СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА К ГИПОКИНЕЗИИ ПРИ ВВЕДЕНИИ ДЕСМОПРЕССИНА
METHOD OF DETERMINING ORGANISM ADAPTATION TO HYPOKINESIA IN CASE OF DESMOPRESSIN INTRODUCTION

Изобретение относится к медицине, более точно к физиологии, биохимии, и может быть использовано для экспресс-диагностики адаптации организма к гипокинезии при введении десмопрессина как в обычных условиях, так и при выполнении космических полетов.
Проблема диагностики наступления адаптации к гипокинезии является актуальной как в экспериментальной, так и в практической медицине.
И в реальном космическом полете, и при моделировании его физиологических эффектов организм человека сталкивается с непривычными для него условиями. Для профилактики неблагоприятного воздействия на организм гипокинезии используют десмопрессин. Установлено, что при приеме десмопрессина наблюдается снижение диуреза, развитие положительного водного баланса, способствующие уменьшению степени гипогидратации организма по сравнению с контрольным экспериментом, вследствие чего организм лучше адаптируется к гипокинезии {Ларина И.М., Носков В.Б., Ничипорук И.А. и др. Влияние десмопрессина на водно-солевой гомеостаз и ортостатическую толерантность в условиях антиортостаза // Авиакосмическая и экологическая медицина 2008. Т.42. №6. С.3-20).
Использование этого профилактического средства требует быстрого и надежного способа диагностики наступления адаптогенного эффекта.
Известен способ определения адаптации к гипокинезии по биохимическим показателям крови и адаптацией с использованием коммерческих наборов реагентов на биохимическом анализаторе (см. Особенности метаболических реакций у мужчин и женщин в динамике длительной антиортостатической гипокинезии // Материалы XIII конференции по космической биологии и авиакосмической медицине. М., 13-16 июня 2006. С.185-186). В этом способе определяли концентрации мочевины, общего холестерина, триглицеридов, первичных продуктов перикисного окисления липидов, токоферола, а также активность аланинаминотрансферазы и креатинфосфатазы.
3
4
Известен способ, описанный в статье: Васильева Г.Ю., Ничипорук И.А. Особенности нейроэндокринной системы и психофизиологического статуса в условиях антиортостатической гипокинезии (Тез. докл. Международной конференции «Медико-биологические аспекты действия физических факторов», Минск, Беларусь, 2006, с.250). В этом известном способе проводили корреляцию между гормональным статусом организма и адаптацией к гипокинезии путем определения концентрации адренокортикотропного гормона (АКТГ), соматотропного гормона (СТГ), пролактина, альдостерона, ангиотензина-1 (А-1), нейронспецифической енолазы (НСЕ), антидиуретического гормона (АДГ); фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), кортизола, тестостерона, тиреотропного гормона (ТТГ), трийодтиронина (Т), тироксина (Т), инсулина и активность ренина плазмы (АРП).
Недостатком этих двух вышеописанных способов является их трудоемкость, необходимость использования большого количества биоматериала, а также невозможность определения исследуемых показателей, находящихся в крови в низкой концентрации.
Наиболее близким к заявленному способу является способ с применением десмопрессина, который описан в статье Лариной И.М. с соавт.«Влияние десмопрессина на водно-солевой гомеостаз и ортостатическую толерантность в условиях антиортостаза» (Авиакосмическая и экологическая медицина, 2008, т.42, №6, с.3-20), где исследовали водный обмен организма в условиях гипокинезии при приеме десмопрессина. Во время выполнения эксперимента у обследуемых определяли водопотребление, диурез, динамику массы тела и жидкостных секторов организма (биоимпедансометрия), в образцах биоматериала - содержание основных электролитов, осмотически активных веществ и креатинина, гормоны водно-электролитного обмена.
Недостатком данного метода является трудоемкость и необходимость проведения большого числа анализов.
