Роль дефенсинов как факторов врожденного иммунитета в защите организма детей с тяжелыми формами паратонзиллитов

Роль дефенсинов как факторов врожденного иммунитета в защите организма детей с тяжелыми формами паратонзиллитов

Л.В. Ганковская1

1ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития России, Москва 2НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва 3Морозовская детская городская клиническая больница № 1, Москва

Резюме

Миндалины, являясь частью иммунной системы человека, играют важную роль в процессах ее развития и функционирования. Противомикробные пептиды, в частности дефенси-ны, относящиеся к классу эффекторных молекул врожденного иммунитета, активно участвуют в процессе защиты от патогенных агентов. До настоящего времени роль дефен-синов в гомеостазе миндалин, в том числе при заболевании паратонзиллитами, не установлена. Целью работы было определение уровней экспрессии генов в-дефенсинов в эпителиальных клетках слизистой миндалин и концентрации а-дефенсинов 1 - 3 в сыворотке крови детей с тяжелыми формами острых и рецидивирующих паратонзиллитов. Концентрацию НЫР-1 - 3 определяли с помощью ИФА, а уровень экспрессии гена НБВ-2 - методом ПЦР-РВ. Использование в работе молекулярно-генетических и серологических методов детекции дефенсинов у больных паратонзиллитами продемонстрировало необходимость их применения с целью дальнейшей оценки эффективности лечения. Ключевые слова: миндалины, дефенсины, паратонзиллит, врожденный иммунитет

Role of Defensins, as Factors of Innate Immunity, in Protection of the Children's Organism from Paratonsillitis

L.V. Gankovskaya1 (lvgan@yandex.ru), M.R. Bogomilskii1, O.A. Gankovskaya2 (oksgan@yandex.ru), R.I. Landa1 (r.landa@ mail.ru), V.F. Lavrov2 (v.f.lavrov@inbox.ru), A.P. Kitajgorodskii3, D.D. Kartashov1 (dmkartashov@yandex.ru) 1The Russian State Medical University, Moscow 2Mechnikov Research Institute of Vaccines and Sera, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow 3Morozovskaya Children's Clinical Hospital № 1, Moscow Abstract

Tonsil, being a part of immune system, play an important role in processes of its development and functioning. Antimicrobial peptides (defensins) belongs to the molecules of innate immunity, which actively participate in process of protection organism against pathogenic agents. Till now the role defensins in a pathology of tonsil (paratonsillitis), isn't established. The aim of this work is to identify of levels of an expression of $-defensine genes in epithelial cells of tonsils and concentration of a-defensins in blood of children with paratonsillitis. Concentration of HNP-1 - 3 was detected by ELISA, the level of expression HBD-2 gene was detected by RT and real time RCR. Identification of defensins during paratonsillitis is necessity for selection of effective therapy.

Key words: tonsil, defensins, paratonsillitis, innate immunity

Введение

Противомикробные пептиды (ПМП) - дефенсины и кателицидины - относятся к группе эффекторных молекул врожденного иммунитета и представляют собой древний, сформированный в процессе эволюции механизм защиты организма от патогенных микроорганизмов (вирусов, бактерий, грибов, простейших). ПМП представляют собой небольшие, положительно заряженные молекулы, образованные 12 - 100 аминокислотными остатками. Обычно их молекулярная масса составляет 2 - 10 кДа. ПМП человека относятся преимущественно к дефенсинам. В свою очередь в зависимости от расположения дисульфидных связей дефен-сины можно разделить на две группы: а-дефенсины и р-дефенсины. Как правило, а-дефенсины (human

neutrophile peptides 1 - 4 - HNP-1 - 4) синтезируются нейтрофилами и до момента секреции депонируются в гранулах этих клеток. Известно, что при стимуляции а-дефенсины 1 - 4 могут вырабатываться моноцитами и Т-лимфоцитами. р-дефенсины продуцируются в различных отделах пищеварительного тракта. В полости рта и слюнных железах обнаруживается главным образом р-дефенсины (human p-defensins 1-3 - HBD-1 - 3). р-дефенсины HBD-1, HBD-2 и HBD-3 преимущественно вырабатываются эпителием слизистой желудка [1 - 3].

