Изменения коллоидно-химических свойств фибриллярного белкового сырья при его модификации

ЁР

ТЕХНОЛОГИИ / Перспективные разработки

Изменения

коллоидно-химических свойств

фибриллярного белкового сырья при его модификации_

А. Ю. Соколов, канд. техн. наук,

ФГБОУ ВПО «Российский экономический университет имени Г.В. Плеханова», Е. И. Титов, доктор техн. наук,

С. К. Апраксина, канд. техн. наук, Л. Ф. Митасева, канд. техн. наук, ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Комплекс потребительских свойств биополимеров (фибриллярных белков) обусловлен с одной стороны, сложнейшей архитектоникой молекул, а с другой, высокими показателями функционально-технологических свойств, которые проявляются после предварительной гидролитической подготовки сырья соединениями - основаниями, кислотами, солями, усиливающими лиофильные свойства природных высокомолекулярных соединений. Принимая во внимание их коллоидно-химические особенности, авторы данной работы установили наиболее рациональный вариант модификации сырья для производства структурообразующих ингредиентов.

УДК 637.614:577.112

Ключевые слова: фибриллярный белок, модификация сырья, структурообразующие ингредиенты, растворение биополимера, гидролиз, щёлочно-солевая обработка.

^ Наиболее динамично развивающаяся отрасль пищевой промышленности - это производство пищевых ингредиентов, количество которых ежегодно возрастает, что взаимосвязано с общим ростом рынка пищевых продуктов. Однако в России сложилась тенденция зависимости от импорта. Поэтому, согласно официальному перечню критических технологий, включая биотехнологии, разработка новых ингредиентов является актуальным направлением научных исследований.

Новизна данной работы обусловлена отсутствием экспериментальных данных о коллоидно-химических свойствах фибриллярного белкового сырья животного происхождения.

В настоящее время сложилась тенденция комплексных исследований структурных биополимеров, например, фибриллярных белков (коллагена, кератина, эластина, хитина, фиброина и т.п.) в различных отраслях науки. Поэтому теоретической основой данных исследований послужило представление о взаимодействии высокомолекулярных веществ, в частности, сложных белков (и продуктов их переработки) с водой - гидратации, а также представление о влиянии на этот процесс следующих электролитов: солей, кислот, щелочей.

Например, наиболее изучено набухание желатина в воде, которое зависит от температуры, длительности обработок, давления, фракционного состава [1]. Кроме того, различные белки и полипептиды могут существовать в виде а-спиралей, р-структур (параллельные молекулярные цепочки) и т.д. В частности, желатин больше соответствует структурам последнего типа.

Отличительная черта гидролиза и растворения

биополимеров - наличие стадии набухания, которая предшествует собственно растворению.

Для биополимеров - фибриллярных белков кол-лагенсодержащего сырья - свойственно ограниченное набухание. Взаимодействие биополимера с растворителем - это диффузионно-контролируемый процесс: проникновение молекул растворителя в биополимерный субстрат приводит к разрыву межмолекулярных связей между цепями и формированию новых, сольватационных контактов в системе биополимер-растворитель. На этапе тепловой обработки гидратированные белки группы коллагена формируют студнеобразные системы.

Зависимость реологических свойств пищевых материалов от содержания влаги сложная, что влияет на объем, форму, прочность, упругость продуктов. Рациональное использование сырья предполагает оптимальную влагоемкость, в том числе для мясных фаршей и продуктов из них.

Академиком П.А. Ребиндером и соавторами была разработана научно обоснованная классификация форм связи влаги с материалами, включая белки, на основе стехиометрических отношений и величин энергии связи.

Различают воду механически удерживаемую (иммобилизованная); физико-химически связанную (за счет адсорбции, осмоса) - не строгое соотношение с субстратом, и химически связанную - ионная, молекулярная со строгим количественным соотношением влаги и материала.

Процессы гидратации и набухания высокомолекулярных соединений обусловлены в основном физико-химической связью, т.е. адсорбцией влаги в гид-ратных оболочках или осмотическим удерживанием

Перспективные разработки / ТЕХНОЛОГИИ

в клетках. Она удаляется из материала испарением, десорбцией (адсорбционная) или вследствие разности концентраций (осмотическая).

Г. Нейрат, К. Бэйли назвали набухание волокон белка в присутствии щелочей, кислот эффектом Дон-нана. В слабых растворах нейтральных солей наблюдается лиофильное (ионное) набухание Гофмейстера, для его устранения требуется продолжительное отмывание водой.

Физико-механическая связь обусловлена удержанием влаги в ячейках структуры (иммобилизацион-ная), в микро- и макрокапиллярах и в результате смачивания (удержание на поверхности) в неопределенных соотношениях; она удаляется путем испарения, механическими способами - отжиманием, центрифугированием и т.п.

