Изучение биохимических механизмов развития дисфункции митохондрий гепатоцитов при экспериментальной гипергомоцистеинемии у крыс

ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ ПИТАНИЯ

Для корреспонденции

Медведев Дмитрий Валериевич - ассистент кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики факультета дополнительного профессионального образования ГБОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России Адрес: 390026, г. Рязань, ул. Высоковольтная, д. 9 Телефон: (4912) 46-08-01 E-mail: meddmit@mail.ru

Д.В. Медведев, В.И. Звягина

Изучение биохимических механизмов развития дисфункции митохондрий гепатоцитов при экспериментальной гипергомоцистеинемии у крыс

The study of biochemical mechanisms of mitochondrial dysfunction in rats' hepatocytes during experimental hyperhomocysteinemia

D.V. Medvedev, V.I. Zvyagina

ГБОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет

им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России

Ryazan State Medical University named after academician I.P. Pavlov

Метионин - незаменимая протеиногенная аминокислота, содержащаяся во многих пищевых продуктах. В ходе ее метаболизма образуется гомоцистеин, с повышением содержания которого в крови - гипергомо-цистеинемией - связывают увеличение риска развития ряда заболеваний, включая неалкогольную жировую болезнь печени. Имеются данные о том, что гомоцистеин способен снижать эффект оксида азота и вызывать митохондриальную дисфункцию. Цель работы - изучение взаимосвязи функционального состояния митохондрий клеток печени и уровня метаболитов оксида азота в них при экспериментальной гипергомоцистеинемии, вызванной избыточным приемом метионина. Эксперимент проводился на 17 крысах-самцах линии Вистар с исходной массой тела 220-270 г. Животным 1-й группы (n=9) в течение 21 дня внутрижелудочно (через зонд) вводили 25% суспензию метионина (1,5 г на 1 кг массы тела) 2 раза в сутки, при этом вместо питьевой воды животные получали 1% водный раствор метионина при свободном доступе к поилкам. Выпиваемый объем раствора метионина составил 17,2 (15,5; 18,1) мл/сут. В эксперимент были взяты 8 животных с развившейся тяжелой гипергомоцистеинемией (>100 мкмоль/л сыворотки крови). Вторая группа (n=8) была контрольной. Этим крысам вводили суспензионную основу, не содержащую метионин (10% твина-80, 1% крахмала, 89% воды). В сыворотке крови измеряли общую концентрацию гомоцистеина иммуноферментным методом. В суспензии митохондрий печени фотометрически измеряли общий белок методом Лоури, концентрацию метаболитов NO - скрининг-методом, активность сукцинатдегидрогеназы - по реакции восстановления гексацианофер-рата (III) калия, лактатдегидрогеназы - по снижению концентрации НАДН в реакции восстановления пирувата, Н+-АТФазы - измеряя содержание неорганического фосфата методом Боданского, суперок-сиддисмутазы - по торможению реакции аутоокисления кверцетина, уровень Ca2+ - по реакции с арсеназо III. Окислительную модификацию

ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ ПИТАНИЯ

белков оценивали на основании реакции взаимодействия карбонильных групп и иминогрупп окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, обладающих специфическим спектром поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. За 3 нед эксперимента масса тела крыс, получавшихметионин, увеличилась с 246 (229; 262) до 302 (283; 311) г, а животных контрольной группы - с 256 (231; 264) до 307 (275; 314) г. Статистически значимые различия в приросте массы тела крыс отсутствовали. В ходе исследования выявлено, что внутрижелудочное введение метионина в течение 3 нед с добавлением этой аминокислоты в питьевую воду вызывает гипер-гомоцистеинемию (повышение уровня в крови в 50 раз) и приводит, с одной стороны, к интенсификации энергетического обмена в митохондриях клеток печени крыс, что выражается в повышении активности лактатдегидрогеназы (на 63,0%), сукцинатдегидрогеназы (на 76,1%) и Н+-АТФазы (на 62,5%), с другой -к нарушению депонирования Са2+ (уровень Са2+ в митохондриях снижался на 68,2%) и усилению карбо-нилирования белков митохондрий (суммарно на 52,2%) с преобладанием процесса агрегации и снижением резервно-адаптационного потенциала, несмотря на увеличение активности супер оксиддисмутазы (на 87,7%). Причиной указанных изменений в митохондриях может служить снижение продукции оксида азота (уровень его метаболитов снижался на 21,3%).

