Динамика изменений концентраций свободных аминокислот в пейровых бляшках после введения животным Инфезола40

УДК 612.017.1: 577.112.3

ДИНАМИКА ИЗМЕНЕНИЙ КОНЦЕНТРАЦИЙ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ В ПЕЙРОВЫХ БЛЯШКАХ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ЖИВОТНЫМ ИНФЕЗОЛА40

© Шейбак В.М, Павлюковец А.Ю., Смирнов В.Ю., Шейбак Л.Н., Жмакин А.И.

Гродненский государственный медицинский университет, Республика Беларусь, 230009, Гродно, ул. Горького, 80

Резюме

Цель. Анализ изменений концентраций свободных аминокислот в пейеровых бляшках крыс в динамике после однократного внутрижелудочного введения Инфезола40.

Методика. Эксперимент проводили на 30 беспородных крысах, животным опытных групп однократно внутрижелудочно вводили раствор Инфезола40 в дозе 20 мл/кг массы, декапитацию животных осуществляли через 10, 20, 30 или 45 мин., соответственно. Для анализа использовали пейеровы бляшки, определение свободных аминокислот производили методом обращеннофазной ВЭЖХ.

Результаты. В результате исследование установлено, что внутрижелудочное введение раствора Инфезола40 повышает относительное количество протеиногенных аминокислот в пейеровых бляшках. В первые 20 мин. после введения раствора аминокислот увеличивается общее количество протеиногенных аминокислот, однако уже через 30 мин. номинальный эффект отсутствует, а через 45 мин. выявлено снижение концентраций аспарагина, серина, глутамина и треонина.

Заключение. Таким образом, изменения концентраций свободных аминокислот в пейеровых бляшках после однократного внутрижелудочного введения Инфезола40 являются следствием активации клеток пейеровых бляшек.

Ключевые слова: крысы, пейеровы бляшки, свободные аминокислоты, Инфезол40

DYNAMICS OF FREE AMINO ACIDS CONCENTRATIONS CHANGES IN PEYER'S PATCHES AFTER INTRODUCTION OF INFESOL40

Shejbak V.M, Pavlyukovec A.Yu., Smirnov V.Yu., Shejbak L.N., Zhmakin A.I.

Grodno State Medical University, 80, Gorky St., 230009, Grodno, Republic of Belarus

Abstract

Objective. The aim of the study was to analyze the changes in the concentrations of free amino acids in Peyer's patches of rats in dynamics after a single intragastric administration of Infezol40.

Methods. The experiment was carried out on 30 rats; the animals of the experimental groups were injected intragastrically with the solution of Inphezol40 at a dose of 20 ml/kg of body weight. The animals were decapitated after 10 min, 20 min, 30 min or 45 min. Peyer's patches were used for the analysis, free amino acids were determined by reversed-phase HPLC.

Results. The results showed that in the Peyer's patches after intragastric administration of the solution Infezola40 the relative amount of proteinogenic amino acids increases. In the first 20 minutes after the injection of the amino acid solution, the total amount of proteinogenic amino acids increases, but after 30 minutes the nominal effect is absent, and after 45 minutes the concentration of asparagine, serine, glutamine and threonine is decreased.

Conclusion. Thus, changes in the concentrations of free amino acids in Peyer's patches after a single intragastric administration of Infezol40 are the result of activation of Peyer's patch cells.

Keywords: rats, Peyer's patch, free amino acids, Infezol40Keywords: rats, Peyer's patch, free amino acids, Infezol40

Введение

Тонкий кишечник является не только местом абсорбции нутриентов, слизистую оболочку тонкого кишечника можно также рассматривать как большой сенсорный орган со сложным

взаимодействием между локализованными в этом компартменте нейронами, клетками иммунной системы и эндокринными клетками. В тонком кишечнике присутствует более 100 млн. нейронов, эндокринные клетки, синтезирующие около 100 биологически активных молекул, а клетки иммунной системы присутствующие в слизистой оболочке тонкого кишечника являются основным клеточным пулом этой системы в организме (70%) [4]. Этот многофункциональный комплекс отвечает за адекватную реакцию на поступающие нутриенты и внешние стимулы, обеспечивая синхронизированную во времени моторику, секрецию ферментов, а также защиту внутренней среды организма от вторжения патогенов. Например, после приема пищи эндокринные клетки тонкого кишечника выделяют холецистокинин, который, в свою очередь, стимулирует выделение пищеварительных ферментов поджелудочной железой, способствует активации нейронов стенки желчного пузыря и последующему высвобождению желчи в просвет кишечника [8]. Существенный вклад во взаимодействие и функционирование регуляторных систем тонкого кишечника вносит микробиом. Синтезируемые микробиотой короткоцепочечные жирные кислоты и гетероциклические молекулы, стимулируют образование клетками кишечника нейропептидов, которые являются сигнальными молекулами для иммуноцитов, экспрессирующих соответствующие рецепторы. Так при инициации локального иммунного ответа (например, во время микробной колонизации) миграция дендритных клеток в лимфатические узлы опосредована а1-адренергическими рецепторами [7].

