СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ CAR-NK-КЛЕТОК И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ

1. Способ ex vivo получения природных клеток-киллеров (NK), сконструированных для экспрессии одного или более химерных антигенных рецепторов (CAR) и/или одного или более T-клеточных рецепторов (TCR), где указанный способ включает:
(а) культивирование исходной популяции NK-клеток в присутствии искусственных презентирующих клеток (APC) и по меньшей мере одного цитокина;
(b) введение одного или более векторов для экспрессии CAR и/или TCR в NK-клетки; и
(c) размножение NK-клеток в газопроницаемом биореакторе в присутствии APC и по меньшей мере одного цитокина с получением размноженной популяции сконструированных NK-клеток.
2. Способ по п. 1, где газопроницаемый биореактор представляет собой G-Rex100M.
3. Способ по п. 1 или 2, где способ не включает удаление или добавление каких-либо компонентов среды на стадии (с).
4. Способ по любому из пп. 1-3, где способ не включает проведение HLA-типирования.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где сконструированные NK-клетки экспрессируют CAR.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где сконструированные NK-клетки экспрессируют TCR.
7. Способ по любому из пп. 1-5, где сконструированные NK-клетки экспрессируют CAR и TCR.
+
8. Способ по любому из пп. 1-7, где исходную популяцию NK-клеток получают из пуповинной крови, периферической крови, костного мозга, CD34-клеток, индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) или линии NK-клеток.
9. Способ по любому из пп. 1-8, где исходную популяцию NK-клеток получают из пуповинной крови.
10. Способ по п. 9, где пуповинная кровь была предварительно заморожена.
11. Способ по п. 9, где пуповинная кровь не была предварительно заморожена.
12. Способ по п. 9, где пуповинная кровь была взята у здорового донора.
13. Способ по п. 9, где исходную популяцию NK-клеток получают путем выделения мононуклеарных клеток в градиенте плотности фиколла-пака.
14. Способ по п. 13, дополнительно включающий истощение мононуклеарных CD3-, CD14- и/или CD19-клеток с получением исходной популяции NK-клеток.
15. Способ по п. 13, дополнительно включающий истощение мононуклеарных CD3-, CD14- и CD19-клеток с получением исходной популяции NK-клеток.
16. Способ по п. 14 или 15, где истощение включает проведение магнитного сортинга.
17. Способ по любому из пп. 1-16, где АРС представляют собой гамма-облученные АРС.
18. Способ по любому из пп. 1-17, где APC представляют собой универсальные APC (uAPC).
19. Способ по п. 18, где uAPC сконструированы для экспрессии (1) CD48 и/или CS1 (CD319), (2) мембраносвязанного интерлейкина-21 (mbIL-21) и (3) лиганда 41BB (41BBL).
20. Способ по любому из пп. 1-19, где NK-клетки и APC присутствуют в отношении от 1:1 до 1:10.
21. Способ по любому из пп. 1-19, где NK-клетки и APC присутствуют в отношении 1:2.
22. Способ по любому из пп. 1-21, где по меньшей мере один цитокин представляет собой IL-2, IL-7, IL-12, IL-21, IL-15 или IL-18.
23. Способ по любому из пп. 1-21, где по меньшей мере один цитокин представляет собой IL-2.
24. Способ по любому из пп. 1-23, где культивирование и/или размножение NK-клеток осуществляют в присутствии 2, 3 или 4 цитокинов.
25. Способ по п. 24, где цитокины выбраны из группы, состоящей из IL-2, IL-7, IL-12, IL-21, IL-15 и IL-18.
26. Способ по любому из пп. 1-24, где по меньшей мере один цитокин присутствует в концентрации 100-300 ед./мл.
27. Способ по любому из пп. 1-24, где по меньшей мере один цитокин присутствует в концентрации 200 ед./мл.
28. Способ по любому из пп. 1-27, где введение включает трансдукцию или электропорацию.
29. Способ по п. 28, где трансдукция представляет собой трансдукцию ретронектином.
30. Способ по п. 29, где эффективность трансдукции составляет по меньшей мере 20%.
31. Способ по любому из пп. 1-30, где конструкция для экспрессии CAR и/или TCR представляет собой лентивирусный вектор или ретровирусный вектор.
32. Способ по любому из пп. 1-31, где популяция сконструированных NK-клеток соответствует требованиям GMP.
33. Способ по любому из пп. 1-32, где указанный способ приводит по меньшей мере к 2000-кратному размножению.
34. Способ по любому из пп. 1-33, где стадии (а)-(с) осуществляют менее чем за 2 недели.
35. Способ по любому из пп. 1-34, где NK-клетки являются аллогенными.
36. Способ по любому из пп. 1-35, где NK-клетки являются аутологичными.
