ПРИБОР ДЛЯ ВЕРТИКАЛЬНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БЕЛКОВ В ГРАДИЕНТНЫХ ГЕЛЯХ

Полезная модель относится к методам разделения заряженных частиц в постоянном электрическом поле с использованием в качестве несущего компонента различных инертных гелей, в частности полиакриламида. Модель может быть использована в исследованиях по молекулярной биологии, медицинской диагностике, в экологическом мониторинге, анализе качества продуктов, в научных исследованиях в областях генетической инженерии, биотехнологии и нанотехнологии [1-8].
Целью является максимальная универсализация, существенное упрощение конструкции и сокращение времени ее подготовки к работе, а также обеспечение возможности подключения различных считывающих устройств в составе дополнительных минимодулей и автоматизации процессов нанесения анализируемых образцов на гель.
На Рис.1 схематично изображено устройство для вертикального электрофореза (ЭФ) в продольном разрезе.
Устройство (Рис.1) состоит из единого корпуса 1, выполненного из органического стекла (полиметилметакрилата), разделенного вертикальной перегородкой 2 и упирающейся на идущие вдоль боковых стенок выступающие полозья 3, ограничивающие область камеры с нагревательным элементом 4. Прижимающие устройство 5 гелей 9 к перегородке 2. Для термостатирования буфера в нижней части прибора установлен стандартный нагревательный элемент 4 и детектирующий и управляющий нагрев камеры термоэлемент 6. Система термостатирования рассчитана на проведение ЭФ в диапазоне температур от 25°С до 80°С. Прибор закрывается крышкой, в которую установлены катодный 7 и анодный 8 электроды. Заливочное устройство представляет собой сборную камеру, открытую со стороны обращенной вверх, боковые стенки, имеют герметичные пазы, а собранное устройство герметично скреплено прижимающими боковые стенки винтами.
В качестве значимых преимуществ полезной модели можно указать на возможность подключения различных модулей, включающих миниатюрные считывающие устройства. Модуль, являясь отдельным объектом для патентования, включают в себя погружаемый в прибор миниблок, состоящий из герметически отделенных камер, одна из которых, свободно сообщаясь с электрофоретическим буфером базового прибора, предназначена для проведения электрофореза в минигеле. Большая камера содержит коммерчески доступный детектирующий блок, представляющий собой, на проводниковой или беспроводной основе, эмитирующие и детектирующие диодные устройства (PEDD). При этом, в качестве одной из двух покрывающих минигель стекол, обращенных в сторону детектирующего устройства, выступает недорогое кварцевое стекло. Возможность автоматизации процессов нанесения образцов представляется важным преимуществом, особенно при использовании нескольких гелей. Она заключается в применении стандартных коммерчески доступных программируемых дозирующих устройств, способных осуществлять нанесение образцов непосредственно в «карманы» подготовленного геля, зафиксированного в стандартном штативе.
Сравнительный анализ с близким аналогом [1].
Признаки аналога, совпадающие с существующими признаками заявленной полезной модели: а) сходным является погруженность пластин геля в электрофоретический буфер, фиксация геля путем его прижатия к перегородке между анодной и катодной камерами и возможность одновременного использования более одного геля; б) наличие единого цельного корпуса и отсутствие необходимости сборки и разборки устройства перед и после прохождения электрофореза (ЭФ); в) практически полное отсутствие резиновых прокладок, что существенно упрощает конструкцию и эксплуатацию прибора.
В случае анализа признаков предложенного экспертом прототипа SU 1707520 А1 «Устройство для электрофореза в вертикальном блоке геля», следует отметить совпадение по признаку термостатирования плоскости геля и поддержания нужных температурных условий в ходе электрофореза, при отсутствии других значимых совпадений.
Признаки, отличающие заявленную полезную модель от аналога и обеспечивающие его преимущества.
