изобретению тождественен противораковому агенту, первоначально выбранному для лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, в качестве единственного агента.
Другим возможным благоприятным исходом для синергизма может быть уменьшение дозировки по меньшей мере одного противоракового агента, но увеличение или сохранение той же эффективности с целью избежать токсичности.
Третий аспект настоящего изобретения относится к способу повышения чувствительности к противораковому агенту у пациента, страдающего раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества композиции, содержащей: i) по меньшей мере один противораковый агент с молекулярной массой в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон, (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или его производное, и, факультативно, (iii) фармацевтически приемлемый носитель.
В определенных вариантах осуществления в композиции, используемой в способе повышения чувствительности к противораковому агенту у пациента, страдающего раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 кДа до 15 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления, в композиции, применяемой в способе повышения чувствительности к противораковому агенту у пациента, страдающего раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 80 кДа до 200 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления, в композиции, применяемой в способе повышения чувствительности к противораковому агенту у пациента, страдающего раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от от 120 до 800 Дальтон
В дополнение к предложенному усовершенствованному лечению рака, введение определенных комбинаций, описанных в данном документе, может улучшить качество жизни пациента по сравнению с качеством жизни, которое испытывает тот же пациент, получающий другое лечение. Например, введение комбинации по меньшей мере одного антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, его функционального фрагмента или его производного, и противоракового агента, как описано в настоящем документе, нуждающемуся в этом пациенту может обеспечить улучшенное качество жизни по сравнению с качеством жизни, которое испытал бы тот же пациент, если бы он получал только противораковый агент в качестве терапии. Например, комбинированная терапия с комбинацией, описанной в данном документе, может снизить необходимую дозу противоракового агента, тем самым уменьшая побочные эффекты, связанные с терапией (например, тошноту, рвоту, выпадение волос, сыпь, снижение аппетита и т.д.). Данная комбинация также может вызвать уменьшение опухолевой нагрузки и связанных с ней побочных эффектов, таких как боль, дисфункция органов, потеря веса и т.д.
Еще одним возможным благоприятным исходом для синергизма может быть сведение к минимуму или замедление развития устойчивости к лекарственному средству и ее значимого последствия- рецидива рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2.
Четвертый аспект настоящего изобретения относится к способу профилактики или отсрочки развития рака, устойчивого к противораковому агенту, у пациента, страдающего раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, включающему введение пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, содержащей: (i) по меньшей мере один противораковый агент, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон, (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или его производное и, факультативно, (iii) фармацевтически приемлемый носитель.
В определенных вариантах осуществления в композиции, применяемой в способе профилактики или отсрочки развития рака, устойчивого к противораковому агенту, у пациента, страдающего от рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу от 10 кДа до 15 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления, в композиции, применяемой в способе профилактики или отсрочки развития рака, устойчивого к противораковому агенту, у пациента, страдающего от раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 80 кДа до 200 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления, в композиции, применяемой в способе профилактики или отсрочки развития рака, устойчивого к противораковому агенту, у пациента, страдающего раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 120 до 800 Дальтон.
Нет ничего необычного в том, что после первичного лечения (т.е. терапии рака «первой линии») рака одним противораковым агентом, пациент выживает без каких-либо признаков или симптомов этого рака в течение непродолжительного периода времени до возвращения рака или его признаков и симптомов. Целью использования комбинации по меньшей мере одного противоракового агента, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон, (ii) по меньшей мере одного антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, его функционального фрагмента или его производного является предотвращение клональной селекции, ведущей к росту резистентных клеток.
В предпочтительном варианте осуществления изобретения, указанный по меньшей мере один противораковый агент, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 100 Дальтон до 200000 Дальтон композиции по изобретению, отличается от такового у источника резистентности рака.
Механизмы терапевтической резистентности включают повышенное распознавание и восстановление ДНК, поврежденной противораковым агентом, измененный контроль контрольной точки клеточного цикла, нарушенное функционирование путей апоптоза и сниженное накопление лекарственных средств в результате повышенной экспрессии АТФ-связывающих кассетных (ABC- от англ. АТР-binding cassette) транспортеров, которые выводят из клетки противораковые агенты. Появились доказательства того, что раковые стволовые клетки (CSC) представляют собой субпопуляцию клеток в раковых образованиях, которая характеризуется повышенной устойчивостью к химио- и радиотерапии, что указывает на то, что традиционные подходы лечению рака зачастую не могут привести к уничтожению субпопуляции клеток, которая инициирует и способствует сохранению онкогенеза. В настоящее время раковые клетки, отличные от CSC, могут развить повышенную устойчивость к химио- и радиотерапии, возможно, с использованием аналогичного пути. Устранить химиорезистентность возможно посредством специфической блокады АВС-транспортеров с множественной лекарственной резистентностью, как показано в меланоме человека.
Неожиданным образом, авторы настоящего изобретения определили новый способ устранения химиорезистентности, особенно в популяциях CSC, без необходимости затрагивать транспортеры с множественной лекарственной устойчивостью или переносчиков, участвующих в захвате противораковых агентов.
Данный четвертый аспект настоящего изобретения также относится к способу лечения рефрактерного или рецидивирующего рака у пациента, страдающего раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, включающему введение нуждающемуся в этом пациенту эффективного количества композиции, содержащей: (Г) по меньшей мере один противораковый агент, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон, (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или его производное, при этом указанный рак не поддается первичному лечению или рецидивирует после первичного лечения рака, включающего один или более противораковых агентов, выбранных из группы, состоящей из алкилирующих агентов, антиметаболитов, противоопухолевых антибиотиков, ингибиторов топоизомераз, митотических ингибиторов, ингибиторов тирозинкиназы и аналогов нуклеозидов.
Данный четвертый аспект настоящего изобретения также относится к композиции, содержащей: (i) по меньшей мере, один противораковый агент, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон, (ii) по меньшей мере, одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное, для применения в лечении рефрактерного или рецидивирующего рака у пациента, страдающего раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, где указанный рак не поддается первичному лечению или рецидивирует после первичного лечения рака, включающего один или более противораковых агентов, выбранных из группы, состоящей из алкилирующих агентов, антиметаболитов, противоопухолевых антибиотиков, ингибиторов топоизомераз, митотических ингибиторов, ингибиторов тирозинкиназы и аналогов нуклеозидов.
В определенных вариантах осуществления изобретения, в композиции, применяемой в способе лечения рефрактерного или рецидивирующего рака у пациента, страдающего раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 кДа до 15 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления изобретения, в композиции, применяемой в способе лечения рефрактерного или рецидивирующего рака у пациента, страдающего раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 80 кДа до 200 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления изобретения, в композиции, применяемой в способе лечения рефрактерного или рецидивирующего рака у пациента, страдающего раком, экспрессирующим ганглиозид OAcGD2, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 120 до 800 Дальтон.
Также в определенных вариантах осуществления изобретения рефрактерный или рецидивирующий рак представляет собой нейробластому.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления, если композицию применяют в способе лечения рефрактерной или рецидивирующей нейробластомы, указанный по меньшей мере один противораковый агент представляет собой темозоломид, топотекан, иринотекан, циклофосфамид, фударабин, цисплатин, доксорубицин, изотретиноин, этопозид или их смесь.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления изобретения, рефрактерный или рецидивирующий рак представляет собой глиобластому.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления, когда композицию применяют в способе лечения рефрактерной или рецидивирующей глиобластомы, указанный по меньшей мере один противораковый агент представляет собой темозоломид, топотекан, иринотекан, циклофосфамид, флударабин, цисплатин, карбоплатин или их смесь.
