Влияние холода на некоторые показатели гемостаза у доноров плазмы

Свежезамороженная плазма (СЗП) обычно используется у пациентов с критическими нарушениями в системе коагуляции, часто проявляющимися кровотечениями. Однако значение режима размораживания СЗП в России подробно не изучено. Цель нашего исследования состояла в том, чтобы оценить деятельность антитромбина (АТ) III в образцах СЗП, размороженной методом теплообмена.

В образцах СЗП была изучена концентрация АТ III после размораживания. Была оценена продолжительность хранения и время размораживания. Мы выявили существенное уменьшение активности АТ III в СЗП, размороженной данным методом. Уменьшение активности АТ III после размораживания СЗП могло бы ограничить эффективность плазмы при использовании у пациентов с ДВС-синдромом.

Ключевые слова: антитромбин III, свежезамороженная плазма, синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови.

УДК 615.382:615.014.4

ВЛИЯНИЕ ХОЛОДА НА НЕКОТОРЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ГЕМОСТАЗА У ДОНОРОВ ПЛАЗМЫ

© 2005 г. Н. А. Воробьева, *О. В. Турундуевская,

**Н. В. Солдатенкова

Северный государственный медицинский университет,

*МУЗ «Первая городская клиническая больница»,

"Областная станция переливания крови, г. Архангельск

В последние годы в отечественной и зарубежной литературе появилось значительное количество работ, посвященных исследованию различных механизмов возникновения тромбозов, тромбофилических состояний, синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови (ДВС-синдром), сопровождающихся выраженной тромбинемией, а также методов их профилактики и лечения [1, 7]. Выявлена определенная зависимость между тромбинемией и наследственными и приобретенными дефектами системы гемостаза, тяжестью основной и сопутствующей патологии, оперативным вмешательством

[1, 3].

Одним из определяющих факторов высокого уровня тромбинемии и устойчивости к терапии антикоагулянтными препаратами является дефицит противосвертывающей системы, а именно депрессия естественного первичного антикоагулянта антитромбина III [3, 5].

Антитромбин, известный также как антитромбин III (АТ III) и кофактор гепарина, является главным физиологическим ингибитором тромбина, кроме того, он принимает участие в ингибировании других серо-тониновых протеаз (факторов Ха, Ка, ХЫ, ХПа) [3]. Следует отметить, что АТ III обеспечивает 75—90 % всей антикоагуляционной активности плазмы. Основной его синтез происходит в эндотелии и гепатоцитах, при этом период полураспада в физиологических условиях составляет 2—3 дня. По химической структуре АТ III представляет собой одноцепочечный а2-гликопротеид с молекулярной массой 58 200 Да, ему присущи структурная и функциональная гомологии с другими членами семейства белков, обозначаемых как ингибиторы сериновых протеаз или суперсемейство серпинов [3]. Антитромбин человека состоит из 432 аминокислотных остатков. Молекула имеет энзимсвязывающий (реактивный), гепаринсвязывающий центры и дисульфидные связи, стабилизирующие молекулу (рис. 1). Антитромбин присутствует в плазме в концентрации 140—200 мкг/мл, небольшие количества антитромбина находятся в эндотелии и субэндотелиальном пространстве. Он циркулирует в крови в форме, проявляющей низкую ингибиторную активность, при этом добавление гепарина увеличивает ингибиторную способность АТ III в 1 000—5 000 раз.

По механизму действия антитромбин относится к ингибиторам сериновых протеаз, образуя комплекс с гепарином, ингибирует II, X, IX, XI, XII факторы свертывания, калликреин, плазмин, препятствует активации системы комплемента [3]. Дефицит этого ингибитора свертывания крови приводит к избыточному образованию тромбина и фибрина и, как результат этого, к тромбозу, тромбинемии и внутрисосудистому свертыванию крови [9]. Установлено, что риск возникновения последнего возрастает при снижении уровня активности АТ III ниже 80 % и достигает

максимума при концентрации его 50—60 %, в случае значительного падения активности АТ III тромбозы и внутрисосудистая тромбинемия носят массивный генерализованный характер [10, 11]. При этом состоянии период полураспада составляет всего 2—3 часа.

