НАНОМАТЕРИАЛ ДЛЯ НАПРАВЛЕННОЙ ДОСТАВКИ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ И ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ
NANOMATERIAL FOR TARGETED DELIVERY OF ANTICANCER AGENTS AND ANTICANCER AGENTS BASED ON IT

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для диагностики и лечения опухолевых заболеваний, а также для снижения общей токсичности используемых в клинической практике цитостатических препаратов (таких как доксорубицин, паклитаксель и др).
Изобретение позволяет эффективно доставлять цитотоксические препараты к опухолевым клеткам при помощи векторного фрагмента - вискумина - с одновременным высвобождением препарата под действием внешнего магнитного поля либо без него.
Уровень техники
Направленная доставка является одним из наиболее эффективных методов снижения общей токсичности цитостатических (противоопухолевых) препаратов при химиотерапии [Muller, R et al., "Challenges and solutions for the delivery of biotech drugs - a review of drug nanocrystal technology and lipid nanoparticles.," Journal of Biotechnology, no. 113 (2004): 151-170, doi:10.1016/j.jbiotec.2004.06.007]. Целью адресной доставки лекарственных препаратов является пролонгация, локализация и увеличение селективности воздействия препарата с пораженной тканью. Обычной формой взаимодействия препарата является его проникновение через биологическую мембрану, адресная доставка позволяет добиться локального увеличения концентрации препарата, препарат высвобождается из системы доставки только в необходимой области. Таким образом удается снизить частоту введения препарата, добиться постоянной концентрации препарата в крови и равномерного эффекта препарата, снизить интенсивность побочных эффектов.
Различают два варианта направленной доставки: пассивная и активная. Эффективность препарата в случае пассивной доставки напрямую зависит от времени циркуляции препарата в кровотоке и заключается в покрытии носителей (контейнеров) препаратов гидрофильными полимерами (полиэтиленгликоли и др.), которые увеличивают время циркуляции препарата в кровотоке. Подобные гидрофильные наночастицы не атакуются ретикулоэндотелиальной системой и могут оставаться в кровотоке длительное время [Vlerken, L.Е. V et al., "Poly(Ethylene Glycol) - Modified Nanocarriers for Tumor-Targeted and Intracellular Delivery.", Pharm. Res., 24 (2007), 1405-1414]. В качестве контейнеров могут использоваться наночастицы магнетита, которые в то же время могут использоваться в качестве контрастных агентов для МРТ; магнитолипосомы, полимерные наночастицы, различные core-shell наночастицы с покрытием из золота или аморфного диоксида углерода. Также часто используются различные немагнитные липосомы, дендримеры или мицеллы, однако их применение ограничено. Важно, чтобы наноконтейнер для препарата был нетоксичным, биосовместимым, неиммуногенным, биоразлагаемым и должен обходить защитные механизмы организма.
Активная доставка загруженных препаратом наночастиц усиливает эффекты пассивной доставки и делает наночастицы более специфичными по отношению к определенным сайтам связывания. Данного эффекта можно достичь несколькими путями. Одним из них является определение рецепторов на поверхности клеток, к которым необходимо доставлять лекарство, и последующая модификация препарата соответствующим рецептор-специфичным лигандом. Первым успешно использованным рецептор-специфичным лигандом является трансферрин [Galvin, P. et al., Nanoparticle-Based Drug Delivery: Case Studies for Cancer and Cardiovascular Applications. Cell. Mol. Life Sci. [Online] 2011, 69, 389-404]. Основным недостатком подобных систем является высокая себестоимость и сложность в дозировке - после введения препарата сложно управлять концентрацией высвобождающегося с поверхности препарата.
Решению задачи обеспечения биосовместимости и эффективности доставки препарата будет способствовать создание системы, состоящей из следующих фрагментов:
- ядро - основа наноконтейнера - как правило, суперпарамагнитные наночастицы магнетита, придающие уникальные свойства наноконтейнеру: возможность управлять накоплением препарата воздействием магнитного поля, использовать их как контрастные агенты для МРТ, а также, за счет явления локальной гипертермии при воздействии переменного магнитного поля, может быть значительно ускорено высвобождение препарата при использовании пространственно затрудненных полимеров или термолабильных линкеров,
- гидрофильное покрытие, увеличивающее гидрофильность и стабильность в физиологических средах,
- векторный фрагмент,
- цитотоксический препарат.
Из уровня техники известно использование в качестве векторных фрагментов различных антител, белков, являющихся нетоксичными [Madduri Srinivasarao et al., "Principles in the design of ligand-targeted cancer therapeutics and imaging agents", Nature Reviews Drug Discovery, 14 (2015), 203-219. doi:10.1038/nrd4519].
Известно, что двумя наиболее распространенными методами введения цитотоксичных препаратов в состав наноконтейнеров являются ковалентная и нековалентная модификация. При этом в результате ковалентной модификации [Akbarzadeh A., et al., "Synthesis, characterization and in vitro studies of doxorubicin-loaded magnetic nanoparticles grafted to smart copolymers on A549 lung cancer cell line." J Nanobiotechnology, (Dec 2012), 10-46. doi: 10.1186/1477-3155-10-46] образуется прочная химическая связь между молекулой препарата и наночастицей (полимером, которым покрыты наночастицы для увеличения гидрофильности). С одной стороны, данный подход позволяет получить прочную связь, которая позволит добиться отсроченного высвобождения препарата в необходимом месте, с другой - ковалентная связь препятствует достаточно быстрому для достижения терапевтической дозы высвобождению препарата. Для достижения равновесия между этими факторами используют pH-чувствительные линкеры, такие как аконитовый ангидрид [Changli Du et al., "A pH-sensitive doxorubicin prodrug based on folate-conjugated BSA for tumor-targeted drug delivery", Biomaterials, 34 (December 2013), 3087-3097], способный к обратной циклизации при низких pH, характерных для опухолевых клеток [Ian F. Tannock et al., "Acid pH in Tumors and Its Potential for Therapeutic Exploitation", Cancer Research, 49, (August 1989), 4373-4384].