В предпочтительных вариантах осуществления, указанный по меньшей мере один противораковый агент, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон композиции, применяемой в способе лечения рефрактерного или рецидивирующего рака, является таким же, что и агент, используемый в первичном лечении.
Другим возможным благоприятным исходом для синергизма может быть обеспечение синергетической комбинации, основанной на балансе между синергизмом и токсичностью клеток.
Пятый аспект настоящего изобретения относится к способу in vitro/ex vivo идентификации синергетической комбинации по меньшей мере одного противоракового агента, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон, и (ii) по меньшей мере одного антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, его функционального фрагмента или его производного, включающий следующие стадии:
a) инкубирование клеток первичной опухоли или клеточных линий раковых клеток, экспрессирующих О-ацетилированную форму ганглиозида GD2 in vitro, с композицией, содержащей по меньшей мере (i) один противораковый агент, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 100 Дальтон до 200000 Дальтон, и (ii) по меньшей мере, одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное, и
b) измерение индекса CI50 в соответствии со способом, описанным Chou и Talalay, где CI50 ниже 1 указывает на синергизм.
Клетки первичной опухоли представляют собой, например, эксплантированные опухолевые клетки человека. Любые производные этих клеток могут образовывать, например, клеточные линии рака.
В определенных вариантах осуществления, в синергетической комбинации, идентифицируемой способом in vitro / ex vivo по изобретению, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 кДа до 15 кДа.
Также в определенных вариантах осуществления в синергетической комбинации, идентифицируемой способом in vitro / ex vivo по изобретению, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 80 кДа до 200 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления в синергетической комбинации, идентифицируемой способом in vitro / ex vivo по изобретению, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 120 до 800 Дальтон.
Шестой аспект настоящего изобретения относится к набору для in vitro скрининга синергетической комбинации по меньшей мере одного противоракового агента, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 100 Дальтон до 200000 дальтон, и (ii) по меньшей мере, одного антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, его функционального фрагмента или производного.
В определенных вариантах осуществления в наборе для in vitro скрининга синергетической комбинаций по изобретению указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 кДа до 15 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления, в наборе для in vitro скрининга синергетической комбинации по изобретению, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 80 кДа до 200 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления, в наборе для in vitro скрининга синергетической комбинации по изобретению, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 120 до 800 Дальтон.
Седьмой аспект настоящего изобретения относится к набору, пригодному для лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2. Во всех вариантах осуществления изобретения указанный набор включает (i) по меньшей мере один противораковый агент, имеющий молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон, и (ii) по меньшей мере одно антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное, и факультативно (iii) фармацевтически приемлемый носитель.
В определенных вариантах осуществления в наборе, подходящем для лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2 по изобретению, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 10 кДа до 15 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления, в наборе, подходящем для лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2 по изобретению, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 80 кДа до 200 кДа.
Кроме того, в определенных вариантах осуществления, в наборе, подходящем для лечения рака, экспрессирующего ганглиозид OAcGD2 по изобретению, указанный по меньшей мере один противораковый агент имеет молекулярную массу в диапазоне от 120 до 800 Дальтон.
Устройство, способное доставлять компоненты набора по определенному выбранному пути введения, также может быть включено.
Компоненты набора могут быть упакованы вместе или разделены на два или более контейнеров. В конкретных вариантах осуществления контейнеры могут представлять собой флаконы, которые содержат стерильные лиофилизированные составы композиции, подходящие для разведения. Набор также может содержать один или более буферов, подходящих для разведения и/или разбавления других реагентов. Другие контейнеры, которые могут быть использованы, включают, но не ограничиваются ими, саше, лоток, бокс, тубу или тому подобное. Компоненты набора могут быть упакованы и храниться стерильно в контейнерах. Другим компонентом, который может быть включен, являются инструкции для человека, использующего комплект для применения.
Антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или его производное, полезно в противоопухолевой терапии в качестве адъюванта.
Восьмой аспект настоящего изобретения относится к применению антитела, распознающего ганглиозид OAcGD2, его функционального фрагмента или его производного, для усиления внутриклеточного захвата противоракового агента, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 100 до 200000 Дальтон, в клетку, экспрессирующую О-ацетилированную форму ганглиозида GD2.
В определенных вариантах осуществления антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или его производное применяют для усиления внутриклеточного захвата противоракового агента, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 10 кДа до 15 кДа.
Также в пределенных вариантах осуществления антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или производное, используют для усиления внутриклеточного захвата противоракового агента, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 80 кДа до 200 кДа.
Кроме того, в некоторых вариантах осуществления, антитело, распознающее ганглиозид OAcGD2, его функциональный фрагмент или его производное, применяют для усиления внутриклеточного захвата противоракового агента, имеющего молекулярную массу в диапазоне от 120 до 800 Дальтон.
Следующие примеры приведены для того, чтобы продемонстрировать и дополнительно проиллюстрировать некоторые предпочтительные варианты осуществления и аспекты настоящего изобретения и не должны рассматриваться как ограничивающие его объем.
ПРИМЕРЫ
1. Обработка клеток нейробластомы и глиобластомы моноклональными антителами mAb 8В6 к OAcGD2 индуцирует порообразование в клеточной мембране.
4
Чашки для культивирования (6 лунок) покрывали 500000 клеток IMR5, LAN-1 или DUASOII на лунку за 24 часа до инкубации с mAb 8В6 к OAcGD2 (мышиное, IgG3) или мышиным IgG3 изотипически сходного отрицательного контроля (CTRL-). Затем в каждую лунку в течение 30 минут добавляли 40 мкг/мл антител. Супернатант замедлял вращение, и клетки отделяли от их носителя, используя механическую прочность (без трипсина), и осаждение. После промывания фосфатно-солевым буфером (PBS) клетки фиксировали 2% глутаральдегидом в 0,1 моль/л натрий-фосфатного буфера, рН 7,4, в течение 1 часа при 4°С. Фиксацию продолжали 1% OsO в течение 15 минут. Дегидратация происходила в ваннах с этиловым спиртом с использованием 25%, 50%, 75% и 100% этилового спирта в течение 15 минут для каждой ванны. Наконец, клетки были закреплены на металлической ножке и проанализированы с помощью сканирующей электронной микроскопии.
2
2
2
Как показано на фигуре 1, порообразование в мембране клеток IMR5 (панель В), LAN-1 (панель D) и DUASOII (панель F) проявляется после 30 минут обработки mAb 8В6. Размер и диаметр клеток и пор определяли для трех типов клеток. Как показано на фигуре 2-А, диаметр поры, индуцированной mAb 8В6 в IMR5, составляет около 1,914 мкм, а ее площадь составляет около 2,877 мкм. В данном случае пора покрывает по меньшей мере 4% всей поверхности клетки. Результаты, полученные для LAN-1 и DUASOII, довольно схожи. Как показано на фигурах 2-В и 2-С, диаметр поры, индуцированной mAb 8В6 в LAN-1, составляет около 1,760 мкм, а ее площадь составляет около 2,433 мкм. В данном случае пора покрывает по меньшей мере 0,7% всей поверхности клетки. Как показано на фигурах 2-D и 2-Е, диаметр поры, индуцированной mAb 8В6 в DUASOII, составляет около 1,459 мкм, а ее площадь составляет около 1,672 мкм. В данном случае поры покрывают по меньшей мере 2,8% всей поверхности клетки.
Кроме того, авторы изобретения установили, что меньшая концентрация антител индуцирует повышенное проникновение йодида пропидия.
2. Лечение изотретиноином, топотеканом или доксорубицином не влияет на экспрессию OAcGD2 на клеточных линиях нейроблатомы.
