Методика количественной обработки результатов планарной хроматографии с использованием неспециализированного программного обеспечения

УДК 543.087.9, 543.544

А. А. Кузьмин, Д. Е. Борисков

МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОБРАБОТКИ РЕЗУЛЬТАТОВ ПЛАНАРНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НЕСПЕЦИАЛИЗИРОВАННОГО ПРОГРАММНОГО ОБЕСПЕЧЕНИЯ

Аннотация.

Актуальность и цели. Ключевым этапом количественной планарной хроматографии является оцифровка результатов разделения для дальнейшей статистической обработки и определения состава смеси. Цель работы - предложить экспресс-методику оцифровки плоских хроматограмм и получения хро-матографических кривых с использованием доступного неспециализированного программного обеспечения.

Материалы и методы. Материалом для работы послужили плоские хрома-тограммы цветных чернил, разделенных на бумажном носителе с помощью системы органических растворителей. Методологической основой работы является денситометрический метод анализа плоских хроматограмм, основанный на применении закона Ламберта - Бера о снижении интенсивности света, прошедшего через тонкий слой окрашенного вещества. Для оцифровки и построения хроматограмм использовали доступное программное обеспечение ImageJ на платформе Java.

Результаты. Предложена экономичная экспресс-методика оцифровки плоской хроматограммы с использованием планшетного сканера и неспециализированного программного обеспечения. Основными операциями процессинга являются следующие: вычитание фона, отброс цветовой информации и авторегулировки яркости/контрастности изображения. Проведен статистический анализ качества полученных денситограмм в зависимости от последовательности операций оцифровки.

Выводы. Качество денситограмм обнаруживает сложную зависимость от последовательности операций оцифровки. Операция авторегулировки яркости/ контрастности или ухудшает качество денситограмм, повышая шум базовой линии, или действует нейтрально. Вычитание фона и отброс цветности важны не столько сами по себе, сколько в комплексе, с приоритетом операции вычитания фона изображения.

Ключевые слова: планарная хроматография, процессинг, хроматографи-ческий пик, количественный анализ хроматограмм, денситометрия, денсито-грамма, шум базовой линии, пигменты.

A. A. Kuzmin, D. E. Boriskov

A METHOD OF QUANTIFICATION OF PLANAR CHROMATOGRAPHY RESULTS USING COMMON SOFTWARE

Abstract.

Background. The key stage of quantitative planar chromatography is image processing. It's necessary for further statistic analysis and mixture compound definition. The aim of the study was to offer an express method of thin-layer chromato-grams processing and chromatographic curves receiving with available common software.

Material and methods. Flat chromatograms of colored dyes separated on paper sorbent in mixture of organic solvents were taken as the study material. Methodologically the study was based on densitometry of flat chromatograms based on the Lanbert-Beer law about light intensity decreasing, when passing through a thin layer of colored substance. For chromatograms' image processing the authors used available ImageJ software on the Java platform.

Results. A low-cost express method of planar chromatogram digitizing for quantitative analysis using an office scanner and common software is offered. Important image processing stages are as follows: background subtracting, image grayscaling, brightnes/contrast auto adjustments. A statistical analysis of densitograms' quality depending on digitizing operations order was carried out.

Conclusions. The quality of densitograms reveals a complex correlation with an image processing operations order. Brightness/contrast auto adjustments either worsen densitogram quality or have a neutral effect. Background subtracting and image grayscaling are important not so much in themselves as in tandem with a background subtracting priority.

Key words: planar chromatography, image processing, chromatographic peak, quantitative analysis of chromatograms, densitometry, densitograms, baseline noise, pigments.

Одним из требований, предъявляемых к методам химического анализа, является точность. Точность анализа обеспечивается использованием математического аппарата статистики. Исходным материалом для статистической обработки являются численные данные, в то время как первичные сигналы многих методов химического анализа (тонкослойная хроматография, гель-электрофорез, видимая спектрофотометрия, титриметрия) являются качественными по своей природе. Проблема количественного преобразования качественных данных, численного их представления, необходимого для статистической обработки и объективной интерпретации, является первостепенной для решения во многих областях прикладной науки [1], в том числе в химическом анализе природных и техногенно преобразованных сред.

