СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЫСОКООЧИЩЕННЫХ ВИРИОННЫХ КОНЦЕНТРАТОВ
METHOD FOR PREPARING HIGH-PURITY VIRION CONCENTRATE

Способ получения высокоочищенных варионных концентратов (далее - Изобретение) относится к биотехнологии, иммунологии и касается вирионных концентратов, которые могут быть использованы для производства различных инактивированных вакцин против гриппа. В настоящее время существует несколько типов инактивированных гриппозных вакцин: цельновирионные, расщепленные, субъединичные, вакцины с адъювантами и виросомальные вакцины. Цельновирионные вакцины обладают высокой иммуногенностью, однако они обладают также и высокой реактогенностью, поэтому они не применяются для вакцинации детей. Расщепленные вакцины, которые являются вакцинами II поколения, обладают меньшей реактогенностью и достаточно высокой иммуногенностью. Поэтому в настоящее время они являются наиболее широко применяемым типом вакцин в мире. Однако для вакцинации детей применяются в основном субъединичные вакцины, которые обладают очень низкой реактогенностью. В то же время субъединичные вакцины в реальной практике показывают сравнительно низкий показатель протективной защиты вакцинированных людей, поэтому в последнее время отдают предпочтение использованию вакцин с различными адъювантами, в частности, с адъювантом MF-59. Широкое применение пандемичной вакцины против «свиного» гриппа фирмы «Новартис», которая содержала в своем составе этот адъювант, показало, что реактогенность вакцины в связи с наличием адъюванта резко выросла. Поэтому применение вакцин против «сезонного» гриппа, содержащих этот адъювант, приостановлено. В России уже в течение 16 лет применяется полимерсубъединичная вакцина Гриппол, в состав которой входит полимер Полиоксидоний. Однако изучение эпидемиологической эффективности этой вакцины, которое проводилось в начале 2000-х годов, показало, что по этому показателю она сильно уступает зарубежным субъединичным и расщепленным вакцинам.
В связи с вышеизложенным наибольший интерес для современного здравоохранения представляют виросомальные вакцины, которые содержат в своем составе только поверхностные антигены и фосфолипиды вирусной оболочки. Такие структуры называются «псевдовирусными», потому что они внешне похожи на препарат очищенных вирионов. Однако в них отсутствует мембранный белок и нуклеокапсид вируса гриппа, что делает эти структуры практически нереактогенными. Следует отметить, что виросомальные вакцины способны индуцировать не только гуморальный, но и клеточный иммунитет, что отличает их от всех других типов инактивированных гриппозных вакцин.
Для того чтобы произвести любой вариант инактивированной гриппозной вакцины с необходимым уровнем качества нужно провести специальную очистку вирионов вируса гриппа из вируссодержащей аллантоисной жидкости. Эта очистка должна отделить вирионные частицы от липотропных мембран разрушенных клеток (дебрис). Проблема состоит в том, что на части дебриса, как правило, бывает презентирован гемагглютинин, который является основным антигеном вируса гриппа.
В мировой литературе описаны различные способы очистки ВАЖ. В патенте US 3989818 описано применение полиэтиленгликоля (ПЭГ) 6000 для выделения очищенных вирионов. Недостатком метода является то, что при низких концентрациях вируса осаждение ПЭГ 6000 происходит неколичественно, и это существенно снижает эффективность технологии.
Использование глубинных фильтров с различным диаметром пор описано в нескольких патентах. В частности, в патенте US 8247207 описано применение глубинных фильтров от 1,5 до 0,2 мкм. Однако для различных вакцинных штаммов вируса гриппа характерен полиморфизм. Поэтому вирусные частицы с размером более 0,2 мкм задерживаются на таких фильтрах, что снижает эффективность этой технологии.
