СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, ОБЛАДАЮЩЕГО ГЕПАТОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
METHOD OF OBTAINING PREPARATION WITH HEPATOPROTECTIVE ACTIVITY

Изобретение относится к медицине, а именно к получению препарата, обладающего гепатопротекторным действием.
В настоящее время известна группа гепатопротекторных средств («Карсил», «Силимарин», «Гепабене», «Гептрал», «Гепа-Мерц», «Уросан» и другие) основным недостатком которых является гиперчувствительность к активному или любому из вспомогательных веществ, возможность аллергических реакций, а также диспепсия и диарея.
Целью изобретения является расширение арсенала отечественных гепатопротекторных средств природного происхождения.
Поставленная цель достигается тем, что предложен способ получения ге-патопротекторного средства, содержащего 0,1% раствор гиматомелановых кислот, выделенных из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, сформированных в восстановительной среде.
Способ включает добавление к 0,50 г гиматомелановых кислот, выделенных из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей согласно методике (1), 50,0 см 0,15 моль/дм раствора натрия гидроксида; термостатирование на водяной бане в течение 3-4 часов при температуре 40°С; фильтрование через бумажный фильтр, нейтрализацию раствора 0,10 моль/л раствором хлороводородной кислоты с использованием рН-метра до значения 7,4; доведение объема дистиллированной водой до 500 см. Готовый раствор расфасовывают в склянки темного стекла, плотно укупоривают и стерилизуют УФ-лучами с помощью бактерицидной лампы.
Гепатопротекторная активность препарата, полученного предложенным способом, подтверждена данными экспериментальных исследований. Эксперимент выполняли на 60 белых беспородных крысах-самцах половозрелого возраста массой 180-200 г, которые содержались в стандартных условиях вивария. Интоксикацию лабораторных животных осуществляли введением отечественной смеси полихлордифенилов (ПХД) торговой марки «Совол» состава:26% тетра-, 64,6% пента-, 9% гексахлордифенилов и следовые количества гептахлордифенилов.
50
Было сформировано три группы экспериментальных животных. Первая группа (контрольная): животные (n=20), получившие однократно внутрижелу-дочно с помощью металлического зонда оливковое масло объемом 1,0 мл. Вторая группа (сравнения): животные (n=20), однократно получившие внутри-желудочным введением при помощи металлического зонда смеси полихлор-дифенилов (ПХД) торговой марки «Совол» в оливковом масле объемом 1,0 мл в расчете 50 мг ПХД на 1 кг массы (0,1LD).
Третья группа (опытная): животные (n=20), однократно получившие 50 мг/кг ПХД торговой марки «Совол» путем внутрижелудочного введения в растворе оливкового масла, которых далее подвергали терапии путем внутрибрюшинных инъекций полученного по предлагаемому способу 0,10% раствора гиматомелановых кислот по 0,2 мл (0,1 мг/кг массы) 1 раз в день в течение 10 дней. Лечение начинали с первого дня эксперимента.
Забой животных осуществляли методом одномоментной декапитации под хлороформным наркозом на 3-й и 10-ые сутки.
3
Гепатопротекторную активность средства оценивали по показателям активности аспартатаминотрансферазы (ACT) и аланинаминотрансферазы (АЛТ), количеству билирубина и холестерина в крови и гомогенате печени. Кровь забирали в сухие стерильные пробирки. Материал центрифугировали при 3000 об/мин. Сыворотку отбирали для дальнейшего биохимического анализа. Активность ACT и АЛТ определяли фотометрическим методом Райтмана - Френкеля при помощи стандартных наборов реактивов. Количество общего билирубина определяли методом Иешдрашика-Грофа с использованием кофеинового реактива и диазосмеси. Количество холестерина осуществляли по методу Ильке: пробы обрабатывали реактивом Либермана - Бурхарда, интенсивность окраски определяли фотоколориметрически с толщиной кюветы 5 мм, на красном светофильтре. Концентрацию холестерина в моль/дм определяли по калибровочному графику.
Расчеты и оценка полученных результатов выполнены с использованием пакета программ статистической обработки данных SPSS 12.0.2 и программы StatSoft Inc. Statistica, 6.0.
Для морфологического исследования образцы ткани доли печени размером 3x3x2 мм фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина в течении 24 часов. Затем материал проходил стандартную обработку. Для микроскопического исследования срезы окрашивались гематоксилином, эозином и пикро-фуксином. Морфологические исследования гистологических препаратов проводили с помощью светооптического микроскопа «ОГутрш СХ 21 FS 1» с увеличением 400. Микрофотографирование проводили с помощью цифровой камеры «01ympus» С - 4000 ZOOM.