По преобладанию формы связи влаги пищевые среды разделяют на коллоидные (физико-химически связанная влага), капиллярно-пористые ( физико-ме-ханически связанная влага) и смешанного типа - коллоидные капиллярно-пористые (мясной фарш).

Сольватационное взаимодействие макромолекул и молекул растворителя значительно изменяет способность полимерных цепей к конформационным трансформациям.

Химические свойства биополимеров (белково-уг-леводных комплексов соединительной ткани) в большой степени зависят от их конформационных свойств. Так, при сильном изменении нативной кон-формации (денатурации) белков они полностью теряют биологическую активность.

Ввиду больших размеров и сложности строения объектов конформационные свойства биополимеров носят очень сложный характер и в данной статье подробно не рассматриваются. Наличие в их молекулах значительных количеств циклосодержащих звеньев пролина и гидроксипролина снижает вероятности их конформационных переходов, поэтому образование как а-спиралей, так и р-складчатых структур ограничено.

Предпринимались попытки сравнительного анализа архитектуры гидратации трехспиральных макромолекул коллагенов и амино- и иминокислот; анализа характеристик сеток водородных связей в коллагенах по совокупности данных термодинамического, спектрального анализа и анализа возможных типов гидратации структур. Полученные новые знания о термодинамике коллагенов дают возможность проектировать коллагеновые материалы с заданной температурной стабильностью и адгезионными свойствами [5].

Известны общие закономерности процессов растворения и студнеобразования полимеров [2-4]. Набухание может быть ограниченным (I стадия) и неограниченным (II стадия). Ограниченное набухание способствует формированию студня. Неограниченное - завершается растворением.

В настоящей работе определение степени набухания выполняли, применяя стандартный гравиметрический метод. Были проведены три серии экспериментальных исследований при варьировании продолжительности щелочно-солевой обработки сырья и концентрации растворов гидроксида натрия (рис. 1).

В I серии экспериментов длительность щелочно-солевой обработки составляла 6 ч, II серии - 13 ч и III серии - 20 ч. В каждой серии концентрацию гидроксида натрия варьировали от 3 до 9% с шагом 2% (число вариантов составило 4, рис. 2). Щелочь во всех случаях растворяли в 6% хлориде натрия, который, по аналогии с другими нейтральными солями, подавлял избыточное набухание, однако безопасен в пищевом отношении, что важно для пищевых производств.

Содержание белка в БПШ составило, в среднем, для I серии - 29,1%; II - 23,0%; III - 23,6%. Такие аминокислоты фибриллярных белков, которые содержат полярные группы, в частности, аспарагино-вая кислота, глицин, лизин, гистидин, аргинин, серин, треонин, способны к сильным взаимодействиям с водой, что по-видимому, вызывало основной эффект набухания [2].

Ковалентные взаимодействия (некоторые пептидные связи), обнаруженные исследователями на различных уровнях структуры биополимеров после щелочных обработок сырья, определяют, в основном, прочность структур, способность к удерживанию определенных объемов влаги.

Наибольшая степень набухания образцов, полученных согласно серии I - 49,5±5,8% от массы исходного сырья, имела место после щелочно-солевой обработки по варианту Б4 (рис. 2, а). Набухание в меньшей степени характерно для образцов, полученных по другим вариантам (например, 29,8±4,2% и 28,6±1,4%, для вариантов и Б2, соответственно). Такое варьирование вызывается, во-первых, известным явлением резкого повышения осмотического набухания при возрастании рН выше 9 [3], и, во-вторых, существованием локальных максимумов набухания в щелочной области, на проявление которых влияют концентрации использованных реагентов, действующих совместно. Проведение солевой промывки привело к возрастанию степени набухания во всех изученных вариантах I серии. Однако увеличение данного показателя в наименьшей степени отмечено для варианта Б2 (до 32,8±2,5%). Видимо, при данной продолжительности щелочно-солевого воздействия, максимум набухания сдерживается влиянием лиотропных релаксационных эффектов (совпадение различных эффектов действующих реагентов, в т.ч. солевого раствора).

Рисунок 1. Схема исследований

Промыш водопровод, водой

ТЕХНОЛОГИИ / Перспективные разработки

Нейтрализация приводит к снижению степени набухания (удаление избытка влаги из внутримолекулярного пространства дермы), которая после дополнительной солевой промывки уменьшается примерно в пять раз по варианту 1-1. При рассмотрении других вариантов: 1-2 - 1-4, это снижение составило от 6 до 7 раз, что связано с повышением интенсивности изменений, произошедших под влиянием нарастающей концентрации щелочи.

