СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ МЕГАЛИНА ЧЕЛОВЕКА
METHOD FOR MEASURING HUMAN MEGALINE

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу измерения мегалина человека. Более конкретно настоящее изобретение относится к способу выявления мегалина человека, включающему количественное определение мегалина, который локально и специфически экспрессируется в клетках, тканях и органах, где наблюдается экспрессия мегалина, быстрым и простым способом, что позволяет прямым образом и на ранних стадиях диагностировать степень поражения клеток, тканей и органов, а также облегчать течение заболеваний, предупреждать их ухудшение и улучшать прогноз посредством лечения. Настоящее изобретение применимо к диагностике заболеваний органов, в которых наблюдается экспрессия мегалина, например заболеваний почек и/или легких.
Уровень техники изобретения
1. Клонирование мегалина
В результате поиска этиологического антигена при нефрите Хеймана, который представляет собой экспериментальную модель мембранной нефропатии, Kerjaschki D. и Farquhar M.G. в 1982 году идентифицировали мембранный клеточный белок gp330 (Kerjaschki D., Farquhar M.G., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79, 5557-5561). В 1994 году Saito A. с соавторами установили полную первичную структуру крысиного gp330 и назвали его мегалином, поскольку этот белок оказался самым крупным клонированным мембранным белком позвоночных (Saito A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 9725-9729).
2. Сайт экспрессии мегалина
Мегалин также известен под названиями гликопротеин 330 (gp330) и белок 2, связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности (LRP-2). Это - гликопротеин с молекулярной массой приблизительно 600 кДа, который экспрессируется в эпителиальных клетках проксимальных канальцев почек, в других тканях и клетках, например в альвеолярных клетках II типа, в мужских семенниках, в эндометрии матки, в плаценте, в эпителии внутреннего уха, в почечном эпителии, в зародышевом вителлариуме и в невральной эктодерме (см. Christensen E. I., Willnow, T. E., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2224-2236; Juhlin C., Klareskog L. et al., 1990, J. Biol. Chem. 265, 8275-8279; а также Zheng G, McCluskey R. T. et al., 1994, J. Histochem. Cytochem. 42, 531-542). В почках мегалин действует как рецептор эндоцитоза, связанный с эндоцитозом реабсорбцией белков и т.п. в проксимальном канальце перед экскрецией с мочой. После этого белки реабсорбции и т.п. разрушаются лизосомами (см. Mausbach A. B., Christensen E. I., 1992, Handbook of Physiology: Renal Physiology, Windhager, editor, New York, Oxford University Press, 42-207).
3. Нуклеотидная последовательность мегалина
Мегалин представляет собой гликопротеин, который чаще всего экспрессируется у млекопитающих животных на эпителиальной мембране проксимального канальца почек. Кодирующая последовательность кДНК мегалина по составу нуклеотидов идентична последовательности кДНК мегалина человека с инвентарным номером гена U04441, раскрытой в работе Korenberg, J. R. et al. (1994), или последовательности кДНК мегалина человека с инвентарным номером гена U33837, раскрытой в работе Hjaeln, G., et al. (1996) (см. Korenberg J. R. et al., 1994, Genomics 22, 88-93; и Hjalm G. et al., 1996, Eur. J. Biochem. 239, 132-137).
Кроме того, в работе Saito et al. (1994) был открыт крысиный мегалин, имеющий гомологию с мегалином человека, и его кодирующая последовательность кДНК с инвентарным номером гена L34049 уже была раскрыта (см. Saito A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 9725-9729).
4. Аминокислотная последовательность и белковая структура мегалина
Мегалин представляет собой гигантский белок клеточной мембраны, состоящий из 4655 аминокислот (мегалин человека) и 4660 аминокислот (крысиный мегалин). Молекулярный вес, выведенный на основе аминокислотной последовательности, составляет приблизительно 520 кДа, но может превысить 600 кДа при включении сахарной цепи (см. Saito A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 9725-9729). Мегалин принадлежит к генному семейству рецепторов LDL, гигантская внеклеточная область которого имеет четыре функциональных домена, причем эта внеклеточная область связана с тонкой внутриклеточной областью через единственную трансмембранную область. Мегалин представлен, главным образом, в покрытой клатрином ямке на почечном клубочке (у крыс) или на эпителиальной люминальной мембране (люминальная и базальная мембраны клеток гломерулярного эпителия) проксимального почечного канальца, альвеолярных клеток II типа, клеток придатка яичка, щитовидной железы, добавочных щитовидных желез, на мембране желточного мешка, во внутреннем ухе, в тонком кишечнике, на собственно сосудистой оболочке (chorioidea) и ассоциирован с поступлением в клетки различных лигандов и их метаболитов (см. Farquhar M. G. et al., 1995, J. Am. Soc. Nephrol. 6, 35-47; и Christensen E. I. et al., 2002, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3, 256-266). У мышей с нокаутом мегалина наблюдаются такие заболевания и расстройства, как низкомолекулярная протеинурия, нарушения костного метаболизма, дыхательная недостаточность, пороки развития головного мозга и другие (см. Willnow T. E. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, 8460-8464). У нематод (C. elegans) также представлен гомолог мегалина, в отношении которого было высказано предположение о биологической важности (см. Yochem J. et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90, 4572-4576).
5. Значение мегалина как причины нефрита
Мегалин, главный этиологический антиген экспериментальной мембранной нефропатии (нефрита Хеймана), представляет собой эпителиальный фагоцитарный рецептор, биологическая и патологическая роль которого выяснены. Для выяснения механизма развития мембранозной нефропатии человека уже давно используются животные модели, и крысиный нефрит Хеймана является моделью мембранной нефропатии. Анализ нефрита Хеймана продвинулся дальше, чем анализ любой другой модели. Saito A. et al. раскрыли результаты анализа патологического эпитопа и лиганд-связывающего домена нефрита Хеймана, а также продемонстрировали главную антигенную область мегалина и функциональный домен мегалина, дающие основной вклад в связывание лиганда (см. Kerjaschki D. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 11179-11183; Saito A., Farquhar M. G. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93, 8601-8605; Yamazaki H., Farquhar M. G. et al., 1998, J. Am. Soc. Nephrol. 9, 1638-1644; и Orlando R. A., Farquhar M. G. et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94, 2368-2373).
6. Различные лиганды мегалина
in vivo
12
3
12
Мегалин наиболее обильно экспрессируется на люминальной стороне эпителиальных клеток проксимальных канальцев почек. В почках человека экспрессия мегалина не наблюдается ни в каких других местах, кроме эпителиальных клеток проксимальных канальцев, включая клубочки. Мегалин инкорпорирует различные лиганды (например, низкомолекулярные белки или лекарства), которые фильтруются клубочками в клетки через эндоцитоз, мегалин транспортирует их в лизосомы, и они вновь появляются на клеточной поверхности посредством рециклинга (см. Farquhar M. G. et al., 1995, J. Am. Soc. Nephrol. 6, 35-47; и Christensen E. I. et al., 2002, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3, 256-266). К тому же, мегалин связан с трансцитозом с люминальной стороны на базальную сторону мембраны. Мегалин также связан с поглощением и метаболизмом связывающих белков, таких как витамины A, B и D (см. Christensen E. I. et al., 2002, Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3, 256-266). Christensen и Willnow продемонстрировали, что мегалин опосредует реабсорбцию трех белков-носителей витаминов: белка, связывающего витамин D (DBP), белка, связывающего ретинол (RBP), и транскобаламина (TC), а также связанных с ними витаминов, то есть (OH) витамина 25D, витамина A (ретинола) и витамина B (см. Christensen E. I., Willnow T. E., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 2224-2236). Saito A. с соавторами продемонстрировали, что лептин, секретируемый адипоцитами, содержание которого повышено в крови больных с ожирением, инкорпорируется и метаболизируется эпителиальными клетками проксимальных канальцев, как лиганд мегалина (см. Saito A., Gejyo F. et al., 2004, Endocrinology. 145, 3935-3940). Адипоциты, то есть накопленные висцеральные жиры, приводят к комбинированным патологическим состояниям, т.е. метаболическому синдрому. Лептин, который представляет собой адипоцитокин, секретируемый адипоцитами, повышен в крови у больных с метаболическим синдромом. Исследователи полагают, что почка является органом, в котором с наибольшей вероятностью накапливается лептин, циркулирующий в крови, причем этот лептин играет нефропатическую роль (см. Tarzi R. M., Lord G. M. et al., 2004, Am. J. Pathol. 164, 385-390). Так называемый лептиновый рецептор также обнаруживается в области между проксимальным канальцем и собирательным канальцем, расположенным ниже области функционирования мегалина.
