Способ приготовления импрессионно-цитологического микропрепарата при помощи комбинированного просветляющего раствора
METHOD FOR PREPARATION OF IMPRESSION-CYTOLOGICAL MICRO-PREPARATION, USING COMBINED CLARIFYING SOLUTION

Изобретение относится к медицине, и касается химической обработки ацетат-целлюлозы, что может применяться в клинической и экспериментальной медицине для мгновенного оптического просветления диагностического ацетат-целлюлозного диска (с коэффициентом пропускания света аналогичным с предлагаемым раствором), в частности для приготовления импрессионно-цитологического микропрепарата с целью создания возможности его последующей микроскопии (световой, флюоресцентной, конфокальной и т.д.), а также в химической и технической промышленности для оптического просветления ацетат-целлюлозных листов.
Зрительная реабилитация пациентов с помутнениями роговицы в основном связана с операцией оптической кератопластики. В то же время при сосудистых бельмах эта операция рассматривается как кератопластика «высокого риска», так как при ней существует большая вероятность рецидива сосудистого помутнения роговицы. Одной из главных причин формирования таких помутнений является дисфункция расположенных в складках палисада Vogt [Nakamura T, et al. Ocular surface reconstruction using stem cell and tissue engineering // Progress in retinal and eye research. - 2016. -Vol. 51. - P. 187-207.] роговичной части лимба стволовых клеток эпителия роговичного фенотипа (лимбальных эпителиальных стволовых клеток - ЛЭСК). Популяция этих клеток обеспечивает постоянное восполнение нормального эпителиального покрова роговицы, в том числе и при его повреждениях. Она также играет роль барьера для нарастания на нее конъюнктивального эпителия. Дисфункция ЛЭСК является следствием их частичного повреждения или полной гибели при травмах, ожогах и некоторых заболеваниях глазной поверхности. [Burman S, et al. Ophthalmic application of preserved human amniotic membrane: a rewiew of current imdications // Cell and Tissue Banking. - 2004. - №5. - P. 161-175; Lavker R, Tseng S, Sun T. Corneal epithelial stem cells at the limbus: looking at some old problems from a new angle // Experimental eye research. - 2004. - Vol. 78. - P. 433-446.]. Клинически она проявляется состоянием, получившим название лимбальной недостаточности [Holland E.J. Management of limbal stem cell deficiency: a historical perspective, past, present, and future // Cornea. -2015. -Vol. 34. - P. 9-15.], при которой на роговицу нарастает эпителий конъюнктивы, содержащий (в отличие от роговичного эпителия) бокаловидные клетки.
Факт наличия бокаловидных клеток в покрывающем роговицу эпителии, является надежным индикатором лимбальной недостаточности. Именно поэтому он лег в основу разработанной в 2013 году (рационализаторское предложение №13663/6 от 28.10.2013 Авторы: Чурашов С.В., Чирский B.C., Григорьевский Д.И., Карпович В.В., Злобин И.А.) на кафедре офтальмологии имени профессора В.В. Волкова ВМедА им. С.М. Кирова, методики прижизненной (витальной) оценки фенотипа покрывающего роговицу эпителия - импрессионной цитологии роговицы, показавшей высокую информативность в определении бокаловидных клеток ее эпителия. Однако на подготовку импрессионно-цитологического микропрепарата по этому методу исследователь вынужден тратить более 1 часа, а одновременная подготовка нескольких образцов сопряжена с риском допущения технологических ошибок, не позволяющих провести цитологическую оценку материала.
Таким образом в настоящее время для решения задачи приготовления импрессионно-цитологического микропрепарата пригодного к последующей микроскопии (световой, флюоресцентной или конфокальной) применяются аналоги, которые ввиду своих технологических особенностей не позволяют быстро и серийно выполнить забор клеточного материала, а оптическое просветление ацетат-целлюлозного диска либо сопряжено с рядом трудностей и не позволяет добиться его полной прозрачности, либо вовсе не описано.
