Препарат для очистки почв и водных объектов от нефти и нефтепродуктов
PREPARATION FOR SOILS AND WATER BODIES PURIFICATION FROM OIL PRODUCTS

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно технологии производства препаратов, предназначенных для очистки почв и воды от нефтезагрязнений.
Известен биопрепарат «Путидойл» (см. SU №1076446, МПК C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20 C02F 3/34, C02F 101:32, C12N 1/20, C12R 1:40, опубл. 28.02.1984), используемый для очистки почвы от нефтяных загрязнений. Биопрепарат создан на основе монокультуры бактерий Pseudomonas putida 36 (см. Дядечко В.Н., Толстокорова Л.Е., Гашев С.Н. и др. О биологической рекультивации нефтезагрязненных песочных почв Среднего Приобья // Почвоведение. - 1990, №9. - С. 148-151).
3
Недостатком препарата является сложная технология его приготовления, которая предусматривает распылительную сушку живой культуры бактерий, что вызывает травмирование бактерий и, как следствие, их гибель или потерю необходимой активности, вследствие инактивации клеток под действием высоких температур (+60°С). Для восстановления жизнедеятельности бактерий авторы применяют сложный комплекс мер: подогрев большого количества воды (5 м) до +18…+28°С, перемешивание, аэрирование, и все это в течение длительного времени (16-24 ч), что в полевых условиях выполнить довольно сложно.
Известен способ очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, в котором в качестве биопрепарата используют консорциум нефтеокисляющих микроорганизмов Pseudomonas putida ПИ Ко-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus sp. ПИ Ky-1, Burkholderia caryophylli Jap-3, Serratia odorifera Jap-1 при весовом соотношении 3-12 масс. % каждого микроорганизма (см. RU №2191643, МПК В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1:01, опубл. 27.10.2002).
2
Недостатком известного способа является то, что совместно с суспензией биопрепарата в загрязненную среду вводят ризоторфин (землеудобрительный препарат азотфиксирующих микроорганизмов), в количестве 30-120 г/м, что усложняет процесс обработки нефтезагрязненного субстрата.
Известен способ очистки почвы с использованием биопрепарата «Деворойл», содержащего консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов Rhodococcus maris, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas stutzeri, Yarrowia lipolytica. Этот способ предусматривает при хранении суспензии микроорганизмов использование NaCl, биологически активных веществ (витамины) и осмопротекторов (бетаин) (см. RU №2114071, МПК C02F 3/34, В09С 1/10, C12N 1/20, C12N 1/26, C12Q 1/02, опубл. 27.06.1998).
Недостатком способа является то, что, несмотря на добавление к бактериальной суспензии защитных веществ численность микроорганизмов снижается независимо от температуры хранения.
9
Известен бактериальный препарат, состоящий из высокоактивных живых аэробных нефтеокисляющих бактерий {Mycobacterium, Pseudomonas и др.), выращенных на твердых субстратах-носителях с титрами 2,5-7,0⋅10 кл./г. В качестве субстрата-носителя для иммобилизации микроорганизмов используют гамма-стерильный торф с рН 6,8-7,0 в количестве 40-45 масс. % и воду в количестве 58,95-53,25 масс. %. С целью поддержания нефтеокисляющей активности в процессе хранения в препарат дополнительно вводят питательные субстраты: аммоний щавелевокислый (0,05-1,0 масс. %) и нормальные парафины (1,0-1,5 масс. %). Срок годности биопрепарата - 6 месяцев при температуре 10-15°С с момента его изготовления (см. RU №2053205, МПК C02F 3/34, C09K З/32, В09С 1/10, В09С 101:00, опубл. 27.01.1996).
Биопрепарат содержит нефтеокисляющие бактерии, для поддержания жизнедеятельности которых требуется рН среды 6.8-7.0 и большое  количество воды (около 60% воды), что снижает его эффективность во времени.
3
Известен способ очистки почв и грунтов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с использованием олеофильного биопрепарата на основе ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов - Rhodococcus erythropolis ИЭГМ 708 и Rhodococcus ruber ИЭГМ 327 и биосурфактанта-Rhodococcus, отличающийся тем, что производят первоначальную обработку сильнозагрязненной почвы/грунта до достижения уровня остаточных нефтепродуктов 5-10 вес. % и последующее добавление органического разрыхлителя, олеофильный биопрепарат вносят в количестве не менее 10 л на 0,5-1,0 м почвы/грунта по меньшей мере один раз в неделю в течение первого месяца и в дальнейшем по меньшей мере один раз в месяц до окончания цикла биоремедиации в сочетании с периодическим рыхлением и увлажнением и дополнительно производят фиторемедиацию - засев многолетними травами (см. RU №2193464, МПК В09С 1/10, C12N 1/26, C12N 1/26, C12R 1:01, опубл. 27.11.2002).
Однако вышеописанный способ предполагает использование твердо-жидкофазного биореактора и/или аэрируемых почвенных площадок в качестве первоначальной обработки сильнозагрязненной почвы. Такой метод снижения уровня загрязнения трудоемок и предполагает нарушение плодородного слоя почвы (гумусированной части почвенного профиля), что не применимо при авариях и разливах нефти и нефтепродуктов в условиях Крайнего Севера (в том числе, в зоне тундры). Поскольку обязательным условием очистки и восстановления нефтезагрязненных мерзлотных почв является сохранение плодородного слоя почвы. Это объясняется тем, что на месте снятия почвенного покрова в мерзлотных условиях возможно образование термокарстовой оттайки с образованием воронок, провалов или аласов, что в свою очередь приводит к развитию термоэрозии и наносит большой ущерб ранимой и трудно восстанавливаемой почвенной экосистеме Крайнего Севера.
