Прогнозирование риска развития нежелательной реакции, связанной с введением антитела к ALK2, и способности отвечать на лечение антителом к ALK2
PREDICTION OF RISK OF DEVELOPMENT OF UNDESIRED REACTION RELATED TO ADMINISTRATION OF ANTIBODY TO ALK2 AND CAPABILITY OF RESPONDING TO TREATMENT WITH ANTIBODY TO ALK2

[0001]
Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для применения в способе лечения и/или профилактики эктопической (или гетеротопической) оссификации (или остеогенеза) и/или опухоли головного мозга, который характеризуется введением антитела к ALK2, обладающего способностями связывания и перекрестного связывания ALK2, пациенту, имеющему активную мутацию в ALK2 и имеющему мутацию аминокислотного остатка в положении 330 ALK2.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002]
Прогрессирующая оссифицирующая фибродисплазия (ФОП) является генетическим заболеванием, при котором хрящевая или костная ткань эктопически формируется в мягких тканях, таких как скелетная мышца, сухожилие и связка, где костные ткани обычно не формируются (Непатентные источники 1-3). При этом заболевании эктопическая оссификация происходит по всему телу, включая лицо, при этом эктопическая костная ткань и существующая костная ткань сплавляются, заметно уменьшая амплитуду движения сустава или вызывая деформацию тела (Непатентные источники 1-3).
[0003]
Известно, что эктопическая оссификация при ФОП включает не только эктопическую оссификацию, хронически протекающую с ростом, но также острую эктопическую оссификацию, протекающую в сопровождении симптома, называемого вспышкой, вызванной травмой мышц, вирусной инфекцией и т.п. (Непатентный источник 1). Вспышка сопровождается опуханием с воспалительной реакцией или устойчивой болью в качестве основных симптомов и, как известно, возникает в результате ушиба, падения, внутримышечной инъекции и т.п., которые вызывают повреждение мышц. Кроме того, известны внезапные вспышки заболевания без установленной причины. При ФОП противопоказаны инвазивные медицинские процедуры, такие как биопсия и операция, поскольку после вспышки могут образовываться эктопические кости. Таким образом, эктопические костные ткани невозможно удалить хирургическим путем. Эктопические костные ткани при ФОП формируются нормальными хрящевыми клетками или остеобластами и метаболизируются так же, как и нормальные костные ткани. Из-за этого нельзя удалять только эктопические костные ткани с помощью лекарственных средств и т.п.
[0004]
Какая-либо фундаментальная терапия для подавления эктопической оссификации при ФОП пока не разработана, и поэтому проводили только симптоматическое лечение боли и т.п. Таким образом, эктопические костные ткани, образующиеся при ФОП, очень сложно удалить, и поэтому ожидают разработку многообещающего лекарственного средства, которое сможет оказывать профилактическое действие до начала эктопической оссификации.
[0005]
Ген активинподобной киназы 2 (ALK2), кодирующий рецептор костных морфогенетических белков (BMP), который вызывает образование эктопической кости в мягких тканях, включая ткани скелетных мышц, был идентифицирован как ген, вызывающий ФОП (непатентная литература 4). Ген ALK2 идентичен гену рецептора 1 активина A типа I (ACVR1). ALK2, имеющий аминокислотную замену, был обнаружен при семейных и спорадических случаях ФОП (Непатентный источник 4).
[0006]
Человеческий или мышиный ALK2 представляет собой отдельный трансмембранный белок, состоящий из 509 аминокислот, имеющий сигнальный пептид и функционирующий как трансмембранный рецептор серин/треонинкиназы, связывающийся с BMP (Непатентные источники 1-3). ALK2 связывает BMP в его N-концевой внеклеточной области, активируя нижестоящий внутриклеточный сигнальный путь посредством своей внутриклеточной серин/треонинкиназы.
[0007]
Рецепторы BMP подразделяются на 2 типа в зависимости от своей структуры и функций: рецепторы I типа, включая ALK2; и рецепторы II типа (Непатентные источники 1-3). Рецепторы II типа представляют собой конститутивно активные ферменты, которые демонстрируют киназную активность, даже если они не связаны с BMP. С другой стороны, рецепторы I типа, включая ALK2, являются ферментами, неактивными в не связанном с BMP состоянии, и демонстрируют киназную активность в зависимости от связывания с BMP. Вероятно, это обусловлено тем, что при связывании с BMP рецепторная киназа II типа фосфорилирует внутриклеточный домен рецептора I типа в качестве субстрата, что может изменять его конформацию, и активирует рецептор I типа (Непатентные источники 1-3).
[0008]
Известно, что рецепторы I типа активируются конститутивно, независимо от рецептора II типа, в результате замены конкретной аминокислоты во внутриклеточной области (Непатентные источники 1-3). Суперэкспрессия конститутивно активированных мутантов рецепторов I типа активирует внутриклеточный сигнальный путь, даже если сигнал не стимулирован BMP. Таким образом, рецепторы I типа считаются молекулами, отвечающими за передачу сигналов BMP извне внутрь клеток.
[0009]
Мутацией в ALK2, идентифицированной при случаях семейной и типичной спорадической ФОП, являлась мутация R206H, при которой Arg206 заменен His (Непатентный источник 4). Все мутации гена, ранее идентифицированные при случаях ФОП, согласно некоторым сообщениям, вызывали аминокислотные замены во внутриклеточной области ALK2. Большинство этих мутаций при случаях ФОП сосредоточены вблизи от АТФ-связывающей области во внутриклеточном домене ALK2 (Непатентный источник 5).
[0010]
Суперэкспрессия мутантов ALK2, идентифицированных при ФОП, в культивируемых клетках активирует внутриклеточный сигнальный путь BMP, даже если сигнал не стимулирован BMP (Непатентный источник 6). Таким образом, антитела к ALK2, которые, как можно ожидать, будут оказывать ингибирующее действие в отношении ALK2 дикого типа и различные внутриклеточные мутанты ALK2, включая новые неидентифицированные мутанты, путем воздействия на внеклеточную область ALK2 и ингибирования передачи его сигнала, разрабатываются в качестве терапевтических средств при ФОП (Патентный источник 1).
[0011]
Диффузная внутренняя глиома моста (DIPG) представляет собой диффузную (инфильтративную) астроцитому, которая обнаруживается в основном в варолиевом мосту головного мозга и, по некоторым сообщениям, составляет примерно 75-80% опухолей ствола головного мозга у детей. DIPG - редкое заболевание с выживаемостью на длительных сроках меньше 10%, поскольку ствол головного мозга регулирует такие важные функции, как дыхание. Такие же мутации в ALK2, как при случаях ФОП, также были идентифицированы при случаях DIPG (Непатентный источник 7). Таким образом, антитела к ALK2 могут лечить опухоль головного мозга, такую как DIPG.
ЛИТЕРАТУРА ПРЕДШЕСТВУЮЩЕГО УРОВНЯ ТЕХНИКИ
Патентная литература
[0012]
Патентный источник 1: Международная публикация WO2016/121908
Непатентная литература
[0013]
Непатентный источник 1: T. Katagiri, J. Oral Biosci., 52, 33-41 (2010)
Непатентный источник 2: T. Katagiri, J. Oral Biosci., 54, 119-123 (2012)
Непатентный источник 3: T. Katagiri and S. Tsukamoto, Biol. Chem., 394, 703-714 (2013)
Непатентный источник 4: E.M. Shore et al., Nat. Genet., 38, 525-527 (2006)
Непатентный источник 5: A. Chaikuad et al., J. Biol. Chem., 287, 36990-36998 (2012)
Непатентный источник 6: T. Fukuda et al., J. Biol. Chem., 284, 7149-7156 (2009)
Непатентный источник 7: K.R. Taylor et al., Nat Genet., 46, 457-461 (2014)
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задача, решаемая изобретением
[0014]
Цель настоящего изобретения состоит в разработке эффективного способа лечения и/или предупреждения эктопической (или гетеротопической) оссификации (или костеобразования) и/или опухоли головного мозга и фармацевтической композиции для применения в этом способе.
Способы решения задачи
[0015]
Авторы настоящего изобретения оценили антитела к ALK2 в качестве терапевтических средств при ФОП и, таким образом, обнаружили, что введение антитела к ALK2 в моделях ФОП на мышах способствует эктопической оссификации. Авторы настоящего изобретения провели тщательные исследования для выполнения задачи и, таким образом, обнаружили, что антитело к ALK2 вызывает внутриклеточную сигнальную трансдукцию мышиного ALK2, имеющего мутацию R206H, но скорее ингибирует внутриклеточную сигнальную трансдукцию в случае использования человеческого ALK2, имеющего мутацию R206H. Соответственно, в результате введения внутриклеточных и внеклеточных замен в ALK2 человека и ALK2 мыши было обнаружено, что антитело к ALK2 способствует передаче внутриклеточного сигнала ALK2, если внутриклеточная область происходит из ALK2 мыши, имеющего мутацию R206H. Сравнение аминокислотных последовательностей внутриклеточных областей между ALK2 человека и ALK2 мыши показало, что их аминокислотные последовательности различаются только аминокислотными остатками в положении 182 (т.е. аспарагиновая кислота (D) у человека и глутаминовая кислота (E) у мыши) и в положении 330 (т.е. пролин (P) у человека и серин (S) у мыши). Таким образом, авторы настоящего изобретения получили мутанты путем замены аспарагиновой кислоты (D) в положении 182 и пролина (P) в положении 330 человеческого ALK2, имеющего мутацию R206H, мышиными аминокислотными остатками, то есть глутаминовой кислотой (E) и серином (S), соответственно, а затем изучали действие антител к ALK2 в отношении мутантов. В результате было обнаружено, что антитела к ALK2 способствуют передаче внутриклеточного сигнала, когда пролин (P) в положении 330 человеческого ALK2, имеющего мутацию R206H, заменен серином (S). Было обнаружено, что замена пролина (P) в положении 330 аспарагиновой кислотой (D), глутаминовой кислотой (E) или аланином (A) дает аналогичные результаты. Кроме того, было обнаружено, что антитела к ALK2 усиливают ALK2-опосредованную передачу сигнала BMP, если глицин (G) в положении 328 человеческого ALK2, не имеющего мутацию R206H, заменен валином (V). В результате авторы настоящего изобретения выполнили настоящее изобретение, обнаружив, что эктопическую оссификацию и/или опухоль головного мозга можно эффективно лечить и/или предотвращать путем введения антител к ALK2 только пациентам, не имеющим мутацию аминокислотного остатка в положении 330 ALK2, и/или пациентам, не имеющих мутацию G328V в ALK2, среди пациентов, имеющих активную мутацию в ALK2.
В частности, настоящее изобретение охватывает следующие признаки:
[0016]
(1) Фармацевтическая композиция для применения в способе лечения и/или предупреждения эктопической оссификации у пациента, где:
пациент имеет активную мутацию в белке активин-подобной киназы 2 (ALK2), который ответственен за эктопическую оссификацию;
аминокислотный остаток в положении 330 ALK2 является пролином; и
действующим веществом композиции является антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий свойство связывания с ALK2, свойство перекрестного связывания ALK2 и свойство ингибирования передачи сигнала BMP.
[0017]
(2) Фармацевтическая композиция согласно (1), где ALK2 имеет мутацию G328V.
[0018]
(3) Фармацевтическая композиция согласно (1), где способ включает следующие стадии:
(a) обнаружение присутствия или отсутствия активной мутации в ALK2 у пациентов;
(b) отбор пациента, имеющего активную мутацию в ALK2;
(c) подтверждение, что у пациента нет мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2; и
(d) введение антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента отобранному пациенту.
[0019]
(4) Фармацевтическая композиция согласно (3), где стадия (c) дополнительно включает стадию подтверждения, что ALK2 у пациента имеет мутацию G328V.
[0020]
(5) Фармацевтическая композиция согласно (3), где отбор пациента, которому следует вводить антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент, включает следующие стадии:
(a) обнаружение присутствия или отсутствия активной мутации в ALK2 у пациентов с эктопической оссификацией;
(b) отбор пациента, имеющего активную мутацию в ALK2; и
(c) исключение пациента, имеющего мутацию аминокислотного остатка в положении 330 ALK2.
[0021]
(6) Фармацевтическая композиция согласно (5), где стадия (c) дополнительно включает стадию исключения пациента, имеющего мутацию G328V в ALK2.
[0022]
(7) Фармацевтическая композиция согласно любому из (1)-(6), где антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связывается с полипептидом, состоящим из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 123 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1.
[0023]
(8) Фармацевтическая композиция согласно любому из (1)-(7), где антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с:
(i) эпитопом, включающим каждый остаток глутаминовой кислоты в положении 38, глицина в положении 39, изолейцина в положении 59, аспарагина в положении 60, аспарагиновой кислоты в положении 61, глицина в положении 62, фенилаланина в положении 63, гистидина в положении 64, валина в положении 65, тирозина в положении 66, аспарагина в положении 102, треонина в положении 104, глутамина в положении 106 и лейцина в положении 107 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1; или
(ii) эпитоп, включающий каждый остаток глутаминовой кислоты в положении 38, глицина в положении 39, лейцина в положении 40, изолейцина в положении 59, аспарагина в положении 60, аспарагиновой кислоты в положении 61, глицина в положении 62, фенилаланина в положении 63, гистидина в положении 64, валина в положении 65, тирозина в положении 66 и треонина в положении 104 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1.
[0024]
(9) Фармацевтическая композиция согласно любому из (1)-(7), где антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент конкурируют за связывание ALK2 с антителом к ALK2 или его антигенсвязывающим фрагментом согласно (8).
[0025]
2
(10) Фармацевтическая композиция согласно любому из (1)-(9), где антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент является моноклональным антителом, поликлональным антителом, химерным антителом, гуманизированным антителом, человеческим антителом, диателом, мультиспецифичным антителом или F(ab').
[0026]
(11) Фармацевтическая композиция согласно любому из (1)-(10), где
последовательность тяжелой цепи антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента включает вариабельную область, содержащую CDRH1, CDRH2 и CDRH3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 состоят из аминокислотных последовательностей:
SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно;
SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, соответственно;
SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, соответственно; или
SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, соответственно, и
где последовательность легкой цепи включает вариабельную область, содержащую CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRL1, CDRL2 и CDRL3 состоят из аминокислотных последовательностей:
SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, соответственно;
SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 10, соответственно;
SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, соответственно;
SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23, соответственно; или
SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29, соответственно.
[0027]
(12) Фармацевтическая композиция согласно любому из (1)-(11), где
последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента является:
a1) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 142 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31;
a2) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 142 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33;
a3) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34;
a4) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36;
a5) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38;
a6) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39;
a7) аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 95% идентичностью с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из аминокислотных последовательностей a1) - a6);
a8) аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 99% идентичностью с любой аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотных последовательностей a1) - a6); или
a9) аминокислотной последовательностью, включающей замену(ы), делецию(и) или добавление(я) нескольких аминокислотных остатков в любой аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотных последовательностей a1) - a6), и
последовательность вариабельной области легкой цепи является:
b1) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 133 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32;
b2) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 129 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35;
b3) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 129 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37;
b4) аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 95% идентичностью с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из аминокислотных последовательностей b1) - b3);
b5) аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 99% идентичностью с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из аминокислотных последовательностей b1) - b3); или
b6) аминокислотной последовательностью, включающей замену(ы), делецию(и) или добавление(и) нескольких аминокислотных остатков в любой аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотных последовательностей b1) - b3).
[0028]
(13) Фармацевтическая композиция согласно (12), где антитело к ALK2 является:
антителом, состоящим из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 142 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 133 последовательности аминокислот SEQ ID NO: 32;
антителом, состоящим из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 142 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 133 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32;
антителом, состоящим из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 129 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35;
антителом, состоящим из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 129 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37;
антителом, состоящим из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 129 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35; или
антителом, состоящим из тяжелой цепи, включающей вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39, и легкой цепи, включающей вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 129 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37.
[0029]
(14) Фармацевтическая композиция согласно любому из (1)-(13), где активная мутация в ALK2 является по меньшей мере одной мутацией, выбранной из L196P, delP197_F198insL, R202I, R206H, Q207E, R258S, R258G, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D и R375P.
[0030]
(15) Фармацевтическая композиция согласно любому из (1)-(13), где активная мутация в ALK2 является мутацией R206H.
[0031]
(16) Фармацевтическая композиция согласно любому из (1)-(15), где эктопическая оссификация представляет собой фибродисплазию оссифицирующую прогрессирующую (ФОП).
[0032]
(17) Фармацевтическая композиция для применения в способе лечения и/или предупреждения опухоли головного мозга у пациента, где пациент имеет активную мутацию в белке активин-подобной киназы 2 (ALK2), который ответственен за опухоль головного мозга; и действующим веществом композиции является антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие свойство связывания с ALK2, свойство перекрестного связывания ALK2 и свойство ингибирования передачи сигнала BMP.
[0033]
(18) Фармацевтическая композиция согласно (17), где аминокислотный остаток в положении 330 ALK2 у пациента является пролином.
[0034]
(19) Фармацевтическая композиция согласно (17) или (18), где активная мутация в ALK2 является по меньшей мере одной мутацией, выбранной из R206H, R258G, G328E, G328W и G356D.
[0035]
(20) Фармацевтическая композиция согласно любому из (17)-(19), где антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент является антителом к ALK2 или его антигенсвязывающим фрагментом, определенным в любом из (7)-(13).
[0036]
(21) Фармацевтическая композиция согласно любому из (17)-(20), где опухоль головного мозга является диффузной внутренней глиомой моста (DIPG).
[0037]
(22) Способ прогнозирования риска развития нежелательной реакции, которая может быть связана с введением антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий следующие стадии:
(a) обнаружение присутствия или отсутствия активной мутации в ALK2 и мутации аминокислотного остатка в положении 330 в ALK2 у пациента; и
(b) определение, что когда пациент имеет активную мутацию в ALK2 и не имеет мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2, пациент подвергается низкому риску развития нежелательной реакции, которая может быть связана с введением антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента.
[0038]
(23) Способ прогнозирования ответа на лечение и/или предупреждение путем введения антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий следующие стадии:
(a) обнаружение присутствия или отсутствия активной мутации в ALK2 и мутации аминокислотного остатка в положении 330 в ALK2 у пациента; и
(b) определение, что когда пациент имеет активную мутацию в ALK2 и не имеет мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2, пациент способен отвечать на лечение и/или предупреждение путем введения антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента.
[0039]
(24) Способ отбора пациента, подлежащего лечению и/или предупреждению путем введения антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий следующие стадии:
(a) обнаружение присутствия или отсутствия активной мутации в ALK2 и мутации аминокислотного остатка в положении 330 в ALK2 у пациента; и
(b) отбор пациента как пациента, подлежащего лечению и/или предупреждению путем введения антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, когда пациент имеет активную мутацию в ALK2 и не имеет мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2.
[0040]
(25) Способ лечения и/или предупреждения заболевания путем введения антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающий следующие стадии:
(a) обнаружение присутствия или отсутствия активной мутации в ALK2 и мутации аминокислотного остатка в положении 330 в ALK2 у пациента; и
(b) введение пациенту антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, если пациент имеет активную мутацию в ALK2 и не имеент мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALk2.
[0041]
(26) Способ согласно (25), дополнительно включающий осуществление стадии (b) способа согласно любому из (22)-(24).
[0042]
(27) Способ согласно любому из (22)-(26), где введение антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента является введением фармацевтической композиции согласно любому из (1)-(21).
[0043]
(28) Способ согласно любому из (22)-(27), где стадия (b) дополнительно включает подтверждение, что активная мутация в ALK2 не является мутацией G328V.
[0044]
(29) Способ согласно любому из (22)-(27), где активная мутация в ALK2 является по меньшей мере одной мутацией, выбранной из L196P, delP197_F198insL, R202I, R206H, Q207E, R258S, R258G, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D и R375P.
[0045]
(30) Способ согласно любому из (22)-(27), где активная мутация в ALK2 является по меньшей мере одной мутацией, выбранной из R206H, R258G, G328E, G328W и G356D.
[0046]
(31) Способ согласно любому из (25)-(30), где заболевание, поражающее пациента, является эктопической оссификацией или опухолью головного мозга.
[0047]
(32) Способ согласно (31), где заболевание, поражающее пациента, является эктопической оссификацией.
[0048]
(33) Способ согласно любому из (25)-(31), где заболевание, поражающее пациента, является оссифицирующей прогрессирующей фибродисплазией (ФОП) или диффузной внутренней глиомой моста (DIPG).
[0049]
(34) Способ согласно (33), где заболевание, поражающее пациента, является оссифицирующей прогрессирующей фибродисплазией (ФОП).
