Природные поликатионы как средство повышения эффективности антибактериальных белков

УДК 578.245

С. Н. Куликов

ПРИРОДНЫЕ ПОЛИКАТИОНЫ КАК СРЕДСТВО ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ

АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ БЕЛКОВ

Ключевые слова: поликатион, хитозан, антибактериальная активность, лизостафин.

Показана способность хитозанового полимера усиливать антибактериальное действие лизостафина в отношении Staphylococcus aureus. Результаты работы позволяют сделать предположение об одном из механизмов антибактериального действия хитозана, которое заключается в усилении деградации клеточной стенки бактерии собственными автолизинами в присутствии хитозанового полимера.

Keywords: chitosan, polycation, antibacterial activity, lysostaphin.

The ability of the chitosan polymer to enhance the antibacterial effect of lysostaphin against Staphylococcus aureus was shown. The results of the lead to the assumption that one of the mechanisms of antibacterial action of chitosan, which is to enhance the degradation of the cell wall of the bacteria in the presence of their own autolysins by chitosan polymer.

Введение

Среди природных веществ с антибактериальными свойствами особую группу образуют соединения которые характеризуются общим свойством - положительным зарядом своих молекул. Эта обширная группа веществ включает в себя как небольшие пептиды, так и белки, которые формируют различные группы живых существ -животные, растения, бактерии - для собственной защиты и для подавления жизнедеятельности различных микроорганизмов.

Одним из наиболее известных антибактериальных белков является лизостафин -цинк-содержащий фермент с молекулярной массой 27000, продуцируемый бактерией Staphylococcus staphylolyticus. Этот фермент обладает тремя видами ферментативных активностей, а именно -глицилглицин эндопептидазной, эндо- P-N-ацетилглюкозаминидазной и N-ацетилмурамил-Ь-аланинамидазной, и эффективно расщепляет пептидогликан золотистого стафилококка -Staphylococcus aureus. Как известно, особенности строения муреина золотистого стафилококка, в частности, очень высокая степень поперечной сшивки пептидными мостиками гликановых цепей, делает клеточные стенки этого вида бактерий необыкновенно устойчивым к ферментативному расщеплению. Кроме того, лизостафин одинаково хорошо расщепляет клеточные стенки как покоящихся, так и делящихся клеток, клеток одиночных и в составе биоплёнок, что придаёт ему ещё большую ценность, поскольку многие классические антибиотики могут проявлять своё действие только на активно растущие и делящиеся бактерии.

Помимо положительно заряженных веществ белковой природы в последнее время много внимания уделяется хитозану - поликатиону углеводной природы. Хитозан является единственным природным поликатионом, который можно получать в практически неограниченном количестве, с высокой степенью очистки, и, при этом, обладающий невысокой стоимостью [1]. Хитозан как таковой в природе встречается

довольно редко, но его ацетилированная форма -хитин, является вторым по массе органическим веществом на планете после целлюлозы. Впрочем и сама целлюлоза отличается от хитозана только отсутствием аминогруппы в своих сахарных остатках.

Хитозан обычно производят

непосредственно из хитина, отщепляя от его молекул ацетильные остатки в ходе процесса дезацетилирования, который в большинстве случаев производят с использованием концентрированной щелочи, реже - с помощью специальных микробных или грибных ферментов - дезацетилаз. Полного дезацетилирования хитина, как обычно не происходит, как в силу особенностей химической реакции и связанной с ней накоплением продуктов реакции, а именно - ацетата натрия, которые ингибируют реакцию, так и в силу особенностей трёхмерной структуры исходного хитина, которая заключается в сложной упаковке хитиновых нитей относительно друг друга, определяющей доступность для дезацетилирования различных областей молекулы хитинового полимера. В результате получаемый хитозан характеризуется необыкновенной разнородностью сразу по нескольким параметрам своей химической структуры: степени полимеризации (молекулярной массы), степени дезацетилирования, расположению ацетилированных и дезацетилированных групп вдоль полимерной цепи [2].

