2D-протеомика рака желудка: идентификация белков с повышенным синтезом в опухоли

лабораторные и экспериментальные исследования

УДК: 616.33-006.6: 612.398

2р-протеомика рака желудка: идентификация белков с повышенным синтезом в опухоли

Е.С. григорьева1, Ю.А. Букурова2, н.В. Нердынцева1, С.г. Афанасьев1,

Т.В. Комарова1, С.А. Тузиков1, н.С. родичева1, С.Ф. Берестень2

НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск1 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, г. Москва2 634050, г. Томск, пер. Кооперативный, 5, e-mail: nvch@oncology.tomsk.ru

Проведен сравнительный протеомный анализ опухолевой и нормальной ткани желудка для идентификации белков, синтез которых значительно повышен в опухоли по сравнению с нормой. Использовались парные образцы опухолевой и нормальной ткани от пациентов с диагнозом рак желудка, полученные при проведении оперативного вмешательства. Для увеличения разрешающей способности ID-гель электрофореза была использована предварительная экстракция растворимой фракции белков для удаления мажорных структурных белков. В ходе сравнительного анализа белковых профилей опухолевой и нормальной тканей 4 пациентов с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии выявлено увеличение синтеза 6 белков: тропомиозина-3, тимозина бета-10, циклофилина А, катепсина Д, белка hCG1816442 и белка S100-A9. Повышенный уровень синтеза большинства белков подтверждается литературными данными, однако стабильное повышение уровня синтеза белка hCG1816442 в опухоли желудка обнаружено нами впервые. Для циклофилина A показан высокий уровень экспрессии только в опухолевой ткани желудка, что делает перспективными дальнейшие исследования для оценки его диагностической значимости.

Ключевые слова: рак желудка, lD-протеомика.

2D PROTEOMICS OF GASTRIC CANCER: IDENTIFICATION OF PROTEINS WITH INCREASED LEVEL OF SYNTHESIS E.S. Grigoryeva1, Yu.A. Bukurova2, N.V Cherdyntseva1, S.G. Afanasyev1, T.V Komarova1, S.A. Tuzikov1,

N.S. Rodicheva1, S.F. Beresten2 Tomsk Cancer Research Institute, Tomsk1,

Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow2 5, Kooperativny Street, 634009-Tomsk, e-mail: nvch@oncology.tomsk.ru1

Highly sensitive techniques of comparative 2D-proteomic analysis were used as a prospective tool in the search for protein markers with consistently differing levels in normal and tumor tissues in stomach cancer patients. We performed the proteomic analysis of protein extracts which are primarily depleted of major physiologically insoluble structural proteins. After the evaluation of four paired gels, we selected six proteins the level of which in two or more tumor specimens was at least 10-fold higher than in the paired normal tissue (thymosin beta-10, cathepsin D (CTSD), S100 calcium binding protein A9 (S100A9), tropomyosin 3 and cyclophillin A. These proteins were identified by mass-spectrometry. For five of the six proteins, the observed upregulation in gastric adenocarcinoma is in agreement with the data of other recent studies. At the same time, our study is the first one to report consistently increased hCG1816442 levels in gastric tumors. Cyclophilin A is the most promising to further investigation to assay its prognostic value, since its expression level is low in most normal tissues and tumors of other localizations.

Key words: stomach cancer, 2D-proteomics.

Злокачественные новообразования желудоч- смертность от РЖ зафиксирована в Японии,

но-кишечного тракта, среди которых лидирует странах Восточной Европы, Юго-Восточной

рак желудка (РЖ), в большинстве стран мира Азии и Латинской Америки. Показатели

занимают 2-3-е место по смертности от онко- 5-летней выживаемости при этой патологии

логических заболеваний. Особенно высокая не превышают 10 %, причем около половины

больных умирают в течение первого года после выявления заболевания [15]. Россия относится к странам с высоким уровнем заболеваемости РЖ, в структуре онкологической заболеваемости он занимает второе место у мужчин, третье - у женщин и лидирует по показателям смертности. Основные перспективы улучшения отдаленных результатов лечения связаны со своевременной диагностикой опухолевого процесса, выявлением ранних форм рака и предраковых изменений слизистой желудка.

