СРЕДСТВО ДЛЯ ИНАКТИВАЦИИ ВИРУСОВ, ОБЛАДАЮЩЕЕ ОДНОВРЕМЕННОЙ РИБОНУКЛЕАЗНОЙ, МЕМБРАНОЛИТИЧЕСКОЙ И ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЯМИ
AGENT FOR INACTIVATION OF VIRUSES EXHIBITING SIMULTANEOUS RIBONUCLEASE, MEMBRANOLYTIC AND ANTIVIRAL ACTIVITIES

Изобретение относится к области химии и медицины, а именно к соединениям, обладающим одновременной рибонуклеазной, мембранолитической и противовирусной активностями.
Вирусные заболевания представляют собой общую угрозу здоровью населения во всем мире. Среди вирусов вирусы, содержащие геном в виде РНК, вызывают целый ряд серьезных заболеваний животных (домашних и диких) и являются одними из наиболее опасных для человека. Высокопатогенные РНК-вирусы, такие как вирус гриппа птиц (Avian Influenza Virus), клещевой энцефалит (Tick-borne enchefalitis), вирус Денге (Denge virus), коронавирус (SARS) и т.д., являются постоянной угрозой для здоровья населения. На сегодняшний день особую опасность представляют вирусы птиц и животных, способных заражать людей (Lipsitch, M. et al. Science, 2006, 312, 845; Krug, R.M. Science, 2006, 311, 1562-1563; Chen, H. et al. Nature, 2005, 436, 191-192). Например, долгое время считалось, что вирус гриппа птиц не может переходить к людям, однако в последние годы было зарегистрировано большое число передач вируса от птиц к человеку, что вызывало смертельные исходы у заразившихся людей (Subbarao, K. et al. Science, 1998, 279, 393-396; Fouchier, R.A. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2004, 101, 1356-1361). Вспышки высокопатогенного вируса гиппа H5N1 в некоторых азиатских и европейских странах вызвало серьезное опасение со стороны мирового сообщества (Koopmans, M. et al. Lancet, 2004, 363, 587-593; Enserink, M., Science, 2006, 311, 932; Fabain, N.J. Environ. Health 2006, 68, 46-63).
Опасность эпидемий и пандемий, вызванных РНК-вирусами, делает разработку новых противовирусных препаратов и новых средств и способов их инактивации одной из наиболее актуальных задач сегодняшнего дня.
В настоящее время в качестве средств инактивации вирусов используют физические методы (облучение ультрафиолетовым светом, ионизирующее излучение, нагревание при повышенном давлении) и целый ряд химических соединений (формалин, β-пропиолактон, этиленимин, ряд детергентов), которые различаются механизмом действия и, следовательно, областью применения, токсичностью, эффективностью инактивации вируса и стоимостью (De Benedictis, P. et al. Zoonoses Public Health. 2007, 54(2), 51-68).
Спектр соединений, позволяющих инактивировать вирус, в том числе и для получения цельновирионных вакцин, ограничен несколькими соединениями: это формальдегид, β-пропиолактон (Goldstein M. and Tauraso N., Applied Microbiol., 1970, 19, 290-294), этиленимин и его производные (Budowsky E.I., et al, Vaccine, 1991, 9, 473-476; Aarthi d., et al, Biologicals, 2004, 32, 153-156), облучение УФ-светом (Budowsky E.I., et al, Arch. Virol., 1981, 68-239-246) или УФ-светом в присутствии соединений, повышающих фоточувствительность вируса (Kasermann F and Kempf С., Antiviral Res., 1997, 34, 65-70), окисление кислородом воздуха на свету (Kasermann F. and Kempf С., Rev. Med. Virol, 1998, 8, 143-151). Известно, что обработка вируса такими соединениями приводит к частичному разрушению вирусных антигенных детерминант и тем самым к снижению иммуногенных свойств вакцин, а выборочное разрушение формалином антигенных детерминант поверхностных гликопротеидов вирусов может индуцировать развитие несбалансированного иммунного ответа (Kasermann F., et al., Antiviral Res., 2001, 52, 33-41).
Идеальной мишенью для инактивации вируса гриппа и других РНК-содержащих вирусов (далее по тексту РНК-вирусы) является геномная РНК вируса. После ее разрушения вирус теряет способность к репликации и, таким образом, не может размножаться.
Наиболее близкими к заявляемым соединениям - прототипом являются производные лизина общей формулы nLm, обладающие рибонуклеазной активностью (Ждан Н.С. и др., Биоорган. химия. 1999, 25, 723-732). На фиг.1 представлена структурная формула соединений nLm, представляющих собой неприродные пептиды на основе лизина, где n - число остатков лизина, m - суммарный положительный заряд соединения при нейтральном рН. Было показано, что хотя эти соединения и проявляют высокую рибонуклеазную активность, эффективность расщепления ими РНК зависела от пространственной структуры этой РНК, не коррелировала с суммарным положительным зарядом молекулы (определяет эффективность связывания с РНК) и мало зависела от числа остатков лизина в молекуле.
