АМПЛИФИКАТОР

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ПОЛЕЗНАЯ МОДЕЛЬ
Настоящая полезная модель относится к области медицинской техники, а именно к медицинским приборам для лабораторной диагностики in-vitro с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). А именно, к амплификатору, предназначенному для размножения (амплификации) патогенных ДНК и РНК, а также для определения их количеств в исследуемых образцах с помощью спектрофотометрии.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В связи с появлением и массовым распространением новых заболеваний, для контроля эпидемиологической ситуации и быстрого выявления заболевших требуется большое количество аппаратных устройств, на которых проводятся ПЦР-анализы. Поэтому с каждым годом совершенствуются ПЦР-машины, появляется множество новых технических решений, используемых в лабораторной диагностике, чтобы улучшить процедуру проведения анализа - увеличить точность, сократить время постановки, снизить стоимость реагентов и оборудования для обеспечения широкого внедрения ПЦР-технологий, особенно в странах с развивающейся экономикой.
По патенту RU2681914 от 13.03.2019 описано изобретение, которое относится к усовершенствованному амплификатору, содержащему вращающуюся платформу, имеющую реакционные лунки и/или выполненную с возможностью приема реакционных контейнеров. Вращающаяся платформа и/или реакционные лунки выполнены из материала, который способен индукционно нагреваться под воздействием электромагнитной энергии. Предусмотрен источник электромагнитной энергии, выполненный с возможностью направления электромагнитной энергии на вращающуюся платформу. Источник электромагнитной энергии полностью окружает значительную часть вращающейся платформы для нагревания платформы, по существу, одновременно. Изобретение включает способ циклической термообработки реакционной смеси между заданными температурами с использованием усовершенствованного амплификатора, выполненного в соответствии с изобретением, а также применение усовершенствованного амплификатора для проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты, такой как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и лигазная цепная реакция (ЛЦР). Уменьшение времени проведения ПЦР-анализа достигается за счет повышения скорости циклической термообработки, модуль оптического детектирования получает данные для обработки при многократном вращении диска с реакционными контейнерами.
Наиболее близким к заявленной полезной модели является техническое решение амплификатора, которое позволяет сделать точный анализ ПЦР в реальном времени (QIAGEN Rotor-Gene Q, https://www.qiagen.com/us/shop/pcr/rotor-gene-q/, патент EP2687294A1 от 22.01.2014). Данное решение амплификатора характеризуется наличием вращающейся центробежной роторной конструкции, в котором каждая пробирка вращается в камере с воздухом, поддерживая все образцы при одинаковой температуре во время быстрого термоциклирования. Когда каждая пробирка совмещена с оптической системой детектирования, образец освещается, и флуоресцентный сигнал быстро собирается с одного короткого оптического пути. Такая термическая и оптическая однородность обеспечивает чувствительный, точный и быстрый ПЦР-анализ в реальном времени. Она также устраняет вариации от образца к образцу и позиционные эффекты. Это неизбежно в традиционных инструментах на основе планшетов из-за градиентов температуры по всему блоку и множества сложных оптических путей. Роторная конструкция обеспечивает отклонение от пробирки к пробирке ±0,02°C, равномерное обнаружение устраняет необходимость в эталонном красителе. Rotor-Gene Q имеет до 6 каналов, охватывающих диапазон длин волн от УФ до инфракрасного. Однако, Rotor-Gene Q, несмотря на определенные преимущества перед амплификаторами планшетного типа, обладает множеством особенностей, которые приводят к существенному удорожанию и усложнению устройства, а также к снижению общей отказоустойчивости устройства и его эксплуатационных характеристик.
Например, температура внутри пробирок не измеряется, что делает устройство зависимым от эмпирической модели терморегулирования и, как следствие, от эпизодических калибровок температур сервисными инженерами с использованием специализированного калибровочного диска. Соответственно, после установки и калибровки устройства не рекомендуется его транспортировка и перемещение. Rotor-Gene Q обладает двумя раздельными контурами термоциклирования, для каждого из которых предусмотрены отдельные электромагнитные клапана и воздушные крыльчатки с моторами и драйверами двигателей, поэтому решение является избыточным и ненадежным. Также система оптического детектирования Rotor-Gene Q содержит крайне дорогостоящие элементы в виде подвижного диска оптических фильтров и фотоэлектронного умножителя, при этом позволяя считать значение только одного оптического канала за один поворот диска, поскольку для считывания различных оптических каналов требуется вращать колеса со светодиодами и фильтрами. Это не позволяет дополнительно уменьшить время на проведения ПЦР-анализа.