Настоящее описание включает содержание, раскрытое в заявке на патент Японии 2018-039066, по которой в настоящей заявке испрашивается приоритет.
[0050]
Настоящее изобретение относится к эффективному способу лечения и/или предупреждения эктопической оссификации и/или опухоли головного мозга у конкретного пациента, а также к фармацевтической композиции для применения в способе. Настоящее изобретение также относится к способу прогнозирования риска развития нежелательной реакции, которая может быть связана с введением антитела к ALK2, к способу прогнозирования ответа на лечение и/или предупреждение путем введения антитела к ALK2 и к способу отбора субъекта, подлежащего лечению и/или предупреждению путем введения антитела к ALK2. Настоящее изобретение также относится к способу лечения и/или предупреждения заболевания, вызванного активной мутацией в ALK2 (например, эктопической оссификации и/или опухоли головного мозга), путем введения антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0051]
[Фиг. 1] Эта фигура представляет собой график, на котором с помощью BMP-специфического люциферазного репортера показано, что антитело к ALK2 (27D-H2L2_LALA) активирует передачу сигнала BMP в клетках HEK293, экспрессирующих мышиный R206H ALK2 (Фиг. 1A), при этом антитело не активирует передачу сигнала BMP в клетках HEK293, экспрессирующих человеческий R206H ALK2 (Фиг. 1B). На оси ординат показана относительная люциферазная активность ("Относительная активность luc") по сравнению с необработанным контролем (т.е. контролем, не содержащим антитело к ALK2). На оси абсцисс показана концентрация антитела. Контрольными белками ALK2 являются мышиный ALK2 дикого типа ("мышиный WT ALK2") и человеческий ALK2 дикого типа ("человеческий WT ALK2"), и контрольным антителом (Ctrl) является IgG1.
2
2
2
[Фиг. 2] Эта фигура представляет собой график, на котором с помощью BMP-специфического люциферазного репортера показано, что F(ab') ('27D-H2L2_F(ab')') активирует передачу сигнала BMP только в клетках HEK293, экспрессирующих мышиный R206H ALK2 (Фиг. 2A), как в антителе против ALK2 ('27D-H2L2_LALA'), тогда как Fab ('27D-H2L2_Fab') не активирует передачу сигнала BMP даже в клетках HEK293, экспрессирующих мышиный или человеческий R206H ALK2 (Фиг. 2А и 2B, соответственно). На оси ординат показана относительная люциферазная активность (относительная активность luc) в сравнении с необработанным контролем (т.е. контролем, не содержащим F(ab')). На оси абсцисс показана концентрация антитела, и контрольным антителом (Ctrl) является IgG1.
2
[Фиг. 3] Эта фигура представляет собой график, на котором при использовании технологии Nanoluc Binary Technology показано, что A2-27D, 27D-H2L2_LALA и 27D-H2L2_F(ab') вызывают образование перекрестной связи (т.е. образование комплекса) ALK2. В отличие от этого, 27D-H2L2_Fab не вызывал образование перекрестной связи (т.е. образование комплекса) ALK2. На оси ординат показана люциферазная активность. На оси абсцисс показана концентрация антитела.
[Фиг. 4] Эта фигура представляет собой выравнивание последовательностей, на котором показано, что при сравнении последовательностей белков ALK2 человека, обезьяны, собаки, крысы и мыши ни аминокислотный остаток в положении 182 (т.е. человеческий "D" и мышиный "E"), ни аминокислотный остаток в положении 330 (т.е. человеческий "P" и мышиный "S") не являются консервативными между человеком и мышью.
[Фиг. 5] Эта фигура представляет собой график, на котором с помощью BMP-специфического люциферазного репортера показано, что антитело к ALK2 (A2-27D) активирует передачу сигнала BMP в клетках HEK293, экспрессирующих человеческий R206H ALK2 с заменой пролина в положении 330 серином. Ингибирование активации передачи сигнала BMP было обнаружено в клетках HEK293, экспрессирующих мышиный R206H ALK2 с заменой серина в положении 330 на пролин (данные не показаны). На этой фигуре также показано, с помощью BMP-специфического люциферазного репортера, что антитело к ALK2 активирует передачу сигнала BMP в клетках HEK293, экспрессирующих мышиный R206H ALK2, но не активирует или подавляет, или ингибирует передачу сигнала BMP в клетках HEK293, экспрессирующих человеческий WT ALK2 и другие указанные мутантные человеческие ALK2, такие как человеческий ALK2 с заменой аспарагиновой кислоты в положении 182 глутаминовой кислотой.
[Фиг. 6] Эта фигура представляет собой график, на котором с помощью BMP-специфического люциферазного репортера показано, что антитело к ALK2 (A2-27D) активирует передачу сигнала BMP в клетках HEK293, экспрессирующих человеческий R206H ALK2 с заменой пролина (P) в положении 330 на серин (S), аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (E) или аланин (A), но не активирует передачу сигнала BMP для человеческого R206H ALK2 с заменой пролина (P) в положении 330 на валин (V). На этой фигуре также показано, что антитело к ALK2 не активирует передачу сигнала BMP для человеческого WT ALK2, имеющего описанную выше замену, но не содержащего мутацию R206H. Присутствие или отсутствие активации сигнальной трансдукции BMP также указано для мышиного ALK2, содержащего мутацию, показанную на этой фигуре. Контроль ('Контроль') представляет собой крысиный IgG2.
[Фиг. 7] Эта фигура представляет собой график, на котором с помощью BMP-специфического люциферазного репортера показано, что четыре типа антител к ALK2 (27D-H2L2_LALA, 15A-H4L6_IgG2, A2-11E и A2-25C) активируют передачу сигнала BMP в клетках HEK293, экспрессирующих мышиный R206H ALK2 (Фиг. 7A), тогда как ни одно из этих антител не активирует передачу сигнала BMP в клетках HEK293, экспрессирующих человеческий мутантный R206H ALK2 (Фиг. 7B). На оси ординат показана относительная люциферазная активность (относительная активность luc) в сравнении с необработанным контролем (т.е. контролем, не содержащим антитело к ALK2). На оси абсцисс показана концентрация антител.
[Фиг. 8] Эта фигура представляет собой график, на котором с помощью BMP-специфического люциферазного репортера показано, что антитело к ALK2 (A2-27D) активирует передачу сигнала BMP в клетках HEK293, экспрессирующих человеческий G328V или Q207D ALK2, но не активирует передачу сигнала BMP в клетках HEK293, экспрессирующих другие мутантные человеческие ALK2 (R206H, L196P, PF197-8L (также называемый "delP197_F198insL"), R202I, Q207E, R258G, R258S, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D и R375P). Активность измеряли так же, как в Примере 5. На оси ординат показана люциферазная активность в сравнении с необработанным контролем. На оси абсцисс показана концентрация A2-27D. Что касается G328V (1/3) и Q207D (1/20), в анализе мутант G328V и мутант Q207D использовали таким образом, чтобы их количества составляли 1/3 от количества других мутантов (например, 12,5 нг/лунка, тогда как каждый из других мутантов составлял 37,5 нг/лунка) и 1/20 (например, 1,875 нг/лунка, тогда как каждый из других мутантов составлял 37,5 нг/лунка).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0052]
Далее настоящее изобретение будет описано более подробно.
[0053]
1. Определения
При использовании в настоящем изобретении термин "ген" включает не только ДНК, но и мРНК, кДНК и кРНК.
При использовании в настоящем изобретении термин "полинуклеотид" используется в том же значении, что и нуклеиновая кислота, и также включает, например, ДНК, РНК, зонды, олигонуклеотиды и праймеры.
При использовании в настоящем изобретении "полипептид" и "белок" используются взаимозаменяемо друг с другом.
При использовании в настоящем изобретении "фракция РНК" относится к фракции, содержащей РНК.
При использовании в настоящем изобретении "клетка" также включает клетки в организме отдельных животных и культивируемые клетки.
При использовании в настоящем изобретении "ALK2" используется в том же значении, что и белок ALK2, и включает ALK2 дикого типа и его мутанты (также называемые "мутантным").
[0054]
2
При использовании в настоящем изобретении "антигенсвязывающий фрагмент антитела", также называемый "функциональным фрагментом антитела", означает неполный фрагмент антитела, обладающий антигенсвязывающей активностью, и включает, например, F(ab'), диатела, линейные антитела, одноцепочечные Fv и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител. Однако антигенсвязывающий фрагмент не ограничивается этими молекулами при условии, что антигенсвязывающий фрагмент обладает способностью связываться с ALK2 (или свойством связывания с ALK2) и обладает способностью перекрестно связывать ALK2 (или свойством перекрестного связывания ALK2), как в антителе против ALK2. Предпочтительно антигенсвязывающий фрагмент антитела дополнительно обладает способностью ингибировать передачу сигнала BMP (или свойством ингибирования передачи сигнала BMP), как и в случае антитела к ALK2. Такой антигенсвязывающий фрагмент включает не только фрагмент, полученный при обработке полноразмерной молекулы белка антитела подходящим ферментом, но и белок, продуцируемый в соответствующих клетках-хозяевах с использованием рекомбинантного гена антитела.
[0055]
При использовании в настоящем изобретении "эпитоп", также называемый "антигенной детерминантой", обычно относится к связываемому антителом антигенному сайту, состоящему из по меньшей мере 7 аминокислот, по меньшей мере 8 аминокислот, по меньшей мере 9 аминокислот или по меньшей мере 10 аминокислот антигена. При использовании в настоящем изобретении термин "эпитоп" означает неполный пептид или неполную конформацию ALK2, с которым связывается конкретное антитело к ALK2. Эпитоп как неполный пептид ALK2 может быть определен с помощью способа, хорошо известного специалистам в данной области, такого как иммуноанализ, и может быть определен, например, с помощью следующего метода, в котором получают различные неполные структуры ALK2. Для получения неполных структур можно использовать метод олигопептидного синтеза, известный в данной области. Например, ряд полипептидных фрагментов, имеющих подходящую длину, получают в порядке, начиная от C или N-конца ALK2, с использованием технологий рекомбинации генов, хорошо известных специалистам в данной области. Затем изучают реактивность антитела по отношению к полипептидным фрагментам, чтобы примерно определить сайты узнавания. Затем синтезируют более короткие пептиды, и может быть изучена реактивность антитела по отношению к этим пептидам для определения эпитопа. В альтернативе эпитоп как неполная конформация ALK2, с которым связывается конкретное антитело ALK2, может быть определен путем идентификации аминокислотных остатков ALK2, находящихся в контакте с антителом, с помощью рентгеноструктурного анализа. Если второе антитело к ALK2 связывается с неполным пептидом или с неполным конформацией, которые связывает первое антитело к ALK2, то можно определить, что первое антитело и второе антитело имеют общий эпитоп. Кроме того, даже если специфическая последовательность или структура эпитопа не определены, можно определить, что первое антитело и второе антитело имеют общий эпитоп, путем подтверждения, что второе антитело к ALK2 (перекрестно) конкурирует с первым антителом к ALK2 за связывание с ALK2 (т.е. второе антитело препятствует связыванию первого антитела с ALK2). Кроме того, когда первое антитело и второе антитело связываются с общим эпитопом и первое антитело обладает такой активностью, как ингибирующая активность в отношении передачи сигнала BMP, опосредованной ALK2, можно также ожидать, что второе антитело будет обладать аналогичной активностью.
[0056]
Известно, что каждая тяжелая и легкая цепь молекулы антитела содержит три определяющие комплементарность области (CDR). Определяющие комплементарность области, также называемые гипервариабельными областями, расположены в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей антитела. Эти участки имеют особо высоковариабельную первичную структуру и разделены на три фрагмента на соответствующих первичных структурах полипептидных цепей тяжелой и легкой цепи. При использовании в настоящем изобретении определяющие комплементарность области антитела обозначают как CDRH1, CDRH2 и CDRH3 от N-конца аминокислотной последовательности тяжелой цепи в случае определяющих комплементарность областей тяжелой цепи и как CDRL1, CDRL2 и CDRL3 от N-конца аминокислотной последовательности легкой цепи в случае определяющих комплементарность областей легкой цепи. Эти участки расположены близко друг к другу в такой конформации и определяют специфичность связываемого антигена.
[0057]
В настоящем изобретении термин "гибридизирующийся в жестких условиях" означает гибридизацию в условиях, включающих гибридизацию при температуре приблизительно от 50 до 70°C (например, 68°C) в коммерческом растворе для гибридизации ExpressHyb Hybridization Solution (выпускаемом Clontech Laboratories, Inc.) или гибридизацию при температуре приблизительно от 50 до 70°C (например, 68°C) в присутствии приблизительно 0,7-1,0 М NaCl при использовании фильтра с иммобилизованной ДНК, с последующей промывкой при температуре приблизительно от 50 до 70°C (например, 68°C) при использовании раствора SSC с концентрацией приблизительно от 0,1 до 2 (SSC, имеющий 1× концентрацию, состоит из 150 мМ NaCl и 15 мМ цитрата натрия; при необходимости раствор может содержать приблизительно от 0,1 до 0,5% SDS), что позволяет выполнять идентификацию или гибридизацию в условиях, эквивалентных указанным.
[0058]
При использовании в настоящем изобретении термин "несколько" во фразе "один или несколько" относятся к 2-10. Термин "несколько" предпочтительно означает 10 или меньше, более предпочтительно 5 или 6 или меньше, еще более предпочтительно 2 или 3.
[0059]
В настоящем изобретении "способность к перекрестному связыванию" или "способность перекрестно связывать" относится к способности одного антитела или антигенсвязывающего фрагмента связываться с соответствующими внеклеточными областями в двух молекулах белка ALK2, таким образом, перекрестно связывая эти молекулы. Обычно ALK2 образует комплекс в присутствии лиганда BMP с активацией нижестоящего SMAD1/5/8. Антитело к ALK2 вызывает образование перекрестной связи между двумя молекулами ALK2, что может приводить к образованию комплексов даже в отсутствие лиганда. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что антитело к ALK2, которое связывается с ALK2, ингибирует передачу сигнала BMP, когда аминокислотный остаток в положении 330 в мутантном белке ALK2 человека представляет собой пролин и, в некоторых случаях, когда мутантный белок ALK2 человека не содержит мутацию G328V, но при этом антитело к ALK2 способствует (или активирует) передаче сигнала BMP, когда пролин в положении 330 является другим аминокислотным остатком, таким как серин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота или аланин. На основании этого открытия, если у пациента в положении 330 в мутантном человеческом белке ALK2 присутствует пролин и, в некоторых случаях, в мутантном человеческом белке ALK2 отсутствует мутация G328V, пациент, идентифицированный таким образом, может быть подвергнут эффективному лечению антителом к ALK2.
[0060]
При использовании в настоящем изобретении стимуляция передачи сигнала BMP относится к активации нижестоящего внутриклеточного сигнального пути через молекулу рецептора ALK2.
[0061]
В настоящем изобретении "пациент" является не только человеком, пораженным (или страдающим) заболеванием, но может быть также человеком, подозреваемым на наличие заболевания.
[0062]
"Биологический образец" при использовании в настоящем изобретении особо не ограничен при условии возможности обнаружения присутствия или отсутствия мутации в ALK2 в биологическом образце. Биологический образец является, например, пробой крови или образцом опухоли. Биологический образец может быть белковыми экстрактами или экстрактами нуклеиновых кислот (например, экстрактами мРНК, а также препаратом кДНК и препаратом кРНК, полученными из экстрактов мРНК), полученными из этих образцов.
[0063]
2. ALK2
Ген ALK2 представляет собой ген, являющийся причиной ФОП, кодирующий рецептор BMP, который вызывает эктопическое образование кости в мягких тканях, включая ткани скелетных мышц. Мутантный ALK2 с аминокислотными заменами был обнаружен при семейных и спорадических случаях ФОП. Например, L196P (т.е. мутация с заменой лейцина в положении 196 пролином), delP197_F198insL (также называемая "PF197-8L") (т.е. мутация с делецией пролина в положении 197 и фенилаланина в положении 198 и вставкой вместо них лейцина), R202I (т.е. мутация с заменой аргинина в положении 202 изолейцином), R206H (т.е. мутация с заменой аргинина в положении 206 гистидином), Q207E (т.е. мутация с заменой глутамина в положении 207 глутаминовой кислотой), R258S (т.е. мутация с заменой аргинина в положении 258 серином), R258G (т.е. мутация с заменой аргинина в положении 258 глицином), G325A (т.е. мутация с заменой глицина в положении 325 аланином), G328E (т.е. мутация с заменой глицина в положении 328 глутаминовой кислотой), G328R (т.е. мутация с заменой глицина в положении 328 аргинином), G328W (т.е. мутация с заменой глицина в положении 328 триптофаном), G356D (т.е. мутация с заменой глицина в положении 356 аспарагиновой кислотой) и R375P (т.е. мутация с заменой аргинина в положении 375 пролином) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 известны как активные мутации в ALK2 человека.
[0064]
Мутантный ALK2, содержащий аминокислотную замену(ы), также был обнаружен в случаях DIPG. Мутации R206H, R258G, G328E, G328V (которая является мутацией с заменой глицина в положении 328 валином), G328W, G356D и т.п. в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 известны как активные мутации в ALK2 человека.
[0065]
ALK2 при использовании в настоящем изобретении, может быть получен путем синтеза in vitro или продукции из клеток-хозяев с помощью генной манипуляции. В частности, кДНК ALK2 встраивают в вектор, который обеспечивает ее экспрессию. Затем белок ALK2 может быть получен путем синтеза в растворах, содержащих ферменты, субстраты и энергетические вещества, необходимые для транскрипции и трансляции, или при экспрессии в других прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах, трансформированных вектором.
[0066]
ALK2 при использовании в настоящем изобретении, происходит из млекопитающего, включая человека или мышь. Например, аминокислотная и нуклеотидная последовательности человеческого ALK2 доступны со ссылкой на рег. номер GenBank NM_001105. В настоящем изобретении аналогичным образом аминокислотная последовательность раскрыта как SEQ ID NO: 1, и нуклеотидная последовательность раскрыта как SEQ ID NO: 2. Аминокислотная и нуклеотидная последовательности ALK2 мыши доступны со ссылкой рег. номер GenBank NP_001103674. В настоящем изобретении аналогичным образом аминокислотная последовательность раскрыта как SEQ ID NO: 3, и нуклеотидная последовательность раскрыта как SEQ ID NO:4. Кроме того, аминокислотные последовательности ALK2 обезьяны, крысы и собаки доступны со ссылкой на рег. номер GenBank NM-001260761 (SEQ ID NO: 40), NP_077812 (SEQ ID NO: 42) и XM_549615.5 (SEQ ID NO: 41), соответственно. ALK2 также называется ACVR1 (рецептор 1 активина A, I типа) или ACTR1 (рецептор активина 1-го типа), при этом все эти термины обозначают одни и те же молекулы.
[0067]
кДНК ALK2 может быть получена с помощью так называемого метода ПЦР, который включает проведение полимеразной цепной реакции (в дальнейшем именуемой "ПЦР") (Saiki, R.K., et al., Science, (1988) 239, 487-49), например, при использовании библиотеки кДНК, экспрессирующей кДНК ALK2, в качестве матрицы и праймеров, специфично амплифицирующих кДНК ALK2.
[0068]
3. Обнаружение мутации в ALK2
В настоящем изобретении термин "обнаружение мутации", как правило, означает обнаружение мутации в геномной ДНК. В альтернативе, когда мутация в геномной ДНК выражается в изменении основания(й) в транскрибируемом продукте или в изменении аминокислоты (аминокислот) в транслируемом продукте, данный термин также означает включение обнаружения такого изменения в транскрибируемом продукте или транслируемом продукте (т.е. косвенное обнаружение).
[0069]
В предпочтительном варианте осуществления способ согласно настоящему изобретению является способом прямого определения нуклеотидной последовательности области гена ALK2 у пациента с обнаружением, таким образом, мутации. При использовании в настоящем изобретении "область гена ALK2" означает некоторую область в геномной ДНК, содержащую ген ALK2. Область также содержит области контроля экспрессии (например, область промотора и область энхансера) гена ALK2, 3'-концевую нетранслируемую область гена ALK2 и т.п. Мутация в этих областях может влиять, например, на транскрипционную активность гена ALK2.
[0070]
В этом способе образец ДНК сначала получают из биологического образца, полученного от пациента. Примеры образца ДНК включают образцы геномной ДНК и образцы кДНК, полученные из РНК при обратной транскрипции.
