Изучение состава клеточных антигенов патогенных буркхольдерий с использованием иммуноблоттинга

микробиология

УДК 616.98:579.841.11

А.А.Будченко, И.Ю.Мазурова, В.И.Илюхин

изучение состава клеточных антигенов патогенных буркхольдерий с использованием иммуноблоттинга

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт», Волгоград,

Российская Федерация

Проведен сравнительный анализ иммуноэлектрофореграмм клеточных антигенов - B. pseudomallei С-141, B. mallei 10230, B. thailandensis 264, B. cepacia 25416 после иммуноблоттинга с иммунными кроличьими сыворотками, полученными к живым клеткам авирулентного штамма B. pseudomallei 107, клеточным и внеклеточным антигенам B. pseudomallei 107, B. pseudomallei С-141, B. mallei 10230, B. thailandensis 264, B. cepacia 25416. Визуальный анализ позволил на иммуноэлектрофореграмме клеточных антигенов B. mallei 10230, полученной в иммуноблоттинге с сывороткой к клеточным антигенам B. mallei 10230, выявить фракции с молекулярными массами 18,4 и 35 kDa, отсутствующие на иммуноэлектрофореграмме B. pseudomallei С-141 после иммуноблот-тинга с этой же сывороткой, что позволяет дифференцировать патогенные буркхольдерии. в то же время использование в иммуноблоттинге гетерологичных иммунных сывороток повышает дискриминирующую способность сравнительного анализа иммуноэлектрофореграмм клеточных антигенов в целях дифференциации патогенных буркхольдерий. Уровень воспроизводимости иммуноэлектрофореграмм позволяет использовать коэффициенты их сходства для сравнительного анализа с применением компьютерных программ.

Ключевые слова: анализ, иммуноблоттинг, клеточные и внеклеточные антигены, сыворотка, Burkholderia pseudomallei, B. mallei.

A.A.Budchenko, I.Yu.Mazurova, V.LIlyukhin

Studies of the Composition of the Cell Antigen Preparations Obtained from Pathogenic Burkholderia, Using Immunoblotting

Volgograd Research Anti-Plague Institute, Volgograd, Russian Federation

Carried out has been comparative analysis of the cell antigen immune-electrophoregrammes of B. pseudomallei C-141, B. mallei 10230, B. thailandensis 264, and B. cepacia 25416 after immunoblotting with immune rabbit sera to living cells of avirulent

B. pseudomallei 107, celllular and extracellular antigens ofB. pseudomallei 107, B. pseudomallei C-141, B. mallei 10230, B. thailandensis 264, and B. cepacia 25416. Visual investigation has revealed the presence of fractions with molar mass of 18.4 and 35 kDa in B. malei 10230 cell antigens' electrophoregramme obtained by means of immunoblotting with serum to B. malei 10230 cell antigens, as distinct from B. pseudomallei C-141 electrophoregramme with the same serum. This makes it possible to distinguish the pathogenic Burkholderia. At the same time utilization of heterologous immune sera enhances discriminating capacity of the comparative assay. The level of reproducibility of immune-electrophoregrammes allows for the deployment of the similarity coefficient for computer-based comparative analysis.

Key words: analysis, immunoblotting, cellular and extracellular antigens, serum, Burkholderia pseudomallei, B. mallei.

Мелиоидоз - инфекция людей и животных, эндемичная в районах Юго-Восточной Азии и Северной Австралии. Быстрая и точная диагностика инфекции имеет большое значение для своевременного адекватного лечения. Несмотря на то, что «золотым стандартом» постановки диагноза мелиоидоза является выделение от больного культуры возбудителя, в эндемичных этому заболеванию регионах для ускоренной диагностики чаще всего применяют РНГА и ТИФА [11, 12]. Чувствительность и специфичность этих методов значительно зависят от антигенов, используемых для сенсибилизации эритроцитов (РНГА) и пластин (ТИФА), и не всегда составляют 100 %. Поэтому активно продолжается поиск антигенов, обеспечивающих одновременно максимальные чувствительность и специфичность этих методов [10]. Иммуноблоттинг, являясь разновидностью гетерогенного иммунного анализа, представляет собой

