Клинические исследования для лечения наследственных заболеваний методами геномного редактирования

DOI: 10.23868/202004023

клинические исследования для лечения наследственных заболеваний методами геномного редактирования

Я.С. Слесаренко, А.В. Лавров, С.А. Смирнихина

Медико-генетический научный центр им. академика Н.П. Бочкова, Москва, Поступив24092019

Россия Принята к печати: 10.06.2020

Россия Опубликована on-line: 24.06.2020

CLINICAL TRIALs FOR THE TREATMENT OF HEREDITARY DIsEAsEs

by genome editing

Y.S. Slesarenko, A.V. Lavrov, S.A. Smirnikhina

N.P. Bochkov Research Centre for Medical Genetics, Moscow, Russia

e-mail: Yaslesarenkobio@gmail.com

Новые высокоэффективные и простые в использовании инструменты редактирования генома открывают возможность лечения различных заболеваний, в том числе наследственных, онкологических и инфекционных. В обзоре представлена информация о клинических исследованиях, направленных на разработку методов лечения моногенных заболеваний с применением таких систем редактирования генома как ZFN, TALEN, а также CRISPR/Cas9. Клинические исследования проводят для шести наследственных заболеваний: мукополисахаридоз I и II типов, серповидно-клеточная анемия, ß-талассемия, гемофилия В и врожденный амавроз Лебера 10. Данные о безопасности и эффективности геномного редактирования пока ограничены и отдаленные последствия такого вмешательства еще предстоит изучить.

Ключевые слова: CRISPR/Cas9, TALEN, ZFN, геномное редактирование, клинические исследования, наследственные заболевания.

New effective and easy-to-use genome editing tools open up the possibility of treating various diseases, including hereditary, oncological and infectious. The review provides information about clinical trials of developing therapies for monogenic diseases using genome editing systems such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9). Clinical trials are carried out for six hereditary diseases: mucopolysaccharidosis types I and II, sickle cell anemia, p-thalassemia, hemophilia B, and Leber congenital amaurosis 10. Knowledge about safety and efficacy of genome editing are still limited and the long-term effects of such intervention have to be studied.

Keywords: CRISPR/Cas9, TALEN, ZFN, genome editing, clinical trials

Введение

Технологии редактирования генома позволяют по-новому взглянуть на генную терапию наследственных, приобретенных и инфекционных заболеваний человека. Направленное воздействие на определенный локус или ген существенно повышает точность и специфичность метода, при этом,в отличие отклассических подходов генной терапии, для достижения терапевтического эффекта достаточно однократной манипуляции с геномом.

В основе геномного редактирования лежит использование программируемых нуклеаз, которые могут прицельно разрезать ДНК, определяя необходимый локус либо с помощью специфичных ДНК-связывающих аминокислотных остатков, либо — коротких РНК. Образующийся в результате нуклеазной активности разрыв ДНК может репарироваться одним из следующих основных способов: 1) негомологичным соединением концов (доминирующий тип репарации в клетке); 2) направленной гомологичной репарацией, которая требует присутствия матрицы ДНК для восстановления последовательности (возможен только в Э2/М фазу клеточного цикла); 3) микрогомологичным соединением концов, характеризующимся использованием коротких гомологичных последовательностей. Однако только с помощью направленной гомологичной репарации можно исправить мутацию, то есть встроить правильную последовательность ДНК вместо мутации [1].

В настоящее время наиболее распространёнными методами геномного редактирования являются нукле-азы цинковых пальцев (7Р№), эффекторные нукле-азы, подобные активаторам транскрипции (ТА1_Е№), и система CRISPR/Cas9 (группа регулярно перемежающихся коротких палиндромных повторов и CRISPR-ассоциированный белок 9).

ZFNs

Нуклеазы цинковых пальцев 7Р№ представляют собой комплекс из нуклеазы Рок! и ДНК-связывающих доменов. Для редактирования необходимо два комплекса на разные цепи ДНК, состоящих из одного домена Рок! и последовательности из нескольких ДНК-связывающих доменов. Когда обе последовательности ДНК-связывающих доменов взаимодействуют с ДНК (каждый домен узнает определённый триплет), Рок! собирается из двух доменов в гомодимер и вносит двухцепочечный разрыв в ДНК (рис. 1). За счет распознавания уникальных последовательностей на разных цепях ДНК, расположенных на определенном расстоянии друг от друга, специфичность системы довольно высока. Несмотря на трудоёмкость создания системы она является самой эффективной и специфичной [2, 3].

Рис. 1. Редактирование генома с использованием ZFNs

ТА1Е№

Эффекторные нуклеазы, подобные активаторам транскрипции (ТА_Е№), имеют структуру, сходную с 7Р№. Задачу разрезания ДНК для обоих методов — 7Р№ и ТА_Е№ — выполняет нуклеаза Рок!, основное различие состоит в ДНК-связывающих доменах (рис. 2). Особенностью ТА_Е№ является то, что каждый домен

распознает не триплеты, а определенные нуклеотиды в двухцепочечной молекуле ДНК [4, 5]. Эта особенность и обусловливает еще большую трудоемкость при создании системы ТА_Е№, по сравнению с ZFN, кроме того, большой размер ТА_Е№ не позволяет применять рутинные способы доставки в клетки.

