СБОРОЧНЫЕ УЗЛЫ ПЕРФУЗИОННЫХ БИОРЕАКТОРНЫХ МЕШКОВ
ASSEMBLY UNITS OF PERFUSION BIOREACTOR BAGS

Перекрестная ссылка на связанные заявки
[1] По данной заявке испрашивают приоритет заявки США № 62/393,583, поданной 12 сентября 2016 года, содержание которой включено, таким образом, посредством ссылки в полном объеме.
Область раскрытия
[2] Это раскрытие относится в некоторых аспектах к сборочным узлам биореакторных мешков, включая сборочные узлы перфузионных биореакторных мешков. Более конкретно, это раскрытие относится в определенных аспектах к готовым к использованию сборочным узлам биореакторных мешков, которые минимизируют количество соединений, которые должен выполнять оператор перед использованием, и контаминации биореакторного мешка.
Предпосылки
[3] Традиционные системы и трубы из нержавеющей стали в производственных процессах для клеточной культуры заменены во многих применениях на одноразовые биореакторные мешки, которые в некоторых случаях качают с помощью биореакторной качалки. Однако доступны биореакторные качалки различных типов, и каждая система биореакторной качалки необязательно может содержать различные компоненты с несколькими соединениями. Эти компоненты могут включать, например, качающуюся платформу, необязательно с крышкой, один или несколько различных контейнеров, в том числе клеточные контейнеры, такие как клеточный мешок, подающие контейнеры, насосный модуль, газовый модуль и контейнер/мешок для отходов. Кроме того, такие компоненты могут включать несколько линий текучего вещества, соединяющих один или несколько таких компонентов друг с другом и/или с подающими текучее вещество соединениями, а также силовые кабели и кабели данных. Поскольку различные биореакторные качалки отличаются друг от друга, в биореакторных качалках часто используют различные и уникальные биореакторные мешки, специфичные для каждой системы качалки.
Краткое изложение
[4] Предоставлены сборочные узлы биореакторных мешков, такие как сборочные узлы перфузионных биореакторных мешков, которые можно использовать в различных биореакторных устройствах. В некоторых аспектах, предоставлены готовые к использованию сборочные узлы биореакторных мешков с предварительно собранными соединением мешка отходов и предварительно собранными компоновками трубок с тем, чтобы клеточные среды и/или источник клеток можно было непосредственно приваривать к предварительно собранным компоновкам трубок. В некоторых вариантах осуществления сборочные узлы биореакторных мешков позволяют минимизировать количество дополнительных соединений/адаптаций, образуемых с биореакторным мешком прежде, чем биореакторный мешок можно использовать для культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления сборочные узлы биореакторных мешков позволяют минимизировать количество компонентов, необходимых для работы, тем самым минимизируя риск целостности сборочного узла биореакторного мешка. По существу, сборочные узлы биореакторных мешков в некоторых аспектах позволяют снижать риск контаминации и/или потери продукта. Кроме того, минимизация соединений, адаптаций и/или компонентов может позволять биореакторному мешку быть совместимым с различными биореакторными качалками.
[5] Некоторые варианты осуществления включают сборочный узел биореакторного мешка, который содержит биореакторный мешок и мешок отходов. В любом варианте осуществления биореакторный мешок может содержать нижнюю поверхность и верхнюю поверхность с множеством портов, где множество портов может включать питающий порт, порт взятия образца и перфузионный порт. В любом варианте осуществления биореакторный мешок может содержать перфузионный фильтр, соединенный по текучему веществу с перфузионным портом. В любом варианте осуществления мешок отходов можно соединять по текучему веществу с перфузионным портом биореакторного мешка. В любом варианте осуществления верхняя поверхность биореакторного мешка имеет первый конец и второй конец напротив первого конца и перфузионный порт находится ближе ко второму концу, чем к первому концу. В любом варианте осуществления питающий порт и порт взятия образца находятся ближе к первому концу, чем ко второму концу. В любом варианте осуществления верхняя поверхность биореакторного мешка имеет первую сторону и вторую сторону напротив первой стороны, и питающий порт находится ближе к первой стороне, чем ко второй стороне. В любом варианте осуществления порт взятия образца находится ближе ко второй стороне, чем к первой стороне. В любом варианте осуществления перфузионный порт находится ближе ко второй стороне, чем к первой стороне. В любом варианте осуществления перфузионный фильтр находится внутри биореакторного мешка. В любом варианте осуществления сборочный узел биореакторного мешка может включать компоновку питающих трубок, соединенных по текучему веществу с питающим портом. В любом варианте осуществления компоновка питающих трубок включает трубку из поливинилхлорида (PVC). В любом варианте осуществления компоновка питающих трубок содержит Y-образный соединитель так, что компоновка питающих трубок имеет два впуска. В любом варианте осуществления сборочный узел биореакторного мешка может включать компоновку трубок взятия образца, соединенную по текучему веществу с портом взятия образца. В любом варианте осуществления компоновка трубок взятия образца может включать PVC трубку. В любом варианте осуществления мешок отходов можно соединять по текучему веществу с перфузионным портом через компоновку трубок отходов. В любом варианте осуществления компоновка трубок отходов включает PVC трубку. В любом варианте осуществления множество портов может включать порт впуска газа и порт выпуска газа. В любом варианте осуществления верхняя поверхность биореакторного мешка имеет середину, которая находится на полпути между первым концом и вторым концом, и порт впуска газа и порт выпуска газа находятся ближе к середине, чем к первому концу или второму концу. В любом варианте осуществления множество портов включает только питающий порт, порт взятия образца, перфузионный порт, порт впуска газа и порт выпуска газа. В любом варианте осуществления сборочный узел биореакторного мешка может включать компоновку трубок впуска газа, которая включает фильтр впуска, соединенный по текучему веществу с портом впуска газа, и компоновку трубок выпуска газа, которая включает выходной фильтр, соединенный по текучему веществу с портом выпуска газа.
[6] Некоторые варианты осуществления включают биореакторную систему, которая содержит биореакторную качалку, биореакторный мешок, опирающийся на биореакторную качалку, и мешок отходов, соединенный по текучему веществу с биореакторным мешком. В любом варианте осуществления биореакторный мешок содержит нижнюю поверхность и верхнюю поверхность, которые содержат множество портов, где множество портов включает питающий порт, порт взятия образца и перфузионный порт. В любом варианте осуществления перфузионный фильтр можно соединять по текучему веществу с перфузионным портом. В любом варианте осуществления мешок отходов можно соединять по текучему веществу с перфузионным портом биореакторного мешка. В любом варианте осуществления биореакторная система может включать компоновку питающих трубок, соединенную по текучему веществу с питающим портом. В любом варианте осуществления компоновка питающих трубок может включать Y-образный соединитель так, что компоновка питающих трубок имеет первый и второй впуск. В любом варианте осуществления источник клеточных сред соединяют по текучему веществу с каждым впуском компоновки питающих трубок. В любом варианте осуществления каждый впуск может содержать PVC и источник клеточных сред можно сваривать с PVC впуска. В любом варианте осуществления источник клеток соединяют по текучему веществу с первым впуском и источник клеточных сред соединяют по текучему веществу со вторым впуском. В любом варианте осуществления каждый впуск может содержать PVC и источник клеток можно сваривать с PVC первого впуска и источник клеточных сред можно сваривать с PVC второго впуска. В любом варианте осуществления перфузионный фильтр может находиться внутри биореакторного мешка. В любом варианте осуществления верхняя поверхность биореакторного мешка имеет первый конец и второй конец напротив первого конца, и перфузионный порт находится ближе ко второму концу, чем к первому концу. В любом варианте осуществления питающий порт и порт взятия образца могут находиться ближе ко второму концу, чем к первому концу. В любом варианте осуществления питающий порт и порт взятия образца могут находиться ближе к первому концу, чем ко второму концу. В любом варианте осуществления верхняя поверхность биореакторного мешка имеет первую сторону и вторую сторону напротив первой стороны, и питающий порт находится ближе к первой стороне, чем ко второй стороне. В любом варианте осуществления порт взятия образца находится ближе ко второй стороне, чем к первой стороне и перфузионный порт находится ближе ко второй стороне, чем к первой стороне. В любом варианте осуществления биореакторная система может включать компоновку трубок взятия образца, соединенную по текучему веществу с портом взятия образца. В любом варианте осуществления компоновка трубок взятия образца содержит PVC трубку. В любом варианте осуществления мешок отходов соединяют по текучему веществу с перфузионным портом через компоновку трубок отходов. В любом варианте осуществления компоновка трубок отходов включает PVC трубку. В любом варианте осуществления множество портов может включать порт впуска газа и порт выпуска газа. В любом варианте осуществления верхняя поверхность биореакторного мешка имеет середину, которая находится на полпути между первым концом и вторым концом, и порт впуска газа и порт выпуска газа находятся ближе к середине, чем к первому концу или второму концу. В любом варианте осуществления множество портов включает только питающий порт, порт взятия образца, перфузионный порт, порт впуска газа и порт выпуска газа. В любом варианте осуществления биореакторная система может включать компоновку трубок впуска газа, которая содержит фильтр впуска, соединенный по текучему веществу с портом впуска газа, и компоновку трубок выпуска газа, которая содержит выходной фильтр, соединенный по текучему веществу с портом выпуска газа.
[7] Некоторые варианты осуществления включают способ использования биореакторной системы, который включает размещение биореакторного мешка сборочного узла биореакторного мешка на биореакторной качалке, подачу клеточных сред в биореакторный мешок через питающий порт биореакторного мешка, подачу клеток в биореакторный мешок через питающий порт, культивирование клеток в биореакторном мешке с использованием возбуждения, обеспечиваемого биореакторной качалкой, перенос фильтрата отходов через перфузионный порт биореакторного мешка в мешок отходов и сбор культивируемых клеток. В любом варианте осуществления сборочный узел биореакторного мешка содержит биореакторный мешок с верхней поверхностью, которая содержит множество портов, где множество портов включает питающий порт, порт взятия образца и перфузионный порт. В любом варианте осуществления сборочный узел биореакторного мешка содержит перфузионный фильтр, соединенный по текучему веществу с перфузионным портом. В любом варианте осуществления сборочный узел биореакторного мешка содержит мешок отходов, соединенный по текучему веществу с перфузионным портом биореакторного мешка. В любом варианте осуществления сборочный узел биореакторного мешка содержит компоновку питающих трубок, соединенную по текучему веществу с питающим портом, где компоновка питающих трубок содержит Y-образный соединитель так, что компоновка питающих трубок имеет первый впуск и второй впуск. В любом варианте осуществления клеточные среды добавляют, приваривая источник клеточных сред к первому впуску. В любом варианте осуществления клетки добавляют посредством приваривания источника клеток к первому впуску. В любом варианте осуществления клеточные среды добавляют посредством приваривания источника клеточных сред к первому впуску, и клетки добавляют посредством приваривания источника клеток ко второму впуску. В любом варианте осуществления множество портов включает порт впуска газа и порт выпуска газа. В любом варианте осуществления способ включает подачу газа для культивирования клеток в биореакторный мешок через порт впуска газа. В любом варианте осуществления способ включает удаление части газа из биореакторного мешка в качестве отработавшего газа через порт выпуска газа. В любом варианте осуществления культивируемые клетки собирают посредством приваривания мешка для сбора к первому или второму впуску питающей трубки и обращения направления потока в компоновке питающих трубок. В любом варианте осуществления способ включает по меньшей мере частичное надувание биореакторного мешка газом через порт впуска газа. В любом варианте осуществления способ включает извлечение образца культивируемых клеток через порт взятия образца.
[8] Дополнительные преимущества будут без труда видны специалистам в данной области из следующего подробного описания. Примеры и описания в настоящем документе следует рассматривать как иллюстративные по природе и неограничивающие.
Краткое описание фигур
[9] Образцовые варианты осуществления описаны со ссылкой на сопроводительные фигуры, где:
[10] Фиг. 1 иллюстрирует пример вида сверху биореакторного мешка, раскрытого в настоящем описании.
[11] Фиг. 2A иллюстрирует первый пример компоновки питающих трубок для сборочного узла биореакторного мешка, который раскрыт в настоящем описании.
[12] Фиг. 2B иллюстрирует второй пример компоновки питающих трубок для сборочного узла биореакторного мешка, который раскрыт в настоящем описании.
[13] Фиг. 3A иллюстрирует первый пример компоновки трубок взятия образца для сборочного узла биореакторного мешка, который раскрыт в настоящем описании.
[14] Фиг. 3B иллюстрирует второй пример компоновки трубок взятия образца для сборочного узла биореакторного мешка, который раскрыт в настоящем описании.
[15] Фиг. 4A иллюстрирует первый пример компоновки трубок отходов для сборочного узла биореакторного мешка, который раскрыт в настоящем описании.
[16] Фиг. 4B иллюстрирует второй пример компоновки трубок отходов для сборочного узла биореакторного мешка, который раскрыт в настоящем описании.
[17] Фиг. 5 иллюстрирует пример компоновки трубок выпуска газа для сборочного узла биореакторного мешка, который раскрыт в настоящем описании.
[18] Фиг. 6 иллюстрирует пример компоновки трубок впуска газа для сборочного узла биореакторного мешка, который раскрыт в настоящем описании.
[19] Фиг. 7 иллюстрирует пример компоновки взятия образца для сборочного узла биореакторного мешка, который раскрыт в настоящем описании.
[20] На фигурах схожие номера позиций соответствуют схожим компонентам, если не указано иное.
Подробное описание
I. БИОРЕАКТОРНЫЙ МЕШОК
[21] В некоторых вариантах осуществления образцовый биореакторный мешок содержит различные порты, погружные трубы, канты и трубку насоса, помимо других компонентов. В некоторых вариантах осуществления эти компоненты не доставляют в запечатанной упаковке, со всеми предварительно прикрепленными необходимыми компонентами. Например, в некоторых вариантах осуществления мешок отходов и/или питающие порты можно не доставлять прикрепленными к биореакторному мешку, и их должен прикреплять оператор в месте использования. В некоторых вариантах осуществления следует выполнять дополнительные соединения и/или адаптации для биореакторного мешка прежде, чем биореакторный мешок используют для культивирования клеток. Например, перфузионный порт можно соединять с мешком отходов и пользователю может потребоваться определять способ соединения источника клеток и/или источника сред с биореакторным мешком прежде, чем перейти к запуску эксперимента. В некоторых вариантах осуществления каждое из этих компонентов, соединений и адаптаций может быть точкой контаминации для биореакторного мешка и ассоциированных компонентов. Соответственно, чтобы гарантировать стерильную окружающую среду инкубации клеток, пользователь может стерилизовать завершенный сборочный узел перед запуском эксперимента или риском потенциальной потери продукта из-за контаминации.
[22] Сборочные узлы биореакторных мешков, описанные в настоящем описании, позволяют снижать один или несколько из вышеуказанных рисков, например, посредством предоставления готового к использованию стерилизованного сборочного узла с предварительно собранным соединением мешка отходов и предварительно собранной PVC трубкой с тем, чтобы источник клеточных сред и/или клеток можно было непосредственно приваривать к PVC трубке. Как описано в деталях далее, сборочные узлы биореакторных мешков позволяют минимизировать количество компонентов, необходимых для работы, и, следовательно, минимизировать различные потенциальные точки отказа в биореакторной системе и минимизировать риск для целостности биореакторного мешка. Кроме того, минимизация соединений, адаптаций и/или компонентов может позволять биореакторному мешку быть совместимым с различными биореакторными качалками.
[23] Сборочные узлы биореакторных мешков, описанные в настоящем описании, можно использовать для культивирования клеток, таких как культура клеток человека, животного, насекомого и растения. В некоторых вариантах осуществления сборочные узлы биореакторных мешков, описанные в настоящем описании, используют в операциях перфузии в биореакторной системе. В некоторых вариантах осуществления сборочные узлы биореакторных мешков, раскрытые в настоящем описании, можно использовать для клинической клеточной терапии и T-клеточных применений. Фиг. 1 иллюстрирует пример вида сверху биореакторного мешка 100. Биореакторный мешок 100 может иметь верхнюю поверхность 101. Верхняя поверхность может содержать множество портов. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из множества портов можно помещать на нижней поверхности биореакторного мешка, напротив верхней поверхности. Множество портов может включать питающий порт, порт взятия образца, перфузионный порт, порт впуска газа, порт DO-зонда, порт pH-зонда и/или порт выпуска газа. В некоторых вариантах осуществления множество портов не включает порт DO-зонда и/или порт pH-зонда. В некоторых вариантах осуществления порты на верхней поверхности включают только питающий порт, порт взятия образца, перфузионный порт, порт впуска газа и порт выпуска газа. Верхняя поверхность 101 биореакторного мешка 100 содержит питающий порт 102. Питающий порт можно использовать для того, чтобы добавлять различные подаваемые компоненты в биореакторный мешок. Например, питающий порт можно использовать для того, чтобы добавлять клетки в биореакторный мешок из источника клеток и/или добавлять клеточные среды в биореакторный мешок из источника клеточных сред. Клеточные среды могут содержать питательные вещества для клеток в течение культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления клеточные среды можно добавлять непрерывно в биореакторный мешок через питающий порт. В некоторых вариантах осуществления биореакторный мешок можно частично наполнять клеточными средами и клетками через питающий порт. В некоторых вариантах осуществления биореакторный мешок можно предварительно заполнять клеточными средами или предварительно заполнять клетками.
[24] Верхняя поверхность 101 также содержит порт 103 взятия образца. Порт взятия образца можно использовать для того, чтобы удалять образец клеток и/или другого материала из биореакторного мешка. Например, в ходе культивирования пользователь может пожелать тестировать некоторые из клеток в отношении различных характеристик. Соответственно, пользователь может использовать порт взятия образца биореакторного мешка для получения образца клеток.
[25] Биореакторный мешок также может содержать первый конец и второй конец напротив первого конца. Кроме того, биореакторный мешок может содержать первую сторону и вторую сторону напротив первой стороны. Например, верхняя поверхность 101 биореакторного мешка 100 содержит первый конец 107, второй конец 108, первую сторону 109 и вторую сторону 110. В некоторых вариантах осуществления стороны могут быть длиннее, чем концы. Например, в некоторых вариантах осуществления стороны могут составлять 558 мм в длину и концы могут составлять 275 мм в длину. В некоторых вариантах осуществления первый конец может представлять собой переднюю часть мешка при использовании и второй конец может представлять собой заднюю часть мешка при использовании. Середина верхней поверхности мешка может находиться на полпути между первым концом и вторым концом. Питающий порт и/или порт взятия образца могут находиться ближе к первому концу, чем ко второму концу. В других вариантах осуществления питающий порт и/или порт взятия образца могут находиться ближе ко второму концу, чем к первому концу. В некоторых вариантах осуществления питающий порт и/или порт взятия образца могут находиться ближе к первому концу, чем к середине. В некоторых вариантах осуществления питающий порт и/или порт взятия образца могут находиться ближе ко второму концу, чем к середине. В некоторых вариантах осуществления питающий порт и/или порт взятия образца могут находиться ближе к середине, чем к первому или второму концу. В некоторых вариантах осуществления питающий порт может находиться ближе к первой стороне, чем ко второй стороне. В некоторых вариантах осуществления питающий порт может находиться ближе ко второй стороне, чем к первой стороне. Кроме того, порт взятия образца может находиться ближе ко второй стороне, чем к первой стороне. В других вариантах осуществления порт взятия образца может находиться ближе к первой стороне, чем ко второй стороне.
[26] Биореакторный мешок может содержать перфузионный порт 104, как показано на фиг. 1. Перфузионный порт можно использовать для того, чтобы удалять отходы клеток из биореакторного мешка. Например, когда клетки культивируют в биореакторе, клетки могут продуцировать токсичные метаболические побочные продукты. Соответственно, токсичные побочные продукты можно удалять через перфузионный порт. Биореакторный мешок также может содержать перфузионный фильтр, соединенный по текучему веществу с перфузионным портом. Перфузионный фильтр может позволять удалять текучее вещество из биореакторного мешка при минимальной или нулевой потере клеток. Соответственно, фильтр может иметь такую пористость, что клетки не могут проходить через него. В некоторых вариантах осуществления перфузионный фильтр можно сконструировать так, что он может свободно двигаться на поверхности текучего вещества в биореакторном мешке. В некоторых вариантах осуществления перфузионный фильтр содержит мембрану 1,2 мкм (размер пор). Труба фильтрата может представлять собой соединение между перфузионным портом и портом фильтрата. Соответственно, фильтрат отходов может выходить из биореакторного мешка сначала через фильтр в трубу фильтрата и затем из перфузионного порта. В некоторых вариантах осуществления фильтрат отходов непрерывно удаляют из биореакторного мешка. Фиг. 1 содержит фильтр 111 внутри биореакторного мешка 100, порт 112 фильтрата на фильтре 11 и трубу 113 фильтрата, соединяющую порт 112 фильтрата и перфузионный порт 104. Пунктирные линии фильтра 111, порта 112 фильтрата и трубы 113 фильтрата обозначают, что эти объекты находятся не на верхней поверхности 101, а внутри биореакторного мешка 100. Труба фильтрата может представлять собой гибкую трубу, которая позволяет фильтру перемещаться свободно на поверхности текучего вещества в биореакторном мешке. В некоторых вариантах осуществления перфузионный порт находится ближе ко второму концу, чем к первому концу биореакторного мешка, как показано на фиг. 1. В других вариантах осуществления перфузионный порт находится ближе к первому концу, чем ко второму концу биореакторного мешка. В некоторых вариантах осуществления перфузионный порт находится ближе к первому концу, чем к середине. В некоторых вариантах осуществления перфузионный порт находится ближе ко второму концу, чем к середине. В некоторых вариантах осуществления перфузионный порт находится ближе к середине, чем к первому или второму концу. Кроме того, перфузионный порт может находиться ближе ко второй стороне, чем к первой стороне. В других вариантах осуществления перфузионный порт может находиться ближе к первой стороне, чем ко второй стороне.
2
[27] Верхняя поверхность биореакторного мешка также может содержать порт впуска газа и порт выпуска газа. Например, фиг. 1 содержит порт 105 выпуска газа и порт 106 впуска газа на верхней поверхности 111. В некоторых вариантах осуществления биореакторный мешок можно надувать, в некоторых вариантах осуществления частично надувать, через порт впуска газа. В некоторых вариантах осуществления газ (например, CO, кислород, азот, воздух или их смеси) из источника газа может поступать через порт впуска газа для того, чтобы надувать биореакторный мешок. Помимо надувания мешка, газ можно использовать для культивирования клеток. Например, газ может требоваться для клеточного метаболизма. Отработавший газ (например, дыхательные газы) из биореакторного мешка может выходить из биореакторного мешка через порт выпуска газа. В некоторых вариантах осуществления порт впуска газа и/или порт выпуска газа находятся ближе к середине, чем к первому концу или второму концу. В некоторых вариантах осуществления порт впуска газа и/или порт выпуска газа находятся ближе к первому концу, чем к середине. В некоторых вариантах осуществления порт впуска газа и/или порт выпуска газа находятся ближе ко второму концу, чем к середине. В некоторых вариантах осуществления порт впуска газа находится ближе к первой стороне, чем ко второй стороне. В некоторых вариантах осуществления порт впуска газа находится ближе ко второй стороне, чем к первой стороне. В некоторых вариантах осуществления порт выпуска газа находится ближе ко второй стороне, чем к первой стороне. В некоторых вариантах осуществления порт выпуска газа находится ближе к первой стороне, чем ко второй стороне.
