СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГЛАЗ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ, ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РЕПАРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ И ЭПИТЕЛИЗАЦИИ
METHOD OF TREATING INFLAMMATORY EYE DISEASES IN HUMAN AND ANIMALS FOR STIMULATION OF REPAIR PROCESSES AND EPITHELISATION

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности и медицины, а именно к созданию офтальмологических средств, и может быть использовано для лечения заболеваний и повреждений роговицы.
Известен состав для лечения ожогов роговицы, содержащий фермент - фибринолизин 30000 ед., вазелин 2,5 г, ланолин - 5,0 г. (Ф.Колущинская и др. Фибринолизин в комплексном лечении ожогов глаз. - Вест. офтальмол., 1977, №3, с.42-45). Состав представляет собой мазь светло-желтого цвета, которую больным закладывали в конъюнктивальный мешок 4-6 раз в день. Почти у всех больных уменьшался отек и инфильтрация роговицы, наступала эпителизация. Однако у части больных отмечалось увеличение эрозии роговицы и неполное очищение от нежизнеспособных тканей стромы.
Известны глазные капли «Баларпан», содержащие сульфатированные гликозаминогликаны, хлорид натрия, одно- и двузамещенные соли натрия и воду, обладающие специфическим действием на репаративные процессы в роговице (патент РФ №2128975 от 1999).
Недостатком этих глазных капель является слабо выраженное антивоспалительное действие.
Известны глазные капли, включающие сульфатированные гликозаминогликаны и физиологический раствор солей натрия, и дополнительно могут содержать тобрамицин (патент РФ №2171107 от 2001).
Недостатком данных капель является узкий спектр терапевтического действия.
Наиболее близким техническим решением являются глазные капли, содержащие водорастворимую смесь гликозоаминогликанов, выделенных из роговицы глаз крупного рогатого скота, в которых гликозоаминогликаны взяты в количестве 0,1-1,0 мас.%, остальное - физиологический раствор (патент РФ №2062079 от 1996).
Недостатком данных капель является то, что они не оказывают достаточного специфического действия на репаративные процессы в роговице, поскольку в их составе раздельно отсутствуют специфические биологические стимуляторы, а также, по-видимому, потому, что они содержат смесь разных гликозаминогликанов, взятых в неэффективном количестве, а не дозированное предлагаемое сочетание натриевой соли кератансульфата, а также натриевой соли хондроитинсульфата.
Задачей настоящего изобретения является создание многофункционального средства для лечения заболеваний и повреждений роговицы.
Техническим результатом заявляемого изобретения является сокращение сроков лечения при воспалительных заболеваниях глаза и при травматических повреждениях его за счет выраженного антиэкссудативного действия и более раннего наступления стимуляции репаративных и обменных процессов и снижения тем самым количества осложнений.
Поставленная задача решена созданием глазных капель для лечения воспалительных заболеваний глаз человека и животных, для стимуляции репаративных процессов и эпителизации.
Глазные капли содержат пептиды, ассоциированные с фосфолипидами, полученные из печени тресковых, лубрикант, буфер, консервант, изотонирующий агент натрия хлорид и воду для инъекций при следующем соотношении ингредиентов в мас.%:
пептиды, ассоциированные с фосфолипидами,
полученные из печени тресковых
0,01-5,0
лубрикант
0,1-5,0
буфер
0,1-5,0
консервант
0,01-0,3
изотонирующий агент натрия хлорид
0,1-0,9
вода для инъекций
остальное до 100,
при условии, что пептиды, ассоциированные с фосфолипидами, используют при соотношении пептидной и фосфолипидной фракции в масс.%: 40-99 пептидов и 1-60 фосфолипидов.
Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, полученных из печени тресковых, которые являются селективными ингибиторами циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) и 5-липооксигеназы (5-ЛОГ).
