СПОСОБ ТВЕРДОФАЗНОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Aspergillus ochraceus ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНАЗЫ - АКТИВАТОРА ПРОТЕИНА С ПЛАЗМЫ КРОВИ
METHOD OF SOLID-PHASE CULTIVATION OF Aspergillus ochraceus TO OBTAIN PROTEINASE - PROTEIN C ACTIVATOR OF BLOOD PLASMA

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения протеолитических ферментов - активаторов протеина С плазмы крови человека.

Активаторы протеина С используются в медицине для диагностики содержания протеина С в плазме крови человека. При недостатке протеина С в крови снижается активность его активированной формы, что обусловливает возникновение тромбоэмболических осложнений с возможным летальным исходом [1]. В связи с этим актуальным является диагностика содержания протеина С в крови [2], которую осуществляют с использованием в диагностических препаратах (Protac фирмы PENTHAPHARM (Швейцария)) специфических протеиназ - активаторов протеина С [3].
Известен способ получения активатора протеина С из яда щитомордника Agkistrodon contortrix contortrix [4]. Недостатками его являются крайняя сложность добывания и ограниченность яда щитомордника как источника активатора протеина С.
Известен способ получения активатора протеина С с использованием глубинного культивирования штаммов микроскопических грибов Aspergillus ochraceus 1, Penicillium claviforme 2, P. granulatum 7, Alternaria sp.10, [5] и штамма Aspergillus ochraceus 513, культуральная жидкость которых обладает антикоагулянтными свойствами [6].
2
4
4
2
-3
Наиболее близким к предлагаемому способу, который следует принять за ближайший аналог, является способ получения активатора протеина С путем культивирования штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D или Aspergillus ochraceus ВКМ F-4105D, или Aspergillus ochraceus BKM F-4106D, или Aspergillus ochraceus BKM F-4107D в течение 2-х суток при 28°С на посевной среде, содержащей сусло, глюкозу и пептон и в течение 2 суток на качалке на ферментационной среде, содержащей (в %): глюкоза - 3,2-3,8, крахмал - 0,1-0,5, гидролизат рыбной муки - 0,5-1,0, пептон - 0,1-0,5, NaCl - 0,1-0,2, KHPO - 0,04-0,06, MgSO·7HO - 0,04-0,06, воду до 100%, начальный рН 6,5 (патент РФ №2468081). Этот способ позволяет получить культуральную жидкость, содержащею протеиназу - активатор протеина С с активностью 79,8-89,9 Е/мл, где единица активности - количество фермента, которое отщепляет 1 мкмоль·10 п-нитроанилина (pNA) от pGlu-Pro-Arg-pNA за 1 мин [7].
Недостатком ближайшего аналога является низкий выход фермента.
Задачей настоящего изобретения является повышение выхода активатора протеина С и разработка стандартных условий для его получения.
Задача решается:
1) с помощью использования штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D - продуцента активатора протеина С;
2) разработкой нового способа получения активаторов протеина С, предусматривающего культивирование в течение 3-7 суток продуцирующего его штамма микроскопического гриба Aspergillus ochraceus BKM F-4104D на ферментационной среде, содержащей глюкозу, крахмал, гидролизат рыбной муки, пептон, хлорид натрия, дигидрофосфат калия и сульфат магния, воду, отличающегося тем, что ферментационная среда содержит твердый сыпучий субстрат или твердый сыпучий носитель, в качестве которых используют пшеничные отруби, силикагель, вермикулит или пенополиуретан.
