КОМПОЗИЦИЯ НА ОСНОВЕ ФИТОЭКСТРАКТОВ, ПОДАВЛЯЮЩАЯ ЧУВСТВО КВОРУМА У БАКТЕРИЙ
COMPOSITION BASED ON PHYTOEXTRACTS, SUPPRESSING QUORUM SENSING IN BACTERIA

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается композиций на основе растительных экстрактов, предназначенных для предупреждения, облегчения или лечения патологических состояний живых организмов путем воздействия на физиологию паразитирующего микроорганизма. В частности, изобретение касается биологических составов, способных подавлять коллективное поведение (чувство кворума) у патогенных, условно-патогенных и гнилостных бактерий.
Изобретение может найти применение при изготовлении лечебных, профилактических, косметических и санитарно-гигиенических средств контроля бактериальных инфекций человека и животных.
Из уровня техники известен ряд растительных композиций с различной лечебно-профилактической направленностью. В частности, известна растительная композиция с противоаллергическими свойствами [1 - Патент RU 2264224. Улучшенная растительная композиция, обладающая противоаллергическими свойствами, и способ ее получения], противоязвенная композиция [2 - Патент RU 2302255. Противоязвенная растительная композиция, способ ее получения и применения] и др. При этом основным аргументом для формирования подобных композиций является наличие у каждого из входящих в их состав растительных экстрактов соответствующей биологической активности, а также аддитивный эффект при их совместном использовании.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому изобретению является растительная композиция с фунгицидным, антимикробным и вирулецидным действием [3 - Патент RU 2372096. Композиция с фунгицидным, антимикробным и вирулецидным действием на основе фитоэкстрактов], направленная на лечение и профилактику инфекций микробной этиологии и инфекций замкнутого пространства путем воздействия на патогенные формы микроорганизмов. Однако, данный способ ориентирован только на развитие прямого антимикробного эффекта, что потенциально может вести к поступлению продуктов разрушения микроорганизмов во внутреннюю среду и среду обитания человека и животных с формированием токсических, аллергических и иных нежелательных эффектов.
В качестве альтернативы природным и химически синтезируемым бактерицидам прямого действия в настоящее время все чаще рассматривается подход, заключающийся не в уничтожении, но в изменении физиологии микроорганизма в направлении подавления (снижения) его способности к паразитированию и повреждению биологических субстратов. В частности, сказанное относится к поиску и созданию ингибиторов чувства кворума (англ. - quorum sensing) у бактерий, оцениваемых как привлекательная альтернатива традиционным средствам борьбы с инфекциями, особенно, вызываемыми полирезистентными штаммами микроорганизмов [4 - Bhardwaj A.K., Vinothkumar K., Rajpara N. Bacterial Quorum sensing inhibitors: attractive alternatives for control of infectious pathogens showing multiple drug resistance // Recent Patents on Anti-Infective Drug Discovery. 2013. V.8. P.68-83].
Под термином «чувство кворума» у бактерий понимается их плотностно-зависимая коммуникация, опосредуемая малыми диффундирующими молекулами (автоиндукторами) и при достижении пороговой плотности популяции ведущая к функциональной и морфологической дифференцировке составляющих ее клеток [5 - Waters C.M., Bassler B.L. Quorum-sensing: cell-to-cell communication in bacteria // Ann. Rev. Cell and Developmental Biol., 2005. V.21. P.319-346]. При этом применительно к цели данного изобретения принципиально важно, что под контролем чувства кворума находятся такие проявления физиологии паразитирующего микроорганизма, как образование факторов вирулентности и формирование биопленок.
