СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ НЕСТАБИЛЬНОЙ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК И УСТРОЙСТВО С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
METHOD FOR DETECTION OF UNSTABLE EXTRACELLULAR DNA, AND DEVICE USING IT

Область техники
Настоящее изобретение относится к способу и устройству для детекции внеклеточной ДНК, имеющей нестабильную двухспиральную структуру, без процесса амплификации гена.
Уровень техники
В последнее время, важность ранней диагностики злокачественных заболеваний явно растет во всем мире. Таким образом, увеличиваются исследования способов ранней диагностики злокачественных опухолей. Однако, до настоящего времени, способы диагностики злокачественных опухолей осуществляли с использованием инвазивных способов, таких как сбор образца ткани и эндоскопия. В частности, проводят гистологическое исследование, таким способом, что часть подозреваемого пораженного заболеванием участка вырезают и наблюдают под микроскопом. Таким образом, из-за того факта, что разрез в теле человека необходимо сделать для сбора образца ткани с использованием иглы, щипцов, эндоскопа или лапароскопа, пациенты не только действительно чувствуют значительный дискомфорт, но также остается шрам и длительное время занимает его заживление.
Способ молекулярной диагностики с использованием жидкой биопсии привлекает внимание в качестве альтернативы инвазивным способам диагностики и обследования. Поскольку в жидкой биопсии используют неинвазивный способ, является возможным быстро идентифицировать его результаты. Кроме того, в отличие от образца ткани, позволяющего анализ только части заболевания, жидкая биопсия позволяет многосторонний анализ заболевания. В частности, ожидают, что жидкая биопсия может иметь отличную эффективность в диагностике злокачественной опухоли. В частности, прогнозируют, что только исследование жидкости организма, такой как кровь и моча, сделает возможным анализ происходящих из клеток злокачественных опухолей ДНК для соответствующих частей организма, которые присутствуют в крови, так что можно будет осуществлять подробное наблюдение развития и метастазирования злокачественной опухоли, и т.п.
ex vivo
Способ молекулярной диагностики представляет собой репрезентативный способ диагностики , который детектирует и диагностирует, посредством числовых значений или изображений, изменения в ДНК или РНК, по образцу, содержащему генетическую информацию, такому как кровь и моча. Благодаря его преимуществам высокой точности и отсутствия необходимости гистологического исследования, предприняты попытки использования способа молекулярной диагностики для способов диагностики злокачественных опухолей, на основе его преимущества снижения затрат, наряду с быстрым развитием способов анализа генома.
С другой стороны, внеклеточная ДНК (далее в настоящем описании обозначенная как вкДНК) относится к ДНК, которая присутствует в плазме и происходит из клеток. вкДНК обычно имеет двухспиральную структуру. Кроме того, существует множество случаев, когда вкДНК имеет суперспиральную структуру. вкДНК может происходить из клеток опухолей. Кроме того, вкДНК, происходящую из клеток опухолей, можно обнаружить в биологических образцах, таких как кровь, плазма или моча, полученных от пациентов с злокачественными опухолями.
вкДНК, обнаруженная у пациентов с злокачественными опухолями, может происходить из некротических клеток, нормальных клеток и/или клеток злокачественных опухолей. Такая вкДНК высвобождается в мочу, кровь или т.п. посредством различных процессов. Таким образом, развитие способов выделения и детекции вкДНК в биологическом образце, таком как кровь, плазма или моча, позволяет жидкой биопсии являться более эффективным и надежным инструментом для мониторирования пациентов, подверженных риску развития злокачественной опухоли. В частности, поскольку моча, плазма, кровь или жидкость организма является легко доступным образцом, является возможным сбор большого количества образцов неинвазивным способом.
Однако, принимая во внимание современный уровень технологии, существует множество трудностей в способах ранней диагностики злокачественных опухолей, включая анализ вкДНК в жидких образцах, таких как кровь и моча, и обнаружение мутаций, присутствующих в генах. Таким образом, существует необходимость в разработке способа простой детекции вкДНК, так же как способов улучшения чувствительности детекции, и в точной ранней диагностике злокачественной опухоли.
В то же время, в Корейском патенте No. 10-1751962 описан способ, способный к количественной оценке вкДНК посредством проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, таким образом, вкДНК детектируют. Однако, все еще существует та проблема, что отдельные полимераза и экспериментальное оборудование являются необходимыми для проведения полимеразной цепной реакции; и существуют те проблемы, что необходимо точное получение праймера для амплификации, и невозможно легко провести диагностику по месту лечения.
Кроме того, в Корейском патенте No. 10-1701618 описана наноструктура, свойства поверхности которой можно изменять посредством изменений в электрическом поле, чтобы эффективно выделять вкДНК. Наноструктура может связывать или диссоциировать вкДНК посредством изменений в электрическом поле, и таким образом, можно легко выделять вкДНК из образца. Однако, в этом случае все еще существует то ограничение, что необходимо использовать полимеразную цепную реакцию для идентификации того, какая вкДНК присутствует.
Для амплификации вкДНК посредством проведения полимеразной цепной реакции, необходимы различные типы наборов праймеров, и это также занимает множество времени для проведения сложных стадий. Таким образом, постоянно проводят исследования для преодоления ограничения необходимости проведения ПЦР, и для разработки способа анализа вкДНК с высокой точностью.
Описание изобретения
Техническая проблема
Обычно, для детекции вкДНК, являлось необходимым осуществление способа, в котором вкДНК денатурируют и амплифицируют с использованием праймеров, комплементарных вкДНК. Однако, авторы настоящего изобретения идентифицировали присутствие нестабильной вкДНК в крови. Кроме того, авторы настоящего изобретения идентифицировали, что, в отличие от стабильной вкДНК, для нестабильной вкДНК показана необычная реакция с одноцепочечным зондом. В частности, авторы настоящего изобретения идентифицировали, что такая нестабильная вкДНК происходит из клеток индивидуума, имеющего злокачественную опухоль или инфекционное заболевание. На основании этих обнаружений, авторы настоящего изобретения завершили настоящее изобретение.
Соответственно, целью настоящего изобретения является предоставление способа идентификации присутствия или отсутствия нестабильной вкДНК, и предоставление способа получения информации для диагностики злокачественной опухоли или различных заболеваний посредством идентификации такой нестабильной вкДНК.
Решение проблемы
Для достижения вышеуказанной цели, представлен способ детекции нестабильной вкДНК из образца без амплификации. Кроме того, представлен способ получения информации для диагностики или прогнозирования злокачественной опухоли и инфекционногое заболевания посредством детекции нестабильной вкДНК из образца без амплификации. Кроме того, представлено устройство для детекции нестабильной вкДНК из образца без амплификации.
Обеспечивающие преимущество эффекты изобретения
Когда используют способ детекции нестабильных вкДНК, в соответствии с вариантом осуществления, не только процесс амплификации нестабильной вкДНК не является необходимым, но также является возможным укорочение времени для анализа вкДНК. В частности, является возможным эффективно детектировать нестабильную двухцепочечную вкДНК, содержащую часть с мутацией в гене, таким образом, эффективно диагностировать или прогнозировать злокачественную опухоль или заболевание, ассоциированное с мутацией в гене. Кроме того, когда используют способ, в соответствии в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, является возможным идентифицировать, быстрым и точным способом, присутствие или отсутствие вкДНК, имеющей нестабильную двухспиральную структуру, по малому количеству биологического образца, такого как моча, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, асциты, плазма, кровь или жидкость организма. Кроме того, поскольку подтверждено, что детектированная таким образом нестабильная вкДНК является ассоциированной с различными злокачественными опухолями или заболеваниями, способ, в соответствии с вариантом осуществления настоящего изобретения, можно полезным образом использовать для диагностики злокачественной опухоли или для идентификации прогноза после лечения.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 иллюстрирует изображение при сканирующей электронной микроскопии (SEM) положительно заряженной нанопроволоки (PEI/Ppy NW).
Фиг. 2 иллюстрирует изображение при трансмиссионной электронной микроскопии (TEM) положительно заряженной нанопроволоки (PEI/Ppy NW).
Фиг. 3 иллюстрирует поверхности наноструктур (PLL/Ppy NW), с которыми связан полилизин (PLL) в качестве катионного полимера, представленные посредством изображения при сканирующей электронной микроскопии.
Фиг. 4 иллюстрирует изображение при сканирующей электронной микроскопии связанных с HRP/стрептавидином наночастиц.
Фиг. 5 иллюстрирует изображение при сканирующей электронной микроскопии (SEM) связанных с PEI наночастиц (PEI/Ppy NP), имеющих диаметр 50 нм.
Фиг. 6 иллюстрирует схематическую диаграмму способа, в котором вкДНК получают из жидкости организма пациента с использованием нанопроволоки (PEI/Ppy NW), имеющей поверхность, с которой связан полиэтиленимин (PEI), и затем мутации в генах анализируют в пределах 60 минут посредством реакции с зондами и меченными HRP/стрептавидином наночастицами (HRP/стрепт.-меченными NP).
Фиг. 7 схематически иллюстрирует способ детекции нестабильной вкДНК с использованием нанопроволоки, зондов и меченных HRP/стрептавидином наночастиц.
Фиг. 8 иллюстрирует, в последовательности операций с течением времени, способ детекции нестабильной вкДНК в образце, таком как кровь, спинномозговая жидкость или плевральная жидкость.
Фиг. 9 иллюстрирует, в последовательности операций с течением времени, способ детекции нестабильной вкДНК в образце, таком как моча.
Фиг. 10 схематически иллюстрирует различия в условиях денатурации, в зависимости от состояний вкДНК, полученной из крови.
Фиг. 11 схематически иллюстрирует различия в условиях денатурации в зависимости от состояний вкДНК, полученной из мочи, слюны и мокроты.
Фиг. 12 иллюстрирует результаты, полученные посредством получения вкДНК из образцов мочи пациентов c раком шейки матки и образцов мочи нормальных субъектов, и затем детекции присутствия или отсутствия мутаций в генах в вкДНК с использованием зонда для HPV 18 или HPV 16.
Фиг. 13 иллюстрирует результат, полученный посредством идентификации, посредством поглощения, для связывания между вкДНК, присутствующими в моче положительных по HPV пациентов c раком шейки матки (HPV16 (+) и HPV18 (+)) и отрицательного по HPV контрольного здорового (HPV-), и зондом, специфическим для HPV 18 или HPV 16.
Фиг. 14 иллюстрирует результаты, полученные посредством подвергания вкДНК, выделенных из мочи пациентов c раком шейки матки, последовательным реакциям с зондами, специфическими для HPV 16, делеции EGFR19, HPV 18 и EGFR 21 L858R, и затем идентификации связывания между вкДНК и каждым зондом.
Фиг. 15 иллюстрирует результат, полученный посредством добавления к плазме нормальных субъектов лестницы маркеров ДНК низкого диапазона (10 п.о. - 100 п.о.), среднего диапазона (100 п.о. - 2 т.п.о.) и высокого диапазона (3,5 т.п.о. - 21 т.п.о.), и затем оценки эффективности связывания, в случае связывания лестницы маркеров ДНК с использованием PEI/Ppy NW.
Фиг. 16 иллюстрирует результат, полученный посредством идентификации размеров геномной ДНК линии клеток (далее в настоящем описании обозначенной как гДНК), полученной посредством деградации линии клеток A549 (дорожки 1 и 2), линии клеток HCC2279 (дорожки 3 и 4) и линии клеток H1975 (дорожки 5 и 6) без обработки ультразвуком, и фрагментированной ДНК (далее в настоящем описании обозначенной как фрДНК), полученной посредством обработки ультразвуком гДНК из каждой линии клеток.
Фиг. 17 иллюстрирует результат, полученный посредством связывания, с использованием PEI/Ppy NW, гДНК, полученных из линии клеток A549, линии клеток HCC2279 и линии клеток H1975 без обработки ультразвуком, и фрДНК, полученных посредством обработки ультразвуком соответствующих линий клеток, и затем оценки эффективности связывания.
Фиг. 18 и 19 иллюстрируют результаты, полученные посредством связывания, с использованием PEI/Ppy NW, гДНК, полученных из линии клеток A549, линии клеток HCC2279 и линии клеток H1975 без обработки ультразвуком, и фрДНК, полученных посредством обработки ультразвуком соответствующих линий клеток, и затем идентификации изменения окраски и изменения УФ-видимой области спектра посредством добавления зондов, специфических для EGFR 19 (19-дел.), EGFR 20 (T790M) и EGFR 21 (L858R). Идентифицировано, что только фрДНК избирательно связываются с целевыми зондами.
Фиг. 20 иллюстрирует результаты, полученные посредством получения, с использованием PEI/Ppy NW, фрДНК из линии клеток H1975, линии клеток HCC2279 и линии клеток A549, и затем анализа мутаций в генах с использованием ДНК-зондов, с которыми связан флуоресцентный краситель.
Фиг. 21 иллюстрирует результат, полученный посредством использования фрДНК клеток HCC2279 (мутация делеции экзона 19 гена EGFR) и зонда, специфического для делеции экзона 19 EGFR, и анализа, с использованием поглощения УФ, связывания фрДНК с зондом в зависимости от концентраций фрДНК. Посредством этого, идентифицированы поддающиеся детекции концентрации вкДНК.
Фиг. 22 иллюстрирует результат, полученный посредством использования фрДНК H1975 (мутации в гене EGFR T790M в экзоне 20 и L858R в экзоне 21) и зонда, специфического для T790M в экзоне 20 EGFR, и анализа, с использованием поглощения УФ, связывания фрДНК с зондом в зависимости от концентраций фрДНК. Посредством этого, идентифицированы поддающиеся детекции концентрации вкДНК.
