ДНК-МИКРОЧИП ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОВ БЕТА-ЛАКТАМАЗ РАСШИРЕННОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ КЛАССА А
DNA MICROCHIP FOR IDENTIFYING EXTENDED SPECTRUM CLASS A BETA-LACTAMASE GENES

Изобретение относится к области молекулярной биологии и аналитической биотехнологии и может быть использовано в клинических микробиологических лабораториях и службах эпидемиологического контроля для выявления устойчивости микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae к антибиотикам группы пенициллинов и цефалоспоринов по наличию мутаций в кодирующих генах.
Антибиотики группы пенициллинов и цефалоспоринов являются наиболее широко применяемыми в настоящее время при лечении инфекционных заболеваний, вызываемых грамотрицательными микроорганизмами семейства Enterobacteriaceae. Основным фактором, ограничивающим их клиническую эффективность, является антибиотикорезистентность, т.е. способность микроорганизмов вырабатывать устойчивость к их действию. Основной причиной резистентности является ферментативный гидролиз ферментами бета-лактамазами, образующимися в клеточной стенке [Paterson DL, Bonomo RA. Extended-spectrum beta-lactamases: a clinical update. Clin Microbiol Rev., 2005, 18, стр.657-686]. Из всего разнообразия бета-лактамаз наибольшую угрозу представляют бета-лактамазы расширенного спектра (БЛРС), вызывающие резистентность у изначально чувствительных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae [Perez F. et. al. The continuing challenge of ESBLs. Curr Opin Pharmacol. 2000, 7, 459-469]. Благодаря плазмидной локализации генов распространение этих ферментов среди возбудителей инфекционных болезней человека, прежде всего - инфекций увеличивается с каждым годом. Наиболее известными и распространенными типами БЛРС являются типы ТЕМ, SHV и СТХ-М. Все описанные ферменты ТЕМ типа являются вариантами бета-лактамазы ТЕМ-1 и отличаются от исходного фермента единичными аминокислотными заменами (от одной до семи). Ключевыми для расширения спектра субстратной специфичности являются мутации в положениях 104, 164, 238 и 240.
Ферменты SHV типа являются производными бета-лактамазы SHV-1 и отличаются от него наличием точечных мутаций. Ключевыми для изменения профиля субстратной специфичности являются мутации в положениях 35, 238 и 240.
В последнее время во многих странах мира, в том числе и в РФ, отмечается стремительное распространение БЛРС СТХ-М типа [Edelstein M., Pimkin M., Palagin I., Edelstein I., Stratchounski L. Prevalence and molecular epidemiology of СТХ-М extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae in Russian hospitals. Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47, 3724-3732]. На основании гомологии аминокислотных последовательностей эти ферменты разделяются на 4 филогенетические группы (субкластеры). Расширение спектра их субстратной специфичности также связано возникновением единичных мутаций. Ключевыми мутациями, определяющими спектр субстратной специфичности в отношении цефалоспоринов, являются мутации в положениях 167 и 240. Мутации в положениях 26, 230, 253, 278 для субкластера СТХ-М-2, в положениях 121, 231 для субкластера СТХ-М-9 важны для распознавания ферментов СТХ-М типа, распространенных в различных странах, в том числе и в России.
Перспективным методом идентификации генов являются методы генотипирования на микрочипах. ДНК-микрочипы представляют собой подложку из стекла, кремния, пористых мембранных материалов, полимерных носителей, на которую нанесены в виде матрицы синтетические олигонуклеотиды или фрагменты ДНК. Технология ДНК-микрочипов для идентификации генов и мутаций в них основана на амплификации необходимого участка нуклеиновой кислоты с одновременным введением метки и последующей гибридизацией на поверхности микрочипа исследуемой нуклеотидной последовательности с иммобилизованными в определенном порядке на микрочипе известными олигонуклеотидами или ДНК-последовательностями [Heller MJ. DNA microarray technology: devices, systems, and applications. Annu Rev Biomed Eng. 2002, 4, 129-53]. Результат гибридизации меченой ДНК образца с иммобилизованными олигонуклеотидами определяется по активности метки на различных участках носителя с помощью специальных устройств. Технология ДНК-чипов позволяет осуществлять многопараметрический анализ и проводить идентификацию патогена и его устойчивости к антибиотикам на молекулярном уровне. Данная технология является более информативной и имеет значительные преимущества перед традиционными молекулярно-биологическими методами, т.к. позволяет миниатюризировать исследуемый образец и анализатор, что значительно снижает стоимость анализа и время его проведения, а также одновременно определять различные параметры исследуемого образца.
