СПОСОБЫ И ДИЕТОЛОГИЧЕСКИЕ СОСТАВЫ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ И СНИЖЕНИЯ ПОБОЧНЫХ ЭФФЕКТОВ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
METHODS AND NUTRITIONAL FORMULATIONS FOR INCREASING EFFECTIVENESS AND REDUCING SIDE EFFECTS OF CANCER TREATMENT

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[1] Данная заявка заявляет преимущество предварительной заявки США № 61/254154, поданной 22 октября 2009 года, раскрытие которой включено в данный документ во всей полноте ссылкой.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[2) Настоящее изобретения относится, в общем, к диете и лечению рака. Более конкретно, данное изобретение обеспечивает способы, которые могут быть использованы для сенсибилизации раковых клеток к химиотерапевтическим препаратам при защите нормальных клеток.
ПРЕДПОСЫЛКИ
[3] Химиотерапия может продлить выживание больных, диагностированных широким диапазоном злокачественных новообразований. Однако токсические побочные эффекты на нормальные клетки и ткани ограничивают интенсивность дозы, частоту и эффективность. Например, кардиотоксичность и нефротоксичность связаны с широко назначаемыми противораковыми препаратами доксорубицином и цисплатином, соответственно, ограничивая их полный терапевтический потенциал (Rajagopalan, S.Cancer Res. 1988; Hale, J.P.Arch. Dis.Child 1994; Dobyan, D.C., J.Pharmacol. E.T1980; Fillastre. J.P. Toxicology let 1989). Таким образом, снижение нежелательной токсичности путем селективной защиты нормальных клеток без ущерба для убийства злокачественных клеток представляет собой перспективную стратегию для улучшения лечения рака.
[4] В последнее время сообщалось о воздействии на основе лечебного голодания, способного дифференциально защищать нормальные, но не раковые, клетки от высокодозовой химиотерапии в культуре клеток и у мышей с нейробластомой (Raffaghello, L. PNAS 2008). В мышиной модели ксенотрансплантата нейробластомы мышам позволялось только потребление воды в течение 48 часов до лечения этопозидом. В то время как высокая доза этопозида приводила к 50% летальности мышей, которых кормили ad lib. (по желанию), голодание не только защищало от токсичности, связанной с химиотерапией, но также задерживало смерть, зависимую от метастазирования нейробластомы (Raffaghello, L. PNAS 2008).
[5] Ограничение калорий, как известно, улучшает устойчивость к стрессу и удлиняет продолжительность жизни организмов в ряду от дрожжей до млекопитающих. Также показано, что ограничение калорий задерживает раковый рост, но его эффект невелик и не может комбинироваться с химиотерапией или применяться отдельно, поскольку требует долгосрочной потери веса, что является вредным для больных раком, а также трудно сохраняется.
[6] Таким образом, по меньшей мере, по этим причинам существует необходимость в дополнительных способах лечения рака, которые эффективно включают диету, помогающую лечению и частично снимающую побочные эффекты химиотерапии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
[7] На основании известного уровня техники обеспечивается способ для частичного снятия ракового роста и симптомов рака. Способ в данном варианте осуществления включает этап, на котором выявляется больной раком и затем ему обеспечивается первая диета в течение первого заранее определенного периода времени. Первая диета обеспечивает больному не более чем 50% нормального потребления калорий больного с по меньшей мере 50% килокалорий, полученных из жира, предпочтительно мононенасыщенного. Затем больному обеспечивают вторую диету в течение второго заранее определенного периода времени. Вторая диета обеспечивает больному не более чем 500 ккал/день. Затем больному обеспечивают третью диету, которая оптимизирует восстановление веса и пополнение необходимых питательных веществ, требующихся для оптимального выздоровления и здоровья нормальных клеток и органов. Настоящий вариант осуществления обеспечивает протокол кратковременной модифицированной диеты, которая является эффективной для защиты нормальных клеток и препятствующей и замедляющей рост раковых клеток. Протокол и модифицированная диета будут способствовать этим эффектам, не вызывая продолжительной потери веса у больных.
[8] В другом варианте осуществления обеспечивается способ сенсибилизации рака к химиотерапевтическим препаратам. Способ включает этап, на котором выявляется больной раком и затем ему обеспечивается первая диета в течение первого заранее определенного периода времени. Первая диета обеспечивает больному не более чем 50% нормального потребления калорий больного с по меньшей мере 50% килокалорий, полученных из жира. Затем больному обеспечивают вторую диету в течение второго заранее определенного периода времени. Вторая диета обеспечивает больному не более чем 500 ккал/день. Затем больному обеспечивают третью диету, которая оптимизирует восстановление веса и пополнение необходимых питательных веществ, требующихся для оптимального выздоровления и здоровья нормальных клеток и органов. Настоящий вариант осуществления обеспечивает протокол кратковременной модифицированной диеты, которая является эффективной для защиты нормальных клеток и повышает чувствительность рака от/к химиотерапии (Дифференциальная Устойчивость к Стрессу). Протокол и модифицированная диета будут способствовать этим эффектам, не вызывая продолжительной потери веса у больных.
[9] Эти результаты являются интригующим с учетом общепринятых убеждений врачей-онкологов, что лечебное голодание является потенциально опасным для больных раком, которые были ослаблены до циклов химиотерапии или истощены.
[10] В еще одном варианте осуществления обеспечивается способ сенсибилизации рака к радиационной терапии. Способ включает этап, на котором выявляется больной раком и затем ему обеспечивается первая диета в течение первого заранее определенного периода времени. Первая диета обеспечивает больному не более чем 50% нормального потребления калорий больного с по меньшей мере 50% килокалорий, полученных из жира. Затем больному обеспечивают вторую диету в течение второго заранее определенного периода времени. Вторая диета обеспечивает больному не более чем 500 ккал/день. Затем больному обеспечивают третью диету, которая оптимизирует восстановление веса и пополнение необходимых питательных веществ, требующихся для оптимального выздоровления и здоровья нормальных клеток и органов. Настоящий вариант осуществления обеспечивает протокол кратковременной модифицированной диеты, которая является эффективной для защиты нормальных клеток и повышает чувствительность рака от/к радиационной терапии (Дифференциальная Устойчивость к Стрессу). Протокол и модифицированная диета будут способствовать этим эффектам, не вызывая продолжительной потери веса у больных.
[11] В другом варианте осуществления обеспечиваются составы, содержащие конкретные диапазоны белков, незаменимых аминокислот, углеводов, жиров, витаминов, минералов и незаменимых жирных кислот для замедления ракового роста при одиночном введении или защиты организма от химиотерапии и/или радиационной терапии и сенсибилизации раковых клеток к химиотерапии и/или радиационной терапии.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРАЖЕНИЙ
[12] Фигура 1 обеспечивает графики лабораторных значений индексов форменных элементов крови для случая 1: (А) нейтрофилы; (В) лимфоциты; (С) белые клетки крови, WBC; (D) тромбоциты; (Е) красные клетки крови, RBC (F) гемоглобин, Hgb; (G) гематокрит, Hct; (Н) вес тела, заполненный треугольник указывает день химиотерапии; открытый квадрат указывает лечебное голодание, нормальные диапазоны лабораторных значений указаны пунктирными линиями;
[13] Фигура 2 является гистограммой, обеспечивающей самостоятельно оцененные побочные эффекты химиотерапии для случая 1, данные представлены как среднее 2 циклов одиночной химиотерапии против 2 циклов химиотерапии - лечебного голодания;
[14] Фигура 3 является гистограммой, обеспечивающей самостоятельно оцененные побочные эффекты химиотерапии для случая 2, данные представлены как среднее 3 циклов одиночной химиотерапии против 5 циклов химиотерапии - лечебного голодания;
[15] Фигура 4 обеспечивает графики лабораторных значений индексов форменных
элементов крови для случая 3: (А) нейтрофилы; (В) лимфоциты; (С) белые клетки крови, WBC; (D) тромбоциты; (Е) красные клетки крови, RBC (F) гемоглобин, Hgb; (G) гематокрит, Hct; (Н) уровень специфического антигена простаты (PSA), больной был зачислен в испытание абиратерона ацетата (CYP17 ингибитор) в течение 90 дней, указанных вертикальными пунктирными линиями, больной также получал G-CSF (Neulasta) в день химиотерапии кроме времени лечения абиратерона ацетатом, заполненный треугольник указывает день химиотерапии; открытый квадрат указывает лечебное голодание, стрелка указывает применение тестостерона (1% крем), нормальные диапазоны лабораторных значений указаны горизонтальными пунктирными линиями;
[16] Фигура 5 является гистограммой самостоятельно оцененных побочных эффектов химиотерапии для случая 3, данные представлены как среднее 5 циклов одиночной химиотерапии против 7 циклов химиотерапии - лечебного голодания;
[17] Фигура 6 обеспечивает графики лабораторных значений индексов форменных элементов крови для случая 4: (А) нейтрофилы; (В) лимфоциты; (С) белые клетки крови, WBC; (D) тромбоциты; (Е) красные клетки крови, RBC (F) гемоглобин, Hgb; (G) гематокрит, Hct; заполненный треугольник указывает день химиотерапии; открытый квадрат указывает лечебное голодание, нормальные диапазоны лабораторных значений указаны пунктирными линиями;
[18] Фигура 7 является гистограммой самостоятельно оцененных побочных эффектов химиотерапии для случая 4, данные представлены как среднее 5 циклов одиночной химиотерапии против 7 циклов химиотерапии - лечебного голодания;
]19] Фигура 8 является гистограммой самостоятельно оцененных побочных эффектов химиотерапии для случая 5, данные представляют 1 цикл одиночной химиотерапии (1-й цикл) против среднего 5 циклов химиотерапии - лечебного голодания;
[20] Фигура 9 обеспечивает графики лабораторных значений индексов форменных элементов крови для случая 6: (А) нейтрофилы; (В) лимфоциты; (С) белые клетки крови, WBC; (D) тромбоциты; (Е) красные клетки крови, RBC (F) гемоглобин, Hgb; (G) гематокрит, Hct; заполненный треугольник указывает день химиотерапии; открытый квадрат указывает лечебное голодание, нормальные диапазоны лабораторных значений указаны пунктирными линиями, больной получил трансфузию красных клеток крови (3 единицы) на 71 день, и также получал G-CSF (Neulasta) как указано;
[21] Фигура 10 является гистограммой самостоятельно оцененных побочных эффектов химиотерапии для случая 6;
[22] Фигура 11 обеспечивает графики лабораторных значений индексов форменных элементов крови для случая 7: (А) нейтрофилы; (В) лимфоциты; (С) белые клетки крови, WBC; (D) тромбоциты; (Е) красные клетки крови, RBC (F) гемоглобин, Hgb; (G) гематокрит, Hct; (Н) уровень специфического антигена простаты (PSA), заполненный треугольник указывает день химиотерапии; открытый квадрат указывает лечебное голодание, стрелка указывает введение абиратерона, нормальные диапазоны лабораторных значений указаны пунктирными линиями, больной также получал G-CSF (Neulasta), как указано;
[23] Фигура 12 является гистограммой самостоятельно оцененных побочных эффектов химиотерапии для случая 7, данные представлены как среднее 8 циклов химиотерапии - лечебного голодания;
[24] Фигура 13 является гистограммой самостоятельно оцененных побочных эффектов химиотерапии для случая 8, данные представлены как среднее 4 циклов химиотерапии - лечебного голодания;
[25] Фигура 14 является гистограммой самостоятельно оцененных побочных эффектов химиотерапии для случая 9, данные представлены как среднее 4 циклов химиотерапии - лечебного голодания;
[26] Фигура 15 обеспечивает графики лабораторных значений индексов форменных элементов крови для случая 10: (А) нейтрофилы; (В) лимфоциты; (С) белые клетки крови, WBC; (D) тромбоциты; (Е) красные клетки крови, RBC (F) гемоглобин, Hgb; (G) гематокрит, Hct; заполненный треугольник указывает день химиотерапии; открытый квадрат указывает лечебное голодание, нормальные диапазоны лабораторных значений указаны пунктирными линиями, больной также получал G-CSF (Neulasta), как указано;
[27] Фигура 16 является гистограммой самостоятельно оцененных побочных эффектов химиотерапии для случая 10, данные представлены как среднее 6 циклов химиотерапии - лечебного голодания;
[28] Фигура 17 является гистограммой самостоятельно оцененных побочных эффектов химиотерапии с или без лечебного голодания. (А) Данные представляют среднее СТС (общие критерии токсичности) оценок, сообщенных всеми больными в данном исследовании; 18 циклов химиотерапии в условиях диеты ad lib. (по желанию) сравнили с 46 циклами химиотерапия - лечебное голодание; (В) Данные представляют среднее СТС оценок соответствующих циклов с и без лечебного голодания; 6 больных получали либо одиночную химиотерапию, либо химиотерапию - лечебное голодание, самостоятельно оцененные побочные эффекты из двух ближайших циклов сравнивали между собой, статистический анализ выполняли только по соответствующим циклам и данные представлены как стандартная ошибка среднего (SEM), Р значения рассчитывали с помощью непарного двустороннего t теста (*, Р<0.05);
[29] Фигура 18 является гистограммой, показывающей результаты эксперимента, в котором мышиные клетки молочной железы (4Т1-luс) высевали на 96-луночные планшеты для клеточных культур (20000 клеток на лунку), и позволяли уравновеситься и достичь сплошного монослоя в течение 48 часов, затем среду меняли на низко- или высокоглюкозную среду на 48 часов до облучения (5 или 10 Гр; Фигуры 18А, 18В), жизнеспособность определяли по МТТ анализу (Фиг.18С) и статистический анализ проводили по t-тесту Стьюдента (N=60);
[30] Фигура 19 является гистограммой, показывающей результаты эксперимента, в котором мышиные клетки глиомы (GL26) высевали на 96-луночные планшеты для клеточных культур (20000/лунку) и позволяли уравновеситься и достичь сплошного монослоя в течение 48 часов, затем среду меняли на низко- или высокоглюкозную среду на 48 часов до облучения (5 или 10 Гр; Фигуры 19А, 19 В), жизнеспособность определяли по МТТ анализу (Фиг.19С), и статистический анализ проводили по t-тесту Стьюдента (N=60);
5
3
[31] Фигура 20 обеспечивает графики эксперимента, в котором самкам мышей BALB/c весом 20-25 г подкожно вводили сингенные клетки рака молочной железы (4Т1-lис; 2×10 клеток/мышь), на 13 день опухоль значительно прогрессировала до 300-500 мм, и начинали лечение путем лечебного голодания мышей в течение 48 часов до облучения (IR; 5 Гр), второй цикл STS/IR (3 Гр) проводили через неделю и статистический анализ с использованием t-теста Стьюдента проводили для каждого дня, *р<0.05;
