ВЫДЕЛЕНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
NUCLEIC ACIDS ISOLATION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способам и продуктам для выделения нуклеиновых кислот из биологических образцов, в первую очередь биологических образцов, содержащих клеточный материал. Аспекты настоящего изобретения дополнительно относятся к способам получения нуклеиновых кислот из биологических образцов для амплификации нуклеиновых кислот.
Уровень техники
Одной из основных проблем диагностики с применением технологии амплификации нуклеиновых кислот является предварительная обработка клеточного материала для выделения нуклеиновых кислот перед процессом амплификации. Технологии, основанные на шариках из силикагеля и магнитных шариках, неэффективны (<=10%) и требуют оптимизации для конкретных целей; тот же самый способ, как правило, не совместим с другими типами образцов. Способы с высоким выходом, использующие фенол и хлороформ, не подходят из-за токсичности компонентов. Способы, основанные на использовании детергентов, обеспечивают простой процесс лизиса, но требуют повышенных температур (95°C), которые не совместимы с одностадийной ОТ-ПЦР, поскольку обратная транскриптаза не является термостабильной.
Современные способы включают выделение нуклеиновых кислот в очищенном виде из другого клеточного материала. Как правило, это требует разрушения клеток с применением ферментов, таких как лизоцим, или детергентов. Mycobacterium требует жесткую предварительную обработку NALC-NaOH для разрушения клеток. Белки удаляют путем гидролиза с применением соответствующих протеаз (например, протеиназы К). Нуклеиновые кислоты связывают со смолой подложки или заряженной матрицей (например, магнитными частицами) и промывают. Нуклеиновые кислоты удаляют с заряженной подложки путем изменения pH в соответствующем буфере. Это приводит к высокой степени чистоты нуклеиновых кислот.
Известные в уровне техники системы, например, Cepheid, Enigma Diagnostics, Roche, Geneprobe, BD и т.д., интегрировали этот традиционный лабораторный способ выделения нуклеиновой кислоты в их диагностические инструменты. Однако данный способ является сложным, дорогостоящим и направленным на конкретные типы образцов.
В настоящем документе описан способ, который является более простым и обеспечивает получение нуклеиновых кислот, способных к амплификации с помощью ПЦР, в простой, одноразовой системе, основанной на бумаге, работающей при комнатной температуре, способной разрушать бактериальные клетки, клетки грибов и вирусы и высвобождать нуклеиновые кислоты в раствор для прямого анализа методом ПЦР.
Международные патентные заявки WO 00/62023 и WO 02/16383 от Watman, Inc, описывают способы лизиса клеток и выделения нуклеиновых кислот с помощью покрытой фильтровальной среды. Фильтрующий материал представляет собой нитроцеллюлозу, обработанную FTA и покрытую анионным детергентом, например, SDS. Покрытие лизирует клетки, а фильтр, обработанный FTA, адсорбирует нуклеиновые кислоты. Покрытие связано с фильтром нековалентно и может быть удалено путем промывки. Нуклеиновые кислоты могут быть элюированы с фильтра для последующей обработки.
Международная патентная заявка WO 2008/134464 от 3M Innovative Properties Company описывает субстрат с присоединенными функциональными группами, лизирующее вещество, матричное вещество и сахарид для применения при выделении нуклеиновых кислот из образцов.
Патентная заявка США 2007/0185322, Akhavan-Tafti, описывает способы выделения РНК из образца, включающие применение кислого раствора и твердофазного связующего вещества, позволяющие высвободить нуклеиновые кислоты без проведения предварительного лизиса клеток. Упоминается применение четвертичных солей аммония для связывания нуклеиновых кислот. Заявка США 2005/0042661, Tarkkanen et al, также описывает применение четвертичных аммониевых соединений, избирательно высвобождающих нуклеиновые кислоты из клеток.
Международные патентные заявки WO 2004/087226 и WO 2006/071191 от Appeartex AB и патент США 5064613, Higgs et al, описывают антимикробные соединения, включающие четвертичные соли аммония.
Сущность изобретения
В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предложен способ получения нуклеиновых кислот из биологического образца, включающего: а) клеточный материал, имеющий клеточную мембрану, или b) клеточный материал, имеющий клеточную стенку, или c) вирусный материал, имеющий вирусную оболочку, или d) вирусный материал, имеющий вирусный капсид; при этом способ включает контактирование образца с субстратом, причем субстрат функционализирован биоцидным агентом, который способен: i) ослаблять клеточную мембрану, клеточную стенку, вирусную оболочку или вирусный капсид; или ii) лизировать клеточный или вирусный материал. Способ может дополнительно включать стадию, на которой данный образец подвергается нагреванию после стадии контактирования. Например, образец может быть непосредственно добавлен в реакцию амплификации нуклеиновой кислоты. Стадия термической обработки необходима, чтобы лизировать ослабленную клеточную стенку, ослабленную клеточную мембрану, вирусную оболочку или вирусный капсид, чтобы высвободить нуклеиновую кислоту. Стадия термической обработки не обязательно необходима для высвобождения нуклеиновой кислоты, например, если биоцидный агент способен лизировать клеточный или вирусный материал.