Описан ДНК-макрочип на основе мембранного носителя, для идентификации генов бета-лактамаз СТХ-М типа и отдельных мутаций в них методом гибридизационного анализа [Ensor V.M., Livermore D.M., Hawkey P.M. A novel reverse-line hybridization assay for identifying genotypes of CTX-M-type extended-spectrum P-lactamases. J. Antimicrob. Chemotherapy, 2007, 59, 387-395]. Недостатком данного подхода является «макро» формат чипа, в процессе полимеразной цепной реакции амплифицируются фрагменты генов бета-лактамаз СТХ-М типа, в результате возможно определить только ограниченное число мутаций. Условия определения мутаций в генах, относящихся к разным субкластерам бета-лактамаз СТХ-М типа, различаются, поэтому определение проводится на разных типах чипов, что затрудняет использование метода в эпидемиологических исследованиях.
Наиболее близким к заявляемому является ДНК-микрочип для идентификации генов бета-лактамаз ТЕМ типа и мутаций в них методом гибридизационного анализа с флуоресцентной детекцией [European Patent 1580281 A2, date of publication 28.09.2005 Bulletin 2005/39]. На данном микрочипе из стекла иммобилизованы олигонуклеотиды, по структуре идентичные различным участкам гена бета-лактамазы ТЕМ-1 и его мутантов, идентификация проводится методом гибридизационного анализа с флуоресцентной детекцией.
Задачей данного изобретения является разработка ДНК-микрочипа с иммобилизованными специфическими олигонуклеотидами для высокоспецифичного одновременного выявления основных типов генов бета-лактамаз класса А (ТЕМ, SHV и СТХ-М) и ключевых точечных мутаций в них, ответственных за развитие устойчивости микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам групп пенициллинов и цефалоспоринов.
Для решения поставленной задачи выполнен молекулярный дизайн структуры олигонуклеотидов для идентификации генов бета-лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М типов и определения ключевых мутаций в них. Для идентификации типа гена использовали последовательность, комплементарную консервативному участку генов данного типа и не имеющую гомологии с генами других типов. Для идентификации субкластера бета-лактамаз СТХ-М типа использовали последовательность, комплементарную участку гена, высокогомологичного для генов одного субкластера и с низкой степенью гомологии с генами, относящимися к другим субкластерам.
Для определения точечной мутации первоначально тестировали набор из четырех олигонуклеотидов с последовательностью оснований, соответствующих структуре гена бета-лактамазы в исследуемом участке и отличающихся друг от друга нуклеотидом в центральной позиции, соответствующей точечной мутации, в качестве которого использовали один из четырех нуклеотидов A, G, С или Т. При гибридизации исследуемой ДНК с набором олигонуклеотидов наиболее стабильный дуплекс образуется с полностью комплементарным олигонуклеотидом и, соответственно, в этом случае детектируется более высокий аналитический сигнал. При образовании дуплексов в результате гибридизации с тремя остальными олигонуклеотидами или только некоторыми из них наблюдаемый аналитический сигнал свидетельствует об уровне неспецифической гибридизации. Молекулярный дизайн состоял в оптимизации длины олигонуклеотидов и введении искусственных замен в их последовательность для обеспечения высокой специфичности идентификации генов и определения мутаций при их одновременном использовании в реакции гибридизации, проводимой в выбранных условиях при фиксированной температуре. Высокая специфичность определения отдельных мутаций в генах бета-лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М типов методом гибридизационного анализа продемонстрирована на фиг.1. Использование биотина в качестве метки ДНК с последующей колориметрической детекцией обеспечило наиболее высокую специфичность определения мутаций.