В патенте EP 0870508 описывается применение только одного глубинного фильтра с диаметром пор 0,5 мкм и применение для ультрафильтрации мембран с молекулярным весом отсечки 300 KD. Недостатком этого метода является то, что в случае сильной неоднородности ВАЖ одного фильтра с диаметром пор 0,5 мкм будет недостаточно и количество литров ВАЖ, которое можно пропустить через этот фильтр, будет незначительным. Для того чтобы технология была эффективной согласно теории микрофильтрации нужно устанавливать каскад из 2-х и более картриджей. Только в этом случае технология будет эффективной.
В России традиционно используется технология очистки вирионов из ВАЖ с использованием формалинизированных куриных эритроцитов. Подобный способ очистки ВАЖ раскрыт в патенте RU 2446824, который взят в качестве прототипа для данного изобретения. Согласно известному решению для получения очищенного концентрата антигенов вируса гриппа расщепленный концентрат вируса центрифугируют при 16000 об/мин в течение 2 ч. Затем производят ультрафильтрацию в тангенциальном потоке на кассете с мембраной 30000 дальтон, до тех пор пока концентрация детергента в фильтрате не снизится до 10 мкг/мл. Полученный концентрат очищенных антигенов вируса гриппа рассматривается как моновакцина. Моновакцину фильтруют через два последовательно соединенных фильтра с размером пор 0,45 и 0,22 мкм.
Однако при использовании этой технологии на эритроциты сорбируются не только вирионы, но и часть дебриса, содержащая гемагглютинин. В рамках этой технологии элюция вирусов с эритроцитов производится с 10-кратным уменьшением объема по сравнению с исходной ВАЖ. Таким образом достигается не только эффект очистки, но и эффект концентрирования. Проблема состоит в том, что вместе с вирионами концентрируется и дебрис. И поэтому в процессе элюции происходит агрегация вирионов и дебриса. Полученные агрегаты очень трудно разделить на последующих стадиях очистки, и гемагглютинин, который в них содержится, как правило, теряется. Это приводит к снижению эффективности технологии. Кроме того, качество очистки вирионов по этой технологии существенно хуже аналогичных мировых образцов, полученных без использования эритроцитов. Для дальнейшего выделения гемагглютинина и создания различных типов инактивированных вакцин качество очистки вирионов и вирусная агрегация имеют огромное значение, потому что из плохо очищенного вируса препарат антигена получается мало стабильным.
В результате длительных экспериментальных работ, проведенных авторами этого изобретения, было установлено, что полного отделения дебриса от вирионов гриппа не удается достичь при любой комбинации фильтров. Было также установлено, что добавление различных электролитов, в частности ПЭГ 6000, приводит к сильной агрегации и последующему осаждению дебрисных структур, вирионы вируса гриппа при определенных концентрациях ПЭГ 6000 продолжают оставаться в растворе (неопубликованные данные). Эти наблюдения легли в основу данного изобретения.
Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в разработке новой технологии очистки вирионов, которая позволит производить российские инактивированные вакцины с мировым уровнем качества.
Технический результат предлагаемого изобретения заключается в разработке промышленного способа получения высокоочищенного вирионного концентрата, который можно было бы испытать для производства инактивированных гриппозных вакцин.
Сущность изобретения заключается в получении высокоочищенных вирионных концентратов с использованием мембранных технологий и специальных добавок.
Объектом изобретения является способ получения высоко очищенных вирионных концентратов для производства инактивированной вакцины против гриппа, включающий заражение куриных эмбрионов, сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ), очистку ВАЖ методом микрофильтрации, концентрирование методом ультрафильтрации и очистку полученных концентратов методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы, отличающийся тем, что очистку ВАЖ осуществляют с использованием полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 в конечной концентрации 1,5% с последующей микрофильтрацией на глубинных фильтрах с диаметром пор 1,0 мкм и 10,0 мкм и концентрированием очищенной ВАЖ на мембранах с отсечкой молекулярного веса 100 килодальтон.
