СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СУХОСТИ ГЛАЗ
METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING DRY EYE

Для настоящей заявки испрошен приоритет по предварительной патентной заявке США с регистрационным номером 60/988623, от 16 ноября 2007, которая включена в настоящее описание с помощью ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Сухость глаз или ксерофтальмия - это состояние, которое для многих является причиной боли и дискомфорта. Для большинства индивидов мигание и пополнение жидкости в течение дня обеспечивает чистую и кондиционированную поверхность глаз. При сухости глаз поверхность глаза становится весьма чувствительной, и в результате появляются боль и раздражение. Этиология сухости глаз неизвестна, хотя существует множество теорий причины или причин этого состояния. Одна теория утверждает наличие гландулярного дефекта, где глазные железы, которые секретируют жидкость для ее пополнения при ее потере при мигании, при оттоке и испарении, становятся дефицитными и секретируют недостаточное количество жидкости. Другая возможная причина сухости глаз включает нервы, которые располагаются в конъюнктиве и роговице. Нервы также становятся десенсибилизированными, что приводит к меньшей частоте мигания и, следовательно, к высыханию, или они становятся сверхсенсибилизированным, что приводит к увеличению боли и раздражения, характеризующих симптоматику сухости глаз. Хроническое воспаление может быть другим причинным фактором или фактором, способствующим сухости глаз, независимо от происхождения воспалительного поражения. Инфекция в глазах может вызывать сухость глаз, а также воспаление, возникшее в результате инфекции, может вызывать блокирование слезных протоков. Аутоиммунные расстройства, где организм, ошибочно идентифицируя свои собственные ткани, как имеющие чужеродное происхождение, может подвергать ткани глаза иммунологической атаке, также могут представлять собой фактор, способствующий этиологии сухости глаз. В одном таком аутоиммунном расстройстве, синдроме Шегрена, сухость глаз (и сухость во рту) среди прочих отличительных симптомов вызвана иммунными клетками, атакующими железы внешней секреции, которые производят слезы и слюну. Синдромом Шегрена по оценкам только в Соединенных Штатах страдает не менее четырех миллионов человек, что делает его вторым наиболее распространенным аутоиммунным заболеванием. Другие возможные причины сухости глаз включают гормональный или витаминный дефицит или избыток. Фактически, сухость глаз может быть результатом множества различных условий, любое или многие из которых могут приводить к состоянию любого индивидуального пациента.
Независимо от причинного фактора(ов) освобождение от болезненных и ослабляющих симптомов требуется большинству пациентов с сухостью глаз. Для этой цели были опробованы многие способы, начиная от хирургических вмешательств до применения предписанных лекарственных средств и до безрецептурных продуктов в виде глазных капель. Хирургические операции включают постоянное или временное удаление нормальных путей отвода жидкости посредством закупоривания слезного канала. Для временного закупоривания используют средства, известные как тампоны местного действия. Безоперационные средства, разработанные для лечения сухости глаз, включают влажные камеры, используемые для увеличения влажности глаз. Терапевтические агенты, которые могут быть представлены в форме глазных капель или в другом виде, стремятся исправить основное физиологическое состояние и, таким образом, уменьшают тяжесть состояния сухости глаз или ликвидируют его полностью. Однако к настоящему времени лишь один терапевтический агент был одобрен FDA для лечения сухости глаз. Хотя каждый из этих терапевтических или мелиоративных способов может обеспечить благоприятное действие для отдельных пациентов, эти способы влекут за собой значительные риски, расходы и/или неудобства для пациента. Для страдающих сухостью глаз в свободном доступе имеется удобное, относительно недорогое и обладающее низким риском лечение для страдающих сухостью глаз в виде продуктов - искусственных слез. Эти местные агенты, как правило, применяются в виде глазных капель, когда это необходимо для дополнения или восстановления слезной пленки. Таким образом, искусственные слезы, в наиболее общем смысле, просто являются еще одним методом увлажнения глаз. Хотя в некоторых случаях они могут обеспечить облегчение симптомов, они редко изменяют какую-либо основную глазную патологию или патологию роговицы.
2
2
Одно из относительно последних направлений исследований происхождения или этиологии сухости глаз рассматривает потенциальную роль металлопротеиназ в роговице. Металлопротеиназы относятся к группе протеолитических ферментов, характеризующихся необходимостью их связывания с ионом металла, таким как Zn+ или Ca+, в их активном сайте с целью придания ферментам каталитической активности. Металлопротеиназы, сокращенно MMP, как известно, включены в процессы, которые включают ремоделирование ткани. Таким образом, физиологически MMP играют роль в метастазировании опухоли, эмбриональном развитии и в заживлении ран. Существует примерно 20 известных MMP, имеющих аминокислотную гомологию, составляющую примерно 40%, каждый из ферментов, по-видимому, структурно связан друг с другом. Исторически, индивидуальные MMP получали названия на основе того, что считают их основным субстратом (например, (i) коллагеназы, которые деградируют внутритканевые коллагены (типов I, II и III); (ii) коллагеназы типа IV и желатиназы, которые деградируют коллаген типа 4 базальной мембраны и желатины (денатурированные коллагены); (iii) стромелизины, которые деградируют широкий спектр субстратов, включающих протеогликаны, ламинин, желатины и фибронектин) или иногда на основе клеточного источника фермента (например, полиморфноядерная лейкоцитарная желатиназа). Наконец было признано, что большинство из этих ферментов расщепляют множество субстратов, включая неактивные полипептидные проформы (зимоген) членов других семейств, и что эти ферменты также могут деградировать нематриксные белки, такие как основной миелиновый белок и альфа-1-антитрипсин. Структурно, большинство MMP имеет каталитический домен, карбоксиконцевой гемопексинподобный домен (гемопексиновый домен) и продомен, который расщепляется во время активации фермента.
