АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ВОДОРАСТВОРИМЫЙ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЙ ХИТОЗАН
ANTIBACTERIAL COMPOSITION CONTAINING WATER-SOLUBLE LOW-MOLECULAR CHITOSAN

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и относится к композиции, обладающей антибактериальной активностью, характеризующуюся тем, что она содержит активное вещество - водорастворимый низкомолекулярный хитозан, а также основу.
10
Хитозан - сополимер глюкозамина и ацетилглюкозамина - является продуктом дезацетилирования хитина, который содержится в экзоскелетах ракообразных и насекомых, гладиусах кальмара, клеточных стенках грибов и некоторых водорослей. Хитозан является единственным положительно заряженным полимером (поликатионом) естественного происхождения, который получают в больших количествах с высокой степенью химической чистоты, и, что немаловажно, обладающего умеренной стоимостью [1]. Мировое количество хитина оценивается на уровне 10 тонн, что, учитывая постоянный биосинтез, делает его неистощимым источником для получения хитозана.
В последние два десятилетия значительно возрос интерес к биоцидным свойствам хитозана, которые наряду с нетоксичностью, биосовместимостью, гипоаллергенностью и биодеградируемостью, позволяют использовать его в биомедицинских целях в качестве альтернативы и/или вспомогательного вещества в антимикробной терапии, особенно по отношению к ряду бактериальных штаммов, резистентных к классическим антибиотикам [2].
а
Однако антибактериальные свойства хитозана сильно зависят от его молекулярно-массовых параметров [3]. Дело в том, что хитозан, являющийся сополимером глюкозамина и ацетилглюкозамина, представляет собой гетерогенную группу веществ, различающихся по молекулярной массе, степени деацетилирования, расположению остаточных ацетилированных звеньев вдоль полимерной цепи, вязкости, значению средней величины рК [4]. В связи с широкой вариацией молекулярно-массовых параметров образцов полимера, для хитозана характерны значительные вариации в проявлении антибактериальных свойств.
Антибактериальные свойства хитозана зависят:
- во-первых, от его степени дезацетилирования, то есть от доли аминосахаридных остатков со свободной аминогруппой. Увеличение степени дезацетилирования хитозана ведет к усилению антибактериальных свойств полиаминосахарида [5].
- во-вторых, от степени протонирования свободных аминогрупп полимера, поскольку именно положительно заряженные аминогруппы во многом определяют сродство хитозана к клеткам микроорганизмов. С увеличением степени протонирования аминогрупп хитозана усиливаются антибактериальные свойства полимера. Степень протонирования полимера зависит от кислотности среды - чем более кислая среда, тем более заряжен положительно хитозановый полимер, поэтому при увеличении кислотности среды антибактериальные свойства хитозана усиливаются, а при защелачивании - уменьшаются [5].
- в-третьих, от молекулярной массы (степени полимеризации) хитозана. Обычно с увеличением молекулярной массы хитозана его антибактериальные свойства усиливаются [5, 6]. Это объясняется его возрастающей способностью взаимодействовать с клетками микроорганизмов при увеличении молекулярной массы. Обычно такая зависимость прослеживается при оценке антибактериальных свойств хитозанов в кислых условиях - при низких значениях pH среды (менее 6,5). Однако, имеются сведения, которые свидетельствуют об усилении антибактериальных свойств хитозана при уменьшении его молекулярной массы, что связывают с лучшей растворимостью более низкомолекулярных форм полимера [7, 8]. Обычно такие данные получают при оценке антибактериальных свойств хитозанов в нейтральных или слабощелочных условиях - при средних значениях pH среды (от 6,5 до 8,0). Такое противоречие в зависимости антибактериальных свойств хитозана от его молекулярной массы (степени полимеризации) обуславливает актуальность поиска оптимальных по молекулярно-массовым параметрам образцов хитозана, которые бы обладали достаточно высокой антибактериальной активностью в широком диапазоне кислотности среды - как в кислых, так и в слабощелочных условиях, для последующего его включения в антибактериальную композицию.
Известен способ стабилизации косметических препаратов путем введения в них хитозана с молекулярной массой от 3 до 700 кДа. В данном случае хитозан используют в качестве консерванта, добавляя его в состав препарата в количестве от 0,005 до 0,5 мол. [9].
Известна композиция, содержащая хитозан (0,19%), аскорбиновую кислоту (0,165%) и аскорбинат натрия, применяемая в хирургической стоматологии для заживления дефектов пародонтальной ткани [10].
Известна композиция, содержащая хитозан (1-4 мас.%), глицерол (10-90 мас.%) и уксусную кислоту (1 мас.%), используемая как носитель для медикаментов анальгетиков и антибактериальных агентов [11].