Отличие предлагаемого способа от прототипа заключается в том, что для очистки ВАЖ формалинизированные куриные эритроциты не используются, а применяются современные технологии и электролиты, допущенные до медицинского применения. Поэтому полученный результат отличается от прототипа степенью очистки вирусного концентрата более высокой эффективностью применяемой технологии.
Краткое изложение способа получения
Для приготовления вакцины используют штаммы вируса гриппа, которые соответствуют рекомендациям ВОЗ.
Куриные эмбрионы, зараженные вирусом гриппа в оптимальной дозе, инкубируют при температуре 33-37°C (согласно паспорту, прилагаемому к штамму вируса) и влажности (65±5) % в термальных комнатах.
После овоскопирования оставшиеся яйца охлаждают в холодильной камере в течение (18±2) ч при температуре (4±2)°C.
Сбор вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) осуществляют на специальной машине для сбора аллантоисной жидкости (фирмы «Техно», Италия).
Отобранную аллантоисную жидкость собирают с помощью вакуума в 2 специальные емкости по 250 л. После сбора к ВАЖ добавляют полиэтиленгликоль (ПЭГ-6000) до конечной концентрации 1,5%. Время выдержки ВАЖ с ПЭГ составляет 17 ч.
Собранную ВАЖ пропускают через два последовательно соединенных картриджа Betapur (фирма 3M, США) для микрофильтрации с размером пор 10 мкм и 1 мкм соответственно.
Ультрафильтрацию проводят на установке ультрафильтрации АСФ-020 (фирмы Владисарт, Россия) в тангенциальном потоке с 10 кассетными модулями. Для проведения концентрирования используют модули (фирмы Владисарт, Россия) с диаметром пор 100 кД.
Установку и систему трубопроводов стерилизуют 3% раствором формалина с экспозицией не менее 10-х часов. Затем от формалина установку отмывают стерильной водой для инъекций в объеме 40 л с последующей проверкой и восстановлением pH.
Очищенную ВАЖ концентрируют в 20 раз. Давление при концентрировании не должно превышать 0,8 бар.
После работы проводят регенерацию кассетных мембранных модулей 1 М раствором гидроксида натрия, а затем промывают очищенной водой. После проведения регенерации установку стерилизуют, используя 3% раствор формалина.
Отфильтрованную жидкость (фильтрат) обеззараживают в автоклаве.
Очистка концентрированной ВАЖ проводится методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы.
Готовят раствор 60% сахарозы на 0,05 М трис-буфере, который стерилизуют в автоклаве при 121°C в течение 20 мин.
В проточный ротор с объемом 3,2 л перистальтическим насосом 520N (фирмы Ватсон-Марлоу, Великобритания) вносится 2 л 60% раствора сахарозы и запускают ротор в стандартный режим (30 тыс. оборотов в минуту, температура плюс 4 градуса). Далее этим же насосом в ротор запускают стерильный фосфатно-буферный раствор со скоростью 10 л/час. После пропускания 5 литров буфера в ротор подают таким же образом очищенную и концентрированную ВАЖ порциями по 10 литров (1 емкость 200 литров - 10 литров концентрата, 2 емкости - 20 литров концентрата).
После остановки ротора сахарозный градиент раскапывают в ламинарном шкафу по фракциям по 100 мл каждая (получается 20 фракций). Во фракциях методом визкозиметрии определяют содержание сахарозы, а также определяют содержание белка и подлинность. Фракции, содержащие более 4000 ЕД гемагглютинина, отделяют от остальных (обычно 5-6 фракций) в один пул, к ним добавляют равный объем глицерина фармакопейного (фирма «Panreac», Испания), жидкость во флаконах тщательно перемешивают и хранят при температуре минус 10°C не более 2 месяцев.
Возможность осуществления изобретения может быть продемонстрирована следующими ниже представленными примерами.