В статье, опубликованной H. Nagase et al в 1992, представлена численная номенклатура и словарь ММР, известных в настоящее время (например, MMP-1, MMP-2 и т.д.), и открытые позднее ММР следуют этой системе. MMP-9 (желатиназа-B, коллагеназа типа IV-B), в качестве физиологического агента ремоделирования ткани, является активным при деградации широкого спектра компонентов внеклеточного матрикса (ECM) и компонентов базальной мембраны. По-видимому, MMP-9 играет роль в опосредовании воспаления путем превращения цитокина воспаления - интерлейкина IL-lβ в его активную секретированную форму путем катализа посттрансляционной активации фактора некроза опухоли (TNFα), с помощью потенциирования IL-8, процессов хемокинов и путем деградации ингибиторов сериновых протеаз. Кроме того, MMP-9 также может играть роль в аутоиммунитете, поскольку она может стимулировать развитие аутоиммунных неоэпитопов. Было показано, что локальная активность ММР-9 повышается в слезной жидкости пациентов с синдромом Шегрена. Некоторые исследования продемонстрировали значительное увеличение активности желатиназ, включая MMP-9, в слезной пленке людей и других млекопитающих с язвенным кератитом по сравнению со слезной пленкой здоровой роговицы. Также исследовали роль желатиназ в патогенезе язвенного кератита. Исследование с использованием MMP-9-нокаутных мышей показало, что отсутствие MMP-9 придает некоторую степень устойчивости по отношению к разрушению эпителиального барьера роговицы при экспериментально индуцированной сухости глаз.
В своих попытках получения терапевтического агента, который функционирует с ингибированием активности различных MMP in vivo, многими различными исследовательскими организациями было синтезировано большое количество новых химических компонентов. Некоторые из этих рационально созданных MMP-ингибиторов прошли ряд преклинических испытаний и продемонстрировали потенциал в качестве лекарственных средств для ряда патологических состояний, в которые, как считается, вовлечены MMP. К сожалению, некоторые из этих соединений, например, маримастат (BB-2516), ингибитор широкого спектра MMP, и трокад (Ro 32-3555), селективный ингибитор MMP-1, не прошли, несмотря на ожидания, клинических испытаний. Одна причина, способствующая отсутствию у них успеха, заключается в существенных побочных эффектах, таких как скелетно-мышечная токсичность, конкретно, у широкого спектра ингибиторов. Отсутствие эффективности модификации заболевания является еще одним вопросом, как в случае трокада, где обнадеживающие результаты, полученные на модели артрита кролика, не дублировались в испытаниях, проводимых на людях. Фактически, маримастат от British Biotech был подвергнут, по меньшей мере, пяти неудачным испытаниям Фазы III, и Bayer и Pfizer прекратили испытания MMP-ингибиторов на Фазе III.
Недавно был открыт новый сайт связывания желатина в части гемопексиновой субъединицы MMP-9.
WIPO Публикация No. WO 95/2969 относится к композициям для слезозаместительной терапии, содержащим цитокины или факторы роста, конкретно, TGFβ8.
Патент США No. 6444791 (Quay) относится к способу лечения кератоконуса с использованием ингибиторов протеаз, включающих альфа2-макроглобулин и ингибитор альфа 1-протеазы.
Патент США No. 4923700 (Kaufman) относится к системе искусственных слез, включающей водную суспензию частиц типа муцина и вещества липидного типа. Частицы типа муцина образованы из коллагена, желатина и/или сыворотки.
Патент США No. 6455583 (Pflugfelder et al.) относится к местному применению тетрациклина для уменьшения воспаления, ассоциированного с замедлением очищения с помощью слез.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время неожиданно обнаружили, что относительно небольшое количество природных ингибиторов пептидных протеаз демонстрирует существенное ингибирование металлопротеиназ при включении в офтальмически совместимые носители, такие как используемые в композициях типа искусственных слез. Также неожиданно было обнаружено, что полученные в результате композиции могут функционировать с увеличением жизнеспособности и уменьшением потери влаги эпителиальных клеток роговицы. Настоящее изобретение относится к MMP-ингибирующим местным офтальмическим композициям, включающим протеазоингибирующий пептидный субстрат в офтальмически приемлемом носителе. Настоящее изобретение также относится к способам лечения сухости глаз, включающим применение к поверхности глаза композиции, содержащей протеазоингибирующий пептидный субстрат в офтальмически приемлемом носителе. Первая группа воплощений настоящего изобретения относится к местным офтальмическим композициям, включающим протеазоингибирующий пептидный субстрат и офтальмически приемлемый носитель. Предпочтительное воплощение в этой группе воплощений представляет собой протеазоингибирующий пептидный субстрат и галактоманнан в офтальмически приемлемом носителе. Следующее предпочтительное воплощение представляет собой местную офтальмическую композицию, включающую желатин и галактоманнан. Следующее предпочтительное воплощение представляет собой композицию альфа-2-макроглобулина и галактоманнана. Другие воплощения настоящего изобретения включают композиции, включающие галактоманнан и овомакроглобулин, галактоманнан и коллаген и галактоманнан и казеин. Предпочтительным галактоманнаном является HP-гуар.
Вторая группа воплощений настоящего изобретения относится к способу лечения сухости глаз, включающему применение к поверхности глаза эффективного количества MMP-9-ингибирующего пептидного субстрата. В предпочтительных воплощениях, представленных здесь, количеств пептидного субстрата достаточно для ингибирования MMP-9, по меньшей мере, на 50%.
