СПОСОБ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ИНАКТИВАЦИИ БАКТЕРИЙ Enterococcus faecalis (ВАРИАНТЫ)
METHOD FOR PHOTODYNAMIC INACTIVATION OF Enterococcus faecalis BACTERIA (VERSIONS)

Изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к способу фотодинамической инактивации и подавления роста бактерий Enterococcus faecalis в присутствии лекарственного препарата, обладающего сенсибилизирующими свойствами.
Enterococcus faecalis (фекальный энтерококк) - условно-патогенный микроб, характерный для нормального состава микрофлоры ротовой полости, пищеварительных органов и кишечника, а также мочеполовой системы человека.
Патогенная форма Enterococcus faecalis вызывает воспаления мочевых и половых путей, мочевого пузыря, органов малого таза и почек, большинство внутрибольничных инфекций, циститы, пиелонефриты, аднекситы, простатиты, уретриты и т.д. Указанный микроорганизм также обнаруживается при персистирующих эндодонтических инфекциях. Его распространенность при таких инфекциях по данным разных источников колеблется от 24% до 77%. Это объясняется особенной устойчивостью и вирулентностью Enterococcus faecalis, способностью конкурировать с другими микроорганизмами.
Бактерии Enterococcus faecalis относятся к роду грамположительных энтерококков подкласса лактобактерий. Enterococcus faecalis способны осуществлять клеточное дыхание как в бескислородной, так и насыщенной кислородом среде; устойчивы к воздействию дезинфицирующих средств и некоторых антибиотиков, хорошо выдерживают высокие температуры и сложные условия окружающей среды: растут при температуре 10-45°C, pH 4,5-10,0, а также при высоких концентрациях хлорида натрия. Enterococcus faecalis обладает определенными факторами вирулентности, включая литические ферменты, цитолизин, вещество аггрегации, феромоны. Enterococcus faecalis в состоянии подавить действие лимфоцитов, потенциально способствуя эндодонтической неудаче.
Известен способ инактивации бактерий Enterococcus faecalis, основанный на обработке микрофлоры раствором антибиотиков (ампицилин, ванкомицин, пенициллин, цефолоспорины, аминогликозиды и др.), антисептиков или других препаратов, обладающим противомикробным действием [1].
Недостатком известного способа подавления энтерококковой активности Enterococcus faecalis является высокий уровень резистентности бактерий к указанным средствам [2]. Некоторые штаммы энтерококков имеют внутренние механизмы устойчивости к бета-лактамным антибиотикам (пенициллины и цефалоспорины), а также ко многим аминогликозидам. В последние два десятилетия появились особо вирулентные штаммы энтерококков, резистентные к ванкомицину и способные вызывать внутрибольничные инфекции.
6
Известен также способ фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis в присутствии красителя, обладающего сенсибилизирующими свойствами, за счет фотодинамического воздействия оптического излучения, соответствующего полосе поглощения красителя [3-16]. В качестве красителей-сенсибилизаторов используются следующие соединения: метиленовый зеленый, акридиновый оранжевый и профлавин [3], метиленовый синий и толуидиновый синий [3, 4, 5, 6, 7], индоцианиновый зеленый [7, 8], бенгальский розовый [6, 7, 9], эозин [9], куркумин [9], хлорин [10], порфирины [11], фталоцианины [12, 13], халькоген-содержащие бензофеноксазиниевые красители [14], конъюгаты наночастиц с метиленовым синим [15], порфирином [16] или хлорином e [17].
В указанных способах фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis микробные клетки выращивают на питательной среде. После предварительной инкубации в темноте Enterococcus faecalis в аэробных условиях в течение 10-30 мин с одним из вышеуказанных красителей при концентрации красителя 1-250 мкМ содержимое облучают оптическим излучением, спектральный диапазон которого соответствует полосе поглощения фотосенсибилизатора. В качестве источников излучения в указанных способах фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis используют лазерные диоды, светодиоды, широкополосные ламповые источники белого света, или ламповые источники, из общего спектра испускания которых с помощью светофильтров выделяют область, соответствующую максимуму полосы поглощения сенсибилизатора.
6
Недостатками известных способов фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis являются: (а) ограничение в использовании некоторых из вышеуказанных сенсибилизаторов (метиленовый синий, толуидиновый синий, метиленовый зеленый, акридиновый оранжевый, бенгальский розовый, индоцианиновый зеленый, эозин, фталоцианины, халькоген-содержащие бензофеноксазиниевые красители) в медицинских целях (антимикробная фотодинамическая терапия заболеваний полости рта, лица и т.п.) по эстетическим соображениям из-за сильного и устойчивого окрашивания поверхности ткани, подвергнутой аппликации красителя; (б) сложность химического синтеза (конъюгаты наночастиц с метиленовым синим, порфирином или хлорином e) и/или химической очистки (профлавин, куркумин, хлорины, порфирины) препаратов, используемых в качестве фотосенсибилизатора.