5
3
[31] Фигура 21 обеспечивает графики эксперимента, в котором самкам мышей C57BL/6 весом 25-30 г подкожно вводили сингенные раковые клетки глиомы (GL26; 3×10клеток/мышь), на 27 день опухоль значительно прогрессировала до 500-1000 мм, и начинали лечение путем лечебного голодания мышей в течение 48 часов до облучения (IR; 7,5 Гр), второй цикл STS/IR (3 Гр) проводили через неделю и статистический анализ с использованием t-теста Стьюдента проводили для каждого дня, *р<0,05;
[33] Фигура 22 обеспечивает графики, показывающие, что лечебное голодание сенсибилизирует опухоли к химиотерапии; в частности, подкожное развитие опухоли мышиного (А) рака молочной железы (4Т1), (В) меланомы (В16), и (С) глиомы (GL26) показаны как процентный рост вместе с размером опухоли непосредственно до и после каждого 48-часового цикла лечебного голодания;
[34] Фигура 23 обеспечивает графики, показывающие, что потеря веса тела во время 48-60 часов лечебного голодания легко восстанавливалась после возобновления нормального питания на (А-С) подкожных и (D) метастатических мышиных моделях рака: (A) BALB/c мыши-носители рака мышиной молочной железы (4Т1), C57BL мыши-носители (В) мышиной меланомы (В 16) и (С) глиомы (GL26), и (D) A/J мыши-носители мышиной нейробластомы (Neuro-2a);
[35] Фигура 24 обеспечивает графики, показывающие, что 24-48 часов лечебного голодания улучшают выживаемость метастатической мышиной меланомы (В 16);
[36] Фигура 25 является диаграммой, показывающей метастазы клеток меланомы В16 в различных органах по сравнению с мышами, которые получали DXR в условиях нормального кормления;
[37] Фигура 26 обеспечивает графики, показывающие, что лечебное голодание также сенсибилизирует опухоли на 2 метастатических моделях мышиной нейробластомы: NXS2 (Р<0,001), приводя к долговременной выживаемости;
[38] Фигура 27 обеспечивает графики, показывающие, что лечебное голодание также сенсибилизирует опухоли на 2 метастатических моделях мышиной нейробластомы: Neuro-2a (Р=0,005), приводя к долговременной выживаемости;
[39] Фигура 28 обеспечивает графики, показывающие, что лечебное голодание
также сенсибилизирует раковые клетки к химиотерапии на метастатической мышиной модели рака молочной железы (4Т1), логарифмический ранговый критерий, Р<0,0005;
[40] Фигура 29 обеспечивает графики, показывающие, что лечебное голодание замедляет развитие опухоли ксенотрансплантированной человеческой нейробластомы (ACN), которая была введена подкожно голым мышам; как только опухоли становились пальпируемыми, выполняли лечебное голодание в течение полных 5 циклов; однофакторный дисперсионный анализ с последующим тестом Тьюки для подкожных моделей (t-тест Стьюдента для (В) день 27)), и логарифмический ранговый критерий для метастатических моделей, *P<0,05, **P<0,01, ***Р<0,001;
[41] Фигура 30 обеспечивает гистограмму, показывающую, что сыворотка крови голодавших мышей сенсибилизировала клетки рака молочной железы к дозам DXR и CP, которые были минимально токсичными в сыворотке мышей, которых кормили ad lib. Контрольные группы культивировали в 1,0 г/л и 2,0 г/л глюкозы, для человеческих и мышиных клеток, соответственно, дополненной 10% FBS. STS группы культивировали в 0,5 г/л глюкозы, дополненной 1% FBS. Выживание определяли по МТТ-снижению. Для действия всех комбинаций глюкозы и сыворотки крови на DXR и CP, обращаться к Фигурам 33-34;
[42] Фигура 31 обеспечивает гистограмму, показывающую уровень глюкозы в крови голодавших мышей;
[43] Фигура 32 обеспечивает графики, показывающие результаты эксперимента, где STS сенсибилизировало 15 из 17 различных раковых клеток к DXR in vitro, STS применяли к 4 мышиным раковым клеткам - рак молочной железы (4Т1), меланома (В16), глиома (GL26), и нейробластома (NXS2 и Neuro-2a) - и 13 различным человеческим раковым клеткам - рак предстательной железы (РС3, 22RV1), рак молочной железы (MCF-7, С42 В), глиобластома (U87-MG), рак шейки матки (HeLa), рак толстой кишки (LOVO), нейробластома (ACN, SH-SY5Y), плоскоклеточный рак (А431), меланома (MZ-MEL) и рак яичников (OVCAR) - и испытывали с DXR;
[44] Фигура 33 обеспечивает графики, показывающие действие всех комбинаций глюкозы и сыворотки крови на DXR;
[45] Фигура 34 обеспечивает графики, показывающие действие всех комбинаций глюкозы и сыворотки крови на CP;
[46] Фигура 35 обеспечивает гистограммы, показывающие что IGF-I обращает вспять STS-зависимую сенсибилизацию раковых клеток к химиотерапии; клетки мышиного рака молочной железы (4Т1) и меланомы (В 16) обрабатывали rhIGF-I (200 мкМ) во время ограничения глюкозы (0,5 г/л vs 2,0 г/л, при 1% FBS), сопровождая обработкой DXR (16 мкМ); t-тест Стьюдента; *Р<0.05, **Р<0.01, ***Р<0.001;
[47] Фигура 36 обеспечивает анализ результатов, показывающих лечебное голодание и регуляцию оксидативного стресса и репарацию ДНК; STS было генотоксичным и синергично повышало повреждение ДНК в комбинации с (A) CP в клетках рака молочной железы (4Т1) и с DXR в клетках (В) меланомы (В 16), и (С) глиомы (GL26), как определено комет-анализом. Клетки в контрольной и STS группах культивировали в нормальной глюкозе (2,0 г/л) или низкой глюкозе (0,5 г/л), соответственно, дополненной 1% FBS. Препараты были отобраны для согласованности с исследованиями in vivo на Фигуре 22 А-С;
[48] Фигура 37 обеспечивает результаты микроматричного анализа подкожных опухолей молочной железы (4Т1) от нормально питавшихся или голодавших мышей, которые показывают дифференциальную регуляцию клеточных пролиферативных путей;
[49) Фигура 38 обеспечивает результаты микроматричного анализа подкожных опухолей молочной железы (4Т1) от нормально питавшихся или голодавших мышей, которые показывают повышение трансляционных механизмов, включая рибосомальную сборку/биогенез;
[50] Фигура 39 обеспечивает результаты анализа, показывающие, что лечебное голодание повышает Akt и S6K и снижает eIF2α фосфорилирование, согласующееся с повышенными компонентами трансляции в мышиных клетках рака молочной железы (4Т1) (A) in vivo и (В) in vitro;
[51] Фигура 40 является гистограммой, показывающей STS помехи пролиферации раковых клеток in vitro, согласующиеся с замедленным опухолевым ростом у мышей;
[52] Фигура 41 является гистограммой, показывающей, что лечебное голодание дифференциально регулирует экспрессию стресс-реактивных компонентов, включая бокс «вильчатой головки» 03 (FOX03), ядерный фактор каппа-В (NFkB), и гемоксигеназу 1 (НО-1), вызывая значительное угнетение в опухолях, но значительную индукцию в нормальных органах; t-тест Стьюдента; *P<0,05, **P<0,01, ***P<0.001;
[53] Фигура 42 обеспечивает результаты анализа, показывающие, что STS повышает внутриклеточный оксидативный стресс, оцененный по маркеру супероксида (DHE);
[54] Фигура 43 обеспечивает результаты анализа, показывающие, что STS повышает CP-индуцированные внутриклеточные уровни супероксида; мышиные клетки рака молочной железы (4Т1) подвергали голоданию и обработке CP in vitro;
[55] Фигура 44 обеспечивает результаты анализа, показывающие, что лечебное голодание выборочно повышает уровень каспазы-3 расщепления/активации в опухолях, но не в нормальных органах/клетках (A) in vivo и (В) in vitro;
[56] Фигура 45 обеспечивает результаты анализа, показывающие, что STS индуцирует аутофагию для поддержания клеточной энергетики;
[57] Фигура 46 является гистограммой, показывающей, что блокада аутофагии во время STS дополнительно повышает клеточную смерть;
[58] Фигура 47 является графиком результатов эксперимента, в котором мышиные клетки рака молочной железы (4Т1) обрабатывали гемином, наиболее распространенным индуктором НО-1 (10 мкМ), в нормальной или низкой глюкозе при 1% FBS, затем испытывали с CP;
[59] Фигура 48 является графиком, показывающим, что НО-1 является главным медиатором зависимого от лечебного голодания DSR; мышиные клетки рака молочной железы обрабатывали гемином, наиболее распространенным индуктором НО-1, в нормальной или низкой глюкозе при нормальном (10%) или низком (1%) FBS в течение 24 часов до и 24 часа во время CP лечения;
[60] Фигура 49 является графиком результатов эксперимента, в котором мышиные клетки рака молочной железы (4Т1) обрабатывали ZnPP (20 мкМ), широко используемым НО-1 ингибитором в нормальной или низкой глюкозе при 1% FBS, затем испытывали с CP;
[61] Фигура 50 является графиком, показывающим, что НО-1 является главным медиатором зависимого от лечебного голодания DSR; мышиные клетки рака молочной железы обрабатывали ZnPP, широко используемым НО-1 ингибитором в нормальной или низкой глюкозе при нормальной (10%) или низкой (1%) FBS в течение 24 часов до и 24 часа во время CP лечения;
[62] Фигура 51 обеспечивает модель для зависимой от лечебного голодания сенсибилизации к химиотерапии в ответ на лечебное голодание, глюкозу, IGF-I и другие сниженные про-ростовые молекулы/факторы, ответ злокачественных клеток на такое снижение активацией AKT/S6K и eIF2α и попыткой повысить трансляцию, но также и путем снижения экспрессии белков стресс-устойчивости FOX03a, NFkB, и НО-1, эти изменения вели к повышению оксидативного стресса и повреждений ДНК, активации каспазы-3 и клеточной смерти;
[63] Фигура 52 является графиком результатов эксперимента, на котором сывороточные уровни IGF-I у самок CD1 мышей, питавшихся контрольной диетой (Т.D.7912), питавшихся аминокислотным составом (AA-D), или голодавших 2,5 дня (кратковременное голодание, STS); модифицированная аминокислотная диета снижала сывороточный IGF-I на 50% после 5-дневного питания;
[64] Фигура 53 является графиком, показывающим, что питание модифицированной аминокислотной диетой сохраняет низкий сывороточный уровень IGF-I после кратковременного голодания (STS); самки CD1 мышей голодали в течение 2,5 дней и питались контрольной диетой (T.D.7912) или модифицированной аминокислотной диетой (AA-D, в течение 2 или 4 дней;
[65] Фигура 54 является графиком, показывающим уровень глюкозы крови: (А) самок CD1 мышей, голодавших в течение 3 дней или питавшихся гипокалорийной (6% от нормального потребления калорий) VCM диетой (в течение 3 дней) или модифицированной аминокислотной диетой (AA-D, в течение 3 или 5 дней); (В) самок CD1 мышей, голодавших в течение 2,5 дней и снова питавшихся контрольной либо модифицированной аминокислотной диетой в течение 4 дней, глюкозу измеряли после 4-часового лишения пищи;
[66] Фигура 55 обеспечивает диаграмму, дающую результаты экспериментов, в которох сывороточные уровни IGF-I: самок CD1 мышей, голодавших в течение 2,5 дней (STS), питавшихся гипокалорийной VCM-M диетой (в течение 2 дней) с последующей 1-дневной модифицированной аминокислотной диетой (М/АА), питавшихся гипокалорийной VCM-H диетой (в течение 2 дней) с последующей 1-дневной модифицированной аминокислотной диетой (Н/АА), Тьюки тест, по сравнению с контролем; (В) Двухдневное кормление гипокалорийной VCM диетой с последующей 1-дневной модифицированной аминокислотной диетой улучшало выживание мышей, которых лечили доксорубицином (DXR, 18 мг/кг);
[67] Фигура 56 является графиком результатов эксперимента, на котором самки CD1 мышей, питавшиеся контролем (TD.7912), голодавшие, или питавшиеся VegeGel в течение 2,5 дней: (А) Глюкоза крови натощак; (В) Сывороточные уровни IGF-I; и
[68] Фигура 57 является графиком результатов эксперимента, на котором самки CD1 мышей, питавшихся контрольной диетой (TD.7912), низкокалорийной кетогенной диетой (3 дня), или низкокалорийной кетогенной диетой (1 день) с последующей VegeGel (2 дня): (А) Глюкоза крови натощак; (В) Сывороточные уровни IGF-I.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[69] Теперь будет сделана подробная ссылка на предпочтительные в настоящее время композиции, варианты осуществления и способы настоящего изобретения, которые составляют лучшие режимы осуществления на практике данного изобретения, известные изобретателям. Фигуры не обязательно сопоставлять. Однако следует понимать, что раскрытые варианты осуществления являются только примерами изобретения, которое может быть осуществлено в различных и альтернативных формах. Таким образом, конкретные детали, раскрытые в данном документе, не должны расцениваться как ограничивающие, но только в качестве репрезентативной основы для любых аспектов изобретения и/или как репрезентативная основа для обучения специалиста в данной области техники различному применению настоящего изобретения.
[70] За исключением примеров, или там, где точно указано иное, все числовые величины в данном описании, указывающие количества материала или условия реакции и/или применения, следует понимать как модифицированные с помощью слова «примерно» в описании самого общего объема данного изобретения. Практика в пределах установленных числовых пределов является, как правило, предпочтительной. Кроме того, если прямо не установлено обратное: процент, "часть от" и соотношение значений являются по весу; описание группы или класса материалов, как подходит или предпочтительно для данной цели в связи с данным изобретением, означает, что смеси или два или более членов группы или класса являются одинаково подходящими или предпочтительными; описание элементов в химических терминах относится к элементам в момент добавления к любой комбинации, указанной в данном описании, и не препятствует химическим взаимодействиям между элементами смеси после смешивания; первое определение акронима или другого сокращения применяется ко всем последующим применениям в данном документе такого же сокращения и применяется mutatis mutandis (с учетом необходимых изменений) к нормальным грамматическим вариантам первоначально определенного сокращения; и, если прямо не указано иное, измерение характеристики определяют по той же методике, как ранее или позднее указано для такой характеристики.
[71] Также должно быть понятно, что данное изобретение не ограничено конкретными вариантами осуществления и способами, описанными ниже, так как конкретные компоненты и/или условия могут, конечно же, меняться. Более того, терминология, использованная в данном документе, используется только для описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и не предполагает какого бы то ни было ограничения.
[72] Необходимо также отметить, что, как используется в описании и прилагаемой формуле изобретения, единственное число включает множественное число обозначаемых объектов, если контекст ясно не указывает обратное. Например, ссылка на компонент в единственном числе предполагает включение множества компонентов.
