ПОЛИПЕПТИДЫ
POLYPEPTIDES

Область настоящего изобретения
Настоящее раскрытие относится к классу сконструированных полипептидов со связывающей аффинностью к альбумину. Оно также относится к новым способам и применениям, в которых используется связывание этих и других соединений с альбумином в разных контекстах, некоторые из которых имеют значимость для лечения заболевания у млекопитающих, включая людей.
Предпосылки к созданию настоящего изобретения
Сывороточный альбумин
Сывороточный альбумин представляет собой имеющийся в наибольшем изобилии белок в сыворотках млекопитающих (40 г/л; примерно 0,7 мМ у людей), и одной из его функций является связывание молекул, таких как липиды и билирубин (Peters, Advances in Protein Chemistry 37:161, 1985). Сывороточный альбумин лишен любой ферментативной или иммунологической функции. Более того, человеческий сывороточный альбумин (HSA) является природным переносчиком, вовлеченным в эндогенный перенос и доставку многочисленных природных а также терапевтических молекул (Sellers and Koch-Weser, Albumin Structure. Function and Uses, eds Rosenoer et al, Pergamon, Oxford, p 159. 1977). Время полужизни сывороточного альбумина прямо пропорционально размеру животного, причем, например, человеческий сывороточный альбумин имеет время полужизни 19 дней, а сывороточный альбумин кролика имеет время полужизни приблизительно 5 дней (McCurdy et al, J Lab Clin Med 143:115, 2004). HSA широко распространен по всему организму, в частности, в интерстициальном и кровеносном компартментах, где он главным образом вовлечен в поддержание осмолярности. Структурно альбумины представляют собой одноцепочечные белки, включающие три гомологичных домена и, в общей сложности, 584 или 585 аминокислот (Dugaiczyk el: al, Proc Nati Acad Sci USA 79:71, 1982). Альбумины содержат 17 дисульфидных мостиков и отдельный реакционно-способный тиол, цистеин в положении 34, но лишены N-связанных и O-связанных углеводных остатков (Peters, 1985, supra; Nicholson et al, Br J Anaesth 85:599, 2000).
Слияние или ассоциация с HSA приводит к увеличенному времени полужизни белков in vivo
Сообщалось о нескольких стратегиях либо ковалентного присоединения белков непосредственно к сывороточным альбуминам, либо к пептиду или белку, который даст возможность in vivo ассоциации с сывороточными альбуминами. Примеры последнего подхода были описаны, например, в документе W091/01743, в документе WO 01/45746 и в Dennis et al (J Biol Chem 277:35035-43, 2002). В первом документе описывается inter alia применение альбумин-связывающих пептидов или белков, полученных из белка G (SpG) стрептококка, для увеличения времени полужизни других белков. Идея состоит в том, чтобы слить полученный из бактерий альбумин-связывающий пептид/белок с представляющим терапевтический интерес пептидом/белком, который, как было показано, быстро элиминируется из крови. Таким образом, созданный гибридный белок связывается с сывороточным альбумином in vivo и приобретает преимущества благодаря своему более длинному периоду времени полужизни, который увеличивает общее время полужизни слитого представляющего терапевтический интерес пептида/белка. WOO 1/45746 и Dennis et al относятся к той же самой концепции, но в данном случае авторы используют относительно короткие пептиды для связывания сывороточного альбумина. Пептиды выбирали из библиотеки пептидов полученной с помощью фагового дисплея. В Dennis et al, упоминается ранняя работа, в которой было обнаружено усиление иммунологического ответа на рекомбинантное слияние альбумин-связывающего домена белка G стрептококка с человеческим комплементарным рецептором типа 1. Заявка на патент США, опубликованная как US 2004/0001827 (Dennis), также раскрывает применение конструкций, включающих пептидные лиганды, снова идентифицированные с применением метода фагового дисплея, которые связываются с сывороточным альбумином и которые конъюгированы с биоактивными соединениями для направленной доставки терапевтического соединения в область опухоли.
Альбумин-связывающие домены бактериальных рецепторных белков
Белок G стрептококка (SpG) является бифункциональным рецептором, присутствующим на поверхности определенных штаммов стрептококков и способным к связыванию как с IgG, так и сывороточным альбумином (Bjorck et al, Mol Immunol 24:1113, 1987). Структура является в высокой степени повторяющейся с несколькими структурно и функционально разными доменами (Guss et al, EMBO J 5:1567, 1986), более точно три Ig-связывающие домена и три домена, связывающие сывороточный альбумин (Olsson et al, Eur J Biochem 168:319, 1987). Была определена, структура одного из трех доменов, связывающих сывороточный альбумин в SpG, показывающая укладку в пучок из трех спиралей (Kraulis et al, FEBS Lett 378:190, 1996, Johansson et al, J. Biol. Chem. 277:8114-20, 2002). Мотив из 46 аминокислот определили как ABD ((albumin binding domain) альбумин-связывающий домен) и впоследствии также обозначили как G148-GA3 (GA - для связывания альбумина с G-родственным белком). Например, в документе WO 09/016043 раскрыты альбумин-связывающие варианты из мотива ABD из 46 аминокислот.
Также идентифицировали другие бактериальные альбумин-связывающие домены отличные от таковых в белке G, некоторые из которых структурно похожи на таковые белка G. Примерами белков, содержащих такие альбумин-связывающие домены, являются РАВ, PPL, MAG и ZAG белки (Rozak et al. Biochemistry 45:3263-3271, 2006). Исследования структуры и функции таких альбумин-связывающих доменов провели и опубликовали, например, Johansson с сотрудниками (Johansson et al, J Mol Biol 266:859-865, 1997). Более того, Rozak et а1 сообщили о создании искусственных вариантов G148-GA3, которые были выбраны и исследованы в отношении специфичности и стабильности у разных видов (Rozak et а1, Biochemistry 45:3263-3271, 2006), тогда как Jonsson et al разработали искусственные варианты G148-GA3 с гораздо более улучшенной аффинностью к человеческому сывороточному альбумину (Jonsson et al, Prot Eng Des Sel 21:515-27, 2008). Для некоторых вариантов достигли более высокой аффинности за счет сниженной термостабильности.
В дополнение к белкам, содержащим три спирали, описанным выше, существуют также другие неродственные бактериальные белки, которые связывают альбумин.
ABD и иммунизация
За последнее время несколько Т- и В-клеточных эпитопов были экспериментально идентифицированы в пределах альбумин-связывающей области белка G штамма стрептококка 148 (G148) (Goetsch et al, Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32, 2003). Авторы в основе исследования интересовались использованием Т-клеточных эпитопов G148 в вакцинах, т.е. чтобы использовать врожденное иммуностимулирующее свойство альбумин-связывающей области. Goetsch et al дополнительно обнаружили В-клеточный эпитоп, т.е. область, связываемую антителом после иммунизации, в последовательности G148.
В фармацевтических композициях для введения человеку иммунный ответ является нежелательным. Таким образом, альбумин-связывающий домен G148 является как таковой непригодным для применения в таковых композициях вследствие вышеупомянутых иммуностимулирующих свойств.
Описание
Вышеупомянутые недостатки и неточности предыдущего уровня техники преодолеваются или уменьшаются в первом аспекте альбумин-связывающим полипептидом, включающим аминокислотную последовательность, выбранную из:
3
6
7
10
14
26
39
40
43
44
i) LAXAKXXANX ELDXYGVSDF YKRLIXKAKT VEGVEALKXXILXXLP,
где независимо друг от друга
3
Х выбран из Е, S, Q и С;
6
Х выбран из Е, S и С;
7
Х выбран из А и S;
10
Х выбран из А, S и R;
14
X выбран из А, S, С и K;
26
Х выбран из D и Е;
39
Х выбран из D и Е;
40
Х выбран из А и Е;
43
Х выбран из А и K;
44
Х выбран из А, S и Е;
L в положении 45 присутствует или отсутствует; и
Р в положении 46 присутствует или отсутствует;
и
ii) аминокислотной последовательности, которая имеет по меньшей мере 95 % идентичности с последовательностью, определяемой в i).
Определенный выше класс родственных по последовательностям полипептидов со связывающей аффинностью к альбумину получают из общей исходной полипептидной последовательностью, которая укладывается в домен с пучком из трех альфа-спиралей. Более конкретно, полипептиды, которые описаны выше, получают из построения модели на основе структуры комплекса между сывороточным альбумином и альбумин-связывающим доменом G148-GA3 (Lejon et al, J Biol Chem 279:42924-8, 2004), а также анализов связывания и структурных свойств ряда мутационных вариантов общей исходной полипептидной последовательности. Определенная выше аминокислотная последовательность i) включает аминокислотные замещения по сравнению с исходной полипептидной последовательностью, которые в результате дают класс полипептидов, которые, как предполагается, укладываются в почти идентичный домен с пучком из трех спиралей. Несмотря на то, что исходная полипептидная последовательность уже включает поверхность связывания для взаимодействия с альбумином, эту поверхность связывания модифицируют посредством некоторых из замещений согласно вышеприведенному определению. Замещения согласно вышеприведенному определению обеспечивают улучшенную альбумин-связывающую способность по сравнению с исходной полипептидной последовательностью.
Альбумин-связывающие полипептиды согласно первому аспекту настоящего раскрытия проявляют ряд характеристик, которые, например, делают их пригодными для применения в качестве партнеров слияния или конъюгации для терапевтических молекул для введения человеку. Альбумин-связывающие полипептиды согласно настоящему раскрытию демонстрируют, например, по сравнению с родственными альбумин-связывающими полипептидами, такими как альбумин-связывающий домен G148-GA3, и альбумин-связывающими полипептидами, раскрытыми в документе WO 09/016043, по меньшей мере пять из следующих шести характеристик:
- полипептиды проявляют другую поверхность в сравнении с; например, G148-GA3 и другие полученные из бактерий альбумин-связывающие домены. Различие может снизить или устранить любой риск в отношении реакций с участием антител у субъекта, такого как человек, которого предварительно подвергали воздействию таких бактериальных белков;
- полипептиды включают меньшее количество потенциальных Т-клеточных эпитопов чем, например, G148-GA3 и другие родственные, но отличные мутационные варианты общей исходной полипептидной последовательности, и, в связи с этим, проявляют низкую иммуногенность при введении субъекту, такому как человек;
- полипептиды проявляют более низкую реактивность с циркулирующими антителами при введении субъекту, такому как человек. Таким образом, путем аминокислотного замещения в поверхности полипептидов, подвергающихся воздействию циркулирующих антител, т.е. в полипептидной поверхности, не вовлеченной в связывающее взаимодействие с альбумином. перекрестная реактивность антител снижена по сравнению с, например, перекрестной реактивностью антител, вызванной G148-GA3, как измерено в ряде тестов человеческих сывороток;
D
off
- полипептиды обладают высокой альбумин-связывающей способностью, как исходя из более высокой связывающей аффинности, определяемой К-значением, так и исходя из более медленной скорости диссоциации, определяемой k-значением, чем, например, известные встречающиеся в природе альбумин-связывающие полипептиды, такие как альбумин-связывающие домены, полученные из бактериальных белков;
- полипептиды включают меньшее количество аминокислотных остатков, которые ассоциированы с проблемами стабильности полипептидов, чем, например, известные встречающиеся в природе альбумин-связывающие полипептиды, такие как альбумин-связывающие домены, полученные из бактериальных белков. Таким образом, полипептиды не включают, например, подверженные окислению метионины или триптофаны, а только один аспарагин;
- полипептиды имеют более высокую структурную стабильность, определяемую по точке плавления свыше 55С, чем предыдущие альбумин-связывающие полипептиды, такие как те, что раскрыты в документе WO 09/016043.
В одном варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид согласно первому аспекту проявляет все шесть из вышеперечисленных характеристик. В другом варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид согласно первому аспекту проявляет при связывании с альбумином более гидрофильный профиль чем, например, предыдущие альбумин-связывающие полипептиды, такие как те, что раскрыты в WO 09/016043. Поверхность альбумин-связывающего полипептида, которая подвергается воздействию окружающей среды, когда полипептид взаимодействует с альбумином, включает меньшее количество аминокислотных остатков, которые придают поверхности гидрофобность.
Специалист в данной области техники поймет, что функция любого полипептида, такая как альбумин-связывающая способность полипептидов согласно первому аспекту, зависит от третичной структуры полипептида. Однако возможно внести изменения в последовательность аминокислот в α-спиральном полипептиде не воздействуя на его структуру (Taverna and Goldstein, J Mol Biol 315(3):479-84, 2002; He et al, Proc Natl Acad Sci USA 105(38): 14412-17, 2008). Таким образом, модифицированные варианты i), которые являются таковыми, что полученная результирующая последовательность по меньшей мере на 95% идентична последовательности, принадлежащей классу, определяемому i), также охвачены первым аспектом. Например, возможно, что аминокислотный остаток, принадлежащей определенной функциональной группе аминокислотных остатков (например, гидрофобный, гидрофильный, полярный и т.д.) можно было бы заменить на другой аминокислотный остаток из той же самой функциональной группы.
Выражение "% идентичный" или "% идентичности", применяемое в описании и формуле изобретения, определяют, как указано далее. Запрашиваемую выравнивают последовательность с целевой последовательностью с использованием алгоритма CLUSTAL W (Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994)). Сравнение делают по окну, соответствующему самым коротким из выровненных последовательностей. Самые короткие из выровненных последовательностей могут в некоторых случаях быть целевой последовательностью, такой как альбумин-связывающий полипептид, раскрываемый в настоящем документе. В других случаях запрашиваемая последовательность может составлять самую короткую из выровненных последовательностей. Запрашиваемая последовательность может, например, состоять из по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, как, например, по меньшей мере 20 аминокислотных остатков, как, например, по меньшей мере 30 аминокислотных остатков, как, например, по меньшей мере 40 аминокислотных остатков, например 45 аминокислотных остатков. Сравнивают аминокислотные остатки в каждом положении, а процент положений в запрашиваемой последовательности, которые имеют идентичные соответствия в целевой последовательности, описывают как % идентичности.
6
В одном варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно первому аспекту Х представляет собой Е.
3
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой S.
3
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой Е.
7
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой А.
14
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой S.
10
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой С.
10
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой А.
10
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой S.
26
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой D.
26
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой Е.
39
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой D.
39
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой Е.
40
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой А.
43
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой А.
44
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой А.
44
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту Х представляет собой S.
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту остаток L в положении 45 присутствует.
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту остаток Р в положении 46 присутствует.
В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида согласно этому аспекту остаток Р в положении 46 отсутствует.
В другом варианте осуществления объектом является альбумин-связывающий полипептид согласно этому аспекту с оговоркой, что Х7 не является ни L, ни, Е, ни D.
14
3
6
14
Альбумин-связывающий полипептид согласно первому аспекту можно получить для конъюгирования с пригодным партнером для конъюгирования путем замены доступных внешних аминокислотных остатков либо на, например, цистеин, либо на лизин. Эти замены можно ввести в N-концевую спираль, т.е. спираль один, полипептида, которая представляет собой спираль, расположенную дальше всего от сывороточного альбумина, когда альбумин-связывающий полипептид связывается с сывороточным альбумином. Таким образом, остаток лизина в положении X определяемой последовательности в i) можно использовать, чтобы сделать возможным сайт-направленное конъюгирование. Это, более того, может быть преимущественным, когда молекулу получают путем химического синтеза пептидов, поскольку можно использовать ортогональную защиту эпсилон-аминогруппы указанного лизина. Более того, остаток цистеина можно вводить в аминокислотную последовательность, чтобы сделать возможным сайт-направленное конъюгирование. Например, остаток цистеина можно вводить в любое из положений Х, X и/или X в соответствии с вышеприведенным определением.
Связывание партнера для конъюгирования с эпсилон- аминогруппой лизина или тиоловой группой цистеина представляет две разные с химической точки зрения альтернативы для получения сайт-направленного конъюгирования с использованием аминокислотного остатка в пределах аминокислотной последовательности i). Как понятно специалисту в данной области техники, существуют другие химические альтернативы для получения аминокислотной последовательности для конъюгирования, и находятся как таковые также в пределах объема настоящего раскрытия. Одним примером такой химии является клик-химия, которая становится возможной благодаря введению тирозина, как представлено Ban et al (J Am Chem Soc 132:1523-5, 2009).