[28] По меньшей мере один из множества портов биореакторного мешка может иметь погружную трубу(ы). В некоторых вариантах осуществления порты не содержат погружные трубы. В некоторых вариантах осуществления биореакторный мешок может содержать канты (т. е. избыток пластмассы) по меньшей мере на одном из концов и/или сторон биореакторного мешка. В некоторых вариантах осуществления один или несколько из этих кантов удаляют в ходе изготовления биореакторного мешка и ассоциированных компонентов. В других вариантах осуществления биореакторный мешок не содержит канты на концах и/или сторонах мешка. Удаление одного или нескольких кантов или отсутствие кантов на мешке может позволять биореакторным мешкам помещаться на многих различных биореакторных качалках.
[29] Верхняя поверхность биореакторного мешка также может содержать продуктовую этикетку. Например, фиг. 1 содержит продуктовую этикетку 114 на верхней поверхности 101. Биореакторный мешок также может содержать нижнюю поверхность (не показано). В некоторых вариантах осуществления нижняя поверхность биореакторного мешка может содержать по меньшей мере один из множества портов, описанных выше. В других вариантах осуществления нижняя поверхность может быть гладкой. В некоторых вариантах осуществления биореакторный мешок помещают на биореакторную качалку. Биореакторная качалка может качать или возбуждать биореакторный мешок, тем самым обеспечивая движение (например, аэрацию и перемешивание) клеток в мешке для того, чтобы способствовать культивированию клеток. Качание или возбуждение биореактора также может обеспечивать эффективный газообмен на поверхности газ-жидкость. Примеры биореакторов с качающими подвижными платформами, совместимых со сборочными узлами биореакторных мешков, раскрытых в настоящем описании, включают, но не ограничиваясь этим, GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20 | 50, Finesse SmartRocker Bioreactor Systems и Pall XRS Bioreactor Systems.
[30] Сборочные узлы биореакторных мешков, раскрытые в настоящем описании, могут представлять собой выбрасываемые сборочные узлы биореакторного мешка однократного использования. Биореакторный мешок можно выполнять из гибкого материала, такого как полимерный материал (например, полиэтилен). Полимерный материал может представлять собой пластмассовую пленку или ламинат. Кроме того, гибкий материал может включать неорганические оксиды и/или металлы. В некоторых вариантах осуществления биореакторные мешки можно выполнять из пленочного материала S80. В некоторых вариантах осуществления биореакторные мешки имеют слой газового барьера. Материал слоя газового барьера может включать EVOH. В некоторых вариантах осуществления биореакторные мешки могут иметь слой контакта с продуктом. Слой контакта с продуктом материал может включать полиэтилен, такой как линейный полиэтилен низкой плотности (LLDPE). В некоторых вариантах осуществления биореакторный мешок можно выполнять из того же материала, что Sartorius Flexsafe RM Perfusion Bag. Биореакторные мешки могут иметь общий объем 1-200 л (например, 1, 2, 10, 20, 50, 100 или 200 л). Биореакторные мешки могут иметь объем культуры от 100 мл до 100 л (например, 0,1-0,5 л, 0,2-1 л, 1-5 л, 2-10 л, 5-25 л, 10-50 л или 20-10 л).
[31] Сборочный узел биореакторного мешка также может содержать компоновку питающих трубок, соединенную по текучему веществу с питающим портом. Компоновка питающих трубок может предоставлять различные подаваемые компоненты (например, клетки и/или среды) в питающий порт биореакторного мешка. На фиг. 2A-B проиллюстрированы примеры компоновки 215 питающих трубок, соединенной по текучему веществу с питающим портом 202 сборочного узла биореакторного мешка, раскрытого в настоящем описании. Компоновка питающих трубок может содержать Y-образный соединитель 216. Y-образный соединитель можно использовать с тем, чтобы компоновка питающих трубок имела два впуска. Соответственно, источник клеточных сред можно соединять по текучему веществу с одним или каждым впуском компоновки питающих трубок. В некоторых вариантах осуществления источник клеток можно соединять по текучему веществу с одним или каждым впуском компоновки питающих трубок. В других вариантах осуществления источник клеток можно соединять с одним впуском и источник сред можно соединять с другим впуском. В некоторых вариантах осуществления Y-образный соединитель может подходить для PVC трубки. Длина трубки в компоновке питающих трубок может быть такой, что длины достаточно для того, чтобы дотянуться до питающего источника (например, источника клеток и/или источника сред). Например, питающий источник можно соединять с IV штативом и длины трубки должно быть достаточно, чтобы компоновка питающих трубок могла достигать питающего источника.
[32] Компоновка питающих трубок также может содержать питающую впускную трубку. Например, фиг. 2A-B содержит питающую впускную трубку 217. Питающая впускная трубка может представлять собой силиконовую трубку и/или трубку из поливинилхлорида (PVC). В некоторых вариантах осуществления питающая впускная трубка представляет собой PVC трубку. В некоторых вариантах осуществления питающая впускная трубка представляет собой PVC трубку 0,118 × 0,164. В некоторых вариантах осуществления питающая впускная трубка представляет собой трубку Tygon 0,118 × 0,164. В некоторых вариантах осуществления питающая впускная трубка является такой, что дополнительные элементы можно сваривать с питающей впускной трубкой. Например, источник клеток и/или источник клеточных сред можно сваривать с питающей впускной трубкой так, что клетки и/или клеточные среды можно подавать в биореакторный мешок через питающий порт. В некоторых вариантах осуществления питающая впускная трубка может соответствовать описаниям сварочного аппарата Terumo TSCD-II. В некоторых вариантах осуществления питающая впускная трубка может быть совместимой со стандартной PVC трубкой для взятия крови. В некоторых вариантах осуществления питающая впускная трубка имеет ID: 2,9-3,1 мм/OD: 3,9-4,5 мм. В некоторых вариантах осуществления питающая впускная трубка имеет ID: 3 мм/OD: 4,17 мм. одна или обе секции питающей впускной трубки могут составлять приблизительно 350-550 мм, 400-500 мм, 425-475 мм или 460 мм в длину. Компоновка питающих трубок также может содержать пробки 218. Пробки могут представлять собой пробки для PVC трубки. В некоторых вариантах осуществления пробки представляют собой вдавливаемые пробки 3/32. Компоновка питающих трубок также может содержать впускной зажим(ы) на питающей впускной трубке. На фиг. 2A-B представлены зажимы 220. В некоторых вариантах осуществления впускные зажимы представляют собой пережимающие зажимы и/или скользящие зажимы. В некоторых вариантах осуществления впускные зажимы подходят для PVC трубки.
[33] Компоновка питающих трубок также может содержать трубку после Y-образного соединителя. Фиг. 2A-2B содержат трубку 219 после Y-образного соединителя. Трубка после Y-образного соединителя может представлять собой силиконовую трубку и/или трубку из поливинилхлорида (PVC). В некоторых вариантах осуществления трубка после Y-образного соединителя представляет собой PVC трубку. В некоторых вариантах осуществления трубка после Y-образного соединителя представляет собой PVC трубку 0,118 × 0,164. В некоторых вариантах осуществления трубка после Y-образного соединителя представляет собой трубку Tygon 0,118 × 0,164. В некоторых вариантах осуществления трубка после Y-образного соединителя является такой, что дополнительные элементы можно сваривать с трубкой после Y-образного соединителя. Например, источник клеток и/или источник клеточных сред можно сваривать с трубкой после Y-образного соединителя так, что клетки и/или клеточные среды можно подавать в биореакторный мешок через питающий порт. В некоторых вариантах осуществления трубка после Y-образного соединителя может соответствовать описаниям сварочного аппарата Terumo TSCD-II. В некоторых вариантах осуществления трубка после Y-образного соединителя может быть совместимой со стандартной PVC трубкой для взятия крови. В некоторых вариантах осуществления трубка после Y-образного соединителя имеет ID: 2,9-3,1 мм/OD: 3,9-4,5 мм. В некоторых вариантах осуществления трубка после Y-образного соединителя имеет ID: 3 мм/OD: 4,17 мм. Трубка после Y-образного соединителя может быть приблизительно 200-400 мм, 250-350 мм, 275-325 мм или 300 мм в длину.
[34] Компоновка питающих трубок также может содержать редуктор, как показано на фиг. 2A-B в виде редуктора 221. Редуктор может представлять собой классическую серию зубцов. В некоторых вариантах осуществления редуктор представляет собой редуктор 1/8 × 5/32. В некоторых вариантах осуществления редуктор представляет собой Value Plastics #3040-6005.
[35] Компоновка питающих трубок может содержать трубку после редуктора, как показано на фиг. 2A-2B в виде трубки после редуктора 222. Трубка после редуктора может представлять собой силиконовую трубку и/или трубку из поливинилхлорида (PVC). В некоторых вариантах осуществления трубка после редуктора представляет собой силиконовую трубку. В некоторых вариантах осуществления трубка после редуктора представляет собой силиконовую трубку 1/8 × 1/4. Трубка после редуктора может быть приблизительно 1000-1500 мм, 1250-1450 мм, 1350-1400 мм или 1380 мм в длину. Компоновка питающих трубок может содержать зажим на трубке после редуктора. Фиг. 2A-B иллюстрирует зажим 223 после редуктора. Зажим после редуктора может представлять собой пережимающий зажим или скользящий зажим. В некоторых вариантах осуществления зажим после редуктора подходит для силиконовой трубки.
[36] Часть трубки компоновки питающих трубок можно соединять с насосом или несколькими насосами так, что текучие вещества, соединенные с питающей впускной трубкой, можно переносить в биореакторный мешок через питающий порт. В некоторых вариантах осуществления силиконовую трубку компоновки питающих трубок соединяют с насосом. В некоторых вариантах осуществления трубку после редуктора соединяют с насосом. В некоторых вариантах осуществления гравитация может обеспечивать усилие для переноса текучих веществ, соединенных с питающей впускной трубкой, в биореакторный мешок через питающий порт.
[37] Соединители, используемые в компоновке питающих трубок, могут представлять собой соединители с зубцами и/или соединители люэровского блокирующего соединения. В некоторых вариантах осуществления используют только соединители с зубцами. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере некоторые из соединений компоновки питающих трубок могут иметь хомуты кабеля или другие хомуты для того, чтобы фиксировать соединение, на них. В других вариантах осуществления хомуты кабеля могут быть на каждом соединении компоновки питающих трубок, как показано на фиг. 2B хомутами 224 кабеля. Кроме того, все соединения компоновки питающих трубок можно соединять по текучему веществу.
[38] В некоторых вариантах осуществления компоновку питающих трубок также можно использовать для сбора культивируемых клеток. Например, мешок для сбора можно сваривать с питающей впускной трубкой и/или трубкой после Y-образного соединителя. В некоторых вариантах осуществления мешок для сбора сваривают с PVC трубкой питающей впускной трубки и/или PVC трубкой в трубке после Y-образного соединителя. Для того чтобы собирать клетки, поток в компоновке питающих трубок можно обращать. Гравитация может обеспечивать достаточное усилие для того, чтобы приводить в движение поток клеток из биореакторного мешка в мешок для сбора. В других вариантах осуществления насос можно использовать для приведения в движение потока клеток из биореакторного мешка в мешок для сбора, как изложено выше.
[39] Сборочный узел биореакторного мешка также может содержать компоновку трубок взятия образца, соединенную по текучему веществу с портом взятия образца. Компоновку трубок взятия образца можно использовать для того, чтобы удалять образец клеток и/или другой материал из биореакторного мешка. Например, в ходе культивирования пользователь может пожелать тестировать некоторые из клеток в отношении различных характеристик. Соответственно, пользователь может использовать компоновку трубок взятия образца, соединенную по текучему веществу с портом взятия образца биореакторного мешка, чтобы получать образец клеток.
[40] Фиг. 3A-B иллюстрирует примеры компоновки 325 трубок взятия образца, соединенной по текучему веществу с портом взятия образца 303 для сборочного узла биореакторного мешка, раскрытого в настоящем описании. Компоновка трубок взятия образца может содержать впускную трубку взятия образца. Например, фиг. 3A-B содержат впускную трубку 326 взятия образца. Впускная трубка взятия образца может представлять собой силиконовую трубку и/или трубку из поливинилхлорида (PVC). В некоторых вариантах осуществления впускная трубка взятия образца представляет собой PVC трубку. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка взятия образца представляет собой PVC трубку 0,118 × 0,164. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка взятия образца представляет собой трубку Tygon 0,118 × 0,164. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка взятия образца является такой, что дополнительные элементы можно сваривать с впускной трубкой взятия образца. Например, компоновку взятия образца можно сваривать со впускной трубкой взятия образца так, что клетки образца можно удалять через порт взятия образца и компоновку трубок взятия образца. Фиг. 7 иллюстрирует пример компоновки взятия образца 780, который можно сваривать со сборочным узлом биореакторного мешка, раскрытым в настоящем описании. Компоновка взятия образца может содержать трубку (781), одноходовой невозвратный клапан (782) и повторно используемый порт (783) взятия образца MicroClave. Трубка компоновки взятия образца может представлять собой силиконовую трубку и/или трубку из поливинилхлорида (PVC). В некоторых вариантах осуществления трубка представляет собой PVC трубку. В некоторых вариантах осуществления трубка представляет собой PVC трубку 0,118 × 0,164. В некоторых вариантах осуществления трубка представляет собой трубку Tygon 0,118 × 0,164. В некоторых вариантах осуществления трубка может соответствовать описаниям сварочного аппарата Terumo TSCD-II. В некоторых вариантах осуществления трубка может быть совместимой со стандартной PVC трубкой для взятия крови. В некоторых вариантах осуществления трубка имеет ID: 2,9-3,1 мм/OD: 3,9-4,5 мм. В некоторых вариантах осуществления трубка имеет ID: 3 мм/OD: 4,17 мм. Конец (784) трубки напротив повторно используемого порта взятия образца MicroClave можно закупоривать. Компоновку взятия образца можно сваривать со впускной трубкой взятия образца сборочного узла биореакторного мешка, чтобы делать возможным взятие образца. Компоновка взятия образца может составлять приблизительно 20-40 мм, 25-35 мм или 30 мм в длину. Компоновка взятия образца также может иметь объем приблизительно 1-5 мл, 2-3 мл или 2,2 мл. По меньшей мере некоторые из соединений компоновки взятия образца можно скреплять для того, чтобы предотвращать утечки. В некоторых вариантах осуществления все соединения компоновки взятия образца скрепляют для того, чтобы предотвращать утечки. Повторно используемый порт взятия образца MicroClave можно закреплять для того, чтобы предотвращать случайное отвинчивание порта взятия образца MicroClave. Повторно используемый порт взятия образца MicroClave можно соединять со шприцом взятия образца для того, чтобы удалять образец из биореакторного мешка. Одноходовой невозвратный клапан может предотвращать случайный обратный поток в ходе взятия образца и может защищать культуру от контаминации. ПО существу, пользователь может не иметь возможности толкать обратно любой материал из шприца взятия образца в культуральный мешок. Кроме того, линию можно прочищать между образцами, пропуская газ из воздушной прослойки в культуральном мешке, когда биореакторный мешок помещают лежа на биореакторной качалке.
[41] В некоторых вариантах осуществления впускная трубка взятия образца может соответствовать описаниям сварочного аппарата Terumo TSCD-II. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка взятия образца может быть совместимой со стандартной PVC трубкой для взятия крови. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка взятия образца имеет ID: 2,9-3,1 мм/OD: 3,9-4,5 мм. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка взятия образца имеет ID: 3 мм/OD: 4,17 мм. Впускная трубка взятия образца может быть приблизительно 200-400 мм, 250-350 мм, 275-325 мм или 300 мм в длину. Компоновка трубок взятия образца также может содержать пробку 318. Пробка может представлять собой пробку для PVC трубки. В некоторых вариантах осуществления пробка представляет собой вдавливаемую пробку 3/32.
[42] Компоновка трубок взятия образца также может содержать редуктор, как показано на фиг. 3A-B в виде редуктора 321. Редуктор может представлять собой классическую серию зубцов. В некоторых вариантах осуществления редуктор представляет собой редуктор 1/8 × 5/32. В некоторых вариантах осуществления редуктор представляет собой Value Plastics #3040-6005.
[43] Компоновка трубок взятия образца может содержать трубку взятия образца после редуктора, как показано на фиг. 3A-B в виде трубки 327 взятия образца после редуктора. трубка взятия образца после редуктора может представлять собой силиконовую трубку и/или трубку из поливинилхлорида (PVC). В некоторых вариантах осуществления трубка взятия образца после редуктора представляет собой силиконовую трубку. В некоторых вариантах осуществления трубка взятия образца после редуктора представляет собой силиконовую трубку 1/8 × 1/4. Трубка взятия образца после редуктора может быть приблизительно 10-100 мм, 25-75 мм, 40-60 мм или 50 мм в длину. Компоновка трубок взятия образца может содержать зажим на трубке взятия образца после редуктора. Фиг. 3A-B иллюстрируют зажим 323 взятия образца после редуктора. Зажим взятия образца после редуктора может представлять собой пережимающий зажим или скользящий зажим. В некоторых вариантах осуществления зажим взятия образца после редуктора подходит для силиконовой трубки.
[44] Часть трубки компоновки трубок взятия образца можно соединять с насосом или несколькими насосами так, что текучее вещество образцов можно удалять из порта взятия образца. В некоторых вариантах осуществления силиконовую трубку компоновки трубок взятия образца соединяют с насосом. В некоторых вариантах осуществления трубку взятия образца после редуктора соединяют с насосом. В некоторых вариантах осуществления гравитация может обеспечивать усилие для удаления текучего вещества образцов из порта взятия образца.
[45] Соединители, используемые в компоновке трубок взятия образца, могут представлять собой соединители с зубцами и/или соединители люэровского блокирующего соединения. В некоторых вариантах осуществления используют только соединители с зубцами. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере некоторые из соединений компоновки трубок взятия образца могут иметь хомуты кабеля или другие хомуты для того, чтобы фиксировать соединение, на них. В других вариантах осуществления хомуты кабеля могут быть на каждом соединении компоновки трубок взятия образца, как показано на фиг. 3B хомутами 324 кабеля. Кроме того, все соединения компоновки питающих трубок можно соединять по текучему веществу.
[46] Сборочный узел биореакторного мешка также может содержать мешок отходов, соединенный по текучему веществу с перфузионным портом биореакторного мешка. Мешок отходов может хранить отходы клеток, удаленные из биореакторного мешка. Соответственно, фильтрат отходов может покидать биореакторный мешок через перфузионный порт и затем храниться в мешке отходов.
[47] Фиг. 4A-B иллюстрирует примеры компоновки 428 трубок отходов, соединяющей по текучему веществу мешок 429 отходов и перфузионный порт 404 сборочного узла биореакторного мешка, раскрытого в настоящем описании. По существу, отходы из биореакторного мешка могут проходить через фильтр 411, из порта 412 фильтрата, через трубу 413 фильтрата, из перфузионного порта 404 и затем в мешок 429 отходов. Длина трубки в компоновке трубок отходов может быть такой, что длины достаточно для того, чтобы мешок отходов находился на той же или другой платформе биореакторного стола или консоли относительно биореакторного мешка. Например, мешок отходов может находиться на полке или платформе ниже биореакторной качалки (с биореакторным мешком), и длины трубки должно быть достаточно, чтобы компоновка трубок отходов могла достигать полки или платформы. Мешок отходов может иметь общий объем 1-200 л (например, 1, 2, 10, 20, 50, 100 или 200 л). В некоторых вариантах осуществления мешок отходов представляет собой мешок 10 л. Мешок отходов может иметь порт отходов. В некоторых вариантах осуществления порт отходов находится на верхней поверхности мешка отходов, как показано на фиг. 4B в виде порта 430 отходов. Наличие порта отходов на верхней поверхности мешка отходов может позволять мешку отходов находиться на полке или платформе ниже биореакторного мешка и трубке из биореакторного мешка из мешка отходов выстраиваться вертикально без необходимости изгибать трубку. Мешок отходов также может иметь первый конец и второй конец напротив первого конца. Кроме того, мешок отходов может иметь первую сторону и вторую сторону напротив первой стороны. Например, мешок 429 отходов может содержать первый конец 431, второй конец 432, первую сторону 433 и вторую сторону 434, как показано на фиг. 4B. В некоторых вариантах осуществления стороны мешка отходов могут быть длиннее, чем концы. Например, стороны могут быть 500 мм в длину и концы могут быть 380 мм в длину. В некоторых вариантах осуществления первый конец может представлять собой переднюю часть мешка отходов при использовании и второй конец может представлять собой заднюю часть мешка отходов при использовании. В некоторых вариантах осуществления порт отходов находится на первом конце мешка отходов. Середина верхней поверхности мешка отходов может находиться на полпути между первым концом и вторым концом. Порт отходов может находиться ближе к первому концу, чем ко второму концу. В других вариантах осуществления порт отходов может находиться ближе ко второму концу, чем к первому концу. В некоторых вариантах осуществления порт отходов может находиться ближе к первому концу, чем к середине. В некоторых вариантах осуществления порт отходов может находиться ближе ко второму концу, чем к середине. В некоторых вариантах осуществления порт отходов может находиться ближе к середине, чем к первому или второму концу. В некоторых вариантах осуществления порт отходов может находиться ближе к первой стороне, чем ко второй стороне. В некоторых вариантах осуществления порт отходов может находиться ближе ко второй стороне, чем к первой стороне.
[48] Компоновка трубок отходов может содержать впускную трубку мешка отходов. Например, фиг. 4A-B содержат впускную трубку 435 мешка отходов. Впускная трубка мешка отходов может представлять собой силиконовую трубку и/или трубку из поливинилхлорида (PVC). В некоторых вариантах осуществления впускная трубка мешка отходов представляет собой PVC трубку. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка мешка отходов представляет собой силиконовую трубку. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка мешка отходов представляет собой PVC трубку 0,118 × 0,164. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка мешка отходов представляет собой трубку Tygon 0,118 × 0,164. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка мешка отходов представляет собой силиконовую трубку 1/8 × 1/4. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка мешка отходов является такой, что дополнительные элементы можно сваривать со впускной трубкой мешка отходов, такие как дополнительные мешки отходов. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка мешка отходов может соответствовать описаниям сварочного аппарата Terumo TSCD-II. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка мешка отходов может быть совместимой со стандартной PVC трубкой для взятия крови. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка мешка отходов имеет ID: 2,9-3,1 мм/OD: 3,9-4,5 мм. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка мешка отходов имеет ID: 3 мм/OD: 4,17 мм. Впускная трубка мешка отходов может быть приблизительно 10-200 мм, 25-300 мм, 25-75 мм или 50 мм в длину.
