ШТАММ ГРИБА Stagonospora cirsii Davis, ОБЛАДАЮЩИЙ ГЕРБИЦИДНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ БОДЯКА ПОЛЕВОГО
STRAIN OF FUNGUS Stagonospora cirsii Davis HAVING HERBICIDAL ACTIVITY AGAINST CANADA THISTLE

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, в частности, к области защиты растений, в частности борьбы с нежелательной растительностью. Может быть использован для получения микогербицида для борьбы с Cirsium arvense L.
2
Известно, что бодяк полевой (Cirsium arvense) и близкие к нему виды - бодяк щетинистый (С.setosum) и бодяк седой (С.incanum) - многолетние корнеотпрысковые сорные растения. В мировом земледелии потери урожая при средней засоренности посевов (около 15 растений/м) этими видами Cirsium ряда культур составляют около 10%. Применение химических гербицидов оправдано уже при плотности их произрастания 2-3 шт./кв.м. (Donald, 1994; Ульянова, 1997 [8,4]).
В качестве продуцентов микогербицидов для борьбы с бодяком полевым ранее были предложены различные виды фитопатогенных грибов, например: Septoria cirsii (Hershenhorn et al., 1993 [11]), Sclerotinia sclerotiorum (Bourdot et al., 2006, [7]), Alternaria cirsinoxia (Green&Bailey, 2000, [9]), Phoma destructiva (Guske et al., 2004, [10]) и P. macrostoma (Bailey&Derby, 2006, [5]). При заражении бодяка полевого измельченным мицелием Septoria cirsii с инфекционной нагрузкой 80 г/л и 48 часовом периоде повышенного увлажнения листьев поражение в контролируемых условиях вызывает гибель растений (Leth, 1988 [12]). Однако такой длительный период увлажнения, необходимый для эффективного поражения растений бодяка полевого Septoria cirsii, сложно воспроизвести в полевых условиях. Alternaria cirsinoxiae и Phoma destructiva поражают лишь нижние листья сорняка. Sclerotinia sclerotiorum и Phoma macrostoma обладают широкой специализацией, поражая широкий круг двудольных растений.
8
6
В качестве продуцента микогербицида для борьбы с бодяком полевым известен штамм гриба Stagonospora cirsii Davis 1.41 (ВИЗР), принятый за прототип. На зерновых субстратах интенсивность спороношения штамма 1.41 (ВИЗР) S.cirsii составляла 5,1×10 конидий/г субстрата. Патогенность на листовых дисках штамма 1.41 (ВИЗР) S.cirsii при инфекционной нагрузке 5×10 конидий/мл была около 50%. Такую же патогенность проявляла водная суспензия на основе мицелия этого штамма в концентрации 100 мг/мл. Выход вирулентного мицелия на сахарозно-соевой среде составлял 36 г/л. Преимуществом штамма 1.41 (ВИЗР) по сравнению с прототипом штаммом гриба Phoma macrostoma являлась высокая специфичность гриба S.cirsii, приуроченного к семейству Asteraceae (Сокорнова, 2011, [3]), к недостаткам этого штамма можно отнести невысокую эффективность.
Задачей изобретения является получение штамма, превосходящего штамм 1.41 (ВИЗР) S.cirsii по гербицидной активности в отношении бодяка полевого и близкородственных видов - С.setosum, С.incanum, продуктивности биомассы и не уступающем ему по специфичности действия.
Поставленная задача была решена путем получения штамма гриба Stagonospora cirsii Davis номер 1.42 (ВИЗР). Он был выделен из листьев бодяка полевого (Cirsium arvense L. Scop.). Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов ГНУ ВИЗР Россельхозакадемии. Его коллекционный номер 1.42 (ВИЗР).
