ЗАЩИТНАЯ И РЕГЕНЕРИРУЮЩАЯ КОМПОЗИЦИЯ
PROTECTIVE AND REGENERATING COMPOSITION

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к защитной и регенерирующей композиции.
Настоящее изобретение относится, в частности, к композиции, содержащей комбинацию первого косметически активного ингредиента, содержащего экстракт виноградных побегов, и второго косметически активного ингредиента, содержащего компонент эктоинового типа или семейства, названный эктоиновым компонентом. Более конкретно, указанный второй ингредиент выбран из эктоина, гидроксиэктоина и их смесей.
Более конкретно, настоящее изобретение относится к косметической композиции для местного нанесения на кожу, содержащей такую комбинацию.
Изобретение также относится к способу косметического ухода, включающему местное нанесение на кожу человека косметической композиции, который хочет осуществить косметический уход с помощью этой композиции.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В документе WO 01/03713 раскрыт способ экстракции ресвератрола и/или виниферина из сухих виноградных побегов. Отмечено, что виниферин представляет собой димер ресвератрола. В вышеупомянутом документе также указано, что ресвератрол присутствует в основном в мономерной форме, но существует также в виде олигомера, содержащего вплоть до 4 мономеров (стр.1, строки 11-17).
Подчеркивается значение использования сухих побегов, поскольку выход ресвератрола и виниферина в этом случае гораздо выше, чем выход, полученный со свежими побегами (стр.2, строка 31 - стр.3, строка 2).
В указанном документе допускается возможность получения экстрактов виноградной лозы, которые являются в тысячу раз более концентрированными в отношении ресвератрола, чем имеющиеся в продаже экстракты, полученные из виноградной лозы, что делает возможным приготовление жидких, порошковых или таблетированных препаратов, имеющих высокое содержание ресвератрола, сравнимое с традиционными промышленными применениями этих продуктов, и упоминается в основном в этом контексте в фармацевтических, диетических и косметических областях (стр.5, строки 25-32 и п.18 формулы изобретения).
Кроме того, следует отметить, что сушка виноградных побегов, описанная в указанном документе из предшествующего уровня техники, осуществляется на открытом воздухе, но в течение периода времени, не превышающего 4 месяцев (Пример 1: 4 месяца сушки; Пример 2: 3 месяца сушки; Пример 3: самая продолжительная сушка составляет 3 месяца).
ЗАДАЧИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Основная задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить новую композицию, содержащую синергическую комбинацию активных ингредиентов, и, более конкретно, косметическую композицию для местного нанесения на кожу.
Другая основная задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить такую композицию из косметически приемлемых активных ингредиентов, т.е. активных ингредиентов с отсутствием обнаружимой токсичности на клетки кожи, которые доступны в больших количествах по умеренной цене для применения в изготовлении косметических композиций в промышленном масштабе.
Еще одна важная задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить композицию с ограниченным содержанием ресвератрола, предпочтительно содержащую его олигомеры.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение одновременно решает вышеупомянутые задачи простым способом, который легко осуществить в косметическом производстве в промышленном масштабе.
Таким образом, согласно первому аспекту в настоящем изобретении предложена композиция, содержащая комбинацию первого косметически активного ингредиента, содержащего высушенный экстракт виноградных побегов, и второго косметически активного ингредиента, содержащего компонент эктоинового типа.
1
6
В рамках изобретения выражение "компонент эктоинового типа" означает (S)-1,4,5,6-тетрагидропиримидин-4-карбоновую кислоту, которая не замещена или замещена по меньшей мере одним радикалом С-Снизший алкил, особенно в положении 2, и/или по меньшей мере одной гидрокси- или метоксигруппой, особенно в положении 5, и ее косметически приемлемые соли или сложные эфиры.
Предпочтительно указанный второй ингредиент выбран из эктоина, или (S)-1,4,5,6-тетрагидро-2-метилпиримидин-4-карбоновой кислоты, и гидроксиэктоина, или (S,S)-1,4,5,6-тетрагидро-5-гидрокси-2-метилпиримидин-4-карбоновой кислоты, и их косметически приемлемых солей или сложных эфиров.
В другом конкретном варианте осуществления изобретения эта композиция содержит от 0,1% до 20% по массе, предпочтительно от 0,1% до 10% по массе первого ингредиента и от 0,1% до 20% по массе, предпочтительно от 0,1% до 10% по массе второго ингредиента, но сумма этих двух ингредиентов преимущественно меньше или равна 20% по массе, предпочтительно меньше 10% по массе от общей массы композиции.
В еще одном конкретном варианте осуществления изобретения соответствующие соотношения по массе первого ингредиента и второго ингредиента составляют от 1/10 до 10/1, в частности примерно 1/1.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения указанный второй ингредиент представляет собой смесь эктоина и гидроксиэктоина в по существу равных соотношениях по массе.