Техническим результатом изобретения является ускорение способа, возможность определения около 20 показателей за один анализ, минимальное количество биоматериала (5-10 мкл). Также существенным преимуществом является возможность автоматизации данной технологии, что повышает точность получаемых результатов.
Этот технический результат достигается тем, что в известном способе определения адаптации организма к гипокинезии при введении десмопрессина, включающем определение показателей крови у пациентов с гипокинезией до и на фоне введения десмопрессина, сравнение полученных результатов и вынесение суждения, в качестве показателей проводят масс-спектрометрическое определение протеомных профилей сыворотки крови в диапазоне масс от 1000 до 17000 при обработке проб магнитными частицами MB WCX и MB IMAC Cu и при отсутствии изменения интенсивности сигнала после введения десмопрессина при префракционировании магнитными частицами MB IMAC Cu m/z=9133 по сравнению с исходными данными, а также при уменьшении интенсивности пиков m/z=1297 на 54%, m/z=2769 на 16%, m/z=7764 на 28%, m/z=6432 и m/z=6630 на 56% при префракционировании магнитными частицами MB WCX у этих пользователей диагностируют стадию адаптации организма к гипокинезии при введении десмопрессина.
Способ осуществляют следующим образом.
1. Отбор проб крови осуществляют до начала эксперимента и сутки спустя в каждой серии.
2. Образцы крови оставляют на 30 минут при комнатной температуре для формирования сгустка, далее центрифугируют при 4500 g в течение 15 минут без охлаждения, затем аликвоты сыворотки замораживают при температуре -80°C.
3. Очистку и концентрацию белков из проб сыворотки осуществляют с помощью наборов магнитных частиц MB-WCX и MB IMAC («Bruker Daltonics»). Магнитные частицы ClinProt имеют сложную функциональную поверхность, которая специфически связывает белки с определенными свойствами. Так, магнитные частицы IMAC Cu, основанные на иммобилизованной метал-ион аффинной хроматографии, предназначены для захвата фосфорилированных белков, а магнитные частицы WCX являются слабым катион-обменником. Все шаги пипетирования растворов, отделения магнитных частиц и нанесения на MALDI-мишень выполнялись роботом с помощью программы ClinProtRobot 1.3 («Bruker Daltonics»). В качестве матрицы использовали α-циано-4-гидроксикоричную кислоту (0,3 мг/мл в растворе ацетон/этанол в соотношении 1:2). Каждый образец смешивали с матрицей в отношении 1:10 и 0,8 мкл раствора наносили на мишень MALDI-TOF AnchorChip (600/384) в 4 повторах. Использовали растворители высокой степени очистки (HPLC-grade), фирмы «Merck», Германия.
4. Масс-спектры были получены на масс-спектрометре Autoflex III TOF (Bruker Daltonics), работающем в положительном линейном режиме. Ионизация достигалась облучением твердотельным лазером. Спектры получены в автоматическом режиме с помощью редактора AutoXecute; мощностью лазера изменялась в диапазоне от 40 до 50%; для увеличения чувствительности детектирования и удаления избытка матрицы перед накоплением спектра было сделано 10 ударов лазера с мощностью около 50%. Общее число ударов лазера было 5000. Калибровка масс-спектрометра осуществлялась с помощью белковых стандартов (Peptide Calibration Standard и Protein Calibration Standard II, «Bruker Daltonics»). Сухой стандарт растворяли в 125 мкл 0,1% ТФУ. Далее стандарт смешивали с матрицей в соотношении 1:10 и наносили на мишень.
