БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЕ СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ЛОКАЛЬНЫМ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ ПРИ АДЪЮВАНТНОМ АРТРИТЕ
BIOLOGICALLY ACTIVE AGENT EXHIBITING A LOCAL ANTI-INFLAMMATORY EFFECT IN ADJUVANT ARTHRITIS

Изобретение относится к экспериментальной медицине в области восстановительного лечения заболеваний костно-мышечной системы, и касается получения биологически активного средства на основе иловой грязи озера «Молочка» месторождения «Сергиевские минеральные воды» и эфирного масла шалфея в определенном соотношении масс.%, с верификацией его локального действия при адъювантном артрите. Средство обладает более выраженным противовоспалительным, хондро- и остеопротективным действием по сравнению с нативной иловой грязью озера «Молочка» месторождения «Сергиевские минеральные воды».
,
Актуальность предлагаемого изобретения обусловлена необходимостью внедрения в практику препаратов локального действия на основе природных компонентов, имеющих широкие показания при патологии опорно-двигательного аппарата с минимальным перечнем ограничительных рекомендаций, в связи с тем, что распространенность заболевания костно-мышечной системы в мире среди взрослого населения составляет 10-12%, при этом в России в 2018 году было зарегистрировано 13356,6 чел. на 100 тыс. населения (Здравоохранение в России 2019: Стат. сб/Росстат. - М., 2019. – 170с. ttps://resursor.ru/statisticheskij-sbornik-zdravooxranenie-v-rossii-2019-polnaya-versiya/zdorovye-naseleniya-vzroslye/). Заболевания костно-мышечной системы характеризуются неуклонно прогрессирующим и рецидивирующим течением, в особенности те нозологии, где аутоиммунные механизмы являются ведущими. С целью профилактики прогрессирования заболеваний костно-мышечной системы и восстановления нарушенных структур, в частности матрикса суставного хряща суставов и периартикулярных мягких тканей подверженных воспалительной атаке, в периоды между обострениями, рекомендовано проводить бальнео – и грязелечение в соответствии с приказом МЗ РФ №1029н от 28.09.2020 «Об утверждении перечней медицинских показаний и противопоказаний для санаторно-курортного лечения» при оказании медицинской помощи на этапе санаторно-курортного лечения пациентам с заболеваниями, относящимися к XIII классу МКБ10.
Грязелечение относится к физиотерапевтическим тепловым процедурам и назначается после снятия болевого синдрома и уменьшения отека в виде аппликаций курсами различной продолжительности, от 6 до 12 сеансов, через 1-2 дня. Однако у большинства предлагаемых на рынке средств, содержащих природные грязи и глины нет подтверждающих документов об их эффективности. В этой связи, требуются предварительные исследования бальнеологических средств, включающие такие теплоносители, как глина и грязь. Во-первых, необходимо in vitro – определить физико-химический состав, а во-вторых, in vivo – оценивать лечебное действие теплоносителя и его биологическую активность (Курбанов В. А., Кайсинова А.С., Демешко Н.И., Абрамцова А.В., Репс В.Ф. Влияние преформированного препарата из желтой глины в сравнении с лечебной грязью озера «Тамбукан» на течение адъювантного артрита. /Курортная медицина. 2014;(4):31-36, Оценка эффективности применения желтой глины, модифицированной бишофитом экспериментальное исследование) Саградян Г.В., Абрамцова А.В., Череващенко Л.А., Ахкубекова Н.К., Урвачева Е.Е., Овсиенко А.Б., Терешин А.Т., Васин В.А. Вопросы курортологии, физиотерапии и лечебной физической культуры. 2018. Т. 95. № 5. С. 40-48. Tékus V., Borbély É., Kiss T., Perkecz A., Kemény Á., Horváth J., Kvarda A., Pintér E. Investigation of Lake Hévíz Mineral Water Balneotherapy and Hévíz Mud Treatment in Murine Osteoarthritis and Rheumatoid Arthritis Models / Evid Based Complement Alternat Med. 2018 Aug 27; 2018:4816905. doi: 10.1155/2018/4816905. Противовоспалительные эффекты илово-сульфидных пелоидов на экспериментальной модели адъювантного артрита у крыс / Бадмаева К.Е., Абушинова Н.Н., Теплый Д.Л.// Медицинский вестник северного Кавказа. 2019. Т. 14. № 1.2. – С.152-155).
Известны способы подготовки природных лечебных грязей к использованию в лечебных целях естественным путем.
Способ получения морской иловой лечебной грязи путем её отстоя и отделения жидкой фазы, в которой отстой производится при температуре 28-30 °С в течение 15-30 суток (патент РФ №2014079, А 61 К 35/00, опубл. 15.06.94). Ограничением в применении данного способа является использование морской иловой лечебной грязи только в санаторно-курортной зоне рядом с местом её добычи.
Способ подготовки к использованию природной иловой грязи озера Тамбукан, заключающийся в извлечении её со дна механизированным способом с последующим механическим отделением инородных включений природного и техногенного характера и разделением по сортам в зависимости от интенсивности ее окраски следующим образом: грязь интенсивно черного цвета соответствует первому сорту, грязь черного цвета соответствует второму сорту, грязь темно-серого цвета соответствует третьему сорту. Грязь 1 сорта помещают в отдельные контейнеры объемом от 20 до 40 л и проводят опрессовку этих контейнеров природным углекислым газом под давлением до 2 МПа, добытым из скважины 1-КМВ-бис Ессентукского месторождения, опрессованные контейнеры с грязью транспортируют в место хранения и/или применения, а также имеются ещё 3 способа расфасовки и упаковки грязи 1 сорта в виде аппликаторов (патент РФ № 2 730 840 A61K 35/10; A61F 7/02, опубл. 26.08.2020). Преимуществом этого способа является извлечение из природной грязи наиболее активной её фракции, соответствующей 1 сорту грязи и изготовление из неё аппликаторов, предназначенных для индивидуального использования. Недостатком данного способа является экстраполяция общих показаний для использования природной иловой грязи озера Тамбукан без изучения её топического лечебного действия.
