Формирование и поддержание специфического клеточного иммунного ответа на вакцинацию приорикс

ВАКЦИНОЛОГИЯ

ЛИТЕРАТУРА

6. Любимов Б.И., Коваленко Л.П., Федосеева В.Н., Иванова А.С., Мастернак Т.Б., Ларин А.С. и др. Методические указания по оценке аллергизирующих свойств фармакологических веществ. В кн.: Миронов А.Н., ред. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. М.: Гриф и К; 2012: 51-63.

REFERENCES

1. Nagatsu T., MogiM., Ichinose H., Togari A. Cytokines in Parkinson’s disease. J. Neural Transmiss. Suppl. 2000; (58): 143-51.

2. Ferrari C., Godoy M., Tarelli R., Chertoff M., Depino A., Pitossi F. Progressive neurodegeneration and motor disabilities induced by chronic expression of IL-1 beta in the substantia nigra. Neuro-biol. Dis. 2006; 24: 183-93.

3. Armentero M.T., Levandis G., Nappi G., Bazzini E., Blandini F. Peripheral inflammation and neuroprotection: systemic pretreatment with complete Freund’s adjuvant reduces 6-hydroxydop-amine toxicity in a rodent model of Parkinson’s disease. Neuro-biol. Dis. 2006; 24: 492-505.

4. Gao H.M., Jiang J., Wilson B., Zhang W., Hong J.S., Liu B. Microglial activation-mediated delayed and progressive degeneration of rat nigral dopaminergic neurons: Relevance to Parkinson’s disease. J. Neurochem. 2002; 81: 1285-97.

5. IravaniM.M., Leung C.C., SedeghianM., Haddon C.O., Rose S., Jenner P. The acute and the long-term effects of nigral lipopoly-saccharide administration on dopaminergic dysfunction and glial cell activation. Eur. J. Neurosci. 2005; 22: 317-30.

6. Lubimov B.I., Kovalenko L.P., Fedoseeva VN., Ivanova A.S., Masternak T.B., Larin A.S. et al. Methodological instructions on assessment of allergenic properties of pharmacological substances. In: Mironov A.N., ed. Guidance on the preclinical study of drugs. Part 1. Moscow: Grif i K; 2012: 51-63 (in Russian).

7. Schallert T., Woodlee M.T. Orienting and placing. In: Whishaw

I.Q., Kolb B., eds. The behavior of the laboratory rat. New York: Oxford University Press; 2005: 129-40.

8. Ivanova E.A., Kapitsa I.G., Valdman E.A., Voronina T.A. The activity of antiparkinsonian drug hemantane in models of peripheral inflammation and lipopolysaccharide-induced neuroinflammation. Adv. Parkinson’s Dis. 2013; 2(1): 11-7.

Поступила 04.04.13

ВАКЦИНОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 615.371.015.46

А.П. Топтыгина1, Е.Л. Семикина2, В.А. Алешкин1

формирование и поддержание специфического клеточного иммунного ответа на вакцинацию приорикс

1Лаборатория цитокинов, ФБУН МНИИЭМ им. ГН. Габричевского, 125212, Москва, Объединенная клиникодиагностическая лаборатория гУ Научный центр здоровья детей РАМН

