Аллергенспецифическая иммунотерапия при экспериментальном атопическом дерматите

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ

Eur. J. Obstetr. Gynecol. Reprod. Biol. 2011; 55(1): 94-8.

7. Arruvito L., Sanz M., Banham A.H., Fainboim L. Expansion of cD4+cD25+ and FOXP3+ regulatory T cells during the follicular phase of the menstrual cycle: implications for human reproduction. J. Immunol. 2007; 178: 2572-8.

8. Khonina N.A., Tikhonova M.A, Dzutseva I.B., Pasman N.M., Ostanin A.A., Chernykh E.R. Immune dysfunctions in women with unexplained infertility. Meditsinskaya immunologiya. 2010; 12

9. Jasper M.J., Tremellen R.P., Robertson S.A. Primary unexplained infertility is associated with reduced expression of the T-regulatory cell transcription factor FoxP3 in endometrial tissue. Mol. Hum. Reprod. 2006; 12: 301-8.

10. Yin Y., Han X., Shi Q., Zhao Y., He Y. Adoptive transfer of CD4+CD25+ regulatory T cells for prevention and treatment of spontaneous abortion. Eur. J. Obstetr. Gynecol. Reprod. Biol. 2012; 161(2): 177-81.

11. Lee S., Kim J., Jang B. Fluctuation of peripheral blood T, B, and NK cells during a menstrual cycle of normal healthy women. J. Immunol. 2010; 185: 756-62.

12. Schulke L.F., Manconi R., Markham I.S. Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle. Hum. Reprod. 2008; 23(7): 1574-80.

13. Tai P., Wang J., Jin H., Song X., Yan J., Kang Y et al. Induction of regulatory T cells by physiological level estrogen. J. Cell. Physiol. 2008; 214(2): 456-64.

14. Lee S.K., Kim J.Y, Hur S.E., Kim C.J., Na B.J., Lee M. et al. An imbalance in interleukin-17-producing T and Foxp3 regulatory T cells in women with idiopathic recurrent pregnancy loss. Hum. Reprod. 2011; 26(11): 2964-71.

15. He S., Li M., Ma X., Lin J., Li D. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory

T cells protect the proinflammatory activation of human umbilical vein endothelial cells. Arteroscler. Thromb.Vasc. Biol. 2010; 30: 2621-30.

16. Kassan M., Galan M., Partyka M., Trebak M., Matrougui.K. Interleukin-10 released by CD4CD25 natural regulatory T cells improves microvascular endothelial function through inhibition of NADPH oxidase activity in hypertensive mice. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2011; 31: 2534-42.

17. Bedke Т, Pretsch L., Karakhanova S., Enk A.H., Mahnke K. Endothelial cells augment the suppressive function of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells: Involvement of programmed death-1 and IL-10. J. Immunol. 2010; 184: 5562-70.

18. Khonina N.A., Broitman E.V., Shevela E.Y., Pasman N.M., Chernykh E.R. Mixed lymptocyte reaction blocking factors (MRL-bf) as potential biomarker for indication and efficacy of paternal lymphocyte immunization in recurrent spontaneous abortion. Arch. Cynecol. Obstetr. 2013; 288: 933-7.

19. Hui Yang, Lihua Qui, Wen Di, Aiming Zhao, Guangjie Chen, Ke Hu et al. Proportional change of CD4+CD25+ regulatory T cells after lymphocyte therapy in unexplained recurrent spontaneous abortion patients. Fertil. and Steril. 2009; 92: 301-5.

20. Kessel A., Ammuri H., Peri R., Pavlotzky E.R., Blank M., Shoen-feld Y. et al. Intravenous immunoglobulin therapy affects T regulatory cells by increasing their suppressive function. J. Immunol. 2007; 179(8): 5571-5.

21. Baeke F., Korf H., Overbergh L., Verstuyf A., Thorrez L., Van Lommel L. et al. The vitamin D analog, Tx527, promotes a human CD4+CD25highCD127low regulatory T cell profile and induces a migratory signature specific for homing to sites of inflammation. J. Immunol. 2011; 186(1): 132-42.

Received 20.11.13

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.5-002-056.43-085.37-092.9

Шершакова Н.Н., Бабахин А.А., Башкатова Е.Н., Камышников О.Ю., Андреев С.М., Шилов-ский И.П., Хаитов М.Р.

