Модифицированная гомосериндегидрогеназа и способ получения гомосерина или L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, с ее использованием
MODIFIED HOMOSERINE DEHYDROGENASE AND METHOD OF PRODUCING HOMOSERINE OR L-AMINO ACID OF ORIGIN FROM HOMOSERINE USING THEREOF

Область техники
Настоящее раскрытие относится к модифицированной гомосериндегидрогеназе и, в частности, к модифицированной гомосериндегидрогеназе, имеющей полипептид, содержащий одну или более аминокислотных замен в аминокислотной последовательности белка, обладающего активностью гомосериндегидрогеназы, в которой аминокислотная замена включает замену аминокислоты в положении 407 аминокислотной последовательности гистидином; и к способу получения гомосерина или L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, с использованием модифицированной гомосериндегидрогеназы.
Предшествующий уровень техники
Среди L-аминокислот L-треонин, L-изолейцин и L-метионин обычно используют гомосерин, продуцируемый гомосериндегидрогеназой (далее “Hom”; EC:
1.1.1.3) из аспартат-полуальдегида (далее “ASA”). Следовательно, для получения аминокислот методом ферментации важно поддерживать активности ферментов, используемых в биосинтетическом пути, на определенном уровне или выше, и для этого были проведены интенсивные исследования.
В частности, известно, что активность гомосериндегидрогеназы, действующей в точке ветвления биосинтетических путей L-лизина и L-треонина, регулируется L- треонином и L-изолейцином. Недавно было несколько сообщений о Hom, десенсибилизированной к ингибированию L-треонином по принципу обратной связи и о способе получения L-треонина с ее использованием. В 1991 Eikmann et al. в Германии сообщили о Hom, десенсибилизированной посредством замены глицина, который представляет собой аминокислотный остаток в положении 378 Hom, глутаматом (Eikmanns BJ et al., Appl. Microbial Biotechnol. 34: 617–622, 1991); и в 1991 Archer et al. сообщили, что десенсибилизация происходит, когда С-конец Hom поврежден из-за мутации сдвига рамки считывания (Archer JA et al., Gene 107: 53–59, 1991).
Раскрытие
Техническая задача
Авторы настоящего изобретения провели исследование по десенсибилизации к ингибированию треонином по принципу обратной связи, и в результате они выделили новый ген, кодирующий модифицированную Hom, и подтвердили, что способность продуцировать L-аминокислоту улучшается в микроорганизме, в который был трансдуцирован новый ген, тем самым завершая настоящее раскрытие.
Решение технической задачи
Задачей настоящего изобретения является обеспечение модифицированной гомосериндегидрогеназы, в которой в аминокислотной последовательности белка, обладающего активностью гомосериндегидрогеназы, аминокислота в положении 407 аминокислотной последовательности заменена гистидином.
Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение полинуклеотида, кодирующего модифицированную дегидрогеназу.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение микроорганизма рода Corynebacterium, содержащего модифицированную гомосериндегидрогеназу.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа получения гомосерина или L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, который включает культивирование микроорганизма в среде; и выделение гомосерина или L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, из культивируемого микроорганизма или культуральной среды.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение способа увеличения продукции гомосерина или L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, в микроорганизме, включающего повышение активности модифицированной гомосериндегидрогеназы.
Еще одной задачей настоящего изобретения является обеспечение применения модифицированной гомосериндегидрогеназы для увеличения продукции гомосерина или L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина.
Полезные эффекты
Модифицированная гомосериндегидрогеназа по настоящему изобретению может широко использоваться для эффективного массового производства гомосерина или L- аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, потому что ингибирование конечным продуктом по принципу обратной связи десенсибилизируется по сравнению с природной гомосериндегидрогеназой или гомосериндегидрогеназой дикого типа.
Лучший способ осуществления изобретения
Ниже настоящее раскрытие описано подробно. При этом каждое из объяснений и примерных воплощений, раскрытых в данном документе, может применяться к другим объяснениям и примерным воплощениям. Таким образом, все комбинации различных факторов, раскрытых в данном документе, входят в объем настоящего раскрытия. Кроме того, объем настоящего раскрытия не должен ограничиваться конкретным описанием, приведенным ниже.
Чтобы достичь решения вышеуказанных задач, согласно аспекту настоящего изобретения предложена модифицированная гомосериндегидрогеназа, имеющая полипептид, содержащий одну или более аминокислотных замен в аминокислотной последовательности белка, обладающего активностью гомосериндегидрогеназы, в которой аминокислотная замена включает замену аминокислоты в положении 407 аминокислотной последовательности другой аминокислотой.
Конкретно, согласно настоящему раскрытию предложена модифицированная гомосериндегидрогеназа, имеющая полипептид, содержащий одну или более аминокислотных замен в аминокислотной последовательности белка, обладающего активностью гомосериндегидрогеназы, в которой аминокислотная замена включает замену аминокислоты в положении 407 аминокислотной последовательности гистидином. Более конкретно, согласно настоящему раскрытию предложена модифицированная гомосериндегидрогеназа, в которой аминокислота в положении 407 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменена гистидином.
В настоящем описании гомосериндегидрогеназа (EC: 1.1.1.3) относится к ферменту, который катализирует синтез гомосерина, являющегося обычным промежуточным соединением в биосинтезе метионина, треонина и изолейцина в растениях и микроорганизмах. В настоящем описании гомосериндегидрогеназа может быть включена независимо от ее происхождения при условии, что она обладает вышеуказанной конверсионной активностью, и фермент, имеющий происхождение из любого организма (растений, микроорганизмов и т.д.), может быть использован в качестве гомосериндегидрогеназы. Конкретно, гомосериндегидрогеназа может иметь происхождение из микроорганизма рода Corynebacterium и, более конкретно, может иметь происхождение из Corynebacterium glutamicum. Например, гомосериндегидрогеназа может представлять собой белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, можно использовать взаимозаменяемо с термином “белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1” или “белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1”.
В настоящем раскрытии могут быть использованы различные способы, хорошо известные в данной области, для получения гомосериндегидрогеназы. Примеры таких способов могут включать методики синтеза генов, включая оптимизацию кодонов для получения белков с высокой эффективностью в микроорганизме рода Corynebacterium, который обычно используется для экспрессии белков, и способы скрининга источников полезных ферментов с использованием биоинформационных методов на основе метагеномной информации микроорганизмов, но методы не ограничиваются этим.
В настоящем раскрытии в белке, обладающем активностью гомосериндегидрогеназы, не исключено наличие мутации, которая может возникать вследствие добавления нонсенс-последовательности до или после аминокислотной последовательности белка, обладающего активностью гомосериндегидрогеназы (например, аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1) или встречающейся в природе мутации или молчащей мутации. Кроме того, до тех пор, пока белок имеет активность, такую же или соответствующую белку, включающему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, белок также соответствует белку, обладающему активностью гомосериндегидрогеназы по настоящему изобретению. В качестве конкретного примера, белок, обладающий активностью гомосериндегидрогеназы по настоящему изобретению, может представлять собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или аминокислотной последовательности, имеющей гомологию с ней, составляющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97%.
Кроме того, хотя в настоящем раскрытии белок описан как “белок или полипептид, включающий аминокислотную последовательность конкретной SEQ ID NO”, очевидно, что любой белок, имеющий аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением части последовательности также может принадлежать к объему настоящего раскрытия, если белок имеет аминокислотную последовательность с любой из указанных выше гомологий и проявляет эффект, соответствующий указанному выше белку. Например, в настоящем раскрытии белок, обладающий активностью гомосериндегидрогеназы, может представлять собой гомосериндегидрогеназу, имеющую происхождение из Corynebacterium glutamicum. Более конкретно, белок, обладающий активностью гомосериндегидрогеназы, может представлять собой аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 1) гомосериндегидрогеназы, имеющей происхождение из Corynebacterium glutamicum ATCC13032, аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 40) гомосериндегидрогеназы, имеющей происхождение из Corynebacterium. glutamicum ATCC14067, или аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 41) гомосериндегидрогеназы, имеющей происхождение из Corynebacterium glutamicum ATCC13869. Поскольку гомосериндегидрогеназы, имеющие вышеуказанные последовательности, демонстрируют гомологию, составляющую по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97% по отношению друг к другу, и поскольку эти гомосериндегидрогеназы проявляют эффекты, соответствующие эффектам гомосериндегидрогеназы, очевидно, что они включены в белок, обладающий активностью гомосериндегидрогеназы, по настоящему изобретению.
Используемый здесь термин “гомология” относится к проценту идентичности между двумя полинуклеотидами или полипептидными фрагментами. Гомология относится к степени соответствия с данной аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью и может быть выражена в процентах. В настоящем описании гомология последовательности, обладающей активностью, которая идентична или сходна с данной аминокислотной последовательностью или нуклеотидной последовательностью, выражается как “% гомологии”. Гомология между последовательностями одного фрагмента c другим может быть определена методиками, известными в данной области. Например, гомология может быть подтверждена с помощью стандартного программного обеспечения (например, BLAST 2.0) для расчета параметров (например, оценки, идентичности и сходства) или путем сравнения последовательностей с помощью Саузерн-гибридизации. Подходящие условия гибридизации могут быть определены способом, известным специалистам в данной
области (например, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York).
Используемый здесь термин “модификация”, “модифицированный” или “вариант” относится к культуре или индивидууму, который демонстрирует наследуемое или не наследуемое изменение в одном устойчивом фенотипе. В частности, эти термины могут относиться к варианту, в котором его активность эффективно увеличена, поскольку одна или более чем одна аминокислота в аминокислотной последовательности, соответствующей белку, имеющему активность гомосериндегидрогеназы, модифицирована по сравнению с таковой у дикого типа, нативного типа или немодифицированного типа; варианту, который свободен от ингибирования по принципу обратной связи изолейцином, треонином или их аналогом или производным; или варианту, в котором достигается как увеличение активности, так и освобождение от ингибирования по принципу обратной связи.
В настоящем описании термин “модифицированная гомосериндегидрогеназа” может использоваться взаимозаменяемо с “вариантом гомосериндегидрогеназы”. При этом такой вариант может не быть встречающимся в природе.
Конкретно, модифицированная гомосериндегидрогеназа по настоящему изобретению может представлять собой модифицированный белок, имеющий полипептид, содержащий одну или более аминокислотных замен в аминокислотной последовательности белка, обладающего активностью гомосериндегидрогеназы, в которой аминокислотная замена включает замену аминокислоты в положении 407 аминокислотной последовательности гистидином. Аминокислотная последовательность белка, обладающего активностью гомосериндегидрогеназы, является такой, как описано выше, и может представлять собой, например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Кроме того, “аминокислота в положении 407” может относиться к аминокислоте в положении, соответствующем 407-ой аминокислоте с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и, конкретно, может относиться к 407-ой аминокислоте с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1. Аминокислота в положении 407 может быть аминокислотой, в которой аргинин заменен гистидином. Более конкретно, модифицированная гомосериндегидрогеназа по настоящему изобретению может представлять собой белок, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. Кроме того, в белке не исключена мутация, которая может возникать из-за добавления нонсенс-последовательности до или после аминокислотной последовательности, встречающаяся в природе мутация или молчащая мутация в ней и любой белок, который обладает активностью, идентичной или соответствующей активности модифицированной гомосериндегидрогеназы, соответствует белку, имеющему активность модифицированной гомосериндегидрогеназы по настоящему изобретению. В качестве конкретного примера, модифицированная гомосериндегидрогеназа по настоящему изобретению может представлять собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, или белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию с указанной выше аминокислотной последовательностью, составляющей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97%, в то время как 407-я аминокислота с N-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 является неизменной.
Кроме того, в отличие от белка дикого типа или нативного белка или немодифицированного белка, обладающего активностью гомосериндегидрогеназы, модифицированная гомосериндегидрогеназа по настоящему изобретению может представлять собой такую, которая свободна от ингибирования конечным продуктом (то есть изолейцином, треонином, метионином, гомосерином или его производным или аналогом) по принципу обратной связи, или в которой оно десенсибилизировано. Используемый здесь термин “ингибирование по принципу обратной связи” означает, что конечный продукт метаболизма предотвращает реакцию на ранней стадии. Следовательно, когда происходит освобождение гомосериндегидрогеназы от ингибирования по принципу обратной связи или его десенсибилизация, продуктивность гомосерина и продуктивность L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, может быть улучшена по сравнению с тем, когда ингибирование по принципу обратной связи не ослаблено или не десенсибилизировано.
