Бессывороточная среда "ВНИИЗЖ" для культивирования клеток почки сирийского хомячка ВНК-21 и получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин
SERUM-FREE ENVIRONMENT “VNIIZZH” FOR THE CULTIVATION OF VNK-21 KIDNEY CELLS OF THE SYRIAN HAMSTER AND THE PRODUCTION OF IMMUNOGENIC COMPONENTS OF CULTURE-BASED VIRUSES OF FOOT-AND-MOUTH DISEASE AND RABIES FOR THE MANUFACTURE OF VACCINES

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к разработке бессывороточной среды «ВНИИЗЖ», применяемой для культивирования клеток почки сирийского хомячка ВНК-21 и получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин.
Вирус ящура остается важным патогеном диких и домашних плотоядных животных более 120 лет после его выявления, с ежегодными затратами на производственные потери и вакцинацию, которые оцениваются в 5,3-17 миллиардов евро в год. Контроль и искоренение затруднены, потому что ящур очень заразен для самых разных видов, генетически и антигенно разнообразен [1].
Ящур вызывается РНК-содержащим вирусом, который принадлежит к порядку Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus [2]. Вирус ящура характеризуется высокой антигенной изменчивостью за счет мутаций в генах капсидных белков [1].
Культивирование вируса ящура в перевиваемой суспензионной клеточной линии почки сирийского хомячка (ВНК-21), применяемой для изготовления противоящурных вакцин, позволяет получать четыре варианта структурных компонентов с разными значениями констант седиментации:
1
2
3
4
1) 146S компонент (полные частицы), состоящие из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представлена комплексом белков VP (1D), VP (1B), VP (1С), VP (1A); отвечает за иммуногенные свойства антигена;
0
1
3
2) 75S частицы («пустые» капсиды), лишенные РНК и включающие в себя 60 копий, состоящих из полипептидов VP (1АВ), VP (1D), VP (1С); отвечают за иммуногенные свойства антигена;
1
2
3
3) 12S частицы (капсомеры), представленные структурными белками VP (1D), VP (1B), VP (1C);
g
4) 3,8S субъединицы, представленные неструктурным белком VP [1, 3].
Система мер по борьбе и профилактике ящура включает вакцинацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной и угрожаемых зонах Российской Федерации [1]. Для этого требуется изготовление противоящурных вакцин в промышленных масштабах. Рутинная вакцинация против данного заболевания проводится во многих странах или зонах, признанных свободными от ящура с вакцинацией, и в странах, где данная болезнь является эндемичной. Кроме того, многие страны, свободные от болезни, не отказываются от проведения иммунизации животных и имеют свои собственные стратегические запасы инактивированных вирусных препаратов, содержащих высокие концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов [2]. Такие запасы антигена обеспечивают возможность поставки полученных вакцин в чрезвычайной ситуации и в короткие сроки. Исходя из этого, потребность в получении иммуногенных компонентов вируса ящура высока для изготовления противоящурных вакцин и обеспечения эпизоотической безопасности отдельных стран и целых регионов.
Традиционные противоящурные инактивированные вакцины должны включать в свой состав определенные количества иммуногенных компонентов вируса ящура, полученные в результате репродукции вируса в чувствительной клеточной линии, с добавлением адъюванта и дополнительных соединений [2].
Для получения 146S и 75S иммуногенных компонентов вируса ящура применяют перевиваемую суспензионную клеточную линию из почки сирийского хомячка ВНК-21, свободную от контаминирующих микроорганизмов [1, 2].
Бешенство - зоонозная инфекция с острым вирусным энцефалитом, с почти 100%-ной летальностью, высокий показатель среди известных инфекционных заболеваний [4].
Возбудителем данной болезни является вирус бешенства порядка Mononegavirales, семейства Rhabdoviridae, рода Lyssavirus, вида Rabies lyssavirus [5].
Геном вируса представлен несегментированной одноцепочечной негативной молекулой РНК длиной около 12000 н.о. Нуклеиновая кислота кодирует 5 основных белков, расположенных в консервативном линейном порядке: нуклеопротеин (N-белок), фосфопротеин (Р-белок), матриксный белок (М-белок), гликопротеин (G-белок), РНК-зависимую РНК-полимеразу (L-белок) [9]. Вирион вируса бешенства имеет пулевидную форму длиной 130-250 нм и диаметром 60-100 нм. Он состоит из следующих функциональных структур: RNP-комплекс (рибонуклеопротеин), расположенный внутри вириона, и внешняя белково-липидная составляющая. RNP-комплекс представляет собой внутренний нуклеокапсид, который включает в себя геномную РНК, прочно связанную с нуклеопротеидом и фосфопротеином, а также вирусную полимеразу. Рибонуклеопротеин является важным иммуногенным компонентом вакцинных препаратов против бешенства. В RNP-комплексе содержится 4% РНК к 96% белка [2]. Снаружи вириона располагается двухслойная липидная оболочка с «шипами» гликопротеина. Матричный белок находится между RNP-комплексом и внешней составляющей вириона, конденсирует нуклеопротеин и взаимодействует с эндодоменом гликопротеином [4].
Белки вируса бешенства полифункциональны. Нуклеопротеин защищает вирусный геном от активности клеточной РНКазы и взаимодействует с L- и Р-белками во время транскрипции и репликации. Фосфопротеин отвечает за правильное позиционирование L-белка и действует как шаперон во время синтеза нуклеопротеина, образуя N-P-комплекс, который предотвращают самоагрегацию N-белка и связывание с клеточной РНК. Матриксный белок является структурным элементом, который связывается с рибонуклеопротеином и цитоплазматическим доменом гликопротеина для облегчения процесса сборки вирусных частиц. Гликопротеин - единственный вирусный белок, расположенный на поверхности вириона. Он обеспечивает связывание с рецепторами клетки-хозяина, индуцирует эндоцитоз, а также взаимодействует с М-белком, облегчая морфогенез вирионов. L-белок выполняет функции, необходимые для транскрипции и репликации генома [4].
Постэкспозиционная профилактика может обеспечить практически полное излечение от болезни при своевременном и правильном применении и доступна уже более века. Тем не менее, данное заболевание по-прежнему ежегодно приводит к гибели десятков тысяч людей и животных из-за плохой доступности соответствующих биологических препаратов, особенно в развивающихся странах тропической Азии и Африки [2]. Как и при любом инфекционном заболевании эффективные программы борьбы с бешенством опираются на строгий лабораторный надзор, надежные диагностические инструменты и высокоэффективные биологические препараты, в том числе антирабические вакцины [4].
Главными иммуногенными компонентами инактивированного вируса бешенства в антирабических вакцинах являются специфичные рибонуклеопротеин и гликопротеин [4].
Культивирование клеток осуществляют с применением различных ростовых сред, содержащих питательные вещества, факторы роста и гормоны, а также соединения, которые регулируют водородный показатель (рН) и осмотическое давление в клетках [6]. В зависимости от необходимости добавления сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) выделяют несколько типов сред:
- основные (базовые) среды (basal media), требующие добавления 10% сыворотки крови КРС;
- улучшенные среды (advanced media), требующие добавления 1-5% сыворотки крови КРС;
- бессывороточные среды (serum-free medium), не требующие добавления сыворотки [7, 8].
Для культивирования перевиваемой суспензионной линии клеток ВНК-21 применяют преимущественно улучшенные среды. Качественный и количественный состав улучшенной среды отражен в таблице 1 (среда №1) (прототип) [6]. Представленная среда включает в себя белки, пептиды и липиды, входящие в состав сыворотки крови КРС (5,0%), гидролизата белков крови (15-20 мл/л) и перевара по Хоттингеру (2-10 мл/л), 8 протеиногенных аминокислот, глюкозу, 8 витаминов и витаминоподобных соединений, минеральные соли.
При использовании данной улучшенной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/мл за 48 ч получают суспензии с содержанием 4,0-4,3 млн клеток/мл [6, 7].
