Влияние нефтепродуктов на активность ферментов почвы

ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ

УДК 574.4:577

А.И. Рыкова, Е.А. Толстых, К.А. Харина Курганский государственный университет

ВЛИЯНИЕ НЕФТЕПРОДУКТОВ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ ПОЧВЫ

Аннотация

В статье представлены результаты исследования оксидоредуктазной и гидролазной активности чернозема обыкновенного Кетовского района Курганской области в присутствии солярового масла.

Ключевые слова: почва, ферменты, нефтепродукты.

A.I. Rykova, Е.А. Tolstykh, К.А. Kharina Kurgan State University

INFLUENCE OF OIL PRODUCTS ON THE ACTIVITY OF SOIL ENZYMES

Annotation

The article presents the results of the study of oxireductasy and hydrolysis activity of ordinary black soil of Ketovo district in the Kurgan region in the presence of solar oil.

Key words: soil, enzymes, oil products.

Введение

К актуальным проблемам взаимодействия природы и общества относится охрана биосферы и почв. Почва является неотъемлемой частью любого наземного биогеоценоза. При этом она выполняет ряд экологических функций, втом числе глобальных, обеспечивающих стабильность биосферы. Кроме того, почва-это один из важнейших незаменимых природных ресурсов, главное средство сельскохозяйственного производства. В условиях интенсивной антропогенной нагрузки важнейшей задачей экологических исследований является оценка состояния почвенного покрова.

Кдеградации почв (земель) ведут различные причины, преимущественно антропогенного характера. Одной из наиболее важных из них является загрязнение почв нефтью и нефтепродуктами. Изучение ферментативной активности почв позволяет определить характер и степень ее изменения при таком воздействии. Те сведения, которые имеются о ферментативной активности почвы при загрязнении ее нефтепродуктами, пока недостаточны и требуют более глубокого изучения. Это делает весьма актуальным в теоретическом и практическом отношениях изучение вопросов, затрагиваемых в работе.

1. Методы исследования

Объектом исследования является чернозём выщелоченный, среднегумусный, среднемощный, тяжелосуглинистый, обыкновенный, полевой и искусственно загрязнённый соляровым маслом. Образцы почвы отбирали в Кетовском районе Курганской области. Почву сушили на воздухе до воздушно-сухого состояния, тщательно очищали от корней, растительных остатков и прочих включений. Высушенные пробы растирали и просеивали через сито с диаметром отверстий 0,25 мм. Готовую для анализа почву хранили в пластиковых контейнерах при комнатной температуре и невысокой влажности воздуха, время от времени перемешивая.

Перед исследованием ферментативной активности гравиметрически [1; 2] определяли начальную концентрацию нефтепродуктов в почве, которая составила 13 мг/кг, то есть исследуемую почву можно считать незагрязненной [3]. С учетом этих данных в почву вносили нефтепродукты (соляровое масло) в количествах 50, 300 и 700 мг/кг почвы [4]. Образцы выдерживали неделю при комнатной температуре, затем определяли активность почвенных ферментов трижды с интервалом в одну неделю.

Ферменты участвуют в распаде растительных, животных и микробных остатков, а также синтезе гумуса. Они отличаются исключительно высокой активностью, строгой специфичностью действия и большой зависимостью от различных условий внешней среды. Наряду с различными классами ферментов гидролазы и оксидоредуктазы представляют наибольший интерес для агрохимии. Гидролазы являются довольно обширной группой ферментов. Наиболее важны сведения о тех ферментах, которые расщепляют сложно-эфирные, кислотно-ангидридные, пептидные, глюко-зидные и некоторые другие связи в органических соединениях. Они имеют большое значение в обогащении почвы питательными веществами, которые становятся подвижными и доступными для растений и микроорганизмов. Получающиеся промежуточные продукты подвергаются воздействию всех групп ферментов: оксидоредуктаз, гидролаз, трансфераз и других, - которые участвуют не только в реакциях разрушения молекул, но и в реакциях синтеза как низкомолекулярных, так и высокомолекулярных веществ. Такой комплекс химических процессов обусловливает в целом плодородие почв.