[0071]

Способ выделения геномной ДНК или РНК из биологического образца особо не ограничен, и для использования при экстракции могут быть соответствующим образом выбраны методы, известные в данной области. Примеры способа выделения геномной ДНК включают SDS-фенольный метод (т.е. метод, который включает: денатурацию белков в тканях, консервированных в растворе, содержащем мочевину, или в этаноле, с использованием протеолитического фермента (протеиназы K), поверхностно-активного вещества (SDS) и фенола; и выделение ДНК путем осаждения из тканей с использованием этанола), и методы экстракции ДНК с использованием Clean Columns (производства NextTec Biotechnolgie GmbH), AquaPure (производства Bio-Rad Laboratories, Inc.), ZR Plant/Seed DNA Kit (производства Zymo Research Corp.), Aqua Genomic Solution (производства MoBiTec GmbH), prepGEM (производства ZyGEM NZ Ltd.) или BuccalQuick (производства TrimGen Corp.). Примеры способа выделения РНК включают методы экстракции с использованием фенола и хаотропной соли (в частности, методы экстракции с использованием коммерческого набора, такого как TRIzol (производства Invitrogen Corp.) или ISOGEN (производства Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)) и способы с использованием других доступных в продаже наборов (набор для выделения суммарной РНК RNAPrep (производства Beckman Coulter, Inc.), RNeasy Mini (производства Qiagen NV), набора для выделения РНК (производства Pharmacia Biotech Inc.) и т.д.). Примеры обратной транскриптазы для использования при получении кДНК из выделенной РНК включают, без ограничения перечисленными, обратную транскриптазу из ретровируса, такого как RAV (Раус-ассоциированный вирус) или AMV (вирус миелобластоза птиц), и обратную транскриптазу, полученную из ретровируса мышей, такого как MMLV (вирус мышиного лейкоза Молони).
[0072]
В этом аспекте ДНК, содержащую сайт мутации в области гена ALK2, впоследствии выделяют и определяют нуклеотидную последовательность выделенной ДНК. Выделение ДНК может быть выполнено, например, с помощью ПЦР при использовании пары олигонуклеотидных праймеров, сконструированных таким образом, чтобы фланкировать с обеих сторон мутацию в области гена ALK2, и с использованием геномной ДНК или РНК в качестве матрицы. Определение нуклеотидной последовательности выделенной ДНК может быть выполнено, например, способом, известным специалистам в данной области, таким как метод Максама-Гилберта или метод Сенгера, или метод с использованием секвенатора следующего поколения.
[0073]
Определенную нуклеотидную последовательность ДНК или кДНК могут сравнивать с контролем (например, нуклеотидной последовательностью соответствующей ДНК или кДНК, полученной из биологических образцов здоровых людей), определяя, таким образом, присутствие или отсутствие мутации в области гена ALK2 у пациента.
[0074]
Способ обнаружения мутации в области гена ALK2 может быть выполнен с помощью различных методов, позволяющих обнаружить мутацию, в дополнение к методу прямого определения нуклеотидной последовательности ДНК или кДНК.
[0075]

Обнаружение мутации согласно настоящему изобретению также может быть выполнено, например, с помощью следующего способа. В частности, образец ДНК или кДНК сначала получают из биологического образца. Затем подготавливают меченный репортерным флуоресцентным красителем и гасителем флуоресценции олигонуклеотидный зонд, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотидной последовательности, содержащей мутацию в области гена ALK2. Затем олигонуклеотидный зонд гибридизуют с образцом ДНК в жестких условиях. После этого нуклеотидную последовательность, содержащую мутацию в области гена ALK2, амплифицируют с использованием образца ДНК, гибридизованного с олигонуклеотидным зондом, в качестве матрицы. Затем детектируют флуоресценцию (сигнал), испускаемую репортерным флуоресцентным красителем в результате разложения олигонуклеотидного зонда при амплификации. После этого детектированную флуоресценцию сравнивают с контролем. Примеры такого метода включают метод с использованием зондов с двумя красителями и метод с использованием зондов TaqMan.
[0076]
В альтернативном способе образец ДНК или кДНК получают из биологического образца. Затем нуклеотидную последовательность, содержащую мутацию в области гена ALK2, амплифицируют при использовании образца ДНК в качестве матрицы в реакционной системе, содержащей интеркалятор, который испускает флуоресценцию при встраивании между двумя цепями ДНК. Затем температуру реакционной системы изменяют и детектируют изменение интенсивности флуоресценции, испускаемой интеркалятором. Обнаруженное изменение интенсивности флуоресценции, вызванное изменением температуры, сравнивают с контролем. Примеры такого метода включают метод HRM (плавления высокого разрешения).
[0077]
В другом альтернативном способе образец ДНК или кДНК сначала получают из биологического образца. Затем ДНК, содержащую сайт мутации в области гена ALK2, амплифицируют. Амплифицированную ДНК затем расщепляют рестриктазами и разделяют расщепленные фрагменты ДНК по их размеру. Затем определенные размеры фрагментов ДНК сравнивают с контролем. Примеры такого способа включают метод с использованием полиморфизма длины фрагмента рестрикции (ПДФР) и ПЦР-ПДФР.
[0078]
В другом альтернативном способе образец ДНК или кДНК сначала получают из биологического образца. Затем ДНК, содержащую сайт мутации в области гена ALK2, амплифицируют. Амплифицированную ДНК затем подвергают диссоциации на одноцепочечные ДНК, которые затем разделяют в неденатурирующем геле. После этого подвижность разделенных одноцепочечных ДНК в геле сравнивают с контролем. Примеры такого метода включают ПЦР SSCP (конформационный полиморфизм одиночных цепей).
[0079]
В другом альтернативном способе образец ДНК или кДНК сначала получают из биологического образца. Затем ДНК, содержащую сайт мутации в области гена ALK2, амплифицируют. После этого амплифицированную ДНК разделяют в геле, в котором концентрация денатурирующего ДНК вещества постепенно увеличивается. Затем подвижность разделенной ДНК в геле сравнивают с контролем. Примеры такого метода включают гель-электрофорез в градиенте денатурирующего вещества (DGGE).
[0080]
Другой альтернативный способ является способом с использованием ДНК, содержащей сайт мутации в области гена ALK2, полученной из биологического образца, и субстрата с иммобилизированными олигонуклеотидными зондами, гибридизующимися с ДНК в жестких условиях. Примеры такого метода включают метод матриц ДНК.
[0081]
В другом альтернативном способе образец ДНК или кДНК сначала получают из биологического образца. Кроме того, получают "олигонуклеотидный праймер, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную 3' нуклеотиду через один нуклеотид после основания в сайте мутации в области гена ALK2 и 3' нуклеотидной последовательности после 3' нуклеотида". После этого проводят реакцию с удлинением ддНТФ праймера при использовании ДНК в качестве матрицы и праймера. Затем продукт реакции удлинения праймера вводят в масс-спектрометр для проведения масс-спектрометрии. После этого определяют генотип на основе результатов масс-спектрометрии. Определенный генотип затем сравнивают с контролем. Примеры такого метода включают МАЛДИ-ВП/МС.
[0082]
В другом альтернативном способе образец ДНК или кДНК сначала получают из биологического образца. Затем получают олигонуклеотидный зонд, состоящий из 5'-(нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотиду в сайте мутации в области гена ALK2, и 5' нуклеотидной последовательности перед этим нуклеотидом) - (нуклеотидной последовательности, которая не гибридизуется с 3' нуклеотидом через один нуклеотид после сайта мутации в области гена ALK2 и с 3' нуклеотидной последовательности после 3' нуклеотида) - 3' (т.е. флэп). Кроме того, получают "олигонуклеотидный зонд, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеотиду в сайте мутации в области гена ALK2, и 3' нуклеотидной последовательности после этого нуклеотида". После этого полученная ДНК гибридизуется с двумя типами олигонуклеотидных зондов, и гибридизованная ДНК расщепляется расщепляющим одноцепочечную ДНК ферментом с высвобождением флэпа. Примеры фермента, расщепляющего одноцепочечную ДНК, включают, без ограничения, кливазу. В этом способе олигонуклеотидный зонд, меченный флуоресцентным репортером и гасителем флуоресценции, имеющий последовательность, комплементарную флэпу, затем гибридизируется с флэпом. Затем измеряют интенсивность генерируемой флуоресценции. После этого измеренную интенсивность флуоресценции сравнивают с контролем. Примеры такого способа включают метод Invader.
[0083]
В другом альтернативном способе образец ДНК или кДНК сначала получают из биологического образца. Затем ДНК, содержащую сайт мутации в области гена ALK2, амплифицируют. Затем амплифицированную ДНК подвергают диссоциации на одиночные цепи и отделяют только одну из одиночных цепей диссоциированной ДНК. После этого проводят реакцию удлинения по одному нуклеотиду от нуклеотида, расположенного вблизи от нуклеотида в сайте мутации в области гена ALK2. Пирофосфорную кислоту, образующуюся во время этой реакции, используют для ферментной люминесценции. Интенсивность испускаемого света измеряют. Измеренную интенсивность флуоресценции сравнивают с контролем. Примеры такого способа включают метод пиросеквенирования.
[0084]
В другом альтернативном способе образец ДНК или кДНК сначала получают из биологического образца. Затем ДНК, содержащую сайт мутации в области гена ALK2, амплифицируют. Затем получают "олигонуклеотидный праймер, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную 3' нуклеотиду, расположенному через один нуклеотид после нуклеотида в сайте мутации в области гена ALK2, и 3' нуклеотидной последовательности после этого 3' нуклеотида". После этого проводят реакцию удлинения по одному основанию с использованием амплифицированной ДНК в качестве матрицы и полученного праймера в присутствии флуоресцентно меченных нуклеотидов. Затем измеряют степень поляризации флуоресценции. Измеренную степень поляризации флуоресценции сравнивают с контролем. Примеры такого способа включают метод AcycloPrime.
[0085]
В другом альтернативном способе образец ДНК или кДНК сначала получают из биологического образца. Затем ДНК, содержащую сайт мутации в области гена ALK2, амплифицируют. Затем получают "олигонуклеотидный праймер, имеющий нуклеотидную последовательность, комплементарную 3' нуклеотиду через один нуклеотид после нуклеотида в сайте мутации в области гена ALK2 и 3' нуклеотидной последовательности после этого 3' нуклеотида". После этого проводят реакцию удлинения по одному нуклеотиду с использованием амплифицированной ДНК в качестве матрицы и полученного праймера в присутствии флуоресцентно меченных нуклеотидов. После этого нуклеотиды, использованные в реакции удлинения по одному нуклеотиду, определяют. Затем определенные нуклеотиды сравнивают с контролем. Примеры такого способа включают метод SNuPE.
[0086]
Образец, полученный из вышеуказанного биологического образца, может быть белком. В таком случае способ с использованием молекулы (например, антитела), специфично связывающейся с сайтом, содержащим аминокислотное изменение, могут применять для обнаружения мутации.
[0087]
4. Обнаружение эктопической оссификации и/или опухоли головного мозга
Эктопическая оссификация и/или опухоль головного мозга вызваны ALK2-опосредованной сигнальной трансдукцией BMP.
[0088]
"Эктопическая оссификация" означает формирование кости в участке, где кость изначально отсутствует. Примеры "эктопической оссификации" могут включать оссифицирующую прогрессирующую фибродисплазию (ФОП) и прогрессирующую костную гетероплазию (ПКГ), хотя эктопическая оссификация не ограничена этим, при условии, что эктопическая оссификация вызвана передачей сигнала BMP, опосредованной ALK2, содержащим активную мутацию.
[0089]
"Опухоль головного мозга" означает опухоль, которая развивается в ткани черепа. Примеры "опухоли головного мозга" могут включать диффузную внутреннюю глиому моста (DIPG), глиому ствола головного мозга, глиобластому, мультиформную глиобластому (МГ), неглиобластомную опухоль головного мозга, менингиому, лимфому центральной нервной системы, глиому, астроглиому, анапластическую астроцитому, олигодендроглиому, олигоастроцитому, медуллобластому и эпендимому, хотя опухоль головного мозга не ограничена этим, при условии, что опухоль головного мозга вызвана передачей сигнала BMP, опосредованной ALK2, содержащим активную мутацию.
[0090]
ALK2 представляет собой трансмембранный рецептор серин/треонинкиназы, связывающийся с BMP. ALK2 связывается с BMP в N-концевой внеклеточной области и активирует нижестоящий внутриклеточный сигнальный путь посредством внутриклеточной серин/треонинкиназы. Костный морфогенетический белок (BMP) представляет собой многофункциональный фактор роста, принадлежащий к суперсемейству трансформирующего фактора роста β (TGF-β), при этом было идентифицировано приблизительно 20 членов семейства BMP. Было подтверждено, что BMP вызывает эктопическое образование кости в мягких тканях, включая ткани скелетных мышц, и поэтому считается, что он участвует в патогенезе заболеваний, способствующих патологическому формированию костной ткани. Считается, что BMP-2 и BMP-4 имеют более высокое сродство к ALK3, чем к ALK2. Поскольку ALK3 экспрессируется повсеместно по сравнению с ALK2, то BMP-2 или BMP-4, по-видимому, часто используют в общем в экспериментах по индукции эктопической оссификации в различных участках. С другой стороны, BMP-7 имеет относительно высокое сродство к ALK2. Обычно считается, что BMP-9 имеет высокое сродство к ALK1, причем также было обнаружено, что он имеет относительно высокое сродство к ALK2. При ФОП эктопическая оссификация проходит через ALK2. Таким образом, присутствие или отсутствие терапевтических и/или профилактических эффектов при ФОП, вероятно, может быть подтверждено путем тестирования эффективности эктопической остеоиндукции, вызванной активацией опосредуемых ALK2 сигналов BMP-7 и BMP-9.
[0091]
Присутствие в культуре миобластов (клетки C2C12) BMP подавляет их дифференцировку в зрелые мышечные клетки посредством механизма внутриклеточной сигнальной трансдукции, специфической для BMP, и вместо этого вызывает дифференцировку в остеобласты. Таким образом, ALK2-опосредованная передача сигнала BMP может быть исследована с помощью моделей индукции дифференцировки клеток C2C12 в остеобласты под действием BMP.
[0092]
5. Получение антитела к ALK2
Антитело, применяемое в настоящем изобретении против ALK2, может быть получено согласно способу, известному в уровне техники (например, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; и Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)). В частности, моноклональное антитело может быть получено путем слияния антителопродуцирующих клеток, которые вырабатывают антитело к ALK2, с миеломными клетками, с получением гибридом. Полученное антитело может быть протестировано на свою связывающую активность и способность перекрестного связывания с ALK2, с отбором антитела, которое может применяться при заболеваниях человека.
[0093]
В настоящем изобретении положения аминокислот, отнесенные к CDR/FR, характеризующим антитело, определены согласно нумерации KABAT (KABAT et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
[0094]
Антитело, применяемое в настоящем изобретении, включает моноклональные антитела к ALK2, описанные выше, а также, например, поликлональные антитела, аналогично обладающие терапевтическим и/или профилактическим действием, рекомбинантные антитела, искусственно сконструированные, например, с целью снижения гетерогенной антигенности против человека, например, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела и т.п. Такие антитела могут быть получены известными методами.
[0095]
Примеры химерного антитела могут включать химерные антитела, включающие вариабельные области и константные области (Fc) антител, полученных из разных биологических видов, например, вариабельные области антитела, полученного из мыши или крысы, соединенные с константными областями человеческого происхождения (см. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984)).
[0096]
Примеры гуманизированного антитела могут включать антитело, включающее только CDR-области, встроенные в человеческое антитело (см. Nature (1986) 321, p. 522-525), и антитело, включающее CDR-последовательности, а также аминокислотные остатки фрагмента каркасных областей, перевитые в человеческое антитело методом CDR-графтинга (Международная публикация WO90/07861).
[0097]
Примеры антитела к ALK2, которое может применяться в настоящем изобретении, могут включать, без ограничения, следующие антитела к ALK2, включающие последовательность вариабельной области тяжелой цепи и последовательность вариабельной области легкой цепи.
[0098]
Антитело к ALK2 то, в котором:
последовательность тяжелой цепи антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента включает вариабельную область, содержащую CDRH1, CDRH2 и CDRH3, где CDRH1, CDRH2 и CDRH3 состоят из аминокислотных последовательностей:
SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно;
SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, соответственно;
SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, соответственно; или
SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, соответственно, и
последовательность легкой цепи которого включает вариабельную область, содержащую CDRL1, CDRL2 и CDRL3, где CDRL1, CDRL2 и CDRL3 состоят из аминокислотных последовательностей:
SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, соответственно;
SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 10, соответственно;
SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16, соответственно;
SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23, соответственно; или
SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 29, соответственно, и
антитело, конкурирующее за связывание ALK2 с антителом к ALK2 и обладающее свойством перекрестного связывания ALK2 и свойством ингибирования передачи сигнала BMP.
[0099]
В альтернативном варианте антитело к ALK2, в котором:
последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента является:
a1) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 142 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31;
a2) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 142 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33;
a3) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34;
a4) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36;
a5) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38;
a6) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39;
a7) аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 95% идентичностью с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из аминокислотных последовательностей a1) - a6);
a8) аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 99% идентичностью с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из аминокислотных последовательностей a1) - a6); или
a9) аминокислотной последовательностью, включающей замену(ы), делецию(и) или добавление(я) нескольких аминокислотных остатков в любой аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотных последовательностей a1) - a6), и
последовательность вариабельной области легкой цепи является:
b1) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 133 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32;
b2) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 129 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35;
b3) аминокислотной последовательностью, состоящей из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 129 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37;
b4) аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 95% идентичностью с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из аминокислотных последовательностей b1) - b3);
b5) аминокислотной последовательностью, обладающей по меньшей мере 99% идентичностью с любой аминокислотной последовательностью, выбранной из аминокислотных последовательностей b1) - b3); или
b6) аминокислотной последовательностью, включающей замену(ы), делецию(и) или добавление(я) нескольких аминокислотных остатков в любой аминокислотной последовательности, выбранной из аминокислотных последовательностей b1) - b3), и
антитело, которое конкурирует за связывание ALK2 с антителом к ALK2 и обладает свойством перекрестного связывания ALK2 и свойством ингибирования передачи сигнала BMP.
[0100]
Более конкретно, примеры антитела к ALK2, которое может применяться в настоящем изобретении, могут включать антитела к ALK2, раскрытые в WO2016/121908 авторами настоящего изобретения.
[0101]
Примеры крысиного антитела к ALK2 могут включать A2-11E, A2-15A, A2-25C и A2-27D, описанные в Примере 1 WO2016/121908.
Примеры человеческого химерного антитела к ALK2 могут включать cA2-15A и cA2-27D, описанные в Примере 5 WO2016/121908.
[0102]
Гуманизированное антитело, полученное из антитела A2-15A, включено в антитело, применяемое в настоящем изобретении, при условии, что гуманизированное антитело содержит все 6 CDR-последовательностей A2-15A и обладает связывающей активностью и способностью к перекрестному связыванию с ALK2. Вариабельная область тяжелой цепи антитела A2-15A включает CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5 (GFTFSHYYMA), CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 (SITNSGGSINYRDSVKG), и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7 (EGGENYGGYPPFAY). Вариабельная область легкой цепи антитела A2-15A включает CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8 (RANQGVSLSRYNLMH), CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9 (RSSNLAS), и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 (QQSRESPFT). Кроме того, антитело, которое конкурирует за связывание ALK2 с антителом A2-15A и обладает свойством перекрестного связывания ALK2 и свойством ингибирования передачи сигнала BMP, также включено в настоящее изобретение.
[0103]
Гуманизированное антитело, полученное из антитела A2-27D, включено в антитело, применяемое в настоящем изобретении, при условии, что гуманизированное антитело содержит все 6 CDR-последовательностей A2-27D и обладает связывающей активностью и способностью к перекрестному связыванию с ALK2. Вариабельная область тяжелой цепи антитела A2-27D включает CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11 (GSTFSNYGMK), CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12 (SISRSSTYIYYADTVKG), и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13 (AISTPFYWYFDF). Вариабельная область легкой цепи антитела A2-27D включает CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14 (LASSSVSYMT), CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15 (GTSNLAS), и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16 (LHLTSYPPYT). Кроме того, антитело, которое конкурирует за связывание ALK2 с антителом A2-27D и обладает свойством перекрестного связывания ALK2 и свойством ингибирования передачи сигнала BMP, также включено в настоящее изобретение.
