Сравнительный анализ структуры и энтальпии гидролиза молекул цАМФ и цГМФ методами квантовой биохимии

УДК 539.19+612.822.3

Вестник СПбГУ. Сер. 3, 2007, вып. 2

О. Н. Рогачева, В. Е. Стефанов, Б. Ф. Щеголев

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И ЭНТАЛЬПИИ ГИДРОЛИЗА МОЛЕКУЛ цАМФ и цГМФ МЕТОДАМИ КВАНТОВОЙ БИОХИМИИ

Аденозин-3',5'-циклофосфат (цАМФ) является внутриклеточным мессенджером, ал-лостерически регулирующим активность ключевых белков сигналинга. Домены, связывающие цАМФ, входят в состав протеинкиназ А [1], фосфодиэстераз [2], транскрипционных факторов и некоторых других белков клеток животных, растений и бактерий. Кроме того, фосфодиэстеразы и аденилатциклазы имеют каталитические центры связывания цАМФ. Все это свидетельствует о непосредственном участии цАМФ в регуляции ряда важнейших клеточных процессов, а следовательно, о необходимости исследования его взаимодействия с соответствующими сайтами связывания в структуре различных белков. Такой анализ в настоящее время проводится методом докинга, когда лиганд (в данном случае цАМФ) помещается в связывающий сайт изучаемого белка с помощью специальных компьютерных программ. Полной оптимизации геометрической структуры цАМФ для последующего проведения докинга и посвящена данная работа.

В предыдущих исследованиях была проанализировала структура аниона цАМФ, причем анализ проводился как эмпирическими методами (рентгеноструктурный анализ [3, 4], ядерно-магнитный резонанс [5, 6]), так и расчетными [7, 8, 9, 10]. Однако структура протонированной формы цАМФ осталась неисследованной. Действительно, существование цАМФ в виде молекулы в водном растворе с нейтральным рН кажется маловероятным (рКа 3.7), однако в белковом окружении протонированная форма может реализовы-ваться. К тому же подобная ситуация была продемонстрирована для других соединений с низким значением рКа [11]. Исходя из вышесказанного, целью настоящей работы стало определение структуры протонированной формы цАМФ.

Известно, что цАМФ и цГМФ (гуанозин-3',5'-циклофосфат) имеют сродство к одним и тем же центрам связывания в структурах различных белков. Обе молекулы имеют сходное строение, таким образом, данные о структуре цГМФ могут не только непосредственно использоваться при изучении его биологической роли как мессенджера, но и помочь в выяснении механизма взаимодействия обоих циклических нуклеотидов с соответствующими сайтами связывания. Вот почему, помимо определения структуры цАМФ, в данной работе также проведено исследование структуры протонированной формы молекулы цГМФ.

Кроме анализа структур молекулцАМФ и цГМФ, с целью проведения последующего докинга, в работе дана оценка энтальпий гидролиза этих циклических нуклеотидмонофос-фатов. Энтальпия гидролиза цАМФ в предыдущих исследованиях экспериментально определялась калориметрическим методом, и ее величина в разных работах варьирует от 26 до 14ккал/моль [12,13]. В то же время сходные экспериментальные оценки энтальпии гидролиза цГМФ дали почти вдвое заниженные, по сравнению с цАМФ, результаты [12], что представляется физически малообоснованным, а следовательно, нуждается в уточнении.

Материалы и методы. Исходные структуры циклических нуклеотидов цАМФ и цГМФ были построены в программном пакете НурегСЬет 7.0 [14] и на первом этапе оптимизированы с помощью полуэмпирического квантово-химического метода МЫОО [15]. Окончательная полная

© О. Н. Рогачева, В. Е. Стефанов, Б. Ф. Щеголев, 2006

оптимизация геометрических параметров этих молекул выполнялась ab initio методом Хартри -Фока-Рутаана [16] с использованием атомных гауссовых базисных наборов 6-31G(d)( [17] и подтверждалась анализом их колебательных частот.

Все неэмпирические расчеты велись на основе пакетов квантово-химических программ GAMESS [18] (версия PC GAMESS 6.4 [19]) и Gaussian 94W [20].

