ИНДУЦИРУЮЩИЙ ИММУНИТЕТ АГЕНТ
IMMUNITY INDUCING AGENT

Область техники
Настоящее изобретение относится к новому индуцирующему иммунитет агенту, который может применяться в качестве терапевтического и/или диагностического средства при раке и тому подобных заболеваниях.
Предшествующий уровень техники
Рак является в целом ведущей причиной смерти. В настоящее время, первичной формой методики лечения рака является хирургическое лечение, которое проводится в комбинации с лучевой терапией и химиотерапией. Несмотря на разработку новых хирургических методик и обнаружение новых противораковых средств в последние годы, исходы лечения рака еще остаются неудовлетворительными, за исключением некоторых форм рака. В последние годы были идентифицированы раковые антигены, распознаваемые цитотоксическими Т-клетками, которые реагируют на рак, и гены, кодирующие раковые антигены, наряду с развитием молекулярной биологии и иммунологии рака, и повысились ожидания антиген-специфической иммунотерапии (Tsuyoshi Akiyoshi, Gan to Kagaku Ryouhou (Cancer and Chemotherapy), 1997, vol. 24, pp. 551-519, Cancer and Chemotherapy Publishers Inc., Japan).
Иммунотерапия требует присутствия специфичного для раковых клеток пептида, полипептида или белка, который распознается в качестве антигена-мишени, а также по существу отсутствия его в нормальных клетках с точки зрения облегчения побочных эффектов. В 1991 г. Boon et al. (the Ludwig Institute for Cancer Research, Belgium) выделили антиген человеческой меланомы MAGE1, распознаваемый Т-клетками CD8+ посредством клонирования экспрессии кДНК с использованием аутологичной линии раковых клеток и реактивных в отношении рака Т-клеток (Bruggen P. et al., Science, 254: 1643-1647, 1991). Затем появилось сообщение о методе SEREX (серологической идентификации антигенов экспрессией клонированных рекомбинантных генов), который идентифицирует опухолевой антиген, распознаваемый антителом, продуцируемым в ответ на аутологичный рак, в теле страдающего раком пациента посредством экспрессии клонированных генов (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92: 11810-11813, 1995; и патент США № 5698396). Некоторые раковые антигены были выделены такими методиками (Int. J. Cancer, 72: 965-971, 1997; Cancer Res., 58: 1034-1041, 1998; Int. J. Cancer, 29: 652-658, 1998; Int. J. Oncol., 14: 703-708, 1999; Cancer Res., 56: 4766-4772, 1996; и Hum. Mol. Genet. 6: 33-39, 1997). Кроме того, было начато клиническое тестирование иммунотерапии рака, нацеленной на некоторые такие антигены.
Известно, что собаки и кошки, как и люди, страдают различными опухолями, такими как рак молочных желез, лейкоз и лимфома, и опухоли занимают высокое место в статистике заболеваний собак и кошек. Однако в настоящее время нет эффективных терапевтических, профилактических или диагностических средств по поводу рака у кошек и собак. Большинство владельцев собак и кошек не замечают опухолей у своих питомцев до тех пор, пока опухоли не становятся запущенными и увеличенными. Даже если опухоли удалены посредством хирургической операции или вводятся лекарственные средства, предназначенные для применения у людей (например, противораковые лекарственные препараты), то опухоли часто уже неизлечимы, и животные часто погибают вскоре после лечения. В таких обстоятельствах, если станут доступными терапевтические, профилактические и диагностические средства по поводу рака, которые эффективны у собак и кошек, то можно ожидать их применения по поводу рака у собак и кошек.
Цитоплазматический и связанный с пролиферацией белок 1 (CAPRIN-1) экспрессирован, когда покоящиеся нормальные клетки активируются или подвергаются клеточному делению. CAPRIN-1 представляет собой внутриклеточный белок, который, как известно, образует внутриклеточные стрессовые гранулы с РНК в клетке и связан с регуляцией транспорта и трансляции мРНК. CAPRIN-1 также известен под многими другими названиями, и их примеры включают заякоренный GPI мембранный белок 1 и мембранный компонентный поверхностный маркерный белок 1 (M11S1). CAPRIN-1 имеет названия, которые передают впечатление, что он был известен как клеточный мембранный белок. Такие другие названия происходят из сообщения о том эффекте, что последовательность гена CAPRIN-1 имеет область связывания GPI, и он представляет собой мембранный белок, экспрессированный в линии клеток, полученной из толстой кишки (J. Biol. Chem., 270: 20717-20723, 1995). Однако позднее стало известно, что последовательность гена CAPRIN-1 в этом сообщении была неправильной, и в последовательности гена делеция одного нуклеотида из последовательности гена CAPRIN-1, в настоящее время зарегистрированная в Генном Банке или тому подобном, вызывает сдвиг рамки, посредством этого приводя к делеции 80 аминокислот из C-конца, и поэтому полученный артефакт (74 аминокислоты) представлял собой связывающую GPI область, упомянутую в указанном выше сообщении. Кроме того, было также известно, что последовательность гена CAPRIN-1, указанная в сообщении, также имела ошибку на стороне 5’, и произошла делеция 53 аминокислотных остатков из N-конца (J. Immunol., 172: 2389-2400, 2004). Сообщалось также, что белок, кодируемый последовательностью гена CAPRIN-1, в настоящее время зарегистрированный в Генном Банке или тому подобном, не является клеточным мембранным белком (J. Immunol., 172: 2389-2400, 2004).
На основании сообщения в публикации J. Biol. Chem., 270: 20717-20723, 1995, о том, что CAPRIN-1 представляет собой клеточный мембранный белок, в документах US 2008/0075722 и WO 2005/100998 описано, что CAPRIN-1 может быть мишенью терапии рака в виде клеточного мембранного белка под названием M11S1. Однако они не включают какие-либо определенные описания в разделе «Примеры». Однако как сообщалось в публикации J. Immunol., 172: 2389-2400, 2004, со времени подачи заявки US 2008/0075722 было принято считать, что CAPRIN-1 не экспрессирован на клеточной поверхности. Очевидно, что описания документов US 2008/0075722 и WO 2005/100998, основанные только на неправильной информации о том, что CAPRIN-1 представляет собой клеточный мембранный белок, не следует понимать как общее техническое представление в данной области. Кроме того, нет сообщений о том, что уровень экспрессии CAPRIN-1 выше в раковых клетках, таких как клетки рака молочной железы, чем в нормальных клетках.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Проблема, подлежащая решению изобретением
Целью настоящего изобретения является выявление нового полипептида, который может применяться в качестве терапевтического и/или профилактического средства по поводу рака и обеспечение применения такого полипептида в качестве индуцирующего иммунитет агента.
Средства для решения проблемы
Заявители провели концентрированные исследования и затем получили кДНК, кодирующие белки, которые связываются с антителами в сыворотке, полученной из пораженного раком живого организма, способом SEREX с использованием библиотеки кДНК, полученной из ткани семенников собак, и сыворотки собаки, страдающей раком молочной железы, и получили собачий полипептид CAPRIN-1, имеющий аминокислотную последовательность, показанную SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 и 14, с использованием таких кДНК. Используя также человеческий гомологичный ген полученного гена, заявители получили полипептид CAPRIN-1 человека, имеющий аминокислотную последовательность, показанную SEQ ID NO:2 и 4. Далее, они обнаружили, что такие полипептиды CAPRIN-1 были специфически экспрессированы при раке молочной железы, опухоли мозга, лейкозе, лимфоме, раке пищевода и колоректальном раке. Кроме того, они обнаружили, что введение таких полипептидов CAPRIN-1 в живые организмы приводит к индукции иммуноцитов против полипептидов CAPRIN-1 в живых организмах и обратному развитию опухолей в живых организмах, экспрессирующих гены CAPRIN-1. Кроме того, заявители обнаружили, что антитела против таких полипептидов CAPRIN-1 разрушают раковые клетки, которые экспрессируют гены CAPRIN-1, и вызывают противоопухолевые эффекты in vivo. Это привело к созданию настоящего изобретения.
Соответственно, настоящее изобретение имеет следующие признаки.
(1) Индуцирующий иммунитет агент, содержащий в качестве активного ингредиента по меньшей мере один полипептид, обладающий индуцирующей иммунитет активностью, и выбранный из следующих полипептидов (a), (b) и (c), или рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий такой полипептид, и способный экспрессировать такой полипептид in vivo:
(a) полипептид по меньшей мере из семи соседних аминокислот аминокислотной последовательности, показанной четным номером SEQ ID, выбранной из SEQ ID NO:2-30, перечисленных в разделе "Список последовательностей";
(b) полипептид по меньшей мере из семи соседних аминокислот, имеющий идентичность с полипептидом (a) 90% или более; и
(c) полипептид, содержащий полипептид (a) или (b) в качестве его частичной последовательности.
(2) Индуцирующий иммунитет агент по п.(1), где полипептид (b) представляет собой полипептид, имеющий идентичность последовательности с полипептидом (a), 95% или более.
(3) Индуцирующий иммунитет агент по п.(1), где полипептид, обладающий индуцирующей иммунитет активностью, представляет собой полипептид по меньшей мере из семи соседних аминокислот аминокислотной последовательности, показанной любым четным номером SEQ ID, выбранной из SEQ ID NO:2-30, перечисленных в разделе "Список последовательностей", или полипептид, содержащий такой полипептид в качестве его частичной последовательности.
(4) Индуцирующий иммунитет агент по п.(3), где полипептид, обладающий индуцирующей иммунитет активностью, представляет собой полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, показанную любым четным номером SEQ ID, выбранную из SEQ ID NO:2-30, перечисленных в разделе "Список последовательностей".
(5) Индуцирующий иммунитет агент по п.(3), где полипептид, обладающий индуцирующей иммунитет активностью, представляет собой полипептид по меньшей мере из семи соседних аминокислот в области аминокислотных остатков (aa) от 41 до 400 или аминокислотных остатков (aa) от 503 до 564 аминокислотной последовательности, показанной любым четным номером SEQ ID, выбранной из SEQ ID NO:2-30, перечисленных в разделе "Список последовательностей", за исключением SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:18, или полипептид, содержащий такой полипептид в качестве его частичной последовательности.
(6) Индуцирующий иммунитет агент по п.(5), где полипептид, обладающий индуцирующей иммунитет активностью, представляет собой полипептид аминокислотной последовательности, показанной любой SEQ ID NO:43-76, перечисленных в разделе "Список последовательностей", или полипептид из 8-12 аминокислот, содержащий аминокислотную последовательность, показанную любой из SEQ ID NO:43-76 в разделе "Список последовательностей", в качестве его частичной последовательности.
(7) Индуцирующий иммунитет агент по любому из пп.(1)-(6), который содержит в качестве активного ингредиента один или множество типов таких полипептидов.
(8) Индуцирующий иммунитет агент по п.(7), где полипептид представляет собой агент для обработки антиген-представляющей клетки.
(9) Индуцирующий иммунитет агент по любому из пп.(1)-(7), который предназначен для применения при лечении или профилактике рака у животных.
(10) Индуцирующий иммунитет агент по п.(9), где рак представляет собой рак молочной железы, опухоль мозга, лейкоз, лимфому, рак легких, рак пищевода или колоректальный рак.
(11) Индуцирующий иммунитет агент по п.(9), где животное представляет собой человека, собаку или кошку.
(12) Индуцирующий иммунитет агент по любому из пп.(1)-(11), который, кроме того, содержит иммунопотенцирующее средство.
(13) Индуцирующий иммунитет агент по п.(12), где иммунопотенцирующее средство представляет собой по меньшей мере один адъювант или цитокин, выбранный из группы, состоящей из неполного адъюванта Фрейнда, монтанида, поли IC (полиинозинокую-полицитидиновую кислоту) и ее производное, олигонуклеотид CpG-олигонуклеотид, интерлейкин 12, интерлейкин 18, интерферон α, интерферон β, интерферон ω, интерферон γ и лиганд Flt3.
(14) Выделенная антиген-презентирующая клетка, содержащая комплекс указанного выше полипептида, обладающего индуцирующей иммунитет активностью, и молекулу HLA (человеческого лейкоцитарного антигена).
(15) Выделенная Т-клетка, которая селективно связывается с комплексом указанного выше полипептида, обладающего индуцирующей иммунитет активностью, и молекулу HLA.
(16) Способ индукции иммунитета, включающий введение индивидууму по меньшей мере одного полипептида, обладающего индуцирующей иммунитет активностью, и выбранного из следующих полипептидов (a), (b) и (c), или рекомбинантного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий такой полипептид, и способный экспрессировать такой полипептид in vivo:
(a) полипептид по меньшей мере из семи соседних аминокислот аминокислотной последовательности, показанной четным номером SEQ ID, выбранной из SEQ ID NO:2-30, перечисленных в разделе "Список последовательностей";
(b) полипептид по меньшей мере из семи соседних аминокислот, имеющий идентичность с полипептидом (a) 90% или более; и
(c) полипептид, содержащий полипептид (a) или (b) в качестве его частичной последовательности.
Эффекты изобретения
Настоящее изобретение относится к новому индуцирующему иммунитет агенту, который может использоваться для лечения и/или профилактики злокачественных опухолей. Как конкретно описано ниже в примерах, введение используемого в настоящем изобретении полипептида страдающему злокачественной опухолью животному обеспечивает возможность индукции иммуноцита в организме такого страдающего злокачественной опухолью животного, что, кроме того, обеспечивает возможность сокращения в размере и обратного развития существующей раковой опухоли.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показан тип экспрессии гена, кодирующего полипептид CAPRIN-1, в нормальной ткани и линии опухолевых клеток. Ссылочная позиция 1 представляет тип экспрессии гена, кодирующего белок CAPRIN-1, а ссылочная позиция 2 представляет тип экспрессии гена GAPDH.
На фиг.2 каждая из ссылочных позиций с 3 по 31 на горизонтальной оси представляет способность Т-клеток HLA-A0201+ CD8+ продуцировать IFN-γ, стимулированные T2-клетками, после импульсного воздействия пептидами SEQ ID NO:43-71. Ссылочная позиция 32 представляет результаты, относящиеся к пептиду отрицательного контроля SEQ ID NO:77 (пептида, имеющего последовательность вне объема настоящего изобретения).
