СПОСОБ МИКРОНИЗАЦИИ
METHOD OF MICRONISATION

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к способу уменьшения размера частиц белковых порошков.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В недавние годы возникла необходимость в изготовлении фармацевтических порошковых дисперсий микронного и субмикронного размера частиц, имеющих контролируемое узкое распределение размера частиц. Применения таких порошков включают, например, доставку фармацевтического аэрозоля с помощью ингаляторов сухого порошка, повышение биодоступности лекарств, не растворимых в воде, и гемостатические устройства, состоящие из биоразлагаемого композитного матрикса, в который включены лиофилизированные порошки факторов свертывания крови. Способ измельчения порошка до микронного и субмикронного размера частиц известен как микронизация.
Среди известных способов микронизации находятся способы, в которые вовлечены высокие скорости сдвига и высокое потребление энергии, такие как системы струйного измельчения или пульверизации, измельчение в шаровой мельнице, гомогенизация высокого давления и микрофлюидизация. Такие способы в целом несовместимы с биологическими молекулами, которые чувствительны к тепловому и/или физическому разрушению. Другие, более мягкие, известные способы включают распылительную сушку, перекристаллизацию, эмульсионно-жидкостную экстракцию и способы с использованием сверхкритических жидкостей, такие как быстрое расширение сверхкритических растворов (Rapid Expansion of Supercritical Solutions, RESS).
Вихревые или циклонные камеры для измельчения также известны. Например, в патенте США №4502641 раскрыто сочетание принципа струйного измельчения с циклонной камерой. Также известные циклонные камеры для измельчения, которые осуществляют так называемое резонансное вихревое измельчение. В WO 94/08719 раскрыт аппарат для измельчения с вихревой камерой, оборудованной соплами для касательной инжекции жидкости, которая осуществляет так называемое "резонансное вихревое измельчение".
В патенте США №5855326 автора Beliavsky, полное содержание которого включено здесь путем ссылки, раскрыта вихревая камера для измельчения для тонкого измельчения твердого вещества, состоящего из частиц, где эта камера устроена в установке, имеющей по существу цилиндрическую форму с двумя торцевыми поверхностями и боковой стенкой, оборудованной одним или более чем одним касательным соплом для инжекции рабочей жидкости в камеру и создания в ней вихревого потока, где указанная камера содержит средства для введения в нее твердого вещества, состоящего из частиц, которое нужно измельчать, расположенный по оси нагнетательный канал, оборудованный в одной или в обеих указанных торцевых поверхностях, и средства контроля в форме одного или более чем одного механического элемента, приспособленного для взаимодействия при создании вихревого потока с его слоями, движущимися вблизи внутренних стенок камеры, посредством этого дающего возможность контроля измельчения. Пример работы вихревой камеры в данном патенте приведен с использованием песка.
В патенте США №6789756 автора Beliavsky, полное содержание которого включено здесь путем ссылки, раскрыта усовершенствованная циклонная мельница для измельчения твердого вещества, по существу состоящего из частиц, которая включает одну или более чем одну рабочую камеру. Эта мельница также включает один или более чем один впускной клапан для рабочей жидкости и один или более чем один выпускной канал. Один или более чем один впускной клапан для рабочей жидкости вместе с одним или более чем одним выпускным каналом способствует вихревому потоку внутри одной или более чем одной рабочей камеры. Также присутствует один или более чем один впускной клапан подачи для обеспечения измельчения твердого вещества, которое выгружается через один или более чем один выпускной канал. Дополнительно присутствует устройство для индукции контролируемых отклонений в потоке рабочей жидкости в одной или более чем одной рабочей камере, посредством чего улучшено измельчение твердого вещества в вихревом потоке.
Текстильное полотно с фибрином Hercules представляет собой гемостатическое устройство, состоящее из биоразлагаемого композитного матрикса из нетканого Vicryl™, связанного в ткань из окисленной регенерированной целлюлозы (ORC, Interceed™), в которую включены лиофилизированные порошки фибриногена и тромбина посредством суспензии в летучем растворителе.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Задачей настоящего изобретения является разработка механизированного способа микронизации дисперсии белковых частиц до определенного распределения размера частиц, при этом по существу сохраняющего активность белка.
