Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии с комбинированным УФ- и масс-селективным детектированием для определения каротиноидов в гонадах промысловых видов морских иглокожих Cucumaria japonica и Strongylocentrotus nudus

2003

Известия ТИНРО

Том 135

УДК 577.1:593.9

В.Г.Рыбин, К.Г.Павель, Е.В.Болтенков; Г.А.Вербицкий

ПРИМЕНЕНИЕ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С КОМБИНИРОВАННЫМ УФ-И МАСС-СЕЛЕКТИВНЫМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРОТИНОИДОВ В ГОНАДАХ ПРОМЫСЛОВЫХ ВИДОВ МОРСКИХ ИГЛОКОЖИХ CUCUMARIA JAPONICA И STRONGYLOCENTROTUS NUDUS

Показана возможность применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с комбинированным масс-селективным и УФ-детектированием для проведения структурного исследования каротиноидов. Используя данный метод, исследовали состав главных каротиноидов гонад двух видов иглокожих Cucu-maria japónica и Strongylocentrotus nudus. Сравнение спектральных данных позволило установить присутствие в гонадах Cucumaria japonica 9,9'-ди-цис-кукумариаксантина А, 9-цис-кукумариаксантина А, 9,9'-ди-цис-кукумариаксантина В, 9,9'-ди-цис-кукумариаксантина С, 9-цис-кукумариаксантина С, кантаксантина и моно-цис-кантаксантина с неустановленным положением цис-двойной связи. Определены условия предварительного фракционирования и препаративного выделения каротиноидов из гонад Cucumaria japonica методом колоночной хроматографии на силикагеле с целью повышения точности последующей их идентификации. В гонадах Strongylocentrotus nudus идентифицированы Р-эхиненон и 0-каротин. Показана универсальность метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с комбинированным масс-селективным и УФ-детектированием для идентификации каротиноидов.

Rybin V.G., Pavel K.G., Boltenkov E.V., Verbitskii G.A. Application of high performance liquid chromatography coupled to UV and mass-selective detection to determination of carotenoids in gonads of two species of marine echinoderms Cucumaria japonica and Strongylocentrotus nudus // Izv. TINRO. — 2003. — Vol. 135. — P. 319-326.

A possibility is shown of high performance liquid chromatography application for structural investigation of carotenoids. The composition of major carotenoids of gonads from two species of echinoderms Cucumaria japonica and Strongylocentro-tus nudus has been investigated. On the base of chromatographical, UV-spectral and mass-spectral data, the following groups of carotenoids were found in the gonads of Cucumaria japonica: 9-cis-cucumariaxanthin A, 9,9'-di-cis-cucumariaxanthin A, 9,9 -di-cis-cucumariaxanthin B, 9,9'-di-cis-cucumariaxanthin C, 9-cis-cucumariaxanthin C, canthaxanthin, and mono-cis-canthaxantin without established cis-double bond location. The conditions have been determined of pre-fractionating and preparative isolation of carotenoids from gonads of Cucumaria japonica by means of column chro-matography on silica gel for more precise identification. In the gonads of Strongylo-centrotus nudus, P-echinenone and P-carotene were identified. The universality of high performance liquid chromatography method coupled with atmospheric pressure chemical ionization mass-spectrometry and UV detection has been shown for caro-tenoids identification.

Каротиноиды являются одной из основных групп природных пигментов. Высокое содержание каротиноидов характерно для тканей ряда растений, а также многих морских организмов. В последние годы в мировой научной литературе наблюдается увеличение числа публикаций, связанных с исследованиями этих соединений. Возросший интерес к каротиноидам объясняется их способностью снижать риск опухолевых и сердечно-сосудистых заболеваний человека, выступать в роли биоантиоксидантов, предшественников витамина А и др. (Bendich, Olson, 1989). В этом отношении значительный интерес вызывают каротиноиды морских организмов, в частности беспозвоночных. Для ряда соединений, выделенных из этих объектов, обнаружена высокая биологическая активность (Mat-suno, 1991; Tsushima et al., 1996).