Исходя из литературных данных о существовании двух (син и анти) конформаций обоих нуклеотидов [4], был проанализирован потенциальный барьер вращения азотистого основания относительно гликозидной связи. При этом заданные значения торсионного угла 06-C7-N8-C17 (рис. 1) фиксировались, а затем проводилась полная оптимизация геометрических параметров молекул. Помимо зависимости потенциальной энергии цАМФ от положения азотистого основания, также анализировалось изменение конформации фуранозного кольца, характеризующееся углом псевдовращения Р. Угол псевдовращения, в свою очередь, рассчитывался по известной формуле

иР= О4 + О-О3 + Г0) 2r2(sin 36° + sin 72°) '

где т0, г,, т2, т3, г4 - торсионные углы, построенные на атомах фуранозного кольца (рис. 2). Все указанные вычисления проводились в газовой фазе при 0 °К. Выбор таких условий оправдан имеющимися литературными данными [7], свидетельствующими об адекватности применения подобных расчетов, если в соединении невозможно образование внутримолекулярных водородных связей. В дальнейшем, однако, влияние белкового окружения будет учтено.

Рис. 1. Лнттш-конформация протонированной формы цАМФ, оптимизированная с использованием базиса 6-ЗЮ(б/).

Рибоза находится в СЗ'-эндо-С4'-экзо-конформации, а фосфатное кольцо - в твист-форме.

Оценка энтальпии гидролиза цАМФ и цГМФ проводилась с использованием полученных в ходе геометрической оптимизации полных энергий син- и аигии-конформаций анализируемых циклических нуклеотидмонофосфатов. Кроме того, была выполнена полная оптимизация гео-

'Дополнительные расчеты, учитывающие р-функции на протонах (6-3 Ю(г/, р)), диффузные функции на всех атомах (6-31++С(г/)), а также расчеты, проведенные методом функционала плотности (ВЗЬУР/ 6-3 Ю(с?)) для анализа возможной роли эффектов корреляции электронов, не дали отличных результатов, и поэтому соответствующие данные не приводятся.

метрических параметров молекул аденозинмонофосфата (АМФ), гуанозинмонофосфата (ГМФ) и воды. Данные расчеты также проводились в газовой фазе при О °К методом Хартри-Фока -Рутаана с использованием атомных гауссовых базисных функций 6-3 Ю(<0, при этом так же, как в случае с циклическими нуклеотидмонофосфатами, исследовалась возможность существования син- и ¿штгаи-конформаций АМФ и ГМФ. В итоге, энтальпии гидролиза цАМФ и цГМФ определялись как разность полных энергий АМФ (ГМФ) и воды, с одной стороны, и цАМФ (цГМФ) - с другой. В ходе вычислений предполагалось, что циклический нуклеотидмонофос-фат в син (й?ши)-конформации гидролизуется до соответствующего нуклеотидмонофосфата также в син (ан?га/)-конформации.

Рис. 2. Пояснения к расчету углов псевдовращения фуранозного кольца.

Результаты исследования и их обсуждения. Как и предполагалось, полная оптимизации геометрии молекулы цАМФ привела к двум устойчивым конформациям (син и анти), характеризующимся значениями гликозидного торсионного угла (06-С7-К8-С17) 68.5° и -173.0° соответственно (рис. 1). Смн-конформация протонированной формы цАМФ энергетически более выгодна (на 2.3 ккал/моль), в то время как для аниона литературные данные свидетельствуют в пользу аш?ш-конформации [7].

При анализе смн-конформации цАМФ было обнаружено, что фуранозное кольцо находится в СЗ'-эндо-С4'-экзо-состоянии (Р=40.7°, причем атом СЗ' выступает вверх над плоскостью кольца на 0.3 А, а атом С4' смещен вниз на 0.37 А (см. обозначения к рис. 2). В случае реализации аштш-конформации цАМ Ф направление смещения углеродных атомов остается тем же (Р=25°), однако величины смещения изменяются: 0.57 А и 0.11 А для СЗ' и С4' атомов соответственно. Что касается фосфатного кольца, то для аниононной формы получена конформация типа «кресло» [3], тогда как для протонированной формы этой молекулы более характерна твист-конформация. Некоторые дополнительные значения торсионных и плоских углов для син- и ангам-конформаций цАМФ приведены в табл. 1.

