Способ повышения уровней экспрессии антигенов
METHOD FOR UPREGULATING ANTIGEN EXPRESSION

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к радиоиммуноконьюгатам, которые способны повышать уровень экспрессии одного или более антигенов. Антигенами с повышенным уровнем могут быть антигены, на которые нацелены радиоиммуноконьюгаты, или другие антигены, экспрессируемые на тех же клетках.
Предшествующий уровень изобретения
Применение терапии моноклональными антителами (МАТ) представляет собой область повышенного интереса и огромных усилий исследователей. Эффективность МАТ зависит от достаточного количества антигенов на клетку, которые могут связываться для инициирования ответа (Sugimoto et al., 2009, Czuczman et al., 2008).
Применение радиоиммунотерапии (RIT) было одобрено в качестве возможного терапевтического способа терапии рака (Stevens et al., 2012). Сегодня радиоиммунотерапия главным образом используется у пациентов, имеющих рецидив после химиотерапии и/или MAT (Stevens et al., 2012).
2
2
Из литературы известно, что внешнее облучение с высокой мощностью дозы может привести к увеличению CD20 в В-клетках и что эта реакция ингибировалась антиоксидантами, такими как аскорбиновая кислота, PEG-каталаза и т.д. и усиливалась окислителями, подобными НО и бутионина сульфоксимину (Kunala et al., 2001; Gupta et al., 2008). Следует отметить, что этот эффект длился в течение всего лишь примерно сорок восемь часов после внешнего облучения.
Однако было неизвестно, может ли низкодозовая радиоиммунотерапия повышать уровень экспрессии антигена. Действительно, Elgstrom et al. (2012) обнаружили уменьшение уровня экспрессии антигена после экспериментальной радиоиммунотерапии.
Терапия моноклональными антителами также может вызвать уменьшение экспрессии антигена на опухолевых клетках (Musto et al., 2011), также как терапия антителами в комбинации с химиотерапией (Hiraga et al., 2009).
Таким образом, в данной области известно, что внешнее облучение с высокой дозой может вызывать увеличение экспрессии антигена и, что радиоиммунотерапия и терапия моноклональными антителами может вызвать уменьшение экспрессии антигена в раковых клетках.
Существующий стандарт применения радиоиммунотерапии в качестве уменьшающего дозу лечения, например ритуксимаб (антитело), дают в качестве подготовительного лечения перед Зевалином (радиоиммуноконьюгат).
Проблема этого подхода заключается в том, что, как показали экспериментальная работа и клинические данные, терапия антителами может вызвать антигенный дрейф, то есть селекционное давление в отношении клеток с низкой экспрессией антигена, которые становятся устойчивыми к лечению (Musto and D'Auria, 2011). Это также было показано в экспериментальной RIT (радиоиммунотерапии) ( et al., 2012).
Вследствие этого возможная таргетная терапия, которая может вызвать противоположный эффект, то есть увеличение антигенов на обработанных клетках, должна быть очень ценным терапевтическим инструментом.
Краткое изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к радиоиммуноконьюгатам, которые способны повышать уровень экспрессии одного или более антигенов. Антигенами с повышенным уровнем могут быть антигены, на которые нацелены радиоиммуноконьюгаты, другие антигены, экспрессируемые на тех же клетках, или их комбинация.
Такая экспрессия обеспечивает возможность нацеливания на раковые клетки и клетки иммунной системы и их специфического ингибирования.
Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к радиоиммуноконьюгату, содержащему моноклональное антитело, возможный линкер и радионуклид, для применения в повышении уровня экспрессии одного или более антигенов.
В одном воплощении настоящего изобретения один или более антигенов с повышенным уровнем экспрессируются на поверхности раковых В-клеток.
В другом воплощении настоящего изобретения повышение уровня выполняют перед иммунотерапией или терапией с использованием иммуноконъюгата у пациента, страдающего от рака.
В еще одном воплощении настоящего изобретения пациент страдает от B-клеточной злокачественного заболевания, выбранного из группы, состоящей из неходжкинской лимфомы и хронического лимфолейкоза.
Еще одном воплощении настоящего изобретения присутствует меченое радиоизотопом моноклональное антитело НН1.
В одном воплощении настоящего изобретения линкер представляет собой хелатирующий линкер, выбранный из группы, состоящей из p-SCN-bn-DOTA ([2-(4-изотиоцианатобензил)-1,4,7,10-тетраазациклодекан-тетрауксусная кислота]), DOTA-NHS-сложный эфир, p-SCN-Bn-DTPA ([2-(4-изотиоцианатобензил)-диэтилентриаминпентауксусная кислота]) и СНХ-А''-DTPA (2-[[(1R)-2-[бис(карбоксиметил)амино]циклогексил]-[(2S)-2-[бис(карбоксиметил)амино]-3-(4-изотиоцианатофенил)пропил]амино]уксусная кислота).
47
67
90
105
117
131
149
153
161
165
177
186
188
211
212
212
213
223
224
225
227
В другом воплощении настоящего изобретения представлен радионуклид, выбранной из группы, состоящей из Sc, Cu, Y, Rh, mSn, I, Tb, Sm, Tb, Dy Lu, Re, Re, At, Pb, Bi, Bi, Ra,  Ra, Ac и Th.
В еще одном воплощении настоящего изобретения представлен антиген с повышенным уровнем, выбранный из группы, состоящей из CD37, CD19, CD20, CD21, CD22, HLA-DR, CD23, CD39, CD52, CDw75 и CD80.
В другом воплощении настоящего изобретения радиоиммуноконьюгат изготовлен в виде фармацевтической композиции.
В другом воплощении настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит один или более фармацевтически приемлемых носителей или вспомогательных веществ.
Еще одним воплощением настоящего изобретения является применение в комбинированной терапии, где радиоиммуноконьюгат сопровождается терапией антителами, терапией иммуноконъюгатом или их комбинацией, одновременно или после лечения.
В другом воплощении настоящего изобретения представлен антиген CD20 с повышенным уровнем, и повышение уровня сопровождается терапией с использованием анти-CD20 антител с ритуксимабом при однократном введении или согласно схеме с повторными введениями.
В еще одном воплощении настоящего изобретения предложено нацеливание на антиген, отличный от радиоиммуноконьюгата, одновременно или после лечения.
Другой аспект настоящего изобретения относится к способу повышения уровня экспрессии антигена, включающему введение радиоиммуноконьюгата субъекту, для которого полезно повышение уровня экспрессии антигена.
В одном воплощении настоящего изобретения субъект страдает от В-клеточного злокачественного заболевания.
В другом воплощении настоящего изобретения предложено применение комбинированной терапии, где радиоиммуноконьюгат сопровождается терапией антителами, терапией с применением иммуноконъюгата или их комбинацией одновременно или после лечения.
В другом воплощении радиоиммунотерапия и иммунотерапия или терапия с применением иммуноконъюгата повторяется в нескольких циклах.
В другом воплощении радиоиммунотерапию применяют в такой низкой дозе, которая сама по себе вызывает незначительную гибель клеток в опухолях, но значительно повышает уровень экспрессии антигена.
Краткое описание графических материалов
На Фиг. 1 показано увеличение экспрессии CD20 и CD37 для клеток Дауди через 24 ч инкубации с Беталутином (t=0 после удаления Беталутина с добавлением свежей среды) при измерении с помощью проточной цитометрии.
177
На Фиг. 2 показана увеличение экспрессии CD37 и CD20 для клеток Дауди, инкубированных в течение 1 ч и 24 ч с помощью Lu-тетуломаба (Беталутина) при измерении с помощью проточной цитометрии.
177
На Фиг. 3 (Таблица 1) показано увеличение экспрессии антигена через 1 ч инкубации с Lu-тетуломабом (Беталутином) при измерении с помощью проточной цитометрии.
