СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ САПОНИНОВ В ТРАВЕ ГИНОСТЕММЫ ПЯТИЛИСТНОЙ
METHOD FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF SAPONINS IN GYNOSTEMMA PENTAPHYLLUM

Предлагаемое изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества и сертификации лекарственных средств, в лабораториях контрольно-аналитического направления при определении количественного содержания суммы сапонинов в траве гиностеммы пятилистной (Gynostemmapentaphyllum) (Thunb.) Makino.
Система контроля качества лекарственных средств требует от фармацевтической науки постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений с применением современных физико-химических методов анализа и актуальных данных об их хроматографических, спектральных и биологических свойствах, позволяющих разделять и избирательно определять содержание конкретных веществ.
Гиностемма пятилистная (Gynostemma pentaphyllum) (Thunb.) Makino является популярным в Юго-Восточной Азии растением. Она применяется как источник полезных активных и синергических компонентов, в числе которых содержатся важные сапонины-гипенозиды. Гиностемма используется для получения чая «Jiaogulan» (Китай, сертификат №AR-16-SU-040016-01-EN) и пищевых добавок в виде капсул от производителей Paradise Herbs (Гиностемма, 60 вегетарианских капсул) и Solaray (экстракт корня гиностеммы, 410 мг, 60 растительных капсул). Лекарственные средства на основе сырья гиностеммы пятилистной обладают тонизирующими, адаптогенными, антиоксидантными, общеукрепляющими и другими фармакологическими свойствами [The determination of antioxidant activity of ethanol extracts of Gynostemma pentaphyllum I A.A. Nizamova, E.Kh. Galiakhmetova, K.S. Mochalov, N.V. Kudashkina // Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences. -2021. - Vol.17, №1. - P. 91-98].
Особый интерес, наряду с дикорастущим растением, представляет гиностемма пятилистная, адаптированная к умеренно-континентальному климату Республики Башкортостан. Доказано, что культивируемое растение содержит целый комплекс биологически активных веществ: полисахариды, витамины, флавоноиды, дубильные вещества, сапонины, аминокислоты, макро- и микроэлементы. Существенный вклад в химический состав и фармакологическую активность гиностеммы вносят тритерпеновые сапонины.
1
Известен способ количественного определения сапонинов в корневищах с корнями синюхи голубой, заключающийся в экстракции сапонинов из навески растительного сырья и их взаимодействии с концентрированной серной кислотой. Измеряют оптическую плотность продукта реакции при длине волны 321 нм и рассчитывают содержание суммы сапонинов в пересчете на β-эсцин [Патент BY 12568, 2009]. Наиболее близким аналогом изобретения является способ определения сапонинов в корнях женьшеня настоящего, характеризующийся тем, что 70% водно-спиртовое извлечение из корней женьшеня смешивают с 70% раствором серной кислоты, затем нагревают полученную смесь на водяной бане в течение 10 мин и определяют на спектрофотометре оптическую плотность при длине волны (λ), равной 526 нм. При осуществлении анализа применяют в качестве стандартного образца спиртовой раствор панаксозида Rg [Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. - М., 2018. - Т. 4 - С. 6058]. Задачей изобретения является разработка способа количественного определения суммы сапонинов в траве гиностеммы пятилистной, обладающего высокой специфичностью и воспроизводимостью. Технический результат - повышение точности количественного определения суммы сапонинов в траве гиностеммы пятилистной в пересчете на β-эсцин.
Предлагаемый способ количественного определения суммы сапонинов в траве гиностеммы пятилистной осуществляется следующим образом. Предварительно получают водно-спиртовое извлечение из сырья путем экстракции 1 г точной навески измельченной и просеянной до размера частиц 3 мм травы гиностеммы пятилистной 70% спиртом этиловым в течение 90 минут при соотношении массы сырья и объема экстрагента 1:200. К извлечению добавляют концентрированную серную кислоту в соотношении 1:5 и нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 322±2 нм. Содержание суммы сапонинов (X) в пересчете на β-эсцин в % рассчитывают по формуле:
где:
X - содержание суммы сапонинов в траве гиностеммы пятилистной в пересчете на β-эсцин, %;
1
A - оптическая плотность испытуемого раствора;
0
А - оптическая плотность раствора СО β-эсцина;
а
1
- масса сырья, г;
а
0
- масса СО β-эсцина;
0
V - объем аликвоты раствора СО β-эсцина, мл;
1
V - объем аликвоты испытуемого раствора, мл;
W - влажность, %.
