Отсроченные нейровоспалительные и поведенческие эффекты введения альфа-синуклеина в черную субстанцию мозга крыс

ВЕСТНИК УДМУРТСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

83

Физиологические исследования

УДК 612.017.1

Т.Н. Сергеева, Н.С. Белослудцева, М.А. Швецова, О.А. Вежеева, В.Г. Сергеев

ОТСРОЧЕННЫЕ НЕЙРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ И ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ВВЕДЕНИЯ АЛЬФА-СИНУКЛЕИНА В ЧЕРНУЮ СУБСТАНЦИЮ МОЗГА КРЫС

Исследовали изменения в двигательной активности и интенсивности экспрессии провоспалительных маркеров в мозге крыс через 4 месяца после стереотаксического одностороннего введения белка альфа-синуклеина в черную субстанцию мозга. Результаты иммуногистохимического исследования срезов мозга показали, что к концу эксперимента в области введения белка сохраняются достоверно высокие уровни экспрессии иммунореактив-ных молекул главного комплекса гистосовместимости II (МНС II) в микроглиальных клетках и кислого фибриллярного глиального белка (GFAP) в астроглиальных клетках. Количество и площадь нейронов компактной части черной субстанции на стороне введения снижались по сравнению с аналогичными показателями контрлатеральной (контрольной) стороны мозга, однако эти изменения не достигали достоверного уровня значимости. Измерение двигательной активности в модифицированном тесте «открытое поле» показало достоверное повышение двигательной активности животных, получивших однократную инъекцию альфа-синуклеина в область черной субстанции мозга, по сравнению с животными, которым в эту область вводился стерильный физиологический раствор. Полученные данные свидетельствуют о длительном персистировании в области черной субстанции нейровоспаления после однократного введения альфа-синуклеина, коррелирующего с повышением двигательной активности экспериментальных животных.

Ключевые слова: болезнь Паркинсона, альфа-синуклеин, черная субстанция, нейровоспаление, микроглия, аст-роглия, нейродегенерация, тест «открытое поле»".

Болезнь Паркинсона (БП) - это нейродегенеративное заболевание, возникающее примерно у 1 % людей в возрасте старше 65 лет. У пациентов с БП наблюдаются характерные двигательные нарушения (тремор, ригидность, брадикинезия, акинезия, постуральная нестабильность) [1], а также вегетативные расстройства и психические отклонения [2]. Цитопатологическим маркером БП является наличие в дофаминергических нейронах ЧС крупных цитоплазматических включений - телец Ле-ви, образованных белком альфа-синуклеином, который, как показали последние исследования, играет ключевую роль в патогенезе болезни Паркинсона [3-5].

Альфа-синуклеин - эволюционно консервативный белок, состоящий из 140 аминокислотных остатков. В клетке он обнаруживается в свободной и мембраноассоциированной формах. В свободном состоянии альфа-синуклеин представляет собой растворимый белок, который обладает слабо упорядоченной структурой с отсутствием определенной пространственной организации. Однако при связывании с мембраной происходит его спирализация [6]. Кроме того, повышение концентрации альфа-синуклеина в цитоплазме вызывает его конденсацию в виде бета-складчатых полимерных фибрилл, агрегация которых в комплексы ведет к формированию телец Леви.

Физиологическая роль альфа-синуклеина определяется его вовлеченностью в процессы синап-тической передачи. Встраиваясь в стенку синаптических пузырьков, альфа-синуклеин способствует их слиянию с пресинаптической мембраной в момент передачи межклеточного сигнала. Это подтверждается экспериментами с нокаутными по гену альфа-синуклеина животными, у которых наблюдается истощение везикулярного пула в синапсах и, как следствие, нарушение процесса синапти-ческой передачи [7]. Известно также, что метаболизм альфа-синуклеина тесно связан с метаболизмом и транспортом дофамина, поэтому изменение уровня содержания белка альфа-синуклеина сказывается на уровне дофамина, так как альфа-синуклеин взаимодействует с ферментом тирозингидроксила-зой и регулирует количество дофаминового транспортера в плазматической мембране [8; 9]. Кроме того, измененные формы альфа-синуклеина, взаимодействуя с дофамином, блокируют убиквитин-протеосомную систему, что ведет к гибели клеток и выходу альфа-синуклеина во внеклеточное пространство [10; 11].