—Л

Рис. 1. Химическая структура молекулы антитромбина III

В настоящее время изучены следующие механизмы возникновения дефицита АТ III [2, 8]: сниженный синтез антикоагулянта; сниженная его функция; повышенное потребление АТ III, наблюдаемое при ДВС-синдро-ме, тромбозе глубоких вен, легочной эмболии; дефицит при протеинурии и неселективной потере АТ III; повышенный неселективный катаболизм белков.

Следует отметить, что при всех указанных выше состояниях ввиду наличия лабораторных признаков тромбинемии показана заместительная терапия прямыми антикоагулянтами на фоне предварительной коррекции дефицита АТ III.

Дефицит антитромбина может быть как наследственно детерминированным, так и приобретенным. Приобретенная форма дефицита антитромбина III весьма распространенная и регулярно встречаемая патология системы гемостаза у пациентов отделений интенсивной терапии. В патогенезе приобретенной недостаточности данного антикоагулянта имеют значение нарушение синтеза белка при заболеваниях печени, выход АТ III из кровеносного русла при нарушении функции почек и ускоренный катаболизм вследствие взаимодействия с тромбином, эластазой и терапии гепарином. При шоке независимо от его причины имеют место периферический стаз и гипоксия, которые вызывают ацидоз, повреждение эндотелия кровеносных сосудов и активацию свертывания крови как по внешнему, так и по внутреннему пути [2, 5, 9]. Усиленное образование тромбина сопровождается потреблением части антитромбина [8, 11]. В присутствии гепарина утилизация антитромбина путем про-теолиза тромбином возрастает. Недостаточность антитромбина отмечается при заболеваниях печени, ДВС-синдроме, нефротическом синдроме, при лечении гепарином. Благоприятное терапевтическое действие гепарина для синдрома ДВС можно ожидать лишь при условии достаточной активности антитром-

бина, которая должна быть не менее 80 % [3, 5]. В случаях острого синдрома ДВС период его полужиз-ни становится менее 4 часов. По этой причине может возникнуть потребность в частом введении антитромбина под контролем его активности в крови.

В настоящее время современными источниками антитромбина являются концентраты АТ III (кибер-нин, рекомбинантные концентраты антитромбина III), в России же основным и доступным источником АТ III считается донорская свежезамороженная плазма (СЗП) [6]. Режим и количество трансфузий СЗП зависит от исходной степени выраженности депрессии данного антикоагулянта у больных с синдромом гиперкоагуляции. При этом необходимо учитывать, что АТ III является термолабильным белком, что влияет на полноценность и адекватность коррекции патологии. Так, при нарушении технологии размораживания свежезамороженной плазмы активность АТ III может значительно снижаться за счет денатурации.

Целью настоящей работы явилось изучение влияния размораживания донорской свежезамороженной плазмы широко используемым в повседневной практике в Российской Федерации методом простого теплообмена на водяной бане при температуре 37—38 °С на активность антитромбина III.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на базе отделения реанимации, анестезиологии и интенсивной терапии (ОРИТ) МУЗ «Первая городская клиническая больница» и областной станции переливания крови г. Архангельска. Донорскую плазму заготавливали методом фракционирования цельной консервированной крови человека в соответствии с «Инструкцией по проведению донорского плазмафереза», утвержденной Минздравом РФ 29.05.1995 года. Нами изучено влияние размораживания плазмы методом теплообмена при температуре 37 °С на активность антитромбина III. Всего исследовано 89 образцов плазмы, заготовленных от 89 доноров. Плазму от 68 доноров в соответствии с требованиями РД МЗ РФ замораживали в течение первых 2 часов от момента заготовки крови стандартным методом воздушного потока (при —45 °С в течение 40 мин) на воздушном быстрозамораживателе плазмы <^п§ега NZKR 18/80VK» (Чехия). Донорскую кровь забирали в пластикатные контейнеры объемом 300/ 300 мл («Компопласт», АКО «Синтез», г. Курган) при соотношении крови к консерванту 4:1. У доноров плазмы определяли исходный уровень антитромбина III, при уровне его ниже 80 % плазму в исследование не включали. Карантинизация плазмы проводилась в течение 6 месяцев при —30 °С. По мере использования СЗП с учетом сроков хранения (при —45 °С в течение 12 месяцев) [4] определяли активность АТ III плазмы, размороженной на водяной бане при температуре 37—38 °С. Время размораживания составляло 17—25 мин при мониторинге термометрии. Данные образцы СЗП переливали больным на фоне диссеминированного внутрисосудистого свер-

тывания крови с целью заместительной антикоагу-лянтной терапии.

