Химико-ферментативный синтез биологически активных соединений на основе бетулина

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА 2/2017

УДК 579.66+547.597

И.Б. Ившина, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермский государственный национальный исследовательский университет Е.В. Тарасова, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН И.А. Толмачева, Институт технической химии УрО РАН В.В. Гришко, Институт технической химии УрО РАН

Биотрансформация полициклических терпеноидов с использованием микроорганизмов - эффективный способ одностадийного получения биологически активных соединений с высокой степенью регио- и стереоселективности. В предыдущих исследованиях нами показана возможность направленной трансформации бетулина актинобактериями рода Rhodococcus с образованием фармакологически значимого бетулона. В данной работе с целью повышения эффективности процесса бактериальной трансформации бетулина исследованы особенности взаимодействия родококков с гидрофобным тритерпеновым субстратом, возможные пути транспорта бетулина в бактериальную клетку и локализация ферментов, катализирующих окисление бетулина. Углубленное изучение процесса взаимодействия родококков с бетулином проведено с использованием комбинированной системы сканирующей зондовой микроскопии. Исследовано влияние бетулина на жирнокислотный состав, а также морфометрические и морфофункциональные характеристики родококков. Предложен общий алгоритм процесса взаимодействия бактериальных клеток с бетулином. На основе бетулона, полученного биотехнологическим путем, синтезированы новые тритерпеновые производные с выраженной противоопухолевой активностью.

Ключевые слова: бетулин, актинобактерии, Rhodococcus, субстрат-клеточные взаимодействия, биологически активные соединения.

Для получения соединений с выраженной противовоспалительной, антибактериальной, противоопухолевой и противовирусной активностью перспективным является использование бетулина - растительного пентациклического тритерпеноида лупанового ряда [1, 2]. Получают его путем экстракции из коры березы - одной из

наиболее распространенной древесной породы в Пермском крае. Содержание бету-лина во внешнем слое коры березы достигает 20-35% [3]. В настоящее время помимо химических модификаций предпринимаются попытки биологической трансформации бетулина с помощью микроорганизмов [4, 5]. Биокатализ открывает воз-

* Исследования поддержаны грантом № 14-04-96017 Российского фонда фундаментальных исследований и Правительства Пермского края.

можность получения целевых продуктов с высокой степенью регио- и стереоселек-тивности в одну технологическую стадию, при обычных температурах и давлении, в неагрессивной реакции среды, экологически безопасных условиях. Однако примеры биологической трансформации бетули-на немногочисленны и связаны преимущественно с использованием эукариотов, в частности грибов, потенциально опасных вследствие характера их посевного (спорового) материала и способности к синтезу канцерогенных микотоксинов. В связи с этим поиск новых непатогенных микроорганизмов, способных к окислительный трансформации бетулина, является весьма актуальным.

Предыдущими нашими исследованиями показана способность актинобактерий рода Rhodococcus к биотрансформации бетулина с образованием бетулона - ин-термедиата для синтеза биологически активных соединений [6, 7]. Перспективность использования родококков в качестве катализаторов процесса биотрансформации бетулина обусловлена отсутствием выраженных патогенных свойств, их политрофностью, лабильностью метаболических систем, способностью к синтезу биосурфактантов и немицелиальным характером роста.

Цель настоящей работы - углубленное исследование механизмов синтеза биологически активных соединений на основе трансформации бетулина с использованием родококков. Программа проведенных исследований включала различные направления работы - от изучения особенностей взаимодействия бактериальных клеток с бетулином и возможных путей его транспорта в клетку до оптимизации процесса биотрансформации бетулина и синтеза новых тритерпеновых производных с выраженной биологической активностью.

МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ

В работе использовали 104 штамма родококков из Региональной профилиро-

ванной коллекции алканотрофных микроорганизмов (официальный акроним коллекции ИЭГМ; номер 768 во Всемирной федерации коллекции культур, www.iegmcol.ru; реестровый номер Уникальной научной установки www.ckp-rf.ru/usu/73559), принадлежащих к видам R. erythropolis (33), 'R. longus' (10), R. opacus (14), R. rhodochrous (17), R. ruber (30). Процесс биотрансформации бетулина (0,5 или 3,0 г/л) проводили с использованием растущих, нерастущих, а также иммобилизованных бактериальных клеток. Для иммобилизации родококков в качестве носителя применяли химически устойчивый и экологически безопасный полипропилен (PP 5-10SL, Wuhu Ecotech Trade Co, Китай).

