Способ лечения мужского бесплодия при высоком показателе ДНК-фрагментации эякуляторных сперматозоидов
METHOD OF TREATING MALE INFERTILITY WITH HIGH DNA FRAGMENTATION OF EJACULATORY SPERM CELLS

Изобретение относится к медицине, а именно, к урологии, и может быть использовано для лечения мужского бесплодия при высоком показателе ДНК-фрагментации эякуляторных сперматозоидов. Способ позволяет осуществить забор из яичка сперматозоидов, наиболее пригодных для использования в программах вспомогательных репродуктивных технологий и повысить показатель рождаемости.
В настоящее время частота бесплодия в браке составляет от 15 до 20%. В России показатель превышает 17%. В большинстве стран мира данная проблема имеет тенденцию к росту [Божедомов В.А., 2015; Гамидов С.И. и соавт., 2013].
Доля мужского фактора в бесплодном браке составляет около 50%. В 30-40% случаев мужское бесплодие носит идиопатический характер [Nieschlag S. Et al. Andrology: Male Reproductive Health and Dysfunction. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg 2010]. Более чем в 40% наблюдений, в связи с отсутствием эффекта от терапии, пары вынуждены прибегать к лечению бездетного брака методами вспомогательных репродуктивных технологий.
На сегодняшний день определение уровня фрагментации ДНК сперматозоидов не рутинный метод исследования в клиниках, занимающихся репродуктивным здоровьем. Тем не менее, целостность структуры ДНК мужской половой клетки является важным элементом, определяющим оплодотворение яйцеклетки, предимплантационное развитие эмбрионов, риски потерь беременности на ранних сроках и ассоциируется с развитием врожденных пороков развития у потомства [Simon L, Brunborg G, Stevenson M, Lutton D, McManus J, Lewis SE. Clinical significance of sperm DNA damage in assisted reproduction outcome. Hum Reprod 2010; Simon L. et al. Sperm DNA damage has negative association with live birth rates after IVF. Reprod. Biomed 2013].
Высокий уровень фрагментации ДНК сперматозоидов (более 15%) является сложно преодолимой формой мужского бесплодия. Основными признанными этиологическими факторами, приводящими к разрывам цепочек ДНК гамет признаны: варикоцеле, инфекционно-воспалительные заболевания полового тракта, вредные привычки (курение, алкоголь), профессиональные вредности (высокие температуры, контакт с тяжелыми металлами, ионизирующее излучение), метаболические нарушения, сахарный диабет, расстройства эякуляции, прием гаметотоксичных медикаментов. И в этих случаях, лечение носит этиотропный характер. Но нередко генез фрагментации ДНК остается невыясненным.
Исследования демонстрируют отрицательную корреляцию между показателем ДНК-фрагментации сперматозоидов и частотой наступления и развития клинической беременности в программах вспомогательных репродуктивных технологий, как экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), так и ИКСИ (интрацитоплазматической инъекции сперматозоида). Высокий уровень ДНК-фрагментации ассоциируется с низким показателем рождаемости после процедур ЭКО/ИКСИ [Lynne Robinson Ioannis D. Gallos Sarah J. Conner Madhurima RajkhowaDavid Miller Sheena Lewis Jackson Kirkman-Brown Arri Coomarasamy. The effect of sperm DNA fragmentation on miscarriage rates: a systematic review and meta-analysis Human Reproduction, Volume 27, Issue 10, 1 October 2012, Pages 2908-2917; M.H. Коршунов, E.C. Коршунова, С.П. Даренков. Прогностическая ценность показателя ДНК фрагментации сперматозоидов в успехе программ вспомогательных репродуктивных технологий. Эмпирическая антиоксидантная терапия в коррекции ДНК-фрагментации на фоне патологического окислительного стресса эякулята. Экспериментальная и клиническая урология. №3 2017. Стр 70-76].
Таким образом, преодоление бесплодия у мужчин с идиопатическим высоким показателем ДНК-фрагментации сперматозоидов имеет особую актуальность.
На сегодняшний день методы коррекции патологического уровня ДНК-фрагментации сперматозоидов неясного генеза основываются на эмпирическом подходе.