Для репродукции вирусов ящура и бешенства применяют поддерживающую среду, содержащую 2,0% сыворотки крови КРС. Качественный и количественный состав данной среды представлен в таблице 2 [6, 7]. Она включает белки, пептиды и жиры, входящие в состав сыворотки крови КРС (2,0%), гидролизата белков крови (5,0 мл/л) и перевара по Хоттингеру (2 мл/л), 4 протеиногенных аминокислоты, глюкозу, 8 витаминов и витаминоподобных соединений, а также минеральные соли. При использовании данной среды для репродукции вируса ящура с суспензии, содержащей 1 млн клеток ВНК-21, получают следующий урожай 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов: 0,57-0,72 и 0,71-0,88 мкг/мл, соответственно [6, 7, 8]. При использовании указанной среды для репродукции вируса бешенства с 1 млн клеток ВНК-21 получают следующий урожай иммуногенных рибонуклеопротеина и гликопротеина: 0,45-0,50 и 0,50-0,52 мкг/мл, соответственно.
Однако данную среду (среды, содержащие сыворотку крови КРС), используют как для культивирования клеток ВНК-21, так и для репродукции вирусов ящура и бешенства в присутствии сыворотки крови КРС, обнаруживает ряд недостатков:
- сыворотка крови может быть цитотоксичной, поскольку содержит фермент полиаминоксидазу, действующую на полиамины (спермин, спермидин), являющиеся продуктами секреции быстро пролиферирующих клеток;
- значительная вариабельность состава сывороток крови разных партий;
- сыворотка может содержать недостаточное количество специфических ростовых факторов, что вызывает необходимость их дополнительного введения в состав базовой среды;
- сыворотка крови может быть контаминирована вирусами, что является дополнительным неизвестным фактором, который невозможно контролировать;
- сыворотка является самой дорогой составляющей питательной среды [6, 7, 8].
Все перечисленные проблемы могут быть разрешены путем удаления сыворотки крови КРС и других продуктов животного происхождения с переходом на применение бессывороточных сред.
В течение последних трех десятилетий сыворотки крови КРС постепенно стали заменять другими добавками или использованием бессывороточных сред с определенным химическим составом. Ряд составов бессывороточной среды был описан для клеточных линий млекопитающих и насекомых, а также для первичных культур [7]. Однако переход на бессывороточную среду по-прежнему требует трудоемкого обзора литературы и поиска подходящей композиции среды для культивирования клеточных линий и репродукции вирусов. Все коммерчески доступные бессывороточные среды доступные в настоящее время у основных дистрибьюторов (например, АТСС, ЕСАСС и DMSZ), включены в базу данных [9].
Бессывороточные среды имеют ряд следующих преимуществ по сравнению со средами, содержащими сыворотку крови КРС: улучшение воспроизводимости результатов получения урожая клеточной культуры и иммуногенных компонентов вирусов вследствие  стабильности состава среды; снижение риска заражения культуры вирусами, бактериями, грибами и микоплазмами; облегчение очистки продуктов клеточного метаболизма; снижение влияния дополнительных протеинов на результаты биологических исследований; отсутствие цитотоксического влияния сыворотки по причине ее отсутствия. Поэтому в последние 2-3 десятилетия учеными ведущих научных институтов ведутся интенсивные исследования по разработке бессывороточных питательных сред для культивирования клеточных культур и получению высокого урожая иммуногенных компонентов вирусов [10].
При этом в настоящее время универсальных питательных сред не разработано по объективной причине: наличие специфических биологических потребностей каждой культуры клеток и вирусов, которые репродуцируются в различных клетках и требуют определенного уникального состава сред [4, 5].
На сегодняшний день известно несколько способов культивирования клеток линии ВНК-21 и получения иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства в ней с применением бессывороточных сред.
В 1975 году американский исследователь Л. Дэвид Томей зарегистрировал противоящурную вакцину [11], которую получали путем выращивания клеток линии ВНК-21 в питательной ростовой среде без L-глутамина и сыворотки крови КРС. Качественный и количественный состав данной термостабильной среды отражен в таблице 3. Данная среда включает в свой состав 17 протеиногенных аминокислот, глюкозу, 10 витаминов и витаминоподобных соединений, метилцеллюлозу и феноловый красный.
Среду стерилизовали автоклавированием в течение 30 минут (120°С, 1 бар) при рН 4,3 и хранят при температуре 4°С до момента использования. Суспензию клеток линии ВНК-21 выращивали при температуре 35°С и рН 7,0-7,2 в указанной среде.
3
3
При использовании данной бессывороточной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/см за 48 ч получали 3,0-3,5 млн клеток/см (табл. 7).
50
Доза заражения вирусом ящура составляла 0,10 ТЦД/клетка. Репродукцию вируса осуществляли в течение 12 часов, после этого определяли количество иммуногенных компонентов возбудителя ящура. С 1 млн клеток концентрация 146S компонента вируса ящура составляла 0,41-0,65 мкг/мл, 146S+75S компонентов - 0,64-0,73 мкг/мл [11] (табл. 7).
50
Доза заражения вирусом бешенства составляла 0,10 ККИД/клетка. Репродукцию осуществляли в течение 48 часов, после этого определяли количество иммуногенных компонентов возбудителя бешенства. С 1 млн клеток концентрация рибонуклеопротеина вируса бешенства составляла 0,40-0,44 мкг/мл, гликопротеина - 0,42-0,46 мкг/мл (табл. 7).
В 1997 году Motono Mitsuru, Yamamoto Ryohel, Takase Kozo, Miyahara Tokuji была представлена бессывороточная среда [12], пригодная для животных клеток, в том числе ВНК-21, и получения на их основе иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства. Состав данной среды отражен в таблице 4, из которой видно, что данная среда включает в свой состав фактор роста фибробластов (0,5-20,0 нг/мл), инсулин (0,1-20,0 мкг/мл), 17 протеиногенных аминокислот, глюкозу, 9 витаминов и витаминоподобных соединений, неорганические соли и краситель феноловый красный. Фактор роста фибробластов - белок, способствующий пролиферации широкого спектра клеток. Концентрация данного компонента составляет от 0,5 до 20,0 нг/мл. Инсулин - гормон белковой природы, образуется в β-клетках островков Лангерганса поджелудочной железы. Оказывает многогранное влияние на обмен веществ практически во всех тканях. Основное действие инсулина заключается в регулировании углеводного обмена, в частности, утилизации глюкозы в клетке. Количество инсулина, добавляемого в среду, составляет 0,1-20,0 мкг/мл, но 10 мкг/мл также достаточно для активного деления и роста клеток, а также с экономической точки зрения.
3
3
Применение данной бессывороточной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/см за 48 ч позволяет получать урожай 3,8-4,2 млн клеток/см. С 1 млн клеток концентрация 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура составляет 0,50-0,75 и 0,70-0,87 мкг/мл, соответственно, а концентрация рибонуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства - 0,45-0,55 и 0,43-0,57 мкг/мл, соответственно (табл. 7).
В 2011 году авторами Ren Zhang, Wenqing Chen, Jlanchao Wang была зарегистрирована бессывороточная среда для выращивания клеток ВНК-21 и репродукции в них вирусов ящура и бешенства - CN 102115729-2011 (среда №2) [13] {наиболее близкий прототип). Данная среда включает в свой состав основную культуральную среду, содержащую необходимый набор протеиногенных аминокислот, минеральных солей, глюкозу, витамины, и дополнительно следующие компоненты в пересчете на 100 л среды: 100-200 г соевого белка, 100-200 г растительного белка семейства бобовых, 0-100 г картофельного белка, 0-200 г пшеничного глютенового белка и 50-100 г рисового белка (табл. 5).
3
3
При использовании представленной бессывороточной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/см за 48 ч получали 4,0-4,3 млн клеток/см (табл. 7). Клетки, выращенные в данной среде, имели высокую плотность культуры, а среда - низкую себестоимость по сравнению с бессывороточной средой, отраженной в патентах US 4049494 (А) [11], JP H09154571 (А) [12].
С 1 млн клеток концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура составляла 0,51-0,75 и 0,74-0,89 мкг/мл, соответственно, а концентрация рибонуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства - 0,46-0,52 и 0,49-0,58 мкг/мл, соответственно (табл. 7).
В 2013 году Zhang Shu и L.V. Hongliang зарегистрировали способ получения очищенной противоящурной вакцины CN 103374547 с применением бессывороточной среды [14]. Качественный и количественный состав среды отражен в таблице 6 и включает в себя 9 протеиногенных аминокислот, сахарозу, 4 варианта солей и краситель феноловый красный.