Фиг. 23 иллюстрирует результаты, полученные посредством анализа, с использованием Bioanalyzer, вкДНК, полученной из 200 мкл плазмы пациентов с раком легкого с использованием PEI/Ppy NW. В соответствии с литературой, известно, что ассоциированная с злокачественной опухолью вкДНК имеет средний размер 166 п.о. Как показано по данным Bioanalyzer, идентифицировано, что для вкДНК, полученной из плазмы пациентов с раком легкого, с использованием PEI/Ppy NW, показан пик при 169 п.о.
Фиг. 24 иллюстрирует результаты, полученные посредством идентификации, что в случае, когда проводят реакцию вкДНК, выделенных из плазмы пациентов с раком легкого, с мутацией гена EGFR, с зондом, специфически связывающимся с делецией экзона 19 EGFR (дел.) или L858R в экзоне 21 EGFR, показывают такое же изменение окраски и поглощение УФ, как и для генотипа ткани.
Фиг. 25 иллюстрирует результаты, полученные посредством идентификации, что в случае, когда вкДНК, выделенные из плазмы пациентов с раком легкого, с мутациями в генах делецией экзона 19 EGFR (дел.), T790M в экзоне 20 EGFR и L858R в экзоне 21 EGFR, подвергают реакции с зондом, специфическим для экзона 19-дел. EGFR, T790M в экзоне 20 EGFR или L858R в экзоне 21 EGFR, показывают такое же изменение окраски и поглощение УФ, как и для генотипа ткани.
Фиг. 26 и 27 иллюстрируют результаты, полученные посредством идентификации, что в случае, когда вкДНК, выделенные, с использованием PEI/Ppy NW, из плазмы пациентов с раком легкого, с мутацией в экзоне 2 гена KRAS, подвергают реакции с зондом, специфическим для экзона 2 KRAS, показывают такое же изменение окраски и поглощение УФ, как и для генотипа ткани.
Фиг. 28 иллюстрирует результаты, полученные посредством идентификации, что в случае, когда вкДНК, выделенные из плазмы пациентов с раком легкого, с мутацией слитого гена ALK-EML4, подвергают реакции с зондом, специфически связывающимся с ALK-EML4, показывают такое же изменение окраски и поглощение УФ, как и для генотипа ткани.
Фиг. 29 иллюстрирует, что в случае, когда вкДНК, выделенные из плазмы пациентов с раком легкого, с мутациями в генах делецией экзона 19 EGFR и T790M в экзоне 20 EGFR, подвергают реакции с различными зондами, специфически связывающимися с делецией экзона 19 EGFR или T790M в экзоне 20 EGFR, показывают изменение окраски и поглощение УФ, соответствующие ткани. Однако, в соответствии с результатами, идентифицировали, что изменение окраски не наблюдают для мутации L858R 21 EGFR независимо от трех типов используемых зондов. В результате, можно видеть, что реакция между геном и зондом не ограничена конкретным зондом, и любой зонд может связываться с геном, имеющим мутацию, при условии, что зонд специфически связывается с геном.
Фиг. 30 иллюстрирует результаты, полученные посредством подвергания вкДНК, выделенных из плазмы пациентов с раком легкого (дикого типа, WT), без мутации в гене EGFR, денатурации при 95°C в течение 1 минуты и 10 минут, соответственно, и затем реакции с зондом для делеции экзона 19 EGFR, T790M в экзоне 20 EGFR, или L858R в экзоне 21 EGFR. Идентифицировано, что для вкДНК, выделенных из плазмы пациентов с EGFR WT, не показано реакции с каким-либо зондом в случае денатурации при 95°C в течение 1 минуты; и с другой стороны, вкДНК вступают в неспецифическую реакцию со всеми зондами после денатурации при 95°C в течение 10 минут.
Фиг. 31, 32, и 33 иллюстрируют результаты, полученные посредством связывания, посредством нанопроволоки, вкДНК из плазмы пациентов с раком легкого, с мутациями в генах делецией экзона 19 EGFR и T790M в экзоне 20 EGFR, и нормальных субъектов, подвергания вкДНК денатурации при 95°C в течение 0 минут (фиг. 31), 1 минуты (фиг. 32) и 10 минут (фиг. 33), соответственно, и затем идентификации их реакции с зондом для делеции 19 EGFR, 20 T790M или 21 L858R.
Фиг. 34 иллюстрирует таблицу, полученную посредством использования вкДНК, полученных из плазмы 151 пациента с раком легкого и анализа мутаций в генах у пациентов с раком легкого.
Фиг. 35 иллюстрирует результат, полученный посредством получения вкДНК из плазмы пациентов с раком легкого с EGFR без мутаций (дикого типа), пациентов с раком легкого с делецией экзона 19 EGFR и пациентов с раком легкого с L858R в экзоне 21 EGFR, смешивания вкДНК с зондом, специфическим для дел. экзона 19 EGFR, и затем идентификации мутации в генах у пациентов с раком легкого посредством анализа значений поглощения УФ-спектра (ΔOD, 500 нм - 650 нм).
Фиг. 36 иллюстрирует результат, полученный посредством получения вкДНК из плазмы пациентов с раком легкого с делецией экзона 19 EGFR, смешивания вкДНК с зондом, специфическим для дел. экзона 19 EGFR, и затем анализа специфичности и чувствительности для мутаций в генах.
Фиг. 37 иллюстрирует результат, полученный посредством получения вкДНК из плазмы пациентов с раком легкого с EGFR без мутаций (дикого типа), пациентов с раком легкого с делецией экзона 19 EGFR, и пациентов с раком легкого с L858R в экзоне 21 EGFR, добавления к ним зонда, специфического для L858R в экзоне 21 EGFR, и затем идентификации мутации в генах у пациентов посредством анализа значений поглощения УФ-спектра (ΔOD, 500 нм - 650 нм).
Фиг. 38 иллюстрирует результат, полученный посредством получения вкДНК из плазмы пациентов с раком легкого с L858R в экзоне 21 EGFR, добавления к ним зонда, специфического для L858R в экзоне 21 EGFR, и затем анализа специфичности и чувствительности для мутаций в генах у пациентов.
Фиг. 39 иллюстрирует результат, полученный посредством подвергания вкДНК, выделенных, с использованием PEI/Ppy NP, из плазмы пациентов с раком легкого, с мутацией в гене делецией экзона 19 EGFR, реакции с зондом, специфическим для дел. экзона 19 EGFR (E19), T790M в экзоне 20 EGFR (E20) или L858R в экзоне 21 EGFR (E21), и в результате, идентификации того, что наблюдают поглощение УФ, соответствующее ткани.
Фиг. 40 иллюстрирует результаты, полученные посредством получения, с использованием PLL/Ppy NW, модифицированных с использованием полилизина, фрДНК из линии клеток H1975 с мутациями в генах T790M в экзоне 20 EGFR и L858R в экзоне 21 EGFR, подвергания фрДНК реакции с зондом, специфическим для дел. экзона 19 EGFR, T790M в экзоне 20 EGFR, или L858R в экзоне 21 EGFR, и затем анализ мутаций в генах.
Фиг. 41 иллюстрирует последовательности CP и DP для делеции экзона 19 EGFR. В этом исследовании, мутации в генах вкДНК у пациентов с раком легкого анализировали с использованием CP_1 и DP. По настоящему изобретению, CP относится к зонду, разработанному для специфического связывания с последовательностью, которая содержит мутантную часть или является соседней с ней, и DP относится к зонду, разработанному для специфического связывания с частью, отделенной от мутантной последовательности.
Фиг. 42 иллюстрирует последовательности CP и DP для T790M в экзоне 20 EGFR. В этом исследовании, мутации в генах вкДНК у пациентов с раком легкого анализировали с использованием CP2 и DP.
Фиг. 43 иллюстрирует последовательности CP и DP для L858R в экзоне 21 EGFR. В этом исследовании, мутации в генах вкДНК у пациентов с раком легкого анализировали с использованием CP2 и DP.
Фиг. 44 иллюстрирует результат, полученный посредством получения вкДНК из плазмы пациентов с раком легкого с мутацией в гене делецией экзона 19 EGFR, и затем анализа мутаций в генах с использованием CP_1 для экзона 19, CP2 для экзона 20 и CP2 для экзона 21 EGFR на фиг. 41-43, без DP.
Фиг. 45 иллюстрирует результаты, полученные посредством подвергания плазмы пациентов с раком легкого с делецией экзона 19 EGFR обработке РНКазой и ДНКазой, получения вкДНК посредством PEI/Ppy нанопроволоки, и детекции нестабильной вкДНК с использованием зонда, специфического для делеции экзона 19 EGFR.
Фиг. 46 иллюстрирует результаты, полученные посредством подвергания плазмы пациентов с раком легкого, с T790M в экзоне 20 EGFR, обработке РНКазой и ДНКазой, получения вкДНК посредством PEI/Ppy нанопроволоки и детекции нестабильной вкДНК с использованием зонда, специфического для T790M в экзоне 20 EGFR.
Фиг. 47 иллюстрирует результаты, полученные посредством подвергания вкДНК, полученных из плазмы пациентов с раком легкого, с мутациями в генах делецией экзона 19 EGFR и T790M в экзоне 20 EGFR, реакции с зондами, специфическими для делеции экзона 19 EGFR (дел.19), T790M в экзоне 20 EGFR и L858R в экзоне 21 EGFR, и затем добавления к этому наночастиц с HRP/стрептавидином (содержащих большое количество HRP) для идентификации детекции вкДНК с использованием изменения окраски и поглощения УФ.
Фиг. 48 иллюстрирует результаты, полученные посредством подвергания вкДНК, полученных из плазмы тех же пациентов с раком легкого, с мутациями в генах делецией экзона 19 EGFR и T790M в экзоне 20 EGFR, как на фиг. 47, реакции с зондами, специфическими для делеции экзона 19 EGFR (дел.19), T790M в экзоне 20 EGFR, и L858R в экзоне 21 EGFR, и затем добавления к этому комплексов HRP/стрептавидин (комплексов, полученных посредством связывания между HRP и стрептавидином при 1:1) для идентификации детекции вкДНК с использованием изменения окраски и поглощения УФ. По результатам, идентифицировано, что образуется шум в случае комплексов HRP/стрептавидин, по сравнению с наночастицами с HRP/стрептавидином.
Фиг. 49 иллюстрирует график, полученный посредством идентификации и сравнения совпадений с генотипом ткани злокачественной опухоли, посредством анализа результатов, полученных как посредством выделения вкДНК из плазмы 5 пациентов с раком легкого, с мутациями в генах делецией экзона 19 EGFR и T790M в экзоне 20, и затем подвергания вкДНК реакции с зондами, специфическими для дел. экзона 19 EGFR, T790M в экзоне 20 EGFR, и L858R в экзоне 21 EGFR, и меченными HRP/стрептавидином наночастицами (HRP/стрепт.-меченными NP), так и реакции с зондами, специфическими для дел. экзона 19 EGFR, T790M в экзоне 20 EGFR и L858R в экзоне 21 EGFR, и комплексами HRP/стрептавидин (в которых HRP и стрептавидин связаны друг с другом при 1:1).
Фиг. 50 иллюстрирует результат, полученный посредством подвергания вкДНК, полученных из плевральной жидкости пациентов с раком легкого, с мутациями в генах T790M в экзоне 20 EGFR и 21 L858R, реакции с зондами для делеции экзона 19 EGFR (19-дел.), T790M в экзоне 20 EGFR и L858R в экзоне 21 EGFR, с которыми уже связаны HRP/стрепт.-меченные NP, и затем идентификации детекции мутаций в генах с использованием поглощения УФ.
Фиг. 51 иллюстрирует результаты, полученные посредством смешивания вкДНК, полученных из плазмы пациентов с раком легкого, с мутациями в генах T790M в экзоне 20 EGFR и L861Q в экзоне 21 EGFR, всех одновременно, с зондами, специфическими для делеции экзона 19 EGFR (19-дел.), T790M в экзоне 20 EGFR, L858R в экзоне 21 EGFR и L861Q в экзоне EGFR, и HRP/стрепт.-меченными NP, для детекции мутаций в генах в вкДНК, и в результате, идентификации, с использованием поглощения УФ, что мутации в генах наблюдают только для T790M в экзоне 20 EGFR и L861Q в экзоне 21 EGFR, как в ткани злокачественной опухоли.
Фиг. 52 иллюстрирует результаты, полученные посредством смешивания вкДНК, полученных из плазмы пациентов с раком легкого, с мутациями в генах слиянием ALK-EML4 и точечной мутацией в ALK (I1171N/T), всех одновременно, с зондами, специфическими для слияния ALK-EML4 и точечных мутаций в ALK (T1151, L1152P, L1152R, C1156Y, I1171N/T), и HRP/стрепт.-меченными NP, для детекции мутаций в генах в вкДНК, и в результате, идентификации, что генотипы слияния ALK-EML4 и точечной мутации в ALK (I1171N/T) детектированы, как в ткани злокачественной опухоли.
Фиг. 53 иллюстрирует результаты, полученные посредством смешивания вкДНК, полученных из плазмы пациентов с раком щитовидной железы, с мутацией в гене V600E BRAF, всех одновременно, с зондом, специфическим для V600E BRAF, и HRP/стрепт.-меченными NP, для детекции мутаций в генах в вкДНК, и в результате, идентификации, что детектирована такая же мутация в гене V600E BRAF, как в генотипе пациентов.
Фиг. 54 иллюстрирует результаты, полученные посредством подвергания образцов, собранных из крови нормальных субъектов, денатурации в условиях различной температуры, и затем детекции нестабильных вкДНК, для соответствующих условий обработки.