Известен биопрепарат (в жидкой и сухой формах) для очистки объектов окружающей среды от углеводородного загрязнения, представляющий собой консорциум микроорганизмов, состоящий из штаммов бактерий: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371, взятых в равных соотношениях (см. RU №2535978, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/01, опубл. 20.12.2014). Биопрепарат применяется в жидкой форме или в форме иммобилизованной клеточной биомассы. Для получения иммобилизованной формы биопрепарата проводится глубинное культивирование консорциума на питательной среде с получением биомассы и дальнейшей иммобилизацией биомассы клеток на органическом или минеральном носителях (в т.ч. на вермикулите). Биопрепарат обладает высокой эффективностью к утилизации углеводородных загрязнений.
В изобретении отсутствует информация о технологии получения сухой формы биопрепарата, параметров и условий приготовления и его применения.
Недостатком жидкой формы биопрепарата является слишком короткий срок годности (до 60 суток), что делает его экономически не выгодным.
Еще одним недостатком является то, что при культивировании посевного материала для приготовления, как жидкой, так и сухой формы биопрепарата не предусмотрено внесение в питательную среду нефти, что обеспечило бы в рабочей суспензии высокую концентрацию микроорганизмов с активированными ферментными системами биодеградации. Кроме того, штаммы бактерий в составе: Rhodococcus qingshengii БАК-ПАУ-1 ВКПМ АС-1946, Pusillimonas ginsegisoli БАК-ПАУ-2 ВКПМ В-11370, Shinella granuli БАК-ПАУ-3 ВКПМ В-11371, составляющие основу биопрепарата, не способны развиваться в условиях широкого диапазона температур (от +5 до +40 градусов С), что делает биопрепарат мало перспективным для применения в различных природно-климатических условиях.
4
Наиболее близкими аналогом к изобретению является «Способ получения биопрепарата для очистки морской воды от нефти», включающий вспученный вермикулит, на который предварительно проведена иммобилизация биомассы штамма Phyllobacterium myrsinacearum ВКПМ В-9079, культивированного на среде с пептоном, сахарозой, источником фосфора, калия, магния, последующее культивирование данного штамма на среде с кукурузным экстрактом сахарозой, источником фосфора, калия, магния, разведение полученного концентрата стерильной дистиллированной водой, в которую добавляют (г/л): концентрат бактериальной суспензии - 100,0; мелассу - 20,0; K2HPO4 - 1,5; KH2PO4 - 1,5; MgSO - 1,5, и выдерживание в течение 3-5 дней при 20-25°С (см. RU №2404138, МПК C02F 3/34, C12N 1/26, опубл. 20.11.2010).
Отличием заявленного изобретения от раскрытого источника (см. RU №2404138, МПК C02F 3/34, C12N 1/26, опубл. 20.11.2010) является использование штамма бактерий Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, составляющего основу биопрепарата, включающего более сложную технологию и состав питательной среды для культивирования штамма, чем таковые в заявленном изобретении, что усложняет и делает более дорогой технологию получения аналога биопрепарата. А также то, что аналог биопрепарата предусматривает только очистку морской воды и не позволяет оценить деструктирующую способность биопрепарата по отношению к почве. Кроме того, штамм бактерий Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 растет при температуре от 22 до 30°С, оптимум 28°С, и не способен развиваться при пониженных положительных температурах (+5°С), что делает его неперспективным для проведения нефтеочистки почвы в районах с коротким тепловым периодом, что также может быть подтверждено другим патентом на штамм Phyllobacterium myrsinacearum, используемый для деструкции нефтяных углеводородов солоноватоводных экосистем, где подтверждается, что культивирование штамма проводят при температуре от 22 до 30°С, оптимум 28°С (см. RU №2268934, C12N 1/20, C02F 3/34, опубл. 27.01.2006).
Отличием заявленного изобретения от раскрытых источников (см. RU №2404138, МПК C02F 3/34, C12N 1/26, опубл. 20.11.2010; RU №2535978, МПК C12N 1/20, C02F 3/34, В09С 1/10, C12R 1/01, опубл. 20.12.2014) является то, что заявленный препарат включает в качестве субстрат-носителя вермикулит месторождения Инагли, вспученный по ГОСТ 12865-67 «Вермикулит вспученный».
Задачей изобретения является расширение номенклатуры препаратов, включающих несложную и недорогую технологию их получения и эффективных не только для очистки воды, а также и для очистки почв от нефтезагрязнений, содержащих в качестве биодеструкторов нефтезагрязнений углеводородокисляющие микроорганизмы, способные развиваться и деструктировать нефть и нефтепродукты в условиях широкого диапазона температур (от +5 до +40°С), что позволит применять препарат для очистки почв и воды в различных природно-климатических условиях.
Технический эффект, получаемый при решении поставленной задачи, выражается в создании препарата для очистки почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов, включающий твердый субстрат-носитель и иммобилизованную на его поверхность биомассу углеводородокисляющих бактерий. Заявленный препарат может содержать остатки питательной среды, используемой для культивирования бактерий.
9
3
Для решения поставленной задачи препарат для очистки почв и водной среды от нефти и нефтепродуктов включает твердый субстрат-носитель и иммобилизованную на его поверхность биомассу углеводородокисляющих бактерий Bacillus subtilis СНБС-1 в концентрации 1⋅10 клеток/см, культивируемых в минеральной питательной среде.
