Особенности гуморального и клеточного иммунитета у новорожденных с герпесвирусной инфекцией

Особенности гуморального и клеточного иммунитета у новорожденных с герпесвирусной инфекцией

Л. В. Кравченко, А. А. Афонин, М. А. Левкович, М. В. Демидова, А. Ю. Левкович

ФГБУ Ростовский научно-исследовательский институт акушерства и педиатрии

Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Ростов-на-Дону

Проведено динамическое клиническое и иммунологическое исследование Т-лимфоцитов CD3+ CD28+, CD3+ CD95+ и В-лим-фоцитов CD20+ CD40+ в сыворотке крови у новорожденных детей с герпесвирусной инфекцией. Нарушения противоинфекци-онной защиты обусловлены снижением CD3+ CD28+ и увеличением CD20+ CD40+. Обнаружено, что снижение CD3+ CD28+ и увеличение CD20+ CD40+ является прогностически неблагоприятным фактором тяжести герпесвирусной инфекции. Ключевые слова: новорожденные дети, герпесвирусная инфекция, лимфоциты

Features of Intercellular Cooperation and Apoptosis in Newborn Children with Herpes Virus Infection

L. V. Kravchenko, A. A. Afonin, M. A. Levkovich, M. V. Demidova, A. Yu. Levkovich

Rostov Research Institute of Obstetrics and Pediatrics, Rostov-on-Don

The dynamic clinical and immunological study of T-lymphocytes CD3+ CD28+, CD3+ CD95+ and B-lymphocytes CD20+ CD40+ in blood serum of newborns with herpes infection was performed. Pathogenetic role of anti-infectious protection was detected. Derangements of anti-infectious protection are due to reduction in CD3+ CD28+ and an increase in CD20+ CD40+. It was found that the decrease in CD3+ CD28+ and an increase in CD20+ CD40+ is a negative prognostic factor for the severity of herpes virus infection. Key words: newborn infants, herpes infection, lymphocytes

Контактная информация: Кравченко Лариса Вахтанговна — д.м.н., вед.н.с. педиатрического отдела РНИИАП Росздрава; 344012, Ростов-на-Дону, ул. Мечникова, 43; 8 (863) 232-56-64; larakra@list.ru

УДК 616.9:578.825.11-053.3

Актуальность изучения герпесвирусной инфекции обусловлена широкой циркуляцией герпесвирусов в популяции и высокой частотой передачи их от матери к плоду [1, 2]. Эта инфекция рассматривается как одна из ведущих причин мертворождаемости, самопроизвольных выкидышей, преждевременных родов, заболеваемости новорожденных и младенческой смертности [3, 4]. Значимое место в защите новорожденных от герпесвирусной инфекции занимает иммунная система. Известно, что течение герпесвирусной инфекции сопряжено с иммунодепрессией, в частности, со снижением функциональной активности Т-лимфоцитов [5]. Выраженность иммунного ответа может определять клиническое течение и исход заболевания при герпесвирусной инфекции, поэтому изучение механизмов иммунодепрессии при данном заболевании является чрезвычайно важным. Исследованиями последних лет идентифицированы пути передачи клеточных и межклеточных сигналов, осуществляемых с участием молекул костимуляции, усиливающих пролиферативную активность Т-лимфоцитов и повышающих способность к синтезу цитокинов. Однако в доступной литературе имеются единичные работы по изучению лимфоцитов с рецепторами CD28+ и CD40+ у детей первых месяцев жизни [6—8]. Причастность апоптоза к формированию иммунодепрессии при герпесвирусной инфекции недостаточно изучена. Усиление экспрессия CD95 на лимфоцитах периферической крови может обусловливать дальнейшее развитие програмированной клеточной гибели [9].

Целью данной работы явилось изучение изменения количества лимфоцитов с рецепторами CD28, CD40 и CD95 у новорожденных с клиническими проявлениями герпесвирусной инфекции.

