КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЕНА REIC/Dkk-3 И ИНГИБИТОРА КОНТРОЛЬНОЙ ТОЧКИ ИММУННОГО ОТВЕТА
COMBINATION THERAPY USING REIC/DKK-3 GENE AND IMMUNE RESPONSE CHECKPOINT INHIBITOR

Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к комбинированной терапии лечения рака с использованием гена REIC/Dkk-3 и ингибитора контрольной точки иммунного ответа.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Ген REIC/Dkk-3 известен как ген, связанный с иммортализацией клеток. Ранее сообщалось, что экспрессия этого гена подавлена в раковых клетках. Также сообщалось, что ген REIC/Dkk-3 использовали для лечения рака (патентный документ 1).
[0003] Известно, что ингибитор контрольной точки иммунного ответа (далее по тексту-«контрольной точки»), такой как антитело анти-PD-1 (Programmed cell death 1), антитело анти-PD-L1 (Programmed cell-death ligand 1) и сходные с ними, могут быть использованы в терапии различных злокачественных опухолей.
[Список цитирования]
[Патентная литература]
[0004] [PTL 1] Международная патентная публикация WO01/038528
Сущность изобретения
Техническая задача
[0005] Целью настоящего изобретения является разработка способа лечения рака с использованием ингибитора контрольной точки в сочетании с геном REIC/Dkk-3.
Решение задачи
[0006] Авторы настоящего изобретения изучили эффект комбинированного применения REIC/Dkk-3 и ингибитора контрольной точки при лечении рака.
[0007] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что использование REIC/Dkk-3 в комбинации с ингибитором контрольной точки усиливает системный ответ Т-клеток и противоопухолевые процессы. Это указывает на то, что комбинированное использование REIC/Dkk-3 и ингибитора контрольной точки представляет собой практический способ лечения рака.
[0008] Более конкретно, настоящее изобретение состоит в следующем.
[0009] 1. Комбинированный фармацевтический набор для лечения рака, включающий REIC/Dkk-3 в комбинации с ингибитором контрольной точки.
2. Комбинированный фармацевтический набор по п.1, в котором ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD-1 антитело или анти-PD-L1 антитело.
3. Комбинированный фармацевтический набор по п.1, в который включен вектор аденовируса, содержащий ген REIC/Dkk-3.
4. Комбинированный фармацевтический набор по п.1, где рак представляет собой рак предстательной железы.
5. Способ лечения рака путем введения гена REIC/Dkk-3 и ингибитора контрольной точки больному раком.
6. Способ лечения рака по п.5, где ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD-1 антитело или анти-PD-L1 антитело.
7. Способ лечения рака по п.5 с введением вектора аденовируса, содержащего ген REIC/Dkk-3.
8. Способ лечения рака по п.5, где рак представляет собой рак предстательной железы.
9. Способ объединения REIC/Dkk-3 с ингибитором контрольной точки для лечения рака.
10. Способ по п.9, в котором ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD-1 антитело или анти-PD-L1 антитело.
11. Способ по п.9, в котором ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD-1 антитело.
12. Способ по п.9, в котором ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD-L1 антитело.
13. Применение анти-PD-1 и анти-PD-L1 антител для настройки действия иммунной системы таким образом, что рак экспрессирует PD-1 и PD-L1 на клеточной поверхности, что делает его восприимчивым к гену REIC/Dkk-3 (т.е. к REIC/Dkk-3 индуцированному противоопухолевому иммунитету, цитотоксичным Т-лимфоцитам (CTL), индуцированным REIC/Dkk-3).
14. Способ объединения REIC/Dkk-3 с ингибитором контрольной точки при изготовлении лекарственного средства для лечения рака.
15. Способ по п.14, в котором ингибитор контрольной точки представляет собой анти-PD-1 антитело или анти-PD-L1 антитело.
Значимый результат изобретения
[0010] При лечении рака ген REIC/Dkk-3 и ингибитор контрольной точки обнаруживают синергический эффект.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0011] [Фиг.1] На Фиг.1 приведен пример последовательности Ad-REIC/Dkk-3.
[Фиг.2] На Фиг.2 приведена последовательность Ad-REIC/Dkk-3.
[Фиг. 3] На Фиг.3 показан план эксперимента по выживаемости групп (см. Пример).
[Фиг.4] На Фиг.4 показана опухолевый рост после внутриопухолевой обработки MTG-201 отдельно и в сочетании с антителами к CTLA4 и PD-1.
[Фиг.5] На Фиг.5 показана общая выживаемость после внутриопухолевой обработки MTG-201 отдельно и в сочетании с антителами к CTLA4 и PD-1.
[0012] Настоящая заявка включает в себя содержание, представленное в описании и чертежах предварительной заявки США №62/277371, на основании которой испрашивается приоритет настоящей заявки.
Подробное описание настоящего изобретения
[0013] Комбинированная терапия по настоящему изобретению основана на использовании ингибитора контрольной точки в сочетании с геном REIC/Dkk-3.
[0014] Ингибитор контрольной точки включает анти-PD-1 антитело (programmed cell Death 1, анти-PD-L1 (Programmed cell Death Ligand 1) и сходные с ними.
[0015] Нуклеотидная последовательность ДНК гена REIC/Dkk-3 представлена SEQ ID NO:1 списка последовательностей. Кроме того, аминокислотная последовательность REIC, кодируемая ДНК REIC/Dkk-3, представлена SEQ ID NO:2 списка последовательностей. ДНК, имеющая по меньшей мере 85%, предпочтительно, по меньшей мере 90%, или, еще более предпочтительно, по меньшей мере 95% или, особенно предпочтительно, по меньшей мере 97% идентичности с нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, и рассчитанной с использованием программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) при Национальном центре биологической информации (NCBI) или сходной с ней (с использованием, например, параметров по умолчанию (т.е. исходных) включена в ДНК REIC/Dkk-3.
[0016] Также может быть использован фрагментарный нуклеотид REIC/Dkk-3. Примеры такого нуклеотида, включающего нуклеотидную последовательность от 1-го нуклеотида до любого нуклеотида от 117-го до 234-го в нуклеотидной последовательности ДНК REIC/Dkk-3, показанной в SEQ ID NO: 1, включают полинуклеотид (SEQ ID NO: 3) длиной от 1-го до 117-го нуклеотида и полинуклеотид (SEQ ID NO: 4) длиной от 1-го до 234-го нуклеотида.
[0017] Ген REIC/Dkk-3 может быть введен пациенту в соответствии с традиционной методикой. Примеры способов введения гена пациенту включают способы введения вирусных и невирусных векторов.
[0018] Ген REIC/Dkk-3 может быть введен в клетку или ткань без использования вышеуказанных вирусов, а с помощью рекомбинантного экспрессирующего вектора, в который включен вектор экспрессии гена, такой как плазмидный вектор.
