РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВИРУС СВИНОЙ ОСПЫ (SWINEPOX) И ВАКЦИНЫ
RECOMBINANT SWINE POX (SWINEPOX) VIRUS AND VACCINES

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новым рекомбинантным вирусам свиной оспы и их применению в вакцинных композициях. Рекомбинантные вирусы свиной оспы по изобретению получают путем вставки одного или нескольких инородных генов в ген IL-18-связывающего белка (IL18bp) вируса свиной оспы. Изобретение особенно подходит для производства свиных вакцин, особенно для вакцинации свиней против инфекции PCV2.
Предшествующий уровень техники
Различные типы вирусов были предложены в данной области как вектор доставки гена или экспрессии пептида in vivo. В частности, были получены ветеринарные вакцины, которые экспрессируют по меньшей мере один соответствующий антиген, используя рекомбинантные вирусы, такие как поксвирусы (вирусы оспы) (Ogawa R. и др., Vaccine, 8: 486-490 (1990)), аденовирусы (HSU, K.H. et al., Vaccine, 12; 607-612 (1994)), бакуловирусы, а также герпесвирусы (Shin, M.-F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 5867-5870 (1984)). Примеры конкретных вирусных векторов, которые допускают экспрессию гена для чужеродного антигена, включают вирус болезни Ауески (вирус псевдобешенства, PRV) (Van Zijl M. et al., J. Virol., 65: 2761-2765 (1991)), герпесвирус индейки (HVT) (Morgan RW et al., Avian Dis. 36: 858-870 (1992)) и вирус болезни Марека (MDV). Рекомбинантные векторы на основе рода герпесвируса интенсивно изучаются.
Однако существует потребность в новых вирусных векторных продуктах, которые могут быть использованы для экспрессии рекомбинантных пептидов или белков in vivo. В связи с этим, поксвирусы были сконструированы для кодирования различных полипептидов. Поксвирусы, будучи выпущенными в кровь из инфицированных клеток, могут инфицировать другие клетки и, следовательно, потенциально привести к повышенным уровням экспрессии. Рекомбинантные поксвирусы были получены из различных типов поксвирусов, включая вирус коровьей оспы, вирус вакцины и вирус свиной оспы (SPV). Однако до сих пор SPV-рекомбинанты были получены, по существу, путем клонирования последовательности инородных генов в генетической области, которая считается несущественной для выживания SPV, области TK (Richard W. Moyer, Eladio Vinuela, EPJ Gibbs, US5651,972 (1997)). Авторы настоящего изобретения обнаружили и доказали целесообразность использования новой области введения гена SPV, в которую могут быть включены различные последовательности инородных генов. Полученные рекомбинантные вирусы SPV обеспечивают эффективную и стабильную экспрессию последовательности клонированных генов и обладают большой способностью клонирования. Кроме того, эти вирусы обладают улучшенной иммуногенностью in vivo и могут быть использованы для получения терапевтических средств или вакцин для лечения любого млекопитающего, особенно свиней.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к новым рекомбинантным вирусам свиной оспы и их применению для доставки и экспрессии генов in vivo, особенно в вакцинных композициях. Рекомбинантные вирусы свиной оспы по изобретению содержат одну или несколько последовательностей инородных генов в гене IL-18-связывающего белка (IL18bp) вируса свиной оспы. Изобретение особенно подходит для производства свиных вакцин, особенно для вакцинации свиней против инфекции PCV2.
Таким образом, первая цель настоящего изобретения относится к рекомбинантному вирусу свиной оспы (rSPV), содержащему по меньшей мере одну первую последовательность инородных генов в своем геноме, где указанную первую последовательность инородных генов вводят в ген IL18bp гена rSPV. В конкретном варианте осуществления последовательность инородных генов вводится с заменой всей или части вирусной последовательности гена IL18bp. В еще одном конкретном варианте осуществления rSPV по изобретению дополнительно содержит, по меньшей мере, вторую последовательность инородных генов, встроенную в определенную область генома rSPV, например, в вирусный ген тимидинкиназы (TK) или ген белка повторения анкирин.
Еще одна цель изобретения состоит в молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей геном rSPV, как определено выше.
Еще одной целью изобретения является клетка-хозяин, содержащая rSVP или молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу получения rSVP, включающему инфицирование или введение в компетентную клетку молекулы нуклеиновой кислоты, как определено выше, и сбор rSVP.
Изобретение также относится к способу размножения rSVP, включающему инфицирование компетентной клетки rSVP, как определено выше, и сбор rSPV, продуцируемого указанными клетками.
Изобретение также относится к композиции, предпочтительно ветеринарной композиции, содержащей rSPV, как определено выше, или клетку, как определено выше, или молекулу нуклеиновой кислоты, как определено выше, и эксципиент.
Еще одной целью изобретения является вакцинная композиция, содержащая rSPV, как определено выше, или клетку, как определено выше, или молекулу нуклеиновой кислоты, как определено выше, подходящий эксципиент и, при необходимости, адъювант.
Изобретение также относится к rSVP или клетке или молекуле нуклеиновой кислоты, как определено выше, используемых для доставки терапевтического или вакцинирующего пептида или белка в свинью.
Изобретение также относится к rSVP или клетке или молекуле нуклеиновой кислоты, как определено выше, используемых для иммунизации или вакцинации свиньи против патогена.
Изобретение также относится к набору для вакцинации с целью иммунизации свиней, который включает следующие компоненты:
а. Эффективное количество rSPV или вакцины, как определено выше, и
б. Средство для введения свинье указанного rSPV или вакцины.
Еще одна цель изобретения относится к челночной плазмиде или вектору, содержащему трансген, фланкированный двумя последовательностями нуклеиновой кислоты, гомологичными последовательностями гена IL18bp, причем упомянутые фланкирующие последовательности позволяют гомологичную рекомбинацию между челночной плазмидой и геномом SPV.
Изобретение может быть использовано для доставки и экспрессии любой последовательности инородных генов млекопитающему, в частности свинье. Он особенно подходит для экспрессии чужеродных антигенов для иммунизации или вакцинации свиней (например, свиней, поросят, свиноматок).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к новым рекомбинантным вирусам свиной оспы и их применениям. Рекомбинантные вирусы свиной оспы по изобретению содержат одну или несколько последовательностей инородных генов в гене IL-18-связывающего белка (IL18bp) вируса свиной оспы. Как показано в экспериментальном разделе, такие новые векторы SPV обеспечивают устойчивую и эффективную экспрессию гена. Кроме того, rSPV по изобретению являются стабильными и могут давать улучшенные иммунные ответы in vivo. Более того, удивительно, что векторы SPV по изобретению более безопасны, чем предыдущие SPV, поскольку они не растут в клетках млекопитающих, таких как клетки Vero. Это первое сообщение о вирусе SPV, содержащем удаленный ген IL18-bp, и первая демонстрация того, что на этом сайте могут быть клонированы последовательности инородных генов, что приводит к стабильным, иммуногенным и высокопродуктивным рекомбинантным векторам SPV. rSPV по изобретению может дополнительно содержать более чем несколько последовательностей инородных генов, введенных в одно и то же или в разные места. Они могут использоваться отдельно или в сочетании с другими рекомбинантными вирусами или антигенами для получения улучшенных вакцин. Изобретение особенно подходит для производства свиных вакцин, особенно для вакцинации свиней против инфекции PCV2.
