Полиморфные системы белков молока овец цигайской породы

БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ

13

УДК 591.151:577.112:636.933.2.034

Т. А. Луполов, В. С. Петку, С. М. Николаевич ПОЛИМОРФНЫЕ СИСТЕМЫ БЕЛКОВ МОЛОКА ОВЕЦ ЦИГАЙСКОЙ ПОРОДЫ

У изученных животных в молоке обнаружен полиморфизм лактопротеинов a1S1Cn, fiCn, kCn, ftLg. В локусе a1S1Cn выявлены два аллеля с наибольшей частотой для типа a1S1CnB- 0,9608. В локусе pCn было установлено два аллеля с наибольшей частотой аллеля вСП - 0,9020. Локусы генов kCn и ftLg также характеризовались присутствием двух аллелей с наибольшей частотой для типов kCnA (0,8627) и fiLgB (0,5294). Исследуемая популяция находилась в условиях генетического равновесия.

Выявленный полиморфизм может быть использован в качестве биохимического теста состояния генофонда породы, а также для прогнозирования на их основе продуктивных качеств животных.

Введение

Практика ведения животноводства выработала различные методы создания и улучшения пород, суть которых сводится к выявлению и использованию животных с желательными признаками. Однако чем выше продуктивность животных, тем труднее достичь селекционных сдвигов. Альтернативой старым методам явились современные генетические подходы к совершенствованию пород, основанные на более полной оценке генотипа животных с помощью маркерных технологий, с использованием наследственного полиморфизма белков. Изменение частоты определённого аллеля типа белков или группы крови при проведении отбора в стаде может указывать на связь между иммуногенетическими свойствами и продуктивностью [1]. Это сделало возможным использование маркерных генов в практической селекции [2].

Например, у каракульской породы, установлено, что генотип АА по P-Lg влияет на молочную продуктивность: особи с таким генотипом производят больше молока по сравнению с другими генотипами [3].

Согласно другим исследованиям, для производства сыров лучше подходит молоко овец с гетерозиготным генотипом AB [4]. Для производства сыра приоритетным является белок kCn -типа В [5].

Целью исследования явилось изучение генетического полиморфизма лактопротеинов aiSiCn, pCn, kCn, pLg в молоке овец цигайской породы.

Материалы и методы исследования. Опыты проводились на популяции овец цигайской породы (n = 51) овцеводческой фермы при Национальном Институте Зоотехнии и Ветеринарии «Tevit» (с. Максимовка, Ново-Анненского района, Молдова). Наследственно обусловленные типы белков определяли методом горизонтального электрофореза [6].

Приготовленный гель состоял из частично гидролизованного крахмала и трис-цитратного буфера с мочевиной, в 1000 мл которого содержалось 8,67 г трис-(оксиметил)-аминометана (С4НпОз№), 1,5 г лимонной кислоты и 396,0 г мочевины. На один литр такого раствора добавляется 190 мл электролитного буфера и 1 мл 2-меркаптоэтанола (концентрация 2-меркаптоэтанола 95%).

Частично гидролизованный крахмал готовился по представленной ниже схеме.

В трёхлитровую колбу отвесили 900 г крахмала, а в двухлитровую колбу налили 1800 мл ацетона. После этого колбы поместили в термостат на 5 часов при температуре +38,5° С. По истечении указанного времени из термостата извлекли ацетон и крахмал. В колбу с ацетоном долили 27 мл HCl (плотность 1,18), перемешали и перелили в колбу с крахмалом. После тщательного смешивания ставили обратно в термостат на определённый срок. Оптимальное время гидролиза было установлено опытным путём.

14

ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА

При концентрации 10-15 г гидролизованного крахмала в 100 мл буфера гель был умеренно эластичным, прочным и разламывался под давлением. Если гидролиз происходил короткий период времени, то гель получался липким, а при увеличении длительности гидролиза выше оптимального гель плохо застывал. По истечении необходимого времени в гидролизат вливали 450 мл ацетата натрия (136 г уксуснокислого натрия на 1 л Н2О), перемешивали и проводили отмывку через воронку Бюхнера, заранее вставив в неё двухслойный фильтр из фильтровальной бумаги.