Двадцать детей (9 мальчиков и 11 девочек) в возрасте от 1 до 2 лет (группа 1) и 20 детей (10 мальчиков и 10 девочек) в возрасте от 6 до 7 лет (группа 2) были привиты (группа 1) или ревакцинированы (группа 2) тривалентной живой аттенуированой вакциной, содержащей вирусы кори, краснухи и эпидемического паротита, - Приорикс. Лимфоциты периферической крови (ЛПК) были изолированы на градиенте плотности до вакцинации, через 1 и 6 нед после и разделены на две части. Первую часть ЛПК окрашивали CFSE и инкубировали в присутствии антигенов вирусов кори или краснухи 8 дней. Вторую часть ЛПК инкубировали при тех же условиях 15 ч и метили CD8 (FITC) и CD107a (РЕ-Су5) антителами. Интенсивность флюоресценции оценивали с помощью проточного цитометра. В группе 1 антигены вирусов кори и краснухи не индуцировали митозов до вакцинации и через неделю после нее, как и в отрицательном контроле, однако через 6 нед более 40% ЛПК демонстрировали антигениндуциро-ванную пролиферацию. Специфическая дегрануляция CD8hi9h-клеток также отсутствовала до вакцинации и через неделю после, но достигала 4-5% через 6 нед после прививки. В группе 2, напротив, до прививки 27-28% ЛПК проходили 1-2 митоза. Через неделю специфическая пролиферация ЛПК снижалась, а через 6 нед достигала 40%. Специфическая CD8high пролиферация была около 2,5% до ревакцинации, повышалась до 3,5-4% через неделю и стабилизировалась на 3% через 6 нед. Показано, что оба использованных нами метода (антигениндуцированная пролиферация и дегрануляция CD8high) способны выявлять антигенспецифические Т-клетки памяти, формирующиеся в ответ на прививку.

Ключевые слова: Т-клетки памяти, специфический клеточный иммунный ответ, дегрануляция CD8high, пролиферативная реакция Т-лимфоцитов

A. P. Toptygina1, Elena L. Semikina2, Vladimir A. Alioshkin1

THE SHAPING AND THE MAINTENANCE OF T- CELL SPECIFIC IMMUNE RESPONSE TO VACCINATION PRIORIX

O.N.Gabrichevsky Institute of Epidemiology and Microbiology, Moscow, Russia Scientific Center of Children’s Health RAMS, Moscow, Russia

Топтыгина Анна Павловна (Toptygina Anna Pavlovna) 8(495) 452-18-01, e-mail: toptyginaanna@rambler.ru; Семикина Елена Леонидовна (Semikina Elena Leonidovna), Алешкин Бладимир Андрианович (Alioshkin Vladimir Andrianovich). 125212, Москва, ул Адм. Макарова 10, МНИИЭМ им. ГН. Габричевского.

- 257 -

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2013

Twenty children aged 1-2 years old (9 boys and 11 girls) - group 1, and 20 children (10 boys and 10 girls) 6-7 years old - group 2 have been vaccinated (group 1) or revaccinated (group 2) with trivalent live attenuated measles, mumps, and rubella vaccine Priorix. Peripheral blood lymphocytes (PBL) were isolated on a gradient of density before vaccination, 1 week, and 6 weeks after and divided into 2 parts. First part of lymphocytes was colored with CFSE. Then PBL were incubated at presence of the measles or rubella viruses antigens for 8 days. Second part of lymphocytes was incubated at the same conditions for 15 hours and was labeled with CD8 (FITC) and CD107a (РЕ-Су5) antibodies. Intensity of a fluorescence estimated by flow cytometr. In group 1, measles or rubella antigens did not induced lymphocytes to enter mitosis, like in negative control, before the vaccination and in a week, however in 6 weeks more than 40% of lymphocytes demonstrated antigen-specific proliferation. Specific degranulation of the CD8high lymphocytes did not be observed before vaccination and in a week, but it was reached 4-5% 6 weeks after vaccination. In group 2, on the contrary, 27-28% of cells passed 2 and more mitoses before the vaccination. In a week specific lymphocyte proliferation decreased and in 6 weeks it was increased up to 40%. Specific CD8high degranulation was about 2,5% before the revaccination, increased up to 3,5-4% in a week, and be stabilized at 3% in 6 weeks. It was shown, that both methods (antigen-induced proliferation and CD8high degranulation) can be applied to revealing the specific cellular immune response to measles and rubella antigens.