3
В настоящем изобретении предложен способ микронизации дисперсии из частиц, содержащей белок, обладающий предопределенным уровнем биологической активности, при котором дисперсию вносят в устройство для измельчения с циклонной камерой в условиях измельчения, в результате чего получают порошок белка, имеющий распределение размера частиц от 5 до 100 мкм и сохраняющий по меньшей мере 80% предопределенного уровня биологической активности белка, где условия измельчения включают один или более чем один параметр, выбранный из: входного давления между 1 и 7 бар; давления форсунки между 0,2 и 5 бар; скорости загрузки между 0,1 и 5 кг/час и скорости газового потока между 30 и 100 м/час.
Способ по изобретению предпочтительно позволяет получить порошок белка, обладающий постоянным и контролируемым распределением размера частиц.
В одном воплощении настоящего изобретения частицы исходной дисперсии белковых частиц априорно получают таким образом, что они имеют трещины или полости либо другие структурные несовершенства, которые составляют слабые точки, которые могут способствовать разрушению частицы в процессе измельчения. В одном воплощении дисперсию белковых частиц готовят способом сушки вымораживанием, таким как лиофилизация. Лиофилизацию обычно осуществляют путем сушки вымораживанием, и она включает удаление воды из замороженной клеточной суспензии путем возгонки при пониженном давлении. Альтернативные процессы дегидратации, которые экстрагируют воду из белкового вещества, также хорошо известны в области изготовления порошка белка и могут быть использованы. В следующем воплощении дисперсию, высушенную вымораживанием, механически дробят перед измельчением. Еще в одном следующем воплощении изобретения дисперсию механически дробят до частиц, которые проходят через сито SS 2 мм.
Белок, обработанный способом по изобретению, обладает биологической активностью, то есть активностью, обладающей эффектом на один или более чем один физиологический процесс в организме человека. Например, белок может представлять собой фермент, и соответствующая биологическая активность должна представлять собой ферментативную каталитическую активность этого фермента. Не ограничивающие примеры белков, которые можно применять в изобретении, включают любую протеазу в каскаде свертывания крови и ее протеазный субстрат; белки в каскаде комплемента и их противоположная часть; факторы роста и их рецепторы; гормоны и их рецепторы; иммуноглобулины; анаболические и катаболические ферменты; ферменты, которые катализируют приведенные ниже биохимические реакции: фосфорилирование, дефосфорилирование, карбоксилирование, отжиг, протеолиз, переаминирование, деаминирование, окисление, гидрогенизацию, гибридизацию, гидролиз, изомеризацию, инверсию, гликолиз, полимеризацию ДНК и РНК, этерификацию и т.д. В одном воплощении белок представляет собой фактор свертывания крови и биологической активностью является активность свертывания крови. В другом воплощении белок представляет собой тромбин или фибриноген. Белок может представлять собой смесь одного или более чем одного из указанных белков. В одном воплощении изобретения белок представляет собой Вас2. В другом воплощении изобретения белок представляет собой тромбин.
Белок может быть синтетическим, встречающимся в природе, полученным с помощью трансгенных или рекомбинантных методов, включая процессированный, денатурированный или иначе модифицированный белок.
Уровень биологической активности может быть предопределен с помощью стандартных биологических анализов, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, если белок представляет собой фермент, его биологическую активность можно определить путем проведения одного или более чем одного анализа, который позволяет измерить активность. В конкретном примере для определения свертывающей активности фибриногена можно использовать анализ Клауса (к подходящему объему и разведению образца фибриногена, поддерживаемого при 37°С, добавляют раствор человеческого тромбина [примерно 20 ед./мл и содержащего по меньшей мере 1 ммоль/литр кальция]; определяют время свертывания и вычисляют активность против калибровочной кривой, полученной с использованием подходящего стандарта фибриногена), либо свертываемый фибриноген можно определить путем измерения поглощения при 280 нм. В другом конкретном примере свертывающую активность тромбина можно определить методом свертывания (к подходящему объему и разведению добавляют раствор фибриногена [1 г/л свертываемого белка], нагретый до 30°С, и сразу измеряют время свертывания. Активность тестируемого препарата вычисляют против калибровочной кривой, полученной со стандартным препаратом тромбина).
Устройство для измельчения с циклонной камерой, используемое в изобретении, предпочтительно содержит сопла касательной инжекции жидкости и осуществляет резонансное вихревое измельчение, используя градиенты давления. Считают, что быстрое изменение давлений газа в циклонной камере вызывает разрушение частиц параллельно их слабым сечениям. В одном воплощении устройство для измельчения является таким, как описано в патенте США №5855326. В другом воплощении устройство для измельчения является таким, как описано в патенте США №6789756. Одним из примеров такого устройства для измельчения является циклонная мельница Super Fine Vortex Mill™ (SFVM), изготавливаемая Super Fine Ltd. Yokneam, Израиль (схематически показана на фиг.6).