37. Способ по любому из пп. 1-36, где CAR и/или TCR обладают антигенной специфичностью к CD70, BCMA, CD5, CD33, CD47, CD99, CLL1, CD38, U5snRNP200, CD200, BAFF-R, CD19, CD319/CS1, ROR1, CD20, карциноэмбриональному антигену, альфа-фетопротеину, CA-125, MUC-1, эпителиальному опухолевому антигену, антигену, ассоциированному с меланомой, мутантному p53, мутантному ras, HER2/Neu, ERBB2, фолат-связывающему белку, гликопротеину оболочки ВИЧ-1 gp120, гликопротеину оболочки ВИЧ-1 gp41, GD2, CD123, CD23, CD30, CD56, с-Met, мезотелину, GD3, HERV-K, IL-11R-альфа, цепи каппа, цепи лямбда, CSPG4, ERBB2, WT-1, EGFRvIII, TRAIL/DR4, VEGFR2 или к их комбинации.
38. Способ по любому из пп. 1-37, где CAR и/или экспрессирующая конструкция дополнительно экспрессируют цитокин.
39. Способ по п. 38, где цитокин представляет собой IL-15, IL-21 или IL-2.
40. Способ по любому из пп. 1-39, дополнительно включающий криоконсервацию популяции сконструированных NK-клеток.
41. Популяция размноженных NK-клеток, полученная способами по любому из пп. 1-40.
42. Фармацевтическая композиция, содержащая популяцию сконструированных NK-клеток по п. 41 и фармацевтически приемлемый носитель.
43. Композиция, содержащая эффективное количество сконструированных NK-клеток по п. 42 для применения в лечении заболевания или расстройства у индивидуума.
44. Применение композиции, содержащей эффективное количество сконструированных NK-клеток, полученных способом по любому из пп. 1-40, для лечения иммунозависимого расстройства у индивидуума.
45. Способ лечения иммунозависимого расстройства у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества сконструированных NK-клеток, полученных способом по любому из пп. 1-40.
46. Способ по п. 45, где способ не включает проведение HLA-типированя между индивидуумом и донором.
47. Способ по п. 45, где NK-клетки имеют KIR-лиганды, которые отличаются у индивидуума и донора.
48. Способ по любому из пп. 45-47, где отсутствие соответствия HLA не приводит к реакции «трансплантат против хозяина» или токсичности.
49. Способ по любому из пп. 45-48, где иммунозависимое расстройство представляет собой рак, аутоиммунное расстройство, реакцию «трансплантат против хозяина», отторжение аллотрансплантата или воспалительное состояние.
50. Способ по любому из пп. 45-48, где иммунозависимое расстройство представляет собой воспалительное состояние, и иммунные клетки по существу не экспрессируют глюкокортикоидный рецептор.
51. Способ по п. 50, где индивидуум проходил или проходит стероидную терапию.
52. Способ по любому из пп. 45-51, где NK-клетки являются аутологичными.
53. Способ по любому из пп. 45-51, где NK-клетки являются аллогенными.
54. Способ по любому из пп. 45-53, где иммунозависимое расстройство представляет собой рак.
55. Способ по п. 54, где рак представляет собой солидный рак или гематологическое злокачественное новообразование.
56. Способ по любому из пп. 45-55, дополнительно включающий введение по меньшей мере второго терапевтического средства.
57. Способ по п. 56, где по меньшей мере второе терапевтическое средство включает химиотерапию, иммунотерапию, хирургию, лучевую терапию или биотерапию.
58. Способ по п 56, где NK-клетки и/или по меньшей мере второе терапевтическое средство вводят внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, интратрахеально, вовнутрь опухоли, внутримышечно, эндоскопически, в участок поражения, интракраниально, чрескожно, подкожно, регионально, путем непосредственной инъекции, перфузии или комбинированными способами.
59. Способ лечения инфекции у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества сконструированных NK-клеток, продуцируемых способом по любому из пп.1-40.
60. Способ по п. 59, где способ не включает проведение HLA-типирования между индивидуумом и донором.
61. Способ по п. 59, где способ не включает проведение HLA-типирования между индивидуумом и донором.
62. Способ по любому из пп. 59-61, где отсутствие соответствия HLA не приводит к реакции «трансплантат против хозяина» или токсичности.
63. Способ по любому из пп. 59-62, где NK-клетки имеют KIR-лиганды, которые отличаются у индивидуума и донора.
64. Способ по любому из пп. 59-63, где инфекция является вирусной, бактериальной или грибковой.
65. Способ по любому из пп. 59-64, где NK-клетки являются аутологичными для индивидуума.
66. Способ по любому из пп. 59-64, где NK-клетки являются аллогенными для индивидуума.