НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ ИНГИБИТОРНЫХ ПУТЕЙ В ЛИМФОЦИТАХ
NEUTRALIZATION OF LYMPHOCYTE INHIBITORY PATHWAYS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительных заявок США №62/050948, поданной 16 сентября 2014 г.; 2014/083929, поданной 25 ноября 2014 г.; и 62/093141, поданной 17 декабря 2014 г., содержание которых полностью включено в настоящий документ посредством ссылок, включая чертежи.
ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка подана вместе с списком последовательностей в электронном формате. Список последовательностей представлен в виде файла с именем «NKG2A-PD1_ST25», созданного 15 сентября 2015 года, размер которого составляет 38 КБ. Информация о списке последовательностей в электронном формате полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к комбинированному применению нейтрализаторов NKG2A и нейтрализаторов PD-1 для лечения рака.
УРОВЕНЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
++
Активность NK-клеток регулирует сложный механизм, включающий как активирующие, так и ингибирующие сигналы. Выявлено несколько отдельных NK-специфических рецепторов, играющих важную роль в распознавании и уничтожении клеток-мишеней, дефицитных по отношению к HLA I, опосредованном NK-клетками. Рецепторы естественной цитотоксичности (NCR) относятся к классу активирующих белков-рецепторов; гены, экспрессирующие их, специфически экспрессируются в NK-клетках. Примеры NCR включают NKp30, NKp44 и NKp46 (см., например, Lanier (2001) Nat Immunol 2:23-27, Pende et al. (1999) J Exp Med. 190:1505-1516, Cantoni et al. (1999) J Exp Med. 189:787-796, Sivori et al (1997) J. Exp. Med. 186:1129-1136, Pessino et al. (1998) J Exp Med. 188(5):953-60; Mandelboim et al. (2001) Nature 409:1055-1060, полные описания которых включены в настоящий документ посредством ссылок). Эти рецепторы являются членами надсемейства Ig, и их перекрестная сшивка, индуцированная специфическими мАт, приводит к усиленной активации NK-клеток, что повышает уровень внутриклеточного Са, вызывает цитотоксичность и высвобождение лимфокинов, и активирует NK-цитотоксичность против многих видов клеток-мишеней.
CD94/NKG2A является ингибиторным рецептором, встречающимся на лимфоцитах различных субпопуляций. CD94/NKG2A ограничивает высвобождение цитокинов и цитотоксические реакции некоторых лимфоцитов по отношению к клеткам, экспрессирующим HLA-E, лиганд CD94/NKG2A (см., например, WO 99/28748). Кроме того, установлено, что HLA-E секретируется в растворимой форме некоторыми опухолевыми клетками (Derre et al., J Immunol 2006;177:3100-7) и активированными эндотелиальными клетками (Coupel et al., Blood 2007;109:2806-14). Антитела, ингибирующие сигнальный путь CD94/NKG2A, могут усиливать высвобождение цитокинов и цитолитическую активность лимфоцитов по отношению к HLA-E-положительным клеткам-мишеням, например, реакцию CD94/NKG2A-положительных NK-клеток по отношению к HLA-E-экспрессирующим опухолевым клеткам или клеткам, инфицированным вирусом. Таким образом, терапевтические антитела, ингибирующие CD94/NKG2A, но не стимулирующие уничтожение CD94/NKG2A-экспрессирующих клеток (т.е. неистощающие антитела), могут индуцировать контроль опухолевого роста у раковых пациентов.
PD-1 является ингибиторным членом семейства рецепторов CD28, которое также включает CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. PD-1 экспрессируется на активированных В-клетках, Т-клетках и миелоидных клетках Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). Выявлены два лиганда PD-1 - PD-L1 и PD-L2, и показано, что они подавляют активацию Т-клеток после связывания с PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). PD-L1 широко распространен в различных злокачественных опухолях человека (Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 приводит к сокращению количества лимфоцитов, проникающих в опухоль, снижению пролиферации, опосредованной Т-клеточным рецептором, и ускользанию раковых клеток от иммунологического надзора. Иммунодепрессию можно купировать путем ингибирования локального взаимодействия PD-1 с PD-L1, и данный эффект является аддитивным при дополнительной блокаде взаимодействии PD-1 и PD-L2.
Блокада PD-1 приводила к выраженным противоопухолевым реакциям в многочисленных клинических исследованиях. Тем не менее, не у всех пациентов наблюдается противоопухолевая реакция на лечение, и, кроме того, у некоторых пациентов были рецидивы рака после лечения. Следовательно, в данной области техники существует необходимость улучшения благоприятного действия лечения с применением ингибиторов пути PD-1 для пациента.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложены улучшенные способы усиления противоопухолевого иммунного ответа посредством комбинированной нейтрализации ингибиторных рецепторов NKG2A и PD-1, например, посредством использования антител. Хотя CD8T-клетки и NK-клетки (в периферической крови) не экспрессируют NKG2A и PD-1, установлено, что лимфоциты, проникающие в опухоль, опосредующие устранение опухолевых клеток, могут экспрессировать как ингибиторный рецептор PD-1, так и ингибиторный рецептор NKG2A. Кроме того, лечение посредством антител против PD1 может вызвать стимуляцию экспрессии рецепторов NKG2A на лимфоцитах, проникающих в опухоль, так что NKG2A может ограничивать эффективность агентов, блокирующих путь PD1. Поскольку оба эти рецептора могут ограничивать цитотоксическую активность лимфоцитов, проникающих в опухоль, нейтрализация ингибиторной активности этих двух рецепторов антителами позволяет NKG2A+PD1+-лимфоцитам эффективно устранять раковые клетки. В одном варианте реализации NKG2A+PD1+-лимфоциты представляют собой цитотоксические лимфоциты, необязательно CD8+ Т-клетки или NK-клетки.
Ингибирование или нейтрализация ингибиторной активности PD-1 может включать использование полипептида (например, антитела, полипептида, объединенного с Fc-доменом, иммуноадгезина и т.д.), что предотвращает PD-L1-индуцированную передачу сигнала посредством PD-1, например, блокируя взаимодействие с его естественным лигандом PD-L1 (и, необязательно, дополнительно блокируя взаимодействие между PD-1 и PD-L2. В одном аспекте полипептид представляет собой антитело, связывающее PD-1 (антитело против PD-1); такое антитело может блокировать взаимодействие между PD-1 и PD-L1 или между PD-1 и PD-L2. В еще одном аспекте полипептид представляет собой антитело, связывающее PD-L1 (антитело против PD-L1) и блокирующее взаимодействие между PD-1 и PD-L1.
Соответственно, в одном варианте реализации предложен способ лечения или профилактики рака у индивида, причем указанный способ включает введение индивиду: а) терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид NKG2A человека и (b) терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека. В одном варианте реализации рак является плотной опухолью. В одном варианте реализации соединение, ингибирующее полипептид NKG2A человека, представляет собой антитело, нейтрализующее ингибиторную активность NKG2A. В одном варианте реализации соединение, ингибирующее полипептид PD-1 человека, представляет собой антитело против PD-1 или против PD-L1, нейтрализующее ингибиторную активность PD-1. Можно указать, что индивид является человеком.
В одном варианте реализации предложен способ активации или усиления активности CD8+ Т-клетки, проникающей в опухоль, у индивида, причем указанный способ включает введение индивиду: а) терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид NKG2A человека и (b) терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека. В одном варианте реализации предложен способ активации или усиления активности NK-клетки, проникающей в опухоль, у индивида, причем указанный способ включает введение индивиду: а) терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид NKG2A человека и (b) терапевтически активного количества соединения, ингибирующего полипептид PD-1 человека.
В одном аспекте предложено лечение, включающее введение комбинации антитела, нейтрализующего ингибиторную активность NKG2A, и антитела, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1.
В одном аспекте представлена композиция, содержащая антитело, ингибирующее полипептид NKG2A человека и антитело, ингибирующее полипептид PD-1 человека. В одном аспекте указанная композиция предназначена для использования при лечении или профилактике рака, необязательно плотной опухоли, необязательно гематологического злокачественного новообразования.
В одном варианте реализации антитело против NKG2A вводят в количестве, приводящем к нейтрализации ингибиторной активности CD94/NKG2A человека в организме пациента-человека (in vivo), например, в количестве, приводящем к нейтрализации ингибиторной активности CD94/NKG2A человека на CD8 Т-клетках и NK-клетках пациента-человека. В одном варианте реализации количество, приводящее к нейтрализации ингибиторной активности CD94/NKG2A человека в организме пациента-человека, по меньшей мере в 10 раз (например, в 10-20 раз, в 10-50 раз, в 10-100 раз, в 20-50 раз, в 20-100 раз, в 30-100 раз, в 50-100 раз), необязательно по меньшей мере в 50, 60, 80 или 100 раз превышает минимальную концентрацию, необходимую для практического насыщения рецепторов NKG2A на поверхности NKG2A+-клеток (например в анализе связывания, где антитело титруют на МПК). В одном варианте реализации антитело против NKG2A конкурирует с HLA-E за связывание с NKG2A человека.
В одном варианте реализации антитело против NKG2A вводят по меньшей мере в течение одного цикла введения, причем цикл введения включает по меньшей мере первое и второе (и, необязательно, 3-е, 4-е, 5-е, 6-е, 7-е или 8-е или дальнейшие) введения антитела против NKG2A, причем антитело против NKG2A вводят в количестве, позволяющем достичь постоянной (минимальной) концентрации антитела против NKG2A в крови, составляющей по меньшей мере 10 мкг/мл (или, необязательно, по меньшей мере 20, 30, 40 или 50 мкг/мл) между первым и вторым (и, необязательно, дальнейшими) введениями. Достижение или поддержание указанной постоянной концентрации в крови означает, что концентрация в крови практически не снижается ниже указанной концентрации в крови в течение указанного периода времени (например, между двумя введениями антител, в течение указанного количества недель), т.е. несмотря на то, что концентрация в крови может меняться в течение указанного периода времени, указанная концентрация в крови представляет собой минимальную или «остаточную» концентрацию.
В одном варианте реализации антитело против NKG2A вводят в количестве, позволяющем достичь пиковой концентрации в крови, составляющей приблизительно или по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70 или 80 мкг/мл, необязательно по меньшей мере приблизительно 100 мкг/мл после введения (например, в течение 1 или 2 дней после введения).
В одном варианте реализации антитело против NKG2A вводят в количестве, позволяющем достичь постоянной (минимальной) концентрации антитела против NKG2A в крови, составляющей приблизительно или по меньшей мере приблизительно 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 или 80 мкг/мл, необязательно по меньшей мере приблизительно 100 мкг/мл, в течение по меньшей мере одной недели или по меньшей мере двух недель после введения антитела.
В одном варианте реализации антитело против NKG2A вводят в количестве, позволяющем достичь постоянной (минимальной) концентрации антитела против NKG2A в крови, составляющей приблизительно или по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70 или 80 мкг/мл, необязательно по меньшей мере приблизительно 100 мкг/мл, между двумя последовательными введениями. В одном варианте реализации первое и второе введения разделены во времени приблизительно на две недели, необязательно приблизительно на одну неделю.
Антитело против NKG2A необязательно можно вводить в эффективном количестве, соответствующем частоте, позволяющей достичь указанной постоянной (минимальной) концентрации в крови на всем протяжении цикла введения.
В одном варианте реализации антитело против NKG2A вводят в комбинации с антителом, нейтрализующим полипептид PD-1 человека для лечения плотной опухоли у индивида, причем цикл введения включает по меньшей мере два введения антитела против NKG2A, причем антитело против NKG2A вводят в количестве, позволяющем достичь постоянной (минимальной) концентрации во внесосудистой ткани (например, в окружении опухоли), составляющей по меньшей мере 4 мкг/мл, необязательно по меньшей мере 10 мкг/мл, между двумя последовательными введениями. Антитело против NKG2A необязательно вводят в количестве, позволяющем достичь постоянной (минимальной) концентрации во внесосудистой ткани (например, в окружении опухоли), составляющей по меньшей мере 4 мкг/мл, необязательно по меньшей мере 10 мкг/мл, на всем протяжении цикла введения. В одном варианте реализации антитело против NKG2A вводят в количестве, позволяющем достичь постоянной (минимальной) концентрации антитела против NKG2A в крови, составляющей по меньшей мере 40 мкг/мл, необязательно по меньшей мере 100 мкг/мл, между двумя последовательными введениями или на всем протяжении цикла введения.
В одном варианте реализации антитело, нейтрализующее полипептид PD-1 человека, вводят в количестве, приводящем к нейтрализации ингибиторной активности PD-1 человека в организме пациента-человека (in vivo), например, в количестве, приводящем к нейтрализации ингибиторной активности PD-1 человека на CD8 Т-клетках и NK-клетках пациента-человека. В одном аспекте комбинацию вводят (или предназначают для введения) согласно определенной клинической схеме приема, особенно в части определенного размера дозы, и согласно определенному графику приема.
В одном аспекте антитело, нейтрализующее NKG2A, является неистощающим антителом, например, антителом, не уничтожающим, ликвидирующим, лизирующим или индуцирующим такое уничтожение, ликвидацию или лизис, тем самым отрицательно влияя на количество клеток, экспрессирующих NKG2A, в образце или в организме субъекта. В одном аспекте антитело, нейтрализующее PD-1, является неистощающим антителом. Неистощающее антитело может, например, не содержать Fc-домена или содержать Fc-домен, не способный или способный в минимальной степени к связыванию одного или более Fcγ-рецепторов (например, CD16). Примеры включают антитела с константными областями антител изотипа IgG4 человека, антитела любого изотипа (например, IgG1, IgG2, IgG3) с константными областями, модифицированными с целью снижения или устранения способности к связыванию с одним или более Fcγ-рецепторами (например, CD16).
В одном варианте реализации рак является плотной опухолью на поздней стадии и/или рефрактерной плотной опухолью. В одном неограничивающем варианте реализации рак (например, рефрактерную плотную опухоль на поздней стадии) выбирают из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), рака почки, аденокарциномы поджелудочной железы или пищевода, рака молочной железы, почечноклеточной карциномы (RCC), меланомы, рака ободочной и прямой кишки и рака яичников.
Соединение, ингибирующее полипептид NKG2A (антагонист NKG2A), представляет собой соединение, которое повышает способность NK- и/или Т-клеток, экспрессирующих NKG2A, вызывать гибель клеток, экспрессирующих HLA-E. Соединение, ингибирующее полипептид NKG2A, необязательно представляет собой полипептид, необязательно, антитело (например, моноклональное антитело), связывающее полипептид NKG2A.
В одном варианте реализации антагонист NKG2A снижает ингибиторную активность NKG2A, блокируя связывание его лиганда, HLA-E, т.е., антагонист NKG2A мешает связыванию NKG2A с HLA-E. Антитело, содержащее тяжелую цепь согласно любой из SEQ ID NO: 4-8 и легкую цепь согласно SEQ ID NO: 9, является примером такого антитела. В одном варианте реализации антагонист NKG2A снижает ингибиторную активность NKG2A без блокады связывания его лиганда, HLA-E, т.е., антагонист NKG2A является неконкурентным антагонистом и не мешает связыванию NKG2A с HLA-E. Антитело, содержащее вариабельные области легкой и тяжелой цепи согласно SEQ ID NO: 10 и 11, соответственно, является примером такого антитела.
В одном варианте реализации антагонист NKG2A представляет собой антитело, обладающее значительно более высоким сродством связывания по отношению к NKG2A, чем к одному или более из активирующих NKG2-рецепторов. Например, в одном варианте реализации указанный агент представляет собой антитело, обладающее значительно более высоким сродством связывания по отношению к NKG2A, чем к NKG2C. В дополнительном или альтернативном варианте реализации указанный агент представляет собой антитело, обладающее значительно более высоким сродством связывания по отношению к NKG2A, чем к NKG2E. В дополнительном или альтернативном варианте реализации указанный агент представляет собой антитело, обладающее значительно более высоким сродством связывания по отношению к NKG2A, чем к NKG2H.