Заявленная полезная модель решает техническую проблему улучшения техничеких и эксплуатационных характеристик устройства для проведения ПЦР-анализов.
СУЩНОСТЬ ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ
Амплификатор предназначен для размножения (амплификации) патогенных ДНК и РНК, а также для определения их количеств в исследуемых образцах с помощью спектрофотометрии в лабораторной диагностике in-vitro с использованием метода количественной полимеразной цепной реакции. Управление амплификатором осуществляется программным обеспечением, с помощью которого выполняются операции термоциклирования и считывания, а также настройка и диагностика устройства. Амплификатор является медицинским изделием для диагностики in-vitro.
Техническим результатом, достижения которого обеспечивается заявленной полезной моделью, является уменьшение времени проведения ПЦР-анализов.
Амплификатор разработан таким образом, чтобы избавиться от большинства подвижных, подверженных поломкам и дорогостоящих комплектующих, которые применяются в известных решениях, что дополнительно позволяет повысить надежность и долговечность устройства. В заявленной полезной модели отсутствуют воздушные клапаны с электроприводами, дополнительная крыльчатка системы охлаждения с двигателем и драйвером, система оптических фильтров с электроприводом. В амплификаторе отсутствует система зеркал для передачи оптического сигнала, координатный стол и фотоэлектронный умножитель.
За счет неподвижного оптического детектора в виде чипа с внутренними светофильтрами заявленная модель является единственной в своем роде, способной к считыванию всех оптических каналов одновременно и восстановлению всего оптического спектра целиком за одну процедуру считывания. Отказавшись от большинства стандартных для роторных амплификаторов функциональных комплектующих в заявленную полезную модель были внедрены следующие новые технические решения и особенности:
а) Многоканальный оптический детектор в виде чипа с интегрированными оптическими фильтрами без подвижных частей и с прямым оптическим путем через волновод из оптического пластика.
б) Цифровые прецизионные датчики температуры, расположенные как внутри эталонных пробирок, так и во вращающемся воздушном потоке на уровне нижней точки пробирок.
в) Одноконтурная прямоточная система термоциклирования без клапанов с использованием аэродинамических эффектов от закручивания воздушного потока и его столкновения с препятствиями на различных скоростях.
г) Предиктивная система регулирования температуры, которая максимизирует температурный градиент и минимизирует перерегулирование с проскоками, без необходимости в эмпирической модели и каких-либо калибровках как при производстве, так и по месту установки.
Система детекции оптического сигнала упрощена до минимально возможной стоимости и габаритов. В амплификаторе используется бюджетный чип-детектор, в котором узкополосные оптические фильтры каналов находятся прямо внутри чипа на поверхности массива фотодиодов. Таким образом, интенсивность света измеряется на всех каналах сразу. Оптический сигнал от пробирки к чип-детектору передается через световод из оптического пластика без подвижных частей. Внутри амплификатора на валу шагового двигателя установлен один подвижный диск со светодиодами. Возбуждающий свет для флуоресцентных меток передается от светодиода к пробирке также через световод из оптического пластика, на конце которого установлена фокусировочная линза для уменьшения угла расхождения светового потока, чтобы избежать паразитной засветки.
Отдельной отличительной особенностью амплификатора является возможность считывания всех оптических каналов сразу, без временных затрат на поворот диска с фильтрами. А также, как следствие, возможность восстановить оптический спектр целиком по калибровочной матрице с шагом в 1 нм. Благодаря этому в результате одной процедуры считывания создается 620 точек измерения, вместо одной, как у известных устройств.