Штамм предназначен для биологической борьбы с бодяком полевым. Штамм 1.42 (ВИЗР) был отобран путем скрининга входящих в коллекцию штаммов Stagonospora cirsii Davis, выделенных из бодяка полевого, различного географического происхождения. Скрининг штаммов проводился по результатам экспресс-метода определения патогенности по площади некрозов, образующихся на третьи сутки, на высечках из листьев бодяка (Berestetskiy et al., 2007, [6]) и по скорости роста на картофельно-глюкозном агаре (КГА). Патогенность отобранного штамма была подтверждена в опытах на целых растениях бодяка полевого. Специализация штамма изучалась на целых растениях 6 семейств в контролируемых условиях.
Штамм был выделен А.О.Берестецким из пораженных пятнистостью листьев Cirsium arvense L. из образца, собранного в Пензенской области п/о Лунево в 2003 году.
Идентификация проводилась по определителю Saccardo (Saccardo, 1921, [13]).
Штамм депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов ГНУ ВИЗР Россельхозакадемии, где ему присвоен коллекционный номер 1.42 (ВИЗР). Штамм предназначен для разработки биогербицида против бодяка полевого и близкородственных видов.
Культурально-морфологические особенности штамма S.cirsii 1.42 (ВИЗР).
Штамм 1.42 (ВИЗР) в гербарном материале дает спороношение в виде пикнид. Конидии цилиндрические, с округлыми вершинами, прямые или слегка изогнутые, бесцветные, с 1-3, редко с 4 перегородками или без перегородок, без перетяжек, (16) 21-23 (28)×(4) 5-6 (7) мкм.
В чистой культуре штамм хорошо растет на картофельно-глюкозной среде, образуя белые, бархатисто-пушистые колонии, темнеющие с возрастом. Пикниды формируются только при освещении колоний эритемными лампами (например, ЛЭ-30 с длиной волны 290-400 нм). Пикниды 120-150 мкм диам., округлые, полушаровидные, одиночные, с 1 (до 4-х) отверстием, коричневые, позже становятся черными. Конидиальная слизь кремовая, светло-оранжевая, до розоватого цвета. Конидии, полученные в чистой культуре, преимущественно без перегородок (более 70%) с многочисленными жировыми включениями (4.5) 7-14×2-3.5 мкм. Конидии с 1-3 перегородками (7.5) 9-21×3-4 (5) мкм. Хламидоспоры отсутствуют.
Физиолого-биохимические признаки S.cirsii 1.42 (ВИЗР).
Штамм хорошо растет на стандартных полусинтетических агаризованных средах. При температуре культивирования 24°С диаметр колоний штаммов S. cirsii на картофельно-глюкозном агаре составляет 70,8±2,8 мм, на овсяном агаре 57,8±2,5 мм, на мальтозном агаре 60,0±2,0 мм. На стандартной агаризованной среде Чапека гриб растет плохо.
6
2
8
В чистой культуре штамм 1.42 (ВИЗР) S. cirsii не спороносит в темноте. Гриб образует пикниды на твердых питательных субстратах (агаризованные среды или зерновые субстраты) при постоянном облучении растущих культур ближним ультрафиолетом в диапазоне 290-400 нм. Источник облучения - 2 лампы ЛЭ-30 (Россия) на расстоянии около 50 см от чашки Петри или колбы с культурой. Выход конидий на КГА составляет около 1×10 конидий/см и 1,2×10 конидий/г зернового субстрата (перловой крупы).
Хранение штаммов S. cirsii осуществляется в пробирках на скошенном картофельно-глюкозном агаре в бытовом холодильнике при температуре 5°С в течение 1 года без пересева, а также на инокулированных грибом кусочками перловой крупы в 10%-ном глицерине при -80°С в морозильной камере (Методы…, 1982; [1]).
Методы использования штамма описаны в примерах, а результаты представлены в таблицах.
Пример 1. Получение инфекционного материала и оценка его качества.