Недостатками известных соединений nLm являются относительно невысокая рибонуклеазная активность и низкая эффективность инактивации РНК-вирусов.
Технической задачей изобретения является получение эффективных, низкотоксичных синтетических соединений (искусственных рибонуклеаз), обладающих одновременной рибонуклеазной, мембранолитической и противовирусной активностями.
Поставленная техническая задача решается предлагаемым средством для инактивации вирусов, обладающим одновременной рибонуклеазной, мембранолитической и противовирусной активностями, представляющим собой производные нескольких аминокислот (АК), связанных гидрофобным линкером (L) общей формулы
2
[nAK]L, где n - число разных аминокислот в молекуле соединения, равное единице для соединения (1) или трем для соединения (2); L - додецильный линкер, АК - глутаминовая кислота для (1) и лизин, 6-аминогексановая и глутаминовая кислоты для (2). На фигуре 2 представлены структурные формулы соединений (1) и (2).
Для повышения рибонуклеазной активности соединений (1) и (2), по сравнению с прототипом, в их структуру была добавлена новая каталитически активная группа (карбоксигруппа), которая присутствует в активном центре многих природных рибонуклеаз. Присутствие в молекуле как отрицательно, так и положительно заряженных функциональных групп позволяет повысить эффективность реакции расщепления РНК. Кроме того, в молекулу был введен протяженный гидрофобный линкер, соединяющий два аминокислотных фрагмента, что позволяет усилить рибонуклеазную активность соединений.
2
Соединения (1) и (2) общей формулы [nAK]L были получены по общей схеме, представленной на фиг.3.
Процесс получения соединений (1) и (2) включает в себя реакцию коммерчески доступных активированных эфиров (N-гидроксисукцинимидные и n-нитрофениловые) аминокислот (соединения 6, 10, 11, 12). Схема синтеза соединений (1) и (2) представлена на фиг.4, 5, где L - 1,12-додекандиамин, AHA - 6-аминогексановая кислота, Glu - глутаминовая кислота, Lys - лизин, Вос - трет-бутилоксикарбонильная защитная группа, Z(2C1) - 2-хлорбензилоксикарбонильная защитная группа, Bzl - бензильная защитная группа, ТФУ - трифторуксусная кислота.
Введение трет-бутилоксикарбонильной защиты по аминогруппе 6-аминогексановой кислоты и синтез активированных эфиров проводили согласно стандартным методикам (А.А.Гершкович, В.К.Кибирев. Синтез пептидов. Реагенты и методы. Киев. Наукова думка. 1987).
Данная схема включает в себя реакцию коммерчески доступного 1,12-додекандиамина (3) с защищенной аминокислотой (AK-D), с образованием дизамещенного производного защищенных аминокислот (D-AK)2L, которое далее освобождали от защитных групп. В случае соединения (2) получающиеся концевые аминогруппы первой аминокислоты использовались для введения второй и третьей аминокислоты по такой же схеме. В результате реакции с высокими выходами образуется продукт, содержащий одну (три) аминокислоты, димеризованные с помощью додецильного линкера (L).
3
3
2
1
Спектры ЯМР записаны на спектрометрах «Bruker AM-400» и «Bruker AV-300» (Германия)» в CDOD, (CD)СО («Aldrich», США). Для Н ЯМР-спектров использовали тетраметилсилан или сигналы остаточных протонов растворителей в качестве внутреннего стандарта. Химические сдвиги приведены в шкале δ, м.д.
Масс-спектры высокого разрешения получали с помощью MALDI-TOF (time-of-flight) масс-спектрометра Bruker reflex III MALDI TOF (Bruker Analytical Systems, Inc., Германия).
Для колоночной хроматографии использовали силикагель Kieselgel 60 (63-100 мкм, «Merck», Германия).