[49] Компоновка трубок отходов также может содержать редуктор, как показано на фиг. 4A-4B в виде редуктора 421. Компоновка трубок отходов также может содержать второй редуктор, как показано на фиг. 4B в виде редуктора 436. Редуктор(ы) может представлять собой классическую серию зубцов. В некоторых вариантах осуществления редуктор(ы) представляет собой редуктор 1/8 × 5/32. В некоторых вариантах осуществления редуктор(ы) представляет собой Value Plastics #3040-6005.
[50] Компоновка трубок отходов также может содержать выпускную трубку перфузионного порта. Например, фиг. 4A-B содержит выпускную трубку 437 перфузионного порта. Выпускная трубка перфузионного порта может представлять собой силиконовую трубку и/или трубку из поливинилхлорида (PVC). В некоторых вариантах осуществления выпускная трубка перфузионного порта представляет собой силиконовую трубку. В некоторых вариантах осуществления выпускная трубка перфузионного порта представляет собой силиконовую трубку 1/8 × 1/4. Выпускная трубка перфузионного порта может быть приблизительно 1000-2000 мм, 1250-1750 мм, 1500-1600 мм или 1520 мм в длину. Компоновка трубок отходов может содержать зажим на выпускной трубке перфузионного порта. Фиг. 4A-B иллюстрирует зажим 423 выпускной трубки перфузионного порта. Зажим выпускной трубки перфузионного порта может представлять собой пережимающий зажим или скользящий зажим. В некоторых вариантах осуществления зажим выпускной трубки перфузионного порта взятия образца после редуктора подходит для силиконовой трубки.
[51] Компоновка трубок отходов также может содержать промежуточную трубку отходов. Например, фиг. 4B содержит промежуточную трубку 438 отходов. Промежуточная трубка отходов может находиться между двумя другими трубками. В некоторых вариантах осуществления промежуточная трубка отходов находится между двумя редукторами. Промежуточная трубка отходов может представлять собой силиконовую трубку и/или трубку из поливинилхлорида (PVC). В некоторых вариантах осуществления промежуточная трубка отходов представляет собой PVC трубку. В некоторых вариантах осуществления промежуточная трубка отходов представляет собой PVC трубку 0,118 × 0,164. В некоторых вариантах осуществления промежуточная трубка отходов представляет собой трубку Tygon 0,118 × 0,164. В некоторых вариантах осуществления промежуточная трубка отходов является такой, что дополнительные элементы можно сваривать с промежуточной трубкой отходов, такие как дополнительные мешки отходов. В некоторых вариантах осуществления промежуточная трубка отходов может соответствовать описаниям сварочного аппарата Terumo TSCD-II. В некоторых вариантах осуществления промежуточная трубка отходов может быть совместимой со стандартной PVC трубкой для взятия крови. В некоторых вариантах осуществления промежуточная трубка отходов имеет ID: 2,9-3,1 мм/OD: 3,9-4,5 мм. В некоторых вариантах осуществления промежуточная трубка отходов имеет ID: 3 мм/OD: 4,17 мм. Промежуточная трубка отходов может быть приблизительно 500-1500 мм, 750-1250 мм, 900-1000 мм или 920 мм в длину.
[52] Часть трубки из компоновки трубок отходов можно соединять с насосом или несколькими насосами так, что отходы из биореакторного мешка можно переносить в мешок отходов через перфузионный порт. В некоторых вариантах осуществления силиконовую трубку из компоновки трубок отходов соединяют с насосом. В некоторых вариантах осуществления выпускную трубку перфузионного порта и/или впускную трубку мешка отходов соединяют с насосом. В некоторых вариантах осуществления гравитация может обеспечивать усилие для удаления отходов из биореакторного мешка, которые подлежат переносу в мешок отходов.
[53] Соединители, используемые в компоновке трубок отходов, могут представлять собой соединители с зубцами и/или соединители люэровского блокирующего соединения. В некоторых вариантах осуществления только используют соединители с зубцами. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере некоторые из соединений компоновки трубок отходов могут иметь хомуты кабеля или другие хомуты для того, чтобы фиксировать соединение, на них. В других вариантах осуществления хомуты кабеля могут быть на каждом соединении компоновки трубок отходов, как показано на фиг. 4B хомутами 424 кабеля. Кроме того, все соединения компоновки трубок отходов можно соединять по текучему веществу.
[54] Сборочный узел биореакторного мешка также может содержать компоновку трубок выпуска газа, соединенную по текучему веществу с портом выпуска газа биореакторного мешка. Компоновка трубок выпуска газа может позволять удалять отработавший газ из биореакторного мешка. Фиг. 5 иллюстрирует пример компоновки 539 трубок выпуска газа, соединенной по текучему веществу с портом 505 выпуска газа биореакторного мешка. Компоновка трубок выпуска газа может содержать выходной фильтр. Выходной фильтр может гарантировать, что не будет происходить высвобождения клеток и/или сред из биореакторного мешка в виде аэрозоля. Кроме того, выходной фильтр также может гарантировать, что любой обратный поток через выходной фильтр не приведет к контаминации клеточной культуры в биореакторном мешке. Фиг. 5 иллюстрирует фильтр 543. Компоновка трубок выпуска газа также может содержать впускную трубку выходного фильтра и выпускную трубку выходного фильтра. Выходной фильтр может находиться между впускной трубкой выходного фильтра и выпускной трубкой выходного фильтра. Например, фиг. 5 иллюстрирует выходной фильтр 543 между впускной трубкой 544 выходного фильтра и выпускной трубкой 542 выходного фильтра.
[55] Впускная трубка выходного фильтра может представлять собой силиконовую трубку и/или трубку из поливинилхлорида (PVC). В некоторых вариантах осуществления впускная трубка выходного фильтра представляет собой силиконовую трубку. В некоторых вариантах осуществления впускная трубка выходного фильтра представляет собой силиконовую трубку 3/16 × 5/16. Впускная трубка выходного фильтра может быть приблизительно 10-100 мм, 25-75 мм, 40-60 мм или 50 мм в длину. Компоновка трубок выпуска газа может содержать зажим на впускной трубке выходного фильтра. Фиг. 5 иллюстрирует зажим 523 впускной трубки выходного фильтра. Зажим впускной трубки выходного фильтра может представлять собой пережимающий зажим или скользящий зажим. В некоторых вариантах осуществления зажим впускной трубки выходного фильтра подходит для силиконовой трубки.
[56] Выпускная трубка выходного фильтра может представлять собой силиконовую трубку и/или трубку из поливинилхлорида (PVC). В некоторых вариантах осуществления выпускная трубка выходного фильтра представляет собой силиконовую трубку. В некоторых вариантах осуществления выпускная трубка выходного фильтра представляет собой силиконовую трубку 3/16 × 5/16. Выпускная трубка выходного фильтра может быть приблизительно 10-100 мм, 25-75 мм, 40-60 мм или 50 мм в длину. Компоновка трубок выпуска газа может содержать зажим на выпускной трубке выходного фильтра. Зажим выпускной трубки выходного фильтра может представлять собой пережимающий зажим или скользящий зажим. В некоторых вариантах осуществления зажим выпускной трубки выходного фильтра подходит для силиконовой трубки.
[57] Компоновка трубок выпуска газа также может содержать M-luer 3/16 (541) и невозвратный клапан (540), как показано на фиг. 5. Соединители, используемые в компоновке трубок выпуска газа, могут представлять собой соединители с зубцами и/или соединители люэровского блокирующего соединения. В некоторых вариантах осуществления используют только соединители с зубцами. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере некоторые из соединений компоновки трубок выпуска газа могут иметь хомуты кабеля или другие хомуты для того, чтобы фиксировать соединение, на них. В других вариантах осуществления хомуты кабеля могут быть на каждом соединении компоновки трубок выпуска газа, как показано на фиг. 5 хомутами 524 кабеля. Кроме того, все соединения компоновки трубок выпуска газа можно соединять по текучему веществу.
[58] Сборочный узел биореакторного мешка также может содержать компоновку трубок впуска газа, соединенную по текучему веществу с портом впуска газа биореакторного мешка. Компоновку трубок впуска газа можно соединять с источником газа и позволять газу из источника газа проходить в порт впуска газа. Фиг. 6 иллюстрирует пример компоновки 645 трубок впуска газа, соединенной по текучему веществу с портом впуска газа 606 биореакторного мешка. Компоновка трубок впуска газа может содержать фильтр впуска. Фильтр впуска может представлять собой стерилизующий фильтр впуска. фиг. 6 иллюстрирует фильтр 647 впуска. Компоновка трубок впуска газа также может содержать трубку впуска газа. Например, фиг. 6 иллюстрирует трубку 646 впуска газа.
[59] Трубка впуска газа может представлять собой силиконовую трубку и/или трубку из поливинилхлорида (PVC). В некоторых вариантах осуществления трубка впуска газа представляет собой силиконовую трубку. В некоторых вариантах осуществления трубка впуска газа представляет собой силиконовую трубку 3/16 × 5/16. Трубка впуска газа может быть приблизительно 10-100 мм, 25-75 мм, 40-60 мм или 50 мм в длину. Компоновка трубок впуска газа может содержать зажим на трубке впуска газа. Фиг. 6 иллюстрирует зажим 623 трубки впуска газа. Зажим трубки впуска газа может представлять собой пережимающий зажим или скользящий зажим. В некоторых вариантах осуществления зажим трубки впуска газа подходит для силиконовой трубки.
[60] Соединители, используемые в компоновке трубок впуска газа, могут представлять собой соединители с зубцами и/или соединители люэровского блокирующего соединения. В некоторых вариантах осуществления используют только соединители с зубцами. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере некоторые из соединений компоновки трубок впуска газа могут иметь хомуты кабеля или другие хомуты для того, чтобы фиксировать соединение, на них. В других вариантах осуществления хомуты кабеля могут быть на каждом соединении компоновки трубок впуска газа, как показано на фиг. 6 хомутами 624 кабеля. Кроме того, все соединения компоновки трубок впуска газа можно соединять по текучему веществу.
[61] Сборочные узлы биореакторных мешков, раскрытые в настоящем описании, могут быть стерильными. Например, сборочные узлы биореакторных мешков можно облучать ионизирующим излучением, таким как γ-излучение, электронный пучок или рентгеновские лучи высокой энергии, используя определенную дозу, чтобы гарантировать стерильность сборочного узла биореакторного мешка. Кроме того, все из различных компонентов сборочного узла биореакторного мешка (например, биореакторный мешок, порты, компоновки трубок, мешок отходов, соединители, фильтры и т. д.) можно конструировать из материалов, устойчивых к излучению, например, сополимеров этилена, силиконов, сополимеров стирола, полисульфонов и т. д. В некоторых вариантах осуществления сборочные узлы биореакторных мешков, раскрытые в настоящем описании, можно стерилизовать, и они могут быть готовыми к использованию без дополнительной стерилизации. В некоторых вариантах осуществления сборочные узлы биореакторных мешков закупоривают в стерилизованном состоянии (т. е. без открытой трубки). В некоторых вариантах осуществления сборочные узлы биореакторных мешков могут содержать пробки, уплотнения или зажимы на трубке для того, чтобы предотвращать открывание трубки.
[62] В некоторых вариантах осуществления PVC трубка, раскрытая в настоящем описании, может представлять собой свариваемую PVC трубку, не содержащую DEHP. В некоторых вариантах осуществления силиконовая трубка, раскрытая в настоящем описании, может представлять собой силиконовую трубку насоса. Кроме того, сборочные узлы биореакторных мешков предпочтительно могут содержать соединения с зубцами. В некоторых случаях, люэровские блокирующие соединения могут быть недостаточно затянутыми или случайно отсоединяться, тем самым нарушая целостность сборочного узла биореакторного мешка.
II. СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ОБРАБОТКИ КЛЕТОК
[63] В некоторых вариантах осуществления сборочные узлы биореакторных мешков, предусмотренные в настоящем описании, такие как сборочные узлы перфузионных биореакторных мешков, можно использовать для культивирования клеток, например, в связи с изготовлением, созданием или производством клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления клеточная терапия включает клетки, такие как сконструированные T-клетки с рекомбинантным рецептором, таким как химерный антигенный рецептор, например, CAR T-клетки. В некоторых вариантах осуществления культивирование осуществляют в условиях для культивирования и/или размножения клеток, например, стимуляции клеток, например, чтобы индуцировать их пролиферацию и/или активацию.
[64] В некоторых вариантах осуществления культивирование клеток с использованием сборочных узлов биореакторных мешков, например, в связи с изготовлением, созданием или производством клеточной терапии, можно осуществлять через процесс, который включает одну или несколько дополнительных стадий обработки, таких как стадии выделения, разделения, отбора, активации или стимуляции, трансдукции, промывания, суспендирования, разведения, концентрирования и/или формулирования клеток. В некоторых вариантах осуществления способы создания или производства клеточной терапии включают выделение клеток у субъекта, получение, обработку, культивирование при одном или стимулирующих условиях, в которых по меньшей мере часть культивирования осуществляют с использованием предоставленных сборочных узлов биореакторных мешков, и/или конструирование (например, трансдукцию) клеток. В некоторых вариантах осуществления способ включает стадии обработки, осуществляемые в определенном порядке, в котором: клетки, например, первичные клетки, сначала выделяют, например, отбирают или отделяют, из биологического образца; отобранные клетки инкубируют с частицами вирусного вектора для трансдукции, необязательно после стадии стимуляции выделенных клеток в присутствии стимулирующего реактива; культивирование трансдуцированных клеток, например, для того, чтобы размножать клетки; и формулирование трансдуцированных клеток в композиции. В некоторых вариантах осуществления созданные сконструированные клетки повторно вводят тому же субъекту, до или после криосохранения.
[65] В некоторых вариантах осуществления предоставленные способы осуществляют так, что одну, несколько или все стадии при получении клеток для клинического использования, например, в адоптивной клеточной терапии, осуществляют без экспонирования клеток для нестерильных условий и без необходимости использовать стерильное помещение или кабинет. В некоторых вариантах осуществления такого процесса клетки выделяют, разделяют или отбирают, трансдуцируют, промывают, необязательно активируют или стимулируют и формулируют, все в закрытой системе. В некоторых вариантах осуществления закрытая система представляет собой или содержит сборочные узлы биореакторных мешков, описанные в настоящем описании, такие как сборочные узлы перфузионных биореакторных мешков. В некоторых вариантах осуществления способы осуществляют автоматизированным образом. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько стадий осуществляют независимо от закрытой системы или устройства.
[66] В некоторых вариантах осуществления сборочные узлы биореакторных мешков, описанные в настоящем описании, предусматривают закрытую систему для размножения клеток, которые можно встраивать в известные системы размножения клеток и/или в системы для осуществления одной или нескольких других стадий обработки способа получения, создания или производства клеточной терапии. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько или все стадии обработки, например, выделения, отбора и/или обогащения, обработки, инкубации в связи с трансдукцией и конструированием, и стадии формулирования осуществляют с использованием системы, устройства или аппарата в интегрированной или автономной системе и/или автоматизированным или программируемым образом. В некоторых аспектах система или аппарат включает компьютер и/или компьютерную программу в связи с системой или аппаратом, которые позволяют пользователю программировать, контролировать, оценивать исход и/или корректировать различные аспекты стадий обработки, выделения, конструирования и формулирования. В одном из примеров система представляет собой систему как описано в международной патентной заявке, номер публикации WO2009/072003, или US 20110003380 A1. В одном из примеров, система представляет собой систему как описано в международной публикации № WO2016/073602.
A. Культивирование клеток
[67] В некоторых вариантах осуществления сборочные узлы биореакторных мешков, предоставленные в настоящем описании, такие как сборочные узлы перфузионных биореакторных мешков, можно заполнять, например, через питающий порт, клеточными средами и/или клетками для культивирования добавленных клеток. Клетки могут происходить из любого источника клеток, для которого культивирование клеток желаемо, например, для размножения и/или пролиферации клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой или содержат клетки иммунной системы, такие как первичные клетки, полученные у субъекта, или происходящие из первичных клеток, полученных у субъекта. В некоторых аспектах, клетки представляют собой или содержат T-клетки или NK клетки. В некоторых вариантах осуществления клетки содержат CD4+ и CD8+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления клетки содержат CD4+ или CD8+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления клетки для культивирования представляют собой клетки, которые являются сконструированными или были сконструированы, например, трансдуцированы, для того чтобы экспрессировать рекомбинантный рецептор, такой как химерный антигенный рецептор (CAR), например, созданный в соответствии с одной или несколькими стадиями обработки для изготовления, производства или создания клеточной терапии. Образцы таких трансдуцированных клеток и одна или несколько стадий обработки описаны далее.
[68] В некоторых вариантах осуществления сборочный узел биореакторного мешка выполнен с возможностью интеграции и или функционального соединения и/или является интегрированным или функционально связанным, с закрытой системой или устройством, которые осуществляют одну или несколько стадий обработки. В одном из примеров, система представляет собой систему как описано в международной публикации № WO2016/073602. В некоторых вариантах осуществления система содержит центробежную камеру, и процесс включает осуществление экспрессии из внутренней полости центробежной камеры образца клеток для культивирования, такого как образец клеток, содержащий клетки, трансдуцированные вирусным вектором, кодирующим рекомбинантный рецептор, в биореакторный мешок предоставленного сборочного узла. В некоторых вариантах осуществления мешок соединяют с системой, содержащей центробежную камеру в выходной линии или выходном положении, что тем самым ведет к переносу клеток из внутренней полости камеры в биореакторный мешок для последующего культивирования или культуры.
[69] В некоторых вариантах осуществления общий объем клеток и сред, перенесенных или внесенных в биореакторный мешок, составляет от или приблизительно от 50 мл до 5000 мл, например, от или приблизительно от 300 мл до 3000 мл, от 300 мл до 1500 мл, от 300 мл до 1000 мл, от 300 мл до 1000 мл, от 300 мл до 500 мл, от 500 мл до 3000 мл, от 500 мл до 1500 мл, от 500 мл до 1000 мл, от 1000 мл до 2000 мл, от 1000 мл до 1500 мл или от 1500 мл до 2000 мл. В некоторых вариантах осуществления общий объем клеток и сред, перенесенных или внесенных в биореакторный мешок, составляет по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере или приблизительно 50 мл, 100 мл, 300 мл, 500 мл, 750 мл, 1000 мл, 1250 мл, 1500 мл, 1750 мл или 2000 мл. В некоторых вариантах осуществления биореакторный мешок способен вмещать общий объем от или приблизительно от 300 мл до 10 л, например, от или приблизительно от 500 мл до 5000 мл, от 500 мл до 2500 мл, от 500 мл до 2000 мл, от 500 мл до 1500 мл, от 500 мл до 1000 мл, от 1000 мл до 5000 мл, от 1000 мл до 2500 мл, от 1000 мл до 2000 мл, от 1000 мл до 1500 мл, от 1500 мл до 5000 мл, от 1500 мл до 2500 мл, от 1500 мл до 2000 мл, от 2000 мл до 5000 мл, от 2000 мл до 2500 мл или от 2500 мл до 5000 мл.
[70] В некоторых аспектах среды для культивирования представляют собой адаптированную среду для культивирования, которая поддерживает этот рост, культивирование, размножение или пролиферацию клеток, таких как T-клетки. В некоторых аспектах, среда может представлять собой жидкость, содержащую смесь солей, аминокислот, витаминов, сахаров или любое их сочетание. В некоторых вариантах осуществления среды для культивирования дополнительно содержат одно или несколько стимулирующих условий или средств, например, для того, чтобы стимулировать культивированию, размножение или пролиферацию клеток в течение инкубации. В некоторых вариантах осуществления стимулирующее условие представляет собой или включает один или несколько цитокинов, выбранных из IL-2, IL-7 или IL-15. В некоторых вариантах осуществления цитокин представляет собой рекомбинантный цитокин. В некоторых вариантах осуществления концентрация одного или нескольких цитокинов в средах для культивирования в течение культивирования или инкубации, независимо, составляет от или приблизительно от 1 МЕ/мл до 1500 МЕ/мл, например, от или приблизительно от 1 МЕ/мл до 100 МЕ/мл, от 2 МЕ/мл до 50 МЕ/мл, от 5 МЕ/мл до 10 МЕ/мл, от 10 МЕ/мл до 500 МЕ/мл, от 50 МЕ/мл до 250 МЕ/мл или от 100 МЕ/мл до 200 МЕ/мл, от 50 МЕ/мл до 1500 МЕ/мл, от 100 МЕ/мл до 1000 МЕ/мл или от 200 МЕ/мл до 600 МЕ/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация одного или нескольких цитокинов, независимо, составляет по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1 МЕ/мл, 5 МЕ/мл, 10 МЕ/мл, 50 МЕ/мл, 100 МЕ/мл, 200 МЕ/мл, 500 МЕ/мл, 1000 МЕ/мл или 1500 МЕ/мл. В определенных аспектах, средство, способное активировать домен внутриклеточной сигнализации комплекса TCR, такое как антитело против CD3 и/или против CD28, также можно включать в течение или в течение по меньшей мере части инкубации или после инкубации.
[71] В некоторых аспектах, биореакторный мешок, такой как перфузионный мешок, предоставленный в настоящем описании, инкубируют в течение по меньшей мере части времени после переноса клеток и сред для культивирования. В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия в целом включают температуру, подходящую для роста первичных клеток иммунной системы, таких как T-лимфоциты человека, например, по меньшей мере приблизительно 25 градусов по Цельсию, в целом по меньшей мере приблизительно 30 градусов, и в целом при или приблизительно при 37 градусах по Цельсию. В некоторых вариантах осуществления биореакторный мешок инкубируют при температуре от 25 до 38°C, например, от 30 до 37°C, например, при или приблизительно при 37°C ± 2°C. В некоторых вариантах осуществления инкубацию осуществляют в течение определенного периода времени, пока культура, например, культивирование или размножение, не приведет к желаемой или пороговой плотности, числу или дозе клеток. В некоторых вариантах осуществления инкубация составляет больше чем или приблизительно больше чем или происходит в течение приблизительно 24 часов, 48 часов, 72 часов, 96 часов, 5 суток, 6 суток, 7 суток, 8 суток, 9 суток или больше.
2
2
[72] В некоторых вариантах осуществления сборочный узел биореакторного мешка культивируют в условиях для поддержания целевого количества диоксида углерода в клеточной культуре. В некоторых аспектах, это обеспечивает оптимальное культивирование, размножение и пролиферацию клеток в течение роста. В некоторых аспектах, количество диоксида углерода (CO) составляет между 10% и 0% (об./об.) указанного газа, например, между 8% и 2% (об./об.) указанного газа, например, количество равно или приблизительно равно 5% (об./об.) CO.