В 100-мл конические колбы вносили 10 г перловой крупы. Субстрат увлажняли 8 мл водопроводной воды. Субстрат стерилизовали автоклавированием в течение 30 мин при 121°С, 2 раза с суточным интервалом. Стерильный субстрат инокулировали агаровыми блоками 5 мм в диаметре, вырезанными из края 2-недельной колонии гриба. Колбы инкубировали при 24°С в темноте 2 суток и затем 8 суток при облучении лампами ЛЭ-30. Колбы встряхивали каждые 2 дня для предотвращения комкования субстрата. Через 10 суток ферментации биоматериал сушили стерильным воздухом в ламинарном боксе 2 суток. Споропродуктивность гриба определили из навески 1 г в 10 мл 0,01% раствора Tween-80, концентрацию конидий в суспензии подсчитали при помощи камеры Горяева.
Для определения жизнеспособности конидий на предметное стекло наносили по 3 капли конидиальной суспензии объемом 50 мкл и помещали его во влажную камеру (чашка Петри с двумя слоями фильтровальной бумаги, смоченными 2 мл дистиллированной воды). Стекла инкубировали 6 ч при 24°С в темноте. Затем капли суспензии высушивали током воздуха в ламинарном боксе. Для учета всхожести конидий на высушенные капли добавили каплю лактофенола (молочная кислота, глицерин, фенол и вода в равном соотношении). Полученные препараты микроскопировали при 100-кратном увеличении, просматривая 50 конидий на каплю, 6 капель/вариант. Конидию считали проросшей, если длина ростковой трубки превышала в 2 раза ширину конидии (Наумов, 1937, [2]).
6
Для оценки патогенности концентрацию конидий в суспензии доводили до 5×10 всхожих конидий/мл, разбавляя ее рассчитанным объемом 0,01% раствора Tween-80. Каплю суспензии объемом 10 мкл наносили на листовые диски, вырезанные из листьев бодяка полевого. На один вариант использовали по 6 дисков. Учет развития болезни (площадь некроза от общей площади диска, %) проводили через 3 дня инкубации при 24°С и 12-часовом фотопериоде (Berestetskiy et al., 2007, [5]).
8
Отмечено хорошее развитие мицелия гриба Stagonospora cirsii штамм 1.42 (ВИЗР) на всех изученных зерновых субстратх за исключением пшеницы. Максимальная споровая продуктивность выявлена при культивировании гриба на перловой крупе (5,1×10 конидий/г субстрата). Гриб удовлетворительно спороносил также на зернах ржи и ячменя (табл.2). Значительно хуже спороношение S. cirsii образовывалось на рисе, пшене и пшенице. Жизнеспособность конидий гриба, полученных на перловой крупе, составляла более 90%, развитие некротических пятен на листовых дисках бодяка было около 5 мм в диаметре через 72 ч после инокуляции.
2
4
4
6
Для получения мицелия штамм культивировали на сахарозно-соевой среде следующего состава: сахароза - 60 г, соевая мука - 15 г, KНРО - 1 г, MgSO - 0.5 г, дрожжевой экстракт - 1 г, вода - 1 л, в 250 мл колбах с 50 мл среды на качалке при 180 об/мин в течение 3 суток (Сокорнова, 2011, [1]). Среду инокулировали 2 мицелиальными агаровыми блоками (диаметр 0.5 см), вырезанными при помощи бура из 14-суточной культуры гриба на картофельно-сахарозной агаризованной среде. Мицелий отфильтровывали через мельничный газ и высушивали до постоянного веса для определения продуктивности, либо для получения мицелиальной суспензии измельчали при помощи блендера. На сахарозно-соевой среде штамм образует многочисленные светло-желтые пеллеты среднего размера, ободок хорошо развит, культуральная жидкость бледно-коричневого цвета, выход сухой биомассы на 3 сутки культивирования составляет 38 г/л (0,12×10КОЕ/мл), что сопоставимо с выходом прототипа 36 г/л.
Пример 2. Оценка гербицидной активности штамма.
