Способ определения эффективности моющих средств на основе пробиотиков
METHOD OF DETERMINING EFFICIENCY OF DETERGENTS BASED ON PROBIOTICS

Изобретение относится к области микробиологии и дезинфектологии и может быть использовано для определения эффективности моющих средств на основе пробиотиков.
Bacillus
Моющие средства на основе пробиотиков (ПМС) представляют собой новое поколение моющих средств, которые содержат смесь спор бактерий рода  в сочетании с поверхностно-активными веществами.  Их механизм действия основан на принципе «конкурентного ингибирования» (вытеснения) имеющейся на поверхностях микрофлоры и перевода ее в пассивное метаболическое состояние. Имеющиеся данные говорят о том, что ежедневная обработка поверхностей средствами на основе пробиотиков эффективно снижает уровень патогенных микроорганизмов в условиях больничной среды. Присутствие пробиотиков на поверхностях в помещениях предотвращает повторную контаминацию микроорганизмами и обуславливает поддержание стабильных гигиенических условий поверхностей.
Известен способ оценки эффективности дезинфектантов и антисептиков, заключающийся в сравнении количеств колониеобразующих единиц микроорганизмов до и после воздействия на инокулюм дезинфектанта или антисептика, причем воздействие на инокулюм дезинфектанта или антисептика проводят в цилиндре, помещенном на поверхность плотной питательной среды, содержащей естественный нейтрализатор, по истечении периода необходимой экспозиции в цилиндр вносят концентрированный искусственный нейтрализатор, через 5 мин цилиндр удаляют, и исследуемую смесь распределяют по поверхности плотной питательной среды с последующей оценкой результатов. (Патент RU №2191829, опубл. 2002).
В патенте RU 2679845, опубл. 2019, описан способ биологической дезинфицирующей пробиотической очистки и обеззараживания от патогенов бактерий и вирусов помещений медицинских учреждений, включающий этапы, на которых обрабатывают помещения медицинских учреждений, проводят сбор смывов в упомянутых помещениях, осуществляют посев смывов на питательные среды в «чашках Петри» для контроля текущей чистоты помещений, где обработку осуществляют следующим образом:  один раз в день обрабатывают помещения медицинских учреждений пробиотиком; осуществляют смывы в разных местах помещений медицинских учреждений и осуществляют их посев на питательные среды в «чашках Петри» не ранее чем через пять часов после каждой обработки пробиотиком; при этом общая длительность процесса очистки и обеззараживания составляет 10 суток, причем пробиотик в первые пять дней представляет собой концентрат 5% водного раствора, который доводится до температуры 40°С, а во вторые пять дней - концентрат 1% водного раствора, который доводится до температуры 40°С.
Полученные результаты показали пролонгирующие свойства пробиотиков, при этом чистоту можно обеспечить без вредных для человека, особенно для лиц аллергическими явлениями,  запахов.
В настоящее время не существует широко признанных стандартов качества, методических рекомендаций и способов по изучению эффективности использования моющих средств на основе пробиотиков.
Предлагаемый способ направлен на решение проблемы и достижение технического результата, состоящего в установлении эффективности использования моющих средств на основе пробиотиков, позволяющий наиболее достоверно и точно с минимальными затратами времени и средств проводить оценку качества действия пробиотиков, содержащихся в качестве активного ингредиента в моющих средствах.
В связи с отсутствием способов оценки эффективности моющих средств на основе пробиотиков в лабораторных условиях с максимально приближенными условиями практического применения, предлагаемый способ соответствует критерию «новизна».
