Рекомбинантный штамм дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующий бета-маннаназу Bacillus subtilis
RECOMBINANT YEAST STRAIN OGATAEA HAGLERORUM PRODUCING BETA-MANNANASE BACILLUS SUBTILIS

Изобретение относится к области биотехнологии и касается получения рекомбинантного штамма дрожжей Ogataea haglerorum N107 - продуцента β-маннаназы.
β-маннаназа (эндо-β-1,4-маннаназа β-1,4-D-маннаназа, 1,4-β-D-маннан манногидролаза, Е.С.3.2.1.78) относится к гемицеллюлазам, к классу ферментов О-гликозид-гидролаз и катализирует расщепление внутренних β-1,4-гликозидных связей в основной полимерной цепи молекулы маннана.
Маннан - важный компонент гемицеллюлозной фракции клеточной стенки многих растений, полисахарид, который в зависимости от строения подразделяют на четыре субсемейства: линейный маннан, галактоманнан, глюкоманнан или галактоглюкоманнан [Carbohydr Polym. 2001, 44, 107-112; Process Biochem. 2010, 45, 1203-1213]. В каждом из этих полисахаридов основная цепь состоит из остатков D-маннозы или комбинации остатков D-маннозы и D-глюкозы, связанных β-1,4-гликозидными связями.
Полная деградация маннана требует комплекса маннолитических ферментов, включающих β-маннаназу, β-маннозидазу (ЕС 3.2.1.25) и β-глюкозидазу (ЕС 3.2.1.21).
Основную роль в разрушении маннана играет β-маннаназа, которая катализирует случайный гидролиз маннана до низкомолекулярных манноолигосахаридов, преимущественно до маннобиозы и маннотриозы [Crit Rev Biotechnol. 2007, 27(4), 197-216]. Низкомолекулярные манноолигосахариды и манноза могут усваиваться живыми организмами.
β-маннаназу применяют в целлюлозно-бумажной промышленности для отбеливания пульпы, в пищевой промышленности (растворимый кофе, экстракция растительных масел из семян, диетические пищевые продукты), производстве синтетических моющих средств, получении биотоплива из лигноцеллюлозы [Appl Microbiol Biotechnol. 2008, 79, 165-178. DOI 10.1007/s00253-008-1423-4]. Важной областью применения β-маннаназы является кормовая промышленность. Наличие маннанов в кормах приводит к повышению вязкости содержимого желудочно-кишечного тракта птицы и животных с однокамерным желудком из-за способности маннанов связывать свободную воду. Введение в корма животных β-маннаназы увеличивает их питательную ценность и энергетический уровень, уменьшает вязкость перевариваемого субстрата, способствует улучшению физиологического состояния животных, приросту их массы и продуктивности [Crit Rev Biotechnol. 2007, 27(4), 197-216]. Манноза - продукт расщепления маннанов, легко усваивается организмом. Неусвояемые формы манноолигосахаридов - маннотриоза и маннобиоза, являются хорошим субстратом для роста бифидобактерий и способствуют улучшению показателей здоровья птицы. Введение маннаназы и других ферментов, разрушающих растительные субстраты, в рацион животных с однокамерным желудком и птиц позволяет использовать такие дешевые корма, как ячмень, овес и отходы сельскохозяйственного производства (отруби, жом), содержащие трудноусвояемые компоненты.
Природными источниками β-маннаназ являются преимущественно бактерии и грибы. Среди грамположительных бактерий преобладают виды рода Bacillus и Clostridium [Carbohydr Polym. 2006, 66, 88-96; J Food Biochem. 2011, 35, 1451-1460; J. Bacteriol. 2004, 186 (19), 6544-6552]. β-Маннаназы синтезируются некоторыми штаммами грамотрицательных бактерий, таких как Pseudomonas [Biochem J. 1995, 305, 1005-1010], Vibrio [Biosci Biotechnol Biochem. 2009, 73, 109-116]. Обширная группа маннолитиков среди грибов представлена родами Aspergillus и Trichoderma [J. Biotechnol. 1998, 63, 199-210; PLOS One. 2011, 6(12), e29302. doi:10.1371/journal. Pone.0029302].
