СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ПСИХИЧЕСКИХ И НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ
METHOD OF TREATING MENTAL AND NEURAL DISORDERS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине и касается использования клеток пуповинной крови для лечения психических и неврологических расстройств.
Уровень техники
Стволовые клетки пуповинной крови представляют собой уникальную клеточную популяцию, отличающуюся от клеток, получаемых из других источников, в том числе эмбриональных, фетальных и «взрослых» стволовых клеток. Уникальность клеток пуповинной крови заключается в том, что это единственный тип клеток постнатального происхождения, способный при трансплантации экспериментальным животным поддерживать кроветворение и формировать полноценную иммунную систему человека, благодаря образованию В- и Т-лимфоцитов и дендритных клеток, формированию первичных и вторичных лимфоидных органов и продукции функциональных иммунных ответов [Traggai Е, Chicha L, Mazzuchelli L, et al. Development of a human adaptive immune system in cord blood cell-transplanted mice. Science 2004; 304: 14-107].
Гемопоэтические стволовые клетки (CD34+) и эндотелиальные клетки-предшественники (CD 133+) являются наиболее представленными клеточными популяциями, найденными в пуповинной крови. Высокое содержание гемопоэтических клеток-предшественников позволяет эффективно использовать трансплантацию клеток пуповинной крови в качестве альтернативы трансплантации костного мозга при острых и хронических лейкозах, лимфомах, анемии Фанкони и других гематологических заболеваниях [Barker J. Umbilical cord blood (UCB) transplantation: An alternative to the use of unrelated volunteer donors? Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2007: 55-61].
Помимо гемопоэтических, в пуповинной крови содержатся и другие типы стволовых клеток, включая эмбрионально-подобные клетки, эпителиальные клетки-предшественники, мезенхимальные стволовые клетки и неограниченные соматические стволовые клетки [Harris David Т., Rogers I. Umbilical Cord Blood: A Unique Source of Pluripotent Stem Cells for Regenerative Medicine, Current Stem Cell Research & Therapy, 2007, 2, 301-309].
Плюрипотентные свойства стволовых клеток пуповинной крови продемонстрированы в целом ряде исследований in vitro и in vivo. В условиях культивирования стволовые клетки пуповинной крови способны дифференцироваться в остеобласты, хондробласты, адипоциты и нервные клетки, а также в эндотелиальные и мышечные клетки, гепатоциты и инсулин-продуцирующие клетки [Kogler, G., Sensken, S., & Wernet, P. (2006) Comparative generation and characterization of pluripotent unrestricted somatic stem cells with mesenchymal stem cells from human cord blood. Experimental Hematology, 34(11), 1589-95 и Tondreau T, Meuleman N, Delforge A, et al. Mesenchymal stem cells derived from CD133-positive cells in mobilized blood and cord blood: proliferation, expression and plasticity. Stem Cells, 2005; 23: 1105-1112].
Стволовые клетки пуповинной крови обладают способностью к хоумингу и при трансплантации экспериментальным животным могут улучшать течение ряда заболеваний, включая диабет, сердечно-сосудистые, и неврологические, и офтальмологические заболевания, болезни опорно-двигательного аппарата и т.д.
Диабет 1 типа встречается в среднем у одного из 300 новорожденных и обнаруживается более чем у 8 млн взрослого населения России. Диабет 1 типа обусловлен иммунной деструкцией бета-клеток в панкреатических островках, ответственных за продукцию инсулина. Результатом является неконтролируемый уровень глюкозы в крови. Осложнения при диабете включают кардиомиопатию, поражения коронарных артерий и периферических сосудов, неврологические расстройства и т.д. При попытках лечения диабета 1 типа были разработаны хирургические методы по трансплантации поджелудочной железы или отдельных островков, имевшие ограниченный успех вследствие иммунного отторжения, отсутствия совместимых доноров и многочисленных осложнений. В этой связи, особые надежды были возложены на использование клеточных технологий, основанных на применении стволовых клеток из различных источников и направленных на восстановление функции инсулин-продуцирующей ткани поджелудочной железы. В исследовании, проведенном Haller и соавт., было констатировано значительное улучшение в конролируемом уровне глюкозы и более продолжительная продукция инсулина по сравнению с другими детьми со сходным прогнозом в ответ на использование клеток пуповинной крови [Haller MJ, Cooper SC, Brusco T, et al. Autologous cord blood transfusion associated with prolonged honeymoon in a child with type 1 diabetes. Diabetes 2005; 53 (Suppl 1): Poster А485]. Протоколы клинических исследований были разработаны на основе данных, полученных на модели диабета 1 типа, согласно которым у опытных животных наблюдался пониженный уровень глюкозы и инсулина в крови и увеличенный период жизни по сравнению с контрольными животными [Ende N, Chen R, Reddi AS. Effect of human umbilical cord blood cells on glycemia and insulinitis in type 1 diabetic mice. Biochem Biophys Res Commun 2004; 325: 665-669 и Ende N, Chen R, Mack R. NOD/LtJ type I diabetes in mice and the effect of stem cells (Berashis) derived from human umbilical cord blood. J. Med 2002; 33: 181-187].
Хотя механизмы действия стволовых клеток пуповинной крови в лечении диабета неизвестны, предполагают, что при инфузии in vivo стволовые клетки дифференцируются в секретирующие инсулин клетки панкреатических островков [Haller MJ, Cooper SC, Brusco T, et al. Autologous cord blood transfusion associated with prolonged honeymoon in a child with type 1 diabetes. Diabetes 2005; 53 (Suppl 1): Poster A485], что было подтверждено в исследованиях in vitro [Sun В, Roh K-H, Lee S-R, Lee Y-S, Kang K-S. Induction of human umbilical cord blood-derived stem cells with embryonic stem cell phenotypes into insulin producing islet-like structures. Biochem Biophys Res Commun 2007, 354: 919-923].
Использование мононуклеарных клеток пуповинной крови в лечении хронического гепатита или цирроза печени описано в патенте RU 2 295 351. Недостатком способа является обязательное HLA-типирование и, более того, для достижения клинического эффекта стволовые клетки пуповинной крови донора должны отличаться от клеток реципиента не менее чем по четырем антигенам из набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR.
Что касается возможности использования стволовых клеток пуповинной крови в репарации костной и хрящевой ткани, то, в отличие от стволовых клеток костного мозга, их потенциальная роль в ортопедии не исследована. Наиболее распространенными ортопедическими нарушениями являются повреждения суставов, включая повреждения хрящей, связок и/или сухожилий, а также переломы. Стволовые клетки пуповинной крови способны к дифференцировке в костные клетки in vitro при индукции ударной волной [Wang FS, Yang KD, Wang СJ, et al. Shockwave stimulates oxygen radical-mediated osteogenesis of the mesenchymal cells from human umbilical cord blood. J Bone Mineral Res 2004; 19: 973-979]. Возможность использования клеток пуповинной крови при переломах была продемонстрирована на моделях животных с переломами бедра. Также была показана способность этих клеток дифференцироваться в клетки хрящевой ткани [Szivek JA, Wiley D, Сох L, Harris D, Margolis DS, Grana WA. Stem cells grown in dynamic culture on micropatterned surfaces can be used to engineer cartilage-like tissue. Abstract, Orthopaedic Research Society meeting, San Diego, CA, 2006].
Способность стволовых клеток пуповинной крови давать начало эпителиальной ткани открывает возможность их клинического применения в регенеративной медицине при заболеваниях глаз (роговица), кожи (заживление ран) и других органов (например, легкие и пищеварительный тракт). Внешний слой глаза состоит из центральной роговицы, лимбуса и склеры. Эпителий роговицы способен к быстрой регенерации и может быть использован как собственный источник стволовых клеток при регенерации. Дефицит эпителиальных клеток роговицы является важной причиной потери зрения, происходящей от химического или термического поражения, синдрома Стивенса-Джонсона, рубцовых изменений, аниридии, хронической розацеи, кератоконъюнктивита. При нарушении эпителия роговицы четкое изображение не может быть сфокусировано на сетчатке глаза. Аутологичная трансплантация эпителиальных стволовых клеток роговицы была успешна у пациентов с односторонним заболеванием. Однако получение клеток из функционального здорового глаза создает риск потери зрения для здорового глаза. Дополнительно, в билатеральных условиях аутологичная трансплантация недоступна, а аллотрансплантация стволовых клеток роговичного эпителия требует иммуносупрессивной терапии с возможными системными побочными эффектами, в результате чего средняя продолжительность выживания такого аллотрансплантата не превышает 2 лет. Повреждения роговицы тяжелой степени, требующие вмешательства, не являются исключением, составляя до 37% всех случаев потери зрения [Germain L, Auger FA, Grandbois E, et al. Reconstructed human cornea produced in vitro by tissue engineering. Pathobiology 1999, 67: 140-147 и Germain L, Carrier P, Auger FA, Salesse C, Guerin S L. Can we produce a human corneal equivalent by tissue engineering? Prog Retinal Eye Res 2000; 19(5): 497-527].
4
Исследователи группы Николса [Harris DT, He X, Camacho D, Gonzalez V, Nichols JC. The Potential of Cord Blood Stem Cells for Use in Tissue Engineering of the Eye, Stem Cells & Regenerative Medicine, Jan 23-25, 2006, San Francisco, Abstract и Nichols JC, He X, Harris DT. Differentiation of Cord Blood Stem Cells Into Corneal Epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci 2005; 46: E-Abstract 4772] использовали СD34-положительные стволовые клетки пуповинной крови как источник ткани для реконструкции поверхности глаза. Гистологические и иммуногистохимические исследования эпителия, образованного из клеток пуповинной крови, выявили, что слой дифференцированных клеток был морфологически неотличим от эпителия роговицы. Новообразованные клетки были также способны экспрессировать специфический маркер эпителия роговицы - цитокератин k3. При трансплантации стволовых клеток кроликам была восстановлена роговица с образованием оптически ясной поверхности. Способность стволовых клеток пуповинной крови дифференцироваться в эпителиальные клетки роговицы предполагает возможность их использования для ускорения заживления ран различной этиологии, например диабетических язв. Согласно этой гипотезе, в 2004 г. было показано, что аллогенные стволовые клетки пуповинной крови способны инициировать восстановление раневых повреждений кожи [Valbonesi М, Giannini G, Migliori F, Dalla Costa R, Dejana AM. Cord blood (CB) stem cells for wound repair. Preliminary report of 2 cases. Transfus Apher Sci 2004; 30(2): 153-156]. Клетки-предшественники были смешаны с аутологичным фибриновым матриксом и в концентрации 3x10 введены в область, прилежащую к повреждениям. Спустя 3-7 месяцев после инъекции наблюдалось значительное заживление повреждений кожи у обоих пациентов.
Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из основных причин смертности и нетрудоспособности населения. Клетки сердечной ткани имеют ограниченную способность к регенерации, и использование стволовых клеток могло бы быть эффективной заменой традиоционных методов терапии.
На моделях животных получены данные, свидетельствующие о миграции стволовых клеток к поврежденной ткани миокарда, увеличении плотности капилляров в участке повреждения и улучшении функции сердца [Botta R, Gao Е, Stassi G, et al. Heart infarct in NOD-SCID mice: therapeutic vasculogenesis by transplantation of human CD34+cells ad low dose D34+KDR+cells. FASEB J 2004; 18: 1392-1394; Henning RJ, Abu-Ali H, Balis JU, et al. Human umbilical cord blood mononuclear cells for treatment of acute myocardial infarction. Cell Transplant 2004; 13: 729-739; Chen HK, Hung HF, Shyu KG, et al. Combined cord blood cells and gene therapy enhances angiogenesis and improves cardiac performance in mouse after acute myocardial infarction. Eur J Clin Invest 2005; 35: 677-686; Hirata Y, Sata M, Motomura N, et al. Human umbilical cord blood cells improve cardiac function after myocardial infarction. Biochem Biophys Res Commun 2005; 327: 609-614; Kim BO, Tian H, Prasongsukarn K, et al. Cell transplantation improves ventricular function after a myocardial infarction: a preclinical study of human unrestricted somatic stem cells in a porcine model. Circulation 2006; 112 (9 suppl): 196-204 и Leor J, Guetta E, Feinberg MS, et al. Human umbilical cord blood-derived CD133+cells enhance function and repair of the infracted myocardium. Stem Cells 2006; 24(3): 772-780].
Gaballa с соавторами [Furfaro MEK, Gaballa MA. Do adult stem cells ameliorate the damaged myocardium? Is human cord blood a potential source of stem cells? Curr Vascular Pharm 2007; 5: 27-44] на модели инфаркта миокарда у крыс показали, что СD34-положительные клетки пуповинной крови индуцируют формирование кровеносных сосудов, уменьшают размеры инфаркта, восстанавливают функцию сердца. Полагают, что эти эффекты обусловлены высвобождением ангиогенных факторов и факторов роста (например, VEGF, EGF, ангиопоэтин-1, 2 и др.), индуцируемых гипоксией.
