Идентификация микробного состава поликультуры рисового гриба как основы получения ферментированных безалкогольных напитков

Идентификация микробного состава поликультуры рисового гриба

как основы получения ферментированных безалкогольных напитков

Л.М. Королева, Е.А. Цед

УО «Могилевский государственный университет продовольствия» (Беларусь) Н.К. Коваленко, С.С. Нагорная

Институт микробиологии и вирусологии им. Заболотного

В настоящее время одно из приоритетных направлений в безалкогольной отрасли — создание новых безалкогольных напитков, обогащенных биологически активными ингредиентами и обладающих целенаправленно заданными свойствами.

Современный рынок Республики Беларусь характеризуется широким ассортиментом безалкогольных напитков, но, к большому сожалению, они предствля-ют собой в основном продукцию, полученную с использованием синтетических либо идентичных натуральным пищевых добавок — ароматизаторов, красителей, подсластителей, консервантов. Однако длительное употребление таких напитков не может не оказывать негативного влияния на здоровье человека, и в особенности детей — основных потребителей такого рода пищевых продуктов.

В этом свете особую значимость приобретают сброженные безалкогольные напитки, представляющие собой субстраты растительного происхождения и обогащенные метаболитами микробиологического биокомплекса. Это обусловлено тем, что в ходе процессов брожения образуется целый ряд биологически активных веществ (витамины, аминокислоты, органические кислоты, минеральные вещества и т.д.), необходимых для нормального функционирования человеческого организма, что в итоге придает сброженным напиткам повышенную биологическую ценность и лечебно-профилактические свойства.

Классическими микроорганизмами, используемыми для получения сброженных безалкогольных напитков, являются в основном дрожжи. Однако в природе существует ряд других возбудителей брожения, которые теоретически могли бы осуществлять биоконверсию углеводов. К ним относят такие широко культивируемые в домашних условиях биокультуры микроорганизмов, как чайный гриб (волжский гриб, морской гриб, японская губка, японский чайный гриб, маньчжурский гриб, Комбуха),

тибетский молочный гриб (гриб индийский йогов), рисовый гриб (индийский морской рис, японский рис, живой рис, «белая крупа», «змеиное просо»).

В литературе имеются данные по установлению видового состава микрофлоры чайного гриба Medusomyces gise-иИ, которая представлена различными видами уксуснокислых бактерий и дрожжей, и приводятся сведения об антибиотическом и терапевтическом действии напитка, называемого «чайным квасом» или «чайным уксусом», полученным на его основе [1].

В настоящее время отсутствуют научные исследования, касающиеся определения видового состава другой естественной поликультуры микроорганизмов под тривиальным названием «рисовый гриб».

Таким образом, цель нашей работы — изучение нового нетрадиционного источника брожения — поликультуры рисового гриба и исследование возможности использования его в качестве сбраживающего компонента для получения безалкогольных напитков брожения.

По внешнему виду рисовый гриб представляет собой прозрачные желеобразные гранулы различного размера, напоминающие по форме рисовые зерна. Считается, что рисовый гриб — это естественная симбиотическая поликультура микроорганизмов, сформировавшаяся в ходе эволюции. Приготовленный в домашних условиях напиток на основе рисового гриба имеет не только приятные органолептические показатели, но и широкий фармацевтический диапазон, обладая целым рядом лечебно-профилактических свойств. Список заболеваний, которые лечатся или облегчаются с помощью напитка, полученного на основе рисового гриба, достаточно широк. Это заболевания центральной нервной системы (депрессивные расстройства, не-врозоподобные состояния, последствия инсульта), иммунной системы (авитаминозы, иммунокомплексные заболевания, ревматоидные артриты), сердечно-сосу-

дистой системы (аритмия, атеросклероз, гипертония, ишемия, тромбофлебит, тахикардия), дыхательной системы (бронхит, гайморит, фарингит, плеврит, туберкулез, фарингит). Напиток на основе рисового гриба способствует восстановлению нарушений обмена веществ, снижению сахара в крови, повышает работоспособность, помогает при бессоннице, нормализует кислотность желудочного сока, эффективен при отложении солей, ревматизме, стоматите, пиелонефрите, обладает противовирусной активностью, онкостатическим и иммуностимулирующим действиями [2, 3, 4].

В связи с этим большой научный и практический интерес представляли исследование и идентифицирование микробного состава поликультуры микроорганизмов рисового гриба Oryzamyces indici РГЦ. Знания морфологических и физиолого-биохимических свойств образующих поликультуру микроорганизмов позволяют эффективно управлять процессами при сбраживании субстратов и тем самым вести целенаправленное получение продукта с заданными свойствами.

