ЖИДКИЙ ЭКСТРАКТ ГИНОСТЕММЫ ПЯТИЛИСТНОЙ, ОБЛАДАЮЩЕЙ АДАПТОГЕННОЙ АКТИВНОСТЬЮ
LIQUID EXTRACT OF JIAOGULAN, HAVING ADAPTOGENIC ACTIVITY

Предлагаемое изобретение относится к фармации, а именно к лекарственным препаратам растительного происхождения, применяемым в качестве лечебно-профилактических адаптогенных средств.
В настоящее время основу адаптогенных, общетонизирующих лекарственных препаратов составляют лекарственные средства из таких лекарственных растений, как: женьшень настоящий, лимонник китайский, элеутерококк колючий, левзея сафлор овидная, родиола розовая, произрастающих на территории Дальнего Востока, Сибири [Шабанов П.Д. Адаптогены и антигипоксанты // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2003. - Т. 2. - №3. - С. 50-81]. В связи с этим стоит вопрос расширения ассортимента лекарственных средств адаптогенного действия и внедрение в практику ранее малоизученных видов лекарственного растительного сырья за счет поиска новых интродуцированных видов. Одной из таких перспективных культур, адаптированных к условиям Республики Башкортостан, является гиностемма пятилистная {Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) из семейства Тыквенные (Cucurbitaceae).
Широко распространенным фитоадаптогеном является женьшень настоящий. В Государственный реестр лекарственных средств России по состоянию на 2021 год входят средства растительного происхождения на основе женьшеня настоящего, обладающие общетонизирующим действием: «Женьшеня настойка», «Гербион женьшень», «Доппельгерц Женьшень», «Женьшень с витамином С» [Государственный реестр лекарственных средств [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://grls.rosminzdrav.ru/default.aspx. Дата доступа: 10.05.2021].
Прототипом изобретения является известный препарат «Женьшеня настойка» из корней женьшеня настоящего, который имеет ряд недостатков в плане заготовки сырья: средняя масса сырья должна быть не менее 10,0 г; возраст растения у дикорастущего 25-30 лет, у культивируемого - 5-8 лет.
Задачей изобретения является расширение ассортимента адаптогенных средств растительного происхождения.
Технический результат при использовании изобретения - получение средства, обеспечивающего повышение физической выносливости, антигипоксическое и антиоксидантное действия.
Сущность изобретения: применение жидкого экстракта травы гиностеммы пятилистной, полученного перколяцией 70% спиртом этиловым в соотношении 1:1, в качестве средства с адаптогенной активностью.
Технология получения. Жидкий экстракт получали методом перколяции. Для этого точную навеску растительного сырья измельчали до размера частиц 3,0 мм и заливали равным объемом по отношению к навеске 70% спиртом этиловым и оставляли для смачивания сырья на сутки. Затем сырье, плотно утрамбовывая, загружали в перколятор, заливали 70% спиртом этиловым до «зеркала» и оставляли для экстрагирования на 48 часов для достижения равновесной концентрации. Далее перколировали со скоростью 1/48 части рабочего объема в час. При этом первую порцию продукта собирали в отдельную емкость в количестве 85% по отношению к массе сырья. Затем перколяцию вели в другую емкость до полного истощения сырья, пока вытекающий раствор не станет бесцветным. Вторую порцию получаемого продукта упаривали под вакуумом при температуре 50-60°С до 15% по отношению к массе сырья. Оба продукта объединяли и получали вытяжку в соотношении 1:1 [Алексеев, К.В. Фармацевтическая технология / К.В. Алексеев, С.А. Кедик. - М.: АО ИФТ, 2019. - 570 с.].
Полученный жидкий экстр акт представлял собой зеленовато-бурую жидкость с пряно-травянистым запахом. Готовый экстракт помещали в плотно укупоренные склянки темного стекла и хранили в защищенном от света месте при температуре от 15 до 25°С [Государственная фармакопея Российской Федерации. - XIV изд. - М., 2018. - Т. 2 - 3262 с.].
Известно применение спиртового экстракта гиностеммы пятилистной для лечения метаболических заболеваний, таких как ожирение, диабет или гиперлипидемия [CN 102470155, 2012].
