Клеточная терапия несовершенного остеогенеза

клеточная терапия несовершенного остеогенеза

В.С. Сергеев 1, Т.И. Тихоненко 2, Д.С. Буклаев 2, А.Г. Баиндурашвили 2, Б.В. Афанасьев 1

1 НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р.М. Горбачевой

Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия

2 Научно-исследовательский детский ортопедический институт им. Г.И. Турнера, Санкт-Петербург, Россия

Cell therapy of osteogenesis imperfecta

V.S. Sergeev1, T.I. Tichonenko 2, D.S. Buklaev 2, A.G. Baindurashvili2, B.V. Afanasiev1 1R. Gorbacheva Memorial Research Institute for Pediatric Oncology, Hematology and Transplantation, I.P. Pavlov First Saint Petersburg State Medical University, Saint Petersburg, Russia 2 G.I. Turner Scientific Research Institute of Children's Orthopedics, Saint Petersburg, Russia

Генетически обусловленное нарушение структуры коллагена I типа является причиной врожденной группы заболеваний — несовершенного остеогенеза. Коллаген I типа представляет собой основной компонент органического матрикса костной ткани и продуцируется остеобластами. Заместительная клеточная терапия может быть радикальным методом лечения несовершенного остеогенеза при достижении высоких уровней стабильного химеризма остеобластического клеточного дифферона. По аналогии с классической трансплантацией гемопоэтических стволовых клеток для получения стабильного остеобластического химеризма необходимо замещение на уровне гипотетических остеогенных стволовых клеток. Стволовые клетки с потенциями к дифференцировке в клетки скелетных тканей впервые были описаны А.Я. Фриденштейном в строме костного мозга. Эволюция представлений о стромальных стволовых клетках привела к появлению концепций «ме-зенхимных стволовых клеток», «стволовых клеток скелетных тканей» и даже «медицинских сигнальных клеток». Трансплантация всех перечисленных видов клеток может приводить к улучшению клинического статуса у пациентов с несовершенным остеогенезом, которое, однако, носит временный характер. В настоящий момент в экспериментальных и клинических исследованиях не удалось достигнуть стабильной химеризации остеобластического диф-ферона, что, прежде всего, связано с недостаточностью фундаментальных знаний об источниках происхождения остеобластов в физиологических условиях in vivo. В то же время, учитывая крайне скудный арсенал и низкую эффективность текущих методов лечения среднетяжелых форм несовершенного остеогенеза, клеточная терапия с использованием ex vivo культивированных стромальных клеток костного мозга имеет хорошие перспективы.

Ключевые слова: несовершенный остеогенез, клеточная терапия, остеобласты, химеризм, стволовые клетки.

Genetically determinated type I collagen structure anomaly causes the group of innate diseases known as osteogenesis imperfecta. Type I collagen is the basic component of the bone tissue organic matrix and is produced by osteoblasts. The replacement cell therapy can be a radical treatment option for the osteogenesis imperfecta if the high stable osteoblast chimerism level is reached. Analogously with the classical hematopoietic stem cell transplantation the replacement of hypothetic osteogenic stem cells is necessary for the stable osteoblasts engraftment. Stem cells with the potency to skeletal tissues differentiation were first described by A.J. Friedenstein in the bone marrow stroma. The evolution of the stromal stem cells vision leaded to the "mesenchymal stem cells", "stem cells of skeletal tissues" and even "medical signal cells" concepts appearance. The transplantation of all listed cell types can lead to the increase of the clinical status in patients with osteogenesis imperfecta which is temporary yet. There was no success in the achievement of the stable osteoblasts engraftment during experimental and clinical studies at the moment. Such fact could be associated with the deficiency of fundamental knowledge about the source osteoblasts origin in vivo. At the same time taking into account extremely low range and poor efficiency of current severe osteogenesis imperfecta forms therapy approaches the cell therapy with ex vivo cultivated bone marrow stromal cells application is quite promising.

Keywords: osteogenesis imperfecta, cell therapy, osteo-blasts, chimerism, stem cells.

Несовершенный остеогенез (НО), известный как «болезнь хрупких костей», представляет собой группу врожденных системных генетических заболеваний соединительных тканей, связанных с нарушением структуры коллагена I типа [1]. Тяжесть заболевания имеет значительные вариации от субклинических проявлений системного остеопороза до внутриутробной смерти [2]. Частота НО в среднем составляет 1 случай на 15 000 человек [3—5]. Средне-тяжелые формы НО (II—IV типы по классификации Silence) характеризуются системным остеопорозом, хрупкостью и деформацией костей, задержкой линейного роста. У большинства пациентов в настоящее время может быть выявлена причина заболевания. Чаще всего она заключается в аутосомно-доминантных мутациях генов, кодирующих альфа-1 и альфа-2

e-mail: sergeev.vlad@gmail.com

цепи коллагена I типа [1]. Значительно реже — мутациями генов белков, участвующих в посттрансляционных модификациях коллагена I типа.

Коллаген I типа является полимером тропоколла-геновых молекул, каждая из которых представляет собой тройную спираль, содержащую одну альфа-2 и две альфа-1 полипептидные цепи [1]. Тип I коллагена является важным структурным белком для костей, сухожилий, связок, кожи и склер. Этот белок составляет основную часть органического вещества костного матрикса, в связи с чем основные клинические проявления заболевания обусловлены аномалиями в строении костной ткани.

В настоящий момент НО остается неизлечимым заболеванием. В большинстве случаев пациентам с НО назначаются препараты из группы бифосфона-

тов. Эти препараты ингибируют резорбцию костей, приводя к увеличению минеральной плотности костной ткани. В некоторых исследованиях было показано, что применение бифосфонатов у пациентов с НО приводит к снижению частоты переломов длинных трубчатых костей [6, 7]. Тем не менее, не все клинические испытания подтвердили эффективность применения бифосфонатов в отношении переломов [8, 9]. В клинических исследованиях, включенных в анализ в Кокрейновском обзоре, не было продемонстрировано улучшение клинического статуса пациентов с НО в отношении болевого синдрома, интенсификации роста или функциональной мобильности [10]. Все другие виды лечения направлены на предотвращение и лечение связанных с НО осложнений, а также улучшение качества жизни пациентов. Прежде всего, оно заключается в умеренном увеличении физической активности и профилактике развития деформаций и кифосколиоза. При возникновении осложнений, например, деформации длинных трубчатых костей, проводят хирургическое лечение, которое заключается в остеотомии деформированных костей и придания им правильной анатомической формы с помощью металлоконструкций.

Таким образом, существующие немногочисленные методы лечения НО малоэффективны, и пациенты остро нуждаются в новых методах терапии.

Механизмы обновления и источники

происхождения остеобластов

Основным видом клеток костной ткани, продуцирующим коллаген I типа, являются остеобласты [11]. Следовательно, клеточная терапия, направленная на системную замену остеобластов, несущих дефектные гены, теоретически может привести к излечению от несовершенного остеогенеза. То есть конечной целью клеточной терапии является системная стабильная химеризация остеобластического клеточного дифферона (вплоть до 100%) аллогенными или генетически модифицированными аутогенными клетками. Разработка подобного метода клеточной терапии должна, прежде всего, основываться на глубоком понимании механизмов поддержания популяций остеобластов костной ткани in vivo.

Существует два основных механизма замещения клеток в физиологических условиях или при повреждении (физиологическая и репаративная регенерация, соответственно): экспансия уже существующих специализированных клеток или восполнение их пула за счет пролиферации и дифференцировки стволовых клеток/клеток-предшественниц [12—14]. В исследованиях было продемонстрировано, что у взрослых мышей располагающиеся на поверхности костей зрелые остеобласты являются постмитотиче-скими клетками и постоянно замещаются благодаря пролиферации и дифференцировке менее зрелых клеток [15—17]. В то же время на ранних этапах онтогенеза, по крайней мере, часть остеобластов сохраняют способность к пролиферации [18]. По различным оценкам, средняя продолжительность жизни остеобластов имеет значительные вариации в зависимости от условий — от 3 дней у быстро растущих юных животных до 2 мес. у взрослых особей [17, 19—20]. Расчетные данные, полученные с использованием непрямых методов оценки, свидетельствуют, что у человека средняя продолжительность

жизни данного вида клеток составляет около 150 дней, за исключением части остеобластов с более коротким периодом жизни, претерпевающих дальнейшую дифференцировку в остеоциты [21, 22]. В целом имеющиеся данные свидетельствуют, что остеобласты являются короткоживущей популяцией клеток с преимущественным механизмом замещения посредством пролиферации и дифференцировки клеток-предшественниц.

По аналогии с гемопоэтическими клетками, быстрое самообновление остеобластов на протяжении всей жизни и их дифференцировка из клеток-предшественниц дают основания полагать, что в основе остеобластического клеточного дифферона лежат клетки со свойствами «стволовости», т.е. с одной стороны способные к самообновлению, а с другой к дифференцировке минимум в остеогенном направлении. Идентификация этой популяции клеток, характеристика естественной ниши, разработка стратегий их трансплантации имеют ключевое значение для клеточной терапии несовершенного остеогене-за, так как долговременную стабильную химериза-цию остеобластичекого клеточного дифферона можно достичь только путем замещения пула стволовых клеток.

