КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ
COMPOSITIONS AND METHODS FOR MALIGNANT NEOPLASMS PREVENTION AND TREATMENT

Перекрестные ссылки на родственные заявки
[0001] Данная заявка заявляет приоритет согласно 35 USС §119(е) по отношению к предварительной патентной заявке США с порядковым номером 61/413330, поданной 12 ноября 2010 года, которая включена в данный документ ссылкой в полном объеме.
Область техники, к которой относится изобретение
[0002] Данное изобретение относится к композициям и способам, связанным с иммунотерапией и медициной. Конкретно, данное изобретение относится к терапевтическим средствам для предотвращения и лечения злокачественных новообразований.
Уровень техники
[0003] Онкоиммунология представляет собой перспективную область в сфере терапевтических средств против злокачественных новообразований, целью которой является использование собственной защиты организма для направленного воздействия и для уничтожения злокачественных клеток. Идея использования собственной иммунной системы организма для атаки на злокачественные клетки имеет много преимуществ по отношению к традиционным терапиям, которые являются сайтспецифическими, такими как облучение и хирургическое вмешательство, или по отношению к химиотерапевтическим методам, с которыми связаны неблагоприятные побочные эффекты и с высокая токсичность.
[0004] Данная область существенно продвинулась благодаря идентификации и описанию множества различных опухолеспецифичных антигенов. Подобные опухолеспецифичные антигены специфичны для злокачественных клеток. Если бы можно было запускать иммунный ответ, который был бы нацелен на такие опухолеспецифичные антигены, то организм был бы сам способен эффективно уничтожать злокачественные клетки. Однако стратегии индуцирования опухолеспецифичного иммунитета у пациентов до сих пор не увенчались успехом. Исследования наводят на мысль о том, что существуют различные факторы, которые вносят вклад в провал существующих в настое время противоопухолевых иммунотерапевтических стратегий. Во-первых, эти стратегии не приспособлены к достаточной наработке циркулирующих цитотоксических Т-лимфоцитов. Во-вторых, у онкологических пациентов часто подавлен иммунитет и они не способны вырабатывать костимулирующие молекулы, необходимые для инициации иммунного ответа. Таким образом, главная цель иммунотерапии злокачественных новообразований заключается в получении большого количества высокоавидных опухолеспецифичных Т-клеток, которые могут эффективно атаковать злокачественные клетки in vivo.
[0005] В настоящем изобретении используется наночастица с покрытием в виде комплексов опухолеспецифичный антиген/МНС и костимулирующих молекул. Данный уникальный комплекс может индуцировать наработку циркулирующих CD8+ Т-клеток в количестве, которое превосходит количество, получаемое с использованием известных в настоящее время иммунотерапий злокачественных новообразований.
Сущность изобретения
[0006] Обычная иммунотерапия злокачественных новообразований не способна эффективно нарабатывать Т-клетки, которые специфично направленно воздействуют на злокачественные клетки, в количествах, достаточных для существенного уменьшения размера опухоли. Предполагается, что наночастицы, покрытые молекулами МНС класса I и/или класса II, презентирующие опухолеспецифичные антигены и костимулирующие молекулы, способны активировать наивные (naïve) Т-клетки, что приводит к массивной наработке антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток, способных дифференцироваться в цитотоксические Т-клетки, эффекторные Т-клетки, Т-клетки памяти и хелперные Т-клетки, которые необходимы для инициации и поддержания устойчивого иммунного ответа против злокачественных, предзлокачественных или неопластических клеток in vivo. В настоящем изобретении описан системный подход направленного воздействия на злокачественные и предзлокачественные клетки, которые являются циркулирующими клетками, как в случае лимфом, так и мигрирующими метастатическими клетками, как в случае твердых опухолей. Такой подход резко контрастирует с сайтспецифичными терапиями, такими как облучение, хирургическое вмешательство и биопсия.
[0007] Аспекты и воплощения данной технологии включают новый способ профилактики или лечения опухолей и злокачественных новообразований, включающий введение объекту комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула, функционально связанного с наночастицей, в количестве, достаточном для наработки противоопухолевых Т-клеток. Традиционно, иммунотерапии, направленно воздействующие на опухоли и злокачественные новообразования, не имели успеха в наработке Т-клеток в количествах, достаточных для эффективного лечения пациентов, имеющих злокачественные клетки и/или опухоли. Аспекты настоящего изобретения относятся к новым комплексам, которые неожиданно оказались способны приводить к наработке популяции противоопухолевых Т-клеток на уровне, который традиционно был не достижим с использованием других иммунотерапий.
[0008] Конкретные воплощения настоящего изобретения относятся к способу ингибирования роста опухолей и профилактики или лечения злокачественных новообразований, который включает введение объекту комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула, функционально связанного с наночастицей, в количестве, достаточном для наработки противоопухолевых Т-клеток, где способ дополнительно включает введение комплексов антиген/МНС/наночастица в количестве, достаточном для активации и/или наработки уже существующих противоопухолевых клеток памяти. Предполагается, что введение пациенту комплексов антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица будет способствовать дифференцировке наивных Т-клеток в различные типы популяций антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток. Как таковая, одна из этих популяций будет представлять собой антигенспецифичные противоопухолевые Т-клетки памяти. Дополнительно предполагается, что последующее введение комплексов антиген/МНС/наночастица без костимулирующих молекул может активировать указанные антигенспецифичные противоопухолевые клетки памяти.
[0009] В следующем аспекте в данном описании предлагается способ активации антигенспецифичных противоопухолевых клеток памяти у пациента, нуждающегося в этом, путем введения эффективного количества комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула, функционально связанного с наночастицей.
+
+
[0010] Еще в одном воплощении изобретение включает способы диагностики злокачественного новообразования, включающие оценку индуцированного лечением увеличения ответов противоопухолевых CD8 или CD4 Т-клеток в качестве показателя активного иммунитета.
[0011] Другой аспект относится к способу ингибирования метастазирования злокачественного новообразования у пациента, включающий введение объекту комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула, функционально связанного с наночастицей, в количестве, достаточном для наработки популяции антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток, где указанной наработанной популяции достаточно для лечения указанного злокачественного новообразования, где указанный антиген специфичен к указанной опухоли, где указанное введение обеспечивает системную циркуляцию комплекса у указанного пациента.
+
+
+
+
+
+
[0012] Следующие воплощения изобретения включают способы наработки антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток, включающие введение объекту или в клетки in vitro комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица в количестве, достаточном для стимуляции наработки антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток. В определенных аспектах Т-клетка представляет собой CD8 или CD4 Т-клетку или NKT-клетку. В других аспектах изобретения Т-клетка представляет собой CD8 или CD4 Т-клетку памяти. В следующих аспектах изобретения Т-клетка представляет собой CD8 цитотоксическую Т-клетку или CD4 хелперную Т-клетку.
[0013] Определенные воплощения настоящего изобретения относятся к способам селективной наработки и/или наращивания популяций антигенспецифчных противоопухолевых Т-клеток у объекта, причем способ включает введение указанному объекту комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица, где указанный комплекс вводят в количестве и с частотой, которые достаточны для наработки указанных популяций. Таким образом, настоящее изобретение может инициировать и поддерживать иммунный ответ, который уменьшает или исключает развитие злокачественных и предзлокачественных клеток in vivo. С помощью настоящего изобретения, как такового, можно нарабатывать описываемые Т-клетки, такие как Т-клетки, которые распознают опухолевые антигены, для профилактики, лечения и/или ослабления заболеваний, ассоциированных с развитием опухолей.
[0014] Настоящее изобретение относится к направлению клеток в организме по антигенспецифическому пути. Опухолеспецифичные антигены хорошо известны в данной области и описаны в различных публикациях, например, в Dranoff, G. ("Targets of Protective Tumor Immunity.» (2009) Cancer Vaccines: Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174: 74-80), и в Патентах США 7795224, 7812116, 7785801, которые включены в данный документ ссылкой. Технология не ограничивается конкретными антигенами, а технологии идентификации опухолеспецифичных антигенов хорошо известны в данной области и ранее были описаны, например, в Schlichtholz et al. ("The immune response to p53 in breast cancer patients is directed against immunodominant epitopes unrelated to the mutational hot spot.» Cancer Res 1992; 52: 6380-4), De Plaen E et al. ("Immunogenic (tum-) variants of mouse tumor P815: cloning of the gene of tum-antigen P91A and identification of the tum-mutation.» Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85: 2274-8), and Sahin U. et al. ("Human neoplasms elicit multiple specific immune responses in the autologous host.» Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 11810-3, которые включены в данный документ ссылкой. Таким образом, без связи с теорией, данная технология инициирует иммунный ответ против любых клеток в организме, которые характеризуются, как имеющие специфический антиген. Настоящее изобретение, как таковое, не ограничивается последовательностью специфического антигена, но может относиться к любой последовательности антигена, которая, как обнаружено, является уникальной по отношению к пораженной клетке в организме.
[0015] Воплощения изобретения относятся к способам диагностики, профилактики или лечения развития опухоли, включающим введение комплекса антиген/МНС/костимулирующпя молекула/наночастица объекту в количестве, достаточном для наработки антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток. В общем, и при использовании в данном документе, термин «антиген» включает в частности все или часть таких компонентов, как пептид, нуклеиновая кислота, углевод, липид или другое соединение, которые могут модулировать активность Т-клеток или Т-клеточных популяций, когда они в контексте МНС или МНС-подобной молекулы связаны с субстратом. В некоторых аспектах данного изобретения наночастица является биоабсорбируемой, что предотвращает продолжительное накапливание наночастиц in vivo без какой-либо сопутствующей токсичности.
[0016] Воплощения изобретения для применения в описанных способах охватывают частицы, включающие наночастицу, связанную с комплексом антиген/МНС/костимулирующая молекула. Комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула может быть связан непосредственно с наночастицей посредством линкера. Наночастица может включать различные слои, которые в свою очередь могут включать множество компонентов (например, металлическое ядро с покрытием или оболочкой из других молекул, которые могут более легко соединяться с комплексом антиген/МНС/костимулирующая молекула, таких как стрептавидин или авидин или другие известные молекулы, используемые для присоединения компонентов к наночастицам). В определенных аспектах наночастица содержит один или несколько материалов, выбранных из группы, состоящей, например, из селенида кадмия, титана, диоксида титана, олова, оксида олова, кремния, диоксида кремния, железа, оксида железа III, серебра, никеля, золота, меди, алюминия, стали, сплава кобальт-хром, сплава титана, брушита, трикальцийфосфата, оксида алюминия, кремнезема, циркония, алмаза, полистирола, силикона, резины, поликарбоната, полиуретанов, полипропиленов, полиметилметаакрилата, поливинилхлорида, сложных полиэфиров, простых полиэфиров, и полиэтилена, трикальцийфосфата, хрома, галлия, а также биосовместимых, биоабсорбируемых полимеров, таких как PGLA, PLLA, PGA, PDLLA, PCL, PDLGA, PLDLA, PLC (каждый из которых имеется в продаже у «Zeus», 3737 Industrial Blvd, Ориджберг, Южная Каролина, 29118 США од торговой маркой «Absorv™»), гиалуроновой кислоты, альгината, полигидроксиалканоатов и так далее. В следующих аспектах биосовместимая, биоабсорбируемая наночастица содержит один или несколько компонентов из числа металлической наночастицы или способной намагничиваться наночастицы, или наночастицы из суперпарамагнетика. Биосовместимая, биоабсорбируемая наночастица может дополнительно включать одно или несколько биодеградируемых покрытий, образованных из декстрана; поли(этиленгликоля); поли(этиленоксида); маннита; поли(гидроксиалканоатов) класса PHB-PHV; и других модифицированных поли(сахаридов), таких как крахмал, целлюлоза и хитозан.
[0017] Определенные аспекты изобретения включают способы и композиции, включающие антигенные композиции, которые, в свою очередь, включают один или несколько сегментов, фрагментов или эпитопов полипептидов, пептидов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и других молекул, которые вызывают или индуцируют антигенный или иммунный ответ, который, как правило, относится к антигенам.
[0018] В определенных аспектах комплекс антигена/МНС и костимулирующей молекулы может быть перекрестно связан (конъюгирован) с наночастицами, описанными в данном документе, с использованием способов, известных в данной области. Один частный пример такого способа конъюгации наночастицы с комплексом антигена/МНС и к-стимулирующей молекулы включает (а) реакцию комплекса антигена/МНС и костимулирующей молекулы с конъюгирующим агентом, с образованием таким образом комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула; и (b) реакцию наночастицы с комплексом стадии (а). Другой частный пример такого метода конъюгации наночастицы с комплексом антигена/МНС и костимулирующей молекулы включает (а) реакцию комплекса антигена/МНС и костимулирующей молекулы с конъюгирующим агентом по отдельности, с образованием, таким образом, комплекса антиген/МНС и комплекса костимулирующей молекулы; и (b) реакцию наночастицы с комплексом стадии (а), так что комплексы антигена/МНС и костимулирующей молекулы по отдельности связываются с наночастицей. В одном воплощении, способ включает концентрированно комплекса стадии (а) перед осуществлением стадии (b). В другом воплощении, конъюгирующий агент включает гетеробифункциональный агент. Еще в одном воплощении, конъюгирующий агент включает DOTA-малеимид (4-малеимидобутирамидобензил-DOTA), SMPT (4-сукцинимидилоксикарбонил-б-метил-б-(2-пиридилдитио)толуол-), сульфо-LC-SMPT (сульфосукцинимидил-6-(б-метил-б-(2-пиридилтио)толуамидо)гексаноат, реагент Трота (2-иминотиолан-HCl), или любую их комбинацию. См. Патентные публикации США No. 20070059775; Пат. США No. 4671958, 4659839, 4414148, 4699784; 4680338; 4569789; 4589071; 7186814 и 5543391 Европейскую Патентную Заявку No. 188256 на предмет обсуждения конъюгации комплексов с микрочастицами или с наночастицами, описание публикаций включено в данный документ ссылкой.
[0019] В определенных воплощениях комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула получают путем осуществления сначала перекрестного связывания костимулирующей молекулы и наночастицы. В этом случае в описании также предлагается промежуточное соединение, которое включает наночастицу и костимулирующую молекулу, связанную с указанной наночастицей.
[0020] Злокачественные новообразования, предзлокачественные, опухоли и/или неопластические патологические состояния, подвергнутые лечению с помощью способов и композиций по настоящему описанию, не ограничены каким-либо конкретным типом клеток или опухолей или конкретным злокачественным новообразованием, но включает любое такое патологическое состояние (например, злокачественное новообразование), в котором опухолеспецифичный антиген присутствует в клетках, таких как злокачественные клетки. В определенных аспектах пептидный компонент комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица выделяют или конструируют из антигена или антигенного эпитопа, или его имитатора, который экспрессируется или присутствует в опухолевых, злокачественных, предзлокачественных или в неопластических клетках. Множество таких белков были идентифицированы для различных злокачественных новообразований.
[0021] В других аспектах данного изобретения, МНС-компонент комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица представляет собой классический или неклассический полипептидный компонент МНС класса I или МНС класса II. Компонент МНС класса I может включать всю или часть молекул из числа HLA-A, HLA-В, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, конкретно всю или часть молекул HLA-A, таких как молекула HLA-A*0201 МНС класса I. Неклассический компонент МНС класса I может включать CD1-подобные молекулы. Компонент МНС класса II может включать все или часть из числа HLA-DR, HLA-DQ, или HLA-DP. В определенных аспектах, комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула ковалентно или нековалентно связан с субстратом или присоединен к нему (комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица).