Без особой связи с теорией, считается, что протеазоингибирующие пептидные субстраты, функционирующие с ингибированием активности протеаз, таких как MMP-9, уменьшают таким образом способность протеаз воздействовать на эндогенные субстраты, как правило, присутствующие в тканях глаза, подверженных расстройству сухости глаз. Таким образом, они могут функционировать с уменьшением непосредственно разрушающих эффектов MMP-9 или других протеаз ткани глаза. Некоторые или все ингибирующие эффекты протеазоингибирующих пептидных субстратов, оказываемые на протеазы, такие как MMP-9, могут быть косвенными, то есть проявляться в виде ингибирования аллостерического типа. Размер или молекулярная масса протеазоингибирующего пептидного субстрата могут влиять на эффективность этого ингибирования. Кроме того, протеазоингибирующие пептидные субстраты могут обеспечивать прямой или косвенный противовоспалительный эффект, оказываемый на сенсибилизированные ткани поверхности глаза, а также антитканевый эффект ремоделирования. Эти функции, как считается, опосредованы взаимодействием пептидных субстратов с ферментами MMP, конкретно с MMP-9. Кроме того, определенные воплощения настоящего изобретения могут продлевать эти терапевтические функции путем обеспечения длительного высвобождения протеазоингибирующих пептидов. Например, в предпочтительном воплощении настоящего изобретения протеазоингибирующий петидный субстрат объединяют с HP-гуаром и боратом с образованием геля. Этот гель функционирует с усилением стабильности слезной пленки и защищает поверхность глаза от потери влаги. Кроме того, гель может улавливать протеазоингибирующий пептидный субстрат, и таким образом субстраты сохраняются в слезной пленке, приводя в результате к длительному периоду активности. Протеазоингибирующие пептидные субстраты также могут функционировать как каркасная структура для растворимого муцина с образованием желатин-муцинового гелевого матрикса, усиливая, таким образом, стабильность слезной пленки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фигуре 1 показано дозозависимое ингибирование MMP-9 Желатином А в буфере Tricine.
На Фигуре 2 показано, что Желатин A в концентрации 0,1% масс./об. в комбинации со смягчающими полимерами показывает существенное ингибирование MMP-9.
На Фигуре 3 показано дозозависимое ингибирование MMP-9 Желатином А, включенным в Систейн (Systane).
На Фигуре 4 показано дозозависимое ингибирование MMP-9 Желатином А в препарате Tears Naturale II.
На Фигуре 5 показано дозозависимое ингибирование бактериальной коллагеназы Желатином А.
На Фигуре 6 показано дозозависимое ингибирование бактериальной коллагеназы Желатином А в Систейне.
На Фигуре 7 показано дозозависимое ингибирование бактериальной коллагеназы Желатином А в препарате Tears Naturale II.
На Фигуре 8 показано, что Желатин А в комбинации со смягчающими полимерами показывает различные степени ингибирования бактериальной коллагеназы.
На Фигуре 9 показана увеличенная защита от потери влаги и увеличенная жизнеспособность клеток, обработанных продуктами в виде искусственных слез, включающими Желатин А.
На Фигуре 11 показано дозозависимое ингибирование MMP-9 с помощью рекомбинантного человеческого желатина 8,5 кДа.
На Фигуре 12 показано дозозависимое ингибирование MMP-9 с помощью рекомбинантного человеческого коллагена.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
При использовании в настоящем описании, если не определено иначе, следующие термины следует понимать в следующих значениях:
Термин "протеаза" охватывает ферменты, которые катализируют расщепление пептидных связей. Характерные протеазы включают коллагеназы и матриксные металлопротеиназы. Термин "протеазоингибирующий пептидный субстрат" охватывает вещества, которые имеют прежде всего пептидную природу, то есть состоят из одной или более аминокислотных цепей и обладают свойством субстрата для протеазных ферментов. Характерные примеры протеазоингибирующих пептидных субстратов включают желатин, альфа-2-макроглобулин, овомакроглобулин, казеин и коллаген.
Термин "MMP" обозначает матриксную металлопротеиназу (фермент).
Термин "MMP-9" обозначает фермент, известный как матриксная металлопротеиназа-9.
Термин "галактоманнан" обозначает полисахариды, полученные из натуральных смол или из аналогичных натуральных или синтетических смол, содержащих компоненты маннозы или галактозы, или обе группы в качестве основных структурных компонентов.
Термин "CMC" обозначает карбоксиметилцеллюлозу и ее соли.
Термин "HPMC" обозначает гидроксипропилметилцеллюлозу.
Термин "HP-гуар" обозначает гидроксипропил-гуар. Гидроксипропил-гуар с низким молярным замещением (например, менее чем 0,6) является предпочтительным.
Термин "поверхность глаз" обозначает доступные извне ткани глаз, характерные, но не ограничивающие примеры которых включают роговицу, конъюнктиву, свод и склеру.
Термин "ингибирующее количество" обозначает нетоксичное, но достаточное количество ингибирующего вещества для обеспечения целевой активности.
Термин "офтальмически приемлемый носитель" обозначает композицию, обладающую физическими свойствами (например, pH и/или осмоляльность), которые физиологически совместимы с офтальмическими тканями.
Неожиданно, было обнаружено, что относительно небольшое количество природных ингибиторов пептидных протеаз демонстрирует существенное ингибирование металлопротеиназ при включении в композиции типа искусственных слез. Еще более неожиданным оказалось, что количество протеазоингибирующего пептидного субстрата может быть достаточно низким, поскольку было обнаружено, что настолько низкие концентрации протеазоингибирующего пептидного субстрата, как 0,1% масс./об., одним из воплощений которого является желатин, могут обеспечивать ингибирование MMP-9 более чем на 50%.
Типичные протеазоингибирующие пептидные субстраты включают желатин, альфа-2-макроглобулин, овомакроглобулин, коллаген и казеин, а также следующие, описанные ниже. Однако следует понимать, что другие протеазоингибирующие пептидные субстраты могут использоваться и, как обнаружено, находятся в рамках настоящего изобретения.
Желатин представляет собой белок, получаемый с помощью частичного гидролиза коллагена, экстрагированного из соединительной ткани животного. Коммерчески доступны два типа желатина: тип А получают из обработанного кислотой предшественника, в то время как тип В получают из обработанного щелочью предшественника. Оба типа желатина являются субстратами различных ММР и функционируют в качестве конкурирующих ингибиторов MMP.
Альфа-2-макроглобулин, крупный белок, получаемый печенью и обнаруженный в крови, способен инактивировать ряд протеиназ, включающих металлопротеиназы. Механизм этой инактивации, как сообщается, заключается в том, что есть участок из 35 аминокислот, которые функционируют в качестве 'затравки' для протеиназы: когда протеиназа связывается и расщепляет этот участок, то она становится связанной с альфа-2-макроглобулином. Полученный в результате комплекс затем выводится из крови с помощью макрофагов.