[0019] Типичные примеры вирусных векторов, используемых для введения генов, включают вектор на основе аденовируса, адено-ассоциированный вирусный вектор и ретровирусный вектор. Желаемый ген может быть введен в клетку путем его встраивания в ДНК- или РНК-содержащий вирус, такой как например детоксифицированные производные ретровируса, вируса герпеса, вируса вакцинии, вируса коровьей оспы, поксвируса, полиовируса, вируса Синдбиса, вируса Сендай, SV40 или вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) с последующем инфицированием клеток таким рекомбинантным вирусом. Предпочтительно используется вектор аденовируса.
[0020] Вектор содержит конструкцию, включающую ген REIC/Dkk-3. Конструкция, включающая ДНК REIC/Dkk-3, может соответственно включать промотор или энхансер для транскрипции гена, поли(А)-хвост и маркерный ген для маркировки и/или выбора клетки, в которую вводится ген, и тому подобное. В таком случае может быть использован известный промотор.
[0021] Конструкция имеет структуру, в которой ДНК-конструкция, содержащая ген REIC/Dkk-3 и добавленную поли-А последовательность (далее по тексту поли(А)-хвост), расположены ниже 1-го промотора по ходу транскрипции, а энхансер или 2-й промотор залигирован уже после конструкции ДНК.
[0022] Промотор представляет собой специфическую нуклеотидную последовательность ДНК для инициации транскрипции на ДНК-матрице и, как правило, имеет определенную общую структуру. Например, прокариоты, такие как Escherichia coli, как правило, имеют последовательность TATAATG на участке из 10 н.п., служащим сайтом инициации транскрипции, и последовательность TTGACA на участке из 35 н.п. Кроме того, эукариоты обычно имеют ТАТА-блок на участке с 20 н.п. Кассета экспрессии по настоящему изобретению может стандартно содержать 1-й промотор расположенный перед геном, подлежащим экспрессии, и 2-й промотор на участке, расположенном после гена, подлежащего экспрессии. Эти промоторы, используемые как 1-й промотор и 2-й промотор, ничем не ограничены (в рамках данной заявки), и могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга. Также могут быть использованы неспецифичные промоторы, способные ускорять экспрессию чужеродных генов во всех клетках или тканях, ткане- или органо-специфичные промоторы, опухоль-специфичные промоторы и другие специфические или селективные промоторы, как, например, специфичные для стадий развития или дифференциации. Так например, возможно применение специфичного промотора в качестве 1-го промотора и неспецифичного промотора в качестве второго. Промоторы для использования в настоящем изобретении перечислены ниже. Примеры опухолеспецифического промотора (специфичных для злокачественных и незлокачественных опухолей) включают: hTERT (обратная транскриптаза теломеразы человека), PSA (простато-специфический антиген), c-myc и GLUT- промоторы. Примеры промоторов, специфичного для раковых стволовых клеток, ES-клеток, включают промоторы OCT3/4 и NANOG. Примером промотора, специфичного для нейронных стволовых клеток, является промотор Nestin. Примеры клеточного стресс-чувствительного промотора включают промоторы HSP70, HSP90 и р53. Примером промотора, специфического для гепатоцитов служит промотор альбумина. Примером радиочувствительного промотора служит промотор TNF-альфа. Примером промотора для увеличения количества копий инфицирующий плазмиды является промотор SV40 и сходные с ним. Примером промотора, специфичного для клеток в состоянии пролиферации, является промотор EF1-альфа. Более конкретно, например, в качестве 1-го промотора используют промотор CMV-i (hCMV+ промотор интрона), промотор β-актина, CAG промотор, CMV промотор или сходные с ними, а в качестве второго промотора используется промотор CMV или сходный с ним. Виды животных, на основе которых получен промотор β-актина, не ограничены в рамках данной заяки. Используются промоторы β-актина млекопитающих, такие как промотор b-актина человека и промотор β-актина куриных. Кроме того, применяется искусственный гибридный промотор, такой как вышеупомянутый промотор CMV-i. Промотор CMV-i может быть синтезирован в соответствии с описанием патента США № 5168062 или с описанием патента США № 5385839. В качестве промотора как такового может быть использован фрагмент промотора (core-промотор), состоящий из минимальной последовательности, обладающей промоторной активностью. Термин «core-промотор» относится к области промотора, способной обеспечивать точную инициацию транскрипции, эта область может содержать ТАТА-бокс. Среди вышеуказанных промоторов, рак- и/или опухолеспецифичные промоторы, такие как промотор hTERT, могут быть предпочтительно использованы в генной терапии для лечения или диагностики рака с использованием экспрессии генов.
[0023] Примеры происхождения поли(А) последовательности (последовательность полиаденилирования, polyA. или поли(А)-хвост) включают, но не ограничиваются, поли(А)-хвостами гена гормона роста (например, поли(А)-хвост бычьего гормона роста, полученную из крупного рогатого скота (BGA polyA), поли(А)-хвост гормона роста человека, поли(А)-хвост вируса SV40 и поли(А)-хвост гена β-глобина человека или кролика. Эффективность транскрипции увеличивается за счет вставки такого поли(А)-хвоста в конструкцию ДНК. Нуклеотидная последовательность поли(А)-хвоста BGA (поли(А)-хвост бычьего гормона роста) показана в SEQ ID NO: 5, начиная с 13-ого нуклеотида и включает последующие нуклеотиды.
[0024] Примеры энхансера не ограничены (рамками данной заявки) при условии, что результатом является увеличение количества информационной РНК (мРНК) в процессе транскрипции. Энхансер представляет собой нуклеотидную последовательность с эффектом ускорения действия промотора и, в большинстве случаев, обычно имеет длину около 100 н.п. Энхансер может ускорить транскрипцию независимо от собственной ориентации. В настоящем изобретении можно использовать один тип энхансера. Более специфично, могут использоваться два или более (несколько) одинаковых энхансеров или комбинация различных энхансеров. Кроме того, при использовании множества различных энхансеров, порядок их расположения не ограничен (рамками данной заявки). Так например, можно использовать энхансер CMV, энхансер SV40, энхансер hTERT (энхансер обратной транскриптазы теломеразы) и сходные с ними. Таким примером является продукт, полученный в результате соединения энхансера hTERT, энхансера SV40 и энхансера CMV именно в таком порядке.
[0025] Кроме того, несколько энхансеров (например, в количестве от 1 до 4) могут быть залигированы перед конструкцией ДНК, содержащей ДНК, кодирующую экспрессируемый белок и последовательность поли(А)-хвоста. Энхансеры, подлежащие лигированию выше по направлению транскрипции, не ограничены (рамками данной заявки), однако энхансер CMV является предпочтительным. Примером этого является 4х кратный CMV-энхансер, полученный путем соединения четырех энхансеров CMV.
[0026] Если энхансер встроен непосредственно после конструкции ДНК, состоящей из «промотора, гена, подлежащего экспрессии, и поли(А)-хвоста», белок гена (с целью усиленной экспрессии) может быть экспрессирован сильнее, чем в случае использования обычной традиционной системы экспрессии генов.
[0027] В частности, при использовании комбинации CMVi промотора и CMVi энхансера почти во всех клетках (клетках-хозяевах) сильная экспрессия белка экспрессируемого гена становится возможной для любого встроенного гена, независимо от типа используемого здесь трансфекционного реагента.
