АДСОРБЦИОННО-КРИОГЕННЫЙ АППАРАТ ДЛЯ СУБЛИМАЦИОННОГО ВЫСУШИВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Полезная модель относится к технике сублимационного высушивания и может быть использована в микробиологической и других отраслях промышленности для высушивания культур микроорганизмов.
Известно устройство для высушивания биоматериалов в вакууме при низких температурах, содержащие цилиндр с силикагелем, помещенный в сосуд Дьюара, на горловине которого установлена сушильная камера. Внутри нее расположена холодильная камера, в которой размещаются ампулы с высушиваемым материалом (Зайчик В.Е., Цисляк Ю.В. Усовершенствованный адсорбционно-криогенный лиофилизатор для консервации биопрепаратов. Лабораторное дело, 1978, №2, с.109-110).
Недостатком известного устройства является необходимость предварительного замораживания образцов биоматериала перед сушкой, а также образования в сорбенте ледяной пробки, препятствующей участие в работе всей массы сорбента.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является адсорбционно-криогенная установка для сублимационного высушивания биологических материалов, содержащая вакуумную камеру, выполненную в виде стакана с осевым отверстием в днище и крышки, имеющей кольцевое эластичное уплотнение и механизм зажима крышки. Адсорбционно-криогенный вакуумный насос выполнен в виде трубы, заполненной сорбентом, один конец которой имеет заглушку, а другой открытый конец подсоединен к днищу стакана соосно отверстия. Труба имеет узел подачи паров азота в вакуумную камеру, включающий размещенный в ней трубчатый змеевик и цилиндр, размещенный с зазором вокруг трубы. Пустотелая емкость для высушиваемого материала размещена в вакуумной камере, к которой подсоединен трубчатый змеевик. Труба с сорбентом размещена в сосуде Дьюара, а вакуумная камера - на горловине сосуда Дьюара (Зайчик В.Е., Цисляк Ю.В. Усовершенствованный адсорбционно-криогенный
лиофилизатор для консервации биопрепаратов. Лабораторное дело, 1981, №2, с.100-101).
Однако такое устройство имеет сложную конструкцию узла подачи паров азота в вакуумную камеру. Трубчатый змеевик затрудняет удаление сорбента при его замене и увеличивает время стерилизации установки при сушке в ней патогенных микроорганизмов. Использование в качестве сорбента силикагель, полученный по традиционной технологии имеет недостаточную сорбционную емкость, что удлиняет время сушки биоматериала или увеличивает количество используемого сорбента. Наличие стеклянных деталей (крышки) снижает надежность конструкции при работе в полевых условиях с патогенными организмами.
Техническим результатом предлагаемой полезной модели является упрощение конструкции установки, обеспечение возможности сушки патогенных микроорганизмов в полевых условиях и сокращение цикла сушки.
Указанный технический результат достигается тем, что в адсорбционно-криогенном аппарате для сублимационного высушивания биологических материалов, содержащем вакуумную камеру, выполненную в виде стакана с осевым отверстием в днище и крышки, имеющей кольцевое эластичное уплотнение и винтовой зажим, адсорбционно-криогенный вакуумный насос, выполненный в виде трубы, заполненной сорбентом, один конец которой имеет заглушку, а другой открытый конец подсоединен к днищу стакана соосно выполненного в нем отверстия, подставку с гнездами для емкостей с высушиваемым материалом, размещенную в вакуумной камере, и узел подачи паров азота в вакуумную камеру, причем труба с сорбентом размещена в сосуде Дьюара, а вакуумная камера - на горловине сосуда Дьюара, согласно полезной модели, узел подачи паров в вакуумную камеру содержит охладительную трубку, размещенную в трубе адсорбционно-вакуумного насоса вдоль ее оси, один конец которой пропущен через заглушку трубы наружу, а другой конец выведен наружу через стенку стакана вакуумной камеры, патрубок, расположенный снаружи стакана вакуумной камеры и упруго-эластичный шланг с пережимным
устройством, один конец которого подсоединен к охладительной трубке, а другой - к патрубку стакана вакуумной камеры.
Сорбентом дополнительно может быть заполнена нижняя часть вакуумной камеры до уровня подставки с гнездами, что сократит время сушки биоматериала.
