СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЁЗА
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления возбудителя туберкулеза в микробиологических культурах.
Известен микробиологический способ диагностики туберкулеза, при котором проводятся микроскопические исследования мазков мокроты и другого клинического материала больных с предварительным окрашиванием по Цилю-Нильсену на наличие кислотоустойчивых микобактерий и с последующим культуральным исследованием материала.
Бактериоскопическая идентификация недостаточно чувствительна, чревата ошибками и зависит от квалификации персонала (при использовании теста в лабораториях развивающихся стран выявляется только 20-40% больных туберкулезом, в развитых странах ~ 40-60%) [Kent, В.D., and G.P. Kubica. 1985. Public health mycobacteriology: a guide for the level III laboratory, 207 p. U. S. Department of Health and Human Services. Centers for Disease Control, Atlanta].
Известен также способ, основанный на биохимическом тестировании выращенных на питательных плотной и жидкой среде Миддлбрук 7Н9 микроорганизмов, с целью быстрой идентификации вида обнаруженных микобактерий.
Этот способ требует значительного времени (4-6 недель от момента сбора материала) из-за медленного роста микобактерий.
Более совершенный способ диагностики туберкулеза основан на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР).
-15
Это высокоспецифичный и чрезвычайно чувствительный тест, с помощью которого возможно идентифицировать в анализируемой пробе наличие даже одной-единственной молекулы ДНК возбудителя (чувствительность составляет порядка 10 М) [Reischl U., Naumann L./ [Molecular biology methods in detection of mycobacteria. Improved and newly developed test systems for the diagnosis of mycobacteria] / Fortschr. Med. - 1996. - Vol. 114. - P. 237-241].
Недостатком этого способа являются его относительно высокая сложность и относительно низкая экономичность, поскольку при его проведении используется дорогое инструментальное и приборное обеспечение. Кроме того, из-за сверхвысокой чувствительности этот тест требует необычайной чистоты и очень зависим от уровня квалификации персонала и соблюдения особых требований к лабораторным помещениям, в которых проводится анализ. Минимальное загрязнение анализируемых образцов, инструментария и воздуха в помещении нуклеиновой кислотой микобактерий может дать ложноположительный результат.
Кроме указанных выше, известен способ, основанный на использовании иммунохроматографических тестов для выявления микобактериального белка МРТ64 в микробиологических культурах, полученных на жидкой питательной среде Миддлбрук 7Н9 в автоматизированной системе учета роста микобактерий ВАСТЕС MGIT320-960.
Известно, что, МРТ64 присутствует только в микобактериях M.tuberculosis complex, которые вызывают туберкулез. Поэтому тесты позволяют быстро идентифицировать рост микобактерий M.tuberculosis complex в жидкой среде при посеве материала от больных туберкулезом. Наиболее известны из них Capilia TBNeoassay (TAUNS, Izunokuni, Япония) [Chikamatsu et al., 2014], SD BIOLINE TBAg (Standard Diagnostics Inc., Корея), MPT64 Rapid [Fabre M. et al., 2011] и TBc ID (Becton Dickinson and Company, США).
Исследование специфичности выявления микобактерий M.tuberculosis complex в этих тестах было проведено Chikamatsu с коллегами в 2014 году на 96-ти референсных штаммах. Тесты дают минимум перекрестных реакций, подтверждая высокую специфичность диагностики по антигену МРТ64.
Недостатком способа является относительно низкая чувствительность способа и как результат этого относительно низкая диагностическая точность.
Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, включающий иммуноанализ с использованием антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка МРВ64, в котором указанное антитело включает антитело против эпитопа МРВ64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4 [RU 2473095 C2, G01N 33/569, G01N 33/533, G01N 33/543, 20.01.2013].
К особенностям известного способа относится то, что указанное антитело представляет собой моноклональное антитело. Способ включает сэндвич-иммуноанализ с использованием первого и второго антител против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка МРВ64, в котором, по меньшей мере, одно из первого и второго антител включает антитело против эпитопа МРВ64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4. По меньшей мере, одно из указанных антител, первое или второе, представляет собой моноклональное антитело, а любое, первое или второе, антитело иммобилизовано на носителе. В этом способе биологический образец подвергают указанному иммуноанализу без культивирования или после культивирования в течение времени перед тем, как бактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis в образце проявляют значительный рост. Биологический образец подвергают обработке для инактивации Mycobacterium tuberculosis или предварительной обработке диспергированием или солюбилизацией перед тем, как подвергать иммуноанализу. Обработку солюбилизацией или диспергированием проводят посредством операции перемешивания или посредством добавления к биологическому образцу по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из щелочного вещества, восстанавливающего вещества, протеазы и поверхностно-активного вещества. Указанный биологический образец представляет собой мокроту.
В известном способе иммунохроматографический анализ детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis включает наличие мембранного носителя, обладающего зоной связывания, сформированной в его заранее определенном положении посредством иммобилизации первого антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка МРВ64, хроматографическое проявление смешанного раствора, содержащего второе антитело против МРВ64 и заранее определенное количество тестируемого образца на мембранном носителе в зоне связывания, в результате чего комплекс антигена, содержащегося в тестируемом образце, и второго антитела связываются в зоне связывания, где, по меньшей мере, одно из первого и второго антител включает антитело против эпитопа МРВ64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4.