[0028] Более того, RU5' может быть залигирован непосредственно перед ДНК, кодирующей белок, подлежащий экспресии. Выражение «…непосредственно перед (выше по ходу транскрипции от…» означает, что соответствующая последовательность непосредственно встраивается/лигируется там, где нет никаких других элементов, обладающих определенными функциями. Однако, короткая последовательность может находится между ними в качестве вставки. RU5' представляет собой LTR вируса HTLV и является элементом, усиливающим экспрессию белка при встраивании в конструкцию последнего. (Mol. Cell. Biol., Том 8 (1), стр. 466-472, 1988). Встраивание RU5 в ориентации, противоположном отмеченному ранее, может свести к нулю влияние промотора на усиление экспрессии из-за встраивания энхансера.
[0029] Более того, UAS можно лигировать непосредственно перед энхансером и/или промотором. UAS является белок-связываюшим-участком (сайтом посадки) гена GAL4. Встраивание гена GAL4 ниже по направлению транскрипции от UAS может привести к увеличению экспрессии белка.
[0030] Более того, SV40-ori может быть залигирован в самой начальной части кассеты экспрессии. SV40-ori является белок-связываюшим-участком (сайтом посадки) гена SV40. Встраивание гена SV40 после SV40-ori приводит к увеличению экспрессии белка.
[0031] Каждый из вышеуказанных элементов должен быть залигирован с сохранением функциональности. Здесь термин «залигированный с сохранением функциональности» означает, что каждый элемент лигируют так, что он способен проявлять свои функции, и таким образом, усиливать экспрессию гена, подлежащего экспрессии.
[0032] В частности, конструкцию ДНК получают при лигировании промотора CMV (цитомегаловируса) перед ДНК REIC/Dkk-3, а поли(А)-хвоста-после ДНК REIC/Dkk-3. Кроме того, энхансеры (3 X enh), полученные путем последовательного соединения энхансера hTERT (обратной транскриптазы теломеразы), энхансера SV40 и энхансера CMV (цитомегаровируса) в таком порядке, встраивают лигированием после поли(А)-хвоста. В частности, конструкцию ДНК получают путем лигирования, начиная с 5'-конца: (i) промотора CMV, (ii) ДНК REIC/Dkk-3, (iii) поли(А)-хвоста и (iv) энхансеров, полученных путем соединения энхансера hTER (обратной транскриптазы теломеразы), энхансера SV40 и энхансера CMV, именно в таком порядке.
[0033] Структура части ДНК-конструкции, содержащей ДНК REIC/Dkk-3 по настоящему изобретению, и не имеющая промотора CMV, показана на Фиг.2, а ее последовательность представлена SEQ ID NO: 6. На Фиг. 2, последовательность поли(А)-хвоста бычьего гормона роста (BGA polyA) содержится между ДНК REIC/Dkk-3 и тремя энхансерами. Конструкция ДНК, содержащая ДНК REIC/Dkk-3 по настоящему изобретению, имеет промотор CMV (в районе 5'-конца) перед последовательностью, представленной SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 7 представляет нуклеотидную последовательность участка, включающего поли(А)-хвост бычьего гормона роста и три энхансера (содержащихся в вышеприведенной конструкции). На Фиг.2 части (1) и (2), заключенные в рамки в нуклеотидной последовательности, указывают ДНК, кодирующую белок REIC/Dkk-3 и три энхансера, соответственно.
[0034] Вышеупомянутые элементы должны быть функционально связаны (лигированы) друг с другом. Используемое здесь выражение, «функционально связанные (лигированные) друг с другом», означает, что элементы связаны или лигированы друг с другом так, что каждый элемент способен проявлять свои функции для усиления экспрессии гена, подлежащего экспрессии.
[0035] Вышеприведенную экспрессирующую кассету можно получить, вставив ДНК REIC/Dkk-3 в вектор pShuttle (Clonetech), содержащий сайт введения чужеродного гена, расположенный после коммерческого промотора CMV, и последовательность поли(А)-хвоста бычьего гормона роста (BGA polyA) после сайта введения гена, с последующим введением (лигированием) энхансеров hTERT (обратная транскриптаза теломеразы), SV40 и CMV именно в таком порядке в сайт, расположенный после последовательности поли(А)-хвоста бычьего гормона роста (BGA polyA).
[0036] Конструкция ДНК, содержащая ДНК REIC/Dkk-3, представляет собой:
[1] ДНК-конструкция для экспрессии ДНК REIC/Dkk-3, получаемая путем лигирования, начиная с 5'-конца, следующих элементов:
(i) промотор CMV;
(ii) ДНК REIC/Dkk-3 как указано ниже:
(а) ДНК, содержащую нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 1,
(b) ДНК последовательность, имеющую по меньшей мере 90%, 95%, 97% или 98% идентичности с нуклеотидной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1,
(iii) поли(А)-хвост; а также
(iv) энхансеры, полученные путем соединения энхансера hTERT (обратной транскриптазы теломеразы), энхансера SV40 и энхансера CMV именно в таком порядке;
[0037] [2] ДНК-конструкция согласно вышеописанному пункту 1, где поли(А)-хвост представляет собой последовательность поли(А)-хвост гена бычьего гормона роста (BGA poly(A)); а также
[0038] [3] ДНК-конструкция согласно вышеописанным пунктам 1 и 2, содержащая нуклеотидную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6, где залигированы (ii) ДНК REIC/Dkk-3, (iii) поли(А)-хвост и (iv) энхансеры, полученные путем соединения энхансеров hTERT (обратной транскриптазы теломеразы), SV40 и CMV, именно в таком порядке.
[0039] Конструкцию ДНК можно получить в соответствии с описаниями WO2011/062298, US2012-0309050, WO2012/161352 и US2014-0147917, которые включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте.
[0040] Согласно настоящему изобретению, вектор аденовируса, содержащий ДНК REIC/Dkk-3, называется «Ad-REIC» или «Ad-REIC/Dkk-3». Векторная система, содержащая описанную выше конструкцию ДНК, называется системой SGE (Super Gene Expression/Системой Супер Экспрессии). Так, например, вектор аденовируса, содержащий ДНК-конструкцию, которая содержит ДНК REIC/Dkk-3, упоминается как «Ad5-SGE-REIC/Dkk-3». На Фиг. 1 приведен пример конструкции Ad-REIC/Dkk-3, а на Фиг. 2 представлена последовательность Ad-REIC/Dkk-3.
[0041] Вышеуказанный вектор аденовируса, содержащий ДНК-конструкцию, получен путем создания рекомбинантного аденовируса при введения ДНК-конструкции в вектор аденовируса. Введение ДНК-конструкции в аденовирус может быть сделано, например, путем введения ДНК-конструкции сначала в вектор pShuttle, с последующим введением вектора pShuttle, содержащего ДНК-конструкцию по настоящему изобретению, в аденовирус.
[0042] Аденовирусный вектор характерен тем, что он: (1) позволяет перенос генов во многие типы клеток; (2) обеспечивает эффективный перенос гена даже в клетки находящиеся в стационарной фазе; (3) может быть сконцентрирован центрифугированием для получения вируса с высоким титром (10-11PFU/мл или более); (4) подходит для прямого переноса гена в клетки in vivo.
