Способ двухстадийного мембранного получения гипоаллергенного продукта на основе лактоферрина, обогащенного иммуноглобулинами, для профилактического диетического питания
METHOD FOR TWO-STEP MEMBRANE PRODUCTION OF A HYPOALLERGENIC PRODUCT BASED ON IMMUNOGLOBULIN ENRICHED LACTOFERRIN FOR PREVENTIVE DIETARY NUTRITION

Область техники
Изобретение относится к молочной, биотехнологической, медицинской, фармацевтической, пищевой промышленности, а именно к способам получения специализированных продуктов профилактического диетического питания.
Предназначено для производства лактоферринсодержащих препаратов, обогащенных иммуноглобулинами, полученных из молозива, содержащих IgA, IgG и IgM, с уменьшенным количеством аллергенных компонентов молока, а также снижающих воспаление, аллергию и аутоиммунные процессы.
Может быть использовано для профилактики, а также в комплексной терапии инфекционных заболеваний различной этиологии, снижения воспалительных и аллергических реакций, профилактики астматического статуса.
Предшествующий уровень техники
Лактоферрин принадлежит к семейству белков-трансферринов, осуществляющих перенос железа в клетки и контролирующих уровень свободного железа в крови и во внешних секретах. Лактоферрин представлен в молоке человека и других млекопитающих. Лактоферрин относят к системе врожденного иммунитета, существуют данные о том, что лактоферрин опосредованно вовлечен в процессы клеточного иммунитета. Главные биологические функции белка — это связывание и транспорт ионов железа, но кроме этого лактоферрин обладает антибактериальной, антивирусной, антипаразитарной, различными каталитическими активностями, а также противораковым, антиаллергическим, иммуномодулирующим действиями и радиопротективными свойствами. Антивирусная активность направлена против широкого спектра вирусов человека и животных с ДНК и РНК геномами, связывает различные антигены вирусной природы преимущественно в условиях in vitro. Концентрация лактоферрина в молоке изменяется от 7 мг/мл в молозиве до 1 мг/мл в зрелом молоке (https://ru.wikipedia.org/wiki/Лактоферрин).
Молозиво - это первое молоко млекопитающих, в том числе человека, которое появляется на поздних сроках беременности или непосредственно перед родами. Молозиво - это смесь иммунных факторов, факторов роста, а также важных питательных веществ, которые обеспечивают поддержку иммунной системы и повышают здоровье, жизнеспособность и рост новорожденных. Молозиво содержит различные иммунные факторы, такие как иммуноглобулины, лактоферрин, а также богатые пролином полипептиды. Богатые пролином полипептиды (PRPs) обладают уникальной способностью модулировать иммунную систему, действуя в качестве сигнальных молекул, которые активируют или деактивируют иммунную систему.
Помимо взаимодействия с клеточными рецепторами, лактоферрин напрямую связывает вирусные частицы и препятствует их проникновению в клетки.
Иммуноглобулины получили свое название по признаку функциональной активности — за способность инициировать процессы иммунной защиты организма. Иммуноглобулины содержатся в крови, слюне, молоке. При попадании в организм антигенов — чужеродных соединений (бактерий, токсинов, вирусов) нейтрализуют их, образуя комплексы: иммуноглобулин-антиген.
Наибольшим содержанием иммуноглобулинов отличается молозиво. В первые часы после рождения теленка их содержание достигает 100 г/л молозива, но быстро снижается, достигая 0,6—1,0 г/л в обычном молоке. Высокое содержание иммуноглобулинов в молозиве обеспечивает новорожденным пассивный иммунитет, пока не сформируется иммунная система.