Пример 1. Куриные эмбрионы в 11-суточного возраста в количестве 46000 штук заразили оптимальной дозой посевного вируса. После инкубации в течение 48 ч при 34°C эмбрионы переносят в холодильную камеру и охлаждают в течение 17 ч. Затем эмбрионы обрабатывают 0,2% спиртовым раствором йода. Далее эмбрионы передают на автомат для сбора ВАЖ (фирма Техно, Италия). Аллантоисная жидкость собирается в 2 емкости по 250 л. Объем ВАЖ составил 290 л. После сбора ВАЖ в емкости добавляют ПЭГ 6000 в концентрации 1,0%. Инкубируют при плюс 4°C в течение 17 ч. Далее производят микрофильтрацию через 2 последовательно соединенных картриджа Betapur (фирма 3M, США) с диаметром пор 10 мкм и 1 мкм соответственно. После этого полученный фильтрат концентрируют в 20 раз на мембранах с молекулярным отсечением 100 KD на установке АСФ 0,20 (Владисарт, Россия). Полученный концентрат наносят на градиент плотности сахарозы со скоростью потока 10 л/ч и 30000 об/мин. Супернатант обеззараживают и удаляют в канализацию, а сахарозный градиент раскапывают по фракциям и определяют в них гемагглютинин. Фракции с высокой гемагглютинирующей активностью (более 4000 единиц гемагглютинина) объединяют в один пул и в этом пуле определяют содержание белка и содержание специфического антигена-гемагглютинина в ОРИД. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Пример 2. Куриные эмбрионы в 11-суточного возраста в количестве 47124 штук заразили оптимальной дозой посевного вируса. После инкубации в течение 48 ч при 34°C эмбрионы переносят в холодильную камеру и охлаждают в течение 17 ч. Затем эмбрионы обрабатывают 0,2% спиртовым раствором йода. Далее эмбрионы передают на автомат для сбора ВАЖ (фирма Техно, Италия). Аллантоисная жидкость собирается в 2 емкости по 250 л. Объем ВАЖ составил 315 л. После сбора ВАЖ в емкости добавляют ПЭГ 6000 в концентрации 0,5%. Инкубируют при плюс 4°C в течение 17 ч. Далее производят микрофильтрацию через 2 последовательно соединенных картриджа Betapur (фирма 3M, США) с диаметром пор 10 мкм и 1 мкм соответственно. После этого полученный фильтрат концентрируют в 20 раз на мембранах с молекулярным отсечением 100 KD на установке АСФ 0,20 (Владисарт, Россия). Полученный концентрат наносят на градиент плотности сахарозы со скоростью потока 10 л/ч и 30000 об/мин. Супернатант обеззараживают и удаляют в канализацию, а сахарозный градиент раскапывают по фракциям и определяют в них гемагглютинин. Фракции с высокой гемагглютинирующей активностью (более 4000 единиц гемагглютинина) объединяют в один пул и в этом пуле определяют содержание белка и содержание специфического антигена-гемагглютинина в ОРИД. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Пример 3. Куриные эмбрионы в 11-суточного возраста в количестве 54174 штук заразили оптимальной дозой посевного вируса. После инкубации в течение 48 ч при 34°C эмбрионы переносят в холодильную камеру и охлаждают в течение 17 ч. Затем эмбрионы обрабатывают 0,2% спиртовым раствором йода. Далее эмбрионы передают на автомат для сбора ВАЖ (фирма Техно, Италия). Аллантоисная жидкость собирается в 2 емкости по 250 л. Объем ВАЖ составил 385 л. После сбора ВАЖ в емкости не добавляли ПЭГ 6000. Инкубируют при плюс 4°C в течение 17 ч. Далее производят микрофильтрацию через 2 последовательно соединенных картриджа Betapur (фирма 3M, США) с диаметром пор 10 мкм и 1 мкм соответственно. После этого полученный фильтрат концентрируют в 20 раз на мембранах с молекулярным отсечением 100 KD на установке АСФ 0,20 (Владисарт, Россия). Полученный концентрат наносят на градиент плотности сахарозы со скоростью потока 10 л/ч и 30000 об/мин. Супернатант обеззараживают и удаляют в канализацию, а сахарозный градиент раскапывают по фракциям и определяют в них гемагглютинин. Фракции с высокой гемагглютинирующей активностью (более 4000 единиц гемагглютинина) объединяют в один пул и в этом пуле определяют содержание белка и содержание специфического антигена-гемагглютинина в ОРИД. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Пример 4. Куриные эмбрионы в 11-суточного возраста в количестве 41112 штук заразили оптимальной дозой посевного вируса. После инкубации в течение 48 ч при 34°C эмбрионы переносят в холодильную камеру и охлаждают в течение 17 ч. Затем эмбрионы обрабатывают 0,2% спиртовым раствором йода. Далее эмбрионы передают на автомат для сбора ВАЖ (фирма Техно, Италия). Аллантоисная жидкость собирается в 2 емкости по 250 л. Объем ВАЖ составил 300 л. После сбора ВАЖ в емкости не добавляли ПЭГ 6000. Инкубируют при плюс 4°C в течение 17 ч. Далее производят микрофильтрацию через 2 последовательно соединенных картриджа Betapur (фирма 3M, США) с диаметром пор 10 мкм и 1 мкм соответственно. После этого полученный фильтрат концентрируют в 20 раз на мембранах с молекулярным отсечением 100 KD на установке АСФ 0,20 (Владисарт, Россия). Полученный концентрат наносят на градиент плотности сахарозы со скоростью потока 10 л/ч и 30000 об/мин. Супернатант обеззараживают и удаляют в канализацию, а сахарозный градиент раскапывают по фракциям и определяют в них гемагглютинин. Фракции с высокой гемагглютинирующей активностью (более 4000 единиц гемагглютинина) объединяют в один пул и в этом пуле определяют содержание белка и содержание специфического антигена-гемагглютинина в ОРИД. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Пример 5. Куриные эмбрионы в 11-суточного возраста в количестве 30542 штук заразили оптимальной дозой посевного вируса. После инкубации в течение 48 ч при 34°C эмбрионы переносят в холодильную камеру и охлаждают в течение 17 ч. Затем эмбрионы обрабатывают 0,2% спиртовым раствором йода. Далее эмбрионы передают на автомат для сбора ВАЖ (фирма Техно, Италия). Аллантоисная жидкость собирается в 2 емкости по 250 л. Объем ВАЖ составил 265 л. После сбора ВАЖ в емкости добавляют ПЭГ 6000 в концентрации 1,5%. Инкубируют при плюс 4°C в течение 17 ч. Далее производят микрофильтрацию через 2 последовательно соединенных картриджа Betapur (фирма 3M, США) с диаметром пор 10 мкм и 1 мкм соответственно. После этого полученный фильтрат концентрируют в 20 раз на мембранах с молекулярным отсечением 100 KD на установке АСФ 0,20 (Владисарт, Россия). Полученный концентрат наносят на градиент плотности сахарозы со скоростью потока 10 л/ч и 30000 об/мин. Супернатант обеззараживают и удаляют в канализацию, а сахарозный градиент раскапывают по фракциям и определяют в них гемагглютинин. Фракции с высокой гемагглютинирующей активностью (более 4000 единиц гемагглютинина) объединяют в один пул и в этом пуле определяют содержание белка и содержание специфического антигена-гемагглютинина в ОРИД. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Пример 6. Куриные эмбрионы в 11-суточного возраста в количестве 29349 штук заразили оптимальной дозой посевного вируса. После инкубации в течение 48 ч при 34°C эмбрионы переносят в холодильную камеру и охлаждают в течение 17 ч. Затем эмбрионы обрабатывают 0,2% спиртовым раствором йода. Далее эмбрионы передают на автомат для сбора ВАЖ (фирма Техно, Италия). Аллантоисная жидкость собирается в 2 емкости по 250 л. Объем ВАЖ составил 230 л. После сбора ВАЖ в емкости добавляют ПЭГ 6000 в концентрации 1,5%. Инкубируют при плюс 4°C в течение 17 ч. Далее производят микрофильтрацию через 2 последовательно соединенных картриджа Betapur (фирма 3M, США) с диаметром пор 10 мкм и 1 мкм соответственно. После этого полученный фильтрат концентрируют в 20 раз на мембранах с молекулярным отсечением 100 KD на установке АСФ 0,20 (Владисарт, Россия). Полученный концентрат наносят на градиент плотности сахарозы со скоростью потока 10 л/ч и 30000 об/мин. Супернатант обеззараживают и удаляют в канализацию, а сахарозный градиент раскапывают по фракциям и определяют в них гемагглютинин. Фракции с высокой гемагглютинирующей активностью (более 4000 единиц гемагглютинина) объединяют в один пул и в этом пуле определяют содержание белка и содержание специфического антигена-гемагглютинина в ОРИД. Полученные результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
№ примера
Кол-во эмбрионов,
Объем ВАЖ, л
Содержание
Общий ОРИД
ОРИД/белок
Выход антигена
Шт.