В одном варианте реализации антагонист NKG2A конкурирует за связывание с CD94/NKG2A с антителом, содержащим тяжелые и легкие цепи SEQ ID NO: 4-8 или 9, соответственно, или антителом, содержащим вариабельные области тяжелой и легкой цепи SEQ ID NO: 10 и 11, соответственно. Указанный агент может являться, например, антителом человека или гуманизированным антителом против NKG2A.
В одном варианте реализации антитело против NKG2A представляет собой гуманизированное антитело, содержащее CDR любой из тяжелых цепей согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 4-8 и CDR легкой цепи SEQ ID NO: 9, соответственно. В одном варианте реализации антитело против NKG2A представляет собой гуманизированное антитело, содержащее вариабельную область любой из тяжелых цепей согласно любой из последовательностей SEQ ID NO: 4-8 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 9, соответственно. Предложены типичные остатки или последовательности области, определяющей комплементарность (CDR) и/или сайты аминокислотных замен в каркасной области (FR) таких гуманизированных антител с улучшенными свойствами, например, пониженной иммуногенностью, улучшенным связыванием антигена или другими функциональными свойствами, и/или улучшенными физико-химическими свойствами, например, улучшенной стабильностью.
В некоторых необязательных аспектах можно выявить, что пациент подлежит лечению с применением антагониста NKG2A и PD1-нейтрализующего агента, путем оценки присутствия в образце опухоли (например, опухолевой ткани и/или ткани, прилегающей к опухоли) лигандов NKG2A, с необязательной дополнительной оценкой лиганда PD-1. В одном варианте реализации любого терапевтического применения или способов лечения или профилактики рака, предложенных в настоящем документе, лечение или профилактика рака у индивида включает:
a) определение статуса злокачественных клеток по отношению к полипептиду HLA-E в организме индивида с раком, и
b) после определения наличия выраженной экспрессии полипептидов HLA-E (например, на поверхности) злокачественных клеток (например, опухолевых клеток), введение в организм индивида соединения, нейтрализующего ингибиторную активность полипептида NKG2A человека и ингибитора полипептида PD-1 человека.
В одном варианте реализации любого терапевтического применения или способов лечения или профилактики рака, предложенных в настоящем документе, лечение или профилактика рака у индивида включает:
a) определение статуса злокачественных клеток (например, опухолевых клеток) по отношению к полипептиду HLA-E и полипептиду PD-L1 в организме индивида с раком, и
b) после определения наличия выраженной экспрессии полипептидов HLA-E и PD-L1 на поверхности злокачественных клеток, введение в организм индивида соединения, нейтрализующего ингибиторную активность полипептида NKG2A человека и ингибитора полипептида PD-1 человека.
В одном варианте реализации определение выраженной экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида HLA-E в биологическом образце (например, образце, содержащем опухолевые клетки, опухолевую ткань и/или ткань, прилегающую к опухоли) указывает на наличие у индивида рака, который можно лечить с применением ингибитора NKG2A в комбинации с ингибитором полипептида PD-1 человека.
В одном варианте реализации любого из способов определение статуса полипептида HLA-E или определение уровня экспрессии на этапе (а) включает определение уровня экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида HLA-E в злокачественных клетках в биологическом образце и сравнение этого уровня с эталонным уровнем (например, значением, слабым или сильным окрашиванием поверхности клеток и т.д.). Эталонный уровень может, например, соответствовать здоровому индивиду, индивиду, у которого не развивается или развивается слабый клинический благоприятный эффект от лечения с применением антитела против NKG2A (необязательно, в комбинации с ингибитором полипептида PD-1 человека), или индивиду, у которого развивается значительный клинический благоприятный эффект от лечения с применением антитела против NKG2A (необязательно, в комбинации с ингибитором полипептида PD-1 человека). Определение повышенного уровня (например, высокого значения, сильного окрашивания поверхности, уровня, соответствующего уровню у индивида, у которого развивается значительный клинический благоприятный эффект от лечения с применением антитела против NKG2A, уровня, превышающего уровень, соответствующий индивиду, у которого не развивается или развивается слабый клинический благоприятный эффект от лечения с применением антитела против NKG2A и т.д.) экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида HLA-E в биологическом образце указывает на наличие у индивида рака, который можно лечить с помощью антитела против NKG2A в комбинации с ингибитором полипептида PD-1 человека, например, согласно способам лечения, описанным в настоящем документе.
В одном варианте реализации предложен способ выявления лимфоцитов с ингибированным NKG2A, экспрессирующих PD-1, причем указанный способ включает:
a) определение статуса NK- и/или CD8 Т-лимфоцитов по отношению к полипептидам NKG2A и PD-1 в биологическом образце, и
b) причем определение наличия экспрессии полипептидов NKG2A и PD-1 на поверхности значительной доли лимфоцитов указывает на то, что эти лимфоциты являются лимфоцитами с ингибированным NKG2A, экспрессирующих PD-1. Указанные лимфоциты необязательно являются лимфоцитами, проникающими в опухоль. Биологический образец необязательно представляет собой образец, содержащий опухолевую ткань и/или ткань, прилегающую к опухоли.
В одном варианте реализации предложен способ выявления индивида с раком, для которого подходит лечение с применением антагониста NKG2A, причем указанный способ содержит:
a) определение статуса лимфоцитов индивида, проникающих в опухоль, по отношению к полипептидам NKG2A и PD-1, и
b) причем определение наличия экспрессии полипептидов NKG2A и PD-1 на поверхности значительной доли лимфоцитов индивида, проникающих в опухоль, необязательно TIL заранее заданной субпопуляции (например, CD8 Т-клеток, NK-клеток), указывает на то, что лечение с применением соединения, нейтрализующего ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, и ингибитора полипептида PD-1 человека подходит для данного индивида.
В одном варианте реализации предложен способ лечения или профилактики рака у индивида, включающий:
a) определение статуса лимфоцитов индивида, проникающих в опухоль, по отношению к полипептидам NKG2A и PD-1, и
b) после определения наличия экспрессии полипептидов NKG2A и PD-1 на поверхности значительной доли лимфоцитов индивида, проникающих в опухоль, необязательно TIL заранее заданной субпопуляции (например, CD8 Т-клеток, NK-клеток), лечение индивида согласно схеме, включающей применение соединения, нейтрализующего ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, и ингибитора полипептида PD-1 человека.
+
+
+
+
+
+
В одном варианте реализации лимфоциты, проникающие в опухоль, представляют собой CD8 Т-клетки. В одном варианте реализации лимфоциты, проникающие в опухоль, представляют собой NK-клетки. В одном варианте реализации по меньшей мере 10, 15, 20, 25% CD8 Т-клеток являются NKG2APD-клетками. В одном варианте реализации по меньшей мере 10%, 15%, 20% или 25% CD8 Т-клеток являются NKG2APD-клетками. В одном варианте реализации по меньшей мере 20%, 25%, 30% или 35% CD8 Т-клеток являются NKG2APD-клетками.
В других вариантах реализации предложены фармацевтические композиции и наборы, а также способы их применения. В одном варианте реализации предложена фармацевтическая композиция, содержащая соединение, нейтрализующее ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, и ингибитор полипептида PD-1 человека. В одном варианте реализации предложен набор, содержащий соединение, нейтрализующее ингибиторную активность полипептида NKG2A человека, и ингибитор полипептида PD-1 человека.
Эти аспекты подробнее описаны в описании изобретения, представленном в настоящем документе, из которого также очевидны дополнительные аспекты, особенности и преимущества.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
3
На фигурах 1А и 1В показана инфильтрация опухолевых клеток PD-L1+ Qa-1+RMA-S Qa-1 Qdm B2m и A20 NK-клетками, экспрессирующими NKG2A, и CD8 Т-клетками, экспрессирующими NKG2A и/или PD-1. Мышей с опухолями RMA-S Qa-1 Qdm B2m (верхний ряд) и А20 (нижний ряд) умерщвляли при объеме опухоли приблизительно 500 мм. Опухолевые клетки (фигура 1А) и лимфоциты, проникающие в опухоль (TIL) (фигура 1В) анализировали проточной цитометрией, соответственно, на предмет экспрессии Qa-1 и PDL-1 для опухолевых клеток и NKG2A/C/E и PD-1 для TIL. MFI: медианная интенсивность флуоресценции.
На фигуре 2 показано распределение NKG2A и PD-1 на субпопуляциях NK- и Т-клеток у мышей. Лимфоциты получали из селезенки, из дренирующих опухоль лимфатических узлов и из плотных опухолевых масс. Экспрессия PD-1 редко встречалась или отсутствовала среди всех субпопуляций клеток из селезенки и лимфатических узлов, однако во всех субпопуляциях лимфоцитов, проникающих в опухоль (TIL), присутствовал относительно высокий процент клеток, экспрессирующих PD-1. С другой стороны, NKG2A обнаруживали на субпопуляциях NK-клеток, но не Т-клеток в селезенке и лимфатических узлах, хотя в опухолях обнаруживали значительный процент TIL, причем в среднем более 30% NK-клеток и более 19% CD8 Т-клеток являлись двойными положительными клетками по отношению к NKG2A и PD-1.
3
На фигурах 3А и 3В показана экспрессия NKG2A и PD-1 у мышей с опухолями. Мышей с опухолями RMA Rae1 (верхняя строка), МС38 (средняя строка) и RMA (нижняя строка) умерщвляли по достижении опухолями объема 500, 2000 и 800 мм, соответственно. NK-клетки (фигура 3А) и CD8 Т-клетки (фигура 3В) из селезенки, дренирующих опухоль лимфатических узлов (ЛУ) и опухоли анализировали проточной цитометрией на предмет экспрессии NKG2A/C/E и PD-1.
На фигуре 4 показано, что лечение мышей мАт против PD-1 увеличивает частоту CD8 Т-клеток, экспрессирующих NKG2A, в опухолях МС38. Мышей с опухолями МС38 обрабатывали с использованием 200 мкг изотипического контрольного (IC) IgG2a крысы или антитела против PD-1 мыши на 11, 14 и 17 сутки после имплантации клеток. Мышей умерщвляли на 31 сутки, характеристики CD8 Т-клеток из селезенки, дренирующих опухоль лимфатических узлов (ЛУ) и опухоли исследовали с помощью проточной цитометрии.
На фигуре 5 показан средний объем опухолей мышей, получавших изотипическое контрольное антитело, мАт против NKG2A мыши (200 мкг, в/в), мАт против PD-L1 мыши (200 мкг, в/б) или комбинацию антител против mNKG2A/mPDL-1 в зависимости от времени на 11, 14 и 18 сутки. В то время как антитело против NKG2A обеспечивало лишь скромный противоопухолевый эффект по сравнению с изотипическим контролем в данной модели, а антитело против PD-L1 обеспечивало существенный противоопухолевый эффект, однако объем опухоли рос до 28 суток, комбинированное лечение с использованием антитела против NKG2A и антитела против PD-L1 полностью прекращало опухолевый рост, и на 28 сутки значимого роста объема опухоли не наблюдали.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
В настоящем описании формы единственного числа могут означать один или более определяемых объектов. Использование форм единственного числа в формуле изобретения в сочетании со словом «содержащий» может означать один или более одного определяемого объекта. В настоящем документе термин «еще один» может означать по меньшей второй или более отдаленный по порядку.
Термин «содержащий» необязательно можно заменять термином «состоящий главным образом из» или «состоящий из».
NKG2A (OMIM 161555, полное описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки) является членом группы транскриптов NKG2 (Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173:1017-1020). NKG2A кодируют 7 экзонов, охватывающих 25 т.п.о. и демонстрирующих в некоторой степени дифференциальный сплайсинг. Вместе с CD94 NKG2A образует гетеродимерный ингибиторный рецептор CD94/NKG2A, присутствующий на поверхности субпопуляций NK-клеток, α/β Т-клеток, γ/δ Т-клеток и NKT-клеток. Аналогично ингибиторным рецепторам KIR, его цитоплазматический домен содержит ITIM. В настоящем документе «NKG2A» относится к любому варианту, производному или изо-форме гена NKG2A или кодируемого им белка. NKG2A человека содержит 233 аминокислоты в 3 доменах, причем цитоплазматический домен содержит остатки 1-70, трансмембранная область содержит остатки 71-93, а внеклеточная область содержит остатки 94-233 следующей последовательности:
NKG2C (OMIM 602891, полное описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки) и NKG2E (OMIM 602892, полное описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки) представляют собой два других члена группы транскриптов NKG2 (Gilenke, et al. (1998) Immunogenetics 48:163-173). Рецепторы CD94/NKG2C и CD94/NKG2E являются активирующими рецепторами, присутствующими на поверхности таких субпопуляций лимфоцитов, как NK-клетки и Т-клетки.
HLA-E (OMIM 143010, полное описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки) представляет собой неклассическую МНС-молекулу, экспрессирующуюся на поверхности клеток и регулируемую за счет связывания пептидов, например, фрагментов сигнальных последовательностей других молекул МНС I класса. Кроме того, выявлены растворимые варианты HLA-E. В дополнение к связыванию Т-клеточного рецептора, HLA-E связывает субпопуляции естественных киллеров (NK-клеток), естественных Т-киллеров (NKT-клеток) и Т-клеток (α/β и γ/δ) посредством специфического связывания с CD94/NKG2A, CD94/NKG2B и CD94/NKG2C (см., например, Braud et al. (1998) Nature 391:795-799, полное описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки). Поверхностная экспрессия HLA-E защищает клетки-мишени от лизиса клонами CD94/NKG2A+ NK-, Т- или NKT-клеток. В настоящем документе «HLA-Е» относится к любому варианту, производному или изоформе гена HLA-Е или кодируемого им белка.
В контексте настоящего изобретения термин «NKG2A» или «CD94/NKG2A-положительные лимфоциты» относится к клеткам лимфоидной линии дифференцировки (например, NK-, NKT- и Т-клеткам), экспрессирующим на своей поверхности CD94/NKG2A, который можно обнаружить, например, посредством проточной цитометрии с использованием антител, специфически распознающих комбинированный эпитоп на CD94 и NKG2A и/или только эпитоп на NKG2A. Термин «NKG2A-положительный лимфоцит» также включает иммортализованные линии клеток лимфоидного происхождения (например, NKL, NK-92).