В молозиве обнаружено несколько классов иммуноглобулинов: IgA IgG и IgM. Структура их хорошо изучена. Все они состоят из нескольких полипептидных цепей разного аминокислотного состава. Больше всего различаются начальные (N-концевые) последовательности, которые отвечают за связывание антигена и поэтому должны обладать особой специфичностью по отношению к нему. У некоторых иммуноглобулинов полипептидные цепи соединяются с помощью минорных белков гликопротеиновой природы. Их называют свободными секреторными компонентами (FSC — free secretory component), поскольку они обнаруживаются не только в структуре иммуноглобулинов, но и в свободном виде в концентрации 50—100 мг/л. Иммуноглобулины не выдерживают высоких температур. Их денатурация начинается при 70°С, а после УВТ-обработки в течение 4 с при 138°С иммуноглобулины полностью теряют свою активность. В чистом виде выделены иммуноглобулины, обладающие активностью по отношению к ротавирусу, кариесогенным бактериям, Escherichiacoli и некоторым другим. Это увеличивает интерес к иммуноглобулинам, которые можно использовать как нативные добавки к пищевым продуктам для сокращения вирусных и бактериальных инфекций и повышения пассивного иммунитета.
Известно, что аллергия — это ответная реакция организма на чужеродный белокантиген. В составе коровьего молока, кроме полезных микроэлементов и витаминов, содержится так же большое количество этих белков-антигенов, которые и вызывают аллергическую реакцию. Но из почти трех десятков белков чаще всего дают аллергический ответ всего три. Это казеин, которого в молоке содержится 80%, альфа-лактоальбумин и бета-лактоглобулин.
Казеин под воздействием соляной кислоты желудка створаживает белок в сгусток. В результате - расщепление белка превращается в длительный процесс, на протяжении которого происходит равномерное освобождение аминокислот. Больше всего казеина содержится в сырах, твороге, простокваше и кефире.
Бета-лактоглобулин. По количественному содержанию в молоке он стоит на втором месте после казеина – около 10%. Он входит в состав почти всех молочных продуктов, содержится даже в детском питании. «Почти» - потому что беталактоглобулин разрушается при длительном нагревании и кисломолочном брожении. Поэтому люди с аллергией к нему могут спокойно употреблять твердые сорта сыров, кефир или творог.
Альфа-лактоальбумин - это белок, который относится к группе сывороточных протеинов и входит в состав плазмы молока. Его содержание незначительно, около 2% от общего числа молочных белков. В организме альфа-лактоальбумин участвует в синтезе лактозы и относится к термостабильным белкам, поэтому его аллергенные свойства сохраняются после кипячения, пастеризации, замораживания и ферментации молока. Например, тяжелые аллергические ответы были отмечены на очень низкое содержание этого белка в продуктах детского питания, замороженных десертах и молочной сыворотке. Альфа-лактоальбумин это основной сывороточный протеин козьего (вот причина перекрестной аллергии на козье молоко) и материнского молока, так же содержится в говядине, телятине и продуктах из коровьего молока.
Известен патент RU 2634859, в котором описан способ выделения и очистки лактоферрина из молочного сырья – коровьего молока, включающий одностадийную хроматографию лактоферрина из молочного сырья в колонке с сорбентом, уравновешенным натрий-фосфатным буфером, элюирование лактопероксидазы натрийфосфатным буфером, элюирование лактоферрина в градиенте натрия хлористого, обессоливание и лиофильное высушивание. Описан лишь способ выделения и очистки лактоферрина из коровьего молока, благодаря которому можно извлекать один из минорных белков молока – лактоферрин. Этот белок имеет специфические свойства, в т.ч. явно выраженные антивирусные свойства.
Известна антибактериальная композиция, разработанная в форме жевательных пастилок, содержащая в качестве активных компонентов лактоферрин и сухое молозиво с добавлением цитрусового пектина (Патент US 6258383 (США))/ Добавка для диетического питания, состоящая из молозива и лактоферрина/ Маркус Б. Кокрум (США), Ричард Н. (США)]. Композиция применяется для лечения и профилактики инфекционных болезней, стимулирования иммунитета и регенерации тканей.
Из патента RU 2400106 известен способ очистки молочного сырья с целью получения лактоферрина. Способ включает в себя очистку молочного сырья, сепарирование, осаждение казеина, двухступенчатую ультрафильтрацию, хроматографическое разделение белков, диализ, микрофильтрацию с селективностью пор 0,2-0,3 мкм, смешивание выделенных монофракций в соотношении, аналогичном их содержанию в свежевыдоенном коровьем молоке, лиофильную сушку. На первой ступени ультрафильтрации осуществляют выделение из сыворотки иммуноглобулиновой фракции через мембраны 100 кДа. Повторной ультрафильтрации через мембраны 30 кДа подвергают пермеат. Полученный при этом концентрат белков подвергают ионообменной хроматографии, илюируя градиентом NaCl от 0,35 до 1 М с получением лактоферриновой и лактопероксидазной фракций. Недостатком данного изобретения является относительная трудоемкость, связанная с поэтапным проведением очистки белка, необходимость отделения балластных белков.
