ОПТОВОЛОКОННЫЙ КОНФОКАЛЬНЫЙ СКАНИРУЮЩИЙ МИКРОСКОП
FIBER-GLASS CONFOCAL SCANNING MICROSCOPE

Изобретение относится к устройствам регистрации излучения, возбуждаемого в локальных областях среды при фокусировке лазерного освещения, и последующего синтеза двухмерного и трехмерного изображений по результатам пространственного сканирования объекта световым пучком. Устройство может быть использовано для спектрального исследования различных биологических сред, включая флуоресцентную диагностику для решения прикладных задач медицины. Конфокальная микроскопия имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционной оптической микроскопией, включая регулируемую глубину поля, исключение ухудшающей изображение внефокусной информации, возможность последовательного анализа оптических срезов толстых образцов.
Известен «Аппарат для микроскопии», являющийся первым описанием конфокального микроскопа (MARVIN MlNSKY АМ/111 7- ATTORNEYS United States Patent office Patented Dec. 19, 1961 3,013,467 MICROSCOPY APPARATUS Marvin Minsky, 44 Bowdoin St., Cambridge, Mass. Filed Nov. 7, 1957, Ser. No. 695,107 4 Claims. C1. 88-14). Устройство, согласно изобретению (Патент М. Минский), содержит источник излучения 10, 12 с точечной коллимирующей диафрагмой 16, объектив 11, конфокальную диафрагму 26, фотоприемник 28, светоделительную пластину 17, причем отражающая поверхность пластины 17 обращена к объективу 11 и фотоприемнику 28 с конфокальной диафрагмой 26, а прозрачная поверхность пластины 17 обращена к источнику освещения 10, 12 с точечной коллимирующей диафрагмой 16, устройство пространственного сканирования объекта (Патент М. Минский). Из описания патента следует, что излучение источника проходит сквозь делительную пластину к объекту, а возвращается по другому пути: отражается от делительной пластины и направляется через конфокальную диафрагму на фотоприемник. В данном случае делительная пластина выполняет функцию невзаимного устройства - трех портового циркулятора (Y-циркулятора). Данное техническое решение позволяет исключить внефокусные лучи, задерживаемые конфокальной диафрагмой и, на основе данных о смещении образца устройством пространственного сканирования, построить двухмерное или трехмерное изображение с высокой контрастностью. Механическая система сканирования объекта исследований построена с использованием резонатора на изгибных колебаниях, возбуждаемых электромагнитными устройствами, синхронизированными с разверткой электронного луча осциллографа.
Основной недостаток устройства - система фокусировки светового пучка точечного источника 16 на объекте и система управления положением конфокальной диафрагмы 26, должны с высокой точностью обеспечить совмещение изображения освещенной локальной области объекта с точечной конфокальной диафрагмой, размещаемой в сопряженной плоскости объектива. При высоком разрешении микроскопа, вследствие «двойной фокусировки», предъявляются высокие требования к оптомеханике устройства. Кроме того, формирование точечного источника света из протяженного источника с помощью диафрагмы 16 не позволяет получить достаточно высокую плотность мощности сканирующего пучка осветителя на объекте. Представленная механическая система сканера с резонатором, на котором закреплен объект исследований, не может обеспечить независимого смещения по осям координат и имеет ограниченные возможности по исследованию различных сред, подвергающихся вибрационному воздействию.
Наиболее близким по совокупности признаков является прибор фирмы Dilor (Франция), ориентированный на проведение измерений с высоким спектральным разрешением, в котором флуоресцентные изображения объектов реконструируются только на основе записанных спектров (А.В. Феофанов «Спектральная лазерная сканирующая конфокальная микроскопия в биологических исследованиях». Успехи биологической химии - т. 47, 2007, с. 371-410, рис. 3 на с. 381). Прибор содержит лазерный источник излучения, возбуждающего флуоресценцию, устройство невзаимной коммутации направляемого на объект излучения и излучения отклика среды в виде светоделительной пластины, объектив, конфокальную диафрагму, фотоприемник с функцией разложения флуоресцентного излучения в спектр и его регистрации, устройство пространственного сканирования оптическим пучком анализируемой области объекта за счет перемещения объектива и синхронного сканирования подвижными зеркалами.