Для изучения рибонуклеазной активности соединений использовали 96-звенный фрагмент РНК вируса иммунодефицита человека HIV1 и синтетический олигорибонуклеотид ON21, r(UCGAAUUUCCACAGAAUUCGU), который был синтезирован фосфитамидным методом на синтезаторе ASM-102U (ТОО "БИОССЕТ", Новосибирск) и очищен ионообменной и обращеннофазовой хроматографией или препаративным электрофорезом в денатурирующих условиях. Чистоту олигонуклеотида проверяли с помощью электрофореза в 15% ПААГ в денатурирующих условиях, визуализацию олигонуклеотида в геле проводили с помощью окраски Stains-All. Фрагмент РНК был получен с помощью реакции транскрипции in vitro согласно опубликованному протоколу (Maniatis Т., Fritsch E. F., Sambrook J. Molecular cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Рибонуклеазная активность соединений (1) и (2) была исследована в реакции расщепления in vitro двух РНК-субстратов - олигорибонуклеотида ON21 и РНК96, а антивирусная и мембранолитическая активности этих соединений - в экспериментах по инактивации РНК содержащих вирусов (вирус гриппа и вирус клещевого энцефалита) и в экспериментах по репродукции этих вирусов в культуре эукариотических клеток in vitro.
Сопоставительный анализ заявляемых соединений с известными и широко используемыми соединениями, такими как формалин, УФ-свет или мономерный или бинарный этиленимин (Budowsky. E.I., et al., Vac. Res., 1996, 5, 29-39), показал, что предлагаемые соединения обладают следующими преимуществами.
1) Заявляемые соединения обладают одновременно рибонуклеазной, мембранолитической и антивирусной активностями, что позволяет рассматривать их как перспективные лекарственные агенты.
2) Заявляемые соединения малотоксичны для человека и не требуют особых мер предосторожности (противогаз, перчатки, работа под вытяжкой) при работе с ними. Кроме того, эти соединения стабильны при хранении в виде концентрированных водных растворов или растворов в апротонных растворителях, таких как диметилсульфоксид.
3) Заявляемые соединения не оказывают побочного действия на белковые компоненты вирионов, что не снижает иммуногенные свойства инактивированных вирусов и улучшает свойства получаемых на их основе вакцин.
2
Поиск по источникам научно-технической и патентной литературы показал, что производные лизина, глутаминовой и 6-аминогексановой кислот общей формулы [nAK]L, обладающие одновременно рибонуклеазной, мембранолитической и противовирусной активностями, в известных источниках не описаны.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение N,N'-бис(глутамил)-1,12-додекандиамина (1).
Схема синтеза соединения (1) представлена на фиг.4.
α
α
3
2
4
К раствору 1,12-додекандиамина (3) (2.1 ммоль, 0.42 г) и этилдиизопропиламина (4.4 ммоль, 0.75 мл) в 10 мл этилацетата добавляли при перемешивании раствор n-нитрофенилового эфира N-трет-бутилоксикарбонил-О-бензил-L-глутаминовой кислоты (6) (4.4 ммоль, 2.01 г) в 5 мл этилацетата. Реакционную смесь перемешивали 24 ч при 22°С. Затем в реакционную смесь добавляли N,N-диметилэтилендиамин (1 ммоль, 110 мкл) и перемешивали 30 мин. Реакционную смесь промывали последовательно 2%-ным раствором лимонной кислоты (20 мл), водой (20 мл), насыщенным раствором NaHCO (20 мл) и водой (20 мл). Органический слой сушили безводным NaSO. Растворитель удаляли в вакууме. Остаток сушили в вакууме. Очистку проводили с помощью хроматографии на силикагеле, элюируя продукт в градиенте концентрации этанола в хлористом метилене от 0 до 5%. Фракции, содержащие целевое соединение, упаривали и сушили в вакууме. Выход N,N'-бис((N-трет-бутилоксикарбонил-O-бензил)глутамил)-1,12- додекандиамина (4) 0.86 г, 49.0%.
1
α
L
Boc
L
Glu, Glu'
Glu, Glu'
L
Glu, Glu'
Bzl
3
2
2
2
2
8
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Данные Н ЯМР-спектра для N,N'-бис((N-трет-бутилоксикар6онил-O-бензил)глутамил)-1,12-додекандиамина ((CD)СО) δ, м.д. (J/Гц): 1.27 (м, 16Н, [-NH-(CH)-(CH)-(CH)-NH-]); 1.41 (с, 18Н, [CH]); 1.49 (м, 4Н, [-NH-CHCH-]); 1.86-2.17 (м, 4Н, [CHCHCH]); 2.48 (т, 4Н, [CHCHCH], J=7.5); 3.22 (м, 4Н, [-NH-CHCH-]); 4.13 (м, 2Н, CHCHCH]); 5.13 (с, 4Н, [CH]); 7.37 (м, 10Н,
аром
[CH]).
