Однодоменное антитело и его модификации, специфически связывающиеся с ботулиническим нейротоксином типа А, и способ их применения для терапии или экстренной профилактики интоксикации, вызванной ботулиническим нейротоксином типа А.
SINGLE-DOMAIN ANTIBODY AND ITS MODIFICATIONS SPECIFICALLY BINDING TO BOTULINUM NEUROTOXIN TYPE A, AND METHOD OF USING THEM FOR THERAPY OR EMERGENCY PREVENTION OF INTOXICATION CAUSED BY BOTULINUM NEUROTOXIN TYPE A

Область техники
Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии и микробиологии. Предложенное средство может применяться для терапии и экстренной профилактики интоксикации, вызываемой ботулиническим нейротоксином типа А.
Предшествующий уровень техники
Ботулизм - тяжелое, потенциально смертельное токсикоинфекционное заболевание, вызываемое нейротоксинами бактерий Clostridium botulinum (Gill, D. Bacterial toxins - a table of lethal amounts. Microbiol. Rev. 1982, 46(1), 86-94. PMID: 6806598; Goonetilleke, A; Harris, J; Clostridial neurotoxins. J. Neurol. Neurosurg. & Psychiatry 2004, 75, 35-39. http://dx.doi.org/10.1136/jnnp.2004.046102. PMID: 15316043). Предполагаемая смертельная доза для человека составляет около 10 нанограмм на килограмм веса тела при вдыхании и 1 микрограмм при пероральном приеме (Arnon, S; Schechter, R; Inglesby, T; Henderson, D.A.; Bartlett, J.G.; Ascher, M.S.; Eitzen, E.; Fine, A.D.; Hauer, J.; Layton, M.; et al. Botulinum toxin as a biological weapon - medical and public health management. JAMA 2001, 285(8), 1059-1070. http://dx.doi.org/10.1001/jama.285.8.1059. PMID: 11209178. Emmeluth, D. Botulism. 2nd; New York, NY, USA; Infobase Publishing; 2010.). Наиболее распространенные естественные формы ботулизма - пищевой, раневой и младенческий (Goonetilleke, A; Harris, J; Clostridial neurotoxins. J. Neurol. Neurosurg. & Psychiatry 2004, 75, 35-39. http://dx.doi.org/10.1136/jnnp.2004.046102. PMID: 15316043). Пищевым ботулизмом можно заразиться при потреблении загрязненной пищи, раневой формой - при попадании спор C. botulinum в открытую рану. Младенческая форма возникает у детей при попадании спор токсина в желудочно-кишечный тракт. Ингаляционная форма ботулизма не встречается в естественных условиях и может произойти только в случае биотеррористической атаки (Goonetilleke, A; Harris, J; Clostridial neurotoxins. J. Neurol. Neurosurg. & Psychiatry 2004, 75, 35-39. http://dx.doi.org/10.1136/jnnp.2004.046102. PMID: 15316043), Spickler, A.R. Botulism. Iowa State University, USA; 2018 Jan. Available online: http://www.cfsph.iastate.edu/DiseaseInfo/factsheets.php [accessed February 19, 2019]). Токсин состоит из 3-х нековалентно связанных белковых компонентов: нейротоксина, гемагглютинина и протектина, обеспечивая высокую токсичность и устойчивость к агрессивным условиям среды. Токсин нарушает процесс активации нейронов, влияя на процесс доставки ацетилхолина к пресинаптической мембране путем расщепления белкового комплекса SNARE, что делает невозможным высвобождение нейромедиатора из синаптических везикул, в результате чего прекращается передача нервных сигналов, что приводит к параличу. Существует 8 типов ботулинического токсина (A-H), из которых тип А является наиболее распространенным. Ежегодно в России регистрируется около 300 случаев ботулизма, 15% из которых являются летальными. Кроме того, ботулинический нейротоксин считается одним из наиболее опасных (Центр по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) - категория А) из существующих угроз биотерроризма. Доступная в настоящее время терапия ботулизма имеет ряд недостатков и ограничивается применением поддерживающей терапии, в частности, длительной искусственной вентиляцией легких, а также введением антитоксина, полученного из гипериммунной сыворотки лошади, применение которой способно вызывать аллергические реакции, реакции гиперчувствительности замедленного типа и анафилактический шок в ответ на не человеческие антитела. Для терапии детского ботулизма FDA одобрило применение препарат Baby BIG, представляющий собой очищенный антиботулинический иммуноглобулин человека (https://www.fda.gov/drugs/bioterrorism-and-drug-preparedness/products-approved-other-bioterrorism-emergencies). Однако этот препарат имеет ряд ограничений (https://www.drugs.com/mtm/botulism-immune-globulin.html). Кроме того, крупные фрагменты IgG имеют ограниченную способность к проникновению в периферические ткани и взаимодействию с эпитопами. В большинстве случаев лечение ботулизма является симптоматическим, при котором искусственная вентиляция лёгких является способом сохранения жизни (Nantel, A.J. Clostridium botulinum - international programme on chemical safety.Centre de Toxicologie du Québec, August, 1999. World Health Organization: Bacteria; 1999. Available online: https://www.who.int/csr/delibepidemics/clostridiumbotulism.pdf [Accessed February 8, 2019]; Patel, K.; Cai, S.; Singh, B. Current strategies for designing antidotes against botulinum neurotoxins. Expert Opin. Drug. Discov. 2014, 9(3), 319-333. http://dx.doi.org/10.1517/17460441.2014.884066. PMID: 24520991).
В связи с этим, актуальной задачей является получение терапевтических антител, способных специфически связать и нейтрализовать ботулинический токсин с минимальными побочными эффектами. Однодоменные антитела, представляющие собой вариабельный фрагмент тяжело цепочечных антител, обнаруженных у семейства Верблюдовых, сохраняют полную антиген-специфичность, и, наряду с малым размером молекул, способны связывать антигенные эпитопы, труднодоступные для классических иммуноглобулинов (Yu R.; Wang S.; Yu Y.Z.; Du W.S.; Yang F.; Yu W.Y.; Sun Z.W. Neutralizing antibodies of botulinum neurotoxin serotype A screened from a fully synthetic human antibody phage display library. J. Biomol. Screen. 2009, 14(8), 991-998. http://dx.doi.org/10.1177/1087057109343206. PMID: 19726786; Rasetti-Escargueil, C.; Avril, A.; Miethe, S.; Mazuet, C.; Derman, Y.; Selby, K.; Thullier, P.; Pelat, T.; Urbain, R.; Fontayne, A.; et al. The European AntibotABE Framework Program and its update: development of innovative botulinum antibodies. Toxins 2017, 9(10). http://dx.doi.org/10.3390/toxins9100309. PMID: 28974033; Harmsen, M.; De Haard, H. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, 77(1), 13-22. http://dx.doi.org/10.1007/s00253-007-1142-2. PMID:17704915). Область CDR3 этих антител обладает способностью образовывать вытянутые структуры, позволяющие проникать в труднодоступные области антигена. За счет малого размера (15 кДа), однодоменные антитела могут эффективно проникать через периферические ткани. Кроме того, антитела имеют низкую иммуногенность и высокую стабильность в различных условиях среды. Однако однодоменные антитела лишены некоторых эффекторных функций Fc-фрагмента и обладают низкой фармакокинетикой. Слияние однодоменного антитела с Fc-фрагментом классического иммуноглобулина нивелирует эти недостатки и, таким образом, сочетает в себе преимущества однодоменных и канонических антител.
В настоящее время не существует разрешенных к применению для терапии ботулизма лекарственных препаратов на основе моноклональных или однодоменных антител. Известно решение CN 103509086 B, в котором была получена панель мышиных моноклональных антител к различным типам ботулинического нейротоксина. Была изучена аффинность полученных моноклональных антител, а также их протективная активность против ботулинического нейротоксина.
Известно также решение US 10618972 B2, в котором была получена панель антител к различным типам ботулинического нейротоксина.
Из патента RU 2571208 C1 известен штамм гибридных клеток животных Mus musculus 1G7 - продуцент моноклональных антител, специфичных к ботулиническому токсину типа В.
В патенте US 8540987 B2 описано получение панели человеческих моноклональных антител специфичных к ботулотоксину типа А. Была изучена аффинность полученных антител, проведено эпитопное картирование. Была изучена протективная активность антител и их комбинаций против летальной дозы ботулотоксина типа А при их предварительном смешивании и инкубации и последующим введении мышам.
