Штамм Streptomyces iakyrus Pe6 ВКПМ Ас-2084 - продуцент антибиотика нибомицина
STRAIN OF STREPTOMYCES IAKYRUS Re6 VKPM Ac-2084 - PRODUCER OF ANTIBIOTIC NIBOMYCIN

Область техники
Изобретение относится к микробной биотехнологии, микробиологической промышленности и касается штамма микроорганизма вида Streptomyces iakyrus Ре6, продуцирующего нибомицин - редкий природный антибиотик азолохинолиновой группы, обладающий активностью против грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий и значительными перспективами для медицины.
Уровень техники
15
13
Впервые о выделении антибиотика нибомицина было сообщено еще в 1955 году (Strelitz F., Flon Н., Asheshov I.N. Nybomycin, a new antibiotic with antiphage and antibacterial properties. Proc Natl Acad Sci USA. 1955. Vol. 41, pp. 620-624), а спустя 15 лет обнаружены природные производные (Naganawa Н., Wakashiro Т., Yagi A., Kondo S., Takita Т., Hamada M., Maeda K., Umezawa H. Deoxynybomycin from Streptomyces. J. Antibiot. 1970. Vol. XXIII. N. 7, pp. 365-369), оценена возможность химического синтеза (Forbis R.M., Rinehart K.L. Nybomycin. VII. Preparative routes to nybomycin and deoxynybomycin. J. Amer. Chem. Soc. 1973. Vol. 95. No. 15, pp. 5003-5013) и затем проанализирована структура нибомицина (Nadzan A.M., Rinehart K.L. Nybomycin. 9. Synthetic and biosynthetic incorporation of N as a means of assigning the C nuclear magnetic resonance spectrum of nybomycin. J. Amer. Chem. Soc. 1977. Vol. 99. No. 14, pp. 4647-4654).
Несмотря на то, что данный антибиотик был открыт в начале эры антибиотиков, он не использовался в медицине и был надолго забыт. Однако в последние годы он был выделен заново, и было показано, что нибомицин и его производные обладают специфической активностью против грамположительных патогенных бактерий (в частности, Mycobacterium tuberculosis), а также против патогенов с множественной резистентностью к другим антибиотикам, например, MRSA (Hiramatsu К., Igarashi М., Morimoto Y., Baba Т., Umekita М., Akamatsu Y. Curing bacteria of antibiotic resistance: reverse antibiotics, a novel class of antibiotics in nature. International Journal of Antimicrobial Agents. 2012. June. Vol. 39, Is. 6, pp. 478-485). Кроме того, есть данные о том, что некоторые химические модификации могут повысить эффективность нибомицина, чтобы расширить спектр его действия также и для грамотрицательных патогенных бактерий (Richter M.F., Drown B.S., Riley A.R. et al. Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic. Nature. 2017. 545(7654) pp. 299-304). Такие особенности делают нибомицин крайне перспективным веществом для дальнейшего исследования и использования в медицине.
В мировых коллекциях микроорганизмов продуценты нибомицина единичны и восходят к единственному штамму Streptomyces hyalinum n. sp. Hamada et Yokoyama, выделенному еще в 1970 году и получившему статус нового вида.
Из уровня техники известен единственный коллекционный штамм продуцент нибомицина - Streptomyces hyalinum АТСС 29817 (известный также как Streptomyces hyalinus NBRC 13850) (Sterlitz et al., 1955; Naganawa et al., 1970).
Однако, к недостаткам выше указанного штамма можно отнести то, что в ходе биосинтеза помимо собственно нибомицина образуется ряд его дериватов (до 5 разнообразных веществ), среди которых доля нибомицина не превышает 40%, что ведет к необходимости проведения сложной многоступенчатой системы очистки и концентрирования целевой субстанции. В продуктах биосинтеза исследованного нами штамма Streptomyces iakyrus Ре6 ВКПМ Ас-2084 был обнаружен только нибомицин, иных его дериватов выявлено не было, таким образом, данный штамм образует нибомицин в виде гомогенной, пригодной для выделения фракции.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является получение бактериального штамма, способного продуцировать ферментационную жидкость с высоким содержанием антибиотика (не менее 15 мг/л).