Согласно второму аспекту настоящее изобретение также относится к косметической композиции для местного нанесения на кожу, содержащей композицию, как она определена выше или как следует из описания ниже, вместе с косметически приемлемым эксципиентом.
В другом варианте композиция содержит по меньшей мере один другой косметически активный ингредиент, особенно другой косметически активный ингредиент, который обладает активностью против старения, в частности для предупреждения, корректирования или замедления эффектов старения кожи, например витамин А, витамин Е или витамин С; или косметически активный ингредиент, который оказывает влияние на регенерацию кожи, например мадекассозид; или косметически активный ингредиент, который имеет увлажняющий эффект, например экдистероид или растительный экстракт, содержащий его, такой как экстракт Ajuga turkestanica (живучки туркестанской); или косметически активный ингредиент для защиты против актиничного излучения, например косметически приемлемый физический или химический солнцезащитный фильтр, такой как метоксициннамат.
Согласно третьему аспекту настоящее изобретение также относится к способу косметического ухода, включающему местное нанесение на кожу человека, который хочет осуществить косметический уход, композиции, как она определена выше, или косметической композиции, как она определена выше или как следует из описания ниже.
В одном конкретном варианте способа указанное косметическое средство выбрано из группы, включающей средство против старения, в частности для предупреждения, корректирования или замедления эффектов старения кожи, и средство для регенерации кожи. Его эффекты в борьбе со старением кожи включают в себя в основном борьбу с возрастным или актиническим старением кожи.
В рамках изобретения можно продемонстрировать синергический эффект, обусловленный комбинацией первого косметически активного ингредиента, содержащего экстракт из виноградных побегов, и второго косметически активного ингредиента, содержащего компонент эктоинового типа.
В рамках изобретения экстракт виноградных побегов представляет собой любой экстракт виноградных побегов, полученных из виноградника. Могут быть использованы побеги любых сортов винограда, при этом конкретные сорта представляют собой Merlot, Cabernet Franc, Gamay, Sirah, Sémillon и Sauvignon. Предпочтительные виноградные побеги по изобретению представляют собой сорта Sémillon и/или Sauvignon.
В одном конкретном варианте осуществления изобретения используют высушенные виноградные побеги. Подразумевают, что высушенные виноградные побеги означают побеги, которые были подвергнуты стадии сушки так, что содержание влаги в них составляет преимущественно ниже 20%, предпочтительно ниже 5% по массе.
В одном конкретном варианте побеги сушат либо естественным образом на открытом воздухе в сухом месте, либо в печи при средней температуре, например не превышающей примерно 40°С, до тех пор, пока полученное содержание влаги в каждом случае не будет ниже 20%, предпочтительно ниже 5% по массе.
Например, сушку можно осуществлять естественным образом на открытом воздухе в сухом месте с помощью способа сушки, рекомендованного в вышеупомянутом документе WO 01/03713, который, в частности, включает период сушки по меньшей мере два месяца, предпочтительно по меньшей мере четыре месяца.
Эта естественная сушка на открытом воздухе благоприятствует последующей экстракции активных ингредиентов и, в частности, образованию олигомеров ресвератрола.
Экстракт виноградных побегов, используемый в рамках изобретения, получают преимущественно способом, который в конечном счете дает экстракт, обогащенный полифеноловыми молекулами и, в частности, олигомерами ресвератрола, которые предложены в рамках изобретения для получения косметического эффекта.
В одном предпочтительном в настоящее время варианте осуществления изобретения процедура экстракции в основном включает следующие стадии:
а) сбор виноградных побегов из виноградника;
б) сушку в течение минимум 4 месяцев;
1
6
в) по меньшей мере одну стадию экстракции полярным органическим растворителем, например C-Снизшим спиртом, таким как метанол, этанол, пропанол, изопропанол, бутанол, пентанол или гексанол, либо чистым, либо смешанным с водой или водным раствором, или кетоном, в частности ацетоном, или смесью кетона с водой, с получением первого экстракта с использованием полярного растворителя;
г) по меньшей мере одну промывку указанного первого экстракта с использованием полярного растворителя неполярным органическим растворителем, таким как гексан, с получением второго экстракта, который может быть использован сам по себе;
д) возможно, и поскольку используют гораздо более очищенный экстракт, очистку осуществляют на колонке, в частности на колонке с силикагелем, в результате чего желаемые активные вещества, в основном полифеноловые вещества и особенно олигомеры ресвератрола, связывают и затем избирательно элюируют соответствующей элюирующей смесью, например смесью этилацетат/гексан, в частности, в соотношении 80/20 об./об., с получением третьего высокоочищенного экстракта, который также может быть использован сам по себе; и
е) возможно, элюирующий растворитель может быть удален, в частности, выпариванием с получением порошка бежевого цвета, который представляет собой предпочтительный конечный очищенный экстракт виноградных побегов по изобретению.
