взаимодействие слабосшитого полиамина с бычьим сывороточным альбумином

ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ УДК 541.1

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ СЛАБОСШИТОГО ПОЛИАМИНА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ

В.Б. Скобелева, А.В. Зинченко, В.Б. Рогачева, А.Б. Зезин

Изучено взаимодействие сетчатого бромида поли-А,А-диметил-А-этилами-ноэтилметакрилата с бычьим сывороточным альбумином. Установлено, что слабосшитый полиаминный гель способен сорбировать БСА при рН выше ИЭТ белка с образованием в фазе геля интерполимерного комплекса, в котором белковые частицы связаны с участками сетчатого полиамина солевыми связями. Показано, что состав комплекса определяется рН и ионной силой среды и не зависит от соотношения компонентов в реакционной смеси. Изучена стабильность образующихся комплексов в водно-солевых средах. Сорбция белка противоположно заряженным гелем осуществляется как фронтально распространяющаяся гетерогенная реакция, приводящая к макроскопическому фазовому разделению в продуктах незавершенных реакций.

В последнее десятилетие особое внимание исследователей привлекают интерполимерные реакции (ИПР) с участием полиэлектролитов (ПЭ) и белков. В первую очередь это связано с тем, что комплексы белков с синтетическими ПЭ представляют собой удобные модели для изучения комплексов белков с природными полигонами, а также являются перспективными носителями биологически активных веществ с точки зрения применения их в биотехнологии и медицине. При этом особый интерес представляет взаимодействие белков с сетчатыми полиэлектролитами (СПЭ). Процессы переноса белков в химически комплементарных гелях могут служить моделью активированного транспорта природных полиэлектролитов в биологических средах, они также могут быть использованы для дизайна различных функциональных полиэлектролитных систем медико-биологического назначения.

В предыдущих работах [1, 2] мы изучили взаимодействие сшитого полиакрилата натрия (СПА№) с ли-зоцимом, цитохромом с и протамином (белками небольшой молекулярной массы) и показали, что движущей силой сорбции белков полиакрилатной сеткой является кооперативная ИПР между компонентами с образованием в фазе геля интерполимерного комплекса (ИПК) СПЭ-белок, стабилизированного солевыми связями. При этом состав образующегося

ИПК в существенной степени зависит от рН, химической природы и концентрации низкомолекулярных ионов и не зависит от соотношения компонентов в реакционной смеси.

В данной статье изложены результаты исследований взаимодействия положительно заряженной высоко-набухшей гомогенной сетки с противоположно заряженным белком, которые могут рассматриваться как продолжение и развитие нового и перспективного направления в области кооперативных ИПР. Мы изучили взаимодействие сшитого этилированного поли-диметиламиноэтилметакрилата (СПДМАЭМ-ИБг ) с бычьим сывороточным альбумином (БСА) - глобулярным белком более высокой молекулярной массы, чем лизоцим и цитохром с.

Экспериментальная часть

Сшитый бромид поли-К,К-диметил-К-этиламино-этилметакрилата (СПДМАЭМ-БШг) синтезировали по аналогии с методикой получения полиакриламидных гелей [3]. ДМАЭМ-БШг получали реакцией алкилиро-вания мономера ДМАЭМ бромистым этилом [4]. К пятикратному избытку мономера при перемешивании и охлаждении (смесью льда с солью) добавляли постепенно бромистый этил (ЕШг). Алкилированный ДМАЭМ образуется в виде белого осадка. Кристаллы ДМАЭМ-БШг промывали несколько раз эфиром и су-

шили в вакууме. Гель СПДМАЭМ-EtBr синтезировали по следующей методике. Водный раствор, содержащий 20 мас.% ДМАЭМ-EtBr, эквимольное количество HCl, 1.0 мол.% от ДМАЭМ-EtBr бифункционального сшивателя, К,К'-метилен-бис-акриламида, 0.5 мас.% от ДМАЭМ-EtBr персульфата аммония, продували аргоном в течение 15 мин, затем добавляли 0.5 мас.% от ДМАЭМ • EtBr метабисульфита натрия, продували аргоном в течение 10 мин и запаивали в ампулы. Полимеризацию проводили в течение суток при Т= 40°. По окончании полимеризации гель СПДМАЭМ • EtBr отмывали водой до установления постоянной величины набухаемости.

