Клинические аспекты применения хемилюминесцентного анализа

©ВИННИК Ю.С., САВЧЕНКО А.А., ПЕРЬЯНОВА О.В., ТЕПЛЯКОВА О.В., ЯКИМОВ С.В.,ТЕПЛЯКОВА ЕЮ., МЕШКОВА ОС.

КЛИНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО

АНАЛИЗА

Ю.С. Винник, А.А. Савченко, О.В. Перьянова, О.В. Теплякова, С.В. Якимов, Е.Ю. Тепляков,

О. С. Мешкова

Красноярская государственная медицинская академия, ректор - д. м. н., проф. И.П. Артюхов;

кафедра общей хирургии, зав. - д.м.н., проф. Ю.С. Винник

Резюме. В обзоре представлены возможности современных методик

хемилюминесценции в диагностике предпатологических состояний, прогнозировании тяжести течения заболевания, контроле безопасности и эффективности проведения окислительной терапии. Основными достоинствами хемилюминесцентного анализа являются простота, высокая чувствительность, экспрессность.

Ключевые слова: хемилюминесцеция, медицина, клинические аспекты, научный обзор Явление хемилюминесценции - свечения, сопровождающего химические реакции, -

все более широко используется в практических целях, поскольку позволяет создать

ультрачувствительные и специфические методы анализа различных биологических

субстратов. Хемилюминесценция (ХЛ) обусловлена, реакциями экзотермического типа и

протекает, как правило, в три стадии [1, 3,16]:

1) Восстановление одного из участников реакции (присоединение электрона) и окисление второго (отрыв электрона), что приводит к запасанию химической энергии в системе, которая позднее выделится в виде фотона.

2) Перенос электрона (окислительно-восстановительная реакция) на один из более высоких энергетических уровней и образование продукта реакции в электронновозбужденном состоянии.

3) Высвечивание фотона при переходе молекулы из электронно-возбужденного в основное состояние (люминесценция). Обычно химические реакции, сопровождающиеся

свечением, протекают через целый ряд промежуточных стадий, но основные этапы образования и испускания энергии сходны [4, 23].

Хемилюминесцентный метод позволяет регистрировать короткоживущие свободные радикалы, которые можно разделить на четыре группы: а) свободные радикалы (СР) активных форм кислорода, б) СР липидов, в) СР, осуществляющие ферментативное дыхание в митохондриях, г) СР естественных антиоксидантов [5, 17, 19].

Анализ кинетики, квантовых и энергетических характеристик ХЛ биологических объектов показал ее тесную взаимосвязь со свободнорадикальным окислением, протекающим неферментативно за счет биохимических процессов восстановления молекулярного кислорода с образованием его активных форм - супероксидного анионрадикала, синглетного кислорода и гидроксильного радикала [4, 20]. Аутоокисление липидов, главным образом, ненасыщенных жирных кислот, приводит к генерации свободных радикалов, взаимодействующих с кислородом и образующих пероксиды, которые рекомбинируют, излучая кванты света. Эмиссия фотонов наблюдается при распаде промежуточных продуктов реакции с молекулярным кислородом (перекисей). Источниками хемилюминесценции при свободнорадикальном окислении могут быть возбужденные молекулы кетонов и димеров кислорода, циклические гидроперекиси при их разложении, оксалаты и альдегиды, биогенные амины [1, 8].

Ингибиторами свободнорадикального окисления в организме являются природные антиоксиданты, обладающие способностью в незначительных концентрациях вызывать обрыв цепи окисления и снижать уровень хемилюминесценции [23]. По своим физикохимическим свойствам они распределяются на антиоксиданты гидрофобной и гидрофильной фазы. К первой группе относятся токоферолы, флавины, каротиноиды, стероидные гормоны, а ко второй - сульфгидрильные соединения БЫ- группы белков, аскорбиновая кислота и некоторые другие [1, 19].

В клинической практике ХЛ используют для измерения содержания АТФ, креатинкиназы, аденилатциклазы, фосфодиэстеразы, АТФ-азы, протеолитических и других ферментов и их изоформ. Особенно расширились возможности ХЛ после разработки ее модификаций, основанных на иммунолюминесцентном анализе [4, 6, 20]. По идеологии хемилюминесцентный иммунный анализ не отличается от радиоиммунного, с той только разницей, что вместо радиоактивно-меченных субстратов или антител используются субстраты и антитела, "меченные" соединением, которое вступает в реакции,

сопровождающиеся ХЛ, в присутствии перекиси водорода и катализатора (обычно это фермент пероксидаза) [23].