По итогам исследования уровня техники не выявлено информации, описывающей использование в составе противоопухолевых препаратов наночастиц магнетита, соединенных нековалентной связью с молекулами цитотоксичного препарата, и одновременно растительного лектина в качестве векторного фрагмента, например вискумина и/или рицина.
Все вышесказанное определяет целесообразность разработки средства для направленной доставки противоопухолевых препаратов для обеспечения необходимой терапевтической дозы, локального высвобождения и способа его получения.
Общая тенденция развития изобретений в данной области предполагает исследование различных векторных фрагментов и комбинаций полимерное покрытие - вектор - противоопухолевый препарат для определения высокоэффективных комбинаций. При этом из уровня техники известны препараты, содержащие в своем составе вискумин [WO 2003066066 A1, Ling Geng et al., 2002]. Однако в известных решениях вискумин используется в качестве цитотоксичного препарата. Использование в составе противоопухолевого препарата направленного дейстия вискумина в качестве векторного фрагмента из уровня техники не известно, что является особенностью заявляемого решения. При этом заявляемое изобретение основано на одновременном использовании двух цитостатических препаратов, один из которых (вискумин) отвечает за доставку и присутствует в наноконтейнере в незначительном количестве, является перспективным для применения в лечении онкологических заболеваний.
Из уровня техники известен метод иммобилизации препаратов на поверхности наночастиц (US 20080268061 A1, Andreas Jordan et al, 2005). Наночастицы синтезируются по известной методике методом соосаждения из водных растворов, затем используется метод ковалентной модификации. Объектом патентования является строение наночастиц, в которых присутствует, по меньшей мере, один терапевтический препарат, связанный с наночастицей с помощью линкерной молекулы. Молекула линкера может содержать группу, являющуюся термолабильной, электромагнитно лабильной, фотолабильной, кислотно-лабильной, или может быть интеркалирована или ферментативно ресщеплена. По меньшей мере, один терапевтический препарат должен высвобождаться с поверхности наночастиц под действием переменного магнитного поля. Терапевтический препарат связывается с поверхностью наночастицы ковалентно, линкером является пептид, нуклеиновая кислота, аптамер, ДНК, РНК, лейциновый фрагмент, олигонуклеотид, олигопептид, авидин, биотин, стрептавидин, гаптеновые антитела или биотин-авидиновый фрагмент. Наночастицы могут быть покрыты полимерами, содержащими карбоксильные или аминогруппы. Наночастицы могут быть модицифированы одним из следующих терапевтических препаратов: актиномицин D, аметантрон, 9-аминокамптотецин, аминоглютетимид, амсакрин, анастрозол, антагонисты пуриновых и пиримидиновых оснований, антрациклина, ингибиторы ароматазы, аспарагиназы, антиэстрогены, бендамустин (бендамастин), бексаротен, биолимус А9, блеомицин, бузерелин, бусульфан, калихеамицин, камптотецин, производные камптотецина, капецитабин, карбоплатин, кармустин, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, циклофосфамид, цитарабин, цитозинарабинозид, алкилирующие цитостатики, дакарбазин, дактиномипин, даунорубицин, 5''-дезокси-5-фторуридин, доцетаксел, доксорубицин (адриамицин), доксорубицин липо, эпирубицин, эстрамустин, этопозид, эксеместан, флударабин, фторурацил, антагонисты фолиевой кислоты, форместан, гемцитабин, глюкокортикоиды, госерелин, гормоны и антагонисты гормонов, гицамтин, гидроксимочевину, идарубицин, ифосфамид, иматиниба, иринотекана, летрозол, лейпрорелин, ломустин, майтансиноиды, мелфалан, меркаптопурин, метотрексат, милтефозин, митомицины, антимитотические агенты, митоксантрон, нимустин оксалиплатин, паклитаксель, пентостатин, производные подофиллотоксина, прокарбазин, рапамицин, родомициновой D, тамоксифен, темозоломида, тенипозид, тестолактон, тиогуанин, тиотепа, ингибиторов топоизомеразы, топотекан, треосульфан, третиноин, трипторелина, алкалоиды барвинка, винбластин, винкристин, виндезин, винорелбин, цитостатические антибиотики, а также моноклональные антитела или фрагменты антител. Наночастицы магнетита могут быть синтезированы в соответствии с методикой, представленной в материалах международной заявки WO 97/38058. В качестве покрытия используется пропиленгликоль, а в примере синтеза упомянуты различные олигонуклеотиды длиной около 15 аминокислот. Недостатками данного метода является синтез наночастиц магнетита из водной фазы, в результате получаются наночастицы с широким распределением по размерам, что приводит к разной загрузке цитотоксичным препаратом. Наличие наночастиц с разным размером, загрузкой препаратом и концентрацией векторных фрагментов может привести к сложностям в контроле дозы препарата и неоднородности свойств наночастиц с препаратом. Использование дорогостоящих в синтезе пептидов или одноцепочечных ДНК для модификации приводит к значительному увеличению стоимости препаратов.
