МНОЖЕСТВЕННОЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ В СМЕСИ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ПОСРЕДСТВОМ СИГНАТУРНЫХ ПЕПТИДОВ И МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ

1. Способ количественного определения одного или более рекомбинантных белков в образце, включающий стадии:
i) увеличения концентрации указанного одного или более рекомбинантных белков посредством аффинной очистки для получения первой фракции;
ii) расщепления указанной первой фракции для высвобождения одного или более конкретных сигнатурных пептидов для каждого из указанных рекомбинантных белков во вторую фракцию;
iii) добавления одного или более пептидов для внутреннего сравнения для каждого из указанных сигнатурных пептидов к указанной первой фракции и/или указанной второй фракции;
iv) количественного определения указанных сигнатурных пептидов масс-спектрометричеким анализом.
2. Способ по п.1, где указанный способ дополнительно включает стадии:
i) повторения стадий i)-iv) по п.1 с соответствующим белковым препаратом, добавленным в известной концентрации в образец, для получения стандартной кривой белка, и
ii) сравнения количественного определения указанных сигнатурных пептидов, полученных на стадии iv) по п.1, со стандартной кривой белка, полученной на стадии i), и количественного определения указанного одного или более рекомбинантных белков в получаемом указанном образце.
3. Способ по п.1, где указанный способ дополнительно включает стадию восстановления и/или алкилирования перед расщеплением на стадии ii) по п.1.
4. Способ по п.1, где указанный способ дополнительно включает стадию увеличения концентрации указанных сигнатурных пептидов и указанных пептидов для внутреннего сравнения с использованием смолы с химическими свойствами, способствующими фракционированию образца и увеличению, таким образом, концентрации представляющих интерес пептидов.
5. Способ по п.1, где указанный способ дополнительно включает стадию увеличения концентрации указанных сигнатурных пептидов и указанных пептидов для внутреннего сравнения с использованием смолы, связанной с антителами против сигнатурного пептида с последующим высвобождением указанных сигнатурных пептидов и указанных пептидов для внутреннего сравнения для получения третьей фракции.
6. Способ по п.1, где аффинная очистка на стадии i) по п.1 включает связывание с одним или более белками, связывающими иммуноглобулины.
7. Способ по п.1, где аффинная очистка на стадии i) по п.1 включает связывание с одним или более бактериальными белками, связывающими иммуноглобулины.
8. Способ по п.6, где иммуноглобулин человека представляет собой IgG1 человека, IgG2 человека, IgM человека, IgA человека или IgE человека.
9. Способ по п.6, где иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин мыши, кролика, козы, свиньи, коровы, верблюда, собаки, кошки, курицы, рыбы или обезьяны.
10. Способ по п.9, где иммуноглобулин мыши представляет собой IgG2a, IgG2b, IgG3 или IgG1 мыши.
11. Способ по п.1, где аффинная очистка на стадии i) включает связывание с белком A, связывание с белком G, связывание с белком A/G, связывание с белком L, связывание с антителом против константной области поликлонального антитела, связывание с Fc-рецептором, связывание с Con A или связывание с мишенью для антитела.
12. Способ по п.1, где расщепление на стадии ii) проводят трипсином, химотрипсином, Asp-N, Glu-C, Lys-C, lys-N или Arg-C.
13. Способ по п.1, где расщепление проводят по существу до конца.
14. Способ по п.3, где восстановление проводят дитиотреитолом (DTT) или меркаптоэтанолом.
15. Способ по п.3, где алкилирование проводят 4-винилпиридином, йодацетамидом или йодацетамидом и/или йодуксусной кислотой.
13
15
18
16. Способ по п.1, где один или более пептидов для внутреннего сравнения на стадии iii) мечены C, N или О.
17. Способ по п.1, где один или более пептидов для внутреннего сравнения на стадии iii) получают постсинтетическим мечением, химическим синтезом или в живых клетках посредством метаболического включения.
18. Способ по п.17, где клетки являются частью микроорганизма.
19. Способ по п.17, где клетки представляют собой клетки млекопитающих в культуре.
in vitro
18
20. Способ по п.1, где один или более пептидов для внутреннего сравнения на стадии iii) получают , способом, включающим дейтерированный ацетат для мечения первичной аминогруппы, способом, включающим N-концевые специфические реагенты, способом, включающим перметиловую этерификацию карбоксильных групп пептидов, способом, включающим добавление пары метокО к C-концу трипсиновых пептидов в процессе расщепления, способом, включающим N-концевое пептидное мечение, способом, включающим NIT (N-концевое изотопно-кодируемое мечение), способом, включающим C-концевое пептидное мечение, способом, включающим мечение, которое является отличным от N-концевого и C-концевого пептидного мечения, способом, включающим обусловленное аминокислотой мечение, или способом, включающим обусловленное аминокислотой мечение одной аминокислоты в каждом пептиде.
21. Способ по п.4, где антитела против сигнатурного пептида представляют собой антитела, полученные из поликлональной сыворотки, или моноклональные антитела.
22. Способ по п.1, где пептид для внутреннего сравнения имеет последовательность, идентичную последовательности внутри рекомбинантного поликлонального антитела и/или TcR.
23. Способ по п.22, где последовательность внутри рекомбинантного поликлонального антитела представлена в константной области указанного рекомбинантного поликлонального антитела, в вариабельной области указанного рекомбинантного поликлонального антитела, в легкой цепи указанного рекомбинантного поликлонального антитела, в тяжелой цепи указанного рекомбинантного поликлонального антитела, в каркасных областях указанного рекомбинантного поликлонального антитела, в гипервариабельных доменах указанного рекомбинантного поликлонального антитела, в определяющих комплементарность областях (CDR) указанного рекомбинантного поликлонального антитела, в CDR1 указанного рекомбинантного поликлонального антитела, в CDR2 указанного рекомбинантного поликлонального антитела или в CDR3 указанного рекомбинантного поликлонального антитела.