Анализ открытых патентных источников позволяет констатировать, что на основе заявленного подхода разработана целая серия изобретений, за последние пять лет (с 2009 по 2013 гг.) нашедших отражение в международных охранных документах: WO 2009055054 A2 (2009), WO 2010033236 (2010), WO 2011001419 A1 (2011), US 20100273890 (2010), US 20100256369 (2010), US 7812134 (2010), US 7642285B2 (2010), US 8063108B2 (2011), US 7910622 (2011), US 8247443B2 (2012), US 20120135925 (2012). При этом предложенными техническими решениями стали: 1) подавление синтеза автоиндуктора; 2) его связывание специфическими антителами; 3) деградация автоиндуктора соответствующими ферментами (лактоназами или ацилазами); 4) ковалентная модификация (инактивация) взаимодействующих с автоиндукторами рецепторных белков; 5) использование агонистов и антагонистов автоиндукторов, способных прямо интерферировать с естественным сигналом за связывание с рецепторными белками.
Среди подобных решений наиболее близким к заявляемому изобретению является поиск природных субстанций растительного происхождения, в естественных условиях служащих для подавления чувства кворума у фитопатогенов, а при их переносе в другие живые системы способных вызывать аналогичный эффект в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры человека и животных [6 - Koh C.-L., Sam C.-K., Yin W.-F., Tan L.Y., Krishnan Т., Chong Y.M., Chan K.-G.. Plant-derived natural products as sources of anti-quorum sensing compounds // Sensors. 2013. V.13. P.6217-6228]. В частности известным решением является патент WO 2009114810 А2 [7 - Mathee K., Adonizio A.L., Ausubel F., Clardy J., Bennett В., Downum K. Use of ellagitaimins as inhibitors of bacterial quorum sensing. 2009], формула которого оговаривает возможность подавления чувства кворума патогенных бактерий с использованием компонентов лекарственных растений - эллагитанинов (вескалагина и касталагина).
В то же время предложенный авторами источник получения эллагитанинов - растение Conocarpus erectus L. (Combretaceae) внесено в Международную Красную книгу [IUCN Red List of Threatened Species. Version 2013.1] и имеет относительно небольшой ареал распространения в тропическом поясе Америки и Западной Африки, что создает ресурсные ограничения для реализации патента WO 2009114810 А2. Кроме того, предложенное использование только одного растительного источника требует дополнительной очистки и выделения из него биологически активных субстанций, т.к. балластные компоненты данного непищевого сырья потенциально способны оказать неблагоприятное влияние на организм человека и животных.
В этой связи задачей данного изобретения является разработка композиции из фитоэкстрактов лекарственных растений, используемых в традиционной (народной) восточно-европейской медицине и проявляющих аддитивный эффект при регуляции чувства кворума патогенных и гнилостных бактерий.
В настоящем изобретении эта задача решается совместным применением водных или спиртовых экстрактов или полученных подобным образом и в последующем высушенных извлечений из коры дуба (Quercus cortex), почек березы (Betulae gemmae) и листьев эвкалипта (Eucalypti folia). В соответствии с настоящим изобретением регуляторный препарат (композиция) на их основе содержит от 33,3 до 50,0 мас.% каждого из фитоэкстрактов, а само подобное соотношение и форма его применения (в виде жидкостей, порошков, аппликаций и т.д.) определяются исходя из особенностей локализации инфекционного процесса и индивидуальных особенностей пациента.
В частности, экстракт коры дуба включается в композиции, предназначенные для лечения и профилактики кишечных инфекций, раневых инфекций, воспалительных заболеваний кожи, инфекций полости рта, а также воспалительных заболеваний женских половых органов. В свою очередь противопоказанием к включению коры дуба в состав композиции является гиперчувствительность к данному препарату.
Экстракт березовых почек включается в состав композиций, предназначенных для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний ЛОР-органов, раневых инфекций, воспалительных заболеваний кожи, а также кишечных инфекций. Противопоказаниями к использованию данного фитоэкстракта являются период беременности и патология мочевыделительной системы (почечная недостаточность и острые заболеваниями мочевыводящих путей).