177
На Фиг. 4 (Таблица 2) показано увеличение экспрессии CD20 и CD37 в клетках, обработанных Lu-ритуксимабом, (Беталутин) при измерении с помощью проточной цитометрии.
125
На Фиг. 5 (Таблица 3) показан % увеличения связывания I-ритуксимаба с опухолевыми клетками после радиоиммунотерапии по сравнению с контролем через 4 суток/8 суток/11 суток/15 суток после добавления Беталутина или контроля при измерении с помощью анализа связывания с клетками.
125
125
На Фиг. 6 показано биораспределение I-ритуксимаба через 3 суток после инъекции I-ритуксимаба. Мышам инъецировали за 5 суток до этого либо 350 МКб/кг Беталутина (обработанные) или холодный НН1 (контрольные).
Настоящее изобретение описано более подробно ниже.
Подробное описание изобретения
177
177
Авторы настоящего изобретения при экспериментировании с низкодозовым бета-излучающим Lu-мечеными НН1 антителом (также называемым Lu-тетуломаб или Беталутин) против антигена CD37, ассоциированного с В-клетками неожиданно обнаружили, что таким образом обработанные клетки имеют повышенный уровень экспрессии как CD37, так и CD20, другого В-клеточного антигена.
177
Таким образом, показано, что терапия с использованием Lu-HH1 может улучшить состояние для МАТ при В-клеточных заболеваниях, таких как рак или аутоиммунное заболевание.
177
Также явилось неожиданным, что радиоиммунотерапия с низкой мощностью дозы при использовании Lu-HH-1 против CD37-антиген-положительных клеток не только вызывала увеличение экспрессии антигена в раковых клетках, но также обеспечивала пролонгированный эффект по сравнению с опубликованными данными по внешнему облучению.
177
Радиоиммунотерапевтическое лечение вызывало увеличенную экспрессию как CD37, так и CD20 антигенов. Это означает, что радиоиммунотерапия, например с помощью Lu-HH-1, может быть использована в качестве индукционной обработки для терапии антителами, так как терапия антителами в значительной степени зависит от хорошей экспрессии антигена.
Другой заслуживающей внимания находкой было то, что повышенная экспрессия антигена могла длиться от одной до двух недель после воздействия радиоиммунотерапией по сравнению только с примерно двумя сутками после внешнего облучения.
Может быть предложен новый способ использования таргетной терапии антителами, то есть индукционная терапия посредством радиоиммунотерапии, за которой следует терапия антителами или конъюгатами антител в последующие дни и недели, чтобы использовать увеличенную экспрессию антигенов.
Таким образом, настоящее изобретение относится к радиоиммуноконьюгатам, которые способны увеличивать экспрессию одного или более антигенов. Антигены с повышенным уровнем могут представлять собой антигены, на которые нацелены радиоиммуноконьюгаты, другие антигены, экспрессируемые на тех же клетках или их комбинацию.
Такая экспрессия обеспечивает возможность нацеливания на раковые клетки и клетки иммунной системы и их специфического ингибирования.
Применение радиоиммуноконьюгатов
Таким образом, один аспект настоящее изобретение относится к радиоиммуноконьюгату, содержащему моноклональное антитело, возможный линкер и радионуклид, для применения в повышении уровня экспрессии антигена или одного или более антигенов.
В одном воплощении настоящего изобретения присутствуют один или более антигенов с повышенным уровнем, экспрессируемых на поверхности раковых В-клеток.
В другом воплощении настоящего изобретения радиоиммуноконьюгаты по настоящему изобретению подавляют клетки иммунной системы.
Такие клетки иммунной системы могут быть повреждены, например, при аутоиммунных заболеваниях.
В другом воплощении настоящего изобретения повышение уровня осуществляют перед иммунотерапией или терапией иммуноконъюгатами пациента, страдающего от рака или заболевания.
В еще одном воплощении настоящего изобретения пациент страдает от В-клеточного злокачественного заболевания, выбранного из группы, состоящей из неходжкинской лимфомы, острого лимфобластного лейкоза и хронического лимфоцитарного лейкоза.
В одном воплощении настоящего изобретения пациент страдает от В-клеточного злокачественного заболевания, которое представляет собой неходжкинскую лимфому.
В одном воплощении настоящего изобретения пациент страдает от В-клеточного злокачественного заболевания, которое представляет собой острый лимфобластный лейкоз.
В одном воплощении настоящего изобретения пациент страдает от В-клеточного злокачественного заболевания, которое представляет собой хронический лимфоцитарный лейкоз.
В другом воплощении радиоиммунотерапию осуществляют в низкой дозе, которая сама по себе вызывает незначительную гибель клеток в опухоли, но обеспечивает значительное увеличение уровня антигена.
В настоящем контексте термин "с повышенным уровнем" означает значительно более высокую экспрессию антигена на уровне белка или мРНК.
177
Эти изобретения неожиданно показали, что предварительное лечение В-клеточного злокачественного заболевания с использованием Lu-меченого НН1 антитела способно увеличивать уровень мишени ритуксимаба - CD20.
177
Таким образом, один аспект настоящего изобретения относится к применению комбинированного лечения В-клеточного злокачественного заболевания с использованием Lu-меченых НН1 антител и затем ритуксимаба.
177
Предпочтительное воплощение настоящего изобретения относится к Lu-меченому НН1 антителу и затем ритуксимабу для применения в лечении В-клеточного злокачественного заболевания.
177
Интервал между введением Lu-меченого антитела НН1 и ритуксимаба может быть оптимизирован, чтобы получить максимальное повышение уровня CD20. Этот интервал, как правило, составляет по меньшей мере одни сутки, 3-5 суток или 3-10 суток.
Интервал также может составлять 0-30 суток, более предпочтительно 3-15 суток после введения радиоиммунотерапии. В случае длительно циркулирующих антител можно рассматривать даже совместную или предварительную обработку, так как антитело присутствует в значительной концентрации в крови в то время, когда происходит повышение уровня антигена.
В объем настоящего изобретения входит применение радиоиммунотерапии другими меченным радиоизотопами антителами против CD37 или других антигенов, ассоциированных с гематологическим раковым заболеванием, например меченными радиоизотопами анти-CD20 антителами, включающими ибритумомаб, тозитумомаб, ритуксимаб, офатумумаб, велтузумаб и окрелизумаб, или меченными радиоизотопами CD19-, CD21-, CD22-, HLA-DR-, CD23-, CD39-, CD52-, CDw75- или CD80-антителами, включающими блинатумомаб и эпратузумаб.
47
67
90
105
117
131
149
153
161
165
177
186
188
211
212
212
213
223
224
225
227
Примерами используемых радионуклидов могут быть Sc, Cu, Y, Rh, mSn, I, Tb, Sm, Tb, Dy, Lu, Re, Re, At, Pb, Bi, Bi, Ra, Ra, Ac и Th, которые могут быть конъюгированы с помощью хелатирующего линкера с антителом или посредством электрофильного или нуклеофильного взаимодействия с группами белка.
Радиоиммуноконьюгаты
Радиоиммуноконьюгатом может быть любое соединение, способное нацеливаться на представляющий интерес антиген или связываться с ним.
Радиоиммуноконьюгаты включают, без ограничения ими, Зевалин, Бексар и Беталутин.
177
177
177
177
В контексте настоящего изобретения Беталутин также упоминается как Lu-HH1, Lu-HH-1, Lu-тетуломаб или Lu-тетраксетан-тетуломаб.
В другом воплощении настоящего изобретения одно или более антител или радиоиммуноконьюгатов нацелены на CD20.
Антитела включают, без ограничения ими, Ритуксимаб, Велтузумаб, Офатумумаб, Афутузумаб, Тозитумомаб, Редитукс и Ибритутомаб.
В другом воплощении настоящего изобретения одно или более антител или радиоиммуноконьюгатов нацелены на CD37.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения представлен CD37 радиоиммуноконьюгат Беталутин.
