Методология поиска новых антибиотиков: состояние и перспективы

Методология поиска новых антибиотиков: состояние и перспективы

А. С. ТРЕНИН

НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе, Москва

Methodology of Screening New Antibiotics: Present Status and Prospects

A. S. TRENIN

G. F. Gause Institute of New Antibiotics, Moscow

В связи с широким распространением устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний к существующим лекарственным препаратам, серьёзными проблемами в лечении микробных и вирусных инфекций, опухолевых заболеваний, потребность в новых антибиотиках чрезвычайно велика. В обзоре рассматриваются основные методологические подходы к созданию антибиотиков — возможностью их получения химическим синтезом или путём поиска биологически активных природных соединений, главным образом среди продуктов микробного вторичного метаболизма. Поиск природных соединений, отличающихся большим разнообразием, позволяет получать антибиотики разнообразной химической структуры и различного механизма действия, способен обеспечить создание новых эффективных лекарственных средств. Основное внимание в обзоре уделяется работе с микроорганизмами-продуцентами и образуемыми ими микробными метаболитами. Подробно рассматриваются методологические вопросы, связанные с выделением микроорганизмов из природных мест обитания, культивированием продуцентов, приводящим к накоплению ими биологически активных соединений, выделением и химической идентификацией микробных метаболитов, выявлением характера их биологического действия. Особое внимание уделяется вопросам микробного вторичного метаболизма и разработке новых моделей поиска биологически активных соединений. Рассматриваются достижения последних лет и наиболее перспективные направления дальнейших исследований. Основной методологический подход, связанный с выделением и культивированием продуцентов, сохраняет актуальность, однако нуждается в значительном усовершенствовании. Повышение эффективности поисковых работ может быть обеспечено ускорением химической идентификации антибиотиков, а также разработкой и применением новых моделей поиска, основанных на выявлении биологической активности.

Ключевые слова: поиск антибиотиков, антибактериальные, противогрибковые, противовирусные и противоопухолевые антибиотики, ингибиторы биосинтеза стеролов, мишени действия антибиотиков, новые антибиотики, микробные модели в поиске антибиотиков, микробные тест-системы, вторичный метаболизм, культивирование микробных продуцентов, миниатюризация, выделение и идентификация антибиотиков.

Due to extensive distribution of pathogen resistance to available pharmaceuticals and serious problems in the treatment of various infections and tumor diseases, the necessity of new antibiotics is urgent. The basic methodological approaches to chemical synthesis of antibiotics and screening of new antibiotics among natural products, mainly among microbial secondary metabolites, are considered in the review. Since the natural compounds are very much diverse, screening of such substances gives a good opportunity to discover antibiotics of various chemical structure and mechanism of action. Such an approach followed by chemical or biological transformation, is capable of providing the health care with new effective pharmaceuticals. The review is mainly concentrated on screening of natural products and methodological problems, such as: isolation of microbial producers from the habitats, cultivation of microorganisms producing appropriate substances, isolation and chemical characterization of microbial metabolites, identification of the biological activity of the metabolites. The main attention is paid to the problems of microbial secondary metabolism and design of new models for screening biologically active compounds. The last achievements in the field of antibiotics and most perspective approaches to future investigations are discussed. The main methodological approach to isolation and cultivation of the producers remains actual and needs constant improvement. The increase of the screening efficiency can be achieved by more rapid chemical identification of antibiotics and design of new screening models based on the biological activity detection.

Key words: antibiotic screening, antimicrobials, antifungals, antivirals, antitumors, sterol biosynthesis inhibitors, targets, new antibiotics, microbial models for antibiotic screening, microbial test-systems, secondary metabolism, producer cultivation, miniaturization, antibiotic recovery and identification.

Введение

Несмотря на грандиозные успехи, достигнутые в лечении инфекционных заболеваний благодаря использованию антибиотиков, потребность в создании новых антибиотических препаратов

© А. С. Тренин, 2015

Адрес для корреспонденции: 119021 Москва, Большая Пироговская, 11. ФГБНУ НИИНА

чрезвычайно велика. Инфекционные заболевания по-прежнему остаются угрозой, являясь основной причиной смертности в развивающихся странах и серьёзной проблемой для передовых стран [1]. Ухудшение экологической обстановки, эпидемия ВИЧ, широкое использование трансплантационной и противораковой терапии, рост числа хирургических вмешательств, широкое и

необоснованное использование антибиотиков приводит к появлению заболеваний, с трудом поддающихся лечению существующими лекарственными препаратами [2, 3]. Лекарственная устойчивость, в том числе множественная лекарственная устойчивость (МБЯ), т.е. одновременная резистентность возбудителей сразу к нескольким лекарственным препаратам, становится одной из основных проблем современной медицины [1, 4].

Наблюдается стремительный рост заболеваемости глубокими (инвазивными) микозами, протекающими крайне тяжело и характеризующимися высокой смертностью. Прогнозы развития грибковых заболеваний неутешительны. Противогрибковых препаратов относительно немного и они, как правило, высокотоксичны. Необходимы новые более совершенные противогрибковые антибиотики [5].

Одной из самых серьёзных проблем современной медицины по-прежнему остаются злокачественные новообразования, трудность лечения которых также усугубляется развитием резистентности опухолей к применяемым лекарственным препаратам. Несмотря на разработку довольно эффективных методов лечения и новых лекарственных средств, в том числе противоопухолевых антибиотиков, потребность в разработке новых противоопухолевых препаратов чрезвычайно велика [6—8].

Очевидна также необходимость создания противовирусных препаратов, особенно в свете развития эпидемии СПИДа. Как показывают результаты исследований, проведённых в последние годы, препараты, эффективные в отношении ВИЧ, могут быть разработаны на основе антибиотиков [9].

Актуальной и нерешённой до сих пор проблемой здравоохранения являются сердечно-сосудистые заболевания на почве атеросклероза. От осложнений, вызванных атеросклерозом, в ведущих странах мира в возрасте после 40 лет погибает каждый второй человек. Вопросы, связанные с возможностью медикаментозного лечения ишемической болезни сердца и профилактикой атеросклероза, весьма актуальны. Их решение в последнее время также связывают с созданием и применением новой группы антибиотических препаратов — статинами, являющимися ингибиторами биосинтеза стеролов [10].

Особую тревогу вызывает тот факт, что стремительное увеличение числа заболеваний, вызываемых устойчивыми формами микроорганизмов, происходит на фоне очевидных трудностей в создании новых лекарственных препаратов. Число новых антибиотиков, прошедших всесторонние испытания и рекомендованных к клиническому использованию, с каждым десятилетием неуклонно снижается [11—14]. Существующие

подходы к созданию новых антибиотиков трудоёмки и не позволяют обеспечить должной эффективности поисковых исследований [15]. Методология поисковых работ и создания новых антибиотиков нуждается в серьёзном усовершенствовании [16—18].

1. Пути создания новых антибиотиков

Как известно, антибиотики являются биологически активными соединениями, в основном природного происхождения, и образуются различными организмами, главным образом микроорганизмами [17, 19]. Основным способом получения антибиотиков является культивирование микробных продуцентов в условиях, способствующих наилучшему выходу целевого продукта, с последующим выделением и химической очисткой препаратов. Этот подход, нередко сопровождаемый химической или биологической трансформацией антибиотиков с целью улучшения их биологических свойств, как полагают, способен обеспечить создание новых эффективных лекарственных препаратов [6, 7, 11, 12, 16, 18, 20—23].

Знание полной структуры природных антибиотиков позволяет в ряде случаев осуществить синтез природного соединения химическим способом. Тем не менее основная масса антибиотиков производится микробиологическим путём и главным способом разработки новых антибиотических препаратов является поиск подобных соединений в природе [17, 18, 24—27].

Другим важным направлением в создании новых антибиотиков является получение и тестирование оригинальных синтетических препаратов. В этом случае наиболее пристального внимания заслуживают соединения, относящиеся к ранее не изученным классам химических веществ, а также производные, получаемые в ряду уже зарекомендовавших себя классов химических соединений [28]. Подобный путь создания новых лекарственных препаратов безусловно заслуживает внимания, однако следует признать, что в настоящее время результаты, полученные с его помощью, значительно уступают успехам, сопутствующим разработке антибиотиков, получаемых на основе природных метаболитов [11, 12, 23].

Микроорганизмы по-прежнему остаются важнейшим и практически неисчерпаемым источником лекарственных соединений [11, 12, 15, 29, 30]. В процессе поиска и выделения новых микробных вторичных метаболитов удается получать соединения, обладающие принципиально новой химической структурой и механизмом действия [11, 12, 15, 16, 23, 28, 31]. Большинство антибиотиков были получены путём выделения микроорганизмов из природных мест обитания, главным образом из почвы, и последующего

культивирования в лабораторных условиях с получением целевого продукта [6, 11 ,12, 15, 17].