На фиг.3 каждая из ссылочных позиций с 33 по 37 на горизонтальной оси представляет способность Т-клеток HLA-A24+ CD8+ продуцировать IFN-γ, стимулированные клетками JTK-LCL, после импульсного воздействия пептидами SEQ ID NO:72-76. Ссылочная позиция 38 представляет результаты, относящиеся к пептиду отрицательного контроля SEQ ID NO:77.
На фиг.4 каждая из ссылочных позиций с 39 по 67 на горизонтальной оси представляет цитотоксическую активность Т-клеток HLA-A0201+ CD8+, стимулированных применением пептидов SEQ ID NO:43-71, в отношении клеток U-87MG. Ссылочная позиция 68 представляет цитотоксическую активность Т-клеток CD8+, индуцированную применением пептида отрицательного контроля (SEQ ID NO:77).
На фиг.5 каждая из ссылочных позиций с 69 по 73 на горизонтальной оси представляет цитотоксическую активность Т-клеток HLA-A24+ CD8+, стимулированных применением пептидов SEQ ID NO:72-76, в отношении клеток JTK-LCL. Ссылочная позиция 74 представляет цитотоксическую активность Т-клеток CD8+, индуцированную применением пептида отрицательного контроля (SEQ ID NO:77).
ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Полипептиды
Полипептиды, содержащиеся в индуцирующем иммунитет агенте по настоящему изобретению в качестве активного агента, включают один или множество полипептидов, выбранных из следующих полипептидов (a), (b) и (c):
(a) полипептид по меньшей мере из семи соседних аминокислот в полипептиде, имеющем аминокислотную последовательность, показанную любым четным номером SEQ ID, выбранную из SEQ ID NO:2-30, перечисленных в разделе "Список последовательностей", и обладающую индуцирующей иммунитет активностью;
(b) полипептид, имеющий идентичность с полипептидом (a). состоящим по меньшей мере из 7 аминокислот, и обладающий индуцирующей иммунитет активностью 90% или более; и
(c) полипептид, содержащий полипептид (a) или (b) в качестве частичной последовательности, и обладающий индуцирующей иммунитет активностью.
Используемый в настоящем описании термин «полипептид» относится к молекуле, образованной посредством пептидных связей среди множества аминокислот. Термин относится не только к молекуле полипептида, составленной большим числом аминокислот, но также к молекуле с низкой молекулярной массой, составленной небольшим числом аминокислот (олигопептиду), и белку полной длины. В настоящем изобретении термин «полипептид» также относится к белку последовательности полной длины, показанному любым четным номером SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30.
Нуклеотидные последовательности полинуклеотидов, кодирующих отдельные белки, состоящие из аминокислотных последовательностей, как показано четными числами SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30 (т.е. SEQ ID NO:2, 4, 6... 28 и 30), показано нечетными числами SEQ ID среди SEQ ID NO:1-29 (т.е. SEQ ID NO:1, 3, 5... 27 и 29).
Используемый в настоящем описании термин «имеющий аминокислотную последовательность» относится к последовательности, составленной из аминокислотных остатков в определенном порядке. Например, термин «полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную SEQ ID NO:2», относится к полипептиду длиной 709 аминокислотных остатков, обладающему аминокислотной последовательностью. Показанной SEQ ID NO:2, т.е. Met Pro Ser Ala Thr...(вырез)...Gln Gln Val Asn. Термин «полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную SEQ ID NO:2» может быть иногда сокращен и представлен в виде «полипептида SEQ ID NO:2». То же относится к выражению «имеющий нуклеотидную последовательность». В контексте этого, термин «имеющий» взаимозаменяем с выражением «состоящий из».
Используемый в настоящем описании термин «индуцирующая иммунитет активность» относится к способности индукции иммуноцита, который секретирует цитокин, такой как интерферон или интерлейкин in vivo.
То, имеет ли полипептид индуцирующую иммунитет активность или нет, может быть подтверждено, например, посредством известного анализа ELISPOT. В частности, клетки, такие как мононуклеарные клетки периферической крови, получают из живого организма, в который был введен полипептид, подлежащий анализу на индуцирующую иммунитет активность, такие клетки кокультивируются в присутствии такого полипептида, и количество продуцируемого из клеток цитокина и/или хемокина, такого как IFN-γ или интерлейкин (IL), измеряется с использованием специфического антитела, как описано, например, ниже в разделе «Примеры». Таким образом, можно провести анализ ряда иммуноцитов среди клеток. Это обеспечивает возможность оценки индуцирующей иммунитет активности.
Альтернативно, рекомбинантный полипептид, полученный на основании аминокислотной последовательности, показанной четным номером SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30, может вводиться страдающему от злокачественной опухоли животному, чтобы опухоль могла подвергнуться обратному развитию индуцирующей иммунитет активностью, как описано ниже в разделе «Примеры». Таким образом, индуцирующую иммунитет активность можно оценить как способность подавления роста раковых клеток, экспрессирующих полипептид, показанный любым четным номером SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30, или способность уменьшения объема или устранения раковой ткани (опухоли) (далее, такая способность именуется «противоопухолевой активностью»). Противоопухолевую активность полипептидов можно определить, например, действительным введением такого полипептида в пораженный злокачественной опухолью живой организм и исследованием того, уменьшается ли опухоль в объеме или нет, как конкретно описано ниже в разделе "Примеры".
51
Альтернативно, то, проявляют ли Т-клетки, стимулированные полипептидом (т.е. Т-клетки, приведенные в контакт с антиген-презентирующими клетками, которые представляют такой полипептид) цитотоксическую активность в отношении опухолевых клеток in vitro или нет, может быть исследовано для оценки противоопухолевой активности полипептида. Т-клетки могут быть приведены в контакт с антиген-презентирующими клетками путем их кокультивирования в жидкой среде, как описано ниже. Цитотоксическая активность может анализироваться посредством известной методики, именуемой методикой анализа высвобождения Cr, описанной, например, в публикации Int. J. Cancer, 58: p. 317, 1994. Когда полипептиды используются для лечения и/или профилактики рака, предпочтительно, чтобы индуцирующая иммунитет активность оценивалась с использованием противоопухолевой активности в качестве индикатора, хотя способ оценки конкретно не ограничивается.
Аминокислотные последовательности, показанные четными числами SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30, перечисленных в разделе "Список последовательностей", раскрытом в настоящем изобретении, представляют собой аминокислотные последовательности полипептидов CAPRIN-1, выделенных в качестве полипептидов, связывающихся с антителами, существующими специфически в сыворотке, полученной у страдающих от злокачественной опухоли собак, и человеческих, бычьих, лошадиных, мышиных и куриных гомологов таких полипептидов методом SEREX с использованием библиотеки кДНК, полученной из нормальной ткани собачьих семенников и сыворотки собаки, пораженной раком молочной железы (смотрите пример 1 ниже).
Указанный выше полипептид (a) состоит по меньшей мере из 7, а предпочтительно по меньшей мере из 8, 9, 10 или более соседних аминокислот в полипептиде, имеющем аминокислотную последовательность, показанную любым четным номером SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30, и имеет индуцирующую иммунитет активность. Особенно предпочтительно такой полипептид имеет аминокислотную последовательность, показанную четным номером SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30. Как известно в данной области, полипептид по меньшей мере из 7 аминокислотных остатков может обладать антигенностью. Соответственно, полипептид по меньшей мере из семи соседних аминокислотных остатков, показанный четным номером SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30, может иметь индуцирующую иммунитет активность, и такой полипептид может применяться для получения индуцирующего иммунитет агента по настоящему изобретению. На основании того, что антитела, продуцируемые против антигенного вещества in vivo, представляют собой поликлональные антитела, полипептид, составленный из большего числа аминокислотных остатков, может индуцировать большее разнообразие антител, распознающих различные сайты антигенного вещества, посредством этого усиливая индуцирующую иммунитет активность. Соответственно, для усиления индуцирующей иммунитет активности число аминокислотных остатков может предпочтительно составлять по меньшей мере 30 или более, или 50 или более, предпочтительнее, по меньшей мере 100 или более, 150 или более, а кроме того, предпочтительно по меньшей мере 200 или более, или еще предпочтительнее, 250 или более.
В качестве принципа индукции иммунитета посредством введения полипептида ракового антигена известно, что полипептид включается в антиген-презентирующую клетку, полипептид разрушается пептидазой в клетке на меньший фрагмент (далее он может именоваться «эпитопом»), такой фрагмент представлен на клеточной поверхности, цитотоксические Т-клетки или тому подобные распознают такой фрагмент и селективно уничтожают антиген-презентирующие клетки. Размер полипептида, представленного на поверхности антиген-презентирующей клетки, относительно мал и составляет примерно от 7 до 30 с точки зрения числа аминокислот. Соответственно, с точки зрения представления на антиген-презентирующей клетке, достаточно, чтобы полипептид (a) представлял собой примерно от 7 до 30, а предпочтительно, примерно от 8 до 30 или от 9 до 30 соседних аминокислот в аминокислотных последовательностях, показанных любым четным номером SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30. Такой полипептид относительно небольшого размера может быть непосредственно представлен на поверхности антиген-презентирующей клетки без включения в антиген-презентирующую клетку.
Полипептид, включенный в антиген-презентирующую клетку, расщепляется в случайных положениях пептидазой, присутствующей в клетках, генерируются разнообразные фрагменты полипептида, и такие фрагменты полипептида представлены на поверхности антиген-презентирующей клетки. Если вводится большой полипептид, такой как имеющий последовательность полной длины, показанный любым четным номером SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30, то, соответственно, фрагменты полипептида, которые эффективны для индукции иммунитета, опосредованной антиген-презентирующими клетками посредством разрушения в антиген-презентирующей клетке, генерируются натурально. Таким образом, полипептид большого размера может предпочтительно применяться индукции иммунитета, опосредованной антиген-презентирующими клетками, и число аминокислот может составлять по меньшей мере 30, предпочтительнее, по меньшей мере 100, кроме того, предпочтительно по меньшей мере 200, и еще предпочтительнее, по меньшей мере 250.
Кроме того, может проводиться скрининг полипептида по настоящему изобретению как пептида, являющегося возможным эпитопом, с использованием подходящего носителя информации, который может проводить поиск пептида, служащего в качестве возможного эпитопа, который имеет мотив связывания для каждого типа HLA, такого как Прогноз биоинформатики связывания HLA пептида и Выбор молекулярного анализа (BIMAS) (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html). В частности, предпочтителен полипептид по меньшей мере из семи соседних аминокислот в области аминокислотных остатков (aa) от 41 до 400 или аминокислотных остатков (aa) от 503 до 564 в аминокислотных последовательностях, показанных любым четным номером SEQ ID, выбранным среди SEQ ID NO:2-30, за исключением SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:18, или полипептида, содержащего такой полипептид в качестве его частичной последовательности. В полипептиде SEQ ID NO:2, предпочтительнее полипептид SEQ ID NO:43-76.
Указанный выше полипептид (b) получен из полипептида (a) замещением, делецией, добавлением и/или вставкой небольшого числа (предпочтительно, одного или нескольких) аминокислотных остатков; он имеет идентичность последовательностей 80% или более, 85% или более, предпочтительно, 90% или более, предпочтительнее, 95% или более, кроме того, предпочтительно 98% или более, 99% или более, или 99,5% или более с первоначальной последовательностью, и он имеет индуцирующую иммунитет активность. Когда небольшое число (предпочтительно, один или несколько) аминокислотных остатков замещены в аминокислотной последовательности, подвергнуты делеции из или вставлены в аминокислотную последовательность белкового антигена, то в целом в данной области широко известно, что полученный белок иногда имеет по существу такую же антигенность или иммуногенность с таковыми первоначального белка. Таким образом, указанный выше полипептид (b) способен оказывать индуцирующее иммунитет воздействие и, таким образом, он может применяться для получения индуцирующего иммунитет агента по настоящему изобретению. Альтернативно, указанный выше полипептид (b) представляет собой предпочтительно полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, полученную из аминокислотной последовательности, показанной четным номером SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30, замещением, делецией, добавлением и/или вставкой одного или нескольких аминокислотных остатков. Термин «несколько», используемый в настоящем описании, относится к целому числу от 2 до 10, предпочтительно, целому числу от 2 до 6, а, кроме того, предпочтительно целому числу от 2 до 4.
Термин «идентичность последовательности», используемый в настоящем описании в отношении аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности, представляет процентную долю (%), определенную вправливанием двух аминокислотных последовательностей (или нуклеотидных последовательностей), подлежащих сравнению, чтобы максимизировать число совпадающих аминокислотных остатков (или нуклеотидов) и делением числа совпадающих аминокислотных остатков (или числа совпадающих нуклеотидов) на общее число аминокислотных остатков (или общее число нуклеотидов). При вправливании последовательностей, как описано выше, пропуск адекватно вставляется в одну или обе последовательности, подлежащие сравнению, в соответствии с потребностью. Такое вправливание последовательностей может проводиться с использованием хорошо известной программы, например, BLAST, FASTA или CLUSTAL W (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 2264-2268, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402, 1997). Когда вставляется пропуск, то общее число аминокислотных остатков (или общее число нуклеотидов) представляет собой число остатков (или число нуклеотидов), подсчитанное обозначением пропуска в виде аминокислотного остатка (или нуклеотида). Когда определенное таким образом общее число аминокислотных остатков (или общее число нуклеотидов) различается между двумя подлежащими сравнению последовательностями, то идентичность (%) определяется делением числа совпадающих аминокислотных остатков (или числа нуклеотидов) на общее число аминокислотных остатков (или общее число нуклеотидов) более длинной последовательности.
Предпочтительное аминокислотное замещение представляет собой консервативное аминокислотное замещение. 20 типов аминокислот, составляющих естественно встречающийся белок, могут классифицироваться на группы аминокислот, имеющие одинаковые свойства: т.е. нейтральные аминокислоты, имеющие боковые цепи низкой полярности (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met и Pro); нейтральные аминокислоты, имеющие гидрофильные боковые цепи (Asn, Gln, Thr, Ser, Tyr и Cys); кислотные аминокислоты (Asp и Glu); основные аминокислоты (Arg, Lys и His); и ароматические аминокислоты (Phe, Tyr, Trp и His). Известно, что замещение внутри таких групп, т.е. консервативное замещение, во многих случаях не изменило бы свойства полипептидов. Соответственно, когда аминокислотные остатки в полипептиде (a) настоящего изобретения замещаются, то замещение может проводиться внутри таких групп, чтобы можно было усилить возможность поддержания индуцирующей иммунитет активности. Однако в настоящем изобретении измененный полипептид может иметь неконсервативное замещение, при условии, что полученный полипептид имеет индуцирующую иммунитет активность, эквивалентную или по существу эквивалентную таковой неизмененного полипептида.