9
6
Технический результат достигается описываемым способом определения эффективности моющих средств на основе пробиотиков, включающим два этапа, при этом на первом этапе тест-поверхность, контаминированную тест-микроорганизмом, после подсушивания обрабатывают раствором моющего средства на основе пробиотиков, через определенные промежутки времени с поверхности берут смывы, осуществляют посевы на твердые питательные среды и определяют время воздействия, за которое обсемененность поверхности тест-микроорганизмом снижается не менее чем на 90%, затем на втором этапе тест-поверхности ежедневно в течение не менее 14 дней контаминируют тест-микроорганизмом, при этом в первый день  наносят суспензию тест-микроорганизма, содержащую 2×10 КОЕ/мл,  далее ежедневно на поверхности наносят суспензию тест-микроорганизма, содержащую 10 КОЕ/мл,  и после полного высыхания  обрабатывают раствором моющего средства на основе пробиотиков, затем, по истечении  времени воздействия, определенного на первом этапе, на  тест-поверхностях определяют  обсемененность тест-микроорганизмом и сравнивают результаты с данными, полученными с аналогично контамированной контрольной поверхностью, обработанной стерильной водой, и по результатам сравнения выносят суждение об эффективности моющего средства на основе пробиотиков при снижении обсемененности тест-микроорганизмом не менее чем на 99,99 % через 5-7 дней от начала обработки поверхностей.
В известном уровне техники не обнаружено сведений о данном способе определения эффективности моющих средств на основе пробиотиков, что позволяет сделать вывод о соответствии данного способа критериям охраноспособности.
Предложенный способ определения эффективности моющих средств на основе пробиотиков основан на изучении динамики гибели бактерий и грибов после однократной обработки поверхностей  пробиотиками и многократной обработки в течение длительного периода.
Сущность настоящего изобретения заключается в следующем.
В качестве тест-поверхностей используют поверхности размером 10×10 см из различных материалов (кафельную, керамическую плитку, стекло, линолеум, металл, пластик).
Тест-поверхности должны быть чистыми и стерильными.
Escherichiacoli
Pseudomonasaeruginosa
Staphylococcusaureus
Candidaalbicans
В качестве тест-микроорганизмов используют бактерии:  (штаммы АТСС 10536, №1257),  (штамм АТСС 27853 или штамм АТСС 15442),  (штаммы АТСС 6538-Р, №906); грибы (штамм АТСС 10231).
Для приготовления рабочей суспензии тест-микроорганизма используют 18-24 часовую культуру бактерий и стерильную питьевую воду.
При приготовлении рабочих растворов моющего средства на основе пробиотиков (ПМС) используют теплую воду с температурой 40-50°С.
Способ включает два этапа.
9
2
Напервом этапе на тест-поверхности, расположенные горизонтально, стерильной пипеткой наносят взвесь тест-микроорганизма из расчета 0,5 мл микробной взвеси, содержащей 2×10КОЕ/мл, на площадь в 100 см и равномерно распределяют ее по поверхности стерильным стеклянным шпателем. Поверхности подсушивают до полного высыхания при температуре окружающей среды (18-20)°C и относительной влажности воздуха (50-60)%, затем обрабатывают рабочим раствором ПМС.
Контрольные поверхности, контаминированные тест-микроорганизмом, после подсушивания обрабатывают стерильной водопроводной водой.
Через определенные промежутки времени (1 час; 2 часа; 4 часа; 24 часа) с поверхностей берут смывы, осуществляют посевы на твердые питательные среды и определяют для опытных поверхностей общее микробное число, обсемененность тест-микроорганизмом и спорами, а для контрольных поверхностей - обсемененность тест-микроорганизмом.
За критерий эффективности берут снижение обсемененности поверхностей тест-микроорганизмом не менее чем на 90% по отношению контролю.
На втором этапе тест-поверхности ежедневно в течение не менее 14 дней контаминируют тест-микроорганизмом и обрабатывают раствором ПМС.
9
2
В первый день на тест-поверхности пипеткой наносят суспензию тест-микроорганизма из расчета 0,5 мл взвеси, содержащей 2×10 КОЕ/мл, на 100 см.
6
2
С последующего дня ежедневно на поверхности наносят суспензию тест-микроорганизма из расчета 0,5 мл взвеси, содержащей 10 КОЕ/мл, на 100 см,
подсушивают до полного высыхания и затем опытные поверхности обрабатывают раствором ПМС.
По истечении  времени воздействия, выбранного на 1-ом этапе, на одной поверхности определяют общее микробное число и обсемененность тест-микроорганизмом и спорами. Остальные поверхности оставляют для последующих экспериментальных дней.