Ключевые слова: метионин, гипергомоцистеинемия, оксид азота, оксидативный стресс, митохондриаль-ная дисфункция

Methionine is an essential proteinogenic amino acid found in many foods. During its metabolism homocysteine is formed. With elevated level of homocysteine in the blood - hyperhomocysteinemia - increased risk of developing certain diseases, such as non-alcoholic fatty liver disease, is associated. There is evidence that the homocysteine is able to reduce the effect of nitric oxide and induce mitochondrial dysfunction. The present study investigates the relationship of the functional state of the liver cells mitochondria and the level of nitric oxide metabolites in them in experimental hyperhomocysteinemia caused by excessive intake of methionine. The experiment was conducted on 17 male Wistar rats with an initial weight of 220-270 g, rats were divided into 2 groups. A 25% suspension of methionine was administered (in a dose of 1.5 g of methionine per kg body weight) two times a day for 21 days intragastrically (by gavage) to rats of the first group (n=9) while instead of drinking water animals received a 1% aqueous solution of methionine. Drinks daily volume of methionine solution was 17.2 [15.5; 18.1] ml. In the experiment 8 animals were used, in which severe hyperhomocysteinemia (> 100 mmol/l) was developed. The second group (n=8) served as a control. These rats were administered suspension base containing no methionine (10% Tween-80, 1% starch, 89% water). The total homocysteine concentration was measured in blood serum by ELISA. In the suspension of liver mitochondria total protein was measured by Lowry method; the concentration of NO metabolites by screening method; succinate dehydrogenase activity - under the reaction of hexacyanoferrate (III) potassium reduction; lactate dehydrogenase activity - by decrease of NADH concentration in the reaction of pyruvate's reduction; activity of H+-ATPase - by measuring the inorganic phosphate; superoxide dismutase - by inhibition of quercetin auto-oxidation, the level of Ca2+ - by reaction with Arsenazo III. Oxidative modification of proteins was evaluated based on the reaction between carbonyl and imino groups of the amino acid residues oxidized with 2,4-dinitrophenylhydrazine to form 2,4-dinitrophenylhydrazone having a specific absorption spectrum in the ultraviolet and visible regions of the spectrum. During three weeks of the experiment the body weight of rats treated with methionine increased from 246 (229; 262) to 302 (283; 311) g, and of control animals -from 256 (231; 264) to 307 (275; 314) g. The difference in body weight gain was not statistically significant. In the study it was revealed that intragastric administration of the methionine for 3 weeks with the addition of this amino acid in the drinking water caused hyperhomocysteinemia. On the one hand it lead to an intensification of energy metabolism in rat liver mitochondria, resulted in increase of lactate dehydrogenase (by 63.0%), succinate dehydrogenase (by 76.1%) and H+-ATPase (by 62.5%) activities. On the other hand it lead to the disruption of the Ca2+ deposit (Ca2+ level in mitochondria was reduced by 68.2%) and to enhance of mitochondrial protein carbonylation (by 52.2%) with a predominance of the aggregation process and a reduction of the reserve-adaptive capacity, despite an increase in superoxide dismutase activity (by 87.7%). The reason for these changes in the mitochondria can be the decrease in production of nitric oxide (the level of its metabolites decreased by 21.3%).