Хемилюминесцентной меткой (ХЛ-меткой) чаще всего служат низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и люцигенину, такие как изолюминол, сукцинилированный люминол, эфиры акридиния и другие. Присоединение хемилюминесцентной метки производится либо к антигену, либо к антителу на этот антиген. В первом случае метод называется хемилюминесцентный иммунный анализ, во втором -иммуно-хемилюминометрический анализ [6]. Оба метода направлены на определение биологически важных низкомолекулярных соединений, например, гормонов в тех концентрациях (как правило, очень низких), в которых они встречаются в биологических объектах.

Другое важное направление клинического применения ХЛ - ее использование для оценки функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Впервые ХЛ лейкоцитов при фагоцитозе была обнаружена в 1972 г. С этого времени ХЛ широко используется для исследования состояния лейкоцитов, нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов и лимфоцитов [9, 13]. Показано, что инкубация фагоцитирующих клеток с зимозаном, латексом или бактериями сопровождается усилением ХЛ, интенсивность которой отражает функциональное состояние клеток и динамику процесса фагоцитоза [7, 10]. Уровень ХЛ при фагоцитозе характеризует интенсивность «респираторного взрыва» в клетках с продукцией

активных форм кислорода, оказывающих бактерицидное действие. Механизм этого действия определяется деполяризацией мембранного потенциала при связывании рецепторов фагоцитов, повышением концентрации внутриклеточного кальция, изменением уровня кальмодулина с активацией фосфолипаз и НАДФН-оксидаз. При этом метаболизм арахидоновой кислоты ускоряется, повышается продукция простагландинов и лейкотриенов

- регуляторов иммунного ответа, ингибирующих ХЛ в системе миелопероксидазы [13, 23].

Следует отметить повышение ХЛ при фагоцитозе иммунных комплексов, инкубации с конканавалином А и компонентами системы комплемента, что позволяет проводить быструю и точную количественную оценку бактерицидной способности клеток. При этом можно получить дополнительную информацию о состоянии рецепторного аппарата, ферментных систем и особенностей метаболизма фагоцитов [14].

ХЛ ответ при фагоцитозе характеризуется бимодальным распределением. Первый быстрый пик имеет небольшую амплитуду и длится 4-5 секунд. Второй подъем более медленный, отличается высокой амплитудой и достигает плато через 2-4 минуты. Бимодальность ХЛ ответа фагоцитирующих нейтрофилов связывают с выделением клетками люминолокисляющих факторов, попадающих в реакционную среду при контактном взаимодействии активирующего агента с мембраной клетки [22]. Второй пик обусловлен реакцией люминола с молекулами перекиси, хлорноватистой кислоты и других кислородсодержащих продуктов, проходящих через систему фагоцита.

Повышение спонтанной и инициированной ХЛ фагоцитов наблюдали у больных опухолями, бактериальной инфекцией, а снижение - при артритах, диабете, врожденном дефиците факторов системы комплемента. При инфекционных процессах повышение индуцированной ионами железа ХЛ фагоцитов коррелировало с увеличением содержания в мембранах конъюгированных диенов и свободных жирных кислот [17, 21].

Помимо фагоцитирующих клеток, собственной слабой ХЛ обладают лимфоциты и тимоциты. Для регистрации свечения этих объектов используют различные инициаторы,

митогены, антииммуноглобулины. Параметры свечения зависят от функционального состояния лимфоцитов и используются для оценки метаболической активности клеток и устойчивости их мембран к повреждению. В основе ХЛ лимфоцитов лежат механизмы, сходные с таковыми у фагоцитирующих клеток, но интенсивность свечения мононуклеаров значительно меньше, что связано с пониженной активностью ряда оксидаз и оксигеназ. ХЛ можно использовать для изучения функционального состояния лимфоцитов, в частности ответа на митогены, поскольку уровень свечения изменяется на разных этапах активации клеток. Различие профилей ХЛ лимфоцитов и фагоцитов позволяет проводить исследование как цельной, так и фракционированной крови [7, 9]. Показана возможность оценки терапевтического эффекта иммуномодуляторов по данным анализа ХЛ лимфоцитов до и после инкубации с этими препаратами.

Большое количество работ посвящено исследованию ХЛ сыворотки и плазмы крови больных с различными заболеваниями [3, 5, 8, 11, 12, 15]. Показано повышение ХЛ сыворотки и плазмы крови при воспалительных процессах, ревматизме, язвенной болезни, на ранних стадиях атеросклероза, при развитии стрессовых ситуаций, при гиповитаминозе Е [11, 12]. Усиление ХЛ при этих заболеваниях связывают с активацией СР окисления, снижением уровня антиоксидантов, накоплением кислородных радикалов и гидроперекисей липидов. При ряде заболеваний интенсивность свечения сыворотки и плазмы крови снижается. Так, при ишемии, гипоксии, злокачественных новообразованиях, хроническом бронхите, гипервитаминозе Е и других наблюдается угнетение свечения сыворотки крови больного [17, 19, 20]. Снижение интенсивности ХЛ при этих патологических состояниях большинство исследователей объясняют нарушением проницаемости клеточных мембран и выходом в кровь низкомолекулярных пептидов, являющихся тушителями ХЛ. Снижают ХЛ содержащиеся в крови церулоплазмин, ионы переменной валентности и антиоксиданты.