[0043] Для применения в генной терапии был разработаны аденовирусный вектор первого поколения, полученный путем удаления области E1/E3 (Miyake, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 1320, 1996), аденовирусный вектор второго поколения, полученный путем удаления, в дополнение к области E1/E3, области E2 или E4 (Lieber, A., et al., J. Virol., 70, 8944, 1996; Mizuguchi, H. & Kay, MA, Hum. Gene Ther., 10, 2013, 1999) и аденовирусный вектор третьего поколения, полученный почти полным удалением генома аденовируса (GUTLESS) (Steinwaerder, DS, et al., J. Virol., 73, 9303, 1999). Любой из этих аденовирусных векторов может применяться для переноса генов в соответствии с настоящим изобретением без особых ограничений.
[0044] Рекомбинантный вектор аденовируса, содержащий ДНК-конструкцию, включающую ДНК REIC/Dkk-3, вводится человеку или другому млекопитающему и, таким образом, ген для лечения рака транспортируется в раковые клетки пациента, экспрессируется в раковых клетках, рост опухолевых клеток подавляется и проявляются противораковые терапевтические эффекты.
[0045] Вектор аденовируса по настоящему изобретению можно вводить способами, используемыми в генной терапии, например, путем внутрисосудистого введения (включая внутривенное и внутриартериальное введение), перорального введения, внутрибрюшинного введения, внутритрахеального введения, внутрибронхиального введения, подкожного введения или трансдермального введения. В частности, вектор аденовируса по настоящему изобретению имеет сильную специфичность по отношению к определенной ткани или типам клеток и, таким образом, способен эффективно доставлять желаемый ген в определенную ткань или клетки. Поэтому эффективную диагностику и лечение можно проводить даже при внутрисосудистом введении аденовирусного вектора.
11
12
11
12
11
11
[0046] Вектор аденовируса можно вводить в терапевтически эффективной дозе, легко определяемой специалистами в области генной терапии. Кроме того, доза может адекватно варьироваться в зависимости от тяжести патологического состояния, пола, возраста, массы тела, образа жизни и других данных пациента. Так например, вектор аденовируса можно вводить в дозах от 0,5×10 до 2,0×10 вирусного генома/кг массы тела, предпочтительно в диапазоне от 1,0×10 до 1,0×10 вирусного генома/кг массы тела и, более предпочтительно, от 1,0×10 до 5,0×10 вирусного генома/кг массы тела. Термин «вирусный геном» представляет собой число молекул генома аденовируса (число вирусных частиц), а также упоминается как «частица(ы)». Таким образом, термин «вирусный геном» совпадает с термином «вирусные частицы (вч)».
[0047] Ингибитор контрольной точки иммунного ответа, такой как анти-PD-1 антитело (Programmed cell death 1)) и анти-PD-L1 антитело (Programmed cell-death ligand 1), функционирует как контрольная точка иммунного ответа для снижения активности иммунной системы, предотвращая активацию Т-клеток. Ингибиторный эффект ингибитора контрольной точки достигается путем содействия апоптозу (процесс запрограммированной гибели клеток) в антиген-специфичных Т-клетках лимфатических узлов и уменьшении апоптоза регуляторных Т-клеткок (Treg).
[0048] Ингибитор контрольной точки можно вводить уже известным способом. Так например, доза подбирается в зависимости от симптомов, возраста, массы тела и других условий. Дозу от 0,001 мг до 100 мг можно вводить с интервалом в несколько дней, несколько недель или несколько месяцев путем подкожной инъекции, внутримышечной инъекции или внутривенной инъекции.
[0049] Вектор аденовируса или ингибитор контрольной точки содержит носитель, разбавитель и эксципиент, которые традиционно используются при составлении лекарственных форм. Например, лактоза, стеарат магния и тому подобное используются в качестве носителей или эксципиентов в таблетках. Для инъекции используют водный раствор, как, например, физиологический или изотонический раствор, содержащий декстрозу или другой адъювант, который может использоваться в комбинации с соответствующим солюбилизирующим агентом (например, спиртом, полиспиртом, таким как пропилен гликоль, или неионным поверхностно-активным веществом). В качестве маслянистой жидкости используют кунжутное или соевое масло или сходные с ними. В качестве солюбилизирующего агента также могут быть использованы бензилбензоат, бензиловый спирт или сходные с ними.
[0050] Белок REIC/Dkk-3, кодируемый геном REIC/Dkk-3, может способствовать лечению или предотвращению рака путем активации противораковой иммунной системы. Более того, он вызывает апоптоз раковых клеток. В частности, белок REIC/Dkk-3 индуцирует CTL (цитотоксические Т-лимфоциты) и CTL атакуют раковые клетки системным образом. Раковые клетки, подвергшиеся атаке CTL, включают функцию защиты и экспрессируют PD-L1. Ингибитор контрольной точки ингибирует защитную функцию раковых клеток.
[0051] Сам по себе ген REIC/Dkk-3 усиливает системную активацию Т-клеток CD8. Кроме того, ген REIC/Dkk-3 сам по себе активирует PD-1 на опухоль-инфильтрирующих Т-клетках CD8 и, предположительно, PD-L1 в микроокружении инъекции. Это снижает интенсивность экспансии клеток CD8 и опухоль-специфичных Т-клеток. Более того, ген REIC/Dkk-3 сам по себе приводит к более высоким уровням истощения Т-клеток памяти CD4. Объединение гена REIC/Dkk-3 с анти-PD-1 или анти-PD-L1 усиливает системный ответ Т-клеток и противоопухолевые реакции. Эта комбинация также активировала макрофаги M2 в микроокружении введения опухоли, что может привести к снижению общей эффективности комбинации. Не было обнаружено никаких дифференциальных эффектов на регуляторные Т-клетки (Tregs).
[0052] Хотя ген REIC/Dkk-3 может индуцировать адаптивную резистентность, препятствующую эффективности терапии, комбинационная терапия с блокадой PD-1 может способствовать ингибированию опухолей при раке предстательной железы у мышей. Комбинированная терапия (ген REIC/Dkk-3 с ингибитором контрольной точки) может стимулировать клетки Spas-1+CD8 как в ипсилатеральных, так и в контралатеральных опухолях. Однако комбинационная терапия оказывала минимальное влияние на регуляторные Т-клетки (Treg). Несмотря на то, что комбинационная терапия способна преодолеть адаптивную резистентность, она может потенциально рекрутировать или увеличивать количество опухолевых инфильтрирующих миелоидных клеток.
[0053] Ген REIC/Dkk-3 и ингибитор контрольной точки обладают синергическим эффект при лечении рака. Анти-PD-1 и анти-PD-L1-антитела влияют на иммунную систему таким образом, что раковые клетки экспрессирует PD-1 и PD-L1 на клеточной поверхности, что делает их восприимчивыми к генам REIC/Dkk-3 (индуцированный REIC/Dkk-3 анти-опухолевый иммунитет; цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), индуцированные REIC/Dkk-3). Комбинированное применение гена REIC/Dkk-3 и ингибитора контрольной точки является более эффективным при лечении рака, чем использование гена REIC/Dkk-3 или ингибитора контрольной точки по отдельности.