Термин "метаболический синдром" определяется как болезненное осложнение висцерального ожирения, сопровождающееся повышением артериального давления, гиперлипидемией, нарушенной толерантностью к глюкозе и другими симптомами, причем основным фактором риска развития этого синдрома является резистентность к инсулину. Такого рода состояния с высокой вероятностью приводят к развитию артериосклеротических заболеваний и протеинурии и могут привести к развитию нефропатии, гистологическим признаком которой является гипертрофия почечных клубочков и канальцев. Если такой случай сочетается с явным диабетом, то еще в большей степени развивается гипергликемия, проявляется диабетическая нефропатия, а сопутствующие болезненные состояния становятся более тяжелыми. Метаболический синдром в основном предшествует диабету II типа или развивается одновременно с ним. В соответствии с этим нефропатия может рассматриваться как нефропатия, сочетающаяся с метаболическим синдромом.
125
Saito A. с соавторами провели эксперимент с эпителиальными клетками, извлеченными из желточного мешка зародыша крысы (клетки L2), в которых мегалин экспрессировался на высоком уровне, и обнаружили, что включение полученных из глюкозы конечных продуктов усиленного гликозилирования (AGE) с радиоизотопной меткой I в клетки L2 можно в значительной степени подавить антителами против мегалина. Таким образом, они продемонстрировали, что мегалин связан с метаболическим путем такого включения (см. Saito A., Gejyo F. et al., 2003, J. Am. Soc. Nephrol. 14, 1123-1131). Взаимодействие конечных продуктов усиленного гликозилирования (AGE) с гликозилированными и модифицированными белками в реакции Майяра было указано в качестве механизма развития диабетической нефропатии. Низкомолекулярный AGE, присутствующий в крови, фильтруется почечными клубочками, а реабсорбируется и метаболизируется эпителиальными клетками проксимальных канальцев. Если нефропатия прогрессирует далее, то клубочками также фильтруется высокомолекулярный AGE, который накапливается в эпителиальных клетках проксимальных канальцев и создает чрезмерную метаболическую нагрузку. Далее, Saito A. с соавторами также продемонстрировали, что мегалин связан с включением в клетки (дополнительно к глюкозе) AGE, полученного из метилглиоксаля, глицеринальдегида или гликолевого альдегида. К тому же, метаболический синдром часто осложняется гепатопатией, например жировым перерождением печени. Белки печеночного типа, связывающие жирные кислоты (L-FABP), обильно представленные в печени, у здоровых людей выбрасываются в кровь. При гепатопатии выброс L-FABP увеличивается, что приводит к повышению их уровня в крови. Saito A. с соавторами также продемонстрировали, что L-FABP в крови быстро фильтруются почечными клубочками и реабсорбируются эпителиальными клетками проксимальных канальцев через мегалин (см. Takeda T., Gejyo F., Saito A. et al., 2005, Lab. Invest. 85, 522-531).
7. Функциональный белок, взаимодействующий с мегалином
12
+
+
+
+
Для того чтобы прояснить механизм транспортировки мегалина в клетках, был проведен поиск адапторных молекул, связывающихся с внутриклеточными доменами мегалина, в ходе которого были идентифицированы различные белки, например, Dab2, ANKRA, MAGI-1, GAIP, GIPC, Galphai3, MegBP и ARH (см. Oleinikov A. V. et al., 2000, Biochem. J. 347, 613-621; Rader K., Farquhar M. G. et al., 2000, J. Am. Soc. Nephrol. 11, 2167-2178; Patrie K. M., Margolis B. et al., 2001, J. Am. Soc. Nephrol. 12, 667-677; Lou X., Farquhar M.G. et al., 2002, J. Am. Soc. Nephrol. 13, 918-927; Petersen H.H., Willnow T. E., 2003, J. Cell. Sci. 116, 453-461; и Takeda T., Farquhar M.G. et al., 2003, Mol. Biol. Cell. 14, 4984-4996). Через эти молекулы мегалин связан с эндоцитозом и трансцитозом, а также с относящейся к ним передачей сигналов. К тому же, мегалин функционирует конъюгативно (сопряженно) с рецептором клеточной мембраны, то есть с кубилином в эпителиальных клетках проксимальных канальцев, благодаря чему он дополнительно вовлекается в процессы включения различных лигандов в клетки (см. Saito A. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91, 9725-9729). Например, кубилин представляет собой рецептор, который непосредственно связывается с трансферрином, альбумином, эндогенным витамином B и т.п., а мегалин косвенно включается в их эндоцитоз. Известно также, что мегалин взаимодействует в эпителиальных клетках проксимальных канальцев с изоформой 3 обменника Na-H(NHE3) (см. Biemesderfer D. et al., 1999, J. Biol. Chem. 274, 17518-17524). NHE3 представляет собой антипортер, играющий важную роль в реабсорбции Na, кроме того, NHE3 влияет на включение лигандов мегалином (см. Hryciw D. H. et al., 2004, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 372-379). Мегалин также может быть вовлечен в инактивацию и метаболизм NHE3. На ранней стадии диабетической нефропатии или нефропатии, связанной с метаболическим синдромом, клубочковая фильтрация становится избыточной. Усиленная реабсорбция Na в проксимальных канальцах является, как было установлено, основной причиной (см. Vallon V. et al., 2003, J. Am. Soc. Nephrol. 14, 530-537), причем NHE3 в данном случае играет ключевую роль, а инактивация и метаболизация NHE3 мегалином, по-видимому, также играют определенную роль в этих процессах (см. Hryciw D. H. et al., 2004, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 372-379).
8. Корреляция мочевой экскреции мегалина и мочевой экскреции лиганда мегалином
Leheste с соавторами раскрыли, что для нокаутных по мегалину мышей и для больных с синдромом Фанкони, у которых ослаблена функция проксимальных канальцев, характерна повышенная мочевая экскреция белков и ретинола (см. Leheste J. et al., 1999, Am. J. Pathol. 155, 1361-1370). Далее, Moestrup S. K. et al. продемонстрировали, что количество мегалина, выделяемого с мочой у больных с синдромом Фанкони, значительно снижено по сравнению со здоровыми индивидуумами. Это вызывает ухудшение функций и экспрессии мегалина в проксимальных канальцах, а впоследствии увеличивает количество фильтруемых клубочками белков, которые содержат связывающие ретинол белки, выводимые с мочой (см. Anthony G. W., Moestrup S. K. et al., 2002, J. Am. Soc. Nephrol. 13, 125-133).
9. Важность функции мегалина, обнаруженная в экспериментах с использованием моделей уремии и моделей регенерации органов
2
2
2
2
2
2
in vivo
125
125
125
Как описано выше, мегалин вовлечен в поглощение различных низкомолекулярных белков эпителиальными клетками проксимальных почечных канальцев и в их метаболизм. Если патологическое состояние прогрессирует до стадии почечной недостаточности, то механизм метаболизма нарушается, вследствие чего низкомолекулярные белки накапливаются в крови и тканях как уремические белки. Типичным примером является β-микроглобулин (β-m), который может вызывать диализный амилоидоз у больных, длительно получающих диализ (см. Gejyo F., Schmid K. et al., 1985, Biochem. Biophys. Res. Commun. 129, 701-706). Вышеупомянутый AGE также считают причиной артериосклероза или органной недостаточности вследствие его накопления в крови у больных с почечной недостаточностью или длительным диализом, причем AGE рассматривается как белок уремического типа (см. Henle T., Miyata T., 2003, Adv. Ren. Replace Ther. 10, 321-331). Далее, лептин накапливается в крови больных, получающих диализ, поэтому считается, что он вовлечен в нарушение питания и расстройство иммунитета. Tabata Y. и Gejyo F. с соавторами раскрыли эффекты и эффективность моделей метаболизма уремического белка с использованием функций мегалина (см. Saito A., Tabata Y., Gejyo F. et al., 2003, J. Am. Soc. Nephrol. 14, 2025-2032 и документ WO 02/091955). То есть клетки, экспрессирующие мегалин, трансплантируют  как строительные белки, а низкомолекулярные белки, просачивающиеся наружу из периферических кровеносных сосудов (кровеносных сосудов новорожденных), встраиваются в клетки с помощью мегалина для последующей метаболизации. Клетки, экспрессирующие мегалин, которые используются для трансплантации (то есть клетки L2, полученные из эпителия желточного мешка), инкорпорируют и метаболизируют β-m при помощи мегалина (см. Saito A., Tabata Y., Gejyo F. et al., 2003, J. Am. Soc. Nephrol. 14, 2025-2032). Состояние почечной недостаточности индуцировали удалением обеих почек у мыши nude, которой была проведена подкожная трансплантация клеток L2, после чего измеряли инкорпорирование клеток в тканевую массу и в органы, куда были трансплантированы клетки с β-m, меченные изотопом I, посредством внутрибрюшинной инъекции. В результате было обнаружено, что клеточная масса, в которую были трансплантированы клетки L2, более интенсивно инкорпорировала β-m, меченный изотопом I, по сравнению с другими органами, и выведение β-m, меченного I, было значительно повышено в группе, в которой были трансплантированы клетки L2 по сравнению с контрольной группой, в которой трансплантация клеток L2 не проводилась (см. Saito A., Tabata Y., Gejyo F. et al., 2003, J. Am. Soc. Nephrol. 14, 2025-2032).
