Исследование эндогенной секреции сосудистого эндотелиального фактора роста мультипотентными мезенхимными стромальными клетками из зачатков третьих моляров человека

Исследование эндогенной секреции сосудистого эндотелиального фактора роста мультипотентными мезенхимными стромальными клетками из зачатков третьих моляров человека

В.В. Соловьева 1, Н.Л. Блатт1, А.К. Шафигуллина 2, А.А. Ризванов 1

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет

2 Казанский государственный медицинский университет

Endogenous secretion of vascular endothelial growth factor by multipotent mesenchymal stromal cells derived from human third molar dental follicles

V.V. Solovyeva 1, N.L. Blatt1, A.K. Shafigullina 2, A.A. Rizvanov1

1 Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan

2 Kazan State Medical University, Kazan

В настоящее время активно ведутся исследования се-кретома стволовых клеток человека. В работе показано, что мультипотентные мезенхимные стромальные клетки, выделенные из зачатков третьих моляров человека (ММСК-ЗТМ], характеризуются высокой продукцией сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) при культивировании in vitro. В связи с тем, что VEGF является известным ангиогенным и нейропротекторным фактором, применение ММСК-ЗТМ перспективно для разработки методов клеточной терапии различных дегенеративных заболеваний человека.

Ключевые слова: секретом, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки, зачатки третьих моляров человека, сосудистый эндотелиальный фактор роста.

Human stem cells secretome is currently a very hot area of research. We report that multipotent mesenchymal stromal cells isolated from human third molar dental follicles (MMSC-TMDF), are able to secrete high levels of vascular endothelial growth factor (VEGF.) when cultured in vitro. Due to the fact that VEGF is a well known angiogenic and neuroprotective factor, the use of MMSC-TMDF is promising for the development of stem cell therapy of various degenerative human diseases.

Key words: secretome, multipotent stem cells, third molar dental follicles, vascular endothelial growth factor.

В последние годы проведены обширные исследования по анализу секретома различных клеточных типов. Термин «секретом» используется для характеристики общего пула белков, секретируемых клеткой, тканью или организмом в данный момент времени и при определенных условиях среды [1]. Также секретом отражает функциональное состояние клетки в заданных условиях среды. Более того, клетки могут активировать секрецию различных белков в зависимости от стимулов и сигналов, которые они получают извне [2]. К настоящему времени есть ряд работ, посвященных исследованию секретома различных клеточных типов, в том числе стволовых [3-5].

Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) играют важную роль в самообновлении и регенерации тканей и органов, они способны к дифференцировке в различных направлениях [6, 7]. ММСК секретируют множество трофических и протекторных факторов, что является основанием для их внедрения в клиническую практику для лечения различных заболеваний человека.

Одним из перспективных источников ММСК являются зачатки и пульпа третьих моляров (зубов мудрости) человека [8, 9]. По своим морфологическим и фенотипическим свойствам клетки из указанных тканевых источников могут быть отнесены к ММСК, поскольку они обладают свойством клоногенности, способны пролиферировать как в условиях in vitro,

e-mail: rizvanov@gmail.com

так и in vivo, а также характеризуются способностью к мультилинейной дифференцировке, в том числе в остеобласты, цементобласты, хондробласты, ади-поциты, мышечные и нервные клетки [7, 10-14]. Кроме того, клетки пульпы зуба секретируют нейро-трофические факторы и способствуют выживанию чувствительных нейронов in vitro и двигательных нейронов in vivo [15]. Как полученные из любого другого нового источника, ММСК из зачатков третьих моляров (МСК-ЗТМ) требуют тщательного исследования как с точки зрения генетических и фенотипических особенностей, так и с точки зрения безопасности и эффективности для клеточной терапии.

По данным литературы, одним из наиболее перспективных для клинического применения факторов роста является сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), обладающий ангиогенными, нейро-протекторными, нейротрофическими свойствами [16-18]. Фактор поддерживает выживание нейронов, защищает нервную ткань от кислородного голодания при гипоксии, стимулирует пролиферацию нейробластов и рост аксонов, а также поддерживает выживание нейронов in vitro и in vivo [19]. Популяции клеток, в том числе стволовых, обладающие способностью секретировать высокий уровень VEGF, могут иметь преимущество в качестве клеточного материала в разработке методов лечения пациентов с нейродегенеративными и ишемическими заболеваниями.

Цель работы — определение эндогенного уровня экспрессии VEGF in vitro ММСК, выделенными из зачатков третьих моляров человека.

