Криоаппликатор для моделирования глиального рубца посредством прецизионной криоаппликации

Полезная модель относится к экспериментальной медицине, точнее хирургическому биомоделированию, и может быть использована для отработки различных методов и подходов при лечении изолированной травмы спинного мозга, в том числе криодеструкции глиальных тканей животных.
Повреждения спинного мозга являются одной из основных причин инвалидности. Актуальность и социальную значимость функционального восстановления спинальных пациентов трудно переоценить (La Placa МС et al., 2007).
Известен способ моделирования позвоночно-спинномозговой травмы шейного отдела/патент РФ 2154862, опубл. 20.08.2000 г. G09B 23/28/. Для этого проводят анестезию внутрибрюшинным введением калипсола в дозе 50 мг/кг. После наступления наркоза по анатомическим ориентирам идентифицируют 6 - 7-е шейные позвонки. Вводят стерильную иглу диаметром, соответствующим диаметру спинного мозга, перпендикулярно оси позвоночного канала в спинной мозг до ощущения «провала», через 2 мин иглу извлекают. Способ позволяет дозировать спинномозговую травму, минимизировать травмирующие воздействия на прилежащие структуры и ткани, увеличить процент выживаемости лабораторных животных. Недостатками данного способа являются использование дорогостоящего вида животных (кроликов), нестандартность воздействия, двустороннее обширное повреждение спинного мозга, отсутствие данных о моделируемом рубце ввиду отличной цели эксперимента - моделирование не глиального рубца, а собственно травмы спинного мозга.
Известен способ моделирования травмы спинного мозга /патент РФ 2 461071, G09B 23/28, опубл. 2012.09.10/. Для этого моделирование изолированной травмы спинного мозга у лабораторных кроликов проводят на фоне медикаментозной седации рометаром с последующим креплением животного на штативе за верхнегрудной отдел позвоночника с помощью пояса. К нижнегрудному отделу позвоночника крепят пояс с грузом массой 2,25-3,0 кг. Проводят тракцию путем опускания груза в течение 30 секунд. Способ обеспечивает создание модели тракционной миелопатии, т.е. изолированной травмы спинного мозга без повреждения позвоночного столба, адекватно отражающей неврологический дефицит, в частности в детском возрасте, для которого характерен данный клинический вариант спинальной травмы. Недостатками указанного способа моделирования являются использование дорогостоящего вида животных (кроликов), нестандартность воздействия, двустороннее обширное повреждение спинного мозга, отсутствие данных о моделируемом рубце ввиду отличной цели эксперимента - моделирование не глиального рубца, а собственно, травмы спинного мозга.
Травма спинного мозга (ТСМ), независимо от ее генеза, неизбежно сопровождается формированием посттравматического глиального рубца, являющегося непреодолимым физическим барьером на пути регенерации аксонов (Nas K et al., 2015; Wang Н. et al., 2018; Marcol W et al., 2012, Zhang C, Morozova AY et al., 2015; Cui ZS et al., 2015; Li et al., 2010, Zhao et al., 2004).
В отличие от достаточно полно изученного патогенеза ТСМ, начало биомоделирования которой датируется еще серединой прошлого столетия (Seddon Н. et al., 1943; Sunderland S. et al., 1951; Rivlin A.S. et al., 1978), возможность функционального восстановления спинальных больных до сих пор остается открытым и актуальнейшим вопросом регенеративной медицины.
Известен аналогичный тип воздействия на спинной мозг /Marcol W et al., Air gun impactor--a novel model of graded white matter spinal cord injury in rodents // J. Reconstr. Microsurg. 2012. V. 28. №8. P. 561-568/. Назначение созданного авторами инструмента (пневматический импактор) - моделирование на крысах, наиболее распространенных в клинике повреждений спинного мозга «закрытого» типа (без нарушения целостности твердой оболочки спинного мозга). В данном исследовании посттравматический рубец спинного мозга объектом моделирования не являлся и особенности его образования, соответственно, не изучались.