Таким образом, способ позволяет осуществить быстрое и простое получение нуклеиновой кислоты из биологического образца для дальнейшей обработки.
Субстрат предпочтительно состоит из целлюлозного материала; например, целлюлозной фильтровальной бумаги или целлюлозной матрицы. Целлюлозным материалом может быть многослойная бумага; например, целлюлозная многослойная бумага может содержать слой для латерального потока для удаления жидких и низкомолекулярных загрязняющих веществ и ингибиторов из образца, который наносят на поверхность бумаги. Целлюлоза обладает тем преимуществом, что она имеет множество свободных гидроксильных групп, к которым могут быть присоединены биоцидные агенты. В некоторых вариантах осуществления, целлюлозный материал может дополнительно содержать реагенты для проведения желаемых действий с образцом; например, РНКазы, протеазы и т.п., для очистки образца. Предпочтительным субстратом является целлюлозная бумага, полученная из хлопка, и, в частности, бумага FP 2992 от Hahnemühle FineArt GmbH (Германия).
Могут быть использованы другие материалы субстратов, предпочтительно несущие гидроксильные группы. Например, субстрат может быть из стекла, пластмассы или подобного материала. Хотя в предпочтительном варианте субстрат является фильтровальной бумагой, которая может быть непосредственно добавлена в реакцию амплификации нуклеиновой кислоты, в других вариантах осуществления субстрат может принимать форму микрожидкостного канала или реакционного сосуда, или другого контейнера, вдоль которого или внутри которого биологический образец может проходить или содержаться.
Биоцидный агент предпочтительно содержит несколько функциональных групп. Функциональные группы предпочтительно включают в себя связывающий фрагмент, который участвует в связывании агента с субстратом; гидрофобный фрагмент; и заряженный фрагмент. Гидрофобный фрагмент способен взаимодействовать с клеточной стенкой или мембраной клетки и проникать через клеточную стенку или мембрану клетки. В предпочтительных вариантах гидрофобный фрагмент может быть алкильной цепью, например, С5-С30 алкилом, предпочтительно C10-C20 алкилом. При проникновении алкильной цепи в легко повреждаемую клеточную стенку стенка ослабляется и в ней образуется отверстие. Заряженный фрагмент, предпочтительно положительно заряженный фрагмент, может привлечь заряженную клеточную стенку и может нарушить поток ионов и гомеостаз при контакте с клеточной мембраной, тем самым помогая разрушить клетку и высвободить нуклеиновые кислоты. Заряженный фрагмент предпочтительно представляет собой четвертичную аммониевую группу. Связывающий фрагмент может включать в себя гидроксильную группу.
В предпочтительных вариантах осуществления функциональные группы предпочтительно представляют собой алкильную цепь (гидрофобный фрагмент), силильную группу (связывающий фрагмент) и группу хлорида аммония (заряженный фрагмент). Предпочтительные биоцидные агенты включают силилированные четвертичные аммониевые соединения (SiQAC), в частности, 3-(триметоксисилил)пропилдиметилоктадециламмония хлорид (3-TPAC). Другие биоцидные агенты включают хлориды бензиламмония. Механизм летального действия SiQAC, как принято считать, происходит путем адсорбции положительно заряженной молекулы на отрицательно заряженной поверхности клеток, нарушения клеточной мембраны липофильной цепью молекулы SiQAC и диффузии через мембрану, что ведет к лизису клеток.
Специалисту в данной области известны другие подходящие биоцидные агенты, которые могут быть использованы в настоящем изобретении. Выбор конкретного агента будет определяться наличием предпочтительных функциональных групп, описанных выше, а также природой предполагаемого биологического образца, например, если образец, подлежащий обработке, является образцом клеток млекопитающих, то у него нет клеточной стенки для проникновения, и может быть целесообразно использовать другие функциональные группы.
Примеры других биоцидных агентов, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают:
телехелатные поли (2-алкил-1,3-оксазолины);
целлюлозу с антимикробной группой DDA, присоединенной через PEtOx, которая уничтожает микробные клетки при контакте (Bieser et al (2011), Contact-Active Antimicrobial and Potentially Self-Polishing Coatings Based on Cellulose. Macromol. Biosci., 11, 111-121);
сапонины, которые представляют собой стероидные или тритерпеноидные гликозиды, которые распространены в большом количестве растений и, как уже давно известно, оказывают литическое действие на мембраны эритроцитов, и многие сапонины известны как антимикробные агенты (Francis et al, British Journal of Nutrition (2002), 88, 587-605). Были проведены обширные исследования способности сапонинов пермеабилизовать мембрану. Также было показано, что указанные структурно различающиеся соединения способны уничтожать простейших и действовать как противогрибковые и антивирусные агенты.
В изолированных клеточных мембранах эритроцитов человека при обработке сапонинами возникали поры диаметром 40-50 Å по сравнению с порами 80 Å, возникающими в искусственных мембранах (Seeman et al. 1973 Structure of membrane holes in osmotic and saponin hemolysis. Journal of Cell Biology 56, 519-527).
Для обзора других соединений, которые могут быть использованы в изобретении, см. "Antimicrobial Polymers in Solution and on Surfaces", Siedenbiedel and Tiller (2012) Polymers, 4, 46-71.
