СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АСТАКСАНТИНА ПУТЕМ ФЕРМЕНТАЦИИ
METHOD OF PRODUCING ASTAXANTHIN BY FERMENTATION

Область, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу получения каротиноидов, включая астаксантин, путем ферментации микроорганизмов.
Предшествующий уровень техники
Каротиноиды представляют собой природные пигменты, которые могут быть использованы в качестве кормовых добавок, пищевых добавок, фармацевтических средств и т.п. Примерами каротиноидов являются астаксантин, кантаксантин, зеаксантин, β-криптоксантин, ликопен, β-каротин, феникоксантин, адониксантин, эхиненон, астероиденон и 3-гидроксиэхиненон.
Из этих каротиноидов, астаксантин используется в качестве пищевых добавок, например, в качестве агента, улучшающего окраску искусственно разводимых рыб, таких как лосось, форель и морской лещ, или в качестве агента, улучшающего окраску желтка яиц домашней птицы. Кроме того, астаксантин является в высокой степени ценным сырьем для производства безопасных натуральных пищевых добавок и диетического питания.
Очевидно, что адониксантин и феникоксантин также, как и астаксантин, могут быть использованы в качестве кормовых добавок, пищевых добавок, фармацевтических средств и т.п. после того, как будут разработаны способы их промышленного производства. β-Каротин используется в качестве кормовых добавок, пищевых добавок, фармацевтических средств и т.п.; кантаксантин используется в качестве кормовых добавок, пищевых добавок, косметических средств и т.п., а зеаксантин используется в качестве пищевых добавок, кормовых добавок и т.п. Кроме того, в качестве кормовых добавок, пищевых добавок и т.п. могут быть также использованы и другие каротиноиды, такие как ликопен, эхиненон, β-криптоксантин, 3-гидроксиэхиненон и астероиденон. Известными методами получения таких каротиноидов являются методы химического синтеза, методы экстракции из природных источников и методы продуцирования с использованием микроорганизмов.
Известными методами химического синтеза астаксантинов являются метод превращения β-каротина (непатентный документ 1) и метод синтеза из соли C15-фосфония (непатентный документ 2). Астаксантин, продуцируемый указанными методами химического синтеза, выпускаются промышленностью в качестве кормовой добавки. Кроме того, поскольку астаксантин присутствует у рыб, таких как морской лещ и лосось, а также у ракообразных, таких как креветки, крабы и криль, то указанный астаксантин может быть также экстрагирован из указанных организмов.
Описанными в литературе методами получения астаксантина с использованием микроорганизмов являются метод культивирования с использованием зеленых водорослей Haematococcus pluvialis (патентный документ 1), метод ферментации с использованием красных дрожжей Phaffia rhodozyma (патентный документ 2) и метод ферментации с использованием бактерий, принадлежащих к роду Paracoccus (иногда называемых здесь «бактериями Paracoccus»).
Примерами астаксантин-продуцирующих бактерий Paracoccus являются штаммы E-396 и A-581-1 (патентный документ 3 и непатентный документ 3). Примерами других астаксантин-продуцирующих бактерий Paracoccus являются штамм MH1 Paracoccus marcusii (патентный документ 4), штамм BC74171 Paracoccus haeundaensis (непатентный документ 4), бактериальный штамм N-81106 Paracoccus (патентный документ 5) и штамм PC-1 Paracoccus sp. (патентный документ 6).
Вышеупомянутые методы продуцирования каротиноидов имеют ряд недостатков. Так, например, применение методов химического синтеза вызывают некоторое беспокойство у потребителей с точки зрения их безопасности. Экстракция из природных источников, таких как креветки и крабы, требует значительных производственных затрат. Кроме того, производство с использованием зеленых водорослей или дрожжей является низкопродуктивным и сталкивается с проблемами, связанными с экстракцией каротиноидов из этих водорослей или дрожжей и обусловленными большой плотностью клеточных стенок.
В связи с этим следует отметить, что бактерии, принадлежащие к роду Paracoccus, имеют те преимущества, что они быстро размножаются и дают высокий выход каротиноидов, и эти каротиноиды могут быть легко экстрагированы из указанных бактерий и т.п. В литературе описано несколько методов культивирования этих бактерий. Так, например, в патентном документе 7 описан метод, проводимый путем добавления соли железа во время культивирования. В патентном документе 8 описан метод, проводимый путем ограничения концентрации источника углерода. Однако, такие методы культивирования связаны с определенными проблемами, заключающимися в том, что во время продуцирования астаксантина наблюдается накопление больших количеств кантаксантина.
Кантаксантин может быть использован в качестве кормовой добавки для улучшения цветового оттенка мяса лосося и куриного яичного желтка, причем, в Европе, его ADI (допустимое суточное потребление) ограничено количеством 0,03 мг/кг массы тела, а верхние пределы количества кантаксантина, приемлемые для включения в корм, предположительно составляют 25 мг/кг и 8 мг/кг для лосося и кур-несушек, соответственно (непатентный документ 5). Таким образом, при продуцировании астаксантина с использованием микроорганизмов, необходимо поддерживать содержание кантаксантина на низком уровне. В патентном документе 9 описан метод, в котором уровень продуцирования кантаксантина снижают путем регуляции концентрации растворенного кислорода. Однако, такой метод также дает значительное снижение концентрации продуцируемого астаксантина, а поэтому он является нерациональным с точки зрения производственных затрат.
Список цитируемой лителатуры
Патентная литература
Патентный документ 1: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 2007-97584 A
Патентный документ 2: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 11-69969 A (1999)
Патентный документ 3: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 7-79796 A (1995)
Патентный документ 4: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 2001-512030 A
Патентный документ 5: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 2007-244205 A
Патентный документ 6: WO 2005/118812
Патентный документ 7: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 2007-143492 A
Патентный документ 8: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 2008-167665 A
Патентный документ 9: Публикация выложенной заявки на патент Японии No. 2001-352995 A
Непатентная литература
Непатентный документ 1: Erich Widmer et al., «Pure Appl. Chem.» 1985, vol. 57, pp. 741-752.
Непатентный документ 2: Erich Widmer et al., «Helv. Chim. Acta» 1981, vol. 64, pp. 2436-2446.
Непатентный документ 3: Akira Tsubokura et al., «International Journal of Systematic Bacteriology», 1999, vol. 49, pp. 277-282.
Непатентный документ 4: Jae Hyung Lee et al., «International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology», 2004, vol. 54, pp. 1699-1702.
Непатентный документ 5: Official Journal of the European Communities L 22/28-30, 25.1,2003.
Описание сущности изобретения
Проблемы, которые могут быть решены с применением настоящего изобретения
Настоящее изобретение было создано в целях решения вышеизложенных проблем. Целью настоящего изобретения является разработка способа микробиологического продуцирования астаксантина в высокой концентрации при низких материальных затратах и с пониженным уровнем продуцирования кантаксантина.
Способы решения таких проблем
В результате проведения крупномасштабных исследований для достижения вышеупомянутой цели, авторами настоящего изобретения было обнаружено, что продуцирование астаксантина в высокой концентрации может быть достигнуто при сохранении концентрации продуцируемого кантаксантина на низком уровне путем добавления биотина в среду во время культивирования бактерии, которая одновременно продуцирует астаксантин и кантаксантин. Этот вывод был положен в основу осуществления настоящего изобретения.
Настоящее изобретение включает притязания по следующим пунктам:
(1) Способ продуцирования каротиноидов, в том числе и астаксантина, включающий культивирование бактерии, которая одновременно продуцирует астаксантин и кантаксантин, в среде, содержащей биотин, где отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования в этой среде, является более низким, чем соответствующее отношение в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования в среде, не содержащей биотина.
(2) Способ по п.(1), где концентрация биотина в среде составляет 0,001 мг/л - 50 мг/л.
(3) Способ по п.(1), где отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, составляет 25% масс. или менее.
(4) Способ по п.(1), где концентрация продуцируемой глюконовой кислоты в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, составляет 30 г/л или менее.
(5) Способ по п.(1), где концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования составляет 1 м.д. или более и поддерживается на этом уровне в процессе всего культивирования.
(6) Способ по п.(1), где содержание поли-β-гидроксибутирата (далее обозначаемого «PHB») в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, в расчете на сухие клетки, составляет 30% масс. или менее.
(7) Способ по п.(1), где концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования составляет 1 м.д. или более и поддерживается на этом уровне в процессе всего культивирования, а отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, составляет 25% масс. или менее.
(8) Способ по п.(1), где концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования составляет 2 м.д. или более и поддерживается на этом уровне в процессе всего культивирования, а отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, составляет 8% масс. или менее.
(9) Способ по п.(1), где концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования увеличивается постадийно или непрерывно в процессе культивирования.
(10) Способ по п.(1), где исходная концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования поддерживается на уровне 1-2,5 м.д. в промежуточной фазе культивирования, а концентрация растворенного кислорода увеличивается постадийно или непрерывно, и где отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, составляет 25% масс. или менее.
(11) Способ по п.(1), где исходная концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования поддерживается на уровне 2-3,5 м.д. в промежуточной фазе культивирования, а концентрация растворенного кислорода увеличивается постадийно или непрерывно, и где отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, составляет 8% масс. или менее.
(12) Способ по п.(1), где указанной бактерией является бактерия, принадлежащая к роду Paracoccus.
(13) Способ по п.(1), где указанной бактерией является мутантный штамм, обладающий пониженной способностью к продуцированию PHB.
(14) Способ по п.(1), где указанной бактерией является мутантный штамм, обладающий пониженной способностью к продуцированию глюконовой кислоты.
(15) Способ по п.(1), где указанной бактерией является бактерия, в которой нуклеотидная последовательность ДНК, соответствующая последовательности рибосомной РНК 16S, по существу гомологична нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:1.
(16) Способ по п.(15), где указанной бактерией является бактерия штамма E-396 (FERM BP-4283) или A-581-1 (FERM BP-4671) или их мутантного штамма.
(17) Каротиноидная композиция для приготовления корма, содержащая каротиноиды, включая астаксантин, и полученная способом по п.(1), где отношение концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина в продуцируемых каротиноидах составляет 25% масс. или менее.