D
D
Выражения "связывание альбумина" и "связывающая аффинность к альбумину", применяемые в этом описании, относятся к свойству полипептида, которое можно протестировать, например, путем применения технологии поверхностного плазменного резонанса, как, например, на приборе Biacore. Например, как описано в примерах ниже, аффинность связывания альбумина можно протестировать в эксперименте, в котором альбумин или его фрагмент иммобилизирован на сенсорном чипе прибора, а образец, содержащий полипептид, который следует протестировать, пропускают через чип. В качестве альтернативы, полипептид, который следует протестировать, иммобилизирован на сенсорном чипе прибора, а образец, содержащий альбумин или его фрагмент, пропускают через чип. Альбумин может в этом отношении быть сывороточным альбумином млекопитающего, как, например, человеческий сывороточный альбумин. Специалист в данной области техники может затем интерпретировать результаты, полученные посредством таких экспериментов, чтобы установить по меньшей мере качественный показатель связывающей аффинности полипептида к альбумину. Если необходим количественный показатель, например, чтобы определить K-значение для взаимодействия, можно также применять способы поверхностного плазменного резонанса. Значения для связывания можно, например, определить на приборе Biacore2000 (GE Healthcare). Альбумин иммобилизуют надлежащим образом на сенсорном чипе для измерения, а образцы полипептида, чью аффинность следует определить, получают путем серийного разведения и впрыскивают. Значения K можно затем вычислить из результатов с применением, например, модели связывания 1:1 Ленгмюра на программном обеспечении BIAevaluation 4.1, поставляемым изготовителем прибора (GE Healthcare).
off
-5
-1
-6
-1
В одном варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид согласно этому аспекту связывается с альбумином, так что k значение взаимодействия составляет не более 5×10 с, как, например, не более 5×10 с.
Как описано выше, альбумин-связывающие полипептиды, которые определены аминокислотной последовательностью i), получают из общей исходной полипептидной последовательности, которая укладывается в домен с пучком из трех альфа-спиралей. В одном варианте осуществления домен из трех спиралей этой исходной полипептидной последовательности образует часть белка G из штамма G148 Streptococcus, в частности, домен СА3.
В другом варианте осуществления аминокислотная последовательность альбумин-связывающего полипептида выбрана из любой из SEQ ID NO:1-144 и SEQ ID NO:164-203, как например, выбрана из любой из SEQ ID NO:1-144. Более конкретно, аминокислотная последовательность выбрана из SEQ ID NO:4-5, SEQ ID NO:7-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO:13-14, SEQ ID NO:16-17, SEQ ID NO:19-20, SEQ ID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42, SEQ ID NO:49-50, SEQ ID NO:164-170 и SEQ ID NO:192-203. Таким образом, аминокислотную последовательность можно выбрать из SEQ ID NO:4-5, SEQ ID NO:7-8, SEQ ID NO:10-11, SEQ ID NO:13-14, SEQ ID NO:16-17, SEQ ID NO:19-20, SEQ ID NO:22-23, SEQ ID NO:25-26, SEQ ID NO:28-29, SEQ ID NO:31-32, SEQ ID NO:34-35, SEQ ID NO:37-38, SEQ ID NO:41-42 и SEQ ID NO:49-50.
В одном варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид согласно этому аспекту дополнительно включает один или несколько дополнительных аминокислотных остатков, расположенных на N- и/или С-конце последовательности, определяемой в i). Эти дополнительные аминокислотные остатки могут играть роль в усилении связывания альбумина полипептидом и улучшении конформационной стабильности уложенного альбумин-связывающего домена, но могут с таким же успехом служить для других целей, связанных, например, с одной или несколькими из получения, очистки, стабилизации in vivo или in vitro, присоединения, мечения или детекции полипептида, а также любой их комбинации. Такие дополнительные аминокислотные остатки могут включать один или несколько из аминокислотного остатка (остатков), присоединенных в целях химического присоединения, например, к хроматографической смоле, чтобы получить аффинную матрицу, или к хелатирующему фрагменту для комплексообразования с радиометаллом.
Аминокислоты непосредственно предшествующие или следующие за альфа-спиралью на N- или С-конце аминокислотной последовательности i) могут, таким образом, в одном варианте осуществления влиять на конформационную стабильность. Одним примером аминокислотного остатка, который может способствовать улучшенной конформационной стабильности, является остаток серина, расположенный на N-конце аминокислотной последовательности i), как определено выше. N-концевой остаток серина может в некоторых случаях образовывать канонический S-X-Х-Е кэппирующий бокс, путем вовлечения образования водородной связи между гамма-кислородом серинсодержащей боковой цепи и NH остатка глутаминовой кислоты полипептидного остова. Это N-концевое кэппирование может способствовать стабилизации первой альфа-спирали домена из трех спиралей, входящего в состав альбумин-связывающего полипептида согласно первому аспекту настоящего раскрытия.
Таким образом, в одном варианте осуществления дополнительные аминокислоты включают по меньшей мере один остаток серина на N-конце полипептида. Аминокислотной последовательности, другими словами, предшествует один остаток или несколько остатков серина. В другом варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида дополнительные аминокислоты включают остаток глицина на N-конце полипептида. Понятно, что аминокислотной последовательности i) может предшествовать один, два, три, четыре или любое подходящее количество аминокислотных остатков. Таким образом, аминокислотной последовательности может предшествовать одиночный остаток серина, одиночный остаток глицина или комбинация из двух, как, например, комбинация глицина-серина (GS) или комбинация глицина-серина-серина (GSS). Примеры альбумин-связывающих полипептидов, включающих дополнительные амино-остатки на N-конце, изложены в SEQ ID NO:145-163, как, например, в SEQ ID NO:145-148 и SEQ ID NO:162-163. Еще в другом варианте осуществления дополнительные аминокислотные остатки включают глутаминовую кислоту на N-конце полипептида, как определено последовательностью i).
Подобным образом, С-концевое кэппирование можно использовать, чтобы улучшить стабильность третьей альфа-спирали домена из трех спиралей, входящего в состав альбумин-связывающего полипептида. Остаток пролина, если присутствует на С-конце аминокислотной последовательности, определяемой в i), может по меньшей мере частично функционировать в качестве кэппирующего остатка. В этом случае остаток лизина после остатка пролина на С-конце может способствовать дополнительной стабилизации третьей спирали альбумин-связывающего полипептида посредством образования водородной связи между эпсилон-аминогруппой остатка лизина и карбонильными группами аминокислот, локализованных за два и три остатка до лизина в полипептидном остове, например, если присутствуют как L45, так и Р46, карбонильные группы остатков лейцина и аланина аминокислотной последовательности, определяемой в i). Таким образом, в одном варианте осуществления дополнительные аминокислоты включают остаток лизина на С-конце полипептида.
Как обсуждалось выше, дополнительные аминокислоты могут иметь отношение к получению альбумин-связывающего полипептида. В частности, если альбумин-связывающий полипептид согласно варианту осуществления, в котором Р46 присутствует, получают путем химического синтеза пептидов, то один или несколько факультативных аминокислотных остатков после С-концевого пролина могут обеспечивать преимущества. Такие дополнительные аминокислотные остатки могут, например, предотвращать образование нежелательных веществ, таких как дикетопиперазин, на стадии дипептидов в ходе синтеза. Одним примером такого аминокислотного остатка является глицин. Таким образом, в одном варианте осуществления дополнительные аминокислоты включают остаток глицина на С-конце полипептида, непосредственно после остатка пролина или после дополнительного остатка лизина и/или глицина, как рассматривалось выше. В качестве альтернативы, получение полипептидов может извлекать пользу от амидирования С-концевого остатка пролина аминокислотной последовательности i), если присутствует. В данном случае С-концевой пролин включает дополнительную аминогруппу на углероде карбоксильной группы. В одном варианте осуществления полипептидов, описанных в настоящем документе, в особенности тех, которые заканчиваются пролином на их С-конце или другой аминокислотой, которая, как известно, рацемизируется на протяжении синтеза пептидов, вышеупомянутое присоединение глицина к С-концу или амидирование пролина, если присутствует, может также противодействовать потенциальным проблемам с рацемизацией С-концевого аминокислотного остатка. Если полипептид, амидированный таким способом, предназначен для получения посредством рекомбинантных способов, а не посредством химического синтеза, амидирование С-концевой аминокислоты можно осуществить посредством нескольких способов, известных в настоящем уровне техники, например, через применение амидирующего РАМ-фермента.
Примеры альбумин-связывающих полипептидов, включающие дополнительные аминокислотные остатки на С-конце, изложены в SEQ ID NO:145-152, как, например, в SEQ ID NO:148-150. Специалист в данной области техники осведомлен о способах выполнения С-концевой модификации, как, например, посредством разных типов предварительно изготовленных матриц для синтеза пептидов.
В другом варианте осуществления дополнительные аминокислотные остатки включают остаток цистеина на N- и/или С-конце полипептида. Такой остаток цистеина может непосредственно предшествовать и/или следовать за аминокислотной последовательностью, как определено в i) или может предшествовать и/или следовать за любыми другими дополнительными аминокислотными остатками, как описано выше. Примеры альбумин-связывающих полипептидов, включающих остаток цистеина на N- и/или С-конце полипептидной цепи, изложены в SEQ ID NO:149-150 (С-конец) и SEQ ID NO:151-152 (N-конец). Путем присоединения остатка цистеина к полипептидной цепи можно получить тиоловую группу для сайт-направленного конъюгирования альбумин-связывающего полипептида. В качестве альтернативы можно вводить остаток селеноцистеина на С-конце полипептидной цепи похожим образом, как для введения остатка цистеина, чтобы облегчить сайт-специфичное конъюгирование (Cheng et al, Nat Prot 1:2, 2006).
В одном варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид включает не более двух остатков цистеина. В другом варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид включает не более одного остатка цистеина.
В другом варианте осуществления дополнительные аминокислотные остатки альбумин-связывающего полипептида включают "метку" для очистки или детекции полипептида, такую как гексагистидиловую (Hise) метку, или "myc" ("с-Мус") метку, или "FLAG" метку для взаимодействия с антителами, специфичными к метке и/или, чтобы применять ее в очистке. Специалист в данной области техники осведомлен о других альтернативах.
Еще в другом варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид согласно этому аспекту связывается с человеческим сывороточным альбумином. В других вариантах осуществления альбумин-связывающий полипептид связывается с альбумином других видов, отличных от человеческого вида, как, например, альбумином мыши, крысы, собаки и яванских макак.
"Дополнительные аминокислотные остатки", обсуждаемые выше, могут также составлять один полипептидный домен или несколько полипептидных доменов с любой необходимой функцией, как например, с такой же функцией связывания, как у первого альбумин-связывающего домена, или другой функцией связывания, или терапевтической функцией, или ферментативной функцией, или флюресцентной функцией и их комбинациями.
Следовательно, в другом, родственном аспекте приведен гибридный белок или конъюгат, включающий
i) Первый фрагмент, состоящий из альбумин-связывающего полипептида согласно первому аспекту, который описан в настоящем документе; и
ii) Второй фрагмент, состоящий из полипептида с требуемой биологической активностью.
Гибридный белок или конъюгат, включающий альбумин-связывающий полипептид согласно первому аспекту раскрытия и второй фрагмент, может увеличить in vitro и/или in vivo время полужизни второго фрагмента по сравнению с in vivo временем полужизни второго фрагмента per se. В результате этого, если гибридный белок или конъюгат согласно этому аспекту вводят субъекту, такому как человеческий субъект, in vivo воздействие второго фрагмента может усилиться, что может привести к улучшенной эффективности биологической активности второго фрагмента по сравнению с эффективностью in vivo воздействия второго фрагмента при введении самого по себе.
Необходимой биологической активностью может, например, быть терапевтическая активность, активность связывания или ферментативная активность. Если необходимая биологическая активностью представляет собой терапевтическую активность, второй фрагмент, проявляющий эту активность, может быть терапевтически активным полипептидом. Неограничивающими примерами терапевтически активных полипептидов являются биомолекулы, такие как молекулы, выбранные из группы, состоящей из человеческих эндогенных ферментов, гормонов, факторов роста, хемокинов, цитокинов и лимфокинов, и не относящихся к человеку биологически активных белков, таких как белки, выбранные из группы, состоящей из бактериальных токсинов (например, экзотоксин синегнойной палочки и стафилококковые или стрептококковые суперантигены), ферментов (например, РНКаза и бета-лактамаза) и активирующих белков (например, стрептокиназа). Неограничивающие примеры терапевтически активных биомолекул, которые могут оказаться полезными при слиянии или конъюгировании с альбумин-связывающм полипептидом, выбраны из группы, состоящей из IL-2, GLP-1, BNP (Alb-бета-натрийуретического пептида), IL-1-RA (антагониста рецептора интерлейкина-1), KGF (фактора роста кератиноцитов), Stemgen, гормона роста (GH), G-CSF, CTLA-4; миостатина, фактора VII, фактора VIII и фактора IX.
Неплотно соединенные дефективные кровеносные сосуды опухолевой ткани делают ее сосудистую сеть (эндотелиальный барьер) проницаемой для макромолекул, тогда как в кровеносных сосудах здоровой ткани только небольшие молекулы могут проходить через эндотелиальный барьер. Подобным образом, проницаемость гематоартикулярного барьера для альбумина в воспаленных суставах пациентов с ревматоидным артритом заметно увеличена. Таким образом, гибридные белки или конъюгаты согласно этому аспекту, по-видимому, проникают через кровеносный сосуд в опухолевой ткани и гематоартикулярный барьер в воспаленных суставах.
Если указанная необходимая биологическая активность второго фрагмента представляет собой активность связывания, то указанным вторым фрагментом может быть связывающий полипептид, способный к избирательному взаимодействию с целевой молекулой. Такой связывающий полипептид можно, например, выбрать из группы, состоящей из антител, и фрагментов, и их доменов, в значительной степени сохраняющих связывающую активность антител; микротелец, макротелец, авимеров и других малых связанных дисульфидной связью белков; и связывающих белков, полученных из скаффолда, выбранных из группы, состоящей из белка А стафилококка и его доменов, других трехспиральных доменов, липокалинов, доменов с анкириновым повтором, доменов, связывающих целлюлозу, γ-кристаллинов, зеленого флуоресцентного белка, антигена 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами человека, ингибиторов протеаз, таких как домены Kunitz, PDZ доменов, SH3 доменов, пептидных аптамеров, нуклеазы стафилококка, тендамистатов, домена фибронектина типа III, трансферрина, доменов "цинковых пальцев" и конотоксинов.
В некоторых вариантах осуществления целевую молекулу для связывания указанного целевого связывающего полипептида можно выбрать из группы, состоящей из амилоидного В (АВ) пептида болезни Альцгеймера; других ассоциированных с заболеваниями амилоидных пептидов; токсинов, таких как бактериальные токсины и змеиные яды; факторов свертывания крови, таких как фактор фон Виллебранда; интерлейкинов, таких как IL-13; миостатина; провоспалительных факторов, таких как TNF-α, рецептор TNF-α, IL-1, IL-8 и IL-23; факторов комплемента, таких как С3 и С5; медиаторов гиперчувствительности, таких как гистамин и IgE; опухолевых специфических антигенов, таких как CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD40, CD52, CD70, cMet, HER1, HER2, HER3, HER4, CAIX (карбонангидраза IX), СЕА, рецептор IL-2, MUC1, PSMA, TAG-72; и других биологических молекул, таких как G-CSF, GM-CSF, гормон роста (GH), инсулин и соматостатин.
Как понятно специалисту в данной области техники, альбумин-связывающий полипептид согласно первому аспекту может быть полезным в гибридном белке или в качестве партнера для конъюгирования с любым другим фрагментом. Таким образом, вышеприведенные перечни терапевтически активных полипептидов, связывающих полипептидов и целевых молекул не должны рассматриваться как ограничивающие каким-либо образом.
3
6
14
14
В одном варианте осуществления гибридного белка или конъюгата согласно настоящему раскрытию второй фрагмент конъюгирован с альбумин-связывающим полипептидом через лизиновый или цистеиновый остаток, присоединенный к N- или С-концу альбумин-связывающего полипептида, или через лизиновый или цистеиновый остаток в положении в пределах альбумин-связывающего полипептида, как, например, в положении, выбранном из Х, Х и Х. Если сайт конъюгирования находится в пределах аминокислотной последовательности i) альбумин-связывающего полипептида, как, например, цистеин в положении Х, то никакие дополнительные аминокислоты не нужно присоединять к альбумин-связывающему полипептиду с целью предоставления возможности для конъюгирования со вторым фрагментом. Сайт конъюгирования в пределах полипептидной цепи, определяемой посредством i), может кроме того прикрывать полипептид против перекрестно-реагирующих антител, в частности, участок полипептида, близкий к сайту конъюгирования. Не желая быть привязанными к теории, если конъюгат через альбумин-связывающий полипептид связывается с сывороточным альбумином in vivo, т.е. расположен в связывающем кармане сывороточного альбумина, второй фрагмент, конъюгированный в положении в пределах, например, спирали один домена из трех спиралей, входящего в состав альбумин-связывающего полипептида, вероятно, обращен далеко от сывороточного альбумина с которым связывается альбумин-связывающий полипептид. Кроме того, сайт конъюгирования в пределах альбумин-связывающего полипептида может ухудшать презентацию участка пептидов, в другом случае получаемых из этого участка полипептида, Т-клеткам вследствие, например, влияний на процессинг в антиген-презентирующей клетке, нарушенного соответствия потенциальных пептидов с пептид-связывающей петлей молекулы МСН класса II, и перестроенной пептидной поверхности, доступной для Т-клеточного рецептора (вследствие выпячивания конъюгированного участка). Таким образом, иммуногенность части конъюгата вблизи сайта конъюгирования, как предполагается, становиться дополнительно сниженной после конъюгирования.