Фиг. 55 иллюстрирует результаты, полученные посредством подвергания образцов, собранных из крови пациентов, денатурации в условиях различной температуры, и затем детекции нестабильных вкДНК, для соответствующих условий обработки.
Фиг. 56 иллюстрирует результаты, полученные посредством подвергания фрДНК, полученных из мутантных линий клеток, денатурации в условиях различной температуры, и затем детекции нестабильных вкДНК, для соответствующих условий обработки.
Фиг. 57 иллюстрирует результаты, полученные посредством подвергания фрДНК, полученных из мутантных линий клеток, обработке ДНКазой при 37°C в течение 30 минут, и затем детекции нестабильных вкДНК, для условий обработки.
Фиг. 58 иллюстрирует результаты, полученные посредством подвергания фрДНК, полученных из мутантных линий клеток, обработке ДНКазой при 37°C в течение 60 минут, и затем детекции нестабильных вкДНК, для условий обработки.
Фиг. 59 иллюстрирует результаты, полученные посредством подвергания фрДНК, полученных из мутантных линий клеток, обработке ДНКазой при 37°C в течение 120 минут, и затем детекции нестабильных вкДНК, для условий обработки.
Фиг. 60 иллюстрирует результаты, полученные посредством подвергания нестабильных вкДНК и стабильных вкДНК обработке с использованием 1 мкл или 2 мкл ДНКазы при 24°C в течение 120 минут, для идентификации различий между нестабильными вкДНК и стабильными вкДНК, в зависимости от активности ДНКазы.
Фиг. 61 иллюстрирует результаты, полученные посредством подвергания нестабильных вкДНК и стабильных вкДНК обработке с использованием 1 мкл или 2 мкл ДНКазы при 3°C в течение 120 минут, для идентификации различий между нестабильными вкДНК и стабильными вкДНК, в зависимости от активности ДНКазы.
Наилучший способ осуществления изобретения
<Определение терминов>
В рамках изобретения, термин «внеклеточная ДНК» также обозначен как вкДНК. Кроме того, вкДНК может также представлять собой циркулирующую опухолевую ДНК (цоДНК), представляющую собой происходящую из клетки злокачественной опухоли ДНК, которую можно обнаружить в биологическом образце, таком как моча, спинномозговая жидкость, плазма, кровь или жидкость организма, полученном от пациентов с злокачественными опухолями. Кроме того, вкДНК может присутствовать в биологическом образце, таком как моча, спинномозговая жидкость, плевральная жидкость, асциты, плазма, кровь, слюна, мокрота или жидкость организма. По настоящему изобретению, вкДНК может иметь размер 80 п.о. - 10 т.п.о., 100 п.о. - 1 т.п.о., или 120 п.о. - 500 п.о. Кроме того, вкДНК может иметь размер 150 п.о. - 200 п.о., и обычно может иметь размер 165 п.о. - 170 п.о.
В рамках изобретения, термин «нестабильная вкДНК» относится к вкДНК, которая является термодинамически нестабильной по сравнению со «стабильной вкДНК». Иными словами, нестабильную вкДНК можно денатурировать в условиях, менее строгих, чем те, при которых денатурируют стабильную вкДНК. Причиной, по которой образуется нестабильная вкДНК, является то, что нестабильная вкДНК имеет нестабильную двухспиральную структуру.
В рамках изобретения, термин «вкДНК, имеющая нестабильную двухспиральную структуру», отличается наличием более низкого значения Tm, чем вкДНК, имеющая стабильную двухспиральную структуру, или денатурирующаяся в условиях, когда вкДНК, имеющая стабильную двухспиральную структуру, не денатурируется. Tm относится к температуре плавления, при которой 50% двухцепочечной ДНК переходит в одноцепочечную ДНК. Значение Tm является пропорциональным длине ДНК и может меняться с нуклеотидными последовательностями. Поскольку большое количество нуклеотидов связаны водородными связями друг с другом в геномной ДНК, геномную ДНК необходимо нагревать при 92°C-95°C в течение 5 минут или дольше, или при 98°C в течение 2 минут или дольше. Кроме того, геномная ДНК не подвергается легко денатурации при температуре ниже 90°C. Поскольку вкДНК, имеющая стабильную двухспиральную структуру, имеет в среднем 170 п.о. нуклеотидов, и таким образом, она может иметь значение Tm, сходное с геномной ДНК.
Однако, «вкДНК, имеющая нестабильную двухспиральную структуру», имеет более низкое значение Tm, чем вкДНК, имеющая стабильную двухспиральную структуру. Таким образом, когда вкДНК, имеющую стабильную двухспиральную структуру, подвергают денатурации при любом из условий, выбранных из группы, состоящей из i) условия оставления в течение 1-120 минут при комнатной температуре; ii) условия нагревания при 90°C - 95°C в течение 1 секунды - 3 минут; iii) условия нагревания при 75°C - 90°C в течение 1 секунды - 5 минут; iv) условия нагревания при 60°C - 75°C в течение 30 секунд - 60 минут; v) условия нагревания при 25°C - 40°C в течение 10-120 минут; vi) условия обработки протеазой в течение 10 секунд - 30 минут; и vii) условия обработки ДНКазой в течение 10 секунд - 30 минут, и затем подвергают реакции связывания с 15-членным - 30-членным зондом, вкДНК, имеющая стабильную двухспиральную структуру, не связывается с зондом. В настоящем описании, «комнатная температура» относится к температуре окружающей среды и может составлять 18°C - 25°C. Кроме того, в дополнение к вышеуказанным условиям, могут быть дополнительно включены условия нагревания при 40°C - 65°C в течение 5-80 минут.
Однако, подтверждено, что когда вкДНК, имеющую нестабильную двухспиральную структуру, подвергают обработке при любом условии из вышеупомянутых i) - vii), и затем подвергают реакции связывания с 15-членным - 30-членным зондом, вкДНК, имеющая нестабильную двухспиральную структуру, связывается с зондом. По настоящему изобретению, зонд может представлять собой 15-членный - 30-членный, или 20-членный - 25-членный, и может представлять собой 21-членный, 22-членный, 23-членный или 24-членный зонд.
По настоящему изобретению, вкДНК имеющая нестабильную двухспиральную структуру, может представлять собой циркулирующую опухолевую ДНК (далее в настоящем описании обозначенную как цоДНК). Кроме того, вкДНК, имеющая нестабильную двухспиральную структуру, может представлять собой вкДНК, происходящую из поврежденной последовательности нуклеиновой кислоты, которая не присутствует в нормальных клетках. По настоящему изобретению, поврежденная последовательность нуклеиновой кислоты, которая не присутствует в нормальных клетках, может содержать структурную аномалию, вызванную делецией, дупликацией, вставкой или транслокацией части гена. Кроме того, поврежденная последовательность нуклеиновой кислоты может содержать структурную аномалию, вызванную несовпадением части нуклеиновой кислоты, и может представлять собой однонуклеотидный вариант (SNV), вызванный мутацией частичной последовательности нуклеиновой кислоты. Поврежденная последовательность нуклеиновой кислоты может иметь мутантную последовательность по меньшей мере одного гена, выбранного из группы, состоящей из EGFR, KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA, ROS1, RET, c-Met, PTEN, RB1, AR, BRCA, KIT, FGFR, IDH, ESR1, HER2, ALK-EML4 и TMPRSS2-ERG.
Конкретно, поврежденная последовательность нуклеиновой кислоты, которая не присутствует в нормальных клетках, может быть вызвана любым из 1) расщепления одной цепи, 2) расщепления двойной цепи, 3) застревания репликативной вилки, 4) несовпадения нуклеиновой кислоты, 5) хромосомной аберрации, 6) внутрицепьевой сшивки, 7) межцепьевой сшивки, 8) вставки чужеродного гена, 9) делеции части гена, 10) замены части нуклеиновой кислоты, 11) вставки нуклеиновой кислоты, 12) формирования димера тимидина, 13) дезаминирования, 14) дупликации гена, 15) хромосомной транслокации или 16) недостаточности основания (участка AP). В частности, в клетках опухолей, двухцепочечный ДНК (дцДНК) часто является поврежденной, и поврежденная дцДНК может содержать специфическую структуру, обнаруженную в клетках опухолей. В частности, поврежденная последовательность нуклеиновой кислоты может иметь качающуюся пару оснований из-за несовпадения нуклеиновой кислоты.
В рамках изобретения, термин «зонд» относится к ДНК или РНК для детекции вкДНК-мишени. Зонд может иметь последовательность, сконструированную, чтобы являться способной к комплементарному связыванию с нестабильной вкДНК. В рамках изобретения, термин «зонд, имеющий последовательность, комплементарную вкДНК», относится к зонду, имеющему последовательность нуклеиновой кислоты, способную к специфическому связыванию с вкДНК, подлежащей детекции, которая имеет двухспиральную структуру-мишень и присутствует в плазме.
По настоящему изобретению, зонд можно получать двумя способами. Один представляет собой первый зонд (далее в настоящем описании обозначенный как CP), сконструированный, чтобы являться способным связываться с частью гена, где произошло повреждение, и другой представляет собой второй зонд (далее в настоящем описании обозначенный как DP), сконструированный, чтобы являться способным связываться с периферией поврежденной части. DP может быть сконструирован для специфического связывания с последовательностью в положении, на 10 п.о. - 100 п.о. или 20 п.о. - 50 п.о. удаленном от последовательности ДНК-мишени или области, где произошло повреждение.
По настоящему изобретению, идентифицировано, что поврежденную вкДНК можно эффективно детектировать не только, когда первый зонд и второй зонд используют в одно и то же время, но также когда первый зонд или второй зонд используют индивидуально. Кроме того, зонд может находиться в форме, с которой связано вещество, такое как биотин, таким образом, чтобы связывать маркер. Альтернативно, зонд может являться напрямую или посредством линкера связанным с маркером. По настоящему изобретению, маркер может представлять собой наночастицу, флуоресцентный краситель, флуоресцентный белок или фермент. Кроме того, зонд и маркер можно добавлять в одно и то же время, или можно добавлять последовательным образом.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, зонд, способный к комплементарному связыванию с вкДНК-мишенью, может специфически связываться с областью, содержащей последовательность, специфическую для каждого типа следующих клеток злокачественных опухолей. Например, последовательность, специфическая для рака яичника или рака молочной железы, может представлять собой SNP, присутствующий в экзоне 7 BRCA1, экзоне 10 BRCA1, экзоне 11 BRCA1 или экзоне 15 BRCA1. Кроме того, последовательность, специфическая для рака желудка, может представлять собой SNP, присутствующий в TP53, и последовательность, специфическая для колоректального рака, может представлять собой SNP, присутствующий в MSH2. Последовательность, специфическая для рака легкого, может представлять собой SNP, присутствующий в EGFR. Кроме того, последовательность, специфическая для рака печени, может быть выбрана из SNP, присутствующих в FGFR3.
[Таблица 1]
Ген
Тип злокачественной опухоли
Нормальная клетка
Клетка злокачественной опухоли
Экзон 7 BRCA1
Рак яичника/рак молочной железы
608:CAAAGTATGGGCTACAGAAACCGTGCCAAAAG (SEQ ID NO: 33)
608:CAAAGTATGGGCTTCAGAAACCGTGCCAAAAG (SEQ ID NO: 34)
Экзон 10 BRCA1
1615:TGGGAAAACCTATCGGAAGAAGGCAAGCCTCC (SEQ ID NO: 35)
1615:TGGGAAAACCTATCGGTAGAAGGCAAGCCTCC (SEQ ID NO: 36)
Экзон 11 BRCA1
3845:GGGGCCAAGAAA-TTAGAGTCCTCAGAAGAG (SEQ ID NO: 37)
3845:GGGGCCAAGAAAATTAGAGTCCTCAGAAGAG (SEQ ID NO: 38)
Экзон 15 BRCA1
7466:ATATACAGGATATGCGAATTAAGAAGAAACAAA (SEQ ID NO: 39)
7466:ATATACAGGATATGTGAATTAAGAAGAAACAAA (SEQ ID NO: 40)
TP53
Рак желудка
125:TAGGAGGCCGAGCTCTGTTGCTTCGAACTCCA (SEQ ID NO: 41)
125:TAGGAGGCCGAGCTCT-TTGCTTCGAACTCCA (SEQ ID NO: 42)
MSH2
Колоректальный рак
126:TGAGGAGGTTTCGACATGGCGGTGCAGCCGA (SEQ ID NO: 43)
126:TGAGGAGGTTTCGACCTGGCGGTGCAGCCGA (SEQ ID NO: 44)
EGFR
Рак легкого
2137:AAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTT (SEQ ID NO: 45)
2137:AAAAAGATCAAAGTGCTGAGCTCCGGTGCGTT (SEQ ID NO: 46)
FGFR3
Рак печени
1771:ATCCTCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAGAAAG (SEQ ID NO: 47)
1771:ATCCTCTCTCTGAAATCACTGCGCAGGAGAAAG (SEQ ID NO: 48)
В рамках изобретения, термин «выделенный биологический образец» относится к образцу мочи, слюны, спинномозговой жидкости, плевральной жидкости, асцитов, плазмы, крови, мокроты или жидкости организма, выделенному из организма человека. Выделенный биологический образец может представлять собой жидкий образец, выделенный из организма человека. По настоящему изобретению, плазма может быть получена из крови.