Задачей заявляемого изобретения является получение бактериологически чистого гипоаллергенного продукта для профилактического диетического питания без использования стандартных методов пастеризации и с максимально сохраненными свойствами лактоферрина и иммуноглобулинов.
Антивирусные свойства лактоферрина являются значительно более широкими и влияют на аденовирусы, ретровирусы, вирус папиломы человека, ВИЧ, в том числе, возможно, и на COVID-19.
Тем самым использование гипоаллергенного продукта на основе лактоферрина, обогащенного иммуноглобулинами, в качестве профилактического питания и в комплексной терапии инфекционных заболеваний различной этиологии, снижения воспалительных и аллергических реакций, профилактики астматического статуса является чрезвычайно актуальным.
В основу решения поставленной задачи заложено несколько основных постулатов:
• В конечном продукте должна сохраняться нативность белка для сохранения активных свойств лактоферрина;
• Конечный продукт должен быть чистым по бактериологическим показателям;
• Иммуноглобулины и лактоферрин не выдерживают высоких температур. Их денатурация начинается при 70°С, а после температурной обработки в течение 4 с при 138°С иммуноглобулины полностью теряют свою активность.
Технический результат: получение гипоаллергенного продукта для профилактического диетического питания («Иммунокол»), который содержит в нативном виде лактоферрин и иммуноглобулины и обладает антивирусным, иммуномодуляторным, антиоксидантным, антистрессовым, антимикробным и общеукрепляющим действием.
Для решения указанной задачи используется двухстадийная мембранная сепарация водного раствора нативного молозива, в котором содержание лактоферрина практически в 100 раз превышает содержание лактоферрина в молоке. При этом появляется возможность оставлять в ретентате не только лактоферрин, а комбинацию лактоферрина с иммуноглобулинами IgA, IgG и IgM - антителом первого иммунного ответа.
Заявляется способ получения бактериологически чистого гипоаллергенного продукта на основе лактоферрина, обогащенного иммуноглобулинами, для профилактического диетического питания («Иммунокол»), заключающийся в том, что используют молозиво первых 24 часов лактации, которое разводят водой до плотности молока, проводят «холодную сепарацию» при температуре до 30°С, в дальнейшем осаждают казеиновую фракцию с помощью сычужного фермента, после чего полученную сыворотку направляют на мембранную фильтрацию - бактофугирование при температурах ниже температуры денатурации сывороточных белков с параллельной элиминацией патогенной флоры: сначала через мембрану 800 нм, затем через мембрану 20 нм, проводят сушку лиофильным способом либо розлив в стеклянную темную тару.
Сбор 100% натурального молозива первых 24 часов лактации позволяет получить максимально обогащенный продукт.
Молозиво разводят водой до плотности молока для того, чтобы он легче проходил через мембрану и для уменьшения расходов электроэнергии на насосах.
Мембранную фильтрацию - бактофугирование проводят в 2 стадии: сначала через мембрану 800 нм, чтобы убрать патогенную флору, затем полученный пермеат пропускают через мембрану 20 нм. В результате уйдет казеин, альфа-лактоальбумин и часть бета-лактоглобулина, а лактоферрин и иммуноглобулины останутся в ретентате между двумя мембранами.
Таким образом, мембранная фильтрация - бактофугирование позволяет провести элиминацию патогенной флоры и получить продукт со значительно сниженными аллергенными свойствами за счет изъятия казеина.
В результате после двухстадийной мембранной фильтрации получаем концентрированный раствор, содержащий лактоферрин и иммуноглобулины, свободный от казеина и обеднѐнный по лактозе.
Перечень иллюстраций
Изобретение поясняется иллюстрациями.
На Фиг.1 представлена экспериментальная мембранная установка, использующая барьерные свойства керамических мембран. Установка была размещена в условиях действующего Полевского молочного завода, что обеспечивало возможность проведения основных анализов (бактериология, жирность, кислотность, общий белок).
