N-КАРБ(ГЛУТАМИНИЛ)ОКСИМЕТИЛИМИДАЗО[4,5-Е]БЕНЗО[1,2-С;3,4-С']ДИФУРОКСАН, ИНГИБИРУЮЩИЙ АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ
THROMBOCYTE AGGREGATION-INHIBITING N-CARB(GLUTAMINYL)OXYMETHYLIMIDAZO[4,5-E]BENZO[1,2-C;3,4-C']DIFUROXANE

Изобретение относится к фармации, в частности к синтезу фармакологически активных соединений.
В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания стабильно занимают первое место среди причин смерти и утраты трудоспособности. Основное значение в этой группе заболеваний имеют артериальная недостаточность сердца и мозга, причиной которых является тромбоз сосудов.
В ряде случаев к тромбозу сосудов приводит чрезмерная активация процесса агрегации тромбоцитов. В результате этого уменьшается приток крови к тканям, развивается ишемия тканей. Следствием ишемии является гибель клеток - некроз. Тромбозы могут быть причиной таких тяжелых осложнений, как инфаркт миокарда (тромбоз коронарных артерий), ишемический инсульт (тромбоз сосудов мозга). Венозные тромбозы могут быть причиной эмболии легочной артерии.
Учитывая распространенность и прогрессирующее увеличение патологий системы кровообращения в мире, а также сравнительно высокий процент смертности больных, разработка новых классов лекарственных препаратов с антиагрегационной активностью является актуальной.
К антиагрегантам относятся препараты различного механизма действия, принадлежащие к разным группам химических соединений.
Известно, что в результате взаимодействия оксида азота (NО) с тромбоцитами и лейкоцитами снижается их агрегация и адгезия на стенках кровеносных сосудов, что приводит к ингибированию процессов тромбообразования. Нарушения, связанные с нормальным протеканием вышеуказанных реакций, лежат в основе патофизиологических процессов, характерных для развития различных заболеваний сердечно-сосудистой системы. При таких заболеваниях наблюдаются множественные нарушения синтеза эндогенного NO, его рецепции растворимой формой гуанилатциклазы (рГЦ), а также регуляции уровня циклических нуклеотидов и ионов кальция [Dessy С., Ferron О. Pathophysiological Roles of Nitric Oxide: In the Heart and the Coronary Vasculature. Current Medical Chemistry - Anti-Inflammatory & Anti-Allergy Agents in Medicinal Chemistry. 2004. Vol.3. P.207-216].
К настоящему времени доказано образование оксида азота в результате биотрансформации нитроглицерина и других нитратов, которые используются для лечения сердечно-сосудистых заболеваний в качестве антиишемических и антиангинальных препаратов. Однако их существенным недостатком является возникновение толерантности и других побочных эффектов при длительном применении [Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарственных средств: монография. - М.: Вузовская книга, 2004, 360 с.].
В связи с этим проводится поиск новых соединений, способных образовывать NO в живом организме неэнзиматическим путем. Данный подход рассматривается как актуальное и перспективное направление создания новых, более эффективных в сравнении с известными ранее антигипертензивных и антиагрегантных фармпрепаратов, обладающих антиангинальной и антиишемической активностью.
Один из классов химических соединений, производные которого являются донорами оксида азота - фуроксаны. Фуроксаны рассматриваются как пролекарства, реализующие свою биологическую активность через рГЦ-цГМФ-путь [Граник В.Г., Григорьев Н.Б. Оксид азота (NO). Новый путь к поиску лекарственных средств: монография. - М.: Вузовская книга, 2004, 360 с.; Граник В.Г., Каминка М.Э., Григорьев М.Б., Северина И.С., Калинкина М.А., Макаров В.А., Левина В.И. Фуроксанопиримидины как экзогенные доноры оксида азота // Хим. Фарм. журнал. 2002, том 36, №10, стр.7-11].
В патенте US №2012/021007 2012 г. был проведен скрининг фуроксанов, однако их антиагрегационная активность не исследовалась.
В патентах RU 2123046 1998 г. и RU 2139932 1998 г. описаны фуроксаны как доноры оксида азота и активаторы рГЦ, но данные по их антиагрегационной активности не представлены.
В патенте US №7838023 2010 г. упоминается, что биологически активные производные фуроксана обладают антиагрегационной активностью, однако никаких данных по исследованиям не приведено.