Полипептид (c) содержит полипептид (a) или (b) в качестве его частичной последовательности и имеет индуцирующую иммунитет активность. В частности, полипептид (c) соответствует полипептиду (a) или (b), к которому добавляется другая аминокислота (аминокислоты) или полипептид (полипептиды) на одном или обоих его концах, и имеющий индуцирующую иммунитет активность. Такой полипептид может применяться для получения индуцирующего иммунитет агента по настоящему изобретению.
Указанный выше полипептид может быть химически синтезирован в соответствии, например, с Fmoc (фторенилметилоксикарбонильным) способом или tBoc (трет-бутоксикарбонильным) способом (издание Японского Биохимического Общества, Seikagaku Jikken Kouza (Проведение Биохимических Экспериментов) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Химия белка) IV, Kagaku Shushoku to Peptide Gousei (Химическая модификация и пептидный синтез), Tokyo Kagaku Dojin, Japan, 1981). Также разнообразные выпускаемые промышленностью пептидные синтезаторы могут применяться для синтеза полипептида в соответствии с обычной методикой. Кроме того, для получения полинуклеотида, кодирующего указанный полипептид, могут применяться методики генной инженерии (например, Sambrook et al., Molecular Cloning, vol. 2, Current Protocols in Molecular Biology, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press; and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, vol. 3, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 1995, John Wiley & Sons), полученный полипептид может быть включен в вектор экспрессии и затем введен в клетку-хозяин, и полипептид может быть получен в такой клетке-хозяине для получения целевого полипептида.
2+
Полинуклеотид, кодирующий указанный выше полипептид, может быть легко получен посредством известной методики генной инженерии или обычной методики с использованием выпускаемого промышленностью синтезатора нуклеиновых кислот. Например, ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, может быть получена выполнением PCR (полимеразной цепной реакцией, ПЦР) с применением библиотеки человеческой хромосомной ДНК или кДНК в качестве матрицы, и пары затравок, сконструированных так, чтобы амплифицировать нуклеотидную последовательность, показанную SEQ ID NO:1. Аналогичным образом, ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5, может быть получена с использованием в качестве матрицы собачьей библиотеки ДНК или кДНК. Условия PCR могут быть определены соответствующим образом. Например, цикл реакции денатурации при 94ºC в течение 30 секунд, отжиг при 55°C в течение от 30 секунд до 1 минуты и удлинение при 72°C в течение 2 минут с использованием термоустойчивой ДНК-полимеразы (например, полимеразы Taq) и содержащего Mg буфера PCR повторяется 30 раз с последующей реакцией при 72°C в течение 7 минут, хотя условия реакции не ограничиваются ими. Методики PCR и тому подобные описаны, например, в публикации Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, vol. 3, A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 1995, John Wiley & Sons (в частности, глава 15). Соответствующие зонды или праймеры могут быть также получены на основании информации о нуклеотидных последовательностях и аминокислотных последовательностях, показанных SEQ ID NO:1-30 в разделе "Список последовательностей" по настоящему изобретению, и может проводиться скрининг библиотек кДНК человека, собак, крупного рогатого скота или других животных с использованием таких зондов или затравок, чтобы можно было выделить представляющую интерес ДНК. Библиотеки кДНК предпочтительно получают из клеток, органов или ткани, в которых экспрессирован белок, показанный четным номером SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30. Процедуры, такие как получение зондов и затравок, конструирование библиотеки кДНК, скрининг библиотеки кДНК и клонирование генов-мишеней, описанные выше, известны в данной области. Например, такие процедуры могут проводиться в соответствии со способами, описанными в публикациях Sambrook et al., Molecular Cloning, vol. 2, Current Protocols in Molecular Biology, 1989), Ausubel et al. (как указано выше). ДНК, кодирующая указанный выше полипептид (a), может быть получена из полученной таким образом ДНК. Поскольку известен кодон, кодирующий каждую аминокислоту, то может быть легко идентифицирована нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего определенную аминокислотную последовательность. Соответственно, может быть легко идентифицирована нуклеотидная последовательность полинуклеотида, кодирующего полипептид (b) или (c), и такой полинуклеотид может быть также легко синтезирован с использованием выпускаемого промышленностью синтезатора нуклеиновых кислот в соответствии с обычной методикой.
Клетки-хозяева могут представлять собой любые клетки, при условии, что в них может быть экспрессирован указанный выше полипептид. Клетки-хозяева включают без ограничения клетку E. coli в качестве прокариотических клеток; и почечные клетки обезьян (COS 1), клетки яичников китайских хомячков (CHO), линия человеческих эмбриональных почечных клеток (HEK293) и линии фетальных мышиных кожных клеток (NIH3T3), почкующиеся дрожжевые клетки, делящиеся дрожжевые клетки, клетки червей и клетки яиц Xenopus (африканской шпорцевой лягушки) в качестве эукариотических клеток.
Когда используются прокариотические клетки-хозяева, то используют векторы экспрессии, имеющие, например, происхождение, промотер, связывающий рибосому сайт, сайт множественного клонирования, терминатор, ген устойчивости и ауксотропный добавочный ген, который может быть реплицирован в прокариотических клетках. Примеры векторов экспрессии E. coli включают pUC, pBluescriptII, экспрессионную систему pET и экспрессионную систему pGEX. ДНК, кодирующая указанный выше полипептид, может быть включена в такой вектор экспрессии, прокариотические клетки-хозяева могут быть трансформированы таким вектором, и полученный трансформант может культивироваться. Таким образом, полипептид, кодируемый ДНК, может быть экспрессирован в прокариотических клетках-хозяевах. В данном случае, такой полипептид может быть экспрессирован в форме белка, слитого с другим белком.
6
10
Когда используются эукариотические клетки, то используются эукариотические векторы экспрессии, имеющие, например, промотер, область сплайсинга и сайт добавления поли(A). Примеры таких векторов экспрессии включают векторы pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV, pRS, pcDNA3 и pYES2. Как описано выше, ДНК, кодирующая указанный выше полипептид, может быть включена в такой вектор экспрессии, эукариотические клетки-хозяева могут быть трансформированы таким вектором, и полученный трансформант может затем культивироваться. Таким образом, полипептид, кодируемый ДНК, может быть экспрессирован в эукариотических клетках-хозяевах. Когда используются pIND/V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1 или другие векторы экспрессии, то полипептид может быть экспрессирован в форме слитого белка с разнообразными метками, таким как метка His (например, от (His) до (His)), метка FLAG, метка myc, метка HA или GFP.
Векторы экспрессии могут быть введены в клетки-хозяева обычными методиками, такими как электропорообразование, кальций-фосфатный способ, липосомный способ, DEAE (диэтиламиноэтанол)-декстрановый способ, микроинъекция, вирусная инфекция, липофекция или связывание с проникающим в клетку пептидом.
Полипептид-мишень может быть выделен и очищен из клеток-хозяев использованием известных методик разделения в комбинации. Их примеры включают без ограничения обработку использованием денатурирующего агента, такого как мочевина, или ПАВ, обработку ультразвуком, перевариванием ферментом, высаливанием или фракционным осаждением растворителем, диализом, центрифугированием, ультрафильтрацией, гель-фильтрацией, SDS-PAGE (электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия), изоэлектрическим фокусированием, ионообменной хроматографией, гидрофобной хроматографией, аффинной хроматографией и хроматографией в обращенной фазе.
Некоторые полипептиды, полученные такими способами, находятся в форме слитых белков с другими белками, как описано выше. Их примеры включают слитые белки с глютатион-S-трансферазой (GST) или меткой His. Такие полипептиды в форме слитых белков находятся в пределах объема настоящего изобретения в качестве полипептида (c). Кроме того, полипептиды, экспрессированные в трансформированных клетках, транслируются, и транслированные полипептиды иногда подвергаются различным типам модификации в клетках. Такие посттрансляционно модифицированные полипептиды также находятся в пределах объема настоящего изобретения, при условии, что такие полипептиды имеют индуцирующую иммунитет активность. Примеры такой посттрансляционной модификации включают устранение N-концевого метионина, ацетилирование N-конца, добавление сахарной цепи, ограниченное разрушение внутриклеточной протеазой, миристоилирование, изопренилирование и фосфорилирование.
Индуцирующий иммунитет агент
Как конкретно описано ниже в примерах, введение указанного выше пептида, обладающего индуцирующей иммунитет активностью, в живое тело, пораженное раком, обеспечивает возможность обратного развития существующей опухоли. Таким образом, индуцирующий иммунитет агент по настоящему изобретению может использоваться в качестве терапевтического и/или профилактического агента при раке.
Используемые в настоящем описании термины «опухоль» и «рак» относятся к злокачественным новообразованиям, и эти термины используются взаимозаменяемо друг с другом.
В этом случае, раковыми формами-мишенями являются те, которые экспрессируют ген, кодирующий полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, показанную любым четным номером SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30, или их частичную последовательность, состоящую по меньшей мере из 7 соседних аминокислот. Предпочтительно, такие формы рака представляют собой рак молочной железы, лейкоз, рак легких, лимфому, опухоль из тучных клеток, рак пищевода и колоректальный рак. Примеры таких специфицированных форм рака включают без ограничения рак молочной железы, комбинированный рак молочной железы, злокачественную смешанную опухоль молочной железы, внутрипроточную сосочковую аденокарциному, хронический лимфолейкоз, желудочно-кишечную лимфому, лимфому пищеварительного тракта и лимфому от мелко- до среднеклеточной.
Животными-мишенями являются млекопитающие, и их примеры включают млекопитающих животных, включая приматов, домашних животных, сельскохозяйственных животных и спортивных животных, причем особенно предпочтительными являются люди, собаки и кошки.
Индуцирующий иммунитет агент по настоящему изобретению может вводиться перорально или парентерально в организм. Предпочтительно парентеральное введение, такое как внутримышечное, подкожное, внутривенное или внутриартериальное введение. Когда такой индуцирующий иммунитет агент используется с целью лечения рака, то агент может вводиться в региональный лимфоузел вблизи подлежащей лечению опухоли, чтобы улучшить противоопухолевые эффекты, как описано в примерах ниже. Доза может представлять собой любое количество, пока она эффективна для индукции иммунитета. Когда агент используется для лечения и/или профилактики рака, например, в достаточном количестве, эффективном для лечения и/или профилактики рака, то такое количество может быть изменено, в зависимости от, например, массы тела, пола (т.е. мужского или женского), или симптома у животного. Количество, эффективное для лечения и/или профилактики рака, адекватно определяется в соответствии с размером опухоли, симптомами или другими состояниями. В целом, эффективное количество для животного-мишени в сутки составляет от 0,0001 мкг до 1000 мкг, а предпочтительно, от 0,001 мкг до 1000 мкг, и агент может вводиться одной дозой или множеством доз. Предпочтительно, агент вводится несколькими отдельными дозами в течение нескольких дней или месяцев. Как конкретно описано в примерах ниже, индуцирующий иммунитет агент по настоящему изобретению обеспечивает возможность обратного развития существующей опухоли. Таким образом, агент может оказывать противоопухолевые эффекты на небольшое число раковых клеток на ранней стадии развития. Его применение перед началом рака или после лечения ведет к предотвращению развития рецидива рака. В частности, индуцирующий иммунитет агент по настоящему изобретению может применяться для лечения и профилактики рака.
Индуцирующий иммунитет агент по настоящему изобретению может состоять из полипептида, или он может быть соответствующим образом смешан с добавкой, которая подходит для релевантной лекарственной формы, такой как фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, эксципиент или тому подобные. Способы получения агента и добавок, которые могут применяться, хорошо известны в области получения медицинских препаратов, и могут использоваться любые способы и добавки. Определенные примеры добавок включают без ограничения: разбавители, такие как физиологические буферные растворы; эксципиенты, такие как сахар, лактоза, кукурузный крахмал, фосфат кальция, сорбит и глицин; связывающие агенты, такие как сироп, желатин, смола акации, сорбит, поливинилхлорид и трагакант; и смазывающие вещества, такие как стеарат магния, полиэтиленгилколь, тальк и диоксид кремния. Примеры форм препаратов включают пероральные средства, такие как таблетки, капсулы, гранулы, порошки, и растворы сиропа, и парентеральные средства, такие как ингаляционные препараты, инъекционные препараты, суппозитории и жидкие лекарственные средства. Такие средства могут быть получены обычными способами.
Индуцирующий иммунитет агент по настоящему изобретению может применяться в комбинации с иммунопотенцирующим агентом, способным потенцировать иммунологическую реакцию in vivo.
Иммунопотенцирующий агент может быть включен в индуцирующий иммунитет агент по настоящему изобретению, или он может вводиться пациенту в виде другой композиции в комбинации с индуцирующим иммунитет агентом по настоящему изобретению.
Термин «пациент», используемый в настоящем описании, относится к животному, в частности, млекопитающему животному, и он предпочтительно представляет собой человека, собаку или кошку.