Контрольные поверхности, аналогично опытным, ежедневно заражают тест-микроорганизмом и обрабатывают водой с последующим определением количества тест-микроорганизма.
2
Контроль эффективности обеззараживания тест-поверхностей проводят следующим образом: марлевой салфеткой (размером 5×5 см), смоченной в растворе универсального нейтрализатора (содержащий Твин-80 (3%), сапонин (0,3-3,0%), гистидин (0,1%), цистеин (0,1%), тщательно протирают тест-поверхность, затем салфетку погружают в 10 мл этого же нейтрализатора, находящегося в пробирке с бусами. Время отмыва марлевой салфетки 10 мин при постоянном встряхивании. Отмывную жидкость сеют (на 2-3 чашки по 0,1-0,2 мл в каждую) на твердые дифференциально-диагностические питательные среды или используют пластины 3М «Petrifilm», представляющие собой готовые системы с культуральной средой, содержащей стандартный набор питательных веществ, гелеобразующий агент, тетразолиевый индикатор, и предназначенные для ускоренного определения бактерий.
В зависимости от вида тест-микроорганизма посевы выращивают в термостате при температуре 37°С.
2
Учет результатов осуществляют через 2 суток путем подсчета количества выросших колоний, затем рассчитывают плотность контаминации 100 см поверхности и % снижения уровня обсемененности тест-микроорганизма, принимая количество колоний, снятых с контрольных поверхностей, за 100%.
За критерий эффективности моющего средства на основе пробиотиков принимают снижение обсемененности тест-микроорганизмом не менее чем на 99,99 % через 5-7 дней от начала обработки поверхностей.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.
Пример
Для исследования выбрано моющее средство Heavy Duty Sanitar Cleaner, производства «CHRISALNV», Бельгия, предназначенное для мытья различных поверхностей в санитарных помещениях и санитарно-технического оборудования в медицинских организациях.
Пробиотические культуры в составе препарата абсолютно безвредны при использовании и официально классифицированы как безопасные, согласно документам производителя.
Средство представляет собой розовую жидкость, в состав которой входят энзимы, пробиотические культуры, биоразлагаемые поверхностно-активные вещества (ПАВ) и вода.
Bacillus
5
5
В качестве пробиотиков в средстве используются бактерии рода , количество которых в 2,0%-ном растворе составляет от 3·10 до  5·10КОЕ/мл.
Готовят рабочий 2%-ный раствор средства на теплой (40-45°С) водопроводной питьевой воде.
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Candida albicans
В качестве тест-поверхностей использовали кафельную плитку, а в качестве тест-микроорганизма:  АТСС 6538-Р -  для оценки бактерицидной активности в отношении грамположительных бактерий,  АТСС 10536,  АТСС 27853 - для оценки бактерицидной активности в отношении грамотрицательных бактерий, грибы АТСС 10231 - для оценки антимикробной активности в отношении грибов и дрожжеподобных грибов.
2
Тест-поверхности располагали горизонтально. При обработке поверхностей способом протирания норма расхода рабочего раствора составляла 100 мл/м поверхности.
9
Staphylococcus aureus
E.coli
P.aeruginosa
C.albicans
На 1-м этапе на опытные поверхности наносили 0,5 мл суспензии тест-микроорганизмов в 2·10КОЕ/мл. После подсушивания поверхности обрабатывали 2%-ным раствором средства. Через 1 час, 2 часа, 4 часа, 24 часа отбирали смывы марлевой салфеткой и делали высевы на плотные питательные среды для подсчета общего микробного числа (мясо-пептонный агар),  АТСС 6538-Р (желточно-солевой агар),  (агар Эндо),  (мясо-пептонный или казеиновый агар),  (агар Сабуро) и помещали их в термостат. Через двое суток проводят подсчет выросших колоний.
Контрольные поверхности обрабатывают стерильной водой и также через 1 час, 2 часа, 4 часа и 24 часа определяют обсемененность тест-культурой.
Excel
Эксперименты ставили не менее чем в трех повторности. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы . Различия считали статистически значимыми при р<0,05.
Результаты исследований представлены в Таблице 1.