Материал и методы

Клеточные культуры. ММСК были выделены из зачатка третьего моляра человека, как описано ранее [9, 20]. По медицинским показаниям «зуб мудрости» удалялся хирургом-стоматологом у пациентов с предварительным получением письменного информированного согласия. В течение 30—40 мин после удаления зуб доставляли в лабораторию в физиологическом растворе с добавлением смеси антибиотиков — пенициллина и стрептомицина. В стерильных условиях ламинарного бокса Herasafe Termo (Германия) (второй уровень защиты) проводили механическое очищение твердых тканей зачатка зуба от фолликулярной капсулы. Обрабатывали зачаток зуба раствором Хэнкса (Gibco, США) с добавлением сме-

си антибиотиков (пенициллина и стрептомицина). Осторожно удаляли неминерализованную межкорне-вую перегородку зуба с помощью стерильного пинцета. Аккуратно извлекали зачаток пульпы из полости зуба. Тщательно измельчали пульпу на мелкие кусочки (1—2 мм) с помощью хиругических скальпелей со сменными лезвиями. Культивирование выполняли на среде Игла, модифицированной по методу Дуль-бекко (Sigma, США), к которой были добавлены 10% сыворотки крови плодов коровы (Sigma, США), 2 мМ L-глутамина (Sigma, США) и 1% смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Sigma, США) при 37°С во влажной атмосфере с содержанием 5% СО2 [21]. На 3 сут. проводили смену питательной среды. После 10—15 сут. инкубации было отмечено формирование «плотного» монослоя клеток. Замену питательной среды проводили через 1 сут. Пересев клеток проводили с применением раствора 1х трипсина-ЭДТА (Sigma, США).

Рис. 1. экспрессия ММСК третьих моляров человека ряда маркерных молекул. Проточная цитофлуориметрия

Культура эмбриональных клеток почки человека HEK-293T была получена из ATCC (American Type Culture Collection, США) (ATCC номер: CRL-11268).

Иммунофенотипирование ММСК. Экспрессию поверхностных антигенов ММСК оценивали методом проточной цитометрии [22]. Клетки трипсинизиро-вали и инкубировали в фосфатно-солевом буфере в течение 45 мин с первичными антителами к CD14, CD29, CD34, CD45, CD90, CD105, CD133, CD166 (SantaCruz Biotechnology, США) и CD73 (Zymed, США). После того, как клетки отмыли от несвязав-шихся антител, все клетки инкубировали со вторичными антителами к иммуноглобулинам кролика или мыши, коньюгированными с FITC (Fluorescein Isothiocyanate, длина волны 488/520) при 4°С в течение 45 мин. CD29-специфичные антитела были РЕ-мечеными (Phycoerythrin, длина волны 488/578) и не требовали инкубации со вторичными антителами. Анализ клеток проводили на проточном цитометре Guava easyCyte 8HT (Millipore, США), согласно инструкциям производителя.

Иммуноферментный анализ экспрессии VEGF в культуре клеток. ММСК и клетки линии HEK-293T культивировали в 12-луночных планшетах. Сбор культуральной среды из лунок с клетками проводили через 1, 3 и 5 сут. Концентрацию VEGF в культуральной среде определяли с помощью набора VEGF-ИФА-БЕСТ А-8784 (Вектор, Россия) по методике, рекомендуемой производителем. Метод определения основан на твердофазном «сэндвич» варианте иммунофермент-ного анализа (ИФА) с применением моно- и поликлональных антител к VEGF человека. Для построения стандартной кривой использовали калибровочные образцы с известной концентрацией VEGF, входящие в состав набора. Стандартная кривая свидетельствует о чувствительности и линейности детекции измеряемых концентраций VEGF в диапазоне 10—2000 пг/мл. Оптическую плотность растворов измеряли на многофункциональном микропланшетного ридере Infinite M200Pro (Tecan, Швейцария) в двухволновом режиме: основной фильтр — 450 нм, референс-фильтр — 655 нм. Исходя из прямой пропорциональности между величиной оптической плотности и концентрацией VEGF в стандартных образцах, вычисляли концентрацию VEGF в исследуемых образцах.

В качестве контрольной клеточной линии с низким эндогенным уровнем экспрессии VEGF использовали иммортализированную линию первичных человеческих эмбриональных клеток почки HEK293T.

Результаты и обсуждение

Из зачатков третьих моляров человека были выделены клетки, по своим морфологическим и фенотипическим свойствам аналогичные ММСК, поскольку они обладали фибробласто-подобной морфологией, были способны к длительной пролиферации in vitro и обладали способностью к дифференцировке в ади-погенном, хондрогенном, остеогенном и нейрогенном направлениям (информация не показана). С помощью проточной цитофлуориметрии было подтверждено, что выделенные клетки экспрессируют поверхностные антигены CD29, CD73, CD90, CD105 и CD166, характерные для ММСК, но не маркёры гемопоэтических клеток CD14, CD34, CD45 и CD133 (рис. 1).

10000

Ч

I 1000

2247

2675

100

10

1 день 3 день 15 день

НЕК-293Т МСК-3ТМ

Рис. 2. Эндогенный уровень экспрессии VEGF ММСК, выделенными из зачатков третьих моляров человека.