Для анализа каротиноидов традиционно используют различные хромато-графические методы на прямых и обращенных неподвижных фазах (Pfander et al., 1994). В последнее время активно проводятся исследования по применению метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с комбинированным УФ- и масс-селективным (MC) детектированием для анализа низкомолекулярных биорегуляторов. Данный метод позволяет проводить эффективное разделение веществ с одновременным получением информации об их хромато-графических характеристиках, а также их электронных и масс-спектров (Lacker et al., 1999; Высоцкий и др., 2001).

Целью исследования было установление возможности использования системы ВЭЖХ-MC в комплексе с УФ-детекцией для идентификации ряда кароти-ноидов промысловых видов морских беспозвоночных. В частности, исследовались основные пигменты гонад голотурии Cucumaria japónica и черного ежа Strongylocentrotus nudus.

Морские ежи Strongylocentrotus nudus были собраны в период активного промысла в июне—июле 2002 г. в бухте Прогулочной зал. Петра Великого, голотурии Cucumaria japonica были собраны в Уссурийском заливе, в прибрежной зоне о. Русского в октябре 2002 г.

Реактивы, использованные в работе, были квалификации "хч". Растворители очищались по стандартным методикам (Гордон, Форд, 1976).

Экстракцию липидов проводили по методу Блайя и Дайера (Bligh, Dyer, 1959).

Тонкослойную хроматографию проводили на пластинках с закрепленным слоем силикагеля Silufol UV254 ("Kavalier", Чехия). Элюировали системой растворителей: н-гексан-диэтиловый эфир в объемных соотношениях 1: 1. Для обнаружения неокрашенных соединений пластинки обрабатывали опрыскиванием 10 %-ным раствором фосфорно-молибденовой кислоты в этаноле с последующим подогревом пластинок до 100 оС.

Колоночную хроматографию осуществляли на силикагеле L Chemapol (Чехия) (40-100 мкм). На колонку, заполненную 15 г сорбента, "мокрым" способом наносили 0,5 г сухой смеси липидов. Элюировали системой растворителей н-гексан-диэтиловый эфир в объемном соотношении 1: 1. Фракции собирали по 20 мл и анализировали методом ТСХ. Фракции, содержащие близкие по значениям Rf компоненты, сушили над безводным сульфатом натрия, упаривали до постоянной массы в вакууме при температуре 35 оС и растворяли в этаноле. Полученные растворы запаивали в ампулы и хранили при температуре минус 18 оС.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию — масс-спек-трометрию проводили на хромато-масс-спектрометре Agilent 1100 Series LC/MSD ("Hewlett Packard", США), с использованием колонки HyperSil ODS (4 x 125 мм, 5 мкм) при температуре термостата 55 оС. В качестве элюента использовали ацетонитрил. Скорость элюирования 0,5 мл/мин, детек-

ция (УФ) — полный диапазон 200600 нм, ионизация — химическая ионизация при атмосферном давлении, режим регистрации положительных ионов, напряжение на фрагмен-торе 70 В, напряжение в ионизационной камере 4 кВ, поток газа-осушителя (азот) 6 л/мин и давление газа-распылителя (азот) 50 кгс/ см2. Диапазон регистрируемых масс составил 150-1000 Да.

В результате проведенных исследований установлен состав главных каротиноидов в гонадах двух видов морских иглокожих — Cucuma-ria japónica и Strongylocentrotus nudus (рис. 1).

Предварительное исследование состава липидов гонад C. japónica показало достаточно сложный состав каротиноидов (рис. 2). На пластинке отчетливо видны 4 группы окрашенных пятен (две желтых и две красно-оранжевых). С целью идентификации компонентов каротиноид-ной природы, обусловливающих окрашивание пятен, суммарный экстракт из гонад C. japónica был разделен методом колоночной хроматографии на силикагеле на группы окрашенных компонентов, различающихся по полярности. Результаты анализа полученных методом ВЭЖХ-МС фракций позволили установить наличие в гонадах C. japónica не менее семи каротиноидов (см. таблицу, рис. 3). На рис. 3 показаны наложенные хро-матограммы различных фракций, полученных после разделения исходных липидов C. japónica методом колоночной хроматографии на силикаге-ле. Нетрудно отметить, что наряду с близостью хроматографических параметров (время удерживания), которая обусловливает низкое качество разделения исследуемых соединений, спектральные характеристики, а именно максимумы поглощения разделяемых компонентов фракций и значения m/z их квазимолекулярных ионов, позволяют достоверно провести идентификацию всех исследуемых компонентов.