Способность плюрипотентных клеток пуповинной крови формировать кровеносные сосуды и восстанавливать миокард показана в исследованиях по восстановлению сердечной функции после инфаркта миокарда с использованием CD34+, СD133+CD45-клеток на различных моделях у животных [Botta R, Gao Е, Stassi G, et al. Heart infarct in NOD-SCID mice: therapeutic vasculogenesis by transplantation of human CD34+ cells ad low dose CD34+KDR+ cells. FASEB J 2004; 18: 1392-1394; Kim BO, Tian H, Prasongsukarn K, et al. Cell transplantation improves ventricular function after a myocardial infarction: a preclinical study of human unrestricted somatic stem cells in a porcine model. Circulation 2006; 112 (9 suppl): 196-204; Leor J, Guetta E, Feinberg MS, et al. Human umbilical cord blood derived CD133+ cells enhance function and repair of the infracted myocardium. Stem Cells 2006; 24(3): 772-780 и Bonnano G, Mariotti A, Procoli A, et al. Human cord blood CD133+ cells imunoselected by a clinical-grade apparatus differentiate in vitro into endothelial-and cardiomyocyte-like cells. Transfusion 2007; 47: 280-289].
Цереброваскулярные заболевания находятся на одном из первых мест по причине смертности, не включая индивидуумов, выживших после инсульта, но с последствиями, проявляющимися в течение оставшегося периода жизни.
Церебральная ишемия является наиболее превалирующей причиной инсультов. В относительно молодом возрасте вследствие пластичности мозга достаточно большая часть мозга может быть удалена (в случае опухолей или гемисферектомии при серьезных повреждениях) без неврологических повреждений или с незначительным периодом восстановления. Эти данные предполагают, что чем моложе нервные клетки, которые могли бы быть продуцированы путем дифференциации из стволовых клеток, тем больше возможность регенерации поврежденного мозга.
В течение всей жизни человека постоянно существует риск неврологических заболеваний и травм. Так, высока частота встречаемости церебрального паралича у новорожденных. От повреждений спинного мозга страдают как дети, так и взрослые. Риск эмболических и геморрагических инсультов увеличивается среди индивидуумов, достигших 40 лет. И, наконец, после 40 лет и в пожилом возрасте высока частота нейродегенеративных заболеваний, как, например, болезнь Паркинсона [Harris, D. Т., Badowski, М., Ahmad, N., & Gaballa, М. (2008). The potential of cord blood stem cells for use in regenerative medicine. Expert Opinion on iological Therapy, 7(9), 1311-1322 и Harris, D.Т., & Rogers, I. (2007). Umbilical cord blood: a unique source of pluripotent stem cells for regenerative medicine. Current Stem Cell Research & Therapy, 2, 301-309]. Традиционные методы терапии, применяемые относительно неврологических заболеваний и травм, неэффективны, что ложится бременем на общество. Использование стволовых клеток в случае неврологических заболеваний или травм открыло бы возможности замещения или регенерации поврежденных тканей спинного или головного мозга. Тем не менее, успех зависит от выбора источника стволовых клеток и соответствующего их применения.
В отличие от многих других патологических состояний, которые были оценены на возможность терапии стволовыми клетками пуповинной крови, восстановление неврологических повреждений имеет намного более сложную этиологию.
Однако на моделях животных с неврологическими повреждениями, обусловленными травмами мозга, инфузия стволовых клеток пуповинной крови приводила к улучшению состояния [Chen J, Sanberg PR, Li Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32: 2682-2688; Willing AE, Lixian J, Milliken M, et al. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke. J Neurosci Res 2003; 73(3): 296-307; Borlongan CV, Hadman M, Sanberg CD, Sanberg PR. Central Nervous System Entry of Peripherally Injected Umbilical Cord Blood Cells Is Not Required for Neuroprotection in Stroke. Stroke 2004; 35: 2385-2389; Newman MB, Willing AE, Manressa JJ, Sanberg CD, Sanberg PR. Cytokines produced by cultured human umbilical cord blood (HUCB) cells: implications for brain repair. Exp Neurol 2006, 199(1): 201-208; Vendrame M, Cassady J, Newcomb J, et al. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose dependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume. Stroke 2004; 35: 2390-2395; Xiao J, Nan Z, Motooka Y, Low WC. Transplantation of a novel cell line population of umbilical cord blood stem cells ameliorates neurological deficits associated with ischemic brain injury. Stem Cells Dev 2005; 14: 722-733; Newcomb JD, Ajrno CT, Sanberg CD, et al. Timing of Cord Blood Treatment After Experimental Stroke Determines Therapeutic Efficacy. Cell Transplant 2006; 15: 213-223; Nan Z, Grande A, Sanberg CD, Sanberg PR, Low WC. Infusion of Human Umbilical Cord Blood Ameliorates Neurologic Deficits in Rats with Hemorrhagic Brain Injury. Ann NY Acad Sci 2005, 1049(1): 84 - 96; Bliss T, Guzman R, Daadi M, Steinberg GK. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke 2007; 38: 817-826; Saporta S, Kim JJ, Willing AE, et al. Human umbilical cord blood stem cells infusion in spinal cord injury: engraftment and beneficial influence on behavior. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12:271-278; Kuh SU, Cho YE, Yoon DH, et al. Functional recovery after human umbilical cord blood cells transplantation with brain derivedneurotropic factor into the spinal cord injured rats. Acta Neurochir (Wein) 2005; 14: 985-992; Kang KS, Kim SW, Oh YH, et al. Thirty-seven-year old spinal cord-injured female patient, transplanted of multipotent stem cells from human UC blood with improved sensory perception and mobility, both functionally and morphologically: A case study. Cytotherapy 2005; 7: 368-373; Lu D, Sanberg PR, Mahmood A, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury. Cell Transplant 2002; 11:275-281; Meier C, Middleanis J, Wasielewski B, et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells. Ped Res 2006; 59: 244-249; Ende N, Chen R. Parkinson's Disease Mice and Human Umbilical Cord Blood. J Med 2002; 33: 173-80; Gaebuzova-Davis S, Willing AE, Zigova T, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and differentiation. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12: 255-270].
Jang et al. [Jang YK, Park JJ, Lee MC, et al. Retinoic acid-mediated induction of neurons and glial cells from human umbilical cord-derived hematopoietic stem cells. J Neurosci Res 2004; 75: 573-584] продемонстрировали, что CD 133+ стволовые клетки пуповинной крови при воздействии ретиноевой кислоты дифференцируются в нервные (астроциты и олигодендроциты) и глиальные клетки с нейромаркерами, включая тубулин, нейроспецифическую энолазу, NeuN, ассоциированный с микротубулином белок-2 (МАР2) и кислый глиальный фибриллярный белок (GFAP), являющийся астроцитоспецифичным маркером.
Более того, негемопоэтические стволовые клетки, найденные в пуповинной крови, способны дифференцироваться в астроциты и олигодендроциты [Buzanska L, Jurga М, Stachowiak ЕК, Stachowiak МК, Domanska-Janik К. Neural stem-like cell line derived from a nonhematopoietic population of human umbilical cord blood. Stem Cells Develop 2006; 15: 391-406]. Таким образом, потомки негемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови также могли бы быть полезны для использования в лечении повреждений мозга и неврологических расстройств.
На модели повреждений спинного мозга у крыс инфузия стволовых клеток пуповинной крови приводила к значительным улучшением на 5-й день после инфузии по сравнению с контрольными животными. Стволовые клетки выявлялись в областях повреждений нервной ткани, но не обнаруживались в неповрежденных областях спинного мозга [Saporta S, Kim JJ, Willing AE, et al. Human umbilical cord blood stem cells infusion in spinal cord injury: engraftment and beneficial influence on behavior. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12:271-278]. Эти данные дополняют результаты исследований о способности клеток пуповинной крови, трансплантированных в спинной мозг животных с травмами, дифференцироваться в нервные клетки различного типа, улучшая регенерацию аксонов и моторную функцию [Kang KS, Kim SW, Oh YH, et al. Thirty-seven-year old spinal cord-injured female patient, transplanted of multipotent stem cells from human UC blood with improved sensory perception and mobility, both functionally and morphologically: A case study. Cytotherapy 2005; 7: 368-373].
В 2001 г. на наиболее распространенной модели инсульта (медиальная закупорка сонной артерии) было продемонстрировано, что инфузия крысам клеток пуповинной крови может улучшить различные физические и поведенческие дефицитные состояния, связанные с болезнью [Chen J, Sanberg PR, Li Y, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32: 2682-2688].
Исследования демонстрируют, что прямая инъекция стволовых клеток в мозг не требуется [Willing AE, Lixian J, Milliken M, et al. Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke. J Neurosci Res 2003; 73(3): 296-307] и, фактически, положительные эффекты можно наблюдать, даже если стволовые клетки не достигают органа-мишени (вероятно, через высвобождение факторов роста и репарации, запускаемое путем аноксии) [Borlongan CV, Hadman М, Sanberg CD, Sanberg PR. Central Nervous System Entry of Peripherally Injected Umbilical Cord Blood Cells Is Not Required for Neuroprotection in Stroke. Stroke 2004; 35: 2385-2389 и Newman MB, Willing AE, Manressa JJ, Sanberg CD, Sanberg PR. Cytokines produced by cultured human umbilical cord blood (HUCB) cells: implications for brain repair. Exp Neurol 2006; 199(1): 201-208].
Является значительным, что в отличие от использования фармацевтических препаратов, для которых требуется применение в первые несколько часов после инсульта, терапия стволовыми клетками пуповинной крови эффективна до 48 часов после тромботического инцидента [Newcomb JD, Ajmo CT, Sanberg CD, et al. Timing of Cord Blood Treatment After Experimental Stroke Determines Therapeutic Efficacy. Cell Transplant 2006; 15: 213-223]. Преимущества терапии клетками пуповинной крови также показаны на модели геморрагического инсульта [Nan Z, Grande A, Sanberg CD, Sanberg PR, Low WC. Infusion of Human Umbilical Cord Blood Ameliorates Neurologic Deficits in Rats with Hemorrhagic Brain Injury. Ann NY Acad Sci 2005; 1049(1): 84-96].
Способ лечения инсульта на основе трансплантации стволовых клеток костного мозга описан в патенте RU 2 283 121. Существенным недостатком способа является нейрохирургическое вмешательство: интрацеребральное стереотаксическое введение стволовых клеток под нейронавигационным контролем в область поражения функционально важных структур (в зависимости от клинических проявлений). При выявлении дефицита перфузии вещества головного мозга эта операция дополняется наложением экстраиптракраниального микроанастамоза.
Хотя костный мозг является источником гемопоэтических, мезенхимальных и эндотелиальных стволовых клеток, большинство стволовых клеток костного мозга получают от взрослых доноров, что ограничивает их пластичность. Клетки пуповинной крови, полученные при рождении, являются уникальным источником плюрипотентных стволовых клеток [Atala et al. Umbilical Cord Blood Current Stem Cell Research & Therapy, 2007, Vol.2, No. 4 307]. Более того, клетки пуповинной крови не подвергаются индуцированным окружающей средой эпигенетическим воздействиям.
Использование мононуклеарных клеток пуповинной крови в лечении ишемической болезни сердца, инфаркта миокарда, ишемии мозга, вызванной атеросклерозом или острым нарушением мозгового кровообращения, описано в патенте RU 2 284 190. Недостатком способа является обязательное HLA-типирование, и, более того, для достижения клинического эффекта при ишемических состояниях стволовые клетки пуповинной крови донора должны отличаться от клеток реципиента не менее чем по четырем антигенам из набора антигенов HLA-A, HLA-B, HLA-DR.
Помимо инсультов, на моделях животных показана возможность использования стволовых клеток пуповинной крови в лечении других форм неврологических повреждений. Среди них [Lu et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces neurological deficit in the rat after traumatic brain injury. Cell Transplant 2002; 11:275-281] на модели крыс было показано, что внутривенное введение мононуклеарных клеток пуповины могло бы быть полезно для лечения травматических повреждений мозга. Причем, было продемонстрировано, что клетки пуповинной крови достигают мозга, селективно мигрируют к поврежденной области мозга, экспрессируют нейромаркеры и уменьшают неврологическое повреждение.
Сходно, трансплантация стволовых клеток пуповинной крови также могла облегчить симптомы церебрального паралича у новорожденных на модели крыс [Meier С, Middleanis J, Wasielewski В, et al. Spastic paresis after perinatal brain damage in rats is reduced by human cord blood mononuclear cells. Ped Res 2006; 59: 244-249].
Регенеративная терапия с использованием стволовых клеток пуповинной крови, фокусируясь на функциональном восстановлении поврежденных тканей, особенно актуальна при заболеваниях центральной нервной системы, в частности дегенеративных заболеваниях.
Болезнь Альцгеймера является наиболее частой причиной развития слабоумия в пожилом и старческом возрасте. Главную роль в патогенезе первичного нейродегенеративного альцгеймеровского процесса отводят нарушению превращений белка-предшественника β-амилоида (Аβ), сопровождающегося накоплением нерастворимого Аβ в мозговой паренхиме в виде агрегированных скоплений - амилоидных бляшек. Агрегаты Аβ в свою очередь являются потенциальными активаторами микроглии и астроцитов, которые отвечают на церебральный амилоидоз активацией хронического воспалительного процесса [Benzing W.C., Wujek J.R., Ward Е.К., Shaffer D., Ashe K.H. et al. Evidence for glialmediated inflammation in aged APP(SW) transgenic mice. Neurobiol Aging, 1999, 20, p.581-589].
