Идентификация аминокислот, входящих в состав кожи человека, с помощью спектров диапазона 0,05–1,2 ТГц

ИДЕНТИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ, ВХОДЯЩИХ В СОСТАВ КОЖИ

УДК 681.784.88, 535.36

ИДЕНТИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ, ВХОДЯЩИХ В СОСТАВ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА, С ПОМОЩЬЮ СПЕКТРОВ ДИАПАЗОНА 0,05-1,2 ТГЦ А.А. Езерская, М.В. Цуркан, О.А. Смолянская, А.В. Капралова, Н.С. Балбекин, И.В. Романов, И.В. Прожеев, Е.А. Стрепитов, И.Ю. Просанов

Методом терагерцовой (ТГц) спектроскопии с разрешением во времени получены спектры кожи человека и таблети-рованных препаратов аминокислот в диапазоне 0,05-1,2 ТГц. Сделано сопоставление спектральных линий аминокислот для идентификации их в коже. Показано, что наиболее хорошо различимы в спектре кожи следующие аминокислоты: триптофан, цистеин, аланин, глицин, фенилаланин и гистидин. ТГц спектральные линии указанных аминокислот связаны с колебательными модами молекул, которые обусловлены химическими реакциями, процессами гидратации и конформных изменений молекул в коже человека. Определение спектральных линий аминокислот и других характерных молекул, участвующих в метаболических процессах кожи, необходимо для разработки ТГц диагностического прибора с максимальной чувствительностью и селективностью. Ключевые слова: терагерцовая спектроскопия, диагностика, кожа человека, аминокислоты.

Введение

Исследования в области применения ТГц излучения в медицине направлены, в основном, на диагностику различных заболеваний человека и животных [1, 2]. Наиболее актуальными объектами диагностических исследований являются патологические новообразования кожи человека, а также динамика восстановления кожи после полученной травмы. В этом направлении получены положительные результаты, показывающие однозначную идентификацию пораженных областей кожи с помощью ТГц спектроскопии [3]. В том числе, большое количество экспериментальных работ по данной тематике было проведено в научно-образовательном центре фемтосекундной оптики и фемтотехнологий НИУ ИТМО. Однако до сих пор неизученным оставался вопрос идентификации различных биологических молекул, входящих в состав кожи человека, в ТГц спектрах. На данный момент имеются предположения о том, что отдельные пики ТГц спектров характеризуют поглощение воды, входящей в состав кожи [1, 4]. Также в литературе встречаются работы, в которых приводятся ТГц спектры отдельных биологических молекул [5, 6]. Однако общая картина изменения спектров ТГц излучения в результате взаимодействия с кожными покровами на данный момент отсутствует. Очевидно, что для разработки медицинских приложений необходимо заполнить эту нишу.

В ТГц диапазоне частот лежат линии поглощения, соответствующие вращательным движениям молекул, молекулярных групп сложных молекул. Также излучение оказывает влияние на молекулярные комплексы, структурированные за счет межмолекулярных взаимодействий - ван-дер-ваальсовых сил и водородных связей. Развитие ТГц спектроскопии позволяет получить новые сведения как о конформации молекул, так и о характеристиках межмолекулярных взаимодействий при различных условиях.

Особый интерес представляет оценка возможных конформационных изменений сложных биологических молекул при их взаимодействии или изменении условий и среды функционирования молекул. К настоящему времени хорошо известно, что функциональное состояние биологической молекулы зависит от ее конформационных особенностей [7-9]. В белке акцепторами ТГц излучения являются аминокислоты, поэтому представляет несомненный интерес изучение влияния излучения ТГц диапазона на состояние колебательно-вращательных мод индивидуальных аминокислот, в первую очередь таких, как характеристические белковые хромофоры - триптофан, тирозин и пр. Практически при любых физико-химических воздействиях на белок, включая и электромагнитное излучение, именно эти аминокислоты обнаруживают различия в поглощении излучения при стандартной УФ спектроскопии [7, 8].

В связи с этим представляется актуальным исследование влияния ТГц излучения на колебательно-вращательные частоты этих хромофоров в коже человека в ТГц диапазоне.