3
4
2
2
4
2
4
При этом, в качестве твердого субстрата-носителя служит вермикулит месторождения Инагли, вспученный по ГОСТ 12865-67 «Вермикулит  вспученный», а в качестве минеральной среды для культивирования бактерий служит смесь питательных компонентов (масс. %): KNO - 0,4; MgSO⋅7НО - 0,08; NaCl - 0,1; K HPO - 0,14; KH PO - 0,06; нефть - 1,5.
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».
Признаки отличительной части формулы изобретения обеспечивают решение следующих функциональных задач.
Отличительными признаками предлагаемого препарата от аналога являются: использование вермикулита месторождения Инагли, вспученного по ГОСТ 12865-67 - «Вермикулит вспученный», в качестве субстрата-носителя для бактерий и клеток штамма бактерий Bacillus subtilis СНБС-1 в качестве биодеструктора нефтезагрязнений, способного развиваться и деструктировать нефть и нефтепродукты в почве и в воде, в условиях широкого диапазона температур (от +5 до +40°С). Полученный препарат позволяет в сравнительно короткий срок, произвести эффективную очистку почв и воды от нефти и нефтепродуктов.
Штамм бактерий Bacillus subtilis СНБС-1 выделен 16 февраля 2015 года из мерзлых почвенных образцов, загрязненных соляркой, отобранных возле емкостей Момского РЭС ОАО «Сахаэнерго», Северо-Восток Якутии, Момский район, село Хонуу.
Штамм идентифицирован и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП «ГосНИИгенетика», 117545, Москва, 1-й Дорожный пр-д, 1 с присвоением коллекционного номера В-12239.
Первичный скрининг по базе данных GenBank и RDP-II показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам Bacteria; Firmicutes; Bacilli; Bacillales; Bacillaceae; Bacillus, причем гомология с некоторыми видами рода Bacillus составляет 99%.
При секвенировании вариабельных участков 16S rDNA получена следующая собранная нуклеотидная последовательность для исследуемого штамма:
Результаты обработки секвенсов при помощи компьютерной программы находящейся на сайте RDB II (Ribosomal Database Project II), предназначенной для определения родства микроорганизмов и построения филогенетических деревьев, представляются в графическом виде:
S000003473
0.986 0.940 1423 Bacillus subtilis (Т); DSM10; AJ276351
S000006847
0.986 0.942 1435 Bacillus mojavensis (Т); IFO15718; АВ021191
S000012241
0.988 0.992 1440 Bacillus vallismortis (T); DSM11031; AB021198
S000014133
0.988 0.969 1426 Bacillus atrophaeus (T); JCM9070; AB021181
S000428475
0.988 0.935 1337 Bacillus subtilis (T); NRRL B-23049; AF074970
S000734915
0.986 0.960 1389 Bacillus amyloliquefaciens (T); NBRC 15535; AB255669
S001239910
0.980 0.903 1355 Bacillus methylotrophicus (T); CBMB205; EU194897
S001576866
0.981 0.965 1433 Bacillus siamensis (T); PD-A10; GQ281299
S002234727
0.984 0.926 1374 Bacillus tequilensis (T); 10b; HQ223107
S002287710
0.980 0.887 1469 Bacillus licheniformis (T); ATCC 14580; DSM 13; CP000002
S004067890
0.986 0.976 1453 Bacillus amyloliquefaciens (T); DSM7; FN597644
По данным анализа RDP II 16S рРНК было построено филогенетическое дерево с гомологичными штаммами Bacillus subtilis СНБС-1 (см. фигуру).
По результатам проведенного анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК (99%), а также ПЦР анализа с использованием видоспецифических праймеров тестируемый штамм отнесен к виду Bacillus subtilis.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Грамположительные споровые палочки, расположенные беспорядочными скоплениями.
Культуральные признаки.
На мясопептонном агаре (МПА) (масс. %): ферментативный пептон - 1,0; натрий хлористый - 0,5; агар - 1,0; вода мясная - остальное, рН 7,0-7,2, формирует желтые округлой формы колонии, диаметром до 5 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.
На питательном агаре на основе гидролизата рыбной муки (масс. %): гидролизат рыбной муки - 1,2; пептон ферментативный - 1,2; натрий хлористый - 0,6; агар - 1,0; вода дистиллированная остальное; рН 7,1-7,5, формирует желтые округлой формы колонии, диаметром до 1-3 мм.
Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности агара, легко размазываются.
На среде Сабуро (масс. %): гидролизат рыбной муки - 1,0; панкреатический гидролизат казеина - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,2; натрия фосфат однозамещенный - 0,2; D-глюкоза - 4,0; агар - 1,0; вода дистиллированная - остальное; рН 6,0±3, формирует непрозрачные желтоватые колонии, диаметром 1-5 мм. Консистенция мягкая, легко снимаются с поверхности среды, легко размазываются.
В мясопептонном бульоне (масс. %): ферментативный пептон - 1,0, натрий хлористый - 0,5, вода мясная - остальное; рН 7,0-7,2, образуют муть и пленку на поверхности бульона.
3
4
2
2
4
2
4
На минеральной среде Мюнца (см. Керстен Д.К. Морфологические и культуральные свойства индикаторных микроорганизмов нефтегазовой съемки - Микробиология, 1963, №5 - С. 1024-1030) с нефтью и нефтепродуктами (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат, бензин) следующего состава (масс. %): KNO - 0,4; MgSO⋅7HO - 0,08; NaCl - 0,1; K HPO - 0,14; KH PO - 0,06; агар - 2,0; нефть или нефтепродукты - 1,0-1,5; вода дистиллированная - остальное, рН - 7,2, растет в виде серовато-желтых выпуклых колоний диаметром 1 мм.