Хотя ранее считалось, что активация микроглии и астроцитов представляет собой только эпифеномен и не участвует в патогенезе болезни Альцгеймера, недавние исследования установили, что вызванный Аβ воспалительный каскад является одним из важных патогенетических механизмов нейродегенеративного процесса альцгеймеровского типа. Доказано, что терапевтические стратегии, направленные на разные компоненты этого воспалительного каскада, в том числе нестероидные противовоспалительные средства, иммунизация и модулирование микроглиальной активации, редуцируют альцгеймероподобную β-амилоидную патологию, когнитивный дефицит и поведенческие нарушения на модели болезни Альцгеймера у трансгенных мышей, а в некоторых случаях уменьшают и патологию у пациентов с болезнью Альцгеймера [Bard F., Cannon С, Barbour R., Burke R.L., Games D. et al. Peripherally administered antibodies against amyloid-beta-peptide enter the central nervous system and reduce pathology in a mouse model of Alzheimer disease. Nature Med., 2000, 6, p.916-919; Lim G.P., Chu Т., Yang F., Beech W., Frautschy S.A. et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J. Neurosci, 2001, 21, p.8370-8377; Nicoll J.A., Wilkinson D., Holmes C, Steart P., Markham H. et al. Neuropathology of human Alzheimer disease after immunization with amyloid- beta peptide: a case report. Nature Med., 2003, 9, p.448-452; Scheme D., Barbour R., Dunn W., Gordon G., Grajeda H. et al. Immunization with amyloid-beta attenuates Alzheimer-disease-like pathology in the PDAPP mouse. Nature, 1999, 400, p.173-177; Szekely C.A., Thorne J.E., Zandi P.P., Ek M., Messias E. Nonsteroidal antiinflammatory drugs for the prevention of Alzheimer's disease: a systematic review. Neuroepidemiology, 2004, 23, p.159-169; Veld B.A., Ruitenberg A., Hofman A., Launer L.J., van Duijn CM. Nonsteroidal anti-inflammatory drugs and the risk of Alzheimer's disease. N. Engl. J. Med., 2001, 345, p.1515-1521].
Как было показано на моделях животных, клетки пуповинной крови человека усиливают противовоспалительный ответ Т-хелперов 2 типа, причем этот ответ сопровождался уменьшением объема инфаркта в ткани мозга [Vendrame М., Cassady J., Newcomb J., Butler Т., Pennypacker K.R. et al. Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dose-dependently rescues behavioral deficits and reduces infract volume. Stroke, 2004, 35, p.2390-2395]. Позднее этот терапевтический эффект был подтвержден и на других моделях нейровоспалительных процессов [El-Badri N.S., Hakki А., Saporta S., Liang X., Madhusodanan S. et al. Cord for glial-mediated inflammation in aged APP(SW) transgenic mice. Neurobiol blood mesenchymal stem cells: Potential use in neurological disorders. Stem Cells Dev., 2006, 15, p.497-506; Garbuzova-Davis S., Gografe S.J., Sanberg CD., Willing A.E., Saporta S. et al., Maternal transplantation of human umbilical cord blood cells provides prenatal therapy in Sanfilippo type В mouse model. FASEB J., 2006, 20, p.485-487; Henning R.J., Burgos J.D., Ondrovic L., Sanberg P., Balis J. et al. Human umbilical cord blood progenitor cells are attracted to infracted myocardium and significantly reduce myocardial infarction size. Cell Transplant., 2006, 15, p.647-658].
В экспериментах на животных на модели болезни Альцгеймера этот эффект ассоциировался с увеличением продолжительности жизни трансгенных мышей [Nikolic W.V., Hou Н., Town Т., Zhu Y., Giunta В. Peripherally administered human umbilical cord blood cells reduce parenchymal and vascular β-amyloid deposits in Alzheimer mice. Stem Cells Dev., 2008, 17, p.1-17], сообщили о заметной редукции уровня Аβ и численности амилоидных бляшек у трансгенных мышей после серии в/в введений концентрата стволовых клеток пуповинной крови.
Болезнь Паркинсона, частота которой в пожилом возрасте также является высокой, является нейродегенеративным заболеванием с "точечным" локусом - поражением клеток черной субстанции, ведущим к их гибели. И хотя история изучения данной патологии длится уже почти два столетия, этиология и генез этого процесса достоверно не известны. Гипотезы о экзотоксической роли некоторых веществ (например, 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрогидроперидин, превращающийся под действием МАО В в токсическое для нейронов черной субстанции соединение N-метил-4-фенилпиридин) или генетическом факторе (связь с сегментом 4q21-q23, наследуемая по аутосомно-доминантному типу) являются все же предположениями [Cleeter MWJ et al.: Irreversible inhibition of mitochondrial complex I by 1-methyl-4-phenylpyridinium: Evidence for free radical involvement. J Neurochem 58:786, 1992; Polymeropoulos MH et al.: Mapping of a gene for Parkinson's disease to chromosome 4q21-q23. Science 274: 1197, 1996].
Образующийся вследствие гибели вышеуказанных клеток дефицит дофаминосинтезирующей функции ведет к сбою работы медиаторной цепочки экстрапирамидной системы, который приводит к торможению моторной коры, что приводит к клиническим симптомам болезни Паркинсона. Актуальность исследования данной проблемы диктуется также и эпидемиологическими данными (распространенность болезни Паркинсона среди населения в целом составляет 1-2 на 1000, а среди лиц старше 65 лет данным недугом страдает уже каждый сотый).
Используемые в настоящее время методы медикаментозной коррекции (препараты, содержащие L-ДОРА; агонисты Д2/Д3 дофаминовых рецепторов; ингибиторы МАО и др.) не являются эффективными, поскольку ведут к прогрессированию процесса и представляют симптоматический подход с массой ограничений (Aminoff MJ: Treatment of Parkinson's disease. West J Med 161: 303, 1994). Более того, применение данной терапии имеет ограничения по времени. Таким образом, восстановление нормальной естественной продукции дофамина реанимированными (или новыми выросшими) клетками черной субстанции является ключевой проблемой в лечении болезни Паркинсона. Учитывая дегенеративный характер патологического процесса при болезни Паркинсона, осуществление клеточной интервенции с целью восстановления опустошенного участка нервной ткани является наиболее привлекательным.
Для бокового амиотрофического склероза, болезни Паркинсона на моделях животных инфузия стволовых клеток пуповинной крови приводила к заметному улучшению поведения по сравнению с контрольными животными [Ende N, Chen R. Parkinson's Disease Mice and Human Umbilical Cord Blood. J Med 2002; 33: 173-80; Garbuzova-Davis S, Willing AE, Zigova T, et al. Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis: distribution, migration, and differentiation. J Hematother Stem Cell Res 2003; 12: 255-270].
Были предприняты попытки использовать эмбриональные стволовые клетки и взрослые стволовые клетки костного мозга при ишемических инсультах и паркинсонизме в клинических исследованиях. Так, были предложены способы лечения ишемического инсульта и паркинсонизма с использованием предварительно размноженных в культуре нейрональных стволовых клеток, полученных из ткани переднего мозга или перивентрикулярной области головного мозга абортированных эмбрионов человека (патенты RU 2258521 и RU 2259836). Однако возможность использования эмбриональных стволовых клеток и стволовых клеток костного мозга в терапии ограничена ввиду существенных недостатков.
Использование фетальных стволовых клеток связано с этическими проблемами, трудностями культивирования клеток и сопряжено с высоким риском контаминации материала бактериальной и/или вирусной микрофлорой. При введении фетальных стволовых клеток путем инфузии без долговременных и дорогостоящих этапов культивирования и дифференциации in vitro возможна злокачественная трансформация эмбриональных клеток, наиболее общей угрозой является образование тератомы. Нежелательной является и длительная иммуносупрессия, которая необходима при использовании эмбриональных клеток из-за угрозы иммунного отторжения. Существенным недостатком способов лечения ишемических инсультов и паркинсонизма, описанных в патентах RU 2258521 и RU 2259836, является и эндолюмбальный способ трансплантации.
9
9
Известен способ лечения бокового амиотрофического склероза путем введения в кровь ядросодержащих клеток пуповинной крови в количестве не менее 5×10 (WO 2004/071283). При осуществлении способа, описанного в WO 2004/071283, не требуется предварительного подавления иммунного ответа или HLA-типирования донора и реципиента, однако для его осуществления необходимы чрезвычайно большие количества клеток. Количество ядросодержащих клеток в одной порции пуповинной крови не превышает 2,8×10. Этого количества недостаточно для осуществления способа. Таким образом, требуется не только одномоментное введение в организм аллогенных клеток, но и клеток от нескольких разных доноров. При этом резко возрастает риск аллергических, в том числе анафилактических реакций, а также риск развития других иммунопатологических состояний, включая иммунодепрессию.
Кроме того, одновременная иммунизация клетками различных доноров приводит к невозможности повторного применения способа у того же больного. Применение способа в 5 случаях из 10 привела к токсическим и аллергическим реакциям с развитием у всех больных иммуносупрессии в течение 7-30 дней после введения. Попытка повторного применения способа приводила к токсико-аллергическим реакциям у большинства пациентов.
Проблема лечения рассеянного склероза, хронического демиелинизирующего заболевания центральной нервной системы (ЦНС), остается одной из самых актуальных в современной неврологии, что объясняется высокой распространенностью заболевания среди лиц молодого трудоспособного возраста и неизбежным развитием на определенной стадии стойкой инвалидизации.
Выявление различных типов демиелинизации, от преобладания воспалительных реакций до олигодендроглиопатии и аномальной ремиелинизации, а также доказательства аксонального повреждения не только в активных очагах, но и во внешне неизмененном белом веществе сблизили рассеянный склероз с нейродегенеративными заболеваниями [Lucchinetti С.et al. Brain Pathol., 1996, V.6, P.25922; Trapp B.D. et al. Neuroscience, 1999, V.5, p.48].
Иммунопатологические механизмы развития обострений при рассеянном склерозе [Завалишин И.А., Захарова М.Н. Рассеянный склероз и другие демиелинизирующие заболевания. /Под ред. Гусева Е.И. и др. М., 2004, С.60; Рассеянный склероз. Избранные вопросы теории и практики. /Под ред. Завалишина И.А., Головкина В.И. М., 2000; Hohlfeld R. Brain, 1997, V.120, P.865] включают активацию энергичных, неактивных Т-клеток типа CD4+ вне ЦНС; проникновение их через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ); образование тримолекулярного комплекса, включающего соответствующий рецептор активированной Т-клетки и аутоантиген, связанный с молекулами II класса главного комплекса гистосовместимости на антигенпрезентирующих клетках (в качестве последних выступают макрофаги и клетки глии). Проникшие в нервную систему аутореактивные Т-клетки и вторично активированные макрофаги и микроглия секретируют провоспалительные цитокины (интерферон-гамма, фактор некроза опухолей-альфа, лимфотоксин и др.), которые в свою очередь в еще большей степени индуцируют и поддерживают воспалительные реакции и усиливают нарушения проницаемости ГЭБ. Несмотря на то что клиническое течение рассеянного склероза на начальных этапах обычно характеризуется чередованием обострений и ремиссий, иммуновоспалительный процесс в целом характеризуется постоянным течением.
В результате каскада иммунологических и биохимических нарушений развивается повреждение миелина и олигодендроцитов. На более поздних этапах патологического процесса активируются неспецифические механизмы: фагоцитоз поврежденных структур и пролиферация глиальных элементов. Однако помимо развития воспалительных реакций, демиелинизирующего процесса и глиальных нарушений, основная роль в развитии рассеянного склероза отводится вовлечению в процесс аксонов. Именно аксональное повреждение при рассеянном склерозе считают ответственным за развитие необратимого неврологического дефицита и трансформацию ремиттирующего течения с лабильностью симптомов во вторично-прогрессирующее [Trapp B.D. et al. Neuroscience, 1999, V.5, P.48].
Рассматривается несколько наиболее вероятных причин деструкции аксонов при рассеянном склерозе. Механизмом прямой иммунологической атаки аксонов при рассеянном склерозе считают экспрессию на них молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости, что делает их уязвимыми к цитотоксическому влиянию Т-лимфоцитов типа CD8+ [Neumann Н. et al. Science, 1995, V.269, P.549]. Развитие аксональной дегенерации, обусловленной воспалительными реакциями, может быть связано с различными факторами [Rieckmann P., Maurer М. Curr. Opin. Neurol., 2002, V.15, p.361], в том числе увеличением внеклеточного давления при воспалительном отеке; повреждением в результате воздействия глутамата (продуцируемого активированными макрофагами и микроглией) на олиго-дендроглиальные АМРА-рецепторы; выделением провоспалительных цитокинов.