Материалы и методы

Терагерцовый рефлектометрический томограф. Исследование спектров отражения образцов в диапазоне 0,05-1,2 ТГц проводилось с помощью терагерцового рефлектометрического томографа. Его схема представлена на рис. 1. В основе работы устройства лежит принцип записи распределения электрической компоненты поля до и после отражения от образцов. Восстановление спектра ТГц излучения реализуется с помощью вычисления интеграла Фурье по записанным данным.

Луч с выхода FL-1 поступает на светоделитель пучка 1, где разделяется на два луча. Пробный луч распространяется по оптической схеме (система зеркал M, электрооптический кристалл 9, ахроматическая четвертьволновая пластина 10, призма Волластона 11) и поступает на вход балансного детектора 12. Луч накачки последовательно проходит оптико-механический модулятор 5, оптическую линию задержки 2 и поступает на вход полупроводникового кристалла InAs 3. Излучение с выхода 3 через систему двух параболических зеркал и делитель ТГц излучения 7 падает на исследуемый образец 6. Отраженное образцом излучение через параболическое зеркало 4 и делитель 7 падает на электрооптический кристалл CdTe 9, фо-

кусируясь линзой 8. Под действием электрической компоненты ТГц излучения изменяется плоскость поляризации электрооптического кристалла. Таким образом, электрическая компонента ТГц излучения с помощью фазосдвигающей пластинки 10 и призмы Волластона 11 детектируется балансным детектором 12 с синхронным усилением. Изменение времени задержки луча накачки приводит к сдвигу времени открытия электрооптического кристалла, что позволяет сканировать распределение электрической компоненты поля по времени. Данные измерений с синхронного усилителя заносятся в персональный компьютер с помощью встроенного аналого-цифрового преобразователя.

В таблице представлены основные характеристики ТГц рефлектометрического томографа.

м ' \М

8 о 10

12

Ч^Г

Рис. 1. Схема ТГц рефлектометрического томографа: FL-1 - лазер фемтосекундных импульсов на Yb:KYW;

М - зеркала с R « 100% при падении светового пучка под 45°; 1 - светоделитель; 2 - оптическая линия задержки; 3 - полупроводниковый кристалл InAs; 4 - 45° параболические зеркала; 5 - оптико-механический модулятор; 6 - объект исследования; 7 - светоделитель ТГц излучения на основе пластины из высокоомного кремния; 8 - линза из TPX (поли-4-метилпентен-1) c f = 5 см; 9 - электрооптический кристалл CdTe; 10 - ахроматическая четвертьволновая пластина; 11 - призма Волластона; 12 - балансный детектор

Характеристика Значение

Средняя мощность ТГц излучения, мкВт 30 ± 3

Мощность импульса, мВт 120 ± 10

Длительность импульса, пс 3

Энергия импульса, фДж 360 ± 30

Спектральный диапазон, ТГц 0,05-2,0

Отношение сигнал/шум в спектре 100

Частота повторения, МГц 75

Частота модуляции, Гц 433

Таблица. Характеристики ТГц рефлектометрического томографа

Методика измерений спектра пропускания кожи человека и отдельных аминокислот состоит из следующих этапов:

1. запускается ТГц рефлектометрический томограф, согласно порядку включения;

2. на персональном компьютере запускается программа управления томографом;

3. производится измерение амплитуды электрической компоненты поля в отсутствии измеряемого образца;

4. предварительно подготовленные образцы помещаются согласно схеме (рис. 1) в измерительную установку;

5. производится измерение амплитуды электрической компоненты поля, отразившегося от образца;

6. полученные данные заносятся в программу, реализующую алгоритм преобразования Фурье;

7. по полученным спектральным выборкам определяется частота отражения ТГц излучения в образцах.

Подготовка кожи для экспериментального исследования. Для получения спектра нормальной кожи облучался участок кожи руки человека с внешней стороны, представленный на рис. 2.

