Роль экспериментального поражения гепатобилиарной системы матери D-галактозамином на морфофункциональное становление яичников потомства в различные сроки постнатального развития

УДК 611.65/67

РОЛЬ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ПОРАЖЕНИЯ ГЕПАТОБИЛИАРНОЙ СИСТЕМЫ МАТЕРИ Р-ГАЛАКТОЗАМИНОМ НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СТАНОВЛЕНИЕ ЯИЧНИКОВ ПОТОМСТВА В РАЗЛИЧНЫЕ СРОКИ ПОСТНАТАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

И.В. Зубарев, Г.В. Брюхин ЧелГМА, г. Челябинск

Проведено исследование влияния экспериментального поражения ге-патобилиарной системы матери различного генеза на морфофункциональное становление яичников потомства. Результаты исследования позволяют констатировать, что у потомства от самок крыс с патологией гепатобилиар-ной системы имеет место нарушение морфофункционального становления яичников.

Ключевые слова: яичники, фолликулогенез, патология гепатобилиарной системы.

Актуальность. Актуальность настоящего исследования определяется важной ролью материнского организма в решении проблемы воспроизводства полноценного потомства, снижении перинатальной заболеваемости и смертности, которые на сегодняшний день в России остаются достаточно высокими.

Согласно современным представлениям, одной из важнейших причин нарушения внутриутробного развития являются экстрагенитальные заболевания женщины, особое место среди которых занимает патология гепатобилиарной системы. Согласно клиническим наблюдениям и экспериментальным исследованиям, у женщин с патологией гепатобилиарной системы рождается физиологически незрелое потомство с нарушением структурно-функционального становления систем жизнеобеспечения [1,7].

За последние годы появилось множество новых данных о факторах, влияющих на становление эндокринной и генеративной функций яичников. Становление данных функций определяется активностью и корректной работой генов, вовлечённых в процессы фолликулогенеза, формирования пула фолликулов, выбора доминантного фолликула, овуляции и формирования жёлтого тела. Многочисленными исследованиями была показана их решающая роль в нормальном развитии и функционировании женской репродуктивной системы. Так, например, мутации таких генов как Бтагса4, ЯЬр), ОппиЗа приводят к эмбриональной смерти, в то время как мутация гена Р1§а вызывает бесплодие. Кроме того мутации других генов могут несущественно влиять на организм плода, вызывая лишь нарушение процесса фолликулогенеза [5, 8, 10, 13].

Вместе с тем, роль патологии печени матери в нарушении генеративной и эндокринной функций яичников потомства до конца на установлена.

В связи с этим, целью настоящего исследования явился анализ особенностей морфофункционального становления яичников потомства самок крыс с экспериментальным хроническим поражением печени различного генеза.

Материалы и методы. Работа выполнена на белых лабораторных крысах «Вистар» - самках на 15, 30, 45 и 60-й день постнатального развития. Сроки исследования обусловлены общепризнанным подразделением возрастных периодов данной группы животных [4] подсосный период (6-21-й день), период полового созревания (22-50-й дни) и период половой зрелости (после 60-го дня).

В качестве веществ, модулирующих поражение печени, нами использовался токсин В-галак-тозамин. Хроническое поражение печени у самок крыс верифицировали с помощью морфологических, биохимических и иммунологических методов. Согласно данным литературы [2], развивающиеся при этом морфофункциональные изменения соответствуют таковым при гепатите В. Всего использовано 64 крысы (по 32 крысы в каждой группе). Для гистологического исследования и оценки фолликулогенеза яичники препарировались и подвергались взвешиванию. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, железным гематоксилином по Гейденгайну, галлоцианином по Эйнерсону [9].

Прежде всего, производилось измерение весовых характеристик, морфофункциональный анализ процесса фолликулогенеза.

При оценке фолликулогенеза использована наиболее распространённая классификация фол-

ликулов по Pedersen, Peters [12], позволяющая проводить тщательный анализ фолликулогенеза. Согласно данной классификации, можно выделить несколько типов фолликулов: малые, средние и большие фолликулы. Данная классификация основывается на двух морфометрических показателях -размерах фолликулов и численности фолликулярных эпителиальных клеток на максимальном сечении фолликула. Группа больших фолликулов объединяет как бесполостные (56 тип), так и полостные (начиная с 6-го типа) фолликулы. Полученные результаты обработаны статистически с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.