Keywords: methionine, hyperhomocysteinemia, nitric oxide, oxidative stress, mitochondrial dysfunction

Метионин - незаменимая протеиногенная ами- на в организме человека включает образование

нокислота, содержащаяся во многих пищевых Б-аденозилметионина, который далее участву-

продуктах. В животноводстве она используется ет в многочисленных реакциях трансметилиро-

как кормовая добавка, в медицине применяется вания. При этом образуется Б-аденозилгомоцис-

как липотропный фактор. Метаболизм метиони- теин, гидролизующийся далее до гомоцистеина

Д.В. Медведев, В.И. Звягина

и аденозина. Гомоцистеин может превращаться обратно в метионин с помощью метионинсинтазы или бетаингомоцистеинметилтрансферазы либо в две реакции образовывать цистеин [1]. Несмотря на то что гомоцистеин является нормальным промежуточным продуктом метаболизма метионина, с повышением его содержания в крови - гипер-гомоцистеинемией (ГГЦ) - связывают увеличение риска развития ряда заболеваний, таких как неалкогольная жировая болезнь печени [2], ише-мическая болезнь сердца, атеросклероз [3]. ГГЦ может развиваться при наследственных дефектах ферментов, участвующих в метаболизме гомо-цистеина (метилентетрагидрофолатредуктазы, цистатионин^-синтазы, реже - метионинсинтазы [4]), при гиповитаминозах В6 и В12, почечной недостаточности, алкоголизме или приеме некоторых лекарственных средств (метотрексата, метилпред-низолона, теофиллина и др.). Повышение уровня гомоцистеина в значительной степени связано с неправильным питанием. Принципиально можно вызвать ГГЦ и избыточным приемом метионина, хотя в отсутствие вышеперечисленных факторов для этого требуются очень высокие дозы аминокислоты. Так, известны модели ГГЦ на крысах, получаемые исключительно путем введения мети-онина [5].

Одним из органов, наиболее чувствительных к ГГЦ, можно считать печень. Механизмы повреждающего действия гомоцистеина на этот орган до конца неясны. Большинство исследований посвящено изучению эндотелиальной дисфункции, вызываемой избыточным уровнем гомоцистеина, в то же время эта аминокислота присутствует внутри клеток различных органов, где она может разрушать дисульфидные связи в белках, нарушать реакции трансметилирования, усиливать перекисное окисление липидов и белков [6]. Имеются данные о том, что гомоцистеин способен снижать эффект оксида азота (NO) [7], однако механизм такого действия не установлен. Также известно, что повышенный уровень гомоцистеина вызывает митохондриальную дисфункцию [6]. С чем связано нарушение функционирования митохондрий: с прямым действием гомоцистеина на клетки или же с нарушением кровотока в органе за счет уменьшения чувствительности эндотелия к сосудорасширяющим факторам, -неясно. Возможно, такой эффект гомоцистеина опосредован его влиянием на метаболизм NO, так как последний является регулятором функций митохондрий - в них NO ингибирует аконитатгидрата-зу и цитохром с-оксидазу, а действие его на другие гемсодержащие белки все еще изучается [8].

Целью исследования стало изучение взаимосвязи функционального состояния митохондрий клеток печени и уровня метаболитов NO в них при экспериментальной ГГЦ, вызванной избыточным приемом метионина.

