Молекулярные маркеры лейкоплакии и прогноз малигнизации

ОБЗОРЫ И ПРОБЛЕМНЫЕ СТАТЬИ

Молекулярные маркеры лейкоплакии и прогноз малигнизации

А.Д.Алиев

Азербайджанский медицинский университет, Национальный центр онкологии, г.Баку

Лейкоплакия относится к факультативным предопухолевым заболеваниям, характеризуется разной степенью ороговения покровного эпителия, а частота опухолевой трансформации лейкоплакии широко варьирует - от 15 до 75% [1].

Одним из важных молекулярных маркеров малигнизации участков слизистой полости рта с лейкоплакией является определение плоидности ДНК в биоптатах с помощью цитологической денситометрии. Как известно, нарушение плоид-ности ДНК в клетках является одним из важных критериев малигнизации ткани. Показано, что в предраковых образованиях слизистой полости рта (лейкоплакия и красный плоский лишай) и в клетках с дисплазией всегда повышено содержание ДНК (анеуплоидность), в то время как в нормальных клетках эпителия наблюдается только диплоидность [2].

Еще одним из признаков неопластической трансформации тканей является нарушение механизмов регуляции апоптоза (запрограммированной гибели клеток) - одна из важных (если не самая важная) причин развития злокачественного процесса [3, 4, 5, 6]. Механизм регуляции нормального апоптоза чрезвычайно сложен, поскольку он обусловлен тонким равновесием между усилением и ингибированием биосинтеза множества белков как внутри, так и на поверхности клеток [7, 8, 9, 10].

Среди многих регуляторов апоптоза важен белок сурвивин, который ингибирует апоптоз. В большинстве опухолей обнаружена повышенная экспрессия этого белка, что может указывать на высокую информативность сурвивина как показателя неоплазии. В участках слизистой полости рта с признаками предрака, но без малигнизации, повышенная экспрессия сурвивина была обнаружена лишь в 33% случаев. В то же время при развитии рака в этих участках повышенная экспрессия сурвивина была обнаружена в 100% случаев, а в участках слизистой с предраком, из которых

развился чешуйчатый клеточный рак - в 94% случаев [11]. Авторы исследования полагают, что высокая экспрессия сурвивина в цитоплазме и ядре клеток является ранним признаком канцерогенеза слизистой полости рта и может указывать на высокий риск прогресса предрака в инвазив-ную карциному [11].

Метилирование генов экзогенными агентами приводит к значительному нарушению экспрессии этих генов [12], поэтому изменение числа метилированных генов может быть важным признаком злокачественной трансформации клеток слизистой полости рта у курящих или жующих табак, поскольку многие компоненты табака являются активными метилирующими агентами [13].

Изменение экспрессии гена р53 обнаруживается в клетках с признаками малигнизации, поэтому важным молекулярным маркером предраковых состояний может быть продукция белка р53 в тканях с подозрением на развитие рака [14]. С использованием молекулярных методов диагностики было показано, что примерно в 90% случаях биопсий слизистой полости рта из пораженных участков изменено содержание р53-белка.

Недавно было показано, что кроме основного онкогена р53 имеются еще несколько гомологичных генов, продукты которых контролируют синтез изоморфных белков альтернативного сплайсинга. Белки этих гомологичных р53 генов имеют чрезвычайно важное значение для клеточного цикла и пролиферации.

Две основных изоформы белков гена р63 -белки ТАр63 и дельта-Кр63 имеют противоположные функции: белок ТАр63 участвует в механизме прерывания клеточного цикла, а белок дельта-Кр63 важен для клеточной пролиферации [15]. При иммунохимическом определении продукции указанных белков в клетках слизистой рта с чешуйчатой карциномой было обнаружено, что в клетках карциномы повышена выработка обоих белков по сравнению с неизмененными

клетками слизистой [15]. Более того, при метас-тазировании малигнизированных клеток в них начинают синтезировать и другие изоформы белков гена р63, а увеличение синтеза разных изо-форм белков этого гена может указывать на плохой прогноз в отношении развития метастазов.

