Продукты метаболизма молочнокислых бактерий, как вещества снижающие действие генотоксикантов

УДК 613.6, 664

С. В. Китаевская, Т. А. Ямашев, О. Б. Иванченко, О. А. Решетник

ПРОДУКТЫ МЕТАБОЛИЗМА МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ, КАК ВЕЩЕСТВА СНИЖАЮЩИЕ ДЕЙСТВИЕ ГЕНОТОКСИКАНТОВ

Ключевые слова: вредные условия производства, молочнокислые бактерии, Lactobacillus casei, генопротекторное действие.

Статья посвящена поиску протекторных веществ, снижающих действие генотоксикантов, что особенно актуально для обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия работников вредных производств. Показано, что в присутствии культуральной жидкости бактерий Lactobacillus casei ТМБ-Д, полученной в различные фазы роста, ДНК-повреждающее действие фурацилина для тестерных штаммов Escherichia coli снижается. Выявлена зависимость генопротектоного действия культуральной жидкости от фазы роста бактерий продуцентов и от природы тест-штамма. Наиболее значительный эффект отмечен у культуральной жидкости, полученной в фазу замедления роста на тест-штамме дикого типа. Рост концентрации культуральной жидкости усиливал ее защитное действие, а термообработка и метаболическая активация не оказывали влияния на ее генопротекторные свойства. Полученные результаты могут быть использованы при разработке рационов лечебно-профилактического питания, позволяющих снизить риски возникновения генотоксических повреждений у работников вредных производств.

Key words: unhealthy conditions of production, lactic acid bacteria, Lactobacillus casei, genoprotective effect.

Abstract: The article is devoted to the search for protective substances that reduce the effect of genotoxicants, it is especially important for the provision of sanitary-epidemiological status of workers in unhealthy conditions of production. It is shown that in the presence of a culture liquid of bacteria Lactobacillus casei TMB-D obtained in different phases of growth, DNA-damaging effect of nitrofurazone for Escherichia coli test strains is reduced. The dependence of genoprotective action culture liquid on the phase of growth lactic acid bacteria and the type of test strain. The most significant effect was detected in the culture liquid obtained in the phase of of slow growth on the wild type test strain. Increasing concentration of the culture liquid enhances its protective effect, but heat treatment and metabolic activation had not effect on genoprotective action culture liquid. The results can be used when formulating therapeutical and prophylactic nutrition, that will reduce the risks of genotoxic damage of workers in unhealthy conditions of production.

Введение

Бурный рост промышленного производства, увеличение числа техногенных катастроф, сокращение площади озонового слоя и другие факторы, связанные с воздействием человека на окружающую среду привели к появлению значительного количества высокореактивных соединений, способных взаимодействовать с макромолекулами клеток живых организмов и тем самым негативно влиять на их функции. Наибольшую опасность для всего живого на земле представляют вещества, обладающие

генотоксическим, тератогенным и ДНК-повреждающим действием, так как они представляют угрозу как для существующих, так и для будущих поколений.

Очевидно, что наиболее эффективным способом борьбы с генотоксикантами, является исключение их воздействия на организм человека, однако в настоящее время это практически невозможно. В связи с этим, одним из перспективных решений данной проблемы является поиск и применение соединений, снижающих и/или полностью устраняющих их действие.

Соединения естественного происхождения, в настоящее время, успешно конкурируют на практике с продуктами химического синтеза, в связи с чем, резко возрастает интерес к микроорганизмам, как к возможным продуцентам биологически активных веществ, обладающих в том числе антимутагенными и генопротекторными свойствами

[1-9]. Особое внимание среди бактерий уделяется резидентной микрофлоре человека, так называемым пробиотикам - это молочнокислые бактерии, бифидобактерии и продукты их жизнедеятельности [9]. Группой немецких исследователей показано антигенотоксическое действие молочнокислых бактерий L. casei и ферментированных ими молочных продуктов (Биойогурт) против мутагенеза индуцированного Ы-метил-Ы-нитро-Ы-

нитрозогуанидином в клетках желудочно-кишечного тракта крыс [2].