Вследствие высокой аффинности между альбумин-связывающим полипептидом настоящего раскрытия и сывороточным альбумином, конъюгатный или гибридный белок, включающий такой альбумин-связывающий полипептид, может рассматриваться в качестве непрямого комплекса с сывороточным альбумином. Конъюгатный или гибридный белок согласно настоящему раскрытию, таким образом, обеспечивает альтернативу для часто применяемого способа использования прямых конъюгатов или продуктов слияния с сывороточным альбумином. Такие прямые конъюгаты с сывороточным альбумином являются часто негомогенными, вне зависимости от того, какой способ применяют для присоединения. Если специфичная молекула присоединяется к сывороточному альбумину через аминогруппу остатка лизина, то любой из большого числа лизинов на поверхности молекулы сывороточного альбумина может подвергаться нацеленному воздействию, которое даст в результате случайный сайт конъюгирования и случайный продукт. Хотя тиоловое присоединение через одиночный неспаренный цистеин в человеческом сывороточном альбумине (в положении 34, Peters, 1985, supra) похоже предлагает альтернативный способ получения прямого конъюгата, такая методология часто не приводит к гомогенному продукту. Только 20-60% молекул в коммерчески доступном (человеческом) сывороточном альбумине демонстрируют свободную тиоловую группу, тогда как остальная часть блокируется тиоловыми соединениями, такими как цистеин, гомоцистеин или глутатион. Наоборот, конъюгирование с доменом из трех спиралей альбумин-связывающего полипептида согласно настоящему раскрытию можно осуществить сайт-специфично. Это можно выполнить, как обсуждалось выше, либо путем присоединения к одному или нескольким цистеинам, к селеноцистеину, либо к обозначенным лизином (ортогонально защищенным на протяжении синтеза).
Согласно этому аспекту настоящего раскрытия второй фрагмент с необходимой биологической активностью можно либо конъюгировать с доменом из трех спиралей альбумин-связывающего полипептида, либо получить как гибридный белок с ним же. Неограничивающий пример конъюгата согласно настоящему раскрытию приводится ниже. Глюкагоноподобный пептид 1 (GLP-1) или его производное представляет собой небольшой полипептид, который может целесообразно присутствовать в качестве второго фрагмента в конъюгате с альбумин-связывающим полипептидом. Конъюгирование GLP-1 с альбумин-связывающим полипептидом можно осуществить в любом из положений полипептидной последовательности, как описано выше. Конъюгат можно как таковой получить не в биологическом процессе и, как предполагается, он продемонстрирует значительно повышенную эффективность по сравнению с эффективностью GLP-1 per se. Конъюгирование можно применять как с небольшими полипептидами или белками, такими как GLP-1, так и с большими полипептидами или белками. Конъюгат согласно настоящему раскрытию может, как правило, включать неаминокислотный спейсерный фрагмент, такой как полиэтиленгликоль (PEG).
Другие полипептиды или белки можно объединить с аминокислотной последовательностью альбумин-связывающего полипептида в форме гибридного белка. Такой гибридный белок может, кроме того, включать один или несколько спейсерных аминокислотных остатков между первым и вторым фрагментами.
Как описано выше, альбумин-связывающий полипептид согласно первому аспекту связывает сывороточный альбумин нескольких видов, включая мышь, крысу, собаку и яванского макака. Таким образом, гибридный белок или конъюгат согласно настоящему раскрытию может способствовать усилению биологического эффекта второго фрагмента не только у человека, но также на животных моделях. Ряд эндогенных белков были получены в качестве прямых слияний с человеческим сывороточным альбумином, примеры таких белков включают G-CSF, GH, интерфероны, CD4, IL-2, инсулин, глюкагон, GLP-1, Fab-фрагменты антител и ингибиторы протеаз, подобные белкам, полученным из Kunitz-доменов. Такие прямые слияния нельзя, однако, полностью оценить на животных моделях. Это происходит вследствие того, что человеческий сывороточный альбумин не взаимодействует надлежащим образом с эндогенным неонатальным Fc-рецептором (FcRn), например, в широко применяемых животных моделях, мышь и крыса, и что это взаимодействие является важным фактором, способствующим длительному времени циркуляции сывороточного альбумина. Как описано выше, конъюгат или гибридный белок согласно настоящему раскрытию может, в присутствии сывороточного альбумина, объединяться с альбумином и функционировать в качестве продукта непрямого слияния с альбумином. Это делает конъюгат или гибридный белок, включающий альбумин-связывающий полипептид согласно первому аспекту, полезным в предклинических модельных видах с условием, что второй фрагмент биологически активен в выбранных видах.
В одном варианте осуществления приведен гибридный белок или конъюгат, включающий дополнительный фрагмент, состоящий из полипептида с дополнительной, необходимой биологической активностью, которая может быть такой же или отличной от таковой второго фрагмента. Один конкретный пример такого гибридного белка или конъюгата включает терапевтически активный полипептид, который определен выше как второй фрагмент, и связывающий полипептид, который определен выше как дополнительный фрагмент.
В отношении вышеприведенного описания гибридных белков или конъюгатов со встроенным альбумин-связывающим полипептидом согласно первому аспекту, следует отметить, что обозначение первого, второго и дополнительного фрагментов делают для ясности, чтобы провести различие между альбумин-связывающим полипептидом или полипептидами согласно настоящему раскрытию с одной стороны, и фрагментами, проявляющими другие функции с другой стороны. Не подразумевается, что эти обозначения относятся к фактическому порядку разных доменов в полипептидной цепи гибридного белка или конъюгата. Таким образом, например, указанный первый фрагмент может без ограничения обнаруживаться на N-конце, посредине или на С-конце гибридного белка или конъюгата.
В связанном с этим аспекте приведен альбумин-связывагощий полипептид, гибридный белок или конъюгат, как определено в настоящем раскрытии, дополнительно включающий органическую молекулу, такую как цитотоксическое средство. Неограничивающие примеры цитотоксических средств, которые можно слить или конъюгировать с альбумин-связывающим полипептидом согласно первому аспекту, или объединить со гибридным белком или конъюгатом согласно второму аспекту, выбирают из калихеамицина, ауристатина, доксорубицина, майтанзиноида, гаксола, эктеинасцидина, гелданамицина, метотрексата, и их производных; и их комбинаций. Ранее, попытки предпринимали для лечения различных нарушении с помощью прямых конъюгатов альбумина. Такие прямые конъюгаты альбумина были использованы, например, с доксорубицином при раке (Kratz et al, J Med Chem 45: 5523-33, 2002) и метогрексатом при ревматоидном артрите (Wunder et al, J Immunol 170:4793-4801, 2003). Следует понимать, что альбумин-связывающий полипептид, либо сам по себе, либо как фрагмент в гибридном белке или конъюгате, посредством своей высокой альбумин-связывающей способности обеспечивает непрямые средства конструирования альбуминовых комплексов и, таким образом, может обеспечить альтернативный способ лечения в сравнении с попытками, упомянутыми выше.
Вышеприведенные аспекты, кроме того, охватывают полипептиды. в которых альбумин-связывающий полипептид согласно первому аспекту или альбумин-связывающий полипептид, в виде включенного в гибридный белок или конъюгат согласно второму аспекту, обеспечивали меченой группой, как, например, меткой, выбранной из группы, состоящей из флуоресцентных красителей и металлов, хромофорных красителей, хемилюминесцентных соединений и биолюминесцентных белков, ферментов, радионуклидов и частиц, например в целях детекции полипептида. В частности, настоящее раскрытие охватывает меченный радиоактивным изотопом полипептид, состоящий из меченного радиоактивным изотопом хелата альбумин-связывающего полипептида, гибридного белка или конъюгата; как описано в настоящем документе, и радионуклида, такого как радиоактивный металл.
В вариантах осуществления, где меченый альбумин-связывающий полипептид включает альбумин-связывающий полипептид согласно первому аспекту раскрытия и метку, меченый полипептид можно, например, применять для опосредованного мечения сывороточного альбумина. Вследствие сильной ассоциации между меченым полипептидом и сывороточным альбумином меченый полипептид можно применять, например, для исследования проницаемости сосудов и пула крови.
В других вариантах осуществления меченый альбумин-связывающий полипептид присутствует в качестве фрагмента в гибридном белке или конъюгате, также включающем второй фрагмент с необходимой биологической активностью. Метку можно в некоторых случаях присоединить только к альбумин-связывающему полипептиду, а в некоторых случаях как к альбумин-связывающему полипептиду, так и ко второй части конъюгатного или гибридного белка. Если ссылаются на меченый полипептид, это следует понимать, как ссылку на все аспекты полипептидов, как описано в настоящем документе, включая гибридные белки и конъюгаты, включающие альбумин-связывающий полипептид, и второй, а факультативно дополнительные фрагменты. Таким образом, меченый полипептид может содержать только альбумин-связывающий полипептид и, например, терапевтический радионуклид, который может быть хелатированным или ковалентно присоединенным к альбумин-связывающему полипептиду, или содержать альбумин-связывающий полипептид, терапевтический радионуклид и второй фрагмент, такой как небольшая молекула с необходимой биологической активностью, такой как терапевтическая эффективность.
В вариантах осуществления, где альбумин-связывающий полипептид, гибридный белок или конъюгат является меченным радиоактивным изотопом, такой меченный радиоактивным изотопом полипептид может включать радионуклид. Большинство радионуклидов имеют металлическую природу, а металлы, как правило, не способны образовывать стабильные ковалентные связи с элементами, присутствующими в белках и пептидах. По этой причине, мечение белков и пептидов радиоактивными металлами осуществляют с применением хелаторов, т.е. мультидентатных лигандов, которые образуют нековалентные соединения, называемые хелатами, с ионами металлов. В варианте осуществления альбумин-связывающего полипептида, гибридного белка или конъюгата, инкорпорация радионуклида возможна через обеспечение хелатирующей среды, посредством которой радионуклид может координироваться, подвергаться хелатированию или образовывать комплексы с полипептидом.
Одним примером хелатора является полиаминополикарбоксилатный тип хелатора. Можно выделить два класса таких полиаминополикарбоксилатных хелаторов: макроциклические и ациклические хелаторы. В одном варианте осуществления альбумин-связывающий полипептид, гибридный белок или конъюгат включает хелатирующую среду, обеспечиваемую полиаминополикарбоксилатным хелатором, конъюгированным с альбумин-связывающим полипептид через тиоловую группу остатка цистеина или эпсилон-аминогруппу остатка лизина.
Наиболее широко применяемыми макроциклическими хелаторами для радиоактивных изотопов индия, галлия, иттрия, висмута, радиоактивных актинидов и радиоактивных лантанидов являются разные производные DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота). В одном варианте осуществления хелатирующая среда для альбумин-связывающего полипептида, гибридного белка или конъюгата обеспечивается DOTA или ее производным. Более конкретно, одну группу хелатирующих полипептидов, охватываемых настоящем раскрытием, получают путем проведения реакции DOTA-производного 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-трис-уксусной кислоты-10-малеимидоэтилацетамид (малеимидомоноамид-DOTA) с, например, тиоловой группой альбумин-связывающего полипептида, например, как описано в примере 5.
Высокая кинетическая инертность, т.е. медленная скорость диссоциации металла от DOTA, способствует стабильному присоединению радионуклида. Однако для мечения требуются повышенные температуры вследствие медленной скорости ассоциации. По этой причине DOTA-производные широко применяют для мечения коротких пептидов, таких как альбумин-связывающие полипептиды настоящего раскрытия, которые демонстрируют функциональную возможность связывания после инкубации при температурах, которые требуются для реакции мечения.
Наиболее широко применяемые ациклические полиаминополикарбоксилатные хелаторы представляют собой разные производные DTPA (диэтилентриамин-пентауксусная кислота). В связи с этим, полипептиды с хелатирующей средой, обеспечиваемой диэтилентриаминпентауксусной кислотой или ее производными, также охвачены настоящим раскрытием.
90

Было обнаружено, что варианты DTPA с модифицированным скелетом и полужесткой структурой обеспечивают адекватную стабильность для мечения с помощью Y, например, Zevalin. Хотя ациклические хелаторы менее инертны и, следовательно, менее стабильны, чем макроциклические хелаторы, их мечение происходит достаточно быстро даже при температуре окружающей среды. По этой причине их можно применять для мечения гибридных белков или конъюгатов согласно настоящему раскрытию. Детальные протоколы для присоединения полиаминополикарбоксилатных хелаторов к целевым белкам и пептидам были опубликованы Cooper et al (Nat Prot 1: 314-7, 2006) и Sosabowski и Mather (Nat Prot 1:972-6, 2006).
61
64
66
67
68
110m
111
44
86
225
212
213
67
166
177
212
149
153
227
90
Альбумин-связывающий полипептид, гибридный белок или конъюгат согласно аспектам, описанным в настоящем документе, присоединенные к полиаминополикарбоксилатному хелатору, можно применять для получения меченного радиоактивным изотопом полипептида, состоящего из меченного радиоактивным изотопом хелата альбумин-связывающего полипептида, гибридного белка или конъюгата, присоединенного к хелатору и радионуклиду, пригодному для медицинской визуализации, причем радионуклид выбирают из группы, состоящей из Cu, Cu, Ga, Ga, Ga, In, In, Sc и Y, или соединенный с радионуклидом, пригодным для терапии, причем радионуклид выбирают из группы, состоящей из Ас, Bi, Bi, Cu, Ho, Lu, Pb, Pm, Sm, Th и Y, где радионуклид образует комплекс с альбумин-связывающим полипептидом через хелатор.
l8
76
211
14
В данных вариантах осуществления полипептид может также быть меченным радиоактивной меткой с помощью радиоизотопов неметаллов с применением так называемого непрямого мечения. Таким образом, для мечения с помощью, например, F, Br, разных изотопов йода и At, промежуточные "линкерные молекулы" применяют для мечения. Такая линкерная молекула должна содержать два функциональных фрагмента, причем один обеспечивает быстрое и эффективное радиомечение, а другой создает возможность для быстрого и эффективного присоединения к белкам, например, к аминогруппам или предпочтительно к тиоловой группе единственного цистеина, такого как в положении X альбумин-связывающего полипептида. Например, малеимидная группа вступает в реакцию с тиоловыми группами с образованием стабильной тиоэфирной связи. "Линкерная молекула" может сначала вступить в реакцию с радиометкой и, впоследствии, с тиоловой или селенотиоловой группой белка.
В другом аспекте приведен полинуклеотид, кодирующий альбумин-связывающий полипептид или гибридный белок, который описан в настоящем документе. Также охватывается способ получения альбумин-связывающего полипептида или гибридного белка, который описан выше, включающий экспрессию полинуклеотида, вектор экспрессии, включающий полинуклеотид и клетку-хозяина, включающую вектор экспрессии.
Альбумин-связывающий полипептид настоящего раскрытия можно в качестве альтернативы получить путем небиологического синтеза пептида с применением аминокислот и/или производных аминокислот с защищенными реакционноспособными боковыми цепями, при этом небиологический синтез пептидов включает:
поэтапное присоединение аминокислот и/или производных аминокислот с образованием полипептида согласно первому аспекту с защищенными реакционноспособными боковыми цепями,
удаление защитных групп с реакционноспособных боковых цепей полипептида и
фолдинг полипептида в водном растворе.
Таким образом, нормальные аминокислоты (например, глицин, аланин, фенилаланин, изолейцин, лейцин и валин) и предварительно защищенные производные аминокислот применяют для последовательного построения полипептидной последовательности в растворе или на твердой подложке в органическом растворителе. Один конкретный пример синтеза пептидов на твердой подложке описан в примере 5. После построения полной полипептидной последовательности удаляют защитные группы удаляют и дают полипептиду свернуться в водном растворе. Каждый полипептид согласно настоящему раскрытию обратимо сворачивается в домен с пучком из трех альфа-спиралей без дополнительных факторов и, следовательно, сворачивается самопроизвольно.
