СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МОДИФИКАЦИИ ФИБРИНОГЕНА ПЛАЗМЫ КРОВИ ПО СОДЕРЖАНИЮ КАРБОНИЛЬНЫХ ГРУПП В ФИБРИНОВОМ СГУСТКЕ
METHOD OF DETERMINING OXIDATIVE MODIFICATION OF FIBRINOGEN IN BLOOD PLASMA BY CONTENT OF CARBONYL GROUPS IN FIBRINOUS CLOT

В развитии ряда патологических состояний: ишемия, воспаление и многих заболеваний, таких как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, сахарный диабет, гипертония, нейродегенеративные, онкологические заболевания ведущую роль играет активация генерации свободных радикалов - окислительный стресс. Современные исследования неоспоримо доказывают, что окислительный стресс предшествует развитию вышеуказанных заболеваний, а измерение маркеров окислительного стресса может быть положено в основу методов прогноза развития и прогрессирования заболеваний. Белки организма являются чувствительными мишенями для активных форм кислорода, а белки плазмы крови, которые также вовлекаются в процессы свободно-радикального повреждения, представляют собой еще и удобный объект для клинико-биохимической диагностики состояний, этиопатогенез которых связан с оксидативным стрессом.
Изобретение относится к области медицины, к клинико-биохимической лабораторной диагностике, а именно к способам определения модифицированных белков и предназначается для селективного количественного определения степени окислительной модификации фибриногена в клинических образцах плазмы крови по содержанию карбонильных групп в фибриновом сгустке.
Не существует единого показателя степени окислительной модификации белков. С этой целью можно регистрировать различные химические или физико-химические изменения белковой молекулы в условиях окислительного стресса, которые будут отражать степень ее повреждения активными формами кислорода. Определение карбонильных групп аминокислотных остатков, образующихся при окислении белков, имеет ряд практических преимуществ по сравнению с другими подходами, а их содержание в белке рассматривается как наиболее адекватный и надежный показатель, количественно характеризующий выраженность химических изменений в структуре белка в зависимости от интенсивности окислительных свободно-радикальных процессов. Согласно оценке, основанной на обобщении литературных данных об окислительной модификации белков in vivo, уровень карбонильных продуктов окисления белков (карбонильных групп) при патологических процессах, сопряженных с окислительным стрессом, возрастает в 2-8 раз (Shacter Е. Quantification and significance of protein oxidation in biological samples. Drug Metabolism Reviews. 2000. V. 32. №3-4. P. 307-326).
В работе Shacter E. и соавторов (1994 г.) было показано, что фибриноген «окисляется» значительно быстрее, чем другие белки при окислении цельной плазмы in vitro в системе железо/аскорбиновая кислота. Содержание карбонильных продуктов окисления (количество карбонильных групп на 1 моль белка) в условиях этого эксперимента для фибриногена составило 9.7 моль/моль, а для альбумина, глобулинов и трансферина - 0.5, 0.6 и 0.8 моль/моль, соответственно (Shacter, Е.; Williams, J.A.; Lim, М.; Levine, R.L. Differential susceptibility of plasma proteins to oxidative modification: examination by Western blot immunoassay. Free Radic. Biol. Med. 17:429-437; 1994).
В клинических исследованиях было показано, что окислительная модификация фибриногена у больных ИБС со стенокардией напряжения, часть из которых перенесла инфаркт, в среднем выше на 40% в сравнении с лицами без ИБС. В то же время окислительная модификация других белков плазмы у этих больных была лишь на 13% выше, чем в группе сравнения (Патент РФ №2298189).
Таким образом, при активации свободно-радикальных процессов окислительная модификация фибриногена идет более интенсивно по сравнению с другими белками плазмы крови.
Накопленные к настоящему времени сведения позволяют многим авторам рассматривать окисленный фибриноген не только как перспективный чувствительный маркер, характеризующий степень выраженности окислительного стресса в организме, но и как фактор, обладающий собственным патогенным действием, в частности при сердечно-сосудистых патологиях. Так, известно, что фибриноген относится к белкам острой фазы, его содержание резко возрастает при воспалительном процессе, который в свою очередь тесно связан с окислительным стрессом. Более высокий уровень фибриногена способствует более интенсивной агрегации тромбоцитов и эритроцитов, ведет к возрастанию вязкости крови. Окислительная же модификация фибриногена под действием активных форм кислорода приводит к изменению его многочисленных свойств и функций. Показано, что «окисленный» фибриноген в большей степени чем «нормальный» усиливает продукцию АФК активированными лейкоцитами, усиливает агрегацию тромбоцитов, активирует апоптоз клеток сосудистого эндотелия, оказывает влияние на параметры свертывания и реологические свойства крови, способствует повышению адгезивных свойств сосудистого эндотелия, что в конечном итоге приводит к формированию и росту атеросклеротической бляшки. Окислительная модификация фибриногена вызывает также изменение его основной функции - превращаться в фибрин и образовывать сгусток, то есть окислительный стресс через модификацию фибриногена вызывает изменение процессов тромбообразования (Азизова О.А., Пирязев А.П., Швачко А.Г. /Окислительная модификация фибриногена замедляет его превращение в фибрин под влиянием тромбина.// Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 2009; 147(2): 160-163). Таким образом, прослеживается связь окисленного фибриногена с ключевыми звеньями патогенеза ряда сердечно-сосудистых заболеваний и развитием таких грозных осложнений, как инфаркты и инсульты. В этой связи важно отметить, что повышенное содержание фибриногена в плазме крови давно уже рассматривается как общепринятый независимый риск-фактор развития атеросклероза и его осложнений. Вместе с тем даже при нормальных величинах содержания фибриногена значительное повышение степени его окислительной модификации регистрируется у лиц с ИБС или с подострым инфарктом миокарда (Рагино Ю.И., Баум В.А., Полонская Я.В., Воевода М.И., Никитин Ю.П. /Атеросклероз и окислительные процессы. Новые способы оценки окислительной модификации белков. // Бюллетень СО РАМН, 2006, №4 (122): 67-74).