Материалы и методы исследования

Изучены иммунологические показатели у 154 новорожденных с герпесвирусной инфекцией (цитомегалови-

русная инфекция, инфекция, вызванная вирусом простого герпеса (ВПГ) 1 и 2 типов, Эпштейна-Барр вирусная (ЭБВ) инфекция), находившихся на стационарном лечении в отделении патологии новорожденных ФГБУ «Ростовский научно- исследовательский институт акушерства и педиатрии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

В зависимости от этиологии заболевания дети были разделены на группы:

1.1 — цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ), типичная генерализованная форма (тяжелая) — 54 человек;

1.2 — ЦМВИ, типичная генерализованная форма с неполной клинической симптоматикой (среднетяжелая) — 52 человек;

2 — дети с инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типов — 22 человека;

3 — дети с Эпштейна-Барр вирусной инфекцией — 26 человек.

Во второй и третьей группах заболевание протекало в генерализованной форме.

Контрольную группу составили 15 условно здоровых детей обоего пола в возрасте до одного месяца, не инфицированных герпесвирусами.

Всем детям на первом месяце жизни проводили комплексное клинико-лабораторное обследование, включавшее использование ПЦР для определения вирусов в крови и моче. Использовали набор реагентов производства «АмплиСенс» (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ) и многоканальный амплификатор ДНК «Терцик» (производство ДНК-Технология г. Москва) с компьютером и программным обеспечением «Sigmagel» (Швеция). Определение специфических антител классов IgG и IgM в сыворотке крови к вирусам простого герпеса (HSV I, II), цитомегаловирусу (CMV) проводилось непрямым твердофазным иммунофер-

Таблица 1. Динамика показателей клеточного иммунитета у детей с герпесвирусной инфекцией

Показатели CD28 CD3+ CD28+

Сроки обследования Группы 1 мес. 3 мес. 1 мес. 3 мес.

109/л % 109/л % 109/л % 109/л %

ЦМВИ, тяжелая форма

* 0,0002 0,001 - - 0,04 0,46 - -

р 1.1.-1.2 0,35 0,37 0,19 0,15 0,01 0,001 0,16 0,07

Р 1.1.-2 0,15 0,12 0,29 0,29 0,37 0,002 0,04 0,11

Р 1.1.-3 0,25 0,22 0,01 0,01 0,41 0,01 0,27 0,008

ЦМВИ, средне-тяжелая форма

Р 1.2-2 0,31 0,23 0,39 0,25 0,16 0,31 0,15 0,45

р 1.2-3 0,45 0,4 0,07 0,15 0,07 0,25 0,15 0,3

* 0,0002 0,0004 0,002 0,0008 - -

Инфекция ВПГ

Р 2-3 0,3 0,3 0,11 0,44 0,38 0,15 0,05 0,33

* 0,0001 0,0001 - - 0,03 0,002 - -

ЭБВИ

* 0,0001 0,0001 - - 0,03 0,02 - -

Контрольная группа п = 15 Медиана 3,70 (2,25-6,60) 0,15 (0,09-0,24) - - 68,10 (42,05-85,50) 2,93 (1,38-3,17) - -

* — достоверность различий показателей от контрольной группы в возрасте 1 месяца; ** — в скобках даны значения 1—3 квартиля; р — достоверность между группами