Материали методы

Объектом исследования служили 17 крыс-самцов линии Вистар. Работа с животными осуществлялась в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986), приказом Мин-здравсоцразвития России от 23.08.2010 № 708н «Об утверждении правил лабораторной практики» и приказом Минздрава СССР от 12.08.1977 № 755 «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных». Крыс содержали в стандартных условиях вивария, в качестве пищи они получали корм «Чара» («Ассортимент-Агро», РФ), содержащий 0,7% метионина-цистина в пересчете на сухое вещество, все витамины группы B, в том числе B6 - 28 мг/кг, B9 - 64 мг/кг, B12 -0,13 мг/кг. Крысы были разделены на 2 группы. 1-я группа(n=9)использовалась для моделирования ГГЦ.С этойцелью применяли метод С.Г. Емельянова и соавт. [5] в нашей модификации: в течение 21 дня крысам внутрижелудочно (через зонд) вводили 25% суспензию метионина в дозе 1,5 г метионина на 1 кг массы тела 2 раза в сутки, при этом вместо питьевой воды животные получали 1% водный раствор метио-нина при свободном доступе к поилкам [9]. Выпиваемый в сутки объем раствора метионина составил 17,2 (15,5; 18,1) мл. В эксперимент были взяты 8 животных с развившейся тяжелой ГГЦ (>100 мкмоль/л), 1 особь была исключена из эксперимента, так как имела умеренную форму ГГЦ. Вторая группа (n=8) была контрольной. Этим крысам вводили суспензионную основу, не содержащую метионин (состав по массе: 10% твина-80, 1% крахмала, 89% воды). Животных умерщвляли под эфирным наркозом путем вскрытия брюшной полости и перерезания брюшной аорты. При этом отбирали кровь и часть печени. Печень отмывали от крови и гомогенизировали на гомогенизаторе «Potter S» («Sartorius», ФРГ) в среде, содержащей 0,25 М сахарозы, 0,001 М ЭДТА и 0,05 М трис-буфер, рН 7,4 [10]. Митохондрии выделяли методом дифференциального центрифугирования при 11 000g [11]. Осадок, содержащий митохондрии, ресуспендировали в среде выделения, не содержащей ЭДТА. Для анализа использовали суспензию митохондрий и сыворотку крови.

В сыворотке крови определяли концентрацию гомоцистеина набором для иммуноферментного анализа («Axis Shield», Великобритания).

В суспензии митохондрий измеряли общий белок методом Лоури с помощью коммерческого набора («Экосервис», РФ), концентрацию

31

ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ ПИТАНИЯ

метаболитов NO - методом в модификации В.А. Метельской [12], активность сукцинатдегид-рогеназы (СДГ) - по реакции восстановления гексацианоферрата (III) калия [11], активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) - по снижению концентрации НАДН в реакции восстановления пирувата с помощью коммерческого набора («Diasys», ФРГ), активность Н+-АТФазы -измеряя содержание неорганического фосфата методом Боданского после остановки реакции [13], активность супероксиддисмутазы (СОД) - по торможению реакции аутоокис-ления кверцети-на [14], уровень Ca2+ - по реакции с арсеназо III с помощью коммерческого набора («Diasys», ФРГ). Окислительную модификацию белков (ОМБ) оценивали по методу R.L. Levine в модификации Е.Е. Дубининой [15], который основан на реакции взаимодействия карбонильных групп и ими-ногрупп окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов, обладающих специфическим спектром поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Затем рассчитывали доли ранних и поздних маркеров окислительной деструкции белков, а также анализировали резервно-адаптационный потенциал [16].

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ MS Excel и Statplus 2009 Portable. Соответствие выборок нормальному распределению проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Поскольку распределение отличалось от нормального, для проверки достоверности отличий значений в контрольной и опытной группах использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Отличия считали статистически значимыми при p<0,05. Результаты представлены в форме медианы (1-й квартиль; 3-й квартиль).

Результаты и обсуждение

За 3 нед эксперимента масса крыс, получавших метионин, увеличилась с 246 (229; 262) до 302 (283; 311) г, а животных контрольной группы -с 256 (231; 264) до 307 (275; 314) г. Статистически значимые различия между экспериментальной и контрольной группами в приросте массы тела крыс отсутствовали.

Введение метионина в дозе 3 г на 1 кг массы тела в течение 3 нед с добавлением его в питьевую воду вызвало у крыс развитие тяжелой ГГЦ - уровень гомоцистеина в сыворотке крови животных увеличился более чем в 50 раз (табл. 1).