[0054] Ген REIC/Dkk-3 можно вводить одновременно, отдельно или последовательно с введением ингибитора контрольной точки. Ген REIC/Dkk-3 также можно вводить до или после введения ингибитора контрольной точки. Предпочтительно, ген REIC/Dkk-3 вводят перед введением ингибитора контрольной точки. При введении ингибитора контрольной точки отдельно, ингибитор контрольной точки вводят от 1 до 24 часов, от 1 до 30 дней до или после введения гена REIC/Dkk-3. Более того, ингибитор контрольной точки можно вводить в том же интервале, что и ген REIC/Dkk-3. Ингибитор контрольной точки вводят один раз, тогда как ген REIC/Dkk-3 вводят несколько раз. Альтернативно, ген REIC/Dkk-3 вводят один раз, а ингибитор контрольной точки вводят несколько раз.
[0055] Примеры рака, подлежащего лечению, включают, но не ограничиваются ими: рак предстательной железы, опухоль головного мозга/нерва, рак кожи, рак желудка, рак легкого, рак печени, лимфома/лейкоз, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы, анальный/ректальный рак, рак пищевода, рак матки, рак молочной железы, рак почек, рак почечной лоханки и рак мочеточника, рак мочевого пузыря, рак уретры, рак полового члена, рак яичек, остеома/остеосаркома, лейомиома, рабдомиома и мезотелиома.
[0056] Настоящее изобретение также включает комбинацию, комбинированный препарат или комбинированный фармацевтический набор, содержащий ген REIC/Dkk-3 и ингибитор контрольной точки.
[0057] Настоящее изобретение также включает способ объединения REIC/Dkk-3 с ингибитором контрольной точки при изготовлении лекарственного средства для лечения рака.
[0058] Настоящее изобретение также включает фармацевтическую композицию, содержащую REIC/Dkk-3 и ингибитор контрольной точки.
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
[0059] В дальнейшем, некоторые варианты осуществления будут описаны более детально посредством примеров, при этом варианты осуществления не ограничены последующими примерами.
[0060] Эффективность комбинации MTG-201 и ингибитора контрольной точки (анти-PD-1, анти-PD-L1 и анти-CTLA-4 антитела) на модели трансгенной аденокарциномы предстательной железы мыши (TRAMP)
[0061] 1. Краткое изложение
Целью этого примера является оценка потенциальных иммунологических эффектов и эффективности применения MTG-201 (Ad5-SGE-REIC/Dkk-3) в сочетании с тремя ингибиторами контрольных точек; анти-PD-1 и анти-CTLA-4 антитела на модели трансгенной аденокарциномы мышиной простаты (TRAMP). В исследовании оценивали рост опухоли и общую выживаемость при применении противоопухолевой терапии MTG-201 самостоятельно и в сочетании с антителами к CTLA4 и PD-1.
10
[0062] После однократной внутриопухолевой инъекции MTG-201 при дозе 5×10в.ч. на мышь наблюдалось статистически значимое уменьшение объема опухоли в группе MTG-201+α-PD-1, по сравнению с другими группами лечения и контрольной группой (p<0,01) и довольно значительное уменьшение по сравнению с контролем ad-LacZ (p <0,001). Кроме того, общая выживаемость мышей, получавших MTG-201+α-PD-1, была значительно выше по сравнению с другими группами лечения и контрольной группой (p<0,01 - p<0,001).
[0063] 2. Введение
2.1. Цель исследования
Целью данного исследования является оценка потенциальных иммунологических эффектов и эффективности MTG-201 (Ad5-SGE-REIC/Dkk-3) в сочетании с тремя ингибиторами контрольных точек, анти-PD1, анти-PD-L1 и анти-CTLA-4 антителами на модели трансгенной аденокарциномы мышиной простаты (TRAMP)
[0064] 3. ФОРМУЛИРОВКА ДОЗЫ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ
3.1. Тестируемое изделие и средство доставки
Тестируемое изделие, средство доставки и меры контроля применялись следующим образом.
3.1.1. Тестируемое изделие
Название тестируемого изделия: MTG-201 (Ad5-SGE-REIC/Dkk3) - вирусный вектор, включающий человеческий трансген (ген Dikkopf-3), который производит белок REIC при заражении клеток-мишеней.
о
Хранение: в замороженном состоянии (от -60 до -90 С)
MTG-201 (Ad5-SGE-REIC/Dkk3) может быть изготовлен в соответствии с описаниями WO2011/062298, US2012-0309050, WO2012/161352 и US2014-0147917.
3.1.2. Средство доставки
Название средства доставки: Трис-буфер/NaCl/pH 8,0/2,5% Глицерин
Трис-буфер/NaCl/pH 8,0/2,5% Глицерин
3.1.3. Контроль
Контроль: Ad-LacZ (аденовирус, экспрессирующий β-галактозидазу)
Хранение: в замороженном состоянии (от -60 до -90°С)
[0065] 4. РЕЦЕПТУРА ТЕСТИРУЕМОГО ИЗДЕЛИЯ
4.1. Приготовление
Тестируемое изделие было поставлено замороженным. В день дозирования тестируемое изделие оттаивали и выдерживали на льду до 6 часов до дозирования.
[0066] 4.2. Концентрация
Концентрации препарата тестируемого изделия рассчитывали, исходя из количества вирусных частиц (в.ч.) на мл. Корректировка на чистоту не проводилась. Перед дозированием тестируемое изделие разбавляли холодным солевым раствором для достижения желаемых концентраций дозы (Таблица 1). Тестируемое изделие не подвергалось фильтрации. Свежие составы готовили для каждой концентрации перед использованием.
[0067] [Таблица 1]
Группы
Концентрация испытуемого изделия
Объем инъекции
Целевая доза
Конечная Концентрация
1, 5-7, 8-9, 12-13
1,01×10<sup>12</sup>вч/мл
50 мкл
5×10<sup>10</sup> вч
1×10<sup>12</sup>вч
[0068] 4.3. Хранение
После приготовления препарат хранился в холодильнике (от 2 до 8°C) или на ледяной бане.
[0069] 4.4. Стабильность
Было подтверждено, что тестируемое изделие было стабильным в течение времени дозирования. Тестируемое изделие использовалась в течение 4 часов после оттаивания.
[0070] 5. ТЕСТОВАЯ СИСТЕМА
5.1. Виды, линия и поставщик
Восемьдесят шесть (86) самцов мышей линии C57BL/6 получали из лабораторий Jackson Laboratories для использования в данном исследовании. Семьдесят восемь (78) мышей были использованы в исследовании.
[0071] 5.2. Спецификация
Мыши были в возрасте 8-9 недель по прибытии. Опухоль вводили инъекцией 8-10 недельным мышам. Мышей обрабатывали MTG в возрасте около 20 недель (в зависимости от кинетики роста опухоли).