Из уровня техники также известно решение, представленное в международной заявке WO 2015074762 А9 (George Kordas et al., 2013), которое описывает векторную систему на основе наночастиц магнетита с различными противоопухолевыми препаратами (таксан, антрациклин, куркумин, доксорубицин, гемцитабин и цисплатин). Изобретение описывает модификацию поверхности нано-/микроконтейнеров (наносферы из органических и неорганических полимеров), которые чувствительны к кислой среде, повышенной температуре (Т ~ 41-43°C), окислительно-восстановительному воздействию, а также воздействию внешнего магнитного поля. Регулировка высвобождения препарата с поверхности осуществляется за счет реакции поверхностных (мостиковых между наночастицей и препаратом) групп на внешнее воздействие. Для pH-чувствительных контейнеров, мономерами для синтеза полимерного покрытия могут быть: метакриловая кислота, акриловая кислота, диизопропиламинометакриловая кислота, малеиновый ангидрид, DMAEMA, N,N-диэтилакрилат или их смесь. Для термолабильной оболочки мономерами могут быть NIP Am, DMAEMA, VLC IOZ, VME, НРМА и их смеси. Для чувствительной к окислительно-восстановительному воздействию оболочки мономеры могут быть выбраны из бис-метакрилоилхлорид цистеамина, диаллил дисульфида и их смеси. Высвобождение лекарственного препарата основано на электростатических, гидрофобных и водородных взаимодействиях. Доксорубицин в данных условиях загружается в наночастицы путем перемешивания с фосфатным буфером.
Недостатками метода является синтез наночастиц магнетита в водной фазе методом соосаждения, использование ковалентной модификации препаратом в ряде примеров, что приводит к медленному высвобождению препарата.
Известен также метод увеличения стабильности мезопористых наночастиц (WO 2012051341 A1, Christy L. Haynes et al., 2010) диоксида кремния. Данные наночастицы легко диспергируются в воде и показывают хорошую эффективность против опухолевых клеток рака шейки матки HeLa, более того, наночастицы обладают большей цитотоксичностью, чем свободный доксорубицин. Доксорубицин загружается в наночастицы путем смешивания растворов наночастиц и доксорубицина, связывание в данном случае - нековалентное за счет электростатических сил. Наночастицы на основе аморфного диоксида кремния достаточно часто используются для доставки противоопухолевых препаратов и являются низкотоксичными и удобными контейнерами (CN 103211767 А, 2013).
Недостатком метода является использование наночастиц большого размера, для которых сильно затруднено проникновение в клетку.
Известен метод синтеза и применения наночастиц магнетита с противоопухолевым или другим препаратом на поверхности, который высвобождается с поверхности наночастиц под действием внешнего воздействия (US 20070196281 A1, Sungho Jin et al., 2003). В материалах заявки описывается использование наночастиц в качестве носителей препарата, который высвобождается под действием магнитного поля. Движение, вызванное магнитным полем, может приводить к разрушению клеток, также магнитное поле может использоваться для направленной доставки препарата. Для увеличения растворимости и стабильности наночастицы покрываются биосовместимым материалом - полимерами, декстраном, оксидом кремния, золотом. На поверхности наночастиц также может быть закреплен вектор - пептид или антитело. Наночастицы могут быть как сферической формы, так и в виде игл, что способствует разрушению клеток под действием магнитного поля. В случае использования терапии с методом магнитной доставки, в соответствии с изобретением, цитотоксический лекарственный препарат может быть 1) прикреплен к поверхности наночастицы посредством функционализированного биосовместимого носителя, 2) включена в пористый полимер, содержащий магнитные частицы, в поры или 3) инкапсулирован в магнитные липосомы.
Недостатком метода является синтез наночастиц магнетита в водных растворах, в материалах заявки представлен большой список возможных используемых терапевтических молекул, однако не приведены методы синтеза наноматериалов с данными препаратами. Наночастицы магнетита сферические, что ограничивает возможность применения переменного магнитного поля для физического воздействия на клетки. Использование антител в качестве векторов значительно увеличивает стоимость синтеза.
Наиболее близким к заявляемой технологии является решение, представленное в заявке US 20070264199 A1 (Vinod Labhasetwar et al, 2005) описывающее методику синтеза наночастиц магнетита и последующую модификацию их гидрофильными полимерами и цитотоксичными препаратами - доксорубицином и паклитакселем. Составы с различными весовыми соотношениями олеиновой кислоты и наночастиц магнетита используются для оптимизации количества олеиновой кислоты, необходимой для полного покрытия наночастиц магнетита: олеиновую кислоту (6-250 мг, 1,7% до 41,0% по массе от общей массы реакционной смеси) добавляют к раствору Fe(III) и Fe(II) после добавления раствора аммиака. Препараты нагревают до 80°C при перемешивании в течение 30 минут, чтобы испарить аммиак, а затем охлаждают до комнатной температуры. Полученный таким образом осадок черного дважды промывают 15 мл воды. Осадок лиофилизируют в течение 2 дней при -60°C и 7 мкм рт.ст. К полученному образцу добавляют PLURONIC (25-500 мг, 5,6%-54,0% от массы реакционной смеси) и перемешивают в течение ночи в закрытом сосуде, чтобы свести к минимуму воздействие кислорода атмосферы. Для модификации наночастиц доксорубицином используется описанный в литературе метод. Метанольный раствор DOX (600 мкл, 5 мг/мл) добавляют по каплям при перемешивании к водной дисперсии кислотно-стабилизированных покрытых PLURONIC наночастиц магнетита (30 мг частиц в 7 мл воды). Перемешивание продолжают в течение ночи (~16 часов), затем наночастицы отделяют от реакционной смеси при помощи постоянного магнита.