Большое количество генов β-маннаназ экспрессировано в гетерологичных хозяевах. Гены β-маннаназ из бактериальных источников экспрессированы в Escherichia coli, Bacillus megaterium, Brevibacillus brevis, Pichia pastoris, Kluyveromyces cicerisporous, гены β-маннаназ из грибов экспрессировали в Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Aspergillus sp., Trichoderma reesei [Biotechnology Advances. 2016. doi:10.1016/j.biotechadv.2016.11.00; Process Biochemistry 2010, 45, 1203-1213. doi:10.1016/j.procbio.2010.05.011].
Грибные штаммы, как правило, продуцируют комплекс ферментов, относящихся к карбогидразам и разрушающих растительные субстраты, а именно, β-маннаназу, ксиланазу, целлюлазу, глюканазу и пектиназу. В этом ферментном коктейле на долю β-маннаназ приходится не более 3% [Carbohydr Polym. 2004, 57, 23-29].
Для производства моноферментных препаратов используют рекомбинантные дрожжевые штаммы.
Наиболее продуктивные рекомбинантные штаммы-продуценты β-маннаназы получены на основе дрожжей Pichia pastoris.
Метилотрофные дрожжи Pichia pastoris являются модельным организмом для экспрессии гетерологичных генов под контролем сильного регулируемого метанолом промотора гена АОХ1. При использовании несбраживаемых источников углерода (глицерина, метанола и т.п.) дрожжи Pichia pastoris способны к росту с образованием биомассы высокой плотности, что позволяет получать значительные количества гетерологичного белка [Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 54(6), 741-750]. При этом процесс культивирования метилотрофных дрожжей достаточно прост, поскольку их рост не блокируется продуктами метаболизма [FEMS Microbiol. Rev., 2000, 24: 45-66, doi: 10.1111/j.l574-6976.2000.tb00532.x].
На базе дрожжей Pichia pastoris получены рекомбинантные штаммы, содержащие гены маннаназ из грибов.
В дрожжах Pichia pastoris Х-33 экспрессирован ген manM Aspergillus sulphureus с кодонами, адаптированными для этого вида дрожжей. Штамм продуцирует 3 мг/мл белка, активность фермента составляет 1100 ед./мл КЖ через 96 ч культивирования в 10 л ферментере. Рекомбинантная β-маннаназа имеет максимальную активность при рН 2,4 и температуре 50°С, удельная активность фермента 344,8 ед./мг [Biologia 2009, 64/2, 235-238. doi: 10.2478/s11756-009-0043-5].
Грибные β-маннаназы, в основном, проявляют максимальную активность при кислых значениях рН (2.0-4.5) и характеризуются невысокой удельной активностью по сравнению с бактериальными β-маннаназами.
Известны примеры создания высокопродуктивных рекомбинантных штаммов-продуцентов на основе дрожжей Pichia pastoris, содержащих гены бактериальных β-маннаназ, преимущественно из Bacillus. Бактериальные β-маннаназы проявляют максимальную активность при нейтральных и щелочных значениях рН и характеризуются в массе своей относительно высокой удельной активностью по сравнению с грибными β-маннаназами, например, удельная активность очищенной β-маннаназы из Bacillus subtilis SA-22 составляет 34780 ед./мг, из Bacillus circulans М-21 - 19373 ед./мг, из Bacillus subtilis WY34 - 8302 ед./мг, из Bacillus sp. MSJ-5 - 5383 ед./мг [Int J Pharm Bio Sci. 2014, 5(1): (B), 176-192] и, в целом, более термостабильны, чем грибные β-маннаназы, что важно для промышленного использования фермента [Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012, 93, 1817-1830. DOI 10.1007/s00253-012-3887-5].
Получен продуцент на основе штамма P. pastoris GS115, в котором экспрессирован ген β-маннаназы из Bacillus megaterium FB101. Активность маннаназы составляет 22000 ед./мл через 120 ч ферментации и не меняется при увеличении времени культивирования до 190 ч. Удельная активность фермента в КЖ составляет 3427 ед./мг, очищенного фермента - 16718 ед./мг. Фермент проявляет максимальную активность при рН 6.5 и температуре 55°С [WO 2012079222].
