СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕТЕРОГЕННОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ ФИЦИНА И НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ХИТОЗАНА
METHOD FOR PRODUCING HETEROGENEOUS ENZYME PREPARATION BASED ON FICIN AND LOW-MOLECULAR CHITOSAN

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано при изготовлении лекарственных средств, обладающих ранозаживляющим действием. Препарат стабилен при хранении, обладает антимикробными и адсорбирующими свойствами.
В современной медицине остается актуальной проблема лечения гнойных ран различной этиологии. Лекарственные препараты на основе ферментов, применяемые при лечении ран, представлены незначительной группой лекарственных средств, так как использование свободных форм энзимов в растворах не дает высокого эффекта из-за того, что белок нестабилен в таких условиях, достаточно быстро инактивируется и не обеспечивает длительного контакта с раневой поверхностью. Наиболее распространенными композициями являются гели, мази и повязки, позволяющие при локальном воздействии на рану одновременно влиять на патогенную микрофлору и стимулировать процессы заживления.
Фицин (КФ 3.4.22.3) принадлежит к группе цистеиновых протеаз, имеет широкую субстратную специфичность, предпочтительно гидролизует в белках связи тирозина и фенилаланина. Проявляет высокую активность в диапазоне рН 6.5-9.5. Его изоэлектрическая точка составляет 9.0. Фермент находит применение в медицине, фармацевтике, ускоряет заживление ран, трофических язв и пролежней, способствуя их очистке от некротических масс, ускоряет очищение раны от патогенной микрофлоры, создает оптимальные условия для репаративных процессов [L. Feijoo-Siota, T.G. Villa, Native and biotechnologically engineered plant proteases with industrial applications, Food Bioprocess Technol. 4 (2011) 1066-1088]. Фицин обладает антиадгезионной активностью в отношении бактерий зубного налета ротовой полости [Патент RU 2393845 С2, МПК A61K 8/66, A61Q 11/00, опубл. 10.07.2010, Бюл. №19]. Он используется в лекарственных средствах для лечения и/или профилактики глазных болезней: макулярной дегенерации, связанной с возрастом, хориоидальной реваскуляризации, болезни Хиппеля-Линдау, реваскуляризации радужной оболочки [Патент RU 2472523 С2, МПК A61K 38/48, А61Р 27/02, опубл. 20.01.2013, Бюл. №2]. Препараты, имеющие в составе фицин, могут применяться для уменьшения концентрации или устранения аллергена Fel dl из окружающей среды: энзим разлагает аллергенные эпитопы [Патент RU 2706206 С1, МПК A61K 38/48, опубл. 14.11.2019, Бюл. №32].
Непосредственное введение свободных ферментов в рану приводит к их быстрой инактивации, что снижает лечебный эффект, поэтому известны многочисленные методы иммобилизации различных ферментов, включая фицин. Использование физической иммобилизации для получения комплекса сополимера винилового спирта, винилглутаранта и винилацетата и протеазы способствует пролонгированию ее лизирующего действия за счет депо-эффекта путем медленного высвобождения фермента в область раны [Патент RU 2014086, МПК A61L 15/12, опубл. 15.06.1994].
Хитозан - это биосовместимый и биодеградируемый полимер, проявляющий антибактериальную активность, что позволяет его использовать в различных областях медицины, в том числе для быстрого заживления ран [Хитин и Хитозан. Получение, свойства и применение. Под ред. академика РАСХН К.Г. Скрябина. Наука. 2002. 365 стр.].