Хроматографические методы анализа, обеспечивая разделение смесей близких по происхождению и свойствам веществ, являются начальным этапом многих методик химического анализа. Среди хроматографических методов одним из наиболее экспрессных и адекватных целям препаративного анализа объектов окружающей среды является планарная хроматография. Ее первичный результат - плоская хроматограмма - представляет собой типичный пример экспериментальных данных качественной природы.

Значительная часть программного обеспечения, разработанного для количественного представления хроматограмм, как правило, входит в комплект поставки дорогостоящего оборудования и специализировано на работе только в комплексе с ним. Между тем современный рынок программного обеспечения предлагает широкий выбор продуктов, предназначенных для цифровой обработки двумерных сигналов. Это обусловлено востребованностью цифровой обработки изображений в различных областях деятельности человека. Технически оцифровка изображения представляет собой длительный и монотонный процесс, поэтому автоматизация этого процесса с использованием вычислительных возможностей ЭВМ является предметом многих научных исследований с момента создания первого компьютера [2].

Использование графических редакторов для количественной обработки цветных плоских хроматограмм детально описано в работе [3]. В других работах автора показано, что применение программной обработки сканированных изображений не требует наличия дорогостоящих аналитических приборов и позволяет объективно количественно оценивать содержание вещества в хроматографическом пике с минимальными затратами времени [4-7]. Однако вопросы усреднения цветовой информации при ее отбросе и переходе к черно-белому режиму, индексирования количественных показателей хро-матографических пиков с учетом собственных яркостных характеристик цвета до сих пор остаются открытыми.

Цель работы - предложить экспресс-методику оцифровки плоских хроматограмм и получения хроматографических кривых с использованием неспециализированного программного обеспечения.

Материал и методы исследования

Материалом для работы послужили плоские хроматограммы цветных чернил, разделенных на бумажном носителе с помощью системы растворите -лей, апробированной в работе [8].

Методологической основой работы является денситометрический метод анализа плоских хроматограмм [9]. Метод основан на применении закона Ламберта - Бера о снижении интенсивности света, прошедшего через тонкий слой окрашенного вещества [10]. Эталоном абсолютно непоглощающего цвета является белый, а абсолютно поглощающего - черный цвет, поэтому цифровым аналогом оптической плотности в денситометрии является процент (доля) черного цвета в пикселах анализируемого изображения. Этим объясняется необходимость отброса цветовой информации при процессинге (цифровой обработке) изображений.

Необходимость отброса цветовой информации продиктована также требованиями, предъявляемыми к изображению программным обеспечением, используемым в работе, - ImageJ (рис. 1). Данное бесплатное приложение построено на платформе Java, обеспечивающей более точный процессинг изображений по сравнению с другими аналогичными платформами [11].

Рис. 1. Меню и панель инструментов Java-приложения Image J для анализа цифровых изображений

При наличии эталонных образцов определяемого параметра для обеспечения точности и воспроизводимости результатов инструментального метода обязательным этапом анализа является калибровка. Для калибровки в работе применяется предложенная разработчиками программы Image J методика, основанная на использовании линейки пошагового градиентного перехода от белого цвета к черному (рис. 2) [12].

Рис. 2. Калибровочная линейка пошагового градиентного перехода от абсолютно белого цвета к абсолютно черному

Результатом цифровой обработки хроматограммы является денсито-грамма, представляющая собой график изменения оптической плотности пикселей изображения по ходу хроматографического разделения (рис. 3). Качество полученных денситограмм, их пригодность для количественного анализа напрямую зависит от цифровой обработки и оценивается в работе по таким критериям, как уровень шума базовой линии, отчетливость хроматографического пика и величина его основания на денситограмме. Под отчетливостью пика мы понимаем достоверное отличие выборки пикселей, принадлежащих пику, от выборки пикселей базовой линии по высоте на денситограмме (т.е. по оптической плотности).