Недостатками данного метода являются отсутствие лиганда, отвечающего за векторную доставку, синтез наночастиц из водных растворов, а также использование лиофилизации для удаления растворителя.
Таким образом, во всех вышеперечисленных изобретениях используется стандартная схема получения противоопухолевого препарата, включающая:
1. синтез наночастиц магнетита из водных растворов,
2. покрытие наночастиц магнетита гидрофильным полимером - производным полиэтиленгликоля и др.,
3. модификация векторным фрагментом или модификация цитотоксичным препаратом (ковалентная или нековалентная).
Стоит отметить, что нет решений, позволяющих осуществить синтез наноконтейнеров для противоопухолевых препаратов на основе наночастиц магнетита, ковалентно модифицированных векторным фрагментом и нековалентно-противоопухолевым препаратом, являющимися цитостатиками.
Заявляемое решение обладает следующими отличительными особенностями.
1. Используется метод синтеза наночастиц магнетита в органических растворах высокотемпературным разложением органических солей железа III. Данный метод позволяет получать наночастицы с узким (±15%) распределением по размерам.
2. Используется метод ковалентной модификации векторным фрагментом с последующим покрытием гидрофильным полимером и модификации цитотоксичным препаратом (например, доксорубицином). Отработана методика модификации наноматериалов векторным фрагментом и противоопухолевым препаратом.
3. В получаемом препарате используются два цитотоксичных препарата: вискумин и доксорубицин, впервые предложено использовать вискумин в качестве векторного лиганда. Известно, что раковые клетки содержат на своей поверхности измененные сахара. Связывание вискумина с терминальной галактозой позволяет его использовать в качестве вектора доставки наноматериалов к опухолевым клеткам.
4. Описан синтез сферических и кубических наночастиц магнетита из органических растворителей с последующим переводом их в водную фазу, кубические наночастицы могут быть более интересны, поскольку могут повреждать клеточную мембрану при облучении переменным магнитным полем за счет вращения.
Раскрытие изобретения
Задачей предлагаемого изобретения является разработка нанокомпозитных материалов (магнитных наноконтейнеров) для доставки цитотоксических препаратов к месту локализации опухоли, а также противоопухолевых препаратов на основе наночастиц магнетита, модифицированных гидрофильными полимерами, вискумином и противоопухолевым препаратом.
Анализ патентной документации свидетельствует о том, что поиск эффективных решений в данной области является крайне актуальной задачей.
Техническим результатом, достигаемым заявляемым техническим решением, является обеспечение направленной доставки цитотоксичных противоопухолевых препаратов к клеткам-мишеням и снижение общей токсичности противоопухолевых препаратов за счет введения этих препаратов в состав наноматериалов на основе наночастиц магнетита.
Получаемый препарат способен селективно связываться с фрагментами сахаров, которых на поверхности опухолевых клеток значительно больше, чем на поверхности здоровых клеток, таким образом, обеспечивая направленную доставку к опухолевым тканям. Вискумин представляет собой большую белковую молекулу, которая выходит за пределы полимерного покрытия, в котором находится противоопухолевый препарат, что обеспечивает надежную доставку препарата к цели. Наличие кубических наночастиц в ядре наноконтейнера обеспечивает возможность при необходимости увеличить скорость и степень высвобождения препарата, что позволяет лучше контролировать дозировку. При внесении полученных наноконтейнеров с противоопухолевым препаратом в переменное магнитное поле высвобождение препарата происходит быстрее, что позволяет увеличить эффективность лечения.
Заявляемое изобретение расширяет арсенал средств, применимых для направленной доставки противоопухолевых препаратов, позволяет улучить качество лечения опухолевых заболеваний и повысить комфорт пациента.
Поставленная задача решается тем, что композитный наноматериал (наноконтейнер) для направленной доставки противоопухолевого препарата к месту локализации опухоли содержит наночастицы магнетита, покрытые, по крайней мере, одним слоем гидрофильного полимера, содержащего в своем составе векторный фрагмент, способный связываться с сахарами на поверхности раковых клеток, выбранный из группы растительных лектинов, например вискумин и/или рицин. Толщина первого слоя гидрофильного полимера может составлять от 2 до 60 нм. В качестве гидрофильного полимера может быть использован полиэтиленгликоль; производное полиэтиленгликоля молекулярной массой от 600 до 6400 Да, содержащее на одном или обоих концах молекулы карбоксильные, или аминогруппы, или триалкоксиаминопропилсилильный заместитель; или блок-сополимер полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля.
3
4
Наилучший результат достигается при использовании наночастиц магнетита FeO, имеющих сферическую форму диаметром 5-50 нм, или кубическую с длиной грани 5-20 нм с допустимой величиной погрешности до 20%.
Для увеличения загрузки цитотоксичного препарата в наноконтейнер, характеризующейся отношением массы доксорубицина в наноконтейнере к массе всего наноконтейнера с препаратом, наночастицы дополнительно могут быть покрыты вторым слоем гидрофильного полимера, в качестве которого может быть использован ПЭГ или блок-сополимер полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля. Толщина второго слоя гидрофильного полимера может составлять от 2 до 60 нм.
