СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК И НАБОРЫ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ НИХ

1. Способ культивирования клеток-мишеней, который включает инкубацию композиции, содержащей клетки-мишени, в присутствии рецепторсвязывающего средства, где рецепторсвязывающее средство i) обратимо связывают с реактивом, содержащим множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с рецепторсвязывающим средством; и ii) специфически связывается с молекулой на поверхности клеток-мишеней, отличной от CD28, CD3 или CD40, таким образом, который индуцирует или модулирует сигнал в клетках-мишенях и/или изменяет функцию клеток-мишеней, тем самым создавая культивируемые клетки-мишени.
2. Способ по п. 1, в котором молекула не представляет собой CD137.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором сигнал не представляет собой ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором молекула представляет собой костимулирующую молекулу, вспомогательную молекулу, цитокиновый рецептор, хемокиновый рецептор, молекулу иммунной контрольной точки, молекулу адгезии, элемент семейства TNF или семейства рецепторов TNF и/или рецептор или корецептор Wnt.
5. Способ по любому из пп. 1, 3 и 4, в котором
молекулу выбирают из CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB), CD154 (CD40L), ICOS, LAT, CD27, OX40 и HVEM.
6. Способ по любому из пп. 1 и 3-5, в котором молекулу выбирают из CD90 (Thy-1), CD95 (Apo-/Fas), CD137 (4-1BB) и CD154 (CD40L).
7. Способ по любому из пп. 1-4, в котором молекула представляет собой цитокиновый рецептор, выбранный из IL-2R, IL-1R, IL-15R, IFN-γR, TNF-αR, IL-4R, IL-10R, IFNR I типа, IL-12R, IL-15R, IL-17R, TNFR1 и TNFR2.
8. Способ по любому из пп. 1-4 и 7, в котором
рецепторсвязывающее средство представляет собой IL-2, IL-1, IL-15, IFN-γ, TNF-α, IL-4, IL-10, IL-12, IL-15, IL-17 или TNF, или представляет собой его биологически активный фрагмент.
9. Способ по любому из пп. 1-4, 7 и 8, в котором молекула представляет собой цитокиновый рецептор, выбранный из IL-12R, IFN-γR, IL-4R и IL-17R.
10. Способ по любому из пп. 1-4 и 7-9, в котором рецепторсвязывающее средство представляет собой IL-2, IL-4, IL-7, IL-10, IL-15 или IL-17, или представляет собой его биологически активный фрагмент.
11. Способ по любому из пп. 1-4, в котором молекула представляет собой цитокиновый рецептор, выбранный из IL-7R, IL-21R и CD132 (общая γ цепь IL рецептора).
12. Способ по любому из пп. 7-11, в котором
рецепторсвязывающее средство представляет собой лиганд, который специфически связывается с цитокиновым рецептором.
13. Способ по любому из 1-4, 11 и 12, в котором рецепторсвязывающее средство представляет собойIL-7, IL-21, IL-2, IL-4, IL-9 и IL-15, или представляет собой его биологически активный фрагмент.
14. Способ по любому из пп. 1-4, в котором молекула представляет собой хемокиновый рецептор, выбранный из CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR9, CXCR1, CXCR3 и CXCR4.
15. Способ по любому из пп. 1-4, в котором
рецепторсвязывающее средство представляет собой лиганд, который специфически связывается с цитокиновым рецептором.
16. Способ по любому из пп. 1-4, 14 и 15, в котором рецепторсвязывающее средство представляет собой CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 и CCL25, или представляет собой его биологически активный фрагмент.
17. Способ по любому из пп. 1-4 и 14-16, в котором молекула представляет собой хемокиновый рецептор, выбранный из CXCR3, CCR7, CXCR1 и CXCR4.
18. Способ по любому из пп. 1-4 и 14-17, в котором рецепторсвязывающее средство представляет собой CXCL9, CXCL10, CCL19, CCL21 и CCL25, или представляет собой его биологически активный фрагмент.