В доступной научно-медицинской и патентной литературе сведений об известности применения жидкого экстракта травы гиностеммы пятилистной, полученного перколяцией 70% спиртом этиловым в соотношении 1:1, в качестве средства с адаптогенной активностью не обнаружено.
Предварительно полученный жидкий экстракт и препараты сравнения, используемые в ниже перечисленных методиках, деалкоголизировали с последующим растворением сухого остатка в дистиллированной воде для получения водного экстракта.
Адаптогенное действие жидкого экстракта травы гиностеммы пятилистной изучали на 48 белых беспородных мышах-самцах массой 18,0-25,0 г. в двух модельных системах.
3
В первой модельной системе формировалась нормобарическая гипоксия с гиперкапнией. Животных одинакового веса помещали по одному в герметически закрываемые банки объемом 250 см. Регистрировали время выживания (резервное время) животных в условиях гипоксии и высчитывали процент увеличения резервного времени относительно контроля. По окончании эксперимента животных декапитировали, извлекали головной мозг, взвешивали и гомогенизировали в 3 мл холодного трис-НСl-буфера (рН 7,4). Биохимические исследования проводили немедленно. Для определения антиоксидантного статуса в гомогенатах измеряли уровень малонового диальдегида (нмоль/г сырой ткани), и уровень каталазы (мкат/г сырой ткани).
Вторая модель основывалась на оценивании работоспособности по продолжительности плавания мышей с нагрузкой (7% от массы животного). Для этого на 15-й день эксперимента мышей заставляли плавать с прикрепленным к спине грузом до полного утомления (до погружения животного под воду и отказ от плавания), затем, мышей обсушивали и через час снова повторяли плавание с нагрузкой. Для снижения стрессовой составляющей теста, мышей предварительно приучали к воде в режиме вынужденного плавания без нагрузки (3 раза, с интервалом 3 дня, продолжительность нахождения в воде 1 мин). Температура воды в сосуде поддерживалась на уровне 26-28°С (термонейтральная для мышей).
Животных раздел или на три группы:
№1 - опытная группа, в которой животных поили водным экстрактом перколята травы гиностеммы пятилистной;
№2 - группа сравнения, в которой животных поили водным экстр актом из известного препарата «Женьшеня настойка», включенного в государственный реестр лекарственных средств;
№3 - контрольная группа, в которой животных поили только дистиллированной водой.
Водные экстракты из исследуемого растительного сырья вводили мышам-самцам пер орально в течение 14 дней по 3 капли. Объем извлечения рассчитывали, исходя из рекомендуемой суточной дозы для взрослого человека массой 70 кг - 30 капель три раза в день: 30 кап*3=90 кап в сутки, 90 кап/70 кг=1,29 кап/кг. Суточная доза мышам весом 20,0 г равна 0,026 кап. Для удобства дозирования жидкий экстракт (1:1) разводили в 100 раз. Следовательно, мышам весом 20,0 г вводили 3 кап.
Согласно полученным данным, экстракт гиностеммы пятилистной увеличивал продолжительность жизни мышей в условиях нормобарической гипоксии в 1,3 раза (Р<0,042285) относительно группы контроля. Опытный экстракт не уступал по активности экстракту женьшеня (Р<0,011387 относительно контроля). В опытных группах уровень малонового диальдегида выше, чем у контроля, что, вероятно, объясняется большей продолжительностью жизни в условиях гипоксии. При увеличении деструктивных процессов в клетке, увеличивается активность ферментов антиоксидантной защиты, в частности, каталазы, что можно наблюдать у животных контрольной группы и группы гиностеммы. В то же время, в группе женьшеня повышения уровня каталазы не отмечено (табл. 1).
Тест на работоспособность показал, что при повторном плавании с нагрузкой, продолжительность плавания увеличилась во всех группах. Дольше продержались животные из группы гиностеммы, их время увеличилось почти в 2 раза относительно времени первого плавания, в группе женьшеня – в 1,3 раза и в группе контроля - в 1,2 раза (табл. 2).
В группе женьшеня продолжительность плавания в обо их заплывах была наименьшей, по сравнению с другими группами: животные очень быстро приобретали вертикальное положение, зависали в воде и тонули.
