Разработка метода флюоресцентного определения 5-фторурацила в крови больных со злокачественными новообразованиями in vitro

XXI РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ТЕЗИСЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

Цель. Изучение сорбционной емкости и десорбции микрочастиц железоуглеродных сорбентов, полученных плазмохи-мическим методом (I) и методом температурного пиролиза активированного угля в присутствии солей железа (II), к рубо-мицину с целью оценки возможности их использования в качестве магнитоуправляемых переносчиков для адресной доставки рубомицина.

Материалы и методы. Сорбент (I) представляет собой нано-структурированный железоуглеродный композит состава: 44% Fe, 56% С с размером частиц в растворе 1—2 мкм. Сорбент (II) представляет железоуглеродный композит, ядром которого согласно данным рентгенофазового анализа является железо в форме магнетита (Fe3O4). Размер частиц железоу-глеродного сорбента (II) в растворе, определенный методом динамического светорассеяния, составляет 0,5—0,6 мкм. Для предотвращения агрегации частиц в растворе и получения однородной суспензии порошки сорбентов (1% суспензия в дистиллированной воде) были озвучены на УЗ-диспергаторе при частоте излучения 22 kHz и температуре 2—40С. Поверхность частиц была модифицирована желатином. Сорбционная емкость магнитных микрочастиц к рубомицину была оценена спектрофотометрически путем определения оптической плотности супернатанта при 480 нм после 1,5 час. инкубации суспензии частиц с рубомицином при весовом соотношении сорбент/рубомицин: 10/1. Исследование динамики десорбции рубомицина проводилась путем инкубации магнитных частиц с иммобилизованным рубомицином в модельной биологической жидкости (0,6% альбумин в физиологическом растворе) при 370C, рН 7.4 с периодическим взятием проб для определения оптической плотности супернатанта для оценки количества десорбированного рубомицина.

Результаты. Рассчитанные значения сорбционной емкости для микрочастиц к рубомицину составили: 60,0 мг/г и 48,0 мг/г для железоуглеродных сорбентов I и II, соответственно и 35,5 мг/г для этих сорбентов с модифицированной желатином поверхностью. Общее количество десорбированного рубомицина после 4-х час. инкубации составило: 65,5% и 70,0% для сорбентов I II, соответственно. После четырех часов инкубации скорость десорбции снижалась и кривая выходила на плато. Для микрочастиц, модифицированных желатином, скорость десорбции уменьшилась в 3,5 раза. Исходя из терапевтической дозы рубомицина, определенной нами для мышей с карциномой Льюисс, равной порядка 4 мг/кг массы тела, была проведена оценка количества магнитных частиц с иммобилизованным рубомицином, необходимого для интратуморального введения животным с учетом значений сорбции и десорбции рубомицина. Это значение, рассчитанное на мышь весом 20—22 г, равно 2 мг, т. е. для достижения терапевтического эффекта необходимо ввести 0,2 мл 1% суспензии магнитных частиц с иммобилизованным рубомицином.

Заключение. Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о возможности использования микрочастиц железоуглеродных сорбентов в качестве магнитоуправляе-мых переносчиков для адресной доставки рубомицина.

Разработка метода функциональной микроволновой термографии: предклинические исследования

С.В. Зиновьев'

Место работы: 'ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» МЗ РФ e-mail: svz32'@mail.ru

Необходимо практическое применение методов контроля развития злокачественных новообразований имеющих

«характерные времена» такие же, как и характерные времена взаимодействия новообразования и терапевтического фактора (лекарственного препарата, лучевых методов терапии, термических воздействий и т. п.) при их введении в организм больного — т. е. секунды, минуты и десятки минут. Злокачественная опухоль представляет собой сложное динамическое морфо-физиологическое образование, прогноз развития которого можно сделать только основываясь на анализе изменений в ней, как целостной структуре. Одним из таких информативных системных изменений является изменение теплового баланса в зоне опухолевого роста (соотношение процессов термопродукции и термодиссипации), выявляемого путем локальной регистрации электромагнитного микроволнового широкополосного излучения на основе принципов контактной радиотермометрии. Кон-структорско-инженерно-технические решения, выполненные фирмой РЭС, позволили разработать на базе НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухоли ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» МЗ России новый медицинский метод-метод функциональной микроволновой термографии (метод ФМТ), который в данное время находится на стадии предкли-нических испытаний и патентной регистрации. Метод основан на комплексных радиофизических измерениях биологических объектов и анализе результатов этих измерений математическим аппаратом нелинейной динамики. Технические особенности регистрации сигнала открывают возможности получения новой информации о процессах метаболизма, кровоснабжения (микроциркуляции) и клеточной кинетики злокачественных новообразований. Рассмотрены теоретические предпосылки методологии анализа первичных данных (получаемых в виде нестационарных временных рядов определенной длительности) с применением математического аппарата нелинейной динамики. Определены оптимальные режимы регистрации интенсивности теплового излучения внутренних тканей лабораторных животных в микроволновом диапазоне длин волн. Приводятся примеры использования данного метода в условиях применения различных терапевтических агентов в предклинических исследованиях: химиотерапевтических препаратов, фотодинамической терапии, сонодинамической терапии в комбинации с термочувствительными нанокомплексами. Внедрение метода ФМТ может существенно облегчить поиск оптимальных параметров применения лекарственных препаратов и физических факторов в экспериментальных исследованиях и клинической практике.