rSPV
В контексте изобретения рекомбинантный вирус свиной оспы обозначает, как правило, вирус свиной оспы, имеющий искусственно (например, рекомбинантно) сконструированный геном. rSPV включают, в частности, вирусы свиной оспы, содержащие инородный генетический материал или последовательность в их геноме. rSPV обычно содержит геном SPV, содержащий последовательность инородных генов, упакованную в капсид или оболочку SPV, который также может содержать инородный белок или пептид.
rSPV по настоящему изобретению может быть получен из с любого SPV, такого как любые встречающиеся в природе SPV или любые SPV, доступные из коллекций, таких как ATCC, CNCM и т.д. Предпочтительно rSPV по изобретению получают из штамма SPV kasza (VR-363), изолята 17077-99 (GeneBank Acc: AF410153.1) или штамма VTCC / AVA / 121 (GeneBank Acc: KJ725378.1). Такие SPV доступны из коллекций или библиотек или могут быть клонированы из их общедоступных геномных последовательностей. Другие изоляты SPV могут также быть выделены из инфицированных животных и использованы для получения rSPV по изобретению.
SPV или rSPV можно культивировать или поддерживать или размножать в любой подходящей клетке. Например, SPV можно культивировать, поддерживать или размножать в эмбриональных клетках почки свиньи, таких как клетки ESK-4 (CL-184), обычно культивируемых при 37°C в 5% CO2 в среде Ham’s F-12K (Gibco, Cat. No.: 21127-022), дополненной 1% стрептомицин-пенициллином (Gibco, Cat. No.: 15140-122) и 5% FBS (Gibco, Cat. No.: 10437-028).
Чтобы сконструировать рекомбинантный вирус по настоящему изобретению, изначально вирус SPV может быть размножен в подходящей клетке-хозяине, а затем может быть получена геномная ДНК. Затем область IL18bp геномной ДНК идентифицируется, при необходимости удаляется, полностью или частично, и в область вводится последовательность инородных генов (или сайт клонирования, позволяющий вводить последовательность инородных генов), при необходимости заменяя всю или частично эндогенную последовательность гена IL18bp. Полученный таким образом рекомбинантный геном SPV может быть использован для получения rSPV путем трансформации подходящих компетентных клеток в соответствии с общепринятыми методиками. Альтернативно, может быть получен челночный вектор, содержащий последовательность инородных генов (или сайт клонирования), фланкированную последовательностями, гомологичными областям гена IL18bp. После введения в компетентную клетку в присутствии вируса SPV или генома гомологичная рекомбинация между челночным вектором и геномом генерирует rSPV. Конечно, как только rSPV был сконструирован, как описано выше, его можно легко воспроизвести и размножить простой культурой в любых компетентных клетках.
SPV можно культивировать, поддерживать или размножать в эмбриональных клетках почки свиньи, таких как клетки ESK-4 (CL-184), обычно культивируемых при 37 ° C в 5% CO2 в среде Ham’s F-12K (Gibco, Cat. No.: 21127-022), дополненной 1% стрептомицин-пенициллином (Gibco, Cat. No.: 15140-122) и 5% FBS (Gibco, Cat. No.: 10437-028). ДНК может быть выделена из инфицированных вирусом клеток любым обычным способом. Например, клетки, выращенные в монослоях, можно очистить, а затем центрифугировать, чтобы собрать супернатант. После того, как белок денатурируют в лизисном буфере и удаляют, ДНК можно экстрагировать фенолом и/или этанолом.
Ген IL18bp вирусной ДНК SPV содержит приблизительно 402 bp и обычно находится у nt остатков 7745-8146 генома SVP. В качестве конкретного примера, в штамме SPV kasza (VR-363) ген IL18bp расположен в nt7745-8146.
В конкретном варианте осуществления rSPV по изобретению содержат последовательность инородных генов, встроенную в месте между nt 7750 и nt 8140 генома SPV. Вставка последовательности инородных генов вызывает прерывание нативной последовательности гена IL18bp, и, как правило, предотвращение экспрессии функционального IL18bp. В предпочтительном варианте осуществления последовательность инородных генов вводится в замещение последовательности гена IL18bp. В этом отношении предпочтительные rSPV по изобретению включают делецию по меньшей мере от 10 до примерно 400 nt геномной последовательности гена IL18bp и последовательность инородных генов, расположенную вместо удаленной последовательности.
Предпочтительные rSPV по изобретению содержат последовательность инородных генов, содержащуюся в гене IL18bp, где эндогенному гену IL18bp не хватает по меньшей мере 50nt, предпочтительно по меньшей мере 100 nt, еще более предпочтительно по меньшей мере 150nt, по меньшей мере 200nt, по меньшей мере 250nt, по меньшей мере 300nt, еще более предпочтительно между 320nt и 380nt.
Конкретные и предпочтительные rSPV по изобретению содержат делецию по меньшей мере nt 100-200 гена IL18bp, еще более предпочтительно по меньшей мере nt50-300 гена IL18bp, такого как nt19-369 гена IL18bp.
Конструкция rSPV по изобретению может быть произведена с использованием способов, известных в данной области, в соответствии с указаниями и информацией, содержащимися в настоящей заявке. В частности, квалифицированный специалист может встроить последовательность инородных генов в последовательность IL18bp, заменяя всю или часть эндогенной последовательности, используя известные способы, такие как мутагенез, ПЦР, гомологичная рекомбинация и т.д.
В конкретном варианте осуществления челночный вектор получают с помощью технологии рекомбинантной ДНК, в которой последовательность инородных генов клонировали в окружении двух областей гомологии IL18bp. Области гомологии обычно содержат каждый 50-1000 nt последовательности гена IL18bp, что даёт возможность специфической гомологичной рекомбинации. Челночный вектор может быть получен из любых известных или общепринятых плазмид, космид, фагов и т.п., таких как плазмиды pBS, pBR322, pUC18, pUC19 и pHC79. Челночную плазмиду можно затем ввести в инфицированную SPV клетку, используя известные методы, такие как электропорация, фосфат кальция, способ на основе липофектина и тому подобные. Затем выбирают рекомбинантные вирусы SPV, которые интегрируют последовательность инородных генов. Их последовательность может быть проверена. Затем rSPV можно поддерживать в любой подходящей компетентной клетке. Вирус можно поддерживать в культуре или очищать, замораживать или лиофилизовывать.