Таблица 1. Значения некоторых торсионных и плоских углов для син- и анти-конформаций цАМФ

Углы

Син цАМФ

Анти цАМФ

06-С7-Ш-С17 С19-С7-К8-С17 06-С7-Ш-С9 06-С7-К8

68.5° -52.5° -104.3° 109.5° 115.8°

-173.0° 69.2° -1.0° 107.5° 113.1°

С19-С7-Ш

Торсионные углы фосфатного кольца

03-Р22-021-С18

Р22-021-С18-С5

021-С18-С5-С4

С18-С5-С4-03

С5-С4-03-Р22

С4-03-Р22-021

-39.0° -17.0° 39.9°

-4.1°

-46.4°

72.9°

-5.3° -45.4° 71.9° -37.8° -18.6° 41.4°

В ходе работы анализировался потенциальный барьер вращения азотистого основания относительно гликозидной связи. Полученные данные приведены на рис. 3. Видно, что минимальная высота барьера составляет около 6 ккал/моль, что примерно в 10 раз превышает энергию теплового движения (кТ) при 300° К, а следовательно, свободный переход из одной конформации цАМФ в другую при физиологических условиях невозможен.

Угол вращения азотистого основания относительно гликозидной связи

Рис. 3. Потенциальный барьер вращения азотистого основания относительно гликозидной связи в протонированной форме цАМФ.

В дополнении к описанной выше зависимости на рис. 4 продемонстрировано влияние положения азотистого основания на угол псевдовращения фуранозного кольца. Следует отметить, что весь имеющийся диапазон углов псевдовращения описывает СЗ'-эндо-С4'-экзо-состояние рибозы, при этом смещение атомов СЗ' и С4' относительно плоскости кольца сильно варьируется.

Согласно имеющимся данным [7], существует две ¿штш-конформации аниона цАМФ: А (06-С7-Ш-С17=-149°, 06-С7-Ш-С9=30°) и В (06-С7-Н8-С17=-174\ 06-С7-Ш-С9=1 Г), причем нет однозначных результатов, свидетельствующих в пользу реализации той или иной формы даже в газовой фазе [7]. Наши данные показывают, что конформация молекулы цАМФ ближе к В форме. Однако из рис. 4 видно: когда торсионные углы 06-С7-Ш-С17 и С19-С7-К8-С17 принимают значения, соответствующие А форме, происходит изменение угла псевдовращения рибозного кольца, что в определенных условиях (например, при наличии белкового окружения) может приводить к стабилизации А конформации.

Все рассмотренные выше закономерности наблюдались и при анализе структуры протонированной формы цГМФ. Ош-конформация цГМФ (06-С7-Ы8-С17= 67.1°, С19-С7-Ы8-С17 = -54.0°) более выгодна энергетически (на 2.2 ккал/моль). Ей свойственно твист-состояние фосфатного кольца и СЗ'-эндо-С4'-экзо-конформация рибозы (Р=40.5°), при этом смещение атома СЗ' над плоскостью фуранозного кольца составляет 0.31 А; атом С4' смещен вниз на 0.37 А. Менее устойчивая ашш-конформация цГМФ (06-С7-М8-С17=

3

го

I 40

о, «

к 35

и

3

& 30

»

о «

м <и

0 С

4

1

25 20

15 -

-50

Син-конформация

ч

400

0 50 100 150 200 250 300 350

Угол вращения азотистого основания относительно гликозидной связи

Рис. 4. Зависимость угла псевдовращения рибозы в составе протонированной формы цАМФ от положения азотистого основания.

=-161.3°, С19-С7-N8-017=80.5°) также характеризуется твист-состоянием фосфатного кольца и СЗ'-эндо-С4'-экзо-состоянием рибозы (Р=29.9°), однако СЗ' и С4' атомы смещены на 0.5 А вверх и на 0.19 А вниз относительно плоскости кольца соответственно. Значения полных энергий, полученных в ходе полной оптимизации геометрии молекулы воды, а также син- и гшти-конформаций молекул цАМФ, цГМФ, АМФ и ГМФ приведены в табл. 2.

