ПЕПТИД, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ (ВАРИАНТЫ) И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ДИАБЕТА ИЛИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СОПУТСТВУЮЩИХ ОЖИРЕНИЮ, СПОСОБ УМЕНЬШЕНИЯ АППЕТИТА, УМЕНЬШЕНИЯ ПОТРЕБЛЕНИЯ ПИЩИ, УМЕНЬШЕНИЯ ПОТРЕБЛЕНИЯ КАЛОРИЙ, УМЕНЬШЕНИЯ МАССЫ ТЕЛА И УВЕЛИЧЕНИЯ РАСХОДА ЭНЕРГИИ
PEPTIDE, PHARMACEUTICAL COMPOSITION (VERSIONS) AND MEDICATION

Область техники, к которой относится изобретение
Данная заявка относится к применению активных веществ, более конкретно, пептида, для контроля аппетита, питания, приема пищи, расхода энергии и потребления калорий, лечения избыточной массы тела, ожирения и для предупреждения и лечения сопутствующих ожирению заболеваний.
Уровень техники
Согласно данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), ожирение представляет собой всемирную эпидемию, в которой более одного миллиарда взрослых людей имеют повышенную массу тела, из которых по меньшей мере 300 миллионов имеют клиническую стадию ожирения. Кроме того, по оценке ВОЗ, 250000 смертей в год в Европе и больше 2,5 миллионов смертей в мире связаны с массой тела (World Health Organisation, Global Strategy on Diet, Physical Activity and Health, (Всемирная Организация Здравоохранения, Мировая стратегия по питанию, физическая активность и здоровье, 2004).
Причина ожирения является сложной и многофакторной. Растущее число фактов позволяет предположить, что ожирение не является простой проблемой самоконтроля, но представляет собой комплексное нарушение, включающее регуляцию аппетита и энергетический обмен. Кроме того, ожирение связано с множеством состояний, ассоциированных с повышенной заболеваемостью и смертностью у населения. Хотя этиология ожирения окончательно не установлена, считают, что в нее вносят вклад генетические, метаболические, биохимические, культурные и психосоциальные факторы. В целом ожирение описано как состояние, при котором избыток жира в организме создает риск для здоровья субъекта.
Имеется веское доказательство того, что ожирение связано с повышенной заболеваемостью и смертностью. Риск развития заболевания, например риск развития сердечно-сосудистого заболевания и риск развития диабета типа 2, повышается независимо с ростом индекса массы тела (BMI).
В действительности риск количественно оценивают как пятипроцентное повышение риска развития сердечных заболеваний у женщин и семипроцентное повышение риска развития сердечных заболевания у мужчин для каждого пункта BMI, превышающего 24,9 (см. статьи Kenchaiah et al., N. Engl. J. Med. 347:305, 2002; Massie, N. Engl. J. Med. 347:358, 2002). Кроме того, имеется существенное доказательство того, что снижение массы тела у субъектов с ожирением или избыточной массой тела уменьшает важные факторы риска развития заболевания. Снижение массы тела на 10% от исходной массы тела у взрослых как с избыточной массой тела, так и с ожирением связана со уменьшением факторов риска, таких как гипертензия, гиперлипидемия и гипергликемия.
Хотя диета и физическая нагрузка представляют простой способ уменьшить набор массы тела и способствуют потере массы тела, субъекты с избыточной массой тела и ожирением часто не могут в достаточной степени контролировать данные факторы, чтобы эффективно терять массу тела. Доступна фармакотерапия; Управление по контролю за продуктами и лекарствами одобрило ряд лекарственных препаратов для снижения массы тела, которые могут быть использованы как часть комплексной программы снижения массы тела. Однако, многие из данных лекарственных препаратов имеют серьезные вредные побочные эффекты. Примером широко используемого супрессора аппетита является сибутрамин (см. обзор McNeely, Wet al., Drugs, 1998, 56(6), 1093-1124). Первичные и вторичные метаболиты сибутрамина фармакологически активны, и считают, что они усиливают насыщение и термогенез путем ингибирования повторного всасывания серотонина и норадреналина. Когда не действуют менее инвазивные способы, и субъект находится в группе высокого риска заболеваемости и смертности, связанных с ожирением, хирургическое вмешательство, направленное на снижение массы тела, представляет собой альтернативу для тщательно отобранных субъект с клинически тяжелым ожирением. Однако данные способы лечения входят в группу высокого риска и подходят для использования только для ограниченного числа субъектов (см. статью Wolfe and Morton, JAMA, 2005, 294, 1960-1963). Это не только субъекты с ожирением, которые хотят снизить массу тела. Люди с массой тела, лежащей в рекомендованном интервале, например, в верхней части рекомендованного интервала, могут иметь желание снизить свою массу тела, чтобы подвести ее ближе к идеальной массе тела.
Оксинтомодулин (далее охт) представляет собой пептидный член из 37 аминокислот суперсемейства глюкагона (см. статью Sherwood et al, Endocrine Reviews, 2000, 21(6): 619-670) включающий полную последовательность глюкагона из 29 аминокислот с карбокси-концевым удлинением из восьми аминокислот, обусловленным тканеспецифическим процессингом предшественника пре-про-глюкагона в головном мозге и кишке (см. статью Holst, Ann Rev Physiol, 1997, 59:257-271). Введение oxm крысам посредством интрацеребровентрикулярной инъекции и инъекции в паравентрикулярные и дуговидные ядра гипоталамуса подавляет повторное питание после голодания (см. статьи Dakin et al, Endocrinology, 2001, 142:4244-4250; Dakin et al, Endocrinology, 2004, 145:2687-2695). Постоянное центральное введение приводило в результате к пониженному уровню набора массы тела, согласующемуся с уменьшением приема пищи (см. статью Dakin et al, Am J Physiol Endocrinol Metab, 2002, 283:E1173-E1177). Периферические введения два раза в день также приводили в результате к пониженному набору массы тела и ожирения (см. статью Dakin et al, Endocrinology, 2004, 145:2687-2695).
WO 03/022304 раскрывает применение oxm в нативной форме и его аналогов в качестве лекарственного средства, предназначенного для применения для контроля аппетита, питания, поглощения пищи, потребления энергии и поглощения калорий, особенно в области ожирения. Исследования на человека показали, что внутривенно вливаемый oxm является эффективным супрессором аппетита (см. статью Cohen et al, J. Clin. Endocrinol Metab, 2003, 88(10): 4696-4701). В исследовании эффектов oxm на потерю массы тела у человека обнаружено, что подкожные инъекции 1,8 мг (приблизительно 400 нмоль) oxm людям-добровольным участникам эксперимента три раза в день (на 30 мин. до приема пищи) в течение 28 дней приводила в результате в существенному снижению массы тела (см. статью Wynne et al, Diabetes, 2005, 54: 2390-2395).
Пептиды широко используют в медицинской практике, хотя при использовании в лечении нативных пептидов или их аналогов, как правило, обнаруживают, что они имеют высокую скорость выведения и/или чувствительны в разложению. В частности, высокий уровень выведения или быстрое разложение лечебного фактора неудобно в случаях, когда требуется поддерживать высокий уровень в крови в течение длительного периода времени, поскольку затем будут необходимы повторные введения, снижающие уровень удобства для субъекта и повышающие стоимость лечения.
Остается потребность в факторах, которые можно использовать для того, чтобы вызвать снижение массы тела у субъекта с избыточной массой тела или ожирением и/или для лечения субъектов с другими состояниями, включающими избыточную массу тела, например, с диабетом или нарушениями питания. Особенно необходимы факторы, структурно близкие охт, которые проявляют повышенную активность и/или пролонгированный или более терапевтически эффективный профиль действия и/или более низкую скорость выведения, чем у нативного oxm.
Раскрытие изобретения
Соединения, соответствующие изобретению, представляют собой новые пептидные аналоги охт (далее "аналоги oxm"), в которых одна или более аминокислот или частей последовательности охт заменены одной или более определенных заменяющих аминокислот или последовательностей.
Соответственно, изобретение предусматривает пептид, включающий последовательность аминокислот:
Хаа1 Хаа2 Хаа3 Gly4 Thr5 Phe6 Thr7 Ser8 Asp9 Tyr10 Ser11 Lys12 Tyr13 Leu14 Хаа15 Хаа16 Хаа17 Хаа18 Хаа19 Хаа20 Хаа21 Хаа22 Хаа23 Хаа24 Trp25 Leu26 Хаа27 Хаа28 Хаа29 Хаа30 Хаа31 Хаа32 Lys33 Asn34 Asn35 Ile36 Ala37;
где:
Хаа1 представляет собой His1 или D-His1,
Хаа2 представляет собой Ser2 или Ala2,
Хаа3 представляет собой Gln3 или Asp3;
Хаа15 Хаа16 Хаа17 Хаа18 Хаа19 Хаа20 Хаа21 Хаа22 Хаа23 Хаа24 представляет собой:
Glu15 Glu16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Glu24,
Glu15 Glu16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Gln24,
Glu15 Glu16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Glu24,
Glu15 Glu16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24,
Glu15 Glu16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Glu24,
Glu15 Glu16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Gln24,
Glu15 Glu16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Glu24,
Glu15 Glu16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24,
Glu15 Gln 16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Glu24,
Glu15 Gln16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Gln24,
Glu15 Gln16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Glu24,
Glu15 Gln16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24,
Glu15 Gln16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Glu24,
Glu15 Gln16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Gln24,
Glu15 Gln16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Glu24,
Glu15 Gln16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24,
или Asp15 Ser16 Arg17 Arg18 Ala19 Gln20 Asp21 Phe22 Val23 Gln24;
Хаа27 Хаа28 Хаа29 Хаа30 Хаа31 Хаа32 представляет собой:
Met27 Asn28 Thr29 Lys30 Arg31 Asn32,
Lys27 Asn28 Ala29 Gly30 Pro31 Ser32,
или Lys27 Asn28 Gly29 Gly30 Pro31 Ser32
либо пептид, как приведено выше, в котором остаток Asn34 заменен Asp34;
или пептид, как приведено выше, в котором Хаа3 представляет собой Glu3;
при условии, что если
Хаа15 Хаа16 Хаа17 Хаа18 Хаа19 Хаа20 Хаа21 Хаа22 Хаа23 Хаа24 представляет собой Asp15 Ser16 Arg17 Arg18 Ala19 Gln20 Asp21 Phe22 Val23 Gln24, то Xaa27 Хаа28 Хаа29 Хаа30 Хаа31 Хаа32 не является Met27 Asn28 Thr29 Lys30 Arg31 Asn32. (SEQ ID NO:356).
В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает пептид, включающий последовательность аминокислот:
Хаа1 Хаа2 Хаа3 Gly4 Thr5 Phe6 Thr7 Ser8 Asp9 Tyr10 Ser11 Lys12 Tyr13 Leu14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Trp25 Leu26 Xaa27 Хаа28 Хаа29 Хаа30 Хаа31 Хаа32 Lys33 Asn34 Asn35 Ile36 Ala37;
где:
Хаа1 представляет собой His1 или D-His1,
Хаа2 представляет собой Ser2 или Ala2,
Хаа3 представляет собой Gln3 или Asp3;
Хаа15 Хаа16 Хаа17 Хаа18 Хаа19 Хаа20 Хаа21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 представляет собой:
Glu15 Glu16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Glu24,
Glu15 Glu16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Gln24,
Glu15 Glu16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Glu24,
Glu15 Glu16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24,
Glu15 Glu16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Glu24,
Glu15 Glu16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Gln24,
Glu15 Glu16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Glu24,
Glu15 Glu16 Glu17 lle18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24,
Glu15 Gln16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Glu24,
Glu15 Gln16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Gln24,
Glu15 Gln16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Glu24,
Glu15 Gln16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24,
Glu15 Gln16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Glu24,
Glu15 Gln16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Gln24,
Glu15 Gln16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Glu24,
Glu15 Gln16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24,
или Asp15 Ser16 Arg17 Arg18 Ala19 Gln20 Asp21 Phe22 Val23 Gln24;
Xaa27 Xaa28 Xaa29 Хаа30 Хаа31 Хаа32 представляет собой:
Met27 Asn28 Thr29 Lys30 Arg31 Asn32,
Lys27 Asn28 Ala29 Gly30 Pro31 Ser32,
или Lys27 Asn28 Gly29 Gly30 Pro31 Ser32
при условии, что если
Хаа15 Хаа16 Хаа17 Хаа18 Хаа19 Хаа20 Хаа21 Хаа22 Хаа23 Хаа24 представляет собой
Asp15 Ser16 Arg17 Arg18 Ala19 Gln20 Asp21 Phe22 Val23 Gln24,
то Хаа27 Хаа28 Хаа29 Хаа30 Хаа31 Хаа32 не является
Met27 Asn28 Thr29 Lys30 Arg31 Asn32.
Пептиды, соответствующие изобретению, являются сильными и длительно действующими супрессорами аппетита.
Краткое описание чертежей
На фигуре 1 показаны 355 специфических пептидных последовательностей, входящих в объем изобретения.
На фигурах 2-41 показаны результаты, полученные в примерах 1-19.
На Фигуре 2 показано влияние нативного оксинтомодулина (человеческого) на суммарное поглощение пищи при внутрибрюшинной инъекции 1400 нмоль/кг группам мышей, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 3 показано влияние нативного оксинтомодулина (человеческого) на суммарное поглощение пищи при подкожной инъекции 1400 нмоль/кг группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 6 часов.
На Фигуре 4 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:178 [SEQ. ID NO:178] при введении его в дозе 10 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 5 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:82 [SEQ. ID NO:82] при введении его в дозе 10 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 6 показано влияние на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:58 [SEQ. ID NO:58] при введении его в дозе 10 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 7 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:52 [SEQ. ID NO:52] при введении его в дозе 10 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 8 показано влияение на поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:164 [SEQ. ID NO:164] при введении его в дозе 4 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 48 часов.
На Фигуре 9 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:167 [SEQ. ID NO:167] при введении его в дозе 5 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 32 часов.