Последовательности инородных генов
Последовательность инородных генов может представлять собой любую последовательность нуклеиновой кислоты или молекулу, естественно не присутствующую в геноме SPV, или естественно не присутствующую в данном месте в геноме SPV. Последовательность инородных генов обычно содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую мРНК, пептид или полипептид (или белок). Последовательность инородных генов может, например, кодировать различные типы активных молекул, таких как антиген, адъювант, цитокин, лимфокин, фактор роста, фермент, метка и т.д.
В предпочтительном варианте осуществления последовательность инородных генов кодирует антиген (пептид, полипептид или белковый антиген) из возбудителя инфекционного заболевания свиней и наиболее предпочтительно антиген из вируса, бактерии, гриба или простейших. В контексте изобретения пептид обычно обозначает молекулу, содержащую от 4 до 30 аминокислот. Полипептидом является любой аминокислотный полимер, содержащий более 30 аминокислот. Термин полипептид включает белки полной длины.
Последовательность инородных генов предпочтительно кодирует пептид или полипептид (например, гликопротеин, капсидный белок или его фрагмент) вируса или патогена, выбранного из цирковируса свиней (PCV1, PCV2, PCV2A, PCV2B), Actinobacillus pleuropneunomia; аденовируса; альфавируса, такого как вирус восточного энцефаломиелита лошадей; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., предпочтительно B. hyodyentheriae, B.pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, предпочтительно биоваров 1, 2 и 3; классического вируса свиной лихорадки, вируса африканской чумы свиней; Chlamydia и Chlamydophila sp., а также предпочтительно C. pecorum и C. abortus; Clostridium spp., предпочтительно Cl. Difficile, Cl. Perfringens типа A, B и C, Cl.novyi, Cl.septicum, Cl.tetani; пищеварительного и респираторного коронавируса; Cryptosporidium parvum; Eimeria spp; Eperythrozoonis suis, в настоящее время названного Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis, предпочтительно подтипов 1, 7 и 14; вируса гемагглютинирующего энцефаломиелита; Lsospora suis; вируса японского энцефалита; Lawsonia intracellulars; Leptospira spp., предпочтительно Leptospira australis, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira interrogans, Leptospira Pomona и Leptospira tarassovi; Mannheimia haemolytica; Mycobacterium spp. предпочтительно M. avium, M. intracellular и M.bovis: Mycoplasma hyponeumoniae; парвовируса; Pasteurella multocida; свиного цитомеголовируса; Porcine parovirus, вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней: вируса псевдорецепции; ротавируса; вируса Sagiyama; Salmonella spp. предпочтительно S. thyhimurium и S.choleraesuis; Staphylococcus spp. предпочтительно S. hyicus; Streptococcus spp., предпочтительно Strep, suis; цитомегаловируса свиней; вируса свиного герпеса; вируса свиного гриппа; вируса свиной оспы; Toxoplasma gondii; визикулярного стоматита или вируса экзантемы свиней.
В особенно предпочтительном варианте осуществления последовательность инородных генов кодирует антиген PCV2, в частности белок PCV2 или пептид, еще более конкретно белок или пептид PCV2 капсида (например, ORF2).
Последовательность инородных генов может содержать транскрипционный промотор, позволяющий или увеличивающий экспрессию кодированной мРНК или полипептида. Используемый промотор может быть синтетическим или природным промотором, включая промотор SPV, промотор поксвируса или промотор, полученный из разных вирусов или клеток, таких как промоторы, полученные из эукариотических или прокариотических организмов. Конкретные примеры промоторов включают промотор 7,5 кД вируса вакцины (the vaccinia virus) (P7,5k) (Davison AJ et al., J. Mol. Biol., 210 (4): 749-69 (1989)), 11- кД -промотор (P11k ) (Bertholet et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 82: 2096-2100 (1985)) или 28- кД -промотор (P28k) (Weir JP & Moss B., J. Virol. 61: 75-80 (1987)) или искусственный синтетический промотор поксвируса (Ps), промотор тимидинкиназы вируса герпеса (Ross LJ, Gen. Virol., 74: 371-377 (1993)), промотор белка gB (supra) HVT или MDV, промотор IE человеческого цитомегаловируса (HCMV) (Alting-Mess MA, Nucleic Acids Res., 17: 9494 (1989)), промотор SV40 (Gunning P., Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 4931-4835 ( 1987)), промотор актина (supra и Kost AT, Nucleic Acids Res., 11: 8287-8301 (1983)), промотор β-глобина (Spitzner JR, Nucleic Acids Res., 18: 1- 11 (1990)), промотор LTR вируса саркомы Rous (Fiek A. et al., Nucleic Acids Res., 20: 1785 (1992)), и тому подобные. Кроме того, могут быть использованы промоторы структурных белков или основные гены SPV.
rSPV по изобретению может содержать несколько последовательностей инородных генов, расположенных в одной и той же области клонирования (то есть IL18bp) и/или в отдельных клонирующих сайтах (один из которых является IL18bp). В конкретном варианте осуществления rSPV по изобретению содержит по меньшей мере 2 последовательности инородных генов, кодирующих два разных антигена (из одного и того же или отдельного патогена). В еще одном конкретном варианте осуществления rSPV по изобретению содержит по меньшей мере последовательность инородных генов, кодирующую антиген PCV2, и последовательность инородных генов, кодирующую отдельный антиген. В другом конкретном варианте осуществления rSPV по изобретению содержит последовательность инородных генов, кодирующую антиген, и последовательность инородных генов, кодирующую адъювант или цитокин. В таком многовалентном rSPV по изобретению по меньшей мере две последовательности инородных генов могут находиться под контролем одного и того же или разных промоторов и в одной и той же или противоположной ориентации.
Молекулы нуклеиновой кислоты
Изобретение также относится к молекулам нуклеиновой кислоты, содержащим геном rSPV по изобретению. Молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению могут представлять собой ДНК или РНК, двухцепочечные или одноцепочечные. Одноцепочечная ДНК или РНК может быть кодирующей цепью, также известной как смысловая цепь, или она может быть некодирующей цепью, также называемой антисмысловой цепью. Изобретение также относится к вариантам или аналогам таких молекул нуклеиновой кислоты, например к молекулам, имеющим по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или более идентичности последовательности.
Степень гомологии между двумя последовательностями нуклеиновых кислот может быть определена с помощью компьютерных программ, известных в данной области, таких как GAP, предоставленных в программном пакете GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 5371 1 ) (Needleman, S. B. and Wunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Рекомендовано использование GAP со следующими настройками для сравнения последовательности ДНК: GAP creation penalty - 5. 0 и GAP extension penalty - 0.3. Молекулы нуклеиновой кислоты могут быть выровнены друг с другом с помощью программного обеспечения выравнивания Pileup, доступного как часть пакета программ GCG, используя, например, настройки по умолчанию: gap creation penalty - 5 и gap width penalty - 0.3.