3
3
При использовании представленной бессывороточной ростовой среды для выращивания клеток линии ВНК-21 с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/см за 48 ч получали 3,5-4,0 млн клеток/см (табл. 7).
50
Клетки линии ВНК-21 заражали вирусом ящура в дозе 0,10-0,50 ТЦД/клетка. С 1 млн клеток концентрация 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура составляла 0,43-0,54 и 0,65-0,75 мкг/мл, соответственно, а концентрация рибонуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства - 0,41-0,49 и 0,40-0,45 мкг/мл, соответственно (табл. 7).
Представленные бессывороточные среды для получения иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства имеют следующие недостатки: 1) за 48 ч культивирования клеток линии ВНК-21 с посевной концентрацией 0,6-0,7 млн клеток/мл получают суспензию с концентрацией не более 4,3 млн клеток/мл; 2) концентрация 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура при использовании данных сред с 1 млн клеток составляет не более 0,75 и 0,89 мкг/мл, соответственно; 3) концентрация рибонуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства при использовании данных сред с 1 млн клеток составляет не более 0,52 и 0,58 мкг/мл, соответственно. В связи с этим целесообразно разработать такую композицию бессывороточной среды, которая: 1) позволит за 48 ч с посевной концентрацией клеток 0,6-0,7 млн клеток/мл получать урожай клеток линии ВНК-21 более 4,3 млн клеток/мл, 2) даст возможность накапливать при репродукции вируса ящура 146S и 146S+75S иммуногенные компоненты с количествами более 0,75 и 0,89 мкг/мл, соответственно, с 1 млн клеток при изготовлении противоящурных вакцин; 3) позволит накапливать при репродукции вируса бешенства рибонуклеопротеин и гликопротеин с количествами более 0,52 и 0,58 мкг/мл, соответственно, с 1 млн клеток при изготовлении антирабических вакцин.
Проблемой являлось отсутствие бессывороточной среды для изготовления противоящурных и антирабических вакцин, которая позволит устранить вышеуказанные недостатки.
На сегодняшний день данная проблема была решена благодаря разработке бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» с новой композицией состава, что позволит повысить урожай клеток перевиваемой суспензионной линии ВНК-21 без снижения размера клетки, повысить накопление 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура, увеличить урожай рибонуклеопротеина и гликопротеина по сравнению с бессывороточными средами, представленными выше.
Сущность изобретения заключается в композиционном составе бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» для получения иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства, необходимых для производства противоящурных и антирабических вакцин. Состав заявляемой бессывороточной среды отличается особой композицией компонентов в определенных концентрациях, что позволяет получать высокие урожаи клеточной линии ВНК-21 (более 4,3 млн клеток/мл); проводить репродукцию культурального вируса ящура с накоплением 146S и 146S+75S компонентов более 0,75 и 0,89 мкг/мл, соответственно, с 1 млн клеток и осуществлять репродукцию культурального вируса бешенства с накоплением рибонуклеопротеина и гликопротеина с концентрацией более 0,52 и 0,58 мкг/мл, соответственно, с 1 млн клеток.
Для культивирования клеток линии ВНК-21 и получения иммуногенных компонентов вирусов ящура и бешенства применяли улучшенную среду (среда №1) и наиболее близкий прототип бессывороточную среду CN 102115729-2011 (среда №2) [13]. По сравнению с прототипами бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» (среда №3) для получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин позволяет: 1) культивировать клетки линии ВНК-21 и за 48 ч с посевной концентрации клеток 0,6-0,7 млн клеток/мл получать урожай клеток линии ВНК-21 от 5,68 до 5,94 млн клеток/мл; 2) накапливать при репродукции вируса ящура 146S и 146S+75S иммуногенные компоненты с количествами 0,79-0,85 и 0,95-1,06 мкг/мл, соответственно, с 1 млн клеток при изготовлении противоящурных вакцин; 3) накапливать при репродукции вируса бешенства рибонуклеопротеин и гликопротеин с концентрациями 0,64-0,72 и 0,66-0,73 мкг/мл, соответственно, с 1 млн клеток при изготовлении антирабических вакцин.
Ключевым элементом заявляемой композиции бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» для получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин является адаптация перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 к выращиванию в представленной бессывороточной среде в течение 6 последовательных пассажей с уменьшением количества сыворотки крови КРС с 5 до 0%, культивирование клеток данной линии в разработанной бессывороточной среде, репродукция вируса ящура в адаптированной клеточной культуре ВНК-21 и получение иммуногенных компонентов вируса в высоких концентрациях для изготовления противоящурных вакцин, репродукция вируса бешенства в адаптированной клеточной культуре ВНК-21 и получение иммуногенных компонентов вируса в высоких концентрациях для изготовления антирабических вакцин.
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключается в: 1) адаптации клеток суспензионной перевиваемой линии ВНК-21 к культивированию в разработанной бессывороточной среде для получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин, 2) репродукции вируса ящура в культуре клеток, адаптированной к данной бессывороточной среде, для получения более высоких концентраций 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов, используемых для изготовления противоящурных вакцин; 3) репродукции вируса бешенства в культуре клеток, адаптированной к данной бессывороточной среде, для получения более высоких концентраций рибонуклеопротеина и гликопротеина вируса, используемых для изготовления антирабических вакцин.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в увеличении количеств 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура, рибонуклеопротеина и гликопротеина иммуногенных компонентов вируса бешенства при производстве противоящурных и антирабических вакцин.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг. 1 - Концентрации клеток перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 при адаптации в течение 6 последовательных пассажей к выращиванию в бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» для получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин.
Фиг. 2 - Концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов культурального вируса ящура в неинактивированных (А) и инактивированных (Б) суспензиях после репродукции в клетках линии ВНК-21, адаптированных к культивированию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».
Фиг. 3 - Концентрации рибонуклеопротеина и гликопротеина культурального вируса бешенства в суспензиях после репродукции в клетках линии ВНК-21, адаптированных к культивированию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».
Бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» для получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин представляет собой светло-серый мелкодисперсный порошок, который хорошо растворяется в очищенной воде без образования осадка. Качественный и количественный состав разработанной бессывороточной среды отражен в таблице 8, из данных которой видно, что по сравнению с бессывороточной средой CN 102115729-2011 [13] (наиболее близкий прототип) суммарные количества аминокислот выше. Они складывались из содержания свободных аминокислот, добавляемых как самостоятельный компонент в среду, а также из растительных белков, прошедших ферментативный гидролиз. Концентрации протеиногенных аминокислот L-аланина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-валина, L-гистидина, L-глицина, L-глутамина, L-глутаминовой кислоты, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-триптофана, L-метионина, L-пролина, L-серина, L-тирозина, L-треонина, L-фенилаланина, L-цистина в разработанной среде было на 134, 65, 69, 56, 80, 85, 66, 73, 216, 81, 484, 39, 25,. 25, 82, 55, 99, 39, 111, 18 мг/л больше, соответственно, по сравнению с прототипом. Увеличено содержание витаминов и витаминоподобных веществ, а именно в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» концентрации инозитола, никотинамида, пантотената кальция, пиридоксаля гидрохлорида, рибофлавина, тиамина гидрохлорида, фолиевой кислоты и холина хлорида на 0,2; 0,3; 0,3; 0,5; 0,05; 0,2; 0,5; 0,5 мг/л больше, соответственно, чем в прототипе. В разработанную среду добавлен митоген инсулин бычий в концентрации 3,0 мг/л. В прототипной среде данный компонент отсутствует. Концентрация глюкозы медицинской и минеральных солей одинаково для двух бессывороточных сред, за исключением, хлорида железа (II) (0,05 мг/л), хлорида меди (II) (0,05 мг/л), хлорида хрома (III) (0,05 мг/л), которые присутствуют только в бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» и необходимы для полноценной работы ферментного звена антиоксидантной системы клеток почки сирийского хомячка [7]. Для поддержания определенной степени вязкости, которую создает сыворотка крови КРС в улучшенных питательных средах, разработанная бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» включает в свой состав безопасный полимерный органический компонент Pluronic F-68 (0,13%).
Наиболее важными строительными компонентами разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» для клеток и структур вирусов ящура и бешенства являются аминокислоты, которые играет существенную роль в процессах жизнедеятельности [17, 18].