Рис. 2. Редактирование генома с использованием TALENs

CRIspR/Cas9

Система CRISPR/Cas9 включает в себя два элемента: CRISPR-ассоциированную нуклеазу (Cas), например, Cas9, и направляющую РНК (sgRNA) (рис. 3). Распознавание таргетного локуса происходит с помощью sgRNA, состоящей из 20-25 нуклеотидов, комплементарных таргетной ДНК. Направляющая РНК соединяется с нуклеазой и этот комплекс связывается с ДНК. При этом необходимо, чтобы в ДНК непосредственно рядом с местом взаимодействия с sgRNA находилась так называемая PAM последовательность — определенная последовательность нуклеотидов, с которой связывается нуклеаза. Для каждого типа нуклеаз есть своя PAM, например, для SpCas9 — NGG. Разрыв ДНК происходит обычно за три нуклеотида от PAM последовательности.

Считают, что CRISPR/Cas9 по сравнению с другими системами редактирования генома обладает повышенной нецелевой, так называемой «off-target» активностью, которая выражается в нуклеазной активности вне выбранного локуса. Тем не менее, простота конструирования системы CRISPR/Cas9 и возможность множественного введения модификаций в геном являются основой ее широкого применения [6-10].

Рис. 3. Редактирование генома с использованием системы СИБРР/СазЭ

Современный статус клинических исследований

В настоящее время разработка методов лечения, в основе которых лежит использование технологии редактирования генома, направлена, в основном, на терапию онкологических и инфекционных заболеваний.

Основываясь на базе данных клинических исследований ClinicalTrials.gov (www.clinicaltrials.gov), по состоянию на апрель 2020 г. в мире зарегистрировано 44 протокола. Для поиска протоколов были использованы запросы по методам геномного редактирования: CRISPR, ZFN и TALEN (табл.). Большинство из этих исследований проводится в США. На сентябрь 2019 г. 6 исследований завершены, из них 5 направлены на лечение ВИЧ, 1 — на лечение рака пищевода. Из 12 исследований при наследственных заболеваниях 11 активны, 1 отложено.

Среди 44 клинических исследований отменены были только шесть. Все они были направлены на разработку лечения онкологических заболеваний с помощью CRISPR/Cas9 (NCT03538613, NCT02863913, NCT02867345, NCT02867332, NCT03681951) или TALENs (NCT04106076). Причиной отмены почти всех этих исследований, по данным ClinicalTrials.gov, было недостаточное финансирование, одно исследование (NCT03681951) было прекращено инициаторами после внутреннего обзора текущего портфеля исследований и разработок компании.

В данном обзоре мы рассмотрим только исследования, связанные с разработкой лечения наследственных заболеваний методами геномного редактирования. Исследования, направленные на создание модели Синдрома Кабуки (NCT03855631) и изучение патогенеза нейрофиброматоза 1 типа (NCTO3332030) с помощью CRISPR/Cas9, анализ профилей аце-тилирования гистонов при синдроме Рубинштейна-Тейби (NCT04122742), а также интервью пациентов и их семей относительно применимости CRISPR/Cas9 (NCT03167450) не будут освещены.

Сегодня клинические исследования проводят для 6 наследственных заболеваний: мукополисахаридозов I и II типов, серповидно-клеточной анемии, ß-талассемии, гемофилии В и врожденного амавроза Лебера 10. Следует отметить, что для разработки методов лечения наследственных заболеваний не проводится ни одного клинического исследования c использованием TALENs, что, по всей видимости, связано с трудоемкостью данного метода. Мукополисахаридозы пока являются единственным примером успешного клинического исследования геномного редактирования для лечения полиорганной наследственной патологии. Большая часть клинических исследований нацелены на терапию наследственных заболеваний крови, таких как гемоглобинопатии (ß-талассемия, серповидно-клеточная анемия) и коагулопатии (гемофилия В), что объясняется хорошей биодоступностью стволовых клеток крови для их редактирования, в том числе возможностью редактирования ex vivo с последующей обратной трансплантацией.

Мукополисахаридозы

Мукополисахаридозы (МПС) — группа метаболических заболеваний соединительной ткани, которые связаны с недостаточностью лизосомных ферментов обмена гликозаминогликанов, в результате чего происходит нарушение обмена кислых гликозаминогликанов (мукополисахаридов). Заболевания проявляются в виде лизосомной болезни накопления, наблюдаются различные дефекты костной, хрящевой и соединительной тканей. Существует несколько форм мукополисахаридозов, различающихся по степени выраженности клинических признаков, а также по распространённости. Общая распространённость МПС составляет 1:20000 новорождённых, встречаемость для каждой отдельной формы варьирует от 1-9:170000 до 1-9:100000 по разным

таблица. Количество зарегистрированных клинических исследований с использованием методов геномного редактирования

Количество исследований

Состояние ZFN TALEN CRISPR/Cas9

Фаза I Фаза I/II не указано Фаза I Фаза I/II не указано Фаза I Фаза I/II не указано

