СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ОБРАЗЦОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ К ГИСТОЛОГИЧЕСКИМ ИССЛЕДОВАНИЯМ
METHOD FOR PREPARING BIOLOGICAL TISSUE SAMPLES FOR HISTOPATHOLOGICAL EXAMINATIONS

Предлагаемое изобретение относится к получению и подготовке образцов для исследования в медицине и может быть использовано при гистологических исследованиях биологических образцов тканей, взятых у человека или животных при хирургических вмешательствах или при аутопсии.
Подготовка тканей к гистологическим исследованиям, как правило, включает пропитывание образца парафином, необходимое для получения срезов, с толщиной, пригодной для исследования в световом микроскопе при проходящем свете. Парафиновый срез размещают на предметном стекле, окрашивают и исследуют под микроскопом. Пропитывание биологических тканей парафином требует предварительного обезвоживания, так как содержащие воду ткани не пропитываются парафином. Поэтому перед пропитыванием парафином образцы необходимо:
1) сохранить в состоянии максимально приближенном к жизни и для этого остановить процессы аутолиза - зафиксировать;
2) удалить несвязанную воду из тканей - обезводить;
3) подготовить ткань к пропитыванию парафином - просветлить.
За аналог заявляемого изобретения приняты технические решения того же назначения, что и заявляемый способ. Известен способ обработки гистологических и биологических образцов путем последовательных погружений образцов в водный раствор фиксирующего вещества, обезвоживания в 6 сменах обезвоживающей жидкости, последние три из которых практически не содержат воды (Р. Лилли. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. - М.: Мир, 1969, с.69). В качестве фиксирующего вещества в известном способе используют 4%-ный водный раствор формальдегида, а в качестве обезвоживающих жидкостей этиловый или изопропиловый спирты, или их смеси. Образцы последовательно выдерживают в трех порциях обезвоживающей жидкости, содержащей воду: 70% этилового спирта в течение 16 часов, 85% этилового спирта в течение 8 часов, 95% этилового спирта в течение 16 часов, а затем в-безводных жидкостей: 100% этилового спирта в течение 2 часов. Смесь 100% этилового спирта и растворителя парафина (бензола) в соотношении 1:1 в течение 1 часа является промежуточной смесью, в которой одновременно завершается обезвоживание и начинается просветление. Далее обработка проводится в двух порциях бензола по 30 минут. А затем осуществляют (пропитывание парафином в нескольких сменах парафина). В качестве растворителя парафина кроме бензола можно использовать толуол, ксилол, петролейный эфир, сероуглерод, хлороформ и четыреххлористый углерод. Кроме очень большой длительности обезвоживания недостатком этого способа является то, что все используемые в нем растворители парафина - вредные вещества, и их вредность имеет кумулятивный характер.
Известен способ обработки операционно-биопсийного и секционного материала для микроскопического исследования по патенту РФ на изобретение №2264608 (МПК G01N 1/28, G01N 1/30, заявлено 26.01.2004 г., опубликовано 20.11.2005 г.), в соответствии с которым проводку по растворам тканей производят на аппарате АТ-4 (автомат универсальный для гистологической обработки и окраски тканей). Фиксацию проводят 20% формалином при температуре 36°С в течение 2 часов, промывают проточной водой 4 часа, затем обезвоживают в пяти емкостях со спиртом концентрации 96% (в первой емкости 5 часов, во второй, третьей и четвертой емкостях по 3 часа, в пятой - 5 часов). Дубят в промежуточной смеси - спиртово-ксилоловом растворе 1 час и в ксилоле 1 час, затем заливают парафином при температуре 36°С на 1 час и при температуре 56°С также на 1 час. Недостатком этого способа также является неадекватная фиксация формалином: в подобной концентрации наступает избыточное образование перекрестных связей между молекулами белков тканей в поверхностной зоне образца, что препятствует равномерной фиксации образца, большая длительность обезвоживания, а также высокая токсичность ксилола, создающая экологическую опасность окружающей среды. Ксилол является нейро- и гепатоксичным ядом, вызывает патологию сердца и почек, лейкемию, оказывает токсическое воздействие на костный мозг и другие вредные воздействия на жизнедеятельность человека [Buesa RJ, Peshkov MV. Histology without xylene. Annals of diagnostic pathology, 2009. Vol.12(4), p.246-256].