[0022] Костимулирующие молекулы представляют собой молекулы, которые производят вторичный сигнал in vivo, служащий для активации наивных Т-клеток в антигенспецифичные Т-клетки, способные вырабатывать иммунный ответ к клеткам, обладающим указанным специфичным антигеном. Различные костимулирующие молекулы хорошо известны в данной области, и настоящее изобретение не ограничивается одной конкретной костимулирующей молекулой. Некоторые примеры костимулирующих молекул представляют собой В7.1, 4-IBBL, CD40, IL-15/IL-15Ra, CD28, CD80, CD86, и ICOS. В некоторых воплощениях только одна специфичная костимулирующая молекула связана с наночастицей. В другом воплощении множество различных костимулирующих молекул связаны с одной и той же наночастицей. В конкретных воплощениях костимулирующая молекула представляет собой белок, такой как антитело, который может быть агонистом костимулирующего рецептора на Т-клетке. В данном случае антитело способно индуцировать костимулирующий сигнал, который необходим для активации наивных Т-клеток и индукции иммунного ответа антигенспецифичным образом.
[0023] Субстратом, как правило, является наночастица. Одним из критических аспектов настоящего изобретения является наночастица. В одном воплощении диаметр наночастицы составляет от около 1 нм до около 100 нм. Предпочтительно, диаметр наночастицы составляет от около 5 нм до около 15 нм. В другом воплощении диаметр наночастицы составляет от около 5 до около 25 нм, или от около 1 до около 50 нм, или от около 2 до около 25 нм, или от около 1 до около 10 нм, или от около 10 до около 20 нм или от около 1 до около 30 нм. В одном воплощении наночастица включает металл, такой как железо или оксид железа. В другом воплощении, наночастица включает биосовместимый, биоабсорбируемый полимер. В определенных воплощениях, наночастица подвергается биоабсорбции in vivo, так что накопление наночастиц in vivo ограничено. Пептиды по изобретению могут быть химически связаны с субстратом и конкретно связаны посредством пептидного линкера. Молекулы CD1 представляют собой пример неклассической молекулы МНС. Неклассические молекулы МНС характеризуются как неполиморфные, консервативные среди видов и обладающие узкими, глубокими, гидрофобными лигандсвязывающими карманами. Эти связывающие карманы способны презентировать гликолипиды и фосфолипиды естественным киллерным Т-клеткам (NKT). NKT-клетки представляют собой уникальную популяцию лимфоцитов, которые коэкспрессируют маркеры клеток NK и полуинвариантный Т-клеточный рецептор (TCR). Они вовлечены в регуляцию иммунного ответа, ассоциированного с широким спектром заболеваний.
[0024] В определенных аспектах комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица не нуждается во введении вместе с адъювантом с целью индукции иммунного ответа, например, антительного ответа. В конкретных воплощениях, композиция антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица может использоваться совместно с другими терапевтическими методами, которые индуцируют антительный ответ, направленный против злокачественных клеток.
Описание чертежей
[0025] Следующие чертежи образуют часть настоящего описания и включены для дополнительной демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение может быть более понятно посредством ссылки на один или несколько из этих чертежей в комбинации с подробным описанием конкретных воплощений, представленных в данном документе.
13
[0026] На Фиг.1 представлено характерное изображение, полученное с помощью ТЕМ. рМНС-покрытые GNP (англ. Gold Nanoparticles, золотые наночастицы) (14 нм) сконцентрированы в высокой плотности (~5×10/мл) и монодиспергированы. Увеличение: 50000Х.
13
[0027] На Фигуре 2 показано влияние, которое оказывают на агонистические свойства рМНС-покрытых GNP доза рМНС (GNP) и валентность рМНС. На Фигуре сравниваются количества IFNγ, секретированного когнатными 8.3-CD8+ Т-клетками в ответ на два различных образца pMHC-GNP (оба состоят из ~2×10 GNP по 14 нм в диаметре/мл). Au-022410 и Au-21910, несущие ~250 и ~120 pMHCs/GNP, соответственно. Au-011810-С, несущие ~120 контрольных pMHC/GNP.
d
[0028] На Фигуре 3 показано влияние размера на агонистическую активность. Au-022410 представляли собой 14 нм GNP, покрытые рМНС с относительно низкой валентностью, но приготовленные с высокой плотностью; Au-032310 представляли собой 40 нм GNP, покрытые рМНС с высокой валентностью, но с низкой плотностью. Образец Au-022410 обладал большей агонистической активностью, чем образец Au-032310. Au-032310-С представляли собой NP (англ. Nanoparticles, наночастицы), покрытые TUM/K (отрицательный контроль рМНС).
13
13
[0029] На Фигуре 4 показано влияние защитных PEG на функцию pMHC-GNP. Au-021910, состояли из ~2×10 GNP 14 нм в диаметре/на мл, защищенные с помощью 2 кДа тиол-PEG и покрытые ~120 pMHC/GNP. Au-011810 GNP (также ~2×10 14 нм GNP/мл) защищали с помощью 5 кДа тиол-PEG и покрывали ~175 pMHC/GNP. Образец Au-021910 очевидно обладал большей агонистической активностью.
206-214
206-214
d
d
d
[0030] На Фигуре 5 изображена in vivo наработка когнатных саморегулирующихся CD8+ Т-клеток с помощью GNP, напрямую покрытых IGRP-K. Средний % CD8+ Т-клеток в крови или в лимфоидных органах (панкреатические или мезентериальные лимфоузлы -PLN и MLN, соответственно), которые связываются с IGRP-K тетрамерами (n=3 мыши). Контрольные рМНС-GNP представляли собой GNP, приготовленные также, но покрытые не связанным с заболеванием комплексом рМНС (TUM/K).
[0031] На Фигуре 6 изображена массивная наработка когнатных CD8+ Т-клеток у мышей, обработанных рМНС-покрытыми NP. Верхняя панель: профиль мыши, умерщвленной после 4 доз. Нижняя панель двух различных мышей после 10 инъекций (только кровь; живы на момент подачи данного документа).
3
4
14
[0032] На Фигуре 7 представлено 30000x и 40000х увеличение рМНС-конъюгированных FeO наночастиц (IGRP/анти-CD28-SFPE-080411) в PBS. Железные наночастицы (SFPE-072611) имели размер ядра 9,4 нм. Концентрация рМНС составила 380 мкг/мл согласно измерениям методом иммуноферментных пятен. Концентрация анти-CD28 составила 124 мкг/мл согласно измерениям методом иммуноферментных пятен. Концентрация Fe составила 700 мкг/мл (3,5×10 рМНС-FeNP/мл). Валентность рМНС составляет 13 pMHC/NP согласно измерениям методом иммуноферментных пятен. Валентность анти-CD28 составила 1,4 pMHC/NP согласно измерениям методом иммуноферментных пятен.
3
4
14
[0033] На Фигуре 8 представлено 30000х и 40000х увеличение рМНС-конъюгированных FeO наночастиц (IGRP-SFPE-080411) в PBS. Железные наночастицы (SFPE-072611) имели размер ядра 9,4 нм. Концентрация рМНС составила 340 мкг/мл согласно измерениям методом иммуноферментных пятен. Концентрация Fe составила 500 мкг/мл (2,5×10 pMHC-FeNP/мл). Валентность рМНС составляет 16 pMHC/NP согласно измерениям методом иммуноферментных пятен.
[0034] На фигурах 9А-С представлен анализ рМНС-конъюгированных SFPE наночастиц на агарозном и нативном гелях. На Фигурах 9А и 9В представлены агарозные гели перед окрашиванием кумасси синим (Фигура 9А) и после окрашивания (Фигура 9В) при этом на дорожки 1-5 внесены: 4 мкг рМНС (дорожка 1), 2 мкг рМНС (дорожка 2), 10 мкг SFPE-080311 (дорожка 3), 20 мкл рМНС/анти-CD28-SFPE-080411 (дорожка 4), и 20 мкл pMHC-SFPE-080411 (дорожка 5). На Фигуре 9С изображен нативный гель, в который внесли 4 мкг рМНС (дорожка 1), 2 мкг рМНС (дорожка 2), 4 мкг анти-CD28 (дорожка 3), 2 мкг анти-CD28 (дорожка 4), 18 мкл pMHC-SFPE-080411 (дорожка 5), 18 мкл pMHC/анти-CD28-SFPE-0080411 (дорожка 6), и 10 мкл SFPE-080311 (дорожка 7).
[0035] На Фигурах 10А-В представлен IFN-γ-ответ и пролиферативный ответ 8,3-клеток на рМНС-конъюгированные SFPE-NP. На Фигуре 10А представлен IFN-γ-ответ (IFNγ, левая панель) и пролиферативный ответ (СРМ, правая панель) на pMHC-SFPE-080411. На Фигуре 10В представлен IFN-γ-ответ (IFNγ, левая панель) и пролиферативный ответ (СРМ, правая панель) на рМНС/анти-CD28-SFPE-080411.
[0036] На Фигурах 11А-В представлены последовательности белка и ДНК конструкта mB7.1-hFcAA. Последовательности индивидуальных компонентов в гибридном белке выделены следующим образом: лидерная белковая последовательность НА выделена в рамке, последовательность белка mB7.1 подчеркнута, последовательность фрагмента белка hFcAA закрашена серым, последовательность биотинилирования белка BirA выделена в диагональной рамке, и мутированный сайт связывания FcR (LL на АА) внутри области СН2 отмечен звездочками (А*А*).
[0037] На Фигуре 12 представлен пролиферативный ответ CD4+ Т-клеток на гибридный белок mB7.1-hFc в присутствии субоптимальной концентрации анти-CD3 (0,5 мкг/мл). Данная фигура демонстрирует, что сконструированный гибридный белок mB7.1-hFc может эффективно передавать костимулирующий сигнал TCR-стимулированным Т-клеткам.
Подробное описание
[0038] Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретными описанными воплощениями, и как таковое может, конечно, варьировать. Также следует понимать, что использованная в настоящем документе терминология необходима только для целей описания конкретных воплощений, и не предназначена для ограничения рамок настоящего изобретения, которые будут ограничены только прилагаемой формулой изобретения.
[0039] Следует отметить, что примененные в версии данного документа и приложенной формуле изобретения на английском языке формы единственного числа «a», «and» и «the» включают значение во множественном числе, если контекст ясно не указывает иное. Таким образом, например, «наполнитель» включает множество наполнителей.
I. Определения
[0040] Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в данном документе, имеют тот же смысл, который вкладывается в них специалистами в области, к которой принадлежит данное изобретение. В описании данного изобретения следующие термины имеют следующие значения:
[0041] При использовании в данном документе, термин «включающий» или «включает» предназначен для обозначения того, что композиции и способы включают перечисленные элементы, но не исключают других. «По существу состоящий из» при применении в отношении определенных композиций и способов будет означать исключение других элементов любого существенного значения по отношению к комбинации для установленных целей. Таким образом, композиция, по существу состоящая из элементов, определенных в данном документе, не будет исключать других материалов или стадий, которые не оказывают материального эффекта на основные и новые характеристики заявленного изобретения. «Состоящий из» будет означать исключение более чем редких элементов или других ингредиентов и существенных стадий способа. Воплощения, определенные каждым из этих переходных терминов, находятся в рамках настоящего изобретения.
[0042] С помощью термина «биосовместимый» обозначают, что компоненты системы доставки не будут вызывать поражения тканей или поражения биологической системы человека. Для придания биосовместимости предпочтительно будут использоваться полимеры и вспомогательные вещества, о которых известно, что они безопасно применялись для человека или имеют статус GRAS (англ. Generally Accepted As Safe, общепринятые как безопасные). С помощью биосовместимости указывают на то, что ингредиенты и вспомогательные вещества, используемые в композиции, будут в конечном счете «биоабсорбированы» или выведены организмом без вредного воздействия на организм. Для того чтобы композиция была биосовместимой и рассматривалась как нетоксичная, она не должна быть причиной токсичности по отношению к клеткам. Аналогично, термин «биоабсорбируемый» относится к наночастицам, сделанным из материалов, которые подвергаются биоабсорбции in vivo в течение такого периода времени, при котором удается избежать продолжительного накапливания материала в пациенте. В предпочтительном воплощении биосовместимая наночастица биабсорбируется в течение периода, составляющего менее, чем 2 года, предпочтительно, менее чем 1 год и еще более предпочтительно, менее чем 6 месяцев. Скорость биоабсорбции связана с размером частицы, используемым материалом и с другим факторами, хорошо известными специалистам в данной области. Смесь из биоабсорбируемых, биосовместимых материалов может использоваться для образования наночастиц, используемых по изобретению. В одном воплощении могут быть объединены оксид железа (III) и биосовместимый, биоабсорбируемый полимер. Например, могут быть объединены оксид железа (III) и PGLA с образованием наночастицы.
[0043] Комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица относятся к презентации пептида, углевода или другого антигенного сегмента, фрагмента или эпитопа антигенной молекулы или белка на поверхности, такой как наночастица. При использовании в данном документе термин «антиген» относится ко всей молекуле, ее части, фрагменту или сегменту, которые могут индуцировать иммунный ответ у объекта или наработку антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток.
[0044] При использовании в данном документе термин «костимулирующая молекула» обозначает молекулу, которая может вызывать костимулирующий сигнал, который активирует наивную Т-клетку. Полная активация наивных Т-клеток требует, по меньшей мере, двух сигналов. Первый сигнал обеспечивается антигеном, представляемым антигенпрезентирующими клетками, связанный с комплексом МНС. Второй сигнал представляет собой костимулирующий сигнал. Данный сигнал является агонистическим сигналом, направленным на костимулирующие рецепторы на Т-клетках. Т-клеточный костимулирующий сигнал является критическим компонентом для пролиферации, дифференцировки и выживания Т-клетки. Настоящее изобретение охватывает молекулы, способные вырабатывать костимулирующий сигнал. Как таковое, настоящее изобретение не ограничено конкретной костимулирующей молекулой. В некоторых случаях костимулирующая молекула представляет собой антитело, способное быть агонистом костимулирующего рецептора на Т-клетке.
[0045] Термин «около» при использовании перед числовым обозначением, например, температуры, времени, количества и концентрации, включая интервал, указывает на приближения, которые могут варьировать в сторону (+) или (-) на 10%, 5%, или на 1%.
[0046] С помощью термина «уничтожение» или «уничтожает» обозначают, что клеточная смерть происходит путем апоптоза или некроза. Апоптоз или некроз может быть опосредован с помощью любого пути клеточной смерти.
[0047] «Иммунные клетки» включают, например, зрелые спленоциты, Т-лимфоциты, В-лимфоциты и клетки, происходящие из костного мозга, такие как клетки млекопитающего, презентирующие дефектный антиген, которые обладают активностью по отношению к организму, из которого была выделена иммунная клетка.
[0048] «Имитатор» представляет собой аналог данного лиганда или пептида, где аналог по существу аналогичен лиганду. «По существу аналогичный» означает, что аналог имеет профиль связывания, аналогичный профилю лиганда, за исключением того, что имитатор содержит одну или несколько функциональных групп или модификаций, который суммарно соответствуют менее чем около 50%, менее чем около 40%, менее чем около 30%, менее чем около 20%, менее чем около 10%, или менее чем около 5% молекулярной массы лиганда.
[0049] «Эффективное количество» это количество, достаточное для достижения предназначенной цели, например, модуляции Т-клеточной активности или Т-клеточных популяций. Согласно описанию в данном документе, эффективное количество или дозировка и частота введения зависят от цели и антигена и могут определяться согласно настоящему описанию.
