ХОЛОДОАДАПТИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА В-В/ВИКТОРИЯ/2/63/87, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ В КАЧЕСТВЕ ШТАММА-ДОНОРА АТТЕНУАЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАССОРТАНТОВ ХОЛОДОАДАПТИРОВАННЫХ ШТАММОВ ДЛЯ ЖИВОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ
COLD-ADAPTED INFLUENZA VIRUS STRAIN B-B/VICTORIA/2/63/87 INTENDED AS STRAIN-DONOR OF ATTENUATION FOR OBTAINING REASSORTANTS OF COLD-ADAPTED STRAINS FOR LIVE INFLUENZA VACCINE

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано при производстве живой холодоадаптированной аттенуированной вакцины против гриппа.
Известно, что живая вакцина против гриппа производится из аттенуированных штаммов вируса, безвредных для людей и обладающих способностью стимулировать противогриппозный иммунитет.
В связи с тем, что антигенная специфичность вирусов гриппа весьма изменчива, вакцинные штаммы этого вируса для гриппозных вакцин приходится заменять на новые почти каждый год в соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения. При получении таких новых вакцинных штаммов для живой холодоадаптированной аттенуированной гриппозной вакцины и для получения новых реассортантных холодоадаптированных вакцинных штаммов в России используют холодоадаптированные штаммы - доноры аттенуации В/СССР/60/69 и В/Ленинград/14/55, также полученные путем пассажей при пониженной температуре (RU 2084525, 1997; RU 2068271, 1996).
Однако эти штаммы обладают серьезным недостатком - авторы не имеют данных о том, какие мутации в определенных участках генов этого вируса имеются у данных ха штаммов, что не позволяет определить, какие гены вируса могут иметь отношение к аттенуации штамма, что дает возможность характеризовать генетическую однородность штаммов, а также определить их генетическую стабильность при размножении в организме вакцинированных людей. Оба штаммы были клонированы методом предельных разведении в куриных эмбрионах, что оставляет генетическую однородность этих штаммов под большим сомнением.
В США для приготовления живой холодоадаптированной гриппозной вакцины используют в качестве штамма-донора аттенуации штамм В/Анн Арбор/1/66, полученный путем пассажей при пониженной температуре (Maassab H, De Borde B. Development and characterization of cold-adapted virus for use as live virus vaccines. Vaccine, 1983й вакцины. Вопросы вирусологии, 2005, №2: 43-46).
Этот штамм имеет восемь кодирующих мутаций в трех вирусных белках (PA, NP и M1) (см. таблицу 2).
Наиболее близким к заявленному изобретению является аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/Ленинград/14/17/55 для получения штаммов живой гриппозной вакцины (RU 2068271, 1996).
Задачей исследования является получение ха генетически однородного штамма-донора аттенуации вируса гриппа B, обладающего уникальными мутациями в генах, кодирующих белки PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1 и предназначенного для получения холодоадаптированных реассортантных штаммов-кандидатов живой гриппозной сезонной вакцины.
Техническим результатом заявленного изобретения является создание аттенуированного холодоадаптированного штамма - донора вируса гриппа, обладающего генетической однородностью, охарактеризованного по количеству и распределению мутаций аминокислот в каждом из внутренних белков вируса, и способного размножаться при пониженной температуре и температуре 34°C как на куриных эмбрионах, так и в культуре клеток, в частности в линии клеток MDCK, одобренной в России для производства вирусных вакцин для людей (4, 5).
Сущность изобретения: холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/Виктория/2/63/87 получен методом серийных пассажей в куриных эмбрионах и клетках MDCK при постепенно снижающейся температуре инкубации. Полученный штамм прошел в сумме 63 пассажа при пониженной температуре (из них 29 пассажей на куриных эмбрионах и 34 пассажа на клетках MDCK), с последующим трехкратным клонированием методом бляшек на культуре клеток MDCK. Последнее обеспечивает полную генетическую гомогенность ха штамма. Полученный штамм обладает хорошей репродуктивной активностью в куриных эмбрионах и на клетках MDCK при пониженной температуре (26°C) и не размножается при повышенных температурах (38° и 40°C). Полученный ха штамм вируса гриппа В имеет во всех внутренних генах 8 мутаций, отличающих его от родительского дикого штамма, причем 6 из 8 мутаций кодируют замену аминокислоты в белках PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1. 5 из 6 кодирующих мутаций являются уникальными для данного штамма по сравнению со всеми эпидемическими штаммами вируса гриппа В, отсеквенированными на данный момент.
Штамм В/Виктория/2/63/87 вируса гриппа В зарегистрирован в Государственной коллекции депозитария НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского под номером 2615 от 13.12.2010.
Штамм В/Виктория/ 2/63/87 полностью генетически охарактеризован и трижды клонирован в культуре MDCK методом бляшек. Методом секвенирования отдельных РНК-сегментов его генома доказана его генетическая однородность.
