Гетерогенность спорадической болезни Паркинсона: молекулярный подход к решению проблемы

Гетерогенность спорадической болезни Паркинсона: молекулярный подход к решению проблемы

С.Н. Иллариошкин1, П.А. Сломинский2, М.И. Шадрина2, Г.Х. Багыева1, Т.Б. Загоровская1, Е.Д. Маркова1, А.В. Карабанов1, В.В. Полещук1, Е.В. Полевая1, Н.В. Федорова3, С.А. Лимборская2, И.А. Иванова-Смоленская1

1НИИ неврологии РАМН, г. Москва Институт молекулярной генетики РАН, г. Москва 3 Российская медицинская академия последипломного образования, г. Москва

Проведен поиск мутаций в генах РЯКЫ (паркин), ЬЯКК2 и ЗЫСЛ (а-синуклеин) у 359 пациентов славянского этнического происхождения (169 мужчин и 190 женщин) с болезнью Паркинсона, из которых 345 представляли спорадические случаи. Возраст манифестации симптомов составил от 23 до 84лет, пациенты с ювенильным паркинсонизмом (дебют симптомов до 20 лет) исключались из набора. При исследовании мажорной мутации в20Ш в гене 1ЯЯК2, а также структурных перестроек в генах РВКЫ и ЗЫСЛ было установлено, что при болезни Паркинсона частота изучаемых мутаций составляет 7,5% (27больных из 359). Мутация LRRK2-G2019S выявлена у 1,1% больных, экзонные перестройки в паркине -у 5,8% (в том числе у 10,7% больных с ранней формой болезни Паркинсона и у 1,7% пациентов с поздней формой болезни), дупликация гена SNCA -у 2 больных. Проведенный анализ показал выраженную гетерогенность молекулярной структуры болезни Паркинсона в российской популяции, что позволяет считать данное заболевание не единой нозологической формой, а совокупностью самостоятельных (хотя и сходных) нейродегенеративных синдромов. Идентификация наследуемых мутаций в части спорадических случаев болезни Паркинсона существенно меняет семейный прогноз и требует проведения медико-генетического консультирования у лиц из группы высокого риска.

Ключевые слова: болезнь Паркинсона, спорадические случаи, мутационный анализ, генетическая гетерогенность,

медико-генетическое консультирование.

Болезнь Паркинсона - прогрессирующее возраст-зависимое нейродегенеративное заболевание, распространенность которого в общей популяции варьирует от 100 до 350 на 100 000 населения, будучи наиболее высокой в группе пациентов пожилого возраста (1-2% среди лиц старше 65 лет) [5, 7].

Этиология болезни Паркинсона остается предметом дискуссий, однако наиболее обоснованной на сегодняшний день признается точка зрения о мультифакторной модели развития заболевания, имеющей как экзогенную, так и эндогенную составляющую [4]. Согласно современным представлениям, в развитии болезни Паркинсона имеет значение специфическое взаимодействие генетических и средо-вых факторов, определяющих особенности клеточной детоксикации и обмена ксенобиотиков, антиоксидантной за-

щиты, митохондриальных реакций, процессинга ряда нейрональных белков, дофаминового обмена [3, 37].

В противоположность доминировавшей на протяжении многих десятилетий точке зрения о «негенетической» природе болезни Паркинсона в настоящее время роль генетики в развитии заболевания подтверждается многочисленными исследованиями, проведенными с использованием различных методических подходов. Во-первых, показано, что для паркинсонизма имеется четкая тенденция к внутрисемейному накоплению случаев заболевания, а ближайшие родственники больных имеют в 2-7 раз более высокий риск развития болезни Паркинсона по сравнению с общепопуляционным [9]. Такое семейное накопление особенно характерно для ранних (до 40 лет) случаев болезни Паркинсона [15]. Во-вторых, благодаря применению новейших

изотопных методов нейровизуализации - ОФЭКТ и ПЭТ, - позволяющих верифицировать пресимптоматическую дисфункцию нигростриарной дофаминергической системы у клинически здоровых братьев и сестер, произошел пересмотр результатов близнецовых исследований и была установлена значительно более высокая конкордантность по болезни Паркинсона среди монозиготных близнецовых пар (55%) по сравнению с дизиготными (18%) [34]. Интересно отметить, что различия в конкордантности также наиболее заметны у молодых больных, что подчеркивает особую роль генетики в развитии раннего паркинсонизма

[38]. В-третьих, результаты анализа генетических ассоциаций показали определенную роль в развитии болезни Паркинсона «аллелей риска» ряда кандидатных генов, имеющих значение в функционировании нигральных нейронов (следует отметить при этом, что вклад каждого из изученных полиморфизмов в формирование предрасположенности к болезни Паркинсона сравнительно невелик) [36].

Несомненно, важнейшее значение в раскрытии генетических основ болезни Паркинсона сыграло выявление родословных с четким менделевским наследованием болезни

[39]. Именно благодаря молекулярному исследованию таких репрезентативных семей оказалось возможным клонирование соответствующих мутантных генов и установление их белковых продуктов.