Результаты исследований и их обсуждение. Анализ весовых характеристик экспериментальных животных позволил выявить следующую закономерность. У интактных животных в пост-натальном периоде происходит постепенное уве-

ного периода, после чего отмечается некоторое увеличение исследуемого показателя. Так, если у интактных животных в подсосный период, исследуемый показатель составил 0,080 ± 0,0054 %, то к 60-му дню он существенно снизился и составил

0,034 ± 0,0021 %. У животных опытной группы весовой индекс исследуемого органа к началу периода полового созревания практически не изменяется, а затем снижается и достигает минимального значения в период половой зрелости (рис. 1).

При этом обращает на себя внимание то, что в период завершения полового созревания и в период половой зрелости исследуемый показатель у подопытных крысят несколько превышает таковой в контроле, что обусловлено, на наш взгляд, увеличением массы органа.

Таким образом, анализ результатов данной серии исследований позволяет констатировать, что у потомства самок крыс с хроническим экспери-

-♦— Контроль

D-галактозами н

15 дней

30 дней

45 дней

60 дней

Рис. 1. Весовой индекс экспериментальных животных в различные сроки постнатального развития: * - результаты статистически достоверны по сравнению с контролем

личение массы яичника. Так у 15-дневных интактных крысят абсолютная масса яичника составляет 11,75 ± 1,36 мг, в то время как в период половой зрелости (60 дней) этот показатель достигает максимальной величины 45,50 ± 3,03 мг.

У подопытных животных в постнатальный период также отмечается постепенное увеличение массы яичников с 7,20 ± 0,93 мг в подсосный период, до 54,18 ± 2,61 мг в период половой зрелости соответственно.

При этом обращает на себя внимание то, что на ранних сроках постнатального развития абсолютная масса яичников у подопытных крысят снижена по сравнению с контролем. В то же время к периоду половой зрелости отмечается увеличение абсолютной массы яичников до уровня, превышающего таковой в контроле.

Наиболее важным показателем морфофункционального состояния органа является его весовой индекс, который представляет собой отношение массы органа к массе тела. Динамика изменения весового индекса яичника экспериментальных животных отражена на рис. 1. Как видно из рис. 1, у интактных крысят весовой индекс яичника после рождения постепенно уменьшается и достигает минимального значения на 45-й день постнаталь-

ментальным поражением печени имеет место изменение относительной и абсолютной массы яичников.

В следующей серии настоящего исследования нами производился анализ морфологических особенностей яичников экспериментальных животных, а также оценён характер фолликулогенеза в них.

Анализ площадей коркового и мозгового вещества яичников позволил выявить следующую закономерность. Нами показано увеличение после рождения площади коркового и мозгового вещества (рис. 2). Как видно из рис. 2а, на ранних сроках исследования весовой индекс яичников крысят подопытной группы снижен по сравнению с таковыми в контроле, а на более поздних, - наоборот, несколько повышен. При этом обращает на себя внимание факт, что на 30-й день у подопытных крысят несколько увеличено мозговое вещество, а на 45-й день снижена площадь коркового вещества по отношению к контролю.

Важным критерием, позволяющим показать уровень развития коркового и мозгового вещества, является коэффициент, отражающий отношение площади коркового вещества к мозговому веществу (рис. 3).

ВКонтроль КВ В Контроль МВ

О-галактозамин КВ

О-галактозамин МВ

Рис. 2. Площади коркового и мозгового вещества экспериментальных животных в различные сроки постнатального развития: * - результат статистически достоверен по сравнению с контролем

15,00п

12,00

9.00

6.00 3,00

0,00

15 дней

30 дней

45 дней

60 дней

ВКонтроль  О-галактозамин

Рис. 3. Динамика изменения коэффициента, отражающего отношение коркового вещества к мозговому веществу экспериментальных животных в различные сроки постнатального развития: * - результат статистически достоверен по сравнению с контролем

1200,00

900.00

600.00 300,00

0,00

15 дней 30 дней 45 дней 60 дней

В Контроль О О-галактозамин

Рис. 4. Суммарное содержание фолликулов яичников экспериментальных животных в различные сроки постнатального развития

Как видно из рисунка, у интактных крыс к периоду полового созревания исследуемый показатель несколько снижается, а к концу данного периода существенно увеличивается до максимального значения. В период половой зрелости исследуемый коэффициент вновь заметно снижается. Аналогичная закономерность выявлена и у крысят обеих опытных групп. Обращает на себя внимание, что в период полового созревания на 30-й и 45-й дни коэффициент, отражающий отношение коркового и мозгового вещества яичников у подопытных крысят снижен по сравнению с контролем, что свидетельствует об уменьшении массы коркового вещества, ответственного за осуществление генеративной и эндокринной функции женских половых желёз.