Для ускорения процесса отмывки воронка Бюхнера соединялась с вакуумным насосом. После этой операции гидролизат заливали водой на 16 часов. По истечении этого времени воду сливали и обезвоживали ацетоном, который отсасывался через воронку Бюхнера вакуумным насосом.

Сушку проводили при температуре 45-50° С.

В качестве электролитного буфера служил раствор, содержащий в 1000 мл 11,8 г борной кислоты и 2,1 г гидрата окиси лития.

Образцы молока перед электрофорезом были обезжирены центрифугированием при 2500 оборотах в течение 10 минут. При необходимости длительного хранения обезжиренные пробы консервировали мертиолатом в концентрации 1:15 000 или помещали в полиэтиленовых ампулах в холодильные камеры при температуре -15° С. При отсутствии таких ампул можно воспользоваться пенициллиновыми.

Ход анализа

Для исследования был заготовлен гель, состоящий из 14,5-процентной взвеси крахмала в трис-цитратном буфере. Заваривали крахмал в колбе с широким горлом до закипания на открытом пламени газовой горелки. С помощью вакуум-насоса, создающего разрежение в колбе до 0,9 атм, из горячего геля удаляли пузырьки воздуха. Откачивание повторяли 2-3 раза с интервалом в 1 минуту.

Формирование пластины геля и электрофорез проводили в плексигласовой ванночке размером 130 x 200 x 6 мм. Между съёмными анодным и катодным бортиками и ванночкой закреплялись из фильтровальной бумаги пятислойные фитили. Два из них имели размер 225 x 140 мм, а внутри находился фитиль размером 225 x 70 мм. Съёмные анодные и катодные бортики крепились к плексигласовой ванночке при помощи пружинок или резинки.

Линию старта устанавливали прокалыванием геля на расстоянии 1-2 см от катодного края металлической гребёнкой с размером зубца 4,0 x 6,0 x 0,5 мм. В каждый прокол на фильтровальной или хроматографической бумажке 4,0 x 6,0 мм вносили пробы молока. На одну ванночку наносили одновременно 40 образцов.

Электрофорез проводился в течение 2,5 часа при силе тока 120 мА на ванночку. Такой режим электрофореза требует принудительного охлаждения геля посредством вентилятора и постоянного орошения водой. Электролит наливался в гнёзда размером 235 x 80 x 75 мм по 110 мл.

После завершения разгонки гелевую пластину разрезали вдоль тонкой проволокой на две части толщиной по 3 мм. Эти пластинки нумеровали и окрашивали в 1-процентном растворе амидо-чёрного 10 Б или в 1-процентном растворе нигрозина, приготовленного на промывной воде (смесь метанола, ледяной уксусной кислоты и дистиллированной воды в пропорциях 5:1:5). Время окрашивания составило 3 минуты. Затем пластину отмывали промывной водой до полного «проявления» фореграммы.

Применение метода электрофореза на крахмальном геле по методу Смитиса позволяет разделить белки молока на следующие полиморфные системы: a SiCn, р Cn, k Cn, р Lg.

Расшифровка фореграмм проводилась согласно следующей схеме:

БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ

15

+

aSjCn

A

В

С

D

з

о

н

ы

aSjCnB/ a SjCnB

A

в Lg B

LgA/ в LgA

A

в Cn B

aSjCnB/ a SjCnc

в LgA/ в LgB

a SjCnc/ a SjCnc

в LgB/ в LgB

в CnA/ в CnA в CnA/ в CnB

в CnB/ в CnB

k Cn A B

k CnA/ k CnA k CnA/ k CnВ

k Cn13/ k Cn13

*•

генотипы

Схема - Расшифровки фореграмм белков молока

Частота аллелей (для двухаллельных систем) была определена по формулам (1), (2).

P

q

где P (A) - частота аллеля A;

AA, ВВ - число особей с гомозиготным генотипом;

AB - число особей с гетерозиготным генотипом; n - число особей в группах; q(B) - частота аллеля В.

