Механизм взаимодействия бактерий с волокнистыми углеродными материалами по данным фазово-контрастной микроскопии

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Н.Н. Зинин-Бермес, Н.Ю. Шишлянникова, В.П. Ковтун

Кемеровская государственная медицинская академия, Институт угля и углехимии СО РАН,

г. Кемерово

МЕХАНИЗМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БАКТЕРИЙ С ВОЛОКНИСТЫМИ УГЛЕРОДНЫМИ МАТЕРИАЛАМИ ПО ДАННЫМ ФАЗОВО-КОНТРАСТНОЙ МИКРОСКОПИИ

С помощью фазово-контрастной микроскопии установлено, что сорбция бактерий на углеродном волокнистом сорбенте проходит в две фазы. Начальная фаза протекает в первые минуты после смешивания бактерий и сорбента и состоит в прочном прикреплении немногочисленных бактерий к поверхности сорбента. Вторая фаза наблюдается после 2040 минут от постановки опыта и состоит в формировании рыхлых, но устойчивых скоплений бактериальных клеток рядом с поверхностью углеродных волокон. Именно эти скопления постепенно, примерно за час, вбирают в себя все бактериальные клетки из суспензии. Механизм второй стадии обеспечивает очень высокую эффективность волокнистого углеродного сорбента по отношению к живым (только) бактериям. Получены данные, позволяющие предполагать индуцированную выработку бактериями лигандных веществ, определяющих главный механизм сорбции микробов на углеродных фибриллах.

Ключевые слова: углеродный сорбент, бактерии, микроскопия.

The phasic contrast microscopy determined the absorption of bacteria on carbon absorbent fibers to pass in two phases. The initial phase passes during the first minutes after the mixing of bacteria and absorbent and consists of the firm attacking of a few bacteria to the absorbent surface. The second phase is observed in 20-40 minutes from the beginning of the experiment and includes the formation of loose but stable accumulations of bacterial cells near the carbon fibers. It is these accumulations that during an hour gradually absorb all bacteria cells from their suspension. The mechanism of the second phase provides very high efficiency of fibrous carbon absorbent only related to living bacteria. The obtained findings suggest that bacteria induce the development of ligand substances making the chief mechanism of microbes absorption carbon on fibers.

Keywords: carbon absorbent, bacteria, microscopy.

Применение углеродных адсорбентов (УА) в медицинской практике широко известно. УА не токсичны при прохождении по желудочно-кишечному тракту человека, безопасны для слизистых оболочек, обладают высокой сорбционной емкостью и удобной фармацевтической формой (таблетированные, гранулированные, эластичные) [1]. Эластичные адсорбенты из углеродных тканей и нетканых материалов, получаемые на основе вискозных волокон [2], рекомендованы для местного применения при лечении ран, трофических язв, ожоговых поверхностей, свищей и др. Состоят они из тонких углеродных волокон, обладающих высокой сорбционной способностью. Инструкция, прилагаемая к изделию, свидетельствует, что наложе-

ние УА на гнойные раны способствует ускорению их заживления. Эффективность действия можно значительно повысить при предварительной нагрузке углеродного материала ионами металлов, обладающих олигодинамическим действием, или другими антимикробными веществами [3, 4, 5].

Механизм присоединения микробов к углеродным фибриллам до настоящего времени недостаточно изучен, что мешает изучению возможности дальнейшего совершенствования лечебных свойств препарата.

Цель работы — наиболее прямым из доступных методов, с помощью фазово-контрастного микроскопа, установить порядок взаимодействия микробов с углеродными фибриллами в процессе сорбции.

24 № 3 2004

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Использованы бактерии четырех видов: S. aureus, E. coli, K. pneumoniae, B. cereus, чтобы иметь в качестве моделей споровые и не споровые, грам (+) и грам (-), кокковые и палочковидные, капсульные и безкапсульные микроорганизмы. В качестве модельных волокнистых УА применяли АУТ-М (активированная углеродная ткань), АНМ (активированный нетканый материал) и АНМ, подвергнутый дополнительному окислению.

Из бактерий готовили взвеси (100 млн. микробных тел в 1 мл) в физиологическом растворе (0,9 %) хлорида натрия. В микрокамере добавляли к взвеси бактерий короткие отрезки углеродных волокон и наблюдали процесс сорбции под фазово-контрастным микроскопом. Микрокамера представляет собой пластмассовую пластинку толщиной 2,5 мм со сквозным круглым отверстием диаметром 10 мм. Сверху и снизу отверстие закрыто покровными стеклами. С верхнего стекла в камеру свисала капля взвеси бактерий с добавленными в нее кусочками углеродных волокон. Благодаря герметичности камеры, препарат не высыхал в течение трех часов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В фазово-контрастном микроскопе были хорошо видны углеродные волокна и взвешенные бактерии. Наблюдали два этапа взаимодействия УА и микробов.