При изучении характеристик спектра выявлено, что именно тритерпеновый сапонин β-эсцин определяет характер кривой поглощения 70% водно-спиртового извлечения из травы гиностеммы пятилистной. Определено, что максимумы спектра извлечения совпали с максимумами спектра раствора СО β-эсцина (CAS №11072-93-8, производитель Santa Cruz Biotechnology) (262, 322, 384 нм) (чертеж), где кривая 1 на чертеже демонстрирует раствор водно-спиртового извлечения из травы гиностеммы пятилистной в присутствии концентрированной серной кислоты в соотношении 1:5, а кривая 2 - раствор СО β-эсцина в присутствии концентрированной серной кислоты в соотношении 1:5. Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы сапонинов в траве гиностеммы пятилистной при аналитической длине волны 322 нм.
В первую очередь нами изучено влияние экстрагента на выход сапонинов в процессе экстракции. В таблице 1 представлены данные зависимости выхода сапонинов из травы гиностеммы пятилистной от концентрации спирта этилового. Максимальный выход суммы сапонинов из травы гиностеммы пятилистной наблюдается при использовании в качестве экстрагента спирта этилового 70%.
Во вторую очередь изучено влияние соотношения массы сырья и объема экстрагента на выход сапонинов (таблица 2). Исходя из полученных результатов видно, что при соотношении навески сырья и объема экстрагента 1:200 выход сапонинов максимален.
Далее нами подобрано оптимальное время экстракции в кипящей водяной бане. Из таблицы 3 видно, что наилучший выход сапонинов из травы гиностеммы пятилистной наблюдается при экстракции в течение 90 минут. После было исследовано влияние степени измельчения сырья на выход сапонинов из травы гиностеммы. В таблице 4 приведены данные, показывающие наибольший выход сапонинов при экстракции измельченного сырья, просеянного сквозь сито диаметром отверстий 3,0 мм.
На последнем этапе изучен вопрос о продолжительности реакции извлечения из травы гиностеммы пятилистной с концентрированной серной кислотой. Из таблицы 5 следует, что оптимальным временем химической реакции при нагревании соответствует 10 минутам. Принимая во внимание тот факт, что пробоподготовка является многостадийным процессом, вероятность возникновения относительной ошибки возрастает. Поэтому был сделан альтернативный выбор в пользу одностадийного процесса экстракции сырья, при котором происходит максимальный выход сапонинов.
Таким образом, в ходе исследования определены следующие оптимальные факторы: экстрагент - спирт этиловый 70%, соотношение навески сырья и объема экстрагента 1:200, время экстракции - 90 минут, степень измельчения сырья - 3,0 мм, время реакции с концентрированной серной кислотой - 10 минут.
Так как доминирующим сапонином в траве гиностеммы пятилистной является β-эсцин и максимальное поглощение водно-спиртового извлечения из сырья наблюдается при 322 нм, рациональным является определение содержания суммы сапонинов в пересчете на β-эсцин при этой длине волны.
Предлагаемый способ реализуется следующим образом. Аналитическую пробу сырья около 1,0 г (точная навеска), измельченного и просеянного до размера частиц 3 мм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 500 мл, наливают 200 мл спирта этилового 70%. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и экстрагируют на кипящей водяной бане 90 мин. Затем колбу охлаждают и извлечение фильтруют, отбрасывая первые порции, в колбу вместимостью 500 мл. Полученное извлечение количественно 5 мл переносят в выпарительную чашку и упаривают на водяной бане досуха. Затем сухой остаток охлаждают, растворяют в 5 мл воды (протирая стеклянной палочкой) и количественно переносят на слой силикагеля (размер частиц 40/100) на стеклянном фильтре. Осадок повторно элюируют 10 мл воды. Водный элюат полностью отбрасывают. Затем элюируют спиртом этиловым 95% в мерную колбу вместимостью 10 мл до метки, перемешивают (раствор А). Далее 1 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью на 10 мл и доводят объем раствора тем же растворителем (раствор Б). 1 мл раствора Б вносят в мерную колбу вместимостью на 25 мл, прибавляют 5 мл серной кислоты концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 322±2 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют спирт этиловый 95%.
СО
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО β-эсцина: 1 мл раствора Б помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл серной кислоты концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. Измерения проводят аналогично испытуемому раствору. Содержание суммы сапонинов (X) в пересчете на β-эсцин в % рассчитывают по формуле:
где:
1
A - оптическая плотность испытуемого раствора;
0
А - оптическая плотность раствора СО β-эсцина;
a
1
- масса сырья, г;
а
0
- масса СО β-эсцина;
0
V - объем аликвоты раствора СО β-эсцина, мл;
1
V - объем аликвоты испытуемого раствора, мл;
W - влажность, %.