5. Каждый масс-спектр был проанализирован с помощью программ FlexAnalysis 3.0 и ClinProTools 2.1 (Bruker Daltonics). FlexAnalysis использовали для предварительной оценки качества спектров. Дальнейший анализ проводили с использованием программы ClinProTools (Bruker Daltonics). Перед вычислением площадей пиков все спектры, помещенные в программу ClinProTools, нормируются. Было показано ранее, что оптимальными настройками для подготовки спектров к анализу являются удаление базовой линии типа «top hat» с 10% минимальной шириной базовой линии, перекалибровка спектров с максимальным сдвигом пика 1000 ppm, отношение сигнал/шум, равное 5. Проводился «контроль качества» всех спектров с помощью методов многомерной статистики (кластерный анализ, программа «Statistica») с удалением из общего набора данных «выбросов» - спектров, резко отличающихся от остальных. Дальнейший анализ осуществлялся с помощью программ Stadia 6.0 и Statistica 6.0.
6. Сравнивают полученные результаты с исходными данными и данными контрольной группы и при отсутствии изменения интенсивности сигнала после введения десмопрессина при префракционировании магнитными частицами MB IMAC Cu m/z=9133 по сравнению с исходными данными, а также при уменьшении интенсивности пиков m/z=1297, m/z=2769, m/z=7764, m/z=6432, m/z=6630 при префракционировании магнитными частицами MB WCX у этих пользователей диагностируют стадию адаптации организма к гипокинезии при введении десмопрессина.
Результаты, подтверждающие решение поставленной задачи.
В исследовании участвовали 8 добровольцев в возрасте от 21 до 30 лет, допущенных врачебно-экспертной комиссией к проведению испытаний. Предварительно процедуры и методики исследований были рассмотрены Комиссией по биомедицинской этике при ГНЦ РФ - ИМБП РАН, а от испытателей, принимавших участие в исследовании, получено письменное Информированное согласие. Испытатели находились в условиях 24-часовой антиортостатической гипокинезии (АНОГ) при наклоне головного конца кровати на -15° по отношению к горизонту. Эксперимент подразделялся на две серии: в первой серии во время АНОГ испытатели принимали десмопрессин в виде таблетки (препарат «Минирин» - «Ферринг АБ», Швеция, по 0,2 мг 2 раза в день), являющийся аналогом антидиуретического гормона, во второй серии испытатели принимали плацебо (контрольная серия).
В обеих сериях во время АНОГ обследуемые находились в условиях клинического стационара, в одинаковых климатических условиях, получали стандартный рацион питания, водопотребление учитывалось. Отбор проб крови осуществлялся до начала эксперимента и через 24 часа у каждого испытуемого после начала гипокинезии. Кроме того, у всех испытуемых была исследована кровь через 2 недели после окончания эксперимента.
Чтобы проверить, не связаны ли обнаруженные нами изменения с естественной изменчивостью протеомного профиля, проводили следующее исследование: у группы здоровых мужчин (4 человека) в возрасте от 22 до 31 года в течение месяца еженедельно отбирались образцы крови. Таким образом, мы определяли степень нормальной вариабельности протеома сыворотки, не связанной с воздействием экстремальных факторов на организм. Сравнение протеомных профилей методом Фридмена и последующее парное сравнение критерием Уилкоксона не выявило достоверных отличий по всем пикам, изменяющихся при антиортостатической гипокинезии. Таким образом, изменение площадей/интенсивностей этих пиков было связано именно с воздействием моделируемой микрогравитации, а не обусловлено естественной изменчивостью протеома.
При прямом профилировании образцов сыворотки крови, собранных в эксперименте с 24-часовой антиортостатической гипокинезией (-15°), получили 131 пик в диапазоне масс от 1000 до 17000 при обработке проб магнитными частицами MB WCX и 139 пиков при обработке MB IMAC Cu. Наибольший интерес представляли пики, уровень сигнала которых изменился в контрольной серии исследования, поскольку они могут свидетельствовать о состоянии дезадаптации, связанном с воздействием гипокинезии. Так, при предобработке образцов сыворотки крови лиц без профилактики АНОГ магнитными частицами MB IMAC обнаружен пик с m/z=9133, площадь/интенсивность которого достоверно увеличивалась (табл.2, 3). Данный пик ранее был идентифицирован с применением тандемной масс-спектрометрии независимо в нескольких исследовательских лабораториях и определен как фрагмент аполипопротеина СIII [Bondarenko, P.V., Cockrill, S.L.,Watkins, L.K. et al., Mass spectral study of polymorphism of the apolipoproteins of very low density lipoprotein // Journal of Lipid Research. 1999. V.40. P.543-555].
