ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЛЕЛЬНОГО СПЕКТРА ГЕНОВ GDF9, PRL, β-LG ОВЕЦ ПОРОДЫ ЛАКОН

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

DOI 10.25930/2687-1254/012.5.13.2020 УДК: 591.151:636.32/.38.082.13

ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЛЕЛЬНОГО СПЕКТРА ГЕНОВ GDF9, PRL, P-LG

ОВЕЦ ПОРОДЫ ЛАКОН

Д.Д. Петухова

Развитие молекулярной генетики создает условия для поиска ключевых генов, полиморфизм которых вносит немаловажный вклад в реализацию хозяйственно-полезных признаков у сельскохозяйственных животных. Наличие разнообразных ал-лельных вариантов, то есть полиморфизма генов и генотипов, - необходимое условие успешной селекции. Технологии, базирующиеся на применении ДНК-маркеров, обширно применяются в национальных селекционных программах ряда стран. Использование генетических ресурсов племенных животных, внедрение современных методов селекционно-племенной работы и совершенствование воспроизводства стада имеют особое значение для сельского хозяйства. Вышеизложенное определило цель настоящих исследований - изучить полиморфизм генов дифференциального фактора роста (GDF9), пролактин (PRL), бетта-лактоглобулин (fi-LG) овец породы лакон. Исследования проводились в аккредитованной лаборатории иммуногенетики и ДНК-технологий ВНИИОК - филиале ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ». Объект исследования - овцы породы лакон (n = 191). Аллельный спектр генов у данной популяции овец, разводимых в КФХ «Николаев» Крымского района Краснодарского края изучался впервые. Методом ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция - полиморфизм длин рестрикци-онных фрагментов) определен полиморфизм генов GDF9, PRL, fi-LG, представленный двумя аллелями - GDF9A, GDF9g; PRLA, PRLB; p-LGA, p-LGB и тремя генотипами -PRLaa, PRLab, PRLbb; p-LGAA, p-LGAB, p-LGBB; GDF9AA, GDF9AG, GDF9og, с разной частотой встречаемости.

Ключевые слова: полиморфизм, ПЦР-ПДРФ, гены, овцы, лакон.

CHARACTERISTICS OF THE ALLELIC SPECTRUM OF GDF9, PRL, p-LG GENES

OF THE LACAUNE SHEEP BREED

D.D. Petukhova

The development of molecular genetics creates conditions for the key genes search, the polymorphism of which makes an important contribution to the achievement of economically useful traits in farm livestock. The presence of multiple allelic variations, namely, genes and genotypes polymorphism is a necessary condition for successful selection. Technologies which are based on the use of DNA markers are widely used in national selective breeding programs in several countries. The use of genetic resources of breeding animals, the introduction of up-to-date methods of selective breeding and the improvement of flock reproduction are of particular importance for agriculture. The foregoing determined the goal of these studies - to study the genes polymorphism of growth differentiation factor (GDF9), prolactin hormone (PRL), and beta-lactoglobulin (в-LG) of the Lacaune sheep breed. The studies were carried out in the accredited laboratory of immunogenetics and DNA technologies of All-

Russian Research Institute of Sheep and Goat Breeding (VNIIOK) - a branch of the Federal State Budgetary Scientific Institution "North Caucasus FARC". The object of the research was the Lacaune sheep breed (n = 191). The allelic spectrum of genes in this population of sheep which were bred on the farm "Nikolaev", Krasnodar Territory, Krymsky District was studied for the first time. By PCR-RFLP method (polymerase chain reaction - restriction fragment length polymorphism) gene polymorphism was determined: GDF9, PRL, в -LG, represented by two alleles: GDF9A, GDF9g; PRLa, PRLb; p-LGA, p-LGB; and by three genotypes: PRLaa, PRLab, PRLbb; p-LGAA, p-LGAB, p-LGBB; GDF9AA, GDF9AG, GDF9og, with different frequency of occurrence.

Key words: polymorphism, PCR-RFLP, genes, sheep, Lacaune.

Введение. Lacaune (лакон) - порода овец молочно-мясного направления продуктивности. Одна из самых популярных молочных пород во Франции. До середины 60-х годов XX столетия доение не было ключевой чертой этих овец. Спустя несколько десятилетий после внедрения селекционных методов разведения овцы лакон из породы двойного назначения, имеющие низкую молочную продуктивностью, превратились в породу с высокими надоями, сохранив при этом мясную продуктивность и быстрый темп роста ягнят (среднесуточный прирост ягнят более 300 грамм) [1, 2]. В настоящее время породу лакон разводят во многих странах мира. В Россию (Краснодарский край, Крымский район) овцы данной породы впервые завезены в 2015 году [2].