Ген β-маннаназы mannS из Bacillus subtilis MAFIC-S11, имеющий адаптированные для дрожжей P. pastoris кодоны, экспрессирован в дрожжах P. pastoris. Для секреции использована модифицированная сигнальная последовательность [Biotechnology and Bioengineering 2009, 103, 1192-1201]. Штамм секретирует 6,6 мг/мл белка, активность маннаназы составляет 24600 ед./мл через 144 ч ферментации в 10 л ферментере. Фермент имеет максимальную активность при рН 6,0 и температуре 50°С [Appl Biochem Biotechnol. 2013, 169, 2326-2340. DOI 10.1007/sl2010-013-0156-8].
Получен [CN 110093331] рекомбинантный штамм Pichia pastoris, содержащий искусственно созданный ген маннаназы ManGold. Штамм секретирует 3,25 мг/мл фермента, активность маннаназы составляет 35000 ед./мл через 96 ч ферментации.
Еще одной известной метилотрофной системой для гетерологичной экспрессии являются термотолерантные дрожжи Ogataea (Hansenula). Дрожжи рода Ogataea, как и дрожжи Pichia pastoris, обладают уникальной организацией и регуляцией метаболизма в присутствии метанола благодаря наличию сильных промоторов, индуцируемых метанолом. Подобно Pichia pastoris, дрожжи рода Ogataea сочетают преимущества простоты выращивания на недорогой ростовой среде с высокой секретирующей способностью, а при культивировании в биореакторе достигают высокой плотности клеток, что способствует высокому выходу целевого продукта [FEMS Yeast Res. 2005, 5, 1079-1096; Microb. Cell Fact. 2006, 5, 39; Curr Microbiol. 2014, 69, 143-148; FEMS Microbiology Letters, 2019, 366, fnz052].
В отличие от Pichia pastoris дрожжи рода Ogataea являются термотолерантными, что позволяет проводить ферментацию при температуре не ниже 37°С. Повышение температуры процесса ферментации снижает контаминацию и затраты на охлаждение биореактора [Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010, 85, 861-867. doi: 10.1007/s00253-009-2248-5] и в результате сокращает длительность ферментации.
Вид Ogataea haglerorum выделен из дрожжей рода Ogataea в 2017 г. в результате проведения анализа последовательностей D1/D1 гена LSU rRNA, ITS1-5.8S-ITS2, фактора элонгации трансляции EF-1α и комплексного генетического анализа Наумовым Г.И. с соавторами [Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2017, 67, 2465-2469. DOI 10.1099/ijsem.0.002012].
Для дрожжей Ogataea haglerorum разработаны генетические технологии конструирования штаммов-продуцентов, включая экспрессионный вектор и метод введения ДНК в клетки реципиента [Биотехнология, 2019, 35 (6), 51-56]. Описано использование штамма Ogataea haglerorum ВКПМ Y-2584 для экспрессии различных генов фитазы. Других сведений об использовании дрожжей Ogataea haglerorum для экспрессии гетерологичных генов не выявлено.
Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих β-маннаназу.
Задача решена путем получения трансформанта дрожжей Ogataea haglerorum, продуцирующего β-маннаназу, содержащего в составе хромосомы оптимизированную последовательность гена MANS, кодирующего β-маннаназу Bacillus subtilis.
В данном изобретении термотолерантные метилотрофные дрожжи рода Ogataea впервые использованы для гетерологичной экспрессии β-маннаназы.
Получение заявляемого трансформанта включает
- трансформацию в клетки дрожжей Ogataea haglerorum экспрессионной кассеты (фиг. 1), содержащей синтетический ген MANS β-маннаназы из Bacillus subtilis;
- отбор репликативного трансформанта, способного продуцировать β-маннаназу;
- селекцию на многокопийную интеграцию экспрессионной кассеты в состав хромосомы трансформанта.