Условия измельчения могут включать один или более чем один из приведенных ниже параметров:
(а) Давление входящего потока дисперсии в мельницу (= входное давление) - как правило, должно составлять между 1 и 7 бар, где нижний предел находится в диапазоне 1-3 бар (например, 1, 2 или 3 бар), а верхний предел находится в диапазоне 4-7 бар (например, 5, 6 или 6,3 бар);
(б) Давление при подающем инжекторе (= давление инжектора - в случаях, где инжектор используют для подачи*) - как правило, должно составлять между 0,2 и 5 бар. В одном воплощении изобретения давление инжектора составляет 2 бар;
(в) Скорость загрузки - как правило, должна составлять между 0,1 и 5 кг/час, где нижний предел находится в диапазоне 0,1-2 кг/час (например, 0,2, 0,4, 0,6 или 1,6 кг/час), а верхний предел находится в диапазоне 3-5 кг/час (например, 2,4, 2,8, 3,0, 3,7 или 4,2 кг/час); и
3
3
(г) Поток газа из инжекционного канала в нагнетательный канал для жидкости (= поток газа**) - как правило, должен составлять между 30 и 100 м/час (например, 35, 40, 50, 58, 60, 69, 70, 80 или 90 м/час).
*Входящий поток дисперсии обычно является высоким, и вакуум, образующийся в мельнице, всасывает порошок в камеру. Поскольку входящий поток в способе по изобретению является относительно низким, всасывание порошка в камеру недостаточно и, следовательно, часто требуется подающий инжектор.
**Любой инертный газ можно использовать в потоке газа из инжекционного канала в нагнетательный канал для жидкости (сухой воздух, аргон, азот и т.д.). В приведенных ниже примерах используют воздух.
В другом воплощении изобретения полученный в результате порошок белка имеет распределение размера частиц от 5 до 100 мкм, где нижний предел составляет 5, 10, 15 или 20 мкм, а верхний предел составляет 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мкм. В следующем воплощении размер по меньшей мере 90% частиц, более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 97% находятся внутри распределения размера частиц. В следующем воплощении изобретения порошок белка сохраняет по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% предопределенной биологической активности.
Еще в одном следующем воплощении микронизация приводит в результате к 30-400-кратному уменьшению размера частиц порошка белка от его исходного размера.
Раскрытие диапазонов легко понятно специалисту в данной области техники. Оно означает раскрытие непрерывных величин и цифр между пределами диапазонов, включая ограничивающие цифры и величины. Например, если приведен диапазон от 1 до 7, под ним подразумевают 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 при всех комбинациях промежуточных подынтервалов, таких как 1 и 2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6 или 1-7 и 2 и 3, 2-4, 2-5, 2-6 или 2-7 и т.д.
Полное описание всех заявок, патентов и публикаций, цитируемых выше или ниже, включено здесь путем ссылки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Чтобы понять изобретение и увидеть, как его можно осуществить на практике, далее описано предпочтительное воплощение путем только не ограничивающего примера со ссылкой на сопроводительные графические материалы, в которых:
на фиг.1 показано сравнение профиля распределения размера порошка человеческого фибриногена 2, измельченного вручную, против SFVM;
на фиг.2 показан профиль распределения размера порошка человеческого фибриногена 2, измельченного при различных давлениях измельчения;
на фиг.3 показан профиль распределения размера тромбина, измельченного при различных давлениях измельчения;
на фиг.4 показан профиль распределения размера частиц двух партий человеческого фибриногена 2 (#4 и #5), измельченных в один и тот же день, с использованием одинаковых стандартных рабочих параметров;
на фиг.5 показано распределение размера частиц двух партий человеческого фибриногена 2 (#6 и #7), измельченных последовательно в один и тот же день, с использованием одинаковых стандартных рабочих параметров; и
на фиг.6 показано схематическое изображение в срезе SFVM.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРИМЕРНЫХ ВОПЛОЩЕНИЙ
Далее примерное воплощение изобретения описано в отношении SFVM, изготовленного фирмой Super Fine Ltd. Yokneam, Израиль. Однако должно быть понятно, что изобретение можно практиковать с другими типами измельчающих аппаратов в соответствии с изобретением.
