Способ определения устойчивости мембран эритроцитов периферической крови при снижении белка полосы-4.1 на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции на третьем триместре гестации
METHOD FOR DETERMINING STABILITY OF MEMBRANES OF PERIPHERAL BLOOD ERYTHROCYTES IN CASE OF REDUCTION OF BAND-4,1 PROTEIN AT BACKGROUND OF EXACERBATION OF CYTOMEGALOVIRAL INFECTION IN THIRD GESTATION TRIMESTER

1. Цель изобретения - разработать способ оценки снижение устойчивости мембран эритроцитов периферической крови у беременных на третьем триместре гестации при снижении белка полосы - 4.1 на фоне обострения цитомегаловирусной инфекции.
2. Изобретение относится к медицине, а именно к разработке способа, позволяющего выяснить причину снижения устойчивости мембран эритроцитов периферической крови у беременных на третьем триместре гестации при обострении цитомегаловирусной инфекции, что создает угрозу развития гемической анемии.
3. Раскрытие изобретения
Каждая клетка имеет внешнюю оболочку, отделяющую внутреннее ее содержание от внешней среды. Внутренний слой, непосредственно примыкающий к цитозолю клетки, называется цитоплазматической мембраной [1]. В таких клеточных элементах, как эритроцит- клеточная мембрана обеспечивается его эластичность, прочность, долговечность, способствуя к растяжению при прохождении через узкие отверстия капилляров. Белки мембраны эритроцитов делят на две группы, в зависимости от того, насколько легко их экстрагировать: на периферические и интегральные белки [2]. Особое внимание привлекают к себе в последнее время периферические белки, образующие цитоскелет эритроцита: спектрин α и β; анкирин белок полосы-4.1, белок полосы-4.2, белок полосы-3, белок полосы-4.9 [2].
В настоящее время проводится много исследований, направленных на изучение взаимодействия и роли этих белков, обеспечивающих строение и функциональные отправления эритроцитов [3]. Ведущую роль в образовании цитоскелета эритроцитов выполняют спектрин α и спектрин β. Молекулы спектрина α и β переплетаются между собой, составляя основу цитоскелета эритроцита [2, 3]. Однако в построении цитоскелета эритроцита принимают участие и другие периферические белки. Большое внимание уделяется изучению роли белка полосы-4.1 [4, 5, 6].
Целью нашего исследования было изучить содержание белка-4.1 в мембранах эритроцитов у беременных, перенесших в период гестации обострение цитомегаловирусной инфекции и показать, что снижение его содержания нарушает структуру мембраны эритроцита.
4. Новая техническая задача
Разрабатывается способ, позволяющий путем гель-электрофореза установить количественные изменения содержания белка полосы-4.1 в мембранах эритроцитов под влиянием цитомегаловируса, по которому можно судить о состоянии целостности скелета эритроцита и увеличению в крови дегенеративных форм, что может привести к формированию гемической анемии.
5. В доступной литературе не отмечено работ освещающих влияние цитомегаловирусной инфекции на белковый скелет эритроцита и, в частности, на изменение содержания белка полосы-4.1.
