Фенотипические, биохимические и молекулярно-генетические свойства штаммов Bacillus anthracis, выделенных во время вспышек сибирской язвы на территории Российской Федерации (2014-2016 годы)

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2018, том 53, № 2, с. 404-413

Микробиология и ветеринария

УДК 619:579.62:616.9 doi: 10.15389/agrobiology.2018.2.404rus

ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ, БИОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММОВ BaciUus anthracis, ВЫДЕЛЕННЫХ ВО ВРЕМЯ ВСПЫШЕК СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (2014-2016 годы)*

Ю.О. СЕЛЯНИНОВ1, И.Ю. ЕГОРОВА1, Я.И. АЛЕКСЕЕВ2, А.В. КАЗАНЦЕВ2, Ю.А. МОНАХОВА2, Д.В. КОЛБАСОВ1

Несмотря на то, что в Российской Федерации разработаны и достаточно широко внедрены эффективные меры по предупреждению возникновения и распространения сибирской язвы, в 2014-2016 годах было зарегистрировано семь ее очагов в Волгоградской, Ростовской, Белгородской, Саратовской областях, в Республике Татарстан и шесть вспышек в популяции северных оленей на территории двух районов Ямало-Ненецкого автономного округа (в последних пало 2657 оленей). В статье нами впервые описаны молекулярно-генетические, биологические свойства и филогенетические взаимоотношения изолятов возбудителя сибирской язвы, выделенных во время вспышек болезни в Волгоградской области, Ямало-Ненецком автономном округе и из почв захоронений в Республике Чувашия в последние три года. При проведении исследований использовали как общепринятые подходы, так и авторские методики. Изучали фенотипические свойства и диагностические признаки бактерий (морфология роста в бактериологических питательных средах, подвижность, окрашивание по Граму, капсулообразование in vivo и in vitro, спорообразование, протеолитическая, гемолитическая, лецитиназная, фосфатазная, гликолитическая активности, способность синтезировать протокатехоевую кислоту, сорбировать конго красный из среды, фагочувствительность, токсинообразование in vitro, плазмидный профиль, чувствительность к антибиотикам, рекомендованным для применения в ветеринарии, вирулентность для лабораторных животных). MLVA-типирование штаммов сибиреязвенного микроба проводили по 20 VNTR-локусам. Показано, что по основным фенотипическим и диагностическим признакам штаммы возбудителя сибирской язвы различались незначительно и в целом соответствовали типовому штамму Bacillus anthracis. Наиболее выраженные различия в фенотипических свойствах выявлены у аспоро-генного и авирулентного штамма № 6017 B. anthracis, выделенного в 2016 году от лопарской олене-гонной собаки. Штаммы, выделенные в течение одной вспышки, группировались в отдельные кластеры, а внутри кластера некоторые из них незначительно различались (по 1-2 локусам). Изоляты из почв захоронений в Республике Чувашия и выделенные от лопарской оленегонной собаки во время вспышки болезни в Ямало-Ненецком автономном округе, сформировали отдельные кластеры. При паспортизации изученных штаммов B. anthracis установлена их высокая эпизоотическая опасность, обусловленная факторами патогенности, экспрессирующимися in vitro. Показано наличие капсуло- и токсинообразования, высокий уровень синтеза гемолизинов, протеаз, продукция прото-катехоевой кислоты, а также вирулентность для лабораторных мышей в дозах 6-1000 спор. Полученные результаты подтверждают необходимость постоянного мониторинга и оценки эпизоотической опасности сибиреязвенных захоронений и падежных мест (моровых полей), а также проведения эффективных профилактических мероприятий против сибирской язвы.

Ключевые слова: сибирская язва, штаммы Bacillus anthracis, фенотипические свойства, генетические свойства, вирулентность, MLVA.

Несмотря на то, что в Российской Федерации разработаны и достаточно широко внедрены эффективные меры по предупреждению возникновения и распространения сибирской язвы, ежегодно (за исключением 2016 года) в стране регистрируют единичные случаи этой инфекции среди животных (1-4). Так, по данным информационно-аналитического центра Россельхознадзора (http://www.fsvps.ru/fsvps/iac/messages), в 2014-2016 годах зафиксировано семь очагов сибирской язвы в Волгоградской, Ростовской, Белгородской, Саратовской областях, Республике Татарстан и шесть вспышек — в популяции северных оленей на территории двух районов Ямало-Ненецкого автономного округа (в последних заболело и пало 2657 оленей).

* Исследование выполнено с использованием научного оборудования Центра коллективного пользования «Биотехнология» ВНИИСБ и поддержано программой развития биоресурсных коллекций ФАНО.

Выделение новых штаммов в процессе мониторинга за инфекционными болезнями животных и человека и изучение фенотипических, биохимических и молекулярно-генетических свойств изолятов позволяет выявить клональное распространение возбудителя и определить его происхождение (5-8). Кроме того, на основе биологических характеристик определяют иммунологическое соответствие штаммов бактерий, циркулирующих среди животных, со штаммами, входящими в состав вакцинных препаратов, исследуются основные диагностические признаки бактериальных патогенов, формирование у них лекарственной устойчивости и устойчивости к биоцидам из различных химических классов (9-12). В свою очередь, эти данные используют при эпидемической и эпизоотической паспортизации штаммов (оценке степени эпидемической/эпизоотической опасности) и разработке корректирующих действий для повышения эффективности специфических и неспецифических мероприятий для профилактики и ликвидации инфекционных болезней животных и человека (13, 14).

