ВАКЦИНА ПРОТИВ ВЫСОКОПАТОГЕННОГО РЕПРОДУКТИВНО-РЕСПИРАТОРНОГО СИНДРОМА СВИНЕЙ (HP PRRS)
VACCINE AGAINST HIGHLY PATHOGENIC PORCINE REPRODUCTIVE AND RESPIRATORY SYNDROME (HP PRRS)

Перечень последовательностей
В настоящую заявку входит перечень последовательностей в бумажной версии и электронной версии, сущность и содержание которых включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Предпосылки создания изобретения
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится в целом к вакцинам против инфекционных болезней. Более конкретно оно относится к вакцинам против высокопатогенного репродуктивно-респираторного синдрома свиней (HP PRRS), вирусного заболевания, поражающего свиней.
Описание известного уровня техники
Репродуктивно-респираторный синдром свиней (PRRS) представляет собой серьезное заболевание свиней, и оно характеризуется либо расстройством органов воспроизводства супоросных свиней, либо нарушением дыхательного пути, прежде всего у поросят-сосунков. Это вирусное заболевание было впервые обнаружено в Соединенных Штатах в 1987 г., затем оно было выявлено в Европе и идентифицировано в Азии в начале 1990-х годов. К настоящему времени PRRS распространился по всему миру, характеризуясь эндемичностью для стран, в которых выращивают свиней, приводя каждый год к значительным экономическим потерям. Возбудителем PRRS является вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), который наряду с вирусом повышения уровня лактатдегидрогеназы мышей (LDEV), вирусом артериита лошадей (EAV) и обезьяним вирусом геморрагической лихорадки (SHFV) принадлежит к семейству Arteriviridae отряда Nidovirales.
PRRSV, который является представителем небольших покрытых оболочкой вирусов, имеет геном, который представлен одной позитивной цепью (ssPHK) размером примерно 15,1-15,5 т.п.н., содержащий по меньшей мере 8 открытых рамок считывания (ОРС), которые кодируют примерно 20 предполагаемых белков. Геном содержит также две нетранслируемые области (UTR) на 5'- и на 3'-концах. Так, ОРС1 (OPC1a и OPC1b) локализована в прямом направлении относительно 5'-UTR и на ее долю приходится более 2/3 полного генома. OPC1a транслируется непосредственно, в то время как OPC1b транслируется со сдвигом рибосомной рамки считывания, что приводит к образованию крупного полипротеина OPC1ab, из которого в результате протеолитического расщепления образуются продукты, связанные с системой транскрипции и репликации вируса. ОРС 2-7, локализованные в обратном направлении относительно 3'-UTR, кодируют ряд вирусных структурных белков, ассоциированных с вирионом, таких как оболочечный белок (Е) и нуклеокапсидный белок (N). Все эти белки транслируются из 3'-котерминального блока субгеномных мРНК (sgmPHK).
Филогенетический анализ изолятов PRRSV из различных географических регионов в мире четко продемонстрировал наличие двух основных генотипов: тип I представлен европейским прототипом (вирус Лелистада, (LV), а тип II представлен северо-американским штаммом АТСС VR2332 (геномная последовательность VR2332 находится в GenBank, регистрационный № AY150564) в качестве прототипа (Murtaugh и др., Arch Virol. 140, 1995, cc.1451-1460). Кроме того, в некоторых исследованиях установлено, что ОРС5 и ген (nsp2), кодирующий неструктурный белок 2 (NSP2), могут представлять собой наиболее генетически вариабельные области в геноме PRRSV (см. SwissProt, регистрационный № Q9WJB2 или SEQ ID NO:2, в которой представлена последовательность NSP2 VR2332). Известно также, что штаммы PRRSV значительно отличаются по патогенности.
В 2006 г. произошла не имеющая себе равных крупномасштабная вспышка ранее неизвестного, но обозначенного в целом как «как сопровождающаяся сильной лихорадкой (отличающаяся высокой температурой) форма» заболевания с симптомами PRRS, которое распространилось более чем в 10 провинциях и поразило свыше 2000000 свиней, из которых погибло примерно 400000. В отличие от типичной формы PRRS «отличающейся высокой температурой формой» поражалось также много взрослых свиней. Эта пандемия атипичного PRRS первоначально была идентифицирована как напоминающее холеру заболевание свиней, для которого характерны неврологические симптомы (например, дрожь), высокая температура (40-42°С), эриматозная исчезающая сыпь и т.д. Аутопсии в сочетании с иммунологическими анализами четко продемонстрировали поражение высокопатогенными PRRSV многих органов, в которых были обнаружены серьезные патологические изменения (Tian и др., PLoS ONE., 2(6), 2007, е526). Wанализ всего генома выделенных вирусов позволил установить, что эти изоляты PRRSV относятся к типу II и обладают высоким уровнем гомологии с НВ-1, китайским штаммом PRRSV (идентичность на уровне нуклеотидной последовательности 96,5%) и с JX143 (Yuan и др., International PRRS Symposium, Chicago, (Международный симпозиум по PRRS, Чикаго) 2007 г.). Геномная последовательность JX143 представлена в SEQ ID NO:1 или в EMBL/GenBank, регистрационный № EU708726. Установлено также, что эти вирусные изоляты содержат уникальный молекулярный отличительный признак, а именно прерывистую делецию 30 аминокислот в неструктурном белке 2 (NSP2) (Tian и др., PLoS ONE., 2(6), 2007, е526), «Отличающуюся высокой температурой» форму PRRS в настоящее время обозначают также как «высокопатогенный PRRS» или HP PRRS.
Выделение вируса PRRS (PRRSV) и изготовление вакцин против PRRS, которые содержат либо модифицированный живой (ослабленный), либо инактивированный PRRSV, описано в многочисленных публикациях (WO 92/21375, WO 93/06211, WO 93/03760, WO 93/07898, WO 96/36356). В частности, в WO 93/03760 описаны методы выделения, культивирования, ослабления вируса PRRS, а также изготовления соответствующих вакцин и, прежде всего изолята прототипа PRRS типа II АТСС VR-2332. В WO 96/36356 описано, в частности, пригодное для применения ослабленное потомство вышеуказанного изолята, полученное путем серийных пассажей в клетках обезьян, которое депонировано под регистрационным номером АТСС VR-2495. Соответствующий продукт в виде модифицированной живой вакцины (MLV) поступает в продажу от фирмы Boehringer Ingelheim под маркой Ingelvac PRRS MLV. Другая MLV-вакцина на основе изолята типа II поступает в продажу под маркой Ingelvac PRRS ATP.
Пригодной стратегией предупреждения PRRS является вакцинация. Однако пока не известно, будет ли обладать эффективностью вакцинация против HP PRRS, и какой тип вакцины можно применять.
Описание изобретения
При создании изобретения неожиданно было установлено, что ослабленные штаммы вируса PRRS типа II можно применять для вакцинации и защиты свиней от форм болезни, отличающихся высокой температурой, которые ассоциированы с репродуктивно-респираторным синдромом свиней. Идентификация профилактических свойств ослабленных штаммов вирусов PRRS типа II может позволить лечить свиней, имеющих высокий риск заражения, например, HP PRRS. Указанная программа вакцинации или лечения может способствовать снижению вероятности возникновения других вспышек HP PRRS, аналогичных той, которая разорила свиноводство Китая в 2006 г. и привела к отбраковке грубо 20 миллионов свиней, или снижению их воздействия.