Таблица 1. Микробная обсемененность поверхностей, контаминированных тест-микроорганизмами,  при обработке 2,0%-ным  раствором средства
Тест-микроорганизм
Экспозиция, час
Контроль,КОЕ/см<sup>2</sup>
Количество тест-микроорганизмов на опытных поверхностях,КОЕ/см<sup>2</sup>
Общее микробное число КОЕ/см<sup>2</sup>
<i>Staphylococcus aureus</i> АТСС 6538-Р
1
3,5·10<sup>5</sup>
2,7·10<sup>3</sup>
3,4·10<sup>3</sup>
2
3,1·10<sup>5</sup>
2,3·10<sup>2</sup>
4,2·10<sup>3</sup>
4
3,2·10<sup>5</sup>
129
3,7·10<sup>5</sup>
24
2,5·10<sup>5</sup>
23
3,5·10<sup>5</sup>
<i>Escherichia coli</i> АТСС 10536
1
2,5·10<sup>5</sup>
2,5·10<sup>3</sup>
2,9·10<sup>3</sup>
2
3,1·10<sup>4</sup>
2,5·10<sup>2</sup>
5,2·10<sup>3</sup>
4
3,0·10<sup>4</sup>
167
2,8·10<sup>5</sup>
24
2,5·10<sup>4</sup>
68
3,2·10<sup>5</sup>
<i>Pseudomonas aeruginosa</i> АТСС 27853
1
3,2·10<sup>5</sup>
2,9·10<sup>3</sup>
3,1·10<sup>3</sup>
2
3,1·10<sup>5</sup>
3,3·10<sup>2</sup>
3,7·10<sup>3</sup>
4
3,0·10<sup>5</sup>
134
2,7·10<sup>5</sup>
24
2,8·10<sup>5</sup>
98
3,3·10<sup>5</sup>
<i>Candida albicans</i> АТСС 10231
1
3,5·10<sup>5</sup>
3,7·10<sup>3</sup>
3,2·10<sup>3</sup>
2
3,1·10<sup>5</sup>
2,7·10<sup>2</sup>
4,3·10<sup>3</sup>
4
3,2·10<sup>5</sup>
119
2,2·10<sup>5</sup>
24
2,5·10<sup>5</sup>
73
3,7·10<sup>5</sup>
Bacillus
Анализ результатов исследований показал, что споры бактерий рода  способны прорастать на неживых поверхностях и подавляют рост тест-микроорганизмов.
Как следует из представленных данных, при отборе смывов через 4 часа обсемененность поверхностей микроорганизмами начинает снижаться и увеличивается общее микробное число.
6
2
S.aureus
E.coli
P.aeruginosa
C.albicans
На 2-м этапе  тест-поверхности ежедневно (в течение 20-28 дней) контаминировали тест-микроорганизмами из расчета 0,5 мл взвеси, содержащей 10 КОЕ/мл, на 100 см, подсушивали и обрабатывали 2,0% раствором средства. Контрольные поверхности обрабатывали водой. Через 5 мин поверхности протирали увлажненными водой салфетками, затем с поверхностей через 4 и 24 часа отбирали смывы и делали высевы на плотные питательные среды для подсчета общего микробного числа (мясо-пептонный или казеиновый агар),  (желточно-солевой агар),  (агар Эндо),  (мясо-пептонный или казеиновый агар),  (агар Сабуро) и помещали их в термостат. Через двое суток проводили подсчет выросших колоний.
Результаты исследований представлены в Таблицах 2-5.
