Биологические свойства и продуктивность нового штамма базидиомицета G. A. -04 Ganoderma applanatum (Pers. Ex Wallr. ) pat

ЭкРлогия

оптиля, а также масса проростков зависели в большей степени от сорта, а длина главного корня и общая масса корней - от применяемых азотных удобрений. По показателю коэффициента симметрии все исследуемые сорта пригодны для посева в максимально ранние сроки.

Азотные удобрения начинают оказывать влияние на ростовые процессы только тогда, когда растения исчерпывают свой запас питательных веществ и от гетеротрофного типа питания переходят к автотрофному [8].

Литература

1. Физиология и биохимия покоя и прорастания семян: пер. с англ. / Н.А. Аскоченской [и др.]. - М.: Колос, 1982. - 495 с.

2. Яровая пшеница /А.И. Бараев [и др.]. - М.: Колос, 1978. - 429 с.

3. Генкель, П.А. Физиология сельскохозяйственных растений / П.А. Генкель // Минеральное питание. Рост и развитие. Эмбриогенез и органогенез. Т. 2. - М.: Изд-во МГУ, 1967. - 482 с.

4. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований) - 3-е изд., перераб. и доп. / Б.А. Доспехов. - М.: Колос, 1973. - 336 с.

5. Каюмов, М.К. Физиология и биохимия растений: учеб. пособие / М.К. Каюмов; Рос. гос. аграр. заоч. ун-т.

- М., 2004. - 192 с.

6. Коваль, С.Ф. Растение в опыте / С.Ф.Коваль, В.П. Шаманин. - Омск: Изд-во ОмГАУ, 1999. - 204 с.

7. Петербургский, А.В. Агрохимия и физиология питания растений. - 2-е изд., перераб. / А.В. Петербургский.- М.: Россельхозиздат, 1981. - 184 с.

8. Реймерс, Ф.Э. Прорастание семян и температуры / Ф.Э. Реймерс, И.Э. Илли. - Новосибирск: Наука, 1978. - 168 с.

9. Реймерс, Ф.Э. Физиология семян культурных растений Сибири / Ф.Э. Реймерс, И.Э. Илли. - Новосибирск: Наука, 1974. - 142 с.

10. Смирнов, П.М. Агрохимия. - 2-е изд., перераб. и доп. / П.М. Смирнов, Э.А. Муравин. - М.: Колос, 1984.

- 304 с.

---------♦-----------

УДК 561.284.579.61 Г.К. Ковалева, Т.И. Громовых

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ПРОДУКТИВНОСТЬ НОВОГО ШТАММА БАЗИДИОМИЦЕТА Э. Д.-04 вАЫОйЕЯМА АРРЬАЫАГиМ ^Б. ЕХ WALLR.) РДТ.

Проведены исследования по количественному содержанию общего белка и аминокислот. Исследованы токсичность в отношении белых мышей аут-бредной линии ICR и антибактериальные свойства водных экстрактов из мицелия и плодовых тел штамма G. a.-04 Ganoderma applanatum.

Одним из приоритетных направлений развития современных микробиологии и биотехнологии является разработка технологий с использованием базидиальных грибов для получения биологически активных соединений, в том числе обладающих лекарственными свойствами. Благодаря исследованиям последних десятилетий, стало известно, что базидиальные грибы являются продуцентами целого ряда биологически активных веществ: белков, липидов, полисахаридов, органических кислот, ферментов, витаминов и др. Многие из этих соединений являются фармакологически активными и, по сравнению с продуктами химического синтеза, менее токсичными и более эффективными при применении в медицинской практике. Разработаны многочисленные биологически активные добавки на основе плодовых тел высших грибов.

В настоящее время на фармацевтическом рынке Японии имеется около десятка препаратов на основе глюканов, полученных из высших базидиомицетов (например, шизофилан (из Schizophyllum commune), крестин (из Trametes versicolor), лентинан (из Lentinus edodes) и др.). Эффективность этих препаратов очень высокая и они занимают в Японии около 30% рынка онкостатиков и иммунокорректоров. В народной меди-

цине России популярностью и доверием пользуется фактически только один гриб - чага, или березовый гриб, Inonotus obliguus (Fr.) Pil., препараты которого признаны и в официальной медицине [2, 5].

К сожалению, большинство работ по поиску и выделению биологически активных веществ базидио-мицетов проведены с использованием плодовых тел. Известно, что биологически активные вещества высших грибов содержатся не только в базидиомах, но и в вегетативном мицелии гриба, получаемом путем жидкофазного и твердофазного культивирования. Так, на основе сухой биомассы базидиомицета Trametes pu-bescens создана лечебно-профилактическая пищевая добавка трамелан [4]. Важным преимуществом получения биомассы мицелия с помощью биотехнологических методов являются: экологическая чистота получаемых препаратов, неограниченная возможность производства, недефицитность сырьевых ресурсов и без-отходность производства.

