СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ КАЛА НА ДИСБАКТЕРИОЗ КИШЕЧНИКА
METHOD RESEARCH ON FECES DYSBACTERIOSIS OF THE INTESTINE

Изобретение относится к области микробиологии, а именно к бактериологическому лабораторному исследованию.
Обследованию подлежат лица, относящиеся к группам риска по развитию дисбактериоза кишечника:
1. Новорожденные, родившиеся недоношенными; которым проводились реанимационные мероприятия при рождении; длительно находившиеся в родильном доме; при позднем прикладывании к груди; от матерей, имевших во время беременности гнойно-воспалительные заболевания; с признаками первичного иммунодефицита.
2. Дети грудного и раннего возраста в случаях неблагоприятного течения периода новорожденности, раннего искусственного вскармливания, с признаками диспепсических расстройств, частых ОРЗ, гипотрофии, анемии, рахита, аллергических реакций.
3. Дети других возрастов при наличии аллергических реакций, частых ОРЗ, сниженном иммунитете.
4. Взрослые, находящиеся на длительной гормональной терапии или лечении антимикробными средствами; лица, имеющие несбалансированное питание, профессиональные вредности, страдающие длительно текущими кишечными инфекциями.
Ограничением применения процедуры являются: прием антимикробных препаратов, использование ректальных свечей, R-исследования с применением бария, исследование замороженных проб, проб без транспортной среды.
Известен способ диагностики дисбактериоза толстого кишечника, включающий исследование фекалий путем прямого электрохимического метода с помощью pH-метра (RU 2324191 С2, 10.05.2008).
Известна методика бактериологического исследования, включающая измельчение образца кала и разведение его в физиологическом растворе, приготовление разведений и посев на питательные среды с подсчетом числа и процента лактозонегативных (бесцветных) колоний по отношению ко всему числу выросших колоний (Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника. Методические рекомендации (утв. Минздравом РСФСР 14.04.1977)).
Недостатками известных способов и методик являются: короткий срок доставки забранного образца в лабораторию для исследования, низкая сохранность жизнеспособности бактерий за период доставки и хранения образца в обычном контейнере, что оказывает негативное влияние на точность результатов бактериологических исследований.
Предложенное изобретение устраняет указанные выше недостатки.
Целью изобретения является:
- обеспечение сохранности бактерий, выявляемых в исследовании на дисбактериоз кишечника, с использованием модифицированной среды Саrу Blair в транспортной системе Fecal Swab (Copan, Italy);
- обеспечение обследуемых из отдаленных регионов России новой лабораторной услугой с целью повышения качества их обследования.
Техническим результатом изобретения является повышение точности исследования на выявление дисбактериоза кишечника у обследуемого, достигаемого благодаря: проведению исследования на более качественном уровне с увеличением преаналитического этапа до 48 часов; прекрасной сохранности жизнеспособности бактерий при доставке образца кала для исследования в указанной транспортной системе и пересчету количества микроорганизмов на 1 грамм кала по приведенной формуле с учетом разведения кала в среде транспортной системы.
-2
-9
Указанный технический результат достигается за счет того, что для исследования используют мазок, собранный на тампон путем погружения в фекалии поочередно в нескольких местах и помещенный в пробирку с модифицированной средой Сагу Blair транспортной системы Fecal Swab, Copan, Italy, которая увеличивает срок преаналитического этапа; определяют истинный вес кала в пробирке (X) путем вычитания веса пробирок с тампоном указанной транспортной системы из веса данных пробирок с пробой, рассчитывают степень разведения кала (N) в 2 мл жидкой транспортной среды как N=2/X+1, перед исследованием пробу тщательно перемешивают и в отдельных пробирках готовят растворы образца в разведениях от 10 до 10, после подготовки разведений делают посев на плотные и жидкие питательные среды, после чего проводят оценку результатов и подсчет количества выросших бактерий (Y), далее осуществляют количественный учет результатов на 1 грамм кала (Z) по формуле:
Z=Y*10*N*M,
где Ζ - количественная оценка типа бактерий на 1 грамм исследуемого материала,
Y - количество выросших бактерий,
10 - коэффициент пересчета из расчета посевной дозы 100 мкл,
N - степень разведения кала в жидкой транспортной среде,
M - степень разведения в пробирке, из которой взята проба для подсчета бактерий.
Исследуемым материалом является кал, полученный естественным путем. Для исследования по изобретению используется мазок, собранный на тампон, входящий в комплект транспортной системы Fecal Swab, Copan, Italy, с 2 мл модифицированной среды CaryBlair.
На фиг. 1 изображена схема разведения образца кала. Подготовка пробы к исследованию.
