СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ФОТОПИГМЕНТОВ ФИТОПЛАНКТОНА, РАСТВОРЁННОГО ОРГАНИЧЕСКОГО ВЕЩЕСТВА И РАЗМЕРНОГО СОСТАВА ВЗВЕСИ В МОРСКОЙ ВОДЕ IN SITU
METHOD FOR DETERMINING THE CONCENTRATION OF PHYTOPLANKTON PHOTOPIGMENTS, DISSOLVED ORGANIC MATTER AND THE SIZE COMPOSITION OF THE SUSPENSION IN SEAWATER IN SITU

Изобретение относится к измерительной технике и может быть использовано для задач экологии, лимнологии и океанологии, в частности может быть использовано для оценки состояния водной среды in situ: оценки трофности вод, антропогенного воздействия на компоненты экосистем, для исследования биооптической структуры.
Технической проблемой является определение биооптических свойств вод, оценка биомассы и первичной продукции - современные направления экологического мониторинга. Биологические организмы обладают высокой чувствительностью к присутствию загрязнителей в окружающей среде, а также к изменениям климата, светового режима и т.п. Наиболее чувствительным является фитопланктон - первичное звено трофической цепи экосистемы. Информация о распределении в толще воды, концентрации и фазах биологического роста представляют наибольший интерес для оценки состояния водной среды.
Несмотря на развитие современных методов биооптических наблюдений, они в основном сконцентрированы либо на приповерхностном слое морской воды, тогда как вертикальное распределение, сезонная и межгодовая изменчивость флюоресценции недостаточно изучена, либо конкретно на флюоресценции хлорофилла «а», не уделяя должного внимания другим фотоактивным веществам.
Методы, позволяющие оценить биомассу и первичную продукцию в водоемах, основаны на отборе проб и требуют длительного времени для анализа, что является существенным недостатком, особенно при исследовании больших акваторий.
Флюоресцентный метод отличается от большинства стандартных гидробиологических методов исследования меньшей трудоемкостью, что предоставляет возможность проводить экспресс-анализ состояния водных экосистем и создавать массивы океанологических данных.
Оценка биомассы фитопланктона по флюориметрическим наблюдениям имеет определенные ограничения, так как соотношение концентраций хлорофилла «а», полученных измерением флюоресценции in situ и методом экстрагирования, непостоянно во всем диапазоне измерений. Значимым источником изменчивости интенсивности флюоресценции является композиция видового состава фитопланктона. Интенсивность флюоресценции различна для пигментов различных таксономических групп и при одинаковой концентрации может отличаться на порядок. Поэтому важной задачей является систематизация пигментов, находящихся в измеряемом объеме.
Существует несколько разных типов устройств, предназначенных для регистрации флюоресценции - флюориметров, они различаются по способу регистрации флюоресценции и по исполнению измерительного блока.
Известно несколько способов регистрации флюоресценции:
- однолучевой метод регистрации флюоресценции;
- двулучевой способ регистрации флюоресценции;
- способ регистрации флюоресценции путем модуляции зондирующего света;
- способ регистрации флюоресценции, основанный на методе «накачки и зондирования»;
- способ регистрации флюоресценции, основанный на методе быстро повторяющихся вспышек;
- способ регистрации флюоресценции, основанный на методе изменяемого градиента фоновой освещенности.
По исполнению измерительного блока флюориметры бывают: лабораторные, бортовые (с системой прокачки воды через кювету) и погружные - зондирующие.
