Способ диагностики гетерозиготной формы семейной гиперхолестеринемии в детском возрасте
METHOD FOR DIAGNOSING HETEROZYGOUS FORM OF FAMILIAL HYPERCHOLESTEROLEMIA IN CHILDHOOD

Изобретение относится к медицине, а именно, к педиатрии и кардиологии, и позволяет выявлять лиц с предрасположенностью к преждевременному развитию атеросклероза с прогрессирующим течением, с целью постановки их на диспансерный учет для раннего начала профилактических, и лечебных мероприятий, позволяет упростить диагностику гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии.
Семейная гиперхолестеринемия (СГХС) — моногенное заболевание, преимущественно, с аутосомно-доминантным типом наследования, сопровождающееся значительным повышением уровня холестерина липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) в крови и, как следствие, преждевременным развитием и прогрессирующим течением атеросклероза, как правило, в молодом возрасте [1, 2].
В настоящее время существует два алгоритма выявления больных с семейной гиперхолестеринемией: 1) анализ фенотипа и 2) исследование генотипа.
Анализ фенотипа включает в себя сбор анамнестических (наличие наследственной отягощенности по сердечно-сосудистым заболеваниям атеросклеротического генеза), клинических (определение признаков гиперхолестеринемии при физикальном осмотре - ксантома сухожилий, липоидная дуга роговицы, ксантеллазмы), и лабораторных данных (увеличение общего холестерина и липопротеинов низкой плотности).
Анализ генотипа включает в себя проведение генетического тестирования на предмет выявления мутаций в генах, ответственных за моногенную форму СГХС: в гене рецептора ЛПНП (до 95% случаев), аполипопротеина В-100 (4-5%) и пропротеинконвертазы субтилизин/кексин 9-го типа (1%). В ряде случаев семейная гиперхолестеринемия имеет аутосомно-рецессивное наследование, и связано с мутацией в гене адаптивного белка LDLR 1 (LDLRAP1) [3].
На основании этих подходов, существуют британские (Simon Broom Registry) и голландские (DLCN – Dutch Lipid Clinic Network) критерии диагностики семейной гиперхолестеринемии, основанные на фенотипических, семейных анамнестических данных и генетических признаках [1].
Многочисленные исследования подчеркивают роль ЛПНП в качестве основного фактора риска развития атеросклероза, лежащего в основе сердечно-сосудистых катастроф. «Классический» взгляд на патогенез этого процесса заключается в том, что ЛПНП является основным компонентом атероматозной бляшки.
В последние годы в центре внимания исследователей, наряду с ЛПНП, находятся вопросы, связанные с изучением аполипопротеинов, которые являются важными структурными, и функциональными, белками в частицах липопротеинов.
Аполипопротеины группы А - это главные белковые компоненты липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) [4]. Примерно 70% ЛПВП представлено аполипопротеином А, поэтому число циркулирующих ЛПВП в значительной степени определяется концентрацией АпоА. В ряде исследований выявлено, что АпоА1 стабилизирует антиатерогенные частицы ЛПВП, и управляет их метаболизмом и функциональными взаимодействиями [4]. Показано, что у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями концентрация этого аполипопротеина достоверно ниже, по сравнению со здоровыми людьми [5]. Повышение уровня АпоА рассматривается в качестве предиктора снижения риска сердечно-сосудистых заболеваний [6].
Другим важным аполипопротеином является аполипопротеин Б (АпоБ), включающий в себя АпоБ-100 и АпоБ-48. Уровень АпоБ отражает общее количество потенциально атерогенных частиц, в том числе, липопротеинов очень низкой плотности, липопротеинов промежуточной плотности, ЛПНП [7]. В работе Ohwada T и соавт. 2019г., приводят прямые корреляционные связи концентрации АпоБ, в частности >91мг/дл, и размера атеросклеротической бляшки коронарных артерий, измеренной путем внутрисосудистого ультразвукового исследования [8]. При этом авторы также обосновывают вероятность увеличения нестабильности бляшки при увеличении уровня АпоБ. Benn M. и соавт. показали, что концентрация АпоБ с высокой вероятностью прогнозирует ишемические сердечно-сосудистые события лучше, чем ЛПНП [9].
