СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВО-ЛИПИДНОЙ БИОМАССЫ ПУТЕМ ВЫРАЩИВАНИЯ ЛИЧИНОК HERMETIA ILLUCENS НА ЦЕЛЛЮЛОЗОСОДЕРЖАЩИХ ОТХОДАХ
METHOD OF PRODUCING PROTEIN-LIPID BIOMASS BY GROWING HERMETIA ILLUCENS LARVAE ON CELLULOSE-CONTAINING WASTES

Изобретение относится к сфере биотехнологии, может быть использовано в области культивирования личинок мухи Hermetia illucens, и заключается в способе приготовления субстрата на основе целлюлозосодержащих отходов (материал отработанной птичьей подстилки), предполагающем внесение инокулята мицелия термофильных мицелиальных грибов с высокой целлюлозолитической активностью.
Известен способ приготовления субстрата для выращивания личинок комнатных мух, например, смеси, в состав которой входит рыба. В смесь вводят закваску в виде водной вытяжки из конского навоза. В подготовленную смесь вводят яйца мух так, чтобы корма хватило для полного роста и развития личинок (Труды Новосибирского сельскохозяйственного института, Новосибирск, 1986, т. 98, с. 93 [1]). Недостатком указанной среды является малый выход личинок, невозможность экстраполяции полученных результатов на технологии, где предполагается использование другого вида - Hermetia illucens, а также иного перерабатываемого сырья.
Известен способ переработки органических отходов, включающий ряд технологических приемов: сначала яйцекладки синатропных мух наносят на питательный субстрат, состоящий из молока и дрожжей, личинки культивируют в оптимальных гидротермических условиях, после чего их переносят на органические отходы и культивируют до состояния предкуколки (RU 2049389 [2]). Недостаток способа - использование видов синантропных мух, а, следовательно, невоспроизводимость результатов в случае замены биообъектов на другой вид - Hermetia illucens, отсутствие эффекта микробиологической активации утилизируемого субстрата.
Известна также среда для выращивания личинок синантропных мух (SU 954079 [3]). Среда состоит из следующих компонентов, мас. %: навоз 70-95, содержимое рубца 5-30. Однако, непостоянство микрофлоры рубца, а также использование другого вида мухи может не обеспечивать необходимого эффекта для Hermetia illucens.
Известны способы повышения эффективности утилизации отходов в системе микроорганизмы - дождевые черви, по сравнению с действием этих организмов по отдельности (Терещенко Н.Н. Эколого-микробиологические аспекты вермикультивирования / Н.Н. Терещенко. - Новосибирск: Наука, 2003. - 113 с. [4]; Stom D.I. Transformation of Oilin Soilbya Microbial Preparationand Earthworms / D.I. Stom, D.S. Potapov, A.E. Balayan, O.N. Matveeva // Eurasian Soil Science. - 2003. - Vol.36, No.3. - Р. 329-331/ [5]).
Однако данные приемы предназначены для сферы вермикомпостирования и не испытаны в целях их включения в технологии переработки отходов личинками насекомых.
3
Известен способ утилизации целлюлозосодержащих отходов, с помощью вермикультуры с дождевыми червями Eisenia fetida и культуры грибов Trichoderma viride, который предусматривает предварительную пероральную инокуляцию дождевых червей Eisenia fetida инсулиновым шприцем со спиленным острием иглы суспензией мицелия и спор целлюлозоразрушающего штамма недельной культуры грибов Trichoderma viride с содержанием в ней колониеобразующих единиц в количестве 10 КОЕ/мл в количестве 0,05 мл или суточное выдерживание червей в субстрате, пропитанном такой суспензией (RU 2488997 C1, опуб. 10.08.2013 [6]). Осуществление изобретения позволяет интенсифицировать утилизацию целлюлозосодержащих отходов путем получения популяции дождевых червей, обладающих повышенной целлюлазной активностью. К недостаткам способа следует отнести сложность проведения процедур и непригодность использования для личинок насекомых.
Наиболее близким к предложенному является способ получения биологически активной кормовой добавки для сельскохозяйственных животных и птиц, предусматривающий смешивание 1 массовой части биомассы личинок Hermetia illucens, выращенных на пшеничном зерне и предварительно промытых водопроводной водой, с содержанием протеина в биомассе не менее 36 мас. %, с 1 массовой частью сырого пробиотического продукта, полученного твердофазной ферментацией штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 на стерильном носителе. Последний представляет собой свекловичный жом, пропитанный питательной средой. Полученную смесь гомогенизируют и проводят комбинированный процесс твердофазной ферментации-высушивания при температуре не выше 55°С (RU 2576200 С1, 12.12.2014 [4]). Осуществление изобретения обеспечивает повышение продуктивности и сохранности поголовья животных и птиц, зоотехнических показателей животных за счет увеличения переваримости кормов, стимуляции обменных и иммунных процессов. Недостатком указанного способа является использование дорогостоящего субстрата (пшеничное зерно) и стерильного носителя, предполагающего процедуру стерилизации, связанную с использованием дополнительного оборудования в виде парового стерилизатора, и затратами электроэнергии на осуществление циклов стерилизации. В предлагаемом изобретении указанный технологический этап отсутствует.