Идентификацию микробного состава поликультуры проводили после предварительного получения чистых культур методом истощающего посева. Видовой состав выделенных чистых культур, входящих в консорциум Oryzamyces indici РГЦ, определяли по совокупности культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков. Проведенные исследования показали, что естественная полисимбиотическая ассоциация микроорганизмов Oryzamy-ces indici РГЦ представляет собой взаимовыгодное сожительство различных таксономических групп микроорганизмов — двух видов дрожжей, двух видов молочнокислых бактерий и одного вида уксуснокислых бактерий.

Дрожжевая микрофлора Oryzamyces indici РГЦ была идентифицирована по определителю «The yeasts. A taxonomic study» (1998) и представлена дрожжами Zygosaccharomyces fermentati Naganis-hi и Pichia membranaefaciens Hansen [5].

Первая культура дрожжей относится к виду Zygosaccharomyces fermentati Naganishi. Культурально-морфологи-ческие признаки данной культуры дрожжей следующие. Через 3 сут при 25 °С на сусло-агаре клетки круглые, слегка овальные, изредка цилиндрические размерами (2,0-7,0) х (3,0-8,0) мкм. Вегетативное размножение — мультиполяр-ным почкованием. Конъюгация клеток предшествует образованию асков, содержащих 1-4 круглых, гладких аско-споры. Штрих-культура белая, образует псевдомицелий.

Данный вид дрожжей сбраживает глюкозу, сахарозу, мальтозу, раффино-

2•2007

40

зу, галактозу и лактозу не сбраживает. Ассимилирует глюкозу, галактозу, L-сорбозу, сахарозу, мальтозу, целлоби-озу, трегалозу, раффинозу, мелецитозу, инулин, этанол, маннит, сорбит, а-ме-тил-Д-глюкозид, салицин, молочную и янтарную кислоты.

Дрожжи Zygosaccharomyces ¡erme-ntati Naganishi не ассимилируют лактозу, мелибиозу, крахмал растворимый, Д-ксилозу, L-арабинозу, Д-арабинозу, Д-рибозу, L-рамнозу, глицерин, эритрит, рибит, дульцит, маннит, лимонную кислоту, инозит. Нитраты не усваивают. Ауксотрофы, не растут в среде без витаминов. Растут при температуре 37 °С.

Вторая культура дрожжей идентифицирована как Pichia membranaefaciens Hansen и имела следующие культураль-но-морфологические признаки. Через 3 сут при 25 °С на сусло-агаре клетки овальные, удлиненные, размерами (1,8-4,5) х (2,5-17) мкм, одиночные, в парах или гроздьях. Аскоспоры (1-4) круглые, шляповидные, при созревании легко освобождаются из асков. Штрих-культура желтовато-белая, сухая, по-рошистая, морщинистая, с псевдомицелием. В жидкой среде образуется сухая, морщинистая пленка.

Pichia membranaefaciens Hansen обладает следующими физиолого-биохими-ческими признаками: глюкозу сбраживает слабо и медленно; не сбраживает галактозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, раффинозу; ассимилирует глюкозу, этанол, глицерин.

Не ассимилирует галактозу, L-сорбо-зу, сахарозу, мальтозу, целлобиозу, тре-галозу, лактозу, мелибиозу, раффинозу, мелецитозу, инулин, крахмал растворимый, Д-ксилозу, L-арабинозу, Д-араби-нозу, рибозу, L-рамнозу, эритрит, рибит, дульцит, маннит, сорбит, а-метил-Д-глю-козид, салицин, молочную, янтарную, лимонную кислоты. Нитраты не усваивает. Ауксотроф, не растет в среде без витаминов. Не растет при температуре 37 °С.

Среди физиолого-биохимических признаков микроорганизмов, применяемых для получения продуктов брожения, наибольшую значимость имеют признаки, характеризующие способность микроорганизма сбраживать и утилизировать различные виды углеродсодержащих веществ, содержащихся в сбраживаемых субстратах. Это связано с тем, что от конечных продуктов метаболизма сбраживающего компонента зависят органо-лептические и физико-химические свойства получаемых продуктов брожения, в частности сброженных безалкогольных напитков.

Молочнокислые бактерии идентифицировали с применением AIP-тест-систе-мы, которая представляет собой раствор АПИ 50 ЦХЛ и служит готовой средой,

предназначенной для исследования ферментации 49 углеводов на специальной полоске. В этом растворе готовится суспензия исследуемого микроорганизма, которой инокулируется каждая микропробирка полоски. Во время инкубации углеводы ферментируются до кислот, которые приводят к снижению рН, что выявляется по изменению цвета индикатора. В результате получается биохимический профиль штамма, который используется для идентификации.