Ключевые слова: Т-клетки памяти, специфический клеточный иммунный ответ, дегрануляция CD8h,gh, пролиферативная реакция Т-лимфоцитов

Введение

Активная вакцинация населения против вирусов кори и краснухи, проводимая в рамках программы ВОЗ по ликвидации кори и врожденной краснухи, дала свои результаты. Заболеваемость этими инфекциями начала снижаться [1]. Однако начиная с 2008 г во всем мире начали отмечать появление вспышек кори и что особенно удивительно, в высоко вакцинированных странах, таких как США [2], Австрия [3], Франция [4], Англия [5], Германия [6], Израиль [7] и др. Поэтому особое внимание стали уделять мониторингу привитых лиц. Известно, что после вакцинации 5-10% привитых остаются серонегативными, в то же время при контакте с инфекционными больными такие люди могут не заболеть, так как имеют сформированный специфический клеточный иммунитет, тогда как другие, также серонегативные привитые лица, заболевают, поскольку не имеют специфической клеточной защиты [8].

Для определения специфического клеточного иммунного ответа применяют реакцию торможения миграции лейкоцитов [9]. Недостатком метода является сложность стандартизации и некоторая субъективность в оценке результатов, также существует довольно много дополнительных факторов, способных маскировать результаты. Известен метод оценки секреторной активности клеток путем определения иммуноферментных пятен - ELISPOT [10], однако для этого требуется довольно большой объем крови для исследования (по оценке разных авторов 10-40 мл). Существует метод определения антигенспецифических Т-лимфоцитов с использовнаием МНС-пептидных тетрамеров [11], в этом случае основной проблемой является HLA-рестрикция, т.е. необходимость совпадения HLA тетрамера и пациента; из-за высокой степени полиморфизма системы HLA это весьма затруднительно. Кроме того, создание тетрамеров дорого и требует очень высокой квалификации. Также используют для определения цитолитических CD8+-Т-клеток реакцию специфической дегрануляции [12, 13], например, для оценки эффективности лечения больных меланомой специфической вакциной [14].

Известно, что после перенесенной вирусной инфекции, равно как и после вакцинации, в организме формируются антигенспецифические CD8+-клетки памяти. Эти клетки вооружены лизосомальными гранулами, нагруженными цитолитическими белками. В составе мембран этих гранул присутствует антиген CD107a. При повторной встрече с «причинным» антигеном эти клетки выбрасывают содержимое гранул и экспрессируют на поверхности CD107a. Этот феномен может быть использован в качестве функционального маркера цитолитических CD8+-лимфоцитов, активированных антигеном, однако неизвестно, возможно ли применение этой реакции для оценки специфического клеточного иммунного ответа в отношении антигенов вирусов кори и краснухи.

Целью настоящей работы являлось исследование возможности разных методов оценки клеточного иммунного ответа на антигены вирусов кори и краснухи у детей, привитых против этих инфекций.

Материалы и методы. В 1-ю группу включены 20 детей (9 мальчиков и 11 девочек) в возрасте от 1 года до 2 лет (средний возраст 1 год 3 мес). Эти дети ранее не прививались против кори, краснухи и эпидемического паротита, не болели этими заболеваниями и подлежали плановой вакцинации против этих инфекций. 2-ю группу составили 20 детей (10 мальчиков и 10 девочек) в возрасте от 6 до 7 лет (средний возраст 6 лет 8 мес). Дети этой группы были вакцинированы против кори, краснухи и эпидемического паротита в возрасте 1 года и подлежали ревакцинации согласно календарю прививок. Все дети были привиты вакциной Приорикс (GlaxoSmithKline, Бельгия), содержащей живые вакцинные штаммы вирусов кори, краснухи и эпидемического паротита. Работа была одобрена этической комиссией ФБУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора, родители подписывали информированное согласие на участие детей в программе исследований.

До вакцинации, через 1 и 6 нед после нее проводили забор 5 мл крови из локтевой вены. Фракцию мононуклеаров выделяли методом градиентного центрифугирования. Моно-нуклеары троекратно отмывали в 5 мл среды центрифугированием при 600 g в течение 10 мин. Отмытые мононуклеары делили на две части.