6. Осуществление изобретения
Исследования проводились на базе акушерского отделения ФГБНУ «Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания». Обследовано 20 беременных на третьем триместре гестации с обострением цитомегаловирусной инфекции с титром антител IgG к ЦМВ 1:1600. Контролем служили 15 беременных, не болевших цитомегаловирусной инфекцией в период гестации. У беременных симптоматически цитомегаловирусная инфекция проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз - обострение цитомегаловирусной инфекции, устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности более 65%, а также ДНК цитомегаловируса (ПЦР). Исследования проводили с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 2008) и Правил клинической практики в Российской Федерации, утвержденных приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №266. Верификация цитомегаловируса, определение типоспецифических антител класса IgM и IgG, индекса авидности осуществлялись методами иммуноферментного анализа на микропланшетном ридере «Stat-Fax-2100» с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), выявление ДНК цитомегаловируса методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва). Исследование белкового спектра мембран эритроцитов проводили с помощью вертикального одномерного диск-электрофореза в градиентном (7,5-10%) полиакриламидном геле в присутствии 0,1% раствора додецилсульфата натрия. Полипептидные зоны окрашивали в 0,1% растворе R-250, 50% растворе спирта и 7% растворе уксусной кислоты. Идентификацию электрофореграмм проводили при длине волны 590-600 нм с помощью установки «Bio-Doc-Analize» (Германия). Ориентировку белковых фрагментов оценивали в соответствии с рекомендациями Steck Т. [7]. Строение эритроцитов исследовали с помощью автоматизированной цитофотометрической установки «Mekos» (Россия). Регистрационное удостоверение МЗ РФ 29/10010198/1282-01. Плотность мембран эритроцитов исследовали с помощью цитофотометрической установки «Pixera» (США) по программе «Biovision». Все расчеты производились с использованием программного обеспечения «Statistica 6.0». Проверку нормальности распределения проводили по критерию Колмогорова-Смирнова. Проверку гипотезы по статистической значимости различий двух выборок проводили с помощью t-критерия Стьюдента. Показатели считали значимыми при р<0,05.
7. Полученные данные
Обострение ЦМВИ до титра антител IgG к ЦМВ 1:1600 отчетливо оказывало влияние на структуру мембран эритроцитов периферической крови беременных. Происходило снижение содержания белков полосы-4.1 до 4,11±0,08% (контроль - 6,86±0,07%). Исследуя структуру эритроцитов периферической крови при обострении ЦМВИ, было обнаружено увеличение в крови эхиноцитов 8,80±0,09% (контроль - 3,00±0,02%) и их дегенеративных форм 21,0±1,3% (контроль - 5,00±0,5%). Исследуя эти мазки крови по программе «Biovision» обнаружено, что дегенеративные формы при снижении содержания в эритроцитах белка полосы-4.1 приобретают резко уплотненную мембрану (фигура 1), в меньшей степени это выглядело у эхиноцитов (фигура 2). Увеличение процентного содержания в периферической крови эхиноцитов и дегенеративных форм эритроцитов создает угрозу формирования у беременной гемической анемии.
Литература
1. Mohandas N., Gallagher P. Red cell membrane past, present and future // Blood. - 2008. - Vol. 112. - P. 3939-3948.
2. Воробьев А.И. Руководство по гематологии. - М.: «Ньюдиамед». - 2007. - 1275 с.
3. Dicas L., Rico F., Deforet M., Scheuring S. Structural and mechanical heterogeneity of the erythrocyte membrane reveals hallmarks of membrane stability // ACS Nano. - 2013. - Vol. 7, №2. - P. 1054-1063.
4. Baines A., Lu H., Bennett P. The protein 4.1 family: Hub proteins in animals for organizing membrane proteins // Biochim. Biophys. Acta. - 2014. - Vol. 1838, №2. - P. 605-619.
5. Salomao. M., Zhang X., Yang Y., Lee S., Hartwing J. Protein 4.1 R dependent multiprotein compex: new insights into the structural organization of the red blood cell membrane // Proc. Nate Acad Sci. USA. - 2008. - Vol. 105. - P. 8026-8031.
6. George A., Pushkaran S., Li L., An X., Zheng Y. Altered phosphorylation of cytoskeleton proteins in sickle red blood cells: the role of proteinkinase C, Rac GTPases, and reactive oxygen species // Blood cells Mol. Dis. - 2010. - Vol. 45. - P. 41-45.
7. Steck T. The organization of proteins in the human red blood cell membrane // J. Cell. Biol. - 1974. - Vol. 62. - P. 1-19.
8. Zhaofel L., Blissard G.W. Baculovirus Gp64 D: the intermolecular disulfide bond of Autographia californica multicapsid nucleopolyhedrovirus Gp64 is not essential for membrane fusion and virion Buudding // J. Virol. - 2010. - Vol. 84, №17. - P. 8584-8595.