Кукумариаксантин С

O

р-каротин

Рис. 1. Структуры каротиноидов C. japónica и S. nudus, идентифицированных методом ВЭЖХ-МС

Fig. 1. Structures of carotenoids identified in gonads of C. japónica and S. nudus by means of HPLC-MS

Рис. 2. ТСХ-анализ суммарных каротиноидов липидного экстракта из C. japonica. Элюент — «-гексан-диэтиловый эфир (1: 1), пятна на хроматограмме имеют желтую (а, в) и красно-оранжевую (б, г) расцветку

Fig. 2. TLC analysis of total carotenoids of lipid extract from C. japonica. n-Hexane-diethyl ether (1: 1) used as eluent. The spots on chro-matogram have yellow (а, в) and red-orange (б, г) colouring

Рис. 3. ВЭЖХ-МС-анализ

Fig. 3. HPLC-MS analysis (total ion current) of carotenoid containing fractions after column chromatography of lipid extract from C. japonica (а, б, в, г — correspond to marked on Fig. 2): 1 — 9,9'-di-cis-cucumariaxanthin A, 2 — 9-cis-cucumariaxanthin A, 3 — 9,9'-di-cis-cucumariaxanthin B, 4 — 9,9'-di-cis-cucumariaxanthin C, 5 — 9-cis-cucumariaxanthin C, 6 — canthaxanthin, 7 — mono-cis-canthaxantin

Было установлено, что верхнее пятно на пластинке (см. рис. 2) представлено двумя изомерами кукумариаксантина А (ди-цис- и моно-цис-) (см. рис. 1), на что указывает состав отвечающей этому пятну фракции "а", определенный методом ВЭЖХ-МС — два пика на хроматограмме (рис. 3), квазимолекулярные ионы веществ, имеющие одинаковое значение m/z, равное 569 и соответствующее составу ионов [M+H]+ (см. таблицу). Различие в электронных спектрах в данном случае незначительное (см. таблицу, рис. 4), однако соотношение значе-

ний величин оптической плотности при "цас-плече" 326 нм и при длине волны с максимальным значением оптической плотности (432 нм для пика № 1 и 436 нм для пика № 2, рис. 4) для компонента, образующего пик №1, составило большее значение (0,137), чем для компонента, образующего пик № 2 (0,116). Это позволяет обозначить большее число двойных связей с цас-конфигурацией в молекуле компонента пика № 1, чем в молекуле компонента пика № 2, однако незначительное различие в полученных величинах, а также малые абсолютные значения полученных величин для обоих компонентов позволяют определить в их молекулах соответственно две и одну двойную связь в ^ас-конфигурации. Отмеченное обстоятельство для каротиноидов было описано ранее (Carotenoids, 1995; Lacker et al., 1999).

Спектральные характеристики идентифицированных методом ВЭЖХ-МС каротиноидов в гонадах C. japónica и S. nudus Spectral data of carotenoids identified by HPLC-MS method in gonads of C. japónica and S. nudus

Объект № Отнесение сигнала [M+H]+, A,max, нм

исследования пика* m/z

C. japónica 1 Кукумариаксантин А (ди-цис-) 569 326,388,406,432,460

2 Кукумариаксантин А (моно-цас-) 569 326,388,414,436,466

3 Кукумариаксантин В (ди-цис-) 571 328,394,416,438,468

4 Кукумариаксантин С (ди-цис-) 573 328,414,438,466

5 Кукумариаксантин С (моно-цас-) 573 328,412,436,464

6 Кантаксантин 565 472

7 Кантаксантин (моно-цас-) 565 364,464

S. nudus 1 Р-Эхиненон 551 464

2 Р-Каротин 537 425,451,482

* Нумерация пиков как на рис. 3 для C. japónica и рис. 4 для S. nudus.