+
+
+
+
[0050] «Антигенспецифичная противоопухолевая Т-клетка» или «противоопухолевая Т-клетка» представляет собой Т-клетку, которая вовлечена в иммунный ответ, направленный на лечение заболевания, связанного со злокачественными клетками, предзлокачественными клетками, неопластическими клетками или с развитием опухолей. Предполагается, что при введении опухолеспецифичных антигенов, ковалентно связанных с комплексами МНС/костимулирующая молекула/наночастица, пациентам, страдающим опухолевым заболеванием или имеющим риск развития опухоли, наивные Т-клетки будут дифференцироваться в Т-клетки, способные воздействовать на иммунный ответ, который направлен на злокачественные клетки, обладающие указанным опухолеспецифичным антигеном. Такие злокачественные клетки, необязательно должны быть в форме твердой опухоли, но также могут циркулировать в крови, как в виде злокачественных лимфатических клеток, так и могут мигрировать по организму, как в случае метастатических клеток. Специфические противоопухолевые Т-клетки, наработанные данным способом, включают, в частности, противоопухолевые CD4 и CD8 Т-клетки памяти, противоопухолевые цитотоксические CD8 Т-клетки и противоопухолевые хелперные CD4 Т-клетки.
[0051] Термины «ингибирование», «уменьшение» или «предотвращение» или любой вариант этих терминов при использовании в формуле изобретения и/или в описании включают любое измеряемое уменьшение или полное ингибирование с достижением целевого результата. Термин предотвращение, когда он относится к злокачественному новообразованию, обозначает предотвращение прогрессии от предзлокачественного состояния до злокачественного состояния.
[0052] Термин «злокачественная клетка» обозначает клетку, которая проявляет одну или несколько характеристик или признаков злокачественного новообразования. Такие признаки злокачественного новообразования включают самодостаточность в сигналах роста, нечувствительность к сигналам, ингибирующим рост (антиростовым), уклонение от программируемой клеточной смерти (апоптоз), безграничный репликативный потенциал, замедленный ангиогенез, и инвазия ткани и матастазирование. Каждое из этих физиологических изменений - новые способности, приобретаемые в процессе развития опухоли - представляют собой успешный прорыв механизма противоопухолевой защиты, имеющийся в клетках и тканях.
[0053] Термин неопластический относится к аномальной массе ткани появившейся в результате неоплазии. Неоплазия представляет собой аномальную пролиферацию клеток. Рост неопластических клеток превышен и не скоординирован с ростом нормальных тканей вокруг них. Рост продолжается в такой же избыточной манере даже после отмены стимулов. Неоплазии могут быть доброкачественные, предзлокачественными или злокачественными. В одном воплощении композиции и способы, описанные в данном документе, направлены на предзлокачественные или злокачественные клетки. При использовании в данном документе, «предзлокачественный» означает раннюю форму злокачественного новообразования, которое определяется отсутствием инвазии опухолевых клеток в окружающие ткани. «Предзлокачественный» также относится к дисплазии, которая является ранней формой предзлокачественного поражения, распознаваемого патологоанатомом по биопсии.
[0054] Использование артиклей «а» или «an» при их использовании совместно с термином «включающий» в формуле изобретения и/или в описании может означать «один», но соответствует значению «один или более», «по меньшей мере, один» и «один или более чем один».
+
+
+
[0055] Термин «противоопухолевый» относится к клеткам, которые обладают защитным эффектом против развития опухоли, неопластических клеток или злокачественного новообразования. Например, «противоопухолевые CD8 Т-клетки» или «противоопухолевые CD4 Т-клетки» относятся к клеткам, которые обладают защитным эффектом против развития опухоли, неоплазии и злокачественного новообразования. «Противоопухолевые CD8 Т-клетки» также относятся к клеткам, которые обладают защитным эффектом против других заболеваний, таких как перечисленные в подразделе V: ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ МИШЕНИ.
[0056] С помощью термина «наночастица» в данном документе обозначают небольшие дискретные частицы, которые могут быть введены объекту. В некоторых воплощениях, наночастицы являются по существу сферическими по форме. Термин «по существу сферический» при использовании в данном документе означает, что форма частиц не отличается от сферической более чем на 10%. В частицах могут применяться различные известные антигенные или пептидные комплексы по изобретению. Наноразмер наночастиц является критическим для данного изобретения и размер частиц по изобретению колеблется в интервале от около 1 нм до около 100 нм в диаметре и предпочтительно от около 5 нм до около 15 нм в диаметре. В некоторых воплощениях данного изобретения размер наночастиц составляет от около 1 нм до около 25 нм в диаметре, от около 1 нм до около 50 нм в диаметре, или от около 5 нм до около 10 нм в диаметре. Могут быть получены наночастицы меньшего размера, например с помощью фракционирования, посредством которого более крупные частицы имеют возможность оседать в водном растворе. Верхнюю часть раствора затем извлекают. Данная верхняя часть обогащена частицами меньшего размера. Процесс может быть повторяться до тех пор, пока не будет получен целевой средний размер.
[0057] Термин «метастатические клетки» относится к злокачественным клеткам, которые обладают приобретенной способностью мигрировать из первичного или исходного очага опухоли в окружающие ткани и/или приобретенной способностью проникать в лимфатическую систему или через стенки кровеносных сосудов и циркулировать в кровотоке. Термин «метастаз» при использовании в данном документе относится к миграции или распространению злокачественных клеток из одной локализации в организме в окружающие ткани, в лимфатическую систему или в кровеносные сосуды. Когда опухолевые клетки метастазируют, то новую опухоль называют метастатической опухолью.
[0058] Термин «или» в формуле изобретения используется для обозначения «и/или», если ясно не указано, что он относится только к альтернативе или альтернативам, которые взаимно исключают друг друга, хотя описание поддерживает определение, которое относится только к альтернативам и «и/или».
[0059] При использовании в данном документе термины «иммуногенный агент» или «иммуноген» или «антиген» используются взаимозаменяемо для описания молекулы, способной индуцировать иммунологический ответ против самой себя при введении реципиенту или индивидуально или совместно с адъювантом или в случае, когда она присутствует на дисплейном носителе.
[0060] При использовании в данном документе, термин «амино-молекула» относится к любой аминокислоте, производному аминокислоты или к имитатору аминокислоты, известному в данной области. В некоторых воплощениях, остатки белковой молекулы расположены последовательно без какого-либо нарушения последовательности амино-молекулярных остатков молекулой, отличной от амино-молекулы. В других воплощениях последовательность может включать один или несколько компонентов, отличных от амино-молекул. В конкретных воплощениях, последовательность остатков белковой молекулы может быть нарушена с помощью одного или нескольких компонентов, отличных от амино-молекул.
+
[0061] При использовании в данном документе, фраза «иммунный ответ» или ее эквивалент «иммунологический ответ» относится к развитию клеточно-опосредованного ответа (опосредованного антигенспецифичными Т-клетками или продуктами их секреции), направленного против опухолеспецифичного антигена или сродного эпитопа опухолеспецифичного антигена. Клеточный иммунный ответ вызывается презентацией полипептидных эпитопов в ассоциации с молекулами МНС класса I и класса II для активации антигенспецифичных хелперных CD4 Т-клеток и/или CD8+ цитотоксических Т-клеток. Ответ может включать активацию других компонентов.
3
+
[0062] Для целей данного описания и сопровождающей его формулы изобретения термины «эпитоп» и «антигенная детерминанта» используются взаимозаменяемо для обозначения сайта антигена, на который отвечают или который распознают В- и/или Т-клетки. В-клеточные эпитопы могут быть сформированы как из сопредельных аминокислот, так и из не сопредельных аминокислот, совмещенных с помощью третичной структуры белка. Эпитопы, сформированные из граничащих аминокислот, как правило, остаются экспонированными при денатурации растворителями, в то время как эпитопы, сформированные третичной структурой, как правило, теряются при обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, включает, по меньшей мере, 3 и более, а более часто, по меньшей мере, 5 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы для определения пространственной конформации эпитопов, включают, например, рентгеновскую кристаллографию и двухмерный ядерно-магнитный резонанс. См., например, Epitope Mapping Protocols (1996). Т-клетки распознают непрерывные эпитопы, состоящие из около девяти аминокислот для CD8-клеток или около 13-15 аминокислот для CD4-клеток. Т-клетки, которые распознают эпитоп, могут быть идентифицированы с помощью анализов in vitro, которые измеряют антигензависимую пролиферацию, что определяется по включению H-тимидина стимулированными Т-клетками в ответ на эпитоп (Burke et al., 1994), по антигензависимой элиминации (анализ с использованием цитотоксических Т-лимфоцитов, Tigges et al., 1996) или по секреции цитокинов. Присутствие клеточно-опосредованного иммунологического ответа может определяться по анализам пролиферации (CD4 Т-клетки) или анализам CTL (цитотоксические Т-лимфоциты).
[0063] Необязательно, антиген или предпочтительно эпитоп антигена могут быть химически конъюгированы или экспрессированы в виде гибридного белка с другими белками, такими как МНС и связанные с МНС белки.
[0064] При использовании в данном документе и в формуле изобретения термины «антитело» или «иммуноглобулин» используются взаимозаменяемо и относятся к любому из нескольких классов структурно родственных белков, которые функционируют как часть иммунного ответа реципиента, и которые включают IgG, IgD, IgE, IgA, IgM и родственные белки.
[0065] Соответственно, термин «белковая композиция» охватывает последовательности аминокислотных молекул, включающих, по меньшей мере, одну из 20 стандартных аминокислот в природном белке или, по меньшей мере, одну модифицированную или редкую аминокислоту.
[0066] При использовании в данном документе, термины «пациент» и «объект» используются как синонимы и относятся к млекопитающему. В некоторых воплощениях пациент является человеком. В других воплощениях пациентом является млекопитающее, обычно используемое в лаборатории, такое как мышь, крыса, обезьяна, собака, кошка, крупный рогатый скот, лошадь или овца.
[0067] При использовании в данном документе, термин «лечение» или «лечить» означает любое лечение заболевания или состояния или ассоциированного расстройства у пациента, включающее:
- ингибирование заболевания или состояния, то есть прекращение или подавление развития клинических симптомов, таких как кахексия при злокачественном новообразовании; и/или
- ослабление заболевания или состояния, то есть вызов регрессии клинических симптомов, например, увеличение общей выживаемости или уменьшение опухолевой массы.
[0068] В некоторых аспектах, термин лечение относится к улучшению по части исхода болезни. Термин «исход болезни» относится к любому клиническому наблюдению или измерению, связанному с реакцией пациента на терапию. Неограничивающие примеры исходов болезни включают онкогенный эффект (TR), общая выживаемость (OS), выживаемость без прогрессии (PFS), стадия ремиссии, время до рецидива опухоли (TTR), время до прогрессии опухоли (ТТР), относительный риск (RR), токсичность или побочные эффекты. «Общая выживаемость» (OS) подразумевает продление ожидаемого срока жизни по сравнению с не подвергнутыми лечению индивидуумами или пациентами. «Выживаемость без прогрессии» (PFS) или «Время до Прогрессии Опухоли» (ТТР) обозначают период времени в процессе или после лечения, когда злокачественное новообразование не растет. Выживаемость без прогрессии включает количество времени, когда пациенты претерпевают полный или частичный ответ, а также количество времени, когда заболевание у пациентов стабилизируется. При использовании в данном документе и по определению Национального института рака «рецидив опухоли» это злокачественное новообразование, которое рецидивирует (возвращается), обычно после периода времени, во время которого злокачественное новообразование не могли детектировать. Злокачественное новообразование может вернуться в том же месте, что и исходная (первичная) опухоль или в другом месте организма. Также его называют рецидивирующим злокачественным новообразованием. «Время до рецидива опухоли» (TTR) определяется как время от даты диагностики злокачественного новообразования до даты первого рецидива, смерти или до последнего контакта, если у пациента не было рецидива опухоли в момент последнего контакта. Если у пациента не было рецидива, то TTR оценивают в момент смерти или в момент последнего планового осмотра. «Относительный риск» (RR), в статистике и в математической эпидемиологии относится к риску возникновения (или развития заболевания) относительно воздействия. Относительный риск вероятности возникновения заболевания, которое встречается в экспонированной группе по отношению к не экспонированной группе.
[0069] Другие субъекты, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из следующего подробного описания. Однако следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры при указании конкретных воплощений изобретения приведены исключительно для иллюстрации, тогда как различные изменения и модификации в рамках смысла и сущности изобретения будут очевидны специалистам в данной области из данного подробного описания.
+
[0070] Предполагается, что наночастицы, покрытые комплексами антиген/МНС/костимулирующая молекула (комплексы антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица), будут нарабатывать популяции антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток, которые направленно воздействуют на злокачественные клетки. Также считается, что такая популяция будет представлять собой антигенспецифичные противоопухолевые Т-клетки памяти. Также предполагается, что последующее введение комплексов антиген/МНС/наночастица без костимулирующих молекул будет нарабатывать и/или активировать указанные предварительно существующие пулы антигенспецифичных противоопухолевых Т-клеток памяти. Предполагается, что данная технология будут нарабатывать противоопухолевые Т-клетки in vivo. В некоторых воплощениях от около 17% до около 47% от всех циркулирующих CD8 Т-клеток представляют собой антигенспецифичные Т-клетки, полученные в результате введения наночастиц, покрытых комплексами антиген-МНС. Предполагается, что введение пациенту наночастиц, покрытых опухолеспецифичными комплексами антиген/МНС/костимулирующая молекула, приведет в результате к наработке циркулирующих антигенспецифичных CD8+ Т-клеток, которые составляют от около 5% до около 90% от суммарно циркулирующих Т-клеток, или от около 10% до около 80%, от около 10% до около 60%, от около 50% до около 90%, от около 20% до около 50%, от около 30% до около 60%, от около 35% до около 65%, от около 40% до около 70%, от около 45% до около 75%, от около 50% до около 80%, от около 25% до около 55%.
II. Фармацевтические композиции и введение
[0071] Настоящее изобретение включает способы для предотвращения, улучшения состояния или лечения пациентов, страдающих заболеванием, ассоциированным со злокачественными клетками, неопластическими клетками, метастатическими клетками или с развитием опухолей. В изобретении, как в таковом, предлагаются «вакцины» или модификаторы иммунной системы для применения в различных воплощениях. Предполагается, что композиции, которые подходят для применения в качестве вакцины, могут быть получены из опухолеспецифичных антигенных молекул. Изобретение включает композиции и способы для индуцирования или модификации иммунного ответа против опухолеспецифичного антигена, например, полипептида, пептида, углевода, липида или другой молекулы или фрагмента молекулы.
[0072] Один аспект настоящего изобретения представляет собой способ предотвращения роста злокачественных клеток у пациента, злокачественные клетки которого подвержены росту. Для определенных типов злокачественных новообразований опухолеспецифичные антигены хорошо охарактеризованы. В этих случаях пациент с риском развития указанного злокачественного новообразования может быть иммунизирован с использованием комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица, которые являются антигенспецифичными по отношению к указанному злокачественному новообразованию.
[0073] Введение композиций согласно настоящему изобретению, как правило, осуществляется посредством любого стандартного пути введения. Которые включают в частности парентеральный путь ведения, ортотопический, внутрикожный, подкожный, внутримышечный, внутрибрюшинный, интраназальный или внутривенную инъекцию. В некоторых воплощениях, вакцинная композиция может быть ингаляционной (например, Пат. США No. 6651655, который введен в данный документ ссылкой в полном объеме. Дополнительные составы, которые подходят для других способов введения, включают пероральные составы. Пероральные составы включают такие стандартно применяемые вспомогательные вещества, как например, фармацевтической категории маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, натрия сахарин, целлюлоза, карбонат магния и т.д. Эти композиции могут принимать форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, составов с замедленным высвобождением или порошков, и содержат от около 10% до около 95% активного ингредиента, предпочтительно от около 25% до около 70%.