На Фигуре 10 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:100 [SEQ. ID NO:100] при введении его в дозе 20 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 11 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:148 [SEQ. ID NO:148] при введении его в дозе 10 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 12 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:60 [SEQ. ID NO:60] при введении его в дозе 100 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 13 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:94 [SEQ. ID NO:94] при введении его в дозе 5 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 14 показано влияение на поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:155 [SEQ. ID NO:155] при введении его в дозе 4 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 32 часов.
На Фигуре 15 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:142 [SEQ. ID NO:142] при введении его в дозе 3 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 16 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:172 [SEQ. ID NO:172] при введении его в дозе 3 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 17 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:184 [SEQ. ID NO:184] при введении его в дозе 3 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 18 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:4 [SEQ. ID NO:4] при введении его в дозе 5 нмоль/кг путем внутрибрюшинной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 19 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:108 [SEQ. ID NO:108] при введении его в дозе 5 нмоль/кг путем внутрибрюшинной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 20 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:195 [SEQ. ID NO:195] при введении его в дозе 800 нмоль/кг путем внутрибрюшинной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 21 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:136 [SEQ. ID NO:136] при введении его в дозе 100 нмоль/кг путем внутрибрюшинной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 22 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:142 [SEQ. ID NO:142] при введении его в дозе 3 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 23 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:22 [SEQ. ID NO:22] при введении его в дозе 3 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 24 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:153 [SEQ. ID NO:153] при введении его в дозе 200 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 25 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:199 [SEQ. ID NO:199] при введении его в дозе 500 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 26 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:210 [SEQ. ID NO:210] при введении его в дозе 20 нмоль/кг путем внутрибрюшинной инъекции группам мышей, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 48 часов.
На Фигуре 27 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:211 [SEQ. ID NO:211] при введении его в дозе 200 нмоль/кг путем внутрибрюшинной инъекции группам мышей, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 48 часов.
На Фигуре 28 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:213 [SEQ. ID NO:213] при введении его в дозе 400 нмоль/кг путем внутрибрюшинной инъекции группам мышей, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 48 часов.
На Фигуре 29 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:214 [SEQ. ID NO:214] при введении его в дозе 400 нмоль/кг путем внутрибрюшинной инъекции группам мышей, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 48 часов.
На Фигуре 30 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:201 [SEQ. ID NO:201] при введении его в дозе 5 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 48 часов.
На Фигуре 31 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:202 [SEQ. ID NO:202] при введении его в дозе 5 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 48 часов.
На Фигуре 32 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:203 [SEQ. ID NO:203] при введении его в дозе 100 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 33 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:204 [SEQ. ID NO:204] при введении его в дозе 5 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 32 часов.
На Фигуре 34 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:205 [SEQ. ID NO:205] при введении его в дозе 5 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 32 часов.
На Фигуре 35 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:206 [SEQ. ID NO:206] при введении его в дозе 80 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 48 часов.
На Фигуре 36 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:207 [SEQ. ID NO:207] при введении его в дозе 80 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 48 часов.
На Фигуре 37 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:209 [SEQ. ID NO:209] при введении его в дозе 80 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 48 часов.
На Фигуре 38 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:215 [SEQ. ID NO:215] при введении его в дозе 5 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 39 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:216 [SEQ. ID NO:216] при введении его в дозе 10 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
На Фигуре 40 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:355 [SEQ. ID NO:355] при введении его в дозе 5 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 4 часов.
На Фигуре 41 показано влияение на суммарное поглощение пищи аналога оксинтомодулина: Пептид NO:130 [SEQ. ID NO:130] при введении его в дозе 5 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам мышей, подвергнутых голоданию, по сравнению с контрольной группой животных, которой вводили физиологический раствор, в течение 24 часов.
Осуществление изобретения
Определения
Для того чтобы облегчить обзор различных вариантов осуществления данного описания, ниже приведены следующие пояснения к специальным терминам:
Животный организм: живые многоклеточные позвоночные организмы, группа, которая включает, например, млекопитающих и птиц. Термин млекопитающее включает как человека, так и млекопитающих, отличных от человека. Аналогично термин "субъект (пациент)" включает человека и субъектов, отличных от человека, в том числе ветеринарных субъектов.
Аппетит: естественное желание или сильное желание принять пищу. В одном варианте осуществления аппетит измеряют путем опроса с целью оценки желания принять пищу. Повышенный аппетит, как правило, приводит к усиленному пищевому поведению.
Супрессоры аппетита: Соединения, которые снижают желание принятия пищи. Коммерчески доступные супрессоры аппетита включают, но без ограничения перечисленным, амфепрамон (диэтилпропион), фентермин, мациндол и фенилпропаноламин фенфлурамин, дексфенфлурамин, сибутрамин, римонабант и флуоксетин.
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Индекс массы тела (BMI): Математическая формула для измерения массы тела, также иногда называемая Индексом Кветелета. BMI рассчитывают путем деления массы тела (в кг) на рост (в м). Рекомендуемые классификации для BMI для человека, принятые Экспертной группой по Идентификации, оценке и лечению избыточной массы тела и ожирению у взрослых, и одобренные ведущими организациями специалистов в области здравоохранения представлены следующими: Пониженная масса тела <18,5 кг/м; нормальная масса тела 18,5-24,9 кг/м; избыточная масса тела 25-29,9 кг/м; ожирение (Класс 1) 30-34,9 кг/м; ожирение (Класс 2) 35-39,9 кг/м; сильное ожирение (Класс 3) ≥40 кг/м (см. Практическое руководство по Идентификации, оценке и лечению избыточной массы тела и ожирению у взрослых, The North American Association for the Study of Obesity (Североамериканская ассоциация по изучению ожирения) (NAASO) и National Heart, Lung, and Blood Institute (Национальный институт сердца, легкого и крови) (NHLBI) 2000). В одном варианте осуществления BMI больше чем 25 кг/м можно использовать для выявления субъекта, нуждающегося в лечения по поводу избыточной массы тела или ожирения. Идеальная масс тела будет варьировать среди видов и субъектов в зависимости от роста, строения тела, структуры костей и пола.
Консервативные замены: Замена остатка аминокислоты в полипептиде другим подобным остатком. Как правило, но без ограничения консервативные замены представляют собой замены одной на другую алифатических аминокислот Ala, Val, Leu и Не; взаимозамену Ser и Thr, содержащих гидроксильные остатки, взаимозамену кислотных остатков Asp и Glu, взаимозамену амидсодержащих остатков Asn и Gln, взаимозамену основных остатков Lys и Arg, взаимозамену ароматических остатков Phe и Tyr и взаимозамену аминокислот маленького размера Ala, Ser, Thr, Met и Gly. Дополнительные консервативные замены включают замену одной аминокислоты на другую близкой пространственной или стерической конфигурации, например, взаимозамену Asn на Asp или Gln на Glu.
Таблица 1
Неограничивающие примеры консервативных замен аминокислот
Исходный остаток
Консервативные замены
Ala
Gly, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Met
Arg
Lys
Asn
Asp, Gln, His
Asp
Glu, Asn
Cys
Ser
Gln
Asn, His, Lys, Glu
Glu
Asp, Gln
Gly
Ala, Ser, Thr, Met
His
Asn, Gln
Ile
Ala, Leu, Val, Met
Leu
Ala, Ile, Val, Met,
Исходный остаток
Консервативные замены
Lys
Arg
Met
Leu, Ile, Ala, Ser, Thr, Gly
Phe
Leu, Tyr, Trp
Ser
Thr, Cys, Ala, Met, Gly
Thr
Ser, Ala, Ser, Met, Gly
Trp
Tyr, Phe
Tyr
Trp; Phe
Val
Ala, Ile, Leu
Неконсервативные замены: Замена в полипептиде остатка аминокислоты другим остатком, который не является биологически близким. Например, замена остатка аминокислоты другим остатком, который имеет в существенной степени другой заряд, в существенной степени другую гидрофобность или в существенной степени другую пространственную или стерическую конфигурацию.
Выражение "альтернативная аминокислота" охватывает альтернативные аминокислоты, которые представляют собой результат как консервативных, так и неконсервативных замен. Кроме двадцати обычно присутствующих аминокислот, которые, как правило, обнаруживают в природных полипептидах, в соответствии с изобретением в качестве "альтернативных аминокислот" могут быть использованы редкие аминокислоты, например, канаванин, орнитин и 5-гидрокситриптофан, и искусственные аминокислоты, т.е. аминокислоты, обычно не обнаруживаемые in vivo, например трет-бутил глицин. Можно использовать любую хиральную форму аминокислоты.
Диабет: Неспособность клеток транспортировать эндогенную глюкозу через свои мембраны вследствие либо эндогенного недостатка инсулина и/либо нарушения чувствительности к инсулину. Диабет представляет собой хронический синдром нарушенного обмена углеводов, белков и жиров, обусловленный недостаточной секрецией инсулина или устойчивостью к инсулину ткани-мишени. Он протекает в двух основных формах: инсулинзависимый сахарный диабет (IDDM, тип I) и инсулинорезистентный сахарный диабет (NIDDM, тип II), который отличается по этиологии, патологии, генетике, возрасту начала заболевания и лечению.
Обе из двух основных форм диабета характеризуются неспособностью доставки инсулина в количестве и в точное время, которые необходимы для контроля гомеостаза глюкозы. Причиной диабета типа I или инсулинзависимого сахарного диабета (IDDM) является разрушение β-клеток поджелудочной железы, которое обусловлено недостаточными уровнями эндогенного инсулина. Диабет типа II или инсулинорезистентный диабет обусловлен дефектом как в чувствительности организма к инсулину, так и в относительной недостаточности продукции инсулина.
Потребление пищи: Количество пищи, потребляемой отдельным субъектом. Потребление пищи можно измерить по объему или по массе. Например, Потребление пищи может представлять собой общее количество пищи, потребленной отдельным субъектом. Иначе потребление пищи отдельным субъектом может представлять собой количество белков, жиров, углеводов, холестерина, витаминов, минералов или другого пищевого компонента. Термин "потребление белков" относится к количеству белка, потребляемого субъектом. Аналогично термины "потребление жиров", "потребление углеводов", "потребление холестерина", "потребление витаминов" и "потребление минералов" относится к количеству жиров, углеводов, холестерина, витаминов или минералов, поглощаемых субъектом, соответственно.
Нормальная суточная диета: Среднее потребление пищи для представителя данного вида. Нормальную суточную диету можно выражать в терминах потребления калорий, потребления белка, потребления углеводов и/или потребления жиров. Нормальная суточная диета для человека, как правило, включает следующее: от приблизительно 2000, приблизительно 2400 или приблизительно 2800 до существенного большего количества калорий. Кроме того, нормальная суточная диета для человека, как правило, включает от приблизительно 12 г до приблизительно 45 г белка, от приблизительно 120 г до приблизительно 610 г углевода и от приблизительно 11 г до приблизительно 90 г жира. Низкокалорийная диета составляла бы не больше чем приблизительно 85% и предпочтительно не больше чем приблизительно 70% от нормального потребления калорий у человека.
У животных организмов требования к калорийности и питательным веществам варьируют в зависимости от вода и размера животного. Например, у кошек общее потребление калорий/фунт, а также процентное распределение белков, углеводов и жиров варьирует в зависимости от возраста кошки и репродуктивного статуса. Общей нормой для кошек, однако, является 40 кал/фунт/день (18,2 кал/кг/день). От приблизительно 30% до приблизительно 40% должны составлять белки, от приблизительно 7% до приблизительно 10% должны составлять углеводы и от приблизительно 50% до приблизительно 62,5% должны быть получены от потребления жиров. Компетентный специалист в области техники легко может определить нормальную суточную диету представителя любого вида.
2
2
2
Ожирение: состояние, при котором избыток жира в организме может привести к риску для здоровья субъекта (см. статью Barlow and Dietz, Pediatrics 102:E29, 1998; National Institutes of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute (Национальные институты здравоохранения, Национальный институт сердца, легкого и крови) (NHLBI)), Obes. Res. 6 (доп.2): 51S-2098, 1998). Избыток жира в организме является результатом дисбаланса поглощения энергии и потребления энергии. Например, для оценки ожирения можно использовать Индекс массы тела. В одном часто используемом соглашении BMI от 25,0 кг/м до 29,9 кг/м считают избыточной массой тела, тогда как BMI от 30 кг/м или выше является ожирением.
2
В другом соглашении для оценки ожирения используют окружность талии. Избыточный жир в абдоминальной области является важной независимой оценкой риска, связанного с ожирением или наличием избыточной массы тела. Измерение окружности талии особенно эффективно у субъектов, которых разделяют на группы с нормальной или избыточной массой. Обычно бывает необходимым измерить окружность талии у субъектов с BMIs ≥35 кг/м, поскольку это несколько повышает предсказательную силу классификации риска заболевания при BMI. Мужчины с окружностью талии больше чем 40 дюймов (102 см) и женщины с окружностью талии больше чем 35 дюймов (90 см) находятся в группе повышенного риска развития диабета, дислипидемии, гипертензии и сердечно-сосудистого заболевания из-за избыточного жира в абдоминальной области. Следует считать, что субъекты с окружностью талии больше чем данные значения находятся в группе более высокого риска, чем определено по их BMI.
Веское доказательство показывает, что ожирение действует как на заболеваемость, так и на смертность субъектов. Например, субъект с избыточной массой тела или ожирением находится в группе повышенного риска развития сердечных заболеваний, инсулинрезистентного диабета (типа 2), гипертензии, инсульта, рака (например, среди прочих, рака эндометрия, молочной железы, простаты и толстой кишки), дислипидемии, болезни желчного пузыря, апноэ во сне, пониженной фертильности и остеоартрита (см. статью Lyznicki et al., Am. Fam. Phys. 63:2185, 2001)).
2
2
Избыточная масса тела: Субъект, масса тела которого превышает идеальную для него массу тела. Субъект с избыточной массой тела может иметь ожирение, но необязательно страдает ожирением. Например, субъект с избыточной массой тела является любым субъектом, который желает уменьшить массу своего тела. В одном соглашении субъект с избыточной массой тела является субъектом с BMI от 25,0 кг/м до 29,9 кг/м.
