СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЧЕРЕПНО-МОЗГОВОЙ ТРАВМЫ
METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CRANIOCEREBRAL INJURY

Согласно настоящей патентной заявке испрашивается преимущество приоритета по предварительной заявке на патент США с серийным номером 62/242457, поданной 16 октября 2015 года, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей полноте.
Уровень техники настоящего изобретения
Черепно-мозговая травма (TBI) возникает, когда внешняя механическая сила вызывает дисфункцию головного мозга.
Черепно-мозговая травма обычно является результатом сильного удара или сотрясения головы или тела. Объект, проникающий в череп, такой как пуля или отколотый кусок черепа, также может вызывать черепно-мозговую травму.
TBI (черепно-мозговая травма) была названа характерным повреждением в современных военных действиях. В обзоре от компании Rand Corporation, опубликованном в 2008 году, оценивается, что не менее 19,5% военных, которые были развернуты в Ираке или Афганистане, подверглись воздействию TBI (RAND; Reports and Bookstore; Research Briefs; RB-9336; Invisible Wounds: Mental Health and Cognitive Care Needs of America's Returning Veterans). По оценке Центра психологической помощи и лечения черепно-мозговых травм (The Defense Centers of Excellence for Psychological Health and Traumatic Brain Injury (DCOE)) 1,7 миллиона людей в год страдают от TBI, и сообщается о том, что почти у 25000 военных за последний год было диагностировано новое TBI (dcoe с дополнением из .health.mil из сети Интернет).
Черепно-мозговая травма может быть вызвана рядом поражающих воздействий. Во время операций в Юго-Восточной Азии подавляющее большинство случаев легкой TBI (mTBI) были вызваны воздействием взрыва. mTBI может вызывать временную дисфункцию клеток головного мозга. Более серьезное травматическое повреждение головного мозга может приводить в результате к ушибу, разрыву тканей, кровотечению и иному физическому повреждению головного мозга, результатом которых являются длительные осложнения или смерть.
Сотрясение мозга представляет собой тип черепно-мозговой травмы, которая вызвана ударом в голову или тело, падением или другим повреждением, которое сотрясает или встряхивает головной мозг внутри черепа. Симптомы сотрясения варьируют от легкого до тяжелого и могут продолжаться в течение периода порядка часов, суток, недель или даже месяцев. Повторяющиеся сотрясения или тяжелое сотрясение мозга может приводить к долговременным проблемам с моторикой, обучением или речью. Покой в сочетании с приемом ацетаминофена для облегчения любой головной боли в настоящее время считается наиболее подходящим подходом для обеспечения возможности восстановления головного мозга после сотрясения.
Несмотря на то что последствия серьезного повреждения мозга изучались в течение многих лет и являются относительно хорошо изученными, последствия вызванной взрывом или сотрясением мозга mTBI требуют более глубокого понимания. Современная литература говорит о том, что большинство симптомов являются нейросенсорными по своей природе (Hoffer et al. Otol Neurotol. 2010 31(2):232-6; Hoffer et al. PLoS ONE 2013 8(1): e54163. doi:10.1371/journal.pone.0054163). Головокружение, потеря слуха, головные боли и нейрокогнитивная дисфункция являются частыми последствиями, и, несмотря на то что они разрешаются со временем у определенной части популяции, они сохраняются и могут ухудшаться у многих индивидов (Hoffer et al. Otol Neurotol. 2010 31(2):232-6). Более того, появляется масса литературы, где высказывается предположение, что со временем mTBI, являющаяся последствием воздействия взрыва, может проявлять характеристики, которые говорят о наличии нейродегенеративных нарушений у этих пациентов (Woods et al. ACS Chem. Neurosci. 2013 Epub ahead of press. DOI: 10.1021/cn300216h).
С учетом роли рецепторов N-метил-О-аспартата (NMDA), а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионата (AMPA) и каинита в неврологическом повреждении, научно-исследовательские работы сфокусировались на применении антагонистов этих рецепторов для препятствования опосредованному рецептором истечению кальция, приводящему к гибели клеток и некрозу.
Некоторые из исследований в отношении этих антагонистов сфокусировались на каннабиноидах, подгруппа которых является антагонистами рецептора NMDA. См., например, патенты США №№5538993, 5521215 и 5284867.
Тем не менее, антагонист рецептора NMDA дексанабинол исследовали в клинических испытаниях в фазе II и фазе III (Shohami Е & Biegon A. CNS Neurol Disord Drug Targets. 2014; 13(4):567-73). Из предыдущих исследований дексанабинола для применения в лечении сотрясения мозга одно исследование показало, что он снижал внутричерепное давление. Тем не менее, другие исследования оказались в лучшем случае неубедительными и выявили, что он не ингибировал глиоз и дальнейший каскад иммунных реакций. Исследованиям оказались неспособны предоставить достаточные основания для применения дексаканабиола в качестве единственного средства для лечения сотрясения мозга.
В патенте США №6630597 предлагается применение каннабиноидов с практически отсутствующем связыванием с рецептором NMDA в качестве нейропротектора.
Каннабиноиды в качестве возможного лечебного средства для сотрясений мозга также были раскрыты в Shohami et al. (Journal of Neurotrauma 2009, 10(2): 109-119. doi:10.1089/neu.l993.10.109); Fernandez-Ruiz et al. (Handb Exp Pharmacol. 2015;231:233-59) и Pryce et al. (Handb Exp Pharmacol. 2015;231:213-31)
Каннабиноидный рецептор CB2 также был раскрыт как мишень для зависимой от воспаления нейродегенерации (Ashton JC & Glass М. Current Neuropharmacology. 2007;5(2):73-80).
В последнее время изучалось лечение прогестероном в качестве возможного средства для улучшения когнитивных результатов при TBI (Si et al. Neurosci Lett. 2013 Aug 14. pii: S0304-3940(13)00714-3. doi: 10.1016/j.neulet.2013.07.052; Baykara et al. Biotech Histochem. 2013 Jul; 88(5):250-7. doi: 10.3109/10520295.2013.769630; и Meffre et al. Neuroscience. 2013 Feb 12; 231:111-24. dl0.1016/j.neuroscience. 2012.11.039).
