СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) ПРИ МИКРОПЛАЗМОЗЕ СВИНЕЙ
METHOD FOR MAKING ERYTHROCYTIC DIAGNOSTICUM FOR INDIRECT HEMAGGLUTINATION REACTION (IHR) IN PIG'S MYCOPLASMOSIS

Изобретение относится к методам лабораторной диагностики микоплазмозов и может быть использовано в ветеринарной медицине.
Наиболее близким к заявляемому способу является эритроцитарный диагностикум для реакции гемагглютинации (РНГА) при микоплазмозе свиней (Андросик Н.Н. Повышение активности эритроцитарных микоплазменных диагностикумов // Ветеринария - 2000, - №3, с.25-29), который готовится по следующей схеме.
1. В качестве сорбента антигенов используют нативные и фиксированные эритроциты барана. Фиксацию проводят 4%-ным раствором формальдегида в присутствии 5% сахарозы по методу J.S. Jngracham (1959) в модификации П.С.Барман и А.В. Месенжиковой (1974) и 0,4%-ным раствором акролеина по методу Ф.С.Носкова и Б.К. Гаврилюк (1970).
2. В качестве гемсенситинов используют корпускулярные антигены микоплазм (М.hyorhinis, A.granularum, A.laidlawii), а также выделенные из них и культуральной жидкости полисахаридные антигены.
Последние выделяют по методике, описанной Н.Н. Костюковой и соавт. Выращенную на триптическом переваре сердца крупного рогатого скота, обогащенном лошадиной сывороткой, дрожжевым экстрактом, гидролизатом лактальбумина и глюкозой, культуру микоплазм освобождают от питательной среды путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение 1 ч. К культуральной жидкости прибавляют 5 объемов этанола, охлажденного до минус 10-15°С. Преципитат отделяют центрифугированием при 6000 об/мин в течение 20 мин. Осадок ресуспендируют в фосфатно-солевом буферном растворе, объем которого составляет 0,1 объема использованной культуральной жидкости. Полученный антиген прогревают 20 мин в водяной бане при 100°С для денатурации неспецифических термолабильных антигенов.
Для выделения полисахаридных антигенов из микоплазм готовят 20-миллиардную взвесь на фосфатно-солевом растворе (рН 7,2), добавляют кристаллический панкреатин из расчета 20 мг/мл, тщательно перемешивают и выдерживают 1 ч в водяной бане при 37°С, периодически встряхивая. Затем смесь обрабатывают 5 объемами охлажденного до минус 10-15°С этанола, выдерживают сутки и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 20 мин.
Надосадочную жидкость удаляют, а осадок растворяют в солевом фосфатно-буферном растворе (рН 7,2) до 0,1 объема первоначально взятой для культивирования питательной среды.
Полученный антигенный препарат прогревают на водяной бане при 100°С в течение 20 мин и используют для сенсибилизации эритроцитов.
3. Для танизации используют 2,5%-ную взвесь нативных или фиксированных эритроцитов, добавляют равный объем танина в концентрации 1:20000 и выдерживают 15-20 мин в водяной бане (37°С). Трижды эритроциты отмывают физиологическим раствором и сенсибилизируют по общепринятой методике.
4. Сенсибилизирующую дозу микоплазменного антигена и температурный режим сенсибилизации подбирают экспериментально. Эритроциты, нагруженные антигеном, отмывают, ресуспендируют фосфатно-солевым раствором (рН 7,2) до 1%-ной концентрации и используют для постановки РНГА в микроварианте на титраторе Такачи.
Испытуемые сыворотки после освобождения от неспецифических гемагглютининов и инактивации в течение 20 мин при 56°С разводят в двукратной последовательности 1%-ным раствором нормальной сыворотки крови лошади в фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,2). К каждому разведению добавляют по одной капле диагностикума, тщательно перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 2-5 ч. Реакцию оценивают на четыре креста. Конечным титром считают последнее разведение сыворотки, дающее агглютинацию на три креста.
Однако данный способ обладает некоторыми недостатками:
1) метод фиксации эритроцитов барана 4% раствором формальдегида более длительный по времени, требует дополнительных затрат, связанных с внесением 5% сахарозы;
2) изготовление антигенов из микоплазм довольно сложный метод, включающий в себя дополнительную обработку культур микоплазм этанолом и панкреатином;
3) дополнительная обработка фиксированных эритроцитов танином, многие серии которого вызывают спонтанную самоагглютинацию эритроцитов, требует проверки каждой серии танина для исключения данных отрицательных свойств препарата, что также усложняет технологический процесс;
4) не указаны оптимальные сенсибилизирующая доза микоплазмозного антигена и температурный режим сенсибилизации, что затрудняет возможность широкого использования данного метода нагрузки эритроцитов.