Набухаемость гелей и продуктов завершенных ИПР определяли весовым методом и характеризовали величиной набухаемости:

H = (mx - m2)lm2 ,

где - масса набухшего образца,

m2 - масса сухого образца.

Набухаемость геля СПДМАЭМ • EtBr (pH = 7) составляла 600.

В работе использовали БСА фирмы Sigma (США) молекулярной массы М = 69000. БСА содержит 143 свободных отрицательно заряженных карбоксильных групп ( аспаргиновой и глутаминовой кислот) и 101 положительно заряженных аминогрупп, 60 из которых первичные аминогруппы лизина, 23 - аминогруппы аргинина и 18 - гистидина [5]. Такое соотношение отрицательно и положительно заряженных ионогенных групп определяет значение ИЭТ БСА, равное 4.9 [6]. Глобула БСА имеет размеры порядка 150x40-457° [5].

Изучение взаимодействия БСА с СПДМАЭМ-EtBr проводили в водных растворах в интервале pH 6-9, при этом концентрация растворов белка составляла -1-4 мг/мл, масса образцов гелей составляла 0.1-1.5 г. Измерение pH растворов производили на рНметре PHM 83 AUTOCAL фирмы «Radiometer» (Дания). Концентрацию БСА определяли по величине поглощения растворов при 1=282нм (коэффициент эк-стинции E =36000л/(моль-см)). Здесь и далее представлены данные в расчете на моль молекул белка. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре «Hitachi-150-20» (Япония).

Результаты и обсуждение

Образцы равновесно набухшего геля СПДМАЭМ-EtBr при погружении в нейтральные бессолевые растворы БСА эффективно сорбируют бе-

лок. Уже через несколько минут на поверхности прозрачного геля образуется тонкая матовая пленка ИПК, которая с течением времени утолщается. Образец геля при этом уменьшается в объеме и при достаточном количестве белка в окружающем растворе в конечном счете превращается в компактный, непрозрачный продукт реакции - ИПК, набухаемость которого на два порядка ниже набухаемости исходного геля

лСПДМАЭМ-EtBr = 600, ЛИПК =

Время, в течение которого происходит полное превращение кубического образца геля массой 0.7 г в ИПК с БСА, составляет около 10 сут. Это время значительно (на порядок и более) превышает время, необходимое для превращения геля СПАКа той же степени сшивания в ИПК с такими глобулярными белками, как цитохром с и лизоцим [1]. Низкая скорость сорбции БСА по сравнению с этими белками объясняется тем, что при сорбции глобулярных белков противоположно заряженными сетками роль кинетической единицы играет целая глобула белка, а молекулярная масса БСА приблизительно в 5 раз выше молекулярной массы цитохрома с и лизоцима. Как и для изученных ранее систем СПЭ - белок [1, 2], взаимодействие БСА с СПДМАЭМ-EtBr наблюдается в таком интервале pH, в котором белковые молекулы и сетка противоположно заряжены фЛИЭТ). Действительно, при погружении образцов СПДМАЭМ-EtBr в растворы БСА при рН<4.5<ИЭТ не наблюдается заметной убыли белка в окружающем гель растворе. Более того, ИПК СПДМАЭМ-EtBr - БСА, полученный в нейтральной среде и помещенный затем в водный раствор HCl при pH<4.5, разрушается в течение нескольких часов, о чем свидетельствует выделение в окружающий раствор практически всего белка, включенного в ИПК. Это означает, что сорбция белка происходит в результате ИПР, сопровождающейся образованием солевых связей между отрицательно заряженными карбоксилатными группами, экспонированными на поверхности белковых глобул, и положительно заряженными аминогруппами сетки. Эта ИПР представлена на схеме I.

Для простоты показаны только доминирующие отрицательные заряды белка и их противоионы, хотя, в действительности, значительная часть отрицательно заряженных групп белковой молекулы может быть включена в цвиттер-ионные пары.