В первые минуты контакта небольшое количество бактерий на некоторых участках сорбента прочно прикреплялось к некоторым углеродным нитям. Прочное прикрепление не допускало броуновского движения бактериальных клеток и не нарушалось воздействием потоков дисперсионной среды и столкновением плывущих клеток с прикрепленными.

Через 20-30 минут начинал проявляться другой процесс связывания бактерий. Около поверхности УА местами собирались скопления бактерий. Ближайшие к УА бактериальные клетки из этих скоплений не контактировали ни с поверхностью, ни друг с другом. Многие из них находились в броуновском движении, но, в то же время, они не рассеивались и не меняли своего расположения. Постепенно рыхлые бактериальные скопления образовывали муфты вокруг некоторых участков углеродных фибрилл. Образование муфт было характерно для всех наблюдаемых типов бактерий, и только при работе с клебсиеллами, примерно через час, некоторые клетки отходили от периферии их скоплений. Вероятно, эта особенность связана с наличием у клебсиелл капсул. Через час или несколько более свободные бактерии в дисперсионной среде не обнаруживались, все они оказались в рыхлых скоплениях, стремящихся расположиться вблизи переплетений отдельных волокон УА. Следовательно, с помощью этого способа основная масса бактерий связывается с УА.

Благодаря большой длине клеток B. cereus наблюдали интересную особенность их прикрепления

к поверхности УА в первой фазе процесса. Они присоединялись к поверхности УА либо одной концевой точкой с перпендикулярным (по отношению к поверхности УА) расположением тела бактерии, либо одной точкой своего тела, при этом концы бактерии старались «оттолкнуться» от поверхности УА. Вполне возможно, что активные центры на поверхности УА, способные присоединять бациллы, лежат на расстояниях, превышающих длину микробных клеток, т.к. последние не размещаются параллельно оси волокна, что получалось бы при присоединении хотя бы к двум точкам.

Технология производства УА не исключает частичного окисления его поверхности вследствие окислительных реакций, протекающих в процессе формирования структуры углерода при высоких температурах. Это приводит к тому, что многие УА проявляют слабо выраженные катионообменные свойства, которые можно усилить путем окислительной модификации [6]. Для проверки роли кислородсодержащих функциональных групп во взаимодействии сорбента с микробами, была проведена оценка сорбционных свойств УА с различным содержанием групп кислотного характера. С этой целью сравнивали образец АНМ, содержащий 0,79 кислотных, 0,37 карбоксильных и 0,42 фенольных групп в мг-экв/г, и окисленный АНМ, содержащий, соответственно, 2,3, 1,34 и 0,88 групп, определенных основаниями различной силы по известным методикам титрования [7].

При наблюдении под фазово-контрастным микроскопом обнаружили, что окисленный УА сорбирует клетки хуже, чем неокисленный. Первая фаза прикрепления вообще отсутствовала, а вторая — формирование рыхлых скоплений микробов вблизи поверхности У А — отчетливо проявлялась только через час наблюдения. В опытах с не окисленным материалом уже через 10 минут отдельные бактерии были соединены с волокнами, а с 20-й по 40-ю минуты вблизи поверхности УА сформировались рыхлые скопления бактерий. Клетки, взвешенные ранее в дисперсионной среде, практически исчезли. Бактерии той части скоплений, которые располагались ближе к сорбенту, скоро уплотнялись и многие входили в контакт с УА.

Для оценки роли активности метаболизма бактерий при взаимодействии с УА, опыты, аналогичные описанным, поставлены с микробами, убитыми ав-токлавированием, а также с микробами, выдержанными трое суток в холодильнике при +40С. Убитые бактерии не сорбировались вообще, охлажденные — присоединялись медленно и в малых количествах.

Таким образом, исследования показали, что с помощью фазово-контрастной микроскопии можно визуально наблюдать, как происходит сорбция бактерий на углеродных волокнистых сорбентах. Установлено, что связывание клеток S. aureus, E. co-li, K. pneumoniae, B. cereus протекает сходно, несмотря на различия микробов этих видов по морфологическим и физиологическим свойствам. Это свидетельствует о высокой универсальности УА.

Медицина № 3 2004

в Кузбассе № 3 2004 25

Выявлено, что процесс сорбции проходит в две фазы. Мало вероятно, что прикрепление бактерий к некоторым точкам фибрилл связано в первой стадии процесса с электростатическим взаимодействием отрицательно заряженных клеток с положительно заряженными химическими группировками на поверхности сорбента. Нужно учесть, что и у убитых бактерий сохраняется отрицательный электро-кинетический потенциал, но они не прикрепляются к фибриллам в первой стадии взаимодействия.

У окисленного сорбента сорбционная способность уменьшена. С одной стороны известно, что при окислении на углеродных фибриллах прибавляется количество отрицательно заряженных группировок. Можно предположить, что это мешает приближению к сорбенту отрицательно заряженных бактерий. Однако, с другой стороны, при физиологической концентрации хлорида натрия в дисперсионной среде, все заряженные группировки сильно экранированы ионами с противоположными знаками заряда. Кроме того, при столь значительной ионной силе неизбежно выраженное уплотнение слоя противоионов, экранирующих потенциал-определяющие заряды, что ведет к уменьшению электрокинетических потенциалов. Для понимания действительной роли кулоновских сил нужны дополнительные эксперименты.