стволовые стромальные клетки

костного мозга

В 60-х годах XX века выдающийся советский ученый Александр Яковлевич Фриденштейн в опытах с трансплантациями фрагментов костного мозга впервые продемонстрировал существование в костном мозге стромальных клеток, имеющих потенцию к остеогенной дифференцировке и способных к длительному самоподдержанию своей популяции in vivo [24—26]. При эксплантации костного мозга через 1—2 недели культивирования стромальные клетки дают начало дискретным клональным колониям фибробластоподобных клеток. Клетки-родоначальницы колоний получили обозначение колониеобра-зующих клеток-предшественниц (КОЕ-Ф) [27, 28]. В зависимости от условий культивирования клетки могут длительное время оставаться в недифференцированном состоянии или быть подвергнуты дифференцировке в остеогенном, адипогенном или хондрогенном направлениях. При гетеротопической трансплантации под почечную капсулу была выявлена ключевая роль культивированных клеток в формировании специфического микроокружения, обеспечивающего эктопический гемопоэз [12, 25, 29]. Выявление схожих по своим характеристикам стромальных клеток в лимфоидных тканях позволило А.Я. Фриденштейну сформулировать понятие о стволовых стромальных клетках кроветворной и лимфоидной тканей [12].

Идеи, заложенные А.Я. Фриденштейном, получили дальнейшее развитие в работах многочисленных научных групп. В настоящее время у научной общественности существуют различные представления о природе и функциях стволовых стромальных клеток, которые с большой долей условности можно разделить на три основные концепции: концепция мезенхимных стволовых клеток (МСК) [30, 32], концепция стволовых клеток скелетных тканей [33, 34] и концепция «медицинских сигнальных клеток, medicinal signaling cells» [35, 36]».

Концепция мезенхимных стволовых клеток

Термин «мезенхимные стволовые клетки (МСК)» по отношению к стромальным клеткам костного мозга был введен в оборот в работах американского ученого Арнольда Каплана в конце 80-х годов XX века [30, 37, 38] и широко популяризирован после публикации статьи M. Pittenger et al. [31]. В настоящее время эта статья цитировалась в научной литературе более 13000 раз (данные Scopus) и является наиболее цитируемой статьей в области изучения стволовых клеток [39]. Согласно концепции, МСК являются гипотетическими постнаталь-ными мультипотентными стволовыми клетками, восполняющими путем пролиферации и дифферен-цировки пулы коммитированных клеток мезенхим-ного происхождения в скелетных (костная, хрящевая и др.) и нескелетных тканях (гладкая мышечная ткань, поперечно-полосатые мышцы, вероятно, поперечнополосатую мышечную ткань миокарда и эндотелий, соединительные ткани внутренних органов), т.е. стволовые клетки, лежащие в основе «мезенгенного процесса» [38]. Материальным воплощением гипотетических стволовых клеток являлись ex vivo культивированные клетки костного мозга, способные формировать отдельные колонии фибробластоподобных клеток с потенциалом к мультипотентной дифференцировке in vitro [31]. Позднее, клетки с подобными характеристиками были получены при эксплантации разных тканей и органов, включая подкожную жировую клетчатку [40], легкие [41], сердце [42], мозг [43], эндометрий [44], плаценту [45] и др. Кроме того, в разное время сообщалось об идентификации субпопуляций МСК с свойствами плюрипотентности («истинных» МСК): MAPC [46], MIAMI [47], Muse [48] и др. В связи с быстрым ростом количества научных публикаций и возникновением многочисленных клинических исследований в начале 2000-х годов в исследовательской и медицинской общественности возник запрос на упорядочение номенклатуры и определение комплекса признаков, присущих МСК. Из-за отсутствия убедительных экспериментальных данных о наличии свойств «стволовости» у ex vivo культивированных клеток международная экспертная группа ученых рекомендовала использование термина «мультипотентные мезенхимные стромальные клетки» (МСК, ММСК) [49] и предложила минимальный ряд характеристик, соответствие которым необходимо для подтверждения идентичности культивируемых клеток муль-типотентным мезенхимным стромальным клеткам: фибробластоподобная морфология и способность к адгезии и росту in vitro в виде адгезивной культуры, дифференцировка в остеогенном, хондрогенном и адипогенном направлении in vitro при культивировании в соответствующих условиях и характерный иммунофенотип: высокая степень экспрессии маркеров CD105, CD73 и CD90 и отсутствие CD45, CD34, CD14 или CD11 b, CD79-alpha или CD19 и HLA-DR [50].

Концепция стволовых клеток скелетных тканей

Концепция стволовых клеток скелетных тканей (СКСТ) сформулирована в работах S. Kuznesov, P. Robey и P. Bianco [33, 34] и основывается на идеях, изначально заложенных А.Я. Фриденштей-

ном. Авторы концепции обращают внимание на отсутствие реальных доказательств существования единой популяции мезенхимных стволовых клеток, способных дифференцироваться в различные ком-митированные клетки мезенхимного происхождения скелетных и нескелетных тканей. Более того, по их мнению, индуцированная in vitro дифферен-цировка МСК не отражает потенциал к дифферен-цировке в физиологических условиях in vivo и является суррогатным тестом [33]. Все нескелетные ткани и органы, из которых были изолированы МСК, являются отличными по происхождению от скелетных тканей. Эти клетки не принимают участия в онтогенезе и постнатальной физиологии скелета, и, кроме того, при гетеротопических трансплантациях не проявляют скелетогенных свойств [51]. В свою очередь клетки-предшественницы костного мозга не принимают участия в физиологической регенерации нескелетных тканей. Фибробласто-подобные клетки нескелетных тканей могут быть индуцированы к остеогенной дифференцировке in vitro путем активации BMP сигнальных каскадов [52]. Однако «индуцибельные» остеогенные клетки имеют принципиальные отличия от «детерминированных» остеогенных клеток костного мозга, которые в нативных условиях экспрессируют мастер ген Runx2 и не требуют активации BMP сигнальных каскадов для дифференцировки в зрелые клеточные элементы скелетных тканей. По сути эти два типа клеток можно отнести к индуцированным и детерминированным остеогенным клеткам-предшественницам по классификации А.Я. Фриден-штейна [12]. Основываясь на более доказательных тестах in vivo, в которых только клетки скелетных тканей способны формировать костные структуры и поддерживающие гемопоэз стромальные элементы при гетеротопической трансплантации, авторы выдвинули гипотезу «стволовых клеток скелетных тканей» (СКСТ), принимающих прямое участие в регенерации скелетных соединительных тканей [33]. Физически СКСТ представлены в виде периваску-лярных клеток костного мозга (адвентициальные периваскулярные клетки), располагающихся с наружной стороны по отношению к клеткам эндотелия синусоидов костного мозга [53, 54]. В нативных условиях СКСТ предположительно характеризуются экспрессией CD146 [53]. CD146+ периваскуляр-ные клетки (СКСТ) включают в себя практически весь пул мультипотентных колониеобразующих единиц костного мозга in vitro. Гетеротопическая трансплантация ex vivo культивированных СКСТ приводит к формированию «миниатюрного костномозгового органа», представленного костными и стро-мальными элементами донорского происхождения, включая CD146+ перициты, и эндотелиальными и гемопоэтическими клеточными элементами реципиента. Подобная картина воспроизводится при последовательной серии трансплантаций СКСТ, свидетельствуя о потенциале к самообновлению этой популяции клеток. Таким образом, концепция СКСТ базируется на более доказательных по сравнению с индукцией дифференцировки in vitro гетеротопи-ческих трансплантациях in vivo. Слабой стороной концепции является отсутствие оценки свойств СКСТ в моделях ортотопических трансплантаций, в которых была бы продемонстрирована пожизненная химеризация линий клеток скелетных тканей, в том числе остеобластов.

Концепция «медицинских сигнализирующих

клеток (МСК)»

В 2010 г. Арнольдом Капланом была сформулирована новая концепция о «медицинских сигнализирующих клетках (МСК)» [35]. Необходимость радикального изменения концепции основывалось на двух группах аргументов. Во-первых, фибробласто-подобные клетки с однородными признаками, характерными для МСК, были выделены из многих онтогенетически различных тканей и органов [40—45, 55, 56]. Этот, на первый взгляд странный факт, легко объясняется тем, что все эти ткани и органы имеют кровеносные сосуды и сопровождающие их клетки мезенхимного происхождения — перициты. Для этих клеток характерна ко-экспрессия характерных для перицитов и МСК маркеров CD146 и CD105 [36]. В то же время не все перициты имеют свойства МСК. Во-вторых, в многочисленных экспериментальных и клинических исследованиях было продемонстрировано, что МСК оказывают терапевтически благоприятные эффекты благодаря миграции в область повреждения и(или) воспаления тканей и экспрессии больших количеств биологически активных молекул с выраженной иммуномодулирующей и трофической активностью [57, 58]. Таким образом, наблюдаемые терапевтические эффекты МСК не обусловлены их свойствами к дифференцировке в различные типы более зрелых клеток мезенхимного ряда.

