Трансгенное растение березы с ранним цветением
TRANSGENIC BIRCH PLANT WITH EARLY BLOSSOMING

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области генной инженерии растений и связано с получением трансгенных растений березы, обладающих ранним цветением. Результаты данного изобретения могут быть использованы в лесной генетике и селекции.
Уровень техники
Главная цель лесной генетики и селекции заключается в повышении продуктивности лесных древесных пород и выращивании устойчивых насаждений с высокими качествами древесины путем получения и размножения таких экземпляров деревьев, которые превосходили бы остальные по ряду хозяйственно-ценных признаков. Селекция древесных растений использует те же методы, что и селекция сельскохозяйственных культур, но имеет свои особенности. Она базируется в основном на использовании метода отбора среди дикорастущих деревьев и лишь в незначительной степени на специально выведенных гибридах. Это сильно ограничивает большой потенциал лесной селекции, так как именно скрещивание между отобранными индивидуумами важно для появления жизнеспособной и разнообразной популяции растений, а также новых комбинаций признаков и элитных генотипов. Причина такого положения дел заключается в длительном ювенильном периоде у древесных растений, в течение которого они не способны образовывать цветки и плоды. У лесных древесных пород ювенильная фаза в целом продолжается 10-20 лет (Longman K.A. Some experimental approaches to the problem of phase change in forest trees. Acta Hort. 1976. 56:81-90). В течение всего этого времени они невосприимчивы к факторам окружающей среды или внутренним сигналам, которые индуцируют цветение у взрослых деревьев. В этот период использование методов гибридизации невозможно. В результате селекция деревьев по сравнению с селекцией однолетних растений намного более длительна, из-за больших размеров деревьев требует значительных площадей, специального оборудования и, в конечном итоге, намного более затратна и менее продуктивна. Выходом из сложившегося положения могло бы стать укорачивание ювенильной фазы древесных растений путем ускорения цветения.
Для более раннего цветения древесных растений в последние десятилетия был разработан ряд самых разнообразных методов. Они включают агротехнические приемы - подрезку корней, кольцевание стволов, отгибание ветвей, прививки на специальные подвои; химические методы - обработку регуляторами роста (паклобутразол и др.); изменение физических условий выращивания - фотопериода, температуры, влажности; отбор природных раноцветущих генотипов. Однако выяснилось, что с помощью подобных подходов цветение можно ускорить у ряда плодовых культур, но многие лесные породы этому не поддаются (Chalupka W., Cecich R.A. Control of the first flowering in forest trees. Scand. J. For. Res. 1997. 12:102-111). Наконец, в последние годы для ускорения цветения стали использовать метод генетической трансформации растений.
Береза очень широко распространена в России, занимая до 2/3 площади всех лиственных лесов страны. Древесина березы находит самое разнообразное применение (производство фанеры, стройматериалов, мебели, паркета, высококачественной целлюлозы, бочек для пищевых продуктов и др.). Древесина карельской березы из-за оригинального рисунка очень высоко ценится и используется как декоративный материал. Известно также большое число декоративных форм березы, отличающихся окраской листьев и коры, формой листьев и кроны, которые широко используются в озеленении. В связи с большим экономическим значением этой породы она является одним из основных объектов лесной селекции среди лиственных видов, но имеет ту же особенность, присущую всем древесным видам - длительный ювенильный период. В природе растения березы зацветают в возрасте 10-15 лет (Perala D.A., Aim A.A. Reproductive ecology of birch: a review. For. Ecol. Manag. 1990. 32:1-38). Для ускорения цветения березы был использован метод генетической трансформации. Например, сообщалось о переносе в растения березы гена BpMADS4 из семейства MADS-генов, регулирующих программы развития (Elo A., Lemmetyinen J., Novak A., Keinonen K., Porali I., Hassinen M, Sopanen T. BpMADS4 has a central role in inflorescence initiation in silver birch (Betula pendula). Physiol. Plant. 2007. 131:149-158). У трансгенных растений цветение было значительно ускорено, вплоть до цветения растений размером 3 см, но у всех раноцветущих линий наблюдались фенотипические отклонения - в частности, сильная разветвленность и короткие междоузлия. В другой работе в растения березы переносили ген BpAP1, играющий важную роль в регуляции развитии цветка (Huang Н., Wang S., Jiang J., Liu G., Li H., Chen S., Xu H.. Overexpression of BpAP1 induces early flowering and produces dwarfism in Betula platyphylla × Betula pendula. Physiol. Plant. 2014. 151:495-506). Трансгенные растения зацвели через 2 месяца после посадки, но их высота была на 41% ниже, чем у контроля, у соцветий было снижено соотношение длина : диаметр, а у мужских соцветий были пустые пыльники и продуцировалось мало пыльцы. По-видимому, встраивание генов, отвечающих за регуляцию развития цветка или времени цветения, вызывает также нарушение других процессов в растениях, что приводит к возникновению отклонений как в вегетативных, так и в генеративных органах.
