Антимикробная активность грибов рода Trichoderma и Trametes в отношении условно-патогенных микроорганизмов рода Staphylococcus

фаголизосомах. Таким образом, входящие через обогащённые ХС мембранные домены клеток-хозяина МБТ могут обеспечить себе последующую выживаемость в покрытых ТАСО фагосомах [11,12]. На основании этого можно полагать, что выявленные нами структурные нарушения плазматической мембраны мононуклеаров крови у больных ТЛ являются скорее предрасполагающим фактором, нежели следствием микобактериальной инвазии и не являются специфичными только для мо-ноцитарных клеток крови, на что указывает однонаправленность изменений показателей флуоресцентного зондирования в лимфоцитах и моноцитах.

Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что в плазматической мембране лимфоцитов и моноцитов периферической крови у больных лекар-

ственно-чувствительным и лекарственно-резистентным инфильтративным ТЛ до лечения отмечаются сходные изменения липидного бислоя, характеризующиеся возрастанием коэффициентов эксимеризации пире-на, снижением процента индуктивно-резонансного переноса энергии, а также существенными изменениями в липидном составе (снижение содержания сфингоми-елина, фосфатидилхолина и повышение количества фосфатидилэтаноламина, фосфатидилинозитола). При этом лекарственно-резистентный ТЛ сопровождается увеличением фракции свободного холестерина и холе-стерин-фосфолипидного соотношения в мембране мононуклеарных лейкоцитов. Данного рода нарушения могут послужить причиной изменений функциональной способности клеток и формирования иммунодефицита.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации для поддержки ведущих школ Российской Федерации РИ-112/001/158 и молодых ученых № МД-3880.2005.7.

MICROVISCOSITY AND LIPIDE SPECTRUM OF MEMBRANE OF BLOOD MONONUCLEAR LEUKOCYTES IN PATIENTS WITH PULMONARY TUBERCULOSIS

I.E. Esimova, V.V Novitskij, O.I. Urazova, A.K. Strelis, O.V. Voronkova, R.R. Hasanova

Parameters of fluorescent intubation and lipide spectrum of membranes of monocytes and lymphocytes of blood in patients with drug-sensitive and drug-resistant pulmonary tuberculosis before treatment are investigated. It was determined, a drug-sensitive and drug-resistant tuberculosis is accompanied by increase of coefficients of formation of excimers pyrene and by decrease of percent of inductive-resonant transmission of energy in membranes of cells. The membrane lipide spectrum of immunocytes in patients with drug-sensitive and drug-resistant pulmonary tuberculosis is characterized by the reduced content of fatty acids, sphingomyelin and phosphatidylcholine, by boosted amount of phosphatidylinositol and phosphatidylethanolamine. Also decrease of contents of aethers of cholesterol, augmentation of the content of loose cholesterol and a cholesterol/phospholipid ratio in membrane of mononuclear leukocytes is marked at drug-resistant tuberculosis.

ЛИТЕРАТУРА

1. Болдырев А.А. Введение в биомембранологию. — М.: Изд-во МГУ. 1990. — 208 с.

2. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. — М.: Наука, 1980. — 320 с.

3. Владимиров Ю.А. Роль нарушений липидного слоя мембран в развитии патологических процессов // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. — 1989. — №4. — С.7-19.

4. Гольдберг Е.Д., Дыгай А. М., Шахов В. П. Методы культуры ткани в гематологии. — Томск: Изд-во Томского унта, 1992. — 272 с.

5. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. — М.: Наука, 1989. — 277 с.

6. Жухоров Л. С., Голованов С.А. Метод количественного определения липидов в лимфоцитах и нейтрофилах периферической крови // Лабораторное дело. — 1984. —

7. Маянский А.Н. Туберкулез // Иммунология. — 2001. — № 2. — С.53-63.

8. Салина Т.Ю., ХудзикЛ.Б. Иммунопатогенетические механизмы в течение туберкулезной инфекции // Проблемы туберкулеза. — 2001. — №8. — С.32-34.

9. Самойлова А.Г., Марьяндышев А.О. Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулёза — актуальная проблема фтизиатрии // Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. — 2005. — №7. — С.3-9.

10. Финдлей Дж.Б, Эванс У.Г. Биологические мембраны. Методы. — М.: Мир. — 1990. — 424 с.

11. Catfleld J., Pieters J. Essential role for cholesterol in entry of mycobacteria into macrophages // Science. — 2000. — Vol. 288, № 5471. — P. 1647-1650.

