СРЕДСТВО ДЛЯ ЗАЩИТЫ ОТ БОЛЕЗНЕЙ И СТИМУЛЯЦИИ РОСТА ТОМАТОВ И ОГУРЦОВ В УСЛОВИЯХ ЗАЩИЩЕННОГО ГРУНТА
REMEDY FOR PROTECTING AGAINST DISEASES AND STIMULATING THE GROWTH OF TOMATOES AND CUCUMBERS IN PROTECTED GROUND CONDITIONS

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и представляет собой использование новой культуры микроорганизмов для защиты томатов и огурцов от заболеваний, вызываемых фитопатогенными микроорганизмами, а также для повышения урожайности растений в условиях защищенного грунта.
Bacillus polymixa
Bacillus thuringiensis
Pantoea agglomerans
Pseudomonas chlororatis
Известен консорциум из штаммов бактерий-антагонистов ВКПМ В-7539, ВКПМ В-7540, ВКПМ В-7541, ВКПМВ-7542, который может использоваться для получения препарата, эффективно подавляющего развитие серой гнили и мучнистой росы у томата и огурца, угловатой пятнистости у огурца, фузариозного увядания у томата на всех стадиях роста в условиях открытого и закрытого грунтов (патент РФ №2149552 С1).
Bacillus amyloliquefaciens
Известны штаммы бактерий  Аб8б и Аб60, способствующие подавлению бактериальных и грибных болезней растений огурца (угловатая пятнистость листьев, сосудистый бактериоз, мучнистая роса, пероноспороз, белая гниль) (патент РФ №2673155 С1).
Serratia ficaria
Известен штамм  TP, обладающий выраженными фитостимулирующими и фунгицидными свойствами по отношению к фитопатогенным грибам, использование которого подавляет развитие альтернариоза и позволяет ускорить рост и повысить урожайность томатов (патент РФ №2545398 С1).
Trichoderma longibrachiatum
Известны штаммы гриба вида  (RCAM 03324, RCAM 03323, RCAM 03325) и биопрепарат на их основе для увеличения всхожести семян, стимулирования роста растений томатов и огурцов и их защиты от фитопатогенных грибов (патент РФ №2607785 С2).
Cylindrocarpon radicicola
Mycelia sterilia
Известны штаммы грибов (патент РФ №2237087 С1) и ЛХ-1 (патент РФ №2238970 С1), обладающие рострегуляторными свойствами. Внекорневая подкормка томатов и полив всходов огурцов жидкими препаратами на основе данных штаммов повышает урожайность овощных культур, а также улучшает качество готовой продукции (повышение содержания каротина в томатах, повышение содержания сухих веществ в огурцах).
Sphingobacterium multivorum
Известен штамм  ВКПМ В-10385, используемый для получения бактериального удобрения под томаты и огурцы, применение которого позволяет повысить урожайность овощных культур, существенно снизив при этом содержание нитратного азота в плодах огурцов и томатов (патент РФ №2458119 С1).
Bacillus megaterium
Наиболее близким аналогом к заявляемому изобретению является штамм споровых бактерий  501 GR, обладающий ростостимулирующим эффектом и защищающий растения от корневых грибных болезней. Полифункциональное средство на основе данного штамма обладает высоким защитным действием против фузариозного увядания томатов и может быть использовано для борьбы с ним (патент РФ №2558291 С2).
К недостаткам использования всех вышеперечисленных штаммов микроорганизмов и препаратов на их основе следует отнести отсутствие комплексного эффекта от их применения, который бы выражался одновременно в защите от болезней, повышении урожайности и улучшении пищевой ценности томатов и огурцов.
Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение устойчивости к болезням и стимуляция роста томатов и огурцов в защищенном грунте. Технический результат - увеличение урожайности томатов и огурцов, выращенных в защищенном грунте, а также повышение содержания витамина С и снижение количества нитратов в плодах данных овощных культур.