Известен аналогичный принцип воздействия на глиальные ткани / С.А. Васильев и др. Криодеструкция опухолей головного мозга: криооборудование и методика // Клин, и эксперимент, хир. Журн. им. акад. Б.В. Петровского. - 2015. - №1. - С. 15-21, датированных 2010 и 2015 годами/. Исследователи изучали закономерности изменений глиальных тканей в результате криодеструкции [фиг. 1]. Оригинальной конструкции криозонд непосредственно погружали в ткани центральной нервной системы подопытных млекопитающих [фиг. 2].
Моделирование посттравматического глиального рубца в задачи данного исследования не входило. Однако изученные авторами закономерности динамики развития криодеструкции глиальных тканей были положены в основу заявляемого способа моделирования глиального рубца в биомоделировании. Оригинальной конструкции криозонд состоит из 1) подвижного криогенного сифона с двумя гибкими криопроводами, содержащими капилляр подвода жидкого азота и трубку откачки пара; 2) промышленного сосуда Дьюара с жидким азотом, в который через открытую на атмосферу горловину погружена холодная часть сифона; 3) системы вакуумной откачки азотного пара; 4) внешней системы газообеспечения для отогрева криоинструмента; 5) съемного и отдельно стерилизуемого криоинструмента. Данный криозонд имеет следующие недостатки: высокая сложность исполнения конструкции, большие размеры, маломобильный, энергозависимый, большой диаметр наконечника криозонда 4,5 мм и не может быть использован для моделирования глиального рубца на спинном мозге.
Аналогичный способ воздействия (криоаппликация) применяется в клинической практике [фиг. 3] в целях криодеструкции опухолей глиальных тканей /Васильев С.А., Песня-Прасолов С.Б. «Применение криохирургического метода в нейрохирургии» // Нейрохирургия, №4, 2009. стр. 63-70.
Известен эндоскопический аппликатор /Патент РФ №2462208, А61В 18/02, опубл. 27.09.2012/. Криоаппликатор содержит рукоятку, цилиндрический сердечник, выполненный из пористого никелида титана, и соединяющий их штыревой держатель, выполненный из никелида титана. Штыревой держатель снабжен скользящей по нему жесткой муфтой из полимерного материала. Участок штыревого держателя, примыкающий к пористому сердечнику, выполнен утонченным и дугообразно изогнут под углом в пределах от 45 до 90°. Недостатками такого эндоскопического аппликатора являются сложное техническое исполнение аппликатора и высокая стоимость составляющих компонентов.
Известен криоаппликатор /патент РФ №2572480, А61В 18/02, опубл. 10.01.2016/. Аппарат содержит корпус и крышку, в которой выполнен канал для отвода паров хладагента, сосуд для хладагента, канюлю для подачи хладагента из сосуда в съемную насадку. В крышке образованы первый, второй и третий дополнительные каналы, внутри сосуда установлены расположенные вертикально первая и вторая внутренние трубки, а к крышке присоединены первая и вторая наружные трубки. Съемная насадка выполнена в виде емкости с внутренней полостью. Недостатками такого криоаппликатора являются большие размеры конструкции, невысокая температурная эффективность сменных насадок за счет необходимости внутри иметь полость, высокая вероятность повреждения вакуумной колбы в результате закупоривания отводящей газы трубки.
Известен криоаппликатор /патент РФ №2702153, А61В 18/02, опубл. 04.10.2019/.