7
2
2
Наиболее близким к заявляемому является способ фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis, основанный на предварительной инкубации изолированных бактерий с красителем-фотосенсибилизатором гиперицином [18]. В известном способе бактерии Enterococcus faecalis выращивают на питательном агаре в аэробных условиях при 37°C в течение 18-24 часов. Затем на стерильном фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) приготавливают суспензию бактерий с концентрацией клеток 10КОЕ/мл (КОЕ - колониеобразующих единиц). К бактериальной суспензии Enterococcus faecalis в темноте вносят раствор гиперицина в конечной концентрации 1,0 мкг/мл. Указанную смесь инкубируют в темноте при 37°C в течение 5 мин. Аликвоты по 200 мкл клеток Enterococcus faecalis, содержащих краситель-фотосенсибилизатор гиперицин, облучают светом в течение 3, 5 и 10 мин. В качестве источника облучения используют светодиод, из спектра испускания которого с помощью желтого светофильтра выделяют излучение с максимумом в области 590 нм (область, соответствующая максимуму спектра поглощения гиперицина). Мощность излучения составляла 30 мВт, плотность мощности излучения, воздействующего на Enterococcus faecalis, 80 мВт/см. При времени воздействия 3, 5 и 10 мин энергетическая доза (плотность дозы) составляла соответственно 14,4; 24; 48 Дж/см [18].
2
2
Согласно известному способу [18] инкубация в темноте бактерий Enterococcus faecalis с гиперицином при его концентрации 0,1; 0,3; 0,6; 1,0 мкг/мл в течение 5 мин не оказывала на них токсичного действия. Воздействие на Enterococcus faecalis в отсутствие гиперицина оптического излучения с максимумом в области 590 нм при плотности мощности 80 мВт/см, экспозиции от 3 до 10 мин и энергетической дозе от 14,4 до 48 Дж/см также не вызывала изменений активности бактерий Enterococcus faecalis.
2
2
7
Однако облучение Enterococcus faecalis в присутствии гиперицина при его концентрации 1 мкг/мл в течение 3 мин при плотности мощности 80 мВт/см(энергетическая доза 14,4 Дж/см) вызывала снижение способности к росту и колониеобразованию. Так, если в контроле (клетках, не содержащих гиперицина и не облученных) концентрация клеток составляла 10 КОЕ/мл, то после их облучения - она снижалась на четыре порядка.
Недостатками известного способа фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis являются: (а) использование в качестве фотосенсибилизатора коммерческого химического препарата (гиперицина), неразрешенного к применению в медицинской практике; (б) высокая стоимость препарата, вызванная сложностью его выделения и химической очистки (согласно каталогу фирмы Sigma-Aldrich стоимость 10 мг препарата составляет 326,5 евро).
Задача предлагаемого изобретения - разработка эффективного способа фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis с использованием в качестве фотосенсибилизатора официнального лекарственного средства, разрешенного к применению в медицинской практике, и обеспечивающего за счет фотодинамического эффекта полное бактерицидное действие в отношении Enterococcus faecalis при более низкой стоимости реализуемого способа.
Поставленная задача решается следующим образом.
Вариант 1
2
В способе фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis, основанный на предварительной обработке бактерий гиперицинсодержащим фотосенсибилизатором и последующем воздействии оптическим излучением видимой области спектра, соответствующим полосе поглощения фотосенсибилизатора, в качестве гиперицинсодержащего фотосенсибилизатора используют препарат «Диагиперон» на основе спиртовой настойки травы зверобоя, разводят его суспензией бактерий 1/30±10 по объему и воздействуют на суспензию излучением лазерного или светодиодного источников с максимумом испускания в области, соответствующей максимумам спектра поглощения или максимумам спектра возбуждения флуоресцирующих компонент суспензии при плотности энергии излучения 0,9-9,0 Дж/см.
Вариант 2
2
В способе фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis, основанный на предварительной обработке бактерий гиперицинсодержащим фотосенсибилизатором и последующем воздействии оптическим излучением видимой области спектра, соответствующим полосе поглощения фотосенсибилизатора, в качестве гиперицинсодержащего фотосенсибилизатора используют официнальный лекарственный препарат «Зверобоя настойка» на основе спиртовой настойки травы зверобоя продырявленного, разводят его суспензией бактерий 1/30±10 по объему и воздействуют на суспензию излучением лазерного или светодиодного источников с максимумом испускания в области, соответствующей максимумам спектра поглощения или максимумам спектра возбуждения флуоресцирующих компонент суспензии при плотности энергии излучения 0,9-9,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют лазерным излучением с длиной волны λ=665±10 нм при плотности энергии 0,9-6,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют лазерным излучением с длиной волны 405 нм при плотности энергии 0,9-6,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют лазерным излучением с длиной волны в области 435-445 нм при плотности энергии 0,9-6,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют лазерным излучением с длиной волны 532 нм при плотности энергии 0,9-9,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют излучением светодиодного источника с максимумом испускания на длине волны λ=405±10 нм при плотности энергии 0,9-6,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют излучением светодиодного источника с максимумом испускания на длине волны λ=450±10 нм при плотности энергии 0,9-6,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют излучением светодиодного источника с максимумом испускания на длине волны λ=545±10 нм при плотности энергии 0,9-6,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют излучением светодиодного источника с максимумом испускания на длине волны λ=590±10 нм при плотности энергии 0,9-4,5 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют излучением светодиодного источника с максимумом испускания на длине волны λ=660±15 нм при плотности энергии 0,9-6,0 Дж/см.
1
2
2
Воздействие осуществляют излучением светодиодного источника белого света с максимумами испускания на длинах волн λ=450±10 нм и λ=575±10 нм при плотности энергии 0,9-6,0 Дж/см.