I. МАТЕРИАЛЫ
Биологический продукт

Все партии биологических продуктов - человеческого фибриногена 2 и тромбина - были лиофилизированы в PFI, Tel Hashomer, Израиль. Человеческий фибриноген 2 (также иногда называемый ВАС2) представляет собой концентрированный криопреципитат плазмы человека с инактивированными вирусами (криопреципитат обычно получают, как описано в ЕР 534178), который состоит главным образом из фибриногена (примерно 85%) и истощен по плазминогену (удаление плазминогена обычно проводят, как описано в ЕР 1390485) и без добавления антифибринолитических агентов. Биологический продукт, полученный в виде лиофилизированного кека в пластмассовом контейнере LyoGuard, дважды обернутый в пакет из алюминиевой фольги и толстый полиэтиленовый пакет. Эти контейнеры с двойной оберткой хранили при 2-8°С до измельчения.
Носитель
Гидрофторуглерод (HFE)-7000 использовали в качестве носителя биологического продукта. Однако биологический материал можно суспендировать любым подходящим растворителем и HFE является только не ограничивающим примером.
II. МЕТОДЫ

Биологические продукты были лиофилизированы в LyoGuard. Все LyoGuard были заполнены 1,5 литрами либо человеческого фибриногена 2, либо тромбина. Сухие лиофилизированные продукты переносили на испытательный объект завернутыми в алюминиевую фольгу. В месте испытания обертки из фольги вскрывали и кек сначала дробили механически шпателем через сито SS 2 мм, а затем крупный порошок подавали в SFVM через конвейер. Давление инжектора и мельницы было предварительно установлено перед загрузкой продукта и точно отрегулировано до желаемого давления в процессе работы. Скорость загрузки поддерживали путем предварительного взвешивания продукта в аликвотах; загрузку каждой аликвоты тщательно регулировали по времени. Порошки собирали в стеклянные банки, присоединенные к концу воронки циклона SS.
Были проведены приведенные ниже тесты на определение биологической активности и физических параметров:
1. Содержание воды - Карл Фишер
2. Распределение размера частиц - Распределение размера частиц можно измерить прибором Beckman Coulter LS 13 320, который дает возможность определить распределение размера частиц порошка либо в жидкости, либо в форме сухого порошка путем использования принципов светорассеяния. Коултер дает возможность проводить измерение размеров частиц в диапазоне 0,375 мкм-2000 мкм в порошке, распределенном в HFE7000.
3. Свертывающая активность фибриногена - анализ Клауса [описан выше].
++
4. Свертываемый фибриноген по поглощению при 280 нм - Чтобы количественно определить свертываемый фибриноген, тестируемый образец смешивают с тромбином, и образуется сгусток. Натриевую соль ЭДТА используют в качестве хелатирующего агента кофактора реакции (Са), и она ингибирует активацию FXIII до FXIIIa (плазматической трансглутаминазы) тромбином, предотвращая, таким образом, переход гаммаглутамил-эпсилонлизина несвертываемого белка в фибрин. Эти несвертываемые белки, которые не сшиты с фибриновой сетью, удаляют сначала путем высушивания сгустка на фильтровальной бумаге с последующими промывками физиологическим раствором. Затем сгусток солюбилизируют в растворе мочевина/NaOH и количественное определение свертываемого фибриногена проводят путем измерения при 280 нм (после уменьшения светорассеяния при 320 нм) против известного внутреннего стандарта.
5. Для определения общего белка, свертываемого фибриногена, определения фибриногена по Клаусу и для определения эффективности тромбина по времени свертывания в лиофилизированных и/или измельченных образцах фибриногена и тромбина соответственно порошки следует ресуспендировать в подходящем буферном растворе.
6. Активность тромбина методом свертывания [описан выше].
III. РЕЗУЛЬТАТЫ
SFVM использует быстрые изменения давления газа в циклонной камере для разрушения частиц вещества параллельно их слабым структурным точкам и посредством этого создает сверхтонкоизмельченные порошки. По существу мельница спроектирована для эффективного, энергосберегающего получения тонкопульверизированного порошка с использованием относительно низкой энергии, то есть энергия, затраченная на пульверизацию одного килограмма порошка, намного ниже, чем энергия, затраченная на пульверизацию такого же количества порошка с помощью общепринятых струйных мельниц или механического (лопастного или шарового) измельчения, при достижении такого же размера частиц (см. таблицу 1).