Однако дегенеративные изменения аксонов возможны и при хроническом демиелинизирующем процессе за счет нарушения миелин-аксональных взаимодействий и трофического влияния олигодендроглиоцитов, в частности модулирующего воздействия миелин-ассоциированного гликопротеина и протеолипидного протеина. Механизмы их трофического влияния на аксон различны, однако при дефиците обоих упомянутых белков аксональная патология развивается в нодальной области с поражением аксонального цитоскелета [Trapp B.D. et al. Neuroscience, 1999, v.5, p.48].
Другим важным аспектом аксонально-глиальных взаимодействий является воздействие трофических факторов. Так, в группе больных рассеянным склерозом с ранним началом и тяжелым течением болезни были выявлены мутации, приводящие к отсутствию цилиарного нейротрофического фактора [Ciess R. et al. Arch. Neurol., 2002, v.59, p.407]. Аналогичное влияние на течение заболевания описано и у пациентов с аллелем е4 аполипопротеина Е, у которых отмечены раннее начало, более высокая частота обострений и более быстрое прогрессирование болезни [Fazekas F. et al. Neurology, 2001, v.57, p.853]. Эти данные свидетельствуют о том, что, независимо от иммуноопосредованного повреждения миелина и аксонов, генетически детерминированная структурная и молекулярная целостность аксонально-глиальных взаимодействий имеет важное значение при демиелинизирующем процессе.
Развитие неврологического дефицита при рассеянном склерозе рассматривают с точки зрения двух патогенетических механизмов: обратимой острой воспалительной демиелинизации, доминирующей при обострении заболевания при ремиттирующем течении рассеянного склероза, и необратимой аксональной дегенерации, преобладающей при вторично-прогрессирующем течении [Trapp B.D. et al. Neuroscience, 1999, V.5, P.48].
Эти же изменения обусловливают и развитие атрофических процессов в ЦНС при рассеянном склерозе. Во-первых, сама демиелинизация ведет к потере компактного миелина и, следовательно, паренхимы мозга. Во-вторых, в результате повреждения аксонов в острых очагах демиелинизации вторично развивается аксональная дегенерация.
Особое место занимает первично-прогрессирующий вариант течения рассеянного склероза, имеющий клинические, генетические, иммунобиохимические, нейровизуализационные и морфологические отличия от ремиттирующего и вторично-прогрессирующего вариантов [Ge Y. et al. Radiology, 2000, V.214, P.665; Redmond IT. Et al. Acta Neurol. Scand., 2000, V.102, P.99], что позволяет предполагать наличие при первично-прогрессирующем течении рассеянного склероза особых патогенетических механизмов. В их числе рассматривают первичное поражение олигодендроглиоцитов, вторичную демиелинизацию при отсутствии ремиелинизации и признаков воспаления, а также диффузную аксональную патологию, которые могли бы обусловить постепенное нарастание неврологического дефицита с самого начала заболевания.
Одной из стандартных схем в терапии рассеянного склероза в настоящее время является применение глюкокортикостероидов (внутривенная пульс-терапия метилпреднизолоном, таблетированный метилпреднизолон), положительно влияющих на скорость восстановления неврологических нарушений при обострении болезни [Goodin D.S. et al. Neurology, 2002, V.58, P.169]. Кроме этого, пульс-терапию используют и при ухудшении состояния на фоне вторичного прогрессирования неврологических симптомов. При первично-прогрессирующем рассеянном склерозе она, как правило, не дает эффекта. Для купирования тяжелых обострений рассеянного склероза при выраженном неврологическом дефиците, особенно при нарушении жизненно важных функций, может использоваться плазмаферез в сочетании с внутривенным введением метилпреднизолона.
Для предотвращения или снижения частоты обострений, стабилизации состояния, предупреждения трансформации в прогрессирующее течение (при ремиттирующем рассеянном склерозе), а также замедления нарастания инвалидизации при вторично-прогредиентном течении назначают в качестве иммуномодулирующих препаратов интерфероны (бетаферон и ребиф для подкожного введения, аво-некс для внутримышечного введения) и глатирамера ацетат (Копаксон-Тева).
Из побочных эффектов при лечении интерферонами отмечаются гриппоподобные (лихорадка, головные и мышечно-суставные боли), местные (гиперемия, болезненность), сердечно-сосудистые (гипотензия, тахикардия и аритмии) и гематологические (лейкопения, тромбоцитопения) реакции; изменения функции печени (повышение уровня билирубина, трансаминаз); неврологические симптомы (нарастание спастичности, реже - усугубление другой неврологической симптоматики на фоне гриппоподобных явлений). Наиболее частыми побочными эффектами при применении глатирамера ацетата являются местные реакции, однако возможно развитие и общих системных побочных эффектов, включающих клинические проявления вазодилатации, боли в груди, одышку, учащенное сердцебиение, состояние тревоги.
При применении традиционной терапии как при ремиттирующем, так и при вторично-прогрессирующем рассеянном склерозе показана необходимость непрерывного курса лечения. Кроме того, учитывая иммуногенность и побочные эффекты каждого из препаратов, модулирующих течение рассеянного склероза, при назначении данной терапии необходим индивидуальный подход.
В последние годы опубликованы результаты испытаний внутривенного введения иммуноглобулина G в ограниченных группах больных. Они свидетельствуют о возможном снижении числа обострений при ремиттирующем течении болезни. Однако в настоящее время отсутствие клинических исследований и четко установленной схемы введения при высокой стоимости препарата являются основными проблемами в применении иммуноглобулина G при рассеянном склерозе.
В основе всех проблем психического и неврологического дефицита при заболеваниях головного мозга лежит нарушение работы нейронов головного мозга. К сожалению, в клинике в настоящее время еще нет эффективных методов для решения этой задачи. В свете сказанного использование клеточной терапии с целью усиления регенерации нервной ткани, стимуляции биологической активности поврежденных нейронов может оказаться весьма плодотворным.
Повышение эффективности лечения больных шизофренией является одной из наиболее актуальных задач современной психиатрии, что связано с тяжелыми последствиями этого заболевания, а также проблематичностью и дискуссионностью принципиальной возможности обратной редукции части симптоматики с компенсацией некоторых утраченных функций и, наконец, с фармакогенным дефицитом, обусловленным побочными эффектами терапии нейролептиками.
В качестве значимой характеристики ремиссий при шизофрении в современной психиатрии выделяются параметры когнитивного функционирования, изучение которых получило статус самостоятельного научного направления [Green M.F. What are the functional consequences of neurocognitive deficits in schizophrenia? Am. J. Psychiat. 1996, vol.153, p.p.321-330; Green M.F., Olivier В., Crawley J.N., Perm D.L., Silverstein S. Social Cognition in Schizophrenia: Recommendations from the Measurement and Treatment Research to Improve Cognition in Schizophrenia New Approaches Conference. Schizophr Bull. Oct 2005, vol.31, p.p.882-887; Green M.F., Perm D.L., Bentall R., Carpenter W.T., Gaebel W., Gur R.C., Kring A.M., Park S., Silverstein S.M., Heinssen R. Social Cognition in Schizophrenia: An NIMH Workshop on Definitions, Assessment, and Research Opportunities. Schizophr Bull. Nov 2008, vol.34, p.p.1211-1220].
Признаки снижения познавательных функций у больных шизофренией, которые встречаются, по меньшей мере, в 10 раз чаще, чем у здоровых (85-94% против 7% соответственно) [Saykin A.J., Shtasel D.L., Gur R.E. et al. Neuropsyhological deficits in neuroleptic naive patients with first-episode schizophrenia. Arch. Gen. Psyhiatry 1994, vol. 51, p.p.124-131], предваряют развитие манифестного психоза, усиливаясь при экзацербации и возвращаясь к «базовому» уровню по его миновании [Spaulding W.D., Fleming S.K., Reed D et al. Cognitive functioning in schizophrenia: implications for psychiatric rehabilitation. Schizophr. Bull, 1999, vol.25, p.p.275-289]. При этом нарушения, определяемые термином «нейрокогнитивный дефицит», коррелируют с выраженностью негативной симптоматики [Harvey P.D., Keefe S.E. Cognition and new antipsychotic. J. Adv. Schizophr. Brain. Res., 1998, vol.1, p.2-8].
Нейрокогнитивный дефицит (бедность ассоциативного процесса, нарушения внимания, памяти и продуктивности мышления, скорости переработки информации и исполнительных/экзекутивных функций) рассматривается в качестве предшественника не только исхода заболевания, но и адаптивных возможностей пациентов [Gold J.M., Harvey P.D. Cognitive deficits on schizophrenia. Psychiatr. Clin. Norm. Am., 1993, vol.16, p.p.295-312; Gallhofer B. Preserving cognitive function - optimizing integration into the community. Schizophr. Rew. 1995, vol. 3, Suppl. 2, №8, p.p.3-4; Stratta P., Daneluzzo E., Bustini M. et al. Schizophrenic deficit in the processing of contex. Arch. Gen. Psychiat. 1998, vol. 55, p.p.186-187; Weickert T.W., Goldberg Т.Е. The course of cognitive impairment in patients with schizophrenia. Cognition in Schizophrenia. Impairments, Importance and Treatment Strategies. Sharma Т., Harvey Ph. (eds.), Oxford University Press, Oxford - New York, 2000, p.p.3-16; Breier A.F. Cognitive deficit in schizophrenia and its neurochemical basis. Br. J. Psychiat. 1999, vol.174, Suppl. 37, p.p.16-18]. По мнению ряда исследователей [Green M.F. What are the functional consequences of neurocognitive deficits ni schizophrenia? Am. J. Psychiat. 1996, vol. 153, p.p.321-330; Goldberg Т.Е., Weinberger D.R. The effects of clozapine on neurocognition: an overview. J Clin Psychiatry. 1994, vol.55, Suppl B, p.p.88-90; Harvey P.D., Keefe S.E. Cognition and new antipsychotics. J. Adv. Schizophr. Brain. Res. 1998, vol. 1, p.p.2-8; Sharma Т., Harvey Ph. Cognition in Schizophrenia. Impairments, Importance and Treatment Strategies. Oxford University Press, Oxford - New York, 2000, p.363; Mueser K.T. Cognitive functioning social adjustment and long-term outcome in schizophrenia. Cognition in Schizophrenia. Impairments, Importance and Treatment Strategies, Sharma Т., Harvey Ph. (eds.), Oxford University Press, Oxford - New York, 2000, p.p.157-177], явления нейрокогнитивного дефицита сохраняются и при полной редукции клинических симптомов в ремиссии и даже более информативны для прогноза функционирования пациентов, поскольку могут препятствовать их реинтеграции в социум.
Терапевтические стратегии, направленные на оптимизацию когнитивного функционирования пациентов, могут способствовать сохранению стабильности ремиссии, повышению уровня функционирования пациентов и качества их жизни. Однако, как показано в ряде исследований, ремиссии с преобладанием негативной симптоматики и когнитивных нарушений (и в их числе ипохондрические) отличаются высокой устойчивостью к медикаментозным воздействиям даже препаратами последних генераций [Мосолов С.Н. Резистентность к психофармакотерапии и методы ее преодоления. Психиатрия и психофармакотерапия, 2002, №4, 132-136; Смулевич А.Б. Неманифестные этапы шизофрении - психопатология и терапия. Журн. невропат, и психиатр, им. С.С.Корсакова, 2005, №5].
При детском церебральном параличе (ДЦП) клинические проявления также отличаются стойкостью и резистентностью к применению традиционных методов лечения. В патогенезе клинических проявлений ДЦП ведущее место занимает структурное поражение мозга, которое является результатом повреждения центральной нервной системы (ЦНС), дисциркуляторных расстройств. Стойкость интеллектуально-мнестических, эмоционально-волевых, двигательных, чувствительных расстройств и других очаговых признаков поражения мозга обусловлена, в частности, и низкой активностью репаративных процессов ЦНС у таких больных.
Под термином «детский церебральный паралич» (ДЦП) объединяются синдромы, возникшие в результате повреждения мозга на ранних этапах онтогенеза и проявляющиеся неспособностью сохранять нормальную позу и выполнять произвольные движения. Двигательные расстройства (параличи, парезы, нарушения координации, насильственные движения) могут сочетаться с изменениями психики, речи, зрения, слуха, судорожными припадками, расстройствами чувствительности. По мере развития ребенка, особенно в раннем возрасте, клиническая симптоматика может видоизменяться. Это связано с возрастной динамикой морфофункциональных взаимоотношений патологически развивающегося мозга, нарастанием декомпенсации, обусловленным все большим несоответствием между возможностями нервной системы и требованиями, предъявляемыми окружающей средой к растущему организму. Кроме того, в случае присоединения таких патологических синдромов, как гидроцефалия, судороги, вегетативные расстройства, а также инфекционных заболеваний, интоксикаций, повторных травм мозга процесс прогрессирует.
Частота церебральных параличей по данным разных авторов в разные годы и в разных странах составляет от 1,5 до 3,0 на 1000 новорожденных.
