СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АХОЕНА
METHOD OF PRODUCING AJOENE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способу получения ахоена и к композиции, содержащей ахоен, полученный этим способом. Более конкретно, настоящее изобретение относится к способу получения ахоена из аллицина с использованием твердофазного полимерного субстрата и к композиции, содержащей ахоен, полученный способом по настоящему изобретению.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Чеснок, также известный как Allium sativum, - это вид растений из рода луков, который традиционно используют во всем мире как кулинарную траву или нутрицевтический пищевой продукт. Чесноку приписывают многочисленные лечебные свойства при лечении или профилактике различных метаболических нарушений или инфекционных болезней. Кроме того, в течение многих тысяч лет его использовали в народной медицине.
Чеснок, в свежем или измельченном виде, содержит различные типы производных, которые включают серосодержащие соединения, способствующие его характерному запаху и вкусу, и соединения, не содержащие серы. Аллицин считают одним из основных химических соединений, содержащихся в чесноке, которое отвечает за большую часть запаха и биологическую активность чеснока. Аллицин является химически нестойким, бесцветным или соломенного цвета маслом, образующимся из его предшественника аллиина [(+)(S-аллил-L-цистеина сульфоксид)] с участием фермента аллииназы. Интактный зубчик чеснока не содержит аллицина, а содержит его лишенный запаха предшественник аллиин. Поскольку аллиин и аллииназа обнаруживают в различных частях зубчика чеснока, аллиин преобразуется в аллицин только в том случае, если разрезание или измельчение зубчика приводит к выделению аллииназы и обеспечивает ее контакт с аллиином. Аллицин является нестойким и летучим и естественным образом может быть преобразован примерно в 15 различных метаболитов, в зависимости от среды, в которой он преобразуется. Эти метаболиты включают диаллилдисульфид, диаллилтрисульфид, винилдитиины, ахоен и другие. Способ получения аллицина с высоким выходом и объемом описан в публикации ЕР 1404853 А1, содержание которой частично включено в данную публикацию посредством ссылки.
Ахоен - один из важных метаболитов чеснока, который в настоящее время представляет интерес во многих областях деятельности, включая лекарственные препараты для людей и животных. На предшествующем уровне техники документировано, что ахоен обладает широким диапазоном лечебных свойств, включающих антиоксидантные, антитромботические, антимикробные широкого спектра действия, профилактику дрожжевой инфекции и ингибирование регулируемых генами дистанционных микроб-микробных взаимодействий («кворум-сенсинг»; от англ.: quorum sensing). Однако исследование и, соответственно, применение ахоена для этих целей было прекращено, поскольку существующие способы получения ахоена обладают низкой селективностью в отношении ахоена. Поэтому получение ахоена является дорогим и возможно лишь с относительно низкими выходами.
На предшествующем уровне техники описано мало ранее разработанных технологий, относящихся к способу получения ахоена. Например, в Патенте US 5612077(A) описан способ получения мацерата, преимущественно содержащего Z-ахоен, с использованием пищевого масла, но в малых объемах и с низкой концентрацией. В другом Патенте US 5741932(A) описан способ получения ахоена с использованием циклодекстрина, который является сложным многостадийным способом и также позволяет получить лишь малые объемы ахоена с низкой концентрацией. Другие подходы к получению ахоена из аллицина, описанные, например, в международной публикации WO 2010/100486 и в публикации Block et al. Am Chem. Soc., 1986, 108 (22), требуют использования больших объемов летучих углеводородных растворителей, которые могут быть неподходящими для использования при производстве пищевых продуктов или травяных экстрактов. Кроме того, подход, включающий экстракцию ахоена растворителем, является трудоемким и дорогим.
С учетом различных лекарственных или терапевтических полезных свойств ахоена и ахоенсодержащей композиции, желательным для промышленности является обеспечение усовершенствованного и инновационного способа получения ахоена с устранением недостатков существующих технологий.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Одним из объектов настоящего изобретения является обеспечение экономически эффективного способа получения ахоена из его предшественника аллицина, который позволяет получить высокий выход и большие объемы с разумными затратами.
Другим объектом настоящего изобретения является разработка инновационного способа получения ахоена или ахоенсодержащих композиций, который включает переход от традиционной технологии экстракции с использованием растворителей к твердофазной экстракции.
Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение способа получения ахоена или ахоенсодержащих композиций, в котором в идеале не используются растворители или требуется меньшее количество летучих углеводородных растворителей, за счет чего он является менее трудоемким и снижает производственные расходы.
Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение способа получения ахоена или ахоенсодержащих композиций, который пригоден для массового получения ахоена для дальнейшего использования в крупномасштабном или промышленном производстве ахоенсодержащих продуктов.
Следующим объектом настоящего изобретения является обеспечение ахоена или ахоенсодержащих композиций пищевого качества за счет способа, в котором не используются растворители или требуется меньшее количество летучих углеводородных растворителей, что обеспечивает ахоен или ахоенсодержащие композиции, которые являются безопасными и/или пригодными для переработки в различные пищевые или медицинские продукты.
По меньшей мере один из указанных объектов настоящего изобретения осуществлен, полностью или частично, за счет одного или более вариантов настоящего изобретения.
В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения ахоена из аллицина с использованием твердофазного полимерного субстрата, включающий стадии нагревания аллицина или раствора аллицина таким образом, что по меньшей мере часть аллицина преобразуется в ахоен с получением раствора ахоена, и выделения ахоена из раствора ахоена, причем по меньшей мере одну из стадий нагревания или выделения выполняют с использованием твердофазного полимерного субстрата.
Твердофазный полимерный субстрат может быть стационарной фазой хроматографической колонки, например - хроматографической колонки для твердофазной экстракции (SPE; от англ.: solid phase extraction), или он может быть диспергирован в свободно текучей форме непосредственно в жидкости. Полимерным субстратом предпочтительно является микропористая смола, более предпочтительно - полистирол-дивинилбензольная (DVB; от англ.: divinylbenzene) сополимерная смола.
Способ получения ахоена из аллицина с использованием твердофазного полимерного субстрата может дополнительно включать стадию удержания аллицина или раствора аллицина на полимерном субстрате перед проведением стадии нагревания внутри полимерного субстрата. Предпочтительно, способ дополнительно включает стадию удаления водорастворимых компонентов и неполярных компонентов из раствора аллицина, так что полимерным субстратом удерживается по существу чистый аллицин. Водорастворимые компоненты можно удалить посредством пропускания через полимерный субстрат полярного водного растворителя, тогда как неполярные компоненты можно удалить посредством пропускания через полимерный субстрат неполярного растворителя. Удаление водорастворимых и неполярных компонентов предпочтительно приводит к удержанию по существу чистого аллицина полимерным субстратом. Аллицин, удерживаемый на полимерном субстрате, может иметь степень чистоты, равную по меньшей мере 50% или по меньшей мере 60% или более.
Аллицин или раствор аллицина можно получить из натурального, синтетического или полусинтетического источника. Раствор аллицина предпочтительно содержит от 0,1 массо-объемного % до 10 массо-объемных %.