Необходимой является идентификация терапевтических средств и способов их применения в предупреждении или лечении нейросенсорных нарушений, ассоциированных с mTBI, вызванной воздействием взрыва или сотрясением мозга.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения черепно-мозговой травмы у субъекта.
Аспект настоящего изобретения относится к способу лечения черепно-мозговой травмы у субъекта, который предусматривает введение субъекту первой композиции, содержащей антагонист рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA), и второй композиции, содержащей противовоспалительное средство, способное к пересечению гематоэнцефалического барьера.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу лечения черепно-мозговой травмы у субъекта, который предусматривает введение субъекту первой композиции, содержащей антагонист рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA), и второй композиции, содержащей агонист СВ2, средство, которое эффективно повышает уровень эндогенного агониста СВ2, и/или средство, которое модифицирует уровни анандамида (АЕА) или 2-арахидоноилглицерола (2-AG).
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления первая вводимая композиция содержит 1,1-диметилгептил-7-гидрокси-дельта-6-тетрагидроканнабинол.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления вторая композиция содержит не относящийся к каннабиноидам агонист СВ2.
В соответствии с другим неограничивающим вариантом осуществления вторая композиция содержит каннабиноидный агонист СВ2, который также связывается с рецептором NMDA.
В соответствии с другим неограничивающим вариантом осуществления вторая композиция содержит средство, которое повышает уровни АЕА.
В соответствии с другим неограничивающим вариантом осуществления вторая композиция содержит средство, которое снижает уровни 2-AG.
В соответствии с еще одним неограничивающим вариантом осуществления вторая композиция содержит ингибитор амидгидролазы жирных кислот.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления черепно-мозговая травма, лечение которой осуществляют, представляет собой сотрясение мозга.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к композициям для лечения черепно-мозговой травмы. В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления композиция содержит антагонист рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA) и противовоспалительное средство, способное к пересечению гематоэнцефалического барьера. В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления композиция содержит антагонист рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA) и агонист СВ2, средство, которое эффективно повышает уровень эндогенного агониста СВ2, и/или средство, которое модифицирует уровни анандамида (АЕА) или 2-арахидоноилглицерола (2-AG).
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение предполагает способы лечения черепно-мозговой травмы у субъекта. В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления черепно-мозговая травма, лечение которой осуществляют, представляет собой сотрясение мозга.
Способы согласно настоящему изобретению предусматривают введение субъекту, страдающему от черепно-мозговой травмы, первой композиции, содержащей антагонист рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA).
Подразумевается, что термин «антагонист рецептора NMDA» в контексте данного документа включает в себя класс средств, которые работают, противодействуя или ингибируя действие рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA). Примеры включают в себя, без ограничения, дизоцилпин(MK-801), кетамин, мемантин, фенциклидин, гасциклидин, АР5, амантадин, ибогаин, оксид азота, рилузол, декстрорфан, АР-7, тилетамин, мидафотель, аптиганель и 1,1-диметилгептил-7-гидрокси-дельта-6-тетрагидроканнабинол (дексанабинол: HU-211). В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления антагонист рецептора NMDA представляет собой неконкурентный антагонист рецептора NMDA, такой как дексанабинол, GK-11, или гасциклидин, или фенциклидин, или неконкурентный антагонист рецептора NMDA, такой как дизоцилпин. Дополнительные неограничивающие примеры антагонистов рецептора NMDA, пригодных в настоящем изобретении, раскрыты в патенте США №5521215, материалы из которого включены в данный документ посредством ссылки в своей полноте. В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления антагонист рецептора NMDA представляет собой 1,1-диметилгептил-7-гидрокси-дельта-6-тетрагидроканнабинол (дексанабинол: HU-211).
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления первую композицию вводят согласно схеме, эффективной для ингибирования отека, который возникает в результате черепно-мозговой травмы.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления первую композицию вводят в пределах 12 часов после черепно-мозговой травмы, или, в качестве альтернативы, в пределах 6 часов после черепно-мозговой травмы, или, в качестве альтернативы, в пределах 3 часов после черепно-мозговой травмы. В соответствии с этими вариантами осуществления первую композицию можно вводить в виде одной дозы или в виде нескольких доз.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления несколько доз первой композиции вводят в течение 72-часового периода после черепно-мозговой травмы.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления первую композицию вводят ежесуточно или каждые вторые сутки до тех пор, пока симптомы черепно-мозговой травмы не будут ослаблены.
Первую композицию можно вводить посредством любого пути, обеспечивающего доставку эффективных количеств антагониста рецептора NMDA в головной мозг. Примеры путей введения включают в себя внутривенный, интраназальный, пероральный, местный, трансдермальный путь или введение посредством ингаляции, но никоим образом не ограничиваются ими.
Как будет понятно специалисту после изучения настоящего раскрытия, дозировки могут быть определены лечащим врачом на основании степени повреждения, подлежащего лечению, способа введения, возраста, массы тела пациента, противопоказаний и т.п. Неограничивающие примеры дозировок включают в себя одну i.v. (внутривенную) дозу, составляющую 150 мг или более, а также дозы в диапазоне от 0,05 мг до приблизительно 50 мг на кг массы тела по схеме 1-4 раза в сутки или через сутки.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления способ согласно настоящему изобретению дополнительно предусматривает введение субъекту второй композиции, содержащей противовоспалительное средство, способное к пересечению гематоэнцефалического барьера. Противовоспалительное средство можно вводить в соответствии с любой схемой дозирования, эффективной для ингибирования воспаления головного мозга, являющегося результатом травматического повреждения. Противовоспалительное средство можно вводить до, одновременно или после введения антагониста рецептора NMDA.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления способ согласно настоящему изобретению дополнительно предусматривает введение субъекту второй композиции, содержащей агонист СВ2, средство, которое эффективно повышает уровень эндогенного агониста СВ2, и/или средство, которое модифицирует уровни анандамида (АЕА) или 2-арахидоноилглицерола (2-AG).