У крыс экспериментальной группы наблюдалось резкое повышение активности митохондриаль-ных оксидоредуктаз, участвующих в энергетическом обмене, - ЛДГ и СДГ (табл. 2). При этом значительно возрастала и активность Н+-АТФазы (см. табл. 2), что указывает на интенсификацию процесса окислительного фосфорилирования. Также отмечалось снижение содержания в митохондриях метаболитов N0 (см. табл. 2), что, скорее всего, свидетельствует об уменьшении его продукции. Невысокий уровень N0 может быть одной из причин, обусловливающих усиление процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях (этот низкомолекулярный регулятор известен как ингибитор ферментов дыхательной цепи и цикла Кребса).

На фоне этих, казалось бы, позитивных эффектов ГГЦ вызывает и негативные явления в митохондриях гепатоцитов. Так, увеличивается степень карбонилирования белков (рис. 1, табл. 3), несмотря на рост активности СОД (см. табл. 2) -одного из ключевых ферментов антиоксидантной защиты митохондрий, обезвреживающего наиболее часто образующийся в результате деятельности дыхательной цепи радикал - супероксидный анион.

Таблица 1. Концентрация гомоцистеина в сыворотке крови крыс с гипергомоцистеинемией и животных контрольной группы

Показатель Контроль (л=8) Гипергомоцистеинемия (л=8) Р

Гомоцистеин, мкмоль/л в сыворотке крови 5,8 (5,6; 5,8) 291,65 (277,38; 334,43) t в 50 раз 0,025

Таблица 2. Биохимические показатели митохондрий гепатоцитов крыс при гипергомоцистеинемии

Показатель Контроль (л=8) Гипергомоцистеинемия (л=8) Р

Концентрация белка, мг/мл 14,71 (13,85; 15,89) 14,04 (13,03; 16,51) 1 4,6% 0,6744

Концентрация метаболитов NO, мкмоль на 1 г белка 38,03 (34,69; 39,43) 29,94 (28,64; 32,74) 1 21,3% 0,0157

Концентрация Ca2+, мкмоль на 1 г белка 26,96 (21,49; 38,03) 8,57 (8,27; 9,62) 1 68,2% 0,0008

Активность ЛДГ, ЕД на 1 г белка 639,38 (608,21; 714,84) 1041,99 (977,92; 1391,70) t 63,0% 0,0008

Активность СДГ, нмоль сукцината на 1 мг белка в минуту 39,69 (27,23; 49,45) 69,91 (56,64; 95,30) t 76,1% 0,0274

Н+-АТФазы, мкг фосфата/ч 2,32 (2,09; 2,69) 3,77 (2,64; 5,00) t 62,5% 0,0372

Активность СОД, усл. ед. на 1 мг белка 3,75 (2,62; 4,38) 7,04 (1,91; 10,28) t 87,7% 0,5286

Д.В. Медведев, В.И. Звягина

0,045 0,04 0,035 0,03 0,025 0,02 0,015 0,01 0,005 0

Контроль

Гипергомоцистеинемия

1-1-1-1-1-1-1-1-1-г

230 254 270 280 356 363 370 428 430 434 520 535 нм

Контроль  Гипергомоцистеинемия

Рис. 1. Содержание карбонилированных производных белков в митохондриях клеток печени крыс, усл. ед. на 1 мг белка

S КДНФГ

S АДНФГ

Рис. 2. Соотношение маркеров агрегации и фрагментации белков в митохондриях гепатоцитов крыс

При этом доля кетондинитрофенилгидразонов (КДНФГ) - маркеров агрегации белков - возрастает на 6,46% (р=0,0163) по сравнению с долей аль-дегиддинитрофенилгидразонов (АДНФГ) - маркеров фрагментации белков (рис. 2).