Пятно, отмеченное на хроматограмме как "б" (см. рис. 2), соответствующее одноименной фракции каротиноидов, образовано двумя изомерами кантаксанти-на — полностью транс- и 9-цис- (см. рис. 1, 3). Пики № 6 и 7 соответствуют компонентам каротиноидной фракции, образующим при проведении ВЭЖХ-МС-анализа в режиме химической ионизации при атмосферном давлении квазимолекулярные ионы состава [М+Н]+ с одинаковым значением т/z, равным 565. Различия в электронных спектрах (рис. 3) указывают на то, что в молекуле компонента, элюирующегося ранее (пик № 6), все двойные связи находятся в транс-конфигурации — отсутствие "цас-плеча" при 364 нм, характерного для спектра 9-цас-кантаксантина е! а1., 1984). В электронном спектре компо-

нента, соответствующего пику № 7 (рис. 4), наблюдалось присутствие отмеченного выше ярко выраженного "цас-плеча", что позволило сделать вывод о наличии в структуре молекулы этого соединения одной цас-двойной связи.

Пятно, отмеченное на хроматограмме как "в" (см. рис. 2), соответствует кукумариаксантину В (ди-цас-) (см. рис. 1), на что указывают как результаты ВЭЖХ-МС-анализа данной фракции (значение т/z протонированного квазимолекулярного иона составило 571), так и электронный спектр исследуемого соединения (см. таблицу, рис. 4).

Пятно, отмеченное на хроматограмме как "г" (см. рис. 2), соответствует двум изомерам кукумариаксантина С (ди-цас- и моно-цас-) (см. рис. 1, 3). Это следует из сравнения результатов ВЭЖХ-МС-анализа данной фракции каротиноидов — значения т/z протонированных квазимолекулярных ионов, образованных искомыми соединениями, составили 573. Кроме того, на различия в конфигурациях двойных связей в молекулах этих соединений указывают различия в соотношениях значений оптической плотности на максимумах поглощения, соответствующих "цас-плечу" и максимальному значению оптической плотности. Эти соотно-

шения равны 0,266 для пика № 4 и 0,464 для пика № 5. Как было отмечено выше, большая величина этого соотношения указывает на большее число двойных связей в ^ас-конфигурации в молекуле каротиноида.

Рис. 4. УФ-спектры компонентов суммарных каротиноидов C. japónica, выделенных последовательно методами колоночной хроматографии на силикагеле и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Нумерация соответствует показанной на рис. 3

Fig. 4. UV-spectra of components of total carotenoids from gonads of C. japónica isolated sequentially by column chromatography on silica gel and reversed-phase HPLC. Numbering is shown on Fig. 3

Результаты исследования состава каротиноидов C. japónica соответствовали полученным ранее сведениям (Matsuno, Tsushima, 1995). Однако методический подход, несомненно, был усовершенствован, что позволило значительно сократить время, отводимое на идентификацию, и особенно на необходимый, в случае использования только УФ-детекторов, структурный анализ неизвестных каротиноидов.

Также была исследована возможность применения ВЭЖХ-МС для разделения и идентификации главных каротиноидов морского ежа 5. nudus. Результаты анализа (см. таблицу, рис. 5) позволили идентифицировать в липидном экстракте из гонад 5. пий^ Р-эхиненон и Р-каротин, на что указывают значения т/ протонированных квазимолекулярных ионов отмеченных каротиноидов — соответственно 551 и 537, а также характеристики электронных спектров, полностью соответствующие полученным ранее (Carotenoids, 1995). Однако ранее было показано, что применение метода химической ионизации при атмосферном давлении не позволяет получать сигналы с высокой интенсивностью полного ионного тока для молекул органических соединений, не имеющих в своих структурах полярных функциональных групп (Высоцкий и др., 2001). Действительно, на представленной на рис. 5 хроматограмме интенсивность сигнала, отвечающего Р~ каротину, оказалась много ниже интенсивности сигнала Р-эхиненона. Тем не менее известно, что содержание этих каротиноидов в гонадах 5. nudus не только оценивается одним порядком, но и является близким по значению (Borisovets et а1., 2002).