В процессе эксперимента смертность животных не наблюдали. После однократного введения ПХД у экспериментальных животных развивалось токсическое поражение печени, что подтверждалось повышением активности ферментов-маркеров по отношению к контролю.
Изменения показателей АлТ и ACT на 3 и 10 сутки эксперимента в плазме крови, представлены в Таблице 1 Приложения 1:
- АлТ и АсТ на третьи соответственно на 18% и 27% (р<0,05) в плазме крови;
- АлТ и АсТ на и десятые сутки соответственно на 36% и 59% (р<0,05) в плазме крови;
Изменения показателей АлТ и ACT на 3 и 10 сутки эксперимента в гомогенате печени, представлены в Таблице 2 Приложения 1:
- АлТ и АсТ на третьи сутки соответственно на 27% и 28%) (р<0,05) в гомогенате печени;
- АлТ и АсТ на десятые сутки соответственно на 37% и 35% (р<0,05) в гомогенате печени.
Введение раствора гуминовых кислот пелоидов снижает выраженность цитоли-тических процессов по отношению ко 2-ой группе животных:
- АлТ и АсТ на третьи сутки соответственно на 34% и 25% (р<0,05) в плазме крови;
- АлТ и АсТ на десятые сутки соответственно на 31% и 36% (р<0,05) в плазме крови;
- АлТ и АсТ на третьи сутки соответственно на 40% и 37% (р<0,05) в гомоге-нате печени;
- АлТ и АсТ на десятые сутки соответственно на 32% и 27% (р<0,05) в гомоге-нате печени.
Общее количество билирубина на 3 сутки после интоксикации смесью поли-хлордифенилов (ПХД) торговой марки «Совол»(Таблица 3 Приложения 1) в гомогенате печени животных превысило норму в 10 раз. Уровень холестерина в группе сравнения держался во все время эксперимента на 25% выше нормы.
После применения средства, полученного по предложенному способу, содержание билирубина в гомогенате печени животных третьей группы уменьшилось в 2 раза на 3 сутки и на 10 сутки соответствовало физиологической норме (Таблица 3 Приложения 1).
Общее количество билирубина и холестерина в плазме крови на 10 сутки после интоксикации смесью полихлордифенилов (ПХД) торговой марки «Совол» превысило норму на 50% и 25% соответственно. После применения средства, полученного по предложенному способу, на 10 сутки количество билирубина и холестерина в плазме животных третьей группы стало ниже физиологической нормы на 8% и 20% соответственно (Таблица 4 Приложения 1). Следовательно, терапия 0,1% раствором гиматомелановых кислот, полученным по разработанному способу, в течение 10 дней вызвала регрессию биохимических показателей в сыворотке крови и гомогенате печени крыс, интоксициро-ванных ПХД и нормализовала исследуемые показатели по сравнению с контролем.
Гистологические срезы ткани печени экспериментальных животных после интоксикации ПХД выявили нарушение структуры печени. На третьи сутки эксперимента наблюдается массивная гибель эпителиоцитов, нарушение радиального расположения печеночных балок и разрыв анастомозов. На десятые сутки наблюдения в центральных зонах печеночных долек формируются очаги некроза и усиливается венозный застой.
Под действием терапии животных третьей группы 0,10% раствором гиматомелановых кислот, полученным по разработанному способу на третьи сутки эксперимента наблюдали уменьшение патологических изменений: синусоиды ге-мокапилляров умеренно расширены; при этом дистрофические изменения носят очаговый характер, большинство гепатоцитов имеют нормальную форму, размеры и структуру. На 10 сутки в клетках обнаруживается гликоген, очаги некроза отсутствуют, структура стенки междольковых артерий и желчных протоков в триадах практически не отличается от структуры ткани печени крыс контрольной группы.
Таким образом результаты лабораторных и морфологических исследований в эксперименте на животных свидетельствуют о гепатопротекторной активности средства, содержащего 0,1% раствор гиматомелановых кислот, полученного по разработанному способу. Заявленное средство не вызывало у животных аллергических реакций.
Заявленный способ можно использовать для получения средства, обладающего гепатопротекторной активностью с целью расширение арсенала отечественных гепатопротекторных средств природного происхождения.