L-аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, относится к L- аминокислоте, которая может быть биосинтезирована с использованием L-гомосерина в качестве предшественника и не ограничена, при условии, что она представляет собой материал, который может быть биосинтезирован из L-гомосерина. L-аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, может включать не только L-аминокислоту, имеющую происхождение от гомосерина, но также и ее производное. Например, L- аминокислота, L-аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, может представлять собой L-треонин, L-изолейцин, O-ацетил-L-гомосерин, O-сукцинил-L- гомосерин, O-фосфо-L-гомосерин, L-метионин и/или глицин, но L-аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, не ограничена этим. Более конкретно, L- аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, может представлять собой L-треонин, L-изолейцин, O-ацетил-L-гомосерин, O-сукцинил-L-гомосерин и/или L- метионин, но L-аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, этим не ограничивается.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий модифицированную гомосериндегидрогеназу.
Гомосериндегидрогеназа и вариант (модифицированный) являются такими, как описано выше.
Используемый здесь термин “полинуклеотид” относится к нуклеотидному полимеру, составленному из нуклеотидных мономеров, ковалентно связанных в длинную цепь (например, цепи ДНК или РНК, имеющие заданную или более длинную длину), и более конкретно, он относится к полинуклеотидному фрагменту, кодирующему модифицированную гомосериндегидрогеназу. Полинуклеотид, кодирующий модифицированный белок по настоящему изобретению, может быть включен без ограничения, если он имеет полинуклеотидную последовательность, кодирующую модифицированный белок, обладающий активностью гомосериндегидрогеназы, по настоящему изобретению.
В настоящем раскрытии полинуклеотид, кодирующий аминокислотную последовательность варианта гомосериндегидрогеназы, может конкретно иметь происхождение из микроорганизма рода Corynebacterium и более конкретно иметь происхождение из Corynebacterium glutamicum. Однако микроорганизм этим не ограничивается.
Кроме того, из-за вырожденности кода или с учетом предпочтительных кодонов в организме, в котором должен экспрессироваться белок, в кодирующей области полинуклеотида, кодирующего белок, могут быть сделаны различные модификации без изменения аминокислотной последовательности белка. В частности, полинуклеотид может представлять собой полинуклеотид, включающий полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок, или полинуклеотидную последовательность, имеющую гомологию с вышеуказанной полинуклеотидной последовательностью, составляющей по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 97%. Кроме того, очевидно, что полинуклеотидная последовательность с делецией, модификацией, заменой или добавлением части последовательности также может входить в объем настоящего изобретения, при условии, что она представляет собой полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок, имеющий указанные выше гомологии, и проявляющий эффект, по существу такой же, как у вышеуказанного белка, или соответствующий ему. Полинуклеотид, кодирующий белок, обладающий активностью гомосериндегидрогеназы по настоящему изобретению, может иметь полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Например, полинуклеотид может иметь полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, но не ограничивается этим. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий модифицированную гомосериндегидрогеназу по настоящему изобретению, может иметь полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, содержащий одну или более аминокислотных замен в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и, в частности, может иметь полинуклеотидную последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 8. Например, полинуклеотид может иметь полинуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 7, но не ограничивается этим.
Кроме того, зонд, который может быть получен из известной последовательности гена, например любой последовательности, которая гибридизуется с последовательностью, комплементарной всей или части полинуклеотидной последовательности в жестких условиях, и кодирует белок, обладающий активностью гомосериндегидрогеназы по настоящему изобретению, также может быть включен без ограничений. “Жесткие условия” означают условия, при которых допускается специфичная гибридизация между полинуклеотидами. Такие условия подробно описаны в литературе (например, J. Sambrook et al., выше). Жесткие условия могут включать, например, условия, при которых гены с высокой гомологией, составляющей 80% или более высокую гомологию, например 90% или более высокую гомологию, более конкретно 95% или более высокую гомологию, еще более конкретно 97% или более высокую гомологию, еще более конкретно 99% или более высокую гомологию, гибридизуются друг с другом, и гены, имеющие гомологию, меньшую, чем вышеуказанная гомология, не гибридизуются друг с другом, или обычные условия отмывки по Саузерн-гибридизации (то есть промывание один раз, особенно, два или три раза при концентрации соли и температуре, соответствующей 60°C, 1×SSC, 0,1% SDS, особенно, 60°C, 0,1×SSC, 0,1% SDS, и в особенности 68°C, 0,1×SSC, 0,1% SDS). Гибридизация требует, чтобы два полинуклеотида содержали комплементарные последовательности, хотя несоответствия между основаниями могут происходить в зависимости от жесткости гибридизации. Термин “комплементарный” используется для описания взаимосвязи между нуклеотидными основаниями, которые могут гибридизоваться друг с другом. Например, в отношении ДНК аденозин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Следовательно, настоящее раскрытие может также включать выделенный нуклеотидный фрагмент, комплементарный всей последовательности, а также нуклеотидную последовательность, по существу аналогичную ей. В частности, полинуклеотид, имеющий гомологию, может быть обнаружен с помощью условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при значении Tm, составляющем 55°C при вышеописанных условиях. Кроме того, значение Tm может составлять 60°C, 63°C или 65°C, но не ограничивается этим, и может соответствующим образом контролироваться специалистами в данной области в зависимости от цели. Соответствующая жесткость для гибридизации полинуклеотидов зависит от длины полинуклеотидов и степени комплементарности, и эти величины хорошо известны в данной области (см. Sambrook et al., выше, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
Еще один аспект настоящего изобретения относится к микроорганизму, содержащему модифицированную гомосериндегидрогеназу. Конкретно, согласно настоящему изобретению предложен микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий гомосерин или L-аминокислоту, имеющую происхождение от гомосерина, содержащий модифицированную гомосериндегидрогеназу.
Гомосериндегидрогеназа и вариант являются такими, как описано выше.
В частности, микроорганизм, содержащий модифицированную гомосериндегидрогеназу по настоящему изобретению, относится к микроорганизму, которому присуща способность продуцировать гомосерин или L-аминокислоту, имеющую происхождение от гомосерина, или микроорганизму, полученному из родительского штамма, не обладающего способностью продуцировать гомосерин или L-аминокислоту, имеющую происхождение от гомосерина, которому передается способность продуцировать гомосерин или L-аминокислоту, имеющую происхождение от гомосерина. В частности, микроорганизм, содержащий гомосериндегидрогеназу, может представлять собой микроорганизм, способный экспрессировать модифицированную гомосериндегидрогеназу, в которой аминокислота в положении 407 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 заменена гистидином, но микроорганизм этим не ограничивается. Микроорганизм может представлять собой клетку или микроорганизм, который включает полинуклеотид, кодирующий модифицированную гомосериндегидрогеназу или способен экспрессировать модифицированный полипептид путем трансформации вектором, который включает полинуклеотид, кодирующий модифицированную гомосериндегидрогеназу. Для задач настоящего изобретения клетка-хозяин или микроорганизм может представлять собой любой микроорганизм, способный продуцировать гомосерин или L-аминокислоту, имеющую происхождение от гомосерина, которые включают модифицированный полипептид.
Микроорганизм, содержащий модифицированную гомосериндегидрогеназу по настоящему изобретению, обладает улучшенной способностью продуцировать гомосерин и L-аминокислоту, имеющую происхождение от гомосерина, по сравнению с диким типом или микроорганизмом, включающим белок, обладающий активностью немодифицированной гомосериндегидрогеназы. Следовательно, гомосерин и L- аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, могут быть получены с высоким выходом из микроорганизма, включающего модифицированную гомосериндегидрогеназу по настоящему изобретению.
В настоящем раскрытии тип микроорганизма, включающего модифицированную гомосериндегидрогеназу, особенно не ограничен, но может быть микроорганизмом рода Enterobacter, микроорганизмом рода Escherichia, микроорганизмом рода Erwinia, микроорганизмом рода Serratia, микроорганизмом рода Pseudomonas, микроорганизмом рода Providencia, микроорганизмом рода Corynebacterium или микроорганизмом рода Brevibacterium. Более конкретно, микроорганизм может быть микроорганизмом рода Corynebacterium.
В настоящем раскрытии “микроорганизм рода Corynebacterium” может представлять собой, в частности, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, и т.д., но микроорганизм рода Corynebacterium не ограничен этим. Более конкретно, в настоящем раскрытии микроорганизм рода Corynebacterium может представлять собой Corynebacterium glutamicum.
При этом микроорганизм, содержащий модифицированную гомосериндегидрогеназу, может представлять собой микроорганизм, в который вводится вектор, включающий полинуклеотид, кодирующий вариант гомосериндегидрогеназы. В частности, введение может быть выполнено путем трансформации, но способ введения не ограничен этим.
Используемый здесь термин “вектор” относится к конструкции ДНК, включающей нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего целевой белок, в которой целевой белок функционально связан с подходящей контрольной последовательностью, так чтобы целевой белок мог экспрессироваться в подходящем хозяине. Контрольная последовательность может включать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность, контролирующую транскрипцию, последовательность, кодирующую подходящий домен связывания мРНК с рибосомой и последовательность, контролирующую терминацию транскрипции и трансляции. Вектор после трансформации в подходящую клетку-хозяина может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина или может быть интегрирован в геном самого хозяина.
Вектор, используемый в данном изобретении, особенно не ограничен, при условии, что он способен реплицироваться в клетке-хозяине, и можно использовать любой вектор, известный в данной области. Примеры обычных векторов могут включать природную или рекомбинантную плазмиду, космиду, вирус и бактериофаг. Например, pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A и т.п. можно использовать в качестве фагового вектора или космидного вектора; и тип pBR, тип pUC, тип pBluescriptII, тип pGEM, тип pTZ, тип pCL, тип pET и т.п. можно использовать в качестве плазмидного вектора. В частности, векторы pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и т.п. можно использовать, но вектор этим не ограничен.
Вектор, пригодный для использования в данном изобретении, особенно не ограничен, и можно использовать любой известный экспрессионный вектор. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий целевой белок, может быть вставлен в хромосому с помощью вектора для хромосомной вставки. Вставка полинуклеотида в хромосому может быть осуществлена любым способом, известным в данной области (например, гомологичной рекомбинацией), но способ этим не ограничивается. Вектор может дополнительно включать селективный маркер для подтверждения вставки полинуклеотида в хромосому. Селективный маркер предназначен для скрининга клеток, трансформированных вектором, то есть для определения, вставлена ли целевая молекула полинуклеотида. Можно использовать маркеры, которые обеспечивают селектируемый фенотип (например, лекарственную устойчивость, ауксотрофию, устойчивость к клеточным токсическим агентам или экспрессию поверхностных белков). В среде, обработанной селективным агентом, могут выживать только клетки, экспрессирующие выбранный маркер, или клетки могут демонстрировать разные фенотипы, и, таким образом, с помощью этого метода могут быть выбраны трансформированные клетки.
Используемый здесь термин “трансформация” относится к введению вектора, включающего полинуклеотид, кодирующий целевой белок, в клетку-хозяина таким образом, чтобы белок, кодируемый полинуклеотидом, экспрессировался в клетке- хозяине. До тех пор, пока трансформированный полинуклеотид может экспрессироваться в клетке-хозяине, не имеет значения, интегрирован ли трансформированный полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина и находится в ней или находится внехромосомно. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, кодирующие целевой белок. Полинуклеотид может быть введен в любой форме, при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессирован в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генную конструкцию, включающую все элементы, требуемые для автономной экспрессии гена. Экспрессионная кассета может включать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, терминатор транскрипции, сайт связывания с рибосомой или сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может быть в форме самореплицируемого эксрессионного вектора. Кроме того, полинуклеотид может быть введен в клетку-хозяина как есть и функционально связан с последовательностями, требуемыми для экспрессии в клетке-хозяине, но способ введения полинуклеотида этим не ограничивается. Способ трансформации включает любой метод введения полинуклеотида в клетку, и он может быть выполнен путем выбора подходящей стандартной методики, известной в данной области техники, в зависимости от клетки-хозяина. Примеры этого способа включают электропорацию, осаждение фосфатом кальция (Ca(H2PO4)2, CaHPO4 или Ca3(PO4)2), осаждение хлоридом кальция (CaCl2), микроинъекцию, методику с полиэтиленгликолем (PEG), методику с DEAE(диэтиламиноэтил)-декстраном, методику с использованием катионных липосом, методику с ацетатом лития и DMSO (диметилсульфоксид) и тому подобные, но способы трансформации этим не ограничиваются.