Известен способ подготовки биологических образцов к гистологическим исследованиям, включающий обезвоживание образца в изопропиловом спирте и последующее парафинирование (заявка на изобретение РФ №94036621, заявлено 26.09.1994 г., опубликовано 10.07.1996 г.). Образцы тканей фиксируют в 4% растворе формальдегида в фосфатном буфере в течение 24 часов, отмывают проточной водой в течение 30 минут. Для обезвоживания образцы тканей последовательно выдерживают в 4-х сменах 99% изопропилового спирта по 3 часа в каждой смене. Для сохранения тканевых и клеточных структур образцов в изопропиловый спирт вводят поверхностно-активное вещество (ПАВ) в количестве 0,01-0,5 массовых частей. Обезвоженные образцы пропитывают парафином выдержкой в двух сменах расплавленного парафина по 2 часа. Недостатком этого способа является трудное удаление из тканей изопропанола при пропитывании горячим парафином. Высокий градиент параметров растворимости (9 МПа) подтверждает это. Но дегидратанты должны быть полностью удалены из парафина, что достигается увеличением температуры при низком давлении перед пропитыванием парафином
Наиболее близким аналогом того же назначения, что и заявляемое изобретение, является техническое решение - способ подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям, включающий последовательную обработку образцов биологической ткани раствором фиксатора, промывку в воде, дегидратацию в нескольких порциях изопропанола, просветление в двух порциях промежуточных смесей, содержащих изопропанол и минеральное масло, просветление в минеральном масле, пропитывание и заливку образцов парафином [Buesa RJ, Peshkov MV. Histology without xylene. Annals of diagnostic pathology, 2009. Vol.12(4), p.246-256]. В известном способе дегидратацию осуществляют путем последовательного погружения образцов в четыре емкости с изопропанолом (на 1 час в каждую), и в две емкости с подогретыми до 50°С промежуточными смесями, содержащими изопропанол и минеральное масло (на 1,5 часа в каждую), причем промежуточная смесь в первой емкости имеет соотношение ингредиентов 5:1, а во второй - 2:1. Затем образцы выдерживают в просветлителе - минеральном масле в течение не менее 2 часов, после чего осуществляют пропитывание парафином при температуре 60°С в четырех емкостях по 1 часу в каждой.
К недостаткам известных технических решений, как аналога, так и прототипа, относится то, что при их реализации не исключены повторные окрашивания образцов биологических тканей, что увеличивает трудозатраты и время получения качественных срезов для гистологических исследований, и/или все они используют экологически вредные ксилол или спиртово-ксилоловые растворы.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является экономия трудозатрат и времени получения качественных срезов для гистологических исследований при любом уровне оснащения лабораторий: при ручной проводке, автоматической, в гистопроцессорах любого типа. Кроме того, задачей изобретения является улучшение экологических условий в гистологических лабораториях и во внешней среде.
Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, заключается в исключении последующей повторной окраске препаратов клеток и использовании безопасных для персонала и окружающей среды реактивов, исключая пагубное действие ксилола и других вредных веществ при последовательной проводке образцов биологических тканей.
Сущность способа подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям, включающего последовательную обработку образцов биологической ткани раствором фиксатора, промывку в воде, дегидратацию в нескольких порциях изопропанола, просветление в двух порциях промежуточных смесей, содержащих изопропанол и минеральное масло, просветление в минеральном масле, пропитывание и заливку образцов парафином, состоит в том, что в качестве фиксатора используют 10% раствор формалина, забуференного фосфатами натрия, обработку в промежуточных смесях ведут при комнатной температуре при этом первая порция промежуточной смеси содержит пять частей изопропанола и одну часть минерального масла, а вторая порция содержит две части изопропанола и одну часть минерального масла, образцы биологических тканей пропитывают расплавленным парафином, в который добавляют 5% пчелиного воска, 0.8% диметилсульфоксида и 0,5% бутилкаучука.