Примеры получения холодоадаптированного (ха) варианта вируса гриппа В/Виктория/2/63/87.
38
26
Пример 1. Получение холодоадаптированного варианта. Эпидемический родительский штамм вируса гриппа В/Виктория/2/87 хорошо размножался при повышенной температуре 38,5°C (ts + признак) и не размножался при пониженной температуре 26°C (ca - признак). Этот штамм вируса прошел в куриных эмбрионах 2 пассажа при 30°C, затем 3 пассажа при 28°C, далее 6 пассажей при 26°C, затем 34 пассажа при 26°C в культуре клеток MDCK и далее 18 пассажей при 26°C в куриных эмбрионах.
26
38
Полученный ха вариант вируса, в отличие от родительского эпидемического штамма, хорошо размножался при 26°C (ca + признак), а также хорошо размножался при 34°C, но не размножался при 38,5°C (ts- признак).
26
38,5
26
38.5
Для получения генетически гомогенного ха штамма вируса полученный вариант был трижды клонирован методом бляшек на линии клеток MDCK при 34°C и был выбран один клон, который хорошо размножался при 26°C (ca + признак) и не размножался при 38,5°C (ts- признак). Ряд пассажей полученного ха варианта на куриных эмбрионах при 34°C не изменили его са+ и ts - признаки, что свидетельствовало о генетической однородности клонированного ха варианта этого вируса.
Пример 2. Размножение холодоадаптированного варианта в куриных эмбрионах.
8.0
8.5
6.0
8.5
50
50
38.5
26
50
50
26
38
При размножении в куриных эмбрионах при 34°C родительского штамма титры вируса составили 128 ГАЕ/мл и 10 ЭИД/0,1 мл, при 38,5°C - 256 ГАЕ/мл и 10 ЭИД/0,1 мл, а при 26°C вирус не размножался, т.е. обладал ts+ и ca - признаками. При заражении куриных эмбрионов ха вариантом вируса титры при 26°C составляли 64 ГАЕ/мл и 10 ЭИД/0,1 мл, при 34°C - 256 ГАЕ /мл и 10 ЭИД/0,1 мл, а при 38,5°C этот вариант не размножался, т.е. обладал ca+ и ts - признаками.
Пример 3. Размножение ха варианта в линии клеток MDCK.
8.0
50
Ха вариант вируса В/Виктория/2/63/87 хорошо размножался в линии клеток MDCK при 33° (титры составили 128-256 ГАЕ/мл и 10 ЭИД/0.1 мл) и не размножался при 26°C.
Пример 4. Размножение ха варианта и родительского штамма вируса при заражении мышей.
7.5
4.5
3.9
50
50
50
При интраназальном заражении самок мышей линии Balb/c (18,0-20,0 г) родительским штаммом вируса (50 мкл в две ноздри) в дозе 10 ЭИД/0,2 мл на 3-й день после заражения титры вируса в носоглотке составляли 10ЭИД/0,2 мл, а в легких 10 ЭИД/0.2 мл.
2.0
1.0
05
50
При интраназальном заражении мышей той же дозой ха варианта титры вируса на 3-й день после заражения титры вируса в носоглотке составляла 10 ЭИД/0,2 мл, а в легких <10 ЭИД/0,2 мл. Эти данные свидетельствуют о хорошей аттенуации ха варианта, потерявшего способность размножаться при заражении мышей.
Пример 5. Анализ мутаций в геноме ха варианта.
Сравнительный анализ последовательности нуклеотидов в генах родительского штамма и ха варианта вируса В/Виктория/2/63/87 выявило 8 мутаций в 6 генах, кодирующих внутренние белки PB2, PB1, PA, NP, M1, NS1, из которых 6 мутаций привели к замене аминокислот в соответствующих белках (см. таблицу 1). В РНК-сегменте 1, кодирующем белок PB2, в позиции 555 наблюдалась нуклеотидная замена G-A, которая сопровождалась аминокислотной заменой Arg-Lys в позиции 185 белка PB2. Нуклеотидная замена A-G в РНК-сегменте 2 в позиции 366 сопровождалась аминокислотной заменой Asp-Gly в позиции 120 белка PB1. В РНК-сегменте 3 наблюдались 2 мутации, из которых одна в позиции 972 (А-Т) оказалась некодирующей, а вторая в позиции 1885 (G-A) приводила к аминокислотной замене Val-Ile в позиции 625 белка PA. Уникальная нуклеотидная замена C-T в позиции 156 в РНК-сегменте 5, кодирующем белок NP, имела следствием аминокислотную замену Pro-Ser в позиции 40 белка NP. В РНК-сегменте 7 ха варианта наблюдались 2 нуклеотидные замены. Первая замена (G-A) в позиции 70 сопровождалась аминокислотной заменой Glu-Lys в позиции 23 белка M1. Вторая нуклеотидная замена C-T в позиции 387 этого РНК-сегмента оказалась некодирующей. Последняя нуклеотидная замена G-A в позиции 62 РНК-сегмента 8 приводила к аминокислотной замене Gly-Ser в белке NS1.