Комплекс пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, получают из печени тресковых рыб. Для этого печень замороженной трески измельчают электромясорубкой, на волчке и т.п. до получения гомогенного сырья. Добавляют воду и растительное масло, например подсолнечное, кукурузное, льняное, соевое, экстрагируют сырье при комнатной температуре 10-15 минут, фильтруют. Полученную эмульсию сепарируют. К водной фазе добавляют спирт этиловый для осаждения белков и выдерживают при 0-(-5°)С в течение 18-24 часов до полного осаждения пептидов, фильтруют и лиофилизируют смесь. Анализ целевого продукта проводили методом газовой хроматографии с масс-спектрометрией. В продукте пептиды, ассоциированные с фосфолипидами, полученные из печени тресковых, содержатся при соотношении: 40-99 мас.% и фосфолипиды 1-60 мас.%.
Фосфолипиды представлены преимущественно фосфатидилхолином. Пептидная фракция представлена комплексом полипептидов различной молекулярной массы (до 25 кДа). Состав пептидов может изменяться в зависимости от конкретного вида рыб, состояния используемого сырья, не оказывая при этом значимого влияния на целевую фармакологическую активность. Заявленные свойства продукт проявляет при указанном соотношении пептидной и фосфолипидной фракций. Выделение из продукта отдельных пептидных фракций или отдельных полипептидов с последующим определением их фармакологической активности свидетельствовало об уменьшении выраженности эффектов и недостижении заявленного в настоящем изобретении суммарного противовоспалительного, противоаллергического и ранозаживляющего действия.
В качестве противовоспалительного средства пептиды, ассоциированные с фосфолипидами, полученные из печени тресковых, используют для профилактики и лечения различных заболеваний, включая воспалительные и аллергические острые и хронические процессы различной этиологии.
Лубрикант выбран из группы, состоящей из полиэтиленгликоля, поливинилпирролидона, поливинилового спирта, водорастворимых производных целлюлозы - метилцеллюлозы или натрия карбоксиметилцеллюлозы, полиакриламида, полиглюкина, пропиленгликоля, полиэтиленгликоля гидроксистеарата, полиэтиленгликоля глицерилгидроксистеарата или их смеси. Лубриканты защищают слизистую оболочку от появления микротрещин и раздражения, через которые проникают инфекции, снимают болевые ощущения и повышают комфорт.
Буфер выбран из группы, состоящей из фосфатного, нитратного, ацетатного, боратного буфера. Буфер стабилизирует глазные капли и способствует комфортному ощущению при закапывании в глаза.
Консервант выбран из группы, состоящей из нипагина, нипазола, цетримида, бензилового спирта, натрия бензоата, натрия сорбата, калия сорбата.
Глазные капли могут дополнительно содержать антиоксидант в количестве 0,01-0,5 мас.%, выбранный из группы, состоящей из натрия метабисульфита, натрия сульфита, натрия тиосульфата или трилона Б.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Глазные капли (состав в мас.%).
Пептиды, ассоциированные с фосфолипидами - 0,1
Полиэтиленгликоль 660 гидроксистеарат (Solutol) - 2,0
Натрия гидрофосфат - 1,5
Калия дигидрофосфат - 0,1
Натрия метабисульфит - 0,05
Нипагин - 0,1
Изотонирующий агент натрия хлорид - 0,2
Вода для инъекций - до 100,0
Способ получения активного начала:
50 кг замороженной печени трески (Gadus morrhua L.) измельчают электромясорубкой, добавляют в фарш 10 л воды, перемешивают и затем приливают 10 л масла растительного, экстрагируют в реакторе при комнатной температуре 15 минут. По окончании экстракции массу выдерживают 5 минут и далее фильтруют через капроновую сетку. Полученную эмульсию разделяют сепарированием. К водному раствору прибавляют спирт этиловый в соотношении 1:2,6, выдерживают при температуре 0-6°С в течение 20-24 ч до полного осаждения белков, фильтруют и лиофилизируют. Выход целевого продукта составляет 18 г на 1 кг исходного сырья.
