Оценка биологической активности растительных экстрактов по показателю LC50 в экспериментах in vitro на примере экстрактов Таволги, Белокопытника и Зюзьника

Bulletin of Medical Internet Conferences

2017. Volume 7. Issue 6

ID: 2017-06-2467-A-14757 Краткое сообщение

Байтман Т.П., Полуконова А.В.

Оценка биологической активности растительных экстрактов по показателю LC50 в экспериментах in vitro на примере экстрактов Таволги, Белокопытника и Зюзьника

ФГБОУ ВО Саратовский ГМУ им. В. И. Разумовского Минздрава России, кафедра общей биологии, фармакогнозии и ботаники

Научный руководитель: д.б.н. Полуконова Н.В.

Резюме

Оценена биологическая активность трех экстрактов: цветков Таволги вязолистной, листьев Белокопытника гибридного и травы Зюзьника европейского при разных концентрациях на культуре клеток SPEV-2 по такому показателю, как LC50, позволяющем выявлять пробиты мертвых клеток в эксперименте. Выявленные зависимости концентрация-эффект являются линейными. Полулетальные концентрации водных растворов экстрактов, полученные пробит-анализом, методом выявления количества мертвых клеток при разных концентрациях, составила для цветков Таволги 0,9 мг/мл, листьев Белокопытника - 4,9 мг/мл и травы Зюзьника - 4,4 мг/мл. В отношении клеток в культуре в эксперименте in vitro понятие LD50 может быть принято условно, т.к. за сутки может происходить увеличение количества клеток путем их деления, в результате количество клеток к концу эксперимента может оказаться больше, чем в начале эксперимента. По нашему мнению, показатель LD50 может быть удобен для сравнительной экспресс-оценки биологической активности растительных экстрактов.

Ключевые слова: растительные экстракты, Таволга вязолистная, Белокопытник гибридный, Зюзьник европейский, SPEV-2

Введение

В настоящее время существуют разные методы оценки биологической активности растительных экстрактов (Умнова, 2010; Викуль, 2012; Габрук и др.. 2012; Наволокин и др., 2013; Георгиянц, Владимирова, 2013; Наволокин и др., 2013; Курчатова и др., 2014; Наволокин и др., 2015, 2016; Полуконова и др., 2016 и др.). Проведенные ранее исследования противоопухолевой активности растительных экстрактов в экспериментах in vitro с использованием разных клеточных культур (Полуконова и др., 2013; Наволокин и др., 2014; Андреева и др., 2016; Байтман и др., 2016) определили необходимость выбора единых критериев оценки активности экстрактов разных растений.

Цель исследования: сравнить биологическую активность растительных экстрактов Таволги вязолистной (Filipendula ulmaria), Белокопытника гибридного (Petasites hybridus) и Зюзьника европейского (Lycopus europaeus) в экспериментах in vitro на культуре клеток SPEV-2 с использованием показателя LC50.

Материал и методы

Использованы водные растворы флавоноидсодержащих экстрактов цветков Таволги, листьев Белокопытника и травы Зюзьника, полученные определенным способом, позволяющим получить нетоксичный экстракт даже из ядовитого растительного сырья (Патент на изобретение RUS 2482863; Navolokin et al., 2012; Полуконова и др., 2013; Polukonova et al., 2014).

Подлинность экстрактов подтверждалась качественными реакциями с кристаллическим магнием и реактивом Вагнера -Бушарда, результаты которых свидетельствуют о наличии флавоноидов и отсутствии алкалоидов в полученных экстрактах.

Культивирование клеток почек эмбриона свиньи (SPEV-2) проводили в среде RPMI-4 в 96 луночных планшетах. Анализировали следующие концентрации экстрактов: 30 мг/мл; 15 мг/мл; 7,5 мг/мл; 3,8 мг/мл; 1,9 мг/мл; 0,9 мг/мл. Контролем служили клетки в питательной среде без добавления экстракта.

В качестве красителей использовали йодистый пропидий и акридиновый оранжевый.

Фотосъемку проводили с использованием нескольких режимов регистрации светорассеяния и флюоресценции (на световом микроскопе Leica DM 2500, конфокальном микроскопе Leica LSM SP - 5).

Перевод процента погибщих клеток в пробиты проводили согласно руководству Коросова, Калинкиной (2003).