Конъюгат согласно второму аспекту можно получить способом, включающим получение альбумин-связывающего полипептида согласно любому из способов, описанных выше, как, например, путем небиологического синтеза пептида, и конъюгирование полученного альбумин-связывающего полипептид со вторым и/или дополнительным фрагментом, как определено в связи со вторым аспектом.
В одном варианте осуществления гибридного белка или конъюгата кроме того обеспечивают гибридный белок или конъюгат, который определен в настоящем документе, для применения в терапии, например, для применения в качестве лекарственного препарата. Такой гибридный белок или конъюгат может проявлять период полужизни in vivo, который является более длительным, чем период полужизни in vivo полипептида с необходимой биологической активностью per se. Слитый белок или конъюгат может кроме того не проявлять иммунный ответ или проявлять пониженный иммунный ответ при введении млекопитающему, такому как человек, по сравнению с иммунным ответом, проявляемым при введении млекопитающему полипептида с необходимой биологической активностью per se. Иначе говоря, это обеспечивает способ снижения иммуногенности полипептида с необходимой биологической активностью благодаря гибридизации или конъюгированию такого полипептида с альбумин-связывающим полипептидом, гибридным белком или конъюгатом согласно аспектам, раскрываемым в настоящем документе. В дополнение к этому, это может предоставить возможность усиления биологической активности второго фрагмента.
В другом варианте осуществления обеспечивают гибридный белок или конъюгат согласно настоящему раскрытию для применения в диагностике, например, для применения в качестве диагностического средства.
Настоящее раскрытие также касается разных аспектов применения вышеописанного альбумин-связывающего полипептида, а также различных способов лечения, диагностики и детекции, в которых полипептид полезен вследствие его характеристик связывания и других характеристик. При упоминании "альбумин-связывающего полипептида" в следующем описании этих применений и способов подразумевается, что это выражение охватывает альбумин-связывающий полипептид сам по себе, а также все те молекулы на основе этого полипептида, описанные выше, которые, например, включают альбумин-связывающий полипептид в качестве фрагмента в гибридном белке или конъюгате и/или конъюгированы с меткой, хелатором, терапевтическим и/или диагностическим средством, и/или снабжены дополнительными аминокислотными остатками в качестве метки или для других целей. Как объяснялось выше, такие гибридные белки, производные и т.д. образуют часть настоящего раскрытия.
Другая совокупность аспектов касается обеспечения новых способов увеличения растворимости в водном растворе слаборастворимого соединения посредством конъюгирования его с альбумин-связывающим полипептидом, гибридным белком или конъюгатом. Полученный в результате комплекс слаборастворимого соединения и альбумин-связывающего полипептида самого по себе, или включенного в качестве фрагмента в гибридный белок или конъюгат, способен ассоциироваться с альбумином in vivo или in vitro, ассоциация которого увеличивает растворимость в водном растворе. Таким образом, в варианте осуществления этого дополнительно аспекта обеспечивают композицию, включающую:
соединение, которое per se имеет растворимость в воде не более 100 мкг/мл; соединенное с
альбумин-связывающим полипептидом, гибридным белком или конъюгатом, как описано в настоящем документе, где соединение и альбумин-связывающий полипептид, гибридный белок или конъюгат ковалентно соединены.
В одном варианте осуществления соединение per se имеет растворимость не более 10 мкг/мл. Еще в другом варианте осуществления указанная растворимость составляет не более 1 мкг/мл.
В некоторых вариантах осуществления соединение может представлять собой фармацевтически активное соединение, например цитотоксическое средство. Неограничивающими примерами цитотоксических средств являются таковые, выбранные из калихеамицина, ауристатина, доксорубицина, майтанзиноида, таксола, эктеинасцидина, гелданамицина, и их производных, и их комбинаций. В качестве альтернативы, цитотоксическое средство может являться синтетическим хемотоксином, произведенным путем органического синтеза, а не полученным из встречающегося в природе соединения.
В дополнение к слаборастворимому веществу и альбумин-связывающему полипептиду, гибридному белку или конъюгату композиция согласно этому аспекту раскрытия может в некоторых вариантах осуществления также включать связывающий полипептид с аффинностью к клинически релевантной мишени. Этот связывающий полипептид пригодным образом отличается от альбумин-связывающего полипептида и может быть нековалентно или ковалентно соединенным с другими компонентами композиции настоящего изобретения. В качестве неограничивающих примеров связывающий полипептид с аффинностью к клинически релевантной мишени можно выбрать из группы, состоящей из антител и их частей и доменов, в значительной степени сохраняющих связывающую активность антител; микротелец, макротелец, авимеров и других малых связанных дисульфидной связью белков; и связывающих белков, полученных из скаффолда, выбранных из группы, состоящей из белка А стафилококка и его доменов, других трехспиральных доменов, липокалинов, доменов с анкириновым повтором, доменов, связывающих целлюлозу, γ-кристаллинов, зеленого флуоресцентного белка, антигена 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами человека, ингибиторов протеаз, таких как домены Kunitz, PDZ-доменов, SH3-доменов, пептидных аптамеров, нуклеазы стафилококка, тендамистатов, домена фибронектина типа III, трансферрина, "цинковых пальцев" и конотоксинов.
Композиция согласно вышеприведенному аспекту настоящего раскрытия обладает способностью к ассоциации с альбумином in vivo или in vitro благодаря обеспечению в композиции альбумин-связывающего полипептида самого по себе или в качестве присутствующего в гибридном белке или конъюгате. В определенных случаях может выгодно образование комплекса композиции с альбумином вне живого организма, т.е. добавление экзогенного альбумина в композицию. Такую композицию можно диофилизировать с получением состава, который пригоден для хранения при температуре окружающей среды. Таким образом, настоящее раскрытие также обеспечивает композицию, как определено выше, которая дополнительно включает альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин.
Настоящее раскрытие также обеспечивает композицию согласно вышеприведенному аспекту для применения в качестве лекарственного препарата, т.е. для применения в терапии, в тех случаях, когда соединение представляет собой терапевтически активное соединение. Соответственно, обеспечение альбумин-связывающего полипептида, гибридного белка или конъюгата и необязательно альбумина пагубно не влияет на терапевтическую эффективность активного соединения, так что композиция настоящего изобретения будет полезной в тех терапевтических или профилактических планах, где показано соединение per se.
В другом варианте осуществления обеспечивают композицию согласно вышеприведенному аспекту для применения в качестве диагностического средства, т.е. для применения в диагностике.
Связанный с этим аспект настоящего раскрытия обеспечивает способ получения композиции, которая описана непосредственно выше. Способ включает:
обеспечение соединения, которое per se имеет растворимость в воде не более 100 мкг/мл; и
ковалентное соединение соединения с альбумин-связывающим полипептидом, гибридным белком или конъюгатом согласно аспектам, которые описаны в настоящем документе, таким образом образуя композицию, включающую ковалентный комплекс соединения и альбумин-связывающего полипептида, гибридного белка или конъюгата.
В вариантах осуществления настоящего раскрытия, где альбумин включают в композицию, способ может включать дополнительный стадию смешивания указанного комплекса соединения и альбумин-связывающего полипептида, гибридного белка или конъюгата с альбумином, таким образом образуя композицию, включающую нековалентный комплекс из i) ковалентного комплекса соединения и альбумин-связывающего полипептида, гибридного белка или конъюгата и ii) альбумина. Относительные пропорции двух компонентов этого нековалентного комплекса могут, например, составлять 1:1 с тем, чтобы одна единица комплекса слаборастворимого соединения и альбумин-связывающего полипептида, гибридного белка или конъюгата была ассоциирована с одной молекулой альбумина. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает лиофилизацию нековалентного комплекса с получением лиофилизированной композиции.
В другом тесно связанном аспекте настоящее раскрытие обеспечивает способ увеличения растворимости в воде соединения, включающий:
обеспечение соединения, которое per se имеет растворимость в воде не более 100 мкг/мл;
ковалентное соединение соединения с альбумин-связывающим полипептидом, гибридным белком или конъюгатом согласно аспектам, которые описаны в настоящем документе, таким образом образуя ковалентный комплекс соединения и альбумин-связывающего полипептида, гибридного белка или конъюгата; и
смешивание указанного комплекса соединения и альбумин-связывающего полипептида, гибридного белка или конъюгата с альбумином при условиях, которые способствуют нековалентной ассоциации альбумин-связывающего полипептида с альбумином;
в результате чего растворимость в воде соединения в указанном комплексе становится больше, чем растворимость в воде соединения per se.
В данных аспектах способа, касающихся растворимости слаборастворимого соединения, необязательные признаки различных компонентов являются такими, которые описаны в связи с непосредственно предшествующем аспектом композиции.
Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано со ссылкой на различные приводимые в качестве примера варианты осуществления, специалисту в данной области техники будет понятно, что можно внести различные изменения, а их элементы можно заменить на эквиваленты без отклонения от объема настоящего изобретения. Кроме того, можно внести много модификаций, чтобы адаптировать частную ситуацию или молекулу к идеям настоящего изобретения без отклонения от его основного объема. Таким образом, подразумевается, что настоящее изобретение не ограничивается любым частным вариантом осуществления, рассматриваемым для выполнения настоящего изобретения, но что настоящее изобретение будет включать все варианты осуществления, подпадающие в пределы объема прилагаемой формулы изобретения.
Фигуры
На фигуре 1 представлен перечень аминокислотных последовательностей примеров альбумин-связывающих полипептидов настоящего раскрытия (SEQ ID NO:1-152, SEQ ID NO:155-203), ОА3-домена из белка G штамма G148 Streptococcus, удлиненного за счет N-концевого остатка глицина (SEQ ID NO:153) и альбумин-связывающего полипептида, полученного из G148-GA3, как ранее описано Jonsson et al (supra, SEQ ID NO:154).
На Фигуре 2 показан результат анализа связывания, выполненного на приборе Biacore, для исследования связывания альбумин-связывающего полипептида РЕР07912 (SEQ ID NO:157) с человеческим сывороточным альбумином. Три разные концентрации очищенного белка (40 нМ, жирная серая линия; 10 нМ, черная линия, и 2,5 нМ, серая линия) вводили на поверхность с 955 RU иммобилизованного человеческого сывороточного альбумина.
На фигурах 3А-С показан результат анализа связывания, выполненного посредством ELISA, для исследования связывания альбумин-связывающих полипептидов РЕР07913 (SEQ ID NO:153), РЕР06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), РЕР07912 (SEQ ID NO:157), PEP07554 (SEQ ID NO:156), PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (DOTA-конъюгированный РЕР07911, SEQ ID NO:159) и РЕР07844 (SEQ ID NO:161) с молекулами IgG, присутствующими в 126 отдельных нормальных человеческих сыворотках, где на А) показано среднее OD-значение, на В) показан процент отрицательных сывороток (определенный как OD<0,15), и на С) показан процент положительных сывороток (определенный как OD>1,0).
На Фигурах 4А-В представлены хроматограммы, показывающие анализ очищенного, полученного химическим способом альбумин-связывающего полипептида РЕР07834 (SEQ ID NO:160), где на А) показан сигнал абсорбции при 220 нМ, фон вычтен, и на В) показан сигнал абсорбции при 280 нМ, фон вычтен. Два пика обнаруживались при обеих длинах волн.
На фигурах 5А-В представлены спектрограммы, показывающие масс-спектрометрический анализ двух пиков, идентифицированных на фигуре 4А) и В). А) представляет собой спектрограмму первого пика, т.е. мономера РЕР07834 (SEQ ID NO:160), а В) представляет собой спектрограмму димера РЕР07834.
+
+
На фигурах 6А-С представлены диаграммы, показывающие оценку иммуногенности альбумин-связывающих полипептидов РЕР07913 (SEQ ID NO:153), РЕР07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158) и PEP07968 (DOTA-конъюгированный PEP07911, SEQ ID NO:159) в анализе пролиферации CD3CD4Т-клеток. На А) показано число индивидуумов, реагирующих на альбумин-связывающие полипептиды в сравнении с рекомбинантным человеческим альбумином в группе из 52 доноров европеоидной расы. На В) показаны средние показатели стимуляции (SI) для РЕР07913, РЕР07912, PEP07914 и PEP07968 в сравнении с отрицательным контролем, содержащим рекомбинантный человеческий альбумин. На С) показано число реагирующих индивидуумов против всех белков в исследовании по сравнению с контролем-буфером.
На фигурах 7А-С показан результат анализа связывания, осуществленного на приборе Biacore, для исследования связывания альбумин-связывающих полипептидов А) РЕР07986 (SEQ ID NO:163), В) РЕР08296 (DOTA-конъюгированный РЕР08185, SEQ ID NO:148) и С) РЕР06923 (SEQ ID NO:154) с альбумином из разных видов. Показанные сенсограммы соответствуют белку, который вводили в концентрации 40 нм на поверхности с иммобилизованным альбумином человека (1130 RU), тонкая серая линия; яванского макака (1046 RU), толстая серая линия; крысы (831 RU), толстая светло-серая линия; собаки (1053 RU), тонкая черная линия; и мыши (858 RU), толстая черная линия.
X
Y
neg
На фигуре 8 показано ингибирующее действие Z-PP013 (не закрашенные круги), Z-РР013 (не закрашенные квадраты) и Z-PP013 (закрашенный треугольник) на цитокин-индуцированную пролиферацию TF-1-клеток в присутствии пятиразового молярного избытка HSA.
На фигуре 9 показаны максимальные ответы на связывание, полученные посредством Biacore-анализа РЕР07986 (SEQ ID NO:163), хранящегося при 4, 25 или 40°С в течение одной недели, двух недель, одного месяца и трех месяцев, как указано, в концентрации 2 мг/мл, который вводили на иммобилизованный HSA (704 RU) в концентрации 10 нМ. Необработанные образцы от момента времени=0 показаны в качестве стандартов.
На фигуре 10 показан результат анализа связывания, осуществленного на приборе Biacore, для исследования связывания альбумин-связывающего полипептида РЕР08296 (DOTA-конъюгированный РЕР08185, SEQ ID NO:148) с человеческим сывороточным альбумином до и после тепловой обработки. Две концентрации РЕР08296 (0,8 нМ, серые линии; 4 нМ, черные линии) вводили на поверхность с 724 RU иммобилизированного человеческого сывороточного альбумина. Сплошные линии представляют результат до тепловой обработки, а штрихованные линии - после тепловой обработки в течение 10 минут при 90°С.
На фигурах 11А-В показано наложение двух CD-спектров РЕР08296 (DOTA-конъюгированный РЕР08185, SEQ ID NO:148) до и после тепловой обработки в течение 12 минут при 90°С. А) Образец, инкубированный в PBS рН 7,2. В) Образец, инкубированный в PBS рН 4,0.
68
На фигуре 12 показано изображение проекции максимальной интенсивности (MIP) распределения по всему организму Ga-PEP08296 у здоровой крысы, суммированной на протяжении 1,5 часов сбора данных непосредственно после внутривенной инъекции (хвостовая вена). Радиоактивность от циркулирующей метки легко очерчивается в крупных сосудах (например, яремных (длинная стрелка) и бедренных (короткая стрелка)), сердце (Н), печени (L), селезенке (S), почке (K) и мочевом пузыре (В).
На фигуре 13 показана гель-фильтрацонная хроматограмма РЕР07986 (SEQ ID NO:163), который вводили в концентрации 42 мг/мл, черная сплошная линия. Хроматограмма овальбумина (молекулярный вес 43 кДа), который вводили в концентрации 5 мг/мл, серая пунктирная линия, включена для сравнения, подтверждающего, что пик для РЕР07986 не представляет собой агрегат, который можно было бы ожидать в «мертвом объеме», элюированном в более ранний момент времени, чем овальбумин.
Настоящее изобретение будет теперь проиллюстрировано дополнительно посредством неограничивающего описания экспериментов, проведенных в соответствии с ним. Если не указано иное, по всему описанию использовались общепринятые методы химии и молекулярной биологии.
Примеры
Пример 1
Клонирование, экспрессия, очистка и характеристика альбумин-связывающих полипептидов
В этом примере клонировали, очищали и характеризовали десять разных альбумин-связывающих полипептидов, РЕР07913 (SEQ ID NO:153), РЕР07912 (SEQ ID NO:156), PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (DOTA-конъюгированный PEP07911, SEQ ID NO:159), PEP06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07554 (SEQ ID NO:156), PEP07844 (SEQ ID NO:161), PEP07986 (SEQ ID NO:163) и РЕР08296 (DOTA-конъюгированный PEP08185, SEQ ID NO:148), аминокислотные последовательности которых представлены на фигуре 1 и в прилагаемом перечне последовательностей.