В дальнейшем для определения одной мутации используют набор из двух или в отдельных случаях большего числа олигонуклеотидов. Последовательность первого олигонуклеотида комплементарна последовательности гена «дикого» типа, второго или других - последовательности одного или нескольких мутантов. Для контроля процессов иммобилизации и гибридизации на ДНК-микрочипе используют контрольные олигонуклеотиды (контроль иммобилизации, положительный контроль гибридизации и отрицательный контроль гибридизации). Последовательности специфических и контрольных олигонуклеотидов приведены в таблице 1.
Специфические олигонуклеотиды и контрольные олигонуклеотиды иммобилизуются одновременно в виде матрицы на поверхности микрочипов из нерастворимого носителя, в качестве которого может быть использовано стекло, пористые мембранные носители и другие материалы. Общий вид ДНК-чипа и расположение специфических олигонуклеотидов на нем изображены на фиг.2. Каждый олигонуклеотид наносят в виде трех пятен, расположенных по горизонтальной линии. Размер пятен определяется параметрами используемого оборудования и принципа нанесения. Контроли иммобилизации и гибридизации наносят на линии, ограничивающие микрочип сверху и снизу, либо справа и слева. Олигонуклеотиды для выявления одной точечной мутации располагают в виде двух линий, каждая из трех точек, друг под другом. Число линий для определения одной мутации увеличивается, если имеется несколько вариантов полиморфизма гена в исследуемом участке. В качестве специфических олигонуклеотидов для идентификации генов бета-лактамаз СТХ-М типа и выявления положений мутации 238/240 в генах SHV типа используют смесь двух олигонуклеотидов в соотношении 1:1 (смесь олигонуклеотидов 30 и 31 для идентификации генов бета-лактамаз СТХ-М типа, смесь олигонуклеотидов 20 и 21 для положения, соответствующего ферменту «дикого» типа SHV-1, смесь олигонуклеотидов 22 и 23 и смесь олигонуклеотидов 28 и 29 для мутантов S_238/240_MT_1 и S_238/240_MT_6, соответственно).
Определение генов бета-лактамаз и точечных мутаций в них проводят методом гибридизационного анализа на ДНК-микрочипе:
1. Выделение ДНК из клинического образца;
2. Амплификация ДНК методом ПЦР с одновременным введением метки-биотина;
3. Фрагментация меченой ДНК с помощью ДНКазы;
4. Гибридизация меченой ДНК с иммобилизованными на ДНК-микрочипе олигонуклеотидами;
5. Детекция активности метки на поверхности микрочипа;
6. Получение изображения микрочипа на сканере и анализ результатов.
В результате использования микрочипа с иммобилизованным набором олигонуклеотидов в гибридизационном анализе образцов ДНК, выделенных из клинических образцов возбудителей, достигается следующий технический результат:
высокоспецифичное одновременное определение генов бета-лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М типов и ключевых мутаций в них.
Состав олигонуклеотидов на ДНК-микрочипе может быть расширен путем добавления новых специфических нуклеотидов для идентификации других мутаций в генах бета-лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М типов, либо для идентификации бета-лактамаз других типов при сохранении способа проведения анализа.
Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения.
Приведенные далее примеры предназначены лишь для подтверждения возможности осуществления изобретения и не ограничивают объем защиты изобретения.
Пример 1.
Сравнение специфичности определения точечных мутаций в генах бета-лактамаз методом гибридизационного анализа на микрочипах с флуоресцентной и колориметрической детекцией.