(18) Каротиноидная композиция для приготовления корма по п.(17), где содержание PHB в продуцируемых каротиноидах, включая астаксантин, составляет 30% масс. или менее.
(19) Каротиноидная композиция для приготовления пищевого продукта, содержащая каротиноиды, включая астаксантин, и полученная способом по п.(1), где отношение концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина в продуцируемых каротиноидах составляет 8% масс. или менее.
Настоящее изобретение включает составную часть или все содержание и/или графический материал заявки на патент Японии No. 2010-057321, которая представляет собой приоритетный документ настоящей заявки.
Эффекты настоящего изобретения
В соответствии с настоящим изобретением, астаксантин в высокой концентрации может быть получен недорогостоящими методами микробиологии, которые позволяют поддерживать концентрацию кантаксантина на низком уровне. Каротиноиды, полученные в настоящем изобретении, могут быть использованы в качестве кормовых и пищевых продуктов.
Варианты осуществления настоящего изобретения
Более подробное описание настоящего изобретения приводится ниже. Объем настоящего изобретения не ограничивается приведенным ниже описанием и проиллюстрированными вариантами его осуществления, и в него могут быть внесены соответствующие изменения, не выходящие за рамки существа изобретения.
Настоящее изобретение относится к способу продуцирования каротиноидов, включая астаксантин, путем культивирования бактерии, которая одновременно продуцирует астаксантин и кантаксантин (иногда называемой далее «каротиноид-продуцирующей бактерией» или «астаксантин-продуцирующей бактерии») в среде, содержащей биотин (этот способ далее называется «способом согласно изобретению»). В соответствии со способом настоящего изобретения, отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования в среде, содержащей биотин, является более низким, чем соответствующее отношение в продукте культивирования, полученном с использованием аналогичной каротиноид-продуцирующей бактерии, после завершения культивирования в среде, не содержащей биотина. В соответствии со способом согласно изобретению, астаксантин в высокой концентрации может быть продуцирован недорогостоящим методом, заключающимся в добавлении биотина в среду и снижении концентрации продуцируемого кантаксантина.
Бактерией, используемой в способе согласно изобретению, является любая бактерия при условии, что она будет одновременно продуцировать астаксантин и кантаксантин. Однако, предпочтительно, использовать бактерии, принадлежащие к роду Paracoccus. Из бактерий, принадлежащих к роду Paracoccus, предпочтительно использовать Paracoccus carotinifaciens, Paracoccus marcusii и Paracoccus haeundaensis, а наиболее предпочтительно, Paracoccus carotinifaciens. Конкретными примерами бактериальных штаммов, принадлежащих к роду Paracoccus, являются бактериальный штамм Paracoccus carotinifaciens E-396 (FERM BP-4283) и бактериальный штамм Paracoccus A-581-1 (FERM BP-4671) (патентный документ 3 и непатентный документ 3). Эти бактериальные штаммы могут быть также предпочтительно использованы в способе согласно изобретению.
В качестве бактерии, продуцирующей каротиноид, предпочтительно использовать бактерию, в которой нуклеотидная последовательность ДНК, соответствующая рибосомной РНК 16S, по существу, гомологична нуклеотидной последовательности E-396, представленной в SEQ ID NO:1. Используемый здесь термин «по существу, гомологичные» означает, что нуклеотидные последовательности, после секвенирования ДНК, являются гомологичными предпочтительно на 95% или более, более предпочтительно, на 96% или более, еще более предпочтительно, на 97% или более, еще более предпочтительно, на 98% или более, а наиболее предпочтительно, на 99% или более и т.п., с учетом частоты встречаемости ошибок. Гомология может быть определена, например, с помощью компьютерной программы для анализа генов Clustal W.
Выражение «нуклеотидная последовательность ДНК, соответствующая последовательности рибосомной РНК 16S» означает нуклеотидную последовательность, полученную путем замены U (урацила) в этой нуклеотидной последовательности рибосомной РНК 16S основанием T (тимином).
В последнее время, классификация микроорганизмов на основе гомологии нуклеотидной последовательности рибосомной РНК 16S становится ведущим направлением. Поскольку стнадартная классификация микроорганизмов основана на общеизвестных микологических свойствах, таких как подвижность, ауксотрофия и утилизация сахаров, то в случае изменения их свойств, обусловленного спонтанной мутацией или т.п., микроорганизмы могут быть неправильно классифицированы. С другой стороны, нуклеотидные последовательности рибосомной РНК 16S являются достаточно стабильными на генетическом уровне, а поэтому классификация на основе их гомологии, по сравнению со стандартными методами классификации, является значительно более надежной.
Гомология между нуклеотидной последовательностью рибосомной РНК 16S штамма Paracoccus carotinifaciens E-396 и нуклеотидными последовательностями рибосомных РНК 16S других бактерий, продуцирующих каротиноид, то есть, штамма Paracoccus marcusii DSM 11574 (International Journal of Systematic Bacteriology (1998), 48, 543-548), бактериального штамма Paracoccus N-81106 (патентный документ 5), штамма Paracoccus haeundaensis BC 74171 (непатентный документ 4), бактериального штамма Paracoccus A-581-1, и штамма Paracoccus sp. PC-1 (патентный документ 6) составляет 99,7%, 99,7%, 99,6%, 99,4% и 95,4%, соответственно, что указывает на то, что эти штаммы являются в наивысшей степени близкородственными по своей таксономии. В соответствии с этим, указанные штаммы могут рассматриваться как одна группа бактерий, продуцирующих каротиноид. Таким образом, эти бактериальные штаммы могут быть, предпочтительно, использованы в способе согласно изобретению для эффективного продуцирования астаксантина.
В соответствии со способом настоящего изобретения, могут быть также использованы мутантные штаммы, обладающие повышенной способностью продуцировать астаксантин. Примерами таких мутантных штаммов являются штаммы, описанные в публикации выложенной заявки на патент Японии No. 2001-95500 A, и штаммы, описанные в патентном документе 9.
Альтернативно, мутантные штаммы, обладающие повышенной способностью продуцировать астаксантин, могут быть получены путем введения мутаций и скрининга. Метод введения мутаций не имеет ограничений, при условии, что он будет обеспечивать индуцирование мутации. Так, например, могут быть применены химические методы с использованием мутагена, такого как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG) или этилметансульфонат (EMS); физические методы, такие как облучение ультрафиолетом и облучение рентгеновскими лучами, и биологические методы, такие как рекомбинация генов и введение транспозона. Кроме того, мутантными штаммами могут быть штаммы, образующиеся благодаря природной мутации. Что касается свободного доступа или безопасности микроорганизма для исследований, то предпочтительно, использовать микроорганизм, который не является генетически рекомбинантным.
Способ скрининга мутантного штамма, имеющего повышенную способность продуцировать астаксантин, не имеет конкретных ограничений, и таким методом может быть, например, метод, в котором представляющий интерес мутантный штамм выбирают в соответствии с цветовым оттенком колонии на агаровой среде, или метод, в котором мутантный штамм культивируют в тест-пробирке, в колбе, в ферментере или т.п., и метод, в котором представляющий интерес мутантный штамм выбирают в соответствии с анализом на каротиноидный пигмент, проводимом с помощью абсорбционной хроматографии, высокоразрешающей жидкостной хроматографии, тонкослойной хроматографии или т.п.
Такие стадии введения мутации и скрининга могут быть осуществлены один раз, либо они могут быть повторены два или более раз; так, например, мутантные штаммы могут быть получены путем мутагенеза и скрининга, а затем они могут быть дополнительно подвергнуты другому способу введения мутаций и скрининга, в результате чего может быть получен мутантный штамм, обладающий повышенной способностью продуцировать астаксантин.
В способе согласно изобретению может быть использован мутантный штамм, обладающий пониженной способностью продуцировать PHB (поли-β-гидроксибутират). Так, например, такой мутантный штамм может быть получен из бактериального штамма Paracoccus E-396 или A-581-1, описанных выше, или т.п. Известно, что бактерии, продуцирующие астаксантин, накапливают PHB внутри клеток в качестве запасного источника углерода. Аккумуляция РНВ приводит к дефициту источника углерода в среде. Таким образом, для снижения производственных затрат, предпочтительно, минимизировать аккумуляцию PHB. То есть, желательно получить такой мутантный штамм, который аккумулировал бы небольшое количество PHB или вообще не аккумулировал бы PHB при введении мутации и при скрининге. Конкретным примером способа получения штамма, характеризующегося низким уровнем продуцирования РНВ, является способ, в котором осуществляют введение мутации как описано выше; затем каждый мутантный штамм культивируют в тест-пробирке, в колбе, в агаровой среде или т.п., после чего определяют количество PHB, и отбирают мутантный штамм, характеризующийся низким уровнем продуцирования РНВ.
В способе согласно изобретению может быть также использован мутантный штамм, обладающий пониженной способностью продуцировать глюконовую кислоту. Так, например, такой мутантный штамм может быть получен из бактериального штамма Paracoccus E-396 или A-581-1, описанных выше, или т.п. При продуцировании глюконовой кислоты происходит истощение источника углерода в среде. Кроме того, аккумуляция большого количества глюконовой кислоты приводит к ингибированию роста бактерий или продуцирования каротиноидов. Таким образом, для продуцирования каротиноидов, желательно минимизировать продуцирование глюконовой кислоты. Конкретным примером способа получения штамма, характеризующегося низким уровнем продуцирования глюконовой кислоты, является способ, в котором осуществляют введение мутации как описано выше, затем каждый мутантный штамм культивируют в тест-пробирке, в колбе или т.п., и определяют рН каждой полученной культутральной жидкости для отбора мутантных штаммов с подтвержденным небольшим снижением значения рН в культуральной жидкости, после чего определяют количество глюконовой кислоты в культуральной жидкости каждого отобранного мутантного штамма, и, наконец, отбирают мутантный штамм, характеризующийся низким уровнем продуцирования глюконовой кислоты.