Известна работа по получению однодоменных антител к ботулиническому токсину типа Е (PMID: 24673401, DOI:10.1002/bab.1226). В данном исследовании показана возможность получение однодоменных антител, способных обеспечивать частичную протекцию мышей от летальной дозы 4ЛД50 ботулотоксина типа Е. Данное решение, как наиболее близкое к заявляемому, было выбрано авторами патента за прототип. Однако, недостатком прототипа является относительно низкий уровень протективной активности (25% выживаемости, введении 4ЛД50 ботулотоксина). Кроме того, недостатком прототипа является отсутствие Fc-фрагмента, что обуславливает низкую фармакокинетику препарата, а также отсутствие Fc-зависимых эффекторных функций.
Таким образом, в уровне техники существует потребность в создании нового антитела, специфически связывающегося ботулиническим нейротоксином типа А, для терапии и экстренной профилактики интоксикации, вызываемой ботулиническим нейротоксином типа А.
Раскрытие сущности изобретения
Технической задачей заявленной группы изобретений является расширение арсенала антител для терапии и экстренной профилактики интоксикации, вызываемой ботулиническим нейротоксином типа А.
Технический результат заключается в создании однодоменного антитела и его модификаций, которые эффективно связывают и нейтрализуют ботулинический нейротоксин типа А, и могут быть использованы для терапии и экстренной профилактики интоксикации, вызываемого ботулиническим нейротоксином типа А. Кроме того, технический результат заключается в том, что разработано антитело, которое обладает улучшенной фармакокинетикой, по сравнению с однодоменными антителами.
Указанный технический результат достигается тем, что создано однодоменное антитело, специфически связывающееся с ботулиническим нейротоксином типа А, обладающее защитной активностью против летальной дозы ботулинического нейротоксина типа А и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2.
Также технический результат достигается тем, что создано олигомеризованное однодоменное антитело, специфически связывающееся с ботулиническим нейротоксином типа А, обладающее защитной активностью против летальной дозы ботулинического нейротоксина типа А, содержащее в качестве мономерного блока любой вариант созданного однодоменного антитела.
Кроме того, создано фьюжн антитело, представляющее собой однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, специфически связывающееся с ботулиническим нейротоксином типа А, обладающее защитной активностью против летальной дозы ботулинического нейротоксина типа А, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6.
Кроме того, создана клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность любого из созданных антител и экспрессирующая данное антитело.
Также разработана нуклеиновая кислота, имеющая нуклеотидную последовательность, кодирующую любое из созданных антител.
А также разработан способ терапии и экстренной профилактики интоксикации, вызванной ботулиническим нейротоксином типа А, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого созданного антитела.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 представлены данные по определению титра специфических антител к ботулотоксину типа А в сыворотке крови альпака после иммунизации.
Ось ординат - оптическая плотность раствора при длине волны 450 нм
Ось абсцисс - разведения сыворотки крови альпака
- Уровень сигнала сыворотки альпака на BSA (отрицательный контроль)
- Уровень специфического сигнала сыворотки альпака на ботулотоксин типа А
На фиг. 2 представлена электрофореграмма анализа результатов очистки однодоменных антител аффинной хроматографией.
1 - препарат однодоменных антител клон 1;
2 - препарат однодоменных антител клон 2;
3 - препарат однодоменных антител клон 3 (В3);
4 - препарат однодоменных антител клон 11;
5 - препарат однодоменных антител клон 12;
6 - препарат однодоменных антител клон 13;
7 - препарат однодоменных антител клон 8;
8 - препарат однодоменных антител клон 9.
9 - препарат однодоменных антител клон 10;
10 - препарат однодоменных антител клон 6;
11 - препарат однодоменных антител клон 7 (B7);
12 - препарат однодоменных антител клон 5;
13 - препарат однодоменных антител клон 4.
На фиг. 3 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности однодоменных антител,
где
1 - N-конец;
2 - последовательность однодоменного антитела;
3 - His-tag (гистидиновая метка);
4 - C-конец.
На фиг. 4 представлены результаты измерения специфической активности клонов однодоменных антител методом непрямого ИФА.
Ось ординат - оптическая плотность раствора при длине волны 450 нм
Ось абсцисс - клоны однодоменных антител
- Уровень сигнала однодоменных антител на BSA (отрицательный контроль)
- Уровень специфического сигнала однодоменных антител на ботулотоксин типа А
Клон 1 - препарат однодоменного антитела клон 1;
Клон 2 - препарат однодоменного антитела клон 2;
Клон 3 - препарат однодоменного антитела клон 3 (В3);
Клон 4 - препарат однодоменного антитела клон 4;
Клон 5 - препарат однодоменного антитела клон 5;
Клон 6 - препарат однодоменного антитела клон 6;
Клон 7 - препарат однодоменного антитела клон 7 (В7);
Клон 8 - препарат однодоменного антитела клон 8;
Клон 9 - препарат однодоменного антитела клон 9;
Клон 10 - препарат однодоменного антитела клон 10;
Клон 11 - препарат однодоменного антитела клон 11;
Клон 12 - препарат однодоменного антитела клон 12;
Клон 13 - препарат однодоменного антитела клон 13;
На фиг. 5 представлены результаты изучение протективной активности очищенных препаратов однодоменных антител при их внутримышечном введении мышам в дозе 50 мг/кг и параллельном внутрибрюшинном введении мышам 5 или 10 ЛД50 ботулотоксина типа А.
Ось ординат - выживаемость животных, %
Ось абсцисс - группы животных
- животные, получившие 10 ЛД50 ботулотоксина типа А
- животные, получившие 5 ЛД50 ботулотоксина типа А
Клон 1 - животные, получившие препарат однодоменного антитела клон 1;
Клон 2 - животные, получившие препарат однодоменного антитела 2;
Клон 3 - животные, получившие препарат однодоменного антитела клон 3 (В3);
Клон 4 - животные, получившие препарат однодоменного антитела клон 4;
Клон 5 - животные, получившие препарат однодоменного антитела клон 5;
Клон 6 - животные, получившие препарат однодоменного антитела клон 6;
Клон 7 - животные, получившие препарат однодоменного антитела клон 7 (В7);
К- - отрицательный контроль.
На фиг. 6 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности олигомеризованных однодоменных антител.
1 - N-конец;
2 - последовательность однодоменного антитела;
3 - глицин-сериновый линкер;
4 - последовательность однодоменного антитела;
5 - His-tag (гистидиновая метка);
6 - C-конец.
На фиг. 7 представлены результаты изучение протективной активности очищенных препаратов димеризованных однодоменных антител при их внутримышечном введении мышам в дозе 50 мг/кг и параллельном внутрибрюшинном введении мышам 10 ЛД50 ботулотоксина типа А.
Ось ординат - выживаемость животных, %
Ось абсцисс - группы животных
- животные, получившие 10 ЛД50 ботулотоксина типа А
B3-dimer (клон 3) - животные, получившие препарат B3-dimer;
B7-dimer (клон 7) - животные, получившие препарат B7-dimer.
На фиг. 8 представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности однодоменных антител, модифицированных Fc-фрагментом IgG1 человека,
где
1 - последовательность однодоменного антитела;
2 - шарнирный регион;
3 - Fc-фрагмент IgG1 человека.
На фиг. 9 представлены результаты изучение протективной активности очищенных препаратов однодоменных антител, модифицированных Fc-фрагментом IgG1 человека, при их внутримышечном введении мышам в дозе 50 мг/кг и параллельном внутрибрюшинном введении мышам 10 ЛД50 ботулотоксина типа А.
Ось ординат - выживаемость животных, %
Ось абсцисс - группы животных
- животные, получившие 10 ЛД50 ботулотоксина типа А
B3-Fc (клон 3) - животные, получившие препарат B3-Fc;
B7-Fc (клон 7) - животные, получившие препарат B7-Fc.
На фиг. 10. Представлены результаты изучения фармакокинетических свойств полученных антител и их модификаций, при внутривенном введении мышам в дозе 100 мкг на животное однократно.
Ось ординат - концентрация препаратов однодоменных антител и их модификаций в сыворотки крови мышей, %
Ось абсцисс - временные точки забора образцов сыворотки, ч.
- животные, получившие препарат однодоменного антитела клон В3;
- животные, получившие препарат однодоменного антитела клон В7;
- животные, получившие препарат димеризованного однодоменного антитела В3-dimer;
- животные, получившие препарат димеризованного однодоменного антитела В7-dimer;
- животные, получившие препарат однодоменного антитела, слитого с Fc-фрагментом IgG1 человека, В3-Fc;
- животные, получившие препарат однодоменного антитела, слитого с Fc-фрагментом IgG1 человека, В7-Fc;
На фиг. 11 представлены результаты изучение протективной активности полученных препаратов при экстренной профилактики интоксикации ботулиническим токсином типа А, при внутримышечном введении препаратов мышам в различных дозировках и параллельном внутрибрюшинном введении 10ЛД50 ботулинического нейротоксина типа А.