Конструирование экспрессионной кассеты осуществляют стандартными методами генетической инженерии [Sambrook J., Maniatis Т., Fritsch Е. Molecular cloning: a laboratory manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989] с использованием генетических элементов, подходящих для работы с дрожжами рода Ogataea (Hansenula). В качестве промоторов могут быть использованы МОХ, FMD, DAS, TPS1, FLD1, PHO1, YNT1, YNI1, YNR1, GAP, ACT, РМА1, АОХ, MAL, АМО, TEF1, РЕХ14, РЕХ11 [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; Curr Microbiol., 2014, 69, 143-148; FEMS Microbiol Lett., 2018, 365, 1-6; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278].
В качестве сигнальных пептидов используют лидерную последовательность PHO1, пре-про-лидерную последовательность MFα из Saccharomyces cerevisiae или Ogataea thermomethanolica, GAM1 из Schwanniomyces occidentalis [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; Curr Microbiol., 2014, 69, 143-148; Appl Biochem Biotechnol., 2016, 178, 710-724].
В качестве терминаторов транскрипции используют МОХ, AMO1, PHO5, АОХ1 [Appl. Microbiol. Biotechnol., 2000, 54, 741-750; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 185-193; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 175-184].
В качестве селективных маркеров используют любые подходящие маркеры, например, гены резистентности к антибиотикам зеоцину, генетицину (G418), гигромицину В, норзеотрицину или бластицидину а также гены комплементирующие ауксотрофные мутации в геноме дрожжей рода Ogataea, например, LEU2, HIS3, TRP3, ADE2, URA3, МЕТ6, ADE11 [FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278; Yeast, 1995, 11, 343-353].
В качестве последовательностей, обеспечивающих эффективную трансформацию и автономную репликацию, используют HARS1, HARS2, HARS3, HARS 36 [Mol. Gen Genet., 1986, 202, 302-308; Yeast, 1995, 11, 343-353; Journal of Bacteriology, 1996, 178 (15), 4420-4428].
В качестве плечей для гомологичной интеграции используют, например, последовательности генов МОХ, TRP, URA3, LEU2, GAP, кластер генов для рибосомальной ДНК, HARS, АМО, TEF1 [FEMS Yeast Research, 2005, 5, 1079-1096; FEMS Yeast Research, 2003, 4, 185-193; FEMS Yeast Res., 2012, 12, 271-278] или другие последовательности, гомологичные участкам хромосомы дрожжей рода Ogataea.
Синтетический ген MANS размером 1032 п.н. с проведенной нами оптимизацией кодонов для метилотрофных дрожжей синтезирован в компании ООО «Иннова плюс» (Санкт-Петербург) по заказу НИЦ «Курчатовский институт»-ГосНИИгенетика. Ген MANS кодирует белок ManS, который по последовательности аминокислот наиболее близок к β-маннаназам из бактерий рода Bacillus subtilis. β-Маннаназа ManS идентична β-маннаназам из Bacillus subtilis MAFIC-S11, Bacillus subtilis WL-7, Bacillus subtilis 168 на 97.4-97.7% на основании анализа, проведенного с использованием программы BLAST.
Изобретение проиллюстрировано следующей фигурой.
Фиг. 1. Экспрессионная кассета.
Пример 1. Конструирование штамма дрожжей Ogataea haglerorum, содержащего оптимизированный ген, кодирующий β-маннаназу из Bacillus subtilis.
Для трансформации штамма Ogataea haglerorum ВКПМ Y-2584 используют экспрессионную кассету с геном MANS (фиг. 1).
При конструировании плазмиды, содержащей экспрессионную кассету с геном MANS, используют экспрессионный вектор pMOX-Km-HARS, 6967 п.н. [Биотехнология, 2019, 35 (6), 51-56].
С матрицы амплифицируют ген MANS методом ПЦР с использованием олигонуклеотидов manS-F и manS-R:
manS-F: 5'-ctgaattcagatctagatctgaagctcac-3',
manS-R: 5' -cagcggccgcttactactcaacgattggagtc-3'.
Амплификацию проводят в присутствии Кара-полимеразы (KapaBiosystems, США) при следующих условиях:
1 цикл: 98°С - 2 мин.