Эффективность и конечный результат поиска новых антибиотиков во многом зависят от применяемых методологических подходов. Современные концепции в области поиска преследуют цель существенно снизить затраты, связанные с повторным выделением и «переоткрытием» уже известных препаратов. Для идентификации подобных веществ на наиболее ранних этапах поиска разрабатываются компьютерные базы данных, широко используются современные методы анализа, позволяющие выявить принадлежность метаболитов к конкретным классам химических соединений [7, 11, 12, 20, 24].

Очевидно, что в силу непомерно большого объёма исследований практически невозможно осуществлять тотальную проверку всех выделяемых в процессе поисковых работ микробных метаболитов. Для выявления среди них веществ, обладающих биологическим действием, позволяющим рассматривать их в качестве потенциальных лекарственных средств, необходим целенаправленный отбор, в основе которого должно быть ясное представление о конечной цели — создании препарата с определённой биологической активностью. Вот почему основной упор делается на разработку новых модельных систем, позволяющих выявлять препараты по их биологической активности и соответственно находить образующие их штаммы-продуценты [18, 22].

Методология поиска стремится учесть такие факторы, как механизм действия препарата, его принадлежность к определённому классу химических соединений, химическую структуру, особенности биосинтеза, потенциальную биологическую роль в физиологии микроорганизма-продуцента и целый ряд других немаловажных факторов, способных кардинальным образом влиять на эффективность и конечный результат поисковой работы [20, 29].

Поскольку подобные разнообразные факторы, заложенные в методологию поиска, весьма неравноценны и обладают разной значимостью на различных этапах исследования, вся система поиска биологически активных веществ требует выработки соответствующей системы приоритетов [32, 33].

Поиск и ранняя идентификация природных соединений, ориентированные на химические характеристики препаратов, их принадлежность к определённым, заранее намеченным классам химических соединений, т.е. проведение так называемого. «химического» скрининга [34], существенно повышают эффективность поисковых работ, однако в наибольшей степени проявляют себя в поиске аналогов уже известных препаратов [35].

Для эффективного обнаружения принципиально новых биологически активных соединений, необходим подход, направленный в первую оче-

редь на выявление их биологической активности. Поиск новых антибиотиков, ориентированный на механизм действия отбираемых соединений, широко используется в мировой практике, приносит успех, позволяет создавать лекарственные препараты, становящиеся родоначальниками новых классов биологически активных соединений (противоопухолевые антибиотики, антибиотики-иммуномодуляторы, гиполипидемические препараты и др.) [13, 22].

Эффективный поиск, направленный на выявление биологической активности соединений, возможен лишь при наличии в практике лаборатории соответствующих биологических и биохимических моделей поиска. От их чувствительности, надёжности, пригодности к использованию для анализа биологически активных метаболитов, прошедших лишь начальные этапы химической очистки на ранних этапах поисковых работ, зависит конечный результат исследований — выявление новых биологически активных соединений [36, 37].

Поскольку практически невозможно создание единого универсального теста, отвечающего одновременно всем критериям, модели разрабатываются для каждой конкретной, отличной от других по механизму действия, группы антибиотиков. Как правило, требуется создание комплекса тестов, обладающих разной эффективностью на разных этапах поиска, и разработка наиболее эффективной схемы их применения.

В поисковой работе используются методологические подходы, позволяющие наиболее полно раскрыть потенциальные возможности микробных продуцентов. Проводимый при этом комплекс работ включает:

♦ выделение микроорганизмов из природных мест обитания,

♦ культивирование продуцентов, приводящее к накоплению ими биологически активных соединений,

♦ выделение и химическую идентификацию микробных метаболитов,

♦ выявление характера их биологического действия (типирование).

Таким образом, все многочисленные манипуляции, используемые при проведении поисковых исследований, можно отнести к двум основным категориям — работе с микроорганизмами-продуцентами и к работе с образуемыми ими микробными метаболитами.

2. Новые методологические подходы в работе с микроорганизмами-продуцентами: выделение и культивирование продуцентов, изучение вторичного метаболизма

2.1. Выделение продуцентов

Микроорганизмы — ценный источник получения разнообразных биологически активных соединений. Их выделению из природных источников уделяется в настоящее время большое внимание [7, 34, 38].

Постоянно совершенствуются методы поиска, изоляции и идентификации микроорганизмов [24]. Особое внимание уделяется редким видам микроорганизмов, как потенциальному источнику новых, ранее неизвестных, антибиотиков [23, 32, 38, 39].

Не все микроорганизмы удается изолировать, не все они поддаются успешному культивированию [40, 41]. Имея в виду химическое разнообразие препаратов, выделенных из культивируемых микроорганизмов, можно ожидать, что многие продукты жизнедеятельности почвенных микроорганизмов по-прежнему остаются неоткрытыми [11, 12, 15, 32, 39]. Существует настоятельная необходимость в создании новых более эффективных методов выделения и культивирования микроорганизмов-продуцентов. Кроме того, необходима разработка подходов, позволяющих использовать некультивируемые микроорганизмы [12, 17, 32].

В настоящее время имеются перспективы изучения биохимии почвенных микроорганизмов, а также доступ к их метаболитам без использования традиционных методов культивирования. Основанные на применении геномных манипуляций, такие подходы подразумевают выделение из почвы не самих микроорганизмов-продуцентов, а их генома. Предполагается, что путём прямого клонирования выделенной из почвы ДНК в виде искусственных бактериальных хромосомных векторов и создания общих геномов («метагеномов») с геномами Е.еоН или других организмов-реципиентов откроется доступ к новым метаболитам, в том числе новым антибиотикам [32, 42].

Проводимые в настоящее время исследования свидетельствуют о том, что подобный подход технически возможен и способен принести определённый успех. Например, таким способом, благодаря созданию и использованию метагеномных библиотек, состоящих из клонов ДНК Е.еоН, содержащих фрагменты ДНК почвенных микроорганизмов, удается получать новые биологические соединения, в том числе новые антибиотики, в частности турбомицин, террагины, а также обладающие широким спектром антибактериального действия виолацеин и дезоксивиолацеин [42, 43].

Тем не менее приходится констатировать, что в силу чрезвычайно высокой трудоёмкости использование метагеномного подхода для разработки новых антибиотиков остается весьма проблематичным, а новые препараты по-прежнему получают менее трудоёмким традиционным способом, с помощью изолированных из

природных источников микроорганизмов продуцентов [16, 18, 25, 44].

2.2. Изучение вторичного метаболизма

Способность микроорганизмов к образованию веществ, обладающих антибиотическими свойствами, является результатом существования и успешного функционирования в микробных клетках особых биохимических процессов, объединяемых понятием вторичного метаболизма. Как известно, реакции вторичного метаболизма не связаны непосредственно с процессами получения энергии или строительством компонентов клетки [17]. Сами антибиотики — типичные вторичные метаболиты — справедливо рассматриваются в качестве одного из наиболее важных продуктов микробного метаболизма этого типа [11, 19].

Изучение вторичного метаболизма помогает выявить способность микроорганизмов-продуцентов к конкретным биохимическим процессам и соответственно повысить вероятность обнаружения образуемых ими вторичных метаболитов [13].

Этому может способствовать также изучение процессов, общих для первичного и вторичного метаболизма, в частности изучение влияния А-фактора и подобных ему соединений стрептоми-цетов, выполняющих функцию авторегуляторов, являющимся, по-видимому, важной составной частью бактериальной системы кворум-сенсинга [45]. Образование подобных веществ и их накопление культурой-продуцентом обычно предшествует началу активного синтеза антибиотика [46]. Дерепрессируя определённые участки ДНК Streptomyеes ^яеия, Б.еогНеоЫг, некоторых других актиномицетов, А-фактор и сходные с ним другие сигнальные молекулы бутиролактонов осуществляют запуск разнообразных процессов, необходимых в конечном счёте как для морфогенеза, так и для вторичного метаболизма продуцентов [17, 45].

Важными регуляторными функциями, необходимыми для поддержания нормальной жизнедеятельности образующих их микроорганизмов, обладают, по-видимому, некоторые антибиотики, например монензин, стауроспорин и его аналоги, являющиеся сильными ингибиторами некоторых протеинкиназ, а также полимиксины В и Е, разнообразные микроцины [45, 47, 48]. Применение подобных регуляторных факторов в исследовательской работе способно влиять на биосинтез антибиотиков и соответственно может повысить вероятность обнаружения новых антибиотиков в поисковой работе.

Образование вторичных метаболитов в значительной степени зависит от состояния и функционирования систем первичного метаболизма, поскольку последний, определяя основные биохимические процессы, способствует накоплению необходимого строительного материала. Ан-

тибиотики синтезируются из продуктов первичного метаболизма, таких как органические кислоты, аминокислоты, сахара. Повышенное внимание к отдельным аспектам первичного метаболизма штаммов-продуцентов, в частности к метаболизму у них аминокислот, может способствовать лучшему выявлению потенциальных возможностей штаммов-продуцентов. Например, при выделении из почвы микроорганизмов, обладающих изменённой регуляцией биосинтеза аминокислот, удается резко повысить вероятность обнаружения продуцентов новых антибиотиков [46, 49, 50].

