Особенности конъюгативного переноса плазмиды pSa между Escherichia coli и Francisella tularensis

УДК 616.9

А.Н.Мокриевич, Н.А.Шишкова, И.А.Дятлов, В.М.Павлов

ОСОБЕННОСТИ КОНЪЮГАТИВНОГО ПЕРЕНОСА ПЛАЗМИДЫ PSA МЕЖДУ ESCHERICHIA COLI И FRANCISELLA TULARENSIS

ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», Оболенск,

Российская Федерация

В процессе конъюгативного переноса плазмиды pSa из штамма E. coli C600(pSa) в штамм F tularensis subsp. holarctica 15 происходит ее модификация. Модифицированная форма плазмиды pSa (pSa') обладает повышенной способностью к прямому и обратному переносу между бактериями E. coli и F. tularensis (частота 5-10~4 и Ы04 на реципиентную клетку, соответственно) и реплицируется в туляремийном микробе. Внутривидовой перенос плазмиды pSa' между штаммами F. tularensis происходит с крайне низкой частотой (2-10~10 на реципиентную клетку). Плазмида pSa' в бактерии E. coli C600 образует несколько топологических форм с разной электрофоретической подвижностью, а в туляремийном микробе эта плазмида, по данным электрофореза, имеет только одну форму. При переносе плазмиды из клеток E. coli в клетки F. tularensis каждый индивидуальный клон туляремийного микроба содержит плазмиду, отличающуюся по электрофоретической подвижности от подвижности плазмид из других клонов.

Ключевые слова: Francisella tularensis, конъюгация, модификация плазмиды pSa, Escherichia coli.

A.N.Mokrievich, N.A.Shishkova, I.A.Dyatlov, V.M.Pavlov

Peculiarities of the Conjugative pSa Plasmid Transfer from Escherichia Coli Into Francisella Tularensis

State Research Center of Applied Microbiology and Biotechnology, Obolensk, Russian Federation

The conditions of conjugative transfer of pSa plasmid from E. coli to F. tularensis have been investigated. It has been shown that pSa plasmid is modified under the process of its transfer from E. coli C600(pSa) strain into F. tularensis subsp. holarctica strain 15. Modified variant of pSa plasmid (pSa') has an enhanced capacity to direct and inverted transfer between E. coli and F. tularensis (the frequency is 5-10-4 and M0-4 per a recipient cell, respectively) and replicates in tularemia microbe. Intraspecific transfer of the pSa' plasmid between F. tularensis strains occurs at an extremely slow rate (2-10-10 per a recipient cell). pSa' plasmid molds several topological shapes with variable electrophoretic mobility in E. coli C600, while in tularemia microbe, this plasmid has only one shape. After the transfer of the plasmid from E. coli cells into F. tularensis cells each individual clone of tularemia microbe possesses a plasmid which differs in its electrophoretic mobility from plasmids of other clones.

Key words: Francisella tularensis, conjugation, pSa plasmid modification, Escherichia coli.

Конъюгативная плазмида pSa, относящаяся к группе несовместимости IncW, впервые была выделена в Японии из клинических изолятов шигелл [8]. Размер плазмиды, в зависимости от источника выделения, варьирует от 35 до 37 т.п.о. [5]. Плазмида pSa может поддерживаться в широком круге бактерий (Agrobacterium tumerfaciens [4], Pseudomonas mallei и Pseudomonas pseudomallei [1], Brucella abortus [7]), куда она передавалась в результате межродового скрещивания. Впервые возможность переноса плазмиды pSa из клеток E. coli в клетки F. tularensis была показана А.П. Померанцевым и соавт. в 1991 г. [3], и этими авторами было сделано предположение о необходимости дополнительных генетических элементов (плунжерной плазмиды) для осуществления такого переноса.