Одним из объектов настоящего изобретения является способ профилактической защиты свиней от воздействия отличающейся высокой температурой формы болезни, заключающийся в том, что вводят свинье, которая нуждается в этом, иммуногенную композицию, содержащую в эффективном количестве вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II. Композиция может содержать также фармацевтически приемлемый носитель. Композиция может содержать также адъювант. Способ можно применять в качестве превентивной или лечебной меры. Кроме того, введение в эффективном количестве такой иммуногенной композиции приводит к снижению коэффициента заболеваемости или серьезности клинических симптомов отличающихся высокой температурой форм заболевания PRRS.
В изобретении предложен также способ вакцинации свиней от отличающейся высокой температурой формы болезни, заключающийся в том, что вводят свинье иммуногенную композицию, содержащую в эффективном количестве вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II. Композиция может содержать также фармацевтически приемлемый носитель, Композиция может содержать также адъювант. Кроме того, введение в эффективном количестве такой иммуногенной композиции приводит к снижению коэффициента заболеваемости или серьезности клинических симптомов отличающейся высокой температурой формы заболевания PRRS.
Отличающаяся высокой температурой болезнь может представлять собой форму, ассоциированную с репродуктивно-респираторным синдромом свиней. Репродуктивно-респираторный синдромом свиней может представлять собой высокопатогенный («HP PRRS»). HP PRRS или отличающуюся высокой температурой форму болезни можно выявлять у свиньи по наличию одного или нескольких следующих клинических симптомов: гиперемия кожи, пятна крови, петехиальное кровоизлияние, эриматозная исчезающая сыпь и папулы, часто присутствующие в ушах, ротовой полости, носовой полости, на спине и внутренней поверхности бедер. Другие обычные симптомы могут включать высокую температуру (температура более 40°С), депрессию, анорексию, кашель, астму, хромоту, дрожь, нарушение дыхательного пути и диарею. HP PRRS вызывается вирусом HP PRRS.
Другим объектом изобретения является способ профилактической защиты свиньи от инфекции, которая вызывается вирусом HP PRRS, заключающийся в том, что вводят свинье, которая нуждается в этом, иммуногенную композицию, содержащую в эффективном количестве вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II.
Присутствие вируса HP PRRS, открытого в 2002 г. в Китае в качестве представителя генотипа 2 PRRS, коррелирует с так называемой отличающейся высокой температурой формой болезни. После этого было установлено, что вирус HP PRRS стал доминантным в некоторых провинциях Китая, что свидетельствует о его избирательном преимуществе при распространении в пораженных популяциях свиней по сравнению с другими вирусами PRRS.
Понятие «вирус HP PRRS» означает (но, не ограничиваясь только ими) штамм вируса PRRS, который имеет нуклеотидную последовательность, практически идентичную последовательности, представленной в SEQ ID NO:1. Предпочтительно вирус HP PRRS представляет собой штамм вируса PRRS, который имеет нуклеотидную последовательность, практически идентичную последовательности, представленной в SEQ ID NO:1. Практически идентичная последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, означает, что нуклеотидная последовательность штамма вируса PRRS предпочтительно содержит последовательность, идентичную на 85-100% последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, предпочтительно при условии, что вирус HP PRRS не представляет собой вирус PRRS типа II, указанный в настоящем описании, например, нуклеотидная последовательность ОРС5 менее чем на 91%, предпочтительно менее чем на 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична последовательности ОРС5 VR2332, референс-изолята вируса. Нуклеотидная последовательность штамма вируса HP PRRS предпочтительно более чем на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% или 89% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, также при условии, что вирус HP PRRS не представляет собой вирус PRRS типа II, указанный в настоящем описании, например, нуклеотидная последовательность ОРС5 менее чем на 91%, предпочтительно менее чем на 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична последовательности ОРС5 VR2332, референс-изолята вируса. Еще более предпочтительно нуклеотидная последовательность штамма вируса PRRS более чем на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или более 99% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, предпочтительно при условии, что вирус HP PRRS не представляет собой вирус PRRS типа II, указанный в настоящем описании, например, нуклеотидная последовательность ОРС5 менее чем на 91%, предпочтительно менее чем на 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична последовательности ОРС5 VR2332, референс-изолята вируса.
Понятие «вирус HP PRRS» может означать также любые штаммы вируса PRRS, которые имеют определенную модификацию в белке NSP2. Согласно этому определению штамм вируса HP PRRS представляет собой штамм вируса PRRS, который кодирует белок NSP2, в котором аминокислота, соответствующая лейцину в положении 482 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, удалена в результате делеции, и который вызывает клинический симптом в виде высокой температуры. В качестве альтернативы или в дополнении к делеции лейцина в указанном положении в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, аминокислоты, соответствующие аминокислотам 534-562 последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, могут быть удалены в результате делеции из кодируемого вирусом PRRS белка NSP2. В этом контексте последовательность, представленную в SEQ ID NO:2, следует рассматривать в качестве примера, и понятие белок NSP2 не ограничено белком NSP2, последовательность которого представлена в SEQ ID NO:2. На основе указанных выше сведений специалист в данной области может легко идентифицировать любую соответствующую модификацию в штаммах вируса PRRS, которые имеют последовательность белка NSP2, отличающуюся от последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, но имеют такую же модификацию, т.е. делецию лейцина, который соответствует лейцину в положении 482 последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и/или делению аминокислот, соответствующих аминокислотам 534-562 последовательности, представленной в SEQ ID NO:2.
Кроме того, вирус HP PRRS может означать также штамм вируса PRRS, который имеет нуклеотидную последовательность, практически идентичную последовательности, представленной в SEQ ID NO:1 (как она описана выше) и кодирует белок NSP2, в котором аминокислота, соответствующая лейцину в положении 482 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и/или аминокислоты, соответствующие аминокислотам последовательности, представленной в 534-562 SEQ ID NO:2, удалены в результате делеции из кодируемого вирусом PRRS белка NSP2.
Кроме того, понятие «вирус HP PRRS» относится к вирусу HP PRRS, который представляет собой штамм вируса PRRS, имеющий нуклеотидную последовательность, которая практически идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, при условии, что вирус HP PRRS не представляет собой вирус PRRS типа II, указанный в настоящем описании, например, нуклеотидная последовательность ОРС5 менее чем на 91%, предпочтительно менее чем на 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична последовательности ОРС5 VR2332, референс-изолята вируса (как описано выше), и кодирует белок NSP2, в котором аминокислота, соответствующая лейцину в положении 482 аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, и/или аминокислоты, соответствующие аминокислотам 534-562 последовательности, представленной в SEQ ID NO:2, удалены в результате делеции из кодируемого вирусом PRRS белка NSP2.
Кроме того, понятие «вирус HP PRRS» относится к вирусу HP PRRS, который представляет собой штамм вируса PRRS, имеющий нуклеотидную последовательность, которая практически идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:1, при условии, что вирус HP PRRS не представляет собой вирус PRRS типа II, указанный в настоящем описании, например, нуклеотидная последовательность ОРС5 менее чем на 91%, предпочтительно менее чем на 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологична последовательности ОРС5 VR2332, реферес-изолята вируса (как описано выше), и кодирует белок NSP2, при этом антитела, обладающие реактивностью к пептидам, соответствующим аминокислотам (ак) в положениях 536-550 или 546-560, или 476-490, не обладают к нему реактивностью.