В рамках изобретения, термин «положительно заряженное вещество» относится к веществу, которое можно использовать в форме наночастицы, нанопроволоки, сетчатой структуры или фильтра. Однако, форма положительно заряженного вещества не является ограниченным этим. Вариант осуществления «положительно заряженного вещества» может представлять собой положительно заряженную нанопроволоку или положительно заряженную мембрану. Нанопроволоку можно получать с использованием проводящего полимера. Проводящий полимер может представлять собой любой полимер, выбранный из группы, состоящей из поли(ацетилена), поли(пиррола), поли(тиофена), поли(пара-фенилена), поли(3,4-этилендиокситиофена), поли(фениленсульфида), поли(пара-фениленвинилена) и полианилина. В зависимости от способов получения, длину и диаметр нанопроволоки можно надлежащим образом корректировать. В одном варианте осуществления, нанопроволока может иметь диаметр 200 нм и длину 18 мкм. Кроме того, в процессе получения можно изготовить нанопроволоку с содержанием биотина.
Поверхность нанопроволоки можно модифицировать с использованием катионного полимера. Тип катионного полимера не является ограниченным. Один вариант осуществления катионного полимера может представлять собой полиэтиленимин (PEI) или полилизин (PLL). Кроме того, катионный полимер может представлять собой катионный разветвленный полимер полиэтиленимин. Нанопроволока, модифицированная с использованием такого катионного полимера, может иметь положительно заряженную поверхность.
В одном варианте осуществления, положительно заряженная нанопроволока может успешно и эффективно связывать вкДНК даже при низкой концентрации. В частности, положительно заряженная нанопроволока может эффективно связывать вкДНК, благодаря таким своим характеристикам, как большая площадь поверхности для связывания с молекулой-мишенью, включая ДНК, и улучшенная подвижность, чтобы способствовать взаимодействию с ДНК.
В рамках изобретения, термин «маркер» относится к веществу для эффективной детекции вкДНК, имеющей нестабильную двухспиральную структуру, и может конкретно включать квантовую точку, вещество, которое вызывает деградацию конкретного субстрата и реакцию развития окраски, и вещество, которое вызывает люминесценцию при облучении светом определенной длины волны. Конкретно, маркер представляет собой флуоресцентный белок, и может представлять собой зеленый флуоресцентный белок (GFP), желтый флуоресцентный белок (YFP), красный флуоресцентный белок (RFP) или голубой флуоресцентный белок (CFP). Альтернативно, маркер может представлять собой вещество, такое как пероксидаза хрена (HRP), способное переводить любой субстрат, выбранный из группы, состоящей из ABTS, OPD, AmplexRed, DAB, AEC, TMB, гомованилиновой кислоты и люминола, в окрашивающее вещество.
Маркер может дополнительно содержать вещество, способное к связыванию с зондом. Конкретного, когда биотин связан с зондом, маркер может дополнительно содержать любой, выбранный из группы, состоящей из авидина, стрептавидина или их комбинации. В одном варианте осуществления, такой маркер можно использовать в форме наночастиц, с которыми связаны стрептавидин и HRP, где наночастицы состоят из проводящего полимера и гиалуроновой кислоты. По настоящему изобретению, проводящий полимер является таким, как описано выше, и может, предпочтительно, представлять собой полипиррол. В другом варианте осуществления, маркер можно использовать в форме наночастиц, с которыми связаны стрептавидин и флуоресцентный белок, где наночастицы состоят из проводящего полимера и гиалуроновой кислоты.
<Способ детекции нестабильной вкДНК>
В одном аспекте, настоящее изобретение относится к способу детекции нестабильной внеклеточной ДНК из образца без амплификации, включающему стадию перемешивания нестабильной вкДНК с зондом, с которым связан маркер.
Такая нестабильная вкДНК может представлять собой циркулирующую опухолевую ДНК (цоДНК), происходящую из опухоли. По настоящему изобретению, цоДНК может иметь поврежденную последовательность гена, как описано выше. Кроме того, цоДНК может являться выделенной из гена, экспрессия которого является высоко активной. По настоящему изобретению, образец может представлять собой биологический образец, и может представлять собой образец, выделенный из организма человека. Конкретно, образец может представлять собой мочу, спинномозговую жидкость, плазму, кровь, плевральную жидкость, асциты, слюну, мокроту или жидкость организма.
Таким образом, нестабильная вкДНК может отличаться от стабильной вкДНК, применительно к реакционной способности по отношению к зонду, во время стадии подвергания образца обработке в любых из следующих условий. Конкретно, обработку можно проводить в любом из условий, выбранных из i) условия оставления в течение 1-120 минут при комнатной температуре; ii) условия нагревания при 90°C - 95°C в течение 1 секунды - 3 минут; iii) условия нагревания при 75°C - 90°C в течение 1 секунды - 5 минут; iv) условия нагревания при 60°C - 75°C в течение 30 секунд - 30 минут; v) условия нагревания при 25°C - 40°C в течение 10 минут - 120 минут; vi) условия обработки протеазой в течение 1-30 минут; и vii) условия обработки ДНКазой в течение 1-30 минут. Зонд может содержать 15-членные - 30-членные нуклеотиды, или 20-членные - 25-членные нуклеотиды. По настоящему изобретению, зонд может быть сконструирован, чтобы является способным к комплементарному связыванию с последовательностью гена нестабильной вкДНК.
Когда стабильную вкДНК подвергают обработке в любом из вышеуказанных условий, стабильная вкДНК не подвергается денатурации и не связывается комплементарно с зондом, из-за сформированной в ней прочной двойной цепи. Однако, нестабильная вкДНК может связываться с зондом в случае подвергания обработке в любом из вышеуказанных условий. Такая нестабильность обусловлена тем фактом, что некоторые нуклеотиды в вкДНК не могут формировать комплементарное связывание, и таким образом, вкДНК имеет измененную двухспиральную структуру.
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу детекции вкДНК, имеющей нестабильную двухспиральную структуру, из образца без амплификации. По настоящему изобретению, способ включает a) стадию перемешивания образца, содержащего вкДНК, с положительно заряженным веществом; b) стадию выделения положительно заряженного вещества, с которым связана вкДНК; c) стадию перемешивания смеси с зондом и маркером; d) удаление зонда и маркера, не связанных с вкДНК; и e) детекцию маркера.
Конкретно, способ может включать стадию перемешивания образца, содержащего вкДНК, с положительно заряженным веществом.
Образец может представлять собой биологический образец, как описано выше. Вариант его осуществления может представлять собой плазму или мочу. В плазме или моче, вкДНК, имеющая нормальную двухспиральную структуру, и вкДНК, имеющая нестабильную двухспиральную структуру, могут присутствовать вместе. Кроме того, положительно заряженное вещество может конкретно представлять собой положительно заряженную нанопроволоку. Положительно заряженная нанопроволока является такой, как описано выше.
Вышеуказанные стадии можно конкретно проводить в следующем порядке и в следующих условиях. Сначала, немедленно после получения от пациента плазмы, мочи, слюны, мокроты или т.п., проводят центрифугирование при 4°C в течение 10 минут при 3000 × g. Затем, плазму, мочу, слюну, мокроту или т.п. от пациента разводят в DPBS в определенном соотношении. Затем, в случае плазмы, 30 мкл плазмы смешивают с 120 мкл дистиллированной воды (DW) и помещают в колонку для центрифугирования (типа G или типа Q). к этому добавляют полипиррольную (PEI/Ppy) нанопроволоку (20 мкл), поверхность которой модифицирована с использованием полиэтиленимина, и перемешивание проводят с использованием термосмесителя при комнатной температуре в течение 20 минут при скорости 12000 об./мин.
Затем, способ может включать стадию выделения положительно заряженного вещества, с которым связана вкДНК.
Способ выделения положительно заряженного вещества можно осуществлять посредством центрифугирования или приложения отрицательного давления, такого как вакуум. вкДНК связывается с положительно заряженным веществом. Таким образом, когда образец, смешанный с положительно заряженным веществом, помещают в колонку для центрифугирования или в вакуумную колонку, и проводят центрифугирование или прилагают отрицательное давление, положительно заряженное вещество, такое как нанопроволока, не проходит через фильтр в колонке, в то время как другие ингредиенты в биологическом образце проходят через фильтр. Таким образом, положительно заряженное вещество, с которым связана вкДНК, можно выделять посредством такого способа, как центрифугирование или вакуум. Кроме того, для удаления загрязнений из выделенной таким образом нанопроволоки, стадию промывки можно дополнительно проводить от одного до трех раз. Для промывки, общепринятый способ можно использовать соответствующим образом.
Вышеуказанные стадии можно конкретно проводить в следующем порядке и в следующих условиях. Колонку для центрифугирования устанавливают в устройство для приложения вакуума, и затем отсос проводят при 550 мбар (55 кПа). Для промывки, к этому добавляют 400 мкл 1 × DPBS, и отсос проводят снова. Такой же процесс можно повторять еще один раз.
В одном варианте осуществления, при проведении термической обработки, колонку для центрифугирования, отсос из которой завершен, можно помещать в нагревательный блок, предварительно нагретый до 95°C, инкубировать при 95°C в течение 1 минуты и затем немедленно извлекать оттуда. Образцы в условиях, не требующих стадии термической денатурации, можно не подвергать этому процессу.
Затем, способ может включать стадию перемешивания смеси с зондом и маркером.
Зонд может состоять из 15-членных - 30-членных нуклеотидов, или 20-членных - 25-членных нуклеотидов, как описано выше. Последовательность зонда может быть сконструирована, чтобы является способной к комплементарному связыванию с вкДНК, подлежащей детекции, которая имеет нестабильную двухспиральную структуру. В частности, вкДНК, имеющая нестабильную двухспиральную структуру, может представлять собой происходящую из опухоли цоДНК. Кроме того, вкДНК, имеющая нестабильную двухспиральную структуру может быть сконструирована, чтобы является способной к комплементарному связыванию с геном, известным как биомаркер злокачественной опухоли.
Кроме того, маркер может представлять собой вещество, такое как флуоресцентный белок или HRP, которое можно детектировать в конкретных условиях. По настоящему изобретению, маркер может содержать вещество, способное связываться с зондом. Конкретно, когда биотин является связанным с маркером, авидин или стрептавидин может связываться с маркером. В одном варианте осуществления, для увеличения чувствительности детекции, маркер может иметь форму наночастицы, в которой агрегированы несколько молекул HRP и несколько молекул стрептавидина.
Вышеуказанные стадии можно конкретно проводить в следующем порядке и в следующих условиях. Зонд (200 мкл) и раствор (200 мкл) HRP/STR наночастиц, подходящие для каждого эксперимента, соответственно, помещают в колонку для центрифугирования. Перемешивание проводят при комнатной температуре в течение 30 минут при скорости 850 об./мин - 1000 об./мин.
Затем, способ может включать стадию удаления зонда и маркера, не связанных с вкДНК.
Это представляет собой стадию удаления зонда, не связанного с вкДНК. 15-членный - 30-членный зонд также является отрицательно заряженным, и может связываться с положительно заряженной нанопроволокой. Таким образом, после завершения реакции смешивания, остаточный зонд и маркер необходимо удалить из реакционного раствора. По настоящему изобретению, зонд и маркер можно удалять посредством центрифугирования или с использованием отрицательного давления. По настоящему изобретению, вкДНК является сильно связанной с положительно заряженным веществом, конкретно, положительно заряженной нанопроволокой, по сравнению с короткоцепочечным зондом. На стадии удаления зонда и маркера, вкДНК является связанной с положительно заряженным веществом, и таким образом, не удаляется.
Варианты осуществления вышеуказанных стадий можно конкретно проводить в следующем порядке. После проведения вышеуказанной стадии, прилагают отрицательное давление к колонке для центрифугирования, и проводят отсос. Затем, к этому добавляют 400 мкл 1 × DPBS, и отсос проводят снова. Такой же процесс можно повторять еще один раз.
Наконец, способ может включать стадию детекции маркера.
Способ детекции маркера можно осуществлять по-разному, в зависимости от использованного маркера. Детекцию маркера можно измерять по изменению окраски, изменению поглощения УФ, изменению ответа флуоресценции или электрохимическому изменению. Например, когда HRP используют в качестве маркера, маркер можно детектировать посредством наблюдения реакции проявления окрашивания. Кроме того, когда маркер представляет собой флуоресцентный белок, такой как GFP, присутствие или отсутствие маркера можно детектировать посредством облучения маркера светом специфической длины волны, и затем наблюдения детектированного света.
Варианты осуществления вышеуказанных стадий можно конкретно проводить в следующем порядке. В колонку для центрифугирования последовательно добавляют 200 мкл буфера ацетата натрия (0,2 M, pH 7,0), 50 мкл TMB (10 мМ) и 50 мкл H2O2 (0,1 M). Затем инкубацию проводят в течение 3 минут. Затем, центрифугирование проводят в течение 30 секунд при скорости 3500 об./мин - 5000 об./мин. Раствор, собранный в пробирке для сбора, переносят в 96 лунок при 200 мкл на лунку, и затем поглощение в диапазоне длин волн 500 нм - 850 нм измеряют с использованием спектрофотометра УФ/видимого диапазона.
Кроме того, способ может дополнительно включать дополнительный способ обработки для увеличения различия реакционной способности, по отношению к зонду, вкДНК, имеющей нормальную двухспиральную структуру, и вкДНК, имеющей нестабильную двухспиральную структуру. Дополнительный способ обработки можно осуществлять после получения образца или после выделения вкДНК.