Подходящие экспериментальные условия для определения того, гибридизуется ли данная молекула нуклеиновой кислоты с указанной нуклеиновой кислотой, включают предварительную пропитку фильтра, содержащего соответствующий образец нуклеиновой кислоты, который должен быть исследован, в 5 × SSC в течение 10 минут, и предварительную гибридизацию фильтра в растворе 5 × SSC, 5 x растворе Денхардта, 0,5% SDS и 100 мкг/мл денатурированной ультразвуком ДНК спермы лосося, затем гибридизацию в том же растворе, содержащем P -dCTP-меченую пробу в концентрации 10 нг/мл в течение 12 часов при приблизительно 45<0>C в соответствии с методами гибридизации, как описано в Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2-е издание, Cold Spring Harbor, New York). Затем фильтр дважды промывают в течение 30 минут в 2 х SSC, 0,5% SDS по меньшей мере 55 <0>C (низкая жесткость), по меньшей мере 60 <0>C (средняя жесткость), по меньшей мере 65 <0>C (средняя/высокая жесткость), по меньшей мере 70 <0> C (высокая жесткость) или по меньшей мере 75 <0> C (очень высокая жесткость). Гибридизация может быть обнаружена путем воздействия фильтра на рентгеновскую пленку.
Молекулы нуклеиновых кислот согласно изобретению могут быть представлены в виде молекулы нуклеиновой кислоты как таковой; вектора; вируса или клетки-хозяина и т.д. Векторы включают векторы экспрессии, которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению.
Клетки-хозяева
В следующем варианте осуществления изобретения предлагается клетка-хозяин, трансформированная нуклеиновой кислотой или rSPV в соответствии с изобретением. Такие клетки могут продуцировать rSPV по изобретению. Подходящие примеры клеток-хозяев известны специалистам в данной области или могут быть легко выбраны специалистами в данной области. Клетки-хозяева предпочтительно представляют собой эукариотические клетки, такие как клетки млекопитающих (например, свиньи), грибковые клетки (например, Saccharomyces cerevisiae, pichia, aspergillus, fusarium), клетки насекомых и растительные клетки. Конкретными примерами клеток-хозяев являются клетки почки свиньи, такие как клетки ESK-4 (CL-184).
Композиции вакцин и методы
Используемый здесь термин «вакцина» включает любую композицию, которая может быть использована для вызывания, стимуляции или усиления иммунного ответа против патогена у животного (например, свиней). Конкретными примерами вакцин по изобретению являются композиции, способные вызывать или стимулировать или усиливать иммунитет против вируса PCV2. В вакцине по изобретению по меньшей мере одна последовательность инородных генов должна кодировать антиген или адъювант.
Термин «иммунизация» включает в себя процесс доставки иммуногена субъекту. Иммунизация может, например, обеспечивать постоянный высокий уровень антител и/или клеточного ответа, при котором Т-лимфоциты могут убивать или подавлять патоген у иммунизированного животного, не являющегося человеком, такого как свиньи, который направлен против патогена или антигена, воздействию которого животное подвергалось ранее.
Вакцины по изобретению содержат иммунологически эффективное количество rSVP или нуклеиновой кислоты или клетки, как описано выше, в фармацевтически приемлемом носителе.
На практике точное количество, необходимое для иммунологически эффективной дозы, может варьироваться от субъекта к субъекту в зависимости от таких факторов, как возраст и общее состояние субъекта, характер препарата и способ введения. Соответствующее «эффективное количество» может быть определено специалистом в данной области, используя только рутинное экспериментирование. Например, в данной области известны способы определения или титрования подходящих доз вакцины для поиска минимальных эффективных доз, основанные на весе животного, не являющегося человеком, концентрации вакцины и других типичных факторов. В типичном варианте осуществления вакцина содержит унитарную дозу от 10 до 1 000 000 TCID50, предпочтительно от 100 до 1 000 000 TCID50, еще более предпочтительно от 1000 до 100 000 TCID50, rSPV по изобретению. TCID50 обозначает медиану инфекционной дозы для культуры ткани, то есть количество вируса, которое вызывает патологические изменения в 50% зараженных клеточных культур.
Дозировка вакцины, концентрация компонентов в ней и сроки введения вакцины, которые вызывают подходящий иммунный ответ, могут быть определены такими методами, как титрование сыворотки антителами, например, с помощью анализа ELISA и/или анализа нейтрализации сыворотки и/или по оценке вакцинации.
Вакцины могут содержать другие ингредиенты, известные специалисту в данной области техники, такие как фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты, разбавители, адъюванты, стабилизаторы сублимационной сушки, смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-буферные агенты, гелеобразующие или вяжущие добавки или консерванты, в зависимости от пути введения.
Примеры фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов или разбавителей включают, но не ограничиваются ими, деминерализованную или дистиллированную воду; солевой раствор; растительные масла, такие как арахисовое масло, сафлоровое масло, оливковое масло, хлопковое масло, масло кукурузы, кунжутное масло или кокосовое масло; силиконовые масла, включая полисилоксаны, такие как метилполисилоксаны, фенилполисилоксан и метилфенилполизолпоксан; летучие силиконы; минеральные масла, такие как легкое жидкое парафиновое масло или тяжелое жидкое парафиновое масло; сквален; производные целлюлозы, такие как метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы или гидроксипропилметилцеллюлоза; низшие алканолы, например этанол или изопропанол; низшие аралканолы; низшие полиалкиленгликоли или низшие алкиленгликоли, например полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, этиленгликоль, пропиленгликоль, 1, 3-бутиленгликоль или глицерин; сложные эфиры жирных кислот, такие как изопропилпальмитат, изопропилмиристат или этилолеат; поливинилпирролидон; агар; каррагинан; камедь трагаканта или камедь акации, и вазелин. Как правило, носитель или носители образуют от 10% до 99,9% по весу от вакцинной композиции и могут быть забуферены обычными способами с использованием реагентов, известных в данной области, таких как гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, гидрофосфат калия, дигидроген калия фосфат, их смесь и тому подобное.
Примеры адъювантов включают, но не ограничиваются ими, эмульсии «масло в воде», гидроксид алюминия (квасцы), иммуностимулирующие комплексы, неионные блок-полимеры или сополимеры, цитокины (такие как IL- 1, IL-2, IL-7, IFN-[alpha], IFN-[beta], IFN-y, и т.д.), сапонины, монофосфориллипид A (MLA), мурамилдипептиды (MDP) и тому подобное. Другие подходящие адъюванты включают, например, алюминиевый сульфат калия, термолабильный или термостойкий энтеротоксин (ы), выделенный из Escherichia coli, холерный токсин или его B субъединица, дифтерийный токсин, столбнячный токсин, коклюшный токсин, неполный или полный адъювант Фрейнда и т.д. Адъюванты на основе токсинов, такие как дифтерийный токсин, столбнячный токсин и коклюшный токсин, могут быть инактивированы до использования, например, путем обработки формальдегидом.
