Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
TEST SYSTEM FOR DETECTION OF SARS-COV-2 VIRUS RNA IN BIOMATERIAL FROM ANIMALS, FOOD AND ENVIRONMENTAL OBJECTS BY THE POLYMERASE CHAIN REACTION METHOD IN REAL TIME

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к выявлению РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды.
Новый коронавирус SARS-CoV-2 вызывает тяжелую форму пневмонии у людей (COVID-19), подобную MERS-CoV и SARS-CoV. Он относится к семейству РНК-содержащих вирусов семейства Coronaviridae, линии Beta-CoVB.
Первые случаи заболевания человека пневмонией неизвестного происхождения были зарегистрированы в декабре 2019 года в городе Ухань китайской провинции Хубэй. Новый коронавирус был выделен из эпителиальных клеток дыхательных путей человека и идентифицирован как возбудитель заболевания. В настоящее время подавляющее большинство стран мира сообщили о случаях заболевания людей, и Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) объявила событие COVID-19 пандемией (2).
Пациенты с COVID-19 проявляют яркие клинические симптомы, такие как лихорадка, сухой кашель, одышка, ринорея, ангина, интерстициальные инфильтраты в легких (3).
Считается, что предшественником SARS-CoV-2 является короновирус летучих мышей (rhinolophus sinicus). От летучих мышей к человеку вирус перешел через промежуточного хозяина, установить которого пока не удалось. Глобальное распространение SARS-CoV-2 не ограничилось человеческой популяцией. В настоящее время имеется много сообщений о случаях обнаружения вируса SARS-CoV-2 у животных: норок, собак, кошек, тигров и львов. Опыты по экспериментальному заражению показали, что хорьки и кошки очень восприимчивы к SARS-CoV-2 и могут передавать вирус от инфицированных здоровым животным контактным или воздушно-капельным путем (1, 4).
Восприимчивость животных к SARS-CoV-2, вероятно, объясняется тем, что рецептором SARS-CoV-2 является клеточный ангиотензинпревращающий фермент 2 (АСЕ2), который почти идентичен или похож у человека и таких видов животных, как куньи, кошачьи, свиньи и обезьяны. Таким образом, существует потенциальная возможность формирования резервуара SARS-CoV-2 в популяции домашних животных, и эпидемиологический надзор за COVID-19 должен предусматривать и диагностические и мониторинговые исследования домашних животных.
Рекомендованным методом специфической лабораторной диагностики COVID-19 является выявление РНК SARS-CoV-2 методом ПНР. Благодаря высокой чувствительности и специфичности метод ПНР является идеальным для первичного скрининга.
Целью изобретения является создание тест-системы для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды.
На сегодняшний день разработано достаточное количество тест-систем, для выявления возбудителя SARS-CoV-2 у людей, однако они не предназначены для анализа биоматериала от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды.
Таким образом, разработка надежного чувствительного и специфичного метода обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды является актуальной технической проблемой. Для ее решения была создана тест-система ПЦР-РВ, содержащая специфичные олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченный олигонуклеотидный зонд, а также осуществлен подбор условий проведения исследований с помощью разработанного диагностикума, обеспечивающий минимальный риск контаминации тестируемых образцов и исключающих субъективность при оценке результатов.
Изобретение относится к тест-системе для специфичной идентификации РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом ПНР в режиме реального времени, состоящей из смеси олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда, фермента Taq-полимеразы, обратной транскриптазы, положительного контроля и отрицательного контроля.
Флуоресценцию измеряют по каналу ROX. Пересечение кривой флуоресценции и линии порогового цикла (Ct), свидетельствует о наличии в образце РНК вируса SARS-CoV-2, причем, чем меньше показатель Ct, тем выше концентрация РНК вируса SARS-CoV-2 в исследуемом образце. Отсутствие пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией свидетельствует об отсутствии РНК вируса SARS-CoV-2 в тестируемом материале.
Представленный метод включает последовательности олигонуклеотидов, специфичные только для вируса SARS-CoV-2 и имеющие следующую нуклеотидную последовательность:
Forward GGACCCCAAAATCAGCGAAA
Reverse CTGGTTACTGCCAGTTGAATC
probe ROX CACCCCGCATTACGTTTGGTGGAC BHQ2
Изобретение может быть использовано для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в пробах биологического материала от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды с целью проведения клинической и лабораторной диагностики, а также научно-исследовательских работ в области ветеринарии.
Техническим результатом изобретения является: высокая специфичность в отношении всех возможных генетических вариантов вируса SARS-CoV-2, широкий спектр пригодного для проведения исследований биологического материала от животных (смывы со слизистых оболочек носовой и ротовой полости, внутренние органы, сыворотка крови, цельная кровь, культура клеток), пищевых продуктов и объектов окружающей среды, без риска получения ложноположительных результатов; минимальные требования для постановки ПЦР-РВ, что дает возможность использования широкого спектра амплификаторов; сокращение времени тестирования проб на наличие РНК вируса SARS-CoV-2, в том числе и при проведении массовых исследований; расширение арсенала средств диагностики Covid-19.