Современные методы селекции нацелены на поиски молекулярно-генетических маркеров, взаимодействующих с хозяйственно-полезными признаками. Одной из главных характеристик маркеров является полиморфизм, представляющий изменение нук-леотидной последовательности в молекуле ДНК, вызванное различными мутациями. Его проявление - аллельный спектр [3, 4]. Метод ПЦР-ПДРФ считается стандартным анализом точечных мутаций диагностики аллельного полиморфизма генов-кандидатов

[4].

Одними из многообещающих генов, считающихся маркерами продуктивности овец, являются гены дифференциального фактора роста (GDF9), пролактин (PRL), бет-та-лактоглобулин (в-LG).

Ген GDF9 находится в области хромосомы 5; полиморфизм представлен двумя аллелями - GDF9A; GDF9G. Рассматривается в качестве маркера продуктивности овец, играет важную роль в процессе фолликулогенеза, нормального созревания ооцитов и развития эмбриона, связан с плодовитостью овец [5, 6].

Ген PRL расположен в 20 хромосоме, аллели PRLA и PRLB различаются положением в аминокислоте 38 (His/Tyr). Ген является ответственным за выработку протеина и лактозы в молоке, кодирует фермент пролактина, играющего большую роль в развитии молочной железы и секреции молока [7,8].

Ген в-LG находится на 3 -й хромосоме; выявлено три аллельных полиморфизма -P-LGA, e-LGB и в-LG0. Генетический вариант аллели в-LGС встречается редко. Полиморфное действие гена в-LG влияет на компоненты молока, включая содержание белка, жира и лактозы. [7, 8].

Известно, что в странах с хорошо развитым животноводством генетическое маркирование сельскохозяйственных животных - обязательное условие. Вышеизложенное предопределило цель настоящих исследований и послужило основанием для изучения полиморфизма генов GDF9, PRL, в-LG овец породы лакон.

Материал и методы исследований. Исследования и обработка полученных результатов проводились в лаборатории иммуногенетики и ДНК-технологий ВНИИОК -филиала ФГБНУ «Северо-Кавказский ФНАЦ».

Объект исследования - овцы породы лакон (n = 191), разводимые в КФХ «Николаев» Крымского района Краснодарского края. Биологическим материалом выступила ДНК, выделенная из цельной крови с применением набора реагентов Diatom™ DNA Prep 100. Анализ проводили методом ПЦР-ПДРФ на программируемом четырехка-нальном термациклере «Терцик» с использованием специфических праймеров [5,7] (табл. 1). При УФ-свете методом горизонтального гель-электрофореза в 1,5-3% агароз-ном геле после окрашивания бромистым этидием определялась длина и число фрагментов рестрикции.

Таблица 1 - Последовательность олигонуклеотидных праймеров

Ген/Эндонуклеаза Праймер Амплификат, (п.н.) T o С, отжига

д F:5' - ACCTCTCCTCGGAAATGTTCA - 3'

(D cd Й Рч R:5' - GGGACACTGAAGGACCAGAA - 3' 1209 58

>са F:5'- CTCTTTGGGTTCAGTGTGAGTCTTG - 3'

Ü bJ 1 са R:5'- CACCATTTCTGCAGCAGGATCTC - 3' 301 56

Й F:5'- GAAGACTGGTATGGGGAAATG - 3'

СЛ S3 OS Рч 8 R: 5'- - CCAATCTGCTCCTACACACCT - 3' 462 63

Генетико-статистический анализ полученных результатов осуществлялся с применением стандартного набора формул [9].

Подсчет частоты встречаемости генотипов определялся по формуле:

п

р = - , где р - частота определенного генотипа,

п - количество животных, имеющих определенный генотип, N - общее число животных.

Расчет частоты встречаемости аллелей осуществлялся по формуле:

^ = -1+-, где

P - частота встречаемости аллели; А - аллель;

N1 - число гомозигот по исследуемому аллелю; N2 - число гетерозигот; п - объем выборки животных.

Результаты исследования и их обсуждение. В результате ПЦР был амплифи-цирован фрагмент гена РКЬ длинною 1209 п.н, рестрикция которого с помощью эндо-нуклеазы НаеШ позволила идентифицировать три генотипа (рис 1).