[0074] Как правило, композиции по изобретению вводят способом, совместимым с дозировочным составом и с частотой и в таком количестве, которое является терапевтически эффективным и иммуномодифицирующим. Вводимое количество зависит от объекта, подвергаемого лечению. Точные количества активного ингредиента, требуемые для введения, зависят от решения врача. Однако подходящие интервалы дозировок имеют порядок от десяти до нескольких сот нанограмм или микрограмм комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица на одно введение. Подходящие режимы исходного введения и бустеров также варьируют, но определяются по типу исходного введения с последующими введениями.
[0075] Способ применения может широко варьировать. Применим любой из подходящих способов введения. Считается, что они включают пероральное применение на твердой физиологически приемлемой основе или в физиологически приемлемой дисперсии, парентерально, инъекцией и так далее. Дозировка комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица будет зависеть от пути введения, частоты введения и будет варьировать согласно массе и состоянию здоровья объекта.
[0076] Во многих случаях будет целесообразно иметь многократные введения комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица, в количестве около, преимущественно около или, по меньшей мере, около 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более. Введения, как правило, будут проискходить в интервале от 2 дней до двенадцати недель, более часто от одной до двух недель. Периодические бустеры будут целесообразны с интервалом 0,5-5 лет, обычно два года для поддержания состояния иммунной системы. За курсом введения могут следовать анализы на предмет иммунного ответа и Т-клеточной активности для отслеживания терапии и лечения. Способы по настоящему изобретению, как таковые, могут быть объединены с известными методами отслеживания иммунной терапии для обеспечения курса лечения пациента до достижения целевого клинического результата.
А. Комбинированная терапия
[0077] Композиции и родственные способы по настоящему изобретению, конкретно введение комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица, также могут использоваться в комбинации с традиционными терапиями.
[0078] В одном аспекте предполагается, что комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица используется совместно с обработкой цитокинами. В ином случае, введение комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица может предшествовать или следовать за другим лечением с интервалом от минут до недель. В воплощениях, где другие агенты и/или комплексы антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица вводят отдельно, специалист, как правило, будет гарантировать, что не будет проходить значительного периода времени между моментами каждой доставки, так что агент и комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица будут способны оказывать на объект преимущественно комбинированный эффект. В таких случаях предполагается, что специалист может вводить оба средства в интервале около 12-24 ч между ними, а более предпочтительно, около 6-12 ч между ними. В некоторых случаях, может быть целесообразным значительно увеличить период времени введения, тем не менее, промежуток между соответствующими введениями составляет от нескольких дней (2, 3, 4, 5, 6 или 7) до нескольких недель (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8).
[0079] Могут применяться различные комбинации, например введение комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица это «А», а дополнительный агент это «В»:
А/В/А В/А/В В/В/А А/А/В А/В/В В/А/А А/В/В/В В/А/В/В
В/В/В/А В/В/А/В А/А/В/В А/В/А/В А/В/В/А В/В/А/А
В/А/В/А В/А/А/В А/А/А/В В/А/А/А А/В/А/А А/А/В/А
[0080] Введение пациенту/объекту композиций по настоящему изобретению, содержащих комплекса пептид-МНС-костимулирующая молекула, будет осуществляться, как правило, согласно протоколам введения таких соединений, принимая во внимание токсичность, если она имеется. Ожидается, что цикл лечения будут повторяться, если это необходимо. Также предполагается, что могут применяться различные стандартные терапии, такие как гидратация, в комбинации с целевой терапией.
В. Фармацевтические композиции
[0081] В некоторых воплощениях, фармацевтические композиции вводят объекту. Различные аспекты настоящего изобретения включают в себя введение объекту эффективного количества композиции, содержащей комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица. Кроме того, такие композиции могут вводиться в комбинации с модификаторами иммунной системы. Такие композиции, будут, как правило, растворимы или диспергированы в фармацевтически приемлемом носителе или в водной среде.
[0082] Выражения «фармацевтически приемлемый» или «фармакологически приемлемый» относятся к молекулярным компонентам и композициям, которые не вызывают побочные аллергические или другие неблагоприятные реакции при введении животному или человеку. При использовании в данном документе, термин «фармацевтически приемлемый носитель» включает любой или все растворители, дисперсные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие абсорбцию агенты и т.п. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. Кроме тех случаев, когда обычные среда или агент являются несовместимыми с активным ингредиентом, предусматривается их применение в иммуногенных и терапевтических композициях.
[0083] Активные соединения по настоящему изобретению могут быть включены в состав для парентерального введения, например состав для инъекции посредством внутривенного пути введения, внутримышечного, подкожного или даже внутрибрюшинного пути введения. Препарат водной композиции, который содержит комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица, который модифицирует иммунный ответ объекта, будет известен специалисту в данной области в свете настоящего описания. Как правило, такие композиции могут быть получены как инъецируемые, либо как жидкие растворы, либо как суспензии; также могут быть получены твердые формы, подходящие для применения с получением раствора или суспензии при добавлении жидкости перед инъекцией; также препараты могут быть эмульгированными.
[0084] Фармацевтические формы, подходящие для применения инъекцией, включают стерильные водные растворы или дисперсии; составы, включающие кунжутное масло, арахисовое масло или водный пропиленгликоль; и стерильные порошки для препаратов для немедленного приема стерильных инъецируемых растворов или дисперсий. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы ее можно было вводить с помощью шприца. Она также должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения и должна быть предохранена от контаминирующего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы.
[0085] Композиции могут быть включены в состав в нейтральной форме или в форме соли. Фармацевтически приемлемые соли включают соли добавления кислоты (образованные со свободными аминокислотными группами белка) и соли, которые образованы с помощью неорганических кислот, таких как, например, соляная или фосфорная кислоты, или органических кислот, как уксусная, щавелевая, виннокаменная, миндальная и т.п. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, могут быть получены из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа, и органических оснований, таких как изопропиламин, триметиламин, гистиндин, прокаин и т.п.
[0086] Носитель также может быть растворителем или дисперсной средой, содержащей например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, и растительные масла. Правильная текучесть может поддерживаться, например, с помощью применения покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии, и с помощью использования ПАВ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть обусловлено различными антибактериальными и противогрибковыми агентами, например, парабенами, хлоробутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой, тимеросалом и т.п. Во многих случаях предпочтительным будет включение изотонических агентов, например, сахара или хлорида натрия. Пролонгированное поглощение инъецируемых композиций может быть обусловлено применением в композициях агентов, замедляющих абсорбцию, например, моностеарат аллюминия и желатин.
[0087] Стерильные инъецируемые растворы готовят включением активных соединений в требуемом количестве в соответствующем растворителе с различными другими требуемыми ингредиентами, перечисленными выше, с последующей стерилизацией фильтром. Стерилизация раствора будет проводиться таким путем, чтобы не ослабить антипатогенные свойства комплекса антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица. В общем, дисперсии готовят путем введения различных активных соединений в стерильный носитель, который содержит основную дисперсную среду и другие требуемые ингредиенты из тех, что перечислены выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов, предпочтительными способами приготовления являются методы вакуумной сушки и сублимационной сушки, которые дают порошок активного ингредиента вместе с любым дополнительным целевым ингредиентом из его предварительно стерилизованного раствора. Одним из таких способов стерилизации раствора является стерильная фильтрация, однако подразумевается, что данное изобретение включает любой способ стерилизации, который не снижает в значительной степени антипатогенных свойств комплексов антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица. Способы стерилизации, которые включают в себя интенсивное нагревание и давление, такие как автоклавирование, могут нарушать третичную структуру комплекса, снижая, таким образом, антипатогенные свойства комплексов антиген/МНС/костимулирующая молекула/наночастица.
[0088] Эффективное количество терапевтической или профилактической композиции определяют на основе предусмотренной цели. Термин «стандартная доза» или «дозировка» относится к физически дискретным элементам, подходящим для применения у объекта, причем каждый элемент содержит определенное количество композиции, рассчитанное для получения целевых ответов, обсуждаемых выше, совместно с введением, т.е. с подходящим путем введения и режимом введения. Вводимое количество, согласно как количеству обработок, так и количеству единичных доз, будет зависеть от искомого результата и/или защитного действия. Точные количества композиции также зависят от решения врача и являются уникальными для каждого индивидуума. Факторы, влияющие на дозировку, включают физическое и клиническое состояние объекта, путь введения, назначенную цель лечения (ослабление симптомов по отношению к терапии), и эффективность, стабильность и токсичность конкретных композиций. После составления растворы будут вводиться способом, совместимым с дозировочным составом и в таком количестве, которое является терапевтически или профилактически эффективным. Составы легко вводятся во множестве лекарственных форм, таких как тип инъецируемых растворов, описанный выше.
С. In Vitro или Ex Vivo Введение
[0089] При использовании в данном документе, термин in vitro введение относится к манипуляциям, осуществляемым на клетках, удаленным из объекта или на клетках вне объекта, включая, без ограничения, клетки в культуре. Термин ex vivo введение относится к клеткам, которые были подвергнуты манипуляциям in vitro, а затем введены объекту. Термин in vivo введение включает все манипуляции, осуществляемые в объекте, включая введения.
[0090] В некоторых аспектах настоящего изобретения композиции могут быть введены либо in vitro, ex vivo, либо in vivo. В определенных in vitro воплощениях аутологичные Т-клетки инкубируют с композициями данного изобретения. Затем клетки могут быть использованы для анализа in vitro, или, в ином случае, для введения ех vivo.
III. Комплексы антиген/мhc и костимулирующие молекулы
[0091] Антигены, включая сегменты, фрагменты и другие молекулы, полученные из антигенных классов, включая, без ограничения перечисленным, пептиды, углеводы, липиды или другие молекулы, презентируемые классическими и неклассическими молекулами МНС изобретения, как правило, образуют комплекс или функционально соединены с молекулой МНС или ее производным. Распознавание антигена Т-лимфоцитами ограничено по главному комплексу гистосовместимости (англ. МНС, major histocompatibility complex). Данный Т-лимфоцит будет распознавать антиген, только если он связан с той или иной молекулой МНС. В целом, Т-лимфоциты стимулируются только в присутствии молекул МНС, а антиген распознается как фрагменты антигена, связанные с молекулами МНС. Ограничение по МНС определяет специфичность Т-лимфоцитов по распознаваемому антигену и по молекуле МНС, которая связывает этот антигенный фрагмент(ы). В определенных аспектах некоторые антигены будут спарены с некоторыми молекулами МНС или полипептидами, полученными из них.
[0092] Термин «функционально связанный» или «покрытый» при использовании в данном документе, относится к ситуации, когда индивидуальный полипептид (например, МНС) и антигенные (например, пептидные) компоненты объединяются для образования активного комплекса перед связыванием в участке-мишени, например, иммунной клеткой. Термин включает ситуацию, когда индивидуальные компоненты полипептидного комплекса синтезируются или рекомбинантно экспрессируются и затем выделяются и объединяются с образованием комплекса, in vitro, перед введением объекту; ситуацию, когда химерный или слитый полипептид (например, каждый дискретный белковый компонент комплекса содержится в одной полипептидной цепи) синтезируется или рекомбинантно экспрессируется в качестве интактного комплекса. Как привило, полипептидные комплексы добавляют к наночастицам для получения наночастиц с адсорбируемым или присоединенным полипептидными комплексами, имеющими соотношение количество молекул: количество наночастиц около, по меньшей мере, около, или, по большей мере, около 0,1, 0,5, 1, 10, 100, 500, 1000 или больше к : 1, как правило, от 0,1:1 до 50:1. Содержание полипептидов в наночастицах может быть определено с использованием стандартных методов.
А. Компоненты костимулирующей молекулы
[0093] Костимулирующие молекулы представляют собой молекулы, которые вырабатывают вторичный сигнал in vivo, который служит для активации наивных Т-клеток до антигенспецифичных Т-клеток, способных вырабатывать иммунный ответ по отношению к клеткам, обладающих указанным специфичным антигеном. Настоящее изобретение не ограничено какой-либо конкретной костимулирующей молекулой. Различные костимулирующие молекулы хорошо известны в данной области. Некоторыми неограничивающими примерами костимулирующих молекул являются В7.1, 4-IBBL, CD40, IL-15/IL-15Ra, CD28, CD80, CD86 и ICOS. С одной наночастицей может быть объединена только одна конкретная костимулирующая молекула или с одной и той же наночастицей может быть объединено множество костимулирующих молекул. В конкретных воплощениях, костимулирующая молекула представляет собой белок, такой как антитело, который может быть агонистом костимулирующего рецептора на Т-клетке. В данном случае антитело способно индуцировать костимулирующий сигнал, который необходим для активации наивных Т-клеток и индуцирования иммунного ответа в антигенспецифичной манере.
[0094] Костимулирующая молекула может быть объединена с наночастицей таким же образом, что и комплекс антиген/МНС. В одном воплощении настоящего изобретения костимулирующая молекула и комплекс антиген/МНС отдельно прикреплены к наночастице. В другом воплощении изобретения костимулирующая молекула и комплекс антиген/МНС вначале объединяются вместе в комплекс, а затем, соответственно, объединяются в комплекс с наночастицей. Как правило, полипептидные комплексы добавляют к наночастицам для получения наночастиц с адсорбируемым или присоединенным полипептидными комплексами, имеющими соотношение количество молекул : количество наночастиц около, по меньшей мере, около или, по большей мере, около 0,1, 0,5, 1, 10, 100, 500, 1000 или больше к : 1, как правило, от 0,1:1 до 50:1. Полипептидное содержание наночастиц может быть определено с использованием стандартных методов. Соотношение костимулирующей молекулы к комплексу антиген/МНС может составлять от около 0,1, 0.5, 1, 2, 5, 10, 50 или больше до 1, предпочтительно, если соотношение костимулирущая молекула : антиген/МНС равно 1:1.
В. Молекулы МНС
+
+
[0095] Внутриклеточные и внеклеточные антигены обеспечивают достаточно различные стимулы иммунной системы, как с точки зрения распознавания, так и с точки зрения соответствующего ответа. Презентация антигенов Т-клеткам опосредуется двумя различными классами молекул МНС класса I (MHC-I) и МНС класса II (МНС-II), которые используют различные пути обработки антигена. Пептиды, полученные из внутриклеточных антигенов, презентируются CD8 Т-клеткам молекулами МНС класса I, которые экспрессируются практически на всех клетках, тогда как пептиды, полученные из внеклеточных антигенов, презентируются CD4 Т-клеткам молекулами МНС-II. Однако существуют некоторые исключения в этой дихотомии. В некоторых исследованиях было показано, что пептиды, полученные из эндоцитированного партикулята или растворимых белков, присутствуют на молекулах MHC-I в макрофагах, а также в дендритных клетках. В некоторых воплощениях изобретения, тот или иной пептид, полученный из опухолеспецифичного антигена, идентифицируется и презентируется в комплексе пептид/МНС/костимулирующая молекула/наночастица в контексте соответствующего полипептида МНС класса I или II. В некоторых аспектах, генетическая структура объекта может быть оценена для определения, какой из полипептидов МНС будет использоваться для того или иного пациента и для того или иного набора пептидов.
[0096] Для применения в комплексах МНС изобретения также предполагаются неклассические молекулы МНС. Неклассические молекулы МНС являются неполиморфными, консервативными среди видов, и обладают тесными, глубокими гидрофобными лигандсвязывающими карманами. Эти связывающие карманы способны презентировать гликолипиды и фосфолипиды естественным киллерным Т-клеткам (NKT). NKT-клетки представляют собой уникальную популяцию лимфоцитов, которые коэкспрессируют маркеры клеток NK и полуинвариантный Т-клеточный рецептор (TCR). Они вовлечены в регуляцию иммунного ответа, ассоциированного с широким спектром заболеваний.