Онкологические 00 1 60 095 2

заболевания

Инфекционные 52 000 000 2

заболевания

Наследственные 1 4 0 0 0 0 1 3 3

заболевания

Всего 13 6 25

данным [11-13]. На сегодняшний день единственный патогенетический метод лечения — ферментозамести-тельная терапия, получаемая пациентами пожизненно, а также симптоматическая терапия для повышения качества жизни. Несмотря на имеющееся лечение, у пациентов прогрессируют нарушения работы сердца, опорно-двигательного аппарата и легких, причем многие пациенты умирают от обструкции дыхательных путей, инфекции верхних дыхательных путей или сердечной недостаточности до достижения 20-летнего возраста. Одним из вариантов лечения является генная терапия, которая может обеспечить непрерывный синтез дефицитных ферментов [14-17].

На симпозиуме в Орландо в феврале 2019 г. были представлены промежуточные результаты по оценке эффективности использования препаратов SB-318 (NCT02702115, фаза I/II) и SB-913 (NCT03041324, фаза I/II) для лечения мукополисахаридозов I и II типов (МПС I и МПС II), соответственно [18, 19]. Препараты SB-318 и SB-913 разрабатываются компанией Sangamo Therapeutics (США) и представляют собой терапевтические средства ZFN-опосредованного редактирования генома, которые доставляют внутривенно векторами на основе аденоассоциированных вирусов серотипа 2/6 и направлены на восстановление функции генов, кодирующих ферменты a-L-идуронидазу (IDUA) для МПС I и идуронат-2-сульфатазу (IDS) для МПС II [12, 15, 20]. По данным исследователей препарат SB-318, достигнув печени, обеспечивает постоянный синтез идуронидазы в диапазоне от 6,0 до 71,4 нмоль/ч./мл, отсутствие активности которой приводит к накоплению гликозами-ногликанов в различных органах и тканях. Нормальную копию гена IDUA интегрируют в локус альбумина в гепатоцитах. Аналогично работает препарат SB-913. Пациенты получают препарат в дозировке 5х1012 вг/ кг, 1х1013 вг/кг и 5х1013 вг/кг. Препарат SB-913 интегрирует правильную копию гена IDS в тот же локус и восстанавливает синтез идунорат-2-сульфатазы в течение всей жизни у пациентов с МПС II на уровне 14 нмоль/ч./ мл [20]. Анализ данных о безопасности показывает, что пациенты, в целом, хорошо переносят введение как SB-318, так и SB-913 без серьёзных побочных эффектов. Легкие и умеренные побочные эффекты соответствуют стандартному течению МПС, и ни один из них не был вызван использованием препаратов. О серьезных побочных эффектах, связанных с лечением, неизвестно, что позволяет надеяться на возможность скорого терапевтического применения этих препаратов. При этом, важно учитывать, что большинство нарушений работы опорно-двигательного аппарата, сердца, нервной системы и органов зрения, вызванных накоплением

гликозаминогликанов, необратимы, поэтому наилучшего эффекта необходимо максимально раннее назначение препаратов, т. к. они не могут исправить уже произошед-ние, описанные выше изменения в организме [18, 19].

Наследственные заболевания крови

Гзмоглобинопатии. Наследственные формы гемогло-бинопатий вызваны изменением структуры белка гемоглобина и нарушением его способности связывать кислород. В настоящее время не существует эффективных препаратов для лечения такой патологии. Пациентам с гемоглоби-нопатиями необходимо регулярное переливание эритро-цитарной массы для поддержания средней концентрации гемоглобина на уровне примерно 9,0-10,5 г/дЛ. Однако в результате множественных переливаний крови происходит перегрузка органов железом, во избежание которой необходимо дополнительно вводить хелатные препараты для связывания железа [21-23].

Генно-клеточная терапия гемоглобинопатий основана на редактировании генов собственных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) пациента. ГСК (С034+-клетки) пациента выделяют из крови и затем подвергают ex vivo редактированию, после чего осуществляют их аутогенную трансплантацию. Основная задача такой терапии — возобновление синтеза фетального гемоглобина, который может частично заменить гемоглобин взрослого [20].

Уже имеются данные об успешном клиническом использовании препарата ST-400 (Sangamo Therapeutics, США) для лечения трансфузионно-зависи-мой р-талассемии (NCT03432364, фаза I/II). Препарат содержит ГСК пациента с нокаутированным при помощи ZFNs геном BCL11A, являющимся ключевым регулятором уровня гемоглобина плода. В норме ген BCL11A ингибирует экспрессию фетального гемоглобина [24], поэтому нокаут этого гена приводит к синтезу последнего. У пациента с наиболее тяжелой формой трансфузионно-зависимой р-талассемии после получения препарата ST-400 наблюдали следующие изменения: восстановление числа нейтрофилов и тромбоцитов в течение первых нескольких недель, обнаружение небольших вставок или делеций в гене BCL11A в циркулирующих лейкоцитах, что свидетельствует о его успешном редактировании, повышение и стабилизация уровня гемоглобина до 9 г/ дЛ через 7 недель после инфузии препарата (в то время как до использования ST-400 уровень гемоглобина был в пределах 5 г/дЛ) [23-25].