Таблица 2. Значения полных энергий молекулы воды, а также син- и аншм-конформаций молекул цАМФ, цГМФ, АМФ и ГМФ, полученные в ходе геометрической оптимизации

данных молекул

Молекулы Энергия, Хартри/моль

Сш-конформация Лн/яи-конформация

цАМФ 1447.912 1447.908

цГМФ 1522.783 1522.780

АМФ 1523.947 1523.949

ГМФ 1598.818 1598.819

Вода 76.011

Исходя из этих данных, были оценены величины энтальпий гидролиза рассматриваемых циклических нуклеотидмонофосфатов. Энтальпия гидролиза цАМФ составила 15.5 и 18.8 ккал/моль, а цГМФ - 15.0 и 17.9 ккал/моль для син-и ¿шт/ш-конформаций циклических нуклеотидмонофосфатов соответственно. При этом, если в случае цАМФ полученные величины хорошо согласовывались с имеющимися литературными данными [12], то для цГМФ расхождение оказывалось значительным. Проведенные нами оценки не показали значительного различия между энтальпиями гидролиза цАМФ и цГМФ, в то время как экспериментальные расчеты энтальпии гидролиза цГМФ дают заниженные в 1.5 раза, по сравнению с цАМФ, результаты [12]. Полученные нами данные, несомненно,

требуют дальнейшего уточнения, однако в силу сходства структур цАМФ и цГМФ результаты квантово-химических расчетов представляются более обоснованными.

Выводы. Таким образом, результаты расчетов, проведенные в газовой фазе, свидетельствуют в пользу существования двух конформаций протонированной формы цАМФ (син и анти), разделенных энергетическим барьером порядка 6 ккал/моль. Сг/н-конфор-мация более выгодна энергетически (на 2.3 ккал/моль). Для нее характерна твист- форма фосфатного кольца и СЗ'-эндо-С4'-экзо-состояние рибозы. Лшгш-конформации также свойственно твист-состояние фосфатного кольца и СЗ'-эндо-С4'-экзо-форма рибозы, однако смещения СЗ' и С4' атомов в данном случае сильно отличаются от наблюдаемых в молекуле цАМФ при реализации смм-конформации. Сходные закономерности были получены и при анализе структуры протонированной формы цГМФ. Энтальпия гидролиза цАМФ составила 15.5 и 18.8 ккал/моль для син- и ¿ш/тш-конформаций соответственно. Близкие значения величин энтальпии 15.0 и 17.9 ккал/моль для син и ашта-конформаций, соответственно, получены и при анализе энтальпии гидролиза цГМФ, что противоречит

литературным данным, однако представляется нам физически более обоснованным.

* * *

Авторы выражают признательность доктору биологических наук Е. Г. Скворцевичуи доктору биологических наук Е. В. Савватеевой-Поповой за обсуждения и ценные замечания по работе.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования РФ (грант РНП 2.1.1.4139) и Инновационного образовательного проекта СПбГУ «Инновационная образовательная среда в классическом университете (пилотный проект "Нанобиология")».

Summary

Rogacheva О. N., Stefanov V. Е., Shchegolev В. F. Comparative analysis of structure and enthalpy of hydrolysis of cAMP and cGMP by means of quantum biochemistry methods.

The structure and enthalpy of hydrolysis of cyclic nucleotides cAMP and cGMP were determined using computational methods of quantum biochemistry. The occurrence of two conformations (syn and anti) with different values of energy and separated by an energy barrier was demonstrated for the nucleotides. The description of the two conformations and corresponding enthalpy values for hydrolysis of the nucleotides are provided.

Литература

1. Berman H. M., Eyck L. F. Т., GoodsellD. S, Haste N. M., KornevA., Taylor S. S. The cAMP binding domain: An ancient signaling module//PNAS. 2005. Vol. 102. P. 45-50. 2. Degerman E., Belfrage P., Manganiello V.C. Structure, Localization, and Regulation of cGMP-inhibited Phosphodiesterase (PDE3) //Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 6823-6826. 3. Varughese К. I., Lu С. Т., Kartha C. The crystal and molecular structure of cyclic adenosine 3',5'-monophosphate sodium salt, monoclinic form // J. Am. Chem. Soc. 1982. Vol. 104. P. 3398-3401.4. WatenpaughK., Dow^J. Jensen L. H„FurbergS. Crystal and molecular structure of adenosine 3',5'-cyclic phosphate// Science 1968. Vol. 159. P. 206-207. 5. Lavallee D. K., Zeltmann A. H. Conformation of cyclic beta-adenosine 3',5'-phosphate in solution using the lanthanide shift technique //J. Am. Chem. Soc. 1974. Vol. 96. P. 5552-5556.6. Kainosho M., Ajisaka K. Conformational study of cyclic nucleotides-lanthanide ion assisted analysis of hydrogen-1 nuclear magnetic-resonance spectra // J. Am. Chem. Soc. 1975. Vol. 97. P. 6839-6843.

