Влияние температуры среды на спектры лазерно-индуцированной флуоресценции микроводорослей

Вестник ДВО РАН. 2015. № 3

УДК 53.096;535.337;535.372

С.С. ВОЗНЕСЕНСКИЙ, А.Ю. ПОПИК, Е Л. ГАМАЮНОВ, Т.Ю. ОРЛОВА, Ж.В. МАРКИНА

Влияние температуры среды на спектры лазерно-индуцированной флуоресценции микроводорослей

Приводятся результаты исследования влияния температуры среды на спектры лазерно-индуцированной флуоресценции для 6 культур микроводорослей. На основе полученных графиков температурной зависимости интенсивности флуоресценции определены значения температурных коэффициентов экспоненциальной математической модели для каждой культуры. Сделан вывод о возможности использования частотных и амплитудных параметров лазерной индуцированной флуоресценции в качестве информативных признаков для идентификации культур микроводорослей.

Ключевые слова: фитопланктон, лазерно-индуцированная флуоресценция, температурные коэффициенты.

The influence of the habitat temperature on the laser-induced fluorescence spectrum of microalgae.

S.S. VOZNESENSKIY, A.Yu. POPIK, E.L. GAMAYUNOV (Far Eastern Federal University, Institute of Automation and Control Processes, FEB RAS, Vladivostok), T.Yu. ORLOVA, Zh.V. MARKINA (A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, FEB RAS, Vladivostok).

The research results of influence of ambient temperature on the spectra of laser induced fluorescence for the 6 cultures of microalgae are given. Based on the obtained graphs of the temperature dependence of the fluorescence intensity the values of the temperature coefficients of the exponential mathematical model for each alga were determined. It is concluded about the possibility of the use of frequency and amplitude parameters of laser-induced fluorescence as informative features for identification of cultures of microalgae.

Key words: phytoplankton, laser-induced fluorescence, temperature coefficients.

Объектами экологического мониторинга могут быть как популяции живых организмов (например, стада животных), так и целые природные биоценозы (например, морские прибрежные акватории). При изучении природных объектов наблюдают за входящими в их состав элементами. По состоянию этих элементов можно судить об изменении экологии среды обитания, поэтому их называют индикаторами, а применительно к живым организмам - биоиндикаторами. Чем проще элемент, тем быстрее в нем отражаются изменения экологического состояния среды. По этой причине в качестве биоиндикаторов удобно использовать микроорганизмы. Экологический мониторинг водных акваторий часто осуществляется на основе изучения микроводорослей [6, 7].

ВОЗНЕСЕНСКИЙ Сергей Серафимович - доктор физико-математических наук, заведующий лабораторией,

*ПОПИК Александр Юрьевич - инженер, ГАМАЮНОВ Евгений Леонидович - кандидат технических наук, старший научный сотрудник (Дальневосточный федеральный университет, Институт автоматики и процессов управления ДВО РАН, Владивосток), ОРЛОВА Татьяна Юрьевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, МАРКИНА Жанна Васильевна - кандидат биологических наук, научный сотрудник (Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН, Владивосток). *Е-таП: PopikAY@yandex.ru

Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП «Лазерные методы исследования» Института автоматики и процессов управления ДВО РАН и частично поддержана грантом РНФ (соглашение № 14-50-00034) и грантом ДВО РАН программы «Дальний Восток».

Одно из важных свойств одноклеточных водорослей - флуоресцентное свечение пигментов клетки при облучении их светом. Флуоресцентное свечение клеток фитопланктона, вызванное лазерным излучением, называется лазерно-индуцированной флуоресценцией (ЛИФ). Как правило, ЛИФ не приводит к повреждению клеток микроводорослей, поэтому большинство современных приборов и методов исследования состава и концентрации микроводорослей фитопланктона основано на использовании явления ЛИФ [2, 3, 8].

В работах [9] и [5] показано, что изменение температуры среды, в которой находится фитопланктон, влияет на интенсивность ЛИФ хлорофилла-а, являющегося основным пигментом микроводорослей. Следовательно, исследования, основанные на методе ЛИФ, должны учитывать влияние параметров среды обитания фитопланктона.