Активность каталазы определяли газометрическим методом, фотометрический метод определения активности нитратредуктазы в почве основан на учете уменьшения количества нитратного азота при инкубации почвы. Активность дегидрогеназы определяли фотометрически, используя в качестве субстрата 2,3,5-трифенилтетразолий хлористый. Для определения активности гидролаз использовали фотоколориметрические методы. Метод определения протеазы основан на учете количества аминокислот, образующихся при

протеолизе внесенных в почву белков путем связывания их в окрашенные комплексы. Субстратом для определения активности уреазы служила мочевина, конечным продуктом гидролиза которой является аммиак и углекислый газ. Аммоний учитывали с реактивом Несслера. Для определения активности инверта-зы использовали редуцирующие свойства глюкозы и фруктозы, которые образуются при гидролизе сахарозы, - способность восстанавливать медь(11) до меди(1) [5]. Параллельно с определением ферментативной активности почвы в опытных образцах в ходе эксперимента многократно определяли активность холостой пробы, то есть незагрязненной нефтепродуктами почвы. Это обусловлено тем, что с течением времени и в зависимости от условий эксперимента активность ферментов может изменяться. В качестве контроля использовали почву, прокаленную при 180 оС в течение трёх часов.

2. Результаты и их обсуждение

В пробах с прокаленной почвой реакции катализируются неферментативно. В холостых пробах на протяжении трёх недель исследования наблюдалось некоторое увеличение активности протеазы, которую выражали в миллиграммах глицина на 100 г почвы за 24 часа. В ходе эксперимента прослеживается стойкая тенденция снижения активности фермента во всех исследуемых образцах. Через 21 день активность протеазы снизилась до 80, 79, 74% и до 89, 70, 57% от холостой пробы при увеличении концентрации солярки с 50 до 700 мг/кг почвы (рис. 1).

] 7 дней  14 дней  21 день

ШЕЮ

Прокаленная Холостая

300 мг/кг 700 мг/кг

Рис. 1. Активность протеазы почвы в присутствии солярового масла

Результаты эксперимента свидетельствуют, что между содержанием в почве загрязняющего вещества и ухудшением того или иного свойства почвы редко наблюдается прямая связь. Отдельные показатели биологической активности могут увеличивать свои значения. Так, в почве, загрязненной нефтепродуктами, процесс гидролиза мочевины, осуществляемый уреазой, активировался на протяжении всего эксперимента во всех исследуемых образцах (рис. 2). Активность уреазы выражали в мг N-NH3/г почвы*час. При внесении в почву солярового масла активность фермента достоверно увеличивалась в первую неделю эксперимента во всех исследуемых образцах. В течение первых семи дней в пробах с содержанием полютанта 50 и 300 мг/кг активность фермента увеличилась на 27 и 40% соответственно. Через 14 дней

резкое увеличение наблюдалось лишь в пробах с содержанием загрязнителя 700 мг на 1 кг почвы (94%). К концу эксперимента во всех образцах уреазная активность почвы увеличилась вдвое относительно холостой пробы. Высокие значения активности данного фермента не всегда благоприятны, так как могут приводить к значительным потерям азота мочевины.

] 7 дней

] 14 дней  21 день

Прокаленная Холостая 50 мг/кг 300 мг/кг 700 мг/кг

Рис. 2. Активность уреазы почвы в присутствии солярового масла

Наиболее часто для оценки биологической активности почв используют определение активности инвер-тазы. Ее обнаружение основано на учете восстанавливающих сахаров, образующихся при расщеплении сахарозы. Инвертаза широко распространена в природе, она имеется у многих микроорганизмов, встречается почти во всех типах почв. Активность инвертазы выражали в миллиграммах глюкозы на 1 г почвы за сутки. На диаграмме, представленной на рис. 3, просматривается стойкая тенденция к уменьшению активности фермента в течение всего эксперимента. К концу третьей недели инвертазная активность снизилась до 97, 69, 62% от холостой пробы при увеличении концентрации солярки с 50 до 700 мг/кг.

И 7 дней  14 дней  21 день

Ишя

Прокаленная Холостая 50 мг/кг 300 мг/кг 700 мг/кг

Рис. 3. Активность почвенной инвертазы в присутствии солярового масла

Роль каталазы в почве заключается в разрушении ядовитой для растений перекиси водорода. Активность каталазы, выражаемая в миллилитрах кислорода, выделившегося на 1 г почвы за 1 мин, представлена на рис. 4. Анализ результатов показывает, что ингибирующее влияние солярового масла на активность фермента усиливается со временем. Кроме того, каталаза чувствительна к высоким концентрациям полютанта.