Известно, что миндалины, являясь частью иммунной системы человека, играют важную роль в процессах ее развития и функционирования. Многие патологические состояния, связанные с поражением миндалин, в том числе ангина, хрониче-

ский тонзиллит, паратонзиллит и некоторые другие, весьма распространены, однако их патогенез изучен недостаточно. В частности, остается неясной роль противомикробных пептидов, в том числе дефенсинов, в гомеостазе миндалин. К классу «естественных антибиотиков» можно отнести р-дефенсины 1 - 3 человека, которые вырабатываются в основном эпителиальными клетками слизистых оболочек и обладают прямым противовирусным, антибактериальным и противогрибковым действием [4, 5]. Wang C. с соавт. определили уровень экспрессии HBD-1 и HBD-2 в небных миндалинах здоровых людей (в норме) и у пациентов с хроническими тонзиллитами. В результате было сделано заключение о существенной роли данных факторов врожденного иммунитета в функционировании миндалин. Показано, что HBD-1 человека экспрессируется на уровне мРНК практически во всех взятых образцах ткани миндалин как в норме, так и при патологии. HBD-2 экспрессируется только у больных хроническим тонзиллитом и практически не определяется в норме у здоровых людей [6].

Цель работы - определение уровней экспрессии генов а- и р-дефенсинов у детей с тяжелой формой острых и рецидивирующих паратонзиллитов.

Материалы и методы

На базе Морозовской детской больницы проводился анализ результатов обследования больных паратонзиллитами, находившихся в стационаре клиники в связи с тяжелым течением заболевания с 2007 по 2010 год. Под медицинским наблюдением находилось 140 пациентов в возрасте от 2-х до 17 лет с диагнозом «острый паратон-зиллит». Клинические методы исследования включали: изучение соматического статуса пациента и оценку жалоб, предъявляемых детьми и их родителями при поступлении в стационар. При осмотре ЛОР-органов оценивали выраженность фарингоскопических признаков паратонзиллита (асимметрия зева за счет смещения небной миндалины к центру на стороне поражения, отек и гиперемия передней небной дужки), состояние регионарных лимфатических узлов и тризм жевательной мускулатуры.

Определение концентрации HNP-1 - 3 в сыворотке крови проводилось с помощью иммунофер-ментного анализа (ИФА), с использованием тест-системы фирмы HyCult Biotehnology (Нидерланды).

Уровень экспрессии гена HBD-2 в эпителиальных клетках слизистой оболочки небных миндалин определялся методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Для этого из клеток слизистой небных миндалин при помощи комплекта реагентов «РИБО-сорб», предназначенного для выделения РНК/ДНК из клинического материала, в строгом соответствии с протоколом выделяли РНК.

На следующем этапе исследований проводили реакцию обратной транскрипции. В эппендорфах

(Axygen, США), погруженных в холодный штатив, готовили смесь праймеров: 3 мкл обратного прай-мера (HBD-2, 1 ОЕ/мкл, «Синтол», Россия), 1 мкл random-праймера (шестичленные олигонуклеоти-ды со случайной последовательностью, 5 ОЕ/мкл, «Синтол», Россия) на одну пробу. Смесь вносили по пробиркам по 4 мкл на эппендорф. Добавляли по 4 мкл пробы РНК, а в пробирку с отрицательным контролем - 4 мкл воды. Пробирки с пробами и праймерами инкубировали в твердотельном термостате при температуре 75 °С (термостат «Термит», «ДНК-Технология», Россия) в течение трех минут, затем добавляли 21 мкл реакционной смеси № 2 (10х буфер для ревертазы («Сибэнзим», Россия), dNTP 2,5 мМ («Синтол», Россия), M-mulv reverse transcriptase 0,1 мкл («Сибэнзим», Россия)). Затем пробирки помещали в амплификатор («Терцик», «ДНК-Технология», Россия) на один час при 37 °С, после чего проводили инактивацию фермента при 94 °С. Полученную в ходе реакции кДНК хранили при температуре минус 70 °С.

В работе применялся метод ПЦР-РВ. Последовательность праймеров HBD-2 подбирали с помощью программы Vector NTI 8.0, анализируя последовательность генов, полученную из электронной базы данных GenBank. Реакционную смесь готовили из реактивов «Набора для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I» («Синтол», Россия) согласно рекомендациям фирмы-производителя. После приготовления реакционных смесей пробирки помещали в амплификатор для ПЦР-РВ АНК-32 (Институт аналитического приборостроения РАН, Россия), позволяющий анализировать образцы ДНК/РНК в динамическом диапазоне от 1 до 109 копий и одновременно детектировать четыре флуоресцентных красителя (FAM/SYBR Green, ROX, R6G, CY5) с заданной программой с числом циклов 35 - 40.