[73] В некоторых случаях, биореактор можно подвергать движению или качанию, что, в некоторых аспектах, может увеличивать перенос кислорода. Движение биореактора может включать, но не ограничиваясь этим, вращение по горизонтальной оси, вращение по вертикальной оси, качающее движение по наклонной или отклоненной горизонтальной оси биореактора или любое их сочетание. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть инкубации осуществляют с качанием. Скорость качания и угол качания можно корректировать для того, чтобы достигать желаемого возбуждения. В некоторых вариантах осуществления угол качания составляет 20°, 19°, 18°, 17°, 16°, 15°, 14°, 13°, 12°, 11°, 10°, 9°, 8°, 7°, 6°, 5°, 4°, 3°, 2° или 1°. В определенных вариантах осуществления угол качания составляет 6-16°. В других вариантах осуществления угол качания составляет 7-16°. В других вариантах осуществления угол качания составляет 8-12°. В некоторых вариантах осуществления скорость качания составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 1 12, 13, 14 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 об./мин. В некоторых вариантах осуществления скорость качания составляет между 4 и 12 об./мин, например, между 4 и 6 об./мин включительно.
[74] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть инкубации осуществляют при статичных условиях. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть инкубации осуществляют с перфузией, например, чтобы выливать отработавшие среды и вливать свежие среды в ходе культивирования. В некоторых вариантах осуществления способ включает стадию перфузии свежей среды для культивирования в клеточную культуру, например, через питающий порт. В некоторых вариантах осуществления среды для культивирования, добавляемые в ходе перфузии, содержат одно или несколько стимулирующих средств, например, один или несколько рекомбинантных цитокинов, таких как IL-2, IL-7 и/или IL-15. В некоторых вариантах осуществления среды для культивирования, добавляемые в ходе перфузии, представляют собой те же среды для культивирования, которые используют в ходе статичной инкубации.
[75] В некоторых вариантах осуществления, после инкубации, сборочный узел биореакторного мешка повторно соединяют с системой для осуществления одной или нескольких других стадий обработки или для изготовления, создания или производства клеточной терапии, например, повторно соединяют с системой, содержащей центробежную камеру. В некоторых аспектах культивируемые клетки переносят из биореакторного мешка во внутреннюю полость камеры для формулирования культивируемых клеток.
B. Другие стадии обработки
[76] В некоторых вариантах осуществления культивирование можно осуществлять в связи с одной или несколькими дополнительными стадиями обработки, например, в связи с клеточной инженерией. Такую одну или несколько стадий обработки можно осуществлять в качестве части одной и той же закрытой системы или в функциональной связи с одной и той же закрытой системой.
[77] В некоторых вариантах осуществления одна или несколько стадий обработки включают одно или несколько из (a) промывания биологического образца, содержащего клетки (например, образец цельной крови, образец лейкотромбоцитарного слоя, образец мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), образец нефракционированных T-клеток, образец лимфоцитов, образец белых клеток крови, продукт афереза или продукт лейкафереза), (b) выделения, например, отбора, из образца желаемого подмножества или популяции клеток (например, CD4+ и/или CD8+ T-клеток), например, посредством инкубации клеток с использованием реактива для отбора или иммуноаффинного реактива для разделения на основе иммуноаффинности; c) инкубации выделенных, например, отобранных, клеток с частицами вирусного вектора, (d) культивирования, культуры или размножения клеток, например, в соответствии со способами, описанными выше, и (e) формулирования трансдуцированных клеток, например, в фармацевтически приемлемом буфере, криоконсерванте или другой подходящей среде. В некоторых вариантах осуществления способы дополнительно могут включать (e) стимулирование клеток посредством экспонирования клеток стимулирующим условиям, которое можно осуществлять до, в течение и/или после инкубации клеток с частицами вирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления одну или несколько дополнительных стадий промывания или стадий суспендирования, например, для разведения, концентрирования и/или замены буфера клеток, также можно осуществлять до или после любой из вышеуказанных стадий.
1. Выделение или отбор клеток из образцов
[78] В некоторых вариантах осуществления стадии обработки включают выделение клеток или их композиций из биологических образцов, таких как те, которые получают от или происходят от субъекта, такого как тот, который имеет конкретное заболевание или состояние или нуждается в клеточной терапии или которому будут вводить клеточную терапию. В некоторых аспектах, субъектом является человек, такой как субъект, который является пациентом, нуждающимся в конкретном терапевтическом вмешательстве, таком как адоптивная клеточная терапия, для которой клетки выделяют, обрабатывают и/или конструируют. Соответственно, клетки в некоторых вариантах осуществления представляют собой первичные клетки, например, первичные клетки человека. Образцы включают ткань, текучее вещество и другие образцы, получаемые непосредственно у субъекта. Биологический образец может представлять собой образец, получаемый непосредственно из биологического источника, или образец, который обрабатывают. Биологические образцы включают, но не ограничиваясь этим, текучие вещества организма, такие как кровь, плазма, сыворотка, цереброспинальная жидкость, синовиальное текучее вещество, моча и пот, образцы тканей и органов, включая обработанные образцы, получаемые из них.
[79] В некоторых аспектах образец представляет собой кровь или получаемый из крови образец или представляет собой или происходит из продукта афереза или лейкафереза. Образцовые образцы включают цельную кровь, мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), лейкоциты, костный мозг, тимус, тканевой биоптат, опухоль, лейкоз, лимфому, лимфатический узел, ассоциированную с кишечником лимфоидную ткань, ассоциированную со слизистой лимфоидную ткань, селезенку, другие лимфоидные ткани, печень, легкое, желудок, кишечник, ободочную кишку, почку, поджелудочную железу, молочную железу, кость, предстательную железу, шейку матки, семенник, яичник, миндалину или другой орган и/или клетки, происходящие из них. Образцы включают, в контексте клеточной терапии, например, адоптивной клеточной терапии, образцы из аутологичных и аллогенных источников.
[80] В некоторых примерах клетки из циркулирующей крови субъекта получают, например, посредством афереза или лейкафереза. Образцы, в некоторых аспектах, содержат лимфоциты, в том числе T-клетки, моноциты, гранулоциты, B-клетки, другие ядросодержащие белые клетки крови, красные клетки крови и/или тромбоциты, и в некоторых аспектах содержат клетки, отличные от красных клеток крови и тромбоцитов.
++
++
[81] В некоторых вариантах осуществления клетки крови, взятые у субъекта, промывают, например, чтобы удалять фракцию плазмы и помещать клетки в подходящий буфер или среды для последующих стадий обработки. В некоторых вариантах осуществления клетки промывают фосфатно-солевым буфером (PBS). В некоторых вариантах осуществления промывающий раствор не содержит кальций и/или магний и/или многие или все двухвалентные катионы. В некоторых аспектах, стадию промывания выполняют на полуавтоматизированной «проточной» центрифуге (например, клеточный процессор Cobe 2991, Baxter) по инструкциям производителя. В некоторых аспектах стадию промывания выполняют посредством тангенциального поточного фильтрования (TFF) по инструкциям производителя. В некоторых вариантах осуществления клетки ресуспендируют в различных биосовместимых буферах после промывания, таких как, например, PBS без Ca/Mg. В определенных вариантах осуществления компоненты образца клеток крови удаляют и клетки непосредственно ресуспендируют в культуральных средах.
[82] В некоторых вариантах осуществления способы получения включают стадии заморозки, например, криосохранения, клеток, или до или после выделения, отбора и/или обогащения и/или инкубации для трансдукции и конструирования. В некоторых вариантах осуществления на стадии замораживания и последующего оттаивания удаляют гранулоциты и, в определенной степени, моноциты в популяции клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки суспендируют в растворе для заморозки, например, после стадии промывания, чтобы удалять плазму и тромбоциты. В некоторых аспектах можно использовать любые из множества известных растворов для заморозки и параметров. Один из примеров включает использование PBS, содержащего 20% DMSO и 8% сывороточный альбумин человека (HSA), или других подходящих сред для заморозки клеток. Затем это разводят 1:1 в средах с тем, чтобы конечная концентрация DMSO и HSA составляла 10% и 4%, соответственно. Затем клетки обычно замораживают до -80°C. со скоростью 1° в минуту и хранят в паровой фазе резервуара для хранения с жидким азотом.
[83] В некоторых вариантах осуществления выделение клеток или популяций включает одну или несколько стадий получения и/или разделения клеток не на основе аффинности. В некоторых примерах, клетки промывают, центрифугируют и/или инкубируют в присутствии одного или нескольких реактивов, например, чтобы удалять нежелательные компоненты, обогащать по желаемым компонентам, лизировать или удалять клетки, чувствительные к конкретным реактивам. В некоторых примерах, клетки разделяют на основе одного или нескольких свойств, таких как плотность, свойства адгезии, размер, чувствительность и/или устойчивость к конкретным компонентам. В некоторых вариантах осуществления способы включают способы разделения клеток на основе плотности, такие как получение белых клеток крови из периферической крови посредством лизирования красных клеток крови и центрифугирования через градиент перколла или фиколла.
[84] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть стадии отбора включает инкубацию клеток с реактивом для отбора. Инкубация с реактивом или реактивами для отбора, например, в качестве части способов отбора, которую можно осуществлять с использованием одного или нескольких реактивов для отбора, для отбора одного или нескольких различных типов клеток на основе экспрессии или присутствия в или на клетке одной или нескольких специфических молекул, таких как маркеры поверхности, например, поверхностные белки, внутриклеточные маркеры или нуклеиновая кислота. В некоторых вариантах осуществления можно использовать любой известный способ с использованием реактива для отбора или реактивов для разделения на основе таких маркеров. В некоторых вариантах осуществления реактив или реактивы для отбора ведут к разделению, то есть разделению на основе аффинности или иммуноаффинности. Например, отбор в некоторых аспектах включает инкубацию с реактивом или реактивами для разделения клеток и популяций клеток на основе клеточной экспрессии или уровня экспрессии одного или нескольких маркеров, обычно поверхностных клеточных маркеров, например, посредством инкубации с антителом или партнером связывания, который специфически связывается с такими маркерами, за чем обычно следуют стадии промывания и отделения клеток, имеющих связанное антитело или партнер связывания, от тех клеток, которые не имеют связанное антитело или партнер связывания.
[85] В некоторых аспектах таких процессов, объем клеток смешивают с определенным количеством желаемого реактива для отбора на основе аффинности. Отбор на основе иммуноаффинности можно осуществлять с использованием любой системы или способа, которые ведут к благоприятному энергетическому взаимодействию между клетками, подлежащими отделению, и молекулой, специфически связывающееся с маркером клетке, например, антителом или другим партнером связывания на твердой поверхности, например, частице. В некоторых вариантах осуществления способы осуществляют с использованием частиц, таких как гранулы, например, магнитные бусы, которые покрывают селекционным средством (например, антителом) со специфичностью к маркеру клеток. Частицы (например, гранулы) можно инкубировать или смешивать с клетками в контейнере, таком как пробирка или мешок, при встряхивании или смешивании, при постоянном соотношении плотности клеток и частиц (например, гранул), чтобы способствовать энергетически благоприятным взаимодействиям. В других случаях способы включают отбор клеток, в которых весь отбор или его часть осуществляют во внутренней полости центробежной камеры, например, при центробежном вращении. В некоторых вариантах осуществления инкубацию клеток с реактивами для отбора, например, реактивами для отбора на основе иммуноаффинности, осуществляют в центробежной камере. В определенных вариантах осуществления выделение или разделение осуществляют с использованием системы, устройства или аппарата, описанных в международной патентной заявке, номер публикации WO2009/072003, или US 20110003380 A1. В одном из примеров, система представляет собой систему как описано в международной публикации № WO2016/073602.
[86] В некоторых вариантах осуществления посредством проведения таких стадий отбора или их частей (например, инкубации с частицами, покрытыми антителами, например, магнитными бусами) в полости центробежной камеры, пользователь может управлять определенными параметрами, таким как объем различных растворов, добавление раствора в ходе обработки и его время, что может обеспечивать преимущества по сравнению с другими доступными способами. Например, способность уменьшать объем жидкости в полости в течение инкубации может увеличивать концентрацию частиц (например, гранул с реактивом), используемых при отборе, и таким образом химических потенциал раствора, не влияя на общее число клеток в полости. Это в свою очередь может усиливать парные взаимодействия между клетками, подлежащими обработке, и частицами, используемыми для отбора. В некоторых вариантах осуществления осуществление стадии инкубации в камере, например, когда в связи с системами, схемой и контролем, как раскрыто в настоящем описании, позволяет пользователю осуществлять возбуждение раствора при желаемом времени(временах) в течение инкубации, что также может усовершенствовать взаимодействие.
[87] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть стадии отбора осуществляют в центробежной камере, которая включает инкубацию клеток с реактивом для отбора. В некоторых аспектах таких процессов, определенный объем клеток смешивают с определенным количеством желаемого реактива для отбора на основе аффинности, которое значительно меньше, чем обычно используют при выполнении схожего отбора в пробирке или контейнере для отбора того же числа клеток и/или объема клеток по инструкциям производителя. В некоторых вариантах осуществления используют количество реактива или реактивов для отбора, которое составляет не больше чем 5%, не больше чем 10%, не больше чем 15%, не больше чем 20%, не больше чем 25%, не больше чем 50%, не больше чем 60%, не больше чем 70% или не больше чем 80% от количества того же реактива(ов) для отбора, которое используют для отбора клеток при инкубации в пробирке или контейнере для того же числа клеток и/или того же объема клеток по инструкциям производителя.
[88] В некоторых вариантах осуществления для отбора, например, отбора клеток на основе иммуноаффинности, клетки инкубируют в полости камеры в композиции, которая также содержит буфер для отбора с реактивом для отбора, таким как молекула, которая специфически связывается с поверхностным маркером на клетке, по которой желают проводить обогащение и/или истощение, но не по другим клеткам в композиции, таким как антитело, которое необязательно сопрягают с остовом, таким как полимер или поверхность, например, гранула, например, магнитная гранула, такая как магнитные бусы, сопряженные с моноклональными антителами со специфичностью к CD4 и CD8. В некоторых вариантах осуществления, как описано, реактив для отбора добавляют к клеткам в полости камеры в количестве, которое по существу меньше (например, составляет не больше чем 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% от количества) по сравнению с количеством реактива для отбора, которое обычно используют или которое необходимо для достижения приблизительно той же или схожей эффективности отбора того же числа клеток или того же объема клеток, когда отбор осуществляют в пробирке при встряхивании или вращении. В некоторых вариантах осуществления инкубацию осуществляют с добавлением буфера для отбора к клеткам и реактива для отбора, чтобы достигать целевого объема, с инкубацией реактива, например, от 10 мл до 200 мл, например, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере или приблизительно или 10 мл, 20 мл, 30 мл, 40 мл, 50 мл, 60 мл, 70 мл, 80 мл, 90 мл, 100 мл, 150 мл или 200 мл. В некоторых вариантах осуществления буфер для отбора и реактив для отбора предварительно смешивают перед добавлением к клеткам. В некоторых вариантах осуществления буфер для отбора и реактив для отбора отдельно добавляют к клеткам. В некоторых вариантах осуществления инкубацию при отборе осуществляют в условиях периодического мягкого перемешивания, что может содействовать энергетически благоприятным взаимодействиям и тем самым позволять использовать меньше реактива для отбора в целом, при этом достигая высокой эффективности отбора.
[89] В некоторых вариантах осуществления общая длительность инкубации с реактивом для отбора составляет от или приблизительно от 5 минут до 6 часов, например, от 30 минут до 3 часов, например, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 30 минут, 60 минут, 120 минут или 180 минут.
[90] В некоторых вариантах осуществления инкубацию в целом осуществляют в условиях перемешивания, например, в присутствии вращения, в целом при относительно низком усилии или скорости, такой как скорость ниже чем та, которую используют для осаждения клеток, например, от или приблизительно от 600 об./мин до 1700 об./мин (например при или приблизительно или по меньшей мере 600 об./мин, 1000 об./мин, или 1500 об./мин или 1700 об./мин), например, при RCF на образце или стенке камеры или другого контейнера от или приблизительно от 80 g до 100 g (например при или приблизительно или по меньшей мере 80 g, 85 g, 90 g, 95 g или 100 g). В некоторых вариантах осуществления вращение осуществляют с использованием повторных интервалов вращения на такой низкой скорости, после чего следует период отдыха, например, вращение и/или отдых в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 секунд, например, вращение приблизительно 1 или 2 секунды, после чего следует отдых приблизительно 5, 6, 7 или 8 секунд.
[91] В некоторых вариантах осуществления такой процесс осуществляют в полностью закрытой системе, в которую встроена камера. В некоторых вариантах осуществления этот процесс (и в некоторых аспектах также одну или несколько дополнительных стадий, таких как предыдущая стадия промывания образца, содержащего клетки, например, образца афереза) осуществляют автоматизированным образом, так что клетки, реактив и другие компоненты засасывают в и выталкивают из камеры при подходящем времени и осуществляемом центрифугировании, чтобы выполнять стадию промывания и связывания в одной закрытой системе с использованием автоматизированной программы.
[92] В некоторых вариантах осуществления после инкубации и/или смешивания клеток и реактива и/или реактивов для отбора, инкубируемые клетки подвергают разделению для того, чтобы отбирать клетки на основе присутствия или отсутствия конкретного реактива или реактивов. В некоторых вариантах осуществления разделение осуществляют в той же закрытой системе, в которой осуществляли инкубацию клеток с реактивом для отбора. В некоторых вариантах осуществления после инкубации с реактивами для отбора, инкубируемые клетки, в том числе клетки, в которых связан реактив для отбора, переносят в систему для разделения клеток на основе иммуноаффинности. В некоторых вариантах осуществления система для разделения на основе иммуноаффинности представляет собой или содержит колонку для магнитного разделения.
[93] Такие стадии разделения могут быть основаны на положительном отборе, при котором клетки, имеющие связанные реактивы, например, антитело или партнер связывания, сохраняют для дальнейшего использования, и/или отрицательный отбор, при котором сохраняют клетки, не связанные с реактивом, например, антителом или партнером связывания. В некоторых примерах, обе фракции сохраняют для дальнейшего использования. В некоторых аспектах, отрицательный отбор в частности можно использовать, когда не доступно антитело, которое специфически идентифицирует клетки определенного типа в гетерогенной популяции, так что разделение лучше всего осуществлять на основе маркеров, экспрессируемых клетками, отличными от желаемой популяции.
высок.
[94] В некоторых вариантах осуществления стадии процесса дополнительно включают отрицательный и/или положительный отбор инкубируемых и клеток, например, с использованием системы или аппарата, которые могут выполнять отбор на основе аффинности. В некоторых вариантах осуществления выделение осуществляют посредством обогащения конкретной популяции клеток посредством положительного отбора или истощения конкретной популяции клеток, посредством отрицательного отбора. В некоторых вариантах осуществления положительный или отрицательный отбор выполняют посредством инкубации клеток с одним или несколькими антителами или другими связывающими средствами, которые специфически связываются с одним или несколькими поверхностными маркерами, которые экспрессированы или экспрессированы (маркер+) на относительно высоком уровне (маркер) на положительно или отрицательно отобранных клетках, соответственно.
[95] Разделение не обязано вести к 100% обогащению или удалению конкретной популяции клеток или клеток, экспрессирующих конкретный маркер. Например, положительный отбор или обогащение клеток конкретного типа, таких как те, которые экспрессируют маркер, относится к увеличению числа или процентной доли таких клеток, но не обязательно ведет к полному отсутствию клеток, не экспрессирующих маркер. Аналогичным образом, отрицательный отбор, удаление или истощение клеток конкретного типа, таких как те, которые экспрессируют маркер, относится к снижению числа или процентной доли таких клеток, но не обязательно ведет к полному удалению всех таких клеток.
[96] В некоторых примерах осуществляют несколько раундов стадий разделения, где положительно или отрицательно отобранную фракцию с одной стадии подвергают другой стадии разделения, такой как последующий положительный или отрицательный отбор. В некоторых примерах, одна стадия разделения может истощать клетки, экспрессирующие несколько маркеров одновременно, например, посредством инкубации клеток с множеством антител или партнеров связывания, каждый со специфичностью к маркеру, по которому происходит отрицательный отбор. Аналогичным образом, несколько типов клеток можно одновременно положительно отбирать посредством инкубации клеток с множеством антител или партнеров связывания, экспрессируемых на различных типах клеток.
[97] Например, в некоторых аспектах, конкретные субпопуляции T-клеток, такие как клетки, положительные или экспрессирующие высокие уровни одного или нескольких поверхностных маркеров, например, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ и/или CD45RO+ T-клетки, выделяют с помощью приемов положительного или отрицательного отбора. В некоторых вариантах осуществления такие клетки отбирают посредством инкубации с одним или несколькими антителами или партнерами связывания, которые специфически связываются с такими маркерами. В некоторых вариантах осуществления антитело или партнер связывания можно конъюгировать, например, непосредственно или опосредованно, с твердым носителем или матрицей для осуществления отбора, например, магнитной гранулой или парамагнитной гранулой. Например, CD3+, CD28+ T-клетки можно положительно отбирать с использованием CD3/CD28 конъюгированных магнитных бус (например, DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T Cell Expander и/или гранулы ExpACT).
[98] В некоторых вариантах осуществления T-клетки отделяют от образца PBMC посредством отрицательного отбора маркеров, экспрессируемых на не T-клетках, таких как B-клетки, моноциты или другие белые клетки крови, например, CD14. В некоторых аспектах, стадию отбора по CD4+ или CD8+ используют для разделения CD4+ хелперных и CD8+ цитотоксических T-клеток. Такие CD4+ и CD8+ популяции дополнительно можно рассортировывать на субпопуляции посредством положительного или отрицательного отбора по маркерам, которые экспрессированы или экспрессированы в относительно высокой мере на одной или нескольких субпопуляциях наивных, эффекторных T-клеток и/или T-клеток памяти.
[99] В некоторых вариантах осуществления CD8+ клетки дополнительно обогащают по или истощают по наивным, центральным, эффекторным клеткам памяти и/или центральным стволовым клеткам памяти, например, посредством положительного или отрицательного отбора на основе поверхностных антигенов, связанных с соответствующей субпопуляцией. В некоторых вариантах осуществления обогащение по центральным клеткам памяти T (TCM) осуществляют для увеличения эффекта, например, чтобы усовершенствовать долгосрочную выживаемость, размножение и/или приживление после введения, что в некоторых аспектах является особенно надежно в таких субпопуляциях. См. Terakura et al., (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701. В некоторых вариантах осуществления объединение TCM-обогащенных CD8+ T-клеток и CD4+ T-клеток дополнительно усиливает эффект.
[100] В вариантах осуществления T-клетки памяти присутствуют как в CD62L+, так и в CD62L- подмножествах CD8+ лимфоцитов периферической крови. PBMC можно обогащать или истощать по CD62L-CD8+ и/или CD62L+CD8+ фракциям, например, с использованием антител против CD8 и против CD62L.