Частота аллелей (для трехаллельных систем) была определена по формулам (3)-(5).

P

q

z

где P (A) - частота аллеля A;

AA, ВВ, СС - число особей с гомозиготными генотипами;

16

ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА

АВ, АС, ВС - число особей с гетерозиготными генотипами; n - число особей в группах; q(B) - частота аллеля В; z(C) - частота аллеля С.

Определение генетического равновесия проводилось с помощью теста х2, согласно закону Гарди-Вайнберга, по формуле (6):

X2 =

где Ф - фактическое количество особей в популяции с определенным генотипом;

Т - теоретически ожидаемое количество особей.

Результаты исследования и их обсуждение

Казеин - главный белок молока всех млекопитающих. Он принадлежит к группе белков, называемых фосфопротеинами. Как и все белки, казеин состоит из последовательности аминокислот, соединенных друг с другом в полипептидную цепь [7].

Установлено, что казеин молока представляет собой смесь нескольких фракций. Современные методы исследования позволяют проводить глубокий анализ состава казеина и выделить из него до 14-20 фракций. Все фракции казеина являются производными от одной из четырех основных (альфа, бета, каппа, гамма). Группа альфа-казеинов составляет 43-55%, бета-казеинов 24-35%, каппа-казеинов 8-15%, группа гамма-казеинов 3-7% [8].

Альфа^-казеин (aS1Cn) - это основная фракция казеина, которая состоит из смеси двух белков - главного и второстепенного компонентов, имеющих одинаковую первичную структуру, но отличающихся степенью фосфорилирования. Главный компонент aS1Cn содержит 8 фосфориновых остатков, а второстепенный компонент - 9 остатков. Оба компонента характеризуются значительной чувствительностью к ионам кальция. Фракция имеет 5 генетических вариантов (A, B, C, D, E), отличающихся друг от друга как содержанием отдельных аминокислот, так и их расположением в полипептидной цепи [9].

В наших исследованиях в локусе aS1Cn было обнаружено 2 аллеля: aS1CnA с частотой 0,0392 и аллель aS^^ с частотой 0,9608 (рисунок 1).

0,0392

Рисунок 1 - Частота аллелей локуса aS1Cn в молоке овец цигайской породы

Присутствие двух аллелей в анализируемой популяции позволило распределить животных по типу aS1Cn на три генотипа (таблица 1).

Таблица 1 - Распределение овец цигайской породы по типу aSiCn

Генетический вариант а81-казеина Количество животных х2

АА 1 (0,08)* 10,58

АВ 2 (3,84)* 0,67

ВВ 48 (47,08)* 0,00

Итого 51 (51)*

*В скобках указано теоретически ожидаемое число голов. То же для таблиц 2-4.

БІЯЛАГІЧНЫЯ НАВУКІ

17

Из 51 исследуемых особей гомозиготными генотипами ВВ обладали 48 или (94,12%), гомозиготным генотипом АА обладала 1 особь (1,96%), а гетерозиготными АВ - 2 особи (3,92%).

Исследуемая популяция в локусе aSiCn находилась в генетическом равновесии, согласно закону Гарди - Вайнберга, по тесту х2 (0,00-10,58).

Бета-казеин (PCn) - молочный белок, который составляет 25-35% от общего молочного белка. Первичная структура PCn представляет собой полипептидную цепь, которая содержит 5 фосфатных групп. Известно 7 генетических вариантов данной фракции [9].

До недавнего времени локус PCn считался мономорфным [10], но в последнее время раскрыт его полиморфизм. В наших исследованиях было установлено присутствие двух аллелей рСпА и pCnB - с частотами 0,9020 и 0,0980 соответственно (рисунок 2).

