ИНДУКТОР ИММУНИТЕТА
IMMUNITY INDUCER

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0001]
Настоящее изобретение относится к новому иммунному индуктору, применимому в качестве активного ингредиента средства для лечения или профилактики злокачественной опухоли.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002]
Белок PDS5A (PDS5, регулятор поддержания когезии, гомолог A), также известный как SSC-112, представляет собой белок, идентифицированный как регулятор клеточного цикла, вовлеченный в распределение хромосом.
[0003]
Предполагалось, что белок PDS5A ассоциирован с развитием злокачественной опухоли. Например, в патентной литературе 1 описано, что экспрессия белка PDS5A выше в случае рака носоглотки, рака почек, рака печения и одного из типов злокачественных клеток молочной железы, по сравнению с нормальной тканью. Кроме того, в патентной литературе 1 также описано, что пролиферация злокачественных клеток может быть ингибирована в результате подавления экспрессии белка PDS5A в злокачественных клетках с использованием антисмысловой нуклеиновой кислоты, рибозима или ми-РНК против гена PDS5A или антитела против белка PDS5A, и что можно индуцировать апоптоз в злокачественных клетках посредством введения полноразмерного белка PDS5A или неполного пептида данного белка.
[0004]
В патентной литературе 2 описано, что белок PDS5A, который связывается с HLA-A0201, который является подтипом молекул MHC класса I, и его неполные пептиды обладают индуцирующей иммунитет активностью против злокачественных клеток, и поэтому применимы для лечения и/или профилактики злокачественной опухоли. Однако в патентной литературе 2 не раскрыты все пептиды, которые связываются с HLA-A0201, нет информации о пептидах, которые связываются с другими подтипами, отличными от HLA-A0201.
Список литературы
Патентная литература
[0005]
Патентная литература 1: WO 2002/081641.
Патентная литература 2: WO 2011/027807.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая проблема
[0006]
Целью настоящего изобретения является обнаружение нового полипептида, применимого в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли, и обеспечение применения полипептида в качестве индуктора иммунитета.
[0007]
Другой целью настоящего изобретения является получение изолированной антигенпрезентирующей клетки, содержащей комплекс полипептида и молекулы HLA, и изолированной T-клетки, которая избирательно связывается с комплексом полипептида и молекулы HLA, а также содержащего их средства для лечения или профилактики злокачественной опухоли.
Решение проблемы
[0008]
В результате интенсивного исследования авторы настоящего изобретения обнаружили, что белок PDS5A человека, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в виде SEQ ID NO: 2, специфично экспрессируется в тканях или клетках лейкоза, злокачественной лимфомы, рака молочной железы, рака печени, рака простаты, рака поджелудочной железы, рака яичника, рака почки, рака прямой и ободочной кишки, рака желудка, злокачественной опухоли головного мозга, рака пищевода и рака легкого. Кроме того, авторы настоящего изобретения обнаружили, что неполный пептид, присутствующий в специфичной области белка PDS5A, обладает способностью (индуцирующей иммунитет активностью) активировать и способствовать размножению T-клеток, специфичных для полипептида посредством презентации антигенпрезентирующими клетками, и что индуцирующая иммунитет активность применима для лечения или профилактики злокачественной опухоли. На основании таких данных авторы настоящего изобретения обнаружили, что полипептид можно применять в качестве активного ингредиента для индуктора иммунитета, предназначенного для лечения или профилактики злокачественной опухоли, и что антигенпрезентирующие клетки, которые контактировали с пептидом, и T-клетки, которые контактировали с антигенпрезентирующими клетками, также применимы для лечения или профилактики злокачественной опухоли, таким образом осуществив настоящее изобретение.
[0009]
В частности, настоящее изобретение имеет следующие характерные признаки (1)-(14).
(1) Индуктор иммунитета содержащий в качестве активного ингредиента следующее (i) или (ii):
[0010]
(i) по меньшей мере, один полипептид, обладающие индуцирующей иммунитет активностью и выбранный из группы полипептидов (a) или (b), указанных ниже:
(a) полипептидов, содержащих семь или больше непрерывно следующих друг за другом аминокислот в области положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 и положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2;
(b) полипептидов, содержащих от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен и/или добавлений в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (a);
(ii) рекомбинантный вектор, содержащий, по меньшей мере, один полинуклеотид, кодирующий любой из полипептидов и способный экспрессировать полипептид in vivo.
(2) Индуктор иммунитета по п. (1), в котором полипептид (i) связывается с молекулой MHC класса I.
(3) Индуктор иммунитета по п. (2), в котором полипептид (i) представляет собой любой из полипептидов, выбранный из группы полипептидов (c)-(e), указанных ниже:
[0011]
(c) полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-34;
(d) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен и/или добавлений в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (c);
(e) полипептиды, каждый из которых содержит неполную последовательность любого из полипептидов (c) или (d).
(4) Индуктор иммунитета по п. (1), в котором полипептид (i) связывается с молекулой MHC класса II.
(5) Индуктор иммунитета по п. (4), в котором полипептид (i) представляет собой любой из полипептидов, выбранный из группы полипептидов (f)-(h), указанных ниже:
[0012]
(f) полипептиды, содержащие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 35-67;
(g) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен и/или добавлений в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (f);
(h) полипептиды, каждый из которых содержит неполную последовательность любого из полипептидов (f) или (g).
(6) Индуктор иммунитета по любому из пп. (1)-(5), который применим в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли.
(7) Индуктор иммунитета по п. (6), в котором злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, экспрессирующую белок PDS5A.
(8) Индуктор иммунитета по любому из пп. (6) или (7), в котором злокачественная опухоль представляет собой лейкоз, злокачественную лимфому, рак простаты, рак печени, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак почки, рак прямой и ободочной кишки, рак желудка, злокачественную опухоль головного мозга, рак легкого или рак пищевода.
(9) Индуктор иммунитета по любому из пп. (1)-(8), дополнительно содержащий иммуностимулятор.
(10) Полипептид, обладающий индуцирующей иммунитет активностью и выбранный из группы полипептидов (a) или (b), указанных ниже:
[0013]
(a) полипептиды, обладающие индуцирующей иммунитет активностью и состоящие из 7 или большего количества непрерывно следующих друг за другом аминокислот в области положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 и положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2;
(b) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен и/или добавлений в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (a).
(11) Полипептид по п. (10), в котором полипептид представляет собой любой полипептид, выбранный из группы полипептидов (c)-(e), указанных ниже:
[0014]
(c) полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-34;
(d) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен и/или добавлений в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (c);
(e) полипептиды, каждый из которых содержит в качестве неполной последовательности любой из полипептидов (c) или (d).
(12) Полипептид по п. (10), в котором полипептид представляет собой любой полипептид, выбранный из группы полипептидов (f)-(h), указанных ниже:
[0015]
(f) полипептиды, состоящие из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 35-67;
(g) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен и/или добавлений в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (f);
(h) полипептиды, каждый из которых содержит в качестве неполной последовательности любой из полипептидов (f) или (g).
(13) Изолированная антигенпрезентирующая клетка, содержащая комплекс полипептида, обладающего индуцирующей иммунитет активностью, по любому из пп. (10)-(12), и молекулы MHC.
(14) Изолированная T-клетка, которая избирательно связывается с комплексом полипептида, обладающего индуцирующей иммунитет активностью, по любому из пп. (10)-(12), и молекулы MHC.
[0016]
Настоящее описание охватывает раскрытие заявки на выдачу патента Японии № 2015-158539, на основании которой настоящая заявка притязает на приоритет.
Эффекты изобретения
[0017]
Настоящее изобретение относится к новому индуктору иммунитета, применимому в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли.
[0018]
Кроме того, как специально показано в примерах, описанных далее, полипептиды, применимые в настоящем изобретении, могут индуцировать иммунные клетки, которые убивают злокачественные клетки, тем самым обеспечивая возможность уменьшения размера или регрессии уже существующей злокачественной опухоли. Кроме того, пептиды, применимые в настоящем изобретении, также могут усиливать индукцию иммунных клеток, которые убивают злокачественные клетки, и тем самым способствовать уменьшению размера или регрессии уже существующей злокачественной опухоли. Таким образом, полипептиды согласно настоящему изобретению применимы в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли.
КРАТКОЕ ОПСИАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0019]
[Фигура 1] На фигуре 1 показаны картины экспрессии гена PDS5A в опухолевых тканях человека и линиях злокачественных клеток. Идентификационный номер 1 указывает картину экспрессии гена PDS5A человека. Идентификационный номер 2 указывает картину экспрессии гена GAPDH человека, который является геном «домашнего хозяйства» человека.
[Фигура 2] На фигуре 2 показано, что CD8-позитивные T-клетки, специфичные для каждого из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-19, узнают комплекс, состоящий из полипептида и HLA-A0201, и продуцируют IFN-γ. На фигуре 2, дорожки 13-29 на горизонтальной оси показывают IFN-γ-продуцирующие способности HLA-A0201-позитивных CD8-позитивных T-клеток в ответ на стимуляцию дендритными клетками, на которые импульсно воздействовали полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19, соответственно. Дорожка 1 показывает результат, полученный, когда описанную выше обработку осуществляли без добавления какого-либо полипептида (имитация); дорожка 2 показывает результат, полученный, когда описанную выше обработку осуществляли с добавлением полипептида для отрицательного контроля, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 74, которая не входит в объем настоящего изобретения; дорожка 3 показывает результат, полученный, когда описанную выше обработку осуществляли с добавлением полноразмерного белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; и дорожки 4-12 показывают результаты, полученные, когда описанную выше обработку осуществляли с добавлением полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 75-83, соответственно, которые не входят в объем настоящего изобретения.
[Фигура 3] На фигуре 3 показано, что CD8-позитивные T-клетки, специфичные для каждого из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 20-34, узнают комплекс, состоящий из полипептида и HLA-A24, и продуцируют IFN-γ. На фигуре 3 дорожки 4-18 на горизонтальной оси показывают IFN-γ-продуцирующую способность HLA-A24-позитивных CD8-позитивных T-клеток в ответ на стимуляцию дендритными клетками, на которые импульсно воздействовали полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20-34, соответственно. Дорожка 1 показывает результат, полученный, когда указанную выше обработку осуществляли без добавления какого-либо полипептида (имитация); дорожка 2 показывает результат, полученный когда указанную выше обработку осуществляли с добавлением пептида для отрицательного контроля, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 84, которая не входит в объем настоящего изобретения; и дорожка 3 показывает результат, полученный, когда указанную выше обработку осуществляли с добавлением полноразмерного белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
[Фигура 4A] На фигуре 4A показана направленная против злокачественных клеток цитотоксическая активность CD8-позитивных T-клеток, специфичных для каждого из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-19. На фигуре 4A дорожки 13-29 на горизонтальной оси показывают цитотоксические активности, направленные против клеток U251, HLA-A0201-позитивных CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19, соответственно. Дорожка 1 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток (имитация), индуцированных без добавления какого-либо полипептида; дорожка 2 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептида отрицательного контроля (SEQ ID NO: 74); дорожка 3 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полноразмерного белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; и дорожки 4-12 показывают цитотоксические активности CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 75-83, соответственно, которые не входят в объем настоящего изобретения.
[Фигура 4B] Фигура 4B показывает направленную против злокачественных клеток цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, специфичных для каждого из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-19. На фигуре 4B дорожки 12-28 на горизонтальной оси показывают цитотоксические активности, направленные против клеток Jurkat, HLA-A0201-позитивных CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19, соответственно. Дорожка 1 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток (имитация), индуцированных без добавления какого-либо полипептида; дорожка 2 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептида отрицательного контроля (SEQ ID NO: 74); дорожка 3 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полноразмерного белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; и дорожки 4-11 показывают цитотоксические активности CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 75-83, соответственно, которые не входят в объем настоящего изобретения.
[Фигура 5A] Фигура 5A представляет собой график, показывающий направленную против злокачественных клеток цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, специфичных для каждого из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 20-34. На фигуре 5A дорожки 4-18 на горизонтальной оси показывают цитотоксические активности, направленные против клеток THP1, HLA-A24-позитивных CD8-позитивных T-клеток, стимулированных с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20-34, соответственно. Дорожка 1 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток (имитация), индуцированных без добавления какого-либо полипептида; дорожка 2 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептида отрицательного контроля (SEQ ID NO: 84); и дорожка 3 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
[Фигура 5B] Фигура 5B показывает направленную против злокачественных клеток цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, специфичных для каждого из пептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 20-34. На фигуре 5B дорожки 4-18 на горизонтальной оси показывают цитотоксические активности, направленные против клеток SW480, HLA-A24-позитивных CD8-позитивных T-клеток, стимулированных с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20-34, соответственно. Дорожка 1 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток (имитация), индуцированных без добавления какого-либо полипептида; дорожка 2 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием полипептида отрицательного контроля (SEQ ID NO: 84); и дорожка 3 показывает цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных с использованием белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
[Фигура 6] Фигура 6 представляет собой график, показывающий, что CD4-позитивные T-клетки, специфичные для каждого из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 35-67, узнают комплекс полипептида и HLA-DRB1*04 и продуцируют IFN-γ. На фигуре 6 дорожки 4-36 на горизонтальной оси показывают IFN-γ-продуцирующую способность HLA-DRB1*04-позитивных CD4-позитивных T-клеток в ответ на стимуляцию дендритными клетками, на которые импульсно воздействовали полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 35-67, соответственно. Дорожка 1 показывает результат, полученный, когда указанную выше обработку осуществляли без добавления какого-либо полипептида (имитация); дорожка 2 показывает результат, полученный, когда указанную выше обработку осуществляли с добавлением полипептида отрицательного контроля, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 85, которая не входит в объем настоящего изобретения; и дорожка 3 показывает результат, полученный, когда указанную выше обработку осуществляли с добавлением полноразмерного белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0020]
Полипептид.
В настоящем изобретении термин «полипептид» относится к молекуле, образованной за счет образования пептидных связей из множества аминокислот. Полипептиды согласно настоящему изобретению включают не только полипептидные молекулы, состоящие из большого количества аминокислот, но также и молекулы с низкой молекулярной массой (олигопептиды), состоящие из небольшого количества аминокислот.
[0021]
Полипептидом, представляющий собой индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению, может быть, например, по меньшей мере, один полипептид, обладающий индуцирующей иммунитет активностью и выбранный из группы полипептидов (a) или (b), указанных ниже:
(a) полипептиды, состоящие из 7 или большего количества непрерывно следующих друг за другом аминокислот в области положений 24-97 (74 аминокислоты), положений 113-132 (20 аминокислот), положений 134-197 (64 аминокислоты), положений 204-225 (22 аминокислоты), положений 265-332 (68 аминокислот), положений 378-463 (86 аминокислот), положений 472-498 (27 аминокислот), положений 533-567 (35 аминокислот), положений 613-643 (31 аминокислота), положений 671-735 (65 аминокислот), положений 737-780 (44 аминокислоты), положений 792-830 (39 аминокислот), положений 832-899 (68 аминокислот), положений 920-943 (24 аминокислоты), положений 946-993 (58 аминокислот), положений 1029-1069 (41 аминокислота) и положений 1074-1215 (142 аминокислоты) в белке PDS5A человека, состоящем из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, при этом инициирующий метионин определяют как положение 1;
(b) полипептиды, содержащие от одной до нескольких аминокислотных делеций, замен и/или добавлений в аминокислотной последовательности любого из полипептидов (a).
[0022]
В настоящем изобретении выражение «состоящий из аминокислотной последовательности» означает, что аминокислотные остатки распределены в определенном порядке. Таким образом, например, «полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2» относится к полипептиду, который имеет аминокислотную последовательность Met Asp Phe Thr… (пропущено)…Asp Leu Gln Arg, представленную в SEQ ID NO: 2, и который имеет размер 1337 аминокислотных остатков. Кроме того, в настоящем описании «полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2» часто сокращенно обозначают, например, как «полипептид с последовательностью SEQ ID NO: 2». ТО же применимо для выражения «состоящий из последовательности оснований».
[0023]
Термин «индуцирующая иммунитет активность» в используемом в настоящем изобретении смысле относится к способности активировать и приводить к размножению T-клеток, которые отвечают на злокачественные клетки, экспрессирующие белок PDS5A. В частности, индуцирующая иммунитет активность означает, что: IFN-γ-продуцирующая способность цитотоксических T-клеток и/или хелперных T-клеток, стимулированных белком PDS5A или его неполным полипептидом, выше, чем IFN-γ-продуцирующая способность нестимулированных контрольных T-клеток; цитотоксическая активность, направленная против злокачественных клеток, экспрессирующих белок PDS5A, цитотоксических T-клеток, стимулированных белком PDS5A или его неполным полипептидом, выше, чем в случае нестимулированных контрольных T-клеток; цитотоксическая активность хелперных T-клеток, стимулированных белком PDS5A или его неполным полипептидом, повышена по сравнению с цитотоксической активностью нестимулированных контрольных T-клеток; или цитотоксические T-клетки или хелперные T-клетки, стимулированные белком PDS5A или его неполным полипептидом, пролиферируют больше, чем нестимулированные контрольные T-клетки.
[0024]
Пролиферация клеток может быть подтверждена в результате: визуального наблюдения; подсчета клеток под микроскопом; проточной цитометрии; определения количества меченого тритием тимидина, включенного из среды в клетки; и тому подобного. Кроме того, можно осуществить измерение IFN-γ-продуцирующей способности, например, в известном анализе ELISPOT, и тому подобное. В частности, как будет описано в примерах ниже, например, T-клетки сначала культивируют совместно с полипептидом, индуцирующую иммунитет активность которого необходимо оценить (белок PDS5A или его неполный полипептид согласно настоящему изобретению), и антигенпрезентирующими клетками, полученными из мононуклеарных клеток периферической крови (далее называемых «PBMC»), чтобы обеспечить возможность T-клеткам контактировать с антигенпрезентирующими клетками, которые презентируют оцениваемый полипептид. Затем измеряют количество IFN-γ, продуцируемого T-клетками, используя антитело, специфичное для IFN-γ. Такой способ позволяет измерить количество иммунных клеток среди T-клеток. Затем индуцирующую иммунитет активность оценивают на основе полученных результатов измерений.
