Нуклеотидная последовательность, оптимизированная для экспрессии в бактериях консенсусного гликопротеина вируса бешенства
NUCLEOTIDE SEQUENCE OPTIMIZED FOR EXPRESSION IN BACTERIA OF CONSENSUS GLYCOPROTEIN OF RABIES VIRUS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для разработки средств диагностики и профилактики бешенства.
Уровень техники
Проблема бешенства продолжает оставаться важным вопросом здравоохранения и ветеринарии как в России, так и во всем мире. В решении данной проблемы необходимы как разработка вакцин для эффективной профилактики бешенства у животных, постэкспозиционной профилактики людей, так и создание систем для диагностики бешенства.
Для предупреждения бешенства используют культуральные антирабические вакцины, представляющие собой препараты инактивированного вируса бешенства, выращенного в клеточных культурах или куриных эмбрионах. Вакцины такого типа наиболее эффективны, но требуют соблюдения строгих условий транспортировки, хранения, режима введения. Нарушение этих условий может привести к снижению эффективности препаратов. В связи с этим разрабатываются новые антирабические вакцины, в том числе и с использованием рекомбинантного гликопротеина вируса бешенства [Стародубова Е.С., Преображенская О.В., Кузьменко Ю.В., Латанова А.А., Ярыгина Е.И., Карпов В.Л. 2015. Вакцины против бешенства: современное состояние и перспективы развития. Молекулярная биология, 49,1-8].
По данным Всемирной Ассоциации Здравоохранения (ВОЗ) имеющиеся на данный момент диагностические средства не подходят для выявления инфицирования бешенством до появления клинических симптомов болезни, и до тех пор, пока не разовьются особые признаки бешенства, такие как гидрофобия или аэрофобия, постановка клинического диагноза может быть затруднена. Прижизненное и посмертное подтверждение бешенства у людей может осуществляться с помощью различных диагностических методик, направленных на выявление целого вируса, вирусных антигенов или нуклеиновых кислот в инфицированных тканях (мозге, коже, моче или слюне) [Информационный бюллетень ВОЗ, 13 сентября 2018 г.]. Методы обнаружения вируса и его антигенов включают инкубацию с флуоресцентно-меченными и моноклональными антителами, изолирование вируса в культурах клеток, иммуноферментный анализ. Имеются патенты на набор олигонуклеотидных праймеров для идентификации РНК вируса бешенства в образцах (патент RUS 2340673 10.04.2007) и рекомбинантный штамм Escherichia coli tg1 (prvmoscow3253g-l) для получения набора ПЦР-стандартов и набор ПЦР-стандартов для определения концентрации штамма вируса бешенства "Москва 3253" в рабическом антигене (патент RUS 2511029 27.07.2012).
Важной задачей при выявлении вируса бешенства также является диагностика наличия антител к вирусу бешенства. Референсными методами для выявления активности антител к вирусу бешенства считаются методы, основанные на нейтрализации вируса в мышах (mouse neutralization test, MNT), уменьшения бляшкообразования (plaque reduction assay), а также тесты ингибирования локусов флюоресценции (fluorescent focus inhibition tests). Для проведения данных тестов требуется от трех дней. Поэтому разрабатываются более быстрые тесты. Имеются патенты на диагностику и тест-система для определения активности антирабических сывороток и препарата гетерологичного антирабического иммуноглобулина in vitro методом дот-иммуноанализа (патент на изобретение RUS 2360252 09.04.2008), способ титрования антирабических вируснейтрализующих антител (патент на изобретение RUS 2254575 10.07.2003).
Следует отметить, что в настоящее время для производства вакцин и систем диагностики вируса бешенства, а также антител к вирусу бешенства в подавляющем большинстве случаев требуется работа с живым вирусом, что требует повышенных мер безопасности при их производстве. Поскольку основным антигеном, вызывающим иммунный ответ при заражении вирусом бешенства, является гликопротеин [Wiktor T.J.,  Е., D. Schlumberger Н., Sokol F., Koprowski H. Antigenic Properties of Rabies Virus Components. 1973. J Immunology, 110 (1), 269-276], то он может стать безопасной заменой живому вирусу. В этой связи представляет интерес получение рекомбинантного гликопротеина вируса бешенства.
Наиболее распространённой системой для получения рекомбинантных белков являются бактерии Escherichia coli. Однако данная система имеет некоторые ограничения. Так, экспрессия генов в гетерологичной системе, например, экспрессия человеческих генов в бактериях, часто бывает неэффективна. Поэтому для получения рекомбинантного белка в бактериях важно адаптировать ген для экспрессии [Burgess-Brown N.A., Sharma S., Sobott F., Loenarz C.. Oppermann U., Gileadi O. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. 2008. Protein Expression and Purification, 59(1), 94-102; Maertens В., Spriestersbach A., von Groll U., Roth U., Kubicek J., Gerrits M., Graf M., Liss M., Daubert D., Wagner R.,  F. Gene optimization mechanisms: a multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. 2010. Protein Science, 19(7), 1312-1326].
