Роль апоптоза в патогенезе ревматоидного артрита

ОБЗОРЫ

РОЛЬ АПОПТОЗА В ПАТОГЕНЕЗЕ РЕВМАТОИДНОГО АРТРИТА

СООБЩЕНИЕ 1

А.Н. Богданов, Т.А. Камилова, В.Н. Цыган, Е.Н. Цыган Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург

Ревматоидный артрит (РА) - наиболее распространенное хроническое аутоиммунное системное заболевание соединительной ткани неизвестной этиологии, проявляющееся эрозивным артритом. В патогенезе РА важнейшая роль принадлежит нарушениям апоптоза резидентных синовиальных клеток, с одной стороны, и иммунных воспалительных клеток - с другой. Прежде чем исследовать патогенетическую роль апоптоза в формировании РА, следует рассмотреть современные представления

о молекулярных механизмах этого феномена.

Современная концепция апоптоза

Апоптоз - нормальный процесс генетически программированной клеточной смерти, задачей которого является элиминация лишних клеток в ходе индивидуального развития и поддержании гомеостаза, а также аутореактивных иммунных клеток, клеток с нерепарабельными повреждениями или представляющих по какой-либо причине угрозу для организма. Механизм апоптоза представляет собой комплексную сеть разнонаправленно действующих индукторов и блокаторов клеточной смерти.

Выделяют два механизма индукции апоптоза: внешний (DR-путь) и митохондриальный (рис.1). Внешняя регуляция апоптоза осуществляется при взаимодействии специфических лигандов с их клеточными рецепторами, способными передавать сигналы смерти и активировать апоптозную программу. К лигандам смерти относятся цитокины TNF (tumor necrosis factor), FasL (Fas ligand) и TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand), которые запускают каскад апоптоза, связываясь с соответствующими рецепторами смерти: Fas (CD95/APO-1), TNFR (TNF receptor), DR (death receptor). Активированные рецепторы смерти привлекают адапторные белки, которые формируют DlSC-комплекс (death-inducing signaling complex).

Активация апоптоза по митохондриальному пути происходит через специфические внутриклеточные сенсоры, находящиеся в клеточном ядре или цитоплазме. Этот путь приводит к формированию проапоптозного комплекса, который называется апоптосомой и состоит из цитохрома С, прокаспазы 9 и про-теазоактивирующего фактора белка Apaf-l (apoptotic protease activating factor 1). В апоптосоме происходит расщепление и активация каспазы 9, являющейся медиатором митохондриального пути апоптоза и активатором эффекторных каспаз.

Эффекторное плечо апоптозного пути представлено семейством внутриклеточных протеаз, называемых каспазами. Каспазы синтезируются как зимогены, но могут быть активированы протеолитическим расщеплением в ответ на апоптоз-индуциру-ющие стимулы. Термин "каспаза" (caspase) отражает свойства белков данного семейства: "с" - подчеркивает цистеинпротеаз-ный (cystein protease) механизм действия, "asp" - способность расщеплять белки после аспартата (aspartic acid), "ase" - указывает на каталитическую функцию.

В соответствии с концепцией каскадного механизма активации каспазы делятся на инициаторные (каспазы 8 и 10) и эффек-торные (каспаза-3-подобные). Привлечение инициаторной каспазы к лиганд-активированным рецепторам смерти на клеточ-

Адрсс: С-Петербург, ул Боткинская, д. 20. РВМА им. С.М.Кирова, каф. факультетской терапии.

Тел. 329-71-62.

ной мембране приводит к формированию DISC-комплекса и ее активации. Мишенями каспаз являются ингибиторы апоптоза и структурные белки, поддерживающие клеточную архитектуру. Расщепление этих белков приводит к биохимическим и морфологическим изменениям, ассоциированным с апоптозом.

Возможность ингибировать рецепторный путь индукции апоптоза заключается в трансдукции сигналов выживания (ростовых факторов и цитокинов), активирующих Р13К-путь передачи сигнала. Протеинкиназа PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase) активирует Akt-киназу, которая фосфорилирует и инактивирует Bad, проапоптозный белок Вс12-семейства (рис. 2). Важным фактором, влияющим на апоптоз, является полифунк-циональный транскрипционный фактор NFkB (nuclear factor кВ), который активируется антиапоптозными сигналами, передаваемыми с рецепторов смерти TRAFI и 2 по Р13К-пути. В норме он находится в цитоплазме в латентном состоянии, в комплексе с ингибитором 1кВ. Многие внешние стимулы, в том числе цитокины и цитостатики, разрушают этот гетеродимер, причем 1к В подвергается деградации, а ДНК-связываюшая частица NFkB мигрирует в ядро, где активирует свои гены-мишени.

Гены-мишени NFkB можно разделить на 4 класса: 1) имму-норегуляторные и воспалительные; 2) про- и антиапоптозные; 3) позитивные регуляторы пролиферации; 4) негативные регуляторы активности NFkB (IkB а и (3). В зависимости от ситуации NF кВ может активировать проапоптозные гены (Fas/CD95, FasL, TRAIL-рецепторы), антиапоптозные гены семейств Вс12 и 1АР и ингибитор каспазы-8 белок FLIP (Fas-associated death domain-like interleukin- lp-converting enzyme-inhibitory protein).

В эндогенной регуляции апоптоза участвует семейство клеточных белков Вс12, основным членом которого является анти-апоптозный белок Вс12. В большинстве случаев экспрессия белка Вс12 происходит в зонах, содержащих пролиферирующие клетки или клетки с большой продолжительностью жизни, т.е. его экспрессия оказывает гомеостатический эффект на численность клеточной популяции. В частности, экспрессия Вс12 продлевает жизнь В- и Т-клеток памяти и поддерживает долговременный иммунный ответ. Семейство Вс12 включает в себя три субсемейства: 1) субсемейство Bcl2 (Bcl2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, Al/Bfl-I) ингибирует апоптоз; 2) субсемейства Вах (Вах, Вак, Вок) и ВНЗ (Bik, Blk, Hrk, BimL, Bad, Bid, BNIP3) промо-тируют апоптоз.