Таким образом, определение окислительной модификации фибриногена является более чувствительным и информативным диагностическим тестом, чем концентрация самого фибриногена в плазме крови. Однако клинические исследования в данном направлении ограничены существующим уровнем развития методов селективного определения окислительно-модифицированного фибриногена в плазме крови, пригодных для использования в клинико-лабораторной практике.
ДНФГ (2,4-динитрофенилгидразин) представляет собой классический реагент для определения карбонильных группы (С=О) альдегидов и кетонов.
Известен способ Levine R.L. и соавторов (R.L. Levine, D. Garland, С.N. Oliver, А. Amici, I. Climent, A. Lenz, B. Ahn, S. Shaltiel, and E.R. Stadtman /Determination of carbonyl content in oxidatively modified proteins. // Methods of Enzymology, 1990, 186: 464-478), в котором ДНФГ-реакцию используют для определения карбонильных групп в белках из тканей и клеточных культур. В результате реакции 2,4-динитрофенилгидразина с карбонильными продуктами окисления (карбонильными группами) белков, к последним через ковалентную связь присоединяются производные 2,4-динитрофенилгидразона, имеющие характерный спектр поглощения. Содержание карбонильных групп в белке пропорционально оптической плотности образовавшихся динитрофенилгидразонов, измеряемой, как правило, при длине волны 370 нм. Способ Levine R.L. и соавторов (1990 г.) по настоящее время является базовым для многочисленных модификаций спектрофотометрического метода определения карбонильных продуктов окисления белков по реакции с ДНФГ. Среди этих модификаций следует выделить методы, которые были целенаправленно разработаны для определения карбонильных продуктов окисления белков сыворотки и плазмы, такие, как метод Дубининой Е.Е. и соавторов (1995 г.), метод Азизовой О.А. и соавторов (2007 г.). Оба эти метода дают интегральную характеристику степени окисления всех белков плазмы, то есть их суммарной фракции.
Известен способ селективного определения окислительной модификации белков плазмы крови, описанный в статье Shacter Е. и соавторов (1994 г.), при котором разделение белков плазмы проводят методом ДСН-гель электрофореза. Способ так же основан на применении ДНФГ-реакции, однако детекцию карбонильных групп в составе индивидуальных белков осуществляют в системе иммуноблоттинга. С этой целью используют антитела, специфические к динитрофенильным группам производных 2,4-динитрофенилгидразона на поверхности белковых молекул. Метод отличается высокой чувствительностью, как минимум в 100 раз превышающей чувствительность классического спектрофотометрического метода. Именно этим методом была показана более высокая окисляемость фибриногена по сравнению с альбумином и другими белками при металл-катализируемом окислении цельной плазмы (Shacter, Е.; Williams, J.A.; Lim, М.; Levine, R.L. Differential susceptibility of plasma proteins to oxidative modification: examination by Western blot immunoassay. Free Radic. Biol. Med. 17:429-437; 1994). Однако способ является сложным, длительным и трудоемким, требует наличия высокоспециализированного оборудования и дорогостоящих реактивов. Кроме того, данный способ, как указывают сами авторы, является, безусловно, полуколичественным. Указанные обстоятельства накладывают существенные ограничения на применение способа в практике клинических лабораторных исследований.
В отечественных исследованиях широкое применение нашел способ определения степени окисления белков в сыворотке крови человека, предложенный Дубининой Е.Е. и соавторами (Дубинина Е.Е., Бурмистров C.O., Ходов Д.А., Портов И.Г. /Окислительная модификация белков сыворотки крови человека, метод ее определения. // Вопр мед хим 1995; 1: 24-26). При данном способе суммарную фракцию белков получают осаждением трихлоруксусной кислотой (ТХУ), а в качестве растворителя белкового осадка используют 8 М мочевину. Для анализа берут 0,05-0,1 мл сыворотки, добавляют 20% раствор ТХУ до объема 1 мл, затем приливают равный объем (1 мл) 0,01 М ДНФГ, растворенного в 2 М HCl. В контрольную пробу добавляют вместо ДНФГ равный объем 2 М HCl. Таким образом, конечная концентрация ТХУ и в контрольной, и в опытной пробе составляет около 10% (9,5-9,75%). Пробы инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре, затем центрифугируют при 3000 g 15-20 мин. Осадок промывают 3 раза раствором этанол - этилацетат (1:1) для экстракции липидов и избытка ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. После высушивания к осадку приливают 2,5 мл 8 М мочевины и выдерживают на кипящей водяной бане в течение 5 мин до полного растворения. Оптическую плотность раствора регистрируют на спектрофотометре в области поглощения образовавшихся 2,4-динитрофенилгидразонов - продуктов реакции карбонильных производных окисления белков с 2,4-динитрофенилгидразином (ДНФГ). Степень окисления белков в сыворотке крови выражают в единицах оптической плотности на 1 мл сыворотки или на 1 мг белка.
Данный способ не является селективным, т.е. не позволяет определить степень окислительной модификации индивидуальных белков, в частности фибриногена, в плазме крови. В связи с этим происходит потеря клинически актуальной информации. Кроме того, выражение степени окислительной модификации белков в Ед оптической плотности/мл сыворотки или мг белка представляется крайне неудачным, так как не позволяет сопоставить результаты, полученные в различных исследованиях. Другим существенным недостатком известного способа является то обстоятельство, что белки сыворотки подвергаются действию 10% ТХУ в течение 1 часа при комнатной температуре. Как известно, ТХУ является сильным денатурирующим агентом, поэтому в биохимической практике осаждение белков с помощью ТХУ осуществляют строго на холоду, при 0°С или при отрицательной температуре, по возможности сводя к минимуму время экспозиции. Необратимая денатурация и агрегация белков может препятствовать как протеканию самой реакции с ДНФГ, так и приводить к ухудшению растворимости белка в мочевине (слипание осадка), что является потенциальной причиной отклонений в результатах и источником артефактов.