Сущность изобретения поясняется чертежами, где:
на фиг.1 показан спектр поглощения «Диагиперона»;
на фиг.2 - спектры поглощения гиперициновой (кривая 1) и хлорофилловой (кривая 2) фракций «Диагиперона» после их предварительного выделения с помощью тонкослойной хроматографии;
возб
на фиг.3 - спектры флуоресценции диагиперона при длине волны возбуждения λ=405 (кривая 1), 445 (кривая 2), 532 (кривая 3) и 545 нм (кривая 4);
рег
на фиг.4 - спектры возбуждения флуоресценции «Диагиперона» при длине волны регистрации λ=653 (кривая 1), 702 нм (кривая 2);
на фиг.5 - спектр поглощения «Зверобоя настойки» после разбавления спиртом в соотношении 200 мкл настойки/4000 мкл этанола;
рег
рег
на фиг.6 - спектры возбуждения флуоресценции «Зверобоя настойки», разбавленной в соотношении 50 мкл настойки/4000 мкл этанола при длине волны регистрации λ=620 (кривая 7) нм и разбавленной в соотношении 200 мкл настойки/4000 мкл этанола при длине волны регистрации λ=720 нм (кривая 2);
макс
на фиг.7 - спектры излучения светодиодных источников с максимумом интенсивности при λ=405 (кривая 1); 450 (кривая 2); 545 (кривая 3); 600 (кривая 4); 660 (кривая 5); 450 и 575 нм (кривая 6).
Лекарственный препарат «Диагиперон» представляет собой настойку (на 70% спирте этиловом) травы зверобоя для внутреннего и наружного применения. Оказывает анксиолитическое (снимает тревогу, напряжение) и антидепрессивное действие (повышает настроение). Улучшает функциональное состояние центральной и вегетативной нервной системы. Обладает вяжущим и противовоспалительным действием, а также антибактериальной активностью (в темновых условиях) по отношению к ряду микроорганизмов, устойчивых к действию антибиотиков.
погл
погл
погл
погл
погл
погл
погл
фл
фл
фл
воз
фл
воз
фл
воз
фл
фл
Как следует из данных, представленных на фиг.1, в спектре поглощения «Диагиперона» отчетливо регистрируются три максимума: при λ=551; 590 и 664 нм. Разделение компонент методом тонкослойной хроматографии показало, что два первых максимума принадлежат гиперицину, входящему в состав «Диагиперона», а длинноволновый максимум при λ=664 нм обусловлен, главным образом, присутствием в препарате хлорофилла a (фиг.2). В пользу такого заключения свидетельствует тот факт, что максимумы спектров поглощения очищенных препаратов хлорофилла a в этиловом спирте расположены при λ=431 и 665 нм, хлорофилла b - при λ=463 и 649 нм, а гиперицина - при λ=477, 510, 548 и 590 нм. После хроматографического разделения компонентов одна из фракций (гиперицин-содержащая, кривая 1, фиг.2) имеет максимумы в спектре поглощения при λ=548 и 591 нм, другая (хлорофилл-содержащая, кривая 2, фиг.2) - при λ=408, 504, 535, 607, 666 нм. Наличие нескольких типов хромофоров, поглощающих в видимой области спектра, в составе «Диагиперона» подтверждается также и данными спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции препарата (фиг.3 и фиг.4). При этом спектры флуоресценции химически чистых этанольных растворов хлорофилла a расположены при λ=674 и 725 нм; хлорофилла b - при λ=650 и 710 нм; гиперицина - при λ=594; 642 и 702 нм. Следовательно, изменение длины волны возбуждения флуоресценции «Диагиперона» приводит к изменению вкладов гиперицина и хлорофилла в общую флуоресценцию настойки диагиперона, а соответственно - и к изменению положения максимумов спектра флуоресценции. Причем, если при возбуждении в области λ≥630 нм (при которой поглощение гиперицина практически отсутствует) в спектре флуоресценции «Диагиперона» регистрируется (фиг.3) только хлорофилловая компонента (λ=673 нм), то при λ=545 нм - преобладает гиперициновая составляющая (λ=595 и 643 нм, кривая 4). При возбуждении в области λ=405 (кривая 1), 445 (кривая 2) и 532 нм (кривая 3) в спектре флуоресценции регистрируются как гиперициновая, так и хлорофилловая компоненты. Отметим, что изменяя длину волны возбуждения, удается зарегистрировать как флуоресценцию хлорофилла a (максимум в спектре в области λ=672 нм, кривая 3), так и хлорофилла b (λ=658 нм, кривая 2), присутствующих в составе «Диагиперона».
рег
макс
макс
Информация об оптимальном диапазоне возбуждения фотосенсибилизирующих компонент в «Диагипероне» получена из данных спектров возбуждения флуоресценции (фиг.4): при регистрации флуоресценции в области λ=653 нм (кривая 1) соответствующие максимумы расположены при λ=430; 546 и 590 нм; при регистрации в области 702 нм (кривая 2) λ=405; 547; 589 и 664 нм.
Обращают на себя внимание заметные отличия спектра возбуждения флуоресценции (фиг.4) от спектра поглощения препаратов (фиг.1 и фиг.2), что обусловлено присутствием в их составе нефлуоресцирирующих (в красной области спектра) компонент: эфирных масел, дубильных веществ, фенолоальдегидов, цинеолов и др. Указанные соединения обладают выраженным поглощением в ультрафиолетовой области спектра и являются причиной высокой оптической плотности растворов «Диагиперона» в диапазоне 350-400 нм (фиг.1).