В настоящем сообщении нами описаны свойства и филогенетические взаимоотношения изолятов возбудителя сибирской язвы, выделенных из почвы с мест захоронения и от павших животных во время вспышек болезни на территории России в 2014-2016 годах, в том числе при крупнейшей за последние несколько десятилетий эпизоотии в популяции северного оленя.

Цель работы — комплексное изучение характеристик и паспортизация штаммов возбудителя сибирской язвы, выявленных на территории Российской Федерации.

Методика. Штаммы (11 культур Bacillus anthracis) были выделены в 2014-2016 годах от крупного рогатого скота, лопарской оленегонной собаки, северных оленей и из почв захоронений во время вспышек сибирской язвы в Волгоградской области и Ямало-Ненецком автономном округе, а также из почв захоронений в Республике Чувашия. Все штаммы депонированы в Государственной коллекции микроорганизмов, вызывающих опасные, особо опасные, в том числе зооантропонозные и не встречающиеся на территории страны болезни животных (ГКМ-ФИЦВиМ).

Диагностические признаки возбудителя сибирской язвы изучали согласно методическим указаниям МУК 4.2.2413-08 (М., 2009), фенотипи-ческие свойства, ассоциируемые с патогенностью возбудителя (протеоли-тическая, гемолитическая, лецитиназная, фосфатазная, гликолитическая активности, способность синтезировать протокатехоевую кислоту, сорбировать конго красный из среды), — в соответствии с рекомендациями (15).

Использовали ростовые и дифференциально-диагностические питательные среды: среду для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба (ФГУН «ГНЦ ПМБ», Россия); агар питательный полужидкий (ООО «БиоКомпас», Россия); среду для определения капсуло- и токсинооб-разования на основе агара Хоттингера (патент РФ № 2204607); казеиновый агар (16); среду на основе 10 % эмульсии куриного желтка в физиологическом растворе; L-агар с конго красным (25 мкг/мл); двухслойный кровяной агар (патент РФ № 2238316); агар Мюллера-Хинтона («HiMedia Laboratories Pvt. Ltd», Индия). Споры сибиреязвенных культур получали на картофельном агаре согласно методическим указаниям МУ 3.5.2435-09 (М., 2009) и хранили в 30 % глицерине.

Чувствительность штаммов B. anthracis к антибактериальным препаратам оценивали в соответствии с МУК 4.2.1890-04 (М., 2004) на агаре Мюлле-ра-Хинтона, используя набор дисков для ветеринарных лабораторий (ООО «НИЦФ», г. Санкт-Петербург).

О капсуло- и токсинобразовании штаммов B. anthracis in vitro судили по наличию слизистых колоний и линии преципитации на среде для определения капсуло- и токсинообразования при содержании в воздушной среде 10 % СО2. Для обнаружения капсулы in vivo 1-суточной бульонной культурой каждого штамма заражали по 2 мыши массой 18-20 г (0,5 см3 внутрибрюшинно). Если мыши не погибали в течение 10 сут, их подвергали эвтаназии СО2. Для подтверждения капсулообразующей способности штаммов из выросших слизистых колоний и из органов павших мышей готовили мазки-отпечатки, фиксировали смесью спирта с эфиром (1:1) в течении 30 мин и окрашивали метиленовым синим по Леффлеру или по Романовскому-Гимзе согласно инструкции по применению красителей. Мазки микроскопировали при увеличении x900, обнаружение вокруг клеток капсулы розового цвета свидетельствовало о продукции штаммом кап-сульного полипептида. Биохимические свойства выделенных культур оценивали с использованием тест-системы для биохимической идентификации бацилл и родственных видов Microgen Bacillus-ID (MID-66) («Microgen Bioproducts», Великобритания).

Вирулентность исследуемых штаммов (показатели LD100 и LD50) определяли на клинически здоровых белых аутбредных мышах массой 18-20 г обоих полов (кормление и содержание животных — согласно принятым нормам). Работу с животными осуществляли в соответствии с European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and Other Scientific Purposes (Strasbourg, 1986). Из животных по принципу аналогов формировали 5 групп мышей (по 6 гол.) для каждого изолята, которым подкожно вводили по 0,5 см3 соответствующей споровой суспензии (2Х108, 4x107, 8x106, 1,6x106, 3,2x105 спор/см3). Наблюдение за мышами и учет их гибели проводили в течение 10 сут. Величину LD50 рассчитывали по формуле Кербера в модификации И.П. Aшмарина и A.A. Воробьева (17). За LD100 принимали минимальное количество спор, вызывающее гибель 100 % мышей в опыте.

Для выделения суммарной (хромосомной и плазмидной) ДНК применяли набор ДНК-сорб-С-М вариант 50 (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребна-дзора, г. Москва).

При постановке PCR использовали тест-систему AмплиСенс Bacillus anthracis-FRT (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, г. Москва) для выявления генетических детерминант основных факторов патогенности — капсултного полипептида и токсина. MLVA типирование (multilocus variable number tandem repeat analysis) осуществляли по 20 VNTR (variable number tandem repeat) локусам хромосомной и плазмидной локализации с PCR-праймерами, описанными F. Lista с соавт. (18), которые входят в набор реагентов для генетического типирования штаммов возбудителя сибирской язвы методом фрагментного анализа (ОМ-Сибирская язва-Генотип) по ТУ 9398-018-46395995-2013 (ООО «Синтол», г. Москва). PCR и MLVA выполняли в соответствии с инструкциями по применению тест-систем на амплификаторе C1000 Touch Thermal Cycler с модулем для PCRq CFX96 Real-Time System («Bio-Rad», СШA). При постановке MLVA (18) секвенирование каждого из локусов проводили в 8-капиллярном автоматическом генетическом анализаторе НAНОФОР 05 (Экспериментальный завод научного приборостроения РAН, г. Черноголовка).