Кроме того, перед стадией c), способ может дополнительно включать стадию подвергания образца или вкДНК, связанных с положительно заряженным веществом, денатурации в любом из условий, выбранных из группы, состоящей из i) условия оставления при комнатной температуре в течение 1-10 минут; ii) условия нагревания при 90°C - 95°C в течение 1 секунды - 1 минуты; iii) условия нагревания при 75°C - 90°C в течение 10 секунд - 3 минут; iv) условия нагревания при 60°C - 75°C в течение 1-30 минут; v) условия нагревания при 25°C - 40°C в течение 5-60 минут; vi) условия обработки протеазой в течение 1-10 минут; и vii) условия обработки ДНКазой I в течение 1-10 минут. Такой способ денатурации не вынуждает стабильную вкДНК подвергаться денатурации, и вынуждает нестабильную вкДНК становиться более нестабильно денатурированной, так что нестабильная вкДНК может более легко связываться с зондом. Денатурацию в вышеуказанных условиях можно проводить после получения образца. Кроме того, денатурацию можно проводить после получения вкДНК, связанной с положительно заряженным веществом. Кроме того, температуру, протеазу и время обработки ДНКазой можно соответствующим образом корректировать, при условии, что стабильная вкДНК не подвергается денатурации.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, идентифицировано, что вкДНК, имеющую нестабильную двухспиральную структуру, подлежащую детекции, можно детектировать с использованием целевого зонда без отдельной стадии денатурации (фиг. 31). Кроме того, идентифицировано, что для вкДНК, имеющей стабильную двухспиральную структуру, и вкДНК, имеющей нестабильную двухспиральную структуру, все еще показывают различные реакции связывания с одним и тем же зондом, даже когда такую вкДНК подвергают способу термической обработки (фиг. 32 и 33).
<Способ получения информации для диагностики посредством детекции нестабильной вкДНК>
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу получения информации для диагностики или прогнозирования злокачественной опухоли и инфекционного заболевания посредством детекции вкДНК, имеющей нестабильную двухспиральную структуру, из образца без амплификации. По настоящему изобретению, способ включает a) перемешивание образца, содержащего вкДНК, с положительно заряженным веществом; b) выделение положительно заряженного вещества, с которым связана вкДНК; c) перемешивание смеси с зондом и маркером; d) удаление зонда и маркера, не связанных с вкДНК; e) детекцию маркера; и f) стадию определения того, что присутствует злокачественная опухоль или инфекционное заболевание, ассоциированные с геном, соответствующим вкДНК, имеющей нестабильную двухспиральную структуру, когда детектирован маркер. Конкретно, способ детекции нестабильной вкДНК является таким, как описано выше.
Вариант осуществления злокачественной опухоли, использованный по настоящему изобретению, может представлять собой любой вариант, выбранный из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, злокачественной опухоли кости, злокачественной опухоли клеток крови, рака молочной железы, меланомы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, злокачественной опухоли костного мозга, рака прямой кишки, рака горла, рака гортани, рака легкого, рака пищевода, рака поджелудочной железы, колоректального рака, рака желудка, рака языка, рака кожи, опухоли мозга, рака тела матки, рака головы или шеи, рака желчного пузыря, злокачественной опухоли полости рта, рака ободочной кишки, злокачественной опухоли перианальной области, опухоли центральной нервной системы, рака печени и колоректального рака. В частности, злокачественная опухоль может представлять собой рак желудка, колоректальный рак, рак печени, рак легкого или рак молочной железы.
В одном варианте осуществления, последовательность, специфически присутствующая в вышеуказанных клетках злокачественных опухолей, может представлять собой SNP, присутствующий в клетках злокачественных опухолей. В случае рака желудка, вариант осуществления последовательности, специфически присутствующей при злокачественной опухоли, может представлять собой мутации в p53 и PTEN, известных как гены супрессоров опухолей. Кроме того, в случае колоректального рака, вариант осуществления этого может представлять собой мутации в генах APC и MSH2. Кроме того, в случае рака печени, поскольку его главной причиной является инфекция вирусом гепатита B (HBV) или вирусом гепатита C (HCV), нуклеиновая кислота HBV или HCV может являться мишенью. Кроме того, в случае рака легкого, мутация в гене рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) может являться мишенью; и в случае рака молочной железы, мутация в гене BRCA1/2 может являться главной мишенью. Кроме того, в случае рака шейки матки, вкДНК, происходящая из ДНК папилломавируса человека (ДНК HPV) может являться мишенью.
Другой вариант осуществления нестабильной дцДНК может представлять собой по меньшей мере одну мутацию в гене, выбранном из группы, состоящей из EGFR, KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA, ROS1, RET, c-Met, PTEN, RB1, AR, BRCA, KIT, FGFR, IDH, ESR1, HER2, ALK-EML4 и TMPRSS2-ERG.
<Устройство для детекции нестабильной вкДНК>
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к устройству для детекции вкДНК, имеющей двухспиральную структуру, которая является нестабильной при комнатной температуре, содержащему a) модуль перемешивания для смешивания образца, содержащего вкДНК, с положительно заряженной нанопроволокой; b) модуль получения для удаления образца, исключая нанопроволоку, с которой связана вкДНК; c) модуль реакции для добавления, к нанопроволоке, с которой связана вкДНК, связанного с биотином зонда, способного к комплементарному связыванию с вкДНК, и наночастицы, содержащей стрептавидин и маркер; d) модуль детекции для детекции маркера; и e) модуль обработки информации для определения того, что образец содержит вкДНК, имеющую последовательность, комплементарную зонду для детекции, и имеющую двухспиральную структуру, которая является нестабильной при комнатной температуре, в соответствии с детекцией маркера.
<Диагностическое устройство с использованием детекции нестабильной вкДНК>
В другом аспекте, настоящее изобретение относится к устройству для получения информации для диагностики или прогнозирования злокачественной опухоли или инфекционного заболевания посредством детекции внеклеточной ДНК, имеющей нестабильную двухспиральную структуру из образца без амплификации. По настоящему изобретению, устройство содержит a) модуль перемешивания для смешивания образца, содержащего вкДНК, с положительно заряженной нанопроволокой; b) модуль получения для удаления образца, исключая нанопроволоку, с которой связана вкДНК; c) модуль реакции для добавления, к нанопроволоке, с которой связана вкДНК, связанного с биотином зонда, способного к комплементарному связыванию с вкДНК, и наночастицы, содержащей стрептавидин и маркер; d) модуль детекции для детекции маркера; и e) модуль обработки информации для определения того, что образец содержит вкДНК, имеющую последовательность, комплементарную зонду для детекции, и имеет двухспиральную структуру, которая является нестабильной при комнатной температуре, в соответствии с детекцией маркера.
Настоящее изобретение основано на различии в реакционной способности, применительно к зонду, стабильной вкДНК и нестабильной вкДНК, из-за различия в их термодинамической стабильности. По настоящему изобретению, положительно заряженная нанопроволока может связываться с геномной ДНК и вкДНК. Однако, геномная ДНК отделяется от положительно заряженной нанопроволоки при промывке, из-за ее различия в силе связывания и размере. Кроме того, в одном варианте осуществления, нанопроволока может быть изготовлена для содержания биотина, когда она модифицирована. Однако, в процессе модификации поверхности нанопроволоки с использованием полиэтиленимина, который представляет собой катионный полимер, биотин, содержащийся в нанопроволоке и экспонированный на поверхности нанопроволоки, связывается с катионным полимером. Кроме того, нанопроволока покрыта катионным полимером, и таким образом, маркер, содержащий стрептавидин, не связывается с нанопроволокой. Кроме того, поскольку зонд также является отрицательно заряженным, он может связываться с нанопроволокой, которая является положительно заряженной. Однако, обнаружено, что зонд удаляется в ходе процесса промывки из-за более слабой силы связывания, чем у вкДНК.
Кроме того, стабильную вкДНК и нестабильную вкДНК обрабатывали зондом (CP), способным к специфическому связыванию с областью, содержащей поврежденную последовательность ДНК, и зондом (DP), способным к специфическому связыванию с периферической областью, не содержащей поврежденную последовательность ДНК. В результате, являлось возможным идентифицировать различную реакцию связывания с зондом между вкДНК, имеющей нестабильную двухспиральную структуру, и вкДНК, имеющей стабильную двухспиральную структуру. По этим результатам, обнаружено, что вкДНК, имеющая нестабильную двухспиральную структуру, может связываться не только с зондом, специфическим для поврежденной последовательности ДНК, но также с зондом, способным к специфическому связыванию с его периферической последовательностью ДНК. Кроме того, подтверждено, что нестабильную вкДНК можно детектировать с использованием только одного из зондов.
Далее в настоящем описании, настоящее изобретение описано более подробно посредством следующих примеров. Однако, следующие примеры предназначены только для иллюстрации настоящего изобретения, и объем настоящего изобретения не ограничен только ими.
I. Экспериментальные способы, и получение нанопроволоки, маркеров и зондов
Экспериментальный способ 1. Способ детекции нестабильной вкДНК
Стадия 1: Получение образца и добавление нанопроволоки
Немедленно после получения от пациента плазмы, мочи, слюны, мокроты или т.п., проводили центрифугирование при 4°C в течение 10 минут при 3000 × g. Плазму, мочу, слюну, мокроту или т.п. от пациента разводили в DPBS в определенном соотношении. В случае плазмы, 30 мкл плазмы смешивали с 120 мкл DW и помещали в колонку для центрифугирования (типа G или типа Q). К этому добавляли PEI/Ppy нанопроволоку (20 мкл), и перемешивание проводили с использованием термосмесителя при комнатной температуре в течение 20 минут при скорости 1200 об./мин.
Стадия 2: Вакуум/промывка/термическая денатурация
Колонку для центрифугирования устанавливали в устройство для вакуум-отсоса, и затем отсос проводили при 550 мбар (55 кПа). К этому добавляли 400 мкл 1 × DPBS, и отсос проводили снова. Такой же процесс повторяли еще один раз. Только комплексы нанопроволока-ДНК, полученные посредством 2-стадийного способа, захватывались в колонке для центрифугирования. При необходимости термической денатурации, колонку для центрифугирования, отсос из которой завершен, помещали в нагревательный блок, предварительно нагретый до 95°C, инкубировали при 95°C в течение 1 минуты, и затем немедленно извлекали оттуда. Образцы, не требующие стадии термической денатурации, не подвергали этому процессу.
Стадия 3: Добавление зондов и HRP/STR NP
Зонд (200 мкл) и раствор (200 мкл) HRP/STR NP, подходящих для каждого эксперимента, помещали, соответственно, в колонки для центрифугирования. Перемешивание проводили с использованием термосмесителя при комнатной температуре в течение 30 минут при скорости 850 об./мин - 1000 об./мин. Колонку для центрифугирования устанавливали в вакуумное устройство, и затем проводили отсос. К этому добавляли 400 мкл 1 × DPBS, и отсос проводили снова. Такой же процесс повторяли еще один раз.
Стадия 4: Ответ TMB для детекции мутации в гене
После замены пробирки для сбора на новую пробирку, 200 мкл буфера ацетата натрия (0,2 M, pH 7,0) и 50 мкл H2O2 (0,1 M) последовательно добавляли в колонку для центрифугирования с использованием шприцевого насоса. Затем инкубацию проводили в течение 3 минут. В конце инкубации, колонку для центрифугирования центрифугировали в течение 30 секунд при скорости 3500 об./мин - 5000 об./мин. Раствор, собранный в пробирке для сбора, переносили в 96 лунок при 200 мкл на лунку, и затем поглощение в диапазоне длин волн 500 нм - 850 нм измеряли с использованием спектрофотометра УФ/видимого диапазона.
Пример получения 1. Получение положительно заряженной нанопроволоки
-3
-4
Как проиллюстрировано на фиг. 1, получали нанопроволоку, имеющую поверхность, с которой конъюгирован полиэтиленимин (PEI), в качестве катионного полимера. Одну сторону анодного оксида алюминия (AAO) покрывали слоем золота (Au) (имеющим толщину приблизительно 150 нм) при 5 × 10 мбар (5 × 10 кПа) и 50 мА в течение 600 секунд, с использованием модульной покрывающей системы Q150T (Quorum Technologies, UK). Во всех электрохимических экспериментах, измерение проводили с использованием покрытой золотом (Au) матрицы AAO с использованием потенциостата/гальваностата (BioLogic SP-150), оборудованного противоэлектродом из платиновой проволоки и электродом сравнения Ag/AgCl (типа 3,0 M NaCl).
Для получения нанопроволоки (PEI/Ppy NW), поверхность которой обработана катионным полимером, электрохимическое осаждение проводили посредством проведения, в порах матрицы AAO, хроноамперометрии в течение 7 минут при 1,0 В (против Ag/AgCl) вместе с 0,01 M раствором пиррола, содержащим 0,01 M поли(4-стиролсульфоновой кислоты) и 1 мг/мл биотина.
Полученную матрицу AAO промывали несколько раз дистиллированной водой, погружали в раствор 2 M гидроксида натрия (NaOH) на 3 часа, и затем помещали в Bioruptor UCD-200 (Diagenode) для обработки ультразвуком, так что получали свободно располагающуюся Ppy NW, легированную молекулами биотина. Затем, к полученной нанопроволоке добавляли 30 мМ гидрохлорида N-(3-диметиламинопропил)-N-этилкарбодиимида (EDC) и 6 мМ N-гидроксисукцинимида (NHS), так что активировали группы карбоновой кислоты (-COOH). Затем, после добавления раствора PEI, реакции позволяли проходить при комнатной температуре в течение 1 часа и проводили промывку водой. Наноструктуры (PEI/Ppy NW), имеющие поверхность, с которой конъюгирован полиэтиленимин, диспергировали в деионизированной воде и хранили при комнатной температуре до использования.
При этом способе получения, после избирательного растворения матрицы AAO, каждую полипирроловую (Ppy) нанопроволоку освобождали от матрицы AAO, и катионный разветвленный полиэтиленимин (PEI) (25 кДа), кроме того, конъюгировали с нанопроволокой посредством взаимодействия биотин-стрептавидин.