19. Способ по любому из пп. 1-4, в котором молекулу адгезии выбирают из CD44, CD31, CD18/CD11a (LFA-1), CD29, CD54 (ICAM-1), CD62L (L-селектин) и CD29/CD49d (VLA-4) и CD106 (VCAM-1).
20. Способ по любому из пп. 1-4 и 19, в котором молекулу адгезии выбирают из LFA-1, L-селектина, VCAM-1 и VLA-4 или она представляет собой биологически активный фрагмент этого.
21. Способ по любому из пп. 1-4, в котором рецепторсвязывающее средство представляет собой фактор, который индуцирует продуцирование цитокинов, продуцирование хемокинов или экспрессию молекулы адгезии.
22. Способ по п. 21, в котором фактор представляет собой ядерный фактор.
23. Способ по п. 21 или 22, в котором фактор представляет собой связанный с рецептором ретиноевой кислоты сиротский рецептор γ (RORγ) или RORα.
24. Способ по любому из пп. 1-23, в котором рецепторсвязывающее средство представляет собой первое рецепторсвязывающее средство и молекула представляет собой первую молекулу, и инкубацию дополнительно осуществляют в присутствии второго рецепторсвязывающего средства, которое специфически связывается со второй молекулой на поверхности одной или нескольких клеток-мишеней.
25. Способ по п. 24, в котором:
второе рецепторсвязывающее средство обратимо связывают с реактивом, указанный реактив содержит множество сайтов связывания для первого рецепторсвязывающего средства и второго рецепторсвязывающего средства. или
первое рецепторсвязывающее средство обратимо связывают со вторым реактивом, содержащим множество сайтов связывания, способных к обратимому связыванию с первым рецепторсвязывающим средством.
26. Способ по п. 24 или 25, в котором сигнал представляет собой первый сигнал, и второе рецепторсвязывающее средство специфически связывается со второй молекулой таким образом, чтобы индуцировать второй сигнал в одной или более клеток-мишеней.
27. Способ по п. 26, в котором
второй сигнал представляет собой ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал.
28. Способ по любому из пп. 24-27, в котором вторая молекула являлась элемент комплекса TCR/CD3.
29. Способ по любому из пп. 24-28, в котором вторая молекула представляет собой CD3.
30. Способ по любому из пп. 26-29, в котором:
специфическое связывание первого рецепторсвязывающего средства с первой молекулой способно усиливать, ослаблять или модифицировать второй сигнал. доставляемый через первую молекулу; или
31. Способ по любому из пп. 24-30, в котором специфическое связывание первого рецепторсвязывающего средства с первой молекулой способно усиливать или потенцировать ассоциированный с комплексом TCR/CD3 сигнал.
32. Способ по любому из пп. 1-31, в котором клетки-мишени содержат клетки иммунной системы.
33. Способ по любому из пп. 1-32, в котором:
клетки-мишени содержат клетки крови;
клетки-мишени содержат лейкоциты;
клетки-мишени содержат лимфоциты;
клетки-мишени содержат B-клетки;
клетки-мишени содержат T-клетки; и/или
клетки-мишени содержат естественные киллерные (NK) клетки.
34. Способ по любому из пп. 1-33, в котором клетки-мишени содержат антиген-специфические T-клетки или их популяцию, T-хелперные клетки или их популяцию, цитотоксические T-клетки или их популяцию, T-клетки памяти или их популяцию, регуляторные T-клетки или их популяцию, NK клетки или их популяцию, антиген-специфические B-клетки или их популяцию, B-клетки памяти или их популяцию или регуляторные B-клетки или их популяцию.
35. Способ по любому из пп. 1-34, в котором клетки-мишени представляют собой T-клетки.