С. Антигенные Компоненты
[0097] Определенные аспекты изобретения включают способы и композиции, касающиеся антигенных композиций, включая сегменты, фрагменты или эпитопы полипептидов, пептидов, нуклеиновых кислот, углеводов, липидов и других молекул, которые провоцируют или индуцируют антигенный ответ, как правило, называющихся антигенами. В частности, антигены, или антигенные сегменты или фрагменты таких антигенов, которые приводят к разрушению клетки через иммунный ответ, могут быть идентифицирвоаны и использованы при изготовлении комплекса МНС/наночастица, описанного в данном документе. Такие антигены могут презентироваться на опухолевых клетках и являться специфичными для опухолевых клеток. Воплощения изобретения включают композиции и способы для модуляции иммунного ответа против конкретной клетки или набора клеток, которые осуществляют определенную физиологическую функцию. Примеры опухолевых антигенов включают антигены, описанные в таблице ниже.
<img file="00000001.TIF" he="144" wi="160" img-content="undefined" img-format="TIF" />
<img file="00000002.TIF" he="238" wi="160" img-content="undefined" img-format="TIF" />
<img file="00000003.TIF" he="116" wi="160" img-content="undefined" img-format="TIF" />
1. Пептидные Компоненты и Белковые Композиции
[0098] Полипептиды и пептиды изобретения могут быть модифицированы различными делециями, вставками и/или заменами аминокислот. В конкретных воплощениях модифицированные полипептиды и/или пептиды способны модулировать иммунный ответ в объекте. При использовании в данном документе «белок» или «пептид» относятся к молекуле, содержащей, по меньшей мере, пять аминокислотных остатков. В некоторых воплощениях используется версия дикого типа белка или пептида, однако, во множестве воплощений изобретения, для получения комплекса пептид/МНС/костимулирующая молекула/наночастица используется модифицированный белок или полипептид. Комплекс пептид/МНС/костимулирующая молекула/наночастица может быть использован для вызова иммунного ответа и/или модификации Т-клеточной популяции иммунной системы (т.е. переобучения иммунной системы). Термины, описанные выше, могут быть использованы в данном документе взаимозаменяемо. «Модифицированный белок» или «модифицированный полипептид» или «модифицированный пептид» относится к полипептиду, чья химическая структура, особенно ее аминокислотная последовательность, изменяется относительно белка или полипептида дикого типа. В некоторых воплощениях, модифицированный белок или полипептид или пептид имеет, по меньшей мере, одну модифицированную активность или функцию (с учетом того, чтоб белки или полипептиды или пептиды могут иметь множество активностей или функций). В частности предполагается, что модифицированный белок или полипептид или пептид может измениться по одной активности или функции все еще сохраняет активность или функцию дикого типа в других аспектах, таких как иммуногенность или способность взаимодействовать с другими клетками иммунной системы, в контексте комплекса МНС/костимулирующая молекула/наночастица.
[0099] Пептиды изобретения включают пептиды, которые обнаружены как специфичные для злокачественных или предзлокачественных клеток в организме. Эти пептиды могут быть ассоциированы со специфическими наночастицами/МНС/костимулирующими молекулами или множество пептидов может быть ассоциировано с обычной наночастицей и одной или большим количеством молекул МНС. Введение комбинации этих пептидов включает введение популяции наночастиц, имеющих множество прикрепленных пептидов и/или введение множества популяций наночастиц, каждая из которых имеет прикрепленный к ней специфический пептид или комбинации таких наночастиц, которые включают наночастицы с 1, 2, 3, 4, 5, 6 или большим количеством пептидов, прикрепленных к 1, 2, 3, 4, 5, 6 или большему количеству наночастиц.
[0100] В некоторых воплощениях размер белка или полипептида (дикого типа или модифицированного), включая любой комплекс представляющего интерес белка или пептида и, в частности, химеры МНС/пептида, могут содержать, без ограничения перечисленным, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, 875, 900, 925, 950, 975, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 амино-молекул или большее количество, включая любой диапазон или значение, выводимые из представленных, или их производное. В некоторых аспектах в качестве антигенов могут быть использованы 5, 6, 7, 8, 9, 10 или большее количество смежных аминокислот, включая их производные, и фрагменты антигена, такие как те аминокислотные последовательности, которые описаны и указаны в данном документе. Предполагается, что полипептиды могут быть мутированы укорочением, преобразованием их в более короткие, чем их соответствующая форма дикого типа, но также они могут быть изменены слиянием или конъюгацией с гетерологичной белковой последовательностью с конкретной функцией (например, для презентации в виде белкового комплекса, для усиления иммуногенности и т.п.).
[0101] Белковые композиции могут быть получены любым способом, известным специалистам в данной области, включая (i) экспрессию белков, полипептидов, или пептидов, стандартными молекулярно-биологическими методами, (ii) выделение белковых соединений из естественных источников, или (iii) химический синтез белковых материалов. Нуклеотидные, а также белковые, полипептидные и пептидные последовательности для различных генов ранее были описаны, и могут быть обнаружены в известных компьютеризированных базах данных. Одними из таких баз данных являются базы данных «GenBank» и «GenPept» Национального центра биотехнологической информации (адрес во всемирной сети ncbi.nlm.nih.gov). Вся или часть кодирующей области этих генов могут быть амплифицированы и/или экспрессированы способами, описанными в данном документе или известными специалистам в данной области.
[0102] Варианты аминокислотных последовательностей антигенных эпитопов и других полипептидов этих композиций могут быть вариантами с заменами, вставками или делениями. Модификация в полипептиде изобретения может затрагивать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500 или большее количество несмежных или смежных аминокислот пептида или полипептида, по сравнению с диким типом. Пептид или полипептид, который приводит к иммунному ответу, предусматривается для применения в способах изобретения.
[0103] Делеционные варианты, как правило, утрачивают один или несколько остатков нативной аминокислотной последовательности или аминокислотной последовательности дикого типа. Могут быть удалены индивидуальные остатки или может быть удалено несколько смежных аминокислот. Может быть введен стоп-кодон (заменой или вставкой) в кодирующую нуклеотидную последовательность для получения укороченного белка. Вставочные мутанты, как правило, включают добавление материал в неконцевой точке полипептида. Модификация может включать вставку одного или нескольких остатков. Также могут быть получены концевые пристройки, называемые химерными белками.
[0104] Замещенные варианты, как правило, включают замену одной аминокислоты на другую в одном или нескольких сайтах в белке, и могут быть спроектированы для модуляции одного или нескольких свойств полипептида, с утратой других функций или свойств или без их утраты. Замены могут быть консервативными, т.е. одна аминокислота замещается другой похожей формы или заряда. Консервативные замены хорошо известны в данной области и включают, например, замены: аланина на серин; аргинина на лизин; аспарагина на глутамин или гистидин; аспартата на глутамат; цистеина на серин; глутамина на аспарагин; глутамата на аспартат; глицина на пролин; гистидина на аспарагин или глутамин; изолейцина на лейцин или валин; лейцина на валин или изолейцин; лизина на аргинин; метионина на лейцин или изолейцин; фенилаланина на тирозин; лейцина на метионин; серина на треонин; треонина на серин; триптофана на тирозин; тирозина на триптофан или фенилаланин; и валина на изолейцин ил лейцин. В ином случае, замены могут быть неконсервативные, так чтобы была затронута функция или активность полипептида или пептида, такая как авидность или аффинность для клеточного рецептора (или рецепторов). Неконсервативные изменения, как правило, включают замены остатка на остаток, который является химически отличным, например, полярная или заряженная аминокислота для неполярной или незаряженной аминокислоты, и наоборот.
[0105] Белки изобретения могут быть рекомбинантными или синтезированными in vitro. В ином случае, рекомбинантный белок может быть выделен из бактерий или другой клетки-хозяина.
[0106] Термин «функционально эквивалентный кодон» используется в данном документе для обозначения кодонов, которые кодируют одну аминокислоту, например, шесть кодонов для аргинина или серина, а также для обозначения кодонов, которые кодируют биологически эквивалентные аминокислоты (см. Таблицу 2 ниже).
Таблица 2.
Таблица кодонов
<img file="00000004.TIF" he="118" wi="158" img-content="undefined" img-format="TIF" />
[0107] Также будет понятно, что аминокислотные и нуклеотидные последовательности, могут включать дополнительные остатки, такие как дополнительные N- и С-концевые аминокислоты, или 5' или 3' нуклеотидные последовательности, соответственно, и все еще оставаться фактически одной из тех последовательностей, что изложены в данном документе, при условии, что последовательность отвечает критериям, изложенным выше, включая сохранение биологической активности белка (например, иммуногенности). Добавление терминальных последовательностей в частности относится к нуклеотидным последовательностям, которые могут включать различные некодирующие последовательности, фланкирующие либо 5' либо 3' часть кодирующей области.
[0108] Предполагается, что в композициях изобретения присутствует от около 0,001 мг до около 10 мг общего белка на мл. Таким образом, концентрация белка в композиции может составлять около, по меньшей мере, около или, по большей мере, около 0,001, 0,010, 0,050, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 50, 100 мкг/мл или мг/мл или больше (или в любом диапазоне, получаемом из этого). Из этого, около, по меньшей мере, около, или, по большей мере, около 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% может приходиться на комплекс пептид/МНС/костимулирующая молекула/наночастица.
[0109] В настоящем изобретении предполагается введение комплекса пептида/МНС/-стимулирующей молекулы/наночастицы для осуществления лечения или превентивной терапии против развития заболевания или состояния, ассоциированного со злокачественным новообразованием, неопластическими клетками или развитием опухоли.
[0110] Кроме того, в пат. США No. 4,554,101 (Норр), который включен в данный документ полностью ссылкой, сообщается об идентификации и получении эпитопов из первичных аминокислотных последовательностей на основании гидрофильности. Благодаря способам, описанным Норр, специалист в данной области будет способен идентифицировать эпитопы в пределах аминокислотной последовательности и подтвердить их иммуногенность. Множество научных публикаций также было посвящено прогнозу вторичной структуры и идентификации эпитопов на основании анализа аминокислотных последовательностей (Chou & Fasman, 1974a,b; 1978a,b; 1979). Любая из них может быть использована, при необходимости, для дополнения описания Норр в пат. США No. 4,554,101.
2. Другие Антигенные Компоненты
[0111] Молекулы, отличные от пептидов, могут быть использованы в качестве антигенов или антигеннных фрагментов в комплексе с молекулами МНС, такие молекулы включают, без ограничения перечисленным, углеводы, липиды, малые молекулы и т.п. Углеводы являются основными компонентами внешней поверхности различных клеток. Некоторые углеводы являются характерной особенностью различных стадий дифференцировки и очень часть этих углеводы распознаются специфическими антителами. Экспрессия различных углеводов может быть ограничена специфическими типами клеток. Аутоантительные ответы к эндометриальным и сывороточным антигенам были показаны в качестве распространенного признака эндометриоза. Было описано, что сывороточный аутоантительный ответ при эндометриозе к нескольким ранее идентифицированным антигенам, включая 2-гликопротеин Хереманса-Шмидта и карбоангидразу, которые являются специфичными к углеводному эпитому (Yeaman et al., 2002).
D. Субстраты/Наночастицы
[0112] В определенном аспекте, комплексы антиген/МНС функционально связаны с субстратом. Субстрат может быть в форме наночастицы, содержащей биосовместимый, биоабсорбируемый материал. Субстрат также может быть в виде наночастицы, такой как те, что описаны ранее в публикации патента США No.: 2009/0155292, которая полностью включен в данный документ ссылкой. Наночастицы могут иметь структуру переменной размерности, и известную под разными названиями, такими как наносфера, наночастица или биосовместимая биодеградируемая наносфера или биосовместимая биодеградируемая наночастица. Такие дисперсные составы, содержащие комплекс антиген/МНС могут быть образованы ковалентным или нековалентным связыванием комплекса и наночастицы.
[0113] Наночастицы, как правило, содержат фактически сферическое ядро и необязательно один или несколько слоев. Ядро может варьировать по размеру и композиции. В дополнение к ядру наночастица может иметь один или несколько слоев для обеспечение функциональностей, подходящих для представляющих интерес применений. Толщина слоев, в случае их наличия, может варьировать в зависимости от потребностей конкретных применений. Например, слои могут придавать полезные оптические свойства.
[0114] Слои также могут придавать химические или биологические функциональности, упоминаемые в данном документе как химически или биологически активные слои, и для этих функциольностей слой или слои могут находиться в диапазоне толщины от около 0,001 микрометра (1 нанометра) до около 10 микрометров или более (в зависимости от искомого диаметра наночастиц), эти слои, как правило, наносят на внешнюю поверхность наночастицы.
[0115] Композиции ядра и слоев могут варьировать. Подходящие материалы для частиц или ядра включают, без ограничения перечисленным, полимеры, керамику, стекло, минеральные вещества и т.п. Примеры включают, без ограничения перечисленным, стандартное и специализированное стекло, силикагель, полистирол, полиэстер, поликарбонат, акриловые полимеры, полиакриламид, полиакрилнитрил, полиамид, фторполимеры, кремнийорганическую смолу, целлюлозы, кремний, металлы (например, железо, золото, серебро), минеральные вещества (например, рубин) наночастицы (например, золотые наночастицы, коллоидные частицы, металлические оксиды, металлические сульфиды, металлические селениды, и магнитные материалы, такие как оксид железа) и их композиты. Ядро может быть гомогенной композицией, или композитом двух или большего числа классов материалов, в зависимости от требуемых свойств. В некоторых аспектах могут быть использованы металлические наночастицы. Эти металлические частицы или наночастицы могут быть получены из Au, Pt, Pd, Cu, Ag, Со, Fe, Ni, Mn, Sm, Nd, Pr, Gd, Ti, Zr, Si, и In, предшественников, их бинарных сплавов, их трехкомпонентных сплавов, и их интерметаллических соединений. См. Патент 6,712,997, который включен в данный документ ссылкой во всей полноте. В некоторых воплощениях композиции ядра и слоев могут варьировать при условии, что наночастицы являются биосовместимыми и биоабсорбируемыми. Ядро может быть гомогенной композицией, или композитом двух или большего числа классов материалов, в зависимости от требуемых свойств. В некоторых аспектах могут быть использованы металлические наносферы. Эти металлические наночастицы могут быть образованы из Fe, Ca, Ga и т.п.
[0116] Как указано ранее, наночастица может, кроме ядра, включать один или несколько слоев. Наночастица может включать слой, содержащий биодеградируемый сахар или другой полимер. Примеры биодеградируемых слоев включают, без ограничения перечисленным, декстран; поли(этиленгликоль); поли(этиленоксид); маннит; поли(эфиры), основанные на полилактиде (PLA), полигликолиде (PGA), поликапролактоне (PCL); поли(гидроксалканоат)ы класса PHB-PHV; и другие модифицированные поли(сахариды) такие как крахмал, целлюлоза и хитозан. Кроме того, наночастица может включать слой с подходящими поверхностями для прикрепления химических функциональностей для химического связывания или участков сопряжения.
[0117] Слои могут быть получены на наночастицах множеством путей, известных специалистам в данной области. Примеры включают методы химии золь-гель, такие как описанные у Iler (1979); Brinker and Scherer (1990). Дополнительные подходы для получения слоев на наночастицах включают химию поверхностей и методы инкапсуляции, такие как те, что описаны у Partch and Brown (1998); Pekarek et al. (1994); Hanprasopwattana (1996); Davies (1998); и цитируемых в них источниках. Также могут быть использованы методы осаждения испарением; например, см. Golman and Shinohara (2000); и Пат. США No. 6,387,498. Другие подходы включают методы послойной самосборки, такие как те, что описаны в Sukhorukov et al. (1998); Caruso et al. (1998); Caruso et al. (1999); Пат. США No. 6,103,379 и процитированные в них источники.