В настоящее время нет специфической терапии, способствующей восстановлению дистрофически измененной мозговой ткани. Существующие методы лечения, в том числе нейрохирургические вмешательства, носят сугубо паллиативный, симптоматический характер.
Таким образом, актуальность проблемы лечения больных ДЦП и/или гидроцефалией со стойким неврологическим дефицитом обусловлена высокой распространенностью этих патологических состояний, тяжестью клинических проявлений и низкой эффективностью традиционных методов лечения. Острая необходимость решения данной проблемы продиктована также тем, что речь идет о большом количестве детей, в отношении которых современные методы лечения не эффективны, что обусловливает низкую семейную и социальную адаптацию таких больных. Применение клеток пуповинной крови могло бы способствовать ускорению восстановительных процессов в ЦНС путем замещения, регенерации или усилении биологической активности поврежденных клеток, приводящих к восстановлению или улучшению функции мозга.
Использование клеток пуповинной крови, которые как предполагается обладают способностью побудить к дифференциации персистирующие в головном мозге стволовые клетки и способствуют нормализации нейрогенеза в мозге за счет паракринных эффектов (воздействие различных цитокинов и факторов транскрипции), может стать инновационной стратегией терапии заболеваний, протекающих с дегенеративными изменениями в головном мозге.
Раскрытие изобретения
Авторами настоящего изобретения впервые предложен способ лечения психических и неврологических расстройств путем внутривенной инфузии ядросодержащих клеток пуповинной крови человека без риска возникновения иммунопатологических состояний, не требующий HLA-типирования, и без ограничений повторного применения способа в случае клинических показаний.
8
8
8
8
Настоящее изобретение обеспечивает способ лечения психических и неврологических расстройств, предусматривающий введение пациенту ядросодержащих клеток пуповинной крови в терапевтически эффективном количестве, которое, в зависимости от веса пациента и клинической картины, составляет от 1×10 до 5×10 и, предпочтительно, от около 2,2×10 до около 2,8×10 ядросодержащих клеток на одно введение. Таким образом, эффективное количество ядросодержащих клеток в соответствии с предложенным способом, по крайней мере, на порядок меньше, чем требуемое количество ядросодержащих клеток пуповинной крови согласно способу лечения бокового амиотрофического склероза и рассеянного склероза, раскрытого в публикации WO 2004/071283.
Более того, неожиданным открытием авторов настоящего изобретения оказалось, что заявленный способ высокоэффективен при однократном введении пациентам клеток пуповинной крови. В некоторых специфических вариантах воплощения способа предусматривается повторное введение препарата; в одном из специфических воплощений введение препарата осуществляется до четырех раз для достижения стойкой ремиссии у больных шизофренией. Таким образом, эффективность заявленного способа значительно превышает, например, эффективность способа лечения ишемии мозга, вызванной атеросклерозом или острым нарушением мозгового кровообращения, описанного в патенте RU 2284190, согласно которому предусматривается повторное введение пациентам мононуклеарных клеток пуповинной крови до 10 раз.
В специфических вариантах изобретение направлено на лечение психических и неврологических расстройств, включающих рассеянный склероз, амиотрофический боковый склероз, связанную с возрастом утрату когнитивных функций, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, деменцию, в том числе связанную с синдромом иммунодефицита, потерю памяти, шизофрению, детский церебральный паралич, гидроцефалию и другие патологические состояния, связанные с дегенеративными изменениями в головном мозге.
В одном из специфических аспектов изобретения способ применяется для лечения пациентов с болезнью Альцгеймера с различной степенью деменции.
Другой специфический аспект изобретения касается использования ядросодержащих клеток пуповинной крови при болезни Паркинсона с различными формами ригидности.
Еще один специфический аспект изобретения касается использования ядросодержащих клеток пуповинной крови при шизофрении в стадии ремиссии с преобладающей негативной симптоматикой в сочетании с выраженными когнитивными нарушениями.
Еще один специфический аспект изобретения касается использования ядросодержащих клеток пуповинной крови при детском церебральном параличе и гидроцефалии.
Еще один специфический аспект изобретения касается использования ядросодержащих клеток пуповинной крови при рассеянном склерозе.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение основано на неожиданном открытии, что ядросодержащие клетки пуповинной крови могут быть введены пациентам с психическими и неврологическими расстройствами без риска возникновения иммунного отторжения и приводить к значительному улучшению дегенеративных нарушений.
8
8
8
8
Предложенный способ лечения психических и неврологических расстройств предусматривает введение пациенту путем внутривенной инфузии ядросодержащих клеток пуповинной крови в терапевтически эффективном количестве. Количество вводимых клеток составляет в зависимости от веса пациента и клинической картины от 1×10 до 5×10 и, предпочтительно, от около 2,2×10 до около 2,8×10 ядросодержащих клеток на одно введение.
В одном из вариантов изобретения осуществляют одноразовое введение препарата пациенту.
8
8
8
8
В специфических вариантах осуществления изобретения введение ядросодержащих клеток пуповинной крови осуществляют повторно (до 3-х раз) в зависимости от клинической картины с интервалом 1-4 недель в количестве от 1×10 до 5×10 и, предпочтительно, от около 2,2×10 до около 2,8×10 ядросодержащих клеток на одно введение.
8
8
8
8
В еще одном варианте осуществления изобретения введение ядросодержащих клеток пуповинной крови осуществляют до четырех раз с интервалом 1-4 недель в количестве от 1×10 до 5×10 и, предпочтительно, от около 2,2×10 до около 2,8×10 ядросодержащих клеток на одно введение.
Для получения препарата клеток пуповинной крови для использования согласно способу образцы пуповинной крови подвергают седиментации или градиентному центрифугированию, отбирая ядросодержащие клетки с последующим ресуспендированием в охлажденной плазме с добавлением диметилсульфоксида. Полученный материал распределяют в криопробирки, подвергают программному замораживанию, после чего переносят в карантинный сосуд Дюара в пары жидкого азота. По истечении карантинного срока хранения при условии отрицательных результатов тестирования на гемотрансмиссивные инфекции и посева в аэробных/анаэробных условиях образцы переносят на постоянное хранение в сосуд Дюара с жидким азотом.
Используемая технология получения концентрата стволовых клеток пуповинной крови является стабильно воспроизводимой и высокоэффективной, позволяющей обеспечить высокую жизнеспособность клеток как сразу после выделения, так и после замораживания и последующего оттаивания.
Препарат представляет собой стерильную суспензию отмытых от криопротектора живых ядросодержащих клеток пуповинной крови человека в количестве не менее 100 млн в 100 мл физиологического раствора с добавлением реополиглюкина и человеческого сывороточного альбумина и предназначен для внутривенной инфузии через систему для переливания крови и кровезаменяющих растворов (капельницу), а также струйным способом.
В одном специфическом варианте осуществления способа используют ядросодержащие клетки пуповинной крови, отмытые от криопротектора.
В другом специфическом варианте осуществления способа используют ядросодержащие клетки пуповинной крови без отмывки от криопротектора.
В одном из специфических вариантов осуществления предложенный способ терапии клетками пуповинной крови направлен на лечение пациентов с болезнью Паркинсона, имеющих стабильный неврологический дефицит на фоне проводимой противопаркинсонической терапии.
Состояние неврологического дефицита пациентов оценивалось посредством стандартных для данного заболевания тестов с использованием Колумбианской Оценочной Шкалы (Columbian Rating Scale (CRS), Yahr M.D., et al. Treatment of parkinsonism with levodopa. Archives of Neurology, 1967, v.21, P.343-354; Lang A.E.T, Fagn S. Assessment of Parkinson's disease In: Quantification of neurologic deficit (ed. T.L., Munsat). Butterworths, Stoneham, 1989, Ch. 21, P.285-309; Wade D.T. Measurement in neurological rehabilitation. Oxford Univercity Press. 2000) и Системы Оценок Качества Жизни при Болезни Паркинсона (PDQ-39 Scoring System, Loma Linda University Surgery Medical Group).
В исследование были включены пациенты в возрасте от 48 до 86 лет с болезнью Паркинсона 2 и 3 стадий умеренного типа прогрессирования с ригидно-дрожательной формой и акинетико-дрожательной формой при длительности заболевания от 3-х до 10 лет.
У всех пациентов, включенных в исследование, не было выявлено каких-либо нежелательных побочных явлений ни в процессе лечения заявленным способом, ни спустя три месяца.
В результате лечения заявленным способом у всех пациентов отмечалось повышение функциональной активности. Расширился диапазон бытовой, повседневной активности, мотивационный градус, улучшилась эмоциональная составляющая состояния пациентов. Положительный эффект развивался в течение первого месяца и характеризовался улучшением состояния кожных покровов в виде уменьшения сальности, себореи, уменьшением выраженности клинических проявлений заболевания.
В результате тестирования также выявлены статистически значимые различия к концу третьего месяца от начала лечения по ригидности, брадикинезии, функциональным возможностям. Уменьшение тремора у пациентов с дрожательными формами отчетливо наблюдалось к концу первого месяца исследования. Ригидность претерпевала явный регресс с постепенным снижением выраженности к третьему месяцу. Брадикинезия, как наиболее инвалидизирующий признак, подверглась более отчетливому регрессу у пациентов с превалированием акинетического компонента. Расширение диапазона функциональных возможностей отчетливо регистрировалось у всех пациентов уже к исходу первого месяца.
Таким образом, на основании данных, полученных при тестировании PDQ-39 Scoring System к исходу третьего месяца, у всех пациентов наблюдалась положительная динамика.
Необходимо отметить, что безусловным положительным результатом заявленного способа лечения также было снижение дозы замещающей терапии препаратами L-ДОПА в процессе наблюдения.
Использование ядросодержащих клеток пуповинной крови при болезни Паркинсона хорошо переносится пациентами и не имеет побочных негативных эффектов. По оценке клинических данных использование заявленного способа положительно влияет на течение патологического процесса в виде умеренного регресса основных симптомов заболевания. Снижение дозы принимаемых пациентами L-DOPA препаратов на фоне стабильного состояния также является безусловным важным техническим результатом, достигаемым при использовании заявленного способа. Простота применения в сочетании с эффективностью обеспечивают преимущества заявленного способа как нового и перспективного направления в лечения болезни Паркинсона.
В другом специфическом варианте осуществления предложенный способ направлен на лечение болезни Альцгеймера. В исследование включались пациенты в возрасте от 50 до 85 лет с умеренной тяжестью деменции по критериям CDR [Morris J.C. The Clinical dementia rating (CDR). Current version and scoring rules. Neurology, 1993, Vol.43, p.2412-2413].
8
8
8
8
После предварительных соматического, неврологического и лабораторного обследований (клинический анализ крови и мочи, ЭКГ) всем пациентам был введены клетки пуповинной крови путем в/в капельной инфузии в количестве от 1×10 до 5×10 и, предпочтительно, от около 2,2×10 до около 2,8×10 ядросодержащих клеток на одно введение с интервалом в 1 неделю.
Оценку состояния когнитивных способностей (шкала MMSE, Mini-Mental-State Examination, Folstein M.F., Folstein S.E., McHugh P.R. Mini-Mental State. A practical method of grading the cognitive state of patients for the clinical. Journal of Psychiatry Research, 1975, Vol.12, p.189-198), нарушений когнитивных функций (шкала ADAS-cog), нарушений повседневной активности (шкала Bristol-ADL), количественную оценку состояния высших корковых функций (по адаптированной методике А.Р.Лурия) и общего клинического впечатления (шкала CGI) проводили через 7, 14 и 90 дней после начала терапии заявленным способом. Одновременно оценивались основные показатели состояния организма (частота пульса, клинический анализ крови и мочи, ЭКГ) до начала и после окончания исследования.
В период исследования 4 из 5 пациентов продолжали прием препаратов, традиционно используемых для лечения Болезни Альцгеймера, -один из ингибиторов ацетилхолинэстеразы или мемантин в стабильных дозах.
Первичными критериями оценки эффективности заявленного способа являлись динамика показателей нарушений когнитивных функций по шкале ADAS-cog и изменение показателей нарушений повседневного функционирования по шкале Bristol-ADL. Вторичными критериями оценки эффективности являлись динамика показателей когнитивного функционирования по шкале MMSE и оценка общего клинического впечатления (шкала CGI).
У всех пациентов установлена позитивная динамика в оценке состояния когнитивных функций по шкалам ADAS-cog и MMSE на 7-й и 14-й день исследования, т.е. через неделю после 1-го и 2-го введения клеток пуповинной крови.
Позитивная динамика также отмечена в повседневном функционировании пациентов (по шкале Bristol ADL) на 14-й день исследования, т.е. через неделю после 2-го введения клеток пуповинной крови. На 90-й день исследования у 3 из 5 больных сохранялась позитивная динамика и стабилизация состояния, достигнутого к 14-му дню исследования, по шкалам ADAS-cog, и Bristol ADL, и MMSE.
По шкале общего клинического впечатления (CGI) на 14 день исследования у 2-х из 5 больных установлено выраженное улучшение когнитивного и повседневного функционирования, сопровождавшееся улучшением памяти, ориентировки и речи, а также восстановлением утраченных навыков личной гигиены и расширением объема повседневных видов деятельности, например в уборке помещения, в приготовлении напитков.