Задачей настоящего изобретения является создание новых эффективных ингибиторов агрегации тромбоцитов.
Поставленная задача решается N-карб(глутаминил)оксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксаном, ингибирующим агрегацию тромбоцитов.
Синтез целевого соединения
Синтез N-карб(глутаминил)оксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксана был выполнен на твердой фазе в условиях автоматического пептидного синтезатора ABI 433А PeptideSynthesizer (AppliedBiosystems, США), используя FastMoc 0.25-стратегию. Стратегия FastMoc 0.25 подразумевает последовательное присоединение остатков аминокислот к нерастворимой полимерной подложке. Базовая лабильная группа Fmoc - 9-флуоренилметоксикарбонил используется для зашиты N-групп каждого аминокислотного остатка. Остатки, которые имеют потенциально реактивные боковые цепи, защищены кислотонеустойчивыми группами.
После удаления группы Fmoc пиперидином следующая защищенная аминокислота добавляется, используя или реактив сцепления, или предварительно активированное производное аминокислоты.
В качестве активатора первой аминокислоты в Fmoc-стратегии в реакции присоединения ее к смоле выступает дициклогексилкарбодиимид (DCC). Реакция протекает в присутствии 4-диметиламинопиридина (DCC/DMAP), который играет роль катализатора процесса.
В качестве активатора второй и последующих аминокислот в Fmoc-стратегии выступает 1-гидроксибензотриазол в дициклогексилкарбодиимиде
(HOBt/DCC). Реакция протекает с образованием активированной аминокислоты и N,N -дициклогексилмочевины (DCU).
Все вышеперечисленные операции протекают в пептидном синтезаторе. Для снятия пептида со смолы в вытяжном шкафу в полипропиленовой пробирке готовили смесь со следующим соотношением компонентов: TAN - 2.5%, TIPS - 2.5%, EDT - 5%, TFA - 90%. Приготовленную смесь помещали на лед до остывания на 20-30 мин. Затем в холодную смесь для снятия пептида помещали пептид-смолу и перемешивали. Помещали пробирку с пептид-смолой в полипропиленовую пробирку, закрывали и выдерживали на качалке в течение 4 часов.
Экстракция пептида со смолы проводилась на стеклянном фильтре-воронке в вытяжном шкафу. Воронка предварительно ополаскивалась дважды МТВЕ (метил-трет-бутиловый эфир). По окончанию снятия сливали смесь со смолой и пептидом на фильтр Шотта. Промывали пробирку, в которой шла реакция TFA, смыв сливали на фильтр. Фильтровали при небольшом вакууме до осушения смолы. Добавляли холодный МТВЕ, тщательно промывали смолу и фильтровали до осушения. Промывали пробирку, в которой находилась пептид-смола, трижды холодным МТВЕ и добавляли смыв к основному сливу. Тщательно перемешивали взвесь, оставляли не менее чем на 1 час при -20°С. Осадок отфильтровывали, сушили.
Очистку пептида осуществляли с помощью высокоэффективного препаративного жидкостного хроматографа PuriFlash 450 (InterCMm).
Условия ВЭЖХ: картридж Interchim PF-C18(20g), 15 мкм. Могут использоваться другие обращенные картриджи С18 или С8.
a. Детекторная ячейка: препаративная
b. Скорость потока - 20.0 мл/мин
c. Длина волны: диапазон 200-400 нм
d. Диапазон детектирования: 2 AUFS
e. Величина петли: 2 мл (объем инжекции 1.5-1.8 мл образца)
f. Элюент А: 5.0% ацетонитрила, 0.1% трифторуксусной кислоты в воде
g. Элюент В: 0.1% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле
h. Градиент: 10-90% В в течение 12 мин.
1
1
6
н
Строение синтезированного соединения подтверждено методами ЯМР Н и хромато-масс-спектроскопии. Спектры ЯМР Н регистрировали на приборе Bruker Avance 600 mhz; химические сдвиги измеряли относительно сигнала растворителя (ДМСО-d, δ 2.5 м.д.).
Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на приборе Waters MSD SQD - ESI с УФ- и масс-спектрометрическими детекторами: длина волны 220 нм, температура пробоотборника 15°С, температура термостата колонок 40°С. MSD - параметры: температура источника 130°С, температура газа 400°С, напряжение на капилляре 3kV; колонка Waters Acquity 1,7 ηm 2.1·50 mm. Градиент от 5 до 100% В за 4 мин (А: 0.1% муравьиной кислоты в воде; В: 0.1% муравьиной кислоты в ацетонитриле).