Решению поставленной задачи способствует признаки, характеризующие изобретение в частных случаях ее выполнения или использования.
В фиксатор для эндоскопических образцов добавляют парфюмерную метку и цветовую метку, в качестве которой использован эозин.
В фиксатор для хирургических образцов добавляют парфюмерную метку и цветовую метку, в качестве которой использован метиленовый синий.
В изопропанол и промежуточные смеси добавляют поверхностно-активное вещество, в качестве которого использован Triton X 15.
Образцы биологических тканей выдерживают в минеральном масле в качестве просветлителя по меньшей мере 2 часа.
Пропитывание парафином осуществляют при температуре 60°С в течение 4 часов, при этом в двух емкостях по 2 часа или в 4 емкостях по 1 часу.
Из уровня техники неизвестно техническое решение с заявляемой совокупностью существенных признаков независимых пунктов формулы изобретения, что подтверждает ее соответствие условию патентоспособности - новизна.
Существенные отличительные признаки независимого пункта формулы заявляемого изобретения для специалиста явным образом не следуют из уровня техники, что подтверждает соответствие изобретения условию патентоспособности - изобретательский уровень.
2
4
2
4
2
Способ подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям может быть осуществлен с реализацией указанного назначения следующим образом. Для подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям полученный материал фиксируют в забуференном нейтральном 10% растворе формалина (рН 7,0) в течение 24 часа при комнатной температуре или 18 часов при подогреве до 37°С. Соотношение объемов фиксатора и ткани не менее 20:1. Для забуферивания формалина используют одно- и двузамещенный фосфаты натрия в количествах, обеспечивающих рН конечного раствора на уровне 6.8-7.4. Полный рецепт нейтрального забуференного формалина: 6.5 г NaHPO б/в и 4 г NaHPO×НО, 900 мл дистиллированной воды, 100 мл 37% формалина). К формалину добавляют цветовую метку: для эндоскопических образцов - эозин, для хирургических образцов - метиленовый синий, а также парфюмерную метку. В фиксатор для эндоскопических образцов биологических тканей добавляют парфюмерную метку и цветовую метку, в качестве которой использован эозин. В фиксатор для хирургических образцов биологических тканей добавляют парфюмерную метку и цветовую метку, в качестве которой использован метиленовый синий.
После фиксации в формалине образцов биологических тканей промывают в проточной воде 15-20 минут для удаления избытка фиксатора, поскольку осадки фосфатов, образующиеся при действии спирта, загрязняют трубопроводы, стенки рабочей камеры и поворотного клапана гистопрцессора, а также осложняют работу на микротоме при получении срезов.
Далее проводят дегидратацию образцов биологических тканей, путем последовательного их погружения образцов в обезвоживающие жидкости, первая порция содержит не более 30% воды, а затем в обезвоживающие жидкости, не содержащие воды. В качестве обезвоживающей жидкости используют изопропанол, являющийся мягким дегидратантом, не уплотняющим и не дубящим ткани. Для облегчения пропитывания тканей в него добавляют поверхностно-активное вещество, в качестве которого использован Triton X15.
Для последующего просветления образцов биологических тканей в промежуточных смесях, в качестве которых используют смеси изопропанола и минерального масла в определенных соотношениях. Промежуточная смесь I содержит 5 частей изопропанола и 1 часть минерального масла, а промежуточная смесь II содержит 2 части изопропанола и 1 часть минерального масла. Промежуточные смеси стабильны, однородны и прозрачны при комнатной температуре и используются без нагревания при комнатной температуре благодаря наличию в их составе поверхностно-активного вещества марки Triton X 15, в них может быть добавлена парфюмерная метка. После обработки в промежуточных смесях образцы биологических тканей для просветления погружают в минеральное масло. Минеральное масло - это смесь насыщенных углеводородов, жидкая при комнатной температуре. Время воздействия минерального масла не менее 2 часов. Также образцы биологических тканей без любых неблагоприятных воздействий можно оставить в минеральном масле на любой необходимый срок: на несколько дней или до нескольких месяцев.