2
4
2
4
На поверхности микрочипа из стекла с эпоксигруппами или пористого мембранного носителя иммобилизуют олигонуклеотиды из растворов с концентрацией 20 мкМ в солевом буфере (160 мМ NаSO, 130 мМ NaHPO) нанесением на микрочип зон в виде пятен с диаметром от 50 до 350 мкм с помощью миниплоттера «Xact Arrayer» (LabNEXT Inc, США). Каждый олигонуклеотид наносят в виде трех пятен, расположенных по горизонтальной линии. После нанесения микрочипы из стекла инкубируют в термостате в течение 30 мин при 60°С, отмывают 5 мин в 0,1% TritonX-100, 4 мин в 0,05% растворе НCl, 10 мин в 100 мМ КCl при постоянном встряхивании на горизонтальном шейкере при комнатной температуре. Для блокирования свободных эпоксигрупп инкубируют микрочипы в блокирующем растворе (25% раствор этиленгликоля, содержащий 0,05% НCl) при 50°С в течение 15 мин при постоянном перемешивании, затем отмывают в деионизованной воде 1 мин и высушивают.
После нанесения микрочипы из мембранного носителя инкубируют в термостате в течение 30 мин при 60°С, затем отмывают в деионизованной воде 1 мин и высушивают.
2
4
2
4
2
4
Для гибридизации 500 нг фрагментированной меченной биотином или флуоресцентной меткой Су3 ДНК растворяли в 400 мкл гибридизационного буфера (2×SSPE (0,8 М NaCl, 50 мМ NaHPO, 5 мМ ЭДТА), рН 7.7, содержащем 0,2% додецилсульфата натрия). Гибридизационную смесь наносили на ДНК-микрочип и инкубировали в течение 2 часов при температуре 45°С. После гибридизации проводили отмывку микрочипа в три стадии: 1) 2×SSC (0,3 М NaCl, 0,03 М цитрат натрия, содержащем 0,1% SDS, 2) 2×SSC и 3) 0,2×SSC, каждая стадия по 10 мин при комнатной температуре. Затем микрочипы с флуоресцентной детекцией сканировали на сканере ScanArray (Perkin Elmer) с разрешение 5 мкм. Микрочипы с биотином в качестве метки инкубировали в растворе конъюгата стрептавидин-пероксидаза (разведение 1/1000) в ФБСТ (0,01 М КНРO, 0,15 М NaCl, 0,05% Tween20 pH 7.0), содержащем 1% БСА, в течение 1 часа при комнатной температуре при встряхивании на горизонтальном шейкере. После инкубации микрочипы отмывали (2 раза по 5 мин в ФБСТ, 1 раз - 5 мин в ФБС (0,01 М КНРO, 0,15 М NaCl, рН 7.0)) и помещали в субстратный раствор, содержащий 9,5 мл 0.1 М ацетатного буфера рН 5,5, 0,75 мл раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (6,3 мг/мл диметилсульфоксида), 1,5 мл 5% декстран сульфата натрия и 0,075 мл 0,2 М пероксида водорода, на 10 мин при комнатной температуре. После окрашивания микрочипы промывали дистиллированной водой и сушили на воздухе. Далее микрочипы сканировали на оптическом сканере Perfection V750 Pro (Epson) при разрешении 4800 dpi. Полученные изображения результатов гибридизации (в tiff формате) обрабатывали количественно с использованием программы Scan Array Express (PerkinElmer, version 3.0). Результаты представлены на фиг.1.
Пример 2.
Иммобилизация специфических олигонуклеотидов на поверхности микрочипа из стекла.