Pseudomonas chlororaphis
aurantiaca
Технический результат достигается применением в качестве средства для повышения устойчивости к болезням и стимуляции роста томатов и огурцов в защищенном грунте штамма бактерий subsp.  IB 51. Указанный штамм был депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под регистрационным номером ВКМ B-3455 D.
Штамм выделен из образца пахотных земель Мелеузовского района Республики Башкортостан и характеризуется следующими признаками.
1. Культурально-морфологические признаки.
Клетки имеют вид коротких, подвижных палочек, по Граму окрашиваются отрицательно, спор не образуют. Морфологию колоний на питательных средах определяли после 4-5 суток роста при 28°С.
На мясо-пептонном агаре (МПА) - колонии круглые с ровными краями, гладкие, слабо-выпуклые, непрозрачные, ярко-оранжевые в центре, с более светлой окантовкой, слизистой консистенции, 5-6 мм в диаметре, пигмент ярко-оранжевый, диффундирующий в среду. На МПА с 2% глицерина колонии крупнее, интенсивнее окрашены, более интенсивная диффузия в среду пигмента.
Пигментация на диагностических средах Кинга для флуоресцирующих псевдомонад: Кинг А - пигмент отсутствует; Кинг B - образуется желто-зеленый флуоресцирующий пигмент.
2. Физиолого-биохимические признаки.
По отношению к кислороду - аэроб, окислительный тип метаболизма. Не нуждается в факторах роста. Разжижает желатин. Пептонизирует и свертывает молоко. Образует леван из сахарозы, не гидролизует крахмал. Продуцирует каталазу, образует аргининдигидролазу. Гидролизует лецитин, Твин-80. Растет при 4°С и на МПБ с 3 % NaCl. Усваивает с образованием кислоты глюкозу, ксилозу, сахарозу, арабинозу, рафинозу, фруктозу.
В качестве источника углерода использует мальтозу, бутанол, гексанол, маннит, глицерин, бензойную кислоту, пропионовую кислоту, антраниловую кислоту, янтарную кислоту, α-кетоглутаровую кислоту, пируват, лактат, цитрат, фенилаланин, серин, лейцин, аргинин, аланин, валин, триптофан, орнитин, пролин, лизин, тирозин. Не усваивает лактозу, этанол, пропанол, сорбит, ацетамид, малеиновую кислоту, треонин, метионин, цистеин, гексан, декан, октадекан, формальдегид, фенол.
Pseudomonas chlororaphis
aurantiaca
Pseudomonas chlororaphis
aurantiaca
Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК с известными таковыми из GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) позволяет с высокой долей вероятности идентифицировать штамм как subsp. IB 51. Уровень сходства с типовым штаммом  subsp.  NCIB 10068 составляет 99,86 %.
Штамм хранится на косяках со средой МПА в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца, а также в лиофильно высушенном состоянии.
Предлагаемое изобретение поясняется следующими примерами.
Pseudomonas chlororaphis
aurantiaca
Pseudomonas chlororaphis
aurantiaca
Пример 1. Штамм бактерий subsp.  IB 51 выращивали в течение 48 ч в ферментере при коэффициенте заполнения 0,7 на питательной среде, имеющей состав, г/л: глицерин - 20,0; пептон ферментативный - 5,0; дрожжевой автолизат - 5,0; калий фосфорнокислый двузамещенный - 1,5; магний сернокислый семиводный - 1,5; вода водопроводная до 1000 мл. Температура процесса - 28-30°С, число оборотов перемешивающего устройства - 350 об/мин, расход воздуха - 100 л/ч. Через 48 ч число жизнеспособных клеток в культуральной жидкости составляло 3 млрд/мл. Наряду с живыми клетками штамма var.ИБ 51 в культуральной жидкости присутствовали также остаточные компоненты питательной среды и продукты микробного синтеза: антибиотические вещества и фитогормоны.