80

60

В 40

20

0

0.5

Рис.4. Активность каталазы почвы в присутствии солярового масла

Активность нитратредуктазы выражали в миллиграммах восстановленного N03 на 10 г почвы за сутки (рис. 5). Из диаграммы следует, что активность фермента под действием загрязнителя достоверно снижается на протяжении всего опыта. Для данного фермента также существенно содержание солярки в почве.

И 7 дней  14 дней  21 день [

ИИ

Прокаленная Холостая 50 мг/кг 300 мг/кг 700 мг/кг

яет на активность фермента. Через 21 день происходит незначительное снижение активности фермента (8,8% относительно холостой пробы). Данное количество загрязнителя действительно можно считать фоновым, мало влияющим на активность дегидрогеназ. Интерес представляет почва с концентрацией нефтепродуктов 300 мг на кг почвы. Через 14 дней после начала эксперимента активность дегидрогеназы возрастает на 10%, аналогичное поведение фермента наблюдается и при внесении в почву более легких фракций нефти [6]. Это может быть связано с увеличением количества субстрата. Однако увеличение содержания углеводородов ингибирует фермент: концентрация нефтепродуктов 700 мг на кг почвы снижает активность дегидрогеназ на 42%. Таким образом, чем больше молярная масса нефтепродуктов и время их нахождения в почве, тем сильнее пагубное влияние на ферменты класса оксидоредуктаз.

]7 дней П14дней  21 день

Рис. 5. Активность почвенной нитратредуктазы в присутствии солярового масла

Активность дегидрогеназы выражали в микролитрах водорода, восстанавливающего субстрат в 1 г почвы в течение 1 часа (рис. 6). В течение недели концентрация солярового масла 50 и 300 мг на кг почвы не вли-

0,012---

/ 0,010--1 I I I I I -1 I I -рЕ-^ -—-

*°,°°8— НПп

1 0,006 --- - - РГ

0,000 -1——————————

Прокаленная Холостая 50 мг/кг 300 мг/кг 700 мг/кг

Рис. 6. Активность дегидрогеназы почвы в присутствии солярового масла

На основании экспериментальных данных был проведен корреляционный анализ активности ферментов с содержанием нефтепродуктов и между собой по классам на 21 день при одинаковом содержании солярового масла. Рассчитанные коэффициенты корреляции Пирсона представлены в табл. 1 и 2.

Внутри группы оксидоредуктаз наиболее тесную

Корреляция активностей ферментов класса оксидоредуктаз и солярового масла

Таблица 1

007

006

005

004

г 0,003

< 0,002

001

000

Каталаза Дегидрогеназа Нитратредуктаза

Соляровое масло 50мг/кг - 0,9550 - 0,9993 - 0,9117

300мг/кг - 0,9301 0,5610 - 0,9140

700мг/кг - 0,9970 - 0,9943 - 0,9962

Каталаза - 0,7372 0,9786

Дегидрогеназа 0,7372 - 0,8604

Нитр атр едуктаза 0,9786 0,8604 -

Таблица 2

Корреляция активностей гидролитических ферментов и солярового масла

Протеаза Уреаза Инвертаза

50 мг/кг - 0,8660 0,5000 - 0,7482

Соляровое масло 300 мг/кг - 0,9930 0,5695 - 0,9357

700 мг/кг - 1,000 0,9271 0,9790

Протеаза - - 0,8333 0,9211

Уреаза - 0,8333 - - 0,7031

Инвертаза 0,9790 - 0,7031 -

связь имеют каталаза и нитратредуктаза, дегидроге-наза и нитратредуктаза. Умеренная корреляционная зависимость наблюдается между каталазой и дегид-рогеназой. При загрязнении почвы соляровым маслом выявлена высокая корреляционная связь окислитель-но-восстановительныхферментов с содержанием нефтепродуктов в почве. Наиболее тесная корреляционная связь с содержанием солярки выявлена для ката-лазы. С ростом концентрации углеводородов в почве корреляционная зависимость активности фермента от их содержания возрастает. Высокую чувствительность ферментативной активности можно объяснить, по-видимому, тем, что каталаза является ферментом весьма чувствительным к изменению окислительно-восста-новительныхусловий среды.

