ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВВОДА И РЕГЕНЕРАЦИИ МЕРИСТЕМ ВИНОГРАДА В УСЛОВИЯ IN VITRO
NUTRIENT MEDIUM FOR INTRODUCING AND REGENERATING GRAPE MERISTEMS INTO IN VITRO CONDITIONS

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биотехнологии, и может быть использовано в питомниководстве при получении оздоровленного посадочного материала винограда при помощи методов клонального микроразмножения.
Известны питательные среды различного минерального состава, предназначенные для культивирования ягодных и плодовых растений in vitro (Шипунова А.А. Подбор минеральной основы питательных сред для клонального микроразмножения жимолости в производственных условиях / А.А. Шипунова, В.А. Высоцкий / Плодоводство и ягодоводство России: Сб. нуч. работ / ВСТИСП. - М., 2001. Т. VII. С. 158-163). При этом наиболее часто для введения и оздоровления плодовых и ягодных культур при помощи метода апикальных меристем в культуре in vitro исследователи используют пропись, разработанную Мурасиге и Скуга (МС) [Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol. 5., 95 - P. 473-497). Для эффективного применения минеральной основы (МС) оптимизируют состав среды, изменяя гормональный фон, а также вводя различные добавки в виде аминокислот, витаминов, полисахаридов (патент РФ №2063682), препаратов нового поколения (патент РФ №2265319). Значительно реже изменяют минеральный состав. При этом минеральный состав среды Мурасиге и Скуга (МС) для ввода меристем растений в культуру in vitro обладает рядом недостатков, так как разрабатывался для культивирования каллусов и каллусных клеток и учитывает, прежде всего, условия для их развития. Концентрация минеральных солей в данной среде 4,5 г/л, при этом для поглощения растворенных в ней элементов растению требуется преодолевать осмотическое давление порядка 2,5 атмосфер. В нашем случае это не растение, а предельно малый участок апикальной меристемы. Соотношение и концентрации макроэлементов в среде не учитывают потребности в них растений винограда, что в короткий отрезок времени при неравномерном их поглощении растением приводит к сдвигу рН и, как следствие, требует частых пересадок конгломератов растений на свежую питательную среду.
2
4
Наиболее близким к предлагаемому решению является питательная среда Ml, разработанная для ввода растений винограда в культуру in vitro П.Я. Галодригой и др. (Голодрига П.Я. Методические рекомендации по клональному микроразмножению винограда / П.Я. Голодрига и др. / Ялта: Издательская группа ВНИИ ВиПП «Магарач», 1986 - 56 с.). Минеральной основой, которой является среда (МС), к составу которой добавлено 170 мг/л NaHPO, остальные макро- и микроэлементы по прописи, витамины: мезоинозит 75 мг, парааминобензойная кислота 5 мг/л, тиамин 10 мг/л, пиридоксин 5 мг/л, никотиновая кислота 4 мг/л, аминокислоты: глутамин 50 мг/л, глицин 10 мг/л, 6-бензиладенин 1 мг/л, аденин сернокислый 80 мг/л, сахароза 30 г/л.
Недостатком данной среды для ввода является высокое осмотическое давление раствора из-за большой концентрации макроэлементов - 4,7 г/л, что при введении меристем предельно малых размеров (для винограда 0,1÷0,2 мм) негативно сказывается на их регенерации. Кроме того, высокое содержание аммиачной формы азота, хлора, несбалансированное содержания макроэлементов часто провоцирует рост каллусной ткани, преждевременный некроз и старение эксплантов.
Задачей, на решение которой направлено изобретение, является создание питательной среды для ввода меристем винограда в условия in vitro, способствующей повышению приживаемости и надежности регенерации меристем у различных сортов винограда, уменьшению расходования минеральных солей, снижению себестоимости технологии на этапе ввода и оздоровления в культуре in vitro.
Задача решается с помощью оптимизации концентраций и соотношения макросолей. Питательная среда для ввода и регенерации меристем винограда в условия in vitro содержит аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, кальций азотнокислый, кальций хлористый, магний сернокислый, натрий фосфорнокислый, железо сернокислое, этилендиаминотетраацетат натрия, борную кислоту, марганец сернокислый, цинк сернокислый, калий йодистый, натрий молибденовокислый, медь сернокислую, кобальт хлористый, миоинозит, тиамин, пиридоксин, 6-бензиламинопурин, сахарозу, агар, воду при следующем соотношении компонентов, мг/л: аммоний азотнокислый 350-450; калий азотнокислый 1000-1200; кальций азотнокислый 400-500; кальций хлористый 50-70; магний сернокислый 300-350; натрий фосфорнокислый 150-200; железо сернокислое 27,8-30,0; этилендиаминотетраацетат натрия 37,3-40,0; борная кислота 6,0-6,4; марганец сернокислый 22,0-22,6; цинк сернокислый 8,0-9,2; калий йодистый 0,40-0,80; натрий молибденовокислый 0,2-0,3; медь сернокислая 0,02-0,03; кобальт хлористый 0,02-0,03; миоинозит 50-100; тиамин 0,2-0,5; пиридоксин 0,2-0,5; 6-бензиламинопурин 0,2-0,5; сахароза 20000-30000; агар 5000-6000; вода остальное до 1,0 л.