В настоящей работе продолжено изучение условий конъюгативного переноса плазмиды pSa из

E. coli в F. tularensis и свойств плазмид, выделенных из трансконъюгантов F. tularensis. Показано, что в процессе конъюгации плазмида pSa' претерпевает изменения, приводящие к появлению способности автономно реплицироваться в клетках туляремийно-го микроба. Эффективность переноса плазмиды pSa' в клетки F. tularensis различных форм (SR и R) практически одинакова.

В работе были использованы штаммы E. coli:

С600, C600(pSa) и штаммы Е tularensis: 15, 15R, 15Sm(pK194), полученные из «ГКПМ-Оболенск».

Конъюгативный перенос плазмид из клеток

Е. соИ в штаммы Е tularensis. Культуры штаммов

Е. соН C600(pSa) и Е. соН C600(pSa') выращивались на среде LA с хлорамфениколом (10 мкг/мл) при температуре 37 °С в течение 18 ч. Культуры штаммов Е tularensis выращивались на среде ТА (3,8 % эритрит-агара, 1 % высушенной крови крупного рогатого скота, 1 % глюкозы, 0,05 % цистеина, 0,0025 % тиамина хлорида, pH 7,2) с полимиксином Б (100 мкг/мл) при температуре 37 °С в течение 18 ч. Клетки донора и реципиента суспендировали в забу-ференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,4, смешивали по 50 мкл каждой суспензии (с концентрацией 2-109 КОЕ мл1 для Е. соМ и 1Т011 КОЕ мл4 для Е tularensis) и наносили пятном на подсушенную поверхность среды LA. Скрещивание проводили при температуре 25 °С в течение 18 ч. После инкубации агаровую культуру суспендировали в ЗФР и высевали на селективный агар.

Конъюгативный перенос плазмиды pSa' из клеток Е tularensis в клетки Е. соИ. Культура Е Ш1агеп-sis 15(pSa') выращивалась на среде ТА с полимиксином Б и хлорамфениколом при температуре 37 °С в течение 18 ч. Культура Е. соИ С600 выращивалась на среде LA при температуре 37 °С в течение 18 ч.

so

Клетки донора и реципиента суспендировали в ЗФP (с концентрацией для F. tularensis 1TO11 КОЕ мл1 и для E. coli 2-1O9 КОЕ мл4). Для скрещивания смешивали по SO мкл суспензий донора и реципиента и наносили пятном на подсушенную поверхность среды LA. Скрещивание проводили при температуре 37 °C в течение 6 ч. После инкубации агаровую культуру суспендировали в ЗФP и высевали на селективный агар.

Конъюгативный перенос плазмиды pSa' между клетками F. tularensis. Культура F. tularensis 1S(pSa') выращивалась на среде TA с полимикси-ном Б и хлорамфениколом при температуре 37 °C в течение 18 ч. Культура F. tularensis 1SSm(pK194) выращивалась на среде TA с добавлением канами-цина (4O мкг/мл) и стрептомицина (1OO мкг/мл) при температуре 37 °C в течение 18 ч. Cyспензии клеток донора и реципиента в ЗФP с концентрацией MOW КОЕ мл-1 и 1TO11 КОЕ мл-1, соответственно, смешивали по SO мкл и наносили пятном на поверхность среды LA. Скрещивание проводили при температуре 37 °C в течение 18 ч. После инкубации агаровую культуру суспендировали в ЗФP и высевали на селективный агар.

Выделение плазмидной ДНК из E. coli, гидролиз ДНК рестриктазами, электрофорез в агарозном геле и трансформацию плазмид в E. coli проводили по руководству [2]. Выделение плазмидной ДНК из F. tularensis и электропорацию плазмидных ДНК в

F. tularensis выполняли по [6].

Эксперименты на лабораторных животных. В работе использовали беспородных белых мышей. Мышам (по S в группе, самцы и самки, возраст 6-8 недель, массой 18-2O г) вводили подкожно бактериальную суспензию в дозе 1-1O2 КОЕ на животное. На 6-й день проводили эвтаназию, забирали селезенки, суспендировали в S мл ЗФP и полученную суспензию, а также ее Ю-кратные разведения высевали на среду TA.