Известные устройства применяют сложные, крайне дорогостоящие и недостаточно отказоустойчивые системы для детектирования оптического сигнала. Как правило в роли детектора выступает фотоэлектронный умножитель, ПЗС-матрица или массив фотодиодов. Перед детектором устанавливается подвижный диск с оптическими фильтрами, для засветки пробирок используется подвижный диск со светодиодами. Либо цельная конструкция со светодиодами, фильтрами и зеркалами устанавливается на подвижный двухосный (XY) координатный стол со сложным электроприводом и линейными передачами.
В заявленной полезной модели датчики температуры располагаются непосредственно в пробирках с кремнийорганической термопастой на вращающемся диске. Термопаста изготавливается таким образом, чтобы ее теплопроводность и теплоемкость были максимально близки к реакционной смеси. Также на вращающемся диске установлены датчики температуры, которые находятся в воздушном потоке и поэтому намного быстрее реагируют на изменения температуры, тем самым позволяя предсказывать температуру внутри пробирок в будущем времени с высокой точностью. Датчики на быстро вращающемся диске получают электропитание с помощью беспроводной индуктивной системы передачи энергии. Данные о температурах с вращающегося диска передаются в цифровом виде по радиоканалу на основной микропроцессор устройства.
В заявленной модели поток воздуха всегда циркулирует по открытому контуру. Воздух забирается снизу устройства из внешней среды и закручивается крыльчаткой охладителя тангенциального типа в горизонтальной плоскости, затем проходит через обтекатель во внутренний канал устройства, где расположены нагревательные спирали и пробирки на вращающемся диске, а затем сразу выбрасывается наружу с изменением направления движения на 90 градусов через препятствие в виде выходного канала, имеющего разное сопротивление для потоков воздуха с различными скоростями. Соответственно, отсутствует необходимость в клапанах с электроприводом, в дополнительных крыльчатках с моторами и управляющей электроникой, а также во множестве вспомогательных механических деталей.
Также, закручивание воздушного потока против направления вращения диска увеличивает скорость столкновения частиц воздуха с пластиком пробирок, благодаря чему усиливается теплообмен и уменьшается время проведения ПЦР-анализов.
Известные роторные амплификаторы, использующие воздушную среду для нагрева и охлаждения пробирок, как правило работают по двухконтурной схеме - открытой на охлаждении (воздух проходит через устройство и выбрасывается наружу) и закрытой на нагреве (воздух циркулирует внутри устройства). Для этого требуется множество малонадежных и дорогостоящих электромеханических компонентов. Также отсутствует возможность часто и быстро менять температуру воздуха с очень горячего внутри на холодный из среды во время закрытого цикла нагрева, что приводит к увеличению времени анализа в известных устройствах по причинам недопущения расплавления доступных пробирок из полиэтилена.
Благодаря наличию в амплификаторе, как и воздушных датчиков, так и датчиков внутри пробирок была разработана уникальная система регулирования температуры, которая строит прогноз о том, какая будет достигнута температура в будущем, в зависимости от текущей скорости ее изменения, не опираясь на абсолютные значения температур. Датчики температуры в воздухе реагируют на изменения температуры намного быстрее, чем датчики в пробирках, что позволяет использовать эти различия в скорости реакции для аппроксимации физической модели процесса термоциклирования и делать точные предсказания об изменениях температур в ближайшем будущем. Соответственно, система упредительно и заранее принимает решение о том, стоит ли включать нагреватель и насколько следует изменить мощность охладителя. Точность системы и быстрота реакции достигаются за счет высокой скорости работы температурных датчиков - упредительные решения рассчитываются и принимаются на скорости до 64 раз в секунду.
В отличие от известных решений отсутствует эмпирическая модель и привязка работы амплификатора к определенным откалиброванным температурам. Соответственно, такая система позволяет избавиться от калибровочных работ по месту при установке амплификатора в лаборатории и обеспечивает его работу в очень широких диапазонах внешних условий (температура, влажность и давление), что делает прибор крайне отказоустойчивым по сравнению с известными решениями. Также такая система позволяет снизить время выполнения анализов за счет избавления от осцилляций и значимых проскоков, в отличие от известных решений, которые используют ПИД-регуляторы. Тем самым существенно повышается стабильность условий для химических реакций среди компонентов ПЦР-микса, в том числе решается проблема выгорания ферментов, что приводит к намного более точным, стабильным и повторяемым результатам ПЦР-анализа.