Наряду с ХЛ крови обнаружено спонтанное и индуцированное сверхслабое свечение мочи человека, отражающее не только состояние почек, но и характер метаболических

изменений в организме. По данным М.Асанова, А.И.Журавлевой, моча имеет определенный показатель сверхслабого свечения, соответствующий норме, что свидетельствует о наличии физиологического уровня перекисных радикальных реакций в организме здоровых людей [2]. При хронических заболеваниях, сопровождающихся гипоксией, наблюдаются метаболические изменения со снижением биоэнергетических реакций и повышением в моче количества недоокисленных продуктов, усиливающих ее ХЛ. Повышение уровня ХЛ мочи отмечено у больных пиелонефритом и гломерулонефритом, по-видимому, в результате накопления продуктов недоокисления при активации СР реакций [18]. Напротив, при заболеваниях, сопровождающихся нарушением концентрационной и выделительной функции почек, ХЛ мочи снижалась [2]. Угнетение свечения наступало до развития клинических признаков почечной недостаточности. Это явление может использоваться для ее раннего определения.

Хемилюминесцентный метод можно применять для оценки степени очищения организма при гемосорбции, гемофильтрации, других эфферентных способах детоксикации организма. По мере удаления среднемолекулярных пептидов, являющихся маркером эндогенной интоксикации, светосумма ХЛ плазмы увеличивается. Таким простым способом удается оценить эффективность и подобрать оптимальные режимы проведения детоксикационной терапии [4, 8]. Существующие способы, основанные на измерении концентрации некоторых веществ - мочевины, креатинина, мочевой кислоты - трудоемки, занимают много времени.

Традиционно для ХЛ анализа в клинике используют клеточные элементы (нейтрофилы, эозинофилы, лимфоциты, моноциты), плазму и сыворотку крови, а также мочу больного [17, 19]. Созданные в последние годы высокочувствительные детекторы позволяют изучать слабое свечение не только в растворах или суспензиях клеток, но и на целых органах в составе организма [23]. Наиболее важные части комплекса регистрации излучения - это совершенно непроницаемый для света ящик, в который помещают лабораторное животное, и

высокочувствительный приемник света - фотоумножитель, соединенный через усилитель и другие промежуточные устройства с самопишущим потенциометром или персональным компьютером. Аналогичную конструкцию используют для изучения свечения

изолированных органов, например, перфузируемого легкого или сердца. При этом исследователь получает информацию о степени активации СР окисления в организме и состоянии антиоксидантной системы, содержании антигенов, гормонов, антител и метаболитов, функциональной активности клеток. Полученные результаты используются для дифференциальной диагностики острых и хронических воспалительных процессов, ишемических, гипоксических и гипероксических состояний, для распознавания стадии заболевания и степени активности патологического процесса, для контроля за эффективностью лечения.

Представленные данные свидетельствуют о перспективности широкого клинического применения ХЛ анализа для оценки состояния свободнорадикальных процессов в организме. Активное внедрение этого метода позволит ускорить и упростить иммунологическое обследование больных.

THE CLINICAL ASPECTS OF CHEMILUMINESCENT ANALYSIS USE Yu.S. Vinnik, A.A. Savchenko, O.V. Peryanova, O.V. Teplyakova, S.V. Yakimov, E.Yu.

Teplyakov, O.S. Meshkova Krasnoyarsk state medical academy The possibilities of modern methods of chemiluminescent analysis in diagnostics of pathologic conditions, prognosis of disease severity, control of safety and efficacy of oxygen therapy are available. The main advantages of chemiluminescent analysis are simplicity; high sensitivity and expression.

Литература

1. Архангельская Н. Н. Сверхслабая хемилюминесценция модельных и биологических систем // Изв. АН ЭССР. - 1982. - Т. 31, № 2. - С. 65-78.

2. Асанов М. Н., Журавлева А. И. Хемилюминесценция мочи здоровых и больных заболеваниями периферических сосудов и ее изменения при лечении физическими

факторами // Сверхслаб. свеч. в мед. и сельск. хозяйстве. - М. :Изд-во Моск. ун-та, 1974. - С. 41-45.

3. Веселовский В.А. Хемилюминесцентный метод анализа в биологии // Спектроскопич. методы исследов. в физиол. и биохимии. - Л.:Наука, 19В7. - С. 34-37.