Предполагается, что термин «агонист СВ2» в контексте данного документа включает в себя классы средств, которые активируют каннабиноидный рецептор 2 селективным или неселективным образом. В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления агонист СВ2 представляет собой не относящийся к каннабиноидам агонист СВ2. В соответствии с другим неограничивающим вариантом осуществления агонист СВ2 представляет собой каннабиноидный агонист СВ2, который также связывается с рецептором NMDA.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления вторая композиция содержит каннабидиол (CBD), химическое соединение, встречающееся в естественных условиях в определенных сортах конопли. CBD не обладает психоактивным эффектом. CBD действует в качестве агониста СВ-2 и обеспечивает широкий спектр противовоспалительных и подавляющих иммунные реакции эффектов.
В качестве альтернативы или дополнения, вторая композиция может содержать средство, которое эффективно повышает уровень эндогенного агониста СВ2, и/или средство, которое модифицирует уровни анандамида (АЕА) или 2-арахидоноилглицерола (2-AG). В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления вторая композиция содержит средство, которое повышает уровни АЕА. В соответствии с другим неограничивающим вариантом осуществления вторая композиция содержит средство, которое снижает уровни 2-AG. В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления вторая композиция содержит ингибитор амидгидролазы жирных кислот. В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления вторая композиция содержит АЕА.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления вторую композицию вводят согласно схеме, эффективной для ингибирования глиоза, который возникает в результате черепно-мозговой травмы.
Вторую композицию можно вводить до, одновременно или после введения первой композиции.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления первую и вторую композиции составляют вместе в одну композицию, содержащую оба терапевтических средства.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления вторую композицию вводят спустя 12-72 часа после черепно-мозговой травмы.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления вторую композицию вводят в пределах 12 часов после черепно-мозговой травмы, или, в качестве альтернативы, в пределах 6 часов после черепно-мозговой травмы, или, в качестве альтернативы, в пределах 3 часов после черепно-мозговой травмы. В соответствии с этими вариантами осуществления вторую композицию можно вводить в виде одной дозы или в виде нескольких доз.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления вторую композицию вводят с первой композицией в виде одной композиции в пределах 12 часов после черепно-мозговой травмы, или, в качестве альтернативы, в пределах 6 часов после черепно-мозговой травмы, или, в качестве альтернативы, в пределах 3 часов после черепно-мозговой травмы. В соответствии с этими вариантами осуществления композицию, содержащую первую и вторую композиции, можно вводить в виде одной дозы или в виде нескольких доз.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления вторую композицию вводят ежесуточно в течение периода вплоть до 7 суток после черепно-мозговой травмы.
В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления вторую композицию вводят ежесуточно или через сутки до тех пор, пока симптомы черепно-мозговой травмы не будут ослаблены.
Вторую композицию можно вводить посредством любого пути, обеспечивающего доставку в головной мозг эффективных количеств агониста СВ2, средства, которое эффективно повышает уровень эндогенного агониста СВ2, и/или средства, которое модифицирует уровни анандамида (АЕА) или 2-арахидоноилглицерола (2-AG). Примеры путей введения включают в себя внутривенный, интраназальный, пероральный, местный, трансдермальный путь или введение посредством ингаляции, но никоим образом не ограничиваются ими.
Как будет понятно специалисту после изучения настоящего раскрытия, дозировки могут быть определены лечащим врачом на основании степени повреждения, подлежащего лечению, способа введения, возраста, массы тела пациента, противопоказаний и т.п.
Также предполагаются фармацевтические композиции для лечения черепно-мозговой травмы. В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления композиция содержит антагонист рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA) и противовоспалительное средство, способное к пересечению гематоэнцефалического барьера, а также фармацевтически приемлемую среду. В соответствии с одним неограничивающим вариантом осуществления фармацевтическая композиция содержит антагонист рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA) и агонист СВ2, средство, которое эффективно повышает уровень эндогенного агониста СВ2, и/или средство, которое модифицирует уровни анандамида (АЕА) или 2-арахидоноилглицерола (2-AG), а также фармацевтически приемлемую среду.
В контексте данного документа «фармацевтически приемлемая среда» включает в себя любые и все растворители, вспомогательные вещества, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотоничные средства и средства, задерживающие абсорбцию, и т.п., которые являются совместимыми с активностью терапевтических композиций и являются физиологически приемлемыми для субъекта. Примером фармацевтически приемлемой среды является буферный нормальный солевой раствор (0,15 М NaCl). Применение таких сред и средств для фармацевтически активных веществ хорошо известно в уровне техники. За исключением тех случаев, когда любая общепринятая среда или средство являются несовместимыми с терапевтической композицией, предусматривается их применение в композициях, подходящих для фармацевтического введения. В композиции также могут быть включены дополнительные активные соединения.
Дисперсии, содержащие терапевтические композиции, могут быть приготовлены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях, а также в маслах. При обычных условиях хранения и применения эти препараты могут содержать консервант для предотвращения роста микроорганизмов.
Фармацевтические композиции, подходящие для применения в виде инъекционного раствора, включают в себя стерильные водные растворы (в случае, когда они являются водорастворимыми) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий непосредственно перед введением. Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть текучей настолько, насколько это обеспечивает возможность легкого введения с помощью шприца. Она должна быть стабильной при условиях производства и хранения и должна быть защищена от контаминирующего воздействия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Среда может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), их подходящие смеси, а также масла (например, растительное масло). Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, посредством применения покрытия, такого как лецитин, посредством поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и посредством применения поверхностно-активных веществ.
Стерильные инъекционные растворы можно приготовить путем включения терапевтических композиций в требуемом количестве в соответствующий растворитель с одним из вышеперечисленных ингредиентов или их комбинацией, если они необходимы, с последующей стерилизацией с помощью фильтрования. Обычно дисперсии готовят путем включения терапевтических композиций в стерильную среду, которая содержит основную дисперсионную среду и необходимые другие ингредиенты из числа перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и сублимационная сушка, которые дают на выходе порошок активного ингредиента (т.е. терапевтического соединения), а также, необязательно, любого дополнительного желаемого ингредиента из их раствора, ранее подвергнутого стерилизации фильтрованием.
