Гидролиз инулина с помощью гетерогенных биокатализаторов

Химия растительного сырья. 2012. №2. С. 27-31.

УДК 541.183.123.8

ГИДРОЛИЗ ИНУЛИНА С ПОМОЩЬЮ ГЕТЕРОГЕННЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ

© И.В. Шкутина , О.Ф. Стоянова, В. Ф. Селеменев

Воронежский государственный университет, Университетская пл., 1,

Воронеж, 394006 (Россия), e-mail: irn55@mail.ru

Проведена адсорбционная иммобилизация гидролитического фермента инулиназы на неионогенном сорбенте «Стиросорб» и анионообменнике MN-200. Исследована сорбционная способность носителей по отношению к ферменту в зависимости от концентрации ионов водорода и белка в растворе. Выявлена высокая каталитическая активность иммобилизованных препаратов фермента. Показано, что иммобилизация инулиназы приводит к расширению диапазона оптимальных значений pH и температур действия гетерогенного биокатализатора.

Ключевые слова: инулиназа, адсорбционная иммобилизация, каталитическая активность.

Получение фруктозы из инулинсодержащих растений относится к одному из перспективных на -правлений переработки растительного сырья. Инулин содержится в клубнях и корнях топинамбура, якона, лопуха, девясила, цикория, одуванчика и ряда других растений. Вместе с инулином почти всегда присутствуют родственные углеводы: псевдоинулин, инуленин, левулин, гелиантенин, синистрин, иризин, дающие, как и инулин, при гидролизе Б-фруктозу. Получение фруктозы из инулина возможно путем кислотного или ферментативного гидролиза. В отличие от кислотного гидролиза ферментативный процесс превращения инулина с помощью инулиназы (2,1-р-Б-фруктан-фруктаногидролаза, КФ 3.2.1.7) является более экологичным, протекает при более низкой температуре и требует меньшей концентрации ионов водорода. При этом не образуется побочных продуктов, которые усложняют выделение и очистку фруктозы. Расщепление инулинсодержащего сырья с использованием инулиназы позволяет получить в одну стадию 95%-ный фруктозный сироп [1].

Фруктоза широко применяется в качестве сахарозаменителя в диабетическом, диетическом питании, в пищевой и фармацевтической промышленности. Возможности практического применения фруктозных сиропов обеспечивают постоянный интерес к инулиназе и методам ее иммобилизации. Иммобилизация способствует прежде всего многократному использованию гетерогенных биокатализаторов и повышению устойчивости их к денатурирующим факторам среды.

Известны работы по получению иммобилизованной инулиназы включением в полиакриламидный гель и гель на основе каррагенана [2]. Представляет интерес способ производства этанола из инулинсодер-

Введение

Шкутина Ирина Викторовна - доцент кафедры аналитической химии, кандидат биологических наук, e-mail: im55@mail.ru

Стоянова Ольга Федоровна - доцент кафедры аналитической химии, кандидат химических наук, e-mail: common@anchem.vsu.ru

Селеменев Владимир Федорович - заведующий кафедрой аналитической химии, доктор химических наук, профессор, e-mail: common@anchem.vsu.ru

жащего сырья с помощью инулиназы, иммобилизованной на альгинатных шариках [3]. Инулиназу им-мобилизовывали методом ковалентного связывания на полисахаридных носителях, которые готовили на основе крахмала, инулина, а также смеси этих полимеров с Р-циклодекстрином. Выявлено, что лучшие результаты получены при использовании крахмала с Р-циклодекстрином. При этом количество связанного фермента составляет 4,8 мг и сохраняет-

* Автор, с которым следует вести переписку.

ся 74,4% исходной активности фермента [4]. Положительные результаты получены при иммобилизации инулиназы на анионообменнике Streamline DEAE [5]. В работах Т.А. Ковалевой [6, 7] показано, что при иммобилизации инулиназы адсорбционным методом на ВИОН КН-1 сохранялось 27,5%, на КУ-2 - 61,7%, а при ковалентной иммобилизации фермента на АВ-17-2П - 75,5% от активности нативного фермента.