Ранее сообщалось об экспрессии OAcGD2 в клеточных линиях нейробластомы (Alvarez-Rued a et al., PLos One 2011 6: e25220). Предыдущие исследования показали, что экспрессия GD2 - предшественника OAcGD2 - в клетках нейробластомы может изменяться при воздействии ретиноевой кислоты (Rebhan et al., Neuroreport. 1994 Apr 14; 5 (8): 941-4 и Hettmer et al., Br J. Cancer. 2004 Jul 19; 91 (2): 389-397). В связи с этим авторы настоящего изобретения проверили, влияет ли воздействие противоракового агента на уровень связывания mAb 8В6. С этой целью исследуемые клеточные линии нейробластомы мыши и человека обрабатывали каждым агентом по отдельности в течение 48 часов до исследования экспрессии OAcGD2 с помощью проточной цитометрии. Концентрации лекарственных средств, используемых в данных экспериментах, указаны в таблице 1.
5
Анализ экспрессии OAcGD2 на клеточной поверхности у клеточных линий нейробластомы оценивали непрямой иммунофлуоресценцией, измеренной с помощью проточной цитометрии. Инкубировали 5×10 клеток в 96-луночных микропланшетах либо с mAb 8В6 (Cerato et al., Hybridoma 1997, 16: 307-316), либо с mAb 7H2 (мышиное моноклональное антитело к О-ацетил-GD3 использовали в качестве антитела отрицательного контроля) по 10 мкг/мл в течение 60 минут при 4°С в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA) в фосфатно-солевом буфере (PBS). Связывание антител анализировали после реакции с козьим F(ab')2-фрагментом к IgG (VH+VL) мыши, конъюгированным с флуоресцинизотиоцианатом, в качестве второго антитела (Jackson, Immunoresearch, Soham, UK) в течение 60 мин при 4°С. Флуоресценцию клеток анализировали с использованием проточного цитометра FACSCalibur™ (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) и программного обеспечения Cell Quest™ Pro (BD Biosciences). Относительные интенсивности флуоресценции 10000 клеток регистрировали в виде однопараметрических гистограмм (логарифмическая шкала, 1024 канала и 4 порядка), и для каждой гистограммы рассчитывали среднюю интенсивность флуоресценции (MFI, от англ. "mean fluorescence intensity"). Результаты выражали в виде коэффициента MFI, рассчитанного путем деления значения MFI для проточной цитометрии клеток, окрашенных антиген-специфическим mAb, на значение MFI для тех же клеток, окрашенных mAb 7Н2 отрицательного контроля. Этот подход позволяет сравнивать несколько тестовых образцов в группе и между различными группами.
Как показано в таблице 2, уровень связывания mAb 8В6 на клетках NXS2 оставался неизменным после 48 часов инкубации с изотретиноином, топотеканом или доксорубицином по сравнению с необработанными клетками.
Также наблюдалось небольшое изменение или его отсутствие при анализе уровня связывания mAb 8В6 на клетках IMR5, LAN-1 и LAN-5 через 48 часов после инкубации с лекарственным средством (Таблица 2).
3. mAb 8В6 к OAcGD2 демонстрирует синергетический эффект с химиотерапевтическими препаратами в клеточных линиях нейробластомы
Чтобы проверить, может ли mAb 8В6 к OAcGD2 усиливать действие химиотерапии, далее было охарактеризовано влияние mAb 8В6 в комбинации с изотретиноином, топотеканом и доксорубицином на жизнеспособность клеток опухоли в четырех различных клеточных линиях нейробластомы.
Антипролиферативную активность противораковых агентов оценивали с использованием набора для МТТ-анализа пролиферации клеток (Roche Diagnostic, Индианаполис, США). МТТ-анализ основан на восстановлении желтого тетразолиевого МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолийбромид) метаболически активными клетками, образующими фиолетовые кристаллы формазана. Фиолетовый формазан растворяют детергентом и определяют его количество с помощью спектрофотометрии при 570 нм.
3
4
Клетки в лог-фазе роста высевали в 96-луночные обработанные планшеты (5×10 для клеток LAN-1 и NXS2; 1×10 для клеток IMR5 и LAN-5) в 100 мкл полной среды. Клеткам давали возможность закрепиться при инкубации в течение ночи перед обработкой тестируемыми агентами. Тестируемые агенты серийно разбавляли в полной культуральной среде и добавляли в каждую лунку в объеме 50/65 мкл для общего конечного объема 165 мкл/лунка. Эквивалентный объем культуральной среды добавляли в контрольные лунки. Были применены три условия: только противораковый агент, только mAb 8В6, mAb 8В6 + противораковый агент. Клетки подвергали воздействию тестируемых агентов в течение 48 часов. После этого в каждую лунку добавляли 15 мкл реагента МТТ. Планшеты на четыре часа возвращали в инкубатор. После инкубационного периода во все лунки добавляли детергент, поставляемый в наборе (100 мкл). Планшеты были завернуты в полиэтиленовую пленку для предотвращения испарения и оставлены на ночь при комнатной температуре в темноте. Оптическую плотность при 570 нм измеряли на следующий день с использованием планшет-ридера iMark ™ Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad). Анализы проводили в четырех параллельных испытаниях, а эксперименты повторяли три раза.
50
Значения оптической плотности были преобразованы в процент контроля и нанесены на график в зависимости от концентраций тестируемых агентов для расчетов полумаксимальной эффективной концентрации (ЕС50) с использованием программного обеспечения CompuSyn (ComboSyn, Paramus, NJ, USA). CompuSyn - это компьютерное программное обеспечение для ПК, разработанное Chou и Martin (2005, CompuSyn для комбинаций лекарственных средств: программное обеспечение для ПК и руководство пользователя: компьютерная программа для количественного определения синергизма и антагонизма в комбинациях лекарственных средств, а также для определения значений IC50, ED50 и LD50. ComboSyn, Paramus, NJ.), которое можно использовать для анализа влияния дозы для отдельных лекарств с использованием уравнения медианного эффекта и для комбинаций нескольких лекарств с использованием как уравнения медианного эффекта, так и уравнения комбинаторного индекса. Уравнение медианного эффекта, используемое программным обеспечением CompuSyn, получено из принципа закона действующих масс в равновесном стационарном состоянии. Термин «полумаксимальная эффективная концентрация (ЕС)» относится к концентрации лекарственного средства, антитела, которое индуцирует ответ на полпути между исходным уровнем и максимумом спустя определенное время воздействия. Значения процента контроля рассчитывали путем деления значений оптической плотности для каждой тестовой лунки на среднее значение контроля без лекарств и умножения на 100.
Данные комбинирования проанализировали с использованием программного обеспечения CompuSyn для расчета значений комбинаторного индекса для оценки синергизма. Затронутая фракция (Fa - от англ. "Fraction Affected"), рассчитывалась исходя из процента контроля по формуле: 1-процент контроля /100), где 1 соответствует 100%-ному эффекту, а 0 - отсутствие эффекта. Дозировка, затронутая фракция и молярное соотношение тестируемых соединений в комбинации вводились в программу CompuSyn для оценки наличия/отсутствия синергизма. CompuSyn присваивает значение комбинаторного индекса, которое оценивает уровень ингибирования соединений 50% от пролиферации клеток. Значения CI ниже 1 указывают на наличие синергизма, а значения CI выше 1 указывают на антагонизм. Значения CI50, равные 1, указывают на аддитивный аффект. См. Chou, PHARMACOL. REV., 58(3):621-81(2006).
