Изменение уровня белка S-100 у новорожденных с перинатальным гипоксическим поражением ЦНС

© Коллектив авторов, 2004

Г. С. Голосная, А. С. Петрухш, К. А. Маркевич, О. Е. Трифонова

ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ БЕЛКА 8-100 У НОВОРОЖДЕННЫХ С ПЕРИНАТАЛЬНЫМ ГИПОКСИЧЕСКИМ ПОРАЖЕНИЕМ ЦНС

Кафедра нервных болезней педиатрического факультета (зав. проф. А. С. Петрухин), РГМУ, отделения реанимации, интенсивной терапии, патологии новорожденных, катамнестического отделения (зам. глав. врача по детскому корпусу к. м. н. А. Б. Дуленков) ГКБ № 7( глав. врач к. м. н. В. А. Афанасьев), Москва

Целью нашего исследования было изучение изменений концентрации белка 8-100 у новорожденных различного гестационного возраста с тяжелыми поражениями ЦНС, возможностей ранней диагностики гипоксических и геморрагических изменений, а также характера изменений концентрации белка 8-100 в динамике. Нами обследовано 60 новорожденных с гестационным возрастом от 25 до 41 недель. Дети были разделены на 3 группы по сроку гестации: до 32 недель, до 37 недель и доношенные. Каждая группа разделена на 2 подгруппы — со структурными поражениями мозга и без них по данным НСГ. Концентрацию 8-100 определяли в сыворотке крови на 1-е, 3-и, 7-е, 14-е и 21-е сутки жизни. Было выявлено повышение концентрации белка 8-100 у всех обследуемых, наиболее выраженное у детей с внутрижелудочковыми кровоизлияниями и перивентрикулярной лейкомаляцией. По-видимому, эти изменения являются неблагоприятным прогностическим признаком у детей с тяжелым поражением ЦНС.

The aim of this work was to investigate the changes of S-100 protein concentration in neonates with different gestation age with severe CNS damage and to study the possibility of early diagnosis of hypoxic and hemorragic changes and to study the dynamic of S-100 protein concentration. Authors examined 60 neonates with gestation age from 25 to 41 weeks. 3 groups with different gestation age were selected — born before 32 weeks, born before 37 weeks and mature born neonates. Every group was divided on two subgroups: patients with and without structure brain changes according to neurosonographic data. Serum S-100 protein concentration was investigated on 1, 3, 7, 14 and 21 days of life. S-100 concentration was increased in all cases, but the most significant inceasing occurred in patients with intraventricular hemorrage and periventricular leukomalation. Authors suppose that changes of S-100 protein concentration are the predictor of bad prognosis in patients with severe CNS lesion.

Проблема прогнозирования перинатальных гипоксических поражений мозга у новорожденных различного гестационного возраста была и остается важной в перинатологии и педиатрии. Значимость ее велика, потому что гипоксия вносит су-щественный вклад в нарушение внутриутробного развития плода, перинатальную смертность, а также определяет формирование неврологических нарушений и детской инвалидности. Так, у недоношенных детей неврологическая инвалидность достигает 40%, а в структуре этой патологии око-ло 60% обусловлено пери- и интранатальными факторами, 10%—антенатального и около 30% — неизвестного происхождения. У доношенных 50% случаев церебрального паралича имеет пренатальную этиологию, 36% — пери-/неонатального происхожения и 14%—неизвестного происхождения [2, 8, 10, 16].

Анатомо-физиологические особенности детей грудного возраста таковы, что иногда даже обширное повреждение мозга в первом полугодии жизни может не вызывать неврологический дефицит и очаговые нарушения, и этот период обозначают как «немой» [4, 6].

Раннюю диагностику необходимо проводить, прежде всего, в группе детей высокого риска по развитию

внутрижелудочковых кровоизлияний (ВЖК) и перивентрикулярной лейкомаляции, кото-рая в 50—70% обусловлена пери- и интравентрикулярным кровоизлиянием. К этой группе относятся, прежде всего, недоношенные дети со сроком гестации менее 32 недель, с внутриутробной гипотрофией, внутриутробно инфицированные, от матерей с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом, течение беременности которых осложнялось кровотечением, гестозом, тяжелой анемией, урогенитальной инфекцией, многоплодием, т. е. женщины с беременностью высокого риска.

Известно, что перинатальная гипоксия инициирует процессы, приводящие к повышению проницаемости клеточных мембран, гибели нейронов и глиальных клеток вследствие некроза и/или апоп-тоза, нарушению целостности структуры гемато-энцефалического барьера (ГЭБ), попаданию в системный кровоток мозговых антигенов, стимули- рующих иммунную систему на выработку аутомозговых антител [ 1, 3 ].