Экстракт листьев эвкалипта включается в состав композиций, предназначенных для лечения инфекционных заболеваний ЛОР-органов и верхних дыхательных путей, раневых инфекций, инфекций полости рта, кишечных инфекций, а также воспалительных заболеваний женских половых органов. Противопоказаниями к использованию данного фитоэкстракта являются гиперчувствительность к данному препарату, а также атрофия слизистой оболочки верхних дыхательных путей, бронхиальная астма, бронхоспазм, коклюш.
Используемые фитоэкстракты готовили на основе сухого растительного сырья, осуществляя из него водные или спиртовые извлечения, после чего при необходимости производили дополнительное высушивание полученных извлечений.
При приготовлении водных извлечений из грубых частей растений (в частности, коры дуба) 6 грамм измельченного растительного сырья, предварительно стерилизованного в автоклаве при 1 атмосфере в течение 30 минут, заливали стерильной дистиллированной водой в объеме 50 мл. На следующем этапе производилось кипячение на водяной бане в течение 30 минут, охлаждение - 10 минут, после чего полученный отвар процеживали через стерильный ватно-марлевый фильтр в стеклянную посуду. При приготовлении водных извлечений из мягких частей растений (березовых почек и листьев эвкалипта) использовали аналогичную последовательность действий за исключением того, что кипячение на водяной бане осуществляли 15 минут, а настаивание - в течение 45 минут.
При приготовлении спиртовых извлечений измельченное растительное сырье экстрагировали 40% этиловым спиртом при комнатной (22-24°C) температуре в течение 24 ч, после чего полученный экстракт процеживали через стерильный ватно-марлевый фильтр в стеклянную посуду.
При необходимости полученные вытяжки выпаривались на водяной бане до получения более густой консистенции, после чего подвергались полному высушиванию до получения порошка.
Композиции получали путем смешивания водных или спиртовых извлечений в соотношении по 33,3 мас.% трех фитоэкстрактов или по 50,0 мас.% при смешивании двух фитоэкстрактов.
По сравнению с упомянутыми выше техническими решениями [3, 7] заявляемое изобретение имеет ряд существенных отличий, отвечающих требованию новизны.
1) В отличие от композиции фитоэкстрактов в патенте RU 2372096 заявляемая композиция обеспечивает развитие не прямого фунгицидного, антимикробного или вирулецидного эффектов, но оказывает регуляторное воздействие на физиологию паразитирующего микроорганизма в направлении подавления чувства кворума патогенных и гнилостных бактерий. В результате эффективный контроль бактериальных патогенов оказывается возможным без разрушения микробных клеток, обычно сопровождающегося высвобождением токсичных и аллегризирующих субстанций.
Экспериментальным обоснованием использования названных фитоэкстрактов являются данные о воздействии водных и спиртовых вытяжек 20 лекарственных растений, используемых традиционной (народной) восточно-европейской медициной для контроля бактериальных инфекций, на рост и проявления чувства кворума у индикаторного штамма Chromobacterium violaceum NCTC 13274.
Адекватность использования данного микроорганизма для заявленных целей определяется наличием у него мутации (инсерции) в гене cviI, ответственном за образование автоиндуктора чувства-кворума С6-гомосеринлактона (С6-ГСЛ). В результате данный штамм оказывается неспособным к развитию плотностно-зависимой коммуникации, в том числе проявляющейся в биосинтезе хорошо регистрируемого оптическими методами сине-фиолетового пигмента виолацеина. С другой стороны, внесение экзогенного С6-ГСЛ восстанавливает чувство кворума и ведет к биосинтезу пигмента. Таким образом, С. violaceum NCTC 13274 оказывается удобным инструментом для выявления веществ, нарушающих восприятие ауторегуляторных сигналов у бактерий, в связи с чем в настоящее время широко используется при поиске ингибиторов чувства кворума: о наличии подобной активности судят по подавлению синтеза виолацеина в присутствии С6-ГСЛ.