51
51
51
+
51
В контексте настоящего изобретения выражения «снижает ингибиторную активность NKG2A», «нейтрализует NKG2A» или «нейтрализует ингибиторную активность NKG2A» относятся к процессу, в котором происходит ингибирование способности CD94/NKG2A оказывать негативное влияние на внутриклеточные процессы, приводящие к таким реакциям лимфоцитов, как высвобождение цитокинов и цитотоксические реакции. Это можно измерить, например, в ходе анализа цитотоксичности на основе NK- или Т-клеток, в котором измеряют способность терапевтического соединения стимулировать уничтожение HLA-E-положительных клеток CD94/NKG2A-положительными лимфоцитами. В одном варианте реализации препарат антител вызывает по меньшей мере 10% увеличение цитотоксичности CD94/NKG2A-ограниченных лимфоцитов, необязательно по меньшей мере 40% или 50% увеличение цитотоксичности лимфоцитов, необязательно по меньшей мере 70% увеличение NK-цитотоксичности» и относится к описанным анализам цитотоксичности. Если антитело против NKG2A ослабляет или блокирует взаимодействие CD94/NKG2A с HLA-Е, оно может увеличивать цитотоксичность CD94/NKG2A-ограниченных лимфоцитов. Оценку этого можно выполнить, например, в ходе стандартного 4-часового анализа цитотоксичности in vitro, с использованием, например, NK-клеток, экспрессирующих CD94/NKG2A, и клеток-мишеней, экспрессирующих HLA-Е. Такие NK-клетки не способны эффективно уничтожать мишени, экспрессирующие HLA-Е, поскольку CD94/NKG2A распознает HLA-Е, что приводит к инициации и распространению ингибиторного сигнального каскада, предотвращающего цитолиз, опосредованный лимфоцитами. Такой анализ цитотоксичности in vitro можно выполнять стандартными способами, хорошо известными в данной области техники, описанными, например, в Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993). Высвобождение хрома и/или другие параметры для оценки способности антитела стимулировать уничтожение таких клеток-мишеней, как Р815, K562 или соответствующих опухолевых клеток лимфоцитами, также описаны в статьях Sivori et al., J. Exp. Med. 1997; 186:1129-1136; Vitale et al., J. Exp. Med. 1998; 187:2065-2072; Pessino et al. J. Exp. Med. 1998; 188:953-960; Neri et al. Clin. Diag. Lab. Immun. 2001; 8:1131-1135; Pende et al. J. Exp. Med. 1999;190:1505-1516, полные описания которых включены в настоящий документ посредством ссылок. Клетки-мишени метят Cr перед добавлением NK-клеток, а затем оценивают уничтожение пропорционально высвобождению Cr из клеток в среду в результате уничтожения. Добавление антитела, предотвращающего связывание CD94/NKG2A с HLA-Е, приводит к предотвращению инициации и распространения инги-биторного сигнального каскада через CD94/NKG2A. Поэтому добавление таких агентов приводит к усилению уничтожения клеток-мишеней, опосредованного лимфоцитами. Тем самым, на данном этапе выявляют агенты, предотвращающие инициацию CD94/NKG2A-индуцированного негативного сигнального каскада путем, например, блокирования связывания лиганда. В конкретном анализе цитотоксичности на основе высвобождения Cr CD94/NKG2A-экспрессирующие эффекторные NK-клетки могут уничтожать HLA-E-отрицательные клетки-мишени LCL 721.221, но в меньшей степени, чем HLA-E-экспрессирующие контрольные клетки LCL 721.221-Cw3. В отличие от этого, эффекторные клетки YTS, не содержащие CD94/NKG2A, эффективно уничтожают клетки обеих линий. Таким образом, эффекторные NK-клетки менее эффективно уничтожают HLA-E клетки LCL 721.221-Cw3 вследствие HLA-E-индуцируемого ингибиторного сигнального каскада за счет CD94/NKG2A. При предварительном инкубировании NK-клеток с блокирующими антителами против CD94/NKG2A согласно настоящему изобретению в таком анализе цитотоксичности на основе высвобождения Cr происходит более эффективное уничтожение HLA-E-экспрессирующих клеток LCL 721.221-Cw3, зависящее от концентрации антител. Ингибиторную активность (т.е. способность усиливать цитотоксичность) антитела против NKG2A также можно оценить любым из ряда других способов, например, по влиянию на внутриклеточный уровень свободного кальция, как описано, например, в статье Sivori et al., J. Exp. Med. 1997; 186:1129-1136, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.. Активацию цитотоксичности NK-клеток можно оценить, например, путем измерения увеличения продукции цитокина (например, продукции ИФН-y) или маркеров цитотоксичности (например, мобилизации CD107 или CD137). В типичном протоколе оценивают продукцию ИФН-y МПК путем окрашивания поверхности клетки и цитоплазмы и анализа с помощью проточной цитометрии после 4-дневного культивирования. Вкратце, в течение последних 4 часов культивирования добавляют брефелдин A (Sigma Aldrich) в конечной концентрации 5 мкг/мл. Затем клетки инкубируют с мАт против CD3 и против CD56 перед пермеабилизацией (IntraPrep™; Beckman Coulter) и окрашиванием с использованием РЕ-антитела против ИФН-y или PE-IgG1 (Pharmingen). Продукцию ГМ-КСФ и ИФН-y поликлональными активированными NK-клетками измеряют в супернатанте с помощью твердофазного ИФА (ГМ-КСФ: DuoSet Elisa, R&D Systems, Миннеаполис, штат Миннесота, ИФН-у: OptEIA set, Pharmingen).
В настоящем документе термин «PD-1» относится к белку запрограммированной гибели-1 (PD-1) (также называемому «белком запрограммированной гибели клеток-1»), ингибиторному члену семейства рецепторов CD28, которая также включает CD28, CTLA-4, ICOS и BTLA. Полную последовательность PD-1 человека можно найти в GenBank под номером доступа U64863; она показана ниже:
«PD-1» также включает любой вариант, производное или изоформу гена PD-1 или кодируемого им белка. PD-1 экспрессируется на активированных В-клетках, Т-клетках и миелоидных клетках Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). Первоначальные члены семейства, CD28 и ICOS, были обнаружены по функциональному усилению пролиферации Т-клеток после добавления моноклональных антител (Hutloff et al. (1999) Nature 397:263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10:247-260). Выявлены два лиганда PD-1 - PD-L1 и PD-L2, и показано, что они подавляют активацию Т-клеток после связывания с PD-1 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). Как PD-L1, так и PD-L2 являются гомологами В7, связывающимися с PD-1, но не связывающимися с другими членами семейства CD28.
Полную последовательность PD-L1 человека можно найти в UniProtKB/Swiss-Prot, под идентификатором Q9NZQ7-1; она показана ниже:
PD-L1 широко распространен в различных злокачественных опухолях человека (Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9). Взаимодействие между PD-1 и PD-L1 приводит к сокращению количества лимфоцитов, проникающих в опухоль, снижению пролиферации, опосредованной Т-клеточным рецептором, и ускользанию раковых клеток от иммунологического надзора (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281- 7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100). Иммунодепрессию можно купировать путем ингибирования локального взаимодействия PD-1 с PD-L1, и данный эффект является аддитивным при дополнительной блокаде взаимодействии PD-1 и PD-L2.
В контексте настоящего изобретения выражения «снижает ингибиторную активность PD-1 человека», «нейтрализует PD-1» или «нейтрализует ингибиторную активность PD-1 человека» относятся к процессу, в котором происходит ингибирование способности PD-1 передавать сигнал, возникающий при взаимодействии PD-1 с одним или более из его партнеров по связыванию, например, PD-L1 или PD-L2. Нейтрализатор ингибиторной активности PD-1 снижает, блокирует, ингибирует, останавливает или мешает передаче сигнала, возникающего в результате взаимодействия PD-1 с одним или несколькими из его партнеров по связыванию, например, PD-L1, PD-L2. Такой агент может тем самым ослабить негативный сигнал совместной стимуляции, опосредованный или осуществляемый через белки клеточной поверхности, экспрессирующиеся на Т-лимфоцитах, усиливая эффекторные функции Т-клеток, например, пролиферацию, продукцию цитокинов и/или цитотоксичность.
Каждый раз при упоминании данной полной формулировки «лечение рака» и т.п. по отношению к связывающему антагонисту NKG2A и антагонисту PD-1 или антагонисту PD-L1 (например, антителу) в данную формулировку входят: (а) способ лечения рака, причем указанный способ включает этап введения (в течение по меньшей мере одной процедуры) NKG2A и связывающего антагониста PD-1 или антагониста PD-L1 (например, совместно или по отдельности в фармацевтически приемлемом носителе) индивиду, млекопитающему, в особенности человеку, нуждающемуся в таком лечении, в дозе, позволяющей осуществлять лечение рака (терапевтически эффективном количестве), необязательно в дозе (количестве), указанной в настоящем документе; (b) применение связывающего антагониста NKG2A и антагониста PD-1 или антагониста PD-L1 для лечения рака, или связывающий антагонист NKG2A для применения в указанном лечении (особенно у человека); (с) применение связывающего антагониста NKG2A и антагониста PD-1 или антагониста PD-L1 для изготовления фармацевтического препарата для лечения рака, способ применения связывающего антагониста NKG2A и антагониста PD-1 или антагониста PD-L1 для изготовления фармацевтического препарата для лечения рака, включающий смешивание связывающего антагониста NKG2A и антагониста PD-1 или антагониста PD-L1 с фармацевтически приемлемым носителем, или фармацевтический препарат, содержащий эффективную дозу антитела против NKG2A и антитела PD-1 или связывающего антагониста PD-L1 и подходящий для лечения рака; или (d) любую комбинацию а), b) и с) в соответствии с предметом исследования, подходящим для патентования в стране, где подана данная заявка.
В настоящем документе термин «биопсия» определяется как удаление ткани для целей обследования, например, установления диагноза. Примеры различных видов биопсии включают биопсию путем всасывания, например, через иглу, присоединенную к шприцу; путем инструментального удаления фрагмента ткани; путем удаления с помощью соответствующих инструментов через эндоскоп; путем хирургического иссечения, например, всего очага; и т.п.
L
H
В настоящем описании термин «антитело» относится к поликлональным и моноклональным антителам. В зависимости от типа константного домена тяжелых цепей антитела относятся к одному из пяти основных классов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Некоторые из них далее подразделяются на подклассы или изотипы, например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 и т.п. Типичная структурная единица иммуноглобулина (антитела) включает тетрамер. Каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, причем каждая пара содержит одну «легкую» (приблизительно 25 кДа) и одну «тяжелую» цепь (приблизительно 50-70 кДа). N-концевой фрагмент каждой цепи содержит вариабельную область из приблизительно 100-110 аминокислот, главным образом отвечающих за распознавание антигена. Термины «вариабельная область легкой цепи» (V) и «вариабельная область тяжелой цепи» (V) относятся к указанным легкой и тяжелой цепям, соответственно. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, называются «альфа», «дельта», «эпсилон», «гамма» и «мю», соответственно. Хорошо известны субъединичная структура и трехмерная конфигурация различных классов иммуноглобулинов. IgG представляют собой типичные классы антител, используемых в настоящем изобретении, поскольку они являются наиболее распространенными антителами в физиологических условиях, и их проще всего получить в лабораторных условиях. Антитело необязательно является моноклональным антителом. Конкретными примерами антител являются гуманизированные, химерные антитела, антитела человека или антитела, подходящие для человека по иным причинам. Термин «антитело» также включает любой фрагмент или производное любого из антител, описанных в настоящем документе.
Термин «специфически связывается с» означает, что антитело может предпочтительно связываться при анализе конкурентного связывания с партнером по связыванию, например, NKG2A, PD-1, PD-L1, согласно оценке с использованием рекомбинантных форм белков, их эпитопов или нативных белков, присутствующих на поверхности выделенных клеток-мишеней. Анализ конкурентного связывания и другие способы определения специфического связывания хорошо известны в данной области техники. Например, связывание можно обнаружить с помощью радиоактивных меток, физическими способами, например, масс-спектрометрией, или с использованием прямых или непрямых флуоресцентных меток, обнаруживаемых с использованием, например, цитофлуориметрического анализа (например, FACScan). Связывание в количестве, превышающем количество, наблюдаемое для контрольного, неспецифического агента указывает на связывание агента с мишенью. Агент, специфически связывающий NKG2A, может связывать только NKG2A или NKG2A в виде димера с CD94.
Когда говорят, что антитело «конкурирует с» конкретным моноклональным антителом, это означает, что антитело конкурирует с указанным моноклональным антителом при анализе связывания с использованием рекомбинантных молекул (например, NKG2A, PD-1, PD-L1) или молекул, экспрессируемых на поверхности клеток (например, NKG2A, PD-1, PD-L1). Например, если тестируемое антитело снижает связывание антитела, содержащего тяжелую цепь согласно любой из SEQ ID NO: 4-8 и легкую цепь согласно SEQ ID NO: 9 с полипептидом NKG2A или клеткой, экспрессирующей NKG2A, при анализе связывания, то говорят, что антитело «конкурирует» с таким антителом, соответственно.
а
В настоящем описании термин «сродство» означает силу связывания антитела с эпитопом. Сродство антитела задается константой диссоциации Kd, определяемой как [Ab]×[Ag]/[Ab-Ag], где [Ab-Ag] - молярная концентрация комплекса антитело-антиген, [Ab] - молярная концентрация свободного антитела и [Ag] - молярная концентрация свободного антигена. Константу сродства K определяют как 1/Kd. Способы определения сродства мАт можно найти в Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), и Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983), включенных в настоящий документ посредством ссылок. Один стандартный способ определения сродства мАт, хорошо известный в данной области техники, представляет собой использование скрининга на основе поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (например, посредством анализа с помощью аналитического ППР-устройства BIAcore™).
В контексте настоящего документа термин «детерминанта» означает сайт взаимодействия или связывания в составе полипептида.
Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте и представляет собой область или регион антигена, с которым связывается антитело. Эпитоп белка может содержать аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в связывании, а также аминокислотные остатки, эффективно блокируемые специфическим антигенсвязывающим антителом или пептидом, т.е. аминокислотные остатки в области распознавания антитела. Это - простейшая форма или наименьшая структурная область сложной молекулы антигена, которая может взаимодействовать с, например, антителом или рецептором. Эпитопы могут быть линейными или конформационными/структурными. Термин «линейный эпитоп» определяется как эпитоп, состоящий из аминокислотных остатков, которые находятся рядом друг с другом на линейной последовательности аминокислот (первичной структуре). Термин «конформационный или структурный эпитоп» определяется как эпитоп, состоящий из аминокислотных остатков, не все из которых расположены рядом друг с другом и, таким образом, представляют собой отдельные части линейной последовательности аминокислот, которые сближаются друг с другом за счет фолдинга молекулы (вторичной, третичной и/или четвертичной структуры). Конформационный эпитоп зависит от 3-мерной структуры. Поэтому термин «конформационный» часто используется на равных основаниях с термином «структурный».
В настоящем документе термин «агент» используется для обозначения химического соединения, смеси химических соединений, биологической макромолекулы или экстракта биологических материалов. Термин «терапевтический агент» относится к агенту, обладающему биологической активностью.
Для целей настоящего изобретения термины «гуманизированное» антитело или антитело «человека» относятся к антителу, в котором константная и вариабельная каркасная области одного или более иммуноглобулинов человека объединены со связывающей областью, например, CDR, иммуноглобулина животного. Такие антитела сконструированы с целью поддержания специфичности связывания нечеловеческого антитела, производными которого являются связывающие области, при избегании иммунного ответа против нечеловеческого антитела. Такие антитела можно получить о трансгенных мышей или других животных, «сконструированных» с целью продукции специфических антител человека в ответ на антигенную стимуляцию (см., например, Green et al. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579, информация из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки). Кроме того, полностью человеческое антитело можно сконструировать с использованием способов трансфекции генов или хромосом, а также технологии фагового дисплея, которые известны в данной области техники (see, e.g., McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553). Кроме того, антитела человека можно получить in vitro с применением активированных В-клеток (см., например, патенты США №5567610 и 5229275, полностью включенные в настоящий документ посредством ссылок).
«Химерное антитело» представляет собой молекулу антитела, в которой (а) константная область или ее фрагмент модифицированы, замещены или заменены таким образом, что антигенсвязывающий сайт (вариабельная область) связан с константной областью, относящейся к другому или измененному классу, обладающей другой эффекторной функцией и/или характерной для другого вида, или с совершенно другой молекулой, придающей химерному антителу новые свойства, например, ферментом, токсином, гормоном, фактором роста, лекарственным веществом и т.д.; либо (b) вариабельная область или ее фрагмент модифицированы, замещены или заменены вариабельной областью, обладающей специфичностью по отношению к другому или модифицированному антигену.
Термины «Fc-домен», «Fc-фрагмент» и «Fc-область» относятся к С-концевому фрагменту тяжелой цепи антитела, например, от приблизительно 230 до приблизительно 450 аминокислоты (АК) тяжелой γ(гамма) цепи человека, или аналогичной ему последовательности в тяжелых цепях антител других типов (например, α, δ, ε и μ для антител человека), либо их аллотипу, встречающемуся в природе. Если не указано иное, в настоящем изобретении используют общепринятую нумерацию аминокислот в иммуноглобулинах по Кабату (см. Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5th ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD).
Термины «выделенный», «очищенный» или «биологически чистый» относятся к материалу, в основном или практически не содержащему компонентов, обычно сопутствующих ему в нативном состоянии. Чистоту и однородность обычно определяют с помощью методик аналитической химии, например, электрофореза в полиакриламидном геле или высокоэффективной жидкостной хроматографии. Белок, являющийся преобладающим в препарате соединением, является в основном очищенным.
Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются в настоящем документе на равных основаниях для обозначения полимера, состоящего из аминокислотных остатков. Эти термины относятся к аминокислотным полимерам, в которых один или более из аминокислотных остатков является искусственным соединением, имитирующим соответствующую природную аминокислоту, а также природным аминокислотным полимерам и аминокислотным полимерам, не встречающимся в природе.
Термин «рекомбинантный», используемый по отношению к, например, клетке, нуклеиновой кислоте, белку или вектору, означает, что указанная клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор модифицированы путем внедрения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка, или что клетка происходит от клетки, модифицированной таким образом Так, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, не встречающиеся в нативной (не рекомбинантной) форме данной клетки, или экспрессируют нативные гены, в противном случае экспрессирующиеся аномальным образом, в недостаточном количестве или вообще не экспрессирующиеся.
В контексте настоящего описании термин «антитело, связывающее» полипептид или эпитоп, означает антитело, связывающее указанную детерминанту с определенной специфичностью и/или сродством.
Термин «идентичность» или «идентичный» при использовании по отношению к связи между последовательностями двух или более полипептидов относится к степени родства последовательностей полипептидов, определенной по количеству совпадений между двумя или более цепями аминокислотных остатков. «Идентичность» измеряет процент идентичных совпадений между меньшей из двух последовательностей при выравнивании промежутков (при их наличии), рассчитываемый определенной математической моделью или компьютерной программой (т.е. «алгоритмами»). Идентичность родственных полипептидов легко рассчитать известными способами. Такие способы включают способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988), но не ограничиваются ими.
Способы определения идентичности выдают степень максимального совпадения между тестируемыми последовательностями. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Программные способы определения идентичности между двумя последовательностями включают программный пакет GCG, включающий GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, и FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). Программа BLASTX общедоступна в Национальном центре биотехнологической информации США (NCBI) и других источниках (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). Кроме того, для определения идентичности можно использовать хорошо известный алгоритм Смита-Уотермана.
NKG2A-нейтрализующие терапевтические агенты
Агент-антагонист NKG2A связывается с внеклеточным фрагментом рецептора CD94/NKG2A человека и снижает ингибиторную активность рецептора CD94/NKG2A человека, экспрессируемого на поверхности CD94/NKG2A-положительных лимфоцитов. В одном варианте реализации данный агент конкурирует с HLA-Е за связывание с CD94/NKG2A, т.е. блокирует взаимодействие между CD94/NKG2A и его лигандом HLA-E. В другом варианте реализации данный агент не конкурирует с HLA-Е за связывание с CD94/NKG2A; т.е. способен связывать CD94/NKG2A одновременно с HLA-Е. Антитело может связываться с комбинированным эпитопом на CD94 и NKG2A и/или только с эпитопом на NKG2A.
HH
В одном аспекте агент-антагонист NKG2A представляет собой антитело, выбранное из полностью человеческого антитела, гуманизированного антитела и химерного антитела. В одном аспекте указанный агент содержит константный домен, происходящий от IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4-антитела человека. В одном аспекте указанный агент представляет собой фрагмент антитела, выбранного из IgA, IgD, IgG, IgE и IgM-антитела. В одном аспекте агент представляет собой фрагмент антитела, выбранный из Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, Fab'-SH-фрагмента, F(ab)2-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fv-фрагмент, тяжелую цепь Ig (Ig ламы или верблюда), V-фрагмент, однодоменный FV и фрагмент одноцепочечного антитела. В одном аспекте агент представляет собой синтетическое или полусинтетическое соединение, происходящее от антитела, выбранное из scFV, dsFV, миниантитела, диатела, триатела, каппа-тела, IgNAR; и полиспецифического антитела.
th
Антитела против NKG2A необязательно не демонстрируют существенного специфического связывания с Fcγ-рецепторами, например, CD16. Такие антитела могут содержать константные области различных тяжелых цепей, заведомо не связывающих Fc-рецепторы. Одним из таких примеров является константная область IgG4 человека. В одном варианте реализации IgG4-антитело содержит модификацию с целью предотвращения образования полуантител (обмена плеч fab) in vivo, например, антитело содержит тяжелую цепь IgG4, содержащую мутацию замены серина на пролин в остатке 241, соответствующем положению 228 согласно ЕС-индексу (Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest", 5 ed., NIH, Bethesda, ML, 1991). Такие модифицированные IgG4-антитела остаются интактными in vivo и поддерживают двухвалентное связывание (с высоким сродством) с NKG2A, в отличие от нативного IgG4, которое должно подвергаться обмену плеч fab in vivo таким образом, что они связываются с NKG2A моновалентным образом, что может влиять на сродство связывания. В качестве альтернативы, во избежание связывания с Fc-рецептором можно использовать фрагменты антител, не содержащие константных областей, например, Fab- или F(ab')2-фрагменты. Связывание с Fc-рецептором можно оценить в соответствии со способами, известными в данной области техники, в том числе, например, тестированием связывания антитела с Fc-рецепторным белком при анализе BIACORE. Кроме того, можно использовать антитело человека любого типа (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), в котором Fc-фрагмент модифицирован с целью минимизации или устранения связывания с Fc-рецепторами (см., например, WO 03101485, описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки). Такие анализы для оценки связывания с Fc-рецептором, как, например, анализы на основе клеток, хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в WO 03101485.
Таким образом, настоящее изобретение относится к антителам или другим агентам, связывающимся с NKG2A. В одном аспекте антитело связывается с NKG2A с по меньшей мере 100-кратно более низкой KD, чем при связывании с NKG2C и/или NKG2E человека.
В одном аспекте изобретения агент уменьшает CD94/NKG2A-опосредованное ингибирование CD94/NKG2A-экспрессирующего лимфоцита, создавая помехи для сигнального пути CD94/NKG2A, например, мешая связыванию HLA-E NKG2A, предотвращая или индуцируя конформационные изменения рецептора CD94/NKG2A и/или влияя на димеризацию и/или кластеризацию рецептора CD94/NKG2A.
В одном аспекте изобретения агент связывается с внеклеточным фрагментом NKG2A с по меньшей мере 100-кратно более низкой KD, чем при связывании с NKG2C. В дополнительном предпочтительном аспекте агент связывается с внеклеточным фрагментом NKG2A с по меньшей мере 150-, 200-, 300, 400- или 10000-кратно более низкой KD, чем при связывании с NKG2C. В еще одном аспекте изобретения агент связывается с внеклеточным фрагментом NKG2A с по меньшей мере 100-кратно более низкой KD, чем при связывании с молекулами NKG2C, NKG2E и/или NKG2H. В дополнительном предпочтительном аспекте агент связывается с внеклеточным фрагментом NKG2A с по меньшей мере 150-, 200-, 300, 400- или 10000-кратно более низкой KD, чем при связывании с молекулами NKG2C, NKG2C и/или NKG2H. Это можно измерить, например, в экспериментах на BiaCore, где измеряют способность агентов связывать внеклеточный фрагмент иммобилизованного CD94/NKG2A (например, выделенного из CD94/NKG2-экспрессирующих клеток или продуцированного в биосистеме) и сравнивают ее со связыванием агентов с аналогично продуцированным CD94/NKG2C и/или другими вариантами CD94/NKG2 в аналогичном анализе. В качестве альтернативы, связывание агентов с клетками, естественным образом экспрессирующими или сверхэкспрессирующими (например, после временной или стабильной трансфекции) CD94/NKG2A можно измерить и сравнить со связыванием клеток, экспрессирующих CD94/NKG2C и/или другие варианты CD94/NKG2. Антитела против NKG2A необязательно могут связывать NKG2B, который является сплайс-вариантом NKG2A, образующим ингибиторный рецептор вместе с CD94. В одном варианте реализации сродство можно измерить с помощью способов, описанных в патенте США №8206709, например, путем оценки связывания с ковалентно иммобилизованным гибридным белком NKG2A-CD94-Fc с помощью Biacore, как показано в примере 8 патента США №8206709, описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.
Антитело против NKG2A может являться гуманизированным антителом, например, содержащим акцепторный каркас VH человека из акцепторной последовательности человека, выбранный из, например, VH1_18, VH5_a, VH5_51, VH1_f и VH1_46 и JH6 J-сегмента, или другие каркасные последовательности VH эмбриональных линий человека, известные в данной области техники. Акцепторная последовательность VL-области человека может представлять собой, например, VKI_O2/JK4.
В некоторых вариантах реализации антитело является гуманизированным антителом на основе антитела Z270. Различные гуманизированные Z270VH-цепи показаны в SEQ ID NO: 4-8 (аминокислоты домена вариабельной области подчеркнуты). HumZ270VH6 (SEQ ID NO: 4) основана на VH5_51; HumZ270VH1 (SEQ ID NO: 5) основана на VH1_18; humZ270VH5 (SEQ ID NO: 6) основана на VH5_a; humZ270VH7 (SEQ ID NO: 7) основана на VH1_f; a humZ270VH8 (SEQ ID NO: 8) основана на VH1_46; все они содержат J-сегмент JH6. Каждое из этих антител сохраняет высокое сродство связывания с NKG2A при низкой вероятности иммунного ответа хозяина против антитела, поскольку 6 С-концевых аминокислотных остатков CDR-H2 по Кабату каждого из этих гуманизированных конструктов идентичны акцепторному каркасу человека. С помощью программы выравнивания VectorNTI получили следующие значения идентичности последовательностей humZ270VH1 и humZ270VH5, -6, -7 и -8: 78,2% (VH1 по сравнению с VH5), 79,0% (VH1 по сравнению с VH6), 88,7% (VH1 по сравнению с VH7) и 96,0% (VH1 по сравнению с VH8).
В одном аспекте агент содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи согласно любой из SEQ ID NO: 4-8 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную ей, и (ii) вариабельную область легкой цепи согласно SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную ей. В одном аспекте агент содержит (i) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 4-8 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную ей, и (ii) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 9 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную ей. Антитело, содержащее тяжелую цепь согласно любой из SEQ ID NO: 4-8 и легкую цепь согласно SEQ ID NO: 9, нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, однако не связывает активирующие рецепторы NKG2C, NKGE или NKG2H в существенной степени. Кроме того, это антитело конкурирует с HLA-Е за связывание с NKG2A на поверхности клетки. В одном аспекте агент содержит последовательности HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3, происходящие от тяжелой цепи, содержащей аминокислотную последовательность согласно любой из SEQ ID NO: 4-8. В одном аспекте настоящего изобретения агент содержит последовательности LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3, происходящие от легкой цепи, содержащей аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 9.
Тяжелые цепи
VH6:
VH1:
VH5:
VH7:
VH8:
Легкая цепь
В одном аспекте антитело против NKG2A представляет собой антитело, содержащее CDR-H1, соответствующую остаткам 31-35 SEQ ID NO: 4-8, CDR-H2, соответствующую остаткам 50-60 (необязательно 50-66 при включении аминокислот человеческого происхождения) SEQ ID NO: 4-8 и CDR-H3, соответствующую остаткам 99-114 (95-102 по Кабату) SEQ ID NO: 4-8. В одном варианте реализации CDR-H2 соответствует остаткам 50-66 SEQ ID NO: 4-8. CDR необязательно может содержать одну, две, три, четыре или более аминокислотные замены.
В одном аспекте антитело против NKG2A представляет собой антитело, содержащее CDR-L1, соответствующую остаткам 24-34 SEQ ID NO: 9, CDR-L2 соответствует остаткам 50-56 SEQ ID NO: 9, a CDR-L3 соответствует остаткам 89-97 SEQ ID NO: 9. CDR необязательно может содержать одну, две, три, четыре или более аминокислотные замены.
В одном аспекте антитело против NKG2A представляет собой антитело, содержащее CDR-H1, соответствующую остаткам 31-35 SEQ ID NO: 4-8, CDR-H2 соответствует остаткам 50-60 (необязательно 50-66) SEQ ID NO: 4-8 и CDR-H3, соответствующую остаткам 99-114 (95-102 по Кабату) SEQ ID NO: 4-8, CDR-L1 соответствует остаткам 24-34 SEQ ID NO: 9, CDR-L2 соответствует остаткам 50-56 SEQ ID NO: 9, a CDR-L3 соответствует остаткам 89-97 SEQ ID NO: 9.
В одном аспекте агент содержит последовательности HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3, происходящие от VH, содержащей аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 10. В одном аспекте настоящего изобретения агент содержит последовательности LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3, происходящие от VL, содержащей аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 11. В одном аспекте агент содержит последовательности HCDR1, HCDR2 и/или HCDR3, происходящие от VH, содержащей аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 10, и LCDR1, LCDR2 и/или LCDR3, происходящие от VL, содержащей аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 11. Антитело, содержащее тяжелую цепь согласно SEQ ID NO: 10 и легкую цепь согласно SEQ ID NO: 11, нейтрализует ингибиторную активность NKG2A, а также связывает активирующие рецепторы NKG2C, NKGE или NKG2H. Указанное антитело не конкурирует с HLA-Е за связывание с NKG2A на поверхности клетки (т.е. Представляет собой неконкурентный антагонист NKG2A).
H
L
В одном аспекте агент содержит аминокислотные остатки 31-35, 50-60, 62, 64, 66 и 99-108 вариабельного домена тяжелой цепи (V) (SEQ ID NO: 10) и аминокислотные остатки 24-33, 49-55 и 88-96 вариабельного домена легкой цепи (V) (SEQ ID NO: 11), необязательно с одной, двумя, тремя, четырьмя или более аминокислотными заменами.
В одном аспекте агент является полностью человеческим антителом, полученное против эпитопа CD94/NKG2A, с которым связывается любое из вышеупомянутых антител.
Следует принимать во внимание, что несмотря на возможность применения вышеупомянутых антител, другие антитела могут распознавать и быть получены против любой части полипептида NKG2A при условии, что данное антитело нейтрализует ингибиторную активность NKG2A. Например, любой фрагмент NKG2A, предпочтительно, но не исключительно представляющий собой NKG2A человека, или любую комбинацию фрагментов NKG2A можно применять в качестве иммуногенов для получения антител, и указанные антитела могут распознавать эпитопы в любом положении в пределах полипептида NKG2A, при условии, что они могут делать это на NK-клетках, экспрессирующих NKG2A, как описано в настоящем документе. Указанный эпитоп необязательно представляет собой эпитоп, специфически распознаваемый антителом, содержащим тяжелую цепь согласно SEQ ID NO: 4-8, и легкую цепь согласно SEQ ID NO: 9.
В одном аспекте агент конкурирует с антителом humZ270, описанным в патенте США №8206709 (описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки), за связывание с внеклеточным фрагментом рецептора CD94/NKG2A человека. Конкурентное связывание можно измерить, например, в экспериментах на BiaCore, где измеряют способность агентов связывать внеклеточный фрагмент иммобилизованного рецептора CD94/NKG2A (например, выделенного из CD94/NKG2-экспрессирующих клеток или продуцированного в биосистеме), насыщенный humZ270. В качестве альтернативы, измеряют связывание агентов с клетками, естественным образом экспрессирующими или сверхэкспрессирующими (например, после временной или стабильной трансфекции) рецептор CD94/NKG2A, предварительно инкубированными с насыщающими дозами Z270. В одном варианте реализации конкурентное связывание можно измерить с помощью способов, описанных в патенте США №8206709, например, путем оценки связывания с клетками Ba/F3-CD94-NKG2A с помощью проточной цитометрии, как показано в примере 15 патента США №8206709, описание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.
Терапевтические агенты, нейтрализующие PD-1
В настоящее время существуют по меньшей мере шесть агентов, блокирующих путь PD-1/PD-L1, которые выпущены на рынок или находятся на стадии клинической оценки. Один агент представляет собой BMS-936558 (ниволумаб/ONO-4538, Bristol-Myers Squibb; прежнее название MDX-1106). Ниволумаб (торговое название Opdivo) представляет собой утвержденное FDA полностью человеческое IgG4-MAT против PD-L1, ингибирующее связывание лиганда PD-L1 с PD-1 и CD80 и описанное как антитело 5С4 в заявке WO 2006/121168, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. Для пациентов с меланомой наиболее значимый OR наблюдали при дозе 3 мг/кг, в то время как для других видов рака он присутствовал при дозе 10 мг/кг. Ниволумаб обычно применяют в дозировке 10 мг/кг каждые 3 недели до прогрессирования рака.