Staphylococcus aureus
Таблица 2. Микробная обсемененность поверхностей, контаминированных   АТСС 6538-Р, при обработке 2,0%-ным раствором средства
Сутки
Экспозиция, час
Контроль,КОЕ/см<sup>2</sup>
<i>S.aureus</i>,КОЕ/см<sup>2</sup>
Общее микробное число КОЕ/см<sup>2</sup>
1
424
5,2·10<sup>5</sup>2,1·10<sup>3</sup>
1,2·10<sup>3</sup>96
7,4·10<sup>3</sup>5,5·10<sup>3</sup>
2
424
6,1·10<sup>3</sup>1,2·10<sup>2</sup>
1,8·10<sup>3</sup>51
7,3·10<sup>3</sup>9,8·10<sup>2</sup>
3
424
4,1·10<sup>3</sup>2,9·10<sup>2</sup>
2,1·10<sup>2</sup>25
1,1·10<sup>4</sup>9,1·10<sup>3</sup>
4
424
7,5·10<sup>3</sup>2,1·10<sup>2</sup>
1,1·10<sup>2</sup>8
9,3·10<sup>3</sup>8,4·10<sup>3</sup>
8
424
3,6·10<sup>3</sup>1,4·10<sup>2</sup>
275
1,0·10<sup>4</sup>7,5·10<sup>3</sup>
9
424
4,1·10<sup>3</sup>2,9·10<sup>2</sup>
152
8,7·10<sup>3</sup>8,4·10<sup>3</sup>
10
424
4,1·10<sup>3</sup>2,9·10<sup>2</sup>
210
9,2·10<sup>3</sup>8,4·10<sup>3</sup>
11
424
4,1·10<sup>3</sup>2,9·10<sup>2</sup>
130
9,1·10<sup>3</sup>8,4·10<sup>3</sup>
15
424
4,8·10<sup>3</sup>1,03·10<sup>2</sup>
221
8,1·10<sup>3</sup>6,5·10<sup>3</sup>
16
424
3,8·10<sup>3</sup>2,9·10<sup>2</sup>
80
9,9·10<sup>3</sup>8,4·10<sup>3</sup>
17
424
4,2·10<sup>3</sup>2,9·10<sup>2</sup>
90
8,0·10<sup>3</sup>6,3·10<sup>3</sup>
18
424
4,1·10<sup>3</sup>2,5·10<sup>2</sup>
60
3,2·10<sup>3</sup>2,9·10<sup>3</sup>
21
424
3,9·10<sup>3</sup>2,8·10<sup>2</sup>
70
7,3·10<sup>3</sup>6,4·10<sup>3</sup>
24
424
3,1·10<sup>3</sup>1,8·10<sup>2</sup>
50
7,2·10<sup>3</sup>6,9·10<sup>3</sup>
25
424
2,6·10<sup>3</sup>1,7·10<sup>2</sup>
40
7,1·10<sup>3</sup>6,3·10<sup>3</sup>
26
424
3,2·10<sup>3</sup>1,9·10<sup>2</sup>
60
7,2·10<sup>3</sup>5,9·10<sup>3</sup>
27
424
2,7·10<sup>3</sup>1,4·10<sup>2</sup>
70
7,9·10<sup>3</sup>6,9·10<sup>3</sup>
28
424
3,2·10<sup>3</sup>1,5·10<sup>2</sup>
30
8,0·10<sup>3</sup>6,3·10<sup>3</sup>
E.coli
АТСС 10536
Таблица 3. Микробная обсемененность поверхностей, контаминированных  , при обработке 2,0% раствором средства
Сутки
Экспозиция
Контроль,КОЕ/см<sup>2</sup>
<i>E.coli,</i>КОЕ/см<sup>2</sup>
Общее микробное число
1
424
3,9·10<sup>2</sup>0
1,2·10<sup>2</sup>0
5,2·10<sup>3</sup>6,2·10<sup>3</sup>
2
424
3,2·10<sup>2</sup>0
1,1·10<sup>2</sup>0
7,5·10<sup>3</sup>2,3·10<sup>3</sup>
3
424
3,4·10<sup>2</sup>0
1,2·10<sup>2</sup>0
7,5·10<sup>3</sup>2,3·10<sup>3</sup>
4
424
3,6·10<sup>2</sup>1
2100
8,1·10<sup>3</sup>8,0·10<sup>3</sup>
10
424
3,7·10<sup>2</sup>0
120
9,1·10<sup>2</sup>1,0·10<sup>3</sup>
14
4
2,2·10<sup>2</sup>
3
1,6·10<sup>3</sup>
21
4
1,8·10<sup>2</sup>
2
4,4·10<sup>2</sup>
27
4
2,4·10<sup>2</sup>
6
3,9·10<sup>2</sup>
P.aeruginosa
Таблица 4.  Микробная обсемененность поверхностей, контаминированных  АТСС 27853, при обработке 2,0% раствором средства
Сутки
Экспозиция