В одном конкретном варианте изобретения указанный конечный порошок может быть снова растворен в смеси спирта и воды, например, при соотношении 80/20 (об./об.) и, в частности, в смеси бутиленгликоля и воды 80/20 (об./об.).
Этот порошок, повторно растворенный в этой 80/20 (об./об.) смеси спирта и воды, дает по меньшей мере примерно 1%, преимущественно по меньшей мере 10% виниферина, димера ресвератрола, в конечном растворе.

Что касается второго косметически активного ингредиента, содержащего компонент эктоинового типа, то он имеется в продаже. Например, можно использовать продукт, поставляемый фирмой MERCK, например, под торговым названием RONACARE гидроин. Этот коммерческий продукт от MERCK является особенно ценным, поскольку соотношения эктоина и гидроксиэктоина по существу равны (50-60% по массе эктоина, 40-50% по массе гидроксиэктоина). Этот продукт имеет также очень хорошую стабильность без необходимости добавления антиоксиданта или консерванта и имеет косметическое качество.
Другие задачи, признаки и преимущества изобретения станут очевидными из следующего пояснительного описания, ссылающегося на примеры по изобретению, которые даны просто для иллюстрации и поэтому не могут каким-либо образом ограничивать объем изобретения.
В примерах все проценты даны по массе, температура представлена в градусах Цельсия, и давление представляет собой атмосферное давление, если не указано иначе.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На Фиг.1 показаны результаты эксперимента по клеточному росту, описанного в примере 3 и проведенного с помощью коммерческого ХТТ теста, известного как "Набор II для пролиферации клеток" от BOEHRINGER, который соответственно демонстрирует кинетику клеточного роста для необработанного контроля, только для экстракта виноградных побегов I3, для "гидроинового" продукта (RONACARE от Merck) и для комбинации экстракта I3 и гидроина, причем указанная кинетика определена на основании измерений клеточного роста во временных точках 6 часов, 9 часов, 15 часов и 18 часов, отмеченных на оси абсцисс, количество клеток отмечено на оси ординат в виде процента от количества клеток в точке 6 часов, взятых за 100%.

На Фиг.2 представлена диаграмма, полученная из Фиг.1, которая показывает соответственно в форме столбиков количество клеток, во временной точке обработки клеток 18 часов, в виде процента для необработанного контроля, экстракта I3, "гидроинового" продукта (RONACARE от Merck) и комбинации по изобретению, в которой объединены экстракт I3 и гидроиновый продукт, демонстрирующая синергический эффект данной комбинации.

На Фиг.3 показаны результаты теста по защите от свободных радикалов, осуществленного в примере 4, в виде процента защиты, отмеченного на оси ординат, относительно результатов, представленных соответственно в форме столбиков, полученных для экстракта I3, "гидроинового" продукта (RONACARE от Merck) и комбинации этих двух активных ингредиентов, отмеченных на оси абсцисс, демонстрирующего неожиданное превосходство защиты, обеспечиваемой комбинацией по сравнению с каждым продуктом, взятым отдельно.
ПРИМЕРЫ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПРИМЕР 1
Способ получения экстракта виноградных побегов по изобретению, обозначенного I3
Согласно изобретению процедура экстракции в основном включает следующие стадии:
а) 1 кг виноградных побегов сорта Sauvignon собирают в марте-апреле в винограднике, расположенном на юго-востоке Бордо (Bordeaux);
б) собранные виноградные побеги сушат на воздухе в сухом месте в течение минимум 4 месяцев до тех пор, пока содержание влаги не будет ниже 5% по массе;
в) для проведения экстракции высушенные виноградные побеги измельчают до среднего размера частиц менее 4 мм. По меньшей мере одну стадию экстракции осуществляют с полярным органическим растворителем, в данном случае с ацетоном, в подходящих соотношениях по массе измельченных побегов к растворителю по меньшей мере 1/10 в течение по меньшей мере 20 часов при комнатной температуре или температуре порядка 30°С; твердый остаток удаляют фильтрацией.
Ацетон выпаривают из ацетонового раствора, содержащего растворимый экстракт, с получением по существу сухого первого грубого экстракта, который снова растворяют в смеси этанол/вода в соотношении 50/50 об./об., причем этот грубый экстракт массой около 30 г требует примерно 225 мл указанного растворителя. Вводно-этанольный раствор, содержащий растворимый экстракт, поддерживают при комнатной температуре или при температуре от 25°С до 30°С в течение одного часа при перемешивании, и супернатанты отделяют фильтрацией.