Пример получения 2. Получение наночастиц (PEI/Ppy NP), поверхность которых обработана катионным полимером
3
Для получения наночастиц (PEI/Ppy NP), имеющих поверхность, с которой конъюгирован полиэтиленимин, 0,2 г поливинилпирролидона (PVP) добавляли к 12,5 мл трижды дистиллированной воды и перемешивали в течение 30 минут. Затем, к этому добавляли 65 мкл пиррола, и затем полученный продукт дополнительно перемешивали в течение 10 минут. Затем к этому добавляли 0,5 мл раствора FeCl в концентрации 0,75 г/мл, и реакции позволяли проходить в течение 10 минут. Затем к этому добавляли 20 мл водного раствора гиалуроновой кислоты (400 мг/20 мл), и полученный продукт перемешивали в течение 3 часов.
Диализ проводили против трижды дистиллированной воды в течение 2 суток с использованием мембраны, имеющей размер пор 50000 MWCO. Центрифугирование проводили при 1200 об./мин в течение 3 минут для удаления агрегатов частиц большого размера, и затем полученный продукт лиофилизировали. 200 мкг Ppy-HA-NP добавляли к 1 мл трижды дистиллированной воды. Затем к этому добавляли раствор 100 мМ EDC/50 мМ NHS, и реакции позволяли проходить в течение 45 минут, так что активировались карбоксильные группы гиалуроновой кислоты. Центрифугирование проводили при 15000 об./мин в течение 10 минут для удаления супернатанта, во время которого промывку проводили дважды.
Затем, 100 мг/мл раствора PEI (растворитель: 0,2 M бикарбонат натрия) добавляли к этому, и реакции позволяли проходить в течение ночи при 4°C. Затем, центрифугирование проводили при 15000 об./мин в течение 10 минут для удаления супернатанта, и затем полученный продукт хранили в трижды дистиллированной воде. Форму наночастиц (PEI/Ppy NP), имеющих поверхность, с которой конъюгирован полиэтиленимин, наблюдали с использованием сканирующей электронной микроскопии. Как проиллюстрировано на фиг. 6A, форму наночастиц (NP), имеющих средний размер 50 нм, с которыми конъюгирован PEI, проверяли с использованием изображения при сканирующей электронной микроскопии (масштабная линейка 200 мкм).
Пример получения 3. Получение полипирроловых наночастиц, меченных HRP и стрептавидином
3
Для получения наночастиц, содержащих HRP и стрептавидин, 0,5 г поливинилпирролидона (PVP) добавляли к 12,5 мл трижды дистиллированной воды и перемешивали в течение 30 минут. Затем, к этому добавляли 65 мкл пиррола, и полученный продукт дополнительно перемешивали в течение 10 минут. Затем, к этому добавляли 0,5 мл раствора FeCl в концентрации 0,75 г/мл, и реакции позволяли проходить в течение 3 часов. Затем, к этому добавляли 20 мл водного раствора гиалуроновой кислоты (400 мг/20 мл), и полученный продукт перемешивали в течение 3 часов.
Диализ проводили против трижды дистиллированной воды в течение 2 суток с использованием мембраны, имеющей размер пор 50000 MWCO. Центрифугирование проводили при 1200 об./мин в течение 3 минут для удаления агрегатов частиц большого размера, и затем полученный продукт лиофилизировали. 200 мкг Ppy-HA-NP, содержащих полипиррол и гиалуроновую кислоту, добавляли к 1 мл трижды дистиллированной воды. Затем, к этому добавляли раствор 100 мМ EDC/50 мМ NHS, и реакции позволяли проходить в течение 45 минут так что активировались карбоксильные группы гиалуроновой кислоты. Центрифугирование проводили при 15000 об./мин в течение 10 минут для удаления супернатанта, во время которого промывку проводили дважды. 1 мг HRP и 1 мг стрептавидина добавляли к Ppy-HA-NP и перемешивали при температуре 4°C. Затем, центрифугирование проводили при 15000 об./мин в течение 10 минут для удаления супернатанта, и затем полученный продукт хранили в трижды дистиллированной воде. Форму наночастиц (HRP/стрепт.-меченных NP), имеющих поверхность, с которой конъюгированы HRP и стрептавидин, наблюдали с использованием сканирующей электронной микроскопии (фиг. 4).
Пример получения 4. Получение зондов
Зонды получали для детекции вкДНК, имеющей нестабильную двухспиральную структуру. Зонды получали по-разному, в зависимости от вкДНК, подлежащей детекции. По настоящему изобретению, зонды получали в форме, в которой биотин связан с ними. Зонды получали в форме двух типов, то есть, первый зонд (далее в настоящем описании обозначенный как CP), комплементарно связывающийся с областью, содержащей поврежденную ДНК, вызывающую нестабильную двухспиральную структуру, и второй зонд (далее в настоящем описании обозначенный как DP), комплементарно связывающийся с периферической областью поврежденной ДНК.
II. Детекция вкДНК с использованием двух зондов
Пример 1. Анализ происходящей из HPV вкДНК, присутствующей в моче
Для выделения внеклеточной ДНК HPV из образца мочи, 10 мкг/мл нанопроволоки (PEI/Ppy NW), поверхность которой обработана катионным полимером, полученной в примере 1, добавляли к 200 мкл мочи от положительного по HPV пациента, и перемешивание проводили при комнатной температуре в течение 30 минут. Выделенную вкДНК денатурировали при 95°C в течение 1 минуты. Затем, первый зонд (CP) и второй зонд (DP), имеющие биотин, связанный с их концами, добавляли к этому при 1 пМ, и реакции позволяли проходить при 37°C в течение 1 часа. Затем, полипирроловые наночастицы (далее в настоящем описании обозначенные как HRP/стрепт.-меченные NP), меченные пероксидазой хрена (HRP) и стрептавидином, добавляли к образцу, и инкубацию проводили при 37°C в течение 30 минут.
Затем, к происходящей из HPV вкДНК добавляли 25 мкл 10 мМ 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB), 25 мкл 0,1 M H2O2 и 200 мкл буфера 0,2 M тригидрата ацетата натрия (pH 5,0). Реакции позволяли проходить, вместе с образцом ДНК, при комнатной температуре в течение 3 минут в темноте. Для идентификации корреляции между концентрацией ДНК HPV и поглощением, детекцию в УФ-видимой области спектра проводили при длине волны 652 нм с использованием DU 730 спектрофотометра в УФ-видимой области спектра (Beckman Coulter, USA).
В результате, являлось возможным идентифицировать результаты, полученные посредством усиления колориметрических сигналов в такой степени, что колориметрические сигналы можно наблюдать визуально. Последовательности зондов для детекции HPV показаны в таблице 2 ниже.
[Таблица 2]
Обозначение зонда
Последовательности
SEQ ID NO
HPV 16CP
5'-биотин-GAG GAG GAG GAT GAA ATA GAT GGT-3'
SEQ ID NO: 1
HPV 16DP
5'-TTG GAA GAC CTG TTA ATG GGC-биотин-3'
SEQ ID NO: 2
HPV 18CP
5'-биотин-CAC ATT GTG GCA CAA TCT TTT A-3'
SEQ ID NO: 3
HPV 18DP
5'-GCC ATA TCG CTT TCA TCT GT-биотин-3'
SEQ ID NO: 4
делеция 19 EGFR CP
5'-GGAATTAAGAGAAGCAACATCTCC-3'
SEQ ID NO: 5
делеция 19 EGFR DP
5'-AACCTCAGGCCCACCTTTT-3'
SEQ ID NO: 6
EGFR 21 L858R CP
5'-CCAGGAACGTACTGGTGAAAA-3'
SEQ ID NO: 7
EGFR 21 L858R DP
5'-GGAAGAGAAAGAATACCATGCA-3'
SEQ ID NO: 8
Кроме того, колориметрический анализ без ПЦР проводили для оценки образцов мочи положительных по HPV пациентов c раком шейки матки (HPV16(+) и HPV18(+)) и отрицательного по HPV здорового контрольного субъекта (HPV-). В качестве отрицательного контроля, использовали PBS. В результате, как проиллюстрировано на фиг. 12, ДНК-мишень HPV, выделенную с использованием нанопроволоки, смешивали с CP и DP, и к этому добавляли HRP/стрепт.-меченные NP. Затем, наблюдали изменение окраски. Денатурацию проводили при 95°C в течение 1 минуты для анализа выделенной вкДНК.
Всего 24 положительных по HPV и отрицательных по HPV образцов мочи собирали и тестировали. В результате, идентифицировано, что вкДНК, выделенные из мочи положительных по HPV пациентов c раком шейки матки (HPV16(+) и HPV18(+)), и отрицательного по HPV здорового контрольного субъекта (HPV-), имели различные значения поглощения (фиг. 13). По настоящему изобретению, использовали зонды, специфически связывающиеся с HPV16 или HPV18, и денатурацию проводили при 95°C в течение 1 минуты для анализа выделенной вкДНК.
Кроме того, реакции не наблюдали, когда использовали не относящиеся к HPV зонды, такие как EGFR 19 и EGFR 21; и обнаружено, что изменение окраски и изменение поглощения УФ возникали в результате типоспецифического связывания между мишенью HPV и комплементарным ей зондом (фиг. 14). По настоящему изобретению, денатурацию проводили при 95°C в течение 1 минуты для анализа выделенной вкДНК.
Пример 2. Идентификация мутации гена EGFR посредством анализа ДНК линии клеток рака легкого
Пример 2.1. Идентификация размера вкДНК, которая может быть получена посредством нанопроволоки
Лестницы маркеров ДНК низкого диапазона (10 п.о. - 100 п.о.), среднего диапазона (100 п.о. - 2 т.п.о.) и высокого диапазона (3,5 т.п.о. - 21 т.п.о.) добавляли к плазме нормальных субъектов, и затем эффективность связывания проверяли с использованием нанопроволоки (PEI/Ppy NW). Идентифицировали, что наноструктуры являются эффективными для связывания ДНК малого размера (фиг. 15).
С использованием нанопроволоки, гены получали из H1975 (линии клеток с мутациями в генах T790M в экзоне 20 EGFR, 21 L858R), HCC2279 (линии клеток с мутацией в гене делецией экзона 19 EGFR) и линии клеток A549 (линии клеток без мутации в гене в экзоне EGFR). Затем, геномные ДНК (гДНК), которые не подвергали обработке ультразвуком, и фрагментированные ДНК (фрДНК), которые подвергали обработке ультразвуком, использовали для сравнения эффективности связывания с наноструктурами. В результате, идентифицировано, что когда использовали наноструктуры, более высокую эффективность связывания наблюдали для фрДНК, чем для гДНК (фиг. 16 и 17).
Пример 2.2. Детекция мутации EGFR посредством анализа нестабильной вкДНК
Колориметрический анализ без ПЦР проводили для выделения гДНК и фрДНК, с использованием наноструктур, из положительной по экзону 20, 21 EGFR линии клеток H1975, положительной по экзону 19 EGFR линии клеток HCC2279 и линии клеток A549 без мутации в гене EGFR. Затем, к этому добавляли зонды для экзона 19, 20 и 21 EGFR, и проводили перемешивание. Затем, к этому добавляли HRP/стрепт.-меченные NP, и наблюдали изменения окраски. В результате, являлось возможным идентифицировать, что наноструктуры являлись намного более эффективными для связывания ДНК малого размера, то есть, фрДНК, и что присутствовали явное изменение окраски и изменение УФ-видимой области спектра, по сравнению с гДНК (фиг. 18 и 19).
Пример 2.3. Детекция cfFNA с использованием флуоресцентных красителей
Для идентификации того, можно ли мутации в генах детектировать по образцам плазмы пациентов с раком легкого с использованием целевых зондов, такую возможность исследовали с использованием флуоресцентного красителя. H1975 (линию клеток с мутациями в генах T790M в экзоне 20 EGFR, 21 L858R), HCC2279 (линия клеток с мутацией в гене делецией экзона 19 EGFR), и линию клеток A549 (линию клеток без мутации в гене в экзоне EGFR) подвергали обработке ультразвуком, и затем полученные ДНК (фрДНК) связывали посредством нанопроволоки. Затем, фрДНК денатурировали при 95°C в течение 1 минуты, и затем смешивали с зондами, специфическими для EGFR19, 20 и 21. Мутации в генах для линий клеток проверяли с использованием флуоресцентного красителя (Alexa488), связанного с зондами.
В результате, в линии клеток A549, флуоресценцию не детектировали при реакции с зондами для EGFR 19 и 21. Однако, являлась возможной детекция флуоресценции, применительно к зондам для EGFR 19 и 20, в H1975 и HCC2279 (фиг. 20).
in vitro
Пример 2.4. Идентификация предела детекции (LOD) для мутации в гене EGFR посредством анализа вкДНК
H1975 (линию клеток с мутациями в генах T790M в экзоне 20 EGFR, 21 L858R) и HCC2279 (линию клеток с мутацией в гене делецией экзона 19 EGFR) подвергали обработке ультразвуком, и затем полученные фрагментированные ДНК в различных концентрациях (фрДНК; 1 аг мл-1-100 нг мл-1) добавляли к плазме (200 мкл) здоровых людей. Затем, фрДНК связывали посредством нанопроволоки. Затем, денатурацию проводили при 95°C в течение 1 минуты, и затем предел детекции (LOD) проверяли с использованием зондов, специфических для дел. экзона 19 EGFR и T790M в экзоне 20 EGFR, и HRP/стрепт.-меченных NP. В результате, идентифицировано, что когда использовали соотношение сигнала к шуму 3 раза, фрДНК из линии клеток HCC2279 поддавалась детекции вплоть до 10 аг мл-1, и фрДНК из линии клеток H1975 поддавалась детекции вплоть до 100 аг мл-1 (фиг. 21 и 22).