[0072] Мыши весили от 20 до 30 г при замере в течение 3 дней после прибытия. Фактический диапазон варьировался, данные были задокументированы.
[0073] 5.3. Содержание
Мышей размещали по 5 штук на клетку. Температура и влажность поддерживались как стандартная комнатная температура и влажность. Люминесцентное освещение обеспечивалось с помощью автоматического таймера примерно по 12 часов в день. В некоторых случаях, темный цикл, возможно, прерывался прерывисто из-за связанных с исследованием процедур.
[0074] Водопроводная вода предоставлялась ad libitum всем животным с помощью автоматической системы водоснабжения, если не указано иначе. Основное питание представлено продуктом PicoLab (R) Mouse Diet 20, продукт 5058, каталог # 0007689, лабораторная диета (Сент-Луис, Миссури). Это питание было доступно ad libitum, если не указано иначе.
[0075] 5.4. Обоснование тестовой системы
5
Для исследования рака предстательной железы у мышей, сингенные трансплантируемые клеточные линии рака предстательной железы были разработаны на основе опухоли предстательной железы, возникающей у мышей из трансгенной аденокарциномы мышиной простаты (TRAMP) в результате экспрессии большого Т-антигена SV40 под специфичным промотором предстательной железы. Группа Фонга (Dr. Fong) использовала эту модель для тестирования иммунотерапии рака предстательной железы. Эти клеточные линии не экспрессируют большой Т-антиген SV40 in vitro или in vivo, что делает их пригодными для иммунотерапевтических исследований. Клетки TRAMP вводили подкожно билатерально (2 опухоли/мышь, каждый сайт опухоли содержал 5×10 опухолевых клеток) в спину самцов мышей дикого типа C57BL/6, который является сингенным хозяином для клеток TRAMP. Одну из опухолей затем обрабатывали либо Ad-LacZ, либо MTG-201. В определенных группах мышей также обрабатывали комбинацией MTG-201 с каждым из двух ингибиторов контрольных точек (анти-PD-1 антитело и анти CTLA-4 антитело мыши) в течение от 3 до 7 дней после обработки Ad-LacZ или MTG- 201. В исследовании оценивали рост опухоли и общую выживаемость при применении внутриопухолевой терапии MTG-201 самостоятельно и в сочетании с антителами к CTLA4 и PD-1. Для анти-CTLA-4 и анти-PD-1 дозировка составляет 200 мкг/мышь, внутрибрюшинно.
[0076] 6. Дизайн исследования
6.1. Ксенографическая модель
5
Группы выживаемости: клетки TRAMP-C2 (5 × 10) вводили подкожно (1 опухоль/мышь) в спины самцов мышей дикого типа C57BL/6, являющегося сингенным хозяином для клеток TRAMP.
5
[0077] Группы иммунного ответа: клетки TRAMP-C2 (5×10) вводили подкожно (2 опухоли/мышь) в спины самцов мышей дикого типа C57BL/6, являющегося сингенным хозяином для клеток TRAMP.
[0078] 6.2. Разбиение по группам
3
Объем каждой опухоли предстательной железы мог доходить до ~150 мм. Опухолевые мыши были случайным образом назначены в контрольные или лечебные группы (Таблица 2 и Таблица 3).
[0079] [Таблица 2]
Группа
Обработка
Количество Животных*
1
Ad-LacZ Контроль
8
2
MTG-201
8
3
Анти-CTLA-4
8
4
Ad-LacZ+анти-CTLA-4**
8
5
MTG-201+анти-CTLA-4**
8
6
MTG-201+анти-PD-1**
8
*см. Раздел 6.3.3 для расписания забоя
**ингибиторы контрольной точки (анти-PD-1 и анти-CTLA-4 мышиные антитела) будут введены в День 0 и День 7 после обработки Ad-LacZ или MTG-201.
[0080] Схема исследования групп выживаемости показана на Фиг.3.
[Таблица 3] Группы по назначению -Группы иммунного ответа
Группа
Обработка
Количество Животных
Всего
Забито на 15 день после обработки антителами
7
Ad-LacZ Контроль
5
5
8
MTG-201
5
5
9
анти-CTLA-4
5
5
10
Ad-LacZ+анти-CTLA-4*
5
5
11
MTG-201+анти-CTLA-4*
5
5
12
MTG-201+анти-PD-1*
5
5
*ингибиторы контрольной точки (анти-PD-1 и анти-CTLA-4 антитела мыши) были введены в День 0 и День 7 после обработки Ad-LacZ или MTG-201. Забой мышей проведен в День 15.
[0081] 6.3. Введение тестируемого изделия и средства доставки
6.3.1 Обоснование уровня дозы
10
12
Уровень дозы был выбран на основе имеющихся данных предыдущих исследований. Этот уровень дозы подтверждается тремя другими исследованиями токсичности GLP у крыс и собак. Одно исследование (1718-003) включало Ad-SGE-REIC/Dkk-3 с инъекцией в простату с той же дозой, что и в данном исследовании (5×10в.ч./животное). Другие два исследования (1718-001 и 1718-002) проводились на крысах в тех же дозах и на собаках в дозах 1,0×10в.ч. с аналогичным вирусным вектором, продуцирующим белок REIC (Ad-CAG-REIC/Dkk-3), в котором промоторная последовательность была другой.
[0082] 6.3.1. Обоснование способов введения
Инъекция в опухоль является одним из предполагаемых путей введения у людей.
[0083] 6.3.2. Введение
10
В День 0 одна из опухолей обрабатывалась либо Ad-LacZ, либо MTG-201 прямой инъекцией в опухоль в объеме 50 мкл. 5×10 бляшко-образующих единиц вектора аденовируса (Ad-LacZ и MTG-201), приведенных к объему 0,05 мл в буфере PBS, вводили инъекцией прямо в опухоль. Перед инъекцией животных анестезировали изофлураном.
[0084] В указанных группах (Таблица 2 и Таблица 3) мышей также обрабатывали анти-CTLA-4 антителом мыши и комбинацией MTG-201 с каждым из двух ингибиторов контрольной точки (анти-PD-1 и мыши анти-CTLA-4 антитела) через 0 и 7 дней после обработки Ad-LacZ или MTG-201.
[0085] 6.4. Оценка исследования
6.4.1 Внешнее наблюдение
Мышей обследовали 3 раза в неделю на предмет заболеваемости, смертности, наличия травм и достаточности пищи и воды. Всех животных в плохом состоянии идентифицировали для дальнейшего наблюдения и возможной эвтаназии.
[0086] 6.4.2. Оценка роста опухоли
Опухоли измеряли и описывали каждые 3-4 дня при помощи калипера, а объем опухоли рассчитывали по формуле V=0,52 (L*W*W), где V-объем, L-длина (более длинный диаметр), а W-ширина (диаметр покороче).
[0087] 6.5. Анализ данных
Индивидуальные данные с указанием времени сообщаются вместе с средними значениями группы + стандартная ошибка.