Материал и способы
Клонирование вариантов альбумин-связывающего полипептида
Мутации в G148-GA3 получали с помощью сайт-направленного мутагенеза с соответствующими олигонуклеотидами для получения необходимых вариантов альбумин-связывающего полипептида. Фрагменты генов амплифицировали посредством ПЦР с праймерами, добавляющими сайты для специфических эндонуклеаз, а также N-концевую MGSS последовательность, предшествующую вариантам альбумин-связывающего полипептида. Фрагменты расщепляли с помощью NdeI и NotI, очищали и лигировали с клонирующим вектором, плазмидой pAY02556 (содержащей точку начала репликации от pBR322, ген устойчивости к канамицину и Т7 промотор для экспрессии представляющего интерес гена), подвергали рестрикции с помощью тех же самых ферментов. Продукты лигирования трансформировали в электрокомпетентные клетки ТОР10 Е. coli. Трансфомированные клетки распределяли по поверхности чашек с ТВАВ (30 г/л основы кровяного агара с триптозой), дополненной 50 мкг/мл канамицина с последующей инкубацией при 37°С на протяжении ночи. Проводили скрининг колоний с помощью ПЦР, а секвенирование амплифицированных фрагментов осуществляли с применением биотинилированного олигонуклеотида и набора для циклического секвенирования Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit BigDye (Applied Biosystems), применяемых в соответствии с протоколом производителя. Продукты секвенирования очищали посредством связывания с магнитными частицами, покрытыми стрептавидином, с помощью Magnatrix 8000 (NorDiag АВ) и анализировали на генетическом анализаторе ABI PRISM 3100 (РЕ Applied Biosystems). Все варианты альбумин-связывающего полипептида субклонировали в качестве мономеров, а конструкциями, кодируемыми векторами экспрессии, были MGSS-[PP###], где РР### соответствует аминокислотным остаткам, составляющим последовательность альбумин-связывающего полипептида.
В дополнение к этому, фрагменты генов G148-GA3, РР007 (SEQ ID NO:7), РР013 (SEQ ID NO:13) и РР037 (SEQ ID NO:37) амплифицировали посредством ПЦР с праймерами, добавляющими сайты для специфических эндонуклеаз, а также последовательность гексагистидина, сайт TEV протеазы и остаток глицина перед аминокислотными остатками, составляющими последовательность альбумин-связывающего полипептида. Полипептиды РЕР07913 (SEQ ID NO:153), РЕР07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158) и РЕР07968 (SEQ ID NO:159) соответствуют альбумин-связывающим полипептидам G148-GA3, РР007 (SEQ ID NO:7), РР013 (SEQ ID NO:13) и РР037 (SEQ ID NO:37) с добавленными остатками глицина. Фрагменты расщепляли с помощью XbaI и NotI, очищали и лигировали с клонирующим вектором, плазмидой pAY02512 (содержащей точку начала репликации от pBR322, ген устойчивости к канамицину и Т7 промотор для экспрессии представляющего интерес гена. Сайту клонирования предшествует последовательность, кодирующая пептид, содержащий гексагистидиновую метку, за которой следует сайт расщепления для протеазы TEV), подвергали рестрикции с помощью тех же самых ферментов. Лигирование, трансформацию и подтверждение последовательности осуществляли, как описано выше. Четыре варианта альбумин-связывающего полипептида G148-GA3, РР007, РР013 и РР037 субклонировали в качестве мономеров, а конструкциями, кодируемыми векторами экспрессии, были MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG-[РР###].
Вектор экспрессии, кодирующий MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG-[PP013], дополнительно модифицировали путем сайт-направленного мутагенеза с применением олигонуклеотидов, приводящего к вставке остатка серина перед аминокислотными остатками, составляющими последовательность альбумин-связывающего полипептида, с получением конструкции MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG5-[PP013]. Эту конструкцию дополнительно модифицировали путем 1) сайт-направленного мутагенеза; чтобы заменить остаток серина в положении 14 (в пределах РР013) на остаток цистеина с образованием MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS-[PP049], и 2) присоединения остатка глицина к С-концу с образованием MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQGS-[PP049]-G. Присоединение глицина к С-концу выполняли посредством ПЦР-амплификации с праймерами, включающими нуклеотиды, кодирующие остаток глицина и сайты для специфических эндонуклеаз. Фрагмент расщепляли с помощью XbaI и NotI, очищали и дотировали с клонирующим вектором, плазмидой pAY02641 (содержащей точку начала репликации от pBR322, ген устойчивости к канамицину и Т7 промотор для экспрессии представляющего интерес гена), подвергали рестрикции с помощью тех же самых ферментов. Лигирование, трансформацию и подтверждение последовательности осуществляли, как описано выше.
Экспрессия белка
6
Варианты альбумин-связывающего полипептида экспрессировали в Е. coli BL21 (DE3), либо с N-концевым MGSS-удлинняющим фрагментом, либо с N-концевой His-меткой, за которыми следует сайт распознавания TEV-протеазы и остаток глицина. Колонию каждого варианта альбумин-связывающего полипептида использовали, чтобы инокулировать 4 мл среды TSB+YE, дополненной канамицином до концентрации 50 мкг/мл. Культуры выращивали при 37°С в течение приблизительно 5 часов. 3 мл из каждой культуры использовали, чтобы инокулировать 800 мл TSB+YE, дополненной канамицином до концентрации 50 мкг/мл в параллельных биореакторах (Greta system, Belach Bioteknik AB). Культивирования осуществляли при 37°С с аэрацией 800 мл/минута и схемой помешивания для поддержания уровней растворенного кислорода выше 30%, до OD600 порядка 2, за которым следовало добавление IPTG до конечной концентрации 0;5 мМ. Культивирование продолжали в течение пяти часов, после чего культуру охлаждали до 10°С, аэрацию прекращали и помешивание снижали до 300 оборотов/минута. Клеточные осадки собирали путем центрифугирования (15600×g, 4°C, 20 минут) и хранили при -20°С до очистки.
6
Очистка вариантов альбумин-связывающего полипептида с His-меткой и сайтом TEV-протвазы
6
6
6
6
Замороженные клеточные осадки, содержащие растворимые меченные гексагистидином полипептиды РЕР07913 (SEQ ID NO:153), РЕР07912 (SEQ ID NO:156), PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (SEQ ID NO:159), PEP07986 (SEQ ID NO:163) и РЕР08185 (SEQ ID NO:148), суспендировали в 35 мл буфера для связывания (20 мМ фосфата натрия, 0,5 М NaCl, 20 мМ имидазола, рН 7,4) с добавлением 1000 Е Benzonase (1,01654,001, Merck) и разрушали путем обработки ультразвуком. Для каждого из полипептидов обработанную ультразвуком суспензию осветляли путем центрифугирования (1 час, 37000×g, 4°C) и супернатант загружали на колонку His GraviTrap™ (11-0033-99, GE Healthcare). Колонку промывали 10 мл промывочного буфера (20 мМ фосфата натрия, 0,5 М NaCl, 60 мМ имидазола, рН 7,4) до элюирования полипептида посредством 3 мл элюирующего буфера (20 мМ фосфата натрия, 0,5 М NaCl, 0,5 М имидазола, рН 7,4). Буфер заменяли на буфер для расщепления (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, рН 8) с использованием колонки для обессоливания PD-10 (17-0851-01, GE Healthcare). Количество полипептидного продукта определяли путем измерения абсорбции при 280 нм перед добавлением DTT до конечной концентрации 5 мМ. His-меченую TEV протеазу добавляли в буфер для расщепления при отношении 1:10 по массе к полипептидному продукту. Расщепление осуществляли на протяжении всей ночи при медленном перемешивании при 4°С. Имидазол добавляли в смесь для расщепления до концентрации 20 мМ перед загрузкой смеси в колонку His GraviTrap™ (11-0033-99, GE Healthcare) для удаления отщепленных His-меток, His-меченной TEV протеазы и His-меченного нерасщепленного продукта.
Для каждого варианта фильтрат, содержащий вариант альбумин-связывающего полипептида, дополнительно очищали путем хроматографии с обращенными фазами (RPC), как указано далее. Фракцию фильтрата загружали на 1 мл колонку Resource 15 RPC (GE Healthcare), предварительно уравновешенную буфером RPC А (0,1% TFA в воде). После отмывки колонки 10 объемами колонки (CV) буфера RPC А связавшиеся полипептиды элюировали линейным градиентом 0-50% буфера RPC В (0,1% TFA ацетонитриле) на протяжении 10 CV. Скорость потока составляла 2 мл/минута, и абсорбцию отслеживали при 280 нм. Фракции, содержащие вариант альбумин-связывающего полипептида, идентифицировали посредством анализа SDS-PAGE и объединяли.
RPC-очищенные варианты альбумин-связывающего полипептида дополнительно очищали посредством гель-фильтрации на 120 мл Superdex 75 (GE Healthcare), заполненной в колонку ХК16 (GE Healthcare). Подвижным буфером был 1×PBS, а скорость потока 2 мл/минута. Фракции, содержащие чистый вариант альбумин-связывающего полипептида объединяли и концентрировали до приблизительно 1,3 мг/мл. В конечном итоге, концентрат очищали от следовых количеств оставшихся эндотоксинов с помощью 1 мл колонок с гелем для удаления эндотоксинов AffinityPak Detoxi-Gel Endotoxin removing gel (Pierce, номер продукта 20344), согласно рекомендациям производителя.
Варианты альбумин-связывающего полипептида РЕР07911 и РЕР08185 конъюгировали с Mal-DOTA перед стадией очистки с RPC, как указано далее. Буфер фракции фильтрата от стадии очистки с IMAC-FT заменили на 0,2 М NaAc, pH 5,5, с использованием одноразовых колонок для обессоливания PD-10 (GE Healthcare). Малеимидо-моно-амид-DOTA (Macrocyclics, номер по каталогу В-272) добавляли в 5-кратном молярном избытке и инкубировали в течение 60 минут при 30°С при постоянном помешивании. Полученный в результате полипептид обозначили РЕР07968 и РЕР08296, соответственно.
6
Очистка вариантов альбумин-связывающего полипептида без His-метки
4
Замороженные клеточные осадки, содержащие растворимые варианты альбумин-связывающего полипептида РЕР06923 (SEQ ID NO:154), РЕР07271 (SEQ ID NO:155), PEP07554 (SEQ ID NO:156) и РЕР07844 (SEQ ID NO:161), суспендировали в 20 мМ Трис-HCl, pH 8, и разрушали путем обработки ультразвуком. Для каждого из вариантов полипептида обработанную ультразвуком суспензию осветляли путем центрифугирования (30 минут, 32000×g, 4°C), а супернатант загружали на колонку HSA-Sepharose (GE Healthcare). После отмывки TST-буфером (25 мМ Трис-HCl, 1 мМ EDTA, 200 мМ NaCl, 0,05% Tween 20, pH 8,0) с последующим 5 мМ NHAc, pH 5,5, связавшийся вариант альбумин-связывающего полипептида элюировали при помощи 0,5 М НАс, pH 3,2.
2
4
2
4
Варианты альбумин-связывающего полипептида дополнительно очищали посредством хроматографии с обращенными фазами (RPC), как указано далее. Для каждого из вариантов элюат из стадии очистки с HSA-аффинностью загружали на 1 мл колонку Resource 15 RPC (GE Healthcare), предварительно уравновешенную буфером RPC А (0,1% TFA в воде). После отмывки колонки 10 CV буфера RPC А связавшиеся полипептиды элюировали линейным градиентом 0-50% буфера RPC В (0,1% TFA в ацетонитриле) на протяжении 10 CV. Скорость потока составляла 2 мл/минута, а абсорбцию отслеживали при 280 нм. Фракции, содержащие чистые варианты альбумин-связывающего полипептида, идентифицировали посредством анализа на SDS-PAGE и объединили. В конечном итоге, буфер заменяли на 1×PBS (2,68 мМ КС1, 137 мМ NaCl, 1,47 мМ KHPO, 8,1 мМ NaHPO, pH 7,4) с использованием одноразовой колонки для обессоливания PD-10 (GE Healthcare).
Характеристика очищенных вариантов альбумин-связывающего полипептида

Концентрацию оценивали путем измерения абсорбции при 280 нм с использованием спектрофотометра NanoDrop ND-1000. Белки дополнительно анализировали с помощью SDS-PAGE и LC-MS.
Для SDS-PAGE-анализа приблизительно 10 мкг каждого варианта альбумин-связывающего полипептида смешивали с буфером для образца NuPAGE LDS (Invitrogen), инкубировали при 70°С в течение 15 минут и загружали на NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gels (Invitrogen). Гели гнали с подвижным буфером NuPAGE MES SDS (Invitrogen) в камере для электрофореза XCell II SureLock (Novex) с применением Sharp Prestained Standard (Invitrogen) в качестве маркера молекулярного веса и с использованием PhastGel BlueR (GE Healthcare) для окрашивания.
Для подтверждения идентичности вариантов альбумин-связывающего полипептида осуществляли LC/MS анализы с использованием LC/MSD системы Agilent 1100, оборудованной API-ESI и масс-спектрометром с одной квадрупольной линзой. Примерно 10 мкг каждого из очищенных вариантов альбумин-связывающего полипептида загружали на колонку Zorbax 300SB-С8 Narrow-Bore (2,1×150 мм, 3,5 мкм, Agilent Technologies) при скорости потока 0,5 мл/минута. Полипептиды элюировали с использованием линейного градиента 10-70% раствора В в течение 15 минут при 0,5 мл/минута. Разделение осуществляли при 30°С. Отслеживали ионный сигнал и абсорбцию при 280 и 220 нм. Молекулярные массы очищенных вариантов альбумин-связывающего полипептида подтверждали посредством MS.
Результаты
Уровни экспрессии вариантов альбумин-связывающего полипептида составляли 10-30 мг продукта/г клеточного осадка при оценке в результате SDS-PAGE-анализа.
Для всех вариантов чистота, которую определили с помощью SDS-PAGE-анализа, превышала 95%, а анализ LC/MS подтвердил правильные молекулярные массы. После очистки получили от 1 до 8 мг чистого полипептида для каждого из десяти вариантов альбумин-связывающего полипептида.
Пример 2
Определение аффинности для альбумин-связывающих полипептидов
В этом примере РЕР06923 (SEQ ID NO:154), РЕР07271 (SEQ ID NO:155), PEP07844 (SEQ ID NO:161), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07913 (SEQ ID NO:153), PEP07914 (SEQ ID NO:158) и РЕР07968, (DOTA-конъюгированный РЕР07911, SEQ ID NO:159), синтезированные или экспрессированные и очищенные в примере 1, характеризовали в отношении аффинности к человеческому сывороточному альбумину (HSA) с использованием прибора Biacore. PEP07913 соответствует аминокислотной последовательности G148-GA3 с присоединением N-концевого остатка глицина, тогда как РЕР07271, PEP07844, PEP07912, PEP07914 и РЕР07968 соответствуют альбумин-связывающим полипептидам РР001 (SEQ ID NO:1). РР043 (SEQ ID NO:43), PP007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID NO:13) и PP037 (SEQ ID NO:37) с разными N-концевыми присоединениями аминокислот.
Материал и способы
Биосенсорный анализ на приборе Biacore2000 (GE Healthcare) осуществляли с HSA (Albucult, Novozymes), иммобилизованным посредством аминоприсоединения на слой карбоксилированного декстрана поверхностей СМ-5-чипов (марка для исследований; GE Healthcare) согласно рекоммендациям производителя. Поверхность 1 у чипа активировали и деактивировали и использовали в качестве сравнительной контрольной ячейки (пустая поверхность) на протяжении введений, тогда как поверхность 2 включала HSA, иммобилизованный на 731 резонансных единицах (RU), а поверхность 4 включала HAS, иммобилизованный на 955 RU. Очищенные варианты альбумин-связывающего полипептида разводили в подвижном буфере HBS-EP (GE Healthcare) до 2,5 нМ, 10 нм и 40 нМ, и вводили при постоянной скорости потока 50 мкл/минута в течение 5 минут с последующим введением HBS-EP в течение 60 минут. Поверхности регенерировали однократным введением 25 мкл HCl, 10 мМ. Измерения аффинности осуществляли в двух группах; в первую группу вводили HBS-EP, РЕР06923, РЕР07271, РЕР07912, РЕР07913, РЕР07914 и РЕР07968 (поверхность чипа 2), а во вторую группу вводили HBS-EP, РЕР06923, РЕР07844, РЕР07912 и РЕР07914 (поверхность чипа 4). РЕР06923 вводили дважды в каждом прогоне в качестве контроля. Результаты анализировали с помощью программного обеспечения BiaEvaluation (GE Healthcare). Кривые пустой поверхности вычитали из кривых поверхностей с лигандом.