[0025]
51
Цитотоксическую активность можно оценить, например, при совместном культивировании T-клеток с полипептидом, цитотоксическую активность которого необходимо оценить (белком PDS5A или его неполным полипептидом, предлагаемом в настоящем изобретении), и антигенпрезентирующими клетками, полученными из PBMC, и затем анализируя проявляют ли T-клетки, или не проявляют способность подавлять пролиферацию опухолевых клеток или убивать опухолевые клетки (далее называемую «цитотоксической активностью») in vitro. Контактирование T-клеток и антигенпрезентирующих клеток можно достичь при совместном культивировании обоих типов клеток в жидкой среде, как будет описано далее. Измерение цитотоксической активности можно осуществить, например, известным способом, называемым анализом высвобождения Cr, описанным в Int. J. Cancer, 58: P 317, 1994.
[0026]
При введении T-клеток, индуцированных, как описано выше, в живой организм, несущий злокачественную опухоль, размер опухоли может уменьшиться, или опухоль может быть подвергнута регрессии вследствие цитотоксической активности T-клеток. Таким образом, Описанная выше индуцирующую иммунитет активность также можно оценивать по способности подавлять пролиферацию злокачественных клеток или по способности вызывать уменьшение размера или исчезновение злокачественной ткани (опухоли) (далее называемая «противоопухолевой активностью»).
[0027]
В случаях, когда описанный выше полипептид применяют для лечения или профилактики злокачественной опухоли, оценку индуцирующей иммунитет активности предпочтительно осуществляют, используя цитотоксическую активность или противоопухолевую активность в качестве показателя, хотя показатель особым образом не ограничен.
[0028]
Так как полипептид длиной примерно 7 или большего количества аминокислотных остатков может содержать эпитоп, и такой полипептид может проявлять антигенность и иммуногенность и может обладать индуцирующей иммунитет активностью, как хорошо известно в данной области, такой полипептид можно применять в качестве индуктора иммунитета согласно настоящему изобретению.
[0029]
Соответственно, полипептид (a) представляет собой полипептид, состоящий из 7 или большего количества непрерывно следующих друг за другом аминокислот, предпочтительно 8, 9 или 10 или больше непрерывно следующих друг за другом аминокислот в области положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 или положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2; и обладающий индуцирующей иммунитет активностью. Полипептид особенно предпочтительно имеет аминокислотную последовательность положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 или положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
[0030]
Принцип иммунной индукции при введении полипептида ракового антигена заключается в том, что полипептид включается в антигенпрезентирующую клетку и затем разрушается на более мелкие фрагменты пептидазами в клетке, и после этого фрагменты антигенного пептида презентируются на поверхности антигенпрезентирующей клетки. Известно, что цитотоксические T-клетки и тому подобные узнают антигены, презентированные на клеточной поверхности, и избирательно убивают злокачественные клетки, презентирующие антигены на клеточной поверхности. Кроме того, также известно, что хелперные T-клетки узнают антигены, презентированные на поверхности антигенпрезентирующих клеток, и усаливают индукцию цитотоксических T-клеток, которые избирательно убивают злокачественные клетки, презентирующие антигены на клеточной поверхности. Размер антигенного полипептида, презентированного на поверхности антигенпрезентирующей клетки, относительно небольшой и составляет примерно от 7 до 30 аминокислот. Таким образом, в отношении возможности того, что полипептид может быть презентирован на антигенпрезентирующих клетках полипептид (a) предпочтительно имеет примерно от 7 до 30 непрерывно следующих друг за другом аминокислот в аминокислотной последовательности положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 или положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. Достаточным является полипептид, состоящий примерно из 8-30, примерно 9-30 или примерно 9-25 аминокислот. Такие относительно небольшие полипептиды могут быть презентированы непосредственно на поверхности антигенпрезентирующих клеток без включения в клетки.
[0031]
Кроме того, так как полипептид, включенный в антигенпрезентирующую клетку расщепляется в случайных местах пептидазами в клетка с образованием различных фрагментов полипептида, и затем полученные в результате фрагменты полипептида презентируются на поверхности антигенпрезентирующей клетки, введение крупного полипептида, такого как полипептид, имеющий аминокислотную последовательность положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 или положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, неизбежно приводит к образованию фрагментов полипептида, активных в отношении индукции иммунитета через антигенпрезентирующие клетки, вследствие распада полипептида в антигенпрезентирующих клетках. Таким образом, крупный полипептид также может быть применим для индукции иммунитета посредством антигенпрезентирующих клеток. Например, можно использовать полипептид, состоящий из 30 или более аминокислот, предпочтительно из 40 или более, более предпочтительно из 50 или большего количества аминокислот и еще более предпочтительно из 100 или более аминокислот.
[0032]
Кроме того, полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть проверены с использованием средства для проверки, такого как Прогнозирование связывания пептидов HLA (Peptide Binding Predictions) (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.htmL) в Bioinformatics and Molecular Analysis Selection (BIMAS), или SYFPEITHI, которые могут искать пептидные эпитопы, состоящие из 8-25, предпочтительно из 9-24 и более предпочтительно из 9-23 аминокислот и имеющие мотивы связывания для молекул класса I или молекул класса II MHC (HLA у человека), которые описаны ниже, чтобы провести скрининг пептидов, которые могут представлять собой пептидные эпитопы. В частности, описанный выше полипептид представляет собой полипептид, состоящий из 7 или более непрерывно следующих друг за другом аминокислот в области положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 или положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. Примеры полипептида включают: полипептиды, представленные в SEQ ID NO: 3-67, и полипептиды, каждый из которых содержит в качестве неполной последовательности любой из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-67 и имеющих от 10 до 30 аминокислотных остатков. Среди полипептидов, представленных в SEQ ID NO: 3-67, и полипептидов, каждый из которых содержит в качестве неполной последовательности любой из полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-67 и имеющих от 10 до 30 аминокислотных остатков, индуцирующая иммунитет активность полипептидов, представленных в SEQ ID NO: 3-67, является следствием связывания с молекулами MHC класса I, и индуцирующая иммунитет активность полипептидов, представленных в SEQ ID NO: 35-67, является следствием связывания с молекулами MHC класса II.
[0033]
С другой стороны, полипептид (b) является полипептидом, содержащим одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или добавлений в аминокислотной последовательности полипептида (a), и обладает индуцирующей иммунитет активностью. Например, полипептид (b) включает полипептид, содержащий одну или несколько аминокислотных замен, делеций и/или добавлений в аминокислотной последовательности, представленной в любой из последовательностей SEQ ID NO: 3-67.
[0034]
Термин «несколько» в используемом в настоящем изобретении смысле относится к целому числу от 2 до 10, предпочтительно к целому числу от 2 до 6, более предпочтительно к целому числу от 2 до 4, и еще более предпочтительно к целому числу 2 или 3.
[0035]
В общем, подразумевают, что модификация одной или нескольких аминокислот в полипептиде не влияет на функции исходного полипептида; а некоторых случаях полагают, что такая модификация даже усиливает необходимую функцию исходного полипептида. Действительно, известно, что модифицированный пептид, содержащий от одной до нескольких модификаций (а именно, замен, делеций, добавлений и/или инсерций) в аминокислотной последовательности исходной аминокислотной последовательности, сохраняет биологическую активность исходного пептида (Mark et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5662-5666, Zoller and Smith, 1982, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6500, Dalbadie-McFarland et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 79: 6409-6413). Соответственно, полипептид (b) также может проявлять индуцирующую иммунитет активность, и таким образом, может быть использован для получения индуктора иммунитета согласно настоящему изобретению.
[0036]
20 типов аминокислот, составляющих встречающиеся в природе белки, могут быть классифицированы на группы аминокислот со сходными свойствами, такие как, например: нейтральные аминокислоты с боковыми цепями, имеющими низкую полярность (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met и Pro); нейтральные аминокислоты, имеющие гидрофильные боковые цепи (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr и Cys); кислые аминокислоты (Asp и Glu), основные аминокислоты (Arg, Lys и His); и ароматические аминокислоты (Phe, Tyr и Trp). Во многих случаях известно, что замены аминокислот в пределах одной и той же группы не изменяют свойства полипептида. Таким образом, в тех случаях, когда аминокислотный остаток(ки) в полипептида (a) согласно настоящему изобретению заменен, замену(ны) предпочтительно осуществляют в пределах одной и той же группы, так как при этом повышается вероятность сохранения индуцирующей иммунитет активности.
[0037]
Кроме того, полипептид (b) может представлять собой полипептид, который имеет идентичность последовательности 90% или больше, предпочтительно 95% или больше, более предпочтительно 98% или больше и еще более предпочтительно 99% или больше или 99,5% или больше с аминокислотной последовательностью положений 24-97, положений 113-132, положений 134-197, положений 204-225, положений 265-332, положений 378-463, положений 472-498, положений 533-567, положений 613-643, положений 671-735, положений 737-780, положений 792-830, положений 832-899, положений 920-943, положений 946-993, положений 1029-1069 или положений 1074-1215 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и которые обладает индуцирующей иммунитет активностью.
[0038]
В используемом в настоящем описании смысле термин «идентичность последовательности» между аминокислотными последовательностями (или последовательностями оснований) относится к значению в процентах, полученному посредством: выравнивания двух сравниваемых аминокислотных последовательностей (или последовательностей оснований), так чтобы максимизировать количество совпадающих аминокислотных остатков (или оснований) между аминокислотными последовательностями (или последовательностями оснований); и деления количества совпадающих аминокислотных остатков (или количества совпадающих оснований) на общее количество аминокислотных остатков (или общее количество оснований). Если требуется, при выравнивании последовательностей, пробел (пробелы) встраивают в одну или обе последовательности, которые необходимо сравнить. Такое выравнивание последовательностей может быть осуществлено с использованием известной программы, такой как BLAST, FASTA или CLUSTAL W. В случаях, когда встраивают пробел (пробелы), указанное выше общее количество аминокислотных остатков представляет собой количество остатков, полученных с учетом одного пробела как одного аминокислотного остатка. Когда такое подсчитанное общее количество аминокислотных остатков отличается в двух сравниваемых последовательностях, идентичность последовательностей (%) вычисляют делением количества совпадающих аминокислотных остатков на общее количество аминокислотных остатков в более длинной последовательность.
[0039]
При применении в связи с лечением или профилактикой злокачественной опухоли полипептид согласно настоящему изобретению должен экспрессироваться на поверхности клетки или экзосомы, предпочтительно в виде комплекса пептида и любого из различных классов HLA. Соответственно, предпочтительно выбрать пептид, обладающий не только индуцирующей иммунитет активностью, но также и высокой аффинностью связывания с различными классами HLA. С указанной целью пептид может быть модифицирован в результате замены, инсерции, делеции и/или добавления аминокислотного остатка(ов), чтобы получить модифицированный пептид, обладающий улучшенной аффинностью связывания. Так как порядок последовательностей пептидов, презентируемых посредством связывания с различными классами HLA, известен, в дополнение к порядку презентируемых в природе пептидов (J. Immunol., 1994, 152: 3913; Immunogenetics, 1995, 41: 178; J. Immunol., 1994, 155: 4307), можно ввести модификацию, основанную на таком порядке, в иммуногенный пептид согласно настоящему изобретению. Например, замена второй аминокислоты на N-конце лейцином или метионином и/или замена аминокислоты на C-конце валином или лейцином может быть желательной в целях улучшения аффинности связывания с HLA-A24. Соответственно, пептид, имеющий аминокислотную последовательность любой из последовательностей SEQ ID NO: 20-34, в котором вторая аминокислота на N-конце заменена лейцином или метионином и/или аминокислота на C-конце заменена валином или лейцином, также входит в объем настоящего изобретения.
[0040]
Замены могут быть введены не только по концевым аминокислотам, но также в потенциальный сайт (сайты) регуляции TCR пептидов. В нескольких исследованиях показано, что пептид с аминокислотными заменами обладает такими же или улучшенными свойствами, по сравнению с исходным пептидом, и примеры пептида с аминокислотными заменами включают CAP1, p53 (264-272), Her-2/neu (369-377) и gp100 (209-217) (Zaremba et al., 1997, Cancer Res. 57: 4570-4577, T. K. Hoffmann et al. 2002, J. Immunol. 168 (3): 1338-47, S. O. Dionne et al. 2003, Cancer Immunol. Immunother. 52: 199-206, и S. O. Dionne et al. 2004, Cancer Immunology, Immunotherapy, 53: 307-314).
[0041]
В дополнение к описанным выше модификациям также можно связывать полипептид согласно настоящему изобретению с другим веществом(ами), при условии, что получаемый в результате связанный полипептид сохраняет необходимую индуцирующую иммунитет активность исходного пептида. Примеры других веществ включают без ограничения пептиды, липиды, сахара и цепи сахаров, ацетильные группы и природные и синтетические полимеры. Пептид также может содержать модификацию, такую как гликозилирование, окисление боковой цепи или фосфорилирование, при условии, что биологическая активность исходного пептида не нарушена вследствие модификации. Указанные типы модификаций могут быть осуществлены для придания дополнительных функций (таких как функция таргетинга и функция доставки) полипептиду или для стабилизации полипептида. Например, в данной области известно введение D-аминокислоты, миметика аминокислоты или неприродной аминокислоты в полипептид для усиления его стабильности in vivo; и такой принцип можно использовать в полипептидах согласно настоящему изобретению. Стабильность полипептида можно анализировать несколькими способами. Например, стабильность можно тестировать, используя пептидазы, а также различные типа биологических сред, таких как плазма и сыворотка человека (смотри, например, Verhoef et al., 1986, Eur. J. Drug Metab. Pharmacokin., 11: 291-302).
[0042]
Кроме того, полипептид согласно настоящему изобретению может быть связан с другим пептидом(ами) посредством спейсера(ов) или линкера(ов). Примеры другого пептида включают без ограничения эпитопные пептиды, полученные из других полипептидов. Альтернативно, два или более полипептидов согласно настоящему изобретению могут быть связаны через спейсер(ры) или линекер(ры). Пептиды, которые связывают спейсером(ами) или линекером(ами), могут быть одинаковыми или могут отличаться друг от друга. Типы спейсера и линкера особым образом не ограничены, и их примеры включают спейсер и линкер, состоящий из пептидов, более предпочтительно состоящий из пептидов, имеющих один или несколько сайтов расщепления, которые можно расщепить ферментами, такими как пептидазы, протеазы и протеосомы. Линкером или спейсером может быть, например, AAY (P. M. Daftarian et al., J. Trans. Med., 2007, 5:26), AAA, NKRK (R. P. M. Sutmuller et al., J. Immunol. 2000, 165: 7308-7315), или от одного до нескольких остатков лизина (S. Ota et al., 2002, Can. Res. 62: 1471-1476, K. S. Kawamura et al., 2002, J. Immunol. 168: 5709-5715), но без ограничения указанными примерами. В настоящем изобретении предлагается полипептид, связанный с другим пептидом(ами) через спейсер(ры) или линекер(ры).
[0043]
В случаях, когда полипептиды согласно настоящему изобретению содержат остатки цистеина, такие полипептиды имеют тенденцию образовывать димеры за счет дисульфидных связей между SH-группами остатков цистеина. Таким образом, димеры таких полипептидов также включены полипептиды согласно настоящему изобретению.
[0044]
Полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть получены с применением известных методик. Например, полипептиды могут быть синтезированы способом химического синтеза, таким как Fmoc-способ (способ на основе флуоренилметилоксикарбонила) или tBoc-способ (способ на основе т-бутилоксикарбонила). Кроме того, они могут быть синтезированы обычными способами с использованием различных типов коммерчески доступных синтезаторов пептидов.
[0045]
Кроме того, представляющий интерес полипептид может быть получен с использованием известных способов генетической инженерии посредством: получения полинуклеотида, кодирующего указанный выше полипептид; включения полинуклеотида в экспрессирующий вектор; введения вектора в клетку-хозяина; и затем обеспечения возможности для продуцирования представляющего интерес полипептида в клетке-хозяине. При получении представляющего интерес полипептида из клеток-хозяев полипептид может быть очищен или выделен так, чтобы полипептид по существу не включал других встречающихся в природе белков и их фрагментов из клеток-хозяев или других произвольных химических веществ.
[0046]
Полинуклеотид, кодирующий описанный выше полипептид, может быть легко получен известным способом генетической инженерии или обычным способом с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновых кислот. Например, ДНК, имеющая последовательность оснований SEQ ID NO: 1, может быть получена в ПЦР с использованием хромосомной ДНК человека или библиотеки кДНК в качестве матрицы и пары праймеров, сконструированных для амплификации последовательности оснований, представленной в SEQ ID NO: 1. Условия реакции для ПЦР могут быть установлены соответствующим образом, и примеры включают без ограничения повторение цикла, состоящего из реакций при: 94°C в течение 30 секунд (денатурация), 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты (отжиг) и 72°C в течение 2 минут (удлинение) в ходе 30 циклов с последующей реакцией при 72°C в течение 1 минуты. Кроме того, требуемая ДНК может быть выделена с использованием получения подходящего зонда(ов) или праймера(ов) на основе информации о последовательности оснований, представленной в SEQ ID NO: 1, и аминокислотной последовательности, и скрининга библиотеки кДНК человека или тому подобной с использованием зонда(ов) или праймера(ов). Библиотеку кДНК предпочтительно получают из клетки, органа или ткани, экспрессирующей белок с последовательностью SEQ ID NO: 2. Описанные выше операции, такие как получение зонда(ов) или праймера(ов), конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование представляющего интерес гена, известны специалистам в данной области и могут быть осуществлены согласно способам, описанным, например, в Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Fourth Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Current Protocol in Molecular Biology: www.currentprotocols.com; и тому подобных публикациях. Из полученной таким образом ДНК может быть получена ДНК, кодирующая полипептид (a). Кроме того, так известны кодоны, кодирующие каждую аминокислоту, последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего конкретную аминокислотную последовательность, может быть легко установлена. Соответственно последовательность оснований полинуклеотида, кодирующего описанный выше полипептид (b), также может быть легко установлена, и таким образом, такой полинуклеотид также может быть синтезирован с использованием коммерчески доступного синтезатора нуклеиновой кислоты согласно обычному способу.
