Способ моделирования физического переутомления у крыс в условиях десинхроноза
METHOD FOR PHYSICAL FATIGUE SIMULATION IN RATS UNDER DESYNCHRONOSIS

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для моделирования физического переутомления у крыс в условиях десинхроноза.
Тренировочно-соревновательный режим высококвалифицированных спортсменов требует постоянных перемещений в различные часовые пояса. Вследствие таких трансмеридианных перемещений развиваются нарушения заложенных эволюцией циркадианных биоритмов физиологических функций - десинхроноза.
Десинхроноз - это процесс, возникающий в организме в связи со значительными нарушениями биологических ритмов, вызванных рассогласованием между физиологическими ритмами организма и внешними датчиками времени, из которых социальные факторы имеют особое значение. Проявления десинхронозов многообразны и зачастую разнонаправленны. При всех видах перемещений в контрастные климато-временные и социальные условия первая кратковременная реакция проявляется в снижении работоспособности и повышении энергозатрат организма. Эту реакцию можно рассматривать как фазу стресса. Одновременно развиваются специфические адаптивные реакции, определяемые экологическими и социальными особенностями среды. Процесс сопровождается рассогласованием деятельности физиологических систем и соподчиненности физиологических функций. Для нормальной жизнедеятельности в новых условиях необходимо достаточно долгое время (дни) для перестройки пространственно-временных взаимодействий функций организма, выработки специальных программ и механизмов регулирования, имеющих свои особенности при разных видах перемещений.
Десинхронизация биоритмов приводит к истощению адаптационных резервов организма и сопровождается синдромом хронической усталости, что требует разработки программ щадящей реабилитации спортсменов в период соревнований и восстановления организма от тренировочных и соревновательных нагрузок. Для обоснования структур реабилитационных программ необходима экспериментальная проверка их эффективности.
Существуют несколько подходов к экспериментальному моделированию физического переутомления, где объектом являются мелкие млекопитающие (мыши, крысы). Один из таких методов - это определение скорости физической выносливости по продолжительности бега мышей в 10-дорожечном третбане, снабженном электростимулятором (70 В), при скорости 40 м/мин [Определение безопасности и эффективности биологически активных добавок к пище, 1999]. Известна методика силовой оценки выносливости, где определяют время виса мышей на шесте от начала удержания до момента падения [Арбузов С.Я., и др., 1960]. Недостатками этих моделей является то, что они в недостаточной мере отражают проблемы в спортивной физиологии, связанные с нарушением адаптивных резервов организма вследствие трансмеридианных перелетов и последующими спортивными тренировками.
Известен способ моделирования десинхроноза - в условиях постоянного освещения при котором экспериментальные животные содержатся несколько суток (от 10 суток до 6 мес) на инверсированном световом режиме либо на круглосуточном освещении или темноте [Замощина Т.А., 2000; Лабунец И.Ф., Бондаренка Л.А., 2013; Жураковский И.П. и др., 2014].
Однако в известном способе оценивали только десинхроноз между одноименными ритмами различных функциональных показателей без исследования физической работоспособности животных.
Наиболее близким к предлагаемому является способ моделирования, заключающийся в том, что экспериментальное животное подвергают «принудительному плаванию». Принцип способа сводится к оценке продолжительности жизни животных в условиях физической нагрузки (плавание) при относительно низкой температуре воды (на 17-20°С ниже средней температуры тела) [Экспериментальное моделирование и лабораторная оценка адаптивных реакций организма / В.А. Волчегорский [и др.]. - Челябинск: ЧГПУ, 2000. - 167 с.]. Тест осуществляется как на мышах, так и на крысах. Животных вынуждают плавать при низкой температуре воды в течение 30 минут. Регистрируют время плавания до наступления летального исхода и оценивают смертность (в процентах от общего числа мышей) за период наблюдения. Для постановки теста на мышах используют стеклянные хроматографические камеры размером 29×19×40,5 см или пластиковые ведра сходных размеров. При проведении теста «принудительного плавания» на мышах высота водного столба должна быть не менее 20 см.