Близким аналогом к нашему изобретению можно считать патент на изобретение «Гель для ухода за кожей и лечения ее заболеваний и композиция для его получения» [12]. Главным недостатком данного примера является то, что в нем используется хитозан с молекулярной массой от 10 до 500 кДа, который не обладает достаточной растворимостью в нейтральных и щелочных условиях.
Таким образом, все приведенные выше примеры подразумевают использование либо хитозана с достаточно высокой молекулярной массой, либо с молекулярными массами в широком диапазоне этого параметра не учитывающие сильные различия в проявлении антибактериального действия у образцов с различными молекулярно-массовыми характеристиками, что может привести к недостаточному использованию антимикробного потенциала этого полимера. Как указывалось выше, образцы хитозанов с более высокой молекулярной массой могут терять свою активность в нейтральных и щелочных условиях. Полидисперсные образцы, которые содержат молекулы хитозанового полимера с сильно различающейся молекулярной массой также могут обладать недостаточной эффективностью в подобных условиях ввиду потери активности входящих в их состав фракций молекул полимера с достаточно высокой степенью полимеризации (молекулярной массой).
В связи с этим целью заявленного изобретения является разработка антибактериальной композиции, включающая в свой состав водорастворимый низкомолекулярный хитозан, обладающий повышенной антибактериальной активностью в широком диапазоне уровней кислотности среды (pH от 5,50 до 8,00) и придающий это свойство композиции.
а
а
Поставленная задача достигается путем включения в состав композиции хитозана с молекулярной массой от 3,5 до 4,9 кДа (степенью полимеризации от 20 до 29), который обладает более высоким уровнем значения рК (значение рК соответствует значению pH среды при котором ровно половина свободных аминогрупп конкретного образца хитозана заряжена положительно), по сравнению с более высокомолекулярными образцами (табл.1). Эти образцы (с молекулярной массой от 3,5 до 4,9 кДа, и степенью полимеризации от 20 до 29, соответственно) также обладают лучшей расторимостью в нейтральных и слабощелочных условиях по сравнению с более высокомолекулярными образцами, о чем можно судить по незначительному выпадению их в осадок при повышении pH среды (рис.1) В ходе оценки антибактериальных свойств этих образцов хитоазана (с молекулярной массой от 3,5 до 4,9 кДа, и степенью полимеризации от 20 до 29, соответственно) было установлено, что они обладают антибактериальной активностью в отношении стафилококков в широком диапазоне pH среды (от 5,50 до 8,00), в отличие от более высокомолекулярных образцов, котрые были малоактивны при нейтральных и в слабощелочных условиях (рис.2 и 3). Использование олигомеров менее 3,5 кДа является нецелесообразным ввиду их слабых антибактериальных свойств (рис.2 и 3). В качестве загустителя возможно использование поливинилового спирта, глицерин, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон.
а
Техническим результатом заявленного изобретения является разработка антибактериальной композиции, включающая в свой состав водорастворимый низкомолекулярный хитозан, характеризующийся повышенным уровнем рК, а также высокой растворимостью и антибактериальной активностью в широком диапазоне уровней кислотности среды (pH от 5,50 до 8,00).
Пример 1. Антибактериальная композиция, включающая в свой состав: хитозан водорастворимый низкомолекулярный с молекулярной массой от 3,5 до 4,9 кДа (степенью полимеризации от 20 до 29) от 0,01 до 10 мас.%, поливиниловый спирт от 2 до 15 мас.%, остальное - вода.
Композиция в виде геля обладает антибактериальной активностью в отношении различных видов бактерий в широком диапазоне pH. Полученные результаты антибактериального теста заявляемой композиции представлены в таблицах 2-4.
Пример 2. Антибактериальная композиция, как и в примере 1, но вместо поливинилового спирта включающая в себя глицерин от 10 до 90 мас.%.
Пример 3. Антибактериальная композиция, как и в примере 1, но вместо поливинилового спирта включающая в себя полиэтиленгликоль от 1 до 20 мас.%.
Пример 4. Антибактериальная композиция, как и в примере 1, но вместо поливинилового спирта включающая в себя поливинилпироролидон от 10 до 50 мас.%.
Пример 5. Антибактериальная композиция, как и в примере 1, но кроме поливинилового спирта от 2 до 15 мас.%., включающая и глицерин от 10 до 90 мас.%, и полиэтиленгликоль от 1 до 20 мас.%, и поливинилпироролидон от 10 до 50 мас.%.