Стадию нагревания для преобразования аллицина в ахоен можно провести внутри полимерного субстрата с дополнительной твердой опорой или без дополнительной твердой опоры в газовой или жидкой среде с термостатическим регулированием или в теплоизолированной камере. Используемым газом или жидкостью предпочтительно является углеводородный растворитель, вода или их комбинация. Альтернативно, стадию нагревания для преобразования аллицина в ахоен можно провести вне полимерного субстрата в растворителе. Растворителем предпочтительно является спирт, простой эфир, кетон или комбинация двух или более из указанных растворителей.
Стадию нагревания можно провести в предварительно заданном температурном диапазоне от 15°С до 90°С. Предпочтительно, предварительно заданный температурный диапазон лежит в пределах от 30°С до 80°С. В результате стадии нагревания по меньшей мере часть аллицина преобразуется в ахоен с образованием раствора ахоена. По меньшей мере часть аллицина может быть равна по меньшей мере 10 массо-объемным %, предпочтительно - по меньшей мере 20 массо-объемным % или по меньшей мере 30 массо-объемным %, более предпочтительно - по меньшей мере 40 массо-объемным %. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере 50 массо-объемных % аллицина преобразуется в ахоен.
2
Стадию выделения ахоена после преобразования можно провести при предварительно заданном давлении с использованием неводного полярного растворителя, жидкого или сверхкритического диоксида углерода (CO). Предпочтительно, способ получения ахоена из аллицина с использованием полимерного субстрата дополнительно включает стадию концентрирования ахоена с получением обогащенного ахоеном масла после стадии выделения. Обогащенное ахоеном масло имеет коричневый цвет. Предпочтительно, обогащенное ахоеном масло содержит от 10 массо-объемных % до 30 массо-объемных % ахоена.
Во втором аспекте настоящее изобретение обеспечивает ахоен или композицию, содержащую ахоен, полученный способом по настоящему изобретению.
Специалист в данной области техники легко поймет, что настоящее изобретение хорошо адаптировано для осуществления объектов изобретения и получения указанных и присущих настоящему изобретению результатов и преимуществ. Описанные в данной публикации варианты осуществления настоящего изобретения не ограничивают объем настоящего изобретения.
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение будет описано согласно предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения и со ссылкой на прилагаемое описание. Однако следует понимать, что ограничение описания предпочтительными вариантами осуществления настоящего изобретения предназначено исключительно для облегчения обсуждения настоящего изобретения, и предполагается, что специалисты в данной области техники могут разработать различные модификации без отклонения от объема прилагаемой формулы изобретения.
Настоящее изобретение раскрывает способ получения ахоена из аллицина с использованием твердофазного полимерного субстрата, включающий стадии нагревания аллицина или раствора аллицина таким образом, что по меньшей мере часть аллицина преобразуется в ахоен с образованием раствора ахоена, и выделения ахоена из раствора ахоена, причем по меньшей мере одну из стадий нагревания или выделения проводят с использованием твердофазного полимерного субстрата.
Присутствие аллицина и/или ахоена в реакционной смеси способа и преобразование аллицина в ахоен в способе можно обнаружить или контролировать с использованием анализа посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ, англ. аббревиатура - HPLC, от high performance liquid chromatography). Основная процедура аналитического способа ВЭЖХ известна на предшествующем уровне техники, тогда как конкретные параметры ВЭЖХ, которые можно использовать в способах по настоящему изобретению, указаны в Примерах с 1 по 3. В Примере 1 указаны параметры, использованные в способе обращенно-фазовой ВЭЖХ для калибровки и определения аллицина с использованием стандартного раствора аллицина. В Примере 2 указаны параметры использованные в способе обращенно-фазовой ВЭЖХ для калибровки и определения ахоена с использованием стандартного раствора ахоена. Способ нормально-фазовой ВЭЖХ для определения E/Z изомеров ахоена, калиброванной с использованием стандартного раствора ахоена, подробно описан в Примере 3.
Настоящее изобретение позволяет получить ахоен или композицию, содержащую ахоен, с использованием твердофазного полимерного субстрата вместо растворителей, в частности - углеводородных растворителей.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения способ получения ахоена из аллицина с использованием твердофазного полимерного субстрата включает минимальное использование углеводородных растворителей или не включает использования углеводородных растворителей.
Твердофазный полимерный субстрат предпочтительно является микропористой смолой. Под смолой понимают мелкий порошок или сферические гранулы, состоящие из органических полимеров и имеющие микро- или мезопористую структуру и специфические функциональные группы, пригодные для абсорбции специфических соединений. Более предпочтительно, микропористая смола является полистирол-DVB-сополимерной смолой. Наиболее предпочтительно, полимерный субстрат является гиперсшитой гидроксилированной полистирол-DVB-сополимерной смолой. Однако другие типы смол, обладающие сходными химическими и физическими свойствами, например - гидрофобными свойствами, также можно использовать в качестве полимерного субстрата по настоящему изобретению. Используемая смола может иметь форму тонкого порошка или сферических гранул. Предпочтительно, смола имеет микро- или мезопористую структуру и способна влиять на сорбцию аллицина и либо на последующее преобразование в ахоен, либо на экстракцию в растворимую органическую фазу. Предпочтительно смола имеет стабильно развитую жесткую пористую структуру.
2
Выбранную микропористую смолу можно синтезировать из ее мономеров или закупить. Чтобы получить смолы с высокой механической прочностью и сложной пористой структурой с большой площадью поверхности, как способ выбора можно использовать суспензионную полимеризацию вследствие легкости ее крупномасштабного применения. Общий принцип, используемый для синтеза этих типов полимерных смол, может включать полимеризацию смеси стирола и DVB со смесью сомономеров и подходящим органическим растворителем (разбавителем или порообразователем). Более конкретно, удаление растворителя или порообразователя в конце полимеризации приводит к тому, что из смолы формируются гранулы, которые являются твердыми, но непрозрачными. Полученная таким образом полимерная матрица является гетерогенной или неоднородной. Важнее всего то, что эти материалы могут иметь гораздо большие площади поверхности в сухом состоянии, чем смолы гелевого типа, по результатам измерения в тесте Брунауэра-Эммета-Теллера (BET; от англ.: Brunauer-Emmett-Teller), которые в характерном случае составляют около 1000 м/г. Что касается ригидности смол такого типа, то они не нуждаются в набухании в растворителе для обеспечения доступа во внутреннее пространство, поскольку они имеют стабильную пористую структуру и сеть пор, размеры которых можно изменять за счет выбора точных условий, используемых в процессе полимеризации.
