СПОСОБ ФОТОИНАКТИВАЦИИ ВИРУСА ГРИППА А ПТИЦ ПОДТИПА H5N1
METHOD OF PHOTO INACTIVATION OF BIRD INFLUENZA A VIRUS OF SUBTYPE H5N1

Настоящее изобретение относится к вирусологии и может быть использовано для фотообеззараживания различных сред от вируса гриппа А птиц подтипа H5N1 (вируса «птичьего гриппа»).
Известно инактивирующее, или повреждающее, действие света, фотосенсибилизированное некоторыми органическими соединениями, преимущественно относящимися к красителям. Характерным примером является фотосенсибилизация различных биологических систем псораленами при УФ облучении.
Так, известен способ фотосенсибилизированной псораленами инактивации вирусов, бактерий и простейших в препаратах крови [Corash L. Inactivation of viruses, bacteria, protozoa and leukocytes in platelet and red cell concentrates. Vox Sang. 2000. V. 78. P.P. 205-210].
Основным недостатком псораленов является их мутагенный потенциал, в том числе в отношении животных клеток, обусловленный фотоиндуцированными ими сшивками ДНК.
Эффект образования цитотоксичных активных форм кислорода (синглетный кислород, супероксид) из молекулярного кислорода при участии красителя называют фотодинамическим, а соответствующий способ фотоинактивации патогенных микроорганизмов и лечения инфекционных заболеваний - антимикробной фотодинамической терапией (АФДТ) [Wainwright М. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT). J. Antimicrob. Chemother. 1998. V. 42, P.P. 13-28]. Селективность антимикробной ФДТ основана на большей чувствительности микроорганизмов по сравнению с животными клетками к активным формам кислорода.
Наиболее широко известен способ фотодинамической инактивации бактерий. В связи с широким распространением лекарственной устойчивости среди возбудителей различных инфекционных заболеваний этому способу придают большое значение и рассматривают как альтернативу традиционной химиотерапии [Hamblin M.R., Hasan T. Photodynamic therapy: a new antimicrobial approach to infectious disease? Photochem. Photobiol. Sci. 2004. V.3.P.P.436-450].
Однако различные виды бактерий сильно отличаются по чувствительности к фотодинамической инактивации. Наиболее устойчивыми являются грамотрицательные бактерии. Это связано с низкой проницаемостью их внешней клеточной мембраны для красителей. Отрицательный заряд поверхности бактериальных клеток определяет активное связывание с ними и, соответственно, широкую антибактериальную активность красителей катонного тала [Minnock A., Vernon D.I., Schofield J., Griffiths J., Parish J.H., Brown S.T. Photoinactivation of bacteria. Use of a cationic water-soluble zinc phthalocyanine to photoinactivate both gram-negative and gram-positive bacteria. J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1996. V. 32. P.P. 159-164; Jori G. Photodynamic therapy of microbial infections: state of the art and perspectives. J. Environ. Pathol. Toxicol. Oncol. 2006. V. 25. P.P. 505-519. Патент РФ №2282647, C09B 47/32, 2006 г.].
Грибы имеют более просто устроенную внешнюю клеточную стенку. Для фотодинамической инактивации патогенов грибковой природы, например, дрожжевых грибов рода Candida, могут применяться анионные [Bertoloni G., Reddi Е., Gatta М., Burlini С., Jori G. Factors influencing the haematoporphyrin-sensitized photoinactivation of Candida albicans. J. Gen. Microbiol. 1989. V. 135. P. 957-966], амфифильные [Патент РФ №2230110, C12N 1/14, 2004 г.] и катионные фотосенсибилизаторы [Патент РФ №2282647, С09В 47/32, 2006 г.].
Вирусы в связи с особенностями строения представляют собой принципиально отличающуюся от клеточных форм микроорганизмов мишень для антимикробной ФДТ. Наибольшее значение для эффективности фотодинамической инактивации с тем или иным типом красителей имеет наличие, состав и строение оболочки вирионов. Так, анионные красители эффективны в отношении вирусов, имеющих оболочку, а механизм инактивации заключается в окислительной деструкции ее компонентов, в частности, индукции сшивок белков. Общепринято, что вирусы, не имеющие оболочек, более чувствительны к фотосенсибилизаторам катионного типа, которые имеют сродство к нуклеиновым кислотам и индуцируют окисление их азотистых оснований, главным образом, гуанозина [Wainwright М. Photoinactivation of viruses. Photochem. Photobiol. Sci. 2004. V. 3. P.P. 406-411]. Однако в связи с особенностями строения разных видов вирусов их чувствительность к фотодинамической инактивации с тем или иным красителем является индивидуальной характеристикой.