Изучение экспрессии исследуемого гена проводили относительно экспрессии гена актина. Для определения экспрессии гена р-актина помимо имеющейся системы использовали «Набор реактивов для обнаружения и определения кДНК в-актина человека» («Синтол», РФ). Все действия по постановке реакции осуществлялись согласно рекомендациям фирмы-производителя.

Статистический анализ проводили с использованием общепринятых статистических методов, рассчитывая в группах данных: среднее арифметическое - X (X = Sx/n), дисперсию - о2 (о2- = 2(х. - X)2/n), среднее квадратичное отклонение - ох (ох = 02(х. - X)2/n), где х. - значение варианта, n - число экспериментов.

Применяли также компьютерные статистические программы BioStat и Excel. В работе результаты представлены в виде X ± о. Для сравнения групп данных использовали непараметрические методы статистической обработки данных. В связи с разным числом наблюдений в каждой из групп для оценки статистической достоверности различий экс-

Рисунок 1.

Изменение уровней продукции НЫР -1- 3 в сыворотке периферической крови

А

800 и

7006005004003002001000

Группа сравнения

Группа детей с острым паратонзиллитом

8 7 6 5

43 2 1

0

Группа сравнения

Группа детей с острым паратонзиллитом

" Показатель статистически значимо отличается от такового в норме (P < 0,05).

прессии генов в исследуемых группах использовали непараметрический критерий Манна-Уитни [7].

Результаты и обсуждение

В сыворотке крови здоровых детей определяли концентрацию а-дефенсинов 1 - 3, которая составила 52, 6 ± 3,8 нг/мл, что соответствовало норме (от 0 до 150 нг/мл у здорового человека). Анализ концентрации противомикробных пептидов выявил у всех пациентов с острым паратонзиллитом резкое увеличение концентрации НИР-1 - 3 (в семь-восемь раз) - 808,5 ± 69 нг/мл (рис. 1А).

Выброс а-дефенсинов нейтрофилами в кровь является одним из регуляторных механизмов стимуляции врожденного и адаптивного иммунитета за счет угнетения избыточной продукции глюко-кортикоидов, вызывающих подавление иммунных реакций. Перспективным является параллельный анализ экспрессии противомикробных пептидов на уровне генов и синтеза белка в клетках периферической крови в связи с поиском критериев прогноза течения паратонзиллитов.

На следующем этапе исследований была проведена оценка уровня экспрессии гена НВО-2. Так, у детей из группы сравнения данный показатель составил 6,48 ± 0,07 логарифма количества копий кДНК гена НВО-2 относительно 106 копий гена р-актина (^ количества копий кДНК гена НВО-2 относительно 106 копий гена р-актина). У 18 (60%) детей с острым паратонзиллитом отмечено снижение экспрессии гена НВО-2 в слизистой оболочке небных миндалин (^ копий кДНК 6,0 ± 0,15), что может указывать на снижение локального иммуни-

тета. У 12 человек (40%) уровень экспрессии гена НВО-2 по сравнению с данными контрольной группы не изменялся (рис. 1Б). По нашим наблюдениям, у больных с острым паратонзиллитом, который сопровождался резким снижением уровня экспрессии гена НВО-2 в слизистой оболочке небных миндалин, отмечались тяжелое течение заболевания или рецидивы паратонзиллита в анамнезе.

Таким образом, установлен дисбаланс в системе противомикробных пептидов, который выражается в сниженной экспрессии гена НВО-1 в эпителиальных клетках слизистой оболочки небных миндалин и повышенной продукции НИР-1 - 3 в сыворотке периферической крови у детей с острым паратонзиллитом. Новый взгляд на механизмы системы врожденного иммунитета, и в первую очередь на систему противомикробных пептидов, открывает совершенно иные подходы к диагностике и лечению острого паратонзиллита.

Исходя из полученных данных, можно сделать заключение, что при лечении больных с тяжелым рецидивирующим течением паратонзиллита, а также при профилактике этого заболевания следует учитывать состояние локального и системного иммунитета. Необходимо так оптимизировать терапию у больных паратонзиллитом, чтобы произошла нормализация экспрессии генов р-дефенсинов в слизистой миндалин и концентрации а-дефенсинов в сыворотке крови, что в свою очередь будет сопровождаться улучшением самочувствия, уменьшением признаков интоксикации, снижением температуры тела до нормальных значений, уменьшением отека в области паратонзиллярной клетчатки. Ш

Б

*

*

Вакцинопрофилактика |

Литература

1. Кокряков В.Н. Очерки о врожденном иммунитете. - СПб.: Наука, 2006. - 261 с.