Соотношение уровней основных представителей этих субсемейств (Вах и Вс12) определяет судьбу клетки - апоптоз или жизнь. Антиапоптозные белки, прежде всего Вс12, способствуют выживанию, связываясь с белком Apaf-l во время формирования апоптосомы. Это предотвращает активацию финального звена в цепи эффекторов апоптоза - каспазного каскада, но не ингибирует апоптоз, индуцированный рецепторами смерти.

Кроме антиапоптозных белков семейства Вс12, митохондриальный путь индукции апоптоза может ингибироваться супрессорами апоптоза семейства 1АР (inhibitors of apoptosis proteins). Эти протеины являются ингибиторами каспаз, непосредственно связываясь с каспазами 3, 7 и 9.

Внешний (рецепторный) и внутренний (митохондриальный) пути индукции апоптоза могут сливаться в общий путь активации каспаз [31). Кроме того, разделение этих путей не является абсолютным, и они могут пересекаться.

DR-путь

ОСНОВНЫЕ ПУТИ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА

Митохондриальный путь

Рисунок. 1

Лиганд смерти (FasL) Рецептор смерти (Fas) Проапопто

¿ FADD 1 Bad, Вах

Прокаспаза 8

1 \

Каспаза 8

FLIP

Клеточная мембрана

cocieses еж

Апоптоз может быть инициирован двумя альтернативными путями: 1) связыванием лиганда смерти (например, CD95/FasL) с его рецептором (Fas) на клеточной поверхности и 2) через митохондрию. Оба пути приводят к активации инициаторных каспаз (каспаз 8 и 10 в первом случае и каспазы 9 во втором).

РІЗК-ЗАВИСИМЬІЙ ПУТЬ СИГНАЛЬНОЙ ТРАНСДУКЦИИ АПОПТОЗА

PI3K

Akt

Рисунок 2

GSK3 Raf

1

Циклин D Р21' р27

NFkB

Bcl-XL

Bcl-2

TRAIL-R, IAP, RIP

Пролиферация,

ангиогенез

Клеточное

выживание

В регуляции апоптоза большую роль играет опухолевосупрессорный ген р53, который способен остановить клеточный цикл в неблагоприятных для роста условиях и предотвращает появление клеточных клонов с поврежденной ДНК. Повреждения ДНК обусловливают быстрое накопление белка р53 в клетке и индуцируют регуляторные механизмы, блокирующие клеточный цикл. По завершении репарации блок снимается, и клеточное деление может продолжаться. Отсутствие продукта гена р53 дестабилизирует геном. Способность индуцировать апоптоз в клетках с нерепарабельными повреждениями ДНК - важная составляющая его опухолесупрессорной функции.

Опухолевый супрессор р53 является транскрипционным фактором белков семейства Вс12 и рецепторов смерти Fas, DR5, TRA1L-R1 и 2, непосредственно активирует транскрипцию гена Вах и подавляет транскрипцию гена Вс12, сдвигая этим баланс в сторону апоптоза. К р53-индуцибельным генам системы апоптоза относится и ген проапоптозного фактора Apafl. Дефекты экспрессии гена р53 и эффекторов его проапоптозной функции отрицательно сказываются на возможности р53-зависимой индукции апоптоза, приводят к тяжелым нарушениям апоптоза и способствуют развитию аутоиммунитета, в частности у больных РА 1181.

Таким образом, апоптоз является одним из фундаментальных биологических механизмов. Нарушения апоптоза имеют большое значение в патогенезе многих заболеваний, в том числе РА.

Апоптоз иммунных клеток при РА Роль цитокинов

Фактор некроза опухоли a (TNFa). Для РА характерно повышение уровня TNFa, который продуцируется в основном активированными макрофагами и способен индуцировать клеточную пролиферацию, функциональную активацию и апоптоз. Биологические эффекты TNFa регулируются связыванием с рецептором TNFR, причем изменение уровня экспрессии рецептора способствует ингибированию действия TNFa . Соотношение TNF/TNFR имеет прогностическое значение при РА. Отк-

рытие функционального регуляторного полиморфизма гена TNFa и мутаций гена рецептораTNFRI привело к концептуальному прорыву в понимании генетического контроля воспаления. До настоящего времени точно не известно, как именно мутации TNFRI создают предрасположенность к иммуновоспали-тельным заболеваниям, однако подавление активности TNFa является новым эффективным методом лечения аутоиммунных болезней, в том числе РА [20].

Высокий уровень TNFa в полости суставов способствует воспалению и защищает воспалительные клетки от апоптоза. Повышенное содержание TNFa в крови промотирует апоптоз в гемопоэтических клетках-предшественницах костного мозга, что является основной причиной развития анемии при РА 117|.

Цитокин FasL представляет собой лиганд проапоптозного рецептора Fas. Дефект FasL/Fas-зависимого апоптоза может оказывать влияние на регуляцию гнпериммунного ответа, характерного для аутоиммунных заболеваний. Мутации гена Fas в В-лимфоцитах редко встречаются при РА [15]. Это означает, что передача проапоптозного сигнала чаше нарушается в дистальных по отношению к рецептору звеньях. В то же время индукция Fas-зависимого апоптоза воспалительных клеток активацией рецептора Fas способствует значительному уменьшению их количества в ревматоидной синовии. На усилении экспрессии рецептора Fas основано терапевтическое действие метотрексата и D-пеницилламина [6, 11].

Индукция Fas-зависимого апоптоза с помощью специфических моноклональных aHTH-Fas-аитител перспективна для лечения РА, однако эти препараты имеют серьезные побочные эффекты, прежде всего поражение печени. В настоящее время разработаны aHTH-Fas-моноклональные антитела нового поколения m-HFE7A, которые избирательно индуцируют апоптоз в Fcf-позитивных воспалительных клетках без гепатотоксичнос-ти. Перекрестное реагирование с рецептором Fcy активированных лимфоцитов существенно для апоптоз-индуцирующей эффективности антител m-HFE7A ¡n vivo, благодаря которой они могут использоваться влечении РА [19].