2
3
В качестве сорбента используют высокодисперсный силикагель с объемом пор до 4,5 куб.см/г, величиной удельной поверхности до 500 м/г, насыпной плотностью 0,1-0,15 г/м, размером частиц до 30 мкм, что также сократит время сушки биоматериала.
На фиг.1 представлена схема адсорбционно-криогенного аппарата для сублимационного высушивания биологических материалов. На фиг.2 - то же, разрез по А-А. На фиг.3 - то же, разрез по Б-Б.
Адсорбционно-криогенный аппарат для сублимационного высушивания биологических материалов содержит вакуумную камеру 1, выполненную в виде стакана 2 с осевым отверстием в днище 3 и крышки 4, имеющей кольцевое эластичное уплотнение и винтовой зажим 5. Адсорбционно-криогенный вакуумный насос выполнен в виде трубы 6, заполненной сорбентом 7, один конец которой имеет заглушку 8, а другой открытый конец подсоединен к днищу 3 стакана 2 соосно выполненного в нем отверстия. Подставка 9 с гнездами для емкостей 10 с высушиваемым материалом размещена в вакуумной камере 1. Труба 6 с сорбентом 7 размещена в сосуде 11 Дьюара, а вакуумная камера 1 - на горловине сосуда 11 Дьюара. Узел подачи паров в вакуумную камеру содержит охладительную трубку 12, размещенную в трубе 6 адсорбционно-вакуумного насоса вдоль ее оси, один конец 13 которой пропущен через заглушку 8 трубы наружу, а другой конец 14 выведен наружу через стенку стакана 2 вакуумной камеры. Кроме того, узел подачи паров в вакуумную камеру 1 содержит патрубок 15, расположенный снаружи стакана 2 вакуумной камеры и упруго-эластичный шланг 16 с пережимным устройством 17, один конец которого подсоединен к концу 14 охладительной трубки 12, а другой - к патрубку 15 стакана вакуумной камеры 1. Устройство снабжено манометром (на чертежах не показан), установленным на боковой стенке камеры 1 для контроля за процессом сушки биоматериалов.
2
3
Нижняя часть вакуумной камеры 1 может быть заполнена сорбентом 7 до уровня подставки 9 с гнездами, что дополнительно сократит время сушки биоматериала. В качестве сорбента используют высокодисперсный силикагель с объемом пор до 4,5 куб.см/г, величиной удельной поверхности до 500 м/г, насыпной плотностью 0,1-0,15 г/м, размером частиц до 30 мкм, например марки ИК-01-2
Высокодисперсный силикагель ИК-01-2 разработан Институтом катализа СО РАН по патенту РФ №2042620 и выпускается несколькими предприятиями в Российской Федерации. Если силикагель марки КСМ, используемый в прототипе, адсорбирует 10 мл воды на 100 г сухого веса гранул сорбента, то высокодисперсный силикагель ИК-01-2 адсорбирует 300-450 мл воды на 100 г сорбента (полная сорбционная емкость), что сокращает время сушки на несколько часов и позволяет уменьшить остаточную влажность сухого биопрепарата.
Аппарат работает следующим образом
1. Подготовка аппарата к работе.
В сушильном шкафу при температуре 140-160°С в течении 5-6 ч проводят регенерацию силикагеля. Для этого силикагель засыпают в стеклянные флаконы объемом 450 мл и помещают в сушильный шкаф. По окончании регенерации флаконы с силикагелем плотно закрывают резиновыми пробками для предотвращения захвата влаги из воздуха. Если силикагель долго не использовался, то его следует промыть водопроводной водой и высушить в сухожаровом шкафу при 80°С. После этого проводят регенерацию силикагеля в сушильном шкафу при температуре 140-160°С в течении 5-6 ч. Сосуд Дьюара марки СК-25 (объем 26,5 л) должен быть полностью заполнен жидким азотом.
2. Подготовка материала для высушивания.