Кроме того, компания Bioverativ Inc. (США) проводит открытое многоцентровое исследование фазы I/II для взрослых с серповидно-клеточной анемией с использованием системы редактирования ZFN (NCT03653247),

чтобы оценить безопасность, переносимость и эффективность препарата BIVV003, содержащего аутогенные ГСК с нокаутированным геном BCL11A. На момент написания статьи открыт набор пациентов для участия в проводимом клиническом исследовании [25].

Несмотря на эффективность системы редактирования ZFNs, система CRISPR/Cas9 является более простой и универсальной с генно-инженерной точки зрения, и её всё чаще выбирают для геномного редактирования. Моделирование заболеваний на животных, а также эксперименты in vitro на клеточных линиях позволили опробовать CRISPR/Cas9 для коррекции генов при миодистрофии Дюшенна, муковисцидозе, катаракте и пигментном ретините, серповидно-клеточной анемии и р-талассемии. По данным ClinicalTrials.gov на момент подготовки обзора проводится несколько клинических исследований с применением технологии CRISPR/ Cas9 при наследственных гемоглобинопатиях. В частности, исследования фазы I/II для лечения пациентов с трансфузионно-зависимой р-талассемией и ранней фазы I — для лечения пациентов с тяжелой формой серповидно-клеточной анемии [25-27].

Компания CRISPR Therapeutics совместно с компанией Vertex Pharmaceuticals (США) разрабатывает метод лечения одновременно двух гемоглобинопа-тий — серповидно-клеточной анемии (NCT03745287) и р-талассемии (NCT03655678) — с использованием препарата CTX001 (фаза I/II). В состав препарата CTX001 входят CD34+-клетки из периферической крови пациента, модифицированные с использованием технологии CRISPR/Cas9, позволяющей разрушить специфичный для эритроидной линии энхансер гена BCL11A с целью реактивации транскрипции и синтеза у-глобина, что в свою очередь приводит к повышению уровня фетального гемоглобина (HbF). Сортированные модифицированные клетки, входящие в состав препарата CTX001, трансплантируют пациенту и затем наблюдают для выявления возможных побочных эффектов. В доклинических исследованиях препарата CTX001 удалось эффективно отредактировать целевой ген более чем в 90% ГСК и достичь примерно 40% выработки феталь-ного гемоглобина, что, по мнению исследователей, является достаточным для улучшения состояния пациентов. Исследование проводится в медицинских центрах США, Канады и Европы. В феврале 2019 г. было опубликовано сообщение об одном пациенте с р-талассемией, который на данный момент проходит лечение. О негативных эффектах не сообщалось [26-29].

Китайская компания Allife Medical Science and Technology Co., Ltd. начала клиническое исследование ранней фазы I препарата, направленного на редактирование гена НВВ у пациентов с р-талассемией (NCT03728322). Редактирование осуществляется с использованием CRISPR/Cas9 в индуцированных ГСК больных, то есть репрограммированных клетках крови, способных к самовоспроизведению и диф-ференцировке во все клеточные компоненты крови, с последующей трансплантацией. Набор пациентов ещё не начат и подробности исследования пока также не разглашаются [30].

Коагулопатии. Коагулопатии представляют собой патологическое состояние организма, связанное с нарушением свёртываемости крови.

Выделяют такие формы коагулопатий, как гиперкоагуляция — повышение свертываемости крови в результате ускорения процесса коагуляции ее белков и тромбообразования и гипокоагуляция — значительное понижение свертываемости крови, в результате

замедления процесса коагуляции ее белков и формирования тромба.

Аномалии синтеза прокоагулянтов могут быть детерминированы генетически. Наиболее часто встречаемая форма гипокоагуляции — гемофилия А — наследственное заболевание, в основе которого лежит дефицит плазменного фактора VIII. Существуют также варианты гемофилии: гемофилия В (дефицит или структурная аномалия фактора IX) и гемофилия С (дефицит фактора XI). Возможен наследственно обусловленный дефицит и других факторов (I, II, V, VII, X и др.), однако частота, с которой они встречаются, весьма незначительна [31].

Гиперкоагуляционный синдром описан при дефиците антитромбина III (ATIII), дефиците и аномалии протеинов С и S, мутантном факторе V (Лейденовская мутация), мутации в гене фермента метилентетрагидрофолатре-дуктазы (МТГФР), при гипергомоцистеинемии, мутации в гене протромбина C.G20210A, антифосфолипидном синдроме [32].

Первостепенная задача в лечении нарушений свёртываемости крови — замена недостающего фактора. Лечение может также понадобиться для восстановления после кровотечений. Следует отметить, что, несмотря на все меры по очистке и сохранению стерильности, ни один препарат, производимый из крови, не является полностью безопасным [31, 32].