Экспрессия другого гена - ТР73, который также гомологичен гену р53, изменяется при ма-лигнизации эпителиальной дисплазии слизистой полости рта. Эти изменения могут быть связаны с дифференциацией чешуйчатого эпителия, указывать на ранние проявления канцерогенеза и служить одним из ранних тестов плохого прогноза дисплазии эпителия очагов поражения слизистой полости рта [16].

Еще один из гомологичных генов р53 - ген p53R2 кодирует синтез белка, который участвует в репарации молекул ДНК. Yamamoto et я1. (2003) показали, что экспрессия гена p53R2 исключительно важна для слизистой оболочки полости рта, а увеличение его экспрессии может указывать как на дисплазию, так и на чешуйчатую клеточную карциному: экспрессии p53R2 не было обнаружено ни в одном из 10 образцов нормального слизистого эпителия, а в 21% образцов дисплазии и 52% образцов чешуйчатой клеточной карциномы экспрессия этого гена была повышена [17]. В то же время, не совсем ясно, для чего определять экспрессию гена p53R2, если экспрессия основного онкогена р53 также изменяется аналогично.

Как известно, для нормальной функциональной активности клеток при пролиферативных процессах имеется система регуляции биосинтеза целого ряда белков цитоскелета, а нарушение биосинтеза таких белков является одним из признаков злокачественности. Важным и достаточно ранним по времени показателем риска малигни-зации очагов лейкоплакии слизистой оболочки полости рта является увеличение экспрессии около 18 генов молекулярных компонентов ци-тоскелета в клетках такой слизистой, что даже выше, чем при чешуйчатой клеточной карциноме [18]. Например, при малигнизации клеток и последующей инвазии раковых клеток в них начинает экспрессироваться ген матриксной металлоп-ротеазы-9 (ММР-9), причем в превращении профермента ММР-9 в активную металлопротеиназу участвует активатор плазминогена урокиназного типа (uPA) [19].

Ответ большинства клеток на стрессовую ситуацию (в широком смысле слова) обычно связывают с увеличением биосинтеза белков теплового шока, особенно HSP70. Удивительно, но био-

синтез HSP70 в клетках лейкоплакии слизистой полости рта значительно выше, чем в клетках красного плоского лишая, которые подвержены значительно большей морфологической трансформации [20]. Авторы полученных данных объясняют такое отличие в биосинтезе HSP70 б?ль-шей активностью пролиферативных процессов в очагах лейкоплакии, чем в очагах красного плоского лишая.

У пациентов с чешуйчатой клеточной карциномой, начиная со II стадии заболевания изменяется содержание гликозилированных белков не только в самих опухолевых клетках, но и в крови и в мембранах эритроцитов. Причем содержание гликозилированных конъюгатов в сыворотке крови и в опухолевой ткани у таких пациентов с чешуйчатой клеточной карциномой увеличивается пропорционально стадии заболевания, а в мембранах эритроцитов их содержание, наоборот, снижается [21]. Это может быть еще одним подтверждением системности нарушений в организме при заболевании лейкоплакией слизистой полости рта.

Предраковые состояния слизистой полости рта этиологически и биологически связаны с первичной опухолью, которая чаще всего чувствительна к ретиноидам. Именно с этим связано широкое использование ретиноидов в качестве терапевтических средств при терапии раковых заболеваний слизистой не только ротовой полости [22].

Ретиноиды, как известно, модулируют уровни биосинтеза мРНК и белка гена р53 в клетках опухолей. Интересно отметить, что обнаружена прямая корреляция между уровнем р53-белка и резистентностью к ретиноидам малигнизирован-ных клеток слизистой полости рта, однако механизм такой связи не совсем ясен. В то же время, показано, что канцерогенные факторы табака действуют не как мутагены, а как метилирующие факторы непосредственно генов рецепторов ре-тиноидов в клетках слизистой, что приводит к ингибированию экспрессии этих рецепторов [22].