[73] Термин "незаменимая аминокислота" относится к аминокислотам, которые не могут быть синтезированы в организме. У людей незаменимые аминокислоты включают изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин. Дополнительно, следующие аминокислоты также являются незаменимыми в определенных условиях - гистидин, тирозин и селеноцистеин.
[74] Термины "килокалория" (ккал) и "Калория" относятся к пищевой калории.
Термин "калория" относится к так называемой малой калории.
[75] Термин "больной" относится к человеку или животному, включая млекопитающих, таких как приматы (в частности, высшие приматы), овца, собака, грызуны (например, мышь или крыса), морская свинка, коза, свинья, кошка, кролик и корова.
[76] Термин "голодание" означает подвергание клетки или больного воздействию снижения или отсутствия питательных веществ.
[77] Термин "рак" относится к заболеванию или расстройству, характеризуемому неконтролируемым делением клеток и способностью этих клеток к распространению путем непосредственного роста в смежные ткани путем инвазии либо путем имплантации в отдаленные места при помощи метастазов. Примеры рака включают, но не ограничиваясь, первичный рак, метастатический рак, карциному, лимфому, лейкемию, саркому, мезотелиому, глиому, герминому, хориокарциному, рак предстательной железы, рак легкого, рак молочной железы, колоректальный рак, рак двенадцатиперстной кишки, рак мочевого пузыря, рак поджелудочной железы, рак эндометрия, рак яичников, меланому, рак мозга, рак яичек, рак почки, рак кожи, рак щитовидной железы, рак головы и шеи, рак печени, рак пищевода, рак желудка, рак кишечника, рак толстой кишки, рак прямой кишки, миелому, нейробластому, феохромоцитому и ретинобластому.
[78] В целом обнаружено, что кратковременное голодание (STS или лечебное голодание) выборочно препятствует росту опухолей и защищает нормальные клетки от токсичности химиотерапии, но сенсибилизирует к ней раковые клетки. Конкретные варианты осуществления способов и композиций для достижения этой цели изложены ниже. Хотя действие данного изобретения не ограничено никаким особым механизмом, защита, наблюдаемая в различных вариантах осуществления настоящего изобретения, представлена, отчасти, благодаря модулированию пути IGF-I и уровней глюкозы, без препятствования этому эффекту на раковые клетки (Дифференциальная Устойчивость к Стрессу, DSR). Основание для защитного действия лечебного голодания, по-видимому, базируется на способности к перераспределению энергии для защиты/сохранения от воспроизведения/роста, когда питательных веществ недостаточно, или они отсутствуют. Следует отметить, что долгосрочное диетическое ограничение вызывает гораздо более умеренное снижение IGF-I и глюкозы по сравнению с лечебным голоданием. Более того, в отличие от лечебного голодания, долгосрочное диетическое ограничение невыполнимо для большинства раковых больных, поскольку вызывает продолжительную потерю веса и является очень трудным для сохранения. Вместо этого в среднем примерно 62 часа лечебного голодания до и 24 часа после химиотерапии хорошо переносились раковыми больными, получавшими различное токсическое лечение.
[79] Следует также отметить, что онкогенные мутации, которые обычно находят на путях, связанных с клеточным ростом и ответом на стресс, предотвращают переключение на высокий уровень защиты в злокачественных клетках и продолжают способствовать росту или связанному с ростом состоянию даже во время лечебного голодания. Исследования на дрожжах и млекопитающих означают, что сенсибилизация злокачественных клеток к токсинам/окислителям может в значительной степени зависеть от типа онкогенных мутаций благодаря избытку про-ростовых путей из-за ингибирования вхождения в защитный режим, указывая, что большинство раковых клеток и типов рака не будут защищены в ответ на STS или низкий IGF-I.
[80] В варианте осуществления настоящего изобретения обеспечивается способ частичного снятия ракового роста или симптомов рака. Согласно настоящему варианту осуществления выявляется больной раком и затем ему обеспечивается первая диета в течение первого заранее определенного периода времени. Первая диета обеспечивает больному не более чем 50% нормального потребления калорий больного с по меньшей мере 50% килокалорий, полученных из жира, предпочтительно, мононенасыщенного жира. Нормальное потребление калорий больного, это такое число ккал, которое употребляет больной для сохранения его/ее веса. Нормальное потребление калорий больного может быть оценено путем опроса больного или путем обсуждения веса больного. В качестве приблизительного ориентира, нормальное потребление калорий больного составляет в среднем 2600 ккал/день для мужчин и 1850 ккал/день для женщин. В уточнении, первая диета обеспечивает больному от 700 до 1200 ккал/день. В особенно применимом уточнении первая диета обеспечивает больному мужчине среднего веса примерно 1100 ккал/день и больной женщине среднего веса 900 ккал/день. Как правило, первый заранее определенный период времени составляет примерно от 1 до 5 дней. В уточнении, первый заранее определенный период времени является 1 днем. Для установления правильного уровня жира в первой диете Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США рекомендует следующую диетологическую разбивку для типичной диеты с 2000 килокалорий в день: 65 грамм жира (примерно 585 килокалорий), 50 грамм белка (примерно 200 килокалорий), 300 грамм суммарных углеводов (примерно 1200 килокалорий). Таким образом, в одной из версий первой диеты, большинство калорий из углеводов и белков исключены.
[81] Таким образом, первая диета охватывает практически любой источник жира, источники жира с высоким содержанием ненасыщенного жира, включая источники мононенасыщенного и полиненасыщенного жира, являются особенно полезными (например, омега-3/6 незаменимые жирные кислоты). Подходящие примеры источников мононенасыщенной пищи включают, но не ограничиваясь, арахисовое масло, маслины, орехи (например, миндаль, пекан, фисташки, кешью), авокадо, семена (например, кунжутное), масла (например, оливковое, кунжутное, арахисовое, рапсовое) и т.д. Подходящие примеры источников полиненасыщенной пищи включают, но не ограничиваясь, грецкие орехи, семена (например, тыквы, подсолнечника), льняное семя, рыбу (например, лосось, тунец, скумбрию), масла (например, подсолнечное, соевое, кукурузное). Первая диета также включает компонент, отобранный из группы, состоящей из овощных экстрактов, минералов, омега-3/6 незаменимых жирных кислот и их комбинаций. В одном уточнении такой овощной экстракт обеспечивает эквивалент 5 рекомендованных ежедневных порций овощей. Подходящие источники овощного экстракта включают, но не ограничиваясь, китайскую капусту, капусту, салат, спаржу, морковь, ореховую тыкву, люцерну, зеленый горошек, томат, цветную капусту, свеклу. Подходящими источниками омега-3/6 жирных кислот являются рыба, такая как лосось, тунец, скумбрия, голубой тунец, рыба-меч, и тому подобное.
[82] Затем больному обеспечивают вторую диету в течение второго заранее определенного периода времени. Вторая диета обеспечивает больному не более чем 500 ккал/день. В уточнении вторая диета обеспечивает больному не более чем 200 ккал/день. Как правило, второй заранее определенный период времени составляет от примерно 2 до 7 дней. В особенно применимом уточнении второй заранее определенный период времени является 3 днями. В еще одном уточнении вторая диета включает компонент, отобранный из группы, состоящей из овощных экстрактов, минералов, омега-3/6 незаменимых жирных кислот и их комбинаций. В одном уточнении такой овощной экстракт обеспечивает эквивалент 5 рекомендованных ежедневных порций овощей. Подходящие источники овощного экстракта включают, но не ограничиваясь, китайскую капусту, капусту, салат, спаржу, морковь, ореховую тыкву, люцерну, зеленый горошек, томат, цветную капусту, свеклу. Подходящие источники омега-3/6 незаменимых жирных кислот включают рыбий жир из лосося, тунца, скумбрии, голубого тунца, рыбы-меч, и тому подобных.
[83] Эффективность первой и второй диет контролируется путем измерения ряда параметров больного. Например, желательно, чтобы сывороточная концентрация IGF-I снижалась на 25-90% к концу периода второй диеты. Также желательно, чтобы концентрация глюкозы в крови больного снижалась на 25-75% к концу периода второй диеты.
[84] В разновидности настоящего варианта осуществления больному обеспечивается третья диета в течение третьего заранее определенного периода времени. Третья диета является дополнением к нормальной диете больного. Характерно, что пополняющая композиция включает незаменимые аминокислоты, минералы и незаменимые жиры. Преимущественно, третья диета позволит больному восстановить нормальный вес и максимизировать силы. Как правило, третий заранее определенный период времени составляет, по меньшей мере, 5 дней. Пополняющая композиция может также факультативно включать ряд дополнительных компонентов. Например, пополняющая композиция может включать овощной экстракт. В одном уточнении такой овощной экстракт обеспечивает эквивалент 5 рекомендованных ежедневных порций овощей. Подходящие источники овощного экстракта включают, но не ограничиваясь, китайскую капусту, капусту, салат, спаржу, морковь, ореховую тыкву, люцерну, зеленый горошек, томат, цветную капусту, свеклу. Пополняющая композиция может также включать омега-3/6 незаменимые жирные кислоты и заменимые аминокислоты. Примеры подходящих заменимых аминокислот включают, но не ограничиваясь, гистидин, серии, таурин, тирозин, цистеин, глутамин, и их комбинации. Пополняющая композиция может также включать мультиминеральные таблетки, содержащие железо, цинк, медь, магний и кальций, и могут также содержать комплекс витамина В, включая витамин В12.
[85] В другом варианте осуществления обеспечивается способ сенсибилизации рака к химиотерапевтическим препаратам. Согласно настоящему способу, выявляется больной раком и затем ему обеспечивается первая диета в течение первого заранее определенного периода времени. Примеры рака, который является чувствительным к настоящему способу, включают, но не ограничиваясь, рак кожи, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак пищевода, рак предстательной железы, рак легких, рак матки, рак яичников, рак предстательной железы, глиому, меланому, нейробластому, и феохромоцитому. Первая диета обеспечивает больному не более чем 50% нормального потребления калорий больного с по меньшей мере 50% килокалорий, полученных из жира. Как правило, первый заранее определенный период времени составляет примерно от 1 до 5 дней. В уточнении, первый заранее определенный период времени является 1 днем. Как указано выше, первый диета охватывает практически любой источник жира с высоким содержанием ненасыщенного жира, особенно мононенасыщенного жира, предпочтительно. Подходящие примеры источников мононенасыщенной пищи включают, но не ограничиваясь, арахисовое масло, маслины, орехи (например, миндаль, пекан, фисташки, кешью), авокадо, семена (например, кунжутное), масла (например, оливковое, кунжутное, арахисовое, рапсовое) и т.д. Подходящие примеры источников полиненасыщенной пищи включают, но не ограничиваясь, грецкие орехи, семена (например, тыквы, подсолнечника), льняное семя, рыбу (например, лосось, тунец, скумбрию), масла (например, подсолнечное, соевое, кукурузное). Дополнительные детали первой диеты являются такими же, как указано выше.
[86] Вторая диета затем обеспечивается больному в течение второго заранее определенного периода времени. Вторая диета обеспечивает больному не более чем 500 ккал/день. В уточнении, вторая диета обеспечивает больному не более чем 200 ккал/день. Как правило, второй заранее определенный период времени составляет от примерно 2 до 7 дней. В особенно применимом уточнении второй заранее определенный период времени является 3 днями. Дополнительные детали второй диеты являются такими же, как указано выше.
[87] Химиотерапевтические средства вводят больному во время или после употребления второй диеты. Как правило, химиотерапевтическое средство вводится через 48-72 часа после второй диеты. Нетрудно отметить, что настоящий способ является эффективным практически с любым химиотерапевтическим средством. Примеры полезных химиотерапевтических средств включают, но не ограничиваясь, ДНК-алкилирующие средства, окислители, ингибиторы топоизомеразы и их комбинации. Конкретные примеры полезных химиотерапевтических средств включают, но не ограничиваясь, метилметансульфонат, циклофосфамид, этопозид и другие ингибиторы топоизомеразы, доксорубицин, цисплатин, карбоплатин и другие препараты на основе платины, гемцитабин, доцетаксел, или 5-ФУ.
[88] В разновидности настоящего изобретения больному впоследствии обеспечивается третья диета в течение третьего заранее определенного периода времени. Третья диета дополняет нормальное потребление калорий больного и включает пополняющую композицию. Характерно, что пополняющая композиция включает незаменимые аминокислоты. Пополняющая композиция может также включать природные источники незаменимых жирных кислот, витаминов и минералов, и мультиминеральные таблетки, содержащие железо, цинк, медь, магний и кальций, и может также содержать комплекс витамина В, включая витамин В12.
[89] Как указывалось выше, третья диета вместе с нормальной диетой больного позволит больному восстановить нормальный вес и максимизировать силы. Как правило, третий заранее определенный период времени составляет, по меньшей мере, 5 дней и может продолжаться неограниченно. В уточнении третий заранее определенный период времени составляет от примерно 4 дней до примерно 14 дней. Неделя оценена как наиболее оптимальная для этой цели. Пополняющая композиция может также факультативно включать ряд дополнительных компонентов. Например, пополняющая композиция может включать овощной экстракт. В одном уточнении такой овощной экстракт обеспечивает эквивалент 5 рекомендованных ежедневных порций овощей. Подходящие источники овощного экстракта включают, но не ограничиваясь, китайскую капусту, капусту, салат, спаржу, морковь, ореховую тыкву, люцерну, зеленый горошек, томат, цветную капусту, свеклу. Пополняющая композиция может также включать омега-3/6 незаменимые жирные кислоты и заменимые аминокислоты. Примеры подходящих заменимых аминокислот включают, но не ограничиваясь, гистидин, серии, таурин, тирозин, цистеин, глутамин, и их комбинации. Дополнительные детали третьей диеты являются такими же, как указано выше.
[90] Способ настоящего варианта осуществления обеспечивает ряд терапевтических преимуществ. Например, способ позволяет предоставлять химиотерапевтическое средство больному в течение более длительного периода времени, чем обычная практика для химиотерапевтического средства, когда больному не предоставлялась первая диета и вторая диета. Это повышение продолжительности является результатом первой и второй диет, снижающих токсическое действие химиотерапевтических средств и/или делающих раковые клетки более восприимчивыми к химиотерапевтическим агентам, чем нормальные (т.е. нераковые) клетки. Для многих больных, защита организма первой и второй диетами позволяет вводить химиотерапевтическое средство в большем количестве, чем в протоколах лечения, не использующих первую и вторую диеты. Как правило, такие средства могут вводиться в количестве, которое, по меньшей мере, на 10% больше, чем количества, нормально переносимые больным. Однако дозы таких средств у некоторых больных могут повыситься от 10% до 40%. При таких сценариях больной может лечиться более агрессивно. В другом уточнении сенсибилизирующие рак первая и вторая диеты позволяют более низкое количество химиотерапевтического средства, чем нормальное количество, предоставляемое больному, сохраняя при этом близкий к оптимальному или улучшенный ответ. В таких условиях химиотерапевтические средства могут вводиться в количестве, которое, по меньшей мере, на 10% ниже, чем нормально вводимые количества. У некоторых больных дозы таких средств могут быть снижены от 10% до 40% для снижения нежелательной токсичности. Настоящий способ также позволяет продолжение химиотерапевтического лечения больных, проявляющих неприемлемые токсические побочные эффекты. В таких ситуациях больные, проявляющие симптом связанной с химиотерапией токсичности выявляются, и затем им обеспечивается первая, вторая и третья диеты в порядке и сроках, перечисленных выше. Преимущественно, настоящий способ также позволяет продолжить лечение больных, которых выявили как терминальных, и кто в противном случае прекратит лечение. В еще одной разновидности первая и вторая диеты вводятся во время продолжительного введения химиотерапевтических средств, например, 5-дневной обработки с 5-ФУ.