Предпочтительно, чтобы биологический образец содержал клеточный материал, имеющий клеточную стенку. Например, клеточный материал может быть прокариотическими клетками, такими как бактериальные клетки; или может быть клетками растений или грибов. Кроме того, биологический образец может содержать клеточный материал, имеющий клеточную мембрану и не имеющий клеточную стенку. Например, клеточный материал может быть эукариотическими животными клетками, в том числе клетками млекопитающих или насекомых. Кроме того, биологический образец может включать вирусный материал.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу амплификации нуклеиновых кислот в биологическом образце, включающему: получение нуклеиновых кислот в соответствии со способом, описанным выше в первом аспекте настоящего изобретения; и стадию амплификации полученных нуклеиновых кислот, предпочтительно с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Амплификация может быть проведена в диагностических целях.
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает устройство для получения нуклеиновых кислот из биологического образца, включающего: а) клеточный материал, имеющий клеточную мембрану, или b) клеточный материал, имеющий клеточную стенку, или c) вирусный материал, имеющий вирусную оболочку или d) вирусный материал, имеющий вирусный капсид; где устройство содержит субстрат, функционализированный биоцидным агентом, который способен i) ослаблять клеточную мембрану, клеточную стенку, вирусную оболочку или вирусный капсид; или ii) лизировать клеточный или вирусный материал.
Субстрат предпочтительно представляет собой целлюлозный материал.
В некоторых вариантах осуществления субстрат может быть интегрирован в картридж для пробоподготовки или тому подобного. Таким образом, устройство может дополнительно содержать реакционный сосуд для получения субстрата или части субстрата. Устройство может дополнительно содержать средство для отделения части субстрата от оставшегося субстрата; это может позволить отделить часть субстрата после того, как был добавлен образец, и затем поместить отделенную часть в реакционный сосуд и использовать в ПЦР.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 показывает структуру молекулы SiQAC, 3-TPAC.
Фиг. 2 иллюстрирует функционализацию целлюлозы SiQAC.
Фиг. 3 представляет собой схематическое изображение принципа действия SiQAC на клетку.
Фиг. 4 показывает обнаружение видов Plasmodium в крови, обработанной SiQAC.
Фиг. 5 сравнивает различные способы обработки бумаги для извлечения ДНК Mycobacterium.
Фиг. 6 показывает данные по качеству для клинических образцов.
Фиг. 7 показывает несколько повторных тестов MTB при различных концентрациях, извлекаемых из мокроты, с использованием описанного способа, ось у показывает пик температуры плавления, и ось х показывает высоту пика.
Фиг. 8 показывает оптимизированный рабочий процесс производства бумаги, функционализированной SiQAC, и анализа проб.
Фиг. 9 показывает выделение микробной ДНК из цельного молока
Фиг. 10 показывает амплификацию нуклеиновой кислоты, полученной из образцов ВИЧ-положительной плазмы.
Фиг. 11 показывает последовательности, полученные из амплифицированной нуклеиновой кислоты ВИЧ.
Подробное описание предпочтительного варианта осуществления
Настоящее изобретение в целом работает следующим образом. Субстрат, такой как целлюлозная фильтровальная бумага, функционализирован биоцидным агентом, предпочтительно SiQAC, более предпочтительно 3-TPAC. Функционализированный субстрат может быть использован в способе подготовки образца для выделения нуклеиновых кислот из клеточного образца для использования в реакции ПЦР.
Клеточный материал наносят на верхний слой бумаги. Жидкость проходит через бумагу, и клеточный материал захватывается на поверхности. Жидкая фаза и любые низкомолекулярные ингибирующие ионы распределяются в слое латерального потока, расположенном ниже поверхностного функционализированного целлюлозного слоя. Микробные клетки в образце (или клетки растений, или животных, или грибов) взаимодействуют с целлюлозой, функционализированной SiQAC, и ослабляются и/или лизируются, высвобождая свое клеточное содержимое обычно в течение 5 минут контакта.
Пробка из многослойной бумаги может быть вырезана из субстрата и добавлена непосредственно в реакцию ПЦР после 10-минутного периода инкубации. Начальное нагревание в ходе ПЦР может служить для дополнительного лизиса оставшихся клеток, чтобы дополнительно высвободить нуклеиновую кислоту. Структура молекулы SiQAC [3-(триметоксисилил)пропилдиметилоктадециламмония хлорида (3-TPAC)] показана на фиг. 1. 3-TPAC был впервые описан в 1972, см. Isquith et al (1972), Appl. Microbiol, 24:6 859-863, http://www.ncbi.nim.nih.gov/pmc/articles/PMC380687/pdf/appimicro00052-0033.pdf). Существует много вариантов базовой химической структуры (например, бензиламмония хлориды, BAC), но все они имеют схожие ключевые фрагменты: вариант хлорида аммония (активный антимикробный агент), кремний в качестве связующего агента (силильная часть) и алкильная цепь. Хлорид аммония представляет собой четвертичную аммониевую группу, которая прикреплена к двум метильным группам и к двум алкильным группам с более длинными цепями. Эта катионная функциональная группа обеспечивает противомикробные свойства, которые приводят к нарушению целостности мембран бактерий, грибов и вирусов, высвобождая содержащиеся нуклеиновые кислоты. Гидрофобная алкильная цепь проникает через клеточные стенки. Триметоксисилиловая группа связывает молекулу с субстратом (например, целлюлозой) с помощью активной гидроксильной группы. Четвертичные аммониевые соединения являются смертельными для широкого спектра организмов, в том числе бактерий, грибков и вирусов с оболочкой, и, в меньшей степени, эндоспор, микобактерий туберкулеза и вирусов без оболочки. Многие биоцидные полимеры, как известно, имеют четвертичные аммониевые группы. Соединения четвертичного аммония (QA) являются одними из наиболее широко используемых антибактериальных агентов для медицинского применения и применения в общественном здравоохранении, и, как было показано, они являются эффективными в отношении как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий (Tashiro (2001) Macromol. Mater. Eng.; 286, 63-87).