Через 90 дней состояние 2-х больных оценивалось как умеренное или минимальное улучшение по сравнению с оценкой до начала терапии.
Преимущества заявленного способа, проявляющиеся в положительной пролонгированной динамике когнитивного и повседневного функционирования при отсутствии побочных эффектов, свидетельствуют о перспективности его использования в лечении болезни Альцгеймера.
8
8
8
8
В еще одном из специфических вариантов осуществления предложенный способ терапии клетками пуповинной крови направлен на лечение пациентов с рассеянным склерозом при ремиттирующем, первично-прогредиентном и вторично-прогредиентном течении заболевания. Пациентам было произведено двукратное введение совместимых по группе крови и резус-фактору клеток пуповинной крови в количестве от 1×10 до 5×10 и, предпочтительно, от около 2,2×10 до около 2,8×10 ядросодержащих клеток на одно введение с интервалом 14 дней. После повторного введения в течение 1 месяца наблюдения у всех больных отмечена положительная динамика.
В еще одном варианте осуществления предложенный способ направлен на лечение пациентов с шизофренией.
В структуре ремиссии при шизофрении преобладает негативная симптоматика (эмоциональная отгороженность, трудности в общении, утрата энергии и волевых побуждений) в сочетании с выраженными когнитивными нарушениями (соскальзывания, шперрунги, разноплановость мышления) и субдепрессивными расстройствами круга негативной аффективности (апатия, чувство собственной несостоятельности) [Смулевич А.Б. Неманифестные этапы шизофрении - психопатология и терапия. Журн. невропат, и психиатр, им. С.С.Корсакова. 2005, №5].
Лечение заявленным способом было проведено по отношению к 10 пациентам со средним возрастом 33,6±10,6 лет в состоянии ипохондрической ремиссии с преобладанием когнитивных расстройств в структуре дефекта, средней длительностью болезни 17,3±4,1 лет, средним числом перенесенных приступов - 4,4±2,2 и средней длительностью ремиссии - 36,7±24,8 мес. В контрольной выборке (10 пациентов с тем же диагнозом, сопоставимых по полу, возрасту, параметрам болезни) использовалось плацебо.
8
8
8
8
Клетки пуповинной крови вводились путем в/в капельной инфузии в количестве от 1×10 до 5×10 и, предпочтительно, от около 2,2×10 до около 2,8×10 ядросодержащих клеток на одно введение по 4 инъекции с интервалом в 14 сут. на фоне поддерживающей терапии (стабильные дозы антипсихотиков).
Состояние больных оценивалось клинически, психометрически и патопсихологически перед каждой инъекцией, а затем через 3, 5 и 7 недель после последней процедуры и через 3 мес в пилотной фазе, а также через 9, 11 и 13 недель в клинической фазе.
Патопсихологическая оценка проводилась с использованием известной методологии тестирования - когнитивной батареи MCCB (The MATRICS Consensus Cognitive Battery) [Nuechterlein K.H., Green M.F., Kern R.S., Baade L.E., Barch D.M., Cohen J.D. et al. The MATRICS Consensus Cognitive Battery, Part 1: Test Selection, Reliability, and Validity. Am. J. Psychiatry, 2008, Vol.165, p.p.203-213].
Батарея включает 10 тестов, оценивающих 7 когнитивных областей и направленных на оценку следующих параметров: сознательное управление эмоциями для личностного роста и улучшения межличностных отношений (социальный интеллект), зрительно-моторная координация (внимание, пространственная ориентация, моторная координация, скорость интеллектуальных процессов); вербальная память и вербальное научение; вербальная ассоциативная продуктивность и нарушение лексической системы; исполнительные/экзекутивные функции (планирование, программирование, моделирование и контроль психической деятельности); способность к символьному кодированию (внимание, рабочая память и скорость интеллектуальных процессов); зрительная память и визуальное научение; внимание (объем, концентрация, переключение и бдительность); невербальная (пространственная) рабочая память; способность к осуществлению аналитико-синтетических операций и ассоциативному процессу.
Для психометрической оценки позитивной и негативной симптоматики шизофрении использовалась «Шкала оценки позитивных и негативных симптомов» (PANSS) [Kay S.R., Fiszbein A., Opler L.A. The Positive and Negative Syndrome Scale (PANSS) for Schizophrenia. Schizophr Bull., 1987, Vol.13, p.p.261-276; Мосолов C.H. Шкалы психометрической оценки симптоматики шизофрении и концепция позитивных и негативных расстройств. М., 2001, с.238].
Во всех случаях введение концентрата клеток пуповинной крови не сопровождалось нежелательными явлениями.
Выявленные у 4 пациентов транзиторные эпизоды субфебрилитета (t° до 37,1-37,2С°) не потребовали дополнительных вмешательств и купировались самостоятельно в течение 1-2 сут.
Улучшение состояния пациентов регистрировалось при патопсихологическом обследовании (показатели МССВ) уже через 3 недели после однократной инфузии ядросодержащих клеток пуповинной крови, возвращаясь к исходному уровню через 5 -7 недель.
Серия из 4 последовательных инфузий препарата оказывает положительное воздействие на когнитивное функционирование.
На патопсихологическом уровне с высокой статистической достоверностью (p<0,001) регистрируется значительное улучшение. Спустя 3 недели после 4-й инфузии значительно повышается скорость психических процессов (динамические характеристики внимания, зрительно-моторная координация, ассоциативная продуктивность мышления, регуляторные функции, скорость образования навыков). Улучшаются внимание/бдительность (объем, концентрация, переключение, распределение) и память (вербальная, невербальная). Возрастает способность к научению - визуальному (заучивание материала в зрительной модальности) и вербальному (заучивание материала в слухо-речевой модальности). Расширяются возможности, связанные с исполнительными (экзекутивными) функциями (оптимизируются процессы планирования, программирования, моделирования и контроля психической деятельности).
Достигаемый в соответствии с заявленным способом эффект отличается не только стойкостью, но и длительностью (положительная динамика параметров когнитивного функционирования регистрируется спустя 3 и 5 недель после последней инфузии, а начиная с 7 до 13 недель сохраняется на уровне плато).
Статистически достоверное (p<0,05) улучшение психометрических показателей, оцениваемых с помощью шкалы PANSS, зарегистрировано по параметру «нарушение спонтанности и плавности речи» (исходная сумма баллов составляла 3,0±0,71), а после серии из 4-х инфузий снизилась до 2,3±0,27; по параметру «депрессия» сумма баллов снизилась до 2,2±0,45 от исходных значений 3,3±0,71; по параметру «моторная заторможенность» сумма баллов после лечения снизилась до 2,3±0,45 от исходных значений 3,7±0,71.
Полученные психометрические данные согласуются с клиническими (улучшение состояния пациентов ограничивается появлением оптимистического настроя, оживлением мимики и пантомимики, признаками заинтересованности в общении, заботой о своей внешности).
Когнитивные эффекты, достигаемые при введении пациентам в состоянии ипохондрической ремиссии концентрата клеток пуповинной крови согласно заявленному способу, приводят к выраженному метаболическому (ноотропному) и психостимулирующему действиям, что проявляется в активации интеллектуальной деятельности, ускорении процессов мышления, коррекции мнестических функций, повышении уровня бодрствования. Эффективность заявленного способа в отношении улучшения когнитивных функций отличается не только стабильностью, но и пролонгированностью.
В еще одном варианте осуществления предложенный способ направлен на лечение пациентов с детским церебральным параличом и гидроцефалией.
Морфологически церебральные параличи характеризуются разнообразными по характеру, степени тяжести и локализации структурными изменениями центральной нервной системы. Особенности этих нарушений зависят, главным образом, от времени действия патогенных факторов и в меньшей степени - от специфических свойств последних. Пороки развития полушарий большого мозга при детских церебральных параличах могут сочетаться с гидроцефалией, обусловленной либо врожденной аномалией развития путей циркуляции спинномозговой жидкости, либо изменением структуры мозговых оболочек при субарахноидальных кровоизлияниях, воспалительных процессах и т.п. Изменения головного мозга при внутриутробной гипоксии плода и асфиксии новорожденных дисциркуляторного происхождения. Их выраженность зависит от длительности и тяжести гипоксии. Сосудистые нарушения и отек создают условия для вторичной ишемии нервной ткани. В белом веществе полушарий, особенно в субэпендимальных отделах, образуются фокусы интенсивного отека, которые позже могут трансформироваться в очаги размягчения и порэнцефалию. При выраженной длительной гипоксии нейроны претерпевают дистрофические изменения в виде хроматолиза, центральной ацидофилии, острого набухания. Ишемические изменения нейронов завершаются лизисом клеток («клетки-тени»).
Таким образом, глубокие циркуляторные расстройства (отек, геморрагии, тромбозы, ишемия), возникающие под влиянием неблагоприятных внешних воздействий в анте- и интранатальный периоды, приводят к дистрофическим изменениям в мозговой ткани, лежащим в основе детских церебральных параличей. У незрелых детей чаще повреждается белое вещество головного мозга. Повышенная ранимость белого вещества развивающегося мозга связана с высоким уровнем его метаболизма, по сравнению с корой при относительно бедном кровоснабжении (C.Kennedy et al., 1979).
Некрозу могут подвергаться и другие области - подкорковое белое вещество, мозолистое тело, внутренняя капсула.
Лечение заявленным способом было проведено по отношению к 19 пациентам в возрасте от 1 г. 3 мес до 10 лет, 17 из которых являлись инвалидами с рождения, с характером патологического процесса, включая гидроцефалию (у 2 больных), детский церебральный паралич (4 пациента), гидроцефалию в сочетании с ДЦП и эпилептическим синдромом (4 пациента), гидроцефалию с эпилептическим синдромом (7 пациентов), гидроцефалия с ДЦП (2 пациента). Все пациенты лечились в различных специализированных клиниках от 3 до 8 стационаров без положительного эффекта. Во всех случаях патологический процесс на фоне лечения имел прогредиентное течение.
Основными клиническими проявлениями заболевания были спастический гемипарез (у 8 больных), тетрапарез (4 пациента), эпилептический синдром (11 больных), отставание в психомоторном и физическом развитии отмечено у всех 19 больных.
Учитывая тяжесть клинической картины заболевания и безуспешность медикаментозной терапии было осуществлено однократное (8 пациентов), двукратное (10 пациентов) и трехкратное (1 пациент) переливание концентрата совместимых по группе крови и резус-фактору клеток пуповинной крови в общей дозе от около 100 до около 600 млн клеток.
При лечении предложенным способом положительная динамика отмечена у всех больных. У 5 больных отмечено уменьшение спастики и гиперкинезов. У одной пациентки на 2 сутки после повторного введения стволовых клеток отмечен регресс правостороннего гемипареза (с 2 до 4 баллов), снижение частоты клонических подергиваний в руке. У другого больного с врожденным амаврозом отмечено улучшение зрительных функций: мальчик стал описывать предметы, которые находятся вокруг него, и называть предметы, которые изображены на картинках, также улучшилась мелкая моторика и появились навыки самообслуживания. У больных с диагнозом ДЦП или гидроцефалия в сочетании с эпилептическим синдромом отмечено снижение частоты приступов без изменения дозы получаемых противосудорожных препаратов. У 9 больных состояние стабилизировалось.
Следует отметить, что при осуществлении всех специфических вариантов заявленного способа введение ядросодержащих клеток пуповинной крови не сопровождалось какими-либо реакциями со стороны сердечно-сосудистой, дыхательной или иммунной систем.
В вариантах осуществления предложенного способа, направленных на лечение психических и неврологических расстройств, у всех пациентов после введения клеток наблюдалась отчетливая тенденция к быстрой редукции структурных компонентов дегенеративных нарушений (симптоматики), существенно повышался уровень психической активности.
Таким образом, у пациентов с различной неврологической симптоматикой, страдающих от дегенеративных патологических расстройств, произошло очевидное улучшение состояния. Полученные данные свидетельствуют о том, что терапия ядросодержащими клетками пуповинной крови при психических и неврологических расстройств в соответствии с предложенным способом неожиданно приводит к быстрому ноотропному и психостимулирующему эффектам, сопровождающимся ускоренным восстановлением когнитивных и «инструментальных» корковых функций.
Представленные ниже примеры осуществления предложенного способа лечения психических и неврологических расстройств иллюстрируют, но не ограничивают заявленный объем притязаний.
Пример 1. Заготовка пуповинной крови и выделение ядросодержащих клеток
Заготовка пуповинной крови проводилась в стерильные емкости (системы для заготовки донорской крови), содержащие изотонический антикоагулянт, с соблюдением предосторожностей, исключающих инфицирование материала в процессе забора и транспортировки. Материал доставлялся в лабораторно-производственный комплекс в изотермическом транспортном контейнере при комнатной температуре (+18…+22ºС).
Все процедуры по выделению ядросодержащих клеток пуповинной крови выполнялись в соответствии с национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р 52249-2004 «Правила производства и контроля качества лекарственных средств» с использованием медицинской технологии, разработанной авторами изобретения.