Важную роль в развитии ишемического повреждения ткани мозга играет уровень его трофического обеспечения, который во многом определяет альтернативный выбор между

Г. С. Голосная, А. С. Петрухин, К. А. Маркевич, О. Е. Трифонова ПЕДИАТРИЯ № 1, 2004 г.

генетическими программами апоптоза и антиапоптозной защиты, а также влияет на механизмы некротической смерти клеток и репаративные процессы. Поэтому в настоящее время во всем мире ведется поиск ранних маркеров повреждения мозга.

Использование нейроспецифических белков в качестве маркеров различных патологических изменений, происходящих в ЦНС, является одним из перспективных направлений современной нейрофизиологии и медицины. Особенности экспрессии нейроспецифических белков у новорожденных и возможность их использования для диагностики перинатальных поражений ЦНС представляют особый интерес [1—3, 5, 11, 12, 16].

Нейротрофические свойства присущи многим протеинам, в том числе структурным белкам. Одним из представителей структурных кислых кальций-связывающих белков группы 8-100 является 8100Р — наиболее специфичный белок мозговой ткани.

8-100 является специфическим белком астро-цитарной глии, способным связывать кальций. Свое название белок получил благодаря свойству оставаться в растворенном состоянии в насыщенном растворе сульфата аммония. Семейство белков 8-100 состоит из 17 тканеспецифичных мономеров, два из которых — а и в — образуют гомо-и гетеродимеры, присутствующие в высокой концентрации в клетках нервной системы. 8-100 (РР) присутствует в высоких концентрациях в глиаль-ных и шванновских клетках, гетеродимер 8-100 (аР) находится в глиальных клетках, гомодимер 8-100 (аа) — в поперечно-полосатых мышцах, печени и почках. Белок метаболизируется почками, его время полураспада составляет 2 ч. Астроглиальные клетки — это наиболее многочисленные клетки в мозговой ткани. Они образуют трехмерную сеть, которая является опорным каркасом для нейронов. Увеличение концентрации 8-100 (аР) и 8-100 (РР) в спинно-мозговой жидкости (СМЖ) и плазме является маркером повреждения головного мозга. При раннем определении содержания 8-100 у пациентов с повреждением мозга концентрация белка отражает степень повреждения мозга [7, 13, 15] .

Повышение белка 8-100 в сыворотке крови и СМЖ при нарушениях мозгового кровообращения обусловлено активацией микроглии. Было показано, что в ранней фазе церебрального инфаркта микроглиальные клетки в периинфарктной зоне экспрессируют белки семейства 8-100 и активно пролиферируют, причем белки экспрессируются не более 3 дней после инфаркта. Это говорит о том, что активация постоянной популяции микроглии является ранним ответом мозговой ткани на ишемию и может быть использована как ранний маркер повреждения.

Исследования последних лет доказали возможность использования белков группы 8-100, в том числе 8-100Р, в качестве маркера и прогностического критерия повреждения ткани мозга при развитии острого ишемического инсульта.

Продемонстрирована корреляция между содержанием общей фракции 8-100 и белка 8-100Р с размерами инфаркта мозга и клиническим исходом инсульта.

Однако анализ данных литературы выявил значительные расхождения в показателях и их интерпретации. Как мы установили, это обусловлено в основном несовершенством метода или нечеткостью отбора групп больных.

Результаты исследования 8-100 можно использовать для предсказания возможного развития различных симптомов при черепно-мозговых травмах, состояниях после ушибов и сотрясений головного мозга [5, 9, 13].

Известно, что при деструкции мозговой ткани 8-100, наряду с другими белками этой группы, может обнаруживаться в крови и СМЖ больных. Белок 8-100 представляет особый интерес в связи с недавним выявлением у него нейроростовых и нейротрофических свойств. Установлено, что добавление малых доз 8-100 в нейрональную культуру обеспечивает поддержание жизнеспособности нейронов, возможность их образования и роста, тогда как в контрольных культурах нервные клетки не выживают [14, 17]. Можно предположить участие белка 8-100Р в процессах регенерации ткани мозга после ишемических нарушений.

Целью нашего исследования было изучение изменений концентрации белка 8-100 у новорожденных различного гестационного возраста с тяжелым поражением ЦНС, возможностей ранней диагностики гипоксических и геморрагических изменений, а также характера изменений концентрации белка 8-100 в динамике.

Материалы и методы исследования

Под нашим наблюдением находилось 60 детей с гестационным возрастом от 25 до 42 недель, массой тела при рождении от 890 г до 4630 г. Мальчиков — 39, девочек — 21. Дети были разделены на 3 группы по сроку гестации: 1-я — 25—31 недели, 2-я — 32—37 недель, 3-я — 38—41 недели. В каждой группе было по 20 детей.

