Гидрофобизованные производные широкопористого криогеля поливинилового спирта: новые возможности применения в биотехнологии

В. Г. Евтюгин, А. Б. Маргулис, О. В. Бушманова, Е. В. Никитина,

А. И. Колпаков, Л. Г. Дамшкалн, В. И. Лозинский, О. Н. Ильинская

ГИДРОФОБИЗОВАННЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ШИРОКОПОРИСТОГО КРИОГЕЛЯ

ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА: НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ

В БИОТЕХНОЛОГИИ

Ключевые слова: гидрофобизованный криогель ПВС, гетерогенные популяции, грамполо-жительные бактерии, грамотрицательные бактерии, гипометаболические формы.

С использованием гидрофобизованных производных широкопористого криогеля поливинилового спирта с различным содержанием привитых изобутиль-ных группировок показано, что гидрофобные свойства поверхности клеток сильнее выражены у грамотрицательных бактерий. Гидрофобность клеточной поверхности при обработке бактерий ауторегулятором гексилрезорцином усиливается у грамотрицательных и снижается у грамположительных. Получены данные, свидетельствующие о вариабельности гидрофобных свойств поверхности грамположительных бактерий (Bacillus subtilis и Staphylococcus epidermidis).

Key words: hydrophobized PVA criogel, heterogenic populations, Gram-positive bacteria, Gram-

negative bacteria, hypometabolic forms.

Using the hydrophobized derivatives of wide-porous poly(vinyl alcohol) cryogel carrying various amount of grafted isobutyl groups it was shown that hydrophobic properties of gram-negative bacteria are more exhibited as compared with the case of gram-positive microorganisms. A hydrophobicity of cellular surface increases upon the treatment of gram-negative microbes with bacterial autoregulator hexylresorcinol. On the contrary, hexylresorcinol reduces the surface hydrophobicity of gram-positive bacteria.

The data obtained testify on the variability of hydrophobic properties of the cellular surfaces in gram-positive bacteria (Bacillus subtilis and Staphylococcus epidermidis).

Введение

Проблемы, связанные с изучением гетерогенных популяций микроорганизмов, являются предметом постоянного внимания исследователей в связи с необходимостью различать в стареющей или отвечающей на воздействие разнообразных стрессоров популяции бактерий различные морфотипы штаммовой принадлежности. Анализ гетерогенных стареющих популяций связан, в первую очередь, с определением диагностических критериев покоящихся форм микроорганизмов с акцентом на выяснение механизмов, ответственных за принципиальную возможность или невозможность реверсии таких клеток к метаболической активности и размножению. В этой связи возникла насущная потребность в разделении субпопуляций бактерий с целью их последующего исследования. Одним из перспективных подходов к решению подобных задач является биоспецифическая сорбция/десорбция соответствующих фракций микроорганизмов с использованием подходящих аффинных носителей. При этом, как природа, так и структура матрицы носителя, должны обеспечивать, с одной стороны, избирательности сорбции, с другой, ее обрати-

мость и возможность получения целевой фракции в препаративных количествах. В этом контексте весьма перспективны так называемые полимерные криогели [1; 2], получаемые в неглубоко замороженных гелеобразующих системах и обладающие развитой крупнопористой структурой, необходимой для эффективного массопереноса во всем объеме гелевой матрицы. В нашей предыдущей работе [3] с помощью частично гидрофобизованного широкопористого агарозного криогеля была показана принципиальная возможность разделения клеточных популяций на субпопуляции по различиям в их гидрофобно-липофильного баланса (ГЛБ). Однако, агарозные криогели довольно хрупкие матрицы, что привносит некоторые экспериментальные трудности при работе с ними, поэтому с целью совершенствования методологии такого разделения клеток в настоящей работе биоаффинные сорбенты были приготовлены на основе более пластичного (нехрупкого) широкопористого гидрофильного криогеля на основе поливинилового спирта (ПВС), последующая прививка алифатических группировок к которому позволила получить гидрофобизованные матрие с разным содержанием алкильных (в данном случае - изобутильных) группировок. Целью настоящей работы явилась оценка эффективности разделения бактериальных клеток в криогелях на основе ПВС, а также выявление воздействия экзогенного индуктора гипоме-таболического состояния микроорганизмов - химического аналога фактора di [4] (гексил-резорцина) - на характеристики поверхностных структур прокариот, определяющие разделение бактерий различных морфотипов и различной грам-принадлежности с использованием вышеуказанных аффинных сорбентов.