Очищенный экстракт в твердом состоянии получают либо путем полного удаления этанола выпариванием, либо путем частичного удаления этанола выпариванием, чтобы вызвать осаждение очищенного экстракта, который сушат стандартным способом с получением очищенного экстракта в форме порошка;
г) вышеупомянутый очищенный экстракт затем снова очищают путем повторного растворения полученного порошка в смеси ацетон/вода в соотношении 80/20 (об./об.).
Добавляют гексан до тех пор, пока не получат двухфазный раствор, при этом органическая фаза состоит по существу из гексана, а водная фаза содержит по существу смесь ацетон/вода. Поэтому экстракцию осуществляют с энергичным перемешиванием при комнатной температуре в течение нескольких минут, например, примерно 10 мин.
Смесь оставляют стоять для того, чтобы разделить фазы путем декантации.
Извлекают водную фазу, содержащую желаемый очищенный экстракт побегов;
д) растворители выпаривают с получением желаемого первого очищенного экстракта побегов, который может быть использован сам по себе и обозначен как продукт I1 по изобретению;
е) данный продукт преимущественно очищают на колонке с силикагелем, при этом желаемые активные вещества, в основном полифеноловые вещества и особенно олигомеры ресвератрола, связываются. Колонка с силикагелем, используемая в этом примере, представляет собой колонку, заполненную силикагелем типа 60 от Merck. Полифеноловые вещества, связанные с силикагелем, затем избирательно элюируют элюирующим растворителем, содержащим смесь этилацетат/гексан в относительном соотношении 80/20 об./об. в количестве 1 литр растворителя на грамм сухого экстракта, введенного в колонку;
ж) элюирующий растворитель удаляют, в частности, выпариванием с получением порошка бежевого цвета, который представляет собой второй конечный очищенный экстракт виноградных побегов по изобретению, названный I2; и
з) предпочтительно этот конечный порошок I2 может быть снова растворен в смеси спирт/вода, в данном случае бутиленгликоль/вода, в соотношении 80/20 (об./об.), чтобы облегчить его применение в композиции, в частности в косметической композиции.
Анализ этого повторно растворенного порошка по изобретению, названного продуктом или экстрактом I3, демонстрирует, что он содержит примерно 68% олигомеров ресвератрола, из которых примерно 24% представляют собой виниферин.
ПРИМЕР 2
Композиция по изобретению

Приготавливают композицию, которая содержит 50% по массе экстракта I3, полученного в примере 1, содержащего примерно 68% олигомеров ресвератрола и примерно 50% компонентов эктоинового типа, полученных коммерческим путем, а именно гидроиновый продукт RONACARE от MERCK.
Эта композиция может быть разбавлена в различных пропорциях для выполнения экспериментов, являющихся предметом следующих примеров.
ПРИМЕР 3
Эксперименты по клеточному росту
А - Модель клеточного роста
Композиция из примера 2 подлежит тестированию для определения ее влияния на клеточный рост с использованием имеющегося в продаже ХТТ теста, названного "Набор II для клеточной пролиферации" от BOEHRINGER.
В этой модели тетразолиевую соль превращают в формазан - оранжевое соединение, определяемое при 450 нанометрах с помощью спектрофлуориметра, имеющегося в продаже, например, под маркой TECAN - посредством дегидрогеназ, присутствующих в митохондриальных дыхательных цепях. Таким образом, только живые клетки способны образовывать формазан.
Реакция представляет собой следующее:

Клетки обрабатывают в течение 24-часового периода композицией из примера 2 по изобретению, но разбавляют до концентрации 1,56 мкг/мл для каждого из двух активных ингредиентов (т.е. 1,56 мкг/мл композиции из примера 2 и 1,56 мкг/мл RONACARE от Merck), или, в качестве сравнения, раствором композиции из примера 2 или только гидроиновым продуктом RONACARE, при этом концентрация составляет 3,52 мкг/мл для того, чтобы иметь одинаковую общую концентрацию.
Измерения производили с помощью ХТТ теста каждые три часа для отслеживания кинетики клеточного роста.
Следует отметить, что первое время, принятое во внимание, а именно 6 часов после начала эксперимента, рассматривают как соответствующее 100% клеток. Невозможно было взять Т0 или Т3, так как стандартные отклонения были слишком большими, возможно, из-за пертурбации, связанной с изменениями среды.
В - Протокол обработки
День D0
В день D0 иммортализованные трансформированные кератиноциты человека НаСаТ типа, хорошо известные специалистам в данной области (смотри http:/cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=15688132?, который цитирует статью POZZI с соавт. в Journal of Endocrinal. Invest. 2004, vol.27, №2, p.147-149), инокулируют в 96-луночный микропланшет в концентрации 10000 клеток на лунку.