Выделенный комплекс пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, используемый в данном изобретении, содержит 15,3% фосфолипидов в пересчете на фосфатидилхолин и 84,7% полипептидов, содержащих преимущественно основные пептидные фракции приблизительной массой 6,5 кДа и 17 кДа в приблизительно равных количествах. Получаемый продукт не содержит высокомолекулярных белковых контаминаций (отрицательная реакция на белок с раствором трифторуксусной кислоты).
Пример 2
Глазные капли (состав в мас.%).
Пептиды, ассоциированные с фосфолипидами - 0,1
Натрия карбоксиметилцеллюлоза - 2,0
Боратный буфер-  0,1
Цетримид - 0,01
Изотонирующий агент натрия хлорид - 0,6
Вода для инъекций - до 100,0
Способ получения активного начала:
10 кг замороженной печени путассу (Micromesistius G.) измельчают на волчке, добавляют в фарш 4,5 л воды и 6 л масла кукурузного и экстрагируют в реакторе при комнатной температуре 20 минут. По окончании экстракции массу выдерживают 10 минут и далее фильтруют через капроновую сетку и фильтрокартон. Полученную эмульсию разделяют. К водному раствору прибавляют спирт этиловый в соотношении 1:4,6, выдерживают при температуре 5-10°С в течение 20-24 ч до полного осаждения белков, фильтруют и высушивают. Выход целевого продукта составляет 21 г на 1 кг исходного сырья.
Выделенный комплекс пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, используемый в данном изобретении, содержит 60,0% фосфолипидов в пересчете на фосфатидилхолин и 40,0% полипептидов, содержащих преимущественно основные пептидные фракции приблизительной массой 11,5 кДа и 24,9 кДа. Получаемый продукт не содержит высокомолекулярных белковых контаминаций (отрицательная реакция на белок с раствором трифторуксусной кислоты).
Экспериментальные исследования показали:
Пример 3. Оценка раздражающего действия in ovo.
Раздражающее действие оценивали с помощью теста на хориоаллантоисной оболочке куриного эмбриона (ХЕТ-КАМ тест) в соответствии с Методическими указаниями по оценке раздражающего действия фармакологических веществ (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва. 2000. - С.87-89).
Для исследования использовали развивающиеся эмбрионы яиц домашних кур породы "Хайсекс браун" в возрасте 10 дней. Яйца выдерживали в инкубаторе при температуре 37,8°С и относительной влажности 62,5%. Перед опытом инкубированные яйца выдерживали в течение 24 часов в стационарном положении тупым концом вверх, за сутки до опыта их переносили из инкубатора в термостат (37,8°С). На подготовленную хориоаллантоисную оболочку наносили по 0,3 мл исследуемого раствора. Наблюдение за состоянием оболочки под каплей осуществляли в течение 100 секунд через бинокулярный стереоскопический микроскоп (Лабостеми-4 зум). Регистрация производилась каждые 10 секунд фотографированием оболочки под каплей с помощью специализированной цветной телевизионной камеры (Зенит ТВК-МИ-01С), соединенной с бинокулярным микроскопом.
В качестве критерия раздражающего действия использовали показатель воздействия на хориоаллантоисную оболочку в течение 100 секунд.
Классификация веществ по степени вызванного раздражения приведена в таблице 1.
Таблица 1
Класс
Наблюдаемая картина
5-й класс, очень сильная
Коагуляция и лизис сосудов мелких и средних, множественные кровоизлияния и тромбоз с остановкой кровотока.
4-й класс, сильная
Тромбоз в мелких сосудах с остановкой кровотока и мелкие точечные кровоизлияния по всей обработанной поверхности. Гиперемия.
3-й класс, умеренная
Покраснение оболочки, замедление тока крови и тромбоз в отдельных капиллярах.
