Влияние спиртового экстракта из серпухи венценосной на жизнеспособность белых крыс

ВЕТЕРИНАРНАЯ МЕДИЦИНА

УДК 619 : 616-0973

Влияние спиртового экстракта из серпухи венценосной на жизнеспособность белых крыс

Милков Антон Андреевич, аспирант ФГБОУ ВПО «Вятская ГСХА», г. Киров, Россия

E-mail: tosamilk@gmail.com

Цель исследований заключалась в оценке действия экстракта серпухи венценосной (S. coronata) на жизнеспособность и выживаемость белых крыс после его инъекционного введения в максимальных дозах. Опыт был поставлен в лабораторных условиях, животные подобраны по принципу аналогов возрастом 5 месяцев и массой 150±2,5 г, клинически здоровые. Было сформировано 5 групп по 6 животных в каждой группе. Предварительно высушенный спиртовой экстракт S.coronata после растворения в дистиллированной воде вводили внутрибрюшинно. По окончании опыта масса тела крыс возрастала на 13±2,5 г, исследуемые морфологические показатели крови (эритроциты, лейкоциты, гемоглобин, гематокрит, тромбоциты и др.) в опытных и контрольной группах были в границах, не выходящих за пределы нормы, внутренние органы без каких-либо патологических изменений. Показатели коэффициентов массы внутренних органов опытных и контрольных животных достоверно не отличались между собой (р<0,05). Весовые коэффициенты взяты в соотношении г/100 г массы животного. Крысы опытной группы имели следующие показатели: масса сердца 0,32±0,008, легких 0,75±0,004, печени 3,19±0,123, почек 0,37±0,023. Крысы контрольной группы: масса сердца 0,30±0,074, легких 0,73±0,003, печени 3,06±0,007, почек 0,36±0,012. При гистологическом исследовании внутренних органов не найдено существенных изменений в их структуре. В результате установлено, что внутрибрюшинное введение экстракта S.coronata крысам в дозах 400, 600, 800 и 1000 мг/кг не вызывает у них негативных последствий. Комплекс полученных данных позволяет заключить, что экстракт из S. coronata при парентеральном введении, даже в высоких концентрациях, не оказывает негативного влияния на организм подопытных животных.

Ключевые слова: серпуха венценосная, белые крысы, водная взвесь, спиртовой экстракт, токсичность, кровь, гистология, выживаемость

Серпуха венценосная, или коронованная (БвггаШШ согопаа), как и левзея сафлоровид-ная (КНаропйсыт carthamoides), является многолетним поликарпическим травянистым растением, продуцентом экдистероидов [1].

Источником экдистероидсодержащего растительного сырья у растений рода БеггаШ1а обычно служат стеблевые листья генеративных побегов, содержащие 0,1-0,7% 20-гидроксиэкдизона [2].

Влияние экдистероидов растений на млекопитающих пока еще недостаточно исследовано. В литературе имеются сведения о том, что растения в ходе их совместной с насекомыми эволюции выработали способность синтезировать экдистероиды, защищающие их от растительноядных насекомых. Известно проявление экдистероидами антиокси-дантных, противомикробных, противовоспалительных и ранозаживляющих свойств. Установлено стимулирование кроветворной функции (эритропоэз), усиление регенерации и возрастание концентрации эритроцитов и гемоглобина в крови, усиление функции фагоцитоза. Анаболический эффект сопостави-

мых доз экдистероидов из многих других источников, в частности, изолированных из S.coronata, не зафиксирован [3].

В официальной научной медицине эк-дистероидсодержащие натуральные составы используют при нарушениях работы сердечнососудистой, центральной нервной и репродуктивной систем, в качестве тонизирующих и стимулирующих при умственном и физическом утомлении, пониженной работоспособности, ослаблении функции разных органов. Могут применяться для заживления ран и язв, лечения ожогов [4].

Анализ водных экстрактов S.coronata путем жидкостной хроматографии показал наличие четырех экдистероидов: 20Е, 25S-инокостерона, макистерона А и Е. Установлено, что, в отличие от корней, в молодых листьях и побегах концентрация действующих веществ в 7-10 раз выше, водо- и спир-торастворимых веществ - больше в 4-5 раз (55% против 12%) [5, 6]. Кроме того, надземные части левзеи и серпухи в условиях европейского Севера не концентрировали элементы первого и второго класса опасности

(Щ, Cd, As, Zn; Ni, Cu, Cr) выше фонового уровня. Хлор- и фосфорорганические соединения отсутствуют. Содержание радионуклидов 90Sr и 137Cs значительно ниже ПДК [7]. До настоящего времени в литературе не удалось обнаружить данных о влиянии высоких и низких концентраций биологически активных веществ З.еогопМа на млекопитающих при их парентеральном введении.

