БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПЕПТИД, ПОЛУЧЕННЫЙ ИЗ МОЛОЧНОГО БЕЛКА
BIOLOGICALLY ACTIVE PEPTIDE PREPARED OF LACTIC PROTEIN

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой чистый пептид, который может быть использован для лечебных целей, в том числе для профилактики гипертонической болезни, характеризуемый аминокислотной последовательностью LLYQQPVLGPVRGPFPIIV, полученный из молочного белка.
В последние годы значительно повысился интерес к структуре и функциям низкомолекулярных пептидов, полученных в результате направленного ферментативного гидролиза полноценных белков молока, выполняющих в организме ряд специфических биологических функций.
Биологически активные пептиды в организме человека оказывают влияние на функции центральной нервной системы, проявляют иммуномодулирующее действие, оказывают влияние на процессы агрегации тромбоцитов и высвобождение вазоактивных простагландинов, регуляцию эндокринной функции поджелудочной железы, желудочной секреции и моторики, проявляют пребиотическое действие, стимулируя рост нормальной симбиотической микрофлоры и одновременно подавляя рост в кишечнике условно патогенных, в том числе потенциально патогенных микроорганизмов. Ряд биологически активных пептидов, образующихся при ферментативном гидролизе белков молока, могут проявлять in vivo свойства ингибитора ангиотензин-конвертирующего фермента и, как следствие, способствовать снижению кровяного давления. Эти пептиды имеют потенциальное использование в продуктах или фармацевтических препаратах и могут быть получены посредством различных способов ферментативного гидролиза и микробного брожения, в настоящее время являющихся наиболее распространенными.
Известны способы получения пептидов путем конденсации блочных фрагментов, кристаллизации, гидролиза и фильтрования, упаривания с последующей очисткой конечного продукта (Deigin V.I., Yarova E.R. "Synthesis of dermorphin and its analogs' // In: Peptides 1984, p.325-328).
Известно, что при протеолитическом расщеплении казеина молока образуются регуляторные пептиды (β-казоморфины и фосфопептиды), которые могут выступать как физиологические модуляторы метаболизма. Например, казеинфосфопептиды являются переносчиками различных микроэлементов, особенно кальция, и обладают цитомодулирующими эффектами, стимулируя активность иммунокомпетентных клеток (Meisel Н., FitzGerald R.J. Curr. Pharm. Des. 2003. V.9. Р.1289-1295). Казоморфины участвуют в обеспечении всасывания питательных веществ и последующем синтезе гормонов, иммунопептиды и казокинины обеспечивают иммунную защиту и перенос информации между эндокринной и нервной системой.
Известно изобретение на способ получения пептида, обладающего антибактериальным действием, полученного из гидролизата казеина (αs2-казеин) (ЕР 1114060, Process for producing cationic peptides from biological fluids) и р-казеин и к-казеин (WO 99/26971, Antimicrobial peptides).
Другая важная группа биологически активных пептидов относится к пептидам, обладающим противогипертоническим действием, способным снизить рост гипертонических заболеваний в развитых странах. Механизм действия таких пептидов основан на ингибировании ангиотензинконвертирующего фермента АКФ - неспецифической дипептидилкарбоксипептидазы, играющей ключевую роль в регуляции давления в системе кровообращения путем модуляции ренинангиотензиновой системы (РАС) (Т Takano, Milk derived peptides and hypertension reduction, International Dairy Journal, 1998, 8: 375-381). Антигипертензивные пептиды могут быть выделены из гидролизатов казеина (казеокинины) (US 6514941, Method of preparing a casein hydrolyzate enriched in antihypertensive peptides) и белков сыворотки (лактокинины) (WOO 1/85984, Enzymatic treatment of whey proteins for the production of antihypertensive peptides, the resulting products and treatment of hypertension in mammals).
Наиболее близким к заявляемым пептидам по структуре и свойствам является амид октапептида, обладающий способностью повышать артериальное давление и частоту сердечных сокращений (патент РФ №2346001, МПК С07К 7/06, А61К 38/08, А61Р 9/04. Амид октапептида, обладающий способностью повышать артериальное давление и частоту сердечных сокращений, опубл. 10.09.2009). Полученный пептид и композиция на его основе обладает широкими функциональными возможностями, однако получение его отличается значительной сложностью из-за высокого молекулярного веса, что удорожает его производство.
Технической задачей является получение биологически активного пептида, обладающего антигипертоническим действием и характеризующегося аминокислотной последовательностью LLYQQPVLGPVRGPFPIIV.