Катионные полимеры с группами QA обычно имеют более высокую противомикробную активность, чем их соответствующие мономеры с низкой молекулярной массой [Ikeda and Tazuke, 1983, Makromol. Chem., Rapid Commun. 4 (1983) 459-461]. Более высокая активность связана с большим электростатическим притяжением между клеткой и полимером за счет большей плотности заряда полимера.
SiQAC действуют в два этапа. Положительный заряд на молекуле SiQAC притягивает отрицательно заряженную клеточную стенку микроорганизма. Сначала гидрофобная алкильная цепь проникает в аналогично гидрофобную клеточную стенку организма, с которым она вступает в контакт. Когда алкильная цепь проникает в легко повреждаемую клеточную стенку, стенка ослабевает и в ней образуется отверстие. Затем, когда катионная четвертичная аммониевая группа вступает в контакт с клеточной стенкой, она нарушает поток ионов и вызывает их утечку в клеточную стенку или из клеточной стенки, в результате чего, как правило, клетки теряют свое содержимое или разрываются в зависимости от ионного окружения. Заряженная группа четвертичного алкиламмония остается неизменной и доступна для повторения процесса неограниченное число раз.
Из-за этого механизма "физического" и "электрического" уничтожения микроорганизмы не имеют возможность развивать сопротивляемость или устойчивость к SiQAC.
4
+
Соединения четвертичного аммония широко используются в качестве дезинфицирующих средств, антисептиков, фармацевтических продуктов и в косметике и могут быть альтернативой для дезинфекции фруктов и овощей. Все четвертичные аммониевые соединения (QAC) являются катионными соединениями, которые имеют базовую структуру (NH). Эти соединения проникают в бактериальную клеточную стенку, реагируя с цитоплазматической мембраной, вызывая лизис клеточной стенки, опосредованный автолитическими ферментами (McDonnell, G. & Russell, A.D. 1999 Antiseptics and disinfectants: activity, action and resistance. Clinical Microbiology Reviews 12, 147-179).
Триметоксисилиловые группы взаимодействуют с гидроксильными группами на таких поверхностях, как стекло и хлопок, с образованием ковалентных связей, которые держат соединения QA на поверхности и не допускают их растворения в воде. Триметоксисилиловые группы могут также реагировать друг с другом, формируя высокостабильное сшитое силановое покрытие, связанное с обработанной поверхностью. Эти покрытия, как было показано, придают биоцидную активность поверхности во многих областях применения без высвобождения химических веществ в окружающую среду [Isquith et al, 1972; Isquith et al, 1973 U. S. Patent 3,730,701; Speier and Malek, 1982 J of Colloid and Interface Science 89, 68; Walters et al., 1973, J., Appl. Microbiol. 25, 253]. В то время как эти покрытия были очень эффективны в качестве фунгицидов и антибактериальных агентов, они оказались неэффективными против спор.
Фиг. 2 иллюстрирует функционализацию целлюлозы молекулой SiQAC, 3-TPAC. В неизмененной природной целлюлозе Х представляет собой атом водорода, что дает множество боковых гидроксильных групп (ОН). В быстрой начальной стадии формируется связь между молекулой и гидроксильной группой, образуя силиловый эфир. На второй медленной стадии между соседними диметоксисилильными группами образуются поперечные связи с образованием случайного полимера силиконового эфира, ориентированного параллельно поверхности субстрата.
Катионный остаток не играет никакой роли в связывании с поверхностью, но остается доступным при связывании с поверхностью субстрата. Его структура аналогична соединениям четвертичного аммония, которые являются местными антисептиками, типичным примером которых является додецилдиметиламмоний хлорид (DDAC).
Механизм, посредством которого молекула SiQAC связывается с поверхностью субстрата, химически подобен механизму сшивания полиэтилена с образованием PEX.