ПЕРЕЧЕНЬ ФИГУР И ЧЕРТЕЖЕЙ ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ
Полезная модель поясняется чертежами, на которых:
Фиг. 1 показывает вид спереди амплификатора;
Фиг. 2 показывает вид сзади амплификатора;
Фиг. 3 показывает вид снизу амплификатора;
Фиг. 4 показывает вид сверху под крышкой амплификатора;
Фиг. 5 показывает вид сверху диска для пробирок;
Фиг. 6 показывает вид сверху внутреннего отсека амплификатора;
Фиг. 7 показывает оптический детектор в виде чипа с внутренними светофильтрами;
Фиг. 8 показывает датчики температуры в пробирках;
Фиг. 9 показывает датчики температуры воздуха;
Фиг. 10 показывает 3D-модель амплификатора в разрезе;
Фиг. 11 показывает работу предиктивной системы терморегулирования;
Фиг. 12 показывает одноконтурную систему термоциклирования амплификатора;
СВЕДЕНИЯ, ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ВОЗМОЖНОСТЬ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ПОЛЕЗНОЙ МОДЕЛИ.
Заявленная полезная модель уже осуществлена в полном объеме в устройстве “Амплификатор autoPCR” разработки и производства компании ТОО “7R Bio”, г. Алматы, Республика Казахстан.
Технические характеристики:
Тип устройства: Роторный со съемным диском
Технология: real time (qPCR)
Диапазон температур: 40… 99°C
Тип пробирок: 200 мкл для ПЦР
Количество пробирок: 40 в стандартном диске
Количество каналов:  9 – детектор, 7 - светодиоды
Частота светодиодов: 390, 450, 470, 520, 590, 630, 430 - 700 нм
9 каналов детектора: 410, 440, 470, 510, 550, 590, 620, 670, 900 нм
Оптическая передача: Оптоволоконный кабель PMMA
Скорость ротора: До 400 оборотов в минуту
Потребляемая мощность: 950W, 220 - 230 V AC, 50 - 60 Hz
Рабочее окружение: Внутри помещений, 20 - 30°C
Соединение с ПК: Wi-Fi 2.4 ГГц или USB COM-порт
Вес и габариты устройства: 6.2 кг, 262 × 222 × 164 мм (Д × Ш × В)
Страна-производитель: Республика Казахстан
На фиг. 1 изображена передняя панель амплификатора, на которой находится светодиодный индикатор работы. Индикатор разделен на три секции: индикатор температуры пробирок (1), индикатор термоциклера (2), индикатор режима работы (3). Каждая секция изменением цветов отображает основные операции, производимые амплификатором.
На фиг. 2 изображена задняя сторона амплификатора с крышкой-слайдером (8), кнопкой питания (4), сетевым разъемом питания (5), разъемом USB для подключения к персональному компьютеру (6) и внешним вентиляционным каналом (7).
На фиг. 3 изображена нижняя сторона амплификатора, где находятся два вентиляционных отверстия для отсеков электроники (9), а также вентиляционный канал охладителя (10) и четыре ножки (11) для устойчивой установки на рабочую поверхность.
На фиг. 4 изображен диск для пробирок (12), куда установлены две ручки диска (14) для удобства его извлечения и установки. Диск для пробирок (12) оснащен 40 лунками для пробирок на 200 мкл (16) и съемными сегментами для установки пробирок (15), которые обладают системой быстрой замены, чтобы обеспечить удобную работу с пробирками разного размера. В центре амплификатора расположен отсек для электроники диска (13). Диск (12) во время работы вращается со скоростью 6.66 оборотов в секунду, а пробирки движутся со скоростью ~3 метра в секунду относительно нагреваемого или охлаждаемого воздуха за счет чего устанавливается высокая однородность температур между пробирками. Диск для пробирок (12) в извлеченном состоянии изображен на фиг. 5.