Первую часть мононуклеаров ресуспендировали в 1 мл среды RPMI-1640 c добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина и гентамицина. Жизнеспособность клеток (по данным окрашивания трипа-новым синим) не должна быть ниже 95%. В 3 стерильные пробирки типа эппендорф (объем 1,5 мл) вносили по 50 мкл раствора моненсина (до конечной концентрации 10 мкМ) , суспензии мононуклеаров (106 клеток на пробирку), моноклональных антител к CD107a-РЕ-Су5 (конечное разведение 1:100) и 10 мкл антигенов вирусов кори или краснухи, в контрольную пробирку вместо антигенов вносили 10 мкл среды. Содержимое каждой пробирки однократно перемешивали пипеткой, после чего эппендорфы центрифугировали для осаждения клеток (200g; 1 мин) и инкубировали 15 ч при 37°С в атмосфере 5% CO2 и 100% влажности. После окончания инкубации пробирки еще раз центрифугировали (500g; 1 мин), аккуратно отбирали супернатант и ресуспен-дировали клетки в забуференном фосфатами физиологическом растворе (ЗФР) с добавлением 0,02% азида натрия и 0,02% №2-ЭДТА, затем клетки отмывали и окрашивали FITC-меченными антителами к CD8. Лимфоциты анализировали на проточном цитометре (FACSCalibur, Becton Dickinson, США) с помощью программы CellQuest: в координатах дот-плот отбирали гейт мононуклеаров (R1). В нем в режиме FL-1 выделяли клетки с высокой экспрессией CD8 (R2). Затем на графике дот-плот CD107a-РЕ-Су5 (FL-3) против CD8-FITC (FL-1) регистрировали облако CD107a+CD8high-клеток, которые соответствуют дегранулированным цитотоксическим Т-лимфоцитам. Поскольку количество специфических цитотоксических лимфоцитов к каждой из инфекций не может быть большим в принципе,

- 258 -

ВАКЦИНОЛОГИЯ

необходимо подсчитывать 50-100 тыс. клеток для получения репрезентативных результатов.

Вторую часть мононуклеаров ресуспендировали в 1 мл среды RPMI-1640 без добавления телячьей эмбриональной сыворотки и 2 мМ L-глутамина, но с гентамицином в концентрации 107 клеток/мл. Клетки помещали в стерильную круглодонную пластиковую пробирку (объем 2 мл) и добавляли краситель 5- и 6-карбоксифлюоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфир (cFSE) в концентрации 1 мкг/мл. Лимфоциты инкубировали при 37°С 30 мин. Затем клетки 4-кратно отмывали холодной RPMI-1640, разводили средой RPMI-1640 c добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ L-глутамина и гентамицина до концентрации 2-106 клеток и помещали в лунки 4-луночной панели в объеме 1 мл. Первая лунка являлась отрицательным контролем, во вторую добавляли фитогемагглютинин (ФГА) - поликлональный митоген (5мкг/мл) в качестве положительного контроля, в третью - антигены кори, в четвертую - антигены краснухи. Панель инкубировали 8 сут при 37°С в атмосфере 5% CO2 и 100% влажности. После инкубации клетки отмывали ЗФР и подсчитывали на проточном цитометре. Окрашенные клетки флюоресцируют в зеленой части спектра и измеряются по каналу FL1. Наиболее интенсивно окрашенными являются покоящиеся клетки. Лимфоциты, прошедшие один митоз окрашены в 2 раза меньше, два митоза - в 4 раза меньше и т.д. На гистограмме это представлено в виде отдельных пиков. Таким образом, удается подсчитать количество клеток, вступивших в митоз под действием ФГА, или антигенов вирусов.

Полученные результаты были подвергнуты обработке методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±SE). О достоверности различий средних величин судили по критерию Стьюдента (t). Различия считались значимыми при р < 0,05. Корреляции оценивали с помощью критерия Пирсона. Статистическую обработку полученных данных проводили с применением программы Microsoft Exell.

Результаты и обсуждение

Митогениндуцировнный пролиферативный ответ у привитых детей.