Для некоторых вирусов, имеющих оболочку, известны способы фотодинамической инактивации также с использованием катионных красителей. Так, имеющий оболочку вирус герпеса более эффективно инактивируется в присутствии катионных и амфифильных производных фталоцианинов по сравнению с анионным Мероцианином 540 [Smetana Z., Mendelson Е., Manor J., van Lier E., Ben-Hur E., Salzberg S., Malik Z. Photodynamic inactivation of herpes viruses with phthalocyanine derivatives. J. Phorochem. Photobiol. B. 1994. V. 22. P.P. 37-43].
Фталоцианины с положительно заряженными остатками на центральном атоме кремния используются для инактивации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) при обеззараживании компонентов крови [Ben Hur Е., Moor C.E,, Margolis-Nunno H, Gottlieb P., Zuk M.M. et al. The photodecontamination of cellular blood components: mechanisms and use of photosensitization in transfusion medicine. Transf. Med Rev. 1996. V.10. P. 15-22].
Монокатионный краситель метиленовый голубой эффективен в инактивации лишенного оболочки аденовируса [Schagen F., Moor А.С, Cheong S.C., Cramer S.J., van Ormondt H., van der Eb A J., Dubbelman Т., Hoeben R.C. Photodynamic treatment of adenoviral vectors with visible light: an easy and convenient method for viral inactivation. Gene Therapy. 1999. V. 6 P.P. 873-881] и имеющего оболочку денге вируса [Huang O., Fu W.L., Chen В., Huang J.F., Zhang X., Xue O. Inactivation of dengue virus by methylene blue/narrow bandwidth light system. J Pnotochem Photobiol B. 2004. V. 77. P.P. 39-43].
В то же время катионный порфирин, вызывающий инактивацию ряда вирусов, имеющих липидные оболочки, оказался неэффективен в отношении лишенного оболочки парвовируса [Trannoy L.L., Terpstra F.G., de Korte D., Lagerberg J.W.,Verhoeven A.J., Brand A., van Engelenburg F.A. Differential sensitivities of pathogens in red cell concentrates to Tri-P(4)-photoinactivation. 2006. Vox Sang V 91. P.P. 111-118].
Таким образом, антивирусная активность сложным образом зависит от физико-химических характеристик красителя и природы объекта фотоинактивации, что затрудняет прогнозирование на основании имеющихся в литературе данных эффективности новых фотосенсибилизаторов и чувствительности неиспытанных видов вирусов.
Несмотря на большое значение разработки эффективных способов борьбы с вирусом «птичьего гриппа», возможность его фотодинамической инактивации для обеззараживания различных сред не изучалась.
Известен способ фотоинактивации вируса гриппа Н5 серогруппы и вируса «птичьего гриппа», выбранных авторами за прототип, с использованием ультрафиолетовых бактерицидных (253,7 нм) облучателей (Информационное письмо ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор» от 2005 г.). Недостатком этого способа является применение коротковолнового УФ излучения, оказывающего вредное воздействие на организмы человека и животных.
Задача предлагаемого изобретения заключалась в разработке такого способа фотоинактивации вируса «птичьего гриппа», который бы обеспечил 100% инактивацию вируса при кратковременном (в течение нескольких минут) действии безвредного излучения видимого спектрального диапазона - белого или красного света.
Поставленная задача решается применением фотосенсибилизаторов - водорастворимых красителей катионного типа путем их введения до облучения в вирусосодержащую среду в концентрации 0,25-2 мкг/мл.
Применение фотосенсибилизатора в концентрации менее 0,25 мкг/мл не обеспечивает эффективную фотоинактивацию, а повышение ее выше 2 мкг/мл нецелесообразно, т.к. не дает повышения эффективности.
Способ осуществляется следующим образом.
9
3
3
50
В экспериментах используют вирус гриппа А птиц подтипа H5N1 (РНК-содержащий, имеющий оболочку вирус) в экстраэмбриональной жидкости с исходным титром 10 ЭЛД (эмбриональных летальных доз). Готовят ряд десятикратных разведений вируса, для чего к 0,5 см вируссодержащей жидкости добавляют 4,5 см физиологического раствора.
2
7
2
50
В вируссодержащую жидкость с дозой вируса 10-10 ЭЛД/мл вводят катионный краситель в концентрации 0,25-2 мкг»мл и через 10 мин облучают 5 мин с использованием галогенового источника белого света (освещенность на уровне образца - 65000 люкс) или светодиодного источника красного света (плотность мощности на уровне образца 17 мВт/см).
В качестве фотосенсибилизаторов применяют, например, монокатионные красители профлавин ацетат и метиленовый голубой или октакатионный октакис(N-(2-гидроксиэтил)-N,N-диметиламмониометил фталоцианин цинка октахлорид (Холосенс).