Существующие диагностические методы обследования не всегда позволяют распознать заболевание на ранних стадиях, при этом в мире практически отсутствуют тесты, которые могли бы обеспечить эффективную диагностику РЖ на доклинической стадии посредством детекции ассоциированных со злокачественными опухолями биологических маркеров. В клинической практике применяется биохимический тест на рак желудка [5], основанный на ПЦР детекции микрометастазирования в перитонеальной жидкости, но он работает лишь на поздних стадиях заболевания, когда терапевтическое воздействие практически неэффективно. Существует также несколько диагностических тестов, основанных на определении поверхностных маркеров опухолевых клеток (например, СА 19.9 и DR70). Эти тесты обладают невысокой эффективностью из-за низкой специфичности и используются в основном для оценки прогноза клинического течения заболевания. Фундаментальные достижения в понимании механизмов канцерогенеза делают перспективными исследования по выявлению потенциальных маркеров, которые отражают генетические и эпигенетические изменения, нарушения протеомного профиля, ассоциированные со злокачественным процессом.

Для идентификации опухолевых маркеров широко применяются протеомные методы сравнительного анализа белковых профилей нормальных и опухолевых тканей [17, 19]. Такой подход позволяет идентифицировать белковые маркеры, ассоциированные с опухолевой трансформацией. Для разработки потенциальных молекулярных маркеров с диагностической целью необходимо выявление белков, содержание которых существенно повышено в опухоли и

биологических жидкостях (сыворотка крови), что позволило бы осуществлять их детекцию на ранних этапах опухолевого процесса.

В литературе представлено ограниченное число публикаций по идентификации белков с различной концентрацией в нормальной и озло-качествленной слизистой оболочке желудка, при этом имеет место высокая вариабельность белков, ассоциированных с РЖ, выявленных в разных исследованиях. В целом, картина изменения протеома при аденокарциноме желудка остается малоизученной, хотя для ряда белков показано значительное повышение уровня их синтеза при РЖ в японской и китайской популяциях [3, 18]. Это делает актуальными дальнейшие исследования по сравнительному анализу про-теомов опухолевой и нормальной ткани желудка для выявления белков со значительными различиями в уровне синтеза. В настоящее время разработаны подходы, позволяющие на основе антител к опухолеассоциированным белкам создавать чувствительные тест-системы для их детекции в сыворотке крови с целью ранней диагностики или прогноза клинического течения злокачественного процесса.

В связи с тем, что использование стандартных протоколов сравнительной протеомики осложняется наличием большого количества высококопийных структурных белков, нами была использована предварительная экстракция растворимой фракции белков, которая позволила значительно увеличить разрешающую способность 2D-гель электрофореза [1]. В настоящем исследовании был проведен сравнительный протеомный анализ опухолевых и нормальных тканей пациентов с диагнозом рак желудка, что позволило идентифицировать несколько белков, синтез которых значительно повышен в опухоли по сравнению с нормой.

Материал и методы

В исследование включены больные раком желудка, получавшие лечение в торако-абдоминальном отделении НИИ онкологии Сибирского отделения РАМН (г. Томск). Работа проведена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента

РФ от 24.12.93 № 2288), получено разрешение этического комитета института.

Для сравнения нормального и опухолевого протеомов использовали метод двумерного электрофореза парных образцов опухолевой и нормальной ткани от 4 пациентов с диагнозом рак желудка, подтвержденным гистологически. Полученные из операционного материала образцы максимально быстро помещались в жидкий азот и хранились при -80°С. Собранные образцы тканей гомогенизировали с помощью шаровой мельницы Sartorius Mikro Dismembrator и при 7200 об/мин в течение 60 сек при охлаждении жидким азотом. К полученному гомогенату добавляли солевой буфер для экстракции (0,12М ШС1, 20тМ ^ (pH 7,5), 20 тМ КС1, 2тМ Mga2, 0,1 тМ EDTA, 1 тМ PMSF). Растворимую фракцию белков осаждали пятикратным объёмом ацетона (при 4°С, 16 ч) и центрифугировали, осадок подсушивали и растворяли в буфере нанесения О’Фаррелла [12]. Концентрации белка измеряли, используя стандартный метод Брэдфорда [2], 2D гель-электрофорез образцов

проводили согласно методу О’Фаррела, с некоторыми вариациями [12].