Кроме того, термин “функциональная связь” означает, что последовательность промотора, которая инициирует и опосредует транскрипцию полинуклеотида, кодирующего целевой белок по настоящему изобретению, функционально связана с полинуклеотидной последовательностью. Функциональная связь может быть получена с использованием методики рекомбинации генов, известной в данной области, и сайт- специфическое расщепление и связывание ДНК могут быть получены с использованием известных рестрикционных ферментов и лигаз, но способы функционального связывания этим не ограничиваются.
Микроорганизм, содержащий модифицированную гомосериндегидрогеназу, может представлять собой микроорганизм, который был трансформирован для включения модифицированной гомосериндегидрогеназы в микроорганизм рода Corynebacterium. Например, микроорганизм рода Corynebacterium может включать штамм, устойчивый к 2-амино-3-гидрокси-валерату (AHV); штамм, продуцирующий L-треонин путем замены лейцина (то есть аминокислоты в положении 377 аспартаткиназы (lysC)) лизином для устранения ингибирования по принципу обратной связи lysC (то есть первого важного фермента, действующего в пути биосинтеза треонина); штамм, продуцирующий L-изолейцин посредством замены аминокислоты в положении 323 гена ilvA, который кодирует дегидратазу L-треонина (то есть первый важный фермент, действующий в биосинтезе изолейцина) в штамме, продуцирующем L-треонин, аланином (Appl. Enviro. Microbiol., Dec. 1996, p. 4345-4351); штамм, продуцирующий O-ацетилгомосерин путем инактивации O-ацетилгомосерин(тиол)- лиазы, которая участвует в пути деградации O-ацетилгомосерина и цистатионин-гамма- синтазы; или штамм, продуцирующий метионин путем инактивации транскрипционных регуляторных факторов метионина и цистеина, но штаммы микроорганизма рода Corynebacterium не ограничены этим.
Еще один аспект настоящего изобретения относится к способу получения гомосерина или L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, включающему: культивирование вышеописанного микроорганизма в среде.
Способ получения L-аминокислоты может включать извлечение гомосерина или L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, из культивируемого микроорганизма или культивируемой среды.
Как описано выше, микроорганизм может представлять собой микроорганизм рода Corynebacterium, содержащим вариант гомосериндегидрогеназы по настоящему изобретению и более конкретно может представлять собой Corynebacterium glutamicum. Кроме того, микроорганизм рода Corynebacterium или Corynebacterium glutamicum представлять собой микроорганизм, продуцирующий гомосерин или полученную из гомосерина L-аминокислоту. L-аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, может включать не только L-аминокислоту, имеющую происхождение от гомосерина, но и ее производное. Например, L-аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, может представлять собой L-треонин, L-изолейцин, O-ацетил-L- гомосерин, O-сукцинил-L-гомосерин, O-фосфо-L-гомосерин, L-метионин и/или глицин,
но L-аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, не ограничена этим. Более конкретно L-аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, может представлять собой L-треонин, L-изолейцин, O-ацетил-L-гомосерин, O-сукцинил-L- гомосерин и/или L-метионин, но L-аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, не ограничена этим.
Гомосерин или L-аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, может представлять собой культуральную среду гомосерина или L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, вырабатываемую микроорганизмом, описанным в данном описании, или может находиться в очищенной форме. Специалистам в данной области техники очевидно, что гомосерин или L-аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, включает не только их, также и их соль.
Специалист в данной области может легко определить способ получения гомосерина или L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, в оптимизированных условиях для культивирования и условиях для активности фермента, известных в данной области.
В вышеупомянутом способе микроорганизм можно культивировать в процессе периодического культивирования, в процессе непрерывного культивирования, в процессе периодического культивирования с подпиткой и так далее, как известно в данной области техники, но процесс культивирования не ограничивается этим. В частности, что касается условий культивирования, то pH культуры может быть отрегулирован до подходящего pH (например, от pH 5 до pH 9, конкретно от 6 до 8 и наиболее конкретно до 6,8) с помощью соответствующего основного соединения (например, гидроксида натрия, гидроксида калия или аммиака) или кислого соединения (например, фосфорной кислоты или серной кислоты), а аэробное состояние культуры можно поддерживать путем введения в культуру кислорода или кислородсодержащей газовой смеси. Температура культивирования, как правило, может находиться в диапазоне от 20°С до 45°С и конкретно от 25° до 40°С в течение примерно от 10 до 160 часов, но условия культивирования этим не ограничиваются. Треонин, изолейцин или ацетилгомосерин, продуцируемые в процессе культивирования, могут секретироваться в культуру или могут оставаться в клетках.
Кроме того, в качестве источников углерода для питательной среды могут быть использованы отдельно или в комбинации сахар и углеводы (например, глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, меласса, крахмал и целлюлоза); масла и жиры (например, соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло); жирные кислоты (например, пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота); спирты (например, глицерин и этанол); органические кислоты (например, уксусная кислота); и тому подобные, но источники углерода не ограничиваются этим. В качестве источников азота для питательной среды могут использоваться отдельно или в комбинации азотсодержащие органические соединения (например, пептон, дрожжевой экстракт, мясной бульон, солодовый экстракт, жидкий кукурузный экстракт, соевая мука и мочевина) или неорганические соединения (например, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония) и тому подобное, но источники азота этим не ограничиваются. В качестве источников фосфора для культуральной среды можно использовать отдельно или в комбинации дигидрофосфат калия, гидрофосфат дикалия, соответствующие натрийсодержащие соли и тому подобное, но источники фосфора этим не ограничиваются. Кроме того, среда может содержать соли других металлов (например, сульфат магния или сульфат железа), аминокислоты, витамины и тому подобное, которые являются важными веществами, способствующими росту.
В соответствии с настоящим изобретением, способ извлечения гомосерина или L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, продуцируемой в процессе культивирования, может быть осуществлен путем сбора целевого продукта из культурального бульона с использованием подходящего метода, известного в данной области техники. Например, могут быть использованы такие методы, как центрифугирование, фильтрация, анионообменная хроматография, кристаллизация, HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) и так далее, и целевой материал, которым является гомосерин или L-аминокислота, имеющая происхождение от гомосерина, может быть извлечен из культивируемой среды или культивируемого микроорганизма с использованием подходящего метода, известного в данной области. Кроме того, извлечение может включать в себя дополнительный процесс очистки и может выполняться с использованием подходящего способа, известного в данной области.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено использование модифицированной гомосериндегидрогеназы для увеличения продукции гомосерина или L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина.
В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ увеличения продукции гомосерина или L-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, в микроорганизме, включающий повышение активности модифицированной гомосериндегидрогеназы.
Используемый здесь термин “экспрессироваться/быть экспрессируемым” относится к состоянию, в котором целевой белок введен в микроорганизм, или к ситуации, когда белок присутствует в микроорганизме и его активность повышается по сравнению с активностью эндогенного белка или белка до его модификации.
В частности, термин “введение белка” означает, что в микроорганизме проявляется активность конкретного белка, который изначально не был обнаружен в микроорганизме, или в микроорганизме белок проявляет повышенную активность по сравнению с его эндогенной активностью или активностью до модификации. Например, это может означать, что полинуклеотид, кодирующий конкретный белок, введен в хромосому микроорганизма или вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий конкретный белок, введен в микроорганизм и тем самым проявляет свою активность. Кроме того, термин “повышение активности” означает, что активность конкретного белка улучшена по сравнению с его эндогенной активностью или его активностью до модификации. Термин “эндогенный белок” относится к активности конкретного белка, изначально принадлежавшего родительскому штамму микроорганизма, в случае, когда признак микроорганизма изменяется из-за генетической модификации, вызванной естественным или искусственным фактором.
В частности, в настоящем раскрытии повышение активности может быть достигнуто с помощью одной или более чем одной из следующих методик: способ увеличения числа внутриклеточных копий гена, кодирующего вариант белка; способ введения модификации в последовательность, контролирующей экспрессию гена, кодирующего вариант белка; способ замены последовательности, контролирующей экспрессию гена, кодирующего вариант белка, последовательностью, имеющей высокую активность; способ замены гена, кодирующего нативный белок в хромосоме, обладающий активностью гомосериндегидрогеназы, на ген, кодирующий вариант белка; способ введения дополнительной модификации в ген, кодирующий белок, обладающий активностью гомосериндегидрогеназы, для повышения активности варианта белка; и способ введения варианта белка в микроорганизм, но способы этим не ограничиваются.
В приведенном выше описании число копий гена может быть увеличено в форме, в которой ген функционально связан с вектором или ген вставлен в хромосому клетки-хозяина, но способ этим не ограничивается. В частности, число копий гена может быть увеличено путем введения вектора в клетку-хозяина, где вектор функционально связан с полинуклеотидом, кодирующим белок по настоящему изобретению, и способен реплицироваться и функционировать независимо от клетки- хозяина. В качестве альтернативы, число копий гена может быть увеличено путем введения вектора, с которым функционально связан полинуклеотид, в хромосому клетки-хозяина. Вставка полинуклеотида в хромосому может быть достигнута способом, известным в данной области (например, гомологичной рекомбинацией).
Затем, чтобы увеличить экспрессию полинуклеотида, последовательность контроля экспрессии может быть модифицирована путем индуцирования модификации в ней путем делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации, чтобы дополнительно повысить активность последовательности контроля экспрессии; или заменой последовательности контроля экспрессии последовательностью нуклеиновой кислоты с более высокой активностью, но способ модификации особо не ограничивается этим. Последовательность контроля экспрессии может включать промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, последовательности, контролирующие терминацию транскрипции и трансляции и так далее, но последовательность контроля экспрессии этим не ограничивается.
Сильный промотор может быть связан с вышестоящей областью единицы экспрессии полинуклеотида вместо исходного промотора, но способ этим не ограничивается. Примеры сильных промоторов, известных в данной области, могут включать промоторы cj1 - cj7 (патент Кореи 10-0620092), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор фага лямбда PR, промотор PL, промотор tet, промотор gapA, промотор SPL7, промотор SPL13 (sm3) (патент Кореи 10-1783170), промотор O2 (патент Кореи 10-1632642), промотор tkt, промотор yccA, и тому подобные, но промоторы не ограничены этим
Кроме того, модификация полинуклеотидной последовательности в хромосоме может быть выполнена путем модификации последовательности контроля экспрессии с помощью делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации для дополнительного усиления активности полинуклеотидной последовательности; или путем замены полинуклеотидной последовательности полинуклеотидной последовательностью, модифицированной так, что она имеет более сильную активность, но способ модификации особо не ограничивается этим
Введение и усиление активности белка, как описано выше, может, как правило, увеличить активность или концентрацию соответствующего белка на по меньшей мере 1%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 25%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 100%, по меньшей мере 150%, по меньшей мере 200%, по меньшей мере 300%, по меньшей мере 400% или по меньшей мере 500%, и максимум 1000% или 2000%, в зависимости от активности или концентрации белка в штамме микроорганизма дикого типа или немодифицированного микроорганизма, но диапазон не ограничен этим.
Аминокислотная последовательность белка, обладающего активностью гомосериндегидрогеназы, аминокислота в положении 407 и микроорганизм являются такими, как описано выше.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее раскрытие будет подробно описано посредством примерных воплощений. Однако эти примерные воплощения предназначены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Пример 1: Скрининг AHV-устойчивых микроорганизмов путем искусственной моди фикации
В этом Примере был выполнен эксперимент по приданию устойчивости к 2- амино-3-гидрокси-валерату (в дальнейшем, “AHV”), который представляет собой аналог L-треонина, с использованием Corynebacterium glutamicum KFCC10881 (патент Кореи 0159812) в качестве родительского штамма, чтобы освободить от ингибирования гомосериндегидрогеназы (в дальнейшем, “Hom”, EC:1.1.1.3) L-треонином по принципу обратной связи.
Модификацию индуцировали методом искусственной модификации с использованием N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина (в дальнейшем, “NTG”). Штамм KFCC10881, который культивировали в среде для посева в течение 18 часов, инокулировали в 4 мл среды для посева и затем культивировали до достижения OD660 приблизительно 1,0. Культуральную среду центрифугировали для извлечения клеток, а затем клетки дважды промывали 50 мМ трис-малатным буфером (рН 6,5) и суспендировали в конечных 4 мл того же буфера. К суспензии клеток добавляли раствор NTG (2 мг/мл в 0,05 М трис-малатном буфере (рН 6,5)) до конечной концентрации 150 мг/л, а затем оставляли стоять при комнатной температуре в течение 20 минут. После этого клетки извлекали центрифугированием и дважды промывали тем же буфером для удаления NTG. Окончательно промытые клетки суспендировали в 4 мл 20% раствора глицерина и затем хранили при -70°С до использования. Штаммы, обработанные NTG, высевали на минимальную среду, содержащую 3 г/л AHV, и затем 126 AHV-устойчивых штаммов, имеющих происхождение от KFCC10881, были получены посредством вышеуказанной процедуры.