Разработка метода флюоресцентного определения 5-фторурацила в крови больных со злокачественными новообразованиями in vitro

А. В. Султанбаев', Д. Д.Сакаева', Р. Р.Каюмова2, С. С.Остахов 2

Место работы: 'ГБУЗ Республиканский клинический онкологический диспансер республики Башкортостан; 2Уфимский институт химии РАН e-mail: sovaa@rambler.ru

Взаимодействие фторурацила (FU) с триптофановой компонентой белков, влияющую на интенсивность флюорес-центсии (ФЛ) белков, открывает возможность определения наличия лекарственного препарата в биологических жидкостях, измерения его концентрации и, как следствие, получения различных фармакокинетических данных. Для оптимизации флюорецентного анализа была поставлена цель: разработать качественную и количественную мето-

Злокачественные опухоли

www.malignanttumours.org

Том / Vol. 7 № 3 S 1 /2017

Malignant Tumours

www.malignanttumours.org

XXI РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ КОНГРЕСС

ТЕЗИСЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ

дику определения 5-фторурацила в крови человека in vitro по тушению ее собственной ФЛ.

Материалы и методы. Скорректированные спектры ФЛ регистрировали на спектрофлуориметре «СМ-2203» в кварцевых кюветах (1=5 мм) при фотовозбуждении под углом 450. Фотовозбуждение крови проводили в полосу S2 «- S0 перехода аминокислоты на длине волны (Xex) 220 нм и записывали спектры ФЛ в интервале длин волн эмиссии (Xem) 300^400 нм. Забор венозной крови осуществлялся у больных с плоскоклеточным раком ротоглотки, раком шейки матки и толстой кишки из локтевой вены. На этапе разработки метода флюоресцентного анализа FU использовали кровь пациентов, разбавленную антикоагулянтом — раствором цитратом натрия в соотношении 1/1. Для достижения необходимой температуры крови с FU использовали термостат (Т=310 К или 37°С). Для исследования использовали препарат «5-Фторурацил». Результаты. С целью исключить влияние на интенсивность ФЛ крови гидрооксида натрия, содержащийся в лекарственном препарате «5-Фторурацил — Эбеве» в качестве вспомогательного вещества, перед исследованием был проведен контрольный опыт. Концентрацию NaOH в крови получили из расчета на 50 мг FU 14,7 мг. NaOH (при внутривенном введении 750 мг FU, концентрация NaOH в крови пациента составляет 1,2 х10-3 М). Оказалось, что щелочь не оказывает влияния на характер ФЛ крови и ее интенсивность. Аналогичные результаты были получены при добавлении цитрата натрия (антикоагулянт), в исходный образец крови, увеличивающего длительность хранения образцов. В данном случае тушение интенсивности ФЛ происходило и не отличалось от интенсивности тушения ФЛ крови при добавлении в нее воды того же объема, что связано с разбавлением растворов. Поэтому равное смешивание образцов крови с антикоагулянтом в процессе одного исследования (кинетики интенсивности ФЛ крови) не будет влиять на его результаты, так как одинаковое уменьшение интенсивности ФЛ крови будет наблюдаться во всех образцах. При добавлении FU к крови наблюдается уменьшение интенсивности ее ФЛ. Наличие тушения ФЛ крови 5-фторурацилом открывает возможность ФЛ контроля над его содержанием, что позволит персонально подбирать дозу противоопухолевого препарата для пациента. Степень тушения собственной флюоресценции крови зависит от концентрации FU. На основании этого нами были получены калибровочные зависимости интенсивности ФЛ крови от концентрации FU при комнатной температуре (Т=200С), и средней температуре тела онкобольных пациентов (Т=37°С).