Рисунок 3

СХЕМА РАЗВИТИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПОРАЖЕНИЯ СУСТАВА ПРИ РА

Потеря хряща Эрозия кости

Воспалительный

енновит

© - антигенная презентация © - секреция ЦИТОКИНОВ © - внутриклеточный сигналинг © - продукция аутоантител ИР - ревматоидный фактор

TRAIL. TRAIL it его рецепторы не определяются на лимфоцитах синовиальной жидкости и синовиальных фибробластах больных РА. Макрофаги синовиальной жидкости экспрессируют рецептор TRAIL-R3, но не лиганд TRAIL и другие его рецепторы (TRAIL-R1, -R2 и -R4), в отличие от нормальных макрофагов периферической крови, которые экспрессируют только TRAIL-R2, но не TRAIL и другие его рецепторы (TRAIL-Rl, -R3 и -R4). Эктопическая экспрессия лиганда TRAIL в нормальных макрофагах больных РА не влияет на их выживаемость [251. Это означает, что проапоптозный цитокин TRAIL не играет роли в воспалительном процессе при РА.

Апоптоз иммунных клеток у больных РА

Одним из основных морфологических признаков РА является лейкоцитарная инфильтрация синовиальной оболочки. В упрощенном виде схема иммунных взаимодействий при РА представлена на рис. 3. Синовиальные Т-клетки способствуют развитию синовита, секретируя интерферон- у (IFN-y) и IL-17, а также взаимодействуя с макрофагами и фибробластами через межклеточные контакты [301.

Т-лимфоциты. Развитию аутоиммунных нарушений способствует дефект апоптоза, являющегося основным механизмом толерантности периферических Т-клеток. На мышиной модели РА (мыши линии BALB/c) показано, что нарушение толерантности сопровождается гиперпролиферацией CD4+ лимфоцитов крови. Несмотря на то, что CD4+ лимфоциты мышей линии BALB/c, иммунизированные хрящевым протеогликаном человека, экспрессируют высокий уровень антигена Fas, они неспособны капопто-зу в связи с усиленной экспрессией ингибитора каспаз белка FLIP. Это препятствует активации каспазы S в DISC-комплексе, супрес-сирует каспазный каскад в Fas-ззвисимом апоптозе и приводит к накоплению аутореактивных Th I -клеток в циркуляции. Аберрантная экспрессия белка FLIP может также привести KTCR-индуци-рованной гиперпролиферации CD4+ клеток мышей BALB/c с экспериментальным артритом [41[.

Персистентная активация аутореактивных лимфоцитов CD4+ является патогенетическим признаком РА. Причина этой аберрантной активности неизвестна. Для активации и диффе-ренцировки предшественников Т-клеток специфичными антигенами требуется не только антиген-специфичный сигнал от комплекса эпитоп/МНС, но и неспецифичный ко-сгимулирую-щий сигнал от молекул семейства В7, экспрессирующихся на макрофагах и дендритных клетках [39]. При активации Т-клеток рецепторы связываются с молекулами В7, которые прикрепляют антиген-презентирующую клетку к Т-лимфоциту. При отсутствии молекул В7 или при их блокаде анти-В7-антителами толерантность Т-клеток нарушается. Аутоантитела против белка 87-Н1, члена B-7-семейства, определяются у 29% пациентов с РА и только у 4% здоровых доноров. Высокий уровень экспрессии аутоантител против В7-Н1 обнаружен на клеточной поверхности активированных Т-клеток фенотипов CD4+, CD8+ и CD45RO+. Иммобилизованные аутоантитела против В7-Н1 могут стимулировать пролиферацию Т-клеток CD4+ in vitro, причем наличие этих аутоантител коррелирует с активностью заболевания. Привлечение аугоантител против B7-HI на Т-клетки CD4+ стимулирует их пролиферацию и секрецию IL-10. В результате развивается апоптоз, сопровождающийся усиленной экспрессией проапоптозного лиганда TRAIL и каспазы 3. Эти данные свидетельствуют о двунаправленной сигнальной роли аутоантител В7-Н1 в ко-стимуляции Т-клеток и апоптозе, которые способствуют прогрессии РА [9].

Парадоксально, но Т-лимфоциты при РА гипореактнвны и слабо пролиферируют в ответ на антигены и митогены, что придает им сходство с энергическими Т-клетками. Анергия - состояние пониженной Т-клеточной реактивности, и некоторые молекулярные события являются общими для энергических и синовиальных Т-клеток при РА (например, подавление экспрессии кальмодулина, ключевой молекулы для активации Т-клеток и клеточной восприимчивости к индукции апоптоза, что может быть причиной резистентности этих клеток к апоптозу при РА). Транскрипция мРНК кальмодулина всиновии при РА составляет менее 1% от уровня транскрипции при реактивном артрите; в мононуклеарах синовиальной жидкости она ниже, чем в моно-нуклеарах периферической крови. После лечения антителами против TNFa количество транскриптов кальмодулина увеличивается в 5-10 раз ]1).

Течение РА ассоциируется с высокой частотой Т-клеток фенотипа CD4+CD28-, которые редко встречаются у здоровых людей моложе 40 лет. Инкубация Т-клеток различных линий с TNFa приводит к снижению уровня экспрессии на их поверхности антигена CD28, который является рецептором сигнала первичной ко-стимуляции. Этот эффект TNFa обратим, но продолжительное культивирование Т-клеток CD4+CD28+ в присутствии TNFa приводит к появлению Т-клеточных клонов фенотипа CD28-. Показано, что TNFa ингибирует активность минимального промотора гена CD28, что сопровождается редукцией формирования в нем ДНК-протеиновых комплексов. Это означает, что TNFa непосредственно влияет на транскрипцию гена CD28, а возникновение Т-клеток CD4+CD28- у больных РА связано с усиленной продукцией TNFa |2]. In vivo Т-клетки CD4+CD28- часто дают начало аутореактивным клонам, пер-систирующим многие годы. Клоногенный потенциал и большая продолжительность жизни этих клеток связаны с измененным ответом на апоптоз-индуцирующие сигналы, в частности с резистентностью к удалению ростового фактора IL-2. Потеря чувствительности к этому проапоптозному сигналу коррелирует в Т-клетках CD4+CD28- с гиперэкспрессией антиапоптозного белка Вс1-2, которая благоприятствует появлению аутореактивных клонов и имеет существенное значение в патогенезе РА [33].