Динамическое наблюдение за активностью антитромбина III проводили на базе экспресс-лаборатории ОРИТ Первой городской клинической больницы г. Архангельска. Для лабораторного исследования системы гемостаза использовались реактивы фирмы «Технология-Стандарт» (г. Барнаул). Определение прогрессивной активности антитромбина III в плазме крови доноров и в плазме свежезамороженной проводилось по методу U. Abilgard (норма 85—115 %).

В исследовании использовался слепой метод. При статистической обработке результатов исследования применялось программное обеспечение MS Excel 2000, при расчете t-критерия — программа Statistica.

Результаты исследования

На первом этапе исследования методом случайной выборки нами были отобраны 89 активных доноров плазмы. При исследовании исходного уровня АТ III у доноров плазмы мы получили следующие результаты. Из 89 образцов плазмы у 14 доноров исходный уровень данного антикоагулянта был ниже 80 % (67,0 ± 4,8 %), что составило 15,7 % от общего числа исследованной плазмы. Учитывая, что донорскую плазму мы вводили больным с острым ДВС-синдро-мом для коррекции дефицита антикоагулянтной системы, мы посчитали целесообразным не использовать данную плазму в нашем исследовании ввиду исходной низкой активности антитромбина. Кроме того, исходный низкий уровень АТ III мог повлиять на величину активности данного антикоагулянта при размораживании свежезамороженной плазмы. Исходная активность АТ III в плазме остальных доноров определялась в пределах 95—140 %, в среднем (135,0 ± 2,1) %, что является достаточным уровнем АТ III. Коэффициент вариации (8 %) данного ряда указывал на слабое разнообразие признака, что позволяет сделать вывод, что взятые в исследование доноры плазмы незначительно отличались по исходной активности АТ III.

При исследовании активности антикоагуляционной системы после размораживания донорской плазмы мы получили следующие результаты. Активность АТ III после размораживания СЗП находилась в значительных пределах (от 50 до 140 %), коэффициент вариации составил 30 %. Среднее значение АТ III снизилось со (135,0 ± 2,1) % до (101,0 ± 6,2) %. Таким образом, отмечено снижение уровня АТ III после размораживания в среднем на 25,2 %, причем почти половина исследуемых пакетов донорской плазмы имела пограничную или сниженную активность АТ III. Этот факт ставит под сомнение эффективность трансфузии данной плазмы для коррекции исходного дефицита АТ III при исходной депрессии естественного антикоагулянта при остром ДВС-синдроме. Статистический анализ подтвердил достоверность различий показателей АТ III до и после размораживания плазмы (р < 0,05).

По степени снижения активности АТ III все исследуемые образцы донорской плазмы мы разделили на 3 группы (рис. 2): 1-ю — с нормальной активностью АТ III (95 % и выше); 2-ю — с пограничной активностью АТ III (79—94 %); 3-ю — с выраженным снижением АТ III (50—79 %).

45

я

3

30

15

-42-

19

14

1 группа 2 группа 3 группа  95% и выше  79—94%  50—79%

Рис. 2. Распределение образцов донорской плазмы по активности антитромбина III

При изучении показателя активности АТ III в донорской плазме мы не выявили какой-либо достоверной связи между сроками хранения, временем размораживания СЗП и степенью снижения активности АТ III (коэффициент корреляции г = +0,16).

Хотелось бы отметить, что при данном методе размораживания плазмы в связи с занятостью среднего медицинского персонала, осуществляющего подготовку СЗП к трансфузии, представляется довольно трудным четко выдержать необходимый температурный режим (и 37 °С), поэтому температура водяной бани изменяется в значительных пределах — в исследовании от 32,0 до 39,5 °С (рис. 3), что может оказывать влияние на качество размороженной плазмы.

Время размораживания, мин

Рис. 3. Пример температурной кривой при размораживании свежезамороженной плазмы методом простого теплообмена на водяной бане

Выводы

В результате проведенного исследования мы пришли к следующему:

1. При размораживании свежезамороженной плазмы широко используемым в России методом простого теплообмена при температуре 37—38 °С

0

на водяной бане не сохраняется исходная активность антитромбина III, несмотря на оптимальный режим замораживания и хранения плазмы.