Статистическую обработку данных проводили по критерию Стьюдента, доверительный интервал устанавливали при вероятности 9S %.

В результате скрещивания клеток E. coli C6OO(pSa) и F. tularensis 1S на селективной среде через 72 ч появились единичные хлорамфениколустой-чивые колонии F. tularensis. Их количество возрастало до восьмого дня наблюдения и достигло порядка 1OOO. При пересеве 1OO произвольно выбранных колоний все они росли на среде с хлорамфениколом. Скрининг плазмидной ДНК из 14 трансконъюгантных клонов, отобранных в разные сроки появления, показал наличие плазмидных полос выше области хромосомной ДНК во всех образцах. Частота межродового переноса плазмиды pSa в клетки F. tularensis составляла порядка 1-1O-7 на одну клетку реципиента. Каждый проанализированный клон содержал по одной плазмиде. Электрофоретическая подвижность в агарозном геле этих плазмид была различной.

Pестрикционный анализ ДНК плазмид с помощью рестриктаз (BamHI, BglII, EcoRI, KpnI, PstI,

SspII) не выявил отличий в количестве и размере получаемых фрагментов. В частности, один из BglII-фрагментов этих плазмид совпадал по размерам с BglII-фрагментом плазмиды pSa, содержащим область репликации.

Плазмидная ДНК из одного произвольно выбранного клона F. tularensis была названа pSa', и клон, содержащий плазмиду pSa', маркированный как F. tularensis 1S(pSa'), использовался в дальнейших экспериментах.

При скрещивании клеток F. tularensis 1S(pSa') и

E. coli C6OO с частотой 1-1O~4 на реципиентную клетку появлялись колонии E. coli, устойчивые к хлорамфе-николу. Скрининг плазмидной ДНК из полученных трансконъюгантных колоний E. coli показал наличие плазмидной ДНК в проверенных клонах. В каждом проанализированном клоне E. coli C6OO(pSa') плаз-мидная ДНК находилась в нескольких топологически различных формах, отличающихся электрофоретической подвижностью. Данное явление не наблюдалось при конъюгативном переносе плазмиды pSa между различными штаммами E. coli.

Плазмида pSa', в отличие от плазмиды pSa, приобрела способность не только реплицироваться в клетках F. tularensis, но и трансформировать туля-ремийный микроб. При электропорации 1 мкг ДНК плазмиды pSa', выделенной из штамма F. tularensis 1S(pSa'), в клетки F. tularensis 1S было получено 136O трансформантов. В случае же электропорации бактерий плазмидой pSa не было получено ни одного трансформанта. Как и в случае межродового скрещивания, каждый образец плазмидной ДНК pSa' из трансформационных клонов имел по одной плазмид-ной полосе, отличающихся между собой по электрофоретической подвижности.

Частота конъюгативного переноса плазмиды pSa' из E. coli C6OO(pSa') в F. tularensis 1S составляла S-1O-4 на клетку реципиента, что существенно выше частоты переноса плазмиды pSa. При использовании в качестве реципиента бактерии F. tularensis 1SR, имеющей клеточную стенку с редуцированным ЛПС, частота переноса плазмиды pSa' составляла около 8-1O-4 на реципиентную клетку, что незначительно отличается от данных для штамма F. tularensis 1S, имеющего SR-тип колоний.

Эффективность конъюгативного переноса плазмиды pSa' из клеток E. coli C6OO(pSa') в клетки

F. tularensis 1S, а также обратный перенос из клеток

F. tularensis 1S(pSa') в клетки E. coli C6OO зависит от состава среды, на которой происходит скрещивание, и температуры инкубации конъюгационной смеси. Перенос плазмиды pSa' из клеток E. coli C6OO(pSa') в клетки F. tularensis 1S наблюдался нами только при температуре 2S °C, но не при 37 °C. Среда LA является более предпочтительной при прямом переносе, чем среда TA. Обратный перенос плазмиды pSa' из клеток F. tularensis в клетки E. coli происходит с большей частотой также на среде LA. Температура обратного скрещивания (37 °C) более оптимальна, чем 2S °C.