День D24
В день D24 начинают обработки предлагаемыми продуктами, упомянутыми выше, в указанных концентрациях, и клеточный рост является следующим.
С - Наблюдения за эффектами обработки во временных точках 3 часа = Т3,
6 часов = Т6, 9 часов = Т9, 15 часов = Т15 и 18 часов = Т18
На каждой стадии обработки, указанной в названии выше, культуральную среду (дополненную KSFM от Gibco) удаляют.

Клетки обрабатывают либо композицией из примера 2 по изобретению, либо только экстрактом I3, либо коммерческим гидроиновым продуктом RONACARE от Merck.
Чтобы осуществить это, сначала готовят разведения 1/16 и 1/32 в нестерильных условиях из 5%-ного исходного раствора в DMSO (диметилсульфоксид) с получением 3,12 мг/мл в случае, когда присутствует один продукт, и 1,56 мг/мл для каждого продукта в случае смеси.
Затем приготавливают разведения 1/1000 в культуральной среде в боксе с получением конечной концентрации 3,12 мкг/мл для смеси и 1,56 мкг/мл для каждого ингредиента.
Таким образом, обработки для проводимого теста представляли собой:
- 3,12 мкг/мл для экстракта I3 из примера 1;

- 3,12 мкг/мл для гидроинового продукта RONACARE от MERCK;

- в случае композиции из примера 2 по изобретению, содержащей смесь, 1,56 мкг/мл для I3 из примера 1 и 1,56 мкг/мл для гидроинового продукта RONACARE от MERCK.
D - Подготовка теста
Для подготовки теста культуральную среду удаляют путем переворачивания планшета.
Клетки промывают один раз: 200 мкл/лунку, клетки промывают PBS при 37°С.
ХТТ раствор в концентрации 0,2 мг/мл (разведение 1/5 исходного раствора с концентрацией 1 мг/мл), приготовленный для немедленного применения в дополненной среде KSFM, добавляют в объеме 100 мкл/лунку.
Приготавливают контроль без клеток.
2
Микропланшет заворачивают в алюминиевую бумагу и инкубируют в течение 3 часов при 37°С в термостате с 5% СО.
В конце 3-часовой инкубации считывают оптические плотности (OD) при 450 нм на коммерчески доступном спектрофотометре Тесаn.
Полученные результаты представлены ниже.
Е - Представление результатов
Считают, что время обработки 6 часов = Т6 соответствует 100% клеток в лунках.
Жизнеспособность в процентах представлена следующей формулой:
% жизнеспособности = (OD×100)/(OD контроль - 100)
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты представлены в Таблице I ниже.
ТАБЛИЦА I
Время обработки в D24
% жизнеспособности без обработки
% жизнеспособности с I3 из примера 1
% жизнеспособности с RONACARE<sup></sup> гидроином
% жизнеспособности с композицией из примера 2 по изобретению
6 часов
100
100
100
100
9 часов
106
108
108
113
15 часов
110
112
111
127
18 часов
126
130
133
142
Полученные результаты представлены в виде кривой на Фиг.1.

Из этих результатов видно, что для клеток, обработанных композицией из примера 2 по изобретению, содержащей комбинацию продукта I3 по изобретению, содержащего примущественно олигомеры ресвератрола, с продуктом гидроинового типа, получают более стабильный рост, чем с необработанными клетками или с клетками, обработанными только продуктом I3 из примера 1 или продуктом гидроинового типа RONACARE от MERCK.
Следует отметить, однако, что продукт I3 из примера 1 и продукт гидроинового типа по отдельности демонстрируют низкую активность.
Кроме того, благодаря композиции по изобретению, динамика клеточного роста значительно лучше в той же 18-часовой конечной точке.
На Фиг.2 представлено сравнение результатов в течение периода обработки 18 часов и ясно показано, что комбинация по изобретению имеет синергический эффект, который является совершенно неожиданным для специалистов в данной области.
ПРИМЕР 4
Тест в отношении защиты от свободных радикалов
Модель: 3D тест (AES лаборатория)
Этот тест позволяет продемонстрировать ДНК-защитный эффект молекулы против гидроксильных радикалов, порождаемых перекисью водорода.
Чтобы охарактеризовать молекулу или смесь, обладающую антиоксидантными свойствами или свойствами, направленными против свободных радикалов, и, следовательно, чтобы защитить человеческую клетку от окислительного повреждения, обусловленного реакционноспособными видами кислорода (ROS), следует принять во внимание 3 критерия, установленных Барри Холлиуэллом (Barry Halliwell):
- молекула должна "доказать", что она активна в клетке; чисто химический тест предполагает, но не демонстрирует это;
- молекула должна быть эффективной в отношении биологического окислителя, т.е. окислителя, присутствующего в клетках. Некоторые антиоксиданты имеют специфическую защитную активность против определенных окислителей; и
- концентрации используемого окислителя должны быть сходны с концентрациями, которые могут быть использованы in vivo.
