АНТИМИКРОБНОЕ СРЕДСТВО НА ОСНОВЕ ЛИШАЙНИКА ЯГЕЛЯ РОДА CLADONIA RANGIFERINA И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
ANTIMICROBIAL AGENT BASED ON LICHEN OF CLOVER SPECIES OF CLADONIA RANGIFERINA AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Изобретение относится к антимикробным средствам, а именно, к продуктам природного происхождения, и может быть использовано в фармакологии, медицине, косметологии, пищевой промышленности, животноводстве и биотехнологиях, в том числе производстве гигиенических, косметических средств и биологически активных добавок.
Предшествующий уровень техники.
В настоящее время поиск новых антимикробных средств является актуальной задачей, что вызвано прежде всего постоянным изменением видового состава патогенной микрофлоры и появлением форм, резистентных к известным препаратам. [Муравьева Д.А. Фармакогнозия. - М.: Медицина, 2002. - 656 с.; J. Glob. Infect. Dis. 2010, 2(3), P. 275-283;  Emerging Infectious Diseases Vol. 11, № 10, 2005, P. 1539-1544; J. Hosp. Infect. 2018, 98(2), P. 111-117; Wright G. D. Antibiotic resistance in the environment: a link to the clinic? // Current Opinion in Microbiology. - 2010. - vol. 13, № 5 - P. 589-594; Levy, Stuart B. Factors impacting on the problem of antibiotic resistance // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 2002 - vol. 49, №1, P. 25-30. Adam M., Murali B., Glenn N., Potter S. Epigenetic inheritance based evolution of antibiotic resistance in bacteria // BMC Evol. 2008 - Vol. 8, P. 1-12].
В медицинской и косметологической практике существует потребность в антимикробных средствах - антибиотиках и антисептиках, пригодных для подавления резистентных штаммов патогенных микроорганизмов, при этом, желательно, лишенных таких побочных эффектов, как аллергенность, гепатотоксичность, раздражение желудочно-кишечного тракта и угнетение естественной микрофлоры. В связи с этим значительный интерес вызывают продукты природного происхождения, в частности вещества, содержащиеся в составе лишайников видов кладония (Cladonia) и цетрария (Cetraria). [А.П. Подтероб. Химический состав лишайников и их медицинское применение. // Хим-Фарм. Журнал. - 2008, Т. 42, № 10, С. 32-38.]. Лишайниковые вещества практически не имеют побочных эффектов, не вызывают аллергических реакций, раздражения и ожогов кожных покровов, не несут раздражающего эффекта для ЦНС. Их применение не ограничено хроническими заболеваниями печени и почек, желудочно-кишечного тракта, ОРЗ, ОРВИ [Аньшакова В.В. Разработки на основе лишайникового сырья (твердофазные биопрепараты) // В.В. Аньшакова, А.В. Степанова, А.Ш. Смагулова и др. // Вестник спортивной науки. - 2013. - №6. - С. 28-30; Грибова Н.А.].
Важнейшим действующим компонентом лишайников считается усниновая кислота, которая обладает противомикробной и антивирусной активностью [А.П. Подтероб. Химический состав лишайников и их медицинское применение. // Хим-Фарм. Журнал - 2008, Т. 42, № 10, С. 32-38; Штро А.А. Исследование активности производных усниновой кислоты в отношении вируса гриппа. - Дисс. канд. биол. наук, СПб, 2014]. Натриевая соль усниновой кислоты использовалась под названием «Бинан» в качестве наружного средства для лечения ран, ожогов, трещин варикозных и трофических язв, острого гнойного воспаления мягких тканей, а также при травматическом остеомиелите и в гинекологии. [Телятьев В.В. Полезные растения Центральной Сибири. Иркутск, 1987. С.21-22). https://findpatent.ru/patent/246/2467063.html ©, 2012-2019].
Интерес к усниновой кислоте связан с обнаружением ее активности в отношении патогенных штаммов, устойчивых к стандартно используемым антибиотикам [Pompilio A. Antimicrobial and antibiofilm activity of secondary metabolites of lichens against methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains from cystic fibrosis patients / A. Pompilio, S. Pomponio, V. Di Vincenzo et al // Future Microbiol - 2013 - №8 - p.281-92].