В последнее время было разработано множество материалов и изделий медицинского назначения на основе природных и синтетических полимеров. Известна композиция, которая ускоряет заживление ран различной этиологии без воспалительных осложнений, содержащая хитозан и/или солевую форму хитозана или его производных с наночастицами золота и аминокислотами [Патент RU 2666599 С1, МПК A61L 15/18, A61L 15/22, A61L 15/28, A61K 31/722, А61Р 17/02, опубл. 11.09.2018, Бюл. №26]. Хитозан входит в состав повязки для лечения ран. Она представляет собой эластичную, нерастворимую в воде пленку, не имеющую в своем составе токсичных веществ, обладающую хорошей адсорбирующей способностью, антибактериальными и ранозаживляющими свойствами [Патент RU 2582220 С1, МПК A61L 15/20, A61L 15/28, A61L 15/44, A61F 13/00, опубл. 20.04.2016, Бюл. №11]. На основе хитозана разработан способ получения биоразлагаемой пленки для ее использования в фармацевтике, медицине, ветеринарии, пищевой или косметической промышленности [Патент RU 2656502 С1, МПК C08J 5/18, C08L 5/08, C08L 3/02, A61L 15/22, опубл. 05.06.2018, Бюл. №16; Патент RU 2613112 С2, МПК A61L 15/44, A61L 15/28, A61L 15/20, А61Р 17/02, опубл. 15.03.2017, Бюл. №8]. Хитозан входит в состав геля для наружного применения, результатом которого является ускорение процессов ранозаживления и снижение выраженности рубцов [Патент RU 261 1400 С2, МПК A61K 31/722, A61K 31/095, A61K 31/17, A61K 9/06, А61Р 17/02, опубл. 21.02.2017, Бюл. №6]. Хитозан добавляют в косметические гели для увлажнения и смягчения кожи лица и тела [Патент RU 2085187 С1, МПК A61K 7/48, опубл. 27.07.1997].
Низкомолекулярные формы хитозана являются перспективными полимерами для разработки и создания нового класса лекарственных форм с ранозаживляющими и антибактериальными свойствами. Показано, что антибактериальные свойства хитозана сильно зависят от его молекулярно-массовых параметров [Куликов С.Н., Тюрин Ю.А., Фассахов Р.С, Варламов В.П. / Антибактериальная и антимикотическая активность хитозана: механизмы действия и роль структуры // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии, 2009, №5, с. 91-98]. Хитозан является сополимером глюкозамина и ацетилглюкозамина, представляет собой гетерогенную группу веществ, различающихся по молекулярной массе, степени деацетилирования, расположению остаточных ацетилированных звеньев вдоль полимерной цепи, и в связи с широким разнообразием данных параметров образцов полимера для хитозана характерны значительные вариации в проявлении антибактериальных свойств [Kumar A.B.V., Varadaraj М.С., Tharanathan R.N. Low molecular weight chitosan - preparation with the aid of pepsin, characterization, and its bactericidal activity. Biochim. Biophys. Acta. 2004, 1670(2): 137-146].
Для эстетической медицины и косметологии создан хитозансодержащий гидрогель для косметического ухода за кожей с низкомолекулярным хитозаном в составе, применяемый для увлажнения кожи, уменьшения морщин, реализации лифтинг-эффекта [Патент RU 2667130 С1, МПК A61K 8/04, A61K 8/73, A61K 8/36, A61Q 19/08, опубл. 14.09.2018, Бюл. №26]. Для применения в медицине разработан препарат, представляющий собой гель следующего состава (в г): низкомолекулярный хитозан - 0.05-2.00; метилцеллюлоза-100 - 1.0-3.0; глицерин - 10.0-20.0; нипагин - 0.1-0.3; вода-до 100.0, где низкомолекулярный хитозан имеет молекулярную массу от 5 до 72 кДа со степенью деацетилирования от 20 до 85-89% в концентрациях от 0.05 до 2.0%. Данный состав обеспечивает высокий ранозаживляющий эффект [Патент RU 2440122 С1, МПК A61K 31/722, A61K 31/717, A61K 47/10, А61Р 31/04, опубл. 20.01.2012, Бюл. №2]. Для фармацевтической промышленности создана антибактериальная композиция, включающая водорастворимый низкомолекулярный хитозан, используемая в широком диапазоне уровней кислотности среды [Патент RU 2494746 C1, A61K 31/722, A61K 47/48, А61Р 31/04, опубл. 10.10.2013, Бюл. №28]. Разработан препарат в порошкообразной форме для регенерации мягких тканей с низкомолекулярным хитозаном с молекулярной массой 5-72 кДа [Патент RU 2485959 С1, МПК A61K 31/722, A61K 33/30, A61K 33/34, A61K 9/14, А61Р 17/02, А61Р 31/04, В82В 1/00, B82Y 5/0, опубл. 27.06.2013, Бюл. №18].