Недостатком данного устройства является наличие светоделительной пластины и, соответственно, необходимость в высокоточной системе синхронной фокусировки - фокусировки излучения на объекте и совмещения изображения фокального пятна в сопряженной плоскости объектива с точечной конфокальной диафрагмой. При этом, для возбуждения флуоресценции используется только одна длина волны лазера, а ее смена требует перенастройки прибора. Система сканирования, построенная на синхронном движении зеркал, отличается сложностью механических узлов и имеет ограничения по динамическим характеристикам сканера.
Техническим результатом изобретения является расширение функциональных возможностей устройства и упрощение конструкции микроскопа за счет применения оптоволоконного Y-циркулятора в качестве устройства невзаимной коммутации, направляемого на объект излучения и излучения отклика среды (Оптоволоконный коммутатор лазерного спектроанализатора. Патент RU 2632993 от 04.04.2016. Опубликовано: 11.10.2017, Бюл. №29).
Преимущество данной системы состоит в том, что она не содержит селективных делительных зеркал, элементов оптомеханики для выполнения оптической юстировки совмещения изображения фокального пятна сканирующего светового пучка с конфокальной диафрагмой в сопряженной плоскости объектива. Предложенный принцип коммутации оптических пучков решает задачу их разделения независимо от спектрального и модового состава излучения, а также поляризации. В рассматриваемом Y-циркуляторе невзаимность обусловлена топологией пространственной коммутации оптических пучков.
Пучок излучения выходного торца первого (однонаправленного) оптического волновода, сопряженного с лазерным источником, возбуждающим флуоресценцию, направляется в торец второго волновода под некоторым углом, задаваемым направляющей системой подложек с канавками в пределах апертурного угла оптического волокна. Излучение выходного торца второго волновода объективом фокусируется на поверхности или в объеме объекта. Отраженное и флуорецентное излучения освещенной локальной области объекта в пределах пространственного угла числовой апертуры собираются объективом и вводятся обратно в выходной торец второго (двухнаправленного) волновода. Пучок излучения объекта из второго волновода направляется в торец третьего (однонаправленного) волновода, расположенного по оси второго волновода. Выход третьего волновода является выходом Y-циркулятора и соединен с входом оптоволоконного спектрометра. Для регистрации спектра флуоресценции в оптический волновод лазерного источника и оптический волновод входа спектрометра дополнительно включены пропускающий и заграждающий фильтры лазерного излучения. Таким образом, выходная апертура второго волновода является как выходной апертурой лазерного источника, так и входной апертурой фотоприемника (конфокальной диафрагмой), блокирующей внефокусные лучи излучения объекта. Исключается высокоточная механика, обеспечивающая совмещение изображения точечного источника флуоресцентного излучения, возбужденного сфокусированным лазерным пучком, с точечной конфокальной диафрагмой, так как конфокальная диафрагма и точечный источник лазерного излучения совмещены в одной апертуре. Остается только одна независимая степень свободы - фокусировка возбуждающего флуоресценцию лазерного излучения в пространственных координатах объекта. Следствием этого является новая возможность построения устройства сканирования микроскопа, когда пространственное сканирование масштабированного объективом изображения апертуры торца второго волновода в сопряженной плоскости, совмещенной с объектом, осуществляется механическим сканированием торца второго волновода (конфокальной диафрагмы) в соответствующем масштабе смещений. Данное решение расширяет возможности построения сканеров наряду с известными техническими решениями - сканированием флуоресцентных сигналов с трехмерным субмикронным разрешением подвижными зеркалами, смещением объекта и смещением объектива. Устройство дополнительно содержит пропускающий и заграждающий оптические фильтры на выходе лазерного источника и входе оптоволоконного спектрометра в соответствии с известным техническим решением, обеспечивающим выделения флуоресцентного излучения на фоне возбуждающего лазерного излучения.