[0104]
Гуманизированное антитело, полученное из антитела A2-11E, включено в антитело, применяемое в настоящем изобретении, при условии, что гуманизированное антитело содержит все 6 CDR-последовательностей A2-11E и обладает связывающей активностью и способностью к перекрестному связыванию с ALK2. Вариабельная область тяжелой цепи антитела A2-11E включает CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18 (GFTFSNYYMY), CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 19 (SINTDGGSTYYPDSVKG), и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20 (STPNIPLAY). Вариабельная область легкой цепи антитела A2-11E включает CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 21 (KASQNIYKYLN), CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22 (YSNSLQT), и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23 (FQYSSGPT). Кроме того, антитело, которое конкурирует за связывание ALK2 с антителом A2-11E и обладает свойством перекрестного связывания ALK2 и свойством ингибирования передачи сигнала BMP, также включено в настоящее описание.
[0105]
Гуманизированное антитело, полученное из антитела A2-25C, включено в антитело, применяемое в настоящем изобретении, при условии, что гуманизированное антитело содержит все 6 CDR-последовательностей A2-25C и обладает связывающей активностью и способностью к перекрестному связыванию с ALK2. Вариабельная область тяжелой цепи антитела A2-25C включает CDRH1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24 (GFTFSYYAMS), CDRH2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25 (SISRGGDNTYYRDTVKG), и CDRH3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26 (LNYNNYFDY). Вариабельная область легкой цепи антитела A2-25C включает CDRL1, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27 (QASQDIGNWLS), CDRL2, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28 (GATSLAD), и CDRL3, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29 (LQAYSAPFT). Кроме того, антитело, которое конкурирует за связывание ALK2 с антителом A2-25C и обладает свойством перекрестного связывания ALK2 и свойством ингибирования передачи сигнала BMP, также включено в настоящее изобретение.
[0106]
CDR-модифицированное гуманизированное антитело, полученное в результате замены 1-3 аминокислотных остатков в каждой CDR другими аминокислотными остатками, также включено в антитело, применяемое в настоящем изобретении, при условии, что гуманизированное антитело обладает связывающей активностью и способностью к перекрестному связыванию с ALK2. Примеры аминокислотной замены в CDRL2 могут включать замену одной аминокислоты в CDRL2 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30 (гуманизированное hA2-15A-L4). CDRL2, состоящая из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17 (RSSNLAQ), является предпочтительной.
[0107]
Фактические примеры гуманизированного антитела, полученного из антитела A2-15A, могут включать:
антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей последовательность вариабельной области тяжелой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положении 20 до положения 142 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31 (гуманизированное hA2-15A-H4), и легкой цепи, включающей последовательность вариабельной области легкой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 133 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32 (гуманизированное hA2-15A-L6), и
антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей последовательность вариабельной области тяжелой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 142 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33 (гуманизированный hA2-15A-H4 IgG2), и легкой цепи, включающей последовательность вариабельной области легкой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 133 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32, и
антитело, которое конкурирует за связывание ALK2 с любым из антител A2-15A и обладает свойством перекрестного связывания ALK2 и свойством ингибирования передачи сигнала BMP, также включено в настоящее изобретение.
[0108]
Предпочтительные примеры комбинации могут включать:
антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до 472 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 238 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32, и
антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 468 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 33, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 238 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32, и
антитело, которое конкурирует за связывание ALK2 с любым из антител и обладает свойством перекрестного связывания ALK2 и свойством ингибирования передачи сигнала BMP, также включено в настоящее описание.
[0109]
Фактические примеры гуманизированного антитела, полученного из антитела A2-27D, могут включать:
антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей последовательность вариабельной области тяжелой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34 (гуманизированное hA2-27D-H2), и легкой цепи, включающей последовательность вариабельной области легкой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 129 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 (гуманизированное hA2-27D-L2);
антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей последовательность вариабельной области тяжелой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36 (гуманизированное hA2-27D-H3), и легкой цепи, включающей последовательность вариабельной области легкой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 129 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37 (гуманизированное hA2-27D-L4);
антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей последовательность вариабельной области тяжелой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38 (гуманизированный hA2 27D H2 LALA), и легкой цепи, включающей последовательность вариабельной области легкой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 129 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35; и
антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей последовательность вариабельной области тяжелой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39 (гуманизированный hA2 27D H3 LALA), и легкой цепи, включающей последовательность вариабельной области легкой цепи, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 129 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37; и
антитело, которое конкурирует за связывание ALK2 с любым из антител и обладает свойством перекрестного связывания ALK2 и свойством ингибирования передачи сигнала BMP, также включено в настоящее изобретение.
[0110]
Предпочтительные примеры комбинации могут включать:
антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 470 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 234 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35;
антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 470 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 234 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37;
антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 470 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 234 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35; и
антитело, состоящее из тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков от положения 20 до положения 470 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39, и легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 234 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37; и
антитело, которое конкурирует за связывание ALK2 с любым из антител и обладает свойством перекрестного связывания ALK2 и свойством ингибирования передачи сигнала BMP, также включено в настоящее изобретение.
[0111]
Другие примеры антитела, применяемого в настоящем изобретении, могут включать человеческое антитело. Человеческое антитело к ALK2 означает человеческое антитело, полученное только из последовательностей генов антител, полученные из хромосом человека. Человеческое антитело к ALK2 может быть получено способом с использованием продуцирующих человеческое антитело мышей, несущих фрагменты человеческих хромосом, которые включают гены тяжелой и легкой цепей человеческого антитела (см., например, Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997), 16, p. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nuc. Acids Res. (1998), 26, p. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, p. 69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; и Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000), 97, p. 722-727).
[0112]
В частности, такая мышь, продуцирующая человеческое антитело, может быть создана как рекомбинантное животное, у которого локусы генов тяжелой и легкой цепей эндогенного иммуноглобулина были прерваны, и вместо них встроены локусы генов тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина человека с помощью вектора, например, вектора на основе искусственной хромосомы человека (HAC) или вектора на основе искусственной хромосомы мыши (MAC), путем получения нокаутного животного или трансгенного животного или путем скрещивания этих животных
[0113]
В альтернативе эукариотические клетки могут быть трансформированы кДНК, кодирующими тяжелую и легкую цепи, соответственно, такого человеческого антитела, предпочтительно посредством векторов, содержащих кДНК, с помощью методов рекомбинации генов. Трансформированные клетки, продуцирующие рекомбинантное человеческое моноклональное антитело, можно культивировать для получения этого антитела из супернатанта культуры. В этом контексте, например, эукариотические клетки, предпочтительно клетки млекопитающих, такие как клетки СНО, лимфоциты или клетки миеломы, могут использоваться в качестве хозяев.
[0114]
Кроме того, известен способ получения человеческого антитела, полученного с применением фагового дисплея, отобранного из библиотеки человеческих антител (см., например, Wormstone, I.M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science (2002), 43 (7), p. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203; и Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002), 109 (3), p. 427-431).
[0115]
Например, может использоваться метод фагового дисплея (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116), который включает обеспечение экспрессии вариабельных областей человеческого антитела в виде одноцепочечного Fv (scFv) на поверхности фага и отбор фага, связывающегося с антигеном. Фаг, отобранный на основе своей способности связываться с антигеном, может быть подвергнут анализу генов для определения последовательностей ДНК, кодирующих вариабельные области человеческого антитела, связывающегося с антигеном. Если последовательность ДНК scFv, связывающегося с антигеном, определена, вектор экспрессии, содержащий эту последовательность, может быть получен и перенесен в соответствующие хозяева с последующей экспрессией для получения человеческого антитела (WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994), 12, p. 433-455; и Nature Biotechnology (2005), 23 (9), p. 1105-1116).
[0116]
Антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и антитело к ALK2, раскрытое в WO2016/121908, также включено в антитело к ALK2, которое может применяться в настоящем изобретении. Их примеры включают антитела, связывающиеся с тем же эпитопом, что и антитело A2-11E, антитело A2-15A, антитело A2-25C и/или антитело A2-27D.
[0117]
Когда антитело связывается или распознает частичную конформацию антигена, эпитоп этого антитела может быть определен путем идентификации аминокислотных остатков на антигене, находящихся в контакте с антителом, при использовании рентгеноструктурного анализа. Например, антитело или его фрагмент и антиген или его фрагмент могут быть связаны друг с другом, кристаллизованы с их последующим структурным анализом для идентификации аминокислотных остатков антигена, находящихся на расстоянии взаимодействия между аминокислотным остатком и антителом. Расстояние взаимодействия составляет 8 ангстрем или меньше, предпочтительно 6 ангстрем или меньше, более предпочтительно 4 ангстрема или меньше. Один или более аминокислотных остатков, находящихся на таком расстоянии взаимодействия от антитела, могут образовывать эпитоп (или антигенную детерминанту) антитела. Когда количество таких аминокислотных остатков равно двум или больше, эти аминокислоты могут не примыкать друг к другу в первичной последовательности.
[0118]
Примеры антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, связывающегося с эпитопом белка ALK2, описаны ниже.
[0119]
Антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент могут специфично связываться с полипептидом, состоящим из аминокислотных остатков от положения 21 до положения 123 в аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 1) ALK2 человека.
[0120]
Антитело A2-27D распознает частичную конформацию на человеческом ALK2. В аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 1) человеческого ALK2 аминокислотные остатки, находящиеся на расстоянии взаимодействия от антитела A2-27D, т.е. эпитоп, сформированы каждым из остатков глутаминовой кислоты (Glu) в положении 38, глицина (Gly) в положении 39, изолейцина (Ile) в положении 59, аспарагина (Asn) в положении 60, аспарагиновой кислоты (Asp) в положении 61, глицина (Gly) в положении 62, фенилаланина (Phe) в положении 63, гистидина (His) в положении 64, валина (Val) в положении 65, тирозина (Tyr) в положении 66, аспарагина (Asn) в положении 102, треонина (Thr) в положении 104, глутамина (Gln) в положении 106 и лейцина (Leu) в положении 107. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или модифицированная форма антитела, или фрагмент, связывающийся с этим эпитопом или находящийся на расстоянии взаимодействия от антитела, или фрагмент и каждый из аминокислотных остатков также включены в антитело, применяемое в настоящем изобретении.
[0121]
Антитело A2-25C распознает частичную конформацию на человеческом ALK2. В аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 1) человеческого ALK2 аминокислотные остатки, находящиеся на расстоянии взаимодействия от антитела A2-25C, т.е. эпитоп, сформированы каждым из остатков глутаминовой кислоты (Glu) в положении 38, глицина (Gly) в положении 39, лейцина (Leu) в положении 40, изолейцина (Ile) в положении 59, аспарагина (Asn) в положении 60, аспарагиновой кислоты (Asp) в положении 61, глицина (Gly) в положении 62, фенилаланина (Phe) в положении 63, гистидина (His) в положении 64, валина (Val) в положении 65, тирозина (Tyr) в положении 66 и треонина (Thr) в положении 104. Антитело, его антигенсвязывающий фрагмент или модифицированная форма антитела, или фрагмент, связывающийся с этим эпитопом или находящийся на расстоянии взаимодействия от этих аминокислотных остатков, также включены в антитело, применяемое в настоящем изобретении.
[0122]
В альтернативе антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, конкурирующими за связывание ALK2 с антителом к ALK2 или его антигенсвязывающим фрагментом, описанным выше (например, антителом A2-27D и антителом A2-25C).
[0123]
D
D
D
-6
-12
Антитело, описанное выше, можно оценить на связывающую активность по отношению к антигену, например, с помощью способа, описанного в Примере 2, 6, 9 или 10 WO2016/121908, для отбора подходящих антител. Константа диссоциации (K) антитела составляет, например, от 1×10 до 1×10 М или меньше, но не ограничена этим диапазоном при условии, что получены терапевтические или профилактические эффекты, представляющие интерес. Константа диссоциации антитела в отношении антигена (ALK2) может быть измерена с помощью BiaCore T200 (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.) на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в качестве принципа обнаружения. Например, антитело в подходящей концентрации реагирует в качестве аналита с антигеном, иммобилизованным в качестве лиганд на твердой фазе. Ассоциация и диссоциация между антителом и антигеном может быть измерена с получением константы скорости ассоциации ka1, константы скорости диссоциации kd1 и константы диссоциации (K; K=kd1/ka1). Оценка связывающей активности в отношении ALK2 не ограничена применением BiaCore T200 и может быть проведена с помощью, например, прибора, основанного на методе поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в качестве принципа обнаружения, KinExA (Sapidyne Instruments Inc.) на основе анализа кинетического исключения в качестве принципа обнаружения, системы BLItz (Pall Corp.) на основе интерферометрии биослоя в качестве принципа обнаружения или ИФА (твердофазного иммуноферментного анализа).
[0124]

Антитело, описанное выше, может быть оценено на способность перекрестного связывания с антигеном, например, с помощью способа, описанного в Примере 4, указанном ниже, для отбора подходящих антител. В частности, слитый белок ALK2 и LgBiT или SmBiT экспрессируют in vitro в клетках с применением технологии NanoLuc Binary Technology: NanoBiT (Promega Corp.), при этом взаимодействие белка ALK2 с антителом может быть обнаружено по люминесценции, вызванной структурной комплементарностью LgBiT и SmBiT.
[0125]
Один из примеров другого показателя для сравнения свойств антител может включать стабильность антител. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) представляет собой метод, который позволяет быстро и точно измерять точку перехода (Tm), которая служит хорошим показателем относительной структурной стабильности белков. Значения Tm можно измерять с помощью ДСК и сравнивать для определения различий в термической стабильности. Как известно, стабильность антитела при хранении в некоторой степени коррелирует с термостабильностью антитела (Lori Burton, et al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p. 265-273). Подходящее антитело может быть выбрано при использовании его термостабильности в качестве показателя. Примеры других показателей для выбора антитела могут включать высокие выходы в соответствующих клетках-хозяевах и низкую агрегацию в водном растворе. Например, антитело, имеющее наиболее высокий выход, не всегда демонстрирует наибольшую термическую стабильность. Следовательно, необходимо выбирать антитело, наиболее подходящее для введения человеку, путем всесторонней оценки, основанной на показателях, указанных выше.
[0126]
Также известен способ получения одноцепочечного иммуноглобулина путем соединения полноразмерных последовательностей тяжелой и легкой цепей антитела с помощью подходящего линкера (Lee, H-S, et al., Molecular Immunology (1999) 36, p. 61-71; и Shirrmann, T. et al., mAbs (2010), 2, (1) p. 1-4). Такие одноцепочечные иммуноглобулины могут быть димеризованы с сохранением структуры и активности, аналогичных таковым у антител, которые изначально являются тетрамерами. В альтернативе антитело, применяемое в настоящем изобретении, может быть антителом, которое имеет одну вариабельную область тяжелой цепи и не имеет последовательности легкой цепи. Такое антитело, которое называется однодоменным антителом (sdAb), нанотелом или антителом Верблюдовых (антитело из тяжелых цепей), действительно было обнаружено у верблюдов или лам, и, согласно некоторым сообщениям, оно обладает способность связываться с антигеном (Muyldemans S. et al., Protein Eng. (1994) 7 (9), 1129-35; и Hamers-Casterman C. et al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8). Эти антитела также можно интерпретировать как антигенсвязывающий фрагмент антитела согласно настоящему изобретению.
[0127]
Антителозависимая клеточная цитотоксическая активность антитела, применяемого в настоящем изобретении, может быть усилена путем контроля модификации сахарной цепи, связанной с антителом. Например, способы, описанные в WO99/54342, WO2000/61739 и WO2002/31140, известны в качестве такого метода контроля модификации сахарной цепи антитела, хотя данный метод не ограничивается этим.
[0128]
В случае получения антитела путем выделения генов антитела и последующего переноса генов в подходящего хозяина, подходящий хозяин может применяться в комбинации с вектором экспрессии.
[0129]
Определенные примеры генов антитела могут включать ген (или полинуклеотид), кодирующий последовательность тяжелой цепи, и ген (или полинуклеотид), кодирующий последовательность легкой цепи антитела, как описано в WO2016/121908, и комбинацию этих генов (или полинуклеотидов).
[0130]
Для трансформации клеток-хозяев ген (или полинуклеотид) последовательности тяжелой цепи и ген (или полинуклеотид) последовательности легкой цепи могут быть встроены в один и тот же вектор экспрессии или могут быть встроены в разные векторы экспрессии. Если в качестве хозяев используются эукариотические клетки, могут использоваться клетки животных, клетки растений или эукариотические микроорганизмы. Примеры клеток животных могут включать клетки млекопитающих, например, клетки обезьян COS (Gluzman, Y., Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), мышиные фибробласты NIH3T3 (ATCC CRL-1658) и линии клеток с дефицитом дигидрофолатредуктазы (Urlaub, G. and Chasin, L.A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p. 4126-4220) клеток яичников китайского хомячка (клетки CHO, ATCC CCL-61). В случае использования прокариотических клеток их примеры могут включать E. coli и Bacillus subtilis. Представляющий интерес ген антитела переносят в эти клетки путем трансформации и культивируют трансформированные клетки in vitro с получением антител. Такие способы культивирования могут отличаться по выходу в зависимости от последовательностей антител. Антитело, которое легко получать в качестве лекарственного средства, может быть выбрано с использованием его выхода в качестве показателя, из антител, обладающих эквивалентной связывающей активностью.
[0131]
Изотип антитела, применяемого в настоящем изобретении, может быть любым изотипом, имеющим способность перекрестно связывать ALK2. Соответствующие примеры могут включать, без ограничения перечисленными, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), IgM, IgAs (IgA1 и IgA2), IgD и IgE. Предпочтительные примеры изотипов могут включать IgG и IgM, более предпочтительно IgG1, IgG2 и IgG4.
[0132]
При использовании IgG1 в качестве изотипа антитела, применяемого в настоящем изобретении, эффекторные функции можно контролировать путем замены части аминокислотных остатков в константных областях (см. WO88/07089, WO94/28027 и WO94/29351). Примеры таких вариантов IgG1 включают IgG1 LALA (IgG1-L234A, L235A) и IgG1 LAGA (IgG1-L235A, G237A). IgG1 LALA является предпочтительным.
[0133]
При использовании IgG4 в качестве изотипа антитела, применяемого в настоящем изобретении, расщепление, уникальное для IgG4, может быть подавлено для увеличения полупериода существования путем замены части аминокислотных остатков в константных областях (см. Molecular Immunology, 30, 1 105-108 (1993)). Пример такого мутанта IgG4 включает IgG4 pro (IgG4-S241P).
[0134]
Антитело, применяемое в настоящем изобретении, может быть антигенсвязывающим фрагментом антитела, имеющим антигенсвязывающие сайты, или модифицированной формой антитела. Фрагмент антитела может быть получен при обработке антитела протеолитическим ферментом, таким как папаин или пепсин, или при экспрессии генетически модифицированного гена антитела в соответствующих культивируемых клетках. Из таких фрагментов антитела фрагмент, который сохраняет все или часть функций, которыми обладает полноразмерная молекула антитела, может называться антигенсвязывающим фрагментом антитела. Примеры функций антитела, как правило, могут включать антигенсвязывающую активность, активность ингибирования активности антигена, активность усиления активности антигена, антитело-зависимую клеточную цитотоксическую активность, комплемент-зависимую цитотоксическую активность и комплемент-зависимую клеточную цитотоксическую активность. Функцией, которой обладает антигенсвязывающий фрагмент антитела согласно настоящему изобретению, является активность связывания ALK2 и способность перекрестно связывать ALK2. ALK2-связывающая активность является свойством антитела или антигенсвязывающего фрагмента связываться (предпочтительно специфично) с молекулой ALK2, и предпочтительно является активностью ингибирования активности ALK2, более предпочтительно активностью ингибирования ALK2-опосредованной передачи сигнала BMP, наиболее предпочтительно активностью подавления, облегчения или регрессии эктопической оссификации и/или опухоли головного мозга.
[0135]
2
Примеры фрагмента антитела могут включать F(ab') и т.п.
Антитело, применяемое в настоящем изобретении, может обладать повышенной аффинностью к антигену в результате мультимеризации. Может быть мультимеризовано одно антитело или может быть мультимеризовано множество антител, распознающих множество эпитопов, соответственно, одного и того же антигена. Примеры способа мультимеризации этих антител могут включать связывание двух scFvs с CH3 доменом IgG, связывание со стрептавидином и введение мотива спираль-петля-спираль.
[0136]
Антитело, применяемое в настоящем изобретении, может быть поликлональным антителом, которое является смесью множества типов антител к ALK2, аминокислотные последовательности которых отличаются друг от друга. Пример поликлонального антитела может включать смесь множества типов антител, которые отличаются CDR-областями. Антитело, полученное при культивировании смеси клеток, которые продуцируют разные антитела, с последующей очисткой из культур, может использоваться в качестве такого поликлонального антитела (см. WO2004/061104).