На конец 2006 г. идентифицировано как минимум 11 хромосомных локусов и 7 самостоятельных генов, ответственных за развитие менделирующих форм болезни Паркинсона, в том числе 4 гена для аутосомно-доминантных и 3 -для аутосомно-рецессивных вариантов болезни [4, 32, 39, 43]. И хотя наследственно-семейные случаи составляют не более 5-10% от общего числа случаев болезни Паркинсона, именно эти редкие моногенные варианты стали ценными «моделями», позволившими раскрыть молекулярные звенья патогенеза первичного паркинсонизма. Так, благодаря анализу уникальной РАЖ1-формы болезни, локус которой картирован на хромосоме 4д21-23, была установлена роль белка а-синуклеина как основного компонента телец Леви и ключевого молекулярного маркера патологии нейронов при развитии нейродегенерации паркинсоновского типа [16]. Сложились современные представления об универсальном значении изменений нативной конформации а-синуклеина (под влиянием наследуемых мутаций либо экзогенных нейротоксических факторов) в патогенезе семейных и спорадических случаев болезни Паркинсона [3, 30]. Показательно в связи с этим, что основным типом мутаций при РАЖ1-форме болезни Паркинсона являются полные дупликации и трипликации гена а-синуклеина (£ЛСА), т.е. дефекты, ведущие к повышению экспрессии (гиперпродукции) белка и его патологической агрегации в клетке [35]. Более того, на экспрессию а-синуклеина могут влиять также полиморфизмы в регуляторной области гена, что является одним из механизмов генетической предрасположенности к развитию спорадической болезни Паркинсона [23].

«Конформационная» теория нашла дальнейшее подтверждение благодаря идентификации других генов, мутации

которых при паркинсонизме сопровождаются нарушением белкового гомеостаза в нейронах. К ним относятся гены белка паркина (локус РАЖ2 на хромосоме 6д25-27 -обозначение гена PRKN) и убиквитин-С-концевой гидро-лазы (локус РАЖ5 на хромосоме 4р14), продукты которых являются ключевыми компонентами протеолитической убиквитин-протеасомной системы клетки [22, 24]. Совсем недавно был идентифицирован еще один ген - LRRK2, ответственный за развитие аутосомно-доминантных случаев болезни Паркинсона, сцепленных с локусом РАВД.8 на хромосоме Щ12 [32, 43]. Соответствующий белок дарда-рин является цитоплазматической ГТф-зависимой киназой, предположительно вовлеченной в процессинг нейрональных белков [12].

Таким образом, семейная болезнь Паркинсона характеризуется чрезвычайной генетической гетерогенностью. При этом в семьях с четким аутосомно-рецессивным наследованием наиболее высок удельный вес мутаций гена PRKN (паркин) - более 50% случаев с ранним началом [26, 29], а при аутосомно-доминантной болезни Паркинсона чаще всего встречаются мутации в гене LRRK2 - от 2 до 13% семей [8, 12, 14].

Наименее изученным остается вопрос о роли всех указанных генов в развитии спорадической болезни Паркинсона. Основные исследования в данном направлении касались гена PRKN. Известно, что при отсутствии семейного анамнеза частота выявления гомозиготных мутаций PRKN зависит от возраста начала болезни: при юношеском спорадическом паркинсонизме они обнаруживаются у 15-18% больных и значительно реже - у пациентов с дебютом в 25-40 лет [1, 26, 29]. Гомозиготность по мутациям PRKN описана даже у отдельных больных с «классическим» поздним фенотипом болезни Паркинсона и отсутствием семейного анамнеза [21, 27], но это скорее казуистика, демонст-

рис. 1: Идентификация мутации 320193 в гене ЦЖ?

короткой стрелкой указан нормальный 31с!-рестрикционный фрагмент размером 228 пар оснований, длинной стрелкой - мутантный фрагмент размером 207 пар оснований (мутация 320193); дорожки 1, 2 и 4 - носители гетерозиготной мутации 320193 в гене Ц№К2, дорожка 3 - норма

рирующая необычайно широкую вариабельность РАЖ2-формы аутосомно-рецессивного паркинсонизма.

В последние годы традиционные представления о генетике паркинопатий как аутосомно-рецессивных форм патологии претерпели значительные изменения. Появились сообщения о случаях паркинсонизма, при которых интенсивный молекулярный скрининг смог выявить мутацию PRKN лишь в одном из двух аллелей гена [21, 40]. Наши собственные данные, полученные ранее при молекулярно-генетическом анализе российских семей с ювенильным паркинсонизмом, показали отсутствие второй мутации PRKN у 44,4% больных с подтвержденным ДНК-диагнозом парки-нопатии [1]. Была высказана гипотеза, что носительство мутации PRKN даже на одной хромосоме иногда может сопровождаться развитием доминантной формы болезни -наиболее вероятно, по механизму гаплонедостаточности

[40]. Патогенетическая роль паркин-гетерозиготности подтвердилась с помощью ПЭТ: ИПкег й а1. в 2001 г. при обследовании асимптомного пациента, имеющего мутантный и нормальный аллель PRKN, выявили отчетливое снижение захвата флюородопы в стриатуме [18], что является четким нейровизуализационным свидетельством субклинической дофаминергической дисфункции. Так было установлено, что гаплонедостаточность по гену PRKN действительно может определять гибель дофаминовых нейронов и быть зна-

чимым фактором генетической предрасположенности к развитию первичного паркинсонизма.