[101] В некоторых вариантах осуществления обогащение по центральным T-клеткам памяти (TCM) основано на положительной или высокой поверхностной экспрессии CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 и/или CD 127; в некоторых аспектах оно основано на отрицательном отборе клеток, экспрессирующих или высоко экспрессирующих CD45RA и/или гранзим B. В некоторых аспектах, выделение CD8+ популяции, обогащенной TCM клетками, осуществляют посредством истощения клеток, экспрессирующих CD4, CD14, CD45RA и положительного отбора или обогащения по клеткам, экспрессирующим CD62L. В одном из аспектов обогащение по центральным T-клеткам памяти (TCM) осуществляют, начиная с отрицательной фракции клеток, отобранных на основе экспрессии CD4, которую подвергают отрицательному отбору на основе экспрессии CD14 и CD45RA и положительному отбору на основе CD62L. Такие отборы в некоторых аспектах осуществляют одновременно и в других аспектах осуществляют последовательно, в любом порядке. В некоторых аспектах, ту же стадию отбора на основе экспрессии CD4, используемую при получении популяции или субпопуляции CD8+ клеток, также используют для того, чтобы создавать популяцию или субпопуляцию CD4+ клеток, так что как положительную, так и отрицательную фракции из разделения на основе CD4 сохраняют и используют на последующих стадиях способа, необязательно после одной или нескольких дополнительных стадий положительного или отрицательного отбора. В некоторых вариантах осуществления отбор популяции CD4+ клеток и отбор популяции CD8+ клеток осуществляют одновременно. В некоторых вариантах осуществления популяцию CD4+ клеток и отбор популяции CD8+ клеток осуществляют последовательно, в любом порядке. В некоторых вариантах осуществления способы отбора клеток могут включать те, которые описаны в опубликованной заявке США № US20170037369. В некоторых вариантах осуществления отобранную популяцию CD4+ клеток и отобранную популяцию CD8+ клеток можно комбинировать после отбора. В некоторых аспектах, отобранную популяцию CD4+ клеток и отобранную популяцию CD8+ клеток можно комбинировать в биореакторном мешке, как раскрыто в настоящем описании.
[102] В конкретном примере, образец PBMC или другой образец белых клеток крови подвергают отбору CD4+ клеток, при котором сохраняют как отрицательные, так и положительные фракции. Затем отрицательную фракцию подвергают отрицательному отбору на основе экспрессии CD14 и CD45RA или CD19 и положительному отбору на основе маркерных характеристик центральных T-клеток памяти, таких как CD62L или CCR7, где положительный и отрицательный отбор осуществляют в любом порядке.
[103] CD4+ T-хелперные клетки можно сортировать на наивные клетки, центральные клетки памяти и эффекторные клетки посредством идентификации популяций клеток, которые имеют антигены клеточной поверхности. CD4+ лимфоциты можно получать стандартными способами. В некоторых вариантах осуществления наивные CD4+ T-лимфоциты представляют собой CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ или CD4+ T-клетки. В некоторых вариантах осуществления центральные CD4+ клетки памяти представляют собой CD62L+ и CD45RO+. В некоторых вариантах осуществления эффекторные CD4+ клетки представляют собой CD62L- и CD45RO-.
[104] В одном из примеров, для обогащения по CD4+ клеткам посредством отрицательного отбора, коктейль моноклональных антител обычно содержит антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. В некоторых вариантах осуществления антитело или партнер связывания связывают с твердым носителем или матрицей, например, с магнитной гранулой или парамагнитной гранулой, чтобы сделать возможным разделение клеток для положительного и/или отрицательного отбора. Например, в некоторых вариантах осуществления клетки и популяции клеток разделяют или выделяют с использованием иммуномагнитных (или аффинномагнитных) приемов разделения (рассмотрено в Methods in Molecular Medicine, том 58: Metastasis Research Protocols, том 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, стр. 17-25, под редакцией S. A. Brooks и U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).
[105] В некоторых аспектах инкубируемые образец или композицию клеток, подлежащие разделению, инкубируют с реактивом для отбора, содержащим небольшой, намагничиваемые или магнитно-чувствительный материал, такой как магнитно-чувствительные частицы или микрочастицы, такие как парамагнитные бусы (например, такие как гранулы Dynalbeads или MACS). Магнитно-чувствительный материал, например, частицы, в целом непосредственно или опосредованно прикрепляют к партнеру связывания, например, антителу, который специфически связывается с молекулой, например, поверхностным маркером, присутствующей на клетке, клетках или популяции клеток, которую желают выделять, например, которую желают отбирать отрицательно или положительно.
[106] В некоторых вариантах осуществления магнитная частица или гранула содержит магнитно-чувствительный материал, связанный со специфическим связывающим элементом, таким как антитело или другой партнер связывания. Известны многие общеизвестные магнитно-чувствительные материалы для использования в способах магнитного разделения, например, те, которые описаны в Molday, патент США № 4452773, и в описании европейского патента EP 452342 B, которые включены, таким образом, посредством ссылки. Частицы коллоидных размеров, такие как те, которые описаны в патенте США № 4795698 на Owen и Liberti et al., патенте США № 5200084, также можно использовать.
[107] Инкубацию в целом осуществляют в условиях, в соответствии с которыми антитела или партнеры связывания или молекулы, такие как вторичные антитела или другие реактивы, которые специфически связываются с такими антителами или партнерами связывания, которые прикрепляют к магнитной частице или грануле, специфические связывают с молекулами клеточной поверхности, если они присутствуют на клетках в образце.
[108] В определенных вариантах осуществления магнитно-чувствительные частицы покрывают первичными антителами или другими партнерами связывания, вторичными антителами, лектинами, ферментами или стрептавидином. В определенных вариантах осуществления магнитные частицы прикрепляют к клеткам через покрытие первичными антителами со специфичностью к одному или нескольким маркерам. В определенных вариантах осуществления клетки, а не гранулы, метят первичным антителом или партнером связывания, и затем добавляют магнитные частицы, покрытые вторичным антителом или другим партнером связывания (например, стрептавидином) со специфичностью к клеткам определенного типа. В определенных вариантах осуществления покрытые стрептавидином магнитные частицы используют в сочетании с биотинилированными первичными или вторичными антителами.
[109] В некоторых аспектах, разделения достигают в процедуре, в которой образец помещают в магнитное поле, и эти клетки с магнитно-чувствительными или намагничиваемыми частицами, прикрепленными к ним, притягивают к магниту и отделяют от немеченных клеток. Для положительного отбора сохраняют клетки, которые прикреплены к магниту; для отрицательного отбора сохраняют клетки, которые не прикреплены (немеченные клетки). В некоторых аспектах, комбинацию положительного и отрицательного отбора осуществляют в течение то же стадии отбора, где положительные и отрицательные фракции сохраняют и дополнительно обрабатывают или подвергают дополнительным стадиям разделения.
[110] В некоторых вариантах осуществления на основе аффинности отбор происходит через магнитно-активированную сортировку клеток (MACS) (Miltenyi Biotech, Auburn, CA). Магнитно-активированная сортировка клеток (MACS), например, системы CliniMACS, делает возможным отбор высокой чистоты в отношении клеток, имеющих намагниченные частицы, прикрепленные к ним. В определенных вариантах осуществления MACS работает в режиме, в котором происходит последовательное элюирование нецелевых и целевых частиц после наложения внешнего магнитного пола. То есть, клетки, прикрепленные к намагниченным частицам, удерживают на месте, тогда как неприкрепленные частицы элюируют. Затем, после этого завершают первую стадию элюирования, частицы, которые были захвачены магнитным полем и которым не позволили элюироваться, освобождают некоторым образом так, что их можно элюировать и извлекать. В определенных вариантах осуществления нецелевые клетки метят и истощают в гетерогенной популяции клеток.
[111] В некоторых вариантах осуществления магнитно-чувствительные частицы оставляют прикрепленными к клеткам, которые впоследствии подлежат инкубации, культивированию и/или конструированию; в некоторых аспектах, частицы оставляют прикрепленными к клеткам для введения пациенту. В некоторых вариантах осуществления намагничиваемые или магнитно-чувствительные частицы удаляют из клеток. Способы удаления намагничиваемых частиц из клеток известны и включают, например, использование конкурирующих немеченных антител, намагничиваемых частиц или антител, конъюгированных с расщепляемыми линкерами, и т. д. В некоторых вариантах осуществления намагничиваемые частицы являются биоразрушаемыми.
2. Генетическая инженерия
[112] В некоторых вариантах осуществления стадии обработки включают введение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный белок. Образцами таких рекомбинантных белков являются рекомбинантные рецепторы, например, любые описанные в разделе III. Введение молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих рекомбинантный белок, такой как рекомбинантный рецептор, в клетку можно осуществлять с использованием любого из множества известных векторов. Такие векторы включают вирусные и невирусные системы, включая лентивирусные и гаммаретровирусные системы, а также системы на основе транспозонов, такие как системы переноса генов на основе PiggyBac или Sleeping Beauty. Образцовые способы включают таковые для переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рецепторы, в том числе через вирусную, например, ретровирусную или лентивирусную, трансдукцию, транспозоны и электропорацию.
[113] В некоторых вариантах осуществления перенос генов выполняют сначала посредством стимуляции клетки, например, посредством ее объединения со стимулом, который индуцирует ответ, такой как пролиферация, выживаемость и/или активация, например, как измеряют посредством экспрессии цитокина или маркера активации, после чего следует трансдукция активированных клеток и размножение в культуре до количеств, достаточных для клинических применений.
[114] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в клетки с использованием рекомбинантных инфекционных вирусных частиц, например, таких как векторы, происходящие из вируса обезьян 40 (SV40), аденовирусов, аденоассоциированного вируса (AAV). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки с использованием рекомбинантных лентивирусных векторов или ретровирусных векторов, таких как гаммаретровирусные векторы (см., например, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557.
[115] В некоторых вариантах осуществления ретровирусный вектор имеет последовательность длинного концевого повтора (LTR), например, ретровирусный вектор, происходящий из вируса мышиного лейкоза Молони (MoMLV), вируса миелопролиферативной саркомы (MPSV), вируса эмбриональных стволовых клеток мыши (MESV), вируса стволовых клеток мыши (MSCV), вируса некроза селезенки (SFFV) или аденоассоциированного вируса (AAV). Большинство ретровирусных векторов получают из ретровирусов мыши. В некоторых вариантах осуществления ретровирусы включают те, которые происходят из любого источника в клетках птиц или млекопитающих. Ретровирусы обычно являются амфотропными, что обозначает, что они способны инфицировать клетки-хозяева нескольких биологических видов, включая человека. В одном из вариантов осуществления геном, подлежащим экспрессии, заменяют ретровирусные последовательности gag, pol и/или env. Описано множество иллюстративных ретровирусных систем (например, патенты США №№ 5219740; 6207453; 5219740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; и Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.
[116] Известны способы лентивирусной трансдукции. Образцовые способы описаны, например, в Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; и Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.
[117] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки через электропорацию (см., например, Chicaybam et al, (2013) PLoS one 8(3): e60298 и Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные нуклеиновые кислоты переносят в T-клетки через транспозицию (см., например, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; и Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Другие способы введения и экспрессии генетического материала в клетках иммунной системы включают трансфекцию с фосфатом кальция (например, как описано в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.), слияние протопластов, опосредованную катионными липосомами трансфекцию; бомбардировку микрочастицами с использованием вольфрамовых частиц (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); и копреципитацию ДНК с фосфатом стронция (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).
[118] Другие подходы и векторы для переноса нуклеиновых кислот, кодирующих рекомбинантные продукты, представляют собой то, что описано, например, в международной патентной заявке, публикация № WO2014055668, и патенте США № 7446190.
[119] В некоторых вариантах осуществления клетки, например, T-клетки, можно трансфицировать или в течение или после размножения, например, с использованием T-клеточного рецептора (TCR) или химерного антигенного рецептора (CAR). Эту трансфекцию для введения гена желаемого рецептора можно осуществлять, например, с использованием любого подходящего ретровирусного вектора. Затем генетически модифицированную клеточную популяцию можно освобождать от начального стимула (например, стимула CD3/CD28) и затем стимулировать стимулом второго типа, например, через введенный рецептор de novo). Этот стимул второго типа может включать антигенный стимул в форме пептида/молекулы MHC, когнатный (сшивающий) лиганд генетически введенного рецептора (например, природный лиганд CAR) или любой лиганд (такой как антитело), который непосредственно связывается с каркасом нового рецептора (например, посредством распознавания константных областей в рецепторе). См., например, Cheadle et al, «Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy» Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 или Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine том 65: 333-347 (2014).
[120] В некоторых случаях, можно использовать вектор, который не требует активации клеток, например, T-клеток. В некоторых таких случаях клетки можно отбирать и/или трансдуцировать перед активацией. Таким образом, клетки можно сконструировать до или после культивирования клеток, и в некоторых случаях одновременно с культивированием или в течение по меньшей мере его части.
[121] В некоторых аспектах, клетки дополнительно конструируют для содействия экспрессии цитокинов или других факторов. Среди дополнительных нуклеиновых кислот, например, гены для введения представляют собой те, которые усовершенствуют эффект терапии, например, посредством содействия жизнеспособности и/или функции перенесенных клеток; гены для предоставления генетического маркера для отбора и/или оценки клеток, например, чтобы оценивать выживаемость in vivo или локализацию; гены для усовершенствования безопасности, например, делающие клетку допускающей отрицательный отбор in vivo, как описано в Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); и Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); см. также публикации PCT/US91/08442 и PCT/US94/05601 Lupton et al., описывающие использование бифункциональных отбираемых генов слияния, происходящих из слияния доминантного положительного селективного маркера с отрицательным селективным маркером. См., например, Riddell et al., патент США № 6040177, колонки 14-17.
[122] В некоторых вариантах осуществления введение осуществляют посредством приведения одной или нескольких клеток композиции в контакт с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный белок, например, рекомбинантный рецептор. В некоторых вариантах осуществления приведение в контакт можно осуществлять при центрифугировании, таком как спинокуляция (например, центробежная инокуляция). Такие способы включают любые из того, что описано в международной публикации № WO2016/073602. Образцовые центробежные камеры включают те, которые производит и продает Biosafe SA, в том числе те, что для использования с системой Sepax и Sepax 2, включая центробежные камеры A-200/F и A-200 и различные наборы для использования с такими системами. Образцовые камеры, системы и инструментарий для обработки и кабинеты описаны, например, в патенте США № 6123655, патенте США № 6733433 и опубликованной патентной заявке США, публикация № US 2008/0171951, и опубликованной международной патентной заявке, публикация № WO 00/38762, содержание каждого из которых включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме. Образцовые наборы для использования с такими системами включают, но не ограничиваясь этим, наборы одноразового использования, продаваемые BioSafe SA под продуктовыми названиями CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 или CS-900.2.
[123] В некоторых вариантах осуществления система включена в и/или находится в связи с другим инструментарием, включая инструментарий для выполнения, автоматизации, контроля и/или мониторинга аспектов стадии трансдукции и одной или нескольких различных других стадий обработки, выполняемых в системе, например, одной или нескольких стадий обработки, которые можно осуществлять с использованием или в связи с системой центробежной камеры, как раскрыто в настоящем описании или в международной публикации № WO2016/073602. Этот инструментарий в некоторых вариантах осуществления содержится в кабинете. В некоторых вариантах осуществления инструментарий включает кабинет, который содержит корпус, содержащий управляющую схему, центрифугу, крышку, мониторы, насосы, датчики, дисплеи и пользовательский интерфейс. Образцовое устройство описано в патенте США № 6123655, патенте США № 6733433 и US 2008/0171951.
[124] В некоторых вариантах осуществления система содержит серию контейнеров, например, мешков, трубок, стопорных кранов, зажимов, соединителей, и камеру центрифуги. В некоторых вариантах осуществления контейнеры, такие как мешки, включают один или несколько контейнеров, таких как мешки, содержащие клетки, подлежащие трансдукции, и частицы вирусного вектора, в одном и том же контейнере или отдельных контейнерах, например, в одном и том же мешке или отдельных мешках. В некоторых вариантах осуществления система дополнительно содержит один или несколько контейнеров, таких как мешки, содержащие среду, такую как разбавитель и/или промывающий раствор, которую подают в камеру и/или другие компоненты для того, чтобы разводить, ресуспендировать и/или промывать компоненты и/или композиции в ходе способов. Контейнеры можно соединять с одном или нескольких положениях в систему, например, в положении, соответствующем входной линии, линии разбавителя, линии промывания, линии отходов и/или выходной линии.
[125] В некоторых вариантах осуществления камера связана с центрифугой, которая способна выполнять вращение камеры, например, вокруг ее оси вращения. Вращение может происходить до, в течение и/или после инкубации в связи с трансдукцией клеток и/или на одной или нескольких других стадиях обработки. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления одну или несколько различных стадий обработки осуществляют при вращении, например, с конкретным усилием. Камера обычно способна к вертикальному или в целом вертикальному вращению, так что камера сидит вертикально в ходе центрифугирования и боковая стенка и ось вертикальны или в целом вертикальны, причем торцевая стенка(и) горизонтальна или в целом горизонтальна.
[126] В некоторых вариантах осуществления композицию, содержащую клетки, вирусные частицы и реактив, можно вращать, в целом при относительно низком усилии или скорости, такой как скорость ниже той, которую используют для осаждения клеток, например, от или приблизительно от 600 об./мин до 1700 об./мин (например, при или приблизительно или по меньшей мере 600 об./мин, 1000 об./мин или 1500 об./мин или 1700 об./мин). В некоторых вариантах осуществления вращение осуществляют при усилии, например, относительной центробежной силе, от или приблизительно от 100 g до 3200 g (например, при или приблизительно или по меньшей мере при или приблизительно 100 g, 200 g, 300 g, 400 g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g или 3200 g), как измеряют, например, на внутренней или внешней стенке камеры или полости. Термин «относительная центробежная сила» или RCF в целом понимают как эффективное усилие, сообщаемое объекту или веществу (такому как клетка, образец или осадок и/или точка в камере или другом контейнере, который вращают), относительно гравитационной силы земли, в конкретной точке в пространстве по сравнению с осью вращения. Значение можно определять с использованием общеизвестных формул, учитывая гравитационную силу, скорость вращения и радиус вращения (расстояние от оси вращения до объекта, вещества или частицы, на которых измеряют RCF).
[127] В некоторых вариантах осуществления в течение по меньшей мере части генетической инженерии, например, трансдукции и/или после генетической инженерии клетки переносят в сборочный узел биореакторного мешка для культивирования генетически сконструированных клеток, например, для культивирования или размножения клеток, как описано выше.
Получение частиц вирусного вектора для трансдукции
[128] Геном вирусного вектора обычно конструируют в форме плазмиды, которую можно трансфицировать в пакующую или продуцирующую клеточную линию. В любом из таких примеров нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантный белок, такой как рекомбинантный рецептор, вставляют или помещают в область вирусного вектора, например, обычно в не необходимую область вирусного генома. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновую кислоту вставляют в вирусный геном вместо определенных вирусных последовательностей для получения вируса с дефектом репликации.
[129] Любые из множества известных способов можно использовать для получения ретровирусных частиц, геном которых содержит РНК-копию генома вирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере два компонента используют при создании системы доставки генов на вирусной основе: первый, пакующие плазмиды, содержащие структурные белки, а также ферменты, необходимые для того, чтобы создавать частицу вирусного вектора, и второй, сам вирусный вектор, т. е. генетический материал, подлежащий переносу. Средства обеспечения биологической безопасности можно вводить в конструкцию одного или обоих этих компонентов.
[130] В некоторых вариантах осуществления пакующая плазмида может содержать все ретровирусные, например, HIV-1, белки, отличные от оболочечных белков (Naldini et al., 1998). В других вариантах осуществления вирусные векторы могут не содержать дополнительные вирусные гены, такие как те, которые связаны с вирулентностью, например, vpr, vif, vpu и nef и/или Tat, первичный трансактиватор HIV. В некоторых вариантах осуществления лентивирусные векторы, такие как лентивирусные векторы на основе HIV, содержат только три гена родительского вируса: gag, pol и rev, что снижает или устраняет возможность восстановления вируса дикого типа через рекомбинацию.
[131] В некоторых вариантах осуществления геном вирусного вектора вводят в пакующую клеточную линию, которая содержит все компоненты, необходимые для упаковки вирусной геномной РНК, транскрибированной с генома вирусного вектора, в вирусные частицы. Альтернативно, геном вирусного вектора может содержать один или несколько генов, кодирующих вирусные компоненты, в дополнение к одной или нескольким последовательностям, например, рекомбинантным нуклеиновым кислотам, представляющим интерес. Однако в некоторых аспектах, чтобы предотвращать репликацию генома в целевой клетке, эндогенные вирусные гены, необходимые для репликации, удаляют и предоставляют отдельно в пакующей клеточной линии.
[132] В некоторых вариантах осуществления пакующую клеточную линию трансфицируют одним или несколькими плазмидными векторами, содержащими компоненты, необходимые для того, чтобы создавать частицы. В некоторых вариантах осуществления пакующую клеточную линию трансфицируют плазмидой, содержащей геном вирусного вектора, содержащий LTR, цис-действующую пакующую последовательность и последовательность, представляющую интерес, т. е. нуклеиновую кислоту, кодирующую антигенный рецептор, такой как CAR; и одной или несколькими плазмидами-помощниками, кодирующими ферментативные и/или структурные компоненты вируса, такие как Gag, pol и/или rev. В некоторых вариантах осуществления несколько векторов используют для разделения различных генетических компонентов, которые создают частицы ретровирусного вектора. В некоторых таких вариантах осуществления, предоставление отдельных векторов в пакующей клетке снижает шанс событий рекомбинации, которые иначе могут создавать вирусы, способные к репликации. В некоторых вариантах осуществления можно использовать один плазмидный вектор, имеющий все ретровирусные компоненты.
[133] В некоторых вариантах осуществления частицу ретровирусного вектора, такую как частицу лентивирусного вектора, псевдотипируют для увеличения эффективности трансдукции клеток-хозяев. Например, частицу ретровирусного вектора, такую как частица лентивирусного вектора, в некоторых вариантах осуществления псевдотипируют с использованием гликопротеина VSV-G, который обеспечивает широкий спектр клеток-хозяев, расширяя типы клеток, которые можно трансдуцировать. В некоторых вариантах осуществления пакующую клеточную линию трансфицируют плазмидой или полинуклеотидом, кодирующими ненативный оболочечный гликопротеин, например, чтобы включать ксенотропные, политропные или амфотропные оболочки, такие как оболочка вируса Синдбис, GALV или VSV-G.
[134] В некоторых вариантах осуществления пакующая клеточная линия предоставляет компоненты, в том числе вирусные регуляторные и структурные белки, которые необходимы в транс для упаковки вирусной геномной РНК в частицы лентивирусного вектора. В некоторых вариантах осуществления пакующая клеточная линия может представлять собой любую клеточную линию, которая способна экспрессировать лентивирусные белки и продуцировать функциональные частицы лентивирусного вектора. В некоторых аспектах подходящие пакующие клеточные линии включают клетки 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLA (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) и Cf2Th (ATCC CRL 1430).
[135] В некоторых вариантах осуществления пакующая клеточная линия стабильно экспрессирует вирусный белок(ки). Например, в некоторых аспектах можно конструировать пакующую клеточную линию, содержащую gag, pol, rev и/или другие структурные гены, но без LTR и пакующих компонентов. В некоторых вариантах осуществления пакующую клеточную линию можно временно трансфицировать молекулами нуклеиновой кислоты, кодирующими один или несколько вирусных белков наряду с геномом вирусного вектора, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гетерологичный белок, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую оболочечный гликопротеин.