Пегилирование: процесс реакции полиалкиленгликоля, предпочтительно активированного полиалкиленгликоля с формированием ковалентной связи. Можно использовать агент, способствующий реакции, например, аминокислоту, например, лизин. Хотя "пегилирование" часто осуществляют с использованием полиэтиленгликоля или его производных, таких как метоксиполиэтиленгликоль, термин в данном контексте не ограничивают использованием метоксиполиэтиленгликоля, но он также включает использование любого другого эффективного полиалкиленгликоля, например, полипропиленгликоля. Термин пегилированный будут определять соответственно.
Периферическое введение: Введение вне центральной нервной системы. Периферическое введение не включает прямое введение в головной мозг. Периферическое введение включает, но без ограничения перечисленным, внутрисосудистое, внутримышечное, подкожное, ингаляционное, пероральное, ректальное, чрескожное, защечное, подъязычное или интраназальное введение.
Полипептид: полимер, в котором мономеры представляют собой остатки аминокислот, которые связаны друг с другом посредством амидных связей. Когда аминокислоты представляют собой α-аминокислоты, можно использовать как L-оптический изомер, так и D-оптический изомер, причем L-изомеры предпочтительны. На протяжении данного описания принимают, что α-аминокислота является L-изомером, если специально не утверждают, что это D-изомер. Термины "полипептид" или "белок", как используют в данном контексте, охватывают любую последовательность аминокислот и включают модифицированные последовательности, такие как гликопротеины.
Термин "полипептид" охватывает природные белки, а также продуцируемые рекомбинантным или синтетическим путем. Термин "полипептидный фрагмент" относится кчасти полипептида, например, такому фрагменту, который представляет по меньшей мере одну последовательность, используемую в связывании рецептора. Термин "функциональные фрагменты полипептида" относится ко всем фрагментам полипептида, которые сохраняют активность полипептида. Биологически функциональные пептиды могут также включать слитые белки, в которых представляющий интерес пептид слит с другим пептидом(ами).
Терапевтически эффективное количество: Доза, достаточная того, чтобы предупредить развитие или вызвать обратное развитие нарушения, или которая способна облегчить проявление или симптом нарушения, или которая способна достигнуть требуемого результата. В ряде вариантов осуществления терапевтически эффективное количество соединения, соответствующего изобретению, представляет собой количество, достаточное для подавления или прекращения набора массы тела, или количество, достаточное для снижения аппетита, или количество, достаточное для снижения потребления калорий или потребления пищи или увеличения потребления энергии, или количество, достаточное для снижения массы тела, или для снижения риска смертности или заболеваемости от состояний, связанных с нарушением.
Детальное описание
Авторы неожиданно обнаружили, что аналоги oxm, соответствующие изобретению, представляют собой супрессоры аппетита и/или имеют более продолжительный эффект, чем нативный oxm на поглощение пищи и/или имеют более сильный эффект, чем нативный oxm на поглощение пищи. Последовательность человеческого охт (такая же, как у крысы и хомячка) представляет собой следующую:
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn lie Ala (SEQ ID NO:357).
Пептиды, соответствующие изобретению, также имеют более длительный полупериод существования или время выведения или повышенную устойчивость к разложению по сравнению с oxm. Повышенная продолжительность подавления аппетита может быть особенно важной, чтобы избежать эффекта, известного как "избегание". Супрессор аппетита с короткой продолжительностью действия может понизить аппетит на время, покрываемое одним приемом пищи, и, во время данного приема пищи, субъекта, как правило, съедает меньше пищи. Однако, если супрессор аппетита имеет короткую продолжительность действия или быстрое время выведения либо затем метаболизируется или иным путем удаляется из кровообращения субъекта, то ко времени следующего приема пищи субъект может восстановить свой "нормальный" аппетит. В виду того, что субъект съел мало пищи во время предшествующего приема пищи, у субъекта может быть в действительности повышенный аппетит ко времени следующего приема пищи. Если субъект удовлетворяет свой аппетит, то возможно, что потребление пищи за два приема пищи в целом не будет ниже, чем было бы потребление пищи без приема супрессора аппетита. Иначе говоря, субъект "избегает" эффекты супрессора аппетита. "Избегание" можноуменьшить при использованием дополнительных доз супрессора аппетита или путем использования супрессора аппетита с более длительной продолжительностью действия. Если у субъекта снижается аппетит на более длительный период, то степень, в которой он может компенсировать пропущенный прием пищи от одного приема пищи до следующего приема пищи, снижается, поскольку имеется реальный предел общего объема пищи, потребляемой во время конкретного приема пищи. Повторное или непрерывное введение соединения в период времени например, в течение дней или недель, будет приводить к пролонгированному подавлению аппетита и пониженной возможности избегания эффектов подавления аппетита.
Повышенная активность и/или продолжительность действия аналогов охт по сравнению с охт дает различные преимущества. Например, будет возможным эффективное подавление аппетита в более низких дозах (при более низкой дозировке и/или более низких максимальных уровнях, представляя перспективу пониженных побочных эффектов (включая тошному) и снижения стоимости лечения) или использование в относительно высоких дозах будет лучше переноситься субъектом, обеспечивая ускоренное и/или усиленное снижение массы тела. Некоторые из соединений, соответствующих изобретению, используемые в примерах в данном контексте, демонстрируют показатель подавления аппетита типа 'плоской кривой крови', т.е. они имеют улучшенную фармакокинетику, проявляя одно или оба свойства: (i) более постепенное начало проявления активности супрессора аппетита, чем охт, и, таким образом, потенциальное избежание исходного острого пика (который может быть ассоциирован с тошнотой), и (ii) потенциальная более длительная продолжительность действия.
Дополнительные преимущества многих соединений, соответствующих изобретению, включают то, что соединения имеют улучшенные характеристики хранения и пригодны для крупномасштабного синтеза, например, некоторые соединения, соответствующие изобретению, не содержат мотивы последовательности, ассоциированные с формированием аспартимидных групп, и/или такие, которым меньше свойственна пониженная стабильность.
В одном варианте осуществления изобретение предусматривает пептид, в котором
Хаа15 Хаа16 Хаа17 Хаа18 Хаа19 Хаа20 Хаа21 Хаа22 Хаа23 Хаа24 представляет собой:
Glu15 Glu16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Glu24,
Glu15 Glu16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Gln24,
Glu15 Glu16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Glu24,
Glu15 Glu16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24,
Glu15 Glu16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Glu24,
Glu15 Glu16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Gln24,
Glu15 Glu16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Glu24,
Glu15 Glu16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24,
Glu15 Gln16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Glu24,
Glu15 Gln16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Gln24,
Glu15 Gln16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 lle23 Glu24,
Glu15 Gln16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 lle23 Gln24,
Glu15 Gln16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Glu24,
Glu15 Gln16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Gln24,
Glu15 Gln16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 lle23 Glu24,
или Glu15 Gln16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24. (SEQ ID NO:359).
В конкретных вариантах осуществления пептид, соответствующий изобретению, представляет собой пептид, в котором
Хаа15 Хаа16 Хаа17 Хаа18 Хаа19 Хаа20 Хаа21 Хаа22 Хаа23 Хаа24 представляет собой:
Glu15 Gln16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24,
Glu15 Glu16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24,
Glu15 Gln16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24,
Glu15 Glu16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Ile23 Gln24,
Glu15 Gln16 Glu17 Ile18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Gln24,
или Glu15 Glu16 Glu17 Leu18 Val19 Lys20 Tyr21 Phe22 Leu23 Gln24.
В следующем варианте осуществления, пептид, соответствующий изобретению, представляет собой пептид, в котором
Хаа15 Хаа16 Хаа17 Хаа18 Хаа19 Хаа20 Хаа21 Хаа22 Хаа23 Хаа24 представляет собой:
Asp15 Ser16 Arg17 Arg18 Ala19 Gln20 Asp21 Phe22 Val23 Gln24.
В следующем варианте осуществления пептид, соответствующий изобретению, включает Хаа1 Хаа2 Хаа3, выбранные из группы, состоящей из:
His1 Ser2 Gln3,
D-His1 Ser2 Gln3,
D-His1 Ala2 Gln3 и
D-His1 Ala2 Asp3.
(SEQ ID NO:360).
В следующем варианте осуществления пептид, соответствующий изобретению, представляет собой пептид, в котором Хаа27 Хаа28 Хаа29 Хаа30 Хаа31 Хаа32 представляет собой: Lys27 Asn28 Ala29 Gly30 Pro31 Ser32, Lys27 Asn28 Gly29 Gly30 Pro31 Ser32, или Met27 Asn28 Thr29 Lys30 Arg31 Asn32.
В следующем варианте осуществления пептид, соответствующий изобретению, представляет собой пептид, в котором
Хаа27 Хаа28 Хаа29 Хаа30 Хаа31 Хаа32 представляет собой:
Lys27 Asn28 Ala29 Gly30 Pro31 Ser32 или Lys27 Asn28 Gly29 Gly30 Pro31 Ser32 (SEQ ID NO:361).
В одном варианте осуществления пептид, соответствующий изобретению, представляет собой пептид, в котором Хаа27 Хаа28 Хаа29 Хаа30 Хаа31 Хаа32 представляет собой: Lys27 Asn28 Ala29 Gly30 Pro31 Ser32.
В частности, пептид, соответствующий изобретению, может иметь последовательность аминокислот, выбранную из группы, включающей:
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:1)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:2)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Тут Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:3)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:4)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Тут Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:5)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:6)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:7)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:8)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:9)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:10)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:11)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:12)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:13)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:14)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Тут Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:15)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:16)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Тут Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:17)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:18)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Тут Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:19)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:20)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:21)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Тут Ser Lys Тут Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:22)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:23)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:24)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Тут Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:25)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:26)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:27)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Тут Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Тут Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:28)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gb Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:29)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Тут Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:30)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:31)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:32)
His Ser Gb Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:33)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Тут Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:34)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:35)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:36)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:37)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:38)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Тут Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:39)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:40)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:41)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu He Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:42)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Тут Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:43)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu He Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:44)
His Ser Gto Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:45)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:46)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Тут Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:47)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:48)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:49)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:50)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:51)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Тут Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:52)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:53)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Тут Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:54)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:55)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:56)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Тут Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:57)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:58)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:59)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:60)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:61)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:62)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:63)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:64)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:65)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:66)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:67)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:68)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:69)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:70)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:71)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:72)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:73)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:74)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:75)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:76)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:77)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:78)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:79)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:80)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:81)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:82)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:83)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:84)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:85)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:86)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:87)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:88)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:89)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:90)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:91)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:92)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:93)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:94)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:95)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:96)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:97)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:98)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:99)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:100)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:101)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:102)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:103)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:104)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:105)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:106)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:107)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:108)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:109)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:110)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:111)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:112)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:113)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:114)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:115)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Тут Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:116)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:117)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:118)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:119)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:120)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:121)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:122)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:123)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:124)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:125)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:126)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Тут Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:127)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:128)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:129)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:130)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:131)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:132)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:133)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:134)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:135)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:136)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:137)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:138)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:139)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:140)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:141)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Тут Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:142)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:143)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:144)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:145)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:146)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Тут Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:147)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:148)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:149)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:150)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:151)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:152)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:153)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:154)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:155)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:156)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:157)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:158)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:159)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:160)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:161)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:162)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Тут Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:163)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:164)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:165)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:166)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:167)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:168)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:169)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:170)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:171)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:172)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:173)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Тут Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gb Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:174)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:175)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:176)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Тут Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:177)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:178)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:179)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:180)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:181)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:182)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu He Val Lys Tyr Phe Leu Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:183)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:184)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:185)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:186)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:187)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:188)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Glu Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:189)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:190)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:191)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:192)
Например, пептид, соответствующий изобретению, может иметь последовательность аминокислот
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:193)
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:194)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:195)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:196)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:197)
D-His Ala Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:198)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:199)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:200)
Необязательно пептид, соответствующий изобретению, имеет удлиняющую группу -А-В-С на С-конце. Соответственно, пептид, соответствующий изобретению, может иметь дополнительную удлиняющую группу с последовательностью -А-В-С, где:
А отсутствует или означает 1, 2, 3 или 4 остатка Ala либо 1, 2, 3 или 4 остатка Glu,
В отсутствует или означает 1, 2, 3 или 4 остатка Ala либо 1, 2, 3 или 4 остатка Glu,
при условии, что оба, А и В, не включают остатки Ala и что оба, А и В, не включают остатки Glu, и
2
С представляет собой Lys или Lys с кислотой, выбранной из каприновой кислоты, лауриновой кислоты, миристиновой кислоты, пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты и арахиновой кислоты, присоединенной посредством своей -СООН-группы к -NH-rpynne боковой цепи Lys с помощью пептидной связи.
В одном варианте осуществления, группы А или В или обе, А и В, отсутствуют. В варианте осуществления, когда оба, А и В, присутствуют, А представляет собой Glu и В представляет собой А1а. Например, в одном варианте осуществления А представляет собой один остаток Glu, и В представляет собой один остаток А1а.
В одном варианте осуществления С представляет собой остаток Lys без замещения.
2
В одном варианте осуществления С представляет собой остаток Lys с жирной кислотой, присоединенной посредством своей -COOH-группы к -NH-группе боковой цепи Lys с помощью пептидной связи. Например, жирная кислота может быть выбрана из
- каприновой кислоты,
- лауриновой кислоты,
- миристиновой кислоты,
- пальмитиновой кислоты,
- стеариновой кислоты и
- арахиновой кислоты (айкозаноевой кислоты)
В других вариантах осуществления С-концевая удлиняющая группа -А-В-С представляет собой:
Lys38,
Lys38-капроил,
Lys38-лауроил,
Lys38-министоил,
Lys38-пальмитоил,
Lys38-стеароил,
Lys38-арахидоил,
Glu38 Ala39 Lys40,
Glu38 Ala39 Lys40-капроил,
Glu38 Ala39 Lys40-лауроил,
Glu38 Ala39 Lys40-миристоил,
Glu38 Ala39 Lys40-пальмитоил,
Glu38 Ala39 Lys40-стеароил,
или Glu38 Ala39 Lys40-арахидоил.
