Получение ферментного препарата липазы методом рекомбинантных ДНК

БИОХИМИЧЕСКОЕ ПРОИЗВОДСТВО

УДК 575.27

Профессор О.С. Корнеева, аспирант В.А. Анненков (Воронеж, гос. ун-т инж. технол.) кафедра биохимии и биотехнологии, тел. (473)255-55-57

Получение ферментного препарата липазы методом рекомбинантных ДНК

Рассмотрено влияние условий биосинтеза (рН, t, времени культивирования, концентрации IPTG-индуктора, времени внесения IPTG и времени биосинтеза) на получение максимального количества фермента LipA.

The influence of the conditions of biosynthesis (pH, t, the culture time, the concentration of IPTG-inducer, IPTG time of application and time of biosynthesis) to obtain the maximum amount of the enzyme LipA.

Ключевые слова: рекомбинантная липаза, индуктор, IPTG, активность фермента, биосинтез.

На основании данных по пространственной структуре ферментов-липаз микробного происхождения и их термостабильных гомологов, а также исходя из новых представлений о механизмах повышения термостабильности белков и новейших компьютерных методов моделирования структуры и свойств биомакромолекул с применением методов генной инженерии предложен способ получения липазы LipA с увеличенной термостабильностью.

Ферментные препараты используются в пищевой, легкой, фармацевтической промышленности и сельском хозяйстве. Препараты липазы входят в состав лекарств для коррекции нарушений процесса пищеварения и регуляции функций поджелудочной железы (панкреатин). Также липаза применяется в процессах пере-этерификации жиров, в составе синтетических моющих средств.

Известно, что существующие коммерческие препараты липазы обладают недостаточной термоустойчивостью, чистотой и являются нестабильными в условиях промышленного производства. Эти недостатки делают процесс применения липаз трудоемким и дорогостоящим.

Одним из путей решения данной проблемы является создание препаратов рекомбинантных липаз, отличающихся повышенной термостабильностью за счет внесения аминокислотных замен, увеличивающих устойчивость молекулы фермента к внешним воздействиям. Кроме того, препараты рекомбинантных липаз обладают высокой активностью и специфичностью действия.

Рекомбинантный белок получали путем плазмидной трансформации гена синтеза липазы LipA в клетки Е. coli ТОР-10. Донором гена служили клетки В. subtilis 168, выбранные путем скрининга продуцентов грибного и бактериального происхождения.

(С)Корнеева О.С., Анненков В.А., 2014

Наращивание биомассы кишечной палочки осуществлялось глубинным способом культивирования в качалочных колбах с питательной средой Лурия-Бертани. Очистку проводили методом аффинной хроматографии [1].Активность липазы определяли титриметрическим методом [2].

Получали порошкообразный препарат липазы с помощью сушки фермента на лиофильной сушилке ЛС-500 (рис.1).

Рис. 1. Схема получения рекомбинантной липазы с повышенной термостабилъностъю

Результаты исследования характеризуют рекомбинантный штамм как высокостабильный. Активность липазы Е. сой ТОР-10 остается выше 90 ед/мг (сохраняется более 80 % активности по сравнению с 1 пассажем) после 3 пересевов культуры [3].

Экспериментом установлено, что оптимальные условия для биосинтеза липазы на питательной среде Лурия-Бертани достигаются при рН = 6 и t = 42 °С.

Зависимость активности липазы от температуры и рН отображена на рис. 2 и 3.

100

£

j 60 StJ

IH-1- -1-1-—-

J J • 5 » 7 » ♦ 1« 11 1; pH

Puc. 2. Зависимость актив- Рис. 2. Зависимость активно-

ности липазы от рН сти липазы от температуры

21 28 30 32 34 36 38 40 42 Температура, С

О 7

1РТСт-индуктор запускает ген синтеза липазы в бактериальных клетках, увеличивая выход требуемого белка и его растворимость. Правильно рассчитанное время его внесения и оптимальная концентрация индуктора косвенно влияет и на искомую активность липолитического фермента.

Максимальную активность белок проявлял при концентрации 1 ммоль 1РТСт. При этом значении активность фермента составила 113,1 ед/мг. Допустимо снизить концентрацию вносимого индуктора в связи с его высокой стоимостью, но не ниже концентрации 0,1 ммоль (при данной концентрации активность снижается до 94,2 ед/мг).

Исследовав продолжительность биосинтеза липазы 1лрА, установили, что оптимальное время культивирования штамма Е.сой ТОР-10 -8 ч. Внесение 1РТСт-индуктора целесообразно проводить через 4 ч после начала биосинтеза вследствие накопления максимальной биомассы культуры микроорганизмов (рис. 4).

120 100 80 £ во

о

5 40 х

% 20 <

0

Рис. 4. Зависимость липазной активности культуры рекожбинантной E.coli от времени внесения индуктора

Исследование физико-химических свойств липазы позволило установить, что фермент может работать в нейтральных и щелочных средах. Оптимум pH = 9,0. Ферментативный гидролиз липазой LipA можно проводить в условиях жестких температур (до 90 °С). Оптимум температуры составляет 60 °С.

Полученные в ходе эксперимента параметры биосинтеза высокоактивной липазы LipA отображены в таблице.

Таблица

Оптимальные условия для синтеза рекомбинантной липазы из штамма E.coli ТОР-Ю на питательной среде Лурия-Бертани

Параметры оптимизации Величина

Время внесения 1РТО, ч 4

Время биосинтеза после внесения индуктора, ч 4

Общее время культивирования, ч 8

Концентрация индуктора, ммоль 1

Температура, °С 42

рН 9

Время внесения индуктора, ч

Большая удельная активность липолитического фермента расширяет область использования LipA на производстве. Полученный высушенный ферментный препарат можно использовать для улучшения органолептических показателей мяса, рыбы, напитков, хлебобулочных изделий; при получении жиров и масел; на химических, косметических, фармацевтических предприятиях.

ЛИТЕРАТУРА

1. Don, S. М. Optimal conditions for the growth of E. Coli // Biology EEI.- 2008.-№ 4,- P. 3-18.

2. Полыгалина, Г.В. Определение активности ферментов [Текст] / Г.В. Полыгалина, B.C. Чередниченко, Л. В. Римарева. - М.: ДеЛи принт, 2003.

- 375 с.

3. Черенков, Д.А. Получение термостабильной липазы с помощью методов компьютерного моделирования и генной инженерии [Текст] / Д. А. Черенков, В. А. Анненков, Е. В. Першина [и др.] // Актуальная биотехнология.- 2013.- № 3.

- С. 34-35.

REFERENCES

1. Don, S. М. Optimal conditions for the growth of E. Coli // Biology EEI.- 2008.-№ 4,- P. 3-18.

2. Polygalina, G.V. Determination of activity of enzymes [Text] / G. V. Polygalina, V. S. Cherednichenko, L.V. Rimarev. - M.: Put a print, 2003. - 375 p.

3. Cherenkov, D. A. Receiving a thermostable lipase by means of methods of computer modeling and genetic engineering [Text] / D.A. Cherenkov, V.A. Annenkov, E. V. Pershina [etc.] // Actual biotechnology. - 2013. - № 3.- P. 34-35.