Таблица 1
Сравнение между струйной мельницей и SFVM (отмечено различие в потреблении энергии)
Мельница
Требуемый поток воздуха (м<sup>3</sup>/мин)
Перепад давления (бар)
Скорость подачи (кг/час)
кВт·час/кг
ккал/кг
Струйная
2,84
7
20
2,360
2029
Super Fine Vortex Mill
1,3
4
25,6
0,483
415
Конструкция SFVM дает возможность гибкой настройки размера частиц и распределения размера частиц путем варьирования приведенных ниже параметров.
Входное давление, повышающее давление, прилагаемое к входному клапану главной камеры мельницы, должно повысить энергию, применяемую на единицу порошка, повышая таким образом, разрушение частиц, которое должно привести к уменьшению размера частиц и сужению распределения. Однако высокая энергия может привести к снижению биологической активности конечного пульверизированного продукта.
Существует два дополнительных параметра, которые контролируют скорость загрузки продукта на мельницу:
(1) скорость, с которой продукт заливают в приемную воронку мельницы,
(2) давление инжектора.
Высокая скорость загрузки должна снизить энергию на килограмм продукта, следовательно, энергия, поглощаемая частицами, должна быть ниже, что приводит в результате к небольшому числу разрушений частиц, что должно привести к большему размеру частиц. В большинстве описанных ниже экспериментов давление инжектора было постоянно установлено на 2 бар, что было достаточно для проталкивания продукта в циклонную камеру при любой исследуемой скорости подачи. Однако в вышеописанном правиле было сделано одно исключение, когда основное давление на входе было высоким, >3 бар, газ, инжектированный в основную часть SFVM, создавал вакуум, который всасывал крупные частицы лиофилизированного порошка в мельницу. Дополнительное инжекционное входное отверстие, следовательно, необходимо при работе при давлениях ниже 3 бар.
Эффект параметров измельчения
Эти эксперименты проводили, используя сжатый воздух при температуре конденсации 40°С при нерегулируемой температуре или влажности.
Порошки человеческого фибриногена 2 и тромбина перевозили к месту испытания в обертке из алюминиевой фольги LyoGuards. Лиофилизированные кеки дробили до мелких частиц, которые проходили через 2 мм сито SS, используя большой шпатель. 50 г каждого загружали на воронку SFVM. При низком давлении воздуха вспомогательный манометр присоединяли к каналу воронки, поскольку всасывание в канале воронки было слишком низким, чтобы выдерживать постоянную загрузку.
1. Влияние параметров измельчения на человеческий фибриноген 2
В таблице 2 представлены результаты, полученные при измельчении лиофилизированного человеческого фибриногена 2 при различных давлениях воздуха и различных скоростях загрузки.
Таблица 2
Измельчение лиофилизированного человеческого фибриногена 2 при различных давлениях воздуха
№ се-рии
Давление на мельнице (бар)
Давление на инжекторе (бар)
Скорость загрузки (кг/час)
D(50), (мкм)
D(90), (мкм)
Поток воздуха**, (м<sup>3</sup>/час)
Эксперимент №1
1
6
0
0,6
4,6
8,8
90
2
3
0
0,2
4,7
8,7
58
3
3
2
2,8
10,7
30,8
69
4
1
2
3,7
43,8
87,2
35
5
2
2
2,4
НВ*
НВ
50
Эксперимент №2
1
2
2
4,2
23,1
50,7
50
2
2
2
3,0
17,5
42
50
3
6,3
0
0,4
4,3
8
90
*НВ = Не выполнено
**В потоке воздуха использовали воздух, высушенный до температуры конденсации 40°С.
280
Все кривые распределения размера частиц (см. фиг.1) имеют вид кривой с двухфазным пиком с небольшим пиком при 0,5-1 мкм и основным пиком примерно при 10-30 мкм. На основании таблицы 2 можно отметить, что только серии 1 и 2, проведенные в эксперименте 2, имели распределения размера, подобные распределению человеческого фибриногена 2, измельченного вручную (см. таблицу 2 и фиг.1). Кроме того, как показано в таблице 3 (эксперимент №2, серии 1 и 2), самые высокие выходы фибриногена, измеренного либо по Клаусу, либо по свертываемому фибриногену (А), были достигнуты, когда основные параметры были установлены на давление 2 бар и скорости загрузки от 3 до 4,2 кг/час.