10. Протеолиз и экскреция мегалина с мочой
В последние годы было высказано предположение о том, что мегалин, возможно, подвержен протеолизу на V-образном сигнальном пути (см. Zou Z., Biemesderfer D. et al., 2004, J. Biol. Chem. 279, 34302-34310; и Grigorenko A. P. et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101, 14955-14960). Этот процесс также включает двухэтапную систему расщепления с шеддингом эктодомена, опосредованным металлопротеазой, и внутримембранным протеолизом, опосредованным гамма-секретазой.
Также известно, что мегалин экспрессируется в альвеолярных клетках II типа.
Таким образом, мегалин интенсивно исследовался на корреляцию с метаболизмом в таких органах, как почки. Однако корреляция между заболеваниями органов, включая почки, и мегалином до сих пор не была выяснена, а экспрессия мегалина или его экскреция биологическими жидкостями в связи с множеством заболеваний органов еще не исследовалась.
На сегодня в качестве способа для выявления мегалина известен способ, включающий тканевое окрашивание или вестерн-блоттинг с использованием поликлонального антитела, полученного при иммунизации иммунного животного, например кролика.
Однако эта методика подразумевает окрашивание клетки или белка, выделенного с помощью электрофореза, а это сопряжено с очень сложными процедурами и большими затратами времени на иммобилизацию тканей, приготовление тканевых срезов, электрофорез и перенос на мембрану. Поэтому количественное определение мегалина весьма затруднительно.
2
С точки зрения диагностики степени функциональных нарушений тканей или органов, особенно при заболеваниях почек, не существует эффективных средств для диагностики недостаточности почечных канальцев достаточно простым, но специфическим образом. К настоящему времени были использованы многие способы диагностики, основанные на выявлении в моче или крови альбумина, креатинина, β-микроглобулина, L-FABP и т.п. диагностических маркеров почечных заболеваний. Однако такие диагностические маркеры происходят не из почечной ткани, а просто являются результатом всех явлений и функций, связанных с фильтрацией в почечных клубочках и реабсорбцией в почечных канальцах. То есть даже при использовании таких маркеров довольно трудно идентифицировать недостаточность почечных клубочков или недостаточность почечных канальцев. К тому же указанные маркеры являются непрямыми маркерами, полученными из других органов, а не из почки. Итак, для ранней диагностики заболевания характерна плохая эффективность. То же самое относится к KL-6 (маркеру острого воспаления), который в настоящее время используется как диагностический маркер легочных, особенно воспалительных заболеваний.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение предлагает способ измерения мегалина человека, осуществляемый достаточно простым образом в течение более короткого промежутка времени по сравнению с традиционными методиками, причем указанный способ позволяет проводить количественное определение мегалина человека. Далее, этот способ позволяет сайт-специфическим образом и на ранней стадии диагностировать функциональные заболевания, специфичные для клеток, тканей или органов. В частности, настоящее изобретение предлагает способ измерения уровня мегалина в моче для выявления почечных нарушений.
Как описано выше, в литературе имеется множество сообщений о мегалине человека и его предполагаемой корреляции с метаболизмом в таких органах, как почки и легкие. Однако в тех случаях, когда функции органа нарушены, пути, по которым развиваются вариабельность экспрессии мегалина и изменения его количества, неизвестны.
Авторы настоящего изобретения провели усиленные исследования, направленные на разработку способа измерения мегалина человека с высокой чувствительностью и быстрым образом. В результате этих исследований они открыли способ точного измерения мегалина в образце биологической жидкости, например моче, с использованием лиганда, способного связываться с мегалином человека, особенно антитела против мегалина человека.
Далее авторы настоящего изобретения проводили измерение мегалина человека в биологической жидкости больного с нарушением функций органа и обнаружили, что мегалин человека может быть маркером для выявления и диагностики заболеваний органов. Это привело к окончательному формированию настоящего изобретения.
Более точно настоящее изобретение заключается в следующем.
[1] Способ измерения мегалина человека в образце с применением первого лиганда, способного связываться с мегалином человека, который связан с твердой подложкой, и второго лиганда, способного связываться с мегалином человека, причем указанный способ включает предоставление образцу возможности прореагировать с первым лигандом, способным связываться с мегалином человека, который связан с твердой подложкой, предоставление образцу возможности прореагировать со вторым лигандом, способным связываться с мегалином человека, и измерение второго лиганда, способного связываться с мегалином человека, который связан с твердой подложкой в результате образования комплекса мегалина человека в образце и лиганда, способного связываться с мегалином человека.
[2] Способ измерения мегалина человека в образце по п.[1], включающий два этапа: реакцию между первым лигандом, способным связываться с мегалином человека, который связан с твердой подложкой, и образцом, а также последующую реакцию между вторым лигандом, способным связываться с мегалином человека, и образцом.
[3] Способ измерения мегалина человека в образце по п.[1], в котором реакция между первым лигандом, способным связываться с мегалином человека, который связан с твердой подложкой, и образцом, а также реакция между вторым лигандом, способным связываться с мегалином человека, и образцом осуществляются в один этап.
[4] Способ измерения мегалина человека в образце по любому из п.п.[1]-[3], в котором и первый лиганд, способный связываться с мегалином человека, и второй лиганд, способный связываться с мегалином человека, представляют собой антитела.
[5] Способ измерения мегалина человека в образце по любому из п.п.[1]-[3], в котором первый лиганд, способный связываться с мегалином человека, представляет собой лектин, специфичный по отношению к сахарной цепи мегалина человека, а второй лиганд, способный связываться с мегалином человека, представляет собой антитело.
[6] Способ измерения мегалина человека в образце по любому из п.п.[1]-[3], в котором первый лиганд, способный связываться с мегалином человека, представляет собой антитело, а второй лиганд, способный связываться с мегалином человека, представляет собой лектин, специфичный по отношению к сахарной цепи мегалина человека.
12
2
2+
+
+
[7] Способ измерения мегалина человека в образце по любому из п.п.[1]-[6], в котором первый лиганд, способный связываться с мегалином человека, и/или второй лиганд, способный связываться с мегалином человека, представляют собой вещества, выбираемые из группы, состоящей из белка, связывающего витамин, который представляет собой транскобаламин-витамин B, белка, связывающего витамин D, или белка, связывающего ретинол, липопротеина, который представляет собой аполипопротеин B, аполипопротеин E, аполипопротеин J/кластерин или аполипопротеин H, гормона, который представляет собой паратиреоидный гормон (PTH), инсулин, эпителиальный фактор роста (EGF), пролактин, лептин или тиреоглобулин, рецептора любого из указанных веществ или рецептора такого гормона, белка, связанного с имунным ответом или реакцией на стресс, который представляет собой легкую цепь иммуноглобулина, PAP-1 или β-микроглобулина, фермента, который представляет собой PAI-I, PAI-I-урокиназу, PAI-I-tPA, проурокиназу, липопротеинлипазу, плазминоген, α-амилазу, β-амилазу, α-микроглобулин или лизоцим, ингибитора любого из указанных веществ или ингибитора такого фермента, лекарственного средства или токсина, который представляет собой аминогликозид, полимиксин B, апротинин или трихосантин, белка-носителя, который представляет собой альбумин, лактоферрин, гемоглобин, одорант-связывающий белок, транстиретин или L-FABP, а также белка, ассоциированного с рецептором (RAP), который представляет собой цитохром-C, кальция (Ca), конечных продуктов усиленного гликозилирования (AGE), кубилина или изоформы 3 ионообменника Na-H (NHE3) или связывающего фрагмента такого вещества.