Новая концепция А. Каплана предполагает, что повреждение сосудов служит сигналом к миграции и дифференцировке перицитов в клетки с фенотипом «медицинских сигнализирующих клеток, МСК» [36]. Мобилизованные клетки секретируют факторы, обеспечивающие благоприятные условия для последующей регенерации. В процессе регенерации активированные МСК вновь занимают характерную периваскулярную нишу в составе формирующихся в месте повреждения микрососудов. Секретируемые МСК биологически активные молекулы оказывают иммуномодулирующие и трофические действия, ограничивая потенциально токсичную активность иммунных клеток, инициируют ангиогенез, препятствуют апоптозу окружающих клеток и стимулируют пролиферацию и дифференцировку резидентных тканеспецифичных клеток-предшественниц.

В экспериментах по внутриартериальному введению ex vivo культивированных МСК костного мозга группой А. Каплана было продемонстрировано селективное долговременное приживление в виде перива-скулярных клеток костного мозга в предварительно облученных конечностях [59]. Этот феномен не воспроизводился при внутривенном введении МСК или внутриартериальном введении отличных от МСК видов клеток. Более того, МСК сохраняли способность к селективному приживлению в облученных конечностях и при серийных интраартериальных трансплантациях. Интересно, что, несмотря на длительную персистенцию, приживляемые клетки на протяжении всего периода наблюдения (более 33 нед.) стабильно сохраняли фенотип периваскулярных клеток без каких-либо признаков дифференцировки в скелетные ткани. Таким образом, полученные в этом исследовании данные могут свидетельствовать, что ex vivo культивированные МСК костного мозга способны к долговременному приживлению в костном мозге в виде периваскулярных клеток, которые, однако, при этом не участвуют в физиологической регенерации

костной ткани.

Трансплантация МСК для лечения

несовершенного остеогенеза

Учитывая остеогенный потенциал МСК костного мозга, продемонстрированный в многочисленных работах in vitro и in vivo, этот вид клеток длительное время рассматривался как основной источник вновь образующихся остеобластов. Тем не менее, в исследованиях на различных животных моделях по введению ex vivo культивированных МСК были получены противоречивые данные о возможности приживления данного типа клеток в костном мозге и дифференцировке в остеобласты (рассмотрено ниже). В то же время, при трансплантации костного мозга была показана кратковременная химеризация остеобла-стического клеточного дифферона. Несмотря на то, что оба метода оказали благотворные эффекты на клиническое течение НО, это влияние, по-видимому, обусловлено разными механизмами.

Использование ex vivo культивированных МСК

для клеточной терапии НО

В ряде работ группы профессора C. Niyibizi (2007, 2010, 2016) была продемонстрирована возможность приживления в скелетных тканях мышей с фенотипом несовершенного остеогенеза (oim/oim) системно и локально вводимых МСК, полученных в результате in vitro экспансии отдельных колониеобразующих единиц костного мозга [60—62]. Через 4 недели после трансплантаций уровень донорских остеобластов в различных костях в среднем составлял 0,3—2% от общей популяции, однако в отдельных случаях достигал 28% [62]. Химеризм наблюдался вплоть до 6 недель наблюдения. При этом доказательная база исследований исключала аутофлуоресценцию и клеточное слияние, как потенциальные источники ложноположительных сигналов. Наличие донорских остеобластов предопределяло синтез а2 цепи коллагена I типа, отсутствующих у интактных oim мышей, и зоны активного формирования костной ткани в местах отложений сформированного коллагена. Интересно, что C. Niyibizi et al. выявили ассоциацию широкого приживления вводимых клеток в скелетных и нескелетных тканях с высокой степенью экспрессии CXCR4 на клональных МСК [60]. Корреляция между приживлением МСК в костном мозге у пренатальных oim мышей и экспрессией рецептора CXCR4 также была продемонстрирована на примере трансплантации фетальных МСК человека [63].

Другие исследовательские группы, включая E. Horwitz et al. (2004, 2012), наблюдали либо низкое количество остеобластов, имеющих донорское происхождение [64, 65], либо их полное отсутствие [66, 67] после трансплантации ex vivo культивированных МСК. Несмотря на наличие 1% донорских остеобластов у гомозиготных oim/oim мышей E. Horwitz et al. не выявили признаков наличия а2 цепи коллагена I типа в образцах костной ткани [65]. Однако, несмотря на фактическое отсутствие приживления вводимых МСК, у oim/oim мышей наблюдалось заметное увеличение динамики линейного роста и общей массы тела в сравнении с мышами контрольной группы [65]. В этом же исследовании было показано, что эффект стимуляции роста

обусловлен индукцией пролиферации хондроцитов в метаэпифизарных пластинках роста трубчатых костей вводимыми МСК путем непрямого паракринного воздействия.

В настоящее время лишь две исследовательские группы опубликовали данные о клиническом применении системных трансфузий МСК для лечения пациентов с несовершенным остеогенезом. В исследовании группы E. Horwitz et al. (2002) 6 пациентам с НО третьего типа, которым ранее выполнялась аллогенная трансплантация костного мозга (алло-ТКМ), проводили двукратную трансфузию МСК с интервалом 8—21 день от тех же доноров в дозе 1—5х106 клеток/кг [68]. У 5 из 6 пациентов наблюдалось ускорение динамики роста в течение 4—6 мес. после инфузий. Позитивные изменения составили от 60% до 94% (в среднем 70%) от ожидаемых медианных значений для здоровых детей соответствующего пола и возраста в сравнении с 0% — 40% (в среднем 20%), которые наблюдались в течение 6 месяцев, предшествующих инфузиям. Группой E. Horwitz было также инициировано более крупное исследование с включением 15 пациентов, которым проводились периодические трансфузии аллогенных МСК 1 раз в 4 мес. на протяжении 2 0 мес. [6 9] . Результаты исследования в настоящий момент не опубликованы. Кроме того, клиническое исследование, в котором оцениваются потенциальные безопасность и эффективность двукратного введения HLA-совместимых аллогенных МСК детям с несовершенным остеогенезом, было инициировано в Испании в 2014 г. (TERCELOI, данные в настоящий момент не опубликованы) [70].

Группой K. Le Blanc et al. (2005, 2014) опубликовано два случая трансфузий аллогенных МСК двум пациентам с несовершенным остеогенезом III и IV типов, диагноз которым был поставлен на внутриутробном этапе развития [71, 72]. Эти случаи имели несколько особенностей:

— в качестве клеточного материала использовались аллогенные МСК фетальной печени, которые по некоторым данным могут иметь больший потенциал к пролиферации и мультилинейной дифферен-цировке в сравнении с МСК взрослых [73, 74];

— первая инфузия проводилась на внутриутробном этапе в пупочную вену и, таким образом, вводимые клетки попадали в системное кровообращение, минуя малый круг кровообращения;

— на момент трансфузий у обоих пациентов по данным ультразвукового исследования выявлялись многочисленные переломы;

— при внутриутробном введении вероятность отторжения аллогенного материала существенно ниже вследствие незрелости механизмов, обеспечивающих иммунный барьер.

По-видимому, эти особенности предопределили высокий уровень химеризма в остеобластическом клеточном диффероне в забранных для анализа образцах костей у первого пациента в возрасте 9 мес. — до 7—15%. Тем не менее, химеризм остеобластов имел временный характер и в образцах костной ткани, полученных в возрасте 6 лет, не выявлялся. В обоих случаях инфузии сопровождались полной консолидацией переломов и успешными родами. Повторные инфузии были проведены уже в постана-тальном периоде в возрасте 8 лет и 19 мес., главным образом, из-за прекращения роста. Инфузии МСК привели к возобновлению роста у обоих паци-

ентов. Учитывая многообещающие результаты, показанные в этих двух случаях, в настоящий момент в Европейском Союзе инициировано клиническое исследование I/II фазы BOOSTB4 для более детального изучения безопасности и эффективности пре- и постнатальных трансплантаций фетальных МСК при тяжелых формах несовершенного остеогенеза [7S].

В целом, данные, полученные в экспериментальных и клинических исследованиях, свидетельствуют об относительно низком потенциале трансфузий ex vivo культивированных МСК костного мозга в качестве заместительной клеточной терапии НО. С другой стороны, учитывая ограниченные возможности современных методов лечения в отношении основных проявлений среднетяжелых форм НО, трансфузии МСК могут применяться, по крайней мере, для стимуляции линейного роста. Насколько этот метод лечения влияет на такие проявления НО, как переломы и деформация костей, предстоит выяснить в дальнейших исследованиях. Кроме того, в настоящий момент можно выделить несколько связанных с применением ex vivo культивированных МСК проблем, прогресс в решении которых может увеличить эффективность применения МСК при НО.