В проведенной серии экспериментов (Табл.1) было установлено, что 4 водных и 8 спиртовых извлечений из лекарственных растений развивают прямую антибактериальную активность в отношении индикаторного штамма С. violaceum NCTC 13274, что проявлялось в формировании детектируемых зон подавления роста вокруг лунок с соответствующими фитоэкстрактами. С другой стороны, 6 водных и 11 спиртовых экстрактов вызывали ингибирование образования данным штаммом пигмента виолацеина, что указывало на подавление инициируемых внесением С6-ГСЛ механизмов чувства кворума. Так на фиг.1 представлены результаты тестирования фитоэкстрактов: 1 - почек березы (Betulae gemmae), I - листьев брусники (Vaccinium folia), 3 - травы череды (Bidentis herba), 4 - листьев толокнянки (Arctostaphylos folia), 5 - листьев эвкалипта (Eucalyptus folia), 6 - коры дуба (Quercus cortex), 1 - контроль; где подавление роста зафиксировано для
Таблица 1.
Площади зон подавления роста и чувства кворума (мм<sup>2</sup>) индикаторного штамма С. violaceum NCTC 13274 с добавлением С<sub>6</sub>-ГСЛ (5*10<sup>-7</sup> моль/л)
Вид растения
Часть растения
Проявления биологической активности фитоэкстрактов
Подавление роста
Подавление «чувства кворума»
Водный экстракт
Спиртовый экстракт
Водный экстракт
Спиртовый экстракт
Achillea millefolium
Трава
0
0
0
0
Arctostaphylos uva-ursi
Листья
207
235
153
126
Betula verucosa
Почки
0
9
113
105
Bidens tripartita
Трава
0
0
0
0
Calendula officinalis
Цветки
0
0
0
31
Chelidonium majus
Корневища
9
14
0
0
Comarum palustre
Корневища
0
0
0
75
Eucalyptus viminalis
Листья
19
31
276
204
Inula helenium
Корневища
0
9
0
85
Juniperus communis
Плоды
0
0
0
19
Lieli palustris
Побеги
0
19
19
25
Matricaria chamomilla
Цветки
0
0
0
0
Plantago major
Листья
0
0
0
0
Quercus spp.
Кора
0
0
94
94
Rosa majalis
Плоды
0
0
0
14
Salvia officinalis
Листья
0
25
0
0
Taraxacum officinale
Корневища
0
0
0
0
Tussilago farfara
Листья
0
0
0
0
Vaccinium vitis-idaeae
Листья
31
59
83
54
Violae tricoloris
Цветки
0
0
0
0
образцов 2, 4 и 5, а подавление образования пигмента виолацеина для образцов 1, 5 и 6.
При этом регистрируемый прямой антибактериальный эффект и ингибирование чувства кворума статистически не значимо коррелировали между собой (для водных экстрактов r=0.430, P>0.01; для спиртовых экстрактов r=0.358, P>0.01). Сказанное позволяет утверждать, что развитие указанных эффектов определяется неидентичными субстанциями в составе фитоэкстрактов, тем самым подчеркивая принципиальную разницу между известным и заявляемым подходами.
2) В отличие от патента WO 2009114810 способность к подавлению чувства кворума у бактерий установлена у экстрактов не из внесенного в Международную Красную книгу тропического растения Conocarpus erectus, но из широко распространенных в умеренном климатическом поясе восточной Европы дуба и березы, а также эвкалипта, в значительных количествах произрастающего в субтропическом поясе России, что снимает ресурсные (сырьевые) ограничения при производстве основанных на них их композиций.
Из доступной научной и патентной литературы сведения о выраженном влиянии фитоэкстрактов коры дуба (Quercus cortex), почек березы (Betulae gemmae) и листьев эвкалипта (Eucalypti folia) на проявления чувства кворума у бактерий не известны. Соответственно, наибольшая выраженность подобного эффекта в отсутствие или при минимальном прямом антибактериальном воздействии явилось основанием для рекомендации по их использованию для «нового способа воздействия на физиологию паразитирующего микроорганизма в направлении подавления его плотностно-зависимой коммуникации.