Результаты
D
a
on
d
off
Прибор Biacore 2000 имеет техническое ограничение, затрудняя измерения очень высокой аффинности. В связи с этим, определение точных кинетических параметров аффинности вариантов альбумин-связывающего полипептида к HSA не было целью Biacore-исследования. Однако результаты дают количественную оценку относительных аффинностей этих полипептидов к альбумину. После вычитания эталонной поверхности и введения буфера кривые аппроксимировали 1:1 (Ленгмюр) с моделью связывания с использованием программного обеспечения BIAevaluation с поправкой на массовый перенос и с RUmax, заданной в качестве локального параметра. Кривые показаны на фигуре 2. Оценили относительные значения K, k (k) и k (k), и они представлены в таблицах ниже.
Таблица 1
Кинетические параметры (k<sub>a</sub>, k<sub>d</sub> и K<sub>D</sub>) альбумин-связывающих полипептидов относительно HSA, 1-я группа
k<sub>a</sub> (Mc<sup>-1</sup>)
k<sub>d</sub> (с<sup>-1</sup>)
K<sub>D</sub> (М)
РЕР07913
5,7×10<sup>5</sup>
9,3×10<sup>-4</sup>
1,6×10<sup>-9</sup>
РЕР06923 (1)
2,9×10<sup>7</sup>
2,9×10<sup>-5</sup>
9,9×10<sup>-13</sup>
РЕР06923 (2)
2,6×10<sup>7</sup>
2,8×10<sup>-5</sup>
1,1×10<sup>-12</sup>
РЕР07271
3,9×10<sup>6</sup>
2,9×10<sup>-5</sup>
7,5×10<sup>-2</sup>
РЕР07912
4,6×10<sup>6</sup>
2,8×10<sup>-5</sup>
6,2×10<sup>-12</sup>
РЕР07914
3,5×10<sup>6</sup>
2,5×10<sup>-5</sup>
7,2×10<sup>-12</sup>
РЕР07968
3,0×10<sup>6</sup>
2,7×10<sup>-5</sup>
9,0×10<sup>-12</sup>
Таблица 2
Кинетические параметры (k<sub>a</sub>, k<sub>d</sub> и K<sub>D</sub>) альбумин-связывающих полипептидов относительно HSA, 2-я группа
k<sub>a</sub> (Mc<sup>-1</sup>)
k<sub>d</sub> (с<sup>-1</sup>)
K<sub>D</sub> (M)
РЕР06923 (1)
2,0×10<sup>7</sup>
2,6×10<sup>-5</sup>
1,3×10<sup>-12</sup>
РЕР06923 (2)
2,1×10<sup>7</sup>
2,5×10<sup>-5</sup>
1,2×10<sup>-12</sup>
РЕР07912
5,4×10<sup>6</sup>
2,8×10<sup>-5</sup>
5,2×10<sup>-12</sup>
РЕР07914
3,8×10<sup>6</sup>
2,6×10<sup>-5</sup>
6,9×10<sup>-12</sup>
РЕР07844
5,4×10<sup>6</sup>
2,3×10<sup>-5</sup>
4,4×10<sup>-12</sup>
Как показано в таблицах 1 и 2, РЕР07271 (SEQ ID NO:155), РЕР07844 (SEQ ID NO:161), РЕР07912 (SEQ ID NO:157), РЕР07914 (SEQ ID NO:158) и РЕР07968 (DOTA-конъюгированный PEP07911, SEQ ID NO:159), все, по-видимому, имеют приблизительно одинаковую аффинность к HSA, значительно превышающую аффинность исходного G148-GA3 (РЕР07913; SEQ ID NO:153). HSA-аффинность этих полипептидов немного ниже в сравнении с РЕР06923 (SEQ ID NO:154), несмотря на похожую скорость диссоциации.
Пример 3
Определение температуры плавления (Tm) альбумин-связывающих полипептидов
В этом примере варианты альбумин-связывающего полипептида РЕР07913 (SEQ ID NO:153), РЕР06923 (SEQ ID NO:154), РЕР07271 (SEQ ID NO:155), PEP07554 (SEQ ID NO:156), РЕР07912 (SEQ ID NO:157), РЕР07914 (SEQ ID NO:158), РЕР07968 (DOTA-конъюгированный PEP07911, SEQ ID NO:159), РЕР07844 (SEQ ID NO:161) и РЕР07986 (SEQ ID NO:163), экспрессированые и очищенные, как описано в примере 1, и вариант альбуминового полипептида РЕР07975 (DOTA-конъюгированный РЕР07834, SEQ ID NO:160), полученный, как описано в примере 5, проанализировали с помощью анализа CD. PEP07913 соответствует последовательности G148-GA3 с N-концевым остатком глицина, РЕР06923 представляет собой сконструированное производное с высокой аффинностью, предварительно описанное Jonsson et al, supra, тогда как РЕР07271, РЕР07554, РЕР07912, РЕР07914, РЕР07968, РЕР07844 и РЕР07975 представляют собой примеры альбумин-связывающих полипептидов РР001 (SEQ ID NO:1), РР007 (SEQ ID NO:7), PP013 (SEQ ID NO:13), PP037 (SEQ ID NO:37) и РР043 (SEQ ID NO:43) с разными присоединениями N-концевых аминокислот согласно настоящему раскрытию.
Материал и способы
Очищенные варианты альбумин-связывающего полипептида, разводили в IxPBS до конечных концентраций 0,4-0,5 мг/мл. Анализ кругового дихроизма (CD) осуществляли на спектрополяриметре Jasco J-810 в ячейке с длиной оптического канала 1 мм. При измерениях с варьируемой температурой абсорбцию измеряли при 221 нм от 20°С до 90°С с крутизной изменения температуры 5°С/минута.
Результаты
Температуры плавления (Tm) разных вариантов альбумин-связывающего полипептида вычисляли путем определения средней точки перехода в CD по отношению к температурному графику. Результаты суммированы в таблице 3 ниже.
Таблица 3
Определенные значения Tm протестированных вариантов альбумин-связывающего полипептида
Вариант
SEQ ID NO:X2
N-концевая последовательность<sup>3</sup>
Tm (°C)
PEP07913
SEQ ID NO:153
G<u>L</u>
61
РЕР06923
SEQ ID NO:154
GSS<u>L</u>
57
РЕР07271
SEQ ID NO:155
GSS<u>L</u>
65
РЕР07554
SEQ ID NO:156
GSS<u>L</u>
58
РЕР07912
SEQ ID NO:157
G<u>L</u>
53
РЕР07914
SEQ ID NO:158
G<u>L</u>
59
РЕР07968
SEQ ID NO:159<sup>1</sup>
G<u>L</u>
53
РЕР07975
SEQ ID NO:160<sup>1,2</sup>
A<u>L</u>
50
РЕР07844
SEQ ID NO:161
GSS<u>L</u>
65
РЕР07986
SEQ ID NO:163
GS<u>L</u>
61
<sup>1)</sup>Пептид конъюгирован с малеинимид-DOTA по цистеину.
<sup>2)</sup>Пептид амидирован по С-концу.
<sup>3)</sup>Лейцин (подчеркнутый) представляет собой остаток в положении 1 аминокислотной последовательности альбумин-связывающего полипептида, как определено в первом аспекте настоящего раскрытия.
14
Полипептид РЕР07968 идентичен РЕР07912, за исключением того, что первый имеет остаток цистеина в положении 14, конъюгированный с малеинимидом-DOTA, а последний остаток серина. Таким образом, DOTA-модификация не должная влиять на температуру плавления. Также РЕР07975 конъюгирован с DOTA с помощью C и идентичен РЕР07968, за исключением С-концевого амида (полученный в результате синтеза пептидов в примере 5) и наличия N-концевого аланина вместо глицина. Более того, сравнение РЕР07912 и РЕР07554 выявляет, что N-концевой серии дает более высокую температуру плавления, чем глицин в том же самом положении (5°С разницы в Tm). Таким образом, все варианты альбумин-связывающего полипептида согласно настоящему раскрытию демонстрируют Tm выше 55°С, за исключением РЕР07912 и DOTA-конъюгированных вариантов. Принимая во внимание важность N-концевой части, все протестированные альбумин-связывающие полипептиды превосходят производное Jonsson et al известного уровня техники, т.е. РЕР06923.
Пример 4
Анализ сывороточного ответа
Процент человеческой сыворотки, содержащей IgG, способный к связыванию с рядом альбумин-связывающих полипептидов, как раскрыто в настоящем документе, анализировали посредством ELISA. В общей сложности проводили скрининг 149 образцов сыворотки, соответствующих 127 индивидуумам.
Материал и способы
2
4
Планшеты для ELISA (96-луночные, планшеты с половинным объемом лунок (Costar, № по кат. 3690) покрывали посредством 50 мкл/лунка Albucult (Novozymes), разведенного до 8 мкг/мл в покрывающем буфере (Sigma, № по кат. 3041). Трое суток на планшеты наносили покрытие в течение ночи при 4 С. В день анализа планшеты промыли дважды водопроводной водой и блокировали в течение 2 часов 100 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS), содержащим 0,05% казеина (PBSC). Планшеты опорожняли и согласно предварительно выполненной разметки планшета добавляли 50 мкл/лунка альбумин-связывающих полипептидов РЕР07913 (SEQ ID NO:153), РЕР06923 (SEQ ID NO:154), PEP07271 (SEQ ID NO:155), PEP07912 (SEQ ID NO:157), PEP07554 (SEQ ID NO:156), PEP07914 (SEQ ID NO:158), PEP07968 (DOTA-конъюгированный РЕР07911, SEQ ID NO:159) и РЕР07844 (SEQ ID NO:161), разведенных до 2 мкг/мл в PBSC. После инкубации в течение двух часов при комнатной температуре (RT) планшеты отмывали в PBSC четыре раза с применением автоматизированного устройства для промывания планшетов ELISA. 149 образцов сыворотки от 129 индивидуумов разводили в 50 раз в PBSC путем добавления 24 мкл сыворотки к 1174 мкл PBSC. 50 мкл разведенных сывороток добавляли в каждую лунку согласно предварительно выполненной разметки планшета. Каждый образец сыворотки тестировали как синглет. Положительные и отрицательные контроли были включены на каждом планшете и для каждого альбумин-связывающего полипептида. Альбумин-связывающие антитела (50 мкл, 0,5 мкл/мл раствора иммуноглобулина, собственного приготовления из сывороток от приматов, иммунизированных РЕР06923) добавляли в качестве положительного контроля, а 50 мкл PBSC использовали в качестве отрицательного контроля. Планшеты инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре и затем отмывали четыре раза в PBSC с применением автоматизированного устройства для промывания планшетов ELISA. Связавшийся IgG детектировали с 50 мкл/лунка антител к IgG человека (Southern Biotech, № по кат.  2040-05), разведенных в 10000 раз в PBSC. После промывания четыре раза в PBSC с применением автоматизированного устройства для промывания планшетов ELISA, добавляли 50 мкл/лунка субстрата (Pierce № по кат. 34021). Реакцию останавливали через 10-15 минут путем добавления 50 мкл HSO в каждую лунку перед измерением абсорбции с помощью многофункционального планшетного ридера (Victor3, Perkin Elmer).
Результаты
Из 149 сывороток, проверенных на связывание IgG с альбумин-связывающими полипептидами, 23 были отрицательными по всем восьми полипептидам (OD-значение<0,1), т.е. не выявили какого-либо IgG, связавшегося с полипептидами. Анализ осуществляли со 126 сыворотками, которые были положительными по одному или нескольким альбумин-связывающим полипептидам. Вычисляли среднюю абсорбцию (фигура 3А) и процент сывороток с OD-значениями либо<0,15 (фигура 3 В), либо >1,0 (фигура 3С). Наиболее высокое среднее OD-значение и наиболее высокий процент сывороток со связыванием IgG получили с РЕР07913 (SEQ ID NO:153), РЕР06923 (SEQ ID NO:154) и РЕР07844 (SEQ ID NO:161), тогда как наименьшую реактивность обнаружили против РЕР07968 (DOTA-конъюгированный РЕР07911, SEQ ID NO:159), РЕР07914 (SEQ ID NO:158) и РЕР07954 (SEQ ID NO:156).
Таким образом, наиболее реактивными альбумин-связывающими полипептидами были исходный G148-GA3 (РЕР07913, SEQ ID NO:153) и производный с предварительно улучшенной аффинностью (РЕР06923, SEQ ID NO:154), обладающий спиралью 1, сохранившейся от G148-GA3. Третий из более реактивных полипептидов (РЕР07844, SEQ ID NO:161) содержи г первоначальный лизин в положении 14 в спирали 1. Этот остаток предназначен для конъюгирования и не будет, таким образом, открытым в конечном итоге. Идентичный вариант альбумин-связывающего полипептида, за исключением того, что имеет аланин в положении 14 (РЕР07554, SEQ ID NO:156), является одним из наименее реактивных.
Пример 5
Химический синтез РОТА-конъюгированного альбумин-связывающего полипептида
Материал и методы
Альбумин-связывающий полипептид РЕР07834 (SEQ ID NO:160) синтезировали путем твердофазного синтеза пептидов (SPPS, как описано Quibell, М. & Johnson, Т., в Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis - A Practical Approach, W.C. Chan, P.D. White Eds, Oxford University Press 2000, 115-135) в реакторе 433 A Peptide Synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA) в масштабе 0,1 ммоль, т.е. с теоретически возможным выходом 0,1 ммоль пептида с использованием стандартной Fmoc-химии. Кислото-неустойчивую амидную смолу Fmoc использовали в качестве твердой подложки в течение синтеза (Rink Amide MBHA Resin LL (100-200 меш), загружая 0,39 ммоль амида/г смолы (Novabiochem)).
47 аминокислотных остатков согласно последовательности ниже соединяли с амидной смолой посредством реакций ацилирования в реакторе в течение 10 минут при комнатной температуре (RT) и смешивали. Реакции ацилирования осуществляли с десятикратным молекулярным избытком Fmoc-защищенных аминокислот в NMP (N-метилпирролидон, Merck), активированного 1 эквивалентом 2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилалюминия гексафторфосфат (HBTU, IRIS Biotech), 1 эквивалента 1 -гидроксибензотриазола (HOBt, IRIS Biotech) и 2 эквивалентами диизопропилэтиламина (DIEA, Applied Biosystems). В дополнение к этому, все реакционноспособные аминокислотные боковые цепи защищали стандартными защитными группами для боковых цепей (трет-бутил (tBu) для Asp, Glu, Ser, Thr и Tyr, трет-бутилоксикарбонил (Boc) для Lys, 2,2,4,6,7-пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонил (Pbf) для Arg и тритил (Trt) для Asn и Cys) до активации и присоединения. Для того чтобы уменьшить количество неполных присоединений, приводящих к усеченным пептидам, меньшее количество выбранных аминокислотных остатков подвергали присоединению путем двухкратного ацилирования, без снятия защиты Fmoc, как описано ниже, между первым и вторым присоединением. Аминокислотной последовательностью синтезированного альбумин-связывающего полипептида РЕР07834 была
N
CY
Y
R
2
ALASAKEAA AELDGVSD FKLIDKAK TVEGVEALKD AILAALP-NH
2
(SEQ ID NO:160-NH).
Подчеркнутые аминокислотные остатки присоединяли дважды. Любые оставшиеся непрореагировавшие аминогруппы на связанных смолой пептидах кэппировали уксусным ангидридом (0,5 М уксусного ангидрида (AlfaAesar), 0,125 М DIEA, 0,015 М HOBt в NMP) в течение 5 минут. После каждого присоединения снятие защиты с N-концевой Fmoc-группы на связанных смолой пептидах осуществляли путем обработки 20% пиперидином (Sigma-Aldrich) в NMP в течение 10 минут.
2
После завершения синтеза пептиды отщепляли от твердой подложки и одновременно защитные группы для боковых цепей отщепляли путем обработки TFA/EDT/HO/TIS (94:2,5:2,5:1) (TFA: трифторуксусная кислота (Apollo), EDT: 1,2-этандитиол (Aldrich), TIS: триизопропилсилан (Aldrich)) при RT в течение 2 часов с периодическим перемешиванием. После обработки TFA пептиды экстрагировали три раза с использованием 20% ацетонитрила (Merck) в воде и трет-бутилметилового эфира (Merck). Водные фазы объединяли, фильтровали и лиофилизировали.
3
3
-1
Неочищенные пептиды анализировали и очищали путем полупрепаративной RP-HPLC (Reprosil GOLD C18 300, 250*10 мм, размер частиц 5 мкм) и градиентом 32-55% В (А: 0,1% TFA-НО; В: 0,1% TFA-CHCN) на протяжении 25 минут при скорости потока 2,5 мл минута с последующей лиофилизацией.
