ЭКСПРЕССИЯ FGFR И ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К ИНГИБИТОРУ FGFR
FGFR EXPRESSION AND SENSITIVITY TO FGFR INHIBITOR

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к выбору субъектов, имеющих опухоли, для лечения ингибитором FGFR, а также к лечению таких субъектов при помощи такого ингибитора.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Факторы роста фибробластов (FGF) и их рецепторы (FGFR) регулируют важные связанные с развитием сигнальные пути, которые влияют на пролиферацию, миграцию и выживаемость клеток. Абберантная (нарушенная) передача сигнала FGF играет важную роль при многих раковых заболеваниях. Turner, N. and Grose, R. (2010) Nat. Rev. Cancer 10: 116-29. Семейство FGFR состоит из FGFR1, FGFR2, FGFR3 и FGFR4. FGFR представляют собой тирозинкиназы, которые активируются во фракции опухолей путем амплификации гена, мутаций или хромосомных транслокаций или перестроек. Увеличение числа молекул FGFR1 происходит при плоскоклеточной карциноме легких и раке груди, положительном по рецептору эстрогена. Количество молекул FGFR2 также увеличивается при раке желудка и раке груди. Мутации в FGFR2 наблюдаются при раке эндометрия, а мутации в FGFR3 при раке мочевого пузыря. The Cancer Genome Atlas Network (2012) Nature 489: 519-25; Elbauomy Elsheikh, S. et al. (2007) Breast Cancer Res. 9: R23; Turner, N. et al. (2010) Cancer Res. 70: 2085-94; Peng, D.F. et al. (2003) J. Pathol. 201: 439-50; Matsumoto, K. et al. (2012) Br. J. Cancer 106: 727-32; Byron, S.A. et al. (2008) Cancer Res. 68: 6902-7; Cappellen, D. et al. (1999) Nat. Genet. 23: 18-20; A1-Ahmadie, H.A. et al. (2011) J. Pathol. 224: 270-9. Хромосомные транслокации и перестройки FGFR1, FGFR2 и FGFR3 были описаны при различных раковых заболеваниях. Parker, B.C. et al. (2014) J. Pathol. 232: 4-15.
Гибридные (слитые) гены FGFR также были описаны при различных раковых заболеваниях, при опухолях как гематологического, так и солидного типа. Например, FGFR1-ERLIN2 - при раке груди, FGFR2-KIAA1967 - при плоскоклеточном раке легких, транслокация t (4, 14) в гене FGFR3 - при множественной миеломе. Отмечается, что некоторое число слияний генов происходит при различных раковых заболеваниях. Слияние генов FGFR3-TACC3 происходит, например, при глиобластоме, раке мочевого пузыря и плоскоклеточной карциноме. Исчерпывающие перечни известных гибридных генов можно найти, например, у Annala et al. (2013) или у Show, А.Т. et al. (2013) Nature Reviews Cancer 13: 772-87.
По причине явной необходимости был разработан ряд более или менее специфичных ингибиторов FGFR. Они включают PD173074 (Mohammadi et al. (1998) EMBOJ. 17: 5896-904), пазопаниб (Harris et al. (2009) J. Med. Chem. 51: 4632-40; Keisner и Shah (2011) Drugs 71: 443-54), AZD4547 (Gavine et al. (2012) Cancer Res. 72: 2045-56), потатиниб (или AP24534) (Huang et al. (2010) J. Med. Chem. 53: 4701-19), довитиниб (Trudel et al. (2005) Blood 105: 2941-8; Man et al. (2014) J. Cell. Mol. Med. 18:143-55), BGJ398 (Guagnano et al. (2011) J. Med. Chem. 54: 7066-83), E-3810 также известный как луцитаниб (Bello et al. (2011) Cancer Res. 71: 1396-405), JNJ-42756493 (Squires et al. (2008) AACR Abstract 1545), ARQ 087 (Yu et al. (2011) Cancer Res. 71 (Suppl. 1) 3671), LY2874455 (Zhao et al. (2011) Mol. Cancer Ther. 10: 2200-10), BAY1163877 (Heroult et al. (2014) Cancer Res. 74 (Suppl. 19) - Abstract 1739), ASP5878 (73 ежегодная встреча японской ассоциации по изучению рака (2014) - Abstract/Poster 1411), Е7090 (Saori Watanabe Miyano et al. (2015) AACR Abstract 770), ODM-203 (HolmstrOm et al. 26 симпозиум ассоциации медсестер скорой помощи (ENA) (2014) Eur. J. Cancer 50(S6):142 - Abstract 432), нинтеданиб (Roth et al. (2015) J. Med. Chem. 58: 1053-63), TAS-120 (Ochiiwa, et al. (2013) AACR; Mol. Cancer Ther. 12 (11 Suppl), Abstract A270), PRN 1109 и PRN 1371 (оба у: Phan V.T. et al. 26 симпозиум ENA (2014) Eur. J. Cancer 50(S6):157 - Abstract 483). Они также включают ингибирующие производные аминопиразола и их фармацевтически приемлемые соли, описанные в международной патентной публикации WO 2011/016528, включая, в частности, 5-амино-1-(2-метил-1Н-бензимидазол-5-ил)-1Н-пиразол-4-ил]-(1Н-индол-2-ил)метанон, в настоящем документе упоминаемый как Соединение А.
Теперь, когда несколько ингибиторов FGFR можно вводить субъектам, представляющим собой человека, возникает вопрос о надлежащих критериях определения того, должен ли конкретный субъект получать лечение конкретным ингибитором или нет. Вопрос относится к тому, является ли ингибитор активным в отношении опухоли, содержащей активируемый мутацией FGFR, опухоли, экспрессирующей гибридный белок FGFR, и/или опухоли, содержащей амплифицированный, не являющийся мутированным или мутированный ген FGFR. Связанный с этим вопрос касается специфичности конкретных членов семейства FGFR. Ответом на данный вопрос могут служить специфичные ингибиторы. По всей видимости принятая в настоящее время практики заключается в лечении любой опухоли, содержащей любое из вышеописанных генетических изменений в гене FGFR, при помощи предпочтительного ингибитора FGFR. Очевидно, что надлежащие критерии отбора пока что неизвестны.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к способу идентификации и выбора группы субъектов, у которых был диагностирован рак, которые с большей вероятностью будут отвечать на схему лечения, которая включает введение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество соединения А. Указанный способ включает отбор биопсии опухоли или жидкой биопсии (биопсии жидкости) у субъекта, страдающего раком, определение уровней экспрессии FGFR1, FGFR2 и FGFR3, и в случае, если определенный при этом уровень экспрессии по меньшей мере одного из FGFR1, FGFR2 и FGFR3 превышает предварительно установленный пороговый уровень для этого FGFR, считают или заявляют, что указанный субъект является подходящим для данной схемы лечения.
В конкретных вариантах реализации вышеописанный способ определяет уровни экспрессии FGFR1, FGFR2 и FGFR3 на уровне матричной РНК (мРНК). Уровни матричной РНК можно оценивать при помощи любого подходящего способа. Предпочтительным является обнаружение молекул мРНК FGFR с помощью цифровых способов. Конкретным типом такого способа является анализ экспрессии генов с применением системы nCounter от компании NanoString, применяемой в настоящем документе. Другим подходящим способом является количественная ПЦР с обратной транскрипцией.
Для того, чтобы установить пороговые уровни для каждого из FGFR1, FGFR2 и FGFR3, составляют сбалансированный набор ксенотрансплантатных моделей опухоли, полученной от пациента (PDX), при этом указанные модели соответствуют четырем различным категориям, которые аналогичным образом представлены в приведенной ниже группе:
(i) с увеличенным числом копий гена FGFR и гиперэкспрессией FGFR, (ii) с увеличенным числом копий гена FGFR без гиперэкспрессии FGFR, (iii) увеличение числа копий гена FGFR отсутствует, но присутствует гиперэкспрессия FGFR, и (iv) с экспрессией продукта гибридного гена FGFR.
Измеряют уровни экспрессии FGFR1, FGFR2 и FGFR3 и эффективность лечения Соединением А. Эти данные устанавливают взаимосвязь между частотами ответов и уровнями предельных значений процентиля (cutoff) уровня экспрессии FGFR. См. Таблицу 1, «Частота ответа» (иногда сокращенно «RR» («Response rate")) относится к проценту моделей, опухоли в которых эффективно поддаются лечению Соединением А, т.е. удовлетворяют требуемой минимальной эффективности лечения ΔТ/ΔС (здесь 0). Предельное значение уровня экспрессии FGFR для процентиля относится к значению (уровню), при котором процентиль моделей имеет тот же самый или более низкий уровень экспрессии FGFR. Например, предельное значение уровня экспрессии для 75-го процентиля относительно FGFR идентифицирует уровень FGFR (пороговый уровень), который соответствует самому высокому уровню, измеренному в 75% моделей, обладающих наименьшими уровнями экспрессии FGFR. Отмечается, что, хотя в Таблице 1 и приведены предельные уровни для предельных значений уровня экспрессии для определенных процентилей, пороговые уровни можно легко определить для предельного значения для другого процентиля. Данные, необходимые для таких определений, приведены ниже в Таблице 2.
Можно выбрать пороговые уровни FGFR, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 44% до приблизительно 73%, поскольку такой диапазон пороговых уровней не исключает любую модель, которая может отвечать на Соединение А, в то же время по существу увеличивая частоту ответа, наблюдаемую в моделях, которые рассматриваются как обладающие гиперэкспрессией FGFR (FGFR-гиперэкспрессирующие), по сравнению с частотой ответа, наблюдаемой во всех моделях (например, более чем на 10%). Соответствующие частоты ответов составляют от приблизительно 36,2% до приблизительно 52,5%. Более предпочтительными являются пороговые уровни FGFR, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 60% до приблизительно 73%. Соответствующие частоты ответов составляют от приблизительно 39,6% до приблизительно 52,5%. Еще более предпочтительными являются пороговые уровни FGFR, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 65% до приблизительно 73%. Соответствующие частоты ответов составляют от приблизительно 42,9% до приблизительно 52,5%. Наиболее предпочтительными являются пороговые уровни FGFR, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 70% до приблизительно 73%. Менее предпочтительными предельным значениям - вследствие более низких частот ответа - являются те, которые соответствуют предельным значениям для процентилей ниже приблизительно 44%. Также менее предпочтительными, поскольку исключена часть из подлежащих лечению субъектов, являются те, которые соответствуют предельным значениям для процентилей, превышающим 73%.
Следует отметить, что для целей обсуждаемого в настоящем документе способа диагностики, независящего от признаков заболевания, FGFR1, 2 и 3 рассматривались при расчетах для каждой модели, т.е. модель рассматривали как FGFR-гиперэкспрессирующую, если уровень экспрессии по меньшей мере одного из FGFR1, FGFR2 или FGFR3 превышает соответствующий пороговый уровень для выбранного предельного значения для процентиля.
* Уровни экспрессии мРНК экзона 14 гена FGFR относительно медианы уровней экспессии мРНК 16 эталонных генов (генов домашнего хозяйства) (АСТВ, ALAS1, CLTC, MRPL19, RPL19, RPLP0, SF3A1, ТВР, TUBB, экзон 1 гена clorf43, экзон 2 гена clorf43, экзон 3 гена СНМР2А, экзон 5 гена ЕМС7, экзон 3 гена ЕМС7, экзон 4 гена GPI и экзон 6 гена GPI), определяемых при помощи анализа экспрессии гена с применением системы nCounter (nCounter Cene Expression Assay). «Частота ответа» (RR) относится к проценту выбранных моделей, опухоли которых эффективно поддаются лечению Соединением А, т.е. удовлетворяют требуемой минимальной эффективности лечения ΔТ/ΔС (здесь 0).
