СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
METHOD TO DIAGNOSE LEUKOSIS IN CATTLE

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способам диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
Современная серологическая диагностика лейкоза крупного рогатого скота основана большей частью на использовании реакции иммунодиффузии в геле агара (РИД) и методов иммуноферментного анализа (ИФА).
В настоящее время у нас в стране и в большинстве зарубежных государств РИД принята в качестве основного серологического теста для диагностики лейкоза. При этом предлагаются разные способы выявления больных лейкозом животных, основанные на данном тесте.
Известен способ выявления больных лейкозом крупного рогатого скота животных, при котором проводят повторные серологические исследования в РИД испытуемых положительных сывороток крови, и при обнаружении специфических антител к антигенам ВЛКРС в титре 1:8 и выше животное оценивают как больное (патент РФ №2200955, МПК G01N 33/53, 2003 г.).
Недостатком этих методов является не высокая чувствительность и специфичность РИД, в результате чего они недовыявляют инфицированных ВЛКРС животных в стаде.
Метод ИФА обладает рядом значительных преимуществ: более высокая, чем в РИД, чувствительность и специфичность, возможность автоматизации процесса и сокращения времени анализа.
Иммуноферментный анализ широко используют в Национальных программах по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота во многих странах Западной Европы и Америки. Несмотря на то, что для постановки ИФА выпускаются специальные диагностические наборы, применение методов иммуноферментного анализа в диагностике лейкоза крупного рогатого скота в нашей стране не нашло широкого применения.
Известно, что при хронических инфекциях, вызванных вирусами семейства Retroviridae, в биологических жидкостях организма образуются иммунные комплексы «антиген-антитело», которые имеют определенное значение в патогенезе этих инфекций.
По данным Ungar-Waron H. et al. (1992) циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) в сыворотке крови ВЛКРС-серопозитивных коров содержат антигены вируса и IgG и IgM. Соотношение антител в комплексах («связанные антитела») меняется с возрастом животного и стадией болезни. Логинов С.И. (2003) утверждает, что у значительной части коров, инфицированных ВЛКРС, имеет место повышенная продукция иммунных комплексов.
Ближайшим аналогом заявленного изобретения является способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота, включающий выявление анти-ВЛКРС (вирус лейкоза крупного рогатого скота) антител в молоке или в сыворотке крови с помощью иммуноферментного анализа, известный из «Методических указаний по диагностике лейкоза крупного рогатого скота». МСХ РФ, Департамент ветеринарии №13-7-2/2130 от 23.08.00.
Одним из недостатков серологических методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота, в том числе и ИФА, является то, что они не позволяют выявлять «связанные антитела». В результате снижается эффективность оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота.
Задачей заявляемого изобретения является повышение достоверности диагностики лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.
Поставленная задача в способе диагностики лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), включающем выявление анти-ВЛКРС антител в молоке или сыворотке крови животного с помощью иммуноферментного анализа, достигается тем, что предварительно перед анализом пробу обезжиренного молока или сыворотки крови инкубируют 2 часа при температуре 50°С, после чего пробы сразу же используют для иммуноферментного анализа.
При этом пробу молока в объеме не менее 10 мл центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин и тщательно удаляют верхний липидный слой; затем отбирают 1-2 мл обезжиренного молока или берут 0,5-1 мл сыворотки крови; пробы инкубируют 2 часа при температуре 50°С, после чего сразу же исследуют методом иммуноферментного анализа («Методические указания по диагностике лейкоза крупного рогатого скота» / МСХ РФ, Департамент ветеринарии №13-7-2/2130 от 23.08.00. - С.5-8).
Предлагаемый способ позволяет увеличить достоверность выявления ВЛКРС-инфицированных животных по сравнению с традиционно применяемым методом ИФА и повысить эффективность диагностики лейкоза, так как, позволяет обнаружить наряду со свободными антителами связанные в иммунных комплексах антитела в сыворотке крови и молоке.
Пример 1. С целью определения возможностей ИФА в диагностике лейкоза крупного рогатого скота с диссоциацией ЦИК в биопробах проводили контрольные исследования. При этом взяли по 10 проб сыворотки крови и молока от одних и тех же животных из благополучных и неблагополучных по лейкозу хозяйств и исследовали в ИФА без диссоциации и с диссоциацией иммунных комплексов.
