БИОЧИП ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ КЛЕТОК

Полезная модель относится к области медицины, но также может быть использована в ветеринарии и биологии.
Известен биочип для исследования клеток (см. А.В.Шишкин, И.И.Шмырев, С.А.Кузнецова, Н.Г.Овчинина, А.А.Бутылин, Ф.И.Атауллаханов, А.И.Воробьев «Иммунологические биочипы для параллельного определения поверхностных антигенов и морфологического исследования клеток». Биологические мембраны, 2008, том 25, №4, с 277-284), взятый в качестве прототипа, представляющий собой твердую подложку, на которой в тестовых участках (пятнах) иммобилизованы антитела, каждое из которых специфично к определенному клеточному поверхностному антигену. Биочип позволяет определять антигены, находящиеся на поверхности исследуемых клеток, по связыванию клеток в тестовых участках.
Недостатком данного биочипа является то, что он содержит тестовые участки только с иммобилизованными молекулами антител, поэтому для определения молекул, находящихся на поверхности исследуемых клеток, используются только взаимодействия типа «антитело-антиген». Другие возможные типы взаимодействий между биологическими молекулами при этом не используются.
Задачей данной полезной модели является возможность определения поверхностных молекул исследуемых клеток посредством межмолекулярных взаимодействий, не относящихся к категории «антитело-антиген».
Поставленная задача решается за счет того, что у биочипа для исследования клеток, содержащего подложку с тестовыми участками, в которых могут связываться клетки, в тестовых участках иммобилизованы молекулы веществ, не являющихся антителами, но способных связываться с определенными типами молекул, находящихся на поверхности исследуемых клеток.
Молекулы веществ, способных связываться с поверхностными молекулами исследуемых клеток, иммобилизованы непосредственно на подложке биочипа.
Молекулы веществ, способных связываться с поверхностными молекулами исследуемых клеток, иммобилизованы на подложке посредством связей с молекулами одного или нескольких других веществ, находящихся на ее поверхности.
На поверхности биочипа иммобилизованы молекулы веществ, ослабляющих связывание исследуемых клеток с материалом подложки.
Биочип имеет приспособление для крепления в инкубационно-отмывочном устройстве.
Биочип имеет один или несколько участков, указывающих на порядок считывания результата.
Биочип имеет разметку, указывающую границы его участков или порядок их расположения.
Подложка является прозрачной.
Подложка является светоотражающей
Биочип имеет участки контроля получаемого результата.
Использование заявленной полезной модели дает возможность определения поверхностных молекул клеток посредством межмолекулярных взаимодействий, не относящихся к категории «антитело-антиген», например, взаимодействий с участием молекул адгезии, взаимодействий типа «рецептор - лиганд» и других. Наличие на подложке иммобилизованных молекул веществ, ослабляющих связывание с ней исследуемых клеток, устраняет или уменьшает фоновое связывание клеток, искажающее результаты анализа. Наличие разметки, указывающей границы участков биочипа или порядок их расположения делает более удобным проведение исследования при неавтоматизированном считывании результата. Наличие участка, указывающего порядок считывания результата, позволяет избежать возможных ошибок при считывании. Прозрачная подложка позволяет использовать микроскопию в проходящем свете при выполнении исследования клеток с помощью данного биочипа. Это также дает возможность определения плотности связывания клеток непрямым путем - по величине светопропускания участков со связанными клетками. При выполнении подложки светоотражающей появляется возможность непрямого определения плотности заполнения тестовых участков связавшимися клетками путем определения яркости света, отражаемого от этих участков.
Предусмотрены различные варианты иммобилизации молекул, способных связываться с поверхностными молекулами клеток, позволяющие использовать широкий круг различных технологических приемов при изготовлении биочипа.