Гиперсшитая гидроксилированная полистирол-DVB смола, например - ISOLUTE ENV+ производства компании Biotage, которая является типом полимерной смолы со сходными молекулярной структурой и свойствами, коммерчески доступна, и ее можно использовать в настоящем изобретении. Полистирол-DVB можно также синтезировать с использованием обычной процедуры, например - подробно описанной в Примере 4. Предпочтительно, процедура включает использование фланцевой колбы, обратного холодильника и водяной бани в атмосфере азота. Мономерные материалы для полистирол-DVB смолы, такие как стирол, п-дивинилбензол и винилпиридин, можно смешать с одним или более поверхностно-активными веществами, добавляемыми к смеси на различных стадиях. Используемым поверхностно-активным веществом может быть Span 80, сульфат натрия, додецилсульфат натрия (SDS; от англ.: sodium dodecyl sulphate) или комбинация двух или более из них. Их используют для поддержания дисперсии капелек в растворе и для обеспечения размера частиц смолы. Можно добавить антиоксидант, такой как гидрохинон, для гашения свободных радикалов. Реакцию полимеризации смолы можно инициировать с использованием инициатора, которым предпочтительно является бензоилпероксид. Также можно использовать другие инициаторы, такие как азобисизобутиронитрил (AIBN; от англ.: azobisisobutyronitrile), бутилпероксид или персульфат натрия, причем в соответствии с типом используемого инициатора необходимо использовать подходящее поверхностно-активное вещество. Реакционным растворителем, используемым в полимеризационной смеси, может быть толуол, циклогексанол, ксилол или другие.
Температура реакции синтеза смолы может лежать в диапазоне от примерно 70°С до примерно 90°С, предпочтительно - может быть равной примерно 80°С. Процесс полимеризации может протекать от примерно 12 часов до 48 часов, предпочтительно - примерно 24 часа. Смолу можно собрать и очистить, а затем высушить при температуре, лежащей в диапазоне от примерно 70°С до примерно 90°С, предпочтительно - при примерно 80°С, в течение примерно 5 часов. Затем смолу можно рассортировать по размерам и собрать гранулы с желаемым размером частиц, например - около 1 мм. У собранной смолы предпочтительно определяют физические параметры с использованием ВЕТ-теста и электронной микроскопии.
Как подробно описано в Примерах 5 и 6, основную процедуру из Примера 4 можно повторить для получения большего количества смолы, а также смолы с различными размерами частиц. Подходящий размер частиц смолы может лежать в диапазоне диаметров от примерно 75 мкм до примерно 1200 мкм. Размер частиц можно определить с использованием ряда стандартных способов, например - с помощью анализатора частиц. Варианты способов синтеза и анализа смолы дополнительно описаны в Примерах с 4 по 15.
Как указано в настоящем описании выше, в качестве предшественника в способе получения ахоена по настоящему изобретению используют аллицин. Использование аллицина из различных источников для получения ахоена более подробно описано в Примерах с 16 по 24. Соответственно, аллицин или раствор аллицина можно получить из природного, синтетического или полусинтетического источника. Более предпочтительно, аллицин получают из способа получения с высоким выходом, который является полусинтетическим источником, как описано в Примере 16. В способе получения аллицина с высоким выходом предшественник аллиин, полученный из натурального источника чеснока, посредством ферментативной реакции с участием аллииназы преобразуют с получением аллицина.
В Примерах 21 и 22 описано использование аллицина, полученного синтетическим способом. Как подробно описано в Примере 21, синтетический аллицин можно получить посредством окисления диаллилдисульфида технического качества перуксусной кислотой. Способ получения аллицина хорошо известен из предшествующего уровня техники. Однако перуксусная кислота может привести к сохранению больших количеств уксусной кислоты в реакционном растворе, что требует дополнительных стадий и затрат для ее удаления. Поэтому более практичным способом синтетического получения аллицина может быть окисление диаллилсульфида технического качества в этаноле водным раствором пероксимоносульфата калия, как описано в Примере 22.
С другой стороны, аллицин также можно получить непосредственно из природного источника посредством измельчения или мацерации свежего чеснока с получением чесночного сока, содержащего аллицин, так, как описано в Примере 23. В этом способе может оказаться невозможным обеспечить высокий выход аллицина. Специалист в данной области техники должен понимать, что высокая концентрация аллицина в растворе аллицина приведет к получению более высокого выхода ахоена в способе получения ахоена. Предпочтительно, раствор аллицина содержит от примерно 0,1 массо-объемного % до примерно 10 массо-объемных % аллицина. В характерном случае концентрация аллицина лежит в диапазоне от примерно 0,5 массо-объемного % до примерно 2,5 массо-объемных %.
Исходный раствор аллицина может содержать по меньшей мере 1000 частей/миллион аллицина. Предпочтительно, раствор аллицина содержит по меньшей мере 10000 частей/миллион аллицина. Раствор аллицина, полученный из природного или полуприродного источника, в характерном случае содержит менее примерно 25000 частей/миллион аллицина. Однако аллицин, полученный из синтетического источника, может обеспечить возможность получения высокой концентрации, превышающей 100000 частей/миллион. Альтернативно, можно также провести процесс предварительной обработки, чтобы сконцентрировать аллицин, полученный из природного или полуприродного источника, для получения раствора аллицина с такой высокой концентрацией.
Для того чтобы обеспечить высокую степень чистоты аллицина, можно также дополнительно провести стадию очистки аллицина, например, описанную в Примере 18, после определения содержания аллицина посредством ВЭЖХ. Обогащенные аллицином фракции, выявленные посредством ВЭЖХ, можно высушить и сконцентрировать с использованием сушильного агента, например - сульфата магния, и профильтровать перед его выпариванием с использованием испарителя. Калибровку аллицина с использованием стандартизованного раствора аллицина можно выполнить способом ВЭЖХ, как описано в Примере 1.
Способ получения ахоена из аллицина с использованием твердофазного полимерного субстрата можно начать со стадии удержания аллицина или раствора аллицина на полимерном субстрате.
Эту стадию можно осуществить посредством пропускания аллицина или раствора аллицина через полимерный субстрат, которым может быть смола, так что аллицин удерживается на твердофазном полимерном субстрате. Этот процесс позволяет удалить более 90% содержания воды из раствора аллицина. Смола может быть стационарной фазой хроматографической колонки, например - SPE хроматографической колонки. В Примере 16 описан один из иллюстративных способов загрузки аллицина в колонку. Как описано в Примере 16, смолу можно загрузить в колонку и очистить водой. Затем аллицин пропускают через слой смолы, предпочтительно его течению способствуют перекачивающие устройства, например - перистальтический насос, с желаемой объемной скоростью потока. Предпочтительно, объемная скорость потока в колонке лежит в диапазоне от примерно 20 мл/мин до примерно 50 мл/мин, предпочтительно - равна примерно 30 мл/мин, причем можно обеспечить течение раствора аллицина против силы тяжести. Полярность аллицина является низкой, поэтому он способен удерживаться на смоле. Способ ВЭЖХ можно использовать для мониторинга элюента колонки, чтобы обеспечить удержание большого количества аллицина на смоле в колонке. Подходящая колонка, количество загружаемого аллицина и соответствующие условия описаны в иллюстративном способе из Примера 16.