Одним из аналогов предлагаемого изобретения является предложенный в 1977 году способ «простой конъюнктивальной биопсии» [Egbert P.R. А simple conjunctival biopsy / Egbert P.R., Lauber S., Maurice D.M. // Am J Ophthalmol. -1977. - Vol. 84, №6. - P. 798-801.], согласно которому забор клеточного материала для импрессионной цитологии осуществляли с помощью аппликаторов из синтетической ацетат-целлюлозной фильтровальной бумаги. Перед аппликацией нарезали полоски из этой бумаги размерами 2×6 мм. Аппликацию проводили на различных участках бульбарной и тарзальной конъюнктивы пациента. После забора клеточного материала для транспортировки в исследовательскую лабораторию ацетат-целлюлозные аппликаторы помещали в специальный контейнер. Морфологическую оценку клеток конъюнктивы и выявление бокаловидных клеток проводили с помощью световой микроскопии. Перед окрашиванием полученного клеточного материала периодической кислотой Шиффа проводили его фиксацию в 96% этиловом спирте.
Таким образом способ «простой конъюнктивальной биопсии» впервые показал перспективы применения ацетат-целлюлозных аппликаторов. Однако данный способ имеет ряд недостатков:
1. ацетат-целлюлозные аппликаторы имеют вид полосок, что не позволяет выполнить одномоментный забор поверхностных эпителиоцитов со всей исследуемой поверхности;
2. не указан диапазон размеров пор диагностических ацетат-целлюлозных аппликаторов;
3. способ предусматривает применение только в целях цитологического исследования конъюнктивальной поверхности;
4. окрашивание полученного клеточного материала периодической кислотой Шиффа занимает не менее 30 минут;
5. кроме того, окраска по Шиффу приводит к равномерному и диффузному прокрашиванию бокаловидных клеток, что препятствует определению ядерно-цитоплазматического отношения, оценка которого важна для выявления дистрофических изменений в исследуемом эпителии;
6. не описана методика оптического просветления ацетат-целлюлозного диска.
Указанные недостатки частично устранены в другом аналоге предлагаемого изобретения, описанном в 1983 году, в котором акцентируется необходимость применения ацетат-целлюлозных аппликаторов с диаметром пор 0,22-0,44 мкм, что объясняется наилучшей сохранностью полученного клеточного материала [Nelson J.D. Cellulose acetate impressions of the ocular surface. Dry eye states / Nelson J.D., Havener V.R., Cameron J.D. // Arch Ophthalmol. -1983. - Vol. 101, №12. - P. 1869-1872.]. Вместе с тем, и этот способ не позволяет выполнить одномоментный забор поверхностных эпителиоцитов со всей исследуемой поверхности, предусматривает применение только в целях цитологического исследования конъюнктивальной поверхности, предусматривает длительное окрашивание бокаловидных клеток, а методика оптического просветления ацетат-целлюлозного диска не описана.
Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является, разработанная на кафедре офтальмологии имени профессора В.В. Волкова ВМедА им. С.М. Кирова, методика импрессионной цитологии роговицы (рационализаторское предложение №13663/6 от 28.10.2013, Авторы: Чурашов С.В., Чирский B.C., Григорьевский Д.И., Карпович В.В., Злобин И.А.), которая и была выбрана в качестве прототипа.
Техника проведения импрессионной цитологии роговицы начинается с забора поверхностных клеток покрывающего роговицу эпителия путем аппликации миллипорового ацетат-целлюлозного аппликатора (диаметр пор 0,45-0,47 мкм) с последующей его покраской гематоксилином-эозином и альциановым синим по стандартной методике [Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. - 4-е изд. - Л.: МЕДГИЗ, 1961. - 343 с.] и химическим просветлением. Таким образом, определен диапазон размеров пор диагностических ацетат-целлюлозных аппликаторов, имеется возможность исследовать не только эпителий конъюнктивы, но и роговицы, благодаря применению красителя «альциановый синий» время окраски бокаловидных клеток сокращено до 5 минут (то есть в 6 раз), а изолированная окраска цитоплазмы не препятствует определению ядерно-цитоплазматического отношения.