Цель настоящей работы - адсорбционная иммобилизация инулиназы на сверхсшитых сорбентах типа «Стиросорб».

Экспериментальная часть

Объектами исследования служили препараты свободной и иммобилизованной инулиназы Aspergillus awamori BKMF 2250, субстрат - инулин фирмы «Spofa». В качестве носителей выступали сверхсшитые сорбенты типа «Стиросорб» на основе стирола с дивинилбензолом - неионогенный сорбент Стиросорб (Sya = 910 м2/г) и MN-200 (Sya = 1050 м2/г), проявляющий анионообменные свойства [8]. Носители предварительно подвергались кондиционированию для удаления органических и неорганических примесей. Для подготовки к работе навески сорбентов заливали ацетоном, оставляли на 6 ч. Далее сорбент отмывали дистиллированной водой. Контроль за содержанием ацетона в растворе осуществляли спектрофотометриче-ским методом при длине волны 211 нм [9].

Иммобилизацию проводили адсорбционным методом в статических условиях при температуре 20 °С при периодическом перемешивании в течение 4 ч. Общее количество белка в нативных ферментных препаратах определяли методом Лоури, в иммобилизованных ферментах - модифицированным методом Лоури [10]. Десорбция белка в буферные растворы составляла не более 2%. Опыты по определению активности ферментных препаратов проводили в термостатируемом реакторе с перемешиванием. Каталитическую активность измеряли фотометрическим методом по реакции Селиванова с помощью резорцина [11]. За единицу активности инулиназы принимали такое количество фермента, которое катализирует гидролиз инулина в течение 1 мин с образованием 1 мкмоль фруктозы. Стандартное отклонение полученных результатов не превышало величину 0,01.

Обсуждениерезультатов

Исследование иммобилизации ферментов предполагает эффективное сочетание подбора носителя с различными условиями и параметрами системы, обеспечивающее максимальное сохранение активности фермента в твердой фазе. При связывании фермента с носителем необходимо учитывать такой важный фактор, как pH среды. В состав активного центра инулиназы Aspergillus awamori входят р- и у-карбо-ксильные группы глутаминовой и аспарагиновой кислот и имидазольная группа гистидина, значения констант протеолиза которых составляют pKj=2,8 и рК2=5,5 [12]. Полученная экспериментальная зависимость количества иммобилизованной инулазы от кислотности среды свидетельствует, что максимальная сорбция белка происходит в интервале pH 4,5-5,0, при котором большая часть фермента находится в виде цвиттер-иона (рис. 1).

Сорбция инулиназы на рассматриваемых сорбентах описывается изотермой Ленгмюра (рис. 2). Количество связанного белка для неионогенного «Стиросорба» составляет 26,3 мг/г, для «Стиросорба» MN-200 - 19,8 мг/г. Сверхсшитые полимеры на основе стирола обладают способностью резко увеличивать свой объем в набухшем состоянии. Поэтому данный тип полимеров интенсивно поглощает органические вещества из водных растворов, проявляя высокую сорбционную емкость, намного превышающую емкость из -вестных типов органических сорбентов. Сорбенты типа «Стиросорб» отличаются также хорошими кинетическими характеристиками и легкостью регенерации. Проведенные ранее нами исследования показали перспективность применения «Стиросорба» в качестве носителя при иммобилизации другого амилолити-ческого фермента - глюкоамилазы [13-15].

Основная роль при сорбции белка на сверхсшитых сорбентах принадлежит гидрофобным взаимодействиям. Высокая удельная поверхность способствует проявлению тс-тс-электронного взаимодействия ме^ду сорбируемым соединением и матрицей сорбента. Кроме того, из-за неполной полимеризации сорбенты содержат 5-6% кислорода в виде гидроксильных, эфирных, карбонильных групп, что способствует образованию водородных связей с сорбируемыми веществами. Для сорбента MN-200 возможно также проявление электростатических взаимодействий ме^ду сорбентом и сорбатом.

