Роль резидентных макрофагов в механизме клеточной пролиферации и опухолевого роста

Роль резидентных макрофагов в механизме клеточной пролиферации и опухолевого роста

Панин Л.Е.

Role of resident macrophages in mechanisms of cells proliferation

and cancerogenesis Panin L.Ye.

НИИ биохимии СО РАМН, г. Новосибирск

© Панин Л.Е.

Введение

Известно, что в условиях функционального напряжения в отдельных органах и системах усиливаются деструктивные процессы, скорость которых характеризует восстановительную регенерацию тканей. При любых воздействиях на организм, приводящих к повреждению тканей, запускается процесс репаративной регенерации, в основе которого лежит усиление клеточной пролиферации. Общим для всех процессов является усиление биосинтеза белка [и].

Ранее было показано, что процессы регенерации в организме зависят от активации резидентных макрофагов [з]. Захватывая продукты деградации клеток, они кооперативно поглощают ЛПВП и стероидные гормоны. В клетке последние восстанавливаются с образованием тетрагидросоединений, а ЛПВП при участии ли-зосомальных гидролаз разрушаются. Освободившийся аполипопротеин А| с высоким аффинитетом образует комплекс со стероидными гормонами, который попадает в интерстициаль-ное пространство, а затем в соматические клетки. Происходит усиление экспрессии генов и скорости биосинтеза белка в них [7]. Однако было не ясно, лежит ли этот механизм в основе редупликации ДНК и клеточной пролиферации.

Самой высокой пролиферативной активностью обладают опухолевые клетки. Известно, что формирование опухоли во многом зависит от активности инфильтрующих их макрофагов [15]. Но оставалось не ясным, в чем проявляется участие макрофагов в усилении клеточного роста и от каких факторов это зависит. Исследования влияния липопротеинов на биосинтез белка и ДНК в опухолевых клетках, по-видимому, никем ранее не проводились. Однако встречаются работы, посвященные изучению влияния ЛПВП на пролиферацию опухолевых

клеток. Так, M. Rothender и G. Kostner [19] показали,

что опухолевые клетки грудной железы, как гормонозависимые, так и гормононезависимые, активно пролиферируют под влиянием ЛПВП. ЛПВП3 стимулировали включение меченого ти-мидина в ДНК опухолевых клеток линии А549, а также усиливали их пролиферацию [14]. В клетках линии Hep G2 ЛПВП повышали скорость образования мРНК Апом [18]. Механизм этого влияния на опухолевые клетки до сих пор не раскрыт.

В данной работе была поставлена задача показать, что в основе усиления пролифератив-ных процессов в нормальных и опухолевых клетках лежит активация макрофагов под влиянием ЛПВП и стероидных гормонов, связанная

Панин Л.Е.

с формированием биологически активного комплекса «тетрагидрокортизол — Апоа1».

Материал и методы

Выделение липопротеинов. Исследование выполнено на крысах линии Вистар (n = 50) массой 180—200 г, содержащихся на стандартной лабораторной диете. Липопротеины сыворотки крови выделяли с помощью ультрацентрифугирования после освобождения от хиломикронов [16]. Получали соответственно ЛПОНП (0,94 < d < 1,006 г/мл), ЛПНП

(1,006 < d < 1,063 г/мл), ЛПВШ (1,063 < d < 1,125 г/ мл), ЛПВП3 (1,125 < d <

< 1,21 г/мл). В дальнейшем работали с фракцией ЛПВП3. Делипидирование ЛП проводили охлажденной смесью хлороформа и метанола (1 : 1) с последующей многократной отмывкой эфиром. Смесь Апо-ЛПВП наносили на колонку (1,6 х 100 см) с сефарозой 6В CL «Pharmacia» ( Швеция) и элюировали 0,01 моль трис-на буфером, рН = 8,6, содержащим 6 моль мочевины, 0,01% азида натрия и 1 ммоль фенилметан-сульфо-нила фторида (ФМСФ). Профиль элюции регистрировали на УФ-детекторе 2151 lkb (Швеция). Проверку чистоты Апоа1 осуществляли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Белок определяли

по Лоури [17].