Трехнедельное введение высоких доз метионина привело к снижению резервно-адаптационного потенциала белков митохондрий как в отношении процесса агрегации (на 31,62%; p=0,0039), так и в отношении фрагментации белков (на 17,64%; p=0,5218), что выражается в увеличении соотношения показателей спонтанной ОМБ к ОМБ, индуцированной реакцией Фентона (рис. 3).

Одной из причин описанного выше окислительного повреждения белков может быть снижение синтеза NO, ведь известно, что в малых концентрациях эта молекула оказывает антиоксидантный эффект, в отношении окислительного повреждения белков обусловленный главным образом конкуренцией NO за связывание с металлами переменной валентнос-

АДНФГ КДНФГ Б ОМБ АДНФГ КДНФГ Б ОМБ контроль контроль контроль ГГЦ ГГЦ ГГЦ

Индуцированная И Спонтанная

Рис. 3. Резервно-адаптационный потенциал белков митохондрий гепатоцитов крыс

ти и торможением реакции Фентона, в результате которой образуется сильнейший окислитель - гид-роксильный радикал [17]. Также дефицит N0, возможно, вызывает повышение продукции дыхательной цепью активных форм кислорода. Это может

Таблица 3. Содержание карбонилированных производных белков в митохондриях клеток сердца крыс, усл. ед. на 1 мг белка

Группа S АДНФГ uv S КДНФГ uv S АДНФГ vs S КДНФГvs S ОМБ

Контроль

Гипергомоцистеинемия (п=8) 4,20 (2,59; 5,53) t 94,4% 1,50 (1,19; 2,04) t 15,4% 0,85 (0,70; 1,11) t 4,9% 0,10 (0,08; 0,15) t 2,4% 6,65 (4,65; 8,75) t 52,2%

Р 0,0104 0,4233 0,631 0,8728 0,0163

П р и м е ч а н и е. АДНФГ - альдегиддинитрофенилгидразоны, КДНФГ - кетондинитрофенилгидразоны, ОМБ - окислительная модификация белков, Э - площадь под кривой (рис. 1), иу - в ультрафиолетовой области спектра, уэ - в видимой области спектра.

33

ФИЗИОЛОГИЯ И БИОХИМИЯ ПИТАНИЯ

быть единым порочным кругом патогенеза, так как увеличение содержания активных форм кислорода способствует скорейшей инактивации NO.

Кроме того, у крыс, получавших метионин, наблюдается нарушение депонирования Ca2+ в митохондриях гепатоцитов.

Таким образом, высокие дозы метионина способны не только стимулировать энергетический обмен митохондрий, но и вызывать в них оксида-тивный стресс и нарушать депонирование Ca2+, что может привести к митохондриальной дисфункции. Указанный эффект метионина скорее всего обусловлен высокими концентрациями образующегося из него гомоцистеина.

Заключение

Гипергомоцистеинемия, вызванная введением высоких доз метионина, приводит, с одной стороны, к интенсификации энергетического обмена в митохондриях клеток печени крыс, что выражается в повышении активности ЛДГ, СДГ и Н+-АТФазы, с другой - к нарушению депонирования Ca2+ и усилению карбонилирования белков митохондрий с преобладанием процесса агрегации и снижением резервно-адаптационного потенциала, несмотря на увеличение активности СОД. Одной из причин указанных изменений в митохондриях может служить снижение продукции NO.

Сведения об авторах

#

Медведев Дмитрий Валериевич - ассистент кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики факультета дополнительного профессионального образования ГБОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России E-mail: meddmit@mail.ru

Звягина Валентина Ивановна - кандидат биологических наук, доцент кафедры биологической химии с курсом клинической лабораторной диагностики факультета дополнительного профессионального образования ГБОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» Минздрава России E-mail: vizvyagina@yandex.ru

Литература

Мирошниченко И.И., Птицына С.Н., Кузнецова Н.Н. и др. Гомо- 10. цистеин - предиктор патологических изменений в организме человека // Рус. мед. журн. 2009. № 4. С. 224-228. Глущенко С.В. Гипергомоцистеинемия как предиктор развития и прогрессирования неалкогольной жировой болезни печени // 11. Проблеми безперервноУ медичноУ осв1ти та науки. 2014. № 2. С. 89-92.