Ось ординат - выживаемость животных, %
Ось абсцисс - группы животных с различными дозировками препаратов
- животные, получившие препарат однодоменного антитела клон В3;
- животные, получившие препарат однодоменного антитела клон В7;
- животные, получившие препарат димеризованного однодоменного антитела В3-dimer;
- животные, получившие препарат димеризованного однодоменного антитела В7-dimer;
- животные, получившие препарат однодоменного антитела, слитого с Fc-фрагментом IgG1 человека, В3-Fc;
- животные, получившие препарат однодоменного антитела, слитого с Fc-фрагментом IgG1 человека, В7-Fc.
На фиг. 12 представлены данные по изучение протективной активности полученных препаратов при терапии интоксикации ботулиническим токсином, при внутрибрюшинном введение мышам 10ЛД50 ботулинического нейротоксина типа А и последующем введении препаратов однодоменных антител, слитых с Fc-фрагментом IgG1 человека через различные временные интервалы.
1 час - введение препарата через час после введения 10ЛД50 ботулотоксина
3 часа - введение препарата через 3 часа после введения 10ЛД50 ботулотоксина
B3-Fc - животные, получившие препарат однодоменного антитела, слитого с Fc-фрагментом IgG1 человека, В3-Fc;
B7-Fc - животные, получившие препарат однодоменного антитела, слитого с Fc-фрагментом IgG1 человека, В7-Fc.
Осуществление изобретения
Вариантом данного изобретения является однодоменное антитело, специфически связывающееся с ботулиническим нейротоксином типа А, обладающее защитной активностью против летальной дозы ботулинического нейротоксина типа А и имеющее аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2.
Для получения данного антитела осуществляли иммунизацию альпаки антитоксином, состоящим из ботулинического токсина, обработанного формальдегидом. Эффективность иммунизации подтверждали оценкой титра специфических к ботулиническому нейротоксину типа А антител в сыворотке крови животного. Далее у животных выделяли мононуклеарные клетки периферической крови, из которых получали РНК. На основе РНК синтезировали кДНК. На матрице, полученной кДНК ставили гнездовую ПЦР, позволяющую амплифицировать последовательности однодоменных антител. Таким образом была получена библиотека ампликонов последовательностей однодоменных антител.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование не только мононуклеарных клеток, а также цельной крови, лимфатических узлов, селезенки, тимуса или других клеток и органов иммунизированного животного, экспрессирующих однодоменные антитела. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование синтетических библиотек последовательностей однодоменных антител.
Селекцию антител проводили методом фагового дисплея с использованием паннинга на антигене (ботунилический нейротоксин типа А обработанный и необработанный дитиотреитолом). Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование других подходов селекции, таких как паннинг в растворе биотинилированного антигена, паннинг с использованием конкурентного связывания и элюции. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование других методов селекции, таких как рибосомный дисплей, дрожжевой дисплей. В результате селекции были отобраны однодоменные антитела, специфически связывающиеся с ботулиническим нейротоксином типа А (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2). В последующих экспериментах было показано, что данные антитела обладают защитной активностью против летальной дозы ботулинического нейротоксина типа А.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности однодоменных антител, специфических к ботулиническому нейротоксину типа А, могут содержать в себе аминокислотные замены, которые не сказываются на вторичной и третичной структуре однодоменных антител и не влияют на их способность связывать и нейтрализовать ботулинический нейротоксин типа А. Более того, поскольку в связывании с антигеном участвуют только антигенсвязывающие петли (CDR домены) однодоменных антител, то, как известно специалистам в данной области, любой иммуноглобулин или его аналог, содержащий такие же аминокислотные последовательности CDR доменов, попадает под объем настоящего изобретения. Более того, последовательности CDR доменов могут содержать замены/делеции/вставки аминокислот, которые при парном выравнивании аминокислотных последовательностей обеспечивают гомологичность не менее 70% и не оказывают качественного влияния на способность связываться с антигеном. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все иммуноглобулины или их аналоги, содержащие последовательности CDR доменов, гомология которых составляет не менее 70% с предлагаемыми последовательностями.
Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности однодоменных антител, специфических к ботулиническому нейротоксину типа А, могут быть модифицированы путем присоединения различных белков, белковых доменов и тэгов, таких, например, как НА-тэг, Flag-тэг, GST-тэг, GFP белок, RFP белок, биотин и другие.
Нуклеотидную последовательность однодоменных антител определяли методом секвенирования. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие однодоменные антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности однодоменных антител SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2. Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8.
С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность однодоменного антитела и экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2. Таким образом, например, были получены: клетка-продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:1; клетка-продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая однодоменное антитело SEQ ID NO:2. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие про- и эукариотические системы экспрессии, такие как лактобактерии, бациллы, растения, дрожжи, культуры клеток и другие. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.
Другим вариантом данного изобретения является олигомеризованное однодоменное антитело специфически связывающееся с ботулиническим нейротоксином типа А, обладающее защитной активностью против летальной дозы ботулинического нейротоксина типа А, содержащее в качестве мономерного блока любой вариант однодоменного антитела, выбранный из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2. Частными случаями данного варианта изобретения являются: димеризованное однодоменное антитело, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером SEQ ID NO 3, димеризованное однодоменное антитело, в котором мономеры соединены глицин-сериновым линкером SEQ ID NO 4. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, олигомеризацию однодоменных антител можно осуществлять при помощи других линкеров. Олигомеризованное однодоменное антитело было получено путем экспрессии соответствующей нуклеотидной последовательности в клетках-продуцентах. В последующих экспериментах было показано, что данные антитела обладают выраженной протективной активностью.
Нуклеотидная последовательность олигомеризованного однодоменного антитела была получена генно-инженерным методом. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие однодоменные антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности олигомеризованных однодоменных антител, в которых мономерами являются однодоменные антитела (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2). Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10.
С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность олигомеризованного однодоменного антитела, в котором мономерами являются однодоменные антитела (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2) и экспрессирующая олигомеризованное однодоменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела (SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2). Таким образом, например, были получены: клетка-продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая олигомеризованное однодоменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела SEQ ID NO:1; клетка-продуцент на основе Escherichia coli (E.coli), экспрессирующая олигомеризованное однодоменное антитело, в котором мономерами являются однодоменные антитела SEQ ID NO:2. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие про- и эукариотические системы экспрессии, такие как лактобактерии, бациллы, растения, дрожжи, культуры клеток и другие. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.
Кроме того, вариантом изобретения является фьюжн антитело, представляющее собой однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, специфически связывающееся с ботулиническим нейротоксином типа А и обладающее защитной активностью против летальной дозы ботулинического нейротоксина типа А, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6. Данное антитело было получено путем экспрессии нуклеотидной последовательности фьюжн антитела в клетках-продуцентах.
Нуклеотидные последовательности фьюжн антител были созданы генно-инженерным путем на основе нуклеотидной последовательности однодоменных антител и нуклеотидной последовательности Fc-фрагмента иммуноглобулина G1 человека. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидные последовательности, кодирующие фьюжн антитела, могут отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, под объем настоящего изобретения попадают все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотные последовательности фьюжн антител (SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6). Например, нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12.
С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, содержащая нуклеотидную последовательность фьюжн антитела и экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6. Таким образом, например, были получены: клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:5; клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая фьюжн антитело SEQ ID NO:6. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие эукариотические системы экспрессии. При необходимости способ получения дополнительно включает в себя выделение и очистку любым способом, известным в данной области.
Изучена фармакокинетика однодоменных антител и их модификаций. Продемонстрировано что модификация однодоменных антител и их олигомеров Fc-фрагментом IgG1 человека, позволяет увеличить время их циркуляции в организме с нескольких часов до нескольких недель.
Таким образом, авторами патента были получены варианты антител, специфически связывающееся с ботулиническим нейротоксином типа А и обладающее защитной активностью против летальной дозы ботулинического нейротоксина типа А и обладающие улучшенной фармакокинетикой по сравнению с однодоменными антителами.
Кроме того, авторами патента разработан способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых ботулиническим нейротоксином типа А, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого из разработанных вариантов антител.
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.
Пример 1. Получение анатоксина для иммунизации альпака.
