БЕЛКОВО-ПОЛИПЕПТИДНЫЙ КОМПЛЕКС (БПК), ОБЛАДАЮЩИЙ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ РЕПАРАТИВНЫМ И ОМОЛАЖИВАЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ НА КОЖНУЮ ТКАНЬ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВО-ПОЛИПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА, ОБЛАДАЮЩЕГО ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ РЕПАРАТИВНЫМ И ОМОЛАЖИВАЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ НА КОЖНУЮ ТКАНЬ, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ БПК, ОБЛАДАЮЩАЯ АНТИГИПОКСИЧЕСКИМ, ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИМ, ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИМ РЕПАРАТИВНЫМ ДЕЙСТВИЕМ НА КОЖНУЮ ТКАНЬ И СЛИЗИСТЫЕ ОБОЛОЧКИ, С ОМОЛАЖИВАЮЩИМ ЭФФЕКТОМ
PROTEIN-POLYPEPTIDE COMPLEX (PPC) POSSESSING TISSUE SPECIFIC REPAIR AND REJUVENATING ACTION ON SKIN TISSUE, METHOD FOR PREPARING PROTEIN-POLYPEPTIDE COMPLEX POSSESSING TISSUE SPECIFIC REPAIR AND REJUVENATING ACTION ON SKIN TISSUE, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION OF PPC POSSESSING ANTIHYPOXIC, IMMUNOMODULATORY, TISSUE SPECIFIC REPAIR AND REJUVENATING ACTION ON SKIN TISSUE AND MUCOUS MEMBRANES, WITH REJUVENATING EFFECT

Изобретение относится к биологически активной субстанции - белково-полипептидного комплекса (БПК), получаемой из тканей кожи, головного и спинного мозга эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, и предназначена в качестве активного вещества для производства лекарственных препаратов, стимулирующих физиологическую и репаративную регенерацию, в лечении заболеваний и травматических поражений кожи, а также для применения в производстве лекарственных препаратов в эстетической медицине, косметологии и способу ее получения.
Принятые сокращения и условные обозначения:
БПК - белково-полипептидный комплекс;
I - ионная сила раствора;
Фармкомпозиция - фармацевтическая композиция.
В настоящее время, на фоне неуклонного роста кожных заболеваний аутоиммунного, сосудистого, токсического, инфекционного, травматического генеза, а также ятрогенных осложнений после применения «омолаживающих» препаратов, косметических средств и процедур, не существует препаратов группы прямых репарантов, специфичных для кожной ткани. Целью данного изобретения явилось создание биологически активной субстанции - прямого репаранта, обладающего тканеспецифическим регенеративным действием на кожную ткань.
Биологически активная субстанция представляет собой БПК с молекулярной массой входящих в него белково-полипептидных компонентов в пределах от 5 до 200 кДа и содержанием среднемолекулярной фракции в пределах от 20 до 160 кДа не менее 70%, общей концентрацией белка 0,1-4,2 мг/мл, с максимумом поглощения ультрафиолетового спектра раствора при длине волны 215±5 нм в УФ-видимой области с интервалом длин волн 200-500 нм (фиг.1) и наличием специфических полос при денатурирующем гель-электрофорезе в 5%-ном полиакриламидном геле (фиг.2), а также фармацевтически приемлемый разбавитель, включающий буферный раствор и вспомогательные вещества - высокомолекулярные соединения, относящиеся к классу консервантов, детергентов и солюбилизаторов в достаточных концентрациях. БПК получен путем ионообменной хроматографии фильтрата экстрагированного гомогената нервной и кожной тканей эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети до середины последней в присутствии буферного раствора, детергентов и солюбилизаторов.
Известен целый ряд препаратов пептидной природы из сырья животного происхождения, обладающих регенеративной активностью, которые используются для лечения заболеваний кожи. Наиболее близкими по достигаемому эффекту являются:
- пептидный экстракт плаценты и способ его [1], заключающийся в солевой экстракции гомогената плаценты с 10 мМ Na-фосфатным буфером рН - 7,0 в присутствии 0,1 мМ ЭДТА и Тритона-100, предварительно выдержав 3 часа при температуре +4°С, с последующей фазой удаления гормонов из элюента после центрифугирования в присутствии полиглюкина и активированного угля, доведя температуру смеси до (+40)-(+45)°С и оставив на 4 часа при комнатной температуре. Полученный элюент из отцентрифугированной смеси содержит 5-35 мг/мл белка, 2-5 мг/мл гликопротеидов и 0,5-1 мг/мл Тритона Х100. Следует отметить достаточно высокий выход по количеству полученных белков. Однако полученные в экстракте белки не охарактеризованных стандартными физико-химическими методами (масса, оптическая плотность, форез и т.д.) белков, а наличие значительного количества гликопротеидов позволяет предполагать высокую иммуногенность и аллергенность экстракта;
- группа изобретений «Лекарственные средства на основе зародыша и способ их получения» [2], данный способ предполагает измельчение и гомогенизацию мягких тканей эмбрионов животных в смеси с физиологическим раствором. Данный способ не позволяет стандартизировать полученную смесь, а отсутствие четких физико-химических характеристик получаемого продукта - применение данного препарата парентерально, из-за присутствия компонентов клеточных стенок и мембран клеточных структур, что определяет его высокую иммуногенность;
- способ изготовления биологически активных препаратов на основе эмбриональных тканей [3], который предусматривает гидролиз гомогената от 2-х до 42 дней при температуре (+4)-(+45)°С с дальнейшей термообработкой при температуре (+60)-(+120)°С, отделением денатурированных веществ и выделение из гидролизата термостабильного целевого продукта неопределенного состава, со средней молекулярной массой менее 10 кДа с содержанием пептидов 1-3 мг/мл и сухим остатком 14-20 мг/мл. При данном способе изготовления получаемый целевой продукт содержит измененные, денатурированные продукты гидролиза с нарушенной четвертичной и третичной структурой, а также продукты распада многих активных молекул, что определяет его невысокую биологическую активность;
- способ биологического омоложения кожи [4], данный способ предлагает внутрикожное и подкожное введение диспергированного биоматериала «Аллоплант» [5], у которого выявлена способность привлечения клеток макрофагального ряда со стимуляцией их созревания, восстановления кислотно-щелочного баланса кожного покрова за счет нормализации работы потовых и сальных желез, со сдвигом обменных процессов в ткани кожи в сторону преобладания процессов, свойственных ткани физиологически более молодого возраста. За счет этого появляется возможность коррекции фиброзных и дегенеративно-дистрофических изменений в тканях (возможность селективного роста тканей на месте имплантированного биоматериала) с усилением обменных процессов, направленных на восстановление фиброархитектоники кожи. Однако отсутствие в препарате сбалансированных факторов роста и дифференцировки, специфичных для кожной ткани, не позволяет получить выраженный омолаживающий эффект, а также стимулировать физиологическую и репаративную регенерацию.