В большинстве известных устройствах измерения флюоресценции применяется классическая схема регистрации флюоресценции под углом 90 градусов. В качестве источника возбуждения флюоресценции могут использоваться различные виды источников оптического излучения: лампы, светодиоды и лазеры. В качестве устройств, регистрирующих флюоресцентное излучение, применяются ФЭУ, фотодиоды, приборы с зарядовой связью (ПЗС). Свет комбинационного рассеяния, вызванный прохождением возбуждающего излучения через исследуемый объем воды, фильтруют с помощью скрещенных светофильтров, расположенных перед фотоприемником. При измерении флюоресценции фитопланктона в природных условиях, характеризующихся предельно низким содержанием клеток фитопланктона, необходима высокая чувствительность фотоприемного устройства, что накладывает определенные требования к конструктивному исполнению флюориметра. В то же время известно, что при проведении биомониторинга естественных акваторий недостаточно одного параметра - концентрации хлорофилла «а», важными параметрами являются концентрация других фото-пигментов фитопланктона, концентрация растворенного органического вещества (РОВ), размерный состав клеток фитопланктона и взвеси. Таким образом, на данный момент времени не существует единого in situ способа, позволяющего получить исчерпывающую информацию о состоянии исследуемой водной экосистемы.
Наиболее близким к заявляемому способу (прототипом) является способ, заложенный в основе работы импульсного амплитудно-модулированного хлорофилл-флюориметра, представленного в [патент Российской Федерации №2652528 на изобретение Флуориметр с многоканальной системой возбуждения на светодиодах]. Данное устройство включает генератор опорных сигналов, управляющий длительностью свечения как минимум восьми светодиодов с разными длинами волн, оптически соединенных с измерительной кюветой, турелью оптических фильтров и регистрирующим фотодетектором, при этом флюориметр дополнительно снабжен опорным фотодетектором, оптически связанным с кюветой, а генератор опорных сигналов выполнен с возможностью генерировать на светодиоды сигналы управления с произвольной частотой, длительностью и скважностью, регистрирующий фотодетектор соединен с полихроматором, оптически соединенным с турелью фильтров, а опорный и регистрирующие фотодетекторы выполнены многоканальными и электрически соединены с аналого-цифровым преобразователем, с которым также соединены установленные в кювете датчики температуры и солености. Возбуждающее излучение подается в кювету, где возбуждает флюоресценцию. Сигнал флюоресценции через турель оптических фильтров проходит через полихроматор и регистрируется многоканальным фотоэлектронным умножителем. Сигнал с фотоумножителя подается на многоканальный АЦП, который подключен к персональному компьютеру.
Прототип имеет следующие признаки, сходные с признаками заявленного изобретения: возбуждение флюоресценции осуществляется светодиодами разных длин волн излучения, осуществляется управление скважностью возбуждающего излучения, регистрация сигнала флюоресценции осуществляется через несколько различных светофильтров фотоэлектронным умножителем.
К недостаткам прототипа можно отнести следующее: регистрация сигнала флюоресценции осуществляется в проходящем свете, при таком исполнении, свет, возбуждающий флюоресценцию, поступает на вход регистрирующего устройства, его интенсивность на несколько порядков выше интенсивности сигнала флюоресценции, в связи с чем требуется отфильтровать этот сигнал с использованием скрещенных светофильтров. Такое исполнение делает невозможным регистрацию сигнала комбинационного рассеяния, позволяющего определить размерный состав взвеси.
Следующим недостатком прототипа является сложность соотнесения флюоресцирующих объемов друг с другом, что усложняет нормировку результирующего сигнала.
Исполнение прототипа предполагается в виде бортового блока, к которому необходимо подвести внешнее питание, обеспечить проток воды через измерительную кювету, что исключает возможность получения in situ вертикальных профилей до больших глубин, а подключение внешнего АЦП в виде законченного блока, который в свою очередь должен быть подключен к персональному компьютеру, существенно влияет на мобильность работы в экспедиционных условиях.
Технический результат заявляемого способа - одновременное измерение in situ, способом зондирования, нескольких биооптических параметров исследуемой акватории, получаемых в спектральном диапазоне от 350 нм до 700 нм, таких как: интенсивность флюоресценции пигментов фитопланктона; интенсивность флюоресценции РОВ; размерный состав взвеси.
Отличительная особенность изобретения в том, что регистрация сигналов флюоресценции комбинационного рассеяния осуществляются под углом 90 градусов.