35 циклов: 98°С - 20 с, 53°С - 15 с, 72°С - 60 с
1 цикл: 72°С - 3 мин.
Полученную последовательность ДНК встраивают в состав экспрессионного вектора pMOX-Km-HARS по сайтам EcoRI и NotI и получают плазмиду, содержащую экспрессионную кассету (фиг. 1), в состав которой входят следующие генетические элементы:
1. Синтетический ген MANS, встроенный в рамку считывания с нуклеотидной последовательностью сигнального пептида MFα из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, транскрипция которого находится под контролем промотора рМОХ, наработанного с хромосомной ДНК из штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-1546 (линия CBS4732);
2. Терминатор транскрипции tMOX, наработанный с хромосомной ДНК из штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-1546;
3. Дрожжевой селективный маркер KmMX, фланкированный сайтами lox66 и lox71, транскрипция которого находится под контролем промотора pGAPD гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы, наработанного с хромосомной ДНК из штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-1546, и терминатора транскрипции tTEF. Маркер KmMX обеспечивает устойчивость дрожжей Ogataea haglerorum к антибиотику генетицину (G418);
4. Последовательность HARS, наработанная с хромосомной ДНК из штамма Ogataea polymorpha ВКПМ Y-916 (линия DL1) и обеспечивающая сохранение трансформируемой ДНК в клетках реципиентного штамма и являющаяся возможным местом интеграции;
5. Область интеграции - нуклеотидная последовательность 3'- области региона МОХ.
600
2
9
Экспрессионную кассету трансформируют в штамм Ogataea haglerorum ВКПМ Y-2584, который предварительно выращивают в жидкой питательной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы (2 мас. %) при 37°С в течение 6 ч до достижения культурой оптической плотности (OD) 1,5. Клетки собирают центрифугированием (здесь и далее 6000 об/мин.) в течение 10 мин. при комнатной температуре, ресуспендируют в буфере TED состава: 100 мМ Tris-HCl, 50 мМ EDTA, рН 8.0, 25 мМ дитиотрейтола в 1 л воды SQ, инкубируют при 37°С в течение 15 мин. и собирают центрифугированием в течение 10 мин. при комнатной температуре. Далее клетки промывают дважды холодным буфером STM состава: 270 мМ сахароза, 10 мМ Tris-HCl, рН 8.0, 1 мМ MgCl в 1 л воде SQ, собирают центрифугированием в течение 10 мин при температуре 5°С. Обработанные таким образом клетки ресуспендируют в холодном растворе STM в концентрации 1-5×10 клеток на 1 мл. Аликвоту объемом 60 мкл клеточной суспензии переносят в охлажденный эппендорф, добавляют 500 нг ДНК экспрессионной кассеты и инкубируют во льду 5 минут. Смесь клеток и ДНК переносят в предварительно охлажденную кювету для электропорации. Электропорацию проводят при 1500 В, 200 Ом, 25 uF. После электропорации к клеткам добавляют 1 мл жидкой среды YP с глюкозой (2 мас. %), переносят клеточную суспензию в стерильные пробирки на 1,5 мл и инкубируют при 37°С в течение 60 мин. при качании.
Селекцию трансформантов проводят на агаризованной среде YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином (G418) в количестве 200 мкг/мл при температуре 37°С в течение 4-х суток.
Для отбора наиболее продуктивных трансформантов осуществляют их культивирование в пробирках в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %) при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Затем проводят индукцию метанолом, который добавляют дважды в количестве 3 об. % через 24 и 48 ч культивирования при 37°С на качалке (250 об/мин). Общее время культивирования 6 дней. В качестве контроля используют штамм Ogataea haglerorum ВКПМ Y-2584.