Таблица 1
Характеристика образцов хитозана
№ образца
Молекулярная масса, кДа
СП
ИП
СД, моль.%
рК<sub>а</sub>
1
0,7
4
1,41
95
7,1
2
1,5
8
1,39
93
6,7
3
2,2
13
1,34
97
6,6
4
3,5
20
1,71
95
6,5
5
4,2
24
1,38
97
6,5
6
4,9
29
2,28
78
6,5
7
8,3
49
1,44
97
6,4
8
15,0
87
1,61
94
6,4
9
19,9
116
1,66
98
6,4
СП - средняя степень полимеризации
ИП - индекс полидисперсности
СД - степень деацетилирования
а
Рис.1. Значения рК хитозанов определенные с помощью кондуктометрического титрования
Таблица 2
Антибактериальная активность в отношении S. aureus заявляемой композиции, по сравнению с композициями в состав которых входят другие образцы хитозана. Состав композиций: хитозан - 1 мас.%, поливиниловый спирт - 5 мас.%, остальное - вода
pH
Зона ингибирования роста микроорганизмов на твердой питательной среде, мм
Хитозан от 3,5 до 5,5 кДа
Хитозан 2 кДа
Хитозан 20 кДа
5,50
10
3
12
5,75
11
3
10
6,00
11
3
11
6,25
10
3
11
6,50
10
3
10
6,75
10
3
9
7,00
8
3
5
7,25
8
3
3
7,50
8
2
0
7,75
7
0
0
8,00
5
0
0
Таблица 3
Антибактериальная активность в отношении Е. coli заявляемой композиции, по сравнению с композициями в состав которых входят другие образцы хитозана. Состав композиций: хитозан - 1 мас.%, поливиниловый спирт - 5 мас.%, остальное - вода.
pH
Зона ингибирования роста микроорганизмов на твердой питательной среде, мм
Хитозан от 3,5 до 4,9 кДа
Хитозан 2 кДа
Хитозан 20 кДа
5,50
14
5
15
5,75
13
5
15
6,00
14
5
14
6,25
13
4
13
6,50
12
4
12
6,75
12
4
10
7,00
12
4
3
7,25
11
2
0
7,50
11
1
0
7,75
8
0
0
8,00
4
0
0
Таблица 4
Антибактериальная активность в отношении S. epidermidis заявляемой композиции, по сравнению с композициями в состав которых входят другие образцы хитозана. Состав композиций: хитозан - 0,01 мас.%, поливиниловый спирт - 5 мас.%, остальное - вода.
pH
Зона ингибирования роста микроорганизмов на твердой питательной среде, мм
Хитозан от 3,5 до 4,9 кДа
Хитозан 2 кДа
Хитозан 20 кДа
5,50
15
12
17
5,75
15
10
17
6,00
15
11
16
6,25
15
11
15
6,50
15
10
15
6,75
15
10
15
7,00
15
3
14
7,25
15
1
6
7,50
11
1
1
7,75
10
0
0
8,00
7
0
0
ЛИТЕРАТУРА
1. Хитин и хитозан: получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. - М.: Изд-во Наука, 2002. - 368 с.
2. Tin S., Sakharkar K.R., Lim C.S., Sakharkar M.K.. // Int. J. Biol. Sci. 2009. V. 5. N2. P.53-60.
3. Куликов С.Н., Тюрин Ю.А., Фассахов Р.С., Варламов В.П. / Антибактериальная и антимикотическая активность хитозана: механизмы действия и роль структуры // Журнал Микробиологии Эпидемиологии и Иммунобиологии, 2009, №5, с.91-98.
4. Tharanathan R.N., Kittur F.S. Chitin - the undisputed biomolecule of great potential. Crit. Rev. Nutr. 2003. V.43. P.61-87.
5. Liu X.F., Guan Y.L., Yang D.Z., Li Z., Yao K.D. Antibacterial action of chitosan and carboxymethylated chitosan. J. Appl. Polym. Sci. 2001. V.79. P.1324-1335.
6. Eaton P., Femandes J.C., Pereira E. et al. Atomic force microscopy study of the antibacterial effects of chitosans on Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Ultramicroscopy. 2008, 108 (10): 1128 - 1134.
7. Герасименко Д.В., Авдиенко И.Д., Банникова Г.Е. и др. Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов. Прикл. биохим. микробиол.2004,40 (З): 301 - 306.
8. Kumar A.B.V., Varadaraj M.C., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosan - preparation with the aid of pepsin, characterization, and its bactericidal activity. Biochim. Biophys. Acta. 2004, 1670 (2): 137 - 146.
9. Патент RU №2028138, 1995. Способ стабилизации косметических препаратов
10. Muzzarelli R, Biagini G, Pugnaloni A, Filippini 0, Baldassarre V, Castaldini C, Rizzoli С./ Reconstruction of parodontal tissue with chitosan. // Biomaterials, 1989, v.10, N 9, p.598 603
11. Пат. США 4659700, AG1K 31/725, 1987.
12. Патент RU №2085187, 1997. Гель для ухода за кожей и лечения ее заболеваний и композиция для его получения.