α
1
L
L
Glu, Glu'
Glu, Glu'
L
Glu, Glu'
Bzl
аром
+
2
2
2
2
3
2
2
2
8
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
N,N'-бис ((N-трет-бутилоксикарбонил-О-бензил) глутамил)-1,12-додекандиамин (4) растворяли в смеси ТФУ:CHCl=1:1 (5 мл) и выдерживали реакционную смесь 1 ч при комнатной температуре. Растворитель и ТФУ удаляли в вакууме, остаток упаривали с этанолом (3×10 мл), растворяли в CHCl (5 мл) и высаживали 10-кратным объемом серного эфира. Выдерживали ночь в холодильнике. Эфир декантировали, твердый остаток сушили в вакууме. Выход трифторацетата N,N'-бис((γ-бензил)-глутамил)-1,12-додекандиамина (5) 0.82 г, 92.0%. Данные Н ЯМР- спектра для N,N'-бис((γ-бензил)-глутамил)-1,12-додекандиамина (5) (CDCl) δ, м.д. (J/Гц): 1.23 (м, 16Н, [-NH-(CH)-(CH)-(CH)-NH-]); 1.49 (м, 4Н, [-NH-CHCH-]); 2.28-2.38 (м, 4Н, [CHCHCH]); 2.48 (м, 4Н, [CHCHCH]); 3.28 (м, 4Н, [-NH-CHCH-]); 4.16 (м, 2Н, CHCHCH]); 5.11 (с, 4Н, [CH]); 7.34 (м, 10Н, [(CH]). MALDI-MS, m/z найдено 639.42 [M+H], вычислено 638.40.
Трифторацетат N,N'-бис((γ-бензил)-глутамил)-1,12-додекандиамина (5) (0.46 ммоль, 400 мг) растворяли в 5 мл метанола и подвергали гидрогенолизу в присутствии 200 мг 5%-ного Pd/C. По окончании реакции катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали в вакууме. Выход N,N'-бис(глутамил)-1,12-додекандиамина (1) после гидрирования 292 мг, 92.2%.
Общий выход N,N'-бис(глутамил)-1,12-додекандиамина (1) в расчете на 1,12-додекандиамин (3) 41.6%.
1
L2
L2
Glu, Glu'
Glu, Glu'
L2
Glu, Glu'
+
3
2
2
2
2
8
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
Данные H ЯМР-спектра для N,N'-бис(глутамил)-1,12-додекандиамин трифторацетата (1) ((CD)СО) δ, м.д. (J/Гц): 1.33 (м, 16Н, [-NH-(CH)-(CH)-(CH)-NH-]); 1.55 (м, 4Н, [-NH-CHCH-]); 2.15 (м, 4Н, [CHCHCH]); 2.49 (м, 4Н, [CHCHCH ); 3.20-3.36 (м, 4Н, [-NH-CHCH-]); 3.90 (т, 2Н, [CHCHCH], J=3.6). MALDI-MS, m/z найдено 459.28 [M+H], вычислено 458.31.
Пример 2. Получение N,N'-бис(глутамил-6-аминогексаноил-лизил)-1,12-додекандиамина (2).
Схема синтеза соединения (2) представлена на фиг.5.
α
ε
α
ε
1
α
ε
L
Boc
L
Lys, Lys'
Lys, Lys'
Lys, Lys'
Lys, Lys'
L
Lys, Lys'
Z(2Cl)
аром
аром.
аром.
3
2
4
3
2
2
2
2
8
2
2
3
2
2
2
8
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
8
2
4
2
К раствору 1,12-додекандиамина (3) (2.4 ммоль, 0.48 г) и этилдиизопропиламина (5 ммоль, 0.85 мл) в 10 мл этилацетата добавляли при перемешивании раствор N-гидроксисукцинимидного эфира N-трет-бутилоксикарбонил-N-2-хлорбензилоксикарбониллизина (10) (5 ммоль, 2.6 г) в 5 мл этилацетата. Реакционную смесь перемешивали 24 ч при 22°С. Затем в реакционную смесь добавляли N,N-диметилэтилендиамин (1 ммоль, 110 мкл) и перемешивали 30 мин. Реакционную смесь промывали последовательно 2%-ным раствором лимонной кислоты (20 мл), водой (20 мл), насыщенным раствором NaHCO (20 мл) и водой (20 мл). Органический слой сушили безводным NaSO. Растворитель удаляли в вакууме. Полученную пену сушили в вакууме. Выход N,N'-бис((N-трет-бутилоксикарбонил-N-2-хлорбензилоксикарбонил)лизил)-1,12-додекандиамина (7) 1.38 г, 57.9%. Данные Н ЯМР-спектра для N,N'-бис((N-трет-бутилоксикарбонил-N-2-хлорбензилоксикарбонил)лизил)-1,12-додекандиамина (7) ((CD)СО) δ, м.д. (J/Гц): 1.29 (м, 16Н, [-NH-(CH)-(CH)-(CH)-NH-]); 1.41 (с, 18Н, [CH]); 1.57 (м, 8Н, [-NH- CHCH-(СН)-], [-CHCHCH(СН)]); 1.64 (м, 4Н, [-СН(СН)CHCH]); 1.79 (м, 4Н, [-CHCH(CH)CH]); 3.18 (м, 8Н, [-СН(СН)CH], 4Н, [-NH-CHCH-(CH)-]); 4.05 (м, 2Н, [-CH(СН)]); 5.17 (с, 4Н, [CH]; 7.35 (м, 4Н, [CH]); 7.44 (м, 2Н, [CH]); 7.50 (м, 2Н, [CH]).