540
540
Активность маннаназы в культуральной жидкости (КЖ) определяют методом ДНС с использованием динитросалициловой кислоты [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428], используя маннозу как стандарт. В качестве субстрата используют галактоманнан Locust bean gum (LBG, Sigma, США). Стандартная реакционная смесь состоит из 0,1 мл 1% раствора субстрата в 0,1М ацетатном буфере, рН 5,0 и 0,1 мл рабочего раствора анализируемого образца. Рабочий раствор анализируемого образца готовят из КЖ путем разведения ее дистиллированной водой таким образом, чтобы значение оптической плотности при длине волны 540 нм (OD) находилось в пределах рабочей зоны градуировочного графика. Реакционную смесь инкубируют при 45°С в течение 10 мин, затем добавляют 0,3 мл раствора ДНС и инкубируют при 98°С в течение 5 мин. Оптическую плотность OD измеряют в плашке на 96 лунок на спектрофотометре Multiskan spectrum (Thermo scientific).
За единицу ферментативной активности маннаназы (1 ед.) принимают количество фермента, действующего на субстрат с высвобождением 1 μМ восстанавливающих сахаров (маннозы) за одну минуту.
По результатам ферментации отбирают наиболее продуктивный трансформант Т1, который при культивировании в пробирках синтезирует маннаназу в количестве 900 ед./мл.
Трансформант Т1 растят в неселективных условиях, в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %), в пробирках на качалке при 37°С в течение 24 ч, затем производят пять последовательных пересевов культуры из неселективньгх условий в пробирки со свежей средой YP с глюкозой (2 мас. %), культивируя каждый раз при тех же условиях, после чего рассевают культуру до отдельных колоний на чашки Петри с агаризованной неселективной средой YP с глюкозой (2 мас. %). С помощью репликатора отбирают 100 независимых колоний и анализируют их на способность расти на среде YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином (200 мкг/мл) и контрольной среде - YP с глюкозой (2 мас. %). Появление отдельных колоний, не растущих на селективной среде с антибиотиком, указывает на то, что экспрессионная кассета содержится в клетках трансформанта Т1 в виде автономно-реплицирующейся ДНК.
Далее проводят селекцию на стабилизацию (многокопийную интеграцию) экспрессионной кассеты. Трансформант Т1 инкубируют в жидкой среде YP с глюкозой (2 мас. %) при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин.). Переносят 1/10 объема культуры в свежую жидкую среду YP с глюкозой (2 мас. %) и инкубируют при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин.). Затем 1/50 объема культуры переносят в колбу с 50 мл селективной среды YP с глюкозой (2 мас. %) и генетицином (200 мкг/мл) и инкубируют при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин.). Рассевают культуру до отдельных колоний на чашки с селективной средой YP с глюкозой (2 мас. %) и разной концентрацией генетицина (200, 400 и 600 мкг/мл). Чашки инкубируют при 37°С в течение 3-х суток. Наблюдают появление гетерогенных по размеру колоний. Отбирают колонии крупного размера, которые анализируют на способность продуцировать β-маннаназу и на стабильность наследования признака - способности сохранять устойчивость к генетицину после продолжительного роста культуры в неселективных условиях.
Таким образом, отобран трансформант Ogataea haglerorum N107 с множественной интеграцией экспрессионной кассеты в состав хромосомы, способный к синтезу β-маннаназы.
Отобранный рекомбинантный штамм Ogataea haglerorum N107 является продуцентом β-маннаназы и депонирован в Биоресурсном центре Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (117545 Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1) как Ogataea haglerorum N107 ВКПМ Y-4639.
Штамм характеризуется следующими признаками:
Культурально-морфологические характеристики заявляемого штамма:
При культивировании при температуре 37°С в течение 48 ч на агаризованной среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, агар - 2, вода - остальное) с добавлением глюкозы - 2 (мас. %) клетки имеют овальную форму, 3-4 мкм в диаметре. Клетки почкуются, при этом почкование истинное, многостороннее. Истинного мицелия не образуют.
Споруляция происходит при инкубации культуры на агаризованной среде следующего состава (мас. %): хлорид калия - 0.5, ацетат натрия - 1.0, агар - 2.0, вода - остальное при 25°С в течение 3-4 дней. Аски имеют тетраэдрическую форму, включают 4 аскоспоры.