При построении дендрограммы на основании данных MLVA-типирования использовали метод UPGMA.

Результаты. Характеристика изученных штаммов по объекту и тер-

ритории, на которой они были выделены, представлена в таблице 1.

1. Штаммы возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis, выделенные на территории России в 2014-2016 годах

Штамм ¡Инвентарный № |

Откуда выделен

Волгоградская область

370 Селезенка крупного рогатого скота

371 Почва

372 Биоматериал (Дубцовский р-н) Республика Чувашия

373 Почва с мест захоронения Ямало-Ненецкий автономный округ

6246

3158/317-318 3184/410

5833

5875

5885

5886 6017 6019

6063

6064

374 Ухо северного оленя

375 Ухо северного оленя

376 Ухо северного оленя

377 Истечения из носа лопарской оленегонной собаки

378 Ухо северного оленя

379 Ухо северного оленя

380 Ухо северного оленя

2. Проявление фенотипических, серологических и биологических свойств, ассоциируемых с патогенностью, у штаммов возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis, выделенных на территории России в 2014-2016 годах

Штамм 1 1 2 1 3 1 4 5 6 7 8 9 1 10 1 11 1 12 1 13 1 14 1 15 16 1 17

6246 T R - + + + + + + - +++ + +++ а + ± +

3158/317-318 T R - + + + + + + - +++ + +++ а + ± +

3184/410 T R - + + + + + + - +++ + +++ а + ± +

5875 T R - + + + + + + - +++ - +++ а + + +

5885 T R - + + + - + + - +++ - +++ а + + +

5886 T R - + + + - + + - +++ - +++ а + + +

6019 T R - + + + + + + - +++ - +++ а + + +

6063 T R - + + + - + + - +++ - +++ а + + +

6064 T R - + + + - + + - +++ - +++ а + + +

6017 T R - - + - - - - - +++ + +++ а + + +

5833 T R - + + + + + + - +++ + +++ а + + +

Примечание. 1 — морфология клеток, 2 — морфология колоний, 3 — фосфатазная активность, 4 — спорообразование, 5 — наличие плазмиды pXO1, 6 — наличие плазмиды pxo2, 7 — токсинообразование in vitro, 8 — капсулообразование in vitro, 9 — капсулообразование in vivo, 10 — лецитиназная активность, 11 — уровень экспрессии протеаз, 12 — синтез протокатахоевой кислоты, 13 — уровень экспрессии гемолизинов, 14 — тип гемолиза,15 — сорбция конго красного из среды, 16 — лизис фагом Fah-ВНИИВВиМ, 17 — лизис фагом RD-ph-6. Т — типичная морфология, R — колонии R-типа (шероховатые); «+/-» — проявление признака оценено положительно/отрицательно, «±» — слабая чувствительность к фагу.

3. Биохимическая активность у штаммов возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis, выделенных на территории России в 2014-2016 годах

6246 - - - + - - - - + - - + - - - + ------- +

3158/317-318 - + - + - - - - + - - + - - - + ------- +

3184/410 - - - + - - - - - - - + - - - + ------- +

5875 - - - - - - - - + - - + - - - + ------- +

5885 - - - + - - - - + - - + - - - + ------- +

5886 - - - + - - - - + - - + - - - + ------ + +

6019 - - - + - - - - + - - + - - - + ------- +

6063 - - - + - - - - + - - + - - - + ------- +

6064 - - - + - - - - - - - + - - - + ------- +

6017 - - - + - - - - + - - + - - - + ------- +

5833 - - - + - - - - + - - + - - - + ------- +

Примечание. 1, 2, 3, 4, 5, 6 — соответственно ферментация арабинозы, маннитола, рамнозы, сахарозы, адонитола, метил^-глюкозида; 7 — продукция индола, 8 — утилизация цитрата; 9, 10, 11, 12, 13, 14 — ферментация целлобиозы, маннозы, салицина, трегалозы, галактозы, инулина; 15 — продукция ONPG (ortho-mtrophenyl-p-D-galactopyranoside), 16 — тест Фогеса-Проскауэра, 17, 18, 19, 20, 21, 22 — ферментация инозитола, раффинозы, сорбитола, ксилозы, метил^-маннозида, мелицитозы; 23 — разложение аргинина, 24 — восстановление нитратов до нитритов; «+/-» — проявление признака оценено положительно/отрицательно.