3) с использованием среды при следующем соотношении компонентов (%):
вермикулит - 14,0-20,0,
глюкоза - 2,5-3,0,
крахмал - 0,4- 0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,5-0,6
пептон - 0,2-0,3,
NaCl - 0,07-0,08
2
4
KHPO - 0,035-0,040,
4
2
MgSO·7HO- 0,035-0,040,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
4) с использованием среды при следующем соотношении компонентов (%):
пенополиуретан - 7,0-15,0,
глюкоза - 3,0-3,3,
крахмал - 0,4-0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,6-0,7,
пептон - 0,25-0,30,
NaCl - 0,09-0,13,
2
4
KHPO - 0,04-0,05,
4
2
MgSO·7HO - 0,04-0,05,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
5) с использованием среды при следующем соотношении компонентов (%):
силикагель - 35,0-45,0,
глюкоза- 1,9-2,3,
крахмал - 0,3-0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,40-0,50,
пептон - 0,20-0,30,
NaCl - 0,08-0,10,
2
4
KHPO - 0,03-0,04,
4
2
MgSO·7HO - 0,03-0,04,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
6) с использованием среды при следующем соотношении компонентов (%):
пшеничные отруби - 22,0,-28,0,
глюкоза - 2,5-2,8,
крахмал - 0,4-0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,5-0,6,
пептон - 0,2-0,3,
NaCl - 0,07-0,08
2
4
KHPO - 0,035-0,040,
4
2
MgSO·7HO - 0,035-0,040,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
По завершению культивирования 0,05 М Трис-HCl буфером (рН 8,2) проводят экстракцию активаторов протеина С из среды на орбитальной качалке. Жидкую фракцию отделяют от биомассы и остатков компонентов среды с помощью фильтрования (центрифугирования).
Выделение внеклеточных ферментов с активаторным к протеину С действием из жидкой фракции проводят известными методами с помощью осаждения белков сульфатом аммония до степени насыщения 80%, растворением в минимальном объеме дистиллированной воды. Сформированные осадки центрифугируют, растворяют в 0,005 М Трис-HCl буфере (рН 8,2) или дистилированной воде, удаляют нерастворимую часть осадков, а для удаления солей аммония раствор диализуют при 4°С против того же буфера или проводят гель-фильтрацию на колонках с сефадексом G-25 [5]. Полученный раствор протеиназы - активатора протеина С хранят в холодильнике при 4°С или лиофилизируют для длительного хранения.
Штамм Aspergillus ochraceus BKM F-4104D выделен А.В. Кураковым, депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов и является активным продуцентом внеклеточных протеиназ - активаторов протеина С [8].
Пример 1.
Посевной материал Aspergillus ochraceus BKM F-4104D получают путем культивирования в пробирках скошенного сусло-агара 4-5° Балинга. К заспоровавшейся культуре 6-8 суточного возраста добавляют стерильный 0,0005% раствор Твин-80 и путем смыва готовят споровую суспензию продуцента. Засев проводят 1 мл суспензии в конические колбы объемом 250 мл с 30,0 г ферментационной среды следующего состава (в%):
вермикулит - 17,0
глюкоза - 2,6,
крахмал - 0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,4,
пептон - 0,2,
NaCl - 0,07,
2
4
KHPO - 0,035,
4
2
MgSO·7HO - 0,035,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Вермикулит (по 5,0 г) и жидкую среду (25,0 мл) стерилизуют раздельно и затем смешивают в колбах.
Твердофазное культивирование проводят в стационарных условиях при 28°С.
По истечении 7 суток культивирования проводят экстракцию ферментов - активаторов протеина С. В колбы добавляют 35 мл 0,05 М Трис-HCl буфера (рН 8,2) и помещают на орбитальную качалку (200 об/мин) на 40-60 мин. Далее проводят отделение жидкой фракции от биомассы с помощью фильтрования (центрифугирования).
-3
В полученном фильтрате (надосадочной жидкости) определяют активаторную к протеину С активность по методике [9] с использованием хромогенного пептидного субстрата pGlu-Pro-Arg-pNA (пироглутамил-пролил-аргинил-пара-нитроанилид) [10, 11]. Активированный протеин С плазмы крови специфично отщепляет п-нитроанилин (pNA) от pGlu-Pro-Arg-pNA. За единицу активности активатора протеина С принимают то количество фермента, которое отщепляет 1 мкмоль·10 п-нитроанилина (pNA) от pGlu-Pro-Arg-pNA за 1 мин в 1 мл при рН 8,2 и 37°С.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 300 Е/мл ферментационной среды (без учета веса вермикулита).
Пример 2.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 1, но используют питательную среду следующего состава (в %):
вермикулит - 20,0.