Известен способ создания средства для местного лечения воспалительных заболеваний суставов с антиревматическим действием (патент РФ № 2 707 278 A61K 31/196; A61K 31/7048; A61K 31/7056; A61K 47/24; A61K9/06; A61P 19/02; A61P 29/00, опубл. 26.11.2019). Указанное средство может быть использовано для изготовления геля, в состав которого входит диклофенак натрия, линкомицин, нистатин и в качестве основы кремнийорганический глицерогидрогель состава Si (C3H7O3)4 · 6C3H8O3 · 24H2O, в определенных количествах. Описываемому средству дано название «Линисдик-гидрогель». Оценка эффективности антиревматического действия «Линисдик-гидрогель» была дана на основе экспериментальных исследования in vivo с использованием моделей классического адъювантного и бактериально-грибкового артритов.
Преимуществом данного средства является такой подбор компонентов геля, для которого был экспериментально подтвержден антиревматический эффект несмотря на известные механизмы действия каждого компонента в отдельности. Данное средство обеспечивает противовоспалительный и обезболивающий эффекты, ускоряющие процесс купирования артрита, и способствующие нормализации структуры тканей суставов, вовлеченных в воспалительный процесс. Недостатком данного изобретения является то, что лечебное действие обеспечивается лекарственными средствами, обладающими системными побочными действиями, и его рекомендуют использовать в острый и подострый периоды воспалительного процесса в суставах.
Известна группа изобретений относящихся к физиотерапевтическому лечению заболеваний опорно-двигательной системы, где используют биологически активное средство, включающее лечебную грязь и добавки (патент № 2686075, A61K 35/04; A61K 36/03; A61P 19/02 опубл.24.04.2019). В состав биологически активного средства в качестве добавок входит гель из ламинарии и Карловарская соль при следующем соотношении компонентов, мас.%: гель из ламинарии 40-47, Карловарская соль 1-3, лечебная грязь – остальное. В качестве лечебной грязи предлагают использовать один из вариантов: Сергиевскую лечебную грязь, Тамбуканскую лечебную грязь, лечебную грязь Мертвого моря или Карловарскую торфяную лечебную грязь. В способе указывают применение биологически активного средства, которое наносят на кожу в районе локализации боли или соответствующей кожной рефлекторной зоне, что непосредственно обеспечивает лечение заболеваний опорно-двигательной системы у пациентов с хронической болью. Продолжительность процедуры 10-15 мин., курс лечения 10-15 сеансов через день. Для повышения проникающей способности биологически активного средства его применяют способом лекарственной электроаппликации и трансдермальной электростимуляции. Недостатком данного способа является использование дополнительного физиотерапевтического оборудования, что затрудняет его широкое применение, при этом не даны точные сроки хранения биологически активного средства и его механизм топического действия.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению относится запатентованное бальнеологическое средство «Глинофир» (патент РФ № 2540396 A61K 35/00; A61K 35/10; A61K 36/537; A61P 19/02; A61K 36/537, опубл. 10.02.2015), которое предназначено для лечения и профилактики артрита, артроза, дегенеративных поражений суставов – артрозо-артритов различной локализации, содержащее желтую глину, рапу из озера Большой Тамбукан, эфирное масла шалфея и диметилсульфоксид в следующем соотношении: Желтая глина 1000±10 г, Рапа из озера Большой Тамбукан 350-450 мл, Эфирное масло шалфея 1-2 мл, Диметилсульфоксид 98±2 мл.
Бальнеологическое средство «Глинофир» изготовлено на основе глины, которые, как и пелоиды в физиотерапевтической практике относятся к теплоносителям, а также входящие в них биологически активные компоненты подобраны таким образом, чтобы соответствовать реологическим свойствам сопочной грязи, и в связи с этим может быть рекомендована к использованию в лечебно-профилактических целях в соответствии с медицинскими показаниями и противопоказаниями, утвержденными для санаторно-курортного лечения. Однако непосредственных данных по лечебному действию бальнеологических средств не приводится, лишь указывается, что они обладают теми же противопоказаниями, что и лечебные грязи, и отсутствует информация об их дифференцированном воздействии на определенные патологические нарушения в организме человека.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание эффективного биологически активного средства на основе иловой грязи озера «Молочка» Сергиевского месторождения, обогащенного 1% эфирным маслом шалфея, обладающего высоким лечебным действием, обоснованного экспериментально при изучении его влияния на основные патоморфологические проявления артрита (аутоиммунного артрита) голеностопных суставов белых беспородных крыс, вызванного полным адъювантом Фрейнда. Эффективность представленного средства проявляется в локальном лечебном действии при аутоиммунном артрите, а именно в значительном снижении воспаления в периартикулярных тканях, восстановлении хрящевой ткани и нормализации остеогенеза субхондральной кости.
Сущность изобретения заключается в создании биологически активного средства, в состав которого входит модифицированная 1% эфирным маслом шалфея иловая грязь, обладающая более выраженным по сравнению с нативной грязью лечебным действием в отношении компонентов воспаления и суставного поражения при аутоиммунном артрите.
Указанный технический результат достигается тем, что биологически активное средство, приготовленное на основе иловой озерной грязи озера «Молочка» Сергиевского месторождения для лечения артритов, представляет собой смесь очищенной иловой грязи озера «Молочка» месторождения «Сергиевские минеральные воды» и эфирного масла шалфея, при этом компоненты в бальнеосредстве находятся в определенном соотношении в масс.%:
Иловая грязь озера «Молочка»
99
Эфирное масло шалфея
1
Биологически активное средство обладает противовоспалительным, а также хондро- и остеопротекторным действием при адъювантном артрите.