3
Заражение проводят на 10-дневных развивающихся куриных эмбрионах. Обработанным материалом с различными разведениями вируса заражают по 6 эмбрионов. Для заражения эмбриона пробойником пробивают в скорлупе 2 отверстия на глубину 1,2±0,3 мм, в которые 1 инокулируют по 0,1 см, отверстия заливают расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы помещают в термостат при температуре 37±0,5°С и овоскопируют 2 раза в день. Учет гибели зараженных эмбрионов заканчивают через 72 часа (через 24 часа после гибели последних эмбрионов). Погибшие эмбрионы вскрывают в день гибели. Результат специфичности гибели куриных эмбрионов подтверждают в реакции гемагглютинации (РГА). Для этого от каждого погибшего эмбриона отдельно стерильно собирают аллантоисную жидкость, которую проверяют на гемагглютинирующую активность и идентичность в РГА.
Контролями служат: вируссодержащие жидкости без обработки светом (Контроль 1); вируссодержащие жидкости с препаратом без обработки светом (Контроль 2); вируссодержащие жидкости без препарата, обработанные светом (Контроль 3); интактные куриные эмбрионы (Контроль 4).
Об инактивации вируса в инокуляте, используемом для заражения куриных эмбрионов, судят по полному падению инфекционности, т.е. потере способности вызывать гибель эмбрионов. Определяют дозу вируса, которая может быть инактивирована с помощью фотодинамической обработки при определенной концентрации катионного красителя.
Предлагаемое изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами.
Пример 1
2
4
50
В вируссодержащие жидкости с различными дозами вируса вводят краситель профлавин ацетат в концентрации 1,0 или 2,0 мкг/мл и через 10 мин облучают белым светом (доза 15 Дж/см). Результаты представлены в таблице 1. Наблюдают полное падение инфекционности (100% выживания куриных эмбрионов) при дозе вируса в обрабатываемой жидкости не более 10ЭЛД/мл. Результаты представлены в таблице 1.
Пример 2
6
50
Аналогично при использовании 1,0 мкг/мл красителя метиленового голубого наблюдают полное падение инфекционности при дозе вируса не более 10 ЭЛД/мл. Результаты представлены в таблице 1.
Пример 3
7
50
Аналогично при использовании 2,0 мкг/мл метиленового и голубого наблюдают полное падение инфекционности при всех испытанных дозах вируса вплоть до 10 ЭЛД/мл. Результаты представлены в таблице 1.
Пример 4
7
50
Аналогично при использовании 1,0 или 2,0 мкг/мл Холосенса наблюдают полное падение инфекционности при всех испытанных дозах вируса вплоть до 10 ЭЛД/мл. Результаты представлены в таблице 1.
Пример 5
2
4
5
7
50
В вируссодержащие жидкости с различными дозами вируса вводят Холосенс в концентрации 0,25, 0,5 или 1,0 мкг/мл и через 10 мин облучают красным светом (доза 5,1 Дж/см). Результаты представлены в таблице 2. Наблюдают полное падение инфекционности при дозах вируса в обрабатываемой жидкости 10, 10 или 10 ЭЛД/мл. Результаты представлены в таблице 2.
4
50
Таким образом, введение в вируссодержащую среду доступных монокатионных красителей профлавина ацетата или метиленового голубого и последующее облучение в течение 5 мин с использованием источника белого света, создающего освещенность, сходную с естественным солнечным светом, обеспечивает 100% инактивацию вируса «птичьего гриппа» при определенных титрах. Профлавин ацетат в концентрации 1,0-2,0 мкг/мл может быть использован для фотоинактивации вируса «птичьего гриппа» при титрах не более 10 ЭЛД/мл. В случае более высокой вирусной контаминации целесообразно применять метиленовый голубой в концентрации до 2,0 мкг/мл.
7
50
Использование предложенного способа с применением нового октакатионного красителя Холосенса позволяет надежно обеззараживать жидкости с высокими титрами вируса «птичьего гриппа». Обработка Холосенсом в концентрации 1,0-2,0 мкг/мл и облучение в течение 5 мин белым или красным светом обеспечивает 100% инактивацию вируса «птичьего гриппа» при всех испытанных титрах, включая 10 ЭЛД/мл.
Противовирусная, а также антибактериальная и противогрибковая активности [Патент РФ №2282647, С09В 47/32, 2006 г.] Холосенса проявляются при сходных режимах фотодинамического воздействия, в связи с чем Холосенс целесообразно также использовать для фотообеззараживания в случае смешанных микробных контаминаций.
Напротив, при фотоинактивации с применением бактерицидного УФ излучения выявлена большая (3,4-кратная) устойчивость вирусов по сравнению с вегетирующими бактериями [Chang J., Ossoff S.F., Lobe D.C., Dorfman M.H., Dumais C.M., Qualls R.G., Johnson J.D. UV inactivation of pathogenic and indicator microorganisms. Applied and Enviromental Microbiology. 1985. P.P. 1361-1365], в результате чего для обеззараживания воды при смешанной контаминации необходимо применять повышенные дозы вредного УФ излучения.