2
4
2
4
На поверхности микрочипа из стекла с эпоксигруппами или пористого мембранного ностеля иммобилизуют олигонуклеотиды из растворов с концентрацией 20 мкМ в солевом буфере (160 мМ NaSO, 130 мМ NaHPO) нанесением на микрочип зон в виде пятен с диаметром от 50 до 350 мкм с помощью миниплоттера «Xact Arrayer» (LabNEXT Inc, США) по схеме, представленной на фиг.2. Каждый олигонуклеотид наносят в виде трех пятен, расположенных по горизонтальной линии. Олигонуклеотиды для выявления одной точечной мутации располагают в виде двух линий, каждая из трех точек, друг под другом. В качестве специфических олигонуклеотидов для идентификации генов бета-лактамаз СТХ-М типа и выявления положений мутации 238/240 в генах SHV типа используют смесь двух олигонуклеотидов в соотношении 1:1 (смесь олигонуклеотидов 30 и 31 для идентификации генов бета-лактамаз СТХ-М типа, смесь олигонуклеотидов 20 и 21 для положения, соответствующего ферменту «дикого» типа SHV-1, смесь олигонуклеотидов 22 и 23 и смесь олигонуклеотидов 28 и 29 для мутантов S_238/240_MT_1 и S_238/240_MT_6, соответственно).
После нанесения микрочипы из стекла инкубируют в термостате в течение 30 мин при 60°С, отмывают 5 мин в 0,1% TritonX-100, 4 мин в 0,05% растворе НCl, 10 мин в 100 мМ КCl при постоянном встряхивании на горизонтальном шейкере при комнатной температуре. Для блокирования свободных эпоксигрупп инкубируют микрочипы в блокирующем растворе (25% раствор этиленгликоля, содержащий 0,05% НCl) при 50°С в течение 15 мин при постоянном перемешивании, затем отмывают в деионизованной воде 1 мин и высушивают.
После нанесения микрочипы из мембранного носителя инкубируют в термостате в течение 30 мин при 60°С, затем отмывают в деионизованной воде 1 мин и высушивают.
Пример 3.
Идентификация гена бета-лактамаз ТЕМ типа и определение точечных мутаций в нем методом гибридизационного анализа на ДНК-микрочипе с колориметрической детекцией.
Для выделения ДНК исследуемые образцы энтеробактерий рассеивались до отдельных колоний на чашки с агаром. Чашки инкубировали в термостате при 37°С в течение 12-15 часов. Затем 2-3 одинаковые колонии (1/2 петли) переносили с помощью стерильной 1-мкл петли в 0,5-мл центрифужную пробирку с 400 мкл стерильной деионизированной воды, суспендировали и микробные клетки осаждали центрифугированием в течение 2 мин при 7000 g. Затем удаляли надосадочную жидкость и ресуспендировали осадок в 100 мкл ТЕ буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7.5). Инкубировали пробирки на водяной бане при 99°С в течение 20 мин. Встряхивали и центрифугировали пробирку при 7000 g в течение 3 мин, далее для ПЦР использовали супернатант.
Амплификацию методом ПЦР проводили в пробирках на 0,5 мл в объеме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили: 1×Taq ДНК полимеразный буфер (2,5 мМ ацетата магния, 50 мМ КCl, 10 мМ Трис-HCl, рН 8.3), 2,5 ед. Taq ДНК-полимераза, 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, 60 мкМ dTTP, 40 мкМ dUTP-биотин, по 0,4 мкМ смеси прямых праймеров (5'-ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3', 5'-TTATATTCGCCTGTGTATTATCTC-3') и 5 мкл раствора образца ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе Mastercycler gradient (Eppendorf, Германия) по следующему протоколу: денатурация в течение 2 мин при 94°С, затем 30 циклов амплификации (20 сек денатурация при 94°С, 30 сек отжиг праймеров при 55°С, 45 сек элонгации при 72°С), затем 8 мин финальная элонгация при 72°С.
4
2
Для фрагментации амплифицированный ген бета-лактамазы растворяли в концентрации 30 нг/мкл в реакционном буфере (40 мМ Трис-НCl, 10 мМ MgSO, 1 мМ CaCl, рН 8.0) и добавляли ДНКазу в концентрации 0,2 мU/нг ДНК. Фрагментацию проводили при комнатной температуре в течение 5 мин. Реакцию останавливали, добавляя 3 мМ ЭДТА и инкубируя 10 мин в термостате при 65°С.