Арахидоиловая группа известна также как айкозаноиловая группа. Примеры соединений, включающих группу С-концевого удлинения -А-В-С могут быть выбраны из группы, включающей:
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala Lys (SEQ ID NO:201)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala Lys (SEQ ID NO:202)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Ile Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala Lys (SEQ ID NO:203)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala Lys (SEQ ID NO:204)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Gln Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala Lys (SEQ ID NO:205)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala Ala Ala Lys-миристоил (SEQ ID NO:206)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Тут Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala Ala Ala Lys-пальмитоил (SEQ ID NO:207)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala Ala Ala Lys-стеароил (SEQ ID NO:208)
D-His Ala Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Ile Gln Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala Ala Ala Lys-арахидоил (SEQ ID NO:209)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala Glu Ala Lys (SEQ ID NO:210)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala Glu Ala Lys-миристоил (SEQ ID NO:211)
L-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala Glu Ala Lys-миристоил (SEQ ID NO:212)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala Glu Ala Lys-пальмитоил (SEQ ID NO:213)
D-His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Тут Leu Glu Glu Glu Leu Val Lys Tyr Phe Leu Gln Trp Leu Lys Asn Ala Gly Pro Ser Lys Asn Asn Ile Ala Glu Ala Lys-арахидоил (SEQ ID NO:214)
Как отмечено выше, нативная последовательность человеческого oxm (такая же как у крысы и хомячка) следующая:
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Arg Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:357)
Нативная последовательность oxm крупного рогатого скота (такая же как у свиньи) следующая:
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn Ile Ala (SEQ ID NO:358)
Иначе говоря, она такая же, как человеческая последовательность за исключением того, что Arg33 в человеческом пептиде заменен Lys33 в пептиде крупного рогатого скота. Настоящее изобретение предусматривает аналоги оксинтомодулина, как приведено выше. Изобретение также предусматривает пептиды, которые являются аналогами, в которых остаток Lys33 вышеуказанного пептида заменен Arg33.
В одном варианте осуществления изобретение предусматривает пептид, соответствующий изобретению, в котором остаток Asn34 заменен Asp34. Некоторые пептиды с Asn34, замененным Asp34, показаны как пептиды No 215-292 на Фигуре 1. В следующем варианте осуществления изобретение предусматривает пептид, в котором остаток Gln3 или Asp3 заменен Glu3. Некоторые пептиды с Glu3 показаны как пептиды No 293-355 на Фигуре 1.
Изобретение, кроме того, включает варианты осуществления, включающие последовательности, раскрытые в прилагаемых примерах и/или фигурах.
Производные
Соединение, соответствующее изобретению, может включать структуру, приведенную выше, модифицированную хорошо известными способами, включая амидирование, гликозилирование, карбамилирование, алкилирование, ацилирование, например ацетилирование, сульфатирование, фосфорилирование, циклизацию, липидизацию, конъюгирование белка (например, альбумина) и пегилирование. Аналоги, соответствующие изобретению, могут быть модифицированы в случайных положениях молекулы или в заданных положениях молекулы и могут включать одну, две, три или больше присоединенных химических групп.
Соединение, соответствующее изобретению, может представлять собой слитый белок, в котором аналог оксинтомодулина слит с другим белком или полипептидов (партнер слияния) с использованием рекомбинантных способов, известных в области техники. Альтернативно данный слитый белок может быть синтетическим образом синтезирован любым известным способом. Данный слитый белок включает аналог оксинтомодулина. Любой подходящий пептид или белок может быть использован в качестве партнера слияния (например, сывороточный альбумин, углеродангидраза, глутатион S-трансфераза, одноцепочечные антитела, антитела, фрагменты антител или тиоредоксин и т.п.). Например, соединение, соответствующее изобретению, можно слить в вариабельным доменом легкой цепи иммуномодулина, который обладает специфичностью связывания в отношении сывороточного альбумина, как описано в заявке WO 05/118642. Предпочтительные партнеры слияния не будут иметь вредной биологической активности in vivo.
Данные слитые белки, включая гибридные полипептиды, можно получить связыванием карбоксиконца партера слияния с аминоконцом аналога оксинтомодулина или наоборот, непосредственно или через линкер, который предпочтительно не включает потерю активности компонентов. Когда он присутствует, линкер может быть химически стабильным или лабильным, например, расщепляемый линкер можно использовать для слияния аналога оксинтомодулина в одним или более партнеров слияния. Полученный в результате расщепляемый слитый белок может расщепляться in vivo, так что высвобождается активная форма соединения, соответствующего изобретению. Примеры данных расщепляющихся линкеров включают, но без ограничения перечисленным, линкеры D-D-D-D-Y, G-P-R, A-G-G и H-P-F-H-L, которые могут расщепляться энтерокиназой, тромбином, убиквитин-расщепляющим ферментом и ренином, соответственно. См., например, патент США No.6410707.
Альтернативно, соединение, соответствующее изобретению, может представлять собой слитый белок, где структура соединения, соответствующего изобретению, присоединена к партнеру слияния посредством дисульфидной связи(ей), приводя в результате к ковалентной связи между по меньшей мере одному остатку одним остатком Cys соединения, соответствующего изобретению, и по меньшей мере одним остатком Cys партнера слияния.
Когда белок используют в качестве партнера слияния, предпочтительно, чтобы его выбирали так, чтобы он не проявлял нежелательной антигенности. Нежелательной антигенности можно избежать, выбирая белок, который является аллогенным для животного, которому должно быть введено соединение.
Соединение, соответствующее изобретению, может представлять собой физиологически функциональное производное соединения, соответствующего изобретению. Термин "физиологически функциональное производное" используют в данном контексте для обозначения химического производного соединения, соответствующего изобретению, имеющего такую же физиологическую функцию, как соответствующее немодифицированное соединение, соответствующее изобретению. Например, физиологически функциональное производное может быть превращающимся в организме в соединение, соответствующее изобретению. Согласно настоящему изобретению примеры физиологически функциональных производных включают сложные эфиры, амиды и карбаматы, предпочтительно сложные эфиры и амиды.
1-6
5-10
5-10
1-6
Фармацевтически приемлемые сложные эфиры и амиды соединений, соответствующих изобретению, могут включать Салкил-, Сарил -, Сар-Салкил- или аминокислота-сложный эфир либо амид, присоединенный к соответствующему центру, например, к кислотной группе.
1
9
1-6
4-40
8-25
16
18
3
2
2
3
2
4
3
2
6
3
2
8
3
2
10
3
2
12
3
2
14
3
2
18
3
2
20
3
2
20
Ацильные боковые цепи могут давать положительный эффект, например, вследствие своей липофильной природы вызывать связывание группы с альбумином, приводя, таким образом, к значительно пониженной скорости выведения из организма субъекта и, таким образом, увеличению полупериода существования и продолжительности эффекта. Хотя ацильные боковые цепи могут представлять собой низший алкил, например, С-Сацил, особенно Сацил, предпочтительно, чтобы они представляли собой С, в частности Сацил, особенно C или Сацил. Пальмитоил является особенно предпочтительным в качестве ацильной боковой цепи, равно как лауроил. Ацильные боковые цепи можно ввести в любое положение пептидного скелета. Ацильный заместитель можно присоединить к остатку аминокислоты таким образом, что карбоксильная группа ацильного заместителя формирует амидную связь с аминогруппой остатка аминокислоты. Альтернативно ацильный заместитель можно присоединить к остатку аминокислоты таким образом, что аминогруппа ацильного заместителя формирует амидную связь с карбоксильной группой остатка аминокислоты. В следующем предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к производному oxm, в котором ацильный заместитель присоединяют к исходному пептиду посредством спейсера. Например, ацильный заместитель можно присоединить к группе oxm посредством спейсера таким образом, что карбоксильная группа спейсера формирует амидную связь с аминогруппой молекулы oxm. Особенно предпочтительным является введение ацильной боковой цепи (необязательно через спейсер) в положение пептидного скелета, в котором находится остаток лизина. Это обусловлено тем, что лизин, имеющий боковую цепь из четырех атомов углерода, заканчивающуюся е-аминогруппой, особенно подходит для легкого введения ацильной боковой цепи. Может быть необходимым ввести остаток лизина в последовательность только с целью создания удобного центра для введения ацильной боковой цепи. Альтернативно ацильная боковая цепь может быть присоединена к остатку лизина перед синтезом пептида, при этом ее введение на соответствующей стадии синтеза будет непосредственно приводить к ацилированию. Данный способ дает преимущество, если последовательность пептида включает больше одного остатка лизина, поскольку это позволяет избежать необходимости использования селективных условий, которые ацилируют только определенный лизин, представляющий интерес. Предпочтительно, когда производные пептида имеют три, более предпочтительно два и наиболее предпочтительно один ацильный заместитель боковой цепи. Примеры ацильных (и других липофильных заместителей), подходы и специальные синтетические способы их присоединения к пептидам (с использованием или без использования спейсеров) описаны в патенте США No.6268343 и патенте США No.6458924. Дальнейшими примерами насыщенных жирных кислот, подходящих для ацильной дериватизации соединений, соответствующих изобретению, являются масляная (бутановая кислота): CH(CH)COOH; капроевая (гексановая кислота): CH(СН)СООН; каприловая (октановая кислота): CH(СН)COOH; каприновая (декановая кислота): CH(CH)COOH; лауриновая (додекановая кислота): CH(СН)COOH; миристиновая (тетрадекановая кислота): CH(CH)СООН; пальмитиновая (гексадекановая кислота): CH(СН)COOH; стеариновая (октадекановая кислота): CH(CH)COOH; арахидиновая (эйкозаноевая кислота): CH(CH)COOH; бегеновая (докозаноевая кислота): CH(CH)COOH.
Согласно ряду вариантов осуществления ацильные боковые цепи можно ввести в положение 30 и/или положение 33 и/или положения 38-46 пептидного скелета.
1-6
5-10
5-10
1-6
Фармацевтические приемлемые амиды и карбонаты соединений формулы (I) могут включать Cалкил-, Сарил-, Сар-Салкил- или аминокислота-сложный эфир либо -амид или -карбамат, присоединенный к соответствующему центру, например, к аминогруппе.
15
31
15
29
17
35
Способы липидизации сульфгидрил-содержащих соединений производными жирных кислот описаны в патенте США No.5936092; патенте США No. 6093692 и патенте США No.6225445. Производные жирных кислот соединения, соответствующего изобретению, включающие соединение, соответствующее изобретению, связанное с жирной кислотой посредством дисульфидной связи, можно использовать для доставки соединения, соответствующего изобретению, в нервные клетки и ткани. Липидизация заметно повышает всасывание соединений относительно скорости всасывания соответствующих нелипидизированных соединений, а также пролонгирует удерживание соединений в крови и ткани. Более того, дисульфидная связь в липидизированном производном относительно лабильна в клетках и, таким образом, способствует внутриклеточному высвобождению молекулы из молекул жирных кислот. Подходящие липид-содержащие группы представляют собой гидрофобные заместители с 4-26 атомами углерода, предпочтительно 5-19 атомами углерода. Подходящие липидные группы включают, но без ограничения перечисленным, следующие: пальмитоил (CH), олеоил (CH), стеароил (CH), холат и дезоксихолат.
Компетентный специалист будет иметь в виду, что определенные остатки аминокислот можно интродуцировать в последовательность oxm с целью облегчения одной или более модификаций, описанных в данном контексте.
Способы циклизации включают циклизацию посредством формирования дисульфидного мостика и циклизации типа "голова к хвосту" при использовании смолы для циклизации. Циклизованные пептиды могут иметь повышенную стабильность, в том числе повышенную устойчивость к ферментному разложению в результате конформационных ограничений. Циклизация может, в частности, быть целесообразной, когда нециклизованный пептид включает N-концевую цистеиновую группу. Подходящие циклизованные пептиды включают мономерные и димерные циклизованные "голова к хвосту" структуры. Циклизованные пептиды могут включать один или более дополнительных остатков, особенно дополнительный цистеин, включенный с целью формирования дисульфидной связи или боковой связи, введенной с целью циклизации на основе смолы.
Соединение, соответствующее изобретению, можно пегилировать. Пегилированные соединения, соответствующие изобретению могут давать дополнительные преимущества, такие как повышенная растворимость, стабильность и время циркуляции полипептида или пониженная иммуногенность (см. патент США No.4179337). В WO 2006/082517 и US 2006/171920, которые включены в данном контексте путем ссылки, приведены примеры и соответствующие способы пегилирования пептидов и их аналогов и производных.
Химические группы для дериватизации соединения, соответствующего изобретению, могут быть также выбраны из водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль, сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт и т.п. Молекула полимера для дериватизации соединения, соответствующего изобретению, может быть любой молекулярной массы и может быть разветвленной или неразветвленной. Для удобства манипуляций и получения предпочтительная молекулярная масса полиэтиленгликоля, предназначенного для дериватизации соединения, соответствующего изобретению, составляет от приблизительно 1 кД до приблизительно 100 кД, причем термин "приблизительно" показывает, что в препаратах полиэтиленгликоля некоторые молекулы будут иметь массу больше, некоторые меньше, чем установленная молекулярная масса. Можно использовать полимеры другой молекулярной массы, в зависимости от требуемого терапевтического профиля, например, требуемой продолжительности замедленного высвобождения, эффектов, если таковые имеются, на биологическую активность, простоты манипуляций, степени или отсутствия антигенности и других известных эффектов полиэтиленгликоля на терапевтический белок или аналог. Например, полиэтиленгликоль может иметь среднюю молекулярную массу приблизительно 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 10500, 11000, 11500, 12000, 12500, 13000, 13500, 14000, 14500, 15000, 15500, 16000, 16500, 17000, 17500, 18000, 18500, 19000, 19500, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 50000, 55000, 60000, 65000, 70000, 75000, 80000, 85000, 90000, 95000 или 100000 кД.
Соли и сольваты соединений, соответствующих изобретению, которые подходят для использования в лекарственном средстве, представляют собой такие, в которых противоион или ассоциированный растворитель фармацевтически приемлемы. Однако соли и сольваты, имеющие фармацевтически неприемлемые противоионы или ассоциированные растворители, входят в объем настоящего изобретения, например, для использования в качестве промежуточных продуктов при получении соединений, соответствующих изобретению, и их фармацевтически приемлемых солей или сольватов.