Предполагается, что алкоголь также действует на систему ретиноидов и их рецепторов, хотя это действие выражается по-разному на метаболизме ретиноидов и изоформы их клеточных рецепторов. Основные места "диверсии" алкоголя -изменение ферментных систем метаболизма ре-тиноидов (в первую очередь систем цитохрома Р450) и ингибирование экспрессии изоформ рецепторов ретиноидов, хотя точные механизмы действия алкоголя неизвестны [22]. Однако уже

перечисленного достаточно, чтобы понять существенно синергичное действие табакокурения и алкоголя на слизистую дыхательно-пищеварительного тракта.

В механизмах туморогенеза важную роль играет изменение проницаемости клеток, которая, как известно, зависит от липидного состава клеточных мембран. Проницаемость мембран клеток слизистой оболочки полости рта у пациентов с лейкоплакией более высока по сравнению с клетками нормальной слизистой. При этом у пациентов с лейкоплакией общее количественное содержание липидов и качественный липидный состав мембран как неизмененных клеток слизистой, так и клеток на участках с лейкоплакией отличается от липидного состава клеток нормальной слизистой полости рта [23]. В опухолевых клетках слизистой полости рта содержание общего и этерифицированного холестерина заметно выше, чем в нормальных клетках слизистой, а содержание свободных жирных кислот и фосфолипидов, наоборот, заметно понижено [24]. Более того, эти же исследователи обнаружили значительное снижение концентрации основного эндогенного антиоксиданта - витамина Е в малигнизированных клетках по сравнению с неизмененными клетками слизистой оболочки полости рта.

Важность нормального биосинтеза мембранных липидов для клеток слизистой рта была подтверждена оригинальными экспериментами в клеточных культурах с использованием церуле-нина - белка, который принимает участие в регуляции биосинтеза ряда мембранных липидов: чем существеннее нарушения в составе клеточной мембраны, тем больше церуленин ингибиру-ет биосинтез жирных кислот. Более того, Guo et al. (2003) показали, что церуленин значительно ингибирует биосинтез жирных кислот в клетках чешуйчатой карциномы и почти не оказывает влияния на биосинтез жирных кислот в клетках нормальной слизистой [16].

Для процессов окисления-восстановления в клетках чрезвычайно важна активность глутати-он^-трансферазы (GST), ген которой полиморфен. При воздействии на слизистую оболочку полости рта различных экзогенных соединений (табак, алкоголь и пр.) активность разных изоформ GST изменяется по-разному. Sikdar et al. (2004) показали, что у курящих табак из четырех изо-форм GST только генотип GSTM3 (A/A) указывает на повышенный риск трансформации лейкоплакии в злокачественное новообразование [17]. В связи с этим определение генотипа изоформ GST

предлагается авторами в качестве молекулярного маркера малигнизации при заболевании лейкоплакией слизистой оболочки полости рта.

Как известно, инвазивность малигнизиро-ванных клеток связана с нарушением адгезивных свойств и механизмов адгезии для таких клеток. Клеточная адгезия во многом обусловлена наличием на поверхности клеток сложных белков семейства кадхеринов - трансмембранных гликоп-ротеидов массой около 120 кДа. Ряд исследователей полагает, что нарушение экспрессии кадхеринов тесно связано с канцерогенезом. Для чешуйчатой клеточной карциномы слизистой полости рта показано нарушение регуляции экспрессии кадхерина Р. Снижение экспрессии этого трансмембранного гликопротеида или полное ее отсутствие указывает на агрессивность клеток карциномы с точки зрения их инвазивнос-ти и плохой прогноз для таких больных [27].

Изменяется экспрессия и другого белка адгезии - моэзина, который участвует в межклеточном взаимодействии. Обычно в нормальных клетках слизистой моэзин обнаруживается только на их поверхности. Показано, что в отличие от клеток нормальной слизистой, в которых моэзин обнаруживается на наружной поверхности мембран, в клетках чешуйчатой карциномы слизистой полости рта этот белок обнаруживается только в цитоплазме [28]. При этом в клетках чешуйчатой карциномы резко изменяется и содержание мат-риксного белка - гиалуронана, который, как предполагается, является промотором роста и миграции раковых клеток. Более того, в плохо дифференцированных опухолях содержание этого белка заметно снижено, что является плохим прогнозом выживаемости больных с таким заболеванием [29].

