Способ хроматографического выделения и очистки иммуноглобулинов
METHOD FOR CHROMATOGRAPHIC EXTRACTION AND PURIFICATION OF IMMUNOGLOBULINS

Изобретение относится к области выделения и очистки белков из плазмы крови с использованием жидкостной хроматографии и может быть использовано для получения высокоочищенных иммуноглобулинов и комплексных препаратов на их основе.
Общепринятым способом фракционирования белков плазмы крови человека является метод Кона, основанный на осаждении фракций белков растворами, содержащими этанол при низких температурах. В этих условиях белки сохраняют свои нативные свойства. В результате фракционирования по Кону получают осадок А, а из него осадки Б и В, содержащие иммуноглобулины. Источником всех трех иммуноглобулинов является осадок А, в осадке В преимущественно находится иммуноглобулин G, иммуноглобулины А и М в основном содержатся в осадке Б, который чаще всего и используют в качестве промышленного источника иммуноглобулинов А и М.
Однако, традиционный метод фракционирования белков плазмы крови по Кону не обеспечивает современных требований по вирусной безопасности и степени очистки. В современных технологиях необходимыми стадиями являются стадии вирусной инактивации и хроматографической очистки.
Одним из востребованных коммерческих препаратов является комплексный иммуноглобулиновый препарат, в котором иммуноглобулины представлены в соотношении: IgG (50-70%) IgA (15-25%), IgM (15-25%). В процессе его получения очищенная фракция иммуноглобулинов А и М смешивается с очищенным иммуноглобулином G, при этом в смесевой фракции иммуноглобулинов желательно сохранение этого соотношения.
В этой связи для выделения иммуноглобулинов используют сочетание нескольких видов хроматографической очистки.
Известен способ, согласно которому осадок по Кону Б обрабатывают 2,5%-ной каприловой кислотой. Затем проводят хроматографию на катионообменнике, полученный элюат концентрируют и центрифугируют. Супернатант подвергают гель-хроматографии на колонке с Sephacryl S400 HR. В результате получают препарат с содержанием IgM 85%, IgG - 5% и IgA - 9%. (US 5190752, 1993).
В данном способе выход IgM из плазмы не превышает 30%, а содержание IgA является недостаточным для составления композиции комплексного препарата.
Известен способ выделения иммуноглобулинов из осадка по Кону А, который включает удаление контаминантов белка путем контакта раствора плазмы крови или фракции плазмы, обогащенной иммуноглобулинами с каприловой кислотой, где концентрация каприловой кислоты составляет от 0,5 до 1,5% об. от раствора плазмы крови или фракции плазмы, обогащенной иммуноглобулинами, и последующую хроматографию на анионите в кипящем слое. Способ обеспечивает получение концентрата человеческих поливалентных иммуноглобулинов с выходом больше, чем 4,5 г иммуноглобулинов на литр плазмы крови (US 9718856, 2017), однако выход и содержание иммуноглобулинов А и М очень низкое, что не позволяет приготовить комплексный препарат. Кроме того, указанный выше способ включает стадию экстракции октановой кислотой, что усложняет технологическую схему процесса.
Известен способ получения фракции, содержащей иммуноглобулины всех трех классов из осадка А по Кону. Способ заключается в том, что после спиртового фракционирование плазмы при низких температурах, сырой осадок фракции II+III суспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида в весовом соотношении 1:10 и обрабатывают аэросилом А-380, балластный осадок удаляют центрифугированием, затем проводят вирусную инактивацию каприлатом и ультрафильтрацию (RU 2158136, 2000).
Способ позволяет получить хорошую по составу композицию иммуноглобулинов М, А и G. Недостатком способа является невысокий выход и недостаточная вирусная безопасность. Обработка аэросилом при высоких температурах может приводить к падению активности целевых белков в связи с частичной денатурацией последних, а отсутствие стадии хроматографии приводит к высокому содержанию примесных белков в целевом продукте.
Известен способ получения иммуноглобулинов М и А из осадка Б по Кону. Способ включает растворение осадка Б в ацетатном буфере, проведение вирусной инактивациии, хроматографическую очистку на анионите. Для проведения вирусной инактивации к раствору белка добавляют октановую кислоту и фосфат кальция и центрифугируют. Затем проводят ультрафильтрацию и хроматографическую очистку с использованием сорбента ДЕАЕ сефадекса А50. Проводят второй акт вирусной инактивации, фильтруя полученный раствор. Способ обеспечивает требования вирусной безопасности. В результате получают иммуноглобулины А и М с выходом 30% от изначального содержания в плазме, содержанием примесных белков не более 20%, содержанием высокомолекулярный примесей не более 10% (US 5075425, 1991).