- косметическое средство для ухода за кожей «Гармония» [6], содержащее экстракт из эмбрионов млекопитающих (человека) и биологически активные добавки природного и химического происхождения (масло герани, масло кориандра, настойку подорожника, экстракт майских листьев березы, экстракт майских листьев черемухи, соки алоэ и чистотела, масло кукурузное, экстракт прополиса, пальмовое масло, облепиховое масло и желток куриного яйца, глицерин, неорганические соли, например соли Хенкса, двузамещенный фосфат натрия, лимонную кислоту, причем соотношение основы и биологически активных добавок природного и химического происхождения составляет (0,59-5,3):1,0. Экстракт из эмбрионов получают путем гомогенизации и экстракции в солевом растворе, ультрацентрифугированием с последующей фильтрацией надосадочной жидкости. Получаемый экстракт содержит разномолекулярные фракции не охарактеризованных стандартными физико-химическими методами водорастворимых денатурированных белков, пептидов, пептидгликанов, липопротеинов, не поддающихся стандартизации, наружное применение которых достаточно иммуногенно с невысоким биологическим эффектом;
- способ получения регенерирующего косметического крема для ухода за кожей [7], содержащего наряду с ростовыми факторами, включающими интерлейкин-2, эритропоэтин, эпидермальный фактор роста и лейкоцитарный гормон роста, продукты метаболизма клеток лейкоцитов человека и/или животных при следующем количественном содержании компонентов крема (мас.%): питательная среда с ростовыми факторами и продуктами метаболизма клеток лейкоцитов - 0,7-8,5; биологически активные вещества природного и химического происхождения - 7,0-27,0, полученные из питательной среды, в которой инкубировались клетки человека и/или животных (например, лейкоциты), в присутствии осматотропина. Данная композиция не содержит цитоплазматических, ядерных и мембранных белков и полипептидов, играющих важную сигнальную роль в механизмах регенерации и репарации клеток, концентрация выделенных лейкоцитами факторов роста и гормонов является не оптимальной, а является продуктом их жизнедеятельности и метаболизма, что значительно снижает биологическую активность композиции, вторично стимулируя физиологическую регенерацию и незначительно репарацию тканей, не имея в составе тканеспецифических факторов для кожи;
- известна композиция по уходу за кожей, содержащая следующие компоненты: ретиноид, выбранный из группы, состоящей из спиртовой формы витамина А, альдегидной формы витамина А, ретинилацетата, ретинилпальмитата и их смесей, масляную фазу, имеющую низкий уровень ненасыщенности, и стабилизирующую систему, выбранную из группы, состоящей по крайней мере из по меньшей мере одного антиоксиданта, растворимого в масле, хилатообразователя, экстракта солодки, гидрохинона, коиэвой кислоты, готулина А, микромерола, глютатиона, L-аскорбил-2 фосфата магния, арбутина, экстракта плаценты и их смесей [8]. Однако известная композиция при длительном применении может вызывать гипертензионнный синдром, не обладает достаточным регенерирующим и омолаживающим эффектом;
- косметическое средство для ухода за кожей на основе развивающихся эмбрионов млекопитающих, содержащее основу в виде геля и компоненты на основе экстракта развивающихся эмбрионов (зародышей) млекопитающих, например крупного рогатого скота [9]. Для экстрагирования используют не весь эмбрион животного, а только его зобную железу. Состав содержит (10-30)% экстракта эмбриона животного и (90-70)% основы в виде геля. Препарат наносят на кожу лица и тела для омоложения клеток кожи, защиты от морщин, повышения сопротивляемости кожи и замедления старения тканей. Однако данное косметическое средство оказывает системную гормональную активность воздействием на весь организм, что имеет противопоказания к применению, а также недостаточную эффективность регенерирующего действия на кожу, не имея в составе тканеспецифических факторов роста и факторов, связанных с предотвращением увядания и старения кожи, сохранением и увеличением ее эластичности и поддержанием хорошего состояния в течение длительного времени;
- средство, нормализующее обмен веществ в тканях кожи [10], включающее в себя помимо фракции низкомолекулярных, ассоциированной с белками РНК из ядер и цитоплазмы клеток любых эмбриональных тканей (взяты в качестве примера ткани мозга, печени, тимуса и селезенки поросят в различных соотношениях), пептидную фракцию из гомогената фетальных органов поросят, выделяемую кислым экстрагированием 0,15М HCl с нагреванием на кипящей водяной бане в течение 30 мин, с последующей нейтрализацией щелочью до рН 7,0 и отделением осадка центрифугированием, в результате чего концентрация пептидов достигает 8 мг/мл. Данный способ получения целевого продукта позволяет получать денатурированные низкомолекулярные фракции пептидов в связи с воздействием в процессе выделения кислотной экстракции и кипячения, что абсолютно меняет четвертичную, третичную структуру не охарактеризованных стандартными физико-химическими методами пептидов и, как следствие, снижает биологическую и физиологическую активность полученных продуктов.
Наиболее близким к заявленной группе изобретений, в том числе и по способу получения БПК, является способ получения биологически активного комплекса, обладающего нейрорегенеративным и нейропротективным действием [11]. Данный способ позволяет получить смесь белков и полипептидов из головного мозга эмбрионов сельскохозяйственных животных, взятого на определенной стадии гестации (от начала средней трети до середины последней трети), методом анионообменной хроматографии, используя для нанесения на уравновешенную колонку предварительно отфильтрованный супернатант гомогената ткани с буферным раствором рН 7,2-8,4, целевые фракции получают, разделяя связавшиеся с носителем белки и полипептиды, используя в качестве подвижной фазы 0.05М ТРИС-глициновый буфер, содержащий 0,1 мМ ЭДТА и 1М NaCl, повышая концентрацию ступенчатым градиентом с шагом 5%. Полученный вышеуказанным способом комплекс подвергают ультрафильтрации на мембране 5 кДа и обессоливают. Характеристику целевой белково-полипептидной фракции проверяют методами ультрафиолетовой спектрометрии, гель-хроматографии, денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Полученный вышеуказанным способом биологически активный комплекс имеет максимум поглощения ультрафиолетового спектра при длине волны 280±5 нм и содержанием входящих в него белков от 5 до 110 кДа не менее 95% от общего содержания белков. Использование при получении данного комплекса на этапе анионообменной хроматографии в составе подвижной фазы 1М NaCl создает слишком высокую ионную силу подвижной фазы, равную 1 моль/л, а включение в состав ЭДТА и ТРИС еще больше ее увеличивает. В связи с этим полученная целевая фракция содержит большое количество кислых высоко заряженных белков и полипептидов, имеющих в клетках мозговой ткани преимущественно мембранную локализацию, в основном выполняющих структурные функции и только в незначительной степени регуляторные, не имеющие не только тканеспецифической, но и выраженной биологической активности. Дальнейшее ступенчатое повышение концентрации соли с шагом 5% еще больше увеличивает присутствие данных белков, увеличивая биологическую инертность смеси, тем самым снижая ее активность. Использование при получении данного комплекса в качестве сырья эмбриональных головной мозг обусловливает наличие тканеспецифических белков, регулирующих физиологические и репаративные процессы преимущественно нервной ткани, оказывая невыраженное системное действие, поэтому спектр биологической активности направлен на коррекцию и лечение нарушенных функций и заболевания нервной системы.
Основной целью является создание эффективного природного белково-полипептидного комплекса, отвечающего современным международным требованиям безопасности, предъявляемым к фармацевтическим препаратам.
Основной, поставленной перед авторами задачей было получение биологически активного комплекса, стимулирующего физиологическую и репаративную регенерацию кожной ткани для лечения заболеваний и травматических поражений кожи, а также для применения в производстве лекарственных препаратов в эстетической медицине и косметологии и фармкомпозиции на основе полученного БПК.
Поставленная задача достигается заявленной группой изобретений при соблюдении всех условий получения БПК и фармкомпозиции.
В заявленную группу изобретений входит белково-полипептидный комплекс, способ его получения из эмбриональных нервной и кожной тканей копытных сельскохозяйственных животных на определенных сроках гестации и фармкомпозиция на основе этого белково-полипептидного комплекса.
Таким образом, поставленная задача достигается новым белково-полипептидным комплексом (БПК), обладающим тканеспецифическим репаративным действием на кожную ткань и слизистые оболочки с омолаживающим эффектом, получаемым из эмбриональных нервной и кожной тканей сельскохозяйственных копытных животных сроком гестации от середины первой до середины последней трети беременности, включающим тканеспецифические отрицательно заряженные слабо кислые, нейтральные белки и полипептиды, относящиеся к факторам роста, дифференцировки, сигнальным молекулам, определяющим его биологическую и фармакологическую активность, с молекулярными массами от 5 до 200 кДа, причем не менее 70% от общей массы белка имеет молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа, имеющих характерный специфический набор полос при денатурирующем гель-электрофорезе («SDS-Page») в 5%-ном полиакриламидном геле по сравнению со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 кДа до 250 кДа и максимумом поглощения при длине волны 215±5 нм, при снятии ультрафиолетового спектра в области длин волн от 200 до 500 нм.
Поставленная задача достигается также новым способом получения выше охарактеризованного белково-полипептидного комплекса, обладающего антигипоксическим, тканеспецифическим репаративным и омолаживающим действием на кожную ткань, заключающегося в том, что эмбриональные нервная и кожная ткани копытных сельскохозяйственных животных сроком гестации от середины первой трети до середины последней трети беременности поэтапно:
- гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии неионных детергентов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5 с последующим центрифугированием при значении g в интервале 10000-28000 в течение 90-30 мин;
- полученный супернатант фильтруют;
- фильтрат подвергают анионообменной хроматографии на колонке с анионообменным носителем и разделяя связавшиеся с носителем белки и полипептиды, используя в качестве подвижной фазы буферный раствор, первоначально имеющий ионную силу (I) не выше 0,1 ммоль/л, повышая ее плавно или ступенчато с шагом 0,025 ммоль/л и начиная сбор целевых фракций с ионной силой элюента от 0,125 до 0,15 ммоль/л при рН от 5,2 до 8,5;
- полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации.
Еще одним изобретением заявленной группы является фармацевтическая композиция на основе БПК, обладающая антигипоксическим, иммуномодулирующим, тканеспецифическим репаративным действием на кожную ткань и слизистые оболочки, с омолаживающим эффектом, выполненная в виде раствора, содержащего в качестве активного ингредиента биологически активный белково-полипептидный комплекс по п.1 в концентрации 0,05-2,0 мг/мл, полученный способом по п.2, и фармацевтически приемлемый разбавитель.