[0088] 7. СТАТИСТИКА
Исходные данные были сведены в таблицу в течение каждого временного интервала, а среднее и стандартное отклонение вычислялось для каждой конечной точки для каждой группы. Для каждой конечной точки, обработанную группу сравнивали с контрольной группой и каждой из других групп лечения с использованием анализа, описанного в Таблице 4.
[0089] При сравнении двух групп для статистического анализа использовался t-критерий Стьюдента, и разница считалась значительной при p <0,05. Для сравнения между группами использовался однонаправленный ANOVA-тест с post-hoc коррекцией Бонферрони.
[0090] [Таблица 4]
Статистические Сравнения
Контрольная Группа
Группы сравнения
Группы Выживания
1
2
3
4
5
6
7
2
1
3
4
5
6
7
3
1
2
4
5
6
7
4
1
2
3
5
6
7
5
1
2
3
4
6
7
6
1
2
3
4
5
7
7
1
2
3
4
5
6
Группы Иммунного Ответа
8
9
10
11
12
13
14
9
8
10
11
12
13
14
10
8
9
11
12
13
14
11
8
9
10
12
13
14
12
8
9
10
11
13
14
13
8
9
10
11
12
14
14
8
9
10
11
12
13
[0091] Конечные точки были следующими:
3
Эксперимент 1: рост опухоли и общая выживаемость. Мышей с опухолями, достигающими 300 мм, подвергали эвтаназии.
[0092] Оценка дисперсии (средняя квадратическая ошибка или MSE) внутри групп была рассчитана по одностороннему анализу дисперсии (ANOVA) с коррекцией Бонферрони. Проверка равенства средних значений двух выборок (данных обработок) проводился с использованием t-критерия Стьюдента.
[0093] Результаты всех парных сравнений соответствовали 0,05 и 0,01уровням значимости. Все конечные точки анализировали с использованием двухсторонних тестов, если не указано иначе.
[0094] 8. РЕЗУЛЬТАТЫ
8.1. Оценка роста опухоли
Была проведена оценка опухолевого роста после обработки внутриопухолевой инъекцией MTG-201 отдельно и в сочетании с антителами к CTLA4 и PD-1. На Фиг. 4 показаны результаты. На Фиг. 4 светлым квадратом () показаны предварительные данные анти-PD-1 (α-PD1) которые были получены той же лабораторией с использованием той же самой мышиной модели. Как видно из Фиг. 4, статистически значимое уменьшением объема опухоли наблюдалось в группе MTG-201+α-PD-1 по сравнению с другими группами и контрольной группой (p <0,01), а также весьма значительным уменьшением по сравнению с ad-LacZ (p <0,001). Кроме того, наблюдалось значительное уменьшение объема опухоли, наблюдаемое в группе MTG-201+α-PD-1, по сравнению с группой обработанной только α-PD-1. Эти результаты показывают, что MTG-201+анти-PD-1 ингибирует рост опухоли.
[0095] 8.2. Общая выживаемость
Была проведена оценка общей выживаемости после обработки внутриопухолевой инъекцией MTG-201 отдельно и в сочетании с антителами к CTLA4 и PD-1.Как видно из Фиг. 5, общая выживаемость мышей в группе MTG-201+α-PD-1 была значительно выше по сравнению с другими группами и контрольной группой (p <0,01- p <0,001). Эти результаты показывают, что MTG-201+anti-PD-1 обеспечивает преимущества для выживания.
[0096] 9. Заключение
В исследовании проводили оценку роста опухоли и общей выживаемости при введении внутриопухолевой обработке MTG-201 отдельно и в комбинации с антителами к CTLA4 и PD-1.
10
[0097] После однократной внутриопухолевой инъекции MTG-201 дозы 5×10 вч на мышь в группе MTG-201+α-PD-1 наблюдалось статистически значимое уменьшение объема опухоли по сравнению с другими группами и контрольной группой (p <0,01) и очень значительное уменьшение по сравнению с контролем ad-LacZ (p <0,001). Кроме того, общая выживаемость мышей, обработанных MTG-201+α-PD-1, была значительно выше по сравнению с другими группами лечения и контрольной группой (p <0,01 - p <0,001).
[0098] Все публикации, патенты и заявки на патент, приведенные здесь, включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте.
--->
СПИСКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Момотаро-Ген Инкорпорэйтед.
<120> Комбинированная терапия с использованием гена REIC/Dkk-3 и
ингибитора контрольной точки (иммунного ответа).
<130>  PH-6456-PCT
<150>  US62/276,371
<151>  2016-01-08
<160>  9
<170>  PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1053
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1053)
<400> 1
atg cag cgg ctt ggg gcc acc ctg ctg tgc ctg cta ctg gcg gcg gcg   48
Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala
1               5                  10                  15
gtc ccc acg gcc ccc gcg ccc gct ccg acg gcg acc tcg gct cca gtc   96
Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Val
20                  25                  30
aag ccc ggc ccg gct ctc agc tac ccg cag gag gag gcc acc ctc aat   144
Lys Pro Gly Pro Ala Leu Ser Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn
35                  40                  45
gag atg ttc cgc gag gtt gag gaa ctg gtg gag gac acg cag cac aaa   192
Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Val Glu Asp Thr Gln His Lys
50                  55                  60
ttg cgc agc gcg gtg gaa gag atg gag gca gaa gaa gct gct gct aaa   240
Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys
65                  70                  75                  80
gca tca tca gaa gtg aac ctg gca aac tta cct ccc agc tat cac aat   288
Ala Ser Ser Glu Val Asn Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Tyr His Asn
85                  90                  95
gag acc aac aca gac acg aag gtt gga aat aat acc atc cat gtg cac   336
Glu Thr Asn Thr Asp Thr Lys Val Gly Asn Asn Thr Ile His Val His
100                 105                 110
cga gaa att cac aag ata acc aac aac cag gct cga caa atg gtc ttt   384
Arg Glu Ile His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Ala Arg Gln Met Val Phe
115                 120                 125
tca gag aca gtt atc aca tct gtg gga gac gaa gaa ggc aga agg agc   432
Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Arg Arg Ser
130                 135                 140
cac gag tgc atc atc gac gag gac tgt ggg ccc agc atg tac tgc cag   480
His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys Gln
145                 150                 155                 160
ttt gcc agc ttc cag tac acc tgc cag cca tgc cgg ggc cag agg atg   528
Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg Met
165                 170                 175
ctc tgc acc cgg gac agt gag tgc tgt gga gac cag ctg tgt gtc tgg   576
Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val Trp
180                 185                 190
ggt cac tgc acc aaa atg gcc acc agg ggc agc aat ggg acc atc tgt   624
Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile Cys
195                 200                 205
gac aac cag agg gac tgc cag ccg ggg ctg tgc tgt gcc ttc cag aga   672
Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg
210                 215                 220
ggc ctg ctg ttc cct gtg tgc ata ccc ctg ccc gtg gag ggc gag ctt   720
Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Ile Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu Leu
225                 230                 235                 240
tgc cat gac ccc gcc agc cgg ctt ctg gac ctc atc acc tgg gag cta   768
Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu Leu
245                 250                 255
gag cct gat gga gcc ttg gac cga tgc cct tgt gcc agt ggc ctc ctc   816
Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu Leu
260                 265                 270
tgc cag ccc cac agc cac agc ctg gtg tat gtg tgc aag ccg acc ttc   864
Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr Phe
275                 280                 285
gtg ggg agc cgt gac caa gat ggg gag atc ctg ctg ccc aga gag gtc   912
Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val
290                 295                 300
ccc gat gag tat gaa gtt ggc agc ttc atg gag gag gtg cgc cag gag   960
Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln Glu
305                 310                 315                 320
ctg gag gac ctg gag agg agc ctg act gaa gag atg gcg ctg ggg gag   1008
Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Gly Glu
325                 330                 335
cct gcg gct gcc gcc gct gca ctg ctg gga ggg gaa gag att tag       1053
Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile
340                 345                 350
<210> 2
<211> 350
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala
1               5                  10                  15
Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Val
20                  25                  30