Признаком ранней прогрессии патологических клеток слизистой оболочки полости рта может быть и нарушение экспрессии циклин-зави-симых киназ, которые играют важную роль в регуляции клеточного цикла. Так, продукция одного из белков этого типа - белка р21 повышается при пролиферации, а продукция белка р27 повышается при клеточной дифференцировке, что указывает на тонкую регуляцию процессов клеточного цикла с участием этих киназ, а нарушение соотношения в их активности может быть важным критерием признаков канцерогенеза слизистой оболочки полости рта [30].

К числу ранних маркеров неопластической трансформации в слизистой оболочке полости рта можно отнести и рецепторы эпидермального фактора роста (EGFR) [31]. На ранних стадиях

малигнизации чешуйчатой клеточной карциномы слизистой оболочки полости рта значительно увеличивается экспрессия EGFR, причем время с момента начала малигнизации пропорционально сверхэкспрессии этого важного белка на поверхности клеточных мембран [32].

Другие белки - семейство ламининов, которые синтезируются в базальных мембранах клеток СОПР, также могут быть ранними маркерами злокачественной трансформации слизистой оболочки полости рта. Показано, что увеличение экспрессии одного из семейства этих белков - ла-минина-5-гамма-2 в поврежденных участках слизистой оболочки полости рта, как правило, указывает на высокий риск малигнизации очагов поражения [33].

Нарушение биосинтеза ряда коллагеновых белков, которые важны для адгезии кератиноци-тов и их подвижности, как правило, также указывает на нарушение механизмов адгезии клеток. При инвазивных формах злокачественной трансформации эпителия слизистой оболочки полости рта начинает увеличиваться экспрессия одной из форм коллагеновых белков - коллагена XVII, и увеличение экспрессии этого белка может указывать на ранние признаки прогрессии опухоли, а экспрессия других белков еще может не нарушаться [34]. В то же время, снижение экспрессии коллагена XVII на ранних стадиях канцерогенеза слизистой может указывать на нарушение механизмов адгезии керацитов к базальной мембране, и при этом, вероятно, нарушается не только экспрессия, но и функции других белков, имеющих отношение к механизмам адгезии и миграции кератиноцитов [34, 35].

При наличии участков лейкоплакии в ротовой полости прогноз заболевания в значительной степени зависит от того, на каком участке слизистой полости рта располагается очаг поражения. Так, лейкоплакия на участках щек и прилегающих к ним участках слизистой в 96% случаев является доброкачественным образованием. Напротив, только около 32% площади слизистой с лейкоплакией под языком могут быть доброкачественными образованиями, в то время как 31% площади являются карциномой in situ и 37% - ин-вазивной карциномой [36]. Другие участки слизистой полости рта также могут проявлять высокую степень малигнизации, особенно при канди-дальной лейкоплакии и лейкоплакии, которая клинически характеризуется серыми или белыми бляшками: в 7-13% таких случаев заболевания лейкоплакией слизистой оболочки полости рта наблюдается прогрессирование в карциному.

В общем случае с точки зрения природы предраковых состояний нелеченную лейкоплакию с большой долей вероятности можно считать признаком малигнизации.

ЛИТЕРАТУРА

¡.Бочарова О.А., Пожарицкая М.М., Чекалина Т.Л. и соавт. Лейкоплакия слизистой оболочки полости рта: патогенез и возможности коррекции фитоадаптогеном // Бюлл.экспер.биол.-2004.-т.138, №12.-С.652-657;

2. Femiano1 F., Scully C. DNA cytometry of oral leukoplakia and oral lichen planus // Oral Med. Pathol. Oral. Cir. Bucal.-2005.-Vol.10.-P.E9-E14.

3.Фильченков А.А. Современные представления о роли апопто-за в опухолевом росте и его значении для противоопухолевой терапии // Экспер. онкол.-1998.-т.20.-С.259-270.

4.Фильченков А.А., Стойка Р.С. Апоптоз и рак // Киев.-Морион.-1999.-184С.