[136] В некоторых вариантах осуществления вирусные векторы и пакующие плазмиды и/или плазмиды-помощники вводят через трансфекцию или инфекцию в пакующую клеточную линию. Пакующая клеточная линия продуцирует частицы вирусного вектора, которые содержат геном вирусного вектора. Способы трансфекции или инфекции хорошо известны. Неограничивающие примеры включают способы с фосфатом кальция, DEAE-декстраном и липофекцию, электропорацию и микроинъекцию.
[137] Когда рекомбинантную плазмиду и ретровирусные LTR и пакующие последовательности вводят в специальную клеточную линию (например, посредством преципитации с фосфатом кальция), пакующие последовательности могут допускать упаковывание РНК транскрипта рекомбинантной плазмиды в вирусные частицы, которые затем могут секретироваться в среды для культивирования. Затем среды, содержащие рекомбинантные ретровирусы, в некоторых вариантах осуществления собирают, необязательно концентрируют и используют для переноса генов. Например, в некоторых аспектах, после совместной трансфекции пакующих плазмид и переносящего вектора в пакующую клеточную линию, частицы вирусного вектора извлекают из сред для культивирования и титруют стандартными способами, используемыми специалистами в данной области.
[138] В некоторых вариантах осуществления ретровирусный вектор, такой как лентивирусный вектор, можно получать в пакующей клеточной линии, такой как образцовая клеточная линия HEK 293T, посредством введения плазмид для того, чтобы сделать возможным образование лентивирусных частиц. В некоторых вариантах осуществления пакующую клетку трансфицируют и/или она содержит полинуклеотид, кодирующий gag и pol, и полинуклеотид, кодирующий рекомбинантный рецептор, такой как антигенный рецептор, например, CAR. В некоторых вариантах осуществления пакующую клеточную линию необязательно трансфицируют и/или дополнительно трансфицируют и/или она содержит полинуклеотид, кодирующий белок rev. В некоторых вариантах осуществления пакующую клеточную линию необязательно трансфицируют и/или дополнительно трансфицируют и/или она содержит полинуклеотид, кодирующий ненативный оболочечный гликопротеин, такой как VSV-G. В некоторых таких вариантах осуществления, приблизительно через двое суток после трансфекции клеток, например, клеток HEK 293T, клеточный супернатант содержит рекомбинантные лентивирусные векторы, которые можно извлекать и титровать.
[139] Извлеченные и/или полученные частицы ретровирусного вектора можно использовать для трансдукции целевых клеток с использованием способов, как описано. В целевых клетках происходит обратная транскрипция вирусной РНК, импорт в ядро и стабильное встраивание в геном хозяина. Через 1 или 2 суток после встраивания вирусной РНК, можно обнаруживать экспрессию рекомбинантного белка, например, антигенного рецептора, такого как CAR.
3. Активация и стимуляция
[140] В некоторых вариантах осуществления одна или несколько стадий обработки включают стадию стимуляции выделенных клеток, таких как отобранных клеточные популяции. Инкубация может быть перед или в связи с генетической инженерией, такой как генетическая инженерия в результате вариантов осуществления способа трансдукции, описанного выше. В некоторых вариантах осуществления стимуляция ведет к активации и/или пролиферации клеток, например, перед трансдукцией.
[141] В некоторых вариантах осуществления стадии обработки включают инкубацию клеток, таких как отобранные клетки, где стадии инкубации могут включать культуру, культивирование, стимуляцию, активацию и/или размножение клеток. В некоторых вариантах осуществления композиции или клетки инкубируют в присутствии стимулирующих условий или стимулирующего средства. Такие условия включают те, которые разработаны для того, чтобы индуцировать пролиферацию, размножение, активацию и/или выживаемость клеток в популяции, чтобы имитировать экспозицию антигена и/или подготавливать клетки для генетической инженерии, например, для введения рекомбинантного антигенного рецептора.
[142] В некоторых вариантах осуществления условия для стимуляции и/или активации могут включать одно или несколько из конкретных сред, температуры, содержания кислорода, содержания диоксида углерода, времени, средств, например, питательных веществ, аминокислот, антибиотиков, ионов и/или стимулирующих факторов, таких как цитокины, хемокины, антигены, партнеров связывания, слитых белков, рекомбинантных растворимых рецепторов и любых других средств, разработанных для того, чтобы активировать клетки.
[143] В некоторых вариантах осуществления стимулирующие условия или средства включают одно или несколько средств, например, лиганд, который способен активировать домен внутриклеточной сигнализации комплекса TCR. В некоторых аспектах, внутриклеточный сигнальный каскад TCR/CD3 в T-клетке запускает или инициирует средство, такое как средства, подходящие для того, чтобы доставлять первичный сигнал, например, чтобы инициировать активацию ITAM-индуцированного сигнала, например, со специфичностью к TCR компоненту, и/или средство, которое способствует костимулирующему сигналу, например, со специфичностью к T-клеточному костимулирующему рецептору, например, против CD3, против CD28 или против 41-BB, например, связанное с твердым носителем, таким как гранула, и/или один или несколько цитокинов. Среди стимулирующих средств имеют место гранулы против CD3/против CD28 (например, гранулы DYNABEADS M-450 CD3/CD28 T Cell Expander и/или гранулы ExpACT). Необязательно, способ размножения дополнительно может включать стадию добавления антитела против CD3 и/или против CD28 в среду для культивирования. В некоторых вариантах осуществления стимулирующие средства включают IL-2, IL-7 и/или IL-15, например, концентрация IL-2 составляет по меньшей мере приблизительно 10 Ед/мл, по меньшей мере приблизительно 50 Ед/мл, по меньшей мере приблизительно 100 Ед/мл или по меньшей мере приблизительно 200 Ед/мл.
[144] Условия могут включать одно или несколько из конкретных сред, температуры, содержания кислорода, содержания диоксида углерода, времени, средств, например, питательных веществ, аминокислот, антибиотиков, ионов и/или стимулирующих факторов, таких как цитокины, хемокины, антигены, партнеров связывания, слитых белков, рекомбинантных растворимых рецепторов и любых других средств, разработанных для того, чтобы активировать клетки.
[145] В некоторых аспектах, инкубацию осуществляют в соответствии с такими приемами, как те, что описаны в патенте США № 6,040,177 на Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82 и/или Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701.
[146] В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть инкубации в присутствии одного или нескольких стимулирующих условий или стимулирующих средств так осуществляют во внутренней полости центробежной камеры, например, при центробежном вращении, как описано в международной публикации № WO2016/073602. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере часть инкубации, выполняемой в центробежной камере, включает смешивание с реактивом или реактивами для того, чтобы индуцировать стимуляцию и/или активацию. В некоторых вариантах осуществления клетки, такие как отобранные клетки, смешивают со стимулирующим условием или стимулирующим средством в центробежной камере. В некоторых аспектах таких процессов определенный объем клеток смешивают с определенным количеством одного или нескольких стимулирующих условий или средств, который значительно меньше, чем обычно используют при выполнении схожей стимуляции в чашке клеточной культуры или другой системе.
[147] В некоторых вариантах осуществления стимулирующее средство добавляют к клеткам в полости камеры в количестве, которое по существу меньше, чем (например, составляет не больше чем 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% от количества) по сравнению с количеством стимулирующего средства, которое обычно используют или требуется для достижения приблизительно той же или схожей эффективности отбора того же числа клеток или того же объема клеток, когда отбор осуществляют без смешивания в центробежной камере, например, в пробирке или мешке, при периодическом встряхивании или вращении. В некоторых вариантах осуществления инкубацию осуществляют с добавлением буфера для инкубации к клеткам и стимулирующего средства, чтобы достигать целевого объема при инкубации реактива, например, от 10 мл до 200 мл, например, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере или приблизительно или 10 мл, 20 мл, 30 мл, 40 мл, 50 мл, 60 мл, 70 мл, 80 мл, 90 мл, 100 мл, 150 мл или 200 мл. В некоторых вариантах осуществления буфер для инкубации и стимулирующее средство предварительно смешивают перед добавлением к клеткам. В некоторых вариантах осуществления буфер для инкубации и стимулирующее средство добавляют к клеткам отдельно. В некоторых вариантах осуществления стимулирующую инкубацию осуществляют в условиях периодического мягкого перемешивания, что может способствовать энергетически благоприятным взаимодействиям и тем самым допускать использовать меньше стимулирующего средства в целом, при этом достигая стимуляции и активации клеток.
[148] В некоторых вариантах осуществления инкубацию в целом осуществляют в условиях перемешивания, например, в присутствии вращения, в целом при относительно низком усилии или скорости, такой как скорость ниже той, которую используют для осаждения клеток, например, от или приблизительно от 600 об./мин до 1700 об./мин (например, при или приблизительно или по меньшей мере 600 об./мин, 1000 об./мин, или 1500 об./мин или 1700 об./мин), например, при RCF на образце или стенке камеры или другого контейнера от или приблизительно от 80 g до 100 g (например, при или приблизительно или по меньшей мере 80 g, 85 g, 90 g, 95 g или 100 g). В некоторых вариантах осуществления вращение осуществляют с использованием повторных интервалов вращения при такой низкой скорости, после чего следует период отдыха, например, вращение и/или отдых в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 секунд, например, вращение приблизительно 1 или 2 секунды, после чего следует отдых в течение приблизительно 5, 6, 7 или 8 секунд.
[149] В некоторых вариантах осуществления общая длительность инкубации, например, со стимулирующим средством, составляет между или между приблизительно 1 часом и 96 часами, 1 часом и 72 часами, 1 часом и 48 часами, 4 часами и 36 часами, 8 часами и 30 часами или 12 часами и 24 часами, например, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 6 часов, 12 часов, 18 часов, 24 часа, 36 часов или 72 часа. В некоторых вариантах осуществления дополнительная инкубация происходит в течение времени между или приблизительно между 1 часом и 48 часами, 4 часами и 36 часами, 8 часами и 30 часами или 12 часами и 24 часами, включительно.
4. Состав
[150] В некоторых вариантах осуществления одна или несколько стадий процесса (например, осуществляемых в центробежной камере и/или закрытой системе) для изготовления, создания или производства клеточной терапии и/или сконструированных клеток, могут включать формулирование клеток, такое как формулирование генетически сконструированных клеток, в результате предусмотренных стадий обработки трансдукцией до или после культивирования, например, культивирования и размножения, и/или одной или нескольких других стадий обработки, как описано. В некоторых вариантах осуществления предоставленные способы, связанные с формулированием клеток, включают обработку трансдуцированных клеток, таких как клетки, трансдуцированные и/или размноженные с использованием стадий обработки, описанных выше, в закрытой системе.
[151] В некоторых вариантах осуществления формулируют T-клетки, такие как CD4+ и/или CD8+ T-клетки, созданные посредством одной или нескольких стадий обработки. В некоторых аспектах отдельно изготавливают, производят или создают множество композиций, каждая содержит отличающуюся популяцию и/или подтипы клеток от субъекта, например, для отдельного или независимого введения, необязательно в определенном периоде времени. Например, отдельные составы сконструированных клеток, содержащие различные популяции или подтипы клеток, могут содержать CD8+ и CD4+ T-клетки, соответственно, и/или обогащенные CD8+ и CD4+ популяции, соответственно, например, CD4+ и/или CD8+ T-клетки, каждая индивидуально содержит клетки, генетически сконструированные для того, чтобы экспрессировать рекомбинантный рецептор. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одну композицию формулируют с содержит CD4+ T-клетки, генетически сконструированные для того, чтобы экспрессировать рекомбинантный рецептор. В некоторых вариантах осуществления формулируют по меньшей мере одну композицию с CD8+ T-клетками, генетически сконструированными для того, чтобы экспрессировать рекомбинантный рецептор. В некоторых вариантах осуществления введение дозы включает введение первой композиции, содержащей дозу CD8+ T-клеток или дозу CD4+ T-клеток, и введение второй композиции, содержащей другую из доз CD4+ T-клеток и CD8+ T-клеток. В некоторых вариантах осуществления первую композицию, содержащую дозу CD8+ T-клеток или дозу CD4+ T-клеток, вводят перед второй композицией, содержащей другую из доз CD4+ T-клеток и CD8+ T-клеток. В некоторых вариантах осуществления введение дозы включает введение композиции, содержащей как дозу CD8+ T-клеток, так и дозу CD4+ T-клеток.
[152] В некоторых вариантах осуществления клетки формулируют в фармацевтически приемлемом буфере, который в некоторых аспектах может содержать фармацевтически приемлемый носитель или эксципиент. В некоторых вариантах осуществления обработка включает замену среды на среду или буфер для формулирования, которые являются фармацевтически приемлемыми или желаемыми для введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления стадии обработки могут включать промывание трансдуцированных и/или размноженных клеток, чтобы заменять клетки в фармацевтически приемлемом буфере, который может содержать один или несколько необязательных фармацевтически приемлемых носителей или эксципиентов. Образцами таких фармацевтических форм, содержащих фармацевтически приемлемые носители или эксципиенты, может быть любое, описанное далее, в сочетании с формами, приемлемыми для введения клеток и композиций субъекту. Фармацевтическая композиция в некоторых вариантах осуществления содержит клетки в количествах, эффективных для лечения или предотвращения заболевания или состояния, таких как терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество.
[153] «Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтическом составе, отличному от активного ингредиента, который является нетоксичным для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничиваясь этим, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.
[154] В некоторых аспектах, выбор носителя определяется частично конкретной клеткой и/или способом введения. Соответственно, существуют различные подходящие составы. Например, фармацевтическая композиция может содержать консерванты. Подходящие консерванты могут включать, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и хлорид бензалкония. В некоторых аспектах используют смесь двух или больше консервантов. Консервант или его смеси обычно присутствуют в количестве приблизительно от 0,0001% приблизительно до 2% по массе всей композиции. Носители описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences 16-го издания, ред. Osol, A. (1980). Фармацевтически приемлемые носители в целом нетоксичны для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, и включают, но не ограничиваясь этим: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, в том числе аскорбиновая кислота и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (меньше чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие средства, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексные соединения с металлами (например Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные средства, такие как полиэтиленгликоль (PEG).
[155] Буферные средства в некоторых аспектах включены в композиции. Подходящие буферные средства включают, например, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, фосфат калия и различные другие кислоты и соли. В некоторых аспектах используют смесь двух или больше буферных средств. Буферное средство или его смеси обычно присутствуют в количестве приблизительно от 0,001% приблизительно до 4% по массе всей композиции. Известны способы получения вводимых фармацевтических композиций. Образцовые способы описаны более подробно, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21-е изд. (1 мая 2005 года).
[156] Составы могут включать водные растворы. Состав или композиция также может содержать больше чем один активный ингредиент, которые можно использовать для конкретного показания, заболевания или состояния, подлежащего лечению клетками, предпочтительно те, активности которых комплементарны клеткам, где соответствующие активности не оказывают нежелательного влияния друг на друга. Такие активные ингредиенты подходящим образом присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для предполагаемой цели. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция дополнительно содержит другие фармацевтически активные средства или лекарственные средства, такие как химиотерапевтические средства, например, аспарагиназу, бусульфан, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевину, метотрексат, паклитаксел, ритуксимаб, винбластин и/или винкристин.
[157] Композиции в некоторых вариантах осуществления предусмотрены в виде стерильных жидких препаратов, например, изотонических водных растворов, суспензий, эмульсий, дисперсий или вязких композиций, которые в некоторых аспектах можно забуферивать до выбранного pH. Жидкие композиции могут содержать носители, которые могут представлять собой растворитель или диспергирующую среду, которые содержат, например, воду, солевой раствор, фосфатно-солевой буфер, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль) и их подходящие смеси. Стерильные инъецируемые растворы можно получать посредством встраивания клеток в растворитель, например, в смеси с подходящим носителем, разбавителем или эксципиентом, таким как стерильна вода, физиологический солевой раствор, глюкоза, декстроза или тому подобное. Композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как смачивающие, диспергирующие или эмульгирующие средства (например, метилцеллюлозу), pH буферные средства, гелеобразующие или увеличивающие вязкость добавки, консерванты, ароматизаторы и/или красители, в зависимости от пути введения и желаемого препарата. Для получения подходящих препаратов в некоторых аспектах можно обращаться к стандартным текстам.
[158] Можно добавлять различные добавки, которые увеличивают стабильность и стерильность композиций, в том числе противомикробные консерванты, антиоксиданты, хелатирующие средства и буферы. Предотвращение действия микроорганизмов можно обеспечивать с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола и сорбиновой кислоты. Пролонгированную абсорбцию инъецируемой фармацевтической формы можно осуществлять с помощью средств, задерживающих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
[159] В некоторых вариантах осуществления буфер для формулирования содержит криоконсервант. В некоторых вариантах осуществления клетки формулируют с раствором криоконсерванта, который содержит раствор DMSO от 1,0% to 30%, например, раствор DMSO от 5% до 20% или раствор DMSO от 5% до 10%. В некоторых вариантах осуществления раствор для криосохранения представляет собой или содержит, например, PBS, содержащий 20% DMSO и 8% сывороточный альбумин человека (HSA), или другие подходящие среды для заморозки клеток. В некоторых вариантах осуществления раствор криоконсерванта представляет собой или содержит, например, по меньшей мере или приблизительно 7,5% DMSO. В некоторых вариантах осуществления стадии обработки могут включать промывание трансдуцированных и/или размноженных клеток для того, чтобы заменять клетки в растворе криоконсерванта.
[160] В некоторых вариантах осуществления формулирование осуществляют с использованием одной или нескольких стадий обработки, включая промывание, разведение или концентрирование клеток, таких как культивируемые или размноженные клетки. В некоторых вариантах осуществления обработка может включать разведение или концентрирование клеток до желаемой концентрации или числа, таких как композиции форм со стандартной дозой, содержащие определенное число клеток для введения заданной дозы или ее фракции. В некоторых вариантах осуществления стадии обработки могут включать уменьшение объема, чтобы тем самым увеличивать концентрацию клеток, по желанию. В некоторых вариантах осуществления стадии обработки могут включать увеличение объема, чтобы тем самым снижать концентрацию клеток по желанию. В некоторых вариантах осуществления обработка включает добавление объема буфера для формулирования к трансдуцированным и/или размноженным клеткам. В некоторых вариантах осуществления объем буфера для формулирования составляет от или приблизительно от 10 мл до 1000 мл, например, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере или приблизительно или 50 мл, 100 мл, 200 мл, 300 мл, 400 мл, 500 мл, 600 мл, 700 мл, 800 мл, 900 мл или 1000 мл.
[161] В некоторых вариантах осуществления такие стадии обработки для формулирования клеточной композиции осуществляют в закрытой системе. Образцы таких стадий обработки можно осуществлять с использованием центробежной камеры в сочетании с одной или несколькими системами или наборами, связанными с системой обработки клеток, такой как центробежная камера, производимая и продаваемая в Biosafe SA, включая таковые для использования с системами обработки клеток Sepax или Sepax 2. Образцовая система и процессы описаны в международной публикации № WO2016/073602. В некоторых вариантах осуществления способ включает осуществление экспрессии из внутренней полости центробежной камеры сформулированной композиции, которая является получаемой композицией клеток, формулируемых в буфере для формулирования, таком как фармацевтически приемлемый буфер, в любом из вышеуказанных вариантов осуществления, как описано. В некоторых вариантах осуществления экспрессия сформулированной композиции происходит в контейнер, такой как мешок, который функционально связан в качестве части закрытой системы с центробежной камерой. В некоторых вариантах осуществления контейнер, такой как мешок, соединяют с системой на выходной линии или в выходном положении.
[162] В некоторых вариантах осуществления закрытая система, например, связанная с центробежной камерой или системой обработки клеток, содержит многопортовый выходной набор, содержащий многонаправленный трубочный манифольд, ассоциированный на каждом конце трубочной линии с портом, с которым один или множество контейнеров можно соединять для экспрессии формулируемой композиции. В некоторых аспектах, желаемое число или множество выходных контейнеров, например, мешков, можно стерильно соединять с одним или несколькими, в целом двумя или больше, например, по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8 или больше портами многопортового выхода. Например, в некоторых вариантах осуществления один или несколько контейнеров, например, мешков, можно прикреплять к портам или к меньше чем всем портам. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления система может осуществлять экспрессию выходной композиции в множество выходных мешков. В некоторых аспектах, клетки можно экспрессировать в один или несколько из множества выходных мешков в количестве для введения дозы, таком как для введения одной стандартной дозы или введения нескольких доз. Например, в некоторых вариантах осуществления каждый из выходных мешков может содержать определенное число клеток для введения заданной дозы или ее фракции. Таким образом, каждый мешок, в некоторых аспектах, может содержать одну стандартную дозу для введения или может содержать фракцию желаемой дозы, так что больше чем один из множества выходных мешков, например, два из выходных мешков или три из выходных мешков, вместе составляют дозу для введения.
[163] Таким образом, контейнеры, например, выходные мешки, в целом содержат клетки, подлежащие введению, например, одну или несколько их стандартных доз. Стандартная доза может представлять собой количество или число клеток, подлежащие введению субъекту или удвоенное число (или больше) клеток, подлежащее введению. Оно может представлять собой наименьшую дозу или наименьшую возможную дозу клеток, которую будут вводить субъекту.
6
6
6
7
7
8
[164] В некоторых вариантах осуществления каждый из контейнеров, например, мешков, индивидуально содержит стандартную дозу клеток. Таким образом в некоторых вариантах осуществления каждый из контейнеров содержит одинаковое или приблизительно или по существу одинаковое число клеток. В некоторых вариантах осуществления каждая стандартная доза содержит по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 1 × 10, 2 × 10, 5 × 10, 1 × 10, 5 × 10 или 1 × 10 сконструированных клеток, всех клеток, T-клеток или PBMC. В некоторых вариантах осуществления объем сформулированной клеточной композиции в каждом мешке составляет от 10 мл до 100 мл, например, по меньшей мере или приблизительно по меньшей мере 20 мл, 30 мл, 40 мл, 50 мл, 60 мл, 70 мл, 80 мл, 90 мл или 100 мл.
[165] В некоторых вариантах осуществления такие клетки, получаемые с помощью способа, или композицию, содержащую такие клетки, вводят субъекту для лечения заболевания или состояния.
III. РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК
[166] В некоторых вариантах осуществления способы культивирования, такие как для размножения или культивирования клеток, осуществляют для генетически сконструированных, например, трансдуцированных, клеток с рекомбинантным белком. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок представляет собой или содержит рекомбинантный рецептор, например, антигенный рецептор. Антигенный рецептор может включать функциональные не TCR антигенные рецепторы, в том числе химерные антигенные рецепторы (CAR) и другие антигенсвязывающие рецепторы, такие как трансгенные T-клеточные рецепторы (TCR). Рецепторы также могут включать другие рецепторы, такие как другие химерные рецепторы, такие как рецепторы, которые связываются с конкретными лигандами и имеют трансмембранные домены и/или домены внутриклеточной сигнализации, схожие с теми, что присутствуют в CAR.