эффективный метод выявления иммуногенных фракций в антигенных комплексах изучаемых микроорганизмов. Применяли иммуноблоттинг при изучении микроорганизмов, относящихся к группе особо опасных, в том числе патогенных буркхольдерий. Так, в 1993 г. N.Anuntagool et al. получили и проанализировали иммуноэлектрофореграммы после иммуноблот-тинга с сывороткой больного мелиоидозом клеточных антигенов B. pseudomallei, B. cepacia, некоторых псевдомонад на наличие перекрестных антигенов [6]. J.B.Katz. et al. предложили ввести иммуноблоттинг как дополнительный метод для выявления антител к антигенам B. mallei у лошадей в требования OIE (The Office of International Des Epizooties) по оформлению таможенных документов на их перевозку за пределы страны-хозяина [8]. Применялся иммуноблоттинг в качестве метода полифазной таксономии при дифференциации видов бруцелл [5].

Целью работы был поиск различий в составах антигенных фракций на иммуноэлектрофореграм-мах клеточных антигенов B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis, B. cepacia, полученных методом им-муноблоттинга с иммунными сыворотками к живым клеткам, клеточным и экстрацеллюлярным антигенам, которые можно использовать для дифференциации патогенных видов буркхольдерий.

Материалы и методы

Для анализа взяты типичные штаммы: вирулентный - B. pseudomallei С-141 и авирулент-ный - B. pseudomallei 107, B. mallei 10230, B. thailandensis 264, B. cepacia 25416 из коллекционного центра Волгоградского противочумного института. Получены иммунные кроличьи сыворотки к живым клеткам B. pseudomallei 107, клеточным и экстрацеллюлярным антигенам (ЭЦА) штаммов B. pseudomallei 107, B. pseudomallei С141, B. mallei 10230, B. thailandensis 264, B. cepacia 25416. Бактерии B. pseudomallei 107 для иммунизации выращивали на питательном агаре Pseudomonas Agar F «Difco» (США) (F-агар) в течение 18 ч при 37 °С. Иммунизировали кроликов дозой - 109 м.к. в 1 мл 0,15 М раствора NaCl (pH 7,2) по схеме: первое введение и через 7 сут второе - подкожно, третье - через 14 сут внутривенно. Кровь брали через 7 сут после последнего введения (титры сыворотки в реакции иммунодиффузии составили 1:32). Клеточные антигены получали из бактериальной массы штаммов B. pseudomallei 107, B. pseudomallei С141, B. mallei 10230, B. thailandensis 264, B. cepacia 25416, выращенной на F-агаре в матрацах в течение 18 ч при 37 °с. Бактериальную массу смывали 0,9 % раствором натрия хлорида и стерилизовали охлажденным до -40 °С ацетоном в соотношении объемов 1:3. Клеточные антигены (суперна-тант) получали после ультразвуковой обработки суспензии бактериальной массы и центрифугирования (10000 g, 25 мин). Хранили антигены при -40 °С. Для получения ЭЦА бактериальную массу, росшую в течение 18 ч на агаре, покрытом целлофаном, смывали 0,9 % раствором натрия хлорида, центрифугировали (15000 g, 25 мин). Супернатант фильтровали (размер пор фильтра 0,45 мкм). ЭЦА стерилизовали и осаждали из суспензии охлажденным ацетоном (-40 °С) в соотношении объемов 1:3. Концентрацию протеина в пробах измеряли методом М.М.Бредфорда [7]. Для получения иммунных сывороток к клеточным антигенам и ЭЦА кроликов иммунизировали смесью антигенов (1 мг/мл) с неполным адъювантом Фрейнда («Calbiochem», США) в соотношении 1:1 вдоль позвоночника в 10 точек четырехкратно с интервалом в 7 дней. Кровь отбирали при титрах сывороток в реакции иммунодиффузии 1:32. Электрофорез в ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСН) проводили в вертикальных пластинах (14^16^0,1 см) по U.K.Laemmli [9]. Одну часть геля после электрофореза окрашивали раствором Кумасси G-250, вторую - использовали в блоттинге (размер пор мембраны - 0,45 мкм, время

