Способ моделирования ишемии глаза
METHOD FOR EYE ISCHEMIA SIMULATION

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии и предназначено для создания модели ишемии глаза.
Нарушение кровообращения в глазу лежит в основе развития большинства глазных патологий, в том числе глаукомы. При глаукоме ишемия является фактором, способствующим развитию метаболических изменений в тканях как переднего, так и заднего отделов глаза, усиливает гидродинамические нарушения в глазу и гибель нервных клеток сетчатки. В настоящее время в лечении глаукомы, помимо снижения внутриглазного давления (ВГД), большое значение придается профилактике и коррекции метаболических изменений в глазу, особенно таких, как нарушение микроциркуляции, усиление свободнорадикальных процессов, развитие гипоксии [Рациональная фармакотерапия в офтальмологии, ред. Е.А. Егоров, Москва, 2004; Егоров Е.А. Принципы нейропротекторной терапии глаукомной оптической нейропатии. Национальное руководство по глаукоме. Ред. Е.А. Егоров, Ю.С. Астахов, А.Г. Щуко. Москва, 2008]. Однако арсенал подобных препаратов в настоящее время очень незначительный. Апробация и экспериментальные исследования эффективности действия новых препаратов требуют использования моделей ишемического повреждения глаз экспериментальных животных. Большинство экспериментальных работ по созданию модели ишемического повреждения глаза проводилось на крысах, кровоснабжение глаза которых сходно с кровотоком глаза человека. Известны механические и метаболические модели создания глазной ишемии in vivo.
К механическим моделям относятся: 1) окклюзия церебральных артерий и ретинальных сосудов различными способами: лигированием (перевязкой) [Lavinsky D., Arterni N.S., Achaval М., Netto С.А. Chronic bilateral common carotid artery occlu-sion: a model for ocular ischemic syndrome in the rat // Arch Clin Exp Ophthalmol. 2006 Feb; 244(2): 199-204], фотокоагуляцией [Romano С., Price M., Bai H.Y., Olney J.W. Neuroprotectants in Honghua: glucose attenuates retinal ischemic damage. Inv. Ophthalmol. Vis. Sci. 1993; 34 (1): 72-80.], созданием искусственного тромбоза [Daugeliene L., Niwa M., Hara A., Matsuno H., Yamamoto Т., Kitazawa Y., Uematsu T. Transcient ischemic injury in the rat retina caused by trombotic occlusion-thrombolytic reperfusion. Inv. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000; 41 (9): 2743-2747.]; 2) модели с повышением внутриглазного давления с помощью перфузии физиологического раствора в переднюю камеру глаза [Wang JM1, Sun NX, Hui N, Fan YZ, Feng HX, Zhao SP Effects of rAAV-mediated rhBDNF gene transfection on BDNF gene expression in the retina of a rabbit model of acute high intraocular pressure.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2009 Nov; 29(11): 2201-4]; 3)хирургические способы - рассечение глазных мышц [Bagheri A., Tavakoli М., Torbati P., Mirdehghan M., Yaseri M., Safarian О., Yazdani S., Silbert D. Natural course of anterior segment ischemia after disinsertion of extraocular rectus muscles in an animal model // J AAPOS. 2013 Aug; 17(4): 395-401].
Перечисленные модели имеют ряд недостатков. В первую очередь, эти воздействия зачастую необратимо повреждают ткани глаза, что исключает возможность повторно использовать лабораторных животных в эксперименте, инвазивны, трудно воспроизводимы, не позволяют регулировать дозу ишемического фактора и достоверно оценивать реперфузионные изменения.
К метаболическим моделям относят модели с введением сосудосуживающих препаратов. Самым мощным из таких агентов является эндотелии-1 (ЭТ-1), который используется для моделирования ишемии заднего отрезка глаза [Koichi Masuzawa, Subrina Jesmin, Seiji Maeda, Yuichi Kaji, Tetsuro Oshika, Sohel Zaedi, Nobutake Shimojo, Naoko Yaji, Takashi Miyauchi, Katsutoshi Goto A Model of Retinal Ischemia-Reperfusion Injury in Rats by Subconjunctival Injection of Endothelin. Exp Biol Med (Maywood) 2006 231: 1085-1089].