Среда для посева (pH 7,0)
20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH2PO4, 8 г K2HPO4, 0,5 г MgSO4 7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 2000 мкг никотинамида (из расчета на 1 л дистиллированной воды)
Минимальная среда (pH 7,2)
5 г глюкозы, 1 г KH2PO4, 5 г (NH4) 2SO4, 0,4 г MgSO4 7H2O, 0,5 г NaCl, 200 мкг биотина, 100 мкг тиамина HCl, 100 мкг пантотената кальция, 0,03 г никотинамида, 2 г мочевины, 0,09 мг Na2B4O7 10H2O, 0,04 мг (NH4)6Mo7O27 4H2O, 0,01 мг ZnSO4 7H2O, CuSO4 5H2O, 0,01 мг MnCl2 4H2O, 1 мг FeCl3 6H2O, 0,01 мг CaCl2 (из расчета на 1 л дистиллированной воды)
Пример 2: Тестпродуцирования L-Треонина для AHV-устойчивого штамма, полученного из KFC C 10881
Тест на способность продуцировать L-треонин был проведен на 126 AHV-устойчивых штаммах, полученных в Примере 1. 126 штаммов, полученных в Примере 1, инокулировали в отдельную колбу с угловыми перегородками (250 мл), содержащую среду для посева (25 мл), и затем культивировали при встряхивании при 30°С и 200 об/мин в течение 20 часов. Культуральную среду для посева (1 мл) инокулировали в отдельную колбу с угловыми перегородками (250 мл), содержащую среду для продуцирования L-треонина (24 мл) и затем культивировали при встряхивании при 30°C и 200 об/мин в течение 48 часов.
Среда для продуцирования L-Треонина (pH 7,2)
30 г глюкозы, 2 г KH2PO4, 3 г мочевины, 40 г (NH4)2SO4, 2,5 г пептона, 5 г (10 мл) CSL (Sigma), 0,5 г MgSO4 7H2O, 400 мг лейцина, 20 г CaCO3 (из расчета на 1 л дистиллированной воды).
После культивирования количества различных продуцируемых аминокислот измеряли с помощью HPLC. Концентрации аминокислот в культуральной среде для 5 лучших штаммов, которые, как было показано, обладают отличными способностями к продуцированию L-треонина среди 126 экспериментальных штаммов, показаны в таблице 1. 5 штаммов-кандидатов, подтвержденных с помощью вышеуказанной процедуры, были названы KFCC10881-1 - KFCC10881-5.
Таблица 1. Эксперименты по продуцированию L-треонина превосходными AHV-устойчивыми штаммами
OD
Thr
Hse
Gly
Ile
Lys
Thr+Hse+Gly+Ile
KFCC10881
60,1
0,0
0,1
0,2
0,0
12,3
0,3
KFCC10881-1
53,6
4,1
1,3
1,4
1,2
2,0
8,0
KFCC10881-2
53,3
2,2
0,9
1,0
1,1
8,3
5,2
KFCC10881-3
68,5
1,5
1,2
1,1
0,2
10,8
4,0
KFCC10881-4
59,1
1,2
0,9
1,0
0,7
1,9
3,8
KFCC10881-5
49,6
2,4
1,1
1,2
0,9
5,4
5,6
Как показано в таблице 1, количество L-треонина, L-гомосерина, глицина, L- аланина и L-изолейцина, которые продуцируются 5 типами штаммов, обладающих устойчивостью к AHV, были увеличены по сравнению с контрольной группой, тогда как количество продуцируемого L-лизина уменьшилось.
Биосинтетические пути L-треонина и L-лизина отделены от аспартат- полуальдегида (в дальнейшем, “ASA”) в точке разветвления. То есть количество продуцируемого L-лизина уменьшается с увеличением количества продуцируемого L- треонина Соответственно, количества гомосерина (Hse), глицина (Gly) и L-изолейцина (Ile), которые могут быть побочными продуктами биосинтеза L-треонина, могут быть увеличены по мере увеличения количества продуцируемого L-треонина. и, таким образом, общее количество полученного продукта (Thr + Hse + Gly + Ile) также было подтверждено.
Следовательно, среди вышеупомянутых AHV-устойчивых штаммов - штамм KFCC10881-1, который показал пониженное количество продукции L-лизина, повышенное количество продукции L-треонина и большое количество общей продукции (Thr + Hse + Gly + Ile), был выбран как наиболее превосходный AHV- устойчивый штамм.
Пример 3: Анализ нуклеотидных последовательностей штаммов, обладающих превосходной способностью продуцировать треонин, имеющих происхождение из KFCC10881
Для анализа нуклеотидных последовательностей ферментов биосинтеза L- треонина штамма, выбранного в Примере 2 выше, был проведен следующий эксперимент. На основании информации о генах, предоставленной Энциклопедией генов и геномов Киото (KEGG), была получена каждая нуклеотидная последовательность hom (SEQ ID NO: 2, NCgl1136), которая кодирует гомосериндегидрогеназу Corynebacterium glutamicum ATCC13032, и нуклеотидная последовательность thrB (SEQ ID NO: 3, Ген No.NCgl1137), которая кодирует гомосеринкиназу. Известно, что оба гена hom и thrB имеют оперонную структуру (Peoples et al., Mol. Biol. 2(1):63-72, 1988).
Для получения фрагмента ДНК, содержащего оперон hom-thrB выбранного штамма, проводили PCR (полимеразная цепная реакция) с использованием геномной ДНК штамма в качестве матрицы и набора праймеров SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5. Высокоточную ДНК-полимеразу PfuUltra ™ (Stratagene) использовали в качестве полимеразы для реакции PCR. Условия PCR были следующими: 30 циклов денатурации при 96°C в течение 30 секунд, отжиг при 52°C в течение 30 секунд и полимеризация при 72°C в течение 3 минут. В результате оказалось возможным амплифицировать фрагмент гена (2778 п.н; SEQ ID NO: 6), который включает нуклеотидную последовательность (300 п.н.), содержащую промоторную область перед кодоном инициации SEQ ID NO: 2, для включения 200 п.н. ниже терминирующего кодона SEQ ID NO: 3.
Нуклеотидную последовательность определяли с использованием приготовленных праймеров с помощью анализатора ABI PRISM 3730XL (тип 96 капилляров; Applied Biosystems). В нуклеотидной последовательности, соответствующей hom оперона hom-thrB в штамме KFCC10881-1, гуанин (то есть нуклеотид в положении 1220 последовательности SEQ ID NO: 2) был модифицирован в аденин и таким образом кодон CGT гена, кодирующего остаток аргинина был модифицирован в кодон CAT гена, кодирующий остаток гистидина (в дальнейшем, “модификация R407H”; SEQ ID NO: 7). При этом никакой модификации не было обнаружено в гене thrB, соответствующем SEQ ID NO: 3.
Из приведенного выше анализа нуклеотидной последовательности можно сделать вывод, что ингибирование L-треонином по принципу обратной связи было десенсибилизировано посредством модификации аргинина (то есть 407-го аминокислотного остатка) из Hom (SEQ ID NO:8) в штамме KFCC10881-1 на гистидин (в дальнейшем, “модификация R407H”).
Пример 4: Получение новых штаммов, в которые была введена гомосериндегидрогеназа
Набор праймеров SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 был приготовлен так, чтобы получить штаммы, в которых вариант (R407H), идентифицированный в Примере 2, был введен в их штаммы дикого типа.
Для получения штаммов, в которые была введена каждая из модификаций R407H hom, проводили PCR с использованием геномной ДНК, выделенной из штамма KFCC10811-1, в качестве матрицы и набора праймеров SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10. ДНК-полимеразу PfuUltra™ с высокой точностью (Stratagene) использовали в качестве полимеразы для реакции PCR. Условия PCR были следующими: 28 циклов денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 55°C в течение 30 секунд и полимеризация при 72°С в течение 2 минут, В результате был получен фрагмент гена (1668 п.н.), включающий промоторную область (приблизительно 300 п.н.) гена hom (1338 п.н.). Амплифицированный продукт очищали с использованием набора для очистки PCR (QIAGEN) и использовали в качестве вставки фрагмента ДНК для получения вектора. При этом после обработки рестриктазой SmaI отношение молярной концентрации (М) вектора pDZ (патент Кореи № 10-0924065), подвергнутого тепловой обработке при 65°С в течение 20 минут, к вставленному фрагменту ДНК, амплифицированному выше с помощью PCR, было установлено как 1:2, и вектор был клонирован с использованием набора для клонирования Infusion Cloning Kit (TaKaRa) в соответствии с руководством производителя, и, таким образом, был получен вектор для введения модификации R407H в хромосому, pDZ-R407H.
Вектором pDZ-R407H была трансформирована Corynebacterium glutamicum ATCC13032 путем электропорации и подвергнут вторичному кроссинговеру, и, таким образом, был получен штамм, у которого в хромосому была введена замена модифицированного нуклеотида. Используя наборы праймеров, перечисленные ниже, и метод PCR специфической амплификации мутантного аллеля (MASA) (Takeda et al., Hum. Mutation, 2, 112-117 (1993)), то, является ли замена подходящей, в первую очередь определяли путем отбора штамма, амплифицированного с использованием набора праймеров, соответствующего модифицированной последовательности (SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12). Кроме того, анализ последовательности hom отобранного штамма проводили для вторичного подтверждения того, является ли замена подходящей, с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 13 и путем анализа модифицированной последовательности таким же образом, как в Примере 2. Штамм с замененным модифицированным нуклеотидом был назван CA09-0900.
Штамм CA09-0900 был депонирован в Корейском культурном центре микроорганизмов (KCCM), Международном депозитарном органе в соответствии с Будапештским договором, 14 декабря 2018 года, и ему был присвоен регистрационный номер KCCM12418P.
Пример 5: Измерение активности гомосериндегидрогеназы
Активность фермента Hom измеряли в полученном штамме. Каждый из штамма дикого типа ATCC13032 (контрольная группа) и штамма CA09-0900, полученного в Примере 4, инокулировали в 25 мл среды для посева и культивировали до тех пор, пока штаммы не достигали поздней логарифмической фазы. Клетки каждого штамма извлекали центрифугированием, дважды промывали 0,1 М калий-фосфатным буфером (рН 7,6) и, наконец, суспендировали в 2 мл того же буфера, содержащего глицерин в концентрации 30%. Каждую клеточную суспензию физически разрушали посредством обычного метода встряхивания со стеклянными шариками в течение 10 минут, и каждый супернатант извлекали посредством двух центрифугирований (13000 об/мин, 4°С, 30 минут) и использовали в качестве неочищенного экстракта для измерения активности Hom. Для измерения активности Hom раствор кофермента (0,1 мл) добавляли к реакционному раствору для измерения активности фермента (калий- фосфатный буфер (pH 7,0), 25 мМ NADPH, 5 мМ аспартатный полуальдегид) и проводили реакцию при 30°C. Активность фермента U Hom определяли как количество мкмоль NADPH, потребляемых в минуту, в соответствии с присутствием L-треонина (0 мМ, 10 мМ), и результаты измерения активности фермента приведены в Таблице 2 ниже.
Таблица 2
Измерение активности (U) Hom и десенсибилизация L-треонином
Штамм
Активность фермента (U) в соответствии с добавленным количеством L-Треонина (мМ)
0 мМ
10 мМ
ATCC13032
0,91
0,02
CA09-0900
1,37
1,23
В результате эксперимента было подтверждено, что в Hom, включающей модификацию R407H, ингибирование активности снижалось в условиях содержания
10 мМ L-треонина, в отличие от Hom дикого типа, подтверждая тем самым возникновение десенсибилизации к L-треонину.
Пример 6: Получение и оценка штаммов микроорганизмов рода Corynebacterium, обладающих способностью продуцировать L-треонин
Штаммы, продуцирующие L-треонин, были созданы из Corynebacterium glutamicum ATCC13032 дикого типа. Конкретно, чтобы устранить ингибирование по принципу обратной связи аспартаткиназой (lysC) (то есть важным ферментом, который действует первым на пути биосинтеза треонина), лейцин (то есть аминокислота в положении 377 в lysC) был заменен лизином (SEQ ID NO: 14).