Цель исследований - изучить влияние спиртового экстракта £. еогопа(а на жизнеспособность и выживаемость белых крыс после инъекционного введения в максимальных дозах.

Материал и методы. Исследование проводили на базе кафедры фармакологии Вятской ГСХА. Опыт проведен на белых крысах, которых подбирали по принципу аналогов (возраст 5 месяцев, масса тела 150±2,5 г, клинически здоровые). Крыс распределяли на 5 групп по 6 животных в каждой (контрольная и 4 опытных). Животных содержали в просторных клетках со свободным доступом к воде. Рацион составляла смесь овса с семенами подсолнуха и тыквы, примерно 50 г зерносмеси на каждую голову в сутки.

При проведении эксперимента за основу был взят метод Кёрбера [8]. Выбор доз обосновывали исходя из общепринятой классификации классов токсичности (опасности) химических веществ в соотвествии с ГОСТом 12.1.007-76. 1 класс токсичности: сильнодействующие вещества - ЛД50 до 50 мг/кг; 2 класс: высокотоксичные - ЛД50 от 50 до 200 мг/кг; 3 класс: среднетоксичные - ЛД50 2001000 мг/кг; 4 класс: малотоксичные - ЛД50 более 1000 мг/кг. Исходя из этого максимальная дозировка (по сухому остатку) составила 1000, а минимальная - 400 мг/кг массы тела.

Метод приготовления экстракта авторский, за основу были взяты общепринятые каноны фармацевтики [9]. Принцип нашей методики заключался в следующем: первоначально получали 70° спиртовой экстракт серпухи, затем выпаривали экстракт в чашках Петри на водяной бане при температуре 40°С, под вытяжкой, до полного испарения спирта. Исследовали экстракт на содержание экдистероидов методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сухой остаток из каждой чашки (концентрации экдистероидов во всех 4 чашках соответствовали расчетным по груп-

пам) разводили дистиллированной водой для последующего внутрибрюшинного введения крысам. За действующее вещество (ДВ) в расчет принимали концентрацию экдисте-роидов в сухом экстракте, которые и определяли дозировки в группах животных. Интервал между дозами составлял 200 мг/кг. Объем вводимой жидкости во всех группах составлял 1 мл на животное. При этом концентрации экдистероидов в данном объеме в каждой группе соответствовали расчетным. Полученную взвесь хранили во флаконах из темного стекла в холодильнике при температуре +5°С, соблюдая условия хранения.

Взвесь вводили парентерально, отступив несколько сантиметров от белой линии живота, фиксируя животное вниз головой, чтобы не задеть внутренние органы. Игла вводилась на глубину примерно 0,5 см. В опытных группах взвесь вводили в следующих дозах по ДВ: в 1-ой 400 мг/кг, во 2-ой 600 мг/кг, в 3-ей 800 мг/кг и в 4-ой 1000 мг/кг. В контроле инъецировали 1 мл стерильной дистиллированной воды. Спустя

2 недели был отобран биоматериал. На исследование была взята кровь для проведения полного спектра морфологических исследований с помощью автоматического гематологического анализатора, а после оглушения и эвтаназии у крыс извлекали сердце, печень, почки, селезенку для гистологических исследований и определения массы органов. Весовые коэффициенты определяли в соотношении г/100 г массы животного. Гистологические исследования проводили по стандартной методике [10]. На протяжении всего эксперимента контролировали клиническое состояние животных, в том числе, визуально оценивая частоту дыхания (ЧД) и частоту сердечных сокращений (ЧСС).

Статистическую значимость полученных результатов исследования крови, массы внутренних органов рассчитывали с использованием критерия Стьюдента при p<0,05 путем сравнения аналогичных показателей в опытных и контрольной группах.

Результаты и их обсуждение. Установлено, что в 1 мл 70° спиртового экстракта 8.еогопа1а содержалось 60 мг экдистерои-дов. После введения экстракта, в форме водной взвеси, у животных 4-ой группы (1000 мг/кг) наблюдали учащенное дыхание, через

3 минуты мочеиспускание, через 5 минут

беспокойство, через 10 минут повышение ЧСС, повышение двигательной активности, а через 15 минут рефлекс умывания. Все крысы в группе выжили.

В третьей группе (800 мг/кг) у животных также наблюдали учащенное дыхание, повышение ЧСС, мочеиспускание, дефекацию через 3 минуты. Все крысы выжили.

