Способ количественного определения содержания рутина в осине обыкновенной
METHOD OF QUANTITATIVE DETERMINING RUTHIN CONTENT IN ASP ORDINARY

Изобретение относится к фармации, а именно к фармацевтической химии, и может быть использовано для количественного определения биологически активных веществ - флавоноидов в осине обыкновенной.
Фармакологические исследования экстракционных препаратов осины обыкновенной показали наличие антимикробной, гипотензивной и противовоспалительной активности, сочетающейся с низкой токсичностью. Многолетний опыт использования в народной медицине и современные данные фармакологических исследований открывают перспективы внедрения осины обыкновенной и экстракционных препаратов на ее основе в медицинскую практику.
Однако разработка и промышленный выпуск препаратов осины обыкновенной затруднен из-за возможной фальсификации и использования недоброкачественного сырья, отсутствия способов промежуточного технологического контроля и оценки качества конечных продуктов. Указанные трудности обусловлены отсутствием надежного способа количественного определения действующих веществ.
Анализ патентной и научной литературы показал: прототип способа определения действующих веществ в осине обыкновенной отсутствует. Об этом, в частности, свидетельствует отсутствие раздела определения действующих веществ в нормативно-технической документации на лекарственное растительное сырье осины обыкновенной (Государственная фармакопея СССР, XI издание, выпуск 2. М.: Медицина, 1990, с. 392).
Широкое распространение получили при определении флавоноидов различные варианты хроматографии.
Известен «Способ количественного определения рутина методом тонкослойной хроматографии» (RU 2469316 С1). Недостатком данного способа являются значительные трудности при количественной оценке хроматограмм.
Для идентификации и количественного определения флавоноидов, в том числе рутина, также широко применяется метод ВЭЖХ (Высочина Г.И., Шалдаева Т.М., Коцупий О.В., Храмова Е.П. Флавоноиды Мари белой (Chenopodium album L.), произрастающей в Сибири. - Химия растительного сырья, 2009. - №4. - С. 107-112; Кошечкина А.С. Разработка методов анализа флавонов как индикаторных компонентов лекарственного растительного сырья. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук. М. - 2007. - 25 с.; Птицын А.В. Технология выделения флавоноидов винограда Vitis vinifera сорта «Изабелла» для косметики и изучение их свойств. Автореф. на соиск. уч. ст. канд. хим. н. М. 2007. - 26 с.), недостатком которого является использование дорогостоящего оборудования и стандартных образцов.
Также известен «Способ количественного определения флавоноидов в растительном сырье флуориметрическим методом» (RU 2475724 С2). Несмотря на высокую чувствительность данного метода, длительность анализа, а также высокая стоимость приборов существенно ограничивают его использование в биохимических исследованиях.
Известные способы количественного определения флавоноидов в растительных объектах (Ломбоева С.С., Танхаева Л.М., Олейников Д.Н. Методика количественного определения суммарного содержания флавоноидов в надземной части ортилии однобокой (Orthilia secunda (L.) House). - Химия растительного сырья. 2008. №2. С. 65-68; Лобанова А.А., Будаева В.В., Сакович Г.В. Исследование биологически активных флавоноидов в экстрактах из растительного сырья. - Химия растительного сырья. 2004. №1. С. 47-52; Зиэп Т.Т. Нго, Жохова Е.В. Разработка методики количественного определения суммарного содержания флавоноидов в траве пустырника спектрофотометрическим методом. - Химия растительного сырья. 2007. №4. С. 73-77) не являются унифицированными и разработаны только для сырья одного вида растений.
Использование этих способов для определения суммы флавоноидов в осине обыкновенной и экстракционных препаратах осины обыкновенной невозможно из-за отличия:
- в химическом составе растений;
- в консистенции и структуре растительного материала;
- в спектральных характеристиках;
- в последовательности выполнения аналитических операций;
- в используемых государственных стандартных образцах (ГСО).
Целью настоящего изобретения является разработка нового специфичного способа количественного определения суммы флавоноидов (в пересчете на рутин) для контроля качества лекарственного растительного сырья осины обыкновенной.
Технический результат - предлагаемый способ позволяет увеличить выход экстракта, уменьшить расход растворителя, сократить время процесса, снизить энергозатраты и упростить условия труда.