О 500 1000

Distance

Рис. 3. Денситограмма хроматографии красных водорастворимых чернил на бумажном носителе в системе растворителей вода-этанол-ацетон (6:4:9), полученная в программе ImageJ

Проявление пика на денситограмме обусловлено наличием на хромато-грамме более темного участка (пигментного пятна) по сравнению с фоном изображения. Фон черно-белого изображения имеет собственную оптическую плотность. Это вызывает необходимость его преобразования при оцифровке хроматограмм. Эффективность преобразования фона оценивалась по снижению уровня шума базовой линии на денситограмме и сохранению на черно-белом изображении хроматограммы более темных по сравнению с фоном, т.е. отчетливых, пятен пигментов.

Узловыми операциями цифровой обработки хроматограммы являются авторегулировка яркости и контрастности, вычитание фона и отброс цветовой информации (рис. 4). При этом обязательна к выполнению только одна из них - преобразование цветного изображения в полутоновое (в оттенках серого цвета). С целью объективной оценки значимости операций оцифровки

хроматограммы для построения качественных денситограмм нами исследованы различные последовательности этих операций:

1. Авторегулировки^-вычитание фона^-отброс цветности

2. Авторегулировки ^-отброс цветности^-вычитание фона

3. Вычитание фона^-авторегулировки^-отброс цветности

4. Вычитание фона^-отброс цветности^-авторегулировки

5. Отброс цветности ^-вычитание фона^-авторегулировки

6. Отброс цветности ^-авторегулировки^-вычитание фона

7. Отброс цветности

8. Отброс цветности ^-вычитание фона

9. Вычитание фона^-отброс цветности

10. Отброс цветности^-авторегулировки

11. Авторегулировки^-отброс цветности

Рис. 4. Этапы цифровой обработки плоской хроматограммы (слева направо): сканирование, авторегулировки, вычитание фона, отброс цветовой информации

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета программ Statistica for Windows. Уровень шума базовой линии статистически оценивали по величине стандартного отклонения (о) от среднего значения оптической плотности базовой линии. Отчетливость хроматографического пика оценивали по значению t-критерия для зависимых переменных при уровне достоверности (p < 0,05) отличия среднего значений оптической плотности пика и шума базовой линии. Для установления связи между переменными использовали коэффициент линейной корреляции Пирсона (r).

Результаты и обсуждение

Шум базовой линии. Диаграмма разброса шума базовой линии денситограмм, полученных при различных последовательностях операций оцифровки, представлена на рис. 5.

Как видно из диаграммы, наилучшими с точки зрения снижения шума базовой линии являются последовательности № 8 и 9, исключающие авторегулировку яркости и контрастности изображения. В то же время последовательности № 10 и 11, исключающие вычитание фона, характеризуются мак-

симальными уровнями шума базовой линии. Это указывает на то, что применение авторегулировок яркости и контрастности повышает шум базовой линии (фона) хроматограммы. Уровень шума базовой линии недостаточен для объективной оценки пригодности денситограммы для количественного анализа. Качество денситограммы в большей степени определяется отчетливостью хроматографического пика.

0,26 0,24

0,22 0,20

л

Б

§ 0,18 ь о л

к 0,16

§

0 ф

1 0,14

ь с

О

0,12

0,10

0,08

0,06

1 23456789 10 11 Вариант алгоритма оцифровки хроматограммы

Рис. 5. Диаграмма размаха значений оптической плотности базовых линий денситограмм, полученных при различных последовательностях операций оцифровки цветных хроматограмм

Отчетливость пика. На рис. 6 представлены диаграммы размаха значений оптической плотности базовой линии и хроматографических пиков на денситограммах, построенных при различных последовательностях операций оцифровки.

Значения /-критерия, представленные в диаграмме на рис. 7, свидетельствуют о том, что максимальная отчетливость хроматографического пика достигается в последовательностях операций оцифровки № 1 и 9, а близкая к минимальной - в последовательностях № 2 и 8 (отличаются отсутствием у коротких алгоритмов № 8 и 9 операции авторегулировки). Это указывает на то, что для обеспечения отчетливости хроматографического пика важна последовательность таких операций, как вычитание фона и отброс цветовой информации.