В 2012 г. K. Le Blanc et al. описали связанную с введением МСК субклиническую трансфузион-ную реакцию, получившую обозначение «немедленная воспалительная реакция крови» (instant blood mediated inflammatory reaction, IBMIR) [76]. IBMIR обусловлена массивной деструкцией вводимых клеток в результате активации комплемента [77, 78]. Таким образом, IBMIR значительно ограничивает выживаемость вводимых МСК. Несмотря на то, что причины этой реакции остаются неизученными, Y. Li et al. (2012, 2013, 2016) продемонстрировали, что различные стратегии, направленные на предотвращение активации комплемента, могут использоваться для эффективной профилактики IBMIR [77—79].

Для приживления и реализации остеогенного потенциала вводимые МСК должны эффективно мигрировать в область своих естественных ниш. В то же время культивирование значительно снижает потенциал МСК к системной миграции [80]. R. Wynn et al. (2004) показали, что лишь небольшая субпопуляция культивированных МСК, характеризующаяся высокой степенью экспрессии CXСR4, может эффективно мигрировать в костный мозг реципиентов при системном введении [81]. При стандартных условиях культивирования лишь 1—3% МСК экспрессируют CXCR4 [81, 82]. В то же время экспрессия CXCR4 может быть индуцирована различными воздействиями in vitro [82, 83]. Jones G. et al. (2004) показали, что индукция экспрессии CXCR4 на фетальных МСК человека путем экспозиции с хемокином SDF-1 ассоциируется с 3-кратным увеличением остеобластов донорского происхождения у oim мышей при внутриутробной трансплантации [84].

Поддержание свойств «стволовости» у стволовых клеток возможно лишь в условиях специализированных ниш, обеспечивающих соответствующее микроокружение. In vitro экспансия находящихся вне физиологических ниш стволовых клеток, например гемопоэтических, сопровождается быстрой диффе-ренцировкой пролиферирующих клеток и утратой способности к долговременному приживлению [8S]. Насколько эта проблема актуальна для МСК остается не совсем ясным. Потенциал к приживлению све-жевыделенных остеогенных клеток-предшественниц

костного мозга значительно превосходит ex vivo культивированные МСК [65, 86]. Симуляция сигналов микроокружения in vitro, например с помощью низкомолекулярных агонистов соответствующих рецепторов, может быть эффективна для экспансии клеток с сохраненным потенциалом к приживлению, однако эта проблема требует дальнейшего изучения.

Успешное приживление гемопоэтических клеток при трансплантации костного мозга зависит от наличия свободных ниш. Высвобождение ниш является одной из задач предшествующего трансплантации костного мозга кондиционирования [87, 88]. Высвобожденные ниши могут являться источником большого количество хемокинов, определяющих направленную миграцию стволовых клеток. В нескольких исследованиях была продемонстрирована необходимость кондиционирования в виде локального или системного облучения для успешного приживления вводимых ex vivo культивированных МСК в костном мозге мышей-реципиентов [60, 65]. Однако вплоть до настоящего времени в клинических исследованиях с НО кондиционирование, предшествующее введению ex vivo культивированных МСК, не проводилось. С другой стороны хорошо известно, что в репарации повреждений костной ткани активно принимают участие мигрирующие по градиентам хемокинов из периоста, окружающих тканей и, в том числе, из циркуляции, мезенхимные клетки-предшественницы (подробнее рассмотрено в обзоре A. Schindeler et al. (2008)) [89]. В ряде исследований было показано, что небольшое количество вводимых внутривенно МСК мигрировали в область переломов и дифференцировались в хондроциты и остеобласты, которые принимали активное участие в репарации и формировании костной костного регенерата [90—92]. При этом направленно мигрирующими клетками являлись исключительно CXCR4-экспрессирующие МСК [91]. МСК значительно улучшали процесс заживления переломов благодаря увеличению массы участвующей в репарации хрящевой и костной тканей и формированию костных регенератов, обеспечивающих большую устойчивость к биомеханическим воздействиям, в сравнении с контрольными мышами, которым не проводилось введение клеток. Таким образом, при введении МСК во время переломов и(или) оперативных вмешательств, связанных с травмой костной ткани (например корригирующая остеотомия), можно ожидать миграцию клеток в места повреждений и дифференцировку в клетки-предшественницы скелетных тканей.

Возникновение аллоиммуного ответа может служить причиной неэффективности клеточной терапии аллогенными клетками, в которой основной целью является длительное замещение или восстановление клеток и тканей донорскими клетками. Таким образом, иммунный ответ может препятствовать длительной персистенции остеобластов донорского происхождения и синтеза ими нормального коллагена I типа. Кроме того, вторичный иммунный ответ может являться препятствием для использования МСК в виде многократных инфузий, например, с целью длительной стимуляции роста у пациентов с НО. Несмотря на то, что по некоторым данным МСК имеют низкую иммуногенность [93, 94], W. Fibbe et al. (2006) и L. Zangi et al. (2009) продемонстрировали иммунное отторжение аллогенных МСК у им-мунокомпетентных реципиентов [95, 96]. Решение данной проблемы при планировании клинических

исследований МСК может заключаться в подборе гистосовместимых доноров или использовании им-муносупрессии.

Использование свежевыделенных клеток

костного мозга для лечения НО

В отличие от ex vivo культивированных МСК в настоящее время накоплено достаточно большое количество научных данных, свидетельствующих о возможности высокой степени химеризации осте-областического клеточного дифферона при трансплантации клеток костного мозга, подвергшихся минимальным манипуляциям in vitro. Более того, выраженная способность к химеризации вероятно обусловлена существованием в костном мозге неад-гезирующей in vitro фракцией клеток с выраженным остеогенным потенциалом [97]. E. Olmsted-Davis et al., (2003) продемонстрировали, что способные к образованию костных химер клетки, как и гемопо-этические стволовые клетки, относятся к клеткам «побочной популяции» (side population) [98]. Трансплантация клеток «побочной популяции» так же, как и костного мозга, летально облученным мышам приводила к неравномерной химерзации костей задних конечностей: донорское происхождение имели в среднем 33—46% клеток эпифизов, 11—18% клеток метафизов и 0,1—1,5% клеток диафизов через 6 месяцев после трансплантации. Высокая степень химеризации костной ткани (до 30%) была также продемонстрирована в работах нашей группы с трансплантацией мононуклеарных клеток костного мозга, проводимой после облучения [99]. Аналогичные данные были получены другими исследовательскими группами при трансплантации неадгезирую-щих клеток костного мозга, включая исследования, в которых донорское происхождение остеобластов подтверждалось наличием половых хромосом с помощью флуоресцентной in situ гибридизацией, т.е. исключались артефакты, связанные с феноменами клеточного слияния и межклеточной миграцией метки [100-102].

При исследованиях кинетики приживления неад-гезирующих клеток костного мозга было обнаружено, что химеризация костной ткани носит временный характер и трансплантация этого вида клеток не приводит к пожизненной генерации донорских остеобластов [99, 103]. При этом в исследуемых трубчатых костях донорские клетки в основном выявляются в областях эпифизов и метафизов с пиком на 2 неделе после трансплантации (до 30% клеток), постепенным снижением до 10% к 24 неделе и последующим снижением вплоть до невыявляемых величин. При этом у всех животных наблюдалось стабильное донорское кроветворение, что исключало иммунные механизмы подавления генерации донорских остеобластов.

В ряде последовательных работ группы S. Otsuru, M. Dominici, E. Horwitz et al. (2010, 2011, 2013) было продемонстрировано, что степень остеобла-стической химеризации можно существенно увеличить путем различных воздействий, как во время трансплантации, так и в посттрансплантационном периоде. Так, например, отсроченная трансплантация клеток через 24 ч. после облучения достоверно ассоциировалась с более высоким пиковым содержанием донорских остеобластов (20,0±4,6% против 12,0±2,0%) [86]. Кроме того, стимуляция

пролиферации остеогенных клеток-предшественниц на 6 неделе посттрансплантационного периода паратиреоидным гормоном, гранулоцитарным коло-ниестимулирующим фактором или фактором роста стволовых клеток приводила к двукратному росту остеобластического химеризма [104]. При оценке роли трансплантируемых облученным мышам моно-нуклеарных клеток костного мозга в репаративном остеогенезе было обнаружено, что практически все клетки в составе костных регенератов с морфологией остеобластов имеют донорское происхождение [99, 105, 106]. Более того, полученные данные свидетельствовали об активном вовлечении меченых клеток в процесс энхондрального остеогенеза, то есть практически все клетки провизорного хрящевого регенерата имели донорское происхождение.

Тем не менее, несмотря на то, что в результате трансплантаций клеток костного мозга удается достичь высоких пиковых уровней донорских остеобластов костной ткани, химеризация остеобластическо-го клеточного дифферона не является стабильной и с течением времени снижается вплоть до нулевых значений [99, 103]. Одним из наиболее вероятных объяснений наблюдаемых явлений является отсутствие приживления остеогенных клеток с долговременным потенциалом к генерации остеобластов при данном типе трансплантаций.