аллергенспецифическая иммунотерапия при экспериментальном атопическом дерматите

ФГБУ ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, г Москва

Атопический дерматит (Ад) представляет собой широко распространенное аллергическое заболевание кожного покрова. Профилактика и лечение аллергических заболеваний, в частности Ад, является важной проблемой в аллергологии. В настоящей работе осуществлена попытка проведения экспериментальной аллергенспецифической иммунотерапии (АСИТ) на модели Ад модифицированным (сукцинилирование) и немодифицированным аллергеном. Использована модель Ад на мышах, основанная на эпидермальном введении (сенсибилизация) модельного аллергена овальбумина (ОА). Выявлено, что проведение АСИТ как модифицированным, так и немодифицированным аллергеном ОА понижает уровень аллергенспецифических IgE-антител, а также соотношение как IgG1/IgG2а, так и интерлейкина-4/интерферона-у. При гистологическом анализе образцов кожи установили, что АСИТ улучшает гистологическую картину, снижая аллергическое воспаление, причем модифицированный аллерген оказался более эффективным, чем немодифицированный. Таким образом, можно полагать, что проведение АСИТ мономерным ал-лергоидом (модифицированное сукцинилирование ОА) является перспективным направлением терапии Ад.

Ключевые слова: атопический дерматит; мышиная модель АД; овальбумин; аллергенспецифическая иммунотерапия; модифицированный аллерген.

Для корреспонденции: Шершакова Надежда Николаевна, e-mail: nsh18.81@mail.ru For correspondence: Shershakova Nadezhda Nikolaevna, e-mail: nsh18.81@mail.ru

- 155 -

ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2014

Shershakova N.N., Babakhin A.A., Bashkatova E.N., Kamishnikov O. Yu., Andreev S.M., Shilovskiy I.P., Khaitov M.R. ALLERGEN-SPECIFIC IMMUNOTHERAPY OF EXPERIMENTAL ATOPIC DERMATITIS NRC Institute of Immunology FMBA, 115478, Moscow

Atopic dermatitis (AD) is a widely spread allergic disorders of the skin. The prophilaxis and treatment of AD is an important problem in allergology. In this study, we investigated whether allergen-specific immunotherapy (ASIT) with model allergens, ovalbumin (oA) or succinylated oA, is effective in a mouse model of atopic dermatitis. Experimental model of AD was reproduced by using an epicutaneous sensitization with oA. It was shown that ASIT with both modified (soA) or unmodified (oA) allergen resulted in a reduction of anti-oA IgE level as well as index (ratio) of IgG1/IgG2a and IL-4/IFN-y. Histological analysis of skin samples from sites of allergen application showed that the ASIT improved histological picture by decreasing of allergic inflammation in comparison to untreated mice. As a drug for ASIT the soA was more effective in comparison to the oA. Taken together, these data indicate that ASIT with succinylated allergens may be suitable approach for the treatment of atopic dermatitis.

Key words: atopic dermatitis (AD); mouse model ofAD; ovalbumin; allergen-specific immunotherapy (ASIT); modified allergen

Введение. В настоящее время обоснованно считается, что только аллергенспецифическая иммунотерапия (АСИТ), воздействующая на природу самого заболевания, является тем подходом в лечении аллергических заболеваний, который надежно обеспечивает в долгосрочной перспективе снижение симптоматики и торможение прогрессии заболевания даже после прекращения терапии. Вместе с тем, согласно всеобщему мнению, требуются дальнейшие усилия по совершенствованию АСИТ в плане повышения ее безопасности и эффективности, базирующиеся как на понимании механизмов АСИТ, так и на современных методических подходах, касающихся изменения схем терапии, улучшения качества аллергенных экстрактов и их модифицированных форм, применяемых для лечения, а также средств и путей доставки аллергенного материала [1, 2].

Ранее на модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы мы показали, что экспериментальная АСИТ мономерным аллергоидом не уступала по эффективности АСИТ немодифицированным аллергеном [3].

В настоящем исследовании мы попытались применить аналогичный подход, используя экспериментальную АСИТ мономерным аллергоидом, для гипосенсибилизации на мышиной модели атопического дерматита (АД). АД представляет собой хроническое аллергическое воспалительное заболевание кожи, основными клиническими признаками которого являются зуд кожных покровов, стойкая гиперемия, экссудация, шелушение и экскориация, носящие распространенный или ограниченный характер. Возникновение данного заболевания может быть обусловлено различными факторами. Например, известно, что у 15-20% пациентов с АД мутирован ген, кодирующий белок филаггрин, обеспечивающий барьерную функцию кожи. Моделирование АД на мышах, лишенных белка филаггрина, подтвердило ключевую роль состояния кожного барьера при возникновении АД [4, 5]. Кроме генетически обусловленных нарушений функций кожного барьера, благоприятные условия для возникновения заболевания создают механические повреждения кожи [6], а также многократная сенсибилизация гаптенами [7, 8]. Патогенез АД связан с доминированием №2-зависимого иммунного ответа [9-11], который характеризуется выработкой клетками таких цитокинов, как интерлейкин (ИЛ)-4, ИЛ-5, ИЛ-13, а также фактор некроза опухоли а и ИЛ-17, что приводит к повышению уровня IgE и лейкоцитарной инфильтрации дермы [12].