12. Cholesterol interactions with phospholipids in membranes / H. Ohvo-Rekila B. Ramstedt, P. Leppimaki, J. P. Slotte // Prog. Lipid Res. — 2002. — Vol. 41, №1. — P. 66-97.

13. Dumas D., Muller S., Gouin F., et al. Membrane fluidity and oxygen diffusion in cholesrol-enriched erythrocyte membrane // Arch. Biochem. Biophys. — 1997. — Vol. 341, № 1. — P. 34-39.

© САДЫКОВА B.C., КОВАЛЕВА Г.К., ЧИЖМОТРЯ H., ГАВРИЛОВА А.Г., ГРОМОВЫХТ.И., НОВИЦКИЙИ.А. - 2006

АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ГРИБОВ РОДА TRICHODERMA И TRAMETES В ОТНОШЕНИИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ РОДА STAPHYLOCOCCUS

В.С. Садыкова1, Г.К. Ковалева', Н. Чижмотря2, А.Г. Гаврилова, Т.И. Громовым1, И.А. Новицкий2

Резюме. Изучена антимикробная активность микромицетов рода Trichoderma и базидиомицета Trametes versicolor в отношении ряда штаммов условно-патогенных микроорганизмов рода Staphylococcus, выделенных из организма больных людей. Показано, что штаммы грибов обладают бактериостатическим, а для ряда штаммов видов бактерицидным действием, что позволяет рекомендовать штаммы МГ-97 и B-18-C как потенциальные продуценты новых активных антибиотиков для лечения заболеваний, вызываемых стафилококками.

Ключевые слова. Бактерицидная активность, метаболитыы, грибыы, условно-патогенные микроорганизмыы.

Опыт более чем полувекового использования антибиотиков в лечении инфекционных заболеваний показывает, что у патогенных микроорганизмов рано или поздно вырабатываются механизмы устойчивости к используемым препаратам как природным, так и их полусинтетическим аналогам. Так, лечение инфекций, вызванных грамположительными бактериями, успешно начатое с применения пенициллина в 40-х годах прошлого столетия, привело к появлению в 50-х годах стафилококков, устойчивых к пенициллину. Для решения этой проблемы были созданы полусинтетические пени-циллины (метициллин, оксациллин). Однако уже в начале 60-х годов появились сообщения о выделении штаммов Staphylococcus aureus, устойчивых к метицил-лину [5,6]. Лечение инфекций, вызванных стафилококками, является одной из сложных задач современной медицины, поскольку штаммы обладают устойчивостью ко всем известным (3-лактамным антибиотикам).

В связи с широким распространением форм стафилококков, устойчивых к антибиотикам, весьма актуальна задача поиска новых продуцентов антибиотических веществ и препаратов, активных в отношении стафилококков, преодолевающих лекарственную устойчивость. Одним из направлений поиска новых антибиотиков является исследование видов грибов, ранее подробно не изучающихся в качестве продуцентов лекарственных веществ.

По сведению ряда авторов [1,7,8] грибы рода Trichoderma являются продуцентами метаболитов, обладающих высокой антибиотической активностью в отношении грибов и бактерий. Антибиотические вещества грибов Trichoderma активно выделяются во внешнюю среду и эффективны в подавлении многих почвенных патогенов. Эти свойства широко используются микробиологами для отбора наиболее перспективных штаммов биологического контроля in vitro.

Большой интерес представляют и грибы рода Trametes, в частности трутовик разноцветный (T. versicolor), также обладающий широким спектром биологического действия. Полученные на его основе препараты усиливают клеточный иммунитет, обладают антивирусным и антибактериальным действием [3,4].

Целью наших исследований являлось изучение антимикробной активности штаммов грибов рода Trichoderma и штамма T. versicolor в отношении условно-патогенных микроорганизмов рода Staphylococus (S.delphini, S.cohnii, S.hаemolitiсus, S.warner, S.intermedius,

S.epidermidis, S.aureus, S.caseoliticus).

Материалы и методы

В работе использовали штаммы МГ-97, МГ-6, GT-4, Lg-2 грибов рода Trichoderma и штамм В-18-С Trametes versicolor из коллекции музея Центра биотехнологии и микологии СибГТУ.