Во второй группе (600 мг/кг) через 3 минуты после введения препарата у животных наблюдали учащенное дыхание и мочеиспускание, через 5 минут учащение ЧСС и беспокойство, через 10 минут дефекацию. Все крысы в группе выжили.

В первой группе (400 мг/кг) через 5 минут наблюдали учащенное дыхание, мочеиспускание через 10 минут, дефекация через 10 минут, беспокойство через 10 минут, учащение ЧСС через 5-7 минут. В контрольной группе поведение и клиническое состояние крыс находилось в пределах физиологической нормы на протяжении всего опыта

Как видно из таблицы 1, некоторые различия в показателях ЧСС и ЧД между опытными и контрольной группой, на наш взгляд, были связаны со стрессовой ситуацией для белых крыс. Изменения по сравнению с контролем во всех опытных группах оказались не достоверны p>0,05. Все крысы выжили. Наблюдение за животными вели в течение двух недель. Клиническое состояние животных в течение этого периода находилось в пределах нормы во всех группах. Таким образом, не удалось определить ЛД50 исследуемого экстракта. В процессе наблюдений установлено, что поведение животных было одинаковым во всех группах. Аппетит в норме, шерстный покров блестящий, анемичности слизистых оболочек не отмечено. Масса животных к концу эксперимента в опытных и контрольной группах достоверно увеличилась на 13±2,5 г (р<0,05) в сравнении с начальными показателями.

Таблица 1

Частота сердечных сокращений в минуту (ЧСС) и частота дыхательных движений (ЧД) через 5-7 минут после введения водного экстракта

№ жи- 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа Контроль

вотного ЧСС ЧД ЧСС ЧД ЧСС ЧД ЧСС ЧД ЧСС ЧД

1 450 170 470 150 460 152 460 100 371 150

2 470 150 471 165 450 152 450 155 350 120

3 480 170 452 151 457 170 451 153 341 131

4 471 171 452 171 460 171 452 156 342 120

5 450 172 460 172 455 150 461 170 370 141

6 450 168 477 165 456 155 477 171 350 145

По окончании опыта исследовали кровь. Полный морфологический анализ крови показан в таблице 2.

Из результатов анализа видно, что все показатели морфологии крови между опытными и контрольными животными не имели существенной разницы и находились в нормативных границах (р<0,05), за исключением количества лейкоцитов, содержание которых изначально было низким у всех животных, что можно объяснить осенне-зимним периодом времени года. Негативного эффекта на морфологию крови подопытных крыс вытяжка из серпухи не оказывала.

При вскрытии не выявлено патологических изменений со стороны внутренних

органов. Показатели коэффициентов массы внутренних органов (г/100 г массы животного) опытных и контрольных животных достоверных отличий не имели (р>0,05). Крысы опытных групп имели следующие показатели: масса сердца 0,32±0,008, легких - 0,75±0,004, печени - 3,19±0,123, почек -0,37±0,023. Показатели весовых коэффициентов внутренних органов в контрольной группе: масса сердца 0,30±0,074, легких -0,73±0,003, печени - 3,06±0,007, почек -0,36±0,012.

При гистологическом исследовании внутренних органов не найдено существенных изменений в их структуре. Все показатели были в пределах физиологической нормы.

Таблица 2

Морфологические показатели крови крыс после введения водной взвеси экстракта серпухи