Для изучения возможности лечения НО группой E. Horwitz et al. (1999, 2001) 5 пациентам с прогрессивно-деформирующим НО была проведена алло-ТКМ от HLA-совместимых доноров [107, 108]. У 3 из 5 пациентов были выявлены признаки химе-ризации остеобластического клеточного дифферо-на и клинические признаки улучшения течения заболевания. Костный химеризм изучался непрямым методом путем культивирования остеобластов био-птатов костной ткани с последующим анализом их происхождения с помощью флуоресцентной in situ гибридизации и/или оценкой полиформизма ДНК. В целом на 80—101 сут. донорский химеризм по полученным оценкам составлял 1,2—2,0%.

У всех пациентов в посттрансплантационном периоде наблюдалось длящееся приблизительно 6 мес. ускорение линейного роста, достигавшего у части пациентов медианных величин, характерных для здоровых детей того же возраста и пола. Кроме того, у пациентов происходило увеличение общего количества костного минерального компонента. Количество переломов до трансплантации в среднем составляло 10 (4—18) за 6 предшествующих трансплантации месяцев, в то время как после трансплантации лишь 2 (1—10) в течение года. Таким образом, трансплантация костного мозга от здорового донора может сопровождаться химеризацией остеобласти-ческого дифферона и ассоциироваться с достаточно выраженными позитивными сдвигами в клинической картине заболевания.

В дальнейшем E. Horwitz et al. (2012) проводили дополнительные инфузии полученных от тех же доноров обедненных Т-лимфоцитами свежевыделенных клеток костного мозга без какого-либо кондиционирования 5 пациентам с ранее выполненной алло-ТКМ [65]. У одного из пациентов при оперативном вмешательстве через два месяца был забран для определения химеризма образец кости. Было выявлено 0,8% остеобластов донорского происхождения. У 3 из 5 пациентов наблюдалось ускорение линейного роста в течение 3 месяцев после трансфузий.

Несмотря на то, что алло-ТКМ и дополнительные последующие инфузии клеток костного мозга, по крайней мере, у части пациентов с НО могут приводить к выраженным позитивным сдвигам в течение заболевания, последние носят лишь временный характер. Это не позволяет широко использовать этот метод лечения, так как в настоящий момент алло-ТКМ характеризуется высоким риском развития серьезных осложнений и даже смерти [109].

Источники происхождения остеобластов -

новые концепции

Несмотря на то, что клетки с мультипотентны-ми потенциями к дифференцировке в направлении скелетных тканей были выделены из костного мозга А.Я. Фриденштейном еще в 60-х годах прошлого века, фенотип «стволовых» остеогенных клеток остается по-прежнему не ясным. Для более глубокого понимания организации остеобластического клеточного дифферона нужны новые методы исследования, способные дать информацию о динамике клеточных популяций in vivo. Такую информацию возможно получить при использовании трансгенных мышей с индуцибельными репортерными генами, находящимися под контролем линейно-специфичных промоторов [110]. Использование таких мышей позволяет визуализировать отдельные популяции клеток в необходимое время при введении индуцирующего экспрессию агента, а также отслеживать их дальнейшую судьбу (метод отслеживания клеточных поколений, lineage tracing). В более сложных системах используется несколько репортерных линейно-специфичных генов, позволяя анализировать происхождение и взаимодействия различных популяций клеток. Наконец, в составе репортера может быть встроен индуцибельный «суицидный ген», позволяющий в случае необходимости вызывать абляцию определенной линии клеток и, например, изучать источники ее регенерации. Еще одной важным подвидом этой группы методов является мечение клеток с их последующим вытеснением вновь образующимися немечеными популяциями (pulse-chase), что позволяет оценить продолжительность существования клеток.

В настоящий момент перечисленные выше методы активно применяются, в том числе, и для более детального изучения организации остеобластического клеточного дифферона. Данные, полученные в этих исследованиях, могут изменить наши традиционные представления об остеобластогенезе и методах клеточной терапии НО.

D. Park at al. (2012) показали, что стромальные клетки костного мозга , экспрессирующие фактор транскрипции Mx-1+, являются основным источником вновь образующихся остеобластов у взрослых животных [20]. Mx-1+ стромальные клетки включают до 80% КОЕ-Ф костного мозга, обладают муль-тилинейным потенциалом in vitro, однако in vivo дифференцируются фактически только в остеобласты. Эта популяция клеток активно участвует в ре-паративной регенерации костной ткани и способна к миграции в костный мозг при системной трансплантации. Тем не менее, потенциал к системной миграции Mx-1+ стромальных клеток в 5 раз менее выражен в сравнении с ГСК. В свою очередь, научная группа Zhou B. et al. продемонстрировала, что LepR + стромальные клетки костного мозга включают в себя

практически все КОЕ-Ф костного мозга [111]. Они ассоциированы с синусоидами и артериолами костного мозга, проявляют мультипотентный потенциал in vitro, однако в физиологических условиях in vivo являются источником остеобластов, адипоцитов и стромальных клеток, но не хондроцитов. При этом их роль в остеогенезе увеличивается с возрастом. Они являются источником до 3-10% вновь образующихся остеобластов метафизов и диафизов у 2-месячных животных, до 23% у 6-месячных, до 43—67% у 10-месячных и до 61—81% у более старых животных. Более того, эта популяция клеток является основным источником адипоцитов костного мозга. В физиологических условиях LepR+ стромальные клетки находятся в состоянии покоя, однако начинают быстро пролиферировать после облучения или травматического повреждения костей, дифференцируясь, в том числе, и хондроциты. Интересно, что стимуляция LepR рецептора физиологическим ли-гандом лептином ингибирует остеогенную и потенцирует адипогенную дифференцировку клеток [112].

С другой стороны, в нескольких исследованиях в области метафизов и эпифизов трубчатых костей было обнаружено существование отдельной популяции клеток, дающей начало остеобластам, хондро-цитам и стромальным клеткам in vivo, но никогда — адипоцитам [113, 114]. По крайней мере, часть этой популяции клеток характеризуется экспрессией Gremlin 1 [113]. При использовании метода отслеживания клеточных поколений (lineage tracing), было продемонстрировано, что через 4 недели после индукции Grem1 + стали источником происхождения 64% остеобластов и 50% хондроцитов в эпифизах и метафизах с незначительным вкладом в клетки ме-тафизов трубчатых костей. Деплеция Grem1 + клеток ассоциируется с характерным фенотипом у мышей:

маленькими размерами и низким объемом костной ткани. В то же время остеохондральные клетки-предшественницы являются гетерогенной популяцией в отношении потенций к дифференцировке in vivo. Изучая дериваты, получаемые при гетеротопической трансплантации различных субпопуляций остеохон-дральных клеток новорожденных мышей, C.K. Chan et al. (2015) установили структурную иерархию клеточной линии, включая идентификацию фенотипа потенциальной остеохондральной скелетной стволовой клетки (CD45-/Ter-/119-/Tie2-/AlphaV+/Thy-/6C3-/ CD105-/CD200 + ) [114].

Таким образом, полученные в этих исследованиях данные могут свидетельствовать в пользу существования в костной ткани, по меньшей мере, двух отдельных клеточных дифферонов, которые могут с различной степенью интенсивности принимать участие в образовании новых остеобластов в зависимости от локализации и фазы онтогенеза [112]. Во время формирования и активного роста костей большую роль, по-видимому, играют остео-хондральные клетки-предшественницы, в то время как у взрослого организма в обновлении костной ткани ведущая роль может принадлежать пери-синусоидальным клеткам костного мозга (рис.). Обе популяции клеток могут принимать активное участие в репаративном остеогенезе. Тем не менее, в настоящий момент данную концепцию нельзя назвать доказанной. Группа I. Matic et al. (2016), используя наиболее чувствительные методы анализа, показала, что Grem1+, AlphaSMA+, а также перисинусоидальные стромальные клетки могут не принимать активного участия в физиологической регенерации костной ткани у взрослых мышей [115]. В их исследовании при тотальной абляции остеобластов основным источником вновь

Рис. Гипотетическая модель, описывающая вклад двух типов клеток-предшественниц в образование основных видов клеток кости на разных этапах онтогенеза: ОХКП — остеохондральная клетка-предшественница; МСК — мультипотентная стромальная клетка

формирующихся клеток являлись выстилающие кость клетки. Фенотип кость выстилающих клеток изучен достаточно плохо и по классическим представлениям выстилающие кость клетки являются постмитотическими плоскими остеобластами с неясными функциями [116]. Matic I. et al. использовали высокочувствительный ген-репортер под контролем промотора протеина 1 матрикса дентина. В свою очередь промотор управлялся индуцибель-ной тамоксифеном Cre-рекомбиназой. Использование такого трансгена позволяет визуализировать остеобласты, остеоциты и выстилающие кость клетки по экспрессии флуоресцентного белка dTomato на любой фазе онтогенеза при введении тамоксифена [117, 118]. Второй трансген Col2.3DeltaTK позволяет проводить деплецию популяции остеобластов, экспрессирующих альфа1 цепь коллагена 1 типа, при введении ганциклови-ра. Использование взрослых мышей, несущих оба трансгена, позволила авторам проводить абляцию остеобластов и визуализировать выстилающие кость клетки, которые не экспрессируют а1 цепь коллагена 1 типа. В течение 21 дня после абляции происходило повсеместное восстановление популяции остеобластов и фактически все они несли флуоресцентный белок dTomato, свидетельствуя о том, что выстилающие кость клетки являлись источником образования остеобластов. При этом в отличие от Grem1+ и aSMA+ клеток, в репаративном остеогенезе выстилающие кость клетки принимают минимальное участие.