Предпочтительно, стадию удаления других водорастворимых компонентов из раствора аллицина можно провести так, чтобы смола удерживала по существу чистый аллицин. Необходимость этой стадии состоит в отделении аллицина с высоким выходом от всех остальных водорастворимых компонентов и неполярных компонентов, которые могут неблагоприятно влиять на последующее преобразование аллицина в ахоен. Водорастворимые компоненты, которые включают, но не ограничиваются этим, аллиин, дезоксиаллиин, пируват, сахара, водорастворимые аминокислоты и белок, можно удалить посредством пропускания полярного водного растворителя, например - высокополярного водного растворителя, через колонку, тогда как неполярные компоненты, такие как диаллилполисульфиды и растительные масла, можно удалить посредством пропускания высоконеполярного растворителя через смолу. Как описано в Примере 16, деионизированную воду можно использовать в качестве полярного водного растворителя для удаления остаточных водорастворимых компонентов. Ее можно прокачать через колонку с использованием перекачивающих устройств, настроенных на такую же объемную скорость и направление потока, что и загрузка аллицина. Эффективность стадии удаления водорастворимых компонентов можно контролировать с использованием ВЭЖХ и спектра поглощения УФ-излучения аллиина, дезоксиаллиина, пирувата, аллицина и ахоена. Удаление водорастворимых и неполярных компонентов предпочтительно приводит к удержанию полимерным субстратом по существу чистого аллицина. Аллицин, удерживаемый на полимерном субстрате, может иметь степень чистоты, равную по меньшей мере 50% или по меньшей мере 60% и более.
Смолу можно также использовать без твердой опоры или в свободно текучей форме, например - в дисперсионном способе. Для использования в дисперсионном способе аллицин предпочтительно подвергают процессу центрифугирования, чтобы удалить из него все твердые частицы, а затем аллицинсодержащую жидкость свободным потоком диспергируют среди гранул смолы. Реакционную смесь аллицина и смолы следует выдерживать холодной в предварительно заданном диапазоне температур ниже 10°С в течение всего процесса диспергирования. Содержание аллицина предпочтительно определяют с использованием способа ВЭЖХ из Примера 1. Дисперсионный способ описан ниже в Примере 19. Этот способ особенно хорошо подходит для крупномасштабного производства аллицина.
Как указано выше в описании настоящего изобретения, преобразование аллицина в ахоен можно осуществить через процесс нагревания. Стадию нагревания для преобразования аллицина в ахоен можно осуществить внутри твердофазного полимерного субстрата, такого как полистирол-DVB смола, в газовой или жидкостной среде с термостатическим регулированием или в теплоизолированной камере. Предпочтительно, используемым газом или жидкостью является углеводородный растворитель, вода или их комбинация. рН термостатически регулируемой жидкости можно отрегулировать посредством добавления любой подходящей кислоты или основания для повышения скорости или селективности реакции. Более предпочтительно, для процесса нагревания использовать водяной резервуар с термостатическим регулированием, поскольку он обеспечивает лучшее распределение температуры и пригоден для использования в крупномасштабном производстве. Колонку со смолой можно подсоединить через перекачивающее устройство к термостатически регулируемому водяному резервуару с получением системы с замкнутым контуром. Иллюстративный способ использования термостатически регулируемого водяного резервуара для процесса нагревания описан ниже в Примере 16.
Дополнительно или альтернативно, колонку со смолой можно нагреть способом нагрева с обратным холодильником. Как указано выше в описании, для перегонки с обратным холодильником можно использовать углеводородный растворитель, воду или их комбинацию. Предпочтительным используемым углеводородом является ацетон. В Примере 18 описано нагревание с обратным холодильником аллицинсодержащей смолы в колонке. В Примере 24 ниже описан способ нагрева с обратным холодильником, который включает систему рециркуляции растворителя, предпочтительно соединенную с экстрактором Сокслета, который способен уменьшать объем использованного растворителя, а также отсоединять аллицин от смолы на более поздней стадии.
Стадию нагревания для преобразования аллицина в ахоен можно осуществить с твердой опорой или без твердой опоры. Способы с использованием водяного резервуара с термостатическим регулированием или обратного холодильника предпочтительно осуществлять на аллицинсодержащей смоле с твердой опорой, например - в SPE-колонке. Альтернативно, стадию нагревания можно провести непосредственно на аллицинсодержащей смоле без твердой опоры в теплоизолированной камере, например - в термостате. Этот способ предпочтительно использовать для свободно текучей аллицинсодержащей смолы, полученной дисперсионным способом. Иллюстративный способ нагревания в термостате описан в Примере 19. Как указано в Примере 19, смолу можно поместить на металлический поддон и нагреть в термостате. Преобразование аллицина в ахоен можно контролировать посредством ВЭЖХ, как в способе из Примера 2, где используют образец смолы после нагревания. Смолу можно экстрагировать с использованием растворителя, например - метанола.
В случае, когда аллицин удерживается в смоле внутри твердой опоры перед стадией нагревания, например - в SPE-колонке, можно осуществить дополнительную стадию удаления аллицинсодержащей смолы из колонки, если необходимо использовать способ нагревания в термостате. Кроме того, аллицин можно также отделить от смолы без осуществления процесса преобразования, чтобы использовать его для дальнейшей переработки в аллицинсодержащие продукты. В этом случае колонку используют в качестве очистительного устройства для аллицинсодержащей смолы, так что получают по существу чистый аллицин. Иллюстративный способ отделения аллицина от смолы в колонке описан в Примере 18. Можно использовать неполярный растворитель с низкой температурой кипения и за счет отрицательного давления ускорить его течение к основанию колонки для сбора аллицинсодержащего раствора. Предпочтительным используемым растворителем является диэтиловый эфир.
Стадию нагревания можно провести в предварительно заданном температурном диапазоне в пределах от примерно 30°С до примерно 90°С. Предпочтительно, предварительно заданный температурный диапазон лежит в пределах от примерно 30°С до примерно 80°С. Более предпочтительно, предварительно заданный температурный диапазон лежит в пределах от примерно 40°С до примерно 60°С. Следует отметить, что температура нагрева, используемая для обоих способов нагрева - с твердой опорой и без твердой опоры - является одинаковой. Однако время, используемое для нагревания в теплоизолированной камере, в отсутствие твердой опоры может быть большим. В целом, чем выше температура, тем короче период времени, необходимый для преобразования аллицина в ахоен. Процесс нагревания может быть проведен в течение достаточного периода времени, например - от примерно 1 часа до примерно 15 часов, для преобразования по меньшей мере части аллицина в ахоен. Предпочтительно, достаточный период времени для преобразования равен примерно 4 часам.
Степень преобразования аллицина в ахоен можно контролировать посредством ВЭЖХ, например - как описано в Примере 2, и посредством регистрации спектра поглощения УФ-излучения аллицина и/или ахоена. Предпочтительно, по меньшей мере часть аллицина, который преобразован в ахоен, составляет по меньшей мере 10 массо-объемных %, предпочтительно - по меньшей мере 20 массо-объемных % или по меньшей мере 30 массо-объемных %, более предпочтительно - по меньшей мере 40 массо-объемных %. В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения по меньшей мере 50 массо-объемных % аллицина преобразуется в ахоен. Стадию нагревания можно проводить до тех пор, пока по меньшей мере 60%, или по меньшей мере примерно 70%, или по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере 90% аллицина, содержавшегося в исходном растворе, преобразуется в ахоен. Наиболее предпочтительно, чтобы по существу весь аллицин был преобразован в ахоен. Термин «по существу весь» означает, что стадию нагревания проводят до тех пор, пока посредством ВЭЖХ больше не будет обнаруживаться аллицин, например - как описано в способе из Примера 2.