[0137]
Антитело, применяемое в настоящем изобретении, может быть антителом, обладающим 80-99% идентичности при сравнении с тяжелыми и/или легкими цепями антитела. В этом контексте термин "идентичность" имеет обычное определение, используемое в данной области. Значение % идентичности относится к проценту идентичных аминокислот относительно общего количества аминокислот (включая пропуски), когда две аминокислотных последовательности выровнены с получением максимального совпадения аминокислот. Антитела, обладающие способностью связываться с антигеном, ингибирующим действием в отношении передачи сигнала BMP и способностью перекрестного связывания на аналогичных уровнях с антителами, описанным выше, могут быть отобраны при комбинировании последовательностей, которые демонстрируют высокую идентичность с аминокислотными последовательностями тяжелых и легких цепей. Такая идентичность обычно является 80% или 85% или более высокой идентичностью, предпочтительно 90% или выше, 91% или выше, 92% или выше, 93% или выше или 94% или более высокой идентичностью, более предпочтительно 95% или выше, 96% или выше, 97% или выше или 98% или более высокой идентичностью, наиболее предпочтительно 99% или более высокой идентичностью. В альтернативе антитела, которые обладают различными эффектами, эквивалентными антителам, описанным выше, могут быть отобраны при комбинировании аминокислотных последовательностей, включающих замену(ы), делецию(и) и/или добавление(я) одного или более аминокислотных остатков в аминокислотных последовательностях тяжелых и/или легких цепей. Количество аминокислотных остатков, подлежащих замене, делеции и/или добавлению, обычно составляет 10 или меньше аминокислотных остатков, предпочтительно 5 или 6 или меньше аминокислотных остатков, более предпочтительно два или три, или меньше аминокислотных остатков, наиболее предпочтительно один аминокислотный остаток.
[0138]
Тяжелая цепь антитела, продуцируемая культивируемыми клетками млекопитающих, как известно, не имеет C-концевого остатка лизина ((Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)). Кроме того, тяжелая цепь такого антитела, как известно, не имеет двух C-концевых аминокислотных остатков (глицин и лизин) и вместо этого на C-конце имеет амидированный остаток пролина (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)).
[0139]
N-концевой остаток глутамина или глутаминовой кислоты в тяжелой или легкой цепи антитела, как известно, подвергается модификации путем пироглутамилирования при получении антитела, и антитело, применяемое в настоящем изобретении, может иметь такую модификацию (WO2013/147153).
[0140]
Такая делеция в последовательности тяжелой цепи или модификация последовательности тяжелой или легкой цепи не влияет на способность антитела связываться с антигеном и на его эффекторные функции (активацию комплемента, антителозависимые цитотоксические эффекты и т.д.).
[0141]
Таким образом, антитело, применяемое в настоящем изобретении, также включает антитело, которое подверглось делеции или модификации. Соответствующие примеры могут включать вариант с делецией, полученный из тяжелой цепи путем делеции одной или двух аминокислот на ее C-конце, амидированную форму варианта с делецией (например, тяжелую цепь, имеющую амидированный остаток пролина на C-конце) и антитело, имеющее пироглутамилированный N-концевой аминокислотный остаток в своей тяжелой или легкой цепи. Однако вариант с делецией на C-конце тяжелой цепи антитела, применяемого в настоящем изобретении, не ограничивается типами, описанными выше, при условии, что вариант с делецией сохраняет способность связываться с антигеном и свои эффекторные функции. Две тяжелые цепи, составляющие антитело, применяемое в настоящем изобретении, могут быть тяжелыми цепями любого типа, выбранного из группы, состоящей из полноразмерной тяжелой цепи и вариантов с делецией, описанных выше, или могут быть комбинацией тяжелых цепей любых двух типов, выбранных из них. На количественное соотношение каждого варианта с делецией может влиять тип культивируемых клеток млекопитающих, продуцирующих антитело согласно настоящему изобретению, а также условия культивирования. Примеры такого случая могут включать делецию одного C-концевого аминокислотного остатка в каждой из двух тяжелых цепей в качестве основных компонентов антитела.
[0142]
Идентичность между двумя типами аминокислотных последовательностей может быть определена при использовании параметров по умолчанию алгоритма Blast версии 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Алгоритм Blast также доступен по адресу www.ncbi.nlm.nih.gov/blast в Интернете. Два типа процентных значений: Идентичность (или Идентичности) и Позитивность (или Позитивности) вычисляют в соответствии с алгоритмом Blast. Первое значение указывает на идентичные аминокислотные остатки в двух типах аминокислотных последовательностей, идентичность которых нужно определить. Последнее значение является числовым значением, определяемым также с учетом сходных аминокислотных остатков исходя из их химической структуры. В данном документе значение идентичности определяется как значение "Идентичности", если аминокислотные остатки в аминокислотных последовательностях являются идентичными.
[0143]
Антитело, конъюгированное с любой из различных молекул, таких как полиэтиленгликоль (ПЭГ), также может использоваться в качестве модифицированной формы антитела.
[0144]
Антитело, применяемое в настоящем изобретении, также может быть любым из конъюгатов, полученных из этих антител с другими лекарственными соединениями (иммуноконъюгаты). Примеры такого антитела могут включать антитело, конъюгированное с радиоактивным материалом или соединением, обладающим фармакологическим действием (Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146).
[0145]
Полученные антитела могут быть очищены до гомогенного состояния. Традиционно используемые способы разделения и очистки белков могут использоваться для разделения и очистки антител. Антитела могут быть разделены и очищены с помощью соответствующим образом выбранных или комбинированных методов, например, с помощью колоночной хроматографии, фильтрации через фильтр, ультрафильтрации, высаливания, диализа, препаративного электрофореза в полиакриламидном геле и/или изоэлектрического фокусирования (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); и Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), хотя способ разделения и очистки не ограничивается этим.
[0146]
Примеры хроматографии могут включать афинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гидрофобную хроматографию, гель-фильтрационную хроматографию, обращенно-фазовую хроматографию и адсорбционную хроматографию.
[0147]
Эти хроматографические методы могут проводить с использованием жидкостной хроматографии, такой как ВЭЖХ или FPLC.
[0148]
Примеры колонки для применения в афинной хроматографии могут включать колонки с белком A и колонки с белком G.
[0149]
Примеры колонок с белком A могут включать Hyper D, POROS и Сефарозу F.F. (GE Healthcare Bio-Sciences Corp.).
[0150]
Кроме того, антитело может быть очищено с использованием его активности связывания с антигеном с помощью носителя с иммобилизированным антигеном.
[0151]
D
-6
-7
-8
-9
-10
-11
-12
Значение K, которое указывает аффинность связывания антитела к ALK2 согласно настоящему изобретению в отношении ALK2, предпочтительно составляет 10 М или меньше, например, 10 М или меньше, 10 М или меньше, 10 М или меньше, 10 М или меньше, 10 М или меньше или 10 М или меньше.
[0152]
6. Способ лечения эктопической оссификации и/или опухоли головного мозга и фармацевтическая композиция для применения в данном способе
Настоящее изобретение относится к способ лечения и/или предупреждения заболевания, вызванного активной мутацией в ALK2, включающий использование биологического образца от пациента, обнаружение присутствия или отсутствия активной мутации в ALK2 в биологическом образце и введение антитела к ALK2 пациенту, имеющему активную мутацию в ALK2 и не имеющему мутации аминокислотного остатка в положении 330 (остатка пролина в последовательности ALK2 человека). Примеры заболевания, вызванного активной мутацией в ALK2, могут включать оссифицирующую прогрессирующую фибродисплазию (ФОП), прогрессирующую костной гетероплазию (ПКГ), травматическую эктопическую оссификации, эктопическую оссификацию после артропластики с использованием имплантата, диффузную внутреннюю глиому моста (DIPG), спондилоартрит (СпА), анкилозирующий спондилит (АС), анемию и истончение волос. Заболеванием предпочтительно является оссифицирующая прогрессирующая фибродисплазия (ФОП), прогрессирующая костная гетероплазия (ПКГ), травматическая эктопическая оссификация или эктопическая оссификация после артропластики с использованием имплантата, более предпочтительно оссифицирующая прогрессирующая фибродисплазия (ФОП), хотя заболевание не ограничивается этим при условии, что заболевание вызвано активной мутацией в ALK2.
У пациентов с ФОП также обнаруживают сращение или деформацию пальцев рук или ног, сращение или деформацию шейных позвонков и т.п., а также наблюдают потерю слуха. Эти состояния также включены в заболевание, вызванное активной мутацией в ALK2.
[0153]
Настоящее изобретение также относится ка фармацевтическая композиция для применения в способе лечения и/или профилактики у пациента, страдающего эктопической оссификацией, где пациент имеет активную мутацию в белке ALK2, которая ответственна за эктопическую оссификацию; аминокислотный остаток в положении 330 ALK2 представляет собой пролин; и действующим веществом композиции является антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент, обладающий свойством связывания с ALK2, свойством перекрестного связывания ALK2 и свойством ингибирования передачи сигнала BMP.
[0154]
В варианте осуществления способ включает следующие этапы: (a) обнаружение присутствия или отсутствия активной мутации в ALK2 у пациентов; (b) отбор пациента, имеющего активную мутацию в ALK2; (c) подтверждение, что пациент не имеет мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2; и (d) введение антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента отобранному пациенту.
[0155]
В другом варианте осуществления этап (c) дополнительно включает этап подтверждения, что ALK2 у пациента имеет мутацию G328V.
[0156]
В другом альтернативном варианте осуществления отбор пациента, которому должно быть введено антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент, включает следующие этапы: (a) обнаружение присутствия или отсутствия активной мутации в ALK2 у пациентов с эктопической оссификацией; (b) отбор пациента, имеющего активную мутацию в ALK2; и (c) исключение пациента, имеющего мутацию аминокислотного остатка в положении 330 ALK2.
[0157]
В другом варианте осуществления этап (c) дополнительно включает этап исключения пациента, имеющего мутацию G328V в ALK2.
[0158]
Примеры "эктопической оссификации" согласно настоящему изобретению могут включать оссифицирующую прогрессирующую фибродисплазию (ФОП). Оссифицирующая прогрессирующая фибродисплазия (ФОП) является предпочтительной.
[0159]
Активные мутации в ALK2 были подтверждены у всех пациентов с ФОП, при этом в настоящее время сообщили о 10 или более типах мутаций. Все эти мутации, как было установлено, были аминокислотными мутациями (миссенс-мутациями), присутствующими во внутриклеточной области белка ALK2, и не вызывают какого-либо изменения в аминокислотной последовательности внеклеточной области. Таким образом, применение антитела к ALK2, связывающегося с внеклеточной областью ALK2, оказывает терапевтическое и/или профилактическое действие при ФОП, независимо от типов мутаций.
[0160]
Лечение ФОП означает излечение симптомов ФОП, уменьшение симптомов, облегчение симптомов или подавление прогрессирования симптомов.
[0161]
Предупреждение ФОП означает преодоление или подавление начала вспышки заболевания или эктопического оссификации.
[0162]
В альтернативе настоящее изобретение относится к способ лечения и/или предупреждения опухоли головного мозга, включающий использование биологического образца, полученного от пациента, обнаружение присутствия или отсутствия активной мутации в ALK2 в биологическом образце и введение антитела к ALK2 пациенту, имеющему активную мутацию кроме мутации G328V в ALK2.
[0163]
Настоящее изобретение также относится ка фармацевтическая композиция для применения в способе лечения и/или предупреждения опухоли головного мозга у пациента, где пациент имеет активную мутацию в белке ALK2, который ответственен за опухоль головного мозга; и действующим веществом композиции является антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент, включающие свойство связывания с ALK2, свойство перекрестного связывания ALK2 и свойство ингибирования передачи сигнала BMP.
[0164]
Примеры "опухоли головного мозга" согласно настоящему изобретению могут включать диффузную внутреннюю глиому моста (DIPG), глиому ствола головного мозга, глиобластому, мультиформную глиобластому (МГ), неглиобластомную опухоль головного мозга, менингиому, лимфому центральной нервной системы, глиому, астроглиому, анапластическую астроцитому, олигодендроглиому, олигоастроцитому, медуллобластому и эпендимому. Диффузная внутренняя глиома моста (DIPG) является предпочтительной.
[0165]
Активные мутации в ALK2 также были подтверждены у пациентов с DIPG. Мутанты R206H, R258G, G328E, G328V, G328W и G356D известны в качестве мутантов ALK2 человека. Эти мутации, за исключением мутации G328V, также распространены у пациентов с ФОП. Антитело к ALK2 демонстрирует ингибирующую ALK2 активность за исключением случаев, когда присутствует мутация G328V. Таким образом, антитело к ALK2, применяемое в настоящем изобретении, обладает терапевтическим и/или профилактическим действием при DIPG у пациента, имеющего активную мутацию в ALK2, кроме мутации G328V.
[0166]
Биологическая активность ALK2 (активность ингибирования сигнала BMP) антитела к ALK2 может быть подтверждена in vitro, например, с помощью люциферазного анализа при использовании репортерных плазмид, имеющих вставку BMP-чувствительной последовательности, фосфорилирования SMAD1/5/8, анализа экспрессии генов-мишеней BMP или измерение активности щелочной фосфатазы в мышиных миобластах C2C12, в которых индуцировали дифференцировку в остеобласты путем стимуляции лигандом BMP.
[0167]
Терапевтическое или профилактическое действие антитела к ALK2 в отношении эктопической оссификации может быть подтверждено in vivo при использовании лабораторных животных, например, путем подкожного или внутривенного введения антитела к ALK2 в моделях индуцированной эктопической оссификации с трансплантацией гранул, содержащих лиганд BMP в мышцу мышей, или в моделях ФОП на мышах, несущих мутантный ALK2, и анализа эктопического образования кости. В альтернативе может быть подтверждено терапевтическое или профилактическое действие на опухоль головного мозга, например, путем подкожного или внутривенного введения антитела к ALK2 в моделях, полученных путем введения опухолевых клеток, полученных от пациента, в мозг или под кожу иммунодефицитных мышей, и анализа роста опухоли или количества дней выживания мышей.
[0168]
В способе согласно настоящему изобретению пациент, подлежащий лечению или предупреждению, является пациентом, имеющим активную мутацию в ALK2, причем пациент не имеет мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2 (пациент, имеющий пролин в положении 330) или пациент не имеет мутации G328V (пациент не имеет замены аминокислотного остатка в положении 328 на валин), предпочтительно пациент не имеет мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2 и имеет активную мутацию кроме мутации G328V в ALK2. Примеры активной мутации в ALK2 включают L196P, delP197_F198insL (также называемую "PF-197-8L"), R202I, R206H, Q207E, R258S, R258G, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D и R375P, хотя мутация не ограничивается этим при условии, что мутация активирует ALK2.
[0169]
Антитело к ALK2, применяемое в настоящем изобретении, могут вводить отдельно или в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим лекарственным средством против эктопической оссификации при лечении или предупреждении эктопической оссификации, и могут вводить отдельно или в комбинации по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим лекарственным средством для опухоли головного мозга, лучевой терапией, иммунотерапией или химиотерапией и т.д. при лечении или предупреждении опухоли головного мозга.
[0170]
Примеры дополнительного терапевтического лекарственного средства против эктопической оссификации, которое могут вводить в комбинации с антителом к ALK2, могут включать, без ограничения перечисленными, противовоспалительные средства, стероиды, бисфосфонаты, миорелаксанты и агонисты рецепторов ретиноевой кислоты (РРК) γ.
[0171]
Примеры противовоспалительного средства могут включать аспирин, диклофенак, индометацин, ибупрофен, кетопрофен, напроксен, пироксикам, рофекоксиб, целекоксиб, азатиоприн, пеницилламин, метотрексат, сульфасалазин, лефлуномид, инфликсимаб и этанерцепт. Предпочтительными являются индометацин, ибупрофен, пироксикам или целекоксиб.
[0172]
Примеры стероида могут включать преднизолон, беклометазон, бетаметазон, флутиказон, дексаметазон и гидрокортизон. Предпочтительным является преднизолон.
[0173]
Примеры бисфосфоната могут включать алендронат, цимадронат, клодронат, этидронат, ибандронат, инкадронат, минодронат, неридронат, олпадронат, памидронат, пиридронат, ризедронат, тилудронат и золедронат. Предпочтительными являются памидронат или золедронат.
[0174]
Примеры миорелаксанта могут включать циклобензаприн, метаксалон и баклофен. Предпочтительным является баклофен.
[0175]
Примеры агониста рецепторов ретиноевой кислоты γ могут включать паловаротен.
[0176]
Примеры дополнительного терапевтического лекарственного средства для опухоли головного мозга, которое могут вводить в комбинации с антителом к ALK2, могут включать темозоломид, бевацизумаб, кармустин, ломустин, прокарбазина гидрохлорид и винкристин.
[0177]
В зависимости от состояния эктопической оссификации или опухоли головного мозга или предполагаемой степени лечения и/или предупреждения могут вводить два, три или более дополнительных терапевтических лекарственных средства, причем эти дополнительные терапевтические лекарственные средства могут быть включены в один и тот же препарат и, таким образом, введены одновременно. Дополнительное терапевтическое лекарственное средство и антитело к ALK2 также могут быть включены в один и тот же препарат и, таким образом, введены одновременно. Кроме того, антитело к ALK2 и дополнительное терапевтическое лекарственное средство могут быть включены в отдельные препараты и введены одновременно. В альтернативе дополнительное средство и антитело к ALK2 могут вводить отдельно друг за другом. В частности, терапевтическое лекарственное средство, содержащее антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве действующего вещества, могут вводить после введения дополнительного терапевтического лекарственного средства, или дополнительное терапевтическое лекарственное средство могут вводить после введения терапевтического лекарственного средства, содержащего антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент в качестве действующего вещества. Для введения в генотерапии ген белка, служащего в качестве терапевтического лекарственного средства против эктопической оссификации или опухоли головного мозга, и ген антитела к ALK2 могут быть встроены в сайт, расположенный после различных промоторных областей или одной и той же промоторной области, и могут быть введены в разные векторы или в один вектор.
[0178]
2
Антитело к ALK2 или его фрагмент могут быть конъюгированы с терапевтическим лекарственным средством против эктопической оссификации или опухоли головного мозга с получением направленно действующего конъюгата лекарственного средства, описанного в M.C. Garnet "Targeted drug conjugates: principles and progress", Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216. Для этой цели может применяться молекула антитела, а также любой фрагмент антитела, если их способность связываться с ALK 2 (свойства распознавания ALK2) и способность перекрестно связывать ALK2 полностью устранены. Примеры фрагмента антитела могут включать такие фрагменты, как F(ab'). Способ конъюгирования антитела к ALK2 или фрагмента антитела с терапевтическим лекарственным средством против ФОП может принимать различные формы, описанные, например, в M.C. Garnet "Targeted drug conjugates: principles and progress", Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216, G.T. Hermanson "Bioconjugate Techniques" Academic Press, California (1996), Putnam and J. Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity" Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. Соответствующие конкретные примеры могут включать способ, в котором антитело к ALK2 химически конъюгируют с терапевтическим лекарственным средством против эктопической оссификации или опухоли головного мозга, напрямую или через спейсер, такой как олигопептид, и способ конъюгирования антитела к ALK2 с терапевтическим лекарственным средством против эктопической оссификации или опухоли головного мозга через соответствующий носитель лекарственного средства. Примеры носителя лекарственного средства могут включать системы доставки лекарственного средства (например, X. Yu et al., J Nanomater. 2016; 2016:doi:10.1155/2016/1087250; and J. Wang et al., Drug Delivery, 25: 1, 1319-1327, DOI:10.1080/10717544.2018.1477857), такие как липосомы, наночастицы, наномицеллы и водорастворимые полимеры. Примеры такого способа через носитель лекарственного средства могут, в частности, включать способ, в котором терапевтическое лекарственное средство против эктопической оссификации или опухоли головного мозга инкапсулируют в липосомы, и липосому конъюгируют с антителом, а также способ, в котором терапевтическое лекарственное средство против эктопической оссификации или опухоли головного мозга химически конъюгируют с водорастворимым полимером (соединением, имеющим молекулярную массу порядка 1000-100000), напрямую или через спейсер, такой как олигопептид, и водорастворимый полимер конъюгируют с антителом. Конъюгирование антитела (или фрагмента) с терапевтическим лекарственным средством против эктопической оссификации или опухоли головного мозга или с носителем лекарственного средства (например, липосомой или водорастворимым полимером) может быть выполнено способом, хорошо известным специалистам в данной области, таким как способ, описанный в G.T. Hermanson "Bioconjugate Techniques" Academic Press, California (1996), and Putnam and J. Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity" Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. Инкапсулирование терапевтического лекарственного средства против эктопической оссификации или опухоли головного мозга в липосомах может быть выполнено способом, хорошо известным специалистам в данной области, таким как способ, описанный, например, в D.D. Lasic "Liposomes: From Physics to Applications", Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam (1993). Конъюгирование терапевтического лекарственного средства против эктопической оссификации или опухоли головного мозга с водорастворимым полимером может быть выполнено способом, хорошо известным специалистам в данной области, таким как способ, описанный в D. Putnam and J Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity" Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. Конъюгат антитела (или фрагмента) с белком в качестве терапевтического лекарственного средства против эктопической оссификации или опухоли головного мозга (например, антителом или его фрагментом) может быть получен любым из способов, описанных выше, или с помощью метода генной инженерии, хорошо известного специалистам в данной области.