Примерами стабилизатора сублимационной сушки могут быть, например, углеводы, такие как сорбитол, маннитол, крахмал, сахароза, декстран или глюкоза, белки, такие как альбумин или казеин, и их производные.
Вакцины могут включать антигены от нескольких патогенов, таких как PCV2, Actinobacillus pleuropneunomia; аденовирус; альфавирус, такой как вирус восточного энцефаломиелита лошадей; Balantidium coli; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., предпочтительно B. hyodyentheriae, B.pilosicoli, B. innocens, Brucella suis, предпочтительно биовары 1, 2 и 3; классический вирус свиной лихорадки, африканский вирус свиной лихорадки; Chlamydia и Chlamydophila sp. и предпочтительно C. pecorum и C. abortus; Clostridium spp., предпочтительно Cl. Difficile, Cl. Perfringens типа A, B и C, Cl.novyi, Cl.septicum, Cl.tetani; пищеварительный и респираторный коронавирус; Cryptosporidium parvum; Eimeria spp; Eperythrozoonis suis, в настоящее время называемый Mycoplasma haemosuis; Erysipelothrix rhusiopathiae; Escherichia coli; Haemophilus parasuis, предпочтительно подтипы 1, 7 и 14; вирус гемагглютинирующего энцефаломиелита; Lsospora suis; вирус японского энцефалита; Lawsonia intracellulars; Leptospira spp., предпочтительно Leptospira australis, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira icterohaemorrhagicae, Leptospira interrogans, Leptospira Pomona и Leptospira tarassovi; Mannheimia haemolytica; Mycobacterium spp. предпочтительно M. avium, M. intracellular и M.bovis: Mycoplasma hyponeumoniae; парвовирус; Pasteurella multocida; свиной цитомеголовирус; паровирус свиней, вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней: вирус псевдорецептов; ротавирус; вирус Sagiyama; Salmonella spp. предпочтительно S. thyhimurium и S.choleraesuis; Staphylococcus spp. предпочтительно S. hyicus; Streptococcus spp., предпочтительно Strep, suis; цитомегаловирус свиней; вирус свиного герпеса; вирус свиного гриппа; вирус свиной оспы; Toxoplasma gondii; Визикулярный стоматит и/или вирус экзантемы свиней.
Вакцинными композициями по изобретению могут быть жидкие составы, такие как водный раствор, эмульсия вода-в-масле или масло-в-воде, сироп, эликсир, настойка, препарат для парентерального, подкожного, внутрикожного, внутримышечного или внутривенного введения (например, инъекционное введение), такие как стерильные суспензии или эмульсии. Такие составы известны в данной области и обычно получают путем растворения антигена и других типичных добавок в соответствующих системах носителя или растворителя. Жидкие составы также могут включать суспензии и эмульсии, которые содержат суспендирующие или эмульгирующие агенты.
Способ введения может быть подкожным, через слизистые оболочки или через парентеральный путь (внутрикожный, внутримышечный, подкожный, внутривенный или внутрибрюшинный). Вакцину по изобретению можно удобно вводить интраназально, трансдермально (то есть наносить на поверхность кожи для системной абсорбции), парентерально, окулярно и т.д. Парентеральный путь введения включает, но не ограничивается ими, внутримышечные, внутривенные, внутрибрюшинные пути и тому подобные.
Вакцины по изобретению можно вводить в виде разовых доз или в повторных дозах. Вакцины по изобретению могут вводиться отдельно или могут вводиться одновременно или последовательно с одной или несколькими дополнительными композициями, такими как, например, другие свиные иммуногенные или вакцинные композиции. Когда композиции вводят в разное время, введения могут быть отделены друг от друга или перекрываться во времени.
Настоящее изобретение также относится к способам иммунизации или индуцирования иммунного ответа у млекопитающего, отличного от человека (например, свиней), включающего введение указанному млекопитающему rSPV или нуклеиновой кислоты, или клетки или вакцины, как описано выше.
Вакцины по изобретению предпочтительно вводят свиньям, взрослым свиньям, а также молодым свиньям, поросятам или беременной свиноматке. Вакцинация беременных свиноматок является предпочтительной, поскольку она может придать пассивный иммунитет новорожденным посредством передачи материнских антител. Возраст свиней может быть менее 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 недели; от 1 до 6 недель; от 2 до 5 недель; или от 3 до 4 недель. Желательно, чтобы вакцина вводилась субъекту, который еще не подвергался воздействию патогена.
Настоящее изобретение также предусматривает контейнер, содержащий иммунологически эффективное количество rSPV, нуклеиновой кислоты, клетки или вакцины, как описано выше. Изобретение также относится к наборам для вакцинации, выборочно включающим в себя стерильный контейнер, содержащий иммунологически эффективное количество вакцины, средство для введения вакцины животным и, дополнительно, руководство по применению, включающее в себя информацию по введению иммунологически эффективного количества композиции для лечения и/или предотвращения инфекционного заболевания.
Вакцина PCV2
Изобретение особенно подходит для лечения (профилактического лечения) инфекции PCV2 и связанных с ней заболеваний.
В настоящее время разработанные вакцины PCV2, такие как Circovac (Merial), Ingelvac, CircoFLEX (Boehringer lngelheim Vetmedica) или Suvaxyn, являются либо инактивированными вакцинами PCV2, либо вакцинами, содержащими субъединицы. В вакцинах, содержащих субъединицы PCV2, обычно используют очищенный рекомбинантный капсидный белок PCV2A, полученный рекомбинантной экспрессией гена ORF2 PCV2A. В этом отношении белок, кодируемый геном ORF2 PCV2 изолята Imp1011, был описан в EP1741785. Белок, кодируемый ORF2 PCV2 изолята PCV2Rm, был зарегистрирован в WO 02010/061000. Белок, кодируемый ORF2 изолята 412 PCV2, был описан в EP1816200. Другой белок, кодируемый ORF2 другого PCV2-изолята, описан в EP1036180 или EP2225367. Улучшенные синтетические белки типа ORF2 описаны в WO2013 / 030320 и WO 024/167060.
В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение относится к rSPV, как определено выше, в котором последовательность инородных генов кодирует антиген PCV2, более предпочтительно белок PCV2, полипептид или пептид. В более предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к rSPV, как определено выше, в котором последовательность инородных генов кодирует полипептид PCV2 ORF2 или его фрагмент. В конкретном варианте осуществления ORF2 выбирают из ORF2 PCV2 изолятов Imp1011, PCV2Rm или 412 или из ORF2, имеющих по меньшей мере 80% идентичности последовательности с такими белками, или его иммуногенный фрагмент, содержащий по меньшей мере 10, 15, или, более предпочтительно, не менее 20 близких аминокислотных остатков.
Еще один аспект изобретения относится к способам лечения и/или предотвращения ассоциированного с PCV2 заболевания у млекопитающего, отличного от человека, и к способам иммунизации или вакцинации животного, отличного от человека, такого как свиньи, свиноматки, поросята, против инфекции PCV2, включающим введение указанному животному rSPV, нуклеиновой кислоты, клетки или вакцинной композиции, как определено выше.