α
ε
2
2
3
2
4
N,N'-бис((N-трет-бутилоксикарбонил-N-2-хлорбензилоксикарбонил) лизил)-1,12-додекандиамин (7) растворяли в смеси ТФУ:CHCl=1:1 (5 мл) и выдерживали реакционную смесь 1 ч при комнатной температуре. Растворитель и ТФУ удаляли в вакууме, остаток упаривали с этанолом (3×10 мл), растворяли в этилацетате (15 мл) и промывали насыщенным раствором NaHCO (10 мл) и водой (10 мл), сушили над безводным NaSO. Растворитель удаляли в вакууме. Полученный маслообразный остаток сушили в вакууме и использовали в дальнейшем без дополнительной очистки.
α
α
Затем аналогично повторяли процедуру конденсации аминокомпоненты последовательно с N-гидроксисукцинимидным эфиром N-трет-бутилоксикарбонил-6-аминогексановой кислоты (11) и N-трет-бутилоксикарбонил-О-бензил-L-глутаминовой кислоты (12) в ДМФА.
α
ε
1
L
Boc
L
Lys, Lys'
AHA, AHA'
Lys, Lys'
AHA, AHA'
AHA, AHA'
Lys, Lys'
AHA, AHA'
AHA, AHA'
Les, Lys'
L
Lys, Lys'
Z(2Cl)
аром.
аром.
аром.
3
2
2
2
8
2
2
3
2
2
2
8
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
3
2
2
3
2
2
4
2
4
2
2
3
2
2
2
2
8
2
4
2
Выход N,N'-бис(N-трет-бутилоксикарбонил-6-аминогексаноил-N-2-хлорбензилоксикарбонил)лизил)-1,12-додекандиамина (8) 0.54 г, 49.0%. Данные Н ЯМР-спектра для ((8) (CDOD) δ, м.д. (J/Гц): 1.30 (м, 16Н, [-NH-(CH)-(CN)-(CH)-NH-]); 1.44 (с, 18Н, [CH]); 1.50 (м, 12Н, [-NH- CHCH-(СН)-], [-CHCHCHCH)], [-С(O)-(СН)-CH-(СН)-NH]); 1.63 (м, 8H, [-СН(СН)CHCH], [-С(O)-(СН)-CH-СН- NH]); 1.73 (м, 4H, [-С(O)-СН-CH-(СН)-NH]); 1.87 (м, 4Н, [-CHCH(СН)]); 2.25 (т, 4Н, [-C(O)-CH-(CH)-NH], J=7.4); 3.03 (м, 4Н, [-C(O)-(CH)-CH-NH]); 3.15 (м, 8Н, [-CH(СН)CH , 4Н, [-NH-CHCH-(CH)-]); 4.27 (м, 2Н, [-CH(СН)]); 5.19 (с, 4Н, [CH]); 7.33 (м, 4Н, [CH]); 7.41 (м, 2Н, [CH]); 7.45 (м, 2Н, [CH]).
α
ε
1
L
Boc
L
Lys, Les'
AHA, AHA'
AHA, AHA'
Lys, Les'
AHA, AHA'
Glu, Glu'
Lys, Lus'
AHA, AHA'
Glu, Glu'
Lys, Lys'
AHA, AHA'
L
Glu, Glu'
Lys, Lus'
Z(2Cl)
аром.
3
2
2
2
8
2
2
3
2
2
2
8
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
2
2
4
2
2
2
3
2
2
4
2
2
2
2
8
2
2
2
4
2
Выход N,N'-бис((N-трет-6утилоксикарбонил-O-бензил)глутамил-аминогексаноил-N-2-хлорбензилоксикарбонил)лизил)-1,12-додекандиамина (9) 0.07 г, 6.1%. Данные H ЯМР-спектра для ((9) (CDOD) δ, м.д. (J/Гц): 1.33 (м, 16Н, [-NH-(CH)-(CH)-(CH)-NH-]); 1.44 (м, 22Н, [CH], [-NH-CHCH-(CH)-]); 1.53 (м, 12Н, [-CH(CH)CHCH], [-С(О)- (CH)-CH-(CH)-NH]), [-C(O)-(CH)-CH-CH-NH]); 1.64 (м, 12Н, [-CHCHCH(СН)], [-C(O)-CH-CH-(CH)-NH], [-CHCHCH]); 1.92 (м, 4Н, [-CHCH(CH)]); 2.13 (м, 4Н, [-С(О)-CH-(CH)-NH]; 2.25 (м, 4Н, [-CHCHCH]); 2.50 (м, 4Н, [-СН(СН)CH]); 3.17 (м, 4Н, [-C(O)-(CH)-CH-NH]); 3.40 (м, 4Н, [-NH-CHCH-(CH)-]); 4.05 (м, 2Н, [-CHCHCH]); 4.16 (м, 2Н, [-CH(СН)]); 5.12 (с, 4Н, [CH]; 7.35 (м, 18Н, [CH]).
