Особенности дегрануляции и апоптоз тучных клеток разных органов у крыс

ОСОБЕННОСТИ ДЕГРАНУЛЯЦИИ И АПОПТОЗ ТУЧНЫХ КЛЕТОК РАЗНЫХ ОРГАНОВ У КРЫС

М.Э. ДЗОДЗИКОВА

Центральная научно-исследовательская лаборатория Северо-Осетинской государственной медицинской академии. РСО-Алания, Владикавказ, 362040, ул. Пушкинская д. 40

Методом электронной микроскопии изучены особенности дегрануляции соединительио-ткаиных тучных (ТК) клеток разных органов у крыс. Исследование проведено на 60 белых беспородных крысах обоего пола, массой 180-240 г. Объектом исследования служили костный мозг, миокард, тимус, кожа, брыжейка, молочная железа и язык интактных животных. Зафиксировано 6 видов дегрануляции ТК. Особенности дегрануляции ТК зависят от их органной дислокации и удаленности от кровеносных сосудов. Рассмотрены некоторые ультра-структурные аспекты апоптозаТК.

Ключевые слова: тучные клетки, костный мозг, миокард, тимус, кожа, брыжейм, молочная железа, язык, апоптоз.

Тучные клетки (ТК) впервые описал Р.ЕЬгНсЬ в 1877 году. Это особая функционально лабильная группа клеток, располагающаяся во всех органах и тканях без исключения, влияющая на микроциркуляцию, трофику тканей и функцию клеток микрорайона. В настоящее время четко установленным является наличие двух сублиний тучных клеток: 1) ТК слизистой оболочки кишечника (атипичных, интестинальных) и 2) типичных ТК, которые еще называют "соединительно-тканными тучными клетками" [8]. ТК рассматриваются как регуляторы тканевого гомеостаза малого радиуса действия [5,8]. Эти функции реализуются благодаря продукции ими ряда биологически активных веществ, которые можно подразделить на две группы: биологически активные вещества, постоянно присутствующие в клетке и образующиеся вновь в период сенсибилизации [1,6,11]. К первой группе относят гепарин, гистамин, эозинофильный хемотаксический фактор анафилаксии. Ко второй группе веществ, которые накапливаются в период сенсибилизации и выделяются при взаимодействии ТК с антигеном, относятся: медленно реагирующая субстанция анафилаксии, простагландины, фактор активирующий тромбоциты, нейтрофильный хемотаксический фактор анафилаксии [7]. Из ТК при дегрануляции выделяются также лизосомальные протеолитические ферменты, стимулирующие коллаге-назную активность, способствующие образованию и разрушению брадикинина [3,9]. Если эти вещества выделяются локально, развивается аллергическое воспаление. При системном характере дегрануляции ТК и базофильных гранулоцитов крови развивается анафилактический шок.

Однако нет еще единого мнения по поводу типов экзоцитоза ТК и репарации или гибели их в постдегрануляционном периоде [1,4]. Поэтому представляет несомненный интерес исследование морфологии процесса дегрануляции и последующих изменений в ТК.

Целью настоящего исследования явилось изучение морфологических особенностей дегрануляции соединительно-тканных ТК разных органов у интактных животных на ультраструктурном уровне и некоторых аспектов апоптоза ТК.

Материал и методы.

Исследование проведено на 60 белых беспородных крысах-самцах, массой 180-240 г. Животных декапитировали в одно и то же время суток. Объектом морфологических исследований служили костный мозг, миокард, тимус, кожа, брыжейка и язык интактных животных.