[91] В другом варианте осуществления настоящего изобретения обеспечивается способ сенсибилизации рака к радиационной терапии. Согласно настоящему способу выявляется больной раком и затем ему обеспечивается первая диета в течение первого заранее определенного периода времени. Примеры рака, который является чувствительным к настоящему способу, включают, но не ограничиваясь, рак кожи, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак пищевода, рак предстательной железы, рак легких, рак матки, рак яичников, рак предстательной железы, глиому, меланому, нейробластому, и феохромоцитому.
Первая диета обеспечивает больному не более чем 50% нормального потребления калорий больного с по меньшей мере 50% килокалорий, полученных из жира. Как правило, первый заранее определенный период времени составляет примерно от 1 до 5 дней. В уточнении, первый заранее определенный период времени является 1 днем. Как указано выше, первый диета охватывает практически любой источник жира с источниками с высоким содержанием ненасыщенного жира, особенно мононенасыщенного жира, предпочтительно. Подходящие примеры источников мононенасыщенной пищи включают, но не ограничиваясь, арахисовое масло, маслины, орехи (например, миндаль, пекан, фисташки, кешью), авокадо, семена (например, кунжутное), масла (например, оливковое, кунжутное, арахисовое, рапсовое) и т.д. Подходящие примеры источников полиненасыщенной пищи включают, но не ограничиваясь, грецкие орехи, семена (например, тыквы, подсолнечника), льняное семя, рыбу (например, лосось, тунец, скумбрию), масла (например, подсолнечное, соевое, кукурузное). Дополнительные детали первой диеты являются такими же, как указано выше.
[92] Вторая диета затем обеспечивается больному в течение второго заранее определенного периода времени. Вторая диета обеспечивает больному не более чем 500 ккал/день. В уточнении, вторая диета обеспечивает больному не более чем 200 ккал/день. Как правило, второй заранее определенный период времени составляет от примерно 2 до 7 дней. В особенно применимом уточнении второй заранее определенный период времени является 3 днями. Дополнительные детали второй диеты являются такими же, как указано выше.
[93] Радиационную терапию вводят больному во время или после употребления второй диеты. Как правило, радиационная терапия вводится через 48-72 часа после второй диеты.
[94] В разновидности настоящего изобретения больному впоследствии обеспечивается третья диета в течение третьего заранее определенного периода времени. Третья диета дополняет нормальное потребление калорий больного и включает пополняющую композицию. Характерно, что пополняющая композиция включает незаменимые аминокислоты. Пополняющая композиция может также включать природные источники незаменимых жирных кислот, витаминов и минералов, и мультиминеральные таблетки, содержащие железо, цинк, медь, магний и кальций, и может также содержать комплекс витамина В, включая витамин В12.
[95] Как указывалось выше, третья диета вместе с нормальной диетой больного позволит больному восстановить нормальный вес и максимизировать силы. Как правило, третий заранее определенный период времени составляет, по меньшей мере, 5 дней и может продолжаться неограниченно. В уточнении третий заранее определенный период времени составляет от примерно 4 дней до примерно 14 дней. Неделя оценена как наиболее оптимальная для этой цели. Пополняющая композиция может также факультативно включать ряд дополнительных компонентов. Например, пополняющая композиция может включать овощной экстракт. В одном уточнении такой овощной экстракт обеспечивает эквивалент 5 рекомендованных ежедневных порций овощей. Подходящие источники овощного экстракта включают, но не ограничиваясь, китайскую капусту, капусту, салат, спаржу, морковь, ореховую тыкву, люцерну, зеленый горошек, томат, цветную капусту, свеклу. Пополняющая композиция может также включать омега-3/6 незаменимые жирные кислоты и заменимые аминокислоты. Примеры подходящих заменимых аминокислот включают, но не ограничиваясь, гистидин, серии, таурин, тирозин, цистеин, глутамин, и их комбинации. Дополнительные детали третьей диеты являются такими же, как указано выше.
[96] В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечивается комплект лечебного питания для предоставления питания больному раком, который замедляет раковый рост и улучшает эффективность химиотерапевтических препаратов. Комплект лечебного питания разработан для предоставления соответствующих диетологических и калорийных потребностей по способам, перечисленным выше. Комплект лечебного питания включает первый компонент питания, второй компонент питания и пополняющую композицию. Первый компонент питания обеспечивает диетологические компоненты первой диеты, перечисленные выше. Первый компонент питания распределен на приемы пищи, которые обеспечивают больному раком не более чем 50% нормального потребления калорий больного с по меньшей мере 50% килокалорий, полученных из жира. Первый компонент питания находится в достаточном количестве, чтобы обеспечить приемы пищи в течение первого заранее определенного периода времени. В уточнении первый компонент питания также включает экстракты, эквивалентные 5 рекомендованным порциям овощей, а также омега-3/6 незаменимые жирные кислоты.
[97] Второй компонент питания обеспечивает диетологические компоненты второй диеты, перечисленной выше. Второй компонент питания распределен на приемы пищи, которые обеспечивают больному раком не более чем 500 ккал/день. Второй компонент питания находится в достаточном количестве, чтобы обеспечить приемы пищи в течение второго заранее определенного периода времени. Второй компонент питания также включает экстракты, эквивалентные 5 рекомендованным порциям овощей, а также минералы и омега-3/6 незаменимые жирные кислоты.
[98] Пополняющая композиция, по меньшей мере, частично, обеспечивает диетологические компоненты третьей диеты, перечисленной выше. Как правило, пополняющая композиция комбинируется с нормальной диетой больного для обеспечения больному отчасти нормального потребления калорий. Пополняющая композиция включает незаменимые аминокислоты. Пополняющая композиция представлена в достаточном количестве, чтобы обеспечить пополнение в течение третьего заранее определенного периода времени.
[99] Как указано выше, первый компонент питания характеризуется высоким содержанием жира. Хотя первый компонент питания охватывает практически любой источник жира, источники с высоким содержанием ненасыщенного жира, особенно источники мононенасыщенного жира, являются предпочтительными для минимизации потенциально вредного сердечно-сосудистого побочного действия жиров, в частности, у больных, которые сделают частым применение этой диеты. Подходящие примеры источников мононенасыщенной пищи включают, но не ограничиваясь, арахисовое масло, маслины, орехи (например, миндаль, пекан, фисташки, кешью), авокадо, семена (например, кунжутное), масла (например, оливковое, кунжутное, арахисовое, рапсовое) и т.д. Подходящие примеры источников полиненасыщенной пищи включают, но не ограничиваясь, грецкие орехи, семена (например, тыквы, подсолнечника), льняное семя, рыбу (например, лосось, тунец, скумбрию), масла (например, подсолнечное, соевое, кукурузное). Первый компонент питания также включает компонент, отобранный из группы, состоящей из овощных экстрактов, минералов, омега-3/6 незаменимых жирных кислот и их комбинации. В одном уточнении такой овощной экстракт обеспечивает эквивалент 5 рекомендованных ежедневных порций овощей. Подходящие источники овощного экстракта включают, но не ограничиваясь, китайскую капусту, капусту, салат, спаржу, морковь, ореховую тыкву, люцерну, зеленый горошек, томат, цветную капусту, свеклу. Подходящие источники омега-3/6 незаменимых жирных кислот включают рыбу, такую как лосось, тунец, скумбрию, голубой тунец, рыбу-меч и тому подобное.
[100] Как указано выше, второй компонент питания обеспечивает очень низкие ккал больному. В одном уточнении второй компонент питания включает компонент, отобранный из группы, состоящей из овощных экстрактов, минералов, омега-3/6 незаменимых жирных кислот и их комбинации. В одном уточнении такой овощной экстракт обеспечивает эквивалент 5 рекомендованных ежедневных порций овощей. Подходящие источники овощного экстракта включают, но не ограничиваясь, китайскую капусту, капусту, салат, спаржу, морковь, ореховую тыкву, люцерну, зеленый горошек, томат, цветную капусту, свеклу. Подходящие источники омега-3/6 незаменимых жирных кислот включают рыбу, такую как лосось, тунец, скумбрию, голубой тунец, рыбу-меч и тому подобное.
[101] Пополняющая композиция разработана так, что обычный вес и силы больного сохраняются (или восстанавливаются, если была потеря веса). В уточнении пополняющая композиция дополнительно включает экстракты, эквивалентные 5 порциям овощей, а также минералы и омега-3/6 незаменимые жирные кислоты. Следует отметить, что пополняющая композиция принимается с нормальной диетой, так что целевые вес и силы достигаются. Как правило, обычная диета обеспечивает нормальное потребление калорий больного, как указано выше.
[102] В разновидности лечебный комплект питания также включает инструкции для введения первого компонента питания, второго компонента питания и пополняющей композиции больному раком. Инструкция будет предоставлять подробности, изложенные выше относительно способов. В одном уточнении инструкции устанавливают, что первый компонент пищи обеспечивается больному в течение первого заранее определенного периода времени, как установлено выше. Как правило, первый заранее определенный период времени составляет примерно от 1 до 2 дней. В уточнении первый заранее определенный период времени является 1 днем. Инструкции также устанавливают, что второй компонент пищи принимается в течение второго заранее определенного периода времени, как указано выше. Как правило, второй заранее определенный период времени составляет от примерно 2 до 7 дней. В особенно применимом уточнении второй заранее определенный период времени является примерно 3 днями. Инструкции также устанавливают, что пополняющая композиция принимается с нормальной диетой и, в частности, достаточным количеством дополнительных продуктов питания, которые сохраняют или восстанавливают вес и силы больного. Как правило, третий заранее определенный период времени составляет, по меньшей мере, 5 дней. В уточнении третий заранее определенный период времени составляет от примерно 4 дней до примерно 14 дней. Обнаружено, что неделя почти оптимальна для этой цели.
[103] В разновидности настоящего варианта осуществления лечебный комплект питания упакован в контейнер (например, коробку). В уточнении каждый из первого компонента питания и второго компонента питания распределен на ежедневные порции с указывающей маркировкой. В дополнительном уточнении каждая ежедневная порция дополнительно распределена на три принятия пищи. Как правило, каждое принятие пищи будет комбинацией твердой пищи, коктейля и супа (день 1) и только супа и коктейля для 2, 3 и 4 дней (3 приема пищи/день). Каждый комплект будет также содержать таблетки с незаменимыми жирными кислотами, минералами и витаминами и/или овощными экстрактами. Коробка будет также содержать недельный запас дополняющей диеты, которая будет в форме таблеток. В целом, неприродные источники любого элемента во всех компонентах диеты минимизированы.
[104] Следующие примеры иллюстрируют различные варианты осуществления настоящего изобретения. Специалистам в данном уровне техники будут понятны многие разновидности в пределах духа настоящего изобретения и в объеме данной формулы изобретения.
Эксперимент 1
[105] Описаны десять случаев, в которых больные с различными диагностированными злокачественными новообразованиями добровольно голодали до (48-140 часов) и/или после (24-56 часов) химиотерапии. Никто из этих 10 больных, получивших в среднем 4 цикла химиотерапии в комбинации с лечебным голоданием, не сообщал о значительных побочных эффектах, вызванных собственно лечебным голоданием, кроме голода. Токсичность, оцененная на основе Общих Критериев Токсичности (СТС) Национального института рака (NCI) и самостоятельно оцененных побочных эффектов пяти больных, указывает, что лечебное голодание может защищать от усталости, слабости и желудочно-кишечных побочных эффектов. У тех больных, у кого можно было наблюдать прогрессирование рака, лечебное голодание не предупреждало зависимое от химиотерапии снижение массы опухоли или опухолевых маркеров. Хотя необходимы контролируемые клинические испытания для определения роли лечебного голодания в улучшении клинических последствий и качества жизни больного, 10 случаев, представленных здесь, означают, что лечебное голодание в комбинации с химиотерапией является осуществимым, безопасным и имеет потенциал для расширения существующей химиотерапии.
[106] Сообщены десять случаев больных с диагностированными различными типами рака, добровольно голодавших до и после химиотерапии. Результаты, представленные на основе самостоятельной оценки последствий для здоровья и показаний крови, предполагают, что лечебное голодание является безопасным и может снижать множественные побочные эффекты, вызванные химиотерапией, без предотвращения убийства раковых клеток.
Случай 1:
[107] 51-летняя женщина белой расы с диагностированной IIА стадией рака молочной железы, которой рекомендовали адъювантную химиотерапию с доцетакселом (DTX) и циклофосфамидом (CP). Она голодала до первого введения химиотерапии. Режим лечебного голодания состоял из полного лишения калорий в течение 120 часов до и 60 часов после химиотерапии (всего 180 часов), во время которых она потребляла только воду и витамины. Больная завершила это длительное лечебное голодание без значительных неудобств и потеряла 7 фунтов, которые были восстановлены в конце лечения (Фигура 1H). После цикла лечебного голодания - химиотерапии, больная испытала легкую усталость, сухость во рту и икоту (Фигура 2); тем не менее, она была способна выполнять свою ежедневную деятельность (работа до 12 часов в день). В противоположность, в последующих циклах химиотерапии (второй и третий), она получала химиотерапию без лечебного голодания и жаловалась на усталость от умеренной до сильной, слабость тошноту, боль в животе и диарею (Фигура 2). На этот раз побочные эффекты заставили ее отказаться от своего регулярного рабочего графика. Для 4-го и последнего цикла она решила голодать еще раз, однако в другом режиме, который состоял из лечебного голодания 120 часов до и 24 часов после химиотерапии. Примечательно, ее самостоятельно оцененные побочные эффекты были ниже, не смотря на ожидаемые кумулятивные повреждения тканей от предыдущих циклов. Соответственно, показания анализов крови подтвердили, что лечебное голодание может иметь благоприятное действие для защиты клеток крови. Сумма белых клеток крови (WBC) и абсолютный индекс нейтрофилов (ANC) показали небольшой, но последовательный прирос в нижнем уровне, когда химиотерапии предшествовало лечебное голодание (Фигура 1А, С; Таблица 1). Более того, было отмечено, что уровни тромбоцитов не падали, но оставались стабильными или повышались во время 1-го и 4-го циклов, соответственно, при циклах лечебного голодания - химиотерапии (Фигура 1D). Интересно, что после 4-го цикла химиотерапии в комбинации с 144-часовым голоданием, ANC, WBC, и индекс тромбоцитов достигли самого высокого уровня с начала химиотерапии 80 днями ранее (Фигура 1A, С и D). В целом, лабораторные значения и обследование на основе СТС означают, что лечебное голодание было безопасным и может предоставлять защиту против токсических побочных эффектов химиотерапии у этой больной.