Детальное исследование взаимодействия родококков с бетулином проводили с использованием комбинированной системы сканирующей зондовой микроскопии, состоящей из атомно-силового микроскопа Asylum MFP-3D-BIO (Asylum Research, США) и конфокального лазерного сканирующего микроскопа Olympus FV1000 (Olympus Corporation, Япония) на базе кабинета микроскопии Rhodococcus-центра Пермского государственного национального исследовательского университета. Применение этого новейшего оборудования позволило изучить ответные реакции живой клетки на присутствие бе-тулина, уловить перестройки поверхностных структур бактериальной клетки в режиме реального времени и с высоким разрешением, которое не дает оптическая микроскопия.

Качественный и количественный анализ продуктов биотрансформации и химического синтеза проводили с помощью высокоэффективных методов хро-матографического, спектрометрического и спектрального анализа (хромато-масс-спектрометрия, УФ-, ИК- и ЯМР-спек-троскопия). Для сравнительной оценки цитотоксической активности полученных соединений в отношении опухолевых клеточных линий использовали МТТ-тест [8].

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сравнительное изучение морфофи-зиологических характеристик родококков в присутствии бетулина. С использованием фазово-контрастной микроскопии выявлено образование гетерогенных клеточных агрегатов, увеличение размеров которых коррелировало с концентрацией вносимого бетулина (рис. 1). Образование агрегатов, по-видимому, обусловлено неспецифическими физико-химическими взаимодействиями между частицами бетулина и поверхностными структурами клеток. Неспецифичность процесса биосорбции бетулина подтвер-

ждается результатами микроскопических исследований мертвых бактериальных клеток в присутствии бетулина. По нашим данным, живые и убитые автоклави-рованием бактериальные клетки образуют агрегаты с частицами бетулина.

По данным конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ), ро-дококки в составе клеточных агрегатов сохраняют высокий (более 80%) уровень жизнеспособности в присутствии бетули-на (рис. 2). Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют об отсутствии токсического действия бетулина на клетки, ибо достоверных различий между их морфометрическими показателями в при-

А

Б

Рис. 1. Клетки R. гНоёвскгош ИЭГМ 66 в фосфатном буфере в присутствии 0,5 г/л бетулина (Б) и без него (А) (фазово-контрастная микроскопия). Бк - бактериальные клетки, Бет -частицы бетулина

Рис. 2. КЛСМ-изображения клеток R. гкоёосИгош' ИЭГМ 66 без бетулина (А) и в присутствии 3,0 г/л бетулина (Б). Клетки, окрашенные зеленым цветом, - живые, красным - мертвые

Таблица 1

Морфометрические показатели клеток R. rhodochrous ИЭГМ 66 в процессе биотрансформации бетулина

Концентрация бетулина, г/л Длина, ^m Ширина, ^m Площадь поверхности, ^m2 Объем, ^m3 Площадь поверхности / объем

0,0 2,1 ±0,3 0,8±0,1 6,3±0,5 1, 1 ±0,4 6,0±0,7

0,5 1,9±0,5 0,7±0,1 5,4±0,4 0,9±0,3 6,5±0,8

3,0 1,8±0,5 0,8±0,1 5,6±1,1 1,0±0,1 6,2±0,9

Примечание. Измерение морфометрических показателей бактериальных клеток проводили через 24 ч с начала эксперимента.

сутствии бетулина и без него не выявлено.