-1
-1
Известен способ определения окисляемости белков сыворотки и плазмы крови, разработанный Азизовой О.А. и соавторами, при котором окислительная устойчивость белков оценивается по накоплению карбонильных продуктов окисления белков в процессе медь-индуцированного окисления (О.А. Азизова, А.П. Пирязев, С.Н. Москвина / Метод определения окисляемости белков сыворотки и плазмы крови. // Биомедицинская химия. 2007. Т. 53, №1, с. 99-106). Для определения степени окислительной модификации белков в данном способе к 0,2 мл исследуемых образцов плазмы или сыворотки добавляют 1,0 мл 0,0025 М ДНФГ, растворенного в 2,5 М HCl, а в контрольные образцы - 1,0 мл 2,5 М HCl. Все пробы инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте, затем добавляют 1 мл охлажденного 20% раствора ТХУ, выдерживают 10 мин в холодильнике и центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. Осадок промывают смесью этанол - этилацетат (1:1) для экстракции липидов и 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков. Для этого к осадку добавляют 2 мл смеси этанол - этилацетат, центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. Затем повторяют процедуру. Полученный осадок высушивают для удаления растворителей. Затем осадок растворяют в предварительно нагретых 2,0 мл 10 М раствора мочевины на кипящей водяной бане. Оптическую плотность опытных и контрольных растворов регистрируют на спектрофотометре при 370 нм. Концентрацию карбонильных продуктов рассчитывают по формуле: С (нмоль/мл)=(Abs370 нм·106/ε370 нм)·X, где С - концентрация карбонильных групп в плазме (нмоль/мл), Abs370 нм - оптическая плотность образца при λ=370 нм, ε370нм=22000М см - коэффициент молярной экстинкции при λ=370 нм, X - фактор разбавления. Содержание карбонильных продуктов пересчитывают на 1 мг белка или 1 мл плазмы. Для определения концентрации белка в плазме используют биуретовый метод.
Способ также является неселективным, поэтому не позволяет получить информацию о степени окисленности индивидуальных белков плазмы, таких как фибриноген, однако авторам данного способа удалось избежать недостатков, отмеченных выше для предыдущего способа.
В качестве прототипа заявляемого изобретения избран способ определения окислительной модификации фибриногена, при котором фибриноген изолируют из плазмы крови, используя его специфическое свойство превращаться в нерастворимый фибрин с образованием организованного сгустка, а содержание карбонильных групп в фибриновом сгустке определяют спектрофотометрическим методом по реакции с ДНФГ (Патент РФ №2298189). Способ является селективным, так как позволяет получить информацию о степени окислительной модификации индивидуального белка плазмы крови - фибриногена. Кроме того, как указывают авторы, способ занимает непродолжительное время исследования, его техническое выполнение весьма простое и работа осуществляется одним врачом-лаборантом, для его выполнения требуется только спектрофотометр и необходимые реактивы, способ может использоваться в условиях клинических биохимических лабораторий для оценки степени окисления фибриногена.
2
Согласно способу-прототипу сначала определяют концентрацию фибриногена: к 1 мл плазмы крови (3,8% цитрата) добавляют 0,5 мл 20 мМ раствора CaCl, далее пробу инкубируют на водяной при 37°С 10 минут, образовавшийся сгусток высушивают на бумажном фильтре, взвешивают на торсионных весах и пересчитывают его массу на концентрацию фибриногена в плазме в мг/мл с использованием коэффициента перерасчета 0,222 (гравиметрический метод определения содержания фибриногена в плазме, предложенный Рутберг Р.А. в 1961 г.). Затем к сгустку добавляют 0,5 мл 0,9% раствора NaCl и такой же объем 20% раствора ТХУ. Далее определяют окислительную модификацию сгустка по вышеописанному способу Дубининой Е.Е. и соавторов (1995 г.). Результаты выражают в Ед оптической плотности/мг фибриногена/мл плазмы.
К недостаткам способа-прототипа следует отнести недостатки самого метода Дубининой Е.Е. и соавторов (1995 г.), отмеченные выше. Это длительный контакт белка с ТХУ при комнатной температуре и использование некорректных единиц измерения карбонильных продуктов окисления белка. Поэтому технически более близким аналогом заявляемого изобретения в части модификации самого базового метода определения карбонильных групп белков Levine R.L. и соавторов (1990 г.) является способ Азизовой О.А. и соавторов (2007 г.).
2
Недостатком способа-прототипа является также активация свертывания плазмы хлоридом кальция, который используется в исходном гравиметрическом методе Рутберг Р.А. для получения фибринового сгустка. Освобождение эндогенного тромбина под действием ионов кальция зависит от состояния плазменных и тромбоцитарных факторов системы свертывания крови у данного пациента и многих других факторов, таких как прием лекарственных препаратов, условия подготовки и хранения образцов и т.д. Поэтому в более поздней модификации гравиметрического метода определения содержания фибриногена в плазме для активации свертывания вместо CaCl было предложено использовать раствор тромбина (прямая стимуляция превращения фибриногена в фибрин). Добавка экзогенного препарата тромбина с известной активностью обеспечивает стандартные условия получения фибринового сгустка. При этом сам гравиметрический метод определения содержания фибриногена в плазме крови считается устаревшим, в настоящее время не используется.
Однако наиболее существенным недостатком известного способа является то обстоятельство, что фибриновый сгусток плазмы практически не растворяется ни в 8М мочевине, ни в других растворителях, поскольку молекулы фибрин-мономера, образующие основу сгустка, сшиты поперечными ковалентными связями. Образование ковалентных связей происходит под действием фибрин-стабилизирующего фактора крови (фактор XIII). Считается, что растворение сгустка исследуемой плазмы в 30% мочевине в течение 1 ч является признаком тяжелой недостаточности фактора XIII. Сгусток нормальной плазмы при этом не растворяется (Смоляницкий А.Я. / Методы исследования системы гемостаза// с. 170, в кн. «Лабораторные методы исследования в клинике». Справочник под редакцией проф. В.В. Меньшикова, М.: Медицина, 1987).
Очевидно, что полное растворение фибринового сгустка является необходимым этапом и условием для осуществления самой реакции с ДНФГ и для спектрофотометрической регистрации образовавшихся в этой реакции соединений с карбонильными группами белка. Более того, корректное определение карбонильных продуктов окисления в составе нерастворимого полимеризованного фибрина, как представляется, невозможно ни одним из известных способов.