Существенным недостатком таких моделей является необходимость введения высокой дозы ЭТ-1 с целью воспроизведения ишемии. В таких условиях нельзя исключить вероятность возникновения побочных эффектов со стороны системной циркуляции крови и повреждение ишемизированных тканей глаза, эти факторы также препятствуют возможности повторного использования животных в эксперименте. Кроме того, отсутствует четкая система количественной оценки степени развития транзиторной ишемии глаза. Эти обстоятельства существенно затрудняют процесс оценки эффективности действия противоишемических препаратов и значительно удорожают проведение исследований.
Известные модели хронической ишемии глаза вызывают грубые необратимые морфологические изменения в ишемизированных тканях, при которых трудно установить эффективность действия препарата.
Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является способ моделирования ишемии глаза путем отсечения верхних прямых мышц глаза кролика с регистрацией развития ишемии переднего отдела глаза [Bagheri А., Tavakoli М., Torbati P., Mirdehghan М., Yaseri М., Safarian О., Yazdani S., Silbert D. Natural course of anterior segment ischemia after disinsertion of extraocular rectus muscles in an animal model // J AAPOS. 2013 Aug; 17(4): 395-401].
К существенным недостаткам этого способа относится необратимость такого повреждения, ишемия, вызванная хирургическим повреждением глазных мышц животных, не является адекватной физиологической моделью и не подходит для оценки эффективности лекарственных веществ во время ишемии.
Задачей изобретения является разработка модели транзиторной ишемии глаза.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность воспроизведения дозированной, транзиторной ишемии глаза для оценки действия фармакологических препаратов с получением адекватных данных.
Технический результат достигается за счет субконъюнктивального введения 0.1-0.3 мл 1% раствора фенилэфрина.
Для оценки гемодинамики глаза кроликов нами была разработана методика офтальмоплетизмографии (ОПГ) с помощью прибора «Офтальмоплетизмограф ОП-А» (СКТБ «Оптимед» (Москва). Датчики ОПГ фиксируют на роговице обоих глаз животного, что существенно облегчает процесс регистрации показателей глазного кровотока. Существующий метод ОПГ был создан для определения увеального кровотока глаза человека и применен нами на экспериментальных животных. Конструкция «Офтальмоплетизмографа ОП-А» позволяет одновременно исследовать гемодинамику парных глаз и объективно оценивать межокулярную асимметрию внутриглазного кровотока. В ходе проведения ОПГ регистрируется динамическое состояние внутриглазного кровообращения у экспериментальных животных, степень ишемизации подтверждается уровнем гипоксии, который определяется по значениям концентрации лактата во внутриглазной жидкости ферментативным амперометрическим методом с помощью прибора Biosen (EKF Diagnostic).
«Офтальмоплетизмограф ОП-А» определяет интенсивность кровенаполнения сосудов увеального тракта глаза. Методика основана на регистрации пульсовых колебаний объема глазного яблока в течение сердечного цикла, возникающих как следствие пульсации внутриглазных сосудов. Расширение сосудов во время систолы вызывает растяжение корнеосклеральной капсулы глазного яблока и уменьшения кривизны роговицы. При диастоле внутриглазные сосуды вследствие эластичности сужаются, уменьшается растяжение корнеосклеральной капсулы, роговица становится более выпуклой. Колебания роговицы вызывают изменения объема воздуха внутри колпачка, который герметично фиксируется в области лимба, и регистрируются высокоточным датчиком. Описанные колебания по своей природе являются пульсовой волной, которая характеризует систолический прирост объема крови, циркулирующий по внутриглазным сосудам. По форме и амплитуде пульсовой волны можно судить об интенсивности внутриглазного кровотока и продолжительности его отдельных фаз.
При исследовании глазного кровотока учитываются следующие показатели:
3
1. Систолический прирост пульсового объема переднего сегмента (СППО), мм - показатель отражает разницу между максимальным и минимальным объемом переднего сегмента глазного яблока в течение одного сердечного цикла.