В состав разработанной бессывороточной среды также включили бычий инсулин, который регулирует поглощение, запасание и утилизацию глюкозы, аминокислот и жирных кислот, ингибирует распад протеинов и липидов. Бычий инсулин - это гормон, имеет вид двуцепочной полипептидной цепи, синтезируется β-клетками островков поджелудочной железы. Молекулярная масса 5,8 кДа, α- и β-цепи соединяются двумя межцепочными дисульфидными связями. В α-цепи присутствует внутрицепочный дисульфидный мостик. Бычий инсулин применяется как фактор роста при культивировании широкого спектра клеток млекопитающих. Бычий инсулин используется для дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (MSCs) в адипоциты [19].
Показано, что предложенный состав бессывороточной среды «ВНИИЗЖ», разработанной в «Федеральном центре охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ») является оптимальным для культивирования и поддержания клеточной линии ВНК-21, используемой для производства вирусных вакцин, подходит для экспрессии вирусов ящура и бешенства и накопления их иммуногенных компонентов в высоких концентрациях. При достижении линией клеток ВНК-21 необходимой концентрации, вирус может быть добавлен непосредственно в биореактор, без замены питательной среды за счет чего достигается высокая эффективность производства вирусных частиц.
На первом этапе работы готовят раствор разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ». Для этого к 9,5 л очищенной воды (Milli-Q) медленно добавляют 200 г порошка разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» при медленном помешивании (300 об/мин) в течение 10 минут. Измеряют значение водородного показателя, которое равно 6,95±0,02 и доводят рН до 7,10-7,20 с помощью 7,5%-ого раствора гидрокарбоната натрия. Конечный объем доводят до 10 л. Полученную среду подвергают стерилизационной фильтрации с применением мембранного фильтра Millipore Express Plus (0,22 мкм, полиэфирсульфон).
Проводят адаптацию перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» в течение 6 последовательных пассажей в колбах Эрленмейера перед масштабированием в биореакторе. Для адаптации используют суспензию клеток ВНК-21 1 пассажа после криозаморозки. Посевная концентрация клеток перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 составляет 0,6-0,7 млн клеток/мл. В качестве ростовой среды используют улучшенную среду, состав которой отражен в таблице 1. Ежедневно в улучшенную среду (прототип) добавляют  объема разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» и в течение 5 пассажей (240 ч) концентрация сыворотки крови КРС уменьшается по схеме: 5,0%→2,5%→1,25%→0,625%→0,3125%. Затем проводят осаждение клеток при 1000 об./мин для того, чтобы их освободить от среды с сывороткой крови КРС и полностью перевести в разработанную бессывороточную среду «ВНИИЗЖ» без добавления сыворотки (шестой пассаж). Иными словами, осуществляют полный перевод клеток на выращивание в бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».
Перевод клеток к бессывороточным условиям культивирования затрагивает биохимические и морфологические характеристики клеточных линий. В ходе исследования через 48 ч в течение 6 последовательных пассажей оценивали концентрацию клеток и анализировали их размеры с помощью световой микроскопии.
Клетки линии ВНК-21, адаптированные к бессывороточной среде, состав которой представлен в таблице 5 (наиболее близкий прототип), получены ранее и хранились в банке ФГБУ «ВНИИЗЖ».
На следующем этапе проводят культивирование клеток линии ВНК-21 с бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» при рН 7,10-7,20 и умеренном обогащении среды очищенным воздухом в процессе барботирования. Посевная концентрация клеток составляет 0,6-0,7 млн/мл. Продолжительность каждого пассажа составляет 48 ч. Через указанный промежуток времени определяют конечную концентрацию клеток и сравнивают ее с контролем. В качестве контроля используют клетки перевиваемой суспензионной линии ВНК-21, выращенные согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов» с применением улучшенной среды, состав которой отражен в таблице 1 (прототип), а также клетки адаптированные к бессывороточной среде, состав которой представлен в таблице 5 (наиболее близкий прототип).
50
На следующем этапе работы проводят репродукцию вируса ящура в перевиваемой суспензионной линии клеток ВНК-21 (1 среда (прототип), 2 среда CN 102115729-2011 (наиболее близкий прототип) и среда 3 - бессывороточная среда «ВНИИЗЖ»).). Доза заражения каждой среды вирусом ящура составляет 0,05 ТЦД/клетка. Культивирование вируса проводят в указанных питательных средах при рН 7,5-7,7. Водородный показатель регулируют с помощью раствора гидрокарбоната натрия. Репродукцию вируса ящура оценивают по количеству клеток, подвергнутых специфическому разрушению, и выражают в %.
После культивирования вируса ящура в обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) подтверждают штаммоспецифичность [2].
В обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) исследуют полученные суспензии вируса ящура и определяют концентрацию 146S иммуногенного компонента [15]. Количество 146S+75S иммуногенных компонентов определяют в реакции связывания комплемента (РСК) [20].
Проводят процесс инактивации антигена вируса ящура. В качестве инактиванта первого порядка используют 1,2-аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в концентрации 0,025-0,050%. Инактивацию осуществляют в течение 12 ч при температуре 37°С.
Оценивают полноту процесса инактивации антигена вируса ящура в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].
Определяют концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура в инактивированной суспензии с помощью реакции связывания комплемента (РСК), которую проводят в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2, 20]. Осуществляют пересчет концентрации иммуногенных компонентов с 1 млн клеток.
Для изготовления эмульсионной вакцины используют антигенный материал с содержанием 146S иммуногенных компонентов вируса ящура не менее 3,0 мкг/мл. Необходимую концентрацию иммуногенных компонентов в эмульсионной вакцине получают путем концентрирования антигена методом проточной ультрафильтрации. Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена вируса ящура, полученного на трех различных средах (3 разные вакцины» и масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG в соотношении 50/50 по массе, соответственно.
Полученные вакцинные препараты исследуют на безвредность и стерильность в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].

Методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) в блокирующем варианте оценивают отсутствие неструктурных белков вируса ящура в конечном продукте [21]. Для этого проводят иммунизацию свиней породы ландрас по 3 головы на каждую из трех вакцин. На 14 день после иммунизации от животных отбирают кровь, получают сыворотки и их тестируют с использованием тест-системы для ИФА «PrioCHECK FMDV NS ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Для контрольных и исследуемых образцов вакцины после проведения реакции на спектрофотометре-ридере измеряют значения оптических плотностей и преобразовывают их в процент ингибиции, пользуясь формулой:
S
КО
PI=(1-ОП/ОП)*100,
где, PI - процент ингибиции (%),
S
ОП - оптическая плотность исследуемой сыворотки крови,
КО
ОП - оптическая плотность отрицательного контроля.
Сыворотки крови свиней в отношении наличия антител к неструктурным белкам вируса ящура следует считать положительными, если значение PI≥50%, отрицательными - при PI<50%. При этом значение оптической плотности отрицательного контроля должно быть >1,000. Процент ингибиции слабоположительного контроля должен составлять >50,00%, положительного контроля - >70,00% [22].
Вакцинные препараты исследуют на животных для оценки безвредности. Для тестирования вакцин на безвредность 6 головам свиней (по 2 на вакцину) внутримышечно в область верхней трети шеи в дозе 6,0 см (трехкратная доза) вводят препарат и наблюдают за клиническим состоянием животного в течение 6 суток. Вакцина признается безвредной в том случае, если все животные по итогам наблюдения остаются клинически здоровыми, и на месте введения препарата не происходит некроза тканей.
До иммунизации и 21 сутки после последнего введения противоящурных вакцин от свиней отбирают кровь и получают сыворотки, которые исследуют на наличие вируснейтрализующих антител (ВНА) с применением реакции микронейтрализации (РМН) вируса по стандартной процедуре [2].
50
Вакцины исследуют также на иммуногенность и проводят оценку протективных свойств конечного продукта. Иммуногенную дозу (ИмД) рассчитывают по формуле Кербера:
50
3
lgД-lgd⋅(ΣI/N-0,5)
ИмД в см = 10
где, Д - доза вакцины,
d - шаг разведения (для свиней - 5),
I - количество защищенных животных,
N - количество зараженных животных, испытанных для одного разведения.
50
Количество протективных доз (ПД) рассчитывают по формуле:
50
50
ПД = прививная доза / ИмД [2].