Работа проведена на базе ЦКП Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов.

Результаты и обсуждение

Нами оценена биологическая активность трех экстрактов: цветков Таволги, листьев Белокопытника и травы Зюзьника при разных концентрациях на культуре клеток SPEV-2 по такому показателю, как LC50, позволяющем выявлять пробиты мертвых клеток в эксперименте. Выявленные зависимости концентрация-эффект являются линейными (рисунок 1). Полулетальные концентрации водных растворов экстрактов, полученные пробит-анализом методом выявления количества мертвых клеток при разных концентрациях, составила для цветков Таволги 0,9 мг/мл, листьев Белокопытника - 4,9 мг/мл и травы Зюзьника - 4,4 мг/мл.

Наиболее активен в отношении клеток SPEV-2 оказался экстракт Таволги.

Как известно, LD50 — средняя концентрация вещества, вызывающая гибель половины членов испытуемой группы в течение суток. При этом, предполагается, что исследуемый объект находится в нормальных условиях, без приёма каких-либо специальных мер предосторожности или, наоборот, усугубляющих факторов. В отношении клеток в культуре в эксперименте in vitro понятие LD50 может быть принято условно, т.к. за сутки может происходить увеличение количества клеток путем их деления, в результате количество клеток к концу эксперимента может оказаться больше, чем в начале эксперимента. Тем не менее, по-нашему мнению, такой показатель, как LD50 может быть удобен для сравнительной экспресс-оценки биологической активности растительных экстрактов.

Бюллетень медицинских Интернет-конференций (ISSN 2224-6150) 2017. Том 7. № 6

Г

/У

#

if

*» Зюаьник *— •велочэпытни* -Таволга

----LCS0

7

2

ío 15 го

Рисунок 1. Зависимость % погибших клеток (в пробитах) от концентраций двух экстрактов А - Таволги, Б - Белокопытника, В - Зюзьника (определение LC 50). По вертикали указаны пробиты, по горизонтали - значения концентраций

Литература

1. Андреева А. А., Гелевера Н.И., Шаркова Е. А, Полуконова А.В., Прилепский А.Ю., Полуконова Н.В. Сравнение активности экстрактов Кирказона ломоносовидного (Aristolóchiaclematítis) и Кипрея узколистного (Chamérionangustifolium) на культуру клеток SPEV-2 // Саратовский медицинский журнал. 2016. Т.12 №2. С. 226.

2. Байтман Т.П., Полуконова А.В., Прилепский А.Ю. Исследование действия растительных экстрактов на морфологические изменения в культуре клеток SPEV-2 // Бюллетень медицинских интернет-конференций. 2016. Т. 6. 5. С. 891.

3. Викуль С.И. Биологическая активность растительного сырья - ингредиента пищевых продуктов // Харчова наука i технолопя. 2012. №4(21). С. 40-44.

4. Габрук Н.Г., Ле Ван Тхуан, Олейникова И.И. Определение интегральной антиоксидантной активности различных экстрактов имбиря с помощью электрохимического детектирования // Научные ведомости. Серия Естественные науки. 2012. №9 (128). Вып. 19. С. 159-162.

5. Георгиянц В. А., Владимирова И. Н. Масс-спектрометрическое определение биологически активных соединений зюзника европейского // Научные ведомости Белгородского государственного университета. Серия: Медицина. Фармация. 2013. Выпуск № 25 (168). Т. 24. С. 213-215.

6. Коросов А.В., Калинкина Н.М. Количественные методы экологической токсикологии. Учебно-методическое пособие. Петрозаводск: ПетрГУ, КНЦ, 2003. 56 с.

7. Курчатова М.Н., Дурнова Н.А., Полуконова Н.В. Влияние экстрактов, содержащих биофлавоноиды, на индукцию микроядер диоксидином в эритроцитах крови беспородных белых мышей // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. 2014 а. № 2. С. 58-65.

8. Курчатова М.Н., Полуконова Н.В., Дурнова Н.А. Определение класса токсичности экстракта Gratiola officinalis L., с использованием нового тест-объекта - личинок Chironomus ripari us // Токсикологический вестник. 2014 б. № 6. С. 40-43.