2.3. Культивирование продуцентов

Вторичные метаболиты не являются незаменимыми веществами, для их биосинтеза ещё недостаточно присутствия в клетках определённой обусловливающей их синтез генетической информации [51]. Для активной экспрессии генов вторичного метаболизма необходимо создание особых условий [24]. Хорошо известно влияние на биосинтез антибиотиков состава питательной среды, уровня аэрации и прочих факторов, изменение которых влечёт за собой многочисленные вариации в продукции вторичных метаболитов [34, 51—53]. Внесение в среду культивирования различных элементов и биохимических метаболитов способно существенно повлиять на образование культурой-продуцентом антибиотиков, резко изменить состав образуемого ею антибиотического комплекса [53]. Таким образом, для выявления потенциальных способностей микроорганизмов к образованию антибиотиков целесообразно проводить выращивание свежевыделенных из почвы новых продуцентов в необычных условиях, в том числе, используя новые способы культивирования, связанные с применением необычной микробиологической посуды, в частности стерильных пластиковых планшетов [23, 51, 54, 55]. Методы, направленные на миниатюризацию и механизацию микробиологических исследований, способствуют эффективному подбору условий культивирования штаммов-продуцентов и увеличению пропускной способности скрининга. Культивирование в пластиковых планшетах позволяет активизировать работу со штаммами-продуцентами при изучении их культуральных и физиолого-биохимических свойств, ростовых потребностей и способности к продукции биологически активных соединений и, в целом, позволяет значительно снизить трудоёмкость изучения штаммов-продуцентов [37].

Методы миниатюризации чрезвычайно полезны также в работе с микробными тест-культурами. На основе использования микрометодов и культивирования микроорганизмов в пластиковых планшетах удается разработать эффективные микрометоды определения антимикробной ак-

тивности [56, 57], а также новые микробные тест-системы, необходимые для поиска новых антибиотиков, в частности ингибиторов биосинтеза сте-ролов, требующие выполнения большого количества манипуляций, постановки значительного числа повторов в опыте, необходимых для проведения статистической обработки получаемых результатов [37, 58—60].

2.4. Биохимические и генетические аспекты биосинтеза антибиотиков

Хорошо известна способность многих штаммов-продуцентов, особенно в группе актиноми-цетов, к образованию одновременно нескольких различных антибиотиков. Секвенирование геномов продуцентов показало существование в каждом из них разнообразных генных кластеров, ответственных за образование антибиотиков различных групп [49], и явилось подтверждением концепции антибиотикообразования, основная идея которой выражается формулой «один штамм — много соединений». Это подразумевает необходимость тщательного изучения каждого конкретного штамма-продуцента [61].

Значительные успехи в последние годы достигнуты в изучении путей биосинтеза вторичных метаболитов, что стало возможным благодаря тесной кооперации специалистов различного профиля, широкому внедрению генетических методов исследования. Особый прогресс наблюдается в изучении вторичных метаболитов, синтезируемых по поликетидному пути, имеющему немало общих черт с системой синтеза жирных кислот, при которой непосредственно вслед за конденсацией очередной малонатной единицы происходит восстановление карбонильных групп, в результате чего образующаяся углеродная цепь обладает линейной структурой и насыщенными углеродными связями [62, 63]. Поскольку при биосинтезе вторичных метаболитов подобного восстановления либо не происходит, либо оно осуществляется частично, образующиеся углеродные структуры имеют характер ароматических или макролидных колец. По этой схеме синтезируются тетрациклины, антрациклины, анзамицины, макролиды и ряд других известных антибиотиков [62]. Досконально изучена схема биосинтеза указанных антибиотиков с выявлением работающих на её отдельных этапах ферментов, ответственных за синтез, циклизацию и восстановление образуемых поликетидных структур.

Гены, кодирующие соответствующие ферменты, картированы [11, 49, 62, 64, 65], участки ДНК, ответственные за биосинтез многих антибиотиков, локализованы [15, 66], геном ряда продуцентов полностью расшифрован [67]. Клонированы гены поликетидсинтаз — больших многофункциональных ферментов, занятых в образовании многих антибиотиков, таких как тет-

рациклин, турбомицин, полиеновые антибиотики и многие другие [49, 62, 63, 68].

Знание точной локализации генов позволяет посредством применения генно-инженерных методов создавать штаммы продуценты, обладающие разным набором генов биосинтеза, открывает новые перспективы для получения подобными гибридными организмами «гибридных» молекул антибиотиков [16, 62, 63, 68].

Комбинирование генов поликетидного синтеза было проведено у различных стрептомицетов — продуцентов актинородина, авермектина, эритромицина [62]. Выявлен «минимальный» набор генов, контролирующих образование молекул антибиотиков, в т.ч. длину цепи, степень её восста-новленности, циклизацию [28]. Изучены разновидности подобных генов у различных стрептомицетов, выявлены их филогенетические связи. Полученные результаты демонстрируют, что описываемый подход, основанный на комбинировании генов, позволяет эффективно влиять на структуру новых «гибридных» молекул [62,69].

Вместе с тем гены, участвующие в биосинтезе антибиотиков, весьма многочисленны, локализованы в различных частях хромосомы продуцента, могут иметь плазмидную локализацию [15], что в совокупности сильно затрудняет их выделение и последующую слаженную организацию работы в новом генно-инженерном продуценте [70]. К тому же для эффективной работы такого гибридного продуцента необходимо учитывать степень его устойчивости к образуемому им антибиотику [71]. В связи с этим параллельно с выделением и клонированием генов биосинтеза проводится выделение и клонирование имеющихся у продуцентов генов устойчивости. Клонированы гены, обусловливающие резистентность Б.аШШоНеш к олеандомицину [72], Amyеolatopsis mediterranei к гликопептидному антибиотику балхимицину [73], другим антибиотикам [49, 74].

Яркой иллюстрацией возможности создания «гибридных» препаратов, являются работы в области генно-инженерных антибиотиков полиенов [69]. Например, антибиотик 844ИР, полученный генно-инженерной модификацией продуцента нистатина Streptomyеes noursei, обладает гидрофильным участком лактонового кольца, аналогичным исходному препарату нистатину, а по своей гидрофобной части оказывается полным аналогом другого антибиотика — амфотерицина В. Генетически модифицированные антибиотики полиены могут быть с успехом использованы в качестве основы для создания новых химически модифицированных производных [75].

Важно отметить, что, несмотря на очевидные достижения в этой области, работа по созданию генно-инженерных продуцентов путём выделения и клонирования всех генов, ответственных за

успешный биосинтез антибиотика, оказывается чрезвычайно трудоёмкой и не гарантирует положительного результата [3, 16]. Вот почему в создании ценных с практической точки зрения продуцентов по-прежнему не утратил значения метод слияния протопластов [76]. Проводя манипуляции не с отдельными генами, а с целыми геномами или блоками генов у недостаточно изученных с генетической точки зрения штаммов, исследователи добиваются существенного и нередко полезного изменения их свойств [77]. Использование на ранних этапах поиска процедуры протопласти-рования клеток продуцентов, в том числе в сочетании с УФ-облучением, оказывает воздействие на продуктивность микроорганизмов и в конечном итоге на обнаружение образуемых им биологически активных метаболитов [78].

Таким образом, в настоящее время подходы к изучению микробных продуцентов на начальном этапе поисковых исследований, связанные с разработкой новых способов изоляции микробных продуцентов из природных мест обитания и использованием новых необычных условий культивирования, удается существенно развить и дополнить. Благодаря успехам в изучении биохимических основ вторичного метаболизма, выявлению генетической природы образования многих антибиотиков, стало возможным проведение целенаправленных перестроек генома продуцентов, приводящих к существенному изменению биосинтеза ими вторичных метаболитов, увеличению активности продуцентов и созданию новых «гибридных» антибиотиков.

3. Новые методологические подходы к работе с микробными метаболитами, их выделение и идентификация, выявление характера биологического действия

3.1. Выделение и идентификация микробных метаболитов

Развитие и широкое использование компьютерных баз данных, применение высокоэффективной жидкостной хроматографии, УФ- и ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии, других методов позволяет существенно увеличить вероятность обнаружения метаболитов, принадлежащих к определённым заранее намеченным классам соединений и тем самым резко повысить скорость и эффективность химической идентификации антибиотиков [7, 20, 79]. По-видимому, дальнейшее совершенствование физико-химических методов быстрой идентификации антибиотиков является одним из наиболее важных и перспективных направлений, способствующих ускорению и интенсификации поисковых иссле-

дований. Тем не менее использование этих методов требует проведения ряда подготовительных операций, подразумевающих обработку культу-ральной жидкости и мицелия продуцентов, обычно включающую в себя экстракцию микробных метаболитов химическими растворителями, упаривание, хроматографию, другие химические методы очистки препаратов. Химические методы выделения и очистки, основанные, как правило, на знании свойств выделяемых вторичных метаболитов, главным образом растворимости в воде или различных органических растворителях, нередко оказываются весьма трудоёмкими и далеко не всегда позволяют в активном виде выделить изучаемые вещества [20].