Ответ лимфоцитов периферической крови на ФГА пролиферативной реакцией является стандартным тестом на функциональную активность Т-клеток. На рис. 1, а представлена пролиферативная реакция лимфоцитов периферической крови интактных детей, привитых вакциной Приорикс. Исходно в пролиферацию вступало 57,8±2,3% лимфоцитов. Это вполне понятно, так как ФГА преимущественно стимулирует Т-лимфоциты, а их количество у детей 1-й группы составило 68,7±5,3% от всего пула лимфоцитов. Следовательно, почти все Т-лимфоциты интактных детей отвечали на ФГА. Через 1 нед после вакцинации отмечалось достоверное снижение пролиферативного ответа до 42,9±3,05 (р < 0,01). На рисунке хорошо видно, что эта тенденция в большей или меньшей степени проявилась у всех обследованных детей. Через 6 нед после вакцинации этот показатель значимо повысился и составил 55,8±2,3% (p < 0,01). На рис. 1, б представлена пролиферация лимфоцитов на ФГА у детей, получивших ревакцинацию Приорикс. Среднее количество Т-лимфоцитов у детей 2-й группы составило 66,7±4,9%. Исходный уровень пролиферации оказался на уровне 52,8±3,6%. Через 1 нед после ревакцинации этот показатель понизился до 47,8±4,3% (p > 0,05). На рисунке видно, что 4 ребенка ответили повышением процента пролиферирующих клеток. Через 6 нед после ревакцинации этот показатель значимо повысился до 56,8±2,7% (p < 0,05). Обнаруженный эффект снижения активности митогениндуцированной пролиферации лимфоцитов описан несколькими авторами [15]. Вполне возможно, что этот эффект связан с тем, что клеточным рецептором для вируса кори служит молекула SLAM [16]. Эта молекула экспрессируется на активированных лимфоцитах и необходима для их дальнейшей пролиферации и дифференцировки

лимфоцитов [17]. Вирус кори, проникая в активированные лимфоциты, инфицирует их, что и приводит к наблюдаемому снижению пролиферативной активности клеток.

Специфически индуцированный пролиферативный ответ на антигены вирусов кори и краснухи у интактных и иммунных детей

Лимфоциты детей 1-й группы до вакцинации не отвечали пролиферативной реакцией на добавление в культуру антигенов вирусов кори или краснухи (рис. 2, а). Через 1 нед после вакцинации также не отмечалось пролиферации в ответ на внесение антигенов. Однако через 6 нед после вакцинации получена хорошо выраженная пролиферация, составившая для антигенов вируса кори 43,9±2,5%, а для антигенов вируса краснухи - 42,2±2,6%. Уровень антигениндуцированной пролиферации был значимо ниже митогениндуцированной

(p < 0,01).

У детей 2-й группы, пришедших на ревакцинацию через 5-6 лет после первичной вакцинации, исходно отмечалась пролиферация на антигены вируса кори 27,3±2,4% и вируса краснухи 28,4±2,4% (рис. 2, б). Уровень антигениндуцирован-ной пролиферации у детей 2-й группы до ревакцинации был значимо ниже уровня, полученного у детей 1-й группы через 6 нед после первичной вакцинации (p < 0,01). Это соответствует общим представлениям о том, что со временем количество антигенспецифических для каждого антигена клеток памяти снижается. Однако этот уровень достоверно отличался от фонового уровня пролиферации (p < 0,01). Через 1 нед после

Рис. 1. Пролиферативная реакция на ФГА лимфоцитов периферической крови детей, привитых вакциной приорикс.

Здесь и на рис. 2-3: а - 1-я группа, б - 2-я группа.

По оси абсцисс - время после вакцинации Приориксом, нед; по оси ординат - процент клеток, вступивших в митоз. Линейными графиками показана пролиферация у каждого ребенка индивидуально. Серые столбики - средние значения по группе.

- 259 -

ИММУНОЛОГИЯ № 5, 2013

70 1 605040

зо-

20-

10

0

70 п

*

1 2 3

ФГА

1 2 3 Агкорь

1 2 3 Аг краснуха

ФГА

1 2 3

Аг корь

т

1 2 3

1

Аг краснуха

Рис. 2. Антигениндуцированная пролиферация лимфоцитов периферической крови детей, привитых вакциной приорикс.

По оси абсцисс - индукторы пролиферации; по оси ординат - процент клеток, вступивших в митоз. Черные столбики - до вакцинации (M ± SE), белые столбики - через 1 нед после вакцинации (M ± SE), серые столбики - через 6 нед после вакцинации (M ± SE).