В качестве фармацевтически приемлемого разбавителя фармацевтическая композиция может содержать фармакопейный буферный раствор и, возможно, вспомогательные вещества, включающие высокомолекулярные соединения, стабилизаторы, консерванты и солюбилизаторы.
Указанная фармацевтическая композиция предназначена для фармацевтической и косметической промышленности, например для применения парентерально (внутрикожно, подкожно), интраназально или апликационно на слизистые оболочки и кожу.
Ниже приводится краткое описание способа получения БПК и сам БПК.
Итак, белково-полипептидный комплекс получают следующим образом (некоторые операции описаны с указанием детализаций, которые не ограничивают способ):
- нервную и кожную ткани эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, сроком гестации от середины первой трети до середины последней трети беременности, размораживают;
- гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии неионных детергентов при рН не менее 5,2 и не выше 8,5, в соотношениях не менее 1:0,5;
- гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при значении g интервале 10000-28000 в течение 90-30 мин,
- надосадочную жидкость фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм;
- фильтрат наносят на уравновешенную хроматографическую колонку с анионообменным носителем, например - Toyopearl DEAE-650M;
- разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом ионной силы раствора, используя в качестве подвижной фазы буферный раствор, имеющий ионную силу не выше 0,1 ммоль/л, повышая ее с шагом 0,025 ммоль/л и начиная сбор целевых фракций с помощью буферного раствора с ионной силой от 0,125 до 0,15 ммоль/л, в интервале рН от 5,2 до 8,5;
- целевые фракции объединяют и разводят буферным раствором, например 0,05М глицин-NaOH в интервале от рН 5,2 до 8,5 и общей концентрации белка 1,0-2,0 мг/мл;
- полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм и определяют суммарную концентрацию белков.
Все предварительные процессы и процессы получения белково-полипептидной фракции желательно производить при температуре от +2 до +8°С.
Для идентификации полученного БПК используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (фиг.1). Молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Page») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 кДа до 250 кДа (фиг.2.). Значение изоэлектрической точки комплекса - от 4,2 до 8,4. В состав препарата входят белки с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых не менее 70% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа.
Для получения фармкомпозиции БПК разводят фармацевтически приемлемым буферным раствором, например 50 мМ глицин-фосфатным, содержащим при необходимости вспомогательные вещества, например, с концентрациями 0,5% маннитола, 0,0005% полисорбата-80 и двузамещенного фосфорнокислого натрия до рН не ниже 5,2 и не выше 8,5, с расчетом конечной концентрации общего белка (по методу Лоури) в полученном растворе в пределах 0,05-2,0 мг/мл. Проводят повторную идентификацию смеси и фильтрующую стерилизацию.
Для идентификации полученного белково-полипептидного комплекса используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле. Ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (фиг.1.). Молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Page») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 кДа до 250 кДа (фиг.3.). В состав препарата входят белки с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых не менее 70% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа.
Таким образом, при выделении БПК важно, чтобы:
- в качестве сырья использовалась эмбриональная нервная и кожная ткань копытных сельскохозяйственных животных со сроком гестации от конца первой трети до середины последней трети беременности;
- присутствие в буферном растворе консервантов, детергентов и солюбилизаторов в достаточных концентрациях;
- на стадиях гомогенизации и анионообменной хроматографии рН буферных сред находился в диапазоне 5,2-8,5;
- при проведении анионообменной хроматографии ионная сила раствора (I) элюента при разделении связавшихся с носителем белков и полипептидов была не ниже 0,1 ммоль/л, а сбор целевых фракций производился элюентом, имеющим ионную силу не выше 0,15 ммоль/л;
- в описываемом БПК содержание белка с молекулярными массами от 20 кДа до 160 кДа было не менее 70% от общего содержания белка;
- при индентификации заявленного БПК и проведении денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Page») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков отмечалось наличие характерных полос, подтверждающих и характеризующих спектр белково-полипептидных составляющих комплекса. При других параметрах получения состав белково-полипептидного компонента и концентрационные соотношения входящих в него компонентов будут иными.
Заявляемый биологически активный белково-полипептидный комплекс принципиально отличается от всех известных биологически активных субстанций, получаемых из сырья животного происхождения по:
- сырьевой основе - используется нервная и кожная эмбриональная ткань сельскохозяйственных животных на определенной стадии гестации от середины первой трети до середины последней;
- методике получения - присутствие в экстрагирующем буферного раствора, детергентов и солюбилизантов и отсутствие денатурирующих и деградирующих соединений - спиртов, щелочей, кислот и ферментов позволяет получить мембранные, межклеточные, цитоплазматические, ядерные белки и полипептиды с сохраненной третичной структурой;
- использование в составе подвижной фазы миллимолярных концентраций катиона для создания умеренной ионной силы, позволяя тем самым получить большое количество специфических для нервной ткани слабо заряженных белков и полипептидов, выполняющих регуляторные, сигнальные и ферментативные функции, определяющие выраженную регенеративно-репаративную биологическую тканеспецифическую активность;
- качественному составу, как определенной фракции тканевых (мембранных, клеточных, цитоплазматических, ядерных) гидрофильных, слабо заряженных отрицательных белков и полипептидов, с эволюционно закрепленным в онтогенезе концентрационным соотношением факторов роста, факторов дифференцировки и сигнальных молекул с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа;
- по идентификации и стандартизации полученной целевой фракции - наличие специфических, характерных для данного комплекса полос при электрофорезе в 5%-ном полиакриламидном геле;
- по чистоте - полученный белково-полипептидный комплекс не содержит примесей в виде липидов, пептидгликанов, липополипротеидов, углеводов, полисахаридов и других соединений;
- по способу применения - парентерально (внутрикожно, подкожно), на слизистые оболочки (интраназально, субконъюнктивально) и кожу;
- по безопасности применения (отсутствие токсических, мутагенных, канцерогенных и аллергизирующих свойств);
- по биологической и фармакологической активности (репаративно-регенеративная) и ее специфичности (ткане- и органоспецифичная).
Заявленная фармкомпозиция в виде БПК с фармацевтически приемлемым разбавителем позволяет повысить стабильность раствора БПК и увеличить сроки его действия и хранения.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами, не ограничивающими его объем.
Пример 1. Способ получения БПК.
Получение белково-полипептидного комплекса из эмбриональной нервной и кожной ткани овец.
2
440 г эмбриональной нервной и кожной ткани ягнят сроком гестации 16-18 недель размораживают и гомогенизируют в 1200 мл 0,05М ТРИС-глициново-фосфатного буфера рН 8,0, содержащего 1 мМ ЭДТА и 0,1% маннит, в течение 5 минут при +4°С, гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при значении g 10000 в течение 90 мин, отделяя фугат. Надосадочную жидкость фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, фильтрат наносят на уравновешенную 4 объемами 0,05М глициново-фосфатного буфера с рН 7,0 хроматографическую колонку объемом 200 мл с анионообменным носителем Toyopearl DEAE-650M, разделение связавшихся с носителем белков производят ступенчатым градиентом тем же буферным раствором, содержащим 0,05 М KCl (I=0,1 ммоль/л), повышая концентрацию соли с шагом 0,025М (I=0,025 ммоль/л) и начиная сбор целевых фракций с концентрациями соли от 0,075 М (I=0,125 ммоль/л) до 0,1 М (I=0,15 ммоль/л), целевые фракции объединяют, подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см через материалы с задерживающей способностью выше 200 кДа и разводят 0,05 М раствором глицин-NaOH рН 8,5 до общей концентрации белка 1,4 мг/мл, полученный раствор подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм и определяют суммарную концентрацию белков.
Все предварительные процессы и процессы получения белково-пептидной фракции производятся при температурах от +2 до +8°С.
Характеристика полученного белково-полипептидного комплекса:
- ультрафиолетовый спектр раствора препарата снимают в области длин волн от 200 до 500 нм: максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (Фиг.1);
- молекулярную массу белков, входящих в препарат, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Page») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 кДа до 250 кДа, в состав фракции входят белки с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых 76% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа (Фиг.2);
- количественное определение белка методом Лоури (без предварительного осаждения) - 1,48 мг/мл.
Пример 2. Способ получения БПК.
Получение белково-полипептидного комплекса из эмбриональной нервной и кожной ткани свиней.