Задачей изобретения является создание нового способа получения белково-липидной кормовой биомассы высокого качества, повышающего продуктивность сельскохозяйственных животных и птиц.
7
Поставленная задача решается способом получения белково-липидной кормовой биомассы, заключающимся в том, что выращивают биомассу личинок Hermetia illucens на ферментируемом субстрате органического происхождения, при этом в качестве основы субстрата органического происхождения используют измельченные целлюлозосодержащие отходы влажностью 50-70%, в которые добавляют свекловичную мелассу в количестве 3-5% от общей массы субстрата, а ферментацию отходов осуществляют культурой термофильных грибов Thielavia terrestris или Myceliophthora thermophila, при этом культуру грибов вносят в субстрат в виде жидкой суспензии со значением КОЕ не ниже 10/мл в количестве 3-8% от массы влажного субстрата в процессе выращивания биомассы личинок после разогрева субстрата до температуры 36-48°С. По истечении 10-14 суток с начала выращивания личинки отделяют, высушивают и измельчают.
Технический результат, достигаемый изобретением, заключается в повышении эффективности биоконверсии целлюлозосодержащих нестерилизуемых отходов в биомассу личинок Hermetia illucens, богатых белком и липидами, вследствие применения культуры термофильных мицелиальных грибов Thielavia terrestris или Myceliophthora thermophila с выраженной целлюлозолитической активностью. Депонирование культуры осуществляется в коллекции Пензенского государственного аграрного университета. Предложенный способ не требует затрат на стерилизацию основы субстрата.
2
Предложенный способ осуществляется следующим образом. Органические отходы с высоким содержанием целлюлозы (например, отработанная птичья пометная подстилка) механически измельчают до размеров частиц 1-5 мм и увлажняют до 50-70%. Затем к полученному материалу добавляют свекловичную мелассу в количестве 3-5% от общей итоговой массы влажного субстрата. Полученный субстрат распределяют по стандартным пластиковым контейнерам слоем 150 мм. Следующим технологическим шагом является заселение субстрата личинками двукрылого насекомого Hermetia illucens трехсуточного возраста из расчета 4 особи на 1 см. Смешиваемая с отходами свекловичная меласса богата легкоассимилируемыми метаболитами и служит стартовым трофическим фактором, предназначенным для питания личинок насекомого на начальном этапе биоконверсии, что способствует проявлению их активной жизнедеятельности. Отмеченный факт, в свою очередь, ведет к разогреву субстрата до температуры 36-48°С через 24-48 часов с момента начала процесса. После достижения субстратом указанных температурных значений его инокулируют жидкой посевной суспензией культур грибов Thielavia terrestris или Myceliophthora thermophila. Высокая температура субстрата обеспечивает необходимую интенсивность роста и целлюлозолитическую активность указанных грибных культур. В свою очередь, накапливаемая мицелиальная биомасса гриба, а также низкомолекулярные продукты ферментативной деградации целлюлозных компонентов субстрата являются пищевыми источниками для личинок насекомого на заключительных этапах биоконверсии, когда основная доля легкодоступных компонентов (главным образом сахаров мелассы) является исчерпанной.
Для получения жидкого инокулюма, культуру грибов выращивают на жидкой питательной среде следующего состава (г/л):
Целлюлоза (порошок) - 10
Глюкоза - 15
Кукурузный экстракт - 10
Дрожжевой экстракт - 5
Глицерин - 3
Аммония сульфат - 2
Натрия нитрат - 3
Магния сульфат - 0,25
Железа сульфат(II) - 0,01
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,5
Мел химически осажденный - 2,5
Вода - до 1 литра
рН питательной среды - 6,8
Питательную среду разливают по 100 мл в колбы Эрленмейера объемом 500 мл, укупоривают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в автоклаве при температуре 115°С в течение 30 минут. Затем среду засевают пробирочной культурой мицелиального гриба вместе с фрагментом скошенной агаризованной среды. Глубинное культивирование осуществляют на лабораторной круговой качалке со скоростью вращения 220 об/мин, при температуре 40-44°С в течение 72-120 часов.