Pseudomonas chlororaphis
aurantiaca
Для бактеризации семян и опрыскивания растений культуральную жидкость штамма subsp.  IB 51 разводили в водопроводной воде до необходимой концентрации: замачивание семян - 10%-ный раствор жидкой культуры, пролив рассады перед высадкой в грунт - 1%-ный раствор, полив растений под корень - 3%-ный раствор, опрыскивание растений - 10%-ный раствор. Вода, используемая для разведений, была отстоявшейся, комнатной температуры. Рабочий раствор готовили непосредственно перед применением.
Pseudomonas chlororaphis
aurantiaca
Пример 2. Изучение антагонистической активности штамма subsp. IB 51.
Pseudomonas chlororaphis
aurantiaca
Azotobacter vinelandii
Антагонистическую активность штамма subsp. IB 51 оценивали, учитывая зоны отсутствия или подавления роста фитопатогенного гриба вокруг колонии штамма на среде картофельно-глюкозный агар (Четвериков С.П., Логинов О.Н. Новые метаболиты , обладающие антигрибной активностью. Микробиология. 2009, 78(4): 479-483). Результаты приведены в таблице 1 и свидетельствуют о высокой антагонистической активности штамма в отношении микромицетов - возбудителей фузариоза томатов и огурцов.
Pseudomonas chlororaphis
aurantiaca
Пример 3. Изучение ростстимулирующей активности штамма subsp. IB 51.
Pseudomonas chlororaphis
aurantiaca
Определение в культуральной жидкости штамма бактерий subsp. IB 51, полученной по примеру 1, содержания ауксина индолилуксусной кислоты (ИУК) и цитокининов проводили методом иммуноферментного анализа (Кудоярова Г.Р. и др. Влияние ауксинпродуцирующих и фосфатмобилизующих бактерий на подвижность почвенного фосфора, скорость роста растений пшеницы и усвоение ими фосфора. Агрохимия. 2016, 5: 28-34). Концентрация ИУК в культуральной жидкости составила 880 нг/мл, цитокининов - 205 нг/мл.
Pseudomonas chlororaphis
aurantiaca
Pseudomonas chlororaphis
aurantiaca
Пример 4. Антагонистическое действие штамма subsp. IB 51 против бактериоза оценивали на огурце сорта Пионер в вегетационном опыте. Для обработки семян использовали разбавленный раствор культуральной жидкости, полученной по примеру 1. В контрольных опытах обработку семян осуществляли дистиллированной водой. Зараженность бактериозом оценивали по семядолям огурцов в соответствии с методическими указаниями (Методические указания по государственным испытаниям фунгицидов, антибиотиков и протравителей семян сельскохозяйственных культур. Под ред. К.В. Новожилова. М., 1985. 130 c.). Эффективность штамма определяли при сопоставлении распространения и развития бактериоза в опыте и в контроле. Результаты приведены в таблице 2. Эффективность защиты от распространения и развития бактериальной инфекции при инокуляции семян штаммом  subsp.IB 51 составила 50,3 и 56,4% соответственно.
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Пример 5. Эффективность использования штамма  subsp. IB 51 против корневых гнилей и для повышения урожайности оценивали на огурце гибрида Кураж в условиях защищенного грунта. Семена перед посадкой обрабатывали культуральной жидкостью штамма, полученной по примеру 1. Помимо бактеризации проводили двукратное опрыскивание растений в период вегетации. Фазы развития растений в момент опрыскивания: развитие боковых побегов и развитие плодов. В контроле семена растений замачивали в дистиллированной воде.
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Использование жидкой культуры штамма subsp. IB 51 на растениях огурца значительно снижало поражение растений корневыми гнилями ризоктониозно-фузариозно-питиозной этиологии (табл. 3). Эффективность штамма  subsp. IB 51 на 55 и 75 сутки после высадки рассады в грунт составила 72,9 и 60,4% при поражении в контроле 32,5 и 47,5% соответственно. Прибавка урожая, полученная в варианте со штаммом  subsp. IB 51, составила 23,8%.