Мутантные штаммы, которым необходимо сообщить предпочтительные свойства, такие как мутантный штамм, обладающий повышенной способностью продуцировать астаксантин, мутантный штамм, обладающий пониженной способностью продуцировать РНВ, и мутантный штамм, обладающий пониженной способность продуцировать глюконовую кислоту, описанные выше, могут быть получены отдельно. Альтернативно, введение мутации и скрининг могут быть проведены повторно с получением мутантного штамма, имеющего два или более из указанных свойств. Может быть также получен мутантный штамм, которому два или более свойства были одновременно сообщены с применением комбинации из двух или более методов скрининга с введением одной мутации. В способе согласно изобретению может быть также использован мутантный штамм, имеющий два или более предпочтительных свойства.
Штамм E-396, представляющий собой каротиноид-продуцирующую бактерию, используемую в способе согласно изобретению, был депонирован как международный депозит в Международном депозитарии патентованных микроорганизмов (IPOD), в Национальном институте передовых промышленных наук и технологий (AIST) и в депозитариях, указанных ниже.
Международная ассоциация депозитариев:
Международный депозитарий патентованных микроорганизмов (IPOD), Национальный институт передовых промышленных наук и технологий (AIST) (бывший Национальный институт биологических наук и технологий, Комитет по научно-техническим исследованиям, Министерство международной торговли и промышленности)
Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, 305-8566, Japan
Идентификационный номер: E-396
Регистрационный номер №: FERM BP-4283
Дата исходного депозита: 27 апреля, 1993.
Штамм A-581-1, представляющий собой каротиноид-продуцирующую бактерию, используемую в способе согласно изобретению, был депонирован как международный депозит, в соответствии с авторизацией, описанной ниже.
Идентификационный номер: A-581-1
Регистрационный номер №: FERM BP-4671
Дата исходного депозита: 20 мая, 1994.
Примерами каротиноидов, не являющихся астаксантином и кантаксантином, и полученных в способе согласно изобретению, являются, но не ограничиваются ими, адониксантин, феникоксантин, β-каротин, эхиненон, астероиденон, 3-гидроксиэхиненон, зеаксантин, β-криптоксантин и ликопен. Предпочтительными примерами являются адониксантин и адонирубин. Каротиноид одного типа или комбинация каротиноидов многих типов могут быть получены способом согласно изобретению.
Ниже также описан метод культивирования вышеописанных бактерий, применяемый в способе согласно изобретению. Используемый здесь термин «продукт культивирования» не ограничивается культуральной жидкостью, и в объем этого термина могут входить твердое вещество, полутвердое вещество или т.п.
Средой для продуцирования астаксантина, используемого для культивирования в способе согласно изобретению, может быть любая среда, при условии, что она содержит биотин и способствует росту астаксантин-продуцирующей бактерии, а также продуцированию астаксантина. Предпочтительно использовать среду, содержащую источник углерода, источник азота, неорганическую соль, и если это необходимо, витамин или т.п. То есть, в соответствии со способом согласно изобретению, биотин добавляют в среду, которая способствует росту астаксантин-продуцирующей бактерии и продуцированию астаксантина.
Примерами источников углерода являются: сахара, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, трегалоза, манноза, маннит и мальтоза; органические кислоты, такие как уксусная кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота, пропионовая кислота, яблочная кислота, малоновая кислота и пировиноградная кислота; спирты, такие как этанол, пропанол, бутанол, пентанол, гексанол, изобутанол и глицерин; а также масла и жиры, такие как соевое масло, масло из рисовых отрубей, оливковое масло, кукурузное масло, кунжутное масло и льняное масло, при этом, предпочтительными являются глюкоза или сахароза. Так, например, могут быть использованы один или несколько типов указанных источников углерода. Количество источников углерода, добавляемых в предкультуральную среду (исходную среду) может варьироваться в зависимости от типа источника углерода, и может быть соответствующим образом скорректировано, но обычно оно составляет 1-100 г, а предпочтительно 2-50 г на 1 л среды. Источник углерода может быть добавлен не только в исходную среду, но также, предпочтительно, он может быть введен во время культивирования либо последовательно, либо непрерывно.
Примерами неорганических источников азота являются: соли аммония, такие как нитрат аммония, сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония; нитраты, такие как нитрат калия; аммиак и мочевина. При этом могут быть использованы один или несколько типов указанных неорганических источников азота. Количество добавляемых неорганических источников азота может варьироваться в зависимости от типа источника азота, и может быть соответствующим образом скорректировано, но обычно оно составляет 0,1-20 г, а предпочтительно 0,2-10 г на 1 л среды.
Примерами органических источников азота являются раствор из выжимок кукурузы (включая отфильтрованные продукты), фармацевтические средства, соевый крахмал, соевая мука, арахисовая мука, моноглутамат натрия, растворимые вещества барды и сухие дрожжи. При этом, могут быть использованы один или несколько типов указанных органических источников азота. Концентрация добавляемых органических источников азота может варьироваться в зависимости от типа источника азота, и может быть соответствующим образом скорректирована, но обычно она составляет 0-80 г, а предпочтительно 0-30 г на 1 л среды.
Неорганический источник азота и органический источник азота обычно добавляют в исходную среду, однако, предпочтительно, они могут быть также введены либо последовательно, либо непрерывно.
Примерами неорганических солей являются: фосфаты, такие как дигидрофосфат калия, бифосфат калия и бифосфат натрия; соли магния, такие как сульфат магния и хлорид магния; соли железа, такие как сульфат железа и хлорид железа; соли кальция, такие как хлорид кальция и карбонат кальция; соли натрия, такие как карбонат натрия и хлорид натрия; соли марганца, такие как сульфат марганца; соли кобальта, такие как хлорид кобальта; соли меди, такие как сульфат меди; соли цинка, такие как сульфат цинка; соли молибдена, такие как молибдат натрия; соли никеля, такие как сульфат накеля; соли селена, такие как селенат натрия; борная кислота и иодид калия. При этом, могут быть использованы один или несколько типов указанных неорганических солей. Количество добавляемых неорганических солей может варьироваться в зависимости от типа неорганической соли и может быть соответствующим образом скорректировано, но обычно оно составляет 0,0001-15 г на 1 л среды. Концентрация фосфата, соли магния, соли кальция, соли натрия или соли железа предпочтительно составляет 0,02-15 г/л среды. При добавлении соли марганца, соли кобальта, соли меди, соли цинка, соли молибдена, соли никеля, соли селена, борной кислоты, иодида калия или т.п., их концентрация предпочтительно, составляет 0,1-15 мг/л. Неорганическую соль обычно добавляют в исходную среду, однако, она может быть также введена либо последовательно, либо непрерывно.
Примерами используемых витаминов, не относящихся к биотину, являются цианокобаламин, рибофлавин, пантотеновая кислота, пиридоксин, тиамин, аскорбиновая кислота, фолиевая кислота, ниацин, п-аминобензойная кислота, инозит и холин. Количество добавляемого витамина может варьироваться в зависимости от типа витамина, однако, оно может быть соответствующим образом скорректировано, но обычно оно составляет 0,001-1000 мг, а предпочтительно, 0,01-100 мг на 1 л среды. Витамин обычно добавляют в исходную среду, однако, он может быть также добавлен либо последовательно, либо непрерывно.
Способ согласно изобретению отличается тем, что он включает культивирование астаксантин-продуцирующей бактерии в среде, в которую был добавлен биотин. При культивировании астаксантин-продуцирующей бактерии в среде, в которую был добавлен биотин, может быть продуцирован астаксантин в высокой концентрации, но концентрация кантаксантина будет оставаться на низком уровне.
Биотином, используемым в способе согласно изобретению, может быть DL-биотин или D-биотин. При этом, предпочтительно использовать D-биотин. Биотин обычно добавляют в исходную среду, однако, он может быть также добавлен либо периодически, либо непрерывно во время культивирования. Альтернативно, биотин может быть добавлен в исходную среду, а затем, он может быть добавлен периодически или непрерывно во время культивирования. Биотин может быть смешан с базальной средой, а затем такая среда может быть стерилизована. Альтернативно, биотин может быть отдельно стерилизован, а затем добавлен в базальную среду. Способ стерилизации биотина не имеет конкретных ограничений, и таким способом может быть тепловая стерилизация или стерилизация на фильтре.
Нижний предел концентрации биотина, добавляемого в среду, не имеет конкретных ограничений, но, предпочтительно, он составляет 0,001 мг/л, более предпочтительно, 0,005 мг/л, еще более предпочтительно, 0,01 мг/л, а особенно предпочтительно, 0,02 мг/л. Верхний предел концентрации биотина, добавляемого в среду, не имеет конкретных ограничений, но предпочтительно, он составляет 50 мг/л, более предпочтительно, 20 мг/л, еще более предпочтительно, 10 мг/л, особенно предпочтительно, 5 мг/л, а наиболее предпочтительно, 2 мг/л.
В способе согласно изобретению предпочтительно использовать пеногаситель для предотвращения образования пузырьков в продукте культивирования. При этом, может быть использован пеногаситель любого типа, при условии, что он будет предотвращать образование пузырьков или удалять образовавшиеся пузырьки, но при этом, не будет оказывать ингибирующее действие на астаксантин-продуцирующую бактерию. Примерами пеногасителей являются пеногасители на основе спирта, пеногасители на основе полиэфира, пеногасители на основе сложного эфира, пеногасители на основе жирной кислоты, пеногасители на основе кремния и пеногасители на основе сульфоновой кислоты. Количество добавляемого пеногасителя может варьироваться в зависимости от типа пеногасителя и может быть соответствующим образом скорректировано, но обычно оно составляет 0,01-10 г на 1 л среды.
Пеногаситель обычно добавляют в исходную среду перед стерилизацией. Он может быть также добавлен непрерывно или периодически во время культивирования. Примерами методов добавления пеногасителя во время культивирования являются метод, в котором, после обнаружения пузырьков с помощью датчика, автоматически добавляется пеногаситель; метод, в котором пеногаситель добавляется через определенные интервалы времени, запрограммированные на таймере; и метод, в котором пеногаситель смешивают с источником углерода, источником азота, рН-корректирующим агентом или т.п. с последующей подачей этой смеси так, чтобы ее добавление происходило в ответ на изменение скорости роста. При этом, пеногасителем, добавляемым в исходную среду, может быть тот же пеногаситель, который был добавлен в продукт культивирования в процессе культивирования. Альтернативно, для достижения нужных эффектов могут быть использованы пеногасители различных типов.