Целью изобретения является разработка способа получения гетерогенного ферментного препарата на основе фицина и низкомолекулярного хитозана 50-190 кДа, обладающего одновременно противовоспалительным и регенераторным действием в сочетании с антибактериальным эффектом. Ранее мы осуществляли иммобилизацию фицина на среднемолекулярном 200 кДа и высокомолекулярном 350 кДа хитозанах, которые сами по себе не проявляли существенной антибактериальной активности [Diana R. Baidamshina, Victoria A. Koroleva, Elena Yu. Trizna, Svetlana M. Pankova, Mariya N. Agafonova, Milana N. Chirkova, Olga S. Vasileva, Nafis Akhmetov, Valeriya V. Shubina, Andrey G. Porfiryev, Elena V. Semenova, Oskar A. Sachenkov, Mikhail I. Bogachev, Valeriy G. Artyukhov, Tatyana V. Baltina, Marina G. Holyavka, Airat R. Kayumov. Anti-biofilm and wound-healing activity of chitosan-immobilized Ficin // International Journal of Biological Macromolecules, 2020, V. 164, P. 4205-4217]. При этом в литературе имеются сведения, которые свидетельствуют об усилении антибактериальных свойств хитозана при уменьшении его молекулярной массы, что связывают с лучшей растворимостью низкомолекулярных форм полимера, поэтому нами был выбран низкомолекулярный хитозан 50-190 кДа как матрица для иммобилизации фицина.
Известны способы получения гетерогенных ферментных препаратов на основе протеаз, в частности бромелайна [Патент RU 2691611, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 14.06.2019 Бюл. №17] и папаина [Патент RU 2712690, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 30.01.2020 Бюл. №4] и гелей пищевого хитозана и сукцината хитозана. В отличие от них мы предлагаем в качестве действующего вещества использовать фицин, который имеет несколько иную (предпочтительно гидролизует в белках связи тирозина и фенилаланина, в то же время совершенно не наблюдается процесс расщепления по связям аргинина и лизина), но при этом довольно широкую субстратную специфичность и гидролизует казеин с большей скоростью, чем папаин, бромелайн или трипсин [Практикум по биотехнологии: иммобилизованные биологические объекты в системе лабораторных работ / М.Г. Холявка, М.А. Наквасина, В.Г. Артюхов. - Воронежский государственный университет.- Воронеж: Издательский дом ВГУ, 2017. 161 с.]. Кроме того, фицин эффективно гидролизует структурные компоненты матрикса биопленки Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis уже при концентрации 10 мкг/мл, почти полностью разрушая биопленку при концентрации 1 мг/мл. После обработки фицином структура биопленки становится пористой и с пониженной вязкостью. Обработка фицином усиливает антимикробное действие ципрофлоксацина, гентамицина и бензалкония хлорида против клеток, находящихся внутри биопленок Staphylococcus aureus и Staphylococcus epidermidis [Baidamshina D.R., Trizna E.Y., Holyavka M.G., Bogachev M.I., Artyukhov V.G., Akhatova F.S., Rozhina E.V., Fakhrullin R.F., Kayumov A.R. Targeting microbial bioflms using Ficin, a nonspecifc plant protease roof // Scientific Reports, 2017, 7:46068, DOI: 10.1038/srep46068].