После этого образцы биологических тканей пропитывают расплавленным парафином с точкой плавления 52°-56°C с добавкой 5% пчелиного воска, 0.8% димтелисульфоксида, облегчающего пропитывание образцов биологических тканей, и 0,5% бутилкаучука, обеспечивающего большую их пластичность. Пропитывание парафином осуществляют при температуре 60°С в течение 4 часов, при этом в двух емкостях по 2 часа или в 4 емкостях по 1 часу.
Длительность проводки образцов биологических тканей по растворам определяется видом образцов и их размерами. Образцы, имеющие размеры 0.1×0.1×0.1 см проводятся по расписанию для эндоскопических образцов, а большие - по расписанию для обычных хирургических образцов.
Для хирургических образцов фиксацию осуществляют вышеописанным способом. Дегидратацию осуществляют последовательным погружением в пять емкостей с изопропанолом с выдержкой в каждой по 1 часу. Для просветления их последовательно погружают в две емкости с промежуточными смесями в каждую на 1,5 часа, а затем - в минеральное масло не менее 1,5 часов. Пропитывание парафином осуществляют при температуре 60°С в течение 4 часов (в двух емкостях по 2 часа или в 4 емкостях по 1 часу). Общее время проводки без учета фиксации 13,5 часов.
Фиксацию эндоскопических образцов размерами до 0.1×0.1×0.1 см осуществляют также как и хирургических образцов. Дегидратацию осуществляют последовательным погружением в две смены раствора изопропанола с выдержкой в каждом в течение 15 минут. Для просветления их последовательно погружают в две емкости с промежуточными смесями, в каждую на 30 минут, а затем в минеральное масло на 30 минут. Пропитывание парафином осуществляют при температуре 60°С в двух порциях по 15 минут. Общее время проводки без учета фиксации 2 часа 30 минут.
Оба расписания пригодны для использования как при ручной проводке, так и для использования в процессорах карусельного и вакуумного типа.
Способ иллюстрируется примерами.
Пример 1.
Ручная проводка образца ткани молочной железы, размером 1,5×1,5×0.3 см.
1. 10% формалин, забуференный фосфатами, 24 часа, комнатная температура, 24 часа. Соотношение фиксатор: ткань не менее 20:1.
2. Промывка в проточной воде 20-30 минут.
3. 70% изопропанол 1 час.
4. 80% изопропанол 1 час.
5. 95% изопропанол 1 час.
6. 99.7% изопропанол 1 час.
7. 99.7% изопропанол 1 час.
8. Промежуточная смесь I, 1.5 часа.
9. Промежуточная смесь II, 1.5 часа.
10. Минеральное масло 1.5 часа.
11. Парафин, 60°С, 1 час.
12. Парафин, 60°С, 1 час.
13. Парафин, 60°С, 1 час.
14. Парафин, 60°С, 1 час.
Заливка в парафин.
Пример 2.
Ручная проводка образца ткани желудка, размером 0,1×0,1×0,1 см.
1. 10% формалин, забуференный фосфатами, 24 часа, комнатная температура, 24 часа. Соотношение фиксатор: ткань не менее 20:1.
2. Промывка в проточной воде 5 минут.
3. 70% изопропанол 15 минут.
4. 99.7% изопропанол 15 минут.
5. Промежуточная смесь I, 30 минут.
6. Промежуточная смесь II, 30 минут.
7. Минеральное масло 30 минут.
8. Парафин, 60°С, 30 минут.
9. Парафин, 60°С, 30 минут.
Заливка в парафин.
Описанные средства и методы, с помощью которых возможно осуществление способа подготовки образцов биологических тканей к гистологическим исследованиям, с реализацией указанного назначения, подтверждает соответствие заявленного изобретения условию патентоспособности - промышленная применимость.