В декабре 2018 г. компания Sangamo Therapeutics опубликовала данные о лечении пациента с гемофилией В препаратом SB-FIX in vivo с использованием технологии ZFNs (NCT02695160, фаза I). Гемофилия В вызвана недостатком фактора IX (FIX), который является протеа-зой и играет важную роль в процессах свёртывания крови. Терапевтическое средство SB-FIX будут доставлять аде-ноассоциированными вирусными векторами серотипа 2/6. Правильную копию трансгена F9 вставляют в локус альбумина собственных гепатоцитов пациента. Препарат вводят внутривенно. Участники исследования, разделенные на 3 группы, получат низкую, среднюю или высокую дозы препарата SB-FIX. В исследовании, прежде всего, оценят побочные эффекты и изменения уровня фактора свертывания крови IX, контроль за пациентами будет осуществляться в течение 36 месяцев после лечения препаратом SB-FIX. Для дальнейших исследований пациентов отбирают в клиниках США и Великобритании [33].

Другие заболевания

Одним из последних клинических исследований на основе технологии CRISPR/Cas9 было анонсировано редактирование мутаций в гене CEP290 у пациентов с врожденным амаврозом Лебера 10 — наследственным заболеванием сетчатки, которое может приводить к полной потере зрения (NCT03872479) [34]. Исследование проводит компания Editas Medicine, препарат называется EDIT-101.

Компании, разрабатывающие методы лечения наследственных заболеваний

Как видно из проанализированной литературы, пальма первенства в разработке методов лечения на основе геномного редактирования в мире принадлежит коммерческим компаниям. Наибольших успехов в разработке новых генно-терапевтических препаратов добилась американская компания Sangamo Therapeutics (https://www.sangamo.com), которая зарегистрировала четыре клинических исследования (NCT02695160, NCT03432364, NCT02702115, NCT03041324) для

лечения наследственных заболеваний с помощью геномного редактирования. Компания была основана в 1995 г., до 2017 г. называлась Sangamo Biosciences, Inc. Ядром всех разработок является технология ZFN, первый известный метод геномного редактирования.

Компании, разрабатывающие методы лечения с использованием технологии CRISPR/Cas9, появились почти сразу после описания этого метода в 2012 г. Все перечисленные ниже компании расположены на территории США, однако некоторые имеют офисы в других странах. Компания CRISPR Therapeutics (http://www.crisprtx.com) была создана в 2013 г., одним из основателей является Эммануэль Шарпентье (Emmanuelle Charpentier), которая вместе с Дженнифер Дудна (Jennifer Doudna) в 2012 г. впервые предложила использовать адаптивную иммунную систему бактерий для внесения изменений в геном эукари-отической клетки [35]. В том же году появилась компания Editas Medicine (https://www.editasmedicine.com), ее научными основателями стали Фен Чжан (Feng Zhang) и Джордж Черч (George Church), одни из основоположников метода CRISPR/Cas9. Компания Intellia Therapeutics (https:// www.intelliatx.com) была создана в 2014 г., один из основателей — Дж. Дудна. Компания Bioverativ Inc. отделилась от компании Sanofi и стала самостоятельной в 2016 г. В 2017 г. появилась компания Beam Therapeutics Inc., основал которую также Ф. Чжан. Приоритетным направлением деятельности этой компании является использование редакторов оснований — модификаций CRISPR/Cas9, позволяющих редактировать нуклеотиды без внесения двухцепочечных разрывов ДНК.

Таким образом, за последние шесть лет было основано пять компаний, три из которых уже запустили клинические исследования (NCT03745287, NCT03655678, NCT03653247 и NCT03872479) по использованию технологии CRISPR/Cas9 для лечения наследственных заболеваний. Между тем, все эти компании анонсировали разработки в области широкого спектра наследственной патологии: р-талассемии (Beam Therapeutics Inc. и Editas Medicine), серповидно-клеточной анемии (Beam Therapeutics Inc. и Editas Medicine), недостаточности альфа-1 -антитрипсина [36] (Beam Therapeutics Inc., Intellia Therapeutics и Editas Medicine), гликогеноза типа !а (Beam Therapeutics Inc. и CRISPR Therapeutics), миодистрофии Дюшенна (Editas Medicine и CRISPR Therapeutics), муковисцидоза [37] (CRISPR Therapeutics и Editas Medicine), болезни Штаргардта (Beam Therapeutics Inc.), наследственного амилоидоза (Intellia Therapeutics), первичной гипероксалурии типа 1 [38] (Intellia Therapeutics), синдрома Ушера (Editas Medicine) и миотонической дистрофии типа 1 (CRISPR Therapeutics). Практически все эти разработки пока на стадии планирования и доклинических исследований.