В соответствии со способом согласно изобретению, рН среды в начале культивирования доводят до значений 2-12, предпочтительно, 6-9, а более предпочтительно, 6,5-8,0. Во время культивирования, предпочтительно, чтобы рН составлял в пределах указанных значений. Предпочтительным методом поддержания нужного рН является метод, в котором pH культуральной жидкости измеряют он-лайн с использованием pH-электрода, установленного внутри ферментера с автоматической подачей щелочи. Примерами pH-корректирующих агентов являются: водный раствор гидроксида натрия, водный раствор гидроксида калия, водный раствор карбоната натрия, аммиачная вода, газообразный аммиак, водный раствор серной кислоты и их смесь.
Среду, используемую в способе согласно изобретению, стерилизуют перед ее применением для культивирования бактерий. Стерилизация может быть соответствующим образом осуществлена специалистом в данной области. Так, например, среда в подходящем контейнере может быть подвергнута тепловой стерилизации в автоклаве. Альтернативно, стерилизация путем фильтрации может быть осуществлена с помощью стерилизующего фильтра. В другом случае, стерилизация может быть осуществлена путем нагрева через рубашку и паровой инжекции. Если источник углерода, такой как глюкоза, подвергают тепловой стерилизации вместе с другими компонентами среды, то этот источник приобретает коричневатый оттенок, а поэтому, он может быть стерилизован отдельно. Витамин или небольшое количество металла могут быть подвергнуты тепловой стерилизации вместе с базальной средой, либо они могут быть стерилизованы отдельно для предотвращения дезактивации или осаждения.
В соответствии со способом согласно изобретению, астаксантин-продуцирующую бактерию инокулируют в биотин-содержащую среду, полученную как описано выше, а затем культивируют в предварительно определенных условиях. Инокуляцию осуществляют путем соответствующего культивирования бактериального штамма в посевной культуре в тест-пробирке, в колбе, в ферментере или т.п., и добавления полученного продукта культивирования в биотин-содержащую среду для продуцирования астаксантина. Среда, используемая для посевной культуры, не имеет конкретных ограничений, и такой средой может быть биотин-содержащая среда или среда, не содержащая биотина, при условии, что она будет обеспечивать хороший рост астаксантин-продуцирующей бактерии.
Культивирование осуществляют в подходящем контейнере для культивирования. Контейнер для культивирования может быть соответствующим образом выбран в зависимости от объема культуры, и такими контейнерами могут быть, например, тест-пробирка, колба, ферментер или т.п.
Температура культивирования составляет, например, 15-40°C, предпочтительно, 20-35°C, а более предпочтительно, 25-32°C. Культивирование осуществляют в аэробных условиях в течение периода времени, обычно составляющего от 1 дня до 20 дней, предпочтительно, от 2 до 12 дней, более предпочтительно, от 3 до 9 дней, а наиболее предпочтительно, от 4 до 7 дней.
Примерами культивирования в аэробных условиях являются: культивирование со встряхиванием или культивирование в условиях аэрации/помешивания. Недостаток кислорода негативно влияет на рост астаксантин-продуцирующей бактерии или на продуцирование каротиноида. Таким образом, непрерывный мониторинг концентрации растворенного кислорода предпочтительно, осуществляют с использованием электрода, содержащего растворенный кислород.
Число микроорганизмов снижается сразу после начала культивирования, а поэтому, концентрация растворенного кислорода должна быть близкой к концентрации насыщения. Однако, по мере роста микроорганизмов повышается и потребление ими кислорода, а поэтому концентрация растворенного кислорода постепенно снижается. Могут быть определены следующие фазы культивирования: период между началом культивирования и временем снижения концентрации растворенного кислорода до определенного уровня, например, до 0-5 м.д., а предпочтительно, 1-4 м.д., где указанный период соответствует начальной фазе культивирования; период между концом начальной фазы культивирования и временем повышения концентрации продуцируемого астаксантина до максимального уровня, соответствующий промежуточной фазе культивирования; и период между временем повышения концентрации продуцируемого астаксантина до максимального уровня и временем завершения культивирования, соответствующий конечной фазе культивирования.
Для того чтобы концентрация растворенного кислорода занимала всю контрольную область как можно за более ранний период времени, объем аэрации, число помешиваний и давление могут быть установлены на низком уровне в начальной фазе культивирования. Следует отметить, что для поддержания смеси продукта культивирования в нужном состоянии, должен быть осуществлен необходимый минимум вращательных движений. Для предотвращения контаминации патогенными микроорганизмами, давление также следует поддерживать на минимально необходимом уровне.
Потребление кислорода микроорганизмами становится более активным на промежуточной фазе культивирования. В данном случае, если аэрация/помешивание являются недостаточными, то концентрация растворенного кислорода снижается до нуля, то есть, можно сказать, что наступает дефицит кислорода. Это негативно влияет на рост микроорганизмов или на продуцирование каротиноида. Таким образом, для предотвращения дефицита кислорода, предпочтительно, регулировать концентрацию растворенного кислорода в промежуточной фазе культивирования. Концентрацию растворенного кислорода можно регулировать, например, путем измерения числа вращательных движений, объема аэрации, внутреннего давления и концентрации кислорода в газе для аэрации.
В соответствии со способом согласно изобретению, чем выше концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования, наблюдаемая в процессе культивирования астаксантин-продуцирующей бактерии, тем ниже отношение концентрации продуцируемого кантаксантина к концентрации продуцируемого астаксантина. Таким образом, концентрацию растворенного кислорода в продукте культивирования на промежуточной фазе культивирования доводят, предпочтительно, до 1 м.д. или более, более предпочтительно, до 1,5 м.д. или более, еще более предпочтительно, до 2 м.д. или более, а особенно предпочтительно, до 2,5 м.д. или более. Верхний предел концентрации растворенного кислорода в продукте культивирования в промежуточной фазе культивирования поддерживается в соответствующем интервале, но не ограничивается им, и составляет, предпочтительно, 8 м.д., более предпочтительно, 7 м.д., еще более предпочтительно, 6 м.д., а особенно предпочтительно, 5 м.д.
Хотя концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования в промежуточной фазе культивирования может регулироваться на указанном уровне, однако, может также оказаться эффективным постадийное или постоянное увеличение концентрации растворенного кислорода для достижения высоких уровней концентрации астаксантина с одновременным снижением концентрации кантаксантина в продукте культивирования. Число стадий увеличения концентрации растворенного кислорода не имеет конкретных ограничений, при условии, что будет проведена хотя бы одна стадия. Так, например, концентрация растворенного кислорода может увеличиваться в полунепрерывном или в непрерывном режиме на 0,2 м.д. в час в течение 20 часов. Нижний предел концентрации растворенного кислорода до постадийного или непрерывного увеличения концентрации растворенного кислорода в продукте культивирования (то есть, исходной концентрации растворенного кислорода) не имеет ограничений, но, предпочтительно, он составляет 1 м.д., более предпочтительно, 1,5 м.д., а еще более предпочтительно, 2 м.д. Верхний предел такой концентрации также не имеет ограничений, и предпочтительно, составляет 3,5 м.д., более предпочтительно, 3 м.д., а еще более предпочтительно, 2,5 м.д. Нижний предел концентрации растворенного кислорода после постадийного или непрерывного увеличения концентрации растворенного кислорода в продукте культивирования не имеет ограничений и составляет, предпочтительно, 2,5 м.д., более предпочтительно, 3 м.д., а еще более предпочтительно, 3,5 м.д. Верхний предел такой концентрации также не имеет ограничений, и предпочтительно, составляет 8 м.д., более предпочтительно, 7 м.д., еще более предпочтительно, 6 м.д., а особенно предпочтительно, 5 м.д.
Время, за которое концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования в промежуточной фазе культивирования начинает постадийно или непрерывно увеличиваться, не имеет конкретных ограничений, и предпочтительно, составляет 0-60 часов, более предпочтительно, 2-50 часов, еще более предпочтительно, 4-40 часов, а наиболее предпочтительно, 6-30 часов от начала промежуточной фазы культивирования. Время, за которое концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования начинает постадийно или непрерывно увеличиваться и достигает наивысшего значения, не имеет ограничений. Если концентрация растворенного кислорода изменяется за одну стадию, то наивысшая концентрация растворенного кислорода может быть достигнута за 1 час. Если концентрация растворенного кислорода увеличивается в полунепрерывном или в непрерывном режиме за 2 или более стадии, то время, за которое концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования начинает увеличиваться и достигает наивысшего значения, не имеет ограничений. Однако, в этом случае, такое время, предпочтительно, составляет 2-120 часов, более предпочтительно, 4-100 часов, еще более предпочтительно, 6-90 часов, особенной предпочтительно, 8-80 часов, а наиболее предпочтительно, 10-70 часов.
Концентрация растворенного кислорода в продукте культивирования может быть, предпочтительно, увеличена или снижена во время культивирования методом, включающим взятие образцов продукта культивирования, если это необходимо, и анализ каротиноидного состава в промежуточной фазе культивирования для доведения отношения концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина до желаемого уровня. В частности, если отношение концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина выше желаемого уровня, то для эффективной корректировки следует увеличить уровень концентрации растворенного кислорода в продукте культивирования, а если отношение концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина ниже желаемого уровня, то будет эффективным снижение концентрации растворенного кислорода в продукте культивирования.
В конечной фазе культивирования, микроорганизм имеет пониженный уровень активности поглощения кислорода, что приводит к прекращению роста бактерии и продуцирования каротиноида. В соответствии с этим, концентрацию растворенного кислорода в продукте культивирования необязательно регулировать так же точно, как в промежуточной фазе культивирования. Однако, можно непрерывно поддерживать концентрацию растворенного кислорода на одном и том же уровне в более позднем периоде промежуточной фазы культивирование, либо можно осуществлять культивирование путем помешивания с постоянной скоростью при постоянном объеме аэрации.
