Способ масс-спектрометрического анализа циклоспоринов
METHOD FOR MASS SPECTROMETRIC ANALYSIS OF CYCLOSPORINS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области аналитической химии и касается способа анализа изомеров циклических пептидов, содержащих β-гидрокси-N-метиламинокислоты, в том числе иммуносупрессора циклоспорина А и его изомера изоциклоспорина А, а также других циклоспоринов.
Предшествующий уровень техники
Среди циклических пептидов, содержащих β-гидрокси-N-метиламинокислоты, наибольшее внимание привлекает циклоспорин А - природный циклический ундекапептид, применяющийся в качестве иммуносупрессора в трансплантации органов и костного мозга. Одной из самых распространенных примесей в препаратах циклоспорина А является изоциклоспорин А, представляющий собой циклический депсипептид, образующийся в результате N-O-ацильного сдвига, возможного для циклических пептидов, содержащих β-гидрокси-N-метиламинокислоты [Bonifacio, F.N. et al. J. Pharm.Biomed.Anal., 2009, 49, 540-546]. Большинство ранее использованных подходов для контроля качества и анализа перпаратов циклоспорина А, а также определения его концентрации in vivo, основаны на различных разновидностях жидкостной хроматографии [Shao Y. et al. J.Anal.Sci., 2016, 6, 23-32; Malaekeh-Nikouei B. et al. Chromatographia, 2011, 73, 817-821]. Методы хроматографического анализа и разделения загрязнений фармакологических композиций, содержащих циклоспорин А, продолжают развиваться. Например, в 2019 году запатентован новый подход к контролю загрязнений в глазном геле на основе циклоспорина А [Patent CN108254457A, EP3502683A1, US 2019194258 A1, 2019]. Недостатком хроматографического подхода к различению циклоспорина А и его изомера изоциклоспорина А заключается в необходимости получения стандартов анализируемых соединений для валидации методики при ее применении.
+
Существенной сложностью при масс-спектрометрическом различении циклоспорина А и его изомера изоциклоспорина А является спонтанная перегруппировка циклоспорина А в его изомер в процесса эксперимента [Jegorov A.,  J.Mass.Spectrom., 2001, 36, 633-640]. Масс-спектрометрический анализ циклоспоринов и их изомеров, в течение долгого времени проводившийся различными группами исследователей с привлечением разнообразных методов ионизации, фрагментации и детекции заряженных частиц, показал, что анализ фрагментации ионов [M+H] циклоспорина А и его изомера не позволяет различить эти соединеиия [ Org.Mass.Spec., 1993, 28, 1440; Kuzma M., J.Mass.Spectrom., 2002, 37. 292]. Предложенный в 2014 году метод различения циклоспорина А и изоциклоспорина А путем тандемной хроматографии и масс спектрометрии с постколоночным добавлением солей двухвалентных металлов оказался эффективен [Cirigliano A.M, Cabrera G.M. Rapid.Commun.Mass.Spectrom., 2014, 28, 465-470], однако требует преодоления существенных технических сложностей и внесения модификаций в стандартное оборудование для хроматомасс-спектрометрии, что делает его затратным. В 2020 году был предложен метод спектроскопии дифференциальной подвижности в сочетании с масс-спектрометрией для разделения изомеров и конформеров дважды протонированных аналогов циклоспорина [BrianLam K. H., YvesLeBlanc J. C., LarryCampbell J. Anal. Chem., 2020, 92, 11053−11061], однако для него также требуется специализированное оборудование.
Раскрытие изобретения
2+
2+
+
Сущность изобретения заключается в способе различения циклических пептидов, содержащих - β-гидрокси-N-метиламинокислоты и изомерных депсипептидов, образующихся в результате N-O-ацильного сдвига, в частности циклоспорина А и изоциклоспорина А, за счет изучения фрагментации CID дважды протонированных молекул [M+2H]. Авторами изобретения обнаружено, что спектры фрагментации дважды протонированных молекул [M+2H], в отличие от спектров фрагментации протонированных молекул пептида [M+H], различаются для циклического пептида и изомерного депсипептида за счет подавления спонтанной перегруппировки в депсипептид.