2
300 г эмбриональной нервной и кожной ткани поросят сроком гестации 16-18 недель размораживают и гомогенизируют в буферном растворе рН 5,2, содержащем 50 мМ Трис-малеата, 1 мМ (ЭДТА) и 0,1% маннита, в течение 5 минут при +2°С. Гомогенат отделяют от балластных веществ фильтрованием через плотную ткань с последующим центрифугированием при значении g 28000 в течение 30 мин. Супернатант фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм и наносят на уравновешенную 4 объемами малеатного буферного раствора рН 5,2 хроматографическую колонку объемом 250 мл с анионообменным носителем DEAE-Сефароза. Разделение связавшихся с носителем белков производят градиентом малеатного буферного раствора рН 5,2 содержащего 0,05М NaCl (I=0,1 ммоль/л), плавно повышая концентрацию соли до 0,1 М (I=0,15 ммоль/л), начиная сбор целевой фракции с концентрации соли 0,075 М (I=0,125 ммоль/л) до 0,1М (I=0,15 ммоль/л), целевую фракцию подвергают ультрафильтрации на установке при противодавлении не более 8,0 кгс/см через материалы с задерживающей способностью выше 200 кДа и подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,22 мкм.
Для характеристики полученного белково-полипептидного комплекса используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 200 до 500 нм - максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (Фиг.3). Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Page») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 кДа до 250 кДа (Фиг.4). В состав препарата входят белки с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых 72% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа. Количественное определение белка в полученном БПК методом Лоури (без предварительного осаждения) - 2,4 мг/мл.
Пример 3. Способ получения фармкомпозиции.
Берут полученный по примеру 1 раствор БПК и разводят 50 мМ глициново-фосфатным буферным раствором и добавляют вспомогательные вещества: детергенты, солюбилизаторы, консерванты и высокомолекулярные соединения до конечных концентраций БПК - 0,05 мг/мл, маннитол - 0,5%, полисорбат-80 - 0,0005%, двузамещенный фосфорнокислый натрий до рН 8,5 и нипагин - 0,03%. Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.
Для характеристики полученной фармкомпозиции с БПК используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 200 до 500 нм - максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (Фиг.1). Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Page») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 кДа до 250 кДа (Фиг.2). В состав препарата входят белки с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых 72% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа. Количественное определение белка в полученном БПК методом Лоури (без предварительного осаждения) - 1,55 мг/мл.
Пример 4. Способ получения фармкомпозиции.
Берут полученный по примеру 2 раствор БПК и разводят 50 мМ глициново-фосфатным буферным раствором и добавляют вспомогательные вещества: детергенты, солюбилизаторы, консерванты и высокомолекулярные соединения до конечных концентрации БПК - 2 мг/мл, манит - 0,5%, полисорбат-80 - 0,0005%, бензалкония хлорид - 0,005% и однозамещенный фосфорнокислый натрий до рН 5,2. Полученную фармкомпозицию подвергают стерилизующей фильтрации, через мембранный фильтр с диаметром пор не более 0,1 мкм, разливают в стерильные стеклянные флаконы и закупоривают.
Для характеристики полученной фармкомпозиции с БПК используют методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, гель-хроматографии, электрофореза в полиакриламидном геле и аминокислотного анализа. Ультрафиолетовый спектр раствора снимают в области длин волн от 200 до 500 нм - максимум поглощения отмечается при длине волны 215±5 нм (Фиг.3). Молекулярную массу белков и полипептидов, входящих в комплекс, определяют методом денатурирующего гель-электрофореза («SDS-Page») в 5%-ном полиакриламидном геле в сравнении со стандартным набором маркерных белков с диапазоном молекулярных масс от 10 кДа до 250 кДа (Фиг.4). В состав препарата входят белки с молекулярной массой от 5 кДа до 200 кДа, из которых 72% имеют молекулярную массу в диапазоне от 20 до 160 кДа. Количественное определение белка в полученном БПК методом Лоури (без предварительного осаждения) - 2 мг/мл.
Пример 5. Исследование токсичности
Свойства полученной фармкомпозиции были изучены с помощью общепринятых методик по экспериментальному (доклиническому) изучению фармакологических веществ [11].
Проведены исследования токсичности в остром и субхроническом эксперименте оригинальной фармкомпозиции. Лекарственная форма: раствор для инъекций: 5 ампул по 1 мл (0,1 мг/мл), 5 ампул по 2 мл (0,1 мг/мл), 1 ампула по 2 мл (0,2 мг/мл). Максимальная рекомендуемая суточная доза 0,4 мг при эндолюмбальном введении и 0,1 мг при внутривенном введении.
Условия проведения эксперимента и методы исследований
Целью исследования явилось определение переносимых, токсических и летальных доз оригинальной фармкомпозиции. Исследование проводили на мышах обоего пола линии BALB/C массой 18-20 г при внутрибрюшинном, подкожном и внутрикожном способах введения. Срок наблюдения составил 14 дней. Животные получены из питомника, паспортизированы. Животных содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 10 особей, количество в группе - 10. Для кормления использовали комбинированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха (+18)-(+20)°С [14]. Максимально возможная для введения мышам доза готовой лекарственной формы 0,2 мл и составила 10 мг/кг, что превысило суточную терапевтическую дозу в 600 раз. Из эксперимента животных выводили эфирным наркозом, подвергали вскрытию и анализу состояния внутренних органов.
Результаты исследования острой токсичности.
Мыши. Масса животных составила от 18 до 20 г. Вводимая доза 0,2 мл, что составило 10 мг/кг. Количество животных в группе 10 голов. Всего две группы: внутрижелудочное и внутрибрюшинное введение. Срок наблюдения 14 суток.
Внешний вид. К концу эксперимента все животные выглядели здоровыми. Шерстяной покров густой, белого цвета. По внешнему виду животные между группами не отличались.
Поведение. Не отличалось между группами и от нормы.
Смертность. Во всех трех группах летальных исходов зафиксировано не было.
Масса животных. В течение всего срока наблюдения произведено шесть контрольных взвешиваний. Резкой потери или увеличения не выявлено.
Внутренние органы. По состоянию внутренних органов группы не отличались между собой. Изменения или увеличения внутренних органов не наблюдалось.
Исследование подострой (субхронической) токсичности
Условия проведения эксперимента и методы исследований
Исследования токсичности оригинальной фармкомпозиции в субхроническом эксперименте проводили на самцах и самках крыс линии Вистар массой от 200 до 250 г. Животные получены из питомника. Крыс содержали в стандартных условиях, в пластмассовых клетках по 5 особей. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи, творог. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха (+18)-(+20)°С. До начала эксперимента животных выдерживали в карантине в течение 10 дней. В группе 10 животных (5 самцов и 5 самок). Группы разделены следующим образом:
1 группа (контроль) - интактные животные
2 группа - оригинальная фармкомпозиция т.д. внутрикожное введение (п/к)
3 группа - оригинальная фармкомпозиция ×10 п/к
4 группа - оригинальная фармкомпозиция внутрибрюшинное введение (в/в) т.д.;
5 группа - оригинальная фармкомпозиция в/в ×10.
Срок наблюдения: 1 месяц введения, 1 месяц наблюдение резорбтивного действия.
Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения:
- по выживаемости и общему виду: (шерстяной покров, глаза, уши, конечности, зубы);
- состоянию и поведению животных (активность, походка, темперамент, питание);
- изменению массы тела (взвешивание крыс проводили до начала и в конце эксперимента);
- физиологическим функциям (дыхание, слюноотделение, мочеиспускание, экскрет).
Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали кровь:
морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина); биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатинина, глюкозы), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Забор крови для гематологических исследований производили из хвостовой вены. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901, «Labsystems» Финляндия. После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза для патоморфологических исследований органов и тканей. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патолого-анатомической схеме. Для патоморфологических исследований образцы ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия). Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными данными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.
Результаты исследования. Макроскопические исследования
Выживаемость: Все подопытные животные перенесли все способы введения. Гибели не наблюдалось ни в экспериментальных, ни в контрольных группах животных.
Поведение: Каких-либо существенных отклонений в поведении (повышенной или пониженной активности) и состоянии подопытных животных по сравнению с контрольными группами не отмечено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью.
Внешний вид: все животные были средней упитанности, истощением или ожирением не страдали. Шерстяной покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков не отмечено. Ушные раковины розового цвета без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета у всех животных, поломок не наблюдалось.
Функции: дыхание у подопытных животных, как и у контрольных, было спокойное обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи был в пределах физиологической нормы.
Клинические исследования: Динамика массы тела: во всех подопытных группах положительная. Достоверных различий между опытными и контрольными животными нет.
Гематологические показатели: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы.
Биохимические исследования: пептидный комплекс в испытуемой дозе не влиял на уровень содержания общего белка сыворотки крови подопытных животных, что свидетельствует об отсутствии повреждающего действия изучаемого препарата на белок-образующую функцию печени. Для выявления возможного повреждающего воздействия на печень в сыворотке крови животных во время хронического эксперимента определяли активность щелочной фосфатазы, аспартат и аланинаминотрансферазы.
Анализ полученных данных показал отсутствие достоверных изменений активности указанных ферментов сыворотки крови.
Патоморфологические данные: Макроскопическое исследование.