В дальнейшем была проведена серия работ, посвященных анализу ассоциаций между болезнью Паркинсона и гетерозиготным носительством мутаций в гене PRKN. Мета-анализ результатов этих исследований, проведенный Европейским консорциумом по болезни Паркинсона, подтвердил, что наличие единственной гетерозиготной мутации в PRKN является фактором риска спорадической болезни Паркинсона [12, 40].

Не меньшее значение в развитии болезни Паркинсона в общей популяции имеет ген LRRK2. Это стало понятным в последние два года, когда мутационный скрининг невыборочных серий больных с «классическиой» спорадической болезнью Паркинсона выявил те или иные мутации LRRK2 у 0,4-2,7% всех обследованных пациентов [6, 11, 14, 28, 33, 42]. В некоторых популяциях частота отдельных мутаций LRRK2 может быть существенно выше в связи с эффектом основателя, как это имеет место, например, в северной Африке. В данном регионе частота мажорной мутации LRRK2-020198 составляет: у арабов - 40,8% в спорадических и 37,0% в семейных случаях болезни Паркинсона, а у евреев ашкенази - 13,3% в спорадических и 29,7% в семейных случаях болезни [25, 31].

таблица 1: Выявленные структурные перестройки в гене РИШ у пациентов с ранней болезнью Паркинсона

Возраст манифестации симптомов (годы) Экзоны гена Р/?КЛ/

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

28

25

31

28

35

39

36

23

26

30

40 ІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІІ

23

45

24

40

гетерозиготная делеция гетерозиготная дупликация

таблица 2: Выявленные структурные перестройки в гене РИКИ у пациентов с поздней болезнью Паркинсона

Возраст манифестации симптомов (годы) Экзоны гена PRKN

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

46

68

50

61

66

67

гетерозиготная делеция гомозиготная делеция

Значительно меньше данных о частоте мутаций в других локусах (РАЖ1, РАЖ6, РАЖ7) при спорадической болезни Паркинсона.

Таким образом, на сегодняшний день весьма актуальным и практически важным является молекулярный скрининг различных каузативных генов в общей группе больных болезнью Паркинсона. В настоящей работе нами представлены первые в России результаты такого систематического мутационного анализа трех генов - PRKN, LRRK2 и SNCA -в большой группе больных-славян со спорадической формой болезни Паркинсона.

Характеристика больных и методов исследования

Отбор больных с первичным паркинсонизмом_________________

В исследование было включено 359 пациентов (169 мужчин и 190 женщин) с различными клиническими вариантами первичного паркинсонизма. У 345 больных имел место отрицательный семейный анамнез по болезни Паркинсона (спорадические случаи). Лишь у 14 (3,9%) пациентов имелись указания на достоверное или вероятное аутосомно-до-минантное наследование болезни Паркинсона (в каждой семье имелись как минимум 2 больных из 2 последовательных поколений родословной); клинико-генетические особенности большинства из этих семейных случаев болезни Паркинсона были описаны нами ранее [2]. Аутосомно-доминант-ный паркинсонизм рассматривался нами в качестве своеобразной группы сравнения по отношению к основной обследованной группе - спорадической болезни Паркинсона.

Большинство пациентов в соответствии с собранными сведениями имели славянские этнические корни по одной либо обеим родительским линиям и происходили из семей, проживавших на протяжении 2-3 поколений на территории европейской части России. В исследование не включа-

лись лица с ювенильным паркинсонизмом, заболевшие на первом-втором десятилетии жизни и имевшие a priori генетическую составляющую в качестве ведущего фактора развития болезни [1, 4, 27].

Таким образом, нами обследована сплошная невыборочная серия преимущественно спорадических случаев болезни Паркинсона, наблюдавшихся в нейрогенетическом отделении Института неврологии РАМН за последние 4 года и соответствующих общепринятыми критериям данного заболевания [19].

Исходя из задач работы, все случаи были подразделены на две большие группы:

1) болезнь Паркинсона с ранним началом - манифестация первых симптомов в возрасте от 23 до 45 лет (средний возраст начала болезни 34,4 ±

11,2 года), всего 62 мужчины и 78 женщин;

2) «классическая» болезнь Паркинсона с более поздним дебютом симптомов - от 46 до 84 лет (59,6 ± 13,3), всего 107 мужчин и 112 женщин.

В целом по группе средний возраст больных составил 56,9 ± 16,8 года, средний возраст начала болезни - 48,8 ± 15,9 года.

В качестве контроля обследованы 350 неврологически здоровых лиц (700 контрольных хромосом), соответствующих основной группе по возрастному и половому составу.

Молекулярно-генетический анализ__________________________

Выделение геномной ДНК производилось из 5-10 мл свежей или замороженной венозной крови стандартными методами.