Более конкретно, для получения штаммов, в которые введена модификация lysC (L377K), проводили PCR с использованием хромосомы ATCC13032 в качестве матрицы и набора праймеров SEQ ID NO: 15 и 16 или SEQ ID NO: 17 и 18. ДНК-полимеразу PfuUltra™ с высокой точностью (Stratagene) использовали в качестве полимеразы для реакции PCR. Условия PCR были следующими: 28 циклов денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжиг при 55°C в течение 30 секунд и полимеризация при 72°C в течение 1 минуты. В результате был получен фрагмент ДНК (515 п.н.) в 5'-верхней области и фрагмент ДНК (538 п.н.) в 3'-нижней области с сайтом модификации гена lysC в качестве центра. PCR проводили с двумя амплифицированными фрагментами ДНК в качестве матрицы и набором праймеров SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 18. PCR проводили следующим образом: денатурация при 95°C в течение 5 минут; 28 циклов денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжиг при 55°C в течение 30 секунд и полимеризация при 72°C в течение 2 минут; и полимеризация при 72°C в течение 5 минут. В результате был амплифицирован фрагмент ДНК (1,023 п.н.), включающий модификацию гена lysC, который кодирует вариант аспартокиназы, в котором лейцин в положении 377 заменен лизином. Амплифицированный продукт очищали с использованием набора для очистки PCR (QIAGEN) и использовали в качестве вставного фрагмента ДНК для получения вектора. Между тем, после обработки рестриктазой SmaI отношение молярной концентрации (М) вектора pDZ (патент Кореи № 10-0924065), подвергнутого тепловой обработке при 65°C в течение 20 минут, к вставленному фрагменту ДНК, амплифицированному выше с помощью PCR было установлено как 1:2, и вектор был клонирован с использованием Infusion Cloning Kit (TaKaRa) в соответствии с руководством производителя и, таким образом, был получен вектор для введения модификации L377K в хромосому, pDZ-L377K.
Полученным вектором pDZ-L377K был трансформирован штамм ATCC13032 и подвергнут вторичному кроссинговеру и, таким образом, был получен штамм, в котором была введена замена модифицированного нуклеотида в хромосому. Штамм был назван CJP1. Штамм CJP1 был снова назван CA01-2307, депонирован в Корейском культурном центре микроорганизмов (KCCM), Международном депозитарном органе в соответствии с Будапештским договором, 29 марта 2017 года, и получил регистрационный номер KCCM12000P. Чтобы подтвердить изменения в продукции L- треонина вышеуказанного штамма, модификация, идентифицированная в Примере 4, была введена в ген, кодирующий гомосериндегидрогеназу. Конкретно, для введения модификации R407H в штамм CJP1, вектором pDZ-R407H, полученный в Примере 4, был трансформирован штамм CJP1 путем электропорации и подвергнут вторичному кроссинговеру, и, таким образом, был получен штамм, в котором модифицированный нуклеотид был введен в хромосому. Штамм с замененным модифицированным нуклеотидом был назван CJP1-R407H.
Таблица 3
Определение L-треонин-продуцирующей способности в полученных штаммах
Штамм
Аминокислота (г/л)
Thr
Lys
CJP1
0,36
3,62
CJP1-R407H
1,50
2,47
В результате в штамме, в который была введена модификация, количество продуцируемого L-лизина уменьшилось, а количество продуцируемого L-треонина увеличилось на 1,14 г/л по сравнению со штаммом CJP1 (контрольная группа), подтверждая тем самым значительное улучшение эффекта десенсибилизации.
Пример 7: Получение и оценка штаммов микроорганизмов рода Corynebacterium, продуцирующих L-изолейцин
Для получения штаммов, продуцирующих изолейцин, был получен вектор для усиления экспрессии модифицированного гена ilvA (V323A) (Appl. Enviro. Microbiol., Dec. 1996, p. 4345-4351), который кодирует известную L-треонин дегидратазу (первый фермент в пути биосинтеза изолейцина) в штаммах, полученных в Примере 6.
Конкретно, чтобы получить вектор для введения модификации, которая нацелена на ген ilvA, были разработаны пара праймеров (SEQ ID NO: 19 и 20) для амплификации
5'-верхней области и пара праймеров (SEQ ID NO: 21 и 22) для усиления 3'-нижней области, с сайтом модификации в качестве центра. Сайты рестрикционного фермента BamHI вставляли на каждом конце праймеров SEQ ID NO: 19 и 22, и праймеры SEQ ID NO: 20 и 21 были сконструированы таким образом, чтобы модификация замены нуклеотида могла быть расположена в области, где должен быть вызван кроссинговер.
PCR проводили с хромосомой штамма дикого типа в качестве матрицы с использованием праймеров SEQ ID NO: 19, 20, 21 и 22. PCR проводили следующим образом: денатурация при 95°C в течение 5 минут; 30 циклов денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжиг при 55°C в течение 30 секунд и полимеризация при 72°C в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°C в течение 7 минут. В результате был получен фрагмент ДНК (627 п.н.) в 5'-верхней области и фрагмент ДНК (608 п.н.) в 3'- нижней области с сайтом модификации гена ilvA в качестве центра.
PCR проводили с использованием двух амплифицированных фрагментов ДНК в качестве матрицы и набора праймеров SEQ ID NO: 19 и 22. PCR проводили следующим образом: денатурация при 95°C в течение 5 минут; 30 циклов денатурации при 95°C в течение 30 секунд, отжиг при 55°C в течение 30 секунд и полимеризация при 72°C в течение 60 секунд; и полимеризация при 72°C в течение 7 минут. В результате был амплифицирован фрагмент ДНК (1217 п.н.), в котором фрагмент ДНК включал модификацию гена ilvA, кодирующего вариант IlvA, где валин в положении 323 был заменен аланином. Вектор pECCG117 (патент Кореи № 10-0057684) и фрагмент ДНК (1217 п.н.) обрабатывали рестриктазой BamHI, лигировали с использованием ДНК- лигазы и затем клонировали для получения плазмиды. Полученная таким образом плазмида была названа pECCG117-ilvA (V323A).
Вектор pECCG117-ilvA (V323A) вводили в штамм CJP1-R407H, полученный в Примере 6, путем электропорации и высевали на селективную среду, содержащую канамицин (25 мг/л), для получения трансформированных штаммов. Полученные таким образом трансформированные штаммы культивировали посредством того же способа культивирования в колбах, как в Примере 2, и анализировали концентрации L- изолейцина в культуральных средах. Результаты приведены в Таблице 4 ниже.
Таблица 4
Подтверждение L-изолейцин-продуцирующей способности полученных штаммов
Штамм
L-изолейцин (г/л)
CJP1/pECCG117-ilvA(V323A)
0,7
CJP1-R407H/pECCG117-ilvA(V323A)
1,4
В результате было подтверждено, что в штамме, включающем модификацию hom (R407H), способность продуцировать L-изолейцин была улучшена на 0,7 г/л по сравнению с контрольным штаммом.
Пример 8: Получение и оценка штамма, продуцирующего O-ацетил-гомосерин (OAH ) с заменой модифицированной Hom
8-1. Получение штамма AT CC13032 с заменой модифицированной Hom
Модификацию R407H вводили в ген hom штамма ATCC13032 таким же образом, как в Примере 4, и полученный таким образом штамм был назван ATCC13032::HomFBR.
8-2. Делеция гена metB
В этом Примере ген metB, кодирующий цистатион-гамма-синтазу в пути разложения О-ацетил-гомосерина, был получен посредством PCR с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13032 в качестве матрицы. На основании GenBank Национального института здравоохранения (NIH GenBank) была получена информация о нуклеотидной последовательности metB (регистрационный номер NCBI Ncgl2360; SEQ ID NO: 23). Кроме того, основываясь на этом, были синтезированы праймеры (SEQ ID NO: 24 и 25), содержащие N-конец и линкерную последовательность гена metB, и праймеры (SEQ ID NO: 26 и 27), содержащие C-конец и линкерную последовательность гена metB. PCR проводили с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13032 в качестве матрицы и олигонуклеотидов с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 24 и 25 и SEQ ID NO: 26 и 27 в качестве наборов праймеров. В качестве полимеразы использовали ДНК-полимеразу PfuUltra™ с высокой точностью (Stratagene). PCR проводили следующим образом: 30 циклов денатурации при 96°C в течение 30 секунд, отжиг при 53°C в течение 30 секунд и полимеризация при 72°C в течение 1 минуты; и полимеризация при 72°C в течение 7 минут. В результате был получен амплифицированный ген (500 п.н.), содержащий N-конец и линкер гена metB, и амплифицированный ген (500 п.н.), содержащий С-конец и линкер гена metB.
PCR проводили с использованием двух полученных таким образом амплифицированных генов в качестве матрицы и набора праймеров SEQ ID NO: 24 и 27 при следующих условиях: 30 циклов денатурации при 96°C в течение 60 секунд, отжиг при 50°C для 60 секунд и полимеризация при 72°C в течение 1 минуты; и полимеризация при 72°C в течение 7 минут. В результате был получен амплифицированный ген ΔmetB (1000 п.н.), который представляет собой кассету инактивации metB, содержащую N-конец-линкер-C-конец гена metB. Ген metB, полученный с помощью PCR, обрабатывали рестриктазами XbaI и SalI, сайты которых вставлены на концах, а затем клонировали в вектор pDZ, который предварительно обрабатывали рестриктазами XbaI и SalI, посредством лигирования. Таким образом был получен рекомбинантный вектор pDZ-ΔmetB, в который окончательно была клонирована кассета инактивации metB.
Полученным вектором pDZ-ΔmetB трансформировали штаммы Corynebacterium glutamicum ATCC13032 и ATCC13032::HomFBR. После вторичного кроссинговера были получены штаммы Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ΔmetB и ATCC13032::HomFBR ΔmetB, в которых ген metB инактивирован в хромосоме. Инактивация гена metB была окончательно подтверждена проведением PCR с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 24 и 27 с последующим сравнением последовательности со штаммом ATCC13032, в котором ген metB не инактивирован.
8-3. Делеция гена metY
В этом Примере ген metY, кодирующий O-ацетилгомосерин(тиол)-лиазу в пути разложения O-ацетил-гомосерина, был получен с помощью PCR с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13032 в качестве матрицы. На основании данных GenBank Национального института здравоохранения (NIH GenBank) была получена информация о нуклеотидной последовательности гена metY (регистрационный номер NCBI Ncgl0625; SEQ ID NO: 28). Кроме того, основываясь на этом, были синтезированы праймеры (SEQ ID NO: 29 и 30), содержащие N-конец и линкерную последовательность гена metY, и праймеры (SEQ ID NO: 31 и 32), содержащие C-конец и линкерную последовательность гена metY.
PCR проводили с хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13032 в качестве матрицы, используя олигонуклеотиды с нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO: 29 и 30 и SEQ ID NO: 31 и 32 в качестве наборов праймеров. В качестве полимеразы использовали ДНК-полимеразу PfuUltra™ с высокой точностью (Stratagene). PCR проводили следующим образом: 30 циклов денатурации при 96°C в течение 30 секунд, отжиг при 53°C в течение 30 секунд и полимеризация при 72°C в течение 1 минуты; и полимеризация при 72°C в течение 7 минут. В результате был получен амплифицированный ген (500 п.н.), содержащий N- конец и линкер гена metY, и амплифицированный ген (500 п.н.), содержащий С-конец и линкер гена metY. PCR проводили с использованием двух полученных таким образом амплифицированных генов в качестве матрицы и набора праймеров SEQ ID NO: 29 и 32 при следующих условиях: 10 циклов денатурации при 96°C в течение 60 секунд, отжиг при 50°C в течение 60 секунд и полимеризация при 72°C в течение 1 минуты; и полимеризация при 72°C в течение 7 минут. В результате был получен амплифицированный ген ΔmetY (1000 п.н.), который представляет собой кассету инактивации metY, содержащую N-конец-линкер-С-конец гена metY.
Ген metY, полученный с помощью PCR, обрабатывали рестриктазами XbaI и SalI, сайты которых были расположены на концах, а затем клонировали посредством лигирования в вектор pDZ, который предварительно обрабатывали рестриктазами XbaI и SalI. После этого был получен рекомбинантный вектор pDZ-ΔmetY, в который окончательно была клонирована кассета инактивации metY.