Из анализа представленных данных следует, что возбуждение гиперициновой и хлорофилловой компонент «Диагиперона» возможно практически во всей видимой области спектра, однако наиболее эффективным является выбор диапазонов, соответствующих максимумам поглощения его флуоресцирующих компонент: 405±10 нм, 430±25 нм; 545±15 нм; 590±10 нм; 665±15 нм.
Практически указанный способ фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis при использовании «Диагиперона» в качестве фотосенсибилизатора может быть реализован за счет использования наиболее доступных в настоящее время полупроводниковых лазеров с длиной волны излучения в области 405 нм; 435-445 нм; 665±15 нм; твердотельного Nd : YAG-лазера с диодной накачкой и удвоением частоты излучения с длиной волны 532 нм; сверхъярких светодиодов, максимум спектра излучения которых расположен в области 405±10 нм (кривая 1 на фиг.7); 450±10 нм (кривая 2); 545±10 нм (кривая 3); 590±10 нм (кривая 4); 660±15 нм (кривая 5). Возможно также использование светодиода белого света, один из максимумов испускания которого расположен при 450 нм, другой - при 575 нм (кривая 6).
Лекарственный препарат «Зверобоя настойка» представляет собой настойку травы зверобоя продырявленного на 40% спирте этиловом для внутреннего и наружного применения. Оказывает вяжущее и противовоспалительное действие, обусловленное содержащимися флавоноидами, азуленом и эфирными маслами, а также мягким антидепрессивным, седативным и анксиолитическим действием.
рег
рег
рег
Данные о спектре поглощения «Зверобоя настойки» представлены на фиг.5. Видно, что в видимой области спектра (400-760 нм) точки экстремумов, которые могли бы быть соотнесены с присутствием в растворе фотосенсибилизирующих компонентов, слабо выражены. Отмечается лишь слабо проявляющийся максимум в области 591 нм и «плечи» в области 485 нм и 548 нм, связанные с присутствием в препарате гиперицина. Не вызывает сомнения, что такая маскировка полос поглощения в препарате обусловлена многокомпонентным составом лекарства, в том числе и присутствием в нем компонентов, не способных оказывать фотосенсибилизирующее действие. По этой причине наиболее достоверная информация о фотосенсибилизирующих соединениях «Зверобоя настойка» получена из анализа спектров возбуждения флуоресценции (фиг.6). Причем для регистрации спектра возбуждения в области 400-600 нм (кривая 1) λ=620 нм использовалась настойка, разбавленная в соотношении 50 мкл настойки/4000 мкл этанола. Необходимость такого разбавления обусловлена высокой оптической плотностью раствора в области 400 нм, что (из-за эффекта экранирования) не позволяет выяснить истинное положение максимумов в спектре возбуждения. При исследовании разбавленных растворов в спектре возбуждения (λ=620 нм) регистрируются максимумы в области 430; 477, 548 и 590 нм. Кроме того, отмечается также максимум в области слабого поглощения (низкой интенсивности в спектре возбуждения при 511 нм). Для регистрации спектра возбуждения флуоресценции в красной области (λ=720 нм, кривая 2) использовались более концентрированные растворы «Зверобоя настойки» (200 мкл настойки/4000 мкл этанола), которые позволили обнаружить в спектре возбуждения флуоресценции наряду с ранее зарегистрированными «гиперициновыми» максимумами в области 548 и 590 нм полосу с максимумом при 659 нм, обусловленную присутствием в растворе хлорофилловой компоненты.
Из представленных данных следует, что для активации фотосенсибилизирующих компонентов «Зверобоя настойки» наиболее подходят источники излучения, максимумы спектра излучения которых находятся в области 430±25 нм; 548±15 нм, 590±10 нм и 659±15 нм.
Практически способ фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis при использовании «Зверобоя настойки» в качестве фотосенсибилизатора реализован за счет использования наиболее доступных в настоящее время полупроводниковых лазеров с длиной волны излучения в области 435-445 нм; 665±10 нм; твердотельного Nd : YAG-лазера с диодной накачкой и удвоением частоты излучения с длиной волны 532 нм; сверхъярких светодиодов, максимум спектра излучения которых расположен в области 450±10 нм (кривая 2 на фиг.7); 545±10 нм (кривая 3); 590±10 нм (кривая 4); 660±15 нм (кривая 5). Возможно также использование светодиода белого света, один из максимумов испускания которого расположен при 450 нм, другой - при 575 нм (кривая 6).
Сущность заявляемого способа фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis заключается в следующем.
8
В опытах по фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis используют пять-восемь штаммов выращенной на скошенном питательном агаре суточной культуры клинически выделенных энтерококков с обязательным контролем чистоты культуры и проверкой основных биохимических родовых и видовых признаков. Из выросшей суточной культуры на стерильном физиологическом растворе готовят суспензию клеток в концентрации 1,5×10 КОЕ/мл, что соответствует 10 ЕД стандарта мутности. Путем последовательных 10-кратных (1:10) разведении готовят суспензию с разведением 1:(100000-10000000) для каждой культуры энтерококков.
