СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ ГРЕЧИХИ IN VITRO
METHOD OF REPRODUCTION OF BUCKWHEAT IN VITRO

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции растений и сельскохозяйственной биотехнологии, и может быть использовано в селекции и семеноводстве растений, в частности для ускорения процесса размножения ценных форм, регенерантов и сортов гречихи, а также в исследованиях по генетике и физиологии растений.
5
Известен способ размножения гречихи in vitro, включающий вычленение эксплантов, их культивирование с получением первичной каллусной ткани, индукцию органогенеза и получение растений-регенерантов (см., например, авторское свидетельство СССР №1704715, МПК A01H 4/00, 1992 г.).
Недостатком этого способа размножения гречихи in vitro является:
- трудоемкость вычленения недозрелых зародышей;
- сложность отбора зародышей требуемого размера от 0,5 до 3,0 мм для культивирования;
- удлинение процесса размножения растений гречихи in vitro из-за наличия этапа получения первичной каллусной ткани;
5
5
Известен также способ размножения гречихи in vitro, в котором в качестве эксплантов используют узлы растений, а культивирование и субкультивирование осуществляют на одной и той же модифицированной питательной среде Гамборга В, в которую дополнительно вносят 6-БАП в количестве 5-10 мг/л и 1-2 мг/л (см., например, авторское свидетельство СССР №1658928, МПК A01H 4/00, 1991 г.).
Недостатком данного способа размножения гречихи in vitro является:
- низкая эффективность получения стерильных растений, так как для стерилизации растительных тканей более сложно подобрать дезинфицирующие средства, чтобы сохранить ткани живыми и способными к регенерации, чем для семян;
- снижение коэффициента размножения после добавления в питательную среду фитогормона 6-БАП, вследствие появления аномальных форм побегов с нехарактерной морфологией, а также раннего цветения микрорастений гречихи.
7
Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ размножения гречихи in vitro, включающий вычленение эксплантов в качестве которых используют участки недельных асептических проростков, их культивирование с получением первичной каллусной ткани, индукцию органогенеза и получение растений-регенерантов (см., например, патент на изобретение №2229219, МПК A01H 4/00, C12N 5/00, A01H 1/04, 2004 г.).
Недостатком известного прототипа является:
- увеличение времени на получение растений гречихи в процессе регенерации из каллуса, так как сначала надо индуцировать образование первичной каллусной ткани;
- снижение частоты регенерации побегов из каллуса по сравнению с прямым органогенезом;
- снижение выхода растений идентичных исходному генотипу при регенерации из каллусной ткани вследствие проявления сомаклональной изменчивости.
Цель изобретения - повысить эффективность процесса размножения микрорастений гречихи в условиях in vitro за счет его упрощения, ускорения, снижения затрат и увеличения выхода пробирочных растений.
Указанная цель достигается тем, что способ размножения гречихи in vitro, включающий размножение гречихи из асептических проростков семян, отличающийся тем, что семена предварительно стерилизуют концентрированной серной кислотой и культивируют на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов с получением асептических проростков, субкультивируют, используя верхнюю часть побега проростка с пазушной почкой с получением микрорастений на питательной среде Мурасиге и Скуга с фитогормонами с содержанием сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л, которые делят на черенки, культивируют, субкультивируют и укореняют на этой среде.
По сравнению с прототипом признаками изобретательского уровня предлагаемого способа размножения гречихи in vitro являются:
1 «…семена предварительно стерилизуют концентрированной серной кислотой и культивируют на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов с получением асептических проростков…», что позволяет:
- значительно упростить процедуру стерилизации семян из-за сокращения времени ее проведения, так как обработку концентрированной серной кислотой проводят однократно в течение 2 минут;
- значительно ускорить снятие плотной околоплодной оболочки и быстрее пассировать плоды на питательные среды за счет того, что после погружения семян гречихи в серную кислоту происходит частичное разрушение (размягчение) околоплодной оболочки;
- снизить затраты на приобретение дорогостоящих фитогормонов за счет получения асептических проростков из семян на среде Мурасиге и Скуга без фитогормонов, так как на этом этапе еще идет выбраковка части инфицированного материала.