На Фиг.2 показано, по какой причине было использовано два типа мембран 800 и 20 нм. Актуальность их применения вызвана следующими особенностями размерных рядов бактерий и белков: используя мембрану 800 нм, получаем бактериологически чистый фильтрат, а используя мембрану 20 нм отсекаем крупные белки (мицеллы) казеина для потенциального предотвращения аллергий у пользователей, страдающих непереносимостью казеина первой формы.
На Фиг.3 представлены образцы полученного фильтрата: левый образец получен при использовании мембраны 20 нм, правый образец - 800 нм.
На Фиг.4 показан результат анализа содержания активного лактоферрина в фильтрате (разведение 1:10).
На Фиг.5 показано содержание сывороточного белка и иммуноглобулинов в фильтрате 800 нм (разведение 1:1).
На Фиг.6 показано наличие иммуноглобулинов в фильтрате.
Осуществление изобретения
Установка (Фиг.1) была размещена на территории действующего молочного завода (г. Полевской Свердловской области), что обеспечивало возможность проведения основных анализов (бактериология, жир, кислотность, общий белок).
Использовалось молозиво первого дня, полученное в группе компаний «Победа» от неиммунизированных черно-пестрых коров беспривязного содержания.
Молозиво разводилось детской бутилированной водой с целью избежания дополнительной минерализации, после чего полученная смесь подвергалась обезжириванию на лабораторном сепараторе «Омь» с целью получения обезжиренного продукта.
Было использовано два типа мембран 800 нм и 20 нм. Актуальность их применения вызвана следующими особенностями размерных рядов бактерий и белков (Фиг.2).
Использование мембраны 800 нм позволяет получить бактериологически чистый фильтрат, а при использовании мембраны 20 нм отсекаются крупные белки (мицеллы) казеина для потенциального предотвращения аллергических реакций у пользователей, страдающих непереносимостью казеина первой формы (Фиг.3).
В дальнейшем, ретентат анализировали на содержание иммуноглобулинов и лактоферрина.
Оценка содержания лактоферрина в разведенном 1:10 ретентате выявила высокую сходимость сохраненного лактоферрина с литературными данными о его нахождении в молозиве: 0,67 мг/мл в растворе 1:10 хорошо коррелируется с данными о средней концентрации лактоферрина в молозиве.
В дальнейшем, оба полученных ретентата исследовались на сохранение сывороточного белка и наличие иммуноглобулинов. Подтверждается наличие в анализах IgM, который представляет собой самый важный представитель семейства человеческих иммуноглобулинов, хотя он и отличается весьма коротким периодом полураспада – около 5 дней. Иммуноглобулинам класса IgM в общей доле сывороточных антител в человеческом организме отведено примерно 10-13%. Они участвуют в первичных иммунных реакциях и являются наиболее важными из антител. IgM преимущественно содержится в лимфатической жидкости и крови и является главным нейтрализующим агентом на ранних стадиях заболевания. IgM – это первая линия защиты человеческого организма от вирусной атаки, в ходе иммунного ответа они вырабатываются первыми, а затем замещаются антителами. (Фиг.4 – 6).
Полученный концентрированный раствор с содержанием иммуноглобулинов в комбинации с лактоферрином может быть использован для создания гипоаллергенного продукта для профилактического диетического питания, а также в рамках комплексной терапии, в том числе и для борьбы с коронавирусом.
Планируется использование изобретения в специализированном продукте профилактического диетического питания «Иммунокол».
В процессе исследований выяснилось, что у лактоферрина имеется выраженная ацидофобность, т.е. при приеме в виде раствора кислота желудка в значительной мере дезактивирует нативный лактоферрин. Поэтому возможно несколько вариантов изготовления продукта:
– применить лиофильную сушку и лиофилизат паковать в двойную желированную капсулу, чтоб она проходила через желудок и растворялась в тонком кишечнике;
- смешать в определенных пропорциях с диоксидом кремния гипоаллергенным мелкодисперсным и получить водорастворимый гель, который фасуется в микроклизмы и годен для введения в прямую кишку и не убивается кислотой и сразу работает в организме;
- в виде ректальных свеч.