2
По 2 мл полученной суспензии каждого штамма вносят в стерильные чашки Петри диаметром 3,5 см (площадь дна S=9,6 см). Готовят четыре группы суспензий:
- 1-я группа (контрольная без фотосенсибилизатора). В каждую чашку в стерильных условиях добавляют по 0,5 мл разведенного 1:5 стерильным физиологическим раствором 70% этилового спирта (этанола),
- 2-я группа (опытная без фотосенсибилизатора). В каждую чашку в стерильных условиях добавляют по 0,5 мл разведенного 1:5 стерильным физиологическим раствором 70% этилового спирта (этанола). Через 5 мин содержимое каждой чашки подвергают воздействию оптического излучения (светодиодного источника или полупроводникового лазера),
- 3-я группа (контрольная с фотосенсибилизатором). В каждую чашку в стерильных условиях добавляют по 0,5 мл разведенного 1:5 стерильным физиологическим раствором «Диагиперона»,
- 4-я группа (опытная с фотосенсибилизатором). В каждую чашку в стерильных условиях добавляют по 0,5 мл разведенного 1:5 стерильным физиологическим раствором «Диагиперона». Через 5 мин содержимое каждой чашки подвергают воздействию оптического излучения (светодиодного источника или полупроводникового лазера).
При использовании для облучения бактерий Enterococcus faecalis официнального лекарственного препарата «Диагиперона» применяют один из следующих источников:
- полупроводниковый лазер с длиной волны излучения в области 405 нм (фиолетовая область спектра);
- полупроводниковый лазер с длиной волны излучения в области 435-445 им (синяя область спектра);
- полупроводниковый лазер с длиной волны излучения в области 665±10 нм (красная область спектра);
- твердотельный Nd : YAG-лазера с диодной накачкой и удвоением частоты излучения с длиной волны 532 нм (зеленая область спектра);
- сверхъяркие светодиоды, максимумы спектра излучения которых расположен в области 405±10 нм (фиолетовая область спектра);
- сверхъяркие светодиоды, максимумы спектра излучения которых расположен в области 450±10 нм (синяя область спектра);
- сверхъяркие светодиоды, максимумы спектра излучения которых расположен в области 545±10 нм (зеленая область спектра);
- сверхъяркие светодиоды, максимумы спектра излучения которых расположен в области 590±10 нм (желтая область спектра);
- сверхъяркие светодиоды, максимумы спектра излучения которых расположен в области 660±15 нм (красная область спектра).
- сверхъяркие светодиоды излучающие белый свет, один из максимумов испускания которых расположен при 450±10 нм, другой - при 575±10 нм.
2
Источник оптического излучения располагают над чашкой Петри таким образом, чтобы оптическая ось излучения была направлена перпендикулярно поверхности чашки, а размер светового пятна несколько превышал площадь дна (S=9,6 см) чашки с культурой, обеспечивая облучение всей суспензии микроорганизмов.
2
Мощность оптического излучения каждого источника измеряют с помощью измерителя ИМО-2Н и регулируют за счет изменения тока накачки полупроводникового излучателя. Мощность лазерного излучения изменяют в диапазоне 100-1000 мВт, а мощность излучения светодиода 75-225 мВт. При этом плотность мощности воздействующего излучения составляет 5-100 мВт/см; а время воздействия оптического излучения составляет от 1 до 5 мин.
k
o
о
к
Затем из каждой чашки контрольной и опытной групп отбирают по 1 мл содержимого и высевают в стерильные чашки Петри диаметром 9 см с энтерококк агаром. Посевы культур на энтерококк агаре инкубируют в термостате при температуре 37°C в течение 24 часов. Через 24 часа инкубации проводят подсчет колониеобразующих единиц в контрольных (n) чашках и в чашках, содержащих облученные клетки (n). Остаточную активность бактерий определяют как γ=n/n·100%.
Полученные результаты при воздействии на бактерии Enterococcus faecalis излучения полупроводникового лазера с длиной волны λ=665 нм суммированы в таблице 1.
Таблица 1
Культура, штамм
Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в группе
1-я группа (контроль без «Диагиперона») (n<sub>k</sub>)
2-я группа (облучение без «Диагиперона») (n<sub>o</sub>)
3-я группа (контроль с «Диагипероном») (n<sub>k</sub>)
4-я группа (облучение с «Диагипероном») (n<sub>о</sub>)
Enterococcus faecalis №1
40
27
26
0
Enterococcus faecalis №2
35
20
18
0
Enterococcus faecalis №3
40
30
29
0
Enterococcus faecalis №4
20
10
10
0
Enterococcus faecalis №5
25
15
13
0
Enterococcus faecalis №6
30
20
21
1
Enterococcus faecalis №7
50
35
36
1
Enterococcus faecalis №8
20
17
16
0
Среднее значение
30
21,8
21,1
0,25
Среднее значение, %
100
72,7
70,3
0,8
2
2
В таблице 1 представлена фотодинамическая инактивация бактерий Enterococcus faecalis при воздействии излучения полупроводникового лазера с длиной волны λ=665 нм при плотности мощности 100 мВт/см в течение 1 мин в отсутствии и присутствии «Диагиперона», добавленного в суспензию бактерий в соотношении 1/30 по объему. Плотность энергии лазерного излучения 6,0 Дж/см.