2. Трансфузия свежезамороженной плазмы, размороженной методом теплообмена при 37 °С, у больных с выраженной тромбинемией на фоне дефицита АТ III при остром ДВС-синдроме не позволяет быстро и полноценно корригировать тромбинемию в связи с уменьшением активности АТ III при данном виде размораживания.

3. Для полноценной коррекции дефицита АТ III при остром ДВС-синдроме требуются значительно большие объемы СЗП, размороженных в режиме активации факторов системы гемостаза.

4. Для получения свежезамороженной плазмы с сохранной активностью естественных антикоагулянтов (АТ III) необходимо обеспечить размораживание плазмы методом мембранного теплообмена как наиболее оптимального для сохранения гемостатического потенциала донорской плазмы.

5. Целесообразно проводить скрининговое исследование доноров плазмы на активность основных антикоагулянтов (АТ III).

Список литературы

1. Винаццер Х.А. Антитромбин III при шоке и диссеминированном внутрисосудистом свертывании крови / Х.А. Винаццер // Казанск. мед. журнал. — 1998. — № 3. — С. 1, 44—48, 79.

2. Заболотских И. Б. Основы гемостазиологии / И. Б. Заболотских, С. В. Синьков. — Краснодар: Изд-во Кубанской государственной академии, 2002. — С. 18—32.

3. Зубаиров Д. М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования / Д. М. Зубаиров. — Казань, 2000. — С. 366.

4. О правилах замораживания и хранения свежезамороженной донорской плазмы: Приказ № 155 МЗ СССР от 12.04.1994 г.

5. Папаян Л. П. Синдром диссеминированного внутрисо-судистого свертывания крови — трагический срыв системы гемостаза / Л. П. Папаян, Б. А. Барышев // Транс-фузиология. — 2001. — № 2. — С. 52—71.

6. Тихомирова Н. И. Организационно-тактические аспекты заготовки и использования аутокрови и ее компонентов в оперативной гинекологии / Н.И. Тихомирова, В. Б. Хватов // Актуальные вопросы гематологии и трансфу-зиологии: Материалы НПК. — СПб., 2000. — С. 302—303.

7. Becker R. C. Antitrombotic Therapy / R. C. Becker,

D. J. Fintel, D. Green // Professional Communicftions, Inc., 2002. — P. 352.

8. Marciniak E. Thrombin-induced proteolysis of human antithrombin III: an outstanding contribution of heparin /

E. Marciniak // Brit. J. Haematol. — 1981. — Vol. 48, N 21. — P. 325—336.

9. Some properties of antithrombin III and its concentration in human plasma / G. Murano, L. Williams, M. Miller-Anderson et al. // Thromb. Res. — 1980. — Vol. 18, N 1—2. — P. 259—262.

10. Vinazzer H. Therapeutic use of antithrombin III in shok and disseminated intravascular coagulation / H. Vinazzer // Semin. Thromb. Hemost. — 1989. — Vol. 15. — P. 347—352.

11. VinazzerH. Clinical use antithrombin III concentrates / H. Vinazzer // Vox Sand. — 1987. — Vol. 53. — N 4. — P. 193—198.

INFLUENCE OF COLD ON SOME HEMOSTASIS INDICES IN PLASMA DONORS

N. А. Vоrobyeva, *O. V. Turunduevskaya,

**N. V. Soldatenkova

Northern State Medical University,

*City Clinical Hospital № 1,

** Regional Station of Blood Transfusion, Arkhangelsk

Fresh frozen plasma (FFP) is routinely used in patients with critical disturbances of coagulation and manifesting bleeding. However, the role of FFP thawing technique was not investigated in Russia as yet. Therefore, the aim of our study was to assess the activity of antithrombin III (AT III) in samples of FFP thawed by the technique of plain water heat exchange (bain-marie). The samples of FFP were analyzed for the AT III concentration after thawing. The FFP doses subjected to sampling were collected, frozen and stored under standard conditions. Storing duration and time of thawing were assessed. We found significant decrease of the activity of AT III in FFP samples thawed by this method. The decrease of AT III concentration after bain-marie thawing might limit the efficacy of FFP transfusions in AT III-deficient patients with disseminated intravascular coagulopathy.

Key words: antithrombin III, fresh frozen plazma, disseminated intravascular coagulopathy.