Как указано в приведенном выше описании, стадию нагревания для преобразования аллицина в ахоен альтернативно можно провести вне полимерного субстрата в растворителе. Растворителем, пригодным для экстракции аллицина из твердофазного полимерного субстрата, который может быть смолой, для прямого преобразования в ахоен, предпочтительно является растворитель, пригодный для сольватирования аллицина и способный обеспечивать надлежащие условия для его преобразования в ахоен. Растворителем может быть спирт, простой эфир, кетон или комбинация из двух или более из них. Как указано в приведенном выше описании, рН растворителя также можно отрегулировать для улучшения преобразования аллицина в ахоен, а также для регулирования отношения E/Z ахоена в конечном продукте. Как хорошо известно на предшествующем уровне техники, рН можно отрегулировать органической или неорганической кислотой или основанием. В характерном случае кислотой, используемой для регулирования рН, является уксусная кислота.
Ахоен, полученный способом по настоящему изобретению, необходимо отделить от твердофазного полимерного субстрата, который содержит ахоен, не вступивший в реакцию аллицин и другие метаболиты. В условиях, когда процесс нагревания аллицинсодержащей смолы выполняют в свободно текучей форме без твердой опоры, можно провести дополнительную стадию набивки смолы для загрузки нагретой смолы в твердую опору, например - в SPE-колонку, для последующего процесса выделения. В Примере 19 описана такая стадия набивки смолы в экстракционную колонку. Нагретая в печи смола может иметь более высокое содержание влаги, поэтому предпочтительно подвергнуть смолу лиофильной сушке перед набивкой в колонку.
2
2
Стадию выделения ахоена можно провести при предварительно заданном давлении с использованием неводного полярного растворителя, такого как жидкий CO или сверхкритический CO. Предпочтительно, неводным полярным растворителем является ацетон, или можно использовать другие неводные полярные растворители, такие как метанол и этилацетат. Однако высокополярные растворители, такие как вода, или неполярные растворители, такие как пентан и гексан, непригодны для использования на этой стадии выделения. Стадию выделения можно осуществить посредством промывания колонки с использованием растворителя, подаваемого под действием силы тяжести с верхней стороны колонки, и последующего сбора элюента. Содержание ахоена в каждой фракции можно определить посредством ВЭЖХ, например, как описано в способе из Примера 2.
Предпочтительно, способ получения ахоена из аллицина с использованием твердофазного полимерного субстрата дополнительно включает стадию концентрирования ахоена с получением обогащенного ахоеном масла после стадии выделения. Фракции с высоким содержанием ахоена, определенным посредством ВЭЖХ, например, как описано в способе из Примера 2, можно объединить и высушить с использованием сушильного средства, например - безводного сульфата магния. Высушенный ахоен в растворителе можно профильтровать под действием силы тяжести для удаления твердых загрязнений. Предпочтительно, раствор, содержащий ахоен, можно профильтровать через бумажный фильтр Whatman. Затем содержание растворителя можно уменьшить под вакуумом при предварительно заданном давлении, лежащем в диапазоне от примерно 400 торр (53,4 кПа) до примерно 150 торр (19,9 кПа), и температуре, лежащей в диапазоне от примерно 56°С до примерно 40°С. Температуру можно отрегулировать в соответствии с различными типами используемых растворителей. Для ускорения экстракции растворителя предпочтительно использовать ротационный испаритель. Способ более подробно описан в Примере 16.
2
2
2
2
Кроме полярного растворителя, для экстракции ахоена из смолы также пригоден жидкий или сверхкритический CO, поскольку эти материалы совместимы с пищевыми продуктами. Экстракцию суперкритическим CO можно провести в предварительно заданном диапазоне давления от примерно 400 бар (40000 кПа) до примерно 500 бар (50000 кПа) и в предварительно заданном температурном диапазоне от примерно 40°С до примерно 55°С, Можно провести последовательную экстракцию с использованием различных концентраций сорастворителя, например - 10%-ного и 20%-ного этанола, при том же давлении и температуре, и полученные экстракты можно проанализировать, чтобы убедиться в том, что произведена полная экстракция сверхкритическим CO. Полученные с использованием сверхкритического CO экстракты и смолу можно проанализировать посредством ВЭЖХ, например, как описано в способе из Примера 2.
2
Раствор ахоена, полученный с использованием сверхкритического CO. можно также дополнительно обработать при другой температуре, чтобы произвести дополнительную экстракцию полученного раствора, например, как описано в Примере 20, с получением эмульсии, которую затем разделяют на водную фазу и масляную фазу. Эти фазы можно проанализировать посредством ВЭЖХ, например, как описано в способе из Примера 2, и аллицин, содержащийся в масляной фазе, можно переработать в обогащенные аллицином продукты или дополнительно преобразовать в ахоен с использованием любого из способов, описанных в настоящем изобретении.
Другие метаболиты аллицина, образовавшиеся в процессе преобразования, или природные соединения из чеснока, такие как жирные кислоты и углеводороды, содержащиеся в конечном растворе ахоена, также можно удалить с использованием подходящего растворителя для получения ахоена высокой степени чистоты. Полученное масло с высоким содержанием ахоена предпочтительно содержит от 10 массо-объемных % до 30 массо-объемных % ахоена, в пересчете на общий объем масляной фракции. Более предпочтительно, способ по настоящему изобретению может обеспечить высококонцентрированное и очищенное масло с высоким содержанием ахоена, лежащим в диапазоне от по меньшей мере 15 массо-объемных % до 30 массо-объемных % жидкости в масляной фракции.
Ахоен существует в двух изомерных формах, которые являются цис- (Z) и транс-(Е) формами. Ахоен, полученный по настоящему изобретению, в характерном случае выделяют в виде смеси обоих изомеров. ВЭЖХ можно использовать для определения отношения E/Z ахоена, например, как описано в Примере 3. Ахоен, полученный по настоящему изобретению посредством экстракции водным раствором ацетона, обычно имеет отношение E/Z, равное 1-2:3, по результатам определения посредством ВЭЖХ анализа. На выход и отношение E/Z ахоена могут влиять температура, продолжительность процесса, полярность и рН конверсионной среды. Масло с высоким содержанием ахоена по настоящему изобретению пригодно для прямого использования в рецептурах продуктов, содержащих ахоен, или его можно дополнительно очистить до чистого Е-ахоена или Z-ахоена с использованием такого способа, как нормально-фазовая хроматография на силикагеле с подвижной фазой из гексана-пропанола, или любых других подходящих способов, известных специалисту в данной области техники.