Недостатком известного решения является использование осадка Б в качестве сырья, поскольку это требует дополнительной стадии осаждения, что приводит к снижению выхода и увеличению времени процесса. Иммуноглобулин G для комплексного препарата необходимо получать по отдельной схеме из осадка А или В. Кроме того, степень очистки от высокомолекулярных примесей и примесных белков не превышает 10% и 20%, соответственно.
Наиболее близким по технической сущности является способ хроматографического выделения и очистки иммуноглобулина, включающий растворение в буферном растворе белковой фракции плазмы крови, в качестве которой используют осадок А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону. Согласно способу, производят предварительную очистку полученного раствора в двух последовательно соединенных колонках, заполненных гидрофобным сорбентом и анионитом, соответственно, с последующим пропусканием через упомянутые две колонки буферного раствора. После сбора предварительно очищенной жидкой фракции, содержащей иммуноглобулин, ее направляют на вирусную сольвент-детергентную инактивацию, а затем на хроматографическую очистку, осуществляемую в системе из трех последовательно соединенных колонок, заполненных анионитом, гидрофобным сорбентом и катионитом, соответственно. Проводят элюирование иммуноглобулина с колонки, заполненной катионитом, а колонки с анионитом и гидрофобным сорбентом направляют на регенерацию. Известный способ обеспечивает возможность выделения иммуноглобулина из необогащенного сырья - осадка А по Кону, достаточный высокий выход и чистоту целевого продукта (RU 2467783, 2012).
К недостаткам известного технического решения можно отнести следующие моменты. Основной задачей этой технологии является получение высокоочищенного вирус-безопасного иммуноглобулина G, а другие иммуноглобулины А и М рассматриваются как отходы технологического процесса и даже не подвергаются сольвент-детергентной обработке. Хотя в этой технологии заложены возможности комплексной переработки всех иммуноглобулинов G, А и М.
Задачей настоящего изобретения является разработка простого способа переработки осадка А по Кону, обеспечивающего получение высокоочищенных и вирус-безопасных иммуноглобулинов G, А и М по единой технологической схеме, в результате чего появится возможность создания комплексных иммуноглобулиновых препаратов.
Поставленная задача решается описываемым способом получения иммуноглобулинов М и А, который предусматривает растворение в натрий-ацетатном буферном растворе осадка А спиртового фракционирования плазмы крови по Кону, который содержит смесь иммуноглобулинов А, М и G, вирусную сольвент-детергентную инактивацию раствора, пропускание раствора через систему из трех последовательно соединенных между собой колонок, уравновешенных натрий-ацетатным буферным раствором, при этом первая из колонок заполнена частицами гидрофобного полимерного сорбента, вторая частицами анионообменного полимерного сорбента, третья частицами сульфокатионита, промывку упомянутых колонок натрий-ацетатным буферным раствором, отсоединение от системы первой колонки, заполненной гидрофобным сорбентом, с дальнейшим направлением ее на регенерацию, отсоединение от системы третьей колонки, заполненной сульфокатионитом, с дальнейшим направлением ее на выделение иммуноглобулина G, промывку второй колонки, заполненной анионообменным сорбентом, элюирование промытого анионообменного сорбента в два этапа, на первом элюируют примеси балластных белковых и полимерных соединений, а на втором элюируют иммуноглобулины А и М натрий-ацетатным буферным раствором с рН 5,6-6,0, содержащим хлористый натрий, полученную фракцию, содержащую иммуноглобулины А и М, подвергают ультрафильтрации и дополнительной очистке на колонке с анионообменным сорбентом при ее ступенчатом элюировании натрий-ацетатным или натрий-фосфатным буферным раствором с рН 5,65-7,4, содержащем хлористый натрий в повышающемся количестве от первой ступени элюирования ко второй ступени, находящемся в интервале от 50 до 300 мМ.
Для повышения степени очистки иммуноглобулина G элюат с сульфокатионита направляют на дополнительную колонку с анионообменным сорбентом и затем возвращают на колонку с сульфокатионитом для концентрирования продукта.
Предпочтительно, в системе из трех последовательно соединенных колонок в качестве гидрофобного сорбента используют пористый стиролдивинилбензол с размером пор менее 10 нм, в качестве анионообменного сорбента используют полимерный метакрилатный сорбент с диэтиламиноэтильными группами, в качестве сульфокатионита используют полимерный сорбент на основе метакрилата.
Вирусную сольвент-детергентную инактивацию, преимущественно, осуществляют в растворе, содержащем твин-80 и трибутилфосфат.
Предпочтительно, на стадии дополнительной очистки иммуноглобулинов А и М в качестве анионообменного сорбента используют сорбент на основе агарозы или метакрилата.
Предпочтительно, на стадии дополнительной очистки иммуноглобулина G в качестве анионообменного сорбента используют сорбент на основе агарозы.