позиция регуляторных органов

Американское Управление по контролю за продуктами и лекарствами (Food and Drug Administration, FDA) поддерживает разработки в сфере генной терапии и геномного редактирования. На апрель 2020 г. FDA выдало 5 разрешений на проведение клинических исследований инструментов генной терапии для лечения наследственных заболеваний: 1) Spinraza (Nusinersen) для лечения спинальной мышечной атрофии, 2) Luxturna (voretigene neparvovec-rzyl) для лечения наследственной дистрофии сетчатки, 3) Zolgensma (onasemnogene abeparvovec-xioi) для лечения спинальной мышечной атрофии, 4) Exondys 51 (Eteplirsen) и Vyondis 53 (golodirsen) для лечения мио-дистрофии Дюшенна, 5) Onpattro (Patisiran) для лечения

наследственного амилоидоза. Так как клинические исследования препаратов, основанных на геномном редактировании, пока не закончены, ни один из них еще не одобрен FDA, однако для препарата CTX001 выдано разрешение на ускоренную процедуру одобрения [39]. Кроме того, FDA выдало разрешения на использование практически всех упомянутых ранее препаратов в рамках клинических исследований: SB-318 [40], SB-913 [41], ST-400 [42], BIVV003 [43], SB-FIX [44], EDIT-101 [45].

Европейское агентство лекарственных средств (European Medicines Agency, EMA) заявляет о том, что геномное редактирование, по сравнению с классической генной терапией, может быть потенциально более безопасным методом для модификации генов. Однако из-за небольшого количества результатов клинических исследований, необходимо их продолжать для обнаружения нецелевых эффектов и подтверждения эффективности лечения [46].

Таким образом, регулирующие органы, связанные с разработкой лекарственных препаратов в США и Европе, поддерживают развитие генной терапии и геномного редактирования, отмечая необходимость доклинических и клинических исследований.

патентные споры

При рассмотрении любого клинического использования CRISPR/Cas9 нельзя не упомянуть о спорах, связанных с приоритетом в данной технологии. Технология была впервые описана в 2012 г. учеными Э. Шарпентье и Дж. Дудна из Калифорнийского университета [35]. Однако в это же время работу с этой технологией начал Ф. Чжан из Института Броуда и в 2013 г. опубликовал 6 статей в ведущих научных изданиях, таких как Science [47], Cell и других [48-52]. Это обстоятельство положило начало «патентной войне» в области применения технологии CRISPR/Cas9.

Хронологически заявка на патент от группы Дж. Дудны была подана раньше (май 2012 г.), чем заявка Ф. Чжана (декабрь 2012 г.) [51], однако Ф. Чжан получил патент раньше [53, 54], так как оплатил ускоренную процедуру рассмотрения заявки [55].

Согласно базе Американского ведомства по патентам и товарным знакам (http://patft.uspto.gov/ netahtml/PTO/index.html), на декабрь 2019 г. Дж. Дудна и ее команда имеют 28 патентов на технологию CRISPR/ Cas9. Между тем, согласно пресс-релизу Института Броуда [52], команда Ф. Чжана имеет 29 ключевых патентов на технологию CRISPR/Cas9. Следует отметить, что Институт Броуда поддерживает широкое использование технологии в целях изучения и некоммерческого применения, тогда как приобретать лицензию необходимо только для коммерческих целей. Всего в США на декабрь 2019 г. выдано 2546 патентов на технологию CRISPR/ Cas9 и на рассмотрении находятся 5924 заявки [56].

В определенной степени, споры вокруг приоритета научных групп в области CRISPR/Cas9 приводят к замедлению внедрения этой технологии в клиническую практику. Авторы данного обзора надеются, что в будущем Калифорнийский университет и Институт Броуда смогут договориться, и это ускорит развитие и использование технологии CRISPR/Cas9 для лечения заболеваний человека.

заключение

Проведенный анализ показывает, что разработка методов лечения наследственных заболеваний набирает силу и все больше фармацевтических компаний

включается в эту гонку. С одной стороны, это говорит о быстром прогрессе в области геномного редактирования, а с другой стороны, требует регулирования таких исследований. Данные о безопасности и эффективности геномного редактирования пока очень ограничены, и отдаленные последствия такого вмешательства еще предстоит изучить. В случае успешно проведённых клинических исследований незавершённые «патентные войны» для технологии CRISPR/Cas9 могут осложнить широкое внедрение и развитие новых методов лечения.

ЛИТЕРАТУРА [REFERENCES]:

1. Shim G., Kim D., Park G.T. et al. Therapeutic gene editing: delivery and regulatory perspectives. Acta Pharmacol. Sin. 2017; 38(6): 738-53.

2. Anguela X., Sharma R., Doyon Y. et al. Robust ZFN-mediated genome editing in adult hemophilic mice. Blood 2013; 122: 3283-7.

3. Kim S., Lee M., Kim H. et al. Preassembled zinc-finger arrays for rapid construction of ZFNs. Nat. Methods 2011; 8: 7.

4. Deng D., Yan. C., Pan X. et al. Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors. Science 2012; 335: 720-3.

5. Christian M., Cermak T., Doyle E. et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics 2010; 186: 757-61.

6. Hsu P., Lander E., Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell 2014; 157: 1262-78.

7. Barrangou R., Fremaux C., Deveau H. et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 2007; 315: 1709-12.

8. Schacker M., Seimetz D. From fiction to science: clinical potentials and regulatory considerations of gene editing. Clin. Transl. Med. 2019; 8(1): 27.