Отличительная особенность изобретения в том, что пучок возбуждающего света коллимируется и точно известны геометрические размеры флюоресцирующего (измерительного) объема воды.
Отличительная особенность изобретения в том, что возбуждающий свет, отразившись от триппель-призмы, дважды проходит через измерительный объем, увеличивая интенсивность флюоресценции.
Отличительная особенность изобретения в том, что возбуждающий свет, отразившись от триппель-призмы, полностью гасится в корпусе излучателя, не вызывая паразитной засветки.
Отличительная особенность изобретения в том, что сигналы флюоресценции и комбинационного рассеяния получены в одном и том же измерительном объеме, что позволяет не только выделить из общего сигнала флюоресценции вклад различных групп фитопланктона и более детально исследовать биооптическую структуру исследуемой экосистемы, но также выявить размерный состав взвеси и учесть вклад сигнала рассеяния в сигнал флюоресценции, для проведения соответствующей нормировки.
Сущность заявленного способа поясняется со ссылкой на чертеж, на котором приведена структурная схема одного из возможных исполнений измерителя, реализующего этот способ.
Измеритель содержит: микроконтроллер (МК) 1, управляющий скважностью и интенсивностью возбуждающего излучения флюоресценции, которое создают два различных по спектру возбуждающего излучения светодиода 2-е разными заданными длинами волн; мотор 3, на котором установлен поворотный диск 4 со светофильтрами 5; первый фотодетектор (фотоприемник, фотоэлектронное устройство - ФЭУ) 6, регистрирующий сигналы флюоресценции и рассеяния под углом 90 градусов, и два других фотодетектора 7, регистрирующих сигналы рассеяния под углом 4 градуса из измерительного объема исследуемой морской воды, который на чертеже обозначен точечной штриховкой; три идентичных триппель-призмы 8 с заданными параметрами, расположенные на оптических осях излучателей (светодиодов) 2 и на оптической оси фотоприемника 6; три коллимирующие линзы - объективы (объективы-коллиматоры) 9 с заданными параметрами, расположенные, соответственно, на оптических осях излучателей 2 и фотоприемника 6 - перед этими элементами; датчик температуры 10 и давления 11; 24-х битный аналого-цифровой преобразователь (АЦП) 12; регулируемый блок питания ФЭУ (БП) 13; транс-импедансный преобразователь 14; карту памяти 15, на которую в формате файловой системы FAT32 записываются регистрируемые сигналы.
В данном случае одним из источников 2 (для возбуждения им света флюоресценции пигментов фитопланктона) является 4-цветный светодиод (RGBA LED) со спектральными интервалами 450-460, 525-535, 565-575 и 620-630 нм, которые соответствуют локальным максимумам поглощения четырех групп микроводорослей. Другим источником 2 (для возбуждения им света флюоресценции растворенного органического вещества и растворенных нефтепродуктов и масел) является источник возбуждающего ультрафиолетового излучения (UV LED) - 360-370 нм.
Каждый из светодиодов 2 установлен в фокусе соответствующего объектива-коллиматора 9, который преобразует излучаемый этим источником 2 свет в параллельный пучок и направляет его по соответствующей оптической оси в измерительный объем.
Пучки возбуждающего света, посланные под углом 90° к фотоприемному объективу ФЭУ 6 (через соответствующие объективы-коллиматоры 9) двумя источниками излучения 2 по двум проходящим через измерительный объем оптическим осям (угол между которыми может быть любой, в данном случае он составляет 90 градусов), достигают соответствующих триппель-призм 8, расположенных на этих оптических осях, отражаются и, двигаясь в обратном направлении по тем же оптическим осям, второй раз проходят через измерительный объем, увеличивая тем самым интенсивность возбуждения флюоресценции, после чего заходят внутрь корпуса соответствующего излучателя 2 (откуда они были испущены), где они гасятся. Такое решение позволяет обходиться без использования светоловушек и повысить чувствительность прибора к малым концентрациям флюорофоров.