Инфекции PCV2 или связанные с ними заболевания включают, среди прочего, синдром постсезонной мультисистемной атрофии (PMWS), синдром свиного дерматита и нефропатии (PDNS), комплекс респираторных заболеваний свиней (PRDC), репродуктивные расстройства, гранулематозный энтерит, экссудативный эпидермит, некротизирующий лимфаденит и врожденный тремор. Предпочтительно, животное отличное от человека, такое как свинья, защищено в такой степени, в которой все неблагоприятные физиологические симптомы или последствия инфекций PCV2 значительно снижаются или полностью предотвращаются.
В одном варианте осуществления вакцинные композиции по изобретению вводят свиньям, тем или иным образом подверженным риску инфицирования PCV2, для улучшения собственных способностей иммунного ответа.
Предпочтительно, субъектом являются свиньи, которые нуждаются в вакцинации против синдрома постсезонной мультисистемной атрофии (PMWS) и/или синдрома свиного дерматита и синдрома нефропатии (PDNS).
Дополнительные аспекты и преимущества изобретения раскрываются в следующем экспериментальном разделе, который иллюстрирует заявленное изобретение.
Примеры
Пример 1. Конструирование плазмид для получения рекомбинантных SPV
(1) Построение pSP92-Ess_ORF2 (фиг. 1)
Геномную ДНК SPV получали следующим образом:
Штамм SPV kasza (VR-363) и эмбриональные клетки почки свиньи, клетки ESK-4 (CL-184), можно было приобрести в Американской коллекции типовых культур (ATCC). Клетки ESK-4 обычно культивировали при 37°С в 5% CO2 в среде Ham’s F-12K (Gibco, Cat. No.: 15140-122), дополненной 1% стрептомицин-пенициллином (Gibco, Cat. No.: 15140 -122) и 5% FBS (Gibco, Cat. No.: 10437-028). Для получения геномной ДНК SPV слитые клетки ESK-4 инфицировали SPV в 225 см2-колбе и инкубировали в течение 6 дней, пока клетки не проявили 100%-ный цитопатический эффект (CPE). Затем инфицированные клетки собирали путем соскабливания клеток в среду и центрифугирования при 1300 об / мин в течение 5 мин. Среду декантировали, и осадок клеток осторожно ресуспендировали в 2 мл солевого раствора фосфатного буфера (PBS: 1,5 г Na2HPO4, 0,2 г KH2PO4, 0,8 г NaCl и 0,2 г KCl на литр H2O) и подвергали двум последовательным процедурам замораживания-оттаивания. Затем клеточные обломки удаляли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин при 4°С. Вирионы SPV, присутствующие в надосадочной жидкости, затем осаждали путем центрифугирования при 20 000 × g в течение 20 мин при 4°С. Полученный осадок затем суспендировали с 10 мМ Трис, pH 7,5. Геномные ДНК SPV затем экстрагировали из вирионов SPV путем суспендирования буфером для лизиса (20 мМ Трис, рН 9, 0,1 М NaCl2, 5 мМ ЭДТА, 0.1% SDS, 0,2 мг/мл протеиназы K) и инкубации при 60°С в течение 5 мин. Фенол: хлороформ (1: 1) экстракцию проводили два раза, и образец осаждали путем добавления двух объемов этанола и центрифугирования. Супернатант декантировали и осадок (ДНК SPV) сушили на воздухе и повторно гидратировали в 10 мМ Трис, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА при 4°С.
Фланкирующие области гена связывающего белка интерлейкина-18 (IL-18bp) в геноме SPV клонировали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Два праймера (синтетические олигонуклеотиды), SP6030F и SP9574R, показанные в SEQ ID NO: 1 и 2, были приобретены у Takara Bio. Реакцию ПЦР проводили с использованием полимеразы LA Taq (Takara Bio) и набора праймеров SP6030F и SP9574R с ДНК SPV в качестве матрицы в соответствии с протоколом производителя.
SEQ ID NO: 1: CGAATTCATTCCTTTATCTTTA
SEQ ID NO: 2: GGAACTACGTTATACGATCAT
Амплифицированная ДНК размером около 3,5 kbp была подтверждена электрофорезом на 0,8% агарозном геле и очищена от геля с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Очищенный фрагмент ДНК клонировали в вектор pCR4-TOPO (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. 12 белых ампициллин-резистентных трансформантов собирали и выращивали в бульоне LB, содержащем 50 мкг / мл ампициллина, и каждую плазмиду готовили с помощью QuickLyse Miniprep Kit (Qiagen). Каждая плазмида была расщеплена ScaI, и были выбраны два вида плазмид-кандидатов (оба направления встроенной ДНК). Встроенные ДНК из них были секвенированы реагентом циклического секвенирования Dye Terminator Cycle Sequencing reagent (DTCS) и CEQ2000XL (Beckman Coulter). Было подтверждено, что одна из кандидатов-плазмид pCR-SPV6030/9574 (# 1) содержала фрагмент ДНК от 6,030 nt до 9,574nt геномной ДНК SPV (GeneBank Acc: NC_003389), и далее она использовалась в качестве основной плазмиды (фиг. 1).
Затем был проведен ПЦР-мутагенез для удаления части гена IL-18bp и введения множества сайтов рестрикционных ферментов с использованием pCR-SPV6030/9574 (# 1) в качестве матрицы и с использованием двух типов наборов праймеров, (1) SEQ ID NO: 3 и 4 или (2) SEQ ID NO: 5 и 6.
SEQ ID NO: 3: TTCGCCCTTACGGTACCATTCCTTTATCTTTATAAACG
SEQ ID NO: 4: CTATAATATTAAATAAGCTTTATGGAGTTGTTTAAATAC
SEQ ID NO: 5: CACACGATAACACTGCAGTCCACATATTACGGTTC
SEQ ID NO: 6: GCCGCGAATTCGCCCTCGAGGAGCTCACTACG
Каждый продукт ПЦР применяли к электрофорезу в 0,8% агарозном геле и очищали с использованием набора QIAquick Gel Extraction Kit. Очищенный фрагмент ДНК, который амплифицировали с помощью ПЦР с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 3 и 4, расщепляли двумя рестрикционными ферментами KpnI и HindIII и лигировали теми же рестрикционными ферментами-cut-pBluescript KS (+) ( Stratagene). Полученную плазмиду pBS-9L (Kpn.Hin) (фиг. 1) расщепляли SacI и PstI, и тот же фрагмент ДНК с рестрикционными ферментами, амплифицированный с помощью ПЦР с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 5 и 6, был встроен в неё. Полученную плазмиду назвали pSP90 (фиг. 1).
Между сайтами EcoRI и HindIII с множественными сайтами рестрикции pSP90 были заменены олигонуклеотидным адаптером, полученным отжигом двух синтетических ДНК-олигонуклеотидов SEQ ID NO: 7 и 8. Полученную плазмиду назвали pSP91 (фиг. 1).
