"Способ очистки почв от нефтяных загрязнений методом гидропосева биосмеси с применением микроводорослей Chlorella vulgaris globosa IPPAS C-2024"
METHOD FOR PURIFYING SOILS FROM PETROLEUM CONTAMINATION BY THE METHOD OF HYDROSEEDING A BIOLOGICAL MIXTURE USING MICROALGAE CHLORELLA VULGARIS GLOBOSA IPPAS C-2024

Изобретение относится к области защиты окружающей среды, восстановления почв биологическим способом от загрязнений нефтепродуктами.
Известны способы биологической очистки почв, загрязненных нефтепродуктами [Патенты РФ № 2271338, № 2355488, № 2398640, № 2378060, № 2618699, № 2594995, № 2525930, № 2525932, № 2636343, № 2617949, № 2630246, № 2528198, № 2695881], в которых используются биопрепараты на основе штаммов бактерий и дрожжей. Производство биопрепаратов требует особых условий (определенная температура, стерильность, автоклавирование питательных сред, посевы, культивирование, лиофилизация). Кроме того, штаммы бактерий и дрожжей до выхода на рынок должны пройти токсиколого-гигиеническую экспертизу, что значительно увеличивает стоимость биопрепаратов. Недостатками является сложность производства и за счет этого высокая стоимость этих способов очистки.
В отличии от бактерий и дрожжей микроводоросли более жизнеспособны, продуктивны, обладают септическими свойствами, дольше сохраняются как в жидком, так и в сухом состоянии. Микроводоросли не подлежат токсиколого-гигиеническому анализу. Микроводоросли облегчают разложение нефтепродуктов в почве, обеспечивая поверхность для адгезии нефтеокисляющих почвенных бактериальных культур, стимулируя их активность, а также являясь для почвы, микроорганизмов и растений эффективной биологической добавкой с расширенным набором аминокислот, витаминов, хлорофилла, ферментов, макро- и микроэлементов.
Задачей заявленного изобретения является разработка способа очистки труднодоступных почв от нефтезагрязнений методом гидропосева биосмеси с применением микроводорослей, который уменьшит трудозатраты, стоимость, увеличит эффективность очистки, и не создаст вторичные отходы.
Технический результат - расширение функциональных возможностей очистки труднодоступных почв от нефтезагрязнений за счет обработки методом гидропосева эффективной биосмеси, состоящей из микроводорослей и семян трав, частичной заменой минеральных удобрений макро- и микроэлементами микроводорослей без образования вторичных отходов.
Поставленная задача и технический результат достигается тем, что в способе очистки труднодоступных почв от нефтезагрязнений применяют микроводоросли, семена трав и аммиачную селитру в составе биосмеси, которую распыляют над загрязненным нефтью или нефтепродуктами участком с помощью мотопомпы методом гидропосева.
Ниже приведено описание биосмеси.
Chlorella vulgaris.
.
8
1. Штамм микроводорослей  Титр клеток штаммов в суспензии составляет 10 кл/мл
Chlorella vulgaris
globosa
Штамм микроводоросли  Beijer. f.  V. Andr выделен в 2010г. из почвы на стоянке оленеводов в Приполярном Урале, способен к нефтеокислению в почве.
Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Штамму присвоен номер IPPAS C-2024.
Описание условий, необходимых для культивирования штамма: среда для культивирования следующего состава: на 1000 мл воды - KNO3 - 5.0 г, MgSO4×7H2O - 2.5 г, KH2PO4×3H2O - 1.25 г, FeSO4 - 0.003 г в течении 7 суток в условиях жидкофазной ферментации.
Морфологическая характеристика штамма:
Форма клеток - шаровидная, размер от 3.3 до 13.3 мкм в диаметре. Пириноид округлый с 2-4 крахмальными зернами, хорошо заметный. Хроматофор чашевидный, зеленый. Жгутиков нет, автоспоры освобождаются путем разрыва материнской оболочки и имеют форму от неправильно шаровидной до тетраэдрической, пустые оболочки материнских клеток двух-трехдольчатые. Особенности морфологии при длительном хранении: увеличение размеров клеток за счет вакуолизации, образование бесцветных капель масла в клетках. Особенности морфологии в условиях оптимального роста: большая часть клеток находится в диапазоне 6-8 мкм.
В классификации микроорганизмов по группам патогенности Санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 от 1 мая 2008 г. «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» данный вид (род) не значится.
Режим хранения штамма - для подготовки биомассы с целевым использованием - периодические пересевы - 1 раз в 2 месяца с хранением выросшей чистой культуры на скошенном агаре среды Болда следующего состава (табл. 1).