Антитела
Антителом по настоящему изобретению может быть любое моноклональное антитело, способное нацеливаться на любой из антигенов, описанных ниже.
Антитела включают, без ограничения ими, Ритуксимаб, Эпратузумаб, L19, F8, F16, Галиксимаб, Торализумаб, Алемтузумаб, Офатумумаб, Велтузумаб, Афутузумаб, Тозитумомаб, Редитукс, Ибритутомаб, K7153A, 37.1 и НН1.
В одном воплощении настоящего изобретения представлено моноклональное антитело НН1 (то есть, тетуломаб).
В одном воплощении настоящего изобретения представлено моноклональное антитело ритуксимаб.
Конкретные варианты НН1 раскрыты в PCT/IB 2012/057230 и РСТ/ЕР 2011/051231, которые тем самым включены посредством ссылки, и описаны, как конкретные воплощения, которые включены в данное изобретение.
Следовательно, можно подобрать вариант НН1, включенный в радиоиммуноконьюгаты по настоящему изобретению, на основании указанных выше описаний изобретений.
Такой вариант включает химерные варианты или варианты с определенной идентичностью последовательности цепей НН1.
Предпочтительное воплощение настоящего изобретение представляет собой вариант химерного НН1 или гуманизированного НН1.
В другом воплощении настоящего изобретения представлен химерный вариант НН1 chНН1.1, который представляет собой химерный НН1 изотип IgG1, или chHH1.3H, который представляет собой химерный НН1 изотип IgG3 с мутацией R435H.
В другом воплощении настоящего изобретения представлено моноклональное антитело ритуксимаб.
Линкеры
Радионуклид может быть присоединен к антителу посредством дополнительного линкера.
125
Например, радиоиммуноконьюгаты с йодом не требуют линкера. Это означает, что у I-НН1 нет необходимости в линкере.
Радионуклид может быть прикреплен к антителу сначала посредством реакции бифункционального хелатирующего агента, например p-SCN-bn-DOTA (Macrocyclics, Тх, USA), с антителом, за которой следует очистка для удаления неконъюгированного хелатирующего агента, и последующей реакции конъюгата антитела с хелатирующим агентом с радионуклидом, за которой следует очистка для удаления любого несвязанного радионуклида.
В качестве альтернативы, хелатирующий агент и радионуклид могут быть сначала объединены, а затем конъюгированы с антителом.
177
Хелатирующие линкеры, такие как, например, p-SCN-bn-DOTA, можно использовать для конъюгации других металлических радионуклидов с НН1 аналогично тому, как описано для Lu.
Может быть использован любой тип линкера с достаточной комплексообразующей способностью и функциональной группой, позволяющей прямую или непрямую конъюгацию с белком или пептидом. Примеры таких линкеров описаны в литературе (например Brechbiel, 2008; Liu, 2008). Некоторые полезные примеры представляют собой бифункциональные циклические хелатирующие агенты, такие как p-SCN-bn-DOTA, DOTA-NHS-эфир; бифункциональные линейные хелатирующие агенты, такие как p-SCN-Bn-DTPA и CHX-A''-DTPA.
Радионуклиды по настоящему изобретению предпочтительно конъюгированы с молекулой-мишенью посредством использования бифункциональных хелатирующих агентов.
Они могут быть циклическими, линейными или разветвленными хелатирующими агентами. Особое внимание следует обратить на полиаминополикилотные хелатирующие агенты, которые содержат линейный, циклический или разветвленный полиазаалкановый скелет с кислотными (например карбоксиалкильными) группами, присоединенными к атомам азота каркаса.
Примеры подходящих хелатирующих агентов включают производные DOTA, такие как пара-изотиоцианатобензил-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота (p-SCN-Bz-DOTA) и производные DTPA, такие как пара-изотиоцианатобензил-диэтилентриаминпентауксусная кислота (p-SCN-Bz-DTPA), где первые являются циклическими хелатирующими агентами, а последние линейными хелатирующими агентами.
Металлирование комплексообразующей группировки может быть выполнено до или после конъюгации комплексообразующей группировки с группировкой, обеспечивающей направленную доставку.
Процедура введения радиоактивной метки будет, в целом, более удобной с точки зрения используемого времени и т.д., если хелатирующий агент конъюгирован с антителом до введения радиоактивной метки.
Принципы получения меченных радиоизотопами конъюгатов с использованием хелатирующих агентов, прикрепленных к антителам, описаны в общих чертах, например, в Liu, 2008.
Таким образом, НН1 можно использовать для получения радиоиммуноконьюгатов с разными облучающими свойствами и эффективными периодами полураспада.
Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения линкер представляет собой хелатирующий линкер, выбранный из группы, состоящей из p-SCN-bn-DOTA, DOTA-NHS-сложный эфир, p-SCN-Bn-DTPA и CHX-A''-DTPA.
Бета- и/или альфа-излучающие радионуклиды с металлическими свойствами обеспечивают возможность комплексообразования с бифункциональными хелатирующими линкерами из следующих примеров: Bn-ТСМС ((бензил)-1,4,7,10-тетрааза-1,4,7,10-тетра(2-карбамоилметил)-циклододекан), DOTA, Bn-DOTA, Bn-NOTA ((бензил)-1,4,7-триазациклононан-1,4,7-триуксусная кислота), Bn-oxo-D03A (1-окса-4,7,10-тетраазациклододекан-4,7,10-триуксусная кислота), DTPA, CHX-A-DTPA, Bn-DTPA, Bn-РСТА (3,6,9,15-тетраазабицикло[9.3.1]пентадека-1(15), 11,13-триен-4-S-(4-изотиоцианатобензил)-3,6,9-триуксусная кислота) и молекулами из классов каликсаренов, криптатов и криптандов и т.д., без ограничения ими.
Таким образом, линкер может быть бифункциональным хелатирующим линкером.
В одном воплощении настоящего изобретения линкер является хелатирующим линкером.
Радионуклиды
Как упоминалось выше, можно сконструировать радиоиммуноконьюгаты, которые имеют разные облучающие свойства и эффективные периоды полураспада.
Естественная часть конструирования таких радиоиммуноконьюгатов заключается в выборе радионуклида.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения радионуклид представляет собой металлический радионуклида.
В еще одном воплощении настоящего изобретения радионуклид представляет собой альфа-излучатель.
212
213
225
227
Альфа-излучатель может быть выбран из группы, состоящей из Bi, Bi, Ас, Th.
В еще одном воплощении настоящего изобретения радионуклид представляет собой бета-излучатель.
90
153
161
177
Бета-излучатель может быть выбран из группы, состоящей из Y, Sm, Tb, Lu.
47
67
90
105
117
131
149
153
161
165
177
186
188
211
212
212
213
223
224
225
227
В другом воплощении настоящего изобретения радионуклид выбран из группы, состоящей из Sc, Cu, Υ, Rh, mSn, Ί, Tb, Sm, Tb, Dy, Lu, Re, Re, At, Pb, Bi, Bi, Ra, Ra, Ac и Th.
211
212
212
213
В еще одном воплощении настоящего изобретения время полураспада радионуклида составляет менее 24 часов, и радионуклид выбран из группы, состоящей из At, Pb, Bi, Bi.
47
67
90
105
117
131
149
153
161
165
177
186
188
223
224
225
227
В другом воплощении настоящего изобретения время полураспада радионуклида составляет более 24 часов, и радионуклид выбран из группы, состоящей из Sc, Cu, Y, Rh, mSn, Ί, Tb, Sm, Tb, Dy, Lu, Re, Re, Ra, Ra, Ac и Th.
Антигены
Антигены по настоящему изобретению представляют собой антигены, уровень которых может быть повышен посредством радиоиммуноконьюгатов по настоящему изобретению.
Эта повышение уровня также можно увидеть по увеличению или индукции экспрессии антигена. Повышение уровня или увеличение может быть измерено стандартными методами, известными специалисту в данной области, включающими вестерн-блоттинг и FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток).