В настоящей статье представлены результаты изучения зависимости от температуры спектров ЛИФ 6 культур микроводорослей - типичных представителей Японского моря.

Материалы и инструменты

Для исследований были выбраны 6 культур микроводорослей Японского моря из коллекции Института биологии моря (ИБМ) ДВО РАН1.

Nannochloris maculata Butch. (Chlorophyta). Штамм NM-86 выделен в культуру из зал. Восток. Клетки мелкие, 2-3 мкм в диаметре, шаровидные, реже - эллипсовидные, одиночные, неподвижные. Культура для эксперимента взята на 7-е сутки.

Porphyridium purpureum (Bory de Saint-Vincent) Drew et Ross (Rhodophyta). Штамм PP-AB11 выделен в культуру из Амурского залива. Клетки сферические 4,5-9 мкм в диаметре, одиночные, неподвижные. Культура для эксперимента взята на 8-е сутки.

Chroomonas salina (Wisl.) Butch (Cryptophyta). Штамм CS-92 выделен в культуру из Амурского залива. Клетки 10-14 мкм в длину, 5-8 мкм в ширину, овальные или эллипсовидные, очень подвижные. Культура для эксперимента взята на 13-е сутки.

Chaetoceros muelleri Lemm. (Bacillariophyta). Выделен в культуру из зал. Восток. Клетки 5-15 мкм в ширину, 5-10 мкм в длину, одиночные, реже - в коротких цепочках по 2-4 клетки. Клетки неподвижные. Культура для эксперимента взята на 14-е сутки.

Heterosigma akashiwo Hada (Raphidophyta). Штамм HA-ЗР 11 выделен в культуру из бухты Золотой Рог. Клетки размером 9,7 х 15,3 мкм, одиночные, очень подвижные. Культура для эксперимента взята на 19-е сутки.

Tisochrysis lutea Bendif, Probert (Haptophyta). Штамм TL-V 08 выделен в культуру из зал. Восток. Клетки имеют размер 5,7 х 7,5 мкм, одиночные, подвижные, эллипсовидные.

Эксперименты выполнялись с культурами, приготовленными для анализа в марте 2015 г.

Для получения клоновых культур из проб морской воды отдельные клетки изолировали, помещали в чашки Петри или пробирки со средой f/2 [1, 10] и экспонировали в климатостате Binder KBW-400 (E5.1) производства Германии при температуре 20 "С со свето-темновым периодом 12 : 12 ч и освещенностью 26-27 мкмоль/м2 • с (1250 лк).

Возбуждение ЛИФ осуществлялось непрерывным лазерным излучением с длиной волны 442 нм для культур N. maculata, P. purpureum и T. lutea с эффективностью возбуждения флуоресценции 0,6, 0,15 и 0,91 соответственно. Культуры Ch. salina, Ch. muelleri, H. akashiwo облучались лазером с длиной волны 473 нм и эффективностью флуоресценции 0,8, 0,99 и 0,89 соответственно. Время воздействия лазерного излучения на пробу во всех случаях составляло 2 с. Эффективность возбуждения ц(Х) определялась как отношение максимума интенсивности ЛИФ образца I в диапазоне длин волн 680-690 нм к интенсивности индуцирующего излучения I(X) :

1 Выделение в культуру штаммов микроводорослей осуществлено старшим научным сотрудником лаборатории

физиологии ИБМ ДВО РАН Н.А. Айздайчер, за что авторы выражают ей глубокую благодарность.

77

I (A) v ;

Спектры ЛИФ фитопланктона при разной температуре измерялись спектрометром Shamrock 303i компании Andor Technology, США (входная щель монохроматора 100 мкм, диапазон длин волн 500-770 нм, разрешающая способность дифракционной решетки 0,167 нм). Измерение спектров осуществлялось в режиме аккумуляции: время экспозиции промежуточного спектра - 0,2 с, количество аккумуляций - 10, частота измерений промежуточных спектров - 5 Гц.

Спектры ЛИФ фитопланктона и эффективность возбуждения ЛИФ при температуре 22 °С измерялись модульным спектрофлуориметром Fluorolog-3 компании Horiba Scientific (Япония) с шагом сканирования спектра 0,062 нм и диапазоном возбуждения и регистрации флуоресценции 200-950 нм.