[0179]
При введении человеческого антитела к ALK2 пациенту доза антитела к ALK2, применяемого в настоящем изобретении, составляет, например, приблизительно 0,1-100 мг/кг массы тела, которую могут вводить несколько раз или больше в течение 1-180 дней. Однако доза и количество доз обычно должны определять с учетом пола, массы тела и возраста пациента, симптомов, тяжести, побочных реакций и т.д., и поэтому они не ограничиваются дозой или применением, описанными выше.
[0180]
Неограничивающие примеры антитела к ALK2, применяемого в настоящем изобретении, могут включать инъекции, в том числе внутривенные капельницы, суппозитории, трансназальные составы, подъязычные составы и составы для трансдермального всасывания. Путь введения - пероральный или парентеральный. Неограничивающие примеры парентерального пути введения включают внутривенный, внутриартериальный, внутримышечный, ректальный, трансмукозальный, внутрикожный, внутрибрюшинный и интравентрикулярный пути.
[0181]
7. Определение пригодности пациента для лечения и/или профилактики
В настоящем изобретении следующие способы могут быть выполнены для эффективного лечения и/или профилактики пациента, имеющего мутацию в белке ALK2 (например, активную мутацию в ALK2), путем введения антитела к ALK2 или фармацевтической композиции, включающей антитело.
[0182]
Первый способ является способом прогнозирования риска развития нежелательной реакции, которая может быть связана с введением антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающим следующие этапы:
(a) обнаружение присутствия или отсутствия активной мутации в ALK2 и мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2 у пациента; и
(b) определение, что когда пациент имеет активную мутацию в ALK2 и не имеет мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2, пациент подвергается низкому риску развития нежелательной реакции, которая может быть связана с введением антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента.
[0183]
Второй способ является способом прогнозирования ответа на лечение и/или предупреждение путем введения антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающим следующие этапы:
(a) обнаружение присутствия или отсутствия активной мутации в ALK2 и мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2 у пациента; и
(b) определение, что когда пациент имеет активную мутацию в ALK2 и не имеет мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2, пациент способен отвечать на лечение и/или предупреждение путем введения антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента.
[0184]
Третий способ является способом отбора пациента, подлежащего лечению и/или предупреждению путем введения антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающим следующие этапы:
(a) обнаружение присутствия или отсутствия активной мутации в ALK2 и мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2 у пациента; и
(b) отбор пациента как пациента, подлежащего лечению и/или предупреждению путем введения антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, если пациент имеет активную мутацию в ALK2 и не имеет мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2.
[0185]
Четвертый способ является способом лечения и/или предупреждения заболевания путем введения антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, включающим следующие этапы:
(a) обнаружение присутствия или отсутствия активной мутации в ALK2 и мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2 у пациента; и
(b) введение пациенту антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, если пациент имеет активную мутацию в ALK2 и не имеет мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2.
[0186]
Четвертый способ может дополнительно включать выполнение любого из этапов (b) первого - третьего способов, т.е.
(Этап (b) первого способа)
этап определения, что когда пациент имеет активную мутацию в ALK2 и не имеет мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2, пациент подвергается низкому риску развития нежелательной реакции, которая может быть связана с введением антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента,
(Этап (b) второго способа)
этап определения, что когда пациент имеет активную мутацию в ALK2 и не имеет мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2, пациент способен отвечать на лечение и/или предупреждение путем введения антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, и
(Этап (b) третьего способа)
этап отбора пациент как пациента, подлежащего лечению и/или предупреждению путем введения антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, если пациент имеет активную мутацию в ALK2 и не имеет мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2.
Посредством такого дополнительного этапа определяют, подходит ли пациент для лечения и/или предупреждения путем введения антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента, есть ли у пациента нежелательная реакция или определено подобное, и, как результат, что антитело к ALK2 или его антигенсвязывающий фрагмент можно затем вводить пациенту, у которого подтверждено соответствие критериям отбора, чтобы вызвать у пациента терапевтическое действие, таким образом, пациенту может быть предоставлено так называемое персонализированная терапия.
[0187]
При использовании в настоящем изобретении термин "определение" включает решение, оценку или помощь в определении.
[0188]
В первом - четвертом способах введение антитела к ALK2 или его антигенсвязывающего фрагмента предпочтительно является введением фармацевтической композиции, описанной в разделе 6.
[0189]
В первом - четвертом способах этап (b) может дополнительно включать этап подтверждения, что активная мутация в ALK2 не является мутацией G328V.
[0190]
В первом - четвертом способах активная мутация в ALK2 предпочтительно является по меньшей мере одной мутацией, выбранной из L196P, delP197_F198insL, R202I, R206H, Q207E, R258S, R258G, G325A, G328E, G328R, G328W, G356D и R375P, или по меньшей мере одной мутацией, выбранной из R206H, R258G, G328E, G328W и G356D.
[0191]
Кроме того, в первом - четвертом способах вышеуказанный пациент является субъектом, имеющим неустановленное заболевание, или субъектом, подозреваемым на наличие заболевания, вызванного активной мутацией в ALK2. Заболевание, подлежащее лечению, является, например, заболеванием, вызванным активной мутацией в ALK2, предпочтительно эктопической оссификацией или опухолью головного мозга, более предпочтительно эктопической оссификацией. Конкретные примеры таких заболеваний описаны в разделе 6. Заболеванием более предпочтительно является оссифицирующая прогрессирующая фибродисплазия (ФОП) или диффузная внутренняя глиома моста (DIPG), еще более предпочтительно оссифицирующая прогрессирующая фибродисплазия (ФОП), хотя заболевание не ограничивается этим.
ПРИМЕРЫ
[0192]
Далее настоящее изобретение будет конкретно описано со ссылкой на Примеры; однако изобретение не ограничивается этим. В следующих примерах, если не указано иное, любые процедуры, касающиеся генетических манипуляций, производили в соответствии со способами, описанными в "Molecular Cloning" (Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), или же в тех случаях, когда использовали доступные в продаже реагенты или наборы, их использовали в соответствии с руководствами для таких коммерческих продуктов.
[0193]
<Пример 1>
Оценка эффекта активации сигнальной трансдукции BMP антителом к ALK2 (27D-H2L2_LALA) с помощью анализа с репортером люциферазой
[0194]
Антитело к ALK2 (27D-H2L2_LALA), используемое в эксперименте, получали способом, описанным в Примере 12 WO2016/121908.
[0195]
4
2
Эффект активации передачи внутриклеточного сигнала BMP, опосредованный полученным антителом к ALK2, исследовали с использованием BMP-специфического репортера люциферазы. Клетки HEK293A сеяли в 96-луночный белый планшет для люциферазного анализа (производства Corning, Inc.) при плотности 1×10 клеток/лунка и культивировали в течение ночи в среде DMEM, содержащей 10% FBS, в условиях 5% CO при 37°C. На следующий день каждую плазмиду, экспрессирующую человеческий или мышиный ALK2 дикого типа или экспрессирующую мутант R206H, вводили вместе с pGL4.26/Id1WT4F-luc (Genes Cells, 7, 949 (2002)) в клетки с использованием Lipofectamine 2000 (производства Invitrogen Corp.). Через 3 часа среду заменяли свежей OPTI-MEM I (производства Life Technologies Corp.). Затем добавляли серийно разведенное антитело и культивировали клетки еще в течение ночи. На следующий день активность люциферазы измеряли с помощью анализатора планшетов SpectraMaxM4 (производства Molecular Devices, LLC) и при использовании системы для анализа люциферазы One-Glo Luciferase Assay System (производства Promega Corp.).
[0196]
Результаты показаны на Фиг. 1. Было подтверждено, что 27D-H2L2_LALA повышает BMP-специфическую люциферазную активность в зависимости от концентрации только в клетках HEK293, экспрессирующих мутант R206H мышиного ALK2 (нижняя панель на Фиг. 1A). С другой стороны не получили подтверждения, что это антитело повышает активность BMP репортера в клетках, экспрессирующих мутант R206H человеческого ALK2 (нижняя панель на Фиг. 1B) или человеческий или мышиный ALK2 дикого типа (верхние панели на Фиг. 1А и 1B).
[0197]
<Пример 2>
2
2
Получение Fab (27D-H2L2_Fab) и F(ab') (27D-H2L2_F(ab')) антитела к ALK2 (27D-H2L2_LALA)
2)-1
Получение Fab из 27D-H2L2_LALA
27D-H2L2_LALA ограниченно расщепляли папаином из латекса папайи (Sigma-Aldrich Co. LLC) для удаления Fc-фрагментов и т.п. при использовании HiLoad 26/600 Superdex 200 pg (GE Healthcare Japan Corp.). Затем непрореагировавшее 27D-H2L2_LALA разделяли с использованием HiTrap MabSelect SuRe, 1 мл (GE Healthcare Japan Corp.), для сбора Fab.
[0198]
2)-2
2
Получение F(ab') из 27D-H2L2_LALA
2
27D-H2L2_LALA ограниченно расщепляли эндопротеиназой Glu-C (Sigma-Aldrich Co. LLC) и непрореагировавшее 27D-H2L2_LALA разделяли с помощью HiTrap MabSelect SuRe, 10 мл (GE Healthcare Japan Corp.). Затем F(ab') собирали при использовании Bio-Scale CHT типа I, 5 мл (Bio-Rad Laboratories, Inc.).
[0199]
<Пример 3>
2
2
Оценка эффектов активации передачи внутриклеточного сигнала BMP для Fab (27D-H2L2_Fab) и F(ab') (27D-H2L2_F(ab')) антитела к ALK2 с помощью анализа с репортером люциферазой
2
Эффекты активации передачи внутриклеточного сигнала BMP, опосредованные 27D-H2L2_Fab и 27D-H2L2_F(ab'), полученными в Примере 2, исследовали с помощью BMP-специфического репортера люциферазы. В качестве сравнительного контроля использовали полноразмерное антитело к ALK2 27D-H2L2_LALA. Репортерный анализ люциферазы проводили так же, как в Примере 1.
[0200]
2
Результаты показаны на Фиг. 2. Было подтверждено, что 27D-H2L2_F(ab') повышает BMP-специфическую люциферазную активность в зависимости от концентрации только в клетках HEK293, экспрессирующих мутант R206H мышиного ALK2, как в 27D-H2L2_LALA. С другой стороны не получали подтверждения, что 27D-H2L2_Fab повышает активность репортера BMP при каком-либо из условий.
[0201]
<Пример 4>
Оценка in vitro активности перекрестного связывания молекул ALK2 антителом к ALK2
2
2
3
Анализ NanoBiT (произведства Promega Corp.) проводили с целью проверки возможности, что эффект активации BMP-специфического репортера люциферазы под действием 27D-H2L2_LALA и 27D-H2L2_F(ab'), подтвержденный в Примерах 1 и 3, был опосредован перекрестным связыванием между двумя молекулами ALK2. Нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерный человеческий ALK2, была встроена в векторы pBit1.1-C [TK/LgBiT] и pBit2.1-C [TK/SmBiT] (производства Promega Corp.) для конструирования векторов экспрессии. Клетки C2C12 сеяли в 96-луночный белый планшет для люциферазного анализа (производства Greiner Group AG) при плотности 5×10 клеток/лунка и культивировали в течение ночи в среде DMEM, содержащей 15% FBS, в условиях 5% CO при 37°C. На следующий день два типа плазмид экспрессии ALK2 вводили в клетки с использованием Lipofectamine 2000 (производства Invitrogen Corp.). Через 2,5 часа среду заменяли свежей OPTI-MEM I (производства Life Technologies Corp.) и культивировали клетки еще в течение ночи. На следующий день серийно разведенное антитело добавляли вместе с субстратом системы анализа Nano-Glo Live Cell Assay System (производства Promega Corp.) и культивировали клетки в течение 15 минут. Затем люциферазную активность измеряли с помощью анализатора планшетов GENios (производства Tecan Trading AG).
[0202]
2
Результаты показаны на Фиг. 3. Было подтверждено, что A2-27D, 27D-H2L2_LALA и 27D-H2L2_F(ab') вызывали образование перекрестной связи ALK2 (или образование комплекса ALK2) в зависимости от концентрации антитела, тогда как 27D-H2L2_Fab не вызывал образование перекрестной связи ALK2 (или образование комплекса ALK2).
[0203]
<Пример 5>
Проверка влияния аминокислотных замен в положениях 182 и 330 на эффект активации BMP-специфического репортера люциферазы антителом к ALK2
5)-1
Выравнивание аминокислотных последовательностей полноразмерного ALK2 человека, яванского макака, собаки, крысы и мыши
Результаты выравнивания последовательностей показаны на Фиг. 4. При сравнении аминокислот внутриклеточных областей ALK2 человека, яванского макака, собаки, крысы и мыши были обнаружены различия по аминокислотным остаткам в положениях 182 и 330.
[0204]
5)-2
Проверка влияния аминокислотных замен в положениях 182 и 330 на эффект активации BMP-специфического репортера люциферазы антителом к ALK2
4
2
Чтобы исследовать роль D182E и P330S, которыми отличаются внутриклеточные области ALK2 человека и мыши, были сконструированы векторы экспрессии с использованием pcDEF3, при этом мутация D182E или P330S была введена в каждый из ALK2 человека дикого типа и мутантов R206H ALK2 человека. Клетки HEK293A сеяли в 96-луночный белый планшет для анализа репортера люциферазы (производства Greiner Group AG) при плотности 1×10 клеток/лунка и культивировали в течение ночи в среде DMEM, содержащей 10% FBS, в условиях 5% CO при 37°C. На следующий день каждый из векторов экспрессии ALK2, pGL4.26/Id1WT4F-luc (Genes Cells, 7, 949 (2002)) и phRL SV40 (производства Promega Corp.), вводили в клетки при использовании Lipofectamine 2000 (производства компании Invitrogen Corp.). Через 2,5 часа среду заменяли свежей OPTI-MEM I (производства Life Technologies Corp.), содержащей серийно разведенное антитело A2-27D и культивировали клетки еще в течение ночи. На следующий день активность люциферазы светляка Renilla измеряли с помощью анализатора планшетов GENios (производства Tecan Trading AG) и с использованием системы анализа люциферазы Dual-Glo (производства Promega Corp.).
[0205]
Результаты показаны на Фиг. 5. Было подтверждено, что A2-27D повышает активность в зависимости от концентрации только для мутантов R206H человеческого ALK2, несущих мутацию P330S, как в мутанте R206H мышиного ALK2.
[0206]
<Пример 6>
Проверка влияния аминокислотных замен в положении 330 на эффект активации BMP-специфического репортера люциферазы антителом к ALK2
Чтобы исследовать роль P330 в ALK2 человека, векторы экспрессии были сконструированы с использованием pcDEF3 таким образом, что мутация P330D, P330E, P330A или P330V была введена в каждый ALK2 человека дикого типа и мутанты R206H ALK2 человека. Чтобы исследовать роль S330 в ALK2 мыши, векторы экспрессии были сконструированы таким образом, что мутация S330P была введена в каждый из ALK2 мыши дикого типа и мутанты R206H ALK2 мыши. Клетки HEK293A трансфицировали этими векторами экспрессии так же, как в Примере 5, и культивировали в течение ночи в питательной среде, содержащей A2-27D, с последующим измерением люциферазной активности.
[0207]
Результаты показаны на Фиг. 6. A2-27D ингибировало активность мутанта R206H мыши, несущего введенную мутацию S330P (т.е. антагонистическая активность), тогда как A2-27D усиливало активность, если в этом положении присутствовала аминокислота S330 (когда аминокислотный остаток в положении 330 - серин.) (т.е. агонистическая активность). С другой стороны, было обнаружено, что A2-27D способствовало активности мутантов R206H человека, несущих введенную мутацию P330S, P330D, P330E или P330A (т.е. агонистическая активность), тогда как антитело ингибировало активность, если присутствовала мутация P330V.
[0208]
<Пример 7>
Оценка эффектов активации передачи сигнала BMP четырех типов антител к ALK2 (27D-H2L2_LALA, 15A-H4L6_IgG2, A2-11E и A2-25C) с помощью анализа с репортером люциферазой
Антитела к ALK2 (27D-H2L2_LALA, 15A-H4L6_IgG2, A2-11E и A2-25C), используемые в эксперименте, были получены способами, описанными в Примерах 12, 11 и 1 WO2016/121908.
[0209]
Эффекты активации передачи внутриклеточного сигнала BMP, опосредованные полученными антителами против ALK2, исследовали так же, как в Примере 1, при использовании BMP-специфического репортера люциферазы.
[0210]
Результаты показаны на Фиг. 7. Было подтверждено, что 15A-H4L6_IgG2, A2-11E и A2-25C повышают BMP-специфическую люциферазную активность в зависимости от концентрации только в клетках HEK293, экспрессирующих мутант R206H ALK2 мыши, как в 27D-H2L2_LALA. С другой стороны, не получали подтверждения, что какое-либо из этих антител повышало активность репортера BMP в клетках, экспрессирующих мутант R206H ALK2 человека.
[0211]
<Пример 8>
Подтверждение эффекта активации BMP-специфического репортера люциферазы антителом к ALK2 в различных мутантах ALK2 кроме мутанта R206H
Векторы экспрессии были сконструированы с использованием pcDEF3, при этом каждый из четырнадцати типов мутантов ALK2 человека (мутанты L196P, P197F198del_insL (также называемый PF197-8L), R202I, R206H, Q207E, R258G, R258S, G325A, G328E, G328R, G328328V G356D и R375P), обнаруженные при ФОП и DIPG, и конститутивно активный мутант Q207D вводили в каждый вектор. В клетках HEK293 индуцировали суперэкспрессию этих мутантов так же, как в Примерах 5 и 6, и культивировали в течение ночи в среде, содержащей серийно разведенное A2-27D, с последующим измерением люциферазной активности. В этом эксперименте мутант G328V и мутант Q207D использовали в анализе таким образом, чтобы их количества составляли 1/3 от количества других мутантов (например, 12,5 нг/лунка по сравнению с 37,5 нг каждого из других мутантов/лунка) и 1/20 (например, 1,875 нг/лунка по сравнению с 37,5 нг каждого из других мутантов/лунка).
[0212]
Результаты показаны на Фиг. 8. Было подтверждено, что A2-27D способствовало активности в зависимости от концентрации для мутанта G328V, обнаруженного только при DIPG, и конститутивно активном мутанте Q207D из мутантов ALK2 человека, но при этом A2-27D ингибировало активность в зависимости от концентрации в случае других мутантов ALK2 человека.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
[0213]
В настоящем изобретении было показано, что можно эффективно лечить и/или предупреждать эктопическую оссификацию и/или опухоль головного мозга путем введения антитела к ALK2, обладающего способностью связываться с ALK2 и способностью перекрестно связывать ALK2, пациенту, имеющему активную мутацию в ALK2 и не имеющему мутации аминокислотного остатка в положении 330 ALK2, предпочтительно пациенту, не имеющему мутации G328V. В настоящем изобретении также было показано, что можно спрогнозировать риск развития нежелательной реакции, связанной с введением антитела к ALK2; что можно спрогнозировать ответ на лечение и/или предупреждение путем введения антитела к ALK2; и что может быть отобран субъект, подлежащий лечению и/или предупреждению путем введения антитела к ALK2.
ТЕКСТ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В СВОБОДНОМ ФОРМАТЕ
[0214]
SEQ ID NO: 17: Gln является замещенным аминокислотным остатком.