Подготовка аминокислот для экспериментального исследования. В качестве объектов были использованы таблетированные формы порошковых лиофиллизированных препаратов следующих аминокислот: аланин, глицин, гистидин, триптофан, фениланин, цистеин (фирма Sigma, США). Образцы для эксперимента готовились путем прессования порошков аминокислот в таблетки диаметром 3 мм и толщиной около 1,5 мм. Прессование производилось в вакууме в стальных оправках. Эксперименты проводились при комнатной температуре. Исследуемые образцы кожи и аминокислот устанавливались в перетяжку ТГц луча, диаметр которого составлял 1 мм. Время экспозиции образца под излучением составляло 5 минут. Спектр каждого образца записывался три раза. Результаты измерений по каждому образцу усреднялись.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТ, ВХОДЯЩИХ В СОСТАВ КОЖИ ...

Рис. 2. Фотография руки женщины 21 года с участком облучаемой кожи

Результаты и их обсуждение

На рис. 3 представлен спектр отражения нормальной кожи человека.

10

bJ о, н

3

й <

< О,

н

^

О

а н

О

J3

О к Ala, 5 о к

F, ТГц

Рис. 3. ТГц спектр отражения участка нормальной кожи человека: R - ТГц отраженный сигнал, в условных единицах; F - частота. Ala - аланин; Cys - цистеин; His - гистидин; Gly - глицин; Trp - триптофан;

Phe - фениланин; H2O - вода

На спектре удалось выделить спектральные линии исследованных аминокислот. Так, рядом с линией отражения кожи на частоте 0,26 ТГц линия отражения имеется у аланина, гистидина, триптофана и лизина. Аминокислоты расположены в порядке уменьшения интенсивности пика отражения. Линия отражения кожи на частоте 0,36 ТГц совпала с линиями следующих аминокислот: глицин, триптофан и аланин. Отражение на частоте 0,82 ТГц совместилось с отражением аланина. Линии отражения кожи имеются в области частот 0,87; 0,89; 0,91 ТГц. Этим линиям сопоставлены следующие аминокислоты: глицин, фениланин, цистеин, аланин и триптофан. Указанные аминокислоты содержатся в больших количествах в коже и соединительной ткани, поэтому полезны для ее восстановления при повреждении [10]. Глицин замедляет дегенерацию мышечной ткани. Он является источником креатина - вещества, содержащегося в мышечной ткани и используемого при синтезе ДНК и РНК. Цистеин играет важную роль в процессах формирования тканей кожи. Он входит в состав альфа-кератина - основного белка ногтей, кожи и волос, способствует формированию коллагена и улучшает эластичность и текстуру кожи.

Линии отражения на частотах 0,55; 0,63; 0,73; 1 ТГц, а также 1,1 и 1,17 ТГц были отнесены к пикам, связанным с поглощением жидкой воды [11, 12] и водяного пара [13] в терагерцовой области частот. Субмиллиметровое, т.е. ТГц излучение поглощается парами воды и молекулярным кислородом [14]. С большой вероятностью можно считать, что в коже человека возможными фоторецепторами субмиллиметрового диапазона могут быть свободная вода и гидратные оболочки ионов и молекул, находящихся во внеклеточной жидкости, а также растворенный в ней молекулярный кислород. Изменение состояния воды и кислорода может вызвать изменение конформации примембранных белков.

8

6

4

2

0

Заключение

Получены ТГц спектры отражения нормальной кожи человека и некоторых аминокислот. Показано, что некоторые линии отражения кожи совпадают со следующими аминокислотами: триптофан, цис-теин, аланин, глицин, фенилаланин, гистидин. Указанные аминокислоты содержатся в больших количествах в коже и соединительной ткани. ТГц спектральные линии указанных аминокислот связаны с колебательными модами молекул, которые обусловлены химическими реакциями, процессами гидратации и конформных изменений молекул в коже человека. Определение спектральных линий аминокислот и других характерных молекул, участвующих в метаболических процессах кожи, необходимо для разработки ТГц диагностического прибора с максимальной чувствительностью и селективностью.