Штамм Streptomyces iakyrus Ре6 ВКПМ Ас-2084 был выделен при поверхностном посеве на среду, содержащую крахмал и нитрат (минеральный агар Гаузе 1), из гомогенизата рабочих особей муравьев Camponotus vagus. Образцы гнездового материала и живые особи муравьев-древоточцев Camponotus vagus были отобраны в Брянской области (государственный природный биосферный заповедник "Брянский лес", 52.440009 N, 34.126288 Е) в июле 2014 года.
Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика (ВКПМ, Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1) под регистрационным номером Ас-2084.
Идентификация штамма Streptomyces iakyrus Ре6 ВКПМ Ас-2084 основывалась на анализе данных секвенирования нуклеотидной последовательности гена 16s рРНК и сопоставления этих данных с последовательностями, депонированными в базу GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank). Данный подход в настоящее время считается безусловно надежным для идентификации мицелиальных актинобактерий на уровне рода.
Штамм Streptomyces iakyrus ВКПМ Ре6 Ас-2084 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками:
Культурально-морфологические признаки
Штамм ВКПМ Ас-2084 при росте на спектре твердых питательных сред, рекомендуемых для фенотипического описания стрептомицетов (Гаузе Г.Ф., Преображенская Т.П., Свешникова М.А., Терехова Л.П., Максимова Т.С. Определитель актиномицетов: роды Streptomyces, Streptoverticillium, Chainia. М.: Наука. 1983. 248 с.) образует:
хорошо развитый воздушный мицелий светло-серого, серого, желтовато-серого или белого цвета;
спороносцы спиральные (S), споры с гладкой оболочкой;
зрелые спороносцы содержат 10-50 спор в цепочке;
субстратный мицелий буроватый, бурый, коричневый, темно-коричневый;
растворимый пигмент бурый, коричневый, темно-коричневый;
меланоидные пигменты образует.
Физиолого-биохимические признаки
Штамм растет в аэробных условиях в диапазоне температур от +18 до +40°С, с оптимумом роста при 28±2°С.
Растет в диапазоне рН 6,0-9,0, оптимальная величина рН всех используемых сред составляет 7,2-7,7.
В качестве источника углерода утилизирует глюкозу, фруктозу, рамнозу, инозит, сахарозу, глицерин. Не использует арабинозу, лактозу, ксилозу, маннит, сорбит, целлюлозу. Крахмал гидролизует.
В качестве источника азота использует нитратные, аммонийные соединения, гидролизаты белков, аминокислоты. Обладает протеолитической активностью. Желатину разжижает, молоко пептонизирует.
Образует антибиотик нибомицин, активный в отношении грамположительных бактерий. Штамм ВКПМ Ас-2084 не патогенен.
Таким образом, на основании филогенетического родства и фенотипических признаков выделенный штамм Ре6 был отнесен к виду Streptomyces iakyrus и депонирован в коллекцию ВКПМ под номером Ас-2084.
Хранение и поддержание жизнеспособности штамма
Штамм можно хранить при +4°С и поддерживать путем пересева раз в 2-3 недели на плотные питательные среды, например, следующего состава: овсяная мука - 20 г, агар - 20 г, раствор микроэлементов - 1 мл, агар - 20 г, вода дистиллированная - 1 л (Гаузе и др., 1983).
Длительное хранение штамма при температуре от -20 до -70°С может быть обеспечено культивированием в жидкой питательной среде содержащей глюкозу, гидролизат белков, дрожжевой экстракт, минеральные соли в течение 3-7 дней, разлив культуральной жидкости в специальные емкости для хранения при низких температурах с добавлением веществ-криопротекторов, соблюдая условия стерильности.
Пример. Штамм Streptomyces iakyrus ВКПМ Ре6 Ас-2084 культивируют в жидкой питательной среде следующего состава: глюкоза - 10 г, пептон - 10 г, гидролизат казеина - 2 г, дрожжевой экстракт - 2 г, NaCl - 6 г, вода - 1 л, при 28°С. Затем в 3-5 суточную культуральную жидкость в качестве криопротектора асептически вводят стерильный раствор 50% глицерола в объемном соотношении 1:1. Полученную смесь раскапывают по криопробиркам и помещают на хранение при температуре ниже -20°С.
Краткое описание чертежей
Изобретение поясняется следующими чертежами.
На фиг. 1 представлены результаты ВЭЖХ-анализа: фракция после XAD-2 (А), очищенное вещество с антибиотическим действием (В).