Среди группы гидролаз наибольший коэффициент корреляции с нефтепродуктами у протеазы и инверта-зы, который составляет 1 и 0,9790 соответственно. Выявлена также высокая степень корреляции уреазы с содержанием солярки в почве при всех концентрациях полюанта. С ростом содержания солярового масла в почве корреляционная зависимость возрастает.

Заключение

Таким образом, проведенные исследования доказывают возможность использования ферментативной активности в качестве диагностического показателя плодородия почв, потому что активность ферментов отражает не только биологические свойства почв, но и их изменения под влиянием экологических факторов. Загрязнение чернозема нефтепродуктами в большинстве случаев ингибирует активность почвенных ферментов. По результатам проделанной работы можно сделать следующие выводы:

1. Загрязнение почвы нефтепродуктами влияет на пул ферментов, формирующих азотный и окислитель-но-воссгановительный режим почвы. Наиболее чувствительны к загрязнению почвы нефтепродуктами в количестве 50 мг/кг почвы нитратредуктаза и каталаза. Нефтепродукты в количестве 300 мг/кг почвы достоверно повышают активность дегидрогеназ. Соляровое масло в количестве 700 мг/кг почвы дезактивирует все изученные ферменты, за исключением уреазы.

2. Ингибирующее действие на ферменты усиливается с увеличением дозы и времени воздействия нефтепродуктов. Выявлена тесная корреляционная зависимость между содержанием нефтепродуктов и активностью исследованных оксидоредуктаз и гидролаз, что делает возможным использование данных ферментов как биоиндикаторов при оценке экологического состояния почв.

Таким образом, использование показателей биологической и биохимической активности почв имеет хорошую перспективу и должно включаться в программу почвенно-экологического мониторинга густонасе-ленныхтерриторий.

Список литературы

1. ГОСТ 17.4.3.03-85. Охрана природы. Почвы. Общие

требования к методам определения загрязняющих

веществ.

2. РД 39-0147098-015-90. Инструкция по контролю за

состоянием почв на объектах предприятий Миннеф-тегазпрома СССР. ВостНИИТБ, Уфа.

3. Пиковский Ю.И. Природные и техногенные потоки

углеводородов в окружающей среде. - М.: Изд-во МГУ, 1993. - 208 с.

4. Порядок определения размеров ущерба от загрязнения

земель химическими веществами (утв. Роскомземом 10 ноября 1993 г. и Минприроды РФ 18 ноября 1993 г.).

5. Практикум по агрохимии: Учеб. пособие / Под ред. акаде-

мика РАСХН В.Г. Минеева. - 2-е изд., перераб. и доп. -М.: Изд-во МГУ, 2001. - 689 с.

6. А.И. Рыкова, E.H. Макарова, К.А. Харина. Влияние нефте-

продуктов на активность гидролаз почвы (на примере керосина) // IX Зыряновские чтения: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (Курган, 8-9 декабря 2011г.). - Курган: Изд-во Курганского гос. ун-та, 2011г. - С. 180-182.

УДК 544.723.54, 544.032.72 А.В. Шарое

Курганский государственный университет

ПРОТОЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА СИЛИКАГЕЛЕЙ, ПОЛУЧЕННЫХ С ПРИМЕНЕНИЕМ МОНОЭТАНОЛАМИНА

Аннотация

Определены константы протонирования сили-кагелей, полученных с применением моноэтанолами-на в качестве катализатора. Выявлено влияние си-ланольного покрова силикагеля и ионной силы на концентрационные константы протонирования.

Ключевые слова: силикагель, моноэтаноламин, константа протонирования.

A.V. Sharov Kurgan State University

SILICA OBTAINED BY THE USE OF MONOETHANOLAMINE PROTOLYTIC PROPERTIES

Abstract

Protonation constants of silica obtained with the monoehanolamine as a catalyst were identified. The effect of silica silanol cover and ionic strength on the concentration protonation constants has been carried out.

Keywords: silica, monoehanolamine, protonation constant.

Введение

Кремнеземы, содержащие в своей структуре функциональные группы кислотного или основного характера, в том числе способные к комплексообразова-нию, используются при концентрировании веществ, в качестве неподвижных фаз в хроматографии, в экспресс-методах анализа ит.д. [1]. Это является факто-