В ряде работ была продемонстрирована связь между экспериментально индуцированной гиперэкспрессией альфа-синуклеина в нейронах черной субстанции и нейровоспалением, ключевую роль в

котором играют микроглиальные и астроцитарные клетки. Однако остается открытым вопрос: вызывается ли в этом случае нейровоспаление секрецией повышенных уровней альфа-синуклеина в окружающую среду или оно является ответной реакцией на дегенерацию нейронов? Недавние исследования показали, что агрегаты этого белка могут передаваться от одного нейрона к другому через последовательный экзоцитоз и эндоцитоз. Предполагается, что, оказавшись во внеклеточной среде, альфа-синуклеин может выступать в роли центра агрегации растворимого мономерного белка [12] и, возможно, принимает участие в процессах провоспалительной активации глиальных клеток, секрети-рующих факторы, повреждающие нейроны [13]. Следует отметить, что вышеупомянутая гипотеза не имеет на сегодняшний день достаточных экспериментальных подтверждений.

Для проверки возможности внеклеточного альфа-синуклеина индуцировать процессы нейро-воспаления и, как следствие, нейродегенерации дофаминергических нейронов нами было проведено исследование, в котором изучались отсроченные иммуногистохимические и поведенческие эффекты стереотаксического введения этого белка в область черной субстанции мозга крыс.

Материалы и методы исследований

Исследование выполнено на 12 самцах крыс массой 250-300 г, содержащихся в стандартных условиях. С помощью стереотаксической установки животным опытной группы однократно в область черной субстанции правого полушария вводили альфа-синуклеин в объеме 2 мкл и концентрации 15 нг/мл (6 крыс), а контрольной группе (6 крыс) - в том же объеме стерильный забуференный физиологический раствор. Через 4 месяца после введения оценивали поведенческие реакции опытных и контрольных крыс в модифицированном тесте «открытое поле» с целью выявления особенностей двигательной активности. При этом измеряли длину пробега через каждые 20 секунд в течение 5 минут, а также измеряли суммарную длину пробега и строили траектории движения крыс в арене. После этого фиксировали мозговую ткань с помощью интракардиальной перфузии 4 %-ного пара-формальдегида и изготавливали фронтальные криостатные срезы мозга толщиной 14 мкм. Часть срезов окрашивали крезиловым фиолетовым, производили подсчет нейронов в компактной части черной субстанции и замеряли их площадь при помощи морфометрической компьютерной программы обработки изображений ImagePro Plus 6.0. Оставшиеся срезы окрашивали при помощи иммуногистохи-мического метода с целью выявления микроглии и астроглии. Для идентификации клеток использовали первые антитела к GFAP, MHCII (Santa-Cruse, USA) и вторые антитела, коньюгированные с ФИТЦ (Sigma, USA). Гистологические препараты исследовали в люминесцентный микроскоп Nikon Eclipse Е200, количество иммунопозитивных клеток на стандартной площадке и интенсивность свечения анализировали в программе ImagePro Plus 6.0. Контрастирование и цветовую коррекцию изображений осуществляли в программе Adobe Photoshop CS6. Статистическую обработку проводили в программе Statistica 6.0. Для сравнения различий групп выборок высчитывали для них значения «среднее арифметическое ± стандартное отклонение». Достоверность различий между средними значениями оценивали с помощью /-критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Исследование поведенческих реакций крыс в модифицированном тесте «открытое поле»