Внедрение нового способа фотоинактивации вируса гриппа А птиц подтипа H5N1 может уменьшить все возрастающую распространенность вызываемых им заболеваний.
Предлагаемый способ включает применение низких концентраций фотосенсибилизаторов и безвредного белого или красного света, что обеспечивает его безопасность и экономические преимущества.
Таблица 1. Вирулицидная активность красителей катионного типа в отношении вируса гриппа А птиц подтипа H5N1 при облучении в течение 5 минут белым светом
Вещество
Концентрация
Доза вируса ЭЛД<sub>50</sub>/мл
% выживания КЭ
Титр в РГА
10<sup>2</sup>
100,0
0
10<sup>3</sup>
100,0
0
1,0 мкг/мл
10<sup>4</sup>
100,0
0
Пример 1
10<sup>5</sup>
33,3
>1:16
10<sup>6</sup>
0
>1:16
Профлавин
10<sup>7</sup>
0
>1:16
ацетат
10<sup>2</sup>
100,0
0
10<sup>3</sup>
100,0
0
2,0 мкг/мл
10<sup>4</sup>
100,0
0
Пример 1
10<sup>5</sup>
50,0
>1:16
10<sup>6</sup>
0
>1:16
10<sup>7</sup>
0
>1:16
10<sup>2</sup>
100,0
0
10<sup>3</sup>
100,0
0
1,0 мкг/мл
10<sup>4</sup>
100,0
0
Пример 2
10<sup>5</sup>
100,0
0
10<sup>6</sup>
100,0
0
Метиленовый
10<sup>7</sup>
0
>1:16
голубой
10<sup>2</sup>
100,0
0
10<sup>3</sup>
100,0
0
2,0 мкг/мл
10<sup>4</sup>
100,0
0
Пример 3
10<sup>5</sup>
100,0
0
10<sup>6</sup>
100,0
0
10<sup>7</sup>
100,0
0
10<sup>2</sup>
100,0
0
10<sup>3</sup>
100,0
0
1,0 мкг/мл
10<sup>4</sup>
100,0
0
Пример 4
10<sup>5</sup>
100,0
0
10<sup>6</sup>
100,0
0
Холосенс
10<sup>7</sup>
100,0
0
10<sup>2</sup>
100,0
0
10<sup>3</sup>
100,0
0
2,0 мкг/мл
10<sup>4</sup>
100,0
0
Пример 4
10<sup>5</sup>
100,0
0
10<sup>6</sup>
100,0
0
10<sup>7</sup>
100,0
0
Контроль 1
-
10<sup>7</sup>
0
>1:16
Контроль 2
2,0 мкг/млПрофлавинацетат
10<sup>7</sup>
0
>1:16
Контроль 2
2,0 мкг/млМетиленовый голубой
10<sup>7</sup>
0
>1:16
Контроль 2
2,0 мкг/мл Холосенс
10<sup>7</sup>
0
>1:16
Контроль 3
-
10<sup>7</sup>
0
>1:16
Контроль 4
-
-
100,0
0
Таблица 2. Вирулицидная активность Холосенса в отношении вируса гриппа А птиц подтипа H5N1 при облучении в течение 5 мин красным светом (5,1 Дж/см<sup>2</sup>)
Доза вируса
% выживания КЭ
Титр в РГА
10<sup>2</sup>
100,0
0
10<sup>3</sup>
66,6
>1:16
0,25 мкг/мл
10<sup>4</sup>
0
>1:16
Пример 5
10<sup>5</sup>
0
>1:16
10<sup>6</sup>
0
>1:16
10<sup>7</sup>
0
>1:16
10<sup>2</sup>
100,0
0
10<sup>3</sup>
100,0
0
Холосенс
0,5 мкг/мл
10<sup>4</sup>
66,6
>1:16
Пример 5
10<sup>5</sup>
33,3
>1:16
10<sup>6</sup>
0
>1:16
10<sup>7</sup>
0
>1:16
10<sup>2</sup>
100,0
0
10<sup>3</sup>
100,0
0
1,0 мкг/мл
10<sup>4</sup>
100,0
0
Пример 5
10<sup>5</sup>
100,0
0
10<sup>6</sup>
100,0
0
10<sup>7</sup>
100,0
0
Контроль 1
-
10<sup>7</sup>
0
>1:16
Контроль 2
1,0 мкг/мл Холосенса
10<sup>7</sup>
0
>1:16
Контроль 3
-
10<sup>7</sup>
0
>1:16
Контроль 4
-
-
100,0
0