У животных во всех группах при вскрытии кожа чистая, подкожно-жировой слой развит умеренно. Расположение внутренних органов правильное, свободной жидкости ни в плевральной, ни в брюшной полостях нет. Просвет трахеи и бронхов свободен, слизистая их чистая, влажная блестящая. Ткань легких опытных групп более интенсивно окрашена, чем у животных интактного контроля, однако без признаков отека. Миокард на разрезе без патологических изменений. Язык чистый. Слизистая полости рта и пищевода без дефектов. Желудок и кишечник без следов раздражения. Печень не увеличена. Капсула почек отделяется легко, мозговое и корковое вещество на разрезе хорошо различимы. Селезенка с гладкой капсулой, на разрезе серовато-бурого цвета, пульпа без соскоба. Семенники и яичники без особенностей. Тимус сероватого цвета, без кровоизлияний. Щитовидная железа плотная с симметричными долями. Оболочки головного мозга умеренного кровенаполнения, влажные, блестящие. Мозговое вещество имеет симметричный рисунок на разрезе. Весовые индексы органов испытуемых животных не имели достоверных отличий от контрольных групп.
Микроскопическое исследование: Во всех исследуемых группах: во внутренних органах (печень, почки, легкие, сердце, селезенка, желудок, толстый и тонкий кишечник), железах внутренней секреции (щитовидная железа, тимус, надпочечники, поджелудочная железа), репродуктивных органах (матка, яичники), лимфатических узлах, головном мозге, коже, слизистых носа и горла - патоморфологических изменений не выявлено.
Исследование субхронической токсичности на неполовозрелых животных при внутрикожном введении на неполовозрелых животных.
Исследования проводили на 3-недельных крольчатах породы Шиншилла весом от 300 до 500 г. Введение препарата производили подкожно ежедневно 1 и 2 раза в день по 0,5 мл (0,05 мг) в течение 2 недель. Животные получены из питомника. Кроликов содержали в стандартных металлических клетках по 1 особи. Для кормления использовали брикетированный корм, свежие овощи. Доступ к воде и корму свободный. Освещение вивария искусственное. Температура воздуха (+18)-(+20)°С. В группе 5 животных, количество групп 3. Группы разделены следующим образом: 1 группа (терапевтическая доза) - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,5 мл, вводимая ежедневно 1 раз в день; 2 группа - фармкомпозиция 0,1 мг/мл 0,5 мл, вводимая ежедневно 2 раза в день; 3 группа - интактные животные. Срок введения 2 недели.
Токсичность оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения: по выживаемости, общему виду, состоянию и поведению животных, изменению массы тела (взвешивание проводили в начале и в конце эксперимента). О местном раздражающем действии в ходе эксперимента судили по изменениям при визуальном и гистологическом исследовании в коже, в местах инъекций.
Экспериментальным животным до начала и в конце эксперимента исследовали морфологический состав периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина), биохимические показатели (уровень белка, мочевины, креатина, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов), активность некоторых ферментов сыворотки крови (аспартат- и аланинаминотрансферазы, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа). Для определения указанных показателей кровь брали из ушной вены в объеме 1,5-2,0 мл. Подсчет форменных элементов крови производили на автоматическом счетчике крови «Пикоскель» (Венгрия). Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным методом. Уровень биохимических показателей определяли с помощью автоматизированной системы. ФП-901, «Labsystems» Финляндия.
После окончания хронического эксперимента животных умерщвляли с помощью передозировки наркоза. Вскрытие животных производили сразу после их гибели по полной патолого-анатомической схеме.
Морфометрическую оценку параметров органов животных проводили с помощью весов фирмы «Sartorius» (Германия) с последующим вычислением массы органов и их стандартных отклонений.
Для патоморфологических исследований образцы свежей ткани подвергали желатинированию и криостатированию с получением срезов толщиной до 5 мкм. Затем ткани фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Микроскопию проводили на микроскопе фирмы «Opton» (Германия).
Полученные экспериментальные данные сравнивали с контрольными и обсчитывали с помощью компьютерной статистической программы.
Результаты исследования
Оценка местнораздражающего действия.
Прижизненные биомикроскопические исследования
На протяжении всего срока наблюдения у животных сохранялось нормальное поведение, гиперемии, отека и других изменений в местах инъекций не выявлялось.
Контрольная интактная группа. Кожные покровы в местах инъекций бледно-розового цвета, без отеков и гиперемии, шерсть обычной густоты, имеет здоровый блеск без гипергидроза и повышенной сальности. Во время наблюдения изъянов на эпидермисе не обнаруживались. Рефлексы соответствовали физиологической норме.
При конфокальной микроскопии: эпидермальный слой и непосредственно дерма имели плотно упакованную структуру, четко дифференцированных клеток. Клетки связаны щелевыми контактами.
В группе терапевтической дозы. Кожные покровы в местах инъекций бледно-розового цвета, без отеков и гиперемии, шерсть обычной густоты, имеет здоровый блеск без гипергидроза и повышенной сальности. Во время наблюдения изъянов на эпидермисе не обнаруживалось. Рефлексы соответствовали физиологической норме. При конфокальной микроскопии: эпидермальный слой и непосредственно дерма имели плотно упакованную структуру, четко дифференцированных клеток. Клетки связаны щелевыми контактами. Ни в одном случае патологических изменений не выявлено.
В группе ×10. Ни в одном случае патологических изменений кожи не выявлено.
Клинические и биохимические исследования
Анализ крови: содержание гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов во всех группах в пределах физиологической нормы. Показатели, полученные в опытных группах, достоверно не отличались от контрольных групп интактных животных и препарата сравнения.
Биохимические исследования: глюкоза крови, активность аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз во всех группах в пределах номы.
Заключение. Проведены исследования токсичности в субхроническом эксперименте на неполовозрелых животных оригинальной фармкомпозиции.
Введение препарата внутрикожно как в терапевтической дозе, так и в десятикратно превышающей в течение 2 недель не вызывало изменений внутренних органов, не оказывало токсического действия на систему крови, не оказывало местнораздражающего действия.
Пример 6. Мутагенность фармкомпозиции.
Для оценки мутагенных свойств заявляемой белково-полипептидной фармкомпозиции применили набор следующих тестов [12]:
- учет генных мутаций в тесте Эймса Salmonella /микросомы с использованием в качестве тест-объектов штаммов Salmonella typhimurium ТА 97, ТА 98 и ТА 100;
- учет микроядер в клетках костного мозга мышей.
Испытан образец белково-полипептидной фармкомпозиции, представляющий собой прозрачную жидкость, стерильно упакованную во флакон темного стекла в количестве 20 мл, содержащую субстанцию в концентрации 0,1 мг/мл.
Оценка мутагенных свойств белково-полипептидной фармкомпозиции в тесте Эймса.
Мутационный тест на Salmonella typhimurium является бактериальной тест-системой для учета генных мутаций к прототрофности по гистидину при действии химических соединений и(или) их метаболитов, индуцирующих мутации типа замены оснований или сдвига рамки считывания в геноме этого организма. Мутагены, индуцирующие замены пар оснований - агенты, вызывающие мутации замены пар оснований в молекуле ДНК. Мутагены, индуцирующие мутации сдвига считывания генетического кода (фреймшифт мутации), - агенты, вызывающие добавление или нехватку одиночных или множественных пар оснований в молекуле ДНК.
Данный метод предназначен для выявления способности фармакологических веществ или их метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных штаммов Salmonella typhimurium. Бактерии обрабатываются тестируемым соединением с системой метаболической активации (СМ+) или без метаболической активации (СМ-). После инкубации в течение определенного периода времени подсчитывается количество ревертантных колоний у разных тестерных штаммов в сравнении с количеством спонтанных ревертантов в вариантах негативного контроля (необработанные культуры или культуры, обработанные растворителем). Если тестируемое соединение и(или) его метаболиты обладают мутагенной активностью, то они будут индуцировать обратные мутации от ауксотрофности к прототрофности по гистидину у гистидин-зависимых штаммов Salmonella typhimurium.
Для тестирования использовали набор индикаторных штаммов Salmonella typhimurium, позволяющий регистрировать мутации типа сдвига рамки считывания генетического кода (ТА 98 и ТА 97) и замены пар оснований (ТА 100).
Штаммы получены из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика.
Регламент работы с бактериальными культурами, проверка генотипов штаммов, правила их музейного хранения, необходимые для проведения экспериментов оборудование, посуда, реактивы и питательные среды и растворы, проведение работ по получению гомогената печени крыс и составление активирующей смеси, а также методы статистического анализа полученных результатов соответствовали стандартным, подробно описанным в соответствующей литературе.