Фиг. 3 представляет собой схематическое изображение, показывающее принцип действия функционализированной SiQAC целлюлозы. Цепи SiQAC связываются с волокнами целлюлозы и становятся ориентированными и поперечно-сшитыми (см. А) с образованием активного слоя. Гидрофобная алкильная цепь (см. В) проникает в аналогично гидрофобную клеточную стенку микроорганизма. Когда алкильная цепь проникает в легко повреждаемую клеточную стенку, стенка ослабевает, и в ней образуется отверстие. Затем катионная четвертичная аммониевая группа (C) входит в контакт с клеточной стенкой и нарушает поток ионов и вызывает их утечку в клеточную стенку или из клеточной стенки, в результате чего, как правило, клетка теряет свое содержимое или, в зависимости от ионного окружения, клетка полностью разрывается. В таком ослабленном состоянии быстрый процесс высыхания клеток дополнительно ослабляет клеточную стенку, так что во время начальных циклов ПЦР материал нуклеиновой кислоты высвобождается в раствор и амплифицируется в ходе ПЦР.
Таким образом, механизм действия молекул SiQAC включает в себя ряд различных элементов. Происходит нарушение цитоплазматического и наружного липидных бислоев мембраны и клеточных стенок с помощью алкильной цепи, в результате чего происходит общая и прогрессирующая утечка цитоплазматического материала, в результате чего клетки лизируются, частично или полностью, в зависимости от ионного окружения. Это усиливается положительно заряженными аммонийными группами, которые связываются с отрицательно заряженной фосфолипидной мембраной. Даже при низкой концентрации активных компонентов происходит утечка низкомолекулярных компонентов цитоплазмы (например, K+, нуклеиновых кислот и аминокислот). Соединения SiQAC действуют значительно мощнее, чем несилилированные четвертичные аммониевые соединения, потому что силильная группа связывается с поверхностями, в результате чего антимикробная часть становится локально концентрированной и ориентированной.
Процесс лизиса клеток с помощью соединений SiQAC происходит при комнатной температуре, в отличие от других процессов, известных в уровне техники. Функционализированная SiQAC целлюлоза подходит для ослабления и/или разрушения клеточной стенки бактерий, грибов и белковой оболочки вирусных частиц. В предпочтительных вариантах, она обеспечивает лизис клеточного материала, который готов для ПЦР в течение 5 минут. Функционализированные субстраты и способы согласно настоящему изобретению позволяют выделять нуклеиновые кислоты ДНК и РНК в сочетании с дезактивацией других потенциально вредных агентов в образце в одну стадию. Кроме того, можно извлекать РНК из вирусных частиц в одну стадию без необходимости сложной обработки образца для доступа к РНК для предстоящей ОТ-ПЦР.
Способы могут быть использованы в качестве средства выбора типов клеток для лизиса, например, данные, представленные здесь, показывают, что после 24 часов инкубации в крови клетки цельной крови остаются нетронутыми, в то время как белые кровяные тельца и эритроциты лизируются.
Мы полагаем, что способ с применением SiQAC совместим, по меньшей мере, со следующими микроорганизмами:
бактерии MRSA, CA-MRSA; Micrococcus sp.; Staphylococcus epidermis; Enterobacter agglomerans; Acinetobacter calcoaceticus; Staphylococcus aureus (пигментированный); Staphylococcus aureus (непигментированный); Klibsiella pneumoniae; Pseudomonas aeruginosa; Streptococcus faecalis; Escherichia coli; Proteus mirabilis; Citrobacter diversus; Salmonella typhosa; Salmonella choleraesuis; Cornyebacterium bovis; Mycobacterium smegmatis; Mycobacterium tuberculosis; Brucella canis; Brucella abortus; Brucella suis; Streptococcus mutans; Bacillus subtilis; Clostridium perfringens; Haemophilus influenzae; Haemophilus suis; Lactobacillus easel; Leuconostoc lactis; Listeria monocytogenes; Propionibacterium acnes; Proteus vulgaris;
грибы Alternaria; Aspergillus flavus; Aspergillus fumigatus; Aspergillus niger; Aspergillus terreus; Aspergillus versicolor; Aureobadisium pullulans; Cephaldascus fragrans; Chaetomium globosum; Cladosporium herbarum; Epidermophyton; Fusarium nigrum; Fusarium solani; Glicocladium roseum; Mucor; Oospora lactis; Pencillium albicans; Tricophyton mentagraphophytes; Pencillium elegans; Pencillium funiculosum; Pencillium humicola; Pencillium notatum; Pullularia pullulans; Penicillium variabile; Rhizopus nigricans; Ricoderm; Stachybotrys atra; Trichophyton interdigitalie; Trichderma flavus; Penicillium citrinum;
дрожжи и водоросли Saccharomyces cerevisiae; Candida albicans; Oscillatoria borneti LB143; Anabaena cylindrica; Selenastrum gracile B-325; Pleurococcus LB11 ; Schenedesmus quadricuada; Gonium LB 9c; Volvox LB 9; Chlorella vulgaris; Cyanophyta (сине-зеленые); Chrysophyta (бурые); Chlorophyta (зеленые) Seienastum; Chlorophyta (зеленые) Protococcus;
вирусы HIV; Денге; Гриппа A/B; SARS; H1 N1 (свиной грипп); H3N2; вирус простого герпеса 1 типа;
другие: Plasmodium malariae.
Подробную информацию о антимикробном действии SiQAC можно найти в Isquith et al (1972).