Как один, так и несколько антигенов могут иметь повышенные уровни.
Например, можно повышать уровни и CD20, и CD37 при помощи радиоиммуноконьюгатов по настоящему изобретению.
Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения антиген с повышенным уровнем выбран из группы, состоящей из CD37, CD19, CD20, CD21, CD22, HLA-DR, CD23, CD39, CD52, CDw75 и CD80.
В еще одном воплощении настоящего изобретения повышенный уровень имеет антиген CD37.
В еще одном воплощении настоящего изобретения повышенный уровень имеет антиген CD20.
В другом воплощении настоящего изобретения повышенный уровень имеет антиген CD22.
B-клеточные антигены, уровень которых повышается посредством радиоиммунотерапии или потенциально может быть повышен, включают CD19, CD20, CD22, CD37 и CD52.
Таким образом, в еще одном воплощении настоящего изобретения антигены выбраны из списка, состоящего из CD19, CD20, CD22, CD37 и CD52.
В еще одном воплощении настоящего изобретения B-клеточные специфические антигены выбраны из группы, состоящей из CD19, CD20, CD22, CD37.
В еще одном воплощении настоящего изобретения уровень и CD20, и CD37 повышен радиоиммуноконьюгатами по настоящему изобретению.
В другом воплощении настоящего изобретения уровень и CD22, и CD37 повышен радиоиммуноконьюгатами по настоящему изобретению.
В еще одном воплощении настоящего изобретения уровень и CD52, и CD37 повышен радиоиммуноконьюгатами по настоящему изобретению.
В другом воплощении настоящего изобретения уровень и CD19, и CD37 повышен радиоиммуноконьюгатами по настоящему изобретению.
Антиген может представлять собой антиген, специфичным для аутоиммунных заболеваний или расстройств.
Когда антиген является специфическим для аутоиммунного заболевания и является подавляемым антигеном, то он, таким образом, может быть использован для лечения, например, воспаления.
Примерами таких антигенов являются TNF-α, IL-2 или иммуноглобулин Е.
В другом воплощении настоящего изобретения заболевание представляет собой множественную миелому и антиген выбран из группы, состоящей из CD38, CD138, ВСМА (антиген созревания В-клеток), CD317, CS1, CD40, BLyS (стимулятор В-лимфоцитов), CD56, CD52, КМА, GRP78, BAFF (фактор, активирующий В-клетки, семейства факторов некроза опухолей), CXCR4 и LMA (антиген мембран гепатоцитов).
Антитела, участвующие в лечение множественной миеломы или в разработке лечения множественной миеломы, могут быть выбраны из группы, состоящей из деносумаба, элотузумаба, даратумумаба, милатузумаба, лукатумумаба, MDX-1097, PAT-SM6, табалумаба, улокуплумаба и MDX-1458.
Конъюгаты антител с лекарственными средствами для лечения множественной миеломы могут быть выбраны из группы, состоящей из ВТ062, милатузумаб-DOX (доксорубицин), лорвотузумаб-мертанзина.
Антитела, вовлеченные в остеолитические заболевания костей у пациентов с множественной миеломой, могут быть выбраны из группы, состоящей из анти-DKK-1(Dickkopf 1) антитело BHQ-880, которое стимулирует активность остеобластов, образующих кости.
Анти-RANKL антитело деносумаб снижает активность остеокластов, что приводит к разрушению костной ткани.
Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения антитело представляет собой деносумаб и заболевание представляет собой остеопороз.
Антигеном ангиогенеза VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор роста) может быть анти-VEGF антитело бевацизумаб, которое предотвращает рост новых кровеносных сосудов в раковых клетках.
Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения мишенью является ангиогенез в раковых клетках, антиген представляет собой VEGF и антитело представляет собой бевацизумаб.
В объем настоящего изобретения входит применение меченного радиоизотопами антитела против одного из вышеупомянутых антигенов миеломы для индукции повышения уровня антигена.
Фармацевтические композиции
Антитела, обычно используемые в лечении заболеваний, приготовлены в в виде фармацевтических композиций.
Такие композиции оптимизированы в отношении таких параметров, как физиологическая устойчивость и срок годности.
Таким образом, в одном воплощении настоящего изобретения радиоиммуноконьюгат приготовлен в виде фармацевтической композиции.
Одно воплощение настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, как описано выше, дополнительно содержащей один или более дополнительных терапевтических агентов.
В другом воплощении настоящего изобретения указанные один или более дополнительных терапевтических агентов выбраны из агентов, индуцирующих апоптоз.
Обычно важным элементом фармацевтической композиции является буферный раствор, который в значительной степени поддерживает химическую целостность радиоиммуноконьюгата и является физиологически приемлемым для инфузии пациентам.
В одном воплощении настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или вспомогательных веществ.
Приемлемые фармацевтические носители включают, без ограничения ими, нетоксичные буферы, наполнители, изотонические растворы и т.д. Более конкретно, фармацевтическим носителем может быть, без ограничения ими, нормальный физиологический раствор (0,9%), полунормальный физиологический раствор, лактат Рингера, 5% декстроза, 3,3% декстроза/0,3% физиологический раствор. Физиологически приемлемый носитель может содержать радиолитический стабилизатор, например аскорбиновую кислоту, которая защищают целостность радиофармацевтического средства во время хранения и транспортировки.
Одно воплощение настоящего изобретения включает фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и один или более дополнительных антител или радиоиммуноконьюгатов.
Способ лечения
Терапевтическое применение радиоиммуноконьюгата по настоящему изобретению может быть использовано для лечения от злокачественных клеток, экспрессирующих антиген, как описано здесь, включающих, без ограничения ими, В-клеточное новообразование, выбранное из группы, состоящей из В-клеточной неходжкинской лимфомы, В-клеточного хронического лимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, лимфоплазмоцитарной лимфомы, острого лимфобластного лейкоза и множественной миеломы.
Другими применениями могли быть лечение аутоиммунных заболеваний и лечение эффектов, связанных с трансплантацией.
Таким образом, один аспект настоящее изобретение относится к способу повышения уровня экспрессии антигена, включающему введение радиоиммуноконьюгата субъекту, для которого повышение уровня экспрессии антигена является полезным.
Одно воплощение настоящего изобретения относится к способу лечения В-клеточного злокачественного заболевания, или заболевания или расстройства иммунной системы, в которой мишенью является CD20 и радиоиммуноконьюгат способен повышать уровень экспрессии антигена CD20.
В предпочтительном воплощении настоящего изобретения радиоиммуноконьюгат, способный повышать уровень экспрессии антигена CD20, представляет собой беталутин, и на CD20 нацелен ритуксимаб или его вариант.
Один аспект настоящего изобретения относится к комбинированному лечению В-клеточного злокачественного заболевания, или заболевания или расстройства иммунной системы с использованием беталутина с последующим использованием ритуксимаба, обинутузумаба или аналогичного терапевтического антитела к CD20.
В одном воплощении настоящего изобретения субъект страдает от В-клеточного злокачественного заболевания или заболевания или расстройства иммунной системы.
Другим воплощением настоящего изобретения является применение комбинированной терапии, где радиоиммуноконьюгат сопровождается, одновременно или после лечения, терапией антителами, терапией иммуноконъюгатами или их комбинацией.
Терапия может быть применена либо в виде монотерапии, либо в виде комбинации с другими терапиями, предпочтительно со стандартными терапиями. Такие другие терапии могут представлять собой предварительную обработку, хирургию, химиотерапию (включающую доксорубицин, винбластин и гемцитабин), иммунотерапию, терапию антителами, фотодинамическую терапию, ингибитор протеасом (включающий бортезомиб), ингибиторы гистондеацетилазы (включающие вориностат и субероиланилид гидроксамовой кислоты), витамин D3 и аналоги витамина D3, ингибиторы контрольной точки клеточного цикла (включающие UCN-01 и 2-(4-(4-хлорфенокси)фенил)-1Н-бензимидазол-5-карбоксамид), радиосенсибилизаторы гипоксических клеток (включающие метронидазол и мисонидазол), индукторы апоптоза (включающие витаферин А) радиосенсибилизаторы, радиоиммунотерапию или комбинацию двух или более из них.