[167] Образцовые антигенные рецепторы, включая CAR, и способы конструирования и введения таких рецепторов в клетки, включают те, которые описаны, например, в публикациях международных патентных заявок №№ WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, публикациях патентных заявок США №№ US2002131960, US2013287748, US20130149337, патентах США №№ 6451995, 7446190, 8252592, 8339645, 8398282, 7446179, 6410319, 7070995, 7265209, 7354762, 7446191, 8324353 и 8479118 и европейской патентной заявке № EP2537416, и/или те, которые описаны Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS one 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75. В некоторых аспектах, антигенные рецепторы включают CAR, как описано в патенте США № 7446190, и те, которые описаны в публикации международной патентной заявки № WO/2014055668 A1. Примеры CAR включают CAR, как раскрыто в любой из указанных выше публикаций, таких как WO2014031687, US 8339645, US 7446179, US 2013/0149337, патент США № 7446190, патент США № 8389282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; и Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177). См. также WO2014031687, US 8339645, US 7446179, US 2013/0149337, патент США № 7446190 и патент США № 8389282.
[168] В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота(ы), кодирующая рекомбинантный белок, дополнительно кодирует один или несколько маркеров, например, для целей подтверждения трансдукции или конструирования клетки для того, чтобы экспрессировать рецептор и/или проводить отбор и/или направлять клетки, экспрессирующие молекулу(ы), кодируемую полинуклеотидом. В некоторых аспектах такой маркер можно кодировать с помощью другой нуклеиновой кислоты или полинуклеотида, которые также можно вводить в ходе процесса генетической инженерии, обычно тем же способом, например, трансдукцией с помощью любого из способов, предусмотренных в настоящем описании, например, через тот же вектор или тип вектора.
[169] В некоторых аспектах, маркер, например, маркер трансдукции, представляет собой белок и/или молекулу клеточной поверхности. Образцовые маркеры представляют собой усеченные варианты встречаемых в природе, например, эндогенных маркеров, таких как встречаемые в природе молекулы клеточной поверхности. В некоторых аспектах, варианты имеют сниженную иммуногенность, сниженную функцию направленной миграции и/или сниженную функцию передачи сигналов по сравнению с природной или эндогенной молекулой клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой усеченную версию рецептора клеточной поверхности, например, усеченный EGFR (tEGFR). В некоторых аспектах, маркер включает целый или частичный (например, усеченную форму) CD34, NGFR или рецептор эпидермального фактора роста (например, tEGFR). В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая маркер, функционально связана с полинуклеотидом, кодирующим линкерную последовательность, такую как расщепляемая линкерная последовательность, например, T2A P2A, E2A и/или F2A. См., например, WO2014/031687.
[170] В некоторых вариантах осуществления маркер представляет собой молекулу, например, белок клеточной поверхности, в природе не встречающийся на T-клетке или в природе не встречающийся на поверхности T-клетки или ее части.
[171] В некоторых вариантах осуществления молекула представляет собой не свою молекулу, например, не свой белок, т. е. тот, который не распознает как «свой» иммунная система хозяина, которому клетки будут адаптивно перенесены.
[172] В некоторых вариантах осуществления маркер не выполняет терапевтическую функцию и/или не вызывает эффекта, отличного от использования в качестве маркера для генетической инженерии, например, для отбора успешно сконструированных клеток. В других вариантах осуществления маркер может представлять собой терапевтическую молекулу или молекулу, иным образом проявляющую некоторый желаемый эффект, такую как лиганд для клетки, встречаемой in vivo, такую как костимулирующая молекула или молекула иммунной контрольной точки для усиления и/или ослабления ответов клеток при адоптивном переносе и встрече с лигандом.
A. Химерные антигенные рецепторы
[173] В некоторых вариантах осуществления CAR в целом представляет собой генетически сконструированный рецептор с внеклеточным лигандсвязывающим доменом, таким как внеклеточная часть, содержащая антитело или его фрагмент, которая связана с одним или несколькими компонентами внутриклеточной передачи сигналов. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит трансмембранный домен и/или внутриклеточный домен, соединяющий внеклеточный домен и домен внутриклеточной сигнализации. Такие молекулы обычно имитируют или приблизительно повторяют сигнал через природный антигенный рецептор и/или сигнал через такой рецептор в комбинации с костимулирующим рецептором.
[174] В некоторых вариантах осуществления конструируют CAR со специфичностью к конкретному маркеру, такому как маркер, экспрессируемый конкретным типом клеток, подлежащим направленному воздействию посредством адоптивной терапии, например, маркер злокачественной опухоли и/или любой из описанных антигенов. Таким образом, CAR обычно содержит один или несколько антигенсвязывающих фрагментов, доменов или частей антитела или один или несколько вариабельных доменов антител и/или молекул антител. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антигенсвязывающую часть или части молекулы антитела, такие как вариабельная тяжелая цепь (VH) или ее антигенсвязывающая часть или одноцепочечный фрагмент антитела (scFv), полученный из вариабельной тяжелой (VH) и вариабельной легкой (VL) цепей моноклонального антитела (mAb).
[175] В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело или антигенсвязывающий фрагмент (например, scFv), который специфически распознает антиген, такой как интактный антиген, экспрессируемый на поверхности клетки.
[176] В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд) представляет собой опухолевый антиген или маркер злокачественной опухоли. В некоторых вариантах осуществления антиген (или лиганд) представляет собой или содержит рецептор-сироту тирозинкиназы ROR1, антиген созревания B-клеток (BCMA), карбоангидразу 9 (CAIX), tEGFR, Her2/neu (рецепторная тирозинкиназа erbB2), L1-CAM, CD19, CD20, CD22, мезотелин, CEA и поверхностный антиген гепатита B, антифолатный рецептор, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, эпителиальный гликопротеин 2 (EPG-2), эпителиальный гликопротеин 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, димеры erbB, EGFR vIII, фолатсвязывающий белок (FBP), FCRL5, FCRH5, фетальный рецептор ацетилхолина, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-α, IL-13R-α2, рецептор с доменом вставки киназы (kdr), легкую цепь κ, Lewis Y, молекулу клеточной адгезии L1, (L1-CAM), ассоциированный с меланомой антиген (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, предпочтительно экспрессируемый антиген меланомы (PRAME), сурвивин, TAG72, B7-H6, IL-13-рецептор α2 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, фолатный рецептор-a, CD44v6, CD44v7/8, интегрин avb6, 8H9, NCAM, рецепторы VEGF, 5T4, эмбриональный AchR, лиганды NKG2D, CD44v6, двойной антиген, антиген злокачественной опухоли яичка, мезотелин, CMV мыши, муцин 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, онкофетальный антиген, ROR1, TAG72, VEGF-R2, эмбриональный опухолевый антиген (CEA), Her2/neu, рецептор эстрогена, рецептор прогестерона, эфрин B2, CD123, c-Met, GD-2, O-ацетилированный GD2 (OGD2), CE7, опухоль Вильмса 1 (WT-1), циклин, циклин A2, CCL-1, CD138, патогенспецифический антиген и антиген, связанный с универсальной меткой, и/или биотинилированные молекулы и/или молекулы, экспрессируемые HIV, HCV, HBV или другими патогенами. Антигены, на которые направлены рецепторы в некоторых вариантах осуществления, включают антигены, связанные со злокачественным B-клеточным новообразованием, такие как любые из множества известных маркеров B-клеток. В некоторых вариантах осуществления антиген, на который направлен рецептор, представляет собой CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igκ, Igλ, CD79a, CD79b или CD30.
[177] В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой патогенспецифический антиген. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой вирусный антиген (такой как вирусный антиген из HIV, HCV, HBV и т. д.), бактериальные антигены и/или паразитарные антигены.
[178] В некоторых вариантах осуществления CAR содержит TCR-подобное антитело, такое как антитело или антигенсвязывающий фрагмент (например, scFv), которые специфически распознают внутриклеточный антиген, такой как опухолеассоциированный антиген, представленный на клеточной поверхности в виде комплекса MHC-пептид. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающую часть, которые распознают комплекс MHC-пептид, можно экспрессировать на клетках в качестве части рекомбинантного рецептора, такого как антигенный рецептор. Среди антигенных рецепторов функциональные не TCR антигенные рецепторы, такие как химерные антигенные рецепторы (CAR). В целом, CAR, содержащий антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые проявляет TCR-подобную специфичность, направленную против комплексов пептид-MHC, также можно обозначать как TCR-подобный CAR.
[179] В некоторых вариантах осуществления внеклеточная часть CAR, такая как его антительная часть, дополнительно содержит спейсер, такой как спейсерная область между антигенраспознающим компонентом, например, scFv, и трансмембранным доменом. Спейсер может представлять собой или содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина или ее вариант или модифицированную версию, такую как шарнирная область, например, шарнирную область IgG4 и/или CH1/CL и/или Fc-область. В некоторых вариантах осуществления константная область или часть происходит из IgG человека, такого как IgG4 или IgG1. Спейсер может иметь длину, которая обеспечивает увеличенную восприимчивость клетки после связывания антигена по сравнению с отсутствием спейсера. В некоторых примерах спейсер составляет ровно или приблизительно 12 аминокислот в длину или составляет не больше чем 12 аминокислот в длину. Образцовые спейсеры включают те, которые имеют по меньшей мере приблизительно от 10 до 229 аминокислот, приблизительно от 10 до 200 аминокислот, приблизительно от 10 до 175 аминокислот, приблизительно от 10 до 150 аминокислот, приблизительно от 10 до 125 аминокислот, приблизительно от 10 до 100 аминокислот, приблизительно от 10 до 75 аминокислот, приблизительно от 10 до 50 аминокислот, приблизительно от 10 до 40 аминокислот, приблизительно от 10 до 30 аминокислоты, приблизительно от 10 до 20 аминокислот или приблизительно от 10 до 15 аминокислот, и включая любое целое между конечными точками любого из перечисленных диапазонов. В некоторых вариантах осуществления спейсерная область имеет приблизительно 12 аминокислот или меньше, приблизительно 119 аминокислот или меньше или приблизительно 229 аминокислот или меньше. Образцовые спейсеры включают отдельно шарнир IgG4, шарнир IgG4, связанный с доменами CH2 и CH3, или шарнир IgG4, связанный с доменом CH3. Образцовые спейсеры включают, но не ограничиваясь этим, те, которые описаны в Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153 или публикации международной патентной заявки № WO2014/031687.
[180] Связывание внеклеточного лиганда, такое как домен распознавания антигена, в целом связано с одним или несколькими внутриклеточными компонентами передачи сигнала, такими как компоненты передачи сигнала, которые имитируют активацию через антигенный рецепторный комплекс, такой как комплекс TCR, в случае CAR, и/или сигнал через другой рецептор клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен связывает внеклеточный лигандсвязывающий домен и домен внутриклеточной сигнализации. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит трансмембранный домен, слитый с внеклеточным доменом. В одном из вариантов осуществления используют трансмембранный домен, который в природе связан с одним из доменов в рецепторе, например, CAR. В некоторых случаях, трансмембранный домен выбирают или модифицируют посредством замены аминокислоты для того, чтобы избегать связывания таких доменов с трансмембранными доменами тех же или других поверхностных мембранных белков для того, чтобы минимизировать взаимодействия с другими элементами рецепторного комплекса.
[181] Трансмембранный домен в некоторых вариантах осуществления происходит или из природного или из синтетического источника. Когда источник является природным, домен в некоторых аспектах происходит из любого мембраносвязанного или трансмембранного белка. Трансмембранные области включают те, которые происходят (т. е. содержат по меньшей мере трансмембранную область(и)) из α-, β- или ζ-цепи T-клеточного рецептора, CD28, CD3ε, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 или CD154. Трансмембранный домен в некоторых вариантах осуществления является синтетическим. В некоторых аспектах, синтетический трансмембранный домен содержит в большинстве своем гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. В некоторых аспектах триплет из фенилаланина, триптофана и валина встречают на каждом конце синтетического трансмембранного домена. В некоторых вариантах осуществления связь опосредована линкерами, спейсерами и/или трансмембранным доменом(ами).
[182] В некоторых вариантах осуществления короткий олиго- или полипептидный линкер, например, линкер между 2 и 10 аминокислотами в длину, такой как тот, который содержит глицины и серины, например, глицин-сериновый дублет, присутствует и образует связь между трансмембранным доменом и цитоплазматическим сигнальным доменом из CAR.
[183] Рекомбинантный рецептор, например, CAR, в целом содержит по меньшей мере один внутриклеточный компонент или компоненты передачи сигнала. В некоторых вариантах осуществления рецептор содержит внутриклеточный компонент комплекса TCR, такой как цепь CD3 TCR, которая опосредует активацию T-клеток и цитотоксичность, например, цепь CD3ζ. Таким образом, в некоторых аспектах, антигенсвязывающую часть связывают с одним или несколькими модулями клеточной сигнализации. В некоторых вариантах осуществления модули клеточной сигнализации включают трансмембранный домен CD3, домены внутриклеточной сигнализации CD3 и/или другие трансмембранные домены CD. В некоторых вариантах осуществления рецептор, например, CAR, дополнительно содержит часть одной или нескольких дополнительных молекул, например, Fc-рецептор γ, CD8, CD4, CD25 или CD16. Например, в некоторых аспектах, CAR или другой химерный рецептор содержит химерную молекулу между CD3ζ (CD3-ζ) или Fc-рецептором γ и CD8, CD4, CD25 или CD16.
[184] В некоторых вариантах осуществления при лигировании CAR или другого химерного рецептора, цитоплазматический домен или домен внутриклеточной сигнализации рецептора активирует по меньшей мере одну из нормальных эффекторных функций или ответов клетки иммунной системы, например, T-клетки, сконструированной для того, чтобы экспрессировать CAR. Например, в некоторых контекстах, CAR индуцирует функцию T-клетки, такую как цитолитическая активность или T-хелперная активность, такая как секреция цитокинов или других факторов. В некоторых вариантах осуществления усеченную часть домена внутриклеточной сигнализации компонента антигенного рецептора или костимулирующей молекулы используют вместо интактной иммуностимулирующей цепи, например, если она трансдуцирует сигнал эффекторной функции. В некоторых вариантах осуществления домен или домены внутриклеточной сигнализации содержат цитоплазматические последовательности T-клеточного рецептора (TCR) и в некоторых аспектах также таковые из корецепторов, которые в природном контексте действуют согласованно с такими рецепторами для того, чтобы инициировать сигнальную трансдукцию после вовлечения антигенного рецептора, и/или любые производные или вариант таких молекул и/или любую синтетическую последовательность, которая обладает такой же функциональной способностью.
[185] В контексте природного TCR, полная активация обычно требует не только передачи сигнала через TCR, также костимулирующего сигнала. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, чтобы содействовать полной активации, компонент для генерации вторичного или костимулирующего сигнала также входит в CAR. В других вариантах осуществления CAR не содержит компонент для генерации костимулирующего сигнала. В некоторых аспектах в той же клетке экспрессируют дополнительный CAR, который предусматривает компонент для генерации вторичного или костимулирующего сигнала.
[186] Активация T-клеток в некоторых аспектах описана как опосредованная цитоплазматическими сигнальными последовательностями по меньшей мере двух классов: те, которые инициируют антигензависимую первичную активацию через TCR (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и те, которые действуют независимо от антигена для того, чтобы предоставлять вторичный или костимулирующий сигнал (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности). В некоторых аспектах CAR содержит один или оба таких компонента передачи сигнала.
[187] В некоторых аспектах, CAR содержит первичную цитоплазматическую сигнальную последовательность, которая регулирует первичную активацию комплекса TCR. Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны в качестве иммунорецепторных тирозиновых активирующих мотивов или ITAM. Примеры содержащих ITAM первичных цитоплазматических сигнальных последовательностей включают те, которые происходят из TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD8, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. В некоторых вариантах осуществления цитоплазматическая сигнальная молекула(ы) в CAR содержит цитоплазматический домен сигнализации, его часть или последовательность, полученную из CD3ζ.
[188] В некоторых вариантах осуществления CAR содержит домен сигнализации и/или трансмембранную часть костимулирующего рецептора, например, CD28, 4-1BB, OX40, CD27, DAP10 и ICOS. В некоторых аспектах, тот же CAR содержит как активирующие, так и костимулирующие компоненты.
[189] В некоторых вариантах осуществления активирующий домен входит в один CAR, тогда как костимулирующий компонент предусмотрен другим CAR, распознающим другой антиген. В некоторых вариантах осуществления CAR включают активирующие или стимулирующие CAR и костимулирующие CAR, и те и другие экспрессирует одна и та же клетка (см. WO2014/055668). В некоторых аспектах CAR представляет собой стимулирующий или активирующий CAR; в других аспектах он представляет собой костимулирующий CAR. В некоторых вариантах осуществления клетки дополнительно содержат ингибирующие CAR (iCAR, см. Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (декабрь 2013 года), такие как CAR, распознающие другой антиген, в соответствии с чем активирующий сигнал, доставляемый через CAR, распознающий первый антиген, уменьшают или ингибируют посредством связывания ингибирующего CAR с его лигандом, например, чтобы снижать эффекты вне мишени.
[190] В некоторых вариантах осуществления домен внутриклеточной сигнализации CD8+ цитотоксических T-клеток является таким же, как домен внутриклеточной сигнализации CD4+ хелперных T-клеток. В некоторых вариантах осуществления домен внутриклеточной сигнализации CD8+ цитотоксических T-клеток отличается от домена внутриклеточной сигнализации CD4+ хелперных T-клеток.
[191] В определенных вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит трансмембранный домен и домен сигнализации CD28, связанные с внутриклеточным доменом CD3 (например, CD3ζ). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточная сигнальная область содержит химерный домен CD28 и (4-1BB, TNFRSF9) костимулирующий домен CD137, связанные с внутриклеточным доменом CD3ζ.
[192] В некоторых вариантах осуществления CAR охватывает один или несколько, например, два или больше костимулирующих доменов и домен активации, например, домен первичной активации, в цитоплазматической части. Образцовые CAR включают внутриклеточные компоненты CD3ζ, CD28 и 4-1BB.
[193] В некоторых случаях, CAR обозначают как CAR первого, второго и/или третьего поколения. В некоторых аспектах, CAR первого поколения представляет собой тот, который обеспечивает лишь индуцируемый цепью CD3 сигнал при связывании антигена; в некоторых аспектах CAR второго поколения представляет собой тот, который обеспечивает такой сигнал и костимулирующий сигнал, такой как тот, который содержит домен внутриклеточной сигнализации из костимулирующего рецептора, например, CD28 или CD137; в некоторых аспектах CAR третьего поколения в некоторых аспектах представляет собой тот, который содержит несколько костимулирующих доменов различных костимулирующих рецепторов.
[194] В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внеклеточную лигандсвязывающую часть, такую как антигенсвязывающая часть, такая как антитело или его фрагмент, и внутриклеточный домен. В некоторых вариантах осуществления антитело или фрагмент включает scFv или однодоменное VH антитело и внутриклеточный домен содержит ITAM. В некоторых аспектах, домен внутриклеточной сигнализации включает домен сигнализации ζ-цепи из цепи CD3-дзета (CD3ζ). В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит трансмембранный домен, связывающий внеклеточный домен и домен внутриклеточной сигнализации. В некоторых аспектах, трансмембранный домен содержит трансмембранную часть CD28. Внеклеточный домен и трансмембранный могут быть связаны непосредственно или опосредованно. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен и трансмембранный связаны посредством спейсера, например, любого описанного в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления химерный антигенный рецептор содержит внутриклеточный домен костимулирующей молекулы T-клетки, например, между трансмембранным доменом и доменом внутриклеточной сигнализации. В некоторых аспектах, костимулирующая молекула T-клетки представляет собой CD28 или 4-1BB.
[195] В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело, например, фрагмент антитела, трансмембранный домен, который представляет собой или содержит трансмембранную часть CD28 или ее функциональный вариант, и домен внутриклеточной сигнализации, содержащий сигнальную часть CD28 или ее функциональный вариант и сигнальную часть CD3ζ или ее функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит антитело, например, фрагмент антитела, трансмембранный домен, который представляет собой или содержит трансмембранную часть CD28 или ее функциональный вариант, и домен внутриклеточной сигнализации, содержащий сигнальную часть 4-1BB или ее функциональный вариант и сигнальную часть CD3ζ или ее функциональный вариант. В некоторых таких вариантах осуществления рецептор дополнительно содержит спейсер, содержащий часть молекулы Ig, такой как молекула Ig человека, например, шарнир Ig, например, шарнир IgG4, например, спейсер только из шарнира.
[196] В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен рецептора, например, CAR, представляет собой трансмембранный домен CD28 человек или его вариант, например, 27-аминокислотный трансмембранный домен из CD28 человека (№ доступа P10747.1). В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит внутриклеточный костимулирующий домен сигнализации из CD28 человека или его функциональный вариант, такой как его 41-аминокислотный домен и/или такой домен с заменой LL на GG в положениях 186-187 нативного белка CD28. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный домен содержит внутриклеточный костимулирующий домен сигнализации из 4-1BB или его функциональный вариант, такой как 42-аминокислотный цитоплазматический домен из 4-1BB человека (№ доступа Q07011.1). В некоторых вариантах осуществления домен внутриклеточной сигнализации содержит стимулирующий домен сигнализации CD3ζ человека или его функциональный вариант, такой как 112 а. к. цитоплазматический домен изоформы 3 CD3ζ человека (№ доступа P20963.2) или домен сигнализации CD3ζ, как описано в патент США № 7446190. В некоторых аспектах, спейсер содержит только шарнирную область IgG, например, только шарнир из IgG4 или IgG1. В других вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнир Ig, например, и шарнир IgG4, связанный с доменами CH2 и/или CH3. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнир Ig, например, шарнир IgG4, связанный с доменами CH2 и CH3. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой шарнир Ig, например, шарнир IgG4, связанный только с доменом CH3. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой или содержит богатую глицином-серином последовательность или другой гибкий линкер, например, известные гибкие линкеры.
[197] Например, в некоторых вариантах осуществления CAR содержит: внеклеточную лигандсвязывающую часть, такую как антигенсвязывающая часть, такая как антитело или его фрагмент, в том числе sdAb и scFv, которые специфически связывают антиген, например, антиген, описанный в настоящем описании; спейсер, например, любой из спейсеров содержащих шарнир Ig; трансмембранный домен, который представляет собой часть CD28 или ее вариант; домен внутриклеточной сигнализации, содержащий сигнальную часть из CD28 или ее функциональный вариант; и сигнальную часть из домена сигнализации CD3ζ или ее функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления CAR содержит: внеклеточную лигандсвязывающую часть, такую как антигенсвязывающая часть, такая как антитело или его фрагмент, включая sdAb и scFv, которые специфически связывают антиген, например, антиген, описанный в настоящем описании; спейсер, например, любой из спейсеров, содержащих шарнир Ig; трансмембранный домен, который представляет собой часть CD28 или ее вариант; домен внутриклеточной сигнализации, содержащий сигнальную часть 4-1BB или ее функциональный вариант; и сигнальную часть домена сигнализации CD3ζ или ее функциональный вариант. В некоторых вариантах осуществления такие конструкции CAR дополнительно содержат элемент рибосомного перепрыгивания T2A и/или последовательность tEGFR, например, ниже по направлению считывания относительно CAR.