На агаризованной среде YP с добавлением глюкозы (2, мас. %) колонии светло-бежевого цвета с ровным краем, матовой поверхностью, линзовидным профилем и пастообразной консистенцией.
При росте в жидкой среде YP (мас. %: дрожжевой экстракт - 1, пептон - 2, вода -остальное) с добавлением глюкозы - 2 (мас. %), при 37°С в течение 24 ч культивирования - жидкость мутная, осадок белый, коагуляции не наблюдается, пристеночных пленок не образует.
Физиолого-биохимические признаки заявляемого штамма:
Штамм способен к росту как в аэробных, так и в анаэробных условиях.
В качестве единственного источника углерода штамм способен использовать глюкозу, глицерин, метанол, этанол, L-рамнозу, сахарозу, мальтозу; не способен ассимилировать D-глюконат, L-арабинозу, сукцинат, лактозу, крахмал.
Штамм способен синтезировать β-маннаназу при культивировании в жидкой среде YP в присутствии глюкозы, биосинтез фермента усиливается при культивировании в присутствии метанола.
Пример 2. Получение β-маннаназы при культивировании штамма Ogataea haglerorum N107 в колбах
Посевную культуру готовят в пробирках в 5 мл среды YP с глюкозой (2 мас. %). Пробирки инкубируют при 37°С в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). В колбу на 0,75 л с 50 мл жидкой среды YP с глюкозой (2 мас. %) переносят 5 мл посевной культуры и колбу инкубируют при 37°С на качалке (250 об/мин.) в течение 6 дней. Метанол (3 об. %) добавляют к культуре через 24 и 48 часов культивирования. Биомассу отделяют центрифугированием в течение 15 мин.
Культуральную жидкость без биомассы (КЖ) используют для определения активности β-маннаназы по методу ДНС и определения количества секретируемого белка по методу Бредфорд с использованием кита Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США).
Рекомбинантный штамм продуцирует белок в количестве 1.0±0.2 мг/мл, активность фермента β-маннаназы составляет 12000±500 ед./мл.
Пример 3. Характеристика рекомбинантной β-маннаназы
Для определения оптимального значения рН для функционирования фермента активность β-маннаназы по отношению к субстрату LBG (галактоманнан Locust bean gum, Sigma, США) измеряют в диапазоне значений рН 1.0-10.0 с использованием 0.1М растворов цитратного (рН 1.0-3.0), ацетатного (рН 4.0-5.0), фосфатного (рН 6.0-8.0) и боратного (рН 9.0-10.0) буферов. Реакцию проводят при температуре 45°С в течение 10 мин. Относительную активность рассчитывают, как процент от средней максимальной активности фермента, измеренной в трех независимых реакциях в диапазоне значений рН 1.0-10.0. Значения рН 5.0-6.0 являются оптимальными для функционирования β-маннаназы, синтезированной дрожжами Ogataea haglerorum, которые содержат ген MANS.
Стабильность полученной β-маннаназы при разных рН определяют путем измерения остаточной активности (в %) после инкубации фермента в течение 24 ч при температуре 35°С в 0,1М буферных растворах с рН 1.0-10.0. Реакцию с субстратом LBG проводят при рН 5.0 и температуре 45°С в течение 10 мин. Остаточную активность (стабильность фермента) рассчитывают, как процент от активности образца фермента (хранится при +5°С в холодильнике), измеренной в 0,1М ацетатном буфере (рН 5,0) и температуре 45°С.
Установлено, что фермент стабилен при значениях рН от 5.0 до 10.0 (сохраняет более 90% активности). В кислой области рН от 1.0 до 3.0 фермент сохраняет около 30% активности, при рН 4.0-75% активности.
Для определения температурного профиля активности фермента β-маннаназы проводят реакции образцов с субстратом LBG в 0.1М ацетатном буфере (рН 5.0) в диапазоне температур от 25 до 80°С с шагом 5°С. Относительную активность рассчитывают, как процент от средней максимальной активности фермента, измеренной в трех реакциях в диапазоне значений температур от 25 до 80°С.