На первом этапе работы был получен иммуноген - анатоксин, состоящий из ботулинического нейротоксина типа А. Для этого, бактерию C. botulinum типа А штамм 501 засевали в пробирки со средой Китт-Тароцци с сырым мясом, под вазелиновым маслом. Культивировали 24-48 ч при 35°С. Рост культуры определяли по помутнению среды и газообразованию. Для приготовления маточной культуры готовили среду, содержащую триптон, дрожжевой экстракт, тиогликолят натрия, натрий хлористый, глюкозу. Во флаконы с 50 мл среды засевали по 1 мл 1-2-х суточной. Культивировали 1-2 суток в тех же условиях. Затем маточную культуру пересевали в две бутыли по 2.5 л среды того же состава. Культивировали 6 суток при 35°С, затем отбирали 2 мл для контроля токсичности. Культуру в бутылях охлаждали. Культуральную жидкость центрифугировали при 5 тыс. об./мин, 30 мин, 50С. Осадок клеток собирали и обезвреживали перекисью водорода в концентрации 6%, затем автоклавировали. Токсин концентрировали кислотным осаждением, добавляя постепенно 3N H2SO4 до рН 3.8. Осадок формировался в течение 18-24 ч при 4°С. Осадок отделяли центрифугированием при 5 тыс. об./мин 30 мин. Выход токсина с 5 л культуральной жидкости составлял 50-60 г сырого веса (паста). Супернатант после центрифугирования обезвреживали автоклавированием. Токсин экстрагировали из осадка растворением в 0.2М натрий-фосфатном буфере рН 6.2 и переосаждали 50% от насыщения сульфатом аммония. Осадок, сформированный в течение 18-24 ч при 4°С, центрифугировали 10 тыс. об/мин 30 мин. Гель-фильтрация на ультрогеле АсА 54. Колонку 2.5х100 см заполняли ультрогелем и уравновешивали 0.067М цитрат-фосфатным буфером рН 5.6. Осадок токсина растворяли в 60-80 мл 0.2М натрий-фосфатного буфера рН 6.2, центрифугировали. Супернатант вносили в колонку, осадок автоклавировали. Токсин элюировали цитрат-фосфатным буфером в первом пике. Фракции первого пика, не содержащие примеси аммония сернокислого объединяли; объем токсина - 80-100мл.
Хроматография на ДЭАЭ-Серваселл 32. Серваселл вносили в колонку 2.5х50 см и уравновешивали цитрат-фосфатным буфером. Токсин, полученный на предыдущем этапе, хроматографировали в том же буфере. Токсический белок свободно элюировался, не сорбируясь на ионообменнике. Объединяли фракции первого белкового пика с оптическим поглощением А280/260=1.8-2.0. Всего получали 120-150 мл токсина, который являлся токсическим комплексом и обозначался как ВТА. Токсин концентрировали добавлением насыщенного раствора сульфата аммония до конечной концентрации 60% от насыщения.
Гель-фильтрация на ультрогеле АсА 34. Ультрогелем АсА34 заполняли колонку 2.5х120 см и промывали 0.045 М борат-фосфатным буфером рН 7.9. Осадок токсина центрифугировали при 10 тыс. об./мин, 30 мин, 5°С и растворяли в 0.1М натрий-фосфатном буфере рН 6.6. Для одной колонки готовили порцию белка в количестве 100-120 единиц А280 в объеме не более 15 мл. Во фракциях первого белкового пика элюировался гемагглютинин, во втором - токсин. Гемагглютинин хранили при 4°С и использовали при дальнейшей очистке токсина. Объем полученного токсина - 60-70 мл, концентрация белка - 0.6-0.8 А278.
Ионообменная хроматография. Колонку 1.5х15 см заполняли подготовленным ДЭАЭ-сефадексом А50 и промывали 0.045М борат- фосфатным буфером рН 7.9. Токсин предыдущего этапа вносили в колонку. В этих условиях токсин сорбировался на ионообменнике. Токсин элюировался борат-фосфатным буфером с линейным градиентом NaCl 0-0.5 М, когда концентрация хлористого натрия достигала 0.04М. На данном этапе получали 10-15 мг высокоочищенного ботулинического токсина, в котором электрофоретическим анализом обнаруживались следовые примеси гемагглютинина.
Контроль конечного продукта. Концентрацию белка определяли по оптическому поглощению А280 с использованием пересчетного коэффициента 1.63 для 1 мг нейротоксина. Концентрация белка составляла 0.4-0.6 мг/мл. Электрофоретическим анализом выявлялась одна полоса на 150 кДа, а при добавлении меркаптоэтанола, восстанавливающего S-S связи, выявлялись две белковые полосы, соответствующие по молекулярной массе 100 и 50 кДа двум субъединицам нейротоксина. В реакции двойной диффузии в агарозном геле образовывалась одна полоса преципитации с коммерческой антитоксической сывороткой.
Далее токсин обрабатывали 0,1% раствором формальдегида в течение 7 дней при температуре 40°C. Наличие остаточной токсичности определяли на мышах линии BALB/c весом 18 гр., вводя внутрибрюшинно 0,5 мл токсина. Перед введением антиген стерилизовали мембранным фильтром 0,22 мкм (MF-Millipore).
Таким образом, в результате проведенной работы был получен очищенный препарат ботулинического анатоксина типа А.
Пример 2. Получение иммунной библиотеки кДНК однодоменных антител альпака.
На следующем этапе работы альпака (Lama pacos - представитель семейства Cameliedae) иммунизировали полученным ботулиническим анатоксином типа А 5 раз с промежутками в 10-14 дней: при первой иммунизации вводили 60 мкг антигена и полный адъювант Фрейнда в соотношении 1:1. при последующих - 90 мкг антигена и неполный адъювант Фрейнда в соотношении 1:1.  На 5 день после последней иммунизации определяли титр антител в сыворотке крови альпака, который составил <1/218700 (фигура 1).
Через 5 дней после последней иммунизации у альпака отбирали 50,0 мл периферической крови и выделяли мононуклеарные клетки на градиенте фиколла 1,077 (Панэко, Россия). Изолированные мононуклеарные клетки использовали для выделения тотальной РНК реагентом Trizol (Invitrogene, США) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенную РНК использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК с использованием набора SuperScript IV First-Strand Synthesis System по протоколу фирмы-производителя с использованием входящих в набор Oligo-d(T)20 праймеров и специфического праймера CH2Forta4. На матрице, полученной кДНК, ставили гнездовую ПЦР, позволяющую амплифицировать последовательности однодоменных антител. Для этой процедуры использовали высокоточную полимеразу Q5 (NEB, Великобритания) и специфические праймеры, содержащие на концах сайты рестрикции.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены ампликоны, которые являются иммунной библиотекой кДНК однодоменных антител альпака.
Пример 3. Получение библиотеки рекомбинантных бактерифагов.
Ампликоны, полученные в примере 2 гидролизовали рестриктазами и клонировали в фагмидный вектор, гидролизованный по тем же сайтам. Затем трансформировали клетки E.coli (штамм TG1) фагмидными векторами, полученными в результате клонирования.
12
Суспензию бактериальных клонов-трансформантов клеток E.coli (штамм TG1) использовали для продукции рекомбинантных бактериофагов с использованием бактериофага-помощника KM13 (NEB, Великобритания) согласно протоколу фирмы-производителя. Рекомбинантные бактериофаги осаждали путем преципитации полиэтиленгликолем (PEG/NaCl). Таким образом, получена библиотека рекомбинантных бактерифагов с титром 10 трансдуцирующих единиц на мл суспензии.
Пример 4. Селекция и определение последовательности специфических однодоменных антител.
11
Селекцию специфических рекомбинантных бактериофагов осуществляли путем паннинга на антигене исходной библиотеки бактериофагов. Для этого ботулинический нейротоксин типа А обработанный и не обработанный дитиотреитолом (пример 1) иммобилизовали в лунке иммунологического планшета в 50,0 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере в течение ночи. Не связавшийся белок удаляли, а лунку блокировали 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем добавляли суспензию 10 рекомбинантных бактерифагов и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Не связавшиеся бактерифаги отмывали коллоидным 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. Связавшиеся бактериофаги элюировали при помощи раствора трипсина (0,1 мг/мл). Элюированные бактериофаги использовали для трансдукции клеток E.coli TG1, которые затем высевали на агаризованные чашки в разведении, позволяющем изолировать индивидуальные колонии. Полученные колонии использовали для наращивания бактериальной массы и выделения плазмидной ДНК. Плазмиды секвенировали для определения нуклеотидных последовательностей, кодирующих однодоменные антитела. Было определено 13 индивидуальных последовательностей.
Пример 5. Продукция и очистка однодоменных антител.