Твердые лекарственные формы для перорального введения включают в себя капсулы для приема вовнутрь, таблетки, пилюли, леденцы, порошки, гранулы, эликсиры, суспензии, сиропы, облатки, буккальные таблетки, пастилки и т.п.В таких твердых лекарственных формах активные соединения смешаны по меньшей мере с одним инертным фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом или разбавителем или с ассимилируемой съедобной средой, такой как цитрат натрия или фосфат дикальция, и/или а) с наполнителями или сухими разбавителями, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота, b) связующими, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и камедь, с) увлажнителями, такими как глицерин, d) разрыхлителями, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, определенные силикаты и карбонат натрия, е) средствами для замедления растворения, такими как парафин, f) ускорителями всасывания, такими как соединения четвертичного аммония, g) смачивающие средства, такие как, например, цетиловый спирт и глицеринмоностеарат, h) абсорбенты, такие как каолиновая и бентонитовая глина, и i) смазывающие средства, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смеси, или они могут быть включены непосредственно в рацион субъекта. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственная форма также может содержать буферные средства. Твердые композиции подобного типа также могут использоваться в качестве наполнителей в мягких и твердых заполняемых желатиновых капсулах с применением таких вспомогательных веществ, как лактоза или молочный сахар, а также высокомолекулярные полиэтиленгликоли и т.п. Процентное содержание терапевтических соединений в композициях и препаратах, естественно, может варьировать. Количество терапевтических соединений в таких терапевтически полезных композициях является таким, чтобы достигалась подходящая дозировка.
Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают в себя фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Дополнительно к активным соединениям жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно применяемые в уровне техники, такие как, например, вода или другие растворители, солюбилизирующие средства и эмульгаторы, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое масло, масло из зародышей кукурузы, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана, а также их смеси. Помимо инертных разбавителей пероральные композиции также могут включать в себя вспомогательные средства, такие как смачивающие средства, эмульгирующие и суспендирующие средства, подсластители, вкусоароматические и душистые средства.
Суспензии дополнительно к активным соединениям могут содержать суспендирующие средства, такие как, например, этоксилированные изостеариловые спирты, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбита и сорбитана, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакантовая камедь, а также их смеси.
Фармацевтические композиции терапевтических соединений также можно вводить в форме с немедленным высвобождением или депо-форме для получения пролонгированного высвобождения терапевтических соединений со временем. Терапевтические соединения согласно настоящему изобретению также можно вводить трансдермально (например, посредством обеспечения терапевтического соединения с подходящей средой в виде пластыря).
Сотрясение мозга вызывает повреждение головного мозга на разных этапах. На первом присутствует первоначальное воздействие, которое вызывает повреждение ткани. На втором ткань головного мозга начинает отекать вследствие воспаления, приводя в результате к повышению внутричерепного давления. Поскольку головной мозг представляет собой ограниченную область, окруженную черепом, по мере того как головной мозг увеличивается в объеме при воспалении, он давит на череп с повышением давления, и это вызывает обширное дополнительное повреждение. Это воспаление начинается в течение первых нескольких часов после первоначального повреждения. Третья волна повреждения возникает в результате процесса, получившего название глиоз, который начинается в пределах 6-12 часов после первоначального повреждения, когда в ткани головного мозга происходит каскад иммунных реакций, вызывая инфильтрацию лейкоцитов (лейкоцитарная и макрофагальная инфильтрация) и высвобождение цитокинов. Этот каскад иммунных реакций сам по себе является причиной обширного повреждения ткани.
За счет воздействия на два разных рецептора в этом процессе комбинированные терапевтические средства согласно настоящему изобретению, как ожидается, предупреждают воспаление и ингибируют глиоз и ассоциированный каскад иммунных реакций, таким образом обеспечивая полезный метод терапии для сотрясения мозга, а также другой черепно-мозговой травмы.
Следующие неограничивающие примеры представлены для дополнительной иллюстрации настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Исследования на грызунах
Способность комбинированного терапевтического средства, содержащего выбранный антагонист NMDA дексанабинол (также известный как HU 211) и агонист СВ2 каннабидиол (CBD) (комбинированное терапевтическое средство называется в данном документе SP-обработкой), к снижению нейросенсорных последствий вызванной воздействием взрыва или сотрясением мозга mTBI по сравнению с плацебо (без обработки) подтверждают в модели на мелких грызунах. Эти исследования наглядно демонстрируют способность этого комбинированного терапевтического средства к снижению повреждения головного мозга, органов слуха и органов равновесия вызванной воздействием взрыва mTBI в модели на мелких грызунах по сравнению с плацебо, когда лекарственный препарат вводят после воздействия взрыва или сотрясения мозга. Кроме того, идентифицируют гистологические различия у животных, получавших SP-обработку, в сравнении с необработанными животными. Также оценивают любое отличие в липодемических характеристиках у животных, получавших SP-обработку, в сравнении с необработанными животными.
Присутствует 8 первоначальных групп обработки с 15 крысами на группу/модель TBI. Три модели TBI представляют собой воздействие взрыва (BLAST), модель закрытой травмы черепа с использованием падающего груза (CHI) и модель повреждения под действием давления жидкости (FPI). Группы представляют собой следующие: группа А (только SP), группа В (только среда), группа С (воздействие взрыва + SP), группа D (воздействие взрыва + среда), группа Е (CHI + SP), группа F (CHI + среда), группа G (FPI + SP) и группа Н (FPI + среда). Использование 15 крыс на группу обеспечивает возможность оценки краткосрочных и долгосрочных результатов. Все группы будут подвергаться поведенческому тестированию в отношении сенсомоторной, когнитивной функции и функции кратковременной памяти, тестированию слуха и равновесия до воздействия и через 3 и 7 суток после воздействия. Треть животных в каждой группе будут умерщвлять через семь суток (5 на группу) и будут подвергать макроскопическому исследованию и ряду гистохимических тестов. Вторую группу из пяти животных будут подвергать поведенческому тестированию и тестированию слуха в День 14, 21 и 31 до умерщвления в День 31, в этот момент их подвергнут такому же окончательному анализу, что и животных, умерщвленных через семь суток. Последние пять животных будут составлять группу для долговременного исследования и будут подвергаться тестам поведенческой и слуховой функции в День 3, День 7, День 31, День 61 и День 91, в этот момент их подвергнут умерщвлению для такого же гистологического анализа, что и первую и вторую группы в соответствующие моменты времени.