[0047]
Клеткой-хозяином может быть любая клетка, при условии, что она может экспрессировать описанный выше полипептид. Примеры прокариотических клеток включают без ограничения E. coli; и примеры эукариотических клеток включают без ограничения культивируемые клетки млекопитающих, включая клетки почки обезьяны COS-1 и клетки яичника китайского хомячка CHO; почкующиеся дрожжи; делящиеся дрожжи; клетки шелкопряда; и яйцеклетки Xenopus laevis.
[0048]
В случаях, когда в качестве клетки-хозяина используют прокариотическую клетку, используют экспрессирующий вектор, содержащий начало, которое обеспечивает его репликацию в прокариотической клетке, промотор, сайт связывания рибосомы, сайт ДНК-клонирования, терминатор и т.д.. Примеры экспрессирующего вектора для E. coli включают систему pUC, pBluescript II, систему экспрессии pET и систему экспрессии pGEX. Полипептид, кодируемый ДНК, может быть экспрессирован в прокариотической клетке-хозяине посредством включения ДНК, кодирующей описанный выше полипептид, в экспрессирующий вектор, трансформации прокариотической клетки-хозяина таким вектором и затем культивирования полученного в результате трансформанта. В таком способе полипептид также может быть экспрессирован в виде белка, слитого с другим белком.
[0049]
В тех случаях, когда в качестве клетки-хозяина используют эукариотическую клетку, используют экспрессирующий вектор для эукариотических клеток, содержащий промотор, сайт сплайсинга, сайт присоединения поли(A) и т.д. Примеры такого экспрессирующего вектора включают вектор pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3, pMSG и pYES2. Таким же образом, который описан выше, полипептид, кодируемый ДНК, может быть экспрессирован в эукариотической клетке-хозяине посредством включения ДНК, кодирующей описанный выше полипептид, в такой экспрессирующий вектор, трансформации эукариотической клетки-хозяина в такой вектор и затем культивирования полученного в результате трансформанта. В случаях, когда pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 или тому подобный используют в качестве экспрессирующего вектора, описанный выше полипептид может быть экспрессирован в виде слитого белка, к которому добавляют различные типы меток, такие как His-метка, FLAG-метка, myc-метка, HA-метка и GFP.
[0050]
Введение экспрессирующего вектора в клетку-хозяина можно осуществить известным способом, таким как электропорация, способ на основе фосфата кальция, способ на основе липосом или способ на основе DEAE-декстрана.
[0051]
Представляющий интерес полипептид может быть выделен и очищен из клеток-хозяев с использованием сочетания известных способов разделения. Примеры известных способов разделения включают без ограничения: обработку денатурирующим агентом, таким как мочевина, или поверхностно-активным веществом; обработку ультразвуком; расщепление ферментами; высаливание или осаждение фракций растворителями; диализ; центрифугирование; ультрафильтрацию; гель-фильтрацию; SDS-ПААГ; изоэлектрическое фокусирование; ионообменную хроматографию; гидрофобную хроматографию; аффинную хроматографию; и обращено-фазовую хроматографию.
[0052]
Полипептиды, полученные описанным выше способом, также включают, как указано выше, полипептиды в виде белка, слитого с другим произвольным белком. Примеры полипептидов включают слитые белки с глутатион-S-трансферазой (GST) и белки, слитые с His-меткой. Соответственно, такой полипептид в форме слитого белка также включен в объем настоящего изобретения. Кроме того, полипептид, экспрессированный в трансформированной клетке, может быть модифицирован посттрансляционно различными путями. Такой посттрансляционно модифицированный полипептид также включен в объем настоящего изобретения, при условии, что он обладает индуцирующей иммунитет активностью. Примеры такой посттрансляционной модификации включают: удаление N-концевого метионина; N-концевое ацетилирование; гликозилирование; ограниченное расщепление внутриклеточной протеазой; миристоилирование; изопренилирование и фосфорилирование.
ИНДУКТОР ИММУНИТЕТА
Уже существующая опухоль может быть подвергнута регрессии при введении полипептида, обладающего индуцирующей иммунитет активностью согласно настоящему изобретению, или экспрессирующего вектора, содержащего ген, кодирующий полипептид, в живой организм, несущий злокачественную опухоль. Кроме того, появление опухоли можно предотвратить введением описанного выше полипептида, обладающего индуцирующей иммунитет активностью, или гена, кодирующего полипептид, в живой организм до появления злокачественной опухоли. Соответственно, полипептид согласно настоящему изобретению или ген, кодирующий полипептид, можно применять в качестве активного ингредиента в индукторе иммунитета.
[0053]
Каждый из терминов «опухоль» и «злокачественная опухоль», используемых в настоящем описании, относится к злокачественной неоплазии, и термины использованы взаимозаменяемо. В данном случае злокачественной опухолью, подвергаемой лечению, предпочтительно является злокачественная опухоль, экспрессирующая белок PDS5A, и более предпочтительно лейкоз, злокачественная лимфома, рак простаты, рак печени, рак молочной железы, рак поджелудочной железы, рак яичника, рак почки, рак прямой и ободочной кишки, рак желудка, злокачественная опухоль головного мозга, рак легкого или рак пищевода.
[0054]
Животным предпочтительно является млекопитающее, более предпочтительно такое млекопитающее, как примат, домашний питомец, домашнее животное или спортивное животное, еще более предпочтительно человек, собака или кошка, и особенно предпочтительно человек.
[0055]
Пораженный злокачественной опухолью индивидуум (пациент со злокачественной опухолью, в тех случаях, когда индивидуумом является человек), подвергаемый лечению, предпочтительно является пораженным злокачественной опухолью индивидуумом, злокачественные клетки у которого экспрессируют белок PDS5A in vivo. В частности, предпочтительным является пораженный злокачественной опухолью индивидуум, подвергнутый скринингу способом выявления злокачественной опухоли, описанном в WO 2011/027807. В частности, пораженным злокачественной опухолью индивидуумом предпочтительно является индивидуум, отобранный при скрининге на основании того факта, что уровни экспрессии антител против белка PDS5A, находящегося в образце, полученном из данного живого организма, выше по сравнению с уровнями экспрессии антител, содержащихся в образце, полученном от здорового индивидуума. Примеры образца, используемого для скрининга пораженных злокачественной опухолью индивидуумов, которых необходимо лечить, включают жидкости организма, такие как кровь, сыворотка, плазма, асциты и плевральный выпот; ткани и клетки. В тех случаях, когда скрининг осуществляют, измеряя уровни экспрессии антител против белка PDS5A, образец предпочтительно представляет собой сыворотку, плазму, асцит и плевральный выпот.
[0056]
Введение индуктора иммунитета согласно настоящему изобретению можно осуществлять либо перорально, либо парентерально. Однако предпочтительными путями введения являются парентеральные пути введения, такие как внутримышечное введение, подкожное введение, внутривенное введение и внутриартериальное введение. В тех случаях, когда индуктор иммунитета применяют для лечения злокачественной опухоли, его можно вводить в регионарный лимфатический узел вблизи опухоли, подвергаемой лечению, чтобы усилить его противоопухолевую активность. Индуктор иммунитета можно вводить в любом дозированном количестве, эффективным для индукции иммунитета. Например, в случаях, когда индуктор иммунитета применяют для лечения или профилактики злокачественной опухоли, средство можно вводить в количестве, эффективном для лечения или профилактики злокачественной опухоли. Количество, эффективное для лечения или профилактики злокачественной опухоли, может быть выбрано соответствующим образом, в зависимости от размера опухоли, симптомов, массы тела и объема данного животного и тому подобного. В случаях, когда животным является человек, эффективное количество обычно составляет от 0,0001 до 1000 мкг и предпочтительно от 0,001 до 1000 мкг в сутки. Описанное выше дозированное количество можно вводить в виде единичной дозы или в виде нескольких дробных доз. Указанное выше дозированное количество дробят и вводят несколько раз в сутки, и введение осуществляют каждые несколько дней или несколько месяцев. Как будет конкретно описано в примерах ниже, индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению может приводить к регрессу уже образованной опухоли. Таким образом, поскольку индуктор иммунитета также может проявлять свою противоопухолевую активность также против небольшого количества злокачественных клеток на ранних стадия, развитие или рецидив злокачественной опухоли можно предотвратить с использованием средства до появления или после лечения злокачественной опухоли. Другими словами, индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению применим как для лечения, так и для профилактики злокачественной опухоли и может быть применен в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли.
[0057]
Индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению содержит в качестве активного ингредиента описанный выше полипептид согласно настоящему изобретению и может состоять из одного полипептида или из сочетания множества полипептидов. При сочетании множества полипептидов согласно настоящему изобретению индуцирующая иммунитет активность (активность в отношении индукции и активации цитотоксических T-клеток) каждого из полипептидов усиливается и может быть осуществлено более эффективное лечение или профилактика злокачественной опухоли.
[0058]
Индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению также можно применять в сочетании с известным пептидом(ами), способным индуцировать цитотоксические T-клетки. При сочетании полипептида(ов) согласно настоящему изобретению с таким известным пептидом(ами) индуцирующая иммунитет активность (активность в отношении индукции и активации цитотоксических T-клеток) каждого из полипептидов усиливается, и может быть осуществлено более эффективное лечение или профилактика злокачественной опухоли. Термин «сочетание» в используемом в данном случае смысле включает случай, когда индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению и известный пептид(ды), способный индуцировать цитотоксические T-клетки, вводят раздельно или одновременно. Выражение «вводимые раздельно» в используемом в настоящем описании смысле означает, что индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению и известный пептид(ды), способный индуцировать цитотоксические T-клетки, вводят по-отдельности в разных временных точках с определенным интервалом времени между введениями. Порядок введения не ограничен. С другой стороны, выражение «вводимые одновременно» означает, что индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению и известный пептид(ды), способный индуцировать цитотоксические T-клетки, смешивают заранее и вводят в форме смеси, или что индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению и известный пептид(ды), способный индуцировать цитотоксические T-клетки, вводят в раздельных формах, но в одно и то же время без какого-либо временного интервала.
[0059]
Индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению можно применять в сочетании с другим иммуностимулятором, способным усиливать иммунный ответ in vivo. Другой иммуностимулятор может быть включен в индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению или может быть введен пациенту в виде отдельной композиции при комбинированном введении с индуктором иммунитета согласно настоящему изобретению.
[0060]
«Другой иммуностимулятор» включает, например, адъювант. Адъювант может усиливать иммунный ответ за счет обеспечения источника антигенов (внеклеточно или в макрофагах), активировать макрофаги и стимулировать конкретные группы лимфоцитов, так чтобы усилить противоопухолевую активность. Таким образом, в тех случаях, когда индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению применяют в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли, индуктор иммунитета предпочтительно дополнительно содержит адъювант кроме полипептида согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента. В данной области известно множество типов адъювантов, и можно применять любой из таких адъювантов. Конкретные примеры адъювантов включают MPL (SmithKline Beecham), аналоги липополисахарида Salmonella minnesota Re 595, полученного после очистки и кислотного гидролиза липополисахарида; QS21 (SmithKline Beecham), чистый сапонин QA-21, очищенный из экстракта Quillja saponaria; DQS21, описанный в заявке PCT WO 96/33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 и QS-L1 (So, H. S., et al., «Molecules and cells», 1997, 7: 178-186); неполный адъювант Фрейнда; полный адъювант Фрейнда; витамин E; монтанид; квасцы; CpG-олигонуклеотиды (смотри, например, Kreig, A. M., et al., 1995, Nature 374: 546-549); поли-I:C и их производные (такие как поли-ICLC); и различные эмульсии типа «вода в масле», полученные из биологически разрушаемых масел, такие как сквален и/или токоферол. Среди указанных адъювантов предпочтительными являются неполный адъювант Фрейнда; монтанид; поли-I:C и его производные; и CpG-олигонуклеотиды. Соотношение в смеси описанного выше адъюванта и полипептида обычно составляет примерно от 1:10 до 10:1, предпочтительно примерно от 1:5 до 5:1 и более предпочтительно примерно 1:1. Однако адъювант не ограничен описанными выше примерами, и также можно использовать любой другой адъювант, известный в данной области, отличный от адъювантов, описанных выше, при введении индуктора иммунитета согласно настоящему изобретению (смотри, например, Goding, «Monoclonal Antibodies: Principles and Practice», 2nd edition, 1986). Способы приготовления смеси или эмульсии индуктора иммунитета и адъюванта хорошо известны специалистам в области вакцинации.
[0061]
Кроме того, в дополнение к описанным выше адъювантам в качестве другого иммуностимулятора можно использовать факторы, которые стимулируют иммунный ответ субъекта. Например, любой из различных типов цитокинов, обладающих свойством стимулировать лимфоциты и/или антигенпрезентирующие клетки, можно использовать в качестве иммуностимулятора в сочетании с индуктором иммунитета согласно настоящему изобретению. Ряд таких цитокинов, способных усиливать иммунный ответ, известны специалистам в данной области, и примеры включают без ограничения интерлейкин-12 (IL-12), GM-CSF, IL-18, интерферон-α (IFN-α), интерферон-β (IFN-β), интерферон-ω (IFN-ω), интерферон-γ (IFN-γ) и лиганд Flt3, которые, как было показано, усиливают защитное действие вакцин. Любой из таких факторов также можно использовать в качестве описанного выше иммуностимулятора и можно вводить пациенту в сочетании с индуктором иммунитета согласно настоящему изобретению, либо включать в индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению, либо вводить в виде отдельной композиции.
СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАТКИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ
Индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению можно применять в качестве активного ингредиента в средстве для лечения или профилактики злокачественной опухоли.
[0062]
Средство для лечения или профилактики злокачественной опухоли может быть приготовлено смешиванием соответствующим образом индуктора иммунитета согласно настоящему изобретению с добавкой(ами), такой как фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или эксципиент, подходящий для каждой дозированной формы.
[0063]
Способы приготовления препаратов и добавки, которые можно использовать, известны в области приготовления фармацевтических препаратов, и можно применять любой из способов и любые добавки. Конкретные примеры добавок включают без ограничения: разбавители, такие как физиологические буферные растворы; эксципиенты, такие как сахар, лактоза, кукурузный крахмал, фосфат кальция, сорбит и глицин; связывающие средства, такие как сироп, желатин, аравийская камедь, сорбит, поливинилхлорид и трагакантовая камедь; и скользящие вещества, такие как стеарат магния, полиэтиленгликоль, тальк и диоксид кремния. Примеры дозированных форм включают пероральные препараты, такие как таблетки, капсулы, гранулы, порошки и сиропы; и парентеральные препараты, такие как ингалируемые средства, инъекционные растворы, суппозитории и растворы. Такие препараты могут быть получены общеизвестными способы приготовления.
АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИЕ КЛЕТКИ
Полипептид может быть презентирован антигенпрезентирующими клетками в результате приведения описанного выше полипептида в контакт с антигенпрезентирующими клетками in vitro. Другими словами, описанный выше полипептид (a) или (b) можно применять в качестве средства для обработки антигенпрезентирующих клеток. В качестве антигенпрезентирующих клеток предпочтительно можно использовать дендритные клетки или B-клетки, имеющие молекулы MHC класса I и молекулы MHC класса II. Было идентифицировано и известно множество молекул MHC класса I и класса II. Молекулы MHC у человека называют HLA.
[0064]
Примеры молекул HLA класса I включают HLA-A, HLA-B и HLA-C. Более конкретные примеры молекул HLA класса I включают HLA-A, HLA-B и HLA-C; и еще более конкретные их примеры включают HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401 и HLA-Cw0602.
[0065]
Примеры молекул HLA класса II включают HLA-DR, HLA-DQ и HLA-DP; и более конкретные примеры таких молекул включают HLA-DRB1*01, HLA-DRB1*03, HLA-DRB1*04, HLA-DRB1*0405, HLA-DRB1*07, HLA-DRB1*08, HLA-DRB1*11, HLA-DRB1*13, HLA-DRB1*15, HLA-DRB1*15, HLA-DQA1, HLA-DQB1 и HLA-DPB1.
[0066]
Дендритные клетки или B-клетки, имеющие молекулы HLA класса I или HLA класса II, могут быть получены из крови или тому подобного хорошо известным способом. Например, специфичные для опухоли дендритные клетки могут быть индуцированы в результате индукции дендритных клеток из костного мозга, пуповинной крови или периферической крови пациента с использованием колониестимулирующего фактора гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF) и IL-3 (или IL-4) и затем добавления связанного с опухолью пептида в систему культивирования.