Казеин представляет собой фосфопротеин, обнаруженный в сыре и молоке. Казеин содержит относительно высокое количество остатков пролина и в результате имеет слабую вторичную или третичную структуру. Будучи относительно гидрофобным, он легко диспергируется в разведенной щелочи и в растворах солей.
Овомакроглобулин, также обозначаемый как овостатин, представляет собой гликопротеин, состоящий из четырех субъединиц, соединенных в пары с помощью дисульфидных связей. Он продемонстрировал ингибирующую активность широкого спектра действия против различных типов протеаз, включающих сериновые протеазы, цистеиновые протеазы, тиоловые протеазы и металлопротеиназы.
Коллаген представляет собой основной белок у животных, обеспечивая почти 25% суммарного содержания белка, и является основным белком в соединительной ткани. Он представляет собой длинный волокнистый белок и образует жесткие слои или волокна, которые вместе образуют внеклеточный матрикс, который обеспечивает структуру тканей и клеток. Коллаген также может быть обнаружен внутри определенных клеток. Коллаген, наиболее часто встречающийся в форме тройной спирали, известен как тропоколлаген. С помощью частичного гидролиза тропоколлагена получается желатин.
Источник протеазоингибирующих пептидных субстратов, применяемых в настоящем изобретении, как правило, имеет животное происхождение. Например, желатин, получаемый из бычьей или свиной кожи или кости, является превалирующей формой, используемой в настоящее время в фармацевтических продуктах. Осуществляется экстенсивная обработка с целью получения насколько возможно гомогенного и чистого продукта с учетом предполагаемого использования (пероральное, парентеральное средство). Коллаген и/или желатин, который свободен от трансмиссивной спонгиозной энцефалопатии (TSR) и Бычьей спонгиозной энцефалопатии (BSE), коммерчески доступен от ряда поставщиков, включающих, например, Gelita (Sergeant Bluff, Iowa) и Rousselot (Компания Sobel, Dubuque, Iowa).
Использование материалов, получаемых с помощью синтетической и/или рекомбинантной технологии, представляет собой другой вариант. Например, Фиброген (San Francisco, California) производит полностью синтетические желатины и коллагены с использованием рекомбинантной дрожжевой системы. Эти синтетические материалы могут обладать некоторыми преимуществами с точки зрения постоянства (однообразия от партии к партии, определяемого молекулярной массой и физико-химическими свойствами), соответствия требованиям заказчика (определенные заранее характеристики, дизайн молекул) и с точки зрения биосовместимости и безопасности (уменьшенный риск индуцирования иммунного ответа, ликвидации загрязнений).
Композиции и способы по настоящему изобретению включают протеазоингибирующие пептидные субстраты в количестве, достаточном для ингибирования металлопротеиназ. Предпочтительной металлопротеиназой является MMP-9. Количество протеазоингибирующего пептидного субстрата может варьироваться в зависимости от конкретного субстрата, но, как правило, количество составляет примерно от 0,010% до 10% масса/объем (масс./об.), более предпочтительно, примерно от 0,05% до 1% (масс./об.), еще более предпочтительно, примерно от 0,05% до 0,25% (масс./об.). Процентная степень ингибирования MMP составляет, предпочтительно, более чем примерно 50%, более предпочтительно более чем примерно 60%, еще более предпочтительно более чем примерно 70%.
В одном воплощении настоящего изобретения протеазоингибирующий пептидный субстрат объединяют с существующей фармацевтической композицией для сухости глаз, такой как Глазные капли СИСТЕЙН Любрикант (SYSTANE Lubricant Eye Drops) (Alcon Laboratories, Inc.), которая содержит смягчающую полимерную систему. Полимеризационная защита СИСТЕЙНА достигается за счет взаимодействия смягчающих веществ (полиэтиленгликоля 400 и пропиленгликоля), HP-Гуара и натуральных слез пациента. При объединении HP-Гуара с натуральными слезами происходит химическая реакция. HP-Гуар связывается с гидрофобной (отталкивающей воду) поверхностью с образованием сети гелеподобной консистенции. HP-Гуар также помогает поддерживать смягчающую систему на поверхности глаза дольше.
Одно воплощение настоящего изобретения представляет собой композицию, объединяющую галактоманнан, борат и желатин. Типы галактоманнанов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, как правило, получают из гуаровой камеди, камеди бобов рожкового дерева и камеди цезальпинии колючей. Дополнительно, галактоманнаны также могут быть получены с помощью классических синтетических способов или с помощью химической модификации природных галактоманнанов.
При использовании в настоящем описании термин "галактоманнан" обозначает полисахариды, полученные из вышеописанных натуральных смол или из аналогичных натуральных или синтетических смол, содержащих компоненты маннозы или галактозы, или обе группы в качестве основных структурных компонентов. Предпочтительные галактоманнаны по настоящему изобретению состоят из линейных цепей (1-4)-.бета.-D-маннопиранозильных единиц с.альфа.-D-галактопиранозильными единицами, присоединенными с помощью связей (1-6). У предпочтительных галактоманнанов соотношение D-галактозы к D-маннозе варьируется, но, как правило, составляет примерно от 1:2 до 1:4. Галактоманнаны, содержащие D-галактозу и D-маннозу с их соотношением, составляющим примерно 1:2, являются наиболее предпочтительными. Дополнительно, в определение "галактоманнан" также могут быть включены другие химически модифицированные варианты полисахаридов. Например, гидроксиэтил, гидроксипропил и карбоксиметилгидроксипропил-замены могут быть получены для галактоманнанов по настоящему изобретению. Особенно предпочтительны неионные замены в галактоманнанах, такие как содержащие алкокси- и алкильные группы (C1-C6), если целевым является получение мягкого геля (например, гидроксипропильные замены). Замены в положениях гидроксила, отличных от cis-положения, являются наиболее предпочтительными. Примером композиции, образованной с помощью неионной замены галактоманнана, является гидроксипропил-гуар с молярной заменой, составляющей примерно 0,4. Анионные замены также могут быть произведены с галактоманнанами. Анионная замена является особенно предпочтительной, когда целевым является получение сильнореактивных гелей.