Следует отметить, что, помимо своей трудоёмкости, подобные методы не могут гарантировать извлечения всех перспективных метаболитов, имеющихся в культуральной жидкости и мицелии конкретного штамма-продуцента, и соответственно не обеспечивают полного выявления указанных метаболитов в ходе поисковых работ. Кроме того, содержание биологически активных соединений в культуральной жидкости может оказаться низким и, при использовании малочувствительных тестов, недостаточным для выявления биологически активных соединений. Тогда, наряду с извлечением изучаемых веществ и их очисткой от нежелательных компонентов питательной среды и других примесей, может потребоваться некоторое, иногда существенное, концентрирование исследуемых метаболитов.

В настоящее время разрабатываются новые подходы к выделению вторичных метаболитов, позволяющие применять более универсальные и менее трудоёмкие методы, включая скоростное центрифугирование, микро- и ультрафильтрационную очистку кудьтуральной жидкости [37]. Сочетание таких приёмов с классическими методами очистки даёт существенный выигрыш в работе, особенно на начальном этапе поиска, позволяет эффективнее проводить выделение вторичных метаболитов, необходимое для их испытания в последующих специальных тестах [24]. Концентрирование микробных метаболитов в образцах культуральной жидкости, необходимое для их обнаружения в специальных тестах, при этом может быть достигнуто с помощью лиофилизации [9].

Применение операций, способствующих лучшему выделению биологически активных соединений несомненно вносят существенный вклад в успех поисковых работ. Однако наиболее значимую роль в поиске играют методы, позволяющие получить представление о характере биологичес-

кой активности выделяемых соединений, их возможном механизме действия [18, 36, 41, 58, 59, 80].

3.2. Выявление характера биологического действия (типирование)вторичных метаболитов

Методы типирования биологической активности позволяют получить представление о возможном механизме действия микробных метаболитов и сделать вывод о целесообразности дальнейшего изучения обнаруженных соединений, а также образующих их микробных штаммов. Совершенствованию методов выявления биологической активности, разработке новых более рациональных схем их применения уделяется в настоящее время самое пристальное внимание. От них в первую очередь зависит конечный результат и эффективность всех поисковых работ.

В отличие от достаточно универсальных микробиологических и химических методов, используемых при культивировании штаммов-продуцентов и очистке образуемых ими микробных продуктов, специальные методы поиска, основанные на выявлении биологического действия препаратов, имеют значительно более узкую направленность. Как правило, они предназначены для выявления микробных метаболитов, принадлежащих к отдельным конкретным группам биологически активных соединений [28, 29], например, специально разрабатываются для поиска антибиотиков-иммунодепрессантов [81], противоопухолевых антибиотиков [82], или препаратов, специфические особенности механизма действия которых позволяют преодолевать лекарственную устойчивость [41, 83].

Для поисковых исследований необходима разработка специальных тестов, пригодных для использования на самых ранних этапах поиска, например, в отборе биологически активных метаболитов, прошедших лишь начальные этапы химической очистки. Такие тесты должны отвечать целому ряду требований:

♦ позволять делать корректные выводы о характере биологической активности тестируемых метаболитов;

♦ обладать достаточно высокой чувствительностью;

♦ не давать ложноотрицательных результа-тов1;

♦ не давать большого числа ложноположи-тельных результатов2;

♦ применяться на разных этапах скрининга, в т.ч. на начальных этапах работы с продуцентами (желательно на уровне тестирования культураль-ной жидкости и грубоочищенных препаратов);

♦ быть относительно недорогими и простыми в использовании;

1 В противном случае при проведении отбора будут в большом количестве отсеиваться ценные метаболиты.

2 В противном случае отбор теряет свою эффективность, поскольку осуществляется слишком малый отсев ненужных веществ.

• обладать высокой пропускной способностью;

♦ быть перспективными для дальнейшей механизации и автоматизации.

Очевидно, что практически невозможно создание универсального теста, в равной степени отвечающего всем перечисленным выше критериям.

Для отбора микробных метаболитов, обладающих специфическим механизмом действия, необходима разработка и использование целого комплекса тестов, обладающих различной эффективностью на разных этапах поисковой работы. Тесты, способные давать лишь приблизительное представление о механизме действия отбираемых препаратов, вполне приемлемы и могут в силу своей простоты и дешевизны применяться на ранних этапах поиска. Важно, чтобы они не давали ложноотрицательных результатов, но при этом эффективно способствовали значительному сужению круга поиска. На более поздних этапах целесообразно применение более информативных, но нередко и более трудоёмких тестов. Таким образом, в поиске биологически активных веществ микробного происхождения необходимо использование комплексного подхода, подразумевающего умелое сочетание различных методов типиро-вания биологической активности.

Разработка моделей поиска, направленных на выявление биологической активности микробных метаболитов, требует серьёзного анализа разнообразных сведений, касающихся механизма действия препаратов, структуры и функционирования чувствительных к этим препаратам мишеней. Эффективные модели поиска должны содержать в себе подобные мишени [18, 22, 29, 36, 41, 64, 84].

В качестве модели для поиска ингибиторов биохимических процессов нередко используются конкретные биохимические реакции [9, 26, 82, 84]. К сожалению, их использование не гарантирует того, что отобранные с их помощью соединения, эффективно подавлявшие соответствующую реакцию in vitro, смогут достигать природную мишень и соответственно проявить свои потенциальные способности в реальных условиях [16, 18, 33]. Кроме того, отбор, основанный на использовании биохимических реакций, как правило, требует анализа хорошо очищенных соединений. Он плохо применим на ранних этапах поиска природных метаболитов, содержащих, как известно, большое количество примесей [20, 29, 35].

Вот почему более целесообразным нередко оказывается разработка и применение в поисковых исследованиях моделей, основанных на использовании целых клеток. Это могут быть разнообразные микроорганизмы [24, 41, 80, 82, 85], или культуры клеток млекопитающих [31, 82, 86,

87]. Разрабатываются модели с использованием инфицированных многоклеточных организмов, среди которых могут быть как традиционные объекты (мыши), так и беспозвоночные животные — фруктовая мушка Drosophila melanogaster или круглые черви — нематоды Caenorhabditis ele-gans [33, 88, 89].

Большой интерес представляет также обращение к необычным группам бактерий, таких как ар-хебактерии, многие свойства которых роднят их с клетками млекопитающих. Несколько видов га-лофильных архебактерий являются отличными модельными организмами, используемыми для исследования различных аспектов биохимии и молекулярной биологии, в частности, для изучения экспорта и деградации белков, регуляции транскрипции, поддержания структуры и репликации хромосом [90]. На их основе возможна разработка моделей поиска новых антибиотиков, в частности, ингибиторов биосинтеза стеролов и противоопухолевых антибиотиков [59, 60]. С помощью бактериальной модели Halobacterium sali-narum, разработанной в виде микрометода и используемой на начальных этапах скрининга антибиотиков были отобраны природные антибиотики — ингибиторы ранних и поздних этапов биосинтеза стеролов, перспективные для разработки средств лечения атеросклероза и грибковых инфекций [37, 91—93], а также производные трисин-долилметанов — аналогов антибиотика турбоми-цина А, полученных в НИИНА им. Г. Ф. Гаузе путём полного химического синтеза [60, 94].

4. Достижения и перспективны дальнейших скрининговых исследований

В настоящее время активно разрабатываются подходы к поиску антибиотиков, действие которых направлено на мишени, ранее широко не использовавшиеся в скрининговых исследованиях. Предложена новая модель поиска ингибиторов у-глютамил спермин синтетазы PAUA2 — одной из шести у-глютамил полиамин синтетаз, имеющихся у Pseudomonas aeruginosa, ответственных за катаболизм полиаминов, жизненно необходимых для роста возбудителя [95]. Поиск биологически активных соединений — ингибиторов бактериальной ДНК гиразы/топоизомера-зы, позволил получить новый антибиотик широкого спектра действия — AZD0914 [96]. Скрининг ингибиторов цистеиновой протеазы фальципаин-2 — одного из факторов вирулентности малярийного плазмодия, способствущего разрушению гемоглобина, позволил выделить новый антибиотик с антималярийным действием фальцитидин, образуемый почвенной миксо-бактерией Chitinophaga sp. [26]. При поиске ан-

тибиотиков, способствующих восстановлению активности бета-лактамов в отношении мети-циллинрезистентного Staphylococcus aureus (MRSA), обнаружены два новых природных антибиотика — циклический депсипептидный антибиотик кризиномицин и липогликопептид-ный антибиотик актинокарбазин, являющиеся ингибиторами сигнальной пептидазы I типа SpsB, предоставляющей сериновую протеазу, необходимую для секреции белков. Синтетическое производное актинокарбазина M131 обладало способностью восстанавливать и усиливать действие бета-лактамного антибиотика имипе-нема в отношении штаммов MRSA [97]. Наконец, проведение активного поиска в группе ингибиторов биосинтеза стеролов позволило обнаружить антибиотики, обладающие не только гиполипидемическим или антифунгальным, но также противовирусным и противоопухолевым действием [10].