Для изоэлектрического фокусирования на трубки наносили по 100 мкг суммарного белка. После изоэлектрофокусировки столбики геля извлекали из трубок, выдерживали в течение 30 мин в буфере Лэммли [9] и замораживали при -80 °С. Разделение во втором направлении проводили в градиентном полиакриламидном геле (10-22 %) при 25 мА, в течение 16 ч. Гели фиксировали и окрашивали нитратом серебра [11]. Кусочки геля, содержащие белки с повышенной экспрессией в опухолях желудка обрабатывались трипсином (метод PMF - Peptide Mass FingerPrint). Белки идентифицировали с помощью MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)-TOF (time of flight) масс-спектрометрии.

Результаты и обсуждение

На рис. 1 представлены фрагменты гелей, полученные после двумерного электрофоретического разделения белков экстрактов нор-

Рис. 1. Фрагменты двумерных электрофореграмм, полученных при разделении белков, растворимых в солевом буфере, из нормальной (А, В) и опухолевой (Б, Г) тканей. Цифрами обозначены белки: 1 - ТВ10, 2 - РР1А, 3 - CTSD/ hCG1816442, 4 - ТРМ3, 5 - 8100А9

е.с. Григорьева, ю.а. букурова, н.в. чердынцева и др.

40 -------------------------------------------------------------------------------------

Таблица 1

Характеристика идентифицированных белков с повышенным содержанием в опухоли

Номер пятна Название белка, сокращенное и полное, номер в базе данных GenPept Повторяемость (число образцов) Мол. вес; локализация Функция Литературные сведения об ассоциации с РЖ

1 TB10 Thymosin beta-10 NP 066926.1 4 5 кДа цитоплазма Формирование цитоскелета [13]

2 PPIA peptidylprolyl isomerase A (cyclophilin A) NP 066953.1 3 18,0 кДа цитоплазма Фолдинг белков Нет данных

3 CTSD Cathepsin D precursor 3 44,5 кДа лизосомы Внеклеточный распад белков [7]

hCG1816442 3 Нет данных Нет данных Нет данных

4 TPM3 tropomyosin 3 NP_001036816.1 2 32,8 кДа цитоплазма Связывание акти-новых филамен-тов, ассоциация тропонинового комплекса Нет данных

5 S100A9 S100 calcium binding protein A9 (calgranulin B) NP_002956.1 2 13,2 кДа секретируемый Регуляция многих клеточных процессов, в том числе клеточного деления. Ингибирует казеин киназу [4]

мальной и опухолевой тканей в соответствии с описанным выше протоколом. Было разделено около 450 белковых пятен в каждом геле. Сравнение 4 пар гелей обнаруживает значительное увеличение интенсивности нескольких пятен в экстракте опухолевой ткани, а также появление новых пятен. В ходе сравнительного анализа электрофореграмм выявлено увеличение синтеза 6 белков: тропомиозина-3, тимозина бета-10, циклофилина А, катепсина Д, ИС01816442 и белка £100-А9 (табл. 1).

В табл. 2 представлены сведения о спектре обнаруженных белков с повышенным синтезом в индивидуальных опухолях во взаимосвязи со стадией процесса и гистопатологической формой опухоли.

Повышение синтеза во всех 4 опухолевых образцах отмечается только для одного белка -тимозина Р-10 (ТВ10). Повышенный синтез циклофилина А отмечен в 3 случаях из 4, тогда как увеличение синтеза катепсина Д, белка ИС01816442, тропомиозина-3 наблюдалось

только в 2 образцах. Кроме того, в 2 случаях из 4 в опухолевых образцах наблюдалось пятно, соответствующее белку 8100-А9, которое отсутствовало во всех образцах нормальной ткани. При характеристике спектра белков с повышенным синтезом в опухоли в сопоставлении с гистологическим типом (интестинальный, диффузный или смешанный) не обнаружено четких взаимосвязей, что, очевидно, обусловлено небольшим числом наблюдений и гетерогенностью материала по клинико-морфологическим параметрам. Следует отметить, однако, что циклофиллин не детектировался в опухоли интестинального гистотипа, в то время как во всех опухолях с наличием элементов диффузного гистологического строения (диффузный и смешанный тип) был выявлен его повышенный синтез.