Таблица 3
Влияние различных условий измельчения на содержание воды и активность человеческого фибриногена
№ се-рии
Давление на мельнице (бар)
Давление на инжекторе (бар)
Скорость загрузки (кг/час)
Содержание воды (%)
Фибриноген (Клаус) (мг/мг твердого вещества)
Общий белок (мг/мг твердого вещества)
Сверт. фибр.* (мг/мг твердого вещества)
Эксперимент №1
1
6
0
0,6
5,34
0,24
0,57
0,35
2
3
0
0,2
НВ
НВ
НВ
НВ
3
3
2
2,8
НВ
НВ
НВ
НВ
4
1
2
3,7
НВ
НВ
НВ
НВ
5
2
2
2,4
4,96
0,35
0,68
0,36
Эксперимент №2
1
2
2
4,2
5,76
0,35
0,67
0,44
2
2
2
3,0
6,13
0,33
0,64
0,44
3
6,3
0
0,4
5,28
0,22
0,58
0,32
*Свертываемый фибриноген определяли методом А<sub>280</sub> нм.
2. Влияние параметров измельчения на порошок тромбина
Как обнаружено в прежних экспериментах, при использовании общепринятой струйной мельницы активность тромбина была относительно нечувствительной к механическому сдвигу, и, следовательно, было обнаружено, что тромбин нечувствителен к параметрам измельчения при использовании SFVM. Поэтому основной целью было нахождение условий, при которых распределение размера частиц тромбина привело бы в результате к распределению, подобному таковому для человеческого фибриногена 2. Учитывали также желание получить распределение размера частиц, которое было бы подобно таковому для тромбина, измельченного вручную. В ходе более ранних экспериментов стало очевидно, что порошок тромбина очень гигроскопичен. Тонко измельченный порошок тромбина обладает очень высокой склонностью к приему влаги. Следовательно, чем меньше размер частиц, тем быстрее увеличение содержания воды порошка тромбина. Все вышеизложенное подтверждает разработку процесса, при котором достигается большой размер частиц тромбина. Однако этот размер не должен превышать размер человеческого фибриногена 2, так чтобы оба продукта имели одинаковые суспензионные характеристики в HFE-7000.
Таблица 4
Влияние параметров измельчения на распределение размеров частиц тромбина
№ серии
Давление на мельнице (бар)
Давление на инжекторе (бар)
Скорость загрузки (кг/час)
D(50), (мкм)
D(90), (мкм)
Поток воздуха**, (м<sup>3</sup>/час)
4
6
НИ
2,7
6,1
12,8
90
5
2
НИ
1,6
10,7
29,7
40
*Инжектор не использовали
На основании таблицы 4 можно отметить, что распределение размера, полученное для тромбина при использовании низкого давления, привело в результате к большему размеру частиц и к распределению размера, которое достаточно сходно с таковым для человеческого фибриногена 2 (см. фиг.1).
Начиная с этой стадии, все рутинное крупномасштабное измельчение как для человеческого фибриногена 2, так и для тромбина с использованием SFVM прототипа 1 было нацелено на те же параметры: 2 бар в главном входном отверстии мельницы, 2 бар в инжекторе и скорость загрузки 2 кг/час.
Прототип был повторно испытан в действующем промышленном объекте с использованием азота и при работе в вытяжном шкафу с ламинарным потоком.
3. Испытание измельчения человеческого фибриногена 2
Во время измельчения человеческого фибриногена 2 влажность в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха составляла 22% и температура составляла 22°С. Все процессы изготовления проводили в асептических условиях, где скорость загрузки была нацелена на 2 кг/час, а давление инжектора было установлено на 2 бар. Измельченный человеческий фибриноген 2 хранили в стеклянных контейнерах при 2-8°С до тестирования.
Измельчению подвергали две партии: партию #1 использовали для измельчения при 2 бар при исходной активности перед измельчением 0,30-0,31 мг фибриногена на мг твердых веществ (фибриноген измерен методом Клауса), а партию #2 с оцененной исходной активностью 0,35 мг/мг (фибриноген/твердые вещества) использовали для экспериментов по измельчению при давлениях 1 и 3 бар.
Среднее содержание воды составляло 9,31±0,59% (измеренное в партии #1), как только порошок был раздроблен на частицы 2 мм. Результаты суммированы в таблице 5.