SEQ ID NO: 7:
AATTGCCCGGGTACCGTCGATCGACTTTTTATGGCCCCCCCGGCCA
SEQ ID NO: 8:
AGCTTGGCCGGGGGGGCCATAAAAAGTCGATCGACGGTACCCGGGC
ДНК-фрагмент кассеты гена P7.5-промотор -LacZ ', полученный из pNZ76, который был разрезан HindIII и SmaI pNZ76 с последующим притуплением ДНК-полимеразой (описанный в USP5,387,519), лигировали в SmaI-сайт pSP91. Полученную плазмиду назвали pSP92 (фиг. 1), а кассету гена P7.5-LacZ 'встраивали в ген IL-18bp (от 8,146 nt до 7,745nt в геноме SPV).
Фрагмент BglI-cut-fragment размером 0.8kb, полученный из pGTPs-Ess_ORF2 (пример 1 из WO2014 / 167060), встраивали в SfiI-сайт pSP92 и полученную плазмиду называли pSP92-Ess_ORF2 (фиг. 1). Эта плазмида включала в себя «генную кассету с сильным поксвирусом (Ps) -Ess_ORF2 (модифицированный PCV2-ORF2)» также в гене IL-18bp и использовалась в качестве гомологичной плазмиды для получения рекомбинантного SPV, SVR12.
(2) Построение pSP911-EssORF2 (фиг. 2)
Последовательность между KpnI и PstI pSP91 была заменена синтетическим адаптером, показанным в SEQ ID NO: 9, для добавления в него промотора 11-kD вируса вакцины (the vaccinia virus). Полученную плазмиду обозначали как pSP911.
SEQ ID NO: 9:
GGTACCGAGCTCGGTAGCCCGGGCCATGGTAGATCCTCTAGAGGATCCAATTCATTTATAGCATAGAAAAAAACAAAATGAAATTCTACTATATTTTCTGCAG
Синтетическая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая модифицированный ORF2 PCV2 (Ess_ORF2), была получена путем переваривания pGTPs-Ess_ORF2 с помощью BamHI и SalI и встроена в разрез pSP911 с помощью BamHI и SalI. Полученную плазмиду обозначали как pSP911-Ess_ORF2 и использовали для получения рекомбинантных вирусов свиной оспы SVR13.
Пример 2. Получение рекомбинантных вирусов свиной оспы (rSPVs)
(1) Получение SVR12 (фиг. 3)
Рекомбинантный SPV был получен в клетках ESK-4 путем гомологичной рекомбинации между геномом SPV дикого типа и векторами гомологии. Субконфлюэнтные клетки ESK-4 в 6-луночном планшете были инфицированы SPV дикого типа (wtSPV), а через 17 часов инфицированные wtSPV клетки подвергали трансфекции 2 мкг pSP92-Ess_ORF2 с использованием реагента Lipofectamin Plus (Invitrogen) и инкубировали при 37°С в течение 5 дней до появления цитопатического эффекта (СРЕ). Клеточные лизаты из инфицированных трансфецированных клеток подвергали скринингу на рекомбинантные бляшки, экспрессирующие β-галактозидазу, путем добавления 0,5 мг/мл Bluo-gal (Invitrogen Cat. No.: 15519-028) в питательный верхний слой агарозы. Два независимых свободных от wtSPV рекомбинантных вируса очищали через 3-4 раунда скрининга. Очищенный rSPV обозначался как SVR12. Два очищенных клона SVR12 обозначали 1Н2С9D4G5 и 2F5D5E5 клоны.
(2) Получение SVR13 (фиг. 3)
o
o
Субконфлюэнтные клетки ESK-4 в 6-луночном планшете были инфицированы SPV дикого типа (wtSPV), а через 17 часов инфицированные wtSPV клетки подвергали трансфекции 2 мкг pSP911-Ess_ORF2 с использованием реагента Lipofectamin Plus (Invitrogen) и инкубировали при 37°С до появления цитопатического эффекта (СРЕ). Клеточные лизаты из инфицированных трансфецированных клеток представляли собой трансфекционные семена (TFS) для SVR13. TFS разбавляли в соотношении 1:20 средой Ham’s F-12K без FBS и инфицировали в клетки ESK-4 в 96-луночных планшетах. Через семь дней инфицированные клетки лизировали лизисным буфером (20 мМ Трис-Cl, 0,1 М NaCl, 5 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, 200 мкг/мл протеназы K) с последующей термообработкой (60C 5 мин и 98C 2 мин). Эти образцы ДНК лизированных инфицированных клеток подвергали скринингу посредством ПЦР с помощью набора праймеров 5'-GGCCGTTGATATGATGAGGT-3 '(SEQ ID NO: 10) и 5'-TCCAGCACTGGCTTAGGAGT-3' (SEQ ID NO: 11).
Образцы, амплифицирующие фрагмент ДНК 0,3kbp, были положительными, и соответствующие супернатанты были перенаправлены на следующую стадию скрининга. Скрининг повторяли до тех пор, пока все появлявшиеся бляшки не были окрашены иммунофлуоресцентным анализом (IFA) с использованием сыворотки свиней против PCV2 (PAB-PCV2, VMR) в качестве 1-го антитела и FITC-конъюгированного IgG против свиньи (F1638-2ML, SIGMA) в качестве вторичного антитела.
Два свободных от wtSPV рекомбинантных клона SVR13 очищали от TFS через три раунда скрининга и обозначали как клоны G2C2D4 и D10E5A5.
Пример 3: in vitro анализ рекомбинантных SPV
(1) Экспрессия генов PCV2-ORF2 с помощью вестерн-блоттинга
Молекулярные размеры белков PCV2-ORF2, экспрессируемых rSPVs, анализировали с помощью 15%-ного SDS-PAGE и вестерн-блот-анализа с использованием анти-PCV2-крысиных сывороток. Клетки ESK-4 были инфицированы клоном SVR12 1H2C9D4G5, клоном 2F5D5E5, SVR14, SVR15 или wtSPV. Шесть дней спустя клеточные лизаты фракционировали на 15% -ной SDS-PAGE. Белки переносили на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) Immobilon-P (Merk Millipore, Cat. No.:IPVH08130) и блокировали 5% сухим молоком в PBS. PDVF-мембранные блоты зондировали крысиной анти-PCV2-сывороткой (1: 1000) в качестве 1-го антитела с последующим взаимодействием с биотином, конъюгированным с вторичным козьим анти-крысиным IgG (1: 1000), и VECTASTAIN ABC-AP Standard Kit (Vector Labs, АК-5000). Мембранные блоты были разработаны с субстратом щелочной фосфатазы, Nitroblue Tetrazolium (NBT) / 5-Бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP).