Случай 2:
[108] 68-летний мужчина белой расы, которому диагностировали в феврале 2008 года аденокарциному пищевода. К моменту диагноза на СТ-РЕТ скане была обнаружена метастаза в левый надпочечник в соответствии с IV стадией заболевания. Первоначальным лечением был 5-фторурацил (5-ФУ) в комбинации с цисплатином (CDDP). Одновременно с этой химиотерапией он также получал локализованное облучение в течение первых двух циклов. В течение этого периода больной испытал множественные побочные эффекты, включая повреждающую слабость, заметную усталость, интенсивную рвоту и значительную периферическую невропатию (Фигура 3). Дополнительно, больной жаловался на интенсивную дисфагию, вторичную по отношению к поражению мукозитом, скорее всего вызванному радиационной обработкой. Во время третьего цикла введение 5-ФУ было отменено из-за сильной тошноты и не поддающейся лечению рвоты (Фигура 3). Не смотря на агрессивный подход с химиотерапией и облучением, его заболевание прогрессировало. Развитие новых метастазов в правом надпочечнике, нижней доле правого легкого, левой части крестца и в клювовидном отростке были показаны при новом СТ-РЕТ, проведенном в августе 2008. Это побудило к увеличению его режима химиотерапии (4-й цикл). Карбоплатин (CBDCA) в комбинации с DTX и 5-ФУ (5-ФУ вводили в течение 96 часов). Больной включил 72-часовое до и 51-часовое пост-химиотерапевтическое лечебное голодание во время 4-го цикла. Основанием для 51 часа пост-химиотерапевтического лечебного голодания была защита против продолжающегося введения 5-ФУ. Больной потерял приблизительно 7 фунтов, 4 из которых были восстановлены во время первых нескольких дней возобновления нормальной диеты (данные не показаны). Хотя три химиотерапевтических средства были использованы в комбинации во время этого цикла, показанные самостоятельно оцененные побочные эффекты были стабильно ниже, чем при ad lib. циклах химиотерапии (Фигура 3). Перед его 5-й химиообработкой больной решил голодать снова. Вместо получения инфузии 5-ФУ в течение 96 часов, как он делал ранее, такая же доза препарата вводилась в течение 48 часов, и режим лечебного голодания был также модифицирован на 48 часов до и 56 часов после доставки препарата. Интересно, что там были не только низкие самостоятельно оцененные побочные эффекты, но также обнадеживающий клинический ответ, подтвержденный на скане СТ-РЕТ. Снижение стандартного значения поглощения (SUV) основной массы пищевода, метастазы надпочечника и узелка в правой нижней доле легкого были показаны на сканах. Для 6-го, 7-го, 8-го цикла больной голодал до и после химиотерапевтических обработок (Таблица 3). Несмотря на ожидаемую кумулятивную токсичность, большинство побочных эффектов были снижены с помощью лечебного голодания, за исключением легкой диареи и спазмов живота, развившихся во время 7-го цикла химиотерапии. Это был очень агрессивный рак, и, несмотря на хорошо переносимую химиотерапию, заболевание больного прогрессировало, и больной скончался в феврале 2009 года.
Случай 3:
2
2
2
[109] 74-летний мужчина белой расы, которому диагностировали в июле 2000 года двустороннюю аденокарциному предстательной железы, индекс Глиссона 7 и уровень PSA 5,8 нг/мл. Простатэктомию выполнили в сентябре 2000 года, что привело к нерегистрируемым уровням PSA до января 2003 года, когда он повысился до 1,4 нг/мл. Лейпролида ацетат вместе с бикалутамидом и финастеридом были прописаны. Однако введение этих препаратов пришлось приостановить в апреле 2004 года из-за сильных побочных эффектов, связанных с потерей тестостерона. Различные препараты, включая трипторелинпамоат, нилутамид, талидомид, CP и кетоконазол были использованы для контроля данного заболевания. В 2007 году уровень PSA больного достиг 9 нг/мл и новые метастазы были обнаружены во время сканирования костей скелета. DTX при 25 мг/мвводили на еженедельной основе, но уровни PSA продолжали повышаться, достигая 40,6 нг/мл (данные не показаны). Бевацизумаб был добавлен к лечению и только тогда PSA значительно упал (данные не показаны). Последовательно, новое сканирование костей показало общее улучшение. На протяжении циклов химиотерапии пациент испытал значительные побочные эффекты, включая усталость, слабость, металлический привкус во рту, головокружение, забывчивость, ухудшение краткосрочной памяти и периферическую невропатию (Фигура 5). После прекращения химиотерапевтических обработок его PSA быстро повысился. DTX при 75 мг/м в 3-недельном цикле был избран режимом, и снова больной страдал от значительных побочных эффектов (Фигура 5). В июне 2008 года химиотерапию прекратили. Больной был зачислен в фазу III клинических испытаний абиратерон ацетата, препарата, который способен выборочно блокировать CYP17, микросомальный фермент, катализирующий серию реакций, необходимых для внегонадного биосинтеза андрогенов (Derek Raghavan и Eric A. Klein J.С.О 2008). Во время испытаний уровни PSA больного повысились до 20,9 нг/дл (Фигура 4Н), что побудило возобновить химиообработку. На этот раз больной решил голодать до химиотерапии. Его режимы лечебного голодания были в основном 60 часов до и 24 после введения препарата (Таблица 3). Уровень PSA упал сразу же после перезапуска обработки химиотерапии - лечебного голодания (DTX 75 мг/м), и, примечательно, больной сообщил о значительно меньших побочных действиях, чем в предыдущих циклах ad lib. химиотерапии (Фигура 5). В соответствии с опытом больного показания крови были последовательно стабильными и оставались в пределах нормы на протяжении всей обработки (Фигуры 4A-G). Во время последних трех циклов, кроме лечебного голодания, больной получал тестостерон (1% крем) в течение пяти дней до химиотерапии. Как следствие, уровень PSA вместе с уровнем тестостерона резко повысился. Тем не менее, 3 цикла комбинированной химиотерапии с лечебным голоданием снизили PSA с 34,2 до 6,43 нг/мл (Фигура 4Н). Эти результаты не поддерживают возможность того, что лечебное голодание может предоставлять частичную защиту раковым клеткам.
Случай 4:
2
2
[110] 61-летняя женщина белой расы, которой диагностировали в июне 2008 года слабо дифференцированную немелкоклеточную карциному легкого (NSCLC). Масса, первоначально видимая на сканировании СТ, оказалась гиперметаболической при исследовании PET (июнь 2008), коррелируя с результатами биопсии. На том же РЕТ-сканировании было показано широко распространенное метастатическое заболевание в множественных медиастинальных и прикорневых лимфатических узлах левого легкого. Также были обнаружены метастазы в кости, печень, селезенку, и поджелудочную железу. Первоначальное лечение началось с введения DTX 75 мг/м и CBDCA 540 мг/м каждые 21 день. Хотя она была на нормальной диете, во время первых 5 циклов она теряла в среднем по 4 фунта после каждой химиообработки; скорее всего, из-за токсичности химиотерапии. Больная сообщила, что ей понадобилось приблизительно три недели, чтобы вернуть свой первоначальный вес. Среди испытанных побочных эффектов она жаловалась на сильные мышечные спазмы, невропатию нижних конечностей, значительную усталость, язвы рта и языка, легкие синяки и дискомфорт кишечника (Фигура 7). Во время 6-го цикла, который состоял из тех же препаратов и дозировок, больная голодала в течение 48-часов до и 24-часов после химиотерапии. Во время этого периода она потеряла приблизительно 6 фунтов, которые восстановила за 10 дней (данные не показаны). Кроме умеренной усталости и слабости, больная не жаловалась ни на какие другие побочные эффекты, которые она испытала в течение пяти предыдущих циклов (Фигура 7). Отметим, что кумулятивные побочные эффекты, такие как периферическая невропатия, выпадение волос или ухудшение краткосрочной памяти, не могут быть обращены вспять лечебным голоданием, когда они развились. В противоположность, острые токсические побочные эффекты успешно избегались, когда химиотерапию вводили в условиях лечебного голодания (Фигура 7). После 6-го и последнего цикла больная сообщила, что ее энергия быстро восстановилась для прогулки 3 мили всего через три дня после введения препарата. Никаких значительных различий не наблюдалось в анализе крови больной (Фигура 6A-G). Последнее радиологическое исследование (PET), выполненное в феврале 2009, показало стабильное заболевание в основной массе (нижняя доля левого легкого), и снижение поглощения радиоактивной метки в селезенке и печени при сравнении с их исходным исследованием.
Случай 5:
[111] Больная 74-летняя женщина с диагностированной в 2008 на IV стадии папиллярной серозной карциномой матки. Рекомендовали операцию (TAH-BSO) в сопровождении адъювантной химиотерапии. Дополнительно, тазовый, периаортальный и верхней полой вены лимфатические узлы были удалены. И наконец, из-за значительного увеличения правого мочеточника правосторонняя нефрэктомия также была выполнена. Шесть циклов CBDCA (480 мг) и паклитаксела (280 мг) вводили каждые 21 день. Во время первого лечения у больной была нормальная диета, и она испытала утомляемость, слабость, выпадение волос, головные боли и жаловалась на желудочно-кишечный дискомфорт (Фигура 8). В противоположность, во время цикла 2-6 больная голодала до и после введения препарата и сообщила о снижении побочных эффектов, развившихся после химиотерапии (Таблица 3; Фигура 8). В соответствии с другими сообщениями, лечебное голодание не мешало зависимому от химиотерапии убийству раковых клеток, подтвержденному снижением на 87% опухолевого маркера СА-125 после 4-го цикла (данные не показаны).
Случай 6:
2
2
[112] Больная 44-летняя белая женщина с диагностированной массой правого яичника (10×12 см) в июле 2007 года. Операция (TAH-BSO) была проведена. Опухоль не показала инвазии в капсулу яичника и 30+ удаленные лимфатические узлы были отрицательные. Ее заболевание оценили как стадия IA карциносаркомы яичника. Начальное развернутое лечение составило курс шести циклов ифосфамида и CDDP, которые больная получила с июля по ноябрь 2007 года. Ее первое сканирование СТ, выполненное в январе 2008 года, не показало заболевание вне яичника. Семь месяцев спустя MRI выявило множественные новые легочные узелки. Этот вывод был подтвержден сканированием СТ, где более чем 20 новых узелков были визуализированы в легких наряду с некоторыми отклонениями (сниженная плотность изображения =MTS?) в области селезенки и дегенеративные изменения в позвоночнике. На основе этих результатов новый режим препаратов, включая таксол, карбоплатин и авастин, был избран. Инфузию начали в августе 2008 года и выполняли с 3-недельным графиком. Одновременно больной добавили высокую дозу витамина С (50 мг/день). В сентябре 2008 года новый анализ СТ сканирования показал заметное снижение размера и количества множественных рассеянных двусторонних легочных узелков. К ноябрю, однако, СТ скан показал, что один из главных узелков увеличился с 0,5 до 0,8 см, указывая на прогрессирование заболевания. Новое лечение, состоявшее из гемцитабина на первый день с последующим гемцитабином и доцетакселом на восьмой день, было прописано. Однако после первого введения гемцитабина в полной дозе (900 мг/м), больная испытала длительную нейтропению (Фигура 9А) и тромбоцитопению (Фигура 9D), что вынудило приостановить последующее лечение. Во время второго цикла больная получала сниженную дозу гемцитабина (720 мг/м), но снова развилась длительная нейтропения и тромбоцитопения, что усложнило завершение первоначального графика. До третьего цикла больная голодала в течение 62 часов до и 24 часа после химиотерапии. Больная не сообщила о побочных эффектах вне зависимости от того, голодала она или нет, но интересно, что анализ крови показал заметное улучшение во время лечебного голодания-химиообработок (Фигура 10). Была отмечена тенденция, при которой нижний уровень был чуть менее выраженным и верхний уровень был значительно выше у количества ANC, лимфоцитов и WBC (Фигура 9А, В, С, соответственно; Таблица 2). Дополнительно, один гемцитабин во время 1-го и 2-го химиоциклов приводил к быстрому и резкому снижению индексов тромбоцитов, восстановление которых заняло 11 и 12 дней, соответственно (Таблица 2). Однако количества тромбоцитов не падали, но даже повышались после первой комбинированной обработки лечебное голодание - гемцитабин (3-й цикл) (Фигура 9D). Низший уровень тромбоцитов достиг самого низкого уровня по сравнению с предыдущими, только химиообработками, что можно объяснить аддитивным действием трех химиотерапевтических средств (Фигура 9D; Таблица 2). Тем не менее, наивысший уровень и время для восстановления нормального уровня были более выраженными и короткими, соответственно, в течение лечебного голодания-химиообработки по сравнению с одной химиообработкой (Фигура 9D; Таблица 2). Это значительное улучшение и более быстрое восстановление тромбоцитов после многократного лечебного голодания/химиотерапии не только позволили больной завершить ее химиолечение, но также означают, что эта стратегия может оказывать защитное действие на предшественники клеток крови, обеспечивая более быстрое восстановление популяции тромбоцитов и гранулоцитов.
Случай 7:
[113] 66-летний мужчина белой расы, которому диагностировали в июле 1998 года аденокарциному предстательной железы, индекс Глиссона 8. Исследование ProstaScint, выполненное в том же году, показало положительное поглощение радиоактивной метки в правых подвздошных узлах в соответствии со стадией заболевания D1. В 1998 году больной получил лейпролида ацетат и бикалутамид в первый раз. В сентябре 1999 года эти препараты исчезли, и он был переведен на финастерид. В декабре 2000 года СТ сканирование намекнуло на локальное прогрессирование заболевания. Он начал второй цикл с лейпролида ацетатом и также получил брахитерапию с высокой мощностью дозы (HDR) и наружную дистанционную лучевую терапию с модуляцией интенсивности (IMRT). Дополнительное лечение с многочисленными препаратами, такими как бикалутамид, трипторелинпамоат и нандролон, применяли для контроля заболевания. Однако его уровень PSA быстро повышался каждый раз, когда лечение останавливали. В апреле 2008 года сканирование Combidex обнаружило массу 3×5 см в тазу и левый гидронефроз; в июне того же года новый рецидив PSA наряду с новым сканированием СТ, которое дополнительно подтвердило массу в левой подвздошной области, побудил к лечению с DTX. Больной решил голодать 60-66 часов до и 8-24 часа после химиотерапии (Таблица 3). Во время лечебного голодания больной испытывал легкое головокружение и значительное падение кровяного давления, но самостоятельно оцененные побочные эффекты после химиотерапии были практически несуществующими за исключением умеренных дрожащих ощущений в ногах, развившихся после семи последовательных циклов DTX (Фигура 12). При анализе показателей больного было обнаружено, что ANC, WBC, уровни тромбоцитов и лимфоцитов сохранялись в нормальном диапазоне, тогда как красные клетки крови и связанные с ними параметры (гематокрит и гемоглобин) нет (Фигуры 11A-G). Это означает, что некоторые клетки крови могут получать пользу от зависимой от лечебного голодания защиты, тогда как другие не могут. Наконец, уровни PSA на протяжении циклов показывали последовательную тенденцию к снижению, поддерживая мысль, что лечебное голодание не мешало убийству клеток рака предстательной железы (Фигура 11Н).