Кюветы с пробами культур помещались в термостатируемый держатель кювет (ТДК) QPOD 2e производства компании Quantum (США), который обеспечивал скорость изменения температуры 1 °С/мин. Погрешность цифрового измерителя с погружаемой термопарой составляла ± 0,15 °С. Равномерное распределение температуры достигалось перемешиванием образца магнитной мешалкой со скоростью вращения 300 об/мин.

Выполнение эксперимента

В кварцевую кювету объемом 3,5 мл при помощи дозатора помещалась культура микроводоросли объемом 1,5 мл. Кювета вставлялась в ТДК с начальной температурой 22 °С. Реакция ЛИФ культуры на изменение температуры среды исследовалась в трех режимах, для обозначения которых используется переменная i: первый режим (i = 1) - нагрев от начальной температуры 22 до 32 °С; второй режим (i = 2) - охлаждение от достигнутой в первом режиме максимальной температуры до 5 °С; третий режим (i = 3) - нагрев от температуры, достигнутой при охлаждении во втором режиме, до 32 °С. Измерения спектров ЛИФ выполняли во время нагревов и охлаждения с шагом изменения температуры 1 °С. Для каждой культуры водоросли процедура измерений повторялась 3 раза.

При формировании графиков полученные в экспериментах данные обрабатывались следующим образом:

1) из спектров ЛИФ вычитался сигнал темнового тока спектрометра;

2) для уменьшения зашумленности сигнала полученные данные подвергались фильтрации с использованием быстрого преобразования Фурье. Фильтрация выполнялась для частот выше 0,5 Гц;

3) после фильтрации из спектров ЛИФ вычислялись интенсивность максимума флуоресценции в диапазоне длин волн 680-690 нм и интенсивность максимума комбинационного рассеяния (КР) в диапазоне длин волн 500-600 нм. Для водоросли P. purpureum интенсивность КР воды невозможно было определить из-за перекрывания спектров КР и ЛИФ дополнительного пигмента;

4) для всех водорослей, кроме P. purpureum, производилась нормировка интенсивности ЛИФ на интенсивность КР воды по формуле:

fn

1 КР

где T- температура образца в заданном режиме; i - номер режима; I - максимальная интенсивность ЛИФ в диапазоне длин волн 680-690 нм при заданной температуре в заданном режиме; I - интенсивность КР воды при заданной температуре в заданном режиме; f (T,i) - интенсивность ЛИФ в диапазоне длин волн 680-690 нм, нормированная на соответствующую интенсивность КР воды, при одинаковых заданных значениях температуры в соответствующих режимах.

К статье: С.С. Вознесенский, А.Ю. Попик, Е.Л. Гамаюнов, Т.Ю. Орлова, Ж.В. Маркина «Влияние температуры среды на спектры лазерно-индуцированной флуоресценции микроводорослей»

Длина волны,

Рис. 1. Спектры флуоресценции различных культур микроводорослей. На врезке представлен участок спектров флуоресценции в диапазоне длин волн 500-650 нм. Культуры микроводослей: 1 - N. maculata; 2 - P. purpureum; 3 - Ch. salina; 4 - Ch. muelleri; 5 - H. akashiwo; 6 - T. lutea

Далее значения интенсивности ЛИФ в диапазоне температур 5-32 °С были нормированы на максимальную интенсивность ЛИФ по формуле:

F{T, i) = ¿iM,

/max

где /max - максимальная интенсивность нормированной ЛИФ в диапазоне длин волн 680-690 нм во всем диапазоне температур;/(T,i) - интенсивность ЛИФ, нормированная на максимальную, при заданной температуре и режиме.

Результаты измерений

Рис. 2. Локализация максимумов ЛИФ в диапазоне длин волн 680-690 нм для исследованных культур микроводорослей

Измеренные при температуре 22 °С спектры ЛИФ для различных культур микроводорослей представлены на рис. 1 (см. вклейку).