B. T-клеточные рецепторы (TCR)
[198] В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный белок представляет собой или содержит рекомбинантный T-клеточный рецептор (TCR). В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный TCR обладает специфичностью к антигену, обычно антиген присутствует на целевой клетке, например, опухолеспецифический антиген, антиген, экспрессируемый на клетках конкретного типа, связанных с аутоиммунным или воспалительным заболеванием, или антиген, происходящий от вирусного патогена или бактериального патогена.
[199] В некоторых вариантах осуществления TCR представляет собой тот, который клонировали из встречаемых в природе T-клеток. В некоторых вариантах осуществления высокоаффинный клон T-клеток для целевого антигена (например, антигена злокачественной опухоли) идентифицируют и выделяют у пациента. В некоторых вариантах осуществления клон TCR для целевого антигена создают в трансгенных мышах, сконструированных с использованием генов иммунной системы человека (например, система лейкоцитарных антигенов человека или HLA). См., например, опухолевые антигены (см., например, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 и Cohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808. В некоторых вариантах осуществления фаговый дисплей используют для выделения TCR против целевого антигена (см., например, Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395 и Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354.
[200] В некоторых вариантах осуществления после получения клона T-клеток, цепи TCR α и β выделяют и клонируют в вектор экспрессии гена. В некоторых вариантах осуществления гены TCR α и β связывают через пептид рибосомного перепрыгивания 2A пикорнавирусов с тем, чтобы совместно экспрессировать обе цепи. В некоторых вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая TCR, дополнительно содержит маркер для того, чтобы подтверждать трансдукцию или конструирование клетки для экспрессии рецептора.
IV. ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[201] Пока не определено иное, все термины в данной области, обозначения и другие технические и научные термины или терминология, используемые в настоящем описании, предполагают имеющими те же значения, как их обычно понимает специалист в области, к которой относится заявленный объект изобретения. В некоторых случаях, термины с обычно понимаемыми значениями определяют в настоящем описании для прозрачности и/или в качестве готовой справки, и включение таких определений в настоящее описание не следует обязательно толковать как представление существенного отличия от того, что обычно понимают в данной области.
[202] Как используют в настоящем описании, формы единственного числа включают множественное число до тех пор, пока контекст явно не диктует иное. Например, форма единственного числа подразумевает «по меньшей мере один» или «один или несколько». Понятно, что аспекты и вариации, описанные в настоящем описании, включают аспекты и вариации «состоит» и/или «состоит по существу из». Также следует понимать, что термин «и/или», как используют в настоящем описании, относится к любым и всем возможным комбинациям, и охватывает их, одного или нескольких ассоциированных перечисленных пунктов. Кроме того, следует понимать, что термины «включает, «включающий», «содержит» и/или «содержащий», когда используют в настоящем описании, определяют присутствие указанных признаков, целых, стадий, операций, элементов, компонентов и/или единиц, и не исключают присутствие или добавление одного или нескольких других признаков, целых, стадий, операций, элементов, компонентов, единиц и/или их групп.
[203] В этой заявке раскрыто несколько числовых диапазонов в тексте и на фиг. Раскрытые числовые диапазоны неотъемлемо предусматривают любой диапазон или значение в пределах раскрытых числовых диапазонов, включая конечные точки, даже несмотря на то, что точное ограничение диапазона не указано в описании буквально, поскольку это раскрытие можно реализовать на практике на всем протяжении раскрытых числовых диапазонов.
[204] Термин «вектор», как используют в настоящем описании, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной распространять другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин включает вектор в виде самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую его вводили. Определенные векторы способны управлять экспрессией нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы обозначают в настоящем описании как «экспрессирующие векторы». Среди векторов имеют место вирусные векторы, такие как ретровирусные, например, гаммаретровирусные и лентивирусные, векторы.
[205] Термины «клетка-хозяин», «клеточная линия-хозяин» и «клеточная культура-хозяин» используют взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которую вводили экзогенную нуклеиновую кислоту, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первичную трансформированную клетку и потомство, происходящее от нее, не взирая на число пассирований. Потомство может не быть полностью идентичным родительской клетке по содержанию нуклеиновых кислот, но может содержать мутации. Мутантное потомство, которое имеет ту же функцию или биологическую активность, по которой осуществляли скрининг или отбор исходной трансформированной клетки, включено в настоящее описание.
[206] Как используют в настоящем описании, утверждение о том, что клетка или популяция клеток является «положительной» по конкретному маркеру, относится к поддающемуся обнаружению присутствию конкретного маркера, обычно маркера поверхности, на или в клетке. В отношении маркера поверхности, термин относится к присутствию поверхностной экспрессии, как обнаруживают посредством проточной цитометрии, например, посредством окрашивания антителом, которое специфически связывается с маркером, и обнаружения указанного антитела, где окрашивание поддается обнаружению посредством проточной цитометрии на уровне по существу выше окрашивания, обнаруживаемого при осуществлении той же процедуры с контролем совпадающего изотипа при в остальном идентичных условиях, и/или на уровне, по существу схожем с таковым для клетки, о которой известно, что она положительна по маркеру, и/или на уровне по существу выше такового для клетки, о которой известно, что она отрицательна по маркеру.
[207] Как используют в настоящем описании, утверждение о том, что клетка или популяция клеток является «отрицательной» по конкретному маркеру, относится к отсутствию существенного поддающегося обнаружению присутствия конкретного маркера, обычно маркера поверхности, на или в клетке. В отношении маркера поверхности, термин относится к отсутствию поверхностной экспрессии, как обнаруживают посредством проточной цитометрии, например, посредством окрашивания антителом, которое специфически связывается с маркером, и обнаружения указанного антитела, где окрашивание не обнаруживают посредством проточной цитометрии на уровне по существу выше окрашивания, обнаруживаемого при осуществлении той же процедуры с контролем совпадающего изотипа при в остальном идентичных условиях, и/или на уровне по существу ниже такового для клетки, о которой известно, что она положительна по маркеру, и/или на уровне по существу схожем при сравнении с таковым для клетки, о которой известно, что она отрицательна по маркеру.
[208] Как используют в настоящем описании, композиция относится к любой смесь из двух или больше продуктов, веществ или соединений, включая клетки. Она может представлять собой раствор, суспензию, жидкость, порошок, пасту, водное, не водное или любое их сочетание.
[209] Как используют в настоящем описании, «субъект» представляет собой млекопитающее, такое как человек или другое животное, и обычно представляет собой человека.
[210] Все публикации, в том числе патентные документы, научные статьи и базы данных, упоминаемые в этой заявке, включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме для всех целей в той же степени, как если бы каждую индивидуальную публикацию индивидуально включали посредством ссылки. Если определение, приведенное в настоящем описании, противоречит или иным образом находится в несоответствии с определением, приведенным в патентах, заявках, опубликованных заявках и других публикациях, которые включены в настоящее описание посредством ссылки, определение, приведенное в настоящем описании, преобладает над определением, которое включено в настоящее описание посредством ссылки.
[211] Заголовки разделов, используемые в настоящем описании, служат только организационным целям и не подлежат толкованию в качестве ограничения описанного объекта изобретения.
V. ОБРАЗЦОВЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[212] Среди вариантов осуществления, предусмотренных в настоящем описании, имеют место:
1. Сборочный узел биореакторного мешка, который содержит:
биореакторный мешок, который содержит:
верхнюю поверхность, содержащую множество портов, где множество портов содержит питающий порт, порт взятия образца и перфузионный порт;
нижнюю поверхность;
перфузионный фильтр, соединенный по текучему веществу с перфузионным портом; и
мешок отходов, соединенный по текучему веществу с перфузионным портом биореакторного мешка.
2. Сборочный узел биореакторного мешка по варианту осуществления 1, в котором верхняя поверхность биореакторного мешка имеет первый конец и второй конец напротив первого конца, и перфузионный порт находится ближе ко второму концу, чем к первому концу.
3. Сборочный узел биореакторного мешка по вариантам осуществления 1-2, в котором питающий порт и порт взятия образца находятся ближе к первому концу, чем ко второму концу.
4. Сборочный узел биореакторного мешка по вариантам осуществления 1-3, в котором верхняя поверхность биореакторного мешка имеет первую сторону и вторую сторону напротив первой стороны, и питающий порт находится ближе к первой стороне, чем ко второй стороне.
5. Сборочный узел биореакторного мешка по варианту осуществления 4, в котором порт взятия образца находится ближе ко второй стороне, чем к первой стороне.
6. Сборочный узел биореакторного мешка по вариантам осуществления 4-5, в котором перфузионный порт находится ближе ко второй стороне, чем к первой стороне.
7. Сборочный узел биореакторного мешка по вариантам осуществления 1-6, в котором перфузионный фильтр находится внутри биореакторного мешка.
8. Сборочный узел биореакторного мешка по вариантам осуществления 1-7, который дополнительно содержит компоновку питающих трубок, соединенную по текучему веществу с питающим портом.
9. Сборочный узел биореакторного мешка по варианту осуществления 8, в котором компоновка питающих трубок содержит трубку из поливинилхлорида (PVC).
10. Сборочный узел биореакторного мешка по вариантам осуществления 8-9, в котором компоновка питающих трубок содержит Y-образный соединитель так, что компоновка питающих трубок имеет два впуска.
11. Сборочный узел биореакторного мешка по вариантам осуществления 1-10, который дополнительно содержит компоновку трубок взятия образца, соединенную по текучему веществу с портом взятия образца.
12. Сборочный узел биореакторного мешка по варианту осуществления 11, в котором компоновка трубок взятия образца содержит PVC трубку.
13. Сборочный узел биореакторного мешка по варианту осуществления 1-12, в котором мешок отходов соединяют по текучему веществу с перфузионным портом через компоновку трубок отходов.
14. Сборочный узел биореакторного мешка по варианту осуществления 13, в котором компоновка трубок отходов содержит PVC трубку.
15. Сборочный узел биореакторного мешка по варианту осуществления 1-14, в котором множество портов дополнительно содержит порт впуска газа и порт выпуска газа.
16. Сборочный узел биореакторного мешка по варианту осуществления 15, в котором верхняя поверхность биореакторного мешка имеет середину, которая находится на полпути между первым концом и вторым концом, и порт впуска газа и порт выпуска газа находятся ближе к середине, чем к первому концу или второму концу.
17. Сборочный узел биореакторного мешка по варианту осуществления 15-16, в котором множество портов состоит из питающего порта, порта взятия образца, перфузионного порта, порта впуска газа и порта выпуска газа.
18. Сборочный узел биореакторного мешка по варианту осуществления 15-17, который дополнительно содержит компоновку трубок впуска газа, содержащую фильтр впуска, соединенный по текучему веществу с портом впуска газа, и компоновку трубок выпуска газа, содержащую выходной фильтр, соединенный по текучему веществу с портом выпуска газа.
19. Биореакторная система, которая содержит:
биореакторную качалку; и
биореакторный мешок, опирающийся на биореакторную качалку, биореакторный мешок содержит:
верхнюю поверхность, содержащую множество портов, где множество портов содержит питающий порт, порт взятия образца и перфузионный порт;
нижнюю поверхность;
перфузионный фильтр, соединенный по текучему веществу с перфузионным портом; и
мешок отходов, соединенный по текучему веществу с перфузионным портом биореакторного мешка.
20. Биореакторная система по варианту осуществления 19, которая дополнительно содержит компоновку питающих трубок, соединенную по текучему веществу с питающим портом.
21. Биореакторная система по варианту осуществления 20, в которой компоновка питающих трубок содержит Y-образный соединитель так, что компоновка питающих трубок имеет первый и второй впуск.
22. Биореакторная система по варианту осуществления 21, в которой источник клеточных сред соединяют по текучему веществу с каждым впуском компоновки питающих трубок.
23. Биореакторная система по варианту осуществления 22, в которой каждый впуск содержит PVC и источник клеточных сред сваривают с PVC впуска.
24. Биореакторная система по варианту осуществления 21, в которой источник клеток соединяют по текучему веществу с первым впуском и источник клеточных сред соединяют по текучему веществу со вторым впуском.
25. Биореакторная система по варианту осуществления 24, в которой каждый впуск содержит PVC и источник клеток сваривают с PVC первого впуска и источник клеточных сред сваривают с PVC второго впуска.
26. Биореакторная система по вариантам осуществления 19-25, в которой перфузионный фильтр находится внутри биореакторного мешка.
27. Биореакторная система по вариантам осуществления 19-26, в которой верхняя поверхность биореакторного мешка имеет первый конец и второй конец напротив первого конца и перфузионный порт находится ближе ко второму концу, чем к первому концу.
28. Биореакторная система по варианту осуществления 27, в которой питающий порт и порт взятия образца находятся ближе к первому концу, чем ко второму концу.
29. Биореакторная система по вариантам осуществления 19-28, в которой верхняя поверхность биореакторного мешка имеет первую сторону и вторую сторону напротив первой стороны и питающий порт находится ближе к первой стороне, чем ко второй стороне.
30. Биореакторная система по варианту осуществления 29, в которой порт взятия образца находится ближе ко второй стороне, чем к первой стороне.
31. Биореакторная система по варианту осуществления 29-30, в которой перфузионный порт находится ближе ко второй стороне, чем к первой стороне.
32. Биореакторная система по вариантам осуществления 19-31, в которой перфузионный фильтр находится внутри биореакторного мешка.
33. Биореакторная система по вариантам осуществления 19-32, которая дополнительно содержит компоновку питающих трубок, соединенную по текучему веществу с питающим портом.
34. Биореакторная система по варианту осуществления 33, в которой компоновка питающих трубок содержит трубку из поливинилхлорида (PVC).
35. Биореакторная система по вариантам осуществления 33-34, в которой компоновка питающих трубок содержит Y-образный соединитель так, что компоновка питающих трубок имеет два впуска.
36. Биореакторная система по вариантам осуществления 19-35, которая дополнительно содержит компоновку трубок взятия образца, соединенную по текучему веществу с портом взятия образца.
37. Биореакторная система по варианту осуществления 36, в которой компоновка трубок взятия образца содержит PVC трубку.
38. Биореакторная система по вариантам осуществления 19-37, в которой мешок отходов соединяют по текучему веществу с перфузионным портом через компоновку трубок отходов.
39. Биореакторная система по варианту осуществления 38, в которой компоновка трубок отходов содержит PVC трубку.
40. Биореакторная система по вариантам осуществления 19-39, в которой множество портов дополнительно содержит порт впуска газа и порт выпуска газа.
41. Биореакторная система по варианту осуществления 40, в которой верхняя поверхность биореакторного мешка имеет середину, которая находится на полпути между первым концом и вторым концом, и порт впуска газа и порт выпуска газа находятся ближе к середине, чем к первому концу или второму концу.
42. Биореакторная система по вариантам осуществления 40-41, в которой множество портов состоит из питающего порта, порта взятия образца, перфузионного порта, порта впуска газа и порта выпуска газа.
43. Биореакторная система по вариантам осуществления 40-42, которая дополнительно содержит компоновку трубок впуска газа, содержащую фильтр впуска, соединенный по текучему веществу с портом впуска газа, и компоновку трубок выпуска газа, содержащую выходной фильтр, соединенный по текучему веществу с портом выпуска газа.
44. Способ использования биореакторной системы, который включает:
предоставление биореакторного мешка сборочного узла биореакторного мешка, где сборочный узел биореакторного мешка содержит:
биореакторный мешок с верхней поверхностью, содержащей множество портов, где множество портов содержит питающий порт, порт взятия образца и перфузионный порт; нижней поверхностью; и перфузионным фильтром, соединенным по текучему веществу с перфузионным портом;
мешок отходов, соединенный по текучему веществу с перфузионным портом биореакторного мешка; и
подачу клеточных сред в биореакторный мешок через питающий порт;
подачу клеток в биореакторный мешок через питающий порт;
культивирование клеток в биореакторном мешке с использованием возбуждения, обеспечиваемого биореакторной качалкой;
перенос фильтрата отходов через перфузионный порт в мешок отходов; и
сбор культивируемых клеток.
45. Способ по варианту осуществления 44, в котором сборочный узел биореакторного мешка содержит компоновку питающих трубок, соединенную по текучему веществу с питающим портом, где компоновка питающих трубок содержит Y-образный соединитель так, что компоновка питающих трубок имеет первый впуск и второй впуск.
46. Способ по варианту осуществления 45, в котором клеточные среды добавляют посредством приваривания источника клеточных сред к первому впуску.
47. Способ по варианту осуществления 45, в котором клетки добавляют посредством приваривания источника клеток к первому впуску.
48. Способ по варианту осуществления 45, в котором клеточные среды добавляют посредством приваривания источника клеточных сред к первому впуску и клетки добавляют посредством приваривания источника клеток ко второму впуску.
49. Способ по вариантам осуществления 44-48, в котором множество портов дополнительно содержит порт впуска газа и порт выпуска газа.
50. Способ по варианту осуществления 49, который дополнительно включает подачу газа для культивирования клеток в биореакторный мешок через порт впуска газа.
51. Способ по варианту осуществления 50, который дополнительно включает удаление части газа из биореакторного мешка в качестве отработавшего газа через порт выпуска газа.
52. Способ по варианту осуществления 45, в котором культивируемые клетки собирают посредством приваривания мешка для сбора к первому или второму впуску и обращения направления потока в компоновке питающих трубок.
53. Способ по вариантам осуществления 44-52, где множество портов содержит порт впуска газа и способ дополнительно включает надувание биореакторного мешка газом через порт впуска газа.
54. Способ по вариантам осуществления 44-53, который дополнительно включает извлечение образца культивируемых клеток через порт взятия образца.
VI. ПРИМЕРЫ
[213] Следующие примеры приведены лишь в иллюстративных целях и не предназначены для того, чтобы ограничивать объем изобретения.
Пример 1: образцовый процесс создания сконструированных T-клеток для аутологичной клеточной терапии.
[214] В этом примере описан образцовый процесс с использованием сборочного узла биореакторного мешка по любому из предоставленных вариантов осуществления, например, образцовых сборочных узлов биореакторных мешков, проиллюстрированных на фиг. 1-7, чтобы получать сконструированные T-клетки для аутологичной клеточной терапии в соответствии с определенными вариантами осуществления, предусмотренными в настоящем описании.
[215] Композиции, содержащие CD4+ и CD8+ клетки, выделяют из образцов лейкафереза человека посредством обогащения на основе иммуноаффинности и криозамораживают. Впоследствии CD4+ и CD8+ клетки оттаивают и переносят в закрытую систему в стерильных условиях. Клетки культивируют при стимулирующих условиях и затем трансдуцируют вирусным вектором, таким как ретровирусный вектор или лентивирусный вектор, который кодирует рекомбинантный рецептор. Рекомбинантный рецептор может представлять собой химерный антигенный рецептор (CAR), такой как CAR против CD19. После трансдукции, клетки переносят в сборочный узел биореакторного мешка, соединенный с закрытой системой в стерильных условиях для последующего размножения.
2
[216] Сборочный узел биореакторного мешка соединяют с биореактором (например, Xuri W25), который регулирует условия клеточной культуры в закрытой системе. Среды для размножения, содержащие один или несколько цитокинов добавляют клетки. Биореактор способен к культивированию клеток при статичных условиях или при перфузии, в соответствии с чем свежие среды постепенно заменяют использованные среды с постоянной скоростью. По меньшей мере часть размножения клеточной культуры осуществляют при перфузии, например, со скоростью 290 мл/сутки, 580 мл/сутки или 1160 мл/сутки. Биореактор регулирует условия клеточной культуры посредством поддержания температуры на или около 37°C и уровней CO на или около 5% при постоянном потоке воздуха на или около 0,1 л/мин. По меньшей мере часть размножения клеточной культуры осуществляют при качающем движении, например, под углом между 5° и 10°, таком как 6°, при постоянной скорости качания, такой как скорость между 5 и 15 об./мин, такой как 6 об./мин или 10 об./мин. Клетки размножают до тех пор, пока они не достигают порогового количества или плотности клеток. Когда достигают порога, соединения между биореакторным мешком и биореактор закупоривают и мешок переносят для последующего формулирования клеток, например, криозаморозки.
Пример 2: образцовый процесс создания композиций сконструированных CD4+ и CD8+ T-клеток для аутологичной клеточной терапии.
[217] В этом примере описан образцовый процесс с использованием сборочного узла биореакторного мешка по любому из предоставленных вариантов осуществления, например, образцовых сборочных узлов биореакторных мешков, проиллюстрированных на фиг. 1-7, чтобы получать отдельные композиции сконструированных CD4+ и CD8+ T-клеток для аутологичной клеточной терапии в соответствии с определенными вариантами осуществления, предусмотренными в настоящем описании.
[218] Отдельные композиции CD4+ и CD8+ клеток выделяют из образцов лейкафереза человека посредством обогащения на основе иммуноаффинности и криозамораживают. CD4+ и CD8+ клетки композиций впоследствии оттаивают и отдельно переносят в закрытую систему в стерильных условиях. CD4+ и CD8+ клетки культивируют при стимулирующих условиях и затем трансдуцируют вирусным вектором, таким как ретровирусный вектор или лентивирусный вектор, кодирующим рекомбинантный рецептор. Рекомбинантный рецептор может представлять собой химерный антигенный рецептор (CAR), такой как CAR против CD19. После трансдукции, CD4+ и CD8+ клетки отдельно переносят в сборочные узлы биореакторных мешков, соединенные с закрытой системой в стерильных условиях для последующего размножения.
2
[219] Сборочные узлы биореакторных мешков соединяют с биореактором (например, Xuri W25), который регулирует условия клеточной культуры в закрытой системе. Среды для размножения, содержащие один или несколько цитокинов, добавляют в CD4+ и CD8+ клетки. Среды для размножения, добавляемые к CD4+ клеткам и CD8+ клеткам, могут представлять собой одно и то же или различное. По меньшей мере часть размножения клеточной культуры осуществляют при перфузии, например, со скоростью 290 мл/сутки, 580 мл/сутки или 1160 мл/сутки. Биореактор регулирует условия клеточной культуры посредством поддержания температуры на или около 37°C и уровней CO на или около 5% при постоянном потоке воздуха на или около 0,1 л/мин. По меньшей мере часть размножения клеточной культуры осуществляют при качающем движении, например, под углом между 5° и 10°, таком как 6°, при постоянной скорости качания, такой как скорость между 5 и 15 об./мин, такой как 6 об./мин или 10 об./мин. CD4+ и CD8+ клетки размножают отдельно до тех пор, пока они не достигнут порогового количества или плотности клеток. Когда достигают порога, соединения между биореакторным мешком и биореактором закупоривают и мешок переносят для последующего формулирования клеток, например, криозаморозки.
[220] Вышеприведенное описание представлено для того, чтобы позволять специалисту в данной области выполнять и использовать раскрытие, и предоставлено в контексте конкретного применения и его требований. Различные модификации предпочтительных вариантов осуществления будут без труда видны специалистам в данной области, и общие принципы, которые определены в настоящем описании, можно применять к другим вариантам осуществления и применениям, не отступая от сущности и объема раскрытия. Таким образом, не предусмотрено, что это раскрытие ограничено приведенными вариантами осуществления, но его следует толковать в самом широком объеме в соответствии с принципами и признаками, раскрытыми в настоящем описании.