С целью использования иловой грязи озера «Молочка» месторождения «Сергиевские минеральные воды» Исаклинского района Самарской области для приготовления на его основе заявленного биологически активного средства проведены исследования полного физико-химического состава образца нативной иловой грязи (протокол № 18/11.18 от 13.02.2019 года), дана оценка физико-химических свойств и микробиологическая характеристика (таблица 1).
Таблица 1- Физико-химические показатели в образце иловой грязи из Сергиевского месторождения «Озеро Молочка» Исаклинского района Самарской области
<b>NN п/п</b>
<b>Показатели</b>
<b>Размерность</b>
<b>Норма для  иловой грязи</b>
<b>Исследованные образцы иловой грязи</b>
1
2
3
4
5
1
Даты отбора образца
21.11.2018
2
Влажность воздушно сухой грязи
%
4,63
2
Влажность естественная
%
25-75
56,6
3
Объемный вес
г/см<sup>3</sup>
1,4-2,0
1,413
4
Сопротивление сдвигу при 25<sup>о</sup>С
дин/см<sup>2</sup>
1500-4000
3231
5
Липкость при 25<sup>о</sup>
дин/см<sup>2</sup>
3630
6
Тверд. включения разм. более 5мм
%
Отсутствие
Отсутствие
7
То же размером 0,25-5,0 мм
%
Не более 3
1,85
8
То же размером 0,1-0,25 мм
%
-
0,50
9
Теплоёмкость
кал/г. град
0,4-0,6
0,65
10
Зольность
% на сухое вещество
>95
96,51
11
Реакция среды
РН
7,0-9,0
7,24
12
Окислительно-восстановительный потенциал (Еh)
МВ
-500 – 50
-263
13
Сероводород общий
% от есте- ств. в-ва
0,15-0,50
0,153
14
Сульфид железа
“         “
-
0,393
15
Железа (II) оксид
“        “
-
2,147
16
Железа (III) оксид
“        “
-
0,225
17
Углерод органический
% на сухое вещество
Не менее 0,5
4,49
18
Азот органический
“      “
-
0,36
19
Отношение C/N
“      “
-
12,5
20
Липиды
“      “
-
0,123
21
в т.ч.хлорофиллыкаротиноиды
мг% на сухой субстрат         «-«
1,93
22
Гуминовые кислоты
% на сухое вещество
-
19,38
23
Минерализация грязевого раствора
г/л
1,0 – 15,0
4,39
24
<b>Микроэлементы:</b>
% на сухое вещество(по Кларку)
24.1
Литий
“
0,00459
24.2
Ванадий
“
0,019
0,0105
24.3
Никель
“
0,0068
0,00678
24.4
Хром
“
0,0090
0,0632
24.5
Бериллий
«
0,0003
Не опр.
24.6
Олово
“
0,00060
Не опр.
24.7
Висмут
“
0,0000008
Не опр.
24.8
Сурьма
«
0,000015
Не опр
24.9
Стронций
«
0,003
0,0335
24.10
Барий
«
0,058
0,106
<b>Естественные радионуклиды *</b>
Бк/кг
СанПиН 2.6.1.2523-09НРБ 99/2009
25.1
Уран U-238
“
/9,0
Не опр.
25.2
Радий Ra-226
“
370/54,0
18,72±5,86
25.3
Торий Th-232
“
282/65,0
16,10±6,30
26
<b>Техногенные радионуклиды *</b>
Бк/кг
Не выше ВДУ
26.1
Цезий Cs-137
“
/200
<8 Бк/кг
26.2
Стронций Sr – 90
“
/100
Не опр
26.3
Калий К-40
258,4±76,40
27
<b>Тяжёлые металлы</b>
ПДК (для Hg) и ОДК ( для Pb, Cd, Zn, Cu) в глинистых почвах с рН>5,5, г/т  не более
27.1
Ртуть /0,000066 %/
г/т
2,1
Не опр.
27.2
Свинец /0,002 %/
“
130,0
0,509
27.3
Цинк /0,0095 %/
“
220,0
7,19
27.4
Медь /0,0045 %/
“
132,0
4,47
27.5
Кадмий /0,00003 %/
“
2,0
Не опр.
27.6
Кобальт /0,0019 %/ по Кларку
“
19,0
1,90
27.7
Марганец  /0,08 %/  по Кларку
“
800,0
40,9
28
Пестициды
«
Не более фона
Не опр
29
<b>Санитарно- микробиологические показатели</b>
29.1
Общее микробное  число /ОМЧ/
Клеток в 1 гестест. в-ва
Не более 500 тысяч
Не опр
29.2
Титр общих коли-формных бактерий.
г естест. в-ва на 1 бакт.
10 и более
Не опр
29.3
Титр сульфит редуцирующих клостридий /титр перфрингенс
г естест. в-ва на 1 бакт.
0,1 и более
Не опр
29.4
Патогенная кокковая микрофлора /стафилококки, стрептококки/
Бактерий в 10 г естественно-го вещества
Отсутствие
Не опр
29.5
Синегнойная палочка
Бактерий в 10 г естественно-го вещества
Отсутствие
Не опр
Примечание - В соответствии с НРБ –99/2009, ОСПОРБ-99/2010, используя методы анализа ГП ВНИИФТРИ 05.05.1996.
3
Внешние признаки образца нативной грязи характерны для тонкодисперсных субстратов. Она чёрного цвета, с очень слабым запахом сероводорода, консистенции густой сметаны, однородной структуры, без видимых включений. По физико-химическим показателям, как видно из таблицы 1, образец грязи относится к иловым низкоминерализованным (4,39 г/дм), среднесульфидным (содержание сероводорода 0,15% на естественную грязь) пелоидам, слабощелочной реакции среды (рН 7,24), и по своему составу и свойствам приближается к лечебной иловой грязи Шатковского месторождения.
Для разработки технологии получения биологически активного средства, нативную лечебную грязь механически очищали от загрязняющих элементов с использованием сита с заданными размерами ячеек. После удаления загрязняющих элементов проводили дробление массы грязи на шнековом измельчителе, с измельчением естественных механических включений в грязевых отложениях. Грязевые отложения, содержащие дробленные естественные механические включения, подавали в жерновую мельницу на гомогенизацию (измельчение) для получения частиц грязевых отложений размером примерно 0,3 мм.