2
4
3
4
2
4
Для гибридизации 500 нг фрагментированной меченой ДНК растворяли в 400 мкл гибридизационном буфере (2×SSPE (0,8 М NaCl, 50 мМ NaHPO, 5 мМ ЭДТА), рН 7.7, содержащем 0,2% додецилсульфата натрия). Гибридизационную смесь наносили на ДНК-микрочип и инкубировали в течение 2 часов при температуре 45°С. После гибридизации проводили отмывку микрочипа в три стадии: 1) 2×SSC (0,3 М NaCl, 0,03 М цитрат натрия, содержащем 0,1% SDS, 2) 2×SSC и 3) 0,2×SSC, каждая стадия по 10 мин при комнатной температуре. Затем микрочипы инкубировали в растворе конъюгата стрептавидин-пероксидаза (разведение 1/1000) в ФБСТ (0,01 М КНРO, 0,15 М NaCl, 0,05% Tween20 pH 7.0), содержащем 1% БСА, в течение 1 часа при комнатной температуре при встряхивании на горизонтальном шейкере. После инкубации микрочипы отмывали (2 раза по 5 мин в ФБСТ, 1 раз - 5 мин в ФБС (0,01 М КНРO, 0,15 М NaCl, pH 7.0)) и помещали в субстратный раствор, содержащий 9,5 мл 0.1 М ацетатного буфера, pH 5,5, 0,75 мл раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (6,3 мг/мл диметилсульфоксида), 1,5 мл 5% декстран сульфата натрия и 0,075 мл 0,2 М пероксида водорода, на 10 мин при комнатной температуре. После окрашивания микрочипы промывали дистиллированной водой и сушили на воздухе. Далее микрочипы сканировали на оптическом сканере Perfection V750 Pro (Epson) при разрешении 4800 dpi. Полученное изображение (в tiff формате) обрабатывали количественно с использованием программы Scan Array Express (PerkinElmer, version 3.0). Результаты представлены на фиг.3.
Пример 4.
Идентификация смеси генов бета-лактамаз ТЕМ, SHV и СТХ-М типов и определение точечных мутаций методом гибридизационного анализа на ДНК-микрочипе с колориметрической детекцией.
Микрочип готовили, как описано в примере 2. Выделение ДНК из образца проводили, как описано в примере 3. Амплификацию методом ПЦР проводили в пробирках на 0,5 мл в объеме 25 мкл. В состав реакционной смеси входили: 1×Taq ДНК полимеразный буфер (2,5 мМ ацетата магния, 50 мМ КCl, 10 мМ Трис-HCl, pH 8.3), 2,5 ед. Taq ДНК-полимераза, 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, 60 мкМ dTTP, 40 мкМ dUTP-биотин, по 0,4 мкМ смеси прямых праймеров (5'-ATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCG-3', 5 '-TTATATTCGCCTGTGTATTATCTC-3', 5'-ATGGTTAAAAAATCACTGCGCCAG-3', 5'-ATGATGACTCAGAGCATTCGCC-3', 5'-GGTGACAAAGAGAGTGCAACGG-3') и обратных праймеров (5'-CTTAATCAGTGAGGCACCTATCTC-3', 5'-GTTAGCGTTGCCAGTGCTCG-3', 5'-CCGTCGGTGACGATTTTAGCCG-3', 5'-CCGTGGGTTACGATTTTCGCCG-3', 5'-CCCTTCGGCGATGATTCTCGC-3') и 5 мкл раствора образца ДНК. Амплификацию проводили в амплификаторе Mastercycler gradient (Eppendorf, Германия) по следующему протоколу: денатурация в течение 2 мин при 94°С, затем 30 циклов амплификации (20 сек денатурация при 94°С, 30 сек отжиг праймеров при 65°С, 45 сек элонгации при 72°С), затем 8 мин финальная элонгация при 72°С. Фрагментирование гена, гибридизацию на ДНК микрочипе и детекцию проводили, как описано в примере 3. Результаты представлены на фиг.4.