Кал собирают в одноразовый пластиковый контейнер. Сразу после сбора вскрывают упаковку от транспортной системы Fecal Swab (кат. №470СЕ) и вынимают аппликатор с тампоном. Тампон погружают в фекалии поочередно в нескольких местах, после чего он помещается в пробирку с 2 мл модифицированной транспортной среды Cary Blair. Излишек аппликатора обламывают по условной линии. Крышку плотно завинчивают. Кусочки кала в пробирку не помещают. Пробу маркируют.
Хранение и транспортировка образца кала осуществляется до истечения 48 часов при температуре +2…+8°С.
Описание способа
Материалы и оборудование
1. Оборудование
2. Питательные среды
3. Реагенты
4. Расходные материалы
Оборудование
1. Вытяжной шкаф, Россия;
2. Вортекс, ELMI Sky Line V3, Латвия;
3. Весы аналитические с точностью измерения до 0,01, Scout Pro, OHAUS, США;
4. Водяной термостат, ULTRATHERM, BWT-U, BIOSAN, Латвия;
5. Обжигатель петель, BACTI-CINERATOR, McCornickScientific, США;
6. Инкубатор с обычной атм., BINDER, Германия или термальная комната (для создания нужных температурных условий);
2
7. Инкубатор с COатм., NUARE, США;
8. MALDI-TOF масс-спектрометр microflex LT компании BRUKER, Германия;
9. Микроскоп, Axiostar, Carl Zeiss, Германия.
Питательные среды
1. Бифидум, среда сухая, Оболенск, Россия, лот С242;
2. Сульфитный агар для клостридий, модификация 1, Оболенск, Россия;
3. Висмут сульфит агар (ВСА)д/выдел. сальмон., /ВСА, ФГУН, Оболенск;
4. Левина среда с эозинметиленовым синим, ФГУН, Оболенск;
5. Селенитовая среда сухая Оболенск, Россия, кат. 11724;
6. MRS /MPC, Scharlau, кат. №01-135;
7. Entrococcosel Agar/Энтерококкосель, BD, кат. №212205;
8. MacConkey Agar/Среда МакКонки, MCV, Bio-Rad, кат. №69084;
9. Columbia Agar base BD / Колумбийский агар с добавлением 5% бараньей крови, кат. №211124;
10. Mannitol-Salt Agar (MSA) / Манитол-Солевой Агар; BD, кат. №211407;
11. Sabouraud Chloramphenicol Agar/Агар Сабуро с хлорамфениколом, BioMerieux, кат. №51021;
12. Clostridium reinforced medium/ клостридиальная усиленная среда, BD, кат. 218081;
13. Клиглера агар двухсахарный с железом, Оболенск, Россия, кат. №17349;
14. Хромогенный агар для идентификации грибов Candida albicans, HiMedia, кат. М1297;
15. Простой питательный агар, Оболенск, Россия.
Реагенты
1. Красители по Граму, набор BBL Becton Dickinson, США;
2. Масло иммерсионное, ApexLab, Россия;
3. Хлористый натрий (NaCl) для физиологического раствора, Россия;
4. Ацетонитрил, кат.№221881.1611С, Panreac, Испания;
5. Трифторуксусная кислота, кат. №363317.1608, Panreac, Испания;
6. Реагент матрицы, Bruker, Германия;
7. Деионизованная вода, полученная в лабораторных условиях на установке Медиана-Фильтр, Россия.
Расходные материалы одноразовые
1. Пробирки пластиковые;
2. Чашки Петри пластиковые;
3. Наконечники с фильтром 5-200 мкл; 50-1000 мкл;
4. Предметные стекла, ApexLab;
5. Пастеровские пипетки на 1 мл, арт. 12006605, Минимед;
6. Шпатели, Copan, Италия, кат. 174CS05.
Расходные материалы многоразового использования
1. Стеклянные пробирки;
2. Стеклянные пипетки;
3. Штативы для пробирок;
4. Пробки для пробирок;
5. Автоматические пипетки;
6. Петли микробиологические калиброванные или некалиброванные с держателями. Подготовительные процедуры:
1. Взвешивают вес (1) пробирок с тампоном в транспортной системе Fecal Swab, Copan, Italy (без проб) в серии из 10 шт. Вычисляют среднее значение, которое впоследствии принимают за постоянную величину.
-2
-3
-4
-10
2. Подготавливают пробирки с 2,7 мл стерильного физиологического раствора для приготовления разведений и маркируют их: 10, 10, 10 … 10.
3. Рразливают жидкие питательные среды (Бифидум, Сульфитный агар) по пробиркам по 10 мл.
4. Разливают по пробиркам селенитовый бульон по 4 мл.
Ход исследования:
При поступлении проб в пробирках с транспортной средой определяют вес (2) каждой на аналитических весах с точностью измерения до 0,01 г.
Истинный вес кала в пробирке (X) определяют путем вычитания из веса (2) веса (1):
Х=2-1.