3) В отдельной серии экспериментов было показано, что экстракты коры дуба, почек березы и листьев эвкалипта обладают аддитивным эффектом при подавлении чувства кворума. Сказанное заключалось в том, что площадь подавления пигментообразования Chromobacterium violaceum NCTC 13274 при внесении комбинации трех фитоэкстрактов превышала ожидаемое значение таковой при их раздельном внесении. В частности, как показано на фиг.2, использование комбинации водных экстрактов коры дуба, почек березы и листьев эвкалипта в соотношении 1:1:1, обозначенной цифрой 4, вело к формированию зоны ингибирования чувства кворума, площадь которой достоверно превышала таковую при изолированном использовании каждого фитоэкстракта: 1 - почек березы (Betulae gemmae), 2 - листьев эвкалипта (Eucalyptus folia), 3 - коры дуба (Quercus cortex), а также оказывалась выше ожидаемого эффекта суммации.
В другом варианте постановки эксперимента, иллюстрируемом фиг.3, аддитивный эффект был зафиксирован при раздельном внесении спиртовых фитоэкстрактов, что заключалось в ингибировании биосинтеза пигмента виолацеина на расстоянии от места внесения двух фитоэкстрактов, превышающем таковое, достаточное для обеспечения аналогичного эффекта только одного фитоэкстракта. В частности, данный эффект зарегистрирован в зонах, отмеченных стрелками и обозначенных цифрами: 4 - для коры дуба (Quercus cortex) и листьев эвкалипта (Eucalyptus folia); 5 - для листьев эвкалипта (Eucalyptus folia) и почек березы (Betulae gemmae); 6 - для почек березы (Betulae gemmae) и коры дуба (Quercus cortex), превышающих формирующиеся в обычном варианте постановки эксперимента зоны подавления «чувства кворума» для: 1 - коры дуба (Quercus cortex), 2 - листьев эвкалипта (Eucalyptus folia), 3 - почек березы (Betulae gemmae).
Таким образом, комбинированное использование фитоэкстрактов коры дуба, почек березы и листьев эвкалипта является новым, обеспечивающим аддитивность их действия на проявления чувства кворума у бактерий. С другой стороны, подобное использование уменьшает возможные нежелательные эффекты балластной фракции каждого из фитоэкстрактов, концентрация которых в составе композиции снижается в два-три раза.
4) Показана возможность экстракции действующих компонентов лекарственных растений как водой, так и спиртом при количественно более высокой эффективности последнего метода. Указанное обстоятельство определяет возможность формирования композиций фитоэкстрактов как на водной, так и на спиртовой основе при некоторых ограничениях использования последних в педиатрической практике. Кроме того, в отдельной серии экспериментов установлено, что высушивание водных и спиртовых экстрактов, а также процедура их повторной солюбилизации не изменяют патентуемую биологическую активность.
5) Описанные выше результаты также явились экспериментальным обоснованием формирования композиций фитоэкстрактов с содержанием каждого компонента от 33,3 мас.% (при создании трехкомпонентных композиций) до 50,0 мас.% (при создании двухкомпонентных композиций в случаях отсутствия показаний или наличия противопоказаний к применению одного из фитоэкстрактов). Заявители предполагают, что достижение аддитивного эффекта возможно в более широком диапазоне соотношений, но ограничивают уровень притязаний имеющимися экспериментальными доказательствами
В состав патентуемого изобретения входит также применение композиции на основе фитоэкстрактов коры дуба, почек березы и листьев эвкалипта для подавления чувства кворума у патогенной и условно-патогенной бактериальной микрофлоры, вовлеченной в развитие инфекционных заболеваний растений, животных и человека. С этой целью данная композиция может вводиться в организм для обеспечения системного эффекта, а также применяться местно для воздействия на определенные области (например, в составе перевязочных материалов для обработки ран, при обработке операционного поля и т.д.). Композиция фитоэкстрактов может использоваться в виде водных или спиртовых растворов, твердых веществ (порошков), а также нанесенными на различные носители.
Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами.
Пример 1.
Композиция, подавляющая чувство кворума у бактерий, например, при лечении раневых инфекций и инфекционно-воспалительных заболеваний кожи. Композиция содержит настойки коры дуба (Quercus cortex), почек березы (Betulae gemmae) и листьев эвкалипта (Eucalypti folia). Настойки приготавливаются по общей схеме: 6 грамм измельченного растительного сырья экстрагируются 40% этиловым спиртом при комнатной (22-24°C) температуре в течение 24 ч, после чего полученные экстракты процеживаются через стерильный ватно-марлевый фильтр в стеклянную посуду. Полученные настойки смешиваются при следующем соотношении компонентов, мас.%:
- настойка коры дуба (Quercus cortex) - 33,3;
- настойка почек березы (Betulae gemmae) - 33,3;
- настойка листьев эвкалипта (Eucalypti folia) - 33,4.
Композиция может использоваться путем примочек, аппликаций или орошений.
Пример 2. Композиция, подавляющая чувство кворума у бактерий, например, при лечении инфекционно-воспалительных заболеваний ЛОР-органов и верхних дыхательных путей. Композиция содержит настои листьев эвкалипта (Eucalypti folia) и почек березы (Betulae gemmae). Настои приготавливаются по общей схеме: 6 грамм измельченного растительного сырья, предварительно стерилизованного в автоклаве при 1 атмосфере в течение 30 минут, заливаются стерильной дистиллированной водой в объеме 50 мл. На следующем этапе производится кипячение на водяной бане в течение 15 минут, настаивание - 45 минут, после чего полученный настой процеживается через стерильный ватно-марлевый фильтр в стеклянную посуду. Полученные вытяжки смешиваются при следующем соотношении компонентов, мас.%:
- настой листьев эвкалипта (Eucalypti folia) - 50,0;
- настой почек березы (Betulae gemmae) - 50,0.
Композиция может использоваться в виде растворов для полоскания или ингаляции.
Пример 3. Композиция, подавляющая чувство кворума у бактерий, например, при лечении и профилактике кишечных инфекций. Композиция содержит высушенные извлечения коры дуба (Quercus cortex), почек березы (Betulae gemmae) и листьев эвкалипта (Eucalypti folia). Извлечения коры дуба приготовляются по следующей схеме: 6 грамм измельченного растительного сырья, предварительно стерилизованного в автоклаве при 1 атмосфере в течение 30 минут, заливаются стерильной дистиллированной водой в объеме 50 мл. На следующем этапе производится кипячение на водяной бане в течение 30 минут, охлаждение - 10 минут, после чего полученный отвар процеживается через стерильный ватно-марлевый фильтр в стеклянную посуду. Извлечения почек березы и листьев эвкалипта приготовлялся по общей схеме: 6 грамм измельченного растительного сырья, предварительно стерилизованного в автоклаве при 1 атмосфере в течение 30 минут, заливаются стерильной дистиллированной водой в объеме 50 мл. На следующем этапе производится кипячение на водяной бане в течение 15 минут, охлаждение - 45 минут, после чего полученные настои процеживаются через стерильный ватно-марлевый фильтр в стеклянную посуду. На следующем этапе отвар и настои выпариваются на водяной бане до получения более густой консистенции, после чего полностью высушиваются до получения порошка. Полученные сухие фитоэкстракты смешиваются при следующем соотношении компонентов, мас.%:
- экстракт коры дуба (Quercus cortex) - 33,3;
- экстракт почек березы (Betulae gemmae) - 33,3;
- экстракт листьев эвкалипта (Eucalypti folia) - 33,4.
Композиция может использоваться в качестве порошков и иных твердых форм для перорального применения, а также нанесенной на различные носители.