Однако, общее время подготовки такого цитологического препарата занимает более 1 часа, не менее 20 минут, из которых приходится на химическое просветление ацетат-целлюлозного диска, которое заключается в последовательной обработке ацетат-целлюлозного диска в растворах орто-ксилола и изопропилового спирта с экспозицией 10 мин при каждой обработке. При этом данный метод просветления диагностического диска не позволяет добиться коэффициента пропускания света аналогичного с просветляющим раствором (то есть полной прозрачности относительно просветляющих растворов), а срок сохранения прозрачности импрессионно-цитологического препарата напрямую зависит от скорости выполнения технологических этапов методики, что негативно сказывается на качестве диагностики ввиду ухудшения оптических свойств импрессионно-цитологического микропрепарата.
Таким образом, основные недостатки прототипа, следующие:
1. способ не позволяет добиться коэффициента пропускания света аналогичного с просветляющими растворами (то есть полной прозрачности относительно просветляющих растворов);
2. подразумевает длительную экспозицию в просветляющих растворах (20 минут);
3. быстрое высыхание просветляющих растворов на поверхности диагностического диска, при его извлечении, приводит к его быстрой (в течение 7-10 секунд) потере оптической прозрачности;
4. срок сохранения прозрачности импрессионно-цитологического препарата напрямую зависит от скорости герметизации под покровным стеклом помещеного на предметное стекло оптически просветленного диагностического диска;
5. при нарушении технологии обработки в просветляющих растворах диагностический диск приходит в негодность, а дальнейшее исследование импрессионно-цитологического препарата становится невозможным;
6. ацетат-целлюлозные аппликаторы имеют вид полосок, что не позволяет выполнить одномоментный забор поверхностных эпителиоцитов со всей исследуемой поверхности;
7. одновременная подготовка нескольких импрессионно-цитологических микропрепаратов сопряжена с риском допущения технологических ошибок, не позволяющих провести цитологическую оценку материала.
Технический результат предлагаемого изобретения - оптимизация приготовления импрессионно-цитологического микропрепарата путем применения адаптированного диагностического ацетат-целлюлозного диска, позволяющего выполнить забор эпителиоцитов со всей роговичной поверхности, использования электромеханической платформы-мешалки для серийной подготовки импрессионноцитологических препаратов, а также применения созданного комбинированного просветляющего раствора, которая при погружении в нее адаптированного диагностического ацетат-целлюлозного диска позволяет добиться мгновенного оптического его просветления (с коэффициентом пропускания света аналогичным с предлагаемым раствором), что дает возможность сократить время приготовления импрессионно-цитологического микропрепарата препарата, улучшить качество его последующей световой микроскопии, снизить вероятность потери оптической прозрачности при извлечении диагностического ацетат-целлюлозного диска из предлагаемого просветляющего раствора, увеличить срок сохранения прозрачности импрессионно-цитологического микропрепарата, а также снизить вероятность нарушения технологии просветления диагностического ацетат-целлюлозного диска без лишних технологических затрат.
Решение поставленной технической задачи обеспечивается тем, что для забора клеточного материала применяется адаптированный диагностический ацетат-целлюлозный диск, имеющий 4 подвижных «лепестка», образованных путем нанесения 4-х взаимно перпендикулярных разреза от края до парацентральной зоны диска, что позволяет ему во время аппликации равномерно прилегать ко всей поверхности роговицы, для серийной подготовки импрессионно-цитологических препаратов используется электромеханическая платформа-мешалка, позволяющая одновременно готовить до 10 импрессионно-цитологических микропрепаратов без риска нарушения технологического процесса, а в состав предлагаемого комбинированного просветляющего раствора входят чистый орто-ксилол и чистый изопропиловый спирт в строгом соотношении 3:1 (3 части орто-ксилола, 1 часть изопропилового спирта), а также дополнительно канадский бальзам в концентрации, равной 0,5 части изопропилового спирта.