В других конкретных вариантах реализации вышеописанного способа уровни экспрессии FGFR1, FGFR2 и FGFR3 оценивают по уровню белка. Подходящие способы включают вестерн-блоттинг, дот-блоттинг, ELISA, иммунохроматографию, иммуногистохимию, масс-спектрометрию и проточную цитометрию.
Вышеописанный способ не включает дифференцирование симптомов (признаков) рака, т.е. не зависит от наличия симптомов (признаков). Настоящее изобретение также охватывает способы идентификации и выбора группы пациентов, у которых диагностирован рак конкретного типа, например, рака пищевода, рака легких (например, плоскоклеточный НМРЛ) или рак мочевого пузыря, которые с большей вероятностью отвечать на схему лечения, которая включает введение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество Соединения А. Такой способ включает отбор биопсии опухоли или жидкой биопсии у субъекта, страдающего последним из перечисленных типом рака, определение уровня экспрессии FGFR (или множества FGFR), который, как известно, повышен в опухолях у ряда субъектов, страдающих раком такого типа, и в случае, если указанный определенный уровень экспрессии FGFR превышает предварительно установленный пороговый уровень, считают или заявляют, что указанный субъект является подходящим для применения данной схемы лечения.
Для того, чтобы установить пороговый уровень для рассматриваемого FGFR (или множества FGFR), можно собрать сбалансированный набор ксенотрансплантатных моделей опухоли (PDX) для рассматриваемого конкретного типа рака, при этом модели обычно соответствуют четырем различным категориям, которые аналогичным образом представлены в приведенной ниже группе:
(i) с увеличенным числом копий гена FGFR и гиперэкспрессией FGFR, (ii) с увеличенным числом копий гена FGFR без гиперэкспрессии FGFR, (iii) увеличение числа копий гена FGFR отсутствует, но присутствует гиперэкспрессия FGFR, и (iv) с экспрессией продукта гибридного гена FGFR.
Измеряют уровни экспрессии рассматриваемого FGFR, а также эффективность лечения Соединением А. Эти данные устанавливают взаимосвязь между частотами ответов и предельным значением уровня экспрессии для процентиля для FGFR. Пороговые уровни FGFR, соответствующие предельным значениям и диапазонам предельных значений, можно выбирать так, чтобы при их возможном повышении они не приводили к исключению любой модели, которая может отвечать на Соединение А (см. вышеупомянутое обсуждение независящего от признаков заболевания способа). Основываясь на требовании к такому выбору, можно отобрать пороговый уровень процентиля более высокого или низкого порядка.
Настоящее изобретение также относится к способу для персонализированной терапии рака, включающему описанный выше способ, предполагающий отбор биопсии опухоли или жидкой биопсии у субъекта, страдающего раком, определение уровней экспрессии любого или всех из FGFR1, FGFR2 и FGFR3, и в случае, если указанный определенный уровень экспрессии по меньшей мере одного из FGFR1, FGFR2 и FGFR3 превышает предварительно установленный пороговый уровень, считают или заявляют, что указанный субъект является подходящим для данной схемы лечения, и включение дополнительной стадии назначения такому субъекту схемы лечения, которая включает введение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество соединения А. В более конкретном варианте реализации последний способ для персонализированной терапии рака можно классифицировать по признакам рака.
Настоящее изобретение также относится к способу выбора субъекта, страдающего раком, для лечения Соединением А, причем указанный способ включает определение уровней экспрессии FGFR1, FGFR2 и FGFR3 в полученной от субъекта биопсии опухоли или жидкой биопсии, и в случае, если указанный определенный уровень экспрессии по меньшей мере одного из FGFR1, FGFR2 и FGFR3 превышает предварительно установленный пороговый уровень, указанного субъекта считают подходящим для лечения.
Настоящее изобретение также относится к применению Соединения А при получении лекарственного средства для лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, или к Соединению А для применения в лечении рака у субъекта, при этом уровень экспрессии по меньшей мере одного из FGFR1, FGFR2 и FGFR3, определяемый в биопсии опухоли или жидкой биопсии, полученной от субъекта, превышает предварительно установленный пороговый уровень.
В конкретном варианте реализации вышеописанных способов и применений уровни экспрессии FGFR1, FGFR2 и FGFR3 измеряют по уровню матричной РНК, а предварительно установленный пороговый уровень экспрессии по меньшей мере одного FGFR соответствует любому уровню в диапазоне предельных значений уровня экспрессии для процентилей от 44% до 73% для по меньшей мере одного FGFR, соответствующего уровням экспрессии относительно медианы уровней экспрессии мРНК набора из 16 эталонных генов, измеренных при помощи анализа экспрессии генов с применением системы nCounter, от 0,104 до 0,641 для FGFR1, от 0,257 до 1,094 для FGFR2 и от 0,128 до 0,815 для FGFR3, указанными 16 эталонными генами являются АСТВ, ALAS1, CLTC, MRPL19, RPL19, RPLP0, SF3A1, ТВР, TUBB, экзон 1 гена clorf43, экзон 2 гена clorf43, экзон 3 гена СНМР2А, экзон 5 гена ЕМС7, экзон 3 гена ЕМС7, экзон 4 гена GPI и экзон 6 гена GPI.
В еще более конкретном варианте реализации предварительно установленный пороговый уровень по меньшей мере одного FGFR соответствует любому уровню в диапазоне предельных значений уровня экспрессии для процентилей от 60% до 73% для по меньшей мере одного FGFR, соответствующего уровням экспрессии относительно медианы уровней экспрессии мРНК вышеописанного набора из 16 эталонных генов, измеренным при помощи анализа экспрессии генов с применением системы nCounter, находящихся в диапазоне от 0,011 до 0,641 для FGFR1, от 0,669 до 1,094 для FGFR2 и от 0,289 до 0,815 для FGFR3. В еще более конкретном варианте реализации предварительно установленный пороговый уровень по меньшей мере одного FGFR соответствует любому уровню в диапазоне предельных значений уровня экспрессии для процентилей от 65% до 73% для по меньшей мере одного FGFR, соответствующего уровням экспрессии относительно медианы уровней экспрессии мРНК вышеописанного набора из 16 эталонных генов, измеренным при помощи анализа экспрессии генов с применением системы nCounter, находящихся в диапазоне от 0,484 до 0,641 для FGFR1, от 0,884 до 1,094 для FGFR2 и от 0,490 до 0,815 для FGFR3. В еще более конкретном варианте реализации предварительно установленный пороговый уровень по меньшей мере одного FGFR соответствует любому уровню в диапазоне предельных значений уровня экспрессии для процентилей от 70% до 73% для по меньшей мере одного FGFR, соответствующего уровням экспрессии относительно медианы уровней экспрессии мРНК вышеописанного набора из 16 эталонных генов, измеренным при помощи анализа экспрессии генов с применением системы nCounter, находящихся в диапазоне от 0,558 до 0,641 для FGFR1, от 0,984 до 1,094 для FGFR2 и от 0,671 до 0,815 для FGFR3.
В другом конкретном варианте реализации настоящего изобретения рак представляет собой рак желудка, а предварительно установленный пороговый уровень экспрессии FGFR2 соответствует любому уровню в диапазоне предельных значений уровня экспрессии для процентилей от 44% до 83% для FGFR2, соответствующего уровням экспрессии относительно медианы уровней экспрессии мРНК вышеописанного набора из 16 эталонных генов, измеренным при помощи анализа экспрессии генов с применением системы nCounter, находящихся в диапазоне от 0,277 до 1,610 для FGFR2. В таком варианте реализации более предпочтительными являются пороговые уровни FGFR2, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 60% и приблизительно 83% (0,669-1,610). Еще более предпочтительными являются пороговые уровни FGFR2, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 70% до приблизительно 83% (0,984-1,610). Наиболее предпочтительными являются пороговые уровни FGFR2, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 80% до приблизительно 83% (1,460-1,610). В таком варианте реализации можно определить уровень экспрессии только FGFR2 или FGFR1, 2 и 3.
В еще одном варианте реализации настоящего изобретения рак представляет собой плоскоклеточную карциному пищевода, а предварительно установленный пороговый уровень экспрессии FGFR1 соответствует любому уровню в диапазоне предельных значений уровня экспрессии для процентилей от 44% до 84% для FGFR1, соответствующего уровням экспрессии относительно медианы уровней экспрессии мРНК вышеописанного набора из 16 эталонных генов, измеренным при помощи анализа экспрессии генов с применением системы nCounter, находящихся в диапазоне от 0,104 до 1,362 для FGFR1. В таком варианте реализации более предпочтительными являются пороговые уровни FGFR1, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 60% до приблизительно 84% (0,301-1,362). Еще более предпочтительными являются пороговые уровни FGFR1, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 70% до приблизительно 84% (0,558-1,362).
Наиболее предпочтительными являются пороговые уровни FGFR1, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 80% до приблизительно 84% (0,759-1,362). В таком варианте реализации можно определить уровень экспрессии только FGFR1 или FGFR1, 2 и 3.
Все вышеупомянутые пороговые уровни, а также пороговые уровни для некоторых промежуточных предельных значений для процентилей приведены в Таблице 1. Как упоминалось ранее, пороговые уровни можно легко определить для другого предельного значения процентиля.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фигуре 1 показана каскадная диаграмма эффективности лечения (ΔТ/ΔС) Соединением А в 66 PDX-моделях. В этом анализе значение ΔТ/ΔС<0 указывает на эффективное лечение. Модели обозначены по оси абсцисс.
Фигура 2. Слева представлена каскадная диаграмма эффективности лечения (ΔТ/ΔС) Соединением А для PDX-моделей, показывающая как отсутствие увеличения числа копий гена для любого FGFR, так и экспрессии гибридного гена. Справа представлен аналогичный график для PDX-моделей, показывающий увеличение числа копий гена для FGFR или экспрессию гибридного гена. Значение ΔТ/ΔС<0 указывает на эффективное лечение. Модели обозначены по оси абсцисс.
Фигура 3. Слева представлена каскадная диаграмма эффективности лечения (ΔТ/ΔС) Соединением А для PDX-моделей, показывающая отсутствие гиперэкспрессии любого из FGFR1, FGFR2 или FGFR3 (значения ниже предельного значения уровня экспрессии для 73 процентиля). Справа представлен аналогичный график для PDX-моделей, гиперэкспрессирующих любой из FGFR1, FGFR2 или FGFR3 (значения выше предельного значения уровня экспрессии для 73-го процентиля). Значение ΔТ/ΔС<0 указывает на эффективное лечение. Модели обозначены по оси абсцисс.
Фигура 4. Слева представлена каскадная диаграмма эффективности лечения (ΔТ/ΔС) Соединением А для PDX-моделей, показывающая как отсутствие увеличения числа копий гена для любого FGFR, экспрессии гибридного гена, так и наличие FGFR-мутации. Справа представлен аналогичный график для PDX-моделей, показывающий увеличение числа копий гена для FGFR или экспрессию гибридного гена, или наличие FGFR-мутации. Величина ΔТ/ΔС<0 указывает на эффективное лечение. Модели обозначены по оси абсцисс.
На Фигуре 5 представлена каскадная диаграмма эффективности лечения (ΔТ/ΔС) Соединением А в 66 PDX-моделях. В этом анализе величина ΔТ/ΔС<0,4 указывает на эффективное лечение. Модели обозначены по оси абсцисс.