Использование метода атомно-силовой микроскопии (АСМ) позволило выявить на поверхности клеток частицы адсорбированного бетулина, а также увеличение степени шероховатости поверхности бактериальных клеток (рис. 3). Использование комбинированной системы сканирующей микроскопии (КЛСМ-АСМ), обеспечивающей получение реальных 3D-изобра-жений живых клеток и более достоверных морфометрических данных, позволило экспериментально подтвердить, что процесс взаимодействия родококков с бетули-ном протекает путем их прямого контакта. На рис. 4 стрелкой обозначены участки взаимодействия бактериальных клеток с тритерпеновым субстратом. Если это связать с выраженной шероховатостью клеточной поверхности, то можно предполо-

жить, что взаимодействие с бетулином протекает в участках локализации адгези-нов [9].

При детальном изучении липидного состава родококков в присутствии бетули-на обнаружена прямая зависимость между содержанием суммарных клеточных липи-дов, концентрацией бетулина и продолжительностью процесса. При этом наблюдается увеличение содержания разветвленных и дикарбоновых жирных кислот, что способствует повышению степени липо-фильности и сродства бактериальных клеток к гидрофобному бетулину (рис. 5).

Для определения локализации ферментов, катализирующих процесс окисления бетулина, была проанализирована трансформирующая активность различных клеточных экстрактов, полученных в результате ультразвуковой санации родо-

Рис. 3. АСМ-изображения (I) R. rhodochrous ИЭГМ 66 без бетулина (А) и в присутствии 0,5 (Б) или 3,0 (В) г/л бетулина. Ниже приведены характерные профили (II) бактериальных клеток

Рис. 4. Комбинированное КЛСМ-АСМсканирование клеток R. гкоёосИгош' ИЭГМ 66 в присутствии бетулина (II) и без него (I): А, В - АСМ-изображения; Б, Г - 3D КЛСМ/АСМ-изображения. Бет - частицы бетулина

Рис. 5. Влияние бетулина на жирнокислотный профиль родококков. Состав жирных кислот определяли через 24*и 96** ч с начала процесса биотрансформации бетулина

кокков. Оказалось, что в процессе окислении бетулина до целевого продукта бету-лона участвуют внутриклеточные ферменты и ферменты, прочно связанные с клеточной мембранной родококков (табл. 2).

Полученные сведения позволили разработать общий алгоритм процесса взаимодействия родококков с бетулином. Согласно схеме алгоритма, за счет действия неспецифических физико-химических сил (ван-дер-ваальсовы, гидрофобные, элек-

Таблица 2

Окислительная биотрансформация бетулина с использованием клеточных _экстрактов R. rhodochrous ИЭГМ 66_

Клеточные экстракты Продукты биот рансформации, %

бетулин бетулон

Целые клетки 40,0±6,2 60,0±8,2

Супернатант с внутриклеточными ферментами 74,2±8,5 25,8±6,0

Супернатант с мембранно-связанными ферментами, экстрагируемыми тритоном Х-100 100 0,0

Супернатант с ферментами, не экстрагируемыми тритоном Х-100 67,9±7,9 32,1±5,1

тростатические) образуются гетерогенные агрегаты из клеток и частиц бетулина, в дальнейшем происходит растворение адсорбированного бетулина в липидах клеточной стенки родококков, транспорт бе-тулина через цитоплазматическую мембрану и ферментативное окисление бетулина с образованием бетулона.

Возможные пути биотрансформации бетулина. Установлено, что в процессе биотрансформации бетулина с использованием штаммов родококков, принадлежащих к виду Я. вгу^горо^, образуются не только бетулон, но и другие окисленные производные бетулина, в частности, С-28 альдегиды бетулина и бетулона, бетулоно-вая и бетулиновая кислоты. По нашим данным, процесс биотрансформации бету-лина идет по двум метаболическим путям. Первый - окисление обеих гидроксиль-ных групп с образованием бетулона (2), альдегида бетулона (3) и бетулоновой кислоты (4). Второй путь предполагает се-

2§СН20Н

лективное окисление бетулина (1) до бету-линовой кислоты (6). При этом образуемые бетулиновая и бетулоновая кислоты обладают выраженным фармакологическим действием, а бетулон, альдегиды бе-тулина и бетулона представляют собой ключевые интермедиаты для синтеза биологически активных производных (рис. 6).