При проведении процесса в объеме вышеуказанной совокупности признаков обеспечивается одновременное получение высокочистых иммуноглобулинов А и М в едином технологическом цикле из осадка А по Кону с возможностью выделения иммуноглобулина G из того же сырья любым известным способом. Кроме того, при введении дополнительной стадии очистки иммуноглобулина G на анионообменной сорбенте достигается степень очистки более 99%.
Ниже приведены конкретные примеры осуществления изобретения.
Пример 1.
10 г осадка А растворяют в 300 мл буфера А (0,02 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,65) при перемешивании в течение ночи при температуре +5°С, затем в течение 4 ч при комнатной температуре. К полученному раствору добавляют 150 мл 1% раствора полисорбата (твин-80) и трибутилфосфата. 450 мл полученного раствора инкубируют 6 ч при перемешивании при комнатной температуре.
Подготовленный таким образом раствор иммуноглобулинов пропускают последовательно через соединенные между собой три колонны. Первая - диаметром 2,5 и длиной 3,0 см заполнена гидрофобным сорбентом Диасфер-СТ-75 на основе стиролдивинилбензола с размером частиц 100-150 мкм, вторая колонна диаметром 2,5 и длиной 3,0 см заполнена ДЕАЕ-полимерным сорбентом Диасфер-АК-ДЕАЕ на основе метакрилата с диэтиламиноэтильными группами с размером частиц 100-250 мкм, третья колонна заполнена сульфокатионитом Диасфер-AK-SP на основе метакрилата с размером частиц 40-120 мкм, колонка имеет диаметр 2,5 см, длину 10 см. Все колонны предварительно уравновешены буфером А. После окончания процесса нанесения 450 мл инактивированного раствора осуществляют промывку. Для промывки через все колонки пропускают 100 мл буфера А. Затем колонку с гидрофобным сорбентом отсоединяют и подвергают регенерации. Колонку с катионитом отсоединяют и далее используют для выделения сорбированного иммуноглобулина G.
Колонку с анионитом подвергают промывке в три этапа: на первом этапе пропускают раствор, содержащий 2% твин-80 (100 мл), на втором - раствор, содержащий 1% твин-80 и 20% этанола (150 мл), а затем колонку промывают 200 мл буфера А.
Элюирование иммуноглобулинов М и А осуществляют 50 мМ натрий-ацетатным буфером с рН 5,65 содержащим хлористый натрий (буфер Б).
Элюирование проводят в 2 этапа - вначале балластные белки и полимеры элюируют 100 мл натрий-ацетатного буфера, содержащего 100 мМ хлористого натрия (100 мл), а фракцию, содержащую иммуноглобулины М и А элюируют 150 мл буфера, содержащего 300 мМ хлористого натрия.
Пропускание растворов при элюировании и сорбции осуществляют со скоростью 3 мл/мин, процессы отмывки и регенерации ведут со скоростью 7 мл/мин.
Полученную фракцию концентрируют до содержания 20 г/л белка с помощью ультрафильтрации против 50 мМ натрий ацетатного буфера. Полученный раствор наносят на колонну с анионообменным сорбентом Relisorb-DA-400, 50-150 мкм на основе полиметилметакрилата (размер 25×100 мм). После нанесения пропускают буфер А в количестве 100 мл, а затем проводят ступенчатое элюирование буферами С (50 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 5,65, содержащим 100 мМ хлористого натрия) и D (50 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 5,65, содержащим 200 мМ хлористого натрия).
В результате хроматографии получают фракцию (элюат D), содержащую 0,20 и 0,12 г иммуноглобулинов А и М соответственно. Выход 45% по IgM, 40% по IgA, что на 45 и 39% выше, чем в известных способах. Количество полимерных примесей не более 5%, содержание сторонних белков плазмы крови не превышает 10%.
Для выделения иммуноглобулина G из ранее отсоединенной колонки с сульфокатионитом ее, также как колонку с анионитом, подвергают промывке в три этапа: на первом этапе пропускают раствор, содержащий 2% твин-80 (100 мл), на втором - раствор, содержащий 1% твин-80 и 20% этанола (150 мл), а затем колонку промывают 200 мл буфера А. Фракцию иммуноглобулина G элюируют 50 мМ натрий-ацетатным буфером, содержащим 300 мМ NaCl, рН 6,0 с выходом 75% и чистотой 97%.
Пример 2.
Выделение и очистку иммуноглобулинов проводят в условиях примера 1, но дополнительную очистку иммуноглобулинов М и А осуществляют на колонке 2,5×10 см с анионообменным сорбентом DEAE Sepharose с размером частиц 65-155 мкм. При нанесении пробу растворяют в 20 мМ натрий-фосфатном буфере и элюируют буфером Е, содержащим 100 мМ хлорида натрия. Данные условия позволяют сорбировать большинство полимеров и сторонних белков плазмы крови на сорбенте, а элюировать иммуноглобулины А и М.