В качестве прототипа служил способ получения гетерогенного ферментного препарата на основе фицина, обладающего ранозаживляющими и регенерирующими свойствами [Патент RU 2677858 С2, МПК A61K 31/74, A61K 38/46, А61Р 17/02, C12N 11/08, опубл. 10.01.2019, Бюл. №1], который включает иммобилизацию фицина в буферном растворе на матрицу ионообменных волокон ВИОН КН-1 в соотношении 20 мл буферного раствора фицина в концентрации 1 мг/ мл на 1 г волокон, при этом в качестве буферного раствора используют 0.05 М трис-HCl буфер с рН 7.0; далее проводят инкубирование в течение 24 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; а затем промывают образовавшийся осадок 0.05 М трис-HCl буфером с рН 7.0 до отсутствия в промывных водах фицина.
Недостатком прототипа является использование синтетических волокон, которые могут прилипать к поверхности раны.
Технический результат заключается в разработке способа получения гетерогенного препарата на основе фицина и низкомолекулярного хитозана 50-190 кДа, позволяющего сократить расход противовоспалительного, ранозаживляющего средства благодаря пролонгированному действию и высокой стабильности получаемого препарата с высокой за счет входящего в состав фицина антибактериальной активностью, превышающей соответственно в 2 и 2.5 раза активность фицина, иммобилизованного на среднемолекулярном 200 кДа и высокомолекулярном 350 кДа хитозанах; сохраняющейся после двух суток инкубации не менее 46% от исходной каталитической способности.
Действующим веществом предлагаемого нами средства является фицин, обладающий противовоспалительными и ранозаживляющими свойствами, в качестве носителя для иммобилизации фермента нами был выбран низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой 50-190 кДа, который как носитель для иммобилизации способен не только повысить стабильность фицина по отношению к различным денатурирующим факторам, но и сам обладает регенерирующей и более высокой антибактериальной активностью, по сравнению со среднемолекулярным и высокомолекулярным хитозанами, что связано с лучшей растворимостью низкомолекулярных форм полимера. Кроме того, низкомолекулярный хитозан защищает обрабатываемый участок кожи от пересыхания, удерживая влагу, позволяет легко удалить препарат вместе с гноем и экссудатом.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гетерогенного ферментного препарата на основе фицина и низкомолекулярного хитозана, включающем иммобилизацию фермента на матрицу носителя в буферном растворе в соотношении 20 мл буферного раствора фермента в концентрации 1 мг/мл на 1 г носителя, инкубирование в течение 24 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием и промывку, согласно изобретению, иммобилизацию фицина проводят на матрицу низкомолекулярного хитозана с молекулярной массой 50-190 кДа; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0.05 М боратный буфер с 0.1 М KCl в составе с рН 8.0; образовавшийся осадок промывают 0.05 М боратным буферным раствором с 0.1 М KCl в составе с рН 8.0 до отсутствия в промывных водах фицина.
Фиг. 1. Диаграмма содержания белка (мг/мл) в препаратах фицина, иммобилизованного на матрице низкомолекулярного хитозана: 1 - 0.05 М фосфатный буфер, 2 - 0.05 М боратный буфер с 0.1 М KCl в составе, 3 - 0.05 М трис-глициновый буфер, 4 - 0.05 М глициновый буфер.
Фиг. 2. Диаграмма общей активности (ед/мл) препаратов фицина, иммобилизованного на матрице низкомолекулярного хитозана: 1 - 0.05 М фосфатный буфер, 2 - 0.05 М боратный буфер с 0.1 М KCl в составе, 3 - 0.05 М трис-глициновый буфер, 4 - 0.05 М глициновый буфер.
Фиг. 3. Диаграмма удельной активности (ед/мг белка) препаратов фицина, иммобилизованного на матрице низкомолекулярного хитозана: 1 -0.05 М фосфатный буфер, 2 - 0.05 М боратный буфер с 0.1 М KCl в составе, 3 - 0.05 М трис-глициновый буфер, 4 - 0.05 М глициновый буфер.