ментным методом с использованием стандартных наборов реактивов фирмы «Вектор-Бест», г. Новосибирск. Определение антител класса IgM к капсидному антигену (VCA) и IgG к ядерному антигену (EBNA) в сыворотке крови проводилось непрямым твердофазным иммуноферментным методом с использованием стандартных наборов реактивов фирмы «BCM DIAGNOSTIC» (LLC USA). Диагностика герпесвирусной инфекции основывалась на комплексной оценке клинической картины заболевания и результатах лабораторных исследований. Диагноз герпесвирусной инфекции ставился при выявлении ДНК вирусов в крови и в моче и нарастании титров специфических антител класса IgG в сыворотке крови к вирусам простого герпеса 1, 2 типов, ЦМВ, ВЭБ в динамике в последующие сроки наблюдения; при наличии специфических антител IgM в сыворотке крови у ребенка, либо при выявлении специфических IgG и/или IgM в цереброспинальной жидкости. Содержание лимфоцитов, экспрессирующих CD28, CD40, CD95+, CD3+ CD28+, CD20+ CD40+, в периферической крови определяли на проточном лазерном цитофлуориметре «Beck-man COULTER» Epics XL II (США) с помощью моноклональ-ных антител к кластерам дифференцировки CD3+, CD20+, CD28+, CD40+ CD95+ фирмы IMMUNOTECH (Франция).

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ «STATISTICA-6» с применением непараметрического критерия Вилкоксона. Различия сравниваемых величин признавались статистически достоверными при уровне значимости p < 0,05. Пересечение интер-

квартильных интервалов не говорит об отсутствии достоверных различий сравниваемых групп [10].

Результаты и их обсуждение

Проведена сравнительная оценка содержания абсолютного и относительного количества лимфоцитов с маркерами костимуляции СР3+ СР28+, СР20+ СР40+ в периферической крови на первом месяце жизни у детей с различными формами герпесвирусной инфекции. У детей с тяжелой формой ЦМВИ отмечалось достоверное (р < 0,04) снижение относительного количества клеток с маркерами костимуляции СР3+ СР28+ (табл. 1) на фоне достоверного снижения СР28 в общей популяции в сравнении с детьми контрольной группы. Наряду с этим достоверно возрастало (р < 0,01) количество СР3+ СР28- (табл. 2). Обращает внимание, что только в этой группе уровень СР3-СР28+ оставался на уровне контрольных значений и не снижался как в других группах больных. При среднетяжелой форме ЦМВИ также отмечалось снижение относительного и абсолютного количества лимфоцитов с маркерами костимуляции СР3+ СР28+ при снижении количества лимфоцитов, экспрессирующих СР28, при этом не отмечалось возрастания числа Т-лимфоцитов без маркеров костимуляции СР28 (СР3+ СР28-). Изменения иммунологических показателей при инфекции, вызванной вирусом простого герпеса, характеризовались достоверным снижением абсолютного числа лимфоцитов с маркерами костимуляции СР3+ СР28+ и увеличением числа клеток без маркеров костимуляции

Таблица 2. Динамика показателей клеточного иммунитета у детей с герпесвирусной инфекцией CD3- CD28+ и CD3+CD28-

Показатели CD3- CD28+ CD3+ CD28-

Сроки обследования Группы 1 мес. 3 мес. 1 мес. 3 мес.

% 109/л % 109/л % 109/л % 109/л

ЦМВИ, тяжелая форма

* 0,28 0,16 — — 0,01 0,0001 — —

р 1.1.— 1.2 0,0001 0,0001 0,01 0,0008 0,0002 0,0001 0,003 0,001

Р 1.1.—2 0,0001 0,0001 0,004 0,004 0,0002 0,0001 0,13 0,008

Р 1.1.—3 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001 0,0001

ЦМВИ, среднетяжела я форма

р 1.2—2 0,15 0,15 0,47 0,48 0,26 0,21 0,19 0,3

р 1.2—3 0,42 0,40 0,04 0,09 0,24 0,39 0,002 0,001

* 0,0002 0,0009 — — 0,1 0,19 — —

Инфекция ВПГ

Рп 2—3 0,14 0,11 0,14 0,14 0,45 0,37 0,0003 0,02

* 0,0001 0,0001 — — 0,04 0,05 — —

ЭБВИ

* 0,0001 0,0001 — — 0,01 0,07 — —

Контрольная группа п = 15 Медиана 4,20 (2,40—8,70) 0,22 (0,09—0,66) — — 3,10 (1,50—7,80) 0,012 (0,04—0,22) — —

* — достоверность различий показателей от контрольной группы в возрасте 1 месяца; ** — в скобках даны значения 1—3 квартиля; р — достоверность между группами

СР95+ по отношению к контрольной группе (р < 0,005) и группам больных с ЦМВИ (р < 0,005 и р < 0,005 соответственно).