Указанные недостатки устраняются в настоящем изобретении.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка селективного, количественного и надежного способа определения окислительно-модифицированного фибриногена в клинических образцах плазмы крови. В идеале такой способ должен быть достаточно точным и чувствительным и при этом простым в исполнении, не требующим специального оборудования и дорогостоящих реактивов, пригодным для осуществления в условиях обычной клинико-диагностической лаборатории. Также важно, чтобы объем крови, требуемый для анализа, был приемлемым с учетом практических возможностей забора крови на дополнительные исследования у пациентов, в частности, с сердечно-сосудистыми заболеваниями.
Поставленная задача решается тем, что фибриноген плазмы переводят в фибрин, при этом для активации свертывания используют тромбин, плазму инкубируют при 37°C, образовавшийся сгусток трижды промывают 0,9% раствором NaCl и высушивают на фильтровальной бумаге. Промывка и высушивание имеет целью максимально удалить посторонние белки плазмы из сгустка. Полученный из 1 мл плазмы фибриновый сгусток переводят в растворимое состояние путем гидролиза в 1 мл 1 М раствора NaOH при 100°C, реакцию останавливают через 120±1 с добавлением 1 мл 2 М HCl, пробирки охлаждают, в гидролизате определяют концентрацию белка и концентрацию карбонильных групп.
-1
-1
Концентрацию белка определяют по биуретовой реакции, пересчитывают на концентрацию фибриногена в мг/мл по калибровке фибриногеном. Концентрацию карбонильных групп определяют по реакции с 2,4-динитрофенилгидразином. Вначале инкубируют 0,5 мл гидролизата фибринового сгустка с 2 мл 0,01 М раствора ДНФГ в 2 М HCl (опытная проба) и 0,5 мл гидролизата с 2 мл 2 М HCl (холостая проба) при комнатной температуре 60 минут. Затем к холостой и опытной пробе добавляют охлажденный 20% раствор ТХУ в объемном соотношении 8:5 (4 мл ТХУ на 2,5 мл пробы), выдерживают при -20°C не менее 10 минут, центрифугируют, полученный осадок трехкратно промывают раствором этанола и этилацетата (1:1) от избытка не прореагировавшего ДНФГ по схеме: 5, 3, и 2 мл с центрифугированием при 1500 g по 10 мин при каждой отмывке. После удаления последней порции супернатанта осадки высушивают, растворяют в 2,5 мл 8 М мочевины, растворы в мочевине еще раз центрифугируют 10 мин при 1500 g, затем спектрофотометрически измеряют оптическую плотность при 370 нм. Содержание карбонильных групп в фибриногене нмоль/мг, эквивалентное образовавшимся динитрофенилгидразонам в реакции с ДНФГ, рассчитывают, используя принятый для динитрофенилгидразонов коэффициент молярной экстинкции 22000 М см при указанной длине волны.
В соответствии с общепринятой практикой анализ одного клинического образца плазмы крови рекомендуется выполнять в трех параллельных экспериментах, в каждом из которых независимо получают фибриновый сгусток, определяют значение концентрации фибриногена и содержание карбонильных групп.
Таким образом, в отличие от способа-прототипа в заявляемом способе фибриновый сгусток перед анализом переводят в растворимое состояние путем гидролиза в специально подобранных и строго контролируемых условиях, благодаря чему получают гидролизат с требуемыми свойствами, а дальнейшее определение карбонильных групп в реакции с ДНФГ проводят способом, модифицированным с учетом специфических физико-химических свойств полученного гидролизата. При этом для активации свертывания плазмы используют раствор тромбина, а содержание фибриногена (мг/мл) определяют биуретовым методом. Результаты определения окислительной модификации фибриногена представляют в стандартизованном виде, как количество карбонильных групп, содержащихся в 1 мг фибриногена (нмоль/мг), что позволяет сравнивать данные различных исследований, в том числе полученные разными способами.
Преимуществом предложенного способа является аналитическая надежность (воспроизводимость, правильность, чувствительность, специфичность) измерения карбонильных групп в фибриновом сгустке, которая достигается, прежде всего, благодаря полной растворимости анализируемого образца в мочевине, в то время как в прототипе выполнение данного условия не обеспечивается.
2
Более высокая аналитическая надежность достигается также за счет применения биуретового метода для определения концентрации фибриногена вместо взвешивания фибринового сгустка, использования стандартного раствора тромбина для прямой активации превращения фибриногена в фибрин вместо опосредованной активации раствором CaCl, а также за счет минимизации денатурирующего действия ТХУ путем сокращения экспозиции и инкубации при -20°C. Добавление охлажденной ТХУ после окончания инкубации образца с ДНФГ, а не в начале, как в прототипе, и последующее охлаждение образца до -20°C призвано еще и остановить реакцию и, следовательно, более точно соблюдать заданное время протекания реакции.
В то же время предложенный способ не требует использования дополнительного по сравнению с прототипом оборудования, редких или дорогостоящих реактивов, также прост в техническом исполнении и может применяться для анализа окислительной модификации фибриногена в условиях общеклинической биохимической лаборатории.
Между тем, процесс температурного щелочного гидролиза характеризуется сильной нелинейностью, а белковый гидролизат по ряду свойств отличается от нативных белков. Поэтому для достижения указанного технического результата необходима оптимизация условий гидролиза, а также существенная модификация самого метода спектрофотометрического определения карбонильных групп белков в ДНФГ-реакции с учетом специфических физико-химических свойств гидролизата фибринового сгустка.
