Роль мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из костного мозга в восстановлении больших костных дефектов

внутримышечная аутотрансплантация СКПК, мобилизованных гранулоцитарным колониестимулирующим фактором. Парафиновые срезы аутопсийного материала и биоптатов икроножной мышцы пораженной конечности, полученных до начала клеточной терапии и через 3 мес. после трансплантации СКПК окрашивали иммуногистохимически с антителами к маркерам эндотелия (С031, С034, фактор фон Виллебрандта) и антителами к миогенину — маркеру активированных клеток-сателлитов. Далее производили морфометрический анализ образцов, подсчитывали число мышечных волокон и капилляров и определяли плотность капиллярной сети.

Результаты исследования. Результаты иммуногис-тохимического окрашивания показали рост плотности капиллярной сети на 25% (соотношение «число капилляров/число мышечных волокон» возрастает после аутотрансплантации с 1,6+0,15 до 2,0+0,12; р<0,001). Средняя плотность капиллярной сети мышечной ткани в аутопсийном материале составила +

от лиц без признаков хронической артериальной недостаточности нижних конечностей и в биоптатах мышечной ткани до введения стволовых клеток мы наблюдали единичные клетки-сателлиты с цитоплазматическим окрашиванием миогенина, через 3 мес. после аутотрансплантации СКПК их количество увеличивалось, появлялись клетки-сателлиты с мио-генин-позитивным ядром — признаком поздней стадии дифференцировки. Также мы наблюдали слияние клеток-сателлитов с образованием мышечных трубочек и новых мышечных волокон.

Количество капилляров на одно мышечное волокно

3 .

— —

Контроль До введения СК Через 3 мес. после

введения СК

* р < 0,001

Вывод: ХОЗАНК приводит к значительному снижению плотности капиллярной сети мышечной ткани, аутотрансплантация СКПК ведет к улучшению васку-ляризации ишемизированной конечности путем нео-ангиогенеза, а также активации миосателлитов и формированию новых мышечных волокон, что способствует восстановлению функции ишемизированной конечности. Аутотрансплантация СКПК является перспективным методом терапии ХОЗАНК.

В.Е. Мамонов, Н.В. Сац, И.Н. Шипунова,

А.Е. Бигильдеев, Д.А. Свинарева, Н.В. Проскурина,

М.М. Ряшенцев, А.Г. Чемис, Н.И. Дризе Роль мультипотентных мезенхимных стромальных клеток из костного мозга в восстановлении больших костных дефектов

Учреждение Российской Академии медицинских наук Гематопогический Научный Центр РАМН,

Москва, Россия ndrize@yandex.ru

V.E. Mamonov, N.V. Sats, I.N. Shipounova, A.E. Bigildeev,

.A. Svinareva, N.V. Proskurina, M.M. Riashentsev,

A.G. Chemis, N.I. Drize

Part of bone marrow multipatent mesenchymal stromal cells in repair of big bone defects

Показано, что мультипотентные мезенхимные стро-мальные клетки (ММСК) способны дифференцироваться in vitro в клетки кости, хряща, жировой ткани. Для восстановления больших незаживающих дефектов кости используют носители из синтетических или натуральных биоматериалов. Комбинация ММСК с различными носителями может значительно улучшить восстановление больших костных повреждений. Целью данной работы было изучить дифференцировочный потенциал ММСК in vivo, а также эффективность регенерации кости с помощью биоматериала в комбинации с ММСК после трансплантации в место повреждения лучевой кости кролика.

Материал и методы. ММСК получали из костного мозга кроликов. Остеогенную дифференцировку ММСК индуцировали in vitro в течение 4 сут. (остео-ММСК). Одну десятую часть трансплантируемых ММСК транс-дуцировали с помощью концентрированного (108 вирусных частиц/мл) LeGO вектора третьего поколения, кодирующего зеленый флуоресцентный белок (EGFP), и 1/10 часть остео-ММСК — с помощью LeGO вектора, кодирующего красный флуоресцентный белок (mCherry). В область повреждения (резекция 1 см лучевой кости) имплантировали аутогенные ММСК или ММСК в комбинации с остео-ММСК, губкой ИНДОСТ (POLYSTOM) и гранулами PRODENS (WMT). За динамикой изменений в области резекции следили в течение 52 нед. Каждые 4 нед. проводили рентгенологические исследования поврежденных конечностей. Через 6, 12, 26^ 29 и 52 нед. новообразованные участки кости и окружающей соединительной ткани анализировали на наличие маркированных клеток методом ПЦР, морфологию изучали на гистологических срезах.

Результаты. В течение 7 мес. не наблюдалось никаких видимых изменений в регенерации повреждения у контрольных животных, в отсутствие клеток и носителей. Имплантация только губки ИНДОСТ (POLYSTOM) и гранул PRODENS без ММСК также не приводит к образованию костной ткани в области резекции. После трансплантации остео-ММСК с носителями в области повреждения уже через 6 нед. наблюдался остеогенез, присутствие маркированных клеток было выявлено в новообразованной костной и соединительной тканях. Не было выявлено отличий в регенерации кости между ММСК и остео-ММСК через 12 нед. Маркированные клетки в новообразованной кости выявлялись в обоих случаях. Клетки, несущие зеленый белок, обнаруживались в фасции, хрящевой и костной тканях. К этому времени формируется костная мозоль, окружающая место дефекта. Через полгода

после трансплантации смеси ММСК, маркированных зеленым белком, и остео-ММСК, маркированных красным, в новообразованных костях доминируют клетки, несущие зеленый белок. Потомки остео-ММСК выявляются в костной мозоли и в фасциях, однако их количество меньше в тысячи раз. Результаты этих экспериментов демонстрируют ограничения пролиферативного потенциала среди ММСК, подвергнутых индукции к дифференцировке, что стоит учитывать при планировании условий для использования ММСК.