Пробы сывороток крови и молока коров из благополучных хозяйств показали отрицательные результаты во всех случаях.
Из неблагополучных по лейкозу хозяйств взяли пробы сывороток крови и молока от отрицательных и положительных в РИД животных. Результаты исследований представлены в таблице 1.
Пробы сывороток крови от РИД положительных коров в ИФА все показали положительные результаты. В ИФА молока от этих же животных, без диссоциации иммунных комплексов, 7 проб дали положительные и 3 - отрицательные результаты; в ИФА с диссоциацией ЦИК все пробы молока были положительные.
Из 10 проб сывороток крови от РИД отрицательных коров в ИФА по общей методике положительно реагировали 2 и по предлагаемой методике 4 пробы. В ИФА молока от этих же животных положительно реагировали 1 и 3 пробы соответственно.
Таким образом, результаты представленные в таблице, свидетельствуют, во-первых, о более низкой чувствительности РИД по сравнению с ИФА, во-вторых, о том, что предварительная диссоциация иммунных комплексов в пробах позволяет повысить чувствительность ИФА диагностики лейкоза.
Пример 2. Исходя из результатов предварительных исследований проводили производственные испытания предлагаемого способа диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
Было исследовано 92 пробы сыворотки крови и молока от одних и тех же животных из неблагополучных по лейкозу хозяйств Нижнекамского, Зеленодольского, Верхне-услонского районов РТ. Результаты исследований представлены в таблице 2. ИФА ставили по традиционной методике и по предлагаемому способу с использованием «Набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа» производства НПО НАРВАК, г.Москва. Учет результатов реакции проводили согласно наставлению по применению набора.
50 проб сывороток крови от РИД положительных животных были положительные в ИФА до и после термической обработки. Однако внутри этой группы наблюдалось увеличение титров анти-ВЛКРС антител после инкубации в международных ИФА единицах от 3-х до 22. Только в трех случаях титры антител до и после инкубации остались неизменными. Пробы молока от этих же коров показали положительные результаты только в 44 случаях, 6 проб определены как сомнительно реагирующие. Однако, после инкубации при 50°C в течение 2-х часов все пробы молока оказались положительными в ИФА.
Из 42 проб сывороток крови от РИД отрицательных коров 37 отрицательно реагировали в ИФА, 5 проб показали положительные результаты. После инкубирования в вышеуказанных условиях положительно реагирующих проб стало 12.
В иммуноферментном анализе проб молока от этих же животных получены следующие результаты: 4 - положительные и 38 - отрицательные по обычной методике ИФА, 7 - положительные и 35 - отрицательные по предлагаемой методике.
Из полученных данных можно сделать вывод, что предварительная диссоциация иммунных комплексов в пробах повышает чувствительность ИФА диагностики лейкоза крупного рогатого скота до 20%.
Таким образом, предлагаемый способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота позволяет более полно выявлять в оздоравливаемых стадах ВЛКРС-инфицированных животных, исключать потенциальные источники перезаражения и повышать эффективность противолейкозных мероприятий в хозяйствах. Кроме того, данный способ открывает широкие перспективы мониторинга эпизоотической ситуации по лейкозу в хозяйствах методом иммуноферментного анализа проб молока.
Таблица 1.
Результаты контрольных исследований в ИФА проб сывороток крови молока от положительных и отрицательных в РИД коров и неблагополучных по лейкозу хозяйств.
Всего проб
ИФА сывороток крови
ИФА молока
Без дис-и ЦИК
С дис-й ЦИК
Без дис-и ЦИК
С дис-й ЦИК
Полож.
Отр.
Полож.
Отр.
Полож.
Отр.
Полож.
Отр.
РИД (+)
10
10
0
10
0
7
3
10
0
РИД (-)
10
2
8
4
6
1
9
3
7
Таблица 2.
Результаты исследования проб сывороток крови и молока методом ИФА на лейкоз крупного рогатого скота.
Всего проб
ИФА сывороток крови
ИФА молока
Без дис-и ЦИК
С дис-й ЦИК
Без дис-и ЦИК
С дис-й ЦИК
Полож.
Отр.
Полож.
Отр.
Полож.
Отр.
Полож.
Отр.
РИД (+)
50
50
0
50
0
44
6
50
0
РИД (-)
42
6
36
11
31
4
38
7
35