В образцы подготовленной очищенной грязи при тщательном перемешивании постепенно добавляли натуральное эфирное масла шалфея в разных процентных соотношениях, концентрация которых соответствовала 0,1%, 1%, 2% и 3%. Перемешивание проводили на верхнеприводной мешалке ULAB US-2200D со скоростью 1500 об/мин в течение 10 минут до получения однородной массы. По внешним признакам, реологическим свойствам, таким как сопротивление сдвигу и липкость, была выбрана для проведения дальнейших исследований смесь в соотношении 99:1, или иловая грязь с 1% эфирного масла шалфея. Приготовленное биологически активное средство, а именно иловая грязь озера «Молочка» Сергиевского месторождения, обогащенная 1% эфирным маслом шалфея упакована в банки для биологических жидкостей, объемом 0,3л и оставлена на хранение при температуре от +8 °С до +12 °С в течение 3-х и 6-и месяцев с последующим анализом микробиологического состава и реологических свойств.
Внешние характеристики образца биологически активного средства после хранения не претерпели никаких изменений и представляют массу чёрного цвета, консистенции густой сметаны, однородной структуры, без видимых включений, с характерным ароматным запахом. Реологические параметры также оставались прежними.
2
Благодаря подобранным соотношениям ингредиентов реологические параметры, такие как сопротивление сдвигу – 2485, липкость – 3123 соответствуют кондиционным требованиям (норма реологическихпараметров для лечебных грязей 1500-4000 дин/см). На базе филиала ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ставропольском крае в г. Пятигорске» были проведены исследования по контролю санитарно-микробиологического состояния разработанного средства в соответствии с нормативными критериями лечебных грязей по титру бактерий группы кишечной палочки (БГКП), общему микробному числу (ОМЧ) на мясо-пептонном агаре, наличию синегнойной палочки, стафилококка. Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2 -  Санитарно-микробиологические показатели образцов нативной иловой грязи озера «Молочка» месторождения «Сергиевские минеральные воды» и биологически активного средства, приготовленного на его основе путем обогащения 1 % эфирным маслом шалфея
№ п/п
Санитарно-микробиологические показатели
Норматив
Нативная грязь
Биологически активное средство
1
Общее микробное  число /ОМЧ/, кл/г
Не более 500 тысяч клеток в 1 г
220000
250000
2
Титр общих колиформных бактерий, титр
10 и более
Более 10
Более 10
3
Патогенная стафилококки
Отсутствие бактерий в 10 г
Не обнаружена в 10 г
Не обнаружена в 10 г
4
Синегнойная палочка
Отсутствие бактерий в 10 г
Не обнаружена в 10 г
Не обнаружена в 10 г
Из данных, приведенных в таблице 2, можно сделать вывод о том, что санитарно-микробиологическое состояние находится в пределах нормы. Патогенных микроорганизмов не обнаружено.
Готовый продукт, биологически активное средство упаковывалось в коробки для хранения и возможного использования продукта в домашних условиях. Коробка должна быть изготовлена из высококачественного пластика - пищевого полипропилена, например, вместимостью 250 гр.
Также была изучена стабильность разработанного средства в течение 6 месяцев хранения (таблица 3).
Таблица 3 - Изучение стабильности образцов биологически активного средства, приготовленного на основе иловой грязи озера «Молочка» Сергиевского месторождения обогащенного 1% эфирным маслом шалфея в динамике хранения
NN п/п
Показатели
Размерность
Норма для  иловой грязи
Исследованные образцы биологически активного средства
1
2
3
4
5
6
1.
Сроки хранения
исходно
6 мес
2.
нативная
1%
нативная
1%
3.
Влажность естественная
%
25-75
56,6
56,4
49,0
46,5
4.
Реакция среды
рН
7,0-9,0
7,24
7,3
7,5
7,7
5.
Сопротивление сдвигу при 25<sup>о</sup>С
дин/см2
1500-4000
3231
2485
2415
2270
6.
Липкость при 25о
дин/см2
3630
3123
3864
3548
Основываясь на полученных результатах можно отметить, что биологически активное средство, а именно иловая грязь озера «Молочка» Сергиевского месторождения, обогащенная 1% эфирным маслом шалфея, стабильна в течение 6-месячного хранения в защищенном от света месте при температуре 8—12 °С и может использоваться для лечебных целей. Описываемому биологически активному средству дано условное название «Пелофит».
Для обоснования заявленного изобретения в отделе изучения механизмов действия физических факторов ПНИИК ФФГБУ СКФНКЦ ФМБА России в г. Пятигорске была проведена оценка лечебного действия биологически активного средства «Пелофит» на экспериментальной модели адъювантного артрита (АА), воспроизведение которого проводили путем введения полного адьюванта Фрейнда (ПАФ) (Imject TM Freund´s Cjmplete Adjuvant (77140 lot UB278619, США) в подошвенную поверхность стопы правой задней конечности крысы по 0,1 мл под апоневроз, однократно. Животных выводили из эксперимента на 57-й день адъювантного артрита.
Всего в исследование включено 36 беспородных белых крыс-самцов, массой 250-320 г., которые находились в стандартных условиях вивария и были разделены на 4 группы методом простой рандомизации:
1-я контрольная группа-1, КГ1 (n=6). Интактные крысы без патологии, которые не подвергались воздействию патологического фактора и выводились из эксперимента одновременно с опытными группами.
2-я контрольная группа-2, КГ2 (n=10). Крысы с АА, не получавшие лечение.
