КЛЕТКИ НИТЧАТЫХ ГРИБОВ С ДЕФИЦИТОМ ПРОТЕАЗ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Клетка нитчатых грибов, содержащая по меньшей мере три эндогенных протеазы со сниженной активностью и рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий гетерологичный полипептид, где полипептид продуцируется на уровне, который по меньшей мере в два раза превышает уровень продукции полипептида в соответствующей родительской клетке нитчатых грибов, в которой протеазы не обладают сниженной активностью.
2. Клетка нитчатых грибов по п. 1 при условии, что, если клетка представляет собой клетку Aspergillus, то общая протеазная активность снижена до 50% или менее от общей протеазной активности соответствующей родительской клетки Aspergillus, в которой протеазы не обладают сниженной активностью.
3. Клетка нитчатых грибов по п. 1, где общая протеазная активность снижена до 49% или менее, предпочтительно до 31% или менее, от общей протеазной активности соответствующей родительской клетки нитчатых грибов, в которой протеазы не обладают сниженной активностью.
4. Клетка нитчатых грибов по п. 1, где каждый по меньшей мере из трех генов, кодирующих эндогенные протеазы, содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы.
5. Клетка нитчатых грибов по п. 1, где каждый из по меньшей мере четырех генов, кодирующих эндогенные протеазы, содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы.
6. Клетка нитчатых грибов по п. 1, где клетка грибов представляет собой клетку грибов Trichoderma, клетку грибов Myceliophthora, клетку грибов Aspergillus, клетку грибов Neurospora, клетку Penicillium или клетку грибов Chrysosporium.
7. Клетка нитчатых грибов по п. 1, где клетка грибов представляет собой Trichoderma reesei.
8. Клетка нитчатых грибов по п. 6 или 7, где указанная клетка представляет собой дикий тип по протеазе pep4.
9. Клетка нитчатых грибов по п. 6 или 7, где клетка имеет сниженную или не имеет протеазной активности по меньшей мере следующих трех протеаз: либо pep1, tsp1 и slp1, либо gap1, slp1 и pep1.
10. Клетка нитчатых грибов по п. 6 или 7, где клетка имеет сниженную или не поддающуюся обнаружению протеазную активность по меньшей мере трех или четырех протеаз, выбранных из группы, состоящей из pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, pep8, pep11, pep12, tsp1, slp1, slp2, slp3, slp7, gap1 и gap2.
11. Клетка нитчатых грибов по п. 10, где каждый из генов, кодирующий три или четыре протеазы со сниженной или не поддающейся обнаружению протеазной активностью, содержит мутацию, которая снижает или устраняет активность соответствующей протеазы.
12. Клетка нитчатых грибов по п. 6 или 7, где клетка имеет сниженную или не имеет протеазной активности по меньшей мере в восьми протеазах, где каждый из генов, кодирующих восемь протеаз, содержит мутацию, которая снижает или устраняет
активность соответствующей протеазы, и восемь протеаз представляют собой pep1, tsp1, slp1, gap1, gap2, pep4, pep3 и pep5.
13. Клетка нитчатых грибов по п. 6 или 7, где клетка содержит от трех до шести протеаз со сниженной или не поддающейся обнаружению активностью, и каждая из от трех до шести протеаз выбраны из группы, состоящей из pep1, pep2, pep3, pep4, pep5, tsp1, slp1, slp2, slp3, gap1 и gap2.
14. Клетка нитчатых грибов по п. 6, где клетка содержит ген, кодирующий дополнительную протеазу, которая содержит мутацию, которая снижает активность соответствующей протеазы, и дополнительная протеаза выбрана из группы, состоящей из pep7, pep8, pep11, pep12, tpp1, gap2, slp3, slp5, slp6, slp7 и slp8.
15. Клетка нитчатых грибов по п. 1, где гетерологичный полипептид представляет собой полипептид млекопитающих.
16. Клетка нитчатых грибов по п. 15, где полипептид млекопитающих является гликозилированным.
17. Клетка нитчатых грибов по п. 15, где полипептид млекопитающих выбран из группы, состоящей из антитела и его антигенсвязывающих фрагментов, фактора роста, интерферона, цитокина и интерлейкина.
18. Клетка нитчатых грибов по п. 15, где полипептид млекопитающих выбран из группы, состоящей из инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1), гормона роста человека (hGH) и интерферона-альфа 2b (IFNα2b).
19. Клетка нитчатых грибов по п. 1, где клетка грибов дополнительно содержит ALG3, имеющую сниженную активность.
20. Клетка нитчатых грибов по п. 19, где ген, кодирующий ALG3, содержит мутацию, которая снижает или устраняет соответствующую активность.
21. Клетка нитчатых грибов по п. 1, где клетка грибов дополнительно содержит полинуклеотид, кодирующий α-1,2-маннозидазу.
22. Клетка нитчатых грибов по п. 1, дополнительно содержащая каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I и, необязательно, каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II.
23. Клетка нитчатых грибов по п. 22, дополнительно содержащая первый полинуклеотид, кодирующий каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы I, и необязательно второй полинуклеотид, кодирующий каталитический домен N-ацетилглюкозаминилтрансферазы II.
24. Клетка нитчатых грибов по п. 1, дополнительно содержащая полинуклеотид, кодирующий маннозидазу II и/или галактозилтрансферазу.
25. Способ повышения стабильности полипептида, включающий
a) наличие клетки нитчатых грибов по любому из пп. 1-24, и
b) культивирование клетки так, чтобы экспрессировался гетерологичный полипептид,
где гетерологичный полипептид проявляет повышенную стабильность по сравнению с гетерологичным полипептидом, полученным в соответствующей родительской клетке нитчатых грибов, в которой протеазы не обладают сниженной активностью.
26. Способ получения гетерологичного полипептида, включающий
a) наличие клетки нитчатых грибов по любому из пп. 1-24,
b) культивирование клетки так, чтобы экспрессировался гетерологичный полипептид, и
c) очистку гетерологичного полипептида.
27. Способ по п. 25 или 26, где клетка нитчатых грибов дополнительно содержит белок-носитель.
28. Способ по п. 27, где белок-носитель представляет собой CBH1.
29. Способ по п. 26, где культивирование проводят в среде, содержащей ингибитор протеаз.
30. Способ по п. 26, где культивирование проводят в среде, содержащей один или два ингибитора протеаз, выбранных из SBT1 и химостатина.