ε
N,N'-бис((O-бензил)глутамил-аминогексаноил-(N-2-хлорбензилоксикарбонил)лизил)-1,12-додекандиамин (0.042 ммоль, 70 мг) растворяли в 5 мл метанола и подвергали гидрогенолизу в присутствии 50 мг 5%-ного Pd/C. По окончании реакции катализатор отфильтровывали, растворитель упаривали в вакууме. Выход N,N'-глутамил-аминогексаноил-лизил-1,12-додекандиамин трифторацетата (2) после гидрирования 38.4 мг, 66.2%.
Общий выход N,N'-бис(глутамил-аминогексаноил-лизил)-1,12-додекандиамин трифторацетата (2) в расчете на 1,12-додекандиамин составил 1.7%.
1
L
Lys, Lys'
AHA, AHA'
L
Lys, Lys'
AHA, AHA'
AHA, AHA'
Gly, Glu'
Lys, Lys'
AHA, AHA'
Glu, Glu'
Lys, Lys'
AHA, AHA'
L
Glu, Glu'
Lys, Lys'
+
3
2
2
2
8
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
8
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
3
2
2
2
2
3
2
2
4
2
2
2
3
2
2
4
2
2
2
2
8
2
2
2
4
Данные Н ЯМР-спектра для N,N'-бис(глутамил-аминогексаноил-лизил)-1,12-додекандиамин трифторацетата (2) (CDOD) δ, м.д. (J/Гц): 1.33 (м, 24Н, [-NH-(CH)-(CH)-(CH)-NH-], [-CHCHCH(CH)], [-C(O)-(CH)-CH-(CH)-NH]); 1.44 (м, 4Н, [-NH-CHCN-(CH)-]; 1.58 (м, 8Н, [-CH(СН)CHCH] [-C(O)-(CH)-CH-CH-NH]); 1.66 (м, 8Н, [-C(O)-CH-CH-(CH)-NH]), [-CHCHCH]); 1.84 (м, 4Н, [-CHCH(СН)]); 2.17 (м, 4Н, [-C(O)-CH-(CH)-NH]); 2.37 (м, 4Н, [-CHCHCH]); 2.47 (м, 4Н, [-СН(СН)CH]); 2.56 (м, 4Н, [-С(O)-(СН)-CH-NH]); 2.94 (м, 4Н, [-NH-CHCH-(CH)-]; 3.88 (м, 2Н, [-CHCHCH]); 4.10 (м, 2Н, [-CH(CH)]). MALDI-MS, m/z найдено 963.27 [M+Na], вычислено 940.67.
Пример 3. Расщепление РНК соединениями (1) и (2).
32
-6
32
-6
-3
Эксперименты по расщеплению РНК данными соединениями проводили в следующих условиях: стандартная реакционная смесь объемом 10 мкл содержала 10000 имп/мин по Черенкову [5'-Р]-меченого ON21 (стабилизированного немеченым ON21 в концентрации 5×10 М) или [5'-Р]-РНК96, одно из соединений (1) или (2) в концентрациях от 10до 10 М и 50 мМ Tris-HCl рН 7.0, содержащий 0.2 М KCl, 0.5 мМ EDTA.
4
Реакции проводили при 37°С в течение 1 - 20 ч и останавливали путем осаждения продуктов реакции 10 объемами (100 мкл) 2%-ного раствора LiClO в ацетоне. Осадок РНК и продуктов ее расщепления отделяли центрифугированием, растворили в 5 мкл буфера для нанесения на гель. Продукты расщепления РНК анализировали электрофорезом в 15%-ном ПААГ, содержащем 8 М мочевину. Гель после электрофореза высушивали, и анализировали с помощью прибора фосфоримиджер "Molecular Imager FX" Степень расщепления РНК определяли как отношение количества радиоактивности в полосе, соответствующей продукту расщепления, к общей радиоактивности, нанесенной на дорожку.