Устройство для подачи хладагента криохирургического аппарата в аппликатор содержит систему подачи хладагента, выполненную в виде паропровода и коаксиально расположенных подвижной и неподвижной трубок. Неподвижная трубка закреплена в паропроводе, подвижная трубка входит в неподвижную с минимальным зазором, выполнена с возможностью перемещения внутри неподвижной трубки по всей длине, выдвижения для подключения аппликатора с упором в его дно и вдвижения в неподвижную трубку с обеспечением подачи хладагента на всю длину аппликатора. Паропровод выполнен с возможностью обеспечения герметичного соединения с аппликатором, а подвижная трубка выполнена с прорезями в концевой части и отверстиями в боковой поверхности. Указанное устройство является прототипом. Недостатком такой конструкции прототипа является то, что подача хладагента осуществляется посредством устройства подачи, что значительно усложняет всю конструкцию устройства. Предлагаемое устройство с установленным аппликатором из-за больших размеров не может быть применено для криодеструкции глиальных тканей мелких грызунов (мыши, крысы).
Таким образом, техническая проблема, решаемая настоящей полезной моделью, - создание мобильного, малогобаритного, энергонезависимого, безопасного криоаппликатора с возможностью криодеструкции небольших объемов глиальных тканей.
Техническим результатом, достигаемым настоящей полезной моделью, также является достижение таких параметров конструкции криоаппликатора, как мобильность, энергонезависимость и его безопасность, при этом предложенная конструкция должна обеспечивать возможностью проведения криодеструкции небольших объемов глиальных тканей.
Для решения заявленной технической проблемы предлагается криоаппликатор, содержащий корпус и термопроводник, корпус состоит из резервуара для хладагента, рукоятки и изолирующей части, при этом резервуар для хладагента содержит пробку, а пробка снабжена резьбовым соединением и имеет патрубок для отведения паров хладагента, при этом термопроводник выполнен с возможностью перемещения внутри корпуса и имеет контактную часть. Контактная часть термопроводника выполнена с возможностью регулирования длины.
Корпус криоаппикатора выполнен монолитным, из пластика медицинского назначения.
В качестве хладагента может быть использован жидкий азот.
Сущность заявленного криоаппликатора поясняется следующими рисунками, представленными на фигурах:
фиг. 1 - криозонд (слева) и термопара (справа) перед погружением в мозг при выполнении криодеструкции глиальных тканей головного мозга;
фиг. 2 - вокруг зонда формируется зона криодеструкции (белого цвета). Рядом с зондом в мозг погружены 4 игольчатых термопары, при выполнении криодеструкции глиальных тканей головного мозга;
фиг. 3 - криодеструкция менингиомы различной локализации;
фиг. 4 - схема криоаппликатора, где 1 - корпус, 2 - термопроводник, 3 - контактная часть термопроводника, 4 - резервуар для хладагента (корпус), 5 - рукоятка (корпус), 6 - изолирующая часть (корпус), 7 - пробка с резьбовым соединением, 8 - патрубок для отведения паров хладагента. 9 - твердая мозговая оболочка; 10 - цереброспинальная жидкость; 11 - спинной мозг;
фиг. 5 - характеристики термопроводника;
фиг. 6 - пригодность и оптимальность инструмента для заявленных целей;
фиг. 7 - экспериментальное подтверждение результатов применения инструмента.
Криоаппликатор позволяет реализовать новый метод криоаппликации в биомоделировании глиального рубца, который заключается в оригинальном применении криодеструкции в целях биологического моделирования глиального рубца и заключается в следующем.
Способ моделирования глиального рубца на спинном мозге крыс с использованием заявленного криоаппликатора разработан исходя из основных требований (в дальнейшем - заявленных характеристик), впервые сформулированных авторами, к моделируемому рубцу с позиций востребованности при апробации перспективных методик восстановления нервной проводимости в посттравматическом периоде спинальной травмы:
1) односторонняя задействованность, обеспечивающая возможность клинической и патоморфологической оценки эффектов испытываемых методик восстановления нервной проводимости в сравнении с противоположной интактной стороной модели;
2) минимизация объема травмы, обеспечивающая сохранность функций естественных отправлений животных в хроническом эксперименте.
