СПОСОБ КАЛИБРОВКИ СИСТЕМЫ ГАЗОВОЙ ХРОМАТОГРАФИИ - МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ (ГХ-МС), ОСНАЩЕННОЙ СПЕЦИАЛЬНЫМ ПО, ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАРКЕРОВ МИКРООРГАНИЗМОВ В ИССЛЕДУЕМОЙ ПРОБЕ МАТЕРИАЛА БИОЛОГИЧЕСКОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

1. Способ калибровки системы газовой хроматографии - масс спектрометрии (ГХ-МС), оснащенной специальным ПО, для определения маркеров микроорганизмов в исследуемой пробе материала биологического происхождения, заключающийся в том, что проводят количественный и количественный хромато-масс-спектрометрический анализ исследуемого биологического материала на содержание жирных кислот и оксикислот, выделяют и производят идентификацию отдельного таксона микроорганизма по его (таксона) профильным и маркерным признакам, для чего определяют специфические ионы маркеров микроорганизмов методом масс-фрагментографии с последующим выявлением полного сообщества микроорганизмов (возбудителей, таксонов) в исследуемом материале биологического происхождения, используя метод внутреннего стандарта (шаблона) идентифицируют компоненты пробы по жирным кислотам и оксикислотам путем сравнения полученных данных со стандартной базой данных, и определяют их количественное содержание, отличающийся тем, что перед измерением серии рутинных клинических проб исследуемого материала собирают произвольную пробу фекалий, принимая ее в качестве эталонной смеси, на основе эталонной смеси строят хроматограмму, и по полученным качественным и количественным характеристикам сообщества микроорганизмов пробы данной эталонной смеси осуществляют определение пиков специфических ионов на шкале времен удержания для дальнейшего расчета состава сообщества микроорганизмов в последующей серии клинических проб по маркерам этих микроорганизмов, причем качественные и количественные характеристики сообщества микроорганизмов произвольной пробы фекалий принимают за необходимое и достаточное количество, характеризующее любой исследуемый материал биологического происхождения, а идентификацию специфического иона осуществляют на основании детектирования пиков хроматограммы маркеров из стандартной (тестовой) базы данных.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что осуществляют калибровку прибора, оснащенного специальным программным обеспечением, по микробным маркерам произвольной пробы фекалий, по временным интервалам их расположения на временной шкале и по площадям пиков.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что осуществляют прямое извлечение с помощью химической процедуры высших жирных кислот из подлежащей исследованию пробы эталонной смеси, на основе которой калибруют временные интервалы для системы ГХ-МС на стандартных (тестовых хроматограммах базы данных.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в пробе эталонной смеси и последующих рутинных клинических пробах осуществляют разделение ЖК и стеринов на хроматографе в капиллярной колонке высокого разрешения, в результате получая графическое изображение селективных хроматограмм жирных кислот и стеринов с помощью ПО Method ГХ-МС-системы, которые образуют сетку маркерных пиков по времени удержания, и сравнивают их между собой.
5. Способ по п.1, отличающийся тем, что на хроматограмме пробы эталонной смеси фиксируют пик с соответствующим временем удерживания для одного или двух специфических ионов, получают результат измерения площадей пиков выбранных ионов определенной массы на селективной хроматограмме (МФ), идентифицируя по ним маркер соответствующего микроорганизма в рутинной клинической пробе.
6. Способ по п.1, отличающийся тем, что площадь каждого пика хроматограммы рутинной клинической пробы рассчитывается по хроматограмме основного иона маркера пробы эталонной смеси.
7. Способ по п.1, отличающийся тем, что проверяют дополнительно достоверность идентификации иона по абсолютным и относительными временам удержания, наличием подтверждающих дополнительных ионов и соотношением площадей ионов идентифицированных маркеров только на хроматограмме пробы эталонной смеси.
8. Способ по п.1, отличающийся тем, что расхождение во временах удерживания маркеров относительно значений стандартных тестовых времен удержания хроматограмм базы данных в хроматограмме пробы эталонной смеси принимают не более 0,1 мин.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что в рутинной клинической пробе осуществляют идентификацию состава сообщества микроорганизмов в динамическом режиме на масс-спектрометре, для чего осуществляют выявление таксономически значимых жирных кислот на хроматограграмме, идентифицируя микроорганизмы по хроматограмме жирных кислот, полученной на пробе эталонной смеси.
10. Способ по п.1, отличающийся тем, что осуществляют расчет концентрации маркеров и отнесение их к конкретным микроорганизмам на основе расчета по калибровочному шаблону по формуле:
1
sam
1
N=Ai[Mst/(q2×M×Ast)]/Ri,
1
- где N - число клеток микроогранима (таксона микроорганизма) в единице объема или веса пробы эталонной смеси,
sam
sam
(-15)
- К - постоянный коэффициент, равный К=Mst/(q2×M×Ast)=Mst(mg)/(5,1×10 (г)×M(мг)×Ast),
- Ai - площадь пика маркера,
- Mst - количество калибровочного шаблона (стандарта) в пробе, в мг,
sam
- М - количество пробы,
- Ast - площадь пика калибровочного шаблона (стандарта),
1
1
- Ri - доля в % маркера с индексом i в профиле ЖК определяемого микроба с номером 1 (N),
(-15)
12
- q2 - коэффициент, равный 5,1×10 г при условии, что 1 г микробной биомассы содержит 5,9×10 клеток микроорганизмов,
- а для всех последующих рутинных клинических проб по формуле
2
2
- N=Ai×k/Ri, где
- Ai - площадь пика i-го маркера, по которому проводятся вычисления,
2
- Ri - содержание i-го маркера (в %) в составе ЖК этого микроорганизма.
11. Способ по п.1, отличающийся тем, что хроматограмму принимают за шаблон для хроматограмм последующей серии рутинных клинических проб в формате Method программного обеспечения системы ГХ-МС.
12. Способ по п.1, отличающийся тем, что целевые пики отбирают в требуемом количестве для последующей идентификации и расчета на основе целевых пиков калибровочного шаблона.
13. Способ по п.1, отличающийся тем, что стабильность параметров, введенных в специальное программное обеспечение системы ГХ-МС, обеспечивают за счет использования редактирования характеристик калибровочного шаблона, введенных в программу в формате Method, и все последующие измерения характеристик последующих рутинных клинических проб и обработку их хроматограмм проводят автоматически с помощью программы Enhanced Data Analysis.