Кроме того, известно, что указанные ниже изоляты вируса PRRS представляют собой штаммы вируса HP PRRS. Таким образом, понятие «штамм вируса HP PRRS» в контексте настоящего описания должно включать также любые из указанных штаммов вирусов, а также любое их потомство: штамм вируса HP PRRS АН-1; AHCFSH; AHCFZC; BB07; BD-8; BQ07; CL07; СХ07; CZ07; FY060915; FY080108; GC-2; GCH-3; GD1; GD2; GD2007; GD3; GD4; GDSD1; GDY1-2007; GDY2-2007; GDYF1; GS2008; GXHZ12; GXHZ13; GXHZ14; GXHZ16; GXHZ19; GXHZ2; GXHZ21; GXHZ4; GXLZ5; GXLZ7; GY; GZCJ; GZDJ; GZHW1; GZHW2; GZHX; GZJS; GZKB; GZKY; GZLJ1; GZWB; GZWM; GZZB; Hainan-1; Hainan-2; HB1; HB2; HB3; HB-Tsh1; HB-Xt1; HEN46; HeN-KF; HeN-LH; HeN-LY; HLJDF; HLJMZ1; HLJMZ2; HLJMZ3; HLJZY; HM-1; HN2; HN2007; HN3; HN1d; HN1y; HNLY01; HNNX01; HNPJ01; HNsp; HNXT1; HNyy; HNyz; HQ-5; HQ-6; HUB; HuN; HUN1; HUN11; HUN15; HUN16; HUN17; HUN2; HUNS; HUN4; HUNS; HUN6; HUN7; Hunan-1; Hunan-2; Hunan-3; HUNH2; HUNH4; HuNh1; HUNL1; HUNX4; HZ061226; HZ070105; Jiangsu-1; Jiangsu-2; Jiangsu-3; Jiangxi-2; Jiangxi-4; JLYS; JN; JX1; JX143; JX2; JX-2; JX2006; JX3; JX4; JX5; JXA1; KS06; LC07; LJ; LS06; LS-4; LY07; NB070319; SC07; SD; SD14; SDWF2; SH02; ST-7; SX2007; SY0608; TJDMJ; TJZHJ2; TJZHJ3; TQ; TQ07; TW07; WF07; XJ07; XL2008; YN2008; YNBS; YNDL; YNMG; YNWS; YNYS; YNYX1; YNYX3; ZJ06; ZJCJ; ZJWL; ZX07; ZS070921. Понятие «потомство» не должно быть ограничено изолятом вируса, полученным из любого родительского вируса, указанного выше, и имеющего нуклеотидную последовательность, которая идентична более чем на 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% и 99% нуклеотидной последовательности соответствующего родительского штамма вируса.
Понятие «вирус PRRS типа II» означает (но, не ограничиваясь только им) штамм вируса PRRS, практически идентичный изоляту вируса, который депонирован как ATCC-VR2332, или любому потомству изолята вируса, депонированного как ATCC-VR2332. Практически идентичный в контексте настоящего описания означает, что нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок ОРС5, идентична на 85-100% нуклеотидной последовательности изолята вируса, депонированного как ATCC-VR2332, и представленной в SEQ ID NO:3. Нуклеотидная последовательность ОРС5 предпочтительно более чем на 86%, 87%, 88% или 89% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. Еще более предпочтительно нуклеотидная последовательность ОРС5 более чем на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или более чем на 99% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO:3. Предпочтительно вирус PRRS типа II в контексте настоящего описания означает штамм вируса PRRS, который практически идентичен изоляту вируса, депонированному как ATCC-VR2332, или любому потомству изолята вируса, депонированного как ATCC-VR2332 (описанному выше), но в котором отсутствует делеция в гене NSP2, который кодирует аминокислоту, соответствующую аминокислотам 534-562 последовательности, представленной в SEQ ID NO:2. Полная последовательность вируса PRRS ATCC-VR2332 находится в GenBank под регистрационным номером U87392.
Понятие «вирус PRRS типа II» должно также включать любой ослабленный вирус, полученный из любого из вышеперечисленных штаммов вируса PRRS типа II. Например, понятие «вирус PRRS типа II» должно также включать ослабленный вирус PRRS типа II, депонированный как ATCC-VR2495. Кроме того, ослабленный вирус PRRS типа II может представлять собой любое ослабленное потомство изолята вируса, депонированного как ATCC-VR2332. В некоторых предпочтительных вариантах вирус PRRS типа II в сочетании с фармацевтически приемлемыми носителями может представлять собой вакцину Ingelvac PRRS MLV (серийный № JA-A64A-149) фирмы Boehrmger Ingelheim Vetmedica, Inc. (Сент-Джозеф, шт.Миссури). Понятие «вирус PRRS типа II» может включать также изоляты, обозначенные как НВ-1; BJ-4; CH-1a; CH-1R; CH-1R01; HB-2; HN1; HT06; HZ07; LS05; LY03; NH04; PL97-1; S1; SH061130; SX071226; TW07-1; WF03; ХХ03; ZJJ04; ZJJ05; ZJJ07, которые не представляют собой штаммы HP PRRS китайского происхождения.
Другим объектом настоящего изобретения является способ профилактики заражения свиней HP PRRS, заключающийся в том, что вводят свинье, которая нуждается в этом, иммуногенную композицию, содержащую в эффективном количестве вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус типа PRRS типа II, где вирус PRRS типа II представляет собой штамм вируса PRRS, который практически идентичен изоляту вируса, депонированному как ATCC-VR2332, или любому потомству изолята вируса, депонированного как ATCC-VR2332. Предпочтительно вирус PRRS типа II не несет делецию в кодируемых геном NSP2 аминокислотах, которые соответствуют аминокислотам 534-562 последовательности, представленной в SEQ ID NO:2. Еще более предпочтительно вирус PRRS типа II представляет собой ослабленный вирус PRRS типа II, депонированный как ATCC-VR2495. Кроме того, вирус PRRS типа II представляет собой вакцину Ingelvac PRRS MLV (серийный № JA-A64A-149).
2,0
9,0
3,0
4,0
4,0
8,0
50
50
50
Эффективное количество вируса PRRS типа II может представлять собой количество вируса, вызывающее или обладающее способностью вызывать иммунный ответ у животного, которому вводят вирус в эффективной дозе. Количество, являющееся эффективным, может зависеть от ингредиентов вакцины и схемы введения. Если применяют препарат инактивированного вируса или модифицированного живого вируса, то можно рекомендовать применять вакцину в количестве, содержащем от 10 до примерно 10 TCID (средняя цитопатогенная доза (инфицирующая 50% клеток)), более предпочтительно от 10 до примерно 10 TCID и еще более предпочтительно от примерно 10 до примерно 10 TCID на дозу.
Согласно настоящему описанию вирус PRRS типа II можно применять в виде инактивированного полностью убитого вируса или в виде ослабленной формы вируса PRRS типа II с целью профилактики свиньи для защиты от отличающейся высокой температурой формы болезни, указанной в настоящем описании. Кроме того, субъединицы, включая иммуногенные фрагменты или фракции вируса PRRS типа II, можно применять также с целью профилактики свиньи для защиты от отличающейся высокой температурой формы болезни.