Сравнение мутаций, обнаруженных в геноме ха варианта штамма В/Виктория/2/63/87 и мутаций в геноме американского ха варианта вируса В/Анн Арбор/1/60 (см. таблицу 2), показало, что мутации, выявленные нами в геноме ха варианта В/Виктория/2/63/87, являются уникальными и отличаются от мутаций, обнаруженных в ха штамме В/Анн Арбор/1/60 (5).
На основе полученного штамма-донора получены реассортанты с актуальными эпидемическими штаммами вируса гриппа В.
ЛИТЕРАТУРА
1. Патент №2084525 "Аттенуированный холодоадаптированный штамм вируса гриппа В/СССР (69) Е для получения живой интраназальной гриппозной вакцины." от 20.07.1997.
2. Патент №2068271. Аттенуированный холоадаптированный штамм вируса гриппа В/Ленинград/14/55 для получения штаммов живой гриппозной вакцины от 27.10.1996.
3. Maassab H, De Borde В. Development and characterization of cold-adapted virus for use as live virus vaccines. Vaccine, 1983й вакцины. Вопросы вирусологии, 2005, N2: 43-46.
4. Радаева И.Ф., Колокольцева Т.Д., Нечаева Е.Д. и др. "Создание и аттестация банков перевиваемой культуры клеток MDCK для производства гриппозной вакцины." Вопросы вирусологии, 2005, №2: 43-46.
5. Выписки из протокола №6 Комитета медицинских иммунобиологических препаратов Министерства Здравоохранения Российской Федерации от 26.06.2003 г.
6. Hoffmann E., Mahmood K., Chen Z. et al. Multiple gene segments control the temperature sensitivity and attenuation phenotypes of ca B/Ann Arbor/ 1/66. J. Virol. 2005. 79: 11014-11021.
Таблица 1
Мутации во внутренних генах холодоадаптированных вариантов штамма В/Виктория/2/63/87
Сегмент РНК
Длина (нт)
Мутации в нуклеотидной последовательности
Белок
Длина (ак)
Аминокислотные замены
Позиция
Уникальность*
Вик (Дт)
Вик (ха)
Позиция
Вик (дт)
Вик (ха)
1
2396
555
Да
AGG
AAG
PB2
770
185
Arg
Lys
2
2386
366
Да
GAC
GGC
PB1
752
120
Asp
Gly
3
2304
972
Нет
АСА
ACT
PA
726
-
-
-
1885
Нет
GTA
АТА
625
Val
Ile
5
1841
156
Да
ССА
ТСА
NP
560
40
Pro
Ser
7
1191
70
Да
GAA
ААА
M1
248
23
Glu
Lys
387
Нет
СТС
СТТ
-
-
-
-
-
-
-
BM2
109
-
-
-
8
1096
62
Да
GGT
AGT
NS1
281
13
Gly
Ser
NS2
122
* Уникальность по сравнению с вирусами гриппа B из базы данных GenBank
Таблица 2
Аминокислотные замены, уникальные для внутренних генов штамма В/Энн Арбор/1/66 по сравнению с дикими штаммами вируса гриппа В по данным Hoffman и др (6)
Сегмент РНК
Длина (нт)
Нуклеотидная последовательность
Белок
Аминокислотные замены
Позиция
Уникальность*
Консенсус (дт)
В/Энн Арбор/1/66 (ха)
Позиция
Консенсус (дт)
В/Энн Арбор/1/66 (ха)
1
2396
1913
Нет*<sup>1</sup>
AGC
AGA
PB2
770
630
Ser
Arg
2
2386
PB1
752
3
2304
1320
Да
GTG
A
PA
726
431
Val
Met
1518
Да
TAT
CAT
497
Tyr
His
5
1841
221
Нет*<sup>2</sup>
ACC
GCC
NP
560
55
Thr
Ala
399
Да
GTG
GCG
114
Val
Ala
1287
Да
CCT
CAT
410
Pro
His
1583
Да
GCT
ACT
509
Ala
Thr
7
1191
501
Нет*<sup>2</sup>
CAT
САА
M1
248
759
His
Gin
571
Да
ATC
GTG
183
Met
Val
-
-
-
-
BM2
109
-
-
-
8
1096
NS1
281
NS2
122
* Уникальность по сравнению с дикими штаммами вируса гриппа B из базы данных GenBank, в том числе с диким штаммом-предком ХА вируса В/Энн Арбор/1/66
*<sup>1</sup> Мутация присутствовала лишь в одном диком штамме вируса гриппа B из всех исследованных (B/Harbin/7/94 (AAF89735))
*<sup>2</sup> Эти мутации присутствовали в диком штамма В/Энн Арбор/1/66 (wt5).