После измерения объема пуповинной крови отбирают аликвоты для проведения гематологического анализа (содержание форменных элементов до выделения, группа крови, резус-фактор).
Для получения ядросодержащих клеток способом седиментации в контейнер с кровью добавляют 6% раствор гидроксиэтилкрахмала (ГЭК) из расчета 1 объем ГЭК к 4 объемам крови и перемешивают в течение 10-15 минут. Содержимое контейнера переносят в пробирки объемом 50 мл, центрифугируют 5 минут при 90 g при отключенном торможении и оставляют на 10-15 минут для формирования видимого раздела между обогащенной лейкоцитами плазмой и осадком эритроцитов. Обогащенную лейкоцитами плазму отбирают в отдельные пробирки и центрифугируют 10 минут при 600g для осаждения клеточных элементов. Полученные клеточные осадки объединяют и ресуспендируют в плазме. Остаток плазмы переносят в отдельную пробирку и устанавливают в контейнер со льдом.
При использовании автоматического сепаратора клеток "SEPAX" после добавления расчетного количества ГЭК мешок с кровью подсоединяют к набору для сепарации через стерильный порт и проводят сепарацию в соответствии с инструкцией на прибор.
Для получения ядросодержащих клеток способом градиентного центрифугирования кровь распределяют в пробирки объемом 50 мл и центрифугируют 10 минут при 600g для осаждения форменных элементов. Полученную плазму отбирают в чистую пробирку и помещают на лед. К клеточным осадкам добавляют фосфатно-солевой раствор Хенска или Эрла и ресуспендируют. В стерильные пробирки на 50 мл добавляют по 20 мл раствора фиколла. Клеточные суспензии наслаивают на раствор фиколла и центрифугируют 30 минут при 400-500g. Интерфазное мононуклеарное кольцо отбирают и переносят в чистые пробирки. В каждую пробирку добавляют фосфатно-солевой раствор до 50 мл, ресуспендируют и центрифугируют 10 минут при 600g. Процедуру отмывки повторяют дважды. Клеточные осадки последовательно ресуспендируют в охлажденной плазме.
Аликвоты клеточных суспензий используют для постановки тестов на стерильность, выявления возбудителей гемотрансмиссивных инфекционных заболеваний, подсчета числа клеток и их жизнеспособности по тесту с трипановым синим, определения содержания CD34/CD45-позитивных клеток методом проточной цитометрии.
К оставшемуся объему плазмы добавляют диметилсульфоксид (ДМСО) до конечной концентрации 20%. К суспензии клеток капельно при постоянном перемешивании добавляют равный объем плазмы с ДМСО. Полученный материал распределяют в криопробирки, подвергают программному замораживанию, после чего переносят в карантинный сосуд Дюара в пары жидкого азота. По истечении карантинного срока хранения при условии отрицательных результатов тестирования на гемотрансмиссивные инфекции и посева в аэробных/анаэробных условиях образцы переносят на постоянное хранение в сосуд Дюара с жидким азотом.
Образцы пуповинной/плацентарной крови тестируется на предмет выявления возбудителей гемотрансмиссивных инфекционных заболеваний: вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1/2, антиген/антитела), вирусов гепатитов В (HBs Ag, anti-HBc-total) и С (anti-HCV-total), вируса Т-клеточного лейкоза (anti-HTLV-1/2), вирусов простого герпеса 1 и 2 типа (anti-HSV IgM), цитомегаловируса (anti-CMV IgM), возбудителей токсоплазмоза (anti-Toxo IgM), сифилиса (Syphilis PRP), бактериальных и грибковых агентов.
Статистический анализ результатов выделения ядросодержащих клеток пуповинной крови (Таблица) свидетельствует о высокой эффективности и воспроизводимости используемой технологии, включая высокую жизнеспособность выделенных клеток до и после пробного замораживания/оттаивания.
Результаты анализа ядросодержащих клеток пуповинной крови человека при выделении путем градиентного центрифугирования, седиментации или автоматической сепарации
№ п.п.
Показатель
Значение, среднее + SD
Градиент
Седиментация
Автоматическая сепарация
1
Число образцов, включенных в анализ
500
500
500
Содержание ядерных клеток до выделения, ×10<sup>9</sup>
1.15±0.5
2
Выход ядерных клеток, % от исходного
50.5±12.2
81.03±2.99
83.0±11.5
3
Степень освобождения от эритроцитов, %
97.82±0.19
71.94±3.33
79.2±12.0
4
Жизнеспособность клеток перед замораживанием, %
99.9
99.9
99.9
5
Соотношение клеточных популяций по данным проточной цитометрии, %
5.1
лимфоциты
51.3±10.9
30.6+1.98
38.0+9.0
5.2
моноциты
13.8±3.8
10.04±0.45
11.7±2.0
5.3
гранулоциты
25.1±11.0
55.93±1.97
43.6±8.6
5.4
гемопоэтические предшественники (CD34+/CD45+, протокол ISHAGE), %
0.46±0.26
0.28±0.03
0.36±0.22
6
Выход гемопоэтических предшественников, %
85.0±23.0
93.0±19.1
91.4±18.9
7
Жизнеспособность клеток после размораживания, %
90.8±10.1
87.12±4.7
83.7±7.1
Пример 2. Приготовление лекарственной формы препарата криоконсервированных клеток пуповинной крови
Препарат представляет собой стерильную суспензию отмытых от криопротектора живых ядросодержащих клеток пуповинной крови человека в количестве не менее 100 млн в 50-100 мл физиологического раствора с добавлением реополиглюкина и человеческого сывороточного альбумина и предназначен для внутривенной инфузии через систему для переливания крови и кровезаменяющих растворов (капельницу), а также струйным способом.
В процессе размораживания клеточной суспензии извлекают необходимое количество криопробирок с замороженными клетками из криогенного хранилища и оставляют на 5 минут при комнатной температуре.
Не снимая защитной упаковки, помещают криопробирки в водяную баню (+37ºС) и размораживают содержимое до исчезновения кристаллов льда. Регулярно перемешивают содержимое переворачиванием пробирок. Вскрывают криопробирки, отвинтив крышку с внутренней резьбой.
С помощью пипеточного дозатора или дозатора с наконечником на 1 мл переносят содержимое каждой криопробирки в пробирки на 50 мл.
Капельно при перемешивании (первые 10 мл), затем струйно добавляют охлажденный раствор для отмывки до конечного объема 45 мл. Ресуспендируют содержимое повторным пипетированием и закрывают пробирки крышками.
Центрифугируют 10 минут при 600 g и удаляют надосадочную жидкость с помощью пипеточного дозатора или аспирационной пипетки и медицинского отсасывателя. Оставляют на дне каждой пробирки около 1 мл жидкости.
Последовательно ресуспендируют клеточные осадки в 10 мл охлажденного раствора для отмывки, избегая вспенивания суспензии. С помощью микродозатора переносят 100-200 мкл клеточной суспензии в микропробирку для последующей оценки жизнеспособности и подсчета числа клеток. С помощью шприца на 20 или 50 мл, снабженного иглой, переносят оставшуюся клеточную суспензию во флакон или полимерный контейнер. С помощью шприца на 50 мл добавляют во флакон (полимерный контейнер) физиологический раствор с реополиглюкином и альбумином до конечного объема 100 мл. Определяют содержание и жизнеспособность клеток в суспензии, используя материал из микропробирки.
Время с момента приготовления лекарственной формы (переноса отмытых клеток во флакон или полимерный контейнер) до начала инфузии не должно превышать 4 (четырех) часов. Транспортировка флакона (полимерного контейнера) к месту проведения инфузии проводится при температуре +2-4ºС (на льду) в термоконтейнере.
Пример 3. Лечение болезни Альцгеймера
Больная 68 лет наблюдается с 65 лет по поводу болезни Альцгеймера. Впервые расстройства памяти появились в возрасте 60 лет. При МРТ-исследовании головы выявлено увеличение боковых желудочков и субарахноидальных пространств в проекции лобных, теменных и височных долей с диагнозом наружная и внутренняя сообщающаяся гидроцефалия. У больной ориентировка во времени и в месте нарушена. Выражены расстройства памяти на события недавнего и отдаленного прошлого, нарушена датировка событий.
Запоминание серии простых слов затруднено. Речь с парафазиями и единичными логоклониями. Узнавание времени по часам не доступно. Запоминание облика людей затруднено. Узнавание реалистических предметов с ошибками. Путает последовательность поз при выполнении проб на исследование динамического праксиса. Пространственно-конструктивная деятельность нарушена в выраженной степени (при перерисовывании трехмерных геометрических фигур допускает значительные ошибки). Собственно интеллектуальные функции умеренно нарушены: путается в трактовке логико-грамматических конструкций, конкретно понимает переносной смысл многих пословиц, не в полной мере понимает сюжетные картинки. Нарушена функция счета - делает ошибки при последовательном вычитании, в примерах на сложение с двухзначными числами. Письмо нарушено, буквы пишет раздельно, крупно. Читает правильно, прочитанное запоминает фрагментарно. Лечение экселоном (ривастигмин) по 1,5 мг 2 раза в сутки не привело к улучшению.
8
На фоне продолжающегося лечения экселоном больной были проведены с интервалом в две недели две капельные внутривенные инфузии отмытых от криопротектора, совместимых по группе крови и резус-фактору клеток пуповинной крови в количестве 2,5×10 на каждое введение. После первого введения препарата пациентка стала энергичнее, лучше вспоминала слова во время беседы, к ней вернулась способность самостоятельно выполнять некоторые домашние дела. Во время обследования на 7 день после 1 введения отмечено улучшение запоминания и узнавания слов, улучшение способности к разговорной речи, улучшение ориентировки во времени.
На 14 день после начала лечения заявленным способом отмечены улучшение ориентировки в месте и времени, лучшее запоминание серии слов и называние предметов и пальцев рук, дальнейшее улучшение узнавания слов, отмечено облегчение поиска слов при произвольной речи и увеличение количества выполняемых команд. В быту стала правильно готовить напитки, выполнять работу по дому. По сравнению с начальной оценкой когнитивного функционирования показатели шкалы MMSE улучшились на 7 баллов, шкалы ADAS - на 14 баллов.
Через 3 мес после начала лечения состояние больной оставалось на уровне, достигнутом к 14 дню исследования.
Пример 4. Лечение болезни Паркинсона
Больной 64 года с акинетико-ригидной формой 2 стадии болезни Паркинсона постоянно принимал мадопар по 250 мг в суточной дозе 1250 мг, мидокалм - по 100 мг 4 раза в день, проноран - по 50 мг 3 р./день, ПК-Мерц - по 100 мг 3 раза в день.
Количество баллов по Колумбианской Оценочной Шкале до лечения заявленным способом составляло 32, по Системе Оценок Качества Жизни при Болезни Паркинсона-39 соответствовало 30 баллам.
Пациенту путем внутривенной инфузии согласно предложенному изобретению была введена пуповинная кровь в дозе 259 млн клеток. На 4 неделе после введения появилась положительная динамика в виде уменьшения мышечной скованности, положительного косметического эффекта. Дозировка противопаркинсонических препаратов была существенно снижена: мадопар до 500 мг в сутки, проноран до 100 мг в сутки, ПК-Мерц до 300 мг в сутки. Через три месяца количество баллов по Колумбианской Оценочной Шкале снизилось до 16, по Системе Оценок Качества Жизни при Болезни Паркинсона-39 до 28 баллов.
Пример 5. Лечение болезни Паркинсона
Больная 58 лет. Отмечалась слабость и тремор в левой руке, слабость в левой ноге и правой ноге, скованность во всем теле, замедление движений, невозможность долго удерживать мочу. На постоянный прием был рекомендован мадопар в дозе 125 мг по 1 капсуле 4 раза в день через каждые 6 часов. Ходила самостоятельно на небольшие расстояния с наклоном корпуса тела вперед. При ходьбе отмечались пропульсии. Количество баллов по Колумбианской Оценочной Шкале составляло 44, по Системе Оценок Качества Жизни при Болезни Паркинсона-39 соответствовало 100 баллам.
Пациентке в соответствии с предложенным способом путем внутривенной инфузии были введены совместимые по группе крови и резус-фактору клетки пуповинной крови в дозе 249 млн клеток. После введения отмечалась положительная динамика: уменьшились проявления себорейного дерматита на лице, улучшился фон настроения, уменьшилась скованность в теле, возросла толерантность к физическим нагрузкам, уменьшилась постуральная неустойчивость. Количество баллов по Колумбианской Оценочной Шкале снизилось до 18, по Системе Оценок Качества Жизни при Болезни Паркинсона-39 до 56 баллов.
Пример 6. Воздействие на негативную симптоматику и когнитивный дефицит в рамках неполной ремиссии при шизофрении
Больной 24 г. после 5-месячного стационарного лечения с диагнозом «Шизофрения параноидная, эпизодический тип течения с нарастающим дефектом, параноидный синдром» (острый манифестный параноидный психоз с бредом величия, синдромом Кандинского-Клерамбо), где получал аминазин, галоперидол, зипрексу, рисполепт, циклодол, испытывал утомляемость, вялость, апатию, подавленность, принимая в качестве поддерживающей терапии галоперидол (10 мг/сут), затем рисполепт (6 мг/сут), в статусе неполной ремиссии в рамках параноидной шизофрении с преимущественно негативной симптоматикой и выраженными когнитивными нарушениями был подвергнут лечению в соответствии с предложенным изобретением.