9. Зайнитдинова М.И., Смирнихина С.А., Лавров А.В. и др. Генотера-певтические подходы к лечению миодистрофии Дюшенна. Гены и Клетки 2019; 14(4): 6-18. [Zaynitdinova M.I., Smirnikhina S.A., Lavrov A.V. et al. Gene therapy approaches to the duchenne muscular dystrophy theatment. Genes and Сells 2019; 14(4): 6-18].

10. Коваленко В.Р., Хабарова Е.А., Рзаев Д.А. и др. Клеточные модели, геномные технологии и клиническая практика: синтез знаний для исследования механизмов, диагностики и терапии болезни Паркинсона. Гены и Клетки 2017; 12(2): 11-28. [Kovalenko V.R., Khabarova E.A., Rzaev D.A. et al. Cellular models, genomic technologies and clinical practice: A synthesis of knowledge for the study of the mechanisms, diagnostics and treatment of Parkinson's disease Genes and Сells 2017; 12(2): 11-28]

11. Beck M., Arn P., Giugliani R. et al. The natural history of MPS I: global perspectives from the MPS I Registry. Genet. Med. 2014; 16(10): 759-65.

12. Mitrovic S., Gouze H., Gossec L. et al. Mucopolysaccharidoses seen in adults in rheumatology. Joint Bone Spine 2017; 84(6): 663-70.

13. Khan S.A., Peracha H., Ballhausen D. et al. Epidemiology of mucopolysaccharidoses. Mol. Genet. Metab. 2017; 121(3): 227-40.

14. Harmatza P., Heather A. Laub, Heldermonc C. et al. A phase 1/2 clinical trial of SB-318 ZFN-mediated in vivo human genome editing for treatment of MPS I (Hurler syndrome). Molecular Genetics and Metabolism 2019; 68.

15. Muenzera J., Carlos E. Pradab, Burtonc B. et al. A phase 1/2 clinical trial with dose escalation of SB913 ZFN-mediated in vivo human genome editing for treatment of MPS II (Hunter syndrome). Molecular Genetics and Metabolism. 2019; 104.

16. Peck S., Casal M., Malhotra N. et al. Pathogenesis and treatment of spine disease in the mucopolysaccharidoses. Mol. Genet. Metab. 2016; 118(4): 232-43.

17. Cimaz R., La Torre F. Mucopolysaccharidoses. Curr. Rheumatol. Rep. 2014; 16: 389.

18. Fraldi A., Serafini M., Sorrentino N. et al. Gene therapy for mucopolysaccharidoses: in vivo and ex vivo approaches. Ital. J. Pediatr. 2018; 44(2): 130.

19. Fecarotta S., Gasperini S., Parenti G. New treatments for the mucopolysaccharidoses: from pathophysiology to therapy. Ital. J. Pediatr. 2018; 44(2): 124.

20. Cavazzana M., Mavilio F. Gene Therapy for Hemoglobinopathies. Hum. Gene Ther. 2018; 29(10): 1106-13.

21. Kohne E., Kleihauer E. Hemoglobinopathies: a longitudinal study over four decades. Dtsch. Arztebl. Int. 2010; 107(5): 65-71.

22. Kohne E. Hemoglobinopathies: clinical manifestations, diagnosis, and treatment. Dtsch. Arztebl. Int. 2011; 108(31-32): 532-40.

23. Psatha N., Reik A., Phelps S. et al. Disruption of the BCL11A Ery-throid Enhancer Reactivates Fetal Hemoglobin in Erythroid Cells of Patients with p-Thalassemia Major. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2018; 10: 313-26.

24. Sankaran V.G., Menne T.F., Xu J. et al. Human fetal hemoglobin expression is regulated by the developmental stage-specific repressor BCL11A. Science 2008; 322: 1839-42.

25. Holmes M.C., Reik A., Rebar E.J. et al. A Potential Therapy for Beta-Thalassemia (ST-400) and Sickle Cell Disease (BIVV003). Blood 2017; 130: 2066.

26. Vertex Pharmaceuticals Incorporated, CRISPR Therapeutics. A safety and efficacy study evaluating CTX001 in subjects with transfusion-dependent p-thalassemia. National Institutes of Health; 2019.

Благодарности

Работа выполнена за счет средств Российского научного фонда (Соглашение No17-75-20095): разделы «Введение», «Современное состояние клинических исследований», «Заключение». В рамках государственного задания Минобрнауки России: разделы «Мукополисахаридозы», «Наследственные заболевания крови», «Другие заболевания», «Компании, разрабатывающие методы лечения наследственных заболеваний», «Позиция регуляторных органов», «Патентные споры».

27. Vertex Pharmaceuticals Incorporated, CRISPR Therapeutics. A safety and efficacy study evaluating CTX001 in subjects with severe sickle cell disease. National Institutes of Health; 2019.

28. Yin H., Xue W., Chen S. et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nat. Biotechnol. 2014; 32: 551-3.

29. Khan S., Mahmood M.S., Rahman S. al. CRISPR/Cas9: the Jedi against the dark empire of diseases. J. Biomed. Sci. 2018; 25(1): 29.

30. Allife Medical Science and Technology Co., Ltd. iHSCs with the gene correction of HBB intervent subjests with p-thalassemia mutations. National Institutes of Health; 2019.