1
7
3
5
4
5
3
10
4
9
5
8
6
7
Согласно настоящему описанию ослабленный вирус PRRS типа II можно применять также в виде модифицированной живой вакцины (MLV), содержащей один или несколько указанных выше живых штаммов в фармацетически приемлемом носителе. В другом или дополнительном варианте инактивированный вирус можно применять для получения убитой вакцины (KV), описанной выше. Можно использовать препаративные формы MLV, которые позволяют вводить от 10 до 10 вирусных частиц, предпочтительно от 10 до 10 частиц на дозу, более предпочтительно от 10 до 10 частиц на дозу. Препаративные формы KV можно создавать на основе титра до инактивации, составляющего от 10 до 10, от 10 до 10, от 10 до 10 или от 10 до 10вирусных частиц на дозу.
Вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II, можно вводить свинье перед обработкой свиньи штаммом вируса PRRS, который вызывает HP PRRS, в виде профилактической меры, одновременно с обработкой свиньи штаммом вируса PRRS, который вызывает HP PRRS, или после обработки изучаемой свиньи штаммом вируса PRRS, который вызывает HP PRRS. Изучаемая свинья может иметь один или несколько клинических признаков или общих симптомов HP PRRS или отличающейся высокой температурой формы болезни, которые описаны выше. Изучаемая свинья может обладать очень высокой чувствительностью к отличающейся высокой температурой форме болезни, ассоциированной с HP PRRS. Изучаемая свинья может обладать очень высокой чувствительностью к HP PRRS. Изучаемая свинья может обладать чувствительностью к HP PRRS из-за иммунодефицита. Изучаемая свинья может обладать чувствительностью к HP PRRS в зависимости от того, на какой ферме она выращивается. Чувствительная свинья может выращиваться на ферме в Китае. Чувствительная свинья может выращиваться в провинции в Китае, такой как провинция Цзянси, провинция Хэбэй или в городе Шанхае (см. Tian и др., PloS ONE, 2(6), 2007, е526, содержание указанной публикации включено в настоящее описание в качестве ссылки). Ослабленный вирус PRRS типа II можно вводить путем инъекции, ингаляции или с помощью имплантата, при этом инъекция является предпочтительной. В зависимости от требуемой продолжительности и эффективности вакцинации или обработки вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II, можно вводить один или несколько раз, а также периодически, например, на суточной основе в течение нескольких дней, недель или месяцев и в различных дозах. При этом предпочтительным является введение одной дозы. Инъекцию можно осуществлять в периферическую или центральную вену в требуемом количестве или в другом варианте применяют непрерывную инфузию. Вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II можно вводить орально, парентерально, подкожно, внутримышечно, внутрикожно, подъязычно, трансдермально, ректально, через слизистую оболочку, местно или путем ингаляции, с помощью трансбуккального введения или использовать их комбинацию. Вирус PRRS типа II, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II, можно применять также в форме имплантата, который может обеспечивать медленное высвобождение ослабленного вируса. Для внутримышечного введения можно использовать объем, составляющий от 0,5 до 3 мл, более предпочтительно от 1 до 2,5 мл, еще более предпочтительно от 1,5 до 2 мл. Наиболее предпочтительным является внутримышечное введение 2 мл. Для внутрикожного введения применяют объем, составляющий от 0,05 до 1 мл, более предпочтительно от 0,1 до 0,8 мл, еще более предпочтительно от 0,1 до 0,5 мл, еще более предпочтительно от 0,2 до 0,4 мл. Наиболее предпочтительно для внутрикожной инъекции можно использовать 0,2 мл вируса PRRS типа II можно использовать объемы, составляющие от 0,5 до 5 мл, более предпочтительно от 1 до 4 мл, еще более предпочтительно от 2 до 3 мл. Для внутриносового введения наиболее предпочтительно следует использовать объем, составляющий 3 мл.
Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой любой и все такие агенты, как растворители, диспергирующие среды, материалы для нанесения покрытия, стабилизаторы, разбавители, консерванты, антибактериальные и противогрибковые средства, агенты для придания изотоничности, замедляющие адсорбцию агенты и т.п.
«Адъюванты» в контексте настоящего описания могут представлять собой гидроксид алюминия и фосфат алюминия, сапонины, например, Quil A, QS-21 (фирма Cambridge Biotech Inc., Кембридж, шт.Массачусетс), GPI-0100 (фирма Galenica Pharmaceuticals, Inc., Бирмингем, шт.Алабама), эмульсию типа вода-в-масле, эмульсию типа масло-в-воде, эмульсию типа вода-в-масле-в-воде. Основой эмульсии может быть легкое жидкое парафиновое масло (типа тех масел, которые входят в Европейскую фармакопею); изопреноидное масло, такое как сквалановое или скваленовое масло, полученное в результате олигомеризации алкенов, в частности изобутена или децена; эфиры кислот или спиртов, содержащие линейную алкильную группу, более предпочтительно растительные масла, этилолеат, ди(каприлат/капрат) пропиленгликоля, три(каприлат/капрат) глицерина или диолеат пропиленгликоля; эфиры разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности, эфир изостеариновой кислоты. Для получения эмульсии масло применяют в сочетании с эмульгаторами. Эмульгаторы предпочтительно представляют собой неионные поверхностно-активные вещества, в частности, эфиры сорбитана, маннида (например, ангидроманнитолеат), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рициноловой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно являются этоксилированными, и блок-сополимеры полиоксипропилена-полиоксиэтилена, в частности продукты типа Pluronic, прежде всего L121 (см. Hunter и др., The Theory and Practical Application of Adjuvants, под ред. Stewart-Tull D. E. S., изд-во JohnWiley and Sons, NY, 1995, cc.51-94 и Todd и др., Vaccine 15, 1997, cc.564-570).
Например, можно применять эмульсию фирмы SPT, которая описана на с.147 в «Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach», под ред. М. Powell и M. Newman, изд-во Plenum Press, 1995, и эмульсию MF59, описанную на с.183 в этой же книге.
Другим примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой и метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и производного алкенила. Предпочтительными адъювантами являются сшитые полимеры акриловой и метакриловой кислоты, прежде всего сшитые с простыми полиалкениловыми эфирами Сахаров или полиспиртов. Эти соединения известны под названием карбомер (Phameuropa, т.8, №. 2, июнь 1996 г.). Специалисты в данной области могут ознакомиться также с US 2909462, в котором описаны такие акриловые полимеры, сшитые с полигидроксилированным соединением, имеющим по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, атомы водорода по меньшей мере трех гидроксилов могут быть замещены ненасыщенными алифатическими радикалами, которые имеют по меньшей мере 2 атома углерода. Предпочтительными являются радикалы, которые содержат от 2 до 4 атомов углерода, например, винилы, аллилы и другие ненасыщенные этиленом группы. Ненасыщенные радикалы могут сами включать заместителей, таких как метил. Наиболее приемлемыми являются продукты, поступающие в продажу по названием Карбопол; (фирма BF Goodrich, шт.Огайо, США). Они сшиты с аллилсахарозой или с аллилпентаэритритолом. Среди них следует упомянуть Карбопол 974Р, 934Р и 971P. Наиболее предпочтительно применяют Карбопол 971P. Из сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного следует упомянуть сополимеры ЕМА (фирма Monsanto), которые представляют собой сополимеры малеинового ангидрида и этилена. Растворение этих полимеров в воде приводит к получению кислого раствора, который надо нейтрализовать, предпочтительно до физиологического значения рН, для получения раствора адъюванта, в который можно включать иммуногенную, иммунологическую композицию или саму композицию вакцины.