ревакцинации у детей 2-й группы обнаружено значимое снижение по сравнению с исходным пролиферативного ответа как на антигены вируса кори - 15,1±3,2% (p < 0,05), так и на антигены вируса краснухи - 16,3±2,8% (р < 0,05). Аналогичную динамику мы обнаружили в пролиферативном ответе на ФГА (см. выше). Через 6 нед после ревакцинации выявлено значимое по сравнению с исходным повышение уровня пролиферации как на антигены вируса кори, составившее 39,4±3,5% (p < 0,01), так и на антигены вирусов краснухи - 40,2±3,6% (р < 0,01). Уровень специфически индуцированной пролиферации, достигнутый через 6 нед после введения вакцины у детей 1-й и 2-й групп, не различался ни по индукции антигенами кори, ни краснухи.

Специфически индуцированная дегрануляция цитотоксических клеток памяти

Спонтанный уровень дегрануляции CD8high-лимфоцитов как в 1-й, так и во 2-й группах не превышал 1%. Однако у детей 2-й группы отмечалось значимое (р < 0,05) повышение спонтанной дегрануляции CD8high через 1 и 6 нед после введения вакцины по сравнению с исходным уровнем (рис. 3).

Антигениндуцированная дегрануляция CD8high-клеток у детей 1-й группы как до вакцинации, так и через 1 нед после нее не отличалась от спонтанного уровня (рис. 3, а). Через 6 нед после вакцинации обнаружено значимое повышение количества дегранулировавших CD8high-лимфоцитов как при добавлении антигенов вируса кори - 4,11 ±0,24% (p < 0,001), так и в ответ на антигены вируса краснухи - 5,2 ±0,37% (p < 0,001). Следует подчеркнуть, что полученные, казалось бы невысокие значения, на самом деле очень весомы, так как в общем пуле специфических цитотоксических Т-клеток памяти лимфоциты, специфичные к каждому конкретному антигену, занимают лишь малую долю популяции.

Рис. 3. Антигениндуцированная дегрануляция С081ив11-лимфоцитов периферической крови детей, привитых вакциной приорикс.

По оси абсцисс - индукторы пролиферации; по оси ординат - процент СБВ^-клеток, экспрессирующих CD107a. Черные столбики - до вакцинации (M ± SE), белые столбики - через 1 нед после вакцинации (M ± SE), серые столбики - через 6 нед после вакцинации (M ± SE).

Исходный уровень специфической дегрануляции CD8high-клеток у детей 2-й группы через 5-6 лет после первичной вакцинации был значимо ниже, чем у детей 1-й группы через 6 нед после прививки и составил 2,27 ±0,23% в ответ на внесение антигенов вируса кори (p < 0,01) и 2,96 ±0,19% на антигены вируса краснухи (p < 0,01). Оба показателя были значимо выше соответствующего уровня спонтанной дегрануляции (p < 0,01 для обоих случаев). Через 7 дней после ревакцинации обнаружено значимое повышение процента дегранулировавших СБ8ыв1-клеток как в ответ на антигены вируса кори - 3,31 ±0,33% (p < 0,05), так и на антигены вируса краснухи - 4,21 ±0,30% (p < 0,05). Через 6 нед после ревакцинации выявлена тенденция снижения процента дегрануляции. Если при добавлении антигенов вируса кори этот показатель еще отличался от исходного уровня, составляя 3,11 ±0,18% (p = 0,047), то в ответ на антигены вируса краснухи различия с исходным уровнем теряли значимость - 3,35 ±0,21% (p = 0,144).