Так, известен унифицированный колориметрический метод определения фибриногена в плазме (утвержден приказом Минздрава СССР от 15.10.1974 №960 "Об унификации клинических лабораторных методов исследования"), при котором фибриноген превращают в фибрин путем добавления тромбина, затем фибриновый сгусток растворяют в щелочи и определяют концентрацию белка по биуретовой реакции. Кратко: в 2 пробирки (для параллельных определений) вводят по 0,2 мл цитратной (3,8% цитрата натрия) или оксалатной (1,34% оксалата натрия) плазмы, добавляют по 0,1 мл раствора тромбина в 0,85% растворе хлорида натрия с активностью 7-10 с и ставят пробирки в водяную баню при 37°С. Через 1 ч сгустки извлекают, трижды отмывают охлажденным 0,85% раствором хлорида натрия и высушивают на фильтровальной бумаге. Каждый из сгустков помещают в пробирку с 1 мл 1 н. раствора NaOH и ставят пробирки на 5 мин в кипящую воду. Пробы охлаждают до комнатной температуры и добавляют в каждую пробирку по 1 мл биуретового реактива. Через 30 мин пробы колориметрируют при длине волны 500-560 нм против дистиллированной воды. Для определения количества фибриногена в мг/мл предварительно строят график соотношения между показаниями ФЭКа и концентрацией фибриногена в растворе. Для этого используют стандартные разведения чистого фибриногена (коагулируемого белка) в пределах от 0,5 до 10 мг/мл (Смоляницкий А.Я. /Методы исследования системы гемостаза// с. 169, в кн. «Лабораторные методы исследования в клинике». Справочник под редакцией проф. В.В. Меньшикова, М.: Медицина, 1987). Унифицированный колориметрический метод сохраняет свое значение по настоящее время в качестве референтного способа определения концентрации фибриногена в плазме крови благодаря высокой точности биуретового метода определения белка.
Исходя из задач настоящего изобретения в представленном примере наиболее важным является то обстоятельство, что белковый гидролизат фибринового сгустка количественно и качественно соответствует фибриногену, содержащемуся в исходном образце плазмы, что указывает на высокую специфичность заявляемого способа, в котором также используется гидролизат фибринового сгустка. В то же время по биуретовой реакции определяется содержание пептидных связей, однако определение содержания карбонильных групп в гидролизате, полученном по вышеописанной методике, с помощью известных способов не представляется возможным из-за малых размеров пептидных фрагментов.
Разделение молекул белка и не прореагировавшего ДНФГ (реакция проводится в условиях 100-1000-кратного избытка ДНФГ) является одним из неотъемлемых этапов определения карбонильных групп. С этой целью обычно проводят осаждение белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ), в присутствии которой выпадают в осадок белки и пептиды с молекулярной массой порядка 10 кД и выше. Метод широко используется в биохимической практике как быстрый и удобный способ очистки белков от низкомолекулярных примесей. Также хорошо известно применение этанола различных концентраций и других органических растворителей с целью осаждения или фракционирования белков. Однако ни ТХУ, ни этанол с этилацетатом, используемые в стандартной методике для дальнейшей отмывки белкового осадка от примесей ДНФГ, не осаждают белок гидролизата фибринового сгустка, полученный вышеуказанным способом, поскольку средний размер пептидов оказывается ниже критического.
В специальных экспериментах установлено, что зависимость среднего размера пептидных фрагментов фибринового сгустка от интенсивности щелочного гидролиза имеет резко выраженный экстремальный характер, в связи с чем возникает необходимость в подборе и строгом контроле условий гидролиза. С этой целью в заявляемом способе используется добавка к 1 М раствору NaOH равного объема 2 М HCl, которая в силу двухкратного избытка кислоты позволяет мгновенно остановить реакцию гидролиза. Изучение различных режимов гидролиза (температура; время; концентрация NaOH) с остановкой реакции показало, что при недостаточном гидролизе фибриновый сгусток остается полностью или частично нерастворимым и не растворяется после всех процедур в мочевине, следовательно, такой образец не может быть использован для спектрофотометрического определения карбонильных продуктов. При более интенсивном гидролизе, например таком, который используется в вышеописанном унифицированном колориметрическом методе определения фибриногена (100°С; 5 мин; 1 М NaOH), гидролизат становится слишком «низкомолекулярным», вследствие чего растворяется в ТХУ, а также в спирте и этилацетате, поэтому его нельзя отделить от свободного ДНФГ методом осаждения. Оптимальным результатом гидролиза было бы полное растворение сгустка в щелочи и полное осаждение белкового гидролизата в растворе ТХУ. Однако даже при минимальной продолжительности гидролиза порядка 2 мин, требующейся для полного растворения фибринового сгустка, возникают значительные потери белка при осаждении.
Для осаждения белков обычно используют ТХУ в конечной концентрации 10%, как правило, путем добавления 20% раствора ТХУ в соотношении 1:1 в исследуемой пробе. ТХУ в конечной концентрации 10% используется и в ранее известных способах определения карбонильных групп белков в реакции с ДНФГ. Установлено, что при объеме пробы 2,5 мл увеличение объема добавки 20% ТХУ с 2,5 мл до 4 мл позволяет практически полностью осадить белок из гидролизата, полученного в оптимальных условиях (100°С; 120±1 с). Использование более высоких концентраций ТХУ является нецелесообразным, так как не повышается эффективность осаждения, приводит к необоснованному расходу реактива.
Поэтому в отличие от известных способов в настоящем изобретении используется экспериментально подобранная конечная концентрация ТХУ около 12,3%, которая достигается при смешивании 20% раствора ТХУ с реакционной смесью, содержащей гидролизат фибрина и раствор ДНФГ, в объемном соотношении 8:5.
Дальнейшая отмывка осадка от ДНФГ, который не связался с карбонильными группами белков, согласно базовому способу Levine R.L. и соавторов (1990 г.), а также его модификациям, проводится смесью этанола и этилацетата в соотношении 1:1. Белки, как известно, не растворяются ни в спирте с низким содержанием воды, ни в этилацетате, в раствор переходят только низкомолекулярные соединения. Смесь также эффективно экстрагирует липиды, с которыми может быть связан ДНФГ, не имеющий отношения к карбонильным группам белка, и другие низкомолекулярные хромофоры, препятствующие спектрофотометрии. При этом использование 1-2 мл смеси этанола и этилацетата оказывается достаточным для эффективной отмывки при условии трехкратной смены раствора. Однако в случае отмывки осадка, полученного из гидролизата фибринового сгустка, от 30 до 50% белка переходит в отмывочный раствор, вследствие чего результаты определения карбонильных групп оказываются не только сильно заниженными, но и характеризуются большим разбросом значений.