Наличие зависимости взаимодействия белков крови с FU от температуры окружающей среды указывает на то, что данная реакция — эндотермичная.

С целью определения концентрации FU в крови пациентов были получены спектры ФЛ до и через 1 минуту после введения FU на примере трех пациентов.

Заключение. Разработана методика определения концентрации 5-фторурацила в крови «in vitro» методом тушения собственной люминесценции крови, обладающим высокой чувствительностью, с целью проведения фармакокинетиче-ских исследований при индивидуальном подборе доз противоопухолевого препарата.

Изучение экспрессии и роли PHF10 (BAF45a) в клеточном цикле

А. И. Хамидуллина, М.А. Ястребова, Е. В. Татарский, Н. В. Сошникова, В. В. Татарский

Место работы: 'ФГБОУ ВО МГУ им. М. В. Ломоносова, Москва; 2ФГБУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина Минздрава России, Москва; 3ФГБУН Институт биологии гена РАН, Москва e-mail: 94alvina@gmail.com

Комплексы SWI/SNF регулируют экспрессию генов за счет перемещения нуклеосом. Компоненты SWI/SNF комплексов подвергаются мутациям в 20% опухолей человека, что определяет свойства опухоли и чувствительность к химиотерапии. Компонент PBAF SWI/SNF комплекса PHF10 участвует в процессах дифференцировки, пролиферации и программируемой клеточной гибели, однако его функции мало изучены. Цель. изучить экспрессию и роль изоформ PHF10 в клеточном цикле, а также рассмотреть влияние белков-ингибиторов циклин-зависимых киназ (p27, p21) и белков про-пролифе-ративных клеточных каскадов на экспрессию и локализацию PHF10 в клетке.

Материалы и методы. Линии HCT116, SW620 (карциномы толстой кишки), ПФЧ (первичные фибробласты), HEK293 (эмбриональные клетки почки), MEF (эмбриональные мышиные фибробласты) культивировали в среде DMEM с 5% телячьей сыворотки. Подавление экспрессии PHF10, (3-катенин, c-Myc осуществлялось с помощью использованием CRISPR/Cas9 (нокаут) или антисмысловой РНК ^РНК, нокдаун). Гиперэкспрессия c-Myc, р27 осуществлялась с помощью ретрови-русной трансдукции. Клеточный цикл исследовали методом проточной цитофлуорометрии. Экспрессию PHF10 и белков клеточного цикла изучали с помощью иммуноблоттинга, проточной цитофлуорометрии и флуоресцентной микроскопии. Результаты. Экспрессия PHF10 коррелирует с уровнем c-Myc. В клеточных линиях PHF10 экспрессируется во всех фазах клеточного цикла, но не в покоящихся (G0) клетках. При увеличении плотности происходит изменение экспрессии изоформ PHF10, что коррелирует с подавлением циклина D1 и увеличением p27. Ингибирование PHF10 приводит к понижению экспрессии циклина D1 и повышению экспрессии p21. В клетках ПФЧ, с гиперэкспрессией р27, наблюдается увеличение синтеза всех изоформ PHF10. Нокаут р-катенина и c-Myc в клетках линий SW620 и HCT116 приводит к подавлению экспрессии всех изоформ PHF10. Ингибирование PHF10 сопровождается повышением уровня p21 и изменением уровня экспрессии циклинов Е1, А2 и D1. В клетках HCT116 с нокаутом PHF10 наблюдается снижение скорости роста клеток, и увеличению количества выхода из клеточного цикла в G0-фазу. Заключение. PHF10 экспрессируется во всех фазах клеточного цикла, переключение изоформ происходит при выходе в G0-фазу; PHF10 связан с белками-регуляторами клеточного цикла: подавляет экспрессию циклина D1, и активирует — р21;экспрессия PHF10 регулируется |3-катенином, c-Myc и p27; нокаут PHF10 отражается на скорости роста клеток, возможно, играя роль при вхождении в G1-фазу клеточного цикла.

Влияние доксорубицина на транскрипционный профиль раково-тестикулярных антигенов в модельном эксперименте на клеточной линии HeLa 00L-2

Д.И. Водолажский', Д. С. Кутилин', А.А. Пушкин', Е. В. Вереникина', Х. А. Могушкова', О.И. Кит' Место работы: 'ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения РФ, Ростов-на-Дону e-mail: k.denees@yandex.ru

Злокачественные опухоли

www.malignanttumours.org

Том / Vol. 7 № 3 S 1 /2017

Malignant Tumours

www.malignanttumours.org