Целью настоящей работы явилось изучение генопротекторного действия продуктов

жизнедеятельности бактерий Lactobacillus casei ТМБ-Д, применяемых в пищевой

промышленности [3,4].

Экспериментальная часть

Используемые среды и растворы: жидкая среда MRS; 0,9 % раствор NaCl; микросомная активирующая смесь состав на 1 мл: фракция S9 -0,3 мл; НАДФЫа - 4 мкМ; глюкоза-6-фосфат - 5 мкМ; КС1 - 33 мМ; МgCl2 - 8 мМ; 0,2М фосфатный буфер (рН 7,4) - до 1 мл; лиофилизированные фракции клеток печени крыс, предоставлены институтом экологии и генетики УрО АН России (г. Пермь).

В качестве позитивного контроля использовали известный ДНК-повреждающий агент - фурацилин (нитрофурал) производства ОАО «Татхимфармпрепараты» (г. Казань). Токсическое

действие фурацилина основано на способности его молекул проникать в клетку микроорганизма и восстанавливаться там микробными

флавопротеинами с образованием

высокореактивных аминопроизводных, которые изменяют конформацию белков, в том числе рибосомальных, и других макромолекул и вызывают гибель клеток [8].

Штамм молочнокислых бактерий Lactobacillus casei ТМБ-Д получен из коллекции микроорганизмов института общей генетики (г. Москва) коллекционный номер В-4486. Клетки микроорганизмов выращивали в среде MRS при 37 °С в стационарных условиях в течении времени необходимого для достижения фазы замедления роста или стационарной фазы роста. По окончании инкубации биомассу отделяли центрифугированием (8000 об/мин, 15 мин), надосадочную жидкость стерилизовали, пропуская ее через мембранный фильтр («Synpon») с диаметром пор 0,45 мкм. Полученный фильтрат, далее называемый культуральной жидкостью (КЖ) использовали для выявления генопротекторных свойств.

В работе также исследовали КЖ концентрированную в 5 раз, КЖ после термообработки (10 мин, 100 °С) и метаболически активированную КЖ. Концентрирование проб проводили путем высушивания КЖ в сушильном шкафу при температуре 30-40 °С.

Для изучения генопротекторной активности и выяснения вкладов систем репараций в исправление повреждений генетического аппарата клетки применяли суспензионный метод ДНК-повреждающего теста [10].

Оценку проводили на тестерных штаммах Escherichia coli дефектных по различным системам репарации: (uvrA' - нарушена эксцизионная репарация; polA - репарация ДНК-полимеразы 1; recA' - пострепликативная репарация). В качестве тест-объекта с нормальным функционированием всех систем репарации использовали дикий тип E. coli - wp.

Изучение протекторных свойств КЖ проводили в 2-х вариантах опыта.

I. Клетки тест-штамма E. coli инкубировали в питательной среде совместно с фурацилином (100 мкг/мл) и КЖ, для выявления десмутагенных свойств исследуемых метаболитов лактобактерий.

Интенсивность роста культуры определяли колориметрическим методом на

фотоэлектроколориметре (ФЭК-56ПМ, D590), как разность между начальной и конечной величиной оптической плотности (AD).

В экспериментах параллельно с мутантными штаммами обязательно засевали дикий тип E. coli (wp).

Генопротекторную активность (ГА) рассчитывали по формуле:

ГА =

1 -

^ Х3 - Xt ^ Vх 2 -Х1

• 100% .

X2 - AD тестерного штамма в опыте с раствором фурацилина (позитивный контроль);

X3 - AD тестерного штамма в опыте с раствором фурацилина и КЖ (эксперимент).

II. Для изучения биоантимутагенных свойств продуктов жизнедеятельности

молочнокислых бактерий, клетки тест-штамма E. coli предварительно обрабатывали КЖ (инкубировали совместно в течение 100 мин). Затем клетки центрифугировали, отмывали и инкубировали с фурацилином.