Случай 8:
[114] 53-летняя женщина белой расы, больная, которой диагностировали стадию IIА рака молочной железы (HER2+). После лимфэктомии, выполненной в 2008 году больную подвергли 4 циклам химиотерапии с графиком каждый 21 день. Режим включал DXT (75 мг/м) и CP (600 мг/м). На протяжении 4 циклов больная голодала 64 часа до и 24 часа после введения химиотерапии. Сообщенные побочные эффекты включали умеренную слабость и умеренное нарушение краткосрочной памяти (Фигура 13).
Случай 9:
[115] 48-летняя женщина белой расы, больная с диагностированным раком молочной железы, которой была рекомендована адъювантная химиотерапия. Ее режим химиотерапии состоял из 4 циклов доксорубицина (DXR) (110 мг) в комбинации с CP (1100 мг) с 21-дневным графиком с последующим паклитакселом и трастузумабом на еженедельной основе в течение 12 недель. До ее первого химиотерапевтического лечения больная голодала в течение 48 часов и не сообщила о неблагоприятном воздействии. Во время второго цикла больная включила 60 часов лечебного голодания до химиотерапии с последующими 5 часами после введения препарата. Интересно, она не выразила трудностей в следующем лечебном голодании. Хотя она испытала потерю волос и умеренную слабость, больная не страдала от других обычно сообщаемых побочных эффектов химиотерапии (Фигура 14).
Случай 10:
2
[116] 78-летняя женщина белой расы с диагностированным RЕR2-позитивным раком молочной железы. На основании диагноза и после осложненного удаления опухоли молочной железы больную подвергли общей мастэктомии. Шесть циклов адъювантной химиотерапии с CBDCA 400 мг (AUC=6), DTX (75 мг/м), дополненной G-CSF (Neulasta) и с последующими 6 месяцами трастузумаба были прописаны онкологами (Таблица 3). На протяжении химиотерапевтических обработок больная голодала до и после введения препарата. Хотя больная выбрала изменение режима лечебного голодания, не было испытано серьезных побочных эффектов (Фигура 16; Таблица 3). Более того, показатели крови для WBC, ANC, уровней тромбоцитов и лимфоцитов были в пределах нормальных уровней (Фигура 15A-D) на протяжении лечения.
[117] Самостоятельно описанные оценки всех 10 больных были получены для определения тяжести испытанных побочных эффектов. Поскольку многие из химиотоксических побочных эффектов являются кумулятивными, данные обследования сравнивали, включая все комбинированные с лечебным голоданием и без лечебного голодания, связанные с химиотерапией побочные эффекты (Фигура 17А). Токсичность оценивали на основании общих критериев токсичности Национального института рака. Обнадеживает, что лучшие результаты самостоятельно оцененного здоровья были направлены всеми больными, даже если циклы химиотерапии-лечебного голодания были главным образом проведены в поздней части терапии. Тошнота, рвота, диарея, боль в животе, язвы рта практически отсутствует в сообщениях всех 10 больных, всякий раз, когда вводили циклы химиотерапии-лечебного голодания, тогда как, по меньшей мере, один из этих симптомов сообщен 5 из 6 ad lib. питавшихся больных (Фигура 17А). Четверо больных, которые всегда голодали в комбинации со всеми химиообработками, сообщили о низкой тяжести большинства побочных эффектов (Фигуры 12, 13, 14, 16). Только умеренная слабость и выпадение волос были сообщены многими больными. Для 6 больных, которые получали химиотерапию в связи с лечебным голоданием или ad lib. диетой, тяжесть самостоятельно оцененных побочных эффектов была определена при рассмотрении только двух ближайших циклов химиотерапии, в которых больной голодал или нет. Существовало общее и главное снижение тяжести многих самостоятельно оцененных побочных эффектов в комбинации с лечебным голоданием (Фигура 17В). В то время как симптомы, такие как усталость и слабость, были значительно снижены (р<0,001 и р<0,00193, соответственно), рвота и диарея никогда не испытывались в комбинации с лечебным голоданием, даже если эти циклы были последовательно проведены последними (Фигура 17В). Примечательно, что не было побочного эффекта, включенного в осмотр на основе СТС, чья средняя тяжесть повышалась при лечебном голодании (Фигура 17А, 17В).
[118] Результаты осмотра от маленькой и гетерогенной группы больных означают, что лечебное голодание является безопасным и хорошо переносимым раковыми больными и может улучшать множественные зависимые от химиотерапии побочные эффекты. Хотя систематическая ошибка оценки, вызванная субъективным фактором, может влиять на оценку побочных эффектов больным, тенденция к улучшению пост-химиотерапевтических показаний крови означает, что лечебное голодание может на самом деле защитить против различных химиотерапевтических препаратов. Примечательно, что лечебное голодание известно как защищающее дрожжи и мышей от различных токсинов и стрессов (Rafaghello, LPNAS 2008; Matsson, М. Annual Rev. Nutr. 2005) и поэтому защитный эффект против многих химиотерапевтических препаратов у людей не должен быть неожиданным.
Результаты
[119] Десять раковых больных, 7 женщин и 3 мужчины в среднем в возрасте 61 год (диапазон 44-78), получающие химиотерапию, представлены в данном исследовании. Четыре страдали раком молочной железы, два раком предстательной железы и четыре раком яичников, матки, немелкоклеточной карциномы легкого или аденокарциномы пищевода. Все больные добровольно голодали в течение в целом от 48 до 140 часов до и/или от 24 до 56 часов после химиотерапии под наблюдением их лечащих онкологов. Лечебное голодание хорошо переносилось во всех случаях. Голод и снижение кровяного давления были общими симптомами, упомянутыми больными после продолжительных периодов лечебного голодания.
Обсуждение
[120] Общие диетические рекомендации во время лечения рака основываются на всеобъемлющих целях предотвратить или обратить вспять недостаток питательных веществ, сохранить мышечную массу и минимизировать побочные эффекты, связанные с питанием (такие как сниженный аппетит, тошнота, изменения вкуса, или кишечные изменения) (Doyle, Nutrition and physical Activity During and After-Cancer Treatment (Питание и физическая активность во время и после лечения рака), 2006). В отличие от стандартных пост-химиотерапевтических диет, большинство больных в этой серии сообщили, что лечебное голодание является возможным и выгодным благодаря снижению побочных эффектов, таких как усталость, слабость, тошнота, рвота, спазмы живота. Незначительные жалобы возникали во время лечебного голодания, включая головокружение, голод, или головную боль, на уровне, который не мешал нормальной деятельности, включая работу.
[121] Потеря веса представляет значительное беспокойство для раковых больных.
Это может быть из-за самого рака, сниженного аппетита после химиотерапии или желудочно-кишечного повреждения. Примечательно, в данном отчете о случаях потеря веса во время лечебного голодания быстро восстанавливалась у большинства больных. Для больных, получавших химиотерапию с и без лечебного голодания, появившиеся химиотоксические побочные эффекты ослабевали во время циклов лечебного голодания-химиотерапии. Симптомы, которые улучшались от этого вмешательства, были, прежде всего, желудочно-кишечными и системными.
[122] В незлокачественных клетках измененные условия, такие как лечебное голодание/глюкозное голодание, стимулируют организм подавлять рост/воспроизводство и отвлекают его энергию в сторону сохранения/восстановления и максимизируют его шанс на выживание (Longo. Nature. 2005). Таким образом, факторы роста, такие как IGF-I, снижаются (Thiessen, J.P. Endocrine Rev. 1994; Stephen R. Spindler Annual review of nutrition 2007) и механизмы устойчивости к стрессу, такие как ответ разобщающих белков (UPR), включая белки теплового шока (HSP 70) и белки глюкозного ответа (GRP 78), повышаются (Mote, P.L. Mechanism Age Dev. 1998; Lee, A.S Trends in biochemical science 2001; Ramachandra K. Reddy J. of Biological. Chemistry 2003). Нормальные клетки будут отвечать на эти изменения, тогда как злокачественные клетки будут невосприимчивыми из-за самообеспеченности ростовыми сигналами (Hanahan. Hallmarks of cancer. 2000). Таким образом, лечебное голодание будет выборочно защищать нормальные клетки от токсичности химиотерапии без снижения активности препарата в раковых клетках.
[123] Хотя результаты являются пока предварительными только с 10 больными, они тем не менее обнадеживающие, поскольку большинство из побочных эффектов, представленных здесь, имеют кумулятивную модель и цикл химиотерапия-лечебное голодание проводили, в основном, в более поздней части лечения.
Таблица 1
Цикл#
Голодание (часы)
Химиотерапия
Ответ опухоли
Случай 1
1
140 до 40 после
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>+Циклофосфамид 600 мг/м<sup>2</sup>
н/о
4
120 до 24 после
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>+Циклофосфамид 600 мг/м<sup>2</sup>
н/о
Случай 2
4
72 до
Доцетаксел 64,6 мг/м<sup>2</sup>+карбоплатин 485 мг.
---
1
51 после
5
48 до 56 после
Доцетаксел 79 мг/м<sup>2</sup>+Карбоплатин 470 мг+5ФУ 2415,7 мг/м<sup>2</sup>
Стабильное заболевание на СТ/РЕТ
6
48 до
Доцетаксел 79 мг/м<sup>2</sup>+Карбоплатин 470 мг
Улучшение на СТ/РЕТ
56 после
+5ФУ 2415,7 мг/м<sup>2</sup>
Обращаться к тексту
7
48 до 56 после
Доцетаксел 79 мг/м<sup>2</sup>+Карбоплатин 470 мг+5ФУ 2415,7 мг/м<sup>2</sup>
---
8
48 до 56 после
Доцетаксел 79 мг/м<sup>2</sup>+Карбоплатин 470 мг+5ФУ 2415,7 мг/м<sup>2</sup>
Прогрессирование заболевания на СТ/РЕТ
Случай 3
5-12
60-66 до
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>
24 после
См. график PSA
Случай 4
6
48 до 24 после
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>+карбоплатин 540 мг
Стабильное заболевание на СТ/РЕТ Обращаться к тексту
Случай 5
2
36 до
Карбоплатин 480 мг+паклитаксел 280 мг
---
3-4
60 до
Карбоплатин 480 мг+паклитаксел 280 мг
87% падение СА 125, уменьшение лимфоузлов на СТ
5-6
60 до 24 после
Карбоплатин 480 мг+паклитаксел 280 мг
Случай 6
3
62 до 24 после
Гемцитабин 720 мг/м<sup>2</sup> (день 1)+GMZ 720 мг/м<sup>2</sup> (день 8)
---
4
62 до 24 после
Гемцитабин 720 мг/м<sup>2</sup> (день 1)+GMZ 720 мг/м<sup>2</sup> (день 8)
---
5-6
602 до 24 после
Гемцитабин 900 мг/м<sup>2</sup> (день 1)+GMZ 900 мг/м<sup>2</sup> Доцетаксел 100 мг/м<sup>2</sup> (день 8)
Стабильное заболевание на PET сканировании, нет новых MTS
Случай 7
1
65 до 8 после
Доцетаксел 60 мг/м<sup>2</sup>
См. график PSA
2-8
65 до st после *
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>
См. график PSA
Случай 8
1-4
64 до24 после **
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>
См. график PSA
Случай 9
1
48 до
Доксорубицин 110 МГ+Циклофосфамид 1100 мг
н/о
2-4
61 до 4 после
Доксорубицин 110 мг+Циклофосфамид 1100 мг
н/о
Случай 10
1
60 до
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>+карбоплатин 400 мг
н/о
2
48 до
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>+карбоплатин 400 мг
н/о
3
40 до 24 после
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>+карбоплатин 400 мг
н/о
4
48 до 24 после
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>+карбоплатин 400 мг
н/о
5
36 до 24 после
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>+карбоплатин 400 мг
н/о
6
20 до 20 после
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>+карбоплатин 400 мг
н/о
* также применялась низко гликемическая диета в течение 24 часов до голодания.** также применялась жидкая диета в течение 24 часов после голодания.
н/о=не имеет отношения, из-за того, что химиотерапия вводилась с адъювантом.
Таблица 2
Дни
Лечение
Лечебное голодание(ч)
G-CSF
WBC
ANC
PLT
до
после
Надир*
клетка/мкл
Восстановление**
Зенит
Надир*
клетка/мк
Восстановление**
Зенит
Надир*
клетка/мкл
Восстановление**
Зенит
--
--
(дни)
(дни)
клетка/ мкл
(дни)
(дни)
клетка/мк л
(дни)
(дни)
клетка/мк л
4
Гемцитаб ин(900 мг/м<sup>2</sup>)
ad Lib.
7
900
16
9000
7
400
16
7500
10
63
11
203
25
G-CSF
27
Гемцитаб лн (720
ad Lib.
--
--
5
700
2
9200
5
700
2
8100
9
59
12
177
Дни
Лечение
Лечебное голодание (ч)
G-CSF
WBC
ANC
PLT
мг/м<sup>2</sup>)
32
G-CSF
33
G-CSF
34
G-CSF
36
G-CSF
39
G-CSF
41
G-CSF
Дни
Лечение
Лечебное голодание (ч)
G-CSF
WBC
AN С
PLT
42
G-CSF
43
Гем цитаб ин(720 мг/м<sup>2</sup>)
62
24
--
5
700
5
7800
5
700
5
6400
--
--
48
G-CSF
49
G-CSF
50
G-CSF
51
G-CSF
53 1
Гемцитабин (720
62
24
--
4
1800
3
11800
4
1300
3
10700
8
27
10
280
Дни
Лечение
Лечебное голодание (ч)
G-CSF
WBC
ANC
PLT
мг/м<sup>2</sup>)Доцетаксел (80 мг/м")
54
G-CSF
67
Гемцитаб ин (720 мг/м<sup>2</sup>)
62
24
--
9
2700
5
21400
9
1600
2
18600
--
--
76
Гемцитаб ин (720 мг/м<sup>2</sup>)Доцетаксел (80 иг/м<sup>2</sup>)
62
24
--
--
--
--
--
8
38
6
286
Дни
Лечение
Лечебное голодание (ч)
G-CSF
WBC
ANC
PLT
78
G-CSF
91
Гемцитабин(720 мг/м<sup>2</sup>)
62
24
--
96
--
6
2300
1
16500
6
1500
1
15300
--
--
--
--
97 -
G-CSF
98
Гемцитабин(900 мг/м<sup>2</sup>) Цоцетакс гл (100 иг/м<sup>2</sup>)
62
24
6
2300
1
14600
6
1700
1
12800
7
16
7
250
Дни
Лечение
Лечебное голодание (ч)
G-CSF
WBC
AN С
PLT
99
G-CSF
112
Гемцитаб ин(900 мг/м<sup>2</sup>)
--
Таблица 3
Дни
Лечение
Лечебное голодание(ч)
WBC
ANC
До
После
Надир* (дни)
клетка/мкл
Восстановление**(дни)
Зенит клетка/мкл
Надир* (дни)
клетка/мкл
Восстановление**(дни)
Зенит клетка/мкл
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>+Циклофосфамид 600 мг/м<sup>2</sup>
140
40
15
1700
4
3900
15
561
4
2601
24
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>+Циклофосфамид 600 мг/м"
ad lib.