Связь наночастицы с ПЭГ или блок-сополимером реализована посредством аминопропилсилильного мостика, образованного за счет реакции наночастиц магнетита с триалкоксиаминопропилсиланом, где алкильный заместитель содержит от 1 до 5 атомов углерода, количество атомов углерода между аминогруппой и атомом кремния в молекуле составляет от 2 до 6. Блок-сополимер полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля имеет формулу HO(CH2CH2O)n(CH2CH(CH3)O)m(CH2CH2P)nH, где n=20-120, m=30-70. При использовании производного полиэтиленгликоля, содержащего на одном или обоих концах молекулы триалкоксиаминопропилсилан, последний расположен между наночастицей и первым слоем полимера или непосредственно в первом слое полимера. В качестве молекулы, содержащей карбоксильную группу, могут быть использованы монокарбоновая кислота с длиной основной цепи, содержащей С1-С6, или продукт раскрытия циклических ангидридов (С3-С7), и непосредственно находящаяся в исходном полиэтиленгликоле; или аминокислота; трикарбоновая кислота, например N,N-(бискарбоксиметиллизин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота); аминогруппа представляет собой концевую группу -NH2 из самого полиэтиленгликоля. В качестве аминокислоты могут быть использованы глицин, лейцин, тирозин, серин, глутамин, аспарагин, фенилаланин, аланин, лизин, аргинин, гистидин, цистеин, валин, пролин, гидроксипролин, изолейцин, метионин, триптофан; в качестве трикарбоновой кислоты -N,N-(бискарбоксиметиллизин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота); в качестве молекулы, содержащей аминогруппу - концевую группу -NH2 из самого полиэтиленгликоля.
Поставленная задача решается также тем, что противоопухолевый препарат, обеспечивающий его направленную доставку к месту локализации опухоли, включает смесь наноматериала перечисленного выше состава с цитотоксичным препаратом, в которой наночастицы магнетита соединены молекулами цитотоксичного препарата нековалентной связью, где на 1 часть наноматериала содержится от 0,5 до 20 мас. частей цитотоксичного препарата. В качестве цитотоксичного препарата может быть использован доксорубицин или другой противоопухолевый препарат из группы антрациклиновых антибиотиков, например блеомицин, митомицин, дактиномицин, а также различные актиномицеты, например оливомицин, руфокромомицин, реумицин.
Осуществление изобретения
Изобретение предполагает использование подхода, заключающегося в последовательной модификации наночастиц магнетита векторным фрагментом и затем гидрофильным полимером и противоопухолевым препаратом.
Наночастицы магнетита могут быть приобретены готовые (сферы или кубы размером 5-50 нм, magnetite nanoparticles, растворы в гексане или толуоле 5 мг/мл фирмы Sigma или Alfa Aesar) или синтезированы двумя методами, одним из которых - синтез в водных растворах соосаждением из раствора хлоридов железа II, III в щелочной среде [K. Petcharoen et al., "Synthesis and characterization of magnetite nanoparticles via the chemical coprecipitation method", Materials Science and Engineering: B, 177, 5 (March 2012), 421-427]. Данный метод препаративно более простой, однако позволяет получать наночастицы с большим разбросом размеров. Примером синтеза является смешивание дегазированных водных растворов хлоридов железа (III, II) в мольном соотношении 1:2 (концентрация 0,01 моль на 10-50 раствора) с последующим добавлением 0,5-5% раствора аммиака по каплям при интенсивном перемешивании в течение 4-х часов. Затем полученные наночастицы осаждают магнитом, промывают дистиллированной водой 2-5 раз, затем 0,1-2% азотной кислотой и редиспергируют в дистиллированной воде. Данный подход позволяет получать широкий спектр наночастиц с широким распределением по размерам, что при его использовании снижает качество конечного препарата.
Вторым методом является синтез в органической фазе термическим разложением органических солей железа III [Shouheng Sun et al., "Size-Controlled Synthesis of Magnetite Nanoparticles", J. Am. Chem. Soc, 124 (2002), 8204-8205], с помощью которого можно получать наночастицы магнетита различной формы: сферические, октаэдрические, кубические и другой формы [Xiaotai Zhang et al., "Controlled synthesis of spherical and cubic magnetite nanocrystal clusters", Journal of Crystal Growth, Volume 372, (June 2013), Pages 170-174, doi: 10.1016/j.jcrysgro.2013.03.040]. В случае использования метода синтеза в органических растворителях образуются наночастицы магнетита, покрытые гидрофобным слоем - органическими поверхностно-активными веществами, контролирующими рост наночастиц, которые адсорбируются на их поверхности. Однако если использовать триэтиленгликоль или тетраэтиленгликоль в качестве органического растворителя возможно получить гидрофильные наночастицы магнетита из органических растворителей. Водорастворимые наночастицы магнетита кубической формы могут быть получены в следующих условиях [Dipak Maity et al., "Studies of magnetite nanoparticles synthesized by thermal decomposition of iron (III) acetylacetonate in tri(ethylene glycol)", Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 321, 19 (October 2009), 3093-3098,, http://dx.doi.org/10.1016/j.jmmm.2009.05.020]. Ацетилацетонат железа (Sigma-Aldrich, 97%) растворяют в триэтиленгликоле или тетраэтиленгликоле (Sigma-Aldrich, 95-99%) и перемешивают в токе аргона в течение часа, нагревают