Обнаружена высокая активность усниновой кислоты в отношении большого количества видов бактерий: Clostridium perfringens, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides vulgatus, Bacteroides fragilis, Bacteroides loeschii, Propionibacterium acnes, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium и Staphylococcus aureus [Lauterwein M. In Vitro Activities of the Lichen Secondary Metabolites Vulpinic Acid,(+)-Usnic Acid, and (-)-Usnic Acid against Aerobic and Anaerobic Microorganisms / M. Lauterwein, M. Oetinger, K. Belsinger et al // Antimicrobial agents and chemotherapy - 1995 - № 39 (11) - p. 2541-2543].
Наибольший интерес привлекло использование усниновой кислоты для лечения туберкулеза. Была предложена специальная диета для туберкулезных больных с добавлением лишайников [Савватеева Л. Ю. Научное обоснование и перспективы пищевого использования ягеля, содержащего усниновую кислоту / Л. Ю. Савватеева, Е. Г. Туршук // Актуальные вопросы развития профилактической медицины и формирования здорового образа жизни - Иркутск: РИО ИГИУВа, 2010. - 180 с.].
Streptococcus mutans
Серьезное внимание к веществам лишайников отмечается в таких сферах, как производство биологически активных добавок, средств гигиены и косметической продукции. Высушенный порошок ягеля зарегистрирован в качестве пищевой добавки («Ягель Детокс», номер свидетельства:RU.77.99.11.003.Е.003704.05.13). В связи с тем, что усниновая кислота подавляет рост штаммов , извлеченных из кариесных полостей пациентов, была разработана зубная паста, содержащая 1% (+) усниновой кислоты [Ghione M. Usnic acid revisited, its activity on oral flora / M. Ghione, D. Parrello, L. Grasso et al // Chemioterapia - 1988 -№ 7 - p. 302-305]. Усниновая кислота также используется в тональных кремах для предотвращения прыщей, и в дезодорантах, что связано с ее способностью подавлять многие микроорганизмы, ответственные за образование специфического запаха пота [Bergerhausen, H. Deodorizing action of a complex of usnic acid / H. Bergerhausen // Cosm Toiletries - 1976 - №91 - p.25-26].
Usnea
Cladonia
Cetraria
Cladonia,
Evernia prunastri
Cetraria islandica
Cetraria islandica
Известен способ получения усниновой кислоты экстракцией смеси лишайников родов  и  органическими растворителями [Патент RU  2317076, МПК А61K 31/343, А61К 36/09 от 20.02.2008 г. Способ получения усниновой кислоты]. Следует отметить, что в составе лишайников, помимо усниновой кислоты, содержатся также другие биологически активные компоненты - полифенолы, карбоновые кислоты, углеводы. Известно более 100 представителей лишайников семейства  и  химический состав и биологическая активность которых изучены не одинаково глубоко. Европейские лишайники изучены лучше, чем разновидности ягеля, произрастающие за Полярным кругом. Экстракты, получаемые из различных видов лишайников путем экстракции органическими растворителями обладают бактерицидными свойствами. Например, известно получение экстракта из дубового мха ( (L.) Ach.), [Патент RU 2348683 от 10.03.2009 г. Способ получения экстракта из дубового мха] и способ получения сухого экстракта  (L.) Ach. [Патент RU 2321419 от 10.04.2008 г. Экстракт  (L.) Ach. сухой, таблетированная форма].
Сladonia
Также в качестве бактерицидных средств заявлялись различные продукты переработки ягеля и родственных лишайников [Патент RU №2385159  «Способ получения препарата ягель-м, обладающего противотуберкулезным действием», патент RU 2624865 «Способ получения экстракта из лишайника рода , обладающего бактерицидными свойствами, патент RU 2467063 «Способ получения высокоактивного твердофазного биопрепарата антибиотического действия ягель из слоевищ лишайников»], однако по уровню активности такие продукты значительно (на 1-2 порядка) уступали чистой усниновой кислоте.
Таким образом, усниновая кислота и содержащие ее продукты переработки лишайников обладают ценными биологическими свойствами и могут использоваться в различных медицинских, производственных и биотехнологических сферах.
Следует отметить ряд недостатков, присущих усниновой кислоте. Прежде всего, это достаточно высокая токсичность: ЛД50 этого вещества составляет для мышей 75 мг/кг при подкожном введении, и 25 мг/кг - при внутривенном [Данные из RTECS]. Учитывая, что эффективные бактерицидные концентрации усниновой кислоты лежат в пределах 2-20 мг/л, ее терапевтический диапазон, определяемый как отношение активность/токсичность, относительно узок.