Примеры
Бумага, использованная во всех примерах, представляла собой полученную из хлопка целлюлозную бумагу FP 2992 от Hahnemühle FineArt GmbH (Германия), если не указано иное.
Пример 1
Основанная на бумаге очистка бактериальных культур с применением раствора SiQAC и исследование продукта с помощью ПЦР
Методика
1. Подготовили выращиваемую в течение ночи культуру бактерии (K. pneumoniae, S. aureus и M. Tuberculosis*) и отобрали из нее 50 мкл (*культуру MTB инкубировали 2 недели (O.D.1.1).
2. Подготовили три набора карточек для сушки в течение ночи
i) необработанная бумага,
ii) бумага, функционализированная 5 мкл раствора SiQAC (3-TPAC), разведенного в 15 мкл воды,
iii) бумага, функционализированная 5 мкл раствора SiQAC (3-TPAC), разведенного в 15 мкл Трис-Cl [pH 7,5].
3. Добавляли 20 мкл культур к каждому набору карточек из обработанной и необработанной бумаги и высушивали их при комнатной температуре в течение 10 минут [x 4 повтора на разной бумаге для каждой культуры].
4. С помощью стерильного дерматома вырезали бумажный диск (1,5 мм).
5. Добавляли вырезанный диск в смесь ПЦР (конечный объем 20 мкл).
6. Выполняли 35 циклов универсальной амплификации 16S для каждого из этих опытов; K. pneumoniae и S. aureus, GD MTB/RIF
7. Использовали стандартное пиросеквенирование продуктов ПЦР K. pneumoniae и S. aureus
Результаты
1. ПЦР со стандартных прокладок (набор 1) для K. pneumonia дала в пиросеквенировании в среднем 18 высококачественных прочтений пар оснований.
2. ПЦР с прокладки, обогащенной 5 мкл раствора SiQAC (3-TPAC), разведенного в 15 мкл воды, (набор 2) для K. pneumoniae дала в пиросеквенировании в среднем 24 прочтений пар оснований среднего качества.
3. ПЦР с прокладки, обогащенной 5 мкл раствора SiQAC (3-TPAC), разведенного в 15 мкл Трис-Cl [pH 7,5], (набор 3) для K. pneumoniae дала в пиросеквенировании в среднем 28 высококачественных прочтений пар оснований.
4. ПЦР с необработанной прокладки (набор 1) для S. aureus дала в пиросеквенировании в среднем 16 высококачественных прочтений пар оснований.
5. ПЦР с прокладки, обогащенной 5 мкл раствора SiQAC (3-TPAC), разведенного в 15 мкл воды, (набор 2) для S. aureus дала в пиросеквенировании в среднем 20 прочтений пар оснований среднего качества.
6. ПЦР с прокладки, обогащенной 5 мкл раствора SiQAC (3-TPAC), разведенного в 15 мкл Трис-Cl [pH 7,5], (набор 3), для S. aureus дала в пиросеквенировании в среднем 25 высококачественных прочтений пар оснований.
7. GD MTB/RIF: определение MTB было корректным для трех наборов образцов, включая идентификацию RIF в образцах, обработанных с помощью прокладок, обогащенных 5 мкл раствора SiQAC (3-TPAC), разбавленного 15 мкл Трис-Cl [pH 7,5]
Выводы
Бумага, обогащенная раствором SiQAC (3-TPAC), успешно способствовала лизису бактериальных клеток, позволяя проводить ПЦР с выделенной нуклеиновой кислоты. Это было подтверждено длиной исходных последовательностей, полученных с помощью пиросеквенирования, и обнаружением конечной точки MTB-RIF Mycobacterium tuberculosis, чьи клетки являются трудно разрушаемыми и обычно требуют жесткой обработки NALC-NaOH для достижения такого же уровня разрушения клеток. Необработанная бумага не обеспечивает такие же результаты. Трис-Cl [pH 7,5] необходим для буферизации SiQAC.
Пример 2
Обнаружение видов Plasmodium в крови, обработанной раствором SiQAC
На фиг. 4 показаны результаты обнаружения нуклеиновых кислот из различных видов Plasmodium в пробах крови, полученных от инфицированных пациентов.
Пример 3
Функционализация бумаги и применение способов
Три альтернативных способа функционализации бумаги приведены ниже.
Способ А
2
Бумагу, функционализированную 20 мкл раствора SiQAC (3-TPAC), сушили в течение 24 часов, а затем промывали 20 мкл 5 мМ Трис-Cl [pH 9,0], 0,2 мМ MgCl, затем сушили и
i. наносили образец, сушили в течение 20', вырезали диск и добавляли 20 мкл воды miliQ для ПЦР, или
ii. наносили образец, сушили в течение 20', вырезали диск и промывали его 20 мкл воды miliQ, осторожно пипетировали, использовали 20 мкл для ПЦР.
Способ B
2
Бумагу, функционализированную 20 мкл раствора SiQAC (3-TPAC), сушили в течение 30 минут и промывали 5 мМ Трис-Cl рН [9,0], 0,2 мМ MgCl, затем сушили и
i. наносили образец, сушили в течение 20', вырезали диск и добавляли 20 мкл воды miliQ для ПЦР, или
ii. наносили образец, сушили в течение 20', вырезали диск и промывали его 20 мкл воды miliQ, осторожно пипетировали, использовали 20 мкл в ПЦР.