общего белка, л
гемагглютинина на 1 эмбрион, мкг/эмбр.
1
2
3
4
5
6
7
1
46800
290,0
4,92
1,47
3,35
31,4
2
47124
315,0
4,31
1,2
3,6
25,4
3
54174
385,0
2,43
0,72
3,38
13,3
4
41112
300,0
2,85
0,6
4,42
14,6
5
30542
265,0
3,44
1,26
2,73
41,2
6
29349
230,0
3,42
1,08
3,17
36,8
Вывод
Из результатов, представленных в примерах 1-6, следует, что без добавления ПЭГ 6000 эффективность технологии чрезвычайно низка. В примере 3 выход антигена в расчете на эмбрион составил 13,3 мкг гемагглютинина на 1 эмбрион. В примере 4 этот выход составил 14,6 мкг гемагглютинина на 1 эмбрион. Это связано с тем, что дебрисные структуры были агрегированы вместе с вирионами и большей частью задерживались на мембранных картриджах. При добавлении ПЭГ 6000 до концентрации 0,5% (пример 2) выход гемагглютинина на 1 эмбрион составил 25,4 мкг/эмбр. При добавлении ПЭГ 6000 до концентрации 1,0% (пример 1) этот выход составил 31,4 мкг/эмбр. При добавлении ПЭГ 6000 до концентрации 1,5% выход составил 41,2 мкг/эмбр. (пример 5) или 36,8 мкг/эмбр. (пример 6). Таким образом, было доказано, что наибольшая эффективность данной технологии достигается при добавлении ПЭГ 6000 в концентрации 1,5%.
Впервые в мировой практике предпринят двойной подход к очистке ВАЖ: 1) разделение вирионов и дебриса за счет полиэлектролита ПЭГ 6000; 2) полное отделение вирионов и дебриса осуществляется с помощью глубинных фильтров. Сочетание этих двух подходов позволит максимально очистить ВАЖ от дебрисных структур, благодаря чему на следующих стадиях очистки, а именно концентрирование ультрафильтрацией и ультрацентрифугирование в сахарозном градиенте, удается получить высокоочищенный вирионный концентрат вируса гриппа.
1
1
На представленном рисунке 1 представлены результаты анализа полипептидного состава очищенных вирионов, полученных по примеру 3 (линия 1) и по примеру 5 (линия 2). Стрелками указано расположение основных полипептидов вируса гриппа серотипа HN (HA0, NP, M1). Очевидно, что по примеру 5 получается более очищенный препарат вирионов, который практически не содержит посторонних полипептидов.
Список литературы
1. Патент РФ 2446824, опубл. 10.04.2012.
2. Патент US 3989818, опубл. 02.11.1976.
3. Патент EP 8247207, опубл. 12.08.2012 г.
4. Патент EP 0870508, опубл. 08.11.2000 г.