При установлении зависимости степени расщепления РНК от концентрации соединений (1) и (2) было обнаружено, что для обоих соединений степень расщепления повышается при повышении концентрации соединений. Оба соединения проявляли наибольшую рибонуклеазную активность при концентрации 1 мМ. В таблице 1 представлены данные по влиянию концентрации соединений (1) и (2) на степень расщепления РНК.
Таблица 1
Зависимость степени расщепления РНК от концентрации соединений (1) и (2) за 3 часа. Выделенные значения соответствуют наибольшей степени расщепления РНК данным соединением.
Концентрация, мМ
Степень расщепления РНК, %
(1)
(2)
0.05
11
13
0.1
11
16
0.2
35
20
0.5
67
29
0.7
77
41
1
<b>82</b>
<b>54</b>
t
∝
t
∝
obs
-Kobs×t
-1
При установлении зависимости степени расщепления РНК соединениями (1) и (2) от времени выяснилось, что степень расщепления линейно возрастает на участке от 1 до 5 ч, а через 7 ч инкубации в расщепляемой смеси остается не более 5-10% исходной РНК (Таблица 2). На линейном участке кинетической кривой по уравнению [P]=[Р]×(1-e), где [P] и [Р] - степени расщепления субстрата за время t и за бесконечное время (можно принять, что за бесконечное время субстрат будет расщеплен на 100%), были найдены константы скорости реакции k, равные 0.273 и 0.408 ч для соединений (1) и (2) соответственно.
Таблица 2
Зависимость степени расщепления РНК в присутствии соединений (1) и (2) в оптимальной концентрации от времени.
Время, ч
Степень расщепления РНК, %
(1)
(2)
0
0
0
1
26
20
3
77
58
7
94
87
18
96
95
Приведенные примеры подтверждают высокую рибонуклеазную активность соединений (1) и (2).
Пример 4. Влияние соединений (1) и (2) на жизнеспособность клеток MDCK
2
Клетки линии MDCK (клетки почек собаки) культивировали в среде IMDM, содержащей 10%-ную эмбриональную телячью сыворотку, антибиотики (100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина) и антимикотик амфотерицин (0.25 мкг/мл), в атмосфере 5%-ного CO при 37°С.
4
-8
-4
570
630
Жизнеспособность клеток после инкубации с соединениями (1) или (2) определяли с помощью МТТ теста, который основан на способности живых клеток превращать соединения на основе тетразола (МТТ) в ярко окрашенные кристаллы формазана, что позволяет спектрофотометрически оценивать количество живых клеток в препарате. Для этого клетки высаживали в 96-луночные планшеты (10 клеток на лунку). Через 24 ч в лунках меняли среду и к клеткам добавляли водный раствор соединения (1) или (2) в воде до конечной концентрации в среде от 10 до 10 М. Клетки инкубировали в присутствии соединений еще в течение суток в тех же условиях. По окончании инкубации без смены среды к клеткам добавляли раствор МТТ (5 мг/мл) в фосфатно-солевом буфере до концентрации 0.5 мг/мл и инкубировали в течение 3 ч в тех же условиях. Среду удаляли, к клеткам добавляли по 100 мкл диметилсульфоксида, в котором происходит растворение образовавшихся в клетках кристаллов формазана, и измеряли оптическую плотность на многоканальном спектрофотометре на длинах волн 570 и 630 нм, где А - поглощение формазана, а А - фон клеток.
50
50
Из экспериментальных данных вычисляли значение IC -концентрацию соединений, при которой наблюдается гибель 50% клеток. Значения IC приведены в таблице 3.
Таблица 3
Значения IC<sub>50</sub> соединений (1) и (2) для клеток MDCK
Соединение
IC<sub>50</sub>, мМ
(1)
>5
(2)
>5
Из приведенных данных видно, что обработка клеток соединениями (1) или (2) вызывает их эффективную гибель только при концентрациях соединений выше 5 мМ, что свидетельствует о чрезвычайно низкой токсичности соединений.
Пример 5. Инактивация вируса гриппа соединениями (1) и (2)
6
Вирулицидную активность искусственных рибонуклеаз (1), (2) изучали на модели вируса гриппа A/WSN/33, (H1N1). В этих экспериментах использовали вирус гриппа A/WSN/33, (H1N1) с инфекционным титром 10 фокус-образующих единиц (ФОЕ) вируссодержащего материала. Инфекционную активность вируса определяли методом ФОЕ на клетках MDCK. В основе метода лежит модифицированная иммуноферментная реакция: вирусные белки, экспрессирующиеся в инфицированных вирусом клетках, специфически связываются с моноклональными антителами, мечеными ферментом. Далее фермент взаимодействует с субстратом, что приводит к окрашиванию инфицированной клетки. Инактивацию вируса гриппа соединениями (1), (2) проводили при 37°С в 50 мМ буфере Трис-HCl, рН 7.0, содержащем 0.2 M KCl и 2 мМ EDTA, в течение 18 ч при 37°С при концентрациях соединений (1), (2) от 200 мкМ до 4 мМ.