[0118] Наночастицы могут быть образованы контактом водной фазы, содержащей комплекс антиген/МНС/костимулирующая молекула и полимер и неводной фазы с последующим испарением неводной фазы для того, чтобы вызвать коалесценцию частиц из водной фазы, как изложено в Пат. США No. 4,589,330 или 4,818,542. Предпочтительными полимерами для таких препаратов являются природные и синтетические кополимеры или полимеры, выбранные из группы, состоящей из желатина, агара, крахмала, арабиногалактана, альбумина, коллагена, полигликолевой кислоты, полимолочной кислоты, гликолид-L(-)- лактида поли(эпсилон-капролактона, поли(эпсилон-капролактон-СО-молочной кислоты), поли(эпсилон-капролактон-СО-гликолевой кислоты), поли(в-гидроксимасляной кислоты), поли(этиленоксида), полиэтилена, поли(алкил-2-цианоакрилата), поли(гидроксиэтилметакрилата), полиамидов, поли(аминокислот), поли(2-гидроксиэтил DL-аспартамида), поли(эфир мочевины), поли(L-фенилаланин/этиленгликоль/1,6-диизоцианатогексана) и поли(метилметакрилата). Особенно предпочтительными полимерами являются полиэфиры, такие как полигликолевая кислота, полимолочная кислота, гликолид-L(-) лактид поли(эпсилон-капролактон, поли(эпсилон-капролактон-СО-молочная кислота), и поли(эпсилон-капролактон-СО-гликолевая кислота. Растворители, подходящие для растворения полимера, включают: воду, гексафтороизопропанол, метиленхлорид, тетрагидрофуран, гексан, бензол или гексафторацетон полуторогидрат.
Е. Соединение антиген-МНС и Комплексов костимулирующих молекул с Наночастицей
[0119] Для соединения субстрата или наночастицы с антиген-МНС и комплексами костимулирующих молекул были применены следующие способы.
[0120] Связывание может быть осуществлено химической модификацией субстрата или наночастицы, которое, как правило, включает образование «функциональных групп» на поверхности, где указанные функциональные группы, способны связываться с комплексом антиген-МНС, костимулирующей молекулой и/или включает связывание необязательно химически модифицированной поверхности субстрата или наночастицы с ковалентно или нековалентно связанными так называемыми «молекулами-линкерами», с последующей реакцией комплекса антиген-МНС и костимулирующей молекулы с полученными наночастицами.
[0121] Термин «молекула-линкер» означает вещество, способное связываться с субстратом или наночастицей, а также способное связывать комплекс антиген-МНС-костимулирующая молекула.
[0122] Термин «функциональные группы» при использовании в данном документе не ограничен реактивными химическими группами, образующими ковалентные связи, но также включает химические группы, приводящие к ионному взаимодействию, или водородным связям с комплексом антиген-МНС-костимулирующая молекула. Более того, следует отметить, что четкая граница между «функциональными группами», образованными на поверхности и связывающими молекулами, несущими «функциональные группы», не возможна, поскольку иногда модификация поверхности требует реакцию более мелких связывающих молекул, таких как этиленгликоль, с поверхностью наночастицы.
[0123] Функциональные группы или связывающие молекулы, несущие их, могут быть выбраны из аминогрупп, карбоксильных групп, тиолов, тиоэфиров, дисульфидов, гуанидиногрупп, гидроксильных групп, аминогрупп, вицинальных диолов, альдегидов, альфа-галоацетильных групп, органилов ртути, эфирных групп, галогенангидрида, тиоэфира кислоты, ангидрида кислоты, изоцианатов, изотиоцианатов, галидов сульфоной кислоты, имидоэфиров, диазоцетатов, солей диазониума, 1,2-дикетонов, фосфоновых кислот, эфиров фосфорной кислоты, сульфоновые кислоты, азолидов, имидазолов, индолов, N-малеимидов, альфа-бета-ненасыщенных карбонильных соединений, арилгалагенидов или их производных.
[0124] Неограничивающими примерами для других молекул-линкеров с более высокими молекулярными массами являются молекулы нуклеиновых кислот, полимеры, кополимеры, полимеризующиеся сшивающие агенты, силикагель, белки, и цепеобразные молекулы, имеющие поверхность с противоположной полярностью относительно субстрата или наночастицы. Нуклеиновые кислоты могут обеспечить связь с аффинными молекулами, содержащими сами молекулы нуклеиновых кислот, и при этом последовательность, комплементарную молекуле-линкеру.
[0125] В качестве примера полимеризующихся сшивающих агентов, могут быть приведены диацетилен, стиренбутадиен, винилацетат, акрилат, акриламид, виниловые соединения, стирол, оксид кремния, оксид бора, оксид фосфора, бораты, пиррол, полипиррол и фосфаты.
[0126] Поверхность субстрата или наночастицы может быть химически модифицирована, например, связыванием производных фосфорной кислоты, имеющих функциональные реактивные группы. Один из примеров этих производных фосфорной кислоты или эфиров фосфорной кислоты является имино-бис(метиленфосфоно)карбоновая кислота, которая может быть синтезирована по реакции «Mannich-Moedritzer». Эта реакция связывания с субстратом или наночастицей может быть осуществлена как в прямом процессе получения, так и после предварительной обработки (например, с помощью триметилсилил бромида). В первом случае производное фосфорной кислоты (эфир) может, например, замещать компоненты реакционной среды, которые еще связаны с поверхностью. Это замещение может быть усилено при повышенных температурах. Триметилсилил бромид, с другой стороны, как считается, деалкилирует содержащие алкильные группы комплексные агенты на основе фосфора, тем самым образуя новые сайты связывания для производного фосфорной кислоты (эфира). Производное фосфорной кислоты (эфира), или молекулы-линкеры, прикрепленные к ним, могут экспонировать такие же функциональные группы, что и представленные выше. Дополнительный пример обработки поверхности субстрата или наночастицы включает нагревание в диоле, таком как этиленгликоль. Следует отметить, что эта обработка может быть излишней, если синтез проведен в диоле. В этих обстоятельствах продукт синтеза, получаемый прямо, вероятно экспонирует необходимые функциональные группы. Эта обработка, однако, применима к субстрату или наночастице с получением N- и Р-содержащих комплексообразующих агентов. Если такой субстрат или частица подвергается окончательной обработке этиленгликолем, ингредиенты реакционной среды (например, комплексообразующий агент) все еще связанный с поверхностью, может быть замещен диолом и/или может быть деалкилирован.
[0127] Также возможно заместить N-содержащие комплексообразующие агенты, все еще связанные с поверхностью частицы, производными первичных аминов, имеющих вторую функциональную группу. Поверхность субстрата или наночастицы также может быть покрыта двуокисью кремния. Двуокись кремния позволяет осуществить относительно простую химическую конъюгацию с органическими молекулами, поскольку двуокись кремния реагирует с органическими линкерами, такими как триэтоксисилан или хлоросилан. Поверхность наночастиц также может быть покрыта гомо- или кополимерами. Примерами полимеризуемых связывающих агентов являются N-(3-аминопропил)-3-меркаптобензамидин, 3-(триметоксилил)пропилгидразин и 3-триметоксилил)пропилмадеимид. Другие неограничивающие примеры полимеризуемых связывающих агентов упомянуты в данном документе. Эти связывающие агенты могут быть использованы отдельно или в комбинации в зависимости от типа кополимера применяемого в качестве покрытия.
[0128] Другой способ модификации поверхности, который может быть использован с субстратами или наночастицами, содержащими соединения переходных металлов заключается в преобразовании оксидных соединений переходных металлов с помощью газообразного хлора или органических хлорирующих агентов в соответствующие оксихлориды. Эти оксихлориды способны реагировать с нуклеофилами, такими как гидрокси- или аминогруппы, часто обнаруживаемые в биомолекулах. Этот метод позволяет получить прямую конъюгацию с белками, например, через аминогруппу побочной цепи лизина. Конъюгация с белками после модификации поверхности оксихлоридами также может быть проведена с помощью бифункционального линкера, такого как гидразид малеимидопропионовой кислоты.
[0129] Для методов нековалентного связывания особенно подходят цепеподобные молекулы, имеющие полярность или заряд, противоположный заряду поверхности субстрата или наночастицы. Примеры молекул-линкеров, которые могут быть нековалентно связаны с ядром/оболочкой наночастицы, включают анионные, катионные или цвиттер-ионные поверхностно-активные вещества, кислые или основные белки, полиамины, полиамиды, полисульфон или поликарбоновую кислоту. Гидрофобное взаимодействие между субстратом или наночастицей и амфифильным реактивом, имеющим функциональную реактивную группу, может образовать необходимую связь. В частности, пригодными являются цепные молекулы амфифильного характера, такие как фосфолипиды или дериватизованные полисахариды, которые могут быть перекрестно связаны друг с другом. Абсорбция этих молекул на поверхности может быть достигнута коинкубацией. Связывание между аффинной молекулой и субстратом или наночастицей также может быть основано на нековалентных, самоорганизующихся связях. Один из примеров таких связей включает простые зонды для детекции с биотином в качестве связывающей молекулы и молекул, связанных с авидином или стрептавидином.
[0130] Протоколы реакций связывания функциональных групп с биологическими молекулами можно найти в литературе, например в «Bioconjugate Techniques» (Greg T. Hermanson, Academic Press 1996). Биологическая молекула (например, молекула МНС или ее производное) может быть связана с молекулой-линкером, ковалентно или нековалентно, в рамках стандартных процедур органической химии, таких как окисление, галогенизация, алкилирование, ацилирование, присоединение, замена или амидирование. Эти способы для сопряжения ковалентно или нековалентно связанной молекулы-линкера могут быть применены перед сопряжением молекулы-линкера с субстратом или наночастицей или после этого. Кроме того, возможно осуществление прямого связывания посредством инкубации (например, с триметилсилил бромидом) молекул с соответствующим предварительно обработанным субстратом или наночастицами, которые имеют модифицированную поверхность вследствие предварительной обработки (например, сильно заряженную или полярную поверхность).
F. Выработка белков
[0131] Настоящее изобретение описывает полипептиды, пептиды и белки для применения в различных воплощениях настоящего изобретения. Например, специфические пептиды и их комплексы проверяются по их способностям вызывать или модулировать иммунный ответ. В конкретных воплощениях все или часть пептидов или белков изобретения также могут быть синтезированы в растворе или на твердой подложке обычными методами. Различные автоматические синтезаторы коммерчески доступны и могут быть использованы согласно известным протоколам. См., например, Stewart and Young (1984); Tam et al. (1983); Merrifield (1986); и Barany and Merrifield (1979), каждый из которых включен в данный документ ссылкой. В ином случае, технология рекомбинантных ДНК может быть использована в случае, когда нуклеотидная последовательность, которая кодирует полипептид изобретения, вставляется в экспрессирующий вектор, трансформируется или трансфецируется в соответствующую клетку-хозяин и культивируется в условиях, подходящих для экспрессии.
[0132] Одно воплощение изобретения включает применение переноса генов в клетки, в том числе микроорганизмы, например, для выработки белков. Ген представляющего интерес белка может быть перенесен в соответствующие клетки-хозяева, с последующим культивированием клеток в соответствующих условиях. Использована может быть нуклеиновая кислота, кодирующая фактически любой полипептид. Получение рекомбинантных экспрессирующих векторов, и элементов, охваченных в данном документе, известно специалистам в данной области и вкратце здесь обсуждается. Примеры линий клеток млекопитающих включают, без ограничения перечисленным, клетки Vero и HeLa, другие В- и Т-клеточные линии, такие как СЕМ, 721.221, Н9, Jurkat, Raji, а также клеточные линии СНО, W138, ВНК, COS-7, 293, HepG2, 3Т3, RIN и MDCK. Кроме того, штамм клеток-хозяев может быть выбран так, чтобы модулировать экспрессию вставленных последовательностей, или так, чтобы модифицировать и процессировать генный продукт требуемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессирование (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важными для функционирования белка. Различные клетки-хозяева имеют характеристики и специфические механизмы для посттрансляционного процессирования и модификации белков. Соответствующие клеточные линии или хозяйские системы могут быть выбраны для гарантии корректной модификации или процессирования экспрессируемого инородного белка. В некоторых случаях белки настоящего изобретения могут быть экспрессированы и очищены из клеток Drosophila.
[0133] Может быть использовано множество систем селекции, включая, без ограничения перечисленным, гены HSV тимидинкиназы, гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы и аденин фосфорибозилтрансферазы, в tk-, hgprt- или aprt-клетках, соответственно. Также в основе отбора может быть использована антиметаболитная устойчивость: с dhfr, который придает устойчивость к триметоприму и метотрексату; с gpt, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте; с neo, который придает устойчивость к аминогликозиду G418; и с hygro, который придает устойчивость к гигромицину.
G. Нуклеиновые Кислоты
[0134] Настоящее изобретение может включать рекомбинантные полинуклеотиды, кодирующие белки, полипептиды, пептиды изобретения. При использовании в данной заявке, термин «полинуклеотид» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая либо является рекомбинантной, либо была выделена из общей геномной нуклеиновой кислоты. В термин «полинуклеотид» включены олигонуклеотиды (нуклеиновые кислоты длиной 100 остатков или меньше), рекомбинантные векторы, включая, например, плазмиды, космиды, фаги, вирусы и т.п. Полинуклеотиды включают, в некоторых аспектах, регуляторные последовательности, фактически отделенные от их естественных генов или кодирующих белок последовательностей. Полинуклеотидами могут быть РНК, ДНК, их аналоги или их комбинации.
[0135] В этом аспекте термин «ген», «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота» используется для обозначения нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид или пептид (включая любые последовательности, необходимые для правильной транскрипции, посттрансляционной модификации или локализации). Специалистам в данной области понятно, что этот термин охватывает геномные последовательности, экспрессирующие кассеты, кДНК-последовательности и более мелкие сконструированные нуклеотидные сегменты, которые экспрессируют, или могут быть адаптированы для экспрессии, белки, полипептиды, домены, пептиды, химерные белки и мутантные белки. Нуклеиновая кислота, кодирующая весь или часть полипептида, может содержать непрерывную нуклеотидную последовательность, кодирующую весь или часть такого полипептида, следующих длин: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, 1000, 1010, 1020, 1030, 1040, 1050, 1060, 1070, 1080, 1090, 1095, 1100, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 9000, 10000, или большее количество нуклеотидов, нуклеозидов или пар оснований. Кроме того предполагается, что тот или иной полипептид из данного вида может быть кодирован нуклеиновыми кислотами, содержащими естественные вариации, которые имеют незначительно отличные нуклеотидные последовательности, но, тем не менее кодируют такой же или фактически такой же белок, полипептид или пептид.
[0136] В конкретных воплощениях изобретение касается выделенных нуклеотидных сегментов и рекомбинантных векторов, включающих нуклеотидные последовательности, которые кодируют опухолеспецифичный антиген и/или молекулу МНС. Термин «рекомбинантный» может быть использован вместе с полипептидом или названием конкретного полипептида и, в общем, относится к полипептиду, продуцируемому с молекулы нуклеиновой кислоты, которая была обработана in vitro или которая является продуктом репликации такой молекулы.
[0137] Нуклеотидные сегменты, используемые в настоящем изобретении, вне зависимости от длины кодирующей последовательности, могут быть объединены с другими нуклеотидными последовательностями, такими как промоторы, сигналы полиаденилирования, дополнительные сайты ферментов рестрикции, сайты множественного клонирования, другие кодирующие сегменты, и т.п., так что их общая длина может варьировать в значительной мере. В связи с этим предполагается, что может быть использован фрагмент нуклеиновой кислоты фактически любой длины, с общей длиной, ограниченной, главным образом, легкостью получения и применения в предполагаемом для использования протоколе рекомбинантных нуклеиновых кислот. В некоторых случаях нуклеотидная последовательность может кодировать полипептидную последовательность с дополнительными гетерологичными кодирующими последовательностями, которые, например, позволяют осуществить очистку полипептида, транспорт, секрецию, пострансляционную модификацию, или получить терапевтические преимущества, такие как направленное воздействие или эффективность. Метка или другой гетерологичный полипептид может быть добавлен к модифицированной полипептид-кодирующей последовательности, где «гетерологичный» относится к полипептиду, который не является тем же самым модифицированным полипептидом.