Для выявления последствий введения альфа-синуклеина в мозг помещали животных контрольной и опытной групп в центр арены и в течение 5 минут фиксировали их горизонтальную активность. Измерение длины пробега животных с интервалом в 5 секунд и 1 минуту продемонстрировало наличие ярко выраженных отличий двигательной активности между исследуемыми группами (рис. 1, 2). Так, траектория движения представителя группы с введением альфа-синуклеина более сложная с преобладанием активности по периферии арены. Причем в отличие от контрольных животных опытные исследуют арену полностью (рис. 1). Длина пробега животных опытной группы достоверно превышала аналогичный показатель у контрольных животных на всем протяжении регистрационного периода (рис. 2, а). Данные свидетельствуют о том, что с течением времени наблюдается снижение двигательной активности, как в опытной, так и контрольной группе животных, но в группе контроля такое снижение выражено сильнее. Уже на второй минуте у контрольных животных регистрируется резкое уменьшение длины пробега по сравнению с первой минутой регистрации. Эта тенденция сохраняется вплоть до конца 4 минуты регистрации. В опытной группе снижение длины пробега начи-

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

2014. Вып. 2

нается только на третьей минуте, при этом крысы сохраняют повышенную активность до конца регистрации (рис. 2, а). Подсчет суммарной длины пробега в течение 5 минут демонстрирует достоверное превышение этого показателя в опытной группе по сравнению с контролем (рис. 2, б). Полученные данные свидетельствуют о повышенной двигательной активности крыс через четыре месяца после однократной инъекции альфа-синуклеина в черную субстанцию мозга по сравнению с животными, которым в аналогичную область вводился стерильный физраствор.

Рис. 1. Траектория движения в модифицированном тесте «открытое поле» и динамика двигательной активности типичных представителей контрольной и экспериментальной

групп крыс

¡00

2 о 400

300

о с. 200

СЗ

а 100

Щ 0

а)

контроль

опыт

2

и

гГ

и

о о

е-

2 3 4

Бремя, мин

о

с

б)

контроль

опыт

Рис. 2. Горизонтальная двигательная активность крыс после введения в черную субстанцию альфа-синуклеина

Исследование морфофункциональных изменений нейронов и глии

На фронтальных криостатных срезах, окрашенных крезиловым фиолетовым, подсчитывали количество и площадь нейронов компактной части черной субстанции правого и левого полушарий в контрольной и опытной группах животных. При подсчете количества нейронов в стандартных площадках на срезах экспериментальной группы обнаружено, что в области введения (правая часть) нейронов меньше, чем в интактной (левая часть), в отличие от группы контроля, где количество нейронов в области введения физраствора мало отличается от интактной области (рис. 3, а). Измерение площади нейронов компактной части черной субстанции показало, что в группе с введением альфа-синуклеина выявляется тенденция к снижению этого показателя в правой части по сравнению с левой. В контрольной группе подобных изменений не наблюдается (рис. 3, б). Выявленные изменения количества и площади нейронов не достигают уровня достоверности, но все же свидетельствуют о функциональных изменениях нейронов под действием внеклеточного альфа-синуклеина.

120 -

100 -

с G п S0 -

— 60 -

С

О 40 -

и

в 20 -

к

0 -

влевое полушарие

правое полушарие

120 -,

£ 100 -

О ко

с.

Ü 60 -

1 40

G

э 20 -

0 -

а)

контроль опыт

б)

контроль опыт

и левое полушарие

правое полушарие

Рис. 3. Количество нейронов (а) и площадь нейронов (б) в компактной части черной субстанции на стороне введения (правое полушарие) и в интактной области (левое полушарие) экспериментальной (введение альфа-синуклеина) и контрольной групп крыс

Рис. 4. Интенсивность экспрессии иммунореактивного глиального кислого фибриллярного белка в астроцитах (а), молекул главного комплекса гистосовместимости второго типа в микроглиоцитах (б) компактной части черной субстанции в области введения (правое полушарие) и интактной области (левое полушарие) экспериментальной (введение альфа-синуклеина) и контрольной групп крыс; достоверность различий между левым и правым полушарием *Р < 0,05

БИОЛОГИЯ. НАУКИ О ЗЕМЛЕ

2014. Вып. 2

Иммуногистохимическое исследование фронтальных срезов области черной субстанции показало наличие нейровоспалительного процесса через 4 месяца после введения альфа-синуклеина. Об этом свидетельствуют результаты окрашивания микроглии, маркером которой являются молекулы главного комплекса гистосовместимости класса II (МНС II) и астроглии, идентифицируемой по экспрессии глиального кислого фибриллярного белка (GFAP). Результаты показали, что в ответ на введение альфа-синуклеина в черную субстанцию (правое полушарие) происходит достоверное усиление экспрессии астроглией GFAP (рис. 4, а) и микроглиоцитами МНС II (рис. 4, б). Введение физраствора не вызывало изменений в экспрессии МНС II и GFAP в области введения (правое полушарие) по сравнению с интактной областью.