Проведенными исследованиями установлено, что при герпесвирусной инфекции у новорожденных детей выявлялось иммунодефицитное состояние, характеризующееся нарушениями кооперации Т и В-лимфоцитов и преобладанием процессов негативной активации (апоптоз). Изучение экспрессии молекул костимуляции привело к пониманию механизмов, лежащих в основе развития герпесвирусных инфекций, и позволило по-новому взглянуть на их патогенез. Сигналы, поступающие в Т клетку через комплекс TCR — СР3, недостаточны для индукции экспрессии генов активации и пролиферации. Эти процессы усиливаются, благодаря сигналам, запускаемым через молекулу СР28. Отсутствие одного из компонентов комплекса костимуляции приводит к дефектам иммунной защиты. Изменения иммунного статуса в исследуемых группах носили разнонаправленный характер. Эти изменения отражали реакцию иммунной системы на инфекцию, имели четкую зависимость от вида возбудителя, что позволило выделить иммунологические особенности в каждой клинической группе. При ЦМВИ, тяжелой форме отмечалось угнетение клеточного звена иммунитета на внедрение патогена, о чем свидетельствовало снижение числа клеток с маркерами СО3+СР28+, через которые проводятся в клетку костимулирующие сигналы, необходимые для активации Т-хелперов.

СР3+ СР28-. При иммунологическом обследовании детей с Эпштейна-Барр вирусной инфекцией обнаружено незначительное повышение, в отличие от других групп больных, относительного числа СР3+ СР28+. В наших исследованиях с целью более глубокого понимания нарушений в гуморальном звене иммунитета было проведено определение молекул СР40 (табл. 3). Полученные данные сравнивались с данными контрольной группы и между клиническими группами. При этом в группе детей с ЦМВИ, генерализованной формой, в сравнении с пациентами других групп, необходимо отметить достоверное увеличении активированных лимфоцитов с маркерами костимуляции СР20+ СР40+. При Эпштейна-Барр вирусной инфекции уровень лимфоцитов с маркерами СР20+ СР40+ был сопоставим с контрольными значениями.

Нами было также проведено изучение роли экспрессии С095 в зависимости от этиологии герпесвирусной инфекции. Анализ процессов апоптоза у обследованных нами больных выявил, что при инфекции, вызванной вирусом простого герпеса, отмечено достоверное повышение экспрессии СР95 на первом месяце жизни, свидетельствующее о нарастании готовности лимфоцитов к апоптозу (табл. 4). У пациентов с ЦМВИ отмечалось более низкое содержание лимфоцитов, экспрессирующих на своей мембране СР95, по сравнению с другими группами больных.

При Эпштейна-Барр вирусной инфекции имело место увеличение содержания лимфоцитов, экспрессирующих

Таблица 3. Динамика показателей гуморального звена иммунной системы у детей с герпесвирусной инфекцией

Показатели CD40+ CD20+ CD40+

Сроки обследования Группы 1 мес. 3 мес. 1 мес. 3 мес.