Медикаментозная коррекция представлена антиоксидантной и гормональной терапией.
Антиоксиданты - биологические и химические соединения, которые нивелируют выраженность окислительного стресса в организме, в том числе семенной жидкости. Это группа органических нутриентов, которые включают: витамины, провитамины, минералы, активные ингредиенты растительного происхождения. Их назначение может улучшить качество спермы и снизить фрагментацию гамет.R. Aitken и соавторы провели метаанализ 20 клинических работ о влиянии использования различных препаратов с антиоксидантным профилем действия в коррекции ДНК-фрагментации сперматозоидов, сочетающейся высокой активностью свободных радикалов спермы. Авторы указали, что антиоксидантная терапия является эффективным методом коррекции патоспермии и окислительного стресса, однако на сегодняшний день нет абсолютных доказательств клинической эффективности использования антиоксидантов, особенно при ДНК-фрагментации [Gharagozloo, P., Aitken, R.J. The role of sperm oxidative stress in male infertility and the significance of oral antioxidant therapy. Hum. Reprod 2011, 26(7); 1628-40]. Кроме того, в ряде случаев назначение антиоксидантов может приводить к ухудшению интеграции генома сперматозоида, вследствие неконтролируемого подавления физиологического уровня свободных радикалов эякулята, необходимого для процесса гаметогенеза.
Альтернативным методом лечения является назначение синтетического рекомбинантного фолликулостимулирующего гонадотропина. Garolla А. с соавторами описали положительный эффект подкожного назначения данного гормона мужчинам с идиопатическим повышенным уровнем ДНК-фрагментации сперматозоидов [Garolla A. et al. FSH treatment in infertile males candidate to assisted reproduction improved sperm DNA fragmentation and pregnancy rate. Endocrine. 2017 Мау;56(2):416-425]. Важно отметить, что наилучший ответ на данный вид терапии отмечается у пациентов с изначально невысокими показателями фолликулостимулирующего гормона сыворотки крови и ДНК-фрагментации и напрямую коррелирует с наличием рецепторного полиморфизма ФСГ p.N680S [Simoni М et al. Treatment with human, recombinant FSH improves sperm DNA fragmentation in idiopathic infertile men depending on the FSH receptor polymorphism p.N680S: a pharmacogenetic study. Hum Reprod. 2016 Sep;31(9): 1960-9].
Поведенческая терапия, направленная на снижение уровня ДНК-фрагментации, основана на получении свежих эякуляторных сперматозоидов. Было отмечено, что меньший срок полового воздержания с предварительными режимом частых эякуляций может привести к улучшению качества спермы и повысить эффективность процедур вспомогательных репродуктивных технологий. Данный метод сложно использовать у больных с нарушенной эякуляторной и сексуальной функциями.
Вышеперечисленные инструменты в большинстве случаев могут оказывать благотворный эффект на целостность цепочек генома мужской половой клетки. Но есть категория пациентов с аномально высокими значениями фрагментации, при которых данные лечебные манипуляции оказываются безуспешными. Сохраняющийся высокий показатель ДНК-фрагментации сперматозоидов может стать причиной повторных неудачных протоколов ЭКО/ИКСИ, обусловленных низким качеством полученных эмбрионов, остановкой их развития после 3-х суток культивирования или выкидышами на ранних сроках гестации.
Несколько экспериментальных исследований показали, что сперматозоиды могут повреждаться свободными радикалами на посттестикулярном уровне в процессе пассажа по семявыносящим путям. При этом было доказано, что у мужчин с данной формой патоспермии, показатель фрагментации тестикулярных сперматозоидов в 2,5-3 раза ниже эякуляторных. Клинические работы показали, что при мужском факторе бесплодия, обусловленном аномально высоким показателем фрагментации ДНК, использование тестикулярных гамет для оплодотворения в процедуре ИКСИ, в сравнении с эякуляторными, приводит к достоверно лучшим показателям рождаемости. [Moskovtsev SI1, Jarvi K, Mullen JB, Cadesky KI, Hannam T, Lo КС. Testicular spermatozoa have statistically significantly lower DNA damage compared with ejaculated spermatozoa in patients with unsuccessful oral antioxidant treatment. Fertil Steril. 2010 Mar 1;93(4):1142-6. Esteves SC. et al. Comparison of reproductive outcome in oligozoospermic men with high sperm DN A fragmentation undergoing intracytoplasmic sperm injection with ejaculated and testicular sperm. Fertil Steril. 2015 Dec;104(6):1398-405; Коршунов M.H., Коршунова E.C., Даренков С.П. Клиническая эффективность использования тестикулярных сперматозоидов в программах вспомогательных репродуктивных технологий при высоком показателе ДНК-фрагментации. Урологические ведомости. 2017 Т. 7 (S):57-58]. Последний источник является наиболее близким аналогом заявленного изобретения. Данный метод лечения оптимален для пациентов, имеющих в анамнезе безуспешные попытки консервативной терапии и неудачные протоколы вспомогательных репродуктивных технологий. Важным моментом является то, что в описываемой литературе сперматозоиды получали по стандартным методикам (путем закрытых и открытых биопсийных вмешательств) без оценки васкуляризации сегментов яичка - «вслепую». Однако, возможно различие в качестве продуцируемых сперматозоидов в сегментах testis. Сперматогенез сложный многоэтапный процесс и на этапах дифференцировки и пролиферации высокочувствителен к гипоксическим воздействиям. В процессе выполнения биопсийного пособия «вслепую» не представляется возможным определить участок яичка для забора с потенциально хорошим качеством сперматозоидов.
Допплерографическое ультразвуковое исследование является признанным методом диагностики в андрологической практике. Показано, что показатели кровотока органов мошонки напрямую коррелируют с функцией гонад и фертильностью. [Schurich М, Aigner F, Frauscher F, Pallwein L. The role of ultrasound in assessment of male fertility. European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology. 2009;144 Suppl 1:S192-8]. Так, предоперационное допплерографическое ультразвуковое сканирование яичек может быть полезным инструментом при обследовании пациентов с обструктивной и необструктивной формами азооспермии, так как позволяет определить область, наиболее благоприятную для поиска или забора сперматозоидов хирургическим путем, являясь своего рода предиктором. [Nowroozi MR, Ayati М, Amini Е, Radkhah K, Jamshidian Н, Delpazir A, Ghasemi F, Rajabzadeh Kanafi A. Assessment of testicular perfusion prior to sperm extraction predicts success rate and decreases the number of required biopsies in patients with non-obstructive azoospermia. Int Urol Nephrol. 2015 Jan;47(l):53-8]. В случаях достаточной концентрации сперматозоидов в эякуляте, их нахождение в яичках не представляет технических сложностей. Существующий метод мультифокальной биопсии яичка, основанный на заборе гамет из разных участков, позволяет эмбриологу выбрать сперматозоиды для оплодотворения по внешним качествам. Но морфологическая характеристика не коррелирует с эффективность процедур ЭКО/ИКСИ, в отличие от целостности структуры генома гаметы, что может быть напрямую связано с состоянием кровотока. К тому же прицельная биопсия позволяет избежать избыточной травматизации органа.
В литературе не выявлены сведения о корреляции скоростных показателей кровотока в артериях яичка с показателем фрагментации сперматозоидов.
Задачей настоящего исследования является разработка способа эффективного лечения мужского бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий при высоком показателе ДНК-фрагментации эякуляторных сперматозоидов.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение потенциально качественного биоматериала для оплодотворения яйцеклеток при мужском факторе бесплодия, обусловленным высоким показателем ДНК-фрагментации эякуляторных гамет за счет прицельного хирургического извлечения сперматозоидов из изначально фиксированного сектора вмешательства, с учетом данных допплерографии яичек.
Для решения задачи при оплодотворении в процедуре ЭКО/ИКСИ используют гаметы, полученные методом открытой биопсии из участка яичка с наилучшими показателями интрапаренхиматозного кровотока, то есть с показателем максимальной систолической скорости кровотока в субкапсулярных отделах внутрияичковых артерий не менее 5,0 см/сек. Полученные из такого участка яичка сперматозоиды имеют уровень фрагментации ДНК менее 15%.
При этом на этапе подготовки супружеской пары к процедуре вспомогательных репродуктивных технологий мужчине выполняется ультразвуковое допплерографическое исследование органов мошонки. Определение кровоснабжения дает возможность оперирующему хирургу прицельно выбрать зону для забора сперматозоидов из яичек.
Способ осуществляют следующим способом.
На этапе предоперационной подготовки пациенту выполняют ультразвуковое исследование органов мошонки с использованием спектрального датчика в режиме допплерографии. Яички полипозиционно делят по секторам (фигура 1). Сканирование проводится по всей проекции органа: передняя и задняя поверхности, медиальная, латеральная области, верхний, средний и нижний сегменты. Регистрируется скорость систолического кровотока в субкапсулярных отделах внутрияичковых артерий (см/сек) в каждом секторе. Результаты фиксируются на бланке (фигура 2).
В день трансвагинальной пункции яичников и получения ооцитов выполняется биопсия яичка. Выбор стороны проведения операции изначально основывается на результатах допплерографии: с максимальными значениями интрапаренхиматозного кровоснабжения.
Продольным срединным разрезом острым и тупым способом выделяется яичко до белочной оболочки. В соответствии с маркировкой анатомо-топографического состояния кровотока в сегменте с показателем максимальной систолической скорости кровотока в субкапсулярных отделах внутрияичковых артерий не менее 5,0 см/сек прицельно иссекается небольшой участок тестикулярной ткани. После предварительной микроскопической оценки эмбриологом материала в случае достаточного количества забранных сперматозоидов для оплодотворения ооцитов, выполняется послойное ушивание оболочек яичка. Полученные сперматозоиды после предварительной обработки в специальных средах используются в процедуре ИКСИ. Таким образом, прицельное хирургическое извлечение сперматозоидов с изначально фиксированным сектором вмешательства, с учетом данных допплерографии яичек, позволяет получить потенциально качественный биоматериал для оплодотворения яйцеклеток при мужском факторе бесплодия, обусловленным высоким показателем ДНК-фрагментации эякуляторных гамет.
Пример номер 1.
Супружеская пара с диагнозом: Первичное бесплодие. Мужской фактор. Астенотератозооспермия. Высокий показатель ДНК-фрагментации сперматозоидов неясного генеза. Неудачные попытки ЭКО/ИКСИ. Возраст пациента - 42 года. Длительность бесплодного брака 10 лет. Репродуктивный статус супруги без патологии. По результатам спермиологического исследования выраженная астенозооспермия, незначительное снижение процента морфологически нормальных сперматозоидов и высокие цифры индекса ДНК-фрагментации гамет - 65%. При обследовании мужчины данных за соматическую патологию и заболевания репродуктивного тракта не выявлено. Вредные привычки отрицает. До обращения в анамнезе у пары 2 неудачных попытки ЭКО/ИКСИ, в обоих случаях наблюдалась высокая степень фрагментации эмбрионов (эмбрионы b, be и с классов), беременность после эмбриотрансферов не наступила. Проведение антиоксидантной терапии улучшило параметры эякулята, как подвижность, так и число морфологически нормальных форм сперматозоидов. Существенной положительной динамики индекса фрагментации ДНК сперматозоидов не наблюдалось - он варьировал от 50-60%. Учитывая положительную динамику параметров эякулята, принято решение о проведении повторного протокола ЭКО/ИКСИ. В 3 попытке были получены эмбрионы со средней степенью фрагментации (класс ab и b), после переноса эмбриона беременность не наступила. На основании анализа предыдущих попыток ЭКО, решено провести протокол ЭКО/ИКСИ с использованием тестикулярных сперматозоидов. На предоперационном этапе выполнено цветное ультразвуковое допплерографическое исследование яичек с полипозиционным разделением по секторам. Показатели скорости систолического кровотока субкапсулярных отделов внутрияичковых артерий (см/сек) зафиксированы в каждом секторе. Результаты анатомо-топографически регистрированы. В день трансвагинальной пункции, после короткого протокола стимуляции супруги и получения 8 ооцитов качества МИ, выполнена открытая биопсия левого яичка. Выбор стороны вмешательства был обусловлен показателями гемодинамики. Биопсия яичка выполнена по общепринятой методике. Интраоперационно, в соответствии с данными секторальной допплерографии, из двух сегментов яичка (с максимальным и минимальным кровоснабжением - 5,4 и 2,5 см/сек соответственно) в достаточной концентрации получены сперматозоиды. На этапе предварительной микроскопической оценки различий в качестве материала зафиксировано не было. Гаметы помещены в 2 маркированные чашки с буферной средой - с учетом показателей перфузии. Часть сперматозоидов из обеих чашки в равных долях использована для оплодотворения яйцеклеток методом ИКСИ, остальной биоматериал проанализирован на степень фрагментации методом sperm chromatin dispersion test. Результат анализа тестикулярных сперматозоидов на фрагментацию составили 12% и 18% из участков с большими и меньшими значениями систолического кровотока в яичке соответственно. Число и качество эмбрионов на пятые сутки культивирования были достоверно выше при использовании гамет, полученных из локуса яичка с лучшим кровоснабжением, вследствие чего данные эмбрионы были использовали для переноса в полость матку. Зафиксирована клиническая беременность. Роды в срок 39 недель.
Пример номер 2.
Супружеская пара с диагнозом: Вторичное бесплодие. Мужской фактор. Олигоастенозооспермия. Высокий показатель ДНК-фрагментации сперматозоидов неясного генеза. Неудачная попытки ЭКО/ИКСИ. Спорадическая потеря беременности. Возраст пациента - 32 года. Длительность бесплодного брака 7 лет. Репродуктивный статус супруги в пределах нормы. По результатам спермиологического исследования олигоастенозооспермия и высокий показатель ДНК-фрагментации сперматозоидов - 42%. Мужчина соматически здоров. Вредных привычек нет. В анамнезе одна попытка ЭКО/ИКСИ с низким показателем эмбриогенеза: остановка развития эмбрионов и формирование одной бластоцисты качества 2 ВС.После переноса эмбриона зафиксирована клиническая беременность, замершая на сроке 4-6 недель гестации. Проведение антиоксидантной терапии и назначение фолликулостимулирующего гонадотропина не улучшило параметры эякулята, фрагментация сперматозоидов составила 41%. Следующий протокол ЭКО/ИКСИ выполнялся с использованием тестикулярных сперматозоидов. На дооперационном этапе проведено цветное ультразвуковое допплерографическое исследование яичек с полипозиционным разделением по секторам. Показатели скорости систолического кровотока субкапсулярных отделов внутрияичковых артерий (см/сек) зафиксированы в каждом секторе. В день трансвагинальной пункции, после короткого протокола стимуляции супруги и получения 12 ооцитов качества МП, выполнена открытая биопсия правого яичка. Интраоперационно, в соответствии с данными секторальной допплерографии, из трех сегментов яичка (с максимальным, средним и минимальным кровоснабжением - 5,1; 4,7 и 2,2 см/сек соответственно) в достаточном количестве получены сперматозоиды. Предварительная световая микроскопическая оценка различий в качестве материала не зафиксировала. Гаметы помещены в 3 маркированные чашки (с учетом показателей гемодинамики) с буферной средой. Сперматозоиды из 3 участков в равных долях использованы для оплодотворения яйцеклеток методом ИКСИ, остальной биоматериал проанализирован на степень фрагментации методом sperm chromatin dispersion test. Результат анализа тестикулярных сперматозоидов на фрагментацию составили 10, 15 и 20% из участков с большим, средний и меньшим значениями систолического кровотока соответственно. Сравнительный анализ показал, что, несмотря на то, что показатель оплодотворения и число эмбрионов статистически не различались при использовании сперматозоидов из разных сегментов, качество эмбрионов было выше при оплодотворении гаметами, полученными из локуса яичка с лучшим кровоснабжением (более 5 см/сек). После эмбриотрансфера развилась клиническая беременность. Роды в срок 38 недель.