Молочнокислые бактерии согласно определителю «Bergey's manual of systematic bacteriology. — 9th» представлены следующими видами: Lactobacillus pa-racasei subsp. paracasei и Leuconostoc mesenteroides subsp. Дextranicum [6].

Молочнокислые бактерии Lactobacil-lus paracasei subsp. paracasei имеют следующие культурально-морфологические признаки: колонии средней величины, круглые, блестящие, сероватого цвета, с ровными краями, плотные при снятии петлей. Колонии, выращенные на жидкой среде МРС при 20 °С, имеют придонный рыхлый рост. При 37 °С — пристеночный и придонный рост с верхней прозрачной зоной в 1 см, при 45 °С — рост отсутствует. Грамположительные палочки с размерами (1,06 х 0,50)-(2,75 х 0,66) мкм, расположены штабельками, спор не образуют, неподвижны.

Физиолого-биохимические признаки молочнокислых бактерий Lactobacillus paracasei subsp. Paracasei: факультативные анаэробы, нитраты в нитриты не восстанавливают, дыхательные системы, содержащие цитохромы, отсутствуют. Каталазоотрицательные, аммиак из аргинина и диоксид углерода из глюкозы не образуют. Растут на среде МРС при 10 °С. Продуцируют молочную кислоту на среде с глюкозой по гомофермента-тивному типу.

Lactobacillus paracasei subsp. paracasei сбраживают рибозу, адонитол, галактозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, дульцитол, маннитол, сорбитол, а-ме-тил-Д-глюкозид, N-ацетилглюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салици-лин, целлобиозу, мальтозу, лактозу, сахарозу, трегалозу, инулин, мелезито-зу, гентобиозу, Д-туранозу, Д-тагатозу; незначительно сбраживает глюконат, 5-кетоглюконат.

Не сбраживают глицерол, эритритол, Д-арабинозу, L-арабинозу, Д-ксилозу, L-ксилозу, р-метил-Д-ксилозид, сорбозу, рамнозу, инозитол, а-метил-Д-маннозид, мелибиозу, раффинозу, крахмал, гликоген, ксилитол, Д-фукозу, L-фукозу, Д-ара-битол, L-арабитол, 2-кетоглюконат.

Молочнокислые бактерии Leucono-stoc mesenteroides subsp. dextranicum имеют следующие культурально-мор-фологические признаки: колонии на МРС-агаре мелкие, средней плотности

с неровными краями, блестящие. Колонии, выращенные на жидкой среде МРС при 20 °С, имеют рыхлый, пристеночный рост. При 37 °С — интенсивный сплошной рост по всей толщине среды; при 45 °С — не растут. Это грамположитель-ные палочки, расположенные одиночно, иногда попарно. Размеры клеток составляют (1,71 х 0,75) - (4,29 х 0,81) мкм, спор не образуют, неподвижны.

Физиолого-биохимические признаки молочнокислых бактерий Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum^. факультативные анаэробы, нитраты в нитриты не восстанавливают, дыхательные системы, содержащие цитохромы, отсутствуют. Каталазоотрицательные, аммиак из аргинина и диоксид углерода из глюкозы не образуют. Растут на среде МРС при 10 °С. Продуцируют кислоту и диоксид углерода по гетероферментативно-му типу. Формирование декстрана происходит на среде МРС с 20 % глюкозы.

Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum сбраживает Д-ксилозу, галактозу, глюкозу, фруктозу, манно-зу, сорбозу, маннитол, сорбитол, а-ме-тил-Д-глюкозид, М-ацетил-глюкозамин, эскулин, салицилин, целлобиозу, мальтозу, сахарозу,трегалозу, гентабиозу, Д-тагатозу; незначительно сбраживает амигдалин, арбутин.

Не сбраживает глицерол, эритритол, Д-арабинозу, L-арабинозу, L-ксилозу, рибозу, адонитол, р-метил-Д-ксилозид, рамнозу, дульцитол, инозитол, а-ме-тил-Д-маннозид, лактозу, мелибиозу, инулин, мелезитозу, раффинозу, крахмал, гликоген, ксилитол, Д-туранозу, Д-ксилозу, Д-фукозу, L-фукозу, Д-ара-битол, L-арабитол, глюконат, 2-кетоглю-конат, 5-кетоглюконат.

Наличие в составе поликультуры огу-zamyces indici РГЦ микроорганизма Le-uconostoc mesenteroides subsp. dextrani-шт, являющегося достаточно активным капсулообразователем, обусловливает формирование зооглеи — плотной слизистой массы, состоящей в основном из углеводов (декстрана, образующегося из сахарозы) и придающей поликультуре своеобразную форму — вытянутых шариков «рисинок».

Уксуснокислые бактерии представлены видом Acetobacter aceti.