36. Способ по любому из пп. 1-35, в котором T-клетки представляют собой не фракционированные T-клетки, представляют собой обогащенные или выделенные CD3+ T-клетки, представляют собой обогащенные или выделенные CD4+ T-клетки или представляют собой обогащенные или выделенные CD8+ T-клетки.
37. Способ по любому из пп. 1-36, в котором перед инкубацией T-клетки не обогащают по наивным T-клеткам.
38. Способ по любому из пп. 1-37, в котором клетки-мишени представляют собой эмбриональные клетки от субъекта.
39. Способ по любому из пп. 1-38, в котором клетки-мишени представляют собой клетки человека.
40. Способ по любому из пп. 1-39, в котором по меньшей мере часть инкубации осуществляют в присутствии дополнительного средства, которое способно доставлять сигнал в T-клетки.
41. Способ п. 40, в котором дополнительное средство способно усиливать или индуцировать пролиферацию T-клеток.
42. Способ по п. 40 или 41, в котором дополнительное средство представляет собой цитокин, выбранный из IL-2, IL-15 и IL-7.
43. Способ по любому из пп. 40-42, в котором дополнительное средство не связывается специфически с CD28 и/или индуцирует передачу сигнала CD28.
44. Способ по любому из пп. 1-43, в котором реактив не связывают с основой во время указанной инкубации.
45. Способ по любому из пп. 1-44, в котором реактив присутствует в растворимой форме.
46. Способ по любому из пп. 1-43, в котором реактив связывают с основой во время по меньшей мере части инкубации, в соответствии с чем множество клеток-мишеней обратимо иммобилизуют на основе во время по меньшей мере части инкубации.
47. Способ по п. 46, в котором основа содержит твердый носитель.
48. Способ по п. 46 или 47, в котором основа содержит стационарную фазу.
49. Способ по любому из пп. 1-48, в котором рецепторсвязывающее средство содержит антитело, фрагмент антитела, белковую связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, молекулу, содержащую домены Ig, цитокин, хемокин, аптамер, молекулу MHC и связывающих фрагменты любого из них.
50. Способ по любому из пп. 1-49, в котором
2
рецепторсвязывающее средство содержит двухвалентный фрагмент антитела, выбранный из F(ab')-фрагмента и двухвалентного одноцепочечного Fv (scFv) фрагмента.
51. Способ по любому из пп. 1-49, в котором рецепторсвязывающее средство представляет собой одновалентный фрагмент антитела, выбранный из Fab-фрагмента, Fv-фрагмента и scFv-фрагмента.
52. Способ по любому из пп. 1-49, в котором рецепторсвязывающее средство содержит белковую связывающую молекулу с антителоподобными связывающими свойствами, выбранную из аптамеров, мутеинов, основанных на полипептиде семейства липокалина, глутел, белков, основанных на анкириновом каркасе, белков, основанных на кристаллиновом каркасе, аднектинов и авимеров.
53. Способ по любому из пп. 1-52, в котором реактив содержит стрептавидин; авидин; мутеин стрептавидина, который обратимо связывает биотин, аналог биотина или стрептавидинсвязывающий пептид; аналог авидина, который обратимо связывает биотин, аналог биотина или стрептавидинсвязывающий пептид; реактив, который содержит по меньшей мере две хелатирующие группы, где по меньшей мере две хелатирующие группы способны к связыванию с ионом переходного металла; средство, способное к связыванию с олигогистидиновой аффинной меткой; средство, способное к связыванию с глутатион-S-трансферазой; кальмодулин или его аналог; средство, способное к связыванию с кальмодулинсвязывающим пептидом (CBP); средство, способное к связыванию с FLAG-пептидом; средство, способное к связыванию с HA-меткой; средство, способное к связыванию с мальтозасвязывающим белком (MBP); средство, способное к связыванию с эпитопом HSV; средство, способное к связыванию с эпитопом myc; или средство, способное к связыванию с биотинилированным белком-переносчиком.
54. Способ по п. 53, в котором реактив содержит олигомер или полимер стрептавидина, авидина, аналога или мутеина стрептавидина или аналога авидина.