Физиолого-биохимические признаки.
Штамм аэроб, растет при температуре от +5 до +40°С, более интенсивно растет +16+37°С. Растет при рН 5,5-9,0. Оптимум рН 6,0-8,0. Растет в солевом бульоне с добавлением 0,1-2,0% NaCl.
Используемые источники углерода: сорбит.
Проверенные неиспользуемые источники углерода: лактоза, глюкоза, цитрат натрия, малонат натрия. Штамм индол-отрицателен. Реакция Фогес-Проскауэра отрицательная. Фенилаланиндезоксаминаза отрицательная. Не ферментирует бета-галактозидазу. Утилизирует инозит. Продукт, синтезируемый штаммом: поверхностно-активные вещества, способные  деструктировать нефть. Использует в качестве источника энергии углеводороды нефти и нефтепродуктов.
Штамм не токсичен по отношению к высшим растениям. Биотестирование проведено на семенах овса обыкновенного и редьки масличной.
Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 10-14 дней) на скошенном мясопептонном агаре или храниться в лиофилизированном состоянии в ампулах при температуре +4°С.
Характеристика субстрата-носителя.
По мнению многих авторов, для иммобилизации УОБ предпочтительны естественные минеральные материалы. При этом, сорбент-носитель, используемый для иммобилизации клеток углеводородокисляющих бактерий (УОБ), должен обладать следующими основными свойствами: проницаемостью, нефтеемкостью, неслеживаемостью, пористостью и сыпучестью.
Наиболее полно этим требованиям отвечает вермикулит месторождения Инагли, вспученный по ГОСТ 12865-67 «Вермикулит вспученный».
3
Вермикулит - это природно-гидратированная слюда. Представляет собой слоистые плиты золотисто-желтого или бурого цвета с объемной массой 100-200 кг/м.
Гидратация первичного флогопита начинается с глубины 100-115 м и завершается образованием вермикулита. Минералы наилучшего технологического качества развиты на поверхностях. Мировая добыча вермикулита составляет около 500-600 тысяч тонн в год, в том числе в России - около 35-40 тысяч тонн (см. Зедгенизов В.Г. Эффективность использования многомодульных модификаций электрических печей для обжига вермикулита / В.Г. Зедгенизов, А.И. Нижегородов // Строительные материалы, 2009. - №12. С. 51-53.; Островский Г.М. Пневматический транспорт сыпучих материалов в химической промышленности / Г.М. Островский Д.: Химия, 1984. - 104 с.; Рыбьев И.А. Строительное материаловедение: учеб. пособие для строительных специальностей вузов. / И.А. Рыбьев. М.: Высш. шк., 2003. - 701 с.).
В России наиболее известными месторождениями вермикулитовых руд являются: Ковдорское (Мурманская область), Татарское (Красноярский край), Кокшаровское (Приморский край), Булдымское и Потанинское (Челябинская обл.), Улунтуйское и Слюдянинское (Иркутская обл.), Инаглинское (Республика Саха (Якутия)) и др. Однако, из-за слабой оснащенности спецоборудованием производство вермикулита и материалов на его основе в России только начинает развиваться и носит пока ограниченный характер (см. Нижегородов А.И. Вермикулит и вермикулитовые технологии: исследования, производство, применение / А.И. Нижегородов Иркутск: Изд-во БизнесСтрой, - 2008. - 96 с.).
Вспученный вермикулит имеет многофункциональное значение и применяется в строительной индустрии, в качестве плиточного утеплителя, тепло-звукоизоляционного материала, пористого наполнителя для легких бетонов и штукатурных растворов, для фильтрационной очистки стоков электростанций и предприятий; в сельском хозяйстве - в качестве мелиоранта при рекультивации земельных участков и т.д.
В качестве сорбента-носителя в заявленном препарате для очистки почв и водных объектов от нефти и нефтепродуктов для иммобилизации УОБ используют вермикулит месторождения Инагли.
Вермикулит месторождения Инагли (Алданский район, Южная Якутия) связан с корой выветривания хромдиопсид-слюдяных метасоматитов, образовавшихся по дунитам Инаглинского плутона (см. Корчагин A.M. Инаглинский плутон и его полезные ископаемые. - М., Недра, 1996. - 160 с.).
Химический состав вермикулита месторождения Инагли представлен в таблице 1.
Нефтеемкость вспученного вермикулита месторождения Инагли к нефти и нефтепродуктам представлена в таблице 2 (см. Кондратьева Н.И., Габышева Р.И., Новгородов П.Г. Вермикулиты месторождения Инагли (Якутия) для очистки водной поверхности и почвы от нефтезагрязнений // Материалы I-й международной конференции: Значение промышленных минералов в мировой экономике: месторождения, технология, экономические оценки - Москва, 31 января - 3 февраля 2006 г. - М., ГЕОС, 2006. - С. 101).
Таким образом, вермикулит месторождения Инагли, вспученный по ГОСТ 12865-67 «Вермикулит вспученный», является перспективным сорбентом-носителем, используемым для иммобилизации клеток УОБ, так как обладает перечисленными выше основными свойствами, а именно: проницаемостью, нефтеемкостью, неслеживаемостью, пористостью и сыпучестью; сочетает в себе свойства носителя для микроорганизмов и сорбента для нефти, что обеспечивает высокую эффективность и пролонгированность реакций деструкции нефтяных углеводородов.
На основании выше изложенных результатов исследований был составлен препарат для очистки почв и воды от нефтезагрязнений.
Краткая характеристика препарата для очистки почв и водной среды от нефтезагрязнений.