В состав иммунной системы желудочно-кишечного тракта входят пейеровы бляшки, аппендикс и регионарные лимфоузлы, а также собственная пластинка (Ьашта ргорйа), эпителиальные клетки слизистой оболочки кишечника и интраэпителиальные лимфоциты [2, 6, 11]. Пейеровы бляшки представляют собой узелковые скопления лимфоидной ткани, состоящей, как и любые лимфоидные образования, из Т- и В-зон [3, 9].

Показано, что аминокислоты, помимо своей основной функции в качестве компонентов белковых молекул, являются энергетическими субстратами для клеток иммунной системы, а также необходимы для антиоксидантной защиты клеток [1, 12, 13]. Экзогенные аминокислоты, изменяя функциональную активность Т- и В-лимфоцитов, дендритных и тучных клеток, влияют на профиль продуцируемых про- и противовоспалительных цитокинов, модулируя интенсивность развития воспаления и окислительного стресса [10]. Таким образом, адекватная обеспеченность незаменимыми и функциональными (аргинин, глутамин, триптофан и таурин) аминокислотами имеет важное значение для развития иммунного ответа. Однако, в литературе отсутствуют сведения о динамике изменений аминокислотного профиля в пейеровых бляшках после энтерального введения смеси аминокислот.

Целью исследования явился анализ изменений концентраций свободных аминокислот в пейеровых бляшках крыс в динамике после однократного внутрижелудочного введения Инфезола40.

Методика

Эксперимент проводили на 30 беспородных крысах-самках массой 120-140 г, при свободном доступе животных к пище и воде. Животные были разделены на 5 групп: 1-й группе (контроль) внутрижелудочно вводили 0,9% раствор натрия хлорида, группам 2, 3, 4 и 5 - внутрижелудочно Инфезол40 (№ серии 42005012 BERLIN-CHEMIE MENARI №1, 12489, Германия) в дозе 20 мл/кг массы, что соответствует 800 мг смеси аминокислот на кг массы животного (табл. 1). Декапитацию животных осуществляли через 10, 20, 30 или 45 мин., соответственно.

Все опыты проведены в соответствии с Хельсинской декларацией о гуманном обращении с животными. На данное исследование получено разрешение Комитета по биомедицинской этике Гродненского государственного медицинского университета. Для анализа использовали пейеровы бляшки.

Определение свободных аминокислот производили методом обращеннофазной ВЭЖХ с о-фталевым альдегидом и 3-меркаптопропионовой кислотой с изократическим элюированием и детектированием по флуоресценции (231/445 нм). Определение ароматических аминокислот (тирозина и триптофана) проводили методом ион-парной ВЭЖХ с детектированием по природной флуоресценции (280/320 нм для тирозина и 280/340 нм - для триптофана). Все определения осуществляли с помощью хроматографической системы Agilent 1100, прием и обработка данных -с помощью программы Agilent ChemStation A10.01.

Математическая обработка данных проведена с помощью программы Statistica 6.0. Для полученных данных рассчитывали среднюю (М) и ошибку средней (m). Характеристика изучаемых показателей проводилась с помощью параметрической статистики (t-критерий

Стьюдента для независимых выборок). Для интегральной оценки метаболических эффектов вводимых соединений на фонд аминокислот, выполнен дискриминантный анализ, вычислены лямбда Вилкса и уровень статистической значимости значения, построен график проекции показателей на плоскость 2-х главных компонент.

Таблица 1. Содержание свободных аминокислот в

растворе Инфезола40 г/л

Заменимые аминокислоты Незаменимые аминокислоты

Аспарагиновая кислота 2,0

Глутаминовая кислота 5,0

Гистидин 1,35

Глицин 7,0

Аргинин 4,55

Аланин 4,0

Лейцин 2,75

Лизина 2,0

Результаты исследования и их обсуждение

Введение Инфезола40 во все изучаемые сроки увеличивает относительное количество протеиногенных аминокислот в пейеровых бляшках. Через 10 мин. в пейеровых бляшках увеличивается общее количество ароматических аминокислот, соотношение аргинин/цитруллин (табл. 2). Повышались концентрации гистидина (в 1,9 раза), глицина (в 1,8 раза), аргинина (в 1,6 раза), метионина (в 2,2 раза), триптофана (в 1,5 раза), фенилаланина (в 2,8 раза), изолейцина (в 1,6 раза). Одновременно снижались уровни треонина (на 25%) и таурина (на 16,5%) (табл. 3, рис. 1-3).