До лечения в соответствии с изобретением позитивная симптоматика соответствовала 9 баллам по шкале PANSS, негативная симптоматика - 20 баллам, общая психопатологии соответствовала 40 баллам. При тестировании с использованием когнитивной батареи MATRICS на первом плане выступали нарушения в таких когнитивных областях, как внимание - 25 Т-баллов (0,65%), визуальное научение - 21 Т-балл (0,2%), скорость психических процессов - 34 Т-балла (5%) и регуляторные функции - 34 Т-балла (5%). Рабочая память (вербальная и зрительно-пространственная) - 45 Т-баллов (31%) и вербальное научение - 48 Т-баллов (42%) также являются дефицитарными.
На фоне фиксированного приема рисполепта в дозе 6 мг/сут была проведена серия инфузии (4 введения) клеток пуповинной крови с интервалом 14 сут), совместимых по группе крови и резус-фактору, в количестве около 250 млн на одно введение (суммарная доза около 1 млрд клеток).
Измерение когнитивных показателей через 9 недель после серии инфузии концентрата клеток пуповинной крови с высокой статистической достоверностью привели к улучшению следующих параметров когнитивного функционирования: скорость психических процессов составляла 51 Т-балл (54%>), рабочая память - 63 Т-балла (90%), вербальное и визуальное научение составляли 78 Т-баллов (99,7%) и 60 Т-баллов (84%) соответственно, а исполнительные (регуляторные) функции - 59 Т-баллов (82%). Наиболее выраженный эффект проявляется в таких когнитивных областях, как научение (визуальное и вербальное), заключающееся в способности к заучиванию материала в зрительной и слухо-речевой модальностях, и исполнительные функции, отвечающие за процессы регулирования, планирования, программирования, и контроля за психической деятельностью. При оценке по шкале PANSS через 9 недель после серии инфузии концентрата клеток пуповинной крови позитивная симптоматика составляла 9 баллов, негативная симптоматика - 14 баллов, общая психопатология соответствовала 36 баллам. Отмечалось улучшение настроения (редукция подавленности), снижение выраженности утомляемости и вялости, появление оптимистического настроя.
Степень восстановления исполнительных функций, визуального и вербального научения, а также памяти и скорости психических процессов в посттерапевтический период (9 неделя) достигает уровня среднестатистической нормы, т.е. превышает среднюю шкальную оценку 50 Т-баллов и 50 процентилей соответственно по когнитивной батарее MATRICS.
Таким образом, у пациента спустя 9 недель наблюдалась отчетливая тенденция к восстановлению всех вышеперечисленных когнитивных функций. Лечение способом согласно предложенному изобретению, приводя к оптимизации когнитивного функционирования пациентов, способствует сохранению стабильности ремиссии, повышению уровня функционирования пациентов и качества их жизни.
Пример 7. Воздействие на негативную симптоматику и когнитивный дефицит в рамках неполной ремиссии при шизофрении
Пациент 47 лет страдает шубообразной шизофренией с 31 года с преимущественно аффективно-параноидными психозами (в основном депрессивно-параноидными эпизодами с синдромом воздействия, бредовыми идеями вины и самоуничижения), перенес 6 приступов с госпитализациями в психиатрические больницы, в анамнезе 2 суицидальные попытки.
Неработоспособен, в картине ремиссии преобладают ипохондрия, апатия, утомляемость, ежегодно отмечаются сезонные депрессивные фазы с чувством витальной тоски, суточным ритмом, снижением веса. Получал поддерживающую терапию: рисполепт 8 мг/сут, карбамазепин 200 мг н/н, амитриптилин 50 мг/сут.
В статусе с неполной ремиссией в рамках шубообразной шизофрении, определяющейся преимущественно негативной симптоматикой, депрессивными расстройствами и выраженными когнитивными нарушениями, был подвергнут лечению заявленным способом. До лечения в соответствии с изобретением позитивная симптоматика соответствовала 12 баллам по шкале PANSS, негативная симптоматика - 24 баллам, общая психопатологии соответствовала 44 баллам. При тестировании с использованием когнитивной батареи MATRICS на первом плане выступали нарушения в таких когнитивных областях, как скорость психических процессов - 32 Т-балла (3,6%), рабочая память (вербальная и зрительно-пространственная) - 37 Т-баллов (10%), вербальное научение - 34 Т-балла (5%) и исполнительные функции - 36 Т-баллов (8%). Выявлены также нарушения объема и динамических характеристик внимания - 41 Т-балл (18%).
8
На фоне фиксированных доз поддерживающей терапии была проведена серия инфузии (4 введения) клеток пуповинной крови с интервалом 14 суток, совместимых по группе крови и резус-фактору, в количестве около 2,5x10 на одно введение.
Измерение когнитивных показателей через 9 недель после серии инфузии концентрата клеток пуповинной крови с высокой статистической достоверностью привели к улучшению всех параметров когнитивного функционирования, а именно: скорости психических процессов до 69 Т-баллов (97,1%), внимания до 67 Т-баллов (96%), рабочей памяти до 66 Т-баллов (95%>), вербального и визуального научения до 61 Т-балла (86%) и 72 Т-балла (98,6%), соответственно, а также исполнительных (регуляторных) функций до 64 Т-баллов (92%). Наиболее выраженный эффект проявился в таких когнитивных областях, как скорость психических процессов, исполнительные функции, непосредственная память (вербальная и невербальная) и вербальное научение. При оценке по шкале PANSS через 9 недель после серии инфузии концентрата клеток пуповинной крови позитивная симптоматика составляла 10 баллов, негативная симптоматика - 18 баллов, общая психопатология - 39 баллов. Заметно редуцировалась подавленность, тревожность, пациент стал более общительным, начал следить за внешним видом.
Степень восстановления исполнительных функций, визуального и вербального научения, а также памяти и скорости психических процессов в посттерапевтический период (9 неделя) достигает уровня среднестатистической нормы, т.е. превышает среднюю шкальную оценку 50 Т-баллов и 50 процентилей соответственно по когнитивной батарее MATRICS.
Таким образом, у пациента спустя 9 недель наблюдалась отчетливая тенденция к восстановлению всех вышеперечисленных когнитивных функций. Лечение способом согласно предложенному изобретению, приводя к оптимизации когнитивного функционирования пациентов, способствует сохранению стабильности ремиссии, повышению уровня функционирования пациентов и качества их жизни.
Пример 8. Детский церебральный паралич с эпилептическими приступами
Пациентка 9 лет с диагнозом: хронический прогрессирующий очаговый энцефалит Расмуссена, эпилепсия с частыми простыми парциальными моторными приступами, миоклоническими и вторично-генерализованными приступами, правосторонний гемипарез. Принимала Кеппра по 750 мг 2 раза в день, Паглюферал-3 по 1/2 табл. 2 раза в день, Трилептал по 150 мг 3 раза в день. Несмотря на проводимую терапию, отмечалось прогрессирующее ухудшение состояния, учащение приступов с неизмененным или частичным нарушением сознания, отведением головы вправо и напряжением правых конечностей, с развитием послеприступного паралича Тодда, не купирующихся введением седуксена.
При исследовании методом эхоэнцефалографии (ЭЭГ) регистрировалась эпилептиформная активность. При анализе магнитно-резонансной томографией регистрировалась картина изменений, характерная для проявлений атрофического процесса в области гиппокампа слева, патологических очагов в корковых зонах левых височной и теменной областей.
Учитывая длительность и безуспешность проводимой консервативной терапии, наличие частых эпилептических припадков и отставание в психоречевом развитии, ребенку было проведено двукратное внутривенное введение концентрата пуповинной крови человека в общей дозе около 500 млн клеток (246 и 254 млн соответственно) с интервалом в 1 месяц.
На следующие сутки после повторного введения препарата клеток пуповинной крови человека у девочки отметили положительную динамику: уменьшение правостороннего гемипареза, особенно в руке (до 4 баллов), девочка стала поднимать правую руку вертикально. Снизилось количество подергиваний в правой руке.
При контрольном обследовании через 5 месяцев: на фоне приема противоэпилептических препаратов приступы полностью исчезли. Степень гемипареза уменьшилась до 3 баллов. На ЭЭГ отмечена положительная динамика. Значительно улучшились показатели качества жизни: улучшилась речь, ребенок способен полностью себя обслуживать, много танцует.
Пример 9. Детский церебральный паралич с гидроцефалией
У пациента 7 лет 5 мес с диагнозом: смешанная гидроцефалия, задержка психомоторного и речевого развития, врожденный двусторонний амавроз, с резким снижением зрительных функций до светоощущения, на фоне проводимой медикаментозной терапии состояние не улучшалось. Данные ЭЭГ указывали на распространенные изменения с вовлечением в процесс стволовых образований с нарушением корково-подкорковых взаимоотношений.
Учитывая тяжесть клинической картины заболевания, данные интероскопии, прогредиентное течение заболевания, безуспешность медикаментозной терапии, ребенку были осуществлены три инфузии с интервалом в 1 месяц концентрата клеток пуповинной крови в общей дозе около 600 млн клеток (около 103, 250 и 250 млн на одно введение соответственно).
Через 3 месяца после последнего введения клеток у мальчика отмечена стойкая положительная динамика. Он стал более спокойный, уменьшились гиперкинезы, в речи появились сложноподчиненные предложения, появились навыки самообслуживания - ест самостоятельно. Отмечается улучшение зрительных функций: мальчик стал говорить, что он видит солнце, небо, видит очертания предметов, называет по картинкам некоторые предметы.
Пример 10. Детский церебральный паралич
Пациент 3,5 года с диагнозом: ДЦП, спастический тетрапарез, симптоматическая фокальная эпилепсия, задержка психоречевого развития, находился в стадии медикаментозной ремиссии 1,5 года.
У ребенка отсутствовала речь при способности воспроизводить только отдельные гласные звуки, артикуляция грубо нарушена. Глаза почти все время закрыты веками. Отмечался выраженный тетрапарез, преимущественно в нижних конечностях, отсутствовала способность самостоятельно передвигаться. Пациент плохо удерживал себя в вертикальном положении, даже с опорой на предметы и плохо удерживал предметы. Степень спастичности рук оценивалась от 2 до 3 баллов, степень пластичности ног составляла 3 балла. Сила мышц конечностей составляла 3 балла.
Учитывая жалобы, клиническую картину заболевания, прогредиентное течение заболевания и безуспешность предшествующей терапии, ребенку было произведено двукратное, с интервалом в 14 дней, внутривенное введение клеток пуповинной крови в общей дозе около 500 млн клеток (около 240 млн и 260 млн на одно введение соответственно).
Через 6 месяцев после введения отмечалось выраженное улучшение клинической картины. Ребенок начал фиксировать взор на окружающих, вышел из задержки речевого развития, импрессивная речь стала соответствовать возрасту, указывал картинки всех тематических групп. Отмечено восстановление артикуляционного аппарата - улучшились переключаемость и удержание позы, ползает на четвереньках, ходит с поддержкой или с опорой на предметы, берет и удерживает игрушку, карандаш. Степень спастичности уменьшилась на 1 балл, сила мышц конечностей возросла на 1 балл.
Восприятие цветовое и предметное стало соответствать возрасту. Стали формироваться количественные представления и способность к операциям сравнения и обобщения. Пациент стал способен понимать речь в полном объеме и строить фразы.
Пример 11. Рассеянный склероз
У пациента 37 лет с первично-прогредиентным течением рассеянного склероза и длительностью заболевания 8 лет отмечался в неврологическом статусе выраженный нижний спастический парапарез с мышечной силой в ногах 2 балла, выраженный мозжечковый синдром, тазовые нарушения.
Уровень нарушений по шкале EDSS составлял 6,5 баллов. Уровень когнитивных нарушений по шкале MMSE соответствовал 30, по шкале PASAT - 32 балла. Данные MP спектроскопии: NAA\Cr=1,62±0,34; Cho\Cr=1,09±0,17.
Пациенту было произведено двухкратное введение совместимых по группе крови и резус-фактору клеток пуповинной крови с разницей в 14 дней в количестве около 250 млн клеток на каждое введение (общая доза введенных клеток составляла около 500 млн).
После повторного введения и в течение 1 месяца наблюдалось улучшение выраженности пирамидного синдрома с уменьшением времени прохождения 7,2 метров (до введения - 45 сек, после введения 40 сек). Уровень EDSS остался прежним. Уровень MMSE - 30, PASAT - 41. Данные MP спектроскопии через 3 месяца после терапии: NAA\Cr=1,66±0,25; Cho\Cr=0,96±0,17. Таким образом, по метаболитам мозга отмечена тенденция к нарастанию уровня NAA-маркера, что свидетельствует об улучшении состояния нейронов.