SEQ ID NO: 30: Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-15A-L4
SEQ ID NO: 31: Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-15A-H4
SEQ ID NO: 32: Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-15A-L6
SEQ ID NO: 33: Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-15A-H4_IgG2 типа
SEQ ID NO: 34: Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-27D-H2
SEQ ID NO: 35: Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-27D-L2
SEQ ID NO: 36: Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-27D-H3
SEQ ID NO: 37: Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-27D-L4
SEQ ID NO: 38: Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-27D-H2_LALA
SEQ ID NO: 39: Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-27D-H3_LALA
[0215]
Все публикации, патенты и заявки на патент, цитируемые в настоящем изобретении, включены в настоящий документ посредством отсылки во всей своей полноте.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  Saitama Medical University
Daiichi Sankyo Company, Limited
<120>  Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики
эктопической оссификации
<130>  PH-7730-PCT
<150>  JP 2018-039066
<151>  2018-03-05
<160>  42
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  509
<212>  БЕЛОК
<213>  Homo sapiens
<400>  1
Met Val Asp Gly Val Met Ile Leu Pro Val Leu Ile Met Ile Ala Leu
1               5                   10                  15
Pro Ser Pro Ser Met Glu Asp Glu Lys Pro Lys Val Asn Pro Lys Leu
20                  25                  30
Tyr Met Cys Val Cys Glu Gly Leu Ser Cys Gly Asn Glu Asp His Cys
35                  40                  45
Glu Gly Gln Gln Cys Phe Ser Ser Leu Ser Ile Asn Asp Gly Phe His
50                  55                  60
Val Tyr Gln Lys Gly Cys Phe Gln Val Tyr Glu Gln Gly Lys Met Thr
65                  70                  75                  80
Cys Lys Thr Pro Pro Ser Pro Gly Gln Ala Val Glu Cys Cys Gln Gly
85                  90                  95
Asp Trp Cys Asn Arg Asn Ile Thr Ala Gln Leu Pro Thr Lys Gly Lys
100                 105                 110
Ser Phe Pro Gly Thr Gln Asn Phe His Leu Glu Val Gly Leu Ile Ile
115                 120                 125
Leu Ser Val Val Phe Ala Val Cys Leu Leu Ala Cys Leu Leu Gly Val
130                 135                 140
Ala Leu Arg Lys Phe Lys Arg Arg Asn Gln Glu Arg Leu Asn Pro Arg
145                 150                 155                 160
Asp Val Glu Tyr Gly Thr Ile Glu Gly Leu Ile Thr Thr Asn Val Gly
165                 170                 175
Asp Ser Thr Leu Ala Asp Leu Leu Asp His Ser Cys Thr Ser Gly Ser
180                 185                 190
Gly Ser Gly Leu Pro Phe Leu Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Gln Ile
195                 200                 205
Thr Leu Leu Glu Cys Val Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Arg
210                 215                 220
Gly Ser Trp Gln Gly Glu Asn Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg
225                 230                 235                 240
Asp Glu Lys Ser Trp Phe Arg Glu Thr Glu Leu Tyr Asn Thr Val Met
245                 250                 255
Leu Arg His Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ser Asp Met Thr Ser
260                 265                 270
Arg His Ser Ser Thr Gln Leu Trp Leu Ile Thr His Tyr His Glu Met
275                 280                 285
Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Gln Leu Thr Thr Leu Asp Thr Val Ser
290                 295                 300
Cys Leu Arg Ile Val Leu Ser Ile Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His
305                 310                 315                 320
Ile Glu Ile Phe Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp
325                 330                 335
Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Gln Cys Cys Ile
340                 345                 350
Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Met His Ser Gln Ser Thr Asn Gln Leu
355                 360                 365
Asp Val Gly Asn Asn Pro Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro
370                 375                 380
Glu Val Leu Asp Glu Thr Ile Gln Val Asp Cys Phe Asp Ser Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Arg Val Asp Ile Trp Ala Phe Gly Leu Val Leu Trp Glu Val Ala Arg
405                 410                 415
Arg Met Val Ser Asn Gly Ile Val Glu Asp Tyr Lys Pro Pro Phe Tyr
420                 425                 430
Asp Val Val Pro Asn Asp Pro Ser Phe Glu Asp Met Arg Lys Val Val
435                 440                 445
Cys Val Asp Gln Gln Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Phe Ser Asp
450                 455                 460
Pro Thr Leu Thr Ser Leu Ala Lys Leu Met Lys Glu Cys Trp Tyr Gln
465                 470                 475                 480
Asn Pro Ser Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Thr
485                 490                 495
Lys Ile Asp Asn Ser Leu Asp Lys Leu Lys Thr Asp Cys
500                 505
<210>  2
<211>  3062
<212>  ДНК
<213>  Homo sapiens
<400>  2
gaagagatgt gggcctctgg ggccgctgga ttcagtaact tccgtcgggt tctagactgg       60
ctcggctctg tccagtttgt gccagatagt ctcccacccc ctccccaccc ctcctttccc      120
ctggagattt gaacgctgct tgcatgggag aaaagctact tagagaagaa aacgttccac      180
ttagtaacag aagaaaagtc ttggttaaaa agttgtcatg aatttggctt ttggagagag      240
gcagcaagcc tggagcattg gtaagcgtca cactgccaaa gtgagagctg ctggagaact      300
cataatccca ggaacgcctc ttctactctc cgagtacccc agtgaccaga gtgagagaag      360
ctctgaacga gggcacgcgg cttgaaggac tgtgggcaga tgtgaccaag agcctgcatt      420
aagttgtaca atggtagatg gagtgatgat tcttcctgtg cttatcatga ttgctctccc      480
ctcccctagt atggaagatg agaagcccaa ggtcaacccc aaactctaca tgtgtgtgtg      540
tgaaggtctc tcctgcggta atgaggacca ctgtgaaggc cagcagtgct tttcctcact      600
gagcatcaac gatggcttcc acgtctacca gaaaggctgc ttccaggttt atgagcaggg      660
aaagatgacc tgtaagaccc cgccgtcccc tggccaagcc gtggagtgct gccaagggga      720
ctggtgtaac aggaacatca cggcccagct gcccactaaa ggaaaatcct tccctggaac      780
acagaatttc cacttggagg ttggcctcat tattctctct gtagtgttcg cagtatgtct      840
tttagcctgc ctgctgggag ttgctctccg aaaatttaaa aggcgcaacc aagaacgcct      900
caatccccga gacgtggagt atggcactat cgaagggctc atcaccacca atgttggaga      960
cagcacttta gcagatttat tggatcattc gtgtacatca ggaagtggct ctggtcttcc     1020
ttttctggta caaagaacag tggctcgcca gattacactg ttggagtgtg tcgggaaagg     1080
caggtatggt gaggtgtgga ggggcagctg gcaaggggag aatgttgccg tgaagatctt     1140
ctcctcccgt gatgagaagt catggttcag ggaaacggaa ttgtacaaca ctgtgatgct     1200
gaggcatgaa aatatcttag gtttcattgc ttcagacatg acatcaagac actccagtac     1260
ccagctgtgg ttaattacac attatcatga aatgggatcg ttgtacgact atcttcagct     1320
tactactctg gatacagtta gctgccttcg aatagtgctg tccatagcta gtggtcttgc     1380
acatttgcac atagagatat ttgggaccca agggaaacca gccattgccc atcgagattt     1440
aaagagcaaa aatattctgg ttaagaagaa tggacagtgt tgcatagcag atttgggcct     1500
ggcagtcatg cattcccaga gcaccaatca gcttgatgtg gggaacaatc cccgtgtggg     1560
caccaagcgc tacatggccc ccgaagttct agatgaaacc atccaggtgg attgtttcga     1620
ttcttataaa agggtcgata tttgggcctt tggacttgtt ttgtgggaag tggccaggcg     1680
gatggtgagc aatggtatag tggaggatta caagccaccg ttctacgatg tggttcccaa     1740
tgacccaagt tttgaagata tgaggaaggt agtctgtgtg gatcaacaaa ggccaaacat     1800
acccaacaga tggttctcag acccgacatt aacctctctg gccaagctaa tgaaagaatg     1860
ctggtatcaa aatccatccg caagactcac agcactgcgt atcaaaaaga ctttgaccaa     1920
aattgataat tccctcgaca aattgaaaac tgactgttga cattttcata gtgtcaagaa     1980
ggaagatttg acgttgttgt cattgtccag ctgggaccta atgctggcct gactggttgt     2040
cagaatggaa tccatctgtc tccctcccca aatggctgct ttgacaaggc agacgtcgta     2100
cccagccatg tgttggggag acatcaaaac caccctaacc tcgctcgatg actgtgaact     2160
gggcatttca cgaactgttc acactgcaga gactaatgtt ggacagacac tgttgcaaag     2220
gtagggactg gaggaacaca gagaaatcct aaaagagatc tgggcattaa gtcagtggct     2280
ttgcatagct ttcacaagtc tcctagacac tccccacggg aaactcaagg aggtggtgaa     2340
tttttaatca gcaatattgc ctgtgcttct cttctttatt gcactaggaa ttctttgcat     2400
tccttacttg cactgttact cttaatttta aagacccaac ttgccaaaat gttggctgcg     2460
tactccactg gtctgtcttt ggataatagg aattcaattt ggcaaaacaa aatgtaatgt     2520
cagactttgc tgcattttac acatgtgctg atgtttacaa tgatgccgaa cattaggaat     2580
tgtttataca caactttgca aattatttat tacttgtgca cttagtagtt tttacaaaac     2640
tgctttgtgc atatgttaaa gcttattttt atgtggtctt atgattttat tacagaaatg     2700
tttttaacac tatactctaa aatggacatt ttcttttatt atcagttaaa atcacatttt     2760
aagtgcttca catttgtatg tgtgtagact gtaacttttt ttcagttcat atgcagaacg     2820
tatttagcca ttacccacgt gacaccaccg aatatattac tgatttagaa gcaaagattt     2880
cagtagaatt ttagtcctga acgctacggg gaaaatgcat tttcttcaga attatccatt     2940
acgtgcattt aaactctgcc agaaaaaaat aactattttg ttttaatcta ctttttgtat     3000
ttagtagtta tttgtataaa ttaaataaac tgttttcaag tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa     3060
aa                                                                    3062
<210>  3
<211>  509
<212>  БЕЛОК
<213>  Mus musculus
<400>  3
Met Val Asp Gly Val Met Ile Leu Pro Val Leu Met Met Met Ala Phe
1               5                   10                  15
Pro Ser Pro Ser Val Glu Asp Glu Lys Pro Lys Val Asn Gln Lys Leu
20                  25                  30
Tyr Met Cys Val Cys Glu Gly Leu Ser Cys Gly Asn Glu Asp His Cys
35                  40                  45
Glu Gly Gln Gln Cys Phe Ser Ser Leu Ser Ile Asn Asp Gly Phe His
50                  55                  60
Val Tyr Gln Lys Gly Cys Phe Gln Val Tyr Glu Gln Gly Lys Met Thr
65                  70                  75                  80
Cys Lys Thr Pro Pro Ser Pro Gly Gln Ala Val Glu Cys Cys Gln Gly
85                  90                  95
Asp Trp Cys Asn Arg Asn Ile Thr Ala Gln Leu Pro Thr Lys Gly Lys
100                 105                 110
Ser Phe Pro Gly Thr Gln Asn Phe His Leu Glu Val Gly Leu Ile Ile
115                 120                 125
Leu Ser Val Val Phe Ala Val Cys Leu Leu Ala Cys Ile Leu Gly Val
130                 135                 140
Ala Leu Arg Lys Phe Lys Arg Arg Asn Gln Glu Arg Leu Asn Pro Arg
145                 150                 155                 160
Asp Val Glu Tyr Gly Thr Ile Glu Gly Leu Ile Thr Thr Asn Val Gly
165                 170                 175
Asp Ser Thr Leu Ala Glu Leu Leu Asp His Ser Cys Thr Ser Gly Ser
180                 185                 190
Gly Ser Gly Leu Pro Phe Leu Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Gln Ile
195                 200                 205
Thr Leu Leu Glu Cys Val Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Arg
210                 215                 220
Gly Ser Trp Gln Gly Glu Asn Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg
225                 230                 235                 240
Asp Glu Lys Ser Trp Phe Arg Glu Thr Glu Leu Tyr Asn Thr Val Met
245                 250                 255
Leu Arg His Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ser Asp Met Thr Ser
260                 265                 270
Arg His Ser Ser Thr Gln Leu Trp Leu Ile Thr His Tyr His Glu Met
275                 280                 285
Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Gln Leu Thr Thr Leu Asp Thr Val Ser
290                 295                 300
Cys Leu Arg Ile Val Leu Ser Ile Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His
305                 310                 315                 320
Ile Glu Ile Phe Gly Thr Gln Gly Lys Ser Ala Ile Ala His Arg Asp
325                 330                 335
Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Gln Cys Cys Ile
340                 345                 350
Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Met His Ser Gln Ser Thr Asn Gln Leu
355                 360                 365
Asp Val Gly Asn Asn Pro Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro
370                 375                 380
Glu Val Leu Asp Glu Thr Ile Gln Val Asp Cys Phe Asp Ser Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Arg Val Asp Ile Trp Ala Phe Gly Leu Val Leu Trp Glu Val Ala Arg
405                 410                 415
Arg Met Val Ser Asn Gly Ile Val Glu Asp Tyr Lys Pro Pro Phe Tyr
420                 425                 430
Asp Val Val Pro Asn Asp Pro Ser Phe Glu Asp Met Arg Lys Val Val
435                 440                 445
Cys Val Asp Gln Gln Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Phe Ser Asp
450                 455                 460
Pro Thr Leu Thr Ser Leu Ala Lys Leu Met Lys Glu Cys Trp Tyr Gln
465                 470                 475                 480
Asn Pro Ser Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Thr
485                 490                 495
Lys Ile Asp Asn Ser Leu Asp Lys Leu Lys Thr Asp Cys
500                 505
<210>  4
<211>  3312
<212>  ДНК
<213>  Mus musculus
<400>  4
ccgcctcccc gggttcagca cccgaccgcc gctggaccag aggaacaaag gagctgcccc       60
cgtgtcaccc agcccttcag tggaagtctg gaaaaggaac agaggtgata ttgcagtgga      120
tgagcagaga gaagccggcc tctggtgctc ttgagctggt ctgcccatag ggagcctgct      180
gggagaaggt acagcttccg gaagactcct cccggagcgc ctctcccatc ctcctctccc      240
ttggagcagt cagtacctct ctgctggagg atctgggctg ggtgtgccgg gagctggctt      300
taactgtagc cctgtcaggc tttccccgga cctcgcggaa gagcgtcacc agcccccacg      360
gctttccaac acatcacctc ttttcatgcc gtttggcaca gatcgaatct acagggatga      420
atggatccag ggtctggttt taagttctat ggtagtcgtc caaggagcca ttggtattca      480
tctaacgcaa acgatcaagt tacattctga aagtaacatc ccaccagaaa ccctccagca      540
gcagtcacgt ctgtgtaaag ccaagccctg gcatgcgcac tgccaggtca gagtgtggtg      600
gtacacgtgt ttaacaggtc atttgtcaac tgaaggaaag accccggctt gacttacctg      660
ttatacaatg gtcgatggag taatgatcct tcctgtgcta atgatgatgg ctttcccttc      720
cccgagtgtg gaagatgaga agcccaaggt caaccagaaa ctttacatgt gtgtgtgtga      780
gggcctctcc tgcgggaacg aggaccactg tgaaggccag cagtgttttt cttctctgag      840
catcaacgat ggcttccacg tctaccagaa gggctgcttt caggtttatg agcaggggaa      900
gatgacgtgt aagaccccgc cgtcacctgg ccaggctgtg gagtgctgcc aaggggactg      960
gtgtaacagg aacatcacgg cccagctgcc cactaaaggg aagtccttcc ccggaacaca     1020
gaatttccac ctggaagttg gccttatcat cctctcggtg gtgtttgcag tatgtctttt     1080
agcttgcatc cttggagttg ctctcaggaa gtttaagaga cgcaatcaag agcgcctgaa     1140
ccccagagac gtggagtatg gtaccattga agggctcatc accaccaatg tgggagacag     1200
cactctagcg gaactactag atcactcgtg tacatcagga agtggctccg gtcttccttt     1260
cctggtacag agaacggtgg ctcgccagat aaccctgttg gagtgtgtcg ggaagggccg     1320
gtatggagaa gtatggaggg gcagctggca aggcgaaaat gtcgctgtga agatcttctc     1380
ctcccgagac gagaagtcat ggttcaggga gacggaattg tacaacactg tgatgttgag     1440
gcatgaaaat atcttaggtt tcatcgcttc agacatgacc tccagacact ccagtaccca     1500
gctgtggctc atcacacatt accatgaaat gggatcgttg tatgactacc ttcagctcac     1560
tactctggat acggttagct gccttcggat tgtactgtcc atagccagcg gccttgccca     1620
tttgcacata gagatatttg ggacccaagg gaagtccgcc attgcccatc gagatctgaa     1680
gagcaaaaac atcctggtga agaagaatgg acagtgctgc atagcagatt tgggcctggc     1740
agtcatgcat tcccagagca caaaccagct tgatgtggga aacaaccccc gtgtggggac     1800
caagcgctac atggctccgg aagtgctcga tgaaaccatc caagtggatt gctttgattc     1860
ttataagagg gtcgatattt gggcctttgg ccttgttctg tgggaagtgg ccaggcgaat     1920
ggtgagcaat ggtatagtgg aagattacaa gccaccattc tatgatgtgg ttcccaatga     1980
cccaagtttt gaagatatga ggaaagttgt ctgtgtggat caacagaggc caaacatacc     2040
taacagatgg ttctcagacc cgacattaac ttctctggcg aagctgatga aagagtgctg     2100
gtatcagaac ccatccgcaa gactcacagc tctacgtatc aaaaagactt tgaccaaaat     2160
cgataattcc ctagacaaat taaaaactga ctgttgacct tgtcaccggt gtcaagaagg     2220
agagtcaatg ctgtccttgt ccagctggga cctaatgctg gcctgactgg ttgtcagaac     2280
agaatccatc tgaccccctt cccgaagtgg ctgctttgac ggaagcagat gtctcttccc     2340
agccatgttc cagggggaga caccaaaacc accctaacct cgctcaaaaa ctgtgactcg     2400
agccctcgat gaactgttca caccacaaag acttaacggt gggcaggtct ggtggcaagg     2460
gggagggaag tggaggaacc cggaaagatc ctgcaggcga tctgggcatt aagacagtgg     2520
ctctctgcgt atctttcgcg ggtctcctag acactcccca cgggaagctc aaggaggcgg     2580
tgaattcgta atcagcaata tcggctgcat ctactcttcg ttgcactagg aattctgtgc     2640
attccttact tgcactgtgg cccttaatct taaagaccca acttgccaaa acattggctg     2700
cgtactccac tggcctgtct ctggataata ggaattcaat ctggcaacac aaaaatgtac     2760
cgttggactc tgctgcattt tacacacgtg ctgatgttta caaggatgcg aacattagga     2820
attgtttaga cacaactttg caaattattt attactggtg cacttagcgg tttgtttgaa     2880
accgcctcgt gcatatgtta aagcttattt ttatgtggtc ttatgatttt attaccgaaa     2940
tgtttttaac acccaactct gaaacggaca ttttctttta ttatcagtta aattcacatt     3000
taagtgcttc acattttttt ttttaaatgt gtgtagactg taactttctt ttcagttcgt     3060
atgcagaaca tatttagcca ttacccatgc aacaccaccc gatatattac tgatttagaa     3120
gcaaagattt cagtagaatt ttagtcccaa acgctgtggg gggaaatgca tcttcttcgg     3180
aattatccat tacgtgcatt taaactctgc cagaaaaaaa aataactatt ttgttttaat     3240
ctactttttg tatttagtag ttatttgtat aaattaaata aactgttttc aagtcaaaaa     3300
aaaaaaaaaa aa                                                         3312
<210>  5
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  5
Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr Tyr Met Ala
1               5                   10
<210>  6
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  6
Ser Ile Thr Asn Ser Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Arg Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  7
<211>  14
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  7
Glu Gly Gly Glu Asn Tyr Gly Gly Tyr Pro Pro Phe Ala Tyr
1               5                   10
<210>  8
<211>  15
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  8
Arg Ala Asn Gln Gly Val Ser Leu Ser Arg Tyr Asn Leu Met His
1               5                   10                  15
<210>  9
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  9
Arg Ser Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>  10
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  10
Gln Gln Ser Arg Glu Ser Pro Phe Thr
1               5
<210>  11
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  11
Gly Ser Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Lys
1               5                   10
<210>  12
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  12
Ser Ile Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  13
<211>  12
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  13
Ala Ile Ser Thr Pro Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe
1               5                   10
<210>  14
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  14
Leu Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Thr
1               5                   10
<210>  15
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  15
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1               5
<210>  16
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  16
Leu His Leu Thr Ser Tyr Pro Pro Tyr Thr
1               5                   10
<210>  17
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  Gln является замещенным аминокислотным остатком.