Такая вариация химической структуры хитозана влияет на проявление им биологической активности, в частности - антибактериальной активности, как по отдельности так и в смеси с другими антибактериальными веществами. Известно, что совместное использование хитозана с некоторыми антибиотиками может проявлять синергизм в отношении подавления некоторых видов бактерий. Кроме того, нами ранее было показано, что совместное действие хитозана с различной молекулярной массой и лизостафина может усиливать лизирующий эффект последнего в отношении инактивированных нагреванием клеток золотистого стафилококка [3].

В связи с этим задачей настоящей работы являлось исследование влияния природного поликатиона - хитозана на лизирующее действие лизостафина в отношении живых клеток стафилококка золотистого

Экспериментальная часть

В качестве объектов исследования использовали высокомолекулярный крабовый хитозан со средневязкостной молекулярной массой (Ми) 400 кДа и степенью дезацетилирования 85% (ЗАО «Биопрогресс», Московская Область), а также образцы хитозанов полученные методом ферментативного гидролиза высокомолекулярного с использованием ферментного препарата Целловиридин Г20х [4] с Ми 120, 30 и 5,5 кДа и степенью дезацетилирования 85, 87 и 90%, соответственно. Средневязкостную молекулярную массу хитозана рассчитывали из уравнения Марка-Хаувинка для хитозанов с различной степенью дезацетилирования согласно [5], степень дезацетилирования определяли как описано в работе [4]. В качестве мономера использовали глюкозамин (Sigma). Образцы хитозана перед экспериментом готовили как описано в работе [6].

В работе использовали штамм грам-положительной бактерии Staphylococcus aureus ATCC 35591.

Минимальную ингибирующую

концентрацию (МИК) образцов хитозана в отношении стафилококка определяли по методу [6]. Оценку МИК проводили по результатам трёх независимых экспериментов.

Оценку лизирующей активности лизостафина и влияние на этот процесс хитозана проводили в соответствии с модифицированным методом [7]. В качестве лизирующего фермента (аналога автолизина) использовали лизостафин (Е.С.3.4.24.75) из Staphylococcus staphylolyticus (Sigma). В качестве субстрата использовали живые клетки S. aureus в виде суспензии в 0,05 М MES-ACES-TES-Na буфере с рН 6,5 и 7,5 с оптической плотностью 0,300 при 600 нм. В опытном варианте добавляли к суспензии клеток аликвоту раствора хитозана до конечной концентрации равной 20 мкг/мл, затем 1U лизостафина. Полученную смесь инкубировали при температуре 37°С. За единицу активности фермента принимали уменьшение оптической плотности суспензии клеток на 0,001 за 1 мин. Активность фермента активированную хитозаном рассчитывали вычитая из общей активности в опыте с хитозаном величину активности фермента в отсутствии полимера.

Результаты и их обсуждение

Было установлено, что лизостафин эффективно лизирует живые клетки стафилококков, по падению оптической плотности клеточных суспензий. В слабокислых условиях (рН 6,5) добавление в реакционную смесь хитозанов усиливало литический эффект лизостафина (табл 1). Как видно из таблицы величина активации хитозаном литического действия фермента зависело

от молекулярной массы хитозанового полимера. Эта величина не имела прямой зависимости от молекулярной массы поликатиона - наибольшим эффектом усиления активности лизостафина демонстрировал образцы со средней Ми, составляющий 16 и 30 кДа. Близким значением активации фермента обладал образец с Ми 120 кДа. Дальнейшее увеличение молекулярной массы полимера ещё более уменьшало способность хитозана активировать лизис клеток.

Таблица 1 - Зависимость активации лизостафина и минимальной ингибирующей концентрации хитозана от молекулярной массы хитозанового полимера

Молекулярная масса хитозана Ми -10-3 Ед. акт. МИК

рН 6,5

400,0 145 250

120,0 195 104

30,0 205 83

16,0 200 125

5,5 155 250

0,2 50 >1000

рН 7,5

400,0 70 >1000

120,0 85 >1000

30,0 165 666

16,0 185 500

5,5 190 333

0,2 45 >1000

При уменьшении молекулярной массы поликатиона также наблюдалось падение способности хитозана активировать действие лизостафина (табл 1). При этом мономер хитозана -глюкозамин - практически был неактивен.

Как и в случае с использованием инактивированных клеток, опыт с использованием живых клеток показал, что активация литического действия лизостафина хитозанами в отношении инактивированных клеток стафилококка

согласуются с показателями МИК данных образцов полимера в отношении S. aureus.