3-я опытная группа-1, ОГ1 (n=10).  Крысы с АА, получавшие курс аппликаций, начиная с 43 дня артрита, всего 7 сеансов через день, нативной иловой грязью озера «Молочка» месторождения «Сергиевские минеральные воды», подогретой на водяной бане до 37 градусов. Длительность сеанса – 15 - 20 минут, грязь наносили на обе задние конечности, путем обертывания стопы и голеностопного сустава, покрывая, конечность полиэтиленовой пленкой и заворачивая животных в хлопчатобумажную ткань.
4-я опытная группа-2, ОГ2 (n=10). Крысы с АА, которым аналогично ОГ1 проводили 7 сеансов аппликаций, но биологически активным средством «Пелофит».
Животные получали лабораторный корм, имели свободный доступ к питьевой воде и ежедневно осматривались. Эвтаназию животных осуществляли путем декапитации, которая проводилась под эфирным наркозом в соответствии с требованиями Европейской конвенции по защите экспериментальных животных [European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for exsperimental and other scientific purposes. Strasburg: Council of Europe, 1986]. Для оценки воспроизведения АА и действия бальнеопроцедур перед началом курса и после последнего сеанса измеряли температуру кожи над голеностопными суставами и длину окружности суставов штангенциркулем, а также проводили забор крови для определения общего содержания лейкоцитов (подсчет лейкоцитов осуществляли в счетной камере Горяева). После эвтаназии у животных проводили ампутацию задних конечностей и помещали их в индивидуальные контейнеры с 10% забуференным формалином в соответствии с правилами для патоморфологических и гистологических исследований. Гистопатологический анализ включал оценку выраженности воспаления периартикулярных тканей, степень дегенерации хряща и изменения в костной ткани (остеолизис). Степень тяжести патологических изменений классифицировалась посредством полуколичественной оценки гистологических изменений, согласно модифицированной шкале Bendele A. et al. и Mankin H.J. Гистопатолог проводил исследования «вслепую», что является условием для слепо контролируемых исследований.
Данные, полученные в результате исследований in vivo, приведены в таблице 4 и рисунках.
С целью достижения хронической стадии АА животные после инъекции ПАФ находились под наблюдением без лечения 42 дня. На 3-й день АА визуализировались внешние проявления артрита на правой задней конечности в виде покраснения кожи и распространения отека в области стопы и голени, при пальпации животные отдергивали лапу и не вставали на неё. К 7-м суткам отек появился и в области коленного сустава, а на контралатеральной конечности определялась припухлость в области лодыжки животных. Дальнейшее наблюдение за развитием отека показало, что кожа стопы, голеностопного сустава и голени приобрели бордовый оттенок, и животные при передвижении не сгибали конечность в голеностопном правом суставе. Через 30 дней наблюдения, тургор кожи стал уменьшаться, цвет кожи правой лапы стал восстанавливаться, однако движения в голеностопном суставе отсутствовали, крыса лишь подтягивала правую лапу и не вставала на неё. Длина окружности голеностопного сустава к 42–у дню определялась на правой конечности в 2-2,5 раза, а левой в 1,5-1,8 раза больше, по сравнению с исходной длиной, а также длиной окружности голеностопных суставов у животных КГ1. Начиная со 2-го дня инициации АА, так и в последующие дни наблюдения температура над стопой и голеностопным суставом ипсилатеральной конечности была выше, чем на контралатеральной на 5-7 °С и к 42-у дню АА была выше на 10-15%, по сравнению со здоровыми животными (КГ1).
Несмотря на внешние проявления локального снижения отека и воспаления, а именно снижение тургора кожи над голеностопными суставами, уменьшение отека на стопе и голени, содержание лейкоцитов в периферической крови отражало воспалительный процесс у животных к 42-у дню АА (табл.4.) Содержание лейкоцитов в периферической крови (КГ2, ОГ1 и ОГ2) превышало в 2 раза значения в группе здоровых животных (КГ1).
Таблица 4 - Клинические показатели динамики адъювантного артрита под влиянием курса аппликаций нативнной грязи и биологически активного средства «Пелофит» у крыс
Показатели
Длина окружности голеностопных суставов (см) у крыс
Температура кожи над голеностопными суставами (°С) у крыс
Количество лейкоцитов в крови крыс,*10<sup>9</sup>/л
правая лапа
левая лапа
правая лапа
левая лапа
группы *
Мe [Q25;Q75]
Мe [Q25;Q75]
Мe [Q25;Q75]
Мe [Q25;Q75]
Мe [Q25;Q75]
КГ1
1
1,2(1,2-1,3)
1,3(1,2-1,4)
25,8(24,3-26)
26(25,5-26,5)
10,5(9,6-11,2)
2
1,2(1,2-1,3)
1,(1,2-1,4)
26(25,4-26,6)
26,4(25,5-26,3)
9,4(8,2-10,9)
КГ2
1
3,6(3,5-3,7)#
2,1(2-2,2)#
33,3(33-33,5)#
29(27,8-31,5)#
23,8(23,2-24,5)#
2
3,5(3,4-3,5)#
1,9(1,8-2)#
33(32-32,8)#
28(27-30,4)#
22,3(21,4-23,5)#
ОГ1
1
3,5(3,3-3,55)
2(1,95-2,5)
33(32,8-33,6)
30(28 -31,6)
22,7(21,3-24,2)
2
3,2(3-3,3) @ &
1,8(1,8-1,95) @&
31,6(31,5-32) &
28,7(27,5-29,6)&
20,6(19,7-22,5) @&
ОГ2
1
3,6(3,4-3,65)
2,1(2,2-2,2)
33(32,5-33,7)
29(28-30)
22,1(21,6-24,2)
2
3,2(3-3,3) @&
1,8(1,7-1,85) @&
31(30,4-31,2) @&
28(27,5-28,4) @&
19,5(19-20,2) @&
Примечание: группы * - обозначены показатели до - 1 и после - 2 проведения курса бальнеопроцедур; # -  статистически значимые различия между группами животных КГ1 и КГ2, при р<0,05; @ -  статистически значимые различия между группами животных ОГ1 и КГ2, ОГ2 и КГ2, при р<0,05; & - статистически значимые различия в группах животных между показателями до и после проведения лечебного курса в ОГ1 и ОГ2 на 43-й день АА и 57-й день АА, при р<0,05.