3
2. Пульсовой объем (ПО), мм - величина СППО в пересчете на площадь всего глазного яблока.
3
3. Основной показатель, который используется в исследовании - минутный объем кровотока (МОК), мм - суммарная величина объема крови, протекающего во время сердечного цикла через системы цилиарных и ретинальных сосудов за 1 мин.
МОК=ПО * Ps, где Ps - частота пульса.
В случае обнаружения межокулярной асимметрии в параметрах плетизмографии у кролика до начала эксперимента, превышающей 11%, свидетельствующей о наличии нарушения кровообращения в одном из глаз, животное выводили из исследования.
По полученным нами данным ОПТ субконъюнктивальное введение 0.1-0.3 мл 1% раствора фенилэфрина вызывает значительное уменьшение кровотока в глазу, при этом интенсивность снижения кровотока зависит от вводимой дозы, максимальное снижение объема кровотока происходит в интервале 60-120 минут (минимум - 90 мин) после инъекции. Поэтому для изучения эффективности лекарственных препаратов, оказывающих влияние на интенсивность увеального кровотока, целесообразно оценивать их действие именно в данный отрезок времени с целью получения адекватных данных.
Для пролонгирования периода развития ишемии до 180-240 мин было установлено время допустимого повторного введения 0.1-0.3 мл 1% раствора фенилэфрина - 90-120 мин после первой инъекции.
Кроме того, определение концентрации лактата во внутриглазной жидкости демонстрирует достоверное увеличение содержания лактата во внутриглазной жидкости после введения 0.1-0.3 мл 1% раствора фенилэфрина. Это подтверждает факт развития гипоксии вследствие ишемизации тканей глаза, так как известно, что лактат является маркером гипоксии [Cerovic, О., Golubovi, V., Spec-Marn, A., Kremzar, В., Vidmar, G. Relationship between injury severity and lactate levels in severely injured patients // Intensive Care Med., 2003, 29(8), 1300-1305].
На Фиг. 1 отражено влияние различных доз раствора фенилэфрина (субконъюнктивально) на значения МОК в % от МОК контрольного глаза.
На этом сводном графике наглядно показан дозозависимый эффект влияния фенилэфрина на степень развития транзиторной ишемии глаза, влияние на снижение глазного кровотока.
Серией сравнительных измерений действия фенилэфрина установлено, что он вызывает достоверное уменьшение (Р<0,005) значений минутного объема кровотока глаза (МОК). Определена прямая корреляция между величиной дозы и интенсивностью снижения кровотока в глазу. Максимальное снижение МОК происходит в интервале от 60 до 120 мин после субконъюнктивального введения, а разница между этим показателем в контрольном глазу и в глазу после инъекции 0,2 мл фенилэфрина превышала 50%. Результаты демонстрируют также нарастающее достоверное увеличение содержания лактата во внутриглазной жидкости после введения фенилэфрина.
Способ осуществляют следующим образом.
Определяют исходный уровень минутного объема кровотока глаза (МОК). Затем субконъюнктивально вводят 0.1-0.3 мл 1% раствора фенилэфрина. Для повторного воспроизведения ишемии препарат вводят повторно через 90-120 мин.
Пример 1. Кролик №1. Субконъюктивальная инъекция 0,2 мл физиологического раствора в OD, OS - контроль.
ОПГ на всех этапах эксперимента проводили одновременно на обоих глазах до субконъюктивальной инъекции и каждые 30 мин после нее в течение 120 мин. Животное находилось в спокойном состоянии (низкая степень подвижности, стабильный пульс и артериальное давление) в течение нескольких часов. Для этого однократно вводили Ветранквил 1%, 0,09 мл/кг, внутримышечно. Частота пульса и артериальное давление сохраняли стабильные значения, тонус век не ослабевал, низкая подвижность животного позволяла проводить ОПГ в течение трех часов. Глаза животного располагались на равноудаленном расстоянии от плетизмографа, т.е. голова животного во время измерения была зафиксирована и располагалась фронтально к передней панели прибора. Глазные колпачки держались на роговице каждого глаза без дополнительных компрессионных нагрузок за счет образовавшейся в пространстве между колпачком и роговицей зоны разряженного давления, и дополнительно прижимались веками животного. Установку колпачков и субконъюнктивальную инъекцию проводили после местной анестезии глаз инсталляцией Инокаина (0,4% оксибупрокаин). После завершения сеанса плетизмографии глаза обрабатывали антибиотиком.
