УСЛОВНО АКТИВНЫЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ БЕЛКИ

1. Способ получения условно активного биологического белка, где указанный условно активный биологический белок представляет собой белок, который проявляет снижение активности в анализе при нормальном физиологическом условии по сравнению с активностью условно активного биологического белка в анализе при аберрантном условии, причем способ включает стадии:
i. эволюционирования ДНК, которая кодирует родительский биологический белок, с применением одного или более методов эволюционирования с получением мутантных ДНК;
ii. осуществления экспрессии указанных мутантных ДНК с получением мутантных белков, по меньшей мере один из которых проявляет снижение активности в анализе при нормальном физиологическом условии по сравнению с активностью того же мутантного белка в анализе при аберрантном условии, и
iii. отбора условно активного биологического белка из указанных мутантных белков, который проявляет снижение активности в анализе при нормальном физиологическом условии по сравнению с активностью того же мутантного белка в анализе при аберрантном условии,
причем анализ при нормальном физиологическом условии и анализ при абберантном условии осуществляют в растворе для анализа, содержащем по меньшей мере один компонент, выбранный из неорганического соединения, иона и органической молекулы.
2. Способ по п. 1, в котором концентрации указанного по меньшей мере одного компонента концентрации в растворе для анализа по существу одинаковы для анализа при нормальном физиологическом условии и для анализа при аберрантном условии.
3. Способ по п. 1, в котором по меньшей мере один компонент представляет собой компонент, который присутствует в физиологической жидкости млекопитающего в нормальной физиологической концентрации.
4. Способ по п. 3, в котором концентрация указанного по меньшей мере одного компонента в растворе для анализа лежит в диапазоне от 5% до 500% от нормальной физиологической концентрации в физиологической жидкости млекопитающего, или от 10% до 400% от нормальной физиологической концентрации в физиологической жидкости млекопитающего, или от 30% до 300% от нормальной физиологической концентрации в физиологической жидкости млекопитающего, или от 50% до 200% от нормальной физиологической концентрации в физиологической жидкости млекопитающего, или от 75% до 150% от нормальной физиологической концентрации в физиологической жидкости млекопитающего.
5. Способ по п. 1, в котором указанное неорганическое соединение выбрано из борной кислоты, хлорида кальция, нитрата кальция, фосфата диаммония, сульфата магния, фосфата моноаммония, фосфата монокалия, хлорида калия, сульфата калия, сульфата меди, сульфата железа, сульфата марганца, сульфата цинка, сульфата магния, нитрата кальция, хелата кальция, хелата меди, хелата железа, хелата марганца, хелата цинка, молибдата аммония, сульфата аммония, карбоната кальция, фосфата магния, бикарбоната калия, нитрата калия, соляной кислоты, диоксида углерода, серной кислоты, фосфорной кислоты, угольной кислоты, мочевой кислоты, хлористого водорода и мочевины.
6. Способ по п. 1, в котором указанный ион выбран из иона магния, иона натрия, иона калия, иона аммония, иона железа, иона цинка, иона фосфора, серного иона и хлорида-иона и иона меди.
7. Способ по п. 1, в котором указанный компонент выбран из одного или более из мочевой кислоты в диапазоне концентраций 2-7,0 мг/дл, иона кальция в диапазоне концентраций 8,2-11,6 мг/дл, хлорид-иона в диапазоне концентраций 355-381 мг/дл, иона железа в диапазоне концентраций 0,028-0,210 мг/дл, иона калия в диапазоне концентраций 12,1-25,4 мг/дл, иона натрия в диапазоне концентраций 300-330 мг/дл и угольной кислоты в диапазоне концентраций 15-30 мМ.
8. Способ по п. 1, в котором указанная органическая молекула представляет собой аминокислоту, выбранную из гистидина, аланина, изолейцина, аргинина, лейцина, аспарагина, лизина, аспарагиновой кислоты, метионина, цистеина, фенилаланина, глутаминовой кислоты, треонина, глутамина, триптофана, глицина, валина, пирролизина, пролина, селеноцистеина, серина и тирозина.
9. Способ по п. 1, в котором указанная органическая молекула представляет собой органическую кислоту, выбранную из лимонной кислоты, а-кетоглутаровой кислоты, янтарной кислоты, яблочной кислоты; фумаровой кислоты, ацетоуксусной кислоты, 0-гидроксимасляной кислоты, молочной кислоты, пировиноградной кислоты, а-кетоновой кислоты, уксусной кислоты и летучих жирных кислот.
10. Способ по п. 1, в котором указанная органическая молекула представляет собой сахар, выбранный из глюкозы, пентозы, гексозы, ксилозы, рибозы, маннозы, галактозы, лактозы, GlcNAcβl-3Gal, Galαl-4Gal, Manαl-2Man, GalNAcβl-3Gal и О-, N-, С- и S-гликозидов.
11. Способ по п. 1, в котором указанный ион выбран из ионов магния, сульфат-иона, бисульфат-иона, карбонат-иона, бикарбоната-иона, нитрат-иона, нитрит-иона, фосфат-иона, гидрофосфат-иона, дигидрофосфат-иона, персульфат-иона, моноперсульфат-ион, борат-иона и иона аммония.