Таблица 5
Влияние давления азота при измельчении на свертываемый фибриноген (по Клаусу) и распределение размера частиц человеческого фибриногена 23, измельченного в промышленных условиях
Давление при измельчении (бар)
Метод Клауса (мг/мг твердых веществ)
Размер частицы (D50) (мкм)
Размер частицы (D90) (мкм)
1
0,36
20,4
39,1
2 (среднее из n=5)
0,30±0,01
16,6±1,0
38,4±1,7
3
0,32
10,4
28,1
После измельчения содержание воды было значительно ниже (6,66±0,57%), что указывает на то, что процесс измельчения также высушивает порошок. Профиль распределения размера частиц значительно менялся при изменении давления (см. таблицу 5 - Размер частиц D50, и фиг.2), однако измельчение при 1 бар все же приводило к узкой кривой распределения, подобной таковой для ручной мельницы (ср. фиг.1 и 2). Кроме того, как можно отметить в таблице 5, давления между 1 и 3 значительно не изменяли свертываемый фибриноген, измеренный по Клаусу.
4. Испытание измельчения тромбина
Во время измельчения тромбина влажность и температура под ламинарным потоком воздуха составляли 26% и 21°С соответственно. Весь процесс изготовления был проведен в асептических условиях. Скорость подачи 2 мм частиц была нацелена на 2 кг/час, а давление инжектора установлено на 2 бар. Измельченный тромбин хранили в стеклянных контейнерах при 2-8°С до тестирования.
Измельчению подвергали две партии: партию #3 использовали для измельчения при 2 бар. Ее исходная активность тромбина перед измельчением составляла 25,85±0,21 ед./мг твердых веществ. Среднее содержание воды составляло 6,08±0,42%, измеренное на частицах, раздробленных до 2 мм. Партию #2 использовали для экспериментов по измельчению при давлениях 1 и 4 бар. Содержание воды уменьшалось безотносительно к давлению, когда порошок измельчали сухим азотом. Результаты показывают, что давления вплоть до 4 бар не изменяют активность тромбина.
Таблица 6
Влияние давления азота при измельчении на активность тромбина и распределение размера частиц тромбина, измельченных в промышленных условиях
Давление при измельче-нии (бар)
Содержание воды (%)
Размер частицы (D50) (мкм)
Размер частицы (D90) (мкм)
Активность тромбина (ед./мг)
1
4,35
13,0
33,6
19,7
2 среднее (n=6)
4,19+0,62
10,4±1,4
17,5±3,0
24,6+1,9
4
4,07
9,2
15,6
20,3
Следует также отметить, что повышение давления от 2 до 4 бар имело только небольшое Влияние на распределение размера частиц (см. таблицу 6 и фиг.3).
5. Испытание повторяемости процесса измельчения с использованием различных партий человеческого фибриногена 2
Предшествующие эксперименты включали подачу в SFVM при непрерывной последовательности контейнеров LyoGuard при поддержании одинакового давления главного входного отверстия, давления инжектора и скорости загрузки. Подразумевали, что поддержание одинаковых условий измельчения должно привести в результате к сравнимому продукту, порошку с одной и той же влажностью, распределением размера и характеристикам свертывания. Для проверки этого принципа проводили сравнение двух партий человеческого фибриногена 2, каждую из которых подвергали нескольким сериям измельчения.
Семь контейнеров LyoGuard, которые были получены из двух партий человеческого фибриногена 2, измельчали по отдельности в SFVM. Относительная влажность в вытяжном шкафу мельницы с ламинарным потоком воздуха составляла 33%, а температура помещения составляла 22°С.
280
280
Содержание воды лиофилизированных кеков перед измельчением было сходным, 5,48% и 5,45% для партии #4 и #5 соответственно. Общее содержание белка лиофилизированного кека было почти идентичным: 0,69 и 0,68 мг белков на мг лиофилизированных твердых веществ в партии #4 и #5 соответственно. Значения свертываемого фибриногена были также очень сходными, составляя 0,41 и 0,42 мг/мг твердых веществ по анализу свертываемого фибриногена (Aнм), в #4 и #5 соответственно, и 0,35 и 0,32 мг/мг твердых веществ по анализу Клауса. После измельчения было только небольшое снижение фибриногена в среднем на 6% (до 0,39 мг/мг твердых веществ) на основании измерения по А нм или на 20% и 6% (до 0,28 и 0,30 мг/мг твердых веществ) на основании измерения методом Клауса в #4 и #5 соответственно (таблица 7 и фиг.4). Никаких изменений ни во влажности, ни в общем содержании белка не наблюдали ни в одной из партий (таблица 7).