Эти комментарии Барри Холлиуэлла, специалиста в области окисления, взяты из статьи, опубликованной в 1995 г. в the Journal Biochemical Pharmacology (том 49, 1341-1348) под названием "Характеристика антиоксидантов - методология и механизм".
2
Поэтому 3D ТЕСТ позволяет продемонстрировать ДНК-защитный эффект молекулы против гидроксильных радикалов, порождаемых перекисью водорода в присутствии FeCl.
Более того, 3D ТЕСТ на клетках полностью удовлетворяет критериям Барри Холлиуэлла.
Принцип
S.F.R.I, и токсико-устойчивая группа I.P.B.S. CNRS, Тулуза, разработали систему определения повреждения (3D ТЕСТ) в ДНК, собранной на микропланшете (Analytical Biochemistry, 1995, 232, 37-42).
ДНК абсорбируют на сенсибилизированные лунки и затем инкубируют с окисляющими агентами (перекись водорода + железо). Произведенное повреждение распознают и затем репарируют специфическими белковыми комплексами, присутствующими в очищенных клеточных экстрактах человеческого происхождения. Репарация повреждений вовлекает фазу эксцизии (вырезания) повреждения и затем повторный синтез фрагмента ДНК или вырезанных оснований.
Во время стадии репаративного синтеза модифицированные нуклеотиды (биотин-связанные dUTP) встраиваются в ДНК. Эти биотинилированные нуклеотиды затем распознаются молекулой авидина, конъюгированной с пероксидазой. Затем добавляют хемолюминисцентный субстрат для пероксидазы, и излучаемый сигнал измеряют люминометром (Spectrafluorplus, Tecan). Интенсивность измеренного сигнала, обозначенного в дальнейшем как RLU, представляет собой функцию количества репарированных повреждений в ДНК. Дозовый эффект наблюдают в пределах от 1 до 15 повреждений на 6 т.п.н. для большинства повреждений.
Эта система способна репарировать все типы повреждений, поскольку в клеточных экстрактах, приготовленных и используемых для этого исследования, присутствуют и активны различные пути репарации повреждений ДНК (NER и ВЕR). Поэтому окислительное повреждение распознается в этой системе.
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
1. Материалы
Используемые реагенты были описаны в статье в Analytical Biochemistry, 1995, 232, 37-42.
Хемолюминисцентный сигнал определяют с помощью люминометра Spectrafluorplus (Tecan).
2. Способы 3D ТЕСТ in vitro
2.1 Разведения тест-образцов
Образцы экстракта побегов I3 и гидроин растворяют в метаноле в исходной концентрации 50 мг/мл.
2
Исследуемые концентрации приготавливают путем последовательного разведения исходного раствора в ультрачистой воде. Все разведения приготавливают в двухкратной концентрации с тем, чтобы получить желаемые концентрации после добавления одного объема окисляющего раствора перекиси водорода + FeCl.
2
Чтобы подтвердить специфичность уменьшения сигнала репарации, такие же разведения (1Х) инкубировали в тех же условиях с ДНК, поврежденной перекисью водорода + FeCl. Разведение будет демонстрировать только защитный эффект, если наблюдается снижение сигнала репарации в присутствии окислителя и наблюдается отсутствие значительной модификации сигнала в предварительно поврежденной ДНК. Ингибирование сигнала репарации в поврежденной ДНК можно объяснить, например, непосредственным взаимодействием образца с ДНК, которое будет оказывать влияние на блокирование доступа к повреждениям белковым репарирующим комплексам.
2.2 Адсорбция целевой ДНК в лунках микропланшета
Сверхочищенную плазмидную ДНК (pBS) (преимущественно сверхспиральную форму) приводят в контакт с сенсибилизированными лунками в течение 30 минут при 30°С при легком встряхивании. В этих условиях адсорбция ДНК является количественной.
2
2
2
Добавляют положительный контроль репарации, состоящий из плазмидной ДНК, предварительно поврежденной НО+FeCl.
2.3 Исследование защитного действия образцов против реакционноспособных видов кислорода
2
Гидроксильный радикал ОН° получают в результате реакции Фентона (перекись водорода + FeCl).
2
2
2
Реакция Фентона: осуществляется путем добавления смеси НО+FeСl
-9
Эти радикалы, которые являются сильными электрофилами, имеют очень короткий период жизни (порядка 10 секунд). Поэтому они очень быстро взаимодействуют с основаниями ДНК и продуцируют различные виды повреждений, такие как модификации или потери оснований. Эти очень генотоксичные повреждения распознаются системой репарации.