Материал фиксировали в течение 2 часов в 2,5% растворе глутаральдегида на 0,1 М фосфатном буфере Милонига (рН=7,2) с дофиксацией в 1% растворе четырехокиси ось-мия, обезвоживали в спиртах и ацетоне и заключали в эпоксидные смолы Эпон-812 и Аралдит М. Полутонкие (1мкм) и ультратонкие (40-60нм) срезы получали на ультрамикротоме УМТГ1-5. Полутонкие срезы окрашивали 1% раствором метиленовой сини с 0,5% раствором буры по Линну. Ультратонкие срезы контрастировали 0,2% раствором уранилацетата и цитратом свинца по Рейнольдсу. Изучение и фотосъемка препаратов

осуществлялась в электронном микроскопе Тесла-ВБ 500. Вычисление площади ТК производилось на полутонких срезах, окрашенных 1% раствором метиленовой сини с бурой, с использованием окулярной измерительной сетки Г. Г. Автандилова, в модификации К.Д. Салбиева (1984), при иммерсионном увеличении в 400 раз на светооптическом микроскопе МИКМЕД-1.

Результаты исследования и их обсуждение.

Результаты проведенного исследования показали, ультраструктура ТК имеет типичное, с небольшими отклонениями, для представителей этой клеточной популяции строение [4]. Хроматин ядра (рис. 1) у зрелых функционально активных клеток более конден-

Рис. 1. Фрагмент тучной клетки тимуса. Слияние перигранулярных мембран нескольких гранул, их просветление, формирование лабиринта для осуществлени экзоцитоза в направлении расположенного рядом фагоцита

Рис. 2. Фрагмент дегранулирующей тучной клетки языка. Просветление гранулы, образование выпячивания в направлении миофибрилл с последующим диффузным экзоцитозом содержимого гранулы. (Ув.20000).

сирован на периферии. Органеллы общего значения, такие как митохондрии, комплекс Гольджи, эндоплазматическая сеть, имеют обычное строение, однако чем больше гранул содержит клетка, тем меньше в ней идентифицируется органоидов [6,11], но это касается зрелых ТК. Большая часть цитоплазмы зрелых ТК занята гранулами разной величины от 0,1 - 0,3 мкм2 до 0,9-1,2 мкм2. Гранулы, в зависимости от степени зрелости, электронноплотные или более светлые и гомогенные, окружены мембраной. Плазмолемма образует небольшие пальцевидные выросты, часто контактирующие с близлежащими клетками. В процессе дегрануляции вначале вытесняются более крупные и зрелые гранулы, лежащие на периферии, затем мелкие, малодифференцированные, расположенные в глубине клетки. Диаметр наиболее крупных гранул ТК может колебаться от 1,2 до 1,4 мкм2. Только в активно дегранулирующих клетках наблюдается более выраженный полиморфизм секреторных гранул. В них встречаются гранулы диаметром 0,9 -0,5 мкм2 и даже 0,3 - 0,1 мкм2. Процессу дегрануляции ТК предшествуют ультраструктурные перестройки внутри клетки и особенности их зависят от вида экскреции и органной дислокаций ТК [4].

Наблюдаемые случаи дегрануляции происходили диффузно (1-е формированием лабиринтов, 2- видимый экзоцитоз единичных гранул, 3-невидимый экзоцитоз, piecemeal degranulation, или микровезикулярный транспорт), цельногранулярно (4-единично, 5-множественно, 6-тотально или анафилактическая дегрануляция).

Диффузная дегрануляция. В первом случае происходило слияние перигранулярных мембран нескольких гранул, формирование своего рода лабиринтов, ориентированных к периферии клетки. Гранулы, при этом, разбухали, светлели, сливаясь теряли свои границы внутри лабиринта, клетка в этом месте слегка выпячивалась. Следующим этапом был диффузный экзоцитоз в межклеточное пространство (рис.1). Во втором происходил диффузный выход содержимого одиночных гранул, расположенных по периферии ТК, которому предшествовало просветление гранулы, слияние её мембраны с плазмолем-мой, с последующим выпячиванием последней в межклеточное пространство и экзоци-тозом её содержимого, без нарушения целостности клетки (рис.2). О наличии третьего (невидимого, микровезикулярного) способа дегрануляции отчетливо свидетельствует явное уменьшение площади ТК при сохранении среднего их количества, при некоторых воздействиях [6].