Полученный вектор pDZ-ΔmetY трансформировали в штаммы Corynebacterium glutamicum ATCC13032, ATCC13032::HomFBR, ATCC13032 ΔmetB и ATCC13032::HomFBR ΔmetB. После вторичного кроссинговера были получены штаммы Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ΔmetY, ATCC13032::HomFBR ΔmetY, ATCC13032 ΔmetB ΔmetY и ATCC13032::HomFBR ΔmetB ΔmetY, в которых ген metY инактивирован в хромосоме. Наконец, инактивация гена metY была подтверждена путем проведения PCR с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 29 и 32 с последующим сравнением последовательности с ATCC13032, в которой ген metY не инактивирован.
8-4. Получение и оценка штамма, продуцирующего O-ацетил-гомосерин
Было проведено сравнение O-ацетил-гомосерин-продуцирующих способностей штаммов ATCC13032, ATCC13032 ΔmetB, ATCC13032 ΔmetY, ATCC13032 ΔmetBΔmetY, ATCC13032::HomFBR, ATCC13032::HomFBR ΔmetB, ATCC13032::HomFBR ΔmetY, и ATCC13032::HomFBR ΔmetBΔmetY, полученными в Примерах 8-1 - 8-3, в которых делетированы гены metB, metY, и metBY а модифицированный ген hom подвергнут замене.
Конкретно, отдельные колонии культивировали в твердой среде LB в течение ночи в инкубаторе при 32°С, и одну петлю каждой из отдельных колоний инокулировали в титрационную среду с O-ацетил-гомосерином (25 мл), а затем полученные продукты роста культивировали при 32°C при 250 об/мин в течение от 42 до 64 часов. O-ацетил-гомосерин из каждой культуры анализировали посредством HPLC, и результаты показаны в Таблице 5 ниже.
Среда для продуцирования O-ацетил-L-гомосерина (pH 7,2)
30 г глюкозы, 2 г KH2PO4, 3 г мочевины, 40 г (NH4)2SO4, 2,5 г пептона, 5 г (10 мл) CSL (Sigma), 0,5 г MgSO4 • 7H2O, 400 мг метионина, 400 мг лейцина, 20 г CaCO3 (из расчета на 1 л дистиллированной воды)
Таблица 5. Оценка продуцирования О-ацетил-гомосерина
Штаммы
О-АН продуцирование (г/л)
ATCC13032
-
0,0
metB
0,3
metY
0,3
metBY
0,5
ATCC13032::HomFBR (R407H)
-
0,0
metB
1,3
metY
1,5
metBY
3,7
В результате, как показано в Таблице 5 выше, O-ацетил-L-гомосерин не накапливался при культивировании Corynebacterium glutamicum ATCC13032, контрольного штамма; тогда как O-ацетил-L-гомосерин накапливался в количестве 0,3 г/л, 0,3 г/л и 0,5 г/л для каждого из штаммов ATCC13032 ΔmetB, ATCC13032 ΔmetY и ATCC13032 ΔmetB ΔmetY, соответственно, в которых инактивированы гены metB, metY и metBY.
Кроме того, в случае штамма ATCC13032::HomFBR, в котором ген hom заменен в форме R407H, и штаммов ATCC13032::HomFBR ΔmetB, ATCC13032::HomFBR ΔmetY и ATCC13032::HomFBR ΔmetB ΔmetY, в которых гены metB, metY и metBY инактивированы, соответственно, было подтверждено, что O-ацетил-L-гомосерин накапливался в количестве 1,3 г/л, 1,5 г/л и 3,7 г/л для каждого из этих штаммов.
Следовательно, на основании приведенных выше результатов было подтверждено, что количество продуцируемой целевой аминокислоты, предшественником которой является гомосерин, может быть значительно увеличено с использованием модифицированного hom по настоящему изобретению.
Пример 9: Получение и оценка штаммов, продуцирующих L-метионин
Пример 9-1: Получение рекомбинантного вектора для делеции гена mcbR
В этом Примере для получения штаммов, продуцирующих метионин, был получен вектор для инактивации гена mcbR (J. Biotechnol. 103: 51-65, 2003), который кодирует известные регуляторные белки транскрипции метионина и цистеина в штаммах, полученных в Примере 6.
Конкретно, рекомбинантный плазмидный вектор получали с использованием описанного ниже способа, чтобы удалить ген mcbR в хромосоме Corynebacterium ATCC13032. На основании нуклеотидных последовательностей, представленных в GenBank Национального института здравоохранения (NIH GenBank), был получен ген mcbR и окружающая его последовательность (SEQ ID NO: 33) Corynebacterium glutamicum.
Для делеции mcbR проводили PCR с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum ATCC13032 в качестве матрицы и наборов праймеров SEQ ID NO: 34 и 35 и SEQ ID NO: 36 и 37 при следующих условиях: денатурация при 95°C в течение 5 минут; 30 циклов денатурации при 95°C в течение 30 секунд; отжиг при 53°C в течение 30 секунд и полимеризация при 72°C в течение 30 секунд; и полимеризация при 72°C в течение 7 минут. В результате были получены фрагменты ДНК (700 п.н.).
Вектор pDZ, который не может быть реплицирован в Corynebacterium glutamicum, и фрагменты амплифицированного гена mcbR обрабатывали рестриктазой SmaI для вставки в хромосому. После этого их лигировали с использованием ДНК-лигазы, трансформировали в E.coli DH5α и высевали на ту же твердую среду LB, содержащую канамицин (25 мг/л). Были отобраны колонии, трансформированные вектором, в который были вставлены удаленные фрагменты целевых генов посредством PCR, и получили плазмиду с использованием метода экстракции плазмиды. Полученная таким образом плазмида была названа pDZ-ΔmcbR.
Пример 9-2: Получение и оценка штаммов микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующих L-метионин
Вектор pDZ-ΔmcbR, полученный в Примере 9-1 посредством гомологичной рекомбинации на хромосоме, трансформировали в каждый из штаммов CJP1-R407H и CJP1, которые были получены в Примере 6, посредством электропорации (van der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 52:541–545, 1999). После этого вторичную рекомбинацию проводили на твердой среде, содержащей Х-gal. Делеция гена mcbR в штаммах была подтверждена методом PCR с трансформированными штаммами Corynebacterium glutamicum, в которых была завершена вторичная рекомбинация, с использованием набора праймеров SEQ ID NO: 38 и 39. Эти рекомбинантные штаммы были названы “CJP1-R407HΔmcbR” и“CJP1ΔmcbR”, соответственно.
Для анализа способности полученного штамма CJP1-R407HΔmcbR продуцировать L-метионин штамм культивировали вместе со штаммом CJP1ΔmcbR следующим образом.
Corynebacterium glutamicum CJP1/ΔmcbR и штамм по изобретению (Corynebacterium glutamicum CJP1-R407HΔmcbR) инокулировали в 250 мл колбу с угловыми перегородками, содержащую среду для посева (25 мл), и затем культивировали при встряхивании при 30°C при 200 об/мин в течение 20 часов. После этого среду для посева (1 мл) инокулировали в колбу с угловыми перегородками емкостью 250 мл, содержащую описанную ниже среду для продуцирования (24 мл), и затем культивировали при встряхивании при 30°C и при 200 об/мин в течение 48 часов. Состав среды для посева и среды для продуцирования является следующим.
Среда для посева(pH 7,0)
20 г глюкозы, 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта, 1,5 г мочевины, 4 г KH2PO4, 8 г K2HPO4, 0,5 г MgSO4 • 7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 2000 мкг никотинамида (из расчета на 1 л дистиллированной воды).
Среда для продуцирования (pH 8,0)
50 г глюкозы, 12 г (NH4)2S2O3, 5 г дрожжевого экстракта, 1 г KH2PO4, 1,2 г MgSO4 • 7H2O, 100 мкг биотина, 1000 мкг тиамина HCl, 2000 мкг пантотената кальция, 3000 мкг никотинамида, 30 г CaCO3 (из расчета на 1 л дистиллированной воды)
После культивирования с использованием вышеуказанного способа культивирования определяли концентрацию L-метионина в каждой культуральной среде, и результаты приведены в Таблице 6.
Таблица 6. Оценка L-метионин-продуцирующих способностей полученных штаммов
Штамм
L-Метионин (г/л)
CJP1ΔmcbR
0,01
CJP1-R407HΔmcbR
0,19
В результате было подтверждено, что в штамме, включающем модификацию hom R407H, способность продуцировать L-метионин была улучшена на 0,18 г/л по сравнению с контрольным штаммом.
На основании вышеприведенных результатов было подтверждено, что количество продуцируемого L-метионина, может быть значительно увеличено при использовании модифицированной hom по настоящему изобретению.
Из вышеизложенного специалист в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, сможет понять, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без изменения технических концепций или существенных характеристик настоящего раскрытия. В связи с этим примерные воплощения, раскрытые в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Напротив, настоящее изобретение предназначено для охвата не только примерных воплощений, но также различных альтернатив, модификаций, эквивалентов и других воплощений, которые могут быть включены в сущность и объем настоящего изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения.