На фиг. 6 изображен внутренний отсек амплификатора под крышкой с извлеченным диском для пробирок (12), где виден внутренний вентиляционный канал (17). Во внутреннем отсеке амплификатора находится крепление волноводов оптического детектора (18) с двумя волноводами. Первый волновод цифрового оптического детектора (19) используется для передачи света от пробирок к сенсору детектора, а второй волновод (20) используется для передачи света от светодиодов к пробиркам. С четырех противоположных сторон от отсека электроники (13) располагаются датчики температуры жидкости в пробирке (21) и датчики температуры воздуха (22).
На фиг. 7 изображен оптический детектор в виде чипа с внутренними светофильтрами. Оптический детектор обладает десятью оптическими каналами. Диаметр поглощающего свет отверстия составляет 900 микрометров, к которому напрямую подсоединен волновод оптического детектора (19). За счет установки световых фильтров внутри чипа отсутствует необходимость в малонадежных и дорогостоящих подвижных деталях.
На фиг. 8 изображены цифровые датчики температуры внутри пробирок (21), а на фиг. 9 изображены цифровые датчики температуры воздуха (22). Датчики обладают разрешением 0.0078°C и продублированы в целях безопасности и улучшения точности. Таким образом, два датчика измеряют температуру в воздушном потоке, а два датчика измеряют температуру в пробирках. Скорость измерения температуры составляет 64 раза за 1 секунду. Пробирки с датчиками температуры (фиг. 8) заполняются кремнийорганической термопастой, которая копирует физические характеристики жидкого ПЦР-микса. Датчики получают электропитание с использованием индуктивной передачи, аналогично беспроводным зарядкам для мобильных телефонов. Данные с датчиков (фиг. 8, фиг. 9) передаются по радиоканалу в основной процессор устройства. Используемые температурные датчики (фиг. 8, фиг. 9) имеют высочайшую точность измерений, а также сертифицированы по медицинским стандартам ASTM E1112 и ISO 80601.
На фиг. 10 изображено сечение 3D-модели устройства. Помимо описанных ранее элементов также изображены система беспроводного питания диска (28), спираль нагревателя устройства (27), электромеханический замок крышки-слайдера (23), бесколлекторный мотор охладителя (24), крыльчатка охладителя (25) и мотор ротора (26). 3D-модель из системы автоматизированного проектирования в разрезе отображает максимально упрощенную и компактную вертикальную компоновку устройства. За счет простоты конструкции и уменьшения количества компонентов значительно снижается себестоимость и габариты устройства, а также улучшается его надежность и минимизируются производственные дефекты.
На фиг. 11 изображены графики работы предиктивного программного регулятора температуры. Синими линиями показана температура воздуха, зелеными линиями показана температура жидкости в пробирках. Верхний график изображает стандартный температурный цикл для ПЦР-анализа (60°С → 95°С → 60°С → 72°С → 95°С → 60°С). На верхнем графике отсутствуют проскоки температуры более чем на 1°С и на 1 секунду по времени в температуре жидкости внутри пробирок. Также отображена адаптивность регулятора к изменяющимся условиям работы, которая выражается в различии между графиками температуры воздуха при нагревании с сохранением формы графиков температуры жидкости в пробирках. Нижний график изображает процесс поддержания температуры на уровне 90°С. На нижнем графике отображена работа терморегулятора на высокой частоте, где температура пробирок остается в пределах допустимого отклонения в 0,1°С, а температура воздуха постепенно снижается за счет прогрева устройства.
На фиг. 12 изображены потоки воздуха внутри устройства. Цвет на линиях отображает скорость потоков воздуха, где желтый соответствует 7 м/c, а синий - 1 м/c. Фиг. 12 отображает одноконтурную проточную систему термоциклирования без клапанов, где воздух всегда забирается из внешней среды и выходит наружу через внешний вентиляционный канал в виде уступа, выполняющего роль аэродинамического тормоза. Также отображено закручивание воздушного потока крыльчаткой охладителя против направления движения диска с пробирками, что существенно улучшает теплообмен за счет увеличения скорости соударения молекул воздуха и пластика.