Отношение концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина в продукте культивирования, полученном как конечный продукт после завершения культивирования вышеописанным методом, предпочтительно, составляет 25% масс. или менее, более предпочтительно, 20% масс. или менее, еще более предпочтительно, 15% масс. или менее, еще более предпочтительно, 8% масс. или менее, особенно предпочтительно, 6% масс. или менее, а наиболее предпочтительно, 4% масс. или менее. Нижний предел отношения концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, не имеет конкретных ограничений, и предпочтительно, составляет 0,5% масс., а более предпочтительно, 1,0% масс. Продукт культивирования, который был получен после завершения культивирования, и в котором отношение концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина составляет 25% масс. или менее, может быть предпочтительно, использован для приготовления кормовых добавок. Кроме того, продукт культивирования, в котором такое отношение составляет 8% масс. или менее, может быть, предпочтительно, использован для приготовления пищевых продуктов.
Бактерия, которая одновременно продуцирует астаксантин и кантаксантин, также одновременно продуцирует адониксантин в виде побочного продукта. Отношение концентрации адониксантина к концентрации астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, проводимого вышеуказанным методом, предпочтительно, составляет 100% масс. или менее, более предпочтительно, 90% масс. или менее, еще более предпочтительно, 80% масс. или менее, еще более предпочтительно, 30% масс. или менее, особенно предпочтительно, 25% масс. или менее, а наиболее предпочтительно, 20% масс. или менее. Нижний предел отношения концентрации адониксантина к концентрации астаксантина в продукте культивирования, полученном после завершения культивирования, не имеет конкретных ограничений, и предпочтительно, составляет 1% масс., а более предпочтительно, 5% масс.
Бактерия, используемая в способе согласно изобретению, продуцирует глюконовую кислоту в культуральной жидкости. Если продуцируется глюконовая кислота, то это приводит к истощению источника углерода в среде по мере продуцирования глюконовой кислоты. В случае накопления большого количества глюконовой кислоты происходит ингибирование роста бактерий или продуцирования каротиноидов. А поэтому, в целях продуцирования каротиноидов может оказаться эффективной минимизация уровня продуцирования глюконовой кислоты. В соответствии со способом согласно изобретению, количество продуцируемой глюконовой кислоты может быть снижено путем добавления биотина в среду. Концентрация глюконовой кислоты в продукте культивирования, полученном в виде конечного продукта после завершения культивирования, предпочтительно, составляет 30 г/л или менее, более предпочтительно, 20 г/л или менее, еще более предпочтительно, 10 г/л или менее, а особенно предпочтительно, 5 г/л или менее. Нижний предел составляет 0 г/л.
В соответствии со способом согласно изобретению, ингибирование продуцирования PHB (поли-β-гидроксибутирата) может быть осуществлено путем добавления биотина в среду. Содержание PHB в продукте культивирования, полученном как конечный продукт после завершения культивирования, в расчете на сухие клетки, предпочтительно, составляет 30% масс. или менее, более предпочтительно, 20% масс. или менее, еще более предпочтительно, 10% масс. или менее, а особенно предпочтительно, 5% масс. или менее. Нижний предел содержания РНВ составляет 0% масс. В частности, продукт культивирования, в котором содержание PHB, после завершения культивирования, в расчете на сухие клетки, составляет 30% масс. или менее, может быть, предпочтительно, использован как кормовая добавка.
В способе согласно изобретению, каротиноид в продукте культивирования, полученном путем культивирования астаксантин-продуцирующей бактерии, или каротиноид, собранный из продукта культивирования, может быть количественно оценен, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Как описано выше, продукт культивирования, полученный путем культивирования астаксантин-продуцирующей бактерии, может быть непосредственно использован в качестве каротиноида. Альтернативно, супернатант культуры, клеточный концентрат (жидкий клеточный концентрат), сырые клетки, сухие клетки, клеточный лизат и т.п. получают из продукта культивирования, такого как культуральная жидкость, и все они могут быть использованы в качестве препаратов. Кроме того, каротиноид может быть получен из указанного продукта культивирования или препарата путем экстракции, очистки или т.п.
Супернатант культуры может быть получен путем центрифугирования или фильтрации продукта культивирования для удаления бактериальных клеток из указанного продукта культивирования. Клеточный концентрат (жидкий клеточный концентрат) может быть получен путем центрифугирования, концентрирования путем фильтрации на мембранном фильтре или декантирования продукта культивирования. Сырые клетки могут быть получены путем центрифугирования или фильтрации продукта культивирования. Сухие клетки могут быть получены путем сушки продукта культивирования, сырых клеток или клеточного концентрата (жидкого клеточного концентрата) с применением стандартного метода сушки. Сухие клетки, содержащие каротиноид и полученные таким способом, могут быть использованы непосредственно в качестве кормовой добавки.
В способе согласно изобретению, метод сбора каротиноида из вышеуказанного продукта культивирования или препарата не имеет конкретных ограничений. Таким методом может быть любой метод, позволяющий осуществлять эффективный и стабильный сбор каротиноида. Специалист в данной области может самостоятельно выбрать нужный метод из известных методов экстракции и очистки.
Кроме того, перед экстракцией, продукт культивирования или препарат может быть подвергнут по меньшей мере одной обработке, выбранной из химической обработки, проводимой с использованием щелочного реагента или поверхностно-активного вещества; биохимической обработки, проводимой с использованием литического фермента; фермента, разлагающего липиды; протеазы или т.п., и физической обработки, такой как обработка ультразвуком или измельчение в порошок.
Так, например, если каротиноид экстрагируют из продукта культивирования или препарата, то растворители, используемые для экстракции и промывки, не имеют конкретных ограничений. Однако, в качестве примеров таких растворителей могут служить низшие спирты (например, метанол, этанол и изопропанол), ацетон, тетрагидрофуран, метилэтилкетон, метилизобутилкетон, дихлорметан, хлороформ, диметилформамид и диметилсульфоксид.
Если во время экстракции желательно минимизировать риск окисления каротиноида, то такая экстракция может быть проведена в атмосфере инертного газа, такой как атмосфера азота. При необходимости, можно также выбрать антиоксидант, используемый для приготовления фармацевтических препаратов или пищевых продуктов, и добавить его в растворитель для экстракции. Альтернативно, может быть осуществлена комбинированная обработка.
Кроме того, экстракция может быть осуществлена в условиях защиты от света в целях минимизации риска разложения каротиноида, вызываемого излучением.
Полученный таким образом экстракт может быть непосредственно использован в качестве каротиноида и может быть дополнительно очищен перед его использованием.
Метод выделения бактерии и т.п. из экстракта (например, жидкого экстракта), полученного после экстракции, не имеет конкретных ограничений. Однако, в качестве примеров такого метода могут служить фильтрация на мембранном фильтре, центрифугирование и декантирование.
В общих чертах, методами получения каротиноидного осадка из экстракта могут быть нагревание и/или вакуумное концентрирование, кристаллизация или т.п. Помимо такого метода может быть применен метод, в котором каротиноидный пигмент может быть выделен путем осаждения при низкой температуре или осаждения с использованием кислотного/щелочного агента или другой соли без концентрирования. Такой экстракт, в случае его промышленного применения, желательно кристаллизовать.
При необходимости, полученный каротиноидный осадок может быть подвергнут суспендированию/помешиванию для промывки с использованием небольшого количества растворителя, такого как низший спирт.
Способ промывки не имеет конкретных ограничений, однако, на практике, предпочтительными являются методы, в которых фильтрацию осуществляют после суспендирования/помешивания, и в которых жидкость пропускают поверх осадка.
Продукт культивирования, препарат, экстракт или очищенный продукт, полученные как описано выше, могут быть использованы отдельно в качестве каротиноида, либо они могут быть смешаны и использованы в определенных соотношениях.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение подробно описано в нижеследующих конкретных примерах, которые не должны рассматриваться как ограничение объема изобретения.
В данных примерах, каротиноиды были количественно оценены с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), как описано ниже.
Для этого были использованы две тандемные колонки (Inertsil SIL-100A, 5 мкм (ϕ: 4,6×250 мм) (GL Sciences)). Элюирование проводили с использованием жидкости, содержащей смесь н-гексана/тетрагидрофурана/метанола (40:20:1), в качестве подвижной фазы при скорости 1,0 мл/мин и при постоянной температуре, примерно, при комнатной температуре. Для проведения измерений, образцы, растворенные в тетрагидрофуране, 100-кратно разводили подвижной фазой, и впрыскивали 20 мкл полученного вещества. Элюент на колонке детектировали на длине волны 470 нм. Кроме того, астаксантин (изготавливаемый Sigma) (Cat. No. A9335) использовали в качестве стандартного препарата для количественной оценки. После измерения, концентрацию астаксантина в стандартном растворе вычисляли по формуле: Концентрация астаксантина (мг/л) = A/2150×B×100, где (A): оптическая плотность стандартного раствора на 477 нм, и (B): процент (%) площади пика астаксантина, полученного с помощью ВЭЖХ-анализа в вышеуказанных условиях.
Пример 1
Сто миллилитров среды (имеющей следующий состав: сахароза: 30 г/л; жидкий кукурузный сироп: 30 г/л; дигидрофосфат калия: 1,5 г/л; додекагидрат бифосфата натрия: 3,8 г/л; дигидрат хлорида кальция: 5,0 г/л; гептагидрат сульфата магния: 0,7 г/л; и гептагидрат сульфата железа: 0,3 г/л (pH 7,2)) выливали в 500-миллилитровую коническую колбу с ватной пробкой и стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 15 минут, в результате чего приготавливали семь колб, содержащих среду для посева.
Затем, 2,0 л среды (имеющей следующий состав: глюкоза: 20 г/л; жидкий кукурузный сироп: 30 г/л; сульфат аммония: 0,5 г/л; дигидрофосфат калия: 2,25 г/л; додекагидрат бифосфата натрия: 5,7 г/л; дигидрат хлорида кальция: 0,1 г/л; гептагидрат сульфата магния: 0,5 г/л; гептагидрат сульфата железа: 5 г/л и пеногаситель на основе спирта: 0,5 г/л) выливали в 5-литровый ферментер. Таким образом приготавливали семь ферментеров. В эти ферментеры добавляли D-биотин до концентраций 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1,0, 10 и 50 мг/л, соответственно, и каждое полученное вещество стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 30 минут.