Цельногранулярный экзоцитоз. При четвертом способе целые гранулы продвигались к периферии клетки, вокруг них. При этом образовывалось разреженное пространство,

ограниченное мембраной \ еще одна мембрана, расположенная поперек этого разреженного цистерноподобного пространства как бы направляла продвижение гранулы к наружной границе ТК. Затем происходил разрыв поверхности ТК, и гранула целиком выпадала в межклеточное пространство, благодаря поперечной мембране, которая, сливаясь с наружной поверхностью клетки, видимо, восстанавливала ее целостность. Попавшие таким образом в межклеточное пространство гранулы разбухают и растворяются или фагоцитируются клетками микроокружения. При активной множественной цельногранулярной (пятый) и тотальной, анафилактической (шестой вид) дегрануляции в ТК образуются пустоты, количество их прямо пропорционально активности клетки.

Выявлено, что для ТК разных органов характерны как разная среднестатистическая площадь, так и разные виды дегрануляции, причем прямой зависимости первого от второго не наблюдается. Так, самыми мелкими из ТК изучаемых органов являются ТК миокарда и костного мозга, далее, по возрастающей, идут ТК тимуса, языка и кожи, и самые крупные - ТК брыжейки (табл.1). При этом цельногранулярный экзоцитоз наиболее характерен для брыжейки, диффузный - для миокарда, тимуса и костного мозга, а в языке, молочной железе и коже с равной частотой встречаются все виды дегрануляции. Диффузный экзоцитоз, по нашему мнению, является наиболее привычным ритмом функционирования для ТК всех органов, но именно его труднее всего визуализировать. В этом случае мы опирались на данные изменения площади ТК, как на показатель, предшество-

вавшей функциональной активности (по диффузному типу), при сохранении их количества, что неоднократно наблюдалось нами при различных воздействиях на систему ТК [б].

Таблица 1

Площадь тучных клеток некоторых органов интактных крыс

Органы

брыжейка костн. мозг тимус миокард язык кожа мол. жел.

120,4±8,6 57,4±4,1 65,8±4,7 54,6±3,9 75,6±5,4 72,8±5,2 60,4±1,9

Довольно часто тотальная дегрануляция в пиках активности, преимущественно за счет деструкции внешней клеточной мембраны на значительном протяжении и полного выхода гранул и содержимого клеток в окружающую среду, может привести к естественному генетически запрограммированному физиологическому концу ТК [4,6]. Хотя ряд авторов придерживаются той точки зрения, что ни анафилактическая, ни постепенная дегрануляция не приводят к гибели ТК [1,3]. Деструктивным изменениям в ТК, как правило, предшествует нарастание функциональной активности ТК, увеличение количества пустот, учащение случаев тотальной дегрануляции, тогда вокруг такой ТК мы наблюдаем обилие гранул на разных этапах растворения в межклеточном пространстве. Случаи тотальной (анафилактической) дегрануляции чаще наблюдались в брыжеечной популяции ТК и, как правило, это клетки, расположенные вдали от микрососудов. Однако степень функциональной активности и учащение тотальных дегрануляций не могут быть главными причинами случаев гибели ТК, скорее всего возраст ТК, в сочетании с другими эндо- и экзогенными факторами запускают или ускоряют процессы апоптоза.