Lys Pro Gly Pro Ala Leu Ser Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn
35                  40                  45
Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Val Glu Asp Thr Gln His Lys
50                  55                  60
Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys
65                  70                  75                  80
Ala Ser Ser Glu Val Asn Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Tyr His Asn
85                  90                  95
Glu Thr Asn Thr Asp Thr Lys Val Gly Asn Asn Thr Ile His Val His
100                 105                 110
Arg Glu Ile His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Ala Arg Gln Met Val Phe
115                 120                 125
Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Arg Arg Ser
130                 135                 140
His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys Gln
145                 150                 155                 160
Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg Met
165                 170                 175
Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val Trp
180                 185                 190
Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile Cys
195                 200                 205
Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg
210                 215                 220
Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Ile Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu Leu
225                 230                 235                 240
Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu Leu
245                 250                 255
Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu Leu
260                 265                 270
Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr Phe
275                 280                 285
Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val
290                 295                 300
Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln Glu
305                 310                 315                 320
Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Gly Glu
325                 330                 335
Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile
340                 345                 350
<210> 3
<211> 117
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 3
atgcagcggc ttggggccac cctgctgtgc ctgctactgg cggcggcggt ccccacggcc       60
cccgcgcccg ctccgacggc gacctcggct ccagtcaagc ccggcccggc tctcagc         117
<210> 4
<211> 234
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 4
atgcagcggc ttggggccac cctgctgtgc ctgctactgg cggcggcggt ccccacggcc       60
cccgcgcccg ctccgacggc gacctcggct ccagtcaagc ccggcccggc tctcagctac      120
ccgcaggagg aggccaccct caatgagatg ttccgcgagg ttgaggaact ggtggaggac      180
acgcagcaca aattgcgcag cgcggtggaa gagatggagg cagaagaagc tgct            234
<210>  5
<211>  262
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтезированная
<400>  5
tgactgactg acgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca       60
tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc      120
ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg      180
gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct      240
ggggatgcgg tgggctctat gg                                               262
<210>  6
<211>  2355
<212>  ДНК
<213>  Искуственная
<220>
<223>  Синтезированная
<400>  6
tctagagcac catgcagcgg cttggggcca ccctgctgtg cctgctgctg gcggcggcgg       60
tccccacggc ccccgcgccc gctccgacgg cgacctcggc tccagtcaag cccggcccgg      120
ctctcagcta cccgcaggag gaggccaccc tcaatgagat gttccgcgag gttgaggaac      180
tgatggagga cacgcagcac aaattgcgca gcgcggtgga agagatggag gcagaagaag      240
ctgctgctaa agcatcatca gaagtgaacc tggcaaactt acctcccagc tatcacaatg      300
agaccaacac agacacgaag gttggaaata ataccatcca tgtgcaccga gaaattcaca      360
agataaccaa caaccagact ggacaaatgg tcttttcaga gacagttatc acatctgtgg      420
gagacgaaga aggcagaagg agccacgagt gcatcatcga cgaggactgt gggcccagca      480
tgtactgcca gtttgccagc ttccagtaca cctgccagcc atgccggggc cagaggatgc      540
tctgcacccg ggacagtgag tgctgtggag accagctgtg tgtctggggt cactgcacca      600
aaatggccac caggggcagc aatgggacca tctgtgacaa ccagagggac tgccagccgg      660
ggctgtgctg tgccttccag agaggcctgc tgttccctgt gtgcacaccc ctgcccgtgg      720
agggcgagct ttgccatgac cccgccagcc ggcttctgga cctcatcacc tgggagctag      780
agcctgatgg agccttggac cgatgccctt gtgccagtgg cctcctctgc cagccccaca      840
gccacagcct ggtgtatgtg tgcaagccga ccttcgtggg gagccgtgac caagatgggg      900
agatcctgct gcccagagag gtccccgatg agtatgaagt tggcagcttc atggaggagg      960
tgcgccagga gctggaggac ctggagagga gcctgactga agagatggcg ctgggggagc     1020
ctgcggctgc cgccgctgca ctgctgggag gggaagagat ttagggggta ccccggctag     1080
atgactaacg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct     1140
gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt     1200
tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg     1260
ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg     1320
gatgcggtgg gctctatggc ggagtactgt cctccgcttc ccacgtggcg gagggactgg     1380
ggacccgggc acccgtcctg ccccttcacc ttccagctcc gcctcctccg cgcggacccc     1440
gccccgtccc gacccctccc gggtccccgg cccagccccc tccgggccct cccagcccct     1500
ccccttcctt tccgcggccc cgccctctcc tcgcggcgcg agttttggaa agtccccagg     1560
ctccccagca ggcagaagta tccaaagcat ccatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg     1620
aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatccaaagc atccatctca attagtcagc     1680
aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca     1740
ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctctgc     1800
ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggccaaggct tttgcaaaaa     1860
gctccgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc     1920
cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac     1980
gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata     2040
tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc     2100
agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta     2160
ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac     2220
ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc     2280
aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc     2340
gtgttgccgg aattc                                                      2355
<210>  7
<211>  1285
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Синтезированная
<400>  7
gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc       60
ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa      120
aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg      180
gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg      240
ggctctatgg cggagtactg tcctccgctt cccacgtggc ggagggactg gtcctccgct      300
tcccacgtgg cggagggact ggggacccgg gcacccgtcc tgccccttca ccttccagct      360
ccgcctcctc cgcgcggacc ccgccccgtc ccgacccctc ccgggtcccc ggcccagccc      420
cctccgggcc ctcccagccc ctccccttcc tttccgcggc cccgccctct cctcgcggcg      480
cgagttttgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatccaaagc atccatctca      540
attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatccaaa      600
gcatccatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc      660
taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg      720
cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg      780
gaggccaagg cttttgcaaa aagctccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc      840
tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg      900
ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg      960
gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa     1020
tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac     1080
atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg     1140
cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg     1200
agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca     1260
ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtg                                           1285
<210>  8
<211>  21
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Праймер
<400>  8
atgagacata ttatctgcca c                                                 21
<210>  9
<211>  22
<212>  ДНК
<213>  Искусственная
<220>
<223>  Праймер
<400>  9
gtaagtcaat cccttcctgc ac                                                22
<---