Далее рассчитывают степень разведения кала (N) в 2 мл жидкой транспортной среды Cary Blair по формуле: N=2/X+1.
Перед началом проведения исследования проба тщательно перемешивается на вортексе в течение 15 секунд, со скоростью вращения 3 PRMX1000.
-2
-3
-9
-10
Из пробирки со средой Cary Blair отбирают 0,3 мл содержимого с помощью стерильного наконечника с фильтром и автоматической пипетки и переносят в пробирку со стерильным физиологическим раствором и маркировкой 10. Тщательно перемешивают и из этой пробирки отбирают 0,3 мл для следующего разведения 10 и до 10 (конечное разведение 10 применяется для детей до 1 года). Схема разведения приведена на фиг. 1.
Рабочие степени разведений в дальнейшем описании для использования в формулах будут обозначены как (М). После подготовки разведений сразу же делается посев на плотные и жидкие питательные среды:
1. На поверхность среды Левина с целью выявления патогенных кишечных бактерий наносится материал петлей 10 мкл из пробирки Fecal Swab, посев делается штриховым зигзагом по всей поверхности среды.
-5
-7
2. На поверхность среды MacConkey Agar с целью выявления грамотрицательных бактерий автоматической пипеткой со стерильным наконечником с фильтром наносят по 100 мкл из 10 и 10 разведений на каждую чашку Петри, посев делают шпателем, равномерно распределяя жидкость по всей поверхности до полного впитывания.
–5
3. На поверхность среды 5% кровяной агар с целью выявления гемолитических свойств бактерий (в основном кишечной палочки) автоматической пипеткой со стерильным наконечником с фильтром наносится 100 мкл из 10 разведения, посев делают шпателем, равномерно распределяя жидкость по всей поверхности до полного впитывания.
-2
-4
4. На поверхность среды MRS Agar с целью выявления лактобацилл автоматической пипеткой со стерильным наконечником с фильтром наносят по 100 мкл из 10 и 10 разведений на каждую чашку Петри, посев делают шпателем, равномерно распределяя жидкость по всей поверхности до полного впитывания.
-4
5. На поверхность среды Entrococcosel Agar с целью выявления энтерококков автоматической пипеткой со стерильным наконечником с фильтром наносят 100 мкл из 10 разведения, посев делают шпателем, равномерно распределяя жидкость по всей поверхности до полного впитывания.
-2
6. На поверхность среды Mannitol-Salt Agar с целью выявления стафилококков автоматической пипеткой со стерильным наконечником с фильтром наносится 100 мкл из 10 разведения, посев делают шпателем, равномерно распределяя жидкость по всей поверхности до полного впитывания.
-2
7. На поверхность среды Sabouraud Chloramphenicol Agar с целью выявления грибов автоматической пипеткой со стерильным наконечником с фильтром наносят 100 мкл из 10 разведения, посев делают шпателем, равномерно распределяя жидкость по всей поверхности до полного впитывания.
8. В пробирки с жидкими средами делают глубинный посев с помощью автоматической пипетки со стерильным наконечником с фильтром. Вносят по 100 мкл в каждую пробирку.
-4
-6
-9
-6
-9
-10
Вглубь среды Бифидум с целью выявления бифидобактерий автоматической пипеткой со стерильным наконечником с фильтром вносят материал из 10, 10, 10 разведений для возрастной группы от 1 до 60 лет, из 10, 10, 10 разведений для возрастных групп до 1 года, и более 60 лет.
-3
-5
Вглубь среды Сульфитный агар, с целью выявления клостридий автоматической пипеткой со стерильным наконечником с фильтром вносят материал из разведений 10 и 10.
Вглубь среды Селенитовый бульон (среда обогащения для лучшего роста сальмонелл) вносят материал из пробирки со средой Cary Blair.
2
9. На следующие сутки из селенитового бульона петлей 10 мкл делают высев на Висмут-сульфитный агар с целью выявления патогенных кишечных бактерий (сальмонелл). Посев производят штриховым зигзагом по всей поверхности среды на  чашки Петри. Инкубацию всех посевов проводят в течение 24-48 часов при температуре +35…+37°C в инкубаторе с обычной атмосферой или термальной комнате, за исключением чашек со средой MRS Agar, которые инкубируют в СО инкубаторе.
По окончании инкубации врач-бактериолог проводит оценку результатов и подсчет количества выросших бактерий (Y).
Количественный учет результата на 1 грамм кала (Z) подсчитывается по формуле:
Z=Y*10*N*M,
где Ζ - количественная оценка выросших бактерий на 1 грамм исследуемого материала;
Y - количество выросших колоний на 1 чашке Петри с питательной средой;
N - основное разведение кала в пробирке со средой Cary Blair;
M - степень разведения в пробирке, из которой взята проба для посева;
10 - коэффициент пересчета из расчета посевной дозы 100 мкл.