Таблица 1
Состав среды Болда
В 936 мл дистиллированной воды необходимо добавить по 10 мл раствора каждого из 6 макроэлементов и по 1 мл каждого микроэлемента и по 1 мл каждого раствора микроэлементов, затем автоклавировать. рН конечного раствора - 6.6. Среда хранится в закрытых пробирках в холодильнике при температуре не выше +6 и не ниже +1 °С.
2. Травосмесь.
Основные параметры и свойства семян для травосмеси отражены в таблице 2. Семена трав не должны быть поражены, либо степень поражения слабая (табл. 3).
Таблица 2
Энергия прорастания и всхожесть семян для травосмеси
Культура
Срок определения, сут.
Энергия прорастания
Всхожесть
Клевер луговой (красный), опрокинутый и пунцовый
3
7
Клевер ползучий и гибридный (белый и розовый)
3
7
Лисохвост
7
14
Овес
7
14
Овсяница
7
14
Тимофеевка
4
8
Таблица 3
Степень поражения семян
Степень поражения семян
Семена, покрытые плесневыми грибами, %
СлабаяСредняяСильная
До 5До 25Более 25
3. Минеральные удобрения - аммиачная селитра.
Пример конкретной реализации способа.
Chlorella vulgaris
Микроводоросли IPPASC-2024 культивированы на питательной среда Люка в объеме 20 литров. Условия культивирования: комнатная температура, освещение фитолампами, аэрация с помощью аквариумного насоса в течении 14 суток.
8
На загрязненном нефтепродуктами участке (территория Западной Сибири, Ханты-Мансийском автономном округе) в полевом эксперименте в бочке, объемом 200 литров, были смешаны ингредиенты: аммиачная селитра (24 кг); травосмесь (состав из табл. 2) -(10 кг); суспензия микроводорослей (20л) титром клеток 10кл.
2
На участке в 4 га была выделена делянка 20 × 20 метров (400 м) с помощью вешек и сигнальной ленты. На данной делянке была отобрана 1 объединенная контрольная неочищенная проба методом «конверта» до начала работ и постановки эксперимента. Почва делянки характеризовалась как избыточно увлажненная. С помощью мотопомпы производили гидропосев биосмеси на загрязненную делянку. Повторные почвенные пробы с участка отбирали спустя 3 и 60 суток после обработки почвы биосмесью.
Фоновая незагрязненная проба почвы отбиралась в 100м от автодороги и загрязненного участка, вне антропогенного воздействия, в лесном массиве, с горизонта 0-5 см и 5-50 см.
В пробах фоновой, необработанных биосмесью и после гидропосева биосмесью были сделаны микробиологические, биохимические и химические анализы.
Северные почвы характеризуются замедленным темпом разложения клетчатки. Наибольшей микробиологической активностью характеризовался верхний слой (0-5 см) (табл.4), преобладали в почве фонового участка аммонификаторы.
Анализ функциональной структуры почвенных микробоценозов выявил преобладание микроорганизмов, усваивающих минеральные соединения азота, над утилизаторами его органических форм в почвах обоих участков (КАА/МПА=3,18-2,3), что указывало на высокую интенсивность процессов микробиологической минерализации органических веществ (табл. 4).
В то же время, к концу эксперимента наблюдалась высокая численность олигонитрофилов (Эшби/МПА), связывающих азот из рассеянного состояния, что доказывало повышенную олиготрофность среды по углероду и азоту. В почве, отобранной спустя 60 суток были обнаружены микромицеты, что свидетельствовало о благоприятном течении восстановительных процессов.
Таблица 4
Ферментативная активность предложена как потенциальный индикатор качества почвы из-за ее связи с почвенной биотой, легкости определения и быстрого отклика на изменения, вызванные антропогенным воздействием. По степени обогащенности ферментом - дегидрогеназой почву верхней толщи фонового участка можно отнести к богатой (табл. 5). В нижней толще активность микроорганизмов и соответственно ферментов снижалась. Повышение процессов дегидрирования в очищаемой биосмесью почве подтверждало благоприятное восстановление (табл. 5).
Таблица 5
Дегидрогеназная активность (мг формазана/ 1 г почвы)
Проба
Дегидрогеназная активность
Фон, 0-5 см
19,25
Фон, 5-50 см
1,532
Контроль
9,24
3 суток
9,87
60 суток
10,97
Почва фоновой пробы характеризовалась повышенной кислотностью(0-5см)- рН (табл.6). Содержание нефтепродуктов в почве 16-27 мг/кг соответствовало региональному фону.
Почва экспериментального участка характеризовалась повышенной кислотностью. Загрязнение в почве участка было преимущественно нефте-сульфатное. Начальное содержание нефтепродуктов было высокое - 89000мг/кг. Спустя 3 суток, после гидропосева биосмеси, содержание нефтепродуктов (НП) снизилось более, чем в 2 раза и спустя 60 суток, эффективность очистки составила 74% (табл. 6).
Таблица 6