В стерильных условиях готовят раствор сахарозы и желатина (САЖ) на физиологическом растворе (20 г сахарозы, 20 г желатина, 0.9 г NaCl и дистиллированной воды до 100 мл). САЖ автоклавируют при 121 атм в течение 30 мин. Подлежащий высушиванию материал смешивают с САЖ в соотношении 1:2-1:4 (например, 1 мл материала и 2-4 мл САЖ) и разливают в ампулы по 0.2 мл или инсулиновые флаконы по 0.4 мл. Горлышко ампулы пинцетом неплотно
затыкают малым количеством стерильной ватой так, что бы свободно проходил воздух. Инсулиновый флакон неплотно закрывают резиновой пробкой с разрезом. Ампулы или флаконы помещают в гнезда подставки 9 для ампул и помещают в вакуумную камеру 1, закрывают крышкой 4 и заворачивают винтовой зажим 6 на крышке до упора.
3. Процесс сушки биологического материала. Трубу 6 аппарата помещают в сосуд 11 Дьюара, предварительно надев на горловину специальную манжету для уменьшения испарения азота. Пережимное устройство 17 снимают с упруго-эластичного шланга 16. Пары азота поднимаются из сосуда 11 Дьюара по охладительной трубке 12 и через упруго-эластичный шланг 16 поступают в вакуумную камеру 1. После охлаждения вакуумной камеры 1 и постепенного замораживания жидкого материала в ампулах 10 (приблизительно через 30-40 мин) упруго-эластичный шланг 16 пережимают устройством 17. За счет глубокого охлаждения жидким азотом силикагеля в камере 1 образуется вакуум, что видно по показаниям манометра (примерно через 5-10 минут). После этого установку оставляют на 4-6 часов для сублимационной сушки замороженных образцов под вакуумом. Через указанное время крышку 4 камеры 1 открывают. Если высушивание проводили во флаконах, то их аккуратно закрывают пробками. После этого флаконы протирают дезинфектантом и завальцовывают. Если высушивание проводили в ампулах, то подставку 9 вынимают из вакуумной камеры 1 установки и ампулы запаивают. Герметичность ампул или флаконов проверяют, помещая их в раствор дезинфектанта на 10-15 сек. Влажность сухого биопрепарата не превышает 2 мас.%.
После сушки патогенных биологических материалов аппарат погружают в 3%-ный раствор формалина и выдерживают в течение 1 часа.
Пример 1. Сублимационное высушивание вирусов и бактерий
Вируссодержащие жидкости (клинические образцы, биопробы, смывы с потенциально зараженных поверхностей, образцы с потенциально зараженных объектов, пробы потенциально зараженных жидкостей, культуральные вируссодержащие жидкости, гомогенаты тканей и т.д) или бактериальную культуру E.coli смешивают с САЖ в соотношении от 1:2 (в случае, если
лиофилизуемый материал с высоким содержанием белков и углеводов, например гомогенаты органов, гомогенаты хориоаллантоисных оболочек, ... и т.д.) до 1:4 (в случае, если лиофилизуемый материал с низким содержанием белков и углеводов, например культуральная вируссодержащая жидкость (КВЖ), транссудаты, смывы со слизистых оболочек и т.д.). Полученную смесь вносят в ампулы ШП-5 по 0,2 мл или в инсулиновые флаконы по 0.4 мл. Горлышки ампул затыкают стерильной ватой, ампулы помещают в подставку для ампул и переносят в камеру 1. Высушивание проводят в течении 4-6 часов. Запайку ампул производят на медицинском сварочном аппарате САМ-1. Результаты сублимационной сушки приведены в таблице 1.