<400>  17
Arg Ser Ser Asn Leu Ala Gln
1               5
<210>  18
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  18
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Tyr Met Tyr
1               5                   10
<210>  19
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  19
Ser Ile Asn Thr Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  20
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  20
Ser Thr Pro Asn Ile Pro Leu Ala Tyr
1               5
<210>  21
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  21
Lys Ala Ser Gln Asn Ile Tyr Lys Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  22
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  22
Tyr Ser Asn Ser Leu Gln Thr
1               5
<210>  23
<211>  8
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  23
Phe Gln Tyr Ser Ser Gly Pro Thr
1               5
<210>  24
<211>  10
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  24
Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Ala Met Ser
1               5                   10
<210>  25
<211>  17
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  25
Ser Ile Ser Arg Gly Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  26
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  26
Leu Asn Tyr Asn Asn Tyr Phe Asp Tyr
1               5
<210>  27
<211>  11
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  27
Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Trp Leu Ser
1               5                   10
<210>  28
<211>  7
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  28
Gly Ala Thr Ser Leu Ala Asp
1               5
<210>  29
<211>  9
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  29
Leu Gln Ala Tyr Ser Ala Pro Phe Thr
1               5
<210>  30
<211>  238
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-15A-L4
<220>
<221>  СИГНАЛЬНЫЙ
<222>  (1)..(20)
<220>
<221>  V_область
<222>  (21)..(133)
<220>
<221>  C_область
<222>  (134)..(238)
<400>  30
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20                  25                  30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Asn Gln Gly
35                  40                  45
Val Ser Leu Ser Arg Tyr Asn Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50                  55                  60
Gly Gln Lys Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Asn Leu Ala Ser
65                  70                  75                  80
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85                  90                  95
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys
100                 105                 110
Gln Gln Ser Arg Glu Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
115                 120                 125
Glu Leu Lys Arg Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130                 135                 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165                 170                 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180                 185                 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195                 200                 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210                 215                 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>  31
<211>  472
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-15A-H4
<220>
<221>  СИГНАЛЬНЫЙ
<222>  (1)..(19)
<220>
<221>  V_область
<222>  (20)..(142)
<220>
<221>  C_область
<222>  (143)..(472)
<400>  31
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35                  40                  45
Ser His Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Asn Ser Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Arg
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser
85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr
100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Gly Glu Asn Tyr Gly Gly Tyr Pro Pro
115                 120                 125
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130                 135                 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr
145                 150                 155                 160
Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165                 170                 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180                 185                 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195                 200                 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile
210                 215                 220
Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
225                 230                 235                 240
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
245                 250                 255
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
260                 265                 270
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
275                 280                 285
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
290                 295                 300
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
305                 310                 315                 320
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
325                 330                 335
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
340                 345                 350
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
355                 360                 365
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
370                 375                 380
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
385                 390                 395                 400
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
405                 410                 415
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
420                 425                 430
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
435                 440                 445
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
450                 455                 460
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>  32
<211>  238
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-15A-L6
<220>
<221>  СИГНАЛЬНЫЙ
<222>  (1)..(20)
<220>
<221>  V_область
<222>  (21)..(133)
<220>
<221>  C_область
<222>  (134)..(238)
<400>  32
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala
20                  25                  30
Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Asn Gln Gly
35                  40                  45
Val Ser Leu Ser Arg Tyr Asn Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50                  55                  60
Gly Gln Lys Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Asn Leu Ala Gln
65                  70                  75                  80
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85                  90                  95
Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Val Tyr Tyr Cys
100                 105                 110
Gln Gln Ser Arg Glu Ser Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu
115                 120                 125
Glu Leu Lys Arg Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
130                 135                 140
Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu
145                 150                 155                 160
Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn
165                 170                 175
Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser
180                 185                 190
Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala
195                 200                 205
Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly
210                 215                 220
Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230                 235
<210>  33
<211>  468
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-15A-H4_IgG2
type
<400>  33
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35                  40                  45
Ser His Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Asn Ser Gly Gly Ser Ile Asn Tyr Arg
65                  70                  75                  80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser
85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr
100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Gly Glu Asn Tyr Gly Gly Tyr Pro Pro
115                 120                 125
Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
130                 135                 140
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
145                 150                 155                 160
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
165                 170                 175
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
180                 185                 190
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
195                 200                 205
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
210                 215                 220
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
225                 230                 235                 240
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
245                 250                 255
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
260                 265                 270
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
275                 280                 285
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
290                 295                 300
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
305                 310                 315                 320
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
325                 330                 335
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
340                 345                 350
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
355                 360                 365
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
370                 375                 380
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
385                 390                 395                 400
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
405                 410                 415
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
420                 425                 430
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
435                 440                 445
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
450                 455                 460
Ser Pro Gly Lys
465
<210>  34
<211>  470
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-27D-H2
<220>
<221>  СИГНАЛЬНЫЙ
<222>  (1)..(19)
<220>
<221>  V_область
<222>  (20)..(140)
<220>
<221>  C_область
<222>  (141)..(470)
<400>  34
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe
35                  40                  45
Ser Asn Tyr Gly Met Lys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ile Ser Thr Pro Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp
115                 120                 125
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130                 135                 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145                 150                 155                 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165                 170                 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180                 185                 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195                 200                 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210                 215                 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225                 230                 235                 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245                 250                 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260                 265                 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275                 280                 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290                 295                 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305                 310                 315                 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325                 330                 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340                 345                 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355                 360                 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370                 375                 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385                 390                 395                 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405                 410                 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420                 425                 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435                 440                 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450                 455                 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>  35
<211>  234
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-27D-L2
<220>
<221>  СИГНАЛЬНЫЙ
<222>  (1)..(20)
<220>
<221>  V_область
<222>  (21)..(129)
<220>
<221>  C_область
<222>  (130)..(234)
<400>  35
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
20                  25                  30
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Leu Ala Ser Ser Ser
35                  40                  45
Val Ser Tyr Met Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg
50                  55                  60
Leu Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
85                  90                  95
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Leu His Leu Thr Ser
100                 105                 110
Tyr Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115                 120                 125
Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130                 135                 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165                 170                 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180                 185                 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195                 200                 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210                 215                 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210>  36
<211>  470
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-27D-H3
<220>
<221>  СИГНАЛЬНЫЙ
<222>  (1)..(19)
<220>
<221>  V_область
<222>  (20)..(140)
<220>
<221>  C_область
<222>  (141)..(470)
<400>  36
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe
35                  40                  45
Ser Asn Tyr Gly Met Lys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ile Ser Thr Pro Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp
115                 120                 125
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130                 135                 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145                 150                 155                 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165                 170                 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180                 185                 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195                 200                 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210                 215                 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225                 230                 235                 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245                 250                 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260                 265                 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275                 280                 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290                 295                 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305                 310                 315                 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325                 330                 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340                 345                 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355                 360                 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370                 375                 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385                 390                 395                 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405                 410                 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420                 425                 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435                 440                 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450                 455                 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>  37
<211>  234
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-27D-L4
<220>
<221>  СИГНАЛЬНЫЙ
<222>  (1)..(20)
<220>
<221>  V_область
<222>  (21)..(129)
<220>
<221>  C_область
<222>  (130)..(234)
<400>  37
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1               5                   10                  15
Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Met Ser
20                  25                  30
Ala Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Leu Ala Ser Ser Ser
35                  40                  45
Val Ser Tyr Met Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ala Ser Pro Arg
50                  55                  60
Leu Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg
65                  70                  75                  80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg
85                  90                  95
Met Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu His Leu Thr Ser
100                 105                 110
Tyr Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
115                 120                 125
Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130                 135                 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145                 150                 155                 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165                 170                 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180                 185                 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195                 200                 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210                 215                 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225                 230
<210>  38
<211>  470
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-27D-H2_LALA
<400>  38
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe
35                  40                  45
Ser Asn Tyr Gly Met Lys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ile Ser Thr Pro Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp
115                 120                 125
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130                 135                 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145                 150                 155                 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165                 170                 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180                 185                 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195                 200                 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210                 215                 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225                 230                 235                 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245                 250                 255
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260                 265                 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275                 280                 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290                 295                 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305                 310                 315                 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325                 330                 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340                 345                 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355                 360                 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370                 375                 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385                 390                 395                 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405                 410                 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420                 425                 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435                 440                 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450                 455                 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>  39
<211>  470
<212>  БЕЛОК
<213>  Искусственный
<220>
<223>  Аминокислотная последовательность гуманизированного hA2-27D-H3_LALA
<400>  39
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20                  25                  30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe
35                  40                  45
Ser Asn Tyr Gly Met Lys Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
50                  55                  60
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Arg Ser Ser Thr Tyr Ile Tyr Tyr Ala
65                  70                  75                  80
Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
85                  90                  95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100                 105                 110
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Ile Ser Thr Pro Phe Tyr Trp Tyr Phe Asp
115                 120                 125
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130                 135                 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145                 150                 155                 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165                 170                 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180                 185                 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195                 200                 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210                 215                 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225                 230                 235                 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245                 250                 255
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260                 265                 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275                 280                 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290                 295                 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305                 310                 315                 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325                 330                 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340                 345                 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355                 360                 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370                 375                 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385                 390                 395                 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405                 410                 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420                 425                 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435                 440                 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450                 455                 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465                 470
<210>  40
<211>  509
<212>  БЕЛОК
<213>  Macca mulatta
<400>  40
Met Val Asp Gly Val Met Ile Leu Pro Val Leu Ile Ile Ile Ala Leu
1               5                   10                  15
Pro Ser Pro Ser Met Glu Asp Glu Lys Pro Lys Val Asn Pro Lys Leu
20                  25                  30
Tyr Met Cys Val Cys Glu Gly Leu Ser Cys Gly Asn Glu Asp His Cys
35                  40                  45
Glu Gly Gln Gln Cys Phe Ser Ser Leu Ser Ile Asn Asp Gly Phe His
50                  55                  60
Val Tyr Gln Lys Gly Cys Phe Gln Val Tyr Glu Gln Gly Lys Met Thr
65                  70                  75                  80
Cys Lys Thr Pro Pro Ser Pro Gly Gln Ala Val Glu Cys Cys Gln Gly
85                  90                  95
Asp Trp Cys Asn Arg Asn Ile Thr Ala Gln Leu Pro Thr Lys Gly Lys
100                 105                 110
Ser Phe Pro Gly Thr Gln Asn Phe His Leu Glu Val Gly Leu Ile Ile
115                 120                 125
Leu Ser Val Val Phe Ala Val Cys Leu Leu Ala Cys Leu Leu Gly Val
130                 135                 140
Ala Leu Arg Lys Phe Lys Arg Arg Asn Gln Glu Arg Leu Asn Pro Arg
145                 150                 155                 160
Asp Val Glu Tyr Gly Thr Ile Glu Gly Leu Ile Thr Thr Asn Val Gly
165                 170                 175
Asp Ser Thr Leu Ala Asp Leu Leu Asp His Ser Cys Thr Ser Gly Ser
180                 185                 190
Gly Ser Gly Leu Pro Phe Leu Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Gln Ile
195                 200                 205
Thr Leu Leu Glu Cys Val Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Arg
210                 215                 220
Gly Ser Trp Gln Gly Glu Asn Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg
225                 230                 235                 240
Asp Glu Lys Ser Trp Phe Arg Glu Thr Glu Leu Tyr Asn Thr Val Met
245                 250                 255
Leu Arg His Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ser Asp Met Thr Ser
260                 265                 270
Arg His Ser Ser Thr Gln Leu Trp Leu Ile Thr His Tyr His Glu Met
275                 280                 285
Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Gln Leu Thr Thr Leu Asp Thr Val Ser
290                 295                 300
Cys Leu Arg Ile Val Leu Ser Ile Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His
305                 310                 315                 320
Ile Glu Ile Phe Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp
325                 330                 335
Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Gln Cys Cys Ile
340                 345                 350
Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Met His Ser Gln Ser Thr Asn Gln Leu
355                 360                 365
Asp Val Gly Asn Asn Pro Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro
370                 375                 380
Glu Val Leu Asp Glu Thr Ile Gln Val Asp Cys Phe Asp Ser Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Arg Val Asp Ile Trp Ala Phe Gly Leu Val Leu Trp Glu Val Ala Arg
405                 410                 415
Arg Met Val Ser Asn Gly Ile Val Glu Asp Tyr Lys Pro Pro Phe Tyr
420                 425                 430
Asp Val Val Pro Asn Asp Pro Ser Phe Glu Asp Met Arg Lys Val Val
435                 440                 445
Cys Val Asp Gln Gln Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Phe Ser Asp
450                 455                 460
Pro Thr Leu Thr Ser Leu Ala Lys Leu Met Lys Glu Cys Trp Tyr Gln
465                 470                 475                 480
Asn Pro Ser Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Thr
485                 490                 495
Lys Ile Asp Asn Ser Leu Asp Lys Leu Lys Thr Asp Cys
500                 505
<210>  41
<211>  509
<212>  БЕЛОК
<213>  Canis lupus
<400>  41
Met Val Asp Gly Val Met Met Leu Pro Val Leu Met Met Ile Ala Phe
1               5                   10                  15
Pro Ser Pro Ser Met Glu Asp Glu Lys Pro Lys Val Asn Pro Lys Leu
20                  25                  30
Tyr Met Cys Val Cys Glu Gly Leu Ser Cys Gly Asn Glu Asp His Cys
35                  40                  45
Glu Gly Gln Gln Cys Phe Ser Ser Leu Ser Ile Asn Asp Gly Phe His
50                  55                  60
Val Tyr Gln Lys Gly Cys Phe Gln Val Tyr Glu Gln Gly Lys Met Thr
65                  70                  75                  80
Cys Lys Thr Pro Pro Ser Pro Gly Gln Ala Val Glu Cys Cys Gln Gly
85                  90                  95
Asp Trp Cys Asn Arg Asn Ile Thr Ala Gln Leu Pro Thr Lys Gly Lys
100                 105                 110
Ser Phe Pro Glu Thr Gln Asn Phe His Leu Glu Val Gly Leu Ile Ile
115                 120                 125
Leu Ser Val Val Phe Ala Val Cys Leu Leu Ala Cys Leu Leu Gly Val
130                 135                 140
Ala Leu Arg Lys Phe Lys Arg Arg Asn Gln Glu Arg Leu Asn Pro Arg
145                 150                 155                 160
Asp Val Glu Tyr Gly Thr Ile Glu Gly Leu Ile Thr Thr Asn Val Gly
165                 170                 175
Asp Ser Thr Leu Ala Asp Leu Leu Asp His Ser Cys Thr Ser Gly Ser
180                 185                 190
Gly Ser Gly Leu Pro Phe Leu Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Gln Ile
195                 200                 205
Thr Leu Leu Glu Cys Val Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Arg
210                 215                 220
Gly Ser Trp Gln Gly Glu Asn Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg
225                 230                 235                 240
Asp Glu Lys Ser Trp Phe Arg Glu Thr Glu Leu Tyr Asn Thr Val Met
245                 250                 255
Leu Arg His Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ser Asp Met Thr Ser
260                 265                 270
Arg His Ser Ser Thr Gln Leu Trp Leu Ile Thr His Tyr His Glu Met
275                 280                 285
Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Gln Leu Thr Thr Leu Asp Thr Val Ser
290                 295                 300
Cys Leu Arg Ile Val Leu Ser Ile Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His
305                 310                 315                 320
Ile Glu Ile Phe Gly Thr Gln Gly Lys Pro Ala Ile Ala His Arg Asp
325                 330                 335
Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Gln Cys Cys Ile
340                 345                 350
Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Met His Ser Gln Ser Thr Asn Gln Leu
355                 360                 365
Asp Val Gly Asn Asn Pro Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro
370                 375                 380
Glu Val Leu Asp Glu Thr Ile Gln Val Asp Cys Phe Asp Ser Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Arg Val Asp Ile Trp Ala Phe Gly Leu Val Leu Trp Glu Val Ala Arg
405                 410                 415
Arg Met Val Ser Asn Gly Ile Val Glu Asp Tyr Lys Pro Pro Phe Tyr
420                 425                 430
Asp Val Val Pro Asn Asp Pro Ser Phe Glu Asp Met Arg Lys Val Val
435                 440                 445
Cys Val Asp Gln Gln Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Phe Ser Asp
450                 455                 460
Pro Thr Leu Thr Ser Leu Ala Lys Leu Met Lys Glu Cys Trp Tyr Gln
465                 470                 475                 480
Asn Pro Ser Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Thr
485                 490                 495
Lys Ile Asp Asn Ser Leu Asp Lys Leu Lys Thr Asp Cys
500                 505
<210>  42
<211>  509
<212>  БЕЛОК
<213>  Rattus norvegicus
<400>  42
Met Val Asp Gly Ala Met Ile Leu Ser Val Leu Met Met Met Ala Leu
1               5                   10                  15
Pro Ser Pro Ser Met Glu Asp Glu Glu Pro Lys Val Asn Pro Lys Leu
20                  25                  30
Tyr Met Cys Val Cys Glu Gly Leu Ser Cys Gly Asn Glu Asp His Cys
35                  40                  45
Glu Gly Gln Gln Cys Phe Ser Ser Leu Ser Val Asn Asp Gly Phe Arg
50                  55                  60
Val Tyr Gln Lys Gly Cys Phe Gln Val Tyr Glu Gln Gly Lys Met Thr
65                  70                  75                  80
Cys Lys Thr Pro Pro Ser Pro Gly Gln Ala Val Glu Cys Cys Gln Gly
85                  90                  95
Asp Trp Cys Asn Arg Asn Val Thr Ala Arg Leu Pro Thr Lys Gly Lys
100                 105                 110
Ser Phe Pro Gly Ser Gln Asn Phe His Leu Glu Val Gly Leu Ile Ile
115                 120                 125
Leu Ser Val Val Phe Ala Val Cys Leu Phe Ala Cys Ile Leu Gly Val
130                 135                 140
Ala Leu Arg Lys Phe Lys Arg Arg Asn Gln Glu Arg Leu Asn Pro Arg
145                 150                 155                 160
Asp Val Glu Tyr Gly Thr Ile Glu Gly Leu Ile Thr Thr Asn Val Gly
165                 170                 175
Asp Ser Thr Leu Ala Glu Leu Leu Asp His Ser Cys Thr Ser Gly Ser
180                 185                 190
Gly Ser Gly Leu Pro Phe Leu Val Gln Arg Thr Val Ala Arg Gln Ile
195                 200                 205
Thr Leu Leu Glu Cys Val Gly Lys Gly Arg Tyr Gly Glu Val Trp Arg
210                 215                 220
Gly Ser Trp Gln Gly Glu Asn Val Ala Val Lys Ile Phe Ser Ser Arg
225                 230                 235                 240
Asp Glu Lys Ser Trp Phe Arg Glu Thr Glu Leu Tyr Asn Thr Val Met
245                 250                 255
Leu Arg His Glu Asn Ile Leu Gly Phe Ile Ala Ser Asp Met Thr Ser
260                 265                 270
Arg His Ser Ser Thr Gln Leu Trp Leu Ile Thr His Tyr His Glu Met
275                 280                 285
Gly Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Gln Leu Thr Thr Leu Asp Thr Val Ser
290                 295                 300
Cys Leu Arg Ile Val Leu Ser Ile Ala Ser Gly Leu Ala His Leu His
305                 310                 315                 320
Ile Glu Ile Phe Gly Thr Gln Gly Lys Ser Ala Ile Ala His Arg Asp
325                 330                 335
Leu Lys Ser Lys Asn Ile Leu Val Lys Lys Asn Gly Gln Cys Cys Ile
340                 345                 350
Ala Asp Leu Gly Leu Ala Val Met His Ser Gln Ser Thr Asn Gln Leu
355                 360                 365
Asp Val Gly Asn Asn Pro Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro
370                 375                 380
Glu Val Leu Asp Glu Thr Ile Gln Val Asp Cys Phe Asp Ser Tyr Lys
385                 390                 395                 400
Arg Val Asp Ile Trp Ala Phe Gly Leu Val Leu Trp Glu Val Ala Arg
405                 410                 415
Arg Met Val Ser Asn Gly Ile Val Glu Asp Tyr Lys Pro Pro Phe Tyr
420                 425                 430
Asp Val Val Pro Asn Asp Pro Ser Phe Glu Asp Met Arg Lys Val Val
435                 440                 445
Cys Val Asp Gln Gln Arg Pro Asn Ile Pro Asn Arg Trp Phe Ser Asp
450                 455                 460
Pro Thr Leu Thr Ser Leu Ala Lys Leu Met Lys Glu Cys Trp Tyr Gln
465                 470                 475                 480
Asn Pro Ser Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg Ile Lys Lys Thr Leu Thr
485                 490                 495
Lys Ile Asp Asn Ser Leu Asp Lys Leu Lys Thr Asp Cys
500                 505
<---