Данное явление, как оказалось, обусловлено разбавлением этанола и этилацетата небольшим остатком жидкости в пробирке с осадком, вследствие чего относительно короткие пептиды гидролизата приобретают растворимость. Полное удаление супернатанта, оставшегося после осаждения ТХУ, технически затруднительно, однако эффект разбавления этанола и этилацетата можно снизить за счет увеличения объема самой промывочной смеси. Увеличение количества смеси для отмывки с 2 до 5 мл позволяет резко сократить потери белка, при этом повышается прочность связывания осадка со стеклом и, что крайне важно, существенно улучшается сходимость результатов в параллельных измерениях.
Таким образом, в отличие от известных способов определения карбонильных продуктов окисления в белках плазмы и сыворотки в предложенном способе отмывка осадка гидролизатата фибрина от избытка ДНФГ производится ступенчато: для 1-й отмывки используют 5 мл смеси этанола и этилацетата, для 2-й - 3 мл, для 3-й - 2 мл. Предложенная схема позволяет максимально снизить потери белка и является оптимальной по расходу реактивов. При этом суммарные потери белка на этапе осаждения и отмывки составляют около 10% от исходного содержания фибриногена. Аналогичные потери по литературным и собственным данным возникают и при определении карбонильных групп в коммерческом препарате фибриногена или альбумина и рассматриваются как вполне приемлемые для данного метода. Однако указанную систематическую погрешность следует учитывать при анализе результатов.
Модификация процедур осаждения белка и отмывок от низкомолекулярных примесей является важным элементом настоящего изобретения, так как стандартные схемы осаждения и отмывки, применявшиеся ранее, не позволяют получить достоверные результаты при определении карбонильных групп в гидролизате фибринового сгустка, физико-химические свойства которого сильно отличаются от свойств обычных белков.
Следует отметить, что в предложенном способе применяется отмывка от не прореагировавшего ДНФГ без разрушения осадка, поэтому эффективность отмывки зависит от параметров, которые влияют на условия диффузии, таких как конфигурация и размеры пробирок, нагрузки по белку, продолжительность центрифугирования. Рекомендуется использовать определенный тип пробирок, указанный в протоколе.
Одной из особенностей заявляемого способа является центрифугирование растворов белка в мочевине перед измерением оптической плотности. Для спектрофотометрии используют 2 мл супернатанта, который отбирают из общего объема 2,5 мл. Данный этап необходим для удаления волокон фильтровальной бумаги, которые прилипают к фибриновому сгустку в процессе высушивания, а также других частиц нерастворимого материала, вызывающих светорассеяние. В связи с небольшой величиной измеряемого сигнала светорассеяние является одним из основных источников артефактов.
К другим источникам артефактов следует отнести неадекватный контроль, или его отсутствие, недостаточно полную отмывку от ДНФГ, не вступившего в реакцию с карбонильными группами белка, неполное растворение белкового осадка в мочевине.
Для устранения роли случайных отклонений, вероятность которых особенно велика на этапах гидролиза, осаждения и отмывки, анализ одного образца плазмы целесообразно выполнять в трех параллельных экспериментах, в каждом из которых независимо получают фибриновый сгусток, определяют значение концентрации фибриногена и карбонильных продуктов окисления.
Ниже представлены аналитические и рабочие характеристики способа, полученные с использованием пулированной плазмы доноров:
1. Линейность: величина регистрируемого сигнала линейно зависит от концентрации карбонильных продуктов окисления белков при дозовой нагрузке по белку 0,25-1,25 мг.
2. Значение коэффициента вариации: не более 10%.
3. Чувствительность: не менее 0,5 нмоль/мг.
4. Специфичность (по отношению к фибриногену): не менее 95%.
5. Количество плазмы/крови для исследования: 3-4/8-10 мл.
6. Затраты времени на анализ 4-х клинических образцов: 4,5-5 ч.
Правильность результатов исследования уровня окислительной модификации фибриногена, как одна из характеристик аналитической надежности диагностического лабораторного теста, достигается за счет выявления и устранения всех факторов, вызывающих отклонение измеряемого значения от его истинной величины (с учетом статистической погрешности). Для проверки правильности измерений заявленным способом были проведены исследования уровня окислительной модификации фибриногена в образцах, полученных путем смешивания плазмы больных с высоким и низким значением данного показателя. Результаты этих измерений в пределах статистической ошибки совпадают с расчетными значениями, что подтверждает аналитическую правильность способа.
О правильности результатов измерений заявляемым способом свидетельствует и сам по себе линейный характер зависимости содержания карбонильных продуктов от количества фибриногена в указанном выше диапазоне 0,25-1,25 мг.
В этой связи необходимо отметить, что правильность и точность измерений достигается также за счет использования в предлагаемом изобретении определенного соотношения компонентов реакционной смеси: 0,5 мл гидролизата фибринового сгустка и 2 мл 0,01 М раствора ДНФГ в 2 М HCl. Указанное соотношение является оптимальным, так как при обычной концентрации фибриногена в плазме 2,0-4,0 мг/мл, содержание белка в пробе для анализа составляет 0,5 мг - 1 мг, то есть не выходит за границы линейного диапазона измерений.
Если в исследуемом образце плазмы крови содержание фибриногена существенно отклоняется от нормальных значений, то добавка гидролизата, вносимая в реакционную смесь, может быть легко скорректирована: при высоком содержании фибриногена - путем разведения, а при низком - путем увеличения объема. В случае гипо- и афибриногенемии способ не применяется.
Необходимым условием получения достоверных результатов при использовании заявляемого способа является строгое соблюдение всех режимов и условий, указанных в формуле изобретения. С этой целью в клинико-лабораторной практике целесообразно придерживаться единого протокола исследования окислительной модификации фибриногена. Ниже представлен рекомендуемый протокол определения карбонильных продуктов окисления белка в гидролизате фибринового сгустка плазмы крови.