Весьма перспективным направлением является поиск так называемых адъювантных соединений, способных усиливать подавляющее действие других антибиотиков. В ходе проведения такого поиска удалось обнаружить новые низкомолекулярные соединения, резко усиливающие активность существующих антибактериальных препаратов, в частности, был выявлен новый класс антрациклиновых антибиотиков, способных повысить чувствительность грамотрица-тельных бактерий к препаратам, исходно активным лишь в отношении грамположительных бактерий. Наблюдаемое повышение активности происходило, по-видимому, за счёт подавления адъювантами процессов активного выброса антибиотиков из клеток [98].

Способность к усилению действия антибиотиков, главным образом, за счёт подавления помпового выброса, выявлена также у алкалоидов, представляющих собой большую структурно разнообразную группу соединений, используемых для получения таких важных антибактериальных препаратов, как метронидазол и хинолоны. Обнаружено, что новый хинолоновый алкалоид ак-тиномицетного происхождения CJ-13136 и сква-ламин-полиаминный алкалоид, выделенный из катрановой акулы, способны усилить чувствительность грамотрицательных бактерий к ципро-флоксацину [99].

Особого внимания заслуживает поиск биологически активных соединений, подавляющих экспрессию у возбудителей факторов вирулентности. К такому подавлению способны некоторые антибиотики, применяемые в субингибитор-ных концентрациях [100, 101]. Недавно с помощью компьютерного поиска удалось обнаружить новые низкомолекулярные соединения, обладающие антивирулентной активностью в от-

ношении метициллинорезистентных штаммов S.aureus. Вымвленные соединения действовали на регулятор ArgA, вытолняющий у этого возбудителя функцию транскрипционного фактора, необходимого для экспрессии генов токсинообразо-вания. Не влияя на рост возбудителя, указанные низкомолекулярные соединения активно подавляли образование а-гемолизина и фенолораство-римого модулина — токсинов, участвующих в патогенезе заболеваний, вызываемых золотистым стафилококком [102].

При проведении скрининга антибиотиков, подавляющих связывание бактериального липо-полисахарида — компонента клеточной стенки грамотрицательных бактерий, известного как бактериальный эндотоксин, с рецептором CD14 лейкоцитов человека, удалось выявить активно блокирующие подобное связывание антибиотики педопептины A, B и С, образуемые грамотри-цательной бактерией Pedobacter sp. SANK 72003, перспективные для лечения сепсиса и септического шока [44].

Поиск ингибиторов миграции опухолевых клеток позволил выделить из культуральной жидкости Streptomyces sp. MI264-NF2 новые вторичные метаболиты — миграцины А и В, подавляющие миграцию клеток лёгочной аденокарциномы А549 и фибросаркомы HT-1080, перспективные для дальнейшей разработки препаратов, подавляющих метастазирование опухолей в организме человека [87].

Перспективным направлением является поиск антибиотиков, подавляющих формирование возбудителями биоплёнок, защищающих их от воздействия антибиотиков и других биологически активных соединений. Биоплёнки представляют собой сложное сообщество микроорганизмов, прикреплённых к поверхности и погружённых в продуцируемую ими же внеклеточную матрицу. Изучению биоплёнок и действию на них различных соединений уделяется в настоящее время большое внимание [103].

Поскольку клетки биоплёнки приобретают повышенную толерантность к антимикробным соединениям и иммунной системе хозяина, инфекционные заболевания, сопровождающиеся образованием биоплёнок, имеют тенденцию переходить в хроническую форму. Активно проводится разработка средств, подавляющих образование биоплёнок [104].

Тот факт, что у бактерий рода Salmonella инактивация любой из систем активного мульти-лекарственного выброса приводит к подавлению транскрипции компонентов матрицы биоплёнки и соответственно к подавлению формирования биоплёнки [105], свидетельствует о тесной взаимосвязи указанных процессов и открывает новые перспективы решения столь важной проблемы.

За последние два — три года удалось выделить целый ряд новых оригинальных соединений. Среди вторичных метаболитов глубоководной культуры Nocardiopsis alba обнаружено семейство новых дикетопиперазиновых антибиотиков, обладающих выраженным противоопухолевым действием [7]. Выделены новые антибиотики андропростамины А и В, образуемые Streptomyces sp. MK 932-CF8, обладающие низкой токсичностью, подавляющие андрогенный рецептор, являющийся характерной мишенью рака простаты [31]. Выделен новый ами-нометилциклиновый антибиотик омадациклин, разработанный для внутривенного и перорального введения, предназначенный для лечения многих инфекционных заболеваний, включая острые бактериальные инфекции кожи и мягких тканей, пневмонию и инфекции мочевого тракта, вызываемые резистентными к метициллину штаммами S.aureus, резистентными к ванкомицину штаммами Enterococcus, гемолитическими стрептококками и устойчивыми к пенициллину штаммами Streptococcus pneumoniae [106].

Выделены аминогликозидный антибиотик нового поколения плазомицин, активный в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и устойчивый к действию наиболее клинически значимых аминогликозид-модифициру-ющих ферментов [107], новый липопептидный антибиотик широкого спектра действия пенибак-терин [108], новый циклический липопептидный антибиотик баттацин, обладающий выраженным бактерицидным действием в отношении грамот-рицательных бактерий, способный к активному разрушению мембран этих микроорганизмов [109], а также антибиотики мангромицины А и В, обладающие значительной антитрипосомальной активностью [79]. Открыт новый класс борсодер-жащих антибактериальных препаратов [110] и переоткрыт «старый» антибиотик нибомицин, но уже с новыми свойствами — действием на хино-лоноустойчивые штаммы S.aureus [83].

Проведённые исследования свидетельствуют о том, что благодаря разработке и внедрению в поисковую практику эффективной модели, основанной, главным образом, на типировании биологической активности, как правило, достигается положительный конечный результат.

ЛИТЕРАТУРА

1. Shallcross L.J., Davies S.C. The World Health Assembly resolution on antimicrobial resistance. J Antimicrob Chemother 2014; 69: 11: 2883—2885.

2. MonnetD.L. Raising awareness about prudent use of antibiotics: a necessity for the European Union. Enferm Infecc Microbiol Clin 2010; 28: Suppl: 4: 1—3.

3. Livermore D.M. Fourteen years in resistance. Int J Antimicrob Agents 2012; 39: 4: 283—294.

4. Magiorakos A.P., Srinivasan A., Carey R.B. et al. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin Microbiol Infect 2012; 18: 3: 268—281.

Заключение

Подводя итог, следует признать, что микроорганизмы остаются важнейшим источником лекарственных препаратов, важным и эффективным способом получения антибиотиков по-прежнему остается выделение и культивирование продуцентов в лабораторных условиях. В процессе поиска и выделения новых микробных вторичных метаболитов удается получать соединения, обладающие принципиально новой химической структурой и механизмом действия. Очевидно, что подход, связанный с созданием новых антибиотиков на основе проведения поиска среди продуктов микробного метаболизма, себя не исчерпал и требует дальнейшего развития.

Работы с микроорганизмами, а также продуктами их жизнедеятельности по-прежнему остаются в центре внимания исследователей, а разработка новых методов поиска антибиотиков среди продуктов микробного метаболизма приобретает ещё большую актуальность. Несмотря на появление многообещающего направления в поисковых исследованиях, связанного с применением «метагеномного» подхода, получение антибиотиков традиционным путём при культивировании продуцентов не утратило своей актуальности. Основные усилия в поиске направлены, главным образом, на разработку новых необычных способов культивирования микробных продуцентов, способов очистки образуемых ими вторичных метаболитов, а также ускоренную химическую идентификацию антибиотиков. Однако одним из наиболее радикальных способов повышения эффективности поисковых работ, по-видимому, является создание новых оригинальных методов типирования биологической активности выделяемых соединений.

Таким образом, основной методологический подход к созданию новых антибиотиков, связанный с выделением из природных источников и культивированием новых продуцентов, выделением и идентификацией образуемых ими биологически активных соединений, нуждается в дальнейшем развитии и совершенствовании.

5. Ruiz-Camps I., Cuenca-Estrella M. Antifungals for systemic use. Enferm Infecc Microbiol Clin 2009; 27: 6: 353-362.

6. Awakawa T. The International Conference of Natural Product Biosynthesis (ICNPB, 8th US-Japan seminar on the Biosynthesis of Natural Products). J Antibiot (Tokyo) 2012; 65: 11: 587-590.

7. Zhang Q, Li S, Chen Y. et al. New diketopiperazine derivatives from a deep-sea-derived Nocardiopsis alba SCSIO 03039. J Antibiot (Tokyo) 2013; 66: 1: 31-36.