Платиновую петлю с культурой штамма Paracoccus carotinifaciens E-396 (FERM BP-4283) вносили в среду для посева, содержащуюся в каждой из колб, приготовленных как описано выше, а затем осуществляли культивирование на роторном шейкере при 100 об/мин. и при 28°C в течение 2 дней. Затем, полученные культуральные жидкости (80 мл каждой) отдельно вводили в ферментеры для культивирования в аэробных условиях при 28°C с объемом аэрации 1% об./мин в течение 120 часов. Во время культивирования, pH постоянно поддерживали при 7,2 путем добавления 15% аммиачной воды. На 1-й, 2-й, 3-й и 4-й дни культивирования добавляли глюкозу (30 г) для предотвращения дефицита глюкозы. Кроме того, число вращательных движений изменяли (наименьшее число вращательных движений: 200 об/мин.) для поддержания концентрации растворенного кислорода в каждой культуральной жидкости на уровне 2 м.д. в промежуточной фазе культивирования. После детектирования образования пузырьков с помощью датчика пузырьков автоматически добавляли пеногаситель на основе спирта для удаления таких пузырьков.
После завершения культивирования определяли концентрацию каротиноида, концентрацию глюконовой кислоты и содержание PHB в расчете на сухие клетки в каждой жидкой культуре. Результаты представлены в таблице 1. Было обнаружено, что на каждом экспериментальном графике, в том случае, когда в среду добавляли биотин в концентрации 0,001-50 мг/л, отношение концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина было ниже, чем на графике, полученном без добавления биотина.
Таблица 1
Концентрация биотина, мг/л
0
0,001
0,01
0,1
1
10
50
Кантаксантин, мг/л
5,2
3,9
3,3
3,3
3,0
2,7
2,5
Астаксантин, мг/л
15,2
15,7
16,5
17,0
15,9
14,3
14,1
Адониксантин, мг/л
6,3
6,6
6,7
6,9
6,8
7,3
7,2
Кантаксантин/астаксантин, % масс.
34,2
24,8
20,0
19,4
18,9
18,9
17,7
Адониксантин/астаксантин, % масс.
41,4
42,0
40,6
40,6
42,8
51,0
51,1
Глюконовая кислота, г/л
45
28
19
14
13
13
10
РНВ, % масс.
35
29
24
25
22
21
23
Пример 2
Сто миллилитров среды (имеющей следующий состав: сахароза: 30 г/л; жидкий кукурузный сироп: 30 г/л; дигидрофосфат калия: 1,5 г/л; додекагидрат бифосфата натрия: 3,8 г/л; дигидрат хлорида кальция: 5,0 г/л; гептагидрат сульфата магния: 0,7 г/л; и гептагидрат сульфата железа: 0,3 г/л (pH 7,2)) выливали в 500-миллилитровую коническую колбу с ватной пробкой и стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 20 минут, в результате чего приготавливали восемь колб, содержащих среду для посева.
Затем, 2,0 л среды (имеющей следующий состав: сахароза: 40 г/л; жидкий кукурузный сироп: 30 г/л; сульфат аммония: 0,5 г/л; дигидрофосфат калия: 2,25 г/л; додекагидрат бифосфата натрия: 5,7 г/л; дигидрат хлорида кальция: 0,1 г/л; гептагидрат сульфата магния: 0,5 г/л; гептагидрат сульфата железа: 5 г/л; и пеногаситель на основе спирта: 0,5 г/л) выливали в 5-литровый ферментер. Таким образом приготавливали восемь чанов. В каждый ферментер добавляли D-биотин до концентрации 0,1 мг/л, и каждое полученное вещество стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 30 минут.
Платиновую петлю с культурой штамма Paracoccus carotinifaciens E-396 (FERM BP-4283) вносили в среду для посева, содержащуюся в каждой из колб, приготовленных как описано выше, а затем осуществляли культивирование на роторном шейкере при 100 об/мин и при 28°C в течение 2 дней. Затем, полученные культуральные жидкости (80 мл каждой) отдельно вводили в ферментеры для культивирования в аэробных условиях при 28°C с объемом аэрации 1% об./мин в течение 120 часов. Во время культивирования, pH постоянно поддерживали при 7,2 путем добавления 15% аммиачной воды. На 1-й, 2-й, 3-й и 4-й дни культивирования добавляли сахарозу (30 г) для предотвращения дефицита сахарозы. Кроме того, число вращательных движений изменяли (наименьшее число вращательных движений: 200 об/мин) для поддержания концентрации растворенного кислорода в культуральных жидкостях на уровне 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 м.д. в промежуточной фазе культивирования. После детектирования образования пузырьков с помощью датчика пузырьков автоматически добавляли пеногаситель на основе спирта для удаления этих пузырьков.
После завершения культивирования определяли концентрацию каротиноида, концентрацию глюконовой кислоты и содержание PHB в расчете на сухие клетки в каждой жидкой культуре. Результаты представлены в таблице 2. Было обнаружено, что отношение концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина снижалось по мере увеличения концентрации растворенного кислорода, и что это отношение может быть снижено до 1,4%.
Для сравнения, аналогичный эксперимент проводили с использованием среды, не содержащей биотина. Результаты представлены в таблице 3. Отношение концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина может быть снижено максимум до 9%.
Таблица 2
Добавление 0,1 мг/л биотина
Концентрация растворенного кислорода, м.д.
0,5
1
2
3
4
5
6
7
Кантаксантин, мг/л
7,3
3,3
1,6
1,2
0,6
0,3
0,2
0,1
Астаксантин, мг/л
8,3
13,3
20,2
20,9
15,8
11,3
9,6
7,0
Адониксантин, мг/л
1,4
2,3
3,9
5,1
6,1
8,2
8,8
11,4
Кантаксантин/астаксантин, % масс.
88,0
24,8
7,9
5,7
3,8
2,7
2,1
1,4
Адониксантин/астаксантин, % масс.
16,9
17,3
19,3
24,4
38,6
72,6
91,7
163
Глюконовая кислота, г/л
24
19
17
14
16
11
10
9
РНВ, % масс.
25
19
18
17
14
20
13
17
Таблица 3
Без добавления биотина
Концентрация растворенного кислорода, м.д.
0,5
1
2
3
4
5
6
7
Кантаксантин, мг/л
6,7
4,1
3,2
2,2
1,2
0,7
0,5
0,4
Астаксантин, мг/л
3,0
7,8
12,3
13,3
10,9
7,8
5,5
4,2
Адониксантин, мг/л
0,6
1,7
3,4
5,5
6,8
6,5
7,3
8,7
Кантаксантин/астаксантин, % масс.
223
52,6
26,0
16,5
11,0
9,0
9,1
9,5
Адониксантин/астаксантин, % масс.
20,0
21,8
27,6
41,4
62,4
83,3
133
207
Глюконовая кислота, г/л
56
47
33
44
35
36
31
31
РНВ, % масс.
44
47
29
34
27
27
36
32
Пример 3
Штамм Paracoccus carotinifaciens E-396 (FERM BP-4283) подвергали мутации путем обработки N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином и отбирали колонию, имеющую ярко-красную окраску. Затем определяли концентрацию PHB и концентрацию каротиноида в культуральной жидкости выбранного штамма, после чего отбирали мутантный штамм LP-26, обладающий низкой способностью продуцировать PHB и высокой способностью продуцировать астаксантин.
Сто миллилитров среды (имеющей следующий состав: сахароза: 30 г/л; жидкий кукурузный сироп: 30 г/л; дигидрофосфат калия: 1,5 г/л; додекагидрат бифосфата натрия: 3,8 г/л; дигидрат хлорида кальция: 5,0 г/л; гептагидрат сульфата магния: 0,7 г/л; и гептагидрат сульфата железа: 0,3 г/л (pH 7,2)) выливали в 500-миллилитровую коническую колбу с ватной пробкой и стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 20 минут, в результате чего приготавливали колбу, содержащую среду для посева.
Затем, 2,0 л среды (имеющей следующий состав: глюкоза: 30 г/л; жидкий кукурузный сироп: 30 г/л; сульфат аммония: 0,5 г/л; дигидрофосфат калия: 2,25 г/л; додекагидрат бифосфата натрия: 5,7 г/л; дигидрат хлорида кальция: 0,1 г/л; гептагидрат сульфата магния: 0,5 г/л; гептагидрат сульфата железа: 5 г/л; моногидрат L-моноглутамата натрия: 6 г/л; и пеногаситель на основе спирта: 0,5 г/л) выливали в 5-литровый ферментер. Таким образом приготавливали восемь ферментеров. В каждый ферментер добавляли D-биотин до концентрации 0,1 мг/л, и каждое полученное вещество стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 30 минут.
Платиновую петлю с культурой бактериального штамма Paracoccus LP-26, выбранного как описано выше, вносили в среду для посева, содержащуюся в колбе, приготовленной как описано выше, а затем осуществляли культивирование на роторном шейкере при 100 об/мин и при 28°C в течение 2 дней. Затем, полученные культуральные жидкости (80 мл каждой) отдельно вводили в ферментеры для культивирования в аэробных условиях при 28°C с объемом аэрации 1% об./мин в течение 140 часов. Во время культивирования, pH постоянно поддерживали при 7,2 путем добавления 15% аммиачной воды. На 1-й, 2-й, 3-й и 4-й дни культивирования добавляли глюкозу (50 г) для предотвращения дефицита глюкозы. Кроме того, число вращательных движений изменяли (наименьшее число вращательных движений: 100 об/мин) для поддержания концентрации растворенного кислорода в культуральных жидкостях на уровне 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 и 7 м.д. в промежуточной фазе культивирования. После детектирования образования пузырьков с помощью датчика пузырьков автоматически добавляли пеногаситель на основе спирта для удаления таких пузырьков.
После завершения культивирования определяли концентрацию каротиноида, концентрацию глюконовой кислоты и содержание PHB в расчете на сухие клетки в каждой жидкой культуре. Результаты представлены в таблице 4. Было обнаружено, что отношение концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина снижалось по мере увеличения концентрации растворенного кислорода, и что это отношение может быть снижено до 1,6%.