Острую токсичность водного экстракта травы гиностеммы пятилистной проводилось на 24 белых беспородных мышах мужского и женского пола весом 18,0-25,0 г. путем перорального введения водного экстракта травы гиностеммы пятилистной в дозах: 5000, 7500, 10000 мг/кг массы животных в пересчете на сухой вес.
Предварительно животных подготавливали к исследованию по схеме: голодание, маркировка, взвешивание, разделение по группам (4 группы по 6 голов). Затем после однократного введения настоя на протяжении двух недель наблюдали за состоянием лабораторных животных: внешний вид, поведенческая реакция, активность, частота дыхания.
При введении исследуемых доз водного экстракта травы гиностеммы пятилистной не было отмечено никаких признаков интоксикации, все животные были живы, подвижны, имели хороший аппетит и летальных исходов не наблюдалось. Максимальная доза введения настоя 10000 мг/кг (табл. 3). Дальнейшие токсикологические исследования не проводились из-за явной не токсичности изучаемых видов сырья. Таким образом, по классификации ГОСТ 12.1.007.76, трава гиностеммы пятилистной была отнесена к классу малотоксичных соединений, что позволяет судить о безопасности данных видов сырья [ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности].
Антиоксидантную активность водного экстракта устанавливали двумя методами.
Первый метод заключался в исследовании водного экстракта различных концентраций in vitro хемилюминесцентным методом. В качестве референс-препарата использовали 0,05% раствор аскорбиновой кислоты.
Водный экстракт (0,01-1 мл) вносили в модельные системы, в которых формировалось образование активных форм кислорода (АФК) и протекали реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ), являющиеся наиболее распространенными процессами свободно-радикального окисления. В качестве первой модельной системы использовали 20 мл фосфатного буфера с добавлением цитрата натрия и люминола (рН 7,5). Добавляли 1 мл 50 мМ раствора сернокислого железа, как инициатора процесса окисления. Окисление солей железа обуславливает появление кислородных радикалов и сопровождается хемилюминесценцией, усиливающейся в присутствии люминола. Регистрацию свечения проводили в течение 5 минут.
В качестве второй модельной системы использовали липопротеиновые комплексы, сходные с липидами крови, приготовленные из куриного желтка. Желток смешивали с фосфатным буфером в соотношении 1:5 и гомогенизировали. В качестве инициатора процесса окисления ненасыщенных жирных кислот добавляли 1 мл 50 мМ раствора сернокислого железа. Контролем служили модельные системы без добавления исследуемых извлечений. Регистрацию свечения проводили на приборе «ХЛМ-003». Антиоксидантную активность оценивали по снижению интенсивности свечения (табл. 4).
Выявлено, что водный экстракт обладает выраженной антиоксидантной активностью и влияет как на образование активных форм кислорода, так и на скорость перекисного окисления липидов.
1
2
Второй метод основывался на способности адреналина к аутоокислению в щелочной среде, с образованием продукта, имеющего максимум поглощения при 347 нм. К 2 мл бикарбонатного буфера (рН=10,56) добавляли 0,1 мл 0,1% раствора адреналина гидрохлорида (раствор контроля) и через 10 минут определяли оптическую плотность при длине волны 347 нм в кювете толщиной 10 мм на спектрофотометре ShimadzuUV1800 (D). К 2 мл бикарбонатного буфер а добавляли 0,03 мл исследуемого раствора и 0,1 мл 0,1% раствора адреналина гидрохлорида, через 10 минут определяли оптическую плотность (D).
Антиоксидантную активность рассчитывали по формуле:
1
2
1
AOA=(D-D)*100/D
Величина АОА более 10% свидетельствует о наличии антиоксидантной активности. При определении АОА также учитывалось, что исследуемый экстр акт имеет собственную окраску, которая поглощает определенную длину волны в видимой области спектра. Величина антиоксидантной активности при определении составила 50,5%.
Таким образом, использование изобретения обеспечивает адаптогенное действие за счет повышения физической выносливости, антигипоксического и антиоксидантного действия, и позволяет расширить ассортимент лекарственных средств растительного происхождения на Российском фармацевтическом рынке.