0,9020'

0,0980

PCnA  pCnB

Рисунок 2 - Частота аллелей локуса PCn в молоке овец цигайской породы

Генотипы особей по типу PCn в популяции распределились следующим образом (таблица 2). Таблица 2 - Распределение овец цигайской породы по типу PCn

Генетический вариант Р-казеина Количество животных х2

АА 42 (41,494) 0,01

АВ 8 (9,016) 0,11

ВВ 1 (0,49) 0,53

Итого 51

Как видно из таблицы, 42 особи (82,35%) имели гомозиготный генотип АА, 8 особей (15,69%) - гетерозиготный генотип АВ и 1 особь - (1,96%) гомозиготный генотип ВВ.

Исследуемая популяция находилась в генетическом равновесии по тесту х2 (0,01-0,53).

Каппа-казеин (kCn) является главным белком, учитываемым при производстве таких молочных продуктов, как творог и сыр. kCn состоит из одного главного компонента, не содержащего углеводы, и шести второстепенных компонентов, относящихся к гликопротеидам.

Первичная структура белка представляет собой полипептидную цепь, содержащую 169 остатков аминокислот (в том числе 2 остатка цистеина), и одну фосфатную группу [11]. В настоящее время выявлено 10 аллелей каппа-казеина. Однако чаще встречаемыми в молоке овец являются варианты А и В.

В наших исследованиях в локусе kCn (рисунок 3) было обнаружено два аллеля -с наибольшей частотой для Кпа (0,8627) и наименьшей для kCnB (0,1373).

kCn

0,1373

kCnB

Рисунок 3 - Частота аллелей локуса kCn в молоке овец цигайской породы

18

ВЕСНІК МДПУ імя І. П. ШАМЯКІНА

Присутствие трех аллелей в локусе kCn позволило распределить поголовье овец на три генотипа - АА, АВ, ВВ (таблица 3).

Наибольшую численность в популяции составил гомозиготный генотип АА - 38 особей (74,51%), гетерозиготным генотипом АВ обладали 12 особей (23,43%), а гомозиготным ВВ -1 особь (1,96%).

Таблица 3 - Распределение овец цигайской породы по типу kCn

Генетический вариант k-казеина Количество животных х2

АА 38 (37,96) 0,00

АВ 12 (12,08) 0,00

ВВ 1 (0,96) 0,002

Итого 51

Исследуемая популяция находилась в генетическом равновесии, согласно закону Гарди -Вайнберга, по тесту х2 (0,00-0,002).

Бета-лактоглобулин (PLg) - это молочный белок, который имеет особый вид полиморфизма. Явление полиморфизма бета-лактоглобулинов было изучено раньше других фракций. Локус, который контролирует синтез PLg, находится в 3 хромосоме. Считается, что именно этот белок придает вкус молоку [12].

PLg является наиболее важным в количественном отношении сывороточным белком (на его долю приходится около половины всех белков сыворотки, и его содержание в молоке составляет 0,2-0,4%). Молекула PLg состоит из 162 аминокислотных остатков и находится в молоке в виде димера.

В наших исследованиях в этом локусе было обнаружено два аллеля - PLgА - 0,4706 и PLgH - 0,5294 с более высокой частотой для типа PLgB (рисунок 4).

0,5294

Lg А  PLg В

Рисунок 4 - Частота аллелей локуса PLg в молоке овец цигайской породы

Популяция овец по типам PLg распределилась по трем генотипам (таблица 4) следующим образом: гомозиготный генотип АА - 19 особей (37,25%), гетерозиготный генотип АВ - 10 особей (19,61%) и гомозиготный генотип ВВ - 22 особи (43,14).

Таблица 4 - Распределение овец цигайской породы по типу PLg

Генетический вариант р-лактоглобулина Количество животных х2

АА 19 (11,29) 5,27

АВ 10 (25,42) 9,35

ВВ 22 (14,29) 4,16

Итого 51

Результаты х2 (4,16-9,35) показывают генетическое равновесие в исследуемой популяции.

БІЯЛАГГЧНЫЯ НАВУКІ

19

Выводы

В результате исследования в молоке овец цигайской породы обнаружен полиморфизм а-казеинов, k-казеинов, р-казеинов и р-лактоглобулинов.