Пример 2. Модель с воздействием взрыва (BLAST)
Воздействия взрывной волной на грызунов в трубе. Система с генератором ударных волн состоит из трехфутовой компрессионной трубы, которая создает герметизированное соединение при выравнивании с одной конденсирующей трубой длиной 12 футов и внутренним диаметром 8 дюймов. Воздух в компрессионную трубу нагнетают с помощью промышленного компрессора. Гидравлическое исполнительное устройство придавливает скользящую часть конденсирующей трубы к компрессионной трубе через пластиковую пленку, герметизируя компрессионную трубу. Система работает удаленно для создания в компрессионной камере выбранного давления, перемещая новую пленку на место, закрытия конденсирующей трубы компрессионной трубой с созданием воздухонепроницаемого уплотнения неразорванной пленкой, активацией внутреннего сердечника для разрыва пленки при выбранных давлениях и перемещения новой неразорванной пленки на место для следующего события взрыва. На выходе из трубы создается сверхзвуковая волна типа Фридландера с избыточным давлением/пониженным давлением, которая имитирует ударную волну в результате детонаций взрывчатых веществ. Могут создаваться силы избыточного давления от 2 фунтов на квадратный дюйм (фунт/кв. дюйм) или 14,5 килопаскалей (кПа) до >50 фунтов/кв. дюйм (0,35 мегапаскаля). Величины воздействия в случае исследований с одним воздействием избыточного давления при взрыве (ВОР) будут находиться в диапазоне от 10 до 20 фунтов/кв. дюйм (в зависимости от первоначальных реакций, которые определены на животных при отработке методики). Всех животных будут подвергать анестезии и помещать в трубу для удерживания животного, вставленную и закрепленную внутри конденсирующей трубы на расстоянии одного фута от ее конца. Труба для удерживания животного располагает животное таким образом, чтобы дорсальная поверхность головы крысы была направлена к приближающейся ударной волне. Субъекты будут располагаться в 10 футах от пленочной диафрагмы на трубе и будут принимать волну ВОР в ориентации головой вперед. Труба для удерживания обеспечивает возможность подачи газа изофлурана к животному для индукции анестезии, обеспечивая воздействия на живых, но находящихся под действием анестезии животных. Волны ВОР будут подвергаться измерению, и будут показаны пиковые интенсивности, время возникновения и продолжительности волны ВОР с использованием прибора Pacific Instruments 6000 DAQ с каналами в количестве до 32 со скоростью записи по каждому из них 250 кГц вместе с измерительными датчиками давления Dytran, рассчитанными на измерение в диапазоне 0-50 фунтов/кв. дюйм и электронными формирователями сигнала, связанными с компьютерами посредством интерфейса. Воздействие будет состоять из подвергнутых анестезии животных, получающих воздействие одной взрывной волной. В первоначальных исследованиях оцениваются эффекты одного воздействия давлением 10-20 фунтов/кв. дюйм (волна Фридландера с последовательностью избыточное давление-пониженное давление), которое, как было показано, демонстрирует патологические эффекты (см. Balaban et al J Neurosci Methods 2016 pii: SO 165-0270(16)00053-4. doi: 10.1016/j.jneumeth.2016.02.001. Epub ahead of print).
Пример 3. Модель закрытой травмы черепа (CHI)
2
2
Крыс подвергают легкой TBI (mTBI) с помощью способов, ранее описанных Foda и Marmarou (J Neurosurg. 1994 80(2):301-13). В частности, самцов крыс линии Спраг-Доули подвергают анестезии 3% изофлураном, 70% NO и 30% О под стеклянным колпаком до тех пор, пока не будет реакции на щипок лапы или хвоста. После первоначальной анестезии животных поддерживают в анестезии с помощью носового конуса с поддерживающей дозой 1-2,5%. Стерильное смазывающее средство для глаз используют для того, чтобы глаза не высыхали в течение хирургической операции. Голову животного бреют и протирают хлоргексидином. Выполняют надрез для получения доступа к черепу. Стальной диск (диаметром 10 мм и толщиной 3 мм) прикрепляют к черепу между брегмой и линиями лямбдовидного шва с использованием стоматологической акриловой смолы. Животных затем перемещают на матрас из вспененного материала (пенополиуретан типа Е) под устройство для нанесения травмы. Грузу массой 450 граммов позволяют свободно упасть по вертикальной трубе с высоты 1 метр. Температуру тела отслеживают с использованием ректального зонда для измерения температуры и температуру височной мышцы отслеживают в качестве косвенного измерения температуры головного мозга. Контрольные животные будут подвергаться всем хирургическим процедурам, но их не подвергают травме головного мозга. После нанесения повреждения животным накладывают швы и возвращают их в клетки, где они содержатся, и дают им корм и воду в неограниченном количестве. Если животное испытывает трудности в употреблении пищи после нанесения повреждения, это животное умерщвляют. Животные имеют катетер в хвостовой артерии, введенный перед нанесением повреждения головного мозга и после травмы головного мозга животных подвергают интубации и им вводят рокуроний или панкуроний в качестве паралитического средства.
Пример 4. Модель повреждения ударным воздействием жидкости (PFI)
Крыс линии Спраг-Доули подвергают анестезии с использованием 3% изофлурана для индукции анестезии в изготовленной по специальному заказу камере для анестезии. Щипок за палец задней конечности выполняют для того, чтобы убедиться, что животные находятся под надлежащей анестезией. Частоту дыхательных движений животных оценивают визуально. Изофлурановую анестезию затем поддерживают с помощью носового конуса и колпак для нанесения повреждения помещают на открытую твердую мозговую оболочку следующим образом: голову крысы бреют и протирают раствором хлоргексидина; затем крысу помещают в стереотаксическую рамку и кожу головы разрезают хирургически; парасагитальную краниотомию (4,8 мм) с использованием трефина осуществляют в 3,8 мм позади брегмы и в 2,5 мм кбоку от срединной линии; стерильную пластиковую трубку для нанесения повреждения(пластиковый коннектор стерильной иглы, обрезанный до длины 1 см, и с кромкой, срезанной для идеального заполнения области краниотомии) затем помещают над открытой твердой мозговой оболочкой и соединяют при помощи цианоактилатного клея с черепом; стоматологическую акриловую смолу затем наливают вокруг трубки для нанесения повреждения для получения полной герметичности; после того как акриловая смола затвердела, трубку для нанесения повреждения закупоривают стерильной губкой на основе вспененного геля или адаптером с насадкой Люэра, кожу головы прикрепляют скобами/швами на место; животных выводят из анестезии и возвращают в клетки, в которых они содержались.