Примером иммунопотенцирующего агента является адъювант. Адъювант обеспечивает антигенный резервуар (вне клетки или в макрофаге), он активирует макрофаг, и он стимулирует лимфоциты в данной ткани. Таким образом, адъювант может потенцировать иммунологическую реакцию и усиливать противоопухолевые эффекты. Когда индуцирующий иммунитет агент по настоящему изобретению используется для лечения и/иди профилактики рака, соответственно, особенно предпочтительно, чтобы индуцирующий иммунитет агент, кроме того, содержал адъювант, в дополнение к полипептиду в качестве активного ингредиента. Различные типы адъювантов хорошо известны в данной области, и могут использоваться любые такие адъюванты. Их определенные примеры включают: MPL (SmithKline Beecham); эквивалент, полученный очисткой и кислотным гидролизом липополисахарида Salmonella minnesota Re 595; QS21 (SmithKline Beecham); чистый сапонин QA-21, очищенный из экстракта Quillja saponaria; DQS21, раскрытый в заявке PCT (WO 96/33739, SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 и QS-L1 (So et al., Molecules and Cells, 1997, 7: 178-186); неполный адъювант Фрейнда; полный адъювант Фрейнда; витамин E; монтанид; квасцы; олигонуклеотид CpG (например, Kreig et al., Nature, 1995, 374: 546-549); поли IC (иммунный комплекс) и его производные (например, поли ICLC); и различные эмульсии вода-в-масле, полученные из биологически разлагаемого масла, такие как сквален и/или токоферол. В частности, могут быть получены неполный адъювант Фрейнда, монтанид, поли I:C, его производное и CpG олигонуклеотид. Частота адъюванта, смешанного с полипептидом, составляет обычно примерно от 1:10 до 10:1, предпочтительно, примерно от 1:5 до 5:1, и, кроме того, предпочтительно примерно 1:1. Следует отметить, что адъюванты не ограничиваются иллюстрируемыми выше, и другие адъюванты, известные в данной области, могут также использоваться во время введения индуцирующего иммунитет агента по настоящему изобретению (например, смотрите публикацию Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, vol. 2, 1986). Способ получения смеси полипептида и адъюванта или эмульсии хорошо известен специалисту в области иммунизации.
В дополнение к указанным выше адъювантам, в качестве иммунопотенцирующего агента могут использоваться факторы, которые стимулируют представляющую интерес иммунологическую реакцию. Например, различные цитокины, которые стимулируют лимфоциты или антиген-презентирующие клетки, могут использоваться в качестве иммунопотенцирующего агента в комбинации с индуцирующим иммунитет агентом по настоящему изобретению. В данной области известно множество цитокинов, которые могут потенцировать иммунологические реакции. Их примеры включают без ограничения интерлейкин-12 (IL-12), GM-CSF, IL-18, интерферон α, интерферон β, интерферон ω, интерферон γ и лиганд Flt3, которые, как известно, потенцируют защитные эффекты вакцины. Такой фактор может использоваться в качестве иммунопотенцирующего агента и может вводиться пациенту в форме их смеси с индуцирующим иммунитет агентом по настоящему изобретению в виде другой композиции.
Антиген-презентирующая клетка
Кроме того, указанные выше полипептиды могут вводиться в контакт с антиген-презентирующими клетками in vitro для представления таких полипептидов антиген-презентирующим клеткам. В частности, полипептиды от (a) до (c) могут использоваться в качестве средств для обработки антиген-презентирующих клеток. Примеры антиген-презентирующих клеток включают дендритные клетки, B-клетки и макрофаги, и предпочтительно используются дендритные клетки или B-клетки, имеющие молекулы I класса MHC (главного комплекса гистосовместимости). Были идентифицированы разнообразные молекулы I класса MHC, и они хорошо известны. Молекулы человеческого MHC именуются «HLA» (человеческими лейкоцитарными антигенами). Примеры молекул I класса MHC включают HLA-A, HLA-B и HLA-C. Определенные примеры включают HLA-A1, HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401 и HLA-Cw0602.
Дендритные клетки или B-клетки, имеющие молекулы I класса MHC, могут быть получены из периферической крови хорошо известной методикой. Например, дендритные клетки индуцируются из костного мозга, крови пупочного канатика, или периферической крови пациента с использованием факторов, стимулирующих колонии гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF) и IL-3 (или IL-4), и к культуральной системе добавляются ассоциированные с опухолью пептиды. Таким образом, могут индуцироваться опухолеспецифические дендритные клетки.
2
Введение эффективного количества таких дендритных клеток обеспечивает возможность индукции реакции, желательной для лечения рака. Примеры клеток, которые могут использоваться, включают костный мозг и кровь пупочного канатика, предоставленную здоровым индивидом, и костный мозг и периферическую кровь пациента. Когда используются собственные аутологичные клетки пациента, уровень безопасности высок, и можно избежать серьезных побочных эффектов. Периферическая кровь или костный мозг может представлять собой свежий, хранившийся в гипотермических условиях или криоконсервированный образец. Периферическая кровь может быть получена культивированием цельной крови или культивированием отделенных лейкоцитарных компонентов, причем последние предпочтительны с точки зрения эффективности. Кроме того, мононуклеарные клетки могут быть выделены из лейкоцитарных компонентов. Когда образец получают из костного мозга или крови пупочного канатика, то могут культивироваться все клетки, которые составляют костный мозг, или из них могут отделяться и культивироваться мононуклеарные клетки. Периферическая кровь, ее лейкоцитарный компонент и клетки костного мозга содержат мононуклеарные клетки, гематопоэтические стволовые клетки, незрелые дендритные клетки или клетки CD4+, из которых происходят дендритные клетки. Цитокины могут быть естественно встречающимися или рекомбинантного генного типа, и способы их получения не ограничиваются, при условии, что были верифицированы их безопасность и виды физиологической активности. Предпочтительно, используется минимальное требование образцов с верифицированными медицинскими качествами. Концентрация добавляемого цитокина конкретно не ограничивается, при условии, что индуцируются дендритные клетки. В целом, предпочтительна общая концентрация цитокина приблизительно от 10 до 1000 нг/мл, и, кроме того, предпочтительна концентрация примерно от 20 до 500 нг/мл. Культивирование может проводиться с использованием хорошо известной среды, которая в целом используется для культивирования лейкоцитов. Температура культивирования конкретно не ограничивается при условии, что лейкоциты могут размножаться, и наиболее предпочтительна температура тела человека (т.е. приблизительно 37°C). Газообразная среда во время культивирования конкретно не ограничивается, при условии, что лейкоциты могут размножаться. Предпочтительна аэрация 5% CO. Кроме того, длительность культивирования конкретно не ограничивается, при условии, что индуцируется необходимое число клеток. Она в целом составляет от 3 дней до 2 недель. Для разделения и культивирования клеток может использоваться соответствующее устройство, и предпочтительно, чтобы такое устройство имело утвержденную медицинскую безопасность и возможность устойчивой и простой эксплуатации. В частности, устройства для клеточной культуры не ограничиваются обычными контейнерами, такими как чашки Петри, колбы и флаконы, и могут также использоваться ламинированные или многокамерные контейнеры, роликовые флаконы, центрифужные пробирки, устройство для культивирования мешочного типа, половолоконные колонки или тому подобные.
3
7
4
6
2
Указанные выше полипептиды могут вводиться в контакт с антиген-презентирующими клетками in vitro посредством хорошо известной методики. Например, антиген-презентирующие клетки могут культивироваться в культуральном растворе, содержащем такие полипептиды. Концентрация пептидов в среде конкретно не ограничивается. В целом, она составляет примерно от 1 до 100 мкг/мл, а предпочтительно, примерно от 5 до 20 мкг/мл. Плотность клеток во время культивирования конкретно не ограничивается и в целом составляет примерно от 10 до 10 клеток/мл, а предпочтительно, примерно от 5×10 до 5×10 клеток/мл. Предпочтительно, чтобы культивирование проводилось при 37°C в 5% CO в соответствии с обычной методикой. Длина пептида, который может присутствовать на поверхности антиген-презентирующей клетки, составляет в целом максимум приблизительно 30 аминокислотных остатков. Когда антиген-презентирующие клетки вводятся в контакт с полипептидами in vitro, то соответственно длина полипептида может регулироваться до примерно 30 аминокислотных остатков или менее, хотя длина конкретно не ограничивается ею.
Путем культивирования антиген-презентирующих клеток в присутствии полипептидов, пептиды включаются в молекулы MHC антиген-презентирующих клеток и представлены на их поверхности. Таким образом, изолированные антиген-презентирующие клетки, содержащие комплекс полипептидов и молекул MHC, могут быть получены с использованием таких полипептидов. Такие антиген-презентирующие клетки могут представлять полипептиды Т-клеткам in vivo или in vitro, индуцировать цитотоксические Т-клетки, специфичные для полипептидов, и размножать такие Т-клетки.
7
4
6
2
Полученные таким образом антиген-презентирующие клетки, содержащие комплекс полипептидов и молекул MHC, могут быть введены в контакт с Т-клетками in vitro, чтобы могли индуцироваться и размножаться цитотоксические Т-клетки, специфичные для таких полипептидов. Это может быть достигнуто культивированием антиген-презентирующих клеток вместе с Т-клетками в жидкой среде. Например, культивирование может проводиться суспендированием антиген-презентирующих клеток, введением полученной суспензии в контейнер, такой как лунки микропланшета, и добавлением к ним Т-клеток. Отношение смешивания антиген-презентирующих клеток к Т-клеткам во время кокультивирования конкретно не ограничивается, и оно в целом составляет примерно от 1:1 до 1:10, а предпочтительно, примерно от 1:5 до 1:20 с точки зрения количества клеток. Также, плотность антиген-презентирующих клеток, суспрендированных в жидкой среде, конкретно не ограничивается, и она в целом составляет от 100 до 10 клеток/мл, а предпочтительно, примерно от 10 до 10 клеток/мл. Кокультивирование предпочтительно проводится в соответствии с обычной методикой при 37°C в 5% CO. Длительность культивирования конкретно не ограничивается и в целом составляет от 2 дней до 3 недель, а предпочтительно, примерно от 4 дней до 2 недель. Предпочтительно, чтобы кокультивирование проводилось в присутствии одного типа или множества типов интерлейкинов, таких как IL-2, IL-6, IL-7 и IL-12. В таком случае, концентрация IL-2 или IL-7 составляет в целом примерно от 5 Ед/мл до 20 Ед/мл, концентрация IL-6 составляет в целом примерно от 500 Ед/мл до 2000 Ед/мл, и концентрация IL-12 составляет в целом примерно от 5 нг/мл до 20 нг/мл, хотя концентрация не ограничивается ею. Используемая в настоящем описании единица «Ед» указывает единицу активности. Кокультивирование может повторяться один или несколько раз с добавлением свежих антиген-презентирующих клеток. Например, супернатант культуры после кокультивирования удаляется, кокультивирование далее проводится с добавлением суспензии свежих антиген-презентирующих клеток, и такая процедура может повторяться один или несколько раз. Условия кокультивирования могут быть такими, как описано выше.
Цитотоксические Т-клетки, специфичные для полипептидов, индуцируются и размножаются посредством кокультивирования. Таким образом, изолированные Т-клетки, которые селективно связываются с комплексом полипептидов и молекул MHC, могут быть получены с использованием указанных выше полипептидов.
Как описано ниже в разделе "Примеры", гены, кодирующие полипептиды любого четного номера SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30, специфически экспрессированы в клетках рака молочной железы, лейкозных клетках и клетках лимфомы. Соответственно, считается, что значительно большее число полипептидов четных номеров SEQ ID среди SEQ ID NO:2-30 присутствует в раковых клетках, чем в нормальных клетках. Когда некоторые полипептиды в раковых клетках представляются молекулам MHC на поверхности раковых клеток, и цитотоксические Т-клетки, полученные, как описано выше, вводятся в живой организм, цитотоксические Т-клетки могут разрушать раковые клетки, используя их в качестве маркера. Поскольку антиген-презентирующие клетки, представляющие полипептиды, способны индуцировать и размножать цитотоксические Т-клетки, специфичные в отношении полипептидов in vivo, то введение антиген-презентирующих клеток в живой организм может также разрушить раковые клетки. То есть цитотоксические Т-клетки, полученные с использованием полипептидов или антиген-презентирующих клеток, могут использоваться в качестве терапевтического и/или профилактического средства при раке, как и индуцирующий иммунитет агент по настоящему изобретению.
Когда выделенные антиген-презентирующие клетки или выделенные Т-клетки вводятся в живой организм, то предпочтительно, чтобы такие выделенные клетки были получены из антиген-презентирующих клеток или Т-клеток, взятых в качестве пробы у пациента, который получает лечение с применением полипептидов от (a) до (c), во избежание иммунологической реакции, которая распознает такие клетки в качестве инородного материала, и атакует такие клетки in vivo.
13
6
9
Путь введения терапевтического и/или профилактического средства при раке, содержащего в качестве активного ингредиента антиген-презентирующие клетки или выделенные Т-клетки, представляет собой предпочтительно парентеральный путь, такой как внутривенное или внутриартериальное введение. Дозировку адекватно выбирают в соответствии с симптомом, целью введения и другими условиями, и для введения используют в целом от 1 до 10 клеток, а предпочтительно, от 10 до 10 клеток, и такие клетки предпочтительно вводят один раз в несколько дней или несколько месяцев. Препарат может представлять собой, например, суспензию клеток в физиологическом забуференном солевом растворе, и может применяться в комбинации с другими противоопухолевыми средствами или цитокинами. Также может добавляться одна или более добавок, хорошо известных в области получения медицинских препаратов.
Вакцина на генной основе
Полинуклеотиды, кодирующие полипептиды от (a) до (c), могут быть экспрессированы в организме животного-мишени, чтобы могла индуцироваться продукция цитотоксических Т-клеток в организме. И могут быть достигнуты эффекты, эквивалентные тем, которые достигаются посредством введения полипептидов. В частности, индуцирующий иммунитет агент по настоящему изобретению может содержать полинуклеотиды, кодирующие полипептиды от (a) до (c), и содержать в качестве активного агента рекомбинантный вектор, способный экспрессировать такой полипептид in vivo. Такой рекомбинантный вектор, способный экспрессировать антигенный полипептид, также именуется «вакциной на генной основе».
Вектор, используемый для получения вакцины на генной основе, конкретно не ограничивается, при условии, что он может экспрессировать представляющие интерес полипептиды в клетках животного-мишени (предпочтительно, клетках млекопитающего животного). Он может представлять собой плазмидный или вирусный вектор, и может использоваться любой вектор, известный в области вакцин на генной основе. Полинуклеотиды, такие как ДНК или РНК, кодирующие полипептиды, могут быть легко получены в соответствии с обычной методикой, как описано выше. Также, полинуклеотиды могут быть включены в вектор способом, хорошо известным в данной области.
Предпочтительно, вакцина на генной основе вводится парентерально (например, внутримышечным, подкожным, внутривенным или внутриартериальным введением), и дозировка может быть адекватно выбрана в соответствии с типом антигена или другими условиями. Дозировка в целом составляет примерно от 0,1 мкг до 100 мг, а предпочтительно, примерно от 1 мкг до 10 мг, с точки зрения массы вакцины на генной основе на кг массы тела.