Одним из важнейших показателей структур-но-функциональной зрелости яичника является общее количество фолликулов и их популяционный состав [3]. Исследование суммарного содержания фолликулов в единице условной площади (103 мкм2) яичников позволило выявить следующую закономерность (рис. 4). У подопытных животных суммарное содержание фолликулов яичников подопытных крысят в единице условной площади на большинстве сроков исследования снижено по сравнению с контролем.

Как известно, у грызунов становление пула примордиальных фолликулов происходит в пост-натальный период. Исследованиями С..!. Зо^ег и соавт. [6] было показано, что мутация гена Ре! приводит к уменьшению содержания фолликулов

500,00

250,00

0,00

* ъ

...ЛІ' * гП ,

1 2-За 36 4 5а 56 6 7-8

В Контроль  Р-галактозамин

Рис. 5. Популяционный состав фолликулов яичников 15-дневных экспериментальных животных:* - результаты статистически достоверны по сравнению с контролем

ВКонтроль  0-галактозамин

Рис. 6. Популяционный состав фолликулов яичников 30-дневных экспериментальных животных: * - результат статистически достоверен по сравнению с контролем

В Контроль  Р-галактозамин

Рис. 7. Популяционный состав фолликулов яичников 45-дневных экспериментальных животных: * - результат статистически достоверен по сравнению с контролем

в яичнике. Можно предположить, что уменьшение у подопытных животных суммарного содержания фолликулов в единице условной площади яичника может быть обусловлено именно мутацией гена Рз1:.

Наибольший интерес представляют данные популяционного состава фолликулов яичников экспериментальных животных. Анализ популяционного состава фолликулов позволил выявить следующую закономерность (рис. 5-8). Как видно из рисунков, у интактных крысят на 15-й день в яичниках преобладают фолликулы с 1 по 4 типы. У подопытных животных в яичниках также преобладали незрелые фолликулы (1-5а типы).

Обращает на себя внимание снижение содержания фолликулов 1-го типа у крысят подопытной

группы. Изменение количества малых фолликулов отражает, на наш взгляд, нарушение становления пула примордиальных фолликулов.

На 30-й и 45-й дни в яичниках интактных животных также преобладают фолликулы с 1 по 5а типы, в то же время количество более зрелых фолликулов (56-8 типов) снижено. У подопытных животных, в яичниках также преобладали незрелые фолликулы (1-5а типы). При этом обращает на себя внимание, что содержание малых и средних фолликулов снижено, а содержание больших фолликулов у них повышено.

На 60-й день у подопытных животных наблюдается снижение малых и средних фолликулов на фоне незначительного повышения содержания больших фолликулов.

Контроль  О-галактозамин

Рис. 8. Популяционный состав фолликулов яичников 60-дневных экспериментальных животных: * - результат статистически достоверен по сравнению с контролем

30

20

10

0 ------------------1----------------1----------------г—1-------------1

15 день 30 день 45 день 60 день

В Контроль  О-галактозамин

Рис. 9. Содержание атретических фолликулов яичников экспериментальных животных

- Контроль О-галактозамин

Рис. 10. Количество жёлтых тел яичников экспериментальных животных

К45

ГВ45

К60

ГВ60

11 Площадь ЖТ

Рис. 11. Площадь жёлтых тел яичников экспериментальных животных

Таким образом, анализ результатов данной серии исследований позволяет констатировать, что у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени на большинстве сроков исследования имеет место снижение со-

держания малых и средних фолликулов. В то же время содержание больших фолликулов оказалось повышенным. Результаты анализа субпопуляци-онного состава фолликулов яичников, позволяют предположить, что нарушение условий внутриут-

робного развития при хроническом поражении печени обусловливает преждевременную активацию пула примордиальных фолликулов и ускоренное созревание большого количества фолликулов. Полученные данные согласуются с данными литературы. Так, исследованиями P. Reddy и соавт. [11] было показано, что мутация гена Pten вызывает преждевременную активацию пула примордиальных фолликулов, а исследованиями S.A. Williams и соавт. [14] было показано, что мутация гена Cigaltl вызывает ускоренное созревание и овуляцию большого количества фолликулов. На основе результатов этих авторов, возможно предположить, что наблюдаемая нами закономерность может быть связана с нарушением экспрессии этих генов.

Одним из показателей интенсивности фолли-кулогенеза в яичниках экспериментальных животных является содержание атретических фолликулов (рис. 9). Установлено, что у подопытных крысят число атретических фолликулов в яичнике изменено относительно контроля. У интактных крысят число атретических фолликулов в яичнике после рождения постепенно увеличивается и достигает максимального значения к концу периода полового созревания, после чего к периоду половой зрелости исследуемый показатель несколько снижается. Аналогичная закономерность выявлена и у подопытных крысят. У подопытных животных в период полового созревания (30-й и 45-й дни) выявлено повышение числа атретических фолликулов, что может быть связанно с чрезмерной активацией процесса фолликулогенеза.