После проведения лечебного курса аппликаций нативнной грязью (ОГ1) и биологически активным средством «Пелофит» (ОГ2) у крыс уменьшилась длина окружности голеностопных суставов в среднем на 10%, и снизилась температура кожи над ними на 10-12 %, как на ипсилатеральной конечности, так и на контралатеральной, однако различий между ОГ1 и ОГ2 по данным показателям не установлено.
Для верификации различия в эффективности лечебного влияния биологически активного средства «Пелофит» и нативной грязи озера «Молочка» месторождения «Сергиевские минеральные воды» на компоненты артрита, был применен метод гистоморфологического исследования голеностопных суставов, который включал оценку выраженности воспаления периартикулярных тканей, степень дегенерации хряща и изменения в костной ткани (остеолизис). Степень тяжести патологических изменений классифицировалась посредством полуколичественной оценки гистологических изменений, согласно модифицированной шкале Bendele A. et al. и Mankin H.J. (Bendele, A., Mccomb, J., Gould, T., Mcabee, T., Sennello, G., Chlipala, E., & Guy, M. Animal Models of Arthritis: Relevance to Human Disease. Toxicologic Pathology, 1999, 27, 134–142.; Mankin, H.J, Dorfman, H, Lippiello, L, Zarins, A: Biochemical and metabolic abnormalities in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data. J Bone Joint Surg Am. 1971, 53, 523–537.;Коржевский Д.Э., Гиляров А.В. Основы гистологической техники. – СПб.: СпецЛит, 2010. – 95 с.).
Выраженность воспаления периартикулярной ткани классифицировалась по пяти категориям (0-5 баллов): 0 - нормальный; 1 - минимальная инфильтрация воспалительных клеток в периартикулярной ткани; 2 - легкая инфильтрация; 3 - умеренная инфильтрация с умеренным отеком; 4 - выраженная инфильтрация с выраженным отеком; 5 - сильная инфильтрация с сильным отеком.
Степень дегенерации хряща классифицировалась по бальной системе (0-9): структура поверхности (1 балл - неровности, эрозии; 2 балла - трещины; 3 балла - расслоение); клеточный состав (1 балл - незначительное снижение количества хондроцитов; 2 балла - значительное снижение количества хондроцитов; 3 балла - нет клеток); пролиферация клеток (1 балл - изогенные группы хондроцитов по 2 клетки в группе; 2 балла - изогенные группы хондроцитов по 2 и 3 клетки в группе; 3 балла - очаги пролиферации более 3 клеток в группе).
Изменения в костной ткани классифицировались по пяти категориям (0-5 баллов):
0 - нормально; 1 – минимальные изменения (небольшие участки резорбции в дистальной части большеберцовой кости или кортикальной кости, не очень заметная при небольшом увеличении, редкие остеокласты); 2 – мягкие изменения (более многочисленные области резорбции в дистальной части большеберцовой или кортикальной кости большеберцовой кости, не очень заметны при небольшом увеличении, остеокласты более многочисленные); 3 - умеренный (очевидная резорбция трабекулярной и кортикальной костей без полных дефектов коры, потеря некоторых медуллярных трабекул, поражение видно при небольшом увеличении, остеокласты более многочисленные); 4 – выраженные изменения (дефекты полной толщины в кортикальной части кости, часто с искажением профиля оставшейся кортикальной поверхности, выраженная потеря мозгового вещества дистальной голени, многочисленные остеокласты, без резорбции в меньших костях лапки); 5 - тяжелые (дефекты полной толщины в кортикальной части кости, часто с искажением профиля оставшейся кортикальной поверхности, заметная потеря медуллярной кости дистальной голени, многочисленные остеокласты, резорбция также присутствует в костях предплюсны).
Данные полученных результатов гистологического исследования голеностопных суставов представлены на фигурах 1-21.
В КГ1 на микрофотографиях гистологических срезов голеностопного сустава здоровой крысы, проходящих через его сагиттальную плоскость, визуализируются эпифиз большеберцовой кости, таранная кость, синовиальная щель, суставные поверхности с хрящами и периартикулярные ткани. Микроструктура костной ткани, хряща суставных поверхностей и связок без патологических изменений (фиг.1, 2, 3).
Гистоморфологические исследования голеностопных суставов животных с АА, представлены обоими конечностями, правой, в которую вводили адъювант Фрейда или ипсилатеральной и левой - контралатеральной.
Микрофотографии гистологических срезов голеностопного сустава представлены в сагитальной плоскости ипсилатеральной конечности крысы с АА (эпифиз большеберцовой кости, таранная кость, синовиальная щель, суставные поверхности с хрящами и периартикулярные ткани), не получавшей лечение из КГ2 (фиг. 4, 5, 6).
Комплексная оценка патологических изменений на ипсилатеральной конечности у крыс с АА по всем оцениваемым критериям характеризуется выраженными признаками поражения суставного аппарата, характерного для АА. Оценка воспаления периартикулярных тканей – 3,9 балла, степень дегенерации хряща – 6,5 балла, изменения костной ткани – 3,5 балла. Общий уровень гистологических изменений на ипсилатеральной конечности в КГ2 по модифицированной шкале Mankin (1971) и Bendele A. et al. (1999) составил 13,9 балла.
В суставе контралатеральной конечности крыс с АА также наблюдались патологические изменения, но с менее выраженными признаками, по сравнению с суставом, в который вводили адъювант, что свидетельствует о системной воспалительной реакции и адекватном воспроизведении модели АА (фиг. 7, 8, 9).
Патологические изменения суставного аппарата в контралатеральной конечности у крыс с АА (КГ2) были менее выражены, по сравнению с ипсилатеральной конечностью (КГ2), и по оцениваемым критериям соответствуют воспалению периартикулярных тканей – 2,5 балла, степени дегенерации хряща – 2,8 балла и изменению костной ткани – 2,5 балла, в сумме общий уровень гистопатологических изменений - 7,8 балла.