Примеры способов, включающих использование вирусных векторов, включают способы, в которых полинуклеотид, кодирующий указанный выше полипептид, включен в вирус РНК или вирус ДНК, такой как ретровирус, лентивирус, аденовирус, адено-ассоциированный вирус, герпесвирус, вирус ветряной оспы, поксвирус, вирус полиомиелита или вирус Синдбис, и животное-мишень инфицировано им. Особенно предпочтительны способы, включающие применение ретровируса, аденовируса, адено-ассоциированного вируса или вируса ветряной оспы.
Примеры других способов включают способ, в котором экспрессионная плазмида непосредственно вводится в мышцу (способ ДНК-вакцины), липосомный способ, липофектиновый способ, микроинъекцию, кальций-фосфатный способ и электропорообразование, причем способ ДНК-вакцины и липосомный способ особенно предпочтительны.
Гену, кодирующему полипептид, используемый в настоящем изобретении, в действительности предоставляется возможность функционирования в качестве фармацевтического продукта способом in vivo, при котором ген вводится непосредственно в организм, или способом ex vivo, при котором данная клетка берется в качестве пробы у животного-мишени, ген вводится в клетку ex vivo, и затем клетка возвращается в организм (Nikkei Science (японская версия журнала Scientific American), April 1994, pp. 20-45, Japan; Gekkan Yakuji (the Pharmaceuticals Monthly), 1994, vol. 36, No. 1, pp. 23-48, Japan; Jikken Igaku Zoukan (дополнительный номер журнала Experimental Medicine), 1994, vol. 12, No. 15, Japan; и документы, приведенные в них в качестве ссылок). Более предпочтителен способ in vivo.
Если фармацевтическое средство вводится посредством способа in vivo, то средство может вводиться соответствующим удобным путем в зависимости от заболеваний, симптомов и другими условиями мишени лечения. Например, введение может осуществляться внутривенно, внутриартериально, подкожно или внутримышечно. Когда средство вводится способом in vivo, то, например, средство может быть представлено в форме жидкого лекарственного средства. В целом, средство представлено в форме препарата для инъекций, содержащего ДНК, кодирующую пептид по настоящему изобретению, в качестве активного ингредиента, и обычные носители могут добавляться в соответствии с потребностью. Также, липосома или мембранная слитая липосома (например, гемагглютинирующий вирус японской (HVJ)-липосомы), содержащая ДНК, может быть представлена в форме липосомного препарата, такого как суспензия, криоген или криоген, конденсированный центрифугированием.
В настоящем изобретении термин «нуклеотидная последовательность, показанная SEQ ID NO:1», относится не только к нуклеотидной последовательности, которая действительно показана SEQ ID NO:1, но также к последовательности, комплементарной ей. Соответственно, термин «полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, показанную SEQ ID NO:1», относится к однонитевому полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность, которая действительно показана SEQ ID NO:1, однонитевому полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность, комплементарную ей, и двухнитевой полинуклеотид, состоящий из таких однонитевых полинуклеотидов. При получении полинуклеотида, кодирующего полипептид, используемый в настоящем изобретении, следует выбрать адекватную нуклеотидную последовательность. Специалист в данной области может легко выбрать такую адекватную последовательность.
ПРИМЕРЫ
Далее, настоящее изобретение описано более детально со ссылкой на примеры, хотя технический объем настоящего изобретения не ограничивается приведенными ниже конкретными примерами.
Пример 1: Получение нового ракового антигенного белка способом SEREX
(1) Получение библиотеки кДНК
Общее количество РНК экстрагировали из семенниковой ткани здоровой собаки способом с использованием гуанидия-фенола-хлороформа в кислых условиях, и поли(A) РНК очищали с использованием набора для очистки мРНК Oligotex-dT30 mRNA purification Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.), в соответствии с протоколами, включенными в набор.
5
Библиотека фагов кДНК собачьих семенников была синтезирована с использованием полученной мРНК (5 мкг). Библиотека фагов кДНК была получена с использованием набора для синтеза кДНК ZAP-cDNA Synthesis Kit, и набора клонирования ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE), в соответствии с протоколами, включенными в наборы. Размер полученной библиотеки фагов кДНК составил 7,73×10 pfu (бляшкообразующих единиц)/мл.
(2) Скрининг библиотеки кДНК с использованием сыворотки
Иммуноскрининг проводили с использованием полученной выше библиотеки фагов кДНК собачьих семенников. В частности, клетки-хозяева E. coli (XL1-Blue MRF’) инъецировали библиотекой фагов при 2210 клонах на агарозную чашку NZY (Φ90×15 мм), культивировали при 42°C в течение 3-4 часов для образования бляшек, чашку покрывали микроцеллюлозной мембраной (Hybond C Extra: GE Healthcare Bio-Science). Инфильтрировали IPTG (изопропил-β-D-тиогалактозидом) при 37°C в течение 4 часов для индукции и экспрессии белков, и белки переносили на мембрану. Затем мембрану извлекали, погружали в TBS (буферный раствор триэтаноламина), содержащий 0,5% сушеного снятого молока (10 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,5), и встряхивали при 4°C в течение ночи для блокирования неспецифической реакции. Фильтру давали возможность взаимодействовать с разбавленной в 500 раз сывороткой собаки с клинически выраженным поражением при комнатной температуре в течение 2-3 часов.
3
В качестве сыворотки собаки с клинически выраженным поражением использовали сыворотку, взятую у собаки, страдающей раком молочной железы. Образцы сыворотки хранили при -80°C и предварительно обрабатывали непосредственно перед применением. Образцы сыворотки предварительно обрабатывали следующим образом. В частности, клетки-хозяева E. coli (XL1-BLue MRF’) инфицировали экспрессионными фагами λ ZAP Express, в которые не были введены чужеродные гены, и культивирование затем проводили на среде NZY в чашке при 37°C в течение ночи. В последующем, в чашку добавляли буфер 0,2 M NaHCO (pH 8,3), содержащий 0,5 M NaCl, чашке давали возможность отстояться при 4°C в течение 15 часов, и супернатант извлекали в виде экстракта E. coli/фага. В последующем, извлеченному экстракту E. coli/фага давали возможность протечь через колонку NHS (GE Healthcare Bio-Science), и белки, полученные из E. coli/фагов были иммобилизованы на ней. Сыворотке собаки с клинически выраженным поражением давали возможность протечь через колонку с иммобилизованным белком для взаимодействия с ним, и антитела, которые адсорбировались к E. coli и фагам, и удалялись из сыворотки. Сывороточную фракцию, которая протекала через колонку, разбавляли в 500 раз TBS, содержащей 0,5% сушеного снятого молока, и полученный материал использовали в качестве образца иммуноскрининга.
4
Мембрану, на которую наносили такую обработанную сыворотку и указанный выше слитый белок, промывали 4 раза TBS-T (0,05% Tween 20/TBS), козьим антисобачьим IgG (козий антисобачий IgG-h+I HRP сопряженно связанный: BETHYL Laboratories), которые были разбавлены в 5000 раз TBS, содержащим 0,5% сушеное снятое молоко в качестве вторичного антитела, давали возможность взаимодействовать с ним при комнатной температуре в течение 1 часа, выявление проводили посредством ферментной реакции с изменением цвета, используя реакционный раствор NBT/BCIP (Roche), колонии, которые соответствуют области, положительной в отношении изменения цвета, удаляли из агарозной чашки NZY (Φ90×15 мм), и удаленные колонии растворяли в 500 мкл буфера SM (100 мМ NaCl, 10 мМ MgClSO, 50 мМ Tris-HCl, 0,01% желатин, pH 7,5). Вторичные и третичные скрининги повторяли до тех пор, пока положительные по изменению цвета колонии не представляли одиночные клоны, таким же образом, как описано выше, и 5 положительных клонов выделяли в результате скрининга 30940 клонов фагов, которые взаимодействуют с IgG в сыворотке.
(3) Поиск гомологии гена выделенного антигена
600
600
Для того, чтобы 5 положительных клонов, выделенных описанным выше образом, подвергнуть анализу нуклеотидной последовательности, фаговые векторы были превращены в плазмидные векторы. В частности, 200 мкл раствора клеток-хозяев E. coli (XL1-Blue MRF’), корригированный при OD 1,0, смешивали с 250 мкл очищенного раствора фага и 1 мкл хелперного фага ExAssist (STRATAGENE), полученный раствор подвергали взаимодействию при 37°C в течение 15 минут, добавляли 3 мл среды LB, культивирование проводили при 37°C в течение 2,5-3 часов, продукт культивирования инкубировали в водяной бане при 70°C в течение 20 минут непосредствен после этого, полученный материал центрифугировали при 4°C и 1000×g в течение 15 минут, и супернатант извлекали в виде раствора фагемидного вектора. В последующем, 200 мкл раствора фагемидного хозяина E. coli (SOLR), корригированного при OD 1,0 смешивали с 10 мкл раствора очищенного фага, полученный материал подвергали взаимодействию при 37°C в течение 15 минут, 50 мкл этого раствора высевали на агаровую среду LB, содержащую ампициллин (конечная концентрация: 50 мкг/мл), и культивирование проводили при 37°C в течение ночи. Одиночную колонию трансформированных SOLR собирали и культивировали в агаровой среде LB, содержащей ампициллин (конечная концентрация: 50 мкг/мл) при 37°C, и плазмидную ДНК, имеющую представляющую интерес вставку, очищали с использованием плазмидного набора QIAGEN Miniprep Kit (QIAGEN).
Очищенную плазмиду подвергали анализу представляющей интерес последовательности полной длины посредством скрининга праймера с использованием праймера T3 SEQ ID NO:31 и праймера T7 SEQ ID NO:32. Генные последовательности, показанные SEQ ID NO:5, 7, 9, 11 и 13, были получены посредством анализа последовательностей. Нуклеотидные последовательности генов и их аминокислотные последовательности (SEQ ID NO:6, 8, 10, 12 и 14) использовали для выполнения поиска гомологии с известными генами с использованием программы поиска гомологии, BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Было обнаружено, что все 5 полученных генов кодируют CAPRIN-1. Идентичность последовательностей среди 5 генов была следующей: идентичность нуклеотидных последовательностей 100% и идентичность аминокислотных последовательностей 99% в областях, подлежащих трансляции в белки. Идентичность последовательности гена с геном, кодирующим человеческий гомолог, была следующей: идентичность нуклеотидных последовательностей 94% и идентичность аминокислотных последовательностей 98% в областях, подлежащих трансляции в белки. Нуклеотидные последовательности человеческих гомологов показаны SEQ ID NO:1 и 3, а их аминокислотные последовательности показаны SEQ ID NO:2 и 4. Идентичность последовательностей полученного собачьего гена с геном, кодирующим бычий гомолог, была следующей: идентичность нуклеотидных последовательностей 94% и идентичность аминокислотных последовательностей 97% в областях, подлежащих трансляции в белки. Нуклеотидная последовательность бычьего гомолога показана SEQ ID NO:15, а его аминокислотная последовательность показана SEQ ID NO:16. Идентичность последовательностей между геном, кодирующим человеческий гомолог, и геном, кодирующим бычий гомолог, была следующей: идентичность нуклеотидных последовательностей 94% и идентичность аминокислотных последовательностей от 93% до 97% в областях, подлежащих трансляции в белки. Идентичность последовательностей полученного собачьего гена с геном, кодирующим лошадиный гомолог, была следующей: идентичность нуклеотидных последовательностей 93% и идентичность аминокислотных последовательностей 97% в областях, подлежащих трансляции в белки. Нуклеотидная последовательность лошадиного гомолога показана SEQ ID NO:17, а его аминокислотная последовательность показана SEQ ID NO:18. Идентичность последовательностей между геном, кодирующим человеческий гомолог, и геном, кодирующим лошадиный гомолог, была следующей: идентичность нуклеотидных последовательностей 93% и идентичность аминокислотных последовательностей 96% в областях, подлежащих трансляции в белки. Идентичность последовательностей полученного собачьего гена с геном, кодирующим мышиный гомолог, была следующей: идентичность нуклеотидных последовательностей от 87% до 89% и идентичность аминокислотных последовательностей от 95% до 97% в областях, подлежащих трансляции в белки. Нуклеотидные последовательности мышиных гомологов показаны SEQ ID NO:19, 21, 23, 25 и 27, а их аминокислотные последовательности показаны SEQ ID NO:20, 22, 24, 26 и 28. Идентичность последовательностей между геном, кодирующим человеческий гомолог, и геном, кодирующим мышиный гомолог, была следующей: идентичность нуклеотидных последовательностей от 89% до 91% и идентичность аминокислотных последовательностей от 95% до 96% в областях, подлежащих трансляции в белки. Идентичность последовательностей полученного собачьего гена с геном, кодирующим куриный гомолог, была следующей: идентичность нуклеотидных последовательностей 82% и идентичность аминокислотных последовательностей 87% в областях, подлежащих трансляции в белки. Нуклеотидная последовательность куриного гомолога показана SEQ ID NO:29, а ее аминокислотная последовательность показана SEQ ID NO:30. Идентичность последовательностей между геном, кодирующим человеческий гомолог, и геном, кодирующим куриный гомолог, была следующей: идентичность нуклеотидных последовательностей от 81% до 82% и идентичность аминокислотных последовательностей 86% в областях, подлежащих трансляции в белки.