Фигура 6. Слева представлена каскадная диаграмма эффективности лечения (ΔТ/ΔС) Соединением А для PDX-моделей, показывающая как отсутствие увеличения числа копий гена для любого FGFR, так и экспрессии гибридного гена. Справа представлен аналогичный график для PDX-моделей, показывающий увеличение числа копий гена для любого FGFR или экспрессию гибридного гена. Величина ΔТ/ΔС<0,4 указывает на эффективное лечение. Модели обозначены по оси абсцисс.
Фигура 7. Слева представлена каскадная диаграмма эффективности лечения (ΔТ/ΔС) Соединением А для PDX моделей, показывающая отсутствие гиперэкспрессии любого из FGFR1, FGFR2 или FGFR3 (значения ниже предельного значения уровня экспрессии для 73 процентиля). Справа представлен аналогичный график для PDX-моделей, гиперэкспрессирующих любой из FGFR1, FGFR2 или FGFR3 (значения выше предельного значения уровня экспрессии для 73-го процентиля). Величина ΔТ/ΔС<0,4 указывает на эффективное лечение. Модели обозначены по оси абсцисс.
Фигура 8. Слева представлена каскадная диаграмма эффективности лечения (ΔТ/ΔС) Соединением А для PDX-моделей, показывающая как отсутствие увеличения числа копий гена для любого FGFR, экспрессии гибридного гена, так и наличие FGFR-мутации. Справа представлен аналогичный график для PDX-моделей, показывающий увеличение числа копий гена для FGFR или экспрессию гибридного гена, или наличие FGFR-мутации. Величина ΔТ/ΔС<0,4 указывает на эффективное лечение. Модели обозначены по оси абсцисс.
2
2
На Фигуре 9 представлена очень хорошая корреляция между уровнями мРНК, измеренными при помощи каждой из технологий количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) и NanoString с применением наборов для исследований образцов PDX-опухоли. Для стандартизации в обоих способах применяли общий набор, состоящий из трех генов домашнего хозяйства (ALAS1, CLTC, MRPL19). (А) 16 образцов PDX-опухоли плоскоклеточной карциномы пищевода (ESCC) - R=0,915 для уровней мРНК FGFR1; (В) 26 образцов PDX-опухоли желудка - R=0,957 для уровней мРНК FGFR2.
На Фигуре 10 показана зависимость между эффективностью лечения (ΔТ/ΔС) Соединением А и уровнями экспрессии FGFR2 в PDX-моделях рака желудка, которая в то же время показывает увеличение числа молекул FGFR2 (незакрашенные кружки) согласно Примеру 1, (А) график зависимости; (В) коробчатая диаграмма.
На Фигуре 11 показана зависимость между эффективностью лечения (ΔТ/ΔС Соединением А и уровнями экспрессии FGFR1 в PDX-моделях ESCC, которая в то же время показывает увеличение числа молекул FGFR1 (незакрашенные кружки) согласно Примеру 2. (А) график зависимости; (В) коробчатая диаграмма.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения:
Соединение А представляет собой 5-амино-1-(2-метил-1Н-бензимидазол-5-ил)-1Н-пиразол-4-ил]-(1Н-индол-2-ил)метанон (CAS 1265229-25-1). Соединение было описано в международной публикации патентной заявки WO 2011016528 и у Nakanishi, Y. et al. (2014) Mol. Cancer Ther. 13: 2547-58. Оно также включает фармацевтически приемлемые соли такого соединения, включая, но не ограничиваясь ими, уксусную кислоту, адипиновую кислоту, L-аскорбиновую кислоту, L-аспарагиновую кислоту, каприновую кислоту (декановую кислоту), угольную кислоту, лимонную кислоту, фумаровую кислоту, галактариновую кислоту, D-глюкогептоновую кислоту, D-глюконовую кислоту, D-глюкуроновую кислоту, глутаминовую кислоту, глутаровую кислоту, глицерофосфорную кислоту, гликолевую кислоту, гиппуровую кислоту, соляную кислоту, DL-молочную кислоту, лауриновую кислоту, малеиновую кислоту, (-)-L-яблочную кислоту, пальмитиновую кислоту, фосфорную кислоту, себациновую кислоту, стеариновую кислоту, янтарную кислоту, серную кислоту, (+)-L-винную кислоту и тиоциановую кислоту, где (-)-L-яблочная кислота является предпочтительной.
«FGFR» относится к члену семейства рецепторов фактора роста фибробластов. Семейство FGFR является членом семейства рецепторных тирозинкиназ. Известны четыре члена семейства FGFR, т.е. FGFR1, FGFR2, FGFR3 и FGFR4. FGFR, как это указано в настоящем изобретении, может быть любого происхождения, но в предпочтительном варианте происходить из млекопитающего и в более предпочтительном варианте быть человеческого происхождения. Настоящее изобретение относится к FGFR1, 2 и/или 3, а в контексте настоящего описания указанный термин FGFR относится к любому виду или любой комбинации последних трех видов FGFR.
«Рак» в целом относится к злокачественному новообразованию, которое может быть метастатическим или неметастатическим. Например, неограничивающие примеры рака, который развивается из эпителиальных тканей, таких как желудочно-кишечный тракт и кожа, включают опухоль головного мозга, рак кожи, рак головы и шеи, рак пищевода, рак легких, рак желудка, рак прямой кишки, рак груди, рак предстательной железы, рак шейки матки, рак тела матки, рак поджелудочной железы, рак печени, холангиокарциному, рак желчного пузыря, колоректальный рак, рак толстой кишки, рак мочевого пузыря и рак яичников. Неограничивающие примеры саркомы, которая развивается из неэпителиальных тканей (стромы), таких как мышцы, включают остеосаркому, хондросаркому, рабдомиосаркому, лейомиосаркому, липосаркому и ангиосаркому. Кроме того, неограничивающие примеры гематологического рака, происходящего из гемопоэтических органов, включают злокачественную лимфому, включая лимфому Ходжкина и неходжкинскую лимфому, лейкоз, включая острый миелоцитарный лейкоз, хронический миелоцитарный лейкоз, острый лимфатический лейкоз, хронический лимфатический лейкоз и множественную миелому. Последние примеры рака также упоминаются в настоящем описании как типы рака.
Под термином «терапевтически эффективное количество» Соединения А (также упоминаемое в настоящем описании как «активный агент» или «соединение») подразумевается количество указанного соединения, которое после однократного или множественного введения оказывает терапевтическое действие на субъект, который получает лечение, при разумном соотношении эффективности/риска, применимом к любому лечению. Однако понятно, что эффективные дозы также будут варьироваться в зависимости от способа введения, а также возможности совместного применения с другими агентами, включая противоопухолевые агенты. Однако следует понимать, что решение о суммарном суточном применении композиций согласно настоящему изобретению будет принимать лечащий врач в рамках обоснованного медицинского заключения. Конкретный терапевтически эффективный уровень дозы для любого конкретного пациента будет зависеть от множества факторов, включая тяжесть состояния/заболевания; конкретную применяемую композицию; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион пациента; время введения, способ введения, скорость выделения активного агента, продолжительность лечения; лекарственные средства, применяемые в комбинации или одновременно с активным агентом, и им подобные факторы, хорошо известные в медицине.
Термин «фармацевтически приемлемый носитель» или «фармацевтически приемлемая среда-носитель» охватывает любой из стандартных фармацевтических носителей, растворителей, поверхностно-активных веществ или сред-носителей. Подходящие фармацевтически приемлемые среды-носители включают водные среды-носители и неводные среды-носители. Стандартные фармацевтические носители и их составы без ограничений описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Истон, штат Пенсильвания, 19-е изд. 1995.
Термин «субъект» относится к животному из млекопитающих и в предпочтительном варианте к человеку.
Термин «гиперэкспрессия», относящийся к FGFR, означает уровень экспрессии (измеренный по уровню РНК или белка) в опухоли или в биопсии опухоли, который превышает уровень, измеренный в соответствующих неопухолевых клетках или ткани.
Методология
Восприимчивость к лечению ингибитором киназы FGFR, Соединением А, было исследовано на 66 полученных от пациента ксенотрансплантатных (PDX) моделях. PDX-модели выбрали на основе доступной информации, полученной с помощью секвенирования РНК (RNA-Seq) с применением технологии секвенирования следующего поколения (NGS) и гибридизации с матричным планшетом Affymetrix Human Genome U219. Был выбран сбалансированный набор моделей, который имел следующие характеристики: (i) увеличенное число копий гена FGFR и гиперэкспрессия FGFR или (ii) увеличенное число копий гена FGFR без гиперэкспрессии FGFR или (iii) увеличение числа копий гена FGFR отсутствует, но присутствует гиперэкспрессия FGFR или (iv) экспрессия продукта гибридного гена FGFR.
Для каждой модели опухоли оценивали (или повторно оценивали) действие Соединения А на рост опухоли (эффективность лечения), число копий FGFR и уровни мРНК FGFR. В нескольких модельных исследованиях уровни белка FGFR также оценивали с применением иммуногистохимических методов. В обычном эксперименте фрагменты опухоли, полученные от обсемененных метастазами мышей (seed mice), инокулированных выбранными PDX-опухолями, собирали и применяли для инокуляции самок безтимусных (голых) мышей Balb/c.
3
Каждую мышь инокулировали подкожно в правую боковую область брюшка с одним фрагментом опухоли (диаметром 2-3 мм) для развития опухоли. Лечение начинали, когда средний размер опухоли достигал приблизительно 200-250 мм. Соединение А (60-80 мг/кг), приготовленное в виде суспензии в 1% коллидоне VA64 в деионизированной воде (т.е. 1% коллидон VA64 в деионизированной воде), или только в среде-носителе перорально вводили мышам с опухолью через желудочный зонд ежедневно в течение 14 последовательных дней.
3
2
а
а
Объем опухоли измеряли два раза в неделю в двух измерениях с применением кронциркуля и объем выражали в мм по формуле: V=0,5×b, где  и b - длинный и короткий диаметры опухоли соответственно. Массу тела также регистрировали два раза в неделю. Эффективность лечения выражали как ΔТ/ΔС, при этом ΔТ говорит об относительном изменении объема опухоли у животных, получавших лечение лекарственным средством, а ΔС выражает относительное изменение объема опухоли у животных, не получавших лечение лекарственным средством, между последним днем лечения и началом лечения (разность в медианных объемах). Результаты, полученные для разных моделей, представлены в Таблице 2.
Число копий FGFR оценивали методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Опухолевую ткань, полученную от животных с опухолью, фиксировали в забуференном формалине и включали в парафиновые блоки (фиксированные формалином и залитые парафином). Срезы тканей размером от 3 до 4 мкм размещали на силанизированных предметных стеклах, депарафинировали, обрабатывали протеазой, промывали, денатурировали ДНК и затем гибридизировали с зондом для определения гена FGFR, как это описано у Schildhaus, H.U. et al. (2012) Mol. Pathol. 25: 1473-80. После гибридизации опухолевую ткань сканировали на определение мест амплификации с применением флуоресцентного микроскопа, как это описано у Schildhaus et al. (2012). В качестве зондов для определения гена FGFR применяли двухцветный зонд FGFR1/CEN 8, двухцветный зонд FGFR2/CEN 10 и двухцветный зонд FGFR3/4p11 (все получены от компании Zytovision GmbH, Бремерхафен, Германия). Увеличение числа копий гена (GCN) определяли либо как амплификацию (соотношение количества сигналов от зонда для определения гена FGFR для FISH-анализа к количеству сигналов от центромерного зонда составляет ≥2,2), либо как полисомию, определяемую как соотношение количества сигналов от зонда для определения гена FGFR к количеству сигналов от центромерного зонда, составляющее <2,2, однако при этом для каждого из зондов для определения гена FGFR и центромерного зонда количество сигналов >2.