[0067]
2
Иммунный ответ, необходимый для лечения злокачественной опухоли, может быть индуцирован введением эффективного количества полученных таким образом дендритных клеток. Используемые клетки могут быть получены из костного мозга или пуповинной крови здорового индивидуума или костного мозга или периферической крови или тому подобного от самого пациента. Использование аутологичных клеток полученных от самого пациента, является предпочтительным, поскольку они в высокой степени безопасны и, как ожидается, позволяют избегать серьезных побочных эффектов. Периферическая кровь или костный мозг могут быть либо в виде свежего образца, либо хранимого в холоде образца, либо замороженного образца. Периферическая кровь может быть получена с использованием культивирования цельной крови или культивирования отдельных лейкоцитарных компонентов, и последнее является более эффективным и, следовательно, предпочтительным. Кроме того, из лейкоцитарных компонентов могут быть отделены мононуклеарные клетки. В случаях, когда используемые клетки представляют собой клетки, полученные костного мозга или пуповинной крови, могут быть культивированы все клетки, составляющие костный мозг, или мононуклеарные клетки могут быть отделены и подвергнуты культивированию. Периферическая кровь, ее лейкоцитарные компоненты и клетки костного мозга содержат мононуклеарные клетки, гематопоэтические стволовые клетки и незрелые дендритные клетки, из которых происходят дендритные клетки, а также CD4-позитивные клетки и тому подобные. Не существует особого ограничения способа получения используемых цитокинов, и может быть использован любой цитокин, либо природный, либо рекомбинантный, при условии, что подтверждена его безопасность и физиологическая активность. Предпочтительно использование препарата гарантированного качества для медицинского применения в минимальном необходимом количестве. Концентрация добавляемого цитокина(ов) особым образом не ограничена, при условии, что она может индуцировать дендритные клетки. Обычно общая концентрация цитокина(ов) предпочтительно составляет примерно от 10 до 1000 нг/мл и более предпочтительно примерно от 20 до 500 нг/мл. Культивирование может быть осуществлено с использованием хорошо известной среды, обычно применяемой для культивирования лейкоцитов. Температура культивирования особым образом не ограничена, при условии, что она позволяет размножаться лейкоцитам; однако температура примерно 37°C, которая равна температуре тела человека, является наиболее предпочтительной. Кроме того, атмосферная среда во время культивирования особым образом не ограничена, при условии, что она позволяет размножаться лейкоцитам; однако предпочтителен приток 5% CO. Период времени культивирования особым образом не ограничен, при условии, что необходимо количество клеток может быть индуцировано в течение такого периода. Культивирование обычно осуществляют в течение периода от 3 дней до 2 недель. Оборудование, используемое для разделения и культивирования клеток, может быть выбрано соответствующим образом. Предпочтительным является оборудование, безопасность применения которого для медицинского применения была подтверждена, и которое может работать стабильно и просто. Что касается оборудования для культивирования клеток, то можно использовать, в частности, не только обычные емкости, такие как чашка Петри, колба или флакон, но и многослойный сосуд, многокамерный сосуд, роллерный флакон, вращаемый флакон, ссуд для культивирования в форме мешка, колонку с полыми волокнами или тому подобное.
[0068]
3
7
4
6
2
Приведение описанного выше полипептида в контакт с антигенпрезентирующими клетками in vitro можно осуществить хорошо известным способом. Например, контакт можно осуществить, культивируя антигенпрезентирующие клетки в культуральной среде, содержащей описанный выше полипептид. Концентрация пептида в среде особым образом не ограничена и обычно составляет примерно от 1 до 100 мкг/мл, и предпочтительно примерно от 5 до 20 мкг/мл. Плотность клеток во время культивирования особым образом не ограничена и обычно составляет примерно от 10 до 10 клеток/мл и предпочтительно примерно от 5×10 до 5×10 клеток/мл. Культивирование предпочтительно осуществляют при 37°C в атмосфере 5% CO согласно обычному способу. Максимальная длина пептида, который может быть презентирован на поверхности антигенпрезентирующих клеток обычно составляет примерно 30 аминокислотных остатков. Таким образом, в тех случаях, когда антигенпрезентирующие клетки приводят к контакту с полипептидом in vitro, может быть получен такой полипептид, чтобы его длина была не больше чем примерно 30 аминокислотных остатков, но особым образом он не ограничен.
[0069]
При культивировании антигенпрезентирующих клеток с описанным выше полипептидом полипептид включается в молекулы MHC антигенпрезентирующих клеток и презентируется на поверхности антигенпрезентирующих клеток. Таким образом, изолированные антигенпрезентирующие клетки, содержащие комплекс полипептида и молекулы MHC, могут быть получены с использованием описанного выше полипептида. Такие антигенпрезентирующие клетки могут презентировать полипептид T-клеткам in vivo или in vitro, индуцировать цитотоксические T-клетки или хелперные T-клетки, специфичные для полипептида, и приводить к размножению таких клеток.
[0070]
2
Посредством приведения полученных таким образом антигенпрезентирующих клеток, содержащих комплекс описанного выше полипептида и молекулы MHC, в контакт с T-клетками in vitro можно индуцировать цитотоксические T-клетки или хелперные T-клетки, специфичные для полипептида и обеспечить возможность пролиферации таких клеток. Указанного эффекта можно достичь в результате совместного культивирования антигенпрезентирующих клеток и T-клеток в жидкой среде. Например, такое совместное культивирование можно осуществить, суспендируя антигенпрезентирующие клетки в жидкой среде, помещая полученную в результате суспензию в такой сосуд, как лунки планшета для микротитрования, добавляя в лунки T-клетки и затем культивируя клетки. Соотношение для смешивания антигенпрезентирующих клеток и T-клеток при совместном культивировании таких клеток особым образом не ограничено и обычно составляет примерно от 1:1 до 1:100 и предпочтительно примерно от 1:5 до 1:20 в пересчете на количество клеток. Плотность антигенпрезентирующих клеток, суспендируемых в жидкой среде, особым образом не ограничено и обычно составляет примерно от 100 до 10 миллионов клеток/мл и предпочтительно примерно от 10000 до 1 миллиона клеток/мл. Совместное культивирование предпочтительно осуществляют при 37°C в атмосфере 5% CO согласно обычному способу. Период времени для культивирования особым образом не ограничен и обычно составляет примерно от 2 суток до 3 недель и предпочтительно примерно от 4 суток до 2 недель. Кроме того, совместное культивирование предпочтительно осуществляют в присутствии одного или нескольких типов интерлейкинов, таких как IL-2, IL-6, IL-7 и/или IL-12. В таких случаях концентрация IL-2 или IL-7 обычно составляет примерно от 5 до 20 единиц/мл, концентрация IL-6 обычно составляет примерно от 500 до 2000 единиц/мл и концентрация IL-12 обычно составляет примерно от 5 до 20 нг/мл, но не ограничена указанными значениями. Описанное выше совместное культивирование можно повторять один или несколько раз, добавляя свежие антигенпрезентирующие клетки. Например, операцию удаления культурального надосадка после совместного культивирования и добавления свежей суспензии антигенпрезентирующих клеток для осуществления следующего совместного культивирования можно повторять один или несколько раз. Условия для каждого совместного культивирования могут быть такими же, как описано выше.
[0071]
Описанное выше совместное культивирование обеспечивает возможность индукции и пролиферации цитотоксических T-клеток и хелперных T-клеток, специфичных для полипептида. Таким образом, изолированные T-клетки, которые избирательно связываются с комплексом полипептида и молекулы MHC, могут быть получены с применением описанного выше полипептида.
[0072]
Как будет описано в примерах ниже, ген (ген PDS5A), кодирующий белок PDS5A, специфично экспрессируется в: лейкоцитах при лейкозе, в тканях злокачественной лимфомы, клетках злокачественной лимфомы, тканях злокачественных опухолей простаты, злокачественных клетках простаты, тканях злокачественных опухолей печени, злокачественных клетках печени, тканях злокачественных опухолей молочной железы, злокачественных клетках молочной железы, тканях злокачественных опухолей поджелудочной железы, злокачественных клетках поджелудочной железы, тканях злокачественных опухолей яичника, злокачественных клетках яичника, тканях злокачественных опухолей почек, злокачественных клетках почек, тканях злокачественных опухолей прямой и ободочной кишки, злокачественных клетках прямой и ободочной кишки, тканях злокачественных опухолей желудка, злокачественных клетках желудка, тканях злокачественных опухолей головного мозга, злокачественных клетках головного мозга, тканях злокачественных опухолей легкого, злокачественных клетках легкого, тканях злокачественных опухолей пищевода и злокачественных клетках пищевода. Таким образом, полагают, что значительно большее количество белка PDS5A присутствует в клетках таких типов злокачественных опухолей, чем в нормальных клетках. Когда цитотоксические T-клетки или хелперные T-клетки, полученные как описано выше, вводят в живой организм в то время, как часть белка PDS5A, присутствующего в злокачественных клетках, презентирована молекулами MHC на поверхности злокачественных клеток, присутствующий белок служит в качестве маркера, позволяя цитотоксическим T-клеткам повреждать злокачественные клетки или усиливать цитотоксическую активность цитотоксических T-клеток. Так как антигенпрезентирующие клетки, презентирующие описанный выше полипептид, также могут индуцировать и способствовать размножению цитотоксических T-клеток и хелперных T-клеток, специфичных для полипептида, in vivo, введение антигенпрезентирующих клеток в живой организм также может позволять цитотоксическим T-клеткам повреждать злокачественные клетки или усиливать цитотоксическую активность цитотоксических T-клеток. Другими словами, цитотоксические T-клетки и хелперные T-клетки, а также антигенпрезентирующие клетки, полученные с использованием описанного выше полипептида, также применимы в качестве средств для лечения или профилактики злокачественной опухоли, как и индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению.
[0073]
В случае введения описанных выше изолированных антигенпрезентирующих клеток или изолированных T-клеток в живой организм такие клетки предпочтительно получают в результате обработки антигенпрезентирующих клеток или T-клеток, собранных от пациента, которому необходимо провести лечение, полипептидом (a) или (b), который описан выше, чтобы избежать иммунного ответа в живом организме, который атакует такие клетки как чужеродные вещества.
[0074]
Средство для лечения или профилактики злокачественной опухоли, содержащее в качестве активного ингредиента антигенпрезентирующие клетки или изолированные T-клетки, предпочтительно вводят парентеральным путем введения, таким как внутривенное или внутриартериальное введение. Дозовое количество выбирают соответствующим образом в зависимости от симптомов, цели введения и тому подобного. Дозовое количество обычно составляет от одной до 10 триллионов клеток и предпочтительно от 1 миллиона до 1 миллиарда клеток, и такое количество предпочтительно вводят один раз в несколько дней или несколько месяцев. Препарат может представлять собой, например, суспензию клеток в физиологическом забуренном растворе соли, и препарат можно применять в сочетании с другим противоопухолевым средством(ами), цитокином(ами) и/или тому подобным. Кроме того, в препарат также может добавлена одна или две или больше добавок.
ГЕННАЯ ВАКЦИНА
Иммунная индукция, а именно, индукция продукции антител или цитотоксических T-клеток в организме животного, также может быть достигнута за счет обеспечения возможности экспрессии полинуклеотида, кодирующего полипептид (a) или (b), в живом организме. При этом обеспечивается эффект, эквивалентный эффекту при введении полипептида. Другими словами индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению может содержать в качестве активного ингредиента рекомбинантный вектор, который содержит полинуклеотид, кодирующий описанный выше полипептид (a) или (b), и который может экспрессировать полипептид в живом организме. Такой рекомбинантный вектор, способный экспрессировать антигенный полипептид, который будет показан в примерах ниже, также называют «генной вакциной».
[0075]
Вектор, применяемый для получения генной вакцины, особым образом не ограничен, при условии, что он может экспрессировать полипептид в клетке животного (предпочтительно, в клетке млекопитающего). Вектор может представлять собой либо плазмидный вектор, либо вирусный вектор, и можно использовать любой вектор, известный в области получения генных вакцин. Полинуклеотид, такой как ДНК или РНК, кодирующий описанный выше полипептид, может быть легко получен, как описано выше, обычным способом. Кроме того, полинуклеотид может быть включен в вектор с использованием способа, хорошо известного специалистам в данной области.
[0076]
Генную вакцину предпочтительно вводят парентеральным путем введения, таким как внутримышечное, подкожное, внутривенное или внутриартериальное введение. Дозированное количество генной вакцины может быть выбрано соответствующим образом в зависимости от типа антигена и тому подобного, и обычно оно составляет примерно от 0,1 мкг до 100 мг, и предпочтительно примерно от 1 мкг до 10 мг в единицах массы генной вакцины на 1 кг массы тела.
[0077]
Способом применения вирусного вектора может быть, например, способ, при котором полинуклеотид, кодирующий описанный выше полипептид, включают в РНК-вирус или ДНК-вирус, такой как ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, вирус герпеса, вирус вакцинии, поксвирус, вирус полиомиелита или вирус Синдбис, и затем животного субъекта инфицируют полученным в результате вирусом. В частности, способ применения ретровируса, аденовирус, аденоассоциированного вируса, вируса вакцинии или тому подобного является особенно предпочтительным.
[0078]
Примеры других способов включают способ, при котором экспрессирующую плазмиду непосредственно вводят внутримышечно (способ ДНК-вакцинации), способ с использованием липосом, способ с использованием липофектина, способ микроинъекций, способ с использованием фосфата кальция и способ электропорации. Из указанных способов особенно предпочтительным является способ ДНК-вакцинации и способ с использованием липосом.
[0079]
Способы, позволяющие гену, кодирующему полипептид, применяемый в настоящем изобретении, действительно действовать как фармацевтическое средство, включают: способ in vivo, включающий в себя непосредственное введение гена в организм субъекта; и способ ex vivo, включающий в себя сбор определенного типа клеток из организма животного субъекта и введение гена в клетки ex vivo с последующим возвращением клеток в организм животного субъекта. Из указанных способов более предпочтительным является способ in vivo.
[0080]
В тех случаях, когда ген вводят способом in vivo, ген можно вводить соответствующим путем введения в зависимости от заболевания, подвергаемого лечению, симптомов и тому подобного. Например, ген можно вводить, используя внутривенное, внутриартериальное, подкожное, внутримышечное введение или тому подобное. В случае введения гена способом in vivo ген может быть приготовлен в дозированной форме, такой как раствор; но обычно его готовят в виде инъекционного раствора или тому подобного, содержащего ДНК, кодирующую описанный выше пептид согласно настоящему изобретению, в качестве активного ингредиента. При необходимости в препарат может быть добавлен обычно используемый носитель (носители). В случае использования липосомы или слитой с мембраной липосомы (вирус Сендай (HVJ)-липосома или тому подобное), содержащей ДНК, липосома может быть приготовлена в виде липосомного препарата, такого как суспензия, замороженный препарат или сконцентрированный центрифугированием замороженный препарат.
[0081]
В настоящем изобретение «последовательность оснований, представленная в SEQ ID NO: 1» включает не только последовательность, фактически представленную в SEQ ID NO: 1, но также и комплементарную ей последовательность. Таким образом, «полинуклеотид, имеющий последовательность оснований, представленную в SEQ ID NO: 1» включает однонитевой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований, фактически представленную в SEQ ID NO: 1, однонитевой полинуклеотид, имеющий последовательность оснований, комплементарную указанной последовательности, и двунитевой полинуклеотид, состоящий из таких однонитевых полинуклеотидов. При получении полинуклеотида, кодирующего полипептид, применяемый в настоящем изобретении, соответствующим образом отбирают любую из таких последовательностей оснований, и такой отбор легко могут осуществить специалисты в данной области.
ПРИМЕРЫ
[0082]
Настоящее изобретение будет более конкретно описано ниже с помощью примеров.
Пример 1: Анализ экспрессии в различных тканях.
(1) Анализ экспрессии гена PDS5A в различных линиях злокачественных клеток.
6
.
Последовательность гена (SEQ ID NO: 1), кодирующую аминокислотную последовательность белка PDS5A человека, получали из Gene Bank. Экспрессию полученного таким образом гена в различных типах линий клеток человека анализировали, используя ОТ-ПЦР (обратная транскрипция-ПЦР). Реакцию обратной транскрипции осуществляли следующим образом. В частности, из 50-100 мг каждой ткани или 5-10×10 клеток каждой клеточной линии экстрагировали суммарную РНК, используя реагент TRIZOL (производства Life Technologies, Inc.) согласно протоколу, описанному в прилагаемых инструкциях. Полученную таким образом РНК использовали для синтеза кДНК с применением системы для синтеза первой нити Superscript для ОТ-ПЦР (производства Life Technologies, Inc.) согласно протоколу, описанному в прилагаемых инструкциях. В качестве кДНК нормальных тканей человека (головного мозга, гиппокампа, семенников, ободочной кишки и плаценты) использовали кДНК генного пула (производства Life Technologies, Inc.), кДНК QUICK-Clone (производства Clontech Laboratories, Inc.) и библиотеку кДНК крупных вставок (Large-Insert) (производства Clontech Laboratories, Inc.). Реакции ПЦР осуществляли следующим образом, используя праймеры, специфичные для получаемого гена (последовательности оснований праймеров представлены в SEQ ID NO: 68 и 69). В частности, добавляли реагенты и прилагаемый буфер для получения смеси, имеющий общих объем 25 мкл и содержащий 0,25 мкл образца, полученного в реакции обратной транскрипции, 2 мкМ каждого из описанных выше праймеров, 0,2 мМ каждого из dNTP и 0,65 единиц полимеразы ExTaq (производства Takara Shuzo Co., Ltd). Затем осуществляли реакцию, используя термоциклер (производства Bio-Rad laboratories Inc.), повторяя цикл, состоящий из реакций при 94°C в течение 30 секунд, при 55°C в течение 30 секунд и при 72°C в течение 1 минуты, 30 раз. В то же время использовали праймеры, специфичные для GAPDH, который является геном «домашнего хозяйства» (последовательности оснований праймеров GAPDH человека представлены в SEQ ID NO: 70 и 71), в качестве контроля для сравнения.
[0083]
В результате, как показано на фигуре 1, экспрессию гена PDS5A человека выявляли в большинстве линий злокачественных клеток, а именно, в линиях клеток лейкоза, злокачественной лимфомы, рака простаты, рака печени, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака яичника, рака почки, рака прямой и ободочной кишки, рака желудка, злокачественной опухоли головного мозга, рака легкого и рака пищевода.
(2) Экспрессия белка PDS5A в ткани злокачественной опухоли человека (иммуногистохимическое окрашивание).