55. Способ по п. 54, в котором индивидуальные молекулы олигомера или полимера сшивают с помощью полисахарида или бифункционального линкера.
56. Способ по любому из пп. 53-55, в котором стрептавидинсвязывающий пептид  представлен в любой из SEQ ID NO: 7, 8 и 15-19.
44
45
46
47
44
45
46
47
57. Способ по любому из пп. 53-56, в котором мутеин стрептавидина содержит аминокислотную последовательность Va1-Thr-Ala-Arg или lle-Gly-Ala-Arg в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 1.
58. Способ по п. 57, в котором мутеин стрептавидина дополнительно содержит замену или замены аминокислот в положении, соответствующем 117, 120 и/или 121 относительно положений в стрептавидине в последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 1.
59. Способ по п. 58, в котором
117
117
117
120
120
120
121
121
121
замену или замены аминокислот выбирают из Glu, Asp, Arg, Ser, Ala, Gly, Trp, Tyr или Phe.
117
120
121
117
120
121
60. Способ по п. 58 или п. 59, в котором замены аминокислот выбирают из одной или более из Glu, Gly или Tyr.61. Способ по любому из пп. 58-60, в котором замены аминокислот выбирают из Glu, Gly и Tyr.
44
45
46
47
44
45
46
47
62. Способ по любому из пп. 53-61, в котором мутеин стрептавидина содержит последовательность аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокую идентичность последовательностей с любой из SEQ ID NO: 3-6, 27 и 28 или ее функциональный фрагмент, который обратимо связывается с биотином, аналогом биотина или стрептавидинсвязывающим пептидом, где последовательность аминокислот или ее функциональный фрагмент содержат последовательность аминокислот, соответствующую Val-Thr-Ala-Argили Ile-Gly-Ala-Arg в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 1.
44
45
46
47
117
120
121
63. Способ по любому из пп. 53-62, в котором аналог или мутеин стрептавидина содержит последовательность аминокислот, которая проявляет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более высокую идентичность последовательностей с SEQ ID NO: 27 или 28, или ее функциональный фрагмент, который обратимо связывается с биотином, аналогом биотина или стрептавидинсвязывающим пептидом, где последовательность аминокислот или ее функциональный фрагмент содержат аминокислотную последовательность, соответствующую Va1, Thr, Ala, Arg, Glu, Gly и Tyr в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 1.
44
45
46
47
44
45
46
47
64. Способ по любому из пп. 53-63, в котором мутеин стрептавидина содержит последовательность аминокислот, представленную в любой из SEQ ID NO: 3-6, 27 или 28, или ее функциональный фрагмент, который обратимо связывается с биотином, аналогом биотина или трептавидинсвязывающим пептидом, где указанный функциональный фрагмент содержит аминокислотную последовательность, соответствующую Va1-Thr-Ala-Arg или lle-Gly-Ala-Arg в положениях последовательности, соответствующих положениям с 44 до 47 последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID NO: 1.
65. Способ по любому из пп. 53-64, где мутеин стрептавидина содержит последовательность аминокислот, представленную в любой из SEQ ID NO: 3-6, 27 и 28.
66. Способ по любому из пп. 1-65, где рецепторсвязывающее средство содержит партнера связывания C1, который обратимо связывается с одним или более сайтов связывания Z1 множества сайтов связывания.
67. Способ по п. 66, в котором
D
-2
-13
константа диссоциации (K) для обратимого связывания между указанным сайтом связывания Z1 и указанным партнером связывания C1 находится в диапазоне от 10 M до 10 M.
68. Способ по п. 66 или 67, в котором реактив содержит мутеин стрептавидина, и партнер связывания С1 содержит биотин, аналог биотина или стрептавидинсвязывающий пептид.