Боратные соединения могут использоваться в определенных воплощениях настоящего изобретения. Боратные соединения, которые могут использоваться в композициях настоящего изобретения, включают борную кислоту и другие фармацевтически приемлемые соли, такие как борат натрия (бура) и борат калия. При использовании в настоящем описании термин "борат" обозначает все фармацевтически приемлемые формы боратов. Бораты представляют собой распространенные вспомогательные вещества в офтальмических фармацевтических композициях благодаря хорошей буферной способности при физиологическом рН, а также хорошо известной безопасности и совместимости с широким спектром лекарственных средств и консервантов. Бораты также обладают собственными бактериостатическими и фунгистатическими свойствами и, таким образом, помогают в сохранности композиций.
Предпочтительное воплощение настоящего изобретения представляет собой композицию, включающую желатин в количестве, составляющем 0,01%-5% (масс./об.), один или более галактоманнанов в количестве, составляющем примерно от 0,1 до 5% (масс./об.), и борат в количестве, составляющем примерно от 0,05 до 5% (масс./об.). Предпочтительно, композиции будут содержать 0,01%-1% желатина (масс./об.), 0,2-2% (масс./об.) галактоманнана и 0,1-2% (масс./об.) соединения бората. Наиболее предпочтительно, композиции будут содержать 0,05%-0,5% желатина (масс./об.), 0,3-0,8% (масс./об.) галактоманнана и 0,25-1% (масс./об.) соединения бората. Конкретные количества будут варьироваться в зависимости от конкретных целевых гелеобразующих свойств. Как правило, концентрацией желатина, бората или галактоманнана можно манипулировать с целью приближения к подходящей вязкости композиции при активации геля (т.е. после введения). Манипулирование концентрацией желатина, бората или галактоманнана может обеспечивать более сильное или более слабое гелеобразование при данном рН. Если целевой является композиция с сильным гелеобразованием, то концентрация желатина, бората или галактоманнана может быть увеличена. Если целевой является композиция с более слабым гелеобразованием, такая как композиция с частичным гелеобразованием, то концентрация желатина, бората или галактоманнана может быть уменьшена. На гелеобразующие свойства композиций по настоящему изобретению могут влиять другие факторы, такие как природа и концентрация дополнительных ингредиентов в композиции, таких как соли, консерванты, хелатирующие агенты и так далее. Как правило, предпочтительные негелевые композиции по настоящему изобретению, т.е. композиции, не активирующие гель в глазах, будут иметь вязкость, составляющую примерно от 5 до 1000 сП. Как правило, предпочтительные гелевые композиции по настоящему изобретению, т.е. композиции, активирующие гель в глазах, будут иметь вязкость, составляющую примерно от 50 до 50000 сП.
TM
Один из самых ранних и наиболее успешных растворов искусственных слез описан в Патенте США No. 4039662 (Hecht, et al.). Этот раствор присутствовал на рынке в течение многих лет в виде Глазных Капель Любриканта TEARS NATURALE (Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, Texas). Раствор, описанный и заявленный Hecht, et al. в патенте '662, и соответствующий коммерческий продукт основаны на использовании уникальной комбинации гидроксипропилметилцеллюлозы, Декстрана 70 и хлорида бензалкония. В более поздней версии этого продукта, который в настоящее время присутствует на рынке под названием Глазных Капель Любрикант TEARS NATURALE(TM) II Polyquad (Alcon Laboratories, Inc.), хлорид бензалкония заменили на поликватерниум-1, который представляет собой полимерный противомикробный агент/консервант.
Примером органического буфера, который может использоваться в настоящем изобретении, является Tricine, или N-[трис(гидроксиметил)метил]глицин. Органический буфер содержит одновременно основную и кислотную группы, и в результате является цвиттерионным; в условиях физиологического рН эти буферы несут одновременно положительный и отрицательный заряды.
2
4
2
4
2
4
В случае контактных линз и офтальмических растворов добавляют различные агенты для усиления совместимости с глазами. Чтобы избежать жжения или раздражения, важно, чтобы раствор обладал тоничностью и pH в физиологическом диапазоне, например, 200-350 мОсмол для тоничности и 6,5-8,5 для pH. С этой целью часто добавляют различные буферные и осмотические агенты. Простейшим осмотическим агентом является хлорид натрия, поскольку это основное растворенное вещество в слезах человека. Кроме того, для частичной или полной замены хлорида натрия также могут быть добавлены пропиленгликоль, лактулоза, трегалоза, сорбит, маннит или другие осмотические агенты. Также могут использоваться различные буферные системы для обеспечения физиологического рН в интервале между 6,5 и 8,5, такие системы, как цитрат, фосфат (подходящие смеси NaHPO, NaHPO и КНРО), борат (борная кислота, борат натрия, тетраборат калия, метаборат калия и смеси), бикарбонат, и трометамин, а также другие соответствующие азотсодержащие буферы (например, ACES, BES, BICINE, BIS-Tris, BIS-Tris Пропан, HEPES, HEPPS, имидазол, MES, MOPS, PIPES, TAPS, TES, Tricine).
Композиции протеазоингибирующего пептидного субстрата по изобретению могут быть объединены с одним или более из дополнительных терапевтических агентов из других терапевтических классов, которые, как считается, обладают полезными эффектами при лечении сухости глаз, с такими агентами, как, например, антибиотики, иммунодепрессанты и противовоспалительные агенты.
Противовоспалительные агенты, которые могут быть включены в композиции по изобретению, включают стероидные и нестероидные лекарственные средства (NSAID). Типичные NSAID включают, но не ограничиваются ими, кеторолак трометамин (Acular), индометацин, флурбипрофен натрия, непафенак, бромфенак, супрофен и диклофенак (Voltaren). Типичные кортикостероиды включают, но не ограничиваются ими, римексолин, гидрокортизон, флудрокортизон, фторметалон, лотепреднол, триамцинолон, дексаметазон, преднизолон, кортизон, алдостерон, мидризон и бетаметазон. Типичные половые стероиды включают стероиды на основе андрогенов, эстрогенов и/или прогестинов.