--
12
1200
6
4600
12
120
6
3036
45
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>+Циклофосфамид 600 мг/м<sup>2</sup>
ad lib.
--
12
1500
8
4100
12
216
8
2932
66
Доцетаксел 75 мг/м<sup>2</sup>+Циклофосфамид 600 мг/м<sup>2</sup>
120
24
--
--
--
5200
--
--
--
3567
Эксперимент 2
[124] Со ссылкой на Фиг.18, лечебное голодание сенсибилизирует злокачественные клетки к облучению. Мышиные клетки молочной железы (4Т1-luс) высевали на 96-луночные планшеты для клеточных культур (20000 клеток на лунку), и позволяли уравновеситься и достичь сплошного монослоя в течение 48 часов. Затем заменяли среду на низко- или высокоглюкозную среду за 48 часов до облучения (5 или 10 Гр; Фигуры 18А, 18В). Жизнеспособность определяли с помощью МТТ-теста (Фиг.18С). Статистический анализ проводили с помощью t-теста Стьюдента (N=60).
[125] Со ссылкой на Фиг.19, лечебное голодание сенсибилизирует злокачественные клетки к облучению. Клетки мышиной глиомы (GL26) высевали на 96-луночные планшеты для клеточных культур (20000 клеток на лунку), и позволяли уравновеситься и достичь сплошного монослоя в течение 48 часов. Затем заменяли среду на низко- или высокоглюкозную среду за 48 часов до облучения (5 или 10 Гр; Фигуры 19А, 19В). Жизнеспособность определяли с помощью МТТ-теста (Фиг.19С). Статистический анализ проводили с помощью t-теста Стьюдента (N=60).
5
3
[126] Со ссылкой на Фиг.20, STS (лечебное голодание) сенсибилизирует клетки рака молочной железы мыши к облучению и повышает контроль опухоли у мышей. Самкам мышей BALB/c весом 20-25 г подкожно вводили сингенные клетки рака молочной железы (4T1-luc; 2×10 клеток/мышь). На 13 день опухоль значительно прогрессировала до 300-500 мм, и начинали лечение путем лечебного голодания мышей за 48 часов до облучения (IR; 5 Гр). Второй цикл STS/IR (3 Гр) проводили через неделю. Статистический анализ с использованием t-теста Стьюдента проводили для каждого дня, *р<0,05.
5
3
[127] Со ссылкой на Фиг.21, STS (лечебное голодание) сенсибилизирует раковые клетки мышиной глиомы к облучению и повышает контроль опухоли у мышей. Самкам мышей C57BL/6 весом 25-30 г подкожно вводили сингенные раковые клетки глиомы (GL26; 3×10 клеток/мышь). На 27 день опухоль значительно прогрессировала до 500-1000 мм, и начинали лечение путем лечебного голодания мышей за 48 часов до облучения (IR; 7.5 Гр). Второй цикл STS/IR (3 Гр) проводили через неделю. Статистический анализ с использованием t-теста Стьюдента проводили для каждого дня, *р<0,05.
Эксперимент 3
[128] Проверяли гипотезу, что многие изменения энергетических источников, роста и других внеклеточных факторов, вызванные лечебным голоданием, не только мешают защите, но также способствуют сенсибилизации широкого разнообразия раковых клеток к химиотерапевтическим препаратам.
[129] Для исследования того, может ли лечебное голодание синергично улучшать токсичность химиотерапии, исследовали различные мышиные модели рака, используя клетки рака молочной железы мыши (4Т1), меланомы (В16), глиомы (GL26), и мышиной нейробластомы (NXS2, Neuro-2-а), а также человеческой нейробластомы (ACN). Кратковременное голодание (STS), или лечебное голодание, достигалось полным удалением пищи в течение 48-60 часов с сохраненным доступом к воде. Как ожидалось, химиотерапия, данная в условиях ad lib. диеты, тормозила рост подкожных опухолей (Фиг.22А-С). Примечательно, что два цикла исключительно лечебного голодания (по 48 часов каждый) были так же эффективны, как два цикла химиотерапевтического лечения. Похожие эффекты наблюдались у мышей, имевших подкожные разрастания меланомы (В 16 клетки), хотя эффект исключительно лечебного голодания не сохранялся после второго цикла (Фиг.22В), и также у мышей, имевших подкожные разрастания глиомы (GL26 клетки) (Фиг.22С). Лечебное голодание в глиомной модели применяли только однократно из-за необычайно быстрого роста опухоли в контрольной группе (ad lib., без химиотерапии). Самый большой терапевтический индекс наблюдался, когда лечебное голодание комбинировали с одним из наиболее часто используемых химиотерапевтических препаратов, доксорубицином (DXR) или циклофосфамидом (CP) (Фиг.22А-С). Для 4Т1 рака молочной железы в результате двух циклов лечебного голодания размер опухоли составил менее половины от того, который был в группе с исключительно CP лечением, даже спустя 20 дней после последнего лечения (Фиг.22А). Похожие эффекты наблюдались на моделях подкожной глиомы и меланомы (Фиг.22В-С). Причем потеря веса тела за время лечебного голодания обычно восстанавливалась в течение 3 дней после возобновления кормления даже после химиотерапевтического лечения (Фиг.23A-D), подтверждая, что лечебное голодание не обостряет воздействий опухолей и химиотерапии на потерю веса у мышей, что согласуется с наблюдениями в предварительном исследовании лечебного голодания и химиотерапии у больных.
[130] Действие лечебного голодания на химиотерапию исследовали на метастатических моделях, созданных внутривенной инъекцией клеток рака молочной железы мыши (4Т1), клеток меланомы (В16), и 2 клеточных линий нейробластомы (NXS2 и Neuro-2a) иммунокомпетентным мышам. Лечебное голодание усиливало действие химиотерапии и продлевало выживание всех мышиных моделей метастатического рака (Фиг.24-28). В метастатической модели меланомы мышей умерщвляли раньше для определения действия STS на метастазы. Интересно, что STS, комбинированное с DXR, вызывало снижение метастазирования клеток меланомы В16 в различные органы по сравнению с мышами, которые получали DXR в условиях нормального питания (Фиг.25). Например, метастазы в легких были обнаружены у 100% по сравнению с 65% мышей, которые получали DXR в условиях нормального питания и лечебного голодания, соответственно. Кроме того, в отличие от нормально питавшихся мышей, метастазы не были зарегистрированы в печени и селезенке голодавших мышей (Фиг.25).
[131] Для испытания действия многократных циклов лечебного голодания и химиотерапии на агрессивный метастатический рак контролировали выживание 2 метастатических мышиных моделей нейробластомы. Долговременного выживания (свыше 180 дней) достигли 42% мышей-носителей мышиной нейробластомы (NXS2), которые подверглись 2 циклам лечебного голодания с лечением высокой дозой DXR (16 мг/кг) (Фиг.26), по сравнению со 100% смертностью в ad lib. группе. Для моделирования запущенного метастатического рака клетки мышиной нейробластомы (Neuro-2a) внутривенно вводили мышам, и опухоли позволили распространиться в течение 9 дней до начала химиотерапии. Для испытания действия STS в комбинации со стандартной терапией на метастатическую модель нейробластомы лечебное голодание комбинировали с коктейлем высокодозной химиотерапии, основанной на широко используемом в лечении этого детского злокачественного новообразования (10 мг/кг DXR+8 мг/кг Цисплатин, CDDP). Удивительно, что в то время, как все мыши, подвергнутые лечению химиотерапевтическим коктейлем в комбинации с ad lib. диетой, погибли к 75 дню, 25% мышей, которые голодали в комбинации с химиотерапевтическим коктейлем, достигли долговременного выживания (свыше 300 дней) (Фиг.27). Для испытания того, может ли множество циклов лечебного голодания (STS) быть эффективным в замедлении прогрессирования нейробластомы в отсутствии химиотерапии, и также испытать их воздействия на модели человеческой опухоли, 5 циклов лечебного голодания были проведены у иммунодефицитных голых мышей с подкожной инъекцией клеток человеческой ACN нейробластомы (Фиг.29). Через 36 дней 5 циклов лечебного голодания были способны ограничить размер опухоли на половину от достигнутого у нормально питавшихся мышей (Фиг.29).
[132] Для моделирования лечебного голодания in vitro, раковые клетки инкубировали в среде, содержащей сыворотку, собранную у мышей, питавшихся ad lib. или голодавших в течение 48 часов. В соответствии с результатами на мышах, клетки рака молочной железы (4Т1), которые культивировали в среде с добавлением сыворотки от голодавших мышей, были сенсибилизированы одновременно к DXR и CP по сравнению с воздействием инкубации в сыворотке от мышей, питавшихся ad lib. (Фиг.30). Поскольку выраженное снижение глюкозы и факторов роста (например, 75% снижение фактора роста IGF-I) являются двумя ключевыми внеклеточными ответами на лечебное голодание, клетки инкубировали при различных концентрациях глюкозы и сыворотки, основанных на измерениях глюкозы в крови у нормально питавшихся и голодавших мышей (Фиг.31), т.е. инкубация при низкой глюкозе (0,5 г/л) с низкой сывороткой (1% FBS), или нормальной глюкозе (1,0 и 2,0 г/л для человеческих и мышиных клеточных линий, соответственно) с нормальной сывороткой (10% FBS) в течение 24 часов до и также во время лечения (Фиг.32). В соответствии с исследованиями in vivo, ограничение глюкозы и сыворотки сенсибилизировало 15 из 17 различных линий раковых клеток, включая клетки мышиной меланомы (В 16), глиомы (GL26), и рака молочной железы (4Т1) к DXR и/или CP (Фиг.32-34). Более того, снижение или только глюкозы, или только сыворотки также усиливало DXR и/или CP токсичность по отношению к раковым клеткам, но было не так эффективно, как их комбинация (Фиг.33, 34). Из множества факторов роста, вовлеченных в зависимое от лечебного голодания DSR, ранее сообщалось, что снижение IGF-I является ключевым изменением, и что инфузия IGF-I может обращать защиту мышей по отношению к химиотерапии. Здесь показано, что обработка IGF-I клеток 4Т1 и В16 также обращала сенсибилизацию раковых клеток к DXR, вызванную ограничением глюкозы, означая, что STS сенсибилизирует раковые клетки частично путем снижения IGF-I (Фиг.35).
[133] Для определения механизмов, ответственных за эту STS-зависимую сенсибилизацию, действие сниженной глюкозы на разрывы одиночных и двойных нитей ДНК в раковых клетках, подвергнутых химиотерапии, исследовали с применением кометного анализа. Глюкоза, которая является главным энергетическим источником для многоклеточных, особенно важна для злокачественных клеток, феномен, известный как эффект Варбурга, и повышенная глюкоза крови способствует повышенному раковому росту. Снижение глюкозы с ad lib. (2,0 г/л) до достигаемого после лечебного голодания (0,5 г/л) в комбинации с условием низкой сыворотки (1% FBS), также для имитации зависимого от лечебного голодания снижения в крови факторов роста и белков, повышает повреждение ДНК в большей степени, чем исключительно химиотерапия, и комбинация 0,5 г/л глюкозы и химиотерапии способствовала заметному 20-кратному повышению повреждений ДНК как в клетках рака молочной железы 4Т1 (Фиг.36А), так и в клетках меланомы В16 (Фиг.36В). Действие сниженной глюкозы, напротив, было аддитивным с таковым доксорубицина в лечении клеток глиомы GL26 (Фиг.36С).
[134] Для получения объективного взгляда на изменения генной экспрессии, происходящие в, раковых клетках в ответ на лечебное голодание, выполнялся полногеномный микроматричный анализ в опухолевых образованиях в сердце, мышцах, печени и подкожном образовании 4Т1 опухоли молочной железы у мышей, которые или голодали в течение 48 часов, или питались ad lib. диетой. Микроматричный анализ четко указал, что лечебное голодание неодинаково регулирует гены, вовлеченные в клеточную пролиферацию (Фиг.37). Кроме того, было обнаружено, что экспрессия генов трансляции и рибосомального биогенеза/сборки значительно повышалась в аутотрансплантатном раке молочной железы (4Т1), тогда как в нормальных тканях они была репрессированы или минимально задействованы (Фиг.38). В соответствии с этим повышением компонентов трансляции, Akt и S6K фосфориляция была повышена, a eIF2α фосфориляция была снижена в предварительно голодавших раковых клетках аутотрансплантатных опухолей (Фиг.39А), и также in vitro, особенно в комбинации с CP лечением (Фиг.39 В). Однако, несмотря на эту зависимую от голода активацию трансляционных механизмов, удвоение раковых клеток было значительно снижено in vitro (Фиг.40), что соответствовало замедлению прогрессирования опухоли при лечебном голодании in vivo (Фиг.36, 37). Трансляция тесно связана с продвижением клеточного цикла и клеточным ростом, и является дорогостоящим процессом, который потребляет 50-75% клеточной энергии в быстро делящихся клетках. Возможно, что опухоль 4Т1 пытается компенсировать недостаток питательных веществ, требуемых для роста, повышением трансляции и, как результат, потребляет еще большее количество энергии, ведущее к клеточной смерти.
[135] Поскольку известно, что транскрипционный фактор устойчивости к стрессу FOX03a инактивируется АКТ, эффект лечебного голодания на его экспрессию испытывали в 4Т1 образованиях и нормальной ткани. Обнаружено, что FOX03a неодинаково регулируется в ответ на лечебное голодание. Его экспрессия была значительно угнетена в опухолях, но индуцирована в нормальных органах (Фиг.41). Был также установлено действие лечебного голодания на другой главный транскрипционный фактор устойчивости к стрессу, ядерный фактор каппа В (NFkB), в аутотрансплантатной опухоли молочной железы (4Т1). RT-PCR показала неодинаковую экспрессию NFkB при лечебном голодании: его экспрессия была в значительной степени подавлена в опухолях, но высоко индуцирована в нормальных органах (Фиг.41). Среди защитных генов, чья экспрессия индуцируется NFkB, гемоксигеназа-1 (НО-1) является эволюционно консервативным ферментом, который высоко индуцируем в ответ на различные стимулы, включая UVA и оксидативный стресс. Обнаружено, что лечебное голодание подавляет экспрессию НО-1 в опухолях, но вызывает значительное повышение этой экспрессии в нормальных органах, что соответствует таковым FOX03a и NFkB (Фиг.41). t-тест Стьюдента; *Р<0,05, **Р<0,01, ***Р<0,001.
