МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛНОСТЬЮ 2-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ТРАНСКРИПТОВ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1. Выделенная T7 РНК-полимераза, содержащая измененную аминокислоту в положении 639 и положении 784, где измененная аминокислота в положении 639 не является фенилаланином, когда измененная аминокислота в положении 784 представляет собой аланин.
2. Выделенная T7 РНК-полимераза по п.1, дополнительно содержащая измененную аминокислоту в положении 378.
3. Выделенная T7 РНК-полимераза по п.1, дополнительно содержащая измененную аминокислоту в положении 266.
4. Выделенная T7 РНК-полимераза по п.1, где измененная аминокислота в положении 639 представляет собой лейцин, и измененная аминокислота в положении 784 представляет собой аланин.
5. Выделенная T7 РНК-полимераза по п.1, где измененная аминокислота в положении 266 представляет собой лейцин.
6. Выделенная T7 РНК-полимераза по п.1, где измененная аминокислота в положении 378 представляет собой аргинин.
7. Выделенная T7 РНК-полимераза по п.1, где измененные аминокислоты увеличивают выход транскрипции нуклеиновых кислот, содержащих 2'-OMe-модификации, посредством полимеразы, в реакции транскрипции, содержащей только 2'-OMe-нуклеотидтрифосфаты.
8. Выделенная T7 РНК-полимераза по п.7, где увеличение выхода транскрипции соотносят с выходом транскрипции для T7 РНК-полимеразы без измененных аминокислот при проведении транскрипции в идентичных условиях транскрипции.
9. Выделенная T7 РНК-полимераза по п.1, где измененные аминокислоты уменьшают дискриминацию против 2'-OMe-нуклеотидтрифосфатов.
10. Выделенная T7 РНК-полимераза по п.9, где уменьшение дискриминации против 2'-OMe-нуклеотидтрифосфатов соотносят с дискриминацией для T7 РНК-полимеразы без измененных аминокислот.
11. Выделенная T7 РНК-полимераза по п.8, где T7 РНК-полимераза без измененных аминокислот представляет собой T7 РНК-полимеразу дикого типа, содержащую аминокислоту в положении 639, замененную фенилаланином, и аминокислоту в положении 784, замененную аланином.
12. Выделенный полипептид, содержащий аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 102 и SEQ ID NO 103.
13. Способ транскрипции одноцепочечной нуклеиновой кислоты, включающий инкубацию полимеразы по п.1 с нуклеиновой кислотой-матрицей в условиях реакции, подходящих для обеспечения транскрипции.
14. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по п.1.
15. Выделенная последовательность нуклеиновой кислоты, выбранная из группы, состоящей из: SEQ ID NO 122, SEQ ID NO 123, SEQ ID NO 124 и SEQ ED NO 125.
16. Вектор, содержащий выделенную последовательность нуклеиновой кислоты по п.14.
17. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.14, функционально связанную с промотором.
18. Клетка, содержащая экспрессирующий вектор по п.17.
19. Клетка по п.18, где клетка экспрессирует мутантную T7 РНК-полимеразу.
20. Набор, содержащий контейнер, содержащий T7 РНК-полимеразу по п.1.
21. Набор, содержащий контейнер, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую T7 РНК-полимеразу по п.1.
22. Способ транскрипции полностью 2'-OMe-нуклеиновой кислоты, включающий стадии a) инкубации нуклеиновой кислоты-матрицы в реакционной смеси, содержащей мутантную РНК-полимеразу, нуклеиновую кислоту-матрицу для транскрипции и нуклеозидтрифосфаты, где нуклеозидтрифосфаты являются 2'-OMe, и
b) транскрипции в реакционной смеси для транскрипции в течение времени, достаточного для получения одноцепочечной нуклеиновой кислоты, где все нуклеотиды одноцепочечных нуклеиновых кислот являются 2'-OMe-модифицированными, за исключением того, что первый нуклеотид в транскриптах может являться 2'-немодифицированным.
23. Способ по п.22, где мутантная РНК-полимераза представляет собой мутантную T7 РНК-полимеразу, содержащую измененную аминокислоту в положении 639 и положении 784.
24 Способ по п.23, где мутантная T7 РНК-полимераза представляет собой мутантную T7 РНК-полимеразу по п.1.
25. Способ по п.22, где реакция транскрипции дополнительно содержит ионы магния.
26. Способ по п.22, где реакция транскрипции дополнительно содержит ионы марганца.
27. Способ по п.22, где реакция транскрипции дополнительно содержит не относящийся к 2'-OMe-гуанозину и к трифосфату остаток.
28. Способ по п.22, где матрица для транскрипции содержит промотор T7 РНК-полимеразы.
29. Способ по п.26, где ионы магния присутствуют в реакции транскрипции в концентрации, в 3,0-3,5 раза превышающей концентрацию ионов марганца.
30. Способ по п.26, где каждый нуклеотидтрифосфат присутствует в реакции транскрипции в концентрации 1,0 мМ, концентрация ионов магния составляет 6,5 мМ, и концентрация ионов марганца составляет 2,0 мМ.