12. Способ по п. 11, в котором концентрация указанного иона лежит в диапазоне от 5 до 500% от нормальной физиологической концентрации иона в физиологической жидкости млекопитающего, или от 10% до 400% от нормальной физиологической концентрации иона в в физиологической жидкости млекопитающего, или от 30% до 300% от нормальной физиологической концентрации иона в в физиологической жидкости млекопитающего, или от 50% до 200% от нормальной физиологической концентрации иона в в физиологической жидкости млекопитающего, или от 75% до 150% от нормальной физиологической концентрации иона в в физиологической жидкости млекопитающего.
13. Способ по п. 11, в котором указанное нормальное физиологическое условие представляет собой нормальный физиологический рН, и указанное аберрантное условие представляет собой рН, который отличается от нормального физиологического рН.
14. Способ по п. 13, в котором рКа указанного иона лежит в пределах 1 единицы рН от рН аберрантного условия, или 0,8 единиц рН от рН аберрантного условия, или 0,6 единицы рН от рН аберрантного условиях, или 0,5 единицы рН от рН аберрантного условиях, или 0,4 единицы рН от рН аберрантного условия, или 0,3 единицы рН от рН аберрантного условия, или 0,2 единицы рН от рН аберрантного условия.
15. Способ по п. 1, в котором
родительский биологический белок представляет собой белок дикого типа с желаемым свойством, фрагмент белка дикого типа типа с желаемым свойством, мутантный белок типа с желаемым свойством или фрагмент мутантного белка с желаемым свойством.
16. Способ по п. 15, в котором родительский биологический белокпредставляет собой фрагмент белка дикого типа.
17. Способ по п. 15, в котором родительский биологический белок представляет собой антитело или фрагмент антитела.
18. Способ по любому из пп. 15-17, в котором указанное желаемое свойство выбрано из сродства связывания, уровня экспрессии и гуманизации.
19. Способ по любому из пп. 15-18, дополнительно включающий стадию эволюционирования указанного условно активного биологического белка, отобранного на стадии (iii), с получением улучшенного условно активного биологического белка с улучшением желаемого свойства.
20. Способ по п. 19, в котором улучшение желаемого свойства представляет собой повышенное отношение активности улучшенного условно активного биологического белка в исследовании при аберрантном условии к активности с условно активного биологического белка, отобранного на стадии (iii).
21. Способ по любому из пп. 15-18, дополнительно включающий стадию конъюгированйя условно активного белка, отобранного на стадии (iii), с агентом, выбранным из цитокинов, интерлейкинов, ферментов, гормонов, факторов роста, цитотоксических агентов, химиотерапевтических лекарственных средств, радиоактивных частиц и диагностических агентов.
22. Способ по любому из пп. 19-20, дополнительно включающий стадию конъюгированйя улучшенного условно активного белка с агентом, выбранным из цитокинов, интерлейкинов, ферментов, гормонов, факторов роста, цитотоксических агентов, химиотерапевтических лекарственных средств, радиоактивных частиц и диагностических агентов.
23. Способ по любому из пп. 15-18 и 21,в котором указанный белок представляет собой антитело и дополнительно включает стадию модификации условно активного антитела, отобранного на стадии (iii), в биспецифическое антитело.
24. Способ по любому из пп. 19-20 и 22, в котором указанный белок представляет собой антитело, и который дополнительно включает стадию модификации улучшенного условно активного антитела в биспецифическое антитело.
25. Способ по любому из пп. 23-24, в котором на стадии модификации получают указанное биспецифическое антитело, которое связывается как с поверхностным антигеном иммунной эффекторной клетки, так и с другим антигеном-мишенью.
26. Способ по п. 25, в котором указанная иммунная эффекторная клетка выбрана из природной клетки-киллера, макрофага, активируемой лимфокином клетки-киллера и Т-клетки.
27. Способ по п. 25, в котором указанная иммунная эффекторная клетка представляет собой Т-клетку, а поверхностный антиген иммунной эффекторной клетки представляет собой CD3.
28. Способ по любому из пп. 25-27, в котором указанный антиген-мишень представляет собой антиген, специфичный к пораженной болезнью клетке или пораженной болезнью ткани.
29. Способ по п. 28, в котором указанная пораженная болезнью ткань представляет собой опухолевую ткань.
30. Способ по любому из пп. 15-18, дополнительно включающий стадию модификации условно активного биологического белка, отобранного на стадии (iii), с включением по меньшей мере одного маскирующего фрагмента и отщепляемого фрагмента.
31. Способ по п. 30, в котором один или оба из указанного маскирующего фрагмента и указанного отщепляемого фрагмента могут отщепляться от условно активного биологического белка при приближении к пораженной болезнью клетке или пораженной болезнью ткани.
32. Способ по п. 1, в котором растворы для анализа в анализе при нормальном физиологическом условии и в анализе при абберантном условии не содержат сыворотку.
33. Способ по п. 1, в котором указанный по меньшей мере один компонент содержит компонент, выбранный из группы, состоящей из мочевины, бикарбоната калия и диоксида углерода.