Фиг. 4. Диаграмма зависимости каталитической активности (%) свободного (1) и иммобилизованного (2) фицина от времени инкубации.
Фиг. 5. Процент сохранения количества фицина в фазе сорбента при инкубации препаратов: 1 - в 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7.5; 2 - в физиологическом растворе.
Фиг. 6. Количество биомассы Escherichia coli (К-12 MKD910) при различных условиях культивирования.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования был выбран фицин фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich», носителем для иммобилизации - низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой 50-190 кДа фирмы «Sigma-Aldrich». Для получения гетерогенных биокатализаторов на основе фицина, иммобилизованного на матрице низкомолекулярного хитозана, в качестве иммобилизационной среды мы использовали следующие буферные растворы: 0.05 М глициновый, 0.05 М трис-глициновый, 0.05 М фосфатный, 0.05 М боратный буфер с 0.1 М KCl в составе в диапазоне рН от 5.8 до 10.0.
Иммобилизацию фицина проводили на матрицу низкомолекулярного хитозана с молекулярной массой 50-190 кДа в буферном растворе в соотношении 20 мл буферного раствора фермента в концентрации 1 мг/мл на 1 г носителя. Инкубирование осуществляли в течение 24 часов при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку проводили буферным раствором, используемым в качестве иммобилизационной среды, до отсутствия в промывных водах фицина.
Содержание белка в препаратах определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent// J. Biol. Chem. - 1951.-V. 193.-P. 265-275]. Измерение уровня протеолитической активности фицина проводили на субстрате азоказеине [Garcia-Carreno, F. L. The digestive proteases of langostilla (Pleuroncodes planipes, Decapoda): their partial characterization and the effect of feed on their composition // Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry - 1992. - V. 103. - P. 575-578]. К 50 мг образца добавляли 200 мкл трис-HCl буфера с рН 7.5, 800 мкл азоказеина в концентрации 0.5% в 50 мМ трис-HCl буфере с рН 7.5 и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) в концентрации 5%, инкубировали 10 минут при -4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 11 700 g для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 3% NaOH для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 1 см кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл трис-HCl буфера. За единицу каталитической активности принимали такое количество фицина, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин. Удельную протеолитическую активность фицина рассчитывали по формуле:
A=D*1000/120/200/C,
где А - протеолитическая активность, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность пробы при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы, в мкл,
1000 - пересчет в мкМ.
Исследование стабильности свободного и иммобилизованного фицина проводили по следующей схеме: инкубация образцов при 37°C с измерением ферментативной активности через 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 часов. Для измерения процента десорбции фицина с матрицы низкомолекулярного хитозана к 50 мг образца добавляли 200 мкл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7.5 или физраствора, инкубацию проводили при 37°С в течение 1, 2, 3, 4, 5, 24, 48 часов с последующим измерением содержания белка в растворе методом Лоури.
Антибактериальную активность соединений определяли в отношении представителя условно-патогенной флоры: коллекционного штамма Escherichia coli (K-12 MKD910). Бактерии были выращены на среде LB [Bowdish D.M.E., Davidson D.J., Hancock R.E.W. A revaluation of the role of host defence peptides in mammalian immunity // Curr. Protein Pept. Sci. 2005. V.6. P. 35-51] (%): триптон - 1.0; дрожжевой экстракт - 0.5; NaCl - 0.5; рН 8.5. Агаризованная среда LBA включает дополнительно 2% агара. В среду добавляли стерильную глюкозу из расчета 1 мл среды: 25 мкл глюкозы. В чашку с ферментами (свободный - 1 мг/мл, иммобилизованный - 75 мг/мл) и глюкозой добавляли культуру. Далее инкубировали в термостате при 37°С в течение суток. Контроль за ростом культуры осуществляли, определяя изменение оптической плотности (ОП600) культуры. Прирост биомассы определяли нефелометрически на спектрофотоколориметре при длине волны 600 нм, разводя при необходимости культуральную жидкость таким образом, чтобы оптическая плотность составляла 0.1. За единицу биомассы принимали поглощение в 1 см кювете, равное единице. Количество биомассы выражали в единицах оптической плотности.