MK-3475 (IgG4-мАТ против PD1 человека производства Merck), также известное под названием ламбролизумаб или пембролизумаб (торговое название Keytruda) одобрено FDA для лечения меланомы и проходит испытания при других видах рака. Пембролизумаб испытывали при дозировке 2 мг/кг или 10 мг/кг каждые 2-3 недели до прогрессирования заболевания. ДНК-конструкты, кодирующие вариабельные области тяжелых и легких цепей гуманизированных антител h409All, депонированы в патентном депозитарии Американской коллекции типовых культур (10801 University Blvd., Манассас, штат Виргиния, США). Плазмида, содержащая ДНК, кодирующую тяжелую цепь h409A-I 1, депонирована 9 июня 2008 г. с присвоением идентификатора 081469_SPD-H, а плазмида, содержащая ДНК, кодирующую легкую цепь h409Al 1, депонирована 9 июня 2008 г. с присвоением идентификатора 0801470_SPD-L-I 1. MK-3475, также известное как Merck 3745 или SCH-900475, также описано в WO 2009/114335.
MPDL3280A/RG7446 (антитело против PD-L1 производства Roche/Genentech) представляет собой мАт человека против PD-L1, содержащее рекомбинантный Fc-домен, сконструированный с целью оптимизации эффективности и безопасности за счет минимизации связывания FcγR и последующей антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). Дозы ≥1, 10, 15 и 25 мг/кг MPDL3280A вводили каждые 3 недели в течение периода продолжительностью до 1 года. В исследовании 3 фазы MPDL3280A вводили в дозе 1200 мг путем внутривенного вливания каждые три недели пациентам с НМРЛ.
АМР-224 (Amplimmune и GSK) представляет собой иммуноадгезин, содержащий внеклеточный домен PD-L2, объединенный с Fc-доменом. Другие примеры агентов, нейтрализующих PD-1, могут включать антитело, связывающее PD-L2 (антитело против PD-L2) и блокирующее взаимодействие между PD-1 и PD-L2.
Пидлизумаб (СТ-011; CureTech) (гуманизированное IgG1-мАт против PD1 производства CureTech/Teva), пидлизумаб (СТ-011; CureTech) (см., например, WO 2009/101611). Тридцать пациентов с рецидивирующей FL, чувствительной к ритуксимабу, лечили путем внутривенного введения 3 мг/кг СТ-011 каждые 4 недели в виде 4 вливаний в комбинации с ритуксимабом в дозировке 375 мг/м2 каждую неделю в течение 4 недель, начиная со 2 недели после первого вливания СТ-011.
Дополнительные известные антитела против PD-1 и другие ингибиторы PD-1 включают АМР-224 (гибридный белок B7-DC/IgG1, лицензированный GSK), АМР-514, описанное в WO 2012/145493, антитело MEDI-4736 (антитело против PD-L1, разработанное AstraZeneca/Medimmune), описанное в WO 2011/066389 и US 2013/034559, антитело YW243.55.S70 (антитело против PD-L1), описанное в WO 2010/077634, MDX-1105, также известное как BMS-936559, представляет собой антитело против PD-L1, разработанное Bristol-Myers Squibb, описанное в WO 2007/005874, и антитела и ингибиторы, описанные в WO 2006/121168, WO 2009/014708, WO 2009/114335 и WO 2013/019906, описание которых включено в настоящий документ посредством ссылок. Дополнительные примеры антител против PD1 описаны в WO 2015/085847 (Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co. Ltd.), например, антитела, содержащие CDR1, 2 и 3 вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и/или SEQ ID NO: 8, соответственно, и CDR1, 2 и 3 вариабельного домена тяжелой цепи антитела согласно SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5, соответственно, причем ссылки на SEQ ID NO пронумерованы согласно WO 2015/085847, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки. Кроме того, можно использовать антитела, конкурирующие с любым из этих антител за связывание с PD-1 или PD-L1.
Типичным антителом против PD-1 является пембролизумаб (см., например, WO 2009/114335, описание которой включено в настоящий документ посредством ссылки). Антитело против PD-1 может представлять собой антитело h409Al 1 из заявки WO 2008/156712, содержащее вариабельные области тяжелой цепи, кодируемые ДНК, депонированной в АТСС как 081469_SPD-H, и вариабельные области легкой цепи, кодируемые ДНК, депонированной в АТСС как 0801470_SPD-L-I 1. В других вариантах реализации антитело содержит CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи пембролизумаба. Соответственно, в одном варианте реализации, антитело содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-домены VH пембролизумаба, кодируемые ДНК, депонированной в АТСС как 081469_SPD-H, и CDR1-, CDR2- и CDR3-домены VL пембролизумаба, кодируемые ДНК, депонированной в АТСС как 0801470_SPD-L-I 1.
В некоторых вариантах реализации изобретения агент, нейтрализующий PD-L1, представляет собой мАт против PD-L1, ингибирующее связывание PD-L1 с PD-1. В некоторых вариантах реализации изобретения агент, нейтрализующий PD1, представляет собой мАт против PD-1, ингибирующее связывание PD-1 с PD-L1. В некоторых вариантах реализации агент, нейтрализующий PD-1, является иммуноадгезином (например, иммуноадгезином, содержащим внеклеточный или PD-1-связывающий фрагмент PD-L1 или PD-L2, объединенный с константной областью (например, Fc-областью последовательности иммуноглобулина).
Еще одним типичным антителом против PD-1 является ниволумаб, содержащий тяжелые и легкие цепи, обладающие соответствующими последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 12 и 13 или соответствующую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную им, или их антиген-связывающие фрагменты и варианты В других вариантах реализации антитело содержит CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи ниволумаба. Соответственно, в одном варианте реализации антитело содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-домены тяжелой цепи ниволумаба, обладающей последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 12, и CDR1-, CDR2- и CDR3-домены легкой цепи ниволумаба, обладающие последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 13.
Типичное антитело против PD-L1 содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепи, обладающие соответствующими последовательностями, показанными в SEQ ID NO: 14 и 15 или аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% или 99% идентичную им, или их антиген-связывающие фрагменты и варианты В других вариантах реализации антитело содержит CDR или вариабельные области тяжелой и легкой цепи MPDL3280A. Соответственно, в одном варианте реализации антитело содержит CDR1-, CDR2- и CDR3-домены тяжелой цепи, обладающей последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 14, и CDR1-, CDR2- и CDR3-домены легкой цепи, обладающие последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: 15.
HH
Антитело против PD-1 или против PD-L1 можно выбрать из полностью человеческого антитела, гуманизированного антитела и химерного антитела. В одном аспекте настоящего изобретения агент содержит константный домен, происходящий от IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4-антитела человека. В одном аспекте настоящего изобретения указанный агент представляет собой фрагмент антитела, выбранного из IgA, IgD, IgG, IgE и IgM-антитела. В одном аспекте настоящего изобретения агент представляет собой фрагмент антитела, выбранный из Fab-фрагмента, Fab'-фрагмента, Fab'-SH-фрагмента, F(ab)2-фрагмент, F(ab')2-фрагмент, Fv-фрагмент, тяжелую цепь Ig (Ig ламы или верблюда), V-фрагмент, однодоменный FV и фрагмент одноцепочечного антитела. В одном аспекте настоящего изобретения указанный агент представляет собой синтетическое или получинтетическое производное антитела, выбранное из scFV, dsFV, миниантитела, диатела, триатела, каппа-тела, IgNAR; и полиспецифического антитела.
Антитело против PD-1 или против PD-L1 может не обладать существенной способностью к специфическому связыванию с Fcγ-рецепторами, например, CD16. Такие антитела могут содержать константные области различных тяжелых цепей, заведомо не связывающих Fc-рецепторы. Одним из таких примеров является константная область IgG4. В качестве альтернативы, во избежание связывания с Fc-рецептором можно использовать фрагменты антител, не содержащие константных областей, например, Fab-или F(ab')2-фрагменты. Связывание с Fc-рецептором можно оценить в соответствии со способами, известными в данной области техники, в том числе, например, тестированием связывания антитела с Fc-рецепторным белком при анализе BIACORE. Кроме того, можно использовать антитело человека любого типа (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), в котором Fc-фрагмент модифицирован с целью минимизации или устранения связывания с Fcγ-рецепторами. Такое антитело против PD-1 или против PD-L1 обычно обладает сниженными или минимальными эффекторными функциями. В одном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом продукции в прокариотических клетках. В одном аспекте минимальная эффекторная функция является результатом «безэффекторной мутации Fc» или агликозилирования. В дополнительном варианте реализации безэффекторная мутация Fc представляет собой N297A или замену D265A/N297A в константной области.
Лекарственные формы
Антагонист NKG2A или PD-1 или PD-L1, например, антитело, можно включить в фармацевтическую лекарственную форму в концентрации от 1 мг/мл до 500 мг/мл, причем рН указанной лекарственной формы составляет от 2,0 до 10,0. Лекарственная форма может также содержать буферную систему, консервант(ы), регулятор(ы) тоничности, хелатирующий(е) агент(ы), стабилизаторы и поверхностно-активные вещества. В одном варианте реализации фармацевтическая лекарственная форма является водной лекарственной формой, например, лекарственной формой, содержащей воду. Такая лекарственная форма обычно представляет собой раствор или суспензию. В дополнительном варианте реализации фармацевтическая лекарственная форма представляет собой водный раствор. Термин «водная лекарственная форма» означает лекарственную форму, содержащую по меньшей мере 50 масс. % воды. Аналогичным образом, термин «водный раствор» означает раствор, содержащий по меньшей мере 50 масс. % воды, а термин «водная суспензия» означает суспензию, содержащую по меньшей мере 50 масс. % воды.
В еще одном варианте реализации фармацевтическая лекарственная форма представляет собой лиофилизированную лекарственную форму, к которой врач или пациент добавляет растворители и/или разбавители перед применением.
В еще одном варианте реализации фармацевтическая лекарственная форма представляет собой высушенную лекарственную форму (например, лиофилизированную или высушенную посредством распылительной сушки), готовую к применению без предварительного растворения.
В другом аспекте фармацевтическая лекарственная форма содержит водный раствор такого антитела и буфер, причем антитело присутствует в концентрации от 1 мг/мл и выше, а рН указанного состава составляет от 2,0 до 10,0.
В еще одном варианте реализации рН лекарственной формы находится в диапазоне, выбранном из списка, состоящего из диапазонов от приблизительно 2,0 до приблизительно 10,0, от приблизительно 3,0 до приблизительно 9,0, от приблизительно 4,0 до приблизительно 8,5, от приблизительно 5,0 до приблизительно 8,0, и от приблизительно 5,5 до приблизительно 7,5.
В дополнительном варианте реализации буфер выбирают из группы, состоящей из ацетата натрия, карбонат натрия, цитрата, глицилглицина, гистидина, глицина, лизина, аргинина, дигидрофосфата натрия, гидрофосфата натрия, фосфата натрия и трис(гидроксиметил)аминометана, бицина, трицина, яблочной кислоты, сукцината, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, аспарагиновой кислоты или их смесей. Каждый из этих конкретных буферов представляет собой альтернативный вариант реализации изобретения.
th
В дополнительном варианте реализации лекарственная форма дополнительно содержит фармацевтически приемлемый консервант. В дополнительном варианте реализации лекарственная форма дополнительно содержит изотонический агент. В дополнительном варианте реализации лекарственная форма также содержит хелатирующий агент. В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения лекарственная форма дополнительно содержит стабилизатор. В дополнительном варианте реализации лекарственная форма дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. Для удобства приведена ссылка на Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19 edition, 1995.
В пептидной фармацевтической лекарственной форме согласно настоящему изобретению могут присутствовать другие ингредиенты. Такие дополнительные ингредиенты могут включать увлажнители, эмульгаторы, антиоксиданты, наполнители, модификаторы тоничности, хелатирующие агенты, ионы металлов, масляные носители, белки (например, человеческий сывороточный альбумин, желатин или белки) и цвиттерион (например, такую аминокислоту, как бетаин, таурин, аргинин, глицин, лизин и гистидин). Такие дополнительные ингредиенты, разумеется, не должно оказывать нежелательного влияния на общую стабильность фармацевтической лекарственной формы согласно настоящему изобретению.
Введение фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению можно осуществлять несколькими путями, например, внутривенно. Подходящие лекарственные формы антител также можно определить путем изучения опыта применения других уже разработанных терапевтических моноклональных антител. Несколько моноклональных антител, например, Rituxan (Rituximab), герцептин (трастузумаб), Xolair (омализумаб), Веххаr (тозитумомаб), Campath (алемтузумаб), зевалин, Oncolym продемонстрировали свою эффективность в клинических ситуациях, и можно использовать аналогичные лекарственные формы, содержащие антитела согласно настоящему изобретению. Например, моноклональное антитело можно поставлять в концентрации 10 мг/мл в 100-мг (10-мл) или 500-мг (50-мл) одноразовых флаконах в составе для в/в введения, содержащем 9,0 мг/мл хлорида натрия, 7,35 мг/мл дигидрата цитрата натрия, 0,7 мг/мл полисорбата 80 и стерильную воду для инъекций. рН доводят до 6,5. В еще одном варианте реализации антитело представлено в виде лекарственной формы, содержащей приблизительно 20 мМ цитрата Na, приблизительно 150 мМ NaCl при рН приблизительно 6,0.
Кроме того, предложены наборы, содержащие фармацевтическую композицию, содержащую антитело против NKG2A и антитело против PD-1 или против PD-L1 и фармацевтически приемлемый носитель в терапевтически эффективном количестве, адаптированные для применения в предыдущих способах. Указанные наборы также могут необязательно содержать инструкции, например, график введения, позволяющий практикующему специалисту (например, врачу, медсестре или пациенту) вводить лекарственную форму, содержащуюся в нем, с целью введения композиции пациенту, страдающему раком (например, плотной опухолью). Кроме того, набор может содержать шприц.
Наборы необязательно содержат несколько упаковок с однократными дозами фармацевтических композиций, каждая из которых содержит эффективное количество антитела против NKG2A, антитела против PD-1 или PD-L1 для однократного введения в соответствии с представленными выше способами. В наборы также могут входить инструменты или изделия, необходимые для введения фармацевтической(их) композиции(й). Например, набор может содержать один или более предварительно заполненных шприцов, содержащих некоторое количество антитела против NKG2A, против PD-1 или против PD-L1.
В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен набор для лечения рака у пациента-человека, причем указанный набор содержит:
(a) дозу антитела против NKG2A, содержащего CDR1-, CDR2- и CDR3-домены тяжелой цепи, обладающей последовательностью, приведенной в любой из SEQ ID NO: 4-8, и CDR1-, CDR2- и CDR3-домены легкой цепи, обладающей последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 9;
(b) дозу антитела против PD-1 или антитела против PD-L1; и
(c) необязательно, инструкции по применению антитела против NKG2A и антитела против PD-1 в любом из способов, описанных в настоящем документе.
Диагностика, прогнозирование и лечение злокачественных новообразований
Описаны способы, которые можно применять при диагностике, прогнозировании, мониторинге, лечении и профилактике рака у индивида. Хотя схемы лечения и способы, описанные в настоящем документе, особенно полезны при лечении плотных опухолей, схемы лечения и способы, описанные в настоящем документе, также можно применять при различных гематологических злокачественных новообразованиях, а также инфекционных заболеваниях и воспалительных и аутоиммунных заболеваниях. Способы и композиции согласно настоящему изобретению применяют, например, для лечения различных раковых заболеваний и других пролиферативных заболеваний, включая: карциному, в том числе карциному мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, почек, печени, легких, яичников, предстательной железы, поджелудочной железы, желудка, матки, щитовидной железы и кожи; кроветворные опухоли лимфоидной линии дифференцировки, в том числе лейкоз, острый лимфолейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, волосатоклеточную лимфому и лимфому Беркитта и множественную миелому; кроветворные опухоли миелоидной линии дифференцировки, в том числе острый и хронический миелоидные лейкозы, промиелоцитарный лейкоз и миелодиспластический синдром; опухоли мезенхимального происхождения, в том числе фибросаркому и рабдомиосаркому; другие опухоли, в том числе меланому, семиному, тератокарциному, нейробластому и глиому; опухоли центральной и периферической нервной системы, в том числе астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы; опухоли мезенхимального происхождения, в том числе фибросаркому, рабдомиосаркому и остеосаркому; и другие опухоли, включая меланому, пигментную ксеродерму, кератоакантому, семиному и фолликулярный рак щитовидной железы, но не ограничиваясь ими.