Таблица 1.Данные по сублимационной сушке вирусного и бактериального материала
Микро
Штамм
Материал
Стерил
Время
Титр микроорганизма
организм
для высушивания
ьность
сушки, влажность после сушки
До лиофилизации
После лиофилизации
Через 1 мес хранения
Вирус осповакцины
Копенгаген
КВЖ*
Стерильно
5 ч, 2%
7.3 lg ТЦЦ<sub>50</sub>/мл
7.2 lg ТЦЦ<sub>50</sub>/мл
7.2 lg ТЦД<sub>50</sub>/мл
Вирус кори
Эдмонстон
КВЖ
Стерильно
4,5 ч, 2%
6.4 lg БОЕ/мл
6.1 lg БOE/мл
6.1 lg БOE/мл
Вирус паротита
ПетроНов
КВЖ
Стерильно
5,0 ч, 2%
5.8 lg БOE/мл
5.4 lg БOE/мл
5.3 lg БOE/мл
Вирус гриппа
A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005
ВАЖ**
Стерильно
5,5 ч, 2%
8.6 lg ТЦЦ<sub>50</sub>/мл
8.5 lg ТЦЦ<sub>50</sub>/мл
8.4 lg ТЦЦ<sub>50</sub>/мл
E.coli
DH5αF'
Культура микроорганизма
-
6 ч, 2%
9.8 КОЕ/мл
9.8 КОЕ/мл
9.7 КОЕ/мл
* - культуральная вируссодержащая жидкость
** - вируссодержащая аллантоисная жидкость
Пример 2. Проверка безопасности адсорбционно-криогенного аппарата с целью использования для высушивания патогенных микроорганизмов
3
Проверку биологической безопасности адсорбционно-криогенного аппарата для лиофильного высушивания проводили на модели бактерии E.coli шт. HD 5α F' и вируса гриппа шт. A/Aichi/2/68 (H3N2). Для проверки отсутствия выброса микроорганизмов из адсорбционно-криогенного аппарата для сублимационного высушивания была использована испытательная установка МДАК. Для этого установку МДАК и адсорбционно-криогенный аппарат, в котором размещены модельные образцы биоматериала, устанавливали в рабочее положение и помещали в изолирующий бокс объемом 3 м. МДАК представляет собой емкость прямоугольной формы с изогнутым диффузором, имеющим спрямляющую решетку на входе в емкость камеры для равномерного рассеивания аэрозоля по всему объему камеры. На выходе из емкости камеры были размещены пробоотборники - микроциклоны (МЦ-2), в которые производился забор проб аэрозоля из камеры с помощью вакуумного насоса. Скорость потока аэрозоля в емкости составляет 10 см/сек, при этом время прохождения потока аэрозоля всей камеры составляет 5-7 секунд. В качестве сорбирующей жидкости использовали бесцветный раствор Хэнкса с 2%-ной по объему сыворотки крупного рогатого скота, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
В работе были использованы по 3 пробоотборника-импинджера МЦ-2, в которые заливали по 10 мл сорбирующей жидкости. Время работы пробоотборников 60 минут с расходом воздуха через пробоотборники 10±0,5 л/мин. Отбор проб начинали проводить за 5 мин до начала работы.
Всего было проведено 3 независимых испытания адсорбционно-криогенного аппарата в процессе сублимационного высушивания в нем биологического материала. Все три образца из микроциклонов были проверены на наличие генетического материала вируса гриппа методом обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Процедура проведения выделения РНК, постановки ОТ-ПЦР и анализа образцов описана ранее (Agranovski I.E., A.S.Safatov, A.I.Borodulin, О.V.Pyankov, V.A.Petrishchenko, A.N.Sergeev, А.Р.Agafonov, G.М.Ignatiev, A.A.Sergeev, and V.Agranovski. Inactivation of Viruses in Bubbling Processes Utilized for Personal Bioaerosol Monitoring. // Applied and Environmental Microbiology, Dec. 2004, p.6963-6967, Vol.70, No. 12). Результаты исследования показали, что ни в одном из 3 образцов РНК вируса гриппа обнаружено не было. Таким образом, результаты проведенных исследований в МДАК с использованием пробоотборника - микроцикдон (МЦ-2), свидетельствуют об отсутствии выбросов вирусного аэрозоля при проведении лиофилизации вируса на адсорбционно-криогенном аппарате для лиофильного высушивания, что свидетельствует о его биобезопасности и пригодности для сушки патогенных микроорганизмов.
Предлагаемая конструкция имеет более простой и надежный узел подачи паров в вакуумную камеру, все детали выполнены из металла, что позволяет проводить сублимационную сушку патогенных микроорганизмов даже в полевых условиях. За счет использования более влагоемкого сорбента ИК-02-1 время сушки сокращается на 2-3 часа по сравнению с прототипом и на 10-12 часов по сравнению с первым аналогом. Остаточная влажность снижается до 2-х процентов.