заключение

Заместительная клеточная терапия, основной целью которой является высокий уровень стабильной химеризации остеобластического клеточного дифферона, имеет потенциал к излечению НО. Открытие Александром Яковлевичем Фриденштейном стромальных клеток костного мозга (или МСК), способных дифференцироваться в клетки скелетных тканей in vitro и in vivo, предопределило огромный интерес исследователей к использованию именно этой популяции клеток для подобного вида терапии. При этом, исходя из типа клеток, проводимые исследования можно разделить на две группы: с использованием ex vivo культивированных клеток костного мозга и с использованием свежевыделенных клеток костного мозга. Проведенные экспериментальные и клинические исследования показали, что использование обоих типов клеток может приводить к положительным сдвигам в течении заболевания, однако, по-видимому, благодаря разным механизмам. Ex vivo культивированные МСК способны стимулировать линейный рост пациентов со средне-тяжелыми формами НО благодаря непрямым пара-кринным воздействиям. В связи с этим механизм их терапевтического действия в большей степени соответствует гипотезе «медицинских сигнализирующих клеток» Арнольда Каплана [36]. Отдельной строкой необходимо рассматривать опубликованные случаи внутриутробного введения МСК пациентам с НО. Использование МСК фетальной печени, пластичность организма и отсутствие иммунных механизмов отторжения на данном этапе развития, особенности распределения клеток при введении в пупочную вену, по-видимому, предопределили вы-

сокие уровни остеобластического химеризма и относительно благоприятные клинические исходы. В данном случае механизм действия использованной популяции клеток больше соответствует классической гипотезе мезенхимных стволовых клеток [30]. Использование свежевыделенных клеток костного мозга в виде трансплантации костного мозга и последующих дополнительных инфузий обедненных Т-лимфоцитами клеток может приводить, по крайней мере у части пациентов, к временной химери-зации костной ткани и некоторым благоприятным терапевтическим эффектам: интенсификации линейного роста, снижению частоты переломов и увеличению общей массы костного минерального компонента. В данном случае механизм действия в целом соответствует концепции стволовых клеток скелетных тканей [33].

Все перечисленные методы клеточной терапии НО приводят лишь к временным позитивным сдвигам в течении заболевания, что налагает существенные ограничения на их применение. Так, например, трансплантация аллогенного костного мозга сопровождается высокими рисками серьезных осложнений и даже смерти, и ее применению должна предшествовать тщательная оценка ожидаемых выгоды и рисков. Ex vivo культивированные МСК могут подвергаться иммунному отторжению, особенно при повторных инфузиях. Решение этой проблемы, по крайней мере частичное, может заключаться в поиске HLA-совместимых доноров. Наиболее перспективным в отношении ожидаемого терапевтического действия представляется внутриутробное введение МСК. Однако ограничениями этого метода могут являться риски, связанные с внутриутробным вмешательством, и необходимость диагностики НО на пренатальном этапе. В то же время, учитывая крайне скудный арсенал и низкую эффективность существующих в настоящее время методов лечения среднетяжелых форм НО, клеточная терапия с использованием МСК имеет хороший потенциал. Особенно это касается ex vivo культивированных МСК, т.к. терапия с использованием этого типа клеток продемонстрировала безопасность во многих клинических испытаниях [119].

Основная цель клеточной терапии НО — высокий уровень стабильной химеризации остеобластического клеточного дифферона, в настоящее время не достигнута. Решение этой проблемы должно основываться на глубоком понимании механизмов обновления клеток in vivo. Первые данные, полученные с использованием сложных модельных систем — трансгенных мышей, показали, что механизмы обновления остеобластов достаточно сложны и в зависимости от локализации, стадии онтогенеза, текущей ситуации (физиологическая или репара-тивная регенерация) источником вновь формирующихся остеобластов могут быть разные популяции остеогенных клеток-предшественниц, в том числе со свойствами «стволовости». Необходимо накопление и осмысление большего количества экспериментальных данных. По-видимому, не все популяции остеогенных клеток-предшественниц могут иметь достаточный потенциал к миграции и приживлению при системном введении, однако точная идентификация их фенотипа в любом случае необходима для радикального лечения НО, например, с помощью генной терапии in vivo.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Steiner R.D., Adsit J., Basel D. COL1A1/2-Related Osteogenesis Imperfecta. In: Pagon R.A., Adam M.P., Ardinger H.H. et al., editors. Gene Reviews. Seattle tWA): University of Washington, Seattle; 1993-2017.

2. Lindahl K., Langdahl B., Ljunggren Ö. et al. Treatment of osteogenesis imperfecta in adults. Eur. J. Endocrinol. 2014; 171(2): R79-90.

3. Andersen P.E. Jr., Hauge M. Osteogenesis imperfecta: a genetic, radiological, and epidemiological study. Clin. Genet. 1989; 36(4): 250-5.

4. Kuurila K., Kaitila I., Johansson R. et al. Hearing loss in Finnish adults with osteogenesis imperfecta: a nationwide survey. Ann Otol. Rhinol. Laryngol. 2002; 111(10): 939-46.

5. Orioli I.M., Castilla E.E., Barbosa-Neto J.G. The birth prevalence rates for the skeletal dysplasias. J. Med. Genet. 1986; 23(4): 328-32.

6. Sakkers R., Kok D., Engelbert R. et al. Skeletal effects and functional outcome with olpadronate in children with osteogenesis imperfecta: a 2-year randomised placebo-controlled study. Lancet 2004; 363(9419): 1427-31.

7. Bishop N., Adami S., Ahmed S.F. et al. Risedronate in children with osteogenesis imperfecta: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet 2013; 382(9902): 1424-32.

8. Rauch F., Munns C.F., Land C. et al. Risedronate in the treatment of mild pediatric osteogenesis imperfecta: a randomized placebo-controlled study. J. Bone Miner. Res. 2009; 24(7): 1282-9.

9. Ward L.M., Rauch F., Whyte M.P. et al. Alendronate for the treatment of pediatric osteogenesis imperfecta: a randomized placebo-controlled study. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2011; 96(2): 355-64.

10. Dwan K., Phillipi C.A., Steiner R.D. et al. Bisphosphonate therapy for osteogenesis imperfecta. Cochrane Database Syst. Rev. 2016; 10: CD005088.

11. Цыган Е.Н., Деев Р.В. Морфофункциональные основы осте-опороза. Санкт-Петербург, 2005.

12. Фриденштейн А.Я., Лалыкина К.С. Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предшественники. Москва: «Медицина»,1973.

13. Dor Y., Brown J., Martinez O.I., Melton D.A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature 2004; 429(6987): 41-6.

14. Li L., Clevers H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science 2010; 327(5965): 542-5.

15. Kalajzic Z., Li H., Wang L.P. et al. Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population. Bone 2008; 43(3): 501-10.

16. McCulloch C.A., Heersche J.N. Lifetime of the osteoblast in mouse periodontium. Anat. Rec. 1988; 222: 128-35.

17. Owen M., MacPherson S. Cell Population Kinetics of an Osteogenic Tissue. J. Cell Biol. 1963; 19: 33-44.

18. Dominici M., Rasini V., Bussolari R. et al. Restoration and reversible expansion of the osteoblastic hematopoietic stem cell niche after marrow radioablation. Blood 2009; 114(11): 2333-43.

19. McCulloch C.A., Heersche J.N. Lifetime of the osteoblast in mouse periodontium. Anat. Rec. 1988; 222: 128-35.

20. Park D., Spencer J.A., Koh B.I. et al. Endogenous bone marrow MSCs are dynamic, fate-restricted participants in bone maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 2012; 10(3): 259-72.

21. Jilka R.L., Weinstein R.S., Parfitt A.M. et al. Quantifying osteoblast and osteocyte apoptosis: challenges and rewards. J. Bone Miner Res. 2007; 22: 1492-501.

22. Parfitt A.M., Han Z.H., Palnitkar S. et al. Effects of ethnicity and age or menopause on osteoblast function, bone mineralization, and osteoid accumulation in iliac bone. J. Bone Miner Res 1997; 12: 1864-73.

24. Friedenstein A., Kuralesova A.I. Osteogenic precursor cells of bone marrow in radiation chimeras. Transplantation 1971; 12(2): 99-108.

25. Friedenstein A.J., Chailakhyan R.K., Latsinik N.V. et al. Stromal cells responsible for transferring the microenvironment of the hemopoietic tissues. Cloning in vitro and retransplantation in vivo. Transplantation 1974; 17(4): 331-40.

26. Чайлахян Р.К., Лациник Н.В., Герасимов Ю.В. и др. Жизнь в науке. Памяти Ученого и Учителя Александра Яковлевича Фри-денштейна посвящается. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; 4(1): 9-12.

