СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОГЕНИТОРНЫХ КЛЕТОК МИОКАРДА

2
2
1. Способ получения прогениторных клеток из образцов миокарда млекопитающего, включающий измельчение образцов, посадку их на культуральные чашки с покрытием, обеспечивающим их адгезию, и культивирование измельченных образцов в условиях гипоксии при концентрации кислорода 0,1-15% в течение 6-36 ч с образованием клеточной культуры, извлечение клеток из клеточной культуры посредством ее ферментативной обработки, культивирование извлеченных клеток на чашках с покрытием, обеспечивающим образование клеточных агрегатов, с последующей ферментативной обработкой клеточных агрегатов для получения прогениторных клеток миокарда, при этом в качестве покрытия чашек, обеспечивающего адгезию измельченных образцов, используют коллаген, и/или фибронектин, и/или ламинин, и/или желатин, и/или фибрин в количестве 0,1-1000 мкг/см, а в качестве покрытия чашек, обеспечивающего образование клеточных агрегатов, используют poly-D(L)-lysine и/или poly-ornithine в количестве 0,1-1000 мкг/см.
3
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что измельчение образцов миокарда проводят до получения кусочков 1-10 мм.
3. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что культивирование образцов миокарда осуществляют в среде содержащей: 0,1-99,9% IMDM, и/или DMEM, и/или DMEM-F12, и/или MEM, и/или Myelocult, и/или RPMI, и 0,01-50% фетальной сыворотки теленка и/или лошади, при этом в процессе культивирования осуществляют смену 0,1-100% среды не реже одного раза в 10 дней.
4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что среда дополнительно содержит 0,01-3% пенициллина-стрептомицина и/или 0,01-1 мМ 2-меркаптоэтанола и/или 0,01-5% Л-глутамина.
5. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что культивирование извлеченных клеток до момента образования клеточных агрегатов осуществляют в среде, содержащей 0,1-99,9% IMDM, и/или DMEM, и/или DMEM-F12, и/или MEM, и/или Myelocult, 0,01-50%) фетальной сыворотки теленка и/или лошади, 0,01-3% пенициллина-стрептомицина, 0,01-1 mM 2-меркаптоэтанола, 0,01-10% В27, 0,10-5% Л-глутамина, 0,01-1000 нг/мл основного фактора роста фибробластов, 0,01-1000 нг/мл эпидермального фактора роста, 0,01-1000 ед/мл тромбина, 0,01-1000 нг/мл кардиотрофина-1 при этом в процессе культивирования осуществляют смену 0,1-100%) среды не реже чем 1 раз в 10 дней.
2
6. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что культивирование измельченных образцов миокарда и извлеченных из клеточной культуры клеток проводят в течение 7-40 дней при 35-39°C в атмосфере 0,1-10% CO.
7. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что культивирование образцов миокарда осуществляют до момента появления округлых клеток.
8. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что для ферментативной обработки клеточной культуры и клеточных агрегатов используют раствор фермента, разрушающий связи между клетками.
9. Способ по п. 8, характеризующийся тем, что в качестве раствора фермента используют 0,1-100% коллагеназу, или диспазу, или трипсин, или Accutase или их комбинацию, при этом обработку раствором фермента осуществляют в течение 0,1-30 мин.
2
10. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что посадку извлеченных клеток на культуральные чашки для образования клеточных агрегатов осуществляют в количестве 1-1000000 клеток/см.