При изучении основных идентификационных признаков штаммов

B. anthracis установлено, что рабочая коллекция представлена 10 типичными вирулентными культурами и одним штаммом, атипичным по капсуло- и спорообразованию. Результаты комплексной оценки свойств штаммов показали, что они по фенотипическим признакам (морфология роста в жидких и на твердых питательных средах, подвижность, окрашивание по Граму, капсуло-образование in vivo и in vitro, спорообразование), биохимической активности (протеолитическая, гемолитическая, лецитиназная, фосфатазная, гли-колитическая активности, способность синтезировать протокатехоевую кислоту, сорбировать конго красный из среды), антигенным свойствам (реакция термопреципитации по Асколи), чувствительность к сибиреязвенным бактериофагам Fah-ВНИИВВиМ и RD-ph-6, токсинообразование in vitro, плазмидный профиль (наличие фрагментов генов капсуло- и ток-синообразования в PCR), чувствительности к антибиотикам, рекомендованным для применения в ветеринарии, имели незначительные различия (табл. 2, 3). За исключением штамма № 6017, выделенного от лопарской оленегонной собаки, все культуры показали высокую экспрессию гемолизинов и протеаз, образовывали капсульный полипептид in vitro (колонии слизистой консистенции S-, M или SM-формы на среде для определения капсуло- и токсинообразования) и in vivo (капсульные палочки в мазках-отпечатках с органов павших мышей), вызывали гемолиз эритроцитов по а-типу, сорбировали конго красный из среды. Отличительной особенностью штаммов B. anthracis, выделенных в Ямало-Ненецком автономном округе было отсутствие или слабая продукция протокатехоевой кислоты. По продукции токсина in vitro (визуально определяемый) штаммы разделились на продуцирующие (№№ 6246, 3158/317-318, 3184/410, 5833, 5875, 6019) и не продуцирующие токсин (№№ 5885, 5886, 6017, 6063, 6064). Изученные культуры также различались по чувствительности к сибиреязвенным фагам: все без исключения лизировались фагом RD-ph-6, но штаммы №№ 6246, 3158/317-318 и 3184/410 были слабо чувствительны к фагу Fah-ВНИИВВиМ.

По показателю LD50 для аутбредных белых мышей, который считается наиболее объективным, штаммы согласно классификации (19) распределились в четыре группы (табл. 4).

4. Вирулентность штаммов возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis, выделенных на территории России в 2014-2016 годах, для аутбредных белых мышей

Штамм

Показатель, спор/гол.

LD100

LD50

Оценка вирулентности

6246

3158/317-318

3184/410

5833

5875

5885

5886 6017 6019

6063

6064

5,4х102 6

1,2х102 30

20 1,1х103 1,7х102 Не титруется 4,7х102 150 60

8

Не титруется

5

6

5 7 12

Не титруется 19 10 21

Высоковируленгный Высоковируленгный Высоковируленгный Высоковируленгный

Высоковируленгный

Высоковируленгный

Вируленгный

Авируленгный

Умеренно вируленгный

Вируленгный

Умеренно вируленгный

Шесть из изученных шгаммов огносились к высоковируленгным, по два — к вируленгным и умеренно вируленгным. Кулкгура B. anthracis, выделенная ог лопарской оленегонной собаки (№ 6017), не вызывала гибели аугбредных белых мышей и была отаесена к группе авируленгных. Показагель LD50 для изученных шгаммов находился в пределах 5-37, LDloo — в пределах 6-2000 спор/гол. LD50 у шгамма № 3158/317-318 опре-

делигь не удалось, гак как величина 1Юю0 составила всего 6 спор/гол.

5. Чувствительность к антибиотикам у штаммов возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis, выделенных на территории России в 2014-2016 годах

Штамм | 1 1 2 1 3 4 | 5 1 6 1 7 1 8 | 9 1 10

6246 S S MS S MS MS R R MS R

3158/317-318 S S S S S S S MS S R

3184/410 S S S S S S S MS S R

5875 S S S S S S S S S R

5885 S S S S S MS S MS S R

5886 S S S MS MS R MS MS S R

6019 S S R S MS MS MS MS S R

6063 S S S S S MS S MS S R

6064 S MS S S MS MS S MS S R

6017 S S S S S MS S S S R

5833 S S S S S MS S S S R

Примечание. 1 — ампициллин, 2 — пенициллин, 3 — неомицин, 4 — энрофлоксацин, 5 — тилозин,

6 — левомицетин, 7 — стрептомицин, 8 — канамицин, 9 — тетрациклин, 10 — полимиксин Б; R (resistance) — слабочувствительные; MS (medium sensitive) — умеренно чувствительные; S (sensitive) — чувствительные.

В. anthracis 29

Дендрограмма филогенетических взаимоотношений изученных штаммов Bacillus anthracis, построенная методом UPGMA по данным MLVA-типирования:

кластер I — штаммы с условным обозначением 38-40 (№№ 5875, 5885, 5886), 42-44 (№№ 6019, 6063, 6064); кластер II — штамм с условным обозначением 41 (№ 6017); кластер III — штаммы с условным обозначением 33-35 (№№ 6264, 3158/317-318, 3184/410); кластер IV — штамм с условным обозначением 37 (№ 5833) (коллекция ГКМ-ФИЦВиМ; описание штаммов см. в табл. 1).

Девягь из 11 изученных шгам-мов обладали природной устойчивостью к полимиксину Б, были чувстви-гельны и высокочувствительны к ле-вомицетану, канамицину, пенициллину, гилозину, сгрепгомицину, нео-мицину, геграциклину, ампициллину и энрофлоксацину. Штамм № 6246 проявил устойчивость к канамицину и стрептомицину (габл. 5).