[8] Способ измерения мегалина человека в образце с применением мегалина человека или частичного фрагмента мегалина человека, который связан с твердой подложкой, и лиганда, способного связываться с мегалином человека, причем указанный способ включает предоставление образцу возможности прореагировать с лигандом, способным связываться с мегалином человека, предоставление продукту реакции возможности прореагировать с мегалином человека, который связан с твердой подложкой, измерение лиганда, способного связываться с мегалином человека, который связан с твердой подложкой, и конкурентное количественное определение мегалина человека в образце, основанное на снижении процентного содержания лиганда, способного связываться с мегалином человека, который связан с твердой подложкой.
[9] Способ измерения мегалина человека в образце по п.[8], в котором лиганд, способный связываться с мегалином человека, представляет собой антитело против мегалина человека.
[10] Способ измерения мегалина человека в образце с применением лиганда, способного связываться с мегалином человека, причем указанный способ включает предоставление образцу возможности прореагировать с лигандом, способным связываться с мегалином человека, который связан с частицей, индуцирующей агглютинацию, и измерение мегалина человека, основанное на степени результирующей агглютинации.
[11] Способ измерения мегалина человека по п.[10], в котором лиганд, способный связываться с мегалином человека, представляет собой антитело против мегалина человека, а агглютинация представляет собой иммунную агглютинацию.
[12] Способ измерения мегалина человека по любому из п.п.[1]-[11] для выявления заболевания в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина.
[13] Способ выявления заболевания в органе по п.[12], в котором заболевание в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина, представляет собой легочное заболевание.
[14] Способ выявления заболевания в органе по п.[12], в котором заболевание в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина, представляет собой почечное заболевание.
[15] Способ выявления почечного заболевания по п.[14], в котором почечное заболевание представляет собой заболевание почечных канальцев.
[16] Способ по п.[14] или п.[15], в котором образец представляет собой мочу.
[17] Набор для выявления заболевания в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина, включающий лиганд, способный связываться с мегалином человека.
[18] Набор для выявления заболевания в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина, по п.[17], в котором лиганд, способный связываться с мегалином человека, представляет собой антитело против мегалина человека.
[19] Набор для выявления заболевания в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина, по п.[18], в котором заболевание в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина, представляет собой легочное заболевание.
[20] Набор для выявления заболевания в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина, по п.[18], в котором заболевание в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина, представляет собой почечное заболевание.
[21] Набор для выявления почечного заболевания по п.[20], в котором почечное заболевание представляет собой заболевание почечных канальцев.
[22] Маркер, определяющий заболевание, для выявления заболевания в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина, содержащий мегалин человека.
[23] Маркер, определяющий заболевание, по п.[22], в котором заболевание в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина, представляет собой легочное заболевание.
[24] Маркер, определяющий заболевание, по п.[22], в котором заболевание в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина, представляет собой почечное заболевание.
[25] Маркер, определяющий заболевание, по п.[24], в котором почечное заболевание представляет собой заболевание почечных канальцев.
[26] Применение мегалина человека в качестве маркера, определяющего заболевание, для выявления заболевания в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина.
[27] Применение мегалина человека в качестве маркера, определяющего заболевание, по п.[26], в котором заболевание в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина, представляет собой легочное заболевание.
[28] Применение мегалина человека в качестве маркера, определяющего заболевание, по п.[26], в котором заболевание в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина, представляет собой почечное заболевание.
[29] Применение мегалина человека в качестве маркера, определяющего заболевание, по п.[28], в котором почечное заболевание представляет собой заболевание почечных канальцев.
Эффекты изобретения
Способ, предлагаемый настоящим изобретением, дает возможность измерять мегалин в образце, например в моче, с высокой чувствительностью и точностью. В тех случаях, когда функции клеток, тканей или органов, экспрессирующих мегалин, нарушены, мегалин выходит из клеток и накапливается в образце. В частности, измерение мегалина человека в образце дает возможность прямого выявления и диагностики функциональных нарушений клеток, тканей или органов вместо косвенного выявления и диагностики. В соответствии с этим, измерение мегалина человека в образце тем способом, который предлагает настоящее изобретение, дает возможность выявления заболевания в органе, в котором наблюдается экспрессия мегалина, например, почечного или легочного заболевания, на ранней стадии и с высокой точностью.
Это описание частично или полностью включает содержание, раскрытое в описании и/или чертежах японской патентной заявки № 2006-089306, которая является приоритетным документом для настоящей заявки.
Краткое описание чертежей
Фигура 1 показывает генный локус и общую белковую структуру мегалина человека.
Фигура 2 показывает калибровочную кривую ELISA для выявления мегалина человека с использованием стандарта мегалина человека.
Фигура 3 показывает клинические результаты по мегалину человека в моче (часть 1).
Фигура 4 показывает клинические результаты по мегалину человека в моче (часть 2).
Наилучшие варианты осуществления изобретения
Настоящее изобретение связано со способом измерения мегалина человека в образце. SEQ ID NO: 1 показывает нуклеотидную последовательность мегалина человека, а SEQ ID NO: 2 показывает аминокислотную последовательность мегалина человека.
В настоящем изобретении измерение мегалина человека проводится с применением первого лиганда, способного связываться с мегалином человека, который связан с твердой подложкой. Может быть использована любая твердая подложка, используемая в традиционном иммуноанализе. Например, предпочтительно могут быть использованы лунки пластмассового планшета для микротитрования или магнитные частицы.
Примером лиганда, способного связываться с мегалином человека, является антитело против мегалина человека, причем можно использовать как моноклональное, так и поликлональное антитело.
Ricinus communis
К тому же, в качестве лиганда, способного связываться с мегалином человека, можно использовать лектин, который специфичен по отношению к сахарной цепи мегалина человека. Примеры лектина включают, но не ограничиваясь ими, конканавалин A, лектин пшеничных зародышей (WGA), лектин (RCA) и лектин чечевицы (LCA).
12
2
1
2+
+
+
Дополнительные примеры лиганда, способного связываться с мегалином человека, включают вещества, выбираемые из группы, которая состоит из белков, связывающих витамины, например, транскобаламина-витамина B, белка, связывающего витамин D, или белка, связывающего ретинол, липопротеинов, например, аполипопротеина B, аполипопротеина E, аполипопротеина J/кластерина или аполипопротеина H, гормонов, например паратиреоидного гормона (PTH), инсулина, эпителиального фактора роста (EGF), пролактина, лептина или тиреоглобулина, рецептора любого из указанных веществ или рецептора такого гормона, белков, связанных с иммунным ответом или реакцией на стресс, например, легкой цепи иммуноглобулина, PAP-1 или β-микроглобулина, ферментов, например, PAI-I, PAI-I-урокиназы, PAI-I-tPA, проурокиназы, липопротеинлипазы, плазминогена, α-амилазы, β-амилазы, α-микроглобулина или лизоцима, ингибитора любого из указанных веществ или ингибитора такого фермента, лекарственных средств или токсинов, например, аминогликозида, полимиксина B, апротинина или трихосантина, белков-носителей, например, альбумина, лактоферрина, гемоглобина, одорант-связывающего белка, транстиретина или L-FABP, а также белков, ассоциированных с рецептором (RAP), например, цитохрома-C, кальция (Ca), конечных продуктов усиленного гликозилирования (AGE), кубилина или изоформы 3 ионообменника Na-H (NHE3) или связывающих фрагментов таких веществ. Термин "связывающий фрагмент" при использовании в настоящем документе относится к фрагменту любого из вышеуказанных веществ, который включает сайт связывания с мегалином человека.
Лиганд, способный связываться с мегалином человека, например антитело против мегалина человека, может быть связан с твердой подложкой при помощи методики, хорошо известной в данной области. Например, если лиганд связан с лунками планшета для микротитрования, то приблизительно от 3 до 10 мкг/мл (предпочтительно приблизительно 5 мкг/мл) раствора лиганда, способного связываться с мегалином человека, например антитела, наносят на твердую подложку, а затем полученный продукт выдерживают при температуре 4°C в течение ночи (предпочтительно 12 часов или более). Рекомендованную плотность указанной выше твердой подложки определяли теоретически в связи с иммобилизацией полноразмерного антитела.