Техническим результатом заявляемого изобретения является качественное различение циклоспорина А и его изомера изоциклоспорина А. Найденный метод может применяться как для анализа индивидуальных препаратов циклических пептидов и изомерных им депсипептидов, так и при хроматомасс-спектрометрическом изучении смесей этих соединений. Также следует отметить более простое аппаратное оформление данного метода в сравнении с ранее описанными подходами: он не требует предварительного получения стандартных образцов соединений и внесения конструктивных изменений в стандартное масс-спектрометрическое оборудование. Кроме того, для всех подобных соединений наблюдается заметно более высокая интенсивность двухзарядных ионов по сравнению с однозарядными благодаря наличию основной боковой цепи в β-гидрокси-N-метиламинокислотах, таким образом описанный метод может обеспечить более высокую чувствительность по сравнению с масс-спектрометическими подходами, включающими регистрацию или фрагментацию однозарядных ионов анализируемых соединений.
Изобретение поясняется подробным описанием, примером осуществления и иллюстрациями, на которых изображено:
Фиг. 1 Структурные формулы циклоспорина А и изоциклоспорина А
Фиг. 2 Масс-спектры циклоспорина А и изоциклоспорина А
+
Фиг. 3 Спектры фрагментации однозарядных ионов [M+H] циклоспорина А и изоциклоспорина А
2+
Фиг. 4 Спектры фрагментации двухзарядных ионов [M+2H] циклоспорина А и изоциклоспорина А
Фиг. 5 Структурные формулы циклоспорина С и изоциклоспорина С
Фиг. 6 Масс-спектры циклоспорина С и изоциклоспорина С
2+
Фиг. 7 Спектры фрагментации двухзарядных ионов [M+2H] циклоспорина С и изоциклоспорина С
Осуществление изобретения
2+
Для качественного анализа циклических пептидов регистрируют масс-спектр с помощью ионизации электрораспылением (ESI) с последующей детекцией любым масс-спектрометрическим детектором в режиме регистрации положительных ионов с возможностью регистрации фрагментации ионов (MS/MS), осуществляют отбор ионов-прекурсоров, соответствующих по соотношению массы и заряда ионам [M+2H], представляющим собой дважды протонированные молекулы анализируемых соединений, затем регистрируют характеристический набор дочерних ионов, в том числе и двухзарядных.
Пример 1 Анализ циклоспорина А и его изомера - изоциклоспорина А.
Изобретение иллюстрируется следующим примером масс-спектрометрического анализа циклоспорина А и его изомера - депсипептида изоциклоспорина А.
Анализируемые образцы массой 100 мкг растворили в 200 мкл метанола для ВЭЖХ (MeOH, “ Biosolve ”). Объем инжектирования составлял 2 μл. Образец пропускали через колонку YMC-Triart C18 (YMC) (50×2.1 мм, размер частиц 1.9 μм) при 30°C. В качестве элюента А использовали деионизированную воду (тридистиллят) с добавкой муравьиной кислоты (0.1% LC/MS grade formic acid, HCOOH, “Honeywell”), элюент В представлял собой ацетонитрил с такой же добавкой кислоты (LC/MS grade acetonitrile, MeCN, “Biosolve”). Колонку элюировали при 0.35 мл/мин: 0-10 мин 98:2 → 2:98 (A:B); 10-12 мин 2:98 → 98:2 (A:B).
Условия источника ионизации электрораспылением (ESI) в режиме положительных ионов были следующими: температура, 335°C; давление распылителя, 30 psi (N2); Поток газа-осушителя, 10 л/мин (N2); напряжение на капилляре, -3500 V. Параметры регистрации были следующими: MS1 Scan range, m/z 420-2200 Да (8100 Да/сек). Параметры MS2: Scan range, m/z 50-2200 Da (8100 Да/сек); количество ионов-прекурсоров, 3; порог отбора на MS2, 2×106; амплитуда фрагментации, 1.00 V. Программное обеспечение: “Chemstation for LC 3D systems” (rev. B.01.03 SR1) (Agilent Technologies, США), “6300 Series Ion Trap LCMS Software” (6300 Series TrapControl v. 6.2 и DataAnalysis for 6300 Series Ion Trap LC/MS v. 3.4, Bruker Daltonik GmbH) было использовано для просмотра, процессинга (обработки), деконволюции и анализа получаемых спектральных данных.
+
2+
Масс-спектры образцов, содержащих циклоспорин А и изоциклоспорин А содержали как однозарядные ионы [M+H] c m/z 1203 Да, так и двухзарядные дважды протонированные ионы [M+H] с m/z 602 Да и более высокой интенсивностью (Фиг. 2). При этом спектры фрагментации MS/MS однозарядных ионов для циклоспорина А и изоциклоспорина А были полностью идентичны (Фиг. 3).