0 2 4 6 8 мин

Рис. 5. ВЭЖХ-МС-анализ смеси каротиноидов липидного экстракта из S. nudus (отклик масс-селективного детектора): 1 — ß-эхиненон и его УФ-спектр, 2 — ß-каротин и его УФ-спектр

Fig. 5. HPLC-MS analysis of mixture of carotenoids from S. nudus gonads (total ion current): 1 — ß-echinenone with UV-spectrum, 2 — ß-carotene with UV-spectrum

Из приведенного выше следует, что метод ВЭЖХ-МС может являться универсальным для идентификации каротиноидов, однако не всегда приемлем для их количественного определения. При этом указанный недостаток можно легко устранить, используя при проведении ВЭЖХ-анализа последовательное детектирование элюируемых компонентов смеси УФ- и масс-селективным детекторами.

Таким образом, показана возможность применения ВЭЖХ-МС для точной идентификации низкомолекулярных биорегуляторов каротиноидной природы в морских иглокожих. Определены условия для предварительного фракционирования каротиноидов и последующего их анализа методом ВЭЖХ-МС. Метод, включая фракционирование и последующий анализ, был апробирован для

исследования состава каротиноидов в гонадах двух видов морских иглокожих — Cucumaria japónica и Strongylocentrotus nudus.

Литература

Высоцкий В.И., Рыбин В.Г., Слабко О.Ю. и др. Использование ВЭЖХ-масс-спектрометрии в анализе биологически активных веществ из морских источников // Изв. ТИНРО. — 2001. — Т. 129. — С. 52-61.

Гордон Ф., Форд Р. Спутник химика. — М.: Мир, 1976. — 541 с.

Bendich A., Olson J.A. Biological actions of carotenoids // FASEB J. — 1989. — Vol. 3. — P. 1927-1932.

Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification // Can. J. Biochem. Physiol. — 1959. — Vol. 37. — P. 911-917.

Borisovets E.E., Zadorozhny P.A., Kalinina M.V. et al. Changes of major carotenoids in gonads of sea urchins (Strongylocentrotus intermedius and S. nudus) at maturation // Comparative Biochem. Physiol. B. — 2002. — Vol. 132. — P. 779-790.

Carotenoids / E ds. G .Britton, S .Liaaen-Jensen, H .Pfander. — Vol. 1B. — B.: Birkhaus-er Verlag, 1995. — 360 p.

Lacker T., Strohschein S., Albert K. Separation and identification of various carotenoids by C30 reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled to UV and atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometric detection // J. Chroma-tography. — 1999. — Vol. 854. — P. 37-44.

Matsuno T. Xanthophylls as precursors of retinoids // Pure Appl. Chem. — 1991. — Vol. 63, № 1. — P. 81-88.

Matsuno T., Tsushima M. Comparative biochemical studies of carotenoids in sea cucumbers // Comp. Biochem. Physiol. B. — 1995. — Vol. 111, № 4. — P. 597-605.

Nelis H.J.C.F., Lavens P., Moens L. et al. Cis-canthaxanthins unusual carotenoids in the eggs and the reproductive system of female brine shrimp Arthemia // J. Biol. Chem. — 1984. — Vol. 259, № 10. — P. 6063-6066.

Pfander H., Riesen R., Niggli U. HPLC and SFC of carotenoids — scope and limitations // Pure Appl. Chem. — 1994. — Vol. 66, № 5. — P. 947-954.

Tsushima M., Fujiwara Y., Matsuno T. Novel marine di-Z-carotenoids: cucumar-iaxanthins A, B, and C from the sea cucumber Cucumaria japonica // J. Nat. Prod. — 1996. — Vol. 59, № 1. — P. 30-34.

Поступала в редащаю 31.10.03 г.