2. Макаров О.В., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. и др. Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет. - М.: Гэотар-Медиа, 2007.

3. Ганковская О.А., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. и др. Роль Toll-подобных рецепторов и дефенсинов в противомикробной защите уро-генитального тракта женщин // Журн. микробиол., эпидемиол. и имму-нобиол. 2008. № 1. С. 46 - 50.

4. Schwaab M., Gurr A., Hansen S. et al. Human beta-defensins in different states of diseases of the tonsilla palatine // Eur. Arch. Otorhinolaryngol. 2010. 267 (5). P. 821 - 830.

5. Pacova H., Astl J., Martinek J. The pathogenesis of chronic inflammation and malignant transformation in the human upper airways: the role of be-ta-defensins, eNOS, cell proliferation and apoptosis // Histol. Histopathol. 2009. 24 (7). P. 815 - 820.

6. Wang C., Dong Z., Yang Z. Expression of human beta-defensin in palatine tonsil // Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za Zhi. 2004. 18 (3). P. 129 - 131.

7. Гланц С. Медико-биологическая статистика. - М.: Практика, 1999. - 459 с.

Иммунологическая эффективность вакцинации против дифтерии и коклюша у детей с патологией нервной системы

С.П. Каплина1

Специализированный психоневрологический дом ребенка № 13, Санкт-Петербург 2ФГУ «НИИ детских инфекций» ФМБА, Санкт-Петербург

Резюме

Представлены данные о течении вакцинального процесса и специфическом антителообразовании у 128 детей в возрасте от года до пяти лет, привитых вакцинами АКДС (73 ребенка) и Инфанрикс (55 детей). Поражение нервной системы имели 64 ребенка (50%), группу сравнения составили 64 практически здоровых ребенка. Поствакцинальный период у 111-ти привитых детей (86,7%) протекал гладко, из них у 85 (83,4%) - бессимптомно. Наслоение интер-куррентных инфекций зарегистрировано у 17 детей (13,3%). Иммунологическая эффективность оценена по уровню антител к дифтерии в РПГА стандартным методом, противоко-клюшных антител - в реакции агглютинации и методом ИФА. После четырехкратной иммунизации титр антител в ИФА в среднем не различался - 40,13 ± 7,81 МЕ/мл (АКДС) и 40,0 ± 15,92 МЕ/мл (Инфанрикс). Дети с низкими титрами и ниже защитного уровня имели в анамнезе перинатальное поражение ЦНС либо синдром Дауна. Через три года после ревакцинации Инфанриксом в 100% случаев и АКДС - в 64,3% отмечено снижение и увеличение частоты серо-негативных лиц.

Ключевые слова: вакцинопрофилактика дифтерии и коклюша, дети с поражением нервной системы, антителообразо-вание, противококлюшные антитела, реакция агглютинации, ИФА

Immunologic Effectiveness of Vaccination against Diphtheria and Pertussis in Children with Pathology of the Nervous System

S.P. Kaplina1

Specialized Neuropsychiatrie Orphanage № 13, St. Petersburg 2Federal State Institution Research Institute of Childhood Infections, Federal Medical-Biological Agency of Russia, St. Petersburg Abstract

It presents data on vaccination during the process and the specific antibody level in 128 children aged from one year to five years, vaccinated with DTP vaccine (73 children) and Infanrix (55 children). Damage to the nervous system had 64 children (50%), the comparison group were 64 healthy children. Postvaccination period, 111 vaccinated children (86.7%) proceeded smoothly, of whom 85 (83.4%) - no symptoms. Layering intercurrent infections were registered in 17 children (13.3%). Immunological efficacy assessed by the level of antibodies to diphtheria in the passive agglutination test standard method, pertussis antibody in agglutination test and ELISA. After four times of immunization antibody titers in ELISA did not differ in average - 40.13 ± 7.81 IU/ml (DTP) and 40.0 ± 15.92 IU/ml (Infanrix). Children with low and lower protective levels had a history of perinatal CNS lesions or Down syndrome. Three years after revaccination with Infanrix in 100% and DTP in 64.3% decreased and increased frequency of IgG seronegative individuals. Key words: vaccination against diphtheria and pertussis, children with damage to the nervous system, antibody formation, pertussis antibodies agglutination test, ELISA

Введение

В последние годы у педиатров появилась возможность выбора вакцин, предпочтительных для применения у детей, в частности, с поражением нервной си-

стемы [1], так как считавшиеся ранее противопоказаниями хронические болезни рассматриваются сейчас как состояния, требующие первоочередной специфической защиты от ряда инфекций [2].