Сущность изобретения заключается в том, что тест-система способна выявлять РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды. Высокая степень специфичности тест-системы подтверждена с помощью лабораторных исследований на панели проб гомологичных и гетерологичных вирусов.
Сущность изобретения пояснена на графическом изображении, на котором показана специфичность тест-системы, проверенная на нескольких видах вирусов:
1 - принадлежащих к семейству Coronaviridae (вирус SARS-CoV-2, вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС), вирус эпизоотической диареи свиней (ЭДС), респираторный коронавирус свиней (РКВС), коронавирус КРС, вирус инфекционного бронхита кур (ИБК));
2 - на гетерологичных вирусах с/х животных: вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС), парвовирус свиней (ПВС), цирковирус свиней типа 2 (ЦВС2), вирус болезни Ауески (ВБА), вирус инфекционной бурсальной болезни (ИББ), вирус гриппа А, вирус инфекционного ринотрахеита (ИРТ), вирус парагриппа-3 (ПГ3) и на РНК/ДНК, выделенной из тканей свиней, КРС, кур. Положительная реакция наблюдалась только с РНК вируса SARS-CoV-2, что свидетельствует о специфичности метода (Фиг. 1).
Детекция продуктов амплификации осуществляется методом регистрации флуоресценции, генерируемой в результате разрушения гибридизационного зонда, находящегося на 5'-конце флуорофора ROX, а на 3'-конце - гасителя BHQ2. В отсутствии мишени флуорофор и гаситель сближены, и наблюдается лишь незначительная флуоресценция, так как гаситель поглощает испускаемое флуорофором излучение. При накоплении в ходе ПЦР специфических продуктов зонд гибридизируется на ампликон, что ведет к его разрушению за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы. В результате флуорофор отделяется от гасителя и его излучение может быть детектировано. Таким образом, увеличение флуоресценции прямо пропорционально количеству синтезированного ПЦР-продукта.
Для разработки праймеров, из базы данных GenBank были получены полногеномные последовательности коронавирусов. Последовательности выравнивали, затем визуально оценивали консервативные участки, на основе которых были получены ряд праймеров. В результате тестирования при различных параметрах была получена оптимальная пара праймеров и зонда, которые используются в тест-системе.
Набор для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ПЦР-РВ состоит из следующих компонентов:
3
№1 ОТ-ПЦР-смесь, объем 1,100 см - 1 пробирка;
3
№2 фермент Taq ДНК-полимераза, объем 0,015 см - 1 пробирка;
3
№3 фермент M-MLV-ревертаза, объем 0,030 см - 1 пробирка;
3
№4 положительный контроль, объем 0,100 см - 1 пробирка;
3
№5 отрицательный контроль, объем 0,100 см - 1 пробирка.
В качестве отрицательного контроля используется деионизованная вода, а в качестве положительного контроля - плазмидная ДНК, содержащая вставку фрагмента гена N вируса SARS-CoV-2.
ПЦР в режиме реального времени с обратной транскрипцией проводится в программируемом амплификаторе в одну стадию с использованием смеси, включающей на одну реакцию: ОТ-ПЦР-смесь (№1), ферментов Taq-ДНК-полимеразы (№2) и обратной транскриптазы (№3). Перед началом постановки реакции необходимо разморозить все компоненты реакции (за исключением ферментов), встряхнуть их на шейкере, затем центрифугировать несколько секунд на низкоскоростной центрифуге.
Смесь для проведения реакции готовят в пробирке в расчете на одну реакцию (V=25 мкл) следующим образом:
- ОТ-ПЦР-смесь №1
20 мкл,
- фермент Taq-ДНК-полимераза №2
0,25 мкл,
- фермент M-MLV-ревертаза №3
0,5 мкл
Приготовленную в отдельных 1,5 мл пробирках смесь для проведения реакции переносят по 20 мкл в 0,2 мл пробирки и вносят 5 мкл суммарной РНК, выделенной из анализируемых проб. В соответствующие пробы вносят также образцы отрицательного и положительного контролей. Общий объем смеси - 25 мкл.
Пробирки устанавливают в амплификатор для постановки ПЦР в режиме реального времени, отмечают в программе расположение и характеристику проб, выбирают рабочий краситель (ROX), устанавливают в программе температурно-временной профиль реакции.
Программирование амплификатора осуществляется согласно инструкции производителя. Подобран режим термического профиля, который должен соответствовать показателям, описанным в таблице 1: обратная транскрипция 42°С - 15 мин, денатурация при 95°С в течение 5 мин и термического циклирования при 95°С - 15 сек., 55°С - 15 сек; 72°С - 20 сек - 40 циклов.
Результаты интерпретируют на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» в соответствующей графе в таблице результатов реакции, выведенной в результате машинного анализа.
Если регистрируемое значение Ct≤35, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается положительным.
Если значение Ct не регистрируется, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается отрицательным.
Если регистрируемое значение Ct находится в пределах от 35 до 40, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается сомнительным и подлежит повторному исследованию. Если при проведении повторного исследования регистрируемое значение Ct≤40, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается положительным; если значение Ct не регистрируется, результат обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 считается отрицательным.