В настоящее время, несмотря на достигнутый успех в расшифровке ряда механизмов развития аллергических реакций при АД, терапия данного заболевания представляет значительные трудности. В связи с этим разрабатываеются новые подходы к лечению АД, в том числе связанные с современными концепциями в области АСИТ.

Целью данного исследования стало сравнительное изучение эффектов АСИТ с использованием сукцинилированной и немодифицированной формы аллергена, в качестве которого выступал овальбумин (ОА).

Материалы и методы. Экспериментальные животные и аллергены. В работе использовали самок мышей линии BALB/c массой 18-20 г в возрасте 6-8 нед, полученных из питомника ГУНЦБМТ РАМН. В качестве модельного аллергена использовали ОА (Sigma, Grade V, США), содержащий не менее 99% основного продукта и обладающий мол. массой 44 287 Д. ОА был оптимально химически модифицирован сукцинилированием (сОА), как описано ранее [13], и получен образец мономерного аллергоида со степенью модификации s-групп лизина около 100%.

Проведение АСИТ на модели АД. Моделирование АД осуществляли согласно методике, представленной ранее [14]. АСИТ проводили по описанной схеме [3]. Кратко: в интервале между первой и второй. ЭД аппликациями ОА мыши получали подкожно (п/к) 16 инъекций ФСБ или ОА в возрастающих дозах с 0,05 до 50 мг/кг (группы АСИТ ФСБ и АСИТ ОА соответственно). Мыши группы АСИТ сОА получали п/к 7 инъекций сОА в возрастающих дозах (с 6 до 50 мг/кг) в 0,5 мл ФСБ. Интактные мыши получали аппликации ФСБ эпидермально.

Иммуноферментный анализ. Уровень специфических IgE-, IgG1- и IgG2а-антител (АТ) в индивидуальных сыворотках крови мышей тестировали согласно инструкции производителя (BD, США). Для сорбции использовали ОА (10 мкг/мл) в ФСБ. Точную концентрацию анти-ОА IgE в сыворотках крови мышей определяли по калибровочной кривой, полученной при титровании стандартного образца анти-ОА IgE мыши (Serotec, Великобритания). Содержание ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-17, интерферона-у (ИФНу) в супернатантах стимулированных спленоцитов определяли, используя набор фирмы BD OptEIA™ (США) в соответствии с методическими рекомендациями производителя. Концентрацию цитокинов изучали по калибровочной кривой, полученной при титровании входящих в состав наборов стандартных образцов ИЛ мыши.

Культура спленоцитов in vitro. Мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации, затем извлекали селезенку в асептических условиях. Селезенку помещали в охлажденную “полной” среду RPMI 1640 (10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma, США), 25 мМ HEPES, 24 мМ Na2CO3, 0,3 мг/мл глутамина, 0,08 мг/мл гентамицина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола). Изолированную селезенку дезинтегрировали и полученную взвесь клеток фильтровали через стерильное ситечко (диаметр пор 40 мкм). Клетки осаждали центрифугированием (10 мин, 150 g, 4°С), затем дважды промывали свежей средой. Спленоциты высевали в 12-луночный планшет в концентрации 5-106 клеток/лунку и стимулировали ОА (4 мкг/мл). Сбор супернатантов для последующего анализа осуществляли через 72 ч после стимуляции.

Гистологическое исследование кожи. Образцы кожи фикировали в 10% растворе формалина. Обезвоживание и проводку образцов, заливку в парафин проводили ручным способом. Микротомирование парафиновых блоков для получения срезов толщиной 4 мкм осуществляли с помощью

- 156 -

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ

Рис. 1. Изменение концентрации (в пг/мл) анти-ОА IgE (M ± т) в индивидуальных сыворотках мышей.

* - достоверно отличается от группы АСИТ ФСБ; p < 0,05.

ротационного микротома Reichert Jung. Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, заключали в пихтовый бальзам под покровные стекла для получения постоянных микропрепаратов. Микроскопический анализ гистологических препаратов кожи мышей разных групп проводили на микроскопе Opton (Германия).