В воспаленной синовиальной оболочке часто встречаются Т-клетки CD4+, экспрессирующие рецептор CXCR4 хемокина СХС. Его лигандом является продуцируемый стромальными клетками фактор SDF-1 (stromal cell-derived factor I), который стимулирует миграцию ревматоидных синовиальных Т-клеток и ингибирует апоптоз Т-клеток. Взаимодействие рецептора CXCR4c его лигандом SDF-I имеет важное значение в накоплении Т-клеток памяти CD4+ и подчеркивает роль стромальных клеток в регуляции ревматоидного воспаления |21).

В свежеизолированных из синовиальной жидкости больных РА Т-клетках наблюдается гиперэкспрессия антиапоптозного белка Bcl-XL. Вариабельность апоптозного индекса у больных РА отчасти обусловлена уровнем экспрессии проапоптозного белка Вах. Пониженное соотношение Bax/Bcl-XL способствует накоплению в синовиальной жидкости инфильтрирующих Т-клеток [35].

Активированные цитотоксические лимфоциты (CTL) и NK-клетки индуцируют апоптоз клеток-мишеней различными механизмами, включая так называемый экзоцитоз гранул. Этот путь активируется секрецией перфорина и семейства ассоциированных со специализированными гранулами серинпротеаз (гранзимов) во время цитолитических реакций in vivo, которые направлены на клетки-мишени. Гранзим-позитивные клетки синовиальной жидкости и синовиальной ткани больных РА могут играть роль медиаторов апоптоза, экстраклеточного преггео-лиза и цитокиновой индукции. Заметное повышение уровней гранзимов А и В в плазме и синовиальной жидкости при активном РА по сравнению с нормой и у больных остеоартрозом и реактивным артритом указывает на активное участие цитотокси-ческих клеток в патогенезе РА. Измерение уровня гранзимов полезно для оценки клинических проявлений, ассоциированных с активированными CTL и NK-клетками [36), и может служить тест-системой для дифференциального диагноза у больных с разными формами артритов [38].

В-лимфоциты. Синовиальная популяция В-лимфоцитов состоит преимущественно из В-клеток памяти и плазматических клеток. Экспрессия антиапоптозного белка Bcl-XL В-клет-ками, культивируемыми совместно со стромальными клетками ревматоидной синовии, заметно повышена по сравнению с монокультурой В-клеток. При РА стромальные клетки блокируют апоптоз В-клеток, индуцируя в них экспрессию Bcl-XL [12]. Межклеточные контакты с фибробластоподобными синовиоци-тами при совместном культивировании также защищают В-клетки от апоптоза [29].

Известно, что тимические питающие клетки, так называемые клетки-няньки (nurse cells), взаимодействуют с Т-клеткамн и играют роль в их функциональном созревании, однако значение nurse-подобных клеток костного мозга в созревании и диф-ференцировке В-клеток, особенно экстралимфоидных, окончательно не установлено. Известно, что nurse-подобныс клеточные клоны, присутствующие в костном мозге и синовии, обладают способностью оберегать В-клетки от спонтанного апопто-

за и облегчать продукцию иммуноглобулинов и, следовательно, могут играть роль в местной и системной гиперреактивности В-клеток, характерной для РА [34).

Для оценки патогенной роли синовиальных В-клеток при РА был проведен скрининг В-клеточных гибридом, секретирую-щих моноклональные аутоантитела. Одно из них (lgG2A.) оказалось высокореактивным против цитоплазмы хондроцитов и эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта. Иммуно-электронная микроскопия выявила наибольшую плотность флуоресцентной метки во внутренней митохондриальной мембране и митохондриальном матриксе. Анализ соматических мутаций в вариабельных регионах тяжелых и легких иммуноглобулиновых цепей показал, что 1£02Х.-продуцируюший В-клеточный клон антиген-селектирован. Интраперитонеальная аппликация моноклональных антител lgG2X мышам линии SC1D (severe combined immunodeficiency) вызывала воспаление и преимущественно гранулоцитарную инфильтрацию брюшины. Экспансия клеток данного клона обнаружена в синовиальной ткани (но не в клетках синовиальной жидкости или периферической крови) больных РА. Следовательно, гибель клеток синовиальной ткани или деструкция хряща являются источником митохондриальных антигенов, индуцирующих локальный антиген-управляемый IgG2X- В - клеточ н ы й ответ. Эти данные подтверждают, что тканевая деструкция высвобождает артритогенные аутоантигены, поддерживающие локальный воспалительный процесс в ревматоидной синовии [14).

Герминальные центры лимфоидных фолликулов - место размножения В-лимфоцитов памяти. Одним из признаков герминальных центров является присутствие фолликулярных дендритных клеток (ФДК), которые необходимы для селекции В-лимфоцитов памяти по их способности к выключению механизма апоптоза. В норме образование герминальных центров и ФДК ограничено периферическими лимфоидными органами, но у пациентов с РА лимфонодулярные инфильтраты часто наблюдаются в воспаленной синовиальной строме и содержат лимфоидные фолликулы с герминальными центрами. Доказано присутствие в них клеток, экспрессирующих маркеры ФДК, причем, возможно, это специфично для РА [27]. Формирование таких эктопических герминальных центров может создать микросреду, в которой В-клетки поддерживаются и селектируются, что дает начало локальной продукции ревматоидного фактора (РФ) (IgG) убольных РА. Это подтверждается способностью си-новиоцитов поддерживать продукцию РФ В-клетками, активированными Staphylococcus aureus Cowan I [8]. Кроме того, клетки, сходные с тимическими питающими клетками, выделенные из костного мозга и синовиальной оболочки больных РА, могут связывать периферические Т- и В-клетки и поддерживать их выживание [34].