Для продукции однодоменных антител к интенсивно делящимся клеткам E.coli TG1, полученных из колоний на предыдущем этапе, добавляли 1,0 мкМ изопропил тиогалактопиранозид (IPTG) (Хеликон, Россия), спустя 4 часа бактериальную массу использовали для выделения рекомбинантных белков на колонке HisTrap FF 5 мл («GE Healthcare Life Sciences», США) с использованием хроматографической системы AKTA start («GE Healthcare Life Sciences», США), согласно протоколу фирмы-производителя. Результаты хроматографической очистки однодоменных антител представлены на фигуре 2. Данный пример демонстрирует простоту и эффективность продукции и очистки однодоменных антител в бактериальной системе экспрессии. Таким образом были получены очищенные препараты однодоменных антител. Одинаковые результаты были получены для всех 13 однодоменных антител. Схематичное изображение аминокислотных последовательностей однодоменных антител представлено на фигуре 3.
Пример 6. Определение специфической активности очищенных клонов однодоменных антител в непрямом ИФА.
Для определения специфической активности 13 очищенных клонов однодоменных антител применяли метод непрямого ИФА. Для этого ботулинический нейротоксин типа А иммобилизовали в лунке иммунологического планшета в 50,0 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере в течение ночи. Не связавшийся белок удаляли, а лунку блокировали 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем лунки промывали 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере и добавляли раствор 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере, содержащим очищенные препараты отобранных антител 1 мкг/мл. Каждый препарат антител вносили в 3-х повторах, инкубировали 1 час при 37°С при слабом перемешивании. Затем проводили 3-х кратную отмывку 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. После отмывки вносили раствор конъюгата, меченного перексидазой и инкубировали 1 час при 37°С при слабом перемешивании. Далее проводили 5-х кратную отмывку 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. Далее вносили раствор субстрата ТМБ и инкубировали 10 мин при комнатной температуре без перемешивания, после чего реакцию останавливали добавлением раствора серной кислоты и проводили измерение на спектрофотометре. В результате было продемонстрировано, что 9 клонов из 13 обладают наиболее выраженной специфической активностью в непрямом ИФА (фигура 4). Таким образом, 9 наиболее специфичных в ИФА клонов были отобраны в дальнейшее исследование.
Пример 7. Определение констант равновесных диссоциаций очищенных клонов однодоменных антител.
Для определения констант равновесных диссоциаций однодоменных антител с антигеном был использован анализ взаимодействия антиген-антитело методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе Biacore 3000 (General Electric, Швеция). Для этого BoNT/A и BoNT/A DTT были ковалентно иммобилизованы на поверхности чипа СМ5 согласно стандартному протоколу прибора. Затем методом была построена кривая образования комплексов однодоменных с антигеном и полученные результаты были использованы для расчета констант реакции в программе Biaevaluation (General Electric, Швеция). Полученные результаты представлены в таблицах 1 и 2.
Таблица 1. Константы равновесной диссоциации (KD), константы скорости диссоциации (ka) и диссоциации (kd), KA, Rmax и Chi2 связывания однодоменных антител с BoNT/A.
Номер клона
KD (M)
ka (1/Ms)
kd (1/s)
KA (1/M)
Rmax (RU)
Chi2
В1
1.95 × 10-8
2.27 × 105
4.42 × 10-3
5.14 × 107
33
3.7
В2
8.24 × 10-7
2.05 × 103
1.69 × 10-3
1.21 × 106
9.61
0.78
В3
7.4 × 10-8
6.88 × 104
5.09 × 10-3
1.35 × 107
15.5
1.45
В4
2.72 × 10-5
19.6
5.32 × 10-4
3.68 × 104
310
0.349
В5
4.03 × 10-8
3.9 × 105
0.0157
2.48 × 107
20.9
1.47
В6
3.66 × 10-6
303
1.1 × 10-3
2.73 × 105
6.54
0.122
В7
1.55 × 10-7
1.36 × 105
0.021
6.46 × 106
19
1.46
В8
7.35 × 10-7
7.79 × 103
5.72 × 10-3
1.36 × 106
18.6
2.84
В9
2.61 × 10-7
3.92 × 103
1.02 × 10-3
3.83 × 106
8.24
0.13
Таблица 2. Константы равновесной диссоциации (KD), константы скорости диссоциации (ka) и диссоциации (kd), KA, Rmax и Chi2 связывания однодоменных антител с BoNT/A DTT.
Номер клона
KD (M)
ka (1/Ms)
kd (1/s)
KA (1/M)
Rmax (RU)
Chi2
В1
9.22 × 10-8
1.77 × 105
0.0163
1.08 × 107
17.1
0.138
В2
7.9 × 10-9
1.03 × 103
7.94 × 10-6
1.27 × 108
2.11
0.314
В3
3.58 × 10-8
1.35 × 105
4.7 × 10-3
2.79 × 107
12.3
0.668
В4
6.08 × 10-7
916
5.57 × 10-4
1.64 × 106
48.7
4.69
В5
8.91 × 10-8
1.27 × 105
0.0114
1.12 × 107
14.7
0.577
В6
3.02 × 10-7
1.59 × 103
4.79 × 10-4
3.32 × 106
2.64
0.166
В7
4.46 × 10-7
1.08 × 104
4.8 × 10-3
2.24 × 106
11.6
2.19
В8
7.68 × 10-8
6.08 × 104
4.64 × 10-3
1.3 × 107
12.4
0.908
В9
8.14 × 10-11
4.22 × 103
3.43 × 10-7
1.23 × 1010
1.01
0.378
Исходя из данных констант равновесных диссоциаций из дальнейшего исследования были исключены клоны 4 и 6, как наименее аффинные.
Таким образом, в результате проведенной работы было создано 7 клонов однодоменных антител, специфически связывающихся с ботулиническим нейротоксином типа А
Пример 8. Изучение протективной активности полученных клонов.
Изучение протективной активности полученных клонов однодоменных антител проводили на летальной модели интоксикации мышей линии BALB/c ботулиническим нейротоксином типа А. В эксперименте использовали два варианта летальной дозы ботулотоксина - 5 и 10ЛД50 соответственно. Для этого мышам весом 18-20 гр. вводили внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера. Параллельно, животным внутримышечно во внутреннюю поверхность бедра вводили 50 мг/кг (1 мг на мышь) отобранные клоны однодоменных антител в 50 мкл фосфатно-солевого буфера. Таким образом, в эксперименте участвовало 16 групп животных (по 3 мыши в группе), 7 групп опытных животных на дозу 5ЛД50 (по одной группе на каждое антитело) и 7 групп опытных животных на дозу 10ЛД50 (по одной группе на каждое антитело) и 2 группы как отрицательный контроль на каждую из доз токсина. Наблюдение за животными проводили в течении 5 дней. Результаты эксперимента продемонстрированы на фигуре 5. Как видно из представленных данных, наиболее выраженной протективной активностью против летальной дозы ботулотоксина типа А обладают два клона: В3 (SEQ ID NO:1) и В7 (SEQ ID NO:2). Данные антитела были выбраны для дальнейших экспериментов.
Таким образом, в результате проведенной работы были созданы два варианта однодоменного антитела (SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2), специфически связывающегося с ботулиническим нейротоксином типа А, обладающего защитной активностью против летальной дозы ботулинического нейротоксина типа А
Пример 9. Получение, продукция и очистка олигомеризованных однодоменных антител
Данный пример иллюстрирует получение олигомеризованных однодоменных антител, в частности димеризованных однодоменных антител В3-dimer (SEQ ID NO:3) и В7-dimer (SEQ ID NO:4). На первом этапе разработали дизайн нуклеотидной последовательности димеризованных антител, которые представляют собой две аминокислотные последовательности однодоменного антитела ((SEQ ID NO:1 или (SEQ ID NO:2 или (SEQ ID NO:3), соединенные через глицин-сериновый линкер (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS). Нуклеотидные последовательности димеризованных антител были синтезированы компанией ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в экспрессионный вектор pET30a, получая таким образом плазмидные векторы pET30a-В3-dimer и pET30a-В7-dimer. Полученными экспрессионными векторами были трансформированы клетки E.coli штамма BL21, экспрессия была индуцирована путем добавления 1,0 мкМ IPTG (Хеликон, Россия). Спустя 4 часа из бактериальной массы выделяли димеризованные однодоменные антитела на колонке HisTrap FF 5 мл («GE Healthcare Life Sciences», США) с использованием хроматографической системы AKTA start («GE Healthcare Life Sciences», США), согласно протоколу фирмы-производителя. Полученные препараты димеризованных однодоменных антител В3-dimer (SEQ ID NO:3) и В7-dimer (SEQ ID NO:4). Схематичное изображение аминокислотных последовательностей олигомеризованных однодоменных антител представлено на фигуре 6.