Степень патоморфологических изменений кожи оценивали по балльной системе. Проанализировали и определили степень утолщения эпидермиса, наличие некроза, гиперкератоза, степень пролиферации соединительнотканных элементов дермы и подкожно-жировой клетчатки (ПЖК), а также присутствие в этих слоях некроза, отека и геморрагий. Кроме того, изучили клеточную инфильтрацию дермы и ПЖК на предмет наличия эозинофилов, полинуклеарных лейкоцитов, лимфоцитов и тучных клеток.

Статистический анализ. Статистическую обработку результатов при сравнении групп проводили с использованием программы Statistica 8.0 (Stat Soft Inc., США), причем статистическую значимость устанавливали с помощью t-критерия Стьюдента. Значения р<0,05 принимали как статистически значимые.

Результаты и обсуждение. Перед началом АСИТ уровень анти-ОА IgE во всех группах был невысок (рис. 1). В дальнейшем концентрация анти-ОА IgE в сыворотках мышей, получавших АСИТ ОА и сОА, на всех этапах оказалась ниже, чем в модельной группе АСИТ ФСБ, но постепенно повышалась, а после последнего этапа наблюдали ее значительное снижение. Следует подчеркнуть, что в группе АСИТ сОА после 4-го этапа терапии отметили статистически значимое снижение уровня анти-ОА IgE по сравнению с таковым в группе АСИТ ФСБ, что свидетельствовало о положительном влиянии терапии на иммунный ответ. Однако после еще двух ЭД-аппликаций ОА итоговый уровень анти-ОА IgE в экспериментальных группах статистически значимо не отличался.

Итоговый уровень анти-ОА IgE во всех группах достоверно отличается от такового в группе интактных мышей (p<0,05).

Что касается уровня анти-ОА IgGl-АТ, то в процессе

АСИТ ФСБ ' АСИТ ОА ' АСИТ сОА ' Интактные

Рис. 2. Соотношение уровня анти-ОА IgG1/IgG2a-АТ по единицам ОП в каждой группе после 3-й ЭД-аппликации ОА.

АСИТ как ОА, так и сОА наблюдали его значительное повышение. В модельной группе АСИТ ФСБ отметили медленное, несущественное повышение уровня анти-ОА IgGl-АТ, достигающее максимума после третьей ЭД-аппликации ОА (итоговый уровень). Следует указать, что итоговый уровень анти-ОА IgGl в группе АСИТ сОА был несколько ниже, чем в модельной (данные не приведены).

Показали, что уровень анти-ОА IgG2a-АТ в процессе АСИТ у мышей повышался. Итоговый уровень специфических IgG2a-АТ в группах АСИТ ОА и АСИТ сОА был выше, чем в модельной группе, и достоверно выше такового перед началом АСИТ (данные не приведены). Косвенной характеристикой перестройки иммунного ответа к аллергену после АСИТ может служить соотношение уровня специфических IgGl и IgG2a. Мы рассчитали соотношение (индекс) анти-ОА IgG1/IgG2a по данным ОП итогового уровня после третьей ЭД-аппликации ОА (рис. 2).

Считается, что увеличение индекса IgG1/IgG2a свидетельствует о №2-направленности иммунного ответа на аллерген, а уменьшение - о преобладании иммунного ответа с участием Thl-клеток. На рис. 2 видно, что в группе АСИТ ФСБ индекс IgG1/IgG2a наибольший - 5,8, а у мышей, получавших АСИТ, он ниже. Так, например, в группе АСИТ ОА он составляет 5,3, а в группе АСИТ сОА - 3,4. В группе ин-

АСИТ ФСБ ИАСИТОА Ш АСИТ сОА Щ Интактные

Рис. 3. Концентрация (в пг/мл) ИЛ-5 в супернатантах стимулированных спленоцитов мышей.

* - достоверно отличается от группы интактных мышей; p < 0,05.

- 157 -

ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2014

Рис. 4. Концентрация (в пг/мл) ИЛ-17 в супернатантах стимулированных спленоцитов.

* - достоверно отличается от группы интактныех мышей; p < 0,05.

** - достоверно отличается от группы АСИТ ОА; p < 0,05.

тактных мышей этот индекс был равен 1. Следует отметить, что наибольший сдвиг профиля иммунного ответа в сторону ТЫ наблюдали у мышей, получавших АСИТ модифицированным аллергеном сОА.