Экспериментальная часть

В работе использовали штаммы Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli K12 и Bacillus subtilis SK1 из музея кафедры микробиологии Казанского государственного университета. Формирование гидрофобизованных производных широкопористых криогелей ПВС (КГПВС) осуществляли согласно схеме, приведенной на рис.1.

Рис. 1 - Последовательность операций при получении частично гидрофобизованных широкопористых криогелей ПВС

Расчетное количество ПВС (молекулярная масса 86000, степень дезацетилирования 99100%) и гуммиарабика (ГуАр) (оба полимера от Acros Organics, Бельгия) диспергировали в деионизованной воде и оставляли набухать при комнатной температуре в течение 18 ч. Далее набухшую смесь нагревали 20 мин при перемешивании на кипящей водяной бане до образования гомогенного раствора. Образец взвешивали до и после нагревания, потери испарившейся воды компенсировали. Концентрация полимеров в полученном растворе составляла: ПВС - 9%, ГуАр - 8,5%. Этим раствором заполняли 5-мл пластиковые шприцы, которые герметизировали и помещали в камеру прецизионного программируемого криостата FP 45 HP (Julabo, Германия), где образцы замораживали при -30оС в течение 30 мин, затем выдерживали в замороженном состоянии при -5оС в течение 12 ч и оттаивали со скоростью 0,03оС/мин, которая контролировалась микропроцессором криостата. По окончании процесса образовавшиеся в результате широкопористые губчатые криогели промывали от растворимых компонентов (главным образом, ГуАр) дистиллированной водой (300 мл на каждый шприц), поток которой пропускали через «протекаемый» столбик криогеля при перепаде давления 100 см вод. ст. Для получения гидрофобизованных производных криогеля ПВС колонки промывали 0,05 N раствором HCl (30 мл на шприц), а затем через соответствующий столбик криогеля пропускали по 30 мл либо 0,1%-ного, либо 1,0%-ного раствора изомасляного альдегида (Реахим, РФ) также в 0,05 N растворе HCl и выдерживали в этой среде 3,5 ч при комнатной температуре. По окончании модификации все колонки промывали водой до нейтральной реакции среды на выходе, затем по 30 мл 0,2N раствора NaCl и окончательно по 300 мл деионизованной воды. При дальнейшем изложении слабо гидрофобизованные носители, приготовленные с использованием 0,1%-ного раствора изомасляного альдегида, мы называем КГПВС/0,1, а умеренно гидрофобизованные носители, модифицированные с помощью 1%-ного раствора этого альдегида, -КГПВС/1,0. Также в работе использовали краситель “Конго красный” (Aldrich Chemical Co., США), желатин марки “Фото”, фенол (хч) и глицерин (чда) (все Реахим, Россия).

Морфологию криогелей изучали с помощью оптического микроскопа Eclipse 55i (Nikon, Япония), снабженного системой цифровой записи изображений. Для исследований готовили тонкие (~10 мкм) срезы КГПВС (криомикротом SM-1900; Leica, Германия). Далее срезы помещали в дистиллированную воду, а затем погружали на 10 секунд в 1%-ный водный раствор Конго красного для окрашивания. Избыток красителя отмывали водой, срез помещали на предметное стекло, избыток влаги удаляли марлевым тампоном, наносили на объект 1 каплю “заливочной среды” (раствор 1 г желатина в 12 мл 50%-ного водного глицерина с добавкой 0,2 г фенола в качестве бакте-риостатика) и прижимали покровным стеклом. Препараты до исследований хранили при 4оС в герметичной таре.

Для разделения суспензий исследуемых штаммов микроорганизмов по гидрофильногидрофобным характеристикам использовали проточные колонки с широкопористыми носителями КГПВС/0,1 и КГПВС/1,0. Выращивали 18-часовые культуры E. coli и S. epidermidis на среде МПА, делали смыв клеток, готовили смешанную суспензию и затем подвергали двухчасовой прединку-бации с тестируемым веществом (гексилрезорцин) в исследуемых концентрациях. Далее 0,5 мл суспензии наносили на поверхность столбика геля, предварительно промытого 20%-ным водным раствором этанола и раствором солевого концентрата % (цитрат натрия трехзамещенный - 2,0 г, К2НРО4*3Н2О -42,0 г, КН2РО4 -18,0 г, (NH4)2SO4 - 4,0 г, вода дистиллированная до 1000 мл; соли растворяют с соблюдением указанного порядка, раствор автоклавируют при 1,0 изб. атм.). При открытом нижнем сливе колонки давали нанесенному объему суспензии впитаться в губчатый материал носителя. Затем последовательно промывали колонку с гелем солевым концентратом в концентрациях 1/40, 1/8, 1/4 (разведение в дистиллированной воде), собирали элюат порциями по 4мл, готовили препараты, окрашивали фуксином и микроскопировали с иммерсией. В каждой фракции элюата определяли количество клеток E. coli и S. epidermidis, в контрольном варианте была смесь клеток без добавления исследуемого вещества. По разнице в количестве задержанных гидрофоби-зованным носителем клеток контрольного и опытных образцов делали вывод об изменении ГЛБ поверхностных структур клеток при действии исследуемых алкилрезорцинов.

Математическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы "Microsoft Excel".

Результаты и их обсуждение

Получение широкопористого криогеля ПВС и его частичная гидрофобизация

Для проведения экспериментов по адсорбции бактерий на амфифильных (гидрофильно-гидрофобных) полимерных носителях нами был сначала получен широкопористый криогель поливинилового спирта (КГПВС), последующая химическая модификация которого с помощью обработки кислыми растворами изомасляного альдегида разной концентрации приводила к частично гидрофобизованным производным КГПВС/0,1 и КГПВС/1,0.

При формировании широкопористой матрицы мы использовали феномен термодинамической несовместимости растворов полимеров различной химической структуры, в данном случае, ПВС и ГуАр, приводящей к жидкофазному расслоению подобных смешанных систем [5]. Поскольку криогенная обработка водных растворов ПВС вызывает гелеоб-разование [6], а растворы ГуАр после оттаивания замороженной системы криогели не образуют, то обогащенная ГуАр жидкая фаза может быть легко отмыта от криогеля ПВС, оставляя полости, заполненные водой. Эта особенность строения подобных широкопористых КГПВС видна на микрофотографии тонкого среза такого криогеля (рис. 2), где темные участки - собственно гелевая фаза, окрашенная Конго красным, а светлые области - содержащие воду поры различной величины и геометрии. Крупные протяженные поры капиллярного размера сечением 20-200 мкм как раз и формируются в КГПВС жидкой фазой, обогащенной гуммиарабиком. Именно по этим взаимосвязанным каналом протекает жидкость через колонки с данным носителем; измерения показали, что скорость протока воды через колонки с этими КГПВС, сформированные в 5-мл шприцах, составляла 220-240 мл/ч при перепаде давления 100 см вод. ст. Поры же меньшего размера (1-10 мкм) и округлой формы в рассматриваемых здесь криогелях образованы кристаллами льда в результате замораживания исходного раствора.

Рис. 2 - Микрофотография (оптический микроскоп) тонкого среза широкопористого КГПВС

Для гидрофобизации широкопористых КГПВС применялась реакция ацеталирова-ния, приводящая к получению ацеталей ПВС [7]. При этом химическая модификация криогелей не вызывала заметных изменений в гидродинамических характеристиках колонок, и скорости протока жидкости через них оставались прежними, что указывало на относительно невысокое повышение гидрофобности носителя, поскольку в противном случае, т.е. при сильной гидрофобизации, степень набухания гелевой фазы в водной среде должна была бы снижаться, вызывая тем самым существенное изменение сечения пор капиллярного размера и, следовательно, скорости протока воды через них. Ранее было показано [3], что полученные с помощью аналогичной реакции амфифильные криогели на основе другого полиольного полимера - агарозы - могут использоваться в качестве биоаффинных широкопористых адсорбентов для разделения микробных клеток, в данной же работе нами были оценены подобные адсорбционные свойства амфифильных широкопористых КГПВС.

Разделение клеток на гидрофобизованных производных КГПВС

Для проведения опытов по разделению бактерий были приготовлены следующие варианты смесей двух культур B. subtilis и S. epidermidis: 1) обе культуры 1-суточные; 2) 1сут. B. subtilis и 7-сут. S. epidermidis; 3) 7-сут. Bacillus subtilis и 1-сут. S. epidermidis. Далее порции (по 4 мл каждая) таких суспензий смешанной биомассы наносились на колонки с частично гидрофобизованными или контрольными КГПВС и элюировались растворами со ступенчато повышаемой ионной силой (см. Экспериментальную часть).