Показатель 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа Контроль

WBC, 109/л 2,01±0,40 1,42±0,20* 2,82±0,50* 1,42±0,10* 1,80±0,10

LYM, 109/л 0,74±0,01 0,59±0,01* 1,14±0,02 0,86±0,04 0,90±0,01

MID, 109/л 0,37±0,01* 0,12±0,01* 0,53±0,04* 0,15±0,01* 0,20±0,02

GRA, 109/л 0,90±0,02* 0,17±0,01* 1,16±0,01* 0,41±0,01 0,50±0,01

RBC, 1012/л 6,53±2,10 7,59±1,50 8,79±0,50 9,18±1,20* 7,69±1,10

HGB, г/л 122±1,1* 134±1,5 138±2,4* 151±2,2* 130±2,1

HCT, % 36,2±1,1* 40,33±1,2 43,30±2,4 46,72±1,5 41,2±2,1

MCV, фл 56±2,1* 53±2,4 49±2,1 51±2,2 50±2,1

MCH, пг 18,8±0,5* 17,6±0,4 15,7±1,4 16,5±1,1 16,1±2,1

MCHC, г/л 338±4,4 332±5,4 319±4,5 323±4,5 320±4,2

RDWc, % 13,1±0,1 13,9±0,2 14,2±0,3 13,9±0,5 13,4±0,4

PLT, 109/л 214±4,5* 145±5,4* 262±4,2* 200±4,4 190±5,0

PCT, % 0,33±0,01* 0,07±0,01* 0,15±0,01 0,11±0,01 0,10±0,01

MPV, фл 6,3±1,4* 5,2±1,0 5,7±1,1 5,7±1,4 5,5± 1,1

PDWc, % 38,0±1,4 33±2,5 38,2±2,4 38,2±2,1 34,2±2,1

Палочкоядерные, % 1±0,01 0 0 0 0

Сегментоядерные, % 55±2,4 61±5,1* 51±5,0 42±4,0* 55±5,1

Лимфоциты, % 34±1,5 35±1,4 41±2,5* 53±3,1* 41±3,1

Эозинофиллы, % 1±0,01 0 0 0 0

Базофиллы, % 0 0 0 0 0

Моноциты, % 9±0,2* 4±0,1 8±0,2* 5±0,1 4±0,1

СОЭ, мм/час 4±0,01 3±0,01 3±0,04 2±0,04 3±0,02

Примечания: * При р<0,05 в сравнении с контролем; WBC - лейкоциты; LYM - лимфоциты; MID - средние клетки моноциты, эозинофилы, базофилы; GRA - гранулоциты (нейтрофилы); RBC - эритроциты; HGB - гемоглобин; HCT -гематокрит; MCV - средний объем эритроцитов; MCH - среднее содержание гемоглобина в эритроците; MCHC - концентрация гемоглобина в эритроците; RDWc - распределение эритроцитов по величине; PLT - тромбоциты; PCT - тромбокрит; MPV -средний объем тромбоцита; PDWc - распределение тромбоцитов по величине

Заключение. В результате исследований получены новые данные о влиянии экстракта 8.еогопа(а при парентеральном введении лабораторным животным на состояние крови, массу внутренних органов и выживаемость. Комплекс полученных данных позволяет сделать вывод о том, что водная взвесь спиртового экстракта 8. еогопа1а при парентеральном введении, даже в высоких концентрациях (от 400 до 1000 мг/кг), не оказывает негативного влияния на организм подопытных животных. Исследуемые морфологические показатели крови как в опытных, так и в контрольной группах не выходили за пределы нормы. Во внутренних органах крыс (сердце, легкие, печень, почки) не обнаружено изменений как на уровне гистоанализа, так и в части изменения массы органов.

Список литературы

1. Тимофеев Н.П. Промышленные источники получения экдистероидов. Часть I. Ponas-terone и muristerone // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты: Сб. науч. трудов. М.: РАЕН, 2003. №9. 105 с.

2. Мишуров В.П., Тимофеев Н.П. Актуальные задачи по созданию, культивированию и использованию сырьевой базы экдистероидсо-держащих растений: Материалы IX Международного симпозиума по новым кормовым растениям. Сыктывкар, 1999. 121 с.

3. Балтаев У.А. Фитоэкдистероиды: структура, источники и пути биосинтеза в растениях. М.: РЕАН, 2000. № 12. 892 с.

4. Ивановский А.А. Фитоэкдистероиды -учебное пособие. Киров: Изд-во ВГСХА, 2012. 12 с.

5. Филиппова Н.В., Володина С.О., Смоленская И.Н., Зоринянц С.Э., Володин В.В. Эк-дистероиды в культурах клеток SERRTULA CORONA-TA И AJUGA REPTANS // Химия растительного сырья. 2002. № 1. С. 57.

6. Тимофеев Н.П. Исследования по экдис-тероидам: Использование в медицине // Биомедицинская химия. 2004. 50 (Прил. 1). С. 133.

7. Тимофеев Н.П. Левзея сафлоровидная и серпуха венценосная - основа новых инновационных продуктов [Электронный ресурс] // Левзея сафлоровидная или серпуха. Режим доступа: www.leuzea.ru.

8. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1975. 60 с.

9. Соколов В.Д., Рабинович М. И., Горшков Г.И. Фармакология / Под ред. В.Д. Соколова. М.: Колос, 1997. 543 с.

10. Афанасьева Ю.И., Юрина Н.А. Гистология, цитология, эмбриология. 5-е изд,. перераб. и доп. М.: Медицина, 2002. 744 с.