5.Абраменко И.В., Фильченков А.А. Оценка параметров апоп-тоза в диагностике онкологических заболеваний, их прогнозе и оптимизации схем терапии // Вопросы онкологии.-2003.-т.49, №1.-С.21-30.

6.Новик А.А., Камилова Т.А., Цыган В.Н. Введение в молекулярную биологию канцерогенеза (под ред. акад. РАМН Ю.Л.Шевченко) // М.-Издательство 'ТЭОТАР-МЕД".-2004.-222С.

7.Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме // Пат физиол. экспер. тер.-1998.-т.2.-С.38-48.

8.Белушкина Н.Н., Белецкий И.П. Молекулярно-медицинские аспекты клеточной гибели // В книге "Введение в молекулярную медицину" (под ред. М.А.Пальцева).-М.-Медицина.-2004.-С.414-445.

9.Пальцев М.А. (под редакцией). Введение в молекулярную медицину // М.-Медицина.-2004.-496С.

10.Раппопорт Е.М., Сапотько Ю.Б., Пазынина Г.В. и соавт. Участие сиалосвязывающих макрофагальных лектинов в фагоцитозе апоптотических телец // Биохимия.-2005.-т.70, вып.3.-С.406-415.

11.Lo Muzio L., Pannone G., Leonardi R. et al. Survivin, a potential early predictor of tumor progression in the oral mucosa // J. Dent. Res.-2003.-Vol.82, №11.-P.923-928.

12.Лихтенштейн А.В., Киселева Н.П. Метилирование ДНК и канцерогенез // Биохимия.-2001.-т.66, №3.-С.293-317.

13.Kulkarni V., Saranath D. Concurrent hypermethylation of multiple regulatory genes in chewing tobacco associated oral squamous cell carcinomas and adjacent normal tissues // Oral 0ncol.-2004.-Vol.40, №2.-P. 145-153.

14.Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых суп-рессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза // Биохимия.-2000.-т.65.-С.5-33.

15. Forschimi M.P., Gaiba A., Cocchi R. et al. Pattern of p63 expression in squamous cell carcinoma of the oral cavity // Virchows Arch.-2004.-Vol.444, №4.-P.332-339.

16. Chen Y-K., Hsue Sh.-S., Lin L.-M. p73 Expression for human buccal epithelial dysplasia and squamous cell carcinoma: does it correlate with nodal status of carcinoma and is there a relationship with malignant change of epithelial dysplasia? // Head Neck.-2004.-Vol.26, №11.-P.945-952.

17.Yamamoto S., Kawasaki G., Yoshitomi I., Mizuno A. Expression of p53R2, newly p53 target in oral normal epithelium epithelial dys-plasia and squamous cell carcinoma // Cancer Lett.-2003.-Vol.190, №2.-P.233-243.

18. Odani T., It D., Li M.H. et al. Gene expression profiles of oral leukoplakia and carcinoma: genome-wide comparison analysis using oligonucleotide microarray technology // Int. J. Oncol.-2006.-

Vol.28.-P.712-717.

19.Beppu M., Ikebe T., Shirasuna K. The inhibitory effects oof immunosuppressive factors, dexamethasone and interleukin-4, on NF-kappa-mediated protease production by oral cancer // Biochim. Biophys. Acta.-2002.-Vol.1586, №1.-P. 11-22. 20.Seoane J., Ramirez J.R., Romero M.A. et al. Expression of heat shock protein (HSP70) in oral lichen planus and non-dysplastic oral leucoplakia // Clin Otolaryngol Allied Sci.-2004.-Vol.29, №2.-P.191-196.

21. Manoharan S., Padmanadhan M., Kalajiappan K. et al. Analysis of glycoconjugates in patients with oral squamous cell carcinoma // Clin. Chim. Acta.-2004.-Vol.339, №1.-P.91-96.

22. Bergheim I., Wolfgarten E., Bollschweiler E. et al. Role of retinoic acid receptors in squamous-cell carcinoma in human esophagus // J.Carcinogen.-2005.-Vol.4, №1.-P.20-26.