(4) Анализ экспрессии генов в ткани
6
Экспрессию генов, полученных описанным выше образом, в собачей и человеческой нормальной ткани и различных клеточных штаммах исследовали посредством обратной транскрипции/ПЦР (RT-PCR). Обратную транскрипцию проводили следующим образом. В частности, общую РНК экстрагировали из 50-100 мг образцов ткани и 5-10×10 клеточных штаммов с использованием реагента TRIzol (Invitrogen), в соответствии с включенной в него последовательностью операций. кДНК синтезировали с использованием экстрагированной общей РНК с использованием системы для синтеза Superscript First-Strand Synthesis System для RT-PCR (Invitrogen), в соответствии с включенной в него последовательностью операций. ПЦР проводили с использованием затравок, специфических для полученных генов (показанных SEQ ID NO:33 и 34) следующим образом. В частности, реагенты (0,25 мкл образца, полученного посредством обратной транскрипции, 2 мкМ каждой из затравок, 0,2 мМ каждого из dNTP и 0,65 Ед полимеразы ExTaq (Takara Shuzo Co., Ltd.)) смешивали с сопровождающим буфером для коррекции с целью соответствия общему объему 25 мкл. Полученный раствор подвергали реакции из 30 циклов при 94°C в течение 30 секунд, 60°C в течение 30 секунд и 72°C в течение 30 секунд с использованием устройства Thermal Cycler (BIO RAD). Указанные выше специфические для генов праймеры использовали для амплификации области нуклеотидов от 206 до 632 нуклеотидной последовательности, показанной SEQ ID NO:5 (т.е. собачьего гена CAPRIN-1) и области нуклеотидов от 698 до 1124 нуклеотидной последовательности, показанной SEQ ID NO:1 (т.е. человеческого гена CAPRIN-1). Для сравнения, одновременно использовали GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа)-специфические праймеры (как показано SEQ ID NO:35 и 36). В результате, наблюдали мощную экспрессию в ткани семенников здоровых собак, и экспрессия наблюдалась в ткани рака молочной железы и аденокарциономы собак, как показано на фиг.1. Далее, также исследовали экспрессию человеческого гомолога полученного гена, и его экспрессию наблюдали только в семенниках в случае нормальной ткани, как и в случае собачьего гена CAPRIN-1. Однако его экспрессия была выявлена в широком разнообразии линий раковых клеток, таких как линии клеток рака молочной железы, опухоли мозга, лейкоза, рака легких и рака пищевода, и, в частности, его экспрессия наблюдалась во многих линиях клеток рака молочной железы. Эти результаты демонстрируют, что экспрессия CAPRIN-1 не наблюдается в нормальных тканях, отличных от ткани семенников, однако, CAPRIN-1 экспрессирован во многих раковых клетках и линиях клеток рака молочной железы, в частности.
На фиг.1 ссылочная позиция 1 на вертикальной оси показывает тип экспрессии идентифицированного выше гена, а ссылочная позиция 2 показывает тип экспрессии контрольного гена GAPDH.
(5) Иммуногистохимическое окрашивание
(5)-1: Экспрессия CAPRIN-1 в нормальной собачей и мышиной ткани
2
2
У мышей (Balb/c, самки) и собак (бигли, самки) проводили кровопускание под эфирным наркозом и в условиях кетаминово/изофлюрановой общей анестезии, вскрывали брюшную полость и органы (желудок, печень, глазные яблоки, тимус, мышцы, костный мозг, матку, тонкую кишку, пищевод, сердце, почки, слюнные железы, толстую кишку, молочные железы, легкие, надпочечники, яичники, поджелудочную железу, селезенку и мочевой пузырь) независимо переносили в чашку диаметром 10 см, содержащую PBS (солевой раствор с фосфатным буфером). Органы разрезали в PBS и иммобилизовали 0,1 M фосфатным буфером, содержащим 4% параформальдегид (PFA) (pH 7,4) в условиях кипячения в сосуде с обратным холодильником в течение ночи. Рециркулирующий раствор удаляли, поверхности тканей органов промывали PBS, раствор PBS, содержащий 10% сахарозу, вливали в центрифужную пробирку емкостью 50 мл, и ткани помещали в нее и встряхивали при 4°C в течение 2 часов, используя ротор. Полученный материал переносили в раствор PBS, содержащий 20% сахарозу, ему давали возможность отстояться при 4°C до осаждения ткани и затем переносили в раствор PBS, содержащий 30% сахарозу, и давали возможность отстояться при 4°C до осаждения ткани. Ткани удаляли, и необходимые области иссекали, используя хирургический скальпель. Затем соединение OCT (для достижения оптимальной температуры производства срезов) (Tissue Tek) наносили на поверхность ткани, и ткани затем помещали на криоформу Cryomold. После помещения Cryomold на сухой лед и быстрого замораживания, делали срезы ткани до толщины от 10 мкм до 20 мкм, используя криостат (LEICA), и срезы ткани на предметных стеклах сушили воздухом с помощью фена для волос в течение 30 минут для получения предметных стекол с находящимися на них срезами тканей. Затем предметные стекла помещали в сосуд для окрашивания, заполненный PBS-T (физиологическим солевым раствором, содержащим 0,05% Tween 20), PBS-T замещали свежим PBS-T через каждые 5 минут, и эту процедуру повторяли 3 раза. Лишнюю влагу вокруг срезов промокали и удаляли, используя впитывающие влагу салфетки Kimwipes, срезы очерчивали вокруг Dakopen (DAKO), на мышиную ткань наносили реагент MOM, блокирующий мышиный Ig (VECTASTAIN), в качестве блокирующего раствора, на собачью ткань наносили раствор PBS-T, содержащий 10% фетальную телячью сыворотку, в качестве блокирующего раствора, и им давали возможность отстояться во влажной камере при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем на него наносили раствор, скорригированный для содержания моноклонального антитела против CAPRIN-1, имеющее вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:78, и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:79, в концентрации 10 мкг/мл с блокирующим раствором, который взаимодействует с поверхностью раковых клеток, полученных в справочном примере 1, и полученному материалу давали возможность отстояться во влажной камере при 4°C в течение ночи. После промывания предметных стекол 3 раза PBS-T в течение 10 минут, добавляли меченое биотином анти-IgG антитело MOM (VECTASTAIN), разбавленное в 250 раз блокирующим раствором, и затем давали возможность отстояться во влажной камере при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывания предметных стекол 3 раза PBS-T в течение 10 минут, на них наносили авидин-биотиновый реагент ABC (VECTASTAIN), и предметным стеклам давали возможность отстояться во влажной среде при комнатной температуре в течение 5 минут. После промывания предметных стекол 3 раза PBS-T в течение 10 минут, на них наносили меняющий окраску раствор DAB (3,3’-диаминбензидина) (10 мг DAB + 10 мкл 30% HO/0,05 M Tris-HCl, pH 7,6, 50 мл), и предметным стеклам давали возможность отстояться во влажной среде при комнатной температуре в течение 30 минут. Предметные стекла промывали дистиллированной водой, на них наносили гематоксилиновый реагент (DAKO), и предметным стеклам давали возможность отстояться при комнатной температуре в течение 1 минуты с последующим споласкиванием дистиллированной водой. Предметные стекла последовательно погружали в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% растворы этанола по 1 минуте в каждый и затем давали возможность отстояться в ксилоле в течение ночи. Предметные стекла удаляли, на них наносили гелевую среду для гистологических срезов Glycergel Mounting Medium (DAKO) и изучали под микроскопом. В результате наблюдали слабую экспрессию CAPRIN-1 внутри клеток тканей слюнных желез, почек, толстой кишки и желудка; однако его экспрессия не наблюдалась на клеточных поверхностях, и не наблюдалась экспрессия в тканях, полученных из других органов.
(5)-2: Экспрессия CAPRIN-1 в ткани рака молочной железы собак
108 замороженных образцов ткани рака молочной железы собак, у которых был диагностирован рак молочной железы посредством патологоанатомической диагностики, использовали для получения предметных стекол, содержащих на них замороженные срезы, и проведения иммуногистохимического окрашивания с использованием моноклонального антитела против CAPRIN-1, имеющего вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:78, и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:79, таким же образом, как описано выше. В результате, экспрессия CAPRIN-1 наблюдалась в 100 из 108 образцов (92,5%), и было обнаружено, что экспрессия CAPRIN-1 особенно сильная на поверхности раковых клеток с высокой степенью атипизма.
(5)-3: Экспрессия CAPRIN-1 в ткани рака молочной железы человека
Иммуногистохимическое окрашивание проводили на 188 образцах ткани рака молочной железы на залитом в парафин чипом с набором информации о человеческой ткани рака молочной железы (BIOMAX). Чип с набором информации о человеческой ткани рака молочной железы обрабатывали при 60°C в течение 3 часов, чип вводили в сосуд для окрашивания, заполненный ксилолом, ксилол замещали свежим ксилолом через каждые 5 минут, и эту процедуру повторяли 3 раза. Затем аналогичные процедуры повторяли с использованием этанола и PBS-T вместо ксилола. Чип с набором информации о человеческой ткани рака молочной железы вводили в сосуд для окрашивания, заполненный 10 мМ цитратного буфера, содержащий 0,05% Tween 20 (pH 6,0), чип обрабатывали при 125°C в течение 5 минут, и чипу давали возможность отстояться при комнатной температуре по меньшей мере в течение 40 минут. Лишнюю влагу вокруг срезов удаляли с использованием салфеток Kimwipes, ткань очерчивали кругом, используя ручку Dakopen, и к ним по каплям добавляли адекватное количество блока пероксидазы Peroxidase Block (DAKO). После того как чипу была предоставлена возможность отстояться при комнатной температуре в течение 5 минут, чип вводили в сосуд для окрашивания, заполненный PBS-T, PBS-T замещали свежим PBS-T через каждые 5 минут, и эту процедуру повторяли 3 раза. Раствор PBS-T, содержащий 10% FBS, наносили на них в качестве блокирующего раствора, и ему давали возможность отстояться во влажной камере при комнатной температуре в течение 1 часа. Затем на него наносили раствор, корригированный для содержания моноклонального антитела против CAPRIN-1, имеющего вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:78, и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:79 в концентрации 10 мкг/мл раствором PBS-T, содержащим 5% FBS, который взаимодействует с поверхностью раковых клеток, полученной в справочном примере 1, и чипу давали возможность отстояться во влажной камере при 4°C в течение ночи. После промывания чипа 3 раза PBS-T в течение 10 минут, к нему по каплям добавляли адекватное количество меченного пероксидазой, сопряженно связанного с полимером (DAKO), и чипу затем была предоставлена возможность отстояться во влажной камере при комнатной температуре в течение 30 минут. После промывания чипа 3 раза PBS-T в течение 10 минут, на него наносили вызывающий изменение цвета раствор DAB (DAKO), чипу была предоставлена возможность отстояться при комнатной температуре в течение примерно 10 минут, и вызывающий изменение цвета раствор удаляли. Чип промывали 3 раза PBS-T в течение 10 минут, споласкивали дистиллированной водой, последовательно погружали в растворы 70%, 80%, 90%, 95% и 100% этанола в каждый в течение 1 минуты и затем давали возможность отстояться в ксилоле в течение ночи. Предметные стекла удаляли, на них наносили гелевую среду для гистологических срезов Glycergel Mounting Medium (DAKO) и изучали под микроскопом. В результате, наблюдали сильную экспрессию CAPRIN-1 в 138 из всех 188 образцов ткани рака молочной железы (73%).
(5)-4: Экспрессия CAPRIN-1 в злокачественной опухоли мозга человека
Иммуногистохимическое окрашивание проводили на 247 образцах ткани злокачественных опухолей мозга на залитом в парафин чипе с набором информации о ткани злокачественных опухолей мозга человека (BIOMAX) моноклональным антителом против CAPRIN-1, имеющим вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:78, и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:79, таким же образом, как в описанном выше разделе (5)-3. В результате, сильную экспрессию CAPRIN-1 наблюдали в 227 из общего числа 247 образцов ткани злокачественных опухолей мозга человека (92%).
(5)-5: Экспрессия CAPRIN-1 в лимфоузле, пораженном метастазом опухоли молочной железы
Иммуногистохимическое окрашивание проводили на 150 образцах ткани лимфоузлов, пораженных метастазами рака молочной железы, на залитом в парафин чипе с набором информации о ткани лимфоузлов, пораженных метастазами рака молочной железы (BIOMAX), моноклональным антителом против CAPRIN-1, имеющим вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:78, и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:79, таким же образом, как в описанном выше разделе (5)-3. В результате, сильную экспрессию CAPRIN-1 наблюдали в 136 из общего числа 150 образцов ткани образцах ткани лимфоузлов, пораженных метастазами рака молочной железы (90%). Было обнаружено, что экспрессия CAPRIN-1 была сильно выражена в раковой ткани, метастазирующей из рака молочной железы.
Справочный пример 1: Получение моноклонального антитела против CAPRIN-1
2
100 мкг антигенного белка SEQ ID NO:2, полученного в примере 2 (человеческого CAPRIN-1) смешивали с эквивалентным количеством адъюванта MPL+TDM (Sigma Corporation), и смесь использовали в качестве раствора антигена на мышь. Раствор антигена вводили внутрибрюшинно 6-недельным мышам Balb/c (Japan SLC, Inc.), и раствор вводили еще 3 раза каждую неделю. Селезенку, удаленную через 3 дня после последней иммунизации, помещали между двумя стерилизованными предметными стеклами, измельчали, промывали PBS(-) (Nissui) и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут и супернатант удаляли. Эту процедуру повторяли 3 раза для получения клеток селезенки. Полученные клетки селезенки смешивали с клетками мышиной миеломы SP2/0 (закупленными в ATCC (Американской Коллекции Типовых Культур)) в соотношении 10:1, к ним добавляли раствор PEG (полиэтиленгликоля), полученный смешиванием 200 мкл среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS, с 800 мкл PEG1500 (Boehringer), нагретого при 37°C, и полученному материалу давали возможность отстояться в течение 5 минут для выполнения слияния клеток. Полученный материал центрифугировали при 1700 об/мин в течение 5 минут, супернатант удаляли. Клетки суспендировали в 150 мл среды RPMI 1640, содержащей 15% FBS, к которой добавляли 2% эквивалента раствора HAT (гипоксантина-аминофенина-тимидина) (Gibco) (селекционная среда HAT), и по 100 мкл каждой из них высевали на лунку 15 96-луночных планшетов (Nunc). Культивирование проводили в течение 7 дней при 37°C в 5% CO для получения гибридом в результате слияния селезеночных клеток с клетками миеломы.