Далее представлены микрофотографии гистологических срезов суставов крыс с АА, получавших курсы аппликаций нативной иловой грязью и биологически активным средством.
Гистоморфологические изменения голеностопных суставов ипсилатеральной и контралатеральной конечностей у крыс с АА после курса процедур грязевыми аппликациями месторождения «Сергиевские минеральные воды» (ОГ1) представлены на фигурах 10-15.
В соответствии с комплексной оценкой суставного аппарата голеностопных суставов ипсилатеральной конечности у крыс с АА после курса аппликациями нативной иловой грязи месторождения «Сергиевские минеральные воды» в ОГ1 определены патологические изменения, которые практически не отличались от изменений в КГ2. Патологические изменения характеризовались воспалением периартикулярных тканей – 3,8 балла, степенью дегенерации хряща – 6,4 балла и костной ткани – 3,6 балла (фиг. 10, 11, 12). Общий уровень гистопатологических изменений голеностопных суставов, характерных для ипсилатеральных конечностей в ОГ1 составил 13,8 баллов.
В этой группе животных суставные ткани контралатеральной конечности также претерпели изменения, как и в КГ2: признаки воспаления периартикулярных тканей – 2,6 балла, степень дегенерации хряща – 3,5 балла и костной ткани – 2,5 балла (фиг. 13, 14, 15). Общий уровень гистологических изменений голеностопных суставов контралатеральной конечности ОГ1 составил 8,6 баллов.
«
Гистоморфологические изменения в голеностопных суставах крыс с АА и после курса аппликаций средством Пелофит», полученным на основе иловой грязи озера «Молочка» месторождения «Сергиевские минеральные воды», обогащенной 1% эфирным маслом шалфея (ОГ2) представлены на фигурах 16-21.
В соответствии с комплексной оценкой патологических изменений тканей суставного аппарата в ипсилатеральной конечности у крыс ОГ2 проявляются в минимальных изменениях: воспаление периартикулярных тканей – 2,2 балла, степень дегенерации хряща – 3,8 балла, изменение костной ткани – 2,3 балла, в сумме гистопатологические изменения составили 8,3 балла (фиг. 16, 17, 18).
В ОГ2 суставные ткани контралатеральной конечности претерпели минимальные изменения: воспаление периартикулярных тканей – 1,5 балла, степень дегенерации хряща – 1,0 балл и изменение костной ткани – 1,5 балла, в сумме гистологические изменения составили 4 балла (фиг. 19, 20, 21).
Во всех опытных группах животных с АА были обнаружены патоморфологические признаки, характерные для адъювантного артрита различной степени выраженности.
У всех животных групп с моделью АА в КГ2 при гистологическом анализе голеностопного сустава (лодыжки крысы, ankles of rats) ипсилатеральной конечности были обнаружены изменения, и в соответствии с полуколичественной оценкой соответствовали - 13,9 баллам, а на контралатеральной - 7,8 баллам.  У животных ОГ1 изменения в голеностопных суставах ипсилатеральных конечностях практически не отличались от данных КГ2 и соответствовали 13,8 баллам, а в контралатеральных конечностях изменения были более выражены, чем в КГ2, и соответствовали 9,6 баллам. В ОГ2, характерные для ревматоидного артрита изменения в голеностопных суставах были минимальными на ипсилатеральных конечностях, и соответствовали в сумме 8,3 баллам, а на контралатеральных – 4 балла, что свидетельствует о меньшем уровне воспалительной реакции у животных, получавших курс аппликаций бальнеологическим средством.
Примеры использования курсового применения биологически активного средства в хроническую стадию АА.
9
9
Пример № 1. Лабораторное животное из КГ1, крыса – самец, массой 340г, активный, подвижный. Движения во всех суставах в полном объёме. На 42-й день эксперимента длина окружности голеностопных суставов справа и слева по 1,3 см, температура кожи над суставами 26°С. Содержание лейкоцитов в периферической крови 10,5*10/л. Перед выводом из эксперимента на 57-й день температура и окружность суставов не изменилась. Содержание лейкоцитов в крови 9,4*10/л. Гистологическая структура периартикулярных тканей сустава, суставной капсулы, хряща и костной ткани эпифиза большеберцовой кости и таранной кости без патологических изменений.
9
9
Пример № 2. Лабораторное животное из КГ2, крыса – самец, массой 300г, малоактивный, при передвижении на правую конечность не опирается. Сгибания в голеностопном суставе отсутствуют, при пальпации кожа натянута, контуры правой лодыжки сглажены, длина окружности на 42-й день эксперимента на правой конечности - 3,6 см, на левой – 1,9 см. Температура кожи над правым голеностопным суставом – 33 °С, над левым – 28°С. Содержание лейкоцитов в крови 23,8*10/л. Перед выведением из эксперимента на 57-й день форма голеностопного сустава, длина его окружности и температура не изменились. Содержание лейкоцитов в крови 22*10/л. Гистоморфологическая картина изменений голеностопного сустава характерна для адъювантного артрита. На правой (ипсилатеральной) лодыжке крысы периартикулярные ткани с повышенной васкуляризацией, отечным воспалением, лейкоцитарной инфильтрацией, определяется утолщение синовиальной оболочки со значительными признаками воспалительной реакции, что соответствует – 3,9 баллам. Дегенерация хряща характеризуется набуханием и вакуолизацией матрикса, дистрофическим поражением хондроцитов, истончением хрящевой ткани, с очагами изогенных групп хондроцитов по 2, 3 клетки и более. Степень дегенерации хряща составила 6,5 балла. Изменения в костной ткани соответствуют 3,5 баллам, в частности определяется остеолизис трабекул, и образование паннусов.  Общий (полуколичественный) уровень гистологических изменений по модифицированной шкале Mankin (1971) и Bendele A. et al. (1999) составил 13,9 балла.