Плотность определяют по теоретической формуле:
-2
9
2
Q = (2/√3)×(MW/N)×(2r)×10 (нг/см), где
2
Q: молекулярно-весовая плотность (нг/см)
MW: молекулярный вес (в дальтонах: Дa)
23
-1
N: число Авогадро = 6×10 (моль)
20
20
20
r: молекулярный стокс-радиус = (R×T)/(6×π×η×D×N) (см)
7
2
-2
-1
-1
R: газовая константа = 8,3×10 (г×см×с×K×моль)
20
T: комнатная температура (20°C)=293K
20
-2
-1
-1
η: вязкость воды при 20°C = 1×10 (г×см×с)
20
2
-1
D: молекулярная производная по отношению к воде при 20°C (см×с)
Такую величину применяют при иммобилизации через физическую адсорбцию. Если лиганд, способный связываться с мегалином человека, иммобилизован, то определяют теоретическую плотность соответствующей твердой подложки, на которую могут влиять вышеупомянутые факторы вариации, например индивидуальный молекулярный вес. Таким образом, плотность варьируется в зависимости от типа молекулы индивидуальной твердой подложки, конфигурации твердой фазы или других условий. В соответствии с этим, плотность не ограничивается вышеупомянутыми величинами. Такая плотность также используется в настоящем изобретении при абсорбции на твердой подложке посредством ковалентного связывания. В этом случае также принимается во внимание количество функциональных групп, представленных на адсорбирующей поверхности и используемых для ковалентного связывания. Плотность твердой подложки не ограничена. После связывания выполняется блокирование с использованием бычьего сывороточного альбумина (далее обозначаемого аббревиатурой "BSA") или казеина, целью которого является блокирование неспецифических сайтов адсорбции на белке и которое основано на традиционной методике. Если твердой подложкой служит магнитный шарик, то твердую подложку обрабатывают таким же образом, как и в случае планшета для микротитрования.
Лиганду, способному связываться с мегалином человека, например антителу против мегалина человека, связанному с твердой подложкой, дают возможность прореагировать с образцом, и мегалин человека, присутствующий в образце, связывается с твердой подложкой при помощи лиганда, способного связываться с мегалином человека и связанного с твердой подложкой посредством реакции связывания лиганда с рецептором, например реакции антиген-антитело. В частности, образуется комплекс, состоящий из первого лиганда, способного связываться с мегалином человека, например антитела против мегалина человека, связанного с твердой подложкой, и из мегалина человека. Можно использовать любой образец при том условии, что он содержит мегалин человека. Примеры образцов включают мочу, альвеолярный смыв, кровь, сыворотку крови, плазму крови и конденсат выдыхаемого воздуха. Такую реакцию антиген-антитело можно выполнить при температуре от 4°C до 45°C, более предпочтительно от 20°C до 40°C и еще более предпочтительно от 25°C до 38°C. Длительность реакции составляет приблизительно от 10 минут до 18 часов, более предпочтительно от 10 минут до 1 часа и еще более предпочтительно от 30 минут до 1 часа.
После промывки второму лиганду, способному связываться с мегалином человека, дают возможность прореагировать с мегалином человека в образце, связанном с твердой подложкой. При этом образуется комплекс, состоящий из первого лиганда, способного связываться с мегалином человека, например антитела против мегалина человека, связанного с твердой подложкой, из мегалина человека и из второго лиганда, способного связываться с мегалином человека. В качестве второго лиганда, способного связываться с мегалином человека, можно использовать то же самое вещество, как и для первого лиганда, способного связываться с мегалином человека, например, антитело против мегалина человека. Однако если и первый лиганд, способный связываться с мегалином человека, и второй лиганд, способный связываться с мегалином человека, представляют собой моноклональные антитела против мегалина человека, то эпитоп, распознаваемый и связываемый первым антителом против мегалина человека, должен отличаться от эпитопа, распознаваемого и связываемого вторым антителом против мегалина человека. В качестве комбинации первого антитела против мегалина человека и второго антитела против мегалина человека можно использовать любую комбинацию из двух моноклональных антител, из моноклонального антитела и поликлонального антитела, из поликлонального антитела и моноклонального антитела или из двух поликлональных антител. Реакцию можно выполнить при температуре от 4°C до 45°C, более предпочтительно от 20°C до 40°C и еще более предпочтительно от 25°C до 38°C. Длительность реакции составляет приблизительно от 10 минут до 18 часов, более предпочтительно от 10 минут до 1 часа и еще более предпочтительно от 30 минут до 1 часа. Таким образом, второй лиганд, способный связываться с мегалином человека, связывается с твердой подложкой при помощи мегалина человека и первого лиганда, способного связываться с мегалином человека.
После промывки проводят измерение второго лиганда, способного связываться с мегалином человека, например второго антитела против мегалина человека, связанного с твердой подложкой. Это можно осуществить посредством многих методик, которые часто используются в области иммунологии. Например, для приготовления ферментативно меченого вещества второй лиганд, способный связываться с мегалином человека, метят ферментом, флуоресценцией, биотином или радиоактивным изотопом. Анализируя такую метку, можно измерить второй лиганд, способный связываться с мегалином человека, который связан с твердой подложкой. Особенно предпочтительно мечение ферментом или флуоресценцией. Примеры ферментов включают пероксидазу, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу и глюкозооксидазу, а примером флуоресцентной метки является флуоресцеинизотиоцианат (FITC), хотя метки не ограничиваются этими примерами. Метку можно выявить, предоставив соответствующему субстрату возможность прореагировать с ферментативно меченым веществом, а затем измеряя полученные в результате реакции краситель, флуоресценцию, эмиссию или т.п. эффекты. Если второй лиганд, способный связываться с мегалином человека, не снабжен меткой, то меченому третьему антителу дают возможность прореагировать со вторым лигандом, способным связываться с мегалином человека, после чего можно измерить третье антитело на основе такого мечения. Таким образом, можно измерить второй лиганд, способный связываться с мегалином человека.
2
Твердая подложка или антитело против мегалина человека, используемые для мечения, могут представлять собой фрагмент иммуноглобулина, например Fab или F(ab'), специфичный по отношению к мегалину человека, или рекомбинантное антитело, например scFv, dsFv, димерное антитело или миниантитело, экспрессируемое как рекомбинантное. В настоящем изобретении термин "антитело" также относится к фрагменту, специфичному по отношению к мегалину человека. Способ получения такого фрагмента хорошо известен в данной области.
Вышеупомянутый способ включает два этапа: 1) реакцию между первым лигандом, способным связываться с мегалином человека, например антителом против мегалина человека, связанным с твердой подложкой, и образцом с последующим промыванием, и 2) реакцию между вторым лигандом, способным связываться с мегалином человека, и образцом. В альтернативном варианте способ включает один этап, в котором происходит реакция между первым лигандом, способным связываться с мегалином человека, например антителом против мегалина человека, связанным с твердой подложкой, и образцом, и одновременно с этим происходит реакция между вторым лигандом, способным связываться с мегалином человека, и образцом.
Далее, настоящее изобретение включает способ измерения мегалина человека в образце с применением мегалина человека или частичного фрагмента мегалина человека, который связан с твердой подложкой, и лиганда, причем указанный способ включает предоставление образцу возможности прореагировать с лигандом, способным связываться с мегалином человека, предоставление продукту реакции возможности прореагировать с мегалином человека, который связан с твердой подложкой, измерение лиганда, способного связываться с мегалином человека, который связан с твердой подложкой, и конкурентное количественное определение мегалина человека в образце, основанное на снижении процентного содержания лиганда, способного связываться с мегалином человека, который связан с твердой подложкой. Этот способ требует связывания мегалина человека с твердой подложкой, причем такое связывание может быть осуществлено в соответствии со способом связывания вещества с твердой подложкой. К тому же, на частичный фрагмент мегалина человека не накладывается каких-либо ограничений, то есть можно использовать любой частичный фрагмент мегалина человека, с которым связан лиганд, способный связываться с мегалином человека. В качестве частичного фрагмента мегалина человека можно использовать часть аминокислотной последовательности мегалина человека, представленную в SEQ ID NO: 2, которую можно получить посредством химического синтеза или генной инженерии. Можно использовать вышеупомянутый лиганд, способный связываться с мегалином человека, причем особенно предпочтительно антитело против мегалина человека. В конкурентном способе важно количество мегалина человека или частичного фрагмента мегалина человека, который связан с твердой подложкой, и используемого лиганда, способного связываться с мегалином человека. Методика выполнения конкурентного способа хорошо известна, и на основе этой методики можно адекватно определить необходимое количество веществ, участвующих в реакции.