Для метаболической активации использовали фракцию S9 печени самцов крыс Wistar, которым за 5 дней до забоя вводили индуктор микросомальных ферментов - совол (300 мг/кг, однократно, внутрибрюшинно). Для контроля активности системы метаболической активации использовали бромид этидия (10 мкг/чашку) на штамме ТА 98 при СМ+.
Белково-полипептидная фармкомпозиция в виде стерильного раствора с содержанием белка 0,1 мг/мл исследовали 1,0 и 0,3 мл исходного раствора на чашку и три 10-кратных разведения в физиологическом растворе (по 0,1 мл/ч). Тестируемые дозы субстанции составили 300; 100; 10; 1 и 0,1 мкг на чашку.
Эксперимент сопровождали положительными контролями, в качестве которых использовали вещества, индуцирующие мутации у соответствующих штаммов-тестеров при наличии или отсутствии условий активации. Для вариантов без активации использовали азид натрия в количестве 10 мкг на чашку для штамма ТА 100 при СМ-; 2,7-диамино-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазопирен (ДИАМ) - 10 мкг на чашку для штамма ТА 98 при СМ-; 9-аминоакридин (9АА) - 50 мкг/чашку для штамма ТА 97 при СМ-. Для контроля активности системы метаболической активации использовали этидиум бромид - 10 мкг на чашку на штамме ТА 98 при СМ+. В качестве негативного контроля использовали физиологический раствор (0,1 мл на чашку).
Селективный полуобогащенный агар (0,7%) в пробирках плавили в водяной бане при 100°С и помещали в термостатируемую водяную баню с температурой (+45)-(+46)°С. Сначала в пробирки с агаром вносили 0,1 мл образца в необходимых разведениях, затем - 0,1 мл суспензии бактерий и 0,5 мл микросомальной активирующей смеси (для варианта с метаболической активацией). Затем содержимое пробирки быстро перемешивали и выливали на слой нижнего минимального агара в чашки Петри. Продолжительность времени внесения микросомальной активирующей смеси и розлива полужидкого агара на чашку не превышала 10-15 секунд. Чашки оставляли при комнатной температуре на 30-40 минут и после полного застывания агара переносили в термостат при +37°С. Учет результатов проводили через 48 часов инкубации.
Параллельно в опыт включали варианты без системы метаболической активации (СМ-) и в присутствии системы метаболической активации (СМ+). В варианте СМ- может быть зарегистрировано действие прямых мутагенов, то есть препаратов, проявляющих мутагенный эффект за счет активности исходной структуры вещества. Действие же промутагенов, то есть соединений, эффект которых связан с образованием мутагенных метаболитов, может быть учтено при сравнении результатов, полученных при анализе данных испытаний вещества в вариантах СМ- и СМ+. В каждом контрольном и опытном вариантах использовали по 2 чашки. Мутагенный эффект считали значимым, если среднее количество колоний ревертантов на чашку в опытном варианте превышало таковое в контрольном варианте в 2 и более раз. Результаты эксперимента учитывали при наличии стандартного ответа во всех вариантах позитивного и негативного контроля. Количество колоний ревертантов в контроле с растворителем в вариантах СМ- и СМ+ было в пределах колебаний спонтанного уровня для данных штаммов. Ответ штаммов на стандартные мутагены был в пределах обычных уровней.
Исследованная белково-полипептидная фармкомпозиция во всех тестируемых концентрациях не показала мутагенного эффекта на штаммах ТА 100, ТА 98 и ТА 97 в вариантах без- и в присутствии системы метаболической активации.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: белково-полипептидная фармкомпозиция не обладает способностью индуцировать генные мутации на тестерных штаммах Salmonella typhimurium во всем диапазоне испытанных концентраций.
Оценка мутагенных свойств белково-полипептидной композиции микроядерным методом в клетках млекопитающих.
Цитогенетическая активность - способность вещества вызывать структурные и численные хромосомные нарушения в соматических и зародышевых клетках.
Микроядра - небольшие ДНК-содержащие образования, состоящие из ацентрических фрагментов хромосом или отставших на стадии анна-телофазы хромосом. На стадии телофазы эти фрагменты могут включаться в ядра дочерних клеток или образовывать одиночные или множественные микроядра в цитоплазме.
Цель исследования - выявление и количественная оценка цитогенетической (мутагенной) активности фармакологических средств в полихроматофильных эритроцитах (ПХЭ) костного мозга млекопитающих. Метод основан на микроскопической регистрации клеток с микроядрами.
Эксперименты проводили на самцах и самках мышей-гибридов F1(CBAx C57BI6/J) двухмесячного возраста массой 18-20 г. В состав каждой группы входило по 6 особей. Животных содержали при 12-часовом световом режиме в условиях свободного доступа к воде и пище. Эксперименты на животных по оценке мутагенных свойств белково-полипептидного комплекса при однократном и пятикратном введении осуществляли в соответствии с официальными протоколами. Проведено 3 серии экспериментов с соответствующими контролями: терапевтическая доза испытана на самцах при однократном введении; субтоксическая доза испытана на самцах при однократном введении; терапевтическая доза испытана на самцах и самках при пятикратном введении.
Учитывая, что возможным предполагаемым способом применения белково-полипептидной фармкомпозиции в клинике - внутривенный или эндолюмбальный, в данном исследовании использовали внутрибрюшинное введение субстанции мышам. Дозу белково-полипептидного комплекса для оценки мутагенной активности рассчитывали, исходя из наибольшей рекомендованной суточной терапевтической дозы (ТД) для человека. Рекомендовано внутривенное введение белково-полипептидной фармкомпозиции в количестве 2 мл при концентрации 0,1 мг/мл. При этом терапевтическая доза (ТД) для человека, в том числе для ребенка, может составить 0,05 мг/кг/сутки. Для расчета дозы в экспериментах на мышах рекомендуется использовать коэффициент пересчета, учитывающий соотношение площади поверхности тела и массы тела человека и мыши. В нашем исследовании он составил 8,33. Поэтому в качестве ТД для мышей использовали дозу, приблизительно равную 8,33 ТД для человека (0,42 мг/кг).
В качестве субтоксической использовали максимально возможную в условиях данного эксперимента дозу 10 мг/кг, поскольку вещество было предоставлено в концентрации 0,1 мг/мл, а общепринятое количество вещества, вводимое мышам, составляет 0,1 мл на 10 г веса. Соответственно в пересчете для человека максимальная испытанная доза составляет 1,7 мг/кг.
Было сформировано 7 групп животных: четыре опытных и три соответствующих контрольных. Субстанцию в дозе 0,1 мг/кг вводили пятикратно с интервалом 24 часа самцам и самкам. Забой во всех группах проводили через 6 часов после последнего введения белково-полипептидного комплекса.
В двух других опытных группах белково-полипептидный комплекс вводили однократно самцам в дозах 0,2 мг/кг и 0,5 мг/кг.
В качестве негативного контроля использовали растворитель - физраствор. Его вводили внутрибрюшинно самцам и самкам двух контрольных групп в те же сроки и в тех же объемах, что и животным опытных серий. В качестве позитивного контроля использовали циклофосфамид в дозе 20 мг/кг, растворенный ex tempore в физрастворе при однократном внутрибрюшинном введении за 24 часа до забоя.
Препараты клеток костного мозга для учета микроядер готовили общепринятым способом в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка мутагенной активности факторов окружающей среды в клетках разных органов млекопитающих микроядерным методом». Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации через 6 часов после последнего введения препарата. Выделяли обе бедренные кости и очищали их от мышц. Для вымывания костного мозга использовали эмбриональную телячью сыворотку (НПП ПанЭКО). Костный мозг из обеих бедренных костей вымывали шприцем в микропробирку. Суспензию центрифугировали при 1000 об/мин, в течение 5 минут, супернатант удаляли, осадок осторожно ресуспендировали. Из капли суспензии готовили мазок, высушивали его на воздухе. Фиксировали метанолом 3 минуты. Окрашивали по методу Романовского-Гимза. Анализировали на зашифрованных препаратах по 2000 полихроматофильных эритроцитов от каждого животного. При подсчете 500 эритроцитов определяли соотношение полихроматофильных и нормохромных эритроцитов. Препараты расшифровывали по окончании анализа.
Критерием позитивного результата является воспроизводимое и статистически значимое увеличение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами по крайней мере в одной из опытных групп по сравнению с контрольной. Полученный положительный результат свидетельствует, что вещество индуцирует хромосомные повреждения и/или нарушения митотического аппарата клеток у экспериментальных животных.
Статистическую обработку результатов по учету микроядер проводили путем сравнения опытных серий с контрольными по критерию Х2; межгрупповое сравнение доли полихроматофильных эритроцитов проводили с помощью критерия Манна-Уитни.