Целью данного изобретения является получение микоплазмозного эритроцитарного диагностикума для выявления антител в сыворотке крови свиней в РНГА с использованием наиболее простых и экономичных методов изготовления антигенов, а также фиксации и сенсибилизации эритроцитов барана, без проведения их танизации (табл.1).
Поставленная цель достигается дробной формалинизацией эритроцитов барана, а также получением антигена из трех культур микоплазм (М. hyosynoviae, M. hyorhinis и Ureaplasma sp.) путем прогревания их на водяной бане при 70°С в течение 30 мин, механического смешивания в равных пропорциях и концентрации центрифугированием; сенсибилизацией формалинизированных эритроцитов барана без предварительной танизации смесью трех микоплазмозных антигенов при 70°С в течение 30 мин с последующим трехкратным отмыванием эритроцитарного диагностикума буферным раствором с рН 7,2.
Таблица 1.
Сравнительная характеристика методов получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации при микоплазмозе свиней
Метод, предложенный Н.Н. Андросиком
Заявляемый метод
1. Фиксацию эритроцитов проводят 4%-ным раствором формальдегида в присутствии 5% сахарозы и 0,4%-ным р-ром акролеина
1. Фиксацию эритроцитов проводят 20%-ным р-ром формальдегида, дробно. 4-кратно отмывают буферным раствором путем центрифугирования.
2. Антигены получают из культур микоплазм, которые освобождают от питательной среды путем центрифугирования. К культуральной жидкости прибавляют 5 объемов охлажденного этанола, преципитат отделяют центрифугированием. Осадок ресуспендируют в фосфатно-солевом буфере, прогревают на водяной бане. Для выделения полисахаридных антигенов к взвеси микоплазм добавляют кристаллический панкреатин, выдерживают на водяной бане и обрабатывают 5 объемами охлажденного этанола, выдерживают сутки и центрифугируют. Осадок разводят в буферном растворе, прогревают на водяной бане.
2. Антигены получают из культур микоплазм, которые освобождают от питательной среды путем центрифугирования. Осадки разводят 1:10 физиологическим р-ром. Прогревают на водяной бане.
Продолжение таблицы 1.
3. Для танизации эритроцитов добавляют танин в концентрации 1:20000 и выдерживают на водяной бане, трижды отмывают физиологическим раствором.
3. Танизацию эритроцитов не проводят.
4. Сенсибилизирующую дозу антигена и температурный режим подбирают экспериментально. Нагруженные антигеном эритроциты отмывают, ресуспендируют фосфатно-солевым буфером до 1%-ной концентрации.
4. Сенсибилизацию формалинизированных 3% эритроцитов проводят на водяной бане при 70°С в течение 30 мин, помешивая. За 10 мин до конца добавляют 1% 40%-ного р-ра формальдегида. Отмывают трехкратно буферным р-ром путем центрифугирования и ресуспендируют до 3%-ной концентрации.
Описание метода
При формалинизации эритроцитов используют свежую дефибринированную кровь барана-донора, которую разводят 1:1 буферным физиологическим раствором рН 7,2 (0,137М NaCl и 0,001 М двузамещенный фосфорно-кислый калий на 1 л дистиллированной воды). Фиксацию эритроцитов проводят по методу Фили в модификации Красикова А.П.
К 100 мл 50% взвеси эритроцитов барана добавляют 20%-ный раствор формальдегида порциями в возрастающих объемах, через каждые 15 минут: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. После каждого внесения смесь перемешивают на водяной бане при 70°С до получения темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов четырехкратно отмывают фосфатно-буферным раствором рН 7,2 путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 2-5 мин и ресуспендируют в 400 мл того же буфера. Из осадка готовят 10% рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе, содержащем 0,3% двадцатипроцентного раствора формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты сохраняют свои сорбционные свойства в течение 5 лет.
В качестве сенситинов используют корпускулярные антигены микоплазм (М.hyosynoviae, М.hyorhinis и Ureaplasma sp.). Микоплазмы выращивают на трех жидких питательных средах: среда для индикации глюкозоферментирующих микоплазм, аргининзависимых микоплазм и уреаплазм, разработанных Омским НИИ природно-очаговых инфекций совместно с ИВМ ОмГАУ, описанных Н.Н. Новиковой (Новикова Н.Н. Экспресс-методы диагностики ассоциативного микоплазмоза плотоядных: дис. … канд. ветеринар. наук: 16.00.03 / Новосибирск, 2002. С.37-55).
Культуры микоплазм освобождают от питательных сред путем центрифугирования при 6000 об/мин в течение одного часа. Осадки трех культур после трехкратного ресуспендирования и последующего центрифугирования смешивают в равных количествах и разводят 1:10 физиологическим раствором. Полученный антигенный препарат прогревают на водяной бане при 70°С в течение 30 мин и используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов.