Анализ комплекса признаков отличающих полезную модель от прототипа предполагается осуществить как с обнаруженным самостоятельно наиболее близким прототипом, так и вторым предложенным экспертом прототипом SU 1707520 А1 «Устройство для электрофореза в вертикальном блоке геля»: а) преимуществом полезной модели является более совершенная система подготовки и заливки гелей, включающая заливочное устройство и оригинальную систему прокладок и гребенок, а также оригинальная система фиксации геля, облегчающая процедуру нанесения образцов и позволяющая осуществлять параллельное использования большего количества гелей; б) возможность заливки градиентных гелей с изменяющейся вдоль геля пористостью и концентрацией денатурирующих ДНК и РНК агентов по ходу перемещения макромолекул в геле в процессе электрофоретического разделения, что резко увеличивает эффективность разделения и количество способов применения прибора (практически на порядок); в) основным преимуществом заявляемой модели является наличие системы термостатирования электрофоретического буфера, что позволяет разделять молекулы ДНК, не только по размеру, но и в зависимости от различий в последовательностях оснований, после перевода разделяемых молекул в одноцепочечную форму в условиях повышенной температуры (около 60°С) и наличия денатурирующих ДНК агентов в гелях.
Сравнительный анализ с прототипом прибора из авторского свидетельства SU 1707520 А1 «Устройство для электрофореза в вертикальном блоке геля» позволяет заключить следующее: остаются в силе преимущества предлагаемой полезной модели, изложенные в пунктах а) и б) предыдущего сравнительного анализа. В прототипе предлагается оригинальный способ термостатирования процесса электрофореза, однако указанный способ менее эффективен вследствие меньшей устойчивости и степени равномерности прогрева гелей. Необходимо также указать на существенную ограниченность областей применения прототипа, только для электрофореза ДНК, в частности, отметить отсутствие возможностей заливки двухуровневых градиентных гелей (с градиентами пористости гелей и денатурирующих компонентов гелей), что не позволяет осуществлять тонкий молекулярно-биологический, иммунохимический и генетический анализ биологических жидкостей, экстрактов тканей, клеток, современные методики несеквенационного изучения полиморфизма генов, методики DGGE и TGGE анализа (см. далее). Анализируемый прототип ограничен только двумя одновременно проводимыми электрофоретическими разделениями, тогда как предлагаемая полезная модель позволяет одновременно осуществлять электрофорез 10-ти гелей. В случае второго прототипа (также как и первого) необходимо осуществлять сложную сборку прибора в прототипе, что существенно удлиняет процесс подготовки электрофореза, а сравнительно небольшие объемы используемых электродных буферов при электрофорезе могут приводить к «истощению» последних и существенному искажению картины разделения биомолекул в электрофореграмме.
Итак, весь перечень преимуществ полезной модели позволяет получать кратное, или даже на порядок (в случае белкового электрофореза) повышение разрешения и чувствительности электрофоретического разделения, с существенно большим количеством выявляемых составляющих минорных видов биомолекул в анализируемых биологических экстрактах. Вышесказанное позволяет в ряде случаев, не только выявлять присутствие долей процентов интересуемых биомолекул в сложных смесях, но и определять их относительную молекулярную массу через стандартные маркеры молекулярных масс. Преимущества полезной модели по сравнению с первым и вторым прототипами, кардинально проявляются при использовании прибора для изучения микробного биоразнообразия различных сред (см. ниже). Так как прототипы не позволяют создавать градиенты денатурирующих агентов в гелях, то в силу этого становится невозможным анализ одноцепочечных молекул ДНК и, соответственно, изучение видов микробов различающихся по нуклеотидной последовательности в анализируемых локусах. Кроме того защищаемая полезная модель является базовым блоком, позволяющим подключение минимодулей со считывающими устройствами, и предоставляющим возможность различных путей полной или частичной автоматизации процесса нанесения образцов в карманы гелей.