переноса - 2 ч) [13]. Фракции антигенов выявляли иммуноферментным методом, используя полученные сыворотки и меченные пероксидазой антитела против кроличьих иммуноглобулинов («Медгамал», Россия). В качестве субстрата применяли тетраме-тилбензидин. Воспроизводимость иммуноэлектро-фореграмм определяли, получая их не менее трех раз для каждой серии сыворотки и вычисляя коэффициент сходства Дайса [1].

Результаты и обсуждение

Получены электрофореграммы суммарных клеточных белков 4 видов буркхольдерий в полиакри-ламидном геле с додецилсульфатом натрия (ПААГ с ДСН) с последующим выявлением протеинов окраской Кумасси G-250 и иммуноферментным методом (иммуноблоттинг) с иммунными сыворотками к живым клеткам и клеточным антигенам B. pseudomallei 107 (рис. 1). На электрофореграммах суммарных антигенов буркхольдерий, окрашенных Кумасси G-250, имеются две мажорные фракции (33,6 и 64 kDa), которые, как ранее нами показано, присутствуют в составе электрофореграмм суммарных клеточных белков штаммов буркхольдерий, имеющихся в коллекции Волгоградского противочумного института [2]. Также нами было доказано, что различия в составе суммарных клеточных белков буркхольдерий позволяют, используя специальные компьютерные программы, проводить их видовую дифференциацию [2]. Визуальный сравнительный анализ полученных иммуноэлектрофореграмм с сывороткой к живым клеткам (рис. 1, Б) и клеточным антигенам (рис. 1, В) B. pseudomallei 107 выявил различия их как в составе мажорных (крупных) фракций, так и всего набора антигенных фракций. так, на иммуно-

А Б В

Мол. м.

97^ 66 ^

45 30

20,1 14,4

М 1 2 3 4 1 2341 234

Рис. 1. Электрофореграммы и иммуноэлектрофореграммы клеточных антигенов буркхольдерий:

А - электрофореграммы после электрофореза в ПААГ с ДСН, окрашенные Кумасси G-250; Б - иммуноэлектрофореграммы блоттинга с иммунной сывороткой к живым клеткам B. pseudomallei 107; В - иммуноэлектрофореграммы блоттинга с иммунной сывороткой к клеточным антигенам B. pseudomallei 107. М - трек с маркерными белками. Обозначения треков с антигенами штаммов: 1 - B. pseudomallei С-141; 2 - B. mallei 10230; 3 - B. cepacia 25416; 4 - B. thailandensis 264

Проблемы особо опасных инфекций, вып. 2, 2015

электрофореграммах анализируемых штаммов, после иммуноблоттинга с сывороткой к живым клеткам B. pseudomallei 107, выявлены мажорные фракции с молекулярной массой 20,1 и 88 kDa, которые на им-муноэлектрофореграммах после блоттинга с сывороткой к клеточным антигенам относятся к фракциям с малым количеством антигена. Можно сделать вывод, что при введении живых бактерий в организм кролика антитела образуются в основном к эпито-пам антигенов, расположенным на поверхности клеток. При иммунизации же животного клеточными антигенами часто сохраняется зависимость: крупная фракция после окраски Кумасси G-250 - крупная фракция на иммуноэлектрофореграмме (пример -антигенная фракции молекулярной массой 60 kDa на рис. 1, А, В). Представляется перспективным препаративное выделение антигенных фракций с молекулярной массой 20,1 и 88 kDa и использование их в получении группоспецифического препарата для идентификации буркхольдерий. Ранее сообщалось о применении фракции 20,1 kDa для сенсибилизации пластин в ТИФА при диагностике мелиоидоза [4].