Одним из показателей полноценного процесса фолликулогенеза является число жёлтых тел. Нами установлено (рис. 10), что содержание жёлтых тел в яичниках у подопытных животных на 45-й день равно таковому в контроле, а на 60-й день оказалось достоверно выше по сравнению с контролем. Так в единице условной площади яичника интактных крысят содержание жёлтых тел составило 1,86 ± 0,13, в то время как у подопытных животных данный показатель оказался сниженным и составил соответственно 1,23 ± 0,04. К 60-му дню в условной единице площади яичника интактных крысят содержание жёлтых тел составило 9,61 ± ± 0,92, в то время как у подопытных животных, данный показатель оказался сниженным и составил соответственно 15,43 ± 1,80. Однако нами было показано, что площадь жёлтых тел у подопытных животных достоверно снижена на всех сроках исследования (рис. 11).

Таким образом, анализ результатов данной серии исследований позволяет констатировать, что у потомства самок крыс с хроническим экспериментальным поражением печени имеет место увеличение числа атретических фолликулов и увеличение количества жёлтых тел яичников экспериментальных животных.

Заключение. Таким образом, результаты исследования позволяют констатировать, что у по-

томства от самок крыс с патологией гепатобилиар-ной системы имеет место нарушение морфофункционального становления генеративной функции яичников.

Литература

1. Брюхин, Г.В. Особенности становления фолликулогенеза в яичниках у потомства матерей с хроническим поражением гепатобилиарной системы в условиях эксперимента /Г.В. Брюхин, Е.В. Вто-ругиина // Проблемы репродукции. — 2004. — № 3. -С. 54-57.

2. Венгеровский, A.C. Метаболизм липидов и функционального состояния печени при интоксикации D-галактозамином у крыс / A.C. Венгеровский // Патол. физиол. и эксперим. терапия. — 1988. -№ 3. - С. 52-54.

3. Волкова, О.В. Морфогенетические основы развития и функции яичников / О.В. Волкова, Т.Г. Боровая. - М., 1999 - 245 с.

4. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте / И.П. За-паднюк, В.И. Западнюк, И.А. Захария, Б.В. Запад-нюк. - Киев: Вища школа, 1983. - С. 1-383.

5. Essential role for de novo DNA methyltrans-ferase Dnmt3a in paternal and maternal imprinting / M. Kaneda, M. Okano, K. Hata et al. //Nature. — 2004 -№429. -P. 900-903.

6. Granulosa cell-specific inactivation of follies-tatin causes female fertility defects / C.J. Jorgez, M. Klysik, S.P. Jamin et al. //Mol Endocrinol. —2004 -№ 18. - P. 953-967.

7. Hay, J. Eileen. Liver Disease in Pregnancy / J. Hay// J. Hepatology. - March 2008. — P. 1067—1076.

8. Infertility in female mice with an oocyte-specific knockout of GPIanchored proteins / J.A. Alfieri, A.D. Martin, J. Takeda et al. // J Cell Sei. — 2003. — №116.-P. 2149-2155.

9. Kiernan, J.A. Histological and Histochemical Methods: Theory and Practice / J.A. Kiernan. —4ed.— Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2008. - 606 p.

10. Maternal BRG1 regulates zygotic genome activation in the mouse / S.J. Bultman, T.C. Gebühr, H. Pan et al. // Genes Dev 2006. —№20. — P. 1744—1754.

11. Oocytespecific deletion of Pten causes premature activation of the primordial follicle pool / P. Reddy, L. Liu, D. Adhikari et al. // Science 2008. -V. 319.-P. 611-613.

12. Pedersen, T. Propousal for a classification of oocytes and follicles in the mouse ovary / T. Pedersen, H. Peters//J. Reprod. Fert. -1968. -V. 17.-P. 555-557.

13. RBPJkappa-dependent notch signaling is dispensable for mouse early embryonic development / C. Souilhol, S. Cormier, K. Tanigaki et al. // Mol Cell Biol. - 2006. - У. 26. - P. 4769-4774.

14. Williams, S.A. Mouse fertility is enhanced by oocyte-specific loss of core 1-derived O-glycans / S.A. Williams, P. Stanley // FASEB J. -2008. -№22.-P. 2273-2284.

Поступила e редакцию 19 июня 2010 г.