Для определения влияния метаболической активации на свойства продуктов

жизнедеятельности L. casei ТМБ-Д, КЖ и микросомную активирующую смесь инкубировали совместно в соотношении 1:1 в течении 40 мин. По окончании инкубации смесь центрифугировали при 8000 об/мин в течение 15 мин. Далее надосадочную жидкость стерилизовали, пропуская ее через мембранный фильтр (диаметр пор 0,45 мкм). Метаболически активированную культуральную жидкость использовали во втором варианте модифицированного ДНК-повреждающего теста.

Результаты и их обсуждение

Результаты изучения генопротекторных свойств КЖ бактерий L. casei в модифицированном ДНК-повреждающем тесте представлены в табл. 1.

Таблица 1 - Генопротекторная активность КЖ бактерий L. casei ТМБ-Д

Варианты опыта Генопротекторная активность, %

Wp Pol Rec Uvr

Фаза замедления роста

I 33 24 5 16

II 48 41 11 17

Стационарная фаза роста

II 38 10 5 15

где Xi - AD тестерного штамма в опыте с физраствором (негативный контроль);

В ходе исследования показано, что продукты жизнедеятельности молочнокислых бактерий L. casei проявляют генопротекторную активность во всех вариантах эксперимента, что свидетельствует об их полифункциональном действии.

Однако необходимо отметить, что десмутагенные свойства исследуемой смеси (вариант опыта I) менее выражены, чем биоантимутагенные (вариант опыта II).

По-видимому, при предварительной обработке тест-штаммов E. coli КЖ, находящиеся в ней соединения делают клетки E. coli менее восприимчивыми к последующему действию ДНК-повреждающего агента.

Известно, что к биоантимутагенам относятся соединения, проявляющие свою активность не за счет непосредственного связывания с генотоксикантами, а путем влияния на процессы взаимодействия веществ с клеткой или их превращения. Кроме того, генопротекторное соединение способно активировать репарационные процессы в клетке, исправлять повреждения в ДНК [10].

Следует отметить, что питательная среда, в которой шел рост L. casei не влияла на спонтанный уровень возникновения повреждений в ДНК. Прирост биомассы в присутствии только КЖ был на уровне негативного контроля. Это свидетельствует о том, что она не является дополнительным стимулятором роста для тест-штаммов E.coli, а более активный рост бактерий в присутствии КЖ обусловлен лишь ее защитными свойствами.

Как следует из данных таблицы 1, генопротекторное действие КЖ зависит от природы тест-штамма. Минимальный эффект был зарегистрирован на штамме с нарушенной пострепликативной репарацией (recA-), а максимальная активность получена на штамме дикого типа. Кроме того, необходимо заметить, что наиболее высокое защитное действие обнаружено у КЖ полученной в фазу замедления роста культуры L. casei - генопротекторная активность во II варианте опыта составляет 11-48 % (табл. 1).

По мере старения культуры генопротекторная активность КЖ снижается, это может быть связано с тем, что в более поздние фазы роста активные вещества могут либо вновь потребляться культурой, либо подвергаться различным модификациям, например окислению.

Повышение концентрации КЖ в 5 раз усиливало ее защитное действие на клетки E. coli (рис. 1), причем и в этом случае, наблюдалась зависимость полученного эффекта от возраста бактерий продуцентов.

л н о о к я Я

Ё

св «

св

к ft

О

Ё (U

н о

Л

и о к

(U

U

100 80 -60 -40 -20 -0

Фаза замедления Стационарная фаза роста роста

Рис. 1 - Генопротекторная активность концентрированной культуральной жидкости Lactobacillus casei ТМБ-Д

Известно, что большинство химических мутагенов является веществами чужеродными для организма (ксенобиотиками), и при их проникновении в организм важную роль в проявлении их биологической активности играют ферментные системы. В большинстве случаев процесс превращения химических соединений расценивается как фактор детоксикации. Однако, известно, что многие вещества, будучи инертными в виде исходной молекулы, метаболизируются с образованием реакционно-способных структур, способных взаимодействовать с макромолекулами клетки. Метаболическая активация химических соединений обычно происходит в микросомах клеток печени животных, в том числе и человека,

под влиянием ферментов - монооксигеназ смешанных функций. Для того, чтобы учесть этот процесс, в среду культивирования микрорганизмов вносят микросомную фракцию S9, полученную из клеток печени крыс (метаболическая активация in vitro) [11].