На фиг. 2 представлены фотографии, демонстрирующие антагонистическое действие, оказываемое на репортерную систему JW5503 Δ tolC -pDualrep2, исходного штамма Ре6 (G2), ферментативной жидкости Streptomyces iakyrus Ре6 ВКПМ Ас-2084 (Ре6 media), активной фракции в 20% ацетонитриле (Ре6 20% ACN fraction) и очищенного антибиотика нибомицина (Nyb pure). В качестве референсных антибиотиков использованы левофлоксацин (Lev) и эритромицин (Ery).
Осуществление изобретения
Выделение и культивирование Streptomyces iakyrus Ре6 ВКПМ Ас-2084
2
4
4
2
3
4
Для исследования отбирали по 4 взрослых особи Camponotus vagus, усыпяли эфиром и перетирали вручную в ступке со стерильным песком и 20 мл стерильной воды в течение трех минут. Полученные гомогенизаты муравьев обрабатывали на шейкере «Multi Reax» (Heidolph, Германия) 10 минут при 2000 об./мин и затем 10-кратно разводили стерильной водопроводной водой. Посев производили на питательные среды следующего состава (г/л): крахмал растворимый - 20, КНРО - 0,5, MgSO×7HO - 0,5, KNO - 1, NaCl - 0,5, FeSO - 0,01, агар - 20 (Гаузе и др., 1983). Для ограничения роста грибов и грамотрицательных бактерий в среды перед разливом добавляли нистатин (250 мкг/мл) и налидиксовую кислоту (10 мкг/мл) соответственно. Засеянные чашки Петри инкубировали при 28°С в течение двух недель.
Выросшие колонии мицелиальных прокариот выделяли в отдельные изоляты, среди которых проводился скриннинг за антагонистическую активность в отношении репортерного штамма JW5503 Δ tolC -pDualrep2 (Osterman I.A., Komarova E.S., Shiryaev D.I., Korniltsev I.A., Khven I.M., Lukyanov D., Tashlitsky V.N., Serebryakova M.V., Efremenkova O.V., Ivanenkov Y.A., Sergiev P.V., and Dontsova O.A. Sorting out antibiotics' mechanisms of action: a double fluorescent protein reporter for high throughput screening of ribosome and dna biosynthesis inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2016. pp. AAC.02117-16. doi: 10.1128/AAC.02117-16). Таким образом, был выявлен штамм Ре6, вызывавший повреждение ДНК у репортерной системы.
Получение нибомицина с использованием нового штамма-продуцента
3
2
3
2
2
3
Клетки штамма-продуцента Streptomyces iakyrus Ре6 ВКПМ Ас-2084 выращивают на агаризованной среде Гаузе I, затем высевают в колбы с жидкой питательной средой следующего состава (г/л): глюкоза - 10, пептон - 6,2, дрожжевой экстракт - 2, гидролизат казеина - 2, NaCl - 2,75, KNO - 0,06, NaCO - 0,7, NaSO - 0,2 (рН после автоклавирования при 0,5 атм составляет 8,5). Культивирование производится при 28°С, аэрации и перемешивании на орбитальном шейкере в течении 7-9 суток. К концу ферментации содержание нибомицина в культуральной жидкости составляет до 25 мг/л.
По окончании срока ферментации культуральную жидкость сливают из колб и фильтруют сначала через стерильные бумажные фильтры "белая лента", а затем через мембранные фильтры Millipore (Merk) с диаметром пор 0,45 мкм.
Фильтрат наносят на хроматографическую колонку 1×15 см, наполненную сорбентом - стироловой/дивинилбензоловой полимерной смолой (XAD-2). Колонку предварительно промывают 50%, а затем 20% раствором ацетонитрила в воде и уравновешивают водой. После нанесения культуральной жидкости колонку элюируют градиентом 0 - 50% ацетонитрила с попутным сбором фракций. Активные фракции объединяют и концентрируют, а затем подвергают дополнительной очистке на ВЭЖХ С18 колонке в градиенте 10 - 40% ацетонитрила (фиг. 1). На всех этапах выделения контролируется антибиотическая активность выделяемых фракций (фиг. 2).
Методами УФ-спектрометрии и масспектрометрии было установлено, что полученная фракция, обладающая высокой ДНК-повреждающей активностью в отношении репортерного штамма JW5503 Δ tolC -pDualrep2 (Osterman et al., 2016), представлена на 89% антибиотиком нибомицином.