Анализ анамнестических данных матерей показал, что во всех группах женщины находились в благоприятном для рождения возрасте. Женщин старше 35 лет было больше в 1-й группе (30%).

Каждая 4-я пациентка из 2-й группы и каждая 3-я женщина из 1-й группы имели отягощенный профанамнез. Эмоциональное напряжение во вреПри изучении динамики содержания белка

8-100 у детей с перинатальным поражением ЦНС (рис. 1) было выявлено следующее: во всех группах отмечалось значительное увеличение его концентрации в первые 48 ч жизни, затем наблюдалось его постепенное снижение. Более высокие уровни белка 8-100 у недоношенных детей 1 -й группы могут служить показателями незрелости головного мозга. Сохранение повышенной концентрации 8-100 связано с увеличением частоты формирования тя-желого поражения

мя беременности во 2-й и в 1-й группах испытывала каждая 3-я, а в 3-й группе — более половины. Курили около 74 женщин в каждой группе.

20% пациенток 3-й группы, 40% во 2-й и половина в 1-й имели соматические заболевания. Среди гинекологической патологии доминируют воспалительные заболевания, осложнения предыдущих родов. Достоверная связь с уменьшением срока гестации таких данных, как самопроизвольное прерывание беременности, привычное невынашивание, рождение детей «small for date» была отмечена только в 1-й группе. Искусственные аборты предшествовали настоящей беременности в 75%, 50% и 40% в 1-й, 2-й и 3-й группах соответственно. При изучении детородной функции матерей выявлены следующие данные: перво-беременные, первородящие женщины составили в 3-й группе 75> во 2-й — 74> а в 1-й — только одна женщина.

Изучение течения настоящей беременности показало, что во всех группах высокой была частота угрозы прерывания беременности, однако в 1-й группе этот показатель составил 75%, в то время как во 2-й и 3-й — соответственно 20% и 25%. Токсикоз I половины беременности отмечался у половины пациенток 3-й группы и у 95% — 2-й и 1-й групп. Гестозы составили 30% в 3-й группе, 70% и 85% — во 2-й и 1-й группах соответственно (P < 0,01).

Говоря об оперативном родоразрешении, важно отметить, что оно достоверно чаще (р < 0,01) проводилось во 2-й (70%) и 1-й группах (40%).

Всем детям, родившимся в тяжелом состоянии, проводили комплекс первичных реанимационных мероприятий. Состояние средней тяжести было констатировано у 9 пациентов, что потребовало проведения посиндромной терапии в условиях родильного дома. На 2—3-й сутки состояние пациентов ухудшилось, и они были переведены в отделение реанимации новорожденных.

Средняя оценка по шкале Апгар на 1-й минуте жизни составила 1—4 балла у 28 детей, 5—7 бал-

Таблица 1

Клиническая характеристика наблюдаемых детей

Показатели 1-я группа 2-я группа 3-я группа

Оценка по шкале Апгар, баллы: 1 4 абс. % абс. % абс. %

15 75 4 20 5 25

5—7 7—8 4 20 12 60 12 60

1 5 4 20 3 15

синдром угнетения ЦНС 19 95 19 95 18 90

Судороги 5 25 7 35 8 40

Кома 1 5 1 5 2 10

лов — 27, 7—8 баллов — у 5 детей (табл. 1). Все дети имели признаки тяжелого перинатального поражения ЦНС, которое было диагностировано на основании данных анамнеза, оценки динамики неврологического статуса и нейросонографическо-го обследования. Основными клиническими проявлениями были следующие: угнетение ЦНС, судороги, кома. Тяжесть состояния детей была обусловлена комплексом различных патологических процессов — внутриутробная пневмония, синдром дыхательных расстройств, гемолитическая болезнь, нарушение водно-электролитного баланса. Наличие и тяжесть дыхательной недостаточности обусловили необходимость проведения ИВЛ с первых часов жизни 81,6% детей, причем у половины из них в первые 5 минут жизни. Перевод в отделение реанимации и интенсивной терапии осуществляли на 1—3-й сутки жизни. Длительность ИВЛ составила в среднем 7 суток, максимально — 29 суток.