Анализ мутации G2019S в гене LRRK2_____________________

Наиболее частой мажорной мутацией в гене LRRK2 является нуклеотидная замена 6055G>A в 41-м экзоне LRRK2, ведущая к замещению глицина (G) на серин (S) в белковой позиции 2019 [14]. В связи с этим нами был проведен скрининг обследованных больных на носительство данной мутации. Детекция нуклеотидной замены 6055G>T в 41-м экзоне гена LRRK2 (мутация G2019S) осуществлялась с использованием праймеров и зонда для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени (real-time PCR) в соответствии с описанным Kachergus et al. протоколом. ПЦР выполнялась в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 10-20 нг геномной ДНК, 1 х ПЦР буфер (Syntol, Москва), 2,5 мМ MgCl2, 10 пМ каждого праймера, 200 мкМ каждого из набора дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1,25 ед. Hot-rescue Taq ДНК-полимеразы (Syntol, Москва), а также 4 пМ зонда, синтезированного на основе TaqMan-химии (Syntol, Москва). Амплификация проводилась по следующему протоколу: 2 мин при 50 oC, 10 мин при 95 oC и далее 40 циклов по 15 с при 95 oC и 50 с при 60 oC. Интенсивность флуоресценции ПЦР-продуктов оценивалась на приборе ANA-32 (Syntol, Москва). В части случаев болезни Паркинсона анализ мутации LRRK2-G2019S осуществлялся с помощью стандартного сайт-специфичного 5Ус1-рест-рикционного теста [17]; данным тестом, в частности, подтверждался факт замены 6055G>A во всех случаях предполагаемого носительства мутации, выявленных с помощью ПЦР в реальном времени.

Анализ структурных перестроек в гене PRKN______________

В гене PRKN описано большое разнообразие типов мутаций, включая как точковые мутации, так и более сложные генные перестройки - экзонные и мультиэкзонные деле-ции, дупликации и трипликации [22, 26, 27, 40]. Во многих популяциях мира, в том числе (согласно нашим предварительным данным) и в России, делеции и мультипликации PRKN являются превалирующим типом мутаций [1], что определяет необходимость использования особых методов мутационного скрининга, ориентированных в первую очередь на количественный анализ ДНК и определение дозы гена у компаунд-гетерозигот [26].

У обследованных больных нами проводился поиск гетерозиготных структурных перестроек в гене PRKN и количественный анализ дозы гена с использованием метода ПЦР в реальном времени на приборе ANA-32 (Syntol, Москва). Структура праймеров, синтезированных для амплификации 2-12 экзонов PRKN, была определена с помощью программы Vector NTI Suite 9 software. В качестве внутреннего стандарта с каждым экзоном PRKN ко-амплифицировался ген бета-глобина. ПЦР проводилась в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 10-20 нг геномной ДНК, 1 х ПЦР буфера (Syntol, Россия), 2,5 мМ MgCl2, 10 пМ каждого из пары праймеров соответствующего экзона PRKN и ft-глобина, 200 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов, 1,25 ед. Hot-rescue Taq ДНК-полимеразы (Syntol, Россия) и 4 пМ зондов на отдельные экзоны генов PRKN и ft-глобина, сконструиро-

ванных с использованием ТадМаи-химии (8уИ;о1, Россия). Амплификация проводилась в соответствии со следующим протоколом: 2 мин при 50 оС, 10 мин при 95 оС и 40 циклов по 15 с при 95 оС и 50 с при соответствующей отжигу температуре. Для максимальной верификации оценки интенсивности флуоресценции ПЦР-продуктов все образцы тестировались трижды.

Отношение концентраций паркин/бета-глобин подсчитывалось для всех ДНК-образцов. Нормальным расценивалось соотношение от 0,7 до 1,3. Показатели ниже 0,6 или выше 1,4 расценивались как гетерозиготная делеция или дупликация определенного экзона соответственно.

Количественный анализ гена а-синуклеина (КЖЛ)____________

С учетом особенностей фенотипических проявлений a-си-нуклеинопатий и редкости мутаций в нем по данным, полученным в ряде исследованных популяций Европы и Северной Америки [І6], мы ограничили анализ гена SNCA группой пациентов с ранней и семейной формой болезни Паркинсона.

До настоящего времени описаны лишь 3 точковые мутации в гене SNCA при болезни Паркинсона, и наши собственные данные свидетельствуют об отсутствии точковых мутаций SNCA даже в семейных случаях болезни [2G]. В то же время в последние годы было показано, что более распространенным мутационным повреждением SNCA при болезни Паркинсона являются полные дупликации и трипликации гена [35]. Нами впервые в России для выявления изменений ко-пийности гена SNCA или отдельных его экзонов разработаны методы, основанные на использовании двух вариантов ПЦР в реальном времени - TaqMan (амплификация с использованием немеченых праймеров в присутствии флуоресцентно меченного экзон-специфичного зонда) и FRET (флуоресцентный резонансный перенос энергии, амплификация с двумя праймерами, несущими на себе флуоресцентный краситель и гаситель флуоресценции).

Результаты____________________________________________

Среди 359 больных с болезнью Паркинсона нами были выявлены 4 случая гетерозиготного носительства мутации G2Gi9S в гене LRRK2 (рис. І), в том числе 3 случая спорадических и один - из семьи с четким аутосомно-доминант-ным наследованием болезни. Суммарная частота данной мутации составила, таким образом, i,i% в общей группе обследованных пациентов с болезнью Паркинсона.