Локусы всех изученных генов характеризовались присутствием двух аллелей с наибольшей частотой для типов aiSiCnB (0,9608), pCnA (0,9020), kCnA (0,8627) и PLgB (0,5294). Исследуемая популяция находилась в условиях генетического равновесия.

Самая низкая частота была установлена в локусе aS1Cn, для типа aS1CnB - 0,0392.

Исследуемая популяция распределилась по изученным локусам по трем генотипам. Наибольшее количество особей обладали гомозиготными генотипами ВВ по типу aS1Cn - (94,1%), а наименьшее (1,96%) - генотипами АА по типу aS1Cn и ВВ в локусе pCn и kCn (1,96%).

Результаты х2 свидетельствуют о генетическом равновесии исследуемой популяции.

Выявленный полиморфизм может быть использован в качестве биохимического теста состояния генофонда породы, а также для прогнозирования на его основе продуктивных качеств животных.

Литература

1. Жебровский, Л. С. Использование полиморфных белковых систем в селекции / Л. С. Жебровский. - Л. : Колос, 1979. - С. 38-41.

2. Меркурьева, Е. К. Генетика / Е. К. Меркурьева, З. В. Абрамова. - М. : Агропромиздат,

1991. - 508 с.

3. Луполов, Т. А. Генетический полиморфизм лактопротеинов и влияние локуса pLg на показатели молочной продуктивности овец каракульской породы / Т. А Луполов, В. С. Петку // Весці Нац. акад. навук Беларусі. Сер. аграр. навук. - 2009. - № 2. - С. 87-90.

4. Wst^pne badania nad okresleniem wplywu genotypu laktoglobuliny na przydatnosc mleka do wyrobu serow podpuszczkowych i serwatkowych / K. Korman [et al.] // Zeszyt Specjalny. - 2002. - № 14. -Р. 85-92.

5. Grosclaude, F. Structure, determinisme genetique et polimorfisme de 6 lactoproteinrs des bovines et des ovines / F. Grosclaude // INRA. ENSAR. Rennes. - 1991. - № 23-24.

6. Smithies, O. Zone electrophoresis in starch gels / O. Smithies // Biochem. J. - 1955. - Vol. 61. - P. 629.

7. Богатова, О. В. Химия и физика молока : учеб. пособие / О. В. Богатова, Н. Г. Догарева. -Оренбург : ГОУ ОГУ, 2004. - 137 с.

8. Дубинин, В. А. Молоко с точки зрения физиолога / В. А. Дубинин, А. А. Каменский // Химия и жизнь. - 1998. - № 6. - С. 44.

9. Martin, P. Polymorphisme de lactoproteines caprines / P. Martin // Le Lait. - 1993. - № 73. -Р. 511-532.

10. Dall Ollio, S. Risherche ellettroforetiche delle proteine del latte nella raza ovina Sopravissana / S. Dall Ollio, R. Davali, R. Bosi // Scientific Technology Latt. Cos. - 1991. - № 40. - Р. 110-112.

11. Горбатова, К. К. Химия и физика белков молока / К. К. Горбатова. - М. : Колос, 1993. - 192 с.

12. Elyasi, Gh. Study of Ovine Beta-Lactoglobulin Gene Polymorphism Using PCR-RFLP / Gh. Elyasi // Technol. Agric. & Natur. Resour: Isf. Univ. Technol., Isf., Iran. - Summer 2005. - Vol. 9, № 2. - Р. 129-134.

Summary

The scientific research has shown that the milk of the animals under discussion has the polymorphism of the following milk proteins: aS1Cn, PCn, kCn, PLg. In the locus aS1Cn there are three alleles which are most typical for the type aS1CnB - 0,9608. There are two alleles which have been discovered in the type pCnA with the frequency of 0,9020 in the locus PCn. The loci of the genes kCn and PLg are characterized by two alleles which are most often found in the type kCnA (0,8627) and pLgB (0,5294). The population under discussion has been at the stage of genetic equilibrum.

Thus the ascertained polymorphism may be widely used as a biochemical test to evaluate the state of the breed gene pool as for predicting the productive qualities of these animals.

Поступила в редакцию 25.01.11.