Effect of extract of saw-wort (Seratulla coronate) on the viability of white rats

Milkov A.A., post-graduate student

Vyatka State Agricultural Academy, Kirov, Russia

The article presents the results of studies on the effect of alcoholic extract of saw-wort (Seratulla coronata) on the viability and survival of white rats after injection of maximal doses of preparation. The experiment was made under laboratory conditions; animals are selected on the basis of analogs principle with 5 months age and weight of 150 ± 3 grams, clinically healthy. Five groups with 6 animals in each were formed. Dried alcoholic extract of S. coronata after dissolving in distilled water was injected intraperitoneally. At the end of the experiment body weight of rats increased by 13 ± 3 g; studied blood parameters in the experimental and control groups were roughly in the same boundaries that do not go beyond the norm; internal organs had no any pathological changes. Indicators of mass coefficients of internal organs of experimental and control animals did not differ significantly with each other (P<0.05). Rats of experimental group had: heart weight 0.32 ± 0.01; lung 0.75 ± 0.00; liver 3.19 ± 0.12; kidney 0.37 ± 0.02. Rats in the control group had: heart weight 0.30 ± 0.07; lungs 0.73 ± 0.00; liver 3.06 ± 0,01; kidney 0.36 ± 0.01. Histological examinations of the internal organs are not found significant changes in their structure. As the result it was found that intraperitoneal injection of S. coronata extract to rats at doses of 400, 600, 800, and 1000 mg/kg did not cause adverse effects. Complex of obtained data allows to conclude that extract of S. coronata at parenteral administration even in high concentrations has no negative effect on the body of experimental animals.

Key words: saw-wort, white rats, water emulsion, alcoholic extract, toxicity, blood, histology, survival

References

1. Timofeev N.P. Promyshlennye istochniki polucheniya ekdisteroidov. Chast' I. Ponasterone i muristerone. [Industrial sources of ecdysteroids. Part I. Ponasterone and muristerone]. Netraditsionnye prirodnye resursy, innovatsionnye tekhnologii i produkty. [Non-traditional natural resources, innovative technologies and products]. Col. scient. works. Moscow: RAEN, 2003. no.9. 105 p.

2. Mishurov V.P., Timofeev N.P. Aktual'nye zadachi po sozdaniyu, kul'tivirovaniyu i ispol'zo-vaniyu syr'evoy bazy ekdisteroidsoderzhashchikh rasteniy. [Actual problems of creation, cultivation and utilization of raw materials base of ecdysteroid-content plants]. Materialy IX mezhdunarodnogo simpoziuma po novym kormovym rasteniyam. [Proceedings of the IX international Symposium on new fodder plants]. Syktyvkar, 1999. 121 p.

3. Baltaev U.A. Fitoekdisteroidy: struktura, istochniki i puti biosinteza v rasteniyakh. [The phyto-ecdysteroids: structure, sources and routes of biosynthesis in plants]. Moscow: REAN, 2000. no. 12. 892 p.

4. Ivanovskiy A.A. Fitoekdisteroidy -uchebnoe posobie. [Phytoecdysteroids - tutorial]. Kirov: VGSKhA, 2012. 12 p.

5. Filippova N.V., Volodina S.O., Smolens-kaya I.N., Zorinyants S.E., Volodin V.V. Ekdisteroidy v kul'turakh kletok SERRTULA CORONATA IAJUGA REPTANS. [Ecdysteroids in cell cultures of SERRTULA CORONATA and AJUGA REP-TANS]. Khimiya rastitel'nogo syr'ya. 2002. no.1. p. 57.

6. Timofeev N.P. Issledovaniya po ekdistero-idam: Ispol'zovanie v meditsine. [Research on ecdyste-roids: Use in medicine]. Biomeditsinskaya khimiya. 2004. 50 (Pril. 1). p. 133.

7. Timofeev N.P. Levzeya saflorovidnaya i serpukha ventsenosnaya - osnova novykh innova-tsionnykh produktov. [Leuzea carthamoides and sabuha crowned the basis of new innovative products]. Levzeya saflorovidnaya ili serpukha. [Leuzea carthamoides or sabuha]. Mode of access: www.leuzea.ru.

8. Urbakh V.Yu. Statisticheskiy analiz v biologicheskikh i meditsinskikh issledovaniyakh. [Statistical analysis in biological and medical research]. Moscow: Medicine, 1975. 60 p.

9. Sokolov V.D., Rabinovich M. I., Gorsh-kov G.I. Farmakologiya. [Pharmacology]. Moscow: Kolos, 1997. 543 p.

10. Afanas'eva Yu.I., Yurina N.A. Gistologiya, tsitologiya, embriologiya. [Histology, Cytology, embryology]. 5th ed,. revised and enlarged extra. Moscow: Medicine, 2002. 744 p.