Через двадцать четыре часа после предшествующей подготовки крыс подвергают анестезии с использованием 3% изофлурана с помощью изготовленной по специальному заказу камеры для анестезии и щипок за палец задней конечности используют для определения уровня анестезии. Животное помещают на стол и анестезирующее средство вводят через носовой конус, пока вводят катетеры и животных интубируют. Катетер вводят в правую бедренную артерию в случае животных, не подвергающихся поведенческому тестированию, или в хвостовую артерию в случае животных, подвергающихся поведенческому тестированию, для отслеживания артериального кровяного давления и концентрации газов в крови. Температуру головного мозга косвенно измеряют с помощью терморезистора, помещенного в левую височную мышцу и поддерживаемого на нормотермическом уровне (37°С) перед TBI и после него. Ректальную температуру также поддерживают на нормотермических уровнях. После интубации животное соединяют с аппаратом искусственной вентиляции легких и вентилируют 0,5-1% изофлураном в смеси из 70% закиси азота и 30% кислорода. Животное парализуют с использованием рокурония для механической вентиляции с целью поддержания концентраций газов в артериальной крови в нормальных пределах. Устройство для осуществления ударного воздействия жидкостью (F-P) состоит из цилиндрического резервуара из плексигласа, соединенного на одном конце покрытым резиной плексигласовым поршнем с противоположным концом, оборудованным корпусом датчика давления и центральным винтом для нанесения повреждения, адаптированным к черепу крысы. Всю систему заполняют изотоничным солевым раствором температурой 37°С. Аспетический металлический винт для нанесения повреждения затем плотно соединен с пластиковой трубкой для нанесения повреждения у интубированной и находящейся под анестезией крысы. Повреждение индуцируется падением металлического маятника, ударяющего по поршню, в результате чего небольшой объем солевого раствора впрыскивается эпидурально в закрытую внутричерепную полость и производит кратковременное (18 мс) смещение нервной ткани. Амплитуда образующегося в результате импульса давления измеряется в атмосферах измерительным датчиком давления и записывается на самопишущей системе PowerLab. Контрольные животные будут подвергаться всем хирургическим процедурам, но их не подвергают F-P имульсу. Будет изучаться легкое (1,4-1,6 атм.) повреждение. После нанесения повреждения катетеры удаляют и разрезы закрывают скобами/швами. Воздействие анестезии прекращают, и животные просыпаются примерно через 30 минут после нанесения повреждения, и их помещают в отдельные клетки с неограниченным обеспечением кормом и водой до завершения исследования.
Пример 5. Содержание после воздействия
Всех животных подвергают мониторингу в отношении частоты дыхательных движений, частоты сердечных сокращений и степени насыщения крови кислородом с использованием прибора от STARR Life Sciences, Corp. и пульсовой оксиметрии до и после воздействия и в течение всего периода восстановления после воздействия. Если у животных проявляются признаки того, что они испытывают крайне сильную боль, или что они могут не восстановиться после воздействия взрыва, ветеринар будет осматривать животное. Животные будут подвергаться тщательному наблюдению в отношении признаков боли, включающих в себя издавание звуков, половое влечение, агрессию, защитное поведение и крайнее возбуждение. Животное может быть умерщвлено или не умерщвлено, исходя из рекомендации ветеринара. Во избежание потенциально возможной болевой реакции кетопрофен будут давать сразу после воздействия взрыва. Оценку боли будут применять, начиная с момента сразу после выхода из-под действия анестезии. Главными оцениваемыми показателями будут: активность, физическое внешнее состояние, издавание звуков, скрежетание зубами, питьевое/пищевое поведение и физические признаки, такие как частота дыхательных движений, частота сердечных сокращений и уровень насыщения кислородом). Если любой из признаков говорит о том, что животное все еще испытывает боль, будут доставляться большие дозы, или, если боль остается некупируемой, животных никогда не будут оставлять испытывающими боль, и ветеринар может принять решение умертвить крысу. Облегчение боли будет производиться в случае, когда это будет необходимо. Сбор данных измеряемых функциональных показателей может быть отложен на следующие сутки, если животные проявляют уровни боли, которые препятствуют проведению тестов. В это время состояние животного будут повторно оценивать, и проведение тестов может быть начато или снова отложено. По завершению измерения функциональных и когнитивных показателей на выживших подвергшихся воздействию взрыва животных, они будут умерщвлены для сбора тканей, жидкостей организма и крови.
Пример 6. Схема дозирования для модели на грызунах
SP вводят в эффективной дозе, составляющей 10 мг/кг CBD и 1 мг/кг HU211, посредством интраперитонеальной (IP) инъекции через 2 часа после воздействия. Введение этой дозы будут повторять ежесуточно в течение дополнительных 7 суток.