Описание полезной модели поясняется следующими фигурами, где:
на фиг.1 представлен общий вид биочипа (сверху)
на фиг.2 представлен разрез А-А на фиг.1 схематически демонстрирующий молекулярную структуру поверхности тестового участка, в котором молекулы веществ, способных связываться с поверхностными молекулами клеток, иммобилизованы непосредственно на подложке биочипа.
на фиг.2 представлен разрез А-А на фиг.1 схематически демонстрирующий молекулярную структуру поверхности тестового участка, в котором молекулы веществ, способных связываться с поверхностными молекулами клеток, иммобилизованы на подложке биочипа посредством связей с молекулами другого вещества, находящихся на ее поверхности.
Биочип включает прозрачную или светоотражающую твердую подложку 1 (фиг.1), которая содержит рабочую область 2, имеющую тестовые участки 3 (пятна биочипа), отделенные друг от друга промежутками (фоновыми участками) 4. В рабочей области 2 подложки 1 присутствует участок 5, указывающий на порядок считывания результата, а также линии разметки 6, обозначающие границы участков 3 и облегчающие их нахождение при неавтоматизированном считывании результата. На обратной стороне подложки 1 (фиг.2, 3) нанесено клейкое покрытие 7, обеспечивающее крепление биочипа в инкубационно- отмывочном устройстве. На поверхность подложки 1 в участке 5 нанесена краска 8. В тестовых участках 3 находятся молекулы 9 веществ, не являющиеся антителами, но способных связываться с поверхностными молекулами клеток. Молекулы 9 по своей химической структуре могут относиться к различным классам веществ, а по биологическим функциям являться рецепторами, лигандами, молекулами адгезии или другими объектами. Молекулы 9 иммобилизованы в тестовых участках 3 непосредственно на поверхности подложки 1 (фиг.2), либо иммобилизованы посредством связей с молекулами 10 (фиг.3), связанными в данных участках 3 с поверхностью подложки 1. В различных тестовых участках 3 иммобилизованы молекулы 9 разных типов. При этом в пределах одного тестового участка 3 иммобилизованы молекулы 9 одного типа.
На поверхности подложки 1 в фоновых участках 4 (фиг.2, 3), а также в тестовых участках 3 в промежутках между молекулами 9 (фиг.2) или 10 (фиг.3) иммобилизованы молекулы вещества 11 (например, бычьего сывороточного альбумина), блокирующего сайты неспецифического связывания и ослабляющего прочность неспецифического связывания клеток с подложкой. Один из тестовых участков 3 (фиг.1) является контрольным и содержит иммобилизованные молекулы 9 (фиг.2, 3) вещества, с которым могут связываться все типы клеток, присутствующих в исследуемом образце (положительный контроль). В качестве участков отрицательного контроля выступают фоновые участки 4.
Исследование клеток с помощью биочипа осуществляют следующим образом. Биочип закрепляют в инкубационно-отмывочном устройстве и инкубируют с исследуемой клеточной суспензией. Затем его отмывают от клеток, не связавшихся с иммобилизованными молекулами 9. Отмывку выполняют под контролем микроскопии. Критерием качества отмывки биочипа является устранение клеток из фоновых участков 4. Связанные клетки могут оставаться только в области тестовых участков 3. Осуществляют считывание результата. При этом в области каждого из тестовых участков 3 определяют наличие связанных клеток и определяют плотность их связывания (отношение количества связавшихся клеток к площади поверхности), исходя из значений которой, устанавливают содержание в исследуемом образце клеток, имеющих на своей поверхности определяемые молекулы. Может быть выполнена идентификация клеток, связанных в различных тестовых участках (пятнах) 3 биочипа, осуществляемая на основании морфологических признаков. Для этого при необходимости биочип обрабатывают раствором вещества, повышающего прочность связывания клеток с поверхностью подложки. Затем связанные с биочипом клетки фиксируют метанолом и обрабатывают красителем. Осуществляют морфологическое исследование и определяют качественный состав клеток, связанных в тестовых участках (пятнах) 3 биочипа.