Проблемы жизни, а точнее жизнедеятельности клетки, всегда были в центре внимания биологов, тогда как смерть клетки не всегда воспринималась как одна из важнейших проблем биологии. Некроз клетки как синоним слова смерть клетки рассматривался как следствие повреждения, не совместимого с жизнью клетки. На этом фоне большое внимание привлекла концепция Хейфлика о генетически запрограммированной продолжительности жизни клетки [8]. Концепция апоптоза как генетически запрограммированного и высокорегулируемого процесса [10] была сразу же принята биологами, вероятно потому, что заранее ими было осознано существование «ниши» в судьбе клетки, которая очень удачно оказалась заполненной апоптозом. Проявления апоптоза (эмбриональные, молекулярные, клеточные, тканевые и организменные) изучаются особенно активно последние 10 лет в культуре клеток, в эксперименте, в норме и в патологии. Роль апоптоза в онтогенезе не исчерпывается только удалением ненужных организму тканей в эмбриогенезе. Так, например, исследование митохондрий в клетках молодых и старых мышей показало, что их старение связано с дисфункцией митохондрий, прежде всего, в нервной и мышечной ткани, а также в лимфоцитах, и что дисфункция митохондрий приводит к апоптозу клеток. И именно с апоптозом лимфоцитов, вызванных дистрофией митохондрий, авторы связывают известное возрастное снижение иммунитета, или иммуностарение [8].

Поддержание тканевого гомеостаза в интактном организме обеспечивается помимо других факторов, локальной и дистанционной работой ТК, как правило, в щадящем режиме. В нашей работе обращал на себя внимание тот факт, что часто ТК интактных крыс, не имевшие видимых причин для гибели, вначале становились функционально более активными, демонстрируя частую дегрануляцию, а опустошившись, не всегда восстанавливались и разрушались. При этом на ультраструкгурном уровне обращало на себя внимание нарастание деструктивных изменений, а также изменение состояния ядра, гранул, митохондрий и мембраны ТК. Так, в таких ТК хроматин располагался внутри ядра в виде темных овальных ядрышко подобных или глыбчатых скоплений, а иногда это бывала темно-серая масса явно деструктивного вида, что свидетельствует о признаках апоптоза в этих клетках [8]. В ТК с обилием пустот обычно не наблюдалось процес-

сов восстановления эндоплазматической сети или комплекса Гольджи и налицо бывала малочисленность явно увеличенных в размерах митохондрий, с деформированными и часто разрушенными кристами. В таких ТК и гранулы более светлые, мелкие (0,1 - 0,5 мкм2) и малодифференцированные, что также может свидетельствовать о процессе апоптоза. При этом поблизости от такой ТК, как правило, фиксируется фагоцит или макрофаг. При некоторых воздействиях явления эти учащаются [4,6]. Замечена также прямая зависимость между частотой цельно гранулярной дегрануляционной активностью ТК и их апоптозом. Такие необратимые изменения происходят прямо пропорционально удаленности ТК от кровеносных сосудов, чаще в ТК популяции брыжейки, реже языка и кожи, в костном мозге и миокарде такие явления единичны.

СПИД и нейродегенеративные болезни типа болезней Альцгеймера и Паркинсона, а также ряд других заболеваний, связанных с дегенеративными процессами в клетках разного гистогенеза, развиваются на основе избыточно прогрессирующего апоптоза в клетках. Апоптотическая гибель клеток выявляется также при ишемических процессах в миокарде и в мозге. В качестве ключевого патогенетического феномена апоптоз рассматривается при таких болезнях, как поликистоз почек, алкоголъ-индуцированные гепатит и панкреатит, диабет. Не срабатывание механизмов апоптоза ведёт к развитию аутоиммунных и опухолевых заболеваний. А то, что процесс часто затягивается на 10-20 лет, объясняется длительной лимфоцитарной реакцией организма [4,8]. Значимость системы ТК в поддержании гомеостаза микроокружения такова, что диктует необходимость специального изучения роли этой клеточной популяции в реализации, запуске или торможении такого жизненно важного для целостного организма явления как апоптоз. Здесь мы лишь коснулись этого вопроса.