Выполнение заявленной технической задачи мгновенного оптического просветления диагностического ацетат-целлюлозного диска, осуществляется благодаря использованию раствора со строгим концентрационным соотношением чистого орто-ксилола (в качестве неполярного разбавителя) и чистого изопропилового спирта (в качестве растворителя для ацетат-целлюлозы), обеспечивающему проникновение предлагаемого раствора в толщу диагностического ацетат-целлюлозного диска с заполнением промежутков между ацетат-целлюлозными волокнами, что ведет к уменьшению рассеивания света и увеличению его коэффициента пропускания света через просветленный диагностический диск. При достижении точного концентрационного соотношения описанных органических растворителей в составе предлагаемого раствора для мгновенного оптического просветления диагностического ацетат-целлюлозного диска (чистого орто-ксилола и чистого изопропилового спирта) в процессе его приготовлении калибровочный ацетат-целлюлозный диск приобретает оптическую прозрачность идентичную с предлагаемым раствором. Добавление в состав предлагаемого раствора для мгновенного оптического просветления диагностического ацетат-целлюлозного диска канадского бальзама в обозначенной концентрации обеспечивает уменьшение интенсивности и увеличение времени испарения предлагаемого раствора с поверхности просветленного диагностического ацетат-целлюлозного диска.
Изобретение поясняется фиг. 1, на которой показан пример способа приготовления импрессионно-цитологического микропрепарата при помощи комбинированного просветляющего раствора. На фиг. 2 показан пример одновременного (серийного) приготовления десяти импрессионно-цитологических микропрепаратов. На фиг. 3 представлен дизайн адаптированного диагностического ацетат-целлюлозного диска.
Пример способа приготовления импрессионно-цитологического микропрепарата при помощи комбинированного просветляющего раствора продемонстрировано на (Фиг. 1):
A. забор клеточного материала с использованием адаптированного диагностического ацетат-целлюлозного диска (1);
Б. окраска клеточного материала на адаптированном диагностическом ацетат-целлюлозном диске (1) клеточным красителем (2) и перемещение окрашенного непросветленного адаптированного диагностического ацетат-целлюлозного диска (1) в предлагаемый комбинированный просветляющий раствор (3);
B. спустя считанные секунды уже прозрачный диагностический ацетат-целлюлозный диск (4) готов к извлечению из предлагаемого комбинированного просветляющего раствора (3);
Г. вид готового импрессионно-цитологического микропрепарата (5), содержащего герметизированный под покровным стеклом прозрачный диагностический ацетат-целлюлозный диск (4). Пример одновременного (серийного) приготовления десяти импрессионно-цитологических микропрепаратов продемонстрировано на (Фиг. 2), где фиксация полученного клеточного материала, прокраска клеток и их отмывание от излишков красителя, а также оптическое просветление адаптированных диагностических ацетат-целлюлозных дисков выполняется в условиях постоянного автоматического перемешивания, обеспечивающееся работой электромеханической платформы-мешалки.
Дизайн адаптированного диагностического ацетат-целлюлозного диска представлен на (Фиг. 3), где 4 взаимно перпендикулярных разреза (6) от края до парацентральной зоны, формируют 4 «лепестка» (7), при этом на верхнем «лепестке» имеется метка (8) в виде небольшого треугольного участка вырезанного из его края.