Cladonia
Наиболее близким по сути к заявляемому изобретению является способ по патенту RU 2624865 «Способ получения экстракта из лишайника рода , обладающего бактерицидными свойствами», который  включает «очистку лишайника от механических примесей, измельчение слоевища лишайника, настаивание с карбонатом натрия, кипячение раствора, фильтрацию, при этом измельченную до порошкообразного состояния лишайниковую массу заливают 10-кратным по отношению к массе объемом 96% этилового спирта и кипятят в течение 1 часа, после чего полученный раствор охлаждают и засыпают измельченным карбонатом натрия в количестве, равном количеству измельченной лишайниковой массы, затем раствор настаивают в течение 5 часов при температуре 5-7°С, после настаивания раствор нагревают до кипения и фильтруют в горячем виде. Вышеописанный способ является исчерпывающим и позволяет получить экстракт с высокими бактерицидными свойствами».
Недостатками известного способа является, прежде всего, использование этилового спирта при экстракции, что существенно удорожает процедуру и приводит к извлечению значительного количества нерастворимых в воде балластных веществ. К недостаткам относится также то обстоятельство, что конечный продукт получается в виде спиртового раствора, что ограничивает его применение.
Cladonia
Технической проблемой, на решение которой направлено создание настоящего изобретения является разработка антимикробного средства из лишайника рода  обладающего широким спектром терапевтического действия.
Технический результат заключается в повышении антимикробной активности разработанного средства и обеспечении удобства использования за счет растворимости в воде.
Известно, что усниновая кислота в свободном виде нерастворима в воде, но может быть растворена в виде натриевой соли. Другие продукты на основе лишайников, известные из патентов, в воде не растворяются.
Cladonia rangiferina
Техническая проблема решается и технический результат достигается тем, что получают антимикробное средство представляющее собой водорастворимое извлечение из лишайника ягеля рода , содержащее не менее 10 % усниновой кислоты
Cladonia
Процедура получения  антимикробного средстваиз лишайника рода включает в себя экстракцию измельченного сырья водным раствором с добавкой основания, и концентрирование полученного раствора с последующей лиофилизацией.
Cladonia rangiferina,
В качестве исходного сырья используют лишайник ягеля рода  экстракцию исходного измельченного сырья водным раствором с добавкой основания, последующим концентрированием и замораживанием полученного раствора с лиофилизацией при остаточном давлении не выше 1  мБар до получения сухого продукта с остаточной влажностью не более 5 %.
Cladonia rangiferina
Согласно изобретению, поставленная задача решается путем выделения фракции активных веществ из исходного сырья в качестве которого применяют лишайник ягеля .
Cladonia rangiferina
В северных районах России произрастает значительное число видов лишайников ягеля, из которых наиболее распространенным является  [Определитель лишайников СССР. Вып. 5. Кладониевые-Акароспоровые. Под ред. И.И. Абрамова. - Л., Наука, 1978 - 305 с.]
Заявителю не известны какие-либо источники информации, в которых бы содержались сведения об идентичных технических решениях, что позволяет сделать вывод о соответствии заявленного изобретения критерию «Новизна».
Заявителем не выявлены какие-либо источники информации, содержащие сведения о влиянии заявленных отличительных признаков на достигаемый вследствие их реализации технический результат. Это, по мнению заявителя, свидетельствует о соответствии данного технического решения критерию «Изобретательский уровень».
Сущность изобретения поясняется приведенными ниже примерами получения заявленного вещества, его характеристиками, экспериментами по изучению биологических свойств и таблицами результатов.
Пример 1 - конкретный вариант получения заявляемого вещества
Cladonia rangiferina
К 100 г измельченного сухого лишайника  ягеля () добавляли 6 г гидрокарбоната натрия приливали 2.5 л воды и нагревали смесь до 90 °С. Перемешивали при этой температуре 1 ч, после чего охлаждали смесь, отделяли нерастворенный материал на фильтре, а полученный  прозрачный раствор упаривали на роторном испарителе до объема 100 мл при температуре бани не выше 70 °С. Полученный концентрированный раствор замораживали при -20 °С. Замороженный материал помещали в систему для лиофильной сушки и лиофилизировали при остаточном давлении 0.5 мБар в течение 30 ч с последующей досушкой при 0.1 мБар в течение 6 ч. Получали 9.3-9.8 г целевого продукта в виде сухой пористой массы светло-коричневого цвета, легко растираемой в порошок.
Выход и характеристики полученных образцов заявляемого вещества приведены в Таблице 1.
Пример 2 - конкретный вариант получения заявляемого вещества.