Для всех трех вариантов было показано, что указанные клетки, суспендированные в среде культивирования, по-разному задерживались в колонках с такими криогелями. Это свидетельствует о разной степени гидрофобности поверхностей изученных микроорганизмов. При этом бациллы не полностью, а стафилококки практически полностью удерживались амфифильным ^^^^,1. Если клетки бактерий после центрифугирования и отделения культуральной жидкости ресуспендировали в солевом концентрате и пропускали через колонку, то разделения по гидрофобности не наблюдалось. Возможно, после взаимодействия клеток с солевым концентратом их поверхностные свойства меняются в сторону снижения гидрофобных свойств.

При оценке влияния возраста культуры на ее сорбцию частично гидрофобизован-ным КГПВС обнаружено, что при старении поверхностные свойства клеток бацилл изменяются в сторону повышения гидрофобности, вследствие чего клетки B. subtilis в большей степени задерживаются матрицей КЕПЕС^,!. Это может отчасти объясняться тем, что стареющая культура накапливает эндогенные ауторегуляторы развития, которые, как показано далее на примере E. coli, способны изменять гидрофобно-гидрофильный баланс поверхности клеток. Кроме того, известно, что у эукариот в процессе старения клеток, может происходить деструкция молекул белка, в результате чего происходит разворачивание белковых глобул, сопровождающееся увеличением их относительной гидрофобности [S].

Разделение обработанных гексилрезорцином клеток на амфифильных КГПВС

Смесь двух суточных культур, грамотрицательной E. coli и грамположительной S. epidermidis, в отсутствии экзогенных ауторегуляторов служила контролем. В результате пропускания суспензии этой смеси через немодифицированные гели ПВС было обнаружено, что бактерии E. coli на 3G% лучше задерживается в геле, чем клетки S.epidermidis. При совместной предварительной обработке клеток обоих штаммов гексилрезорцином в тех же условиях (1G и 5G мкг/мл, 2 часа при З7оС) при первичном смыве солевым концентратом

клетки E. шИ удерживались в геле лучше, чем необработанные клетки; а клетки S. epider-midis хуже, чем без обработки веществом. С увеличением концентрации гексилрезорцина этот эффект более выражен (рис. 3).

Клеток/попе зрения

1200

1000

800

600

400

200

Е. coli  S. epidemics

1 1 2 3 4 1 1 1 2  3  4 1 1 2 3  4

контроль НехЮ MKtAyUI Hex 50 мкгАлл

1200 1000 S00 600 + 00 200

Смывы клеток

а

Клеток/поле зрения

контроль

Е. coli  S. epidermidis

Hex 10 Hex 50

икг/нл икг/ил

Смъиы клеток

б

Рис. 3 - Результаты разделения смесей клеток на колонках с амфифильными КГПВС: смешанная биомасса была предварительно обработана различными концентрациями гексилрезорцина и пропущена через колонку (а) с КГПВС/0.1; (б) с КГПВС/1.0. В качестве контроля использовали суспензию клеток, не обработанную исследуемым веществом. Hex - Гексилрезорцин. 1-4 - порядковые номера последовательных фракций элюата

Таким образом, исследуемые нами грамотрицательные клетки E. coli обладают большей гидрофобностью по сравнению с грамположительными S. epidermidis, причем их гидрофобные свойства усиливаются при обработке гексилрезорцином. У грамположитель-ных бактерий гексилрезорцин ослаблял гидрофобные свойства поверхности. Установлено, что бациллы плохо вымываются из гелей даже при обработке дезинфицирующими раство-

рами: промывание солевым концентратом и спиртом (до 10 раз) не приводила к выходу свободного от бацилл элюата, в то время как стафилококки полностью исчезали из элюата к пятому акту промывания. Эти данные свидетельствуют о высокой степени адгезии клеток бацилл на криогеле и о большей гидрофобности их поверхностных структур по сравнению со стафилококками, что предопределяет возможность разделения смесей таких культур на колонках с гидрофобизованными производными широкопористого КГПВС. Отметим, что гексилрезорцин по-разному изменяет свойства клеточной поверхности бактерий различной грампринадлежности. Поверхность грамотрицательных бактерий становится более гидрофобизованной по сравнению с поверхностью необработанных клеток вследствие усиления гексилрезорцином гидрофобных свойств внешней липидной мембраны. Грамположительные бактерии отчасти теряют гидрофобность. Вероятно, связывание гексилрезорцина с липопротеидами и липополисахаридами клеточной стенки приводит к их модификации поверхностных структур [9]. Известно, что такие антибиотики, как мак-ролиды, из-за гидрофобности и значительного молекулярного веса не активны против ряда энтеробактерий, поскольку плохо проникают через клеточную стенку грамотрицательных бактериальных клеток. Возможно, что увеличение гидрофобности энтеробактерий может повысить эффективность макролидов против этой группы микроорганизмов. Гидрофоби-зация поверхностных оболочек бактерий может быть использована для повышения сродства к ним некоторых высокомолекулярных соединений, а также при решении прикладных задач нефтехимии [10]. Результаты, полученные в ходе выполнения работы, позволят обосновать новые технологические подходы к решению проблемы фракционирования клеток с различными метаболическими характеристиками и узкого исследования физиологобиохимических свойств отдельных фракций.