Несмотря на то, что общий объем публикаций, посвященный базидиомицетам, чрезвычайно велик, относительно мало работ по сравнительному анализу биологической активности плодовых тел и вегетативного мицелия.

Целью исследования явилось проведение сравнительного анализа биологических свойств и биохимического состава белка вегетативного мицелия и плодовых тел нового штамма базидиомицета G. a.-04 Gano-derma applanatum (Pers. ex Wallr.) Pat.

Методы исследований. В результате исследований из плодовых тел, собранных в лесных комплексах на территории Красноярского края в 2004 г., был выделен в чистую культуру новый штамм G. a.-04 Gan-oderma applanatum.

Биомассу мицелия наращивали на неохмеленном пивном сусле, разбавленном дистиллированной водой (1,3°Б), в колбах в течение 14 суток при температуре 25 ± 1°С. Водные экстракты из мицелия и плодовых тел гриба готовили из высушенной при комнатной температуре и измельченной на гомогенизаторе биомассы путем холодной экстракции дистиллированной водой в соотношении 1:30 к растворителю, после чего суспендировали при комнатной температуре на качалке (120 об/мин) в течение пяти часов.

Водные экстракты из мицелия и плодовых тел исследовали на токсичность. В качестве тест-объектов использовали самок и самцов белых мышей аутбредной линии ICR (по 7 животных на каждый эксперимент). Исходные экстракты и их разведение в соотношении 1:10, 1:100 и 1:1000 вводили внутрибрюшинно и подкожно. Животным контрольных групп вводили соответствующее количество физиологического раствора. О токсическом действии судили по общему состоянию и поведению животных, а также летальности в течение срока наблюдения.

Оценку биохимического состава белка мицелия и плодовых тел гриба проводили по следующим показателям: общий белок и аминокислотный состав. Общее содержание белка в образцах определяли с помощью красителя амидо-черного 10В по Бузуну. Гомогенат с 1 мл осаждающего реагента выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин. После чего объем в пробирке доводили до 10 мл и центрифугировали 15 мин при 9000 об/мин. Количество белка определяли по показателю оптической плотности надоса-дочной жидкости с помощью аппарата СФ-26 (Л=500 ± 10 нм). Используя калибровочную кривую, предварительно построенную по сывороточному альбумину быка, рассчитывали количество белка в образцах. Аминокислотный состав белков определяли на автоматическом анализаторе аминокислот ААА 339М (Microtechna, Чехия). Гидролиз белков и подготовка образцов для аминокислотного анализа проводили по методике, описанной в работе Б. П. Плешкова [3].

Оценку антимикробного действия изучали методом лунок [1]. В качестве тест-культур были использованы 5 штаммов условно-патогенных грамположительных микроорганизмов рода Staphylococcus (S. aureus, S. epidermidis, S. caprae, S. warneri, S. cophnii) и один штамм дрожжеподобного гриба Candida albicans. Тест-организмы выращивали на унифицированной питательной среде - агаре Мюллера-Хинтона. Суточную культуру микроорганизмов суспендировали в физиологическом растворе до мутности 0,5 по стандарту McFarland (1,5 х 108 КОЕ/мл) и использовали в течение 15 мин. Инокуляцию культуры на чашку осуществляли штрихами в трех направлениях под углом 60°, каждый раз поворачивая чашку вокруг своей оси. В заключение делали несколько вращательных движений тампоном по краям агаровой пластинки. После чего в питательной среде с помощью пробойника делали лунки, в которые вносили экстракт в количестве 0,1 мл. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение суток.

Противоопухолевое действие водного экстракта из мицелия базидиомицета G. applanatum изучали в отношении опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха in vitro. К водному экстракту из мицелия прибавляли взвесь опухолевых клеток в питательной среде 199 с титром 4.02 х 106 в соотношении 1:10. Культивирование проводили на водяной бане при температуре 37°С. Противоопухолевое действие оценивали по физиологическому состоянию клеток карциномы Эрлиха с окрашиванием 1% раствором метиленового синего:

живые клетки, клетки с признаками блебинга (частичное разрушение клеточной стенки и выход содержимого цитоплазмы наружу) и мертвые клетки. Подсчет клеток осуществляли с помощью камеры Горяева при увеличении на 640 под микроскопом SK 14 26183, Польша.

Результаты исследование и их обсуждение. Штамм G. a.-04 Ganoderma applanatum хорошо культивируется на жидких и агаризованных питательных средах с образованием септированного с разветвленными, тонкостенными клеточными стенками мицелия. Генеративные гифы с пряжками, бесцветные, изредка буроватые (рис.).

Морфология колоний и мицелия штамма G. a.-04 Ganoderma applanatum

Биохимический анализ штамма G. a.-04 Ganoderma applanatum показал, что доля белка в мицелии составляет 23,43%, тогда как в плодовом теле всего 14,95%.