7
Инокулюм получали в 300-мл конических колбах на перловой крупе (20 г перловой крупы, 16 мл воды). Через 14 суток инкубирования в темноте субстрат с образовавшимися пикнидами сушили 2 суток. Готовили конидиальную суспензию концентрацией 0,6×106 до 2×10 конидий/мл (жизнеспособность конидий составляла около 90%) в 0,01% растворе Твин-80. Растения бодяка, выращенные из семян, в фазе розетки (возраст около 4 недель) опрыскивали суспензией (2 мл/растение). Инокулированные растения выдерживали в полиэтиленовых пакетах для поддержания высокой влажности при 20°С в течение 24 или 36 ч. Затем пакеты снимали, растения инкубировали при 24°С и искусственном освещении (16 ч) и при 20°С в темноте (8 ч). Через 7 суток после заражения проводили оценку развития болезни на листьях бодяка (площадь некрозов по отношению к общей площади листьев, %), а также определяли свежую биомассу надземной части растений (Методы…, 1982; [2]).
6
При концентрации инокулюма 2×10 конидий/мл и 36-ч увлажнении листьев площадь некрозов на листьях бодяка через 7 суток после инокуляции составляла около 100%. При этом потеря свежей надземной биомассы была около 85%, а сухой массы подземных побегов - около 50%. При концентрации инокулюма 5×10 конидий/мл площадь некрозов на листьях растений бодяка полевого после обработки была около 50%, потеря биомассы надземной части этого растения составила примерно 35% (табл. 3), что сопоставимо с прототипом.
Оценку патогенности мицелия, полученного в жидкой культуре, осуществляли для целых растений в контролируемых условиях. Для инокуляции использовали 3-суточную культуру штамма на сахарозно-соевой среде, полученную при глубинном культивировании на качалке. Сырой мицелий (относительная влажность 80%) в виде суспензии испытывался в следующих концентрациях: 25, 50, 75 и 100 мг/мл. Сосуды с растениями после инокуляции помещались на 24 часа во влажные камеры.
4
Штамм проявляет высокую патогенность в отношении бодяка полевого. На 7 сутки после обработки растений в контролируемых условиях мицелиальной суспензией штамма при 24 ч продолжительности росяного периода и концентрации сырого инокулюма 50 мг/мл (5×10 КОЕ/мл) приводила к полной гибели растений (табл.3), потеря биомассы надземной части этого растения составила примерно 65%, что превосходит микогербицидную активность прототипа.
Пример 3. Пример оценки специфичности штамма.
Растения выращивали из семян в тепличных условиях до фазы розетки (5-6 настоящих листьев). Инокуляцию проводили, как в примере 2. Через 14 суток после заражения проводили оценку развития болезни на листьях растений (площадь некрозов по отношению к общей площади листьев, %).
Оценено 14 видов растений из 7 семейств (Asteraceae, Brassicaceae, Cucurbitaceae, Fabaceae, Malvaceae, Poaceae, Solanaceae).
Фитопатоген Stagonospora cirsii характеризуется узкой специализацией и приурочен к семейству Asteraceae. Из представителей семейства Asteraceae штамм был патогенен для Cirshim arvense, Chrysanthemum segetum и Cynara scolymus, в меньшей степени для Zinnia elegans. Среди видов других семейств отмечено поражение на Althaea rosea и Cucumis sativus. На растениях других семейств поражения конидиями S.cirsii не обнаружено (табл.4).