Костюченко Г.И. Гипергомоцистеинемия: клиническое значение, 12. возрастные особенности, диагностика и коррекция // Клин. геронтология. 2007. Т. 13. № 4. С. 32-40.

Гречанина Е.Я. Метионин - незаменимая аминокислота // КлМч- 13. на генетика I перинатальна д1агностика. 2013. № 1 (2). С. 19-35. Пат. 2414755. Способ моделирования гипергомоцистеин индуцированной эндотелиальной дисфункции / С.Г. Емельянов, М.В. 14. Корокин, М.В. Покровский и др.; заявитель и патентообладатель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Юго-Западный государственный университет»; № 2009138369/14; опубл. 20.03.2011, 15. Бюл. № 8. 4 с.

Arun K., Lijo J., Shuvadeep M. et al. Converging evidence of mitochondrial dysfunction in a yeast model of homocysteine metabolism imbalance // J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286, N 24. 16. P. 21779-21795.

Puddu P., Puddu G. M., Cravero E. et al. The emerging role of cardiovascular risk factor-induced mitochondrial dysfunction in atherogenesis // J. Biomed. Sci. 2009. Vol. 16, N 1. P. 112-118. Martinez-Ruiz A., Cadenas S., Lamas S. Nitric oxide signaling: classical, less classical, and nonclassical mechanisms // Free Radic. Biol. Med. 2011. Vol. 51, Is. 1. P. 17-29.

Медведев Д.В., Звягина В.И., Фомина М.А. Способ моделирования тяжелой формы гипергомоцистеинемии у крыс // Рос. 17. медико-биологический вестн. им. акад. И.П. Павлова. 2014. № 4. С. 42-46.

Колесник М.Ю., Беленичев И.Ф., Дзяк Г.В. и др. Особенности функционирования митохондрий миокарда у крыс со спонтанной гипер-тензией (SHR) на фоне экспериментального сахарного диабета и атеросклероза // Запорож. мед. журн. 2012. № 2 (71). С. 26-30. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / под ред. М.И. Прохоровой. Л. : Изд-во Ленинград. ун-та, 1982. 327 с.

Метельская В.А., Гуманова Н.Г. Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке // Клин. лаб. диагностика. 2005. № 6. С. 15-18.

Биоэнергетика клетки. Химия патологических процессов / под ред. В.Ю. Сереброва, Г.А. Сухановой. Томск : Сибир. гос. мед. ун-т, 2008. С. 79-82.

Костюк В.А., Потапович А.И., Ковалева Ж.В. Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина // Вопр. мед. химии. 1990. № 2. С. 88-91.

Дубинина Е.Е. Продукты метаболизма кислорода в функциональной активности клеток (жизнь и смерть, созидание и разрушение). Физиологические и клинико-биохимические аспекты. СПб. : Медицинская пресса, 2006. С. 276-282. Пат. 2524667 РФ, МПК 11, G01N33/52. Способ комплексной оценки содержания продуктов окислительной модификации белков в тканях и биологических жидкостях / заявители: Фомина М.А., Абаленихина Ю.В., Фомина Н.В., Терентьев А.А.; патентообладатель: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (RU); № 2013102618/15; заявл. 21.01.2013; опубл. 27.07.2014; Бюл. № 21. 9 с. Wink D. A., Miranda K. M., Espey M. G. et al. Mechanisms of the antioxidant effects of nitric oxide // Antioxidants Redox Signaling. 2001. Vol. 3, N 2. P. 203-213.

34

2.