Комбинированные способы лечения лечения рака, предложенные в настоящем документе, включают введение нейтрализующего антитела против NKG2A и агента, нейтрализующего PD-1, например, нейтрализующего антитела против PD-1 или против PD-L1, с целью лечения субъектов, страдающих раком (например, рефрактерными плотными опухолями на поздней стадии). В одном варианте реализации настоящего изобретения предложено антитело против NKG2A и антитело против PD-1 в комбинации для лечения субъектов с плотной опухолью (например, плотной опухолью, рефрактерной плотной опухолью на поздней стадии) или субъектов с гематологической опухолью. В конкретном варианте реализации антитело против NKG2A содержит тяжелую цепь согласно любой из SEQ ID NO: 4-8 и легкую цепь согласно SEQ ID NO: 9. В одном варианте реализации антитело, нейтрализующее ингибиторную активность PD-1, выбрано из группы, состоящей из пембролизумаба, ниволумаба, АМР-514, MEDI-4736, СТ-011 и MPDL3280A.
В настоящем документе дополнительное или комбинированное введение (совместное введение) включает одновременное введение соединений в одинаковой или разной лекарственной форме, или раздельное введение соединений (например, последовательное введение). Так, антитела против NKG2A и антитела против PD-1 или против PD-L1 можно одновременно вводить в виде единой лекарственной формы. В качестве альтернативы, антитела против NKG2A и антитела против PD-1 или против PD-L1 могут содержаться в лекарственных формах для раздельного введения, и их можно вводить одновременно или последовательно.
В одном варианте реализации рак, подвергаемый лечению с использованием способов, описанных в настоящем документе, представляет собой HLA-E-экспрессирующий рак. В одном варианте реализации рак выбирают из группы, состоящей из рака легких (например, немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ)), почечноклеточной карциномы (RCC), меланомы, рака ободочной и прямой кишки и рака яичников.
Пациента, страдающего от рака, можно лечить с применением антагонистов NKG2A с предварительным этапом обнаружения с целью оценки экспрессии HLA-Е на поверхности опухолевых клеток или без него. Преимущество состояит в том, что способы лечения могут включать этап обнаружения нуклеиновой кислоты или полипептида HLA-E в биологическом образце опухоли (например, опухолевой клетке) индивида. Пример биологических образцов включают любые подходящие биологические жидкости (например, сыворотку крови, лимфу, кровь), образец клеток или образец ткани. Например, образец ткани может представлять собой образец опухолевой ткани или ткани, прилегающей к опухоли. Полипептид HLA-Е необязательно обнаруживают на поверхности злокачественной клетки. Определение наличия экспрессии HLA-Е (например, выраженной экспрессии; высокого уровня экспрессии HLA-Е, высокой интенсивности окрашивания антителом против HLA-Е по сравнению с эталоном) в биологическом образце указывает на наличие у индивида рака, при котором лечение с применением ингибитора NKG2A может обеспечить сильное благоприятное действие. В одном варианте реализации способ включает определение уровня экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида HLA-Е в биологическом образце и сравнение этого уровня с эталонным уровнем (например, значением, слабым окрашиванием поверхности клеток и т.д.), соответствующим здоровому индивиду. Определение повышенного уровня экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида HLA-Е в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем указывает на наличие у индивида рака, который можно лечить с применением ингибитора NKG2A.
В одном варианте реализации определение выраженной экспрессии нуклеиновой кислоты или полипептида HLA-Е в биологическом образце (например, образце, содержащем опухолевые клетки, опухолевую ткань и/или ткань, прилегающую к опухоли) указывает на наличие у индивида рака, который можно лечить с применением ингибитора NKG2A. «Выраженная экспрессия» по отношению к полипептиду HLA-Е означает, что полипептид HLA-Е экспрессируется в значительном количестве опухолевых клеток, полученных от данного индивида. Хотя определение термина «выраженная экспрессия» не связано с точным процентным значением, в некоторых примерах рецептор, о котором говорят, что он «выраженно экспрессируется», должен присутствовать на по меньшей мере 30%, 40%, 50 ° %, 60%, 70%, 80%, или более опухолевых клетках, полученных от пациента (в образце).
Определение наличия у индивида раковых клеток, экспрессирующих полипептид HLA-Е может включать, например, получение биологического образца (например, путем выполнения биопсии) от индивида, содержащего раковые клетки, приведение указанных клеток в контакт с антителом, связывающим полипептид HLA-Е, и обнаружение наличия экспрессии HLA-Е на поверхности указанных клеток. Определение наличия раковых клеток, экспрессирующих HLA-Е, у индивида необязательно включает проведение иммуногистохимического анализа. Определение наличия раковых клеток, экспрессирующих HLA-E, у индивида необязательно включает проведение анализа посредством проточной цитометрии.
В способах лечения антитело против NKG2A и антитела против PD-1 или против PD-L1 можно вводить раздельно, совместно или последовательно, или в составе смеси. В некоторых вариантах реализации антиген-связывающее соединение вводят до введения антител против PD-1 или против PD-L1. Например, антитело против NKG2A можно вводить приблизительно за 0-30 дней до введения антител против PD-1 или против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело против NKG2A вводят в диапазоне от приблизительно 30 минут до приблизительно 2 недель, от приблизительно 30 минут до приблизительно 1 недели, от приблизительно 1 часа до приблизительно 2 часов, от приблизительно 2 часов до приблизительно 4 часов, от приблизительно 4 часов до приблизительно 6 часов, от приблизительно 6 часов до приблизительно 8 часов, от приблизительно 8 часов до 1 дня, или от приблизительно 1 до 5 дней до введения антител против PD-1 или против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело против NKG2A вводят одновременно с введением антител против PD-1 или против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело против NKG2A вводят после введения антител против PD-1 или против PD-L1. Например, антитело против NKG2A можно вводить приблизительно через 0-30 дней после введения антител против PD-1 или против PD-L1. В некоторых вариантах реализации антитело против NKG2A вводят в диапазоне от приблизительно 30 минут до приблизительно 2 недель, от приблизительно 30 минут до приблизительно 1 недели, от приблизительно 1 часа до приблизительно 2 часов, от приблизительно 2 часов до приблизительно 4 часов, от приблизительно 4 часов до приблизительно 6 часов, от приблизительно 6 часов до приблизительно 8 часов, от приблизительно 8 часов до 1 дня, или от приблизительно 1 до 5 дней после введения антител против PD-1 или против PD-L1.
Подходящие протоколы лечения человека, страдающего раком, включают, например, введение пациенту эффективного количества каждого из антитела, ингибирующего NKG2A, и антитела, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 человека, причем данный способ включает по меньшей мере один цикл введения, в котором по меньшей мере одну дозу антитела против NKG2A вводят в дозировке 1-10 мг/кг массы тела и по меньшей мере одну дозу антитела против PD-1 или против PD-L1 вводят в дозировке 1-20 мг/кг массы тела. В одном варианте реализации продолжительность цикла введения составляет от 2 до 8 недель.
В одном варианте реализации способ включает по меньшей мере один цикл введения, причем указанный цикл представляет собой период продолжительностью восемь недель или менее, причем в каждом из по меньшей мере одного цикла две, три или четыре дозы антитела против NKG2A вводят в дозировке 1-10 мг/кг массы тела и две, три или четыре дозы антитела против PD-1 или против PD-L1 вводят в дозировке 1-20 мг/кг массы тела.
Антитело против NKG2A можно предпочтительно вводить в количестве, позволяющем достичь концентрации в кровотоке, по меньшей мере в 10, 20 или 30 раз превышающей концентрацию, необходимую для практически полного (например, 90%, 95%) насыщения рецепторов (например, согласно оценке путем титрования антитела против NKG2A на NKG2A-экспрессирующих клетках, например, МПК), или, необязательно, в количестве, позволяющем достичь концентрации в внесосудистой ткани (например, опухолевой ткани или окружении опухоли), по меньшей мере в 10, 20, или 30 раз превышающей концентрацию, необходимую для практически полного насыщения рецепторов (например, согласно оценке путем титрования антител против NKG2A на NKG2A-экспрессирующих клетках, например, МПК).
50
100
Ответ NKG2A+ NK-клеток можно оценить с помощью подходящего анализа цитотоксической активности NKG2A-экспрессирующих NK-клеток по отношению к клеткам-мишеням, экспрессирующим HLA-Е. Примеры включают анализы на основе маркеров активации NK-клеток, например, экспрессии CD107 или CD137. По отношению к ответу NKG2A+ NK-клеток (например, согласно оценке с помощью анализа мобилизации CD107) ЕС блокирующего антитела humZ270 против NKG2A, используемого в примерах в настоящем документе (например, содержащего тяжелую цепь согласно любой из SEQ ID NO: 4-8 и легкую цепь согласно SEQ ID NO: 9) составляет приблизительно 4 мкг/мл, а ЕС - приблизительно 10 мкг/мл. Таким образом, вводимое количество антитела против NKG2A позволяет поддерживать постоянную (минимальную) концентрацию в крови, составляющую по меньшей мере 4 мкг/мл. Предпочтительно, можно ввести такое количество антитела против NKG2A, которое позволяет достичь и/или поддерживать постоянную (минимальную) концентрацию в крови, составляющую по меньшей мере 10 мкг/мл. Например, достигаемая и/или поддерживаемая концентрация в крови может составлять 10-12 мкг/мл, 10-15 мкг/мл, 10-20 мкг/мл, 10-30 мкг/мл, 10-40 мкг/мл, 10-50 мкг/мл, 10-70 мкг/мл, 10-100 мкг/мл, 10-150 мкг/мл или 10-200 мкг/мл. Если мишенями являются внесосудистые ткани (например, при лечении плотных опухолей), вводят количество антитела против NKG2A, позволяющее достичь и/или поддерживать концентрацию в тканях, составляющую по меньшей мере 10 мкг/мл; например, ожидается, что введения количества антитела против NKG2A, позволяющего достичь концентрации в крови, составляющей по меньшей мере 100 мкг/мл, позволит достичь концентрации в ткани, равной по меньшей мере 10 мкг/мл. Например, концентрация в крови, достигаемая и/или поддерживаемая с целью достижения/поддержания концентрации в ткани, составляющей 10 мкг/мл, может составлять 100-110 мкг/мл, 100-120 мкг/мл, 100-130 мкг/мл, 100-140 мкг/мл, 100-150 мкг/мл, 100-200 мкг/мл, 100-250 мкг/мл или 100-300 мкг/мл.
50
100
50
100
100
50
100
В некоторых вариантах реализации вводят количество антитела против NKG2A, позволяющее получить концентрацию в крови (например, сыворотке), соответствующую по меньшей мере ЕС для ответа NKG2A+ лимфоцитов (например, ответа NKG2A+ NK-клеток), необязательно приблизительно или по меньшей мере приблизительно ЕС. «ЕС» (или «ЕС») по отношению к ответу NKG2A+ клеток (например, ответу NK-клеток) относится к эффективной концентрации антитела против NKG2A, обеспечивающей 50% (или 100%, когда речь идет о ЕС) от его максимальной реакции или действия по отношению к такому ответу NKG2A+ клеток (например, ответу NK-клеток). В некоторых вариантах реализации, особенно для лечения плотных опухолей, достигаемая концентрация должна обеспечить концентрацию в тканях (за пределами сосудистого русла, например, в окружении опухоли), соответствующую по меньшей мере ЕС по отношению к ответу NKG2A+ NK-клеток, необязательно приблизительно или по меньшей мере приблизительно ЕС по отношению к ответу NKG2A+ NK-клеток.
100
Подходящие протоколы лечения для антитела против NKG2A, например, humZ270, использованного в примерах в настоящем документе, обладающего ЕС по отношению к ответу NKG2A+ NK-клеток, составляющей приблизительно 10 мкг/мл, включают по меньшей мере один цикл введения, в котором по меньшей мере одну дозу антитела против NKG2A вводят в дозировке 2-10 мг/кг, необязательно 4-10 мг/кг, необязательно 6-10 мг/кг, необязательно 2-6 мг/кг, необязательно 2-8 мг/кг или необязательно 2-4 мг/кг массы тела. Необязательно вводят по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 доз антитела против NKG2A. В одном варианте реализации продолжительность цикла введения составляет от 2 до 8 недель. В одном варианте реализации продолжительность цикла введения составляет 8 недель. В одном варианте реализации продолжительность цикла введения составляет 8 недель, и он включает введение одной дозы антитела против NKG2A каждые две недели (т.е. в общей сложности четырех доз).
В одном из аспектов любого из вариантов реализации, приведенных в настоящем документе, антитело против NKG2A вводят приблизительно раз в две недели.
100
Протоколы лечения, подходящие для использования с антителом против NKG2A, особенно для лечения кроветворной опухоли, включают, например, введение пациенту антитела против NKG2A два раза в месяц в количестве, позволяющем поддерживать постоянную концентрацию антитела против NKG2A в крови между по меньшей мере двумя последовательными введениями антитела против NKG2A, составляющую по меньшей мере 10 мкг/мл, между 2-10 мг/кг, необязательно 2-6 мг/кг, необязательно 2-8 мг/кг, необязательно 2-4 мг/кг, необязательно 2-6 мг/кг, необязательно 2-4 мг/кг, необязательно приблизительно 4 мг/кг массы тела. Эти дозы при необходимости можно вводить, обеспечивая постоянную концентрацию антитела против NKG2A в крови, составляющую по меньшей мере 10 мкг/мл, на протяжении всего цикла лечения. Достижение концентрации антитела против NKG2A в крови, равной 10 мкг/мл, соответствует ЕС для такого антитела, как гуманизированное антитело Z270.
50
50
Протоколы лечения, подходящие для использования с антителом против NKG2A, особенно для лечения плотной опухоли, где желательна EC антитела против NKG2A во внесосудистой ткани (например, в опухоли или окружении опухоли), включают, например, введение пациенту антитела против NKG2A два раза в месяц в количестве, позволяющем поддерживать постоянную концентрацию антитела против NKG2A в крови между по меньшей мере двумя последовательными введениями антитела против NKG2A, составляющую по меньшей мере 40 мкг/мл, между 2-10 мг/кг, необязательно 2-6 мг/кг, необязательно 2-4 мг/кг, необязательно приблизительно 4 мг/кг массы тела. Эти дозы при необходимости можно вводить, обеспечивая постоянную концентрацию антитела против NKG2A в крови, составляющую по меньшей мере 40 мкг/мл, на протяжении всего цикла лечения. Ожидается, что достижение концентрации антитела против NKG2A в крови, равной 40 мкг/мл, обеспечит концентрацию в ткани (например, внесосудистой ткани, окружении опухоли), составляющей приблизительно 4 мкг/мл, что, в свою очередь, соответствует ЕС для такого антитела, как гуманизированное антитело Z270.