2
2
о
k
Из таблицы 1 следует, что воздействие на суспензию бактерий Enterococcus faecalis без добавления фотосенсибилизаторов излучения полупроводникового лазера с длиной волны λ=665 нм при плотности мощности 100 мВт/см в течение 1 мин (плотность энергии лазерного излучения 6,0 Дж/см) приводит (2-я группа таблицы) к снижению количества колониеобразующих единиц. Остаточная активность при этом составляет γ=n/n·100%=72,7%. Наличие эффекта фотодинамической инактивации без добавления «Диагиперона» может быть обусловлено сенсибилизирующим действием эндогенных сенсибилизаторов порфириновой природы, присутствующих в бактериях Enterococcus faecalis.
о
k
o
k
2
2
Внесение к суспензии Enterococcus faecalis «Диагиперона» в соотношении 1/30 по объему и последующая инкубация с ним приводят (см. 3-ю группу таблицы) к частичной инактивации клеток. Остаточная активность при этом составляет γ=n/n·100%=70,3%. Указанная инактивация может быть обусловлена антисептическими свойствами «Диагиперона», что подтверждается имеющимися данными о способности одного из компонентов препарата, гиперицина, оказывать инактивирующее действие на Enterococcus faecalis в темновых условиях (без воздействия света). Однако при воздействии на суспензию бактерий Enterococcus faecalis в присутствии «Диагиперона», предварительно добавленного в соотношении 1/30 по объему, излучения полупроводникового лазера с длиной волны λ=665 нм при плотности мощности 100 мВт/см в течение 1 мин (плотность энергии лазерного излучения 6,0 Дж/см) наблюдается (4-я группа таблицы) практически полная фотодинамическая инактивация клеток. Остаточная активность при этом составляет γ=n/n·100%=0,8%. Полная фотодинамическая инактивация бактерий (γ=0) наблюдается в 6 из 8 опытов и лишь в 2 опытах обнаруживаются единичные колониеобразующие единицы.
Таким образом, представленные данные свидетельствуют, что фотодинамическое действие, сенсибилизированное входящим в состав «Диагиперона» хлорофиллом, поглощающим на длине волны воздействующего излучения λ=665 нм, приводит к фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis.
Инактивация бактерий Enterococcus faecalis наблюдается также при воздействии излучения фиолетовой области спектра, что обусловлено возбуждением как хлорофилловой, так и гиперициновой компонент «Диагиперона».
2
2
o
k
Полученные результаты при воздействии на бактерии Enterococcus faecalis излучения светодиодного источника с максимумом испускания при длине волны λ=405 нм при плотности мощности 15 мВт/см суммированы в таблице 2. Из представленных данных видно, что воздействие излучения при плотности энергии 4,5 Дж/см приводит (см. 4-ю группу) к полной потере способности к колониеобразованию клеток (остаточная активность γ=n/n·100%=0.
Таблица 2
Культура, штамм
Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в группе
1-я группа (контроль без «Диагиперона») (n<sub>k</sub>)
2-я группа (облучение без «Диагиперона») (n<sub>o</sub>)
3-я группа (контроль с «Диагипероном») (n<sub>k</sub>)
4-я группа (облучение с «Диагипероном») (n<sub>o</sub>)
Enterococcus faecalis №1
220
140
165
0
Enterococcus faecalis №2
200
130
150
0
Enterococcus faecalis №3
190
130
140
0
Enterococcus faecalis №4
250
100
175
0
Enterococcus faecalis №5
180
90
125
0
Среднее значение
208
118
151
0
Среднее значение, %
100
56,7
72,5
0
2
2
В таблице 2 представлена фотодинамическая инактивация бактерий Enterococcus faecalis при воздействии излучения светодиодного источника с максимумом испускания при длине волны λ=405 нм при плотности мощности 15 мВт/см в течение 5 мин в отсутствии и присутствии «Диагиперона», добавленного в суспензию бактерий в соотношении 1/30 по объему. Плотность энергии лазерного излучения 4,5 Дж/см.
Следует отметить, что фотодинамическое действие, сенсибилизированное красителем, не зависит от степени монохроматичности оптического излучения и степени его поляризации, а определяется лишь плотностью энергии (плотностью энергетической дозы), поглощенной сенсибилизатором. По этой причине фотодинамическая инактивация бактерии Enterococcus faecalis наблюдается как при действии монохроматического излучения лазерных источников (длина волны 405 нм, 435-445 нм, 532 нм, 665±15 нм), так и квазимонохроматического излучения светодиодных источников (с максимумом спектра испускания при 405±10 нм, 450±10 нм, 545±10 нм, 590±10 нм, 660±15 нм), диапазон излучения которых соответствует максимумам в спектре поглощения или спектрах возбуждения флуоресценции хлорофилловых и гиперициной компонентов «Диагиперона». Данные, приведенные в таблице 2, подтверждают сказанное при использовании излучения светодиодного источника с максимумом 405 нм.
При этом, учитывая многокомпонентный состав фотосенсибилизирующих соединений, изменение длины волны оптического излучения приводит к изменению суммарного поглощения света фотосенсибилизирующими компонентами «Диагиперона», а также вклада хлорофилловых и гиперициновых компонетов лекарственного препарата. Однако, поскольку фотодинамическую инактивацию бактерий вызывает как возбуждение хлорофилловых составляющих, так и гиперициновой компоненты, то изменение длины волны лазерного (405 нм, 435-445 нм, 532 нм, 665±15 нм) или светодиодного источника (405±10 нм, 450±10 нм, 545±10 нм, 590±10 нм, 660±15 нм) в пределах полос поглощения указанных компонентов обеспечивает фотодинамическую инактивацию бактерий при сопоставимых плотностях энергии излучения. По этой же причине фотодинамическая инактивация Enterococcus faecalis наблюдается также и при воздействии на бактерии в присутствие «Диагиперона» светодиодного источника белого света, один из максимумов спектра испускания которого расположен при 450 нм, другой - при 575 нм.