Происхождение ФДК точно не установлено. Они обладают фенотипом, частично сходным с фенотипом фибробластов, и медленно пролиферируют. Некоторые данные указывают на происхождение ФДК из стромальных клеток. В частности, у животных после иммуносупрессии локальное присутствие В-кле-ток является предпосылкой индукции дифференцировки стромальных клеток в ФДК. Важную роль в формировании герминальных центров и сети ФДК играют TNFa и его рецептор TNFR1, которые экспрессируются в синовиальных тканях больных РА. Следовательно, условия, которые приводят к индукции ФДК в лимфоидных органах, имеются в ревматоидной синовии. На основании этих фактов выдвинуто предположение, что синовиальные фибробласты больных РА склонны дифференцироваться в ФДК-подобные клетки.

С другой стороны, продукция РФ в воспаленной синовии у больных РА означает, что существуют места, где предшественники плазматических клеток претерпевают переключение изотипа и созревание (повышение аффинности) путем соматических мутаций и селекции. Наиболее вероятными кандидатами на роль исполнителей этой функции являются присутствующие в синовии лимфонодулярные инфильтраты с герминальными центрами, которые, предположительно, организуются вокруг эктопических ФДК. Клетки с ФДК-фенотипом обнаружены в синовиальных биоптатах больных РА и неревматоидными формами артрита. При культивировании фибробластоподобных синовио-цитов in vitro часть клеточных линий безотносительно к их РАИЛИ неРА-происхождению может быть индуцирована цитокина-

ми IL-I и TNFa к экспрессии ФДК-фенотипа. Однако ФДК-специфическая функция, т.е. связывание В-клеток герминального происхождения и выключение апоптоза в них, является прерогативой лишь ревматоидных фибробластоподобных сино-виоцитов. Таким образом, фибробластоподобные синовиоциты больных РА обладают уникальной способностью в результате дифференцировки приобретать ФДК-фснотип [16|.

Эритропоэз у больных РА. Исследованы роль TN Fa в эритро-поэзе у пациентов с активным РА и влияние анти-TNFa-антител на их состояние. Установлено, что количество эритроидных бурст-формирующих единиц значительно ниже у больных РА по сравнению со здоровыми донорами. Эти аномалии наиболее выражены у больных с анемией хронических заболеваний. Повышенный уровень TNFa в супернатантах долговременных культур костного мозга больных РА негативно коррелирует с количеством эритроидных бурст-формирующих единиц и уровнем гемоглобина и позитивно - с числом эритроидных клеток-предше-ственников с признаками апоптоза. Анти-TNFa -антитела приводят к нормализации соотношения общего количества эритроидных клеток-предшественнии и таких же клеток, находящихся в процессе апоптоза, и значительно повышают уровень гемоглобина. Следовательно, ингибирующее влияние TNFa на эритропоэз, обусловленное апоптозной делецией эритроидных предшественников костного мозга, имеет значение в развитии анемии хронических заболеваний при РА. Назначение анти-TN Fa -антител этим пациентам подавляет нежелательный апоптоз эритроидных предшественников [23].

Аналогичные данные получены для клеток-предшественни-ков с иммунофенотипом CD34+. Оказалось, что при РА наблюдается усиленный апоптоз клеток CD34+; клоногенный потенциал мононуклеаров костного мозга и клеток CD34+ понижен по сравнению с нормой, а клетки стромы продуцируют аномально большие количества TNFa и неспособны поддерживать нормальный гемопоэз. Уровень TNFa в супернатантах культур костного мозга негативно коррелирует с количеством CD34+ и колониеформирующих клеток и позитивно - с процентом апоптоз-ных клеток CD34+. Существенное восстановление нарушенного гемопоэза у больных было достигнуто в результате лечения анти-TN Fa-антителами. Следовательно, дефекты кроветворения у больных РА в значительной мере обусловлены гиперпродукцией TNFa [24].

Нейтрофилы. Известно, что нейтрофилы способствуют повреждению суставов при РА. Главной детерминантой нейтро-фильного повреждения суставных тканей считаются иммунные комплексы, которые накапливаются в синовиальной жидкости. Апоптоз нейтрофилов - способ избежать обширного тканевого повреждения. В отличие от некротических клеток, апоптозные нейтрофилы распознаются и поглощаются макрофагами, не стимулируя воспалительной активности фагоцитирующих клеток. Провоспалительные цитокины синовиальной жидкости способны пролонгировать выживаемость нейтрофилов.

Провоспалительное влияние микросреды синовиальной жидкости при РА ответственно за персистенцию активированных и долгоживущих нейтрофилов. В синовиальной жидкости больных РА нейтрофилы экспонированы к провоспалительным медиаторам, наделенным анти- или проапоптозными свойствами. Спонтанный и опосредованный иммунными комплексами апоптоз нейтрофилов уменьшается in vitro синовиальной жидкостью больных РА, хотя активация нейтрофилов, индуцированная иммунными комплексами, не подвержена влиянию синовиальной жидкости. Антиапоптозная активность синовиальной жидкости зависит от присутствия в ней аденозина. Уровень аденозина в синовиальной жидкости коррелирует с числом апоптозных нейтрофилов в экссудате |22]. Метотрексат, наиболее широко используемый базисный препарат для лечения РА, усиливает экстраклеточное высвобождение аденозина. который, в свою очередь, усиливает противовоспалительное действие медикамента [5].

Апоптоз и клиренс нейтрофилов существенны для успешного разрешения воспаления. Нейтрофилы зоны воспаления претерпевают апоптоз в культуре быстрее, чем нейтрофилы периферической крови; следовательно, увеличенная продолжительность жизни воспалительных нейтрофилов не может объясняться изменением экспрессии рецептора Fas или индукцией Fas-лиганда. Клетки сохраняют такую же чувствительность к Fas-3a-

вмсимому апоптозу, как и нейтрофилы периферической крови. Ростовой фактор GM-CSF редуцирует апоптоз, не отменяя Fas-зависимый сигналинг. Это означает, что апоптоз воспалительных нсйтро<1)илов зависит от сигналов клеточной смерти или выживания в воспалительной среде, и снижение уровня факторов выживания способствует разрешению воспаления [28].