Фермент глутаминсинтетаза (GS) играет центральную роль в метаболизме азота у растений, катализируя превращение аммония в глутамин, который является аминокислотным предшественником глутамата и всех азотсодержащих компонентов, необходимых для роста растения. Встраивание гена этого фермента используется для повышения продуктивности растений, в том числе и древесных (Gallardo F., Fu J., Cantorn F.R., Garcia-Gutierrez A., Canovas F.M., Kirby E.G. Expression of a conifer glutamine synthetase gene in transgenic poplar. Planta. 1999. 210:19-26), так как доступность неорганического азота в почве зачастую является лимитирующим фактором роста и развития растений. Однако, насколько нам известно, использование этого гена для ускорения цветения растений ранее не проводилось.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения было получение трансгенной березы, отличающейся ускоренным цветением, на основе различных генотипов Betula pubescens.
Используемый в настоящем описании термин «растение» охватывает целые растения, предшественники и потомство растений и части растений, включая семена, побеги, стебли, листья, корни, цветки и ткани и органы, причем все они содержат нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 1. Термин «растение» также охватывает клетки растений, суспензионные культуры, каллусную ткань, зародыши, меристемы, гаметофиты, спорофиты, пыльцу и микроспоры, причем все они, опять же, содержат нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 1.
Учитывая то, что большинство древесных растений, в том числе и береза, являются труднотрансформируемыми и труднорегенерируемыми, а также то, что даже при условии осуществления акта трансформации вероятность регенерации из трансформированной клетки экспланта целого трансгенного растения, в котором уровень экспрессии встроенного гена достаточен для проявления соответствующего фенотипического признака, а экспрессия эндогенных генов растения не нарушена, весьма мала, получение положительного результата при решении поставленной задачи не являлось очевидным фактом.
В качестве трансформирующего агента при получении трансгенной березы по изобретению использовали бинарный вектор pGS, включающий нуклеотидную последовательность глутаминсинтетазы. Структура вектора представлена на фиг. 1.
Настоящее изобретение относится к растению березы с ранним цветением, где указанное растение березы трансформировано молекулой нуклеиновой кислоты, которая кодирует глутаминсинтетазу.
Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой кДНК, РНК или их гибридную молекулу. Предпочтительно молекулой нуклеиновой кислоты является молекула кДНК, кодирующая глутаминсинтетазу. Наиболее предпочтительно молекула кДНК имеет нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1.
Молекулу нуклеиновой кислоты глутаминсинтетазы можно выделить из любого вида растений. Предпочтительно растение представляет собой Pinus sylvestris.
Растение березы, трансформированное молекулой нуклеиновой кислоты глутаминсинтетазы, может представлять любой вид березы из рода Betula. Предпочтительно растение березы выбрано из группы, состоящей из B. pubescens, B. pendula, B. pendula var. carelica, В. nigra, B. ermanii и B. schmidtii.
Настоящее изобретение относится к трансгенному растению березы, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей глутаминсинтетазу, где экспрессия данной молекулы приводит к получению трансгенного растения, которое демонстрирует способность к цветению в более раннем возрасте по сравнению с аналогом дикого типа.
Настоящее изобретение также относится к способу получения трансгенного растения березы с повышенной продуктивностью, где способ включает стадии:
а) агробактериальной трансформации эксплантов березы in vitro молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей глутаминсинтетазу;
б) регенерации целых растений из трансформированных клеток эксплантов;
в) идентификации молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей глутаминсинтетазу, в регенерированных растениях или их потомстве;
г) размножение, укоренение и акклиматизацию трансгенных растений;
д) культивирование трансгенных растений в условиях защищенного или открытого грунта;
е) отбор растений с ранним цветением по сравнению с аналогом дикого типа, который не содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую глутаминсинтетазу.
Полученные таким образом трансгенные растения не имели каких-либо фенотипических отклонений от исходного генотипа.
В еще одном варианте осуществления способ дополнительно включает стадию трансформации растения березы с нуклеотидной последовательностью, кодирующей селективный или репортерный ген, который функционально связан с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей глутаминсинтетазу, посредством чего облегчается отбор трансгенного растения березы среди регенерированных растений.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 - схема основных генетических элементов трансформационного вектора pGS.
Фиг. 2 - результат проведения ПЦР на фрагмент гена глутаминсинтетазы на геномной ДНК березы.
Фиг. 3 - культивирование трансгенных растений березы в условиях открытого грунта.
Фиг. 4 - раннее цветение у трансгенного растения березы с геном глутаминсинтетазы (возраст три года).
Осуществление изобретения
Пример 1. Подготовка штамма бактерий A. tumefaciens СВЕ21 (рСВЕ21, pGS) для трансформации растений
Для трансформации растений используют ночную культуру бактерий A. tumefaciens. Для этого 100 мкл суспензии клеток бактерий A. tumefaciens СВЕ21 (рСВЕ21, pGS) добавляют к 50 мл жидкой среды LB, содержащей 50 мг/л канамицина и инкубируют в течение ночи на термостатируемом орбитальном шейкере при 28°С и 120-150 об/мин, после чего центрифугируют полученную суспензию 5 минут при 4000 об/мин, осадок промывают жидкой средой MS и повторяют центрифугирование и промывание. После осаждения клеток их заливают 50 мл жидкой среды MS и ресуспендируют.