--->
<110> CJ CheilJedang Corporation
<120> A homoserine dehydrogenase variant and a method for producing
homoserine or L-amino acid derived from homoserine using the same
<130> OPA19096
<150> KR 10-2018-0167599
<151> 2018-12-21
<160> 41
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 445
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> гомосериндегидрогеназа
<400> 1
Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly
1  5   10   15
Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu
20   25   30
Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile
35   40   45
Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys
50   55   60
Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala
65   70   75   80
Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly
85   90   95
Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys
100   105   110
Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu
115   120   125
Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala
130   135   140
Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu
145   150   155   160
Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr
165   170   175
Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp
180   185   190
Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr
195   200   205
Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala
210   215   220
Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu
225   230   235   240
Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala
245   250   255
Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys
260   265   270
Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro
275   280   285
Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe
290   295   300
Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala
305   310   315   320
Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala
325   330   335
Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr
340   345   350
Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His
355   360   365
Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala
370   375   380
Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu
385   390   395   400
Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu
405   410   415
Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val
420   425   430
Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp
435   440   445
<210> 2
<211> 1338
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ген hom
<400> 2
atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga  60
attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120
ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 180
gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240
ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300
cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360
cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420
tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480
gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540
gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600
ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660
gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720
ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780
aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 840
cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 900
aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960
ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020
gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1080
ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1140
gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200
gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260
tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320
cgcctcgaaa gggactaa       1338
<210> 3
<211> 930
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ген thrB
<400> 3
atggcaattg aactgaacgt cggtcgtaag gttaccgtca cggtacctgg atcttctgca  60
aacctcggac ctggctttga cactttaggt ttggcactgt cggtatacga cactgtcgaa 120
gtggaaatta ttccatctgg cttggaagtg gaagtttttg gcgaaggcca aggcgaagtc 180
cctcttgatg gctcccacct ggtggttaaa gctattcgtg ctggcctgaa ggcagctgac 240
gctgaagttc ctggattgcg agtggtgtgc cacaacaaca ttccgcagtc tcgtggtctt 300
ggctcctctg ctgcagcggc ggttgctggt gttgctgcag ctaatggttt ggcggatttc 360
ccgctgactc aagagcagat tgttcagttg tcctctgcct ttgaaggcca cccagataat 420
gctgcggctt ctgtgctggg tggagcagtg gtgtcgtgga caaatctgtc tatcgacggc 480
aagagccagc cacagtatgc tgctgtacca cttgaggtgc aggacaatat tcgtgcgact 540
gcgctggttc ctaatttcca cgcatccacc gaagctgtgc gccgagtcct tcccactgaa 600
gtcactcaca tcgatgcgcg atttaacgtg tcccgcgttg cagtgatgat cgttgcgttg 660
cagcagcgtc ctgatttgct gtgggagggt actcgtgacc gtctgcacca gccttatcgt 720
gcagaagtgt tgcctattac ctctgagtgg gtaaaccgcc tgcgcaaccg tggctacgcg 780
gcataccttt ccggtgccgg cccaaccgcc atggtgctgt ccactgagcc aattccagac 840
aaggttttgg aagatgctcg tgagtctggc attaaggtgc ttgagcttga ggttgcggga 900
ccagtcaagg ttgaagttaa ccaaccttag      930
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 4
ctgcgacagc atggaact       18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 5
caacgacaaa cgcccatc       18
<210> 6
<211> 2778
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> фрагмент гена
<400> 6
ctgcgacagc atggaactca gtgcaatggc tgtaaggcct gcaccaacaa tgattgagcg  60
aagctccaaa atgtcctccc cgggttgata ttagatttca taaatatact aaaaatcttg 120
agagtttttc cgttgaaaac taaaaagctg ggaaggtgaa tcgaatttcg gggctttaaa 180
gcaaaaatga acagcttggt ctatagtggc taggtaccct ttttgttttg gacacatgta 240
gggtggccga aacaaagtaa taggacaaca acgctcgacc gcgattattt ttggagaatc 300
atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga 360
attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 420
ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 480
gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 540
ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 600
cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 660
cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 720
tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 780
gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 840
gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 900
ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 960
gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 1020
ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 1080
aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 1140
cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 1200
aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 1260
ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1320
gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1380
ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1440
gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1500
gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1560
tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1620
cgcctcgaaa gggactaatt ttactgacat ggcaattgaa ctgaacgtcg gtcgtaaggt 1680
taccgtcacg gtacctggat cttctgcaaa cctcggacct ggctttgaca ctttaggttt 1740
ggcactgtcg gtatacgaca ctgtcgaagt ggaaattatt ccatctggct tggaagtgga 1800
agtttttggc gaaggccaag gcgaagtccc tcttgatggc tcccacctgg tggttaaagc 1860
tattcgtgct ggcctgaagg cagctgacgc tgaagttcct ggattgcgag tggtgtgcca 1920
caacaacatt ccgcagtctc gtggtcttgg ctcctctgct gcagcggcgg ttgctggtgt 1980
tgctgcagct aatggtttgg cggatttccc gctgactcaa gagcagattg ttcagttgtc 2040
ctctgccttt gaaggccacc cagataatgc tgcggcttct gtgctgggtg gagcagtggt 2100
gtcgtggaca aatctgtcta tcgacggcaa gagccagcca cagtatgctg ctgtaccact 2160
tgaggtgcag gacaatattc gtgcgactgc gctggttcct aatttccacg catccaccga 2220
agctgtgcgc cgagtccttc ccactgaagt cactcacatc gatgcgcgat ttaacgtgtc 2280
ccgcgttgca gtgatgatcg ttgcgttgca gcagcgtcct gatttgctgt gggagggtac 2340
tcgtgaccgt ctgcaccagc cttatcgtgc agaagtgttg cctattacct ctgagtgggt 2400
aaaccgcctg cgcaaccgtg gctacgcggc atacctttcc ggtgccggcc caaccgccat 2460
ggtgctgtcc actgagccaa ttccagacaa ggttttggaa gatgctcgtg agtctggcat 2520
taaggtgctt gagcttgagg ttgcgggacc agtcaaggtt gaagttaacc aaccttaggc 2580
ccaacaagga aggccccctt cgaatcaaga agggggcctt attagtgcag caattattcg 2640
ctgaacacgt gaaccttaca ggtgcccggc gcgttgagtg gtttgagttc cagctggatg 2700
cggttgtttt caccgaggct ttcttggatg aatccggcgt ggatggcgca gacgaaggct 2760
gatgggcgtt tgtcgttg       2778
<210> 7
<211> 1338
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R407H
<400> 7
atgacctcag catctgcccc aagctttaac cccggcaagg gtcccggctc agcagtcgga  60
attgcccttt taggattcgg aacagtcggc actgaggtga tgcgtctgat gaccgagtac 120
ggtgatgaac ttgcgcaccg cattggtggc ccactggagg ttcgtggcat tgctgtttct 180
gatatctcaa agccacgtga aggcgttgca cctgagctgc tcactgagga cgcttttgca 240
ctcatcgagc gcgaggatgt tgacatcgtc gttgaggtta tcggcggcat tgagtaccca 300
cgtgaggtag ttctcgcagc tctgaaggcc ggcaagtctg ttgttaccgc caataaggct 360
cttgttgcag ctcactctgc tgagcttgct gatgcagcgg aagccgcaaa cgttgacctg 420
tacttcgagg ctgctgttgc aggcgcaatt ccagtggttg gcccactgcg tcgctccctg 480
gctggcgatc agatccagtc tgtgatgggc atcgttaacg gcaccaccaa cttcatcttg 540
gacgccatgg attccaccgg cgctgactat gcagattctt tggctgaggc aactcgtttg 600
ggttacgccg aagctgatcc aactgcagac gtcgaaggcc atgacgccgc atccaaggct 660
gcaattttgg catccatcgc tttccacacc cgtgttaccg cggatgatgt gtactgcgaa 720
ggtatcagca acatcagcgc tgccgacatt gaggcagcac agcaggcagg ccacaccatc 780
aagttgttgg ccatctgtga gaagttcacc aacaaggaag gaaagtcggc tatttctgct 840
cgcgtgcacc cgactctatt acctgtgtcc cacccactgg cgtcggtaaa caagtccttt 900
aatgcaatct ttgttgaagc agaagcagct ggtcgcctga tgttctacgg aaacggtgca 960
ggtggcgcgc caaccgcgtc tgctgtgctt ggcgacgtcg ttggtgccgc acgaaacaag 1020
gtgcacggtg gccgtgctcc aggtgagtcc acctacgcta acctgccgat cgctgatttc 1080
ggtgagacca ccactcgtta ccacctcgac atggatgtgg aagatcgcgt gggggttttg 1140
gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc tgcgtacaat ccgacaggaa 1200
gagcgcgatg atgatgcaca tctgatcgtg gtcacccact ctgcgctgga atctgatctt 1260
tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta aggcaatcaa cagtgtgatc 1320
cgcctcgaaa gggactaa       1338
<210> 8
<211> 445
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> гомосериндегидрогеназа R407H
<400> 8
Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly
1  5   10   15
Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu
20   25   30
Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile
35   40   45
Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys
50   55   60
Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala
65   70   75   80
Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly
85   90   95
Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys
100   105   110
Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu
115   120   125
Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala
130   135   140
Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu
145   150   155   160
Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr
165   170   175
Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp
180   185   190
Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr
195   200   205
Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala
210   215   220
Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu
225   230   235   240
Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala
245   250   255
Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys
260   265   270
Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro
275   280   285
Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe
290   295   300
Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala
305   310   315   320
Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala
325   330   335
Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr
340   345   350
Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His
355   360   365
Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala
370   375   380
Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu
385   390   395   400
Glu Arg Asp Asp Asp Ala His Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu
405   410   415
Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val
420   425   430
Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp
435   440   445
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 9
tcgagctcgg tacccctgcg acagcatgga actc     34
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 10
ctctagagga tccccttagt ccctttcgag gcgg     34
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 11
caccggcgct gactatgc       18
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 12
tgggtgacca cgatcagat       19
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 13
ttagtccctt tcgaggcg       18
<210> 14
<211> 421
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lysC(L377K)
<400> 14
Val Ala Leu Val Val Gln Lys Tyr Gly Gly Ser Ser Leu Glu Ser Ala
1  5   10   15
Glu Arg Ile Arg Asn Val Ala Glu Arg Ile Val Ala Thr Lys Lys Ala
20   25   30
Gly Asn Asp Val Val Val Val Cys Ser Ala Met Gly Asp Thr Thr Asp
35   40   45
Glu Leu Leu Glu Leu Ala Ala Ala Val Asn Pro Val Pro Pro Ala Arg
50   55   60
Glu Met Asp Met Leu Leu Thr Ala Gly Glu Arg Ile Ser Asn Ala Leu
65   70   75   80
Val Ala Met Ala Ile Glu Ser Leu Gly Ala Glu Ala Gln Ser Phe Thr
85   90   95
Gly Ser Gln Ala Gly Val Leu Thr Thr Glu Arg His Gly Asn Ala Arg
100   105   110
Ile Val Asp Val Thr Pro Gly Arg Val Arg Glu Ala Leu Asp Glu Gly
115   120   125
Lys Ile Cys Ile Val Ala Gly Phe Gln Gly Val Asn Lys Glu Thr Arg
130   135   140
Asp Val Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Thr Thr Ala Val Ala
145   150   155   160
Leu Ala Ala Ala Leu Asn Ala Asp Val Cys Glu Ile Tyr Ser Asp Val
165   170   175
Asp Gly Val Tyr Thr Ala Asp Pro Arg Ile Val Pro Asn Ala Gln Lys
180   185   190