Основание хроматографического пика является одной из линейных характеристик, позволяющих косвенно оценить полноту отображения пигментного пятна хроматограммы на денситограмме. Диаграмма значений величины основания хроматографического пика в зависимости от алгоритма

I—Ф—I

оцифровки изображения представлена на рис. 8. Уменьшение основания пика при использовании отдельных алгоритмов оцифровки свидетельствует о потере части экспериментальных данных и ведет к ошибкам анализа. Наиболее высокие значения величины основания достигаются в алгоритмах № 9 и 4, наиболее низкие - в алгоритмах № 8 и 2. Последовательность операций в алгоритмах указывает на то, что высокие значения исследуемого параметра зависят от порядка применения вычитания фона и отброса цветовой информации и не зависят от авторегулировок яркости/контраста.

1

0,45 -г-

¡5 0,40

Базовая линия Пик

3

-

р

—=х=_

Базовая линия Пик

4

-1

i

- y/лбул в

Базовая линия Пик

Базовая линия Пик

Рис. 6. Диаграммы размаха значений оптической плотности базовой линии и хроматографических пиков на денситограммах, полученных при различной последовательности операций оцифровки хроматограмм

вариант алгоритма оцифровки хроматограммы

Рис. 7. Диаграмма значений /-критерия отличия средних значений оптической плотности базовой линии и хроматографического пика на денситограммах, полученных при различных последовательностях операций оцифровки

300

251 253

263

250 - 229

¡200

= 150

3100

о

О 50

144

235

182

144

105

252

235

1 23456789 10 11 вариант алгоритма оцифровки хроматограммы

Рис. 8. Диаграмма значений величины основания хроматографического пика при различных алгоритмах оцифровки изображения

0

Примечательно, что между величиной основания пика и значением /-критерия (т.е. отчетливостью пика) обнаружена достоверная линейная корреляция (коэффициент линейной корреляции Пирсона г = 0,8067, р = 0,027, рис. 9). Объяснение полученной закономерности кроется в природе зависимых параметров. И величина основания, и отчетливость пика (при первом приближении выражающаяся в его высоте на денситограмме) являются линейными характеристиками хроматографического пика.

Таким образом, качество денситограмм обнаруживает сложную зависимость от последовательности операций оцифровки. Операция авторегулировки яркости/контрастности или ухудшает качество денситограмм, повышая шум базовой линии, или действует нейтрально. Вычитание фона и отброс цветности важны не столько сами по себе, сколько в комплексе, с приоритетом операции вычитания фона изображения.

Итогом работы стала оригинальная пошаговая методика цифровой обработки плоских хроматограмм с использованием бесплатного программного обеспечения ImageJ, обеспечивающая по сравнению с известными алгоритмами оцифровки изображений получение отчетливых пятен пигментов неяр-

кого (например, желтого) цвета (табл. 1). Предложенная методика позволяет оперативно, без использования дорогостоящего оборудования и специализированного программного обеспечения преобразовывать качественную информацию тонкослойной хроматографии в объективные количественные данные, необходимые для определения содержания компонентов в разделяемых смесях.

28 26 24 22 20 I 18

а)

II 16

14 12 10 8 6

80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

Основание пика

Рис. 9. График корреляции между значениями величин основания хроматографического пика и /-критерия отличия средних высот пика и базовой линии

Таблица 1

Алгоритм цифровой обработки цветной хроматограммы

Шаги оцифровки Примечания

1 2

1. Отсканировать хроматограмму в виде цветного изображения с разрешением не менее 300 dpi. Сохранить в форматах .tiff или .jpg Важно не менять значения настроек яркости и контрастности при сканировании. Это необходимо для максимальной передачи естественных цветов изображения

2. Открыть файл с изображением в ImageJ -

3. Открыть файл градиентной калибровочной шкалы Пройти по web-адресу http://imagej.nih.gov/ij/ docs/examples/calibration/ и кликнуть на ссылку «ZIP compressed TIFF file» для загрузки файла

4. Провести калибровку, следуя инструкциям на открытой в п. 3 странице интернет-браузера Следует обратить внимание, что калибровку надо проводить каждый раз при открытии программы. Для сохранения калибровки на всю рабочую сессию необходимо поставить галочку напротив Global calibration