Биотрансформация бетулина иммобилизованными клетками. Использование приема адсорбционной иммобилизации родококков на полипропилене (рис. 7) способствовало заметному увеличению выхода бетулона, но не бетулино-вой кислоты и альдегида бетулина (табл. 3). Это, по-видимому, связано с индукцией процесса окисления вторичной гидроксильной группы бетулина и образованием (более 50%) бетулона.

Химический синтез производных бетулина. Бетулон, полученный в результате биотрансформации бетулина иммобилизованными бактериальными клетками, в

л

л

1CH2OH

Рис. 6. Возможные пути биотрансформации бетулина с использованием клеток Я. вrythropolis ИЭГМ 209

O

дальнейшем был использован нами в химическом синтезе тритерпеновых производных с целевой биологической активностью. В ходе проведенных химических реакций получены новые лупановые А-кон-денсированные азолы с выраженной (1С50 1,5±0,70 и 1,4±0,50) цитотоксичной активностью в отношении ларингеальной и ко-лоректальной карцином соответственно.

Заключение. В результате проведенных исследований впервые установлена способность актинобактерий рода Rhodococcus к окислительной биотрансформации бетулина с образованием фармакологически значимых производных с высокой степенью регио- и стереоселек-тивности. При этом характерной особенностью родококков в присутствии бетули-на является изменение их морфофизиоло-гических свойств, как то: адгезия клеток к частицам бетулина и образование гетерогенных клеточных агрегатов, увеличение размеров клеточных агрегатов при повы-

шении концентрации вносимого бетулина, увеличение степени шероховатости клеточной поверхности, повышение степени липофильности бактериальных клеток за счет увеличения содержания суммарных клеточных липидов и бетулинзависимых изменений жирнокислотного профиля ро-дококков. Выявленные особенности взаимодействия родококков с гидрофобным тритерпеновым субстратом можно рассматривать как механизмы адаптации бактериальных клеток к воздействию бетули-на. Данные механизмы обеспечивают сохранение высокого (более 80%) уровня жизнеспособности и высокой (до 75%) каталитической активности родококков в присутствии сравнительно высоких (3,0 г/л) концентраций бетулина. На основе полученных экспериментальных данных предложен общий алгоритм процесса взаимодействия бактериальных клеток с бетулином и синтезированы новые тритер-пеновые производные с выраженной противоопухолевой активностью.

Рис. 7. Биотрансформация бетулина иммобилизованными клетками R. егу(ИгороН&' ИЭГМ10: А - диски полипропилена в минеральной среде без клеток; Б - иммобилизованные клетки в присутствии бетулина через 2 суток; В - 7 суток с начала эксперимента

Таблица 3

Биотрансформация бетулина иммобилизованными клетками_

Штамм Бетулиновая кислота, % Бетулиновый альдегид, % Бетулон, % Бетулин, %

ИЭГМ 10 5,3±1,5 8,5±2,2 50,5±8,2 37,1 ±6,6

ИЭГМ 254 5,1±1,6 6,8±2,0 36,3±6,2 49,0±7,6

ИЭГМ194 5,5±1,7 5,8±1,5 26,2±5,1 54,6±6,3

ИЭГМ199 4,6±0,8 4,0±0,9 27,0±5,2 52,6±6,2

ИЭГМ 205 5,5±1,8 2,0±0,5 41,2±6,5 42,1 ±4,6

Библиографический список

1. Alakurtti S., Makela T., Koskimies S., Yli-Kauhaluoma J. Pharmacological properties of the ubiquitous natural product betulin // Eur. J. Pharm. Sci. - 2006. - Vol. 29. - № 1. - P. 1-13.

2. Santos R.C., Salvador J.A.R., Marin S., Cascante M. Novel semisynthetic derivatives of betulin and betulinic acid with cytotoxic activity // Bioorgan. Med. Chem. - 2009. - Vol. 17. - № 17. - P. 6241-6250.

3. Tolstikov G.A., Flekhter O.B., Shultz E.E., Baltina L.A., Tolstikov A.G. Betulin and its derivatives. Chemistry and biological activity // Chem. Sustain. Devel. - 2005. - Vol. 13. - P. 1-29.