Технический результат достигается за счет использования в качестве биологической системы белка молока β-казеин, проведения целенаправленного гидролиза белков при помощи энзиматической системы, состоящей из смеси ферментных препаратов (концентрация составляет 0,01-0,05% от массы белка), обеспечивающих разделение полипептидной цепи на короткие пептиды и очистку полученного пептида с необходимой аминокислотной последовательностью из полученных гидролизатов с помощью мембранных фильтров с последующей стерилизацией полученного фильтрата, его сгущением и сушкой. Таким образом, достигается получение заданного пептида из биологической системы.
Способ получения биологически активного пептида с аминокислотной последовательностью реализуют следующим образом: подготавливают биологическую систему (в качестве биологической системы используют β-казеин, который предварительно восстанавливают, пастеризуют и охлаждают до температуры 36-39°С), подготавливают энзиматическую систему (ферментные препараты: трипсин или химотрипсин или термолизин в одинаковом количестве). После подготовки обеих систем приступают к проведению ферментативного гидролиза. Для этого в подготовленную биологическую систему вносят энзиматическую систему при температуре 35-38°С; концентрация ферментов 0,01-0,05% от массы белка, продолжительность процесса 9-10 часов. После этого ферменты инактивируют методом кратковременного нагревания до 90-92°С и проводят ультрафильтрацию полученных гидролизатов с помощью установки производства «ВЛАДИСАРТ» (Россия) с использованием мембран с диаметром пор 10 и 15 кД при рН 6,0-6,5. Полученный фильтрат стерилизуют, сгущают до содержания сухих веществ 50-55% и сушат до содержания влаги 14-16%.
Пример
Выделение пептида из молока
Подготавливают биологическую систему (в качестве биологической системы используют β-казеин, который предварительно восстанавливают, пастеризуют и охлаждают до температуры 36-39°С), подготавливают энзиматическую систему (ферментные препараты: трипсин или химотрипсин или термолизин в одинаковом количестве). После подготовки обеих систем приступают к проведению ферментативного гидролиза. Для этого в подготовленную биологическую систему вносят энзиматическую систему при температуре 35-38°С; концентрация ферментов 0,01-0,05% от массы белка, продолжительность процесса 9-10 часов. После этого ферменты инактивируют методом кратковременного нагревания до 90-92°С. Затем проводят ультрафильтрацию полученных гидролизатов с помощью установки производства «ВЛАДИСАРТ» (Россия) с использованием мембран с диаметром пор 10 и 15 кД при рН 6,0-6,5. Полученный фильтрат стерилизуют, сгущают до содержания сухих веществ 50-55% и сушат до содержания влаги 14-16%.
Установление аминокислотной последовательности пептида
Идентификацию пептида (определение аминокислотной последовательности) проводили на газофазном секвенаторе 477А и Pth-анализаторе 120А фирмы «Applied Biosystems» (США). Для этого фракции, содержавшие заявляемый пептид, после стадии очистки диализовали против воды, лиофилизовали и растворяли в 0.1% ТФА. Объем колонки 1.9 см, скорость элюции составила 0.2 мл/мин. На секвенирование пептиды отбирали по результатам аминокислотного анализа.
В результате устанавливают полную аминокислотную последовательность, состоящую из 19 аминокислотных остатков: LLYQQPVLGPVRGPFPIIV
Leu-Leu-Tyr-Gln-Gln-Pro-Val-Leu-Gly-Pro-Val-Arg-Gly-Pro-Phe-Pro-Ile-Ile-Val.
Определение относительной молекулярной массы пептида
Полученную аминокислотную последовательность, а также индивидуальность очищенного пептида подтверждают масс-спектрометрическим анализом. Масс-спектры получают на MALDI-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II TOF/TOF (Bruker Daltonik, Германия), с идентификацией положительных ионов в рефлекторном режиме. В качестве матрицы используют дигидробензойную кислоту (10 мг/мл в 50%-ном ацетонитриле, содержащем 0,1%-ную трифторуксусную кислоту). Для калибровки прибора используют стандартную смесь пептидов и белков с диапазоном молекулярных масс 700-66000 Да (Sigma, США).
Измеренная моноизотопная молекулярная масса пептида LLYQQPVLGPVRGPFPIIV составляет 2107,23 Да и в пределах точности MALDI-масс-спектрометра (0,01%) не отличается от расчетной (2125,13 Да).
Таким образом, заявляемое изобретение позволяет получить из молочного белка β-казеина биологически активные пептиды обладающие антигипертоническим действием.