Некоторые линии в ТГц спектрах кожи человека соотнесены с поглощением воды, находящейся во внеклеточной жидкости, а также с растворенным в ней молекулярным кислородом. Таким образом, изменение состояния воды и кислорода под влиянием ТГц излучения может вызвать изменение конформа-ции примембранных белков в структуре кожи.

Полученные результаты актуальны для диагностики и терапии кожи человека, нормальной и с патологическими изменениями.

Работа поддержана Министерством образования и науки РФ (ГК № 14.В37.21.0248).

Литература

1. Езерская А.А., Романов И.В., Смолянская О.А., Грачев Я.В. Ранняя диагностика кариеса твердых тканей зубов с помощью лазерного излучения терагерцового диапазона // Научно-технический вестник СПбГУ ИТМО. - 2011. - № 6 (76). - С. 92-97.

2. Езерская А.А., Смолянская О.А., Парахуда С.Е., Грачев Я.В., Гончаренко А.О. Терагерцовые спектры пропускания и отражения катарактально измененных хрусталиков глаза человека // Научно-технический вестник информационных технологий, механики и оптики. - 2012. - № 2 (78). - С. 3336.

3. Joseph C.S., Yaroslavsky A.N., Al-Arashi M. Terahertz spectroscopy of intrinsic biomarkers for non-melanoma skin cancer // Proceedings of SPIE (SPIE, Bellingham, WA 2009). - V. 7215. - P. 72150I.

4. Laman N., Harsha S.S., Grischkowsky D., Melinger J.S. High-resolution waveguide thz spectroscopy of biological molecules // Biophysical Journal. - 2008. - V. 94. - P. 1010-1020.

5. Xu J., Plaxco K.W., Allen S.J. Probing the collective vibrational dynamics of a protein in liquid water by terahertz absorption spectroscopy // Protein Science. - 2006. - V. 15. - P. 1175-1181.

6. Казаринов К. Д. Биологические эффекты электромагнитного поля терагерцового диапазона // Электронная техника. Сер. 1: СВЧ-техника. - 2009. - Т. 503. - № 4. - С. 48-58.

7. Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. - Кн. 2 / Под ред. Ю.А. Грызунова, Г.Е. Добре-цова. - М.: ГЭОТАР, 1998. - 440 с.

8. Добрецов Г.Е., Миллер Ю.И. Биохимия и физико-химия сывороточного альбумина. Центры связывания органических молекул // Альбумин сыворотки крови в клинической медицине. - Кн. 1 / Под ред. Ю.А. Грызунова и Г.Е. Добрецова. - М.: ИРИУС, 1994. - С. 13-28.

9. Капралова А.В., Погодин А.С. Влияние терагерцового излучения различных диапазонов на конфор-мацию молекул бычьего сывороточного альбумина // Вестник НГУ. Серия: Физика. - 2010. - Т. 5. -Вып. 4. - С. 182-185.

10. Аминокислоты [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.strong-atlet.net/main/dobavki/133-aminokisloty.html, свободный. Яз. рус. (дата обращения 17.10.2012).

11. Globus T., Anwar Mehdi, DeMaria Anthony J., Shur Michael S. Low-Terahertz spectroscopy of liquid water // Terahertz Physics, Devices and Systems II // Proc. of SPIE. - 2007. - V. 6772. - Р. 67720S-1-67720S-11.

12. Анцыгин В.Д., Мамрашев А.А., Николаев Н.А., Потатуркин О.И. Малогабаритный терагерцовый спектрометр с использованием второй гармоники фемтосекундного волоконного лазера // Автометрия. - 2010. - Т. 46. - № 3. - С. 110-117.

13. Martin van Exter, Fattinger Ch., Grischkowsky D. Terahertz time-domain spectroscopy of water vapor // Optics Letters. - 1989. - V. 14. - № 20. - P. 1128-1130.

14. Айвазян Г.М. Распространение миллиметровых и субмиллиметровых волн в облаках. - Л.: Гидроме-теоиздат, 1991. - 480 с.

Езерская Анна Александровна - Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет

информационных технологий, механики и оптики, студент, a.a.ezerskaya@gmail.com

Цуркан Мария Валерьевна - Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет

информационных технологий, механики и оптики, аспирант, tsurkan.maria@yandex.ru

ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОСТРУКТУРЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ СЛОЕВ .