Выход конидий штамма гриба Stagonospora cirsii 1.42 (ВИЗР) на зерновых субстратах (14-е сутки)
Таблица 1
Субстрат
Конидий/г субстрата, × 10<sup>8</sup>
Рис
0,69
Пшеница
0,74
Пшено
1,19
Ячмень
2,41
Рожь
3,33
Перловая крупа
5,05
НСРо.05
0,4
Патогенность конидий штамма гриба Stagonospora cirsii 1.42 (ВИЗР) для растений бодяка полевого
Таблица 2
Концентрация спор, × 10<sup>6</sup> конидий/мл
Площадь некрозов листьев, %
Период повышенного
Период повышенного
увлажнения листьев 24 ч
увлажнения листьев 36 ч
0,6
0
0
1,2
0
1,1
2,5
0
11,70
5
3,48
51,68
10
5,88
80,28
20
20,51
96,18
НСР0,05
5,2
8,3
Патогенность мицелия штамма гриба Stagonospora cirsii 1.42 (ВИЗР) для растений бодяка полевого
Таблица 3
Концентрация сырого мицелия, мг/мл
Площадь некрозов листьев, %
12,5
24
25
58
27,5
85
50
100
62,5
100
75
100
НСРо.05
12
Специализация штамма гриба Stagonospora cirsii 1.41 (ВИЗР)
Таблица 4
Семейство
Вид растения
Площадь некрозов листьев, %
Asteraceae
Cirsium arvense
94,5
Calendula officinalis
0
Zinnia elegans
17,4
dehorium intybus
0,2
Lactuca sativa
1
Chrysanthemum segetum
30,60
Cynara scolymus
24,80
Brassicaceae
Raphanus sativus
3,00
Cucurbitaceae
Cucumis sativus
27,90
Fabaceae
Phaseolus vulgaris
5,9
Malvaceae
Althaea rosea
34,5
Poaceae
Triticum aestivum
0
Zea mays
0
Solanaceae
Lycopersicon esculentum
0
НСР<sub>0,05</sub>=14,6
Таким образом, приведенные данные для штамма S. cirsii 1.42 (ВИЗР) свидетельствуют о более высокой агрессивности в отношении целевого растения (таблица 2, 3), а также сопоставимы с прототипом по выходу биомассы и специализации. Что позволяет применять его для борьбы с бодяком полевым в посевах большинства культурных растений и охраняемых природных зонах.
Использованная литература
1. Методы экспериментальной микологии (под ред. Билай В.И.), 1982, 550 с.
2. Наумов Н.А. Методы микологических и фитопатологических исследований. М.-Л.: Госиздат колхозной и совхозной литературы, 1937, 272 с.
3. Сокорнова С.В. Биологическое обоснование создания микогербицида на основе фитопатогенного гриба Stagonospora cirsii: автореф. дис. на соиск. учен. степ. канд. биол. наук. ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений РАСХН. - СПб, 2011. - 18 с.
4. Ульянова Т.И. Сорные растения во флоре России и других стран СНГ. 1998. Спб.: ВИР.
5. Bailey K.L., Derby J.A. Fungal isolates and biological control compositions for control of weeds US2006/0084574 Al.
6. Berestetskiy A.O., Fyodorova A.F., Kustova S. A laboratory technique for the evalution of pathogenicity of Septoria cirsii for Cirsium arvense, XV Congress of European mycologists, 2007, p.242.
7. Bourdot G.W., Hurrell G.A., Saville D.J., Leathwick D.M. Impacts of applied Sclerotinia sclerotiorum on the dynamics of a Cirsium arvense population Weed Res. 2006, vol. 46, no 1,61-72.
8. Donald W. Management and control of Canada thistle (Cirsium arvense). Rewiews of Weed Science. 1990. Vol.5. P.193-250.
9. Green S., Bailey K.L. Influence of moisture and temperature on infection of Canada thistle by Alternaria cirsinoxia. Plant Dis. 2000. V.84. P.1126-1132.
10. Guske S., Schulz В., Boyle C. Biocontrol options for Cirsium arvense with indigenous fungal pathogens. Weed Sci. 2004. Vol.44. P. 107-116.
11. Hershenhom J., Vurro M., Zonno C, Stierle A., Strobel G. Septoria cirsii, a potential biocontrol agent of Canada thistle and its phytotoxin - p-nitropropionic acid. Plant Science. 1993. Vol.94. P. 227-234.
12. Leth V., Herbicide, 1988, USPatent 4753670.
13. Saccardo, Sylloge fungorum, 1921, XXV, 364.