Данный технический результат достигается тем, что в оптоволоконном конфокальном микроскопе, содержащем лазерный источник излучения, устройство невзаимной коммутации, направляемого на объект излучения и излучения отклика среды, объектив, конфокальную диафрагму, фотоприемник, устройство пространственного сканирования анализируемой области объекта согласно изобретению, в качестве устройства невзаимной коммутации используется оптоволоконный Y-циркулятор, формирующий пространственное разделение коммутируемых оптических пучков, первый однонаправленный вход оптического волновода которого соединен с источником освещения объекта, а оптический пучок выходного торца этого волновода направляется в торец второго волновода под некоторым углом к оси второго волновода, задаваемым направляющей системой подложек с канавками в пределах апертурного угла оптического волокна, выходной торец оптического двунаправленного второго волновода является апертурой, формирующей световой пучок освещения объекта через объектив и, одновременно апертурой, являющейся конфокальной диафрагмой, фильтрующей излучение отклика среды объекта, проходящего обратно через этот же объектив и второй волновод в торец третьего однонаправленного волновода, расположенного по оси второго волновода, выход которого является выходом Y-циркулятора, соединенным с входом оптоволоконного спектрометра, а излучающий торец второго волновода соединен с механической системой смещения этого торца для сканирования масштабированного объективом изображения апертуры излучателя в сопряженной плоскости, совмещенной с объектом.
Сущность изобретения поясняется схемой, приведенной на Фиг. 1, на которой показан оптоволоконный конфокальный сканирующий микроскоп. Оптоволоконный Y-циркулятор (См. Фиг. 1), формирующий пространственное разделение коммутируемых оптических пучков включает оптические волокна 1, 2, и 3, размещенные на подложке 4. Конфокальная диафрагма и одновременно апертура лазерного излучателя 5 соответствуют выходному торцу оптического волновода 2. Лазерный источник 6, сопряженный с волокном 7 через оптический разъем 8 соединен с входом коллиматора 9, обеспечивающего функционирование пропускающего фильтра 10. Оптический выход коллиматора 9 соединен с волокном 1 Y-циркулятора. Объектив 11 формирует сканирующий лазерный пучок 12 на объекте 13. Выход волокна 3 соединен с входом коллиматора 14, содержащего заграждающий фильтр 15. Выход коллиматора 14 через оптический разъем 16 подключен к входу оптоволоконного спектрометра 17. Излучающий торец волокна 2 соединен с механической системой смещения этого торца 18.
Работа оптоволоконного конфокального сканирующего микроскопа (см. Фиг. 1) осуществляется следующим образом. Лазерный источник 6, через оптический волновод 7, оптический разъем 8 передает излучение на вход коллиматора 9, формирующего коллимированный пучок излучения с апертурой, необходимой для функционирования фильтра 10, пропускающего основную линию излучения лазера 6 и подавляющего остальное излучение. Выходное излучение коллиматора 9 поступает на вход волокна 1 Y-циркулятора. Выходной оптический пучок волокна 1 направляется на входной торец волокна 2 под заданным углом к оси волокна 2. Излучающий торец 5 волокна 2 расположен в фокальной плоскости объектива 11, формирующего сканирующий пучок 12, сфокусированный в сопряженной плоскости объектива 11 на исследуемым объекте 13. В локальном объеме сфокусированного лазерного излучения среда объекта 13 создает излучение флуоресценции. Это излучение в границах пространственного угла 12 вместе с отраженным лазерным излучением объективом 11 фокусируется на торце 5 волокна 2, апертура которого выполняет функцию конфокальной диафрагмы, так как иные лучи, кроме излучения из области фокусировки, не могут быть введены в волокно 2. Флуоресцентное излучение из волокна 2 в соответствие с направлением оптического пучка вводится в волокно 3, затем поступает в коллиматор 14, проходит через заграждающий фильтр 15, подавляющий лазерное излучение и пропускающий излучение флуоресценции. Выход коллиматора 14 через оптический разъем 16 соединен с входом оптоволоконного спектрометра 17, регистрирующего спектр флуоресценции сканируемой области объекта 13. Излучающий торец волокна 2 соединен с механической системой смещения этого торца 18. Смещение конфокальной диафрагмы 5, апертура которой также является излучателем, приводит к смещению фокального пятна в сопряженной плоскости объектива 11, расположенной на объекте 13.