Контроль,КОЕ/см<sup>2</sup>
<i>P.aeruginosa,</i>КОЕ/см<sup>2</sup>
Общее микробное число
1
424
5,6·10<sup>2</sup>94
2,3·10<sup>2</sup>2
6,5·10<sup>3</sup>6,2·10<sup>3</sup>
2
424
6,6·10<sup>2</sup>1,13·10<sup>2</sup>
3,8·10<sup>2</sup>1
7,4·10<sup>3</sup>7,9·10<sup>3</sup>
4
424
4,1·10<sup>2</sup>82
240
8,7·10<sup>3</sup>8,3·10<sup>3</sup>
8
424
1,2·10<sup>2</sup>1,04·10<sup>2</sup>
310
7,4·10<sup>3</sup>6,5·10<sup>3</sup>
11
4
3,8·10<sup>2</sup>
27
8,9·10<sup>3</sup>
15
4
7,2·10<sup>2</sup>
22
7,8·10<sup>3</sup>
17
4
6,3·10<sup>2</sup>
34
7,1·10<sup>3</sup>
C.albicans
Таблица 5.  Микробная обсемененность поверхностей, контаминированных  АТСС 10231, при обработке 2,0% раствором средства
Сутки
Экспозиция
Контроль,КОЕ/см<sup>2</sup>
<i>C.albicans</i>,КОЕ/см<sup>2</sup>
Общее микробное число
1
424
2,6·10<sup>3</sup>194
2,3·10<sup>2</sup>12
5,5·10<sup>3</sup>5,9·10<sup>3</sup>
2
424
4,3·10<sup>3</sup>1,13·10<sup>2</sup>
3,8·10<sup>2</sup>9
6,4·10<sup>3</sup>7,2·10<sup>3</sup>
4
424
6,1·10<sup>2</sup>98
7412
8,3·10<sup>3</sup>8,1·10<sup>3</sup>
8
424
1,2·10<sup>2</sup>1,04·10<sup>2</sup>
315
7,8·10<sup>3</sup>7,9·10<sup>3</sup>
11
4
3,8·10<sup>2</sup>
34
7,4·10<sup>3</sup>
15
4
7,2·10<sup>2</sup>
18
7,2·10<sup>3</sup>
17
4
6,3·10<sup>2</sup>
23
7,9·10<sup>3</sup>
2
2
2
2
4
2
Bacillus
S.aureus
P.aeruginosa
S.aureus
P.aeruginosa
C.albicans -
.
E.coli
После обработки раствором моющего средства на основе пробиотиков общая численность микроорганизмов увеличилась и достигла до 10000 микробных тел в 1 см, которая состояла из спор бактерий рода , а количество тест-микроорганизма резко снижалось.  Как следует из полученных данных, при отборе смывов через 4 часа (Таблицы 2-4) обсемененность поверхностей тест-микроорганизмами начинает снижаться уже в 1-е сутки после начала использования средства и через 10 суток на поверхностях остаются единичные тест-микробы. При отборе смывов через 24 часа  и  не обнаруживались на опытных поверхностях уже через 3-4 суток, на контрольных поверхностях КОЕ/см для  через трое суток составляло 2,9·10, а для  – 82, для98 Культура  через 24 часа не была выявлена как в смывах с опытных поверхностей, так и в смывах с контрольных поверхностей. Общее микробное число на опытных поверхностях, складывающееся из споровой микрофлоры пробиотика и тест-культуры, колебалось в пределах от 10 до 10  КОЕ/см.
S.aureus
Фиг. 1. Динамика обсемененности  и общего микробного числа на поверхностях.
S.aureus
Фиг. 2. Динамика обсемененности  и общее микробное число на поверхностях.
Bacillus
Таким образом, проведенные исследования показали, что применение для мытья поверхностей моющего средства на основе спорообразующих бактерий рода  приводит к значительному снижению обсемененности поверхностей тест-микроорганизмами.