Типичные антибиотики включают, но не ограничиваются ими, тетрациклин, доксициклин, и химически модифицированные тетрациклины, бета-лактамные антибиотики, такие как цефокситин, н-формамидоилтиенамицин и другие производные тиенамицина, хлорамфеникол, неомицин, карбенициллин, колистин, пенициллин G, полимиксин В, ванкомицин, цефазолин, цефалоридин, хиброрифамицин грамицидин, бацитрацин, сульфаниламиды эноксацина, офлоксацин, циноксацин, спарфлоксацин, тиамфеникол, налидиксовая кислота, тосуфлоксацина тозилат, норфлоксацин, тригидрата пипемидовой кислоты, пиромидовая кислота, флероксацин, биомицин, ципрофлоксацин, эритромицин, гентамицин, норфлоксацин, сульфацетамид, сулфиксоксазол, тобрамицин, моксифлоксацин и левофлоксацин.
Типичные иммунодепрессанты включают, например, циклоспорины, такие как циклоспорин А, и аскомицины, такие как FK-506, рапамицин и такролимус.
К композициям по настоящему изобретению могут быть добавлены другие ингредиенты. Такие ингридиенты, как правило, включают агенты, регулирующие тоничность, хелатирующие агенты, активные фармацевтические агенты, солюбилизатор, консерванты, агенты, регулирующие рН, и носители. Другие полимерные или мономерные агенты, такие как полиэтиленгликоль и глицерин, также могут быть добавлены для специальной обработки. Агенты тоничности, используемые в композициях по настоящему изобретению, могут включать соли, такие как хлорид натрия, хлорид калия и хлорид кальция; неионные агенты тоничности могут включать пропиленгликоль и глицерин; хелатирующие агенты могут включать пропиленгликоль и глицерин; хелатирующие агенты могут включать EDTA и ее соли; солюбилизирующие агенты могут включать Cremophor EL и tween 80; другие носители могут включать Amberlite IRP-60; pH-регулирующие агенты могут включать хлорводородную кислоту, Tris, триэтаноламн и гидроксид натрия; а также подходящие консерванты могут включать хлорид бензалкония, поликватерниум-1 и полиэкзамэтиленбигуанид. Вышеперечисленные примеры приведены для иллюстративных целей и не претендуют на то, чтобы быть всеобъемлющими. Примеры других агентов, используемых для вышеуказанных целей, хорошо известны в офтальмических фармацевтических композициях и предусмотрены настоящим изобретением.
Следующие примеры дополнительно иллюстрируют различные воплощения изобретения. Примеры представлены для помощи в понимании изобретения и не должны рассматриваться, как его ограничения.
Пример 1:
2
2
4
В этом и в следующих примерах, пока не определено иначе, активность MMP оценивали с использованием флуорогенных субстратов, чувствительных к MMP-1, -2 и -9, включая DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH и DNP-Pro-Cha-Gly-Cys (Me)-His-Ala-Lys (N-Me-Abz)-NH. Эти анализы флуорогенных субстратов хорошо известны из уровня техники; например, смотри Bickett et al. Analytical Biochemistry 212, 58-64 (1993) и Netzel-Arnett et al, Analytical Biochemistry 195, 86-92 (1991), обе публикации включены в настоящее описание с помощью ссылки. Перед проведением анализа про-MMP-9 активировали с помощью ацетата п-аминофенилртути, и требовалось отсутствие активации бактериальной коллагеназы. Для анализа готовили основной раствор субстрата с концентрацией 0,1 mM в ДМСО, и все анализы активности фермента вместе или без ингибиторов осуществляли в 50 mM буфере tricine, pH 7,5, содержащем 0,2M NaCl, 10 mM CaCl, 50 mM ZnSO, и 0,05% Brij-35, при комнатной температуре. (Brij-35 представляет собой коммерчески доступное поверхностно-активное вещество, эфир полиоксиэтиленлаурила). Суммарный объем образца составляет 200 мкл, и анализ проводят в 96-луночном микропланшете. Изменения флуоресценции записывали каждую минуту в течение 10 минут с помощью прибора, считывающего флуоресценцию с микропланшетов (Model FL x800I, Bio-Tek Instrument), с установками соответствующей длины волны возбуждения/эмиссии (т.e. λвозб.=280 нм; λэм.=360 нм и λвозб.=280 нм; λэм.=360 нм) для конкретного используемого субстрата. Активность фермента выражали в виде изменения флуоресценции в минуту, что соответствовало наклону прямой линии относительно флуоресценции против времени, записанного для ферментативной реакции в течение 10 минут. Процент ингибирования рассчитывали путем вычитания доли образца с ингибитором из доли образца без ингибитора и затем деления на долю образца без ингибитора и умножения на 100%.
Это исследование было предпринято для изучения потенциала Желатина А в ингибировании активности MMP-9. В этом конкретном исследовании концентрация MMP-9 составила 360 мкЕдиниц/анализ в буфере Tricine, в качестве желатина использовали Желатин А (Sigma каталог #1890-50G, Lot #014K0077, кислый экстракт из свиной кожи), и в качестве субстрата использовали MMP-2/MMP-9 флуорогенный субстрат I (Calbiochem Каталог #44215, lot #B47246; пептидная структура = DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH.) 20 мкМ/анализ. Желатин А в буфере Tricine показал дозозависимое ингибирование активности MMP-9. Начиная от 0,01% до 0,2% (масс./об.) наблюдали пропорциональное увеличение ингибирования. После 0,2%, ингибирование начало выравниваться. Результаты исследования описаны на Фигуре 1.
Пример 2:
2
м.