В общих фракциях мицелия и плодового тела преобладает гистидин, входящий в группу незаменимых аминокислот. Кроме того, присутствуют такие аминокислоты, как метионин, изолейцин, лейцин, аргинин. В незначительных количествах присутствуют лизин и валин. Отсутствует триптофан, который содержится в плодовых телах и мицелии многих базидиомицетов (табл. 1).

Таблица 1

Содержание аминокислот в мицелии и плодовом теле базидиомицета G. a. - 04 Ganoderma applanatum, mol %

Аминокислота Мицелий Плодовое тело

Незаменимые

Валин 3,83 1,29

Метионин 0,96 0,95

Изолейцин 6,88 1,71

Лейцин 3,97 6,68

Гистидин 35,04 10,78

Лизин 0,53 1,54

Аргинин 6,02 0,97

Заменимые

Аспарагиновая кислота 7,16 5,27

Треонин 2,98 1,69

Серин 3,10 1,55

Глютаминовая кислота 11,79 7,77

Пролин - 0,57

Глицин 6,43 22,42

Аланин 5,06 30,42

Тирозин 6,25 5,13

Фенилаланин - 1,26

В составе заменимых аминокислот общей фракции мицелия преобладает глютаминовая кислота, тогда как в общей фракции плодового тела - глицин и аланин. Совершенно отсутствует в составе мицелия пролин и фенилаланин, которые выявлены в плодовом теле.

Изучение бактерицидной активности показало, что водные экстракты из мицелия и плодовых тел ба-зидиомицета G. applanatum не проявляют антибактериальных свойств в отношении условно-патогенных микроорганизмов рода Staphylococcus и Candida albicans.

Изучаемый штамм не обладает токсическим действием. Проведенные исследования всех изученных концентраций водных экстрактов из мицелия и плодовых тел гриба G. applanatum при внутрибрюшинном и подкожном введении самцам и самкам белых мышей аутбредной линии ICR были отнесены к классу нетоксичных.

Изучение противоопухолевой активности водного экстракта из мицелия гриба G. applanatum проводили в экспериментах in vitro на клетках, полученных из асцитной опухоли мышей. Клетки карциномы Эрлиха оказались чувствительны к действию экстракта. Так, через 2 ч после введения экстракта в культуру клеток, число клеток с признаками блебинга составило 17,21%, тогда как число погибших клеток - 7,11%. Дальнейшее действие экстракта приводит к увеличению смертности и блебинга клеток (табл. 2).

Таблица 2

Действие водного экстракта мицелия базидиомицета G. applanatum на клетки асцитной карциномы Эрлиха in vitro, %

Время культивирования Живые клетки С признаками блебинга Окрашены 1% метиленовой синью

экстракт контроль экстракт контроль экстракт контроль

20 мин 94,85±1,58 97,72±1,79 2,41 ±0,04 1,89±0,09 2,74±0,04 0,39±0,01

1 ч 92,87±1,01 94,86±1,12 2,73±0,25 0,97±0,01 4,40±0,16 2,28±0,01

2 ч 75,68±1,25 93,46±0,57 17,21 ±0,13 4,48±0,09 7,11 ±0,02 2,06±0,01

3 ч 48,96±0,98 90,10±1,95 36,36±0,75 5,73±0,21 14,68±0,11 4,17±0,17

Таким образом, можно утверждать, что в экспериментах in vitro водный экстракт проявляет цитопати-ческий эффект в отношении асцитной карциномы Эрлиха. Для подтверждения противоопухолевого действия необходимо проведение экспериментов in vivo.

В заключение следует, что новый штамм G. а. - 04 Ganoderma applanatum имеет аминокислотный состав, отличающийся от такового у плодового тела, и может служить источником для получения гистидина, глютаминовой кислоты и изолейцина. Кроме того, мицелий может представлять интерес для дальнейших исследований по поиску противоопухолевых препаратов.

Литература

1. Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров. - М., 2004. - 567 с.

2. Круподерова, Т.А. Лекарственные свойства грибов рода Ganoderma P. Karst / Т.А. Круподерова // Успехи

медицинской микологии. - Т. VII. - М.: Изд-во Национальной акад. микологии, 2006. - С. 288-290.

3. Плешков, Б.П. Практикум по биохимии растений. - Изд. 2-е, доп. и перераб. / Б.П. Плешков. - М.: Колос, 1976. - 310 с.

4. Скворцова, М.М. Иммунотропные свойства БАД «Трамелан». Биохимические, медико-биологические и клинические исследования / М.М. Скворцова, Е.С. Горшина // Успехи медицинской микологии. - Т. VII. -М.: Изд-во Национальной акад. микологии, 2006. - С. 198-199.

5. Чхенкели, В.А. Биоэкологические аспекты изучения и использования биологически активных веществ

дереворазрушающего гриба Coriolus pubescens (Shum.: FR.) Quel.: автореф. дис. ... д-ра биол. наук / В.А. Чхенкели. - Иркутск, 2006.

---------♦'----------