Для сравнения, аналогичный эксперимент проводили с использованием среды, не содержащей биотина, где концентрацию растворенного кислорода поддерживали на уровне 2 м.д. в промежуточной фазе культивирования. Результаты представлены в таблице 5. Отношение концентрации кантаксантина к концентрации астаксантина в среде, в которую был добавлен биотин, составляло 8%, а концентрацию растворенного кислорода поддерживали на уровне 2 м.д. С другой стороны, в среде, не содержащей биотина, такое отношение составляло до 26,8%.
Таблица 4
Добавление 0,1 мг/л биотина
Концентрация растворенного кислорода, м.д.
0,5
1
2
3
4
5
6
7
Кантаксантин, мг/л
243
122
59
52
24
10
6
4
Астаксантин, мг/л
301
499
741
746
577
401
315
244
Адониксантин, мг/л
45
73
130
201
255
259
309
332
Кантаксантин/астаксантин, % масс.
80,7
24,4
8,0
7,0
4,2
2,5
1,9
1,6
Адониксантин/астаксантин, % масс.
15,0
14,6
17,5
26,9
44,2
64,6
98,1
136
Глюконовая кислота, г/л
26
17
19
15
15
16
14
10
РНВ, % масс.
12
10
9
6
1
3
0
6
Таблица 5
Без добавления биотина
Концентрация растворенного кислорода, м.д.
2
Кантаксантин, мг/л
132
Астаксантин, мг/л
493
Адониксантин, мг/л
144
Кантаксантин/астаксантин, % масс.
26,8
Адониксантин/астаксантин, % масс.
29,2
Глюконовая кислота, г/л
35
РНВ, % масс.
22
Кроме того, эксперименты на постадийное или непрерывное изменение концентрации растворенного кислорода в промежуточной фазе культивирования осуществляли в четырех различных условиях, описанных ниже, а именно, в условиях с добавлением D-биотина до концентрации 0,1 мг/л и в условиях, отличающихся тем, что в них использовали другие концентрации растворенного кислорода.
Измененное условие 1
Исходную концентрацию растворенного кислорода в промежуточной фазе культивирования доводили до 2 м.д. и поддерживали на этом уровне в течение 40 часов. Затем, концентрацию растворенного кислорода доводили до 2,5 м.д. и поддерживали на этом уровне вплоть до завершения культивирования. В частности, концентрация растворенного кислорода спонтанно снижалась от концентрации насыщения до 2 м.д. через 0-8 часов после начала культивирования, и эту концентрацию поддерживали на уровне 2 м.д. в течение 8-48 часов и 2,5 м.д. в течение 48-140 часов.
Измененное условие 2
Исходную концентрацию растворенного кислорода в промежуточной фазе культивирования доводили до 1 м.д. и поддерживали на этом уровне в течение 8 часов, при этом, регулируемую концентрацию повышали на 0,1 м.д. каждый час так, чтобы концентрация растворенного кислорода увеличивалась до 5 м.д. за 40 часов, и такой уровень концентрации поддерживали вплоть до завершения культивирования. В частности, концентрация растворенного кислорода спонтанно снижалась от концентрации насыщения до 1 м.д. через 0-9 часов после начала культивирования, и эту концентрацию поддерживали на уровне 1 м.д. в течение 9-17 часов, затем повышали на 0,1 м.д. каждый час от 1 м.д. до 5 м.д. в течение 17-57 часов, и поддерживали на уровне 5 м.д. в течение 57-140 часов.
Измененное условие 3
Исходную концентрацию растворенного кислорода в промежуточной фазе культивирования доводили до 3 м.д. и поддерживали на этом уровне в течение 50 часов. Затем, концентрацию растворенного кислорода доводили до 3,5 м.д. и поддерживали на этом уровне вплоть до завершения культивирования. В частности, концентрация растворенного кислорода спонтанно снижалась от концентрации насыщения до 3 м.д. через 0-7 часов после начала культивирования, и эту концентрацию поддерживали на уровне 3 м.д. в течение 7-57 часов и 3,5 м.д. в течение 57-140 часов.
Измененное условие 4
Исходную концентрацию растворенного кислорода в промежуточной фазе культивирования доводили до 2 м.д. и поддерживали на этом уровне в течение 4 часов, при этом, регулируемую концентрацию повышали на 0,1 м.д. каждые 2 часа так, чтобы концентрация растворенного кислорода увеличивалась до 7 м.д. за 100 часов, и такой уровень концентрации поддерживали вплоть до завершения культивирования. В частности, концентрация растворенного кислорода спонтанно снижалась от концентрации насыщения до 2 м.д. через 0-8 часов после начала культивирования, и эту концентрацию поддерживали на уровне 2 м.д. в течение 8-12 часов, затем повышали на 0,1 м.д. каждые два часа от 2 м.д. до 7 м.д. в течение 12-112 часов, и поддерживали на уровне 7 м.д. в течение 112-140 часов.
Культивирование осуществляли в четырех вышеуказанных различных условиях. Затем определяли концентрацию каротиноида, концентрацию глюконовой кислоты и содержание PHB в расчете на сухие клетки в каждой культуральной жидкости после завершения культивирования (через 140 часов после начала культивирования). Результаты представлены в таблице 6. Эти результаты сравнивали с результатами, полученными путем регуляции концентрации растворенного кислорода на указанных уровнях (таблица 4). В соответствии с этим, было обнаружено, что культуральная жидкость, имеющая высокую концентрацию продуцируемого астаксантина и более низкое отношение продуцируемого кантаксантина к продуцируемому астаксантину, может быть получена в любых из вышеуказанных условий.
Таблица 6
Добавление 0,1 мг/л биотина
Условия с изменением концентрации растворенного кислорода
Условие 1
Условие 2
Условие 3
Условие 4
Кантаксантин, мг/л
154
166
39
41
Астаксантин, мг/л
796
863
752
800
Адониксантин, мг/л
156
162
214
212
Кантаксантин/астаксантин, % масс.
19,3
19,2
5,2
5,1
Адониксантин/астаксантин, % масс.
19,6
18,8
28,5
26,5
Глюконовая кислота, г/л
8
11
13
6
РНВ, % масс.
3
2
5
0
Пример 4
Штамм Paracoccus carotinifaciens E-396 (FERM BP-4283) подвергали мутации путем обработки N-метил-N'-нитро-N- нитрозогуанидином, и отбирали колонию, имеющую ярко-красную окраску. Выбранный штамм культивировали в тест-пробирке. Мутантный штамм отбирали в условиях, при которых наблюдалось небольшое снижение рН в культуральной жидкости, и при которых культуральная жидкость имела ярко-красную окраску. Затем определяли концентрацию глюконовой кислоты и концентрацию каротиноида в тест-пробирке, содержащей культуральную жидкость отобранного мутантного штамма, после чего отбирали мутантный штамм LG-7, обладающий низкой способностью продуцировать глюконовую кислоту и высокой способностью продуцировать астаксантин.
Сто миллилитров среды (имеющей следующий состав: сахароза: 30 г/л; фармацевтическое средство: 10 г/л; дигидрофосфат калия: 0,8 г/л; бифосфат калия: 4,2 г/л; дигидрат хлорида кальция: 1 г/л; гептагидрат сульфата магния: 12 г/л; и гептагидрат сульфата железа: 1 г/л (pH 7,2)) выливали в 500-миллилитровую коническую колбу с ватной пробкой и стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 20 минут, в результате чего приготавливали колбу, содержащую среду для посева.
Затем, 2,0 л среды (имеющей следующий состав: сахароза: 30 г/л; фармацевтическое средство: 20 г/л; сульфат аммония: 1,5 г/л; дигидрофосфат калия: 1,5 г/л; додекагидрат бифосфата натрия: 3,8 г/л; дигидрат хлорида кальция: 0,1 г/л; гептагидрат сульфата магния: 4,5 г/л; гептагидрат сульфата железа: 5 г/л; моногидрат L-моноглутамата натрия: 6 г/л; пеногаситель на основе кремния: 1 г/л) выливали в 5-литровый ферментер. Таким образом приготавливали два ферментера. В каждый ферментер добавляли D-биотин до концентрации 1 мг/л, и каждое полученное вещество стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 30 минут.
Платиновую петлю с культурой штамма Paracoccus LG-7, отобранного как описано выше, вносили в среду для посева, содержащуюся в колбе, приготовленной как описано выше, а затем осуществляли культивирование на роторном шейкере при 100 об/мин и при 28°C в течение 3 дней. Затем, культуральные жидкости (80 мл каждой) отдельно вводили в ферментеры для культивирования в аэробных условиях при 28°C с объемом аэрации 1% об./мин в течение 120 часов. Во время культивирования, pH постоянно поддерживали при 7,2 путем добавления 15% аммиачной воды. На 1-й, 2-й, 3-й и 4-й дни культивирования добавляли сахарозу (40 г) для предотвращения дефицита сахарозы. Кроме того, число вращательных движений изменяли (наименьшее число вращательных движений: 200 об/мин) для поддержания концентрации растворенного кислорода в культуральной жидкости в соответствии с двумя нижеследующими условиями.
Измененное условие 5
Исходную концентрацию растворенного кислорода в промежуточной фазе культивирования доводили до 2,5 м.д. и поддерживали на этом уровне в течение 35 часов. Затем, концентрацию растворенного кислорода доводили до 3 м.д. и поддерживали на этом уровне вплоть до завершения культивирования. В частности, концентрация растворенного кислорода спонтанно снижалась от концентрации насыщения до 2,5 м.д. через 0-8 часов после начала культивирования, и эту концентрацию поддерживали на уровне 2,5 м.д. в течение 8-43 часов и 3 м.д. в течение 43-120 часов.
Измененное условие 6
Исходную концентрацию растворенного кислорода в промежуточной фазе культивирования доводили до 3,5 м.д. и поддерживали на этом уровне в течение 4 часов, при этом, регулируемую концентрацию повышали на 0,1 м.д. каждые четыре часа так, чтобы концентрация растворенного кислорода увеличивалась до 5 м.д. за 60 часов, и такой уровень концентрации поддерживали вплоть до завершения культивирования. В частности, концентрация растворенного кислорода спонтанно снижалась от концентрации насыщения до 3,5 м.д. через 0-7 часов после начала культивирования, и эту концентрацию поддерживали на уровне 3,5 м.д. в течение 7-11 часов, затем повышали на 0,1 м.д. каждые четыре часа от 3,5 м.д. до 5 м.д. в течение 11-71 часов, и поддерживали на уровне 5 м.д. в течение 71-120 часов.