Подходящие соли, соответствующие изобретению, включают такие, которые образованы с помощью органических или неорганических кислот или оснований. Фармацевтически приемлемые кислотно-аддитивные соли включают такие, которые образованы с помощью хлористоводородной, бромистоводородной, серной, азотной, лимонной, винной, уксусной, фосфорной, молочной, пировиноградной, трифторуксусной, янтарной, хлорной, фумаровой, малеиновой, гликолевой,, салициловой, щавелевоуксусной, метансульфоновой, этансульфоновой, п-толуолсульфоновой, муравьиной, бензойной, малоновой, нафталин-2-сульфоновой, бензолсульфоновой и изетионовой кислот. Другие кислоты, такие как щавелевая, хотя сами не являются фармацевтически приемлемыми, могут быть использованы как промежуточные продукты при получении соединений, соответствующих изобретению, и их фармацевтически приемлемых солей. Фармацевтически приемлемые соли, полученные с помощью оснований, включают соли аммония, соли щелочных металлов, например, соли калия и натрия, соли щелочно-земельных металлов, например, соли кальция и магния, и соли, полученные с помощью органических оснований, например, дициклогексиламина и N-метил-D-глюкомина.
Компетентные специалисты в области органической химии будут иметь в виду, что многие органические соединения могут образовывать комплексы с растворителями, в которых с ними проводят реакцию, или из которых их осаждают или кристаллизуют. Данные комплексы известны как "сольваты". Например, комплексе водой известен как "гидрат". Настоящее изобретение предусматривает сольваты соединений, соответствующих изобретению.
Пептиды, соответствующие изобретению, можно получить любым подходящим способом получения пептидов, включая, но без ограничения перечисленным, принятые способы, например, синтез из отдельных аминокислот, особенно поэтапный синтез с использованием автоматического синтезатора пептидов, модификацию нативных пептидов или рекомбинантные способы получения.
Состояния
Изобретение предусматривает фармацевтическую композицию включающую пептид, соответствующий изобретению, и один или более фармацевтически приемлемых носителей. Изобретение предусматривает также фармацевтическую композицию, предназначенную для использования для контроля аппетита, питания, поглощения пищи, потребления энергии и потребления калорий, причем композиция включает эффективное количество соединения, соответствующего изобретению. Более подробно изобретение предусматривает фармацевтическую композицию, предназначенную для использования при лечении ожирения, для использования при лечении пищевых нарушений или для использования при лечении диабета или симптома диабета, либо для использования для лечения или предупреждения сопутствующих заболевания, ассоциированных с ожирением или избыточной массой тела.
Более того, изобретение предусматривает способ снижения избыточной массы тела, например, косметической избыточной массы тела, включающий введение субъекту, желающему уменьшить массу тела, эффективного количества соединения или фармацевтической композиции, соответствующих изобретению.
Более того, изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения ожирения или диабета либо другого сопутствующего ожирению заболевания у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества соединения или фармацевтической композиции, соответствующих изобретению.
Изобретение предусматривает также способ снижения аппетита у субъекта, снижения поглощения пищи у субъекта или уменьшения потребления калорий у субъекта, уменьшения массы тела у субъекта, снижения набора массы тела у субъекта или повышения потребления энергии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту пептида или фармацевтической композиции, соответствующей изобретению.
Изобретение предусматривает также способ, позволяющий вызвать потерю массы тела или предупреждения набора массы тела для косметических целей, включающий введение субъекту пептида или фармацевтической композиции, соответствующей изобретению.
Изобретение предусматривает также пептид, соответствующий изобретению, для использования в качестве лекарственного средства. Он может быть предназначен для использования в качестве лекарственного средства для лечения ожирения или диабета или заболеваний, сопутствующих ожирению. Он может быть предназначен для использования в качестве лекарственного средства для снижения аппетита у субъекта, уменьшения поглощения пищи у субъекта или уменьшения потребления калорий у субъекта, снижения массы тела у субъекта, уменьшения набора массы тела у субъекта или увеличения потребления энергии у субъекта.
Изобретение предусматривает также использование соединения, соответствующего изобретению, в изготовлении лекарственного средства, предназначенного для лечения состояния, выбранного из ожирения, нарушений питания, диабета, сердечной болезни, гипертензии, заболевания, связанного с липидами, и нарушений двигательной активности кишечника и желудка и других аспектов, касающихся кишки и функции кишечника, например, всасывания воды и манипуляций с жидкостью или функции поджелудочной железы, включая эндокринную функцию поджелудочной железы, или нарушений гепатобилиарной функции либо предупреждения рака. В частности, изобретение предусматривает использование пептида, соответствующего изобретению, для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения ожирения или диабета или заболевания, сопутствующего ожирению. Кроме того, изобретение предусматривает использование соединения, соответствующего изобретению, при получении лекарственного средства, предназначенного для использования в контроле любого одного или больше факторов из аппетита, питания, поглощения пищи, потребления энергии и потребления калорий. В частности, изобретение предусматривает использование пептида, соответствующего изобретению, для получения лекарственного средства, предназначенного для снижения аппетита у субъекта, уменьшения поглощения пищи у субъекта или уменьшения потребления калорий у субъекта, снижения массы тела у субъекта, уменьшения набора массы тела у субъекта или увеличения потребления энергии у субъекта.
Субъект, которому вводят соединение, может иметь избыточную массу тела, например, ожирение. Альтернативно или дополнительно субъект может болеть диабетом, например, иметь устойчивость к инсулину или непереносимость глюкозы либо оба заболевания. Субъект может болеть сахарным диабетом, например, у субъекта может быть диабет типа II. Субъект может иметь избыточную массу тела, например, ожирение, и иметь сахарный диабет, например, диабет типа II.
Кроме того или альтернативно субъект может иметь или быть в группе риска развития нарушения, при котором ожирение или избыточная масса тела являются фактором риска. Данные нарушения включают, но без ограничения перечисленным, сердечно-сосудистое заболевание, например, гипертензию, атеросклероз, застойную сердечную недостаточность и дислипидемию; инсульт; заболевание желчного пузыря; остеоартрит; апноэ во сне; репродуктивные нарушения, например, синдром поликистоза яичников; формы рака, например, рак молочной железы, простаты, толстой кишки, эндометрия, почки и пищевода; варикоз вен; акантокератодермию; экзему; непереносимость физических нагрузок; инсулинустойчивость; гипертензию; гиперхолестеринемию; холитиаз; остеоартрит; ортопедическое повреждение; устойчивость к инсулину, например, диабет типа 2 и синдром X; метаболический синдром и тромбопоэтическое заболевание (см. статьи Kopelman (2000), Nature 404:635-43; Rissanen et al., British Med. J. 301, 835, 1990).
Другие нарушения, ассоциированные с ожирением, включают депрессию, тревогу, приступы паники, головные боли по типу мигрени, PMS, состояния, связанные с хронической болью, фибромиалгию, бессонницу, импульсивность, обсессивно-компульсивное нарушение, синдром раздраженной кишки (IBS) и миоклонус. Более того, ожирение представляет собой признанный фактор риска в плане повышенной частоты осложнений при общей анестезии. (См., например, статью Kopelman, Nature 404:635-43, 2000). Как правило, ожирение уменьшает продолжительность жизни и несет серьезный риск сопутствующих заболеваний, таких, как вышеперечисленные.
Другие болезни или нарушения, ассоциированные с ожирением, представляют собой врожденные дефекты, ожирение у матери, ассоциированное с повышенной частотой дефектов нервных трубок, кистевой туннельный синдром (CTS); хроническую венозную недостаточность (CVI); сонливость в дневное время; тромбоз глубоких вен (DVT); конечную стадию почечной болезни (ESRD); подагру; сердечные нарушения; нарушенный иммунный ответ; нарушенную респираторную функцию; бесплодие; болезнь печени; боль в нижнем отделе спины; акушерские и гинекологические осложнения; панкреатит, а также грыжи брюшной стенки; эндокринные патологии; хроническую гипоксию и гиперкапнию; дерматологические эффекты; элефантит; гастро-эзофагеальный рефлюкс; пяточные шпоры; отек нижних конечностей; маммегалия, которая вызывает значительные проблемы, такие как боль от бретелей бюстгальтера, кожное повреждение, боль в шейке матки, постоянный запах и инфекции кожных складок под грудью и т.п.; большие массы передней брюшной стенки, например, абдоминальный панникулитит, обычно с целлюлитом, затрудненная походка, вызывающая частые инфекции, запахи, трудности надевания одежды, мышечно-скелетное заболевание; псевдоопухоль головного мозга (или доброкачественная внутричерепная гипертензия) и скользящая хиатальная грыжа.
В статье Wynne et al (см. Intenational Journal of Obesity 12: 1729-1736, 2006) описано, как введение 400 нмоль оксинтомодулина перед приемом пищи три раза в день в течение четырех дней повышает связанное с активность потребление энергии на 143±109 ккал/день или 26,2±9,9% (P=0,0221); общее потребление энергии на 9,4±4,8% (P=0,0454) уровень физической активности на 9,5±4,6% (P=0,0495). Соответственно настоящее изобретение предусматривает способ повышения потребления энергии у субъекта. Способ включает, например, периферическое введение терапевтически эффективного количества соединения, соответствующего изобретению, субъекту, изменяя, таким образом, потребление энергии. Энергия сжигается во всех физиологических процессах. Организм может изменить скорость потребления энергии непосредственно, путем модуляции эффективности данных процессов, или изменяя число и природу процессов, которые имеет место. Например, во время переваривания организм расходует энергию, продвигая пищу через кишечник и переваривая пищу, и в клетках, причем эффективность клеточного метаболизма можно изменить, чтобы образовывать больше или меньше тепла.
В одном аспекте способ, соответствующий изобретению, включает манипуляции с дуговидной схемой, которые согласованно изменяют поглощение пищи и взаимно изменяют потребление энергии. Потребление энергии представляет собой результат клеточного метаболизма, синтеза белка, скорости метаболизма и использования калорий. Таким образом в данном аспекте изобретения введение соединения, соответствующего изобретению, может привести в результате в повышенному потреблению энергии и пониженной эффективности использования калорий.
Изобретение предусматривает также способ улучшения липидного профиля у субъекта. Изобретение предусматривает также способ облегчения состояния или нарушения, которое можно облегчить путем снижения доступности питательных веществ.
Аппетит можно измерить любыми способами, известными компетентному специалисту в области техники. Например, пониженный аппетит можно определить с помощью психологической оценки. Например, введение соединения, соответствующего изобретению, приводит в результате к изменению ощущаемого голода, насыщения и/или сытости. Чувство голода можно оценить любыми средствами, известными специалисту в области техники. Например, чувство голода определяют с помощью психологических тестов, например, по оценке чувства голода и сенсорного восприятия с использованием анкеты, такой как, но без ограничения перечисленным, анкета оценки визуального аналога (VAS). В одном специальном неограничивающем примере чувство голода оценивают по ответам на вопросы, относящиеся к желанию пищи, питья, предполагаемому потреблению пищи, тошноте и ощущениям, относящимся к запаху или вкусу.
Соединение, соответствующее изобретению, можно использовать для контроля и лечения массы тела, например, уменьшения или предупреждения ожирения, в частности, любого одного или более из следующих факторов: предупреждения и снижения набора массы тела; индукции и стимуляции потери массы тела и снижения ожирения, как измеряют по индексу массы тела. Соединение, соответствующее изобретению, можно использовать для контроля любого одного или более факторов из аппетита, насыщения и голода, в частности, любого одного или более из следующих факторов: снижения, подавления и ингибирования аппетита; индукции, повышения, усиления и стимуляции насыщения и чувства насыщения, и уменьшения, ингибирования и подавления голода и ощущений голода. Соединение, соответствующее изобретению, можно использовать для поддержания любого одного или более из требуемой массы тела, требуемого индекса массы тела, желательного внешнего вида и хорошего состояния здоровья.
Субъект может являться субъектом, который хочет снизить массу тела, например субъектами женского и мужского пола, которые хотят изменений в своем внешнем виде. Субъект может хотеть пониженного чувства голода, например, субъект может быть лицом, включенным в длительную работу, которая требует высокого уровня концентрации, например, солдаты на действительной службе, авиадиспетчеры или водители грузовых автомобилей на большие расстояния и т.п.
Настоящее изобретение можно также использовать для предупреждения, облегчения или ослабления состояний или нарушений, вызываемых, осложняемых или усиливаемых относительно высокой доступностью пищи. Термин "состояние или нарушение, которое можно облегчить снижением доступности калорий (или питательных веществ)" используют в данном контексте, чтобы обозначить любое состояние или нарушение у субъекта, которое либо вызывается, осложняется или усугубляется относительно высокой доступностью пищи, либо которое можно облегчить снижением доступности питательных веществ, например, путем уменьшения поглощения пищи. Субъекты с устойчивостью к инсулину, непереносимостью глюкозы или имеющие любую форму сахарного диабета, например, типа 1, 2 или диабета беременных, также могут получить положительный эффект от способов, соответствующих настоящему изобретению.
Состояния или нарушения, ассоциированные с повышенным потреблением калорий, включают, но без ограничения перечисленным, устойчивость к инсулину, непереносимость глюкозы, ожирение, диабет, в том числе диабет типа 2, нарушения питания, синдромы инсулинустойчивости и болезнь Альцгеймера.
Согласно настоящему изобретению соединение, соответствующее изобретению, предпочтительно используют при лечении человека. Однако, хотя соединения, соответствующие изобретению, будут, как правило, использованы для лечения субъектов-людей, их можно также использовать для лечения аналогичных и идентичных состояний у других позвоночных, например, других приматов; сельскохозяйственных животных, например, свиней, крупного рогатого скота и птицы; спортивных животных, например, лошадей; животных-компаньонов, например, собак и кошек.
Подводя итоги, изобретение предусматривает также пептид, соответствующий изобретению, предназначенный для использования в качестве лекарственного средства для предупреждения или лечения ожирения. Предусматривают также пептид, соответствующий изобретению, предназначенный для использования в качестве лекарственного средства для предупреждения или лечения диабета или заболеваний, сопутствующий ожирению. Кроме того, предусматривают пептид, соответствующий изобретению, предназначенный для использования в качестве лекарственного средства для уменьшения аппетита у субъекта, уменьшения потребления пищи у субъекта или уменьшения потребления калорий у субъекта, уменьшения массы тела у субъекта, уменьшение набора массы тела у субъекта или повышения потребления энергии у субъекта.