Пример 2. Подготовка растительного материала березы in vitro для трансформации
Для трансформации растений березы используют листовые экспланты с растений in vitro. Размножение культуры березы проводят на питательной среде WPM, содержащей 0,6 мг/л БАП, 0,1 мг/л ИМК, 20 г/л сахарозы и 7 г/л агара. Растения выращивают при фотопериоде 16/8 часов, температуре 22-24°С и освещенности 3000-3500 люкс.
Пример 3. Трансформация растений березы клетками бактерий A. tumefaciens СВЕ21 (pCBE21, pGS)
Для трансформации используют листья с растений in vitro возрастом 1 месяц. У листьев удаляют черешки и верхушки (у крупных листьев - также и боковые стороны) и наносят несколько надрезов перпендикулярно центральной жилке, не доводя их до краев листа. Подготовленные таким образом экспланты помещают на 40-50 минут в суспензию агробактерий, после чего осушают стерильными фильтрами и размещают на фильтрах, расположенных в чашках Петри на поверхности среды для кокультивации, содержащей минеральные соли MS, 5 мг/л зеатина, 5 мг/л БАП, 0,2 мг/л ИМК, 30 г/л сахарозы и 7 г/л агара. В каждую чашку помещают по 10-15 эксплантов. Кокультивацию проводят в течение 3 суток.
Пример 4. Регенерация растений березы из трансформированных эксплантов
После периода кокультивации экспланты промывают в дистиллированной воде с добавлением 1 г/л цефотаксима в течение 20-30 минут и затем дважды в воде без цефотаксима. Отмытые экспланты подсушивают на фильтрах и переносят на среду для регенерации и селекции трансформантов того же состава, как и среда для кокультивации, содержащую дополнительно 50 мг/л канамицина и 500 мг/л цефотаксима. На этой среде экспланты выдерживают в условиях 16-часового светового дня при 22-23°С с пересадкой каждые 4 недели. Регенерированные побеги пересаживают на среду для размножения, содержащую 50 мг/л канамицина и 250 мг/л цефотаксима.
Пример 5. Идентификация фрагмента последовательности гена глутамин синтетазы в регенерантах березы методом ПЦР
Присутствие гена GS в трансгенных растениях березы подтверждают методом ПЦР с праймерами GS1 (SEQ ID NO: 2) и GS2 (SEQ ID NO: 3), специфичными для кодирующей области трансгенной конструкции.
4
2
4
2
Геномную ДНК из растений березы выделяют по методу Rogers and Bendich (1994, in: Gelvin SB, Schilperoort RA (eds) Plant Molecular Biology Manual. Boston, MA: Kluwer Academic Publishers, D 1: 1-8). Для выделения используют листья растений in vitro (около 100 мг). Полученную растительную ДНК используют в качестве матрицы в ПЦР-анализах. Реакционная смесь содержит 67 мМ Tris-HCl, рН 9.0, 16 мМ (NH)SO, 2 мМ MgCl, 0,01% желатина, по 0,2 мМ каждого dNTP, 0,6 мкМ конечной концентрации каждого праймера и 0,2 единицы/мкл Taq полимеразы. Реакцию проводят в объеме 25 мкл при следующих условиях: 92°С - 3 мин; 35 циклов: 92°С - 20 сек, 62°С - 10 сек, 72°С - 1 мин, затем 72°С - 5 мин.
Продукты ПЦР анализируют в 1,8% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Гель фотографируют в ультрафиолете при длине волны 260-280 нм. Появление продукта ПЦР (ДНК размером 1190 н.п.) при использовании указанных праймеров, а также при условии отсутствия его в реакциях, поставленных на контрольной ДНК, свидетельствует о присутствии искомого гена в ДНК исследуемых растений (Фиг. 2).
Пример 6. Культивирование трансгенных растений березы с геном глутаминсинтетазы
Укорененные в условиях in vitro растения березы (линии, по итогам ПЦР содержащие ген глутаминсинтетазы и нетрансформированный контроль) высаживают в теплицу в пластиковые кассеты. В качестве субстрата используют смесь торфа и перлита (3:1). На период акклиматизации растения накрывают полиэтиленовой пленкой, которую снимают через один месяц. Акклиматизированные растения пересаживают в пластиковые сосуды с субстратом того же состава и культивируют в условиях защищенного или открытого грунта (Фиг. 3).
Пример 7. Отбор трансгенных растений березы с ранним цветением
Отбор трансгенных растений с ранним цветением осуществляется по признаку появления соцветий в срок до шести лет включительно с момента высадки из условий in vitro в нестерильные условия или посадки различных частей растения в условия защищенного или открытого грунта (Фиг. 4).