Для образцов, содержащих циклоспорин А получали спектр фрагментации двухзарядного иона с массой 602 Да (Фиг. 4, верхний спектр), содержащий ключевые характеристические дочерние ионы с высокой интенсивностью: двухзарядные ионы с m/z 546 Да и 482 Да; однозарядные ионы с m/z 907 Да (80-100%), 935 Да (40-60%).
Для образцов, содержащих изоциклоспорин A, получали спектр фрагментации двухзарядного иона с массой 602 Да (Фиг 4, нижний спектр), содержащий ключевые характеристические дочерние ионы с высокой интенсивностью: двухзарядные ионы с m/z 593 Да и 550 Да, однозарядные ионы с m/z 1076 Да (25-50%), 1058 Да (20-40%), а также серию других однозарядных ионов с m/z в интервале 900-1000 Да, имеющих невысокую интенсивность (10-30%) и массовый инкремент в 18 единиц массы, как правило отвечающий потере воды (пары 963-945 Да, 1005-987 Да, 934-916 Да).
Пример 2. Анализ циклоспорина С и его изомера - изоциклоспорина С.
Анализируемые образцы массой 100 мкг растворили в 200 мкл метанола для ВЭЖХ (MeOH, “ Biosolve ”). Объем инжектирования составлял 2 μл. Образец пропускали через колонку YMC-Triart C18 (YMC) (50×2.1 мм, размер частиц 1.9 μм) при 30°C. В качестве элюента А использовали деионизированную воду (тридистиллят) с добавкой муравьиной кислоты (0.1% LC/MS grade formic acid, HCOOH, “Honeywell”), элюент В представлял собой ацетонитрил с такой же добавкой кислоты (LC/MS grade acetonitrile, MeCN, “Biosolve”). Колонку элюировали при 0.35 мл/мин: 0-10 мин 98:2 → 2:98 (A:B); 10-12 мин 2:98 → 98:2 (A:B).
Условия источника ионизации электрораспылением (ESI) в режиме положительных ионов были следующими: температура, 335°C; давление распылителя, 30 psi (N2); Поток газа-осушителя, 10 л/мин (N2); напряжение на капилляре, -3500 V. Параметры регистрации были следующими: MS1 Scan range, m/z 420-2200 Да (8100 Да/сек). Параметры MS2: Scan range, m/z 50-2200 Da (8100 Да/сек); количество ионов-перкурсоров, 3; порог отбора на MS2, 2×106; амплитуда фрагментации, 1.00 V. Программное обеспечение: “Chemstation for LC 3D systems” (rev. B.01.03 SR1) (Agilent Technologies, США), “6300 Series Ion Trap LCMS Software” (6300 Series TrapControl v. 6.2 и DataAnalysis for 6300 Series Ion Trap LC/MS v. 3.4, Bruker Daltonik GmbH) было использовано для просмотра, процессинга (обработки), деконволюции и анализа получаемых спектральных данных.
+
2+
Масс-спектры образцов, содержащих циклоспорин С и изоциклоспорин С содержали как однозарядные ионы [M+H] c m/z 1219 Да, так и двухзарядные дважды протонированные ионы [M+H] с m/z 610 Да и более высокой интенсивностью (Фиг. 6).
Для образцов, содержащих циклоспорин С получали спектр фрагментации двухзарядного иона с массой 610 Да (Фиг.7, нижний спектр), содержащий ключевые характеристические дочерние ионы с высокой интенсивностью: двухзарядный ион с m/z 554 Да; однозарядные ионы с m/z 923 Да (80-100%), 941 Да (40-60%).
Для образцов, содержащих изоциклоспорин С, получали спектр фрагментации двухзарядного иона с массой 610 Да (Фиг. 7, верхний спектр), содержащий ключевые характеристические дочерние ионы с высокой интенсивностью: двухзарядные ионы с m/z 601 Да и 559 Да, однозарядные ионы с m/z 1092 Да (25-50%), 1074 Да (20-40%), а также серию других однозарядных ионов с m/z в интервале 800-1000 Да, имеющих невысокую интенсивность (10-30%) и массовый инкремент в 18 единиц массы, как правило отвечающий потере воды (например, пары 805-823 Да, 922-940 Да).
Промышленная применимость
Изобретение может быть использовано для контроля примесей в лекарственных препаратах на основе циклоспорина А, а также для изучения других циклических пептидов, содержащих - β-гидрокси-N-метиламинокислоты. В настоящих материалах заявки было представлено предпочтительное осуществление заявленного изобретения, которое не должно использоваться как ограничивающее иные, частные воплощения его реализации, которые не выходят за рамки испрашиваемого объема правовой охраны и являются очевидными для специалистов в соответствующей области техники.