Пример 7. Поведенческие тесты в модели на грызунах
Тестирование сенсомоторной функции
Спонтанное использование передней конечности. В этом тесте, описанном Schallert и Lindner (Can J Psychol. 1990 44(2):276-92), оценивается использование передней конечности при произвольной спонтанной активности посредством оценки предрасположенности животных к приведению их передних конечностей к телу при подъеме на задние конечности или стоянии. Осуществляют видеозапись поведения животных в прозрачном пластиковом цилиндре в течение 5 минут. Видеозаписи оценивают в отношении асимметрии использования передних конечностей при вертикальных движениях вдоль стенки цилиндра и при возвращении к опоре на все четыре конечности после подъема на задние конечности: (а) независимое использование левой или правой передней конечности для контактирования со стенкой цилиндра при полном вставании на задние конечности, для начала движения с переносом веса или для возвращения центра тяжести при боковом движении в вертикальной позе вдоль стенки; каждое из возвращения на все четыре конечности после стояния вдоль стенки/движения вдоль стенки и возвращения на все четыре конечности при вставании на пол выражено в виде (а) процента использования ипсилатеральной (функционирование которой не нарушено) передней конечности в сравнении с общим количеством случаев опоры на ипсилатеральную и контралатеральную конечность. При вставании на задние лапы первая конечность, контактирующая со стенкой с явным переносом веса (при этом другая конечность контактирует со стенкой в пределах 0,5 секунды), оценивается как независимый случай опоры этой конечностью на стенку. Соотношение использования конечностей рассчитывают как использование контралатеральной/(использование ипсилатеральной + контралатеральной).
Тестирование когнитивных функций
Анализ когнитивной функции включает оценку определения местоположения в пространстве с использованием водного лабиринта. Эксперименты, которые преимущественно направлены на оценку активности животных в различные моменты времени после TBI (как например, при оценке эффективности терапевтических лечебных средств, предназначенных для уменьшения последствий TBI), преимущественно основываются на парадигме «приобретения навыка», включающей простую задачу по определению местоположения и задачу на кратковременную память, в которой от животных требуется научиться находить новое местоположение платформы при каждом сеансе проведения тестов. Этот протокол не предусматривает предварительной тренировки или проведение теста в водном лабиринте перед хирургической операцией.
Используемый водный лабиринт представляет собой круглый бассейн (диаметром 122 см; глубиной 60 см), заполненный водой температурой 25°С, и ее делают непрозрачной за счет добавления двух фунтов нетоксичной белой краски. Лабиринт расположен в тихой комнате без окон с рядом определенных сигналов вне лабиринта. Четыре точки на кольце, обозначенные как север (N), восток (Е), юг (S) и запад (W), служат в качестве стартовых положений и делят лабиринт на четыре квадранта. Круглую платформу (диаметром 10 см) помещают в 1,5 см ниже поверхности воды в местоположении, которое изменяется в зависимости от требований задачи. Выполняют видеозапись перемещений животного с использованием видеокамеры с CCD-матрицей, которая записывает траекторию плавания. Траекторию плавания животного затем анализируют с использованием программного обеспечения Ethovision (Noldus). Эта программа определяет длину траектории, время ожидания до достижения платформы (в секундах), время, проведенное в каждом квадранте водного лабиринта, и скорость плавания.
Платформу располагают в северо-западном квадранте лабиринта. Каждое животное получает четыре 60-секундных испытания каждые сутки. Если крыса успешно находит платформу, ей позволяют оставаться на ней в течение 10 секунд; в ином случае, ее помещают на платформу на период продолжительностью 10 секунд. Интервалы между испытаниями составляют от двух до четырех минут, в течение которых крыс помещают под инфракрасную лампу. Животных подвергают тестированию после проведения тестов сенсомоторной функции.
Проверочное испытание состоит из удаления платформы и выпуска животного из западного положения и осуществления видеозаписи характера плавания животного в течение 60 секунд. Животное без нарушения должно проводить большую часть времени, плавая в квадранте, который ранее содержал скрытую платформу.
В случае задачи на кратковременную память животному дается 60 секунд для поиска погруженной (не обозначенной сигналом) платформы. Если крыса оказывается неспособна найти платформу в течение 60 секунд, животное помещают на платформу на 10 секунд. Через пять секунд после первого испытания для той же крысы проводят второе идентичное испытание. Крыс помещают под инфракрасную лампу на 4 минуты между каждым спаренным испытанием. После проведения серии испытаний с группой крыс, как указано выше, платформу перемещают в следующее местоположение в лабиринте и процедуру повторяют в этом местоположении. Пять спаренных испытаний проводят с каждой крысой в каждые сутки.
Новую задачу по узнаванию объекта проводят на арене с открытым полем с двумя разными видами объектов. Оба объекта будут соотноситься по высоте и объему, но будут отличаться формой и внешним видом. Животным позволяют изучить пустую арену и в ходе ознакомления животных помещают на этой знакомой арене с двумя идентичными объектами, размещенными на равном расстоянии. На следующие сутки животные изучают открытое поле в присутствии знакомого объекта и нового объекта для тестирования долговременной опознающей памяти. Записывают время, затраченное на изучение каждого объекта, и выраженный в процентах индекс различения.
Пример 8. Тесты слуха и равновесия в модели на грызунах
Ответ ствола мозга на звуковой стимул (ABR)
Значения порога слышимости определяют по ответу ствола мозга на звуковой стимул с помощью подкожных платиновых иглообразных электродов, помещенных на темя (сравнительный), правый сосцевидный отросток (отрицательный) и левую заднюю конечность. Генерируемые цифровым устройством стимулы состоят из 1024 тональных посылок со специфической частотой от 3 до 30 кГц и трапециевидным профилем общей длительностью 5 мс. У трапециевидного сигнала присутствовало плато продолжительностью 3 мс с нарастанием и падением продолжительностью по 1 мс. Стимул направляют через управляемый компьютером аттенюатор ко вставленному наушнику (Etymotic Research ER-2). Трубка для доставки звука во вставленном наушнике расположена приблизительно в 5 мм от барабанной перепонки. Выходную мощность вставляемого наушника калибруют посредством измерения уровня звукового давления в положении 4-5 мм от барабанной перепонки. Животных помещают в пластиковую замкнутую трубу в течение процедуры записи продолжительностью сорок пять минут. Электрический ответ от записывающего электрода усиливают (в 100000 раз), фильтруют (100-3000 Гц) и подают в A/D преобразователь на пульте для обработки сигнала на компьютере. От восьми до двенадцати сотен образцов усредняют для каждого уровня. Стимулы представляют со скоростью 16/секунду, и уровень стимула изменяется с поэтапными понижениями на 10 дБ до тех пор, пока будет достигнут порог, с последующим этапом повышения на 5 дБ для подтверждения. Порог определяют как среднюю точку между самым низким уровнем, на котором наблюдался явный ответ, и следующим более низким уровнем, на котором ответ не наблюдался. ABR определен как воспроизводимый в виде волны II типа.