31. Способ по п.26, где каждый нуклеотидтрифосфат присутствует в реакции транскрипции в концентрации 1,5 мМ, концентрация ионов магния составляет 8 мМ, и концентрация ионов марганца составляет 2,5 мМ.
32. Способ по п.26, где каждый нуклеотидтрифосфат присутствует в реакции транскрипции в концентрации 2,0 мМ, концентрация ионов магния составляет 9,5 мМ, и концентрация ионов марганца составляет 3,0 мМ.
33. Способ по п.22, где реакция транскрипции дополнительно содержит полиэтиленгликоль.
34. Способ по п.22, где не относящийся к 2'-OMe-гуанозину и к трифосфату остаток выбран из группы, состоящей из: гуанозинмонофосфата, гуанозиндифосфата,
2'-фторгуанозинмонофосфата, 2'-фторгуанозиндифосфата,
2'-аминогуанозинмонофосфата, 2'-аминогуанозиндифосфата,
2'-дезоксигуанозинмонофосфата и 2'-дезоксигуанозиндифосфата.
35. Способ по п.22, где реакция транскрипции содержит неорганическую пирофосфатазу.
36. Способ идентификации аптамеров, включающий:
a) получение реакционной смеси для транскрипции, содержащей мутантную полимеразу по п.1, и одну или несколько нуклеиновых кислот-матриц для транскрипции;
b) транскрипцию в реакционной смеси для транскрипции для получения смеси одноцепочечных нуклеиновых кислот-кандидатов, где все, необязательно, за исключением одного, нуклеотиды одноцепочечных нуклеиновых кислот являются 2'-модифицированными,
c) контактирование смеси кандидатов с молекулой-мишенью,
d) выделение нуклеиновых кислот, обладающих увеличенной аффинностью по отношению к молекуле-мишени по сравнению с аффинностью смеси кандидатов, из смеси кандидатов и
e) амплификацию нуклеиновых кислот с увеличенной аффинностью для получения обогащенной смеси аптамеров, посредством чего идентифицируют аптамеры к молекуле-мишени, содержащие все 2'-модифицированные нуклеотиды, за исключением того, что первый нуклеотид аптамеров может являться 2'-немодифицированным.
37. Способ по п.36, где стадия амплификации включает i) необязательно, диссоциацию нуклеиновых кислот с увеличенной аффинностью от мишени, ii) обратную транскрипцию нуклеиновых кислот с увеличенной аффинностью, диссоциированных из комплексов нуклеиновая кислота-мишень, iii) амплификацию обратно-транскрибированных нуклеиновых кислот с увеличенной аффинностью; и (iv) получение реакционной смеси для транскрипции, содержащей амплифицированные нуклеиновые кислоты с увеличенной аффинностью, полученные обратной транскрипцией, в качестве матрицы для транскрипции, и транскрипцию в смеси для транскрипции.
38. Способ по п.36, где все нуклеотидтрифосфаты в реакционной смеси для транскрипции являются 2'-OMe-модифицированными.
39. Способ по п.36, где одна или несколько нуклеиновых кислот-матриц для транскрипции содержат промотор T7 РНК-полимеразы и лидерную последовательность непосредственно 3' по отношению к промотору T7 РНК-полимеразы.
40. Способ по п.37, включающий повторяющиеся несколько раз стадии a)-e).
41. Способ идентификации последовательности компонента нуклеиновой кислоты-матрицы для усиления транскрипции, включающий:
a) получение библиотеки матриц-кандидатов для транскрипции, где матрицы содержат промотор, первую фиксированную область непосредственно 3' по отношению к промотору, вырожденную область непосредственно 3' по отношению к первой фиксированной области и вторую фиксированную область 3' по отношению к вырожденной области,
b) транскрипцию библиотеки матриц-кандидатов для транскрипции в реакции транскрипции для получения смеси для транскрипции с выходом транскрипта,
c) обратную транскрипцию смеси для транскрипции для получения смеси кДНК-матриц-кандидатов, где кДНК-матрицы содержат 5'- и 3'-конец,
d) лигирование последовательности ДНК, кодирующей промотор, с 3'-концом кДНК-матриц в реакции лигирования,
e) амплификацию кДНК-матриц для получения библиотеки матриц-кандидатов для транскрипции и
f) идентификацию компонента последовательности нуклеиновой кислоты для усиления транскрипции из библиотеки матриц-кандидатов для транскрипции, где компонент последовательности нуклеиновой кислоты содержит последовательность, полученную по меньшей мере из части вырожденной области.
42. Способ по п.41, где стадия f) включает стадии:
i) клонирования библиотеки матриц-кандидатов для транскрипции в отдельные матрицы для транскрипции,
ii) транскрипции отдельных матриц для транскрипции в реакции транскрипции для получения выхода транскриптов,
iii) оценки выхода транскриптов отдельных матриц для транскрипции, и
iv) идентификацию в матрице для транскрипции компонента последовательности нуклеиновой кислоты, приводящего к предопределенному выходу транскрипта.