Дальнейшие наблюдения в течение года после операции выявили присутствие маркированных клеток в образующихся костной и хрящевой тканях, а также в прилегающих фасциях. Полученные данные говорят о том, что:

1) комбинация ММСК с носителями способствует регенерации кости в области обширного незаживающего дефекта;

2) культивированные ММСК способны in vivo к соединительнотканным дифференцировкам и образуют костную, хрящевую и волокнистую соединительную ткани;

3) предварительная индукция дифференцировки ММСК снижает их пролиферативный потенциал in vivo;

4) введение маркерного гена не нарушает способности ММСК к пролиферации и мультипотентной дифференцировке;

5) Терминально дифференцированные потомки маркированных ММСК сохраняются в регенерировавшей ткани по крайней мере в течение года.

ММСК могут быть использованы в терапевтических целях в регенеративной медицине для заживления тяжелых костных и хрящевых повреждений. Длительное сохранение маркированных клеток в регенерате позволяет использовать ММСК для генотерапии.

Е.В. Мартынова 1, Н.Л. Блатта, М.Э. Ялвач 3,

Е.В. Головин 1, О.Р. Галеев 1, В.А. Анохин 1,

А.А. Ризванов 123 Влияние гипотонического шока на инфицирование клеток рекомбинантным лентивирусом in vitro

1 ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет», Казань, Россия

2 ФГАОУВПО «Казанский [Приволжский} федеральный университет», Россия

3 Департамент генетики и биоинженерии.

Университет Едитепе, Стамбул, Турция Martynova85@gmail.com

E.V. Martynova, N.L. Blatt, М.Е. Yalvac, E.V. Golovin,

O.R. Galeev, V.A. Anokhin, A.A. Rizvanov

Effect of hypotonic stress on recombinant ientivirai

transduction in vitro

Процесс проникновения ретровирусов в клетку-хо-зяина происходит по одному из двух механизмов: pH-зависимое проникновение в клетку при помощи клатрин-опосредованного эндоцитоза или рН-незави-симое проникновение в клетку посредством прямого взаимодействия со специфическими рецепторами на поверхности клетки с последующим слиянием мембран. Известно, что гипотоническая среда приводит к значительной активации процессов эндоцитоза. В 2009 г. Yu-Hsiang Lee и Ching-An Peng показали, что гипотоническая среда значительно повышала инфек-ционность MoMuLV-GFP ретровируса (экотропный вирус, содержащий геном вируса лейкемии мышей

Молони, экспрессирующий белок GFP; Ecotropic Moloney murine leukemia virus). Лентивирусы, в частности ВИЧ-1, также принадлежат к семейству Retroviridae. Представители этого рода используют связывание поверхностных гликопротеинов с рецепторами на мембране клетки, что, в свою очередь, запускает каскад механизмов, способствующих последующему слиянию внешней оболочки вируса и клеточной мембраны с высвобождением вирусного капсида в цитоплазму.

Лентивирусы — один из наиболее эффективных векторов доставки рекомбинантных генов в клетки мишени. Лентивирусы способны инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки с высокой эффективностью, а современные способы получения рекомбинантных вирусов позволяют работать с ними в стандартных лабораториях 2 уровня биологической опасности. Интеграция провируса, содержащего рекомбинантные гены, в геном клетки-хозяина приводит к перманентной генетической модификации клеток и долговременной экспрессии трансгенов. Одним из применений рекомбинантных векторов на основе ленти-вирусов служит генетическая модификация клеток in vitro для последующего использования в генно-клеточных приложениях. В связи с этим встаёт вопрос о повышении эффективности вирусной трансдукции in vitro.

Цель работы: исследование влияния гипотонической обработки клеток на эффективность инфицирования рекомбинантным лентивирусом.

Материал и методы. Работу проводили в ламинаре 2 класса биологической защиты. В качестве инфекционного агента использовали рекомбинантный ленти-вирус (LV-GFP), созданный на основе генома ВИЧ-1, псевдотипированный поверхностным гликопротеином вируса везикулярного стоматита G (VSV-G) и экспрессирующий зелёный флуоресцентный белок GFP. В качестве модельной культуры клеток использовали клетки человека HeLa. Клетки высевали в 24-х луночный культуральный планшет и инкубировали при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% С02. Изотоническая среда состояла из 50% культуральной среды и 50% дистиллированной воды. Эксперимент состоял из 3 групп: 1) клетки, инфицированные LV-GFP в изотонической среде (контроль);

2) клетки, прошедшие предобработку гипотонической средой и инфицированные LV-GFP в изотонической среде; 3) клетки, инфицированные LV-GFP в гипотонической среде. Подсчет процента инфицированных клеток осуществляли с помощью проточного цито-флуориметра FACSCalibur (Becton Dickinson).

Результаты и обсуждение. Анализ количества GFP-позитивных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии и проточной цитофлуориметрии не показал значительных различий в исследуемых экспериментальных группах. Показано, что гипотоническая среда не оказала влияния на эффективность инфицирования клеток рекомбинантным летивирусом LV-GFP, что свидетельствует о том, что проникновение рекомбинантного лентивируса в клетку, в отличие от ретровируса MoMuLV-GFP, по-видимому, не связано с активностью процессов эндоцитоза.

Таким образом, применение гипотонических сред не повышает эффективность лентивирусной трансдукции in vitro.