Все колонии, имеющие диагностическое значение, идентифицируются на MALDI-TOF масс-спектрометре microflex LT компании BRUKER, Германия, или с помощью альтернативных методов с использованием анализатора Vitek 2 com производителя bioMerieux, Франция.
Патогенные кишечные бактерии (сальмонеллы, шигеллы) типируют с помощью поливалентных диагностических сывороток производственного объединения «Микроген».
При выявлении патогенных кишечных бактерий определяется чувствительность в антимикробным препаратам и бактериофагам. Валидация способа проведена в 2 этапа.
1. С использованием контрольных штаммов бактерий, находящихся в коллекции лаборатории (для оценки выживаемости изучаемых бактерий в транспортной среде в течение 48 часов и хранении при температуре +2…8°С).
2. С использованием образцов кала, поступивших на исследование дисбактериоза кишечника, путем сравнения результатов, полученных в ходе стандартного проведения методики, и в эксперименте.
1 этап
При проведении испытаний использовались суточные культуры бактерий, перечисленные в таблице 1.
Ход исследования:
1. Подготовлена суточная культура нижеперечисленных бактерий.
2. Приготовлена микробная взвесь - инокулюм - в концентрации 0,5 ед. по Мак Фарланду.
-7
-6
-5
-4
-3
3. Из инокулюма приготовлена серия 10-кратных разведений - 10, 10, 10, 10, 10 (пробирки с 4,5 мл стерильного физ. раствора были приготовлены в день исследования), для каждого разведения использован новый наконечник, перемешивание произведено на вортексе.
-4
-5
4. В FecalSwab было внесено по 100 мкл из разведений 10 и 10 (в 3 репликах)
5. Подготовленные образцы посеяны петлей 10 мкл истощающим методом на чашки Петри с 5% кровяным агаром (приготовленном на основе Колумбийского агара BD, лот 3232498, в лабораторных условиях).
6. Посевы произведены в день приготовления (без хранения), через 24 и 48 часов (после хранения в холодильнике при +2…+8°С). Каждый раз перед посевом все пробирки были тщательно перемешаны на вортексе.
7. Посевы инкубировали в течение 24-48 часов при 37°С (просмотр через каждые 24 часа, окончательные учет результатов - через 48 часов).
8. Получены следующие результаты:
2 этап
В основу положено сравнение результатов, полученных при стандартном выполнении исследования на дисбактериоз кишечника, и полученных при проведении эксперимента из одних и тех же образцов кала.
Выполнение способа модифицированного исследования дисбактериоза кишечника подробно описано на стр. 3-5.
Для статистической достоверности обследовано 5 проб кала в трех репликах (повторах) сразу после разведения, а также через 24 и 48 часов. Методики проводились одновременно и в одинаковых условиях:
Д - дисбактериоз в стандартном исполнении;
Э - экспериментальные данные.
В ходе проведения исследований для оптимизации методики были предприняты корректирующие действия:
1. Произведена замена среды Reinforced Clostridial Medium на Сульфитный агар при выявлении клостридий ввиду невозможности проведения достоверного учета результатов.
-7
-5
2. Высев на среду МакКонки сделан из 10 и 10 разведений.
3. Увеличена посевная доза с 10 мкл на 100 мкл и сделаны высевы из тех же разведений, что в исследовании на дисбактериоз.
Исследование трех последних проб кала производилось в условиях, приближенных к выполнению рутинного исследования на дисбактериоз, и показало наилучшие результаты по совпадению.
Результативность
При сравнительном изучении двух методов - модифицированного и стандартного, используемого в ежедневной практике лаборатории, получены сопоставимые результаты в группе из 5 проб, при постановке методики в трех репликах и повторах через 0, 24, 48 часов, что позволило сделать заключение о приемлемости внедрения данного способа в рабочую практику лаборатории.
Изобретение обеспечивает:
1. Более длительную сохранность жизнеспособности бактерий, изучаемых в исследовании на дисбактериоз кишечника, при использовании транспортной среды Fecal Swab, Copan, Italy по сравнению с биоматериалом (калом), собранным в обычный контейнер. До 48 часов с момента взятия до начала исследования.
2. Возможность приема материала на исследование в различное время суток, в течение всего рабочего времени лаборатории (снятие ограничений доставки в короткий срок).
3. Возможность приема материала из отдаленных районов России, где нет хорошо оснащенных лабораторий при налаженной транспортной логистике. Улучшение качества оказания диагностической лабораторной помощи населению из отдаленных регионов страны.
4. Улучшение условий обработки материала (более легкая гомогенизация при первичной обработке и др.) и проведения исследования на более качественном уровне.