Следует отметить, что выбор концентрации фотосенсибилизатора при его конечном разведении в соотношении к суспензии бактерий 1/(30±10) по объему обусловлен следующими соображениями. Оптимальным является разведение 1/30, что обеспечивает эффективную фотодинамическую инактивацию бактерий Enterococcus faecalis. Снижение концентрации фотосенсибилизатора за счет увеличения его разведения суспензии бактерий 1/40 по объему приводит к резкому снижению фотодинамического эффекта. Увеличение концентрации фотосенсибилизатора за счет снижения его разведения суспензии бактерий 1/20 является нежелательным в силу выраженной темновой (в отсутствие света) инактивации бактерий спиртом.
Наряду с «Диагипероном» в качестве фотосенсибилизатора для фотодинамической инактивации бактерий Enterococcus faecalis может использоваться также официнальный лекарственный препарат «Зверобоя настойка». Фотодинамическая инактивация бактерий при конечном разведении препарата «Зверобоя настойка» в соотношении к суспензии бактерий 1/(30±10) по объему реализуется при воздействии одного из следующих источников: лазеров (с длиной волны излучения 405 нм, 435-445 нм, 532 нм, 665±10 нм) или светодиодов (с максимумом спектра испускании при 405±10 нм; 450±10 нм; 545±10 нм, 590±10 нм и 660±10 нм), диапазон излучения которых соответствует максимумам (430±25 нм; 548±15 нм, 590±10 нм и 659±15 нм) в спектре поглощения или спектрах возбуждения флуоресценции хлорофилловых и гиперициной компонентов «Зверобоя настойки».
При использовании «Диагиперона» в качестве официнального лекарственного препарата на основе спиртовой настойки травы зверобоя или официнального лекарственного препарата «Зверобоя настойка» на основе спиртовой настойки травы зверобоя продырявленного в соотношении к суспензии бактерий 1/(30±10) по объему:
2
Воздействие осуществляют лазерным излучением с длиной волны λ=665±10 нм при плотности энергии 0,9-6,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют лазерным излучением с длиной волны 405 нм при плотности энергии 0,9-6,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют лазерным излучением с длиной волны в области 435-445 нм при плотности энергии 0,9-6,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют лазерным излучением с длиной волны 532 нм при плотности энергии 0,9-9,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют излучением светодиодного источника с максимумом испускания на длине волны λ=405±10 нм при плотности энергии 0,9-6,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют излучением светодиодного источника с максимумом испускания на длине волны λ=450±5 нм при плотности дозы 0,9-6,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют излучением светодиодного источника с максимумом испускания на длине волны λ=545±10 нм при плотности дозы 0,9-6,0 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют излучением светодиодного источника с максимумом испускания на длине волны λ=590±10 нм при плотности дозы 0,9-4,5 Дж/см.
2
Воздействие осуществляют излучением светодиодного источника с максимумом испускания на длине волны λ=660±10 нм при плотности дозы 0,9-6,0 Дж/см.
1
2
2
Воздействие осуществляют излучением светодиодного источника белого света с максимумами испускания на длинах волн λ=450±10 нм и λ=575±10 нм при плотности дозы 0,9-6,0 Дж/см.
Результаты воздействия излучения каждого из вышеуказанных лазерных или светодиодных источников на суспензию бактерий Enterococcus faecalis в присутствии официнального лекарственного препарата «Зверобоя настойка» на основе спиртовой настойки травы зверобоя продырявленного при разведении в соотношении к суспензии бактерий 1/30 по объему представлены в таблице 3.
Таблица 3
Тип источника оптического излучения
Длина волны излучения, нм
Плотность энергии воздействующего излучения, Дж/см<sup>2</sup>
Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) после воздействия излучения
Лазер
665±10
6,0
0
Лазер
405
6,0
0
Лазер
435-445
6,0
0
Лазер
532
9,0
0
Светодиод
405±10
6,0
0
Светодиод
450±5
6,0
0
Светодиод
545±10
6,0
0
Светодиод
λ=590±10
4,5
0
Светодиод
660±10
6,0
0
Светодиод
450±10 и 575±10
6,0
0
2
2
При использовании в качестве фотосенсибилизатора официнального лекарственного препарата «Диагиперон» или официнального лекарственного препарата «Зверобоя настойка» на основе спиртовой настойки травы зверобоя и воздействии в присутствии одного из них на суспензию бактерий Enterococcus faecalis излучения одного из указанных источников при плотности энергии 0,9-9,0 Дж/см наблюдается фотодинамическая инактивация бактерий. При плотности энергии оптического излучения любого из источников 9,0 Дж/см обеспечивается полная фотодинамическая инактивация бактерий Enterococcus faecalis, исключающая возможность их роста.
Таким образом, приведенные данные показывают, что фотодинамическая инактивация бактерий Enterococcus faecalis достигается за счет использования в качестве фотосенсибилизатора официнального лекарственного препарата на основе спиртовой настойки травы зверобоя, разрешенного к применению в медицинской практике, стоимость минимального объема которого в сотни раз ниже стоимости аналога (согласно каталогу фирмы Sigma-Aldrich стоимость минимальной навески гиперицина (10 мг) составляет 326,5 евро). Следовательно, заявляемый способ обеспечивает фотодинамическую инактивацию бактерий Enterococcus faecalis с использованием в качестве фотосенсибилизатора доступных по цене лекарственных препаратов, разрешенных к использованию в медицинской практике.