глюкоза - 2,8,
крахмал - 0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,6,
пептон - 0,3,
NaCl - 0,08
2
4
KHPO - 0,040,
4
2
MgSO·7HO - 0,035-0,040.
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Для этого в конических колбах объемом 250 мл смешивают 4,0 г вермикулита и 16,0 мл жидкой среды.
Активность активатора протеина С при культивировании A. ochraceus BKM F-4104D на данной среде составляет 290 Е/мл ферментационной среды.
Пример 3.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 1, но используют питательную среду следующего состава (в %):
вермикулит - 14,0.
глюкоза - 2,8,
крахмал - 0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,6,
пептон - 0,3,
NaCl - 0,08
2
4
KHPO - 0,040,
4
2
MgSO·7HO - 0,035-0,040,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Для этого в конических колбах объемом 250 мл смешивают 4,0 г вермикулита и 24,0 мл ферментационной среды.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 235 Е/мл ферментационной среды.
Пример 4.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 1, но выращивание проводят в течение 5 суток и используют питательную среду с пенополиуретаном следующего состава (в %):
пенополиуретан -11,0,
глюкоза - 3,2,
крахмал - 0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,6,
пептон - 0,25,
NaCl - 0,11,
2
4
KHPO - 0,04,
4
2
MgSO·7HO - 0,04,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 131,8 Е/мл ферментационной среды.
Пример 5.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 4, но используют питательную среду с пенополиуретаном следующего состава (в %):
пенополиуретан - 15,0,
глюкоза - 3,3,
крахмал - 0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,7,
пептон - 0,30,
NaCl - 0,13,
2
4
KHPO - 0,05,
4
2
MgSO·7HO - 0.05,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 125,5 Е/мл ферментационной среды.
Пример 6.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 4, но используют питательную среду с пенополиуретаном следующего состава (в %):
пенополиуретан - 7,0,
глюкоза - 3,0,
крахмал - 0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,6,
пептон - 0,25,
NaCl - 0,09,
2
4
KHPO - 0,04,
4
2
MgSO·7HO - 0,04,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 126,5 Е/мл ферментационной среды.
Пример 7.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 1, но выращивание ведут 4 суток и используют питательную среду следующего состава (в %):
силикагель - 35,0,
глюкоза - 1.9,
крахмал - 0,3,
гидролизат рыбной муки - 0,40,
пептон - 0,20,
NaCl - 0,08,
2
4
KHPO - 0,03,
4
2
MgSO·7HO - 0,03,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 185,5 Е/мл ферментационной среды.
Пример 8.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 1, но выращивание ведут 4 суток и используют питательную среду следующего состава (в %):
силикагель - 45,0,
глюкоза - 2,3,
крахмал - 0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,50,
пептон - 0,30,
NaCl - 0,10,
2
4
KHPO - 0,04,
4
2
MgSO·7HO - 0,04,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 191,1 Е/мл ферментационной среды.
Пример 9.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 1, но выращивание ведут 6 суток и используют питательную среду следующего состава (в %):
пшеничные отруби - 22,0,
глюкоза - 2,5,
крахмал - 0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,5,
пептон - 0,2,
NaCl - 0,07,
2
4
KHPO - 0,035,
4
2
MgSO·7HO - 0,035,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 100,9 Е/мл ферментационной среды.
Пример 10.
Культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D, получение фильтрата и определение активности активатора протеина С проводят по примеру 1, но выращивание ведут 6 суток и используют питательную среду следующего состава (в %):
пшеничные отруби - 28,0,
глюкоза - 2,8,
крахмал - 0,5,
гидролизат рыбной муки - 0,6,
пептон - 0,3,
NaCl - 0,08
2
4
KHPO - 0,040,
4
2
MgSO·7HO - 0,040,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D составляет 99,1 Е/мл ферментационной среды.
Пример 11.
Твердофазное культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D проводят с вермикулитом в качестве носителя по примеру 1. Активность активатора протеина С определяют ежесуточно со 2-х до 8-х суток (табл.1).