2
Перекись водорода приготавливают в концентрации 4 мМ в ультрачистой воде (MilliQ качество от Millipore). FeCl приготавливают в концентрации 2 мкМ в ультрачистой воде. Эти два раствора разбавляют в равных объемах непосредственно перед применением.
Этот раствор смешивают непосредственно перед применением с равным объемом различных разведений тест-образцов. 50 мкл смеси добавляют в лунки, содержащие адсорбированную плазмидную ДНК. Все затем инкубируют в течение 30 минут при 30°С при легком встряхивании.
Затем осуществляют стадию промывки для того, чтобы сохранить только ту ДНК, которая была более или менее повреждена окислителем.
Стадию репарации повреждений затем осуществляют специфическими комплексами для репарации. Во время фазы повторного синтеза вырезанной нити ДНК биотин-меченый нуклеотид встраивается в ДНК (инкубация в течение 3 часов при 30°С, без встряхивания).
Затем осуществляют стадию промывки для того, чтобы удалить биотин, не встроенный в ДНК.
После этого следует стадия распознавания биотина молекулой авидина, конъюгированной с молекулой пероксидазы (15 минут при 30°С при легком встряхивании).
Затем осуществляют дополнительную стадию промывки для того, чтобы удалить авидин, конъюгированный с молекулой пероксидазы, который не связывается с биотином.
В конце осуществляют стадию проявления реакции репарации путем добавления хемолюминисцентного субстрата для пероксидазы (5 минут при 30°С при легком встряхивании) и затем считывания люминесценции.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Визуализация результатов улучшается путем представления их в виде процента защиты или процента ингибирования образования оскислительного повреждения в ДНК. Значение 0% соответствует сигналу репарации для ДНК, поврежденной только окислителем.
1
2
Процент защиты в присутствии ROS рассчитывают как относительное снижение повреждающего эффекта, обусловленного радикалами ОН° или O, т.е.:
Иногда может наблюдаться неспецифическое ингибирование (в отсутствие ROS) сигнала репарации. Это может происходить в результате прямого взаимодействия соединения с ДНК (десорбция ДНК из лунок, неспецифическое связывание с ДНК, которое будет маскировать повреждения от белков репарации и т.д.). Поэтому добавляют контроль, который состоит в инкубации тестируемых агентов с предварительно поврежденной ДНК. Снижение сигнала в этих условиях отражает неспецифическое ингибирование соединения, которое не зависит от его возможных свойств в отношении свободных радикалов.
Ингибирование репарации в присутствии ROS может быть следствием:
- естественной защиты;
- уменьшения эффективности репарации поврежденной ДНК вследствие прямого взаимодействия тестируемой молекулы с ДНК или обработанным микропланшетом; или
- одновременного наличия этих 2 явлений.
Поэтому оценивают неспецифическое ингибирование. Оно рассчитывается из результатов, полученных для образцов, инкубируемых с предварительно поврежденной ДНК.
Специфическое ингибирование или специфическая защита равно(а) разности между ингибированием в присутствии ROS и неспецифическим ингибированием. Она отражает активность в отношении свободных радикалов, обусловленную только молекулой.
ТАБЛИЦА IIТест на защиту от свободных радикалов
Образец
% защиты
Контрольный растворитель
-
I3
43
RONACARE<sup></sup> гидроин
47
I3+RONACARE<sup></sup> гидроин (изобретение)
62
Образцы экстракта побегов I3 и гидроин демонстрируют защитную активность против свободных радикалов. Эффективность защиты увеличивается примерно на 40% при обработке композицией по изобретению.
Следовательно, между двумя молекулами действительно существует синергизм.
Рекомендованные дозы составляют от 0,1% до 10% из смеси (1/1) экстракта побегов и гидроинового компонента.
Из Таблицы II и прилагаемой Фиг.3 видно, что каждый образец продукта I3 и гидроинового продукта демонстрирует защитную активность против свободных радикалов.
В отличие от этого, композиция по изобретению, в которой продукт I3 и гидроиновый продукт объединены, дает приблизительно 40%-ное увеличение эффективности защиты, демонстрирующее синергический эффект между двумя молекулами, который является совершенно неожиданным для специалистов в данной области.
ПРИМЕР 5
Подтверждение активности комбинации по изобретению против свободных радикалов
Виды свободных радикалов кислорода продуцируются в коже различными агрессивными факторами, такими как УФ-лучи, стрессы и воспалительные реакции.