Иммуногистохимическое окрашивание осуществляли на 72 образцах тканей злокачественных опухолей на залитой в парафин матрице множества тканей злокачественных опухолей (производства Biomax Inc.). Матрицу тканей злокачественных опухолей человека обрабатывали при 60°C в течение 3 часов и помещали в сосуд для окрашивания, наполненный ксиленом и процедуру замены ксилена свежим ксиленом повторяли каждые 5 минут 3 раза. Затем такую же процедуру осуществляли, используя этанол и PBS-T вместо ксилена. Матрицу тканей злокачественных опухолей человека помещали в сосуд для окрашивания, наполненный 10 мМ раствором цитратного буфера (pH 6,0), содержащего 0,05% твин 20, обрабатывали при 125°C в течение 5 минут и затем оставляли стоять при комнатной температуре в течение 40 минут или больше. Избыток влаги вокруг срезов тканей вытирали, используя Kimwipes, срезы тканей окружали кольцом, используя DAKOPEN, и по каплям добавляли соответствующее количество пероксидазного блока (производства DAKO). После того как матрица стояла при комнатной температуре в течение 5 минут, матрицу помещали в сосуд для окрашивания, наполненный PBS-T, и процедуру замены PBS-T свежим PBS-T каждые 5 минут повторяли 3 раза. Раствор PBS-T, содержащий 10% FBS, в качестве блокирующего раствора наносили на матрицу, и матрицу оставляли стоять во влажной камере при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем коммерчески доступное поликлональное антитело кролика (производства Sigma-Aldrich Co. LLC.), которое взаимодействует с белком PDS5A, разбавляли раствором PBS-T, содержащим 5% FBS, до концентрации 10 мкг/мл и полученный в результате раствор наносили на матрицу, затем оставляли матрицу стоять в течение ночи во влажной камере с контролируемой температурой 4°C. После промывки матрицы в PBS-T в течение 10 минут 3 раза добавляли по каплям соответствующее количество меченого пероксидазой конъюгируемого полимера (производства DAKO) и матрицу оставляли стоять во влажной камере при комнатной температуре в течение 30 минут. После промывки матрицы PBS-T в течение 10 минут 3 раза наносили раствор для развития окраски DAB (производства DAKO) и матрицу оставляли стоять при комнатной температуре в течение примерно 10 минут. Затем раствор для развития окраски удаляли и матрицу промывали PBS-T в течение 10 минут 3 раза с последующей промывкой дистиллированной водой. Затем матрицу последовательно погружали в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% растворы этанола по 1 минуте в каждый и затем оставляли стоять в течение ночи погруженной в ксилен. Предметные стекла с матрицей извлекали, заливали средой для заливки глицергелем (производства DAKO) и затем проводили исследования.
[0084]
В результате наблюдали сильную экспрессию белка PDS5A в большинстве тестируемых тканей злокачественных опухолей, а именно: рака простаты, рака печени, рака молочной железы, рака поджелудочной железы, рака яичника, рака почки, рака прямой и ободочной кишки, рака желудка, злокачественной опухоли головного мозга, рака легкого и рака пищевода.
Пример 2: Индукция реактивных по отношению к пептидным эпитопам CD8-позитивных T-клеток.
(1) Прогнозирование пептидных мотивов, которые связываются с HLA-A0201 и HLA-A24.
Информацию об аминокислотной последовательности белка PDS5A человека, представленной в SEQ ID NO: 2, получали из GenBank. Для прогнозирования мотивов связывания HLA-A0201 и HLA-A24 анализировали аминокислотную последовательность белка PDS5A человека с помощью компьютерной программы прогнозирования, используя известную компьютерную программу BIMAS (доступную на сайте http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/). В результате отобрали 17 типов полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 3-19, которые, как предполагалось, способны связываться с молекулой HLA-A0201; и 14 типов полипептидов, состоящих из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 20-34, которые, как предполагалось, способны связываться с молекулой HLA-A24 молекула. Все выбранные полипептиды синтезировали в компании Greiner Japan Co. Ltd., которая предоставляет специализированные услуги по синтезу пептидов. Качество синтезированных полипептидов было гарантирована основании анализа ВЭЖХ и масс-спектрометрии.
(2) Индукция реактивных по отношению к пептидным эпитопам CD8-позитивных T-клеток.
2
Периферическую кровь разделяли, используя кровь HLA-A0201-позитивного здорового индивидуума. Периферическую кровь наносили на среду для отделения лимфоцитов (Organon Teknika Corporation, Durham, NC) и затем центрифугировали при 1500 об./мин при комнатной температуре в течение 20 минут. PBMC-содержащую фракцию собирали и 3 раза (или больше) промывали холодным раствором фосфатного буфера, получая PBMC. Полученные таким образом PBMC суспендировали в 20 мл среды AIM-V (производства Life Technologies, Inc.) и давали возможность прикрепиться к культуральному сосуду (производства Falcon Plastics Co.) в течение 2 часов в условиях 37°C и 5% CO. Неприкрепленные клетки использовали для получения T-клеток, а прикрепленные клетки использовали для получения дендритных клеток.
[0085]
Прикрепленные клетки культивировали в среде AIM-V в присутствии IL-4 (1000 ед./мл) и GM-CSF (1000 ед./мл). Спустя шесть дней среду заменяли средой AIM-V с добавлением IL-4 (1000 единиц/мл), GM-CSF (1000 единиц/мл), IL-6 (1000 единиц/мл, производства Genzyme Corporation), IL-1β (10 нг/мл, производства Genzyme Corporation) и TNF-α (10 нг/мл, производства Genzyme Corporation), и клетки культивировали в течение еще двух дней. Полученную в результате популяцию неприкрепленных клеток использовали в качестве дендритных клеток.
[0086]
6
5
6
5
5
2
2.
Полученные таким образом дендритные клетки суспендировали в среде AIM-V при плотности клеток 1×10 клеток/мл. Каждый из пептидов, которые были выбраны в соответствии с описанным выше пунктом (1) и предположительно способны связываться с молекулой HLA-A0201, добавляли к клеткам в концентрации 10 мкг/мл, затем культивировали в течение 4 часов в условиях 37°C и 5% CO, используя 96-луночный планшет. После культивирования клетки облучали рентгеновским излучением (3000 рад), промывали средой AIM-V, суспендировали в среде AIM-V, содержащей 10% сыворотки AB человека (производства Nabi Biopharmaceuticals Inc.), IL-6 (1000 единиц/мл) и IL-12 (10 нг/мл, производства Genzyme Corporation), и затем помещали в лунки 24-луночного планшета в количестве 1×10клеток на лунку. Затем полученную популяцию T-клеток добавляли в лунки в количестве 1×10 клеток на лунку, и клетки культивировали в условиях 37°C и 5% CO Спустя семь дней надосадок каждой культуры отбрасывали. Затем дендритные клетки, полученные таким же образом, как описано выше, обработкой каждым пептидом и последующим облучением рентгеновскими лучами, суспендировали (плотность клеток: 1×10 клеток/мл) в среде AIM-V, содержащей 10% сыворотки AB человека(производства Nabi Biopharmaceuticals Inc.), IL-7 (10 единиц/мл, производства Genzyme Corporation) и IL-2 (10 единиц/мл, производства Genzyme Corporation), и полученную в результате суспензию добавляли в лунки 24-луночного планшета в количестве 1×10 клеток на лунку, затем дополнительно культивировали клетки. Такие же операции повторяли 4 раза с интервалами в 7 дней и затем собирали стимулированные T-клетки. затем индукцию CD8-позитивных T-клеток подтверждали проточной цитометрией.
[0087]
Кроме того, такую же обработку, как описано выше, осуществляли, используя отрицательный контроль, пептид (SEQ ID NO: 74), имеющий последовательность, не входящую в объем настоящего изобретения; и используя в качестве сравнительных примеров известные пептиды (SEQ ID NO: 75-83), которые связываются с молекулой HLA-A0201, и белок PDS5A, который был получен согласно примеру 5 в WO 2011/027807 и который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
[0088]
Также делали попытки индукции реактивных по отношению к пептидным эпитопам CD8-позитивных T-клеток для пептидов, которые предположительно способны связываться с молекулой HLA-A24 молекула, таким же образом, как описано выше, используя дендритные клетки и популяцию индуцированных T-клеток из периферической крови HLA-A24-позитивного здорового индивидуума. Кроме того, такую же обработку, как описано выше, осуществляли, используя в качестве отрицательного контроля пептид (SEQ ID NO: 84), имеющий последовательность, не входящую в объем настоящего изобретения; и используя в качестве сравнительного примера белок PDS5A, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2.
Пример 3: Определение эпитопов антигенов цитотоксических T-клеток.
(1) Способность продуцирования IFN-γ.
2
4
3
Чтобы исследовать специфичность соответствующих T-клеток, индуцированных в примере 2 (2), по отношению к соответствующим пептидным эпитопам и белку, дендритные клетки, экспрессирующие молекулу HLA-A0201, импульсно обрабатывали различными типами полипептидов. Дендритные клетки получали культивированием в среде AIM-V с добавлением каждого полипептида в концентрации 10 мкг/мл в условиях 37°C и 5% CO в течение 4 часов. В качестве различных типов полипептидов использовали соответствующие полипептиды, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 3-19 и предположительно способные связываться с молекулой HLA-A0201, полипептид отрицательного контроля (SEQ ID NO: 74), известные полипептиды (SEQ ID NO: 75-83), которые связываются с молекулой HLA-A0201, и белок PDS5A, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. К 5×10 дендритных клеток, которые были импульсно обработаны каждым пептидом, добавляли 5×10 T-клеток, и клетки культивировали в течение 24 часов в среде AIM-V, содержащей 10% сыворотки AB человека, в 96-луночном планшете. Каждый надосадок после культивирования собирали, и количество продуцированного IFN-γ измеряли в ELISA.
[0089]
В результате явно более высокую продукцию IFN-γ наблюдали в надосадках на дорожках 13-29, на которых использовали дендритные клетки, которые были импульсно обработаны полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19, по сравнению с надосадками на дорожках 1 и 2, на которых использовали дендритные клетки, которые не были импульсно обработаны никаким полипептидом, и дендритные клетки, импульсно обработанные полипептидом отрицательного контроля, соответственно (фигура 2). Полученные результаты показали, что пептиды SEQ ID NO: 3-19 являются T-клеточными эпитопными пептидами, обладающими способностью специфично стимулировать пролиферацию HLA-A0201-позитивных CD8-позитивных T-клеток, и индуцировать продукцию IFN-γ. Кроме того, также было обнаружено, что количества IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными такими пептидами, намного выше, чем количества IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными известными пептидами, которые связываются с молекулой HLA-A0201 и которые имеют аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 75-83 (дорожки 4-12), и полноразмерным белком PDS5A, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2 (дорожка 3). Другими словами, полученные результаты свидетельствуют, что полипептиды SEQ ID NO: 3-19 обладают намного более высокой индуцирующей иммунитет активностью, по сравнению с пептидами, о которых сообщалось ранее. Кроме того, хотя последовательности SEQ ID NO: 3-19, обладающие описанной выше индуцирующей иммунитет активностью, входят в состав аминокислотной последовательности полноразмерного белка PDS5A, представленной в SEQ ID NO: 2, количество IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными полноразмерным белком PDS5A SEQ ID NO: 2, было меньше. Полагают, что причиной такого явления то, что полноразмерный белок PDS5A не может проявлять достаточную индуцирующую иммунитет активность, поскольку аминокислотная последовательность полноразмерного белка PDS5A также включает в себя ряд последовательностей, которые ингибируют индуцирующую иммунитет активность.
[0090]
Кроме того, чтобы исследовать специфичность каждой взаимодействующих с пептидными эпитопами CD8-позитивных T-клеток, индуцированных в примере 3 (2) с использованием полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20-34, по отношению к пептидным эпитопам, количество IFN-γ, продуцированного T-клетками, против дендритных клеток, экспрессирующих молекулу HLA-A24, измеряли в ELISA таким же образом, как описано выше, при этом дендритные клетки были импульсно обработаны каждым из следующих полипептидов: полипептидами SEQ ID NO: 20-34 (дорожки 4-18); полипептидом отрицательного контроля, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 84; и полноразмерным белком PDS5A, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2.
[0091]
В результате намного более высокую продукцию IFN-γ наблюдали в надосадках культур на дорожках 4-18, в которых использовали дендритные клетки, импульсно обработанные полипептидами SEQ ID NO: 20-34, по сравнению с надосадками на дорожках 1 и 2, в которых использованы дендритные клетки, импульсно не обработанные никаким полипептидом, и дендритные клетки, импульсно обработанные полипептидом отрицательного контроля, соответственно (фигура 3).
[0092]
Полученные результаты показали, что полипептиды SEQ ID NO: 20-34 являются пептидами T-клеточных эпитопов, обладающими способностью специфично стимулировать пролиферацию HLA-A24-позитивных CD8-позитивных T-клеток и индуцировать продукцию IFN-γ. Кроме того, также было обнаружено, что количества IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными такими полипептидами, намного больше, чем количества IFN-γ, продуцированного T-клетками, стимулированными полноразмерным белком PDS5A, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2. Полагают, что причина такого явления заключается в том, что полноразмерный белок PDS5A не может проявлять достаточную индуцирующую иммунитет активность по той же причине, которая описана выше.
(2) Анализ цитотоксичности
Затем исследовали следующее: презентируются или не презентируются полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19, которые применяют в настоящем изобретении, на молекулах HLA-A0201 на опухолевых клетках, которые являются HLA-A0201-позитивными и которые экспрессируют белок PDS5A человека; могут ли или не могут CD8-позитивные T-клетки, стимулированные полипептидами согласно настоящему изобретению, повреждать опухолевые клетки, которые являются HLA-A0201-позитивными и которые экспрессируют белок PDS5A человека; и кроме того, обладают ли или не обладают описанные выше CD8-позитивные T-клетки намного более высокой способностью повреждать опухолевые клетки, по сравнению с CD8-позитивными T-клетками, стимулированными известными пептидами (SEQ ID NO: 75-83), и T-клетками, стимулированными белком PDS5A.
[0093]
6
3
4
2.
Каждую из 10 типов клеточных линий, экспрессия белка PDS5A человека в которых была подтверждена, а именно: клетки U251 линии клеток глиомы (злокачественной опухоли головного мозга) человека; клетки линии клеток лейкоза Jurkat; линию клеток рака печени SK-Hep1; линию клеток рака молочной железы MCF7; линию клеток рака поджелудочной железы Panc1; линию клеток рака яичника OVCAR3; линию клеток рака почки A498; линию клеток рака прямой и ободочной кишки HCT116; линию клеток рака желудка KATO3; и линию клеток рака легкого NCI-H522 (приобретенную из ATCC); собирали в центрифужную пробирку объемом 50 мл в количестве 1×10 клеток каждой. После добавления в пробирки 100 мккюри хрома клетки инкубировали при 37°C в течение 2 часов. Затем каждый тип клеток промывали 3 раза средой RPMI (производства Gibco Brl Co.), содержащей 10% фетальной сыворотки теленка (далее называемой FBS; производства Gibco Brl Co.) и помещали в лунки 96-луночного планшета с V-образным дном в количестве 1×10 клеток на лунку. Затем в каждую лунку добавляли 5×10 клеток HLA-A0201-позитивных CD8-позитивных T-клеток, суспендированных в среде RPMI, содержащей 10% FBS, и такие клетки были индуцированы посредством стимуляции каждым из следующих полипептидов: полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19, полипептидом отрицательного контроля (SEQ ID NO: 74), известными пептидами (SEQ ID NO: 75-83) и полноразмерным белком PDS5A, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, затем культивировали в течение 4 часов в условиях 37°C и 5% CO После культивирования измеряли количество хрома 51, высвобождаемого из поврежденных опухолевых клеток в каждый надосадок культуры, при этом вычисляли цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток, индуцированных стимуляцией каждым из полипептидов и белком.
[0094]
В результате было показано, что HLA-A0201-позитивные CD8-позитивные T-клетки, индуцированные стимуляцией полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19, проявляют заметную высокую цитотоксическую активность, которая намного выше обычно прогнозируемого диапазона, против всех описанных выше 10 типов клеток. В качестве типичных примеров цитотоксическая активность против клеток U251 и клеток Jurkat показаны на фигуре 4A и фигуре 4B, соответственно. Можно видеть, что CD8-позитивные T-клетки, стимулированные полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 3-19 (дорожки 13-29, соответственно), проявляют намного более высокую цитотоксическую активность против клеток U251 и клеток Jurkat, по сравнению с CD8-позитивными T-клетками, стимулированными полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 75-83 (дорожки 4-12, соответственно), и такими клетками, стимулированными полноразмерным белком PDS5A (дорожка 3). С другой стороны, CD8-позитивные T-клетки, индуцированные полипептидом отрицательного контроля (дорожка 2), не проявляли какой-либо цитотоксической активности, результат примерно такой ж, как в случае имитации (дорожка 1). Полученные результаты свидетельствуют, что каждый из полипептидов SEQ ID NO: 3-19, используемых в настоящем изобретении, презентируется на молекулах HLA-A0201 на опухолевых клетках, которые являются HLA-A0201-позитивными и которые экспрессируют полипептид PDS5A человека, и кроме того, свидетельствуют, что полипептиды согласно настоящему изобретению обладают способностью индуцировать CD8-позитивные цитотоксические T-клетки, способные повреждать такие опухолевые клетки, до уровня, намного выше прогнозируемого диапазона. Кроме того, независимо от того факта, что аминокислотная последовательность полноразмерного белка PDS5A включает в себя последовательности SEQ ID NO: 3-19, CD8-позитивные T-клетки, стимулированные полноразмерным белком PDS5A, проявляли намного более низкую цитотоксическую активность, по сравнению с активностью CD8-позитивных T-клеток, стимулированных полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 3-19 (дорожки 3, 13-29). Причина такого явления заключается в том, что белок PDS5A не может индуцировать T-клетки, обладающие высокой цитотоксической активностью, так как аминокислотная последовательность белка PDS5A включает в себя ряд последовательностей, которые ингибируют индуцирующую иммунитет активность.