Исходя из анализа данных, видно, что наиболее эффективное снижение степени набухания после всех этапов обработки, имело место в случае обработок сырья по вариантам 1-2, 1-3. Однако вследствие недостаточного обезволашивания и модификации, в частности, выраженной в определенной устойчивости к гидротермическому сокращению, нельзя признать эти варианты оптимальными.

В случае обработки коллагенсодержащего сырья в соответствии с серией II (рис. 2, б), степень набухания изученных образцов была больше выражена, чем при обработке согласно серии I. Анализ данных показал, что степень набухания сырья после ЩСО по варианту 11-8 - наибольшая и составила 120,0±12,4%. После проведения солевой промывки, степень набухания по данному варианту возросла на 26,1% относительно этой величины для сырья после ЩСО. Это свидетельствует о том, что фибриллярные белки обрабатываемых полуфабрикатов способны ассоциировать еще некоторое количество диполей воды. Аналогичная картина характерна и для других вариантов щелочно-солевой модификации сырья по II серии: 11-6, П-7, П-8. Можно предположить, что при данном режиме обработки достигается наибольшая «раз-деленность» структурных элементов коллагена, т.е. существенное межмолекулярное отталкивание его основных и боковых цепей.

После выполнения операции нейтрализации раствором соляной кислоты, набухание изученных образцов практически полностью исчезает, за исключением образца по варианту П-8 (рис. 2, б). Это можно объяснить влиянием сильной молекулярной адсорбции гидроксил-ионов на коллаген при предшествующем щелочно-солевом воздействии.

Необходимо отметить, что некоторое повышение степени набухания образцов сырья после дополнительной солевой промывки обусловлено повышенной гидрофильностью коллагена дермы вследствие наличия положительного заряда, возникающего после воздействия кислоты, а также полярных и различных гидрофильных центров (группы боковых цепей: —ОН, —КН= -О—КН— и др.).

Из представленных данных можно сделать заключение, что наиболее эффективное понижение степени набухания полуфабрикатов, после проведения нейтрализации, имело место при обработке по варианту П-7. Это свидетельствует о выраженной способности модифицированной структуры коллагена поглощать и отдавать влагу. Указанная особенность, а также достигнутое полное удаление производных кератина, позволяют считать данный вариант обработки предпочтительным для дальнейших исследований.

60,0

ЩСО СП Н ДСП б)

80,0

70,0 67'4

Рисунок 2. Изменение степени набухания сырья на различных этапах модификации по сериям: а - I; б - II; в - III

При обработке по варианту II-8 было невозможно определить гидротермическую устойчивость из-за деструкции коллагена, что дало основание исключить его из дальнейшего анализа.

Как можно заметить, в соответствии с серией экспериментов III (рис. 2, в), наибольшая степень набухания характерна для образцов полуфабрикатов, подвергнутых ЩСО в соответствии с вариантом III-10 -67,4±6,2%. Наименьшая степень набухания установлена после ЩСО по варианту III-11 - 44,7±5,8%. В процессе выполнения последующих этапов обработки: солевой промывки, нейтрализации и дополнительной солевой промывки, этот показатель понижался и составил по завершении последнего этапа -11,5±2,6% и 9,3±2,8%, соответственно, для вариантов III-10 и III-11. По остальным вариантам обработки, согласно данной серии, наблюдалась практически аналогичная картина по изменению степени набухания полуфабрикатов.

Обобщенный анализ результатов определения степени набухания по всем сериям показал, что после щелочно-солевой обработки длительностью 13 ч, достигаются более значительные величины, чем после обработки в течение 6 и 20 ч. Например, в первом случае значения достигали 120,0±12,4% (вариант II-8). Кроме того, после других этапов ЩСО, при об-

Перспективные разработки / ТЕХНОЛОГИИ

ЁР

Таблица. Функционально-технологические свойства объектов исследования

Показатели Объекты исследования

Сырье БПШ

Влагосвязывающая способность, % к общей влаге 76,1 80,0

Напряжение среза, Па - 20,0*104*>

Работа резания, Дж/м2 - 5,5*102*>

*) после тепловой обработки

работке длительностью 13 ч, степень набухания была весьма существенна. Это явление можно объяснить тем, что внутриструктурные связи коллагена (водородные связи, солевые мостики, ионные связи и др.) при 20-часовом щелочно-солевом воздействии деградируют в большей степени, чем при менее продолжительной обработке.