Компонентами препарата являются: твердый субстрат-носитель, иммобилизованная на его поверхность биомасса нефтедеструкторов, отличающийся от аналогов тем, что:
9
3
- в качестве нефтедеструкторов содержит биомассу углеводородокисляющих бактерий (УОБ) Bacillus subtilis СНБС-1 в концентрации 1×10 кл./см, выделеных из мерзлых почвенных образцов, загрязненных соляркой, методом накопительных культур на среде Мюнца с нефтью с последующим пересевом на МПА;
2
2
2
3
2
3
2
- в качестве твердого субстрата-носителя содержит вермикулит месторождения Инагли, вспученный до фракции 0,6-20 мм с химическим  составом (%): SiO 33,28-36,53; TiO 0,58-0,64; AlO 6,21-13,00; FeO 6,21-6,43; FeO 0,28-0,28; MnO следы … 0,02; MgO 24,75-25,12; CaO 0,65-1,01; KO следы … 0,09.
В качестве примеси заявленный препарат может содержать остатки питательной среды, используемой при культивировании бактерий.
Применение препарата актуально в следующих направлениях:
- интродукция активно деградирующих нефть селектированных штаммов УОБ (в загрязненную экосистему) и управление данным процессом;
- стимуляция естественной углеводородокисляющей микрофлоры нефтезагрязненных субстратов, участвующей в биодеградации нефтяных загрязнений;
- оптимизация процессов биологической деградации нефтезагрязнений с целью достижения высокого эффекта в очистке и доочистке нефтезагрязненных субстратов.
Технология получения препарата для очистки почв от нефтезагрязнений включает следующие этапы:
1. Получение маточной культуры.
Для получения маточных культур используют агаровые культуры штамма Bacillus subtilis СНБС-1. Эта культура является посевным материалом, используемым для засева в ферментеры.
3
4
2
2
4
2
4
Для получения маточной культуры используют минеральную среду следующего состава (масс. %): KNO - 0,4; MgSO⋅7НО - 0,08; NaCl - 0,1; K НРО - 0,14; KH РО - 0,06; нефть - 1,0-1,5; вода дистиллированная - остальное; рН среды - 7,2. Объем посевного материала должен составлять 5-10% от объема питательной среды.
9
-3
3
Культуры изолята, выращенные на скошенном ГРМ-агаре промышленного производства, основой которого является гидролизат рыбной муки, либо мясопептонный агар (МПА) промышленного производства, смывают физиологическим раствором, готовят суспензию. Концентрация клеток в суспензии должна составлять 1×10 кл/см по  оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича; объем - не менее 25-50 см.
2. Культивирование посевного материала в колбах.
3
3
3
3
Питательную среду того же состава (см. п. 1) разливают по 150 см в колбы вместимостью 500 см, в среду засевают 15-25 см бактериальной суспензии штамма Bacillus subtilis СНБС-1, приготовленной методом смыва. Туда же вносят 1,5 см стерильной нефти. Посевы в колбах инкубируют в «УВМТ 12-250» в течение 72 часов при 180-200 об/мин., при температуре от +5 до +29±1°С.
3. Получение посевного материала для иммобилизации.
Выращивание штамма Bacillus subtilis СНБС-1, составляющего основу препарата, проводят на той же среде; в качестве единственного источника углерода используют стерильную сырую нефть, концентрация углеводородсодержащих продуктов в ферментационной жидкости составляет 1,0-1,5% (по объему). Процесс ферментации осуществляют при интенсивном перемешивании при температуре +29±1°С в течение 36-48 часов.
По окончании процесса культивирования наработанную жидкость сливают в стерильные емкости и используют для иммобилизации сорбента-носителя (вермикулита вспученного, приготовленного по ГОСТ 12865-67).
4. Иммобилизация штамма Bacillus subtilis СНБС-1 на сорбент-носитель.
Жидкость, наработанную в процессе культивирования штамма Bacillus subtilis СНБС-1 (см. п. 3), смешивают в аппарате с мешалкой с сорбентом-носителем (вермикулитом вспученным) фракции 0,6-20 мм, в соотношении 1:1. После пропитки вермикулита вспученного посевным материалом его высушивают контактным способом при температуре 37°С или при комнатной температуре в течение 2-х суток до влажности не более 3% (табл. 3). Биопрепарат готов к использованию. Сухой биопрепарат помещают в кеги или двухслойные полиэтиленовые мешки и запаивают.
Параметры и характеристики биопрепарата должны соответствовать значениям таблицы 3.
5. Указания по применению препарата.
5.1. Применение препарата для очистки почв от нефтезагрязнений.
При использовании препарата необходимо учитывать содержание микроэлементов в почве (местный геохимический фон) согласно нормативам (см. ГН 2.1.7.2041 Предельно допустимые концентрации (ПДК) химических веществ в почве).
Препарат вносят в почву без предварительной подготовки (в том виде, в котором он поступил на объект) с помощью:
- специальной техники (сеялки, навозоразбрасыватели, машины для внесения удобрений и др.) при больших объемах работ;
- вручную при небольших площадях нефтезагрязнений.
Нормы расхода препарата представлены в таблице 4.
Препарат рекомендуется вносить при среднесуточных температурах почвы +5+40°С. Допустимый уровень кислотности рН 4,5-9,0. Влажность почвы в пределах 40-60%. Рекомендуемый временной интервал между внесениями биопрепарата в почву - 30-45 суток.
Через 30-45 суток проводится повторный отбор почвенных проб на содержание остаточного количества нефти и нефтепродуктов. Данный анализ позволит определить необходимость проведения повторной обработки.