50
100
Протоколы лечения, подходящие для использования с антителом против NKG2A, особенно для лечения плотной опухоли, где желательна ЕС антитела против NKG2A во внесосудистой ткани (например, в опухоли или окружении опухоли), включают, например, введение пациенту эффективного количества антитела против NKG2A, причем указанное антитело вводят 2 раза в месяц в количестве, позволяющем поддерживать постоянную концентрацию антитела против NKG2A в крови между по меньшей мере двумя последовательными введениями антитела против NKG2A, составляющую по меньшей мере 100 мкг/мл, между 4-10 мг/кг, необязательно 4-6 мг/кг, необязательно 4-8 мг/кг, необязательно приблизительно 4 мг/кг, необязательно приблизительно 6 мг/кг, необязательно приблизительно 8 мг/кг или необязательно приблизительно 10 мг/кг. Эти дозы при необходимости можно вводить, обеспечивая постоянную концентрацию антитела против NKG2A в крови, составляющую по меньшей мере 100 мкг/мл, на протяжении всего цикла лечения. Ожидается, что достижение концентрации антитела против NKG2A в крови, равной 100 мкг/мл, обеспечит концентрацию в ткани (например, внесосудистой ткани, окружении опухоли), составляющей приблизительно 10 мкг/мл, что, в свою очередь, соответствует ЕС для такого антитела, как гуманизированное антитело Z270.
Дополнительные протоколы лечения, подходящие для использования с антителом против NKG2A, включают схемы, которые используют нагрузочный период с приемом повышенной дозы с последующим поддерживающим периодом. Например, нагрузочный период может включать введение пациенту эффективного количества антитела против NKG2A, причем указанное антитело вводят один или более раз в количестве, позволяющем поддерживать постоянную концентрацию антитела против NKG2A в крови, составляющую по меньшей мере 100 мкг/мл до первого введения антитела против NKG2A в рамках поддерживающей схемы. Например, при однократном приеме можно ввести нагрузочную дозу 10 мг/кг антитела против NKG2A, причем первое введение антитела против NKG2A в период поддерживающей схемы происходит приблизительно через две недели (или менее) после нагрузочной дозы. Затем в рамках поддерживающей схемы можно использовать более низкую дозу или пониженную частоту введения для поддержания непрерывной концентрации антитела против NKG2A в крови, составляющей по меньшей мере 100 мкг/мл, между последовательными введениями в рамках поддерживающей схемы. Например, поддерживающая схема может включать введение антитела против NKG2A каждые две недели в дозе между 2-10 мг/кг, необязательно 4-10 мг/кг, необязательно 2-4 мг/кг, необязательно 4-6 мг/кг, необязательно 4-8 мг/кг, необязательно приблизительно 4 мг/кг, необязательно приблизительно 6 мг/кг, необязательно приблизительно 8 мг/кг.
В некоторых вариантах реализации дозу (например, каждую дозу) антитела против NKG2A вводят в дозировке 4, 6, 8 или 10 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозу (например, каждую дозу) антитела против PD-1 вводят в дозировке 1-20 мг/кг, необязательно 10 мг/кг. В некоторых вариантах реализации дозу (например, каждую дозу) антитела против PD-L1 вводят в дозировке 10, 15, 20 или 25 мг/кг, необязательно в общей дозе 1200 мг/кг. В некоторых вариантах реализации комбинированная терапия позволяет вводить антитело против PD-1 или PD-L1 в пониженной дозе; в одном варианте реализации каждую дозу антитела против PD-1 вводят в дозировке 2 или 3 мг/кг.
В одном варианте реализации антитело против NKG2A и антитело против PD-1 или против PD-L1 вводят в следующих дозах:
(a) 1-10 мг/кг антитела против NKG2A и (i) 1-10 мг/кг антитела против PD-1 или (ii) 1-20 мг/кг антитела против PD-L1;
(b) 4, 6, 8 или 10 мг/кг антитела против NKG2A и 10 мг/кг антитела против PD-1 или против PD-L1;
(c) 4, 6, 8 или 10 мг/кг антитела против NKG2A и 3 мг/кг антитела против PD-1; или
(d) 4, 6, 8 или 10 мг/кг антитела против NKG2A и 2 мг/кг антитела против PD-1.
В одном из аспектов любого из вариантов реализации, приведенных в настоящем документе, антитело против NKG2A вводят приблизительно раз в две недели. В одном из аспектов любого из вариантов реализации, приведенных в настоящем документе, антитело против PD-1 или против PD-L1 вводят приблизительно раз в три недели. В одном из аспектов любого из вариантов реализации, приведенных в настоящем документе, антитело против PD-1 или против PD-L1 вводят приблизительно раз в две недели. В одном из аспектов любого из вариантов реализации, приведенных в настоящем документе, антитело против PD-1 или против PD-L1 вводят приблизительно раз в четыре недели.
В одном варианте реализации антитело против PD-1 или против PD-L1 и антитело против NKG2A вводят в/в. В одном варианте реализации антитело против PD-1 или против PD-L1 и антитело против NKG2A вводят в один и тот же день, кроме того, необязательно приблизительно раз в каждые две недели, кроме того, необязательно в/в.
В других аспектах предложены способы выявления NKG2A+ PD1+ NK-клеток и/или Т-клеток. Оценку совместной экспрессии NKG2A и PD-1 на NK-клетках и/или Т-клетках можно применять в способах диагностики и прогнозирования. Например, можно получить биологический образец от индивида (например, из рака или ткани, прилегающей к раку, полученной от пациента с раком) и проанализировать его на наличие NKG2A+ PD1+ NK- и/или Т-клеток. Экспрессию NKG2A и PD-1 на таких клетках можно, например, применять для выявления индивидов с NK- и/или Т-клетками, проникающими в опухоль, которые ингибируют полипептиды NKG2A и PD1. Указанный способ, например, можно применять для прогнозирования реакции на лечение с применением агента, нейтрализующего NKG2A, прогнозирования реакции на лечение с применением агента, нейтрализующего PD1, или прогнозирования реакции на комбинированное лечение с применением агента, нейтрализующего NKG2A, и агента, нейтрализующего PD1.
В одном варианте реализации предложен способ оценки того, подходит ли человек для лечения с применением ингибитора NKG2A и агента, нейтрализующего ингибиторную активность PD-1 человека, причем указанный способ включает обнаружение популяции лимфоцитов (например, CD8+ Т-клеток), экспрессирующих как нуклеиновую кислоту или полипептид NKG2A, так и нуклеиновую кислоту или полипептид PD-1, в биологическом образце индивида. Определение наличия у индивида популяции лимфоцитов, экспрессирующих как нуклеиновую кислоту или полипептид NKG2A, так и нуклеиновую кислоту или полипептид PD-1, указывает на наличие у индивида рака, который можно лечить с применением ингибитора NKG2A в комбинации с агентом, нейтрализующим ингибиторную активность PD-1 человека.
В других аспектах предложены способы выявления NKG2A+ PD1+ NK-клеток и/или Т-клеток. Данные о том, что эффекторные лимфоциты, проникающие в опухоль, могут экспрессировать оба из ингибиторных рецепторов NKG2A и PD-1, приводят к появлению усовершенствованных способов лечения, а также способов обнаружения таких дважды ограниченных/ингибированных эффекторных клеток, которые можно применять в диагностических и прогностических целях.
Например, можно получить биологический образец от индивида (например, из рака или ткани, прилегающей к раку, полученной от пациента с раком) и проанализировать его на наличие NKG2A+ PD1+ NK- и/или Т-клеток. Экспрессию NKG2A и PD-1 на таких клетках можно, например, применять для выявления индивидов с NK- и/или Т-клетками, проникающими в опухоль, которые ингибируют полипептиды NKG2A и PD1. Указанный способ, например, можно применять для прогнозирования реакции на лечение с применением агента, нейтрализующего NKG2A, прогнозирования реакции на лечение с применением агента, нейтрализующего PD1, или прогнозирования реакции на комбинированное лечение с применением агента, нейтрализующего NKG2A, и агента, нейтрализующего PD1.
Обнаружение NKG2A- и PD-1-ограниченных NK- и/или CD8 Т-клеток в биологических образцах в более общем случае может обладать преимуществами при применении в целях исследования, оценки, диагностики, прогноза и/или предсказания патологий, где важное значение имеет оценка характеристик NK- и/или CD8 Т-клеток. Например, можно сделать благоприятный или неблагоприятный прогноз рака путем оценки того, характеризуется ли опухоль или ткани, прилегающие к опухоли, проникновением NK- и/или CD8 Т-клеток, экспрессирующих как NKG2A, так и PD-1.
Например, можно исследовать или оценивать рак у пациентов с помощью антител против NKG2A и против PD1 с целью оценки того, являются ли NK- и/или CD8 Т-клетки, проникающие в опухоль, NKG2A+ PD1+, и в том числе, присутствуют ли такие NK- и/или CD8 Т-клетки на периферии опухоли (в ткани, прилегающей к раку). Эти способы можно применять для определения наличия у пациента патологии, характеризующейся NK- и/или CD8 Т-клетками, которые можно было бы модулировать с использованием терапевтических агентов, непосредственно действующих на такие NK- и/или CD8 Т-клетки (например, путем связывания с NKG2A и/или PD-1, и/или их соответствующим лигандам HLA-Е или PD-L1), или косвенно действующих на такие NK- и/или CD8 Т-клетки (например, путем продукции цитокинов или других сигнальных молекул, которые могут модулировать активность NK- или CD8 Т-клеток). В любом варианте реализации пациента необязательно лечат агентом, нейтрализующим PD-1. Способы, описанные в настоящем документе, необязательно могут дополнительно включать введение индивиду такого терапевтического агента, если установлено, что у индивида есть патология, которую можно было бы модулировать с использованием терапевтических агентов, действующих на NK- и/или CD8 Т-клетки, проникающие в опухоль.
В одном аспекте авторы изобретения предлагают способ обнаружения in vitro NKG2A+ PD-1+ лимфоцита, необязательно NK- или CD8+ Т-клетки, причем указанный способ включает предоставление биологического образца, содержащего лимфоциты, проникающие в опухоль, и определение наличия экспрессии NKG2A и PD-1 лимфоцитами.
В одном аспекте авторы изобретения предлагают способ обнаружения in vitro NKG2A- и PD-1-экспрессирующих (т.е. двойных положительных) CD8 Т-клеток или NK-клеток в образце от индивида-человека, причем указанный способ включает предоставление образца от индивида, контакт клеток в указанном образце с использованием моноклонального антитела, специфически связывающегося с полипептидом NKG2A человека, и моноклонального антитела, специфически связывающегося с полипептидом PD-1 человека в образцах, и обнаружение связывания антител с клетками. В одном варианте реализации клетки представляют собой CD8 Т-клетки и/или NK-клетки.
В одном аспекте авторы изобретения предлагают способ обнаружения in vitro CD8 Т-клеток и/или NK-клеток, ингибированных как NKG2A, так и PD-1, в образце от индивида-человека, причем указанный способ включает предоставление образца от индивида и обнаружение CD8 Т-клеток и/или NK-клеток в указанном образце с использованием моноклонального антитела, специфически связывающегося с полипептидом NKG2A человека, и моноклонального антитела, специфически связывающегося с полипептидом PD-1 человека в образцах, причем обнаружение полипептида NKG2A и PD-1 указывает на присутствие NKG2A- и PD-1-ингибированных CD8 Т-клеток и/или NK-клеток, проникающих в опухоль. В любом варианте реализации пациента необязательно лечат агентом, нейтрализующим PD-1. В одном варианте реализации образец содержит опухолевые клетки, опухолевую ткань или ткань, прилегающую к опухоли. В одном варианте реализации CD8 Т-клетки и/или NK-клетки выявляют с помощью иммуногистохимических способов. В одном варианте реализации образец является образцом, залитым парафином; образец, залитый парафином, необязательно фиксируют, заливают парафином, нарезают, удаляют парафин и переносят на предметное стекло перед введением в контакт с моноклональным антителом. В одном варианте реализации CD8 Т-клетки и/или NK-клетки выявляют с помощью проточно-цитометрических способов.
Примеры
Пример 1 - NK-клетки, экспрессирующие NKG2A, и CD8 Т-клетки, экспрессирующие NKG2A и/или PD-1, инфильтрируют опухолевые клетки RMA-S и А20
Лимфоциты, как правило, не характеризуются совместной экспрессией NKG2A и PD-1. Для изучения экспрессии этих рецепторов на лимфоцитах, проникающих в опухоль, исследовали распределение NKG2A и PD-1 на субпопуляциях NK- и Т-клеток в опухоли мыши. Лимфоциты получали из селезенки, из дренирующих опухоль лимфатических узлов, а также из плотных опухолей.
3
Мышам C57/BL6 имплантировали (п/к) PDL-1+ Qa-1+ RMA-S-клетки (Qa-1, Qdm, B2m) или опухолевые клетки А20. Мышей с опухолями RMA-S Qa-1 Qdm B2m (верхняя строка) и А20 (нижняя строка) умерщвляли при размере опухолей, составлявшем приблизительно 500 мм.
Результаты показаны на фигурах 1А и 1В. Опухолевые клетки (фигура 1А) и лимфоциты, проникающие в опухоль (TIL) (фигура 1В) анализировали проточной цитометрией, соответственно, на предмет экспрессии Qa-1 и PDL-1 для опухолевых клеток и NKG2A и PD-1 для TIL. Показана одна из 3 типичных мышей. MFI: медианная интенсивность флуоресценции.
Более половины NK-клеток, проникающих в опухоли обоих типов, экспрессировали NKG2A, что указывает на ингибирование NK-клеток, проникающих в опухоль, за счет NKG2A. NKG2A+ NK-клетки обычно не экспрессируют PD-1 в значительном количестве. Несмотря на это, были обнаружены CD8 Т-клетки, положительные как по отношению к NKG2A, так и к PD-1, что указывает на ограничение CD8 Т-клеток обоими ингибиторными рецепторами NKG2A и PD-1.
Пример 2 - субпопуляции NK- и Т-клеток мышей с опухолями rma-rae1 способны совместно экспрессировать NKG2A и PD-1
Для дальнейшего изучения экспрессии рецепторов NKG2A и PD-1 исследовали распределение NKG2A и PD-1 на субпопуляциях NK- и Т-клеток у мышей. Лимфоциты получали из селезенки, из дренирующих опухоль лимфатических узлов, а также из плотных опухолей.
3
3
Мышам C57/BL6 имплантировали (п/к) клон 6 RMA-Rae (2 миллиона клеток). Эти опухолевые клетки экспрессируют лиганд CD94/NKG2A - Qa-1. Мышей умерщвляли на 12 день при среднем объеме опухоли: 723 мм, СО: 161 мм, n=4. После получения суспензии клеток селезенки, ЛУ и опухоли клетки окрашивали следующим образом: CD3e PerCP Су5.5, NKP46 Alexa 647, NKG2A/C/E FITC, PD1 РЕ, CD8 Pacific Blue.
Результаты показаны на фигуре 2 и в таблицах 1-3.
+
-
-
-
+
+
+
-
-
-
+
+
В субпопуляции NK-клеток клетки в дренирующих лимфатических узлах и селезенке были приблизительно наполовину NKG2A-положительными и наполовину NKG2A-отрицательными, однако в обоих случаях имела место значимая экспрессия PD1. NK-клетки из лимфатических узлов являлись NKG2A PD-1 (49.2%) и NKG2A PD-1 (49.5%), и менее чем 1% (среднее значение) NK-клеток являлись NKG2A PD-1. NK-клетки из селезенки являлись NKG2A PD-1 (44,1%) и NKG2A PD-1 (55,7%), и менее чем 0,1% (среднее значение) NK-клеток являлись NKG2A PD-1.
+
+
+
-
+
+
+
+
В субпопуляции Т-клеток большинство клеток являлись NKG2A-отрицательными (лишь 1,1% клеток в лимфатических узлах и 4,7% в селезенке являлись NKG2A), и небольшая фракция клеток являлась PD-1 (3.5% в лимфатических узлах и 10% в селезенке являлись PD-1 NKG2A), а значимое количество двойных положительных NKG2A PD-1 клеток отсутствовало. Лишь 0,1% (среднее значение) Т-клеток в лимфатических узлах являлись NKG2A PD-1, и лишь 0,4% (среднее значение) Т-клеток в селезенке являлись NKG2A PD-1. 95,1% Т-клеток в лимфатических узлах представляли собой двойные отрицательные клетки, и 85,6% Т-клеток в селезенке представляли собой двойные отрицательные клетки.