Устройство работает следующим образом:
Для заливки блока гелей собирается стопка из вырезанных стекол, проложенных с боковых краев тонкими прокладками-спейсерами. Блок гелей, скрепленный скотчем помещают в заливочное устройство, прижимают винтами, вставляют длинную иглу шприца диаметром около 1 мм. К игле подключается длинный прозрачный силиконовый шланг, подсоединенный к стандартному устройству для получения градиентов (или к программируемому прибору для получения сложных градиентов). Гель заливается в виде двух частей - нижнего разделяющего, содержащего нужные градиенты компонентов (80% нижнего пространства гелевой пластины) и, затем верхним более разбавленным концентрирующим гелем (20%). При заливке верхнего геля в гель вставляется гребенка для формирования карманов для нанесения образцов. Гребенки могут иметь разное количество карманов, но не более 15-ти.
После того, как гель заполимеризуется, аккуратно вынимают гребенку, добавляют буфер для электрофореза в карманы, чтобы гель не усыхал и затем пластины с гелем устанавливают в катодную камеру и прижимают к перегородке прижимным устройством. Если используется только одна пластина с гелем, то дополнительно со стороны катодной части камеры клина устанавливают вкладывающиеся вкладыши из оргстекла для снижения свободного объема камеры, в целях экономии буфера. Затем анодная и катодная камеры заполняются буферным раствором, в карманы пластинки геля 9 наслаивают анализируемое вещество и с помощью погружных электродов 8 и 7 подают электрическое напряжете. Ток в устройстве протекает от катода 7 через пластину геля, далее через нижнюю щель к аноду 8. После прохождения электрофореза стеклянные пластины 9 отслаивают от геля, который затем обрабатывают соответствующим образом для выявления в нем разделенных компонентов анализируемой смеси.
Предполагаемое устройство имеет простую конструкцию из единого корпуса и приспособлено для подключения дополнительных устройств для автоматизации нанесения (при наличии множества проб) и подключения детектирующего устройства для автоматизации процессов компьютерного анализа результатов электрофоретического разделения биомолекул. Прибор прост, не нуждается в сложной сборке и разборке, что повышает его надежность, функциональность. Прибор превосходит имеющиеся аналоги в 5 раз по продуктивности и скорости. В разделяющем устройстве исключены герметизирующие элементы, что значительно упрощает его конструкцию и эксплуатацию, увеличивает срок непрерывной работы.
В предлагаемом универсальном комплексном устройстве можно использовать обычные нарезанные стекла и, при подключении дополнительного блока для микроэлектрофореза, можно использовать стандартные покровные стекла. Прибор позволяет проводить ЭФ одновременно в 5 пластинах геля (желательно использовать более мощные источники тока со стабилизированным напряжением). При этом объем буфера экономится в 2-3 раза по сравнению с традиционными методиками.
Устройство может найти применение в исследованиях по молекулярной биологии, медицинской диагностике, в экологическом мониторинге, анализе качества продуктов, в научных исследованиях в областях генетической инженерии, биотехнологии и нанотехнологии.
Краткие примеры применения прибора в соответствии с преимуществами заявляемой полезной модели.
В качестве примера можно привести несколько основных направлений применения прибора из большого комплекса соответствующих DGGE (денатурирующий градиентный гель-электрофорез) технологий. Среди них изучение различных видов полиморфизма генов, расположенных в ядерном или митохондриальном геномах, ассоциированных с распространенными патологиями человека [2-4], изучение микробного биоразнообразия микрофлоры ротовой полости [5, 6], а также микробного биоразнообразия природных сред, в частности, почвы [7-8]. Во всех случаях комплексные методики включают специфические, часто оригинальные методы выделения образцов ДНК из биологического материала.