Изобретение предусматривает также способ лечения или предупреждения ожирения у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту пептида, соответствующего изобретению.
Предусматривают также способ лечения или предупреждения диабета или заболеваний, сопутствующих ожирению у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение субъекту пептида, соответствующего изобретению. Кроме того, предусматривают способ уменьшения аппетита у субъекта, уменьшения потребления пищи у субъекта или уменьшения потребления калорий у субъекта, уменьшения массы тела у субъекта, уменьшение набора массы тела у субъекта или повышения потребления энергии у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту пептида, соответствующего изобретению, или фармацевтической композиции, соответствующей изобретению.
Композиции
Хотя возможно активный компонент можно вводит в виде монокомпонента, предпочтительно, когда он находится в фармацевтическом препарате или композиции. Соответственно, изобретение предусматривает фармацевтический препарат, включающий соединение, соответствующее изобретению, или его вариант либо производное или его соль либо сольват, как определено выше, и фармацевтически приемлемый наполнитель. Фармацевтические композиции, соответствующие изобретению, могут принимать форму фармацевтического препарата, как определено ниже.
Фармацевтические препараты, соответствующее изобретению, включают подходящие для перорального, парентерального (в том числе подкожного, внутрикожного, внутримышечного, внутривенного и внутриартериального), ингаляционного (в том числе пылевидных или аэрозольных препаратов из тонких частиц, которые можно генерировать посредством разных типов дозаторов, аэрозолей под давлением, пульверизаторов или инсуффляторов, и включая интраназальные или через легкие), ректального или местного (в том числе кожного, чрескожного, через слизистые, защечного, подъязычного и внутриглазного) введения, хотя наиболее подходящий путь может зависеть от, например, состояния и нарушения у реципиента.
Препараты могут быть удобно представлены в единичной дозированной лекарственной форме и могут быть получены любыми из способов, хорошо известных в области фармации. Все способы включают стадию получения ассоциации активного ингредиента с фармацевтическим носителем, который содержит один или больше вспомогательных ингредиентов. Как правило, препараты получают путем равномерного и тесного ассоциирования активного ингредиента с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями или тем и другим, и затем, при необходимости, формования продукта с получением требуемого препарата.
Препараты, соответствующие настоящему изобретению, подходящие для перорального введения, могут быть представлены в виде отдельных единиц, таких как капсулы, крахмальные капсулы или таблетки, каждая из которых включает заданное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной жидкости или неводной жидкости; либо в виде жидкой суспензии типа масло в воде или жидкой эмульсии типа вода в масле. Активный ингредиент может быть также представлен в виде болюса, электуария или пасты. Различные фармацевтически приемлемые носители и их получение описаны в стандартных справочниках по препаратам, например, Remington's Pharmaceutical Sciences (Справочник по фармацевтическим наукам Ремингтона) by E.W.Martin. См. также статью Wang, Y.J. and Hanson, M.A., Journal of Parenteral Science and Technology, технический обзор No.10, доп. 42:2S, 1988.
Таблетку можно изготовить прессованием или формованием, необязательно с одним или более вспомогательных ингредиентов. Прессованные таблетки можно получить прессованием в соответствующем оборудовании активного ингредиента в свободно сыпучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанные со связующим компонентом, смазывающим агентом, инертным разбавителем, смазывающим поверхностно-активным или диспергирующим агентом.
Формованные таблетки можно изготовить формованием в соответствующем оборудовании смеси порошка соединения, увлажненного инертным жидким разбавителем. Таблетки необязательно могут быть покрыты или иметь насечки и могут быть рецептированы так, чтобы обеспечить замедленное или контролируемое высвобождение содержащегося в них активного ингредиента. Настоящие соединения можно, например, ввести в форме, подходящей для немедленного высвобождения или замедленного высвобождения. Немедленное высвобождение или замедленное высвобождение могут достигаться при использовании подходящих фармацевтических композиций, включающих настоящие соединения, или, особенно в случае замедленного высвобождения, при использовании устройств, таких как подкожные имплантаты или осмотические насосы. Соединения могут быть рецептированы для перорального введения с доставляющими агентами или носителями, которые облегчают транспорт терапевтических макромолекул и соединений с высоким зарядом через клеточные мембраны, особенно в тонкой кишке. Данные доставляющие агенты или носители могут, кроме того, ингибировать ферментное разложение пептидов во время прохождения через желудочно-кишечный тракт (GI), и/или препарат может включать дополнительные агенты, которые защищают от данного разложения. Настоящие соединения можно также ввести липосомально.
Примеры композиций для перорального введения включают суспензии, которые могут содержать, например, микрокристаллическую целлюлозу для придания объема, альгиновую кислоту или альгинат натрия в качестве суспендирующего агента, метилцеллюлозу как компонент, повышающий вязкость, подсластители или вкусовые агенты, такие как известные в области техники, и таблетки с немедленным высвобождением, которые могут включать, например, микрокристаллическую целлюлозу, дикальцийфосфат, крахмал, стеарат магния и/или лактозу и/или другие наполнители, связующие компоненты, наполнители, разрыхлители, разбавители и смазывающие агенты, такие как известны в области техники. Соединения, соответствующие изобретению, могут быть также доставлены через полость рта путем подъязычного и/или защечного введения. Формованные таблетки, прессованные таблетки или лиофилизированные таблетки представляют собой примеры форм, которые можно использовать. Примеры композиций включают те, в которых настоящее соединение(я) с быстрорастворимыми разбавителями, такими какманнит, лактоза, сахароза и/или циктодекстрины.
В данный препарат(ы) могут быть также включены высокомолекулярные наполнители, такие как целлюлозы (avicel) или полиэтиленгликоли (ПЭГ). Данные препараты могут также включать наполнитель, способствующий адгезии к слизистым, такой как гидроксипропилцеллюлоза (НРС), гидроксипропилметилцеллюлоза (НРМС), карбоксиметилцеллюлоза натрий (SCMC), сополимер малеинового ангидрида (например, Gantrez) и агенты для контроля высвобождения, такие как полиакриловый сополимер (например Carbopol 934). Смазывающие компоненты, скользящие агенты, вкусовые добавки, красители и стабилизаторы можно добавить для легкости изготовления и использования.
Препараты для парентерального введения включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут включать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и растворенные агенты, которые делают препарат изотоническим с кровью планируемого реципиента, и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и сгустители. Препараты могут быть представлены в однодозных или многодозных контейнерах, например, запечатанных ампулах и флаконах, и могут храниться в высушенными распылительной сушкой (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого носителя, например физиологического раствора или воды для инъекций, непосредственно перед использованием. Приготовленные для немедленного использования инъекционные растворы и суспензии можно получить из стерильных порошков, гранул и таблеток ранее описанного типа. Примеры композиций для парентерального введения включают инъекционные растворы или суспензии, которые могут включать, например, подходящие нетоксичные парентерально приемлемые разбавители или растворители, такие как манит, 1,3-бутандиол, вода, раствор Рингера, изотонический раствор хлорида натрия или другие подходящие диспергирующие или смачивающие и суспендирующие агенты, включая синтетические моно- или диглицериды, и жирные кислоты, включая олеиновую кислоту, или Cremaphor. Водный носитель может представлять собой, например, изотонический буферный раствор при pH от приблизительно 3,0 до приблизительно 8,0, предпочтительно при pH от приблизительно 3,5 до приблизительно 7,4, например, от 3,5 до 6,0, например, от 3,5 до приблизительно 5,0. Используемые буферы включают буферы на основе цитрата натрия-лимонной кислоты и фосфата натрия-фосфорной кислоты и ацетата натрия-уксусной кислоты. Предпочтительно, когда композиция не включает окислители и другие соединения, которые, как известно, вредны для oxm и агонистов oxm.
Наполнителями, которые могут быть включены, являются, например, другие белки, такие как человеческий сывороточный альбумин или препараты плазмы. При необходимости фармацевтическая композиция может также включать минимальные количества нетоксичных вспомогательных субстанций, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, консерванты и pH-забуферивающие агенты и т.п., например, ацетат натрия или сорбитанмонолаурат.
Примеры композиций для назального аэрозоля или ингаляционного ведения включают растворы в физиологическом растворе, который может включать, например, бензиловый спирт или другие подходящие консерванты, агенты, способствующие всасыванию, предназначенные для повышения биодоступности и/или другие солюбилизирующие или диспергирующие агенты, такие как известные в области техники. Удобно, когда в композициях для назального аэрозоля или ингаляционного введения соединение, соответствующее изобретению, доставляют в форме представления в виде аэрозольного спрея из упаковки под давлением или пульверизатора с использованием подходящего пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением однократную дозу можно определить обеспечением клапана для доставки отмеренного количества. Можно изготовить такие капсулы и картриджи, например, из желатина, предназначенные для использования в ингаляторе или инсуффляторе, чтобы они содержали порошковую смесь соединения и подходящей порошковой основы, например, лактозу или крахмала. В одном специфическом неограничивающем примере соединение, соответствующее изобретению, вводят в виде аэрозоля из дозирующего клапана через адаптер аэрозоля, известного также как исполнительный механизм. Необязательно может быть включен стабилизатор и/или включены пористые частицы для глубокой доставки в легкие (например, см, патент США No.6447743). Интраназальные препараты могут включать доставляющие агенты для обратимого открывания носовой плотной перегородки, повышая таким образом проницаемость лекарственного препарата (например, см. патентую заявку США 10/322266).
Препараты для ректального введения могут быть представлены в виде удерживающей клизмы или суппозитория с обычными носителями, такими как масло какао, синтетические сложные глицеридные эфиры или полиэтиленгликоль. Данные носители, как правило, плотные при обычных температурах, но разжижаются и/или растворяются в полости прямой кишки для высвобождения лекарственного препарата.
Препараты для местного применения в полости рта, например, защечно или подъязычно, включают лепешки, содержащие активный ингредиент в основе с вкусовой добавкой, такой как сахароза и акация или трагакант, и пастилки, содержащие активный ингредиент в основе, такой как желатин и глицерин или сахароза и акация. Примеры композиций для местного применения включают носитель для местного применения, такой как Plastibase (минеральное масло, желированное полиэтиленом).
Предпочтительные единичные дозированные лекарственные препараты представляют собой препараты, содержащие эффективную дозу активного ингредиента, как заявлено в данном материале ранее, или ее соответствующую часть.
Следует иметь в виду, что в дополнение к ингредиентам, подробно упомянутым ранее, препараты, соответствующие данному изобретению, могут включать другие агенты, принятые в области техники, имеющие отношение к типу рассматриваемого препарата, например, препараты, подходящие для перорального применения, могут включать вкусовые компоненты.
Соединения, соответствующие изобретению, кроме того, удобно вводить в виде систем с замедленным высвобождением. Подходящие примеры систем с замедленным высвобождением, соответствующих изобретению, включают подходящие полимерные материалы, например полупроницаемые полимерные матрицы в виде имеющих определенную форму изделий, например, пленок или микрокапсул; подходящие гидрофобные материалы, как, например, эмульсия в приемлемом масле, или ионообменные смолы и труднорастворимые производные соединений, соответствующих изобретению, например, труднорастворимую соль. Системы с замедленным высвобождением могут быть введены перорально, ректально, парентерально, интрацистернально, внутривагинально, внутрибрюшинно, местно, например в виде порошка, мази, геля, капель или чрескожного пластыря, защечно или в виде орального или назального спрея.
Препараты, предназначенные для введения, могут быть соответствующим образом составлены, чтобы давать контролируемое высвобождение соединения, соответствующего изобретению. Например, фармацевтические композиции могут быть в форме частиц, включающих один или более биоразрушаемых полимеров, желирующих полисахариды и/или биоадгезионных полимеров, амфифильных полимеров, агентов, способных модифицировать свойства раздела границ частиц соединения, соответствующего изобретению. Данные композиции проявляют определенные свойства биосовместимости, которые обеспечивают контролируемое высвобождение активной субстанции. См. патент США No.5700486.
Соединения, соответствующие изобретению, могут быть доставлены посредством насоса (см. статьи Langer, Science 249:1527-1533, 1990; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201, 1987; Buchwald et al., Surgery 88:507, 1980; Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574, 1989) или путем непрерывных подкожных инфузий, например, при использовании мининасоса. Можно также использовать внутривенный раствор в резервуаре. Ключевым фактором в выборе подходящей дозы является полученный результат, как измеряют по снижению общей массы тела или соотношению жировой и не содержащей жир массы либо по другим критериям для измерения контроля или предупреждения ожирения или предупреждения связанных с ожирением состояний, как считает подходящим практический врач. Другие системы с контролируемым высвобождением обсуждают в обзоре Langer, см. выше. В другом аспекте описания соединения, соответствующие изобретению, доставляют посредством имплантируемого насоса, описанного, например, в патенте США No.6436091, патенте США No.5939380, патенте США No.5993414.
Имплантируемые устройства для инфузий лекарственного препарата используют для обеспечения субъектов постоянной и долгосрочной дозой или инфузий лекарственного препарата или любого другого терапевтического агента. В основном данные устройства можно разделить на либо активные, либо пассивные. Соединение, соответствующее настоящему изобретению, можно получить как депо-препарат. Данный пролонгированный депо-препарат можно ввести путем имплантации, например, подкожной или внутримышечной, либо путем внутримышечной инъекции. Таким образом, например, соединения можно приготовить с подходящими полимерными или гидрофобными материалами, например, в виде эмульсии в приемлемом масле, или ионообменных смол, или в виде труднорастворимых производных, например, в виде труднорастворимой соли.
Терапевтически эффективное количество соединения, соответствующего изобретению, можно ввести как одну импульсную дозу, как болюсную дозу или как импульсные дозы, вводимые в течение времени. Так, при импульсных дозах предусматривают болюсное введение соединения, соответствующего изобретению, после чего следует период времени, в который соединение, соответствующее изобретению, вводят субъекту с последующим вторым болюсным введением. В специальных неограничивающих примерах импульсные дозы соединения, соответствующего изобретению, вводят в течение дня, в течение недели или в течение месяца.