69. Способ по любому из пп. 66-68, в котором
реактив содержит мутеин стрептавидина; и
партнер связывания C1 содержит стрептавидинсвязывающий пептид, где последовательность стрептавидинсвязывающего пептида представлена в любой из SEQ ID NO: 7, 8 и 15-19.
70. Способ по любому из пп. 1-69, который дополнительно включает разрушение обратимого связывания между рецепторсвязывающим средством и реактивом.
71. Способ по п. 70, в котором разрушение осуществляют в пределах 14 суток после инициации инкубации, в пределах 12 суток после инициации инкубации, в пределах 10 суток после инициации инкубации в пределах 8 суток после инициации инкубации или в пределах 6 суток после инициации инкубации.
72. Способ по п. 70 или 71, в котором указанное разрушение завершает или уменьшает сигнал, индуцируемый рецепторсвязывающим средством в клетках-мишенях.
73. Способ по любому из пп. 70-72, в котором указанное разрушение включает введение в клетки композиции, содержащей вещество, способное к обращению связи между рецепторсвязывающим средством и реактивом.
74. Способ по п. 73, в котором вещество представляет собой конкурентное средство.
75. Способ по п. 73 или 74, в котором вещество в композиции не является вредоносным для клеток-мишеней и/или в котором добавление указанного вещества не снижает процентную долю выживших клеток-мишеней до меньше чем 90%, 80%, 70%, 60% или 50%, по сравнению с инкубацией клеток-мишеней при сравнимых или тех же условиях, без вещества.
76. Способ по любому из пп. 73-75, в котором:
реактив содержит мутеин стрептавидина; и
вещество содержит стрептавидинсвязывающий пептид, биотин или аналог биотина.
77. Способ по п. 76, в котором последовательность
стрептавидинсвязывающего пептида представлена в любой из SEQ ID NO: 7, 8 и 15-19.
78. Способ по п. 76 или 77, в котором аналог биотина представляет собой дестиобиотин.
79. Способ по любому из пп. 73-78, где вещество содержит D-биотин.
80. Способ по любому из пп. 1-79, в котором
перед инкубацией, приведение в контакт клеток со средством отбора, которое специфически связывается с маркером, который содержат клетки-мишени композиции, тем самым создавая или получая композицию, содержащую клетки-мишени.
81. Способ по любому из пп. 1-80, в котором по меньшей мере часть инкубации осуществляют дополнительно в присутствии средства отбора, которое специфически связывается с маркером, который содержат клетки-мишени композиции, где культивируемые клетки-мишени обогащают по клеткам-мишеням, содержащим маркер.
82. Способ по п. 80 или 81, в котором
средство отбора обратимо связывают с дополнительным реактивом, содержащим множеством сайтов связывания, способных к специфическому связыванию со средством отбора.
83. Способ по любому из пп. 1-82, в котором индукция сигнала вызывает увеличение размножения и/или активации культивируемых клеток-мишеней по сравнению с инкубацией клеток-мишеней в отсутствие индукции сигнала.
84. Способ по любому из пп. 26-83, в котором индукция первого сигнала и второго сигналаувеличивает размножение и/или активацию клеток-мишеней по сравнению с инкубацией клеток-мишеней в отсутствие индукции первого сигнала или второго сигнала.
85. Способ по п. 83 или 84, в котором увеличение является по меньшей мере 2-кратным, 3-кратным, 4-кратным, 5-кратным, 6-кратным, 7-кратным, 8-кратным, 9-кратным, 10-кратным или более.
86. Способ по любому из пп. 1-85, в котором способ увеличивает размножение T-клеток в композиции, изменяет метаболический профиль T-клеток в композиции, изменяет подмножество CD8+ T-клеток в композиции; и/или увеличивает процентную долю долгоживущих T-клеток памяти в композиции, каждое по сравнению с T-клетками в композиции перед инкубацией или после инкубации, но в присутствии средства, которое специфически связывает CD28.