Качество очистки почв от нефтезагрязнений контролируется гравиметрическим методом (см. РД 39-0177098-015-90 «Инструкция по контролю за состоянием почв на объектах предприятий Миннефтепрома»).
5.2. Применение препарата для очистки воды от нефтезагрязнений.
Препарат вносят в водные объекты без предварительной подготовки (в том виде, в котором он поступил на объект) с помощью:
- специальной техники (сеялки, навозоразбрасыватели, машины для внесения удобрений и др.) при больших объемах работ;
2
- вручную при небольших площадях нефтезагрязнений, из расчета 1-2 л препарата на 1 м водной поверхности.
Препарат рекомендуется вносить при среднесуточных температурах воды выше +5+40°С. Допустимый уровень кислотности рН 4,5-9,0. Рекомендуемый временной интервал между внесениями биопрепарата - 30-45 суток.
Через 30-45 суток проводится повторный отбор проб воды на содержание остаточного количества нефти и нефтепродуктов. Данный анализ позволит определить необходимость проведения повторной обработки.
Качество очистки воды от нефтезагрязнений контролируется ИК-фотометрическим методом (см. ФР.1.31.2010.07127 МВИ01.02.161 «Методика выполнения измерений массовой концентрации нефтепродуктов в питьевых, природных и сточных водах ИК-спектрометрическим методом с использованием концентратомера нефтепродуктов ИКН-025»; РД 52.24.476-2007 Массовая концентрация нефтепродуктов в водах. Методика выполнения измерений ИК-фотометрическим методом).
6. Утилизация.
Утилизация некондиционных отходов и отсевов сырья осуществляется в соответствии с указаниями СанПиН 2.1.7.1322-03, требованиями по защите окружающей среды и действующего законодательства, а также органов местной власти (см. СанПиН 2.1.7.1322-03 Гигиенические требования к размещению и обезвреживанию отходов производства и потребления). По возможности следует избегать образования отходов или минимизировать их количество. Утилизация неотработанного препарата проводится по требованиям, предъявляемых к веществам 4 класса опасности.
7. Требования к условиям производства и техники безопасности.
Помещения для работы с микроорганизмами должны отвечать Санитарно-эпидемиологическим правилам (см. СП 1.3.2322-08 Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней).
К работам на оборудовании при работе с микроорганизмами и изготовлении сорбента-носителя должны допускаться лица, достигшие 18-летнего возраста, прошедшие обучение.
Все работающие должны проходить периодические медицинские осмотры в порядке, установленном органами здравоохранения (см. Приказ Минздравмедпрома России от 14.03.96 №90 «О порядке проведения предварительных и периодических медицинских осмотров работников и медицинских регламентах допуска к профессии»; Приказ Минздравсоцразвития России от 16.08.04 №83 «Об утверждении перечней вредных и (или) опасных производственных факторов и работ, при выполнении которых проводятся предварительные и периодические медицинские осмотры (обследования), и порядка проведения этих осмотров (обследований)» (с изменениями от 16 мая 2005 г.)).
Выполнение требований техники безопасности должно обеспечиваться соблюдением соответствующих утвержденных инструкций и правил по технике безопасности при осуществлении соответствующих работ.
8. Ускорение сроков восстановления (рекультивации почв).
Процесс самовосстановления нефтезагрязненных почвенных экосистем в регионах с благоприятными климатическими условиями занимает 10-25 лет, в то время, как деструкция нефти и ее производных в условиях Севера составляет минимум 50 лет (см. Оборин А.А., Калачникова И.Г., Масливец Т.А. и др. Биологическая рекультивация нефтезагрязненных земель в условиях таежной зоны // Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем: Сб. науч. Тр. М.: Наука, 1988. - С. 140-159).
Для ускоренной рекультивации нефтезагрязненных почв необходимо соблюдение следующих мероприятий:
1) нефтезагрязненные почвы необходимо смешать с чистым плодородным почвенным слоем или торфом;
2) по результатам агрохимических исследований (при необходимости) - внесение в расчетных дозах недостающих в почве минеральных компонентов в виде удобрений. Обычно в сельском хозяйстве для основного, предпосевного и местного внесения при посеве или для подкормки растений применяют азотно-фосфорно-калийные удобрения (нитроаммофорску, аммофоску или азофоску), Данные удобрения универсальны и используются на всех типах почв и под все сельскохозяйственные культуры. При основном внесении на черноземных и тяжелых глинистых почвах удобрения целесообразно вносить осенью, а на легких почвах - весной. Нормы внесения зависят от плодородия почвы и в среднем составляют 35-45 кг на гектар;
3) увеличение кратности обработки почв препаратом до 3-4 раз за 1 вегетационный сезон;
4) рыхление почвы не реже 1 раза в неделю;
5) поддержание оптимальной влажности и рН почвы;
6) посев многолетних нефтетолерантных трав (овсяница, пырей ползучий, пырейник сибирский, тимофеевка луговая, осот полевой, костер безостый, клевер луговой).
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1. Выделение и культивирование штамма Bacillus subtilis СНБС-1.
Штамм бактерий Bacillus subtilis СНБС-1 выделен из мерзлых почвенных образцов, загрязненных соляркой, методом накопительных культур на среде Мюнца с нефтью с последующим пересевом на МПА.