СО
СО
Приготовление раствора СО β-эсцина. Около 0,05 г (точная навеска) СО β-эсцина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 95% (раствор А), 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью на 10 мл и доводят объем раствора тем же растворителем (раствор Б). Срок годности раствора 1 месяц. Предлагаемый способ поясняется следующими примерами. Пример 1. Аналитическую пробу сырья гиностеммы пятилистной (заготовлено в Уфимском районе Республики Башкортостан, 2020 г. ) 1,010 г, измельченного и просеянного до размера частиц 3 мм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 500 мл, наливают 200 мл спирта этилового 70%). Колбу присоединяют к обратному холодильнику и экстрагируют на кипящей водяной бане 90 мин. Затем колбу охлаждают и извлечение фильтруют, отбрасывая первые порции, в колбу вместимостью 500 мл. Полученное извлечение количественно 5 мл переносят в выпарительную чашку и упаривают на водяной бане досуха. Затем сухой остаток охлаждают, растворяют в 5 мл воды (протирая стеклянной палочкой) и количественно переносят на слой силикагеля (размер частиц 40/100) на стеклянном фильтре. Осадок повторно элюируют 10 мл воды. Водный элюат полностью отбрасывают. Затем элюируют спиртом этиловым 95% в мерную колбу вместимостью 10 мл до метки, перемешивают (раствор А). Далее 1 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью на 10 мл и доводят объем раствора тем же растворителем (раствор Б).
1 мл раствора Б вносят в мерную колбу вместимостью на 25 мл, прибавляют 5 мл серной кислоты концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 320 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют спирт этиловый 95%.
СО
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО β-эсцина: 1 мл раствора Б помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл серной кислоты концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. Измерения проводят аналогично испытуемому раствору. Содержание суммы сапонинов (X) в пересчете на β-эсцин в % рассчитывают по формуле:
где:
0,420 - оптическая плотность испытуемого раствора;
0,510 - оптическая плотность раствора СО β-эсцина;
1,010 - масса сырья, г;
0,05 - масса СО β-эсцина;
1 - объем аликвоты раствора СО β-эсцина, мл;
1 - объем аликвоты испытуемого раствора, мл;
5,51 - влажность, %.
СО
СО
Приготовление раствора СО β-эсцина. 0,05 г СО β-эсцина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 95% (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью на 10 мл и доводят объем раствора тем же растворителем (раствор Б). Срок годности раствора 1 месяц.
Содержание суммы сапонинов в пересчете на β-эсцин составило 17,26%. Все результаты статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила 0,07%).
Пример 2. Аналитическую пробу сырья гиностеммы пятилистной (заготовлено в Уфимском районе Республики Башкортостан, 2020 г.) 1,000 г, измельченного и просеянного до размера частиц 3 мм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 500 мл, наливают 200 мл спирта этилового 70%). Колбу присоединяют к обратному холодильнику и экстрагируют на кипящей водяной бане 90 мин. Затем колбу охлаждают и извлечение фильтруют, отбрасывая первые порции, в колбу вместимостью 500 мл. Полученное извлечение количественно 5 мл переносят в выпарительную чашку и упаривают на водяной бане досуха. Затем сухой остаток охлаждают, растворяют в 5 мл воды (протирая стеклянной палочкой) и количественно переносят на слой силикагеля (размер частиц 40/100) на стеклянном фильтре. Осадок повторно элюируют 10 мл воды. Водный элюат полностью отбрасывают. Затем элюируют спиртом этиловым 95% в мерную колбу вместимостью 10 мл до метки, перемешивают (раствор А). Далее 1 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью на 10 мл и доводят объем раствора тем же растворителем (раствор Б).
1 мл раствора Б вносят в мерную колбу вместимостью на 25 мл, прибавляют 5 мл серной кислоты концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. После охлаждения измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 324 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют спирт этиловый 95%.
СО
Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО β-эсцина: 1 мл раствора Б помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 5 мл серной кислоты концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане 10 мин. Измерения проводят аналогично испытуемому раствору. Содержание суммы сапонинов (X) в пересчете на β-эсцин в % рассчитывают по формуле:
где:
0,415 - оптическая плотность испытуемого раствора;
0,510 - оптическая плотность раствора СО β-эсцина;
1,000 - масса сырья, г;
0,05 - масса СО β-эсцина;
1 - объем аликвоты раствора СО β-эсцина, мл;
1 - объем аликвоты испытуемого раствора, мл;
5,51 - влажность, %.
СО
СО
Приготовление раствора СО β-эсцина. 0,05 г СО β-эсцина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 95% (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью на 10 мл и доводят объем раствора тем же растворителем (раствор Б). Срок годности раствора 1 месяц.
Содержание суммы сапонинов в пересчете на β-эсцин составило 17,22%. Все результаты статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила 0,06%).
Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы сапонинов в пересчете на β-эсцин в траве гиностеммы пятилистной с использованием спектрофотометрического метода разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими достоинствами:
1. Разработанный метод является воспроизводимым, доступным и не трудоемким.
2. Пересчет суммы сапонинов идет на специфическое для травы гиностеммы пятилистной вещество тритерпеновой природы - β-эсцин.
3. Относительная погрешность единичного определения предлагаемой методики составляет 0,06% и 0,07%, что свидетельствует об объективности разработанного способа количественного определения сапонинов.