Культивирование осуществляли в двух вышеуказанных различных условиях. Затем определяли концентрацию каротиноида, концентрацию глюконовой кислоты и содержание PHB в расчете на сухие клетки в каждой культуральной жидкости после завершения культивирования (через 120 часов после начала культивирования). Результаты представлены в таблице 7. Для сравнения, в таблице 7 также представлены результаты культивирования, полученные путем поддерживания концентрации растворенного кислорода в промежуточной фазе культивирования и в конечной фазе культивирования на постоянном уровне 4 м.д. без добавления биотина.
Таблица 7
Концентрация биотина
1 мг/л
1 мг/л
0
Условия с изменением концентрации растворенного кислорода
Условие 5
Условие 6
4 м.д. (постоянная)
Кантаксантин, мг/л
61
25
40
Астаксантин, мг/л
607
429
414
Адониксантин, мг/л
133
252
258
Кантаксантин/астаксантин, % масс.
10,0
5,8
9,7
Адониксантин/астаксантин, % масс.
21,9
58,7
62,4
Глюконовая кислота, г/л
3
0
7
РНВ, % масс.
17
18
35
Пример 5
Сто миллилитров среды (имеющей следующий состав: сахароза: 20 г/л; жидкий кукурузный сироп: 5 г/л; дигидрофосфат калия: 0,54 г/л; бифосфат калия: 2,78 г/л; дигидрат хлорида кальция: 5 г/л; гептагидрат сульфата магния: 0,7 г/л; и гептагидрат сульфата железа: 3 г/л (pH 7,2)) выливали в 500-миллилитровую коническую колбу с ватной пробкой и стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 20 минут, в результате чего приготавливали колбу, содержащую среду для посева.
Затем, 2,0 л среды (имеющей следующий состав: глюкоза: 40 г/л; жидкий кукурузный сироп: 30 г/л; сульфат аммония: 0,5 г/л; дигидрофосфат калия: 2,25 г/л; додекагидрат бифосфата натрия: 5,7 г/л; дигидрат хлорида кальция: 0,1 г/л; гептагидрат сульфата магния: 0,5 г/л; гептагидрат сульфата железа: 5 г/л; моногидрат L-моноглутамата натрия: 6 г/л; и пеногаситель на основе спирта: 0,5 г/л) выливали в 5-литровый ферментер. Затем в ферментер добавляли D-биотин до концентрации 0,1 мг/л, и полученное вещество стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 30 минут.
Платиновую петлю с культурой бактериального штамма Paracoccus А-581-1 (FERM BP-4671) вносили в среду для посева, содержащуюся в колбе, приготовленной как описано выше, а затем осуществляли культивирование на роторном шейкере при 150 об/мин и при 27°C в течение 2 дней. Затем, культуральную жидкость (80 мл) выливали в ферментер для культивирования в аэробных условиях при 28°C с объемом аэрации 1% об./мин в течение 120 часов. Во время культивирования, pH постоянно поддерживали при 7,2 путем добавления 15% аммиачной воды. На 1-й, 2-й, 3-й и 4-й дни культивирования добавляли глюкозу (30 г) для предотвращения дефицита глюкозы. Кроме того, число вращательных движений изменяли (наименьшее число вращательных движений: 200 об/мин.) для поддержания концентрации растворенного кислорода в культуральной жидкости на уровне 2 м.д. в промежуточной фазе культивирования.
Затем определяли концентрацию каротиноида, концентрацию глюконовой кислоты и содержание PHB в расчете на сухие клетки после завершения культивирования. Результаты представлены в таблице 8. Для сравнения, в таблице 8 также представлены результаты культивирования, полученные путем поддержания концентрации растворенного кислорода в промежуточной фазе культивирования на постоянном уровне 2 м.д. без добавления биотина.
Таблица 8
Концентрация биотина
0,1 мг/л
0
Условия с изменением концентрации растворенного кислорода
2 м.д. (постоянная)
2 м.д. (постоянная)
Кантаксантин, мг/л
1,7
3,3
Астаксантин, мг/л
7,5
6,9
Адониксантин, мг/л
1,8
2,0
Кантаксантин/астаксантин, % масс.
22,7
47,8
Адониксантин/астаксантин, % масс.
24,0
29,0
Глюконовая кислота, г/л
17
40
РНВ, % масс.
18
29
Пример 6
Бактериальный штамм Paracoccus A-581-1 (FERM BP-4671) подвергали мутации путем облучения ультрафиолетом. В соответствии с этим, отбирали колонию, имеющую ярко-красную окраску. Затем анализировали каротиноиды в культуральной жидкости выбранного штамма. Таким образом, был отобран мутантный штамм К-185, обладающий улучшенной способностью продуцировать астаксантин.
Сто миллилитров среды (имеющей следующий состав: сахароза: 30 г/л; жидкий кукурузный сироп: 30 г/л; дигидрофосфат калия: 1,5 г/л; додекагидрат бифосфата натрия: 3,8 г/л; дигидрат хлорида кальция: 5 г/л; гептагидрат сульфата магния: 0,7 г/л; и гептагидрат сульфата железа: 0,3 г/л (pH 7,2)) выливали в 500-миллилитровую коническую колбу с ватной пробкой и стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 20 минут, в результате чего приготавливали колбу, содержащую среду для посева.
Затем, 2,0 л среды (имеющей следующий состав: глюкоза: 30 г/л; соевая мука: 20 г/л; сульфат аммония: 1,5 г/л; дигидрофосфат калия: 1,5 г/л; додекагидрат бифосфата натрия: 3,8 г/л; дигидрат хлорида кальция: 5 г/л; гептагидрат сульфата магния: 0,7 г/л; гептагидрат сульфата железа: 0,6 г/л; моногидрат L-моноглутамата натрия: 6 г/л; и пеногаситель на основе сложного эфира: 0,2 г/л) выливали в 5-литровый ферментер. Затем в ферментер добавляли D-биотин до концентрации 1 мг/л, и полученное вещество стерилизовали в автоклаве при 121°C в течение 30 минут.
Платиновую петлю с культурой бактериального штамма Paracoccus К-185, отобранного как описано выше, вносили в среду для посева, содержащуюся в колбе, приготовленной как описано выше, а затем осуществляли культивирование на роторном шейкере при 150 об/мин и при 27°C в течение 2 дней. Затем, культуральную жидкость (80 мл) выливали в ферментер для культивирования в аэробных условиях при 28°C с объемом аэрации 1% об./мин в течение 120 часов. Во время культивирования, pH постоянно поддерживали при 7,2 путем добавления 15% аммиачной воды. На 1-й, 2-й, 3-й и 4-й дни культивирования добавляли глюкозу (30 г) для предотвращения дефицита глюкозы. Кроме того, число вращательных движений изменяли (наименьшее число вращательных движений: 200 об/мин) для поддержания концентрации растворенного кислорода в культуральной жидкости на уровне 3,5 м.д. в промежуточной фазе культивирования.
Затем определяли концентрацию каротиноида, концентрацию глюконовой кислоты и содержание PHB в расчете на сухие клетки после завершения культивирования. Результаты представлены в таблице 9. Для сравнения, в таблице 9 также представлены результаты культивирования, полученные путем поддержания концентрации растворенного кислорода в промежуточной фазе культивирования на уровне 3,5 м.д. без добавления биотина.
Таблица 9
Концентрация биотина
1 мг/л
0
Условия с изменением концентрации растворенного кислорода
3,5 м.д. (постоянная)
3,5 м.д. (постоянная)
Кантаксантин, мг/л
2,2
6,0
Астаксантин, мг/л
39,0
35,2
Адониксантин, мг/л
29,6
28,9
Кантаксантин/астаксантин, % масс.
5,6
17,0
Адониксантин/астаксантин, % масс.
75,9
82,1
Глюконовая кислота, г/л
19
38
РНВ, % масс.
15
33
Все цитируемые здесь публикации, патенты и патентные заявки во всей своей полноте вводятся в настоящее описание посредством ссылки.
0-1
Форма РСТ/RO/134 (SAFE)Данные, относящиеся к депонированному(ым) микроорганизму(ам) или к другому биологическому материалу (в соответствии с правилом РСТ 13(2))
0-1-1
Готовность к применению
JPO-PASi172
0-2
Международная заявка №
0-3
Регистрационный номер заявителя или агента
PH-4733-PCT
1
Данные, представленные ниже, относятся к депонированному(ым) микроорганизму(ам) или к другому биологическому материалу, описанному в настоящей заявке:
1-1
Параграф
0052
1-3
Идентификация депозита
1-3-1
Название депозитария
IPOD Международный депозитарий патентованных микроорганизмов, Национальный институт передовых промышленных наук и технологий (AIST)
1-3-2
Адрес депозитария
AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japan
1-3-3
Дата депонирования
27 апреля 1993 (27.04.1993)
1-3-4
Регистрационный номер
IPOD FERM BP-4283
1-5
Договаривающиеся страны, для которых представлены данные
Все договаривающиеся страны
2
Данные, представленные ниже, относятся к депонированному(ым) микроорганизму(ам) или к другому биологическому материалу, описанному в настоящей заявке:
2-1
Параграф
0054
2-3
Идентификация депозита
2-3-1
Название депозитария
IPOD Международный депозитарий патентованных микроорганизмов, Национальный институт передовых промышленных наук и технологий (AIST)
2-3-2
Адрес депозитария
AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japan
2-3-3
Дата депонирования
20 мая 1994 (20.05.1994)
2-3-4
Регистрационный номер
IPOD FERM BP-4671
2-5
Договаривающиеся страны, для которых представлены данные
Все договаривающиеся страны
Только для принимающего ведомства
0-4
Эта форма соответствует Международной заявке: (да или нет)
0-4-1
Уполномоченное должностное лицо
0-5
Эта форма была принята Международным патентным ведомством
0-5-1
Уполномоченное должностное лицо