Cladonia rangiferina
К 100 г измельченного лишайника  сухого ягеля () приливали 2 л воды и нагревали смесь до 60 °С. Затем добавляли при перемешивании водный раствор гидроксида натрия 1 %  до получения раствора с рН 7.5-8.0. Смесь нагревали до 70 °С и выдерживали при этой температуре 2 ч, после чего охлаждали смесь, отделяли нерастворенный материал на фильтре и промывали его 0.5 л воды. Объединенный прозрачный фильтрат упаривали на роторном испарителе до объема 100 мл при температуре бани не выше 70 °С. Полученный концентрированный раствор замораживали при -20 °С. Замороженный материал помещали в систему для лиофильной сушки и лиофилизировали при остаточном давлении 0.5 мБар в течение 30 ч, с последующей досушкой при 0.1 мБар в течение 6 ч. Получали 9.9-10.5 г целевого продукта в виде сухой пористой массы светло-коричневого цвета, легко растираемой в порошок.
Выход и характеристики полученных образцов заявляемого вещества приведены в Таблице 1.
Характеристики заявляемого вещества.
Содержание усниновой кислоты в составе заявляемого вещества определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) со спектрофотометрическим детектированием. Условия хроматографического анализа: хроматограф Shimadzu LC-20 Prominence, снабженный детектором типа диодная матрица, рабочая длина волны 280 нм, скорость потока элюента 5 мл/мин, колонка Chromolit Perfomans RP, подвижная фаза - ацетонитрил (А) и водный раствор трифторуксусной кислоты 0.1% (Б). Режим элюирования градиентный: компонент А 20% (0 мин), А от 20% до 60 % (0-5 мин), А 60 (5-6 мин).
Для анализа образцы заявляемого вещества растворяли в воде и раствор вводили в хроматограф. Объем вводимой пробы 10 мкл, концентрация образца 1 мг/мл. Время удерживания стандартного образца (+)-усниновой кислоты (Sigma-Aldrich) в данных условиях составляет 3.91 мин. Типичная хроматографическая картина, полученная при исследовании образцов заявляемого вещества методом ВЭЖХ изображена на рисунке 1, характеристики полученных образцов приведены в Таблице 1.
На рисунке 1 представлена  Хроматограмма ВЭЖХ заявляемого вещества.
Таблица 1 - Характеристики образцов заявляемого вещества
Образец, №
Метод получения (Пример, №)
Выход, %
Остаточная влажность, %
Содержание усниновой кислоты, %
1
1
9.72
2.9
12.3
2
1
9.34
3.4
11.5
3
1
9.60
3.1
12.1
4
2
9.91
4.0
11.1
5
2
10.13
3.6
10.8
in vitro
Пример 3 - Определение антимикробной активности заявляемого вещества .
Для исследований образцы заявляемого вещества растворяли в дистиллированной воде. В качестве аналога для сравнения использовали (+)-усниновую кислоту (Usnic acid, 98%, Sigma-Aldrich), которую растворяли в воде с добавкой эквивалентного количества гидрокарбоната натрия. Оценку антимикробной активности проводили методом 1.5-кратных серийных разведений.
Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Streptococcus mutans
Mycobacterium tuberculosis
Тестирование антимикробных свойств проводили на стандартных штаммах возбудителей широко распространенных инфекционных заболеваний:  ATCC 25923 (золотистый стафилококк),  (эпидермальный стафилококк),  (стрептококк пародонтопатогенной группы),  H37Rv и Candida albicans АТСС, чувствительных к основным антимикробным препаратам.
S. aureus
S. epidermidis
При исследовании противостафилококковой активности использовались стандартные питательные среды: среда Эндо и мясопептонный агар, которые были приготовлены по стандартной прописи (МУК 4.2.1890-04) с добавлением в питательную среду исследуемого образца. Посев культур  и  производился газонным методом, интенсивность роста микроорганизмов оценивалась после культивации в термостате при 37.0 °C.
S. mutans
Исследование активности в отношении представителей парадонтопатогенной микрофлоры проводили на модели  с использованием известной методики [В.Н. Царев, М.С. Подпорин, Е.В. Ипполитов. // Бактериология, 2017, том 2, №1, с. 6-13]. Культивирование проводили в течение 5 суток, регистрируя точки кривой роста каждые 4 ч.