Таблица 2. Структура пула свободных аминокислот и их азотсодержащих производных в

пейеровых бляшках крыс, получавших Инфезол40 (20 мл/кг внутрижелудочно), M±m

Показатель Контроль Инфезол40

10 мин. 20 мин. 30 мин. 45 мин.

Общее количество протеиногенных аминокислот 27805±2153 32479±2428 35698±579* 29039±2183 29020±2274

Общее количество заменимых аминокислот 23322±1860 27149±1900 30388±507* 24734±1860 25337±1985

Заменимые / незаменимые аминокислоты 5,30±0,34 5,23±0,32 5,84±0,40 5,83±0,33 7,01±0,48*

Протеиногенные / азотсодержащие метаболиты аминокислот 0,84±0,04 1,16±0,08* 1,10±0,04* 0,95±0,03* 0,98±0,05*

Общее количество аминокислот с разветвленной углеродной цепью (АРУЦ) 1405±134 2043±280 2043±99* 1345±174 1260±100

Общее количество ароматических аминокислот (ААА) 566±71 1016±155* 990±79* 531±43 558±54

АРУЦ / ААА 2,54±0,12 2,04±0,09* 2,11±0,15* 2,54±0,26 2,28±0,09

Аргинин / орнитин 4,67±0,46 6,91±0,52* 6,02±0,37* 3,90±0,31 3,80±0,19

Аргинин / цитруллин 1,29±0,15 2,22±0,22* 1,73±0,22 1,28±0,15 1,12±0,15

Глутамат / глутамин 6,58±0,41 7,64±0,51 7,83±0,59 8,44±0,41* 8,83±0,19*

Примечание: * - статистически значимые различия относительно контрольной группы

Через 20 мин. после введения Инфезола40 в пейеровых бляшках увеличивалось общее количество протеиногенных аминокислот, заменимых аминокислот, аминокислот с разветвленной углеродной цепью, ароматических аминокислот, повышается соотношение аргинин/орнитин (табл. 2). Повышались концентрации заменимых аминокислот: глицина (в 2,2 раза), аргинина (в 1,5 раза), аланина (в 1,5 раза), незаменимых аминокислот: гистидина (в 1,8 раза), валина (в 1,3 раза), метионина (в 2,1 раза), фенилаланина (в 2,6 раза), изолейцина (в 1,6 раза), лейцина (в 1,5 раза) и метаболита аргинина - орнитина (в 1,2 раза). Одновременно снижаются уровни таурина (на 7,7%) и цистеиновой кислоты (на 12,5%) (табл. 3, рис. 1-5).

200,00

Рг

% 100,00 те

о

0,00

1

I

10

мин

20 мин

30 мин

45 мин

.........Общее

количество

протеиногенных

аминокислот

---Общее

количество заменимых аминокислот — * - Общее

количество

незаменимых

аминокислот

Рис. 1. Динамика изменений общего количества свободных протеиногенных аминокислот в пейеровых бляшках после введения Инфезол40. * - статистически значимые различия относительно контрольной группы

# ^ ^ ^ # ^

-Треонин

Валин

&

Изолеицин ^ Лейцин

200

л §

р-

5 юо

ас

*

.1

-1

# ^ Г # ^

Дспартэт Глутамат Аспарагин

— — Глутамин

- - - Алании

Рис. 2. Динамика изменений концентраций треонина, валина, изолейцина и лейцина

200

о 100 х

о

ь4

......... Цитруллии

-"—Аргинин -- Орнитин

200

100

- Фосфо этанол а мин

Этаноламин

¡^ ^

йГ «Г сГ Ф Ч3 <§? ь?

Рис. 3. Динамика изменений концентраций аргинина, цитруллина и орнитана

Однократное введение Инфезола40 через 30 мин. увеличивало соотношение глутамат/глутамин (табл. 2). Среди индивидуальных показателей свободных аминокислот и их производных снижалась концентрация цистеиновой кислоты (на 33%) (табл. 3, рис. 1-3).