2
Первый пример. Изучения полиморфизма генов, расположенных в ядерном или митохондриальном геномах [2-4]. В случае изучения вариаций в митохондриальной ДНК из биологических образцов выделяют стандартным способом суммарную ДНК, затем ее обрабатывают набором ферментов, специфически расщепляющих ДНК из ядра клеток и оставляющих в реакционной смеси только митохондриальную ДНК [4]. Интересуемый фрагмент гена размножается с применением особых затравок, содержащих дополнительный GC тяж (для образования V-образных структур в ходе ЭФ). Структура затравок определялась в процессе тщательного компьютерного анализа в зависимости от поставленной задачи изучения полиморфизма митохондриальной ДНК [2-4]. Условия ПНР амплификации: реакционная смесь в общем объеме 50 мкл содержала 0,1 мкг очищенной из биологических образцов митохондриальной ДНК, 250 мкМ «прямой» и «обратной» затравок, 200 мкМ каждого из dNTP, 2,0 мМ MgCl, 5 мкл 10 X PCR буфера и 0,75 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Условия амплификации - 94°С 4 мин., затем 30 циклов 94°С в течение 1 мин, 55°С 1 мин и 72°С 1 мин, конечный этап «достраивания» в течение 5 мин при 72°С. Предварительные результаты по ПЦР размножению интересуемого участка гена 16S рРНК анализировали с помощью стандартного ЭФ в 1,0%-ном агарозном геле.
Условия заливки гелей. Использовались следующие комплектующие и растворы: стекла для гелей с набором прокладок и гребенок, камера для заливки гелей, 40%-ный раствор акриламида, формамид (деионизованный), мочевина, 50-кратный ТАЕ (2 М трис, 1 М ацетат, 50 мМ ЭДТА) рН 8,3, персульфат аммония, TEMED, раствор для окрашивания геля. Использовали для заливки 2 раствора из расчета на объем в 100 мл: а) исходный, содержащий 6%-ный акриламид, 0% денатурирующих ДНК агентов, 2 мл 50-кратного ТАЕ буфера и вода до 100 мл; б) конечный, содержащий 6%-ный акриламид, 80% денатурирующих ДНК агентов (33,6 г мочевины, 32 мл формамида), 2 мл 50-кратного ТАЕ буфера и вода до 100 мл. Для полимеризации геля в оба раствора добавляли рассчитанные количества персульфата и TEMED, чтобы полимеризация началась уже после процедуры заливки гелей. Для заливки линейного градиента денатурирующего агента использовали 2 сообщающихся сосуда и магнитную мешалку. Гель заливался из перемешиваемой емкости, в котором находился исходный раствор (а). После окончания процедуры заливки гелей, аккуратно вставляли гребенки в верхнюю часть геля. В каждый карман геля после установки геля в прибор (предварительно заполненный однократным ТАЕ буфером) наносили 0,2-0,5 мкг амплификата ДНК. Режим электрофореза (ЭФ) включал предварительный ЭФ при низком напряжении на этапе нагревания буфера до нужной температуры для вхождения ДНК в гель и препятствия перемешиванию образцов между карманами в процессе диффузии с последующим разделением в течение 17 часов при напряжении в 100 V.
Гель для прокрашивания аккуратно отделяли от стекол покрыв его тонким листом полиэтиленовой пленки (или оставляя на одном из стекол гелевой пластины) помещали в ванночку, промывали 10%-ным спиртом 10 мин, ополаскивали 1%-ной азотной к-той - 6 мин, ополаскивают гель дистиллятом и промывали в нем 5 мин, гель погружают на 40 мин в раствор 0,012 М нитрата серебра, гель ополаскивали дистиллятом, погружают в 0,28 М углекислый натрий для проявления, останавливают проявление 10%-ной уксусной кислотой, затем окончательно промывют гель дистиллятом в течение, как минимум 5 мин. Гель фотографируют. В случае необходимости дальнейшей работы с ДНК из геля, окраску осуществляют красителем Sybr Green в соответствии с методикой поставщика. Подробный анализ картин DGGE электрофореза позволяет выявлять полиморфизм различных участков митохондриальной ДНК, включая гены и регуляторные участки и изучать связь этих полиморфизмов с физическими способностями в спорте [9], распространенными заболеваниями, в частности различными миопатиями, сердечнососудистыми патологиями, склонностью к формам диабета, механизмы старения [4].