На графике видно, что все образцы имеют отчетливо наблюдаемый пик флуоресценции в диапазоне длин волн 680-690 нм, который в первую очередь обусловлен флуоресценцией хлорофилла-^ - основного пигмента клеток фитопланктона. Наибольшая интенсивность ЛИФ в этом диапазоне наблюдается в образцах культур N. macu-lata и T. lutea. Для P. purpureum и Ch. salina кроме пика флуоресценции в диапазоне длин волн 680-690 нм отмечается также небольшой пик флуоресценции дополнительного пигмента в области 560-600 нм. Этот пик могут давать фикобилипротеи-ды (соединения пигментов фикобилинов с белками). Данные пигменты есть только у трех типов микроводорослей - красных, криптофитовых и синезеленых. Среди исследованных микроводорослей P. purpu-

reum является представителем красных, а Ch. salina - криптофитовых водорослей. Для фикоэритрина, представителя фикобилипротеидов, характерна яркая флуоресценция с максимумом 575 нм, что мы и наблюдаем при измерении спектра флуоресценции в диапазоне 560-600 нм. При денатурации белка и нарушении связей фикобилины должны терять способность флуоресцировать [1].

Кроме различий в спектрах флуоресценции в диапазоне 400-750 нм для всех образцов отмечается разная локализация максимумов флуоресценции в диапазоне длин волн 680-690 нм (рис. 2). При этом у некоторых водорослей различия незначительны. Например, для N. maculata и P. purpureum максимумы ЛИФ фиксируются на длинах волн 687 и 688 нм, а для Ch. salina, Ch. muelleri и H. akashiwo - на длинах волн 683, 682 и 681 нм соответственно. В то же время разница между максимумами флуоресценции у P. purpureum и H. akashiwo составляет 7 нм. Таким образом, положение максимума ЛИФ в диапазоне длин волн 680-690 нм может быть использовано как информативный признак для идентификации культур по спектру флуоресценции.

В данной работе динамика спектров флуоресценции дополнительных пигментов P. purpureum и Ch. salina в зависимости от температур не рассматривалась.

Исследования зависимости спектров ЛИФ хлорофилла-^ шести разных культур микроводорослей от температуры проводились по описанной выше методике. Полученные

- режим 1; V - режим 2; А - режим .

Рис. 3. Зависимость интенсивности ЛИФ хлорофилла в диапазоне длин волн 680-690 нм от температуры в режиме нагрев-охлаждение-нагрев для культур микроводорослей: а - N. maculata; б - P. purpureum; в - Ch. salina; г - Ch. muelleri; д - H. akashiwo; е - T. lutea. Режимы изменения температуры: 1 - нагрев от 20 до 30 °С; 2 - охлаждение от 30 до 5 °С, 3 - нагрев от 5 до 30 °С

значения интенсивностей ЛИФ культур микроводорослей при разных температурах в режиме нагрев-охлаждение-нагрев представлены на рис. 3.

В работе [4] показано, что изменение интенсивности ЛИФ хлорофилла можно описать выражением:

I

где 10 - интенсивность флуоресценции без температурного тушения (с учетом всех нормировок); а - температурный коэффициент флуоресценции.

Выражение (4) использовалось как аппроксимирующая функция полученных значений зависимости интенсивности ЛИФ, изображенная на рис. 3 сплошной линией. Максимальные отклонения экспериментальных данных от кривых, рассчитанные методом наименьших квадратов (я), и значения температурного коэффициента флуоресценции (а) представлены в таблице.

Судя по значению коэффициента a для исследованных образцов, водоросли, представленные на рис. 3, можно условно разделить на три группы: 1 - N. maculata (-0,01); 2 -P. purpureum, Ch. salina и T. lutea (-0,0073); 3 -Ch. muelleri и H. akashiwo (-0,0035). Таким образом, микроводоросли имеют разные значения коэффициента a, поэтому этот коэффициент может быть использован как второй информативный признак для идентификации видов микроводорослей.

Выводы

В ходе экспериментов была показана принципиальная возможность идентификации культур микроводорослей фитопланктона по характеристикам спектров ЛИФ.