Для проведения теста «принудительного плавания» на крысах использовали резервуар большей емкости, например, согласно описанию металлический бак круглого сечения, диаметром 63 см, высотой 72 см. Водный столб не менее 50 см, высота части бака, которая не занята водой, не менее 22 см. Температура воды для «принудительного плавания» крыс колеблется в диапазоне 17-18°С. В остальном тест проводится аналогично вышеописанной методике для мышей. При соблюдении описанных условий, по данным авторов, летальность крыс составляет 93,87% за 30-минутный период наблюдения, средняя латентность гибели животных равняется 18,88±2,2 минутам Указанные параметры теста следует расценить как недостатки, так как, во-первых, согласно описанию модель предусматривает высокий процент гибели животных, что не вполне отвечает современным принципам гуманного обращения с животными, и, кроме того, повышает расход животных на проведение эксперимента, соответственно повышая затраты; во-вторых, указанный период наблюдения является достаточно длительным, что увеличивает затраты времени на проведение эксперимента. Согласно описанию, тест «принудительное плавание» предназначен для интегральной оценки механизмов резистентной (т.е. стрессорной) стратегии адаптации.
Новый технический результат - расширение арсенала экспериментальных моделей которые в большей мере отражают проблемы спортивной физиологии, связанные с нарушением адаптивных резервов организма вследствие трансмеридианных перелетов и последующими спортивными тренировками, при снижении летальности животных и сокращении времени формирования модели.
Для достижения нового технического результата в способе моделирования физического переутомления у крыс в условиях десинхроноза, включающем оказание нагрузки с помощью принудительного плавания животного в емкости с водой, нагрузку осуществляют в два этапа: на первом этапе проводят индукцию экспериментального десинхроноза, путем содержания крыс в течение 12 суток круглосуточно при искусственном освещении либо в полной темноте, после чего животных при естественном освещении подвергают принудительному плаванию в течение 5 дней, с грузом, закрепленным на хвосте, вес которого составляет 10% веса тела животного, при температуре воды 26°-28°С до полного утомления, критерием которого являются три безуспешные попытки всплыть на поверхность либо отказ от таких попыток с опусканием на дно.
Способ осуществляют следующим образом.
На первом этапе для индукции экспериментального десинхроноза животных опытных групп в течение 12 дней круглосуточно содержали в условиях искусственного яркого освещения 150 LX (группа №1) либо полного затемнения 2-3 LX (группа №2) на обычном рационе со свободным доступом к воде и пище. На втором этапе при естественном освещении крыс подвергали пятидневному принудительному плаванию в стеклянном аквариуме прямоугольной формы с размерами 100 см ×100 см ×20 см разделенном на отсеки, соединяющиеся у дна, и снабженном двумя вентилями: по одному сверху и снизу одной из боковых стенок, с утяжеляющим грузом, равным по весу 10% от массы тела конкретной особи, при температуре воды 26°-28°С до полного утомления, критерием которого служили три безуспешные попытки всплыть на поверхность либо отказ от таких попыток с опусканием на дно, после чего животное извлекали из аквариума.
Предлагаемый способ основан на анализе данных экспериментальных исследований.
Экспериментальное исследование выполнено на 30 половозрелых крысах-самцах породы «Wistar» массой 280-300 г, содержащихся в стандартных условиях вивария на обычном рационе со свободным доступом к воде и пище. Помещение вивария полностью изолировано от других подразделений Филиала ТНИИКиФ ФГБУ СибФНКЦ ФМБА России. Полы выполнены из водонепроницаемого материала, стены покрыты глазурованной плиткой. Все комнаты вивария отапливаются с помощью системы центрального отопления, имеют естественное и искусственное освещение, подключены к горячему и холодному водоснабжению и к канализации, оборудованы принудительной приточно-вытяжной вентиляцией, обеспечивающей необходимые кратность воздухообмена и микроклиматические условия. Круглогодично в помещении вивария поддерживается 50-65% относительная влажность и температура воздуха 20-25°С. Для снижения микробной контаминации используются облучатели-рециркуляторы бактерицидные закрытого типа.
Все процедуры с животными выполнялиь в соответствии с международными правилами и нормами (European Communities Council Directives of 24 November 1986, 86/609/EEC).
Все животные случайным образом были разделены на 3 группы по 10 особей:
1) крысы, находившиеся в естественных условиях освещения и подвергавшиеся моделированию физического переутомления; контрольная группа;
2) крысы, на которых моделировалось физическое переутомление после формирования у них экспериментального десинхроноза в виде круглосуточного освещения; группа №1;
3) крысы, на которых моделировалось физическое переутомление после формирования у них экспериментального десинхроноза в виде круглосуточной темноты; группа №2.