В последние годы, ввиду высокой информативности прогностической значимости аполипопротеинов А и Б в диагностике липидных нарушений, некоторыми учеными предложено использовать уровень АпоА1 вместо традиционного ЛПВП [4], а рекомендации Канадского сердечно-сосудистого общества включают АпоБ в качестве альтернативы оценки ЛНП [10]. Исходя из этого, представляет ценность определение соотношения АпоБ/АпоА для оценки траектории атерогенных липидных нарушений, и выявления дислипидемий, в том числе, первичного генеза.
Представленные ранее критерии диагностики СГХС (Голландские, Британские) трудоемки – требуют подробного сбора семейного анамнеза, физикального осмотра врачом пациента и его родственников, измерения в сыворотке крови общего холестерина, ЛПНП, а также генетического тестирования.
Сущность настоящего изобретения состоит в совокупности существенных признаков, обеспечивающей достижение искомого технического результата, состоящего в создании более простого в исполнении способа диагностики гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии в детском возрасте, требующего меньших затрат времени, и финансовых средств.
Нами было обследовано 243 ребенка в возрасте от 5 до 17 лет (медиана 11 [7,0 – 15,0]), из них 122 ребенка - с диагнозом «семейная гиперхолестеринемия», вошедшие в основную группу. Контрольную группу составил 121 здоровый ребенок.
Критерии включения детей в основную группу:
– возраст пациента от 5 до 17 лет 11 месяцев и 29 дней включительно;
– установленный диагноз «Гетерозиготная форма семейной гиперхолестеринемии» в соответствии с клиническими рекомендациями, согласно критериям Simon Broome Registry [1];
– информированное согласие на участие в проводимом исследовании детей и/их родителей.
Критерии исключения детей основной группы:
– возраст пациента менее 5 и более 17 лет 11 месяцев и 29 дней;
– основные заболевания/состояния, а также лекарственные препараты, которые могут обусловливать вторичное повышение ЛПНП (холестаз, нефротический синдром, хроническая болезнь почек, сахарный диабет, гипотиреоз, ожирение, синдром Кушинга; лекарственные средства – циклоспорин, диуретики, глюкокортикоиды, амиодарон, иммунодепрессанты, комбинированные оральные контрацептивы, антивирусная терапия при ВИЧ).
Всем детям проводили оценку липидограммы: общий холестерин - ОХ, липопротеины высокой плотности - ЛПВП, липопротеины низкой плотности - ЛПНП, триглицериды - ТГ, аполипопротеин А1 – АпоА1, аполипопротеин Б – АпоБ. Результаты сведены таблицу 1.
Таблица 1. Липидный профиль детей основной и контрольной групп
<b>Показатель</b>
<b>Здоровые</b><b>Ме(Q1-Q3)</b>
<b>СГХС</b><b>Ме(Q1-Q3)</b>
<b>p</b>
ОХ, ммоль/л
3,60 (3,30‒4,10)
7,30 (6,96‒7,74)
<0,0001*
ЛПВП, ммоль/л
1,20 (1,10‒1,27)
1,30 (1,10‒1,40)
<0,0001*
ЛПНП, ммоль/л
2,20 (1,90‒2,43)
5,20 (4,90‒5,77)
<0,0001*
ТГ, ммоль/л
1,00 (0,78‒1,20)
1,10 (0,90‒1,30)
0,0175*
АпоА1 (мг/дл)
128 (119‒140)
118 (110‒127)
<0,0001*
АпоВ(мг/дл)
68 (58‒77)
98 (87‒110)
<0,0001*
АпоВ/АпоА1
0,51 (0,45‒0,60)
0,84 (0,72‒0,93)
<0,0001*
p-значение получено с использованием теста Манна-Уитни
Количественное определение АпоА1, АпоБ в сыворотке крови проводили иммунотурбидиметрическим методом на автоматическом анализаторе Beckman Coulter AU5800, c использованием набора реактивов Apolipoprotein А1, Apolipoprotein B «Beckman Coulter» (США). После проведения калибровки, визуально оценивали полученную кривую на анализаторе Beckman Coulter. Сразу после калибровки, в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики, проводили измерение контроля качества. При смешивании пробы с буфером R1 и раствором антисыворотки R2, АпоА1 и АпоБ специфически связываются с антителами к человеческому АпоА1 и АпоБ, в результате чего образуются нерастворимые агрегаты. Интенсивность поглощения агрегатов пропорциональна концентрации АпоА1 и АпоБ в пробе. Единица измерения мг/дл. После определения количественных показателей АпоА1 и АпоБ, вычисляли соотношение АпоБ/АпоА1.
Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v.1.2.0 (разработчик – ООО «Статтех», Российская Федерация). Количественные данные были подвергнуты статистической обработке с использованием параметрических или непараметрических методов в зависимости от результатов проверки на нормальность распределения, проводимой с помощью критерия Шапиро-Уилка. Ввиду распределения, отличного от нормального, количественные данные описывались при помощи значений медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей (Q1-Q3), а сравнение количественных показателей между двумя независимыми группами выполнялось с помощью критерия Манна-Уитни. Различия показателей и выявленные связи считались статистически значимыми при p<0,05.
Анализ параметров проведенной липидограммы по стандартному алгоритму, включающему оценку ОХ, ЛПВП, ЛПНП, ТГ, подтверждает нам отсутствие нарушения липидного обмена в группе здоровых участников (таблица 1). При этом в группе СГХС зарегистрировано увеличение ОХ и ЛПНП, что соответствует критериям диагностики данного заболевания. Анализ содержания АпоА1 и АпоБ в сыворотке крови у исследуемых детей показывает статистически значимое увеличение АпоБ и снижение АпоА1 среди пациентов с СГХС в сравнении со здоровыми сверстниками, что приводит к смещению соотношения АпоБ/АпоА1 в сторону его увеличения у детей с семейной гиперхолестеринемией.
Для оценки дискриминативных характеристик АпоБ/АпоА1 проводился ROC-анализ (Фиг.1). ROC-анализ (от receiver operating characteristic - рабочая характеристика приемника) - полезный способ оценить точность предсказаний модели путем построения графика чувствительности в зависимости от значения теста классификации. Основой данного анализа является построение, так называемой, ROC-кривой, которая наиболее часто используется для представления результатов бинарной классификации в машинном обучении. ROC кривая показывает зависимость количества верно классифицированных положительных примеров от количества неверно классифицированных отрицательных примеров. В результате построения ROC кривой получают набор значений порога отсечения, и соответствующие ему значения чувствительности и специфичности.
Чувствительность теста показывает долю (процент) истинно положительных результатов у всех лиц, имеющих исследуемую патологию; специфичность теста показывает долю (процент) лиц, не имеющих исследуемой патологии (здоровых), у которых результаты теста оказались отрицательными.
Для получения численного значения клинической значимости теста, а также для сравнения двух тестов, используется показатель AUC (Area Under Curve), который может быть рассчитан при помощи численных методов.
С целью оценки информативности соотношения АпоБ/АпоА1 для выявления семейной гиперхолестеринемии была построена ROC-кривая. В качестве критерия диагностической эффективности рассчитывалась площадь под кривой с соответствующим 95% доверительным интервалом. Она составила 0,95 (95% ДИ: 0,93; 0,98) что, согласно экспертной оценке шкалы AUC, соответствует отличному качеству модели, и доказывает ее высокую прогностическую ценность (таблица 2) [11]. Для оценки порога оптимального порогового значения АпоВ/АпоА1 использовалась J-статистика Юдена. В качестве диагностических характеристик использовались чувствительность и специфичность с соответствующими 95% точными доверительными интервалами. Значение соотношения АпоВ/АпоА1 равное 0,645, оказалось оптимальным (чувствительность - 92,6 (95% ДИ: 86,5; 96,6), специфичность – 86,0 (95% ДИ: 78,5; 91,6)) для диагностики гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии для детей в возрасте 5-17 лет включительно.
Таблица 2. Экспертная шкала для значений AUC [11].