3
4
2
2
4
2
4
Для этого 1,0 г мерзлого грунта с вышеуказанного объекта вносили в 250 мл минеральной среды Мюнца следующего состава (масс. %): KNO - 0,4; MgSO⋅7HO - 0,08; NaCl - 0,1; K HPO - 0,14; KH PO - 0,06; нефть - 1,0-1,5; вода дистиллированная - остальное; рН - 7,2. На первом этапе инкубация проводилась в качалочных условиях при 200 об/мин и температуре +20±1°С. Рост бактерий наблюдали уже через 3 дня инкубации по образованию мутной эмульсии с и дезинтеграции слоя нефти.
Чистая культура бактерий Bacillus subtilis СНБС-1 была получена путем культивирования при выше перечисленных условиях и многократных пересевов (более 10) накопительной культуры на чашки Петри с мясо-пептонным агаром (МПА).
Далее посевы инкубировали в стационарных условиях при различных температурах от +5 до +40°С. Через 72 ч. на поверхности МПА наблюдали появление пастообразных блестящих колоний желтого цвета, диаметром до 5 мм, которые по культурально-морфологическим и биохимическим признакам, а также по результатам проведенного анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и ключевых фенотипических признаков согласно таксономическим описаниям, приведенным в Определителе Берги (см. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Book Review Int. J. of Syst. Bact.; July 1985, p. 408) идентифицированы, как штамм Bacillus subtilis.
Пример 2. Приготовление бактериальной суспензии из клеток штамма Bacillus subtilis СНБС-1.
9
3
Изолированные колонии, полученные по примеру 1, пересевали на скошенный МПА и инкубировали 48 часов при температуре +20±1°С. Выросшие на МПА культуры Bacillus subtilis СНБС-1 смывали 0,9% раствором NaCl; готовили исходную микробную суспензию бактериального изолята с титром 1×10 микробных клеток/см по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.
9
3
Для получения бактериальной суспензии готовили жидкую минеральную среду по примеру 1 и культивировали в колбах в качалочных условиях в течение 48 часов, при температуре 20±1°С, при 200 оборотах/мин. Полученную жидкую смесь клеток штамма Bacillus subtilis СНБС-1, с титром 1×10 клеток/см использовали для исследования нефтеокисляющей активности штамма.
Пример 3. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Bacillus subtilis СНБС-1.
3
9
3
Клетки штамма Bacillus subtilis СНБС-1 смывают 0,9% раствором NaCl со скошенного МПА. Готовят исходную микробную суспензию бактериального изолята, объемом 25 см, с концентрацией 1×10 микробных клеток/см по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.
Полученный бактериальный изолят штамма Bacillus subtilis СНБС-1 культивируют в водной среде с минеральным составом по примеру 1 в условиях постоянной аэрации.
3
3
9
3
В колбочки объемом 250,0 см вносят по 100,0 см готовой минеральной среды и 1000 мг нефти. Колбы засевают клетками штамма до концентрации 1⋅10 клеток/см. В качестве контроля ставят такую же колбу со средой, нефтью и без бактерий для определения общих (естественных) потерь. Опыт проводят в трех повторениях. Колбы культивируют при разных температурах (от +5°С до +40°С) в течение 3-5 суток.
Данные эксперимента показывают, что в водной среде с минеральными компонентами предлагаемый штамм уже на 3-е сутки при температуре +5°С утилизирует 4,8-5,4% - нефти и нефтепродуктов; при температуре +20°С - 57,2-57,8%; при температуре +30°С - 62,6-63,7%, при температуре +40°С - 52,2-52,8%; в зависимости от типа ксенобиотика (см. таблицу 5).
Пример 4. Получение препарата для очистки почв и водных объектов от нефти и нефтепродуктов.
3
9
-3
Для получения препарата для очистки почв и водных объектов от нефти и нефтепродуктов готовят посевной материал из штамма Bacillus subtilis СНБС-1. Для этого, штамм Bacillus subtilis СНБС-1, выращенный на скошенном ГРМ-агаре промышленного производства, основой которого является гидролизат рыбной муки, либо мясопептонном агаре (МПА) промышленного производства, смывают 0,9% физиологическим раствором (NaCl) или стерильной водой в необходимом объеме (но, не менее 25-50 см). Концентрация клеток штамма Bacillus subtilis СНБС-1 в посевном материале должна составлять 1×10 кл/см по оптическому стандарту ГИСК им. A.M. Тарасевича.
3
4
2
2
4
2
4
Полученный посевной материал, вносят в колбы с заранее подготовленной минеральной питательной средой, следующего состава (масс. %): KNO - 0,4; MgSO⋅7HO - 0,08; NaCl - 0,1; K HPO - 0,14; KH PO - 0,06; нефть - 1,0-1,5; вода дистиллированная - остальное; рН среды - 7,2. Объем посевного материала должен составлять 5-10% от объема питательной среды. Посевы в колбах инкубируют на установке «УВМТ 12-250» в течение 72 часов при 180-200 об/мин.
На следующем этапе, проводят ферментацию выращенного штамма Bacillus subtilis СНБС-1.
3
4
2
2
4
2
4
Для этого, в ферментер марки Ф-300В заливают необходимый объем чистой воды комнатной температуры, после чего в воду вносят минеральные элементы (масс. %, от объема воды): KNO - 0,4; MgSO⋅7НО - 0,08; NaCl - 0,1; K HPO - 0,14; KH PO - 0,06 и нефть - 1,0-1,5%.
Затем корректируется рН среды до уровня 7,2. Для этого отбирают пробу минеральной среды, измеряют рН и при необходимости вводят в емкость с минеральной средой по 10-20 мл, либо 10%-ного водного раствора кислоты (HCl), либо раствора щелочи (NaOH).