Под введением подразумевают внутривенную инфузию или внутривенную инъекцию. Более конкретно, радиоиммуноконьюгат по настоящему изобретению может быть введен непосредственно в вену с помощью периферической канюли, соединенной с капельницей, что предотвращает воздушную эмболию и обеспечивает возможность оценки скорости потока в организм пациента.
В одном воплощении радиоиммуноконьюгат может быть введен многократно.
В другом воплощении радиоиммуноконьюгат с последующим моноклональным антителом (или иммуноконъюгатом) могут быть оба введены многократно.
В другом воплощении настоящего изобретения радиоиммуноконьюгат может быть введен многократно, но с разными радионуклидами, например за бета-радиоиммунотерапией может следовать альфа-радиоиммунотерапия или наоборот.
Один аспект настоящего изобретения относится к применению радиоиммуноконьюгата по настоящему изобретению для лечения В-клеточных злокачественных заболеваний.
Одно воплощение настоящего изобретения относится к применению радиоиммуноконьюгата по настоящему изобретению, введенного в комбинации с другой терапией или в дополнение к ней.
В одном воплощении настоящего изобретения другие терапии выбраны из предварительной обработки, химиотерапии, терапии моноклональными антителами, хирургии, радиотерапии и/или фотодинамической терапии.
В другом воплощении настоящего изобретения другие терапии представляют собой пересадку костного мозга или трансплантацию стволовых клеток и/или терапию с помощью стволовых клеток.
177
В одном воплощении настоящего изобретения доза антитела составляет 1-1000 мг на пациента, более предпочтительно 5-50 мг на пациента, и Lu в количестве 1-200 МБк/кг, более предпочтительно 10-100 МБк/кг массы тела.
Комбинированная терапия
Как отмечено выше, радиоиммуноконьюгаты могут быть использованы в комбинации с другими типами терапии.
Таким образом, в еще одном воплощении настоящего изобретения предложено применение комбинированной терапии, где радиоиммуноконьюгат сопровождается одновременной или следующей после лечения терапией антителами, терапией иммуноконъюгатами или их комбинацией.
В другом воплощении настоящего изобретения повышенный уровень имеет антиген CD20 и повышение уровня сопровождается терапией анти-CD20 антителом с ритуксимабом в однократном введении или в нескольких введениях.
Таким образом, можно использовать настоящие радиоиммуноконьюгаты для повышения уровней антигенов, отличных от антигена, на который нацелены радиоиммуноконьюгаты.
Таким образом, в еще одном воплощении настоящего изобретения представлено совместное или последующее нацеливание на антиген, отличный от радиоиммуноконьюгата.
Схема введения может представлять собой однократное введение, где радиоиммуноконьюгаты повышают уровень экспрессии одного или более антигенов, на которые затем нацелены однократная доза или несколько доз антиген-специфичной терапии.
Такая терапия может представлять собой терапию моноклональными антителами, такими как ритуксимаб или НН1, в зависимости от антигена, находящегося в центре внимания.
Терапия может быть повторена циклично, когда введение радиоиммуноконьюгатов и моноклональных антител повторяют один, два или несколько раз.
Преимуществом такого введения является то, что клетка-мишень может быть обработана теми же или другими антителами в каждом цикле, гарантируя, что антиген с самой высокой экспрессией находится в центре внимания.
Стратегия, где несколько антигенов находятся в центре внимания, ограничивает риск дрейфа экспрессии антигенов, экспрессируемых на поверхности клеток-мишеней.
Следует отметить, что воплощения и признаки, описанные в контексте одного из аспектов настоящего изобретения, также применимы к другим аспектам изобретения.
Все патенты и непатентные ссылки, указанные в настоящей заявке, тем самым включены посредством ссылки во всей своей полноте.
Изобретение теперь будет описано более подробно в следующих неограничивающих примерах.
Примеры
177
177
Пример 1 - Обработка Беталутином (Lu-тетраксетан-тетуломаб, или Lu-HH1) и влияние на экспрессию антигена
Материалы и методы: Мечение антител
177
Мечение антитела НН-1 с помощью p-SCN-Bn-DOTA и Lu выполняли в соответствии со стандартными процедурами, описанными в Dahle et al. (2013) и Repetto-Llamazares et al. (2013). Радиохимическую чистоту (RCP) радиоиммуноконьюгата (RIC) оценивали с использованием мгновенной тонкослойной хроматографии. Если RCP была менее 95%, конъюгат очищали с использованием колонок Econo-Pac 10 DG (Bio-rad Laboratories, California, USA). RCP была выше 97% для всех RIC, используемых в экспериментах. Специфическая активность Беталутина составляла 92 МКб/кг с концентрацией антитела 178 мкг/мл. Иммунореактивные фракции (IRF) RIC оценивали с использованием клеток лимфомы линии Рамос и Дауди и одноточечного анализа. Использовали концентрации клеток 75 миллионов клеток/мл. Клетки, инкубированные с холодными тетуломабом, использовали для оценки неспецифического связывания. Блокированные и неблокированные клетки инкубировали в течение 1,5 ч с 40 нг/мл радиоиммуноконьюгата. Добавленную активность измеряли, используя откалиброванный гамма-детектор (Cobra II auto-gamma detector, Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA). Клетки затем промывали три раза PBS с 0,5% BSA и связанную активность измеряли в гамма-счетчике. IRF оценивали путем вычитания неспецифического связывания, измеренного с использованием блокированных образцов, из связывающей активности неблокированных образцов. IRF составляли 52+/- 3 в клетках Дауди и 75+/-1 в клетках Рамос.
Мечение ритуксимаба с помощью Alexa 647 выполняли с использованием соответствующего набора для мечения белков Alexa Fluor Protein Labeling Kit (Molecular Probes, Life Technologies) в соответствии с процедурой, предусмотренной изготовителем.
Обработка клеток
177
В сутки 0 клетки Дауди разбавляли до 1 миллиона клеток/мл с использованием среды RPMI 1640, дополненной 10% FBS. Затем клетки аликвотировали в два культуральных флакона, по 6 мл в каждый. В один из флаконов вносили примерно 4,6 МБк Lu-тетраксетан-тетуломаба (10 мкг/мл), в то время как к другому не применяли никакой обработки. Оба флакона инкубировали в течение 24 ч, промывали и ресуспендировали в свежей среде до концентрации 0,5 миллионов клеток/мл. Поглощенная доза радиации в среде обработанных клеток составляла примерно 1,1 Гр. И обработанные, и контрольные клетки затем аликвотировали во флаконы для культивирования клеток в соответствии с каждой измеряемой временной точкой. Каждый флакон с клетками содержал примерно 5 мл клеточной суспензии. Свежую среду не добавляли к клеткам вплоть до окончания эксперимента через 72 ч после обработки.
Измерения с помощью проточной цитометрии
В каждой временной точке контрольные клетки окрашивали с помощью 0,4 мкг/мл ДНК-красителя Hoechst33342 (Н33342) в течение 20 минут при 37°C. Затем контрольные и обработанные клетки промывали и смешивали. Клетки инкубировали в течение 20 минут с холодным тетуломабом для того, чтобы насытить все сайты CD37. После этого клетки промывали с помощью PBS и к раствору добавляли анти-CD20 антитело ритуксимаб, конъюгированное с Alexa647, и вторичное антитело кролика против мыши (конъюгированное с фикоэритрином (PE) (DakoCytomation). После инкубирования на льду в течение 30 минут образцы промывали и измеряли с помощью проточной цитометрии. Увеличение экспрессии антигена (CD37 или CD20) рассчитывали как разницу измерений интенсивности (в %) контрольных и обработанных клеток. Контрольные и обработанные клетки различали путем установки дискриминационного окна в синей части флуоресценции красителя Н3342 в ДНК контрольных клеток. Повышение уровня CD20 оценивали в течение 0, 18, 24, 48 и 72 часов. CD37 оценивали в 24 и 48 ч. Для установления того, что Ab кролика против мыши не влияют на измерения CD20, выполняли окрашивание с анти-мышиным Ab и без него в 24 ч и 48 ч.