[0095]
Подобным образом, было исследовано, презентируются ли или не презентируются полипептиды SEQ ID NO: 20-34 на молекулах HLA-A24 на опухолевых клетках, которые являются HLA-A24-позитивными и которые экспрессируют белок PDS5A человека; могут ли или не могут CD8-позитивные T-клетки, стимулированные полипептидами согласно настоящему изобретению, повреждать опухолевые клетки, которые являются HLA-A24-позитивными и которые экспрессируют белок PDS5A человека; и кроме того, обладают ли описанные выше CD8-позитивные T-клетки намного более высокой способностью повреждать опухолевые клетки, по сравнению с CD8-позитивными T-клетками, стимулированными белком PDS5A.
[0096]
Обеспечивали возможность включения хрома 51 в 6 типов клеточных линий, которые являются HLA-A24-позитивными и которые экспрессируют белок PDS5A человека, а именно: линию лейкозных клеток THP1; линию клеток глиомы человека KNS-42; линию клеток рака печени SK-Hep1; линию клеток рака почки Caki1; линию клеток рака прямой и ободочной кишки SW480; и линию клеток рака желудка KATO3 (приобретенные из RIKEN и ATCC). Клетки каждого типа культивировали с HLA-A24-позитивными CD8-позитивными T-клетками, которые были индуцированы стимуляцией каждым из полипептидов: полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20-34; полипептидом отрицательного контроля (SEQ ID NO: 84) и полноразмерным белком PDS5A, и измеряли количество хрома 51, высвобождаемого из поврежденных клеток в надосадок каждой культуры.
[0097]
В результате было обнаружено, что HLA-A24-позитивные CD8-позитивные T-клетки, стимулированные полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20-34, проявляют заметно более высокую цитотоксическую активность, которая была намного выше обычно прогнозируемого диапазона, против всех типов используемых злокачественных клеток. В качестве типичным примеров показана цитотоксическая активность против клеток THP1 и клеток SW480 на фигуре 5A и фигуре 5B, соответственно. Можно видеть, что CD8-позитивные T-клетки, стимулированные полипептидами, имеющими аминокислотные последовательности, представленные в SEQ ID NO: 20-34 (дорожки 4-18, соответственно), проявляют заметно более высокую цитотоксическую активность против клеток THP1 и клеток SW480, по сравнению с CD8-позитивными T-клетками (дорожка 3), стимулированными полноразмерным белком PDS5A. С другой стороны, CD8-позитивные T-клетки, индуцированные полипептидом отрицательного контроля (дорожка 2) не проявляли никакой цитотоксической активности, результат примерно такой же, как в случае имитации (дорожка 1). Таким образом, можно видеть, что каждый из полипептидов SEQ ID NO: 20-34 презентируется на молекулах HLA-A24 на клетках, которые являются HLA-A24-позитивными и которые экспрессируют белок PDS5A человека, и полученные результаты свидетельствуют о том, что полипептиды согласно настоящему изобретению обладают способностью индуцировать CD8-позитивные цитотоксические T-клетки, способные повреждать такие клетки.
[0098]
С другой стороны, когда описанные выше 14 типов злокачественных клеток подвергали воздействию полипептидов, представленных аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 3-34, и полноразмерного белка PDS5A, состоящего из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, злокачественные клетки вообще не были убиты. Полученный результат подтверждает тот факт, что такие полипептиды не обладают активностью непосредственно убивать злокачественные клетки.
[0099]
4
3
Цитотоксическую активность определяли, как описано выше, смешивая 5×10 клеток CD8-позитивных T-клеток, стимулированных и индуцированных каждым из полипептидов, применяемых в настоящем изобретении, и 1×10 клеток каждого типа опухолевых клеток, в которые был включен хром 51; культивируя каждую смесь клеток в течение 4 часов; измеряя количество хрома 51, высвобождаемого в каждую культуральную среду, после культивирования; и вычисляя цитотоксическую активность CD8-позитивных T-клеток против каждого типа опухолевых клеток (называемых клетками-мишенями) согласно следующей формуле *.
[0100]
*Формула: цитотоксическая активность (%)=количество хрома 51, высвобождаемого из клеток-мишеней при добавлении CD8-позитивных T-клеток/количество хрома 51, высвобождаемого из клеток-мишеней при добавлении 1 N хлористоводородной кислоты × 100.
Пример 4: Индукция CD4-позитивных T-клеток, взаимодействующих с пептидными эпитопами, полученными из пептида, происходящего из белка PDS5A.
Для прогнозирования эпитопов антигенов CD4-позитивных T-клеток аминокислотную последовательность белка PDS5A человека анализировали с помощью компьютерной программы прогнозирования, в которой использован алгоритм SYFPEITHI (Rammensee), и отобрали 33 типа пептидов, представленных в SEQ ID NO: 35-67, и предположительно являющихся пептидами, связывающими молекулы HLA класса II. Все отобранные пептиды синтезировали в компании Greiner Japan Co. Ltd., которая предоставляет специализированные услуги по синтезу пептидов.
[0101]
2
Периферическую кровь, полученную от здорового HLA-DRB1*04-позитивного индивидуума, разделяли. Периферическую кровь наслаивали на среду для отделения лимфоцитов (производства Organon Teknika Corporation) и центрифугировали при 1500 об./мин при комнатной температуре в течение 20 минут. PBMC-содержащую фракцию собирали и промывали 3 раза (или больше) холодным раствором фосфатного буфера, получая PBMC. Полученные таким образом PBMC суспендировали в 20 мл среды AIM-V (производства Life Technologies, Inc.) и давали возможность прикрепиться к культуральному флакону (производства Falcon Plastics Co.) в течение 2 часов в условиях 37°C и 5% CO. Неприкрепленные клетки использовали для получения T-клеток, а прикрепленные клетки использовали для получения дендритных клетки.
[0102]
Прикрепленные клетки культивировали в среде AIM-V в присутствии IL-4 (1000 ед./мл) и GM-CSF (1000 ед./мл). Спустя шесть дней среду заменяли средой AIM-V с добавлением IL-4 (1000 единиц/мл), GM-CSF (1000 единиц/мл), IL-6 (1000 единиц/мл, производства Genzyme Corporation), IL-1β (10 нг/мл, производства Genzyme Corporation) и TNF-α (10 нг/мл, производства Genzyme Corporation), и клетки культивировали в течение еще 2 дней. Полученную в результате популяцию неприкрепленных клеток использовали в качестве дендритных клеток.
[0103]
6
5
6
5
2
2.
Полученные таким образом дендритные клетки суспендировали в среде AIM-V при плотности клеток 1×10 клеток/мл. Каждый из полипептидов SEQ ID NO: 35-67, полипептид отрицательного контроля (SEQ ID NO: 85) и белок PDS5A, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, добавляли к клеткам в концентрации 10 мг/мл с последующим культивированием в течение 4 часов в условиях 37°C и 5% CO с использованием 96-луночного планшета. После культивирования клетки облучали рентгеновскими лучами (3000 рад), промывали средой AIM-V, суспендировали в среде AIM-V, содержащей 10% сыворотки AB человека (производства Nabi Biopharmaceuticals Inc.), IL-6 (1000 единиц/мл) и IL-12 (10 нг/мл, производства Genzyme Corporation), и затем помещали в лунки 24-луночного планшета в количестве 1×10 клеток на лунку. Затем полученную популяцию T-клеток добавляли в лунки в количестве 1×10 клеток на лунку, и клетки культивировали в условиях 37°C и 5% CO Спустя семь дней надосадок каждой культуры отбрасывали. Затем дендритные клетки, обработанные каждым пептидом, полученным таким же образом, как описано выше, или белком PDS5A, после облучения рентгеновским излучением суспендировали в среде AIM-V, содержащей 10% сыворотки AB человека (производства Nabi Biopharmaceuticals Inc.) и IL-2 (10 единиц/мл, производства Genzyme Corporation), и полученную суспензию добавляли в лунки 24-луночного планшета в количестве 1×10 клеток на лунку с последующим дополнительным культивированием клеток. Такие же операции повторяли 4 раза с интервалами в 7 дней и затем собирали стимулированные T-клетки. Затем индукцию CD4-позитивных T-клеток подтверждали проточной цитометрией. В результате было подтверждено, что индуцированные T-клетки в каждой лунке пролиферировали.
Пример 5: Определение полученных из белка PDS5A эпитопов антигена хелперных T-клеток, которые стимулируют HLA-DRB1*04-позитивные CD4-позитивные T-клетки.
2
4
4
Чтобы исследовать специфичность соответствующих CD4-позитивных T-клеток, индуцированных, как описано выше в примере 4, по отношению к соответствующим пептидам и белкам, PBMC, экспрессирующие молекулы HLA-DRB1*04, импульсно обрабатывали различными типами полипептидов. PBMC получали культивированием в среде AIM-V с добавлением каждого полипептида в концентрации 10 мкг/мл в условиях 37°C и 5% CO в течение 4 часов. В качестве разных типов полипептидов использовали соответствующие полипептиды, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 35-67, полипептид отрицательного контроля (SEQ ID NO: 85) и полноразмерный белок PDS5A, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2. К 5×10 PBMC, которые были импульсно обработаны каждым пептидом, добавляли 5×10 CD4-позитивных T-клеток и клетки культивировали в течение 24 часов в среде AIM-V, содержащей 10% сыворотки AB человека, в a 96-луночном планшете. Каждый надосадок после культивирования собирали и измеряли количество продуцированного IFN-γ, используя ELISA.
[0104]
В результате была подтверждена продукция IFN-γ 1000 пг/мл и больше в надосадках культур в лунках с PBMC импульсно обработанными соответствующими пептидами SEQ ID NO: 35-67. С другой стороны, продукцию IFN-γ почти не наблюдали в надосадках культур в лунке с PBMC, импульсно обработанными полипептидом отрицательного контроля, и в лунке, содержащей только дендритные клетки, не обработанные импульсно никаким полипептидом. Таким образом, было обнаружено, что полипептиды, представленные аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 35-67, являются пептидами T-клеточных эпитопов, обладающими способностью специфично стимулировать и вызывать размножение HLA-DRB1*04-позитивных CD4-позитивных T-клеток и индуцировать продукцию IFN-γ. Кроме того, независимо от того факта, что аминокислотная последовательность полноразмерного белка PDS5A включает в себя описанные выше последовательности SEQ ID NO: 35-67, обладающие индуцирующей иммунитет активностью, количество IFN-γ, продуцированного в надосадке культуры в лунке с клетками PBMC, импульсно обработанными полноразмерным белком PDS5A, было намного меньше. Полагают, что причина такого явления заключается в том, что белок PDS5A не может проявлять достаточную индуцирующую иммунитет активность, поскольку аминокислотная последовательность белка PDS5A включает в себя несколько последовательностей, которые ингибируют индуцирующую иммунитет активность.
[0105]
2
2
5
4
4
Затем исследовали, являются ли полипептиды SEQ ID NO: 35-67 способностью, стимулирующие пролиферацию HLA-DRB1*04-позитивных T-клеток, эпитопами, которые в природе процессируются из белка PDS5A в антигенпрезентирующих клетках и презентируются на HLA-DR. Лизат клеток HEK293 (приобретенных из ATCC), временно экспрессирующих белок PDS5A, добавляли к незрелым дендритным клеткам, обеспечивая возможность расщепления белка и созревания дендритных клеток. Затем исследовали, стимулируются ли T-клетки, стимулируемые каждым из полипептидов SEQ ID NO: 35-67, полипептидом отрицательного контроля и белком PDS5A, полученными в результате дендритными клетками. Периферическую кровь из крови HLA-DRB1*04-позитивного здорового индивидуума разделяли. Периферическую кровь наслаивали на среду для отделения лимфоцитов и центрифугировали при 1500 об./мин при комнатной температуре в течение 20 минут. Промежуточный слой, содержащий PBMC, собирали и 3 раза (или больше) промывали холодным раствором фосфатного буфера, получая PBMC. Полученные таким образом PBMC суспендировали в 20 мл среды AIM-V и давали возможность прикрепиться к культуральному флакону (производства Falcon Plastics Co.) в течение 2 часов в условиях 37°C и 5% CO. Прикрепленные клетки культивировали в среде AIM-V в присутствии IL-4 (1000 единиц/мл) и GM-CSF (1000 единиц/мл) в течение 6 дней, чтобы получить незрелые дендритные клетки. Описанный выше лизат добавляли к 5×10 незрелых дендритных клеток с последующим культивированием в среде AIM-V с добавлением IL-4 (1000 единиц/мл), GM-CSF (1000 единиц/мл), IL-6 (1000 единиц/мл), IL-1β (10 нг/мл) и TNF-α (10 нг/мл) в течение 2 дней. Культивированные дендритные клетки облучали рентгеновским излучением (3000 рад), промывали средой AIM-V, суспендировали в среде AIM-V, содержащей 10% сыворотки AB человека, и затем помещали в лунки 96-луночного планшета в количестве 3,3×10 клеток на лунку. В каждую лунку добавляли 5×10 T-клеток, стимулированных каждым из полипептидов SEQ ID NO: 35-67, полипептидом отрицательного контроля и белком PDS5A, и клетки культивировали в условиях 37°C и 5% CO в течение 24 часов. Каждый надосадок после культивирования собирали и измеряли количество продуцированного IFN-γ, используя ELISA.
[0106]
В результате, как показано на фигуре 6, было обнаружено, что T-клетки на дорожках 4-36, которые были стимулированы полипептидами SEQ ID NO: 35-67, соответственно, продуцировали IFN-γ в ответ на стимуляцию дендритными клетками, к которым добавляли белок PDS5A. С другой стороны, продукцию IFN-γ почти не наблюдали в T-клетках на дорожке 2, стимулированных полипептидом отрицательного контроля, и T-клетках на дорожке 1, не стимулированным никаким полипептидом. Таким образом, было обнаружено, что полипептиды SEQ ID NO: 35-67 являются эпитопами, которые в природе процессируются из белка PDS5A в антигенпрезентирующих клетках и презентируются на HLA-DR. Кроме того, в настоящем эксперименте продукция IFN-γ в T-клетках на дорожке 3, импульсно обработанных полноразмерным белком PDS5A, также была экстремально низкой. Полагают, что причина такого явления заключается в том, что полноразмерный белок PDS5A не может проявлять достаточную индуцирующую иммунитет активность, поскольку аминокислотная последовательность полноразмерного белка PDS5A включает в себя несколько последовательностей, которые ингибируют индуцирующую иммунитет активность.
Промышленная применимость
[0107]
Индуктор иммунитета согласно настоящему изобретению, содержащий полипептид, который проявляет противоопухолевую активность против различных типов злокачественных опухолей, применим для лечения или профилактики злокачественной опухоли, или для выявления злокачественной опухоли.
[0108]
Все публикации, патенты и заявки на выдачу патентов, цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в виде ссылки в полном объеме.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  TORAY INDUSTRIES, INC.