Конъюгативный перенос плазмиды pSa' между клетками Е tularensis происходил с частотой 2-1040. Данная величина существенно ниже, чем частота переноса плазмиды pSa' из Е tularensis в Е. соИ. При пассировании штамма Е. tularensis 15(pSa') через беспородных белых мышей было показано, что величина обсемененности селезенок не отличалась от исходного штамма Е tularensis 15 и составляла около 1-105 КОЕ на орган, однако выделяемая культура Е tularensis была чувствительна к хлорамфениколу и ее клетки, по данным электрофореза, не содержали плазмидную ДНК.

Проведенные эксперименты показали, что плазмида pSa модифицируется при первичном переходе в клетки туляремийного микроба, приобретая способность реплицироваться в этих клетках. Полученные результаты не подтверждают предположение, сделанное в работе А.П.Померанцева и соавт. [3] о необходимости дополнительных генетических элементов (плунжерной плазмиды) для межродового переноса плазмиды pSa в клетки Е tularensis. Исходя из того, что частота повторного переноса плазмиды pSa' в клетки туляремийного микроба возрастает на три порядка, по сравнению с первоначальной частотой переноса плазмиды pSa, можно сделать предположение, что модификация плазмиды происходит с частотой около 10-3, и данный процесс осуществляется в клетках Е Ш1аг-ensis. В пользу этого свидетельствует то, что при первичном конъюгативном переносе плазмиды pSa на селективных чашках колонии конъюгантов Е и1агеп-sis появляются начиная с 72 ч инкубации, и затем их количество увеличивается вплоть до 192 ч инкубации, а при переносе модифицированной плазмиды pSa' из клеток Е. соИ в клетки Е tularensis практически все колонии трансконъюгантов вырастают через 72 ч.

На эффективность конъюгативного переноса плазмиды pSa' из клеток Е. соИ в клетки туляремий-ного микроба практически не влияет тип культуры Е tularensis (SR или R).

Особенностью препаратов плазмиды pSa', выделенных из изолированных колоний трансконъюган-тов Е tularensis, является их различная электрофоретическая подвижность в агарозном геле, что может быть объяснено разным количеством супервитков в кольцевой молекуле ДНК, возможно, являющихся следствием встраивания в плазмиду коротких АТ-богатых фрагментов ДНК из хромосомы туляре-мийного микроба. При попадании такой плазмиды в клетку Е. соН, возможно, происходят внутримолекулярные рекомбинации в этих плазмидах, приводящие к появлению целого спектра относительно устойчивых форм плазмиды. Такие плазмиды практически не отличаются по размерам, но обладают разной степенью суперспирализации и, соответственно, различной электрофоретической подвижностью.

Плазмида pSa' при попадании в клетки туляре-мийного микроба вызывает изменения их микробиологических и биологических свойств. Штамм Е Ш1а-rensis 15(pSa') крайне нестабилен при пассировании через белых мышей, и в процессе размножения ис-

ходная популяция клеток замещается бесплазмидны-ми сегрегантами.

Благодаря высокой пластичности плазмиды pSa модификация репликативной машины этой плазмиды в клетках туляремийного микроба происходит с довольно высокой частотой. Интересно отметить, что оперон tra плазиды pSa функционально активен в клетках туляремийного микроба

Проведенные эксперименты по успешному переносу плазмиды pSa в туляремийный микроб позволяют сделать предположение о том, что подобные процессы могут происходить и с другими конъюга-тивными плазмидами, тем самым ускоряя эволюцию возбудителя туляремии и его адаптацию к меняющейся среде обитания.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абаев И.В., Асташкин Е.И., Пачкунов Д.М., Стагис И.И., Шитов В.Т., Светоч Э.А. Pseudomonas mallei и Pseudomonas pseudomallei: введение и поддержание природных и рекомбинантных плазмидных репликонов. Мол. генет., микробиол. и ви-русол. 1995; 1:28-36.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир; 1984. 479 с.