Для достижения этих целей:
1) разработан и стандартизирован хирургический доступ (авторами предложены интраоперационные ориентиры и оригинальный в биомоделировании чрескостный доступ - прецизионная гемиляминотомия);
2) разработан и апробирован оперативный прием (криоаппликация на спинной мозг крыс), позволяющий воспроизводимо моделировать глиальные рубцы заявленных характеристик.
Обоснование заявленного способа хирургического моделирования глиального рубца на спинном мозге с использованием заявленного криоаппликатора. Криодеструкция выполняется методом апплицирования в связи с невозможностью погружения инструмента в толщу сравнительно небольшого объема глиальных тканей спинного мозга крыс, признанных на сегодняшний день оптимальным видовым объектом моделирования спинальной патологии (Minakov A.N. et al., 2018).
Способ хирургического моделирования глиального рубца на спинном мозге осуществляют в 3 этапа: проведение предоперационной подготовки, хирургического вмешательства и травмирования спинного мозга (непосредственно осуществляют криодеструкцию).
На этапе предоперационной подготовки осуществляют проведение газовой анестезии животных и подготовку материалов, при этом инструмент погружают в хладагент до и после заправки криоаппликатора для криодеструкции.
На этапе хирургического вмешательства осуществляют прямой доступ к спинному мозгу. Для этого в проекции пересечения позвоночного столба с реберной дугой животного осуществляют медианное рассечение кожи, подкожной фасции и жировой клетчатки протяженностью не более 2 см. Прецезионную гемиляминэктомию выполняют относительно дорсальной площади дужки позвонка с окном доступа 1 мм. На этапе криодеструкции экспозицию апплицирования осуществляют от 40 до 50 секунд. При этом криоаппликацию выполняют без вскрытия твердой мозговой оболочки, при температуре проводника в зоне контакта до -20°С.
Для выполнения криоапликации использовали заявленный криоапликатор. Конструктивно криоаппликатор имеет корпус (1), внутри которого размещен термопроводник (2). Термопроводник (2) имеет контактную часть (3) и выполнен с возможностью перемещения внутри корпуса (1). При этом термопроводник (2) находится в непосредственном контакте с хладагентом и короткой изолирующей частью (6), плотно охватывающей термопроводник (2), но не препятствующей тем не менее свободному его перемещению, необходимому для регулировки глубины погружения в позвоночный канал к спинному мозгу (11).
Корпус криоаппликатора состоит из резервуара для хладогента (4), рукоятки (5), которая является зауженной частью корпуса, и изолирующей части (6). Резервуар для хладагента (4) содержит пробку (7), которая снабжена резьбовым соединением. Пробка (7) имеет по центру патрубок для отведения паров хладагента (8). В качестве хладагента может быть использован жидкий азот.
Материалы изготовления: корпус (1) криоаппикатора выполнен монолитным. Материал корпуса (1) криоаппликатора представляет собой пластик медицинского назначения (полипропилен, ГОСТ 26996-86. Полипропилен и сополимеры пропилена). Корпус криоаппликатора состоит из трех составляющих - сертифицированных образцов расходного материала медико-биологического назначения.
1. Центрифужная пробирка, 50 мл резервуар.
2. Шприц инъекционный, 1 мл со съемной иглой рукоятка.
3. Катетер внутривенный G20 - изолирующая часть.
Соединение и герметизация составляющих корпуса (1) (резервуара для хладогента (4), рукоятки (5) и изолирующей части (6)) выполнены без использования композитных и клеевых основ, исключительно методом термической спайки.
Находящаяся вне корпуса (1) контактная часть термопроводника (3) за счет возможности перемещения в изолирующей части корпуса (6) имеет регулируемую длину, обеспечивая тем самым регулировку температуры контактного участка термопроводника (2) за счет изменения его удаленности от источника холода (хладогента), а также необходимую глубину погружения в позвоночный канал к спинному мозгу (11).