Результаты:
Для большинства временных точек наблюдалось увеличение экспрессии CD20 примерно на 130% по сравнению с необработанным контролем (Фиг. 1). Увеличение экспрессии CD37 составляло примерно 60% (Фиг. 1). Между ритуксимабом и антителом кролика против мыши не происходило взаимодействия, так как увеличение экспрессии CD20 в образцах с кроличьим антителом или без него было одинаковым.
Заключение
177
Уровень антигенов CD20 и CD37 был повышен после воздействия на клетки Lu-тетраксетан-тетуломаба. Увеличение было примерно постоянным для всех временных точек и составляло примерно 130% для CD20, и оно увеличивалось на 30-60% для CD37 через 48-72 ч после обработки.
Пример 2
Введение
177
Для определения, был ли эффект Lu-тетуломаба обусловлен клеточно-специфическим излучением, клетки Дауди инкубировали с Беталутином в течение 1 часа.
Материалы и методы
Мечение антител
177
Процедуру, используемую для мечения антител и расчета IRF, ранее обсуждали в Примере 1. Удельная радиоактивность Lu-тетуломаба составляла 212 МБк/мг и концентрация Ab составляла 0,5 мг/мл. IRF составляла 72+/-2% и была измерен в клетках Рамос.
Обработка клеток
Процедура обработки клеток была аналогична процедуре, описанной в примере 1. В данном примере оценивали две разные обработки. Одна обработка включала инкубацию клеток в течение 24 часов, аналогично примеру 1. Другая обработка включала инкубацию клеток в течение 1 часа. Контрольные клетки готовили для каждой из обработок, как описано в примере 1. В обоих способах обработки добавляли одно и то же количество активности (4,6 МБк, такую же активность, как указано в примере 1). Каждые 2-5 суток клетки разделяли и добавляли свежую среду, так что концентрация клеток составляла от 0,5 до 1 миллионов клеток/мл после разведения.
Измерения с помощью проточной цитометрии
Окрашивание клеток и измерение повышения уровня антигена в обработанных клетках по сравнению с контрольными клетками выполняли с использованием той же процедуры, что описана в примере 1. Измерения выполняли во временных точках между 0 до 14 сутками.
Результаты
Доза для среды клеток, инкубированных в течение 1 ч, составляла примерно 0,05 Гр, в то время как доза для клеток, инкубированных в течение 24 часов, составляла примерно 1,1 Гр. Клетки, инкубированные в течение 1 ч, имели 45,5% увеличение CD20 и 3,8% увеличение CD37 через 48 ч после воздействия, и 48,8% и 15,1% соответственно через 144 ч после воздействия, что указывало на то, что клеточно-специфическое излучение радиоиммуноконьюгата было важным компонентом этого эффекта, в частности для антигена CD20 (Фиг. 2). Повышение уровня антигенов, по-видимому, снижается до 0 через 14 суток.
Пример 3
Введение
Чтобы определить, было ли повышение антигенов общим свойством лимфомы, а не эффектом конкретной клеточной линии, клетки Дауди тестировали вместе с тремя другими клеточными линиями лимфомы Раджи, Рамос и Rec-1.
Материалы и методы
Мечение антител
177
Процедура, используемая для мечения антител и расчета IRF, ранее обсуждалась в Примере 1. Удельная активность Lu-тетуломаба составляла 212 МБк/мг и концентрация Ab составляла 0,5 мг/мл. IRF составляла 72+/-2% и была определена в клетках Рамос.
Обработка клеток
Процедура обработки клеток была аналогична описанной в Примере 1. Клетки инкубировали в течение 1 часа. Контрольные клетки готовили для каждой из клеточных линий, как описано в Примере 1. К клеточным линиям добавляли одно и то же количество активности (4,6 МБк, такая же активность, как приведена в Примере 1). Доза для клеточной среды составляла примерно 0,05 Гр. Каждые 2-5 суток клетки разделяли и добавляли свежую среду так, чтобы концентрация клеток была от 0,5 до 1 миллионов клеток/мл после разведения.
Измерения с помощью проточной цитометрии
Окрашивание клеток и измерение повышения уровня антигена в обработанных клетках по сравнению с контрольными клетками выполняли с использованием той же процедуры, что описана в Примере 1. Измерения выполняли во временные точки от 0 до 7 суток.
Результаты
177
Представляется, что повышение уровней антигенов является общим свойством клеток неходжкинской лимфомы. Увеличение CD20 наблюдалось у всех клеточных линий, в то время как увеличение экспрессии CD37 наблюдалось у 3 из 4 клеточных линий (Таблица 1). Наконец, воздействие радиоиммуноконьюгата Lu-тетуломаб вызывает увеличение CD20 и CD37 и это кажется общим свойством В-клеточных лимфом.
177
Пример 4. Влияние на экспрессию антигена нацеливания на CD20 Lu-ритуксимаба.
Введение
177
177
177
Чтобы определить, является ли этот эффект общим свойством радиоиммуноконьюгатов, а не специфическим эффектом Беталутина (то есть Lu-HH-1 или Lu-тетуломаба), клетки Дауди и Раджи обрабатывали Lu-ритуксимабом.
Материалы и методы
Мечение антител
177
Процедура, используемая для мечения ритуксимаба и для расчета IRF, была ранее описана в Примере 1. Удельная радиоактивность Lu-ритуксимаба составляла 165 МБк/мг и концентрация Ab составляла 0,2 мг/мл. IRF составляла 60+/-2% и была измерена в клетках Рамос.
Мечение тетуломаба с помощью Alexa 488 выполняли с использованием соответствующего набора Alexa Fluor Protein Labeling (Molecular Probes, Life Technologies) в соответствии с процедурой, представленной изготовителем.
Обработка клеток
Процедура обработки клеток была аналогична описанной в примере 1. Клетки инкубировали в течение 1 часа или 24 часов. Использовали клетки лимфомы Дауди и Раджи. Контрольные клетки готовили для каждой из клеточных линий, как описано в примере 1. Такое же количество активности добавляли к клеточным линиям (4,6 МБк, такая же активность, что и приведена в примере 1). Доза для клеточной среды составляла примерно 0,05 Гр. Каждые 2-5 суток клетки разделяли и добавляли свежую среду, так что концентрация клеток составляла от 0,5 до 1 миллионов клеток/мл после разведения.
Измерения с помощью проточной цитометрии
177
Окрашивание клеток и измерение повышения уровней антигенов в обработанных клетках по сравнению с контрольными клетками выполняли, используя такую же процедуру, которая описана в примере 1. Измерения проводили в моменты времени от 0 до 7 суток. Учитывая, что Lu-ритуксимаб связывается с CD20 и что то же самое антитело использовали для измерения интенсивности флуоресценции, обнаруженные результаты давали минимальное значение для повышения уровня CD20. Повышение уровня CD37 оценивали, используя как вторичное (кролика против мыши), так и прямое Ab (тетуломаб, связанный с Alexa488).
Результаты
177
177
Повышение уровня CD20 и CD37 также наблюдалось, когда клетки обрабатывали Lu-ритуксимабом (Таблица 2). Таким образом, повышение уровней антигенов не является специфическим эффектом Lu-тетуломаба.
Пример 5
Введение
177
125
Чтобы подтвердить, что радиоиммунотерапия приводит к увеличению связывания антител с клетками в другом анализе, две клеточные линии Дауди (неходжкинекая лимфома) и JMV-3 (В-клеточный лейкоз) обрабатывали с помощью Lu-HH-1 (анти-CD37) и затем измеряли связывание I-меченого ритуксимаба (анти-CD20).