до 110-120°C и ждут час. Затем быстро нагревают до 270-290°C при интенсивном перемешивании, держат при данной температуре 1-2 ч. Темный раствор охлаждают до комнатной температуры и добавляют этилацетат (объемные пропорции от 1:1 до 1:4, реакционная смесь : этилацетат соответственно) для осаждения наночастиц центрифугированием. Полученный осадок редиспергируют в этаноле, осаждают этилацетатом и снова центрифугируют. Процедуру повторяют 2-5 раз, затем наночастицы редиспергируют в деионизованной воде. Вторым похожим методом является нагревание смеси ацетилацетоната железа (III) с 4-бифенилкарбоновой кислотой, олеиновой кислотой в массовых пропорциях 1±0,25:1±0,25:2±0,25 соответственно и бензиловым эфиром в токе аргона до 270-290°C со скоростью нагрева 12-20°C/мин. После нагревания до необходимой температуры реакция протекает 30 мин, затем смесь охлаждают, добавляют толуол и гексан (двойной объем исходной реакционной смеси), центрифугируют при 5000 об/мин, полученный осадок наночастиц редиспергируют в хлороформе [Abdullah N et al., "Synthesis of magnetite nanocubes (Fe3O4) from Iron (III) acetylacetonate by removal gas and higher temperature obtained." Orient J. Chem, 30(3), 2014]. В случае использования других растворителей (октадецена, дифенилового эфира) и других ПАВ (олеиновая килоста, олеиламин, додециламин) необходим дополнительный шаг - перевод гидрофобных наночастиц магнетита в водную фазу. Может быть также использован следующий метод: магнитные наночастицы диспергируют в смеси этанол/вода (об. 1±0,3:1). Затем добавляют APTES (аминопропилтриэтоксисилан) (1,1-2,5-кратный мольный избыток) в атмосфере азота при температуре 40°C, и смесь перемешивают 2 часа. Полученные наночастицы собирают при помощи постоянного магнита, промывают этанолом и три раза деионизованной водой и затем редиспергируют в деионизованной воде [Sadati Behbahani N et al., "Covalently modified magnetite nanoparticles with PEG: preparation and characterization as nano-adsorbent for removal of lead from wastewater." Journal of Environmental Health Science and Engineering, 12, 2014, 103. doi: 10.1186/2052-336Х-12-103]. Наночастицы магнетита с лучшим распределением по размерам получаются при синтезе в органических растворителях без триэтиленгликоля, поэтому необходима стадия перевода в водную фазу перед проведением дальнейшей модификации.
Введение векторного фрагмента производится в основном ковалентно, поскольку нет необходимости в отделении векторного фрагмента от препарата для обеспечения нужного терапевтического эффекта. Наиболее препаративно удобным методом является создание амидной связи между карбоксильной группой на поверхности наночастицы и аминогруппы векторного фрагмента (или между аминогруппой на поверхности наночастицы и карбоксильной группой векторного фрагмента) в реакции карбодиимидного синтеза [Karolina  et al., "The Chemistry of Bioconjugation in Nanoparticles-Based Drug Delivery System." Advances in Condensed Matter Physics, vol. 2015, Article ID 198175, 27. doi:10.1155/2015/198175].
Для нековалентной модификации цитотоксичным препаратом используются разветвленные полимеры наподобие полоксамеров-плюроников, которые удерживают препарат за счет электростатических взаимодействий между гидрофобными частями препарата и полимера [Somayeh Sadighian et al., "Doxorubicin-conjugated core-shell magnetite nanoparticles as dual-targeting carriers for anticancer drug delivery", Colloids and surfaces B: Biointerfaces, 116 (2014); 406-413. DOI: 10.1016/j.colsurfb.2014.03.001;  et al., "Enhancing Anti-Tumor Efficacy of Doxorubicin by Non-Covalent Conjugation to Gold Nanoparticles - In Vitro Studies on Feline Fibrosarcoma Cell Lines", PLoS One, 10, 4 (2015), e0129639. DOI: 10.1371/journal.pone.0129639]. Для создания гидрофильной полимерной оболочки может быть использован следующий метод: ПЭГ (молекулярная масса 600-20000 г/моль), ангидрид, DMAP и триэтиламин растворяют в 1,4-диоксане и оставляют перемешиваться при комнатной температуре на ночь. Затем раствор фильтруют, добавляют эфир для осаждения наночастиц, покрытых полимером и сушат полученный материал в вакууме при комнатной температуре [Javid A et al., "Biocompatible APTES-PEG modified magnetite nanoparticles: effective carriers of antineoplastic agents to ovarian cancer." Appl Biochem Biotechnol, 173(1) (May 2014), 36-54. doi: 10.1007/s12010-014-0740-6]. Для модификации наночастиц магнетита плюроником (123, F127, F68, РЕ6400, L61) может использоваться следующий метод: раствор плюроника добавляют к раствору модифицированных наночастиц в массовом соотношении 5÷15:1 соответственно и перемешивают 30-60 мин при комнатной температуре, затем наночастицы осаждают постоянным магнитом и промывают деионизованной водой, затем редиспергируют в деионизованную воду. Наиболее подходящим для данной модификации является полоксамер 407 (плюроник F127) за счет оптимального соотношения размеров гидрофильной (полиэтиленовый фрагмент) и гидрофобной (полипропиленовый фрагмент) частей. Толщина первого слоя гидрофильного полимера составляет 2-60 нм, толщина второго слоя гидрофильного полимера, в качестве которого может быть использован ПЭГ или блок-сополимер полиэтиленгликоля и полипропиленгликоля, составляет 2-60 нм. Для модификации наночастиц используется количество полимера в 0,2-20 раз большее, чем масса исходных наночастиц.