Способ C
Бумагу, функционализированную 20 мкл раствора SiQAC (3-TPAC), сушили в течение 30 минут и
i. наносили образец, сушили в течение 20', вырезали диск и промывали его 20 мкл воды miliQ, осторожно пипетировали, использовали 20 мкл в ПЦР, или
2
ii. наносили образец, сушили в течение 20', вырезали диск и добавляли 20 мкл 5 мМ Трис-CI [pH 9,0], 0,2 мМ MgCl для ПЦР; или
2
iii. наносили образец, сушили в течение 20', вырезали диск и промывали его 20 мкл 5 мМ Трис-CI [pH 9,0], 0,2 мМ MgCl, осторожно пипетировали, использовали 20 мкл в ПЦР.
Различные способы обработки бумаги сравнивали по выделению ДНК Mycobacterium tuberculosis из клинических проб сырой мокроты между собой и с результатами, полученными с помощью стандартной обработки Cepheid GeneXpert MTB с применением NALC-NaOH. Результаты показаны на фиг.5. (MTB = обнаружен ген rpoB Mycobacterium; RIFs или RIFr = обнаруженные мутации, придающие устойчивость с рифампицину; нет данных = нет обнаружения). Три способа обработки в той или иной степени высвобождали нуклеиновые кислоты в раствор для ПЦР, позволяя обнаружить множественные копии и единственную копию гена rpoB и обнаружить мутацию, придающую устойчивость к рифампицину. Все способы дали сравнимые данные с системой GeneXpert, которая является «золотым стандартом» для таких систем. Способ C дал лучшие результаты по сравнению с указанной системой, обеспечивая высокую степень разрушения клеток и стабильное получение высококачественной ДНК для ПЦР-анализа, что далее было подтверждено пиросеквенированием. Пиросеквенирование показало вариации последовательности, наблюдаемые в последовательности 30 п.о. в ампликонах рибосомальной ДНК V2, длинные желтые и синие прочтения иллюстрируют отсутствие мутаций в последовательности, подтверждая наличие хороших продуктов амплификации.
На фиг. 6 показаны совокупные данные по качеству 5 клинических образцов мокроты (4 × RIFs и 1 × RIFr), обработанных с помощью 7 различных описанных модификаций (т.е. 35 тестов). Измерение температуры плавления для мутаций MTB (голубой) и rpoB, указывающих на RIF статус (RIFs, RIFr), и связанные с ними величины ошибок, представляющие стандартное отклонение для измеренных данных, показывают, что способ не влияет на точность определения пика плавления, которая составляет ±0,5°С. Стандартные методики могут влиять на точность измерения.
Фиг. 7 показывает несколько повторов теста MTB при различных концентрациях, выделенных из мокроты, с применением описанного способа, где по оси у показан пик температуры плавления, а по оси х показана высота пика.
На фиг. 8 показан оптимизированный способ функционализации бумаги соединениями SiQAC и анализа проб.
Пример 4
Пиросеквенирование ДНК Mycobacterium tuberculosis, выделенной с применением SiQAC из образцов мокроты
Три образца мокроты были обработаны с применением многослойных карт, функционализированных SiQAC (3-TPAC). 1,5 мм диски были добавлены к стандартной амплификации 16S рибосомной ДНК без горячего старта (т.е. только повторение циклов), и полученные ампликоны анализировали с помощью пиросеквенирования. Результаты показали хорошую амплификацию коровых областей последовательностей, обеспечивающую прочтения с длиной >25 нуклеотидов, что говорит о хорошем выделении и амплификации.
Режим поиска: расширенный поиск
Средний уровень идентификации: 100%
Поисковая система: PyroMark Q96 ID
Сравнительная база данных: HULPII
Сравнительная последовательность: М. microti ATCC19422.
Образец 1 > CGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTCCTTCTT
Образец 2 > CGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTCCTTCTT
Образец 3 > CGGCTGCTGGCACGTAGTTGGCCGGTCC
Пример 5
Выделение микробной ДНК из цельного молока
Цельное молоко является сложным видом образца для ПЦР, включающим большое количество ингибиторов. Многослойная бумага была функционализирована с применением предпочтительного способа (показан на фиг. 8). Один 1,5 мм диск функционализированной бумаги и высушенный образец молока добавляли в стандартную ПЦР, смешивали с праймерами для универсальной амплификации 16S рибосомной ДНК. Амплифицированную ДНК наносили на стандартный гель. На фиг. 9 показаны результаты. (Дорожка 1: маркер молекулярной массы; дорожка 2: 5 мкл образец сравнения геномной ДНК E. coli + 1 мкл 100% раствора SiQAC (3-TPAC); дорожка 3: 5 мкл образец сравнения геномной ДНК E. coli + 1 мкл 10% раствора SiQAC (3-TPAC); дорожка 4: 5 мкл образец сравнения геномной ДНК E. coli + 1 мкл 1% раствора SiQAC (3-TPAC); дорожка 5: 1,5 мм диск, функционализированный 10% раствором SiQAC (3-TPAC), + 20 мкл цельного молока; дорожка 6: 1,5 мм диск, функционализированный 1% раствором SiQAC (3-TPAC), + 20 мкл цельного молока; дорожка 7: 1,5мм функционализированный диск + 20 мкл цельного молока; дорожка 8: 1 мкл цельного молока).