Клетки NXS2 выращивали в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла, от англ. Dulbecco modified Eagle's medium) 4,5 г/л глюкозы с 10% инактивированной нагреванием фетальной сывороткой теленка, 2 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С в 5% CO2. Клетки IMR5, LAN-1 и LAN-5 выращивали в среде RPMI 1640 (Roswell Park Memorial Institute medium,) с 10% инактивированной нагреванием фетальной сывороткой теленка, 2 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37°С в 5% CO2.
Мы обнаружили аналогичные наблюдения, когда тестировали клеточные линии нейробластомы NXS2, IMR5, LAN-1 и LAN-5. Рассчитанные значения ЕС 50 каждого тестируемого химиотерапевтического препарата были значительно ниже для комбинаций двух агентов (то есть противоракового агента и mAb 8В6) (р меньше 0,05, таблица 3).
Наконец, были вычислены медианные значения комбинаторного индекса для характеристики эффекта всех протестированных комбинаций. Было обнаружено, что медианные значения комбинаторного индекса были значительно меньше 1,0 (р меньше 0,05) во всех протестированных комбинациях, что указывает на синергетическое взаимодействие (см. Таблицу 4). Комбинация изотретиноина и mAb 8В6 дала значения комбинаторного индекса в диапазоне от 0,33 до 0,81 (NXS2=0,74, IMR 5=0,81, LAN-1=0,47, LAN-5=0,33) (таблица 4). Топотекан продемонстрировал более сильный синергизм со значениями комбинаторного индекса в диапазоне от 0,28 до 0,60 (NXS2=0,60, IMR 5=0,50, LAN-1=0,58, LAN-5=0,28) (таблица 4). Комбинация с доксорубицином дала наиболее сильную синергию среди протестированных клеточных линий нейробластомы со значениями комбинаторного индекса, равными или меньшими, чем 0,30 (NXS2=0,30, IMR 5=0,10, LAN-1=0,05, LAN-5=0,16) (таблица 4). Эти данные свидетельствуют о более сильной противонейробластомной эффективности химиотерапии при применении с mAb 8В6 kOAcGD2.
Комбинации mAb 8В6 к OAcGD2 с другими противораковыми агентами также подвергали анализу на клеточной линии нейробластомы LAN-1. В данном эксперименте включение фторурацила (5-FU), цисплатина и доксорубицина в клетки в присутствии mAb 8В6 или CTRL-(IgG) детектировали с использованием проточной цитометрии (возбуждение лазером с длиной волны 535 нм). Противораковые агенты и mAb инкубировали в течение 30 минут при 37°С. Положительный контроль (сапонин 0,05%) показывает максимальное включение химиотерапии в клетках LAN-1.
Как показано на фиг. 3, больше клеток были позитивными в отношении 5-FU (панель А), цисплатина (панель В) в концентрации 1,52 мкм и доксорубицина (панель С) в концентрации 4,7 мкм при инкубации с mAb 8В6, чем те же клетки, инкубированные только с противораковым агентом и CTRL-(IgG). Более того, больше клеток были позитивными в отношении доксорубицина (панель D) при 4,7 мкм при инкубации с mAb c8B6.14b и mAb c8B6.15b, чем те же клетки, инкубированные только с противораковым агентом и CTRL-(IgG).
Все эти результаты ясно иллюстрируют, что mAb 8В6 к OAcGD2 способствует проникновению противораковых агентов в опухолевые клетки.
4. mAb 8В6 к OAcGD2 демонстрирует синергетический эффект с темозоломидом (TMZ) в первичных клетках глиобластомы.
Чтобы проверить, может ли mAb 8В6 к OAcGD2 усиливать действие химиотерапии, было охарактеризовано влияние mAb 8В6 в комбинации с темозоломидом на жизнеспособность клеток опухоли в шести различных первичных клеточных культурах глиобластомы.
Были собраны образцы опухоли у пациентов с гистологическим диагнозом ГБМ. Опухоли собирали во время хирургической резекции и сразу же помещали в культуру после диссоциации опухолей, используя Dissociator gentleMACs (Miltenyi) в соответствии с инструкциями производителя. Сбор и анализ всех образцов проводили в соответствии с протоколом, одобренным Институциональным ревизионным советом по вопросам этики, и все пациенты или их опекуны давали письменное информированное согласие (Comite de Protection des Personnes Ouest IV, протокол № DC-2012-1555). Клетки содержали в атмосфере 5% CO2 и 95% влажности в определенной среде (DMEM/Ham F12, содержащей 2 мМ L-глутамина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, добавку В27, добавку N2, 2 мкг/мл гепарина, 40 нг/мл бета-FGF и 40 нг/мл EGF) для образования нейросфер.
4
Клетки в лог-фазе роста высевали в 96-луночные обработанные планшеты (1×10 для клеток глиобластомы АМВМа, DUGAn, DUASOII, GLIO 5, GUITh, и HARCI) в 100 мкл полной среды. Клеткам давали возможность закрепиться при инкубации в течение ночи перед обработкой тестируемыми агентами. Тестируемые агенты серийно разбавляли в полной культуральной среде и добавляли в каждую лунку в объеме 50/65 мкл для общего конечного объема 165 мкл/лунка. Эквивалентный объем культуральной среды добавляли в контрольные лунки. Были применены три условия: только темозоломид, только mAb 8В6, mAb 8В6 + темозоломид. Клетки подвергали воздействию тестируемых агентов в течение 72 часов. Затем в каждую лунку добавляли 15 мкл реагента МТТ. Планшеты на четыре часа возвращали в инкубатор. После инкубационного периода во все лунки добавляли детергент, поставляемый в наборе (100 мкл). Планшеты были завернуты в полиэтиленовую пленку для предотвращения испарения и оставлены на ночь при комнатной температуре в темноте. Оптическую плотность при 570 нм измеряли на следующий день с использованием планшет-ридера iMark ™ Microplate Absorbance Reader (Bio-Rad). Анализы проводили в четырех параллельных испытаниях, а эксперименты повторяли три раза.
Жизнеспособность клеток измеряли, используя МТТ-анализ, а полумаксимальную эффективную концентрацию (ЕС50) рассчитывали в соответствии с вышеописанным. Результаты представлены в таблице 5 ниже. При тестировании первичных клеток глиобластомы АМВМа, DUGAn, DUASOII, GLIO 5, GUITh и HARCI были выявлены аналогичные наблюдения. Вычисленные значения ЕС50 каждого тестируемого химиотерапевтического лекарственного средства были ниже для комбинаций двух агентов (то есть, темозоломида и mAb 8В6).
Наконец, были вычислены медианные значения комбинаторного индекса для характеристики эффекта испытуемой комбинации TMZ и mAb 8В6 к OAcGD2. Было обнаружено, что медианные значения комбинаторного индекса были значительно меньше 1,0 (р меньше 0,05) во всех протестированных комбинациях, что указывает на синергетическое взаимодействие (см. Таблицу 6). Комбинация TMZ и mAb 8В6 дала значения комбинаторного индекса в диапазоне от 0,27 до 0,66 (GUITh=0,66; DUGAn=0,58; АМВМа=0,27 и HARCI=0,30; GLIO 5=0,41 и DUASOII=0,65) (таблица 6). Эти данные свидетельствуют о более сильной противоглиобластомной эффективности TMZ при применении с mAb 8В6 к OAcGD2.
5. mAb 8В6 к OAcGD2 демонстрирует синергетический эффект с химиотерапевтическими лекарственными средствами в других видах рака.
