СПОСОБ ОЦЕНКИ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА У ДЕТЕЙ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ
METHOD OF ASSESSING INNATE IMMUNITY IN CHILDREN WITH BRONCHIAL ASTHMA

Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии, аллергологии, пульмонологии, может быть использовано для оценки врожденного иммунитета слизистых оболочек респираторного тракта у детей с бронхиальной астмой.
Бронхиальная астма у детей является наиболее распространенным хроническим респираторным заболеванием в мире, поэтому одной из актуальных проблем в педиатрии является изучение факторов, способствующих формированию аллергически измененной реактивности. В последние годы в патогенезе бронхиальной астмы важнейшую роль отводят системе врожденного иммунитета. Представляется актуальным раннее выявление дефектов в системе врожденного иммунитета у детей с бронхиальной астмой для оптимизации лечения.
В последние годы достигнуты значительные успехи в изучении роли распознающих рецепторов врожденного иммунитета Toll-подобных рецепторов (TLRs), их роли в патогенезе различных заболеваний человека.
Известен способ оценки врожденного иммунитета, а именно Toll-подобных рецепторов у детей с бронхиальной астмой, которой основан на измерении уровня экспрессии TLR2 и TLR9 на мононуклеарных клетках периферической крови методом проточной цитометрии. (High expression of Toll-like receptors 2 and 9 and Th1/Th2 cytokines profile in-asthmatic children,  N, Del Rio-Navarro B, Gallardo-Casas C, Del Rio-Chivardi J, Muriel-Vizcaino R, Rivera-Pazos C, Huerta-Yepez S,  M, Maldonado-Bernal C. Allergy Asthma Proc. 2014 May-Jun; 35 (3): 34-41.) По данным исследования отмечается увеличение экспрессии рецепторов TLR2 и TLR9 у детей астматиков относительно группы здоровых детей. Данный способ выбран в качестве прототипа.
Более информативной считается оценка показателей врожденного иммунитета на уровне слизистой респираторного тракта, учитывая локальный характер воспаления, в связи с чем недостатком данного способа является выявление маркеров на лейкоцитарных клетках периферической крови.
Авторами поставлена задача разработать достоверный метод выявления нарушений врожденного иммунитета у детей с бронхиальной астмой, приводящих к обострению заболевания на фоне острой респираторной инфекции (ОРИ).
Техническим результатом предлагаемого изобретения является упрощение способа диагностики дефекта врожденного иммунитета у детей с бронхиальной астмой, неинвазивность исследования при одновременном повышении достоверности, специфичности диагностики за счет комплексной оценки влияния на ребенка широкого спектра патогенов бактериальной природы, а также ДНК вирусов, являющихся этиологическими факторами при острой респираторной инфекции путем использования в качестве количественного показателя состояния иммунитета экспрессии генов TLR2 и TLR9 эпителиальными клетками полости носа.
Известно, что TLR2 распознает широкий спектр патогенов бактериальной природы, a TLR9 - распознает неметилированные CpG повторы ДНК вирусов, являющихся этиологическими факторами при ОРИ (Л.В. Ковальчук, Л.В. Ганковская, Р.Я. Мешкова. Клиническая иммунология и аллергология, с основами общей иммунологии. С. 74-85).
Мы предположили, что выбранные гены будут информативны в плане оценки состояния врожденного иммунитета у детей с бронхиальной астмой и, соответственно, своевременной коррекции его нарушений.
Авторами была обследована группа здоровых детей (n=10) в возрасте от 3 до 7 лет и определены показатели системы врожденного иммунитета, а также установлена норма экспрессия генов TLR2 и TLR9.
В контрольной группе уровень экспрессии гена TLR2 был сравнительно невысок и составил 6 631,2 (5046-7116) копий к ДНК на 1 млн копий кДНК β-актина, p≤0,05, а уровень экспрессии гена TLR9 - 3 326,5 (2965-4548) копий кДНК на 1 млн копий кДНК β-актина, p≤0,05.
При исследовании детей с бронхиальной астмой (n=24) нами впервые было выявлено повышение экспрессии генов TLR2 и TLR9. Показатель уровня экспрессии гена TLR2 возрастал в 20 раз и составил 129 253,3(27637-262959) копий кДНК на 1 млн копий кДНК β-актина, p<0,05. Уровень гена TLR9 у детей с бронхиальной астмой увеличен относительно группы контроля в 9,5 раз - 31 441,6 (4916-52449) копий кДНК на 1 млн копий кДНК β-актина, p<0,05.