При иммунохроматографическом анализе, по меньшей мере, одно из указанных антител, первое или второе, представляет собой моноклональное антитело, тестируемый образец содержит биологический образец, который не культивировали или культивировали в течение времени перед тем, как бактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis проявляют значительный рост, биологический образец подвергают предварительной обработке посредством обработки для инактивации Mycobacterium tuberculosis или обработки диспергированием или солюбилизацией, диспергирование или солюбилизацию биологического образца проводят посредством операции перемешивания или посредством добавления к биологическому образцу по меньшей мере одного, выбранного из группы, состоящей из щелочного вещества, восстанавливающего вещества, протеазы и поверхностно-активного вещества, биологический образец представляет собой мокроту, второе антитело является меченным коллоидными частицами металлов или частицами латекса, мембранный носитель представляет собой нитроцеллюлозную мембрану.
Иммунохроматографическая тест-полоска для детекции комплекса Mycobacterium tuberculosis, которая, по меньшей мере, содержит первое и второе антитела против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка МРВ64 и мембранный носитель, где первое антитело предварительно иммобилизовано в заранее определенном положении на мембранном носителе так, чтобы сформировать зону связывания, второе антитело мечено подходящим средством для мечения и подготовлено в положении, удаленном от зоны связывания, для хроматографического проявления на мембранном носителе, где, по меньшей мере, одно из первого и второго антител включает антитело против эпитопа МРВ64, локализованного в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4. В иммунохроматографической тест-полоске, по меньшей мере, одно из первого и второго антител представляет собой моноклональное антитело, второе антитело мечено коллоидными частицами металлов или частицами латекса, мембранный носитель представляет собой нитроцеллюлозную мембрану.
Моноклональное антитело, распознающее эпитоп МРВ64, локализовано в любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2-4.
Недостатком способа является относительно низкая чувствительность способа и как результат этого относительно низкая диагностическая точность.
Задача, которая решается в изобретении, заключается в повышении чувствительности способа и как результат этого диагностической точности исследования.
Требуемый технический результат заключается в повышении чувствительности и диагностической точности способа.
Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что в способе, включающему сэндвич-иммуноанализ с использованием первого и второго антител против специфического для комплекса Mycobacterium tuberculosis секреторного белка MPB64(24kDa), согласно изобретению используют два моноклональных антитела, направленные против двух разных антигенных детерминант микобактериального белка MPT64(24kDa), обладающие специфичностью и высокой аффинностью по отношению к исследуемому антигену и имеющие различную изотипическую принадлежность, при этом одно моноклональное антитело фиксируют на твердой фазе, после отмывки неадсорбировавшихся антител добавляют исследуемый материал и инкубируют, а при образовании комплекса антиген MPT64(24kDa) - моноклональное антитело после очередной отмывки добавляют другое моноклональное антитело и связывают с этим комплексом, после чего распознают его меченными пероксидазой изотип-специфическими антителами для детектирования комплекса в количественной манере на основе стандартов с известной концентрацией белка МРТ64(24kDa).
На графических материалах представлены:
в таблице 1 - противотуберкулезные МАТ против МРТ64, их изотип и специфичность по отношению к микобактериальным и бактериальным ультразвуковым дезинтегратам (УЗД) и исходному иммуногену;
на фиг. 1 - иммуноблоттинг анти-МРТ64 МАТ с культуральным фильтратом M.tuberculosis H37Rv;
на фиг. 2 - двусайтовый ИФА с MAT 2Н3С6 и 1Н10 с рекомбинантным белком МРТ64;
на фиг. 3 - двусайтовый ИФА с МАТ против МРТ64 с цельными живыми клетками M.tuberculosis H37Rv, измерения в колониеобразующих единицах (КОЕ);
на фиг. 4 - двусайтовый ИФА с МАТ против МРТ64 с антигенами различных микобактерий;
в таблице 2 - определение МРТ64 в культурах с ВАСТЕС MGIT960;
в таблице 3 - статистические данные обработки результатов наличия МРТ64 в 546 микробиологических образцах, выделенных при культивировании диагностического материала от больных туберкулезом и другими заболеваниями.
Реализуется предложенный способ диагностики микобактерий туберкулеза следующим образом.
Способ основан на стандартном двусайтовом методе твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), который позволяет регистрировать комплекс антитело-антиген-антитело, зафиксированный на твердой фазе, с помощью изотип-специфических «вторых» антител с ковалентно связанной ферментной меткой. Взаимодействие фермента с субстратом цветной реакции позволяет в зависимости от величины регистрируемого комплекса получить большую или меньшую засветку реакции, которая считывается спектрофотометрически. Основными компонентами теста являются два моноклональных антитела, направленные против двух разных антигенных детерминант микобактериального белка МРТ64 (24kDa), обладающие специфичностью и высокой аффинностью по отношению к исследуемому антигену и имеющие различную изотипическую принадлежность. Одни из этих моноклональных антител фиксируется на твердой фазе (лунка планшета для ИФА). После отмывки неадсорбировавшихся антител добавляется исследуемый материал и инкубируется. Если образуется комплекс антиген МРТ64 - моноклональные антитела, то после очередной отмывки добавленные «вторые» моноклональные антитела связываются с этим комплексом, образуя 3-этажную структуру типа «сэндвич». Эти вторые моноклональные антитела распознаются меченными пероксидазой изотип-специфическими антителами, что позволяет детектировать комплекс в количественной манере, при наличии стандартов с известной концентрацией белка МРТ64.