Для того чтобы проверить, может ли mAb 8В6 к OAcGD2 усиливать химиотерапию не только при нейробластоме и глиобластоме, клеточные линии, демонстрирующие меланому (клетки М21), рак молочной железы (клетки MDA-MB-231, которые сверхэкспрессируют ганглиозид OAcGD2), мелкоклеточный рак легкого (клетки Н524), глиобластома (клетки DUGAn) и саркому Юинга (клетки ТС71) инкубировали со специфической комбинацией доксорубицина (0,26 мкм, за исключением клеток MDA-MB-231, где концентрация доксорубицина составляла 0,18 мкм, и клеток DUGAn, где концентрация доксорубицина составляла 1 мм) и mAb 8В6 или CTRL-(IgG) в течение 30 минут. Проточную цитометрию использовали для оценки количества доксорубицин-позитивных клеток, как описано ранее в части 3 примера.
Как показано на фиг. 4, mAb 8В6 к OAcGD2 значительно увеличивает процент доксорубицин-позитивных клеток во всех типах рака. В частности, шестикратное увеличение количества доксорубицин-позитивных клеток наблюдается для клеточной линии меланомы М21 (панель А), более чем двукратное увеличение доксорубицин-позитивных клеток наблюдается для клеточной линии саркомы Юинга ТС71 (панель D), почти двукратное увеличение доксорубицин-позитивных клеток наблюдаются для клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231 (панель В), увеличение в 1,5 раза по доксорубицин-позитивным клеткам для линии клеток мелкоклеточного рака легкого Н524 (панель С), увеличение в 1,16 раза по доксорубицин-позитивным клеткам для клеток глиобластомы DUGAn (панель Е).
Взятые в совокупности, данные результаты продемонстрировали, что mAb 8В6 к OAcGD2 способствует проникновению противоракового агента в нескольких типах рака, особенно в тех, где имеются клетки, экспрессирующие О-ацетилированный ганглиозид GD2.
6. mAb 8В6 к OAcGD2 усиливает противоопухолевую активность химиотерапевтических лекарственных средств в мышиной модели метастаз в печени нейробластомы.
6.1 - Мышиная модель опухоли
5
Противонейробластомную эффективность mАb8В6 к OAcGD2 и химиотерапевтическое лечение определяли на экспериментальной модели метастаз в печени мышиной нейробластомы NXS2, у мышей A/J, ранее описанной Lode et al. (J. Natl Cancer Inst 1997, 89:1586-1594). Данное исследование проводили в строгом соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве по содержанию и использованию лабораторных животных Министерства сельского хозяйства Франции. Протокол был одобрен Комитетом по этике проведения опытов с животными региона Долина Луары. Мышей содержали в виварии UTE-UN (Нант, Франция). Самки и самцы мышей A/J (в возрасте 6-8 недель) были получены от Harlan Laboratories (Ганна, Франция). Инокулировали 2,5×10 клеток опухоли через хвостовую вену в PBS. Мышей распределяли на девять групп, по 10 мышей в каждой: 1) группа, которую лечили инертным веществом; 2) группа, которую лечили контрольным антителом; 3) группа, которую лечили mAb 8В6 к OAcGD2; 4) группа, которую лечили изотретиноином; 5) группа, которую лечили топотеканом; 6) группа, которую лечили доксорубицином; 7) группа, которую лечили изотретиноином + mAb 8В6, 8) группа, которую лечили топотеканом + mAb 8В6; и 9) группа, которую лечили доксорубицином + mAb 8В6. Лечение mAb 8В6 к OAcGD2 было начато на третьи сутки после введения клеток опухоли. Мыши получали по 25 мкг mAb 8В6 дважды в неделю посредством внутривенных инъекций в течение трех недель подряд (сутки 3, 7, 10, 14, 17 и 21; общая доза = 150 мкг). Изотретиноин вводили перорально, разведенный в Ora-Plus ©, по 10 мг/кг ежедневно в течение 2 недель подряд (на сутки 10-14 и 17-21). Топотекан, разведенный в PBS, вводили посредством внутрибрюшинных инъекций по 0,36 мг/кг ежедневно в течение одной недели (на сутки 10-14). Доксорубицин вводили посредством внутрибрюшинных инъекций по 1 мг/кг ежедневно в течение двух недель (на сутки 10-14 и 17-21). Мышей умерщвляли через 28 дней после инокуляции, и противоопухолевую эффективность оценивали по массе печени в свежем образце, а также по количеству метастазов в печени.
6.2 - Результаты
Чтобы расширить данные наблюдения, полученные in vitro, в дальнейшем была проведена оценка потенциальных терапевтических эффектов комбинации mAb 8В6 и химиотерапии in vivo. Были проведены исследования in vivo с использованием экспериментальной модели метастаз в печени нейробластомы мыши NXS2, как описано Alvarez-Rued a et al. (ALVAREZ-RUE DA и др. PLoS One 2011, том 6 (9), с: e25220). Противораковые агенты вводили в низких дозах, чтобы, как ранее сообщалось в литературе, минимизировать сопутствующие побочные эффекты. Через трое суток после внутривенной инокуляции клеток опухоли NSX2 десяти мышам назначали лечение одним агентом или комбинацией mAb 8В6 и противораковых агентов, как описано ранее. На 28 сутки после инокуляции клеток опухоли определяли количество метастазов в печени и массу печени после эвтаназии мышей. Доза mAb 8В6 (кумулятивная доза = 150 мкг), которая была использована в данном исследовании, дала значительное снижение метастазов в печени NXS2, о чем свидетельствует масса печени в сравнении с мышами, которых лечили инертным веществом. Средняя масса печени в группе, получавшей mAb 8В6, составила 1,5±0,15 г по сравнению с 2,5±0,18 г в группе, получавшей инертное вещество (р меньше 0,05, фиг. 5). Была продемонстрирована специфичность терапии mAb 8В6 к OAcGD2, поскольку лечение эквивалентным количеством неспецифического антитела было полностью неэффективным (средняя масса печени = 2,5±0,18 г, р больше 0,05 в сравнении с мышами, получавшими инертное вещество, данные не показаны). Антитело 8В6 взаимодействовало с изотретиноином (10 мг/кг перорально, пять раз в неделю в течение 2 недель), что приводило к значительной сенсибилизации изотретиноина к ингибированию роста метастазирования NXS2 (р меньше 0,05, фиг. 5, панель А). Средняя масса печени в группе, получавшей лечение изотретиноином + mAb 8В6, составила 1,0±0,06 г и 2,0±0,24 г для группы, получавшей лечение изотретиноином. Комбинация ингибитора топоизомеразы I топотекана (0,36 мг/кг, внутрибрюшинно, пять раз в неделю в течение 1 недели) плюс mAb 8В6 также значительно снижала массу печени (0,9±0,03 г) по сравнению с топотеканом (1,22±0,09 г) или mAb 8В6 по отдельности (р меньше 0,05, фиг. 5, панель В). Комбинация с антрациклиновым антибиотиком доксорубицин (1 мг/кг, внутрибрюшинно, пять раз в неделю в течение 2 недель) привела к значительному снижению веса печени (1,33±0,12 г) по сравнению с лечением любым доксорубицином (1,75±0,09 г), или только mAb 8В6 (р меньше 0,05, фиг. 5, панель С). Комбинация mAb 8В6 с изотретиноином или топотеканом привела к наибольшей терапевтической эффективности из трех протестированных схем комбинированного лечения (рис. 5).