87. Способ по любому из пп. 1-86, где способы ведут к культивируемым клеткам-мишеням, в которых
число или процентную долю CD3+ T-клеток, CD4+ T-клеток или CD8+ клеток увеличивают по меньшей мере 2-кратно, 3-кратно, 4-кратно, 5-кратно, 6-кратно, 7-кратно, 8-кратно, 9-кратно или 10-кратно по сравнению с числом или процентной долей CD3+ T-клеток, CD4+ T-клеток или CD8+ T-клеток, соответственно, в композиции перед инкубацией или после аналогичной инкубации, но выполняемой в присутствии средства, которое специфически связывает CD28 и/или индуцирует или модулирует передачу сигнала CD28;
соотношение CD8+ T-клеток или относительное или нормализованное соотношение CD8+ T-клеток в композиции увеличивают по меньшей мере 2-кратно, 3-кратно, 4-кратно, 5-кратно, 6-кратно, 7-кратно, 8-кратно, 9-кратно или 10-кратно по сравнению с соотношением или относительным или нормализованным соотношением CD8+ T-клеток в композиции перед инкубацией или после аналогичной инкубации, но в присутствии средства, которое специфически связывает CD28; и/или число или процентную долю CD62L+ T-клеток памяти в композиции увеличивают по меньшей мере 2-кратно, 3-кратно, 4-кратно, 5-кратно, 6-кратно, 7-кратно, 8-кратно, 9-кратно или 10-кратно по сравнению с числом или процентной долей CD62L+ T-клеток в композиции перед инкубацией, или после аналогичной инкубации, но в присутствии средства, которое специфически связывает CD28.
88. Способ по любому из пп. 1-87, в котором культивируемые клетки-мишени содержат больше чем 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% подмножества T-клеток, содержащих фенотип, который представляет собой поверхность, положительную по CD62L (CD62L+), в виде процентной доли от всех T-клеток в композиции или всех клеток в композиции.
89. Способ по п. 88, в котором подмножество T-клеток дополнительно содержит фенотип, содержащий:
a) CD127+; и/или
низк.
b) любое одно или несколько из CD45RA+, CD45RO-, CCR7+ и CD27+ и любое одно или несколько из t-bet, IL-7Ra+, CD95+, IL-2Rβ+, CXCR3+ и LFA-1+.
90. Способ по п. 88 или 89, в котором подмножество T-клеток:
a) содержит низкий уровень эксцизионных колец реаранжировки TCR (TREC); и/или
b) экспрессирует маркер пролиферации, который необязательно представляет собой Ki-67; и/или
c) демонстрирует способность пролиферировать в присутствии стимулирующего средства; и/или
d) демонстрирует способность продуцировать цитокин, выбранный из IFN-γ, TNF и IL-2, в присутствии стимулирующего средства.
91. Способ по п. 90, в котором стимулирующее средство представляет собой антиген, гомеостатический цитокин или представляет собой средство, которое способно к инициации ассоциированного с комплексом TCR/CD3 сигнала в T-клетках.
92. Способ по любому из пп. 88-91, в котором подмножество T-клеток представляет собой или содержит долгоживущие T-клетки памяти.
SCM
93. Способ по любому из пп. 88-92, в котором подмножество T-клеток представляет собой или содержит стволовые T-клетки памяти (T).
94. Способ по любому из пп. 1-93, который дополнительно включает введение рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты в клетки-мишени популяции, эта молекула нуклеиновой кислоты кодирует рекомбинантный белок, в соответствии с чем клетки экспрессируют рекомбинантный белок.
95. Способ по п. 94, в котором рекомбинантный рецептор представляет собой химерный антигенный рецептор или трансгенный T-клеточный рецептор (TCR).
in vitro
ex vivo
96. Способ по любому из пп. 1-95, в котором способ осуществляют  или .
97. Способ по любому из пп. 1-96, который дополнительно включает введение культивируемых клеток субъекту, имеющему заболевание или состояние.