Получены иммуноэлектрофореграммы клеточных антигенов 4 штаммов буркхольдерий в иммуно-блоттинге с иммунными кроличьими сыворотками к клеточным антигенам и ЭЦА B. pseudomallei С-141 и B. mallei 10230 (рис. 2). В результате визуального анализа представленных иммуноэлектрофореграмм установлено, что спектры антигенных фракций штаммов B. pseudomallei С-141, B. mallei 10230 и B. thailandensis 264, выявленные в иммуноблоттин-ге с сывороткой к клеточным антигенам B. pseudo-mallei с-141, отличались незначительно (рис. 2, А). это показывает, что существует большое количество идентичных эпитопов на антигенных комплексах, взятых для иммунизации [3]. Анализ состава мажор-

Мол. м.

97 66

45 30

20,1

14,4

М 1 2 3 4 1 2 3 4 1234 1234

Рис. 2. Иммуноэлектрофореграммы клеточных антигенов буркхольдерий после иммуноблоттинга с иммунными сыворотками к клеточным антигенам и ЭЦА B. pseudomallei С-141 и B. mallei 10230:

Обозначения иммуноэлектрофореграмм: А - с сывороткой к клеточным антигенам B. pseudomallei С-141; Б - с сывороткой к ЭЦА B. pseudomallei С-141; В - с сывороткой к клеточным антигенам B. mallei 10230; Г -с сывороткой к ЭЦА B. mallei 10230. М - трек с маркерными белками. Обозначения треков с антигенами штаммов: 1 - B. pseudomallei С-141; 2 - B. mallei 10230; 3 - B. cepacia 25416; 4 - B. thailandensis 264

ных фракций выявил в составе спектра антигенов B. cepacia 25416 (рис. 2, А, трек 3) антигенную фракцию с молекулярной массой 23 kDa, отсутствующую в составе спектров антигенных фракций трех других штаммов. Эти различия в составах антигенных фракций при достаточной воспроизводимости имму-ноэлектрофореграмм делают возможным анализ их сходства с применением компьютерных программ. Такого же уровня были различия спектров клеточных антигенов анализируемых штаммов при использовании в иммуноблоттинге сыворотки к ЭЦА B. pseudomallei С-141 (рис. 2, Б). Иммуноэлектрофореграммы клеточных антигенов этих же штаммов, выявленных в иммуноблоттинге с сывороткой к клеточным антигенам B. mallei 10230, имели большие отличия, чем выявлялись в предыдущем случае. Так, на иммуноэлектрофореграмме B. mallei 10230 присутствовали мажорные фракции с молекулярной массой 18,4 и 35 kDa, отсутствующие или имеющие следовые количества на иммуноэлектрофореграммах остальных трех штаммов. Использование этих различий позволяет дифференцировать близкородственные B. mallei 10230 и B. pseudomallei С-141 (рис. 2, В, трек 2). В то же время составы спектров B. pseudomallei С-141 и B. thailandensis 264 очень близки в диапазоне 14,4-30 kDa и различались незначительно в зоне 30-66 kDa (рис. 2, В, треки 1 и 4).

Визуальный анализ клеточных антигенов бурк-хольдерий после иммуноблоттинга с сывороткой к ЭЦА B. mallei 10230 также выявил высокое сходство спектров антигенных фракций B. pseudomallei С-141 и B. thailandensis 264 (рис. 2, Г, треки 1 и 4), что коррелирует с данными о близости их фенотипов [4]. Однако спектры B. pseudomallei С-141 и B. mallei 10230, обладая высоким сходством, имеют различия в низкомолекулярной области трека. Так, в составе спектра B. mallei 10230 присутствует мажорная фракция 15 kDa, практически отсутствующая в спектре B. pseudomallei С-141 (рис. 2, Г, треки 1 и 2). Состав антигенных фракций B. cepacia имел большие отличия от составов фракций штаммов «группы pseudomallei» (рис. 2, В).