Таким образом, в результате нашей работы удалось показать, что оба использованных нами метода способны выявлять антигенспецифические Т-клетки памяти, формирующиеся в ответ на прививку. Оба метода показали отрицательные результаты у всех интактных детей. Это позволяет исключить неспецифическую активацию лимфоцитов. Оба метода выявили наличие антигенспецифических Т-лимфоцитов через 6 нед после вакцинации. Следует отметить, что срок в 6 нед выбран не случайно. В модельных экспериментах мы показали, что в более ранние сроки, например через 3 и 4 нед после вакцинации, не удается получить отчетливый прирост показателей. Мы полагаем, что на ранних сроках искомые клетки уже сформировались, но еще не появились в достаточном количестве в кровотоке. В более поздние сроки - через 2 и 3 мес также

- 260 -

ВАКЦИНОЛОГИЯ

обнаруживается достоверно повышенный процент лимфоцитов как в тесте антигениндуцированной пролиферации, так и в тесте специфически индуцированной дегрануляции CD8Mgh-клеток. Оба метода выявили наличие антигенспецифичных Т-клеток в организмах детей даже спустя 5-6 лет после первичной вакцинации, хотя и в меньшем количестве, чем было обнаружено через 1,5 мес после прививки. Это свидетельствует в пользу того, что Т-клетки памяти, сформированные после однократного введения вакцины, поддерживаются в организме многие годы. Спустя 1 нед после ревакцинации выявлены различия между исследуемыми тестами. Если пролиферативная реакция как на специфические, так и на неспецифические индукторы снижалась, то дегрануляция - повышалась. Это связано, по-видимому, с функциональными особенностями каждого теста. Тем не менее, через 6 нед оба теста выявили повышение количества позитивно реагирующих клеток, что, очевидно, связано с бустер-эффектом.

Поскольку исследуемые тесты основываются на разных функциях лимфоцитов (пролиферация и дегрануляция), мы исследовали корреляцию между результатами, полученными этими двумя методами. Так, в 1-й группе выявлена положительная тесная корреляция как для коревых антигенов, r = 0,779 (p < 0,01), так и для антигенов вирусов краснухи, r = 0,846 (p < 0,01). Через 5 лет после первичной вакцинации, но до ревакцинации у детей 2-й группы, эти коэффициенты составили r = 0,314 (p > 0,05) для кори и r = 0,239 (р > 0,05) для краснухи. Однако после ревакцинации эти показатели вновь повысились до r = 0,648 (p < 0,05) и r = 0,681 (p < 0,05) для вирусов кори и краснухи соответственно. Следует отметить, что тест специфически индуцируемой пролиферации лимфоцитов проводился на всей лимфоидной популяции без разделения на Т- и В-лимфоциты или на CD4+- и CD8+-Т-клетки, тогда как тест специфически индуцированной дегрануляции проводился только на CD8+-Т-лимфоцитах. Возможно именно с этим связаны колебания в коэффициентах корреляции, наблюдаемые на разных сроках после вакцинации. Несмотря на то что оба теста хорошо зарекомендовали себя, мы полагаем, что тест дегрануляции CD8high-клеток имеет серьезные преимущества. Во-первых, этот тест демонстрирует антигенспецифическую активацию конкретно цитотоксических Т-клеток памяти (CD8high), а не всей популяции лимфоцитов как это происходит в тесте индукции пролиферации. Во-вторых, тест дегрануляции требует инкубации 15 ч (одна ночь), а для специфической индукции пролиферации требуется 8 сут. В-третьих, последовательное гейтирование и подсчет CD107a+CD8high являются вполне рутинной для цитометриста процедурой, тогда как для анализа пиков пролиферативной активности требуются некоторые навыки и последующие расчеты. В настоящий момент нет единого, принятого всеми исследовательскими группами, метода оценки специфического Т-клеточного иммунного ответа, как, например, иммуноферментный метод для измерения количества специфических антител. Мы полагаем, что тест специфической индукции дегрануляции CD8high-клеток мог бы быть предложенным в качестве такого относительно простого не требующего особой квалификации и дорогостоящего оборудования и весьма информативного теста.

ЛИТЕРАТУРА

13. Пащенков М.В., Муругина Н.Е., Муругин Б.В., Пинегин Б.В.

Выявление и характеризация цитолитических CD8+- и CD4+-

Т-клеток. Иммунология. 2010; 31: 4-12.