M. tuberculosis
Для оценки противотуберкулезной активности заявляемого вещества использовали стандартный штамм  H37Rv АТСС. Исследование проводили на среде Левенштейна - Йенсена. Тестируемые вещества растворяли в воде и добавляли в пробирки со средой. Тест-штамм засевали на поверхность среды, после чего пробирки инкубировали в течение 30 суток при 37°С. В качестве контроля использовали воду. Фиксацию момента начала бактериального роста и его количественную оценку проводили флюорометрическим методом. Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) исследуемого вещества определяли как концентрацию, задерживающую рост бактерий не менее чем на 5 суток.
C. albicans
Противогрибковые свойства заявляемого вещества исследовали на штамме  в жидкой питательной среде Сабуро. В качестве контроля использовали пробирки с питательной средой, засеянные по 0,2 мл культуры патогенных грибов. Посевы инкубировали в термостате при 37°С, визуальный учет роста культуры проводили через 48 часов.
Результаты исследования антимикробной активности образцов заявляемого вещества и прототипа (усниновой кислоты) приведены в Таблице 2.
Таблица 2 - Результаты определения антимикробной активности заявляемого вещества
Тест-штамм
Минимальная ингибирующая концентрация (МИК) мг/л
Образец №1
Образец №2
Усниновая кислота
<i>S. aureus</i>
5.2
5.2
2.3
<i>S. epidermidis</i>
5.2
7.8
3.5
<i>M. tuberculosis</i> H37Rv
17.5
17.5
17.5
<i>S. mutans</i>
7.8
11.7
5.2
<i>C. albicans</i>
90
90
130
S. mutans
Из данных, приведенных в Таблице 2, видно, что заявляемое вещество (образцы №1 и №2) обладает выраженным антимикробным действием на выбранные патогенные штаммы. По уровню антимикробной активности в отношении штаммов золотистого стафилококка, эпидермального стафилококка и стрептококка  заявляемое вещество незначительно (в 1.5-2.2 раза) уступает чистой усниновой кислоте. По отношению к микобактерии туберкулеза заявляемое  вещество было так же активно, как усниновая кислота, а по уровню противогрибковой активности заявляемое вещество было несколько более эффективно.
Следует отметить, что уровень антимикробной активности заявляемого вещества нельзя объяснить только присутствием в нем усниновой кислоты. Содержание усниновой кислоты в образцах №1 и №2 составляет 11-12 % (Таблица 1), а уровень активности этих образцов - от 45 % до 100 % к усниновой кислоте. Из этого можно сделать вывод, что заявляемое вещество, помимо усниновой кислоты, содержит либо еще и другие антимикробные компоненты, способные усиливать антимикробные свойства  усниновой кислоты.
Пример 4. Определение острой токсичности заявляемых веществ.
Острую токсичность LD 50 (дозировку, вызывающую 50%-ную гибель животных) образцов заявляемого вещества и прототипа определяли на беспородных белых мышах массой 18-20 г, при подкожном и пероральном введении. Для подкожного введения заявляемое вещество (образец №1) растворяли в дистиллированной воде, а прототип (усниновую кислоту) растворяли в воде с добавкой эквивалентного количества гидрокарбоната натрия, концентрация растворов вводимых веществ в обоих случаях составляла 2 %. Для перорального введения использовали 10 %-ный водный раствор заявляемого вещества, а прототип вводили в виде вводно-крахмальной суспензии с помощью желудочного зонда. Для исследования каждой дозировки использовали по 5 мышей. Погрешность оценки значений LD 50 составляет 10 %.
Результаты оценки острой токсичности заявляемого вещества (LD 50, мыши) приведены в таблице 3.
Таблица 3 - Острая токсичность заявляемого вещества и прототипа
Вещество
LD 50 (мыши)
Подкожно, мг/кг
Перорально, мг/кг
Заявляемое вещество (Образец №1)
460
4150
Аналог ((+)-Усниновая кислота)
78
525
На основе полученных результатов можно заключить, что заявляемое вещество обладает значительно более низкой токсичностью, чем усниновая кислота. При подкожном введении LD 50 заявляемого вещества примерно в 6 раз выше, а при преоральном введении - в 8 раз выше, чем у чистой усниновой кислоты.
Таким образом, заявляемое вещество обладает преимуществом перед чистой усниновой кислотой: его антимикробная активность составляет от 45 % до 100 % от активности усниновой кислоты, при существенно (в 6-8 раз) меньшей токсичности, чем у усниновой кислоты.
Сladonia
Известный продукт переработки ягеля из родственного лишайника рода  по патенту  RU 2624865  обладает бактерицидными свойствами, однако по уровню активности такие продукты значительно (на 2 порядка) уступали чистой усниновой кислоте.