Настоящее изобретение также обеспечивает ахоен или композицию, содержащую ахоен, полученный способом по настоящему изобретению. Ахоен можно включить в различные типы продуктов с терапевтическими эффектами или полезными для здоровья свойствами. За счет использования в рецептуре таких соединений, как микрокристаллическая целлюлоза, мальтодекстрин и циклодекстрины, можно оказать полезное влияние на физико-химические свойства ахоена и других соединений чесночного масла, такие как запах, стабильность и растворимость.
Настоящее изобретение включает содержание формулы изобретения и приведенного выше описания. Хотя настоящее изобретение описано в предпочтительной форме с определенным уровнем конкретности, следует понимать, что представленное раскрытие предпочтительной формы выполнено только в качестве примера, и что возможно осуществить многочисленные изменения деталей конструкции и комбинации и расположения деталей без отклонения от объема изобретения.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Примеры, приведенные ниже, предназначены для иллюстрации различных аспектов и вариантов осуществления настоящего изобретения. Эти примеры никоим образом не ограничивают раскрытое изобретение, которое ограничено только формулой изобретения.
Пример 1
Условия обратно-Фазовой ВЭЖХ для калибровки аллицина с использованием стандартизованного раствора аллицина
Идентификация пика: аллицин через 9,5 минут
Колонка: Асе 5 С18
Размеры: 250×4,6 мм
Защитная колонка: Асе 5 С18
Подвижная фаза: 50% метанола - 50% воды
Температура: 30°С
Длина волны детектирования: 210 нм (УФ)
Объем пробы: 20 мкл
Растворитель пробы: вода
Объемная скорость потока: 1,0 мл/мин
Пример 2
Условия обратно-фазовой ВЭЖХ для калибровки ахоена с использованием стандартизованного раствора ахоена
Идентификация пика: ахоен (E/Z изомеры, элюированные совместно) через 6,5 минут
Колонка: Асе 5 С18
Размеры: 250×4,6 мм
Защитная колонка: Асе 5 С18
Подвижная фаза: (растворитель А) вода - (растворитель В) ацетонитрил
Объемная скорость потока: 1,5 мл/мин
Градиент:
Температура: 30°С
Длина волны детектирования: 254 нм (УФ)
Объем пробы: 20 мкл
Растворитель пробы: метанол
Пример 3
Условия нормально-фазовой ВЭЖХ для калибровки изомеров ахоена Е и Z, калиброванных с использованием стандартизованного раствора ахоена
Идентификация пика: Z ахоен через 14 минут, Е ахоен через 17 минут
Использованная колонка: силикагель
Размеры: 250×4,6 мм, производства компании NM Scientific Ltd.
Подвижная фаза: 92% гексана - 8% 2-пропанола
Температура: 30°С
Длина волны детектирования: 240 нм (УФ)
Объем пробы: 20 мкл
Растворитель пробы: 2-пропанол
Объемная скорость потока: 1,0 мл/мин
Пример 4
Приготовление полимерного субстрата (сополимерная полистирол-дивинилбензольная смола)
Во фланцевую колбу, снабженную верхнеприводной мешалкой и якорным валом, впускным устройством для подачи азота, обратным холодильником и водяной баней, поместили деионизированную воду (100 г). Через водную фазу пропускали пузырьки сухого азота. К этому перемешиваемому раствору добавили гидрохинон (0,01 г), затем - сульфат натрия (0,02 г) и поверхностно-активное вещество (SDS, 0,015 г). По каплям в течение 30 минут добавили заранее смешанный раствор стирола (4 г), п-дивинилбензола (2 г), винилпиридина (0,5 г), Span 80 (1 г) и бензоилпероксида (0,5 г) в толуоле (20 мл). Смесь перемешивали со скоростью вращения мешалки, равной 200 об/мин, и температуру реакционной смеси повысили до 80°С. Впускное устройство для подачи азота подняли выше поверхности реакционной смеси и оставили смесь для протекания полимеризации на 24 часа. В конце этого периода смолу собрали посредством фильтрации и последовательно промыли водой, а затем - этанолом. Смолу высушили при 80°С в течение 5 часов. Смолу откалибровали по размеру и отобрали гранулы с размером частиц, равным 1 мм (выход 2,5 г). Физические параметры гранул определили посредством BET и электронной микроскопии.
Пример 5
Приготовление полимерного субстрата (сополимерная полистирол-дивинилбензольная смола)
2
Эксперимент, описанный в Примере 4, повторили несколько раз, так что после серии экспериментальных манипуляций получили примерно 500 г смолы. Номинальный размер частиц смолы варьировался в диапазоне от 800 мкм до 1200 мкм, и площадь поверхности была равна 1200 м/г.
Пример 6
Приготовление полимерного субстрата (сополимерная полистирол-дивинилбензольная смола)
Эксперимент, описанный в Примере 4, повторили, за исключением того, что скорость эмульгирования при помощи мешалки увеличили до 1000 об/мин для получения смолы с распределением частиц по размеру в диапазоне от 75 мкм до 190 мкм. Образец этой смолы был использован для оценки в начальных исследованиях сорбции.
Пример 7
Приготовление полимерного субстрата (сополимерная полистирол-дивинилбензольная смола)
Процесс получения смолы, описанный в Примере 4, повторили, но инициатор заменили на AIBN в толуоле (40 мл). После элютропической сортировки по размеру полученных гранул была получена темная смола (450 г). Высушенный материал последовательно промыли водой и ацетоном для удаления остаточных растворимых веществ. Смола продемонстрировала превосходные сорбционные и десорбционные характеристики в отношении аналита.
Примеры 8-15
Приготовление полимерного субстрата (сополимерная полистирол-дивинилбензольная смола)
Эксперимент, описанный в Примере 4, повторили с использованием других субстратов или параметров, указанных в Таблице 2.
Пример 16
Получение ахоена из аллицина
90 г смолы загрузили в стеклянную колонку с размерами 3 см × 38 см. Смолу промыли 200 мл деионизированной воды. 1500 мл раствора аллицина с концентрацией 15000 частей/млн, полученного с использованием способа, описанного в публикации ЕР 1404853 А1, пропустили через слой смолы с использованием перистальтического насоса Cole Palmer Master Flex. Насос настроили на объемную скорость потока, равную 30 мл в минуту. Поток раствора аллицина был направлен против силы тяжести. Аликвоты элюента контролировали посредством ВЭЖХ с использованием способа, описанного в Примере 1. Результаты ВЭЖХ показали, что основное количество аллицина связалось с колонкой. Затем загруженную аллицином смолу промыли 500 мл деионизированной воды для удаления остаточных водорастворимых компонентов. Воду прокачивали через смолу с использованием перистальтического насоса, настроенного на ту же объемную скорость и направление потока, что и во время загрузки аллицина. Затем колонку со смолой подсоединили через перистальтический насос к резервуару с водой с получением системы с замкнутым контуром. Температуру воды в резервуаре установили равной 57°С±2°С. Нагретая вода циркулировала с той же объемной скоростью потока и в том же направлении, что и загрузка аллицина, в течение периода времени, равного 3 часам. Затем колонку промыли 600 мл ацетона; ацетон пропускали под действием силы тяжести с верхней стороны колонки и собирали аликвотами по 100 мл. Содержание ахоена в каждой фракции определили способом ВЭЖХ, как описано в Примере 2. Фракции с высоким содержанием ахоена (фракции 2-5) объединили и высушили с использованием безводного сульфата магния. Затем высушенный ахоенсодержащий ацетон профильтровали через бумагу под действием силы тяжести для удаления твердых веществ. Содержание ацетона снизили под вакуумом при 50°С с использованием ротационного испарителя Buchii RE300. Получили 16 г светло-оранжевого масла. Масло сканировали с использованием способа ВЭЖХ из Примера 2 и определили, что содержание ахоена в нем было равно 18%. С использованием способа ВЭЖХ, описанного в Примере 3, определили, что отношение 27Е изомеров в ахоене было равно 2,3.