Кроме того, приемлемыми адъювантами среди многих других являются (но, не ограничиваясь только ими), ацетат α-токоферола, система адъювантов RIBI (фирма Ribi Inc.), блок-сополимер (CytRx, Атланта, шт.Джорджия), SAF-M (Хирон, Эмеривилль, шт.Калифорния), монофосфорил липида А, адъювант на основе липида авридина-амина, термолабильный энтеротоксин из Е.coli (рекомбинатный или любой другой), холерный токсин, IMS 1314 или мурамилдипептид.
Предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 100 мкг до примерно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 500 мкг до примерно 5 мг на дозу. Еще более предпочтительно адъювант добавляют в количестве от примерно 750 мкг до примерно 2,5 мг на дозу. Наиболее предпочтительно адъювант добавляют в количестве примерно 1 мг на дозу.
Изобретение относится также к способу получения ослабленного вируса PRRS типа II, который можно применять для лечения или иммунизации изучаемой свиньи от HP PRRS. Способ может заключаться в том, что осуществляют одну или несколько следующих стадий: (а) осуществляют пассаж ATCC-VR2332 или любого вируса PRRS типа II, практически идентичного ATCC-VR2332, согласно описанному ниже процессу для модификации вируса и придания ему авирулентности и способности иммунизировать изучаемую свинью против HP PRRS, (б) собирают полученные клетки или клеточную культуру вируса, (в) добавляют стабилизатор в полученную культуру вируса; и/или (г) лиофилизируют полученную культуру вируса. Пассаж вируса может предусматривать применение классических методов размножения и селекции; например, длительное размножение в приемлемых клетках-хозяевах для усиления ослабленного фенотипа. Пассажи могут приводить к получению вирусного штамма, который несет приобретенные мутации, многие из которых могут не изменять существенно свойства родительского штамма. Ослабленный вирус PRRS типа II можно получать на основе ATCC-VR2332 или любого другого вируса PRRS типа II, практически идентичного ATCC-VR2332, пассажи которого в клетки-хозяева осуществляли по меньшей мере 60, 65, 70, 75, 80 или более раз. Ослабленный вирус PRRS типа II можно получать из ATCC-VR2332 или любого вируса PRRS типа II, практически идентичного ATCC-VR2332, после пассажей в клетке-хозяине от 50 до 100 раз, от 60 до 90 раз, от 70 до 80 раз или от 65 до 75 раз. Ослабленный вирус PRRS типа II можно получать из ATCC-VR2332 или любого вируса PRRS типа II, практически идентичного ATCC-VR2332, после пассажей в клетке-хозяине от 70 до 75 раз. Приемлемая клетка-хозяин может представлять собой обезьянью клеточную линию, клетки Vero или альвеолярные свиные макрофаги. Предпочтительной обезьяньей клеточной линией является МА-104. Клетка-хозяин может представлять собой культуру клеток. Клеточная линия может быть заражена вирусом, который подлежит пассированию. При осуществлении каждого пассажа может требоваться инкубация образовавшейся зараженной вирусом клеточной линии или культуры клеток при температуре от 34°С до 40°С, более предпочтительно от 35°С до 39°С, еще более предпочтительно от 36°С до 38°С и еще более предпочтительно от 35°С до 37°С. Наиболее предпочтительно при осуществлении каждого пассажа может требоваться инкубация образовавшейся зараженной вирусом клеточной линии или культуры клеток при температуре 37°С. Стадия сбора может включать замораживание зараженной вирусом клеточной культуры. Лиофилизация может включать сублимацию влаги из замороженного образца зараженной вирусом клеточной культуры.
Для получения ослабленного вируса PRRS типа II можно использовать также модификацию вируса и для этой цели можно применять направленную мутацию нуклеотидной последовательности штамма вируса с помощью пригодных методов генной инженерии. Указанные методы можно применять для создания полноразмерной нуклеотидной копии вирусного генома, который может быть модифицирован с помощью методов рекомбинации нуклеиновых кислот и манипуляции ими. В таких методах можно применять сайтнаправленный мутагенез. Затем можно модифицировать антигенные центры или ферментативные свойства вирусных белков.
Изобретение относится также к набору, предназначенному для осуществления любого из вышеуказанных методов. Набор может включать контейнер, иммуногенную композицию, предпочтительно содержащую ослабленный вирус PRRS типа II, фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и инструкции по введению иммуногенной композиции животному, которое нуждается в этом, с целью снижения коэффициента заболеваемости или серьезности клинических симптомов или воздействий заражения PRRS и предпочтительно отличающихся высокой температурой форм PRRS или НР-PRRS. Набор может содержать также средства для осуществления инъекции и/или средства для других форм введения. Набор может содержать также растворитель. Вакцину на основе ослабленного вируса можно сушить вымораживанием и ее можно восстанавливать с помощью растворителя, получая раствор, предназначенный для инъекции и/или ингаляции. Растворитель может представлять собой воду, физиологический раствор, буфер или раствор адъюванта. Набор может включать различные контейнеры для ослабленного вируса, растворителя и/или фармацевтически приемлемого носителя. Инструкции могут представлять собой листовку и/или этикету, прикрепленную к одному или нескольким контейнерам.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг.1 - схема, согласно которой осуществляли балльную оценку состояния легких и определяли процент площади легкого, имеющей видимые невооруженным глазом признаки пневмонии;
на фиг.2 - график, на котором представлено сравнение ректальной температуры свиней в вакцинированных и невакцинированных группах;
на фиг.3 - график, на котором представлено сравнение средних значений соотношения S/P для свиней в вакцинированных и невакцинированных группах; среднее значение S/P, определенное методом ELISA, применяли в качестве критерия серологического ответа соответствующей группе на PRRSV;
на фиг.4 - график, на котором продемонстрировано сравнение групповых средних клинических баллов у свиней в вакцинированных и невакцинированных группах при регистрации баллов респираторного заболевания у свиней в вакцинированных и невакцинированных группах;
на фиг.5 - график, на котором продемонстрировано сравнение среднего суточного прироста массы (тела) (ADG) свиней в вакцинированных и невакцинированных группах;
на фиг.6 - график, на котором продемонстрирован суммарный процент PRRSV-позитивной по данным ОТ-ПЦР сыворотки у вакцинированных MLV свиней и невакцинированных/подвергнутых контрольному заражению свиней.
Подробное описание изобретения
Определения
Применяемая в контексте настоящего описания терминология дана только с целью описания конкретных вариантов осуществления изобретения и не направлена на ограничение его объема. В настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения упоминание понятия в единственном числе подразумевает также его употребление во множественном числе, если из контекста ясно не следует иное.
При указании численных диапазонов подразумевается, что каждое находящиеся внутри диапазона численное значение характеризуется той же самой степенью точности. Например, под диапазон значений 6-9 подпадают помимо 6 и 9 численные значения 7 и 8, и очевидно, что под диапазон значений 6,0-7,0 подпадают численные значения 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0.
В контексте настоящего описания понятие «ослабленный вирус» может означать авирулентный вирус, который не вызывает клинических симптомов заболевания PRRS, но обладает способностью индуцировать иммунный ответ у изучаемого млекопитающего, и оно может означать также, что клинические симптомы снижены по частоте или серьезности у животных, зараженных ослабленным вирусом, по сравнению с «контрольной группой животных», зараженных неослабленным вирусом PRRS и не подвергнутых воздействию ослабленного вируса. В этом контексте «снижен/сниженный» означает, что снижение составляет по меньшей мере 10%, предпочтительно 25%, еще более предпочтительно 50%, наиболее предпочтительно более 100% по сравнению с контрольными группами, указанными выше.