Через 45 мин. увеличивается относительное количество заменимых аминокислот и протеиногенных аминокислот (табл. 2). Снижаются уровни цистеиновой кислоты (на 25%), аспарагина (на 25,5%), серина (на 21%), глутамина (28,2%), треонина (на 30,5%), а-аминомасляной кислоты (на 33,8%). Увеличивались концентрации глицина (в 1,9 раза) и орнитина (в 1,3 раза) (табл. 3, рис. 1-а, д). Снижение концентрации глутамина, который является важным регулятором синтеза азотистых оснований и белка, основным пластическим и энергетическим субстратом для лимфоцитов и макрофагов [5]. Одновременное повышение уровня орнитина (предшественник для синтеза полиаминов) через 45 мин. после внутрижелудочного введения Инфезола40, может указывать на активацию синтеза нуклеиновых кислот в клетках пейеровых бляшек [1, 12].

Таблица 3. Концентрации свободных аминокислот и их азотсодержащих производных в пейеровых бляшках крыс, получавших Инфезол40

Показатель Контроль Инфезол40,

10 мин. 20 мин. 30 мин. 45 мин.

Цистеиновая к-та 48±2 43±1 42±1* 37±2* 36±2*

Аспарагин 475±42 377±30 415±24 400±41 354±19*

Серин 1124±75 940±78 1064±66 983±73 883±59*

Глутамин 1390±148 1228±86 1349±151 1115±87 998±65*

Гистидин 207±21 394±52* 378±45* 203±28 221±36

Глицин 3942±368 7228±946* 8344±567* 5385±752 7393±1091*

Треонин 2069±168 1552±95* 1586±198 1964±193 1438±208*

Аргинин 385±38 621±94* 594±57* 352±20 400±25

Аланин 2696±68 3287±332 3898±244* 2759±251 3174±244

Таурин 18943±519 15826±1230* 17478±349* 17395±1737 17065±1130

а-Аминомасляная к-та 148±12 113±14 118±12 117±13 98±18*

Валин 567±46 739±96 760±33* 589±84 537±41

Метионин 157±18 342±62* 337±28* 180±16 189±12

Триптофан 103±15 157±14* 148±17 100±10 89±8

Фенилаланин 215±30 598±117* 559±50* 197±15 254±27

Изолейцин 320±35 510±71* 499±26* 310±38 305±23

Гидроксилизин 115±5 129±12 151±8* 123±11 162±12*

Лейцин 518±55 795±114 784±44* 446±52 418±36

Орнитин 83±3 88±8 98±4* 93±10 106±5*

Примечание: * - статистически значимые различия относительно контрольной группы

Формирование пула протеиногенных аминокислот пейеровых бляшек крыс после однократного внутрижелудочного введения Инфезола40 также было проанализировано с использованием линейного дискриминантного анализа, позволяющего перейти к рассмотрению малого набора переменных (корней дискриминантных функций). Значение критерия лямбда Уилкса и соответствующего ему критерия Фишера (0,0000065 и 6,100439 соответственно) доказывают высокую степень дискриминации групп, а на основании классификационной матрицы можно сделать вывод о 100% корректности обучающих выборок для всех групп. Наибольший вклад в дискриминацию функций (т.е. имеющие наибольшую вариабельность) вносят глицин (Б=24,68559) в наибольшем количестве представленный в составе раствора Инфезол40 (27,6% от всех входящих в состав раствора аминокислот), гистидин (Б=32,46392) и изолейцин (Б=6,91005) увеличение концентраций которых регистрировали в течение 20 мин после введения раствора, цистеиновая кислота (Б=26,54177), этаноламин, валин, цитруллин, лизин, (Б=18,63010; 19,92814; 16,99056; 10,93164, соответственно) (рис. 4).

Анализируя значения квадратов расстояний Махаланобиса между центроидами групп и диаграмму рассеяния (рис. 2), можно заключить, что центроид группы «45 мин. Инфезол40» наиболее удален в пространстве дискриминантных функций от такового контрольной группы (квадрат расстояния Махаланобиса = 4155,5). Напротив, квадрат расстояния Махаланобиса наименьший между центроидами группы «10 мин. Инфезол40» (квадрат расстояния Махаланобиса = 411,4), что говорит о слабой дискриминации, для групп «20 мин. Инфезол40» и «30 мин. Инфезол40» квадрат расстояния Махаланобиса составляет 1468,1 и 827,9; соответственно.