Для финальной модификации цитотоксичным препаратом смешивают водные растворы цитотоксичного препарата и наночастиц магнетита, покрытых гидрофильным полимером в следующих пропорциях: в смешиваемых растворах на 1 массовую часть модифицированных наночастиц берут от 0,5 до 20 массовых частей цитотоксичного препарата (доксорубицина), например раствор наночастиц, 10 мл, 1 мг/мл (10 мг сухого в-ва) смешивают с 10 мл, 1 мг/мл раствора доксорубицина (10 мг сухого вещества). Объемы воды для приготовления растворов подбирают таким образом, чтобы концентрации реагентов находились в диапозоне 0,3-5 мг/мл. Полученную смесь перемешивают в темноте в течение ночи [Yongyong Li et al., "Engineering of a Pluronic F127 functionalized magnetite/graphene nanohybrid for chemophototherapy." Nanotechnology, 25 (Jan 2014), 6].
Изобретение поясняется следующими примерами осуществления.
Пример 1. Синтез наночастиц магнетита сферической формы
Реагенты: дифениловый эфир (95%), олеиновая кислота (техническая, 80%), олеиламин (технический, 80%), гександиол (95+%), ацетиацетонат железа (III) (99+%), хлорид железа (III) (99+%), дифениловый эфир (95%), приобретенные в Sigma Aldrich, использовали без дальнейшей очистки.
Для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) использовали микроскоп JEOL 1400 (напряжение 120 кВ). Для статистической обработки использовалась случайная выборка из 350 наночастиц. Для анализа размера наночастиц использовалась NanoSight NS500 и концентрации наночастиц порядка 108 частиц/мл. Для записи спектров поглощения доксорубицина использовался спектрофотометр MD SpectraMax Plus 384 | UV/Vis Plate Reader.
Получение олеата железа(III)
В одногорлой колбе объемом 500 мл смешивали 3,24 г (0,02 моль) безводного хлорида железа(III) с 3-мя эквивалентами олеиновой кислоты (18 мл, 0,06 моль) в 50 мл безводного метанола, по каплям добавляли раствор 2,4 г гидроксида натрия (0,06 моль) в 50 мл метанола, затем 100 мл перегнанного гексана, 30 мл деионизованной воды и перемешивали на магнитной мешалке при кипении с обратным холодильником в течение 3 ч. Затем смесь охлаждали, переносили в делительную воронку, отделяли органический слой, промывали его три раза водой, высушивали над прокаленным сульфатом натрия и упаривали. Олеат железа(III) использовали без дальнейшей очистки.
Синтез сферических наночастиц магнетита из олеата железа(III).
В трехгорлую колбу с обратным холодильником, термометром и входом для аргона объемом 250 мл загружали 1,5 г (0,0024 моль) олеата железа(III), 3,5 г (0,012 моль) олеиновой кислоты, 1,5 г (0,0056 моль) олеиламина и 100 мл дегазированного в токе аргона бифенилового эфира. Систему прогревали в токе аргона и в течение 30 минут нагревали до кипения растворителя (265°C), затем перемешивали 1 час. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли 150 мл изопропилового спирта и центрифугировали в течение 10 мин при 15000 об/мин в пластиковых эппендорфах. Затем раствор сливали и промывали изопропиловым спиртом 3 раза с промежуточными центрифугированиями. Затем добавляли хлористый метилен, держали в ультразвуке 3 мин, затем снова центрифугировали и промывали 2 раза этиловым спиртом. Наночастицы затем промывали, высушивали на роторном испарителе. В результате были получены сферические наночастицы магнетита сферической формы диаметром 16±2 нм.
Пример 2. Синтез кубических наночастиц магнетита с гранью 20 нм
В трехгорлую колбу с обратным холодильником, термометром и входом для аргона объемом 250 мл загружали 1,5 г (0,0024 моль) олеата железа(III), 1,5 г (0,0053 моль) олеиновой кислоты и 100 мл дегазированного в токе аргона бифенилового эфира. Систему прогревали в токе аргона и в течение 30 минут нагревали до кипения растворителя (265°C) и перемешивали 24 часов. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли 150 мл изопропилового спирта и центрифугировали в течение 10 мин при 15000 об/мин в пластиковых эппендорфах. Затем раствор сливали и промывали изопропиловым спиртом 3 раза с промежуточными центрифугированиями. Затем добавляли хлористый метилен, держали в ультразвуковой бане 3 минуты, затем снова центрифугировали и промывали 2 раза этиловым спиртом. Наночастицы затем промывали и высушивали на роторном испарителе.
Пример 3. Кубические наночастицы магнетита с гранью 5 нм
В трехгорлой колбе с обратным холодильником и термометром смешивали 20 мл дифенилового эфира, 0,71 г ацетиацетоната железа(III), добавляли 5 мл олеиновой кислоты, 5 мл олеиламина в атмосфере аргона. К смеси при перемешивании добавляли 2,58 г 1,2-гександиола. Смесь нагрели до кипения и перемешивали 2 часа. В смесь добавляли этанол и затем наночастицы отделяли центрифугированием. Наночастицы три раза промывали этанолом и центрифугировали. Наночастицы редиспергировали в 20 мл безводного хлористого метилена и затем упарили на роторном испарителе.