Вызванные вестибулярные миогенные потенциалы (VEMP)
Вестибулярные миогенные потенциалы (cVEMP) для исследования функции удержания равновесия измеряют до нанесения травмы и в несколько моментов времени после нанесения травмы вплоть до 30 суток. Измерения осуществляют с использованием подкожных иглообразных электродов, присоединенных к предварительному усилителю и системе для сбора данных (Intelligent Hearing Systems). Вызванные вестибулярные миогенные потенциалы (VEMP) измеряют с помощью подкожных электродов, помещенных в мышцы шеи, в ответ на акустические стимулы, которые стимулируют сферический мешочек перепончатого лабиринта внутреннего уха. После осуществления записей за животными наблюдают каждые 15 минут в течение выхода из анестезии и каждый час после того, как они начинали двигаться до тех пор, пока они полностью оправлялись от действия анестезии, и у них проявлялось нормальное поведение. Остаточную функцию у необработанных животных сравнивают с обработанными животными. Отслеживают потенциальные побочные эффекты, такие как проблемы с равновесием, поведение, характеризующееся вращением, и боль. В исследованиях для оценки кратковременных эффектов животных умерщвляют через 24, 48 и 72 часа (иммуногистохимический анализ и анализ экспрессии генов) или по окончании исследования долговременных эффектов (гистологический анализ). Исходя из этих исследований, устанавливают критическое время для вмешательства, зависимость доза-эффект и оптимальную длительность обработки.
Пример 9. Гистопатологическое исследование в модели на грызунах
Сбор тканей
После тестирования поведенческой функции животных умерщвляют и ткани собирают следующим образом:
В случае гистологических исследований под анестезией избыточной дозой кетамина (150 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) или изофлурана крыс подвергают транскраниальной перфузии солевым раствором с последующим введением 4% параформальдегида. Голову, печень и почки удаляют и подвергают последующей фиксации в том же фиксаторе. Или декальцифицированные головы, или извлеченные головные мозги используют для гистопатологического анализа.
2
В случае масс-спектроскопической визуализации под анестезией избыточной дозой кетамина (150 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) или изофлурана крыс подвергают транскраниальной перфузии солевым раствором для очистки от крови. Головные мозги затем быстро удаляют и замораживают в изопентане, охлаждаемом твердом СО (сухой лед).
В случае молекулярно-биологических исследований под анестезией избыточной дозой кетамина (150 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) или изофлурана крыс декапитируют, ткань, такую как головной мозг и почка/печень быстро удаляют, замораживают в жидком азоте и хранят при -80°С до использования.
ый
Обработка тканей при гистопатологическом исследовании После обеспечения выживания в течение соответствующих периодов времени контрольных и подвергнутых травматическому воздействию крыс подвергают анестезии с использованием пентобарбитала натрия (100 мг/кг, i.p.) и транскардиальной перфузии ОД М PBS с последующим введением фиксатора в виде параформальдегида-лизина-перйодата. Интактные головы подвергают последующей фиксации в 4% параформальдегиде в течение 24 часов при комнатной температуре, декальцификации в 10% муравьиной кислоте до соответствия критерию проведения химических исследований и нейтрализуют в течение ночи в 5% сульфате натрия. После заливки в парафин делают срезы с шагом 8-10 мкм в горизонтальной плоскости. Каждый 25 срез окрашивают гематоксилином и эозином для стандартного гистопатологического анализа. Для иммуногистохимического анализа наборы срезов последовательно инкубируют в следующих растворах при комнатной температуре: 5% нормальная ослиная сыворотка (NDS) в 0,1 М PBS в течение 2 часов; первичная антисыворотка в 0,1 М PBS в течение 72 часов и 0,1 М PBS в течение 15 минут. Антитела затем подвергают визуализации либо с использованием ABC пероксидазы, либо с помощью метода иммунофлуоресценции. Первичные антитела, используемые в декальцифицированных головах с воздействием взрыва, включают в себя как маркеры нервной ткани, так и иные маркеры, такие как супероксиддисмутаза 2, рецептор интерлейкина 8, хемокиновый рецептор 3 с СХС-мотивом, ангиопоэтин 1, фактор роста сосудистого эндотелия А, TNF-альфа и матриксная металлопротеиназа 2.
Масс-спектрометрическая визуализация
2
Животных умерщвляют спустя 1, 3 или 7 суток после нанесения повреждения. Под анестезией смесью кетамина/ксилазина (100 мг/кг; 10 мг/кг) грудную клетку каждой крысы вскрывают и голову перфузируют через катетер, установленный в восходящую аорту, 50-100 мл фосфатно-буферного солевого раствора при комнатной температуре, позволяя крови вытекать из головы через отверстие в верхней полой вене. Когда перфузат в основном очищается от крови, череп аккуратно вскрывают и головной мозг вырезают. После удаления мозговых оболочек каждый головной мозг быстро замораживают в стакане, содержащем приблизительно 30 мл холодного изопентана, предварительно охлажденного за счет погружения стакана в твердый СО, затем удаляют, заворачивают по отдельности в алюминиевую фольгу и хранят при -80°С до получения срезов. Срезы головных мозгов в коронарной плоскости толщиной 18 микрон получают с использованием криостата (Leica Microsystems CM3050S, Баннокберн, Иллинойс). В срезы тканей внедряют серебряные наночастицы (AgNP) диаметром 6 нм с использованием устройства для внедрения наночастиц (Ionwerks, Хьюстон, Техас). Спектрометр Thermo Scientific MALDI LTQ-XL-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, Сан-Хосе, Калифорния) и программное обеспечение Xcalibur используют для сбора данных масс-спектрометрической визуализации (MSI) с матрично-активированной лазерной десорбцией (MALDI). Изображения коронарных срезов конструируют на основании данных, собранных в режиме с образованием положительных и отрицательных ионов, с использованием специального пакета программного обеспечения Ionwerks, Хьюстон, Техас), который экспортирует данные MS пиков для дальнейшего статистического анализа в программе MATLAB.