Выделение клеток печени. Клетки печени получали по методу p. Segien [20] в нашей модификации, используя рециркуляционную перфузию органа 0,03%-м раствором коллагеназы. После диссоциации ткани гепатоциты отделяли от НП-клеток с помощью дифференциального центрифугирования. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Жизнеспособность их оценивали методом исключения трипанового синего, а чистоту клеточных фракций определяли с помощью световой и электронной микроскопии. Полученные клетки ресуспендировали в среде dmem, рН = 7,4, содержащей 15 ммоль hepes, 10% эмбриональной сыворотки крови и 50 мкг/мл гентамицина. Инкубацию проводили в СО2-инку-баторе в течение 24 ч, используя 24-луночные планшеты «ипы-о» (Германия), покрытые колла-

геном i типа. Конечная плотность гепатоцитов в первичной культуре составляла 700 клеток на 1 мм2.

Измерение скорости биосинтеза ДНК и белка в культуре клеток. За 2 ч до окончания инкубации в лунки с клетками добавляли по 20 мкл Н3-тимиди-наили С|4-лейцина из расчета 3,7 • 104 Бк/мл. Реакцию останавливали добавлением o,2n раствора NaOH. Для измерения радиоактивности ДНК содержимое каждой лунки переносили на gf/c фильтры и последовательно промывали 10%-й трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и 95%-м этанолом. Для измерения радиоактивности белка содержимое лунки переносили на фильтр FN-16, обработанный 0,1 моль раствором лейцина в 10%-м растворе ТХУ. Затем фильтры последовательно промывали раствором ТХУ и спиртоэфирной смесью. Радиоактивность образцов измерялась на жидкостном сцинтилляционном счетчике mark-з (США) и рассчитывалась в импульсах в минуту на лунку.

Получение РНК-полимеразы. Препарат РНК-полимеразы фага Т7 выделяли из клеток Е. coli, содержащих клонированный ген РНК-полимеразы из бактериофага Т7. Чистота препарата составила не менее 90% по результатам sDs-ПА-АГ-электрофореза. Удельная активность фермента составляла 20 000 ед/ОЕ260. За единицу активности РНК-полимеразы принимали количество фермента, катализирующее включение 1 нмоль нуклеозидтрифосфата в кислотоне-растворимый продукт за 1 ч при температуре 37 °С в реакционной смеси 100 мкл следующего состава: 40 ммоль трис-на, рН = 7,5, 6 ммоль MgCb, 2 ммоль спермидин-НС1,10 ммоль дитио-треитол, 1 ммоль нуклеозидтрифосфаты ( каждый из 4), 1 мкг плазмиды, содержащий Т7-про-мотер.

Выбор сайта связывания комплекса «тет-рагид-рокортизол (тГк) — АпоАЬ> с ДНК. Компьютерный поиск по базам данных нуклео-тидных последовательностей млекопитающих

(Gen. Bank, DNA Library) показал, что в структуру

многих генов входит последовательность типа cc(Gcc)n. В структуре гена аполипопротеина А1 она имеет вид СС^сск Эта последователь-

ность, но с числом повторов 5, была выбрана для анализа на специфичность взаимодействия с комплексом «тГк — Апоа1». Для сравнения был также взят фрагмент кДНК регуляторной области гена цитохрома Р-450 и гомогенный олиго-нуклеотид (Т19). Все последовательности имели вид:

1) 5'-CCGCCGCCGCCGCCGCC-3';

2) 5' - ATCTTTAACTGATGAACTTCT- 3';

3) 5'-ТТТТТТТТТТТТТТТТТТТ-з'.

Малоугловое рентгеновское рассеяние

(МУРР). Для анализа эффектов взаимодействия эукариотической ДНК и синтетических олигону-клеотидов с комплексом «тГк — Апоа1» использовали метод МУРР. Измерение малоугловых рентгенограмм проводили на дифрактометре фирмы Siemens (Германия). Длина волны рентгеновского излучения Х = 0,154 нм (СиКа). Использовали гомогенные препараты Апоа1, РНК-поли-меразы, ДНК и олигонуклеотидов с исходными концентрациями соответственно 0,40; 4,16; 3,12 и 1,52 мг/мл. Малоугловые рентгенограммы получали в угловом диапазоне: 0,024 < h < 3,423 нм', где h = 4п sin(0)/X, 20 — угол рассеивания. В рентгенограммы вносили поправки на фоновое рассеивание, коллимацию; проводили их сглаживание.