Кроме антительного ответа мы проанализировали также показатели цитокинового профиля: ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-17 и ИФНу. Показали, что уровень ИЛ-4 в супернатантах стимулированных спленоцитов мышей опытных групп был достоверно выше, чем в супернатантах нестимулированных спленоцитов. Кроме того, концентрация данного цитокина в группах АСИТ ОА и АСИТ сОА оказалась достоверно ниже, чем в модельной группе АСИТ ФСБ (данные не приведены). Это свидетельствует о том, что АСИТ снижает продукцию ИЛ №2-профиля, в частности ИЛ-4.

Уровень ИЛ-5 в супернатантах стимулированных ОА и нестимулированных спленоцитов мышей опытных групп достоверно отличался (рис. 3).

Следует отметить, что в супернатантах стимулированных ОА клеток селезенок мышей, получавших АСИТ ОА и сОА, наблюдали тенденцию к снижению концентрации ИЛ-5.

Что касается ИЛ-17, то его концентрация в супернатантах стимулированных ОА спленоцитов мышей всех экспериментальных групп была выше, чем в интактной группе (рис. 4).

Кроме того, на рис. 4 видно, что при ОА-стимуляции спленоцитов мышей группы АСИТ ОА количество ИЛ-17 достоверно снижается относительно такового в модельной группе животных, а также по сравнению с аналогичным показателем у мышей, получавших АСИТ сОА. Полученные данные свидетельствуют о том, что АСИТ ОА ведет к изменению так называемого ТЫ7-иммунного ответа, что в свою очередь может влиять на уровень цитокинов, характерных для №2-ответа [8]. Это предположение отчасти подтверждается данными по уровню ИЛ-4 и ИЛ-5, описанными выше.

Наибольшую концентрацию ИФНу выявили в супернатантах ОА-стимулированных спленоцитов мышей группы АСИТ сОА. Отличия являлись достоверными (данные не приведены).

Для определения степени влияния АСИТ модифицированным и немодифицированным аллергеном на характер иммунного ответа рассчитали соотношение (индекс) концентрации ИЛ-4/ИФНу (рис. 5).

Выявили наибольший сдвиг цитокинового профиля в

Рис. 5. Соотношение уровня ИЛ-4/ИФНу по каждой группе.

сторону ТЫ-иммунного ответа в группе животных, которым проводили АСИТ модифицированным аллергеном сОА.

Визуальная оценка выраженности воспалительных явлений кожи включала такие показатели, как эритема/гемор-рагия, экскориация/эрозия, шелушение/сухость кожных покровов [15]. Следует отметить, что признаки аллергического воспаления кожи в группах мышей, получавших АСИТ, в целом были менее выражены по сравнению с таковыми в модельной группе. Результаты гистологической оценки патоморфологических изменений пораженных участков кожи мышей показали максимальную степень поражения кожи (24 балла) в группе АСИТ ФСБ (рис. 6).

В группах АСИТ ОА и АСИТ сОА степень гистологических поражений кожных тканей мышей составила 20,1 и 17,7 балла соответственно. В группе интактных мышей патоморфологических изменений практически не обнаружили.

Заключение. Изучение АД на экспериментальных моделях позволяет прийти к пониманию как этиологии, так и патогенеза аллергического воспаления кожи.

Выявили, что АСИТ снижала концентрацию специфических IgE до минимальной. Кроме того, зафиксировали достоверное повышение уровня специфических IgG2a-АТ и тенденцию к снижению содержания IgG1. Индекс IgG1/IgG2a показал, что наибольший сдвиг иммунного ответа в сторону

Рис. 6. Степень (в баллах) патоморфологических изменений кожного покрова мышей.

- 158 -

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ

ТЫ наблюдается у мышей, получавших АСИТ модифицированным аллергеном (сОА).

Результаты оценки цитокинового профиля показали, что после АСИТ концентрация ИЛ-4 и ИЛ-5 в супернатантах стимулированных спленоцитов снижается. Следует отметить, что при проведении АСИТ ОА выявили также снижение уровня ИЛ-17. Роль ИЛ-17 в развитии АД изучена еще мало, однако, опираясь на представленные данные, можно предположить, что повышение его содержания опосредованно ведет к смещению иммунного ответа в сторону Ты. Далее установили, что индекс ЙЛ-4/ИФНу, характеризующий направленность иммунного ответа, был наименьший в группе АСИТ сОА. Кроме того, после проведения терапии сОА отметили улучшение гистологической картины кожи, что свидетельствует о модулирующем эффекте модифицированной формы аллергена.