9. Наволокин Н.А., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н., Скворцова В.В., Байтман Т.П., Бучарская А.Б., Дурнова Н.А. Противоопухолевая активность растительных экстрактов, содержащих биофлавоноиды // Российский биотерапевтический журнал. 2013. Т. 12. № 2. С. 59-59a.

10. Наволокин Н.А., Полуконова А.В., Бибикова О.А., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н., Бучарская А.Б. Цитоморфологические изменения в культуре клеток почки эмбриона свиньи при воздействии экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.) // Фундаментальные исследования. 2014. № 10-7. С. 1369-1374.

11. Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Матвеева О.В., Тычина С.А., Бучарская А.Б., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н. Влияние растительных экстрактов, содержащих флавоноиды, на лейкоцитарную формулу и красный костный мозг лабораторных крыс с перевитой саркомой 45 // Успехи современного естествознания. 2015. № 4. С. 134-140.

12. Наволокин Н.А., Полуконова Н.В., Маслякова Г.Н., Скворцова В.В., Байтман Т.П., Бучарская А.Б., Дурнова Н.А. Противоопухолевая активность растительных экстрактов, содержащих биофлавоноиды // Российский биотерапевтический журнал. 2013. Т. 12. № 2. С. 59-59a

13. Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Полуконова Н.В., Тычина С.А., Корчаков Н.В., Бучарская А.Б., Маслякова Г.Н. Оценка противоопухолевой и антикахексической активности экстракта аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.) у крыс с перевитой саркомой // Сибирский онкологический журнал. 2016. Т. 15. № 1. С. 37-43.

14. Полуконова Н.В., Наволокин Н.А., Дурнова Н.А., Маслякова Г.Н., Бучарская А.Б. Способ получения сухого экстракта из растительного сырья, обладающего биологической активностью // Патент на изобретение RUS 2482863 15.02.2012

15. Полуконова А.В., Наволокин Н.А., Бибикова О.А. Цитотоксическая активность in vitro экстракта аврана на культуре клеток почек эмбрионов свиньи, зараженных онковирусом // Бюллетень медицинских интернет-конференций. 2013. Т. 3. № 2. С. 375.

16. Полуконова Н.В., Дурнова Н.А., Курчатова М.Н., Наволокин Н.А., Голиков А.Г. Химический анализ и способ получения новой билогически активной композиции из травы аврана лекарственного (Gratiola officinalis L.) // Химия растительного сырья. 2013. № 4. С. 165-173.

17. Полуконова Н.В., Наволокин Н.А., Полуконова А.В., Бучарская А.Б., Маслякова Г.Н. Культура клеток почки эмбриона свиньи, инфицированных онковирусом (SPEV-2) как модельный объект для исследования цитотоксического действия противоопухолевых средств на примере экстракта аврана (Gratiola officinalis L.) // Бюллетень медицинских интернет-конференций. 2015. Т. 5. № 6. С. 926-928.

18. Полуконова Н.В., Наволокин Н.А., Мудрак Д.А., Прилепский А.И., Широков А.А., Бучарская А.Б., Маслякова Г.Н. Исследование цитотоксической активности экстракта аврана лекарственного и кверцетина на клеточной культуре рака шейки матки // Российский биотерапевтический журнал. 2016. Т. 15. № 1. С. 88-89.

19. Умнова О.А. Сравнение биологической активности фитохимических композиций в нативной и липосомальной формах // Вестник Московского университета. Серия 2 Химия. 2010. Т. 51 №6. С. 476- 484.

20. Navolokin N.A., Polukonova N.V., Maslyakova G.N., Bucharskaya A.B., Durnova N.A. Effect of extracts of Gratiola officinalis and Zea mays on the tumor and the morphology of the internal organs of rats with trasplanted liver cancer // Russian Open Medical Journal. 2012. Т. 1. № 2. С. 0203.

© Бюллетень медицинских Интернет-конференций, 2017

www.medconfer.com

Bulletin of Medical Internet Conferences (ISSN 2224-6150) 1272_2017. Volume 7. Issue 6

21. Polukonova N.V., Kurchatova M.N., Navolokin N.A., Bucharskaya A.B., Durnova N.A., Maslyakova G.N. A new extraction method of bioflavanoids from poisonous plant (Gratiola officinalis L.) // Russian Open Medical Journal. 2014. T. 3. № 3. C. 304.