СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ФОСФОРИРОВАННОЙ И НЕФОСФОРИЛИРОВАННОЙ ФОРМЫ RKIP В БИОЛОГИЧЕСКОМ ОБРАЗЦЕ

1. Способ количественного измерения белка RKIP и белка p-RKIP в биологическом образце, включающий следующие этапы:
a) нанесение на два отдельных носителя:
a1) антитела, распознающего первую аминокислотную последовательность, присутствующую в белке p-RKIP, и
а2) антитела, распознающего первую аминокислотную последовательность, присутствующую в белке RKIP;
b) добавление блокирующего раствора на оба носителя;
c) добавление биологического образца;
d) добавление на соответствующие носители:
d1) антитела, распознающего вторую аминокислотную последовательность, присутствующую в белке p-RKIP, и
d2) антитела, распознающего вторую аминокислотную последовательность, присутствующую в белке RKIP,
при этом одна из указанной первой и второй аминокислотной последовательности является общей для RKIP и p-RKIP, а другая представляет собой последовательность, содержащую фосфорилирование серина 153 и, следовательно, различна для p-RKIP и RKIP;
e) добавление маркера, способного определять изменение оптических свойств, пропорционально количеству указанного антитела, связанного с указанной второй аминокислотной последовательностью, при контакте с указанным антителом, распознающим указанную вторую аминокислотную последовательность;
f) измерение оптического свойства двух образцов и сравнение его с калибровочной кривой, полученной путем измерения того же оптического свойства двух серий носителей, в которые они были добавлены, в следующем порядке:
i) антитело, распознающее указанную первую аминокислотную последовательность, присутствующую в белке p-RKIP, для первой из указанных серий и указанную первую аминокислотную последовательность, присутствующую в белке p-RKIP, для второй из указанных серий
ii) блокирующий раствор
iii) известные и увеличивающиеся количества рекомбинантного гибридного стандарта, включающие в себя обе из указанных первой и второй аминокислотной последовательности, присутствующие в белке p-RKIP для первой из указанных серий, и обе из указанных первой и второй аминокислотной последовательности, присутствующие в белке RKIP для второй из указанных серии;
iv) антитела, распознающие указанную вторую аминокислотную последовательность, присутствующую в p-RKIP, или указанную вторую последовательность, присутствующую в RKIP, соответственно;
v) маркер, способный определять изменение оптических свойств, пропорционально количеству указанного антитела, связанного с указанной второй аминокислотной последовательностью, при контакте с указанным антителом, распознающим указанную вторую аминокислотную последовательность.
2. Способ по п. 1, характеризующийся тем, что указанный рекомбинантный гибридный стандарт, который включает как указанную первую, так и вторую аминокислотные последовательности, присутствующие в белке p-RKIP, имеет следующую аминокислотную последовательность
DPDAPSRKDPKYRE-(линкер)-GDHRGKFKVASFRKKYELRA.
3. Способ по п. 1 или 2, характеризующийся тем, что указанный рекомбинантный гибридный стандарт, который включает как указанную первую, так и вторую аминокислотные последовательности, присутствующие в белке RKIP, имеет следующую аминокислотную последовательность
DPDAPSRKDPKYRE-(линкер)-GDHRGKFKVASFRKKYELRA.
4. Способ по п. 3, характеризующийся тем, что как указанная первая последовательность, присутствующая в RKIP, так и указанная первая последовательность, присутствующая в p-RKIP, равна следующей последовательности
DPDAPSRKDPKYRE.
5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что указанная вторая последовательность, присутствующая в RKIP, является следующей
GDHRGKFKVASFRKKYELRA;
тогда как указанная вторая последовательность, присутствующая в р-RKIP, является следующей
GDHRGKFKVASFRKKYELRA.
6. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что указанными носителями являются лунки микротитрационного планшета ELISA, поскольку после пункта d) вводится следующий этап:
d3) добавление в соответствующие носители конъюгированных с HRP антител, специфичных для указанных антител, которые распознают указанные вторые аминокислотные последовательности,
и после пункта iv) к указанной серии лунок добавляют конъюгированные с HRP антитела, специфичные для антител, которые распознают указанные вторые аминокислотные последовательности,
а также тем, что указанный маркер, способный определять изменение оптических свойств при контакте с указанным антителом, распознающим указанную вторую аминокислотную последовательность, представляет собой ТМБ (тетраметилбензидин), а указанное оптическое свойство представляет собой оптическую плотность.
7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что указанными носителями являются хроматографические картриджи,
тем, что указанный биологический образец добавляется к концу картриджа, тем, что указанные антитела, которые распознают указанные первые аминокислотные последовательности, взаимодействуют в области указанного картриджа, дистально к абсорбирующей бумаге,
а также тем, что указанные антитела, которые распознают упомянутые вторые аминокислотные последовательности, прилипают к хроматографической поверхности указанного картриджа в области, ближайшей к абсорбирующей бумаге,
и тем, что указанный маркер, способный определять изменение оптических свойств при контакте с указанным антителом, распознающим указанную вторую аминокислотную последовательность, представляет собой флуоресцентный зонд, а указанное оптическое свойство представляет собой флуоресценцию на определенной длине волны.
8. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что указанный биологический образец может быть образцом мочи, сыворотки, плазмы, слюны, брохолвеолярной жидкости, спинномозговой жидкости, каловой массы, спермы, клеточного или тканевого белкового экстракта или клеточной культуральной среды.