50
На следующем этапе проводят репродукцию вируса бешенства в клетках перевиваемой суспензионной линии ВНК-21, (1 среда (прототип), 2 среда CN 102115729-2011 (наиболее близкий прототип) и среда 3 - бессывороточная среда «ВНИИЗЖ»). Доза заражения вирусом каждой среды составляет 0,05 ККИД/клетка. Культивирование вируса проводят в указанных средах при рН 7,4-7,6. Водородный показатель регулируют с помощью раствора гидрокарбоната натрия. Культивирование вируса проводят в течение 48 ч.
После культивирования вируса бешенства в обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) подтверждают штаммоспецифичность [2].
50
В реакции иммунофлуоресценции (РИФ) определяют титр инфекционной активности вируса, который должен быть не ниже 6,0 lg ККИД/мл.
Проводят процесс инактивации антигена вируса бешенства. В качестве инактиванта первого порядка используют 1,2-аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в концентрации 0,05% (от объема). Инактивацию осуществляют в течение 12 ч при температуре 37°С. Оценивают полноту процесса инактивации антигена вируса бешенства в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].
В обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) исследуют полученные суспензии вируса бешенства и определяют концентрацию рибонуклеопротеина [23]. Количество гликопротеина вируса бешенства оценивают методом ИФА [21]. Осуществляют пересчет концентрации иммуногенных компонентов с 1 млн клеток.
Для изготовления антирабической эмульсионной вакцины используют антигенный материал с содержанием рибонуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства не менее чем по 3,0 мкг/мл каждого. Необходимую концентрацию иммуногенных компонентов в эмульсионной вакцине получают путем концентрирования антигена методом проточной ультрафильтрации. Эмульсионную вакцину получают путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена вируса и масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG в соотношении 40/60 по массе, соответственно.
Полученный вакцинный препарат исследуют на ареактогенность, безвредность и стерильность в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].
3
3
Наличие поствакцинальных антител исследуют после иммунизации крупного рогатого скота полученными вакцинами. Испытания осуществляют на десяти головах КРС в возрасте 1 года со средней массой 200 кг. Животных прививают вакциной в дозе 2,0 см внутримышечно однократно. Для оценки напряженности поствакцинального антирабического иммунитета у животных, в соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE), применяют реакцию нейтрализации в монослойной культуре клеток ВНК-21 (модификация реакции - FAVN (Fluorescent antibody virus neutralization)), выражая значения титра антирабических антител в МЕ/см [2]. Для анализа использовали положительный сывороточный контрольный стандарт, разведенный до иммуногенности 0,5 МЕ/мл, и отрицательный сывороточный контрольный стандарт с иммуногенностью <0,1 МЕ/мл [2].
Оценку протективных свойств не проводят по этическим соображениям, чтобы не подвергать животных смертельному заболеванию.
Статистическую обработку данных проводили с применением средних значений и стандартного отклонения, учитывая коэффициент Стьюдента [24].
Пример 1. Адаптация перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 к культивированию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».
На первом этапе работы готовили раствор разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ». Для этого к 9,5 л очищенной воды (Milli-Q) медленно добавляют 200 г порошка разработанной бессывороточной питательной среды при медленном помешивании (300 об/мин) в течение 10 минут. Измеряли значение водородного показателя, которое равно 6,95±0,02 и доводили рН до 7,10-7,20 с помощью 7,5%-ого раствора гидрокарбоната натрия. Конечный объем доводили до 10 л. Полученную среду подвергали стерилизационной фильтрации с применением мембранного фильтра Millipore Express Plus (0,22 мкм, полиэфирсульфон).
Проводили адаптацию перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» в течение 6 последовательных пассажей в колбах Эрленмейера. Для адаптации использовали суспензию клеток ВНК-21 первого пассажа после криозаморозки. Посевная концентрация клеток перевиваемой суспензионной клеточной линии составляла 0,70 млн клеток/мл. Ежедневно в улучшенную среду (среда №1) добавляли  объема бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» и в результате в течение 5 последовательных пассажей концентрация сыворотки крови КРС уменьшалась по схеме: 5,0%→2,5%→1,25%→0,625%→0,3125%. Затем проводили осаждение клеток при 1000 об./мин, чтобы их освободить от среды с сывороткой крови КРС и полностью перевести в бессывороточную среду «ВНИИЗЖ». В качестве контроля использовали клетки линии ВНК-21, выращенные с применением улучшенной среды (среда №1), состав которой отражен в таблице 1 (прототип), а также клетки линии ВНК-21, адаптированные к выращиваю в бессывороточной среде CN 102115729-2011 (среда №3 - наиболее близкий прототип). В ходе исследования через каждые 48 ч в течение 5 последовательных пассажей оценивали концентрацию клеток и анализировали их размеры с помощью световой микроскопии (таблица 9, фиг. 1).
Из данных таблицы 9 и фиг. 1 следует, что контрольные клетки линии ВНК-21, выращенные в улучшенной среде (среда №1), с посевной концентрацией 0,70 млн клеток/мл через 48, 96, 144, 192, 240, 288 ч при уменьшении количества сыворотки крови КРС с 5 до 0% имели конечную концентрацию 4,20; 2,84; 2,21; 1,48; 0,95; 0,62 млн клеток/мл. Данные по адаптации клеток линии ВНК-21 к среде CN 102115729-2011 (среда №2) были также получены и составляли: 4,20; 4,25; 4,31; 4,35; 4,52; 4,70 млн клеток/мл. Клетки линии ВНК-21 с посевной концентрацией 0,70 млн клеток/мл через 48, 96, 144, 192, 240, 288 ч при уменьшении количества сыворотки крови КРС с 5 до 0% и замене ее на бессывороточную среду «ВНИИЗЖ» (среда №3) имели концентрацию 4,25; 4,32; 4,68; 5,02; 5,39; 5,65 млн клеток/мл, что в 1,01; 1,52; 2,12; 3,39; 5,67; 9,11 раз выше по сравнению с прототипом (среда №1) и в 1,01; 1,02; 1,08; 1,15; 1,19; 1,20 раз выше по сравнению с наиболее близким прототипом (среда №2). Результаты исследований также показали, что клетки, выращенные в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» - среда №3 (количество сыворотки 0% через 6 пассажей), имели размер 10-14 мкм (не менее, чем в контролях). Таким образом, была проведена адаптация клеток линии ВНК-21 к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» в течение 6 последовательных пассажей (288 ч).
Пример 2. Процесс культивирования клеток перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21 в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».
После адаптации клеток линии ВНК-21 к бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» проводили культивирование клеток в биореакторах объемом 6 л в течение 3 последовательных пассажей, каждый из которых длился 48 ч. Выращивание клеток осуществляли при рН 7,0-7,2, умеренном обогащении среды очищенным воздухом в процессе барботирования. Посевная концентрация клеток составляла 0,70 млн клеток/мл. Через каждые 48 ч определяли конечную концентрацию клеток и сравнивали ее с контролем. В качестве контроля использовали клетки линии ВНК-21, выращенные с применением улучшенной среды, состав которой отражен в таблице 1 (5% сыворотки крови КРС) (прототип) и клетки, адаптированные к бессывороточной среде CN 102115729-2011 (наиболее близкий прототип). Исследования проводили в трех повторениях. Полученные результаты представлены в таблице 10.
Из данных, отраженных в таблице 10, видно, что клетки линии ВНК-21, адаптированные к бессывороточной среде «ВНИИЗЖ», в течение 3 последовательных пассажей по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом имели большую концентрацию в среднем на 35,0 и 21,5%, соответственно.
Пример 3. Получение иммуногенных компонентов культурального вируса ящура штамма Азия-1/Шамир/89 с применением перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21, адаптированной к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».
50
В полученных клетках линии ВНК-21, адаптированных к выращиванию в бессывороточной среде «ВНИИЗЖ», проводили репродукцию вируса ящура штамма Азия-1/Шамир/89 в биореакторах объемом 40 л. Доза заражения вирусом составляла 0,05 ТЦД/клетка. Культивирование вируса осуществляли при рН 7,5-7,7. Водородный показатель регулировали с помощью раствора гидрокарбоната натрия. Цитопатическое действие (ЦПД) оценивали по количеству клеток, подвергнутых специфическому разрушению. Исследование проводили в трех повторениях. Культивирование осуществляли до 95% цитопатического действия. В качестве контроля использовали клетки линии ВНК-21, выращенные в улучшенной среде, состав которой представлен в таблице 1 (среда №1 - прототип), а также в бессывороточной среде CN 102115729-2011 (среда №2 - наиболее близкий прототип). Время репродукции вируса ящура для всех случаях составляло 10,5-11,0 ч.