Таким образом, в результате проведенной работы были получены олигомеризованные однодоменные антитела, мономерами которых являются разработанные однодоменные антитела (SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2).
Пример 10. Определение протективной активности димеризованных однодоменных антител.
Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанных димеризованных однодоменных антител защищать против летальной дозы ботулинического нейротоксина типа А.
Изучение протективной активности полученных димеризованных однодоменных антител проводили на летальной модели интоксикации мышей линии BALB/c 10ЛД50 ботулинического нейротоксина типа А. В эксперименте использовали 9 мышей 18-20 гр. Животные были разделены на 3 группы, которым вводили:
1) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 50 мг/кг антитела B3-dimer в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
2) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 50 мг/кг антитела B7-dimer в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
3) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 50 мкл фосфатно-солевого буфера (группа отрицательного контроля).
В течение 5 дней фиксировали выживаемость животных. Полученные результаты представлены на фигуре 7. Как видно из представленных данных, контрольной группе погибли все животные, тогда как в группе, получавшей димеризованные однодоменные антитела B3-dimer (SEQ ID NO:3) и B7-dimer (SEQ ID NO:4) выжило 67% и 100% животных, соответственно. Полученные результаты демонстрируют, что димеризованные однодоменные антитела обладают выраженной протективной активностью против летальной дозы 10ЛД50 ботулинического нейротоксина типа А.
Таким образом, в результате проведенной работы были созданы варианты олигомеризованного однодоменного антитела, специфически связывающегося с ботулиническим нейротоксином типа А, обладающего защитной активностью против летальной дозы ботулинического нейротоксина типа А.
Пример 11. Получение, продукция и очистка фьюжн антител.
Фьюжн антитело представляет собой однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина человека.
Данная модификация однодоменных антител позволит улучшить их фармакокинетические свойства за счет добавления Fc-фрагмента IgG1 человека и его правильного гликозилирования в эукариотических клетках-продуцентах. Кроме того, модификация Fc-фрагментом позволит антителам активировать систему комплимента и связываться с Fc-рецепторами на поверхности иммунокомпетентных клеток.
На первом этапе работы разработали дизайн аминокислотной последовательности фьюжн антитела (SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6,), которое представляет собой однодоменное антитело (SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2), слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека. На основе аминокислотной последовательности были получены нуклеотидные последовательности фьюжн антител, которые были синтезированы в компании ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в вектор для экспрессии в эукариотических клетках. Далее проводили трансфекцию клеток линии СНО полученными экспрессионными векторами с использованием системы CHO Gro (Mirus Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. После чего культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Антитело очищали аффинной хроматографией на системе AKTA start (Cytiva, Швеция), используя колонки MAbSelect SuRe 1 мл (Cytiva, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva, Швеция), упакованной сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva, Швеция). Чистоту полученных препаратов фьюжн антител B3-Fc и B7-Fc, определяли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в не денатурирующих условиях и денатурирующих условиях. Схематичное изображение аминокислотной последовательности фьюжн антител представлено на фигуре. 8.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено фьюжн антитело, представляющее собой разработанное однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6.
Пример 12. Определение протективной активности фьюжн антител.
Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанных однодоменных антител, слитых с Fc-фрагментом IgG1 (фьюжн антител) защищать против летальной дозы ботулинического нейротоксина типа А.
Изучение протективной активности полученных фьюжн антител проводили на летальной модели интоксикации мышей линии BALB/c 10ЛД50 ботулинического нейротоксина типа А (ботулотоксина). В эксперименте использовали 9 мышей 18-20 гр. Животные были разделены на 3 группы, которым вводили:
1) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 50 мг/кг антитела B3-fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
2) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 50 мг/кг антитела B7-fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
3) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 50 мкл фосфатно-солевого буфера (группа отрицательного контроля).
В течение 5 дней фиксировали выживаемость животных. Полученные результаты представлены на фигуре 9. Как видно из представленных данных, в контрольной группе все животные погибли, тогда как в группах, получавших фьюжн антитела B3-Fc (SEQ ID NO:5) и B7-Fc (SEQ ID NO:6) все животные выжили. Полученные результаты демонстрируют, что фьюжн антитела обладают выраженной протективной активностью против летальной дозы 10ЛД50 ботулинического нейротоксина типа А.
Таким образом, в результате проведенной работы были созданы варианты фьюжн антитела, представляющего собой однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом иммуноглобуллина G1 человека, специфически связывающееся с ботулиническим нейротоксином типа А, обладающее защитной активностью против летальной дозы ботулинического нейротоксина типа А, имеющее конечную аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6.
Пример 13. Изучение фармакокинетических свойств однодоменных антител и их модификаций.
Для оценки фармакокинетических свойств полученных однодоменных антител В3 и В7 и их модификаций самкам мышей линии Balb/c весом 20 гр. вводили внутривенно препараты В3, В7, В3-dimer, В7-dimer, В3-Fc, В7-Fc, в дозе 100 мг/мышь однократно. Для каждого препарата использовали по 6 животных. Далее у мышей отбирали сыворотку крови спустя 0,1,4,24,48,96,168,240,336 часов после введения препарата соответственно. Далее в образцах сыворотки определяли концентрацию вводимого препарата в непрямом ИФА. Для этого на плашки сорбировали очищенный препарат ботулинического нейротоксина А 100 нг на в лунку. Концентрацию препарата в различные временные интервалы рассчитывали исходя из оптической плотности специфического сигнала испытуемых образцов относительно стандартов (образцы препарата в заданных концентрациях). Параметры фармакокинетики вычисляли использую программу PK solver 2.0. Результаты представлены на фигуре 10. В результате время циркуляции препаратов В3, В7, В3-dimer, В7-dimer составила менее 4 часов, тогда как препаратов В3-Fc, В7-Fc не менее 240 часов. Продемонстрировано увеличение циркуляции в организме однодоменных антител при их модификации Fc-фрагментом IgG1 человека с нескольких часов до 10 дней.
Таким образом, были изучены фармакокинетические свойства полученных препаратов однодоменных антител и их модификаций при внутривенном введении и продемонстрировано, что наибольшим временем циркуляции в организме обладают однодоменные антитела, слитые с Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека (SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6).
Пример 14. Способ экстренной профилактики интоксикации, вызванной ботулиническим нейротоксином типа А.
Целью данного эксперимента являлась оценка возможности применения препаратов В3, В7, В3-dimer, В7-dimer, В3-Fc, В7-Fc для экстренной профилактики интоксикации, вызванной ботулотоксином типа А, а также определение минимальных эффективных концентраций.
Для этого мышам весом 20 гр. вводили внутрибрюшинно летальную дозу 10ЛД50 ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера. Одновременно, тем же животным внутримышечно во внутреннюю поверхность бедра вводили препарат исследуемых антител (1000 мкг/мышь, или 100 мкг/мышь, или 50 мкг/мышь, или 20 мкг/мышь, или 10 или 1 мкг/мышь) в 50 мкл фосфатно-солевого буфера, либо 50 мкл фосфатно-солевого буфера Таким образом, в эксперименте участвовало 36 опытных группы животных (6 различных концентраций каждого препарата, по 5 мышей в группе), и одна группа как отрицательный контроль:
1) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 1000 мг/мышь антитела B3 в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
2) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 1000 мг/мышь антитела B7 в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
3) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 1000 мг/мышь антитела B3-dimer в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
1) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 1000 мг/мышь антитела B7-dimer в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
2) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 1000 мг/мышь антитела B3-Fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
3) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 1000 мг/мышь антитела B7-Fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
4) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 100 мг/мышь антитела B3 в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
5) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 100 мг/мышь антитела B7 в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
6) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 100 мг/мышь антитела B3-dimer в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
7) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 100 мг/мышь антитела B7-dimer в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
8) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 100 мг/мышь антитела B3-Fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
9) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 100 мг/мышь антитела B7-Fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
10) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 50 мг/мышь антитела B3 в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
11) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 50 мг/мышь антитела B7 в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
12) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 50 мг/мышь антитела B3-dimer в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
13) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 50 мг/мышь антитела B7-dimer в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
14) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 50 мг/мышь антитела B3-Fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
15) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 50 мг/мышь антитела B7-Fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
16) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 20 мг/мышь антитела B3 в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
17) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 20 мг/мышь антитела B7 в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
18) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 20 мг/мышь антитела B3-dimer в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
19) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 20 мг/мышь антитела B7-dimer в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
20) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 20 мг/мышь антитела B3-Fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
21) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 20 мг/мышь антитела B7-Fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
22) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 10 мг/мышь антитела B3 в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
23) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 10 мг/мышь антитела B7 в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
24) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 10 мг/мышь антитела B3-dimer в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
25) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 10 мг/мышь антитела B7-dimer в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
26) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 10 мг/мышь антитела B3-Fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
27) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 10 мг/мышь антитела B7-Fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
28) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 1 мг/мышь антитела B3 в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
29) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 1 мг/мышь антитела B7 в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
30) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 1 мг/мышь антитела B3-dimer в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
31) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 1 мг/мышь антитела B7-dimer в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
32) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 1 мг/мышь антитела B3-Fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
33) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 1 мг/мышь антитела B7-Fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера
34) внутрибрюшинно летальную дозу ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера и одновременно 50 мкл фосфатно-солевого буфера (группа отрицательного контроля).