В контрольной группе (клинически здоровые лица из общей популяции) мутация G2Gi9S в гене LRRK2 не обнаружена.

У всех G2019S-позитивныx пациентов имел место типичный фенотип болезни Паркинсона, включавший леводопа-чувствительный паркинсонизм с асимметричным началом симптомов и вариабельной комбинацией брадикинезии, ригидности и тремора покоя. Реже наблюдались постуральная неустойчивость, дистония и (в единственном случае) -

леводопа-индуцированные дискинезии; когнитивные и вегетативные расстройства отсутствовали. Яркой особенностью данной подгруппы явилась выраженная вариабельность значений возраста начала болезни: так, у обследованных носителей мутации LRRK2-G2019S первые симптомы паркинсонизма манифестировали в 29, 39, 52 и 57 лет, а в единственном семейном случае с выявленной мутацией у матери пробанда болезнь началась еще позднее - в 71 год. Интересно отметить, что в этой же семье у всех больных родственников выраженным и ранним симптомом болезни был постуральный тремор.

При количественном анализе гена PRKN (паркина) у 140 пациентов с ранней болезнью Паркинсона нами в 15 случаях (10,7% от общего числа больных с ранним началом) были выявлены различные структурные перестройки в PRKN. Все перестройки были гетерозиготными (табл. 1). В их числе: де-леции отдельных экзонов (изолированных или примыкающих друг к другу) - 9 случаев; дупликации отдельных экзо-нов - 3 случая; сочетание делеций и дупликаций или сочетание удаленных разноэкзонных делеций - 3 случая.

При поздней болезни Паркинсона структурные перестройки гена PRKN были выявлены нами у 6 больных, т.е. в 1,7% случаев болезни с началом после 45 лет (табл. 2). В их числе: гомозиготная делеция экзона - 1 случай; гетерозиготные де-леции отдельных экзонов - 4 случая; гетерозиготная деле-ция трех экзонов (с межэкзонным разрывом) - 1 случай.

Таким образом, суммарная частота выявления мутаций гена PRKN в общей группе пациентов с болезнью Паркинсона составила 5,8% (21 случай из 359).

В контрольной группе ни у кого из обследованных лиц де-леций либо мультипликаций в PRKN не выявлено.

Нами было проведено сопоставление клинических особенностей заболевания в паркин-позитивных и паркин-нега-тивных случаях болезни Паркинсона. Единственным существенным различием между группами стал возраст манифестации заболевания - более ранний при носительстве мутаций: так, у больных с выявленными мутациями в PRKN возраст начала заболевания варьировал от 23 до 68 лет (средний возраст 39,6 ± 15,1 года), а в группе больных без структурных перестроек в PRKN - от 24 до 84 лет (54,4 ±

14,2 года), различия статистически значимы. Каких-либо других фенотипических различий между сопоставляемыми подгруппами больных отмечено не было. Клиническая картина заболевания в обеих группах больных соответствовала изолированному леводопа-чувствительному паркин-соновскому синдрому (брадикинезия, мышечная ригидность, тремор покоя, постуральная неустойчивость), в ряде случаев сочетающемуся с дистонией и леводопа-индуциро-ванными дискинезиями.

У 2 пациентов с семейной формой болезни Паркинсона нами была выявлена дупликация гена SNCA. Заболевание у пробандов манифестировало в 57 и 49 лет. Клиническая картина соответствовала типичной дрожательно-ригидной форме паркинсонизма. Интересно отметить, что у сына од-

ного из больных в возрасте 13 лет появилось и стало нарастать дрожание рук, усиливающееся при волнении и физической нагрузке; осмотрен в возрасте 16 лет, диагностирован классический фенотип эссенциального тремора.

Обсуждение____________________________________________

Проведенное исследование впервые позволило оценить молекулярную структуру болезни Паркинсона в российской популяции, преимущественно у больных славянского этнического происхождения.

Нами показано, что в невыборочной серии спорадических случаев болезни Паркинсона частота наследуемых мутаций в 3 основных «паркинсонических» генах - SNCA (PARK1), PRKN (PARK2) и LRRK2 (PARK8) составляет 7,5% (те или иные мутации выявлены у 27 больных из 359). Отметим, что эта частота явно занижена, поскольку по техническим причинам мы ограничились лишь исследованием наиболее значимых или наиболее типичных мутаций, не предпринимая тотального мутационного скрининга. Так, у больных была исследована лишь одна мажорная мутация в гене LRRK2 (исследование всех 40 экзонов гена LRRK2 представляет собой крайне сложную самостоятельную задачу), а для гена PRKN в данной работе ставилась задача скрининга типичных для локуса PARK2 структурных перестроек (без детального поиска точковых мутаций). С учетом возможной частоты других мутаций в исследованных генах общая распространенность форм PARK1, PARK2 и PARK8 среди спорадических случаев болезни Паркинсона может, по-видимому, достигать 10-12% [12, 40]. Иными словами, как минимум каждый десятый случай болезни Паркинсона может иметь прямую генетическую основу.

В нашей серии частота мутации G2019S в гене LRRK2 составила 1,1%, что вполне соответствует средним показателям частоты PARK8-формы болезни Паркинсона и связанной с ней наиболее распространенной мутации в большинстве исследованных популяций [8, 11, 14, 28, 42].