В данном изобретении предложена генетическая конструкция, которая включает в себя создание оптимизированного для экспрессии в бактериях гена, кодирующего гликопротеин вируса бешенства с консенсусной аминокислотной последовательностью, и клонирование этого гена в вектор в рЕТ28. Было показано, что трансформация бактерий E.coli полученной плазмидой позволяет получить рекомбинантный гликопротеин вируса бешенства с консенсусной последовательностью. Из российских генно-инженерных разработок против вируса бешенства имеется патент №2008355, опубликованный 28.02.1994, на фрагмент ДНК, кодирующий синтез гликопротеина G вируса бешенства, рекомбинантная плазмидная ДНК pvg18-1, кодирующая гликопротеин G вируса бешенства, штамм бактерий Escherichia coli - продуцент гликопротеина G вируса бешенства. В данной разработке был использован ген гликопротеина штамма вируса «Внуково-32» без оптимизации для экспрессии в бактериях.
Раскрытие сущности изобретения
Оптимизация нуклеотидной последовательности гена позволяет повысить эффективность синтеза кодируемого белка, что в свою очередь увеличивает выход конечного продукта. Задачей данного изобретения была оптимизация гена, кодирующего консенсусный гликопротеин вируса бешенства, для экспрессии в клетках Escherichia coli. Предложенное нами изобретение направлено на получение дешевого безопасного иммуноактивного препарата рекомбинантного гликопротеина вируса бешенства для замещения использования живого вируса бешенства при производстве препаратов.
На основании консенсусной аминокислотной последовательности гликопротеина вируса бешенства (патент РФ №2626605 С2) составлена нуклеотидная оптимизированная для экспрессии в бактериях последовательность гена консенсусного гликопротеина SEQ ID NO 1. Оптимизация включала в себя адаптацию по представленности кодонов и выравнивание по GC-составу.
В соответствии с предложенным дизайном методами генной инженерии получен синтетический фрагмент ДНК длинной 1575 п.н., который клонирован в вектор для экспрессии белков в клетках E. coli. Показано, что в трансформированных полученной плазмидой клетках E. coli нарабатывается консенсусный гликопротеин вируса бешенства. Выделенный рекомбинантный белок узнается коммерческими антителами к гликопротеину вируса бешенства в различных иммунных тестах.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание генетической конструкции, применяемой для получения рекомбинантного консенсусного гликопротеина вируса бешенства.
Краткое описание фигур и таблиц.
Фигура 1. Распознавание коммерческими мышиными моноклональными антителами к гликопротеину вируса бешенства и коммерческими мышиными моноклональными антителами к предшественнику гликопротеина вируса Ласса образца рекомбинантного консенсусного гликопротеина и контрольного образца - лизатов нетрансформированных клеток E. coli.
Таблица 1. Оптическая плотность проб, полученная в результате проведения иммуноферментного анализа образца рекомбинантного консенсусного гликопротеина с коммерческими мышиными моноклональными антителами к гликопротеину вируса бешенства (клон 1С5, Abeam) и коммерческими мышиными моноклональными антителами к предшественнику гликопротеина вируса Ласса (Cat. no #01-04-0103, Cambridge Biologies, LLC).
Осуществление изобретения
Пример 1. Составление оптимизированной для экспрессии в бактериях нуклеотидной последовательности гена, кодирующего консенсусный гликопротеин вируса бешенства
Для составления нуклеотидной последовательности, адаптированой по представленности ко донов в клетках E. coli, использовали он-лайн инструменты (OPTIMIZER http://genomes.urv.es/OPTIMIZER/, EnCor Biotechnology Inc. http://www.encorbio.com/protocols/Codon.htm, JCat http://www.jcat.de/). Полученные по разным алгоритмам последовательности выравнивали и в ручную составляли обобщенную нуклеотидную последовательность.
Затем в 5'-концевой области гена (первые 150 нуклеотидов) проводили минимизацию GC-состава. По возможности основания G/C заменяли на А/Т, но так, чтобы не происходило изменений аминокислотной последовательности кодируемого гликопротеина.
В результате была составлена оптимизированная для экспрессии в бактериях нуклеотидная последовательность SEQ ID NO 1, кодирующая консенсусный гликопротеин вируса бешенства.
Пример 2. Получение синтетического гена консенсусного гликопротеина и его клонирование в вектор pET-23d(+).
Для разработанной нуклеотидной последовательности методом сборки из синтетических олигонуклеотидов получали синтетический ген Gc-bac-opt, кодирующий гликопротеин вируса бешенства с консенсусной аминокислотной последовательностью. Ген клонировали в вектор pET-23d(+) (Novagen, cat. no # 69748-3), по сайтам NcoI/XhoI. Структуру нуклеотидной последовательности района вставки подтверждали секвенированием.
Пример 3. Получение в E.coli рекомбинантного гликопротеина вируса бешенства, кодируемого геном с оптимизированной нуклеотидной последовательностью.