Таблица 1
Носитель
Активаторная к протеину С активность, Е/мл
2 сут
3 сут
4 сут
5 сут
6 сут
7 сут
8 сут
Вермикулит
98,1
104,7
110,4
148,2
180,3
300,0
256,9
коэффициент вариации данных - 4%
Активность активатора протеина С A. ochraceus BKM F-4104D растет от 98,1 Е /мл (2-е сутки) и достигает наибольших значений 148,2-300 Е/мл ферментационной среды на 5-7 сутки, а снижается при более длительном культивировании (256,9 Е /мл на 8 сутки).
Пример 12.
Твердофазное культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D проводят с пенополиуретаном в качестве носителя по примеру 4, но продолжительность выращивания составляет 2, 3, 4, 5 и 6 суток. Активность активатора протеина С достигает наибольших значений в период 3-5 сутки, 111,0-131,8 Е/мл ферментационной среды (табл.2).
Таблица 2
Носитель
Активаторная к протеину С активность, Е/мл
2 сут
3 сут
4 сут
5 сут
6 сут
Пенополиуретан
88,7
111,0
118,4
131,8
94,6
коэффициент вариации данных - 2%
Пример 13.
Твердофазное культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D проводят с силикагелем в качестве носителя по примеру 7, но выращивание ведут в течение 2-х, 3-х, 4-х, 5-ти, 6-ти и 7-ми суток и используют среду следующего состава (в %):
силикагель - 40,0
глюкоза - 2,1,
крахмал - 0,35,
гидролизат рыбной муки - 0,45,
пептон - 0,25,
NaCl - 0,09,
2
4
KHPO - 0,035,
4
2
MgSO·7HO - 0,035,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С достигает наибольших значений в период 3-5 сутки с максимумом 200,0 Е /мл ферментационной среды на 4 сутки (табл.3).
Таблица 3
Носитель
Активаторная к протеину С активность, Е/мл
2 сут
3 сут
4 сут
5 сут
6 сут
7 сут
Силикагель
148,3
152,7
200,0
156,3
146,3
135,4
коэффициент вариации данных - 3%
Пример 14.
Твердофазное культивирование штамма Aspergillus ochraceus BKM F-4104D проводят с пшеничными отрубями по примеру 9, но выращивание ведут в течение 3-х, 4-х, 5-ти, 6-ти и 7-ми суток и используют среду следующего состава (в %):
пшеничные отруби - 25,0,
глюкоза - 2,7,
крахмал - 0,45,
гидролизат рыбной муки - 0,55,
пептон - 0,25,
NaCl - 0,07
2
4
KHPO - 0,035,
4
2
MgSO·7HO - 0,035,
вода остальное.
Начальный рН 6,5.
Активность активатора протеина С достигает наибольших значений в период 4-6 сутки, 98,3-102,0 Е /мл ферментационной среды (табл.4).
Таблица 4
Твердый субстрат
Активаторная к протеину С активность, Е/мл
3 сут
4 сут
5 сут
6 сут
7 сут
Пшеничные отруби
84,4
98,3
116,3
102,0
80,4
коэффициент вариации данных - 2%
Пример 15. Сравнение предлагаемого способа и ближайшего аналога
Сравнение активаторной к протеину С активности в культуральной жидкости штамма A. ochraceus BKM F-4104D при культивировании 7 суток по предлагаемому способу на среде, содержащей (в %):
вермикулит - 17,0
глюкоза - 2,6,
крахмал - 0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,4,
пептон - 0,2,
NaCl - 0,07,
2
4
KHPO - 0,035,
4
2
MgSO·7HO - 0,035,
вода остальное,
начальный рН 6,5;
при культивировании A. ochraceus BKM F-4104D 4 суток на среде, содержащей (в %):
силикагель - 40,0
глюкоза - 2,1,
крахмал - 0,35,
гидролизат рыбной муки - 0,45,
пептон - 0,25,
NaCl - 0,09,
2
4
KHPO - 0,035,
4
2
MgSO·7HO - 0,035,
вода остальное,
начальный рН 6,5;
при культивировании A. ochraceus BKM F-4104D 5 суток на среде, содержащей (в %):
пенополиуретан - 11,0,
глюкоза - 3,2,
крахмал - 0,4,
гидролизат рыбной муки - 0,6,
пептон - 0,25,
NaCl - 0.11,
2
4
KHPO - 0,04,
4
2
MgSO·7HO - 0,04,
вода остальное,
начальный рН 6,5.