* BL: мочевой пузырь; BR: грудь; BN: головной мозг; CR: ободочная и прямая кишка; EN: эндометрий, ES: пищевод: GA: желудок; GL: желчный пузырь; HN: голова и шея; KI: почка; LI: печень; ЛУ: легкие; РА: поджелудочная железа. Все модели получены от компании Crown Biosciences (Crown Biosciences Inc, 3375 Scott Blvd., Suite 108, Санта Клара, штат Калифорния, 95054, США), за исключением моделей 7 и 8, которые получены от компании Oncodesign (Oncodesign, 20, гае Jean Mazen - BP 27627 - 21076 Дижон Седекс, Франция), моделей 56 и 57, которые получены от компании Urolead (Urolead, 11 rue Humann,  3, Etage 8, 67085 Страсбург, Франция), моделей 63,64,65 и 66, которые получены от компании START (START, 4383 Medical Drive, Suite 4021, Сан Антонио, штат Техас 78229, США).
* Е10-14 представляют собой экзоны от 10 до 14 кодирующей последовательности РНК FGFR. Последние экзоны кодируют большую часть тирозинкиназного домена FGFR. Числа обозначают уровни экспрессии относительно медианы уровней экспрессии эталонных генов АСТВ, ALAS1, CLTC, MRPL19, RPL19, RPLPO, SF3A1, ТВР, TUBB, экзона 1 гена clorf43, экзона 2 гена clorf43, экзона 3 гена СНМР2А, экзона 5 гена ЕМС7, экзона 3 гена ЕМС7, экзона гена 4 GPI и экзона 6 гена GPI (измерены при помощи анализа экспрессии генов с применением системы nCounter от компании NanoString).
* E10-14 и 16 представляют собой экзоны от 10 до 14 и 16 кодирующей последовательности РНК FGFR. Последние экзоны кодируют большую часть тирозинкиназного домена FGFR. Числа обозначают уровни экспрессии относительно медианы уровней экспрессии эталонных генов АСТВ, ALAS1, CLTC, MRPL19, RPL19, RPLP0, SF3A1, ТВР, TUBB, экзона 1 гена clorf43, экзона 2 гена clorf43, экзона 3 гена СНМР2А, экзона 5 гена ЕМС7, экзона 3 гена ЕМС7, экзона гена 4 GPI и экзона 6 гена GPI (измерены при помощи анализа экспрессии генов с применением системы nCounter от компании NanoString).
* Е10, 11 и 14 представляют собой экзоны 10, 11 и 14 кодирующей последовательности РНК FGFR. Последние экзоны кодируют большую часть тирозинкиназного домена FGFR. Числа обозначают уровни экспрессии относительно медианы уровней экспрессии эталонных генов АСТВ, ALAS1, CLTC, MRPL19, RPL19, RPLP0, SF3A1, ТВР, TUBB, экзона 1 гена clorf43, экзона 2 гена clorf43, экзона 3 гена СНМР2А, экзона 5 гена ЕМС7, экзона 3 гена ЕМС7, экзона гена 4 GPI и экзона 6 гена GPI (измерены при помощи анализа экспрессии генов с применением системы nCounter от компании NanoString).
Для определения уровней мРНК FGFR суммарную РНК экстрагировали из первого и до шестого полученных при помощи макроскопического препарирования фиксированных формалином и залитых парафином срезов с применением FFPE-набора QIAgen miRNeasy (QIAgen 217504) согласно инструкциям производителя. Процедура включала лизис депарафинированной ткани с применением запатентованного буфера QIAgen для лизиса РНК из ткани и инкубацию в присутствии протеиназы К. В присутствии хаотропных солей РНК специфическим образом связывалась со стеклянными волокнами спин-колонки. Связанную РНК инкубировали с ДНКазой и очищали в серии стадий быстрой промывки и вращений, а затем элюировали в воде. Концентрацию РНК определяли по уровню абсорбции с применением спектрофотометра NanoDrop (Thermo Fischer Scientific, Уолтем, штат Массачусетс, США) и флуоресценции с применением флуорометра Qubit (Life Technologies).
300 нг суммарной РНК на образец анализировали с использованием протокола для анализа экспрессии генов с применением системы nCounter согласно инструкциям производителя NanoString Technologies Inc., Сиэтл, штат Вашингтон, США (www.nanostring.com). Анализ с применением системы nCounter основан на прямом цифровом обнаружении представляющих интересующих молекул мРНК с применением специфичных к мишени зондов с цветовой индикацией, которые гибридизируются непосредственно с молекулами-мишенями в растворе, так что уровень экспрессии каждого гена измеряют соответствующим образом по подсчетам (зондов), без необходимости проведения синтеза и амплификации кДНК. Каждый зонд состоит из репортерной (сигнальной) части зонда, состоящей из 50 оснований, которая несет штрих-код на 5'-конце, и захватывающей части зонда, состоящей из 50 оснований, которая несет молекулу биотина на 3'-конце, что позволяет иммобилизовать комплекс зонд-мишень на покрытом стрептавидине картридже nCounter для сбора цифровых данных (подсчетов) после вымывания излишних зондов. Описание методологии NanoString приведены у Geiss, G.K. et al. (2008) Nat. Biotech. 26: 317-325; Malkov V.A. et al. (2009) BMC Research Notes 2: 80; и у Guancial, E.A. et al. (2014) Cancer Med. 3 (4): 835-44.
Авторы изобретения выбрали гены FGFR и эталонные гены (т.е. гены домашнего хозяйства). Зонды для таких генов FGFR и генов домашнего хозяйства были разработаны и синтезированы компанией NanoString Technologies Inc. (Custom CodeSet), которые затем включали совместно со всеми расходными материалами и реагентами (включая 8 отрицательных и 6 положительных зондов для нормализации, обеспечиваемых компанией NanoString) в готовые для применения наборы nCounter Master kit для обработки образцов в системе анализа с применением системы nCounter. Для коррекции фона применяют отрицательные зонды для нормализации (см. ниже), а для контроля качества картриджа применяют только положительные зонды для нормализации. Способ нормализации с применением положительных зондов для нормализации был описан в Руководстве по анализу данных экспрессии с применением системы nCounter, опубликованном компанией NanoString в 2012 году. Последовательности-мишени (последовательности-мишени FGFR, а также последовательности-мишени для стандартизации, т.е. последовательности генов домашнего хозяйства), применяемые для разработки зондов, обеспечиваемых компанией NanoString, продублированы в Таблице 3 ниже. Ссылки на зонды для нормализации приведены ниже в Таблице 4. Уровни экспрессии мРНК FGFR (относительно уровней набора из 16 эталонных генов, состоящего из АСТВ, ALAS1, CLTC, MRPL19, RPL19, RPLP0, SF3A1, ТВР, TUBB, экзона 1 гена clorf43, экзона 2 гена clorf43, экзона 3 гена СНМР2А, экзона 5 гена ЕМС7, экзона 3 гена ЕМС7, экзона 4 гена GPON и экзона 6 гена GPI), определенные для разных моделей, представлены в Таблице 2.
Полученные значения подсчетов были откорректированы относительно фона. Стандартизацию откорректированных относительно фона значений проводили на основе параллельного измерения уровней экспрессии «генов домашнего хозяйства» в каждом анализируемом образце РНК. Применяли следующую процедуру:
Коррекция фона
1. Для каждого образца значение коррекции фона получали путем вычисления среднего +2 раза стандартного отклонения числа подсчитанных отрицательных зондов для нормализации.
2. Откорректированные относительно фона значения получали путем вычитания значения коррекции фона из всего числа подсчитанных зондов, за исключением отрицательных зондов для нормализации.
Стандартизация генов домашнего хозяйства
1. Для каждого образца рассчитывали медианный показатель откорректированных относительно фона числа подсчитанных зондов, применяемых для стандартизации генов домашнего хозяйства [HKG MEDIAN].
2. Стандартизированное число подсчетов получали путем деления откорректированных относительно фона числа подсчитанных зондов для определения FGFR на величину HKG MEDIAN соответствующего образца.
* NanoString предоставляет следующую дополнительную информацию по отрицательному и положительному контролю для нормализации: Консорциум по контрольной внешней РНК (ERCC) представляет собой группу представителей отрасли, созданную для разработки контрольных транскриптов РНК, которые можно применять для оценки технических характеристик в анализах экспрессии генов. NanoString адаптировала последовательности, разработанные и исследованные ERCC для положительных и отрицательных контролей для гибридизации. Контрольные последовательности ERCC не являются гомологичными к любому известному организму, их можно применять и переносить во всех кодовых наборах (CodeSet), и они также обеспечивают согласованные результаты в анализах экспрессии генов. Репортерные зонды, разработанные для последовательностей транскриптов ERCC, предварительно смешиваются в каждом кодовом наборе и поэтому доступны для применения в анализах данных.
Отмечается, что нормированные пороговые уровни чувствительны к набору эталонных генов, применяемому для стандартизации (Таблица 5).
В альтернативном варианте уровни мРНК FGFR можно определить любым другим способом, при помощи которого можно количественно оценивать уровни мРНК. Подходящие способы включают, но не ограничиваются ими:
(1) Нозерн-блот. Нозерн-блоты можно применять для оценки молекулярной массы мРНК и для измерения относительных количеств мРНК, присутствующих в разных образцах. Общая процедура блоттинга начинается с экстракции суммарной РНК из образца гомогенизированной ткани или из клеток. РНК разделяют методом гель-электрофореза, обычно на агарозном геле. Поскольку на геле присутствует очень много различных видов РНК, РНК обычно проявляется скорее в виде мазка, нежели чем в виде дискретных полосок. РНК переносят на нитроцеллюлозную мембрану, хотя можно применять и другие типы мембран. Молекулы РНК сохраняют тот же характер разделения, который они имели в геле. Указанный блот инкубируют с зондом, обычно одноцепочечной ДНК. Этот зонд образует пары оснований с комплементарной последовательностью РНК и связывается с образованием двухцепочечной РНК-ДНК-молекулы. Зонд может быть радиоактивно меченым, или его можно присоединить к ферменту (например, щелочной фосфатазе или пероксидазе хрена). В последнем случае местоположение зонда обнаруживают путем его инкубации с бесцветным субстратом, так что присоединенный фермент превращается в окрашенный продукт, который можно увидеть или который продуцирует свет, который будет экспонироваться на рентгеновской пленке. Если зонд был радиоактивно меченым, то его можно непосредственно экспонировать на рентгеновскую пленку. (2000) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 41: 2357-62.