Увеличение этого пика свидетельствует о сдвигах липидного обмена. Ранее было установлено, что аполипопротеин CIII ингибирует липопротеинлипазу и таким образом регулирует распад триглицеридов. При увеличении аполипопротеина CIII концентрация холестерина и триглицеридов повышается. Распад этих соединений свидетельствует о наступлении напряженности в системе адаптации.
В серии с применением десмопрессина площади пиков тромбоцитарного фактора IV (m/z=7764 Да), ангиотензина I (m/z=1297 Да) и фибриногена (m/z=2769 Да) достоверно снижались (см. табл.1, 2, 3). Уменьшение концентрации тромбоцитарного фактора IV свидетельствует о снижении активности системы сосудисто-тромбоцитарного (или первичного) гемостаза в крови. Эти изменения пиков являются результатом компенсаторных реакций организма при АНОГ вследствие приема десмопрессина.
Как уже указывалось ранее, прием десмопрессина приводит к лучшей адаптации к ортостатической гипокинезии.
Следовательно, уменьшение пиков тромбоцитарного фактора IV (m/z=7764 Да), ангиотензина I (m/z=1297 Да) в сочетании с уменьшением пика m/z=2769 Да, идентифицируемого как фибриноген, при АНОГ с приемом десмопрессина также свидетельствуют о достаточно выраженных адаптационных способностях организма.
Необходимо также отметить, что фибриноген - это плазменный глобулярный гликопротеин, относящийся к белкам «острой фазы» и определяющий вязкость крови и плазмы, а также интенсивность агрегации тромбоцитов. Как показали наши наблюдения, этот фактор не повышается при ортостатической гипокинезии ни в серии без профилактики, ни в серии с профилактикой, что позволяет констатировать при АНОГ отсутствие значительных сдвигов в системе гемостаза и развития острой реакции в виде дезадаптации.
Однако у пациентов без профилактики АНОГ в отличие от аналогичного показателя при приеме десмопрессина наблюдалось увеличение пика m/z=9133, который в этом случае по нашему мнению свидетельствует о напряженности адаптационных сил организма.
Соответствие этого показателя исходному уровню после приема десмопрессина свидетельствует об информативности его как маркера наступившей адаптации.
Таким образом, сравнение протеомных профилей сыворотки крови после приема десмопрессина с исходными в диапазоне масс от 1000 до 17000 при обработке проб магнитными частицами MB WCX и MB IMAC Cu позволяет диагностировать стадию адаптации организма к гипокинезии после приема десмопрессина при отсутствии изменения интенсивности сигнала после введения десмопрессина при префракционировании магнитными частицами MB IMAC Cu m/z=9133, а также при уменьшении при префракционировании магнитными частицами MB WCX.
Интересным оказался тот факт, что некоторые пики достоверно изменялись не в течение суток, а спустя определенное время после окончания эксперимента. К такому выводу нас привел анализ протеомных профилей между двумя сериями исследования, временной интервал между которыми составлял 12-20 суток. Оказалось, что площадь пика ангиотензина II увеличилась, а с m/z=6432.02; 6630.36 уменьшилась практически в 2 раза спустя две недели после 24-часовой АНОГ (табл.1), (чертеж). Увеличение пика ангиотензина II до фонового уровня (табл.1) свидетельствует о восстановлении объема циркулирующей плазмы после окончания гипокинезии. Уменьшение пиков с m/z=6432 и 6630 Да свидетельствует о нормализации липидного обмена после кратковременной АНОГ.