2 «…субкультивируют, используя верхнюю часть побега проростка с пазушной почкой с получением микрорастений на питательной среде Мурасиге и Скуга с фитогормонами с содержанием сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л, которые делят на черенки, культивируют, субкультивируют и укореняют на этой среде», что позволяет:
- увеличить выход активно растущих микрорастений за счет использования верхней части побега с пазушной почкой;
- увеличить выход пробирочных растений гречихи за три пассажа в 1,9 раз;
- ускорить размножение ценных форм и сортов гречихи;
- максимально снизить появление микрорастений с аномальной морфологией, так как 6-БАП не используется, и получать идентичные исходному генотипу микрорастения с нормальной морфологией;
- повысить эффективность и упростить процесс микроразмножения при культивировании и субкультивировании черенков гречихи за счет применения питательной среды одного состава, которая обеспечивает одновременно рост микрорастений и их укоренение;
- снизить затраты на культивирование микрорастений в условиях in vitro за счет сокращения сроков размножения материала до необходимого объема, ускорить производство семян.
Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели доказывают, что заявляемый способ размножения гречихи in vitro обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решения, дает основание сделать вывод, что заявляемый способ имеет изобретательский уровень.
Предлагаемый способ размножения гречихи in vitro осуществляется следующим образом. Зрелые семена гречихи стерилизуют, погружая на две минуты в концентрированную серную кислоту. В таблице 1 представлены результаты эксперимента по эффективности стерилизации семян гречихи хлорсодержащим дезинфицирующим агентом раствором хлорамина Б в сравнении с предлагаемым способом стерилизации концентрированной серной кислотой. Результаты свидетельствуют о существенном повышении эффективности процесса стерилизации семян концентрированной серной кислотой, так как процент освобожденных от инфекции семян составил от 71,0 до 100.
Семена, прошедшие стерилизацию серной кислотой, трижды промывают в течение 5-10 минут стерильной дистиллированной водой, освобождают от перикарпия (плодовой оболочки) и пассируют на питательную среду Мурасиге и Скуга без фитогормонов, содержащую следующие
Таблица 1
Эффективность различных способов стерилизации семян гречихи
№ п/п
Сорт, гибрид
70% раствором этанола и 10% раствором хлорамина Б
концентрированной серной кислотой
1
2
1
2
1
Приморская 7
47
38,3
31
71,0
5
Приморская местная
31
13,0
30
100
6
Изумруд x Наташа
36
0
25
76,0
8
Приморская местная
31
13,0
30
100
Примечание:
- обработано семян, шт.; 2 - эффективность стерилизации, %.
компоненты (в мг/л): тиамин-НСl - 2,0; пиридоксин-НСl - 1,0; гидролизат казеина - 1000,0; сахароза - 20000; агар микробиологический - 6000 при pH от 5,6 до 6,0. Культивирование проводят в пробирках с ватно-марлевыми пробками до получения асептических проростков в контролируемых условиях: 16-часовой фотопериод, интенсивность освещения 4-5 тысяч люкс, температура 23±2°C.
При появлении из зоны семядольного узла асептического проростка растущего побега, отделяют его верхнюю часть (примерно длиной 10-20 мм) и помещают на питательную среду, включающую следующие компоненты (в мг/л):
4
3
Аммоний азотнокислый (NHNO) - 1650
3
Калий азотнокислый (KNO) - 1900
2
4
Калий фосфорнокислый однозамещенный (KHPO) - 170
4
2
Магний сернокислый семиводный (MgSO×7HO) - 370
2
2
Кальций хлористый двухводный (CaCl×2HO) - 440
4
2
Железо сернокислое семиводное (FeSO×7HO) - 27,8
2
2
Трилон Б (NaЭДТА×2HO) - 37,3
3
3
Борная кислота (HBO) - 6,2
4
2
Марганец сернокислый четырехводный (MnSO×4HO) - 22,3
2
2
Кобальт хлористый шестиводный (CoCl×6HO) - 0,025
4
2
Медь сернокислая пятиводная (CuSO×5HO) - от 9,2 до 23,0
4
2
Цинк сернокислый семиводный (ZnSO×7HO) - 8,6
4
2
Натрий молибденовокислый двухводный (NaMoO×2HO) - 0,25
Калий йодистый (KI) - 0,83
Тиамин-HCl - 2,0
Пиридоксин-HCl - 1,0
Гидролизат казеина - 1000,0
ИУК (индолил-3-уксусная кислота) - 0,5
ИМК (3-индолилмасляная кислота) - 0,2
Сахароза - 20000
Агар микробиологический - 6000
при pH от 5,6-6,0.