Эти окисляющие молекулы атакуют составляющие компоненты кожи, а именно липиды, белки, полисахариды и клеточную ДНК, нарушая биологические функции. Тест, используемый в данном описании для подтверждения защитного эффекта комбинации экстракта виноградных побегов и компонента эктоинового типа по изобретению после его нанесения на кожу, основан на тесте, который описан в публикации, озаглавленной "Новый способ оценки in vivo у субъектов-людей фонового или УФ-индуцированного перекисного оксиления stratum corneum (рогового слоя). Применение для тестирования эффективности продуктов, захватывающих свободные радикалы", из Р.Girard, L.Lempereur, P.Buche и L.Violin, в обзоре Curr. Probl. Dermatol., 1998, 26, 99-107.
*
Принцип этого теста основан на взаимодействии свободных радикалов кислорода, присутствующих на поверхности кожи, с маркером, представляющим собой DCF(H)-DA (2'7'-дихлорфлуоресциндиацетат), которое дает флуоресцентный продукт, известный как DCF, флуоресценцию которого измеряют с помощью флуорометра. Измерение этой флуоресценции позволяет количественно определять присутствие свободных радикалов и, следовательно, степени активности защитного продукта.
Выбрали 30 здоровых волонтеров белой расы и женского пола.
2
Продукт, подлежащий тестированию, наносят на участок внутренней части предплечья в количестве 2 мкл/см. Осуществляют четыре аппликации, через 2 часа каждая.
Тестируемый человек имеет право в дальнейшем использовать свои обычные средства для очистки, за исключением любого средства по уходу за кожей.
Через 24 часа после первого нанесения тестируемого продукта осуществляют удаление с помощью стандартных прозрачных клейких дисков, имеющихся в продаже под торговым названием D-Squames.
Количество корнеоцитов, удаленных таким образом, оценивают путем измерения инфракрасного света, проходящего через D-Squames, с помощью имеющегося в продаже устройства, названного скваметр (Squameter), чтобы учесть количество сквамозных клеток в статистическом анализе измеренных результатов.
*
Различные диски D-Squames затем инкубируют в растворе, забуференном фосфатами, 66 мМ при рН 7,4, в течение 32 часов при 37°С, содержащем DCF. В каждом случае количественно измеряют флуоресценцию раствора после инкубации с помощью флуорометра торговой марки Fluroskan Ascent (Labsystems).
Были протестированы следующие продукты:

- продукт 1 (по изобретению): эмульсия (крем), содержащая 1% по массе экстракта I3 и 1% гидроина RONACARE от компании MERCK, в данном описании "гидроин",
- продукт 2 (по изобретению): лосьон, содержащий 1% экстракта 13 и 1,5% гидроина,
- продукт 3: эмульсия, содержащая полифенолы из виноградных семян,
- продукт 4: эмульсия, содержащая 0,5 идебенона, хорошо известного антиоксиданта,
- продукт 5: эмульсия, содержащая 1% идебенона.
Результаты измерений флуоресценции представлены в таблице III ниже.
ТАБЛИЦА III
Флуоресценция
Сравнение с необработанным субъектом (TNT) (%)
Продукт 1 (по изобретению)
106,6
-19%
Продукт 2 (по изобретению)
101,0
-23%
Продукт 3
121,1
NS
Продукт 4
126,5
NS
Продукт 5
114,7
-13%
Контроль (необработанный субъект) (”TNT”)
131,7
S(<0,01)
Таким образом, флуоресценция непосредственно коррелирует с количеством присутствующих свободных радикалов, согласно представленным выше результатам совершенно очевидно, что количество свободных радикалов существенно снижается в присутствии продуктов по изобретению. Поэтому продукты по изобретению обеспечивают гораздо лучший противорадикальный эффект in vivo.
Различные примеры косметических препаратов композиции по изобретению будут представлены ниже, при этом различные ингредиенты приготавливают стандартным способом, известным специалистам в данной области.
ПРИМЕР 6
Косметическая композиция в форме крема по изобретению
Стеарет-21 (Brij 721)
2,5%
Глицерилстеарат (Tegin)
1,1
Стеариловый спирт
5
Глицеринтрикапрат/каприлат
11,5
Бутиленгликоль
3
Глицерин
2
Консервант
0,5
Парфюмерная композиция
0,5
Вода
62,4
Композиция из примера 2
5
Октилметоксициннамат
7,5
ПРИМЕР 7
Косметическая композиция в форме геля
Глицерин
3%
AMPS полимер (Sepigel 305)
3
Гидрогенизированное касторовое масло
(Cremophor СО-60)
2
Полиэтиленгликоль
1,5
Консервант
0,5
Парфюмерная композиция
0,3
Вода
85,7
Композиция из примера 2
3
Бензофенон 4
1
ПРИМЕР 8
Косметическая композиция в форме лосьона
Бутиленгликоль
3%
EDTA
0,1
Солюбилизатор
1
Парфюмерная композиция
0,3
Спирт
5
Вода
80,47
Композиция из примера 2
10
Бензофенон 4
0,13