Таблица 7
Воспроизводимость в двух партиях человеческого фибриногена
2 (#4 и #5), измельченных последовательно, в один и тот же день и в одинаковых условиях измельчения
Партия #
Содержание воды (%)
Общий белок (мг/мг твердых веществ)
Свертываемый Фиб, (мг/мг твердых веществ)
Фиб, Клаус (мг/мг твердых веществ)
Размер частиц (D50/D90) (мкм)
4
6,48
0,67
0,39
0,28
15,0/35,9
4
4,51
0,68
0,39
0,28
17,8/38,6
Сред-нее
5,50
0,68
0,39
0,28
16,4*/37,3**
СО
1,39
0,01
0,00
0,00
2,0/1,9
5
6,83
0,67
0,39
0,32
20,4/41,8
5
4,98
0,67
0,4
0,3
19,3/39,5
5
5,25
0,67
0,38
0,29
16,8/39,0
5
5,42
0,69
0,4
0,29
21,4/44,2
5
6,19
0,67
0,39
0,3
17,4/41,3
Сред-нее
5,73
0,67
0,39
0,30
19,1/41,2**
СО
0,68
0,01
0,01
0,01
1,9/2,1
*Т-критерий Стьюдента для D50- р=0,16
**Т-критерий Стьюдента для D90- р=0,07
Хотя среднее распределение размера частиц, как показывают кривые D50/D90, было неидентичным, 16,4 против 19,1 мкм и 37,3 против 41,2 соответственно, эти различия были статистически недостоверны (см. таблицу 7 и фиг.4).
Повторяемость снова оценивали, где шесть контейнеров LyoGuard, взятых из двух партий человеческого фибриногена (#6 и #7), измельчали последовательно (фиг.5 и таблица 8). Относительная влажность и температура в помещении в вытяжном шкафу с ламинарным потоком воздуха для измельчения составляли 18% и 17°С соответственно.
280
Общее содержание белка лиофилизированного кека было почти идентичным, 0,65 против 0,69 мг белка на мг лиофилизированных твердых веществ в партии #6 и #7 соответственно. Свертываемый фибриноген был по существу идентичен при 0,39 против 0,4 мг/мг твердых веществ в партии #6 и #7 соответственно. Небольшое различие было обнаружено между двумя партиями в концентрации фибриногена, которая измерена кинетическим методом Клауса, 0,47 против 0,42 в партии #6 и #7 соответственно. Такая вариабельность очень распространена при измерении фибриногена с помощью анализа Клауса в высококонцентрированных растворах фибриногена. Однако только очень редко показатели фибриногена, полученные методом Клауса, превышают свертываемый белок (А). После измельчения отсутствовали изменения в свертываемом фибриногене (А280 нм), и только небольшие снижения примерно на 11% и 5% были обнаружены в фибриногене, измеренном методом Клауса, в партиях #6 и #7 соответственно.
Также никаких изменений ни в содержании воды, ни в общем содержании белка не наблюдали ни в одной из партий. Даже хотя средние значения обоих D50/D90 были не идентичны в двух партиях, 17,9 против 18,9 мкм и 41,5 против 42,3 мкм в партии #6 и #7 соответственно, результаты распределения размера были статистически идентичными, Р>95% (см. таблицу 8 и фиг.5).
Таблица 8
Воспроизводимость двух партий человеческого фибриногена 2 (партии #6 и #7), измельченных последовательно в один и тот же день и в одинаковых условиях измельчения
Пар-тия #
Содержаниеводы (%)
Общий белок (мг/мг твердых веществ)
Свертываемый Фиб, (мг/мг твердых веществ)
Фиб, Клаус (мг/мг твердых веществ)
Размер частиц (D50/D90) (мкм)
6
3,80
0,65
0,39
0,44
18,7/42,1
6
3,30
0,67
0,39
0,40
17,0/40,9
Сред-нее
3,55
0,66
0,39
0,42
17,9/41,5
СО
0,35
0,01
0,00
0,03
1,2/0,9
7
3,70
0,70
0,40
0,41
18,7/40,5
7
3,80
0,69
0,39
0,41
17,6/38,5
7
3,70
0,69
0,40
0,40
19,4/46,7
7
3,70
0,68
0,40
0,38
19,9/43,4
Сред-нее
3,73
0,69
0,40
0,40
18,9/42,3
СО
0,05
0,01
0,01
0,01
1,0/3,6