(2) Анализы зашиты от нуклеазы (NPA). NPA (включая анализы защиты от рибонуклеазы и анализы защиты от S1-нуклеазы) представляют собой чрезвычайно чувствительный способ обнаружения и количественного определения конкретных мРНК. Экстрагированную РНК сначала смешивают с радиоактивно мечеными РНК или ДНК-зондами, которые комплементарны представляющей интерес последовательности или последовательностям, и комплементарные цепи гибридизируются с образованием двухцепочечной РНК (или ДНК-РНК-гибрида). Затем указанную смесь подвергают воздействию рибонуклеаз, которые специфически расщепляют только одноцепочечную РНК (ДНК), но не обладают активностью в отношении двухцепочечной РНК (или ДНК-РНК-гибрида). Когда реакция заканчивается, чувствительные области РНК разлагаются до очень коротких олигомеров или отдельных нуклеотидов; оставшиеся фрагменты РНК представляют собой фрагменты, которые комплементарны добавленной антисмысловой цепи и, таким образом, содержат представляющую интерес последовательность. Оставшиеся защищенные фрагменты разделяют методом гель-электрофореза и визуализируют при помощи авторадиографии. Maddula, K. et al. FGFR и FGF ligand overexpression in lung cancer: Implication for targeted therapy. HTG Molecular Diagnostics, Тусон, штат Аризона, США, 2014 ASCO Annual meeting.
(3) Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР). ОТ-кПЦР произвела революцию в изучении экспрессии генов. В настоящее время теоретически возможно обнаружить транскрипт РНК любого гена, независимо от ограниченного количества исходного материала или относительно большого количества конкретной мРНК. В ОТ-кПЦР РНК-матрицу копируют в комплементарную ДНК (кДНК) с применением обратной транскриптазы ретровируса. Затем количество молекул кДНК экспоненциально увеличивают при помощи ПЦР, и такое увеличение числа молекул (амплификация) связано с образованием флуоресценции, которую можно легко обнаружить камерой во время каждого цикла ПЦР. Процесс отслеживают в режиме реального времени, поэтому он является количественным. Относительная количественная ОТ-кПЦР включает в себя увеличение числа молекул внутреннего контрольного транскрипта одновременно с представляющим интерес транскриптом гена. Внутренний контрольный транскрипт применяют для стандартизации образцов. После стандартизации непосредственное сравнение относительного количества конкретной мРНК можно осуществить по образцам. Для того чтобы относительные результаты ОТ-кПЦР являлись значимыми, все продукты ПЦР-реакции следует анализировать в линейном диапазоне амплификации. Yan, D., et al. (2011) Arthritis Res. Ther. 13 (4): R130; Wong, M.L. and Medrano, J.F. (2005) BioTechniques 39: 75-85.
(4) Гибридизация на ДНК-микроматрице. В микроматрицах GeneChip применяется гибридизация ДНК-сегментов (на матрице) и молекул-мишеней, представляющих собой РНК (из анализируемых образцов), для определения уровня экспрессии, т.е. для определения того, сколько молекул РНК образуется из данного гена. Известные ДНК-сегменты применяют в качестве «зондов» для связывания и идентификации образца мРНК. Хотя данный метод по существу не отличается от других методов гибридизации (таких как суазен- и нозерн-блоттинг), уникальным в отношении микроматриц является тот объем информации, который можно получить за один раз. Десятки тысяч последовательностей ДНК (или даже большее число олигонуклеотидов) расположены известным и упорядоченным образом (отсюда и термин «микроматрица») на небольшой твердой поддерживающей структуре или микрочипе. Образец РНК после амплификации и нанесения метки способствует связыванию с указанной микроматрицей. Если происходит экспрессия гена в образце, то будет происходить и гибридизация его мРНК (кДНК) с комплементарным ДНК-зондом на чипе. Затем указанный чип сканируют, получая как качественную, так и количественную информацию о функции конкретных генов. Dalma-Weiszhausz, D.D. et al. (2006) Methods enzymol. 410: 3-28; Yadav, V. et al. (2012) J. Biol. Chem. 287: 28087-98.
(5) Секвенирование РНК. Секвенирование РНК - это недавно разработанный подход к профилированию транскриптомов, в котором применяют технологии глубокого секвенирования. Способ секвенирования РНК также обеспечивает гораздо более точное измерение уровней транскриптов и их изоформ, чем другие способы. При проведении всех экспериментов по секвенированию РНК придерживаются одного и того же протокола. Суммарную РНК выделяют из представляющего интерес образца, который в зависимости от типа профилируемой РНК можно очистить для обогащения по содержанию мРНК, микроРНК или длинной промежуточной некодирующей РНК и т.д. до получения библиотеки. Получение библиотеки может включать такие стадии, как обратная транскрипция к кДНК, амплификация с применением ПЦР, и при получении можно сохранять или не сохранять информацию о цепочечности (strandedness). При секвенировании можно получить одно прочтение (рид) в реакции секвенирования одиночных концов или два прочтения, разделенных при помощи несеквенируемого фрагмента, в реакциях секвенирования спаренных концов. Li, F. et al. (2015) Cancer Discov. 5: 438-51. Обзор технологий глубокого секвенирования см. у Metzker, M.L. et al. (2010) Nat. Rev. Genet. 11: 31-46.
Экспрессию генов FGFR также можно оценить при помощи способов, в которых можно достоверным образом количественно определить уровни белка разных FGFR. Подходящие способы включают, но не ограничиваются ими:
(1) Вестерн-блоттинг. В вестерн-блоттинге применяют гель-электрофорез для разделения нативных белков по трехмерной структуре или денатурированных белков по длине полипептида. Затем указанные белки переносят на мембрану (обычно нитроцеллюлозу или ПВДФ), где их окрашивают при помощи первичных антител, специфичных к белку-мишени. После связывания антитело визуализируют либо при помощи определенной метки, присоединенной к первичному антителу, либо при помощи вторичного антитела, которое можно визуализировать. Wynes, M.W. et al. (2014) Clin. Cancer Res. 20: 3299-309.
(2) Иммунодоттинговый анализ. Дот-блоттинг представляет собой простой метод для идентификации известного белка в биологическом образце. Легкость и простота этого метода делает дот-блоттинг идеальным инструментом для диагностики. Ключевой особенностью дот-блоттинга является применение иммунообнаружения для идентификации конкретного белка, например, белкового маркера для заболевания. Как только белки иммобилизуются на белок-связывающей мембране, обычно нитроцеллюлозе или ПВДФ, их можно исследовать в присутствии первичного антитела, т.е. антитела, специфичного для представляющего интерес белка. После связывания указанное антитело визуализируют либо при помощи определенной метки, присоединенной к указанному первичному антителу, либо при помощи вторичного антитела. Girjes, А.А. et al. (1993) Veterinary Record 133: 136-41; Shekhar, M.S. (2010) Aquaculture Research 41: 1683-90.
(3) Иммуноанализ. Ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA) представляет собой исследование, в котором применяют антитела и явление изменение цвета для идентификации вещества, и твердофазный иммуноферментный анализ (EIA) для обнаружения присутствия вещества, обычно антигена, в жидком образце или влажном образце. Антигены, полученные из образца, присоединяют к поверхности. Затем на поверхность наносят дополнительное специфическое антитело, которое может связываться с антигеном. Это антитело связывается с ферментом, и на последней стадии добавляют субстрат фермента. В последующей реакции образуется обнаруживаемый сигнал, чаще всего это изменение цвета в указанном субстрате. Ряд технологий с применением платформ предлагают способы для мультиплексных и миниатюрных иммуноаффинных анализов (например, Luminex, MesoScale Discovery и PerkinElmer). Набор ELISA для определения рецептора фактора роста фибробластов человека 3 (FGFR3) (http://www.cusabio.com/); Lequin, R.M. (2005) Clin. Chem. 51: 2415-8.
(4) Иммунохроматография. В иммунохроматографическом анализе (также известный как горизонтальный проточный анализ или анализ на тест-полосках) применяют простые устройства, предназначенные для обнаружения присутствия (или отсутствия) мишени, представляющей собой анализируемое вещество, в образце (матрице) без необходимости в специализированном и дорогостоящем оборудовании, хотя существует много применений, которые поддерживаются считывающим оборудованием. Технология основана на применении серии капиллярных слоев, как, например, пористая бумага или спеченный полимер. Каждый из этих элементов обладает способностью к спонтанной транспортировке флюида (например, мочи). Первый элемент (подушечка для образца) действует как губка и удерживает избыток образца флюида. После впитывания указанный флюид перемещается ко второму элементу (подушечка для конъюгата), находящимся в высушенном состоянии биологически активным частицам в сахарно-соляной матрице, которая содержит все, чтобы гарантировать оптимизированную химическую реакцию между указанной молекулой-мишенью (например, антигеном) и ее химическим партнером (например, антителом), который иммобилизован на поверхности частиц. В то время как указанный образец флюида растворяет указанную сахарно-солевую матрицу, он также растворяет частицы и в процессе комбинированного транспорта указанную смесь образца и конъюгата, протекая через пористую структуру. Таким образом, указанное анализируемое вещество связывается с частицами при дальнейшем перемещении через третий капиллярный слой. Этот материал имеет одну или несколько областей (часто называемых полосами), в которой иммобилизацию третьей молекулы осуществляет изготовитель. К тому времени, когда смесь образца и конъюгата достигает таких полосок, анализируемое вещество связывается на частице, а третья «захватывающая» молекула связывает указанный комплекс. Через некоторое время, когда все больше и больше флюида проходит полоски, частицы накапливаются, а зона с полосками изменяет цвет. Как правило, имеется по меньшей мере две полоски: одна (контрольная), которая захватывает любую частицу и тем самым показывает, что условия реакции и технология протекают нормально, вторая содержит специфичную захватывающую молекулу и захватывает только те частицы, на которых иммобилизована молекула анализируемого вещества. После прохождения этих реакционных зон флюид проникает в конечный пористый материал, впитыватель, который действует просто как контейнер для отходов. Zeng. Q. et al. (2009) Am. J. Biomed. Sci. 1: 70-79.
(5) Иммуногистохимия. Иммуногистохимия (ИГХ) представляет собой метод, при помощи которого можно определить присутствие и расположение белков в тканевых срезах. Хотя он и является только полуколичественным, он позволяет наблюдать процессы в контексте интактной ткани. Основные стадии протокола ИГХ заключаются в следующем: фиксация и заливка ткани, разрезание и установка среза, депарафинизация и повторное гидратирование среза, применение процесса поиска антигена, иммуногистохимическое окрашивание и просмотр окрашивания под микроскопом. Для определения экспрессии FGFR в опухолевых тканях применяли следующий протокол: иммуноокрашивание проводили на 4-мкм парафинированных тканевых срезах. Вкратце, предметные стекла депарафинировали в ксилоле и повторно гидратировали с применением градиентов концентраций этанола, и эндогенную пероксидазу блокировали в присутствии 3% перекиси водорода. После демаскировки эпитопа предметные стекла промывали и блокировали забуференным TRIS солевым раствором в присутствии 0,1% (об.) Tween 20/5% (об.) нормальной сыворотки козы. Инкубацию в присутствии первичного антитела проводили в течение ночи при 4°С с последующей инкубацией в присутствии вторичного антитела в течение 30 мин при комнатной температуре. Срезы трижды промывали забуференным TRIS солевым раствором в присутствии 0,1% (об.) Tween 20, окрашивали диаминобензидином (DAB) и проводили контрокрашивание гематоксилином. Первичные антитела:
Моноклональное антитело кролика против FGFR1 (Cell Signaling Technology, № по каталогу 9740, №клона D8E4).
Поликлональное антитело кролика против FGFR2 (Novus Biologicals, № по каталогу NB200-642).
Моноклональное антитело мыши против FGFR3 (Santa Cruz Biotechnology, № по каталогу sc-13121, клон В-9)
Guancial et al. (2014); Redler, A. et al. (2013) PLoS One. 8: e72224.