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Пример 6. Эффективность использования штамма  subsp. IB 51 против корневых гнилей и для повышения продуктивности оценивали на томате сорта Ультраранний в условиях защищенного грунта. Семена перед посадкой обрабатывали культуральной жидкостью, полученной по примеру 1. Помимо бактеризации проводили двукратное опрыскивание растений в период вегетации. Фазы развития растений в момент опрыскивания: цветение 1-й цветочной кисти и цветение 2-й цветочной кисти. В контроле семена растений замачивали в дистиллированной воде.
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Использование жидкой культуры штамма subsp. IB 51 на растениях томата значительно снижало поражение растений корневыми гнилями фузариозно-питиозной этиологии (табл. 4). Эффективность штамма  subsp. IB 51 составила 53,3% при поражении в контроле 56,3%. При использовании штамма улучшились биометрические показатели растений томата: высота растений, количество кистей, количество цветков и количество плодов с диаметром более 5 мм.
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Пример 7. Эффективность использования жидкой культуры штамма  subsp. IB 51 против заболеваний растений томата, вызванных возбудителями фитофтороза и серой гнили, для увеличения количества и качества товарной продукции оценивали в тепличных условиях на гибриде Верлиока Плюс. Схема обработок включала в себя замачивание семян, пролив рассады перед высадкой в грунт, полив растений под корень, опрыскивание растений в начале бутонизации, повторное опрыскивание через 14 суток. В эксперименте использовали разбавленный раствор культуральной жидкости, полученной по примеру 1.
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Фенологические наблюдения в период вегетации показали, что на делянках, где применялся штамм  subsp. IB 51, количество растений, имеющих распустившиеся цветки, составляло 66,7 % против 43,3% в контроле, а число растений со сформировавшимися плодами превышало контрольные значения на 8,3%.
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
2
2
Распространенность серой гнили в контроле достигала 69,2%, количество больных растений в варианте со штаммом  subsp. IB 51 составило 35,0%. Обнаружены лишь единичные случаи повреждения плодов томата фитофторозом. Большее количество пораженных плодов отмечено в контрольном варианте (0,04 кг/м), в варианте с использованием штамма  subsp. IB 51 - 0,02 кг/м(табл. 5).
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
2
2
Данные по урожайности ранней продукции показали, что в варианте со штаммом  subsp. IB 51 превышение урожайности по отношению к контролю составило 0,6 кг/м(31,6%). За весь период сбора штамм  subsp. IB 51 способствовал повышению урожайности товарной продукции на 1,1 кг/м (31,4%). Использование штамма  subsp. IB 51 повышало качество плодов томатов в сравнении с плодами контрольного варианта. В опытном варианте плоды отличались повышенным содержанием витамина С и пониженным содержанием нитратов.
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Пример 8. Оценку эффективности использования штамма  subsp. IB 51 для повышения урожайности томатов проводили в ходе производственных испытаний в условиях защищенного грунта. Растения томата сорта Гамаюн были трехкратно обработаны (опрыскивание) штаммом subsp. IB 51. В эксперименте использовали разбавленный раствор культуральной жидкости, полученной по примеру 1. В результате на опытных участках отмечена стимуляция роста растений и более раннее созревание плодов. После применения штамма  subsp. IB 51 урожайность томатов возросла в 1,2 раза (на 20%) по сравнению с контролем.
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Пример 9. Оценку эффективности использования штамма  subsp. IB 51 для повышения урожайности томатов проводили в ходе производственных испытаний в условиях защищенного грунта на томатах сорта Энерго. Технология использования заключалась в предпосадочной обработке семян и рассады растений, а также обработке растений по вегетации (полив под корень и двукратное опрыскивание). В эксперименте использовали разбавленный раствор культуральной жидкости, полученной по примеру 1. Прибавка урожая по сравнению с контрольным участком за пять недель после начала сбора томатов составила 899,5 кг (15%).