Штаммы Lg2 и Gt4 Trichoderma sp были выделены из плодового тела лиственничной губки Fomitopsis oficienalis в 2004 г., штамм МГ-97 Т. asperellum — из почв Маганского лесопитомника Красноярского края в 1997 г., штамм МГ-6 Т. аsperellum — моноспоровый клон штамма МГ-97 — в 2001 г. в Московском государственном университете им. Ломоносова, штамм В-18-С T. versicolor был выделен из плодового тела на территории Красноярского края в 2004 г.

Культивирование грибов рода Trichoderma проводили в кол6ах Эйленмеера объемом 250 мл на жидкой питательной среде Чапека в течение 14 суток, затем культуральную жидкость фильтровали с использованием мембранных бактериологических фильтров на воронке Зейца под вакуумом. Отфильтрованную стерильную культуральную жидкость

исследовали на антибиотическую активность в отношении 9 штаммов видов рода Staphylococcus.

Для оценки биологической активности штамма В-18-С использовали водный экстракт мицелия. Мицелий наращивали на сусло-агаре в течение 14 суток в термостате при температуре 25+2°С. После чего мицелий высушивали в термостате при температуре 20+2°С и измельчали на гомогенезаторе до достижения частиц 0,01 мм. Для получения экстракта измельченную массу мицелия смешивали с дистиллированной водой в соотношении 1:30 к растворителю, после чего суспендировали на качалке при 120 оборотах при комнатной температуре в течение 4-х часов.

Для изучения бактерицидной активности водной вытяжки мицелия T. versicolor и культуральной жидкости штаммов Trichoderma были взяты 5 штаммов условно-патогенных грамположительных микроорганизмов Staphylococcus aureus, S. epidermidis, S. caprae, S. warneri, S. cophnii, выделенные от больных. Штаммы условно-патогенных микроорганизмов рода Staphylococcus, предоставлены коллекцией культур Красноярского научно-исследовательского института Проблем Севера (НИИ проблем Севера, г. Красноярск). Тест-организмы выращивали на унифицированной плотной питательной среде — агаре Мюллера-Хинтона. Для получения взвеси использовали сливной или полусливной рост посева микроорганизмов. Посев осуществляли путем инокуляции тампоном по методу Кирби-Бауэра. Посевная доза взвеси культур составляла 1,5х 108 КОЕ/мл (0,5 по стандарту мутности McFarland).

Оценку бактерицидной активности исследуемых экстрактов и культуральной жидкости осуществляли методом лунок по Егорову. Вытяжку вносили в лунки в количестве 0,1 мл. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37+2°С в течение суток. Учет результатов проводили с использованием линейки для измерения зон подавления роста.

Результаты и обсуждение

Скрининг штаммов рода Trichoderma по антибиотической активности в отношении условно-патогенных тест-объектов выявил два активных штамма грибов МГ-97 и Gt-4.

Примечание: слева — бактериостатическое действие метаболитов штамма МГ-97 на штамм S. haemoliticus; справа — бактерицидное действие метаболитов штамма МГ-97 на штамм S. aureus.

Рис. 1. Биологическая активность штаммов грибов рода Trichoderma в отношении условно-патогенных микроорганизмов видов S. aureus и S. haemoliticus.

Наибольшим спектром действия в отношении всех изученных штаммов условно-патогенных микроорганизмов обладают метаболиты, продуцируемые штаммом МГ-97 Trichoderma asperellum. В результате исследований было установлено, что культуральная жидкость штамма МГ-97 обладает биологической активностью в отношении всех исследуемых условно-патогенных грамположительных микроорганизмов, кроме S. caseoliticus (табл. 1). При этом наиболее чувствительным к метаболитам МГ-97 оказались штаммы S.cophnii и S. aureus, в отношении которых он проявлял бактерицидное действие. Диаметр зоны подавления роста варьировал от 24,8 до 27 мм, причем только метаболиты данного штамма подавляют штамм вида S. epidermidis.

Биологическая активность культуральной жидкости грибов рода

Trichoderma

Тест- культура Зона подавления роста, мм Контроль вода

Хср, мм m

МГ-97 Lg2 Gt4 МГ-6

S.delphinii 18 - 4,6 - 0,3 —

S.cophnii 25 - - 0 —

S.hаemolitiсus 24 - - - 0 —

S.warneri 27,6 - - - 0,2 —

S.intermedius 27,6 - 10 - 0,2 —

S.epidermidis 22,6 - - - 0 —

S.aureus 24,6 - - - 0,2

S.caseoliticus - - - - -

S.equorum 22,9 4,8 0,1

Примечание: 1 — водная вытяжка мицелия Trametes versicolor; 2 — водная вытяжка мицелия Trametes versicolor в разведении 1:10; 3 — водная вытяжка плодовых тел Trametes versicolor; 4 — водная вытяжка плодовых тел Trametes versicolor 1:10; 5 — контроль (вода).