Иммуноэлектрофореграммы патогенных бурк-хольдерий получены в иммуноблоттинге с гетеро-логичными для патогенных видов иммунными сыворотками к клеточным антигенам и ЭЦА B. cepacia 25416 и B. thailandensis 264 (рис. 3). Спектры антигенов, выявленные сывороткой к клеточным антигенам и ЭЦА B. thailandensis 264, различались незначительно. Также незначительны различия спектров B. pseudomallei С-141 и B. mallei 10230 при использовании сыворотки к клеточным антигенам B. cepa-cia 25416 (рис. 3, А). В то же время есть явные различия в спектрах B. pseudomallei С-141 и B. mallei 10230, выявленных сывороткой к ЭЦА B. cepacia 25416 (рис. 3, Б). На треке 1 (B. pseudomallei С-141) присутствует антигенная фракция с молекулярной массой 19 kDa, отсутствующая на треке 2 (B. mallei 10230). Перспективным представляется выделение этой фракции и использование в создании препарата,

А Б В Г

Мол. м.

97 66

45 30

20,1 14,4

M 1 2 3 4 123412341234

Рис. 3. Иммуноэлектрофореграммы суммарных клеточных антигенов буркхольдерий после иммуноблоттинга с иммунными сыворотками к клеточным антигенам и ЭЦА B. cepacia 25416 и B.t hailandensis 264:

Обозначения иммуноэлектрофореграмм: А - с сывороткой к клеточным антигенам B. cepacia 25416; Б - с сывороткой к ЭЦА B. cepacia 25416; В - с сывороткой к клеточным антигенам B. thailandensis 264; Г - с сывороткой к ЭЦА B. thailandensis 264. М - трек с маркерными белками. Обозначения треков с антигенами штаммов: 1 - B. pseudomallei С-141; 2 - B. mallei 10230; 3 - B. cepacia 25416; 4 - B. thailandensis 264

позволяющего дифференцировать патогенные виды буркхольдерий.

Воспроизводимость иммуноэлектрофореграмм, вычисленная для полученных сывороток как среднее значение коэффициентов сходства Дайса, имела значения от 91 до 95 %.

Таким образом, проведенный анализ полученных иммуноэлектрофореграмм клеточных антигенов B. pseudomallei, B. mallei, B. thailandensis, B. cepacia в иммуноблоттинге с иммунными сыворотками к клеточным антигенам и ЭЦА четырех видов буркхоль-дерий выявил отдельные фракции, присутствующие в антигенных спектрах штаммов одного патогенного вида и отсутствующие в спектрах штаммов другого патогенного вида, которые позволяют дифференцировать эти виды. Достигнутая воспроизводимость иммуноэлектрофореграмм позволяет использовать их в сравнительном анализе сходства спектров антигенных фракций анализируемых видов с применением компьютерных программ.

Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бейли Н. Математика в биологии и медицине. М.: Мир;

1970.

2. Будченко А.А., Илюхин В.И., Викторов Д.В. Сравнительный анализ электрофореграмм суммарных клеточных белков патогенных буркхольдерий. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2005; 2:24-8.

3. Домарадский И.В. Проблемы перекрестного иммунитета. М.: Медицина; 1973.

4. Илюхин В.И., Сенина Т.В., Плеханова Н.Г., Антонов В.А., Меринова Л.К., Сеимова И.К. Burkholderia thailandensis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2002; 1:7-11.

5. Кулаков Ю.К., Желудков М.М., Толмачева Т.А.

Использование молекулярно-биологических методов идентификации бруцелл в сравнительном анализе штаммов, выделенных от больных собак. Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2003; 1:6-14.

6. Anuntagool N., Rugdech P., Sirisinha S. Identification of specific antigens of Pseudomonas pseudomallei and evaluation of their efficacies for diagnosis of melioidosis. J. Clin. Microbiol. 1993; 31(1):1232-6.

7. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the guan-titation of microgram guantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72:248-54.

8. Katz J., Devvald R., Nicholson J. Procedurally similar com-

Eetitive immunoassay systems for the serodiagnosis of Babesia eaui, 'abesia eaballi, Trypanosoma euuiperdum and Burkhohleria mallei infection in horses. J. Vet. Diagn. Invest. 2000; 12:46-50.