Весьма значимыми являются и мутации в гене PRKN. Те или иные структурные перестройки (делеции, дупликации) выявлены у 5,8% больных, причем значительно чаще при ранней болезни Паркинсона (10,7%), чем при поздней форме заболевания (1,7%). Следует подчеркнуть, что в настоящей работе не анализировались случаи ювенильного паркинсонизма (дебют симптомов до 20 лет), для которого характерна еще более высокая частота повреждений гена PRKN [1, 26, 29]. При этом ювенильный паркинсонизм -аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное носи-тельством двух мутантных по PRKN хромосом [27]. В нашем же материале при классической спорадической болезни Паркинсона обычно выявлялись гетерозиготные структурные перестройки гена, и лишь у 1 пациента (см. табл. 2) при дебюте болезни в 61 год была выявлена гомозиготная деле-ция 3-го экзона. Данный пациент представляет собой пример аутосомно-рецессивноого PARK2-паркинсонизма, но отнюдь не ювенильного, а развившегося уже в пожилом возрасте. Таким образом, клинический спектр паркинопатий значительно шире, чем это предполагалось ранее.

Результаты проведенной работы, показывающие сравнительно высокую частоту гетерозиготных делеций и дупликаций в локусе PARK2, в определенной степени подтверждают обсуждаемую в литературе точку зрения о возможности доминантного эффекта мутаций гена PRKN [17, 18]. Предполагается, что гетерозиготное носительство мутаций в PRKN может быть либо каузативным само по себе, либо служить одним из значимых факторов риска развития болезни Паркинсона [13, 27]. В то же время нельзя исключить, что у части обследованных нами больных имеются какие-либо дополнительные генетические дефекты (например, «неблагоприятные» полиморфизмы или неиден-тифицированные точковые мутации в локусе PARK2, мутации в других локусах паркинсонизма и т.д.), которые в сочетании с рецессивной делецией (дупликацией) PRKN приводят к развитию клинической симптоматики.

Нами впервые в двух российских семьях с болезнью Паркинсона у пробандов выявлена полная дупликация гена SNCA (а-синуклеин). Эти данные в целом подтверждают, что первичные а-синуклеинопатии обычно встречаются в семейных (аутосомно-доминантных) случаях болезни Паркинсона [16]. Однако у одного из больных, поступившего в клинику как «спорадический» случай, четкие указания на положительный семейный анамнез были получены лишь в результате целенаправленного опроса уже после идентификации мутации, причем у сына пробанда имел место типичный эссенциальный тремор. Данное наблюдение демонстрирует возможную патогенетическую взаимосвязь между некоторыми вариантами первичного паркинсонизма и эс-сенциального тремора у носителей мутаций в гене SNCA.

Анализ наших данных и аналогичных результатов, полученных другими авторами, приводит к выводу о гетерогенности спорадической болезни Паркинсона. Болезнь Паркинсона - не единая нозологическая форма, а совокупность самостоятельных (хотя и сходных) нейродегенеративных синдромов. Причем эта гетерогенность проявляется на всех уровнях - молекулярном, биохимическом, клиническом, морфологическом. Молекулярная гетерогенность опосредована повреждениями и/или вариабельностью различных генов, определяющих характер функционирования нейронов дофаминергической нигростриарной системы (примеры вариабельной комбинации таких генных перестроек представлены выше). Фенотипическая гетерогенность четко проявляется, например, при сравнительном анализе ранних и поздних вариантов болезни Паркинсона: для пер-

вых характерно более благоприятное течение, нередкое начало болезни с дистонии, более частое развитие тремора (в том числе статокинетического), более быстрое развитие ле-водопа-индуцированных дискинезий и двигательных флуктуаций [15]. На морфологическом уровне ярким примером гетерогенности болезни Паркинсона является отсутствие в дегенерирующих нейронах телец Леви при многих вариантах «паркинопатий» [27] и наличие этих классических маркеров при поздних формах болезни; в рамках некоторых других форм первичного паркинсонизма (РАМ.8 и др.) также отмечен выраженный полиморфизм -от типичной болезни Паркинсона с тельцами Леви до необычных вариантов синуклеин- и тау-патологии [41, 43].

Интересно, что анализ молекулярных основ паркинсонизма ведет не только к «расщеплению» болезни Паркинсона на отдельные формы, но и, с другой стороны, к сближению некоторых самостоятельных форм патологии. Так, показано, что с молекулярной точки зрения между болезнью Паркинсона и деменцией с тельцами Леви существуют лишь количественные различия: дупликация гена SNCA приводит к манифестации «чистого» паркинсоновского фенотипа, тогда как трипликация того же гена (и соответственно усиление экспрессии а-синуклеина) ведет к развитию тяжелого фенотипа с ранней деменцией и быстрым фатальным течением [10]. По-видимому, можно говорить о болезни Паркинсона и деменции с тельцами Леви как об альтернативных фенотипах единого патологического процесса -«болезни телец Леви» [3, 10], в рамках которого отдельные формы отличаются лишь степенью вовлечения различных клеточных популяций в формирование а-синуклеиновых агрегатов.