Кровь из локтевой вены забирают по стандартной методике, в качестве антикоагулянта используют цитрат натрия в конечной концентрации 3,8%, центрифугируют в пластиковых пробирках 15 мин при 1000 g. Плазму разливают на аликвоты объемом 3,5-4 мл, хранят при -20°C.
Анализ фибриногена из одного образца плазмы проводят в трех параллельных экспериментах. Плазму размораживают, встряхивают на вортексе, центрифугируют 15 мин при 1500 g для удаления нерастворимого материала. В три пластиковые пробирки разливают по 1 мл исследуемого образца плазмы, добавляют по 0,2 мл p-pa тромбина с активностью 6 IU/мл и помещают на 40-60 мин в термостат при 37°C для образования фибриновых сгустков. Сгустки промывают трехкратно 10 мл физраствора. Для удаления посторонних белков и влаги сгустки высушивают между листами фильтровальной бумаги: полностью высушенный сгусток при сжатии не оставляет влажный отпечаток на бумаге. Для проведения гидролиза и реакции с ДНФГ каждый из сгустков помещают в отдельную стеклянную толстостенную пробирку с круглым дном.
В пробирки с высушенными сгустками добавляют по 1 мл 1 М NaOH, немедленно помещают в кипящую воду, через 120±1 с реакцию останавливают добавлением 1 мл 2 М раствора HCl, пробирки погружают в холодную водопроводную воду (10-15°C) на 3-5 мин.
Гидролизаты фибриновых сгустков тщательно пипетируют, добиваясь однородности (раствор фибрина как правило мутный и может содержать взвесь, однако это не является препятствием для проведения анализа), после чего из каждого образца отбирают по 0,5 мл в 2 круглодонные стеклянные толстостенные пробирки (контрольная и опытная проба) для определения карбонильных групп (реакция с ДНФГ).
Оставшийся гидролизат используют для определения концентрации белка по биуретовой реакции согласно унифицированному колориметрическому методу определения фибриногена, описанному выше (см. например: Смоляницкий А.Я. / Методы исследования системы гемостаза// с. 169, в кн. «Лабораторные методы исследования в клинике». Справочник под редакцией проф. В.В. Меньшикова, М.: Медицина, 1987). С этой целью можно использовать готовые реагенты, например, набор реагентов для определения общего белка в сыворотке и плазме крови «Общий белок-01-витал» фирмы «Витал Диагностике Спб». Для построения калибровочной зависимости используют коммерческий препарат фибриногена с известной степенью очистки (по содержанию коагулируемого белка).
Ход определения карбонильных продуктов окисления. В опытную пробу с гидролизатом сгустка добавляют 2,0 мл 0,01М р-ра ДНФГ в 20% HCl, в контрольную - 2,0 мл 20% HCl без ДНФГ (холостая проба), инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа, добавляют по 4 мл охлажденного 20% раствора ТХУ, выдерживают не менее 10 мин в морозильной камере при -20°С для формирования преципитата, центрифугируют 10 мин при 1500 g. Супернатант осторожно удаляют пипеткой, избегая разрушения осадка. К осадку добавляют 5 мл смеси этананола с этилацетатом, взятых в соотношении 1:1, центрифугируют 10 мин при 1500 g, супернатант сливают. Вторую отмывку проводят 3 мл смеси этананола с этилацетатом, третью - 2 мл в том же режиме центрифугирования. Пробирки с осадком высушивают в перевернутом состоянии при комнатной температуре не менее 20 мин. К осадкам добавляют по 2,5 мл 8 М мочевины. Полное растворение осадка достигается в течение 3 мин на кипящей водяной бане (время засекается по секундомеру). Перед измерением оптической плотности растворы белка в мочевине центрифугируют 10 мин при 1500 g для осаждения мелкодисперсных нерастворимых компонентов, затем отбирают пипеткой по 2 мл в измерительную кювету с длиной оптического пути 1 см.
-1
-1
Оптическую плотность контрольной и опытной пробы измеряют против воды при длине волны 370 нм. Содержание карбонильных групп рассчитывают как количество динитрофенилгидразонов, образовавшихся при связывании карбонильных групп белка с 2,4-динитрофенилгидразином, выраженное в наномолях, на 1 мг белка. Содержание белка в пробе определяют на основании ранее полученного значения концентрации фибриногена в плазме мг/мл биуретовым методом и коэффициента разведения образца, который при использовании объемных соотношений, указанных в протоколе, равен 10. Коэффициент молярной экстинкции динитрофенилгидразонов при 370 нм принимают равным 22000 М см. Для расчета используют рабочую формулу (1):
(1) Скарб=454,55×(А370оп-А370кон)/Сфб, где
Скарб - содержание карбонильных групп в фибриногене (нмоль/мг);
А370оп - оптическая плотность опытной пробы;
А370кон - оптическая плотность контрольной пробы.
6
Коэффициент 454,55=10×10/22000 включает коэффициент разведения образца, коэффициент молярной экстинкции динитрофенилгидразонов и коэффициент перевода размерности моль/литр в нмоль/мл.
Для каждого исследуемого образца плазмы крови содержания карбонильных групп в гидролизате фибринового сгустка вычисляют как среднее значение по результатам трех измерений.
Оборудование: 1) лабораторная настольная центрифуга с горизонтальным ротором типа ОПН-8, СМ-12 или СМ-6М; 2) вортекс; 3) спектрофотометр; 4) кварцевая кювета с длиной оптического пути 1 см и объемом 4 мл; 5) водяная баня до 100°С; 6) секундомер; 7) термометр для измерения комнатной температуры; 8) пластиковые пробирки на 12-15 мл; 9) круглодонные стеклянные толстостенные пробирки с внутренним диаметром 13,5 мм, высотой 100 мм.
Реактивы и материалы: 1) цитратная плазма замороженная (не мене 3 мл); 2) набор реагентов «Тромбин-реагент» производства НПО «Ренам»; 3) набор реагентов для определения общего белка в сыворотке и плазме крови биуретовым методом «Общий белок-01-витал» фирмы «Витал Диагностикс Спб»; 4) 1М раствор NaOH; 5) 2 М раствор HCl; 6) 20% раствор ТХУ (w/v); 7) смесь этанола с этилацетатом в соотношении 1:1; 8) лиофилизированный человеческий фибриноген фирмы «Sigma» с известной степенью очистки.