Интервал AUC
Качество модели
0,9-1,0
Отличное
0,8-0,9
Очень хорошее
0,7-0,8
Хорошее
0,6-0,7
Среднее
0,5-0,6
Неудовлетворительное
Таким образом, настоящее исследование, проведенное с включением 243 детей (121 здоровый ребенок и 122 ребенка с семейной гиперхолестеринемией), измерением у них в сыворотке крови аполипопротеина А1, аполипопротеина Б, определением соотношения АпоБ/АпоА1 показал, что при значении соотношения АпоБ/АпоА1, равному 0,645 и выше, диагностируют гетерозиготной семейную гиперхолестеринемию. Выбранный нами способ, не требующий дорогостоящего оборудования, простой в исполнении, является достоверным и высокоинформативным в диагностике гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии в детском возрасте, что подтверждается показателем AUC, равным 0,95, высокой чувствительностью (92,6 (95% ДИ: 86,5; 96,6)), и специфичностью (86,0 (95% ДИ: 78,5; 91,6)), доказывающим высокую прогностическую силу представленного способа.  Его применение в клинической практике позволит значительно упростить, ускорить, и удешевить выявление гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии. Использование настоящего способа допускает диагностику СГХС без сбора семейного анамнеза, оценки липидограммы, проведения сложного, дорогостоящего и, занимающего достаточно много времени, генетического тестирования.
Сущностьспособа диагностики гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии в детском возрасте по соотношению в сыворотке крови аполипопротеина Б к аполипопротеину А1 включает физикальный осмотр пациента. Определяют в сыворотке крови уровень аполипопротеина А1, аполипопротеина Б, вычисляют соотношение АпоБ/АпоА1, и при значении, равном 0,645, и выше, диагностируют гетерозиготной семейную гиперхолестеринемию.
Способ осуществляют следующим образом.
Проводят физикальный осмотр пациента, определяют в сыворотке крови уровень аполипопротеина А1, аполипопротеина Б, вычисляют соотношение АпоБ/АпоА1, и при значении, равном 0,645, и выше, диагностируют семейную гиперхолестеринемию.
Клинический пример 1.
Родители ребенка Б., 8 лет, обратились с жалобами на стойкие изменения в липидограмме в виде гиперхолестеринемии до 10,1 ммоль/л, ЛПНП до 6,07 ммоль/л.
Проведен врачебный осмотр ребенка. Вторичные причины гиперлипидемии исключены. Ожирение, артериальная гипертензия не отмечались. Проведено определение аполипопротеинов А и Б в сыворотке крови, вычисление их соотношения. Результаты показали, что уровень АпоА1 составил 136 мг/дл, уровень АпоБ 102 мг/дл, соотношение АпоБ/АпоА1= 0,75. Согласно представленному способу, при значении АпоБ/АпоА1, равному 0,645 и выше, диагностируют семейную гиперхолестеринемию.
Генетическое тестирование выявило наличие мутации в экзоне 6 гена LDLR (NM_000527, MIM_143890, Hypercholesterolemia, familial, 1_аутосомно доминантный тип наследования) – гетерозиготная замена, имеющая патогенетический характер. Далее ребенок был взят на диспансерный учет врачом детским кардиологом в условиях специализированной липидологической клиники. Ему проведены расширенные инструментальные исследования сердечно-сосудистой системы (ультразвуковое исследование сердца, ультразвуковое исследование сосудов шеи, суточное мониторирование артериального давления с оценкой ригидности сосудов) с целью оценки ранних признаков атеросклеротического поражения сосудов и начала профилактических мероприятий. Пациенту даны рекомендации по особенностям диеты и физической нагрузки.
Клинический пример 2.
Ребенок Р., 13 лет, обратился в детский стационар с целью планового медицинского осмотра. Во время физикального врачебного осмотра ожирение, артериальная гипертензия были исключены. В липидограмме отмечалось значимое повышение уровня общего холестерина до 7,27 ммоль/л и ЛПНП до 5,52 ммоль/л. Результаты измерения аполипопротеинов в сыворотке крови показали, что уровень АпоА1 составил 134 мг/дл, уровень АпоБ 65 мг/дл, соотношение АпоБ/АпоА1 0,48. Согласно представленному способу, при значении АпоБ/АпоА1, равному 0,645 и выше, диагностируют семейную гиперхолестеринемию. Учитывая, что у пациента значение АпоБ/АпоА1 было ниже 0,645, семейная гиперхолестеринемия диагностирована не была.
Проведенное генетическое тестирование не выявило генетических вариантов, связанных с моногенными дислипидемиями.
Таким образом, используя предложенный способ диагностики гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии, можно диагностировать заболевание без сбора семейного анамнеза, оценки липидограммы и проведения генетического тестирования.