-1
Выход синтеза определяли путем вычисления площадей полученных путем интегрирования под пиками 220 нм сигнала от анализа неочищенных пептидов на RP-HPLC. Точную молекулярную массу проверяли с использованием жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии с электрораспылительной ионизацией (LC-ESI-MS) на 6520 Accurate Mass Q-TOF LC/MS (Agilent Technologies). Чистоту продукта проверяли с использованием RP-HPLC (Reprosil GOLD C18 300, 250*4,6 мм, размер частиц 3 мкм) с использованием градиента 35-55% В в течение 25 минут при скорости потока 1,0 мл минута.
DOTA-конъюгирование
3 мг РЕР07834-амида (SEQ ID NO:160-амид) восстанавливали 20 мМ DTT при 40°С в течение 30 минут. Избыток DTT удаляли путем замены буфера на колонке PD-10 (GE Healthcare) на 0,2 М ацетата аммония, рН 5,5. Связывание осуществляли с 5-кратным молярным избытком хелатора, раствора малеимидо-моно-амид-DOTA (Macrocyclics, № по кат. В-272) в воде (1 мг/мл). Смесь инкубировали в течение 1 часа при 30°С при постоянном встряхивании. Очистку от неконъюгированных хелаторов выполняли на полупрепаративной RPC-колонке (Zorbax 300SB C18, 9,4×250 мм, 5 мкм). Степень присоединения очищенного материала анализировали посредством HPLC-MS на аналитической колонке Zorbax 300SB С8 150×2,1 мм, 3,5 мкм. Данным способом выявляли только конъюгированный с малеинимид-DOTA РЕР07834, обозначенный РЕР07975.
Результаты
На основе профиля элюирования неочищенного материала выход синтеза альбумин-связывающего полипептида РЕР07834-амида (SEQ ID NO:160-амид) определяли равным 8%. Определяемая молекулярная масса составляла 4952,9 Да, что хорошо согласуется с рассчитанной теоретической молекулярной массой 4952,6 Да. При анализе очищенного продукта приблизительно 10-15% белка, как было обнаружено, представляло собой связанный дисульфидной связью гомодимер (фигуры 4 и 5). Активность связывания DOTA-конъюгированного пептида (РЕР07975) подтверждали, как описано в примере 2 (данные не показаны), а температуру плавления определяли, как описано в примере 3.
Пример 6
Тестирование альбумин-связывающих полипептидов на иммуногенность
Проводили скрининг РЕР07913 (SEQ ID NO:153), РЕР07912 (SEQ ID NO:157), PEP07914 (SEQ ID NO:158) и РЕР07968 (DOTA-конъюгированного PEP07911, SEQ ID NO:159) в отношении способности индуцировать пролиферацию Т-клеток в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) (полученных от CRI-Labo Medische Analyse, Gent, Belgium) от 52 индивидуумов кавказской национальности. РЕР07913 соответствует последовательности G148-GA3 с N-концевым остатком глицина, тогда как РЕР07912, PEP07914 и РЕР07968 являются примерами альбумин-связывающих полипептидов РР007 (SEQ ID NO:7), РР013 (SEQ ID NO:13) и РР037 (SEQ ID NO:37) с добавлениями разных N-концевых аминокислот согласно настоящему раскрытию.
Материалы и методы
РВМС, полученные согласно стандартным методам клеточной биологии, добавляли в обработанный культурой ткани (ТС) 96-луночный круглодонный планшет (Falcon) в количестве 300000 РВМС/лунка. Клетки стимулировали путем добавления 100 мкл/лунка альбумин-связывающих полипептидов РЕР07913, РЕР07912, РЕР07914 и РЕР07968 в среде AIMV (Invitrogen), дополнительно содержащей 900 мкг/мл (3-кратный молярный избыток) рекомбинантного человеческого альбумина (Albucult, Novozymes). Это соответствовало конечной концентрации альбумин-связывающего полипептида 30 мкг/мл. Стимуляцию выполняли в восьми повторностях, т.е. тот же самый альбумин-связывающий полипептид добавляли в восемь лунок в идентичных количествах и при тех же самых условиях. В лунках положительного контроля клетки стимулировали либо 30 мкг/мл гемоцианина фиссуреллы (KLH, Calbiochem), либо 30 мкг/мл столбнячного токсина (ТТ, Statens Serum Institut). В лунки отрицательного контроля добавляли только среду AIMV с или без 900 мкг/мл альбумина.
Пролиферацию клеток оценивали через семь дней культивирования с использованием набора для проточной цитометрии Alexa Fluor 488 Click-iT EdU (Invitrogen). На шестой день добавляли 1 мкМ/лунка маркеравключения EdU. На седьмой день клетки отмывали, отделяли от планшета, отмывали снова и окрашивали в течение 30 минут реактивом anti-CD3-PerCP (Becton Dickinson) и реактивом anti-CD4-Alexa647 (Becton Dickinson). После окрашивания клетки отмывали, фиксировали (BD cellfix, BD biosciences), пермеабилизировали (с использованием сапонина) и окрашивали на EdU пугем добавления реактива Click-iT согласно протоколу производителя (Invitrogen). После завершения окрашивания клетки отмывали снова и анализировали с использованием проточной цитометрии (FACSCantoII, BD Biosciences). Чтобы оценить количество пролиферирующих клеток, фиксированное количество флуоресцирующих сферических частиц (Invitrogen) добавляли в каждую лунку перед анализом. Все методики окрашивания и отмывок осуществляли непосредственно в 96-луночном планшете.
+
+
Необработанные данные от FACSCantoII гейтировали иерархически на CD3CD4Т-клетках и записывали количество гейтированных клеток, а также их интенсивность флуоресценции в отношении маркера инкорпорации EdU-Alexa Flour 488. Средние значения количества пролиферирующих клеток/на восемь повторностей обработанных белком лунок сравнивали с положительным и отрицательным контролями и вычисляли полученные в результате соотношения, описанные как индексы стимуляции (SI). На основе SI и вариаций между повторностями устанавливали пороговые SI-значения 2,0 и 0,5 для стимуляции и ингибирования, соответственно.
Результаты
+
+
Альбумин-связывающие полипептиды РЕР07913, РЕР07912, РЕР07914 и РЕР07968 оценивали в отношении их иммуногенного потенциала в присутствии 3-кратного избытка рекомбинантного человеческого альбумина в целевой человеческой популяции с использованием in vitro анализа пролиферации РВМС. В сравнении с контролем-альбумином РЕР07913 индуцировали пролиферацию CD3CD4Т-клеток у 6 из 52 доноров, РЕР07912 у 5 из 52 доноров, а РЕР07914 и РЕР07968 у 1 из 52 доноров (Фигура 6А).
Средний индекс стимуляции (SI) для всех 52 доноров не отличался значительно для РЕР07914 и РЕР07968 в сравнении с отрицательным контролем, содержащим рекомбинантный человеческий альбумин (р=0,79 и 0,48, соответственно, фигура 6 В). SI для РЕР07913 был значительно выше (р=0,002), тогда как SI для РЕР07912 был выше, но не значительно (р=0,03, фигура 6В).
По сравнению только с буфером количество реагировавших индивидуумов составляло 10 для РЕР07912, 7 для РЕР07912; 2 для РЕР07914, 1 для РЕР07968, 2 для рекомбинантного человеческого альбумина, а 49 и 51 для двух положительных контролей ТТ и KLI-L соответственно, (фигура 6С). Альбумин-связывающие полипептиды ранжировали по их иммуногенности в следующем порядке: РЕР07913>РЕР07912>РЕР07914>РЕР07968. Как РЕР07914, так и РЕР07968 определялись как неиммуногенные. Приведенные выше результаты, таким образом, демонстрируют, что иммуногенный потенциал альбумин-связывающих полипептидов настоящего раскрытия является низким по сравнению с положительными контролями.
Пример 7
Аффинность альбумин-связывающих полипептидов к альбумину из разных видов
В этом примере РЕР06923 (SEQ ID NO:154), РЕР07986 (SEQ ID NO:163) и РЕР08296 (DOTA-конъюгированный РЕР08185, SEQ ID NO:148), экспрессированные и очищенные, как описано в примере 1, характеризовали в отношении аффинности к альбумину от человека (HSA), яванского макака (CSA), крысы (RSA), мыши (MSA) и собаки (DSA) с использованием прибора Biacore.
Материал и методы
Биосенсорный анализ на приборе Biacore2000 (GE Healthcare) осуществляли с HSA (Albucult, Novozymes), CSA (очищен в лаборатории из сыворотки яванского макака), RSA (Sigma-Aldrich, № по кат. А6272), MSA (Sigma-Aldrich, № по кат. А3559) и DSA (MP Biomedicals, № по кат. 55925), иммобилизованным посредством присоединения амина на слое карбоксилированного декстрана поверхностей чипов СМ-5 (марка для исследований; GE Healthcare) согласно рекомендациям производителя.
На чипе 1 поверхность 1 активировали и деактивировали, а также использовали в качестве контрольной ячейки (пустая поверхность) на протяжении введений, тогда как поверхность 2 включала HAS, иммобилизованный на ИЗО резонансных единицах (RU), поверхность 3 включала CSA, иммобилизованный на 1046 RU, поверхность 4 включала RSA, иммобилизованный на 831 RU. На чипе 2 поверхность 1 использовали в качестве пустой поверхности, тогда как поверхность 3 включала MSA, иммобилизованный на 858 RU. На чипе 3 поверхность 1 использовали в качестве пустой поверхности, тогда как поверхность 2 включала DSA, иммобилизованный на 1053 RU.
Для анализа аффинности к HSA, CSA и RSA (чип 1) очищенные варианты альбумин-связывающего полипептида разводили в подвижном буфере HBS-EP (GE Healthcare) до 40 нМ, 10 нм и 2,5 нМ; для анализа аффинности к MSA (чип 2) варианты альбумин-связывающего полипептида разводили до 1280 нМ, 640 нМ, 160 нм и 40 нм, а для анализа аффинности к DSA (чип 3) варианты альбумин-связывающего полипептида разводили до 1280 нМ, 640 нМ, 160 нМ, 40 нм и 10 нМ. Альбумин-связывающие полипептиды вводили при постоянной скорости потока 50 мкл/минута в течение 5 минут с последующим введением HBS-EP в течение 60 минут. Поверхности регенерировали с помощью одного введения 25 мкл HCl, 10 мМ. Все образцы прогоняли в двух повторностях.
Результаты анализировали с помощью программного обеспечения BIAevaluation (GE Healthcare). Кривые пустой поверхности вычитали из кривых поверхностей лиганда.
Результаты
Прибор Biacore 2000 имеет техническое ограничение, препятствующее измерению очень высокой аффинности. В связи с этим целью исследования на Biacore было не определение точных кинетических параметров аффинности вариантов альбумин-связывающего полипептида к HSA, CSA, RSA, MSA и DSA, соответственно. Однако результаты обеспечивают количественную оценку относительных аффинностей прилагаемых полипептидов к альбумину от этих разных видов. После вычитания эталонной поверхности и введения буфера кривые аппроксимировали 1:1 (Ленгмюр) с моделью связывания с использованием программного обеспечения BIAevaluation с поправкой на массовый перенос и с RUmax, заданной в качестве локального параметра. Типичные кривые связывания показаны на фигуре 7.
D
D
D-RSA
D-HSA
D-CSA
D-MSA
D-DSA
РЕР07986 и РЕР08296 (DOTA-конъюгированный РЕР08185) связываются с высокой аффинностью (K в диапазоне or ниже пикомолярной до ниже наномолярной) к человеческому сывороточному альбумину, а также к альбумину от часто встречающихся доклинических моделей видов - крыса, яванский макак, мышь и собака. Относительные аффинности для разных видов можно расположить как RSA≥HSA/CSA>MSA/DSA, т.е. значения K можно расположить как K≤K/K<K/K. Аффинности в отношении значений KD являются такими же или немного ниже (но в том же порядке величины), как аффинность, полученная для РЕР06923 (не являющийся предметом настоящего изобретения полипептид).
Пример 8
In vitro активность вариантов белка Z. слитого с альбумин-связывающим полипептидом
В этом примере полипептиды, включающие варианты цитокин-специфичного белка Z (производное домена В белка А стафилококка), генетически слитого с вариантом альбумин-связывающего полипептида РР013 (SEQ ID NO:13), тестировали по их функциональности, что заключалось в блокировании цитокин-индуцированной пролиферации TF-1-клеток в присутствии человеческого сывороточного альбумина. Пролиферация TF-1-клеток зависит от присутствия любого из нескольких разных типов цитокинов, а пролиферативный ответ может ингибироваться посредством блокирующих реактивов, таких как соответствующий цитокин-специфичный вариант белка Z. РР013, слитый с вариантом белка Z со специфичностью к нерелевантному белку использовали в качестве отрицательного контроля.
Материалы и методы
Клонирование слитых белков Z- РР013
Фрагменты генов вариантов белка Z со специфичностью к цитокину Х или Y, соответственно, или к нерелевантному белку (отрицательный контроль) амплифицировали посредством PCR с использованием праймеров, добавляющих специфичные сайты эндонуклеаз PstI и AccI. Фрагменты расщепляли с помощью PstI и AccI, очищали и лигировали с вектором экспрессии, плазмидой pAY02747, подвергали рестрикции с помощью тех же самых ферментов. pAY02747 содержит точку начала репликации от pBR322, ген устойчивости к канамицину и промотор Т7 для экспрессии представляющего интерес гена. Сайту клонирования предшествует последовательность, кодирующая аминокислоты MGSSLQ, а за ней следует последовательность, кодирующая VDSS-PP013, где РР013 представляет собой раскрываемый альбумин-связывающий полипептид с SEQ ID NO:13. Лигирование, трансформацию и подтверждение последовательности осуществляли, как описано выше. Кодированными белками были:
X
X
1) MGSSLQ-Z-VDSS-PP013 (обозначенный Z-PP013),
Y
Y
2) MGSSLQ-Z-VDSS-PP013 (обозначенный Z-PP013),
neg
neg
3) MGSSLQ-Z-VDSS-PP013 (обозначенный Z-РР013).
Экспрессия белка
X
Y
neg
Z-PP013, Z-PP013 и Z-PP013 экспрессировали в клетках Е. coli BL21 (DE3). Колонии от трансформаций каждого слитого варианта применяли, чтобы инокулировать стартовые культуры из 50 мл среды TSB+YE, дополненной канамицином до концентрации 50 мкг/мл. Культуры выращивали при 37°С всю ночь со встряхиванием 100 оборотов/минута. Стартовые культуры затем использовали, чтобы инокулировать 900 мл среды TSB+YE, дополненной канамицином до концентрации 50 мкг/мл. Культуры выращивали в течение приблизительно 1,5 часов часа до OD600>1,1, после чего добавляли IPTG до конечной концентрации 0,2 мМ. Культивирование продолжали в течение пяти часов. Клеточные осадки собирали путем центрифугирования (15600 g, 4°C, 20 минут) и хранили при -20 С до очистки.
Очистка белка
X
Y
neg
4

Замороженные клеточные осадки, содержащие варианты растворимого слитого белка Z-PP013, Z-PP013 и Z-PP013, ресуспендировали в 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, pH 8, и добавляли 1000 Е Benzonase (Merck № по кат. 1.01654.0001). Клетки разрушали путем обработки ультразвуком и для каждого из вариантов слитого белка обработанную ультразвуком суспензию очищали путем центрифугирования (15 минут, 37000 g, 4°С). Добавляли 20×TST-буфер (20×[25 мМ Трис-HCl, 1 мМ EDTA, 200 мМ NaCl, 0,05% Tween 20, pH 8,0]) при объеме, приводящем к 1×TST-буферу в очищенной суспензии. Каждый образец варианта слитого белка загружали на колонку HSA-Sepharose (GE Healthcare). После отмывки TST-буфером с последующим 5 мМ NHAc, pH 5,5, связанный вариант слитого белка элюировали 0,5 М НАс, pH 2,5.
2
4
2
4
Варианты слитого белка дополнительно очищали посредством хроматографии с обращенными фазами (RPC), как указано далее. Для каждого из вариантов элюат из этапа аффинной очистки HSA загружали на 1 мл колонку Resource 15 RPC (GE Healthcare), предварительно уравновешенную буфером А RPC (0,1% TFA в воде). После отмывки колонки 10 CV буфера А RPC и 5 CV буфера В RPC (0,1% TFA в ацетонитриле) связанные белки элюировали с линейным градиентом 10-50% буфера В RPC более 20 CV. Скорость потока составляла 2 мл/минута, проводили контроль абсорбции при 280 нм. Фракции, содержащие чистые варианты слитого белка, идентифицировали посредством анализа на SDS-PAGE и объединяли. В конечном итоге буфер заменяли на 1×PBS (2,68 мМ KCl, 137 мМ NaCl, 1,47 мМ KHPO 8,1 мМ NaHPO, pH 7,4) с применением одноразовых колонок PD-10 для обессоливания (GE Healthcare). Чтобы подтвердить идентичность вариантов слитого белка; выполняли анализы SDS-PAGE и LC/MS, как описано в примере 1.