30

О,мг/г

25

20

15

10

рн

Рис. 1. Зависимость количества сорбированной инулиназы (Р, мг/г) на «Стиросорбе» (1) и МЫ-200 (2) от pH равновесного раствора

СХ10, моль/л

Рис. 2. Изотермы сорбции инулиназы на «Стиросорбе» (1) и МЫ-200 (2) при pH 4,7 равновесного раствора. Р - количество сорбированной инулиназы, мг/г; С - исходная концентрация белка в растворе, моль/л

Одним из основных свойств гетерогенных биокатализаторов является каталитическая активность, которая при иммобилизации, как правило, уменьшается из-за изменения структурно-функциональных свойств белка и диффузионных затруднений при подходе субстрата к каталитическим группам активного центра фермента. С этой целью были оценены кинетические параметры реакции гидролиза инулина свободным и иммобилизованным биокатализаторами (табл.). Установлено, что связывание инулиназы на рассматриваемых сорбентах приводит к незначительному увеличению Кт и уменьшению Ущах по сравнению со свободным ферментом, что свидетельствует о сохранении нативной структуры белка при адсорбционной иммобилизации.

Изучение зависимости активности фермента от концентрации ионов водорода и температуры позволило установить оптимальные условия функционирования иммобилизованного фермента. Отмечено, что при иммобилизации инулиназы наблюдается по сравнению с нативным ферментом расширение интервала концентраций ионов водорода, при которых гидролиз протекает с максимальной скоростью. При переходе от pH оптимума в более кислую и щелочную область активность иммобилизованного фермента становится даже выше, чем нативного (рис. 3).

Максимальную активность как свободный, так и иммобилизованный фермент проявляет при температуре 50-55 °С (рис. 4). Активность иммобилизованной инулиназы на «Стиросорбе» составляет 90% от активности свободного фермента, на МЫ-200 - 77%. При дальнейшем повышении температуры каталитическая активность нативной инулиназы быстро снижается, а у иммобилизованного биокатализатора достаточно высокая активность сохраняется и при 80 °С. Данный фактор, вероятно, обусловлен тем, что при иммобилизации фермента повышается конформационная жесткость третичной структуры белка в резуль -тате многоточечного связывания с носителем, препятствующая деформационному разворачиванию и тем самым инактивации.

Таким образом, можно отметить, что pH и температурный оптимумы при иммобилизации биокатализатора не только сохраняются, но даже расширяются. Данное обстоятельство является благоприятным фактором, поскольку не изменяются производственные условия работы для гетерогенного биокатализатора.

В результате проведенных исследований показана перспективность применения сорбентов типа «Стиросорб» для иммобилизации инулиназы. Полученные данные представляют собой результат оценки поведения фермента в конкретных условиях, который предопределяет возможность внедрения биокатализатора в технологический процесс.

Кинетические параметры реакции гидролиза инулина свободной и иммобилизованной инулиназой

Фермент Утах, мкмоль мг/мин Ктх10 4, моль/л

Свободная инулиназа 13,8 1,9

Иммобилизованная инулиназа на «Стиросорбе» 12,5 2,5

Иммобилизованная инулиназа на МЫ-200 10,6 3,7

1

2

5

0

2

3

4

5

6

7

А,Ед/мг

pH Температура,0С

Рис. 3. Зависимость активности инулиназы от pH Рис. 4. Зависимость активности инулиназы от

среды: 1 - инулиназа, иммобилизованная на температуры

«Стиросорбе»; 2 - инулиназа, иммобилизованная на MN-200; 3 - свободная инулиназа

Выводы

Определены условия получения гетерогенных биокатализаторов на основе гидролитического фермента инулиназы. Рассчитаны кинетические параметры реакции гидролиза инулина свободной и иммобилизованной инулиназой. Установлено, что иммобилизованная инулиназа на неионогенном носителе «Стиросорб» сохраняет 90% от активности свободного фермента, а на cop6eHTe MN-200 - 77%. Иммобилизация приводит к расширению диапазона оптимальных значений pH (4,0-5,0) и температуры действия (50-75 °С) фермента. В результате проведенных исследований показана перспективность применения сорбентов типа «Стиросорб» для иммобилизации инулиназы.