Это исследование было предпринято для изучения потенциала Желатина А в ингибировании активности MMP-9 при использовании с различными смягчающими полимерами. Для этой цели был выбран 0,1% масс./об. Желатин A, который обеспечил приблизительно 59% ингибирования в Примере 1. MMP-9 = Calbiochem Кат# 444231;Lot# B56458; человеческие нейтрофилы. Используемая активность составила 200 мкЕдиниц/анализ. Желатин = Желатин A. Sigma Кат# 1890-50G, Lot# 014K0077 (кислый экстракт из свиной кожи). Аналитический буфер = 50 mM Tricine, pH 7,5, содержащий 0,2M NaCl, 10 mM CaCl. Субстрат = MMP-l/MMP-9 флуорогенный субстрат. Calbiochem кат# 44221, lot# B54710. Молекулярная масса, 1077,2; 1 мкМ в анализе. Пептидная структура = DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH2. Возб. 365 нм; Эм, 450 нм.
Результаты этого исследования показывают, что Желатин А в концентрации 0,1% масс./об., в комбинации с 0,18% масс./об. HP-гуаром, 0,3% масс./об. HPMC и 0,5% масс./об. CMC, способен обеспечивать 74,8%, 71,8% и 79,1% ингибирования MMP-9, соответственно, как показано на Фигуре 2.
Пример 3:
Следующие серии исследований изучали способность Желатина А ингибировать активность ММР-9 при включении в репрезентативные растворы искусственных слез. Для этой цели выбрали растворы искусственных слез, известные как Систейн и Tears Naturale II. Для этой серии исследований различные концентрации желатина А в интервале от 0,01% до 0,20% (масс./об.) включали одновременно в имеющиеся на рынке растворы Систейн и Tears Naturale II. Анализ проводили с использованием того же фермента и субстрата и следуя той же процедуре, как описано в Примере 2. Результаты этого исследования демонстрируют, что Желатин-А показал дозозависимое ингибирование активности MMP-9 при включении одновременно в растворы Систейн и Tears Naturale II, способствуя более чем 50% ингибированию от 0,01% масс./об. и выше в Систейне, и от 0,05% масс./об. и выше в Tears Naturale II. Результаты этих исследований описаны графически на Фигурах 3 и 4.
Пример 4:
2
4
Это исследование было предпринято для изучения ингибирующей реактивности Желатина А по отношению к бактериальной коллагеназе. Бактериальные коллагеназы представляют собой экзотоксины, которые способствуют разрушению внеклеточных структур в процессе бактериального патогенеза. Для исследования готовили различные концентрации желатина А в интервале от 0,05% до 0,8% (масс./об.) в 50mM буфера tricine pH 7,5, содержащего 0,2 M NaCl, 10 mM CaCl, ZnSO, и Brij-35. Активность бактериальной коллагеназы оценивали с помощью записи изменения флуоресценции в течение 10 мин на спектрофлюориметре при 25°С. Активность выражали в виде изменения флуоресценции в минуту. Концентрации бактериальной коллагеназы и субстрата I составили 20 Единиц/анализ и 20 мкМ/анализ, соответственно. В качестве коллагеназы использовали Клостридопептидазу (Sigma Каталог #C-7657; lot #107H8632). В качестве желатина использовали Желатин А (Sigma Кат #1890-50G, Lot #014K0077. Кислый экстракт из свиной кожи). В качестве субстрата использовали MMP-2/MMP-9 флуорогенный субстрат I (Calbiochem кат #44215, lot #B47246; Пептидная структура = DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH). Результаты показывают, что требуется более чем 0,4% масс./об. Желатина A для достижения более 50% ингибирования бактериального фермента, тогда как желатин А в интервале 0,05%-0,1% (масс./об.) легко может обеспечивать более чем 50% ингибирования MMP-9. Таким образом, ингибирование Желатином А бактериальной коллагеназы оказывается не настолько эффективным, как ингибирование ММР-9. Результаты исследования описаны графически на Фигуре 5.
Пример 5:
Это исследование тестировало способность Желатина А ингибировать бактериальную коллагеназу при включении в продукты искусственных слез. Для этой серии исследований различные концентрации желатина А в интервале от 0,05% до 0,25% (масс./об.) включали одновременно в имеющиеся на рынке растворы Систейн и Tears Naturale II. Анализ проводили с помощью той же процедуры и того же субстрата, как описано в Примере 4. Результаты показывают, что Желатин А при включении в продукты искусственных слез Систейн и Tears Naturale II, также может обеспечивать дозозависимое ингибирование бактериальной коллагеназы. Однако он менее эффективен и требуется более чем 0,25% масс./об. желатина для достижения 50% ингибирования в обоих продуктах искусственных слез, как показано графически на Фигурах 6 и 7.
Пример 6:
Это исследование было предпринято для изучения потенциала Желатина А в ингибировании активности бактериальной коллагеназы при использовании с различными смягчающими полимерами. Для этой цели Желатин А 0,1% масс./об. объединяли с HP-Гуаром, CMC и HPMC. Исследование проводили с помощью той же процедуры и того же субстрата, как описано в Примере 4. Результаты показывают, что вместе с 0,18% HP-гуаром достигают 51% ингибирования, в то время как вместе с 0,3% HPMC и 0,5% CMC достигают только 24% и 21% ингибирования, соответственно. Эти результаты показаны графически на Фигуре 8.
Пример 7:
Эти исследования изучали способность Желатина А обеспечивать защиту от потери влаги и усиливать жизнеспособность человеческих эпителиальных клеток роговицы. В этих исследованиях анализировали человеческие эпителиальные клетки CEPI 17 с использованием метода Alamar Blue, описанного здесь. Клетки роговицы человеческой эпителиальной клеточной линии (CEPI 17, Alcon Laboratories Inc.) растили до конфлюэнтного состояния в 96-луночном микропланшете. Среду удаляли из тестируемых лунок и добавляли 100 мкл каждого тестируемого раствора. Контрольные лунки со средой оставляли отдельно. Планшет помещали обратно в инкубатор на 60 минут. После инкубации все лунки аспирировали и промывали один раз с помощью 200 мкл на лунку буфера HyQ (Модифицированный Dulbecco фосфатный буферный раствор, Hyclone кат# SH30028.02). Делали разведение 1/10 Alamar Blue (Biosource, DAL 1100) в HyQ и добавляли 100 мкл в каждую лунку для инкубации при 37°C. Через 4 часа инкубации планшет считывали с помощью прибора для считывания флуоресценции с микропланшетов (Model FLx800, Bio-Tek Instrument) с установкой возбуждения при 560 нм и эмиссии при 590 нм. Расчет % жизнеспособности клеток проводили путем деления средней флуоресценции образца на среднюю флуоресценцию контроля и умножали на 100%.