Повышенный уровень синтеза трех белков (8100-А9, катепсина Д и тимозина Р-10) в опухолях желудка подтверждается литературными данными (табл. 1), тогда как стабильное

Таблица 2

Наличие белков с повышенным синтезом в злокачественных опухолях желудка

№ образца опухоли в базе Локализация и гистологическая характеристика опухоли (тип) Стадия процесса Идентифицированные белки с повышенным содержанием в опухоли

30 Опухоль антрального отдела, умереннодифференцированная аденокарцинома (смешанный) ТДМ, Тимозин бета-10, тропомиозин-3, циклофилин А, катепсин Д/ hCG1816442

32 Кардиоэзофагеальный рак, низкодифференцированная карцинома с перстневидными клетками (интестинальный) Т4^М, Тимозин бета-10, Б100-А9

33 Опухоль средней трети желудка, перстневидноклеточный рак (диффузный) тМ0 Тимозин бета-10, циклофилин А

37 Опухоль верхней трети желудка, низкодифференцированная карцинома (диффузный) Т3^ Тимозин бета-10, тропомиозин-3, циклофилин А, катепсин Д/ Ы^1816442, Б100-А9

повышение уровня синтеза циклофилина А, тропомиозина-3 и белка ЬС01816442 обнаружено нами впервые. Компьютерный анализ базы данных ОепеСаМ8 [6] показал, что для трёх белков (тимозин бета-10, тропомиозин 3, 8100-А9) характерен средний и высокий уровень экспрессии в нормальных и опухолевых тканях различной природы, и, следовательно, эти белки не могут использоваться в качестве специфичных сывороточных маркеров рака желудка. Однако для одного белка - циклофилина А - показан высокий уровень экспрессии только в опухолевой ткани желудка, что делает целесообразными дальнейшие исследования по оценке возможности его использования для диагностики и прогнозирования клинического течения злокачественных опухолей желудка.

Большинство протеомных исследований в настоящее время выполняются с использованием тотального экстракта ткани, содержащего высокий уровень структурных белков, что затрудняет выявление минорных растворимых протеинов, концентрация которых на порядки ниже. Для устранения данного недостатка нами была проведена предварительная экстракция растворимых белков опухолей желудка и парных образцов нормальных тканей. Используя данный подход, мы руководствовались тем, что белки, растворимые в солевом буфере, должны гораздо легче проникать в кровоток в процессе роста опухоли и её некротического распада. Ранее мы показали эффективность такого подхода при протеомном анализе опухолей кишечника

[1]. В настоящем исследовании мы идентифицировали 6 растворимых белков с повышенным уровнем синтеза в опухоли желудка. Среди них, как свидетельствуют данные литературы, нами впервые было обнаружено стабильное увеличение уровня синтеза белков циклофилина А и тропомиозина-3 в опухолевой ткани при раке желудка. В то же время существуют сведения о повышенной экспрессии этих белков в опухолях других локализаций [10, 16]. Также нами впервые было обнаружено стабильное увеличение синтеза в опухоли желудка белка ЬС01816442. Белок ЬС01816442 обнаружен в процессе секвенирования генома человека, и функция его пока не известна [14]. Данные о повышении уровня экспрессии остальных трех белков представлены ранее другими авторами (табл. 1).

Для целей сывороточной диагностики опухолей желудка наиболее перспективным представляется дальнейшее изучение белка циклофилина А, поскольку не показано повышения его экспрессии в нормальной ткани. Циклофилин А локализован в цитозоле, является одним из представителей семейства иммунофилинов и катализирует реакцию цис-транс изомеризации Х-Рго пептидной связи. Показано, что данный белок участвует в регуляции процессов клеточного роста и дифференцировки [8].

Для получения более убедительной информации о возможном диагностическом и прогностическом значении циклофиллина А необходимо увеличение выборки пациентов со

стратификацией групп по гистологическому типу и стадии заболевания. В ближайшей перспективе предполагается провести валидацию его экспрессии в опухолях желудка путем им-муногистохимического исследования на образцах опухолевой ткани от пациентов с раком желудка.