23. Banoczy J., Squier C.A., Kremer M. et al. The permeability of oral leukoplakia // Eur. J. Oral Sci.-2003.-Vol.111, №4.-P.312-315.

24. Kolanjiappan K., Ramachandran c.R., Manoharan S. Biochemical changes in tumor tissues of oral cancer patients // Clin. Biochem.-2003.-Vol.36, №2.-P.61-65.

25.Guo Ch.-B., Cui N.-H., Yu G.-Y. et al. Effects of cerulenin on the endogenous fatty acid synthetic activity in squamous cell carcinoma of the oral cavity // J. Oral Maxillofac. Surg.-2003.-Vol.61, №8.-P.909-912.

26.Sikdar N., Paul R.R, Roy B. Glutathione S-transferase M3 (A/A) genotype as a risk factor for oral cancer and leukoplakia among Indian tobacco smokers // Int. J. Cancer.-2004.-Vol.109, №1.-P.95-101.

27.Lo Muzio L., Campisi G., Farina A. et al. P-cadherin expression and survival rate in oral squamous cell carcinoma:an immunohisto-chemical study // BMC Cancer.-2005.-Vol.5, №6.-P.63-72.

28.Kobayshi H., Sagaro J., Masumoto J. Shifts in cellular localization of moesin in normal oral epithelium, oral epithelial dysplasia, verrucous carcinoma and oral squamous cell carcinoma // J. Oral. Pathol. Med.-2003.-Vol.32, №7.-P.344-349.

29. Kosunen A., Ropponen K., Kellokoski J. et al. Reduced expression of hyaluronan is a strong indicator of poor survival in oral squamous cell carcinoma // Oral Oncol.-2004.-Vol.40, №3.-P.257-263.

30. Choi H.-R., Tucker S.A., Huang Z. et al. Differential expressions of cyclin-dependent kinase inhibitors (p27 and p21) and their relation to p53 and Ki-67 in oral squamous tumorigenesis // Int. J. Oncol.-2003.-Vol.22, №2.-P.409-411.

31. Дигтярь А.В., Киселев С.М., Макаров В.А., Луценко Е.В.,

Попова О.Н., Фельдман Н.Б., Посыпанова ГА., Луценко С.В., Северин С.Е. Фрагменты рецепторсвязывающих участков ЭФР и ТФР- человека - эффективные векторы для создания противоопухолевых препаратов с избирательным действием // Вестник НИИ молекулярной медицины.-2005.-Вып.5.-С.51-61.

32. Hsu E.R., Anslyn E.V., Dharmawardhane s. et al. A far-red fluorescent contrast agent to image epidermal growth factor receptor expression // Photochem. Photobiol.-2004.-Vol.79, №3.-P.272-279.

33. Nordemar S., Hogmo A., Lindholm J. et al. Laminin-5 gamma 2: a marker to identify oral mucosal lesions at risk for tumor development? // Anticancer Res.-2004.-Vol.23, №12.-P.4985-4989.

34. Parikka M., Kainulainen T., Tasanen K. et al. Alterations of collagen XVII expression during transformation of oral epithelium to dysplasia and carcinoma // J. Histochem. Cytochem.-2003.-Vol.51, №7.-P.921-929.

35. Poomsawat S., Whawell S.A., Morgan M.J. et al. Scatter factor regulation of integrin expression and function on oral epithelial cells // Arch. Dermatol. Res.-2003.-Vol.295, №6.-P.63-70.

36. Schell H., Schonberger A. Zur Lokalisationshaufikeit von benignen und prakanzerosen Leukoplakien und von Karzinomen in der Mundhohle // Z. Hautkr.-1987.-Bd.62.-S.798-804.

SUMMARY

Molecular markers and prognosis of malignant transformation of leukoplakia A.Aliyev

Azerbaijan Medical University, National Center of Oncology, Baku

Leukoplakia refers to an optional precancerous disease characterized by varying degrees of kera-tinization of the surface epithelium, and the rate of malignant transformation of leukoplakia varies widely.

In general, the nature of untreated precancerous leukoplakia with a high degree of probability can be considered a sign of malignancy.

Поступила 11.01.2013