4. Parra A., Rivas F., Garcia-Granados A., Martinez A. Microbial transformation of triterpenoids // Mini-Rev. Org. Chem. - 2009. - Vol. 6. - № 4. - P. 307-320.

5. Muffler K., LeipoldD., Scheller M.-C., Haas C., Steingroewer J., Bley T., Neuhaus H.E., MirataMA., Schrader J, Ulbera R. Biotransformation of triterpenes // Process Biochem. - 2011. - Vol. 46. - № 1. - P. 1-15.

6. Grishko V. V., Tarasova E. V., Ivshina I.B. Biotransformation of betulin to betulone by growing and resting cells of Rhodococcus rhodochrous IEGM 66 // Process Biochem. - 2013. - Vol. 48. - № 11. -P. 1640-1644.

7. Grishko V.V., Nazarov A.V., Tolmacheva I.A., Tarasova E.V., Ivshina I.B. Chemical conversions of betulone produced by biotransformation // Chem. Nat. Compd. - 2014. - Vol. 50. - № 5. - P. 857-861.

8. Kim J.Y., Koo H.M., Kim D.S. Development of C-20 modified betulinic acid derivatives as antitumor agents // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2001. - Vol. 11. - № 17. - P. 2405-2408.

9. Pen Y., Zhang Z.J., Morales-Garcia A.L., Mears M., Tarmey D.S., Edyvean R.G., Banwart S.A., Geoghegan M. Effect of extracellular polymeric substances on the mechanical properties of Rhodococcus // Biochim. Biophys. Acta. - 2015. - Vol. 1848. - № 2. - P. 518-526.

CHEMICAL AND ENZYMATIC SYNTHESIS OF BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS BASED ON BETULIN

I.B. Ivshina1'2, E.V. Tarasova1, I.A. Tolmacheva3, V.V. Grishko3

1 Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms UB RAS

2 Perm State National Research University

3 Institute of Technical Chemistry UB RAS

Biotransformation of polycyclic terpenoids by microorganisms is an efficient method for singlestage production of biologically active compounds with high regio- and stereoselectivity. In the previous studies we have reported about the possible directed transformation of betulin by Rhodococcus actinobacteria to produce pharmacologically valuable betulone. In order to increase the efficiency of the process of biotransformation of betulin, this study focuses on the interactions between rhodococci and hydrophobic triterpene betulin, possible ways of betulin transport into bacterial cells, and the localization of enzymes responsible for betulin oxidation. A detailed study on rhodococci and betulin interactions was performed using a combined system of scanning probe microscopy. The effects of betulin on fatty acid composition of rhodococci and their morphometric and morphofunctional characteristics during biotransformation were studied. A general algorithm of the interactions between bacterial cells and betulin was proposed. New triterpene derivatives with a marked antitumor activity were synthesized based on betulone obtained by a biotechnological method.

Keywords: betulin, actinobacteria, Rhodococcus, cell-substrate interactions, biologically active compounds.

Сведения об авторах

Ившина Ирина Борисовна, доктор биологических наук, академик РАН, заведующая лабораторией алканотрофных микроорганизмов, Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (ИЭГМ УрО РАН), 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13; профессор кафедры микробиологии и иммунологии, Пермский государственный национальный исследовательский университет (ПГНИУ), 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15; e-mail: ivshina@iegm.ru

Тарасова Екатерина Владимировна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории алканотрофных микроорганизмов, ИЭГМ УрО РАН; e-mail: tarasova@iegm.ru Толмачева Ирина Анатольевна, кандидат химических наук, старший научный сотрудник лаборатории биологически активных соединений, Институт технической химии УрО РАН (ИТХ УрО РАН), 614013, г. Пермь, ул. Академика Королева, 3; e-mail: tolmair@gmail.com Гришко Виктория Викторовна, кандидат химических наук, заведующая лабораторией биологически активных соединений, ИТХ УрО РАН; e-mail: grishvic@gmail.com

Материал поступил в редакцию 21.10.2016 г.