Пример 17
Получение ахоена из аллицина
Способ, описанный в Примере 16, использовали для абсорбции 1500 мл раствора аллицина с концентрацией, равной 15000 частей/млн, на 90 г смолы и преобразования аллицина в ахоен с использованием циркулирующего потока горячей воды. Затем абсорбированный ахоен вымыли из колонки с использованием 900 мл этанола. Этанол собрали аликвотами по 100 мл. Содержание ахоена в каждой фракции определили посредством ВЭЖХ, как описано в Примере 2. Фракции с высоким содержанием ахоена (фракции 3-6) объединили. Объединенные фракции испарили под вакуумом при 60°С с использованием ротационного испарителя Buchii RE300. Получили 40 мл водного раствора с масляным осадком, который затем разделили на две фазы с использованием центрифуги Beckman, установленной на 2000 об/мин, в течение 20 минут. Затем масляную и водную фазы разделили с использованием делительной воронки объемом 200 мл. Получили 15 мл масла с содержанием ахоена, равным 17,5%, по результатам определения с использованием способа ВЭЖХ из Примера 2.
Пример 18
Получение ахоена из аллицина
1600 мл раствора аллицина с концентрацией, равной 15000 частей/млн, загрузили в колонку со смолой, как описано в Примере 16. Раствор аллицина охладили до температуры ниже 10° для сохранения аллицина. Затем колонку промыли 1000 мл деионизированной воды, охлажденной до температуры ниже 10°. 500 мл диэтилового эфира подали с верхней стороны колонки, а у основания создали отрицательное давление для сбора жидкости. Диэтиловый эфир собрали аликвотами по 100 мл. Все фракции собрали и определили содержание в них аллицина способом ВЭЖХ из Примера 1. Фракции с высоким содержанием аллицина (1-6) объединили и высушили сульфатом магния. Затем профильтровали диэтиловый эфир под действием силы тяжести через фильтровальную бумагу Fluted Whatman сорта 113. После этого объем эфира уменьшили с получением светло-желтого масла с использованием ротационного испарителя Buchii RE300 при 20°С. Получили 10,5 мл светло-желтого масла и посредством ВЭЖХ анализа определили степень чистоты, равную 90%. Чистый аллицин развели в 200 мл 60%-ного ацетона и перегоняли с обратным холодильником при 56°С в течение 3,5 часов. После перегонки ацетон удалили под вакуумом с использованием ротационного испарителя Buchii RE300. Получили водный раствор, содержавший светло-оранжевое масло. Светло-оранжевое масло отделили с использованием делительной воронки. Масло (9 г) проанализировали с использованием способов ВЭЖХ из Примеров 2 и 3; определили, что содержание ахоена было равно 21%, а отношение Z/E было равно 1,3.
Пример 19
Получение ахоена из аллицина
2
2
1500 мл раствора аллицина с концентрацией, равной 15000 частей/млн, получили с использованием способа, описанного в публикации ЕР 1404853 А1. Аллицинсодержащую жидкость центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 минут с использованием центрифуги Beckman J6B для удаления твердых частиц. Затем жидкость осторожно перемешали с 110 г смолы в стакане объемом 4000 мл. Низкая скорость перемешивания, достаточная для диспергирования смолы в объеме жидкости, была достигнута с использованием магнитной мешалки. Жидкость перемешивали в течение 4 часов и поддерживали температуру ниже 10°С посредством периодического добавления дробленого льда в реакционную смесь. Через 5 часов определили, что содержание аллицина в жидкости было меньше 1000 частей/млн, с использованием способа ВЭЖХ из Примера 1. Затем жидкость и смолу разделили посредством вакуумной фильтрации с использованием бумажного фильтра Whatmann сорта 113. Смолу промыли под вакуумом 1000 мл холодной деионизированной воды, пока она оставалась в фильтре. Затем смолу поместили в герметично закрытый металлический лоток и нагревали при 50°С в термостате в течение 10 часов. Преобразование аллицина в ахоен контролировали посредством забора проб смолы массой 10 мг, экстракции 1 мл метанола и сканирования с использованием способа ВЭЖХ из Примера 2. После завершения преобразования смолу перенесли в лиофилизатор Edwards Super Modulyo и высушили до постоянной массы. Содержание влаги в смоле до лиофильной сушки было определено как 40%. 40 г лиофилизированной смолы загрузили в экстрактор объемом 100 мл, соединенный с лабораторной системой Thar SFC-1000 с сепаратором объемом 25 мл, в котором поддерживалось давление, равное 15 бар, температура, равная 35°С. Экстракцию выполнили сверхкритическим CO в течение 3 часов при 400 бар и 40°С с последующей последовательной экстракцией 10%-ным и 20%-ным этанолом, использованным в качестве сорастворителя, при том же давлении и той же температуре. Сепаратор промыли этанолом и сохранили раствор. Затем экстрактор опорожнили и сохранили экстрагированную смолу. Экстракты и смолу проанализировали с использованием способа ВЭЖХ из Примера 2. Анализ экстрактов, полученных с использованием 10%-ного этанола в качестве сорастворителя, показал, что большая часть винилдитинов и сульфидов была экстрагирована сверхкритическим CO, и экстракты, полученные с использованием сорастворителей, преимущественно содержали ахоен. Анализ экстрактов, полученных с использованием 20%-ного этанола в качестве сорастворителя, показал, что добавления 10%-ного этанола уже было достаточно для того, чтобы в этих последних экстрактах по существу отсутствовал ахоен. Анализ смолы, оставшейся после экстракции, показал, что была достигнута полная экстракция ахоена.