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
2
Пример 10. Оценку эффективности использования штамма  subsp. IB 51 для повышения урожайности проводили в ходе производственных испытаний в условиях защищенного грунта на огурцах сорта Атлет и томатах сортов Белле и Марисса. Технология применения штамма заключалась в предпосадочной обработке семян и рассады растений, а также в двукратном опрыскивании и поливе растений под корень. В эксперименте использовали разбавленный раствор культуральной жидкости, полученной по примеру 1. Прибавка урожая огурцов в опыте по сравнению с контролем за весь период сбора оказалась равной 2,01 кг/м (16,3%). Положительное влияние штамма на урожайность прослеживалось на протяжении всего сезона, однако наиболее существенным оно было в начальный период плодоношения и доходило до 22,7%. В начальный период сбора томатов вес урожая на участках, обработанных штаммом  subsp. IB 51, превышал показатели по контрольным участкам на 11,1% и на 5,9% для сортов Белле и Марисса соответственно.
Pseudomonas chlororaphis
аurantiacа
Таким образом, по совокупности показателей (эффективность против бактериальных и грибных болезней, положительное влияние на урожайность, улучшение качества продукции) штамм  subsp. IB 51 может быть рекомендован для использования на растениях томата и огурца в условиях защищенного грунта.
Таблица 1Антагонистическая активность штамма <i>Pseudomonas chlororaphis </i>subsp. <i>aurantiaca</i> IB 51 в отношении фитопатогенных грибов - возбудителей фузариоза томата и огурца <i>in vitro</i>
Вид фитопатогенного гриба
Диаметр зоны подавления роста тест-гриба вокруг колонии бактерии, мм
Fusarium culmorum ВКМ 844
9
F. gibbosum ВКМ 848
35
F. solani ВКМ 142
9
F. oxysporum ВКМ 137
29
Таблица 2Эффективность штамма <i>Pseudomonas chlororaphis </i>subsp.<i> aurantiaca</i> IB 51 против бактериоза огурца
Вариант
Распростра-нение бактериоза, %
Биологичес-кая эффектив-ность, %
Развитиебактериоза, %
Биологичес-кая эффектив-ность, %
Контроль
92,9
-
75,0
-
Pseudomonas chlororaphis subsp. aurantiaca IB 51
46,2
50,3
32,7
56,4
Таблица 3Эффективность штамма <i>Pseudomonas chlororaphis</i> subsp. <i>аurantiacа </i>IB 51 против корневых гнилей огурцав условиях защищенного грунта
Вариант
Число суток после высадки рассады в грунт
Урожайность
55
75
Поражение, %
Биологическая эффективность, %
Поражение, %
Биологическая эффективность, %
кг/м<sup>2</sup>
% к контролю
Контроль
32,5
-
47,5
-
4,2
100,0 (-)
Pseudomonas chlororaphissubsp. аurantiacа IB 51
8,8
72,9
18,8
60,4
5,2
123,8 (23,8)
Таблица 4Эффективность штамма <i>Pseudomonas chlororaphis</i> subsp. <i>аurantiacа </i>IB 51 против корневых гнилей томатав условиях защищенного грунта
Вариант
Корневые гнили
Биометрические показатели
Поражение, %
Биологичес-кая эффектив-ность, %
Высота растений, см
Кол-во кистей, шт.
Кол-во цветков, шт.
Кол-во плодов с диаметром более 5 мм, шт.
Контроль
56,3
-
123,0
4,0
22,0
1,0
Pseudomonas chlororaphissubsp. аurantiacа IB 51
26,3
53,3
132,0
5,8
36,5
1,7
Таблица 5Влияние обработки штаммом <i>Pseudomonas chlororaphis</i> subsp. <i>аurantiacа </i>IB 51 на урожайность и биохимический состав плодов томатагибрида Верлиока Плюс
Вариант
Товарнаяпродукция, кг/м<sup>2</sup>
Кол-во нестан-дартных плодов, кг/м<sup>2</sup>
Кол-во боль-ных плодов, кг/м<sup>2</sup>
Вита-мин С, мг %
Нитра-ты, мг/кг
За первый месяц
За весь период вегета-ции
Контроль
1,9
3,5
0,3
0,04
13,0
34,1
Pseudomonas chlororaphis subsp. аurantiacа IB 51
2,5
4,6
0,2
0,02
14,8
33,5