Для нагрузки формалинизированных 3% эритроцитов их сенсибилизируют в соотношении 2:1 (2V антигена: 1V эритроцитов). Сенсибилизацию проводят на водяной бане при температуре 70°С в течение 30 мин при перемешивании взвеси через каждые 5 минут. За 10 минут до конца сенсибилизации для закрепления сенситина на эритроцитах добавляют 1% сорокапроцентного раствора формальдегида.
Эритроциты, нагруженные антигеном, трехкратно отмывают от несвязавшихся сенситинов фосфатно-буферным солевым раствором с рН 7,2 путем центрифугирования при 3000 об/мин, ресуспендируют в этом же растворе, доводя до первоначальной 3% концентрации, и используют для постановки РНГА макрометодом в объеме 0,5 мл на полистироловых планшетах.
Испытуемые сыворотки после освобождения от неспецифических гемагглютининов путем инактивации в течение 20 мин при 56°С, разводят в двукратной последовательности фосфатно-буферным раствором (рН 6,4), начиная с 1:10. К каждому разведению добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, тщательно перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 1,5-2 часа. Реакция оценивается по четырехкрестной системе. Конечным титром считают последнее разведение сыворотки, дающее гемагглютинацию на три креста.
Определены специфичность и активность четырех серий (С-1 - С-4) микоплазмозного эритроцитарного диагностикума (МЭД) в РНГА (табл.2, 3).
Преимущество данного эритроцитарного диагностикума в специфичности и активности в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при микоплазмозе свиней.
Контроль на специфичность МЭД в РНГА
Для контроля специфичности полученных серий микоплазмозных эритроцитарных диагностикумов ставят РНГА с гетерологичными сыворотками. МЭД в РНГА не вызывает перекрестных реакций с бруцеллезной, пастереллезной, лептоспирозной, листериозной, сальмонеллезной и хламидиозной гетерологичными сыворотками, во всех разведениях РНГА отрицательная при четко выраженных положительных реакциях с гомологичными микоплазмозными сыворотками. Поэтому за диагностический (патологический) титр принимается разведение сыворотки 1:10 и выше (табл.2).
Таблица. 2.Специфичность МЭД в РНГА
МЭД
Стандартные диагностические сыворотки
Микоплазмозные сыворотки
Г
А
У
бруц.
паст.
лепт.
лист.
сальм.
хлам.
1/10
1/10
1/10
С-1
-
-
-
-
-
-
++++
++++
++++
С-2
-
-
-
-
-
-
++++
++++
++++
C-3
-
-
-
-
-
-
++++
++++
++++
С-4
-
-
-
-
-
-
++++
++++
++++
Примечание: бруц. - бруцеллезная; паст. - пастереллезная, лепт. - лептоспирозная; лист. - листериозная; сальм. - сальмонеллезная; хлам. - хламидиозная; Г - глюкозоферментирующая - M.hyorhinis, А - аргининферментирующая - M.hyosynoviae, У - Ureaplasma sp.
Контроль на активность МЭД в РНГА
Для контроля активности полученного эритроцитарного диагностикума проводят постановку РНГА. Реакцию ставят макрометодом, в объеме 0,5 мл в полистироловых пластинках, с микоплазмозными (Г, А, У-сыворотками) и смешанной (Г+А+У) микоплазмозными сыворотками в разведениях с 1:10 до 1:640. В качестве разбавителя применяют фосфатный буфер с рН 6,4, так как при разведении исследуемой сыворотки этим буфером результаты реакции более демонстративны, чем при применении физиологического раствора. В качестве контроля используют фосфатный буферный раствор (ФБР) рН 6,4 и заведомо отрицательные и положительные на микоплазмоз сыворотки: свиней в разведениях 1:25-1:1600 и кроликов в разведениях 1:10-1:640.
С микоплазмозными сыворотками по отдельности и со смешанной сывороткой против трех видов микоплазм полученный диагностикум реагирует на три креста до разведения 1:160, на два креста 1:320. С отрицательной сывороткой отмечается четко выраженная отрицательная реакция во всех разведениях. В контроле с буферным раствором отрицательная реакция наблюдается во всех разведениях (табл.3).
Таблица 3.
Активность (МЭД) в РИГА
Титр сыворотки
Микоплазмозные кроличьи сыворотки
Г+А+У сыворотка
Свиные микоплазмозные сыворотки
ФБР
Титр сыв-ки
Позитивная
Негативная
Г
А
У
1:10
++++
++++
++++
++++
1:25
++++
-
-
1:20
++++
++++
++++
++++
1:50
++++
-
-
1:40
++++
++++
++++
++++
1:100
++++
-
-
1:80
+++
+++
+++
+++
1:200
+++
-
-
1:160
+++
+++
+++
+++
1:400
+++
-
-
1:320
++
++
++
++
1:800
++
-
-
1:640
-
-
-
-
1:1600
-
-
-
Примечание: Г - глюкозоферментирующая - M.hyorhinis, A - аргининферментирующая - M.hyosynoviae, У - Ureaplasma sp.; ФБР - фосфатный буферный раствор рН 6,4.