Таким образом, по совокупности иммунологических, гистологических и клинических изменений в результате проведения АСИТ сОА можно сделать вывод о том, что модифицированный таким образом аллерген может быть перспективным терапевтическим препаратом для АСИТ при АД.

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ (соглашение № 8146).

ЛИТЕРАТУРА

1. calderon M.A., Demoly P., van wijk R.G. et al. EAAcI: A European Declaration on Immunotherapy. Designing the future of allergen specific immunotherapy. Clin. Transl. Allergy. 2012; 2(20): 1-20.

2. Хаитов М.Р. Рекомбинантные аллергены. Стратегия создания аллерговакцин нового поколения. Российский аллергологический журнал. 2004; 1: 73-6.

3. Бабахин А.А., Литвин Л.С., Стеценко О.Н., Борзова Н.В., Иванова А.С., Барсегян ГГ, Хаитов М.Р, Петров Р.В. Аллергенспецифическая иммунотерапия химически модифицированными аллергенами. Часть 2. Гипосенсибилизация ал-лерготропиноидом (комплексом мономерного аллергоида и иммуномодулятора полиоксидония) на модели экспериментальной аллергической бронхиальной астмы. Физиология и патология иммунной системы. Иммунофармакогеномика. 2011; 11: 3-16.

4. Mildner M. et al. Filaggrin knockdown in a human skin model. J. Investigative Dermatol. 2010; 130: 2286-94.

5. Oyoshi M.K., Murphy G.F., Geha R.S. Filaggrin deficient mice exhibit Th17-dominanted skin inflammation and permissiveness to epicutaneous sensitization with protein antigen. J. Allergy Clin. Immunol. 2009; 124: 485-93.

6. Spergel J., Mizoguchi E., Brewer J., Martin T., Bhan A., Geha R. Epicutaneous sensitization with protein antigen induces localized allergic dermatitis and hyperresponsiveness to metacholine after single exposure to aerosolized antigen in mice. J. clin. Invest. 1998; 101: 1614-22.

7. Hatano Y., Man M.Q., Uchida Y. et al. Murine atopic dermatitis responds to peroxisome proliferator-activated receptor-a, p/S(but not y), and liver-X-receptor activators. J. Allergy Clin. Immunol. 2010; 125: 160-9.

8. Sugiyama A., Hata S., Suzuki K., Yoshida E., Nakano R. Oral administration of paramylon, P-1,3-D-Glucan isolated from Eu-glena gracilis Z inhibits development of atopic dermatitis - like skin lesion in NC/Nga mice. J. Vet. Med. Sci. 2010; 72: 755-63.

9. Leung D.Y.M., Boguniewicz M., Howell M.D., Hamid Q. New insights into atopic dermatitis. J. Clin. Invest. 2004; 113: 651-7.

10. Novak N., Bieber T., Leung D.YM. Immune mechanisms leading to atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 2003; 112: 128-38.

11. Хаитов М.Р., Акимов В.С. Генетическая предрасположенность к развитию бронхиальной астмы и атопии, подходы к идентификации новых генов, ассоциированных с развитием бронхиальной астмы и атопии. Российский аллергологический журнал. 2004; 3: 67-74.

12. He R., Kim H. Y., Yoon J. et al. Exaggerated IL-17 response to epicutaneous sensitization mediates airway inflammation in the absence of IL-4 and IL-13. J. Allergy clin. Immunol. 2009; 124(4): 761-70.

13. Бабахин А.А., Андреев С.М., Бабиевский К.К., Ямсков И.А., Медведев С.А., DuBuske L.M., Некрасов А.В., Хаитов Р.М., Петров Р.В. Аллергенспецифическая иммунотерапия химически модифицированными аллергенами. Часть 1. Аллергенность и иммуногенность сукцинилированного аллергена и его комплексов с иммуномодулятором полиоксидонием. Физиология и патология иммунной системы. Иммунофармакогеномика. 2011; 7: 17-37.

14. Шершакова Н.Н., Бабахин А.А., Камышников О.Ю., Башкатова Е.Н., Елисютина О.Г., Хаитов М.Р. Разработка модели атопического дерматита in vivo. Физиология и патология иммунной системы. Иммунофармакогеномика. 2011; 8: 3-10.

15. Azuma M., Ritprajak P., Hashiguchi M. Topical application of siRNA targeting cutaneous dendritic cells in allergic skin disease. Meth. Mol. Biol. 2010; 623: 373-80.

Поступила 21.11.13

REFERENCES

1. Calderon M.A., Demoly P., van Wijk R.G. et al. EAACI: A European Declaration on Immunotherapy. Designing the future of allergen specific immunotherapy. Clin. Transl. Allergy. 2012; 2(20): 1-20.