B. anthracis — один из наиболее генегически гомогенных пагоге-нов, чго загрудняег распознавание его изолягов. Для решения проблемы ис-пользуюг анализ множественных ган-демных повторов (МЬУА), позволяющий с помощью ПЦР выявлягь участки бактериальной ДНК, которые в ре-зульгаге проскальзывания репликагив-ной вилки подвергаюгся ошибочному копированию, приводящему к их укорочению или удлинению (20).

МЬУА-типированис выполняли по 20 УОТ^-локусам при мулкгиплекс-ной амплификации препарага ДНК с последующим усгановлением длин флуоресценгно меченных продуктов по каждому из VNTR-локусов. Для вычисления рассгояний между шгаммами использовали значения числа

повторов в каждом из локусов (рис.).

По результатам МЦУА-анализа изученные штаммы распределились в четыре кластера. Штаммы, полученные от северных оленей во время вспышки сибирской язвы в Ямало-Ненецком автономном округе в 2016 году, формировали I кластер, во II кластер входил один штамм (№ 6017, выделен в Ямало-Ненецком автономном округе в 2016 году от лопарской оленегонной собаки), III — образовали штаммы, выявленные в Волгоградской области в 2014 году, IV — представляла культура В. anthracis из почв захоронений в Республике Чувашия (см. рис., табл. 6).

6. MLVA-генотипы штаммов возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis, выделенных на территории России в 2014-2016 годах, по 20 VNTR-локусам

III кластер

6246 30 31 14 9 45 13 8в 20 13 57 78 4 20 5 20 14в 4 4 14 17

3158/317-318 30 31 14 9 45 13 10 20 13 57 78 4 20 5 20 12 4 4 14 17

3184/410 30 31 14 9 45 13 10 20 13 57 78 4 20 5 20 12 4 5 14 17

I кл а с т е р

5875 27 27 15 10 45 14 9 16 14 53 17 3 21 3 23 9 3 5 14 15

5885 27 27 15 10 45 14 9 16 14 53 17 3 21 3 23 9 3 5 14 15

5886 27 27 15 10 45 14 9 16 14 53 17 3 21 3 23 9 3 5 14 15

6019 27 27 15 10 45 14 9 16 14 53 17 3 21 3 23 9 3 5 14 15

6063 27 27 15 10 45 14 9 16 14 53 17 3 21 3 23 9 3 5 14 15

6064 27 27 15 10 45 14 8в 16 14 53 17 3 21 3 23 9 3 5 14 15

II к л а с т е р

6017 24 30 16 12 45 13 8 20 13 57 75 - - 4 20 - 4 4 14 16

IV к л а с т е р

5833 30 30 14 9 45 13 10 20 13 57 75 4 20 4 20 13 4 4 14 16

Примечание. VNTR — variable-number tandem-repeat; указано число повторов в локусе (от 1 до 45).

Локусы: 1 — Geb-Bams3, 2 — Geb-Bams13, 3 — Geb-Bams22, 4 — Geb-Bams23, 5 — Geb-Bams15, 6 — VNTR32, 7 — pXO1 aat, 8 — vrrC2, 9 — Geb-Bamsl, 10 — vrrCl, 11 — Geb-Bams30, 12 — VNTR17, 13 — VNTR16, 14 — vrrA, 15 — vrrB1, 16 — CL33, 17 — VNTR23, 18 — VNTR35, 19 — vrrB2, 20 — CL12; а — локус находится на плазмиде рХ01 B. anthracis, б — полиморфные локусы находятся на плазмиде рХ02 B. anthracis; прочерки означают, что локус не выявлен.

Эти данные подтвердили ранее установленный факт, что штаммы, выделенные в 2016 году в Ямало-Ненецком автономном округе от оленей и людей, имели один и тот же MLVA-генотип (21), а также то, что разные штаммы возбудителя сибирской язвы, циркулирующие на определенных территориях, имеют генотипы с географической приуроченностью (22-25).

У штаммов из I и III кластеров проявлились незначительные различия по 1-2 локусам внутри кластера, что может быть свидетельством их пассирования на чувствительных животных. Выявление в одной вспышке сибирской язвы (Ямало-Ненецкий автономный округ, 2016 год) штаммов, относящихся к двум различным кластерам (I и II), позволяет сделать предположение о наличии как минимум двух источников заражения животных. Эта гипотеза требует дальнейшего подтверждения.

Таким образом, по основным фенотипическим свойствам и диагностическим признакам штаммы возбудителя сибирской язвы, выделенные с 2014 по 2016 год в трех разных субъектах Российской Федерации, практически не отличались от типового штамма своего вида. Выявлена принадлежность этих штаммов к четырем MLVA20-генотипам, приуроченным к разным географическим территориям. Исключение составил штамм № 6017 Bacillus anthracis, выделенный от лопарской оленегонной собаки, который занимал промежуточное положение между штаммами из Волгоградской области и Республики Чувашия. Установлена высокая эпизоотическая опасность изученных штаммов (наличие факторов патогенно-сти, экспрессирующихся in vitro, высокая вирулентность для лабораторных

животных), что подтверждает необходимость микробиологического мониторинга сибиреязвенных захоронений и падежных мест (моровых полей), а также эффективных профилактических мероприятий.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ладный В.И., Ющенко Г.В. Сибирская язва на территории Российской Федерации. Эпидемиология и инфекционные болезни, 2009, 2: 36-40.