27. Friedenstein A.J., Chailakhyan R.K., Gerasimov U.V. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in diffusion chambers. Cell Tiss. Kinet. 1987; 20(3): 263-72.

28. Чайлахян Р.К., Фриденштейн А.Я., Васильев А.В. Клоноо-бразование в монослойных культурах костного мозга. Бюлл. эксп. биол. мед. 1970; 12(9): 1147-55.

29. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Лациник Н.В. и др. Стромальные клетки, ответственные за перенос микроокружения в кроветворной и лимфойдной ткани. Пробл. гемат. перелив. крови. 1973; 10: 14-23.

30. Caplan A.I. Mesenchymal stem cells. J. Orthop. Res. 1991; 9(5): 641-50.

31. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284(5411): 143-7.

32. da Silva Meirelles L., Chagastelles P.C., Nardi N.B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. J. Cell Sci. 2006: 119; 2204-13.

33. Bianco P., Robey P.G. Skeletal stem cells. Development 2015; 142: 1023-7.

34. Bianco P., Kuznetsov S.A., Riminucci M. et al. Postnatal skeletal stem cells. Methods Enzymol. 2006; 419: 117-48.

35. Caplan A.I. What's in a name? Tissue Eng. Part A. 2010; 16(8): 2415-7.

36. Caplan A.I., Correa D. The MSC: an injury drugstore. Cell Stem Cell. 2011; 9(1): 11-5.

37. Caplan A.I. Biomaterials and bone repair. Biomaterials 1988; 87: 15-24.

38. Caplan A.I. The mesengenic process. Clin. Plast. Surg. 1994; 21(3): 429-35.

39. Rehman J. Replicability of high-impact papers in stem cell research. https://thenextregeneration.wordpress.com/2013/07/23/ replicability-of-high-impact-papers-in-stem-cell-research/

40. Feisst V., Meidinger S., Locke M.B. From bench to bedside: use of human adipose-derived stem cells. Stem Cells Cloning 2015; 8: 149-62.

41. Foronjy R.F., Majka S.M. The potential for resident lung mesenchymal stem cells to promote functional tissue regeneration: understanding microenvironmental cues. Cells 2012; 1(4): 874.

42. Subramani B., Subbannagounder S., Palanivel S. et al. Generation and characterization of human cardiac resident and non-resident mesenchymal stem cell. Cytotechnology 2016; 68(5): 2061-73.

43. Ozen I., Boix J., Paul G. Perivascular mesenchymal stem cells in the adult human brain: a future target for neuroregeneration? Clin. Transl. Med. 2012; 1(1): 30.

44. Meng X., Ichim T.E., Zhong J. et al. Endometrial regenerative cells: a novel stem cell population. J. Transl. Med. 2007; 5: 57.

45. Talwadekar M.D., Kale V.P., Limaye L.S. Placenta-derived mesenchymal stem cells possess better immunoregulatory properties compared to their cord-derived counterparts-a paired sample study. Sci. Rep. 2015; 5: 15784.

46. Sohni A., Verfaillie C.M. Multipotent adult progenitor cells. Best Pract. Res. Clin. Haematol. 2011; 24(1): 3-11.

47. D'Ippolito G., Diabira S., Howard G.A. et al. Marrow-isolated adult multilineage inducible (MIAMI) cells, a unique population of postnatal young and old human cells with extensive expansion and differentiation potential. J. Cell Sci. 2004; 117(Pt 14): 2971-81.

48. Wakao S., Kitada M., Kuroda Y. et al. Multilineage-differentiating stress-enduring (Muse) cells are a primary source of induced pluripotent stem cells in human fibroblasts. PNAS USA 2011; 108(24): 9875-80.

49. Horwitz E.M., Le Blanc K., Dominici M. et al. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2005; 7(5): 393-5.

50. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy 2006; 8(4): 315-7.

51. Ruetze M., Richter W. Adipose-derived stromal cells for osteoarticular repair: trophic function versus stem cell activity. Expert Rev. Mol. Med. 2014; 16: e9.

52. Medici D., Shore E.M., Lounev V.Y. et al. Conversion of vascular endothelial cells into multipotent stem-like cells. Nat. Med. 2010; 16: 1400-6.

53. Sacchetti B., Funari A., Michienzi S. et al. Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment. Cell 2007; 131(2): 324-36.

54. Bianco P., Robey P.G., Simmons P.J. Mesenchymal stem cells: revisiting history, concepts, and assays. Cell Stem Cell 2008; 2(4): 313-9.

55. Hass R., Kasper C., Böhm S., Jacobs R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun. Signal 2011; 9: 12.

56. Marquez-Curtis L.A., Janowska-Wieczorek A., McGann L.E. et al. Mesenchymal stromal cells derived from various tissues: Biological, clinical and cryopreservation aspects. Cryobiology 2015; 71(2): 18197.

57. Caplan A.I., Dennis J.E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J. Cell Biochem. 2006; 98(5): 1076-84.

58. Baraniak P.R., McDevitt T.C. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regen. Med. 2010; 5(1): 121-43.

59. Lin P., Correa D., Kean T.J. et al. Serial transplantation and long-term engraftment of intra-arterially delivered clonally derived mesenchymal stem cells to injured bone marrow. Mol. Ther. 2014; 22(1): 160-8.

60. Li F., Niyibizi C. Engraftability of murine bone marrow-derived multipotent mesenchymal stem cell subpopulations in the tissues of developing mice following systemic transplantation. Cells Tissues Organs 2016; 201(1): 14-25.

61. Li F., Wang X., Niyibizi C. Bone marrow stromal cells contribute to bone formation following infusion into femoral cavities of a mouse model of osteogenesis imperfecta. Bone 2010; 47(3): 546-55.

62. Li F., Wang X., Niyibizi C. Distribution of single-cell expanded marrow derived progenitors in a developing mouse model of osteogenesis imperfecta following systemic transplantation. Stem Cells 2007; 25(12): 3183-93.

63. Jones G.N., Moschidou D., Lay K. et al. Upregulating CXCR4 in human fetal mesenchymal stem cells enhances engraftment and bone mechanics in a mouse model of osteogenesis imperfecta. Stem Cells Transl Med. 2012; 1(1): 70-8.

64. Dominici M., Pritchard C., Garlits J.E. et al. Hematopoietic cells and osteoblasts are derived from a common marrow progenitor after bone marrow transplantation. PNAS USA 2004; 101(32): 11761-6.

65. Otsuru S., Gordon P.L., Shimono K. et al. Transplanted bone marrow mononuclear cells and MSCs impart clinical benefit to children with osteogenesis imperfecta through different mechanisms. Blood 2012; 120(9): 1933-41.

66. Ishihara A., Ohmine K., Weisbrode S.E. et al. Effect of intra-medullar and intra-venous infusions of mesenchymal stem cells on cell engraftment by in-vivo cell tracking and osteoinductivity in rabbit long bones: a pilot study. Orthop. Muscular Syst. 2014; 3(3) pii: 1000172.

67. Lange C., Reimer R., Zustin J. et al. Mesenchymal stromal cells protect from consequences of HSCT-transplantation preparatory irradiation: insights into possible mechanisms. Cellular Therapy and Transplantation 2016; 5(2); 50-8.

68. Horwitz E.M., Gordon P.L., Koo W.K. et al. Isolated allogeneic bone marrow-derived mesenchymal cells engraft and stimulate growth in children with osteogenesis imperfecta: Implications for cell therapy of bone. PNAS USA 2002; 99(13): 8932-7.

69. Repeated infusions of mesenchymal stromal cells in children with osteogenesis imperfecta (STOD3). https://clinicaltrials.gov/ct2/ show/NCT01061099

70. Mesenchymal stem cell based therapy for the treatment of osteogenesis imperfecta (TERCELOI). https://clinicaltrials.gov/ct2/ show/NCT02172885

71. Le Blanc K., Götherström C., Ringden O. et al. Fetal mesenchymal stem-cell engraftment in bone after in utero transplantation in a patient with severe osteogenesis imperfecta. Transplantation 2005; 79(11): 1607-14.

72. Götherström C., Westgren M., Shaw S.W. et al. Pre-and postnatal transplantation of fetal mesenchymal stem cells in osteogenesis imperfecta: a two-center experience. Stem Cells Transl Med. 2014; 3(2): 255-64.

73. Zhang Z.Y., Teoh S.H., Chong M.S. et al. Superior osteogenic capacity for bone tissue engineering of fetal compared with perinatal and adult mesenchymal stem cells. Stem cells 2009; 27: 126-137.

74. Chan J., Waddington S.N., O'Donoghue K. et al. Widespread distribution and muscle differentiation of human fetal mesenchymal stem cells after intrauterine transplantation in dystrophic mdx mouse. Stem cells 2007; 25: 875-884.

75. BOOSTB4 - Boost Brittle Bones Before Birth. http:// boostb4.eu/

76. Moll G., Rasmusson-Duprez I., von Bahr L. et al. Are therapeutic human mesenchymal stromal cells compatible with human blood? Stem Cells 2012; 30(7): 1565-74.