На первом этапе для индукции экспериментального десинхроноза животные опытных групп в течение 12 суток круглосуточно находились при искусственном освещении либо полной темноте. Затем, на втором этапе крысы были подвергнуты физической нагрузке при естественном освещении. Физическая нагрузка реализована путем принудительного плавания крыс в стеклянном аквариуме с грузом в 10% от веса тела при температуре воды 26°-28°С до полного утомления в течение 5 дней.
Плавание проводили в специальной боксированной установке представляющей собой стеклянный аквариум прямоугольной формы размерами 100 см ×100 см ×20 см, разделенный на пять отсеков, соединяющихся у дна, и снабженный двумя вентилями - по одному сверху и снизу одной из боковых стенок, с утяжеляющим грузом, равным по весу 10% от массы тела конкретной особи, при температуре воды 26°-28°С. Параметры аквариума и груза, а также длительность (5 суток) нагрузки подобраны на основании экспериментальных наблюдений и позволяют снизить летальность животных и, в то же время, получить модель за более короткое время.
Животным на хвост с помощью нитки одинарным узлом фиксировали калиброванный груз весом, соответственно, 10% от индивидуальной массы его тела, после чего его помещали в отсек по одной особи в каждый. Температуру воды контролировали каждые 10 минут и поддерживали на уровне 26°-28°С. Животные плавали до полного утомления. Критерием полного утомления служили три безуспешные попытки всплыть на поверхность, либо отказ от таких попыток с опусканием на дно. При этом животное сачком подхватывали и извлекали из аквариума.
2
В конце эксперимента крыс выводили одномоментным декапитированием под СО наркозом, согласно Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации о гуманном отношении к животным и приказу Минздрава СССР №577 от 12.08.1977 «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Статистическую обработку полученных результатов проводили на основе пакета программ StatSoft Statistica v6.0. (непараметрические критерии Манна - Уитни, Вилкоксона, Фридмана).
Как показали эксперименты, при ежедневной физической плавательной нагрузке до полного утомления без моделирования нарушений циркадных биоритмов в контрольной группе к 3-му дню исследования наблюдается увеличение времени активного плавания, причем на 4 сутки - статистически значимо с последующей стабилизацией показателя. Полученные результаты свидетельствуют о достижении животными состояния тренированности и резистентности к нагрузке. Описанная динамика во многом соответствует изменению фаз адаптации (тревога, резистентность, истощение) (Селье Г., 1960; Горизонтов П.Д. и др., 1983; Меерсон Ф.З., 1988), что свидетельствует о зависимости работоспособности от смены стрессреализующих и стресслимитирующих нейроэндокринных реакций.
1
3
1
Световой десинхроноз нарушал динамику показателей физической работоспособности. Предварительное воздействие или лишение света вызывало срыв адаптации к физической нагрузке, выражающийся в прогрессирующем снижении времени плавания крыс. Согласно статистическому анализу (парные множественные сравнения непараметрическим тестом Фридманам) динамика плавания крыс контрольной группы значимо отличалась от динамики плавания животных, содержащихся в условиях круглосуточного освещения (р=0,003) или круглосуточного затемнения (р=0,05). При этом физическое переутомление у крыс после воздействия света было более заметным по сравнению с группой, находившейся в условиях затемнения. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что в весенний период десинхроноз в виде избыточного воздействия света или темноты ускорял развитие физического переутомления у крыс в плавательном тесте. В Таблице 1 представлены данные о физической работоспособности экспериментальных животных при моделировании хронических физических нагрузок на фоне десинхронизации циркадных биоритмов в весенний период, Me (Q;Q). Примечание: p - статистическая значимость различий в сравнении с первым днем плавания.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет создать модель, в ходе формирования которой животные достигают состояния тренированности и резистентности к нагрузке. Полученная модель в достаточной мере отражает проблемы спортивной физиологии, связанные с нарушением адаптивных резервов организма вследствие трансмеридианных перелетов и последующими спортивными тренировками, и в большей мере может служить для поиска способов и средств профилактики и коррекции спортивных перегрузок и дезадаптации.