Указанный результат при осуществлении изобретения достигается тем, что способ количественного определения рутина в осине обыкновенной характеризуется измельчением образцов растительного материала, переносом точной навески в колбу со шлифом, добавлением экстрагента, присоединением колбы к обратному холодильнику, экстрагированием в три фазы на кипящей водяной бане, охлаждением, фильтрацией извлечения после каждой фазы экстракции, доведением экстракта растворителем до необходимого объема, перемешиванием, добавлением к извлечению спиртового раствора алюминия хлорида, определением оптической плотности растворов относительно спиртового раствора алюминия хлорида в сравнении со стандартным раствором рутина с последующим расчетом процентного содержания рутина, при этом измерение оптической плотности растворов осуществляют дискретно в диапазоне длин волн 402-408 нм, причем экстрагирование проводят в течение 1-2 часов в три фазы с использованием растворителя в объеме 100 мл в соотношении 50:25:25 соответственно при первом, втором и третьем контакте фаз, а в качестве растворителя при экстрагировании используют этиловый спирт 50-95%, для измерения оптической плотности готовят раствор, взяв аликвоту полученного экстракта в объеме 1 мл.
На фиг. 1 изображены спектры поглощения окрашенных комплексов раствора ГСО рутина с алюминия хлоридом, на фиг. 2 - зависимость содержания рутина от концентрации используемого при экстракции растворителя, на фиг. 3 - зависимость содержания рутина от длительности экстракции.
Способ осуществляется следующим образом.
В качестве растительного сырья используются образцы коры осины обыкновенной (Populus tremula L.), заготовленные преимущественно в фазу сокодвижения. Кору осины, предварительно высушенную в естественных условиях (в тени под навесами), измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. 1 г (точная навеска) измельченного сырья переносят в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, приливают 50 мл 70% этилового спирта, присоединяют обратный холодильник и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. После охлаждения извлечение фильтруют в мерную колбу. Экстракцию повторяют дважды в тех же условиях с 25 мл 70% этилового спирта в течение 30 мин при втором и третьем контакте фаз. Объем объединенного извлечения доводят 70% этиловым спиртом до 100 мл (раствор А). 1 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 2% раствора алюминия хлористого в 95% спирте этиловом, 1 каплю 5% кислоты уксусной и доводят объем раствора 95% спиртом этиловым до метки (раствор В).
Определяют оптическую плотность раствора В через 40 мин на спектрофотометре при длине волны 402 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Для приготовления раствора сравнения 1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 1 каплю 5% кислоты уксусной и доводят объем раствора 95% спиртом этиловым до метки. Параллельно определяют оптическую плотность раствора государственный стандарт (ГСО) рутина.
Суммарное содержание флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:
где D - оптическая плотность исследуемого раствора;
S
D - оптическая плотность раствора ГСО рутина;
m - масса сырья, г;
S
m - масса ГСО рутина, г;
V
K - коэффициент разбавления исследуемого раствора (1250);
V
s
K - коэффициент разбавления раствора ГСО рутина (2500);
W - потеря в массе при высушивании сырья, %.
Приготовление раствора Государственного стандартного образца (ГСО) рутина. Около 0,05 г ГСО рутина, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 100-105°С, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 95% спирте этиловом и доводят объем раствора до метки тем же растворителем (раствор А').
1 мл раствора А' переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 2 мл 2% раствора алюминия хлористого в 95% спирте этиловом, 1 каплю 5% кислоты уксусной и доводят объем раствора 95% спиртом этиловым до метки.
Для приготовления раствора сравнения 1 мл раствора А' переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, приливают 1 каплю 5% кислоты уксусной и доводят объем раствора 95% спиртом этиловым до метки.
Для решения поставленной цели были решены следующие задачи:
- выбран доступный комплексообразующий реагент, позволяющий спектрально зафиксировать наличие флавоноидов в растениях и растительных препаратах путем образования устойчивого во времени комплексного соединения;
- определен метод спектрального обнаружения флавоноидов с комплексообразующим реагентом;
- выбрана аналитическая длина волны, позволяющая избирательно определять флавоноидные соединения (фиг. 1);
- подобран государственный стандартный образец для пересчета суммы флавоноидов;
- определены оптимальные условия извлечения флавоноидов из сырья (экстрагент, фиг. 2; соотношение сырья и экстрагента; время экстракции, фиг. 3);
- разработаны оптимальные условия количественного определения суммы флавоноидов в экстракционных препаратах осины обыкновенной (рабочая длина волны, навески, разведение).
Дифференциальная спектрофотометрия предусматривает использование в качестве контроля испытуемый раствор без реактивов, что позволяет исключить влияние окрашенных и сопутствующих веществ, а также веществ, не образующих комплексов с реактивами. Хлористый алюминий является дешевым и доступным реагентом.
Для определения метода спектрального обнаружения и аналитической длины волны были изучены УФ-спектры спиртовых извлечений лекарственного сырья осины обыкновенной и государственного стандартного образца (ГСО) рутина (ФС 42-2508-87).