Макрофаги. Синовиальные моноциты/макрофаги больных РА имеют активированный фенотип с перманентной цитокино-вой экспрессией. Моноциты/макрофаги периферической крови и синовиальной жидкости больных РА не отличаются от нормы по уровню экспрессии Fas и FasL. Несмотря на это, моноциты/макрофаги синовиальной жидкости больных РА резистентны к апоптозу, индуцированному анти-Fas-антителам и. По-видимому, за это ответственен усиленно экспрессирующийся в синовиальной ткани белок FLIP [25, 26]. Ингибитор каспазы 8 белок FLIP предотвращает ассоциацию каспазы 8 с адапторным белком FADD (Fas-assodated death domain) и, следовательно, ингибирует Fas-зависимый апоптоз. TNFa защищает эти клетки от апоптоза индукцией экспрессии NFk- В и FLIP. Анти-TNFa-антитела (инфликсимаб) и анти-TNFR-антитела (эта-нерцепт) индуцируют клеточно-специфичный апоптоз и подавляют воспаление в синовии [4|. В рандомизированных клинических исследованиях установлено, что включение инфликси-маба в программу лечения в дополнение к метотрексату дает значительное улучшение клинических и лабораторных данных у больных РА по сравнению с монотерапией метотрексатом [4, 37].

Уровень апоптоза в синовии при РА значительно выше у пациентов с длительным анамнезом (более 20 лет), чем у пациентов с ранним РА (менее 6 мес.); количество макрофагов и экспрессия белка FLIP выше в группе с ранним РА, чем в группе с длительным анамнезом. Экспрессия FLIP на макрофагах защищает их от Fas-зависимого апоптоза и способствует развитию воспаления [32]. Поэкспрессии цитокинови количествуТ-лим-фоцитов эти группы больных не отличались. Не было достоверных отличий между пациентами в зависимости от лечения глюкокортикоидами или нестероидными противовоспалительными препаратами. Следовательно, синовиальные макрофаги, экспрессирующие высокий уровень FLIP, резистентны к апоптозу при раннем РА. но при прогрессии заболевания механизм апоптоза макрофагов может быть восстановлен [3].

Воспалительные макрофаги из синовиальной жидкости пациентов с РА экспрессируют высокоаффинный рецептор для IgG (FcyRl), благодаря которому они могут быть избирательно элиминированы токсин-конъюгированными моноклональными антителами CD64-ricinA (CD64-RÍA) против Fey RI. Этот рецептор обладает способностью к эффективному эндоцитозу связанных с ним антител. Элиминация макрофагов происходит путем апоптоза. Моноциты/макрофаги периферической крови, которые имеют низкий уровень экспрессии Fey RI, в значительно меньшей степени подвержены апоптозной элиминации. Индукция апоптоза макрофагов синовиальной жидкости ассоциирована с ингибированием антиген-индуцированной пролиферации лимфоцитов и снижением секреции TNFa, что согласуется со способностью антител CD64-RÍA ингибировать продукцию TNFy и IL-1 . Эти данные подчеркивают роль синовиальных макрофагов в воспалении суставов при РА, поэтому их избирательная элиминация с помощью иммунотоксинов может стать новым методом лечения РА [40].

Роль свободных радикалов в поддержании хронического воспаления

Свободные радикалы могут повреждать клеточные структуры и способствовать развитию большого количества заболеваний, в том числе РА. Свободные кислородные (ROS) и азотные (RNS) радикалы могут прямо или косвенно повреждать основные суставные структуры и приводить к артриту. Перекись водорода ингибирует синтез хрящевых протеогликанов, так как препятствует синтезу АТФ, супрессируя гликолитический фермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу в хондроцитах и усугубляя протеолитическое и свободнорадикальное повреждение хряша. Пероксинитрит (ONOO-) И HOCI могут облегчать повреждение хряща, инактивируя ингибиторы матриксных метал-лопротеиназ Т1МР (tissue inhibitors of metalloproteinases). TIMP-

I ингибирует стромелизины, коллагеназы и желатиназы, но эта

способность утрачивается после обработки ONOO(-) или HOCI. При этом HOCI может также активировать латентные формы нейтрофильных коллагеназ и желатиназ. Гипохлорная кислота, ONOO(-) и 0(2)(*-) реагируют с аскорбиновой кислотой, необходимой для функционирования хряща, и снижают уровень ас-корбата в синовиальной жидкости. Низкие концентрации перекиси водорода или 0(2)(*-) ускоряют костную резорбцию остеокластами, тогда как оксид азота (N0) ингибирует ее. N0 про-мотирует апоптоз хондроцитов, ингибирует синтез протеогликанов и активирует латентные металлопротеиназы и циклооксиге-назы. ROS, продуцированные активированными фагоцитами, могут изменить антигенное поведение IgG, что приводит к активации фагоцитирующих клеток. IgG после воздействия свободных радикалов способен связывать РФ и генерировать СЗа. Эта реакция при РА может самоподдерживаться в полости сустава, что подтверждает значение свободных радикалов в хронизации воспаления и деструкции хряща и кости. ROS могут также функционировать как сигнальные мессенджеры, активируя транскрипционные факторы, например NkF В и АР-1, и индуцируя генную экспрессию. Изучение этого вопроса могло бы послужить основой рационального выбора антиоксидантов для усиления комбинированной терапии РА [10].

Ревматоидные узелки

Ревматоидные узелки имеют типичные признаки гранулемы. На начальной стадии формирования гранулемы в ней группируются инфильтрирующие Т-клетки и макрофаги. При пер-систирующем воспалении туда привлекаются и другие клетки, которые создают организованную структуру с центральной осью из макрофагов, окруженных лимфоцитами. Развитие такой организованной структуры зависит от цитокинов. Под влиянием INF и TNFa формируются гранулемы типа Thl, подобные тем, которые образуются при инфекции Mycobacterium tuberculosis. В развитии, персистенции и разрешении гранулем важно соотношение между привлечением Т-клеток и макрофагов, с одной стороны, и апоптозной гибелью этих клеток - с другой. Клеточная резистентность к апоптозу приводит к накоплению клеток, формирующих гранулему, и ее персистенции. Выживаемости воспалительных клеток в гранулеме способствуют цитокины IL-12 и IL-15, а также взаимодействие этих клеток с фибробласта-ми. Разрешение поражений данного типа ассоциировано с высоким уровнем апоптоза.