при культивировании A. ochraceus BKM F-4104D 4 суток на среде, содержащей (в %):
пшеничные отруби - 25,0,
глюкоза - 2,7,
крахмал - 0,45,
гидролизат рыбной муки - 0,55,
пептон - 0,25,
NaCl - 0,07
2
4
KHPO - 0,035,
4
2
MgSO·7HO - 0,035,
вода остальное,
начальный рН 6,5.
и при культивировании A. ochraceus BKM F-4104D по ближайшему аналогу, на ферментационной среде с начальным рН 6,5, содержащей (в %):
глюкоза - 3,5,
крахмал - 0,1,
гидролизат рыбной муки - 1,0,
пептон - 0,1,
NaCl - 0,2,
2
4
KHPO - 0,05,
4
2
MgSO·7HO - 0,05,
воду до 100%,
начальный рН 6,5;
показывает, что по предлагаемому способу твердофазного культивирования получают более высокую активаторную к протеину С активность (на 13-250%) в зависимости от твердого субстрата или носителя в ферментационной среде (табл.5).
Таблица 5
Вариант
Активаторная к протеину С активность, Е/мл
Способ - ближайший аналог глубинного культивирования A. ochraceus BKM F-4104D
86,1
Предлагаемый способ твердофазного культивирования A ochraceus BKM F-4104D с вермикулитом в ферментационной среде
300,0
Предлагаемый способ твердофазного культивирования A ochraceus BKM F-4104D с силикагелем в ферментационной среде
200.0
Предлагаемый способ твердофазного культивирования A. ochraceus BKM F-4104D с пенополиуретаном в ферментационной среде
131,8
Предлагаемый способ твердофазного культивирования A. ochraceus BKM F-4104D с пшеничными отрубями в ферментационной среде
116,3
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить культуральную жидкость с более высокой активностью протеиназы - активатора протеина С.
Литература
1. Коган А.Е., Струкова С.М. 1993. Протеин С: механизм активации и антикоагулянтного действия. Биохимия, 58, 6, 827-844.
2. Gempeler-Messina P.M., Volz К., Buhler В., Muller С.2001. Protein С activators from snake venoms and their diagnostic use. Haemostasis, 31, 266-272.

3. Martinoli J.L., Stoker K. 1986. Fast functional protein С assay using Protac, a novel protein С activator. Thromb. Res., 43, 253-256.
4. Stoker К., Fisher H., Meier J., Brogli M., Svedsen L., 1987. Characterization of the protein С activator Protac from the venom of southern copperhead (Agkistrodon contortrix) snake. Toxicon, 25, 3, 239-252.
5. Ландау Н.С., Кураков А.В., Гуликова О.М., Батомункуева Б.П., Струкова С.М., Егоров Н.С.1998. Экстрацеллюлярные протеиназы микромицетов с фибринолитическими и антикоагулятными свойствами. Микробиология, 67, 2, 215-220.
6. Батомункуева Б.П., Егоров Н.С.2001. Выделение, очистка и разделение комплексного препарата внеклеточных протеиназ Aspergillus ochraceus 513 с фибринолитическими и антикоагулянтными свойствами. Микробиология. 70, 5, 602-606.
7. Патент РФ №2468081.
8. Патент РФ №2461614.
9. Осмоловский А.А., Крейер В.Г., Кураков А.В., Баранова Н.А., Егоров Н.С. 2012. Микромицеты Aspergillus ochraceus - продуценты внеклеточных протеиназ - активаторов протеина С плазмы крови. Прикладная биохимия и микробиология, 48, 5, 537-542.
10. Sakata Т., Hatsuyama H., Kitamura Т., Hekida К., Katayama J., Matsumata T. Study of chromogenic substrate on protein С activity assay - in patients treated with narfarin. Rinsho Byori. 1990. V.38, №8, P.937-941.
11. Dang Q.D., Cera E.D., 1997. Chromogenic Substrates selective for activated protein C. Blood, 89, 2220-2221.