Пример 4. Перевод наночастиц магнетита с органическим покрытием в водный раствор
К раствору наночастиц магнетита в абсолютном толуоле (1 мг/мл) добавляли двухкратный избыток по массе триэтоксиаминопропилсилана и одну каплю ледяной уксусной кислоты. Полученную смесь держали в ультразвуке при 50°C в течение 4 часов. Затем наночастицы осаждали постоянным неодимовым магнитом, раствор сливали и частицы промывали водой (3×30 мл), затем растворяли в воде с получением концентрации 0,2 мг/мл. 133 мг ПЭГ-дикислоты с мол. массой 3000 кДа растворяли в 10 мл воды, после растворения реагента растворяли 45 мг N-гидроксисукцинимида и 75 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида.
Через полчаса после растворения 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида полученный раствор добавляли в золь аминированных наночастиц магнетита объемом 25 мл и концентрацией магнетита 0,7 мг/мл и оставляли перемешиваться в холодильнике.
По прошествии 12 часов пэгилированные наночастицы отцентрифугировали на микропробирочной центрифуге в режиме 14500 об в течение 20 минут. Далее сливали супернатант и редиспергировали осадок в 35 мл деионизованной воды. После редиспергирования измеряли размер и дзета-потенциал на Zetasizer.
Пример 5. Модификация наночастиц магнетита вискумином
К охлажденному до 4°C водному раствору наночастиц добавляли 1 эквивалент N-гидроксисукцинимида, держали в ультразуковой бане 30 мин, затем добавляли один эквивалент рецептор-специфичного лиганда - вискумина, и держали в ультразвуковой бане 2 часа, затем оставляли в холодильнике на ночь. Центрифугировали на микропробирочной центрифуге в режиме 14500 об в течение 20 минут. Далее сливали супернатант и редиспергировали осадок в 20 мл деионизованной воды.
Пример 6. Модификация наночастиц наноматериалов плюроником и доксорубицином
2
2
101
2
3
56
2
2
101
Для модификации использовали плюроник F127 - блок-сополимер HO(CHCHO)(CHCH(CH)O)(CHCHO)H. 15 мл раствора наночастиц магнетита с вискумином (1 мг/мл) смешивали с 15 мл водного раствора плюроника (25 мг/мл) и интенсивно перемешивали в течение 10 часов. Затем АКНМ центрифугировали и редиспергировали в деионизованной воде. Водный раствор доксорубицина (0,5 мл с концентрацией 5 мг/мл) добавляли к 10 мл раствора полученных наночастиц, содержащих в своем составе вискумин, перемешивали на магнитной мешалке в течение ночи при комнатной температуре. Наночастицы центрифугировали, промывали, после трех промываний дистиллированной водой наночастицы редиспергировали в дистиллированной воде.
Пример 7. Модификация наночастиц наноматериалов доксорубицином
К полученному по П.5 раствору наночастиц (10 мл, 2 мг сухих наночастиц) добавляли водный раствор гидрохлорида доксорубицина (0,5 мл с концентрацией 5 мг/мл) и перемешивали в течение ночи в холодильнике. После проведения реакции наночастицы центрифугировали, промывали, после трех промываний дистиллированной водой наночастицы редиспергировали в дистиллированной воде.
Пример 8. Исследование воздействия магнитного поля на полученные материалы
Клетки рассаживали на стекла в 2 мл чашках Петри в концентрации 80000 кл./мл и культивировали при 37°C и 5% CO2. Через 3 суток для ТНР1 и 1 сутки для А172 к клеткам добавляли препарат (в соотношении наночастицы : бессывороточная среда = 1:10) на 2 часа. Часть клеток окрашивали прижизненно LysoTracker Red для выявления кислого везикулярного компартмента. Перед фиксацией клетки промывали 2 раза средой без сыворотки. В качестве фиксатора использовался 3,7% раствор формальдегида на PBS (1:10) 20 мин. После фиксации клетки отмывали PBS и заключали в мовиол с DAPI. Препараты анализировали с помощью инвертированного флуоресцентного конфокального микроскопа Nikon С2 с использованием черно-белой камеры Andor iXon, объектива Plan Аро с увеличением 40х (апертура 0,95) и приложения NIS-Elements AR 4.13. Дальнейшую обработку фотографий осуществляли в программе ImageJ.
Было сравнено распределение доксорубицина, высвободившегося из АКНМ в клетках через два часа в контрольном образце и в образце после двух часов облучения магнитным полем. Локализация наночастиц с доксорубицином в клетках линий ТНР1 и А172 исследована за счет флуоресценции доксорубицина.
Клетки рассаживали на стекла в 2 мл чашки Петри. Через 1 сутки в среду культивирования добавляли наноматериал с доксорубицином в конечной концентрации наночастиц в среде 25 и 50 μg/мл. Клетки инкубировали с раствором наночастиц в течение 2 часов (как до облучения магнитным полем, так и после). Затем фиксировали 3,7% раствором формальдегида на PBS и заключали в мовиол с DAPI.
Клетки линии ТНР1 более чувствительны к воздействию АКНМ, чем клетки линии А172. Кроме того, через 2 часа инкубации клеток линии ТНР1 с АКНМ выделяли 2 субпопуляции клеток, что, возможно, связано с окружением клеток. Что касается клеток линии А172, то во всех клетках доксорубицин выявлялся в ядре. Однако через 2 часа облучения магнитным полем в клетках линии А172 доксорубицин также накапливается вокруг ядра в связанном с АКНМ состоянии.