2. Khaitov M.R. Recombinant allergens. Strategy for a new generation allergovaccin. Rossiyskiy allergologicheskiy zhurnal. 2004; 1: 73-6.

3. Babakhin A.A., Litvin L.S., Stetsenko O.N., Borzova N.V., Ivanova A.S., Barsegyan G.G., Khaitov M.R., Petrov R.V Allergen-specific immunotherapy using modified allergens. II. Physi-ologiya i Pathologiya Immunoi Systemy. Immunofarmakogeno-mika. 2011; 11: 3-16.

4. Mildner M. et al. Filaggrin knockdown in a human skin model. J. Invest. Dermatol. 2010; 130: 2286-94.

5. Oyoshi M.K., Murphy G.F., Geha R.S. Filaggrin deficient mice exhibit Th17-dominanted skin inflammation and permissiveness to epicutaneous sensitization with protein antigen. J. Allergy Clin. Immunol. 2009; 124: 485-93.

6. Spergel J., Mizoguchi E., Brewer J., Martin T., Bhan A., Geha R. Epicutaneous sensitization with protein antigen induces localized allergic dermatitis and hyperresponsiveness to metacholine after single exposure to aerosolized antigen in mice. J. Clin. Invest. 1998; 101: 1614-22.

7. Hatano Y, Man M.Q., Uchida Y et al. Murine atopic dermatitis responds to peroxisome proliferator-activated receptor-a, p/S(but not y), and liver-X-receptor activators. J. Allergy Clin. Immunol. 2010; 125: 160-9.

8. Sugiyama A., Hata S., Suzuki K., Yoshida E., Nakano R. Oral administration of paramylon, P-1,3-D-Glucan isolated from Eu-glena gracilis Z inhibits development of atopic dermatitis - like skin lesion in NC/Nga mice. J. Vet. Med. Sci. 2010; 72: 755-63.

9. Leung D.YM., Boguniewicz M., Howell M.D., Hamid Q. New insights into atopic dermatitis. J. Clin. Invest. 2004; 113: 651-7.

10. Novak N., Bieber T., Leung D.Y.M. Immune mechanisms leading to atopic dermatitis. J. Allergy Clin. Immunol. 2003; 112: 128-38.

11. Khaitov M.R., Akimov V.S. Genetic predisposition to the development of bronchial asthma and atopy, approach to the identification of new genes associated with the development of bronchial asthma and atopy. Rossiyskiy allergologicheskiy zhurnal. 2004; 3: 67-74.

12. He R., Kim H. Y, Yoon J. et al. Exaggerated IL-17 response to epicutaneous sensitization mediates airway inflammation in the absence of IL-4 and IL-13. J. Allergy Clin. Immunol. 2009; 124(4): 761-70.

13. Babakhin A.A., Andreev S.M., Babievskiy K.K., Yamskov I.A., Medvedev S.A., DuBuske L.M. et al. Allergen-specific immunotherapy using modified allergens. Part 1. Allergenicity and im-munogenicity succinylcholine allergen and its complexes with

- 159 -

ИММУНОЛОГИЯ № 3, 2014

the immunomodulator polyoxidonium. Physiologiya i pathologi-ya immunnoy systemy. Immunopharmacogenomika. 2011; 7: 17-37.

14. Shershakova N.N., Babakhin A.A., Kamyshnikov O.Yu., Bashkatova E.N., Elisyutina O.G.,Khaitov M.R. The development in vivo model of atopic dermatitis. Physiologiya i pathologiya im-

munnoy systemy. Immunopharmacogenomika. 2011; 18: 3-10.

15. Azuma M., Ritprajak P., Hashiguchi M. Topical application of siRNA targeting cutaneous dendritic cells in allergic skin disease. Meth. Mol. Biol. 2010; 623: 373-80.

Received 21.11.13

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.248-092:612.6.05]-07

Руденко К.А., Тугуз А.Р., Анохина Е.Н., Муженя Д.В.