[136] Поскольку и FOX03a, и NFkB снижают оксидативный стресс посредством НО-1 и/или MnSOD, уровень активных форм кислорода (ROS) измерялся, используя окисление дигидроэтидия (DHE) в клетках 4Т1 в качестве способа оценки уровней супероксида при стандартных и STS условиях после лечения с CP (Фиг.42, 43). Более высокие уровни окисления DHE были зарегистрированы в раковых клетках после лечебного голодания/химиотерапии, означая повышенный оксидативный стресс и, возможно, уровни супероксида. Кроме того, обнаружено, что уровни каспазы-3 были повышены только в аллотрансплантатных опухолях после STS, но не в нормальных органах in vivo (Фиг.44А) и также in vitro (Фиг.44 В), в соответствии с действием окислителей в стимуляции апоптоза и с ролью НО-1 в ингибировании активности каспазы-3. Апоптоз, индуцированный ограничением глюкозы в раковых клетках, предполагалось, также был стимулирован аутофагией. Ограничение глюкозы при инкубации с низкой сывороткой повышало аутофагию в клетках 4Т1 (Фиг.45), но ингибирование аутофагии хлорохином дополнительно повышало клеточную смерть, указывая, что сниженная глюкоза не стимулирует клеточную смерть путем клеточной смерти, зависимой от аутофагии (Фиг.46).
[137] Для подтверждения роли НО-1 в зависимой от лечебного голодания
сенсибилизации к химиотерапии, НО-1 экспрессию индуцировали во время лечебного голодания, используя гемин, и обнаружили, что сенсибилизация может быть частично обращена (Фиг.47, 48). С другой стороны, ингибитор НО-1 протопорфирин цинка (ZnPP) сенсибилизировал раковые клетки к химиотерапии (Фиг.49, 50). Вместе эти исследования указывают, что сниженная экспрессия НО-1 является частью механизма, ответственного за зависимую от лечебного голодания сенсибилизацию клеток рака молочной железы 4Т1.
[138] Таким образом, показано, что значительное снижение глюкозы, 1GF-I, и, возможно, многие другие известные изменения, происходящие в ответ на голод/лечебное голодание в культурах клеток и у мышей, приводят к задержке роста и значительному повышению клеточной смерти у широкого диапазона опухолевых клеток (Фиг.51), особенно в комбинации с химиотерапией. Эти результаты означают, что многократные циклы лечебного голодания имеют возможность обеспечить как защиту пациента, так и сенсибилизационные воздействия на рак в терапии рака.
Способы
Клеточные культуры
2
[139] Клетки рака молочной железы мыши 4Т1-luс были приобретены у SibTech (Brookfield, СТ). Клетки мышиной меланомы В1 6-fluc были предоставлены Noah Craft (UCLA). Клетки мышиной глиомы GL26, человеческой глиобластомы U87-MG были предоставлены Thomas Chen (USC). Клетки человеческого рака предстательной железы РС3 и 22RV1 были предоставлены Pinchas Cohen (UCLA). Клетки человеческого рака молочной железы MCF-7 и С42В и клетки человеческого рака шейки матки HeLa были предоставлены Amy Lee (USC). Клетки человеческого рака толстой кишки LOVO были предоставлены Darryl Shibata (USC). Клетки мышиной нейробластомы NXS2 и Neuro-2a, человеческой нейробластомы ACN и SH-SY5Y, человеческой карциномы яичников OVCAR, человеческой меланомы MZ-MEL, А431 плоскоклеточного рака выращивали по стандартной методике в лаборатории онкологии Института Гаслини. Клетки 4Т1 были устойчиво трансфицированы LC3-GFP, который был любезно предоставлен Jae Jung из USC, для исследований аутофагии. Все клетки поддерживали по стандартной методике в DMEM 10% FBS при 37°С, 5% СO. Для ингибирования аутофагии клетки были обработаны 5 мкМ хлорохина (CQ) в течение 48 часов во время in vitro STS. Для модулирования активности НО-1 клетки 4Т1 обрабатывали 10 мкМ гемина (Sigma) или 20 мкМ протопорфирина цинка (ZnPP; Sigma) за 24 часа до и 24 часа во время химиотерапевтической обработки.
Химиотерапия
[140] Доксорубицин (DXR; Bedford Laboratories, USA) и циклофосфамид (CP; Baxter, USA) использовались in vitro и in vivo.
[141] In vitro химиотерапия выполнялась путем лечения клеток в среде, содержащей химиотерапию, в течение 24 часов. Оптимальные дозы препарата определяли для каждой индивидуальной клеточной линии. Для in vivo исследований, DXR вводили внутривенно через боковую хвостовую вену, a CP вводили внутрибрюшинно.
Мышиные модели рака
5
5
6
6
3
7
7
6
6
3
[142] Все эксперименты на животных проводили в соответствии с процедурами, утвержденными Институционным комитетом по уходу и применению животных Университета Южной Калифорнии и разрешительным и этическим комитетом Национального института исследования рака, Генуя, Италия, и Министерством здравоохранения Италии. Для создания мышиной модели подкожного рака, 12-недельным самкам мышей BALB/c, 12-недельным самкам и самцам мышей C57BL/6 и 7-недельным голым мышам вводили инъекцию с клетками рака молочной железы 4Т1, клетками меланомы В16 и клетками глиомы GL26, и клетками ACN человеческой нейробластомы, соответственно. Для метастатических мышиных моделей рака 12-недельным самкам мышей BALB/c, 12-недельным самкам и самцам мышей C57BL/6 внутривенно вводили через боковую хвостовую вену 2×10 4Т1, В16, GL26 клеток, соответственно, и 6-недельным самкам мышей A/J вводили через боковую хвостовую вену 2×10 NXS2 и 1×10 Neuro-2a клеток. До инъекции клетки в логарифмической фазе роста собирали и суспендировали в PBS из расчета 2×10 клеток/мл, и 100 мкл (2×10 клеток/мышь) вводили подкожно в область нижней части спины или внутривенно через боковые хвостовые вены. Клетки ACN и Neuro-2а суспендировали в PBS при плотности 5×10и 1×10 клеток/мл, и 100 мкл (5×l0ACN клеток/мышь и 1×10 Neuro-2a клеток/мышь) вводили подкожно в область нижней части спины или внутривенно через боковые хвостовые вены, соответственно. Всех мышей брили перед подкожной инъекцией опухоли и слегка нагревали перед внутривенной инъекцией для расширения вен. Вес тела определяли периодически, и размер опухоли измеряли, используя цифровой штангенциркуль. Объем опухоли рассчитывали, используя следующую формулу: объем опухоли (мм)=(длина×ширина×высота) х π/6, где длина, ширина и высота в мм.
In vitro лечебное голодание
[143] Клеточное лечебное голодание выполняли путем ограничения глюкозы и/или сыворотки, которое основывалось на измерении глюкозы крови у голодавших и нормально питавшихся мышей; нижний уровень приближался к 0,5 г/л, а верхний уровень к 2,0 г/л. Для человеческих клеточных линий нормальной глюкозой считалась 1,0 г/л. Клетки были дважды промыты в PBS до замены на среду лечебного голодания.
In vivo лечебное голодание
[144] Животные голодали в течение в целом 48-60 часов путем полного лишения пищи, но со свободным доступом к воде. Мышей содержали индивидуально в чистых новых клетках, чтобы уменьшить каннибализм, копрофагию и остаточную пищу. Вес тела измеряли непосредственно до и после лечебного голодания.
In vitro анализы
[145] Цитотоксичность измеряли по способности снижать метилтиазолилдифенил-тетразолий бромид (МТТ). Коротко, МТТ подготовили из расчета 5 мг/мл в PBS, разбавили до конечной концентрации 0,5 мг/мл для анализов, и инкубировали в течение 3~4 часов при 37°С. Кристаллы формазана растворяли в течение ночи (16 часов) при 37°С с 100 мкл лизирующего буфера ((вес/об.) 15% SDS, (об./об.) 50% диметилформамид, рН 4,7). Выживание представляли как процент уровня снижения МТТ обработанных клеток к контрольным клеткам. Поглощение считывали при 570 нм, используя считывающее устройство для микропланшетов SpectraMax 250 (Molecular Devices) и программу SoftMax Pro 3.0 (Molecular Devices).
[146] Уровни супероксида оценивали с использованием окисление флуоресцентного красителя DHE (дигидроэтидин; Invitrogen, USA). Клетки культивировали на предметных стеклах, обрабатывали и дважды промывали PBS до инкубирования с DHE (10 мкМ; в 0,1% DMSO) в течение 30 минут.
Иммуноблоттинг-анализ
[147] Клетки промывали однократно в ледяном PBS и собирали в буфер RIPAlysis, содержащий ингибиторы протеаз (Roche) и коктейль из ингибиторов фосфатаз (Sigma). Опухолевые ткани гомогенизировали в буфере RIPAlysis с добавлением тех же ингибиторов протеаз и фосфатаз. Белки из общих лизатов были растворены в 8-12% SDS-PAGE и проанализированы путем иммуноблоттинга, используя антитела для GAPDH, Akt и фосфо-Ser473 Akt, р70 S6 киназы и фосфо-Тhr389 р70 S6 киназы, eIF2α и фосфо-8еr51 elF2α, (1:1000-2000, Cell Signaling Technology).
Протокол кометного анализа
5
[148] Клетки разбавляли до 10/мл в культуральной среде (DMEM/F12 с 10% FBS) и обрабатывали 50 мкМ DXR в течение 1 часа при 37°С. Затем клетки однократно промыли в ледяном PBS и подвергли кометному анализу (Trevigen, Inc, Gaithersburg, MD) согласно процедуре, рекомендованной изготовителем. Изображения «комет» были получены на флуоресцентном микроскопе Nikon Eclipse ТЕ300 и проанализированы программой Comet Score (TriTek Corp., verl.5). 100-300 клеток оценивалось для каждой группы генотипа/обработки.
Сбор крови и измерения глюкозы
2
[149] Мышей анестезировали 2% ингаляционным изофлураном, и кровь собирали с помощью сердечной пункции левого желудочка. Кровь собирали в пробирки, покрытые K-EDTA для получения сыворотки (BD, USA). Глюкоза крови измерялась с использованием системы контроля за глюкозой крови Precision Xtra (Abbott Laboratories, USA).
Микроматричный анализ
[150] РНК из тканей выделяли согласно процедурам, описанным изготовителем, используя набор RNeasy от Qiagen (cat #74106). Затем, РНК гибридизовали с BD-202-0202 чипом от IlluminaBeadchips (San Diego, СА). Исходные данные были подвергнуты Z-нормализации, как описано ранее. Параметризованный анализ значимости завершали согласно протоколу SAM с ANOVA фильтрацией (ANOVA р<0,05). Значимые гены отбирали для каждого попарного сравнения. Насыщение набора генов проверяли, используя способ PAGE, как описано ранее. Данные отбирали на основе названий и описаний, предоставленных базой данных Gene Ontology и Pathway Data Set. Кроме того правильная связь генов и анализ канонических метаболический путей были проведены с помощью Ingenuity Pathway Analysis System (Ingenuity Systems; Redwood City, CA).
ПЦР в реальном времени
-ΔΔСР
[151] РНК из тканей выделяли согласно процедурам, описанным изготовителем, используя набор RNeasy от Qiagen (cat #74106). кДНК синтезировали, используя высокопроизводительный набор для обратной транскрипции кДНК (АВ Applied Biosystems cat# 4368814) и ПЦР в реальном времени выполняли, используя SYBR Green PCR master mix (АВ Applied Biosystems cat# 4309159). Ген GAPDH использовался как ген-калибратор. Анализ каждой обработки выполнялся с тремя биологическими повторами, и по меньшей мере три реакции использовались для расчета экспрессии. Соотношение экспрессии рассчитывали согласно способу 2.
Эксперимент 4
[152] Ряд диетических составов испытывали на мышиных моделях для обоснования диетического режима для раковых больных, подвергающихся химиотерапии. Целевой конечный результат составил 20-75% снижения сывороточной глюкозы и/или IGF-1, которое, как показано, было эффективно в защите организма и сенсибилизации широкого ряда раковых клеток. Составы отбирали для обеспечения уровня питательных веществ, достаточного для сохранения нормального веса тела. Ежедневный прием пищи, вес тела контролировались наряду с общим здоровьем (поведение и внешний вид). В конце каждого графика питания кровь собирали для определения глюкозы и IGF-1. Обнаружено, что диета, недостаточная по конкретным аминокислотам (AA-D), но с нормальной общей калорийностью, значительно снижает сывороточный IGF-1 (Фиг.52) и глюкозу (Фиг.54А), если скармливать в течение 5 дней (Фиг.52). Такой благоприятный эффект повышался, если использовался в разновидности повторного кормления (Фиг.53 и 54В), где за кратковременным голоданием следовал AA-D состав.
[153] Диетический режим, состоящий из 2 дней на очень низкокалорийной диете (VCM, 6% от нормального поступления калорий) с последующим 1 днем на аминокислотно-дефицитном составе (АА), снижал сывороточные уровни IGF-1 значительно больше, чем кратковременное голодание (STS) (Фиг.55А). Более того, этот диетический режим защищал мышей от химиотерапевтического препарата доксорубицина (DXR) (Фиг.55В). Здесь DXR вводили инъекционно через 2 дня VCM после начала повторного кормления аминокислотно-дефицитным составом (АА).
[154] Было установлено, что низкокалорийный состав VegeGel (эквивалентен 5 рекомендованным порциям овощей) снижает сывороточную глюкозу и IGF-1 подобно кратковременному голоданию (STS) (Фиг.56А и В). Более того, было показано, что калорийно-ограниченная кетогенная диета (90% калорий получены из жира) в течение 3 дней снижала сывороточный IGF-1 и глюкозу (Фиг.6А и В, зеленые треугольники). Важно, что 1 день этой кетогенной диеты с последующими 2 днями на VegeGel составе показал благоприятный эффект в снижении глюкозы и IGF-I по сравнению с исключительно кетогенной диетой (Фиг.57А и В, красные квадраты).
[155] Хотя примеры вариантов осуществления описаны выше, это не предполагает, что эти варианты осуществления описывают все возможные формы данного изобретения. Предпочтительнее, слова, использованные в спецификации, являются словами описания, а не ограничения, и понятно, что различные изменения могут быть сделаны без отступления от духа и объема данного изобретения. Кроме того, особенности различных выполняемых вариантов осуществления могут комбинироваться для формирования дополнительных вариантов осуществления данного изобретения.