Методы:
125
125
125
I-ритуксимаб получают с использованием пробирок с иодогеном (Pierce). Пробирку с иодогеном промывали 1 мл трис-буфера и затем добавляли 100 мкл трис-буфера (рН 7,5) и йод I. Раствор осторожно перемешивали в пробирке несколько раз в течение 6 минут, после чего некоторую часть или весь I раствор добавляли во флакон, обычно с 100 мкл трис с 50-200 мкг антитела OI-3.
При использовании периодического перемешивания флакона реакция продолжалась в течение 7 минут. После этого добавляли 50 мкл I-тирозина (насыщенного) в трис-буфере и проводили реакцию в течение по меньшей мере 5 минут, после чего раствор очищали, используя гель-фильтрационную колонку Sephadex G-25 PD-10 (GE Health).
Примерно 70% активности должно элюироваться в высокомолекулярных фракциях, которые собирали и использовали в эксперименте по клеточному связыванию.
177
Антитело НН-1 сначала метили с помощью p-SCN-Bn-DOTA, растворенного в 0,005 M HCl. Молярное соотношение p-SCN-Bn-DOTA и антитела составляло 6:1. рН реакционной смеси доводили до 8,5±0,2, используя карбонатный буфер. Через 45 минут инкубации при 37°С реакцию останавливали путем добавления 50 мкл 0,2 M раствора глицина/мг Ab. Для удаления свободного хелатирующего агента конъюгированное антитело промывали путем разбавления конъюгата антитела 1:10 с помощью 0,9% NaCl и концентрировали путем центрифугирования с помощью AMICON-30 центрифужных пробирок (Millipore, Cork, Ireland). Процедуру повторяли 4-5 раз. Перед мечением с помощью 220 МБк Lu (Perkin Elmer, Boston, Ma, USA), рН 1 мг конъюгата антитела доводили до 5,3±0,3, используя 0,25 M аммоний ацетатный буфер. Реакционную смесь инкубировали в течение 15 минут при 37°С.
177
125
177
177
125
2
177
177
Радиохимическую чистоту (RCP) радиоиммуноконьюгата (RIC) оценивали, используя мгновенную тонкослойную хроматографию (ITLC). RCP составляла 95,5%. Иммунореактивные фракции (IRF) радиоиммуноконъюгатов RIC измеряли, используя клетки лимфомы Рамос (Lu-HH1) или Дауди (I-Ритуксимаб) и одноточечный анализ. Использовали концентрацию клеток примерно 50 миллионов клеток/мл. Две пробирки не блокировали и 2 пробирки предварительно обрабатывали 10 мкг НН-1, после чего к ним добавляли 2 нг Lu-HH1 и их встряхивали в течение 1,5 часов. После этого пробирки подсчитывали на гамма-счетчике, чтобы определить задействованную активность, промывали и центрифугировали три раза с 0,5 мл DPBS (фосфатно-солевой буфер Дульбекко)/В8А (бычий сывороточный альбумин), затем в пробирках подсчитывали связанную с клетками активность. Активность связывания с клетками корректировали с учетом неспецифического связывания путем вычитания значений из блокированных пробирок. IRF, то есть специфически связанные против суммарных, составляла 78% (Lu-HH1) и 71% (I-ритуксимаб). Во флаконы с культурой клеток (25 см, Corning), содержащие 5 мл RPMI 1640 с добавлением 10% FBS (эмбриональная бычья сыворотка) и с 1 млн клеток на мл были добавлены либо 2,5 МБк Lu-Bn-DOTA-HH-1 (Lu-НН-1), Bn-DOTA-HH-1 (DOTA-HH-1, контрольная группа 1) или буфер для создания композиции, то есть тот же раствор, что и в случае двух других обработок, за исключением RIC или конъюгата антитела (контрольная группа 2) в 16,7 мкл. Через одни сутки удаляли 2 мл и добавляли 3 мл свежей среды (разбавление в 1,7 раз), через трое суток добавляли 3 мл среды (разбавление в 1,5 раз), через пять суток удаляли 4 мл и добавляли 3 мл свежей среды (разбавление в 1,8 раз), на 8 сутки удаляли 6 мл и добавляли 5 мл свежей среды (разбавление в 2,7 раз), на 11 сутки удаляли 7 мл и добавляли 4 мл свежей среды (разбавление в 5 раз). Это делали для того, чтобы пополнить ростовую среду и симулировать снижения концентрации во времени, наблюдаемое для RIC in vivo.
177
125
177
125
125
125
177
177
125
125
Через 3,5 суток отбирали клеточные суспензии и измеряли концентрацию и выживаемость клеток, используя автоматизированный счетчик клеток Countess (Invitrogen), и 0,5 мл добавляли к пробиркам с реакционной смесью, центрифугировали и клеточные осадки ресуспендировали в 200 мкл DPBS (Gibco) с 0,5% BSA (VWR). К двум пробиркам в группе Lu-HH-1 добавляли 0,8 мкг, то есть примерно 1,6 мкг/мл, I-ритуксимаба в 10 мкл DPBS/BSA, и к двум пробиркам добавляли только DPBS (для коррекции подсчета из-за интерференции Lu в окне I). К двум пробиркам в контрольных группах 1 и 2 добавляли 0,8 мкг, то есть примерно 1,6 мкг/мл I-ритуксимаба в 10 мкл DPBS/BSA и 10 мкл DPBS/BSA буфера. Пробирки инкубировали в течение 1,5 часов и после этого промывали и дважды центрифугировали до подсчета в окне I счетчика гамма-излучения Cobra II Autogamma (Packard). Подсчеты в группе Lu-HH-1 скорректировали с учетом перекрестных импульсов от Lu в окне I, используя измерения от двух пробирок, к которым не добавляли I-ритуксимаб.
Результаты
177
125
177
125
177
Связанную с клетками активность корректировали с поправкой на количество клеток, и Lu интерференция в окне I и сравнения обработанных RIC и необработанных контролей 1 (конъюгат антитела за исключением Lu) и 2 (буферный раствор RIC) представлены в Таблице 3. Показано, что клетки, обработанные RIC, имели повышенное связывание I-ритуксимаба во всех временных точках вплоть до и включая 15 суток после начала терапии Lu-НН1.
Заключение
125
177
Как показано в таблице 3, и клетки В-клеточной лимфомы, и В-клеточного лейкоза демонстрировали повышенное связыванием I-ритуксимаба после воздействия Lu-HH1. Это указывает на то, что радиоиммунотерапия может быть полезна в качестве индукционной терапии у пациентов, подвергнутых терапии моноклональными антителами, например лечению ритуксимабом лимфомы и лейкоза.
Пример 6. Оценка неспецифического связывания.
Предпосылки:
Чтобы подтвердить, что повышенное связывание антиген-специфического антитела с клетками, подвергнутыми радиоиммунотерапии, не было вызвано повышенным неспецифическим связыванием к клеткам, был выполнен эксперимент, с использованием блокирования антигена.
Эксперимент:
2
177
125
177
125
125
125
На клетки Дауди, примерно 1 млн на мл в 25 см культуральных флаконах, воздействовали либо немеченым НН1 антителом (контроль 1), буфером композиции (контроль), либо 0,1 МБк/мл или 0,5 МБк/мл Lu-HH-1 в течение трех суток. Через один сутки концентрацию уменьшали до 50% путем добавления свежей среды. На третий сутки клеточные суспензии отбирали, и использовали для анализа связывания, и обрабатывали, как в примере 4, с двумя параллельными пробирками из трех групп, получающих I-ритуксимаб. Кроме того, вторые экземпляры каждой группы обрабатывали немеченым ритуксимабом (100 мкг/мл) в течение получаса для блокирования антигена CD20. Для коррекции Lu в окне I использовали вторые экземпляры из двух радиоактивных групп без добавления I-ритуксимаба, и их обрабатывали и промывали таким же способом, как тестируемые пробирки с I-ритуксимабом.