(6) Масс-спектрометрия. Масс-спектрометрия (MC) измеряет отношение массы к заряду ионов для идентификации и количественного определения белков. Хотя при помощи масс-спектрометрии можно обнаруживать очень низкие концентрации анализируемого вещества в сложных смесях, МС по своей сути не является количественным методом вследствие значительной потери пептидов и ионов во время анализа. Поэтому пептидные метки или стандарты анализируют одновременно с образцом, и они действуют в качестве эталонной точки для относительного или абсолютного количественного определения содержания пептида. Catenacci. D.V. et al. (2014) PLoS One 9: e100586; Razavi, M. et al. (2013) Clin. Chem. 59:1514-22. Для объективной количественной оценки уровней FGFR можно применять метод масс-спектрометрии, используя режим жидкостного мониторинга выбранных реакций для ткани (LT-SRM). Hembrough, Т. et al. (2012) Clin. Proteomic: 9: 5; Hembrough, T. et al. (2013) J. Mol. Diagn. 5: 454-65.
(7) Проточная цитометрия. Проточная цитометрия представляет собой основанный на применении лазера биофизический метод, используемый для подсчета клеток, сортировки клеток, обнаружения биомаркеров и конструирования белков, включая суспендирование клеток в потоке флюида и их прохождение при помощи электронного устройства для обнаружения. Он позволяет одновременно проводить многопараметрический анализ физических и химических характеристик вплоть до тысячи частиц в секунду. При применении специфичных к белку антител, проточная цитометрия может обеспечить информацию относительно экспрессии на поверхности клеток и в некоторых случаях цитоплазматических или ядерных маркеров, которые применяют для понимания сложных популяций клеток или процессов. Yan, D. et al. (2011) Arthritis Res. Ther. 13: R130.
Каскадный график значений ΔТ/ΔС всех 66 PDX-моделей показан на Фигуре 1. В случае, когда значение ΔТ/ΔС в 0 применяли для определения эффективности лечения лекарственным средством (полное ингибирование роста опухоли), только для 21 из 66 опухолей (частота ответа приблизительно 32%) лечение Соединением А было эффективным. Поскольку PDX-модели представляют собой модели опухолей человека с низким пассажем и поэтому вероятно, что они в большей степени будут воспроизводить свойства опухолей человека, данные получали, чтобы спрогнозировать, что только приблизительно 32% людей (которые имели амплифицированный ген FGFR, экспрессировали продукт гибридного гена FGFR и/или демонстрировали некоторый уровень избыточной экспрессии мРНК FGFR) будут отвечать на лечение лекарственным средством, и что, скорее всего, для почти 68% лекарственное средство будет неэффективным. Отмечается, что обычными критериями отбора людей для проведения исследования на селективные ингибиторы тирозинкиназы (New Chemical Entities), которые обладают активностью в отношении FGFR, являются увеличенное число копий (амплификация, полисомия) гена FGFR или присутствие гена гибридного белка FGFR. Каскадный график значений ΔТ/ΔС всех PDX-моделей, которые демонстрируют увеличение числа копий гена и/или присутствие гибридного гена FGFR, также показал частоту ответа в 32,5% (Фигура 2, правый график). В связи с этим, применение этих критериев отбора не позволило идентифицировать подгруппу моделей, которые получали эффективное лечение Соединением А, или по меньшей мере дополнить такую подгруппу. По существу, тот же результат получали в обратном анализе, т.е. в том случае, когда были рассмотрены все PDX-модели, для которых не было обнаружено увеличение числа копий гена для любого FGFR или экспрессии гибридного гена FGFR (Фигура 2, левый график).
Неожиданно было обнаружено, что в том случае, когда рассматривались только модели, гиперэкспрессирующие FGFR до определенного уровня, 21 из 40 PDX-моделей (частота ответа приблизительно 52%) отвечала на лечение Соединением А (Фигура 3, правый график). И наоборот, когда в анализ были включены только модели, которые не гиперэкспрессировали FGFR до этого уровня, частота ответа равнялась 0 (Фигура 3, левый график). Эти данные убедительно доказали, что гиперэкспрессия FGFR (т.е. FGFR1, FGFR2 и FGFR3) является значительно лучшим прогностическим фактором эффективной терапии с применением Соединения А, чем увеличенное число копий гена FGFR и/или присутствие гибридного гена FGFR. Для целей последнего анализа уровень FGFR считался значительно гиперкспрессированным в том случае, если стандартизированный уровень его РНК был выше чем тот, который обнаруживают у 73% из 66 PDX-моделей (предельное значение для 73 процентиля). Пороговые уровни (экзон 14 РНК/эталонной РНК FGFR, определенный при помощи технологии NanoString, как это описано выше) составили 0,641 для FGFR1, 1,094 для FGFR2 и 0,815 для FGFR3.
Полученные результаты анализа всех моделей выявили присутствие FGFR-мутаций в некоторых моделях. Расчет частоты ответов, включая такие мутации в качестве критерия отбора, неожиданным образом подтвердил превосходную прогностическую способность гиперэкспрессии FGFR по сравнению с генетическими изменениями. Каскадный график значений ΔТ/ΔС всех PDX-моделей, которые показали увеличение числа копий гена и/или присутствие гибридного гена FGFR и/или FGFR-мутации, показал, что частота ответа составляет приблизительно 32% (Фигура 4, правый график), Таким образом, аналогично описанному выше, применение генетических изменений в качестве критериев отбора, включая FGFR-мутации, также не позволило идентифицировать подгруппу моделей, для которых лечение Соединением А являлось эффективным, или по меньшей мере включить их в эту подгруппу. По существу, тот же результат получили в обратном анализе, т.е. в случае, когда рассматривались все PDX-модели, для которых не было обнаружено никакого увеличения числа копий гена для любого FGFR, экспрессии гибридного гена FGFR или наличия FGFR-мутации (Фигура 4, левый график).
Отмечается, что прогностическую способность гиперэкспрессии FGFR можно изменить путем уменьшения или увеличения пороговых уровней экспрессии FGFR. На предельном значении уровня экспрессии для процентиля 44 частота ответа на терапию с применением Соединения А составляла приблизительно 36% (Таблица 1). Это значение по-прежнему является лучшим значением частоты ответа, чем значение, которое получают путем отбора по увеличенному числу копий гена FGFR и/или наличию гибридного гена FGFR и/или наличию FGFR-мутации. На предельном значении уровня экспрессии для 73 процентиля частота ответа была значительно выше, т.е. более 52% (Фигура 3, правый график, Таблица 1). На предельном значении уровня экспрессии для 90 она составляла более 71%. Однако на уровне 74 процентиля и при более высоких предельных значениях исключались некоторые модели, которые отвечали на лечение Соединением А.
Было установлено, что гиперэкспрессия как критерий отбора относительно нечувствителен к пороговому уровню ΔТ/ΔС, которое выбирали для того, чтобы отделить эффективное лечение Соединением А от неэффективного лечения. В приведенном выше анализе порог ΔТ/ΔС был установлен на нуле (0), соответствующий полной остановке роста опухоли в течение периода лечения. Когда порог ΔТ/ΔС был установлен на 0,4, что соответствует значительному уменьшению роста опухоли в течение периода лечения, частота ответа без отбора составляла 51,5% (Фигура 5). Когда рассматривались только модели, которые имели увеличенное число копий гена FGFR и/или они экспрессировали гибридный ген FGFR, частота ответа составляла 50% (Фигура 6, правый график). Когда рассматривались только PDX-модели, для которых не было обнаружено ни увеличения числа копий гена для любого FGFR, ни обнаруживаемой экспрессии гибридного гена FGFR, частота ответа составляла 53,8% (Фигура 6, левый график). И в этом же случае эти результаты подтвердили, что последние два критерия отбора были незначительными или не обладали прогностичностью. Когда рассматривались только модели, которые гиперэкспрессировали FGFR (предельное значение уровня экспресии для 73 процентиля), частота ответа достигала более 72% (Фигура 7, правый график). Таким образом, даже применяя такой менее строгий порог в 0,4 для определения эффективности лечения, гиперэкспрессия FGFR по-прежнему оставалась значимым прогностическим фактором эффективной терапии с применением Соединения А.
При пороговом уровне ΔТ/ΔС, установленном на 0,4, можно сделать такое же наблюдение, которое было описано выше, при рассмотрении FGFR-мутаций в критериях отбора. В случае, когда рассматривались только модели, которые имели увеличенное число копий гена FGFR, экспрессировали гибридный ген FGFR и/или содержали мутацию в гене FGFR, частота ответа составляла 52,4% (Фигура 8, правый график). Когда рассматривались только PDX-модели, для которых не было обнаружено ни увеличения числа копий гена для любого FGFR, экспрессии гибридного гена FGFR, ни наличия FGFR-мутации, частота ответа составляла 50% (Фигура 8, левый график).
2
2
Как ранее обсуждалось, вышеприведенные анализы не ограничивались методологией, применяемой для оценки экспрессии FGFR. Аналогичные данные можно получить другими способами измерения уровней мРНК, такими как нозерн-блоты, анализы защиты нуклеазы, ОТ-кПЦР, гибридизация на микроматрицах или секвенирование РНК. Пример, демонстрирующий хорошую корреляцию между результатами определения экспрессии мРНК с применением ОТ-кПЦР и технологии NanoString, показан на Фигуре 9. Графики показывают уровни мРНК, измеренные с применением каждой из технологий ОТ-кПЦР и NanoString на наборах для исследования образцов PDX-опухоли: (А) 16 образцов PDX-опухоли плоскоклеточной карциномы пищевода (ESCC) (R=0,915 для уровней мРНК FGFR1) и (В) 26 PDX-опухолей желудка (R=0,957 для уровней мРНК FGFR2). Измерения с применением технологии NanoString проводили в соответствии с процессом, описанным в разделе «Методология» настоящего документа, за исключением того, что стандартизацию выполняли с применением того же набора из трех эталонных генов, который использовали для стандартизации данных ОТ-кПЦР (см. ниже). Измерения с применением ОТ-кПЦР осуществляли следующим образом: суммарную РНК, полученную из фиксированных формалином и залитых парафином срезов ткани, выделяли с применением набора miRNeasy FFPE kit (QIAgen). Обратную транскрипцию проводили в присутствии 500 нг РНК с использованием набора Transcriptor Universal cDNA Master (Roche). Для проведения кПЦР кДНК амплифицировали с применением FAM-меченых красителей TaqMan Assays (Roche, Thermo) и набора LightCycler 1536 DNA Probes Master (Roche). Вычисление нормированных относительных уровней экспрессии осуществляли с применением программного обеспечения qbasePLUS версии 3.0 (Biogazelle). Нормирование проводили с применением трех стабильно экспрессируемых эталонных генов (CLTC, ALAS1 и MRPL19), которые были проверены с применением geNorm-модуля в qbasePLUS. Гиперэкспрессию FGFR можно также оценить по уровню экспрессии белка при помощи таких способов, как, например, вестерн-блоттинг, дот-блоттинг, ELISA, иммунохроматография, иммуногистохимия, масс-спектрометрия и проточная цитометрия. На основании данных, полученных при помощи любого из этих способов, можно определить необходимое предельное значение процентиля и соответствующие пороговые уровни для экспрессии мРНК FGFR или белка, обсужденные ранее.