2
Второй пример. Изучение микробного биоразнообразия микрофлоры ротовой полости [5, 6]. Применение заявляемой модели прибора для ЭФ и соответствующих DGGE методик является в настоящее время одной из основных надежных и относительно простых методик изучения биоразнообразия экосистем на основе анализа препаратов ДНК различных организмов. Метод основывается на изучении полиморфизма участка гена 16S рРНК, последовательность оснований которого обладает высоким межвидовым разнообразием и, поэтому, может быть успешно применен для выявления и идентификации микроорганизмов в сложных сообществах. Для проведения комплекса методик собирают биологические образцы в соответствии со стандартными для изучаемой природной среды, в частности, водной среды или почвы (или макроорганизма, при изучении микрофлоры) и выделяют с применением стандартных наборов (например, магнитных наночастиц фирмы «Силекс М») препараты ДНК. Препараты подвергают процедуре ПЦР- амплификации с применением следующих затравок: Бак-1 5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGACTACGTGCCAGCAGCC-3' и Бак-2 5'-GGAСТАССАGGGТАТСТААТСС-3'. Затравка Бак-1 содержит длинный тяж из повторяющихся оснований GC, для образования V-образных структур в процессе ЭФ, что необходимо для успешного прохождения DGGE процедуры. Условия ПЦР: реакционная смесь в общем объеме 50 мкл содержала 0,1 мкг очищенной из биологических образцов геномной ДНК, 150 мкМ обеих затравок, 200 мкМ каждого из dNTP, 4.0 мМ MgCl; 5 мкл 10Х PCR буфера и 2.5 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Условия амплификации - 94°С 3 мин., затем 30 циклов 94°С в течение 1 мин, 56°С 1 мин и 72°С 2 мин, конечный этап «достраивания» в течение 5 мин при 72°С. Предварительные результаты по ПЦР размножению интересуемого участка гена 16S рРНК анализировали с помощью стандартного ЭФ в 1.0%-ном агарозном геле.
Для проведения непосредственно DGGE анализа использовались те же комплектующие, что в примере 1. Для заливки гелей использовались следующие растворы: сформированный в собранной и установленной в заливочное устройство пластинке градиентный раствор геля с постоянной концентрацией ПААГ в 8% и линейными градиентами концентраций мочевины и формамида (2,8 М -→4,9 М мочевины и 16% -→28% формамида). Процедура заливки осуществлялась как в примере 1. В карманы геля установленного в прибор и погруженного в 1 Х ТАЕ буфер (см. выше) наносили около 0,3 мкг амплификата ДНК и проводили DGGE разделение при 58°С в течение 17 час при постоянном напряжении в 60 V. После процедуры ЭФ гель обрабатывали как в примере 1. Гель фотографировали и подвергали последующим этапам анализа в зависимости от специфики объекта и поставленной задачи.
Третий пример. Изучение микробного биоразнообразия почвы [7, 8].
2
Приводимый пример применения процедуры DGGE для изучения микробного биоразнообразия почв применяется при решении большого перечня фундаментальных и прикладных задач в области экологии и биологии данной природной среды. Особенностью данной области применения технологии являются высокие требования к качеству выделяемых препаратов ДНК. Среди них необходимость очистки от гуминовых кислот, присутствующих в больших количествах в почвенной среде, так как последние являются мощными ингибиторами ПЦР. Другим важным требованием является необходимость максимальной «представленности» в суммарном препарате ДНК образцов генетического материала почвенных микроорганизмов. Следовательно, успешность дальнейшего DGGE анализа существенно зависит от этапа выделения и очистки ДНК из биологических образцов. Используемые в данном примере затравки: Прямая 5' - 5'-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3' и обратная затравки 5'-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3'. Затравки сконструированы для размножения гипервариабельного участка V6-V8 в бактериальной 16S рДНК. Прямая затравка содержит длинный тяж из повторяющихся оснований GC, для образования V-образных структур в процессе ЭФ, что необходимо для успешного прохождения DGGE процедуры. Условия ПЦР: реакционная смесь в общем объеме 50 мкл содержала 0,05 мкг очищенной из биологических образцов геномной ДНК, 150 мкМ обеих затравок, 200 мкМ каждого из dNTP, 30 мкг бычьего сывороточного албумина, 4,0 мМ MgCl, 5 мкл 10 X PCR буфера и 2,5 ед. Taq-ДНК-полимеразы. Условия амплификации - 94°С 2 мин, затем 35 циклов 94°С в течение 30 сек, 55°С 1 мин и 72°С 45 сек, конечный этап «достраивания» в течение 5 мин при 72°С. Предварительные результаты по ПЦР размножению интересуемого участка гена 16S рРНК анализировали с помощью стандартного ЭФ в 1,5%-ном агарозном геле. Получаемый фрагмент имел длину в 500 н.п.