ПОЛИМОРФИЗМЫ ГЕНОВ TOLL-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ, АССОЦИИРОВАННЫЕ

с наследственной отягощенностью и возрастом манифестации бронхиальной астмы

ФГБУ ВПО Адыгейский государственный университет, НИИ комплексных проблем, 385000, г. Майкоп, РФ

При исследовании ассоциации трех single nucleotide polymorphisms(SNP) генов ToN-подобных рецепторов (Toll-like receptor, tip) мембранного TLR4 (миссенс-мутации Asp299Gly; rs4986790 и Thr399Ile; rs4986790) и внутриклеточного TLR9 (A2848G; rs352140 - нуклеотидные замены в кодирующем регионе гена) с бронхиальной астмой (БА) в зависимости от возраста манифестации и наследственной отягощенности статистически значимые отличия между донорами и больными выявлены по частоте генотипов SNP гена внутриклеточного TLR9. Для A2848/2848G-полиморфизмов, расположенных в кодирующем регионе гена внутриклеточного TLR9, установлена ассоциация патологического гомозиготного (G2848/2848G или GG) генотипа с ненаследственной формой БА (х2 = 3,62; OR = 3,03) и зрелым возрастом манифестации болезни (х2 = 4,69; Or = 5,19). У жителей Республики Адыгея из трех наиболее часто регистрируемых генотипов по исследованным SNP TLR4 и TLR9 (AspAsр/ThrThr/АА, AspAsр/ThrThr/ AG, AspAsр/ThrThr/GG) повышенный риск развития БА в зрелом возрасте связан с сочетанным носительством AspAsр/ThrThr/GG.

Ключевые слова: гены Toll-подобных рецепторов; TLR4 и TLR9; SNP, Asp299Gly и Thr399Ile (TLR4); A2848G (TLR9); бронхиальная астма.

Rudenko K.A., Tuguz A.R., Anokhina E.N., Muzhenya D.V

GENE POLYMORPHISMS OF TOll-lIKE RECEPTORS ASSOCIATED WITH HEREDITARY ABNORMALITIES AND AGE OF ASTHMA ONSET

Adyghe State University, 385000, Maykop, Russian Federation

In the study of the Association of three SNP (single nucleotide polymorphisms) genes of Toll-like receptors (Toll-like receptor) membrane TLR4 (missense mutations Asp299Gly; rs4986790 and Thr399Ile; rs4986790) and intracellular TLR9 (A2848G; rs352140 - nucleotide substitutions in encoding a region of a gene) with bronchial asthma (BA) depending on the age of onset and hereditary family history, statistically significant differences between donors and patients identified on the frequencies of genotypes gene SNP intracellular TLR9. For A2848/2848G polymorphisms located in encoding a region of the gene intracellular TLR9 installed Association pathological homozygous (G2848/2848G or GG) genotype with non-hereditary form BA (C2 = 3,62; OR = 3,03) and Mature age of onset of disease (C2 = 4,69; OR = 5,19). The residents of the Republic of Adygeya (RA) of the three most frequently reported genotypes investigated by SNP TLR4 and TLR9 (AspAsр/ThrThr/AA AspAsр/ThrThr/AD AspAsр/ThrThr/GG), increased risk of ad development in adulthood is associated with combined carriage AspAsр/ThrThr/GG.

Key words: genes of Toll-like receptor; TLR4 and TLR9; SNP; Asp299Gly and Thr399Ile (TLR4); A2848G (TLR9); bronchial asthma

Введение. Исследование ассоциации single nucleotide polymorphisms (SNP) генов Toll-подобных рецепторов (Tollline receptor, TLR) TLR4 и TLR9 с хроническими воспалительными заболеваниями органов дыхания обусловлено их ролью в распознавании паттернов основных групп вирусов и бактерий, активацией специфического иммунитета, каскада неспецифических базовых воспалительных реакций, вовлеченных в патогенез бронхиальной астмы (БА) [1-3].

Для корреспонденции: Руденко Ксения Андреевна, e-mail: lab_genetic@mail.ru

For correspondence: Rudenko Kseniya Andreevna, e-mail: lab_genetic@mail.ru

Из типированных SNP генов TLR4 и TLR9 (169 для мембранного TLR4 и 33 для внутриклеточного TLR9) в мировых популяциях наиболее распространены Asp299Gly (rs4986790) и Thr399Ile (rs4986790) (TLR4); A2848G (rs352140) (TLR9) [4, 5]. В соотношении частоты Asp299/299Gly-полиморфизмов гена мембранного TLR4 преобладает нормальная Asp29-аллель (0,93-0,96). Носители редкой мутантной 299Gly-аллели не превышают 7% населения мира, а в азиатских популяциях этот полиморфизм практически не выявлен. По Thr399Ile SNP гена TLR4 прослеживаются аналогичные закономерности: мутантная 399Ile-аллель, регистрируемая у 3-6% населения Европы и Америки, не типируется в Азии и Африке. A2848G-полиморфные варианты гена внутриклеточного TLR9 в Америке, Азии и Европе отме-

- 160 -