Через измерительный объем также проходит третья оптическая ось, под углом 90 градусов к первым двум, на которой размещена третья триппель-призма 8, которая по этой оптической оси направляет свет флюоресценции и рассеяния из измерительного объема на третий объектив-коллиматор 9, который фокусирует это излучение измерительного объема на фотокатоде ФЭУ 6.
Перед окном ФЭУ 6 размещен поворотный диск 4 с поочередно сменяющимися, благодаря мотору 3, светофильтрами 5. В данном случае используется шесть светофильтров со спектральными диапазонами 345-370, 450-470, 520-540, 560-580, 615-635 и 675-695 нм. Регистрация флюоресценции и рассеяния происходит в спектральных диапазонах 345-370, 450-470, 520-540, 560-580, 615-635 и 675-695 нм.
Импульсы возбуждающего света имеют одинаковую амплитуду и длительность, при этом интенсивность флюоресценции измеряют при естественной фоновой засветке, которая регистрируется на каждом светофильтре при выключенном возбуждающем излучении и вычитается из полезного сигнала.
Момент прохождения света через светофильтры 5 синхронизирован с излучением светодиодами 2 различных длин волн возбуждающего света таким образом, чтобы сочетание излучаемого света, возбуждающего флюоресценцию и комбинационное рассеяние света в измерительном объеме и светофильтров, соответствовали свету флюоресценции фитопланктона, растворенного органического вещества и комбинационного рассеяния света.
Строго заданные геометрические размеры коллиматоров, взаимное расположение оптических осей - обеспечивает точно известные геометрические размеры флюоресцирующего (измерительного) объема исследуемой воды, что позволяет определить концентрацию флюоресцирующего вещества.
На основе информации от двух фотодетекторов 7, регистрирующих сигналы рассеяния под углом 4 градуса, вычисляют размерный состав взвеси в измерительном объеме.
Наличие датчика 10 температуры морской воды обеспечивает упрощение сопоставления полученных данных с вертикальным распределением температуры, т.к. в этом случае данные получены одним прибором одновременно. Данные о температуре записываются в файл на карту памяти вместе с оптическими данными, что дает более полную картину.
Датчик 11 давления определяет, на какой глубине находится прибор в каждый момент времени, благодаря чему получают вертикальный профиль.
Чтобы обеспечить работу измерителя флюоресценции в широком диапазоне потока излучения, ФЭУ 6 охвачен отрицательной обратной связью по цепи питания, составленной из транс-импедансного преобразователя 14, микроконтроллера (МК) 1 и регулируемого источника высокого напряжения (БП) 13.
Выходной сигнал ФЭУ 6 поступает на вход транс-импедансного преобразователя 14, и далее - на вход АЦП 12. Затем МК 1, анализируя амплитуду сигнала ФЭУ 6, управляет БП 13. В результате чувствительность ФЭУ 6 непрерывно подстраивается под величину измеряемого излучения путем поддержания среднего выходного тока ФЭУ 6 на заданном уровне. МК 1 посредством широтно-импульсной модуляции управляет возбуждающими вспышками светодиодов 2, мотором 3, на валу которого установлен диск 4 со светофильтрами 5, опросом АЦП 12 и записью регистрируемых данных в файл на SD-карту памяти 15.
Регистрация интенсивности флюоресценции пигментов фитопланктона и комбинационного рассеяния света в одном и том же измерительном объеме позволяет не только проводить коррекцию сигнала флюоресценции на сигнал рассеяния, но и определять размерный состав взвеси.
Заявляемый способ позволяет определять, с применением калибровочных коэффициентов, излучение флюоресценции различных компонентов исследуемой акватории in situ: флюоресценцию хлорофилла «а», флюоресценцию фикоэретинов и фикоцианинов, флюоресценцию РОВ, флюоресценцию растворенных в воде нефтепродуктов и масел, спектры комбинационного рассеяния, с помощью которых можно определить размерный состав взвеси.
Данный результат интеллектуальной деятельности создан при выполнении темы государственного задания №0555-2021-0003 (шифр «Оперативная океанология»).