В контексте настоящего описания «иммуногенный фрагмент» может означать часть пептида или полипептида или нуклеотидной последовательности вируса PRRS типа II, которая может формировать иммунный ответ у хозяина, включая клеточно- и/или антитело-опосредованный иммунный ответ на PRRSV.
В контексте настоящего описания понятия «идентичные» или «идентичность» двух или большего количества полипептидных или нуклеотидных последовательностей могут означать, что последовательности имеют определенный процент одинаковых остатков или нуклеотидов в конкретной области. Процент можно рассчитывать путем оптимального выравнивания двух последовательностей, сравнения двух последовательностей в конкретной области с определением количества положений, в которых находятся идентичные остатки в обеих последовательностях, получения количества совпадающих положений, деления количества совпадающих положений на общее количество положений в конкретной области и умножения результата на 100, получая тем самым процент идентичности последовательностей. В случае, когда две последовательности имеют различную длину или когда в результате выравнивания получают один или несколько выступающих концов, и конкретная область, для которой осуществляют сравнение, включает только одну последовательность, то при расчете остатки одной последовательности включают в знаменатель, но не в числитель дроби.
Изолят PRRS АТСС VR-2332 депонирован согласно Будапештскому договору в Американской коллекции типовых культур, Роквилл, шт.Мэриленд 7 июля 1992 г. и ему присвоен регистрационный № АТСС VR-2332.
Изолят PRRS VR-2495 депонирован согласно Будапештскому договору в Американской коллекции типовых культур, Роквилл, шт.Мэриленд 28 января 1995 г. и ему присвоен регистрационный № АТСС VR-2495.
В контексте настоящего описания «иммуногенная композиция» или «вакцина» означает композицию, содержащую вирус PRRS типа II (MLV или убитый вирус) или его любой иммуногенный фрагмент или фракцию, предпочтительно ослабленный вирус PRRS типа II, такую как Ingelvac PRRS MLV или Ingelvac PRRS ATP, которая вызывает «иммунологический ответ» у хозяина, включая клеточно- и/или антитело-опосредованный иммунный ответ на PRRSV. Предпочтительно указанная иммуногенная композиция может обеспечивать защитный иммунитет против заражения PRRSV и ассоциированных с ним клинических симптомов.
В контексте настоящего описания понятие «вызывает иммунологический ответ или иммунный ответ» означает способность вызывать любой клеточно- и/или антитело-опосредованный иммунный ответ на иммуногенную композицию или вакцину, введенную животному, которое обрабатывают иммуногенной композицией или вакциной. Как правило «иммунный ответ» включает (но, не ограничиваясь только ими) одну или несколько из следующих реакций:
производство или активацию антител, В-клеток, Т-клеток-хелперов, Т-клеток-супрессоров и/или цитотоксических Т-клеток и/или γδ-Т-клеток, специфически направленных на антиген или антигены, включенный(е) в представляющую интерес композицию или вакцину. Предпочтительно хозяин должен вырабатывать либо терапевтический, либо защитный иммунологический (вторичный иммунный) ответ так, чтобы повышалась устойчивость к новой инфекции и/или снижалась клиническая серьезность заболевания по сравнению с контрольными животными, которым не вводили иммуногенную композицию или вакцину. Такое защитное действие можно выявлять либо по снижению вероятности или серьезности заболевания, вплоть до отсутствия симптомов, ассоциированных с заражением хозяина, как описано выше.
В контексте настоящего описания «защитный иммунитет» означает устойчивость группы животных к заражению PRRS, предпочтительно HP PRRS, может быть повышена по сравнению с контрольной группой животных, зараженных HP PRRS, но не обработанных содержащей вирус PRRS, предпочтительно вирус PRRS типа II, иммуногенной композицией или вакциной. В контексте настоящего описания понятие «повышенная устойчивость» означает, что менее чем у 10%, предпочтительно менее чем у 20%, еще более предпочтительно менее чем у 30%, еще более предпочтительно менее чем у 40%, еще более предпочтительно менее чем у 50%, еще более предпочтительно менее чем у 75%, еще более предпочтительно менее чем у 100% животных, которых обрабатывали иммуногенной композицией или вакциной, предлагаемой в изобретении, развился один или несколько клинических симптомов, ассоциированных с отличающейся высокой температурой формой заболевания, предпочтительно вызываемой HP PRRS, как указано в настоящем описании, по сравнению с группой животных, зараженных PRRS, но не обработанных иммуногенной композицией или вакциной.
В контексте настоящего описания понятие «практически комплементарна» означает, что первая последовательность по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% идентична комплементу второй последовательности в области, состоящей из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или большего количества нуклеотидов, или что две последовательности гибридизуются в строгих условиях гибридизации.
В контексте настоящего описания «практически идентичны» означает, что первая и вторая последовательность идентичны по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% или 99% в области, состоящей из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или большего количества нуклеотидов или аминокислот, или касательно нуклеиновых кислот, если первая последовательность практически комплементарна комплементу второй последовательности.
«Свинья», «молодая свинья» и «поросенок» в контексте настоящего описания применяют взаимозаменяемо.
«Вакцинация» относится к введению иммуногенной композиции или вакцины, представленной в настоящем описании, перед воздействием отличающихся высокой температурой форм заболевания PRRS или HP-PRRS.
«Защищать» или «защита» относится к снижению серьезности или встречаемости клинических симптомов заражения HP-PRRS или отличающихся высокой температурой форм заболевания PRRS в результате введения иммуногенной композиции, предлагаемой в настоящем изобретении. Снижение серьезности или встречаемости оценивают по сравнению с животным или группой животных, которое(ых) не обрабатывали иммуногенной композицией, предлагаемой в настоящем изобретении.
Предпочтительные варианты осуществления изобретения
Ниже в примерах представлены предпочтительные материалы и процедуры, применяемые в настоящем изобретении. Хотя при воплощении на практике и проверке настоящего изобретения можно применять любые материалы и методы, аналогичные или эквивалентные представленным в настоящем описании, ниже описаны предпочтительные методы, устройства и материалы. Однако следует понимать, что эти примеры даны только с целью иллюстрации и не направлены на ограничение общего объема изобретения.
Примеры
Ниже в примерах проиллюстрирована высоковирулентная природа изолята PRRSV JX143. У свиней, которых вакцинировали с помощью Ingelvac PRRS MLV, обнаружена 100%-ная выживаемость и существенной более высокий гуморальный иммунный ответ, более низкое соотношение клинических симптомов PRRS и виремии, менее серьезное поражение легких, меньшее количество, более слабые и более короткие клинические симптомы и более короткий период наличия высокой ректальной температуры по сравнению с невакцинированными свиньями после из контрольного заражения высоковирулентным штаммом PRRSV.
Материалы и методы
1.1. Вакцины и вирус
50
Вакцину Ingelvac PRRS MLV (серийный № JA-A64A-149) получали от фирмы Boehringer Ingelheim Vetmedica. Высоковирулентный изолят PRRSV JX143 был выделен в Шанхайском исследовательском институте ветеринарии (Shanghai Veterinary Research Institute). Для инокуляции свиней тканевую культуру, содержащую PRRSV JX143 (105,2 TCID/мл) разводили в пять раз с помощью среды DMEM.