+
+
+
-
+
+
+
+
В субпопуляции CD8 Т-клеток большинство клеток также являлись NKG2A-отрицательными (лишь 1,6% клеток в лимфатических узлах и 3,9% в селезенке являлись NKG2A), и небольшая фракция клеток являлась PD-1 (1,1% в лимфатических узлах и 2,5% в селезенке являлись PD-1 NKG2A), а значимое количество двойных положительных NKG2A PD-1 клеток отсутствовало. Лишь 0,2% (среднее значение) Т-клеток в лимфатических узлах являлись NKG2A PD-1, и лишь 0,3% (среднее значение) Т-клеток в селезенке являлись NKG2A PD-1. 97,3% Т-клеток в лимфатических узлах представляли собой двойные отрицательные клетки, и 93,6% Т-клеток в селезенке представляли собой двойные отрицательные клетки.
+
+
+
+
+
Вместе с тем, во всех субпопуляциях лимфоцитов, проникающих в опухоль (TIL), были клетки, экспрессирующие PD-1. Обнаружено, что NK-клетки, которые ранее не экспрессировали PD-1 на значительном количестве клеток, в опухоли являлись PD-1-положительными, включая субпопуляцию NKG2A, причем 31,8% (среднее значение) NK-клеток являлись NKG2APD-1. Хотя CD8 Т-клетки с экспрессией NKG2A практически отсутствовали за пределами опухоли, CD8 Т-клетки, экспрессирующие PD-1, часто встречались в опухоли (в субпопуляции CD8 Т-клеток, проникающих в опухоль, в среднем 26,3% клеток являлись NKG2A+ положительными клетками). Кроме того, большинство клеток этой субпопуляции NKG2A-положительных CD8 Т-клеток являлись NKG2A PD-1 (19,4% (среднее значение). Тем не менее, среди субпопуляции CD8- Т-клеток существовало небольшое различие в экспрессии NKG2A между TIL и клетками селезенки и лимфатических узлов, поскольку лишь 5,1% Т-клеток в опухоли экспрессировали NKG2A, и лишь 3,6% Т-клеток являлись двойными положительными по NKG2A и PD-1.
Пример 3 - экспрессия NKG2A и PD-1 у мышей с опухолями.
3
Для дальнейшего изучения экспрессии NKG2A и PD-1 у мышей с опухолями мышам C57/BL6 имплантировали (п/к) различные опухолевые клетки линий RMA-Rae1, МС38 или RMA. Для оценки влияния объема опухоли мышей умерщвляли по достижении опухолями объема 500, 2000 и 800 мм, соответственно.
Результаты показаны на фигурах 3А и 3В для опухолей RMA Rae1 (верхняя строка), МС38 (средняя строка) и RMA (нижняя строка). NK-клетки (фигура 3А) и CD8 Т-клетки (фигура 3В) селезенки, дренирующих опухоль лимфатических узлов (ЛУ) и опухоли анализировали проточной цитометрией на предмет экспрессии NKG2A и PD-1. Показана одна из 2-4 типичных мышей.
3
В субпопуляции NK-клеток клетки в опухоли, лимфатических узлах и селезенке были приблизительно наполовину NKG2A-положительными и наполовину NKG2A-отрицательными. NK-клетки (независимо от экспрессии ими NKG2A) из дренирующих лимфатических узлов или селезенки не демонстрировали значимой экспрессии PD1. Однако NK-клетки, проникающие в опухоли RMA-Rae1 и RMA, экспрессировали NKG2A и PD1 на значимых уровнях. NK клетки, проникающие в опухоль линии МС38 у мышей, умерщвленных при особенно большом объеме опухоли (2000 мм), экспрессировали NKG2A (50%), но не экспрессировали PD1 в значимой степени (3%).
В отличие от NK-клеток, приблизительно половина популяции которых экспрессировала NKG2A, CD8 Т-клетки селезенки и лимфатических узлов обвчно не экспрессировали ни NKG2A, ни PD1. Однако в опухолях значительная доля CD8 Т-клеток экспрессировала NKG2A и PD1 (28% в RMA-Rae1, 43% в МС38 и 40% в RMA являлись дважды положительными). Эти результаты повторно указывают, что CD8 Т-клетки, проникающие в опухоли, так же как и NK-клетки, могут быть ограничены как ингибиторным рецептором NKG2A, так и PD1 в опухолях различного типа.
Пример 4 - лечение мышей мАт против PD-1 увеличивает частоту CD8 Т-клеток, экспрессирующих NKG2A, в опухолях
Для оценки воздействия лечения антителом против PD-1 на CD8 Т-клетки мышей с опухолями МС38 обрабатывали с использованием 200 мкг изотипического контрольного (IC) IgG2a крысы или нейтрализующего моноклонального антитела против PD-1 мыши на 11, 14 и 17 сутки после имплантации клеток. Мышей (n=3/группу) умерщвляли на 31 сутки, характеристики CD8 Т-клеток из селезенки, дренирующих опухоль лимфатических узлов (ЛУ) и опухоли исследовали с помощью проточной цитометрии. Представлены средние значения +/-SD (n=3) доли CD8 NKG2A+ среди CD8 Т-клеток. Р<0,005 (***), Р<0.0005 (****), статистический анализ выполняли с использованием двухфакторного дисперсионного анализа, а затем - критерия множественных сравнений Тьюки.
Результаты показаны на Фигуре 4. Аналогично результатам, наблюдавшимся в других экспериментах, CD8 Т-клетки из селезенки и лимфатических узлов не экспрессировали NKG2A в значимой степени. Введение антитела против PD1 не вызвало изменений уровня экспрессии NKG2A в Т-клетках из селезенки или лимфатических узлов. Однако в популяции CD8 Т-клеток, проникающих в опухоли, введение антитела против PD1 вызвало более чем 50% увеличение NKG2A-экспрессирующих CD8 Т-клеток. Эти результаты показывают, что после лечения антителом против PD1 рецептор NKG2A может вносить повышенный вклад в ингибирование CD8 Т-клеточного ответа на опухоли in vivo. Поэтому нейтрализацию NKG2A можно использовать для купирования ингибирования NKG2A-ограниченных Т-клеток у индивидов, получавших агент, нейтрализующий путь PD-1, например, антитело против PD1 или PDL1.
Пример 5 - комбинированная блокада с использованием антитела против NKG2A/антитела против PD1 ингибирует опухолевый рост
Для оценки эффекта комбинированного лечения нейтрализующим антителом против PD1 и нейтрализующим антителом против NKG2A мышам C57BL/6 имплантировали (п/к) опухолевые клетки RMA-S Qa-1 Qdm B2m и вводили нейтрализующий антагонист PD1 (нейтрализующее антитело против PD-L1) и нейтрализующее антитело против NKG2A.
3
3
Вкратце, мышей C57BL/6 рандомизировали на 11 сутки по достижении опухолями RMA-S Qa-1 Qdm B2m объема приблизительно 85 мм (n=8 мышей/группу) и лечили изотипическим контрольным антителом, мАт против NKG2A мыши (200 мкг, в/в), мАт против PD-L1 мыши (200 мкг, в/б) или комбинацией антител против mNKG2A/mPDL-1 на 11, 14 и 18 сутки. Объем опухоли измеряли два раза в неделю с помощью штангенциркуля. Животных умерщвляли при достижении опухолями значительного размера (объем >2000 мм), изъязвлении или некрозе опухоли. Данные представляют собой медианный объем опухоли в зависимости от эксперимента.
Рост медианного объема опухоли со временем показан на фигуре 5. В то время как антитело против NKG2A обеспечивало лишь скромный противоопухолевый эффект по сравнению с изотипическим контролем в данной модели, а антитело против PD-L1 обеспечивало существенный противоопухолевый эффект, однако объем опухоли рос до 28 суток, комбинированное лечение с использованием антитела против NKG2A и антитела против PD-L1 полностью прекращало опухолевый рост, и на 28 сутки значимого роста объема опухоли не наблюдали.
Все источники, включая публикации, патентные заявки и патенты, приведенные в настоящем документе, полностью включены в настоящий документ посредством ссылок в той же степени, как если каждый источник был отдельно и конкретно указан для включения посредством ссылки и был изложен в полном объеме в настоящем документе (в максимальной степени, разрешенной законом), независимо от любого отдельно взятого включения в настоящий документ конкретных документов, независимо от места их подготовки.
Термины, относящиеся к единственному числу, и аналогичные термины, используемые в контексте описания настоящего изобретения, должны толковаться как охватывающие как единственное, так и множественное число, если в настоящем документе не указано иное, или если это не противоречит контексту явным образом.
Если не указано иное, все точные значения, представленные в настоящем документе, являются типичными примерами соответствующих приближенных значений (например, все точные типичные значения конкретного фактора или измерения можно считать также относящимися к соответствующему приблизительному измерению при добавлении слова «приблизительно» в соответствующих случаях). Там, где термин «приблизительно» используется в связи с численным значением, можно указать, что этот термин включает значения, соответствующие ±10% от указанного числа.
Приведенное в настоящем документе описание любого аспекта или варианта реализации настоящего изобретения с использованием таких терминов, как «содержащий», «обладающий», «включающий» по отношению к элементу или элементом, предназначено для подтверждения подобного аспекта или варианта реализации изобретения, который «состоит из», «главным образом состоит из» или «главным образом содержит» данный конкретный элемент или элементы, если не указано иное или иное не противоречит контексту явным образом (например, если в настоящем документе описано, что композиция содержит определенный элемент, следует понимать, что это также относится к композиции, состоящей из этого элемента, если не указано иное или иное не противоречит контексту явным образом).
Использование всевозможных примеров или типичных выражений (например, выражения «такой как») в настоящем документе предназначено только для лучшего освещения изобретения и не накладывает ограничений на область изобретения, если в формуле изобретения не указано иное. Ни одно выражение в описании не следует рассматривать в качестве обозначения элемента, не предусмотренного формулой изобретения и необходимого для осуществления изобретения.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  INNATE PHARMA
<120>  НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ ИНГИБИТОРНЫХ ПУТЕЙ В ЛИМФОЦИТАХ
<130>  NKG2A-PD1
<150>  US 62/050 948
<151>  16.09.2014
<150>  US 62/083 929
<151>  25.11.2014
<150>  US 62/093 141
<151>  17.12.2014
<160>  15
<170>  Версия PatentIn 3.5
<210>  1
<211>  233
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Asp Asn Gln Gly Val Ile Tyr Ser Asp Leu Asn Leu Pro Pro Asn
1               5                   10                  15
Pro Lys Arg Gln Gln Arg Lys Pro Lys Gly Asn Lys Ser Ser Ile Leu
20                  25                  30
Ala Thr Glu Gln Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Leu Gln Lys Ala
35                  40                  45
Ser Gln Asp Phe Gln Gly Asn Asp Lys Thr Tyr His Cys Lys Asp Leu
50                  55                  60
Pro Ser Ala Pro Glu Lys Leu Ile Val Gly Ile Leu Gly Ile Ile Cys
65                  70                  75                  80
Leu Ile Leu Met Ala Ser Val Val Thr Ile Val Val Ile Pro Ser Thr
85                  90                  95
Leu Ile Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys
100                 105                 110
Ala Arg His Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn
115                 120                 125
Ser Cys Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu
130                 135                 140
Leu Ala Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu
145                 150                 155                 160
Glu Glu Met Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly
165                 170                 175
Val Phe Arg Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu
180                 185                 190
Ala Phe Lys His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys
195                 200                 205
Ala Val Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser
210                 215                 220
Ile Ile Tyr His Cys Lys His Lys Leu
225                 230
<210>  2
<211>  288
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1               5                   10                  15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20                  25                  30
Asn Pro Pro Thr Phe Phe Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35                  40                  45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50                  55                  60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65                  70                  75                  80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85                  90                  95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100                 105                 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115                 120                 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130                 135                 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145                 150                 155                 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165                 170                 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180                 185                 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195                 200                 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210                 215                 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225                 230                 235                 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245                 250                 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260                 265                 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275                 280                 285
<210>  3
<211>  290
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  3
Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu
1               5                   10                  15
Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr
20                  25                  30
Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu
35                  40                  45
Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile
50                  55                  60
Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser
65                  70                  75                  80
Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn
85                  90                  95
Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr
100                 105                 110
Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val
115                 120                 125
Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val
130                 135                 140
Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser
165                 170                 175
Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn
180                 185                 190
Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr
195                 200                 205
Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu
210                 215                 220
Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His
225                 230                 235                 240
Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr
245                 250                 255
Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys
260                 265                 270
Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu
275                 280                 285
Glu Thr
290
<210>  4
<211>  452
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химерная последовательность человек/мышь
<400>  4
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe
50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115                 120                 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130                 135                 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165                 170                 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180                 185                 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
195                 200                 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210                 215                 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260                 265                 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435                 440                 445
Ser Leu Gly Lys
450
<210>  5
<211>  452
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химерная последовательность человек/мышь
<400>  5
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115                 120                 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130                 135                 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165                 170                 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180                 185                 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
195                 200                 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210                 215                 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260                 265                 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435                 440                 445
Ser Leu Gly Lys
450
<210>  6
<211>  452
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химерная последовательность человек/мышь
<400>  6
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe
50                  55                  60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115                 120                 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130                 135                 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165                 170                 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180                 185                 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
195                 200                 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210                 215                 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260                 265                 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435                 440                 445
Ser Leu Gly Lys
450
<210>  7
<211>  452
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химерная последовательность человек/мышь
<400>  7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Glu Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Thr Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115                 120                 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130                 135                 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165                 170                 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180                 185                 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
195                 200                 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210                 215                 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260                 265                 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435                 440                 445
Ser Leu Gly Lys
450
<210>  8
<211>  452
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химерная последовательность человек/мышь
<400>  8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe
50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115                 120                 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130                 135                 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165                 170                 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180                 185                 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
195                 200                 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210                 215                 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225                 230                 235                 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245                 250                 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260                 265                 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275                 280                 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290                 295                 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305                 310                 315                 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325                 330                 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340                 345                 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355                 360                 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370                 375                 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385                 390                 395                 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
405                 410                 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420                 425                 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435                 440                 445
Ser Leu Gly Lys
450
<210>  9
<211>  214
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химерная последовательность человек/мышь
<400>  9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>  10
<211>  119
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химерная последовательность человек/мышь
<400>  10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50                  55                  60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Thr Arg His Gly Asp Tyr Pro Arg Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  11
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  Химерная последовательность человек/мышь
<400>  11
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20                  25                  30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35                  40                  45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65                  70                  75                  80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Tyr Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100                 105
<210>  12
<211>  432
<212>  БЕЛОК
<213>  homo sapiens
<400>  12
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Trp Gln Pro Gly Arg Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser Gly
20                  25                  30
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
35                  40                  45
Val Arg Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50                  55                  60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe Leu
65                  70                  75                  80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100                 105                 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
115                 120                 125
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Asp Tyr Phe
130                 135                 140
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
145                 150                 155                 160
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
165                 170                 175
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Thr Tyr Thr
180                 185                 190
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Arg Val Glu
195                 200                 205
Ser Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
210                 215                 220
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
225                 230                 235                 240
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Trp Val Asp Val Ser Gln Glu
245                 250                 255
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Tyr Asp Gly Val Glu Val His
260                 265                 270
Asn Ala Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val
275                 280                 285
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
290                 295                 300
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys
305                 310                 315                 320
Thr Ile Ser Lys Ala Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
325                 330                 335
Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
340                 345                 350
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
355                 360                 365
Asn Gly Gln Pro Glu Lys Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
370                 375                 380
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
385                 390                 395                 400
Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
405                 410                 415
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
420                 425                 430
<210>  13
<211>  207
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  13
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser
100                 105                 110
Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Ser Gly Thr Ala Ser
115                 120                 125
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Val Gln Trp
130                 135                 140
Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr
145                 150                 155                 160
Glu Gln Asp Ser Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Leu Ser
165                 170                 175
Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His
180                 185                 190
Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
195                 200                 205
<210>  14
<211>  117
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20                  25                  30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100                 105                 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  15
<211>  107
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20                  25                  30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35                  40                  45
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65                  70                  75                  80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100                 105
<---