Достоверное увеличение экспрессии TLR2 и TLR9 приводит к обострению бронхиальной астмы на фоне острой респираторной инфекции за счет гиперактивации гуморальных факторов врожденного иммунитета (провоспалительных цитокинов), в том числе тимического стромального лимфопоэтина, приводящего к дифференцировке Т-хелперов наивных в Т-хелперы 2-го типа и к каскаду провоспалительных реакций.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Для оценки врожденного иммунитета у детей с бронхиальной астмой в соскобах со слизистой полости носа с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени определяют уровень экспрессии генов Toll-подобных рецепторов TLR2, TLR9. При одновременном повышении этих уровней больше чем в 20 и 9 раз соответственно, по сравнению с их уровнем, установленным у здоровых детей, диагностируют нарушение врожденного иммунитета, приводящее к обострению бронхиальной астмы на фоне острой респираторной инфекции (ОРИ) (гиперактивацию факторов врожденной иммунной системы, приводящих к обострению бронхиальной астмы на фоне острой респираторной инфекции).
Способ осуществляется следующим образом.
Для изучения экспрессии генов TLR2 и TLR9 используют следующую методику, которая включала в себя несколько последовательных этапов: взятие соскоба со слизистой полости носа, выделение из полученных клеток РНК, проведение реакции обратной транскрипции для синтеза на матрице РНК копии кДНК и проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР).
В качестве исследуемого материала в работе были использованы соскобы со слизистой оболочки полости носа, полученные с помощью «цитощеточки», тип D.
Для выделения РНК использовали набор реактивов для выделения ДНК/РНК методом аффинной сорбции на частицах силикагеля «АмплиПРАЙМ Рибо-сорб» (ИнтерЛабСервис, РФ) строго в соответствии с протоколом. В пробирки на 1,5 мл вносится 450 мкл прогретого до 60°C лизирующего буфера и 100 мкл буфера, содержащего эпителиальные клетки. Содержимое перемешивают и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 сек. В пробирку вносят 25 мкл ресуспензированного сорбента, перемешивают и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 30 сек, после чего надосадочную жидкость удаляют. Далее добавляют 500 мкл раствора для отмывки, перемешивают и центрифугируют при 10000 об/мин 30 сек и удаляют надосадочную жидкость. Данную отмывку производят дважды. Потом в пробирку вносят 400 мкл раствора 4, перемешивают и центрифугируют при 10000 об/мин 30 сек, удаляют надосадочную жидкость. Осадившийся в пробирках сорбент подсушивают в термостате при температуре 60°C 15 минут с открытыми крышками. Затем в пробирку вносят 50 мкл РНК-буфера, перемешивают и помещают в термостат на 3 мин при температуре 60°C, потом снова перемешивают и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 1 мин. Надосадочную жидкость переносят в отдельную пробирку, не захватывая сорбент, и хранят при -70°C.
В реакции обратной транскрипции (ОТ) используют 5 мкл РНК. ОТ проводят с использованием наборов реактивов для проведения реакции обратной транскрипции (Синтол, РФ) для синтеза кДНК на матрице РНК. Реакционная смесь содержит: 1 мкл праймера Random с концентрацией 0,5 ОЕ/мл (Синтол, РФ), 1 мкл праймера Oligo(dT) с концентрацией 15 ОЕ/мл (Синтол, РФ) и 3 мкл деионизированной воды. Проводят отжиг Random гексамеров и праймера Oligo(dT) на матрице мРНК при температуре 75°C в течение 3 минут. После этого в пробирку вносят 10 мкл 2,5х реакционной смеси, 1 мкл ревертазы MMLV-RT с концентрацией 50 ед./мкл при температуре +4°C и инкубируют 40 мин при температуре 37°C. Далее инактивацию ревертазы проводят при 95°C в течение 5 минут. Полученную кДНК хранят при -70°C.
В качестве контроля прохождения реакции ОТ и для стандартизации метода используют ПЦР-систему на определение экспрессии гена β-актина.
6
ПЦР в реальном времени ставят с использованием наборов реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I (Синтол, РФ) и специфических праймеров. В готовую смесь добавляют 3 мкл кДНК, полученной при реакции ОТ. Условия прохождения ПЦР со специфическими праймерами к гену β-актина, гену TLR2 и гену TLR9 были смоделированы с помощью программы VectorNTI 8,0 в соответствии с последовательностями мРНК, опубликованными в базе данных Gene Bank. Отрицательным контролем служит проба с реакционной смесью, не содержащая мРНК. ПЦР в реальном времени проводят на приборе ДТ-96 (ДНК-Технология, РФ) по следующей схеме: денатурация - 95°C - 5 мин, отжиг и элонгация (94°C - 20 сек, 62°C - 40 сек) - 40 циклов. Полученные результаты анализируют с помощью программы, прилагающейся к прибору ДТ-96. Расчет количества копий кДНК гена β-актина, TLR2, TLR9 проводят относительно разработанных ранее калибровочных прямых. Количество копий кДНК гена генов TLR2 и TLR9 определяют относительно 1×10 копий к ДНК гена β-актина.
В результате данной работы выявлены параметры, которые оказались весьма показательными и пригодными для клинических целей.
Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.