Окончание табл. 1

1 2

5. Применить ProcesssSubtract Background. В открывшемся окне оставить предложенный по умолчанию радиус в 50.0 пикселей, поставить галочку напротив Light background, кликнуть кнопку Ok Программа выполняет вычитание фона согласно установленным опциям для минимизации шума базовой линии

6. Применить ImagesTypesS bit Программа отбрасывает цветовую информацию изображения

7. Применить Images-Adjusts Brightness/Contrast. В появившемся окне кликнуть кнопки Auto, затем Apply Программа отбрасывает значения в темных и светлых участках изображения, привязывает оставшиеся самые светлые и самые темные пикселы изображения к асболютно белому (значение 255) и абсолютно черному (значение 0) цветам. Светлые участки становятся светлее, а темные - темнее [13]

8. Применить Images-Adjusts Window/Level. В появившемся окне кликнуть кнопки Auto, затем Apply В каждом из цветовых каналов программа придвигает правый движок к правой границе гистограммы, а левый - к левой границе, т.е. делает цвета в снимке после сканирования более чистыми [14]

9. Ориентировать изображение хроматограммы горизонтально, выделить прямоугольную область, соответствующую распределению компонентов одной пробы Узкая прямоугольная область ограничивается линиями старта разделения и фронта растворителя

10. Применить AnalyzesPlot Profile В новом окне отображается денситограмма -график в координатах «пискели - оптическая плотность»

11. Нажать в окне денситограммы кнопку Save Программа предлагает сохранить координаты графика в формате .хЬ

12. Открыть полученный файл в табличном редакторе Файл представляет собой таблицу, состоящую из двух столбцов. Первый столбец -координаты оси абсцисс, второй - координаты оси ординат. При этом разделителем целой и дробной частей чисел является точка

13. Заменить точки в значениях координат на запятые Числовой формат данных в программе подразумевает использование запятой для отделения целой части числа от дробной

14. Построить точечный график в координатах «пиксели» -«оптическая плотность» -

Список литературы

1. W. Young, Forrest. Quantifying Qualitative Data / Forrest W. Young, Jan de Leeuw, Yoshio Takane // Similarity and Choice / H. Feger. - Bern : Hans Huber, 1980.

2. Rosenfeld, Azriel. Picture Processing by Computer / Azriel Rosenfeld. - New York : Academic Press, 1969. - 198 p.

3. Герасимов, А. В. Применение цветной компьютерной обработки хромато-грамм при ТСХ-анализе тартразина / А. В. Герасимов // Журнал аналитической химии. - 2003. - Т. 58, № 3. - С. 241.

4. Герасимов, А. В. Применение программной обработки сканированных изображений хроматограмм в количественной планарной хроматографии / А. В. Герасимов // Журнал аналитической химии. - 2004. - Т. 59, № 4. - С. 392-397.

5. Герасимов, А. В. Применение планшетных сканеров и специализированного программного обеспечения для определения цветности сахарного песка в цветовом режиме CIE XYY / А. В. Герасимов, Я. С. Бурыгина // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2002. - № 10. - С. 62.

6. Gerasimov, A. V. Application of planar chromatography with the computer processing of chromatograms to the analysis of flavoring materials using the determination of 4-(4-hydroxyphenyl)-2-butanone (raspberry ketone) as an example / A. V. Gerasimov // Journal of Analytical Chemistry. - 2001. - Vol. 56, № 4. - P. 370-375.

7. Gerasimov, A. V. Identification of colored substances in thin-layer chromatography by computer processing / A. V. Gerasimov, I. I. Malakhova, V. D. Krasikov // Russian Journal of Applied Chemistry. - 2000. - Vol. 73, № 10. - P. 1722-1725.

8. Кузьмин, А. А. Количественная оценка критериев эффективности разделения смесей методом бумажной хроматографии / А. А. Кузьмин, С. В. Зиновьев, А. А. Блинохватов, Д. Е. Борисков // XXI век: итоги прошлого и проблемы настоящего. - Пенза : ПензГТУ, 2015. - № 5 (27). - С. 89-95.

9. Touchstone, J. C. Densitometry in thin layer chromatography, practice and applications / J. C. Touchstone, J. Sharma. - New York : Wiley, 1979. - P. 241-250.