Наблюдение за животными проводили в течении 5 дней. Результаты эксперимента продемонстрированы на фигуре 11. Как видно из представленных данных в группах, получавших фьюжн антитела B3-Fc (SEQ ID NO:5) и B7-Fc (SEQ ID NO:6) в любой концентрации, все животные выжили. В группах, получавших однодоменные и димеризованные однодоменные антитела, уровень защиты более 50% наблюдался только в группах, получивших дозы 1000 и 100 мкг/мышь, в остальных группах наблюдалась частичная протекция или ее отсутствие. В отрицательном контроле наблюдалась полная гибель животных (данные на графике не представлены). В результате, в данном примере была продемонстрирована возможность применения полученных препаратов для экстренной профилактики интоксикации ботулиническим нейротоксином типа А. Также, в данном примере продемонстрировано, что наиболее выраженной активностью обладают препараты В3-Fc и В7-Fc, минимальная концентрация которых для обеспечения 100% защиты составляет 20 мкг на мышь (1 мг/кг).
Таким образом, в результате проведенных экспериментов был разработан способ экстренной профилактики интоксикации, вызванной ботулиническим нейротоксином типа А, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого созданного однодоменного антитела или его модификаций.
Пример 15. Способ терапии интоксикации, вызванной ботулиническим нейротоксином типа А.
Целью данного эксперимента являлась оценка возможности применения препаратов В3-Fc и В7-Fc для терапии интоксикации, вызванной ботулиническим нейротоксином типа А. Данные препараты, были выбраны для данного исследования, так как обладают оптимальными фармакокинетическими свойствами и наименьшей концентрацией способной обеспечивать 100% протективную активность.
Для этого мышам весом 20 гр. вводили внутрибрюшинно летальную дозу 10ЛД50 ботулотоксина в 250 мл стерильного фосфатно-солевого буфера. Спустя 1 и 3 часа после введения токсина, животным внутримышечно во внутреннюю поверхность бедра вводили 20 мкг/мышь (1 мг/кг) препарата В3-Fc или В7-Fc в 50 мкл фосфатно-солевого буфера соответственно. Таким образом, в эксперименте участвовало 4 опытные группы животных (2 временные точки на каждый препарат, по 5 мышей в группе), и одна группа как отрицательный контроль. Наблюдение за животными проводили в течении 5 дней. Результаты эксперимента продемонстрированы на фигуре 12. Данные по отрицательному контролю на графике не представлены. В результате в данном примере была продемонстрирована возможность применения полученных препаратов для терапии интоксикации ботулиническим нейротоксином типа А. Также, в данном примере продемонстрировано, что концентрация препаратов В3-Fc и В7-Fc 1 мг на кг способна обеспечивать 100% защиты животных от летальной дозы 10ЛД50 ботулинического нейротоксина типа А, при терапевтическом режиме применения. Человеку данные антитела могут вводиться в концентрации от 1 до 100 мг/мл.
Таким образом, можно сделать вывод, что разработанные однодоменные антитела и их производные могут быть использованы для терапии интоксикации, вызванной ботулиническим нейротоксином типа А.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают эффективность созданных однодоменных антител и их модификаций, обладающих терапевтическими и протективными свойствами против ботулинического нейротоксина типа А и их промышленную применимость.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
SEQ ID NO:1.
<110> Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Национальный
исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного
академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации
<120> Однодоменные антитела и их модификации, специфически связывающиеся
с ботулиническим нейротоксином типа А и способ их применения для терапии и
экстренной профилактики интоксикации, вызванной ботулиническим
нейротоксином типа А (варианты).
<160> 1
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 139
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<220>
<223> аминокислотная последовательность однодоменного антитела B3
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                   15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35                  40                  45
Ala Ala Ile Thr Trp Thr Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ala Thr Leu Gly Gly Phe Tyr Tyr His Ser Glu Tyr Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys
115                 120                 125
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
130                 135                 140
SEQ ID NO:2.
<210> 2
<211> 139
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<220>
<223> аминокислотная последовательность однодоменного антитела B7
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                   15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Ser Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35                  40                  45
Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ala Thr Leu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys
115                 120                 125
Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
130                 135                 140
SEQ ID NO:3.
<210> 3
<211> 281
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> аминокислотная последовательность олигомеризованного однодоменного
антитела B3
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                   15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Ser Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35                  40                  45
Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ala Thr Leu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val
130                 135                 140
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu
145                 150                 155                 160
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Ser Ser Ser Tyr Gly Met
165                 170                 175
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
180                 185                 190
Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
195                 200                 205
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
210                 215                 220
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
225                 230                 235                 240
Thr Leu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln
245                 250                 255
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile
260                 265                 270
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
275                 280                 285
SEQ ID NO:4.
<210> 4
<211> 281
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> аминокислотная последовательность олигомеризованного
однодоменного антитела B7
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                   15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35                  40                  45
Ala Ala Ile Thr Trp Thr Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ala Thr Leu Gly Gly Phe Tyr Tyr His Ser Glu Tyr Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115                 120                 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val
130                 135                 140
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu
145                 150                 155                 160
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Ser Tyr Gly Met
165                 170                 175
Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala
180                 185                 190
Ile Thr Trp Thr Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
195                 200                 205
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln
210                 215                 220
Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala
225                 230                 235                 240
Thr Leu Gly Gly Phe Tyr Tyr His Ser Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Pro
245                 250                 255
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile
260                 265                 270
Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala
275                 280                 285
SEQ ID NO:5.
<210> 5
<211> 356
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> аминокислотная последовательность фьюжн антитела B3-Fc,
представляющего собой однодоменное антитело B3,
модифицированное Fc-фрагментом
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                   15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35                  40                  45
Ala Ala Ile Thr Trp Thr Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ala Thr Leu Gly Gly Phe Tyr Tyr His Ser Glu Tyr Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Thr Met Val Arg
115                 120                 125
Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
130                 135                 140
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
145                 150                 155                 160
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
165                 170                 175
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
180                 185                 190
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
195                 200                 205
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
210                 215                 220
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
245                 250                 255
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
260                 265                 270
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
275                 280                 285
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
290                 295                 300
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
305                 310                 315                 320
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
325                 330                 335
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
340                 345                 350
Ser Pro Gly Lys
355                 360                 365
SEQ ID NO:6.
<210> 6
<211> 356
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> аминокислотная последовательность фьюжн антитела B7-Fc,
представляющего собой однодоменное антитело B7,
модифицированное Fc-фрагментом
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ala Val Gln Ala Gly Gly
1               5                   10                   15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Ser Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35                  40                  45
Ala Ala Ile Asn Trp Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Ala Thr Leu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Thr Met Val Arg
115                 120                 125
Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
130                 135                 140
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
145                 150                 155                 160
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
165                 170                 175
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
180                 185                 190
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
195                 200                 205
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
210                 215                 220
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
225                 230                 235                 240
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
245                 250                 255
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
260                 265                 270
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
275                 280                 285
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
290                 295                 300
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
305                 310                 315                 320
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
325                 330                 335
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
340                 345                 350
Ser Pro Gly Lys
355                 360                 365
SEQ ID NO:7.
<210> 7
<211> 417
<212> DNA
<213> Vicugna pacos
<220>
<223> нуклеотидная последовательность однодоменного антитела G3
<400> 1
GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGA TTGGTGCAGG CTGGGGGCTC TTTGAGACTC  60
TCCTGTGCAG CCTCTGGACG CGCCTTCAGT AGCTATGGCA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGG AGCGTGAGTT TGTAGCAGCT ATTACCTGGA CTGGTGGTAG CACAGACTAT 180
GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CACGGTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ACCTGAGGAC ACGGCCGTTT ATTACTGTGC AGCCACCTTG 300
GGTGGTTTTT ACTACCATTC TGAGTATGAC TACTGGGGCC CGGGGACCCA GGTCACCGTC 360
TCCTCAGCGG CCGCAGAACA AAAACTCATC TCAGAAGAGG ATCTGAATGG GGCCGCA    417
SEQ ID NO:8.