Выход при таком способе очистки составляет 0,17 и 0,11 г или 40 и 35%, что больше на 33 и 17%, чем в известных способах. Содержание примесей не превышает 5%, а сторонних белков плазмы крови 8%.
Пример 3.
Выделение и очистку иммуноглобулинов проводят в условиях примера 2, но используют колонну с анионообменным сорбентом Relisorb-DA-400, 50-150 мкм на основе полиметилметакрилата (размер 25×100 мм), как и в первом примере. В данном варианте происходит связывание полимеров и сторонних белков плазмы крови, а в проскоке находятся иммуноглобулины.
Выход составляет 35% для обоих белков, что на 17% больше, чем в известных способах. Содержание полимеров не превышает 3%, а сторонних белков плазмы крови 10%.
Пример 4.
Выделение и очистку иммуноглобулинов проводят в условиях примера 1, но элюирование осуществляют 20 мМ натрий-ацетатным буферным раствором с рН - 6,8, содержащим 100 мМ хлорида натрия.
Выход составил 35 и 30% для иммуноглобулинов А и М соответственно, что на 17% больше, чем в известных способах. Содержание полимеров не превышает 5%, а сторонних белков плазмы крови 10%.
Пример 5
Выделение и очистку иммуноглобулинов проводят в условиях примера 1, но элюат, содержащий иммуноглобулин G с колонки с сульфокатионитом разбавляют 40 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера, рН 6,8 и добавляют 40-50 мл воды, затем 0,5 М NaOH доводят рН пробы до 6,8. Хроматографическую колонну (20×100 мм), объемом 10 мл, с сорбентом WorkBeads DEAE 40 на основе агарозы с диэтиламиноэтильными группами и размером частиц 40-50 мкм уравновешивают 50 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 6,8.
Нанесение пробы проводили со скоростью потока 1,5 мл/мин в течение 1-1,5 часов. Вслед за пробой пропускали еще 30 мл 50 мМ натрий-фосфатного буфера рН 6,8. Собирали проскоковую фракцию, в которую добавляли 0,3 М уксусную кислоту до рН 5,6.
Концентрирование целевого вещества проводили на третьей колонне с катионитом из примера 1. Колонна уравновешена 20 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 5,65. Буфер элюирования 0,35 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,6. Скорость потока - 2 мл/мин. Целевая фракция составила 10-13 мл.
Выход на дополнительной стадии - 90%. Чистота - 99,3%.
Пример 6
Выделение и очистку иммуноглобулинов проводят в условиях примера 1, но элюат, содержащий иммуноглобулин G с колонки с сульфокатионитом разбавляют 40 мл 20 мМ трисового буфера рН 6,8 и добавляют 40-50 мл воды, затем 0,5 М NaOH доводят рН пробы до 6,8. Хроматографическую колонну (20×100 мм), объемом 10 мл, с сорбентом WorkBeads DEAE 40 на основе агарозы с диэтиламиноэтильными группами и размером частиц 40-50 мкм уравновешивают 20 мМ трисовым буфером, рН 6,8.
Нанесение пробы проводили со скоростью потока 1,5 мл/мин в течение 1-1,5 часов. Вслед за пробой пропускали еще 30 мл 50 мМ трисового буфера, рН 6,8. Собирали проскоковую фракцию, в которую добавляли 0,3 М уксусную кислоту до рН 5,6.
Концентрирование целевого вещества проводили на третьей колонне с катионитом из примера 1. Колонна уравновешена 20 мМ натрий-ацетатным буфером, рН 5,65. Буфер элюирования 0,35 М натрий-ацетатный буфер, рН 5,6. Скорость потока - 2 мл/мин. Целевая фракция составила 10-13 мл.
Выход на стадии - 91%. Степень очистки - 99,5%.
Как видно из представленных примеров реализации изобретения, в объеме заявленной совокупности признаков обеспечена простая технологическая схема переработки осадка А по Кону с возможностью получения всех трех видов высокоочищенных и вирус-безопасных иммуноглобулинов: смеси А и М с выходом от 30 до 45% в расчете на содержание в плазме крови, a G с выходом до 75% и чистотой 97%. Дополнительная стадия очистки иммуноглобулина G повышает степень очистки до 99,0-99,5%.
В этой технологии реализованы все возможности комплексной переработки иммуноглобулинов G, А и М из осадка А по Кону. Кроме того, комбинацией полученных продуктов можно создавать препараты, содержащие все три иммуноглобулина в требуемых соотношениях и с удовлетворительным выходом.
По сравнению с прототипом (RU 2467783), удается помимо иммуноглобулина G получить из того же количества сырья иммуноглобулины А и М, а введение дополнительной стадии очистки элюата с колонки с сульфокатионитом позволяет увеличить степень очистки иммуноглобулина G до 99,0-99,5%.