Leu Glu Lys Leu Ser Phe Glu Glu Met Leu Glu Leu Ala Ala Val Gly
195   200   205
Ser Lys Ile Leu Val Leu Arg Ser Val Glu Tyr Ala Arg Ala Phe Asn
210   215   220
Val Pro Leu Arg Val Arg Ser Ser Tyr Ser Asn Asp Pro Gly Thr Leu
225   230   235   240
Ile Ala Gly Ser Met Glu Asp Ile Pro Val Glu Glu Ala Val Leu Thr
245   250   255
Gly Val Ala Thr Asp Lys Ser Glu Ala Lys Val Thr Val Leu Gly Ile
260   265   270
Ser Asp Lys Pro Gly Glu Ala Ala Lys Val Phe Arg Ala Leu Ala Asp
275   280   285
Ala Glu Ile Asn Ile Asp Met Val Leu Gln Asn Val Ser Ser Val Glu
290   295   300
Asp Gly Thr Thr Asp Ile Thr Phe Thr Cys Pro Arg Ser Asp Gly Arg
305   310   315   320
Arg Ala Met Glu Ile Leu Lys Lys Leu Gln Val Gln Gly Asn Trp Thr
325   330   335
Asn Val Leu Tyr Asp Asp Gln Val Gly Lys Val Ser Leu Val Gly Ala
340   345   350
Gly Met Lys Ser His Pro Gly Val Thr Ala Glu Phe Met Glu Ala Leu
355   360   365
Arg Asp Val Asn Val Asn Ile Glu Lys Ile Ser Thr Ser Glu Ile Arg
370   375   380
Ile Ser Val Leu Ile Arg Glu Asp Asp Leu Asp Ala Ala Ala Arg Ala
385   390   395   400
Leu His Glu Gln Phe Gln Leu Gly Gly Glu Asp Glu Ala Val Val Tyr
405   410   415
Ala Gly Thr Gly Arg
420
<210> 15
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 15
tcgagctcgg tacccgctgc gcagtgttga atac     34
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 16
tggaaatctt ttcgatgttc acgttgacat      30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 17
atgtcaacgt gaacatcgaa aagatttcca      30
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 18
ctctagagga tccccgttca cctcagagac gatt     34
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 19
acggatccca gactccaaag caaaagcg      28
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 20
acaccacggc agaaccaggt gcaaaggaca      30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 21
ctggttctgc cgtggtgtgc atcatctctg      30
<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 22
acggatccaa ccaaacttgc tcacactc      28
<210> 23
<211> 1161
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ген metB
<400> 23
ttgtcttttg acccaaacac ccagggtttc tccactgcat cgattcacgc tgggtatgag  60
ccagacgact actacggttc gattaacacc ccaatctatg cctccaccac cttcgcgcag 120
aacgctccaa acgaactgcg caaaggctac gagtacaccc gtgtgggcaa ccccaccatc 180
gtggcattag agcagaccgt cgcagcactc gaaggcgcaa agtatggccg cgcattctcc 240
tccggcatgg ctgcaaccga catcctgttc cgcatcatcc tcaagccggg cgatcacatc 300
gtcctcggca acgatgctta cggcggaacc taccgcctga tcgacaccgt attcaccgca 360
tggggcgtcg aatacaccgt tgttgatacc tccgtcgtgg aagaggtcaa ggcagcgatc 420
aaggacaaca ccaagctgat ctgggtggaa accccaacca acccagcact tggcatcacc 480
gacatcgaag cagtagcaaa gctcaccgaa ggcaccaacg ccaagctggt tgttgacaac 540
accttcgcat ccccatacct gcagcagcca ctaaaactcg gcgcacacgc agtcctgcac 600
tccaccacca agtacatcgg aggacactcc gacgttgttg gcggccttgt ggttaccaac 660
gaccaggaaa tggacgaaga actgctgttc atgcagggcg gcatcggacc gatcccatca 720
gttttcgatg catacctgac cgcccgtggc ctcaagaccc ttgcagtgcg catggatcgc 780
cactgcgaca acgcagaaaa gatcgcggaa ttcctggact cccgcccaga ggtctccacc 840
gtgctctacc caggtctgaa gaaccaccca ggccacgaag tcgcagcgaa gcagatgaag 900
cgcttcggcg gcatgatctc cgtccgtttc gcaggcggcg aagaagcagc taagaagttc 960
tgtacctcca ccaaactgat ctgtctggcc gagtccctcg gtggcgtgga atccctcctg 1020
gagcacccag caaccatgac ccaccagtca gctgccggct ctcagctcga ggttccccgc 1080
gacctcgtgc gcatctccat tggtattgaa gacattgaag acctgctcgc agatgtcgag 1140
caggccctca ataaccttta g       1161
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 24
tctagacgcc cgcatactgg cttc      24
<210> 25
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 25
cccatccact aaacttaaac agatgtgatc gcccggc     37
<210> 26
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 26
tgtttaagtt tagtggatgg ggaagaacca cccaggcc     38
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 27
gtcgaccaat cgtccagagg gcg       23
<210> 28
<211> 1314
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ген metY
<400> 28
atgccaaagt acgacaattc caatgctgac cagtggggct ttgaaacccg ctccattcac  60
gcaggccagt cagtagacgc acagaccagc gcacgaaacc ttccgatcta ccaatccacc 120
gctttcgtgt tcgactccgc tgagcacgcc aagcagcgtt tcgcacttga ggatctaggc 180
cctgtttact cccgcctcac caacccaacc gttgaggctt tggaaaaccg catcgcttcc 240
ctcgaaggtg gcgtccacgc tgtagcgttc tcctccggac aggccgcaac caccaacgcc 300
attttgaacc tggcaggagc gggcgaccac atcgtcacct ccccacgcct ctacggtggc 360
accgagactc tattccttat cactcttaac cgcctgggta tcgatgtttc cttcgtggaa 420
aaccccgacg accctgagtc ctggcaggca gccgttcagc caaacaccaa agcattcttc 480
ggcgagactt tcgccaaccc acaggcagac gtcctggata ttcctgcggt ggctgaagtt 540
gcgcaccgca acagcgttcc actgatcatc gacaacacca tcgctaccgc agcgctcgtg 600
cgcccgctcg agctcggcgc agacgttgtc gtcgcttccc tcaccaagtt ctacaccggc 660
aacggctccg gactgggcgg cgtgcttatc gacggcggaa agttcgattg gactgtcgaa 720
aaggatggaa agccagtatt cccctacttc gtcactccag atgctgctta ccacggattg 780
aagtacgcag accttggtgc accagccttc ggcctcaagg ttcgcgttgg ccttctacgc 840
gacaccggct ccaccctctc cgcattcaac gcatgggctg cagtccaggg catcgacacc 900
ctttccctgc gcctggagcg ccacaacgaa aacgccatca aggttgcaga attcctcaac 960
aaccacgaga aggtggaaaa ggttaacttc gcaggcctga aggattcccc ttggtacgca 1020
accaaggaaa agcttggcct gaagtacacc ggctccgttc tcaccttcga gatcaagggc 1080
ggcaaggatg aggcttgggc atttatcgac gccctgaagc tacactccaa ccttgcaaac 1140
atcggcgatg ttcgctccct cgttgttcac ccagcaacca ccacccattc acagtccgac 1200
gaagctggcc tggcacgcgc gggcgttacc cagtccaccg tccgcctgtc cgttggcatc 1260
gagaccattg atgatatcat cgctgacctc gaaggcggct ttgctgcaat ctag  1314
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 29
tctagaccat cctgcaccat ttag      24
<210> 30
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 30
cccatccact aaacttaaac acgctcctgc caggttc     37
<210> 31
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 31
tgtttaagtt tagtggatgg gcttggtacg caaccaagg    39
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 32
gtcgacgatt gctccggctt cgg       23
<210> 33
<211> 2213
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ген mcbR
<400> 33
aatctggatt tccgccaggt tttggcacgc ccgtctggtt taggcaatga gataccgaac  60
acacgtgcca aaagttcggc tttttcgccg atcttgtcac gcctgcctgg tttgtcttgt 120
aaagagtgat ttcatggccg agactcctaa aagtttgacc tcacaggatt gcttctaagg 180
gcctctccaa tctccactga ggtacttaat ccttccgggg aattcgggcg cttaaatcga 240
gaaattaggc catcaccttt taataacaat acaatgaata attggaatag gtcgacacct 300
ttggagcgga gccggttaaa attggcagca ttcaccgaaa gaaaaggaga accacatgct 360
tgccctaggt tggattacat ggatcattat tggtggtcta gctggttgga ttgcctccaa 420
gattaaaggc actgatgctc agcaaggaat tttgctgaac atagtcgtcg gtattatcgg 480
tggtttgtta ggcggctggc tgcttggaat cttcggagtg gatgttgccg gtggcggctt 540
gatcttcagc ttcatcacat gtctgattgg tgctgtcatt ttgctgacga tcgtgcagtt 600
cttcactcgg aagaagtaat ctgctttaaa tccgtagggc ctgttgatat ttcgatatca 660
acaggccttt tggtcatttt ggggtggaaa aagcgctaga cttgcctgtg gattaaaact 720
atacgaaccg gtttgtctat attggtgtta gacagttcgt cgtatcttga aacagaccaa 780
cccgaaagga cgtggccgaa cgtggctgct agcgcttcag gcaagagtaa aacaagtgcc 840
ggggcaaacc gtcgtcgcaa tcgaccaagc ccccgacagc gtctcctcga tagcgcaacc 900
aaccttttca ccacagaagg tattcgcgtc atcggtattg atcgtatcct ccgtgaagct 960
gacgtggcga aggcgagcct ctattccctt ttcggatcga aggacgcctt ggttattgca 1020
tacctggaga acctcgatca gctgtggcgt gaagcgtggc gtgagcgcac cgtcggtatg 1080
aaggatccgg aagataaaat catcgcgttc tttgatcagt gcattgagga agaaccagaa 1140
aaagatttcc gcggctcgca ctttcagaat gcggctagtg agtaccctcg ccccgaaact 1200
gatagcgaaa agggcattgt tgcagcagtg ttagagcacc gcgagtggtg tcataagact 1260
ctgactgatt tgctcactga gaagaacggc tacccaggca ccacccaggc gaatcagctg 1320
ttggtgttcc ttgatggtgg acttgctgga tctcgattgg tccacaacat cagtcctctt 1380
gagacggctc gcgatttggc tcggcagttg ttgtcggctc cacctgcgga ctactcaatt 1440
tagtttcttc attttccgaa ggggtatctt cgttggggga ggcgtcgata agccccttct 1500
ttttagcttt aacctcagcg cgacgctgct ttaagcgctg catggcggcg cggttcattt 1560
cacgttgcgt ttcgcgcctc ttgttcgcga tttctttgcg ggcctgtttt gcttcgttga 1620
tttcggcagt acgggttttg gtgagttcca cgtttgttgc gtgaagcgtt gaggcgttcc 1680
atggggtgag aatcatcagg gcgcggtttt tgcgtcgtgt ccacaggaag atgcgctttt 1740
ctttttgttt tgcgcggtag atgtcgcgct gctctaggtg gtgcactttg aaatcgtcgg 1800
taagtgggta tttgcgttcc aaaatgacca tcatgatgat tgtttggagg agcgtccaca 1860
ggttgttgct gacccaatag agtgcgattg ctgtggggaa tggtcctgtg aggccaaggg 1920
acagtgggaa gatcggcgcg aggatcgaca tcacgatcat gaacttcagc atgccgttag 1980
agaatccgga tgcgtaatcg ttggtttgga agctgcggta catggacatc gccatgttga 2040
ttgcggtgag gattgcggct gtgatgaaca gtggcaaaac gaaactaaga acttccgcct 2100
gcgtggtgct caaatatttt agctgctcag tgggcatcga aacataagcg ggcagaggca 2160
cattgctcac gcgaccagcg aggaaagatt ccacttcctc aggagttagg aag  2213
<210> 34
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 34
ggcccgggcc tgcctggttt gtcttgta      28
<210> 35
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 35
cggaaaatga agaaagttcg gccacgtcct ttcgg     35
<210> 36
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 36
aggacgtggc cgaactttct tcattttccg aaggg     35
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 37
atcccggggt ttcgatgccc actgagca      28
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 38
aatctggatt tccgccaggt       20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> праймер
<400> 39
cttcctaact cctgaggaag       20
<210> 40
<211> 445
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> гомосериндегидрогеназа (ATCC14067)
<400> 40
Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly
1  5   10   15
Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu
20   25   30
Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile
35   40   45
Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys
50   55   60
Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala
65   70   75   80
Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly
85   90   95
Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys
100   105   110
Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu
115   120   125
Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala
130   135   140
Ala Val Ala Gly Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu
145   150   155   160
Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr
165   170   175
Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp
180   185   190
Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr
195   200   205
Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala
210   215   220
Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu
225   230   235   240
Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala
245   250   255
Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys
260   265   270
Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro
275   280   285
Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe
290   295   300
Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala
305   310   315   320
Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala
325   330   335
Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr
340   345   350
Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His
355   360   365
Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala
370   375   380
Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu
385   390   395   400
Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu
405   410   415
Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val
420   425   430
Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp
435   440   445
<210> 41
<211> 445
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> гомосериндегидрогеназа (ATCC13869)
<400> 41
Met Thr Ser Ala Ser Ala Pro Ser Phe Asn Pro Gly Lys Gly Pro Gly
1  5   10   15
Ser Ala Val Gly Ile Ala Leu Leu Gly Phe Gly Thr Val Gly Thr Glu
20   25   30
Val Met Arg Leu Met Thr Glu Tyr Gly Asp Glu Leu Ala His Arg Ile
35   40   45
Gly Gly Pro Leu Glu Val Arg Gly Ile Ala Val Ser Asp Ile Ser Lys
50   55   60
Pro Arg Glu Gly Val Ala Pro Glu Leu Leu Thr Glu Asp Ala Phe Ala
65   70   75   80
Leu Ile Glu Arg Glu Asp Val Asp Ile Val Val Glu Val Ile Gly Gly
85   90   95
Ile Glu Tyr Pro Arg Glu Val Val Leu Ala Ala Leu Lys Ala Gly Lys
100   105   110
Ser Val Val Thr Ala Asn Lys Ala Leu Val Ala Ala His Ser Ala Glu
115   120   125
Leu Ala Asp Ala Ala Glu Ala Ala Asn Val Asp Leu Tyr Phe Glu Ala
130   135   140
Ala Val Ala Ala Ala Ile Pro Val Val Gly Pro Leu Arg Arg Ser Leu
145   150   155   160
Ala Gly Asp Gln Ile Gln Ser Val Met Gly Ile Val Asn Gly Thr Thr
165   170   175
Asn Phe Ile Leu Asp Ala Met Asp Ser Thr Gly Ala Asp Tyr Ala Asp
180   185   190
Ser Leu Ala Glu Ala Thr Arg Leu Gly Tyr Ala Glu Ala Asp Pro Thr
195   200   205
Ala Asp Val Glu Gly His Asp Ala Ala Ser Lys Ala Ala Ile Leu Ala
210   215   220
Ser Ile Ala Phe His Thr Arg Val Thr Ala Asp Asp Val Tyr Cys Glu
225   230   235   240
Gly Ile Ser Asn Ile Ser Ala Ala Asp Ile Glu Ala Ala Gln Gln Ala
245   250   255
Gly His Thr Ile Lys Leu Leu Ala Ile Cys Glu Lys Phe Thr Asn Lys
260   265   270
Glu Gly Lys Ser Ala Ile Ser Ala Arg Val His Pro Thr Leu Leu Pro
275   280   285
Val Ser His Pro Leu Ala Ser Val Asn Lys Ser Phe Asn Ala Ile Phe
290   295   300
Val Glu Ala Glu Ala Ala Gly Arg Leu Met Phe Tyr Gly Asn Gly Ala
305   310   315   320
Gly Gly Ala Pro Thr Ala Ser Ala Val Leu Gly Asp Val Val Gly Ala
325   330   335
Ala Arg Asn Lys Val His Gly Gly Arg Ala Pro Gly Glu Ser Thr Tyr
340   345   350
Ala Asn Leu Pro Ile Ala Asp Phe Gly Glu Thr Thr Thr Arg Tyr His
355   360   365
Leu Asp Met Asp Val Glu Asp Arg Val Gly Val Leu Ala Glu Leu Ala
370   375   380
Ser Leu Phe Ser Glu Gln Gly Ile Ser Leu Arg Thr Ile Arg Gln Glu
385   390   395   400
Glu Arg Asp Asp Asp Ala Arg Leu Ile Val Val Thr His Ser Ala Leu
405   410   415
Glu Ser Asp Leu Ser Arg Thr Val Glu Leu Leu Lys Ala Lys Pro Val
420   425   430
Val Lys Ala Ile Asn Ser Val Ile Arg Leu Glu Arg Asp
435   440   445
<---