<210> 8
<211> 417
<212> DNA
<213> Vicugna pacos
<220>
<223> нуклеотидная последовательность однодоменного антитела B7
GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGA GCGGTGCAGG CTGGGGGCTC TTTGAGACTT  60
TCCTGTGCAG CCTCTGGACG CTCCTCCAGT AGCTATGGCA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCT 120
CCAGGGAAGG AGCGTGAGTT TGTAGCAGCT ATTAACTGGA GTGGTGGTAG CACACACTAT 180
GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CACGGTGTAT 240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ACCTGAGGAC ACGGCCGTTT ATTACTGTGC AGCAACCCTC 300
GGGGGTTACT ACTATATATA TGAGTATGAC TACTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACTGTC 360
TCCTCAGCGG CCGCAGAACA AAAACTCATC TCAGAAGAGG ATCTGAATGG GGCCGCA    417
SEQ ID NO:9.
<210> 9
<211> 843
<212> DNA
<213> Vicugna pacos
<220>
<223> нуклеотидная последовательность однодоменного антитела G3-dimer
GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC CGGCGGGGGA CTTGTGCAGG CCGGTGGATC CCTCCGGCTG  60
TCTTGCGCGG CCAGCGGTCG CGCTTTCTCC AGTTATGGCA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCC 120
CCCGGTAAGG AACGCGAGTT CGTGGCGGCC ATCACTTGGA CTGGCGGAAG TACCGATTAT 180
GCTGACAGTG TCAAGGGGCG CTTCACTATT TCTAGAGACA ACGCGAAGAA CACCGTATAC 240
CTGCAGATGA ACTCCCTGAA ACCAGAGGAC ACCGCGGTGT ACTATTGCGC CGCTACCTTG 300
GGCGGATTTT ATTACCATTC CGAGTATGAC TACTGGGGTC CAGGAACCCA GGTGACAGTG 360
TCCAGTAGCG GTGGCGGGGG ATCAGGAGGT GGAGGCAGCG GGGGTGGGGG CTCAGGGGGC 420
GGAGGCGAAG TGCAGCTGGT TGAGTCCGGG GGCGGGCTGG TGCAGGCCGG GGGCAGCCTG 480
CGCCTGTCCT GTGCCGCTAG TGGTCGCGCG TTTAGCAGTT ACGGGATGGG CTGGTTCCGC 540
CAGGCCCCGG GCAAAGAGCG CGAATTTGTG GCGGCAATCA CCTGGACCGG GGGATCCACG 600
GACTACGCCG ACTCCGTTAA GGGTCGGTTT ACTATCAGTC GGGATAATGC GAAGAACACT 660
GTGTACTTGC AGATGAACTC CCTGAAGCCC GAGGACACGG CCGTATATTA CTGCGCGGCC 720
ACTCTGGGCG GGTTCTATTA CCACAGCGAG TACGATTACT GGGGCCCCGG AACACAGGTG 780
ACCGTCTCCA GCGCCGCTGC CGAGCAGAAG CTGATCTCTG AAGAGGATTT GAACGGCGCC 840
GCC                                                               843
SEQ ID NO:10.
<210> 10
<211> 843
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> нуклеотидная последовательность олигомеризованного однодоменного
антитела B7-dimer
<400>
GAGGTGCAGC TTGTGGAGAG CGGTGGAGGC GCCGTGCAGG CGGGAGGGTC TCTCCGGCTG  60
AGTTGTGCGG CCTCCGGTCG CAGCTCCAGC TCCTATGGTA TGGGCTGGTT TAGACAGGCG 120
CCCGGTAAGG AAAGGGAGTT TGTCGCTGCA ATCAACTGGA GCGGCGGTAG CACCCATTAT 180
GCTGACAGCG TGAAGGGTCG CTTCACAATC TCCCGCGACA ATGCCAAGAA CACCGTCTAC 240
TTGCAAATGA ACAGCCTGAA GCCTGAGGAT ACGGCCGTGT ACTATTGTGC GGCCACACTC 300
GGGGGATACT ATTACATTTA TGAGTATGAC TATTGGGGCC AGGGCACTCA AGTGACCGTG 360
AGCTCCAGTG GTGGCGGTGG ATCTGGGGGC GGTGGAAGCG GTGGCGGTGG CAGTGGTGGC 420
GGAGGCGAGG TGCAGCTGGT TGAGAGCGGT GGCGGTGCCG TGCAGGCTGG CGGTTCTCTG 480
CGCCTGTCCT GCGCTGCATC TGGTCGCTCT AGCAGTTCCT ACGGAATGGG TTGGTTTCGC 540
CAGGCTCCCG GCAAGGAGCG TGAGTTCGTG GCTGCCATTA ACTGGAGTGG GGGTTCAACC 600
CACTATGCCG ACTCCGTGAA GGGCAGGTTC ACCATTAGCC GCGATAATGC CAAGAATACC 660
GTGTACCTGC AAATGAACTC CTTGAAGCCG GAAGACACCG CTGTCTATTA CTGTGCGGCC 720
ACGCTGGGTG GCTACTATTA CATCTACGAA TATGATTATT GGGGACAGGG TACCCAGGTC 780
ACTGTGAGCA GTGCCGCTGC CGAGCAGAAG TTGATCTCTG AAGAGGATCT GAACGGGGCG 840
GCT                                                               843
SEQ ID NO:11.
<210> 11
<211> 1068
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> нуклеотидная последовательность фьюжн антитела G3,
представляющего собой однодоменное антитело G3,
модифицированное Fc-фрагментом
<400>
GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGA TTGGTGCAGG CTGGGGGCTC TTTGAGACTC   60
TCCTGTGCAG CCTCTGGACG CGCCTTCAGT AGCTATGGCA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCT  120
CCAGGGAAGG AGCGTGAGTT TGTAGCAGCT ATTACCTGGA CTGGTGGTAG CACAGACTAT  180
GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CACGGTGTAT  240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ACCTGAGGAC ACGGCCGTTT ATTACTGTGC AGCCACCTTG  300
GGTGGTTTTT ACTACCATTC TGAGTATGAC TACTGGGGCC CGGGGACCCA GGTCACCGTC  360
TCCTCATCGA GCACCATGGT TAGATCTGAC AAAACTCACA CATGCCCACC GTGCCCAGCA  420
CCTGAACTCC TGGGGGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC  480
ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACATGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA CGAAGACCCT  540
GAGGTCAAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG  600
CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT CCTGCACCAG  660
GACTGGCTGA ATGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC  720
ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG  780
CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT GGTCAAAGGC  840
TTCTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC  900
AAGACCACGC CTCCCGTGCT GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC  960
GTGGACAAGA GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCACGAGGCT 1020
CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA              1068
SEQ ID NO:12.
<210> 12
<211> 1068
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> нуклеотидная последовательность фьюжн антитела B7,
представляющего собой однодоменное антитело B7,
модифицированное Fc-фрагментом
<400>
GAGGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGA GCGGTGCAGG CTGGGGGCTC TTTGAGACTT   60
TCCTGTGCAG CCTCTGGACG CTCCTCCAGT AGCTATGGCA TGGGCTGGTT CCGCCAGGCT  120
CCAGGGAAGG AGCGTGAGTT TGTAGCAGCT ATTAACTGGA GTGGTGGTAG CACACACTAT  180
GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CACGGTGTAT  240
CTGCAAATGA ACAGCCTGAA ACCTGAGGAC ACGGCCGTTT ATTACTGTGC AGCAACCCTC  300
GGGGGTTACT ACTATATATA TGAGTATGAC TACTGGGGCC AGGGGACCCA GGTCACTGTC  360
TCCTCATCGA GCACCATGGT TAGATCTGAC AAAACTCACA CATGCCCACC GTGCCCAGCA  420
CCTGAACTCC TGGGGGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC  480
ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACATGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA CGAAGACCCT  540
GAGGTCAAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCG  600
CGGGAGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT CCTGCACCAG  660
GACTGGCTGA ATGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC  720
ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG  780
CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT GGTCAAAGGC  840
TTCTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC  900
AAGACCACGC CTCCCGTGCT GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC  960
GTGGACAAGA GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCACGAGGCT 1020
CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA              1068
<---