Если количество белка в растворе, окружающем гель, недостаточно для полного превращения образца геля в ИПК, поглощение белка из раствора протекает практически до полного исчерпания последнего, иными словами, равновесие ИПР (схема I) нацело сдвинуто вправо.

Максимальное количество сорбирующегося белка, или состав ИПК, определяли как

ИПК = ( ЛСПДМАЭМ-ЫВг ) ,

ГДе 41 Г1МЛ')\ГВ| и N - количество звеньев сетки и молекул белка в образце ИПК соответственно. Значения лПДМАЭМ-аВг определяли весовым методом, зная величину набухаемости геля. Значения N определяли по убыли концентрации белка в окружающем растворе или весовым методом по разнице масс сухого исходного СПДМАЭМ-ЕШг и продукта его реакции с БСА, высушенного до постоянной массы.

Полученный нами состав ИПК СПДМАЭМ-ИБг -БСА соответствовал фИПК» 55-60. Другими словами, предельная емкость полиаминного геля по БСЛ составляет порядка 6 -7 г белка на 1г сухого геля. Следует отметить, что практически такая же величина фИПК=55 была получена ранее [7] при изучении составов нерастворимых ИПК, образующихся между линейным поли-Ы-этил-4-винилпиридиний бромидом (ЛПЭВП) и БСА. Существенно, что состав ИПК, образованных сетчатым полиамином, не зависит от исходного соотношения компонентов в реакционной смеси. Полученные значения фИПК остаются неизменными в широком интервале изменения составов реакционных

смесей ЛмЛСПДМАЭМЛВгЛБЛ20-55- Иными слова-

ми, введение избыточных количеств белка в реакционную систему не приводит к его дополнительной сорбции сеткой. Это свойство является общим для широкого круга ИПК, в том числе для ИПК, образованных сетчатыми и линейными полиэлектролитами [8], противоположно заряженными сетчатыми полиэлектролитами и ионногенными ПАВ [9], и наконец, противоположно заряженными сетчатыми полиэлектролитами и белками [1]. В то же время известно, что при взаимодействии линейных полиэлектролитов с белками в водных растворах, содержащих значительный избыток белка, возможно

образование водорастворимых нестехиометричных ИПК (НИПК), обогащенных белком. Так, в системе ЛПЭВП - БСА состав такого НИПК отвечает соотношению отрицательно заряженных групп БСА и положительно заряженных аминогрупп полимера, равному 2.3 [10]. В таком НИПК на одну глобулу БСА в среднем приходится 45 звеньев ЛПЭВП.

В литературе описаны водорастворимые НИПК, включающие избыток заряженных звеньев линейного полиэлектролита. В частности, в работе [11] описаны водорастворимые НИПК, образованные ЛПЭВП и БСА, в которых на одну глобулу белка приходится 330 звеньев поликатиона. В работе [1] при составе смеси Фс.=(КлПаы!/№б)с„>160 мы обнаружили водорастворимые НИПК ЛПА№-лизоцим, в которых на одну глобулу лизоцима приходится 160 и более звеньев полианиона. Совершенно иначе ведут себя системы белок - сетчатый полиэлектролит. Здесь даже при значительном дефиците молекул белка по отношению к общему числу звеньев в исходной сетке в объеме геля происходит макроскопическое фазовое разделение, т.е. образование слабонабухшего наружного слоя ИПК определенного состава (фИПК), сосуществующего с сильно набухшим исходным гелем, который практически не содержит белка. На схеме II изображены образцы гетерофазного геля, получающиеся при различных составах реакционной смеси ф 1 < ф 2< ф 3 .

т см смЧм т

слпП ИПК МЛ К

Схема II

Такое макроскопически неравномерное распределение белка в образце геля, по-видимому, отвечает термодинамическому равновесию сосуществующих фаз, поскольку длительное выдерживание гетерогенных образцов А и Б в воде не приводит ни к смешению, ни к размыванию межфазной границы. В то же время добавление в окружающую среду новых порций белка сопровождается увеличением толщины наружного слоя ИПК и соответственно уменьшением массы внутренней области.