Забор крови проводили на 1-е, 3-й, 7-е, 14-е, 21-е сутки жизни. Полученную сыворотку в объеме 0,5 мл замораживали и хранили при температуре -20°С не более 2 месяцев. Определение содержания белка 8-100 проводили твердофазным иммуноферментным методом, используя реактивы фирмы CanAg (Швеция). Стандарты и образцы пациентов инкубировали вместе с биотинилиро-ванными анти- Б-ЮО моноклональными антителами (полученными из мыши) в покрытых стрептавидином ячейках микропланшета. В процессе инкубации белок Б-ЮО, содержащийся в стандартах или образцах пациентов, адсорбируется на покрытых стрептавидином ячейках микропланшета с биотинилированными анти- Б-ЮО моноклональными антителами. Стрипы затем промывают и инкубируют с пероксидазой хрена, меченной анти- Э-ЮО моноклональными антителами. После промывки в каждую ячейку добавляют буферный субстрат, проходит ферментная реакция. В процессе реакции развивается голубая окраска, если присутствует антиген. Интенсивность окраски пропорциональна количеству антигена й-ЮО, присутствующему в образце. Интенсивность окраски измеряют на микропланшетном ридере при длине волны 405 нм после добавления стоп раствора. Стандартные кривые строят для каждого анализа в координатах — оптическая плотность против концентрации для каждого стандарта. Концентрацию Б-ЮО в образцах пациента рассчитывают по калибровочной кривой.

Каждая группа детей была разделена на 2 подгруппы: в 1-ю включали детей, у которых на нейросонографии не было выявлено структурной патологии, однако отмечалась клиническая картина тяжелого гипоксически-ише-мического поражения ЦНС, во 2-ю — с интравентрику-лярными кровоизлияниями различной степени и пери-вентрикулярной лейкомаляцией.

Для получения нормативных показателей в-100 были использованы пробы сыворотки здоровых доношенных детей, а также 10 недоношенных детей без поражения ЦНС. Нормальные значения Б-ЮО были следующие: 0,18—0,3 мкг/л.

Результаты и их обсуждение

Динамика концентрации белка в-ЮО представлена в табл. 2.

4

ПЕДИАТРИЯ № 1, 2OO4 г.

6

ПЕДИАТРИЯ № 1, 2004 г.

острую ишемию мозга, высвобождаясь из привычных связей. Обнаружение Й-ЮО в сыворотке крови свидетельствует о его выходе в межклеточное пространство в результате разрушения нейрональных мембран, индуцированного внутриклеточным накоплением кальция и последующими реакциями глутамат-кальциевого каскада. Нарастание концентрации этого белка в сыворотке крови по срокам^ примерно соответствует развертыванию реакций глутамат-кальциевого каскада.

Таким образом, у детей 48—72 ч жизни повышение уровня белка Й-ЮО при тяжелом поражении ЦНС является прогностически неблагоприятным и позволяет использовать его как биохимический маркер повреждения ткани мозга.

ЛИТЕРАТУРА

1. Володин Н. Н., Дегтярев Д. Н„ ХачатрянА. В. и др // Педиатрия. — 1998. — № 5. — С. 15—20.

2. Гурина О. И., Рябухин И. А., Рогаткин С. О и др / / Педиатрия. — 1995. — № 3. — С. 15—19.

3. Гусев У. И., Скворцова В. И. Ишемия головного мозга. — М., 2001.

4. ПетрухинА. С. // 2-й съезд РАСПМ. — М., 1997. — С. 3—4,

5. Anderson R. E„ Hansom L. O., Nilson O et al // Neirosurgery. — 2001. — Vol. 48. — p. 1255—1258.

6. Distefano J„ Curerri K, Betta P. et al. // Am J. Perinatol. — 2002. — Vol. 19. № 6. — P. 317—322

7. Fassbender K., Schmidt R. et al. // J. of Neur Sciences. — 1997. — Vol. 148. — p, 101—105.

8. Freeman J. M., Nelson N. B. // Pediatrics. - 1988

— Vol. 82. — P. 240—249.

9. Garnett M. R., Blamire A. M„ Corkill R G et al // Brain. - 2002. - Vol. 123. - P. 2046-2054.

10. Gazollo D„ Di Lorio R„ Marinory E. et al // Crit Care Med. - 2002. — Vol. 30. - P. 1356-1360.

11. Maschman J.. Erb M. A., Heinemann M. K. et al // Acta Paediatr. — 2000. — Vol. 89. — P. 533 _ 535,

12. Michetti F., Gazollo D. S. // Clin Chem. — 2002 — Vol. 48, № 12. —P. 2097—2104.

13. Misslel V., Wiesmann M. et al. // Stroke — 1997

- Vol. 28. — P. 1956-1960.

14. McAdory B. S., van Eldik L. G„ Norden J. J //Brain Res. - 1998. — Vol. 813. — P. 211-217.

15. Shaefer B. W., Helzmann C. w. // Trends Biochem Sol. - 1996. -Vol. 21. — P. 134-140.

16. Wirds J. W., DuynA. E„ Geraerts S.D.et al. // Arch Dis. Child. Fetal Neonatal Ed. — 2003 — Vol 88 № 1 — P. 67—69.  , - .

17. ZimmerD., B., Cornwall E„ H., LandarA., Song W // Brain Res. Bus. — 1995. — Vol. 37. — p. 417—429,