Статистическую обработку полученных результатов проводили при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
В ходе выполнения эксперимента по определению содержания белка было выявлено, что наибольшее количество фермента (в мг на г носителя) в препаратах фицина, иммобилизованного на матрице низкомолекулярного хитозана, наблюдается при проведении процесса в фосфатном буфере с рН 7.8 (фиг. 1).
Высокую общую активность (в ед на мл раствора) показали препараты фицина, приготовленные с помощью боратного буфера с рН 8.0 с 0.1 М KCl в составе (фиг. 2).
Максимальная удельная активность (в ед на мг белка) гетерогенного биокатализатора на основе фицина, сорбированного на матрице хитозана, регистрируется при использовании боратного буфера с 0.1 М KCl в составе с рН 8.0-8.5 (фиг. 3).
Таким образом, по соотношению таких параметров как содержание белка, общая и удельная активности биокатализатора, наиболее перспективным буфером для иммобилизации фицина на низкомолекулярном хитозане является боратный буфер с 0.1 М KCl в составе с рН 8.0.
Одним из главных требований к иммобилизованным ферментам является их устойчивость по отношению к различным денатурирующим агентам (температура, рН, действие микроорганизмов и т.д.) и времени их воздействия на катализатор. Анализ каталитической активности нативного энзима и гетерогенного ферментного препарата показал, что растворимый фицин инактивируется на 30% после 4 часов инкубации и сохраняет не более 50% от исходной активности после двух суток инкубации. Сорбированный на матрице низкомолекулярного 50-190 кДа хитозана фицин высоко активен даже после двух суток инкубации - сохраняет не менее 46% от исходной каталитической способности (фиг. 4).
Десорбция фицина из фазы сорбента в 50 мМ трис-HCl буфере с рН 7.5 после 48 часов инкубации не превышала 60%. При помещении препарата в физиологический раствор 40%-ая десорбция была детектирована через 3 ч инкубации, после инкубации в течение 48 часов десорбция составила 80% (фиг. 5).
Таким образом, иммобилизация фицина на низкомолекулярном хитозане 50-190 кДа препятствует его быстрой инактивации и увеличивает время полужизни фермента.
По количеству биомассы Escherichia coli (K-12 MKD910) при различных условиях культивирования мы определяли антибактериальную активность низкомолекулярного хитозана 50-190 кДа и фицина, иммобилизованного на низкомолекулярном хитозане 50-190 кДа, в сравнении с антибактериальной активностью других типов хитозана и иммобилизованного на них фицина (фиг. 6). Установлено, что антибактериальная активность низкомолекулярного хитозана 50-190 кДа примерно в 2 раза выше, чем у среднемолекулярного 200 кДа и высокомолекулярного 350 кДа хитозанов. Антибактериальная активность фицина, иммобилизованного на низкомолекулярном хитозане 50-190 кДа, соответственно в 2 и 2.5 раза выше, чем у фицина, иммобилизованного на среднемолекулярном 200 кДа и высокомолекулярном 350 кДа хитозанах.
Нами разработана методика получения ранозаживляющего и регенерирующего гетерогенного препарата медицинского и фармацевтического назначения на основе фицина и низкомолекулярного хитозана 50-190 кДа, который обладает выраженным антимикробным и адсорбирующим действием по отношению к бактериальным культурам, стабилен при хранении и использовании, что характеризует его как эффективное средство борьбы с гнойными осложнениями ран, вызванными микроорганизмами.