Далее, настоящее изобретение включает способ измерения мегалина человека с применением лиганда, способного связываться с мегалином человека, причем указанный способ включает предоставление образцу возможности прореагировать с лигандом, способным связываться с мегалином человека, который связан с частицей, индуцирующей агглютинацию, и измерение мегалина человека, основанное на степени результирующей агглютинации.
Примеры частиц, используемых в таком способе, включают частицы с диаметром от 0,05 до 10 мкм, предпочтительно частицы латекса с диаметром от 0,1 до 0,4 мкм, частицы желатина с диаметром от 0,5 до 10 мкм и эритроциты животных. Антитело может быть связано с частицей способом, хорошо известным в данной области, например физической адсорбцией или ковалентным связыванием.
При таком способе частицы, включающие связанные с ними антитела против мегалина человека, смешивают с образцом, например, на черном предметном стекле и наблюдают частицы, выпавшие в осадок в результате агглютинации. Таким образом, можно определить мегалин человека в образце. Для количественного определения мегалина человека можно также измерять абсорбцию агглютината. Далее, мегалин человека можно также выявлять импульсным иммунотестом.
В соответствии с настоящим изобретением способ измерения мегалина человека позволяет проводить измерение не только интактного мегалина, но фрагментов мегалина человека.
Посредством проводимых измерений можно оценить содержание мегалина человека в образце независимо от того, имеется ли у субъекта, от которого получен этот образец, заболевание или нарушение в экспрессирующих мегалин клетках, тканях, органах и т.п. В частности, можно специфически выявить или диагностировать у субъекта органное или подобное заболевание.
Мишенями могут быть любые клетки, ткани и органы при том условии, что в них наблюдается экспрессия мегалина. Предпочтительными мишенями являются легкие и почки, причем более предпочтительны почки. Из числа почечных заболеваний особенно поддаются выявлению нефрит или нарушения почечных канальцев. Адекватному выявлению также поддается диабетическая нефропатия. Далее, те клетки, ткани или органы, в которых экспрессируется мегалин, также могут быть использованы для выявления метаболического синдрома или нефропатии, ассоциированной с метаболическим синдромом.
in vitro
У вышеуказанного субъекта с функциональными нарушениями клеток, тканей или органов мегалин человека выходит из клеток, и его количество в образце (биологической жидкости) увеличивается. Если содержание мегалина человека в образце, полученном от субъекта, измеряют , и концентрация мегалина человека в этом образце значительно повышена по сравнению с концентрацией мегалина человека в образце, полученном от здорового индивида, то у субъекта можно диагностировать функциональное нарушение клеток, тканей или органов.
Как описано выше, в качестве образцов можно использовать мочу, альвеолярный смыв, кровь, сыворотку крови, плазму крови, конденсат выдыхаемого воздуха и т.п. Если необходимо диагностировать легочное заболевание, то особенно предпочтительно использовать в качестве образца альвеолярный смыв. Если необходимо диагностировать почечное заболевание, то предпочтительно использовать в качестве образца мочу.
in vitro
Далее, измерение мегалина человека в образце, полученном от субъекта, позволяет оценить риск возникновения функциональных нарушений клеток, тканей или органов, например, риск развития почечного заболевания. Если содержание мегалина человека в образце, полученном от субъекта, измеряют , и концентрация мегалина человека в этом образце значительно повышена по сравнению с концентрацией мегалина человека в образце, полученном от здорового индивида, то можно считать, что у данного субъекта значительно повышен риск функциональных нарушений клеток, тканей или органов. То есть измерение мегалина человека в образце делает возможным скрининг субъектов на высокую вероятность развития заболевания, например почечного заболевания, что позволяет назначить указанному субъекту адекватное лечение (профилактическое).
Далее, периодическое измерение мегалина человека в образцах, полученных от субъекта, и мониторинг концентрации мегалина человека дают возможность контролировать и корректировать функции целевого органа.
Мегалин человека можно использовать как маркер для выявления или диагностики функциональных нарушений в тех клетках, тканях или органах, где наблюдается экспрессия мегалина. Настоящее изобретение включает применение мегалина человека в качестве маркера, определяющего заболевание, для выявления функционального нарушения, то есть заболевания органа, в котором наблюдается экспрессия мегалина. Настоящее изобретение дополнительно включает маркер выявления/диагностики заболевания для выявления и установления диагноза функционального нарушения, то есть заболевания клеток, тканей или органа, в которых наблюдается экспрессия мегалина.
Кроме того, для выявления или диагностики функционального нарушения, то есть заболевания клеток, тканей или органов, в которых наблюдается экспрессия мегалина, можно проводить измерение не только интактного мегалина человека, но и фрагментов мегалина человека.
Примеры
Далее в этой заявке настоящее изобретение более подробно описано в примерах, хотя оно не ограничивается этими примерами. Следует заметить, что метод твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), использованный в примерах, был описан ранее многими исследователями после того, как Engvall E. и Perlmann P. опубликовали первое сообщение о нем в 1971 году. Для использования этой методики имеются твердые основания (Engvall E., Perlmann P., 1971, Immunochemistry, 8, 871-874).
Далее настоящее изобретение будет более подробно описано в примерах, хотя оно не ограничивается этими примерами.
Выявление мегалина человека в моче методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA)
(1) Приготовление мышиного моноклонального антитела против мегалина человека
2
6
Подопытную мышь иммунизировали несколькими внутрибрюшинными инъекциями 50 мкг мегалина человека с адъювантом при последующем подтверждении повышенного титра в сыворотке крови. Через 3 дня после введения бустерной дозы (внутривенная иммунизация) у животного удаляли селезенку для получения клеток селезенки. Для приготовления клеток гибридомы клетки селезенки объединяли с клетками мышиной миеломы (10:1) в присутствии полиэтиленгликоля 3500. Полученные в результате этих манипуляций клетки культивировали в течение недели в присутствии CO при температуре 37°C, после чего супернатант культуры проверяли на присутствие или отсутствие антитела против мегалина человека. В позитивных лунках, где наблюдалась выработка антитела, клетки разбавляли методом серийных разведений с последующим двухнедельным культивированием и проверкой супернатанта культуры на присутствие или отсутствие антитела против мегалина человека таким же образом, как было указано выше. После этого в позитивных лунках, где наблюдалась выработка антитела, клетки разбавляли методом серийных разведений с последующим культивированием по той же схеме. На этом этапе клетки, в которых происходила выработка антител против мегалина человека, культивировали в колбе, и часть этих клеток суспендировали в эмбриональной телячьей сыворотке (FCS), содержащей 10% диметилсульфоксида (DMSO) (5×10 клеток/мл), а полученный материал сохраняли в жидком азоте.