Таким образом, результаты данного исследования показывают, что через 4 месяца после однократного введения альфа-синуклеина в черной субстанции сохраняется нейровоспаление, сопровождающееся двигательной гиперактивностью животных. Известно, что черная субстанция через свои проекции в полосатое тело вовлечена в тоническое ингибирование корково-подкорковых механизмов контроля произвольных движений, поэтому логично полагать, что провоспалительная активность глии ингибирует активность нигростриальной системы, что ведет к усилению спонтанной двигательной активности животных. Обнаруженный феномен может быть использован в качестве маркера ранних функциональных нарушений, характеризующих продромальную стадию паркинсонподобной нейродегенерации у животных.

Выводы

1. Одностороннее введение альфа-синуклеина в черную субстанцию приводит к достоверному увеличению двигательной активности (по сравнению с контролем), выражающемуся в достоверном увеличении длины пробега в течение регистрационного периода.

2. В компактной части черной субстанции правого полушария после введения альфа-синуклеина наблюдается тенденция к уменьшению количества и площади нейронов по сравнению с левым полушарием, что не характерно для контрольной группы животных.

3. В компактной части черной субстанции правого полушария опытной группы животных наблюдается достоверное увеличение интенсивности свечения иммунореактивного МНС II и GFAP, что свидетельствует о провоспалительной активации микроглии и астроглии.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bernheimer H., Birkmayer W., Hornykiewicz O., Jellinger K., Seitelberger F. Clinical, morphological and neurochemical correlations // J. Neurol Sci. 1973. Vol. 20, No. 4. P. 415-455.

2. Lee S-J. Origins and Effects of Extracellular a -synuclein : Implications in Parkinson's Disease // J. Mol. Neurosci. 2008. No. 34. Р. 17-22.

3. Forno L.S. Neuropathology of Parkinson's disease // Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 1996. No. 55. Р. 259-272.

4. Beyer K., Domingo-Sabat M., Ariza A. Molecular Pathology of Lewy Body Diseases // Int. J. Mol. Sci. 2009. Vol. 10, No. 3. Р. 724-745.

5. Hsu L.J., Sagara Y., Arroyo A., Rockenstein E., Sisk A., Mallory M., Wong J., Takenouchi T., Hashimoto M., Masliah E. a-Synuclein рromotes mitochondrial deficit and oxidative stress // Amer. J. of Pathol. 2000. Vol. 157, No. 2. P. 401-410.

6. Bisaglia M., Mammi S., Bubacco L. Structural insights on physiological functions and pathological effects of alpha-synuclein. FASEB J. 2009. No. 23. Р. 329-340.

7. Brighina L., Prigione A., Begni B., Galbussera A., Andreoni S., Piolti R., Ferrarese C. Lymphomonocyte alpha-synuclein levels in aging and in Parkinson disease // Neurobiol. Aging. 2010. No. 31. Р. 884-885.

8. Perez R., Waymire J., Lin E., Liu J., Guo F., Zigmond M. A role for alpha-synuclein in the regulation of dopamine biosynthesis // J. Neurosci. 2002. No. 22. Р. 3090-3099.

9. Kim S., Seo J.H., Suh Y.H. Alha-synuclein, Parkinson's disease, and Alzheimer's disease. Parkinsonism // Relat. Disord. 2004. No. 10. Р. 9-13.

10. McNaught K.S., Mytilineou C., Jnobaptiste R., Yabut J., Shashidharan P., Jennert P., Olanow C. Impairment of the ubiquitin-proteasome system causes dopaminergic cell death and inclusion body formation in ventral mesencephalic cultures // J. Neurochem. 2002. Vol. 81. P. 301-306.