Часть резервуара для хладагента (4), в которую заливается жидкий азот, снабжена пробкой с резьбовым соединением (7) с впаянной по ее центру канюлей инъекционного шприца (на фигуре не обозначена), способной служить штуцером для соединения с любой медицинского назначения трубкой подходящего внутреннего диаметра (например, от инфузионной системы) для отведения паров азота.
Характеристики термопроводника [фиг. 4]:
материал: медь;
прямое назначение: электропроведение (моножила из электропровода);
диаметр: 0,8 мм;
удаленность контактной части термопроводника (3) от источника холода: до 2,0 см;
длина контактной части термопроводника (3) может достигать до 2 мм.
Принцип действия криоаппликатора. Действие криоаппликатора в экспериментах in vivo основано на принципах передачи низкой температуры от источника холода - хладагента (жидкий азот) - к ткани-потребителю (спинной мозг крыс) посредством термопроводника (2).
Локальность низкотемпературного воздействия достигается за счет минимизации площади пятна контакта между термопроводником (2) и глиальными тканями спинного мозга крыс, а также за счет того, что твердая мозговая оболочка (9) выполняет функцию демпфера охлаждения.
Подготовка криоаппликатора к работе.
С целью увеличения КПД криоаппликатора, перед заправкой хладагентом инструмент рекомендуется целиком погрузить в жидкий азот. С помощью тиглевых щипцов извлечь криоаппликатор из жидкого азота и наполнить резервуар хладогентом (4).
Закрутить пробку (7) заливного отверстия и снова поместить инструмент в жидкий азот.
Пример. Методология применения заявленного способа:
1) произвести хирургический доступ к области криоаппликации по схеме, описанной выше;
2) извлечь предварительно подготовленный к работе криоаппликатор из жидкого азота;
3) под визуальным контролем с помощью хирургической лупы ввести контактную часть термопроводника (3) в окно гемиляминотомии;
4) выдержать согласно таймеру необходимую экспозицию (на данном этапе разработки - 40-50 сек.);
5) крановым движением, строго вертикально, извлечь криоаппликатор;
6) ушить операционную рану.
Контроль качества инструмента производится непосредственно перед каждым использованием криоаппликатора. Посредством увеличительной оптики и измерительных принадлежностей контролируются качество обработки и форма сечения поверхности пятна контакта проводника термопроводника (2), а также длина контактной части термопроводника (3).
Пример. Апробация заявленного способа хирургического моделирования глиального рубца на спинном мозге. Экспериментальное подтверждение осуществления заявленного способа и достижения указанных результатов с использованием разработанной конструкции криоаппликатора.
Период клинического наблюдения в опытах составил 30 дней. Отработанный протокол хирургической интервенции и схема клинического мониторинга обеспечивали 100% выживаемость крыс.
В процессе разработки прибора проводились его испытания как in vitro [фиг. 5А], используя электронный термометр с выносным датчиком температуры для измерения температуры контактной части криоаппликатора, так и in vivo [фиг. 5Б], когда с помощью электронного термомента с выносным датчиком температуры измеряли температуру непосредственно в спинном мозге в зоне охлаждения. Данные испытания подтвердили пригодность криоаппликатора для заявленных целей.
Экспериментальное подтверждение результатов применения инструмента представлено на фиг. 6. Проведенные гистологические исследования области структурного дефекта, полученного после криоаппликации, у разных животных показали, что у всех животных формируется сходный по структуре дефект как в сагиттальной плоскости [фиг. 6Б], так и фронтальной плоскости [фиг. 6А]
Таким образом, проведенная апробация подтвердила на данном этапе принципиальную пригодность и сравнительную (относительно механического и лучевого воздействия) оптимальность заявленного метода криоаппликации в целях моделирования глиального рубца на спинном мозге у крыс с использованием заявленного криоаппликатора. В частности, метод обеспечивает возможность проведения клинической и патоморфологической оценки эффектов испытываемых методик восстановления нервной проводимости и осуществлять такую оценку в сравнении с противоположной интактной стороной модели. Метод минимизирует объем травмы, обеспечивая сохранность функций естественных отправлений животных в хроническом эксперименте. Такой подход является безопасным для животных.