2
4
2
3
2
2
2
Заявленное решение отличается от прототипа тем, что в 1,8-2 раза снижена концентрация солей в питательной среде, при этом изменено и сбалансировано соотношение этих солей с учетом потребностей виноградного растения. Так изменено соотношение азота и калия, содержание хлора уменьшено в 9 раз, изменено соотношение фосфора и магния до оптимальных величин. В качестве источника фосфора используется только NaHPO, что способствует повышению буферных свойств питательной среды, предотвращая снижение значений рН, которое происходит после стерилизации среды в автоклаве и культивирования пробирочных растений. Кроме того, в среде применяются два источника кальция CaCl и Ca(NO)⋅4HO, что положительно влияет на приживаемость и регенерацию меристем предельно малых размеров, при этом сниженная концентрация CaCl является дополнительным источником Са и Cl для растений винограда, а также помогает предотвратить повышение значений рН выше оптимальных значений. Эти отличия позволяют сделать вывод о соответствии заявленного решения критерию "новизна".
Заявленное решение обладает изобретательским уровнем, так как не является очевидным для специалистов питомниководов и биотехнологов, а является продуктом творческой деятельности автора изобретения.
Заявленное техническое решение соответствует и другому требуемому критерию изобретения - промышленному применению, что подтверждено экспериментальными данными, полученными при реализации способа.
На Фиг. 1 представлены сравнительные характеристики разработанной питательной среды и прототипа по соотношению макроэлементов относительно азота (А) и концентрации макроэлементов по действующему веществу (Б).
Предлагаемое снижение концентрации макросолей и оптимизация их соотношения пропорционально уменьшают высокое осмотическое давление в питательной среде и способствуют более сбалансированному поступлению питательных элементов в ткани меристем, что положительно сказывается на их развитии после высадки в условия in vitro.
Пример осуществления способа.
4
3
3
2
4
4
2
3
2
2
2
4
2
2
2
3
3
4
2
2
4
4
2
2
2
В питательную среду вносят следующие компоненты (концентрации в мг), макроэлементы: NHNO - 350-450; KNO - 1000-1200; NaHPO - 150-200; MgSO⋅7HO - 320-340, Ca(NO)⋅4HO - 400-500; CaCl 50-80; мезоэлементы: FeSO⋅7HO - 27,8-30,0; Na ЭДТА⋅2HO - 37,3-40,0; микроэлементы: HBO - 6,0-6,4; MnSO4⋅4H2O - 22,0-22,6; ZnSO⋅7HO - 8,0-9,2; KJ - 0,40-0,80; NaMoO - 0,2-0,3; CuSO⋅5HO - 0,02-0,03; CoCl⋅6HO - 0,02-0,03; витамины: миоинозит - 50-100; тиамин и пиридоксин, по 0,2-0,5 мг/л; 6-бензиламинопурин 0,2-0,5; сахароза - 20000-30000; агар - 5500-6500; остальное бидистиллированная вода до 1000,0.
В начале объем раствора доводят до 0,5 л, устанавливают pH 5,6-5,7 и добавляют 0,5 л воды с агаром, предварительно нагретой до кипения, для полного расплавления и растворения агара. Питательную среду разливают по сосудам и автоклавируют при давлении 0,7-1,0 атм (температура 119-121°C) в течение 20-25 мин. После остывания среды осуществляют высадку эксплантов.
4
3
Испытание разработанной прописи макроэлементов показало эффективность ее применения на большинстве сортов. При этом наибольший эффект получен на сортах Илья и Магия. Таким образом, установлено, что оптимизация концентраций и соотношения в питательной среде: NH и NO, общего N и K, K и Ca, P и Mg, и уменьшение содержания Cl, а также добавление оптимальной концентрации Na - способствует повышению адаптивности растений винограда к условиям культивирования in vitro до 40% (в зависимости от сорта).
4
3
Из приведенных данных в Табл. 1 видно, что кратное уменьшение стандартной прописи Мурасиге и Скуга для большинства сортов недостаточно. При снижении общей концентрации макросолей среды до 1/2 такие макроэлементы, как фосфор и магний, оказываются в питательной среде в недостаточном количестве для полноценного развития меристем. При этом все еще достаточно высокая концентрация аммиачной формы азота в нитрате аммония (NHHO) способствует развитию некрозов и каллусной ткани.
Испытание разработанной прописи макроэлементов на фоне прототипа (Табл. 2) показало эффективность ее применения на различных сортах винограда. В вариантах с предложенной средой была лучше приживаемость меристем, стабильно увеличивалось число хорошо развитых меристем, а также снижалось число отбракованных эксплантов из-за некроза или отсутствия развития. При этом наибольший эффект получен на сортах Илья и Магия, которые при использовании прототипа регенерировали слабо, проявляя сортовую специфичность к культивированию in vitro.
4
3
Таким образом, предложена новая рецептура макроэлементов для питательной среды на этапе ввода растений винограда в культуру in vitro с учетом потребностей виноградного растения. Оптимизированы концентрации и соотношения в питательной среде: NH и NO, общего N и K, K и Ca, P и Mg, уменьшено содержание Cl в 9 раз, все это способствует повышению адаптивности растений винограда к условиям культивирования in vitro в среднем по сортам на 20-25%.
Использование предложенной питательной среды для ввода и регенерации меристем винограда в условия in vitro обеспечивает по сравнению с существующей следующие преимущества:
1. Повышается приживаемость и качество меристем при вводе в культуру in vitro.
2. Снижается проявление сортовой специфичности к культуре in vitro, предложенная среда дает стабильные результаты на большинстве сортов.
3. Снижается количество отбракованных меристем из-за некроза и отсутствия развития.
4. Снижается себестоимость технологии за счет уменьшения концентраций применяемых минеральных солей в питательной среде в 1,8-2 раза.