Вероятно, вследствие более длительного воздействия, структура дермы диспергируется, и некоторые гидрофильные центры утрачивают активность к ассоциации молекул воды. Поэтому может сказываться деформация и/или раскручивание мономерных единиц коллагена в процессе ЩСО. На определенном этапе обработки полярные боковые цепи занимают положение, способствующее утолщению, а затем -сокращению волокон. Эти особенности, как можно предположить, снижают коллоидно-химические и функционально-технологические показатели белковых систем, что сделало бы малоэффективным использование образцов III серии.

Таким образом, рассмотрение всех серий опытных данных, подтверждало выбор в качестве рационального варианта II-7. Изучение физико-механических характеристик образцов белкового продукта по данному варианту свидетельствовало о повышении способности удерживать влагу и о снижении прочностных характеристик, влияющих, в частности, на сенсорное восприятие получаемых комбинированных мясных продуктов (таблица).

Первичная регистрация данных измерений на универсальной испытательной машине Instron-1140 показала, что образцы свиных шкур имели напряжение среза, превышающее наибольший предел измерений (200 кПа). Это вызвало необходимость изучения влияния не только щелочно-солевой модификации, но и модельной тепловой обработки на структурно-механические свойства сырья. После проведения модификации образцы также характеризовались значительными прочностными свойствами. Только после тепловой обработки было выявлено улучшение структурно-механических показателей - напряжение среза БПШ составило около 200 кПа.

Согласно представленным данным, проведение модификации приводит к изменениям (поляризации) свойств функциональных групп белка, в т.ч. появлению свободных амино-, карбоксильных, гидроксиль-

ных групп и увеличению гидратации, набухания образцов. Такие процессы также инициировались электростатическим взаимодействием активных групп белка и диполей воды, что увеличивало количество прочносвязанной влаги и, как следствие, приводило к возрастанию влагосвязывающей способности. В частности, БПШ по данному показателю превосходил исходное сырье примерно на 4%.

После тепловой обработки образуются фибриллярные студнеобразные структуры, которые не только оказывают положительное влияние на функционально-технологические свойства мясных фаршевых продуктов, но и способствуют, a priori, уменьшению бульонно-жировых отеков, и, следовательно, способствуют повышению эффективности производства. Данное предположение позволило определить молекулярную массу белка, перешедшего в коллоидный раствор после модельной тепловой обработки.

Известно, что молекулярная масса тропоколла-гена составляет 300-500 кДа, а отдельных полипептидных цепей белков группы коллагена - от 80 до 125 кДа [2, 3]. Из продуктов тепловой денатурации коллагена были выделены а-, р- и Y-полипептиды (цепи) с молекулярной массой 100, 200 и 300 кДа.

Согласно полученным в настоящей работе данным, молекулярная масса растворенного белка БПШ составила порядка 200 кДа. Таким образом, можно предположить наличие в коллоидно-дисперсной системе в основном высокомолекулярных р-структур типа димеров; способность студнеобразования была инициирована формированием структурированной дисперсной фазы из полипептидов, в ячейках которой заключена водная среда.

Поэтому при использовании БПШ в рецептурах мясных продуктов, можно прогнозировать формирование белковой системы с более плотной структурной компоновкой.

Таким образом, комплекс потребительских свойств биополимеров обусловлен с одной стороны, сложнейшей архитектоникой молекул, а с другой, высокими показателями функционально-технологических свойств, которые проявляются после предварительной гидролитической подготовки сырья соединениями - основаниями, кислотами, солями, усиливающими его лиофильные свойства. Учитывая особенности коллоидно-химических свойств модифицированных биополимеров, в перспективе возможно получение готового продукта с более плотной стабилизированной структурой.

Контакты:

Александр Юрьевич Соколов, Евгений Иванович Титов, Светлана Константиновна Апраксина, Людмила Филипповна Митасева +7(499)237-4079

Литература

1. Антипова Л.В., Жаринов А.И., Глотова И.А. Прикладная биотехнология. Воронеж, Воронеж. гос. технол. акад., 2000. 332 с.

2. Геллер Б.Э., Геллер А.А., Чиртулов В.Г. Практическое руководство по физикохимии волокнообразующих полимеров. М.: Химия, 1996. 432 с.

3. Неклюдов А.Д., Иванкин А.Н. Коллаген: получение, свойства и применение: монография. Москва: Изд-во Московского гос. ун-та леса, 2007. 334 с.

4. Косой В.Д., Виноградов Я.И., Малышев А.Д. Инженерная реология биотехнологических сред. СПб.: ГИОРД, 2005. 648 с.

5. Рубин М. А. Влияние пролина на конформационную стабильность полипептидных цепей коллагенов: дис. ... канд. физ.-мат. наук. М.: Моск. гос. ун-т им. М.В. Ломоносова, 2009. 101 с.