Аналогичные данные были получены и при определении влияния хитозана на литическое действие лизостафина и МИК в слабощелочных условиях (рН 7,5) с той разницей, что наибольшей антибактериальной активностью обладали образецы с Ми 5,5 и 16 кДа (табл. 1). То есть оптимальная величина молекулярной массы для проявления наблюдаемого эффекта сместилась в область от низкомолекулярных хитозанов в область олигохитозанов.

Основным результатом работы стало то, что показатели активации лизостафина хитозанами в отношении живых клеток стафилококка были существенно выше (примерно в 2 раза), чем в случае использования клеток инактивированных нагреванием [3]. По всей видимости это связано с тем, что высокая температура вызывает изменения структуры молекул, входящих в состав бактериальных стенок. Вероятно происходит

денатурация бактериальных белков, в том числе входящих в состав муреина, что делает пептидогликановый комплекс менее доступным для гидролитического воздействия лизостафина.

Использование живых клеток допускает вовлечение в лизис клеточных стенок и собственных стафилококковых автолизинов. Проведённые исследования с добавлением хитозанов в разных концентрациях позволили заключить, что такой эффект наблюдается, однако не превышает 5% от величины активности, которая была индуцирована хитозанов в отношении именно лизостафина.

Таким образом, проведенные исследования показали, что хитозан усиливает лизис клеток стафилококка лизостафином. Этот эффект значительно сильнее проявляется на живых клетках бактерий, чем на клетках инактивированных высокой температурой. Вероятно это связано с большей доступностью пептидогликана для действия фермента в живых клетках. Выявленный в работе эффект также открывает возможность использования данного эффекта для увеличения ферментативного извлечения антиенов и белков из клеточных стенок бактерий при производстве бактерийных препаратов.

Работа выполнена за счёт средств субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров.

Литература

1. Хитозан / Под. ред. К.Г. Скрябина, С.Н. Михайлова, В.П. Варламова. Центр «Биоинженерия» РАН, Москва, 2013. 593 с.

2. Куликов, С.Н. Роль структуры в биологической активности хитозана / С.Н. Куликов, Ю.А. Тюрин, Д.А. Долбин, Р.З. Хайруллин // Вестник Казанского технологического университета, - 2007. - №6. - С. 10-14.

3. Куликов, С.Н. Активация лизостафина как инструмент оценки антибактериального потенциала хитозана / С.Н. Куликов, Р.З. Хайруллин Вестник Казанского технологического университета, - 2013. - № 7. - С. 155157.

4. Ильина, А.В. Деполимеризация хитозана ферментным препаратом Целловиридин Г20х / А.В. Ильина, Ю.В. Ткачёва, В.П. Варламов // Прикл. биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38. - №2. - С. 132-135.

5. Wang, W. Determination of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degree of deacetylation / W. Wang, S. Bo, S. Li, W. Qin // Int. J. Biol. Macromol. -1991. V 13. - №5. - P. 281-285.

6. Kulikov, S.N. Molecular weight and pH aspects of efficacy of oligochitosan against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) / S. Kulikov, V. Tikhonov, I. Blagodatskikh, E. Bezrodnykh, S. Lopatin, R. Khairullin, Yu. Philippova, S. Abramchuk // Carb. Polymers. - 2012. -V. 87. - №1. - P. 545-550.

7. Bierbaum, G. Autolytic system of Staphylococcus simulans 22: influence of cationic peptides on activity of N-acetylmuramoil-L-alanine amidase / G. Bierbaum, H.G. Sahl // J. Bacteriol. - 1987. - V. 169. - P. 5452-5458.

© С. Н. Куликов - канд. биол. наук, доц. кафедры технологии пищевых производств КНИТУ; н.с. кафедры микробиологии К(П)ФУ; в.н.с. лаб. иммунологии и разработки аллергенов Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, kuliks@yandex.ru

© S. N. Kulikov - Cand. Biol. Sci., associate professor, Department of Technology of Food Production KNRTU; scientific researcher of Department of Microbiology KFU; Leading researcher, Kazan Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology at Rospotrebnadzor, kuliks@yandex.ru.