9. Laemmli U.K. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227: 680-5.

10. Pal V., Kumar S., Malik P., Rai G.P. Evaluation of Recombinant Proteins of Burkholderia mallei for Serodiagnosis of Glanders Clin. Vaccine Immunol. 2012; 19:1193-8.

11. Sermswan R.W., Wongratanacheewin S., Anuntagool N. Comparison of the polymerase chain reaction and serologic tests for diagnosis of septicemic melioidosis. J. Trop. Med. Hyg. 2000; 63:146-9.

12. Tiyawisutsri R., Peacock S.J., Langa S., Limmathurotsakul D., Cheng A.C., Chierakul W., Chaowagul W., Day N.P., Wuthiekanun V. Antibodies from patients with Melioidosis recognize Burkholderia mallei but not Burkholderia thailandensis antigens in the indirect hemagglutination assay. J. Clin. Microbiol. 2005; 43:4872-4.

13. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979; 76:4350-4.

References

1. Beily N. [Mathematics in Biology and Medicine]. M.: Mir; 1970.

2. Budchenko A.A., Ilyukhin V.I., Viktorov D.V. [Comparative analysis of electrophoregrammes of bulk cell proteins in pathogenic Burkholderia]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 2005; 2:24-8.

3. Domaradsky I.V. [Problems of Cross-Protective Immunity]. M.: Meditsina; 1973.

4. Ilyukhin V.I., Senina T.V., Plekhanova N.G., Antonov V.A., Merinova L.K., Seimova I.K. [Burkholderia thailandensis: biological properties, identification and taxonomic position]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 2002; 1:7-11.

5. Kulakov Yu.K., Zheludkov M.M., Tolvacheva T.A. [Application of molecular-genetic methods for Brucella identification in comparative assay of the strains isolated from infected dogs]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 2003; 1:6-14.

6. Anuntagool N., Rugdech P., Sirisinha S. Identification of specific antigens of Pseudomonas pseudomallei and evaluation of their efficacies for diagnosis of melioidosis. J. Clin. Microbiol. 1993; 31(1):1232-6.

7. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the guantitation of microgram guantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72:248-54.

8. Katz J., Devvald R., Nicholson J. Procedurally similar competitive immunoassay systems for the serodiagnosis of Babesia eaui, Babesia eaballi, Trypanosoma euuiperdum and Burkhohleria mallei infection in horses. J. Vet. Diagn. Invest. 2000; 12:46-50.

9. Laemmli U.K. Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970; 227: 680-5.

10. Pal V., Kumar S., Malik P., Rai G.P. Evaluation of Recombinant Proteins of Burkholderia mallei for Serodiagnosis of Glanders Clin. Vaccine Immunol. 2012; 19:1193-8.

11. Sermswan R.W., Wongratanacheewin S., Anuntagool N. Comparison of the polymerase chain reaction and serologic tests for diagnosis of septice-mic melioidosis. J. Trop. Med. Hyg. 2000; 63:146-9.

12. Tiyawisutsri R., Peacock S.J., Langa S., Limmathurotsakul D., Cheng A.C., Chierakul W., Chaowagul W., Day N.P., Wuthiekanun V. Antibodies from patients with Melioidosis recognize Burkholderia mallei but not Burkholderia thailandensis antigens in the indirect hemagglutination assay. J. Clin. Microbiol. 2005; 43:4872-4.

13. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979; 76:4350-4.

Authors:

Budchenko A.A., Mazurova I.Yu., Ilyukhin V.I. Volgograd Research Anti-Plague Institute. 7, Golubinskaya St., Volgograd, 400131, Russian Federation. E-mail: vari2@sprint-v.com.ru

об авторах:

Будченко А.А., Мазурова И.Ю., Илюхин В.И. Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт. Российская Федерация, 400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7. E-mail: vari2@sprint-v.com.ru

Поступила 30.09.14.