Список литературы

1. Корнеева О.С. Карбогидразы: препаративное получение, структура и механизм действия на олиго- и полисахариды. Воронеж, 2001. 184 с.

2. Gurta А.К., Nagpal В., Kaur N. et. Al. Production thermal stability and immobilization of inulunase from Fusarium oxysprorum // J. Chem. Technol. and Biotechnol. 1990. V. 47, N3. Pp. 245-257.

3. Kum D.M., Kem H.S. Continuous production of gluconic acid and sorbital from Jerusaleum artishoke and gluconic using an oxidoriductase from Zymomonas mobilis and inulinase // Biotechnol. and Bioeng. 1992. V. 39, N3. Pp. 336-342.

4. Абелян B.A., Манукян Л.С. Иммобилизация микробной инулиназы на различных носителях // Прикладная биохимия и микробиология. 1992. Т. 28, вып. 3. С. 356-361.

5. Makino Y., Lima P.S.C., Filho F.M., Rodrigues M.I. Adsorbtion of the inulinase from Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 on Streamline DEAE resin // Braz. J. Chem. Eng. 2005. V. 22, N.4. Pp. 539-545.

6. Ковалева T.A., Холявка М.Г., Таха A.C. Разработка гетерогенного катализатора на основе иммобилизованного препарата инулиназы из Kluyveromyces marxianus // Биотехнология. 2007. №3. С. 80-87.

7. Ковалева Т.А., Холявка М.Г., Таха А.С. Исследование некоторых параметров иммобилизованной инулиназы из Kluyveromyces marxianus как перспективного катализатора реакции гидролиза инулина // Биотехнология. 2009. №2. С. 55-59.

8. Филиппов О.А., Тихомирова Т.И., Цизин Г.И., Золотов Ю.А. Динамическое концентрирование органических веществ на неполярных сорбентах // Журнал аналитической химии, 2003. Т. 58, №5. С. 454-479.

9. Селеменев В.Ф., Славинская Г.В., Хохлов В.Ю. и др. Практикум по ионному обмену. Воронеж, 2004. 160 с.

10. Chibata I. Industrial application of immobilized enzyme system // Pure and Appl. Chem., 1978. V. 50, N7. Pp. 667-675.

11. Nakamura T., Nakatsu S. General properties of extracellar inulase from Penicillum // J. Agr. Chem. Loc. Jap. 1997. V. 1, N12. Pp. 681-689.

12. Жеребцов H.A., Корнеева O.C., Тертычная Т.Н. О механизме каталитического действия карбогидраз (обзор) // Прикладная биохимияи микробиология. 1999. Т. 35, №2. С. 123-132.

13. Патент N 2181770 (РФ). Способ получения иммобилизованной глюкоамилазы / В.Ф. Селеменев, О.Ф. Стоянова, И.В. Шкутина и др. // БИ. Опубл. 27.04.2002. №12.

14. Шкутина И.В., Стоянова О.Ф., Селеменев В.Ф. Адсорбционная иммобилизация глюкоамилазы на неионогенном сорбенте «Стиросорб» // Журнал прикладной химии, 2001. Т. 74, №5. С. 869-871.

15. Шкутина И.В., Стоянова О.Ф., Селеменев В.Ф., Григорьева Г.А. Зависимость термостабильности свободной и иммобилизованной глюкоамилазы от концентрации ионов водорода // Журнал физической химии, 2001. Т. 75, №12. С. 2292-2293.

Поступило в редакцию 29 июня 2011 г.