IV. Терапевтические мишени
[0138] Способ настоящего изобретения включает лечение заболевания или состояния, вызванного неоплазией клеток организма. Иммуногенный полипептид изобретения может быть представлен для индукции или модификации иммунного ответа у персоны, имеющей, или предположительно имеющей риск развития злокачественного новообразования, неоплазии клеток или опухоли. Способы могут быть применены в отношении индивидуумов, у которых тест на антигенную иммунореактивность был положительным, или которые предположительно имеют риск развития такого состояния или схожего состояния.
[0139] Злокачественные и/или неопластические состояния, охватываемые данным изобретением, не ограничены конкретным клеточным типом или конкретным злокачественным новообразованием, но включают любое злокачественное новообразование, в котором опухолеспецифичный антиген присутствует в указанных злокачественных клетках. Кроме того, злокачественная клетка или клетка в состоянии, предшествующем злокачественному, должна быть расположена таким образом, чтобы она поддавалась действию иммунного ответа, индуцированного композициями и способами настоящего изобретения. Некоторые примеры таких злокачественных новообразований включают, без ограничения перечисленным, аденокортикальную карциному; рак мочевого пузыря, рак молочной железы, протоковый рак молочной железы, инвазивный внутрипротоковый рак молочной железы; рак молочной железы - яичников; лимфому Беркитта, рак шейки матки, колоректальную аденому, колоректальный рак, наследственный неполипозный колоректальный рак 1 типа, наследственный неполипозный колоректальный рак 2 типа, наследственный неполипозный колоректальный рак 3 типа, наследственный неполипозный колоректальный рак 6 типа, наследственный неполипозный колоректальный рак 7 типа; дерматофибросаркому выбухающую, карциному эндометрия, рак пищевода, рак желудка, фибросаркому, мультиформую глиобластому; множественные гломусные опухоли; гепатобластому; гепатоцеллюлярный рак; гепатоцеллюлярную карциному; острый лимфобластный лейкоз; острый миелоидный лейкоз; острый миелоидный лейкоз с эозинофилией; острый нелимфоцитарный лейкоз; хронический миелоидный лейкоз, синдром Ли-Фраумени; липосаркому, рак легкого, мелкоклеточный рак легкого, неходжкинскую лимфому; наследственный синдром Линча II; опухоли мужских зародышевых клеток; тучноклеточный лейкоз; медуллярную тиреоидную карциному; медуллобластому; меланому, менингиому; множественные эндокринные неоплазии, предрасположенности к миелоидным злокачественным новообразованиям; миксосаркому, нейробластому, остеосаркому, рак яичников, серозный рак яичников, карциному яичников, опухоли полового тяжа яичников; рак поджелудочной железы, эндокринные опухоли поджелудочной железы; наследственную нехромаффинную параганглиому; пиломатрикому, инвазивную опухоль гипофиза; аденокарциному предстательной железы, рак предстательной железы, папиллярный, семейный и спорадические рак почки; ретинобластому; наследственный синдром предрасположенности к рабдоидной опухоли; рабдоидные опухоли; рабдомиосаркому, мелкоклеточный рак легкого, саркомы мягких тканей, плоскоклеточный рак головы и шеи, Т-клеточный острый лимфобластный лейкоз; синдром Турко с глиобластомой; тилез с раком пищевода, рак шейки матки, рак толстой кишки-прямой кишки, рак легкого, рак предстательной железы, рак кожи; остеокарциному; солидные опухоли/злокачественные новообразования; миксоидную, круглоклеточную липосаркому; местно-распространенные опухоли; карциномы мягких тканей человека, метастазы злокачественных опухолей, плоскоклеточную карциному, плоскоклеточную карциному пищевода, карциному ротовой полости; кожную Т-клеточную лимфому, ходжкинскую лимфому, неходжкинскую лимфому, рак коры надпочечников, АКТГ-продуцирующие опухоли; немелкоклеточный раки; желудочно-кишечного злокачественные новообразования, урологические злокачественные новообразования, злокачественные новообразования женских половых путей, злокачественные новообразования мужских половых путей, рак почки, рак головного мозга, злокачественные новообразования костей, злокачественные новообразования кожи, рак щитовидной железы, ретинобластому, перитонеальный выпот; злокачественной плевральный выпот; мезотелиому; опухоли Вильмса, рак желчного пузыря, трофобластную неоплазию; гемангиоперицитому, саркому Капоши и рак печени.
VI. Примеры
[0140] Следующие примеры даны в целях иллюстрации различных воплощений изобретения и не предназначены для ограничения настоящего изобретения любым образом. Специалисту в данной области совершено ясно, что настоящее изобретение хорошо адаптировано для выполнения задач и получения упомянутых результатов и преимуществ, а также задач, результатов и преимуществ, которые вытекают из данного документа. Настоящие примеры, вместе со способами, описанными в данном документе, представляющие предпочтительные в настоящее время воплощения, являются примерными, не предназначенными для ограничения объема притязаний изобретения. Изменения и другие применения, которые охвачены сущностью изобретения, определенной объемом формулы изобретения, будут приходить на ум специалистам в данной области.
Пример 1
14
[0141] Синтез и описание pMHC-NP на основе золота. Золотые наночастицы (англ. Gold nanoparticles, GNP) конкретных размеров могут быть синтезированы по Levy, R. et al. ("Rational and combinatorial design of peptide capping ligands for gold nanoparticles.» J Am Chem Soc 126, 10076-84 (2004)). Размер, плотность, заряд и монодисперстность препаратов GNP измеряют с помощью спектрофотометрии, трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) и динамического рассеяния света. Образцы GNP затем концентрируют и конъюгируют с рМНС (комплекс антиген-МНС) с помощью различных подходов. Были разработаны способы для количественной оценки валентности pMHC/GNP и концентрации антиген = MHC-GNP с высокими плотностями (~10/мл) без ущерба для монодисперсности (Фиг.1).
Пример 2
2
[0142] рМНС-связывающая емкость GNP. pMHC наносили на GNP различных размеров с помощью двух подходов: (i) случайное связывание pMHC с GNP через электростатические взаимодействия; и (ii) направленное связывание через линкер тиол-PEG-NH. В этом случае, для предотвращения агрегации используется дополнительный тиол-ПЭГ в качестве стабилизатора GNP. Предполагалось, что первый подход позволит получить очень высокие плотности лиганда, хотя и с ущербом для направленности связывания pMHC (т.е. только часть pMHC будет доступна для распознавания когнатными Т-клетками). Цель второго подхода заключалась в получении pMHC-GNP, несущих меньшее количество pMHC, но при этом присоединенных направленно, через их С-концы. Оба подхода проверяли на GNP с размером частиц от 14 нм до 40 нм. Было подтверждено, что для обоих подходов емкость связывания pMHC на GNP является функцией площади поверхности. Соответственно, больше pMHC было связано, когда наночастицы были большего размера. Неожиданно, было установлено, что PEG-опосредованное связывание не только обеспечивает направленность связывания, но также повышает емкость связывания индивидуальных GNP (вопреки нашим изначальным ожиданиям). Таблица 1 суммирует эти результаты.
Таблица I.
рМНС-связывающая емкость GNP
Диаметр (нм)
S площадь поверхности (×10<sup>2</sup> нм<sup>2</sup>)
pMHCs/GNP (адсорбция)
pMHCs/GNP (линкер)
14
7
N
212
20
12
3,750
30
28
335
40
50
2,850
5,250
Пример 3
206-214
206-214
206-214
d
d
d
d
[0143] Агонистическая активность в зависимости от содержания pMHC. Проверяли влияние валентности pMHC, размера GNP, плотности GNP и стратегии нанесения покрытия на агонистическую активность pMHC-GNP in vitro. Сравнивали способность различных препаратов активировать когнатные (IGRP-специфичные) наивные CD8+ Т-клетки (в данном документе они называются '8.3-CD8+ Т-клетки'), полученные из трансгенных мышей NOD с 8.3-Т-клеточным рецептором (TCR). В первой группе экспериментов сравнивали эффекты валентности IGRP-K (pMHC) по всему диапазону плотностей GNP. GNP, покрытые контрольными (некогнатными) pMHC (Tum-K) использовали в качестве отрицательных контролей. Как и ожидалось, IGRP-K- (но не TUM-K) GNP активировали эти Т-клетки (что измеряется по выработке IFNγ) зависимым от дозы рМНС образом. На Фиг.2 показан эксперимент с 14 нм GNP, которые покрыты различным количеством рМНС посредством линкера. Кроме того, GNP, покрытые в ~2 раза большим количеством рМНС, имеют исключительную агонистическую активность. Таким образом, агонистическая активность pMHC-GNP является функцией общего содержания рМНС.
Пример 4
13
12
[0144] Агонистическая активность в зависимости от размера и плотности GNP. Дополнительные анализы указывают на то, что общее содержание рМНС не является единственным фактором, влияющим на агонистическую активность pMHC-GNP и на то, что размер GNP также важен. Это было проверено путем сравнения активностей двух образцов pMHC-GNP различного размера (14 и 40 нм) и различных валентностей рМНС, но с одинаковым содержанием рМНС. В эксперименте, показанном на Фиг.3, использовали 14 нм GNP, несущие ~200 pMHC/GNP, и 40 нм GNP, несущие ~5,000 pMHC/GNP. Плотности GNP в этих двух образцах корректировали до 3×10 и 10GNP/мл, соответственно, для корректировки общего содержания рМНС до ~450 мкг/мл. Следует отметить, 8,3-CD8+ клетки отвечали значимо лучше на 14 нм соединение pMHC/GNP, чем на 40 нм, по всему диапазону содержания рМНС, несмотря на то, что последний имел большее соотношение pMHC/GNP. Это подтверждает то, что плотность GNP (больше GNP на когнатную Т-клетку) является ключевой. Например, 4×40 нм NP, несущие 1000 pMHC/GNP (4000 рМНС) будет менее желательна, чем 40×10 нм NP, несущие 100 pMHC/GNP (4000 рМНС).
[0145] В совокупности эти данные подтверждают, что оптимальными препаратами pMHC-GNP являются те, которые содержат малые GNP, используемые при высоких плотностях. Преимущества увеличения валентности рМНС выше некоторого уровня (т.е. 25 pMHC/GNP) менее значимо.
Пример 5
2
2
[0146] Агонистическая активность относительно экспонирования рМНС. Как упоминалось выше, образцы pMHC-GNP получают одновременным покрытием GNP 3,4 кДа тиол-ПЭГ-NH линкером (выступающим в качестве акцептора для карбоксильных концов рМНС) и тиол-ПЭГ линкером, который действует в качестве стабилизатора GNP. Для определения оказывает ли влияние длина стабилизирующих тиол-ПЭГ на антиагрегационные свойства GNP, сравнивали pMHC-GNP, полученные с помощью стабилизирующих линкеров различной длины (2 кДа и 5 кДа, короче и длиннее, чем акцептор рМНС, соответственно). Оба линкера имели схожие антиагрегационные свойства и 5 кДа линкер не ингибирует связывание рМНС с более коротким 3,4 кДа тиол-ПЭГ-NH. Следует отметить, однако, что pMHC-GNP, защищенные более короткими (2 кДа) тиол-ПЭГ имели исключительную агонистическую активность, чем те, которые были покрыты более длинными (5 кДа) тиол-ПЭГ (Фиг.4). Это говорит о том, что длинные защитные тиол-ПЭГ линкеры экранируют молекулы рМНС, связанные с акцепторным ликером, от экспонирования Т-клеткам.
Пример 6
206-214
d
13
[0147] Наработка авторегуляторных CD8+ клеток посредством pMHC-GNP in vivo: ключевая роль стратегии покрытия. Была протестирована способность некоторых различных образцов IGRP-K-GNP увеличивать количество когнатных авторегуляторных CD8+ клеток in vivo. pMHC-GNP инъецировали в.в. в 10 недельных мышей NOD. Каждая получала 2 инъекции в неделю в течение 5 недель. Изменения в размере популяции когнатных Т-клеток в крови и лимфоидных органах оценивали окрашиванием клеточной суспензии с помощью флуоресцентно-меченных тетрамеров рМНС. Вначале были проверены два образца 30 нм pMHC/GNP (~1,8-2,2×10 GNP/мл), которые были покрыты высокими валентностями рМНС прямой адсорбцией (300-600 pMHC/GNP) (10 мкл GNP/инъекцию). Оба образца демонстрировали агонистическую активность in vitro (не показано). Однако ни один образец не был способен индуцировать наработку когнатных авторегуляторных CD8+ клеток в крови или лимфоидных органах (не показано), по всей видимости из-за того, что рМНС быстро отрываются от GNP-каркаса in vivo.
[0148] Проверяли два образца 14 нм pMHC-GNP при одинаковой плотности NP, но покрытые меньшими валентностями (40-100 pMHC/GNP) через ПЭГ-линкеры. В отличие от случая с pMHC-GNP, полученных способом адсорбции, инъекции (10 мкл/доза) этих pMHC-GNP индуцируют значительную наработку когнатных Т-клеток как в крови, так и в лимфоидных органах (Фиг.5). Эта наработка была антигенспецифичной, поскольку GNP, конъюгированные с контрольными рМНС, не индуцируют наработку, даже при более высоких дозах (100 мкл/дозу). Таким образом, pMHC-GNP малого диаметра (14 нм) ковалентно покрытые рМНС через соответствующие ПЭГ-линкеры и использованные в значимо более высоких количествах способны привести к наработке когнатных авторегуляторных CD8+ клеток in vivo.
Пример 7
12
d
d
206-214
206-214
[0149] Массивная наработка когнатных CD8+ Т-клеток с помощью pMHC-GNP, покрытых при более высоких валентностях рМНС. Далее определяли потенциал pMHC-NP к индукции массивной наработки когнатных Т-клеток in vivo. Определение было осуществлено путем обработки мышей несколькими инъекциями 3×10 10-14 нм NP, несущих 25 мкг общего количества рМНС (~150 IGRP/Kd молекул на NP). Как показано на Фиг.6, мыши, обработанные 10 дозами (дважды в неделю в течение 10 недель), демонстрируют массивную наработку когнатных IGRP (NRP-V7)-реактивных CD8+ Т-клеток в периферической крови по сравнению с необработанными контролями (от <0,4 до >17 или 47% CD8+ Т-клеток) (нижние панели). Такая наработка ранее наблюдалась в мышах, которые были умерщвлены после 4 доз pMHC-NP (верхние панели). pMHC-NP-экспансированные клетки специфически связывают когнатные тетрамеры рМНС, но не связывают некогнатные тетрамеры рМНС (NRP-V7/Kотносительно TUM/K, соответственно).