Смолянская Ольга Алексеевна

Капралова Ангелина Владимировна Балбекин Николай Сергеевич

Романов Илья Владимирович Прожеев Игорь Александрович

Стрепитов Евгений Александрович

Просанов Игорь Юрьевич

Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет

информационных технологий, механики и оптики, кандидат физ.-

мат. наук, доцент, o_smolyanskaya@mail.ru

Институт лазерной физики СО РАН, аспирант, kapralova@ngs.ru

Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет

информационных технологий, механики и оптики, студент,

godnikolay@yandex.ru

Томский государственный университет, аспирант, roil@elefot.tsu.ru Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики, студент, prozheev.iv@gmail.com

Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет информационных технологий, механики и оптики, студент, e-strep@yandex.ru

Институт химии твердого тела и механохимии СО РАН, доктор технических наук, ст. научный сотрудник, prosanov@mail.ru

УДК 53.086

ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОСТРУКТУРЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ СЛОЕВ РАСТИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ МЕТОДОМ ОПТИЧЕСКОЙ КОГЕРЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ М.А. Волынский, И.П. Гуров, Е.В. Жукова, Н.Б. Маргарянц, Е.С. Рысева

Исследована микроструктура поверхностных слоев биологических тканей на примере изучения экзокарпия растительных плодов методом спектральной оптической когерентной микроскопии с перестраиваемой длиной волны в пределах 1305±75 нм и методом корреляционной оптической когерентной микроскопии при среднем значении длины волны 940 нм. Эксперименты выполнены для неповрежденных и дефектных структур, выполнен расчет профиля поверхности экзокарпия.

Ключевые слова: оптическая когерентная микроскопия, поверхность, 3Б-изображение, экзокарпий.

Введение

Оптическая когерентная микроскопия - это современный метод неразрушающего контроля и исследования разнообразных сред, обладающих сложным пространственным строением. Оптические свойства таких микроструктур случайно-неоднородны, что затрудняет их диагностику традиционными оптическими методами. Изучение биотканей растительного происхождения методами оптической когерентной томографии (ОКТ) позволило исследовать структуру объектов на клеточном уровне, обнаружить характер видоизменения тканей в момент протекания важнейших физиологических процессов [1-3]. Прикладное значение исследований состоит в создании инновационных технических решений и диагностических приборов, обладающих высоким разрешением и быстродействием [4].

Оптические методы диагностики широко используются в растениеводстве и в плодоовощной отрасли для контроля качества продукции, создания диагностических комплексов наблюдения за процессами выращивания, хранения и сортификации овощных и фруктовых культур. Изучение плодов семейства яблоневых, которые относятся к группе приоритетных культур, привлекает особое внимание. Для контроля плодов широко используются спектрофотометрические и лазерные методы, люминесцентный анализ, а также методы компьютерного зрения, позволяющие одновременно диагностировать многие параметры развивающегося плода [5-7]. Широко используются методы отражения оптического излучения для неразрушающего контроля состояния поверхности плодовых культур [8].

Известно, что многие потребительские и органолептические свойства плодов яблок определяются состоянием внешнего слоя плода или его кожуры (экзокарпия). Экзокарпий - это многофункциональная биологическая ткань, имеющая слоистую структуру. Кожица плода выполняет защитную функцию от проникновения в плод болезнетворных микроорганизмов и механического повреждения мягких тканей, а также обеспечивает протекание выделительных процессов, сопровождающихся выходом на поверхность эфирных масел и влаги. Анализ состояния экзокарпия используется как один из критериев для определения сорта, сохранности и пищевой пригодности.

В настоящей работе были использованы спектральный и корреляционный методы оптической когерентной микроскопии для изучения экзокарпия плодов разных сортов.

Исследование микроструктуры ткани

Для проведения экспериментальных исследований были выбраны сорта яблок Айдаред и Роял Га-ла, которые широко представлены на потребительском рынке, а также груши сорта Вильямс. Исследова-