Рис. 1. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ пролактина (РКЬ) Обозначения:

1 - ДНК-маркер 50 bp (Изоген);

2 - генотип АА (540, 370, 147, 152 п.н.);

3, 4, 6, 8, 11, 12 - генотип ВВ (517, 370, 147, 152 п.н.); 5, 7, 9, 10 - генотип АВ (540, 517, 370, 147, 152 п.н.).

После амплификации гена Р~ЬО получили фрагмент длиной 301 п.н., который затем разрезали эндонуклеазой рестрикции (рис 2).

Рис. 2. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ Р-лактоглобулин

Обозначения:

1 - ДНК-маркер 50 bp (Изоген); 8, 10, 16 - генотип АА (241, 60 п.н.);

2, 11, 14, 18 - генотип ВВ (175, 66, 60 п.н.);

3, 4, 5, 6, 7, 9, 12, 13, 14, 17 - генотип AB (241, 175, 66, 60 п.н.).

В результате амплификации получен фрагмент гена ОПГ9, размер которого составил 462 п.н. Анализ фрагмента гена осуществляли путём использования эндонукле-азы АврШ! (рис. 3).

Рис. 3. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ гена дифференциального фактора роста GDF9

Обозначения:

1 - ДНК-маркер 50 bp (Изоген);

3 - генотип АА (462 п.н.);

9, 18 - генотип AG (462, 250, 220 п.н);

2, 4, 5 ,6 ,7, 8, 10, 11 ,12, 13, 14, 15, 16, 17 - генотип GG (250, 220 п.н.).

Анализ полиморфизма генов пролактина, Р-лактоглобулина, дифференциального фактора роста выявил наличие двух аллелей - PRLA и PRLB; fi-LGA и fi-LGB; GDF9A и GDF9g и трёх генотипов, гомозиготный (PRLAA, PRLBB; p-LGAA, p-LGBB; GDF9AA, GDF9GG) и гетерозиготный (PRLAB, e-LGM, GDF9AG) (табл. 2).

Таблица 2 - Частота встречаемости аллелей и генотипов генов PRL и P-LG овец лакон породы

Ген Частота встречаемости

генотипов, % аллелей

АА ВВ АВ А В

PRL 84,0 9,0 7,0 0,87 0,13

в-LG 12,0 39,0 49,0 0,36 0,64

GDF9 GG AA AG A G

85,0 9,0 6,0 0,12 0,88

Для полиморфизма пролактина характерна высокая (0,87) концентрация аллеля PRLA и низкая (0,13) аллеля PRLB, что нашло отражение в наличии гомо- и гетерозиготных генотипов: PRLAA - 84,0%; PRLBB - 9,0%; PRLAB - 7,0%.

В гене Р-лактоглобулин отмечается преобладание аллеля fi-LGB (0,64) над алле-лем e-LGA (0,36) почти в 2 раза. Присутствие гомозиготных генотипов fi-LG^, fi-LGBB составило 12,0% и 39,0 %, гетерозиготного p-LGAB - 49,0%.

Частота встречаемости аллеля GDF9^ равнаа 0,12; аллеля GDF9g - 0,88, что нашло отражение в частоте встречаемости гомозиготных GDF9AA, GDF9gg и гетерозиготного GDF9AG генотипов, составившей - 9,0%; 85,0%; 6,0%, соответственно.

Заключение. В результате проведенного исследования методом ПЦР-ПДРФ установлены породные особенности полиморфизма аллельного спектра генов GDF9, PRL, в-LG овец породы лакон. Полученные данные могут быть использованы как генетическая характеристика популяции овец данной породы, а также найти применение в селекционно-племенной работе, направленной на сохранения генетического разнообразия.

Литература

1. Genomic selection in the French Lacaune dairy sheep breed / S.I.Duchemin, C. Co-lombani, A. Legarra et al. // Journal of Dairy Science. 2012. 95 (5). PP. 2723-2733. doi: 10.3168/jds.2011-4980.

2. Светличный С.П. Пилотный проект промышленного производства овечьего молока на Кубани / С.И. Светличный, Н.Н. Бондаренко, Н.В. Меренкова, М.И. Се-лионова, С.В. Свистунов // Овцы, козы, шерстное дело. 2019. № 1. С. 20-24.

3. Селионова М.И. Геномные технологии в селекции сельскохозяйственных животных / М.И. Селионова, А.-М.М. Айбазов // Сельскохозяйственный журнал. 2014. №7 (1).

4. Молекулярно-генетические исследования сельскохозяйственных животных методом ПЦР-ПДРФ: учебное пособие / Л.В. Гетманцева [и др.]; Донской ГАУ. -Персиановский: Донской ГАУ. 2018. C. 119.