4. Власенко Н.Б., Гаврилова Е. М. Научные основы и перспективы применения в иммунохимических методах анализа хеми- и биолюминесцентных реакций // Журн. Всесоюз. хим. о-ва им. Д.И.Менделееева. - 19В9. - Т. 34, № 1. - С.24-29.

5. Гительзон И.И., Сандалова Т.П. Перспективы применения биолюминесцентных методов в медицине // Врачебное дело. - 199G. - № 9. - С. 31-34.

6. Гриневич Ю.А., Барабай В.А., Орел В.Э. Хемилюминесцентный метод в иммунологии // Журн. микроб, эпидемиол. и иммунол.. - 19В6. - № 1. - С. 91-97.

7. Дорохина Н.А., Савченко A.A., Чесноков А.Б. Использование специфических антигенных препаратов в качестве индукторов дыхательного взрыва лейкоцитов крови при хемилюминесцентном анализе // Клин. лаб. диагностика. - 2GG1. - № 1. -С. 39-43.

В. Журавлев А. К., Шерстнев М. И. Метод регистрации перекисной хемилюминесценции плазмы крови // Лаб. дело. - 19В5. - № 1G. - С. 5В6-5В7.

9. Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б. Практические замечания по регистрации хемилюминесценции фагоцитирующих клеток // Бюлл.СО АМН СССР. - 199G. - № 2. - С. 72-77.

1G. Зурочка А.В., Долгушин И.И., Власов А.В., Рябинин В.Е. Изучение латексиндуцированной люминолзависимой хемилюминесценции нейтрофилов // Лаб. Дело. - 19В9. - №3. - С. 32-36.

11. Иванишкина Е.В., Подопригорова В.Г., Каневский и др Значение хемилюминесцентных тестов в оценке эффективности лечения язвенной болезни микроволновой резонансной терапией // Клин. мед. - 2GGG. - № 3. - С. 39-41.

12. Маргулис Г.В., Журавлев А.И. Сверхслабое свечение сыворотки крови человека при некоторых хронических заболеваниях // Сверхслаб. Свечен. в медиц. и сельском хозяйстве. - М.: изд-во Моск. ун-та, 1972. - С. 27.

13. Маянский А.Н., Невмятуллин А. Л., Чеботарь И.В. Реактивная хемилюминесценция в системе фагоцитоза // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 19В7. - № 7. -С. 1G9-115.

14. Павленко Р.А., Куденко Ю.А. Хемилюминесцентный метод определения окислительной активности нейтрофилов в процессе фагоцитоза // Лаб. дело. - 19ВВ. -№1. - С. 35-37.

15. Решетова Н.В., Дидковский Н.А., Литвиненко Е.В. Хемилюминесцентный способ диагностики непереносимости лекарственных средств // Клин. лаб. диагност. - 1997.

- №5. - С. 83-84.

16. Тарусов Б.Н., Иванов И.И., Петрусевич Ю.М. Сверхслаб. Свечен. Биологич. систем. -М.: Изд-во Моск. ун-та, 1967. - 70 с.

17. Угарова Н.Н., Боровко Л.Ю., Лебедева О.В. и др. Биолюминесцентные методы и реагенты для целей медицинской диагностики // Вестн. АМН СССР. - 1985. - № 7. -

С. 1540-1558.

18. Фархутдинов Р.Р., Кантюков С.А., Ахмадеев Р.И. Хемилюминесценция мочи, индуцированная ионами двухвалентного железа // Лаб. дело. - 1986. - № 5. - С. 263267.

19. Шестаков В.А., Шерстнев М.П. Применение биохемилюминесценции в медицине (научный обзор) // Медицина и здравоохранение. Сер. Хирургия. - 1977. - № 3. - С. 40-96.

20. Bochev B.G., Margisso M.J., Bochev P.G. et al. Depedence of whole blood luminol chemiluminescence on PMNL and RBC count // J. Biochem. Biophys. Methods. - 1993. -Vol. 27, № 4. - P. 301-311.

21. De Sole P., Lippa S., Littaru G.P. Chemiluminescence of phagocytic cells // Acta med. Romane. - 1984. - Vol. 22, № 2. - P. 178-195.

22.Pauksens K., Sjolin J.,Venge P. Chemiluminescence of polymorphonuclear leukocytes and whole blood during acute bacterial infections // Scand. J. Infec. Dis. - 1989. - Vol. 21. - P. 277-284.

22. Vladimirov Yu.A., Sherstnev M.P. Biophysical chemiluminescent analysis. Physicochemical Aspects of Medicine Rewiews // Harwood Academic Publishers GMBH. -1991. - Vol. 2. - Р. 1-44.