С целью апробации заявляемого способа на клинических образцах плазмы крови были проведены исследования уровня окислительной модификации фибриногена у ограниченной группы больных ИБС со стенокардией напряжения II-III функционального класса до прохождения курса лечения (1-я группа, 9 пациентов) и после прохождения 12-недельного курса комбинированной фармакотерапии (2-я группа, 12 пациентов). При этом во вторую группу исследуемых вошло 9 пациентов из первой группы, у которых измерялся уровень окислительной модификации фибриногена до начала лечения. Таким образом, на данном примере клинических исследований имеется возможность оценить изменение степени окислительной модификации фибриногена у пациентов после длительной терапии, направленной на улучшение состояния больных ИБС.
Пример клинического осуществления способа
Больная Н., 63 года, со стабильной ИБС (стенокардия напряжения II-III функционального класса), без сердечной недостаточности, в анамнезе инфаркт миокарда, в течение последних 7 лет умеренная артериальная гипертония. Курс лечения продолжительностью 12 недель включал аспирин, β-блокаторы, статины, антагонисты кальция, ингибиторы АПФ, нитраты. Исходно, а также спустя 12 недель с момента начала терапии был определен уровень окислительно-модифицированного фибриногена в плазме крови. Образцы плазмы хранились в замороженном состоянии при -20°С. Для первого и второго определения использовали по 3 мл плазмы. Выделение и обработку фибриновых сгустков, измерение содержания карбонильных групп осуществляли в трех параллельных экспериментах, в полном соответствии с представленным выше протоколом.
2
2
Определяли: С фб - концентрацию фибриногена в плазме в мг/мл, A370 оп - поглощение опытного образца при длине волны 370 нм против HO, А370 кон - поглощение контрольного образца при длине волны 370 нм против HO.
С карб - содержание карбонильных групп, выраженное в нмоль/мг белка, рассчитывали по рабочей формуле (1). Уровень окислительно-модифицированного фибриногена в плазме крови представлен как среднее значение и стандартная ошибка среднего.
1. Определение исходного уровня окислительно-модифицированного фибриногена в плазме крови:
Результаты 1-го опыта: С фб = 3,98 мг/мл; А370 оп = 0,067; А370 кон = 0,012;
С карб = 454,6×0,067-0,012)/3,98=6,28 нмоль/мг.
Результаты 2-го опыта: С фб = 3,96 мг/мл; А370 оп = 0,063; А370 кон = 0,012;
С карб = 454,6×(0,063-0,012)/3,96=5,85 нмоль/мг.
Результаты 3-го опыта: С фб = 3,91 мг/мл; А370 оп = 0,06; А370 кон = 0,013;
С карб = 454,6×(0,06-0,013)/3,91=5,46 нмоль/мг.
Таким образом, содержание карбонильных групп в фибриногене (степень его окислительной модификации) составило 5,87±0,236 нмоль/мг, содержание фибриногена в плазме крови - 3,95±0,021 мг/мл.
2. Определение уровня окислительно-модифицированного фибриногена в плазме крови спустя 12 недель с момента начала терапии:
Результаты 1-го опыта: С фб = 3,59 мг/мл; А370 оп = 0,046; А370 кон = 0,01;
С карб = 454,6×(0,046-0,01)/3,59=4,56 нмоль/мг.
Результаты 2-го опыта: С фб = 3,66 мг/мл; А370 оп = 0,044; А370 кон = 0,013;
С карб = 454,6×(0,044-0,013)/3,66=3,85 нмоль/мг.
Результаты 3-го опыта: С фб = 3,61 мг/мл; А370 оп = 0,041; А370 кон = 0,009;
С карб=454,6×(0,041-0,009)/3,61=4,03 нмоль/мг.
Таким образом, содержание карбонильных групп в фибриногене (степень его окислительной модификации) составило 4,14±0,213 нмоль/мг, содержание фибриногена в плазме крови - 3,62±0,025 мг/мл.
Остальные примеры выполнены аналогичным образом. Результаты определения содержания карбонильных групп в гидролизате фибринового сгустка и концентрации фибриногена в плазме крови, как самостоятельного показателя, обобщены в таблице.
1
2
1
2
Достоверность отличий между группами оценивали по t-критерию Стьюдента. В случае «окисленного» фибриногена значение t-критерия, рассчитанное для двух независимых выборок (n=9, n=12; непарный Т-тест), составило 0,09 (p<0.1), а для зависимых выборок (n=n=9; парный Т-тест) - 0,01 (p<0.05).
В случае «общего» фибриногена оба значения t-критерия оказались выше принятого уровня значимости (p=0.05).
Таким образом, у больных ИБС уровень окислительной модификации фибриногена в процессе лечения достоверно снизился, то время как концентрация самого фибриногена в плазме практически не изменилась.
Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что определение окислительной модификации фибриногена является более чувствительным и информативным диагностическим тестом, чем концентрация самого фибриногена в плазме крови при патологических состояниях, в возникновении и развитии которых ведущая роль отводится действию факторов окислительного стресса, в частности, при сердечно-сосудистых заболеваниях атеросклеротического генеза. Кроме того, из представленного примера следует, что достигнутая аналитическая точность и чувствительность измерений степени окисленности фибриногена у больных до и после лечения позволяет использовать данный показатель в качестве дополнительного клинико-биохимического критерия эффективности лечения и подбора индивидуальной терапии.
Таким образом, результаты клинической апробации предлагаемого изобретения наряду с характеристиками, полученными на пулированной плазме доноров, подтверждают высокую аналитическую надежность способа, которая включает специфичность, воспроизводимость, чувствительность и правильность результатов измерения диагностического показателя.
Благодаря этому, а также доступности и простоте исполнения, заявляемый способ определения окислительной модификации фибриногена может быть рекомендован для широкого внедрения в клинико-лабораторную практику с целью диагностики, прогноза развития и прогрессирования заболеваний, контроля эффективности лечения.