Клетки Escherichia coli BL21 (В F- dcm ompT hsdS(rB- mB-) gal) трансформировали плазмидой pET28d(+) со вставкой гена Gc-bac-opt методом солевой трансформации. Индивидуальную колонию трансформированных клеток помещали в среду LB с добавлением ампицилина (50 мкг/мл) и 1% (м/о) D-глюкозы и растили в течение ночи при 37°С при постоянном перемешивании. Аликвоту ночной культуры добавляли в среду LB с добавлением ампицилина (50 мкг/мл) в соотношении 1:25 и растили до оптической плотности 0.6. Затем индуцировали LacZ промотор 10 mM IPTG и инкубировали 4 часа при 37°С. Выделение рекомбинантного гликопротеина проводили из телец включения. Клетки собирали центрифугированием и добавляли буфер А (50 mM Трис-HCl рН 8.0, 0.2М NaCl, 2% Тритон Х-100, 1 mM ЭДТА). Проводили озвучивание 3 раза по 1 мин импульсом 7 мс на льду и центрифугировали 30 мин при 15000*g при 4°С. Осадок ресуспендировали в буфере В (50 mM Трис-HCl рН 8.0, 0.2 М NaCl, 2 М мочевина) и проводили повторное озвучивание и центрифугирование в тех же условиях. Осадок ресуспендировали в буфера С (50 mM Трис-HCl рН 8.0, 0.5 М NaCl, 8 М мочевина). Полученный образец рекомбинантного гликопротеина использовали в иммунных тестах. Для получения отрицательного контрольного образца нетрансформированные клетки Escherichia coli BL21 наращивали, лизировали в буфере А, озвучивали и центрифугировали в аналогичных условиях, но затем собирали надосадочную жидкость.
Пример 4. Проверка иммуноактивности рекомбинантного консенсусного гликопротеина.
Для оценки иммуноактивности рекомбинантного консенсусного гликопротеина использовали образец, представляющий собой растворенные в мочевине тельца включения. Образец тестировали в двух иммунных тестах - иммуноблот и иммуноферментный анализ.
2
4
2
4
Для оценки активности в иммуноблоте образец рекомбинантного консенсусного гликопротеина и контрольный образец смешивали с буфером нанесения Лэмли (0.0625 М Трис-HCl рН 6.8, 2% SDS, 10% глицерин, 0.05% бромфеноловый синий, 1% 2-меркаптоэтанол) и нагревали 5 мин при 95°С. Затем образец наносили на полиакриламидный гель и проводили электрофорез. Белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану электропереносом, после чего мембрану блокировали от неспецифического связывания в течение ночи в буфере PBST (80 мМ NaHPO, 20 мМ NaHPO, 100 мМ NaCl, 0.1% Твин-20) с 5% обезжиренным молоком. Затем проводили окрашивание коммерческими мышиными моноклональными антителами к гликопротеину вируса бешенства (клон 1С5, Abeam) или коммерческими мышиными моноклональными антителами к предшественнику гликопротеина вируса Ласса (Cat. no #01-04-0103, Cambridge Biologies, LLC) в течение часа при комнатной температуре, промывали буфером PBST три раза по 15 минут, и инкубировали с соотвествующими вторичными антителами в течение часа при комнатной температуре. Показано, что полученный белок распознается только коммерческими антителами к гликопротеину (Фиг. 1.). В отрицательном контрольном образце нетрансформированных бактериальных клеток распознавания детектировано не было.
Для оценки активности в иммуноферментном анализе образец рекомбинантного консенсусного гликопротеина и контрольный образец разводили (1:10, 1:50, 1:100) в буфере сорбции (2.5% бычий сывороточный альбумин в фосфатном буфере) и сорбировали на 96-луночные плоскодонные планшеты из полистирола (Microlon). Инкубировали планшет ночь при температуре 4°С, промывали 5 раз буфером промывки (0.15 М NaCl, 0.05% Твин-20). Блокировали неспецифическое связывание в течение часа при комнатной температуре (1% бычий сывороточный альбумин в фосфатном буфере). Затем наносили коммерческие мышиные моноклональные антитела к гликопротеину вируса бешенства (клон 1С5, Abeam) или коммерческие мышиные моноклональные антитела к предшественнику гликопротеина вируса Ласса (Cat. no #01-04-0103, Cambridge Biologies, LLC) в разведении 1:10000 в буфере сорбции и инкубировали ночь при температуре 4°С. Затем промывали и добавляли вторичные HRP-конъюгированные антитела к иммуноглобулинам мыши в буфере сорбции. Инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С, промывали и добавляли буфер с 3,3',5,5'-тетраметилбензидин гидрохлоридом. Инкубировали 15 мин, останавливали реакцию добавлением 2,5 М серной кислоты и измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм.
Показано, что рекомбинантный гликопротеин специфически распознается только коммерческими антителами к гликопротеину вируса бешенства (Таблица 1.). Специфической реакции обоих вариантов антител с отрицательным контрольным образцом нетрансформированных бактериальных клеток детектировано не было.