77. Li Y., Lin F. Mesenchymal stem cells are injured by complement after their contact with serum. Blood 2012; 120(17): 3436-43.

78. Soland M.A., Bego M., Colletti E. et al. Mesenchymal stem cells engineered to inhibit complement-mediated damage. PLoS One 2013; 8(3): e60461.

79. Li Y., Qiu W., Zhang L. et al. Painting factor H onto mesenchymal stem cells protects the cells from complement- and neutrophil-mediated damage. Biomaterials 2016; 102:209-19.

80. Rombouts W.J., Ploemacher R.E. Primary murine MSC show highly efficient homing to the bone marrow but lose homing ability following culture. Leukemia 2003; 17(1): 160-70.

81. Wynn R.F., Hart C.A., Corradi-Perini C. et al. A small proportion of mesenchymal stem cells strongly expresses functionally active CXCR4 receptor capable of promoting migration to bone marrow. Blood 2004; 104(9): 2643-5.

82. Li N., Yang Y.J., Qian H.Y. et al. Intravenous administration of atorvastatin-pretreated mesenchymal stem cells improves cardiac performance after acute myocardial infarction: role of CXCR4. Am. J. Transl. Res. 2015; 7(6): 1058-70.

83. Liu H., Xue W., Ge G. et al. Hypoxic preconditioning advances CXCR4 and CXCR7 expression by activating HIF-1a in MSCs. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010; 401(4): 509-15.

84. Jones G.N., Moschidou D., Lay K. et al. Upregulating CXCR4 in human fetal mesenchymal stem cells enhances engraftment and bone

mechanics in a mouse model of osteogenesis imperfecta. Stem Cells Transl. Med. 2012; 1(1): 70-8.

85. Walasek M.A., van Os R., de Haan G. Hematopoietic stem cell expansion: challenges and opportunities. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2012; 1266: 138-50.

86. Marino R., Otsuru S., Hofmann T.J. et al. Delayed marrow infusion in mice enhances hematopoietic and osteopoietic engraftment by facilitating transient expansion of the osteoblastic niche. Biol. Blood Marrow Transplant. 2013; 19(11): 1566-73.

87. Copelan E.A. Hematopoietic stem-cell transplantation. NEJM 2006; 354(17): 1813-26.

88. Lucchini G., Labopin M., Beohou E. et al. Impact of conditioning regimen on outcomes for children with acute myeloid leukemia transplanted in first complete remission. An analysis on behalf of the Pediatric Disease Working Party of the Ebmt. Biol. Blood Marrow Transplant. 2016 pii: S1083-8791(16)30522-5.

89. Schindeler A., McDonald M.M., Bokko P. et al. Bone remodeling during fracture repair: The cellular picture. Semin. Cell Dev. Biol. 2008; 19(5): 459-66.

90. Obermeyer T.S., Yonick D., Lauing K. et al. Mesenchymal stem cells facilitate fracture repair in an alcohol-induced impaired healing model. J. Orthop. Trauma 2012; 26(12): 712-8.

91. Granero-Molto F., Weis J.A., Miga M.I. et al. Regenerative effects of transplanted mesenchymal stem cells in fracture healing. Stem Cells 2009; 27(8): 1887-98.

92. Rapp A.E., Bindl R., Heilmann A. et al. Systemic mesenchymal stem cell administration enhances bone formation in fracture repair but not load-induced bone formation. Eur. Cell Mater. 2015; 29: 22-34.

93. Amado L.C., Saliaris A.P., Schuleri K.H. et al. Cardiac repair with intramyocardial injection of allogeneic mesenchymal stem cells after myocardial infarction. PNAS USA 2005; 102(32): 11474-9.

94. Quevedo H.C., Hatzistergos K.E., Oskouei B.N. et al. Allogeneic mesenchymal stem cells restore cardiac function in chronic ischemic cardiomyopathy via trilineage differentiating capacity. PNAS USA. 2009; 106(33): 14022-7.

95. Nauta A.J., Westerhuis G., Kruisselbrink A.B. et al. Donor-derived mesenchymal stem cells are immunogenic in an allogeneic host and stimulate donor graft rejection in a nonmyeloablative setting. Blood 2006; 108(6): 2114-20.

96. Zangi L., Margalit R., Reich-Zeliger S. et al. Direct imaging of immune rejection and memory induction by allogeneic mesenchymal stromal cells. Stem Cells 2009; 27(11): 2865-74.

97. Long M.W., Williams J.L., Mann K.G. Expression of human bone related proteins in the hematopoietic microenvironment. J. Clin. Invest. 1990; 86: 138795.

98. Olmsted-Davis E.A., Gugala Z., Camargo F. et al. Primitive adult hematopoietic stem cells can function as osteoblast precursors. PNAS USA 2003; 100: 1587782.

99. Деев Р.В., Цупкина Н.В., Сергеев В.С. и др. Особенности физиологического и репаративного остеогенеза после трансфузии ядросодержащих клеток костного мозга. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2006; I(3): 54-8.

100. Marino R., Martinez C., Boyd K. et al. Transplantable marrow osteoprogenitors engraf in discrete saturable sites in the marrow microenvironment. Exp. Hematol 2008; 36: 3608.

101. Otsuru S., Hofmann T.J., Rasini V. et al. Osteopoietic engraftment after bone marrow transplantation: effect of inbred strain of mice. Exp. Hematol. 2010; 38(9): 836-44.

102. Nilsson S.K., Dooner M.S., Weier H.U. et al. Cells capable of bone production engraft from whole bone marrow transplants in nonablated mice. J. Exp. Med. 1999; 189(4): 729-34.

103. Dominici M., Marino R., Rasini V. et al. Donor cell-derived osteopoiesis originates from a self-renewing stem cell with a limited regenerative contribution after transplantation. Blood 2008; 111: 438691.

104. Otsuru S., Rasini V., Bussolari R. et al. Cytokine-induced osteopoietic differentiation of transplanted marrow cells. Blood 2011; 118(8): 2358-61.

105. Деев Р.В., Цупкина Н.В., Сериков В.Б. и др. Участие транс-фузированных клеток костного мозга в репаративном остеогенезе. Цитология 2005; 9: 755-9.

106. Bozo I.Y. Restoration of bone marrow niches is the basis of optimization of HSC engraftment. Cell therapy and transplantation 2011; 3(10): e.000095.01.

107. Horwitz E.M., Prockop D.J., Fitzpatrick L.A. et al. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nat. Med. 1999; 5(3): 309-13.

108. Horwitz E.M., Prockop D.J., Gordon P.L. et al. Clinical responses to bone marrow transplantation in children with severe osteogenesis imperfecta. Blood 2001; 97(5): 1227-31.

109. Mateos M.K., O'Brien T.A., Oswald C. Transplant-related mortality following allogeneic hematopoeitic stem cell transplantation for pediatric acute lymphoblastic leukemia: 25-year retrospective review. Pediatr. Blood Cancer 2013; 60(9): 1520-7.

110. Kretzschmar K., Wattcor F.M. Lineage Tracing. Cell 2012; 148(1-2): 33-45.

111. Zhou B.O., Yue R., Murphy M.M. et al. Leptin-receptor-expressing mesenchymal stromal cells represent the main source of bone formed by adult bone marrow. Cell Stem Cell 2014; 15(2): 154-68.

112. Yue R., Zhou B.O., Shimada I.S. et al. Leptin receptor promotes adipogenesis and reduces osteogenesis by regulating mesenchymal stromal cells in adult bone marrow. Cell Stem Cell 2016; 18(6): 782-96.

113. Worthley D.L., Churchill M., Compton J.T. et al. Gremlin 1 identifies a skeletal stem cell with bone, cartilage, and reticular stromal potential. Cell 2015; 160(1-2): 269-84.

114. Chan C.K., Seo E.Y., Chen J.Y. et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell 2015; 160(1-2): 285-98.

115. Matic I., Matthews B.G., Wang X. et al. Quiescent bone lining cells are a major source of osteoblasts during adulthood. Stem Cells 2016; 34(12): 2930-42.

116. Miller S.C., de Saint-Georges L., Bowman B.M., Jee W.S. Bone lining cells: structure and function. Scan. Microsc. 1989; 3(3): 953-60.

117. Kim S.W., Pajevic P.D., Selig M. et al. Intermittent parathyroid hormone administration converts quiescent lining cells to active osteoblasts. J. Bone Miner. Res. 2012; 27(10): 2075-84.

118. Powell W.F. Jr., Barry K.J., Tulum I. et al. Targeted ablation of the PTH/PTHrP receptor in osteocytes impairs bone structure and homeostatic calcemic responses. J. Endocrinol. 2011; 209(1): 21-32.

119. Lalu M.M., McIntyre L., Pugliese C. et al. Safety of cell therapy with mesenchymal stromal cells (SafeCell): a systematic review and meta-analysis of clinical trials. PLoS One 2012; 7(10): e47559.

Поступила: 18.11.2016