SI-нуклеазный анализ взаимодействия комплекса «тГк — АпоAI» с ДНК. Комплекс «глю-кокортикои-

ды — Апоа1» получали, выдерживая их смесь в молярном отношении 2 : 1 в калий-фосфатном буфере 0,05 моль, рН = 7,4 при комнатной температуре в течение 5 мин. Полученный комплекс добавляли к 500 нг нативной ДНК, растворенной в буфере для si-нуклеазы в соотношении 5 моль белка на 1000 п.н. К полученному раствору добавляли si-нуклеазу в концентрации 0,2 ед активности и инкубировали в течение 30 мин при температуре 30 °С. Электрофорез полученных фрагментов ДНК проводили в 0,3-, 0,5- и 1%-м агарозных гелях [2]. В качестве маркеров использовали ДНК фага х и ее рестрикты. После электрофореза гель окрашивали в растворе бромистого этидия и фотографировали в ультрафиолете. Фотопленки сканировали на сканере фирмы «Кора» (Новосибирск).

Исследование опухолевых клеток. В качестве экспериментальной модели использовали культуру клеток асцитной гепатомы мышей линии ha-i, полученную В.И. Калединым (ИЦиГ СО РАН, г. Новосибирск). Свежевыделенные клетки гепатомы ресуспендировали в среде rpmi-1640, содержащей ю ммоль HEPEs-буфера, 2 ммоль l-глютатиона и 50 мкг/мл гентамицина, наносили на 24-луночные планшеты «Linbro» (США). Инкубацию проводили в атмосфере СО2 (5%) и воздуха (95%) при температуре 37 °С в течение i сут. Для получения культуры без макрофагов ( прилипающих клеток) исходную культуру инкубировали i ч; после адгезии макрофагов содержимое лунки осторожно переносили в другой планшет и продолжали инкубировать в течение i сут. Плотность клеток в первом случае составляла 5 • io3 на i мм2, во втором случае — 3,5 • io3 на i мм2. За 2 ч до окончания инкубации в лунки добавляли по 20 мкл Н3-тимидина (для определения скорости синтеза ДНК) или С|4-лейцина ( для определения скорости биосинтеза белка). Условия измерения радиоактивности такие же, как и для нормальных гепатоцитов.

Достоверность полученных результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при уровне значимости р < 0,05.

Результаты

Впервые показано, что восстановленная форма кортизола — тетрагидрокортизол — является биологически активной формой гормона. Она образуется в клетках Купфера при участии 5а- и 5р-редуктаз и принимает участие в регуляции экспрессии генов. Данный эффект связан с усилением биосинтеза как ДНК, так и белка (табл. i). Однако биологическая активность гормона проявляется только тогда, когда он образует комплекс с Апоа1. Данный белок входит в структуру ЛПВП3 и освобождается при дезинтеграции последних во вторичных лизосомах клеток Купфера под влиянием лизосомальных протеиназ. В данном случае Апоа1 выполняет роль адресного переносчика тетрагидрокортизо-ла в ядро для дальнейшего взаимодействия с депротеинизированными участками ДНК. Эта версия была проверена с помощью МУРР.

Таблица 1 Влияние комплекса «тетрагидрокортизол — АпоAI» на скорость биосинтеза ДНК и белка в первичной культуре гепатоцитов

Условия инкубации Скорость включения Нз-тимидина в ДНК, имп./мин на лунку Скорость включения С„-лейцина в белок, имп./мин на лунку

Без Апом С Апом Без Апом С Апом

Контроль Тетрагид-рокортизол 4459 ± 157 3320 ± 511 760,0 ± 4,7 386,0 ± 21,1 3393 ± 333* 4928 ± 115*' * 692,0 ± 4,7 1098,0 ± 107,4*' *

Примечание. * - р < 0,05 по сравнению с контролем;

* - по сравнению со скоростью без Апом.

Ранее метод МУРР с успехом применялся для получения информации о механизме молекулярных взаимодействий, для определения стехиометрии этого взаимодействия, констант равновесия макромолекулярных комплексов, структурных и весовых характеристик макромолекул и их агрегатов [21]. Анализ полученных с помощью МУРР данных показал, что препараты используемых в работе РНК-полимеразы, Апом и нативной ДНК были достаточно монодисперсны. Структурные характеристики Апом и нативной ДНК из печени крыс были определены ранее [8, 9]; т7-специфическая РНК-полимераза содержала одну субъединицу с молекулярной массой 110 кДа [13].