Технический результат предлагаемого изобретения достигается благодаря тому, что для забора клеточного материала используется адаптированный диагностический ацетат-целлюлозный диск (1), состоящий из 4 взаимно перпендикулярных «лепестков» (7), сформированных 4-мя разрезами (6) от края до парацентральной зоны, и метки (8), располагающейся на верхнем «лепестке» в виде небольшого треугольного участка вырезанного из его края, для одновременного (серийного) приготовления до десяти импрессионно-цитологических микропрепаратов применяется электромеханическая платформа-мешалка (5), представляющая из себя электронно-механическое устройство, обеспечивающее цикличное вращение горизонтальной площадки (с 50 гнездами (по 5 на один образец) для размещения 10 наборов емкостей с необходимыми для подготовки препаратов жидкостями) в горизонтальной плоскости и дающее возможность выбора режима работы платформы («вибрация» / «перемешивание») для регулирования интенсивности перемешивания жидкостей в процессе покраски и просветления адаптированных диагностических дисков, а также оснащенное таймером для автоматического отключения через заданный промежуток времени, а для мгновенного оптического просветления диагностического ацетат-целлюлозного диска применяется комбинированный просветляющий раствор (3) со строгим концентрационным соотношением чистого орто-ксилола (в качестве неполярного разбавителя) и чистого изопропилового спирта (в качестве растворителя для ацетат-целлюлозы), обеспечивающему проникновение предлагаемого раствора в толщу не просветленного диагностического ацетат-целлюлозного диска (1) с заполнением промежутков между ацетат-целлюлозными волокнами, что ведет к уменьшению рассеивания света и увеличению его коэффициента пропускания через прозрачный диагностический ацетат-целлюлозный диск (4). При достижении точного концентрационного соотношения описанных органических растворителей в составе комбинированного просветляющего раствора (3) - чистого орто-ксилола и чистого изопропилового спирта, в процессе его приготовления калибровочный ацетат-целлюлозный диск приобретает оптическую прозрачность идентичную с предлагаемым комбинированным просветляющим раствором. Добавление в состав предлагаемого комбинированного просветляющего раствора (3) канадского бальзама обеспечивает уменьшение интенсивности и увеличение времени его испарения с поверхности прозрачного диагностического ацетат-целлюлозного диска (4).
Предлагаемый способ приготовления импрессионно-цитологического микропрепарата позволяет оптимизировать процесс его приготовления путем применения адаптированного диагностического ацетат-целлюлозного диска, использования электромеханической платформы-мешалки, а также благодаря созданию оптимизированной концентрационной химической композиции для мгновенного оптического просветления диагностического ацетат-целлюлозного диска, что определяет наличие следующих преимуществ перед прототипом:
1. используется комбинированный просветляющий раствор позволяющий добиться показателей прозрачности диагностического ацетат-целлюлозного диска с коэффициентом пропускания света аналогичным с предлагаемым раствором (то есть полной прозрачности относительно просветляющего раствора);
2. подразумевает мгновенное оптическое просветление;
3. увеличено время и уменьшена интенсивность испарения предлагаемого раствора с поверхности прозрачного диагностического ацетат-целлюлозного диска за счет добавления в его состав канадского бальзама, что в 3-4 раза повышает время сохранения прозрачности диагностического диска;
4. увеличен срок сохранения прозрачности импрессионно-цитологического препарата за счет добавления канадского бальзама в состав раствора для мгновенного оптического просветления диагностического ацетат-целлюлозного диска;
5. за счет использования одного комбинированного просветляющего раствора отсутствует риск нарушения технологии оптического просветления диагностического диска;
6. способ позволяет выполнить забор эпителиоцитов со всей роговичной поверхности;
7. имеется возможность выполнять серийную подготовку импрессионноцитологических препаратов.
Таким образом, при использовании предлагаемого способа сокращается время приготовления импрессионно-цитологического микропрепарата препарата, улучшается качество его последующей световой микроскопии, снижается вероятность потери оптической прозрачности при извлечении диагностического ацетат-целлюлозного диска из предлагаемого просветляющего раствора, увеличивается срок сохранения прозрачности импрессионно-цитологического микропрепарата, а также снижается вероятность нарушения технологии просветления диагностического ацетат-целлюлозного диска без лишних технологических затрат.