1.2. Праймеры и реагенты
Полимеразу, инициирующую обратную транскрипцию, и ДНК-лестницу покупали у компании Tiangen biotechnology. Двукратную (2×) ПЦР-смесь покупали у компании Dongsheng. Использовали Trizol и праймеры компании Invitrogen.
Таблица 1
Праймеры, применяемые для ОТ-ПЦР-амплификации
Название праймера
Последовательность
SF14413
5'-CTGATCGACCTCAAAAGAGTTGTGCTTG-3' (SEQ ID NO:4)
SR15497
5'-CAATTAAATCTTACCCCCACACGGTCG-3' (SEQ ID NO:5)
Qst
5'-gagtgacgaggactcgagcgcattaaTTTTTTTTTTTTTT-3' (SEQ ID NO:6)
1.3 Источник используемых животных и их разделение на группы
Пятьдесят (50) свиней 29-дневного возраста покупали для опыта на племенной свиноводческой ферме Henan Muyuan. С помощью ОТ-ПЦР (для PRRSV и PCV2) и ELISA (набор анти-PRRSV, фирма IDEXX Laboratory, Inc.) путем трехкратного анализа образцов сыворотки, собранных в момент прибытия, было подтверждено, что животные являлись PRRSV- и PCV2-негативными. Свиней взвешивали и произвольно разделяли на группы 1, 2 и 3, в каждую из которых входило 22, 14 и 14 свиней соответственно. Затем каждую группу свиней содержали по отдельности в различных помещениях.
1.4 Вакцинация и контрольное заражение вирусом
В день 0 22 свиньи в группе 1 (V/C) вакцинировали внутримышечно одной дозой вакцины Ingelvac PRRS MLV в объеме 2 мл. 14 свиньям в группе 2 (не-V/C) инъецировали по 2 мл ЗФР в день 0. Контрольное заражение свиней из группы 1 и группы 2, которое осуществляли в день 28, проводили путем внутриносового введения 3 мл разведенного штамма PRRSV JX143. Свиней в группе 3 (не-V/не-С) не вакцинировали и не подвергали контрольному заражению, они представляли собой строгий отрицательный контроль, им инъецировали по 3 мл среды DMEM в день 28. По две свиньи из каждой группы подвергали аутопсии в день 14 и 42 соответственно для проведения обследования. Остальных свиней подвергали аутопсии в день 49.
1.5 Ректальная температура
Ректальную температуру определяли в одно и тоже время каждый день в период со дня 0 до дня 49 (21 день после контрольного заражения).
1.6 Серологическое обследование
Образцы сыворотки всех свиней получали в дни 0, 7, 14, 21, 28, 32, 42 и 49 и анализировали в отношении антитела к PRRSV с помощью набора IDEXX PRRSV ELISA.
1.7. Клиническое обследование
В период со дня 0 и по день 49 осуществляли ежедневный мониторинг свиней и оценивали в баллах серьезность изменений поведения (внешних реакций) и клинические респираторные показатели, включая дыхание и кашель. Балльная система оценки клинических симптомов представлена в таблице 2.
Таблица 2
Балльная система клинических симптомов
Серьезность клинических симптомов
Балльная оценка
Дыхание*
Поведение (внешние реакции)*
Кашель*
Норма
1
1
1
Серьезность клинических симптомов
Балльная оценка
Дыхание*
Поведение (внешние реакции)*
Кашель*
Слабый
2
2
2
Серьезный
3
3
3
Смерть
4
4
4
*Дыхание: Балл 2 (слабый) соответствует поверхностному дыханию, выделениям из носа, абдоминальному «тяжелому (шумному)» дыханию при стимуляции. Балл 3 (серьезный) соответствует быстрому и поверхностному дыханию, выделениям из носа, дыханию открытым ртом, абдоминальному «тяжелому (шумному)» дыханию.
*Поведение: 1. На коже ротовой полости, носа, ушей и внутренней части ног появляются краснота, гиперемия, красные точки, папулы 2. Депрессия, грубый волосяной покров. 3. Анорексия 4. Хромота, тремор, конвульсии 5. Истощение. Балл 2 соответствует наличию одного или двух из описанных выше симптомов. Балл 3 соответствует наличию трех или большего количества из описанных выше симптомов.
*Кашель: Балл 2 соответствует непродуктивному кашлю. Балл 3 соответствует продуктивному кашлю.
1.8 Оценка продуктивности
Массу всех свиней оценивали в день 0 (перед вакцинацией), день 28 (перед контрольным заражением), день 49 (через 21 день после контрольного заражения).
1.9 Эффективность Ingelvac PRRS MLV оценивали, определяя клинические симптомы, балл поражения легких и ректальную температуру после контрольного заражения вакцинированных свиней по сравнению с контрольной группой, которую подвергали контрольному заражению, и группой, представляющей собой отрицательный контроль. Свиней рассматривали как имеющих признаки клинического поражения PRRS в тех случаях, когда: 1) высокая ректальная температура (41°С) сохранялась в течение более 3 дней, 2) обнаружена депрессия, анорексия, конъюнктивит, кашель, респираторное заболевание, и 3) обнаружена пневмония.
1.10 Поражение легкого
Аутопсию осуществляли в день 49 (через 21 день после контрольного заражения PRRSV). В легком каждой свиньи оценивали методом вслепую процент площади (от 0 до 100%), пораженной сильными видимыми признаками пневмонии (отек, гиперемия, кровоизлияние, мясистая и твердая фиброзная структура).
1.11 Выявление и количественная оценка РНК PRRSV
Получали образцы сыворотки у свиней группы 1 (V/C) в дни 0, 7, 14, 21, 28, 32, 35, 42 и у свиней группы 2 (не-V/C) в дни 28, 32, 35 и 42. Экстракцию РНК из индивидуальных образцов сыворотки объемом 140 мкл осуществляли с помощью мини-набора для вирусной РНК QIAamp (фирма QIAGEN). Затем осуществляли ОТ-ПЦР с помощью комбинации праймеров-зондов (фирма Invitrogen) (таблица 1), специфических для консервативной области РНК PRRSV (Genbank).
Для каждой ОТ-реакции использовали 12,5 мкл РНК-матрицы, 4 мкл дНТФ, 2 мкл 10×буфера, 0,5 мкл праймера Qst и 1 мкл обратной транскриптазы Quant, Смесь инкубировали при 37°С в водяной бане в течение 1 ч и хранили при -20°С. Затем осуществляли ПЦР, используя 1 мкл смеси для ОТ-реакции, по 1 мкл праймеров SF14413 и SR1549, 2 мкл 10×буфера, 2 мкл дНТФ, 5 ед. rTaq-полимеразы и воду до доведения общего объема до 20 мкл, В реакционном планшете проводили последовательную реакцию с использованием идентифицирующей системы в специфических условиях (94°С в течение 5 мин; затем 40 циклов при 94°С в течение 30 с, 65°С в течение 30 с, 72°С в течение 75 с, 40 циклов; и наконец при 72°С в течение 10 мин). Амплифицированный ПНР-фрагмент разделяли на агарозном геле, и обнаружение проводили в ультрафиолетовом свете.
1.12 Иммуногистохимический анализ для обнаружения антигена PRRSV
Иммуногистохимический анализ с целью обнаружения специфического для PRRSV антигена осуществляли на фиксированных в формалине и залитых в парафин срезах ткани легкого, которые приготавливали в период времени до 48 ч после осуществления аутопсии с использованием моноклонального антитела к N-белку PRRSV (SR30 или SDOW17) и вторичного конъюгированного антитела.