Результаты учета микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей: во всех вариантах опыта белково-полипептидная фармкомпозиция не вызывала увеличения частоты клеток с микроядрами в костном мозге мышей при сравнении опытных и соответствующих контрольных серий. Циклофосфамид (позитивный контроль) при внутрибрюшинном введении самцам мышей в дозе 20 мг/кг вызывал повышение частоты клеток с микроядрами в 19,6 раза (62,1‰ против 3,16‰ в контроле, Р<0,001). Доля ПХЭ от общего числа эритроцитов костного мозга была приблизительно на одном уровне в группах опытных и контрольных серий, что свидетельствует об отсутствии токсического действия композиции в испытанных дозах на кроветворение. При действии позитивного контроля (циклофосфамида) отмечен сдвиг соотношения полихроматофильных и нормохромных эритроцитов в сторону последних (при сравнении с контролем Р<0,005).
Таким образом, мутагенная активность белково-полипептидной фармкомпозиции не выявлена в тесте на индукцию микроядер в полихроматофильных эритроцитах костного мозга мышей при условии однократного и пятикратного введения самцам и самкам внутрибрюшинно в дозе 0,42 мг/кг массы тела, что в пересчете соответствует суточной терапевтической дозе для человека. Мутагенная активность не выявлена также в условиях однократного введения белково-полипептидной фармкомпозиции самцам в максимально возможной дозе - 10 мг/кг. Белково-полипептидный комплекс не проявил токсического действия по показателю «доля полихроматофильных эритроцитов».
Заключение по оценке мутагенных свойств белково-полипептидной фармкомпозиции.
Белково-полипептидная фармкомпозиция не обладает мутагенной активностью в тесте Эймса Salmonella / микросомы и в тесте на индукцию микроядер в клетках костного мозга мышей в условиях экспериментов, проведенных в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ.
Пример 7. Исследование биологической активности
Репаративное действие. Данный вид фармакологического действия установлен на стандартной модели с полнослойным дефектом кожи на мышах, которым вводили заявляемый БПК в дозах 0,2-1,0 мг/кг. Под влиянием препарата срок заживления по сравнению с контролем сокращается с 17 дней до 10. Аналогичный эффект оказывает препарат из плаценты амниоцен только в дозе 75 мг/кг. При этом существенным преимуществом применения заявляемого препарата является отсутствие рубцов в процессе заживления.
Адаптогенное действие. Данный вид действия в процессе создания новых лекарственных средств приобретает одно из самых актуальных направлений поиска, т.к. это может дать возможность влиять на физиологические процессы при физических, термических, химических перегрузках, особенно для предотвращения отравлений, ожогов, повышения выносливости организма и т.д. В процессе исследования заявляемого препарата установлено, что предварительная обработка животных (мыши) в течение 7 суток в условно-терапевтической дозе (0,1 мл/кг) предотвращает гибель животных от токсической дозы ядовитых веществ (стрихнин), летального облучения, инфицирования синегнойной палочкой.
Антистрессовое действие. Антистрессовое действие заявляемого препарата исследовано на основе многомерных методов оценки состояния различных компонентов устойчивости к эмоциональному стрессу у крыс (поведенческий и висцеральный компоненты). В результате данных исследований установлено, что заявляемый препарат обладает способностью повышать устойчивость к эмоциональному стрессу, т.е. предупреждать развитие функциональных расстройств высшей нервной деятельности, общего иммунитета и метаболических нарушений сердечной деятельности. Наиболее эффективной оказалась доза 20 мкл на 100 г массы крысы, что соответствует дозе 2 мл на 1 инъекцию у человека.
Антикоагулянтное действие. В процессе исследования степени влияния заявляемого препарата на свертываемость крови установлено, что в дозе 0,2 мг/кг при месячном введении проявляется антикоагулянтное действие, которое исчезает через 30 дней после окончания введения препарата. Данный факт может иметь существенное практическое значение при лечении состояний, сопровождающихся симптоматической гиперкоагуляцией.
Пример 8. Противоожоговое и репаративное действие.
1
2
2
20 крыс линии F (AMCY×Wistar), массой тела 250-270 г, наркотизировали внутрибрюшинным введением тиопентала в дозе 60 мг/кг. Для получения ожога на эпилированный участок кожи лопаточной области, размерами 3×3 см, накладывали четырехслойную медицинскую марлю, размером 1 см, предварительно смоченную дистиллированной водой, и прижимали нагретый термоэлектрод площадью 1 см с температурой нагрева 200°С.
Степень ожога дозировали временем экспозиции электрода, которое составляло от 3 до 15 с.
Крыс забивали на 3, 7, 14, 23, 30 и 60 сутки после нанесения ожога и осуществляли гистологическое исследование ожоговых тканей. Макроскопическое наблюдение показало, что сразу после нанесения ожога на коже образуется сухой, плотный, беловато-серый, местами багрово-синюшный струп с четко определяющими границами. Кожа вокруг зоны термического воздействия становится пастозной. По краю струпа образуется розовый венчик.
10 крыс, составивших группу фармкомпозиции с БПК, получали внутрикожные инъекции в 8 точек по периферии ожога в суммарной дозе 0,2 мг/кг, что по объему составило 2 мл раствора. 10 оставшихся крыс составили контрольную группу, получавшую в то же количество точек, внутрикожно 2 мл физиологического раствора.
На третьи сутки после нанесения ожога появляется выраженная клеточная реакция на повреждение в виде лимфомоноцитарной инфильтрации по границе поврежденных и неповрежденных тканей.
На 7 сутки в обеих группах, под струпом определяется грануляционная ткань, умеренно инфильтрированная моноцитами и лимфоцитами, но опытная группа отличалась от группы контроля тем, что на фоне обычной грануляционной ткани, возникающей на месте повреждения, регенерирующие коллагеновые волокна, еще тонкие и нежные, уже располагаются в соответствии с гистроархитектоникой сетчатого слоя дермы, а поврежденные ткани подкожной клетчатки и мышечного слоя замещались рыхлой волокнистой соединительной тканью с небольшим избытком фибробластов. С краев под струп врастал эпидермис, под которым структура всех слоев кожи не отличалась от контроля. Капилляры субэпидермального слоя были расширены и полнокровны во всех группах.
К 14 суткам, в группе фармкомпозиции, за тонким плотным струпом и следующей за ним узкой зоной клеточного детрита располагалась молодая соединительная ткань, пучки коллагеновых волокон которой, тонкие и слабо фуксинофильные, четко воспроизводили структуру и архитектонику коллагеновых пучков сетчатого слоя дермы. За регенерирующей дермой располагается ткань, состоящая из нежной сети ретикулиновых волокон, между которыми встречаются жировые клетки. Это позволяет говорить о восстановлении структуры подкожной жировой клетчатки. В группе контроля отмечалась некоторая хаотичность организации пучков коллагеновых волокон без четкой архитектоники, за которой располагаемая сеть ретикулиновых волокон с вплетением пучков коллагена.
На 23 сутки, во всех группах поверхность поражения полностью эпителизирована. Эпидермис, несколько утолщенный с правильно расположенных краев, давал в подлежащие ткани выросты в виде гребней. Сосочковый слой дермы, в группе фармкомпозиции отличался от группы контроля более плотным расположением волокон и повышенной клеточностью.
На 30 сутки опыта во всех группах отмечали дальнейшее созревание коллагеновых волокон дермы, причем в группе фармкомпозиции отмечалась их выраженная структуризация с несколько меньшим размером волокон. В контрольной группе отмечалось достоверное утолщение эпидермиса у всех животных.
На 60 сутки при осмотре область термического ожога в группе фармкомпозиции визуально не отличается от окружающей ткани, по морфологическому строению никаких качественных отличий от нормальной кожной ткани не обнаружено. В контрольной группе отмечается образование гипертрофического рубца с возвышением над поверхностью окружающих кожных покровов. При морфологическом исследовании во всех слоях кожи отмечалось повышенное содержание деструктурированного коллагена.
Пример 9. Иммуномодулирующая активность.
Иммуномодулирующие свойства БПК, полученного так же, как и в примерах 1 и 2, определяли по активации макрофагов перитонеального экссудата крыс линии Wister в опытах in vitro no усилению ферментативной активности в восстановлении нитро-синего тетразолия в диформазан (НСТ-тест) и по усилению фагоцитарной активности к E.Coli.