В целом полученные результаты согласуются с данными [1] о многообразии форм дегрануляции ТК. Нами запротоколировано 6 видов дегрануляции ТК, не считая диффузного, его выявление требует разработки специальных методик. Процессу дегрануляции ТК предшествуют ультраструктурные перестройки внутри клетки и особенности их зависят от вида экскреции и органной дислокации ТК. Диффузный экзоцитоз, наряду с цельногранулярным, является наиболее привычным ритмом функционирования для ТК исследуемых нами органов. Установлено, что частота случаев цельногранулярного экзо-цитоза прямо пропорциональна удаленности ТК от кровеносных сосудов [4,6]. По-видимому, есть прямая связь между дегрануляционной активностью и апоптозом ТК. Выявлены некоторые ультраструктурные признаки апоптоза ТК, которые интересны и требуют дальнейшего изучения и специального анализа.

Литература

1. Быков B.J1. Секреторные механизмы и секреторные продукты тучных клеток//Морфология. - 1999. - № 2.-С. 64-72.

2. Данилов А.Б., Окулов В.Б., Папаян Л.П., Афанасьев Б.В. Нарушение системы свёртывания крови у онкологических больных//Вопросы онкологии. - 1998.-№1,-С. 12-18.

3. Ионов ИД. Известия АН СССР. Сек. биол. - 1987. - № 4. - С. 519-526.

4. Дзодзикова М.Э. Морфо-функциональные параметры тучных клеток при опухолевых заболеваниях молочной жслезы//Вестник ВНЦ РАН. - 2004. - № 2. - С. 46-52.

5. Северин С.Е., Катуков В.Ю., Муйжнек Е.Л., Северин Е.С. Проблемы избирательной регуляции клеточной активности - от фундаментальных основ к практическим результатам //Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 1998. -№ 1. С. 6-15.

6. Туриева-Дзодзикова М.Э., Салбиев К.Д. и Какабадзе С.А. Повреждение и адаптация тканевых базофи-лов при воздействии магнитного поля Мат. 1-ой Российской конференции по патофизиологии - М - 1996 -С. 233-234.

П.Хрущов Н.Г., Чернышова Э.В., Васильев Т.В. Кроветворное происхождение перитонеальных тучных клеток//Доклады АН СССР. - 1980. -№ 2. -С. 463-465.

8. Швенбергер КН., Л.Б. Гинкул. Апоптоз: роль в нормальном онтогенезе и патологии//Вопросы онкологии.. - 2002. -№ 2. - С. 153-171.

9. Clausen J., John U. and Nelson E. Electron microscopical study of rat mast cell maturation.//Virch Arch -1983. - V. - 43. № 2. - P. 151-158.

10. Kerr Y.E.R, Apoptosis. Its cancer and cancer therapy/ZCancer (Philad.). - 1994. - № 73. P. 2013-2026.

11. Kobayasi T., Miltgard K. and Asboe-Hansen G.: Ultrastracture of human mast cell granules//.!. Ultra-struct.Res. - 1996. - № 23. - P. - 153-165.

RECULIARITUS OF DEGRANULATION AND APOPTOSIS OF MAST CELLS OF RATS DIFFERENT

ORGANS

M.E. DZODZIKO V A

Central Scientific Research Laboratory of the North-Ossetian State Medical Academy. Republic of Northe Ossetia-Alania, Vladikavkaz, 362040. Puschkynscaya st. 40. N-OSMA

By the method of electronic microscopy peculiarities of degranulation of connective tissues must cells (MC) of rats different organs were studied. The investigation was carried out on 60 write breadless rats with mass of 180-240g. By the object of investigation served man-ow of bones, myocardium, thimus,skin, mesenterium and a tongue of intact animals. 6 types of MC degranulation were established. Tlie peculiarities of MC degranulation depend on their organ dislocation and distance from blood vessels. The same ultrastructural aspects of MC apoptosis were investigated.

Key words: must cells, marrow of bones, myocardium, thimus, skin, mesenterium, mammary gland, tongue, apoptosis, rat.