2. Результаты
2.1. Изменение ректальной температуры после контрольного заражения
После инокуляции высоковирулентным штаммом PRRSV JX143 ректальнная температура у свиней как в вакцинированной, так и в невакцинированной группе быстро повышалась. Наиболее высокая температура составляла 41°С и у 75% свиней обнаружена лихорадка сразу же после инокуляции применяемым для контрольного заражения вирусом. У вакцинированных животных ректальная температура снижалась до уровней, имевших место до контрольного заражения, через 10 дней, в то время как для группы не-V/C был характерен более длительный период лихорадки, и повышенная ректальная температура сохранялась в течение существенно более длительного периода (фиг.2).
2.2. Серологическая реакция.
Среднее значение величины S/P в группе, определенное по данным ELISA, применяли в качестве меры серологической реакции соответствующей группы на PRRSV (фиг.3). Применяемые в качестве отрицательного контроля свиньи оставались негативными в отношении антител к PRRSV в течение исследования. В V/C-группе антитело впервые обнаружено через 10-14 дней после вакцинации и соотношение S/P составляло ≥0,4 через 14 дней после инокуляции (p.i.), при этом в V/C-группе 8 из 20 свиней оказались позитивными, а через 21 день p.i., 13 из 20 свиней оказались позитивным. Наиболее высокое значение соотношения S/P в V/C-группе обнаружено после контрольного заражения и сохранялось на высоком уровне до конца опыта (ELISA, S/P≈2). У свиней в не-V/C-группе видоизменение серологической специфичности после контрольного заражения происходило быстро; через 7 дней после p.i. 9 из 12 свиней оказались позитивными, при этом соотношение S/P составляло ≥0,4.
2.3. Клинические симптомы
Оценивали в баллах респираторное заболевание для V/C-группы и не-V/C-группы (фиг.4). После контрольного заражения 5 из 20 свиней в V/C-группе имели клинические симптомы респираторного заболевания и кашель, а у 2 свиней обнаружено абдоминальное «тяжелое (шумное)» дыхание. Восемь из 12 свиней в не-V/C-группе погибли до 21 дня p.i., а оставшиеся свиньи в не-V/C-группе имели симптомы серьезного респираторного заболевания и кашель с абдоминальным «тяжелым (шумным)» дыханием. У свиней в не-V/C-группе балл, превышающий 6, обнаружен в течение 10 дней и наивысший балл достигал 7. Свиньи в V/C-группе не имели выраженных клинических симптомов и наиболее высокий балл, характеризующий заболевание, достигал 4-5 в течение 7 последовательных дней. У применяемых в качестве строго отрицательного контроля свиней не-V/не-С-группы не было обнаружено клинических симптомов и средний балл для них составлял 3 (норма).
2.4. Средний суточный прирост массы до и после контрольного заражения
Данные о среднем суточном приросте массы (ADG) обобщены на фиг.5. С дня 0 по день 28 не обнаружено существенного различия в величине ADG между вакцинированными свиньями (0,3301±0,0414 кг) и невакцинированными свиньями (0,3008±0,0653 кг). С дня 28 (перед днем контрольного заражения) до дня 49 величина ADG для вакцинированных свиней была аналогична величине для контрольных свиней из не-V/не-С-группы (0,3373±0,0800 кг против 0,3484±0,0890 кг), в то время как у свиней из не-V/С-группы была обнаружена существенно более низкая величина ADG (0,0392±0,2398 кг).
2.5. Эффективность вакцинации
После контрольного заражения у вакцинированных MLV свиней обнаружены клинические симптомы сразу после контрольного заражения, при этом средний клинический балл составлял 5, и более чем у 3 свиней обнаружена высокая ректальная температура (41°С) и повреждения в легких. Согласно критериям, изложенным в разделе «Методы», 25% (5/20) вакцинированных MLV свиней имели PRRS, а 75% (15/20) свиней оказались защищенными от болезни. В противоположность этому все невакцинированные свиньи имели PRRS после контрольного заражения и 8 свиней погибли до осуществления аутопсии.
Таблица 3
Эффективность MLV-вакцинации
Группа
Подвергнутые контрольному заражению свиньи
Погибшие свиньи
Больные свиньи
Результат контрольного заражения
MLV-V
20
0
5 (25%)
Выживаемость 100%
Группа
Подвергнутые контрольному заражению свиньи
Погибшие свиньи
Больные свиньи
Результат контрольного заражения
Невакцинированные/ подвергнутые контрольному заражению
12
8
12 (100%)
Выживаемость 33%
2.6 Макроскопические повреждения
При аутопсии четырех выживших свиней из не-V/С-группы обнаружены макроскопические повреждения, такие как недостаточность/коллапс легких, рыжевато-коричневая пятнистость, гиперемия, увеличение лимфатических желез в паховой области, в челюстной области, отек и гиперемия брыжейки и в некоторых случаях некроз печени. Некоторые свиньи в V/C-группе имели подобные, но менее серьезные повреждения. В контрольной не-V/не-С группе у свиней не обнаружены макроскопические повреждения.
2.7 Степень макроскопических повреждений легких
Степень повреждения легких у вакцинированных MLV свиней была существенно меньшей, чем у свиней из не-V/С-группы, это позволяет предположить, что MLV обеспечивает надежную защиту при инокуляции высокопатогенным штаммом PRRSV (таблица 4, в которой степень макроскопических повреждений легких оценивали в процентах от 0 до 100%).
Таблица 4
Сравнение серьезности макроскопических повреждений легких у свиней из различных групп
День после вакцинации
Группа
MLV-V/C
не-V/C
не-V/не-С
14
0,500±2,00
0,30±2,30
42
28,58±16,15
75,25±7,27
0,25±1,00
49
19,12±8,37
69,6±12,97
0,30±0,50
2.8 Определение виремии
Данные о проценте позитивной в отношении PRRSV сыворотки, полученные с помощью ОТ-ПЦР, обобщены на фиг.6. Виремия обнаружена у 60% вакцинированных MLV свиней через 7 дней после вакцинации, она снижалась до 20% перед контрольным заражением. После контрольного заражения у 70% вакцинированных свиней обнаружена виремия, которая снижалась до 60% к дню 7 p.i., и у 20% свиней обнаружена виремия к дню 21 p.i. В отличие от этого виремия обнаружена у 100% свиней из не-V/С-группы после контрольного заражения, виремия сохранялась на высоком уровне после контрольного заражения, и у 70% свиней из не-V/С-группы виремия обнаружена через 21 день после контрольного заражения.
2.9 Выявление антигена с помощью иммуногистохимического анализа
Под микроскопом оценивали микроскопические повреждения легких. Инфицированные PRRSV клетки обнаружены у всех подвергнутых контрольному заражению свиней. У свиней из MLV-V/C-группы выявлено меньше количество инфицированных PRRSV клеток. Общее количество клеток и количество инфицированных PRRSV клеток определяли в различных областях. Уровень инфицированных клеток существенно различался между группами: 23,34±4,691 у свиней из не-V/С-группы, 9,36±8,069 у свиней из V/C-группы и 0,24±0,114 у свиней из не-V/не-С-группы (таблица 5).
Таблица 5
Количество инфицированных PRRSV клеток по данным иммуногистохимического анализа залитых в парафин блоков легких свиней
Уровень инфицированных PRRSV клеток
Группы
MLV-V
не-V/контрольное заражение
не-V/не-С
%
9,36±8,069
23,34±4,691
0,24±0,114