43. Способ по п.42, где предопределенный выход транскрипта представляет собой выход, превышающий выход транскрипта, полученный на стадии b) посредством транскрипции смеси матриц-кандидатов для транскрипции.
44. Способ по п.41, где стадия f) включает анализ состава оснований вырожденной области библиотеки матриц-кандидатов для транскрипции и идентификацию компонента последовательности нуклеиновой кислоты на основании усредненного состава оснований библиотеки матриц-кандидатов для транскрипции.
45. Способ по п.41, где стадия b) дополнительно включает обработку смеси для транскрипции после транскрипции ДНКазой.
46. Способ по п.41, где стадия дополнительно включает очистку реакционной смеси для транскрипции после транскрипции посредством отделения транскрибированных матриц для транскрипции от других компонентов реакции транскрипции.
47. Способ по п.46, где стадия очистки включает замену буфера для реакции транскрипции путем пропускания реакции транскрипции через обессоливающую колонку.
48. Способ по п.41, где стадию d) выполняют перед стадией c).
49. Способ по п.41, где реакция лигирования представляет собой реакцию лигирования с расщеплением, и реакция лигирования содержит нуклеиновокислотный шунт и 5'-монофосфорилированный олигонуклеотид, кодирующий промотор.
50. Способ по п.41, дополнительно включающий повторяющиеся более одного раза стадии b)-e) перед проведением стадии f).
51. Способ по п.41, где реакция транскрипции содержит один или несколько модифицированных нуклеотидтрифосфатов и мутантную полимеразу.
52. Способ по п.51, где один или несколько модифицированных нуклеотидтрифосфатов представляет собой 2'-модифицированный нуклеотидтрифосфат.
53. Способ по п.51, где мутантная полимераза представляет собой мутантную T7 РНК-полимеразу.
54. Способ по п.51, где модифицированный нуклеотидтрифосфат представляет собой 2'-OMe-нуклеотидтрифосфат.
55. Способ по п.51, где реакция транскрипции содержит ионы магния и ионы марганца.
56. Способ по п.55, где мутантную T7 РНК-полимеразу выбирают из группы, состоящей из: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 100, SEQ ID NO 101, SEQ ID NO 102 и SEQ ID NO 103.
57. Способ по п.55, где ионы магния присутствуют в реакции транскрипции в концентрации, что в 3,0-3,5 раз больше концентрации ионов марганца.
58. Способ по п.55, где каждый нуклеотидтрифосфат присутствует в реакции транскрипции в концентрации 1,0 мМ, причем концентрация ионов магния составляет 6,5 мМ, и концентрация ионов марганца составляет 2,0 мМ.
59. Способ по п.55, где каждый нуклеотидтрифосфат присутствует в реакции транскрипции в концентрации 1,5 мМ, причем концентрация ионов магния составляет 8 мМ, и концентрация ионов марганца составляет 2,5 мМ.
60. Способ по п.55, где каждый нуклеотидтрифосфат присутствует в реакции транскрипции в концентрации 2,0 мМ, причем концентрация ионов магния составляет 9,5 мМ, и концентрация ионов марганца составляет 3,0 мМ.
61. Способ по п.41, где реакция транскрипции дополнительно содержит полиалкиленгликоль.
62. Способ по п.61, где полиалкиленгликоль представляет собой полиэтиленгликоль.
63. Способ по п.41, где реакция транскрипции дополнительно содержит остаток гуанозина, выбранный из группы, состоящей из: гуанозинмонофосфата, гуанозиндифосфата,
2'-фторгуанозинмонофосфата, 2'-фторгуанозиндифосфата,
2'-аминогуанозинмонофосфата, 2'-аминогуанозиндифосфата,
2'-дезоксигуанозинмонофосфата и 2'-дезоксигуанозиндифосфата.
64. Способ по п.41, где реакция транскрипции содержит неорганическую пирофосфатазу.
65. Способ по п.41, где первая фиксированная область состоит из 2, 3, 4 или 5 остатков гуанозина.
66. Способ по п.41, где вырожденная область содержит по меньшей мере 4, 10, 20 или 30 нуклеотидов.
67. Способ по п.41, где последовательность компонента нуклеиновой кислоты-матрицы, подлежащая идентификации, представляет собой лидерную последовательность.
68. Способ по п.67, где лидерная последовательность содержит первую фиксированную область и последовательность, полученную из вырожденной области библиотеки матриц-кандидатов для транскрипции.
69. Лидерная последовательность, идентифицированная способом по п.41.
70. Лидерная последовательность, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты от нуклеотида 22 до нуклеотида 32 в любой из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO 10-99.
71. Лидерная последовательность, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты от нуклеотида 18 до нуклеотида 32 в любой из последовательностей, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO 10-99.
72. Матрица для транскрипции, содержащая лидерную последовательность по п.70.
73. Олигонуклеотидная матрица для транскрипции, выбранная из группы, состоящей из: SEQ ID NO 3-6 и 106.