В голеностопном суставе контралатеральной конечности установлены проявления аутоиммунного артрита умеренной степени выраженности. Общая воспалительная реакция в периартикулярных тканях и синовиальной оболочки – 2,5 балла, степень дегенерации хряща – 2,8 балла и явления остеолизиса – 2,5 балла. Общий полуколичественный уровень гистологических признаков артрита – 7,8 балла.
9
Пример № 3. Лабораторное животное из ОГ1, крыса – самец, массой 300г, малоактивный, при передвижении щадит правую конечность. Сгибание в голеностопном суставе активно не осуществляет, контуры правой лодыжки сглажены, длина окружности на 42-й день эксперимента на правой конечности - 3,5 см, на левой – 2 см. Температура кожи над правым голеностопным суставом – 33 °С, над левым – 30°С. Содержание лейкоцитов в крови 22,7*10/л. Начиная с 43 дня артрита животным проводили курс аппликаций, всего 7 сеансов через 1- 2 дня, нативной иловой грязью озера «Молочка» месторождения «Сергиевские минеральные воды».  Грязь подогревают на водяной бане до 37 °С и наносят на обе задние конечности, путем обертывания стопы и голеностопного сустава, покрывая, конечность полиэтиленовой пленкой и заворачивают животное в хлопчатобумажную ткань. Длительность сеанса 15-20 минут. Затем грязевые аппликации удаляют, а лапы животного моют под теплой проточной водой и вытирают.
9
Перед выведением крысы из эксперимента на 57-й день, форма голеностопного сустава оставалась прежней, животное подтягивает правую лапу при движении, но полностью на неё не опирается. Длина окружности голеностопного сустава с права – 3,2 см, слева – 1,9 см, температура кожи справа -31,6 °С, а слева – 28,7 °С не изменилась. Содержание лейкоцитов в крови 20,6*10/л. Гистоморфологическая картина изменений голеностопного сустава характерна для адъювантного артрита на правой (ипсилатеральной) лодыжке крысы.  Бальная характеристика патологических изменений, происходящих в голеностопном суставе правой конечности соответствует воспалительной реакции – 3,8 балла, степень дегенерации хряща – 6,4 балла, и изменения костной ткани – 3,6 балла. Общий полуколичественный уровень гистологических признаков артрита на правой конечности – 13,8 баллов.
В голеностопном суставе контралатеральной конечности проявления аутоиммунного артрита умеренной степени выраженности. Общая воспалительная реакция в периартикулярных тканях и синовиальной оболочки – 2,6 балла, степень дегенерации хряща – 3,5 балла и явления остеолизиса – 2,5 балла. Общий уровень гистологических признаков артрита на левой конечности – 8,6 баллов.
9
Пример № 4. Лабораторное животное из ОГ2, крыса – самец, массой 310г, при передвижении опирается на обе задние конечности. Длина окружности голеностопного сустава на 42-й день эксперимента на правой конечности - 3,6 см, на левой – 2,1 см. Температура кожи над правым голеностопным суставом – 33 °С, над левым – 29°С. Содержание лейкоцитов в крови 22,1*10/л. Начиная с 43 дня артрита животным проводили курс аппликаций, всего 7 сеансов через 1-2 дня, бальнеологическим средством «». Бальнеологическое средство подогревают на водяной бане до 37 °С, наносят на обе задние конечности, путем обертывания стопы и голеностопного сустава, покрывая, конечность полиэтиленовой пленкой и заворачивают животное в хлопчатобумажную ткань. Длительность сеанса 15-20 минут. Затем бальнеологическое средство удаляют и лапы животного моют под теплой проточной водой, вытирают.
9
После завершения курса аппликаций животное использует в передвижение обе задние конечности, встает на них. На 57-й день эксперимента длина окружности голеностопного сустава справа – 3,2 см, слева – 1,8 см, температура кожи справа - 31,6 °С, а слева – 28,7 °С не изменилась. Содержание лейкоцитов в крови 20,6*10/л.
При гистологическом анализе голеностопного сустава ипсилатеральной конечности в периартикулярных тканях и суставной капсуле определяется умеренная лимфогистиоцитарная инфильтрация с минимальным отеком, незначительное снижение количества хондроцитов и фиксируются отдельные изогенные группы хондроцитов по 2, 3 клетки в группе и умеренный уровень остеолизиса трабекул. Бальная характеристика патологических изменений, происходящих в голеностопном суставе правой конечности соответствует воспалительной реакции – 2,2 балла, степень дегенерации хряща – 3,8 балла, и изменения костной ткани – 2,3 балла. Общий полуколичественный уровень гистопатолологических признаков на правой конечности – 8,3 баллов.
В голеностопном суставе контралатеральной конечности проявления аутоимунного артрита в минимальной степени выраженности. Общая воспалительная реакция в периартикулярных тканях и синовиальной оболочке – 1,5 балла, степень дегенерации хряща – 1,0 балл и явления остеолизиса – 1,5 балла. Общий уровень гистологических признаков артрита на левой конечности – 4,0 балла.
Таким образом, полученное биологически активное средство «Пелофит» оказывает более выраженное локальное действие при АА по сравнению с нативной иловой грязью озера «Молочка» месторождения «Сергиевские минеральные воды», которое проявляется в уменьшение местного воспалительного процесса в синовии и прилежащих периартикулярных тканях в виде снижения отёка, лейкоцитарной инфильтрации, и влияет на восстановление структуры хрящевой ткани и субхондральной кости.
Поскольку адъювантный артрит является аналогом аутоиммунного воспаления с преимущественным повреждением суставов, то полученные эффекты локального противовоспалительного действия, а также хондро- и остеопротекторного действия позволяют провести экстраполяцию, полученных в эксперименте результатов для прогнозируемого действия биологически активного средства «Пелофит» при использовании его в восстановительном лечении аутоиммунных артритов.