Работа выполнена в рамках программы «Развитие научного потенциала высшей

школы» (РНП 2.1.1.1005) и ГК 02.512.12.2010.

Литература

1. Лозинский В.И. Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения / В.И. Лозинский // Успехи химии. - 2002. - Т. 71. - №6. - С. 559-585.

2. Лозинский В.И. Новое семейство макропористых и сверхмакропористых материалов биотехнологического назначения - полимерные криогели / В.И. Лозинский // Известия РАН. - 2008. Сер. хим. - N5. - С. 996-1013.

3. Евтюгин В.Г., Сорбция микроорганизмов крупнопористыми агарозными криогелями, содержащими привитые алифатические цепи различной длины В.Г Евтюгин, А.Б. Маргулис, Д.Г. Дамшкалн, В.И. Лозинский, А.И. Колпаков, О.Н. Ильинская // Микробиология. - 2009. Т. 78. -№5. - С. 667-673.

4. Мулюкин А.Л., Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора di в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus / А.Н. Козлова, А.С. Капрельянц, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. - 1996. Т. 65. - Вып. 1. - С. 20-25.

5. Альбертсон П.О. Разделение клеточных частиц и макромолекул./ Пер. с англ., - М.: Мир. 1974. - 383 с.

6. Лозинский В.И. Криотропное гелеобразование растворов поливинилового спирта / В.И. Лозинский // Успехи химии. - 1998. Т. 67. - № 7. - C. 641-655.

7. Ушаков С.Н. Поливиниловый спирт и его производные / С.Н. Ушаков // М.-Л.: АН СССР, -1960. Т. 1. - С. 329-427.

8. Бердина А.Н. Жироудерживающая и жироэмульгирующая способность липопротеинов подсолнечника. / А.Н. Бердина, Н.В. Ильчишина, Н.С. Безверхая. // Труды V Международной научнопрактической конференции «Пища. Экология. Качество». Новосибирск: РАСХН. Сибирское отделение ГНУ СибНИПТИП. - 2008. - С. 243-244.

9. Бутова С.Н. Теоретические основы биотехнологии. Биохимические основы синтеза биологически активных веществ / С.Н. Бутова, И.А. Типисева, Г.И. Эль-Регистан // Теоретические основы биотехнологии Под общей редакцией И.М. Грачевой. М.: Элевар. - 2003. - С. 554.

10. Никитина Е.В. Особенности распределения и физиологического состояния микроорганизмов нефтешлама - отхода нефтехимического производства / Е.В. Никитина, О.И. Якушева, С.А. Зарипов, Р.А. Галиев, А.В. Гарусов, Р.П. Наумова // Микробиология. - 2003. Т. 72. - № 5. - С. 699706.

© В. Г. Евтюгин — асп. каф. микробиологии КФУ, : vevtugyn@gmail.com; А. Б. Маргулис -канд. биол. наук, доцент той же кафедры, Anna.Margulis@ksu.ru; О. В. Бушманова - - асп. той же кафедры, olechka@kzn.ru; Е. В. Никитина — канд. биол. наук, доцент каф. технологии пищевых производств КГТУ, elenik@mail.ru; А. И. Колпаков - канд. биол. наук, ст. науч. сотр. НИЛ ББФ КФУ, Alexei.Kolpakov@ksu.ru; Л. Г. Дамшкалн - науч. сотр. Института элементоорганических соединений РАН, ligry@mail.ru; В. И. Лозинский - д-р хим. наук, проф., зав. лаб. Института элементоорганических соединений РАН, loz@ineos.ac.ru; О. Н. Ильинская - д-р биол. наук, проф., зав. каф. микробиологии КФУ, Olga.Ilinskaya@ksu.ru