Пример 3. Идентификация мутаций в генах EGFR, KRAS и ALK-EML4 посредством анализа вкДНК, присутствующей в образцах плазмы или спинномозговой жидкости: пациенты с раком легкого
Пример 3.1. Идентификация мутаций в гене EGFR посредством анализа нестабильной вкДНК
В одном варианте осуществления, всего 60 минут было необходимо для выделения вкДНК из образца жидкости организма от пациентов с злокачественными опухолями с использованием наноструктуры, и для детекции мутаций в генах посредством гибридизации с зондами и последующего связывания с HRP/стрепт.-меченными наночастицами (фиг. 6).
Для выделения вкДНК из образца плазмы или спинномозговой жидкости, 200 мкл плазмы положительного по EGFR пациента и 5 мкг/мл PEI/Ppy NW смешивали при комнатной температуре в течение 30 минут для выделения вкДНК из плазмы пациента. Размер вкДНК, выделенной, с использованием PEI/Ppy NW, из 200 мкл плазмы пациента с раком легкого анализировали посредством Bioanalyzer (фиг. 23). Как правило, подобно тому факту, что ассоциированная с злокачественной опухолью вкДНК, как известно, имеет средний размер 166 п.о., идентифицировано, что в результате выделения вкДНК из плазмы пациента с раком легкого с использованием PEI/Ppy NW в настоящем эксперименте в Bioanalyzer, пик наблюдали при 169 п.о.
Затем, ДНК, связанную с наноструктурой, денатурировали при 95°C в течение 1 минуты, к этому добавляли связанный с биотином CP и связанный с биотином DP при 1 пМ, и реакции позволяли проходить при 37°C в течение 1 часа. Затем полипирроловые наночастицы (HRP/стрепт.-меченные NP), меченные HRP и стрептавидином, добавляли к образцу, и реакции позволяли проходить при 37°C в течение 30 минут.
Затем, в реакционный раствор добавляли 25 мкл 10 мМ TMB, 25 мкл 0,1 M H2O2, и 200 мкл буфера 0,2 M тригидрата ацетата натрия (pH 5,0). Затем, свет блокировали и реакции позволяли проходить при комнатной температуре в течение 3 минут. Затем, детекцию в УФ-видимой области спектра проводили при длине волны 652 нм с использованием спектрофотометра в УФ-видимой области спектра DU 730 (Beckman Coulter, USA).
Различие окраски, вызванное реакцией окисления TMB, наблюдали визуально. Последовательности зондов для связывания и детекции мутантной вкДНК с делецией экзона 19 EGFR, 20 T790M и 21 L858R, показаны в таблице 3 ниже.
[Таблица 3]
EGFR
Последовательности зондов
Делеция экзона 19 EGFR-зонд 1 (специфический для мишени)
CP1: GGAATTAAGAGAAGCAACATCTCC(SEQ ID NO: 9)DP: AACCTCAGGCCCACCTTTT(SEQ ID NO: 10)
Делеция экзона 19 EGFR-зонд 2 (не специфический для мишени)
CP2: AAAATTCCCGTCGCTATCAAG(SEQ ID NO: 11)DP: AACCTCAGGCCCACCTTTT(SEQ ID NO: 12)
Делеция экзона 19 EGFR-зонд 3 (не специфический для мишени)
CP3: GGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAG(SEQ ID NO: 13)DP: AACCTCAGGCCCACCTTTT(SEQ ID NO: 14)
T790M в экзоне 20 EGFR-зонд 1 (не специфический для мишени)
CP1: CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC(SEQ ID NO: 15)DP: GCAAGAGTTTGCCATGGGGATATG(SEQ ID NO: 16)
T790M в экзоне 20 EGFR-зонд 2 (специфический для мишени)
CP2: CCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCA(SEQ ID NO: 17)DP: GCAAGAGTTTGCCATGGGGATATG(SEQ ID NO: 18)
T790M в экзоне 20 EGFR-зонд 3 (не специфический для мишени)
CP3: GAAGCCTACGTGATGGCCAGCGT(SEQ ID NO: 19)DP: GCAAGAGTTTGCCATGGGGATATG(SEQ ID NO: 20)
L858R в экзоне 21 EGFR-зонд 1 (не специфический для мишени)
CP1: CCAGGAACGTACTGGTGAAAA(SEQ ID NO: 21)DP: GGAAGAGAAAGAATACCATGCA(SEQ ID NO: 22)
L858R в экзоне 21 EGFR-зонд 2 (специфический для мишени)
CP2: AAG ATC ACA GAT TTT GGG CGG G(SEQ ID NO: 23)DP: GGAAGAGAAAGAATACCATGCA(SEQ ID NO: 24)
L858R в экзоне 21 EGFR-зонд 3 (не специфический для мишени)
CP3: GGC ATG AAC TAC TTG GAG GAC CGT(SEQ ID NO: 25)DP: GGAAGAGAAAGAATACCATGCA(SEQ ID NO: 26)
В этом эксперименте, если не указано иное, делеция экзона 19 EGFR-зонд 1 (специфический для мишени), T790M в экзоне 20 EGFR-зонд 2 (специфический для мишени), и L858R в экзоне 21 EGFR-зонд 2 (специфический для мишени) использовали в качестве CP и DP. В результате, идентифицировано, что выделенная вкДНК с мутантным EGFR была специфически детектирована, в зависимости от зонда для детекции (фиг. 24 и 25). Идентифицировали, что когда вкДНК, связанную из плазмы пациента с раком легкого, с мутацией в гене делецией экзона 19 EGFR, 20 T790M или 21 L858R подвергали реакции, соответственно, с зондом, нацеленным на делецию экзона 19 EGFR, 20 T790M или 21 L858R, и HRP/стрептавидин-связанными наночастицами (NP), когда использовали зонд, нацеленный на ту же мутацию в гене, что и в ткани пациента, показывали изменение окраски и изменение УФ-видимой области спектра (фиг. 24).
Кроме того, вкДНК, связанную от пациента с раком легкого, с другой мутацией EGFR, подвергали реакции с теми же зондами, нацеленными на EGFR 19, 20 и 21. В результате, идентифицировано, что когда использовали зонд, нацеленный на ту же мутацию в гене, что и в ткани пациента, показывали изменение окраски и изменение УФ-видимой области спектра (фиг. 25).
Пример 3.2. Идентификация мутаций в генах KRAS и ALK-EML4 посредством анализа вкДНК
Кроме того, подобно EGFR, для анализа мутаций в генах KRAS и ALK-EML4, вкДНК выделяли из образца плазмы или спинномозговой жидкости, и затем связанную ДНК денатурировали при 95°C в течение 1 минуты. Связанный с биотином CP и связанный с биотином DP добавляли к этому при 1 пМ, и реакции позволяли проходить при 37°C в течение 1 часа. Затем полипирроловые наночастицы, меченные HRP и стрептавидином, добавляли к образцу, и реакции позволяли проходить при 37°C в течение 30 минут.
В результате, являлось возможным идентифицировать, что вкДНК, выделенная из плазмы пациента с раком легкого, с мутацией в экзоне 2 гена KRAS и мутацией слитого гена ALK-EML4, вступала в реакцию с зондом для экзона 2 KRAS и зондом для ALK-EML4, и таким образом, показали изменение окраски и поглощения УФ, совпадающее с тканью пациента (фиг. 26-28). Последовательности зондов (CP и DP) для детекции вкДНК с мутацией в экзоне 2 KRAS (фиг. 26 и 27) и вариантами 1 и 3 ALK-EML4 (фиг. 28) показаны в таблице 4 ниже.
[Таблица 4]
EGFR
Последовательности зондов
экзон 2 KRAS-зонд
CP1: AAATGACTGAATATAAACTTG (SEQ ID NO: 27)DP: GAGTGCCTTGACGATACAGCT (SEQ ID NO: 28)
ALK-EML4 вариант 1-зонд
CP2: TAGAGCCCACACCTGGGAAA (SEQ ID NO: 29)DP: CGGAGCTTGCTCAGCTTGTA (SEQ ID NO: 30)
ALK-EML4 вариант 3-зонд
CP3: GCATAAAGATGTCATCATCAACCAAG (SEQ ID NO: 31)DP: CGGAGCTTGCTCAGCTTGTA (SEQ ID NO: 32)
Пример 3.3. Идентификация неспецифической реакции посредством термической денатурации
Каждый из трех типов зондов (то есть, включая специфические для мишени или не специфические для мишени зонды) в таблице 3 добавляли к плазме пациентов с раком легкого, с мутациями в генах делецией экзона 19 EGFR и 20 T790M, и проводили перемешивание. В результате, после денатурации ДНК при 95°C в течение 1 минуты, для всех использованных зондов (то есть, независимо от того, является ли зонд специфическим для мишени или не специфическим для мишени) показаны изменения окраски и поглощения УФ только для делеции экзона 19 EGFR и 20 T790M, сходные с тканью, что делает возможным идентификацию специфических мутаций в генах (фиг. 29). Однако, для экзона 21 EGFR, изменения окраски и поглощения УФ не наблюдали, независимо от типа зонда. Это позволяет предполагать, что нестабильная вкДНК вступает в реакцию с зондами, специфическими для мутаций в экзоне 19 EGFR и экзоне 20 EGFR, и это позволяет анализ мутаций в генах.
Кроме того, вкДНК получали из плазмы пациентов с раком легкого без мутаций в гене EGFR. После денатурации при 95°C в течение 1 минуты и 10 минут, соответственно, проверяли связывание между зондами, специфическими для мутаций в EGFR 19, 20 и 21, и нестабильной вкДНК. В результате, в случае денатурации при 95°C в течение 1 минуты, изменение окраски и изменение поглощения УФ не наблюдали для пациента с раком легкого без мутаций в гене EGFR. Однако, в случае денатурации при 95°C в течение 10 минут, изменение окраски и изменение поглощения УФ в результате неспецифической гибридизации поддавались наблюдению для всех зондов для экзона 19, 20 и 21 EGFR (фиг. 30).
Кроме того, вкДНК связывали, посредством нанопроволоки, из плазмы других пациентов с раком легкого с мутациями в генах делецией 19 EGFR и 20 T790M, и нормальных субъектов. Затем, посредством денатурации при 95°C в течение 0, 1 и 10 минут, соответственно, проверяли их способность к реакции гибридизации с зондами для EGFR 19, 20 и 21. В результате, как проиллюстрировано на фиг. 31-33, в случае нормальных субъектов без мутаций в гене EGFR, изменение окраски и изменение поглощения УФ не наблюдали с использованием денатурации при 95°C в течение 0 минут (фиг. 31) и 1 минуты (фиг. 32), соответственно. Однако, посредством денатурации при 95°C в течение 10 минут (фиг. 33), изменение окраски и изменение поглощения УФ в результате неспецифической гибридизации наблюдали для всех зондов для экзона 19, 20 и 21 EGFR. Таким образом, идентифицировано, что мутации в генах в вкДНК можно анализировать без денатурации.
Пример 4. Идентификация точности способа детекции нестабильной вкДНК посредством анализа образцов от пациентов с раком легкого
В одном варианте осуществления настоящего изобретения, идентифицировано, что результаты, полученные посредством анализа специфичности и чувствительности для мутаций в генах в вкДНК, полученной из плазмы 151 пациентов с раком легкого, совпадали с результатами для мутаций в генах в ткани злокачественных опухолей пациентов (фиг. 34). Зонд, специфический для дел. экзона 19 EGFR добавляли к вкДНК пациентов с раком легкого (EGFR дикого типа) без мутаций в EGFR, пациентов с раком легкого с делецией экзона 19 EGFR (дел.) и пациентов с раком легкого с L858R в экзоне 21 EGFR, и образовавшиеся мутации в генах проверяли посредством анализа значений поглощения УФ-спектра (ΔOD, 500 нм - 650 нм). В результате, идентифицировано, что для полученных результатов показано 98,4% совпадение с результатами для мутаций в генах в ткани злокачественных опухолей пациентов (фиг. 35 и 36).
Кроме того, зонд для L858R в экзоне 21 EGFR добавляли к вкДНК пациентов с раком легкого без мутаций в EGFR, пациентов с раком легкого с делецией экзона 19 EGFR (дел.) и пациентов с раком легкого с L858R в экзоне 21 EGFR, и образовавшиеся мутации в генах проверяли посредством анализа значений поглощения УФ-спектра (ΔOD, 500 нм - 650 нм). В результате, идентифицировано, что для полученных результатов показано 98,0% совпадение с результатами для мутаций в генах в ткани злокачественных опухолей пациентов (фиг. 37 и 38).
Пример 5. Детекция вкДНК с использованием положительно заряженных наночастиц
Подобно вышеописанному эксперименту для EGFR, для выделения вкДНК из образца плазмы пациента с раком легкого, имеющего мутацию в гене делецию 19 EGFR (дел.), связанные с PEI наночастицы (PEI-Ppy NP, 5 мкг/мл), полученные в примерах получения, добавляли к 200 мкл плазмы положительного по EGFR пациента, и перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем связанную ДНК либо не денатурировали, либо денатурировали при 95°C в течение 1 минуты. Затем связанный с биотином CP и связанный с биотином DP добавляли к этому при 1 пМ, и инкубацию проводили при 37°C в течение 30 минут. Затем, HRP/стрепт.-меченные NP добавляли к образцу, и реакции позволяли проходить при 37°C в течение 15 минут. Идентифицировали, что изменение поглощения в УФ-видимой области спектра наблюдали только для зонда, специфического для EGFR 19, в результате реакции окисления TMB (фиг. 39).