После этого, в минеральную среду вносят посевной материал, содержащий клетки штамма Bacillus subtilis СНБС-1, наработанный в установке «УВМТ 12-250» по вышеописанному способу, в объеме 10% от общего объема минеральной среды в ферментере. Закрывают крышку ферментера. Материал готов к ферментации. Процесс ферментации осуществляют при интенсивном перемешивании при температуре +29±1°С в течение 36-48 часов.
В процессе ферментации контролируют работу ферментера, заданные значения температуры, степень аэрации и пенообразования, состояние систем обеспечения.
По окончании работы ферментера наработанную жидкость, содержащую клетки Bacillus subtilis СНБС-1, сливают в стерильные емкости и используют для иммобилизации сорбента-носителя (заранее подготовленного вермикулита вспученного, по ГОСТ 12865-67). Процесс иммобилизации вермикулита полученной биомассой, осуществляют при комнатной температуре, в аппарате с мешалкой типа БС-180, при 29±1 об./мин., в течении 30 минут, в соотношении 1:1 (1 часть биомассы клеток Bacillus subtilis СНБС-1, наработанной в ферментере на 1 часть вспученного вермикулита). Например, для иммобилизации 1 л биомассы необходимо 1 л вспученного вермикулита; для иммобилизации 10 л биомассы нефтедеструкторов необходимо 10 л вспученного вермикулита; для иммобилизации 100 л биомассы необходимо 100 л вспученного вермикулита и т.д.). Полученную смесь оставляют при комнатной температуре на 24-48 часов для закрепления клеток Bacillus subtilis СНБС-1, на вермикулите. После чего полученный биопрепарат высушивают контактным способом при температуре 37°С или при комнатной температуре в течение 2-х суток до влажности 3%. Сухой биопрепарат помещают в кеги или двухслойные полиэтиленовые мешки и запаивают. Препарат готов к использованию.
Параметры и характеристики биопрепарата должны соответствовать значениям таблицы 3.
Пример 5. Очистка почвы от нефтезагрязнений с применением препарата.
Опыты с применением препарата проведены на супесчанной почве, загрязненной нефтью. Исходное содержание нефтепродуктов (НП) в почве до внесения препарата составило от 2780 до 2960 мг/кг. Эффективность применения препарата оценивали по степени деградации нефтезагрязнения в соответствии с инструкцией РД 39-0177098-015-90.
Для этого образцы почвы до и после обработки биопрепаратом подвергались экстракции в аппарате Сокслета четыреххлористым углеродом, после чего экстрагент удаляли перегонкой с дефлегматором, доводя остаток  до постоянного веса. Определение влажности образцов проводили общепринятым методом (см. ГОСТ 28268-89 «Почвы. Методы определения влажности, максимальной гигроскопической влажности»), после чего производили перерасчет содержания нефтепродуктов на сухую почву.
Установлено, что степень биодеградации нефти и нефтепродуктов в опытных образцах через 45 суток после однократной обработки почв полученным препаратом составила при температуре +5±1°С - 26,0-28,7%; при температуре +20±1°С - 69,1-70,0%; при температуре +30±1°С - 61,670,6-71,4%; при температуре +37±1°С - 70,8-71,2% при температуре +40±1°С - 57,8-62,6% (см. таблицу 6).
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об эффективности препарата для очистки почв от нефтезагрязнений.
Пример 6. Очистка воды от нефтезагрязнений с применением препарата.
3
3
3
3
3
Для опыта в эксикатор объемом 5,0 дм вносили 3,0 дм водопроводной воды отстоявшейся в течение суток и 0,03 л препарата. Для создания нефтяной пленки в емкости добавили 2880 мг/дм нефти и нефтепродуктов. В качестве контроля использовали воду в количестве 3,0 дм с добавлением 2880 мг/дм нефти и без внесения препарата.
Эксперимент проводили в течение 45 суток, поддерживая температуру воды в интервале +20±2°С. Полученные результаты показали, что деструкция нефти за 45 суток под действием препарата составила 54-59% (см. таблицу 7).
Таким образом, преимуществом препарата является то, что он благодаря совокупности уникальных свойств субстрата-носителя (вспученного вермикулита) и иммобилизованным на него бактерий Bacillus subtilis СНБС-1 обладает способностью стимулировать очистку почв и воды от нефти и нефтепродуктов.
Способ приготовления и использования предлагаемого препарата экономически выгоден, так как для своего осуществления не требует сложного технологического оборудования. А вермикулит, служащий в данном способе субстратом-носителем является одновременно и доступным, и дешевым сырьем, поскольку вермикулиты имеют поверхностное залегание и разрабатываются открытым способом. В России наиболее известными месторождениями вермикулитовых руд являются: Ковдорское (Мурманская область), Татарское (Красноярский край), Кокшаровское (Приморский край), Булдымское и Потанинское (Челябинская обл.), Улунтуйское и Слюдянинское (Иркутская обл.), Инаглинское (Республика Саха (Якутия)) и др.
Очистка почвы и воды от нефтезагрязнений, предлагаемым препаратом позволяет предотвратить распространение веществ-загрязнителей на сопряженные ландшафты и добиться устранения пятен загрязненного грунта, что значительно улучшает санитарно-экологическое состояние нарушенной территории.
Предлагаемый препарат для очистки почвы и воды от нефтезагрязнений является экологически безопасным, поскольку основой для его приготовления являются природные образования - минерал-вермикулит и не патогенный штамм бактерий Bacillus subtilis СНБС-1, обладающий эффективностью не только для очистки воды, но так же и для очистки почв от нефтезагрязнений, в условиях широкого диапазона температур (от +5 до +40 градусов, С; см. табл. 5-6), что позволяет применять препарат в различных природно-климатических условиях.