Результаты исследования генопротекторных свойств КЖ в условиях метаболической активации in vitro представлены на рис. 2.

Максимальная генопротекторная

активность вновь была отмечена на штамме дикого типа. Метаболическая активация практически не изменяла зарегистрированный эффект, и при проникновении в организм человека продуктов метаболизма молочнокислых бактерий их положительные свойства будут сохраняться.

о4

О К я

5

13

се «

се К Л о

13

<и н

о

6

о к <и U

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

-

- Wp

- Pol Uvr

-

- Rec

Рис. 2 - Генопротекторная активность метаболически активированной культуральной жидкости Lactobacillus casei ТМБ-Д

Многочисленные данные литературы свидетельствуют об антимутагенных и защитных эффектах соединений белковой природы, являющихся продуктами жизнедеятельности целого ряда микроорганизмов [6, 9, 12, 13].

Вместе с тем, в работе Lankaputhra, Shan всесторонне обсуждается вопрос о влиянии органических кислот (молочной, масляной, уксусной, пировиноградной), синтезируемых L. acidophilus на индуцированный мутагенез [14]. Значительное десмутагенное действие было обнаружено в случае коинкубации изучаемых мутагенов (Ы-метил-Ы-нитро-Ы-нитрозогуанидина, 2-нитрофлуорена, 4-нитро-О-фенилендиамина, афлатоксина В-i, 2-амино-3-метил-3Н-

имидазолхинолина, 2-амино-1-метил-6-

фенилимидазо (4,5 -в)пиридина, 2-амино -3 -метил-9Н -пиридо(3,3-6)индола) с масляной кислотой. Авторы [14] полагают, что исследованная кислота предотвращает мутагенез на стадии экспрессии генов.

Одним из метаболитов бактерий рода Lactobacillus, является />-амино-бензойная кислота (ПАБК) [15].

В работах [16, 17] было показано, что ПАБК проявляет как дес- так и биоантимутагенные свойства. Говоря, об антимутагенной активности

этой кислоты необходимо также заметить, что она оказывает защитное действие на клетки разного уровня организации - про- и эукариоты.

Для выяснения природы активного компонента, КЖ была подвергнута термообработке в течение 10 минут при 100 °С.

Было показано, что и после нагревания КЖ сохраняла свои генопротекторные свойства (рис. 3). Таким образом, можно предположить, что вещество, проявляющее защитные свойства термостабильно и, вероятно, имеет небелковую природу.

i00

80 -

60 -

40 -

20 -

. Wp

- Uvr

_ Pol Rec

-

л н о о к m S

Ë

св «

св

к ft

О

(U H

о

Л G о к

(U

U

Рис. 3 - Влияние термообработки на генопротекторную активность культуральной жидкости Lactobacillus casei ТМБ-Д

Полученные результаты изучения генопротекторного действия КЖ L. casei могут быть обусловлены присутствием в многокомпонентной смеси, какой является КЖ, какого-то одного соединения, но возможно, что зарегистрированный эффект связан не с одним веществом, а является результатом совместного действия нескольких компонентов. Известно, что вещества в смеси могут проявлять синергический эффект, влияя друг на друга, в результате чего повышается или понижается биологическая активность комплекса [18].

Таким образом, в результате проведенного исследования установлено, что КЖ молочнокислых бактерий Lactobacillus casei ТМБ-Д, способна оказывать генопротекторное действие,

проявляющееся на внутриклеточном уровне. Причем основная роль в реализации данного эффекта принадлежит термостабильному активному компоненту КЖ, вероятно небелковой природы, или комплексу соединений.