В целом стратегия выявления белков с повышенным синтезом в злокачественных опухолях предполагает возможность ранней серологической диагностики рака соответствующей локализации с помощью антител, полученных к этим белкам, при этом важным является и аспект прогнозирования рецидива заболевания при мониторинге больного после проведенного противоопухолевого лечения.

Авторы приносят глубокую благодарность Н.А. Лисицыну за плодотворное обсуждение результатов работы.

Настоящая работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (гранты 08-04-13705 офи-ц, 09-04-99072 р-офи ) и Международного научнотехнического центра (грант 3909).

ЛИТЕРАТУРА

1. Краснов Г.С., Ханкин С.Л., Букурова Ю.А. и др. Проте-ом злокачественных опухолей толстой кишки человека: идентификация растворимых белков с повышенным содержанием в опухоли // Молекулярная биология. 2009. Т 43. С. 610-615.

2. BradfordM.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248-254.

3. Cheng Y., Zhang J., Li Y. et al. Proteome analysis of human gastric cardia adenocarcinoma by laser capture microdissection // BMC Cancer. 2007. Vol. 7. P. 191

4. El-Rifai Wa’el, Moskaluk C.A., Abdrabbo M.K. et al. Gastric Cancers Overexpress S100A Calcium-binding Proteins //Cancer Res. 2002. Vol. 62. P. 6823-6826.

5. Fuyiwara Y. Genetic detection of free cancer cells in the peritoneal cavity of the patient with gastric cancer: present status and future perspectives // Gastric Cancer. 2007. Vol. 10 (4). P. 197-204.

6. GeneCards, http://www.genecards.org/

7. Ikeguchia Masahide, Fukudaa Kenji, Okaa Shinichi et al. Clinicopathological Significance of Cathepsin D Expression in Gastric Adenocarcinoma // Oncology. 2001. Vol. 61. P 71-78.

8. Khromykh L.M., Kulikova N.L., Anfalova T. V et al. Cyclophilin A produced by thymocytes regulates the migration of murine bone marrow cells // Cell. Immun. 2007. Vol. 249. P. 46-53.

9. Laemmly U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227. P. 680-685.

10. Melle C., Osterloh D., Ernst G. et al. Identification of proteins from colorectal cancer tissue by two-dimensional gel electrophoresis and SELDI mass spectrometry // Int. J. Mol. Med. 2005. Vol. 16. P. 11-17.

11. Mortz E., Krogh T., Vorum H., Gorg A. Improved silver staining protocols for high sensitivity protein identification using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight analysis // Proteomics. 2001. Vol. 1. P. 1359-1363.

12. OFarrellP.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins // J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250. P 4007^021.

13. Oien KA., Vass K.J., Downie I. et al. Profiling, comparison and validation of gene expression in gastric carcinoma and normal stomach // Oncogene. 2003. Vol. 22. P. 4287-4300.

14. PubMed, http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

15. Peddanna N., Holt S., Verma R.S. Genetics of gastric cancer // Anticancer Res. 1995.Vol. 15 (5B). P 2055-2064.

16. Santelli G., Califano D., Chiappetta G. et al. Thymosin b-10 Gene Overexpression Is a General Event in Human Carcinogenesis // Am. J. Pathol. 1999. Vol. 155 (3). P. 799.

17. Veenstra T.D., Conrads T.P., HoodB.L. et al. Biomarkers: mining the biofluid proteome // Mol. Cell Proteomics. 2005. Vol. 4 (4). P. 409-418.

18. Yoshihara T., Kadota Y., Yoshimura Y. et al. Proteomic alteration in gastic adenocarcinomas from Japanese patients // Mol. Cancer. 2006. Vol. 5. P. 75.

19. Zhang H., Yi E.C., Li XJ. et al. High-throughput quantitative analysis of serum proteins using glycopeptide capture and liquid chromatography mass spectrometry // Mol. Cell Proteomics. 2005. Vol. 4 (2). P 144-155.

nocrynu^a 9.09.09