50
Соединения (1), (2) эффективно инактивируют вирус гриппа, причем степень инактивации вируса увеличивается с повышением концентрации соединений, при которой проводится инактивация вируса. Так, инкубация вируса в течение 18 ч при 37°С с соединениями (1), (2) в концентрации 200 мкМ, снижает титр вируса на 0.8 lg по сравнению с контролем. При увеличении концентрации соединений (1), (2) до 2 мМ наблюдается полная инактивация вируса гриппа (таблица 4). Следует отметить, что концентрация соединений (1) и (2), при которой наблюдается полная инактивация вируса гриппа, значительно ниже, чем значение IC для этих соединений.
Пример 6. Инактивация вируса клещевого энцефалита (КЭ) соединениями (1) и (2).
6
Вирулицидную активность соединений (1), (2) изучали на модели вируса КЭ (штамм Софьин) с инфекционным титром 10 бляшко-образующих единиц (БОЕ). Инфекционную активность вируса КЭ определяли на клетках СПЭВ. Инактивацию вируса КЭ соединениями (1), (2) проводили при концентрации соединений 2 мМ в 50 мМ буфере Трис-HCl, рН 7.0, содержащем 0.2 M KCl и 2 мМ EDTA, в течение 18 ч при 37°С.
Соединения (1), (2) в этих условиях (концентрация 2 мМ, 18 ч, 37°С) полностью инактивируют вирус КЭ (таблица 4).
Инкубация клеток, инфицированных вирусом КЭ с соединением (2) в концентрации 1 мМ, приводила к снижению репродукции вируса на порядок, по сравнению с контролем.
Полученные результаты однозначно свидетельствуют о высокой антивирусной активности соединений (1), (2).
Таблица 4
Вирулицидное действие соединений (1), (2).
Соединение
Вирус гриппа
Вирус КЭ
Концентрации соединений, использованные для инактивации вируса
Титр вируса при инкубации 18 ч при 37°С, lg (ФОЕ/мл)
Концентрации соединений, использованные для инактивации вируса
Титр вируса при инкубации 18 ч при 37°С, lg (БОЕ/мл)
(1)
2 мМ
<1
2 мМ
<1
(2)
2 мМ
<1
2 мМ
<1
контроль
-
5,2
-
4,2
Пример 7. Исследование мембранолитической активности соединений (1) и (2)
Исследование морфологии вирусных частиц после инкубации с соединениями (1) и (2) проводили с помощью электронной микроскопии методом негативного контрастирования. Исследуемые образцы сорбировали на опорные электронно-микроскопические сетки, покрытые формоваровой пленкой, в течение 1.5 минут, остаток жидкости убирали, сетку высушивали и помещали в контрастирующий раствор (2%-ный раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты в дистиллированной воде) на 45 сек, остаток раствора убирали, сетку высушивали. Образцы (4-6 сеток) изучали в трансмиссионном электронном микроскопе Hitachi-H800 при увеличениях от 10000 до 200000.
-3
Электронно-микроскопическое исследование морфологии вирусных частиц, инактивированных соединениями (1) и (2) выявило вирионы с поврежденной липидной оболочкой, у небольшой части вирусных частиц также наблюдали изменение толщины липидного слоя, пепломеры на поверхности вирусной оболочки были сохранены. Степень повреждения структуры вирионов прямо зависела от концентрации соединений (1) и (2). По мере возрастания концентрации соединений до 10М происходило развитие повреждений их структуры.
На фиг.6 представлены электронные микрофотографии частиц вируса гриппа, где на снимке 1 - интактный вирус (на поверхности сферической частицы видны пепломеры, оболочка не повреждена), на снимках 2-4 - вирус гриппа, обработанный искусственной рибонуклеазой в стандартных условиях (на поверхности частиц видны пепломеры, разрывы оболочки, частицы деформированы) Негативное контрастирование ФВК. Длина масштабной линии 50 нм.
На основании результатов электронно-микроскопических исследований можно предполагать, что соединения (1) и (2) дезинтегрируют липидные оболочки вирионов, что способствует быстрой инактивации вируса.
Таким образом, полученные данные однозначно указывают на высокую рибонуклеазную, мембранолитическую и антивирусную активность соединений (1) и (2), что позволяет использовать их в качестве активных компонентов для разработки лекарственных форм препаратов, предназначенных для лечения вирусных заболеваний.