В ревматоидных узелках встречаются два типа клеточной смерти: апоптоз и некроз. Центр узелка заполнен клеточными органеллами и другими некротическими осколками, а также небольшим количеством клеток с интактными мембранами, но и с признаками дегенерации. Некротические клетки концентрируются вокруг некротического центра, тогда как клетки, погибающие по механизму апоптоза, равномерно распределяются во всех зонах ревматоидного узелка. В целом, уровень апоптоза в ревматоидных узелках (3,5%) не отличается от такового в пораженных синовиальных мембранах (3,6%). Чаще наблюдается апоптоз инфильтрирующих Т-лимфоцитов и макрофагов, чем резидентных фибробластов. Это наблюдение согласуется с предположением о том, что инфильтрирующие воспалительные клетки контролируют накопление клеток в ревматоидных узелках [13].

Заключение

Причины нарушения толерантности и развития аутоиммунной агрессии при РА неизвестны. Вероятно, в каждом отдельном случае существуют особые причины в виде индивидуального паттерна генетической предрасположенности, которая играет роль в нарушении регуляции апоптоза иммунных клеток. Генетический полиморфизм и мутации в генах любых элементов апоптозного механизма, включая рецепторы и их лиганды, пути передачи апоптозных и митогенных сигналов, регуляторные про- и антиапоптозные белки, внутриклеточные протеазы семейства каспаз, могут оказывать влияние на уровень апоптоза воспалительных клеток и тяжесть воспалительного процесса. Контролирующие апоптоз молекулы, дефектно экспрессирующиеся в иммунных клетках больных РА, потенциально представляют собой мишени для специфической противоревматоид-ной терапии.

ЛИТЕРАТУРА

1. АН М., Ponchel F., Wilson К.Е. et al. Rheumatoid arthritis synovial T cells regulate transcription of several genes associated with antigen-induced anergy. J. Clin. Invest., 2001, 107, 4, 519-528.

2. Bryl E., Vfollejo A.N., Wfeyand C.M. et al. Down-regulation of CD28 expression by TNF-alpha. J. Immunol., 2001, 167, 6, 3231-3238.

3. Catrina A.I., Ulfgren A.K., Lindblad S. et al. Low levels ofapop-tosis and high FLIP expression in early rheumatoid arthritis synovium. Ann. Rheum. Dis., 2002, 61, 10, 934-936.

4. Catrina А.1., Troilmo Ch., Klint E. et al. Evidence that antitumor necrosis factor therapy with both etanercept and infliximab induces apoptosis in macrophages, but not lymphocytes in rheumatoid arthritis joints. Arthr. Rheum., 2005, 52, 1, 61-72.

5. Cronstein B.N. Molecular therapeutics: methotrexat and its machanism of action. Arthr. Rheum., 1996, 39, 1951-1960.

6. Cutolo М., Sulli A., Craviotto C. et al. Modulation of cell growth and apoptosis by sex hormones in cultured monocytic THP-1 cells. Ann. NY Acad. Sci., 2002, 966, 204-210.

7. Cutolo M„ Sulli A., Craviotto C. et al. Antiproliferative-antiinflammatory effects of methotrexate and sex hormones on cultured differentiating myeloid monocytic cells (THP-1). Ann. NY Acad. Sci., 2002, 966, 232-237.

8. Dechanet J., Merville P., Durand 1. et al. The ability of synoviocytes to support terminal differentiation of activated В cells may explain plasma cell accumulation in rheumatoid synovium. J. Clin. Invest., 1995, 95, 456-460.

9. Dong H., Strome S.E., Matteson E.L. Costimulating aberrant T cell responses by B7-H1 autoantibodies in rheumatoid arthritis. J. Clin. Invest., 2003, 111, 3, 363-370.

10. Hadjigogos K. The role of free radicals in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Panminerva Med., 2003,45, 1, 7-13.

11. Harada S., Sugiyama E., Takj H. et al. D-penicillamine cooperates with copper sulfate to enhance the surface expression of functional Fas antigen in rheumatoid synovial fibroblasts via the generation of hydrogen peroxide. Clin. Exp. Rheumatol., 2002, 20,4, 469-476.

12. Hayashida K., Shimaoka Y., Ochi T. et al. Rheumatoid arthritis synovial stromal cells inhibit apoptosis and up-regulate Bcl-xL expression by В cells in a CD49/CD29-CD106-dependent mechanism. J. Immunol., 2000, 164, 2, 1110-1116.

13. Highton J., Hessian P.A., Kean A. et al. Cell death by apoptosis is a feature of the rheumatoid nodule. Ann. Rheum. Dis., 2003, 62, 1,77-80.

14. Krenn V., Molitoris R., Berek C. et al. A novel monospecific lgG2/lambda-autoantibody with specificity for a mitochondrial antigen: evidence for an antigen-driven pathogenetic B-cell response in rheumatoid synovial tissue, induced by tissue alteration. Lab. Invest., 1998, 78, 4, 485-496.

15. Kurth J., PemiokA., Schmitz R. etal. Lack of deleterious somatic mutations in the CD95 gene of plasmablasts from systemic lupus erythematosus patients and autoantibody-producing cell lines. Eur. J. Immunol., 2002, 32, 12, 3785-3792.

16. Lindhout E., van Eijk М., van Pel M. et al. Fibroblast-like synoviocytes from rheumatoid arthritis patients have intrinsic properties of follicular dendritic cells. J. Immunol., 1999, 162, 10, 5949-5956.