7
Количество вносимого инокулята составляет 3-8% от массы влажного субстрата, при этом значение КОЕ составляет не ниже 10/мл. По истечении 10-14 суток переработки личинки отделяют от субстрата с помощью вибросита, высушивают в вакуумной сушилке до 5% влажности и измельчают.
Технический результат, достигаемый использованием культур грибов, определяется более эффективной биоконверсией целлюлозосодержащих нестерилизуемых отходов личинками Hermetia illucens в биомассу богатую белками и липидами.
Пример 1.
2
Для проведения производственного эксперимента в условиях ООО «Биогенезис» было сформировано два варианта опытный и контрольный, каждый из которых включал по пять ящиков с субстратом, изготовленным на основе целлюлозосодержащих отходов (измельченная пометная подстилка сельскохозяйственной птицы, смешанная со свекловичной мелассой). Плотность расселения личинок составляла 4 особи на 1 см, т.е. 8976 особей на контейнер, а масса субстрата влажностью 60% составляла 15 кг. В контейнеры опытной группы через 48 часов от момента заселения личинками вносили жидкий инокулюм культуры Thielavia terrestris. В контейнеры контрольного варианта инокулят целлюлозолитического гриба не вносился. В целом, процесс биоконверсии осуществлялся на протяжении 12 суток
По итогам культивирования проводили оценку накопления сырой биомассы личинок Hermetia illucens, степень конверсии субстратного материала. Внесение жидкого инокулюма культуры термофильного гриба Thielavia terrestris способствует активации процесса биопереработки отходов, содержащих значительную долю целлюлозы. Суммарная биомасса сырых личинок в опытных вариантах составляет 1020 г на 15 кг субстрата 60% влажности. В контрольных вариантах аналогичный показатель находится на уровне 865 г на 15 кг субстрата 60% влажности. Таким образом, превышение показателя выхода биомассы личинок в опытном варианте составляет 17,9% по отношению к контролю. Оценка эффективности процесса биоконверсии перерабатываемого субстрата, осуществляемая путем сравнения остаточных количеств не переработанного материала, показала превышение в опытном вариантепо сравнению с контрольным на 31%.
Пример 2.
Для проведения производственного эксперимента в условиях ООО «Биогенезис» было сформировано два варианта опытный и контрольный, каждый из которых включал по пять ящиков с субстратом, изготовленным на основе целлюлозосодержащих отходов (измельченная пометная подстилка сельскохозяйственной птицы, смешанная со свекловичной мелассой). Параметры процесса (плотность расселения личинок в контейнере, влажность, сроки внесения инокулята термофильного гриба, продолжительность выращивания личинок) поддерживались на уровне тех же численных значений, что и вышеприведенном примере. Принципиальное различие заключалось в использовании культуры Myceliophthora thermophila. В контейнеры контрольного варианта инокулят целлюлозолитического гриба не вносился.
По итогам культивирования проводили оценку накопления сырой биомассы личинок Hermetia illucens, степень конверсии субстратного материала. Внесение жидкого инокулюма культуры термофильного гриба Myceliophthora thermophila увеличивает эффективность биопереработки отходов, содержащих значительную долю которых составляет целлюлоза. Суммарная биомасса сырых личинок в опытных вариантах составляет 1230 г В контрольных аналогичный показатель находится на уровне 865 г на 15 кг субстрата 60% влажности. Таким образом, превышение показателя выхода биомассы личинок в опытном варианте составляет 42,2% по отношению к контролю. Оценка эффективности процесса биоконверсии перерабатываемого субстрата, осуществляемая путем сравнения остаточных количеств не переработанного материала, показала превышение в опытном варианте по сравнению с контрольным на 54%.
Включение в субстрат свекловичной мелассы, содержащей легкодоступные углеводы, обеспечивает высокую интенсивность обменных и ростовых процессов личинок на начальном этапе роста личинок и переработки субстрата. На этом фоне также отмечается увеличение двигательной активности личинок и разогрев субстрата до достаточно высокой температуры, являющейся оптимальной для проявления максимального ростового потенциала, а также целлюлозолитической активности используемых культур термофильных мицелиальных грибов. Таким образом, наращиваемая биомасса грибов, а также образующиеся продукты ферментативного гидролиза целлюлозных компонентов, являются трофическими факторами на поздних этапах развития личинок Hermetia illucens на отходах с высоким содержанием целлюлозных материалов. Привнесение в органический материал одновременно свекловичной мелассы и жидкого инокулята термофильного гриба позволяет получить субстрат, обеспечивающий более высокие показатели накопления биомассы личинок Hermetia illucens по сравнению с контролем в 1,2-1,4 раза.