Снижение массы тела используется в качестве чувствительного маркера для мониторинга состояния здоровья. Поэтому на период лечения был проведен параллельный анализ массы тела. Потери массы тела не наблюдалось (рис. 6), что указывает на отсутствие токсичности, связанной с лечением, у мышей, получавших лечение mAb 8В6, изотретиноином, изотретиноином + mAb 8В6, топотеканом или топотеканом + mAb 8В6. У мышей, получавших доксорубицин или доксорубицин плюс mAb 8В6, наблюдалась потеря массы тела спустя 17 суток в сравнении с мышами, получавшими только mAb 8В6. Однако разница в массе тела между двумя группами, получавшими доксорубицин, в сравнении с группой, не получавшей доксорубицин, не была значительной в течение периода лечения (р больше 0,05). Данные наблюдения позволяют предположить, что комбинация с противораковым агентом плюс mAb 8В6 обладает более высокой противоопухолевой эффективностью in vivo, чем один из этих препаратов, без обнаруживаемой токсичности.
7. 8В6 mAb к OAcGD2 восстанавливает противораковый эффект химиотерапевтических препаратов в модели рефрактерной глиобластомы
7.1 - Материалы и способы.
1.7.1.1 - Фармакологический агент.
mAb 8В6 к OAcGD2 и антитело изотипического контроля (CTRL) получали, как описано ранее. Темозоломид (TMZ) приобрели у Interchim (Монлюсон, Франция). TMZ разводили диметилсульфоксидом (DMSO) и аликвоты хранили при -20°С. DMSO в конечном процентном отношении, эквивалентном проценту раствора TMZ, служил в качестве контроля инертного вещества для всех исследований.
7.1.2 - Клеточная культура.
Полученные от пациентов клетки глиобластомы GBM-10 содержали в виде нейросфер в среде DMEM/Ham F12, содержащей 1% пенициллин и стрептомицин, обогащеный L-глутамином, добавки В27, N2 и гепарин (2 мкг/мл), при этом дополнительные факторы роста бета-FGF (40 нг/мл) и EGF (40 нг/мл) добавляли непосредственно перед применением. Культуральные реагенты были получены у Gibco Life Technologies (Уолтем, MA). Все типы клеток хранились при раннем пассаже и регулярно проверялись на микоплазму методом ПЦР.
7.1.3 - экспрессия О-ацетил-GD2 в клетках GBM-10
Анализ экспрессии OAcGD2 в клетках GBM проводили методом непрямой иммунофлюоресценции, измеренной проточной цитометрией. Клетки промывали холодным PBS, фиксировали 4% PFA (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) в течение 10 минут при 4°С и затем инкубировали с mAb 8В6 (10 мкг/мл) в течение 45 минут. Связывание антитела 8В6 детектировали путем инкубации с меченым флуоресцинизотиоцианатом козьим F(ab')2-фрагментом к IgG мыши, (Jackson Immunoresearch, Soham, UK) в течение 60 мин при 4°С. Отдельные эксперименты проводили с контрольным IgG. Флуоресценцию клеток анализировали с использованием проточного цитометра FACSCanto (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) и программного обеспечения FlowJo (Flowjo LLC, Орегон, Орегон, США). Результаты были выражены в соотношениях MFI.
7.1.4. Анализ методом лимитирующего разведения.
3
Для анализа лимитирующего разведения опухоли GBM диссоциировали, а выделенные клетки высевали при начальной концентрации 10 клеток/мл, откуда проводили серийные разведения в 96-луночном планшете. Клетки культивировали в течение 15 дней, после чего рассчитывали фракцию лунок, которые не содержали нейросфер для каждой плотности посева клеток, и данные анализировали с помощью программного обеспечения ELDA (ELDA, Линц, Австрия) для количественного определения частоты стволовых клеток глиобластомы (GSC) в образце и влияние различного лечения.
7.1.4 - Мышиная модель ксенотрансплантата глиобластомы.
6
Мышей NSG (NOD.Cg-Prkdcscid II2rgtm1Wjl/SzJ), приобретенных у Charles River Laboratories, (г.Уилмингтон, MA), разводили в помещении для животных Университета Нанта (UTE, SFR F. Вопаплу) в статусе SPF и использовали на 6-12 неделях, в соответствии с принятыми правилами (Соглашение №00186.02; Региональный комитет по этике, долина Луары, Франция). Клетки GBM-10 (1×10 в 100 мкл Matrigel, Corning, Corning, NY, США) вводили подкожно в 0 сутки. TMZ вводили внутрибрюшинной инъекцией в однократной дозе 0,05 мг/мышь на 12, 22 и 32 сутки.
7.2 - Результаты
Клетки GBM-10, не поддающейся лечению TMZ (TMZR GBM-10) выделяли из клеток рецидивирующей GBM-10 после химиотерапии TMZ (фиг. 7, панель А). Уровень экспрессии О-ацетил-GD2 определяли проточной цитометрией, как описано в разделе «Материалы и методы». Результаты показывают, что экспрессия О-ацетил GD2 сохраняется после химиотерапии TMZ по сравнению с клеткой GBM-10, выделенной из мышей, не получавших лечение (рис. 7, панель В).
Затем уровень рефрактерности TMZ определяли путем анализа методом лимитирующего разведения и выражали в виде частоты стволовых клеток глиобластомы в ксенотрансплантате опухоли. Результаты показывают, что частота стволовых клеток увеличилась после химиотерапии TMZ (Рис. 7 Панели С и D). Действительно, у мышей, не получавших лечение, воздействие TMZ или mAb 8В6 снижало выживаемость стволовых клеток (фиг. 7, панель С). Что еще более важно, эффект, индуцированный комбинацией двух агентов (TMZ + 8В6), был значительно выше, чем два агента, используемых в качестве монотерапии, соответственно.