4

5

7

8

9

Д.В. Медведев, В.И. Звягина

References

Miroshnichenko I.I., Pticyna S.N., Kuznecova N.N., Kalmykov Yu.M. 10. Homocysteine - predictor of pathological changes in the human body. Russkij medicinskij zhurnal [Russian Medical Journal]. 2009: Vol. 4: 224-8.

Glushhenko S.V. Hyperhomocysteinemia as a predictor of the development and progression of nonalcoholic fatty liver disease. Prob- 11. lemi bezperervnoi medichnoi osviti ta nauki. 2014; Vol. 2: 89-92.

Kosyuchenko G.I. Hyperhomocysteinemia: clinical significance, age 12. features, diagnosis and correction. Klinicheskaja gerontologija [Clinical Gerontology]. 2007; Vol. 13

Pat. 2414755. Method for modeling hyperhomocysteine induced endo- 14. thelial dysfunction. S.G. Emel'janov, M.V. Korokin, M.V. Pokrovskij i dr.; zajavitel' i patentoobladatel': Gosudarstvennoe obrazovatel'noe uchrezhdenie vysshego professional'nogo obrazovanija «Jugo-Zapadnyj gosudarstvennyj universitet»; N 2009138369/14; opubl. 15. 20.03.2011; Bul. N 8: 4 p.

Arun K., Lijo J., Shuvadeep M. et al. Converging evidence of mitochondrial dysfunction in a yeast model of homocysteine metabolism imbalance. J Biol Chem. 2011; Vol. 286 (24): 21779-95. 16.

Puddu P., Puddu G. M., Cravero E. et al. The emerging role of cardiovascular risk factor-induced mitochondrial dysfunction in atherogen-esis. J Biomed Sci. 2009; Vol. 16 (1): 112-8. Martinez-Ruiz A., Cadenas S., Lamas S. Nitric oxide signaling: classical, less classical, and nonclassical mechanisms. Free Radic Biol Med. 2011; Vol. 51 (1): 17-29.

Medvedev D.V., Zvyagina V.I., Fomina M.A. A method of modeling of severe hyperhomocysteinemia in rats. Rossijskij mediko-biologicheskij vestnik imeni akademika I.P. PavlovaI. 17. [P. Pavlov Russian Medical Biological Herald]. 2014; Vol. 4: 42-6.

Kolesnik M.Yu, Belenichev I.F., Dzjak G.V., Chekman I.S. Features of myocardium mitochondrial functions in spontaneously hypertensive rats

Metel'skaya V.A., Gumanova N.G. The screening method for determining the level of nitric oxide metabolites in serum. Klinicheskaja laboratornaja diagnostika[Russian Clinical Laboratory Diagnostics]. 2005; Vol. 6: 15-8.

Cell's bioenergy. Chemistry of pathological processes / eds V.Yu. Serebrova, G.A. Suhanova. Tomsk : Sibirskiy Gosudarstvennyy Medicinskiy Universitet, 2008: 79-82.

Dubinina E.E. Products of metabolism of oxygen in the functional activity of cells

Pat. 2524667 RF, MPK 11, G01 N33/52. Way of a comprehensive assessment of the content of oxidative modification of proteins in tissues and biological fluids. Zajaviteli: Fomina M.A., Abaleni-hina Yu.V., Fomina N.V., Terent'ev A.A.; patentoobladatel': Gosu-darstvennoe bjudzhetnoe obrazovatel'noe uchrezhdenie vysshego professional'nogo obrazovanija «Rjazanskij gosudarstvennyj medicinskij universitet imeni akademika I.P. Pavlova» Ministerstva zdra-voohranenija Rossijskoj Federacii (RU); N 2013102618/15; zajavl. 21.01.2013; opubl. 27.07.2014; Bull. N 21: 9 p. (in Russian) Wink D. A., Miranda K. M., Espey M. G. et al. Mechanisms of the antioxidant effects of nitric oxide. Antioxidants Redox Signaling. 2001; Vol. 3 (2): 203-13.

35

2

6.

7

8.

9