Явление макроскопического диспропорционирова-ния характерно для всех изученных реакций заряженных сеток с противоположно заряженными полигонами различной химической природы: полиэлектролитами [8], ионогенными мицеллообразующими ПАВ [9] и белками [1,2].

Интересно, что состав ИПК СПДМАЭМ-Б1Бг-БСА (Фипк) совпадает с величиной f* =\n+ - n\, представляющей собой абсолютную величину разности между числом положительно заряженных (n+) и отрицательно заряженных (n) групп в молекуле белка, которая определяется их аминокислотным составом. Так, если учесть, что в молекуле БСА в нейтральных средах группы гистидина еще не заряжены [12], то f* = 60, что практически совпадает с фИПК. Очевидно, однако, что fraK a priori нельзя отождествить с количеством солевых связей q, образованных единичной молекулой белка со звеньями заряженной сетки. Эти величины были определены при измерении количества низкомолекулярных противоионов, выделившихся в результате взаимодействия карбокси-латных групп белка и протонированных аминогрупп сетки для НИПК ЛПЭВПБ-БСА [11]. Было показано, что только около половины (55+10) отрицательно заряженных групп БСА, определяемых из аминокислотного состава, участвуют в образовании солевых связей с линейным полиэлектролитом. Можно думать, что величина q существенно не изменится при замене в системе линейного полиамина на слабосшитый полиамин. Отметим, что в изученных ранее системах СПАКа-цитохром с и лизоцим количество солевых связей q в образующихся ИПК также практически совпадало с суммарным зарядом на глобулах белка [1].

Интерполимерные комплексы, стабилизированные системой межцепных солевых связей, разрушаются под действием экранирующих низкомолекулярных солей. Исследования стабильности ИПК СПДМАЭМ-Б1Бг-БСА при различных концентрациях NaCl показали, что ИПК устойчив вплоть до

Сшс1 » 0.2N ( равновесные концентрации БСА не превышают 5-10-6моль/л). При С№с1 > 0^ происходит интенсивное выделение белка из ИПК в раствор, свидетельствующее о диссоциации ИПК, и при достижении С№с1 » 0.3N практически весь БСА обнаруживается в растворе, окружающем гель. Полученная величина разрушающей С№с1 близка к аналогичной величине для ИПК, образованных линейным полиамином и БСА [13].

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Карабанова В. Б., Рогачева В. Б., Зезин А. Б., Кабанов В.А. //

Высокомолек. соед. 1995. 37. С. 1861.

2. Скобелева В.Б., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. // ДАН. 1996. 347. С. 207.

3. Ilavsky M. // Polimer. 1981. 22. Р. 1687.

4. Асонова Т.А., Разводовский Е. Ф., Зезин А.Б. //Хим -фарм.жур. 1973. 7. №8. C. 3.

5. Тристрам Г. / Белки. Т.1. М., 1956. С. 244. Tristram G.R / Proteins./ Ed. H. Neurath , K. Bailey. V.1. N.Y., 1953. P. 244.

6. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии. Т. 1. М., 1981. С. 125. White A., Handler Ph., Smit E. Principles of biochemistry. V. 1. 1978. P. 125.

7. Зайцев В.С., Изумрудов В.А., Зезин А.Б. // Высокомолек. соед. 1992. 34. C. 138.

8. Рогачева В.Б., Превыш В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. // Высокомолек. соед. А. 1988. 30. C. 2120.

9. Хандурина Ю.В., Рогачева В.Б., Зезин А.Б., Кабанов В.А. // Высокомолек. соед. А. 1994. 36. C. 229.

10. Зайцев В.С., Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. // ДАН СССР. 1992. 322. C. 318.

11. Изумрудов В.А., Касаикин В.А., Ермакова Л.Н., Муста-фаев М.И., Зезин А.Б., Кабанов В.А. // Высокомолек. соед. А. 1981. 23. C. 1365.

12. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. Т. 1. М., 1984. С. 51. Cantor Ch.R., SchimmelPR Biophysical chemistry. V. 1. 1980. P. 51.

13. Зайцев В.С., Изумрудов В.А., Зезин А.Б., Кабанов В.А. // ДАН СССР. 1992. 323. №5. C. 890.

Поступила в редакцию 05.11.96