Установлено, что фермент проявляет максимальную активность при температуре 55°С. В интервале температур 35-45°С (температура тела животного) фермент сохраняет 45-65% активности. При температурах выше 65°С активность фермента значительно падает.
Перед определением термостабильности β-маннаназы образцы выдерживают в 0.1 М ацетатном буфере (рН 5.0) при температурах от 25°С до 60°С с шагом 5°С в течение 24 ч. Реакцию с субстратом проводят при температуре 45°С в течение 10 мин. Остаточную активность (стабильность фермента) рассчитывают, как процент от наибольшей активности фермента.
Установлено, что фермент проявляет высокую стабильность (сохраняет более 90% активности) в диапазоне температур 25-40°С, близкой к температуре желудочно-кишечного тракта животных.
Для определения молекулярного веса полученной β-маннаназы проводят электрофоретическое разделение белков из образца КЖ в 12% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (SDS-PAGE) в камере для вертикального электрофореза Mini-PROTEAN Tetra Bio-Rad (Bio-Rad США). Для визуализации белков используют Кумасси бриллиантовый синий R250.
β-Маннаназа, синтезированная штаммом Ogataea haglerorum N107, имеет молекулярный вес 40 кДа.
Пример 4. Получение β-маннаназы при культивировании штамма Ogataea haglerorum N107 в ферментере
600
600
Из суточной биомассы штамма Ogataea haglerorum N107 с чашки Петри со средой YP с глюкозой (2 мас. %) готовят суспензию клеток в стерильной дистиллированной воде, определяют оптическую плотность клеточной суспензии (OD). В качал очные колбы объемом 750 мл с рабочим объемом 110 мл жидкой посевной среды YP с глюкозой (2 мас. %) вносят суспензию клеток до получения OD равной 0.1. Колбы инкубируют при температуре 37°С на качалке при 220 об/мин. до достижения культурой оптической плотности равной 12.
Основную ферментацию проводят в ферментере КФ-103 (ООО-фирма «Проинтех») объемом 3 л на питательной среде состава (табл. 1).
Раствор микроэлементов РТМ1 имеет состав (табл. 2).
2
Исходный объем жидкости в ферментере составляет 1 л. Культивирование проводят при следующих параметрах: температура 37°С; начальное перемешивание 500 об/мин., аэрация 1.0 л/мин., рН 4.6 поддерживается титрованием 25% водным раствором аммиака. Значение pO поддерживают на уровне 20.0% (от насыщения среды воздухом) с использованием каскадной регулировки скорости вращения мешалки.
В рабочий ферментер вносят культуру, выращенную на качалке в колбах, до стартового значения оптической плотности равной 1.8. Наращивание биомассы осуществляют в два этапа. На первом этапе проводят рост биомассы на глюкозе, введенной в ферментер с начальной средой (16 часов). На втором этапе производят наращивание биомассы путем подачи в ферментер глюкозной подпитки состава (мас. %): глюкоза - 28.6, раствор микроэлементов РТМ1 - 1.1 (об./об.), биотин - 0.0004, вода - остальное до значения сырого веса биомассы 18±1 (мас. %).
Далее в ферментер со скоростью 1,2 г/ч на л подается раствор метанольной подпитки состава (мас. %): метанол - 95.9, раствор микроэлементов РТМ1 - 1.4 об./об., биотин - 0.00054, вода - остальное. Индукция метанолом продолжается в течение 134 ч.
Во время культивирования отбирают образцы КЖ для определения активности маннаназы при рН 5.0 и температуре 55°С по методу ДНС [Anal. Chem., 1959, 31 (3), 426-428]. Концентрацию белка в отобранных образцах КЖ определяют по методу Бредфорд с использованием кита Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США). Результаты приведены в табл. 3
Таким образом, при культивировании в 3-х литровом ферментере штамм Ogataea haglerorum N107 ВКПМ Y-4639 продуцирует 4.25 мг/мл белка, при этом активность β-маннаназы через 160 ч культивирования при 37°С составляет 51066 ед./мл КЖ.
Заявляемый штамм по своим биотехнологическим показателям сравним с лучшими зарубежными штаммами - продуцентами β-маннаназы.