Известно, что о целостности вторичной структуры ДНК можно судить по наличию дифракционного максимума в области углов h ~ 2,66 нм- на рентгенограмме МУРР, соответствующего диаметру двойной цепи ДНК (2,2 нм). Из рис. 1 видно, что при h ~ 2,7 нм- на рентгенограммах МУРР для препаратов нативной ДНК и для смесей ДНК с Апом и РНК-по-лимеразой без тГк четко наблюдается дифракционный максимум, а в случае аналогичных смесей в присутствии тГк величина пика достоверно снижалась. Это свидетельствует о плавлении вторичной структуры ДНК в результате взаимодействия ее с комплексом «тГк — Апом».

Рис. 1. Рентгенограммы МУРР смесей ДНК с Апом и РНК-полимеразой без ТНС и в присутствии ТНС. Концентрации: ДНК - 0,043 мкмоль; Апом - 1,22 мкмоль; ТНС - 2,55 мкмоль; РНК-поли-

мераза - 0,568 мкмоль

В полученных выше результатах оставалась неясной область взаимодействия комплекса «тГк — Апом» с ДНК. Поиск вероятных последовательностей по международным базам данных показал присутствие цис-элемента типа ^сс)„ в структуре гена АпоAI человека. Аналогичная последовательность выявлена в регуляторных областях многих генов млекопитающих и человека. Дальнейшие исследования были проведены на трех синтетических олигонуклеотидах ( см. выше). При используемой в работе точности измерений интенсивностей МУРР заметное взаимодействие Апом отмечено только с олигону-клеотидом-1.

В отсутствие тГк взаимодействие олигонуклео-тида-1 с Апом существенно слабее. Характер изменения значений а J(o) показал, что в сме-

сях происходит образование комплексов исходных макромолекул.

Для оценки максимальной стехиометрии комплекса, образующегося в результате взаимодействия олигонуклеотида с Апоа1 (р), была использована кооперативная равновесная схема, разработанная ранее [12].

Ктп

тР + nS ^ PmSn

Ктп = [P]m[S]n/[PmSn]

R(m, п, Ктп) = 2/рЕ|АН(0) - AJi(0)l/Ali(0) + AJi(0),

где Ктп — константа диссоциации комплекса PmSn; [р], [s], [PmSn] — равновесные концентрации белка, олигонуклеотида и комплекса соответственно; R — критерий оптимизации; Ali (0), AJi(0) — экспериментальные и модельные значения разностных интенсивностей рассеивания под нулевым углом [22].

Минимальное значение критерия R соот-ветству-

ет стехиометрии образующегося комплекса 1 : 1 (т = 1, п = 1) при значении константы диссоциации Ктп = 60,1 мкмоль (Касс = 1,66 • 106 моль-

Таким образом, впервые описано специфическое взаимодействие Апоа1 с олигонуклеоти-дом cc(Gcc)5 и определены структурные характеристики этого олигонуклеотида и их комплексов с Апоа1 в присутствии тГк. При замене тГк на кортизол и при отсутствии тГк константа диссоциации увеличивалась в несколько раз. Связывание Апоа1 с другими олигонуклеотидами оказалось достаточно слабым, т.е. подтверждается предположение, что комплексы «тГк — Апоа1» при взаимодействии с ДНК связываются с участками цепи, имеющими структуру №сс)„, что и приводит к разрыву водородных связей между парами азотистых оснований ДНК. Локальная денатурация ДНК и расплетание двойной цепи являются необходимым условием для взаимодействия с РНК-полимеразой и усиления экспрессии генов.

О появлении однонитевых участков ДНК при взаимодействии ее с комплексом «тГк — Апоа1» можно судить по взаимодействию с Sl-нукле-азой. Показано значительное увеличение числа э-нуклеазочувствительных участков в нативной

ДНК, полученной из печени крыс под влиянием данного комплекса. Комплекс Апоа1 с невосстановленной формой гормона — кортизолом не увеличивал заметно количество sl-нуклеазочув-ствительных участков. Добавление к ДНК АпоА| в отсутствие лиганда также не приводило к изменению распределения и количества однони-тевых участков. Полученные результаты свидетельствуют о том, что э-нуклеазочувствитель-ные участки, появляющиеся в ДНК под влиянием комплекса «тГк — Апоа1», неравномерно распределены в структуре макромолекулы. Однако при определенном соотношении ДНК, комплекса «тГк — Апоа1» и Sl-нукпеазы удается выявить определенную периодичность в распределении сайтов связывания комплекса с ДНК, т.е. один сайт приходится на 5,5 и 6 тыс. п.н. соответственно.