Приведенные данные показывают, что функционализация 1% SiQAC (3-TPAC) повышает амплификацию по сравнению с необработанной бумагой (дорожки 6 и 7).
Диски были проверены на наличие остаточных бактерий путем посева на обогащенную среду для молочнокислых бактерий (5 г/л триптона, 1 г/л глюкозы, 2,5 г/л дрожжевого экстракта и 1 г/л сухого обезжиренного молока) с 4% агара, R.C. MARSHALL (1993) Standard Methods for the Microbiological examination of dairy products, 16th Ed. (American Public Health Association). Ночная культура не показала рост бактерий на дисках, обработанных SiQAC (3-TPAC), но на планшетах для культивирования с необработанных дисков наблюдали сплошной рост, что подтверждает, что функционализированная бумага обеззараживает жидкость в течение 15 минут.
Пример 6
ОТ-ПЦР с РНК, выделенной из вируса ВИЧ из сыворотки с применением функционализированных карт
Результаты анализа кратко
Функционализированные карты использовали для ОТ-ПЦР с заглубленными праймерами ампликона K103 ВИЧ из образца плазмы от анонимного пациента с ВИЧ-положительным диагнозом. Параллельный анализ с образцом цельной крови от другого пациента (также с ВИЧ-положительным диагнозом) не дал никаких результатов ни в ПЦР (фрагменты не были обнаружены в 1% агарозном геле), ни при пиросеквенировании.
Описание анализа
Две карты были функционализованы с применением раствора для очистки (раствор PF, содержащий 3-TPAC) в соответствии со стандартной процедурой.
2
1. Открывали карту и вносили 20 мкл 1/100 раствора PF, разведенного в буфере (5 мМ Трис HCl (pH 9,0), 0,2 мМ MgCl)
2. Сушили в течение 15 минут
3. Наносили 20 мкл образца*
4. Сушили в течение 15 минут
5. Вырезали один диск и добавляли его в смесь для ОТ.
*Образцами были плазма из периферической крови ВИЧ-положительного индивидуума (1) и периферическая кровь ВИЧ-положительного индивидуума (2)
Использовали смесь для ОТ из набора для синтеза кДНК Applied Biosystems Superscript VILO, как описано в инструкции пользователя, в конечном объеме 30 мкл.
Смесь для ПЦР затем получали следующим образом:
2
HО - 5,8 мкл
10 × буфер для ПЦР - 5 мкл
2
MgCl (50 мМ) - 2 мкл
дНТФ (10 мМ) - 1,2 мкл
1849+ (10 мкМ) - 1 мкл
3500- (10 мкМ) - 1 мкл
полимераза Ultratools Taq [1 ЕД/мкл] - 1 мкл
кДНК из набора для синтеза кДНК Superscript VILO - 30 мкл
Использованные праймеры:
1849+ 5'-GATGACAGCATGTCAGGGAG
3500- 5 '- СТATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA
Программа ПЦР:
94°С 2 мин, затем 45 циклов
94°С 30 сек
50°С 30 сек
72°С 1 мин 30 сек; после чего
72°С 5мин
10°С ∞
Продукт этой ПЦР длиной 1702 п.о. содержит область GAG-Pro-Pol HIV1. Этот ампликон был использован в качестве матрицы для второй ПЦР.
Смесь для второй ПЦР получали следующим образом:
2
HО - 20 мкл
10 × буфер для ПЦР - 4 мкл
2
MgCl [50 мМ] - 1 0,6 мкл
дНТФ (10 мМ) - 0,8 мкл
К103F 10 мкМ - 3,2 мкл
BioK103F 10 мкМ - 3,2 мкл
Полимераза Biotools Taq [1 ЕД/мкл] - 0,5 мкл
ПЦР-продукт из ПЦР с заглубленными праймерами - 5 мкл
Использованные праймеры:
K193F 5'-GGAATACCACATCCYGCAGG
BioK103R 5'-[Биотин]AATATTGCTGGTGATCCTTTCC
Программа ПЦР:
95°С 5 мин; затем 30 циклов
95°С 30 сек
55°С 30 сек
72°С 30 сек; затем
72°С 5 мин
10°С ∞
Продукт ПЦР второй ПЦР длиной 203 п.о. использовали в реакции пиросеквенирования с последующим подходом обогащения, показанным на фиг. 10.
Результаты
Только образец плазмы дал хорошие сигналы в пиросеквенировании, образец крови вообще не дал результата в анализе в соответствии с описанным протоколом. Для секвенирования использовали праймер K103F (5'-GGAATACCACATCCYGCAGG), и полученную последовательность сравнивали с полным геномом ВИЧ с применением функции BLAST в NCBI. Последовательность успешно совпала с последовательностью ВИЧ - см. фиг. 11.