5. Широкова Н. В., Оптимизация техники проведения ПЦР-ПДРФ для генотипиро-вания овец / Н. В. Широкова, Ю. А. Колосов, Л. В. Гетманцева, А. В. Радюк, Н. Ф. Бакоев // Научный журнал КубГАУ - Scientific Journal of KubSAU. 2015. № 113.

6. Effect of the GDF9 gene on the weight of lambs at birth / L. Getmantseva, N. Bakoev, S. Bakoev, N. Shirokova, M. Kolosova, A. Kolosov, Y. Kolosov, A. Usatov, V. Shev-tsova // Bulgarian Journal of Agricultural Science. 2019. Т. 25. № 1. P. 153-157.

7. Jawasreh K. Effect and Interaction of P-Lactoglobulin, Kappa Casein, and Prolactin Genes on Milk Production and Composition of Awassi Sheep / K. Jawasreh, A.A. Amareen, P .Aad // Animals 2019. 9(6). Р. 382.

8. Padilla P. Polymorphisms of a-lactoalbumin, P-lactoglobulin and prolactin genes are highly associated with milk composition traits in Spanish Merino sheep / P. Padilla, M. Izquierdo, M. Martinez-Trancon, J. Carlos Parejo, et al. // Livest. Sci. 2018. 217. Р. 26-29.

9. Селионова М. И. Породные особенности аллельного профиля генов, контролирующих молочную продуктивность крупного рогатого скота / М. И. Селионова, Л. Н. Чижова, Е. С. Суржикова и др. // АгроЗооТехника. 2019. № 1. Т. 2. С. 3.

Петухова Дарья Дмитриевна, аспирант, лаборатории иммуногенетики и ДНК-технологий. Младший научный сотрудник лаборатории геномной селекции и репродуктивной криобиологии в животноводстве ВНИИОК - филиал ФГБНУ «СевероКавказский ФНАЦ» г. Ставрополь. E-mail: D1319731@yandex.ru

Petukhova Daria Dmitrievna - postgraduate student of the Immunogenetics and DNA Technologies Laboratory. Junior Researcher of the Genomic Breeding and Reproductive Cryobiology in Livestock Laboratory, Federal State Budgetary Scientific Institution "North Caucasus FAR C", Stavropol. E-mail: D1319731@yandex.ru

DOI 10.25930/2687-1254/013.5.13.2020 УДК 636.32/.38.082.2

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ В СЕЛЕКЦИИ ОВЕЦ

А.В. Суховеева

Перспективными задачами в селекции и разведении сельскохозяйственных животных на сегодняшний день являются выявление параметров мясной продуктивности и пролиферативности у овец. Улучшение этих качеств позволит создать генофонд, и как следствие улучшит производительность баранины высокого качества. Массовое применение находит маркер-ассоциированный отбор (marker assisted selection - MAS) с использованием ДНК-маркеров, тесно сцепленных с локусами, детерминирующими важные признаки в овцеводстве. Поэтому выявляются ассоциированные с такими показателями гены-кандидаты, идентифицирующие однонуклеотидные полиморфизмы (Single Nucleotide Polymorphism - SNP), которые и определяют вариативность уровня продуктивности. Исследованиями установлено, что перспективными маркерами являются следующие гены: CAST (кальпастатин), GH (гормона роста, соматотропин), GDF9 (дифференциальный фактор роста) и BMPR-1B (ген морфогенетического белка кости). Целью настоящего обзора стал анализ современного состояния исследований по выявлению генов, контролирующих мясную продуктивность и воспроизводительные качества овец.

Ключевые слова: MAS, SNP, полиморфизм, CAST, GH, GDF9, BMPR-1B GENETIC MARKERS IN SHEEP BREEDING

A.V. Sukhoveeva

Nowadays, the promising goals in the farm animal breeding are the identification of meat productivity and sheep proliferation parameters. The improvement of these qualities will allow creating a gene pool. As a result, it will improve the productivity of high-quality mutton. Marker assisted selection (MAS) is widely used with DNA markers which are closely linked to locus that determine important traits in sheep breeding. Therefore, candidate genes associated with such indicators are disclosed that identify single nucleotide polymorphisms (SNPs), which determine the variability of the productivity level. Studies have established that promising genetic markers are the following: CAST (calpastatin), GH (growth hormone, somatotropin), GDF9 (growth differentiation factor), and BMPR-1B (bone morphogenetic protein receptor type 1B). The aim of this review was to analyze the current state of research