8. Орлова Т.И., Булгакова В.Г., Полин А.Н. Вторичные метаболиты микроорганизмов — потенциальный резерв фармацевтических препаратов. Антибиотики и химиотер 2014; 3—4; 38—44. / Orlova T.I., Bulgakova V.G., Polin A.N. Vtorichnye metabolity mikroorganiz-mov — potencial'nyj rezerv farmacevticheskih preparatov. Antibiotiki i himioter 2014; 3—4; 38—44. [in Russian]

9. Тренин А.С., Дудник Ю.В. Твердофазная система РНК-зависимой ДНК-полимеразы в поиске антибиотиков — потенциальных ингибиторов ВИЧ. Антибиотики и химиотер 2005; 50: 10—11: 4— 12. / Trenin A.S., Dudnik Ju.V. Tverdofaznaja sistema RNK-zavisimoj DNK-polimerazy v poiske antibiotikov — potencial'nyh ingibitorov VICh. Antibiotiki i himioter 2005; 50: 10—11: 4—12. [in Russian]

10. Тренин А. С. Микробные метаболиты — ингибиторы биосинтеза стеролов, их химическое разнообразие и особенности механизма действия. Биоорган хим 2013; 39: 6: 633—657. / Trenin A.S. Mikrobnye metabolity — ingibitory biosinteza sterolov, ih himicheskoe raznoobrazie i osobennosti mehanizma dejstvija. Bioorgan him 2013; 39: 6: 633—657. [in Russian]

11. Berdy J. Bioactive microbial metabolites. J Antibiot (Tokyo) 2005; 58: 1: 1—26.

12. Berdy J. Thoughts and facts about antibiotics: where we are now and where we are heading. J Antibiot (Tokyo) 2012; 65: 8: 385—395.

13. Demain A.L., Sanchez S. Microbial drug discovery: 80 years of progress. J. Antibiot (Tokyo) 2009; 62: 1: 5—16.

14. Freire-Moran L, Aronsson B, Manz C. et al. Critical shortage of new antibiotics in development against multidrug-resistant bacteria. Time to react is now. Drug Resist. Updat 2011; 14: 2: 118—124.

15. Clardy J., Fischbach M.A., Currie C.R. The natural history of antibiotics. Curr Biol 2009; 19: 11: 437—441.

16. Coates A.R., Hu Y. Novel approaches to developing new antibiotics for bacterial infections. Br J Pharmacol 2007; 152: 8: 1147—1154.

17. Aminov R.I. A brief history of the antibiotic era: lessons learned and challenges for the future. Front Microbiol 2010; 1: 134: 1—7.

18. Brotz-Oesterhelt H, Sass P. Postgenomic strategies in antibacterial drug discovery. Future Microbiol 2010; 5: 10: 1553—1579.

19. Егоров H.C. Основы учения об антибиотиках. 6-е изд. 2004. М.: Изд. МГУ; Наука, 528. / Egorov H.S. Osnovy uchenija ob antibiotikah. 6-e izd. 2004. M.: Izd. MGU; Nauka, 528. [in Russian]

20. Koehn F.E. High impact technologies for natural products screening. Prog Drug Res 2008; 65: 177—210.

21. Molinari G. Natural products in drug discovery: present status and perspectives. Adv Exp Med Biol 2009; 655: 13—27.

22. Donadio S, Maffioli S, Monciardini P. et al. Antibiotic discovery in the twenty-first century: current trends and future perspectives. J Antibiot (Tokyo) 2010; 63: 8: 423—430.

23. Genilloud O, Gonzalez I, Salazar O. et al. Current approaches to exploit actinomycetes as a source of novel natural products. J Ind Microbiol Biotechnol 2011; 38: 3: 375—389.

24. Leeds J.A., Schmitt E.K., Krastel P. Recent developments in antibacterial drug discovery: microbe-derived natural products—from collection to the clinic. Expert Opin Investig Drugs 2006; 15: 3: 211—226.

25. Li J.W., Vederas J.C. Drug discovery and natural products: end ofan era or an endless frontier? Science 2009; 325: 5937: 161—165.

26. Somanadhan B, Kotturi S. R, Leong C. Y. et al. Isolation and synthesis offal-citidin, a novel myxobacterial-derived acyltetrapeptide with activity against the malaria target falcipain-2. J Antibiot (Tokyo) 2013; 66: 5: 259—264.

27. Singh S.B., Young K. New antibiotic structures from fermentations. Expert Opin Ther Pat 2010; 20: 10: 1359—1371.

28. Sunazuka T, Hirose T, Omura S. Efficient total synthesis of novel bioactive microbial metabolites. Acc Chem Res 2008; 41: 2: 302—314.

29. Сазыкин Ю.О., Бибикова М.В, Иванов В.П. и др. Технология скрининга вторичных микробных метаболитов: к эволюции методологии. Антибиотики и химиотер 2002; 47: 10: 25—31. / Sazykin Ju.O., Bibikova M.V., Ivanov V.P. i dr. Tehnologija skrininga vtorichnyh mikrobnyh metabolitov: k jevoljucii metodologii. Antibiotiki i himioter 2002; 47: 10: 25—31. [in Russian]

30. Феофилова Е.П, Алехин А.И., Гончаров Н.Г. и др. Фундаментальные основы микологии и создание лекарственных препаратов из мицелиальных грибов. М.: Национальная академия микологии: 2013; 152. / Feofilova E.P., Alehin A.I., Goncharov N.G. i dr. Fundamental'nye osnovy mikologii i sozdanie lekarstvennyh preparatov iz micelial'nyh gribov. M.: Nacional'naja akademija mikologii: 2013; 152. [in Russian]

31. Yamazaki Y, Someno T., Igarashi M. et al. Androprostamines A and B, the new anti-prostate cancer agents produced by Streptomyces sp. MK932-CF8. J Antibiot (Tokyo) 2015; 68: 4: 279—285.

32. Singh S.B., PelaezF. Biodiversity, chemical diversity and drug discovery. Prog Drug Res 2008; 65: 141: 143—174.

33. ZanellaF, Lorens J.B., Link W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol 2010; 28: 5: 237—245.

34. Berrue F, Withers S.T., Haltli B. et al. Chemical screening method for the rapid identification of microbial sources of marine invertebrate-associated metabolites. Mar Drugs 2011; 9: 3: 369—381.

35. Blondelle S.E., Lohner K. Optimization and high-throughput screening of antimicrobial peptides. Curr Pharm Des 2010; 16: 28: 3204—3211.

36. Alksne L.E., Dunman P.M.Target-based antimicrobial drug discovery. Methods Mol Biol 2008; 431: 271-283.

37. Тренин A.C. Микробные модели в поиске ингибиторов биосинтеза стеролов. Антибиотики и химиотер 2013; 58: 7—8: 3—14. / Trenin A.S. Mikrobnye modeli v poiske ingibitorov biosinteza sterolov. Antibiotiki i himioter 2013; 58: 7—8: 3—14. [in Russian]

38. Rahman H, Austin B, Mitchell W.J. et al. Novel anti-infective compounds from marine bacteria. Mar Drugs 2010; 8: 3: 498—518.

39. Tiwari K, Gupta R.K. Rare actinomycetes: a potential storehouse for novel antibiotics. Crit Rev Biotechnol 2012 Jun; 32: 2: 108—132.

40. Handelsman J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol Mol Biol Rev 2004; 68: 4: 669—685.

41. Hu Y, Shamaei-Tousi A., Liu Y, Coates A. A new approach for the discovery of antibiotics by targeting non-multiplying bacteria: a novel topical antibiotic for staphylococcal infections. PLoS One 2010; 5: 7: P.e11818.

42. Gillespie D.E., Brady S.F., Bettermann A.D. et al. Isolation of antibiotics turbomycin A and B from a metagenomic library of soil microbial DNA. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 9: 4301—4306.

43. Brady S.F., Simmons L, Kim J.H., Schmidt E.W. Metagenomic approaches to natural products from free-living and symbiotic organisms. Nat Prod Rep 2009; 26: 11: 1488—1503.

44. Hirota-Takahata Y, Kozuma S, Kuraya N. et al. Pedopeptins, novel inhibitors of LPS: Taxonomy of producing organism, fermentation, isolation, physicochemical properties and structural elucidation. J Antibiot (Tokyo) 2014; 67: 3: 243—251.

45. Raina S, De Vizio D, Odell M. et al. Microbial quorum sensing: a tool or a target for antimicrobial therapy?. Biotechnol Appl Biochem 2009; 54: 2: 65—84.

46. Sanchez S, Demain A.L. Metabolic regulation and overproduction of primary metabolites. Microb Biotechnol 2008; 1: 4: 283—319.

47. Amano S.I., Sakurai T, Endo K. et al. A cryptic antibiotic triggered by monensin. J Antibiot (Tokyo) 2011; 64: 10: 703.

48. Булгакова, В. Г., Виноградова К. A., Орлова, Т. И. и др. Действие антибиотиков как сигнальных молекул. Антибиотики и химиотер 2014; 59: 1—2: 36—43. / Bulgakova, V. G., Vinogradova K. A., Orlova, T. I. i dr. Dejstvie antibiotikov kak signal'nyh molekul. Antibiotiki i himioter 2014; 59: 1—2: 36—43. [in Russian]

49. Challis G.L., Hopwood D.A. Synergy and contingency as driving forces for the evolution of multiple secondary metabolite production by Streptomyces species. Proc Natl Acad Sci USA 2003; 100: Suppl 2: 14555—14561.