17. Liu H., Pope R.M. The role of apoptosis in rheumatoid arthritis. Curr. Opin. Pharmacol., 2003, 3, 3, 317-322.

18. Maas K., Wfestfall М., Pietenpol J. et al. Reduced p53 in peripfer-al blood mononuclear cells from patients with rheumatoid arthritis is associated with loss of radiation induced apoptosis. Arthr. Rheum., 2005, 52, 4, 1047-1057.

19. Matsuno H., Yudoh K., Nakazawa F. et al. Antirheumatic effects of humanized anti-Fas monoclonal antibody in human rheumatoid arthritis/SCID mouse chimera. J. Rheumatol., 2002, 29, 8, 1609-1614.

20. McDermott M.F. TNFand TNFR biology in health and disease. Cell. Mol. Biol., 2001, 47,4, 619-635.

21. Nanki Т., Hayashida K., El-Gabalawy H.S. et al. Stromal cell-derived factor-1-CXC chemokine receptor 4 interactions play a central role in CD4+ T cell accumulation in rheumatoid arthritis synovium. J. Immunol., 2000, 165, II, 6590-6598.

22. Ottonello L., Cutolo М., Frumento G. et al. Synovial fluid from patients with rheumatoid arthritis inhibits neutrophil apoptosis:

role of adenosine and proinflammatory cytokines. Rheumatology (Oxford), 2002, 41, 11, 1249-1260.

23. Papadaki H.A., Kritikos H.D., Gemetzi C. et al. Bone marrow progenitor cell reserve and function and stromal cell function are defective in rheumatoid arthritis: evidence for a tumor necrosis factor alpha-mediated effect. Blood, 2002, 99, 5, 1610-1619.

24. Papadaki H.A., Kritikos H.D.. VWatas V. et al. Anemia of chronic disease in rheumatoid arthritis is associated with increased apoptosis of bone marrow erythroid cells: improvement following anti-tumor necrosis factor-alpha antibody therapy. Blood, 2002, 100, 2, 474-482.

25. Perlman H., Nguyen N., Liu H. et al. Rheumatoid arthritis synovial fluid macrophages express decreased tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand R2 and increased decoy receptor tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand R3. Arthr. Rheum., 2003, 48, 11, 3096-3101.

26. Perlman H., Pagliari L.J., Liu H. et al. Rheumatoid arthritis synovial macrophages express the Fas-associated death domain-like interleukin-1 beta-converting enzyme-inhibitory protein and are refractory to Fas-mediated apoptosis. Arthr. Rheum., 2001, 44, 1,21-30.

27. Randen I., Mellbye O., Natvig J.B. The identification of germinal centers and follicular dendritic cell networks in rheumatoid synovial tissue. Scand. J. Immunol., 1995,41, 481-490.

28. Renshaw S.A., Timmons S.J., Eaton V. et al. Inflammatory neutrophils retain susceptibility to apoptosis mediated via the Fas death receptor. J. Leukoc. Biol., 2000, 67, 5, 662-668.

29. Reparon-Schuijt C.C., van Esch W.J., van Kooten C. et al. Regulation of synovial В cell survival in rheumatoid arthritis by vascular cell adhesion molecule 1 (CD106) expressed on fibroblast-like synoviocytes. Arthr. Rheum., 2000,43, 5, 1115-1121.

30. Romas E., Gillespie M.T., Martin T.J. Involvement of receptor activator of NFkappaB ligand and tumor necrosis factor-alpha in bone destruction in rheumatoid arthritis. Bone, 2002, 30,2, 340346.

31. Rossi D, Gaidano G. Messengers of cell death: apoptotic signaling in health and disease. Haematologica, 2003, 88, 2,212-218.

32. Schedcl J., Gay R.E., Kuenzler P. et al. FLICE-inhibitory protein expression in synovial fibroblasts and at sites of cartilage and bone erosion in rheumatoid arthritis. Arthr. Rheum., 2002,46, 6, 1512-1518.

33. Schirmer М., Vallejo A.N., Wfeyand C.M. et al. Resistance to apoptosis and elevated expression of Bcl-2 in clonally expanded CD4+CD28- T cells from rheumatoid arthritis patients. J. Immunol., 1998, 161, 2, 1018-1025.

34. Shimaoka Y„ Attrep J.F., Hirano T. et al. Nurse-like cells from bone marrow and synovium of patients with rheumatoid arthritis promote survival and enhance function of human В cells. J. Clin. Invest., 1998, 102, 3,606-618.

35. Sioud М., Mellbye O., Forre O. Analysis of the NF-kappa В p65 subunit, Fas antigen, Fas ligand and Bcl-2-reIated proteins in the synovium of RA and polyarticular JRA. Clin. Exp. Rheumatol., 1998, 16, 2, 125-134.

36. Spaeny-Dekking E.H., Hanna W.L., Walbink A.M. et al. Extracellular granzymes A and В in humans: detection of native species during CTL responses in vitro and in vivo. J. Immunol.,

1998, 160, 7, 3610-3616.

37. StClair E.W., van der Heijde D., Smolen J.S. et al. Combination of infliximab and methotrexate therapy for early rheumatoid arthritis. A randomized, controlled trail. Arthr. Rheum., 2004, 50, II, 3432-3443.

38. Tak P.P., Spaeny-Dekking L., Kraan M.C. etal. The levels of soluble granzyme A and В are elevated in plasma and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis (RA). Clin. Exp. Immunol..

1999, 116,2, 366-370.

39. Vim Parijs L., Perez VI., Biuckians A. Role of interleukine 12and costimulators in T cell energy in vivo. J. Exp. Med., 1997, 186, 7, 1119-1128.

40. Vim Roon J.A., van Vuuren A.J., Wijngaarden S. et al. Selective elimination of synovial inflammatory macrophages in rheumatoid arthritis by an Fcgamma receptor l-directed immunotoxin. Arthr. Rheum., 2003,48, 5, 1229-1238.

41. Zhang J., Bardos Т., Mikecz K. et al. Impaired Fas signaling pathway is involved in defective T cell apoptosis in autoimmune murine arthritis. J. Immunol., 2001, 166, 8, 4981-4986.

Поступила 10.01.05