Способность молочнокислых бактерий, входящих в состав многих продуктов питания, образовывать подобные вещества, имеет особое значение, так как проявляемый внутриклеточный механизм защиты генома предполагает его универсальность, и следовательно применимость для профилактики генетических заболеваний у человека. Полученные результаты могут быть использованы при разработке рационов лечебно-профилактического питания, позволяющих снизить риски возникновения генотоксических повреждений у работников вредных производств.

Литература

1. Weisberger E.K., Eds Shankel D.M., Hartman Ph.E., Kada T., Hollaender A., Antimutagenesis and Anticancerogenesis. Mechanisms. Plenum Press, N-Y.:, i985., P. 5ii-5i2.

2. Pool-Zobel B.L., Bertram B., Knoll M., Lambertz R., Nutr. Cancer. IG, 3, 27i-28i

3. Пономарев В.Я., Китаевскеая С.В., Шнип Е.О., Вестник Казанского технологического университета, i5, i79-i82

4. Китаевская С.В., Пономарев В.Я., Вестник Казанского технологического университета, 2i, 248-250

5. A. Ryan, E. Kaplan, N. Laurieri, E. Lowe, E. Slim, Scientific Reports, 1, 63, i-5

6. Иванченко О.Б., Ильинская О.H., Карамова Н.С., Микробиология, 64, 2, 234-238

7. Ooka K., Tanaka M., Ishikawa T., Kato F., Biol. Pharm. Bull., 22, i, i07-ii0

8. Воробьева Л.И., Ходжаев Е.Ю., Пономарева Г.М., Микробиология,. 7G, i, 39-44

9. Воробьева Л.И., Абилев С.К., Прикладная биохимия и микробиология, 38, 2, ii5-i27

10. Абилев С.К., Порошенко Г.Г., Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Токсикология, 14, i, 3-i74

11. Порошенко Г.Г., Абилев С.К., Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Общая генетика, 12, i, 5-208

12. Hosono A., Sagae S., Tokita F., Milchwissenschaft,. 41, i, i42

13. Osawa T., Namiki M., Udaka S., Kada T., Antimutagenesis and Anticancerogenesis. Mechanisms. Plenum Press, N-Y.:, i986. P. 573.

14. Lankaputhra W.E., Shan N.P.,MutatRes., 397, 2, i69-i82

15. Квасников Е.И., Нестеренко О.А., Молочнокислые бактерии и пути их использования. Пищевая промышленность, M.:, i975. 350 с.

16. Васильева С.В., Давниченко Л.С., Генетика, 19, i0, i9i6-i920

17. Gichner T., Veleminsky J., Rapoport I.A., Vasilieva S.V., Mutat Res., 192, 2, 95-98

18. Saffiotti V., Environ Health. Perspect., 47, 3i9-324

© С. В. Китаевская - к.т.н., доцент кафедры технологии пищевых производств КНИГУ, kitaevskayas@mail.ru; Т. А. Ямашев - к.т.н., доцент той же кафедры, yamashev555@mail.ru; О. Б. Иванченко - к.б.н., доц. каф. химии и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного торгово-экономического университета, obivanchenko@yandexl.ru; О. А. Решетник - д.т.н., проф., зав. каф. технологии пищевых производств КНИГУ, roa.olga@mail.ru.

© S. V. Kitaevskaya - Candidate of Engineering Sciences (Ph.D.), Associated Professor of the Department of Technology of Food Productions of KNRTU, kitaevskayas@mail.ru; T. A. Yamashev - Candidate of Engineering Sciences (Ph.D.), Associated Professor of the Department of Technology of Food Productions of KNRTU, yamashev555@mail.ru; O. B. Ivanchenko - Candidate of Biological Sciences (Ph.D.), Associated Professor, obivanchenko@yandexl.ru; O. A. Reshetnik - Doctor of Engineering Sciences, Full Professor of the Department of Technology of Food Productions of KNRTU, reshetnik@kstu.ru.

0