% 109/л % 109/л % 109/л % 109/л

ЦМВИ, тяжелая форма

* 0,006 0,005 — — 0,0001 0,0001 — —

р 1.1.— 1.2 0,09 0,25 0,37 0,11 0,001 0,0007 0,38 0,009

Р 1.1.—2 0,11 0,18 0,44 0,28 0,0001 0,0001 0,37 0,05

Р 1.1.—3 0,23 0,35 0,018 0,018 0,0001 0,0001 0,0004 0,0001

ЦМВИ, средне-тяжелая форма

р 1.2—2 0,49 0,38 0,45 0,38 0,22 0,19 0,48 0,48

р 1.2—3 0,30 0,35 0,04 0,19 0,22 0,27 0,0006 0,005

* 0,0003 0,0006 — — 0,0003 0,0001 — —

Инфекция ВПГ

Р 2—3 0,28 0,25 0,03 0,14 0,42 0,32 0,001 0,08

* 0,001 0,001 — — 0,14 0,06 — —

ЭБВИ

* 0,0006 0,0006 — — 0,18 0,09 — —

Контрольная группа п = 15 Медиана 1,27 (0,30—5,80) 0,06 (0,01—0,22) — — 5,90 (3,15—11,45) 0,22 (0,11—0,38) — —

* — достоверность различий показателей от контрольной группы в возрасте 1 месяца; ** — в скобках даны значения 1—3 квартиля; р — достоверность между группами

Это являлось одной из причин более тяжелого течения заболевания у пациентов этой группы по сравнению с другими группами больных.

Как и при взаимодействии антигенпредставляющей клетки с Т-хелперами, при Т-В кооперации имеется двусторонняя направленность сигналов, однако преобладающее направление их в этом случае происходит от Т к В клетке, и при этом активируется В-лимфоцит.

Высокая значимость определения повышенного содержания В-клеток, экспрессирующих на своей поверхности рецепторы СР40 (СР20+СР40+), отражает важность прямого контакта между Т- и В-клетками, которые осуществляются через эту молекулу. Сигнал, возникающий в результате участия клеток С020+СР40+, является основным костимулирующим сигналом при включении ответа В-лимфоцитов, что, в конечном итоге, обеспечивает пролиферацию В-лимфоцитов.

Изменения в иммунном статусе пациентов со среднетя-желой формой ЦМВИ носили однонаправленный характер, но по некоторым параметрам были менее выраженными, чем при тяжелой форме ЦМВИ. Проведенное сравнительное изучение иммунного статуса у пациентов при инфекции, вызванной вирусом простого герпеса, выявило достоверное снижение СО3+СР28+, сопоставимое с тяжелой формой ЦМВИ. Уровень лимфоцитов С020+СР40+ не отличался от значений контрольной группы.

При иммунологическом обследовании детей с Эпштей-на-Барр вирусной инфекцией изменения субпопуляцион-

ного состава лимфоцитов были менее выражены в отличие от других групп больных.

Нами показана значимость исследования экспрессии СР95 у больных с герпесвирусной инфекцией. Индуцированный апоптоз, определяемый по содержанию лимфоцитов, экспрессирующих на своей мембране СР95+, при герпесвирусной инфекции служит защитным механизмом элиминации вирусинфицированных клеток и препятствует прогрессированию заболевания.

Изучение показателей клеточного и гуморального звеньев иммунной системы в динамике по группам по сравнению с началом заболевания не выявило тенденции к их снижению к 3 месяцам (табл. 5), за исключением относительного количества СО3+СР28+ при тяжелой форме ЦМВИ, что свидетельствовало о сохраняющихся нарушениях в системе иммунитета и необходимости проведения повторных курсов иммунокорригирующей терапии.

Выводы

1. Герпесвирусная инфекция у детей вызывает иммунологические сдвиги в Т-клеточном (снижение СР3+ СР28+) и в В-клеточном (увеличение СР20+ СР40+) звеньях иммунной системы.

2. Тяжелая форма ЦМВИ характеризуется достоверно более выраженным снижением экспрессии СР3+ СР28+ и увеличением СР20+ СР40+.

3. В группе детей с инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типов, и с Эпштейна-Барр вирусной

* — достоверность различий показателей от контрольной группы в возрасте 1 месяца; ** — в скобках даны значения 1—3 квартиля; р — достоверность между группами

Таблица 4. Динамика экспрессии CD95 у детей с герпесвирусной инфекцией

Показатель CD95

Сроки обследования Группы 1 мес. 3 мес.