10. Ламберт, И. Г. Феноменология, или Учение о видимости / И. Г. Ламберт ; пер. К. А. Волковой // Историко-философский ежегодник. - М. : Наука, 2006. - С. 105-113.

11. Burger, Wilhelm. Digital Image Processing: An Algorithmic Introduction Using Java / Wilhelm Burger, Mark J. Burge. - Springer, 2007. - 107 p.

12. Perez, J. M. M. Image Processing with ImageJ / J. M. M. Perez, J. Pascau. - Packt, 2013. - 140 p.

13. Nixon, Mark S. Feature Extraction and Image Processing / Mark S. Nixon, Alberto S. Aguado. - Boston : Academic Press, 2008. - P. 88.

14. Jahne, Bernd. Digital Image Processing / Bernd Jahne. - Springer, 2002. - 608 p.

References

1. W. Young Forrest, Jan de Leeuw, Yoshio Takane. Similarity and Choice. Bern: Hans Huber, 1980.

2. Rosenfeld Azriel. Picture Processing by Computer. New York: Academic Press, 1969, 198 p.

3. Gerasimov A. V. Zhurnal analiticheskoy khimii [The journal of analytical chemistry].

2003, vol. 58, no. 3, p. 241.

4. Gerasimov A. V. Zhurnal analiticheskoy khimii [The journal of analytical chemistry].

2004, vol. 59, no. 4, pp. 392-397.

5. Gerasimov A. V., Burygina Ya. S. Khranenie i pererabotka sel'khozsyr'ya [Storing and and processing of agricultural raw products]. 2002, no. 10, p. 62.

6. Gerasimov A. V. Journal of Analytical Chemistry. 2001, vol. 56, no. 4, pp. 370-375.

7. Gerasimov A. V., Malakhova I. I., Krasikov V. D. Russian Journal of Applied Chemistry. 2000, vol. 73, no. 10, pp. 1722-1725.

8. Kuzmin A. A., Zinovev S. V., Blinokhvatov A. A., Boriskov D. E. XXIvek: itogiprosh-logo i problemy nastoyashchego [XXI century: results of the past and problems of the present]. Penza: PenzGTU, 2015, no. 5 (27), pp. 89-95.

9. Touchstone J. C., Sharma J. Densitometry in thin layer chromatography, practice and applications. New York: Wiley, 1979, pp. 241-250.

10. Lambert I. G. Istoriko-filosofskiy ezhegodnik [Historical and philosophical yearbook]. Moscow: Nauka, 2006, pp. 105-113.

11. Burger Wilhelm, Burge Mark J. Digital Image Processing: An Algorithmic Introduction Using Java. Springer, 2007, 107 p.

12. Perez J. M. M., Perez J. Pascau. Image Processing with ImageJ. Packt, 2013, 140 p.

13. Nixon Mark S., Aguado Alberto S. Feature Extraction and Image Processing. Boston: Academic Press, 2008, p. 88.

14. Jähne Bernd. Digital Image Processing. Springer, 2002, 608 p.

Кузьмин Антон Алексеевич кандидат биологических наук, доцент, кафедра биотехнологий и техносферной безопасности, Пензенский государственный технологический университет

E-mail: kuzmin-puh@yandex.ru

Kuzmin Anton Alekseevich

Candidate of biological sciences, associate

professor, sub-department of biotechnology

and technosphere security, Penza State

Technological University

(1a/11 Baydukova lane / Gagarina street,

Penza, Russia)

Борисков Дмитрий Евгеньевич кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, кафедра биотехнологий и техносферной безопасности, Пензенский государственный технологический университет

E-mail: boriskovde1965@gmail.com

Boriskov Dmitriy Evgenyevich Candidate of agricultural sciences, associate professor, sub-department of biotechnology and technosphere security, Penza State Technological University

УДК 543.087.9, 543.544 Кузьмин, А. А.

Методика количественной обработки результатов планарной хроматографии с использованием неспециализированного программного обеспечения / А. А. Кузьмин, Д. Е. Борисков // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. - 2016. - № 1 (13). -С.59-70.