6
6
6
6
2
В брюшную полость декапитированных животных с помощью иглы со шприцом вводили 20 мл бесцветного раствора Хенкса, содержащего 20 ед/мл гепарина. После 2-3-минутного массажа живота делали надрез и тем же шприцом отсасывали из полости введенную жидкость, которую после фильтрации через нейлоновый фильтр центрифугировали при ускорении 150-200 g в течение 15 мин. Полученный осадок суспендировали в половинном объеме свежей порции раствора Хенкса и вновь центрифугировали при тех же условиях. Промывку выделенных клеток осуществляли 3-4 раза, после чего концентрацию клеток в суспензии доводили до 80×10 клеток/мл. Содержание макрофагов в тканевом экссудате всех клеток составляло 25-35%. Определение ферментативной активности макрофагов перитонеального экссудата крыс проводили спектрофотометрически по восстановлению нитро-синего тетразолия в диформазан. Осадок клеток перитонеального экссудата крыс разводили бесцветным раствором Хенкса до концентрации 80×10 клеток/мл. К 50 мкл клеточной суспензии добавляли 50 мкл пробы с рН 7,4 и концентрацией белково-полипептидного комплекса 0,1 мг/мл. Смесь ставили на инкубирование при температуре +37°С в водяную баню при постоянном встряхивании в течение 30 мин, после чего добавляли 50 мкл насыщенного при температуре +20°С раствора нитро-синего тетразолия фирмы Reanal (Венгрия) и продолжали инкубировать еще 30 мин. Затем вносили 3 мл ацетона и центрифугировали при ускорении 2000 g в течение 20 мин. Надосадочную ацетоновую вытяжку фотометрировали при длине волны 515 нм. В качестве контроля сравнения ферментативной активности использовали пробу с консервантом на физиологическом растворе. Фагоцитарную активность клеток перитонеального экссудата крыс определяли по их способности захватывать E.Coli. К 50 мкл клеточной суспензии добавляли 50 мкл пробы с рН 7,4 и препарата с общей концентрацией белков 0,05 мг/мл. Смесь ставили на инкубирование при температуре +37°С в водяную баню при постоянном встряхивании в течение 30 мин. По окончании инкубации смесь суспендировали в 10 мл бесцветного раствора Хенкса при температуре +4°С и центрифугировали при ускорении 150-200 g в течение 15 мин. Осадок клеток перитонеального экссудата крыс разводили раствором Хенкса до концентрации 2,5×10 клеток/мл. Полученную суспензию в количестве 0,2 мл наносили на стекло размером 18×18 мм и инкубировали при температуре +37°С в течение 30 мин в атмосфере, содержащей 5%-ный углекислый газ (CO) для прикрепления к стеклу макрофагов. После инкубации для удаления неприкрепившихся клеток стекло ополаскивали 3 раза в стаканах со средой Хенкса. К оставшимся на стекле клеткам добавляли 0,2 мл суспензии E.Coli при концентрации 20×10 клеток/мл и инкубировали в тех же условиях 45 мин. В дальнейшем стекло вновь трижды ополаскивали, фиксировали метанолом и окрашивали по Романовскому Гимзе. Индекс фагоцитоза (ИФ) определяли по формуле: ИФ (0+2,5n+6Т+9р+10R)/количество клеток, где 0 - количество клеток, не фагоцитирующих E.Coli; n - количество клеток, поглотивших 1-4 клетки; Т - количество клеток, поглотивших 5-7 клеток; р - количество клеток, поглотивших 8-9 клеток; R - количество клеток, поглотивших 10 и более клеток E.Coli. Идентификацию макрофагов проводили по окраске неспецифической эстеразы.
Уровень активации макрофагов перитонеального экссудата крыс линии Wister в опытах in vitro в группе препарата достоверно, р<0,05 (в 12 раз) превосходил контрольную группу при исследовании усиления ферментативной активности в восстановлении нитро-синего тетразолия в диформазан (НСТ-тест) и в 8 раз (р<0,01) - по усилению фагоцитарной активности к E.Coli.
Пример 10. Регенеративная активность и омолаживающее действие.
Пациентка Л., 41 год. Обратилась осенью с жалобами на значительную выраженность старых и появление новых морщин после отдыха на юге. При осмотре выявлены поверхностные морщины «гусиная лапка» в латеральных углах глаз, переносице, коже лба, резкая выраженность носогубных складок. Кожа лица сухая и истонченная, тургор ее снижен. Обращает на себя внимание выраженная седина и разреженность волос. Проведено 5 сеансов, в течение трех недель с промежутками в 3 дня в виде внутрикожных инъекций заявленного белково-полипептидного комплекса по примеру 1 и фармкомпозиции с БПК, полученной по примеру 3, в концентрации 0,1 мг/мл и дозе 0,4 мг на сеанс. Внутрикожное введение препарата осуществлялось симметрично, непосредственно в линии морщин по 10 точек с каждой стороны, по 0,2 мл на точку. Инъекции проводились симметрично в шахматном порядке, на одинаковом расстоянии друг от друга. Уже к концу первой недели отмечались следующие результаты: кожа лица приобрела естественный свежий вид, восстановился ее тонус и упругость. Морщинки у наружных углов глаз практически исчезли, на коже лба и переносицы значительно разгладились. К концу третьей недели отмечалось уменьшение седины. Результат на протяжении последующих месяцев стойкий, пациентка лечением довольна, отмечая значительное уменьшение седины с повышением густоты волос. Таким образом, предложенная фармкомпозиция позволяет повысить эффективность лечения старения кожи за счет быстрого восстановления ее фиброархитектоники и системного иммунорегулирующего воздействия на организм в целом.
На прилагаемых фиг.1 - фиг.4 представлены результаты испытаний и исследований комплекса по изобретению.
На фиг.1 представлена спектральная характеристика белково-полипептидного комплекса в УФ-видимой области спектра, полученного по примеру 1. Согласно данной фигуре полученный заявленным способом по примеру 1 белково-полипептидный комплекс характеризуется наличием пика при длине волны 215±5 нм в УФ-видимой области спектра.
На фиг.2 представлен денатурирующий электрофорез белково-полипептидного комплекса, полученного по примеру 1. (2), в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым в сравнении со стандартным набором маркерных белков (1) с диапазоном молекулярных масс от 10 до 250 кДа.
На фиг.3 представлен ультрафиолетовый спектр белково-полипептидного комплекса, полученного по примеру 2. Согласно данной фигуре в области длин волн от 200 до 500 нм отмечается максимум поглощения при длине волны ~(215±5) нм.
На фиг.4 представлен денатурирующий электрофорез белково-полипептидного комплекса, полученного по примеру 2. (2), в 5%-ном полиакриламидном геле при окрашивании реактивом Кумасси бриллиантовым голубым в сравнении со стандартным набором маркерных белков (1) с диапазоном молекулярных масс от 10 до 250 кДа.
Изобретение позволяет создать биологически активную субстанцию, с расширенными свойствами и высокой биологической активностью, обладающую тканеспецифическим репаративно-регенеративным и омолаживающим действием на кожную ткань и разработать способ ее получения путем выделения биологически активного белково-полипептидного комплекса из нервной и кожной ткани эмбрионов копытных сельскохозяйственных животных, которая решается за счет выбранной совокупности действий и режимов. Особенно важным оказалось определение оптимальных сроков гестации эмбриональной кожной и нервной тканей, а также набора реагентов, их доз, режимов экстракции, буферизации для сохранения эффективных концентрационных соотношений белков, полипептидов и нуклеотидов, закрепленных эволюционно и определяющих биологическую активность комплекса, обеспечивая репаративно-регенеративное тканеспецифическое и омолаживающее действие.
Изобретение предназначено для использования в химико-фармацевтической промышленности, медицине и косметологии, касается биологически активной субстанции - белково-полипептидного комплекса, получаемого из эмбриональной нервной и кожной ткани копытных сельскохозяйственных животных, обладающей антигипоксическим, омолаживающим действием, стимулирующим физиологическую и репаративную регенерацию кожной ткани, для применения в производстве лекарственных препаратов и косметических средств при заболеваниях кожи, эстетической медицине и косметологии.
Источники информации
1. Патент РФ №2355405, МПК A61K 39/17, A61K 35/50.
2. Заявка Франции №2413912.
3. Патент РФ №2132688, МПК A61K 35/48.
4. Патент №RU 2289417 С1.
5. Патент РФ №2189257, МПК A61L 27/00, A01N 1/00.
6. Патент РФ №2142784, МПК A61K 7/48, A61K 35/78.
7. Патент РФ 2144815, С1(51) A61K 7/00, A61K 7/48, A61P 17/16.
8. Патент US №9703169.
9. Заявка Франции N 2530466, МКИ A61K 7/48, 27.01.2084.
10. Патент РФ №2229886 С1.
11. Международная заявка WO 2009/088314 A1.
12. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО Издательство «Медицина», 2005, с.131-170.
13. Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО Издательство «Медицина», 2005, с.100-122.
14. Методические указания по оценке канцерогенности свойств фармакологических средств и вспомогательных веществ в краткосрочных тестах. // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под общей редакцией чл.-кор. РАМН, проф. Р.У.Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО Издательство «Медицина», 2005, с.131-170.
15. Программа по уходу и содержанию лабораторных животных НПП «Питомник лабораторных животных» ФИБХ РАН от ноября 2005 г.