11. Martinez-Vicente M., Talloczy Z., Kaushik S. Massey A., Mazzulli J., Mosharov E., Hodara R., Fredenburg R., Wu D., Follenzi A., Dauer W., Przedborski S., Ischiropoulos H., Lansbury P., Sulzer D., Cuervo A. Dopamine-modified alpha-synuclein blocks chaperone-mediated autophagy // J. Clin. Invest. 2008. Vol. 118, No. 2. P. 777-788.

12. Waxman E.A., Giasson B.I. A novel, high-efficiency cellular model of fibrillar alpha-synuclein nclusions and the examination of mutations that inhibit amyloid formation // J. Neurochem. 2010. No 113. Р. 374-388.

13. Lee S-J. Origins and Effects of Extracellular a-synuclein: Implications in Parkinson's Disease // Journal of Molecular Neuroscience. 2008. Vol. 34, No. 1. Р. 17-22.

Поступила в редакцию 10.04.14

T.N. Sergeeva, N.S. Belosludtseva, M.А. Shvetsova, O.A. Vezheeva, V.G. Sergeev

DEFERRED NEUROINFLAMMATORY AND BEHAVIORAL EFFECTS OF ALPHA-SYNUCLEIN ADMINISTRATION IN THE RAT SUBSTANTIA NIGRA

We examined changes in the locomotor activity and the intensity of inflammatory markers expression in the rat brain in 4 months after a-synuclein unilateral stereotaxic administration in the substantia nigra. The results of immunohisto-chemical studies of brain sections showed that by the end of the experiment there remain reliably high levels of expression of immunoreactive major histocompatibility complex II (MHC II) in microglial cells and glial fibrillary acid protein (GFAP) in astroglial cells in the area of the peptide administration. The number and the area of neurons of the sub-stantia nigra on the side of administration were decreasing as compared with those of the contralateral (control) side of the brain, but these changes did not reach the reliable level of significance. The measurement of the locomotor activity in the modified test "open field" showed a significant increase in the locomotor activity of animals receiving a single injection of alpha-synuclein in the substantia nigra compared with the animals injected with sterile saline. These data indicate that single administration of alpha-synuclein in substantia nigra induces the prolonged persistence of neuroinflammation associated with the increased motor activity in the experimental animals.

Keywords: Parkinson's disease, alpha-synuclein, substantia nigra, neuroinflammation, microglia, astroglia, neurodegeneration, "open field" test.

Сергеева Татьяна Николаевна, доцент кафедры анатомии и физиологии человека и животных E-mail: tnbio@ya.ru

Белослудцева Наталья Сергеевна, студентка кафедры анатомии и физиологии человека и животных E-mail: mipnatser@mail.ru

Швецова Марина Александровна, студентка кафедры анатомии и физиологии человека и животных E-mail: mariiiiha@mail.ru

Вежеева Ольга Александровна, аспирант кафедры

иммунологии и клеточной биологии

E-mail: promo-olga@ya.ru

Сергеев Валерий Георгиевич,

доктор биологических наук, профессор кафедры

иммунологии и клеточной биологии

E-mail: cellbio@ya.ru

Sergeeva T.N., Associate Professor of Department of Anatomy and Human and Animal Physiology E-mail: tnbio@yandex.ru

Belosludtseva N.S., student of Department of Anatomy and Human and Animal Physiology E-mail: mipnatser@mail.ru

Shvetsova M.A., student of Department of Anatomy and Human and Animal Physiology E-mail: mariiiiha@mail.ru

Vezheeva O.A., postgraduate student of Department of Immunology and Cell Biology E-mail: promo-olga@ya.ru

Sergeev V.G.,

Doctor of biology, Professor of Department of Immunology and Cell Biology E-mail: cellbio@yandex.ru

ФГБОУ ВПО «Удмуртский государственный университет» Udmurt State University

426034, Россия, г. Ижевск, ул. Университетская, 1 (корп. 1) Universitetskaya st., 1/1, Izhevsk, Russia, 426034