В одном варианте осуществления терапевтически эффективное количество соединения, соответствующего изобретению, вводят с терапевтически эффективным количеством другого агента, например дополнительного супрессора аппетита, агента, снижающего поглощение пищи, ингибирующего дипептидилпептидазу IV (DPP-IV), снижающего уровень глюкозы в плазме или изменяющего липиды плазмы. Специальные неограничивающие примеры дополнительного супрессора аппетита включают амфепрамон (диэтилпропион), фентерамин, мациндол и фенилпропаноламин, фенфлурамин, дексфенфлурамин, сибутрамин, римонабант и флуоксетин. Специальные неограничивающие примеры ингибиторов DPP-IV включают джанувию (ситаглиптинфосфат) и галвас (вилдаглиптин). Соединение, соответствующее изобретению, можно вводить одновременно с дополнительным агентом или его можно ввести последовательно. Таким образом в одном варианте осуществления соединение, соответствующее изобретению, получают и вводят с дополнительным агентом в виде однократной дозы.
В другом варианте осуществления терапевтически эффективное количество соединения, соответствующего изобретению, вводят в комбинации в терапевтически эффективным количеством другого агента для лечения заболеваний, отличных от ожирения, например, диабета, где специальными неограничивающими примерами дополнительного терапевтического агента являются GLP-1 или его аналог, эксенатид и прамлинтид.
Соединение, соответствующее изобретению, можно вводить, когда требуется эффект, например, подавление аппетита, пониженный уровень поглощения пищи или пониженное потребление калорий, или немного ранее, чем период, когда требуется эффект, например, но без ограничения перечисленным, приблизительно за 10 минут, приблизительно за 15 минут, приблизительно за 30 минут, приблизительно за 60 минут, приблизительно за 90 минут, приблизительно за 120 минут, приблизительно за 4 часа, приблизительно за 8 часов или приблизительно за 12 часов до времени, когда требуется эффект.
Соединение, соответствующее изобретению, можно вводить в комбинации, когда требуется эффект, например, подавление аппетита, пониженный уровень поглощения пищи или пониженное потребление калорий, или немного ранее, чем время, когда требуется эффект, например, но без ограничения перечисленным, приблизительно за 10 минут, приблизительно за 15 минут, приблизительно за 30 минут, приблизительно за 60 минут, приблизительно за 90 минут, приблизительно за 120 минут, приблизительно за 4 часа, приблизительно за 8 часов или приблизительно за 12 часов до времени, когда требуется эффект.
Дозы
Терапевтически эффективное количество соединения, соответствующего изобретению, будет зависеть от используемой молекулы, субъекта, которого лечат, тяжести и типа поражения и способа и пути введения. Например, терапевтически эффективное количество соединения, соответствующего изобретению, может варьировать от приблизительно 0,01 мкг/килограмм (кг) массы тела до приблизительно 1 г/кг массы тела, например от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 5 мг/кг массы тела или приблизительно 1 мкг до приблизительно 1 мг/кг массы тела/день. Соединение, соответствующее изобретению, можно вводит субъекту в дозе 0,5-200 пикомоль (пмоль)/кг массы тела или приблизительно 20 пмль/кг массы тела. Для особенно активных соединений или соединений, вводимых особенно эффективным путем, в одном специальном неограничивающем примере соединение, соответствующее изобретению, вводят в дозе приблизительно 1 нмоль или больше, 2 нмоль или больше, 5 нмоль или больше или 10 нмоль или больше, и доза соединения, соответствующего изобретению, как правило, не превышает 100 нмоль, например, доза составляет 90 нмоль или меньше, 80 нмоль или меньше, 70 нмоль или меньше, 60 нмоль или меньше, 50 нмоль или меньше, 40 нмоль или меньше, 30 нмоль или меньше, 20 нмоль или меньше или 10 нмоль или меньше. Для менее активного соединения или соединения, вводимого менее эффективным путем, в другом специальном неограничивающем примере соединение, соответствующее изобретению, вводят в дозе приблизительно 100 нмоль или больше, 200 нмоль или больше, 300 нмоль или больше, 400 нмоль или больше, 500 нмоль или больше, 600 нмоль или больше, 700 нмоль или больше, 800 нмоль или больше, 900 нмоль или больше или 1 мкмоль или больше и доза соединения, соответствующего изобретению, как правило, не превышает 10 мкмоль, например, доза составляет 9 мкмоль или меньше, 8 мкмоль или меньше, 7 мкмоль или меньше, 6 мкмоль или меньше, 5 мкмоль или меньше, 4 мкмоль или меньше, 3 мкмоль или меньше, 2 мкмоль или меньше, 1 мкмоль или меньше. Например, интервал доз может включать любую комбинацию любого из определенных интервалов более низких доз с любым из интервалов более высоких доз. Таким образом, примеры неограничивающих интервалов доз соединений, соответствующих изобретению, лежат в интервале от 1 нмоль до 1 мкмоль, от 1 до 900 нмоль или от 1 до 800 нмоль. Для особенно активных соединений или соединений, вводимых особенно эффективным путем доза может составлять от 1 нмоль до 100 нмоль, от 2 до 80 нмоль или от 5 до 60 нмоль. Для менее активного соединения или соединения, вводимого менее эффективным путем доза может составлять от 100 нмоль до 10 мкмоль, от 200 нмоль до 5 мкмоль или от 500 нмоль до 2 мкмоль.
В одном специфическом неограничивающем примере вводят от приблизительно 0,5 до приблизительно 50 нмоль соединения, соответствующего изобретению, например от приблизительно 1 до приблизительно 20 нмоль, например, приблизительно 2 нмоль, вводят как подкожную инъекцию. Компетентный специалист в области техники легко определит точную дозу на основе активности используемого специфического соединения, возраста, массы тела, пола и физиологического состояния субъекта.
В другом специфическом неограничивающем примере соединение, соответствующее изобретению, вводят субъекту в дозе от приблизительно 1 мкг до приблизительно 2 мг/дозу, приблизительно один, приблизительно два, приблизительно три раза или приблизительно четыре раза в день. Терапевтически эффективное количество соединения, соответствующего изобретению, может варьировать от приблизительно 0,01 мкг/килограмм (кг) массы тела до приблизительно 1 г/кг массы тела, например от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 5 мг/кг массы тела или от приблизительно 5 мкг до приблизительно 1 мг/кг массы тела/день. Имея в виду, что типичный аналог оксинтомодулина, соответствующий изобретению, имеет молекулярную массу приблизительно 4500, соединение, соответствующее изобретению, можно вводить субъекту в дозе 2,25 - 900 нг/кг массы тела или приблизительно 90 нг/кг массы тела. Для особенно активных соединений или соединений, вводимых особенно эффективным путем, в одном специфическом неограничивающем примере, соединение, соответствующее изобретению, вводят в дозе приблизительно 4,5 мкг или больше, 9 мкг или больше, 22,5 мкг или больше или 45 мкг или больше и доза соединения, соответствующего изобретению, какправило, не превышает 450 мкг, например, доза составляет 405 мкг или меньше, 360 мкг или меньше, 315 мкг или меньше, 270 мкг или меньше, 225 мкг или меньше, 180 мкг или меньше, 135 мкг или меньше, 90 мкг или меньше или 45 мкг или меньше. Для менее активного соединения или соединения, вводимого менее эффективным путем, в другом специфическом неограничивающем примере соединение, соответствующее изобретению, вводят в дозе приблизительно 450 мкг или больше, 900 мкг или больше, 1350 мкг или больше, 1800 мкг или больше, 2250 мкг или больше, 2700 мкг или больше, 3150 мкг или больше, 3600 мкг или больше, 4050 мкг или больше или 4500 мкг или больше, и доза соединения, соответствующего изобретению, как правило, не превышает 45000 мкг, например, доза составляет 40500 мкг или меньше, 36000 мкг или меньше, 31500 мкг или меньше, 27000 мкг или меньше, 22500 мкг или меньше, 18000 мкг или меньше, 13500 мкг или меньше, 9000 мкг или меньше, 45000 мкг или меньше. Например, интервал доз может включать любую комбинацию любого из определенных интервалов более низких доз с любым из интервалов более высоких доз. Таким образом, примеры неограничивающих интервалов доз соединений, соответствующих изобретению, лежат в интервале от 4,5 мкг до 4500 мкг, от 4,5 до 4050 мкг или от 4,5 до 3600 мкг. Для особенно активных соединений или соединений, вводимых особенно эффективным путем, доза может составлять от 4,5 мкг до 450 мкг, от 9 до 360 мкг или от 22,5 до 270 мкг. Для менее активного соединения или соединения, вводимого менее эффективным путем, dose может составлять от 450 мкг до 45000 мкг, от 900 мкг до 22500 мкг или от 2250 до 9000 мкг.
Подходящие дозы соединений, соответствующих изобретению, включают также такие, которые приводят в результате к снижению потребления калорий, поглощения пищи или аппетита либо к повышению потребления энергии, которое эквивалентно снижению потребления калорий, поглощения пищи или аппетита, либо к повышению потребления энергии, вызываемому уровнями oxm, которые наблюдают у мужчин. Примеры доз включают, но без ограничения перечисленным, дозы, которые дают эффект, демонстрируемый, когда сывороточные уровни oxm составляют от приблизительно 800 пМ до приблизительно 1300 пМ или от приблизительно 900 пМ до приблизительно 1000 пМ или приблизительно 950 пМ.
Подходящие дозы соединений, соответствующих изобретению, включают также такие, которые эквивалентны уровням охт, наблюдаемым у субъектов, испытывающих состояния, связанные с пониженным аппетитом, например, брыжеечный анастамоз (см. статьи Sarson et al., Int J Obes, 1981, 5:471-480; Hoist et al., Scand J Gastroenterol, 1979, 14:205-207).
При исследовании эффектов оксинтомодулина на подавление аппетита и уменьшение поглощения пищи у человека (см. статью Cohen et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 2003, 88(10), 4696-4701) обнаружено, что инфузия оксинтомодулина людям-добровольным участникам эксперимента в дозе 3,0 пмоль/кг.мин. в течение 90 минут приводит к существенному снижению свободного поглощения энергии (19,3+5,6%; Р<0,01). Общая инфузия оксинтомодулина составляет 270 пмоль/кг массы тела. Наблюдаемая оксинтомодулин-подобная иммунореактивность в крови субъектов поднимается до приблизительно 800 пмоль/л во время инфузии.
При исследовании эффектов оксинтомодулина на снижение массы тела у человека (см. статью Wynne et al., Diabetes., 2005, 54(август), 2390-2395) показано, что подкожные инъекции оксинтомодулина людям-добровольным участникам эксперимента приводят в результате к существенному снижению массы тела. Во время 28-дневого периода исследования масса тела в группе, получающей лечение, снижается на 2,3 (0,4 кг по сравнению с 0,5 (0,5 кг в контрольной группе (Р=0,0106). 1,8 мг (приблизительно 400 нмоль) оксинтомодулина вводят три раза в день за 30 минут до приема пищи. В среднем группа, получающая лечение, имеет дополнительное снижение массы тела 0,45 кг/неделю. Потребление энергии группой, получающей лечение, существенно снижают на 170 (37 ккал (25 (5%) при приеме пищи в начале исследования за 28-дневный период исследования (Р=0,0007) и на 250 (63 ккал (35 (9%) при приеме пищи в конце исследования за 28-дневный период исследования (Р=0,0023) при отсутствии изменений в субъективной вкусовой привлекательности пищи. Лечение оксинтомодулином приводит в результате к снижению массы тела и изменению уровней жировых гормонов, соответствующих потере жировой ткани. Аноректический эффект поддерживают в течение 4 недель.
Соединения, соответствующие изобретению, как показано, являются более активными и длительно действующими, чем нативныйоксинтомодулин, как используют в исследованиях на человека в настоящее время (см. статьи Cohen et al. (2003) and Wynne et al. (2005) Diabetes 54(август), 2390-2395). Доза, необходимая для соединения, соответствующего изобретению, может быть несколько ниже, чем требуется для нативного оксинтомодулина. Можно ожидать, что дозы пептидов, соответствующих изобретению, требуемые для получения эффекта у человека, будут ниже, например в 2,5 раза, 200 раз, 400 раз и 1-4000 раз ниже, чем доза нативного оксинтомодулина. Величина активности пептидов, соответствующих изобретению, по сравнению с пептидом нативного оксинтомодулина также может позволить уменьшить частоту введения соединения, соответствующего изобретению, относительно требуемой для нативного оксинтомодулина.
Описание иллюстрируют следующими неограничивающими примерами
Примеры
Материалы и способы
Животные: Все процедуры, проводимые с животными, одобрены Актом 1986 г. по животным Министерства внутренних дел Великобритании (Научные процедуры) (лицензия на исследования No 70/5516). Самцов мышей C57BL/6 и самцов крыс Wistar содержат в отдельных клетках при контролируемой температуре (21-23°С) при свободном доступе к стандартному корму (диета RM1, SDS Ltd, Witham, Essex, UK) и воде. Жизненный цикл представляет собой 12 часов освещения и 12 часов темноты при 'рассвете' в 07:00, освещении в полную мощность в 07:30, 'закате' в 19:00 при выключении ламп в 19:30. Данное время фиксируют в аппаратуре для животных. Всех животных осматривают почти ежедневно в течение в среднем девяти суток до первого исследования. В период привыкания мыши получают две инъекции физиологического раствора в последние два дня до исследования с целью дальнейшего привыкания к процедуре в дни исследования. На крысах показано, что минимизация числа инъекций дает оптимальный ответ, и, вследствие этого, инъекции для привыкания не используют.
Внутрибрюшинные (IP) инъекции: IP инъекции делают мышам с помощью шприца объемом 0,5 мл с иглой размера 29 (максимальный объем инъекции 0,1 мл). Максимальный объем, вводимый IP, составляет 0,1 мл.