После культивирования вируса ящура в ОТ-ПЦР подтверждали штаммоспецифичность [2]. В результате исследования в суспензии подтверждено наличие только вируса ящура штамма Азия-1/Шамир/89.
Исследовали полученные суспензии вируса ящура и определяли концентрацию 146S в обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) и 146S+75S иммуногенных компонентов в РСК (фиг. 2А) [15].
Проводили процесс инактивации антигена вируса ящура. В качестве инактиванта первого порядка использовали 1,2-аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в концентрации 0,050%. Инактивацию осуществляли в течение 12 ч.
Оценивали полноту процесса инактивации антигена вируса ящура при инокуляции перевиваемой монослойной клеточной линии из почки свиньи IB-RS-2 в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].
После подтверждения полноты инактивации антигена вируса ящура определяли концентрации 146S и 146S+75S иммуногенных компонентов вируса ящура в инактивированной суспензии с помощью РСК, которую проводили в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2, 16]. Осуществляли пересчет концентрации иммуногенных компонентов с 1 млн клеток (фиг. 2Б).
Результаты определения концентрации 146S и 146S+75S компонентов вируса ящура отражены в таблице 11 и на фиг. 2, из которой следует, что количества 146S частиц в неинактивированной суспензии, полученных с помощью разработанной бессывороточной среды, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 18-38 и 13-55%, соответственно. Концентрации 146S частиц в инактивированной суспензии, полученных с помощью разработанной среды «ВНИИЗЖ», больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 20-36 и 13-49%, соответственно. Накопления 146S+75S частиц в неинактивированной суспензии, полученных с помощью разработанной среды «ВНИИЗЖ», больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 20-34 и 19-28%, соответственно. Концентрации 146S+75S иммуногенных компонентов в инактивированной суспензии, полученных с помощью разработанной бессывороточной среды, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 23-32 и 26-30%, соответственно. Иными словами, разработанная бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» и клетки линии ВНК-21, к ней адаптированные, позволяют значительно увеличить накопление 146S и 146S+75S иммуногенных частиц вируса ящура по сравнению с прототипными вариантами.
Пример 4. Изготовление и исследование противоящурной инактивированной эмульсионной вакцины из штамма Азия-1/Шамир/89, получение иммуногенных компонентов которого проведено с применением перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21, адаптированной к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».
Проводили получение трех противоящурных инактивированных эмульсионных вакцин из штамма Азия-1/Шамир/89: 1) из антигена, полученного в клетках линии ВНК-21, выращенных в улучшенной среде с 5% сыворотки крови КРС (прототип); 2) из антигена, полученного в клетках линии ВНК-21, выращенных в бессывороточной среде CN 102115729-2011 (наиболее близкий прототип); 3) из антигена, полученного в клетках линии ВНК-21, выращенных в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ». Для изготовления трех вакцинных препаратов использовали инактивированные антигены вируса ящура штамма Азия-1/Шамир/89, полученные в примере 3. Концентрация 146S и 146S+75S иммуногенных частиц вируса ящура представлена в таблице 11. Для вакцин №1, 2, 3 концентрация 146S компонентов составляла 0,71; 0,75 и 0,85 мкг/мл, соответственно, концентрация 146S+75S компонентов соответствовала значениям 0,86; 0,84 и 1,06 мкг/мл. Требованием для антигена при изготовлении противоящурной вакцины является концентрация 146S иммуногенных компонентов не менее 3,0 мкг/мл. После концентрирования в 10 раз содержание 146S компонентов для вакцин №1, 2, 3 составило 7,10; 7,50 и 8,50 мкг/мл, соответственно. После данного процесса концентрация 146S+75S компонентов для вакцин №1, 2, 3 составила 8,60; 8,40 и 10,60 мкг/мл, соответственно.
В качестве масляного адъюванта применяли Montanide ISA-206 («Seppic») в количестве 500000,0-575000,0. Эмульсионные вакцины получали путем диспергирования на коллоидных мельницах концентрата антигена вируса ящура и масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG в соотношении 50/50 по массе, соответственно.
Полученные вакцинные препараты исследовали на авирулентность для подтверждения отсутствия инфекционности антигена. Вакцины разрушали и отделяли антиген, которым инокулировали перевиваемую монослойную клеточную линию из почки свиньи IB-RS-2. Выявили, что по итогам 3 последовательных пассажей в культуре клеток IB-RS-2 вирулентный вирус ящура не был выявлен, иными словами, препараты безвредны.
Проводили оценку стерильности с помощью высевов на твердые и жидкие питательные среды. При использовали соево-казеинового агара (СКА), соево-казеинового бульона (СКБ), тиогликолевой среды (ТГС) подтвердили стерильность всех вакцинных препаратов.
Методом твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) [17, 18] оценивали отсутствие антител к неструктурным белкам вируса ящура в конечном продукте. Тремя вакцинами иммунизировали свиней и на 14 сутки после инокуляции отбирали кровь, получали сыворотки и исследовали их указанным методом. Результаты исследования представлены в таблице 12. Из которой следует, что при исследовании сывороток после введения животным вакцины №1 средняя оптическая плотность составляет 1,080±0,007, процент ингибиции (PI) - 3,282±0,609% (РК 50%); для вакцины №2 средняя оптическая плотность - 1,020±0,003, процент ингибиции (PI) - 8,674±0,284% (PI<50%); для вакцины №3 средняя оптическая плотность - 1,070±0,003, процент ингибиции (PI) - 4,238±0,288% (PI<50%). Иными словами, было доказано отсутствие неструктурных белков вируса ящура в полученных противоящурных инактивированных эмульсионных вакцинах.
3
Для тестирования каждой из трех вакцин на безвредность по 5 голов КРС внутримышечно в область верхней трети шеи в дозе 6,0 см (трехкратная доза) иммунизировали препаратами данных вакцин, и наблюдали за клиническим состоянием животных в течение 6 суток. Вакцины признаны безвредными, поскольку все животные по итогам наблюдения оставались клинически здоровыми, и на месте введения препарата не отмечено некроза тканей.
3
2
2
2
Иммуногенность каждой из трех вакцин исследовали на 17 головах свиней количественным методом с контрольным заражением против гомологичного штамма Азия-1/Шамир/89 (генетическая линия A/ASIA/Shamir) вируса ящура. Для иммунизации животных готовили по 3 образца каждой из вакцин: 1) противоящурную эмульсионную вакцину без разведения; 2) вакцину, разбавленную «Плацебо» в соотношении 1:5; 3) вакцину, разбавленную «Плацебо» в соотношении 1:25. Приготовленные образцы вводили внутримышечно в верхнюю треть шеи в дозе 2,0 см. Свиньи с порядковыми номерами с 1 по 5 инокулировали вакциной без разведения, животным с номерами с 6 по 10 вводили вакцину, разведенную 1:5, животным с номерами с 11 по 15 - вакцину, разведенную 1:25, животных с номера 16 и 17 - не иммунизировали (контрольная группа). Спустя 21 сутки после иммунизации от вакцинированных животных отбирали кровь и полученные сыворотки анализировали в РМН с целью определения уровня вируснейтрализующих антител (ВНА). Результаты исследования отражены в таблицах 13-15, из которой следует, что при введении цельной дозы вакцины №1, а также в разведениях 1/5 и 1/25 средний титр антител составил 5,40±0,14; 3,80±0,21 и 2,65±0,22 log, соответственно, для вакцины №2 в цельном виде, в разведениях 1/5 и 1/25 титры антител составили 5,88±0,21; 3,81±0,14 и 3,00±0,38 log, соответственно, для вакцины №3 в цельном виде и в разведениях 1/5 и 1/25 титры антител составили 6,81±0,25; 4,38±0,27 и 3,13±0,42 log, соответственно.
4,0
3
3
50
Свиней заражали гомологичным штаммом Азия-1/Шамир/89 в слизистую оболочку языка в дозе 10 ИД/0,20 см (в две точки по 0,10±0,05 см). В течение 7 суток после заражения за животными вели наблюдение и ежедневно измеряли температуру. Через 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и проводили патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения, характерные для ящура.