Эффект химиотерапии TMZ был гораздо менее эффективным в подавлении выживаемости стволовых клеток у клеток GBM-10, выделенных из ксенотрансплантатов рецидивирующей GBM-10 (фиг. 7, панель D). Как ни удивительно, комбинация из двух агентов (TMZ + 8В6) смогла снизить выживаемость GSC.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  OGD2 PHARMA
Université de Nantes
Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)
Institut national de la santé et de la recherche médicale
(INSERM)
Institut de Cancérologie de l'Ouest (ICO)
<120>  ПРИМЕНЕНИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ O-АЦЕТИЛИРОВАННОГО ГАНГЛИОЗИДА
GD2 ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ПОТЕНЦИАЛА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ
<130>  ATL-B-0006-PCT1
<150>  EP16002576.3
<151>  2016-12-05
<160>  50
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  113
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 Consensus sequence for third humanized VL sequence
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  X=D or E
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (9)..(9)
<223>  X=L or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (10)..(10)
<223>  X=S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  X=P or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (13)..(13)
<223>  X=V or L or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (14)..(14)
<223>  X=S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (15)..(15)
<223>  X=L or P or V
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (17)..(17)
<223>  X=D or Q or E
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (18)..(18)
<223>  X=Q or P or R
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (19)..(19)
<223>  X=A or V
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (20)..(20)
<223>  X=S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (21)..(21)
<223>  X=I or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (22)..(22)
<223>  X=S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (25)..(25)
<223>  X=S or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (29)..(29)
<223>  X=L or V
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (30)..(30)
<223>  X=L or V
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (32)..(32)
<223>  X=N or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (33)..(33)
<223>  X=N or Q
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (34)..(34)
<223>  X=G or A or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (35)..(35)
<223>  X=N or Y or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (36)..(36)
<223>  X=T or N or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (37)..(37)
<223>  X=F or Y
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (39)..(39)
<223>  X= H or N or S or A or D or Y or G
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (41)..(41)
<223>  X=Y or F
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (42)..(42)
<223>  X=L or Q
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (44)..(44)
<223>  X=K or R
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (47)..(47)
<223>  X=Q or K
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (48)..(48)
<223>  X=S or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (50)..(50)
<223>  X=K or Q or R
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (51)..(51)
<223>  X=L or R
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (55)..(55)
<223>  X=K or G or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (56)..(56)
<223>  X=V or A or G
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (58)..(58)
<223>  X=N or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (60)..(60)
<223>  X=L or D or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (61)..(61)
<223>  X=S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (63)..(63)
<223>  X=V or I
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (65)..(65)
<223>  X=D or A or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (75)..(75)
<223>  X=Y or D
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (79)..(79)
<223>  X=K or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (82)..(82)
<223>  X=R or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (83)..(83)
<223>  X=V or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (84)..(84)
<223>  X=E or Q
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (85)..(85)
<223>  X=A or P
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (88)..(88)
<223>  X=L or V or F
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (89)..(89)
<223>  X=G or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (90)..(90)
<223>  X=V or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (92)..(92)
<223>  X=Y or F
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (94)..(94)
<223>  X=S or M or Q
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (96)..(96)
<223>  X=S or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (97)..(97)
<223>  X=T or Y  or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (98)..(98)
<223>  X=H or Q  or N
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (99)..(99)
<223>  X=I or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (100)..(100)
<223>  X= P or S
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (101)..(101)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (105)..(105)
<223>  X=G or Q
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (106)..(106)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400>  1
Xaa Val Val Met Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Arg Xaa Ser Gln Ser Xaa Xaa Lys Xaa
20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Trp Xaa Xaa Gln Xaa Pro Gly Xaa Xaa
35                  40                  45
Pro Xaa Xaa Leu Ile Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Arg Xaa Xaa Gly Xaa Pro
50                  55                  60
Xaa Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Phe Thr Leu Xaa Ile
65                  70                  75                  80
Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Cys Xaa Gln Ser
85                  90                  95
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Val Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210>  2
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 Consensus sequence for third humanized VH sequence
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  X=E or Q
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (5)..(5)
<223>  X=V or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (13)..(13)
<223>  X=Q or K
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (16)..(16)
<223>  X= G or R
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (23)..(23)
<223>  X= A or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (24)..(24)
<223>  X= T or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (26)..(26)
<223>  X= E or G
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (30)..(30)
<223>  X= T or S or G
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (32)..(32)
<223>  X= Y or H
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (35)..(35)
<223>  X= T or D or S or H or N
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (48)..(48)
<223>  X= L or V
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (49)..(49)
<223>  X= G or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (50)..(50)
<223>  X= F or Y
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (51)..(51)
<223>  X= I or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (54)..(54)
<223>  X= R or K or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (55)..(55)
<223>  X= A or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (57)..(57)
<223>  X= G or A or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (58)..(58)
<223>  X= Y or S or G
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (59)..(59)
<223>  X= T or I
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (60)..(60)
<223>  X= T or I
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (61)..(61)
<223>  X= E or Y
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (63)..(63)
<223>  X= N or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (64)..(64)
<223>  X= P or A or D
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (76)..(76)
<223>  X= N or G
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (77)..(77)
<223>  X= S or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (79)..(79)
<223>  X= S or N
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (80)..(80)
<223>  X= I or S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (81)..(81)
<223>  X= L or T or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (89)..(89)
<223>  X= R or K or Q
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (90)..(90)
<223>  X= T or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (95)..(95)
<223>  X= V or I or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (99)..(99)
<223>  X= T or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (114)..(114)
<223>  X= T or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (115)..(115)
<223>  X= L or V
<400>  2
Xaa Val Gln Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Xaa Pro Gly Xaa
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Xaa Xaa Ser Xaa Phe Thr Phe Xaa Asp Xaa
20                  25                  30
Tyr Met Xaa Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa
35                  40                  45
Xaa Xaa Xaa Arg Asn Xaa Xaa Asn Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Xaa Xaa Lys Xaa Xaa
65                  70                  75                  80
Xaa Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Xaa Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Xaa Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Xaa Xaa Thr Val Ser Ser
115
<210>  3
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 Consensus sequence for second humanized VL sequence
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  X=D or E
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (9)..(9)
<223>  X=L or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (10)..(10)
<223>  X=S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  X=P or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (13)..(13)
<223>  X=V or L or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (14)..(14)
<223>  X=S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (15)..(15)
<223>  X=L or P or V
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (17)..(17)
<223>  X=D or Q or E
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (18)..(18)
<223>  X=Q or P or R
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (19)..(19)
<223>  X=A or V
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (20)..(20)
<223>  X=S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (21)..(21)
<223>  X=I or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (22)..(22)
<223>  X=S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (25)..(25)
<223>  X=S or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (29)..(29)
<223>  X=L or V
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (30)..(30)
<223>  X=L or V
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (32)..(32)
<223>  X=N or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (33)..(33)
<223>  X=N or Q or D
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (34)..(34)
<223>  X=G or A or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (35)..(35)
<223>  X=N or Y or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (36)..(36)
<223>  X=N or T or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (37)..(37)
<223>  X=F or Y
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (39)..(39)
<223>  X= H or N or S or A or D or Y or G
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (41)..(41)
<223>  X=Y or F
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (42)..(42)
<223>  X=L or Q
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (44)..(44)
<223>  X=K or R
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (47)..(47)
<223>  X=Q or K
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (48)..(48)
<223>  X=S or A or V
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (50)..(50)
<223>  X=K or Q or R
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (51)..(51)
<223>  X=L or R or V
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (55)..(55)
<223>  X=K or G or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (56)..(56)
<223>  X= V or A or G
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (58)..(58)
<223>  X= N or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (60)..(60)
<223>  X= L or D or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (61)..(61)
<223>  X=S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (63)..(63)
<223>  X=V or I
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (65)..(65)
<223>  X=D or A or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (75)..(75)
<223>  X=Y or D
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (79)..(79)
<223>  X=K or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (81)..(81)
<223>  X=S or N
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (82)..(82)
<223>  X=R or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (83)..(83)
<223>  X=V or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (84)..(84)
<223>  X=E or Q
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (85)..(85)
<223>  X=A or P
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (88)..(88)
<223>  X=L or V or F
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (89)..(89)
<223>  X=G or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (90)..(90)
<223>  X=V or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (92)..(92)
<223>  X=Y or F
<220>
<221>  misc_feature
<222>  (94)..(94)
<223>  Xaa can be any naturally occurring amino acid
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (96)..(96)
<223>  X=S or G or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (97)..(97)
<223>  X=T or Y or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (98)..(98)
<223>  X=H or Q or N
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (98)..(98)
<223>  X=H or Q or N
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (99)..(99)
<223>  X= I or W or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (100)..(100)
<223>  X= P or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (105)..(105)
<223>  X=G or Q
<400>  3
Xaa Val Val Met Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Arg Xaa Ser Gln Ser Xaa Xaa Lys Xaa
20                  25                  30
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Xaa Trp Xaa Xaa Gln Xaa Pro Gly Xaa Xaa
35                  40                  45
Pro Xaa Xaa Leu Ile Tyr Xaa Xaa Ser Xaa Arg Xaa Xaa Gly Xaa Pro
50                  55                  60
Xaa Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Phe Thr Leu Xaa Ile
65                  70                  75                  80
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Cys Xaa Gln Xaa
85                  90                  95
Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  4
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VL15
<400>  4
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Lys Asn
20                  25                  30
Gln Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  5
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VL16
<400>  5
Glu Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Lys Asn
20                  25                  30
Gln Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala
35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Thr Gly Ile Pro
50                  55                  60