125
125
177
После добавления I-ритуксимаба тестируемые пробирки инкубировали в течение двух часов и подсчитывали приложенную активность. Использовали счетчик гамма-излучения Cobra tl auto gamma (Packard Instruments Company Inc, Downers Grove, IL, USA). После этого тестируемые пробирки дважды промывали DPBS/0,5% BSA, дважды центрифугировали и подсчитывали активность, связанную с клетками. Данные корректировали с учетом спилловера гамма-излучения в окне I от Lu в обработанных клетках.
Результаты:
При сравнении чистых индексов активности на клетку в блокированных пробирках против неблокированных пробирок результаты были следующими: 0,1 и 0,5 МБк/мл группы, 0,8% и 1,1% неспецифического связывания; контроль 1 и контроль 2, 1,3% и 1,1% неспецифического связывания.
Заключение:
Блокирование антигена было одинаково эффективным в обработанных и необработанных клетках. Таким образом, увеличенное связывание с обработанных радиоиммуноконьюгатом клетками не было вызвано неспецифическим связыванием и, следовательно, должно быть вызвано увеличенной экспрессией антигена.
177
177
Пример 7: Обработка Беталутином (Lu-тетраксетан-тетуломабом или Lu-HH1) и воздействие на экспрессию антигена CD20 in vivo
177
Этот пример подтверждает, что эффект повышения уровня антигена посредством Lu-HH1 также наблюдается in vivo. Биораспределение и захват опухолью у бестимусных мышей, несущих подкожные ксенотрансплантаты Рамос, измеряли через 3 суток после обработки Беталутином или с контрольной инъекцией холодного НН1.
Метод:
177
Мечение тетуломаба с помощью Lu
177
177
Хелатирующий агент p-SCN-Bn-DOTA (DOTA) растворяли в 0,005 M HCl, добавляли к антителу в соотношении 6:1, и рН доводили до примерно 8,5 с помощью карбонатного буфера. Через 45 минут инкубации при 37°С реакцию останавливали добавлением 50 мкл 0,2 M раствора глицина на мг Ab. Для удаления свободного DOTA, конъюгированное антитело промывали, используя центрифужные пробирки AMICON-30 (Millipore, Cork, Ireland), 4-5 раз 0,9%NaCl. Перед мечением с помощью Lu рН доводили до 5,3±0,3, используя 0,25 M аммоний-ацетатный буфер. Примерно 150 МБк Lu (Perkin Elmer, Boston, Ma, USA) добавляли к 0,5 мг DOTA-Ab и инкубировали в течение 20 минут при 37°С.Удельная радиоактивность составляла 250 МБк/мг.Радиохимическую чистоту (RCP) конъюгата оценивали, используя мгновенную тонкослойную хроматографию. Если RCP была ниже 95%, конъюгат очищали, используя колонки Econo-Pac 10 DG (Bio-rad Laboratories, California, USA).
125
Мечение ритуксимаба с помощью I
125
Ритуксимаб метили с помощью I посредством непрямого йодирования, используя предварительно покрытые IODOGEN пробирки для йодирования (Pierce, Rockford, IL), в соответствии с описанием производителя. После завершения реакции с L-тирозином реакционную смесь элюировали через колонку Sephadex G-25 PD-10 для удаления низкомолекулярных соединений. Удельная радиоактивность конечного продукта составляла 12 МБк/мг.
177
125
Иммунореактивная фракция Lu-HH1 и I-ритуксимаба
2
Одноклеточные суспензии клеток лимфомы Рамос выращивали в среде RPMI 1640 (РАА, Linz, Austria) с добавлением 10% инактивированной нагреванием FCS (РАА), 1% L-глутамина (РАА) и 1% пенициллин-стрептомицина (РАА) во влажной атмосфере со смесью 95% воздуха/5% СО. Иммунореактивность радиоиммуноконьюгатов измеряли, используя одноточечный модифицированный метод Lindmo. Используемая концентрация клеток составляла 75 миллионов клеток/мл. Иммунореактивность конъюгатов составляла от 60% до 82%.
Животные
Использовали воспроизводимых в учреждении самок бестимусных голых мышей Foxnlnu в возрасте примерно 8-9 недель и которые имели массу тела примерно 22 г в начале эксперимента. Животных содержали в беспатогенных условиях, и еду и воду поставляли без ограничения. Все процедуры и эксперименты с участием животных в этом исследовании были одобрены Национальным управлением исследованиями на животных (National Animal Research Authority) и выполнялись в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных, используемых для научных целей. Мышам подкожно инъецировали в оба бока по 50 мкл кашеобразного раствора опухолевой ткани лимфомы Рамос, слегка разбавленной примерно 300 мкл NaCl на каждый мл кашеобразного раствора опухоли.
Эксперименты по биораспределению захвата
125
177
177
125
125
177
125
177
125
177
125
125
177
177
125
177
Биораспределение I-ритуксимаба и Lu-HH1 определяли в бестимусных мышах Foxnlnu с ксенотрансплантатами Рамос диаметрами от 5 до 14 мм в начале исследования. Препараты вводили путем инъекции 100 мкл раствора в хвостовую вену каждого животного. Дозу примерно 350 МКб/кг Беталутина, равную дозе белка 2,3 мг/кг (Lu-HH-1 хранили до использования, следовательно удельная радиоактивность уменьшалась) вводили 5 мышам (обработанные мыши). Контрольная группа состояла из 7 мышей, которым инъецировали такую же белковую дозу холодного НН1, что и обработанным животным (2,3 мг/кг). Через двое суток после инъекции Беталутина или холодного НН1 всем мышам вводили 3 мг/кг I-ритуксимаба. Через трое суток после инъекции I-ритуксимаба мышей подвергали эвтаназии путем смещения шейных позвонков и выполняли вскрытие. Определяли массу каждого образца ткани и измеряли количество Lu и I с помощью калиброванного гамма-детектора (Cobra II auto-gamma detector, Packard Instrument Company, Meriden, CT, USA). Образцы вводимых растворов использовали в качестве растворов для сравнения при измерении. Для каждой временной точки рассчитывали процент инъецируемой дозы на грамм ткани (%ИД/г) с коррекцией на распад. Активность в органах измеряли с помощью двойного окна, при этом активности Lu и I измеряли одновременно. Контрольные пробирки с одним либо Lu, либо I использовали для оценки перекрывания окон. Перекрывание окном I окна Lu составляло примерно 0,006% и считалось незначительным. С другой стороны, перекрывание окном Lu окна I составляло примерно 10% и все данные были соответственно скорректированы. Кроме того, образцы оставляли распадаться в течение 10 недель (периоды полураспада Lu примерно 10) и снова подсчитывали для подтверждения эффективности поправок.
Результаты:
125
125
На Фиг. 6 показано биораспределение I-ритуксимаба через 3 суток после инъекции I-ритуксимаба. Мышам инъецировали за 5 суток до этого либо 350 МКб/кг Беталутина (обработанные), либо холодный НН1 (контроль). Захват в нормальных органах было одинаковым в обеих группах (р>0,05), в то время как захват в опухоли было примерно в 3 раза выше у обработанных мышей (р=3,19 10-10). Среднее значение % ИД/г в опухоли у контрольных мышей составляло 1,3 +/- 0,2, в то время как у обработанных мышей он было 3,6 +/- 0,7.
Заключение:
Обработка Беталутином увеличивает захват опухолевыми клетками в 3 раза, в то время как захват нормальными органами остается постоянным по сравнению с мышами, обработанными холодным НН1. Эти результаты вместе с данными, представленными в предыдущих примерах, указывают на то, что обработка Беталутином активирует антиген CD20 in vivo и это преобразуется в существенно повышенный захват опухолью.