Пример 6. Идентификация мутаций в гене EGFR посредством анализа вкДНК, присутствующей в плазме
С использованием линии клеток H1975 (с мутациями в генах T790M в экзоне 20 EGFR и 21 L858R), фрДНК получали посредством обработки ультразвуком. Затем, наноструктуры (PLL/Ppy NW), имеющие поверхность, с которой конъюгирован полилизин, полученные способом из примера получения, добавляли к этому, и затем проводили колориметрический анализ без ПЦР (фиг. 40). фрДНК из положительной по экзону 20, 21 EGFR линии клеток H1975 выделяли с использованием нанопроволоки. Затем к этому добавляли зонды для экзона 19, 20 и 21 EGFR, и реакции позволяли проходить. Затем к этому добавляли HRP/стрепт.-меченные NP, и затем наблюдали изменение окраски. Как проиллюстрировано на фиг. 40, являлось возможным идентифицировать явное изменение окраски и изменение УФ-видимой области спектра только для EGFR 20 и EGFR 21.
III. Детекция нестабильной вкДНК с использованием одного зонда
Пример 7. Детекция нестабильной вкДНК с использованием только зонда, способного связываться только с поврежденной частью
вкДНК выделяли из образцов плазмы пациентов с раком легкого. Затем, для детекции мутаций в генах, два типа зондов, то есть, CP и DP, использовали в смеси. Как проиллюстрировано на фиг. 41-43, для детекции мутаций в генах делеции экзона 19 EGFR, T790M в экзоне 20 и L858R в экзоне 21, CP_1 (делеция экзона 19 EGFR), CP2 (T790M в экзоне 20 EGFR) и CP2 (L858R в экзоне 21 EGFR), представляющие собой зонды, специфические для вкДНК, содержащей вышеуказанные области, использовали в смеси с DP.
Однако, как проиллюстрировано на фиг. 44, являлось возможным идентифицировать тот же самый результат для мутации в гене делеции экзона 19 EGFR, что и результат (делецию экзона 19 EGFR) в ткани злокачественной опухоли пациента, даже когда CP отдельно добавляли без DP.
IV. Идентификация возможности детекции для нестабильной вкДНК, в зависимости от способа обработки образца
Пример 8. Идентификация возможности детекции для нестабильной вкДНК, в зависимости от обработки ДНКазой или РНКазой
Образцы плазмы пациентов с раком легкого сначала обрабатывали ДНКазой или РНКазой, и затем вкДНК выделяли из них с использованием наноструктур для идентификации мутаций в генах. Как проиллюстрировано на фиг. 45, после того как плазму пациентов с раком легкого с мутацией в гене делецией экзона 19 EGFR, предварительно обрабатывали РНКазой A, вкДНК получали из них с использованием нанопроволоки, и затем подвергали реакции с зондом для дел. экзона 19 EGFR. В результате, идентифицирован такой же пик в УФ-видимой области спектра для мутации в гене делеции экзона 19 EGFR, как и результат для ткани злокачественных опухолей пациентов, подобно контролю (контрольной вкДНК). Однако, являлось возможным идентифицировать, что после предварительной обработки ДНКазой I, поглощения УФ не наблюдали, из-за возможности того, что вкДНК была деградирована (фиг. 45).
Подобным образом, как проиллюстрировано на фиг. 46, после того как плазму пациентов с раком легкого с мутацией в гене T790M в экзоне 20 EGFR предварительно обрабатывали РНКазой A, вкДНК получали из нее с использованием нанопроволоки, и затем подвергали реакции с зондом для T790M в экзоне 20 EGFR. В результате, идентифицировано такое же поглощение УФ для мутации в гене T790M в экзоне 20 EGFR, как и результат для ткани злокачественных опухолей пациентов. Однако, являлось возможным идентифицировать, что поглощения УФ не наблюдали после обработки ДНКазой I (фиг. 46); и это было обусловлено возможностью того, что вкДНК была деградирована из-за добавления ДНКазы I в плазму пациентов.
V. Идентификация возможности детекции для вкДНК, в зависимости от маркеров
Пример 9. Идентификация возможности детекции для вкДНК с использованием комплексов HRP/стрептавидин
Как проиллюстрировано на фиг. 47, вкДНК выделяли из плазмы пациентов с раком легкого с мутациями в генах делецией экзона 19 EGFR и T790M в экзоне 20, подвергали реакции с зондами для дел. экзона 19 EGFR, 20 T790M и 21 L858R, и HRP/стрепт.-меченными NP, и затем идентифицировали такие же результаты для мутации в гене делеции экзона 19 EGFR и T790M в экзоне 20, как и результаты для ткани злокачественных опухолей пациентов, с использованием поглощения УФ и изменения окраски.
Однако, как проиллюстрировано на фиг. 48, когда вкДНК выделяли из плазмы тех же пациентов, и затем подвергали реакции с зондами для дел. экзона 19 EGFR, 20 T790M, 21 L858R и комплексами HRP-стрептавидин (в которых HRP и стрептавидин связаны друг с другом при 1:1) вместо HRP/стрепт.-меченных NP, наблюдали результаты для мутации в гене, полностью отличные от результатов для тканей злокачественных опухолей пациентов. Обнаружено, что когда комплексы HRP/стрептавидин использовали вместо меченных HRP/стрептавидином наночастиц (NP), наблюдали неточные результаты для мутации в гене, из-за увеличенного неспецифического связывания.
Как проиллюстрировано на фиг. 49, проводили анализ результатов, полученных посредством выделения вкДНК из плазмы 5 пациентов с раком легкого с мутациями в генах делецией экзона 19 EGFR и T790M в экзоне 20, и затем подвергания вкДНК реакции с зондами для дел. экзона 19 EGFR, 20 T790M и 21 L858R, и HRP/стрепт.-меченными NP, и с зондами для дел. экзона 19 EGFR, 20 T790M и 21 L858R, и комплексами HRP/стрептавидин (в которых HRP и стрептавидин связаны друг с другом при 1:1) вместо HRP/стрепт.-меченных NP. В результате, идентифицировано, что для вкДНК, полученных посредством нанопроволоки, показали поглощение УФ, совпадающее с тканью злокачественной опухоли, из-за увеличенной специфичности реакции, обусловленной связыванием с ними зондов и HRP/стрепт.-меченными NP. Кроме того, идентифицировано, что HRP/стрепт.-меченные NP играли важную роль в определении мутаций в генах даже в плазме 5 пациентов с раком легкого с мутациями в генах T790M в экзоне 20 EGFR и 21 L858R.
VI. Детекция вкДНК с использованием комплексов, в которых зонд и маркер связаны друг с другом
Пример 10. Детекция мутаций в генах с использованием зондов, с которыми связана HRP/стрепт.-меченная NP
Как проиллюстрировано на фиг. 50, вместе подвергания вкДНК последовательной реакции с зондами и HRP/стрепт.-меченными NP, соответственно, HRP/стрепт.-меченные NP сначала связывали с зондами, специфическими для дел. экзона 19 EGFR, 20 T790M и 21 L858R, для получения продуктов связывания в форме зонд-HRP-маркер, и вкДНК подвергали реакции с такими продуктами связывания; и в результате, идентифицировано, что такой же генотип, как в ткани злокачественной опухоли, детектировали даже в плевральной жидкости пациентов с раком легкого, с мутациями в генах T790M в экзоне 20 EGFR и 21 L858R.
VII. Детекция вкДНК, в зависимости от последовательности смешивания
Пример 11. Идентификация детекции нестабильной вкДНК посредством одновременного перемешивания зонда и маркера
Как проиллюстрировано на фиг. 51, вместо подвергания вкДНК последовательной реакции с зондами CP и DP, и HRP/стрепт.-меченными NP, соответственно, вкДНК смешивали, все одновременно, с зондами и HRP/стрепт.-меченными NP, и реакции позволяли проходить; и в результате, идентифицировано, что такой же генотип, как в ткани злокачественной опухоли, детектировали даже в плазме пациентов с раком легкого с мутациями в генах T790M в экзоне 20 EGFR и 21 L858R. Кроме того, как проиллюстрировано на фиг. 52, вкДНК смешивали, все одновременно, с зондами CP и DP, и HRP/стрепт.-меченными NP, и реакции позволяли проходить; и в результате, идентифицировано, что такой же генотип, как в ткани злокачественной опухоли, детектировали даже в плазме пациентов с раком легкого с мутациями в генах слиянием ALK-EML4 и точечной мутацией в ALK (I1171N/T).
VIII. Детекция нестабильной вкДНК, в зависимости от условий денатурации образца
Пример 12. Детекция вкДНК после денатурации образца, в зависимости от условий температуры
Проводили эксперименты для идентификации того, можно ли отличать друг от друга нестабильную вкДНК и стабильную вкДНК, в зависимости от условий денатурации образца. Конкретно, с использованием зонда, способного к детекции делеции 19 EGFR, плазму, собранную от нормальных субъектов и пациентов с раком легкого (0208-343, 20190311_LC#1, результат для ткани: E19 дел.) подвергали различным условиям денатурации, и затем проверяли, можно ли отличать друг от друга нестабильную вкДНК и стабильную вкДНК.
Для зонда, использовали ggaattaaga gaagcaacat ctcc (SEQ ID NO: 9), представляющий собой зонд, способный к детекции делеции экзона 19 EGFR. По настоящему изобретению, использовали связанный с биотином зонд. Использовали PEI/Ppy нанопроволоки, и наночастицы, с которыми агрегирован HRP/стрептавидин, использовали а качестве маркеров.
Конкретно, перед выделением вкДНК с использованием нанопроволоки, образцы обрабатывали в различных условиях следующим образом. Образец нагревали при 30°C в течение 15 минут и 0 минут, соответственно. Кроме того, образец нагревали при 60°C в течение 5 минут и 0 минут, соответственно. Кроме того, образец нагревали при 95°C в течение 1 минуты и 0 минут, соответственно. Другие стадии осуществляли в способе, как схематично указано на фиг. 8.
В результате, у нормальных субъектов без мутации делеции 19 EGFR, нестабильную вкДНК не детектировали ни в одном из условий денатурации (фиг. 54). Однако, для пациентов с E19 дел., идентифицировано, что нестабильную вкДНК детектировали во всех различных условиях денатурации (фиг. 55). По этим результатам, посредством присутствия или отсутствия нестабильной вкДНК, является возможным получать информацию о том, что пациент с раком легкого имеет мутацию E19 дел.
Пример 13. Детекция происходящей из линии клеток нестабильной вкДНК, в зависимости от условий температуры
В качестве образцов, полученных из организма человека, проводили эксперименты для идентификации положений мутаций, присутствующих в линиях клеток. Конкретно, фрДНК, имеющую размер, сходный с размером вкДНК, получали из каждой из HCC2279 (экзон19-дел), HCC827 (экзон19-дел), H1975 (T790M, L858R) и A549 (EGFR дикого типа). Конкретно, фрДНК получали посредством способа из примера 2.
В результате, идентифицировано, что в условиях денатурации из нагревания при 95°C в течение 1 минуты и 0 минут, соответственно, только нестабильная вкДНК специфически связывалась с зондами и была детектирована в состоянии связывания с маркером (фиг. 56). По этим результатам, подтвердили, что являлось возможным идентифицировать присутствие или отсутствие нестабильной вкДНК, которую возможно было также идентифицировать в образцах, полученных из линий клеток.
Пример 14. Детекция нестабильной вкДНК, в зависимости от обработки ДНКазой
Для идентификации того, отличаются ли нестабильная вкДНК и стабильная вкДНК, в зависимости не только от условий температуры, но также от деградирующего ДНК фермента, нестабильную вкДНК и стабильную вкДНК подвергали обработке ДНКазой, и затем проверяли ее реакционную способность для зондов. По настоящему изобретению, образец не подвергали денатурации с использованием высокой температуры.
Конкретно, фрДНК, полученную, с использованием PEI/Ppy нанопроволоки, из каждой из HCC2279 (экзон19-дел), HCC827 (экзон19-дел), H1975 (T790M, L858R) и A549 (EGFR дикого типа) суспендировали в PBS, и затем обрабатывали с использованием 1 мкл ДНКазы. В результате обработки при 37°C в течение 30 минут, идентифицировано, что нестабильная вкДНК и стабильная вкДНК отличались, применительно к реакционной способности в отношении зондов (фиг. 57). Кроме того, идентифицировано, что такой же эффект показывали, даже когда обработку ДНКазой проводили при 37°C в течение 60 минут (фиг. 58). На основании этих результатов, являлось возможным идентифицировать, что стабильная вкДНК не поддавалась легкой деградации посредством фермента ДНКазы.
Однако, в результате обработки с использованием 1 мкл или 2 мкл ДНКазы при 37°C в течение 120 минут, идентифицировано, что стабильная вкДНК также вступала в реакцию с зондами, когда время для обработки ДНКазой продлевали или использовали увеличенное количество ДНКазы (фиг. 59). По этим результатам, являлось возможным идентифицировать различия в стабильности между нестабильной вкДНК и стабильной вкДНК.
Кроме того, для идентификации различий между нестабильными вкДНК и стабильными вкДНК, в зависимости от активности ДНКазы, результаты, полученные посредством обработки с использованием 1 мкл или 2 мкл ДНКазы при 24°C в течение 120 минут, проиллюстрированы на фиг. 60. В результате, несмотря на то, что активность фермента уменьшалась при 24°C, идентифицировано, что нестабильная вкДНК и стабильная вкДНК отличались, применительно к реакционной способности в отношении зондов (фиг. 60).
Кроме того, для идентификации различий между нестабильными вкДНК и стабильными вкДНК, в зависимости от активности ДНКазы, результаты, полученные посредством обработки с использованием 1 мкл или 2 мкл ДНКазы при 3°C в течение 120 минут, проиллюстрированы на фиг. 58. В результате, несмотря на то, что активность фермента уменьшалась при 3°C, идентифицировано, что нестабильная вкДНК и стабильная вкДНК отличались, применительно к реакционной способности в отношении зондов (фиг. 61).