В качестве контрольной клеточной линии с низким эндогенным уровнем экспрессии VEGF использовали культуру клеток НЕК-293Т

Также в ходе работы было установлено, что ММСК, выделенные из зачатков третьих моляров человека, обладают высокой эндогенной экспрессией гена vegf и активно секретируют белок VEGF в культуральную среду. Концентрация VEGF в культуральной среде на 1 день инкубации составила 367 пг/мл, на 3 день — 2247 пг/мл, на 5 день — 2675 пг/мл. Клетки НЕК-293Т обладали низким эндогенным уровнем экспрессии VEGF на 1, 3 и 5 день инкубации — 11, 58 и 78 пг/мл, соответственно (рис. 2).

Таким образом, показано, что клетки, выделенные из зачатков третьих моляров человека, соответствуют ММСК и способны секретировать высокие уровни VEGF при культивировании in vitro. Так как высокий уровень секреции эндогенного VEGF не требует никакой дополнительной генетической модификации или культивирования при специализированных условиях (например, в присутствии факторов роста или при гипоксии), применение ММСК перспективно для разработки методов клеточной терапии различных дегенеративных заболеваний человека.

Благодарности

Работа частично финансировалась грантами Российского Фонда Фундаментальных Исследований (11-04-00902-а) и ФЦП Министерства образования и науки Российской Федерации (соглашение № 14.A18.21.0113). Работа частично выполнена на оборудовании Федерального центра коллективного пользования физико-химических исследований веществ и материалов (ФЦКП ФХИ) Казанского (Приволжского) федерального университета.

о

ЛИТЕРАТУРА:

1. Hathout Y. Approaches to the study of the cell secretome. Expert. Rev. Proteomics. 2007; 4(2): 239—48.

2. Chenau J., Michelland S., Seve M. Secretome: definitions and biomedical interest. Rev. Med. Interne. 2008; 29(7): 606—8.

3. Estrada R., Li N., Sarojini H. et al. Secretome from mesenchymal stem cells induces angiogenesis via Cyr61. J. Cell Physiol. 2009; 219(3): 563-71.

4. Justewicz D.M., Shokes J.E., Reavis B. et al. Characterization of the human smooth muscle cell secretome for regenerative medicine. Tissue Eng. Part C Methods, 2012.

5. Kim J.M., Kim J., Kim Y. et al. Comparative secretome analysis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells during osteogenesis. J. Cell Physiol. 2012. Epub ahead of print.

6. Домарацкая Е.И., Стволовые клетки — резиденты костного мозга. Известия Российской академии наук 2011; 3: 261—72.

7. Pevsner-Fischer M., Levin S., Zipori D. The origins of mesenchymal stromal cell heterogeneity. Stem Cell Rev. 2011; 7(3): 560—8.

8. Tziafas D., Kodonas K. Differentiation potential of dental papilla, dental pulp, and apical papilla progenitor cells. J Endod. 2010; 36(5): 781—9.

9. Yalvac M.E., Ramazanoglu M., Rizvanov AA. et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo- and neurogenesis. Pharmacogenomics 2010; 10(2): 105—13.

10. Tarnok A., Ulrich H., Bocsi J. Phenotypes of stem cells from diverse origin. Cytometry 2010; 77(1): 6—10.

11. Gronthos S., Mankani M., Brahim J. et al. Postnatal human dental pulp stem cells tDPSCs) in vitro and in vivo. PNAS USA 2000; 97(25): 13625—30.

12. Morsczeck C., Gotz W., Schierholz J. et al. Isolation of precursor cells [PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biol. 2005; 24(2): 155-65.

13. Yao S., Pan F., Prpic V. et al. Differentiation of stem cells in the dental follicle. J Dent. Res. 2008; 87(8): 767-71.

14. Kerkis I., Ambrosio C.E., Kerkis A. et al. Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic? J. Transl. Med. 2008; 6: 35.

15. Nosrat I.V., Widenfalk J., Olson L. et al. Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury. Dev. Biol. 2001; 238(1): 120-32.

16. Storkebaum E., Lambrechts D., Carmeliet P. VEGF: once regarded as a specific angiogenic factor, now implicated in neuroprotection. Bioessays 2004; 26(9): 943-54.

17. Patan S. Vasculogenesis and angiogenesis. Cancer Treat. Res. 2004; 117: 3-32.

18. Sun Y., Jin K., Xie L. et al. VEGF-induced neuroprotection, neurogenesis, and angiogenesis after focal cerebral ischemia. J. Clin. Invest. 2003; 111(12): 1843-51.

19. Jin K., Zhu Y., Sun Y. et al. Vascular endothelial growth factor (VEGF) stimulates neurogenesis in vitro and in vivo. PNAS USA 2002; 99(18): 11946-50.

20. Yalvac M.E., Ramazanoglu M., Gumru O.Z. et al. Comparison and optimisation of transfection of human dental follicle cells, a novel source of stem cells, with different chemical methods and electroporation. Neurochem. Res. 2009; 34(7): 1272-7.

21. Harris J.H., Graham J., Rickwood D. Cell Biology Protocols. John Wiley & Sons, Ltd.; 2006.

22. Hawley T.S., Hawley R.G., Totowa N.J. Flow Cytometry Protocols 2ed. Methods in Molecular Biology. Humana Press; 2004.

Поступила 24.09.2012