Shkutina I.V.*, Stoyanova O.F., Selemenev V.F. HYDROLYSIS OF INULIN ON HAND OF HETEROGENEOUS BIOCATALYSTS

Voronezh State University, Department of Chemistry, Universitetskaia pl., 1, Voronezh, 394006 (Russia), e-mail: irn55@mail.ru

The adsorption immobilization of the inulinase hydrolyte enzyme was carried out on the non-ionogenic sorbent of Stiro-

sorb and the anion-supporter MN-200. By means of sorption examination and photometry, the sorption aptitude of carriers re-

garding the enzyme was investigated subject to the concentration of the ions of hydrogen and protein in the solution. It was stated that inulinase immobilized on the non-ionogenic supporter preserves 90% of the free enzyme activity, whereas on the anion supporter MN-200 it is 77%. It was shown that the immobilization of inulinase could lead to widening of the range both of pH optimum values (4,0-5,0) and the temperature effect (50-75 °C) of the heterogeneous biocatalyst. Following the conducted investigations, the prospects of application of sorbents like Stirosorb for inulinase immobilization were shown. Keywords: inulinase, adsorption immobilization, catalytic activity.

Referenses

1. Korneeva O.S. Karbogidrazy: preparativnoe poluchenie, struktura i mekhanizm deistviia na oligo- i polisakharidy. [Car-bohydrases: Preparative obtaining the structure and mechanism of action on oligo-and polysaccharides]. Voronezh, 2001, 184 p. (in Russ.).

2. Gurta A.K., Nagpal V., Kaur N. et.al. J. Chem. Technol. and Biotechnol, 1990, vol. 47, no. 3, pp. 245-257.

3. Kum D.M., Kem H.S. Biotechnol. andBioeng, 1992, vol. 39, no. 3, pp. 336-342.

4. Abelian V.A., Manukian L.S. Prikladnaia biokhimiia i mikrobiologiia, 1992, vol. 28, no. 3, pp. 356-361. (in Russ.).

5. Makino Y., Lima P.S.C., Filho F.M., Rodrigues M.I. Braz. J. Chem. Eng, 2005, vol. 22, no. 4, pp. 539-545.

6. Kovaleva T.A., Kholiavka M.G., Takha A.S. Biotekhnologiia, 2007, no. 3, pp. 80-87. (in Russ.).

7. Kovaleva T.A., Kholiavka M.G., Takha A.S. Biotekhnologiia, 2009, no. 2, pp. 55-59. (in Russ.).

8. Filippov O.A., Tikhomirova T.I., Tsizin G.I., Zolotov Iu.A. Zhurnal analiticheskoi khimii, 2003, vol. 58, no. 5. pp. 454-479.

(in Russ.).

9. Selemenev V.F., Slavinskaia G.V., Khokhlov V.Iu. etc. Praktikum po ionnomu obmenu. [Workshop on ion exchange]. Voronezh, 2004, 160 p. (in Russ.).

10. Chibata I. Pure andAppl. Chem., 1978, vol. 50, no. 7, pp. 667-675.

11. Nakamura T., Nakatsu S. J. Agr. Chem. Loc. Jap, 1997, vol. 1, no. 12, pp. 681-689.

12. Zherebtsov N.A., Korneeva O.S., Tertychnaia T.N. Prikladnaia biokhimiia i mikrobiologiia, 1999, vol. 35, no. 2, pp. 123-132. (in Russ.).

13. Patent 2181770 (Russia). V.F. Selemenev, O.F. Stoianova, I.V. Shkutina etc. 2002. (in Russ.).

14. Shkutina I.V., Stoianova O.F., Selemenev V.F. Zhurnalprikladnoi khimii, 2001, vol. 74, no. 5, pp. 869-871. (in Russ.).

15. Shkutina I.V., Stoianova O.F., Selemenev V.F., Grigor'eva G.A. Zhurnal fizicheskoi khimii, 2001, vol. 75, np. 12, pp. 2292-2293. (in Russ.).

Received June 29, 2011

* Corresponding author.