<120>  Индуцирующее иммунитет средство
<130>  PH-6650-PCT
<150>  JP 2015-158539
<151>  2015-08-10
<160>  85
<170>  PatentIn version 3.1
<210>  1
<211>  7190
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  Кодирующая последовательность
<222>  (541)..(4554)
<400>  1
ggccggcgga ggaaggggag ggagcgagga gcgcgcgctg ctctcgcgtg ctctcgcgcc     60
gctcgcgtga ccggccggtg tgtgcgcgag gccccggctc ccggggcacg gacggccggg    120
cgcgcgcctc tgcgaggggc gtccgggtcc gagtcggcgg tccgggccgg cgcgaggtgc    180
gtgcgggcgg gccgcggggg tcccggacgg acacaagcgc acacactccc ggaggagcct    240
tcgaggctgc tcttcctcgg ccagacggag agcggcactg tctccccgcc cagcgctcac    300
tcgccccgcg tctccccccg cggcggctgc tcctcctcgg caccgccagc cccagcgccg    360
ctcccgggcg ggcgggcggc ggcggcggcg gcggcgggac ccgcggagcc gctttgtgtg    420
cagcccgact aggggcggcg gcgcaaccac ctgacagagg cccgggcgct cgatgcacct    480
tccgcccgca tgaggaggag aggccggtag aggactgtga accaaaagtt gtcccccagg    540
atg gac ttc acc gcg cag ccc aag cct gcc act gcc ctc tgt ggc gtc      588
Met Asp Phe Thr Ala Gln Pro Lys Pro Ala Thr Ala Leu Cys Gly Val
1               5                   10                  15
gtg agt gcc gac ggg aag atc gct tac cct ccg ggg gta aaa gag atc      636
Val Ser Ala Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile
20                  25                  30
acc gac aag atc acc acg gac gag atg atc aaa cgc ctg aag atg gta      684
Thr Asp Lys Ile Thr Thr Asp Glu Met Ile Lys Arg Leu Lys Met Val
35                  40                  45
gtg aaa acc ttt atg gat atg gat cag gac tca gaa gat gaa aaa cag      732
Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln
50                  55                  60
cag tat ctc cca cta gcc ttg cat ctt gca tct gaa ttc ttc ctc agg      780
Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg
65                  70                  75                  80
aac ccc aat aaa gat gtg cgt ctc ctt gta gca tgt tgt ttg gct gat      828
Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp
85                  90                  95
atc ttt cgt atc tat gcc cca gaa gct cca tat act tcc cat gat aaa      876
Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr Ser His Asp Lys
100                 105                 110
ctt aag gac ata ttt ttg ttt att acc aga caa tta aaa ggt ttg gag      924
Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu
115                 120                 125
gat aca aag agt cca cag ttt aat aga tac ttt tat tta tta gag aat      972
Asp Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn
130                 135                 140
tta gct tgg gtt aaa tca tat aac atc tgc ttt gaa ttg gaa gat tgc     1020
Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu Asp Cys
145                 150                 155                 160
aat gaa att ttt att cag ctt ttt aga act ctc ttc tca gtg atc aac     1068
Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn
165                 170                 175
aat agc cac aat aag aag gta caa atg cac atg cta gat ttg atg agt     1116
Asn Ser His Asn Lys Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser
180                 185                 190
tct atc atc atg gaa ggt gat gga gtt act caa gaa tta ttg gac tcc     1164
Ser Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr Gln Glu Leu Leu Asp Ser
195                 200                 205
att ctt att aac ctc att cct gca cat aag aac tta aat aaa cag tcc     1212
Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn Lys Gln Ser
210                 215                 220
ttt gac ctt gca aaa gtg cta ttg aaa aga aca gtc cag act att gag     1260
Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg Thr Val Gln Thr Ile Glu
225                 230                 235                 240
gca tgc att gct aat ttt ttc aat caa gtc ctg gtg ctg gga aga tca     1308
Ala Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser
245                 250                 255
tca gta agt gat ttg tca gaa cat gta ttt gat ctg att cag gaa ctt     1356
Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe Asp Leu Ile Gln Glu Leu
260                 265                 270
ttt gct ata gat cct cat tta tta tta tcc gtc atg cca cag ctt gaa     1404
Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met Pro Gln Leu Glu
275                 280                 285
ttc aaa cta aag agc aat gat gga gaa gag cga tta gct gtt gtt cga     1452
Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg
290                 295                 300
ctt cta gct aaa ttg ttt ggc tcc aaa gat tct gat ttg gca aca cag     1500
Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp Leu Ala Thr Gln
305                 310                 315                 320
aat cgt cct ctt tgg caa tgt ttt ctt gga cga ttt aat gat att cat     1548
Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His
325                 330                 335
gtt cct gtg aga tta gaa agt gtg aaa ttt gcc agt cat tgt tta atg     1596
Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser His Cys Leu Met
340                 345                 350
aat cac cca gat tta gcg aag gat ctc aca gaa tat tta aag gtt aga     1644
Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Tyr Leu Lys Val Arg
355                 360                 365
tca cat gat cca gaa gaa gct att cgt cat gat gtc att gtt act ata     1692
Ser His Asp Pro Glu Glu Ala Ile Arg His Asp Val Ile Val Thr Ile
370                 375                 380
ata aca gct gcc aag agg gac ctg gcc tta gta aat gat cag ctg ctt     1740
Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala Leu Val Asn Asp Gln Leu Leu
385                 390                 395                 400
ggc ttt gta agg gaa aga aca ctg gat aaa cgg tgg cga gta aga aaa     1788
Gly Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp Arg Val Arg Lys
405                 410                 415
gaa gct atg atg ggt ctg gct cag ctt tat aag aaa tac tgt ctt cat     1836
Glu Ala Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Tyr Cys Leu His
420                 425                 430
ggt gaa gca gga aag gaa gct gca gag aaa gtc agc tgg ata aag gac     1884
Gly Glu Ala Gly Lys Glu Ala Ala Glu Lys Val Ser Trp Ile Lys Asp
435                 440                 445
aaa ctt ctg cat att tat tat cag aac agc att gac gac aaa ctg ttg     1932
Lys Leu Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu Leu
450                 455                 460
gta gag aaa atc ttt gct cag tat ctt gtc ccc cac aac ctg gaa aca     1980
Val Glu Lys Ile Phe Ala Gln Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr
465                 470                 475                 480
gaa gag aga atg aaa tgc tta tat tac tta tat gct agt ttg gat cca     2028
Glu Glu Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro
485                 490                 495
aat gct gta aaa gct ctc aac gaa atg tgg aag tgt cag aac atg ctt     2076
Asn Ala Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys Gln Asn Met Leu
500                 505                 510
cgg agc cat gta cgc gaa cta ttg gat ttg cac aag cag cct aca tca     2124
Arg Ser His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys Gln Pro Thr Ser
515                 520                 525
gag gct aac tgt tct gcc atg ttt gga aaa ctg atg acc ata gca aag     2172
Glu Ala Asn Cys Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys
530                 535                 540
aat ttg cct gac ccc ggg aaa gca caa gat ttt gtg aag aaa ttt aac     2220
Asn Leu Pro Asp Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn
545                 550                 555                 560
cag gtt ctc ggc gat gat gag aaa ctt cgg tct cag ttg gag tta tta     2268
Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Glu Leu Leu
565                 570                 575
att agc cca acc tgt tct tgc aaa caa gca gat att tgt gtg aga gaa     2316
Ile Ser Pro Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala Asp Ile Cys Val Arg Glu
580                 585                 590
ata gcc cgg aaa ctt gca aat cct aag caa cca aca aat cct ttt cta     2364
Ile Ala Arg Lys Leu Ala Asn Pro Lys Gln Pro Thr Asn Pro Phe Leu
595                 600                 605
gag atg gtc aaa ttt ctg ttg gaa aga atc gca cct gtg cac att gat     2412
Glu Met Val Lys Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val His Ile Asp
610                 615                 620
tca gaa gcc ata agt gca cta gtg aaa ttg atg aat aag tca ata gag     2460
Ser Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser Ile Glu
625                 630                 635                 640
ggg aca gca gat gat gaa gag gag ggt gta agt cca gat aca gct atc     2508
Gly Thr Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro Asp Thr Ala Ile
645                 650                 655
cgt tca gga ctt gaa ctt ctt aag gtt ctg tct ttt aca cat cct acc     2556
Arg Ser Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe Thr His Pro Thr
660                 665                 670
tcg ttc cac tct gca gag aca tat gag tcc ttg tta cag tgc cta aga     2604
Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys Leu Arg
675                 680                 685
atg gag gat gac aag gta gca gaa gct gct att caa att ttt aga aat     2652
Met Glu Asp Asp Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn
690                 695                 700
aca ggt cac aaa ata gaa aca gac ctt ccc cag ata cga tcg acc tta     2700
Thr Gly His Lys Ile Glu Thr Asp Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu
705                 710                 715                 720
att ccc att tta cat caa aaa gca aag agg ggt act cca cac caa gca     2748
Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln Ala
725                 730                 735
aaa cag gct gtg cac tgt ata cac gcc ata ttc aca aat aaa gaa gtc     2796
Lys Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val
740                 745                 750
cag ctt gca cag att ttt gag cca ctc agt agg agt ctg aat gct gat     2844
Gln Leu Ala Gln Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asn Ala Asp
755                 760                 765
gtg cca gaa caa ctt ata act cca tta gtt tca ttg ggc cac att tct     2892
Val Pro Glu Gln Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser Leu Gly His Ile Ser
770                 775                 780
atg tta gca cca gat cag ttt gct tcc cca atg aaa tct gta gta gca     2940
Met Leu Ala Pro Asp Gln Phe Ala Ser Pro Met Lys Ser Val Val Ala
785                 790                 795                 800
aat ttt att gtg aaa gat ctg cta atg aat gac agg tca aca ggt gaa     2988
Asn Phe Ile Val Lys Asp Leu Leu Met Asn Asp Arg Ser Thr Gly Glu
805                 810                 815
aag aat gga aaa ctg tgg tct cca gat gaa gag gtt tcc cct gaa gta     3036
Lys Asn Gly Lys Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val Ser Pro Glu Val
820                 825                 830
cta gca aag gta cag gca att aaa ctt ctg gta agg tgg ctg ttg ggt     3084
Leu Ala Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly
835                 840                 845
atg aaa aac aac cag tct aaa tct gcc aat tca acc ctt cgg tta tta     3132
Met Lys Asn Asn Gln Ser Lys Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu
850                 855                 860
tca gcg atg ttg gtt agt gag ggt gac ctg aca gag caa aag agg atc     3180
Ser Ala Met Leu Val Ser Glu Gly Asp Leu Thr Glu Gln Lys Arg Ile
865                 870                 875                 880
agt aaa tct gat atg tct cgc ttg cga tta gct gct ggt agt gcc ata     3228
Ser Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile
885                 890                 895
atg aag ctt gct cag gaa cct tgt tac cat gaa att att acc cca gaa     3276
Met Lys Leu Ala Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile Ile Thr Pro Glu
900                 905                 910
cag ttt cag ctc tgt gca ctt gtt att aat gat gag tgt tac caa gta     3324
Gln Phe Gln Leu Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val
915                 920                 925
agg cag ata ttt gct cag aag ctg cat aag gca ctt gtg aag tta ctg     3372
Arg Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu Val Lys Leu Leu
930                 935                 940
ctc cca ttg gag tat atg gcg atc ttt gcc ttg tgt gcc aaa gat cct     3420
Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro
945                 950                 955                 960
gtg aag gag aga aga gca cac gca cga caa tgt tta ctg aaa aat atc     3468
Val Lys Glu Arg Arg Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile
965                 970                 975
agt ata cgc agg gaa tac att aag cag aat cct atg gct act gag aaa     3516
Ser Ile Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys
980                 985                 990
tta tta tca ctg ttg cct gaa tat  gta gtt cca tac atg  att cac ctg   3564
Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr  Val Val Pro Tyr Met  Ile His Leu
995                 1000                 1005
cta gcc  cat gat cca gat ttt  aca aga tca caa gat  gtt gat cag      3609
Leu Ala  His Asp Pro Asp Phe  Thr Arg Ser Gln Asp  Val Asp Gln
1010                 1015                 1020
ctt cgt  gat atc aaa gag tgc  cta tgg ttc atg ctt  gaa gtt tta      3654
Leu Arg  Asp Ile Lys Glu Cys  Leu Trp Phe Met Leu  Glu Val Leu
1025                 1030                 1035
atg aca  aag aat gaa aac aat  agc cat gcc ttt atg  aag aag atg      3699
Met Thr  Lys Asn Glu Asn Asn  Ser His Ala Phe Met  Lys Lys Met
1040                 1045                 1050
gca gag  aac atc aag tta acc  aga gat gcc cag tct  cca gat gaa      3744
Ala Glu  Asn Ile Lys Leu Thr  Arg Asp Ala Gln Ser  Pro Asp Glu
1055                 1060                 1065
tcc aag  aca aat gaa aaa ctg  tat aca gta tgt gat  gtg gct ctc      3789
Ser Lys  Thr Asn Glu Lys Leu  Tyr Thr Val Cys Asp  Val Ala Leu
1070                 1075                 1080
tgt gtt  ata aat agt aaa agt  gct ttg tgc aat gca  gat tca cca      3834
Cys Val  Ile Asn Ser Lys Ser  Ala Leu Cys Asn Ala  Asp Ser Pro
1085                 1090                 1095
aag gac  cca gtc ctc cca atg  aaa ttt ttt aca caa  cct gaa aag      3879
Lys Asp  Pro Val Leu Pro Met  Lys Phe Phe Thr Gln  Pro Glu Lys
1100                 1105                 1110
gac ttc  tgt aac gat aag agt  tat att tca gaa gag  aca aga gta      3924
Asp Phe  Cys Asn Asp Lys Ser  Tyr Ile Ser Glu Glu  Thr Arg Val
1115                 1120                 1125
ctt ctg  tta aca gga aag cca  aag cct gct gga gta  cta ggt gca      3969
Leu Leu  Leu Thr Gly Lys Pro  Lys Pro Ala Gly Val  Leu Gly Ala
1130                 1135                 1140
gta aat  aag cct tta tca gca  acg gga agg aaa ccc  tat gtt aga      4014
Val Asn  Lys Pro Leu Ser Ala  Thr Gly Arg Lys Pro  Tyr Val Arg
1145                 1150                 1155
agc act  ggc act gag act gga  agc aat att aat gta  aat tca gag      4059
Ser Thr  Gly Thr Glu Thr Gly  Ser Asn Ile Asn Val  Asn Ser Glu
1160                 1165                 1170
ctg aac  cct tca acc gga aat  cga tca agg gaa cag  agt tca gag      4104
Leu Asn  Pro Ser Thr Gly Asn  Arg Ser Arg Glu Gln  Ser Ser Glu
1175                 1180                 1185
gca gca  gaa act gga gtt agt  gaa aat gaa gag aac  cct gtg agg      4149
Ala Ala  Glu Thr Gly Val Ser  Glu Asn Glu Glu Asn  Pro Val Arg
1190                 1195                 1200
att att  tca gtc aca cct gta  aag aat att gac cca  gta aag aat      4194
Ile Ile  Ser Val Thr Pro Val  Lys Asn Ile Asp Pro  Val Lys Asn
1205                 1210                 1215
aag gaa  att aat tct gat cag  gct acc cag ggc aac  atc agc agt      4239
Lys Glu  Ile Asn Ser Asp Gln  Ala Thr Gln Gly Asn  Ile Ser Ser
1220                 1225                 1230
gac cga  gga aag aaa aga aca  gta aca gca gct ggt  gca gag aat      4284
Asp Arg  Gly Lys Lys Arg Thr  Val Thr Ala Ala Gly  Ala Glu Asn
1235                 1240                 1245
atc caa  caa aaa aca gat gag  aaa gta gat gaa tcg  gga cct ccc      4329
Ile Gln  Gln Lys Thr Asp Glu  Lys Val Asp Glu Ser  Gly Pro Pro
1250                 1255                 1260
gcc cct  tcc aaa ccc agg aga  gga cgt cga ccc aag  tct gaa tct      4374
Ala Pro  Ser Lys Pro Arg Arg  Gly Arg Arg Pro Lys  Ser Glu Ser
1265                 1270                 1275
cag ggc  aat gct acc aaa aat  gat gat cta aat aaa  cct att aac      4419
Gln Gly  Asn Ala Thr Lys Asn  Asp Asp Leu Asn Lys  Pro Ile Asn
1280                 1285                 1290
aag gga  agg aag aga gct gca  gtg ggt cag gag agc  cct ggg ggt      4464
Lys Gly  Arg Lys Arg Ala Ala  Val Gly Gln Glu Ser  Pro Gly Gly
1295                 1300                 1305
ttg gaa  gca ggt aat gcc aaa  gca ccc aaa ctg caa  gat tta gcc      4509
Leu Glu  Ala Gly Asn Ala Lys  Ala Pro Lys Leu Gln  Asp Leu Ala
1310                 1315                 1320
aaa aag  gca gca cca gca gaa  aga caa att gac tta  caa agg taa      4554
Lys Lys  Ala Ala Pro Ala Glu  Arg Gln Ile Asp Leu  Gln Arg
1325                 1330                 1335
aaatgcattt gcaaagggag aaaatgaagg ccaaacagaa gcaggctcca gcttctgcaa   4614
aaacttggat tcacaaatgt ccctgaacag aaaatgaagc tcacttcaga acacacactc   4674
tctgccttga aaactaaaga gactattact tccttttcac atgaccacaa gtcctctgat   4734
ggaaatgtac agcagaaact cttgagagag aggctaaaag caactctgtt ctcccccttc   4794
ccctagactt ttcttacgaa aagtcaataa ttaagcaaat tgcttaacac ttggttccag   4854
ttcctgccta tctggagttt aaatgcgtaa tacaccatta atttccacgc tgcagttttt   4914
attttaaaga aagtaacaag atgtctttac actgacactg aaaattcatc cattttagag   4974
ccaggaattc ccatgttaca caggaaaaaa tagaagtcta ctgaattaat tttttaaaag   5034
aaaagagatc agattaaata tttctttgtt tttccttttg gaaactttta tgtataattc   5094
tttctgcctg cctacttttc tgcaaaaatg agatgtacag atttcggttc cctgctatga   5154
aaagtgatgt ggtagcaatt ttataaatgt tgctttctga tttttatcag agtgagaaaa   5214
ttaaaattat tgatttgcaa gtagtaaaca gttcatattt tgatttcccc tcattttagt   5274
ttaatataat ttgcaataaa tgtacatatt gttgtttgtt tcataaagca tatcacttta   5334
aaatggtttt tactcctgtg attatgttgg aatatttgga attttaaagg agtaaagact   5394
gtccagcatt tggttttata atgtttgtca ccagattttt attaatgtaa aaaaaatcaa   5454
tttttaaaaa atagttggac tttggcagct tttaaggaaa gttggaggtg ttttaggatt   5514
gctatcaatt ttcagcattg tgctatttgg aaataagtgt tttgcttttg tctgatggtc   5574
tgggctcatt tttatgttta ttttagaaaa ctgttgcatc aatatattat gtttcttggc   5634
attgttcagc ataggtaatg tgtgcacttt atgtgtacac ataatcatat ttaagttttt   5694
tgcataaaat aaatgcttct agatgtcatg gcagtctttt taatcttttt atcatatgct   5754
ttcttgtgaa ttttttcatg ttaaagagct aaagtcataa catgattaca gtcaactctc   5814
cattatctat ataaaatagt gactaagcct caggttttta attttgtgat aacaaaataa   5874
cgaaggcatg taagacctga ttctggagga acatgaaatt tgtcttttct catgtccaga   5934
gttctatcct gcccccactg tccactgtag ggtcatccgc aaagccctag cagaatgtgc   5994
tcactccatt tccttacacg tttctagcat gggtcagagg aaacaacatt tgtgttataa   6054
cttcgtcttg ataggctgta gtgtacatgg gatgtaaaac aaacaagtgt atcaaaggtg   6114
gatgattctg ttagagtgaa gtttgagagt aaatgtcact tacgtttctc atagataatc   6174
aagagttggc tgtgtattga ctgaaagatg ggtaattatt ttaaatatgc atttacacac   6234
atttaggtat cagaagatgc ttagggaaca atggatacca atgatagaaa atgatacctt   6294
tacaggggca gaaaaatccc cactcttcct tattgcctct tcagaaccct ttagaaagta   6354
taaaatattg cctccaacat gctgaaaaag agtatctatg cataagtatc agagaagtcc   6414
ctcaagcaat cagtaggtgt gttctattta gagagagttt aaagttctct tagcatcaga   6474
caacttgatt cctaaggttt ccagtgtgtc accaacaaaa agtgcattga tagggacctt   6534
tgtctcttcc tccctttgat taattgcccg gcatcacagt ttactagatt accaagtgtt   6594
acatcatatt aaataaaatg tagcagaacc atctgcatca atatattcct gtttagattt   6654
ttgcaggaga gaagttaaaa ggatttgctc cttgtatgat gtaagtggcc caccccaatt   6714
ttgtaacatg atgcaagtgt ctggcactaa gggaagcaag agtagggttg tggaaagacc   6774
aagctgatgg ggagggactt gtttacggga atttttttag ttttcctttt caaaggaaaa   6834
cattaaaatc ccttaggaat ttggtattca catctcagag aactacaaca caaaagtgca   6894
gacttatatt tgagaattaa tgttaaccct ttgtgtctag tttgaagctt cttgtatttg   6954
tctaaaacaa caagccagaa ttttgtatct cctttgataa aaagtgtgta taatgtaaag   7014
tagttttgca tattcttgtg ctgcacatgg gctgaatttt taaatttttt ttaaaaactt   7074
gaagcagaac cttgtaattt gtgtaaatga caagtgtaaa atcctaccat aaaatgctaa   7134
aaatatgcac tgtttcaaat aaaaccaaga aatgcagcat taaaaaaaaa aaaaaa       7190
<210>  2
<211>  1337
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Asp Phe Thr Ala Gln Pro Lys Pro Ala Thr Ala Leu Cys Gly Val
1               5                   10                  15
Val Ser Ala Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile
20                  25                  30
Thr Asp Lys Ile Thr Thr Asp Glu Met Ile Lys Arg Leu Lys Met Val
35                  40                  45
Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln
50                  55                  60
Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg
65                  70                  75                  80
Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp
85                  90                  95
Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr Ser His Asp Lys
100                 105                 110
Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu
115                 120                 125
Asp Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn
130                 135                 140
Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu Asp Cys
145                 150                 155                 160
Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn
165                 170                 175
Asn Ser His Asn Lys Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser
180                 185                 190
Ser Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr Gln Glu Leu Leu Asp Ser
195                 200                 205
Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn Lys Gln Ser
210                 215                 220
Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg Thr Val Gln Thr Ile Glu
225                 230                 235                 240
Ala Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser
245                 250                 255
Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe Asp Leu Ile Gln Glu Leu
260                 265                 270
Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met Pro Gln Leu Glu
275                 280                 285
Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg
290                 295                 300
Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp Leu Ala Thr Gln
305                 310                 315                 320
Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His
325                 330                 335
Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser His Cys Leu Met
340                 345                 350
Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Tyr Leu Lys Val Arg
355                 360                 365
Ser His Asp Pro Glu Glu Ala Ile Arg His Asp Val Ile Val Thr Ile
370                 375                 380
Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala Leu Val Asn Asp Gln Leu Leu
385                 390                 395                 400
Gly Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp Arg Val Arg Lys
405                 410                 415
Glu Ala Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Tyr Cys Leu His
420                 425                 430
Gly Glu Ala Gly Lys Glu Ala Ala Glu Lys Val Ser Trp Ile Lys Asp
435                 440                 445
Lys Leu Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu Leu
450                 455                 460
Val Glu Lys Ile Phe Ala Gln Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr
465                 470                 475                 480
Glu Glu Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro
485                 490                 495
Asn Ala Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys Gln Asn Met Leu
500                 505                 510
Arg Ser His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys Gln Pro Thr Ser
515                 520                 525
Glu Ala Asn Cys Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys
530                 535                 540
Asn Leu Pro Asp Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn
545                 550                 555                 560
Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu Lys Leu Arg Ser Gln Leu Glu Leu Leu
565                 570                 575
Ile Ser Pro Thr Cys Ser Cys Lys Gln Ala Asp Ile Cys Val Arg Glu
580                 585                 590
Ile Ala Arg Lys Leu Ala Asn Pro Lys Gln Pro Thr Asn Pro Phe Leu
595                 600                 605
Glu Met Val Lys Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val His Ile Asp
610                 615                 620
Ser Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser Ile Glu
625                 630                 635                 640
Gly Thr Ala Asp Asp Glu Glu Glu Gly Val Ser Pro Asp Thr Ala Ile
645                 650                 655
Arg Ser Gly Leu Glu Leu Leu Lys Val Leu Ser Phe Thr His Pro Thr
660                 665                 670
Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys Leu Arg
675                 680                 685
Met Glu Asp Asp Lys Val Ala Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn
690                 695                 700
Thr Gly His Lys Ile Glu Thr Asp Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu
705                 710                 715                 720
Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln Ala
725                 730                 735
Lys Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val
740                 745                 750
Gln Leu Ala Gln Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu Asn Ala Asp
755                 760                 765
Val Pro Glu Gln Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser Leu Gly His Ile Ser
770                 775                 780
Met Leu Ala Pro Asp Gln Phe Ala Ser Pro Met Lys Ser Val Val Ala
785                 790                 795                 800
Asn Phe Ile Val Lys Asp Leu Leu Met Asn Asp Arg Ser Thr Gly Glu
805                 810                 815
Lys Asn Gly Lys Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val Ser Pro Glu Val
820                 825                 830
Leu Ala Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly
835                 840                 845
Met Lys Asn Asn Gln Ser Lys Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu
850                 855                 860
Ser Ala Met Leu Val Ser Glu Gly Asp Leu Thr Glu Gln Lys Arg Ile
865                 870                 875                 880
Ser Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile
885                 890                 895
Met Lys Leu Ala Gln Glu Pro Cys Tyr His Glu Ile Ile Thr Pro Glu
900                 905                 910
Gln Phe Gln Leu Cys Ala Leu Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val
915                 920                 925
Arg Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu Val Lys Leu Leu
930                 935                 940
Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro
945                 950                 955                 960
Val Lys Glu Arg Arg Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile
965                 970                 975
Ser Ile Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys
980                 985                 990
Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr  Val Val Pro Tyr Met  Ile His Leu
995                 1000                 1005
Leu Ala  His Asp Pro Asp Phe  Thr Arg Ser Gln Asp  Val Asp Gln
1010                 1015                 1020
Leu Arg  Asp Ile Lys Glu Cys  Leu Trp Phe Met Leu  Glu Val Leu
1025                 1030                 1035
Met Thr  Lys Asn Glu Asn Asn  Ser His Ala Phe Met  Lys Lys Met
1040                 1045                 1050
Ala Glu  Asn Ile Lys Leu Thr  Arg Asp Ala Gln Ser  Pro Asp Glu
1055                 1060                 1065
Ser Lys  Thr Asn Glu Lys Leu  Tyr Thr Val Cys Asp  Val Ala Leu
1070                 1075                 1080
Cys Val  Ile Asn Ser Lys Ser  Ala Leu Cys Asn Ala  Asp Ser Pro
1085                 1090                 1095
Lys Asp  Pro Val Leu Pro Met  Lys Phe Phe Thr Gln  Pro Glu Lys
1100                 1105                 1110
Asp Phe  Cys Asn Asp Lys Ser  Tyr Ile Ser Glu Glu  Thr Arg Val
1115                 1120                 1125
Leu Leu  Leu Thr Gly Lys Pro  Lys Pro Ala Gly Val  Leu Gly Ala
1130                 1135                 1140
Val Asn  Lys Pro Leu Ser Ala  Thr Gly Arg Lys Pro  Tyr Val Arg
1145                 1150                 1155
Ser Thr  Gly Thr Glu Thr Gly  Ser Asn Ile Asn Val  Asn Ser Glu
1160                 1165                 1170
Leu Asn  Pro Ser Thr Gly Asn  Arg Ser Arg Glu Gln  Ser Ser Glu
1175                 1180                 1185
Ala Ala  Glu Thr Gly Val Ser  Glu Asn Glu Glu Asn  Pro Val Arg
1190                 1195                 1200
Ile Ile  Ser Val Thr Pro Val  Lys Asn Ile Asp Pro  Val Lys Asn
1205                 1210                 1215
Lys Glu  Ile Asn Ser Asp Gln  Ala Thr Gln Gly Asn  Ile Ser Ser
1220                 1225                 1230
Asp Arg  Gly Lys Lys Arg Thr  Val Thr Ala Ala Gly  Ala Glu Asn
1235                 1240                 1245
Ile Gln  Gln Lys Thr Asp Glu  Lys Val Asp Glu Ser  Gly Pro Pro
1250                 1255                 1260
Ala Pro  Ser Lys Pro Arg Arg  Gly Arg Arg Pro Lys  Ser Glu Ser
1265                 1270                 1275
Gln Gly  Asn Ala Thr Lys Asn  Asp Asp Leu Asn Lys  Pro Ile Asn
1280                 1285                 1290
Lys Gly  Arg Lys Arg Ala Ala  Val Gly Gln Glu Ser  Pro Gly Gly
1295                 1300                 1305
Leu Glu  Ala Gly Asn Ala Lys  Ala Pro Lys Leu Gln  Asp Leu Ala
1310                 1315                 1320
Lys Lys  Ala Ala Pro Ala Glu  Arg Gln Ile Asp Leu  Gln Arg
1325                 1330                 1335
<210>  3
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu Ala
1               5
<210>  4
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  4
Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp Ile
1               5                   10
<210>  5
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  5
Tyr Leu Leu Glu Asn Leu Ala Trp Val
1               5
<210>  6
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  6
Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val
1               5
<210>  7
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  7
Leu Leu Asp Ser Ile Leu Ile Asn Leu
1               5
<210>  8
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  8
Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val
1               5                   10
<210>  9
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  9
Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr
1               5
<210>  10
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  10
Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro Asn Ala
1               5                   10
<210>  11
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  11
Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile
1               5
<210>  12
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  12
Phe Leu Leu Glu Arg Ile Ala Pro Val
1               5
<210>  13
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  13
Leu Asn Ala Asp Val Pro Glu Gln Leu
1               5
<210>  14
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  14
Gln Leu Ile Thr Pro Leu Val Ser
1               5
<210>  15
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  15
Lys Leu Trp Ser Pro Asp Glu Glu Val Ser
1               5                   10
<210>  16
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  16
Val Ile Asn Asp Glu Cys Tyr Gln Val
1               5
<210>  17
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  17
Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala
1               5
<210>  18
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  18
Lys Leu Tyr Thr Val Cys Asp Val Ala Leu
1               5                   10
<210>  19
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  19
Tyr Thr Val Cys Asp Val Ala Leu Cys Val
1               5                   10
<210>  20
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  20
Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile
1               5
<210>  21
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  21
Gln Tyr Leu Pro Leu Ala Leu His Leu
1               5
<210>  22
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  22
Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu
1               5
<210>  23
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  23
Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu
1               5
<210>  24
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  24
Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn Leu
1               5
<210>  25
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  25
Phe Tyr Leu Leu Glu Asn Leu Ala Trp
1               5
<210>  26
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  26
Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe
1               5                   10
<210>  27
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  27
Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu
1               5
<210>  28
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  28
Val Phe Asp Leu Ile Gln Glu Leu Phe
1               5
<210>  29
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  29
Leu Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu
1               5
<210>  30
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  30
Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe
1               5
<210>  31
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  31
Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu
1               5                   10
<210>  32
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  32
Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln Cys Leu
1               5
<210>  33
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  33
Ile Phe Arg Asn Thr Gly His Lys Ile
1               5
<210>  34
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  34
Ile Phe Glu Pro Leu Ser Arg Ser Leu
1               5
<210>  35
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  35
Ala Ser Glu Phe Phe Leu Arg Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu
1               5                   10                  15
<210>  36
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  36
Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu
1               5                   10                  15
Asp Thr Lys
<210>  37
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  37
Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn Leu Ala Trp Val Lys Ser
1               5                   10                  15
Tyr
<210>  38
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  38
Asn Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu
1               5                   10                  15
<210>  39
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  39
Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn
1               5                   10                  15
Asn Ser
<210>  40
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  40
Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn Asn Ser His Asn Lys Lys Val Gln Met
1               5                   10                  15
His
<210>  41
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  41
Asn Lys Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser Ser Ile Ile
1               5                   10                  15
Met Glu
<210>  42
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  42
Leu Asp Ser Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn
1               5                   10                  15
Lys Gln Ser
<210>  43
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  43
Ile Gln Glu Leu Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met
1               5                   10                  15
Pro Gln Leu Glu Phe Lys Leu
20
<210>  44
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  44
Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly
1               5                   10                  15
Ser Lys
<210>  45
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  45
His Asp Val Ile Val Thr Ile Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala
1               5                   10                  15
Leu Val Asn
<210>  46
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  46
Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys Asn Leu Pro Asp
1               5                   10                  15
Pro Gly Lys
<210>  47
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  47
Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn Gln Val Leu Gly Asp Asp Glu
1               5                   10                  15
<210>  48
<211>  21
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  48
Glu Cys Leu Glu Ala Ile Ser Ala Leu Val Lys Leu Met Asn Lys Ser
1               5                   10                  15
Ile Glu Gly Thr Ala
20
<210>  49
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  49
Pro Thr Ser Phe His Ser Ala Glu Thr Tyr Glu Ser Leu Leu Gln
1               5                   10                  15
<210>  50
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  50
Glu Ala Ala Ile Gln Ile Phe Arg Asn Thr Gly His Lys Ile Glu Thr
1               5                   10                  15
Asp Leu
<210>  51
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  51
Leu Pro Gln Ile Arg Ser Thr Leu Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala
1               5                   10                  15
Lys Arg
<210>  52
<211>  16
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  52
Leu Ile Pro Ile Leu His Gln Lys Ala Lys Arg Gly Thr Pro His Gln
1               5                   10                  15
<210>  53
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  53
Lys Gln Ala Val His Cys Ile His Ala Ile Phe Thr Asn Lys Glu Val
1               5                   10                  15
Gln Leu Ala Gln
20
<210>  54
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  54
Ala Ser Pro Met Lys Ser Val Val Ala Asn Phe Ile Val Lys Asp
1               5                   10                  15
<210>  55
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  55
Val Leu Ala Lys Val Gln Ala Ile Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu
1               5                   10                  15
Gly Met Lys
<210>  56
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  56
Lys Leu Leu Val Arg Trp Leu Leu Gly Met Lys Asn Asn Gln Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Ala
<210>  57
<211>  20
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  57
Ser Ala Asn Ser Thr Leu Arg Leu Leu Ser Ala Met Leu Val Ser Glu
1               5                   10                  15
Gly Asp Leu Thr
20
<210>  58
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  58
Lys Ser Asp Met Ser Arg Leu Arg Leu Ala Ala Gly Ser Ala Ile Met
1               5                   10                  15
Lys Leu
<210>  59
<211>  19
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  59
Cys Tyr Gln Val Arg Gln Ile Phe Ala Gln Lys Leu His Lys Ala Leu
1               5                   10                  15
Val Lys Leu
<210>  60
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  60
Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile Phe Ala Leu Cys Ala Lys Asp Pro
1               5                   10                  15
<210>  61
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  61
Ala His Ala Arg Gln Cys Leu Leu Lys Asn Ile Ser Ile Arg Arg Glu
1               5                   10                  15
Tyr Ile
<210>  62
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  62
Arg Arg Glu Tyr Ile Lys Gln Asn Pro Met Ala Thr Glu Lys Leu
1               5                   10                  15
<210>  63
<211>  22
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  63
Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val Leu Met Thr Lys Asn Glu Asn
1               5                   10                  15
Asn Ser His Ala Phe Met
20
<210>  64
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  64
Ser His Ala Phe Met Lys Lys Met Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr Arg
1               5                   10                  15
Asp Ala Gln Ser Pro Asp Glu
20
<210>  65
<211>  23
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  65
Lys Ser Tyr Ile Ser Glu Glu Thr Arg Val Leu Leu Leu Thr Gly Lys
1               5                   10                  15
Pro Lys Pro Ala Gly Val Leu
20
<210>  66
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  66
Pro Ala Gly Val Leu Gly Ala Val Asn Lys Pro Leu Ser Ala Thr Gly
1               5                   10                  15
Arg Lys
<210>  67
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  67
Glu Asn Pro Val Arg Ile Ile Ser Val Thr Pro Val Lys Asn Ile Asp
1               5                   10                  15
Pro
<210>  68
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  искусственная
<220>
<223>  праймер смысловой
<400>  68
gtaaggtggc tgttgggtat g                                               21
<210>  69
<211>  24
<212>  ДНК
<213>  искусственная
<220>
<223>  праймер антисмысловой
<400>  69
ggctagcagg tgaatcatgt atgg                                            24
<210>  70
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  искусственная
<220>
<223>  праймер GAPDH
<400>  70
gggctgcttt taactctg                                                   18
<210>  71
<211>  18
<212>  ДНК
<213>  искусственная
<220>
<223>  праймер GAPDH
<400>  71
ccaggaaatg agcttgac                                                   18
<210>  72
<211>  29
<212>  ДНК
<213>  искусственная
<220>
<223>  праймер смысловой
<400>  72
gcggccgcat ggacttcacc gcgcagccc                                       29
<210>  73
<211>  29
<212>  ДНК
<213>  искусственная
<220>
<223>  праймер антисмысловой
<400>  73
ctcgagttac ctttgtaagt caatttgtc                                       29
<210>  74
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  74
Ser Leu Tyr Asn Thr Tyr Ala Thr Leu
1               5
<210>  75
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  75
Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu
1               5
<210>  76
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  76
Lys Glu Cys Leu Trp Phe Met Leu Glu Val
1               5                   10
<210>  77
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  77
Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His Val
1               5                   10
<210>  78
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  78
Leu Leu Leu Pro Leu Glu Tyr Met Ala Ile
1               5                   10
<210>  79
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  79
Ser Leu Asp Pro Asn Ala Val Lys Ala Leu
1               5                   10
<210>  80
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  80
Lys Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile
1               5
<210>  81
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  81
Leu Leu Ser Leu Leu Pro Glu Tyr Val Val
1               5                   10
<210>  82
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  82
Lys Met Ala Glu Asn Ile Lys Leu Thr
1               5
<210>  83
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  83
Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser Ser Val
1               5                   10
<210>  84
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  84
Arg Tyr Leu Arg Asp Gln Gln Leu Leu
1               5
<210>  85
<211>  18
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  85
Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gln Ala Thr Gln
1               5                   10                  15
Asp Val
<---