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
2
4
™
™
Затем супернатанты в лунках использовали для проверки реактивности антител против мегалина человека, выделенного клетками в супернатанты культур. Мегалин человека растворяли в растворе, содержащем 140 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ NaHPO и 1,8 мМ KHPO (pH 7,3), который далее будет упоминаться под сокращенным названием "PBS, pH 7,3". В лунки пластмассового планшета для микротитрования (Nunc-ImmunoModule F8 Maxisorp Surface plate, Nalge Nunc International) добавляли 100 мкл раствора мегалина человека в PBS (pH 7,3) на лунку, после чего мегалин человека иммобилизовали на планшете для микротитрования из расчета 3 пмоль на лунку при 4°C в течение 12 часов. Затем раствор мегалина человека в PBS (pH 7,3), который был добавлен в лунки, удаляли посредством декантации, а в лунки планшета для микротитрования добавляли раствор 145 мМ NaCl, 3,6 мМ NaHPO, 1,4 мМ KHPOи 0,05% (об./об.) Tween 20 (далее упоминаемый под сокращенным названием "PBS-T") из расчета 200 мкл на лунку, PBS-T удаляли посредством декантации, а излишек адсорбированного мегалина человека в лунках промывали. Этот процесс промывания выполняли в общей сложности дважды. Затем в лунки добавляли раствор, содержащий 145 мМ NaCl, 7,2 мМ NaHPO, 2,8 мМ KHPO, 1% (вес./об.) BSA и 5% (вес./об.) лактозы (далее упоминаемый под названием "блокирующий раствор для планшета с иммобилизованным антигеном") из расчета 200 мкл на лунку, а внутреннюю часть лунок планшета для микротитрования, где был иммобилизован мегалин человека, блокировали при температуре 4°C на 12 часов. Полученный в результате этих действий материал хранили при 4°C. Для того чтобы проверить реактивность антител в супернатанте культуры, после блокирующей обработки использовали планшет для микротитрования на котором был иммобилизован мегалин человека. В лунки планшета для микротитрования, где был иммобилизован мегалин человека, добавляли супернатант культуры гибридомы из расчета 100 мкл на лунку, а планшет нагревали до 37°C и поддерживали эту температуру в течение 1 часа. Затем супернатант культуры, который был добавлен в лунки, удаляли посредством декантации, в лунки планшета для микротитрования добавляли PBS-T из расчета 200 мкл на лунку, PBS-T удаляли посредством декантации, а внутренность лунок промывали. Этот процесс промывания выполняли в общей сложности трижды. Затем в лунки планшета (из расчета 100 мкл на лунку) добавляли конъюгированные с пероксидазой козьи иммуноглобулины против мышиных антигенов (DAKO) (разведенные в 2000 раз, 0,55 мкг/мл), а полученный в результате этих действий материал нагревали до 37°C, поддерживая эту температуру в течение 1 часа. Ферментативно меченое антитело разбавляли раствором, содержащим 145 мМ NaCl, 3,6 мМ NaHPO, 1,4 мМ KHPO, 0,05% (об./об.) Tween 20 и 0,5% (вес/объем) BSA (далее упоминаемым под названием "разбавитель ферментативно меченого антитела"). Затем ферментативно меченые антитела, которые были добавлены в лунки, удаляли посредством декантации, в лунки планшета для микротитрования добавляли PBS-T из расчета 200 мкл на лунку, PBS-T удаляли посредством декантации, а внутренность лунок промывали. Этот процесс промывания выполняли в общей сложности трижды. Затем в лунки (из расчета 100 мкл на лунку) добавляли раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (далее упоминаемый как "TMB") (одноступенчатая субстратная система TMB: DAKO), который выполнял роль субстратного раствора для ферментативной реакции пероксидазы, а полученному в результате этих действий материалу давали выстояться при температуре 25°C в течение 30 минут. Немедленно после этого к субстратному раствору добавляли раствор 313 мМ HSO (далее упоминаемый как "терминатор реакции") из расчета 100 мкл на лунку для прекращения ферментативной реакции в лунках. После этого в лунках измеряли спектральную поглощательную способность, а величину, полученную в результате вычитания поглощения при 630 нм из поглощения при 450 нм, обозначали как индикатор оценки реактивности (Josephy P.D., Mason R.P. et al., 1982, J. Biol. Chem. 257, 3669-3675). С тех пор как Bos E. S. с соавторами впервые описали колориметрию на основе TMB в 1981 году (Bos E. S. et al., 1981, J. Immunoassay, 2, 187-204), в литературе появилось много публикаций по этому вопросу, и использование этой методики твердо обосновано.
В результате были отобраны моноклонализированные клетки гибридомы, демонстрирующие сильную реактивность антител против мегалина человека по отношению к иммобилизованному мегалину человека, а класс и подкласс иммуноглобулина в супернатанте культуры были исследованы относительно каждого клона из 100 мкл раствора супернатанта маточной культуры с использованием набора для типирования мышиного иммуноглобулина (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).На основе полученных результатов из результирующей библиотеки моноклональных клеток были отобраны клоны класса IgG, а затем был выполнен процесс получения асцитной жидкости, как это описано ниже.
Впоследствии эти клетки были культивированы в колбе объемом 25 мл, а затем в колбе объемом 75 мл. Клетки были введены посредством внутрибрюшинной инъекции мышам, подвергнутым обработке пристаном, у которых после этого собирали образцы асцитной жидкости.
(2) Очищение мышиного моноклонального антитела (IgG) против мегалина человека
Полученную асцитную жидкость (10 мл) смешивали с контрастным агентом для обработки сыворотки крови (FRIGEN (зарегистрированная торговая марка) II:Kyowa Pure Chemical Co., Ltd.) в объемном соотношении 1:1,5, а полученный в результате этих действий материал встряхивали и перемешивали в течение 1-2 минут для делипидизации асцитной жидкости. Материал асцитной жидкости центрифугировали на скорости 3000 оборотов в минуту (1930×g) в течение 10 минут, а центрифугированный супернатант осветленной асцитной жидкости (10 мл) фракционировали. Центрифугированный супернатант асцитной жидкости (10 мл) подвергали фракционированию сульфатом аммония (конечная концентрация: 50% насыщенного сульфата аммония) на ледяной бане в течение 1 часа, а осажденные фракции иммуноглобулина суспендировали и растворяли в PBS. Для получения неочищенной фракции иммуноглобулина из асцитной жидкости этот процесс фракционирования сульфатом аммония выполняли в общей сложности два раза. Полученную в результате этих действий неочищенную фракцию иммуноглобулина (10 мл) смешивали с эквивалентным количеством 20 мМ фосфата натрия (pH 7,0), далее упоминаемого как "20 мМ NaPB (pH 7,0)", а затем подвергали аффинной очистке в белковой колонке G (HiTrap Protein G HP, 5 мл; Amersham BioSciences). Образец был адсорбирован на белковой колонке G, 20 мМ NaPB (pH 7,0, 50 мл), струйно промыт через белковую колонку G, и загрязнения, отличающиеся от IgG, которые присутствовали в образце, были удалены промыванием. Затем IgG, аффинно адсорбированный на белковой колонке G, элюировали агентом 0,1 M глицин-HCl (pH 2,7), а элиюрованную фракцию сразу же после элюирования из колонки нейтрализовали агентом 1M трис(гидроксиметил)аминометан-HCl (pH 9,0), а затем восстанавливали (далее агент "трис(гиброксиметил)аминометан" будет упоминаться под сокращенным названием "Tris"). После нейтрализации аффинно-очищенный продукт был диализирован по отношению к PBS при 4°C в течение 6 часов в количестве, которое по объему в 500 раз превышало очищенный продукт, и этот процесс диализа выполняли в общей сложности два раза. В качестве диализной мембраны была использована пробирка с целлюлозой для диализа (Viskase Companies). Полученную в результате элюированную фракцию IgG обозначали как очищенное моноклональное антитело против мегалина человека и хранили при температуре 4°C, и подвергали описанным ниже процедурам. Процесс очистки осуществляли, соединяя вышеупомянутую белковую колонку G с системой BioLogic LP (Bio Rad Laboratories) при постоянной скорости потока 1 мл в минуту.
(3) Подготовка планшета для микротитрования, на котором было иммобилизовано моноклональное антитело против мегалина человека
™
™
Очищенное моноклональное антитело против мегалина человека разбавляли в PBS (pH 7,3) до получения конечной концентрации 5 мг/мл. В лунки пластмассового планшета для микротитрования (Nunc-ImmunoModule F8 Maxisorp Surface plate, Nalge Nunc International) добавляли раствор моноклонального антитела против мегалина человека в PBS (pH 7,3) из расчета 100 мкл на лунку, после чего моноклональное антитело против мегалина человека иммобилизовали на планшете для микротитрования при 4°C в течение 12 часов. Затем раствор моноклонального антитела против мегалина человека в PBS (pH 7,3), который был добавлен в лунки, удаляли посредством декантации, в лунки планшета для микротитрования добавляли PBS-T из расчета 200 мкл на лунку, PBS-T удаляли посредством декантации, а избыток адсорбированного моноклонального антитела против мегалина человека в лунках промывали. Этот процесс промывания выполняли в общей сложности дважды. Затем в лунки добавляли раствор, содержащий 86 мМ NaCl, 100 мМ Tris, 0,5% (вес./об.) BSA и 0,05% (об./об.) Tween 20 (далее упоминаемый как блокирующий раствор для планшета с иммобилизованным антителом) из расчета 200 мкл на лунку, а внутреннюю часть лунок планшета для микротитрования, где был иммобилизован мегалин человека, блокировали при температуре 4°C на 12 часов. Затем полученный в результате этих действий материал хранили при температуре 4°C.