Рис. 2. Зона подавления роста S. delphini водным экстрактом мицелия Trametes versicolor.

Примечание: « — » — активность не выявлена.

Штамм С1:-4 проявлял бактериостатические свойства в отношении трех видов тест-объектов equorum, 5. т1егтесИт, 5. Ьаето1Шст, однако степень активности метаболитов оценивается как низкая. Диаметр зоны подавления роста не превышал 10 мм.

Таблица 1 Отсутствие антимикробной активно-

сти у моноспорового клона МГ-6 можно объяснить гетерогенностью свойств штамма МГ-97, из которого он был получен.

В результате исследований водного экстракта мицелия гриба T. versicolor было установлено, что штамм В-18-С обладает биологической активностью в отношении всех исследуемых условнопатогенных грамположительных микроорганизмов, кроме S. epidermidis (табл. 2), степень активности оценивается как средняя. Причем активность в отношении грамположительных стафилококков проявляется только в экстрактах из мицелия, а экстракты из плодовых тел

антибиотической активностью не обладают (рис. 2). Данные, полученные в результате проведенных ис-

Таблица 2

Биологическая активность экстракта гриба

Trametes versicolor

Тест- культура Зона подавления роста, мм Контроль вода

Хср m

S. delphini 13 0,5 —

S. epidermidis — — —

S. hemoliticus 17 0,6 —

S. intermidius 14,3 0,7 —

S. schleiferi 13,3 0,5 —

S. warneri 14 0,5 —

Примечание: « — » — активность не выявлена.

следований, указывают, на то, что культуральная жидкость штаммов МГ-97, Gt-4 грибов рода Trichoderma и водная вытяжка из мицелия базидиомицета Trametes versicolor содержат активные антимикробные вещества в отношении условно-патогенных стафилококков. В этой связи они могут представлять особый интерес, так как являются потенциальным биологическим ресурсом для получения противомикробных препаратов для грамположительных условно-патогенных микроорганизмов.

ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF TRICHODERMA AND TRAMETES FUNGI TOWARDS MICROORGANISMS FROM GENUS STAPHYLOCOCCUS

V.S. Sadykova, G.K. Kovaleva, N.M. Chizhmotry, A.G. Gavrilova, T.I. Gromovykh, I.A. Novitsky

Mycromycetes of Trichoderma as well as basidiomycetes from Trametes genus were investigated towards antibiotic resistant strains of Staphylococcus obtained from infected humans. It was observed that hot water extract from Trametes mycelium and methabolites of some Trichoderma strains had bactericidal effect towards bacteria. The strain ofMr-97 Trichoderma asperellum and B-18-C Trametes versicolor can be reccomended as potential new antimicrobial agents for the battle against staphylococcal infections.

ЛИТЕРАТУРА

1.

Александрова А.А., Великанов Л.Л., Сидорова И.И. Исторический обзор и современная система рода Trichoderma (EUMYcOTA, DEUTEROMYCOTINA, HYPHOMYCETES) // Микология и фитопатология. -2004. — Т. 38, вып. 1. — С.3-141.

Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Филимонова Т.В. и др. Phallus impudicus и Trametes versicolor — перспективные объекты биотехнологии // Мат. IV съезда Успехи медицинской микологии. — 2006. — Т. 7. — С.220-222.

3. Галатенко О.А., Терехова Л.П., Булина Т.И. Методы

2.

изыскания новых антибиотиков // Биотехнология. — 2004. — № 4. — С. 17-21.

4. Чхенкели В.А. Биоэкологические аспекты изучения и использования биологически активных веществ дереворазрушающего гриба Coriolus pubescens (Shum.: FR.) Ouel.: Автореф ...дисс. д.м.н. — Иркутск, 2006.

5. Barber M. // Clin. Pathol. — 1961. — Vol. 14. — P.385-393.

6. Jevons M.P // Br. Med. J. — 1961. — Vol. 1. — P. 124-125.

7. Howell C.R. Cotton seedling pre-emergence damping-oV incited by Rhizopus oryzae and Pythium spp. and its biological control with Trichoderma spp. // Phytopathology. — 2002. — Vol. 92. — P. 170-182.