Гиперэкспрессия FGFR представляет собой эффективный критерий для отбора субъектов, которые могут отвечать на терапию с применением Соединения А, независимо от признаков или подтипов рака. Расслоение результатов анализа, основанного на признаках или подтипе рака, обладает потенциалом для улучшения прогностической способности анализа гиперэкспрессии (который проводят так, как это описано выше), в частности, признаков или подтипов. Примеры, показывающие, что корреляция между экспрессией FGFR и эффективностью лечения имеет место для конкретных признаков, представлены на Фигурах 10 и 11. Например, график на Фиг. 11А показывает, что в PDX-моделях плоскоклеточной карциномы пищевода (ESCC) эффективность лечения Соединением А увеличивается со степенью экспрессии FGFR1. Отношение ΔТ/ΔС обратно коррелирует с показателем экспрессии FGFR1 в исследованных моделях пищевода (р-значение корреляции Спирмана: 0,0043872).
На основании вышеописанных выводов и заключений авторы настоящего изобретения предлагают способ идентификации и выбора субъектов, у которых диагностирован рак, которые могут отвечать на лечение Соединением А. Первая стадия состоит в получении от субъекта биопсии опухолевой ткани или жидкой биопсии (например, крови, из которой можно выделить циркулирующие опухолевые клетки или экзосомы). Биопсию обрабатывают согласно требованиям способа, выбранного для определения уровней экспрессии генов FGFR1, FGFR2 и FGFR3. На следующей стадии оценивают количество РНК или белка FGFR1, FGFR2 и FGFR3. На последней стадии полученные таким образом значения экспрессии сравниваются с предварительно установленными пороговыми уровнями, которые определяли при помощи анализа, тип которого обсуждали ранее. Если уровень РНК или белка субъекта для любого из FGFR1, FGFR2 и FGFR3 превышает соответствующий пороговый уровень, указанный субъект рассматривается в качестве кандидата на лечение Соединением А. Изобретение также относится к способу персонализированной терапии рака, при котором пациенту, отобранному посредством последнего способа диагностики, который может отвечать на лечение Соединением А, назначают схему лечения, включающую введение фармацевтической композиции, содержащей Соединение А.
Отмечается, что предварительно установленные пороговые уровни для конкретных признаков рака и, как следствие, предельных значений, могут отличаться от тех значений, которые определяют для признаков. В случае плоскоклеточной карциномы пищевода можно выбрать пороговые уровни FGFR1, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 44% до приблизительно 84% (0,104-1,362), поскольку этот диапазон пороговых уровней не исключает любую модель, которая может отвечать на лечение Соединением А. Более предпочтительными являются пороговые уровни FGFR1, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 60% до приблизительно 84% (0,301-1,362). Еще более предпочтительными являются пороговые уровни FGFR1, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 70% до приблизительно 84% (0,558-1,362). Наиболее предпочтительными являются пороговые уровни FGFR1, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 80% до приблизительно 84% (0,759-1,362). Для рака желудка можно выбрать пороговые уровни FGFR2, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 44% до приблизительно 83% (0,257-1,610), поскольку этот диапазон пороговых уровней не исключает любую модель, которая может отвечать на Соединение А. Более предпочтительными являются пороговые уровни FGFR2, соответствующие предельным значениям для процентилей приблизительно от 60% до приблизительно 83% (0,669-1,610). Еще более предпочтительными являются пороговые уровни FGFR2, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 70% до приблизительно 83% (0,984-1,610). Наиболее предпочтительными являются пороговые уровни FGFR2, соответствующие предельным значениям для процентилей от приблизительно 80% до приблизительно 83% (1460-1,610). Отмечается, что в общем (независимом от показаний для лечения) способе определяются уровни FGFR1, FGFR2 и FGFR3, тогда как в способе, связанным с определенном типом рака, достаточно определить представляющий(-щие) интерес FGFR (т.е. известно, что его содержание увеличено у части субъектов, страдающих раком этого типа).
Также отмечается, что описанный метод диагностики основан на рациональном предположении, что опухоль пациента и опухоль, выращенная у животного непосредственно из фрагментов опухоли указанного пациента, демонстрируют близкие уровни экспрессии генов FGFR как на уровне РНК, так и белков. Правдоподобность этого предположения подтверждается недавним анализом Guo et al. 2016 Cancer Res. [электронная публикация до выхода в печать] (CAN-15-3245, опубликовано в июне 2016 года).
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, содержащие ингибитор киназы FGFR, Соединение А, можно вводить перорально, парентерально, при помощи ингаляционного спрея, локально, ректально, назально, буккально, вагинально или через имплантированный резервуар, в предпочтительном варианте путем перорального введения или введения путем инъекции. Указанные фармацевтические композиции могут содержать любые обычные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные вещества или среды-носители. В некоторых случаях рН состава можно регулировать при помощи фармацевтически приемлемых кислот, оснований или буферов для улучшения стабильности активного агента или его формы доставки. Стандартные фармацевтические носители и их составы описаны, без ограничений, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Истон, штат Пенсильвания, 19-е изд. 1995. В контексте настоящего описания термин парентеральный включает подкожную, внутрикожную, внутривенную, внутримышечную, внутрисуставную, внутриартериальную, интрасиновиальную, интрастернальную, интратекальную, внутриочаговую и внутричерепную инъекцию или инфузионные методы.
Жидкие лекарственные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, микроэмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к активному агенту жидкие лекарственные формы могут содержать инертные разбавители, обычно применяемые в данной области техники, такие как, например, вода или другие эмульгаторы, солюбилизирующие агенты и растворители, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности, хлопковое, арахисовое, кукурузное, масло из зародышей пшеницы, оливковое, касторовое и кунжутное масло), глицерин, тетрагидрофурфуриловый спирт, полиэтиленгликоли и сложные эфиры жирных кислот и сорбитана и их смеси. Помимо инертных разбавителей, композиции для перорального введения могут также включать адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты, подсластители, ароматизаторы и ароматизирующие агенты.
Препараты для инъекций, например, стерильные водные или масляные суспензии для инъекций, можно получить в соответствии с известным уровнем техники с применением подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный препарат для инъекций может также представлять собой стерильный раствор для инъекций, суспензию или эмульсию в нетоксичном разбавителе или растворителе, приемлемом для парентерального введения, например, в виде раствора в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых сред-носителей и растворителей, которые можно использовать, присутствует вода, раствор Рингера, U.S.P. и изотонический раствор хлорида натрия и раствор декстрозы. Кроме того, стерильные нелетучие масла обычно используют в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как олеиновая кислота, применяют для получения инъекционных препаратов.
Составы для инъекций можно стерилизовать, например, методом фильтрации через удерживающий бактерии фильтр, при помощи автоклавирования, сухого жара, ионизирующего излучения или путем включения активного агента в форме стерильной твердой композиции, которую можно растворить или диспергировать в стерильной воде или другой стерильной среды для инъекций перед применением.
Чтобы продлить действие активного агента, зачастую желательно замедлить абсорбцию активного агента из подкожной или внутримышечной инъекции. Этого можно достигнуть за счет применения жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала с плохой растворимостью в воде. Скорость абсорбции активного агента затем зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера кристалла и кристаллической формы. В альтернативном варианте всасывание с отсрочкой парентерально вводимого лекарственного средства достигается при помощи растворения или суспендирования активного агента в масляной среде-носителе. Депо-формы для инъекций получают путем микрокапсулирования активного агента в биологически разлагаемые полимеры, такие как полилактид-полигликолид. В зависимости от соотношения активного агента и полимера, а также природы конкретного используемого полимера, можно контролировать скорость высвобождения активного агента. Примеры других биологически разлагаемых полимеров включают поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Депо-составы для инъекций также получают путем захвата активного агента в липосомах или микроэмульсиях, которые совместимы с тканями организма.
Твердые лекарственные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активный агент смешан с по меньшей мере одним инертным, фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом или носителем, таким как цитрат натрия или дикальция фосфат, и/или: а) наполнителями или удешевляющими добавками (extender), такими как крахмалы, лактоза, целлюлоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота, b) связывающими веществами, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и аравийская камедь, с) увлажнителями, такими как глицерин, d) дезинтегрирующими агентами, такими как агар-агар, карбонат кальция, кроскармелоза, кросповидон, карбоксиметилцеллюлоза, картофельный крахмал или крахмал тапиоки, альгиновая кислота, некоторые силикаты и карбонат натрия, е) замедляющими образование раствора агентами, такими как парафин, f) ускорителями абсорбции, такими как соединения четвертичного аммония, g) смачивающими агентами, такими как, например, цетиловый спирт, лаурилсульфат натрия и моностеарат глицерина, h) абсорбентами, такими как каолин и бентонитовая глина, и/или i) смазывающими веществами, такие как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия и их смесями. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственная форма может также содержать буферные агенты.
Твердые композиции аналогичного типа также можно использовать в качестве наполнителей в желатиновых капсулах с мягким и твердым содержимым с применением таких вспомогательных веществ, как лактоза или молочный сахар, а также полиэтиленгликолей с высокой молекулярной массой и им подобных.
Твердые лекарственные формы таблеток, драже, капсул, пилюль и гранул можно получить с применением покрытий и шеллаков, таких как энтеросолюбильные покрытия и другие покрытия, хорошо известные в области получения лекарственных средств. Они могут необязательно содержать непрозрачные агенты, и могут также состоять из композиции, из которой они высвобождают активный агент только или в предпочтительном варианте в определенной части кишечного тракта, необязательно, с отсрочкой. Примеры композиций, находящихся в виде включений, которые можно применять, включают полимерные вещества и воски.
В целом схемы лечения согласно настоящему изобретению включают введение субъекту-человеку, нуждающемуся в таком лечении, от 10 мг до 250 мг Соединения А в день в однократных дозах или дозах для многократного приема, как, например, 2-суточных дозах.
Количество активного агента, которое можно комбинировать с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами или носителями для получения лекарственной формы с однократной дозировкой, будет варьироваться в зависимости от конкретного способа введения и, возможно, от субъекта, который получает лечение. Обычный препарат будет содержать от 1% до 95% активного агента (масс./масс.). В альтернативном варианте такие препараты могут содержать от 20% до 80% активного агента. Может потребоваться более низкая или более высокая доза, чем те, которые указаны выше. Конкретные дозировки и схемы лечения для любого конкретного субъекта будут зависеть от множества факторов, включая возраст, массу тела, площадь поверхности тела, общее состояние здоровья, пол, диету, время введения, скорость выделения, комбинацию лекарственных средств, тяжесть и течение заболевания, состояние или симптомы, предрасположенность субъекта к указанному заболеванию, состоянию или симптомам и мнение лечащего врача.
Вычисление диапазонов значений в настоящем документе предназначено просто для использования в качестве условного способа индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в указанный диапазон до тех пор, пока в настоящем документе не указано иное, и каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было отдельно представлено в настоящем документе. До тех пор, пока не указано иное, примерами соответствующих приблизительных значений (например, все точные примеры значений, представленные относительно конкретного фактора или измерения, можно также рассматривать для получения соответствующего приблизительного измерения, измененного при помощи термина «приблизительно» в случае, когда это необходимо).
Применение любых и всех примеров или формулировок для описания примеров (например, «такой как»), приведенных в настоящем документе, предназначено только для лучшего освещения настоящего изобретения и не является ограничением для объема настоящего изобретения до тех пор, пока не указано иное.
Цитирование и включение патентных документов в настоящем описании сделано только для удобства и не отражает какого-либо представления о действительности, патентоспособности и/или принудительной реализации таких патентных документов. Описание в данном документе любого аспекта или варианта реализации настоящего изобретения с применением терминов, как, например, ссылка на элемент или элементы, предназначено для обеспечения поддержки аналогичного аспекта или варианта реализации настоящего изобретения, который «состоит из», «состоит по существу из» или «по существу содержит» такой конкретный элемент или элементы до тех пор, пока не указано иное или до тех пор, пока это явно не противоречит контексту (например, композицию, описываемую как содержащую конкретный элемент, следует понимать как описание композиции, состоящей из этого элемента до тех пор, пока не указано иное или до тех ор, пока это явно не противоречит контексту).
Настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты предмета изобретения, указанного в аспектах или формуле изобретения, представленных в настоящем документе, в максимальной степени, разрешенной применяемыми правовыми нормами.
Все публикации и патентные документы, приведенные в настоящем описании, полностью включены в настоящее описание посредством ссылки, как если бы каждая отдельная публикация или патентный документ были конкретно и отдельно указаны для включения посредством ссылки.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Эффективность Соединения А в PDX-моделях желудка in vivo относительно экспрессии и/или амплификации FGFR2
11 PDX-моделей рака желудка были выбраны с учетом числа их копий гена (GCN) и уровня экспрессии FGFR2, а также числа слияний FGFR2, чтобы составить сбалансированный набор моделей с уровнями экспрессии FGFR2, также распределенными настолько, насколько это возможно.
3
Для каждой модели опухоли оценивали (или повторно оценивали) действие Соединения А на рост опухоли (эффективность лечения), числа копий гена FGFR и уровни мРНК FGFR. Фрагменты опухолей, полученные от обсемененных метастазами мышей, инокулированных выбранными PDX-опухолями, собирали и применяли для инокуляции самок безтимусных (голых) мышей Balb/c. Каждую мышь инокулировали подкожно в правую боковую область брюшка с одним фрагментом опухоли (диаметром 2-3 мм) для развития опухоли. Лечение начинали, когда средний размер опухоли достигал приблизительно 200-250 мм. Соединение А (60-80 мг/кг), приготовленное в виде суспензии в 1% коллидоне VA64 в деионизированной воде (т.е. 1% коллидон VA64 в деионизированной воде), или только в среде-носителе перорально вводили мышам с опухолью через желудочный зонд ежедневно в течение 14 последовательных дней. Для каждой PDX-модели в группе лечения применяли 3 мышей, а 3 мышей применяли в качестве контрольных животных (только среда-носитель).
3
1
а
а
Объем опухоли измеряли два раза в неделю в двух измерениях с применением кронциркуля и объем выражали в мм по формуле: V=0,5×b, где  и b - длинный и короткий диаметры опухоли соответственно. Массу тела также регистрировали два раза в неделю. Эффективность лечения выражали как ΔТ/ΔС, при этом ΔТ говорит об относительном изменении объема опухоли у животных, получавших лечение лекарственным средством, а ΔС выражает относительное изменение объема опухоли у животных, не получавших лечение лекарственным средством, между последним днем лечения и началом лечения (разность в медианных объемах). Результаты, полученные для разных моделей, представлены в Таблице 6.
Число копий FGFR оценивали методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Опухолевую ткань, полученную от животных с опухолью, фиксировали в забуференном формалине и включали в парафиновые блоки (фиксированные формалином и залитые парафином). Срезы тканей размером от 3 до 4 мкм размещали на силанизированных предметных стеклах, депарафинировали, обрабатывали протеазой, промывали, денатурировали ДНК и затем гибридизировали с зондом для определения гена FGFR, как это описано у Schildhaus, H.U. et al. (2012) Mol. Pathol. 25: 1473-80. После гибридизации опухолевую ткань сканировали на определение мест амплификации с применением флуоресцентного микроскопа, как это описано у Schildhaus et al. (2012). В качестве зондов для определения гена FGFR применяли двухцветный зонд FGFR1/CEN 8, двухцветный зонд FGFR2/CEN 10 и двухцветный зонд FGFR3/4p11 (все получены от компании Zytovision GmbH, Бремерхафен, Германия). Увеличение числа копий гена (GCN) определяли либо как амплификацию (соотношение количества сигналов от зонда для определения гена FGFR для FISH-анализа к количеству сигналов от центромерного зонда составляет ≥2,2), либо как полисомию, определяемую как соотношение количества сигналов от зонда для определения гена FGFR к количеству сигналов от центромерного зонда, составляющее <2,2, однако при этом для каждого из зондов для определения гена FGFR и центромерного зонда количество сигналов >2.
Уровни мРНК определяли при помощи технологии NanoString, описанной выше в разделе «Методология».
*Е10-14и16 представляют собой экзоны 10-14 и 16 кодирующей последовательности РНК FGFR. Последние экзоны кодируют большую часть тирозинкиназного домена FGFR. Числа обозначают уровни экспрессии относительно медианы уровней экспрессии 16 эталонных генов, перечисленных в нижней части Таблицы 2 (измерены при помощи анализа экспрессии генов с применением системы nCounter от компании NanoString).
Взаимосвязь между эффективностью лечения Соединением А (ΔТ/ΔС) и экспрессией мРНК FGFR2 (измеренной как уровень экспрессии одного из вышеупомянутых экзонов 10-14 и 16) показана на Фигуре 10 (А), при этом также указаны модели, демонстрирующие амплификацию FGFR2 (FISH-соотношение >2,2, незакрашенные кружки). По всей видимости повышенный уровень FGFR2 ассоциируют с лучшей противоопухолевой эффективностью (р-значение корреляции Спирмана: 0,0150174).
На Фигуре 10 (В) в ином виде представлены те же результаты, сгруппированные по двум категориям, а именно отвечающие модели (ΔТ/ΔС<0) и не отвечающие модели (ΔТ/ΔС>0) по сравнению с уровнями экспрессии мРНК FGFR2, а также указывающие на амплификацию FGFR2 (FISH-соотношение >2,2, незакрашенные кружки).
Очевидно, что отвечающие модели и не отвечающие модели отображают разные уровни экспрессии FGFR2, и что выбор моделей (т.е. опухолей пациента) только на основе увеличения числа молекул FGFR2 (незакрашенные кружки) не позволяет выбрать все отвечающие модели. Действительно, одна модель, в которой не наблюдали амплификации, но наблюдали высокий уровень экспрессии FGFR2, ответила на лечение Соединением А.
Пример 2: Эффективность Соединения А в PDX-моделях плоскоклеточной карциномы пищевода (ESCC) in vivo относительно экспрессии и/или амплификации FGFR1
13 PDX-моделей ESCC выбрали с учетом их GCN и уровня экспрессии FGFR1, чтобы составить сбалансированный набор моделей с уровнями экспрессии FGFR1, также распределенными настолько, насколько это возможно. В данном конкретном методе индикации ESCC ни о каких слияниях FGFR1 пока не сообщалось.
3
Для каждой модели опухоли оценивали (или повторно оценивали) действие Соединения А на рост опухоли (эффективность лечения), числа копий гена FGFR и уровни мРНК FGFR. Фрагменты опухолей, полученные от обсемененных метастазами мышей, инокулированных выбранными PDX-опухолями, собирали и применяли для инокуляции самок безтимусных (голых) мышей Balb/c. Каждую мышь инокулировали подкожно в правую боковую область брюшка с одним фрагментом опухоли (диаметром 2-3 мм) для развития опухоли. Лечение начали, когда средний размер опухоли достигал приблизительно 200-250 мм. Соединение А (60-80 мг/кг), приготовленное в виде суспензии в 1% коллидоне VA64 в деионизированной воде (т.е. 1% коллидон VA64 в деионизированной воде), или только в среде-носителе перорально вводили мышам с опухолью через желудочный зонд ежедневно в течение 14 последовательных дней. Для каждой PDX-модели в группе лечения применяли 3 мышей, а 3 мышей применяли в качестве контрольных животных (только среда-носитель).
3
2
а
а
Объем опухоли измеряли два раза в неделю в двух измерениях с применением кронциркуля и объем выражали в мм по формуле: V=0,5×b, где  и b - длинный и короткий диаметры опухоли соответственно. Массу тела также регистрировали два раза в неделю. Эффективность лечения выражали как ΔТ/ΔС, при этом ΔТ говорит об относительном изменении объема опухоли у животных, получавших лечение лекарственным средством, а ΔС выражает относительное изменение объема опухоли у животных, не получавших лечение лекарственным средством, между последним днем лечения и началом лечения (разность в медианных объемах). Результаты, полученные для разных моделей, представлены в Таблице 7.
Число копий FGFR оценивали методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Опухолевую ткань, полученную от животных с опухолью, фиксировали в забуференном формалине и включали в парафиновые блоки (фиксированные формалином и залитые парафином). Срезы тканей размером от 3 до 4 мкм размещали на силанизированных предметных стеклах, депарафинировали, обрабатывали протеазой, промывали, денатурировали ДНК и затем гибридизировали с зондом для определения гена FGFR, как это описано у Schildhaus, H.U. et al. (2012) Mol. Pathol. 25: 1473-80. После гибридизации опухолевую ткань сканировали на определение мест амплификации с применением флуоресцентного микроскопа, как это описано у Schildhaus et al. (2012). В качестве зондов для определения гена FGFR применяли двухцветный зонд FGFR1/CEN 8, двухцветный зонд FGFR2/CEN 10 и двухцветный зонд FGFR3/4p11 (все получены от компании Zytovision GmbH, Бремерхафен, Германия). Увеличение числа копий гена (GCN) определяли либо как амплификацию (соотношение количества сигналов от зонда для определения гена FGFR для FISH-анализа к количеству сигналов от центромерного зонда составляет ≥2,2), либо как полисомию, определяемую как соотношение количества сигналов от зонда для определения гена FGFR к количеству сигналов от центромерного зонда, составляющее <2,2, однако при этом для каждого из зондов для определения гена FGFR и центромерного зонда количество сигналов >2.
Уровни мРНК определяли при помощи технологии NanoString, описанной выше в разделе «Методология».
*Е10-14и16 представляют собой экзоны 10-14 и 16 кодирующей последовательности РНК FGFR. Последние экзоны кодируют большую часть тирозинкиназного домена FGFR. Числа обозначают уровни экспрессии относительно медианы уровней экспрессии 16 эталонных генов, перечисленных в нижней части Таблицы 2 (измерены при помощи анализа экспрессии генов с применением системы nCounter от компании NanoString).
Взаимосвязь между эффективностью лечения Соединением А (ΔТ/ΔС) и экспрессией мРНК FGFR1 (измеренной как уровень экспрессии одного из вышеупомянутых экзонов 10-14) показана на Фигуре 11 (А), при этом также указаны модели, демонстрирующие амплификацию FGFR1 (FISH-соотношение >2,2, незакрашенные кружки). По всей видимости повышенный уровень FGFR1 связан с лучшей противоопухолевой эффективностью (р-значение корреляции Спирмана: 0,0043872).
На Фигуре 11 (В) в ином виде представлены те же результаты, сгруппированные по двум категориям, а именно отвечающие модели (ΔТ/ΔС<0) и не отвечающие модели (ΔТ/ΔС>0) по сравнению с уровнями экспрессии мРНК FGFR1, а также указывающие на амплификацию FGFR1 (FISH-соотношение >2,2, незакрашенные кружки).
Очевидно, что отвечающие модели и не отвечающие модели отображают разные уровни экспрессии FGFR1, и что для данного конкретного признака ESCC изменения в структуре генов, как, например, амплификация (незакрашенные кружки) не позволяет выбрать модели, которые отвечают на лечение Соединением А.
Хотя настоящее изобретение было более подробно описано при помощи иллюстрации и примера для ясности понимания, специалисту в данной области техники будет понятно, что в рамках идеи настоящего изобретения в нем можно осуществить некоторые изменения и модификации без отклонения от объема прилагаемой формулы изобретения.