Литературные источники
1. Stuart C.H., Schwartz S.A., Beeson T.J., Owatz C.B. Enterococcus faecalis: its role in root canal treatment failure and current concepts in retreatment. J Endod. 2006 Vol.32 №2 P.93-98.
2. Сидоренко C.B. Клиническое значение антибиотикорезистентности грамположительных микроорганизмов. Инфекции и антимикробная терапия. 2003. Том 5, №2. С.48-55.
3. Wainwright M., Phoenix D.A., Marland J., Wareing D.R., Bolton F.J. A study of photobactericidal activity in the phenothiazinium series. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1997 Vol.19 №1 P.75-80.
4. Foschi F., Fontana C.R., Ruggiero K., Riahi R., Vera A., Doukas A.G., Pagonis T.C., Kent R., Stashenko P.P., Soukos N.S. Photodynamic inactivation of Enterococcus faecalis in dental root canals in vitro. Lasers Surg. Med. 2007 Vol.39 №10 P.782-787.
5. Rios A., He J., Glickman G.N., Spears R., Schneiderman E.D., Honeyman A.L. Evaluation of photodynamic therapy using a light-emitting diode lamp against Enterococcus faecalis in extracted human teeth. J Endod. 2011 Vol.37 №6 P.856-859.
6. Kishen A., Upadya M., Tegos G.P., Hamblin M.R. Efflux pump inhibitor potentiates antimicrobial photodynamic inactivation of Enterococcus faecalis biofilm. Photochem Photobiol. 2010 Vol.86 №6 P.1343-1349.
7. George S., Hamblin M.R., Kishen A. Uptake pathways of anionic and cationic photosensitizers into bacteria. Photochem Photobiol Sci. 2009 Vol.8 №6 P.788-795.
8. Nagayoshi M., Nishihara T., Nakashima K., Iwaki S., Chen K.K., Terashita M., Kitamura C. Bactericidal effects of diode laser irradiation on Enterococcus faecalis using periapical lesion defect model. ISRN Dent. Published online 2011 July 14. dot: 10.5402 / 2011/870364.
9. Pileggi G., Wataha J.C., Girard M., Grad I., Schrenzel J., Lange N., Bouillaguet S. Blue light-mediated inactivation of Enterococcus faecalis in vitro. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2013 Vol.10 №2 P.134-140.
10. Kranz S., Guellmar A., Völpel A., Gitter В., Albrecht V., Sigusch B.W. Photodynamic suppression of Enterococcus faecalis using the photosensitizer mTHPC. Lasers Surg Med. 2011 Vol.43 №3 P.241-248.
11. Burda W.N., Fields K.B, Gill J.B., Burt R., Shepherd M., Zhang X.P., Shaw L.N. Neutral metallated and meso-substituted porphyrins as antimicrobial agents against gram-positive pathogens. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2012 Vol.31 №3 P.327-335.
12. Mantareva V., Kussovski V., Angelov I., Dimitrov S. Advance photodynamic inactivation of dental pathogenic microorganisms with water-soluble and cationic phthalocyanines. In: Science against Microbial Pathogens: Communicating Current Research and Technological Advances. Ed.A. Mendez-Vilas, Formatex Research Center, Badajoz (Spain) 2011 Vol.1, P.650-661.
13. Mantareva V., Kussovski V., Angelov I., Wöhrle D., Dimitrov R., Popova E., Dimitrov S. Non-aggregated Ga(III)-phthalocyanines in the photodynamic inactivation of planktonic and biofilm cultures of pathogenic microorganisms. Photochem Photobiol Sci. 2011 Vol.10 №1 P.91-102.
14. Foley J., Hamblin M. Antimicrobial photoinactivation using chalcogen analogs of benzo(A)phenoxazinium dyes. US 20080015189 A1.
15. Pagonis T.C., Chen J., Fontana C.R., Devalapally H., Ruggiero K., Song X., Foschi F., Dunham J., Skobe Z., Yamazaki H., Kent R., Tanner A.C., Amiji M.M., Soukos N.S. Nanoparticle-based endodontic antimicrobial photodynamic therapy. J Endod. 2010 Vol.36 №2 P.322-328.
16. Carvalho C.M., Alves E., Costa L., Tome J.P., Faustino M.A., Neves M.G., Tome A.C., Cavaleiro J.A., Almeida A., Cunha A., Lin Z., Rocha J. Functional cationic nanomagnet-porphyrin hybrids for the photoinactivation of microorganisms. ACS Nano. 2010 Vol.4 №12 P.7133-7140.
17. Huang L., Zhiyentayev Т., Xuan Y., Azhibek D., Kharkwal G.B., Hamblin M.R. Photodynamic inactivation of bacteria using polyethylenimine-chlorin(e6) conjugates: effect of polymer molecular weight, substitution ratio of chlorin(e6) and pH. Lasers Surg Med. 2011 Vol.43 №4 P.313-323.
18. Kashefa N., Borghei Y.S., Djavid G.E. Photodynamic effect of hypericin on the microorganisms and primary human fibroblasts. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2013 Vol.10, №2 P.150-155.