Идентификация наследуемых мутаций в определенной части случаев болезни Паркинсона, в том числе у лиц без семейного анамнеза, имеет серьезные последствия для медико-генетического консультирования, поскольку потомки таких больных имеют высокий риск заболевания. С помощью прямой ДНК-диагностики становится возможным точное установление лиц высокого риска - носителей мутаций в тех или иных «паркинсонических» генах. Такие лица должны выявляться в рамках соответствующих скрининговых программ и становиться объектами целенаправленных превентивных мероприятий (коррекция стиля жизни, диеты, профессиональных и бытовых вредностей, использование нейропротекторов и т.д.).

Список литературы

1. Загоровская Т.Б., Иллариошкин С.Н., Сломинский П.А. и др. Клинико-генетический анализ ювенильного паркинсонизма в России. Журн. неврол. и психиатрии им. С.С. Корсакова 2004; 8: 66-72.

2. Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д., Загоровская Т.Б., Иллариошкин С.Н. Семейные случаи болезни Паркинсона (клинико-генетический анализ). Мед. генетика 2002; 5: 234-237.

3. Иллариошкин С.Н. Конформационные болезни мозга. М.: Янус-К, 2003.

4. Иллариошкин С.Н., Загоровская И.А., Иванова-Смоленская И.А., Маркова Е.Д. Генетические аспекты болезни Паркинсона. Неврол. журн. 2002; 5: 47-51.

5. Левин О.С., Докадина Л.В. Эпидемиология паркинсонизма и болезни Паркинсона. Неврол. журн. 2005; 5: 41-49.

6. Berg D., Schweitzer K.J., Leitner P. et al. Type and frequency of mutations in the LRRK2 gene in familial and sporadic Parkinson’s disease. Brain 2005; 128: 3000-3011.

7. DeRijkM.C., BretelerM.M., Graveland G.A. etal. Prevalence of Parkinson’s disease in the elderly: the Rotterdam study. Neurology 1995; 45: 2143-2146.

8. Di Fonzo A., Tassorelli C., De Mari M. et al. Comprehensive analysis of the LRRK2 gene in sixty families with Parkinson’s disease. Eur. J. Hum. Genet. 2006; 14: 322-331.

9. Elbaz A., Grigoletto F., Balderschi M. et al. Familial aggregation of Parkinson’s disease: A population-based case-control study in Europe. Neurology 1999; 52: 1876-1882.

10. Farrer M., Kachergus J., Forno L. et al. Comparison of kindreds with familial parkinsonism and 6-synuclein genomic multiplications. Ann. Neurol. 2004; 55: 174-179.

11. Farrer M., Stone J., Mata I.F. et al. LRRK2 mutations in Parkinson disease. Neurology 2005; 65: 738-740.

12. Foroud T. LRRK2: both a cause and a risk factor for Parkinson’s disease? Neurology 2005; 65: 664-665.

13. Foroud T., Uniacke S.K., Liu L. et al. Heterozygosity for a mutation in the parkin gene leads to later onset Parkinson disease. Neurology 2003; 60: 796-801.

14. Gilks W.P., Abou-Sleiman P.M., Gandhi S. et al. A common LRRK2 mutation in idiopathic Parkinson’s disease. Lancet 2005; 365: 415-416.

15. Golbe L.I. Young-onset Parkinson’s disease: a clinical review. Neurology 1991; 41: 168-173.

16. Golbe L.I. Alpha-synuclein and Parkinson’s disease. Mov. Disord. 1999; 14: 6-9.

17. Hernandez D.G., Paisan-Ruiz C., McInerney-Leo A. et al. Clinical and positron emission tomography of Parkinson’s disease caused by LRRK2. Ann. Neurol. 2005; 57: 453-456.

18. Hilker R., Klein C., Hedrich K. et al. The striatal dopaminergic deficit is dependent on the number of mutant alleles in a family with mutations in the parkin gene: evidence for enzymatic function in humans. Neurosci. Lett. 2002; 323: 50-54.

19. Hughes A.J., Daniel S.E., Kilford L., Lees A.J. Accuracy of clinical diagnosis of idiopathic Parkinson’s disease: a clinico-pathological study of 100 cases. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 1992; 55: 181-184.

20. Illarioshkin S.N., Ivanova-Smolenskaya I.A., Markova E.D. et al. Lack of a-synuclein gene mutations in families with autosomal dominant Parkinson’s disease. J. Neurol. 2000; 247: 968-969.

21. Khan N.L., Graham E., Critchley P. et al. Parkin disease: a phenotypic study of a large series of cases. Brain 2003; 126: 1279-1292.

22. Kitada T., Asakawa S., Hattori N. et al. Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism. Nature 1998; 392: 605-608.

23. Kruger R., Vieira-Saecker A., Kuhn W. et al. Increased susceptibility to sporadic Parkinson’s disease by a certain combined 6-synuclein/apolipoprotein E genotype. Ann. Neurol. 1999; 45: 611-617.

24. Leroy E., Boyer R., Auburger G. et al. The ubiquitin pathway in Parkinson’s disease. Nature 1998; 395: 451-452.

25. Lesage S., Diirr A., Tazir M. et al. LRRK2 G2019S as a cause

of Parkinson’s disease in North African Arabs. New Engl. J. Med. 2006; 354: 422-423.

26. Liicking C.B., Diirr A., Bonifati V. et al. Association between early-onset Parkinson’s disease and mutations in the parkin gene. New Engl. J. Med. 2000; 342: 1560-1567.

27. Mata I.F., Lockhart P.J., Farrer M.J. Parkin genetics: one model for Parkinson’s disease. Hum. Mol. Genet. 2004; 13: 127-133.

28. Mata I.F., Ross O.A., Kachergus J. et al. LRRK2 mutations are a common cause of Parkinson’s disease in Spain. Eur. J. Neurol. 2006; 13: 391-394.

29. Morrison K.E. Parkin mutations and early onset parkinsonism. Brain 2003; 126: 1250-1251.

30. Mouradian M.M. Recent advances in the genetics and pathogenesis of Parkinson disease. Neurology 2002; 58: 179-185.

31. Ozelius L.J., Senthil G., Saunders-Pullman R. et al. LRRK2 G2019S as a cause of Parkinson’s disease in Ashkenazi Jews. New Engl. J. Med. 2006; 354: 424-425.

32. Paisan-Ruiz C., Jain S., Evans E.W. et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neurol. 2004; 44: 595-600.

33. Paisan-Ruiz C., Lang A.E., Kawarai T. et al. LRRK2 gene in Parkinson disease: mutation analysis and case control association study. Neurology 2005; 65: 696-700.

34. Piccini P., Burn D.J., Ceravolo R. et al. The role of inheritance in sporadic Parkinson’s disease: evidence from a longitudinal study of dopaminergic function in twins. Ann. Neurol. 1999; 45: 577-582.

35. Singleton A.B., Farrer M., Johnson J. et al. Alpha-synuclein locus triplication causes Parkinson’s disease. Science 2003; 302: 841.

36. Tan E.K., Khajavi M., Thoronby J.I. et al. Variability and validity of polymorphism association studies in Parkinson’s disease. Neurology 2000; 55: 533-538.

37. Veldman B., Wijn A., Knoers N. et al. Genetic and environmental risk factors in Parkinson’s disease. Clin. Neurol. Neurosurg. 1998; 100: 15-26.

38. Vieregge P., Hagenah J., Heberlein I. et al. Parkinson’s disease in twins: a follow-up study. Neurology 1999; 53: 566-572.

39. Vila M., Przedborski S. Genetic clues to the pathogenesis of Parkinson’s disease. Nat. Med. 2004; 10 (Suppl.): S58-S62.

40. West A., Periquet M., Lincoln S. et al. Complex relationship between parkin mutations and Parkinson disease. Am. J. Med. Genet. 2002; 114: 584-591.

41. Wszolek Z.K., Pfeiffer R.F., Tsuboi Y. et al. Autosomal dominant parkinsonism associated with variable synuclein and tau pathology. Neurology 2004; 62: 1619-1622.

42. Zabetian C.P., Samii A., Mosley A.D. et al. A clinic-based study of the LRRK2 gene in Parkinson disease yields new mutations. Ibid. 2005; 65: 741-744.

43. Zimprich A., Biskup S., Leitner P. et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 2004; 44: 601-607.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Гетерогенность спорадической болезни Паркинсона

Heterogeneity of sporadic Parkinson’s disease: molecular approach to solving the problem

S.N. Illarioshkin1, P.A. Slominsky2, M.I. Shadrina2, G.Kh. Bagyeva1, T.B. Zagorovskaya1, E.D. Markova1, A.V. Karabanov1, V.V. Poleshchuk1, E.V. Polevaya1, N.V. Fedorova3, S.A. Limborskaya2, I.A. Ivanova-Smolenskaya1

1 Institute of Neurology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

2 Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences, Moscow

3 Russian Medical Academy of Postgraduate Education, Moscow

Key words: Parkinson’s disease, sporadic cases, mutation analysis, genetic heterogeneity, genetic counseling.

We performed search for mutations in the LRRK2, PRKN (parkin) and SNCA (a-synuclein) genes in 359 patients of Slavonic ethnic origin (169 men and 190 women) with Parkinson’s disease, of whom 345 represented sporadic cases. Age at the disease onset was from 23 to 84 years, and patients with juvenile parkinsonism (debut of symptoms before 20 years) were excluded from enrollment. On study of a major mutation G2019S in the gene LRRK2, as well as of structural rearrangements in the PRKN and SNCA genes it was established that in Parkinson’s disease the frequency of these mutations is 7.5% (27 patients of 359). The mutation LRRK2-G2019S was found in 1.1% of patients, parkin gene exon-

ic rearrangements in 5.8% (including 10.7% patients with an early form of Parkinson’s disease and 1.7% patients with a late form of the disease), and SNCA gene duplication in two patients. The performed analysis showed marked heterogeneity of the molecular structure of Parkinson’s disease in Russian population, which allows to consider this disorder not to be a unified form but rather a group of separate (although similar) neurodegenerative syndromes. The identification of inherited mutations in a part of sporadic cases of Parkinson’s disease changes significantly the familial prognosis and requires genetic counseling in persons from the ‘high risk’ group.