50
50
По результатам наличия/отсутствия генерализованных признаков ящура у зараженных животных определяли иммуногенную дозу и количество протективных доз. Иммуногенная доза (ИмД) и количество протективных доз (PD) для вакцины №1 составляли 0,13 и 15,43, для вакцины №2 - 0,09 и 21,28, для вакцины №3 - 0,07 и 29,37. Следовательно, вакцинный препарат №3 обладал наиболее высокой иммуногенностью. Данный факт является доказательством того, что разработанная бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» позволяет получать противоящурную инактивированную вакцину с высокими значениями иммуногенной активности.
Таким образом, с применением разработанной бессывороточной средой «ВНИИЗЖ» возможно получать противоящурную инактивированную вакцину, которая является безвредной, стерильной, свободной от неструктурных белков и высокоиммуногенной.
Пример 5. Получение иммуногенных компонентов культурального вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ с применением перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21, адаптированной к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».
50
В полученных клетках линии ВНК-21, адаптированных к выращиванию в бессывороточной среде «ВНИИЗЖ», проводили репродукцию вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ в биореакторах объемом 6 л. Доза заражения вирусом составляла 0,05 ККИД/клетка. Культивирование вируса осуществляли при рН 7,4-7,6. Водородный показатель регулировали с помощью раствора гидрокарбоната натрия. Исследование проводили в трех повторениях. Культивирование осуществляли в течение 48 ч. В качестве контроля использовали клетки линии ВНК-21, выращенные в улучшенной среде, состав которой представлен в таблице 1 (среда №1 - прототип) и в бессывороточной среде CN 102115729-2011 (среда №2 - наиболее близкий прототип).
После культивирования вируса бешенства в ОТ-ПЦР подтверждали штаммоспецифичность [2]. В результате исследования в суспензии подтверждено наличие только вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ.
Проводили процесс инактивации антигена вируса бешенства. В качестве инактиванта первого порядка использовали 1,2-аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в концентрации 0,05%. Инактивацию осуществляли в течение 12 ч при температуре 37°С.
Определяли полноту процесса инактивации антигена вируса бешенства в РИФ в соответствии с требованиями МЭБ (OIE) [2].
Исследовали полученные суспензии вируса бешенства и определяли концентрации специфических рибонуклеопротеина (в обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ)) [23] и гликопротеина (в ИФА) [15]. Осуществляли пересчет концентрации иммуногенных компонентов с 1 млн клеток.
Результаты определения концентрации иммуногенных компонентов вируса бешенства отражены в таблице 16 и на фиг. 3, из которой следует, что количества рибонуклеопротеина в вирусной суспензии, полученные с помощью разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ», больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 42-44 и 38-39%, соответственно. Накопления гликопротеина вируса бешенства в вирусной суспензии, полученного с помощью предложенной среды, больше по сравнению с прототипом и наиболее близким прототипом на 32-40 и 26-35%, соответственно. Следовательно, разработанная бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» и клетки линии ВНК-21, к ней адаптированные, позволяют значительно увеличить накопление иммуногенных компонентов вируса бешенства по сравнению с прототипными вариантами.
Пример 6. Изготовление и исследование антирабической инактивированной эмульсионной вакцины из штамма ВНИИЗЖ, получение иммуногенных компонентов которого проведено с применением перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21, адаптированной к выращиванию в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ».
Проводили получение трех антирабических инактивированных эмульсионных вакцин из штамма ВНИИЗЖ: вакцина №1 - из антигена, полученного в клетках линии ВНК-21, выращенных в улучшенной среде с 5% сыворотки крови КРС (среда №1 - прототип); вакцина №2 - из антигена, полученного в клетках линии ВНК-21, выращенных в бессывороточной среде CN 102115729-2011 (среда №2 - наиболее близкий прототип); вакцина №3 - из антигена, полученного в клетках линии ВНК-21, выращенных в разработанной бессывороточной среде «ВНИИЗЖ» (среда №3). Для изготовления вакцинных препаратов использовали инактивированные антигены вируса бешенства штамма ВНИИЗЖ, полученные в примере 5. Концентрации рибонуклеопротеина и гликопротеина вируса бешенства представлены в таблице 16. Для вакцин №1, 2, 3 концентрация рибонуклеопротеина была равна 0,50; 0,52 и 0,72 мкг/мл, соответственно, концентрация гликопротеина соответствовала значениям 0,52; 0,58 и 0,73 мкг/мл. Требованием для антигена при изготовлении антирабической вакцины является концентрация рибонуклеопротеина и гликопротеина не менее 3,0 мкг/мл каждого. После концентрирования в 8 раз содержание рибонуклеопротеина вируса бешенства для вакцин №1, 2, 3 составило 4,00; 4,16 и 5,76 мкг/мл, соответственно. После данного процесса концентрация гликопротеина вируса бешенства для вакцин №1, 2, 3 составила 4,16; 4,64 и 5,84 мкг/мл, соответственно.
В качестве масляного адъюванта применяли Montanide ISA-61 VG («Seppic»). Эмульсионные вакцины получали путем диспергирования на приборе Silverson L5 концентрата антигена вируса бешенства и масляного адъюванта Montanide ISA-61 VG в соотношении 40/60 по массе, соответственно.
Проводили оценку стерильности с помощью высевов на твердые и жидкие питательные среды. При использовали соево-казеинового агара (СКА), соево-казеинового бульона (СКБ), тиогликолевой среды (ТГС) подтвердили стерильность всех вакцинных препаратов.
Оценку ареактогенности и безвредности каждой антирабической инактивированной эмульсионной культуральной вакцины проводили на КРС, МРС, свиньях, собаках, кошках и кроликах.
3
3
3
max
на 0 день после вакцинации
Вакцины вводили всем видам животных внутримышечно в дозе, рекомендованной для каждого вида животных. Прививная доза 2,0 см предназначена для КРС, 1,0 см - для овец и коз, взрослых собак крупных и средних пород, 0,5 см - для кошек, щенков с 2-х месячного возраста всех пород и для взрослых собак мелких пород (болонки, таксы и др.). За животными осуществляли клиническое наблюдение. Температуру тела измеряли в течение 7 суток после инъекции, затем через 10 и 14 суток после вакцинации. Критерием оценки клинического наблюдения было развитие или отсутствие общей и местной реакции на введение испытуемых препаратов. По результатам исследования все испытуемые животные были клинически здоровы, общей и местной реакции на введение препаратов не было выявлено. Незначительное повышение температуры тела (0,2-0,5°С) у животных было отмечено в 1-2 сутки после введения вакцины №3. В течение этого времени наблюдения разница температур (ΔT=T-Т) У КРС составила 0,3-0,5°С, у МРС - 0,3-0,4°С, у свиней - 0,2-0,5°С, у собак - 0,2-0,5°С, у кошек - 0,3-0,5°С. Начиная с 3 суток температура животных была в норме. Местная реакция (отек, болезненность, хромота) у целевых видов животных не отмечена. Таким образом, по результатам исследований три антирабические инактивированные эмульсионные культуральные вакцины являются безвредными и аректогенными препаратами для целевых видов животных.
3
3
3
Проводили исследование гуморального иммунитета трех полученных эмульсионных инактивированных антирабических вакцин. Испытания представленных вакцин проводили на десяти головах КРС черно-пестрой породы в возрасте 1 года со средней массой 200 кг. Животных прививали вакцинами в дозе 2,0 см внутримышечно однократно, разделив КРС на группы по 5 голов: первую инокулировали цельной дозой вакцин, вторую - разведением вакцин на 1/15 М растворе ФБР в 4 раза, третью - разведением вакцин на 1/15 М растворе ФБР в 16 раз. Для оценки напряженности поствакцинального антирабического иммунитета у животных, в соответствии с рекомендациями МЭБ (OIE), применяли реакцию нейтрализации в монослойной культуре клеток ВНК-21 (модификация реакции - FAVN (Fluorescent antibody virus neutralization)), выражая значения титра антирабических антител в МЕ/мл [2]. Для анализа использовали положительный сывороточный контрольный стандарт, разведенный до иммуногенности 0,5 МЕ/см, и отрицательный сывороточный контрольный стандарт с иммуногенностью <0,1 МЕ/см [2].