Root 1 vs . Rent 2

ЭНТрЕПЬ Н^ЕИЗП-Ч ЮМИН Н4ЕМЗЛ40 20М И Н Н4ЕЮЛ40 30М И Н Н4ЕМЗЛ40 45М И Н

а rfl „ fl 0  о

О £  a д *

Д о

* *

0 с ° • * f

о о

-Ш -30 -20 -10 0 10 20 30 ¿0 Rent 1

Рис. 4. Проекция распределения фонда протеиногенных аминокислот пейеровых бляшек крыс, получавших Инфезол40

Заключение

Таким образом, внутрижелудочное введение Инфезола40 повышает относительное количество протеиногенных аминокислот в пейеровых бляшках. В первые 20 мин. после введения раствора аминокислот увеличивается общее количество протеиногенных аминокислот, однако уже через 30 мин. номинальный эффект отсутствует, а через 45 мин. выявлено снижение концентраций аспарагина, серина, глутамина и треонина. Вероятно, данные изменения концентраций свободных аминокислот в пейеровых бляшках после однократного внутрижелудочного введения Инфезола40 являются следствием активации клеток пейеровых бляшек.

Литература

1. Шейбак В.М., Горецкая М.В. Аминокислоты и иммунная система. - Москва: Пальмир, 2010. - 356 с. [Shejbak V.M., Goreckaja M.V. Aminokisloty i immunnaja sistema. Amino acids and immune system -Moscow: Palmyr: 2010. - 356 p. (in Russian)]

2. Brandtzaeg P. Mucosal immunity: induction, dissemination, and effector functions// Scandinavian Journal of Immunology. - 2009. - V.70. - P. 505-515.

3. Brandtzaeg P. The gut as communicator between environment and host: immunological consequences// European Journal of Pharmacology. - 2011. - V.668. - P. 1632.

4. Furness J.B., Kunze W.A., Clerc N. Nutrient tasting and signalling mechanisms in the gut II. The intestine as a sensory organ: neural, endocrine, and immune responses. // American Journal of Physiology. - 1999. - V.277. -P.922-928.

5. Kim H. Glutamine as an Immunonutrient // Yonsei Medical Journal. - 2011. - V.52, N6. - P. 892-897.

6. Lamichhane A., Kiyono H., Kunisawa J. Nutritional components regulate the gut immune system and its association with intestinal immune disease development // Journal of Gastroenterology and Hepatology. -2013. - V.28. - P. 18-24.

7. Maranduba C.M., De Castro S.B., de Souza G.T. et.al. Intestinal microbiota as modulators of the immune system and neuroimmune system: impact on the host health and homeostasis. // Journal of Immunology Research. -2015. - V.2015. - P.1-14.

8. Newson B., Ahlman H., DahlstrSm A, Nyhus LM. Ultrastructural observations in the rat ileal mucosa of possible epithelial taste cells and sensory neurons. // Acta Physiologica Scandinavica. - 1982. - V.114. - P.161-164.

9. Newberry R.D., Lorenz R.G. Organizing a mucosal defense.// Immunological Reviews. - 2005. - V. 206. - P.6-21.

10. Ruth M.R., Field C.J. The immune modifying effects of amino acids on gut-associated lymphoid tissue// Journal of Animal Science and Biotechnology. - 2013. - V.4. - P. 27-37.

11. Turner J.R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease // Nature Reviews Immunology. - 2009. -V.9. - P.799-809.

12. Wu G. Glucose and glutamine metabolism in rat macrophages: enhanced glycolysis and unaltered glutaminolysis in spontaneously diabetic BB rats // Amino Acids. - 2013. - V.45. - P. 407-411.

13. Xue H., Field C.J. New role of glutamate as an immunoregulator via glutamate receptors and transporters // Frontiers in Bioscience (Scholar edition). - 2011. - V.3. - P. 1007-1020.

Информация об авторах

Шейбак Владимир Михайлович - доктор медицинских наук, профессор кафедры биологической химии Гродненского государственного медицинского университета. E-mail: vsheibak@gmail.com

Павлюковец Анастасия Юрьевна - кандидат биологических наук, доцент кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии им. С.И. Гельберга Гродненского государственного медицинского университета. E-mail: anastasiayk@mail.ru

Смирнов Виталий Юрьевич - кандидат биологических наук, доцент, старший научный сотрудник научно-исследовательской лаборатории Гродненского государственного медицинского университета. E-mail: vit_sm@mail.ru

Шейбак Лидия Николаевна - доктор медицинских наук, профессор 2-й кафедры детских болезней Гродненского государственного медицинского университета. E-mail: lsheibak@gmail.com

Жмакин Андрей Игоревич - кандидат медицинских наук, доцент, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии им. С. И. Гельберга Гродненского государственного медицинского университета. E-mail: microbivir@gmail.com