31. Blennerhassett R., Favaloro E.J., Pasalic L. Coagulation studies: achieving the right mix in a large laboratory network. Pathology 2019; 51(7): 718-22.

32. Воробьев А.И., Васильев С.А., Городецкий В.М. и др. Гипер-коагуляционный синдром: классификация, патогенез, диагностика, терапия. Гематология и трансфузиология 2016; 61(3): 116-22 [Vorobiev A.I., Vasiliev S.A., Gorodetskiy V.M. et al. Hypercoagulation syndrome: classification, pathogenesis, diagnostics, and therapy. Russian journal of hematology and transfusiology 2016; 61(3): 116-22].

33. Sangamo Therapeutics, Inc. Sangamo provides clinical development update including early phase 1/2 beta thalassemia gene-edited cell therapy data. National Institutes of Health; 2019.

34. Allergan plc and Editas Medicine, Inc. Allergan and Editas Medicine Initiate the Brilliance Phase 1/2 Clinical Trial of AGN-151587 (EDIT-101) for the Treatment of LCA10. National Institutes of Health; 2019.

35. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012; 337(6096): 816-21.

36. Editas Medicine. Diverse pipeline across range of diseases, https:// editasmedicine.com/pipeline/.

37. CRISPR Therapeutics. Tackling a range of diseases with different approaches, http://www.crisprtx.com/programs/pipeline.

38. Intellia Therapeutics. R&D pipeline: Looking ahead, https://www. intelliatx.com/pipeline-2/.

39. CRISPR Therapeutics and Vertex Announce FDA Fast Track Designation for CTX001 for the Treatment of Sickle Cell Disease, http://www. globenewswire.com/news-release/2019/01/04/1680551/0/en/ CRISPR-Therapeutics-andVertex-Announce-FDA-Fast-Track-Designation-for-CTX001-for-the-Treatment-of-Sickle-Cell-Disease.html.

40. FDA Clears Sangamo Biosciences' IND Application of SB-318 for Treatment of MPS I, http://www.spjnews.com/2016/02/08/fda-clears-sangamo-biosciences-ind-application-of-sb-318-for-treatment-of-mps-i/.

41. Sangamo BioSciences Announces FDA Clearance of Investigational New Drug Application for ZFN-Mediated Genome Editing Treatment of MPS II, https://www.prnewswire.com/news-releases/ sangamo-biosciences-announces-fda-clearance-of-investigational-new-drug-application-for-zfn-mediated-genome-editing-treatment-of-mps-ii-300286861.html.

42. Sangamo And Bioverativ Announce FDA Acceptance Of IND Application For ST-400, https://www.worldpharmatoday.com/press-releases/san-gamo-and-bioverativ-announce-fda-acceptance-of-ind-application-for-st-400/.

43. Bioverativ and Sangamo Announce FDA Acceptance of IND Application for Gene-Edited Cell Therapy BIVV003 to Treat Sickle Cell Disease, https://www.businesswire.com/news/home/20180516005404/en/ Bioverativ-Sangamo-Announce-FDA-Acceptance-IND-Application.

44. Sangamo BioSciences Announces FDA Clearance Of Investigational New Drug Application For SB-FIX, First In Vivo Protein Replacement Platform Program For Treatment Of Hemophilia B, https://www.prnewswire.com/ news-releases/sangamo-biosciences-announces-fda-clearance-of-inves-tigational-new-drug-application-for-sb-fix-first-in-vivo-protein-replacement-platform-program-for-treatment-of-hemophilia-b-300185804.html.

45. Editas Medicine Announces FDA Acceptance of IND Application for EDIT-101, https://ir.editasmedicine.com/node/9016/pdf.

46. Expert meeting on genome editing technologies used in medicine development, https://www.ema.europa.eu/en/documents/report/ report-ema-expert-meeting-genome-editing-technologies-used-medicinal-product-development_en-0.pdf.

47. Cong L., Ran F.A., Cox D. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013; 339(6121): 819-23.

48. Wang H., Yang H., Shivalila C.S. et al. One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell 2013; 153(4): 910-8.

49. Jiang W., Bikard D., Cox D. et al. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nat. Biotechnol. 2013; 31(3): 233-9.

50. Bikard D., Jiang W., Samai P. et al. Programmable repression and activation of bacterial gene expression using an engineered CRISPR-Cas system. Nucleic Acids Res. 2013; 41(15): 7429-37.

51. Ran F.A., Hsu P.D., Lin C.Y. et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell 2013; 155(2): 479-80.

52. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 2013; 8(11): 2281-308.

53. For journalists: statement and background on the crispr patent process, https://www.broadinstitute.org/crispr/ journalists-statement-and-background-crispr-patent-process.

54. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products, https://www.broadinstitute.org/files/shared/osap/pdf/ US8697359.pdf.

55. Methods and compositions for RNA-directed target DNA modification and for RNA-directed modulation of transcription, http://www.freepa-tentsonline.com/10000772.pdf.

56. United states patent and trademark office, http://patft.uspto.gov/ netahtml/PTO/index.html.