% 109/л % 109/л

ЦMВИ, тяжелая форма

* 0,13 0,02 — —

р 1.1.— 1.2 0,05 0,01 0,49 0,49

P 1.1.—2 0,0005 0,12 0,008 0,07

P 1.1.—3 0,03 0,05 0,001 0,01

ЦMВИ, среднетяжелая форма

P 1.2—2 0,003 0,0001 0,002 0,05

р 1.2—3 0,05 0,0001 0,01 0,45

* 0,43 0,23 — —

Инфекция ВПГ

P 2—3 0,001 0,05 0,007 0,05

* 0,001 0,001 — —

ЭБВИ

* 0,05 0,01 — —

Контрольная группа n = 15 Mедиана 2,4 (1,8—3,4) 0,085 (0,07—0,12) — —

Таблица 5. Статистический анализ показателей гуморального и клеточного звеньев иммунной системы в 1 и 3 месяца, представленных в таблицах 1—4, в сравниваемых группах

Показатели Группы

ЦMВИ, тяжелая форма ЦMВИ, среднетяжелая форма Ифекция, вызванная вирусом простого герпеса I, II типа Эпштейна-Барр вирусная инфекция

% абс. % абс. % абс. % абс.

CD3+CD28+ 0,01 0,15 0,06 0,2 0,4 0,14 0,11 0,26

CD20+CD40+ 0,3 0,14 0,06 0,17 0,03 0,06 0,5 0,44

инфекцией число клеток с маркерами CD20+ CD40+ не отличается от контрольных значений.

4. Инфекция, вызванная вирусом простого герпеса 1 и 2 типов и Эпштейна-Барр вирусная инфекция характеризовались повышением абсолютного количества лмфоцитов, экспрессирующих на своей мембране CD95+, по сравнению с контрольной группой, причем более высокий уровень лимфоцитов, экспрессирующих маркеры готовности к апоптозу (CD95), отмечен в группе пациентов с инфекцией, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типов.

Литература:

1. Орджоникидзе Н.В. Современные аспекты внутриутробной инфекции / Н.В. Орджоникидзе, Н.Г. Агаронян // Ж. Российского общества акушеров-гинекологов. — 2005. — № 1. — С. 8—12.

2. Сенчук А.Я., Дубоссарская З.М. (ред.) Перинатальные инфекции. — М.: Медицинское информационное агентство, 2005. — 318 с.

3. Володин Н.Н. (ред.) Неонатология: национальное руководство. — М.: ГЭОТАР-Медиа, 2007. — 848 с.

4. Итоги и перспективы научных исследований по проблеме внутриутробной инфекции новорожденных / И.И. Бочарова и др. // Росс. вестник акушера-гинеколога. — 2GG7. — № 5. — С. 6G— 63.

5. Whitley R. Neonatal herpes simplex virus infection // Curr. Opin. Infect. Dis. — 2GG4. — V. 17. — № 3. — P. 243—246.

6. Хаитов P.M. Физиологические особенности активации и торможения функций клеток иммунной системы. Рецепторные структуры и внутриклеточные сигнальные пути макрофагов и естественных клеток-киллеров / РМ. Хаитов, B.M. Mанько // Росс. физиологический журнал им. KM. Сеченова. — 2GG6. — Т. 92. — № 6. — С. 662—667.

7. Congenital cytomegalovirus infection after recurrent infection: case reports and review of the literature / M.A. Gaytant et al // Eur. J. Pediatr. — 2GG3. — V. 162. — № 34. — P. 248—253.

8. Рабсон А., Ройт А., Далвз П. Основы медицинской иммунологии. — M.: Бином, 2GG6. — 32G с.

9. Барышников А.Ю. Иммунологические проблемы апоптоза. — M.: Эдиториал УРСС, 2GG2. — 32G с.

1G. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. — M.: MедиаСфера, 2GG2. — 312 с.