3
В соответствии с международными требованиями, защитным является уровень вируснейтрализующих антител (ВНА) против вируса бешенства ≥0,50 МЕ/см [2]. В реакции нейтрализации оценивали сыворотки крови от КРС до и на 21 сутки после вакцинации.
3
До иммунизации в крови животных антирабические антитела не были выявлены. Уровень антирабических вируснейтрализующих антител у КРС после введения одной дозы (2,0 см) полученных вакцин отражен в таблицах 17-19, из которой следует, что при введении вакцины №1 - цельной и в разведениях 1/4 и 1/16 средний титр антител составил 24,14±1,84; 7,22±0,61 и 2,3±±0,30 МЕ/мл, соответственно, для вакцины №2 в цельном виде, в разведениях 1/4 и 1/16 титры антител были незначительно выше по сравнению с иммунным ответом на первую вакцину и составили 24,88±1,86; 7,60±0,50 и 2,92±0,18 МЕ/мл, соответственно, для вакцины №3 в цельном виде и в разведениях 1/4 и 1/16 титры антител составили 30,82±1,10; 10,44±0,73 и 4,10±0,32 МЕ/мл, соответственно.
Следует отметить, что вакцина №3, для изготовления которой антиген вируса бешенства был получен с применением разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ», позволяла на 21 сутки после инокуляции индуцировать более высокий иммунный ответ (в среднем на 5,94 МЕ/мл выше для цельной вакцины, на 2,84 МЕ/мл - для разведения вакцины 1/4 и на 1,18 МЕ/мл - для разведения вакцины 1/16). Так, вакцинный препарат №3 обладал наиболее высокой иммуногенностью. Данный факт является доказательством того, что разработанная бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» позволяет получать антирабическую инактивированную вакцину с высокими значениями иммуногенной активности.
Таким образом, с применением разработанной бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» возможно получать антирабическую инактивированную вакцину, которая является безвредной, стерильной, ареактогенной и высоко иммуногенной.
Основным преимуществом предлагаемого изобретения является применение бессывороточной среды «ВНИИЗЖ» для адаптации клеток перевиваемой суспензионной линии ВНК-21 к выращиванию в данной среде без наличия сыворотки крови животных, для культивирования клеток линии ВНК-21 с целью получения суспензий большей концентрацией клеток, для репродукции вирусов ящура и бешенства с целью повышения количеств иммуногенных компонентов для производства безопасных и высокоиммуногенных противоящурных и антирабических вакцин.
Предлагаемое изобретение позволяет получать антиген вируса ящура с концентрациями 146S иммуногенного компонента по сравнению с прототипами большими на 18-39 и 13-55%, соответственно, и 146S+75S иммуногенного компонента - на 20-34 и 19-28%, соответственно. Предлагаемое изобретение позволяет получать антиген вируса бешенства с концентрациями рибонуклеопротеина по сравнению с прототипами большими на 42-44 и 38-39%, соответственно, и гликопротеина - на 32-40 и 26-35%, соответственно.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Бессывороточная среда «ВНИИЗЖ» для культивирования клеток почки сирийского хомячка ВНК-21 и получения иммуногенных компонентов культуральных вирусов ящура и бешенства для изготовления вакцин»:
1. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.
2. OIE. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals. 7th ed. Paris, 2017.
3. Способ определения концентрации 146S компонента вируса ящура в сырье для вакцины с применением метода ОТ-ПЦР-РВ / М.И. Доронин, A.M. Тимина, Д.А. Лозовой, В.А. Стариков, Д.В. Михалишин, Н.Н. Медведева, А.В. Борисов // Ветеринария сегодня. - 2018. - №2. - С. 26-35.
4. Груздев К.Н., Метлин А.Е. Бешенство животных. - Владимир: ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2019. - 394 с.
5. Молекулярно-генетическая характеристика изолятов вируса бешенства, выделенных на территории Западной Сибири // А.В. Зайковская, B.А. Терновой, В.И. Аксенов, Ю.Н. Рассадкин // Вестник РАМН. - №2. - 2005. - С. 31-35.
6. Влияние изменений аминокислотного состава гидролизата белков крови на продуктивность клеточной линии ВНК-21/2-17 и количество иммуногенных компонентов вируса ящура / М.А. Шевченко, М.Н. Гусева, Д.А. Лозовой, М.И. Доронин [и др.] // Ветеринария сегодня. - 2018. - №1. - C. 55-59.
7. Фрешни Р.Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. - 691 с.
8. Трошкова Г.П. Бессывороточная питательная среда для культивирования клеток VERO / Г.П. Трошкова, Л.Д Мартыней, Е.В. Кирова [и др.] // - Фундаментальные исследования. - 2005. - №5 - С. 94-94.
9. Официальный сайт Good Cell Culture. Animal Cell Culture - http://www.goodcellculture.com. (Дата обращения 01.11.2020).
10. Шаманская T.B. Культивирование мезенхимальных стволовых клеток EX VIVO в различных питательных средах (обзор литературы и собственный опыт) / Т.В. Шаманская, Е.Ю. Осипова, Б.Б. Пурбуева [и др.] // Онкогематология. - 2010. - №3. - С. 65-71.
11. Патент US №4049494 (А), 04.09.1975. Vaccine production process // L. David Tomei, Buffalo N.Y.
12. Патент JPH №09154571 (A), 17.06.1997. Бессывороточная среда для производства антигенов вирусов. // Motono Mitsuri, Yamamoto Ryohei, Takase Kozo, Miyahra Tokuji.
13. Патент CN №102115729, 06.07.2011. Способ получения вакцины с применением среды без сыворотки крови животных // Ren Zhang, Wenqing Chen, Jlanchao Wang.
14. Патент CN №103374547, 30.10.2013. Способ получения очищенной вакцины против ящура с применением бессывороточных сред // Zhang Shu, L.V. Hongliang.
15. Патент РФ №2619878/13, 18.05.2017. Способ определения концентрации 1468-компонента вируса ящура в вируссодержащем сырье для вакцины с применением метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в режиме реального времени // Патент России №2016140460/15. 2017. Бюл. №14 / Лозовой Д.А., Михалишин Д.В., Доронин М.И. [и др.].
16. Синютина С.Е. Биохимия белков и ферментов. - Тамбов: ТГУ им. Г. Р. Державина, 2010. - 385 с.
17. Биохимия человека: [Учеб.]: В 2 т./ Р. Марри, Д. Греннер, П. Мейес, В. Родуэлл; Пер. с англ. к. ф.-м. н. В.В. Борисова и Е.В. Дайниченко Под ред. д. х. н. Л. М. Гинодмана. - М.: Мир, 2004.
18. Chen, W.W., Neipel, М., Sorger, Р.K. Classic and contemporary approaches to modeling biochemical reactions (англ.) // Genes Dev: journal. - 2010. -Vol. 24, no. 17. - P. 1861-1875.
19. Wollmer A., Dieken M. L., Federwisch M., De Meyts P. Insulin & related proteins structure to function and pharmacology (англ.). - Boston: Kluwer Academic Publishers, 2002. - ISBN 1-4020-0655-1.
20. Бондаренко А.Ф. Качественный и количественный иммунохимический анализ вирусных белков. - Суздаль, 1994. - 92 с.
21. Сухарьков Андрей Юрьевич. Разработка методов оценки оральной антирабической вакцинации животных: диссертация... кандидата биологических наук: 03.02.02 / Сухарьков Андрей Юрьевич; [Место защиты: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральный центр охраны здоровья животных»]. - Владимир, 2014. - 141 с.
22. Comparative evaluation of non-structural protein-antibody detecting ELISAs for foot-and-mouth disease sero-surveillance under intensive vaccination/G.K. Sharma, J.K. Mohapatra, S. Mahajan [et al] // J. Virol. Methods. - 2014. - V. 207. - P. 22-28.
23. Доронин М.И. Опосредованное определение концентрации рибонуклеопротеина вируса бешенства в сырье для вакцин методом амплификации и гибридизационно-флуоресцентной детекции ампликонов / М.И. Доронин, Д.В. Михалишин, Н.С. Мудрак, А.В. Борисов, К.Н. Груздев // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2021. - №3. - С. 14-19.
24. Тукшаитов, Р.Х. Основы оптимального представления статистических показателей на графиках, диаграммах и в таблицах. / Р.Х. Тукшаитов. - К.: Типография КГЭУ, 2006. - 227 с.