7. Salter E. A., Wierzbicki A., Sperl G., Thompson W. J. Quantum Mechanical Study of the Syn and Anti Conformations of Solvated Cyclic GMP // Structural Chemistry. 2003. Vol. 14. P. 527-533.

8. KirschnerK. N., SchererE. C., Shields G. C. Use of the Supermolecule Approach to Model the Syn and Anti Conformations of Solvated Cyclic 3',5'-Adenosine Monophosphate // J. Phys. Chem. 1996. Vol. 100. P. 3293-3298. 9. Topiol S., Morgan T. K.} Sabio M., lurrima W. C. The role of intramolecular

hydrogen bonding as a determinant of the conformational profiles of cGMP and cAMP // J. Am. Chem. Soc. 1990. Vol. 112, P. 1452-1459.10. Yathindra N., Sundaralingam M. Conformations of cyclic 3',5'-nucleotides. Effect of the base on the synanti conformer distribution // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1974.N56. P. 119-126.11. PassnerJ. M., SteizT.A. The structure of a CAP-DNA complex having two cAMP molecules bound to each monomer // Proc. Natl. Acad. Sci. 1997. Vol. 94. P. 2843-2847. 12. GreencardP., Rudolph S. A., Sturtevant J. M. Enthalpy of hydrolysis of the 3' bond of adenosine 3',5'-monophosphate and guanosine 3',5'-monophosphate //J. Biol. Chem. 1969. Vol. 244. P. 4798-4800. 13. Bryan A. M., Olafsson P. G. Calorimetric investigations of crystalline 3',5'-cyclic nucleotides // Biopolymers 1973 Vol. 12. P. 229-235. 14. HYPERCHEM Professional Release 5.1 (demoversion). A Molecular Visualization and Simulation Software Package. Gainesville (Florida), 1998.15. DewarM.J. S., Reynolds С. H, An improved set of mndo parameters for sulfur //J. Comp.Chem. 1986. Vol. 7. P. 140-143.16. Roothan С. C. J. New Developments in Molecular Orbital Theory // Rev. Mod. Phys. 1951. Vol. 23. P. 69-83.17. Petersson G. A., Al-Laham M. A. A complete basis set model chemistry. II. Open-shell systems and the total energies of the first-row atoms //J. Chem. Phys. 1991. Vol. 94. P. 6081-6090. 18. Schmidt M. Baldridge K. K„ Boatz J. A., Elbert S. Т., Gordon M. Sh Jesen J. H., Koseki 5., Matsunaga N., Nguyen K. A., Su S., Wiindus T. L., Dupuis M., Montgomery J. A. General atomic and molecular electronic structure system //J. Comput. Chem. 1993. Vol. 14. P. 1347-1363. 19. GranovskyA. A., www.http://classic.chem.msu.su/gran/ gamess/ index.html. 20. Frisch M.J., Trucks G. W., SchlegelH. В., Scuseria G. E., Robb M. A., CheesemanJ. R., Zakrzewski V. G., Montgomery,Jr., J. A., Stratmann R. E., BurantJ. C„ Dapprich S., Milium J. M., Daniels A. D., Kudin K. N., Strain M. C., Farkas O., Tomasi J., Barone V., Cossi M., Cammi R., Mennucci В., Pomelli C., Adamo C., Cliffords., Ochterski ]., Petersson G. A., Ayala P. Y., Cui Q., Morokuma K., Salvador P., DannenbergJ.J., Malick D. K., Rabuck A. D., Raghavachari K., Foresman J. В., CioslowskiJ., Ortiz J. V., Baboul A. G., StefanovB. В., Liu G., Liashenko A., PiskorzP., KomaromiL, Gomperts R., Martin R. L, FoxD.J., Keith Т., Al-Laham M. A., Peng C. Y., Nanayakkara A., Challacombe M., Gill P. M. W., Johnson В., Chen W., WongM. W., AndresJ. L., Gonzalez C., Head-Gordon M., Replogle E. S., PopleJ. A. Gaussian 98, Revision A.ll.l, Gaussian, Inc., Pittsburgh PA, 1995. 21. Altona C., Sundaralingam M. Conformational analysis of the sugar ring in nucleosides and nucleotides. A new description using the concept of pseudorotation //J. Amer. Chem. Soc. 1972. Vol. 94. P. 8205-8212.

Статья принята к печати 18 декабря 2006 г.

E-mail: vastef@mail.ru