Культурально-морфологические признаки Acetobacter aceti следующие. Колонии округлые, блестящие, бесцветные или желтоватые. На жидких покислен-ных средах образуют пленку, опускающуюся на дно пробирки. При посеве уколом на МПЖ дают гроздевидный рост.

Форма клеток варьировала от кокко-подобных до палочковидных, иногда прямых или слегка изогнутых палочек, размерами (0,6-0,8) х (1,0-3,0) мкм. Располагались одиночно, попарно, изредка в цепочках. При микроскопии некоторых

2 • 2007

41

колоний встречались инволюционные клетки — раздутые, булавовидные и т.д. Грамотрицательные, подвижные (пери-трихи), спор не образуют.

Физиолого-биохимические признаки Acetobacter aceti: строгие аэробы (микроаэрофилы), хорошо растут при 28 °С, каталазоположительные, желатин не разжижают, лактозу не гидро-лизуют, ацидофильны, устойчивы к спирту и уксусной кислоте, уксусную кислоту окисляют до диоксида углерода и спирта; мезофилы,оптимальная температура развития 28...30 °С, минимальная 4...5 °С, максимальная 42 °С; оптимальная рН 5,4-6,3.

Уксуснокислые бактерии также принимают участие в формировании зоо-глеи.

Помимо идентификации видового состава микрофлоры Orуzamyces in-dici РГЦ нами было исследовано такое важнейшее физиологическое свойство самой полисимбиотической ассоциации изучаемой поликультуры, как устойчивость ее к действию антибиотиков. Для этого на чашки Петри с посеянной культурой Orуzamyces indici РГЦ накладывали специальные диски, пропитанные различными растворами антибиотиков. Появление стерильных зон вокруг дисков после термостатирования свидетельствовало о чувствительности изучаемой поликультуры к данному антибиотику.

В процессе проведенного эксперимента установлено, что O^zamyces indici РГЦ чувствительна к ампициллину, кар-бенициллину, эритромицину, олеандо-мицину, линкомицину, клиндамицину, тетрациклину, цефтазидиму, левомице-тину, рифамицину.

Устойчива к оксациллину, неомицину, канамицину, гентамицину, тобрамицину, микомицину, цесепиму, фуразолидону, ванкомицину, имипенему, нистатину, незначительно чувствительна к стрептомицину, ципрофлоксацину, норфлоксацину.

На основании проведенных исследований по расшифровке микробного состава поликультуры рисового гриба был составлен и зарегистрирован в установленном порядке паспорт поликультуры Orуzamyces indici РГЦ.[7]

Таким образом, поликультура O^za-myces indici РГЦ, представляющая собой ассоциативный консорциум разных таксономических групп микроорганизмов Zygosaccharomyces fermentati Nagan-ishi, Pichia membranaefaciens Hansen, Lactobacillus paracasei subsp. рaracasei, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextr-anicum, Acetobacter aceti, потенциально способна активно осуществлять процессы брожения. Это обусловлено тем, что микроорганизмы, входящие в состав консорциума, утилизируют значительный спектр углеводов в тех питательных средах, которые используются для полу-

чения безалкогольных напитков брожения. Исходя из этого, можно сделать вывод о том, что рисовый гриб O^zamyces indici РГЦ — перспективный источник брожения при получении ферментированных безалкогольных напитков, и его можно использовать в безалкогольной промышленности.

ЛИТЕРАТУРА

1. Домарецький В.А., Прибильський В.Л., Михайлов М.Г. Технолопя екстраклв, концентратов i напо!в i3 рослинно! сировини./За редакщею В.А. Домарецького. Шдручник. — Вшниця.: Нова Книга, 2005.

2. Буторина О. Индийский морской рис. — Ростов-на-Дону.: Феникс, 2005.

3. Филиппова И.А. Грибы, которые лечат. Первая книга об очищающих грибах. — СПб.: ИД «Весь», 2004.

4. Полевая М.А Индийский рис — целебный рис. Здоровье сердца и сосудов, восстановление после инфаркта. — СПб.: ИД «Весь», 2005.

5. «The yeasts. A taxonomic study» (ed. Kurtzman & Fell), 1998, Elsevier: Amsterdam etc., 1055 р.р.

6. Sneath P.H. A., Mair N.S., Shap M.E. et al. Be-rgey's manual of systematic bacteriology. — 9th ed. — Baltimore; London: Williams & Wilkins Co., 1986. Vol 2. РР. 1043-1434.

7. Паспорт на естественную полисимбиотиче-скую ассоциацию микроорганизмов Oryzamyces indici РГЦ/Белорусская коллекция непатогенных микроорганизмов. Регистрационный номер БИМ: В-220Д. &

42