24. Способ по п.4, где концентрацию сигнатурных пептидов увеличивают, используя разделение, основанное на ионном обмене, обратно-фазовое разделение, разделение, основанное на гидрофильном взаимодействии, разделение, основанное на гидрофобном взаимодействии или эксклюзионное разделение.
25. Способ по п.5, где антитела против сигнатурного пептида индуцированы в кролике, в курице, в козе или в овце.
26. Способ по п.5, где способ осуществляют в периодическом формате, в 96-луночном формате, как часть многомерной системы ЖХ-МС или автоматически.
27. Способ по п.5, где указанные сигнатурные пептиды и пептиды сравнения элюируют непосредственно в источник ионов.
28. Способ по п.5, где указанные сигнатурные пептиды и пептиды сравнения элюируют непосредственно в источник ESI.
29. Способ по п.1, где масс-спектрометрия включает ионизацию посредством ESI, ионизацию посредством MALDI, анализ ЖХ-МС, состоящий из двух или более размеров хроматографического фракционирования, анализ ЖХ-МС, включающий многомерную хроматографию, анализ ЖХ-МС, включающий одномерное разделение ЖХ, анализ ЖХ-МС, включающий два или более размеров разделения ЖХ, ионно-циклотронный резонанс с преобразованием Фурье (FTICR), Q-TOF или способы, основанные на тройном квадруполе, ЖХ-МС/МС, ЖХ-ESI-МС/МС, ЖХ-MALDI-МС/МС, способы, основанные на множественном мониторинге реакций (MRM), экстрагированные хроматограммы, способы, основанные на ионной ловушке, способ, основанный на ESI-тройном квадруполе, способ, основанный на Orbitrap, способы, основанные на ESI-TOF, или способы, основанные на ESI-Q-TOF.
30. Способ по п.1, где один или более рекомбинантных белков включают два или более рекомбинантных поликлональных антитела.
31. Способ по п.1, где один или более рекомбинантных белков включают два или более химерных поликлональных антитела.
32. Способ по п.31, где два или более химерных поликлональных антитела включают часть, происходящую от человека, и часть, происходящую от мыши.
33. Способ по п.32, где часть, происходящая от человека, представляет собой константную область поликлонального антитела или вариабельную область поликлонального антитела.
34. Способ по п.32, где часть, происходящая от мыши, представляет собой константную область поликлонального антитела или вариабельную область поликлонального антитела.
35. Способ по п.1, где один или более рекомбинантных белков включает один или более гомологов.
36. Способ по п.1, где образец представляет собой образец сыворотки, образец плазмы, супернатант клеточной культуры или супернатант биореактора.
37. Способ по п.1, где один или более рекомбинантных белков включают рекомбинантное поликлональное антитело, используемое для лечения и/или профилактики двух или более инфекционных заболеваний, двух или более бактериальных инфекций, двух или более вирусных инфекций или двух или более форм злокачественной опухоли.
38. Способ по п.1, где один или более рекомбинантных белков включают рекомбинантное поликлональное антитело, состоящее из различных рекомбинантных поликлональных антител.
39. Способ по п.1, где один или более рекомбинантных белков включают рекомбинантное поликлональное антитело, состоящее из различных рекомбинантных поликлональных антител против резус D (RhD), таких как Sym001.
40. Способ по п.1, где один или более рекомбинантных белков включают рекомбинантное поликлональное антитело против вируса вакцинии для замены существующих гипериммунных иммуноглобулинов против вакцинии (VIG), такое как Sym002.
41. Способ по п.1, где один или более рекомбинантных белков включают рекомбинантное поликлональное антитело, нацеленное против респираторно-синцитиального вируса (RSV), такое как Sym003.
42. Способ по п.1, где один или более рекомбинантных белков включают рекомбинантное поликлональное антитело, нацеленное на антиген злокачественной опухоли, EGFR человека, бактериальный патоген, вирусный патоген или мишень инфекционного заболевания.
43. Способ по п.1, где один или более рекомбинантных белков включают один или более рекомбинантных B-клеточных рецепторов.
44. Способ по п.1, где один или более рекомбинантных белков включают один или более рекомбинантных T-клеточных рецепторов.
45. Применение способа по любому из пп.1-44 для количественного определения одного или более рекомбинантных белков в образце.
in vivo
46. Применение по п.45, где способ применяют для определения  клиренса индивидуального антитела, составляющего композицию рекомбинантного поликлонального антитела в сыворотке индивидуума.
47. Применение по п.45, где способ применяют для фармакокинетических исследований индивидуума.
48. Применение по п.46 или 47, где индивидуум представляет собой человека.
49. Применение по п.46 или 47, где индивидуум представляет собой грызуна.
50. Применение по п.46 или 47, где индивидуум представляет собой обезьяну.
51. Применение по п.45, где способ применяют для определения характеристик поликлональности в лекарственном веществе, поликлональности в лекарственном продукте или для количественного определения одного или более рекомбинантных антител в образцах, полученных в процессе производства.
52. Применение способа по п.1 в отношении производства рекомбинантных поликлональных антител.
53. Применение способа по п.1 в отношении производства рекомбинантных поликлональных антител на стадиях, предшествующих получению лекарственного вещества, или стадиях после получения лекарственного вещества.
54. Применение способа по п.1 в отношении производства рекомбинантных поликлональных антител на стадиях, предшествующих получению лекарственного продукта, или стадиях после получения лекарственного продукта.
55. Применение способа по п.1 для отбора клонов для поликлонального клеточного банка.
56. Способ по п.1, где количество рекомбинантных белков, подлежащих количественному определению, составляет два или более.