50. Rigali S., Titgemeyer F, Barends S. et al. Feast or famine: the global regulator DasR links nutrient stress to antibiotic production by Streptomyces. EMBO Rep 2008; 9: 7: 670—675.

51. Sánchez S, Chavez A., Forero A. et al. Carbon source regulation of antibiotic production. J Antibiot (Tokyo) 2010; 63: 8: 442—459.

52. Стоянова Л. Г., Левина Н.В. Регуляция синтеза бактериоцина рекомбинантного штамма Lactococcus lactis subsp. lactis F-116 компонентным составом среды. Микробиология. 2006; 75: 3: 286—291. / Stojanova L. G., Levina N.V. Reguljacija sinteza bakteriocina rekombi-nantnogo shtamma Lactococcus lactis subsp. lactis F-116 komponentnym sostavom sredy. Mikrobiologija. 2006; 75: 3: 286-291.

53. Ruiz B., Chávez A., Forero A. et al. Production of microbial secondary metabolites: regulation by the carbon source. Crit Rev Microbiol 2010; 36: 2: 146—167.

54. Duetz W.A., Witholt B. Effectiveness of orbital shaking for the aeration of suspended bacterial cultures in square-deepwell microtiter plates. Biochem Eng J 2001; 7: 113-115.

55. Dieting U, Trauthwein H, Zimmermann H. High-throughput screening in the climatic chamber. Elements Degussa Sci News 2005; 11: 14-18.

56. Clinical and Laboratory Standards Institute. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts: Approved Standard 2nd edn CLSI document M27-A2 Clinical and Laboratory Standards Institute: Wayne, PA, 2002.

57. Кубанова A.A., Степанова Ж.В., Гусъкова Т.А. и др. Методические указания по изучению противогрибковой активности лекарственных средств. В кн.: Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2012; 944: 578—586. / Kubanova A.A., Stepanova Zh.V., Gus'kova T.A. i dr. Metodicheskie ukazanija po izucheniju protivogribkovoj aktivnosti lekarstvennyh sred-stv. V kn.: Rukovodstvo po provedeniju doklinicheskih issledovanij lekarstvennyh sredstv. Chast' pervaja / Pod red. A.N. Mironova. M.: Grif i K, 2012; 944: 578—586. [in Russian]

58. Тренин A.C. Микробная тест-система для поиска ингибиторов биосинтеза стеролов. Антибиотики и химиотер 2013; 58: 3—4: 3—9. / Trenin A.S. Mikrobnaja test-sistema dlja poiska ingibitorov biosinteza sterolov. Antibiotiki i himioter 2013; 58: 3—4: 3—9. [in Rissian]

59. Тренин А.С. Микробная модель Halobacterium salinarum для поиска ингибиторов биосинтеза стеролов. Антибиотики и химиотер 2013; 58: 5—6: 3—10. / Trenin A.S. Mikrobnaja model' Halobacterium salinarum dlja poiska ingibitorov biosinteza sterolov. Antibiotiki i himioter 2013; 58: 5—6: 3—10. [in Russian]

60. Тренин А.С., Цвигун Е.А., Бычкова О.П., Лавренов С.Н. Микробная модель Halobacterium salinarum в отборе синтетических аналогов антибиотика турбомицина А, обладающих противоопухолевым действием. Антибиотики и химиотер 2013; 58: 9—10: 3—7. / Trenin A.S., Cvigun E.A., Bychkova O.P., Lavrenov S.N. Mikrobnaja model' Halobacterium salinarum v otbore sinteticheskih analogov antibiotika turbomicina A, obladajushhih protivoopuholevym dejstviem. Antibiotiki i himioter 2013; 58: 9—10: [in Russian]

61. Bode H.B., Bethe B, Hufs R, Zeeck A. Big effects from small changes: possible ways to explore nature's chemical diversity. Chembiochem 2002; 3: 7: 619—627.

62. Hopwood D.A. Cracking the polyketide code. PLoS Biol. 2004. V.2. N.2. E35. P.0166-0169. — Режим доступа: 10.1371/journal.pbio.0020035 — PMID:14966534.

63. Kotowska M. Application of molecular biology for the discovery of biosynthetic genes of polyketide and peptide antibiotics produced by actinomycetes. Postepy Biochem 2005; 51: 3: 345—352.

64. Егоров A.M. Антибиотики: прошлое, настоящее и будущее препаратов для лечения инфекционных болезней. Ведом науч центра экспер средств мед прим 2007; 3: 1—6. / Egorov A.M. Antibiotiki: proshloe, nastojashhee i budushhee preparatov dlja lecheni-ja infekcionnyh boleznej. Vedom nauch centra jeksper sredstv med prim 2007; 3: 1—6. [in Russian]

65. Medema M.H., Kottmann R, Yilmaz P. et al. Minimum information about a biosynthetic gene cluster. Nat Chem Biol 2015 Aug; 11: 9: 625— 631.

66. Olano C, Méndez C, Salas J.A. Molecular insights on the biosynthesis of antitumour compounds by actinomycetes. Microb Biotechnol 2011; 4: 2: 144—164.

67. Nishida H, Beppu T, Ueda K. Whole-genome comparison clarifies close phylogenetic relationships between the phyla Dictyoglomi and Thermotogae. Genomics. 2011. Nov; 98; 5: 370—375.

68. Ma S.M., Li J.W., Choi J.W. et al. Complete reconstitution of a highly reducing iterative polyketide synthase. Science 2009: 326: 5952: 589—592.

69. Caffrey P., Aparicio J.F., Malpartida F, Zotchev S.B. Biosynthetic engineering of polyene macrolides towards generation of improved antifun-gal and antiparasitic agents. Curr Top Med Chem 2008; 8: 8: 639—653.

70. Schirmer A., Gadkari R., Reeves C.D. et al. Metagenomic analysis reveals diverse polyketide synthase gene clusters in microorganisms associated with the marine sponge Discodermia dissoluta. Appl Environ Microbiol 2005; 71: 8: 4840—4849.

71. Hopwood D.A. How do antibiotic-producing bacteria ensure their self-resistance before antibiotic biosynthesis incapacitates them? Mol Microbiol 2007; 63: 4: 937—940.

72. Méndez C., Künzel E., Lipata F. et al. Oviedomycin, an unusual angucy-clinone encoded by genes of the oleandomycin-producer Streptomyces antibioticus ATCC11891. J Nat Prod 2002; 65; 5: 779—782.

73. Shawky R.M., Puk O., Wietzorrek A. et al. The border sequence of the balhimycin biosynthesis gene cluster from Amycolatopsis balhimycina contains bbr, encoding a StrR-like pathway-specific regulator. J Mol Microbiol Biotechnol 2007; 13: 1—3: 76—88.

74. Gupta S.K., Padmanabhan B.R., Diene S.M. et al. ARG-ANNOT, a new bioinformatic tool to discover antibiotic resistance genes in bacterial genomes. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58: 1: 212—220.

75. Preobrazhenskaya M.N., Olsufyeva E.N., Tevyashova A.N. et al. Synthesis and study of the antifungal activity of new mono- and di-sub-stituted derivatives of a genetically engineered polyene antibiotic 28, 29-didehydro nystatin A1 (S44HP). J Antibiot (Tokyo) 2010; 63: 2: 55—64.

76. Macone A.B., Caruso B.K., Leahy R.G. et al. In vitro and in vivo antibacterial activities of omadacycline, a novel aminomethylcycline. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58: 2: 1127—1135.

77. Chen X., Wei P., Fan L. et al. Generation of high-yield rapamycin-pro-ducing strains through protoplasts-related techniques. Appl Microbiol Biotechnol 2009; 83: 3: 507—512.

78. Тренин А.С., Федорова Г.Б., Лайко А.В., Дудник Ю.В. Увеличение продукции эремомицина в результате регенерации и УФ-облучения протопластов Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini. Антибиотики и химиотер 2001; 46: 3: 6—11. / Trenin A.S., Fedorova G.B., Lajko A.V., Dudnik Ju.V. Uvelichenie produkcii jeremomicina v rezul'tate regeneracii i UF-obluchenija protoplastov Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini. Antibiotiki i himioter 2001; 46: 3: 6—11. [in Russian]

79. Nakashima T., Iwatsuki M., Ochiai J. et al. Mangromicins A and B: structure and antitrypanosomal activity of two new cyclopentadecane compounds from Lechevalieria aerocolonigenes K10-0216. J Antibiot (Tokyo) 2014; 67: 3: 253—260.

80. Testa C.A., Johnson L.J. A whole-cell phenotypic screening platform for identifying methylerythritol phosphate pathway-selective inhibitors as novel antibacterial agents. Antimicrob Agents Chemother 2012 Sep; 56: 9: 4906—4913.

81. Kahan B.D. Forty years of publication of transplantation proceedings— the second decade: the cyclosporine revolution. Transplant Proc 2009; 41: 5: 1423—1437.

82. Iwasaki S, Omura S. Search for protein farnesyltransferase inhibitors of microbial origin: our strategy and results as well as the results obtained by other groups. J Antibiot (Tokyo) 2007; 60: 1: 1—12.