Пример №1
Ребенок Г., мужского пола, 6 лет 6 мес. Наследственность отягощена - у отца поллиноз. С рождения на искусственном вскармливании. На первом году жизни - кожные высыпания при смене смеси. В 3 года впервые отмечались признаки аллергического ринита. В 5 лет кашель в ночные часы. В феврале 2014 г. установлен диагноз обструктивный бронхит. В марте 2014 - выраженная бронхообструкция на фоне ОРИ. Январь 2015 г. - ОРВИ, обструктивный бронхит. В ходе обследования выявлено повышение уровня IgE до 200 ед./мл, резкоположительная сенсибилизация к эпидермальным аллергенам пера подушки и шерсти кошки, слабая - к домашней пыли и библиотечной пыли, оксид азота в выдыхаемом воздухе ниже нормы. Установлен диагноз: Бронхиальная астма, атопическая форма, легкое персистирующее течение, контролируемая.
У данного пациента число копий кДНК TLR2 составляло 249458 копий относительно 1×106 копий кДНК β-актина, a TLR9 - 38769 копий относительно 1×106 копий кДНК β-актина. Повышение уровня TLR2 в 37 раз, TLR9 - в 11,5 раз по сравнению с группой здоровых детей.
Вывод: у данного пациента отмечается дефект врожденного иммунитета - значительное повышение показателей врожденного иммунитета, гиперэкспрессия которых приведет к обострению бронхиальной астмы на фоне ОРИ. При наблюдении за больным были отмечены неоднократные обострения бронхиальной астмы на фоне респираторной инфекции.
Пример №2
Ребенок И., женского пола, 3 г. 7 мес. Наследственность отягощена - у отца поллиноз, пищевая аллергия. На первом году жизни - атопический дерматит. В 1,5 года - отек Квинке после употребления рыбы.
Июль 2014 года - впервые приступы затрудненного свистящего дыхания. Выявлена сенсибилизация к пыльцевым аллергенам. Лечение ингаляционными глюкокортикостероидами с положительным эффектом. Далее в течение одного года, ребенок перенес трижды ОРИ, осложнившуюся приступами бронхообструкции. В ходе обследования выявлено повышение уровня IgE до 563 ед./мл, резкоположительная сенсибилизация к пыльцевым аллергенам (береза, лещина, ольха), слабая - к пыльцевым аллергенам дуба и эпидермальным аллергенам шерсти кошки, рентгенологическая картина бронхитических изменений. Установлен диагноз: Бронхиальная астма, атопическая форма, легкое персистирующее течение.
Количество копий кДНК TLR2 у данной пациентки составляет 449 799 копий, a TLR9 53 489 копий относительно 1×106 копий кДНК β-актина. Повышение уровня TLR2 в 67 раз, TLR9 - в 15 раз по сравнению с группой здоровых детей.
Вывод: у девочки выявлено повышение показателей врожденного иммунитета относительно группы здоровых детей, при наблюдении за пациенткой выявлялись неоднократные обострения бронхиальной астмы на фоне ОРИ.
Пример №3
Ребенок Г., мужского пола, 4 г. 6 мес. Наследственность отягощена - поллиноз у дяди по отцовской линии. На грудном вскармливании до 4 месяцев. На первом году жизни атопический дерматит. С 3-х лет на фоне каждого ОРЗ-бронхообструктивный синдром. В ходе обследования выявлено повышение уровня IgE до 214,07 ед./мл, резкоположительная сенсибилизация к аллергенам домашней пыли и клещам домашней пыли, библиотечной пыли и пера подушки. Установлен диагноз: Бронхиальная астма, атопическая форма, легкое персистирующее течение.
Количество копий кДНК TLR2 у данного пациента составляет 142430 копий, a TLR9 129136 копий относительно 1×106 копий кДНК β-актина. Повышение уровня TLR2 в 21 раз, TLR9 - в 38 раз по сравнению с группой здоровых детей.
Вывод: у ребенка с бронхиальной астмой выявлена гиперэкспрессия показателей врожденного иммунитета, что провело к частым обострениям основного заболевания в результате ОРИ.
Выявленные в соответствии с предлагаемым способом нарушения врожденного иммунитета у 24 детей с бронхиальной астмой, большая часть которых имела атопическую бронхиальную астму, во всех случаях сопровождались обострениями основного заболевания на фоне ОРИ.
Предложенный способ пригоден для широкого клинического применения: оценка врожденного иммунитета у пациентов с бронхиальной астмой, в том числе с ее атопической формой, дает возможность прогнозировать развитие инфекционно-зависимого течения заболевания, сопровождающегося обострением бронхиальной астмы на фоне ОРИ. Выявление нарушений врожденного иммунитета в соответствии с предлагаемым способом позволяет своевременно корригировать терапию детей с бронхиальной астмой.
Таким образом, заявленное изобретение позволяет проводить диагностику нарушений системы врожденного иммунитета у детей с бронхиальной астмой, установить их связь с обострениями данного заболевания на фоне ОРИ, что важно в практическом отношении и основано на конкретных объективных лабораторных показателях.
Использование данного способа будет способствовать правильному ведению пациентов с бронхиальной астмой со своевременной коррекцией проводимой терапии.