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  6
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VL17
<400>  6
Glu Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Lys Asn
20                  25                  30
Gln Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Thr Gly Ile Pro
50                  55                  60
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  7
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VL18
<400>  7
Glu Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Lys Asn
20                  25                  30
Gln Ala Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala
35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Thr Gly Ile Pro
50                  55                  60
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  8
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 Consensus sequence for second humanized VH sequence
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  X=E or Q
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (5)..(5)
<223>  X=V or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (13)..(13)
<223>  X=Q or K
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (16)..(16)
<223>  X= G or R
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (23)..(23)
<223>  X= A or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (24)..(24)
<223>  X= T or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (48)..(48)
<223>  X= L or V
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (49)..(49)
<223>  X= G or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (57)..(57)
<223>  X= G or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (63)..(63)
<223>  X= N or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (64)..(64)
<223>  X= P or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (77)..(77)
<223>  X= S or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (79)..(79)
<223>  X= S or N
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (80)..(80)
<223>  X= I or S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (81)..(81)
<223>  X= L or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (89)..(89)
<223>  X= R or K or Q
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (90)..(90)
<223>  X= T or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (95)..(95)
<223>  X= V or I
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (114)..(114)
<223>  X= T or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (115)..(115)
<223>  X= L or V
<400>  8
Xaa Val Gln Leu Xaa Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Xaa Pro Gly Xaa
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Xaa Xaa Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Xaa
35                  40                  45
Xaa Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Xaa Tyr Thr Thr Glu Tyr Xaa Xaa
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa Lys Xaa Xaa
65                  70                  75                  80
Xaa Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Xaa Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Xaa Xaa Thr Val Ser Ser
115
<210>  9
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VH19
<400>  9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  10
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VH20
<400>  10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  11
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VH21
<400>  11
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  12
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 Consensus sequence for first humanized VL sequence
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  X = D or E
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (3)..(3)
<223>  X = V or Q
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (9)..(9)
<223>  X = L or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (10)..(10)
<223>  X = S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (12)..(12)
<223>  X = P or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (13)..(13)
<223>  X = V or L or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (14)..(14)
<223>  X = S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (15)..(15)
<223>  X = L or P or V
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (17)..(17)
<223>  X = D or Q or E
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (18)..(18)
<223>  X =Q or P or R
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (19)..(19)
<223>  X = A or V
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (20)..(20)
<223>  X = S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (21)..(21)
<223>  X = I or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (22)..(22)
<223>  X = S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (42)..(42)
<223>  X = L or Q
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (44)..(44)
<223>  X = K or R
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (47)..(47)
<223>  X = Q or K
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (48)..(48)
<223>  X = S or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (50)..(50)
<223>  X = K or Q or R
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (61)..(61)
<223>  X = S or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (63)..(63)
<223>  X = V or I
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (65)..(65)
<223>  X =D or A or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (75)..(75)
<223>  X =Y or D
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (79)..(79)
<223>  X =K or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (82)..(82)
<223>  X = R or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (83)..(83)
<223>  X = V or L
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (84)..(84)
<223>  X = E or Q
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (85)..(85)
<223>  X = A or P
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (88)..(88)
<223>  X = L or V or F
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (89)..(89)
<223>  X = G or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (90)..(90)
<223>  X = V or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (92)..(92)
<223>  X = Y or F
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (105)..(105)
<223>  X = G or Q
<400>  12
Xaa Val Xaa Met Thr Gln Ser Pro Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly
1               5                   10                  15
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Asn
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Xaa Gln Xaa Pro Gly Xaa Xaa
35                  40                  45
Pro Xaa Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Xaa Gly Xaa Pro
50                  55                  60
Xaa Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Xaa Phe Thr Leu Xaa Ile
65                  70                  75                  80
Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Asp Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Xaa Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  13
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 Consensus sequence for first humanized VH sequence
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (1)..(1)
<223>  X = E or Q
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (13)..(13)
<223>  X = Q or K
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (16)..(16)
<223>  X = G or R
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (23)..(23)
<223>  X = A or T
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (77)..(77)
<223>  X = S or A
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (79)..(79)
<223>  X = S or N
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (80)..(80)
<223>  X = I or S
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (89)..(89)
<223>  X = R or K
<220>
<221>  MISC_FEATURE
<222>  (90)..(90)
<223>  X = T or A
<400>  13
Xaa Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Xaa Pro Gly Xaa
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Xaa Thr Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Xaa Lys Xaa Xaa
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  14
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  14
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Asn
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  15
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Mus musculus
<400>  15
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Leu Pro Gly Asp
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Arg Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210>  16
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDR1_VH
<400>  16
Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Thr
1               5                   10
<210>  17
<211>  19
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDR2_VH
<400>  17
Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro Ser
1               5                   10                  15
Val Lys Gly
<210>  18
<211>  10
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDR3_VH
<400>  18
Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  19
<211>  16
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDR1_VL
<400>  19
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Asn Asn Gly Asn Thr Phe Leu His
1               5                   10                  15
<210>  20
<211>  7
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDR2_VL
<400>  20
Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu
1               5
<210>  21
<211>  9
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CDR3_VL
<400>  21
Ser Gln Ser Thr His Ile Pro Tyr Thr
1               5
<210>  22
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  scFv linker
<400>  22
Gly Ser Gly Gly Ser
1               5
<210>  23
<211>  4
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  scFv linker
<400>  23
Gly Gly Gly Ser
1
<210>  24
<211>  5
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  scFv linker
<400>  24
Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>  25
<211>  15
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  ((G4S)3 linker
<400>  25
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5                   10                  15
<210>  26
<211>  18
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  CD19 linker
<400>  26
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1               5                   10                  15
Lys Gly
<210>  27
<211>  18
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  18mer
<400>  27
Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly
<210>  28
<211>  20
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  (G4S)4 linker
<400>  28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1               5                   10                  15
Gly Gly Gly Ser
20
<210>  29
<211>  18
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  linker
<400>  29
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1               5                   10                  15
Leu Asp
<210>  30
<211>  14
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  linker
<400>  30
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1               5                   10
<210>  31
<211>  12
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  linker
<400>  31
Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly Ser Gly Glu Phe
1               5                   10
<210>  32
<211>  8
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  linker
<400>  32
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>  33
<211>  6
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  linker
<400>  33
Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>  34
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VL1
<400>  34
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Asn
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  35
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VL2
<400>  35
Glu Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Asn
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Thr Gly Ile Pro
50                  55                  60
Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  36
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VL3
<400>  36
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Asn
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  37
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VL4
<400>  37
Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Asn
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35                  40                  45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65                  70                  75                  80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  38
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VL28BH
<400>  38
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Asn
20                  25                  30
Asn Ala Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  39
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VL30BH
<400>  39
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Lys Asn
20                  25                  30
Gln Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  40
<211>  112
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VL28Bs01/A2
<400>  40
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Lys Ser
20                  25                  30
Asn Ala Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
85                  90                  95
Thr His Ile Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210>  41
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VH1
<400>  41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  42
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VH2
<400>  42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  43
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  201 VH3-11*01A
<400>  43
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  44
<211>  118
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VH 72BCDR
<400>  44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  45
<211>  118
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 72BH
<400>  45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Glu Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  46
<211>  118
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VH49BCDR
<400>  46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Arg Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  47
<211>  118
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VH49BH
<400>  47
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Glu Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Asn Pro
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85                  90                  95
Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  48
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VH72max
<400>  48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  49
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VH49B
<400>  49
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  50
<211>  119
<212>  PRT
<213>  Artificial Sequence
<220>
<223>  OGD201 VH49Bmax
<400>  50
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35                  40                  45
Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala
50                  55                  60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Ile
65                  70                  75                  80
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85                  90                  95
Tyr Cys Thr Arg Val Ser Asn Trp Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<---