2-й класс, слабая
Сужение сосудов без остановки или с временной остановкой кровообращения в отдельных капиллярах.
1-й класс, отсутствие воздействия
Не нарушенная прозрачная тонкая оболочка с нормально функционирующей сетью кровеносных сосудов и капилляров.
Результаты исследования по определению степени раздражения хориоаллантоисной оболочки (М±m) приведены в таблице 2.
Таблица 2
Образец
Среднее значение наблюдаемой степени раздражения по 10 временным точкам М±m, n=15
Глазные капли по примеру 2
1,24±0,03
Глазные капли по примеру 1
1,20±0,05
Исходя из данных, полученных в ходе эксперимента на хориоаллантоисной оболочке, можно сделать вывод о том, что глазные капли, содержащие комплекс пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, полученный из печени тресковых, не оказали выраженного влияния на целостность сосудов разного диаметра и их тонус. Согласно классификации веществ по степени раздражения исследуемый образец относится к классу 1, что позволяет сделать вывод о том, что глазные капли, содержащие комплекс пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, полученный из печени тресковых, не относятся к раздражающим веществам.
Пример 4. Изучение влияния глазных капель на эпителизацию.
Оценивали влияние глазных капель, приготовленных по примеру 1 и примеру 2, на эпителизацию раны глаза кролика.
Кроликам (5 животных) произведены непроникающие ранения роговицы правых и левых глаз. Через 1 сутки наблюдалась умеренная смешанная инъекция сосудов, отек роговицы, частичная эпителизация раневой поверхности, края раны разомкнуты, незначительный фибринозный экссудат в передней камере в области зрачка. Радужная оболочка гиперимирована. Спустя 1 сутки после вмешательства в конъюнктивальную полость правых глаз животных 5 раз в день проводились инстилляции приготовленных в соответствии с примерами 1 или 2 глазных капель. В левый глаз кроликов проводились инстилляции раствора сравнения, содержащего вспомогательные вещества в указанных в примере 1 (или 2) соотношениях и не содержащего активного вещества (комплекс пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, полученный из печени тресковых).
Через 2 суток после вмешательства: правый глаз спокойный, отек роговицы не определяется, большая часть зоны ранения покрыта эпителием, края формирующегося рубчика сомкнуты, роговица в этой зоне непрозрачна. Экссудат в передней камере отсутствует, радужная оболочка без особенностей. Через 3 суток зона ранения полностью покрыта эпителием. Через 9 дней прозрачность роговицы восстановилась полностью. Спустя три недели при гистологическом и электронно-микроскопическом исследовании изменений в структуре роговицы не обнаружено. Эпителизация раны левых глаз испытуемых животных происходила медленнее: инъекция сосудов и экссудат в передней камере сохранялись до 4 дня после вмешательства. Полное покрытие эпителием отмечено на 5 сутки после вмешательства, прозрачность роговицы практически полностью восстановилась через 14 дней.
Были проведены клинические испытания.
Пример 5. Применение средства на основе пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, для лечения воспалительных офтальмологических заболеваний у человека.
Пациент-доброволец, студент, возраст 26 лет. Более 1 месяца жалобы на зуд в глазах при и после ношения контактных линз, быструю утомляемость глаз при чтении и работе с компьютером. Объективно: глаз раздражен, покраснение, инъекция сосудов, роговица отечная, скудное отделяемое. Диагноз - конъюнктивит. Для лечения были назначены глазные капли, приготовленные по примеру 1, в конъюнктивальную полость по 1-2 капли 4 раза в день в течение 7 суток в оба глаза. После лечения: жалоб не предъявляет, глаза спокойные, конъюнктива розовая, роговица прозрачная.
Таким образом, глазные капли, содержащие комплекс пептидов, ассоциированных с фосфолипидами, полученный из печени тресковых, ускоряли репаративные процессы поврежденных тканей глаза, способствуя эпителизации и восстановлению функций, оказывали противовоспалительное действие.