Для проведения непосредственно DGGE анализа использовались те же комплектующие, что в примере 1. Для заливки гелей использовались следующие растворы: сформированный в собранной и установленной в заливочное устройство пластинке градиентный раствор геля с постоянной концентрацией ПААГ в 6% в 1 Х ТАЕ и линейными градиентами концентраций мочевины и формамида (55% -→61% М денатурантов, исходя из состава 100%-ного денатуранта в 7 М мочевины и 40%-ного формамида). Процедура заливки осуществлялась как в примере 1. В карманы геля установленного в прибор и погруженного в 0,5 Х ТАЕ буфер (см. выше) наносили около 0,5 мкг амплификата ДНК и проводили DGGE разделение при 60°С в течение 17 час при постоянном напряжении в 200 V. После процедуры ЭФ гель обрабатывали как в примере 1. Гель фотографировали и подвергали последующим этапам анализа в зависимости от специфики объекта и поставленной задачи.
ЛИТЕРАТУРА
1. Rafael J., Prieto-Ruiz J.F., Hemandez-Yago J. Conformation-Sensitive Gel Electrophoresis as an Ideal High-Throughput Strategy for Accurate Detection of Sequence Variations in DNA: Screening hTomm and hTimm Genes. Journal of Biomolecular Screening 2004, Vol.35, p.621-624
2. Pumomosari D., Paramita D.K., Aryandono Т., Pals G., van Diest P.J. A novel BRCA2 mutation in an Indonesian family found with a new, rapid, and sensitive mutation detection method based on pooled denaturing gradient gel electrophoresis and targeted sequencing. J Clin Pathol. 2005, 58 (5), p.493-499.
3. Michikawa Y, Attardi G. Screening for aging-dependent point mutations in mtDNA. Methods Mol Biol, 2002, Vol.197, p.75-92.
4. Tian Y., He X., Torralba M., Yooseph S., Nelson K.E., Lux R., McLean J.S., Yu G., Shi W. Using DGGE profiling to develop a novel culture medium suitable for oral microbial communities. Mol Oral Microbiol. 2010, Vol.25 (5), p.357-67.
5. Ahmed A., Liu J., Moosa Y., Tang L., Zang S., Xin Y. Microbial profiling of dental caries and periodontitis patients using denaturing gradient gel electrophoresis. African Journal of Microbiology Research, 2012, Vol.6 (10), p.2559-2566
6. Valaskova V., Baldrian P. Denaturing gradient gel electrophoresis as a fingerprinting method for the analysis of soil microbial communities. Plant Soil Env., 2009, Vol.55 (10), p.413-423
7. Yang Z.H., Xiao Y., Zeng G.M., Xu Z.Y., Liu Y.S. Comparison of methods for total community DNA extraction and purification from compost. Appi Microbiol Biotechnol, 2007, Vol.74 (4), p.918-925.
8. Calo C.M., Vona G. Gene polymorphisms and elite athletic performance. Journal of Anthropological Sciences, 2008, Vol.86, p.113-131