Подкожные (SC) инъекции: SC делают крысам с помощью шприца объемом 0,5 мл с иглой размера 29 (максимальный объем инъекции 0,2 мл)., при объеме 0,1 мл при введение в кожу бедра или 0,2 мл, если вводят в заднюю часть шеи.
Протокол исследования: Мышам C57BL/6 (массой 20-35 г) инъецируют исследуемый пептид после голодания в течение 20 часов. Крысам Wistar делают инъекцию после 24-часового голодания. Как правило, используют 6-10 грызунов/экспериментальную группу. Инъекции, как правило, делают в 9:00. Предварительно взвешенное количество корма представляют сразу после инъекции. Остающуюся пищу измеряют через равные интервалы времени (например 1, 2, 3, 4, 6, 8, 24, 32 и 48 часов после инъекции) и рассчитывают поглощение пищи.
Пептидный синтез
Синтез пептидов
Пептиды получают твердофазным постадийным синтезом (SPSS) с использованием стратегии N-концевой защиты Fmoc. Сборку цепи осуществляют на автоматизированных синтезаторах Applied Biosystems 431, 433 или Pioneer. Используют твердофазные смолы с предварительно нагруженной при изготовлении С-концевой аминокислотой или с амидным линкером, как необходимо. Используют следующие защитные группы боковой цепи: Asn(Trt), Gln(Trt), Cys(Trt), His(Trt), Asp(tBu), Glu(tBu), Ser(tBu), Thr(tBu), Tyr(tBu), Arg(Pbf), Lys(Boc), Trp(Boc). В ряде случаев, когда предвидят трудность синтеза, используют предварительно полученные оксазолидиновые дипептиды вместо соответствующих мономеров. Все химические вещества (различных производителей, включая Applied Biosystems, Merck Biosciences и AGCT) используют качества для синтеза. На всем оборудовании используют мониторинг обратной связью для оптимизации синтеза.
Выделение пептидов
После синтеза пептиды очищают от твердо-фазной смолы-носителя и полностью снимают защиту с боковой цепи. Этого достигают обработкой в течение 2 часов трифторуксусной кислотой (TFA), содержащей 4% воды и 2,5% триизопропилсилана для связывания защитных групп боковой цепи. Растворы пептид-TFA отфильтровывают от смол и осаждают пептиды метил-трет-бутиловым эфиром (МТВЕ). Пептиды выделяют центрифугированием, промывают в МТВЕ и сушат под вакуумом. Анализ и очистка пептидов
Пептиды растворяют в деионизированной воде с добавлением уксусной кислоты при необходимости. Перед анализом и очисткой растворы пептидов очищают центрифугированием или фильтрацией (шприц-фильтр Whatman GD/X).
Все пептидные продукты анализируют обращенно-фазовой ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией) на приборе Applied Biosystems BioCad с использованием аналитической колонки Brownlee Aquapore RP300 С8 или Phenomenex Synergi Hydro C18 column. Очистку осуществляют обращенно-фазовой ВЭЖХ с использованием препаративных колонок вышеуказанных типов. Для элюции продуктов используют градиенты ацетонитрил-вода (с TFA в качестве противоиона). Капиллярный зональный электрофорез (CZE) проводят на неочищенных и очищенных пептидах с использованием прибора Hewlett Packard 3DCE. Определение молекулярной массы осуществляют на масс-спектрометре Micromass MALDI-R.
Очищенные пептиды лиофилизируют в стеклянных флаконах фармацевтического качества (Adelphi Vials) и закрывают под вакуумом.
Дериватизированные боковые цепи
Пептиды, имеющие боковые цепи, дериватизированные ацильной или алкильной группой, получают стандартными способами.
Растворимость дериватизированных пептидов
Дериватизированные полипептиды следует полностью растворить перед введением. Для того, чтобы достигнуть растворения может быть необходимым растворить полипептиды в маленьком количестве разбавленной щелочи (например, 50 мкл 0,01 NaOH) и затем разбавить растворенный пептид в физиологическом растворе.
Эксперименты по подавлению поглощения пищи
Пример 1 (сравнительный пример)
Эффект нативного оксинтомодулина (человеческого) на питание исследуют путем внутрибрюшинной инъекции 1400 нмоль/кг группам мышей, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 24 часов показано в сравнении с физиологическим раствором на Фигуре 2. Вследствие относительно низкой активности нативного оксинтомодулина дают высокую дозу. При более низких дозах наблюдают менее существенные результаты.
Пример 2 (сравнительный пример)
Эффект нативного оксинтомодулина (человеческого) на питание исследуют путем подкожной инъекции 1400 нмоль/кг группам крыс, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 6 часов показано в сравнении с физиологическим раствором на Фигуре 3. Можно видеть, что даже в высокой дозе 1400 нмоль/кг нативный оксинтомодулин не способен снизить поглощение пищи у крыс, подвергнутых голоданию в данных условиях. При более низких дозах наблюдают такое же отсутствие эффективности.
Пример 3
Исследуют эффекты следующих аналогов оксинтомодулина на питание: Пептид NO:178 [SEQ. ID NO:178], Пептид NO:82 [SEQ ID NO:82], Пептид NO:58 [SEQ ID NO:58] и Пептид NO:52 [SEQ ID NO:52]. Аналоги вводят в дозе 10 (Пептид NO:178 [SEQ ID NO:178]) и 10 (Пептид NO:82 [SEQ ID NO:82], Пептид NO:58 [SEQ ID NO:58] и Пептид NO:52 [SEQ ID NO:52]) нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 24 часов показано в сравнении с физиологическим раствором на фигурах 4-7. Аналоги демонстрируют сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 24-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающей физиологический раствор. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 4
Исследуют эффекты на питание следующих аналогов оксинтомодулина: Пептид NO:164 [SEQ ID NO:164] и Пептид NO:167 [SEQ ID NO:167]. Аналоги вводят в дозе 4 и 5 нмоль/кг, соответственно, путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 48 часов (Пептид NO:164 [SEQ ID NO:164]) и 32 часов (Пептид NO:167 [SEQ ID NO:167]) показано в сравнении с физиологическим раствором на фигурах 8 и 9. Аналоги демонстрируют сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 48-(Пептид NO:164 [SEQ ID NO:164]) и 32- (Пептид NO:167 [SEQ ID NO:167]) часового периода, иначе говоря, поглощение пищи в течение первого 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающей физиологический раствор и продолжает оставаться ниже его в последующие 24 часа (Пептид NO:164 [SEQ ID NO:164]) или 8 часов (Пептид NO:167 [SEQ ID NO:167]). Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 5
Исследуют эффекты на питание следующих аналогов оксинтомодулина: Пептид NO:100 [SEQ ID NO:100] и Пептид NO:148 [SEQ ID NO:148]. Аналоги вводят в дозе 20 и 10 нмоль/кг, соответственно, путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 24 часов показано в сравнении с физиологическим раствором на фигурах 10 и 11. Аналоги демонстрируют сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 24-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающей физиологический раствор. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 6
Исследуют эффекты на питание следующих аналогов оксинтомодулина: Пептид NO:60 [SEQ ID NO:60] и Пептид NO:94 [SEQ ID NO:94]. Аналоги вводят в дозе 100 и 5 нмоль/кг, соответственно, путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 24 часов показано в сравнении с физиологическим раствором на фигурах 12 и 13. Аналоги демонстрируют сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 24-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение 24-часового периода ниже, чем в контрольной группу, получающей физиологический раствор. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 7
Исследуют эффекты на питание следующего аналога оксинтомодулина: Пептид NO:155 [SEQ ID NO:155]. Аналог вводят в дозе 4 нмоль/кг путем подкожной инъекции группе крыс, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 32 часов показывают в сравнении с физиологическим раствором на Фигуре 14. Аналог демонстрируют сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 32-часового периода, иначе говоря, поглощение пищи в течение первого 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающей физиологический раствор и продолжает оставаться ниже его в следующие 8 часов. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 8
Исследуют эффекты на питание следующих аналогов оксинтомодулина: Пептид NO:142 [SEQ ID NO:142], Пептид NO:184 [SEQ ID NO:184] и Пептид NO:172 [SEQ ID NO:172]. Аналоги вводят в дозе 3 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 24 часов показано в сравнении с физиологическим раствором на фигурах 15-17. Аналоги демонстрируют сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 24-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающей физиологический раствор. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 9
Исследуют эффекты на питан исследующих а налогов оксинтомодулина: Пептид NO:4 [SEQ ID NO:4], Пептид NO:195 [SEQ ID NO:195], Пептид NO:136 [SEQ ID NO:136] и Пептид NO:108 [SEQ ID NO:108]. Аналоги вводят в дозах 5, 800, 5 и 100 нмоль/кг соответственно, путем внутрибрюшинной инъекции группам мышей, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 24 часов показано в сравнении с физиологическим раствором на фигурах 18-21. Аналоги демонстрируют сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 24-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающей физиологический раствор. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 10
Исследуют эффекты на питание следующих аналогов оксинтомодулина: Пептид NO:142 [SEQ ID NO:142], Пептид NO:22 [SEQ ID NO:22], Пептид NO:153 [SEQ ID NO:153] и Пептид NO:199 [SEQ ID NO:199]. Аналоги вводят в дозе 3 нмоль/кг, 200 нмоль/кг (Пептид NO:153 [SEQ ID NO:153]) и 500 нмоль/кг (Пептид NO:199 [SEQ ID NO:199]) путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 24 часов показано в сравнении с физиологическим раствором на фигурах 22-25. Аналоги демонстрируют сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 24-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающей физиологический раствор. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 11
Исследуют эффекты на питание следующих аналогов оксинтомодулина: Пептид NO:210 [SEQ ID NO:210], Пептид NO:211 [SEQ ID NO:211], Пептид NO:213 [SEQ ID NO:213] и Пептид NO:214 [SEQ ID NO:214]. Аналоги вводят в дозе 20, 200, 400 and 400 нмоль/кг, соответственно, путем внутрибрюшинной инъекции группам мышей, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 48 часов показано в сравнении с физиологическим раствором на фигурах 26-29. Аналоги демонстрируют сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 48-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение первого 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающей физиологический раствор, и продолжает оставаться ниже его в течение следующих 24 часов. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 12
Исследуют эффекты на питание следующих аналогов оксинтомодулина: Пептид NO:201 [SEQ ID NO:201] и Пептид NO:202 [SEQ ID NO:202]. Аналоги вводят в дозе 5 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 48 часов показано в сравнении с физиологическим раствором на фигурах 30 и 31.
Аналоги демонстрируют сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 48-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение первого 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающей физиологический раствор, и продолжает оставаться ниже его в течение следующих 24 часов. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 13
Исследуют эффект на питание следующего аналога оксинтомодулина: Пептид NO:203 [SEQ ID NO:203]. Аналог вводят в дозе 100 нмоль/кг путем подкожной инъекции группе подвергнутых голоданию крыс. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 24 часов показано в сравнении с физиологическим раствором на Фигуре 32. Аналог демонстрирует сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 24-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающей физиологический раствор. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 14
Исследуют эффекты на питание следующих аналогов оксинтомодулина: Пептид NO:204 [SEQ ID NO:204] и Пептид NO:205 [SEQ ID NO:205]. Аналоги вводят в дозе 5 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 32 часов показано в сравнении с физиологическим раствором на фигурах 33 и 34. Аналоги демонстрируют сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 32-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение первого 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающей физиологический раствор, и продолжает оставаться ниже его в течение следующих 8 часов. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 15
Исследуют эффекты на питание следующих аналогов оксинтомодулина: Пептид NO:206 [SEQ ID NO:206], Пептид NO:207 [SEQ ID NO:207] и Пептид NO:209 [SEQ ID NO:209]. Аналоги вводят в дозе 80 нмоль/кг путем подкожной инъекции группам крыс, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 48 часов показано в сравнении с физиологическим раствором на фигурах 35-37. Аналоги демонстрируют сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 48-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение первого 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающей физиологический раствор, и продолжает оставаться ниже его в течение следующих 24 часов. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 16
Исследуют эффект на питание следующего аналога оксинтомодулина: Пептид NO:215 [SEQ ID NO:215]. Аналог вводят в дозе 5 нмоль/кг путем подкожной инъекции группе крыс, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 24 часов показано по сравнению с физиологическим раствором на Фигуре 38. Аналог демонстрирует сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 24-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающей физиологический раствор. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 17
Исследуют эффект на питание следующего аналога оксинтомодулина: Пептид NO:216 [SEQ ID NO:216]. Аналог вводят в дозе 10 нмоль/кг путем подкожной инъекции группе крыс, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 24 часов показано по сравнению с физиологическим раствором на Фигуре 39. Аналог демонстрирует сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 24-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающем физиологический раствор. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 18
Исследуют эффект на питание следущего аналога оксинтомодулина: Пептид NO:355 [SEQ ID NO:355]. Аналог вводят в дозе 5 нмоль/кг путем подкожной инъекции группе крыс, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 4 часов показано по сравнению с физиологическим раствором на Фигуре 40. Аналог демонстрирует сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 4-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение первого 4-часового периода ниже, чем в контроле, получающем физиологический раствор. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Пример 19
Исследуют эффект на питание следующего аналога оксинтомодулина: Пептид NO:130 [SEQ ID NO:130]. Аналог вводят в дозе 20 нмоль/кг путем подкожной инъекции группе мышей, подвергнутых голоданию. Другой группе вводят физиологический раствор (контроль). Среднее кумулятивное поглощение пищи в течение 24 часов показано по сравнению с физиологическим раствором на Фигуре 41. Аналог демонстрирует сильное и длительное подавление поглощения пищи по сравнению с контрольным физиологическим раствором. Подавление поглощения пищи продолжается в течение всего 24-часового периода; иными словами, поглощение пищи в течение 24-часового периода ниже, чем в контрольной группе, получающей физиологический раствор. Оно также ниже, чем в контрольной группе, леченной нативным оксинтомодулином.
Следует иметь в виду, что на протяжении вышеописанных примеров соединения, соответствующие изобретению, способны подавлять поглощение пищи в дозах, существенно более низких, чем дозы нативного пептида, используемого в сравнительных экспериментах.