3. Померанцев А.П., Домарадский И.В., Шишкова Н.А. Гибридная плазмида pSKFT5 обеспечивает перенос плазмиды Sa из клеток Esherichia coli в клетки вакцинного штамма туля-

емийного микроба. Мол. генет. микробиол. и вирусол. 1991; 8: 3-6.

4. FarrandS.K., Kado C.I., Ireland C.R. Supression of tumore-genicity by the IncW R plasmid pSa in Agrobacterium tumefaciens. Mol. Gen. Genet. 1981; 181(1):44-51.

5. Ireland C.R. Detailed restriction enzyme map of crown gall-supressive IncW plasmid pSa, showing ends of deletion causing chloramphenicol sensitivity. J. Bacteriol. 1983; 155:722-7.

6. Pavlov V.M., Mokrievich A.N., Volkovoy K. Cryptic plasmid pFNL10 from Francisella novicida-like 6168: The base of plasmid vectors for Francisella tularensis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996; 13:253-6.

7. Rigby C.E., Fraser A.D. Plasmid transfer and plasmid-mediated genetic exchange in Brucella abortus. Can. J. Vet. Res. 1989; 53(3):326-30.

8. Watanabe T., Furuse C., Sakaizumi S. Transduction of various R factors by phage P1 in Escherichia coli and by phage P22 in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 1968, 96:1791-5.

References

1. Abaev I.V., Astashkin E.I., Pachkunov D.M., Stagis I.I., Shitov V.T., Svetoch E.A. [Pseudomonas mallei and Pseudomonas pseudomallei: introduction and maintenance of natural and recombinant plasmid replicons]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 1995; 1:28-36.

2. Maniatis T., Frich E., Sembruk G. [Methods of Gene-Engineering. Molecular Cloning]. M.: Mir; 1984. 479 p.

3. Pomerantsev A.P., Domaradsly I.V., Shishkova N.A. [Hybrid pSKFT5 plasmid provides for Sa plasmid transfer from Escherichia coli cells into the vaccine strain of tularemia microbe]. Mol. Genet. Mikrobiol. Virusol. 1991, 8:13-6.

4. Farrand S.K., Kado C.I., Ireland C.R. Supression of tumoregenicity by the IncW R plasmid pSa in Agrobacterium tumefaciens. Mol. Gen. Genet. 1981; 181(1):44-51.

5. Ireland C.R. Detailed restriction enzyme map of crown gall-supres-sive IncW plasmid pSa, showing ends of deletion causing chloramphenicol sensitivity. J. Bacteriol. 1983; 155:722-7.

6. Pavlov V.M., MokrievichA.N., Volkovoy K. Cryptic plasmid pFNL10 from Francisella novicida-like 6168: The base of plasmid vectors for Francisella tularensis. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996; 13:253-6.

7. Rigby C.E., Fraser A.D. Plasmid transfer and plasmid-mediated genetic exchange in Brucella abortus. Can. J. Vet. Res. 1989; 53(3):326-30.

8. Watanabe T., Furuse C., Sakaizumi S. Transduction of various R factors by phage P1 in Escherichia coli and by phage P22 in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 1968, 96:1791-5.

Authors:

Mokrievich A.N., Shishkova N.A., Dyatlov I.A., Pavlov V.M. State Research Center for Applied Microbiology and Biotechnology. Obolensk, Moscow Region, 142279, Russian Federation. E-mail: info@obolensk.org

Об авторах:

Мокриевич А.Н., Шишкова Н.А., Дятлов И.А., Павлов В.М. Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. Российская Федерация, 142279, Московская обл., п. Оболенск. E-mail: info@obolensk.org

Поступила 02.10.12.