Результат считается достоверным только в случае, если:
- для положительного контроля амплификатором на канале ROX регистрируется значение порогового цикла амплификации - Ct≤30;
- для отрицательного контроля амплификатором не регистрируется какого-либо значения порогового цикла на канале ROX.
Результат считается недостоверным (не подлежат учету) в случае, если: для образца положительного контроля регистрируется значение Ct>30;
- для образца отрицательного контроля регистрируется какое-либо значение Ct.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Оценка специфичности тест-системы.
Специфичность метода была проверена на нескольких видах вирусов, принадлежащих к семейству Coronaviridae (вирус SARS-CoV-2, вирус ТГС, вирус ЭДС, респираторный коронавирус свиней, коронавирус КРС, вирус инфекционного бронхита кур), других вирусах с/х животных (РРСС, ПВИС, ЦВС-2, ВБА, ИББ, гриппа А, ИРТ, ПГ-3), а также на РНК/ДНК, выделенной из тканей свиней, КРС, кур. Положительная реакция наблюдалась только с РНК вируса SARS-CoV-2, что свидетельствует о специфичности метода (табл. 2). Полученные данные приведены на графическом изображении (Фиг. 1).
Из таблицы 2 видно, что разработанная тест-система специфично выявляет вирус SARS-CoV-2.
Работу с нуклеиновой кислотой проводили в условиях, регламентированных МУ 1.3. 2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» (5).
Процедуру выделения нуклеиновых кислот из исследуемого материала проводили с использованием 6М гуанидинтиоцианата и стекловолокнистых фильтров GF/F (6).
ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе по описанной выше программе.
Результаты интерпретировали на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линии, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла Ct в соответствующей графе в таблице результатов. Результат считали положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имела характерную «сигмовидную» форму и пересекала пороговую линию.
При тестировании специфичности тест-системы с использованием нуклеиновых кислот различных видов вирусов семейства Coronaviridae и гетерологичных вирусов ложноположительных и ложноотрицательных результатов не выявлено (табл. 2).
Пример 2. Оценка чувствительности тест-системы.
Для определения чувствительности исследовали серию последовательных 10-кратных разведений РНК вируса SARS-CoV-2.
Чувствительность определяли как процентное отношение положительных результатов (полученных при использовании предлагаемой тест-системы) к общему количеству исследований. Определение чувствительности осуществляли по формуле:
Se = (ИП/(ИП+ЛО)) × 100%,
где: Se - чувствительность тест-системы;
ИП - истинноположительный результат,
ЛО - ложноотрицательный результат.
Все исследованные пробы с наличием РНК вируса SARS-CoV-2 показали в предлагаемой тест-системе положительный результат (табл. 3). Таким образом, рассчитанная чувствительность предлагаемой тест-системы составила 100%
Пример 3. Оценка воспроизводимости тест-системы.
При определении воспроизводимости исследовали одну положительную и одну отрицательную пробу в 10 повторностях, выполненных при измененных условиях измерения: одним исследователем в параллельных исследованиях в течение разных дней (10 дней) и двумя разными исследователями в параллельных исследованиях (в 10 повторах). Для определения сходимости учитывали степень близости результатов последовательных измерений одной и той же пробы. Для предлагаемой тест-системы воспроизводимость была абсолютна, т.е. положительная проба всегда показывала положительный результат, а отрицательная проба - отрицательный результат.
Таким образом, предлагаемое изобретение может быть использовано в ветеринарной практике для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды с целью постановки и уточнения диагноза, для решения научно-исследовательских задач, проведения мониторинга распространения вируса SARS-CoV-2 у животных. Полученные характеристики тест-системы соответствуют критериям, предъявляемым к качественным лабораторным методам исследования.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени».
1. Bats, pangolins, minks and other animals - villains or victims of SARS-CoV-2? / B. do Valel, A. P. Lopes, M. da Conceicao Fontes [et al.] // Veterinary Research Communications (2021) https://doi.org/10.1007/s11259-021-09787-2.
2. Diagnosis of the Coronavirus disease (COVID-19): rRT-PCR or CT / C. Long, H. Xu, Q. Shen, [et al.] // European Journal of Radiology 126 (2020) https://doi.org/10.1016/j.ejrad.2020.108961.
3. Featuring COVID-19 cases via screening symptomatic patients with epidemiologiclink during flu season in a medical center ofcentral Taiwan / W. Hsih, M. Cheng, M. Ho [et al.] // Journal of Microbiology, Immunology and Infection (article in press) https://doi.org/10.1016/j.jmii.2020.03.008.
4. SARS-CoV-2 host diversity: An update of natural infections and experimental evidence / G. Hossain, A. Javed, S. Akter [et al] // Journal of Microbiology, Immunology and Infection (2021) 54, 175el81.
5. МУ 1.3.2569-09 Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности.
6. Использование аэросила А-300 и фильтров GF/F (GF/C) для очистки фрагментов ДНК, ДНК-плазмид и РНК / Грибанов О.Г., Щербаков А.В., Перевозчикова Н.А. [и др.] // Биохимия. - 1996. - Т. 21, №6. - С. 1064-1070.