(4) Приготовление меченного пероксидазой моноклонального антитела против мегалина человека
2
3
3
2
3
3
2
4
2
4
Пероксидазу хрена (далее упоминаемую под сокращенным названием "HRP") (Horseradish peroxidase, Type VI, Sigma) разбавляли чистой водой до концентрации 4 мг/мл, к 500 мкл раствора HRP (2 мг) добавляли 100 мкл 100 мМ раствора метапериодата натрия, а полученную смесь взбалтывали при комнатной температуре в течение 20 минут. Полученный в результате этих действий материал диализировали в 1 мМ растворе ацетата натрия (pH 4,0) (далее упоминаемом как "1 мМ ацетатный буфер") в количестве, которое по объему в 500 раз превышало объем раствора HRP, при температуре 4°C в течение 6 часов, и эту процедуру проводили два раза. В качестве диализной мембраны была использована пробирка с целлюлозой для диализа (Viskase Companies). Затем моноклональное антитело против мегалина человека разбавляли в растворе 2,4 мМ NaCO и 7,6 мМ NaHCO (pH 9,6) (далее упоминаемом как "10 мМ карбонатный буфер") до концентрации 8 мг/мл. Раствор 120 мМ NaCO и 380 мМ NaHCO (pH 9,6) (далее упоминаемый как "0,5 M карбонатный буфер") добавляли к 500 мкл раствора HRP (2 мг) в количестве одной трети по его объему, туда же добавляли 500 мкл вышеупомянутого моноклонального антитела против мегалина человека (4 мг), а полученный в результате этих действий материал перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем добавляли 50 мкл раствора борогидрида натрия (4 мг/мл), а полученный материал перемешивали на ледяной бане в течение 2 часов. Полученный материал подвергали фракционированию сульфатом аммония (конечная концентрация: 50% насыщенного сульфата аммония) на ледяной бане в течение 1 часа, а осажденную фракцию суспендировали и растворяли в 1 мл раствора, содержащего 100 мМ Tris, 145 мМ NaCl и 1% (об./об.) BSA (pH 7,6) (далее упоминается как "суспензия меченого антитела"). Это фракционирование сульфатом аммония проводили в общей сложности два раза, после чего раствор, содержащий 2,8 мМ KHPO, 7,2 мМ NaHPO, 145 мМ NaCl, 1% (вес./об.) BSA, 0,02% (об./об.) фенола и 40% (вес./об.) D-сорбита (далее упоминаемый как маточный раствор меченого антитела), добавляли к раствору меченого антитела в количестве трех четвертей от раствора меченого антитела (далее упоминаемого как маточный раствор меченого антитела). Было получено меченное HRP моноклональное антитело против мегалина человека. С тех пор как Nakane, P. K. и Kawaoi, A. сделали первое сообщение о способе мечения HRP в 1974 году (Nakane, P. K., Kawaoi, A., 1974, J. Histochem. Cytochem. 22, 1084), в научной литературе появилось много публикаций по этому вопросу. Поэтому имеются твердые обоснования для применения этой методики.
(5) Измерение мегалина человека в моче
Для измерения мегалина человека в моче были использованы вышеупомянутые моноклональное антитело против мегалина человека, иммобилизованное на планшете для микротитрования, и меченное HRP моноклональное антитело против мегалина человека. Вначале 90 мкл клубочкового фильтрата смешивали с 10 мкл раствора, содержащего 2 M Tris и 0,2 M этилендимамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты (далее "этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусная кислота" обозначается сокращением EDTA, pH 8,0), и 100 мкл полученного раствора добавляли в лунки планшета для микротитрования, в который было иммобилизовано моноклональное антитело против мегалина человека. Полученному материалу давали выстояться при температуре 37°C в течение 1 часа, образец раствора мочи, добавленный в лунки, удаляли посредством декантации, в лунки планшета для микротитрования добавляли PBS-T из расчета 200 мкл на лунку, затем PBS-T удаляли посредством декантации с последующим промыванием материала. Процесс промывания выполняли в общей сложности три раза. Затем добавляли раствор меченного HRP моноклонального антитела против мегалина человека из расчета 100 мкл на лунку (вышеуказанный маточный раствор разбавляли в 10000 раз раствором разбавленного меченого антитела). Полученному материалу давали выстояться при температуре 37°C в течение 1 часа, раствор меченного HRP антитела, ранее добавленный в лунки, удаляли посредством декантации, в лунки планшета для микротитрования добавляли PBS-T из расчета 200 мкл на лунку, затем PBS-T удаляли посредством декантации с последующим промыванием материала. Процесс промывания выполняли в общей сложности три раза. Затем в лунки (из расчета 100 мкл на лунку) добавляли раствор TMB (одноступенчатая субстратная система TMB; DAKO) для ферментативной реакции пероксидазы, а полученному в результате этих действий материалу давали выстояться при температуре 25°C в течение 30 минут. Немедленно после этого для прекращения ферментативной реакции к раствору субстрата в лунках добавляли терминатор реакции из расчета 100 мкл на лунку. После этого в лунках измеряли спектральную поглощательную способность, а величину, полученную в результате вычитания поглощения при 630 нм из поглощения при 450 нм, обозначали как оценочный индикатор для измерения мегалина человека в моче. В качестве эталонного образца для калибровочной кривой использовали мегалин человека, который был использован как иммунологический антиген в процессе приготовления моноклонального антитела против мегалина человека, а результаты анализа показаны в таблице 1 и на фигуре 2. Результаты реального клинического измерения мегалина человека в моче показаны в таблице 2, на фигуре 3 и на фигуре 4. В результате было обнаружено, что количество мегалина человека, выделяемого в мочу, явно увеличено у больных с почечными заболеваниями и у лиц с повышенной предрасположенностью к почечным заболеваниям по сравнению со здоровыми людьми (фигуры 3 и 4). Результаты анализов на клиренс креатинина в отношении количества мегалина, выделяемого в мочу, также оказались сходными. Это указывает на то, что концентрация во время экскреции мочи не имеет значения (фигуры 3 и 4). Настоящее изобретение предлагает способ измерения мегалина человека, осуществляемый достаточно простым образом в течение более короткого промежутка времени по сравнению с традиционными методиками, причем указанный способ позволяет проводить количественное определение мегалина человека. Далее, этот способ позволяет сайт-специфическим образом и на ранней стадии диагностировать функциональные заболевания, специфичные для клеток, тканей или органов. Представленные выше клинические результаты, очевидно, подтверждают эти характеристики настоящего изобретения.
Таблица 1
[мегалин человека](нM)
Калибровочная кривая ELISA для выявления мегалина человека
n=1
n=2
n=3
Средняя
Ст. откл.
6,250
2,4356
2,4416
2,3576
2,4116
0,0469
3,125
1,2551
1,2596
1,2261
1,2469
0,0182
1,563
0,6288
0,6576
0,6358
0,6407
0,0150
0,781
0,3282
0,3296
0,3282
0,3287
0,0008
0,313
0,1341
0,1359
0,1370
0,1357
0,0015
0,156
0,0788
0,0917
0,0858
0,0854
0,0065
0,078
0,0582
0,0638
0,0727
0,0649
0,0073
0,031
0,0390
0,0503
0,0468
0,0454
0,0058
0,000
0,0465
0,0409
0,0431
0,0435
0,0028
Таблица 2
Пункт
Креатининв моче
Мегалин в моче
Способ измерения
Ферментный метод:Цветной метод
ELISA
Происхождение образцов
Число образцов
[u-Cre]
O.D. (450 нм) -O.D. (630 нм)
[мегалин]
Клиренс креатинина
(мг/дл)
(нM)
(нмоль мегалина/г Cre)
Диабет
D-1
117,96
0,241
0,513
0,435
D-2
68,16
0,110
0,168
0,246
D-3
102,53
0,102
0,146
0,142
Нефропатия
N-1
178,52
2,472
6,398
3,584
N-2
33,55
0,459
1,088
3,243
N-3
41,24
0,161
0,302
0,732
N-4
78,29
0,110
0,168
0,215
N-5
36,97
0,129
0,218
0,590
Метаболический синдром
M-1
302,32
0,169
0,323
0,107
M-2
59,56
0,086
0,104
0,175
Здоровые индивиды
H-1
44,11
0,061
0,038
0,086
H-2
92,72
0,082
0,094
0,101
H-3
134,72
0,056
0,025
0,019
H-4
123,59
0,063
0,044
0,036
H-5
104,31
0,052
0,015
0,014
H-6
96,64
0,050
0,009
0,009
Все цитированные в настоящем документе публикации, патенты и патентные заявки включены в описание в качестве ссылок во всей полноте.