Изменение МОК глаз кролика №1 OD и OS после субконъюнктивального введения 0,2 мл физиологического раствора в OD
Как следует из приведенных данных, введение физиологического раствора не оказывает влияние на уровень глазного кровотока.
Пример 2. Кролик №7. Субконъюктивальная инъекция 0,1 мл 1% раствора фенилэфрина в OD, OS - контроль.
Методы исследования такие же, как в примере №1. Инъекцию 0,1 мл 1% раствора фенилэфрина проводили после измерения исходных показателей ОПТ. Изменение МОК OD выражено в % от МОК контрольного глаза.
После однократной инъекции 0,1 мл 1% раствора фенилэфрина у кролика №7 минутный объем глазного кровотока был снижен в течение 180 мин, что свидетельствует о наличии ишемического процесса.
Пример 3. Кролик №9. Субконъюктивальная инъекция 0,15 мл 1% раствора фенилэфрина в OD, OS - контроль.
Методы исследования такие же, как в примере №1. Инъекцию 0,15 мл 1% раствора фенилэфрина проводили после измерения исходных показателей ОПТ. Изменение МОК OD выражено в % от МОК контр. глаза.
Показатели минутного объема глазного кровотока кролика №9 после инъекции 0,15 мл фенилэфрина снизились значительнее по сравнению с показателями МОК за такой же интервал времени у кролика №7, получившего меньшую дозу 0,1 мл 1% раствора фенилэфрина.
Пример 4. Кролик №10. Субконъюктивальная инъекция 0,20 мл 1% раствора фенилэфрина в OD, OS - контроль.
Методы исследования такие же, как в примере №1. Инъекцию проводили после измерения исходных показателей ОПТ.
Изменение МОК OD выражено в % от МОК контрольного глаза.
Инъекция большей дозы фенилэфрина - 0,20 мл кролику №10 вызвала максимальное снижение МОК в глазу, что свидетельствует о дозозависимом эффекте влияния фенилэфрина на развитие ишемии глаза.
Пример 5. Кролик №12 получил 2 инъекции 0,20 мл фенилэфрина с интервалом 90 мин.
Изменение МОК OD выражено в % от МОК контрольного глаза.
Повторная инъекция 0,2 мл фенилэфрина с интервалом 90 мин после первой позволила пролонгировать период развития транзиторной ишемии глаза до 240 мин.
Пример 6. Кролик №6. Определение содержания лактата во внутриглазной жидкости через 60 мин после инъекции фенилэфрина.
Пример 7. Кролик №11. Определение содержания лактата во внутриглазной жидкости через 120 мин после инъекции фенилэфрина.
После окончания сеанса ОПТ у кролика №6 и у кролика №11 осуществляли взятие ВЖ из передней камеры методом парацентеза роговицы. Как и в предыдущих экспериментах, у каждого кролика на одном глазу воспроизводили ишемию введением 0,20 мл фенилэфрина, парный глаз служил контролем. Измерение концентрации лактата в ВЖ проводили сразу после ее взятия ферментативным амперометрическим методом с помощью прибора Biosen (EKF Diagnostic).
Концентрация лактата в ВГЖ в условиях ишемии, % от контроля
Полученные результаты демонстрируют нарастающее достоверное увеличение содержания лактата во внутриглазной жидкости после введения фенилэфрина, что указывает на развитие гипоксии вследствие ишемизации тканей глаза.
Таким образом, транзиторная модель ишемии глаза может быть использована для изучения эффективности действия лекарственных препаратов, оказывающих влияние на интенсивность увеального кровотока с возможностью регулирования дозы ишемического фактора без развития побочных эффектов.