Для исследованных культур микроводорослей длина волны максимума ЛИФ в диапазоне длин волн 680-690 нм при температуре 22 °С имеет разное значение, что позволяет использовать ее в качестве информативного признака для идентификации видов по спектрам их флуоресценции.

Для всех типов исследованных культур микроводорослей зависимость интенсивности ЛИФ хлорофилла-а от температуры среды хорошо аппроксимируется экспоненциальной функцией. Значение температурного коэффициента флуоресценции a находится в диапазоне от -0,0035 до -0,01 и различается для разных культур. Это позволяет использовать температурный коэффициент флуоресценции a в качестве еще одного информативного признака для идентификации видов по их спектрам флуоресценции.

ЛИТЕРАТУРА

1. Алехина Н.Д., Балнокин Ю.В., Гавриленко Г.Ф. и др. Физиология растений: учебник для студентов вузов / под ред. И.П. Ермакова. М.: Изд. центр «Академия», 2005. 640 с.

2. Букин О.А., Пермяков М.С., Майор А.Ю., Павлов А.Н., Скороход Г.В., Чекункова В.В., Царева О.С., Тархова Т.И. Связь параметров спектров флуоресценции морской воды, возбуждаемых лазерным излучением, с типом морских вод // Оптика атмосферы и океана. 2000. Т. 13, № 11. C. 1011-1014.

3. Вознесенский С.С., Гамаюнов Е.Л., Попик А.Ю., Коротенко А.А. Оптоволоконный флуориметр для измерения параметров фотосинтеза фитопланктона // Приборы и техника эксперимента. 2014. Т. 3. C. 97-103.

4. Гамаюнов Е.Л., Попик А.Ю. Зависимость флуоресценции фитопланктона от внешних воздействий // Биофизика. 2015. Т. 60, № 1. C. 143-151.

5. Гамаюнов Е.Л., Вознесенский С.С., Коротенко А.А., Попик А.Ю. Система мониторинга воды с погружаемым модулем // Приборы и техника эксперимента. 2012. Т. 2. C. 135-143.

6. Кульчин Ю.Н., Вознесенский С.С., Гамаюнов Е.Л., Коротенко А.А., Попик А.Ю., Майор А.Ю. Комплексный контроль состояния морских акваторий оптическими методами. Ч. 4. Оптоволоконная система измерения концентрации фитопланктона // Оптика атмосферы и океана. 2013. Т. 26, № 1. C. 40-45.

7. Маторин Д.Н., Осипов В.А., Яковлева О.В., Горячев С.Н., Рубин А.Б. Об использовании зависимостей параметров флуоресценции хлорофилла от освещенности для изучения фотосинтетической активности фитопланктона // Вода: химия и экология. 2011. Т. 4. C. 44-49.

8. Пат. 2426779 Российская Федерация, МПК C12N 1/12, МПК C12N 11/02, МПК C12Q 1/06, МПК G01N 33/18. Биосенсор на основе клеток микроводорослей для определения тяжелых металлов и гербицидов в водных системах / Е.Н. Ефременко, А.В. Холстов, Е.Н. Воронова, И.В. Конюхов, С.И. Погосян, А.Б. Рубин; Мин-во образования и науки РФ, МГУ им. М.В. Ломоносова. № 2009141878/10; заявл. 13.11.2009; опубл. 20.08.2011, Бюл. № 23. 15 с.

9. Попик А.Ю., Гамаюнов Е.Л. Восстановление картины распределения фитопланктона по глубине при измерениях флуоресцентными методами // Материалы III Междунар. науч.-практ. конф. «Академическая наука -проблемы и достижения», Москва, 20-21 февр. 2014 г. М., 2014. Вып. 1. C. 190.

10. Guillard R.R.L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates // Culture of Marine Invertebrate Animals. N.Y.: Plenum Press, 1975. P. 26-60.

Результаты аппроксимации полученных значений зависимости интенсивности ЛИФ от температуры

Микроводоросль s a

N. maculata 0,13 -0,01

P. purpureum 0,07 -0,007

Ch. salina 0,07 -0,007

Ch. muelleri 0,03 -0,004

H. akashiwo 0,12 -0,003

T. lutea 0,09 -0,008