В связи с тем что связывание ДНК с комплексом «гормон — Апоа1» ранее проводили в буфере с рН = 7,5 [5], а оптимум рН для э-нуклеазы составляет 5,0 [2], в данной работе исследования выполняли как в том, так и в другом буфере. Оказалось, что при замене буфера картина расщепления ДНК э-нуклеазой в присутствии комплекса не изменилась.

Ранее было показано, что комплекс «гормон — Апоа1» активно формируется при рН = 5—8 [4]. В этом же интервале рН осуществляется его взаимодействие с ДНК, что указывает, вероятно, на очень малый вклад электростатических связей как в образование самого комплекса, так и в его взаимодействие с ДНК. По-видимому, определяющую роль здесь играют гидрофобные взаимодействия, не исключено также участие и водородных связей. Данный вывод позволяет предполагать, что связывание комплекса с ДНК осуществляется по малой бороздке.

Также были исследованы различные соотношения гормона и Апоа1 в комплексе. Оказалось, что соотношение два гормона (тГк) на одну молекулу Апоа1 является самым оптимальным для взаимодействия комплекса с ДНК.

Выявленные молекулярные механизмы усиления биосинтеза ДНК и белка в первичной культуре нормальных гепатоцитов под влиянием глюкокортикоидов и ЛПВП в дальнейшем

изучались на культуре опухолевых клеток. Исследования проводились на клетках мышиной гепатомы ha-i [1]. Эта клеточная линия получена из печени мыши-самца линии А/Не, которой вводился ортоаминоазотолуол после перевода ее в асцитную культуру (рис. 2).

Оказалось, что в культуре клеток гепатомы в отсутствие макрофагов совместное добавление кортизола и ЛПВП не оказывало влияния на биосинтез ДНК и белка. Добавление кортизола и ЛПВП к исходной культуре клеток гепа-томы значительно усиливало синтез как ДНК, так и белка (табл. 2).

В свете изложенных данных это означает, что перитонеальные макрофаги, которые всегда присутствуют в асцитной опухоли мышей, активно захватывают

Рис. 2. Клетки асцитной гепатомы НА-1. Окраска по Романовскому-

Гимзе. Ув. 1800

Т а б л и ц а 2

Влияние кортизола и ЛПВП на скорость биосинтеза ДНК и белка в культуре клеток асцитной гепатомы мышей линии НА-!

Условия инкубации Скорость включения Н3-тимидина в ДНК, имп./мин на i мг белка Скорость включения С14-лейцина в белок, имп./мин на 1 мг белка

С макрофагами Без макрофагов С макрофагами Без макрофагов

Контроль Кортизол и ЛПВП 115,0 ± 8,0 81,0 ± 9,0 4408,0 ± 376,0 3164,0 ± 98,0 153,0 ± 7,0* 77,0 ± 3,0 6610,0 ± 351,0* 3206,0 ± 107,4

запускает механизм усиления биосинтеза белка и ДНК, описанный выше. Ранее было показано, что в сокультуре гепатоцитов и макрофагов добавление кортизола и ЛПВП не оказывало усиливающего влияния на синтез белка без стимуляции макрофагов липополисахаридами (ЛПС) [10]. В переживающих срезах печени одновременное добавление кортизола и ЛПВП значительно усиливало биосинтез белка без добавления ЛПС [6]. Взаимодействия макрофага и гепатоцита в условиях регенерации представлены на рис. з.

В переживающих срезах макрофаги стимулируются продуктами клеточного повреждения, которые образуются в процессе приготовления срезов. Оказалось, что в культуре клеток гепато-мы также не обязательно стимулировать макрофаги, чтобы повысить захват ими кортизола и ЛПВП для дальнейшего образования биологически активного комплекса «тГк — Апоаь. В связи с этим можно полагать, что опухолевые клетки сами синтезируют какие-то продукты, способные стимулировать макрофаги. Данное обстоятельство и определяет программу деятельности макрофагов, направленную на повышение пролифера-тивной активности клеток гепатомы. В таком случае достаточно появиться хотя бы одной клетке в результате мутации, чтобы процесс клеточного роста при участии макрофагов стал необратимым.

* р < 0,05 по сравнению с контролем.