83. Hiramatsu K, Igarashi M, Morimoto Y. et al. Curing bacteria of antibiotic resistance: reverse antibiotics, a novel class of antibiotics in nature. Int J Antimicrob Agents 2012; 39: 6: 478—485.

84. Bugg T.D., Braddick D, Dowson C.G., Roper D.I. Bacterial cell wall assembly: still an attractive antibacterial target. Trends Biotechnol 2011; 29: 4: 167—173.

85. Бибикова M.B., Грамматикова Н.Э., Катлинский А.В. и др. Влияние природных гиполипидемических соединений на формирование биоплёнок штаммами рода Pseudomonas. Антибиотики и химиотер 2009; 54: 1-2: 10-13. / Bibikova M.V., Grammatikova N.Je., Katlinskij A.V. i dr. Vlijanie prirodnyh gipolipidemicheskih soedinenij na formirovanie biopljonok shtammami roda Pseudomonas. Antibiotiki i himioter 2009; 54: 1—2: 10—13. [in Russian]

86. Тренин А.С., Терехова Л.П., Толстых ИВ. и др. Отбор микробных вторичных метаболитов — ингибиторов биосинтеза холестерина с помощью культуры клеток гепатобластомы G2. Антибиотики и химиотер 2003; 48: 1: 3-8. / Trenin A.S., Terehova L.P., Tolstyh I.V. i dr. Otbor mikrobnyh vtorichnyh metabolitov — ingibitorov biosinteza holesterina s pomoshh'ju kul'tury kletok gepatoblastomy G2. Antibiotiki i himioter 2003; 48: 1: 3—8. [in Russian]

87. Arai Y, linuma H, Ikeda Y. et al. Migracins A and B, new inhibitors of cancer cell migration, produced by Streptomyces sp. J Antibiot (Tokyo) 2013; 66: 4: 225—230.

88. Moy T.I., Conery A.L., Larkins-Ford J. et al. High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model. ACS Chem Biol 2009; 4: 7: 527—533.

89. Zhang B, Watts K.M., Hodge D. et al. A second target of the antimalari-al and antibacterial agent fosmidomycin revealed by cellular metabolic profiling. Biochemistry 2011; 50: 17: 3570—3577.

90. Soppa J. From genomes to function: Haloarchaea as model organisms. Microbiology 2006; 152: 3: 585—590.

91. Терехова Л.П., Галатенко О.А., Тренин А.С.и др. Выделение и изучение антибиотика ИНА-1132 (хлоротрицина), образуемого штаммом Streptomyces baarnensis. Антибиотики и химиотер 2008; 53: 7—8: 3—7 / Terehova L.P., Galatenko O.A., Trenin A.S.i dr. Vydelenie i izuchenie antibiotika INA-1132 (hlorotricina), obrazue-mogo shtammom Streptomyces baarnensis. Antibiotiki i himioter 2008; 53: 7—8: 3—7 [in Russian]

92. Шашков А. С., Цветков Д. Е, Лапчинская О. А. и др. Строение, спектры ЯМР 1H и 13С и биологическая активность антибиотика ИНА-1278, родственного ирумамицину и продуцируемого экспериментальным штаммом Streptomyces sp. № 1278. Известия РАН. Серия химическая. 2011; 60: 11: 2365—2370. / Shashkov A. S., Cvetkov D. E., Lapchinskaja O. A. i dr. Stroenie, spektry JaMR 1H i 13S i biologicheskaja aktivnost' antibiotika INA-1278, rodstvennogo irumamicinu i produciruemogo jeksperimental'nym shtammom Streptomyces sp. № 1278. Izvestija RAN. Serija himicheskaja. 2011; 60: 11: 2365—2370.

93. Тренин А.С., Кац Н.Ю., Цвигун Е.А., Бычкова О.П., Краснопольская Л.МБазидиальные грибы Kuehneromyces mutabilis, Flammulina velu-tipes и Lentinus edodes, как возможные продуценты ингибиторов биосинтеза стеролов. Успехи мед микол 2014; 12: 353—354. / Trenin A.S., Kac N.Ju., Cvigun E.A., Bychkova O.P., Krasnopol'skaja L.M. Bazidial'nye griby Kuehneromyces mutabilis, Flammulina velutipes i Lentinus edodes, kak vozmozhnye producenty ingibitorov biosinteza sterolov. Uspehi med mikol 2014; 12: 353—354. [in Russian]

94. Степанова Е.В., Штиль A.A., Лавренов С.Н. и др. Соли трис(1-алкилиндол-3-ил)метилия — новый класс противоопухолевых соединений. Известия Академии наук. Серия химическая. 2010; 12: 1—9. / Stepanova E.V., Shtil' A.A., Lavrenov S.N. i dr. Soli tris(1-alk-ilindol-3-il)metilija — novyj klass protivoopuholevyh soedinenij. Izvestija Akademii nauk. Serija himicheskaja. 2010; 12: 1—9. [in Russian]

95. Yao X., Li C, Zhang J., Lu C.D. г-Glutamyl spermine synthetase PauA2 as a potential target of antibiotic development against Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob Agents Chemother 2012; 56: 10: 5309—5314.

96. Huband M.D., Bradford P.A., Otterson L.G. et al. In vitro antibacterial activity of AZD0914, a new spiropyrimidinetrione DNA gyrase/topoiso-merase inhibitor with potent activity against gram-positive, fastidious gram-negative, and atypical bacteria. Antimicrob Agents Chemother 2015; 59: 1: 467-474.

97. Therien A.G., Huber J.L., Wilson K.E. et al. Broadening the spectrum of /^-lactam antibiotics through inhibition of signal peptidase type I. Antimicrob Agents Chemother 2012; 56: 9: 4662—4670.

98. Cox G., Koteva K., Wright G.D. An unusual class of anthracyclines potentiate gram-positive antibiotics in intrinsically resistant gram-negative bacteria. J Antimicrob Chemother 2014; 69: 7: 1844—1855.

99. Cushnie T.P., Cushnie B., Lamb A.J. Alkaloids: an overview of their antibacterial, antibiotic-enhancing and antivirulence activities. Int J Antimicrob Agents 2014; 44: 5: 377—386.

100. Otto M.P., Martin E., Badiou C. et al. Effects of subinhibitory concentrations of antibiotics on virulence factor expression by community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Antimicrob Chemother 2013; 68: 7: 1524—1532.

101. Diep B.A., Afasizheva A., Le H.N., et al. Effects of linezolid on suppressing in vivo production of staphylococcal toxins and improving survival outcomes in a rabbit model of methicillin-resistant Staphylococcus aureus necrotizing pneumonia. J Infect Dis 2013; 208:1: 75—82.

102. Khodaverdian V., Pesho M., Truitt B. et al. Discovery of antivirulence agents against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 2013; 57: 8: 3645—3652.

103. Maiolo E.M., Furustrand Tafin U., Borens O., Trampuz A. Activities of fluconazole, caspofungin, anidulafungin, and amphotericin B on planktonic and biofilm Candida species determined by microcalorimetry. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58: 5: 2709—2717.

104. Arita-Morioka K., Yamanaka K., Mizunoe Y. et al. Novel strategy for biofilm inhibition by using small molecules targeting molecular chaper-one DnaK. Antimicrob Agents Chemother 2015; 59: 1: 633—641.

105. Baugh S, Phillips C.R., Ekanayaka A.S. et al. Inhibition of multidrug efflux as a strategy to prevent biofilm formation. J Antimicrob Chemother 2014; 69: 3: 673-681.

106.Marcone G.L., Carrano L, Marinelli F, Beltrametti F. Protoplast preparation and reversion to the normal filamentous growth in antibiotic-producing uncommon actinomycetes. J Antibiot (Tokyo) 2010; 63: 2: 83-88.

107. Walkty A., Adam H, Baxter M. et al. In vitro activity of plazomicin against 5,015 gram-negative and gram-positive clinical isolates obtained from patients in canadian hospitals as part of the CANWARD study, 2011-2012. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58: 5: 2554-2563.

108. Huang E, Yousef A.E. Paenibacterin, a novel broad-spectrum lipopep-tide antibiotic, neutralises endotoxins and promotes survival in a murine model of Pseudomonas aeruginosa-induced sepsis. Int J Antimicrob Agents 2014; 44: 1. P.74-77.

109. Qian C.D., Wu X.C, Teng Y. et al. Battacin (Octapeptin B5), a new cyclic lipopeptide antibiotic from Paenibacillus tianmuensis active against multidrug-resistant Gram-negative bacteria. Antimicrob Agents Chemother 2012; 56: 3: 1458-1465.

110. Hernandez V., Crepin T, Palencia A. et al. Discovery of a novel class of boron-based antibacterials with activity against gram-negative bacteria. Antimicrob Agents Chemother 2013; 57: 3: 1394-1403.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Тренин Алексей Сергеевич — д.б.н., заведующий сектором Разработки методов поиска биологически активных соединений ФГБНУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе»