ИЗМЕРЕНИЕ ПОТЕРИ МЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК, СВЯЗАННОЙ С РЕПЛИКАЦИЕЙ

1. Способ, предусматривающий:
a) идентификацию исследуемой клетки или образца ткани, для которых желательно определение потери метилирования геномной ДНК связанной с репликацией;
(x)
(x)
b) получение, в устройстве обработки данных, данных о метилировании динуклеотидной последовательности CpG для геномной ДНК, полученной из исследуемой клетки или образца исследуемой ткани, причем геномная ДНК содержит высокометилированные домены (HMD) и частично метилированные домены (PMD), причем каждый такой динуклеотид CpG представляет собой единственную динуклеотидную последовательность CpG в мотиве последовательности геномной ДНК nWCpGWn (мотив Solo-WCGW) по меньшей мере одного PMD, и где W=А или Т, n=А или G, или С, или Т, и х≥9;
c) определение, в устройстве обработки данных, на основе данных метилирования динуклеотидной последовательности CpG среднего значения метилирования динуклеотида CpG или значения, связанного с ним, для множества последовательностей мотива Solo-WCGW по меньшей мере одного PMD, для получения величины потери метилирования ДНК связанной с репликацией, причем предоставленное измерение связанной с репликацией потери метилирования ДНК отражает совокупное количество клеточных делений или митотическую историю; и
d) на основе предоставленной величины потери метилирования ДНК, связанной с репликацией получение, в устройстве обработки данных, заключения о состоянии исследуемой клетки или образца ткани.
2. Способ по п. 2, при котором получение данных метилирования геномной динуклеотидной последовательности CpG предусматривает исключение, в устройстве обработки данных, из большего набора данных метилирования геномных CpG данных метилирования динуклеотидных последовательностей CpG, не входящих в последовательность мотивов Solo-WCGW по меньшей мере одного PMD.
3. Способ по любому из пп. 1, 2, при котором получение данных метилирования геномной динуклеотидной последовательности CpG предусматривает исключение, в устройстве обработки данных, из большего набора данных метилирования геномных CpG данных метилирования последовательностей не межгенных мотивов Solo-WCGW по меньшей мере одного PMD.
4. Способ по любому из пп. 1-3, при котором получение данных метилирования динуклеотидной последовательности геномного CpG предусматривает исключение, в устройстве обработки данных, из большего набора данных метилирования геномного CpG данных метилирования меченных гистоном H3K36me3 последовательностей мотива Solo-WCGW или последовательностей мотива Solo-WCGW, попадающих в транскрибируемые генные тела по меньшей мере одного PMD.
5. Способ по любому из пп. 1-4, при котором множество последовательностей мотивов Solo-WCGW по меньшей мере одного PMD расположены в одном или нескольких PMD одной хромосомы.
6. Способ по любому из пп. 1-4, при котором множество последовательностей мотива Solo-WCGW по меньшей мере одного PMD расположено между несколькими хромосомами или среди них.
7. Способ по любому из пп. 1-6, при котором х представляет собой значение, выбранное из группы, состоящей по меньшей мере из 9, по меньшей мере из 14, по меньшей мере из 19, по меньшей мере из 24, по меньшей мере из 29, по меньшей мере из 34, по меньшей мере из 39, по меньшей мере из 44, по меньшей мере из 49, по меньшей мере из 54 и по меньшей мере из 59.
8. Способ по любому из пп. 1-7, при котором х представляет собой значение в диапазоне, выбранном из группы, состоящей из приблизительно 9-49, 9-99, 9-149, 9-199, 14-49, 14-99, 14-149, 14-199, 19-49, 19-99, 19-149, 19-199, 24-49, 24-99, 24-149, 24-199, 29-49, 29-99, 29-149, 29-199, 34-49, 34-99, 34-149, 34-199, 39-49, 39-99, 39-149, 39-199, 44-49, 44-99, 44-149, 44-199, 49-99, 49- 149, 49-199 54-99, 54-149, 54-199, 59-99, 59-149, 59-199 и любых поддиапазонов из предыдущих диапазонов.
9. Способ по любому из пп. 1-8, при котором х составляет 34±25 (например, в диапазоне 9-59, или при котором х составляет 34±15 (например, в диапазоне 19-49).
10. Способ по любому из пп. 1-9, при котором х составляет 34 или приблизительно 34.
(x-1)
(x-1)
11. Способ по любому из пп. 1-10, при котором мотив Solo-WCGW содержит последовательность nmWCpGWGn, и где W=А или Т, n=А или G, или С, или Т, m=С или А и х≥9.
(x-1)
(x-1)
12. Способ по любому из пп. 1-11, при котором мотив Solo-WCGW содержит последовательность nCWCpGWGn, и где W=А или Т, n=А или G, или С, или Т и х≥9.
13. Способ по любому из пп. 1-12, при котором по меньшей мере один PMD характеризуется, по меньшей мере частично, поздним временем репликации и/или локализацией ядерной пластинки и/или Hi-C-определенным гетерохроматическим компартментом В.
14. Способ по любому из пп. 1-13, при котором по меньшей мере один PMD, по меньшей мере частично, определяется путем оценки, в устройстве обработки данных, данных метилирования динуклеотидной последовательности CpG последовательностей мотива Solo-WCGW.
15. Способ по любому из пп. 1-14, при котором по меньшей мере один PMD, по меньшей мере частично, определяется путем оценки в устройстве обработки данных стандартного отклонения (SD) данных метилирования динуклеотидной последовательности CpG последовательностей мотивов Solo-WCGW в наборе образцов и/или путем оценки в устройстве обработки данных ковариации между множественными последовательностями мотивов Solo-WCGW в наборе образцов.
16. Способ по п. 15, при котором SD гипометилирования PMD solo-WCGW бимодально распределяется в бинах размером 100 т.п.н.
17. Способ по любому из пп. 1-16, при котором по меньшей мере один PMD содержит общий PMD, совместно содержащийся во множестве различных типов клеток или тканей или среди них, или представляет собой PMD, инвариантный для определенного типа клеток.
18. Способ по любому из пп. 1-16, при котором по меньшей мере один PMD включает в себя общий PMD, совместно содержащийся в нормальных и раковых клетках или тканях или среди них.
19. Способ по любому из пп. 1-16, при котором по меньшей мере один PMD включает в себя общий PMD, совместно содержащийся в большинстве здоровых типов тканей млекопитающих, начиная с внутриутробного развития.
20. Способ по любому из пп. 1-19, при котором по меньшей мере один PMD содержит специфический для типа клетки PMD.
21. Способ по любому из пп. 1-20, при котором связанная с репликацией потеря метилирования ДНК отражает специфическую для конкретного типа клеток скорость репликативного/митотического цикла.
22. Способ по п. 21, дополнительно предусматривающий определение присутствия геномной ДНК высокорепликативного типа целевых клеток в образце, содержащем геномную ДНК нескольких типов клеток, на основании специфической для конкретного типа клетки скорости связанной с репликацией потери метилирования ДНК.
23. Способ по любому из пп. 1-22, при котором совокупное число клеточных делений или митотическая история относятся к ранней стадии эмбрионального развития.
24. Способ по любому из пп. 1-23, при котором связанная с репликацией потеря метилирования ДНК отражает хронологический возраст клетки или образца ткани.
25. Способ по любому из пп. 1-24, при котором клетка или образец ткани представляет собой раковую клетку или образец раковой ткани.
26. Способ по любому из пп. 1-25, при котором геномная ДНК, полученная из клетки или образца ткани, включает в себя геномную ДНК, полученную из биопсии ткани, или внеклеточную ДНК, полученную из крови или других неинвазивных образцов, включая в себя, без ограничения, мочу, кал, слюну и др.
27. Способ по любому из пп. 1-26, при котором множество последовательностей мотивов Solo-WCGW по меньшей мере одного PMD представляет собой число, выбранное по меньшей мере из 5, по меньшей мере из 10, по меньшей мере из 100, по меньшей мере из 500, по меньшей мере из 1000, по меньшей мере из 1500, по меньшей мере из 2000, по меньшей мере из 5000 и по меньшей мере из 10000.
28. Способ по любому из пп. 1-27, при котором получение данных о метилировании динуклеотидной последовательности CpG включает в себя получение данных о метилировании динуклеотидной последовательности CpG из менее чем полного считывания генома.
29. Способ по любому из пп. 1-28, при котором получение данных о метилировании динуклеотидной последовательности CpG происходит из геномной ДНК отдельной клетки.
30. Способ по любому из пп. 1-29, при котором степень связанной с репликацией потери метилирования ДНК варьируется между типами клеток или типами тканей, отражая специфическую для типа клетки или ткани скорость связанной с репликацией потери метилирования ДНК.
31. Способ по любому из пп. 1-30, при котором множество последовательностей мотивов Solo-WCGW по меньшей мере одного PMD содержат склонные к гипометилированию мотивы последовательности Solo-WCGW, выбранные для минимизации формы ДНК в виде пропеллерного поворота.
32. Способ идентификации связанной с репликацией потери метилирования ДНК целевого типа клеток в образце, содержащем геномную ДНК нескольких типов клеток, предусматривающий:
a) идентификацию исследуемого образца, содержащего геномную ДНК нескольких типов клеток, включая в себя геномную ДНК целевого типа клеток; и
b) определение, в устройстве обработки данных, для геномной ДНК из исследуемого образца потери метилирования ДНК связанной с репликацией, в соответствии со способом по любому из пп. 1-31, причем по меньшей мере один PMD содержит специфический для целевого типа клетки PMD для измерения специфической для целевого типа клетки связанной с репликацией потери метилирования ДНК.
33. Способ по п. 32, при котором присутствие геномной ДНК целевой клетки идентифицируют в устройстве обработки данных на основании присутствия специфической для целевого типа клетки связанной с репликацией потери метилирования ДНК.
34. Способ по любому из пп. 32-33, при котором по меньшей мере один PMD содержит специфический для типа клетки PMD для целевого типа клетки и для каждого из других типов клеток образца, чтобы получить величину специфической для типа клетки потери метилирования ДНК связанной с репликацией для целевой клетки и для каждого из других типов клеток в образце.
35. Способ по п. 34, при котором присутствие геномной ДНК нескольких типов клеток идентифицируется в устройстве обработки данных на основании наличия соответствующих специфических для типа клетки связанных с репликацией потерь метилирования ДНК.
36. Способ по п. 35, дополнительно предусматривающий идентификацию, в устройстве обработки данных, наиболее гипометилированных типов клеток в образце.
37. Способ по любому из пп. 32-36, при котором геномная ДНК включает в себя геномную ДНК, полученную из биопсий тканей, или внеклеточную ДНК, полученную из крови или других неинвазивных образцов, включая в себя, без ограничения, мочу, стул, слюну, и т.п.
38. Способ обеспечения измерения митотической истории/возраста клетки или образца ткани, предусматривающий:
a) идентификацию исследуемой клетки или образца ткани, для которых желательно определение митотической истории/возраста; и
b) определение, в устройстве обработки данных, геномной ДНК из исследуемой клетки или образца исследуемой ткани потери метилирования ДНК связанной с репликацией в соответствии со способом по любому из пп. 1-31, для получения величины митотической истории/возраста для исследуемой клетки или исследуемой ткани (исследуемый митотический возраст).
39. Способ по п. 38, дополнительно предусматривающий сравнение, в устройстве обработки данных, величины митотической истории/возраста исследуемой клетки или исследуемой ткани, определенных на стадии b), с одним или несколькими контрольными значениями митотической истории/возраста, полученными с использованием того же способа, что и на стадии b), для геномной ДНК нормальной соответствующей клетки/ткани, характеризующейся известной репликативной историей, и приписывание митотической истории/возраста исследуемой клетке или исследуемой ткани.
40. Способ по п. 39, при котором нормальная соответствующая клетка/ткань, характеризующаяся известной репликативной историей, включает в себя первичную клеточную линию или иммортализованную первичную клеточную линию, для которой митотическая история/возраст откалиброваны по количеству пассажей с использованием способа по любому из пп. 1-31.
41. Способ по любому из пп. 38-40, при котором определенная митотическая история/возраст клетки или ткани представляет собой специфическую для типа клетки или специфическую для типа ткани митотическую историю/возраст.
42. Способ определения хронологического возраста образца клетки или ткани, предусматривающий:
a) идентификацию исследуемой клетки или образца ткани, для которого требуется определение хронологического возраста;
b) определение, в устройстве обработки данных, для геномной ДНК из исследуемой клетки или образца исследуемой ткани связанной с репликацией потери метилирования ДНК в соответствии со способом по любому из пп. 1-31, чтобы получить величину митотической истории/возраста для исследуемой клетки или исследуемой ткани (исследуемый митотический возраст); и
c) определение хронологического возраста исследуемой клетки или исследуемой ткани путем сравнения, в устройстве обработки данных, исследуемого митотического возраста с одним или несколькими контрольными значениями митотического возраста, полученными с использованием того же способа, что и в а), для геномной ДНК нормальной, соответствующей клетки и/или соответствующей ткани контрольной популяции, рассчитанной в устройстве обработки данных в хронологическом возрастном диапазоне, и присвоение хронологического возраста исследуемой клетке или исследуемой ткани.
43. Способ по п. 42, при котором фактический хронологический возраст исследуемой клетки или исследуемого образца известен и меньше, чем хронологический возраст, определенный на стадии b), что обеспечивает измерение ускоренного старения.
44. Способ по п. 42 или 43, причем способ является частью судебно-медицинской экспертизы.
45. Способ определения повышенного риска состояний, связанных с ускоренным репликативным циклом или старением, предусматривающий:
a) идентификацию исследуемой клетки или образца ткани, для которых желательно определение повышенного риска состояний, связанных с ускоренным репликативным циклом или старением;
b) измерение, в устройстве обработки данных, для геномной ДНК из исследуемой клетки или образца исследуемой ткани, характеризующегося известным хронологическим возрастом, связанной с репликацией потери метилирования ДНК в соответствии со способом по любому из пп. 1-31, чтобы получить величину митотического возраста исследуемой клетки или исследуемой ткани (исследуемый митотический возраст); и
c) определение того, что существует повышенный риск состояний, связанных с ускоренным репликативным циклом или старением, путем сравнения на устройстве обработки данных исследуемого митотического возраста с контрольными значениями митотического возраста, полученными с использованием того же способа, что и в а), для геномной ДНК нормальной, соответствующей клетки или соответствующей ткани контрольной популяции, характеризующейся тем же хронологическим возрастом, что и исследуемая клетка или исследуемая ткань, и обнаружение в устройстве обработки данных того, что исследуемый митотический возраст больше, чем соответствующий по возрасту контрольный митотический возраст.
46. Способ по п. 45, при котором состояние, связанное с ускоренным репликативным циклом или старением, выбрано из группы, состоящей из рака, нейродегенеративного заболевания, сердечно-сосудистого заболевания, желудочно-кишечного заболевания, аутоиммунных заболеваний и прогерии.
47. Способ определения повышенного риска у субъекта состояний, связанных с ускоренным репликативным циклом или старением, предусматривающий:
a) определение, в устройстве обработки данных, связанной с репликацией потери метилирования геномной ДНК для исследуемой клетки или исследуемой ткани исследуемого субъекта;
b) сравнение, в устройстве обработки данных, связанной с репликацией потери метилирования геномной ДНК, определенной в а), с соответствующей по возрасту нормальной контрольной клеткой или тканью; и
c) на основе сравнения в части b), заключение, на устройстве обработки данных, что субъект, характеризующийся большей связанной с репликацией потерей метилирования геномной ДНК, по сравнению с таковой соответствующего по возрасту контроля, является субъектом, характеризующимся повышенным риском состояний, связанных с ускоренным репликативным циклом или старением,
причем связанную с репликацией потерю метилирования геномной ДНК определяют способом по любому из пп. 1-31.
48. Способ по п. 47, при котором состояние, связанное с ускоренным репликативным циклом или старением, выбрано из группы, состоящей из рака, нейродегенеративного заболевания, сердечно-сосудистого заболевания, желудочно-кишечного заболевания, аутоиммунных заболеваний и прогерии.
49. Способ оценки поддержания метилирования в стволовых клетках, предусматривающий:
идентификацию исследуемого образца стволовых клеток;
определение, в устройстве обработки данных, величины потери метилирования геномной ДНК связанной с репликацией способом по любому из пп. 1-31; и
на основе величины потери метилирования геномной ДНК связанной с репликацией, заключение, в устройстве обработки данных, о степени поддержания метилирования по сравнению с нормальным значением контрольных стволовых клеток.
50. Способ по п. 49, при котором стволовая клетка выбрана из группы, состоящей из эмбриональных стволовых клеток (ESC), индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) и мезенхимальных стволовых клеток (MSC).
51. Способ структурного определения частично метилированного домена (PMD) геномной ДНК, предусматривающий:
a) идентификацию геномной ДНК, для которой требуется по меньшей мере одно структурное определение PMD;
(x)
(x)
b) получение, в устройстве обработки данных, данных метилирования динуклеотидной последовательности CpG для геномной ДНК, причем каждый такой динуклеотид CpG представляет собой единственную динуклеотидную последовательность CpG в пределах мотива последовательности геномной ДНК nWCpGWn (мотив Solo-WCGW) по меньшей мере одного PMD, и где W=А или Т, n=А, или G, или С, или Т и х≥9; и
c) определение, в устройстве обработки данных, структуры PMD на основе данных метилирования динуклеотидной последовательности CpG.
52. Способ по п. 51, при котором по меньшей мере один PMD, по меньшей мере частично, определяется путем оценки в устройстве обработки данных стандартного отклонения (SD) данных метилирования динуклеотидной последовательности CpG последовательностей мотива Solo-WCGW.
53. Способ по п. 52, при котором SD гипометилирования PMD solo-WCGW бимодально распределен в пределах 100 т.п.н.
54. Способ разработки митотических часов, предусматривающий:
a) идентификацию исследуемой клетки, для которой желательно определение митотических часов;
b) создание условий для деления исследуемой клетки;
c) определение количества эффективных делений клеток в исследуемой клетке в одну или несколько временных точек;
(x)
(x)
d) получение, в устройстве обработки данных, данных о метилировании динуклеотидной последовательности CpG для геномной ДНК, полученной из исследуемой клетки, во временные точки, причем геномная ДНК содержит высокометилированные домены (HMD) и частично метилированные домены (PMD), причем каждый такой динуклеотид CpG представляет собой единственную динуклеотидную последовательность CpG в мотиве последовательности геномной ДНК nWCpGWn (мотив Solo-WCGW) по меньшей мере одного PMD, и где W=А или Т, n=А или G, или С, или Т и х≥9;
e) на основе данных метилирования динуклеотидной последовательности CpG, определение в устройстве обработки данных среднего значения метилирования динуклеотида CpG или значения, связанного с ним, в каждую из временных точек для множества последовательностей мотивов Solo-WCGW по меньшей мере одного PMD, чтобы получить величину потери метилирования ДНК связанной с клеточной репликацией в каждую из временных точек;
f) сопоставление в устройстве обработки данных эффективных делений клеток в каждую из временных точек с величиной потери метилирования ДНК, связанной с клеточной репликацией в каждую из временных точек; и
g) если корреляция на стадии корреляции статистически значима, определение величины потери метилирования ДНК, связанной с клеточной репликацией в качестве митотических часов.
55. Способ по п. 54, при котором стадия корреляции включает в себя вычисление регрессии в устройстве обработки данных.
56. Способ по п. 55, при котором расчет регрессии определяется с помощью модели регрессии эластичной сети или модели независимой регрессии.
57. Способ по п. 54, при котором каждая из одной или нескольких временных точек представляет собой пассаж клетки in vitro.
58. Способ по п. 57, при котором исследуемая клетка проходит через определенные количества пассажей, а временные точки являются номерами пассажей.
59. Способ по п. 58, дополнительно предусматривающий экстракцию ДНК при каждом номере пассажа и выполнение бисульфитной конверсии и получения библиотеки.
60. Способ по п. 59, дополнительно предусматривающий стадию, на которой в устройстве обработки данных определяют калибровочную кривую числа пассажей.
61. Способ по п. 54, при котором условия соответствуют животному, и при котором исследуемая клетка делится с образованием клеточной массы.
62. Способ по п. 61, при котором стадия определения включает в себя измерение объема клеточной массы в одну или несколько временных точек и при котором увеличение объема клеточной массы во временные точки отражает увеличение количества эффективных делений клеток.