кортизол и ЛПВП и формируют биологически активный комплекс «тГк — Апоа1». Последний и

[Продукты клеточной деградации + АПВП; + кортизоол

Тетрагидрокортизол — аполипопротеин AI

Рис. з. Электронная микроскопия: а — клетка Купфера. Видна вторичная лизосома (белая стрелка), содержащая продукты клеточной деградации, ЛПВПз, меченные коллоидным золотом и нагруженные кортизолом; б — гепатоцит, ядрыш-ковый аппарат. Усиленное образование предшественников рибосом под влиянием комплекса

«тетрагидрокортизол — АпоА|»

Заключение

Таким образом, в настоящем исследовании вскрыты молекулярные механизмы, лежащие в основе клеточной пролиферации и опухолевого роста. Показано, что предпочтительным сайтом связывания комплекса «тГк — Апоа1» с ДНК является последовательность типа сс№сс)п. Взаимодействие комплекса с ДНК в этих участках приводит к расплетанию двойной цепи, что и ведет к инициации взаимодействия ее с РНК-полимеразой. Впервые с помощью МУРР даны характеристики РНК-полимеразы и комплексов ее с нативной ДНК в присутствии Апоа1 и тГк. Установлено, что в образовании комплекса «тГк — Апоа1» важную роль играют резидентные макрофаги. Последние участвуют в восстановлении стероидных гормонов с образованием тет-рагидросоединений, в дезинтеграции ЛПВП с освобождением Апоа1 и образованием биологически активного комплекса «тГк — Апоа1». Впер-

вые показано, что тетрагидрокортизол является биологически активной формой гормона, участвующей в усилении экспрессии генов в соматических клетках, при этом AпоAl используется для направленного транспорта гормона в ядро. Данный механизм играет важную роль в пролиферации как нормальных, так и опухолевых клеток.

Литература

i. Каледин В.И., Серова И.А., Целлариус Ю.Г. и др.

Исследования по индукции и метастазированию злокачественных опухолей у экспериментальных животных. Новосибирск, 1984. С. 98-124. г.Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование.

М., 1984.

3. Панин Л.Е. // Бюл. СО РAМН. 1998. № з. С. 11-23.

4. Панин Л.Е., Биушкина Н.Г., Поляков Л.М. БЭБиМ,

199г. Т. Иг. С. 34-36.

s. Панин Л.Е., Гимаутдинова О.П., Поляков Л.М., Наякшина Т.Н. Молекулярная биология. 1998. Т. иг.

С. з4-з6.

6. Панин Л.Е., Маянская Н.Н. Лизосомы: роль в адаптации и восстановлении. Новосибирск, i987.

198 с.

7. Панин Л.Е., Тузиков Ф.В., Тузикова Н.А. и др. // Биоорганическая химия. 2ooi. Т. г7. № г. С. 114-119.

8. Панин Л.Е., Тузиков Ф.В., Тузикова НА. и др. // Биофизика. 2ooo. Т. 45. С. 611-619.

9. Панин Л.Е., Тузиков Ф.В., Тузикова Н.А. и др. // Молекулярная биология. 1999. Т. зз. С. 1-6.

10. Панин Л. Е., Усынин И. Ф., Харьковский А.В., Трубицына О.М. // Вопр. мед. химии. 1994. Т. 4o. № 4. С. 6-8.

11. Саркисов Д.С. Очерки по структурным основам го-меостаза. М., 1977. 224 с.

12. Тузиков Ф.В., Тузикова Н.А., Вавилин В.И. и др. // Молекулярная биология. 1991. Т. 2s. С. 74o-7si.

13. Уотсон Д. Молекулярная биология гена. М., 1978.

14. Favre G., Tazi K.A., Gaillard F. et al. // j. Lipid Res.

1993. V. 34. P. io93-io96. is. Giormo R., Ringel S.P. // Pathol. immunopathol. Res. 1986. № s. P. 491-499.

16. Hatch F.T., Lees R.S. // Advanc. Lipid Res. 1968. V. 6. P. 268.

17. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. // J. Biol. Chem. 19si. V. 193. P. 26s-27s.

18.Monge J.C., Hoeg J.M., Law S.W., Brewer H.B. //

FEBS Letters. 1989. V. 243. № 2. P. 213-216.

19. Rothender M., Kostner G. // int. j. Cancer. i989. v. 43.

P. 87s-879.

20. Seglen P. Methods of Cell Biology. N.Y., 1968. V. 13. P. 8o-83.

21. TuzikovF.V., Zinoviev V.V, Malygin E.G. et al. // febs

Letters. 1988. V. 232. P. Ю7-1Ю.

22. TuzikovF.V., Zinoviev V.V., Vavilin V.A., Malygin E.G. // Biopolymers. 1996. V. 38. P. 131-139.