Физико-химическая природа образования рыхлых скоплений бактерий около УА понятна также не во всех деталях. Рыхлость, т.е. наличие ясных зазоров между клетками, легко объяснить их одноименными зарядами, а также «расклинивающим давлением» [8] гидратных оболочек поверхности бактерий. А вот взаимную связь бактерий между собой и УА можно представить, только допустив наличие невидимых при микроскопии тяжей из веществ-лигандов. Доводом, подтверждающим это предположение, является то обстоятельство, что, искусственно мешая бактериям что-либо синтезировать (убивка автоклавированием) или ослабляя их метаболизм длительным выдерживанием при низкой температуре, устранялась их способность образовывать рыхлые скопления около фибрилл. Отметим, что в отдалении от сорбента, или в отсутствии последнего, устойчивые скопления бактериальных клеток не образуются, а появление их около сорбента похоже на осуществление описанного в литературе универсального генетического механизма саморегуляции микробов[9]. Мы не знаем пока, каким способом УА осуществляет воздействие на соответствующие пусковые рецепторы на микробной поверхности.

Постепенное (после часа наблюдения) уплотнение рыхлых скоплений бактерий, особенно вблизи поверхности УА, очень напоминает описанный в литературе [10] феномен синерезиса с некоторым своеобразием, связанным с наличием лигандных веществ.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что фазово-контрастная микроскопия дает возможность прямого визуального наблюдения процесса связывания бактерий фибриллами углеродного сорбента. Выявлено, что соединение микробов с фибриллами проходит в две фазы. В первую из них незначительное количество бактериальных клеток в течение нескольких минут прочно прикрепляется к некоторым углеродным нитям. Во второй фазе, начинающейся через 20-30 минут, бактерии, ранее взвешенные в дисперсионной среде, начинают скапливаться около углеродных фибрилл в виде устойчивых рыхлых скоплений. Примерно за 1 час все бактерии оказываются сосредоточенными около нитей сорбента. Описанная последовательность взаимодействия наблюдалась при работе с разными по морфологическим и физиологическим свойствам бактериями. Это свидетельствует об универсальности сорбента. Важным фактом, обнаруживающимся с помощью фазово-контрастной микроскопии, является то, что сорбция бактерий на фибриллах углеродного сорбента не могла бы быть настолько эффективной, если бы требовала обязательного контакта клеток с поверхностью сорбента. На поверхности фибрилл не может уместиться такое большое количество микробов, какое содержится в расположенных рядом рыхлых скоплениях.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Применение углеродного адсорбента ФАС в медицинской практике /В.В. Гурьянов, В.М. Мухин, Н.М. Бакунина и др. //Актуал. пробл. адсорбц. процессов: Мат IV Всерос/ симп. - М., 1998. - С. 39.

2. Мухин, В.М. Активные угли России /В.М. Мухин, А.В. Тарасов,

B.Н. Клушкин. - М., 2000. - 352 с.

3. Углеродосодержащие адсорбенты как носители для иммобилизованных биологически активных веществ и не растущих бактериальных клеток /Е.В. Кузнецова, ГА. Коваленко, Д.Г. Кувшинов и др. //Тр. 2-го Междунар. сем. «Углеродные адсорбенты». - Кемерово, 2000. - С. 133-136.

La Pape, H. Evaluation of the antimikrobial propererties of an activated carbon fibre supporting silvernsing adinamic metod /Н. La Pape, F. Solano, P. Contini //Carbon. - 2002. - Р. 2947-2954.

Won-Chun, Oh. Physical properties and biological effect of activated carbon fibers treated with the herbs /Won-Chun Oh., Won-Cheoul Yang //Carbon. - 2003. - Р. 1737-1742.

Углеродно-волокнистые сорбенты с катионообменными свойствами /Г.П. Хохлова, И.Я. Петров, С.И. Сенкевич и др. //ХТТ. -1998. - № 1. - С. 49-53.

Фролов, Ю.Г. Разработка методов исследования поверхности углеродных материалов /Ю.Г. Фролов, А.С. Федосеев, С.Г. Авруц-кая. - М., 1987. - 14 с. Рук. деп. в ВИНИТИ, № 32782.

Дерягин, Б.В. Современные методы исследования физико-химических свойств почв /Б.В. Дерягин, М.М. Кусаков. - М.,1948. - С. 128-143. Коротяев, А.И. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология /А.И. Коротяев, С.И. Бабичев. - СПб., 1998. - 880 с. Воюцкий, С.С. Курс коллоидной химии /С.С. Воюцкий. - М., 1964. -

C. 120-121.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

26

№ 3 2пп4 ’Медицина

№ 3 2004 в Кузбассе