2. Рязанова А.Г., Аксенова Л.Ю., Буравцева Н.П., Головинская Т.М., Еременко Е.И., Цыганкова О.И., Варфоламеева Н.Г., Куличенко А.Н. Сибирская язва: эпидемиологическая и эпизоотологическая ситуация в 2015 году, прогноз на 2016 год. Проблемы особо опасных инфекций, 2016, 2: 24-27 (doi: 10.21055/0370-1069-2016-2-2427).

3. Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Аксенова Л.Ю., Семенова О.В., Буравцева Н.П., Головинская Т.М., Куличенко А.Н. Оценка эпидемиологической и эпизоотологической обстановки по сибирской язве в 2016 году. Прогноз на 2017 год. Проблемы особо опасных инфекций, 2017, 1: 21-23 (doi: 10.21055/0370-1069-2017-1-21-23).

4. Дугаржапова З.Ф., Чеснокова М.В., Гольдапель Э.Г., Косилко С.А., Балахонов С.В. Сибирская язва в Азиатской части Российской Федерации. Сообщение 2. Современная эпи-зоотолого-эпидемиологическая ситуация в Сибири и на Дальнем Востоке (1985-2016 годы). Проблемы особо опасных инфекций, 2017, 1: 59-64 (doi: 10.21055/0370-1069-2017-1-59-64).

5. Lekota K.E., Hassim A., Mafofo J., Rees J., Muchadeyi F.C., Van Heerden H., Madoroba E. Polyphasic characterization of Bacillus species from anthrax outbreaks in animals from South Africa and Lesotho. J. Infect. Dev. Ctries, 2016, 10(8): 814-823 (doi: 10.3855/jidc.7798).

6. Fouet A., Smith K.L., Keys C., Vaissaire J., Le Doujet C., Levy M., Mock M., Keim P. Diversity among French Bacillus anthracis isolates. J. Clin. Microbiol., 2002, 40(12): 4732-4734 (doi: 10.1128/JCM.40.12.4732-4734.2002).

7. Kolton C.B., Podnecky N.L., Shadomy S.V., Gee J.E., Hoffmaster A.R. Bacillus anthracis gamma phage lysis among soil bacteria: an update on test specificity. BMC Res. Notes, 2017, 10(1): 598 (doi: 10.1186/s13104-017-2919-8).

8. Antonation K.S., Grutzmacher K., Dupke S., Mabon P., Zimmermann F., Lankester F., Peller T., Feistner A., Todd A., Herbinger I., de Nys H.M., Muyembe-Tamfun J.-J., Karhemere S., Wittig R.M., Couacy-Hymann E., Grunow R., Calvignac-Spencer S., Corbett C.R., Klee S.R., Leendertz F.H. Bacillus cereus biovar anthracis causing anthrax in Sub-Saharan Africa — chromosomal monophyly and broad geographic distribution. PLoS Neglected Tropical Diseases, 2016, 10(9): e0004923 (doi: 10.1371/journal.pntd.0004923).

9. Саперкин Н.В., Алебашина Л.А., Квашнина Д.В. Устойчивость бактерий к дезинфектантам: оценка доказательной базы. Современные проблемы науки и образования, 2016, 5. Режим доступа: https://www.science-education.ru/ru/article/view?id=25429. Дата обращения: 24.12.2017.

10. Tahoun A.B.M.B., Abou Elez R.M.M., Abdelfatah E.N., Elsohaby I., El-Gedawy A.A., Elmos-lemany A.M. Listeria monocytogenes in raw milk, milking equipment and dairy workers: molecular characterization and antimicrobial resistance patterns. J. Glob. Antimicrob. Resist., 2017, 10: 264-270 (doi: 10.1016/j.jgar.2017.07.008).

11. Morvan A., Moubareck C., Leclercq A., Hervé-Bazin M., Bremont S., Lecuit M., Courvalin P., Le Monnier A. Antimicrobial resistance of Listeria monocytogenes strains isolated from humans in France. Antimicrob. Agents Chemother., 2010, 54(6): 2728-2731 (doi: 10.1128/AAC.01557-09).

12. Granier S.A., Moubarek C., Colaneri C., Roussel S., Courvalin P., Brisabois A. Antimicrobial susceptibility among Listeria monocytogenes isolates from non-human sources in France over a ten year period. Lirvo de actas do congress ISOPOL XVII. Porto, 2010: 63.

13. Сомов Г.П., Зайцева Е.А., Бузолева Л.С., Глазырина Т.А., Терехова В.Е. Изоляция Listeria monocytogenes из различных объектов в Приморском крае и их биологические свойства. Эпидемиологические и инфекционные болезни, 2002, 1: 47-49.

14. Egorova I.Yu., Sevskii T.A., Selyaninov YuO. Immunobiological properties of new unencaspsu-lated Bacillus anthracis 363/11 strain. Appl. Biochem. Microbiol., 2016, 52(8): 733-738 (doi: 10.1134/S0003683816080044).

15. Смирнов А.М., Гулюкин М.И., Субботин В.В., Колбасов Д.В., Донник И.М., Скира В.Н., Суворов А.В., Бабышова Л.В., Срибный Н.И. Методические рекомендации по комплексной оценке фенотипических признаков (гемолитической, протеолитической, ле-цитиназной и пигментсинтезирующей активностей, способности штаммами/изолятами продуцировать капсулу и токсин in vitro) культур B. anthracis. В сб.: Новые методы исследований по проблемам ветеринарной медицины. М., 2008: 177-186.

16. Шевченко О.В. Протеолитическая активность возбудителя сибирской язвы. Канд. дис. Саратов, 1999.

17. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962.

18. Lista F., Faggioni G., Valjevac S., Ciammaruconi A., Vaissaire J., Doujet C., Olivier G., De Santis R., Carattoli A., Ciervo A., Fasanella A., Orsini F., D'Amelio R., Pourcel C., Cas-sone A., Vergnaud G. Genotyping of Bacillus anthracis strains based on automated capillary 25-loci multiple locus variable-number tandem repeats analysis. BMC Microbiol., 2006, 6: 33 (doi: 10.1186/1471-2180-6-33).

19. Шляхов Э.Н., Груз Е.В. Титрация ЛД50 на мышах как метод определения вирулентности сибиреязвенных бацилл. В сб.: Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР. М., 1978: 97-99.

20. Keim P., Price L.B., Klevytska A.M., Smith K.L., Schupp J.M., Okinaka R., Jackson P.J., Hugh-Jones M.E. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis. J. Bacteriol., 2000, 182(10): 2928-2936 (doi: 10.1128/JB.182.10.2928-2936.2000).

21. Куличенко А.Н., Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Аксенова Л.Ю., Ковалев Д.А., Писарен-ко С.В., Варфоломеева Н.Г., Жиров А.М., Волынкина А.С., Буравцева Н.П., Головинская Т.М., Котенева Е.А., Цыганкова О.И., Дятлов И.А., Тимофеев В.С., Богун А.Г., Бахтеева И.В., Кисличкина А.А., Миронова Р.И., Титарева Г.М., Скрябин Ю.П., Селя-нинов Ю.О., Егорова И.Ю., Колбасов Д.В. Биологические свойства и молекулярно-генетическая характеристика штаммов Bacillus anthracis, выделенных во время вспышки сибирской язвы в Ямало-Ненецком автономном округе в 2016 году. Проблемы особо опасных инфекций, 2017, 1: 94-99 (doi: 10.21055/0370-1069-2017-1-94-99).

22. Thierry S., Tourterel Ch., Le Ftache Ph., Derzelle S., Dekhil N., Mendy Ch., Colaneri C., Vergnaud G., Madam N. Genotyping of French Bacillus anthracis strains based on 31-loci multi locus VNTR analysis: epidemiology, marker evaluation, and update of the internet genotype database. PLoS ONE, 2014, 9(6): 95-131 (doi: 10.1371/journal.pone.0095131).

23. Fasanella A., Van Ert M., Altamura S.A., Garofolo G., Buonavoglia C., Leori G., Huynh L., Zanecki S., Keim P. Molecular diversity of Bacillus anthracis in Italy. J. Clin. Microbiol., 2005, 43: 3398-340 (doi: 10.1128/JCM.43.7.3398-3401.2005).

24. Merabishvili M., Natidze M., Rigvava S., Brusetti L., Raddadi N., Borin S., Chanishvili N., Tediashvili M., Sharp R., Barbeschi M., Visca P., Daffonchio D. Diversity of Bacillus anthracis strains in Georgia and of vaccine strains from the former Soviet Union. Appl. Environ. Microbiol., 2006, 72: 5631-5636 (doi: 10.1128/AEM.00440-06).

25. Antwerpen M., Ilin D., Georgieva E., Meyer H., Savov E., Frangoulidis D. MLVA and SNP analysis identified a unique genetic cluster in Bulgarian Bacillus anthracis strains. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2011, 30(7): 923-930 (doi: 10.1007/s10096-011-1177-2).

1ФБГНУ Федеральный исследовательский центр Поступила в редакцию

вирусологии и микробиологии, 30 октября 2017 года

601125 Россия, Владимирская обл., Петушинский р-н,

пос. Вольгинский, ул. Академика Бакулова, стр. 1,

e-mail: yusel1@yandex.ru, iegorova@list.ru Н, kolbasovdenis@gmail.com;

2ФГБНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной биотехнологии,

127550 Россия, г. Москва, ул. Тимирязевская, 42, e-mail: jalex@iab.ac.ru, honeybee777@rambler.ru

Sel'skokhozyaistvennaya biologiya [Agricultural Biology], 2018, V. 53, № 2, pp. 404-413

PHENOTYPIC, BIOCHEMICAL AND MOLECULAR ANALYSIS OF Bacillus anthracis STRAINS ISOLATED DURING THE OUTBREAKS OF ANTHRAX IN THE RUSSIAN FEDERATION, 2014-2016

Yu. O. Selyaninov1, I. Yu. Egorova1, Ya.I. Alekseev2, A. V. Kazantsev2, Yu.A. Monakhova2,

D. V. Kolbasov1

1Federal Research Center for Virology and Microbiology, Federal Agency of Scientific Organizations, 1, ul. Akad-emika Bakuleva, pos. Vol'ginskii, Petushinskii Region, Vladimir Province, 601125 Russia, e-mail iegorova@list.ru (Н corresponding author), kolbasovdenis@gmail.com, yusel1@yandex.ru;

2All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology, Federal Agency of Scientific Organizations, 42, ul. Ti-

miryazevskaya, Moscow, 127550 Russia, e-mail jalex@iab.ac.ru, honeybee777@rambler.ru

ORCID:

Selyaninov Yu. O. orcid.org/0000-0002-4252-8714 Kazantsev A.V. orcid.org/0000-0003-3072-9110

Egorova I.Yu. orcid.org/0000-0002-5023-0897 Monakhova Yu.A. orcid.org/0000-0002-6772-609

Alekseev Ya.I. orcid.org/0000-0002-3426-7323 Kolbasov D.V. orcid.org/0000-0002-4935-0891

The authors declare no conflict of interests Acknowledgements:

The study was carried out with the equipment of «Biotechnology» center (All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology).