7
В таблице 2 приведены результаты испытания пяти вариантов питательных сред, среди которых среда Барсукова Е.Н. использована как наиболее близкий прототип (патент на изобретение №2229219, МПК A01H 4/00, C12N 5/00, A01H 1/04, 2004 г.).
Таблица 2
Коэффициент размножения микроклонов гречихи на питательных средах различного состава
Вариант среды
Среднее количество микрорастений, шт.
Выход растений за три пассажа, шт.
I пассаж*
II пассаж
III пассаж
Среднее за три пассажа
Bohanec В., 6-БАП 1,0 мг/л, ИУК 0,5 мг/л
1,2
2,6
1,9
1,9
6,86
Суворова Г.Н., 6-БАП 2,25 мг/л, ИУК 0,2 мг/л
1,1
1,5
0,4
1,0
1,0
Барсукова Е.Н., ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л
2,0
2,8
2,8
2,5
15,63
БТМ<sub>1</sub>, ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л, 23,0 мг/л CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
2,6
3,3
3,4
3,1
29,79
БТМ<sub>2</sub> ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л; 69,0 мг/л CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
1,1
1,3
0
0,8
0,51
Среднее по опыту
1,6
2,3
1,7
1,9
6,86
Примечание - * пассаж составляет 25-30 дней
1
4
2
Максимальное количество растений за три пассажа получено 29,79 штук при культивирования на среде БТМ, содержащей наряду с фитогормонами ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л дополнительно 23,0 мг/л CuSO×5HO.
Оптимальное для микроразмножения гречихи в условиях in vitro содержание в питательной среде сернокислой меди установлено экспериментально и приведено в таблице 3.
Таблица 3
Коэффициент размножения микроклонов гречихи на питательных средах с различным содержанием сернокислой меди
№ п/п
Вариант среды (содержание сернокислой меди, мг/л)
Количество микрорастений, шт.
Выход растенийза три пассажа, шт.
I пассаж*
II пассаж
III пассаж
среднее за три пассажа
1
контроль 0,025
1,8±0,13
2,4±0,16
2,3±0,30
2,1±0,12
9,3
2
4,625
1,8±0,13
2,6±0,33
2,6±0,33
2,3±0,17
12,2
3
9,225
2,3±0,15
2,7±0,30
2,8±0,29
2,6±0,14
17,6
4
13,825
2,3±0,21
2,7±0,26
2,8±0,20
2,6±0,13
17,6
5
18,425
1,6±0,22
3,0±0,21
3,2±0,20
2,6±0,17
17,6
6
23,025
2,0±0,14
2,6±0,16
2,9±0,23
2,5±0,12
15,6
7
27,625
1,5±0,16
2,7±0,21
2,5±0,16
2,2±0,13
10,6
8
32,225
1,5±0,16
2,3±0,23
1,8±0,35
1,8±0,15
5,8
9
36,825
1,6±0,49
2,1±0,23
1,8±0,20
1,8±0,19
5,8
10
41,425
1,0±0,13
2,1±0,23
1,9±0,17
1,6±0,13
4,1
11
46,025
1,25±0,16
1,8±0,20
1,7±0,33
1,6±0,14
4,1
HCP<sub>05</sub>
0,4
5,4
Примечание: *пассаж составляет 25-30 дней
7
В качестве контроля использовали среду Барсукова Е.Н., ИУК 0,5 мг/л, ИМК 0,2 мг/л (патент на изобретение №2229219, МПК A01H 4/00, C12N 5/00, A01H 1/04, 2004 г.) со стандартным для минеральной основы по Мурасиге и Скугу содержанием меди сернокислой пятиводной - 0,025 мг/л. Добавление в питательную среду сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л статистически достоверно увеличило выход растений гречихи за три пассажа от 15,6 до 17,6 шт., что в 1,7-1,9 раза больше, чем на контрольной среде (табл.3).
Полученные микрорастения делят на черенки с пазушной почкой, культивируют, субкультивируют и укореняют на питательной среде одного состава, который приведен выше, с содержанием меди сернокислой пятиводной от 9,2 до 23,0 мг/л.
Условия культивирования асептических проростков, черенков и микрорастений аналогичны. Для получения семян укорененные растения гречихи из пробирок высаживают в почву.
Применение предлагаемого изобретения позволит повысить эффективность процесса размножения гречихи в условиях in vitro, значительно упростить и ускорить его, снизить затраты и существенно увеличить выход пробирочных растений.