Пример 20
Получение ахоена из аллицина
2
62 г смолы, нагруженной аллицином, получили с использованием дисперсионного способа, как описано в Примере 19. Аллицин промыли холодной деионизированной водой, но не подавали тепла для начала преобразования. Смолу (62 г) поместили в экстрактор объемом 100 мл. Эта дополнительная масса, по сравнению с Примером 19, объясняется содержанием воды. Начальную экстракцию выполнили с использованием жидкого CO при 65 бар и 10°С с объемной скоростью потока, равной 10 г/мин, в течение 2 часов. Это дало 0,111 г (0,184%) аллицина. Затем температуру повысили до 40°С, а давление - до 400 бар, и провели экстракцию в сверхкритических условиях в течение следующих 3 часов. Получили 2,93 г эмульсии. После отстаивания при комнатной температуре эмульсия разделилась на водную фазу и нижнюю масляную фазу. ВЭЖХ анализ экстрагированной смолы показал, что экстракция была успешной, и на смоле по существу не осталось аллицина. Масляную фазу проанализировали способом ВЭЖХ из Примера 2. Масло с высоким содержанием аллицина было пригодным для дальнейшей переработки в обогащенные аллицином продукты или для преобразования в ахоен любыми подходящими способами, описанными в Примерах.
Пример 21
Получение ахоена из аллицина
25 мл синтетического аллицина получили посредством окисления диаллилдисульфида технического качества перуксусной кислотой с использованием способа, описанного в публикации Iberl et al. (Plant Med 56 (1990)). Затем аллицин энергично смешали с 2000 мл воды с получением нестабильной эмульсии, которая может начать расслаиваться при отстаивании. 90 г смолы загрузили в колонку с размерами 3 см × 38 см. Затем через слой смолы пропустили раствор синтетического аллицина с использованием перистальтического насоса Cole palmer master flex L/5. Насос был настроен на объемную скорость потока, равную 40 мл в минуту. Поток раствора аллицина был направлен против силы тяжести. Аликвоты элюента контролировали способом ВЭЖХ из Примера 1. ВЭЖХ показала, что большая часть аллицина присоединилась к смоле. Затем нижнее выпускное отверстие колонки присоединили к колбе для сбора образцов с боковым отводом. В колбе создали отрицательное давление и использовали 200 мл деионизированной воды для промывки колонки. Отрицательное давление было приложено непрерывно, и через колонку пропустили воздух для удаления избытка влаги из смолы. Затем смолу поместили на открытый металлический лоток и нагревали при 50°С в термостате Raven в течение 10 часов. Преобразование аллицина в ахоен контролировали посредством забора образцов смолы массой 10 мг, экстракции 1 мл метанола и сканирования с использованием способа ВЭЖХ из Примера 2. После нагревания смола была сухим свободно текучим твердым веществом. Смолу загрузили в колонку с размерами 3 см × 40 см и промыли колонку 500 мл пентана. Анализ пентанового элюента выявил преимущественно винилдитин и полисульфиды. Затем из смолы удалили остаток растворителя посредством подачи положительного давления в колонку и отведения отработанного газа. После этого колонку промыли 600 мл ацетона, нагретого до 40°С; ацетон подавали с верхней стороны колонки под действием силы тяжести и собирали аликвотами по 100 мл. Содержание ахоена в каждой фракции определили с использованием способа ВЭЖХ из Примера 2. Фракции с высоким содержанием ахоена объединили и высушили с использованием сульфата магния. Затем высушенный ацетон профильтровали через бумагу под действием силы тяжести для удаления твердых веществ. Ахоенсодержащий ацетон выпарили под вакуумом при 50°С с использованием ротационного испарителя Buchii. Получили 10 г светло-оранжевого масла. Масло сканировали с использованием способа ВЭЖХ из Примера 2 и определили, что оно имеет содержание ахоена, равное 34%.
Пример 22
Получение ахоена из аллицина
Синтетический аллицин (25 мл) получили посредством окисления диаллилдисульфида технического качества в этаноле водным раствором пероксимоносульфата калия. Водный раствор соли по каплям добавляли в течение 2 часов, температуру поддерживали ниже 30°С и раствор постоянно перемешивали. Преобразование диаллилдисульфида в аллицин контролировали способом ВЭЖХ из Примера 2. После завершения реакции жидкость профильтровали через бумагу для удаления соли. Профильтрованный раствор разбавили деионизированной водой с получением 1000 мл раствора аллицина с концентрацией 25000 частей/млн. Затем раствор аллицина загрузили на 50 г смолы, загруженной в колонку с размерами 4 см × 38 см, и преобразовали в ахоен в соответствии с процедурой, описанной в Примере 21. В случае аллицина, полученного из оксона, использовали 3000 мл деионизированной воды для промывки аллицина, абсорбированного в колонке, чтобы гарантировать полное удаление соли.
Пример 23
Получение ахоена из аллицина
Из 15 кг свежего очищенного чеснока, закупленного на местном рынке, выжали сок с использованием центрифужной соковыжималки Silvercrest. Получили 10 л сока, который затем смешали с 10 л водопроводной воды. Затем чесночный раствор осветлили посредством центрифугирования. Жидкость проанализировали способом ВЭЖХ из Примера 1 и определили, что она имеет содержание аллицина, равное 1000 частей/млн. Жидкость, содержавшую чесночный сок, преобразовали с использованием способа, описанного в Примере 16, со следующими модификациями. Жидкость, содержащую аллицин, пропускали через смолу со скоростью, равной 150 мл в минуту. Элюент из колонки не уничтожали, а добавляли к подаваемому раствору аллицина для создания системы с замкнутым контуром. Резервуар для подачи аллицина погрузили в ванну со льдом, чтобы поддерживать температуру ниже 10°С. Содержание аллицина в резервуаре проверяли с использованием способа ВЭЖХ из Примера 1 с 1-часовыми интервалами. Через 6 часов аллицин больше не адсорбировался на колонку, поток остановили и колонку дренировали. После этой стадии обработка, промывка и преобразование были идентичными Примеру 16. Способ дал 20 г светло-оранжевого масла с содержанием ахоена, равным 15%.
Пример 24
Получение ахоена из аллицина
40 г смолы, нагруженной аллицином, получили так, как описано в Примере 19. Смолу перенесли в экстракционную гильзу из целлюлозы с размерами 4,5 см × 10 см и установили ее внутри экстрактора Сокслета подходящего размера, оборудованного охлаждаемым водой конденсатором и круглодонной колбой объемом 2 л, помещенной в электрический колбонагреватель с электронагревательным кожухом. В круглодонную колбу поместили 500 мл 40%-ного водного раствора ацетона. Ацетон осторожно нагрели до рефлюкса и дистиллировали через смолу способом, обычно используемым во время экстракции Сокслета. Через 1 час обнаружили, что циркулирующий растворитель, возвращающийся в сифон из смолы, стал прозрачным. В этот момент нагревание прекратили и удалили круглодонную колбу. Затем круглодонную колбу соединили с конденсатором и перегоняли раствор с обратным холодильником при 56°С в течение 1,5 часов. После перегонки ацетон удалили под вакуумом с использованием ротационного испарителя Buchii RE300. Получили водный раствор, содержавший светло-оранжевое масло. Светло-оранжевое масло отделили с использованием делительной воронки. Светло-оранжевое масло (10 г) проанализировали с использованием способа ВЭЖХ из Примеров 2 и 3 и определили, что содержание ахоена в нем было равно 14%, а отношение 27Е было равно 3,1.