Результаты вестерн-блоттинга показали, что SVR12 и SVR13 представляют собой два вида ORF2, молекулярные размеры 27 кДа и 25 кДа (фиг. 4). Форма первого белка 27 кДа соответствует форме предшественника, а форма второго белка 25 кДа соответствует обработанной форме, полученной после расщепления в конце сигнального пептида B5R. Эти результаты, таким образом, демонстрируют эффективную экспрессию антигенов из SPV по изобретению.
(2) Долгосрочная стабильность и экспрессия гена PCV2-ORF2
Чтобы проверить стабильность rSPV по изобретению с использованием гена IL-18bp в качестве сайта для введения, SVR12 и SVR13 были переданы в клетки ESK-4 15 раз. Стабильность и экспрессию встроенных генов после 15проходов проверяли с помощью ПЦР и вестерн-блоттинга. Результаты ПЦР показали, что встроенные гены всех rSPV были стабильными после 15x in vitro проходов (фиг. 5). Никакая полоса нерегулярных размеров генных продуктов PCV2-ORF2 не появлялась в полосах x15 in vitro проходов на PDVF мембране по сравнению с x0 проходов в вестерн-блот-анализе.
(3) Рост рекомбинантов в нецелевых клетках животных
Важной задачей является безопасность в среде генетически модифицированной живой вакцины. В качестве оценки риска безопасности SPV можно проверить способность к инфекционному воздействию или росту в нецелевых животных или клеточных линиях. SPV обычно не растут в клетках HeLa, а могут расти в клетках Vero. Клетки Vero были широко протестированы, и было показано, что они свободны от посторонних агентов и наиболее широко приняты регулирующими органами для использования в производстве вакцин, таких как вакцины против полиомиелита и диареи у свиней.
Клетки Vero (ATCC CCL-81, коммерческая клеточная линия, полученная из почки африканской зеленой обезьяны), культивируемые в 6-луночных планшетах, были инфицированы в отдельных культурах тремя SPV: SVR12 и двумя сравнительными SPV, а именно SVR3, который содержит ген ORF2 в клонирующем сайте ARP и SVR7, который содержит ген ORF2 в клонирующем сайте TK. Инфицирование проводилось при двух вариантах инфекции (MOI) (высокая: ~ 0,01 и низкая: ~ 0,001), и клетки культивировали в 37°C инкубаторе с 5% CO2 в течение двух недель после заражения. Через 0, 4, 7, 11 и 14 дней после инфицирования (DPI) инфицированные клетки и супернатанты восстанавливали, замораживали и оттаивали. Количество инфекционных вирусов в пробах 0, 4, 7, 11 и 14 DPI титровали методом TCID50 с использованием клеток ESK-4 в 24-луночных планшетах.
Результаты суммированы в таблице 1 и на фиг. 6. Относительные отношения роста к каждому титру «0 DPI» показаны в круглых скобках в таблице 1, а временной ход относительных коэффициентов роста изображен на фиг. 6. Результаты на удивление показывают, что способность роста рекомбинантных SPV зависит от сайтов вставки и что рекомбинантные SPV по изобретению с использованием гена IL-18bp в качестве сайта вставки преимущественно не растут в клетках Vero.
Это является дополнительным преимуществом рекомбинантных SPV по изобретению с использованием гена IL-18bp в качестве сайтов вставки с точки зрения более низкого риска для окружающей среды.
Таблица 1. Рост rSPV в клетках Vero
Вирус
MOI
Титр вируса: TCID50/well (Ratio to 0 DPI)
0 DPI
4 DPI
7 DPI
11 DPI
14 DPI
SVR 3
ВысокаяНизкая
4,8Е+04(1,0)4,8Е+03(1,0)
6,3Е+05(13,1)8,5Е+04(17,7)
8,5Е+05(17,7)1,4Е+05(29,2)
6,3Е+05(13,1)8,5Е+04(17,7)
4,2Е+05(8,7)6,3Е+04(13,1)
SVR 7
ВысокаяНизкая
4,8Е+04(1,0)4,8Е+03(1,0)
4,2Е+05(8,8)4,8Е+04(10,0)
4,2Е+05(8,8)8,5Е+04(17,8)
1,4Е+05(2,8)6,3Е+04(13,1)
1,4Е+05(2,8)1,4Е+04(2,8)
SVR 12
ВысокаяНизкая
8,5Е+03(1,0)8,5Е+02(1,0)
4,8Е+03(056)4,2Е+02(049)
4,2Е+03(0,49)1,4Е+02(0,16)
8,5Е+02(0,10)8,5Е+01(0,10)
1,4Е+02(0,02)6,3Е+01(0,07)
Пример 4. Индуцирование иммунного ответа in vivo
Группы (N = 7) анти-PCV2-негативных поросят возрастом 4 недели иммунизировали подкожно в левое ухо каждым из рекомбинантных SPV, SVR7 или SVR12 (5.0E + 04 TCID50 / свинью) или PBS. Образцы крови брали из наружной яремной вены до иммунизации, через 1, 2 и 3 недели после иммунизации (wpi), и антитела против PCV2 в сыворотке измеряли с помощью непрямой иммунофлуоресценции. PCV2-инфицированные клетки RPL-2 культивировали на 96-луночных планшетах для культивирования тканей и фиксировали ацетоном/метанолом (2: 1). После блокировки 0,5% нежирным молоком в PBS в течение 1 часа двухкратные разведения сывороток наносили на 96-луночные планшеты для культивирования тканей и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Серийно разведенные сыворотки свиньи PAB-PCV2 (VMRD) также наносили на один ряд каждого 96-луночного планшета в качестве положительных контрольных сывороток. После инкубации планшеты промывали 3 раза, а антитела IgG-FITC против свиньи, полученные у кролика (SIGMA Cat. #: F1638, 1: 1000), наносили на 96-луночные планшеты для культивирования тканей и инкубировали в течение 1 часа при 37ºC. После инкубации планшеты трижды промывали PBS. Сигналы вторичных антител выявляли с помощью флуоресцентной микроскопии и регистрировали положительный или отрицательный сигналы каждой лунки. Наибольшее разведение, приводящее к положительной флуоресцентной реакции, принимали за IF- титр образца, и экспериментальные ошибки между планшетами и днями были откалиброваны с помощью IF-титра (1: 2560) положительных контрольных сывороток.
Полученные результаты показывают, что средние IF-титры вакцинированной SVR12 группы статистически значимо (p <0,05) выше, чем у вакцинированной SVR7 группы. Кроме того, от 1 до 3 недель после иммунизации (wpi) было начато клиническое наблюдение за формирующимися оспинами или покраснением на участках вакцинации. Пиковые размеры оспин вакцинированной SVR12 группы были меньше, чем у вакцинированной SVR7 группы.
Вышеприведенные результаты показывают, что rSPV по изобретению, в котором инородный ген встроен в ген IL-18bp, такой как SVR12, был более ослаблен и мог индуцировать более высокие иммунные ответы, чем rSPV, с использованием сайта TK в качестве сайта вставки, такой как SVR7.