Supported by the program of Federal Agency of Scientific Organizations for bioresource collections

Received October 30, 2017 doi: 10.15389/agrobiology.2018.2.404eng

Abstract

In 2014 to 2016, despite effective measures to prevent an introduction and transmission of Anthrax in the Russian Federation, there were seven outbreaks of Anthrax in Volgograd, Rostov, Belgorod, Saratov regions, the Republic of Tatarstan, and also six outbreaks in reindeer population in two districts of Yamal-Nenets Autonomous Okrug where 2657 reindeers died. In this article we present some results of comprehensive characterization of genetic, biological features and phyloge-netic relationship of Bacillus anthracis strains isolated during the outbreaks in Volgograd region, Yamal-Nenets Autonomous Okrug and from the soils of burial in Chuvash Republic during last 3 years. Here, we differentiated 11 strains as followed from growth morphology, mobility, Gram stain procedure, capsule in vivo and in vitro formation, sporulation, proteolytic, hemolytic, lecithinase, phosphatase, glycolytic activity, protocatechuic acid production, Congo red sorption from the medium, phage sensitivity, toxicity in vitro, plasmid profile, sensitivity to antibiotics recommended for use in veterinary medicine, virulence for mice. MLVA-typing of the anthrax strains was performed for 20 VNTR loci. It was shown that the main phenotypic and diagnostic features of anthrax strains differed insignificantly and, in general, corresponded to those of a typical B. anthracis strain. The most significant phenotypic differences were found in asporogenous and avirulent strain B. anthracis № 6017 isolated in 2016 from a Lappish reindeer dog. The B. anthracis strains isolated during one outbreak were grouped into separate clusters, and within the cluster some strains had insignificant differences in 1-2 loci. The strains isolated from the soils of burials in the Republic of Chuvashia and from the Lappish reindeer dog during the Yamal outbreak formed separate clusters. B. anthracis strains showed high epizootic risk due to pathogenicity factors expressed in vitro. The tests identified the presence of capsula and toxins, high hemolytic and proteolytic activity, protocatechuic acid synthesis, and high virulence for laboratory mice (at 6-1000 spores). These results confirm the necessity of continuous monitoring and evaluation of epizootic caution of anthrax burials and case sites (frost fields), and specific preventive anti-anthrax measures.

Keywords: Bacillus anthracis, anthrax, strains, phenotypic properties, genotypic properties, virulence, MLVA.

Научные собрания

МЕЖДУНАРОДНЫЙ ФОРУМ

БИОТЕХНОЛОГИЯ:

СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ

МЕЖДУНАРОДНАЯ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННАЯ ВЫСТАВКА

МИР БИОТЕХНОЛОГИИ 201 8

><В10 23-25

WORLD

МАЯ 2018 l^ëp

МОСКВА [ТОСТИНЫЙДБОР V

ИЛЬИНКА,4 \ ií*

ОСНОВНЫЕ ПОТОКИ ФОРУМА

• Геномное редактирование в биамвдицинв.

• Постгенам ноя медицина.

• Генная и вирусная терапия:успехи И проблемы.

• Геномное редактирование в агротехнологиях.

• Умные материалы дли диагностики И терапии' возможности синтетической биологии.

• Современная иммунология.

• Регенеративная и клеточная медицина: создание биобанков, депозитариев и коллекций биоматериалов.

• Мета геном и ка и персонализированная медицина.

Тканевая инженерия и биопритинп оборудование, методики и области применения. От клеточных культур к органам. Матриксы для биопринтинга.

• Биоматериалы в биотехнологиях и медицине.

• Биотехнология и проблемы актив но го долголетия.

• Омиксные технологии в клинической онкологии И болезней мозга. Лечение с позиций био информатики, молекулярной/ клеточной биологии и клинической медицины.

• Моноклональныеантитела: наука, бизнес, государство.

• Проблемы рв1улирования биомедицинских клеточных продуктов.

• Инновационные технологии И оборудование в биофармацевтике.

СЕКЦИЯ БИЗНЕС

• Перспективы выхода на рынок новых лекарственных средств, в том числе, на основемоноклональныхантител.

• "Умные* продукты питания.

• Современные технологические решения для биофармацевтических производств.

БИОСофт

Программные продукты для биотехнологии. Большие маосивы данных- Big Data. Облачные технологии И сервисы. Банки данных в биотехнологии. IT- решения для биологических задач.

БИОМед

Персонализированная диагностика и лечение.

Продукция и у слуги биотехно логических компаний для конечного пользователя.

Мобильные технологии И индивидуальное диагностическое оборудование. Медицинские продукты питания. Биофармацевтика и фармацевтические компании. Биочигы и биосенсоры.

Генетическая инженерия и биосовместимые материалы. Биомедицинские и роботические тех налоги и.

Биопрепараты для медицины и косметологии, а также готовые продукты на их основе.

БИОАгро

Весь спектр биопродуктов для агропромышленного комплекса. Технологии производства.

Продукция и у слуги биотехно логических компаний для конечного по льзова-

БИОВенчур + Стартап

Венчурные фонды и программы поддержки н гической сфере