In vitro клеточный анализ слитых белков Z-PP013
Клеточную линию TF-1 (CLS № по кат. 300434) размножали, как рекомендуется поставщиком, в среде RPMI 1640+10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco) с добавлением 2 нг/мл rhGM-CSF (Miltenyi). В день эксперимента клетки отмывали в среде RPMI 1640+10% фетальной телячьей сыворотки, чтобы удалить GM-CSF.
X
Y
X
Y
neg
2
Способность Z-PP013 и Z-РР013 блокировать цитокин-индуцированную пролиферацию анализировали посредством смешивания молекул Z-PP013, Z-ppob и Z-PP013 с цитокинами Х и Y, соответственно, и с пятикратным молярным избытком HSA (Albucult, Novozymes). Молекулы титровали в 2-кратных серийных разведениях с фиксированной концентрацией цитокина (4,9 пМ) и пятикратным молярным избытком HSA. Титрование осуществляли в 96-луночных планшетах в объеме 100 мкл. 25000 клеток добавляли на лунку (100 мкл) и планшеты инкубировали при 37°С, 5% СО, в течение трех дней. Чтобы измерить пролиферацию 19 мкл реактива для пролиферации клеток CCK-8 (Sigma), разведенного в два раза в среде RPMI 1640+10% эмбриональной телячьей сыворотки, добавляли на лунку. Контролировали цветную реакцию через 4 часа с использованием устройства для считывания 96-луночных планшетов (Victor3; PerkinElmer).
Результаты
X
Y
neg
Как показано на Фигуре 8, как Z-PP013, так и Z-РР013 ингибировали индуцированную соответствующим цитокином пролиферацию в присутствии HAS, тогда как Z-PP013, отрицательный контроль, не влиял на пролиферацию TF-1. Таким образом, эксперимент показывает, что функция Z-молекул сохранялась при включении в слитый белок, содержащий альбумин-связывающий полипептид, и также когда слитые белки связывали с альбумином.
Пример 9
Долговременная устойчивость альбумин-связывающего полипептида
В этом примере устойчивость РЕР07986 (SEQ ID NO:163), экспрессированного и очищенного, как описано в Примере 1, исследовали после хранения при 4, 25 и 40°С сроком до трех месяцев. Состояние полипептида после хранения исследовали путем измерения его связывания с HSA с применением прибора Biacore.
Материал и методы
Лиофилизированный РЕР07986 растворяли в стерильном буфере NaPi (20 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2) в концентрации 2 мг/мл. Контрольный образец (время=0) извлекали и хранили при -80°С. Аликвоты по 105 мкл хранили в стерильных пробирках Эппендорфа с завинчивающимися крышками, герметизированными парафильмом при 4, 25 и 40°С.Через одну неделю, две недели, один месяц и три месяца образец, хранящийся при каждой температуре, охлаждали до 4°С, центрифугировали в течение 5 минут при 13000 оборотов/минута и затем хранили при -80°С до биосенсорного анализа.
Биосенсорный анализ выполняли по существу, как описано в примере 2, но с HSA (Albucult, Novozymes), иммобилизованном на 704 резонансных единицах (RU), а вариант альбумин-связывающего полипептида разводили до 10 нМ и вводили при постоянной скорости потока 20 мкл/минута в течение 10 минут с последующим введением HBS-EP в течение 10 минут.
Результаты
Связывание с HSA РЕР07986 (SEQ ID NO:163) сохранялось после хранения при 4, 25 и 40°С в течение по меньшей мере трех месяцев. Максимальные ответы на связывание с HAS, полученные для РЕР07986, хранящегося при различных условиях, показаны на фигуре 9.
Пример 10
Стабильность альбумин-связывающего полипептида в экстремальных условиях
68
В этом примере описан биосенсорный анализ и анализ кругового дихроизма (CD) альбумин-связывающего полипептида РЕР08296 (DOTA-конъюгированного РЕР08185, SEQ ID NO:148) после тепловой обработки (90°С) в буфере с низким рН (~4,0). Поскольку такие экстремальные условия реакции следует применять, например, для Са-мечения DOTA-модифицированных белков, влияние высокотемпературной обработки и обработки с низким рН на структурную идентичность полипептида и его способность связывать HSA исследовали путем измерения температуры плавления (Tm), свойств рефолдинга и связывания с HSA.
Материал и методы
Биосенсорный анализ тепловой устойчивости
68
68
Биосенсорный анализ на приборе Biacore 2000 (GE Healthcare) осуществляли с HSA (Albucult, Novozymes), иммобилизованным посредством присоединения амина на слое карбоксилированного декстрана поверхностей чипа СМ-5 (марка для исследований; GE Healthcare) согласно рекомендациям производителя. Поверхность 1 чипа активировали, деактивировали и использовали в качестве контрольной ячейки (пустая поверхность) на протяжении введений, тогда как поверхность 2 включала HAS, иммобилизованный на 724 резонансных единицах (RU). PEP08296 (50 мкл, 100 мкг) в 15 мл пробирке Falcon разводили 450 мкл 0,2 М ацетата натрия (NaAc), рН 5,5, до конечной концентрации пептида 0,2 мг/мл. После добавления 1,5 мл 0,05 М НС1 (условия и объем подобны используемым для элюирования Ge/Ga генератора), образец инкубировали в течение 10 минут при 90°С или RT (контроль), а затем переносили в RT. Добавляли 6 мл 0,1 М цитрата натрия, чтобы нейтрализовать рН. Термообработанный PEP08296 (0,8 и 4 нМ) вводили при постоянной скорости потока 50 мкл/минута в течение 5 минут с последующей диссоциацией в HBS-EP в течение 15 минут. Поверхности регенерировали с помощью одного введения 25 мкл 10 мМ HCl. Результаты анализировали с помощью программного обеспечения BIAevaluation (GE Healthcare). Кривые пустой поверхности вычитали из кривых поверхностей лиганда.
Определение температуры плавления (Тm)
PEP08296 растворяли в PBS до конечной концентрации 0,5 мг/мл. PBS с рН приблизительно 4,0 получали путем добавления 9,5 мкл 100 мМ НС1 к 100 мкл PBS. Анализ кругового дихроизма (CD) осуществляли, как описано в примере 3.
CD-анализ тепловой устойчивости
Чтобы исследовать структурную обратимость РЕР08296 после тепловой обработки, в образце регистрировали два CD-спектра между от 195 до 250 при 20°С. После первого спектра выполняли VTM-цикл с нагревом до 90°С, как описано выше, за которым следовало поглощение второго CD-спектра от 195 до 250 нм при 20°С. В дополнение к этому, РЕР08296 инкубировали в буфере PBS с рН 4,0 или в буфере PBS с рН 7,2 в течение 12 минут при 90°С в термомиксере (500 оборотов/минута, интервал перемешивания 10 с включением, 30 с выключением). После инкубации образцы охлаждали на льду с последующим центрифугированием при 13000 оборотов/минута в течение 1 минуты, а CD-спектр от 195 до 250 нм регистрировали при 20°С.
Результаты
68
Биосенсорный анализ применяли для того, чтобы исследовать, будет ли тепловая обработка в комбинации с низким рН, т.е. в обычных условиях, необходимых для Ga-мечения полипептида, влиять на способность РЕР08296 связываться с HSA. На фигуре 10 показан результат этого анализа связывания, осуществленного с помощью прибора Biacore 2000. Две разные концентрации РЕР08296, 0,8 нм и 4 нМ, вводили на поверхности с 724 RU иммобилизированного человеческого сывороточного альбумина. Тепловая обработка в течение 10 минут при 90°С, рН 4,0, немного снижала способность связывания РЕР08296 с HSA, что свидетельствует о потенциальном структурном изменении молекулы.
CD использовали для того, чтобы дополнительно исследовать потенциальное структурное изменение молекулы. Похожие CD-спектры до и после нагрева доказали бы, что образец структурно обратим. В первом эксперименте образцы нагревали с температурным градиентом от 20°С до 90°С. CD-спектры до и после тепловой обработки были похожими в эксперименте определения Tm с характерными минимумами при 207 и 221 нм, указывая на α-спиральность, т.е. краткосрочный нагрев до 90°С в буфере либо с рН 4, либо рН 7,2 не влиял на структуру РЕР08296.
Однако предварительная обработка РЕР08296 в течение 12 минут при 90°С показала немного сниженное содержание альфа-спирали РЕР08296 при инкубировании при рН 4,0, но не было никого изменения в содержании альфа-спирали при инкубировании при рН 7,2. Характерные наложения двух CD-спектров до и после нагрева показаны на фигуре 11.
Результаты из определения температуры плавления (Tm) суммированы в Таблице 4.
Таблица 4
Tm РЕР08296
Обозначение
Tm (°С)
РЕР08296 при рН 7,2
59
РЕР08296 при рН 4,0
62
Пример 11
68
Визуализация пулов крови с использованием Ga-меченного альбумин-связывающего полипептида
68
В экспериментах, составляющих этот пример, через 1,5 часа после распределения по всему организму Ga-меченного РЕР08296 (DOTA-конъюгированный РЕР08185, SEQ ID NO:148) у крыс выполняли динамическую визуализацию. Вследствие сильной ассоциации между меченным полипептидом и сывороточным альбумином меченый полипептид можно применять, например, для исследования пула крови и тканевой проницаемости.
Материал и методы
68
Ga-мечение РЕР08296
68
68
68
68
3
4
3
Ga элюировали в качестве 68GaCl из Ge/Ga генератора (Obninsk, Russia) с помощью 0,1 М HCl, преобразовывали с помощью концентрированной HCl в GaCl-, захваченный на анионообменной колонке (Chromafix-НСО), а затем элюировали с помощью 18 MQ воды, как ранее описано (Vehkyan et al (2008), Nucl Med Biol 35:529-536).
68
Мечение осуществляли по существу, как описано в Tolmachev et al. (EJNMMI 37:1356-1367, 2010). Концентрированный Ga-элюат (150-200 мкл) добавляли к РЕР08296 (≥100 мкг в 0,2 М натрий-ацетатного буфера, рН 5,5) и рН. доводили до 3,5-4 с использованием ацетата натрия (1,25 М) или HCl (0,1 М). Смесь для мечения инкубировали при 90 С в течение 15 минут перед охлаждением, а меченый белок выделяли путем эксклюзионной очистки на колонке NAP-5, элюированной с помощью забуференного физиологического раствора.
68
Радиохимическую чистоту и идентичность Ga-меченного белка оценивали путем радио-HPLC с применением UV (210 нм) и детекторов радиоактивности, соединенных последовательно, а колонку Superdex Peptide 10/300 GL (GE Healthcare) элюировали с помощью забуференного физиологического раствора.
PET мелких животных
2
68
Крысу (277 г) анестезировали с помощью изофлурана (первоначально 5%, затем 2%, смешанного с 7:3 воздух/О), контролировали посредством аппарата для ингаляционного наркоза E-Z с применением кислородной маски от Euthanex Corporation и держали на электрической грелке (37°С) внутри системы microPET Focus 120 (Siemens, CTI Concorde Microsystems). Ga-PEP08296, 33 МБ к, распределяли в шприце, разводили физиологическим раствором до 0,5 мл и инъецировали через хвостовую вену. Данные получали со всего тела путем передвижения стола согласно протоколу, предусматривающему непрерывное движение стола, в течение 1,5 часа. Данные обрабатывали с MicroPET Manager и делали поправку на случайные совпадения, запаздывание и распад. Изображения реконструировали путем стандартной двухмерной фильтрованной обратной проекции с применением линейного фильтра и оценивали с использованием программного обеспечения Inveon Research Workplace (Siemens Medical Solutions).
Результаты
68
64
11
11
11
Паттерны основного распределения (фигура 12) для РЕР08296 были очень похожими на таковые альбумина, меченного радиоизотопами, такими как Ga-DOTA, Cu-DOTA и С (смотри, например, Hoffend et al (2005), Nucl Med Biol 32:287-292, и Lu et al (2008), "[1-C]Butanol and [Methyl-C]Albumin for Blood Flow and Blood Pool Imaging", poster at the Xlth Turku PET Symposium, 24-27 May 2008). Вкратце, концентрации с высокой радиоактивностью наблюдали в главных кровеносных сосудах на протяжении сканирования. Органы с большими объемами крови (печень, селезенка и почка) были также четко очерчены, какой была радиоактивность пула крови сердца. Радиоактивность в мочевом пузыре увеличивалась на протяжении периода наблюдения, причем это наблюдение почечной экскреции было сопоставимо с предыдущими наблюдениями с мечеными индикаторами на основе альбумина и с наблюдениями метаболизма альбумина самого по себе.
68
Паттерн общего распределения радиоактивности и очень медленного плазматического клиренса после внутривенной инъекции Ga-PEP08296 сопоставимы с его предполагаемым очень быстрым и сильным связыванием с альбумином. Таким образом, эти результаты говорят в пользу дальнейших применений радиоактивного индикатора в качестве средства для визуализации пулов крови in vivo для применения в исследованиях с позитронно-эмиссионной томографией тканевой проницаемости как на протяжении развития заболевания, так и на протяжении терапевтического вмешательства.
Пример 12
Растворимость альбумин-связывающего полипептида
Растворимость РЕР07986 (SEQ ID NO:163) в физиологическом буфере исследовали посредством последовательных концентраций образца с применением ультрафильтрации с последующим измерением концентрации и исследованием состояния агрегации. Концентрации, определенные путем непосредственного считывания показаний абсорбции при 280 нм, соответствовали концентрациям, определенным посредством гель-фильтрации, показывая растворимость более чем 42 мг/мл без выявления агрегатов.
Материал и методы
Лиофилизированный РЕР07986 растворяли в буфере NaPi (20 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия, рН 7,2) в концентрации 3 мг/мл. Элементы центрифужного фильтра Amicon Ultra, пропускная способность 3 кДа, (Millipore, № по кат. UFC800324) предварительно промывали 2 мл буфера NaPi путем центрифугирования при 4000 g в течение 20 минут в роторной центрифуге с качающимися корзинами (Multifuge, Heraeus). 1620 мкл 3 мг/мл РЕР07986 наносили на первый элемент центрифужного фильтра и центрифугирование осуществляли при 4000 g, 20°С, в течение 7 минут. 25 мкл образца извлекали (UF-образец 1) для следующего анализа, а остаток образца переносили на второй элемент центрифужного фильтра. Центрифугирование и извлечение образца повторяли три раза с временем вращения 8, 9 и 20 минут, соответственно (UF-образец 2, 3 и 4, соответственно). Считывание показаний оптической плотности осуществляли с использованием спектрофотометра NanoDrop ND-1000 и путем разведения UF-образцов 1-4 в буфере NaPi в 2, 4, 6 и 12 раз, соответственно. Концентрации вычисляли с использованием коэффициента затухания 1 Abs 280=1,955 мг/мл. Гель-фильтрацию осуществляли на системе 1100 HPLC (Agilent Technologies) с использованием колонки Superdex75 10/300 GL (GE Healthcare), которую уравновешивали в буфере NaPi. 10 мкл каждого UF-образца наносили на колонку; буфер NaPi использовали в качестве подвижного буфера, скорость потока составляла 0,5 мл/минута. Так же получали хроматограмму стандарта молекулярной массы - овальбумина (GE Healthcare), который вводили в концентрации 5 мг/мл. Концентрации определяли посредством интегрирования площади под кривой.
Результаты
Концентрации, определенные путем непосредственного считывания показаний оптической плотности при 280 нм, и концентрации, определенные посредством гель-фильтрации, показаны в Таблице 5. Растворимость РЕР07986 (SEQ ID NO:163) составляет по меньшей мере 42 мг/мл в физиологическом буфере (20 мМ фосфата натрия, 150 мМ хлорида натрия. рН 7,2). Никаких агрегатов посредством гель-фильтрации обнаружено не было, как показано на фигуре 13.
Таблица 5
Концентрации, определенные после последовательной концентрации РЕР07986 (SEQ ID NO:163)
Образец
Концентрации (мг/мл), спектрофотометра
определенные посредством гель-фильтрации
UF2
12,1
12,4
UF3
22,2
22,1
UF4
42,7
42,6