1
2
2
2
Спектр ЯМР Н (δ, м.д.) 1.98 (м, 2Н, С(21)Н); 2.26 (м, 2Н, С(22)Н); 3.86 (м, 1H, С(20)Н); 4.22 (м, 1Н, С(16)Н); 6.94 (м, 2Н, NH); 7.44 (с, 1Н, NH); 8.84 (м, 1Н, С(13)Н); 9.03 (с, 1H, СООН).
+
Масс-спектр [MS (ES)] m/z 421.19 [М+Н]
Фармакологическое действие
Оценку специфической активности антиагрегационного действия N-карб(глутаминил)оксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксана проводили in vitro с использованием крови здоровых доноров. Взятие крови проводили непосредственно перед исследованием, используя в качестве антикоагулянта цитрат натрия (3.8%). Соотношение антикоагулянт : кровь соответствовало 1:9.
Антиагрегационная активность полученного соединения изучалась на богатой тромбоцитами плазме с использованием аденозиндифосфата (АДФ) в качестве индуктора агрегации тромбоцитов.
Для приготовления богатой тромбоцитами плазмы кровь сразу после получения центрифугировали в течение 10 минут при 1000 об/мин, после чего верхний слой плазмы переносили в другую пробирку, а остаток центрифугировали в течение 20 мин при 3000 об/мин для получения безтромбоцитарной плазмы. Все процедуры проводили в полистирольной посуде, обладающей тромборезистентными свойствами. В течение всего периода исследования богатая и безтромбоцитарная плазма находились при комнатной температуре, а запись агрегации тромбоцитов осуществляли при 37°С.
Для исследования специфической антиагрегационной активности N-карб(глутаминил)оксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксана руководствовались требованиями к доклиническим исследованиям фармакологических веществ данного класса, утвержденными Фармакологической службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития.
-8
Агрегацию тромбоцитов изучали с использованием турбидиметрического метода Борна (Born, 1962), основанного на изменении пропускания света (540 нм) через исследуемую плазму при ее постоянном перемешивании (1000 об/мин). В качестве образца сравнения использовали безтромбоцитарную плазму. Светопропускание через безтромбоцитарную плазму принимали за 100%, а светопропускание через богатую тромбоцитами плазму принимали за 0%. Концентрацию тромбоцитов доводили в богатой тромбоцитами плазме до 2.5·10 клеток/мл с помощью разведения бедной тромбоцитами плазмой.
-6
-6
-6
-6
Для проведения исследования применяли двухканальный лазерный анализатор агрегации тромбоцитов/счетчик 230LA-2 (НПФ «Биола»). Объем пробы составлял 300 мкл. Время проведения измерения - 8 мин. В качестве индуктора использовали АДФ в концентрации 50 мкМ. Получаемые агрегограммы представляют собой зависимость степени агрегации от времени, прошедшего после добавления индуктора агрегации. Изучаемое соединение (в виде водного раствора, при необходимости, содержащего ДМСО до 0.2%) в разных концентрациях (0.15·10, 0.3·10, 0.45·10, 0.55·10 М) добавляли в пробу до внесения индуктора агрегации (АДФ). Результаты исследований на крови здоровых доноров представлены в таблице.
Результаты исследования специфической антиагрегационной активности N-карб(глутаминил)оксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксана
Концентрация N-карб(глутаминил) оксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксана, М
% агрегации в присутствииN-карб(глутаминил)оксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксана
0
50.4
0.15·10<sup>-6</sup>
44.1
0.3·10<sup>-6</sup>
30.5
0.45·10<sup>-6</sup>
24.3
0.55·10<sup>-6</sup>
19.2
При исследовании ингибирующего действия
N-карб(глутаминил)оксиметилимидазо[4,5-е]бензо[1,2-с;3,4-с']дифуроксана на агрегацию тромбоцитов здоровых доноров был обнаружен эффект ингибирования АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов.
Зависимость агрегации тромбоцитов от концентрации соединения представлена на рис.1.
50
Соединение ингибировало АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов с IC 0.41 мкМ, что демонстрирует выраженный антиагрегационный эффект.