Пример реализации способа.
При проведении двусайтового ИФА для определения МРТ64 использовали моноклональные антитела 2Н3С6 и 1Н10. Специфичность реакции этих МАТ в ИФА и распознаваемый ими антиген приведены в таблице 1 и на фиг. 1. МАТ реагируют только с антигенами микобактерий M.tuberculosis и распознают эпитоп на микобактериальном антигене массой 24кДа.
Прежде всего, для проведения ИФА иммуноглобулины MAT 2Н3С6 и 1Н10 были очищены из культуральной среды методом иммуноаффинной хроматографии на сорбенте, содержащем белок L, отдиализованы против забуференного фосфатами физраствора (PBS) и спектрофотометрически определена концентрация глобулинов.
Далее иммуноглобулины 1Н10 адсорбировали на дно лунок 96-луночных планшетов для ИФА в PBS в концентрации 1 мкг/мл. После инкубации в течение 18 часов при 4°C планшеты трехкратно отмывали PBS с 0,1% Tween 20 (PBS-Tw) и «блокировали» 1% BSA в PBS-Tw. После получасовой инкубации планшеты отмывали PBS-Tw и вносили исследуемые образцы культуральной жидкости, полученной при культивировании клинического материала в ВАСТЕС MGIT960; препараты цельных клеток, ультразвукового дезинтеграта (УЗД), культурального фильтрата M.tuberculosis H37Rv; и микобактерий других видов и/или в качестве калибраторов - рекомбинантный белок МРТ64 в разных концентрациях. После 30-минутной инкубации планшеты трижды отмывали PBS-Tw и добавляли «вторые» MAT 2Н3С6 в концентрации 1 мкг/мл в 1% BSA в PBS-Tw. После получасовой инкубации и отмывки несвязавшегося материала в лунки планшета вносили изотипический иммунопероксидазный антимышиный конъюгат против IgG1 мыши («вторые» MAT 2Н3С6 - IgG1 изотипа). После 30 мин инкубации и пятикратной отмывки PBS-Tw цветную реакцию в течение 15 минут проявляли с помощью 0,05 мМ ТМБ (3,3′,5,5′-тетраметилбензидин) в качестве хромогена в 0,1 М цитратном буфере pH 5,3 в присутствии пербората натрия. Реакцию останавливали 10% серной кислотой и считывали на автоматическом спектрофотометре с вертикальным лучом для определения оптической плотности реакции в ИФА-планшетах ELx800 (Biolline, США).
-15
-15
На фиг. 2 представлена кривая определения рекомбинантного белка МРТ64. Как видно из рисунка, минимальная чувствительность метода лежит в области ниже чем 10 М. Физическая чувствительность метода составляет 10 М, что сопоставимо с проведением ПНР-анализа для выявления ДНК возбудителя.
Высокая физическая чувствительность метода достигается путем использования «пары» моноклональных антител, реагирующих с двумя различными антигенными детерминантами на поверхности белка МРТ64, что позволяет выявлять комплекс с аффинностью, превышающей аффинность каждого из используемых моноклональных антител, тем самым многократно повышая физическую чувствительность метода.
Аналогичная кривая, полученная в ИФА на цельных клетках M.tuberculosis H37Rv, позволяет говорить о чувствительности метода для определения цельных клеток микобактерий в пределах нескольких клеток на мкл (фиг. 3).
На фиг. 4 приведены кривые титрования, полученные для антигенов туберкулезных микобактерий и нетуберкулезных микобактерий. Из рисунка видно, что МРТ64 определяется только в растворимых микобактериальных антигенах микобактерий M.tuberculosis.
Для изучения диагностической специфичности и чувствительности в тесте были исследованы образцы ВАСТЕС MGIT960, выращенные из мокроты больных туберкулезом и неспецифическими заболеваниями легких.
В таблице 2 приведены данные по исследованию микробиологических культур с официально подтвержденным ростом: туберкулезных микобактерий «+» - образцы, НТМБ - образцы с ростом нетуберкулезных микобактерий и «-» - образцы с ростом бактерий немикобактериальной природы.
Результаты статистической обработки данных приведены в таблице 3.
Как видно из приведенных статистических выкладок, диагностическая специфичность описываемого метода составляет 100%, а диагностическая чувствительность - 98,5%, при эффективности диагностики 99,06%. Эти значения указывают на уникальность белка МРТ64 и специфичность моноклональных антител против МРТ64, используемых в тесте. А также подтверждает достижение требуемого технического результата - повышение чувствительности и точности диагностики.