Гибридомы отбирали с использованием аффинитета связывания антитела, продуцируемого полученными гибридомами, с белком CAPRIN-1 в качестве индикатора. Раствор белка CAPRIN-1 (1 мкг/мл), полученный в примере 2, добавляли в 96-луночный планшет в количествах 100 мкл на лунку, и планшету давали возможность отстояться при 4°C в течение 18 часов. Лунки промывали 3 раза PBS-T, добавляли 0,5% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) (Sigma Corporation) в количествах 400 мкл на лунку. И планшету давали возможность отстояться при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор удаляли, лунки промывали 3 раза 400 мкл PBS-T на лунку, культуральный супернатант гибридом, полученных выше, добавляли в количествах 100 мкл на лунку, и планшету давали возможность отстояться при комнатной температуре в течение 2 часов. После промывания лунок 3 раза PBS-T, меченное HRP (пероксидазой хрена) антитело против мышиного IgG (H+L) (Invitrogen), разбавленное в 5000 раз PBS, добавляли в количествах 100 мкл на лунку, и планшету давали возможность отстояться при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывания лунок 3 раза PBS-T, добавляли субстратный раствор TMB (тетраметилбензидина) (Thermo) в количествах 100 мкл на лунку, и планшету давали возможность отстояться в течение 15-30 минут для выполнения реакции с изменением цвета. После изменения цвета добавляли 1 н. серную кислоту в количествах 100 мкл на лунку для прекращения реакции, и спектральную поглощательную способность при 450 нм и при 595 нм анализировали с использованием абсорбционного спектрометра. В результате были выбраны множественные продуцирующие антитела гибридомы с большими величинами спектральной поглощательной способности.
Выбранные гибридомы добавляли в 96-луночный планшет в количествах 0,5 клеток на лунку и культивировали. Через одну неделю наблюдалось, что некоторые гибридомы образовали одиночные колонии в лунках. Клетки в таких лунках культивировали далее, и гибридомы выбирали с использованием аффинитета связывания продуцируемых клонированными гидридомами антител против белка CAPRIN-1 в качестве индикатора. Раствор белка CAPRIN-1 (1 мкг/мл), полученный в примере 2, добавляли в 96-луночный планшет в количествах 100 мкл на лунку, и планшету давали возможность отстояться при 4°C в течение 18 часов. После промывания лунок 3 раза PBS-T, добавляли 0,5% раствор BSA в количествах 400 мкл на лунку, и планшету давали возможность отстояться при комнатной температуре в течение 3 часов. Раствор удаляли, лунки промывали 3 раза 400 мкл PBS-T на лунку, культуральный супернатант гибридом, полученных выше, добавляли в количествах 100 мкл на лунку, и планшету давали возможность отстояться при комнатной температуре в течение 2 часов. После промывания лунок 3 раза PBS-T, меченное HRP антитело против мышиного IgG (H+L) (Invitrogen), разбавленное в 5000 раз PBS, добавляли в количествах 100 мкл на лунку, и планшету давали возможность отстояться при комнатной температуре в течение 1 часа. После промывания лунок 3 раза PBS-T, добавляли субстратный раствор TMB (Thermo) в количествах 100 мкл на лунку, и планшету давали возможность отстояться в течение 15-30 минут для выполнения реакции с изменением цвета. После изменения цвета добавляли 1 н. серную кислоту в количествах 100 мкл на лунку для прекращения реакции, и спектральную поглощательную способность при 450 нм и при 595 нм анализировали с использованием абсорбционного спектрометра. В результате были получены множественные продуцирующие моноклональные антитела штаммы гибридомы, проявляющие реактивность с белком CAPRIN-1 культуральные супернатанты гибридом очищали, используя белок G как носитель, для получения 150 моноклональных антител, связывающихся с белком CAPRIN-1.
6
Затем моноклональные антитела, обладающие реактивностью с поверхностями раковых клеток молочной железы, экспрессирующих CAPRIN-1, выбирали среди указанных выше моноклональных антител. В частности, 10 клеток линии клеток рака молочной железы человека, MDA-MB-231V, центрифугировали в центрифужных микропробирках емкостью 1,5 мл, к ним добавляли 100 мкл супернатантов гибридом, полученных выше, и полученным материалам давали возможность отстояться на льду в течение 1 часа. После промывания планшета PBS, добавляли меченное FITC (флюоресцеином изотиоцианатом) козье антитело против мышиного IgG (Invitrogen), разбавленное в 500 раз PBS, содержащим 0,1% фетальную телячью сыворотку планшету давали возможность отстояться на льду в течение 1 часа. После промывания планшета PBS, интенсивность флюоресценции измеряли с использованием аппарата FACSCalibur (Becton Dickinson). Отдельно, в качестве контроля, проводили такую же процедуру, за исключением добавления среды вместо антител. В результате, были отобраны 11 моноклональных антител, проявляющих более высокую интенсивность флюоресценции, чем контроль; т.е. 11 моноклональных антител, реагирующих с поверхностями раковых клеток молоченой железы. Последовательность вариабельной области тяжелой цепи одного такого моноклонального антитела показана SEQ ID NO:78, а последовательность вариабельной области легкой цепи показана SEQ ID NO:79.
Пример 2: Получение новых собачьих и человеческих раковых антигенных белков
(1) Получение рекомбинантного белка
Рекомбинантный белок получали с использованием гена SEQ ID NO:5, полученного в примере 1, описанным ниже образом. Реагенты (вектор (1 мкл), полученный из фагемидного раствора, полученного в примере 1, и подвергнутого анализу последовательности, 0,4 мкМ каждого из двух типов затравок, содержащих рестрикционные сайты NdeI и KpnI (SEQ ID NO:37 и 38), 0,2 мМ dNTP и 1,25 Ед полимеразы PrimeSTAR HS (Takara Shuzo Co., Ltd.)) смешивали с сопутствующим буфером, подлежащим коррекции для соответствия общему объему 50 мкл. Полученный раствор подвергали реакции из 30 циклов при 98°C в течение 10 секунд и 68°C в течение 1,5 минут с использованием устройства термической циклической обработки Thermal Cycler (BIO RAD). Два указанных выше типа затравок использовали для амплификации области, кодирующей аминокислотную последовательность полной длины SEQ ID NO:6. После проведения ПЦР, амплифицированную ДНК подвергали электрофорезу на 1% агарозном геле, и фрагмент ДНК примерно 1,4 тысяч пар оснований очищали с использованием экстракционного набора QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
Очищенный фрагмент ДНК лигировали в вектор клонирования pCR-Blunt (Invitrogen). Полученный конструкт трансформировали E. coli, извлекали плазмиду, и посредством секвенирования подтверждали, что амплифицированный генный фрагмент соответствует представляющей интерес последовательности. Плазмиду, которая, как было обнаружено, соответствовала представляющей интерес последовательности, обрабатывали рестрикционными ферментами NdeI и KpnI, полученный конструкт очищали с использованием экстракционного набора QIAquick Gel Extraction Kit, и представляющую интерес генную последовательность вставляли в вектор экспрессии E. coli (pET30b, Novagen), обработанный рестрикционными ферментами NdeI и KpnI. Применение данного вектора обеспечивает возможность получения слитого с гистидиновой меткой рекомбинантного белка. Плазмиду трансформировали в E. coli BL21 (DE3) и индуцировали 1 мМ IPTG для экспрессии представляющего интерес белка в E. coli.
Отдельно получали рекомбинантный белок собачьего гомологичного гена с использованием гена SEQ ID NO:7 описанным выше образом. Реагенты (кДНК (1 мкл), экспрессия которой была подтверждена посредством RT-PCR среди тканевой или клеточной кДНК, полученной в примере 1, 0,4 мкМ каждого из двух типов затравок, содержащих рестрикционные сайты NdeI и KpnI (SEQ ID NO:39 и 40), 0,2 мМ dNTP и 1,25 Ед полимеразы PrimeSTAR HS (Takara Shuzo Co., Ltd.)) смешивали с сопровождающим буфером, подлежащим коррекции для соответствия общему объему 50 мкл. Полученный конструкт подвергали реакции из 30 циклов при 98°C в течение 10 секунд и при 68°C в течение 2,5 минут с использованием устройства Thermal Cycler (BIO RAD). Два указанных выше типа затравок использовали для амплификации области, кодирующей аминокислотную последовательность полной длины SEQ ID NO:8. После проведения PCR, проводили электрофорез амплифицированной ДНК на 1% агарозном геле, и фрагмент ДНК примерно 2,2 т.п.о. очищали, используя экстракционный набор QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
Очищенный фрагмент ДНК лигировали в вектор клонирования pCR-Blunt (Invitrogen). Полученный конструкт трансформировали E. coli, извлекали плазмиду, и посредством секвенирования подтверждали, что амплифицированный генный фрагмент соответствует представляющей интерес последовательности. Плазмиду, которая, как было обнаружено, соответствовала представляющей интерес последовательности, обрабатывали рестрикционными ферментами NdeI и KpnI, полученный конструкт очищали с использованием экстракционного набора QIAquick Gel Extraction Kit, и представляющую интерес генную последовательность вставляли в вектор экспрессии E. coli (pET30b, Novagen), обработанный рестрикционными ферментами NdeI и KpnI. Применение данного вектора обеспечивает возможность получения слитого с гистидиновой меткой рекомбинантного белка. Плазмиду трансформировали в E. coli BL21 (DE3) и индуцировали 1 мМ IPTG для экспрессии представляющего интерес белка в E. coli.
Рекомбинантный белок человеческого гомологичного гена получали с использованием гена SEQ ID NO:1 описанным выше образом. Реагенты (кДНК (1 мкл), экспрессия которой была подтверждена посредством RT-PCR среди тканевой или клеточной кДНК, полученной в примере 1, 0,4 мкМ каждого из двух типов затравок, содержащих рестрикционные сайты SacI и XhoI (SEQ ID NO:41 и 42), 0,2 мМ dNTP и 1,25 Ед полимеразы PrimeSTAR HS (Takara Shuzo Co., Ltd.)) смешивали с сопровождающим буфером, подлежащим коррекции для соответствия общему объему 50 мкл. Полученный конструкт подвергали реакции из 30 циклов при 98°C в течение 10 секунд и при 68°C в течение 2,5 минут с использованием устройства Thermal Cycler (BIO RAD). Два указанных выше типа затравок использовали для амплификации области, кодирующей аминокислотную последовательность полной длины SEQ ID NO:2. После проведения PCR, проводили электрофорез амплифицированной ДНК на 1% агарозном геле, и фрагмент ДНК примерно 2,1 т.п.о. очищали, используя экстракционный набор QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
Очищенный фрагмент ДНК лигировали в вектор клонирования pCR-Blunt (Invitrogen). Полученный конструкт трансформировали E. coli, извлекали плазмиду, и посредством секвенирования подтверждали, что амплифицированный генный фрагмент соответствует представляющей интерес последовательности. Плазмиду, которая, как было обнаружено, соответствовала представляющей интерес последовательности, обрабатывали рестрикционными ферментами SacI и XhoI, полученный конструкт очищали с использованием экстракционного набора QIAquick Gel Extraction Kit, и представляющую интерес генную последовательность вставляли в вектор экспрессии E. coli (pET30a, Novagen), обработанный рестрикционными ферментами SacI и XhoI. Применение данного вектора обеспечивает возможность получения слитого с гистидиновой меткой рекомбинантного белка. Плазмиду трансформировали в E. coli BL21 (DE3) и индуцировали 1 мМ IPTG для экспрессии представляющего интерес белка в E. coli.
(2) Очистка рекомбинантного белка
Клетки рекомбинантной E. coli, экспрессирующие ген SEQ ID NO:1, 5 или 7, полученный выше, культивировали в среде LB, содержащей 30 мкг/мл канамицина, при 37°C до тех пор, пока спектральная поглощательная способность при 600 нм не становилась равной примерно 0,7, добавляли изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид до конечной концентрации 1 мМ, и культивирование проводили при 37°C в течение 4 часов. Затем клетки центрифугировали при 4800 об/мин в течение 10 минут и собирали. Клеточный осадок после центрифугирования суспендировали в физиологическом солевом растворе с фосфатным буфером, полученный материал центрифугировали при 4800 об/мин в течение еще 10 минут, и клетки затем промывали.
Клетки суспендировали в физиологическом солевом растворе с фосфатным буфером и разрушали ультразвуковой обработкой на льду. Раствор разрушенных ультразвуком клеток E. coli центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 минут, полученный супернатант обозначали как растворимую фракцию, а осадок обозначали как нерастворимую фракцию.
TM
TM
Растворимую фракцию добавляли на никель-хелатирующую колонку, полученную в соответствии обычной методикой (носитель: Chelateing Sepharose Fast Flow (GE Health Care); объем колонки: 5 мл; уравновешивающий буфер: 50 мМ хлористоводородного буфера, pH 8,0). Неадсорбированную фракцию вымывали 10 колоночными объемами 50 мМ хлористоводородного буфера (pH 8,0) и 20 мМ фосфатного буфера, содержащего 20 мМ имидазола (pH 8,0), с последующим элюированием 6 объемами слоев 20 мМ фосфатного буфера, содержащего 100 мМ имидазола (pH 8,0), непосредственно после этого. Фракцию, элюированную 20 мМ фосфатного буфера, содержащего 100 мМ имидазола (pH 8,0), в которой элюирование представляющего интерес белка было подтверждено окрашиванием Кумасси, добавляли на колонку с сильной анионообменной смолой (носитель: Q Sepharose Fast Flow (GE Health Care); объем колонки: 5 мл; 20 мМ фосфатного буфера (pH 8,0) в качестве уравновешивающего буфера). Неадсорбированную фракцию отмывали 10 колоночными объемами 20 мМ фосфатного буфера (pH 7,0) и 20 мМ фосфатного буфера, содержащего 200 мМ хлорида натрия (pH 7,0), с последующим элюированием 5 объемами слоев 20 мМ фосфатного буфера, содержащего 400 мМ хлорида натрия (pH 7,0), непосредственно после этого. Получали каждую из очищенных фракций белков, содержащую аминокислотные последовательности, показанные SEQ ID NO:2, 6 и 8, и затем обозначали как материалы для теста введения.
2
Фракцию (200 мкл) очищенных образцов, полученных описанным выше способом, подавали в 1 мл реакционного буфера (20 мМ Tris-HCl, 50 мМ NaCl, 2 мМ CaCl, pH 7,4), добавляли 2 мкл энтерокиназы (Novagen), полученному материалу давали возможность отстояться при комнатной температуре в течение ночи, реакции давали возможность продолжаться, расщепляли гистидиновую метку, и затем проводили очистку с использованием набора захвата продуктов расщепления энтерокиназой Enterokinase Cleavage Capture Kit (Novagen), в соответствии с сопровождающими последовательностями операций. Затем 1,2 мл очищенного образца, полученного описанным выше способом, подвергали замещению буфера солевым раствором с фосфатным буфером (Nissui) посредством ультрафильтрации с использованием Nanosep 10K Omega (Pall), асептическую фильтрацию проводили через фильтр HT Tuffryn Acrodisc (размер пор: 0,22 мкм, Pall), и полученный материал использовали для следующего эксперимента.