Для оценки защиты от потери влаги используется похожая процедура с предварительной инкубацией в течение 15 минут и с периодом потери влаги в течение 30 минут. После предварительной инкубации аспирировали все тестируемые лунки за исключением контролей. Контроли накрывали парафильмом. Планшет помещали в вытяжку с нисходящим потоком воздуха на 30 минут для того, чтобы подвергнуть клетки потере влаги. После потери влаги все лунки промывали один раз с помощью 200 мкл HyQ. Клетки анализировали на жизнеспособность с помощью анализа с использованием Alamar Blue, как описано в процедуре анализа на клеточную жизнеспособность. Расчет защиты от потери влаги проводили путем деления средней флуоресценции образца на среднюю флуоресценцию контроля и умножали на 100%.
Результаты этого исследования демонстрируют, что включение Желатина А в различные продукты искусственных слез, включающие Систейн, Tears Naturale II и GenTeal Mild, оказывается обеспечивает лучшую защиту клеток от потери влаги и усиливает жизнеспособность клеток. Результаты этого исследования показаны графически на Фигуре 9.
Пример 8:
Это исследование было предпринято для определения способности альфа-2-макроглобулина ингибировать активность MMP-9. Активность MMP-9 оценивали путем записи изменения флуоресценции в течение 10 минут на спектрофлюориметре при 25°C. Активность выражали в виде изменения флуоресценции в минуту. Использовали 360 мкЕдиниц/анализ MMP-9 (Calbiochem кат #444231, Lot #B56458; человеческие нейтрофилы). Альфа-2-макроглобулин (Sigma Кат #M-6159, Lot #118H7606; из человеческой плаценты). В качестве субстрата использовали MMP-2/MMP-9 флуорогенный субстрат I 10 мкМ/анализ (Calbiochem кат #44215, lot #B47246; Пептидная структура = DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH). Результаты показывают, что альфа-2-макроглобулин ингибирует активность MMP-9 дозозависимым образом. Результаты описаны графически на Фигуре 10.
Пример 9:
2
2
Это исследование было предпринято для определения эффекта ингибирования рекомбинантным желатином известного размера активности MMP-9. Активность MMP-9 оценивали путем записи изменения флуоресценции в течение 10 минут с помощью спектрофлюориметра при 25°C. Активность выражали в виде изменения флуоресценции в минуту. Концентрация MMP-9 (Calbiochem каталог #444231, lot #B56458, человеческие нейтрофилы) составила 200 мкЕдиниц/анализ в буфере Tricine (50 mM Tricine, pH 7,5, содержащий 0,2M NaCl, 10 mM CaCl). В качестве желатина использовали рекомбинантный человеческий желатин 8,5 кДа (FibroGen, Lot #04AE001R-01). В качестве субстрата использовали MMP-l/MMP-9 флуорогенный субстрат (Calbiochem Каталог #44221, lot #B54710; пептидная структура = DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH; Возб. 365 нм; Эм. 450 нм). Использовали 1 мкМ/анализ. В этом анализе для достижения более чем 50% ингибирования требовался рекомбинантный человеческий желатин 8,5 кДа с концентрацией в интервале между 0,15%-0,25% (масс./об.). Результаты исследования описаны графически на Фигуре 11.
Пример 10:
2
2
Это исследование было предпринято для определения эффекта ингибирования рекомбинантным человеческим Коллагеном Типа I активности MMP-9. Активность MMP-9 оценивали путем записи изменения флуоресценции в течение 10 минут с помощью спектрофлюориметра при 25°C. Активность выражали в виде изменения флуоресценции в минуту. Концентрация MMP-9 (Calbiochem каталог #444231, lot #B56458, человеческие нейтрофилы) составила 200 мкЕдиниц/анализ в буфере Tricine (50 mM Tricine, pH 7,5, содержащий 0,2M NaCl, 10 mM CaCl). В качестве коллагена использовали рекомбинантный человеческий коллаген типа I (FibroGen, Lot #04AE001R-01). В качестве субстрата использовали MMP-1/MMP-9 флуорогенный субстрат (Calbiochem Каталог #44221, lot #B54710; пептидная структура = DNP-Pro-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH; Возб. 365 нм; Эм. 450 нм). Использовали 1 мкМ/анализ. В этом анализе для достижения более чем 50% ингибирования требовался рекомбинантный человеческий коллаген типа I с концентрацией в интервале между 0,03%-0,04% (масс./об.). Результаты исследования описаны графически на Фигуре 12.
Пример 11:
Далее представлен пример двух растворов искусственных слез по настоящему изобретению.
Соединение
Количество % (масс./об.)
Систейн
Tears Naturale II
Желатин
0,1
0,1
Борная кислота
1
отсутствует
Борат натрия
отсутствует
0,35
HPMC
отсутствует
0,3
Гидроксипропил-Гуар
0,18
отсутствует
Пропиленгликоль
0,3
отсутствует
ПЭГ-400
0,4
отсутствует
Декстран 70
отсутствует
0,1
Хлорид натрия
0,1
0,6
Хлорид калия
0,12
0,12
Хлорид кальция (безводный)
0,0053
отсутствует
Хлорид магния (гексагидрат)
0,0064
отсутствует
Поликватерниум-1
0,001
0,001
Гидроксид натрия/Хлороводородная кислота
до pH 7,0
до pH 7,4
Очищенная вода
qs до 100%
qs до 100%