Пример 8
[0150] Кооптирование оптимального дизайна pMHC-GNP для разработки 'мультиплексных' NP с костимулирующими свойствами. Одним из примеров костимулирующей молекулы является IL-15/IL-15Ra. Например, IL-15 требуется для поддержания ответов CD8+ Т-клеток памяти (например, см. Kennedy, М.К. et al. «Reversible defects in natural killer and memory CD8 Т cell lineages in interleukin 15-deficient mice.» J Exp Med 191, 771-80 (2000) и Becker, Т. et al., «Interleukin 15 is required for proliferative renewal of virus-specific memory CD8 Т cells.» J. Exp. Med. 195, 1541-1548 (2002), которые включены в данный документ ссылкой). Транс-презентация IL-15 мембранным IL-15Ra на АПК поддерживает выживание CD8+ Т-клеток памяти и усиливает их пролиферацию в ходе антигенных вторичных иммунных ответов (см. например, Sato, N. et al., «The IL-15/IL-15Ralpha on cell surfaces enables sustained IL-15 activity and contributes to the long survival of CD8 memory Т cells.» Proc Natl Acad Sci USA 104, 588-93 (2007) и Mortier, E. et al. «Macrophage- and dendritic-cell-derived interleukin-15 receptor alpha supports homeostasis of distinct CD8+ Т cell subsets.» Immunity 31, 811-22 (2009), которые включены в данный документ ссылкой). Соответственно, предполагается, что pMHC-NP, экспонирующие комплексы IL-15/IL-15Ra, будут иметь лучшие свойства наработки Т-клеток памяти, чем NP, покрытые только рМНС. Следовательно, возможно будет получить схожие или лучшие эффекты при значительно более низких дозах общих рМНС и NP. В одном воплощении мультиплексной платформы pMHC-NP, NP могут нести как рМНС, так и рекомбинатную химеру IL-15/IL-15Ra-hFc при различных стехиометриях (диапазон: от 1:25 до 25:1).
[0151] В одном примере, кДНК-фрагмент mIL-15, кодирующий остатки N49-S162, был объединен с кДНК mIL-15Ra, кодирующей остатки G33-A132, через гибкий GS линкер. Эта IL-15/IL-15Ra кДНК затем была слита с кДНК, кодирующей Fc-часть человеческого IgG (hFc). Мы субклонировали этот конструкт в вектор для экспрессии в клетках мух, который был трансфецирован в клетки SC2 Drosophila melanogaster вместе с геном устойчивости к пуромицину для получения стабильных клеточных линий. Рекомбинантные белки очищали из надосадочных жидкостей с помощью аффинной хроматографии с протеином А. Похожий дизайн может быть применен к другим костимулирующим молекулам (т.е. для образования димеров димеров или тримеров, слитых с Fc-частью IgG).
Пример 9
Получение рМНС, конъюгированных с золотыми наночастицами.
4
[0152] Получение золотых наночастиц, конъюгированных с рМНС (pMHC-GNP, 12 и 30 нм). Получение GNP. GNP получали нагреванием D.D. воды (дистиллированной, деионизованной) (200 мл) в круглой колбе в бане с силиконовым маслом до кипения. Затем в кипящую воду добавляли раствор 1% HAuCL (4 мл). Раствор перемешивали в течение 10 мин. до добавления 1% раствора цитрата натрия. Для 12 нм GNP добавляли 12 мл раствор цитрата натрия. Для 30 нм GNP, добавляли 12 мл раствора цитрата натрия. Темно-красный цвет появлялся сразу же после добавления раствора цитрата натрия. Для окончания реакции GNP перемешивали в течение более 30 минут. Это модификация способа, описанного в Levy, R. et al. ("Rational and combinatorial design of peptide capping ligands for gold nanoparticles.» J Am Chem Soc 126, 10076-84 (2004)), которая включена в данный документ ссылкой.
2
6
13
4
2
[0153] Модификация поверхности GNP. GNP пэгилировали добавлением 25 мМ тиол-ПЭГ-NH (M.W. 3400) и 50 мМ тиол-ПЭГ (M.W. 2000, соотношение ПЭГ/GNP 10000:1) в раствор GNP. Раствор перемешивали в течение 5 часов при комнатной температуре. Пэгилированные GNP затем отмывали 3×30 мл стерильной D.D. воды для удаления избытка ПЭГ, и ресуспендировали в 40 мл 10 мМ MES буфера (CHNOS.×HO), pH 5,5.
206-214
[0154] Конъюгация рМНС. рМНС (IGRP/Kd, 4 мг) добавляли в раствор пэгилированных GNP покапельно при умеренном перемешивании и комнатной температуре. Смесь перемешивали в течение одного часа перед добавлением 20 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC). Смесь дополнительно перемешивали в течение 4 часов. pMHC-GNP конъюгаты затем отмывали 40 мл фосфатно-солевого буферным раствором (PBS, PH 7,2-7,4) три раза, и ресуспендировали в 8 мл PBS.
Пример 10
Получение рМНС, конъюгированных с золотыми наночастицами.
3
[0155] Приготовление GNP, конъюгированных с рМНС (pMHC-GNP, 2-10 нм). Приготовление GNP (2-5 нм). GNP 2-5 нм готовили растворением 250 мг (для 2 нм GNP) или 50 мг (для 4 нм GNP) додециламина в 10 мл раствора DDAB (100 мМ дидоцедицдиметиламмония бромид (DDAB) в толуоле). Затем растворяли 100 мг борогидрида тетрабутиламмония (ТВАВ) в 4 мл раствора DDAB. Затем смешивали растворы додециламина и ТВАВ в 50 мл трехгорлой колбе и перемешивали в атмосфере азота. 34 мг AuCl растворяли в 4,5 мл раствора DDAB, и быстро инъецировали в смесь ТВАВ и раствора додециламина. Раствор сразу же становился темно-красным, что указывало на образование GNP. Смесь непрерывно перемешивали в течение 30 мин., затем в смесь добавляли 15 мл этанола. Затем смесь центрифугировали при 4100×g в течение 12 мин. для осаждения GNP.
3
[0156] Приготовление GNP (6-10 нм). Для приготовления 6-10 мм GNP вначале растворяли декановую кислоту (172 мг) в 10 мл толуола, а затем смешивали с различными количествами раствора ТВАВ (4 и 1 мл для 6 и 10 нм GNP, соответственно) в 50 мл трехгорлой колбе, а затем перемешивали в атмосфере азота. Затем в смесь ТВАВ и раствора декановой кислоты быстро инъецировали AuCl (34 мг растворяли в 4,5 мл стокового раствора DDAB). Раствор сразу же становился темно-красным. Смесь непрерывно перемешивали в течение 30 мин., и добавляли в смесь 15 мл этанола. Затем смесь центрифугировали при 4100×g в течение 12 мин для осаждения GNP.
6
13
4
2
[0157] Модификация поверхности GNP. GNP ресуспендировали в 20 мл 0,1 М меркаптопропановой кислоты (МРА) в метаноле, рН 10 и перемешивали в течение одного часа при комнатной температуре. Затем добавляли 10 мл этилацетата. Затем смесь центрифугировали при 4100×g в течение 15 мин. После этого осажденные GNP трижды отмывали 30 мл стерилизованной D.D. воды, и ресуспендировали в 20 мл 100 мМ MES (CHNOS.×HO) буфера, рН 5,5. К этой смеси добавляли растворы 0,5 М полиоксиэтилен бис(амина) (при соотношении ПЭГ/GNP 10000/1) и 0,1 М 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) (конечная концентрация EDC 2 мМ). Перемешивали смесь в течение 4 часов. Пэгилированные GNP отмывали 3×30 мл стерильной D.D. водой для удаления избытка ПЭГ и EDC.
6
13
4
2
[0158] Конъюгация рМНС. Пэгилированные GNP ресуспендировали в 20 мл 100 мМ буфера MES (CHNOS.×HO), рН 5,5. затем к ресуспендированным GNP добавляли рМНС (5 мг/мл, общее количество 10-30 мг) (соотношение pMHC/GNP 500:1), покапельно, и перемешивали в течение 1 часа при комнатной температуре перед добавлением 0,1 М 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC) (конечная концентрация EDC 2 мМ). Смесь перемешивали в течение более 4 часов. pMHC-GNP конъюгаты трижды отмывали 40 мл фосфатно-солевого буферного раствора (PBS, РН 7,2-7,4), а затем ресуспендировали в 10-20 мл PBS.
Пример 11
206-214
d
Получение, описание и функциональный анализ наночастиц оксида железа, конъюгированных с IGRP/K и агонистическим анти-CD28 антителом, для усиления активации наивных когнатных CD8+ Т-клеток.
3
4
[0159] Наночастицы оксида железа (FeO NP) синтезировали способом термической деструкции и измеряли размер наночастиц с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЕМ) (9,4 нм).
206-214
d
[0160] Синтезированные частицы конъюгировали с 3,4 кДа линкерами функционализированный допамин-ПЭГ, разработанными как для стабилизации наночастицы, так и функции в виде акцепторов лимфоцитстимулирующих лигандов. Эти пэгилированные наночастицы затем конъюгировали с агонистическим анти-CD28 моноклональным антителом (клон 37,51 мАТ; лимфоцит-активирующий рецептор для костимулирующей молекулы В7.1) и/или множественными копиями пептид-главный комплекс гистостосовместимости (рМНС), которые служат мишенью для значительной популяции CD8+ Т-клеток в не страдающих ожирением диабетических (англ. nonobese diabetic, NOD) мышах (IGRP/K). Плотность наночастиц определяли измерением содержания железа в образцах. Валентность рМНС и антитела в препаратах рМНС/анти-CD28 мАТ-конъюгированных наночастиц определяли способом дот-тИФА, использующим МНС и IgG-специфичные антитела, определенные детектирующими реактивами для рМНС и анти-CD28 мАТ, соответственно. Фигуры 7 и 8 демонстрируют репрезентативные изображения ТЕМ, демонстрирующие, что как препараты рМНС/мнти-CD28 мАТ (Фигура 7), так и рМНС-конъюгированных наночастиц (Фигура 8) были монодисперированы и имели сходное содержание железа (наночастиц) и валентностей рМНС.
[0161] Результаты анализа электрофорезом в агарозном геле показали, что, как и ожидалось, контрольные неконъюгированные наночастицы, не содержали молекул белков (см. утрату окрашивания Кумасси синим в дорожке 3 на Фигуре 9В). Напротив, препараты белок-конъюгированных неночастиц, окрашенных Кумасси синим (дорожки 4 и 5 Фигуры 9В) и краска мигрировали вместе с сигналом железа (дорожки 4 и 5 Фигуры 9А). Электрофорез этих препаратов на 5% полиакриламидных гелях дополнительно указывает на то, что практические все белковое содержание в обоих препаратах приходилось на наночастицы, с недетектируемыми уровнями неконъюгированного белка в растворе (Фигура 9С). Как и ожидалось, наночастицы, в отличие от контрольных неконъюгированных мономеров рМНС в растворе, не мигрируют в геле согласно своему размеру.
206-214
d
5
[0162] Затем мы сравнили способности рМНС и рМНС/анти-CD28 мАТ-конъюгированных наночастиц стимулировать и активировать когнатные наивные CD8+ Т-клетки, выделенные из трансгенных мышей NOD, экспрессирующих IGRP/K-реактивный трансген TCR. Сравнение было осуществлено измерением пролиферативной активности и активности секреции интерферона-гамма наивными CD8+ Т-клетками этих мышей (правая и левая панели в Фигуре 10, соответственно) (2,5×10 клеток/мл) в ответ на серийно разведенные препараты наночастиц. Как показано в Фигуре 10, рМНС/анти-CD28 мАТ-конъюгированные наночастицы (Фигура 10В) имеют значительно более высокую агонистическую активность, чем наночастицы, покрытые только рМНС (Фигура 10А). pMHC/анти-CD28 мАТ-конъюгированные наночастицы индуцируют максимальную пролиферацию (Фигура 10В, правая панель) и секрецию интерферона-гамма (Фигура 10В, левая панель) при низких плотностях наночастиц и эти значения были в существенной степени выше, чем максимальные значения, полученные для наночастиц, конъюгированных с рМНС (Фигура 10А) при наивысших протестированных плотностях.
Пример 12
Экспрессия, очистка и функциональное описание рекомбинантного мышиного химерного белка B7.1-hFc
[0163] В идеале, рМНС-покрытые наночастицы, предназначенные для активации наивных Т-клеток, должны быть покрыты целым диапазоном костимулирующих молекул, способных привлекать когнатные сигнал-передающие рецепторы на поверхности Т-клетки (т.е. CD28 для В7.1, как в случае анти-CD28 мАТ). Это было бы особенно целесообразно для рецепторов, для которых не доступны агонистические мАТ. Для проверки выполнимости этого подхода мы создали ДНК-конструкт, кодирующий мышиный В7.1 (mB7.1)-hFc химерный белок (с помощью гибкого GS связанного спейсера частей В7.1 и hFc) для экспрессии в клетках дрозофилы S2 (с помощью вектора pMT/V5) или в клетках яичника китайского хомяка (СНО) (с помощью вектора pcDNA3.3). Химерный белок включает фрагмент mB7.1 (209 ак, D37-K245), за которым следует область СН2 человеческого IgG1 (hIgG1) (227 ак). Химерный белок был очищен из культуральной надосадочной жидкости аффинной хроматографией на сефарозе с протеином А. Нуклеотидная и аминокислотная последовательность химерного белка представлена на Фигурах 11А-В.
3
3
[0164] Для проверки костимулирующей активности химеры mB7.1-hFc, мы очистили наивные CD4+ Т клетки из мышей NOD дикого типа и культивировали их в присутствии серийных разведений mB7.1-hFc, в присутствии субоптимальной концентрации агонистического анти-CD3 мАТ, иммобилизованного на планшетах. Культуры, инкубированные только в присутствии отдельно иммобилизованных анти-CD3 мАТ или анти-CD28 мАТ (отрицательные контроли) не пролиферировали (что дает фоновые уровни включения Н тимидина; данные не показаны). Добавление анти-CD28 мАТ к культурам на планшетах, покрытых с анти-CD28 мАТ, драматически понижает уровни включения Н тимидина (положительный контроль). Добавление mB7.1-hFc к культурам, рассеянных в присутствии субоптимальных концентраций анти-CD3 мАТ, индуцирует зависимое от концентрации повышение пролиферативной активности наивных CD4+ Т-клеток, вне зависимости от то продуцируется ли химерный белок в клетках S2 или СНО (Фигура 12). Это демонстрирует, что химерный белок, в том виде, в котором он был спроектирован, может эффективно доставлять костимулирующий сигнал к стимулированным TCR Т-клеткам. Такой дизайн, следовательно, будет служить в качестве матрицы конструирования химерных белков, кодируемых другими костимулирующими молекулами, которые будут конъюгированы в рМНС-покрытые наночастицы для активации и наработки антиген-специфичных Т-клеток in vivo.
[0165] Таким образом, следует понимать, что хотя настоящее изобретение было конкретно описано предпочтительными воплощениями и необязательными признаками, специалисты в данной области могут прибегнуть к модификации, улучшению и видоизменению изобретений, описанных в данном документе, и что такие модификации, улучшения и видоизменения рассматриваются как находящиеся в рамках данного изобретения. Материалы, способы и примеры, представляющие в данном документе предпочтительные воплощения, являются примерными и не предназначены для ограничений рамок данного изобретения.
[0166] Изобретение было описано в данном документе широко и в общем смысле. Каждое из более узких видов и субродовых групп, подпадающих под общее описание, также являются частью изобретения. В это включено общее описание изобретения при том условии, что или с отрицательным ограничением, которое удаляет любой объект изобретения из рода, вне зависимости от того изложен удаленный материал в данном документе или нет.
[0167] Кроме того, если признаки или аспекты изобретения описаны в рамках групп Маркуша, то специалисты в данной области поймут, что изобретение также описано посредством этого относительно индивидуального представителя или подгруппы представителей группы Маркуша.
[0168] На протяжении всего описания, различные публикации, патенты и описания опубликованных патентов указаны идентифицирующим цитированием. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие источники, упомянутые в данном документе в явной форме, включены ссылкой во всей полноте, в той же степени, как если бы каждый из них был включен ссылкой индивидуально. В случае противоречий, настоящее описание изобретения, включая определения, будет проверено.