REFERENCES

1. Strebel P.M., Henao-Restrepo A.M., Hoekstra E., Olive J.M., Papania M.J. Cochi S.L. Global measles elimination efforts: the significance of measles elimination in the United States. J. Infect. Dis. 2004; 189 (Suppl. 1): 251-7.

2. Sugerman D.E., Barskey A.E., Delea M.G., Ortega-Sanchez I.R., Bi D., Ralston K.J. et al. Measles outbreak in a highly vaccinated population, San Diego, 2008: role of the internationally undervaccinated. Pediatrics. 2010; 125: 747-55.

3. Kasper S., Holzmann H., Aberle S.W., Wassermann-Neuhold M., Gschiel H., Feenstra O. et al. Measles outbreak in Styria, Austria, March-may 2009. Euro Surveill. 2009; 14: 19347.

4. Parent du Chatelet I., FloretD., Antona D., Levy-BruhlD. Measles resurgence in France in 2008 preliminary report. Euro Surveill. 2009; 14: 19118.

5. Eaton L. Measles cases in England and Wales rise sharply in 2008. BMJ. 2009; 338: b533.

6. Batzing-Feigenbaum J., Pruckner U., Beyer A., Sinn G., Dinter

A. , MankertzA. et al. Spotlight on measles 2010: preliminary report of an ongoing measles outbreak in a subpopulation with low vaccination coverage in Berlin, Germany, January-March 2010. Euro Surveill. 2010; 15: 19527.

7. Anis E., Grotto I., Moerman L. Warshavsky B., Slater P.E., Lev

B. et al. Measles in a highly vaccinated society: the 2007-08 outbreak in Israel. J. Infect. 2009; 59: 252-8.

8. Orenstein W.A., Strebel P.M., Papania M., Sutter R.W., Bellini W.J., Cochi S.L. Measles eradication: is it in our future? Am L Public Health. 2000; 90: 1521-5.

9. Rodriguez-Sosa M., Rosas L.E., David J.R., Bojalil R., Satoskar A.R., Terrazas L.I. Macrophage Migration Inhibitory Factor plays a critical role in mediating protection against the helminth parasite taenia crassiceps. Infect. Immun. 2003; 71: 1247-54.

10. Scheibenbogen C., Romero P., Rivoltini L. Herr W., SchmittelA., Cerottini J.C. et al. Quantitation of antigen-reactive T cells in peripheral blood by IFNgamma-ELISPOT assay and chromium-release assay: a four-centre comparative trial. J. Immunol. Methods. 2000; 244: 81-9.

11. Altman J.D., Moss P.A., Goulder P.J. Barouch D.H., McHeyzer-Williams M.G., Bell J.I. et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science 1996; 274: 94-6.

12. Betts M.R., Brenchley J.M., Price D.A., De Rosa S.C., Douek D.C., Roederer M. et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation. J. Immunol. Methods. 2003; 281: 65-78.

13. Pashenkov M.V., Murugina N.E., Murugin V.V., Pinegin B.V Detection and characterization of cytolytic CD8+ and CD4+ T cells. Immunology Russ. 2010; 31: 4-12.

14. Rubio V., Stuge T.B., Singh N., Betts M.R., Weber J.S., Roederer

M. et al. Ex vivo identification, isolation and analysis of tumor-cytolytic T cells. Nat. Med. 2003; 9: 1377-82.

15. Salonen R., Nonen J., Salmi A.A. Measles virus inhibits lymphocytes proliferation in vitro by two different meckanisms. Clin. Exp. Immunol. 1989; 75: 376-80.

16. Erlenhoefer C., Wurzer W.J., Loffler S., Schneider-Schaulies S., ter Meulen V., Schneider-Schaulies J. CD150 (SLAM) is a receptor for measles virus but is not involved in viral contact-mediated proliferation inhibition J. Virol. 2001; 75: 4499-505.

17. Wang N., Satoskar A., Faubion W., Howie D., Okamoto S., Feske

S. et al. The cell surface receptor SLAM controls T cell and macrophage functions. J. Exp. Med. 2004; 199: 1255-64.

Поступила 20.02.13

- 261 -