Как показали проведенные исследования, конструкция криоаппликатора обладает рядом преимуществ, а именно: является мобильной (имеет компактные размеры и небольшой вес), имеет энергонезависимый принцип работы (не требует использования внешних и внутренних источников энергии), является безопасной как для пользователя, так и для подопытного животного.
Литература:
La Placa М.С., Simon СМ., Prado G.R., Cullen D.K. // Prog.Brain.Res. 2007. V. 161. P. 13-26. Nas K., Yazmalar L., Şah V., Aydin A., Öneş K. // World J. Orthop. 2015. V.18. №6 (1). P. 8 16.
H. Wang, G. Song, H. Chuang, С Chiu, A. Abdelmaksoud, Y. Ye, L. Zhao // Int J Immunopathol Pharmacol. 2018 Jan-Feb; 31: 2058738418801406. doi: 10.1177/2058738418801406. Marcol W, Slusarczyk W, Gzik M, Larysz-Brysz M, Bobrowski M, Grynkiewicz-Bylina B, Rosicka P, Kalita K, Węglarz W, Barski JJ, Kotulska K, Labuzek K, Lewin-Kowalik J (2012). Air gun impactor - a novel model of graded white matter spinal cord injury in rodents. J Reconstr Microsurg. Oct;28(8):561-8
Zhang C, Morozova AY, Abakumov MA, Gubsky IL, Douglas P, Feng S, Bryukhovetskiy AS, Chekhonin VP (2015). Precise Delivery Into Chronic Spinal Cord Injury Syringomyelic Cysts with Magnetic Nanoparticles MRI Visualization. Med Sci Monit. Oct 21;21:3179-85. Cui ZS, Zhao P, Jia CX, Liu HJ, Qi R, Cui JW, Cui JH, Peng Q, Lin B, Rao YJ (2015). Local expression and role of BMP-2/4 in injured spinal cord. Genet Mol Res. Aug 7;14(3):9109-17. Li Z, Fang ZY, Xiong L and Huang XL (2010). Spinal cord injury-induced astrocyte migration and glial scar formation: effects of magnetic stimulation frequency. Indian J. Biochem. Biophys. 47: 359-363.
Zhao Z, Alam S, Oppenheim RW, Prevette DM (2004). Overexpression of glial cell line-derived neurotrophic factor in the CNS rescues motoneurons from programmed cell death and promotes their long-term survival following axotomy. Exp. Neurol. 190: 356-372.
Sunderland S., A classification of peripheral nerve injuries producing loss of function. Brain (1951). 74(4): p. 491-516.
Rivlin AS, Tator CH (1978). Effect of duration of acute spinal cord compression in a new acute cord injury model in the rat. Surg Neurol; 10:38-43
Seddon, H (1943). Three types of nerve injury. Brain. 66(4): p. 237-288
Васильев C.A., Крылов В.В., Песня-Прасолов СБ., Зуев А.А., Левин Р.С., Павлов В.Н., Жидков И.Л., Ховрин В.В., Федоров Д.Н., Ветшева Н.Н. // Нейрохирургия. 2010. №4. С. 58-64.
Васильев С.А., Песня-Прасолов С.Б, Кунгурцев С.В., Павлов В.Н. // Клиническая и экспериментальная хирургия. Журнал им. Б.В. Петровского. 2015. Т.1. №7. С. 15-21. Minakov A.N., Chernov A.S., Asutin D.S., Konovalov N. A., Telegin G.B. // Acta Naturae. 2018. V. 10. №3 (38). P. 4-10.
Minakov A., Chernov A., Sirotkin A., Asutin D., Konovalov N., Telegin G. Surgical model of spinal cord injury in rats // Laboratory Animals. 2019 V. 53(1S), P. 130.