Пример 3: Тест введения рекомбинантного белка собаке, пораженной раком
(1) Оценка противоопухолевого эффекта
Собаку, пораженную раком (раком молочной железы), имеющую опухоль на эпидермисе, подвергали оценке противоопухолевых эффектов рекомбинантного белка, очищенного выше.
3
3
3
3
Рекомбинантный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную SEQ ID NO:6, очищенный описанным выше образом (100 мкг, 0,5 мл) смешивали с эквивалентным количеством неполного адъюванта Фрейнда (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) для получения терапевтического средства против рака. Полученное средство вводили в целом 3 раза в региональный лимфоузел вблизи опухоли в качестве первоначального введения и затем через 3 и 7 дней. В результате опухоль, имевшая размер примерно 86 мм при введении терапевтического средства против рака, сократилась до 55 мм, 30 мм и 20 мм соответственно через 10 дней, 20 дней и 30 дней после первоначального введения.
3
Смесь 0,5 мл рекомбинантного полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную SEQ ID NO:2, и 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда вводили другой собаке, имеющей рак молочной железы, в целом 3 раза таким же образом, как описано выше. Также, вместе со средством подкожно вводили 100 мкг собачьего интерлейкина 12. В результате, через 45 дней после первоначального введения противоракового терапевтического средства произошло полное обратное развитие опухоли, имевшей размер примерно 123 мм при введении терапевтического средства.
3
Далее, смесь 0,5 мл рекомбинантного полипептида, имеющего аминокислотную последовательность, показанную SEQ ID NO:8, и 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда вводили другой собаке, имеющей рак молочной железы, в целом 3 раза таким же образом, как описано выше. Также, вместе со средством подкожно вводили 100 мкг собачьего интерлейкина 12. В результате, через 27 дней после первоначального введения противоракового терапевтического средства произошло полное обратное развитие опухоли, имевшей размер примерно 96 мм при введении терапевтического средства.
(2) Оценка индуцирующей иммунитет способности
Образцы крови собак с клинически выраженными поражениями, которым в тесте введения, проведенном в описанном выше пункте (1), вводили рекомбинантные полипептиды, имеющие аминокислотные последовательности, показанные SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:8, получали перед введением и через 10 и 30 дней после первоначального введения, мононуклеарные клетки периферической крови отделяли в соответствии с обычной методикой, и способность рекомбинантных белков индуцировать иммунитет оценивали посредством анализа ELISpot IFNγ с использованием мононуклеарных клеток периферической крови.
5
2
70% этанол добавляли в 96-луночный планшет (MultiScreen-IP, MAIPS4510, Millipore) в количествах 100 мкл/лунку, планшету давали возможность отстояться в течение 5 минут, этанол удаляли аспирацией, планшет промывали стерилизованной водой, добавляли 200 мМ бикарбоната натрия (pH 8,2) в количествах 300 мкл/лунку, планшету давали возможность отстояться в течение 5 минут, бикарбонат натрия удаляли аспирацией, и планшет промывали. Затем моноклональное антитело против собачьего интерферона γ (clone142529, MAB781, R&D), добавленное к 200 мМ бикарбоната натрия, добавляли в планшет в количествах 0,5 мкг/лунку, инкубацию проводили при 37°C в течение ночи, и первичное антитело подвергали твердофазной экстракции. После удаления первичного антитела в растворе аспирацией, добавляли блокирующий раствор (1% BSA-5% сахароза-200 мМ бикарбоната натрия, pH 8,2) в количествах 300 мкл/лунку, и инкубацию проводили при 4°C в течение ночи для блокировки планшета. После удаления блокирующего раствора аспирацией, добавляли среду RPMI, содержащую 10% фетальную телячью сыворотку (Invitrogen) в количествах 300 мкл/лунку, планшету давали возможность отстояться в течение 5 минут и среду удаляли аспирацией. Затем в планшет добавляли мононуклеарные клетки периферической крови собаки суспендировали в среде RPMI, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, в количествах 5×10 клеток/лунку, к ним добавляли полученный у собаки полипептид или полученный у человека полипептид, используемый для введения, в количествах 10 мкл/лунку, и культивирование проводили при 37°C в 5% COв течение 24 часов для получения интерферона γ из иммуноцитов среди мононуклеарных клеток периферической крови. После проведения культивирования среду удаляли, и лунки промывали 6 раз промывным раствором (0,1% Tween 20-200 мМ бикарбоната натрия, pH 8,2). В планшет добавляли кроличьи антисобачьи поликлональные антитела, разбавленные в 1000 раз блокирующим раствором, в количествах 100 мкл/лунку и затем инкубировали при 4°C в течение ночи. После промывания лунок 3 раза промывным раствором, в планшет добавляли меченные HRP антикроличьи антитела, разбавленные в 1000 раз блокирующим раствором, в количествах 100 мкл/лунку, и реакции давали возможность продолжаться при 37°C в течение 2 часов. После промывания лунок 3 раза промывным раствором, изменение цвета получали с помощью иммунного красителя Konica (Konica), и лунки промывали водой для прекращения реакции. После прекращения реакции мембрану сушили, и число проявившихся пятен подсчитывали, используя аппарат KS Elispot (Carl Zeiss). В результате, перед введением полипептида не были выявлены пятна в мононуклеарных клетках периферической крови собак с клинически выраженным поражением. Однако в случае, когда подсчет проводили после введения полипептидов, 13 и 82 пятна были выявлены в мононуклеарных клетках периферической крови, полученной у собак с клинически выраженным поражением, которым вводили рекомбинантный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную SEQ ID NO:6, через 10 и 30 дней после введения. В случае, когда собакам с клинически выраженным поражением уводили рекомбинантный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную SEQ ID NO:2, 53 и 189 пятен были выявлены в мононуклеарных клетках периферической крови через 10 и 30 дней после введения. В случае, когда собакам с клинически выраженным поражением вводили рекомбинантный полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, показанную SEQ ID NO:8, 32 и 117 пятен были выявлены в мононуклеарных клетках периферической крови через 10 и 30 дней после введения.
Представленные выше результаты демонстрируют, что иммуноциты, которые специфически продуцируют интерферон γ в ответ на введенные рекомбинантные белки, индуцируются у собак с клинически выраженным поражением, которым был введен рекомбинантный полипептид. Полученные результаты также демонстрируют, что иммунные реакции, при которых такие иммуноциты играют центральную роль, оказывают противоопухолевые эффекты, описанные выше в пункте (1).
Пример 4: Противоопухолевые эффекты ДНК вакцин
Рекомбинантную плазмиду получали, используя ген SEQ ID NO:19, следующим образом. Реагенты (кДНК (1 мкл), экстрагированный таким же образом как в примере 1(4) из линии клеток мышиного колоректального рака (CT26, закупленной у ATCC), в которой наблюдалась экспрессия CAPRIN-1, 0,4 мкМ каждого из двух типов затравок (показанных в SEQ ID NO:80 и 81), 0,2 мМ dNTP и 1,25 Ед полимеразы PrimeSTAR HS) смешивали с сопровождающим буфером, подлежащим коррекции для соответствия общему объему 50 мкл. Полученный материал подвергали ПЦР из 30 циклов при 98°C в течение 10 секунд, при 55°C в течение 15 секунд и при 72°C в течение 4 минут, с использованием устройства термической циклической обработки Thermal Cycler. Указанные выше два типа затравок использовали для амплификации области, кодирующей аминокислотную последовательность полной длины SEQ ID NO:20. После проведения ПЦР, проводили электрофорез амплифицированной ДНК на 1% агарозном геле, и фрагмент ДНК примерно 2100 т.п.о. очищали, используя экстракционный набор QIAquick Gel Extraction Kit.
Очищенный фрагмент ДНК лигировали в вектор клонирования pCR-Blunt (Invitrogen). Полученный конструкт трансформировали в E. coli, плазмиду извлекали, анализировали последовательность фрагмента и получали плазмиду, имеющую амплифицированный фрагмент гена, соответствующий представляющей интерес последовательности. Плазмиду обрабатывали рестрикционным ферментом EcoRI, полученный конструкт очищали экстракционным набором QIAquick Gel Extraction Kit, и представляющую интерес генную последовательность вставляли в вектор экспрессии млекопитающих (pcDNA3.1, Invitrogen), обработанный рестрикционным ферментом EcoRI, в соответствии с обычной методикой.
2
50 мкг частиц золота (Bio Rad), 100 мкл спермидина (SIGMA) и 100 мкл 1 M CaCl добавляли к 100 мкг полученной выше плазмидной ДНК, смесь перемешивали вихревой мешалкой. И полученному материалу давали возможность отстояться при комнатной температуре в течение 10 минут (далее именуемые как «частицы золота-ДНК»). После того как смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 1 минуты, супернатант удаляли, и частицы промывали 3 раза 100% этанолом. 100% этанол (6 мл) добавляли к частицам золота-ДНК, полученный материал тщательно перемешивали вихревой мешалкой и частицы золота-ДНК вводили в трубку Tefzel Tubing (Bio Rad) и осаждали на стенках. Этанол в трубке Tefzel Tubing, к которой прилипли частицы золота-ДНК, сушили воздухом, и высушенную трубку разрезали на отрезок, подходящий для применений генного ружья.
6
2
Клетки CT26 трансплантировали подкожно в область спины 20 мышей Balb/c (Japan SLC, Inc.) в количествах 10 клеток/мышь и выращивали до диаметра опухоли приблизительно 7 мм. Затем полученную выше трубку фиксировали на генном ружье, клетки вводили через кожу в брюшные полости бритых мышей под давлением 400 фунтов/дюйм (примерно 58 кПа) с использованием чистого газообразного гелия (количество инокулированной плазмидной ДНК составляет 2 мкг/мышь), и оценивали противоопухолевые эффекты.
В результате, опухоли увеличились у 10 контрольных мышей, которым вводились чистые плазмиды, не содержащие гены CAPRIN-1. И все 10 мышей погибали через 63 дня после трансплантации опухоли. Однако у 10 мышей, которым вводили плазмиду, содержащую гены CAPRIN-1, вставленные в нее, наблюдалась полная регрессия опухолей к 25 дню после трансплантации опухоли, и все мыши оставались живыми через 63 дня после трансплантации опухоли, когда все контрольные мыши погибали.
Пример 5: Индукция CD8+ Т-клеток, реагирующих на пептидный эпитоп
(1) Прогноз связывающего HLA-A0201 пептидного мотива и связывающего HLA-A24 пептидного мотива
Информацию об аминокислотной последовательности человеческого полипептида CAPRIN-1 получали из GenBank (Банка генов). Для прогнозирования связывающего HLA-A0201 пептидного мотива и связывающего HLA-A24 пептидного мотива, аминокислотную последовательность человеческого полипептида CAPRIN-1 анализировали посредством компьютерной программы прогнозирования с использованием известных программных обеспечений BIMAS (доступных на сайте интернета http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/), были выбраны 29 типов пептидов, показанных от SEQ ID NO:43 до SEQ ID NO:71, которые по прогнозам были способны связываться с молекулами HLA-A0201, и 5 типов пептидов, показанных от SEQ ID NO:72 до SEQ ID NO:76, которые по прогнозам были способны связываться с молекулами HLA-A24.
(2) Индукция CD8+ Т-клеток, реагирующих на пептидный эпитоп
2
Периферическую кровь брали у HLA-A0201-положительного здорового индивида, наслаивали на среду для отделения лимфоцитов (OrganonpTeknika, Durham, NC) и центрифугировали при 1500 об/мин при комнатной температуре в течение 20 минут. Извлекали фракцию, содержащую PBMC, и промывали 3 (или более) раз в холодном фосфатном буфере для получения мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC). Полученные PBMC суспендировали в 20 мл среды AIM-V (Life Technologies) и осуществляли их адгезию к культуральной колбе (Falcon) при 37°C в 5% CO в течение 2 часов. Неприлипшие клетки использовали для получения Т-клеток, а прилипшие клетки использовали для получения дендритных клеток.
Прилипшие клетки культивировали в среде AIM-V в присутствии IL-4 (1000 Ед/мл) и GM-CSF (1000 Ед/мл). Среду обменивали на другую среду AIM-V, к которой через 6 дней добавляли IL-4 (1000 Ед/мл), GM-CSF (1000 Ед/мл), IL-6 (1000 Ед/мл, Genzyme, Cambridge, MA), IL-1β (10 нг/мл, Genzyme, Cambridge, MA) и TNF-α (10 нг/мл, Genzyme, Cambridge, MA), культивирование проводили в течение еще 2 дней, и полученную популяцию неприлипших клеток использовали в качестве дендритных клеток.
6
5
6
5
5
2
2
Полученные дендритные клетки суспендировали в среде AIM-V при клеточной плотности 1×10 клеток/мл, к ним добавляли пептиды, показанные от SEQ ID NO:43 до SEQ ID NO:71, которые по прогнозам способны связываться с молекулами HLA-A0201, выбранные в представленном выше пункте (1), в концентрации 10 мкг/мл, и культивирование проводили с использование 96-луночного планшета при 37°C в 5% CO в течение 4 часов. После проведения культивирования клетки подвергали рентгеновскому облучению лучами (3000 рад), промывали средой AIM-V, суспендировали в среде AIM-V, содержащей 10% человеческую сыворотку AB (Nabi, Miami, FL), IL-6 (1000 Ед/мл) и IL-12 (10 нг/мл, Genzyme, Cambridge, MA), и добавляли в 24-луночный планшет в количествах 1×10 клеток/лунку. Далее, полученную популяцию Т-клеток добавляли в количествах 1×10 клеток/лунку и культивировали при 37°C в 5% CO. Супернатанты культур удаляли через 7 дней, дендритные клетки, обработанные пептидами, полученными описанным выше образом, и затем подвергнутые рентгеновскому облучению, суспендировали в среде AIM-V, содержащей 10% человеческую сыворотку AB (Nabi, Miami, FL), IL-7 (10 Ед/мл, Genzyme, Cambridge, MA) и IL-2 (10 Ед/мл, Genzyme, Cambridge, MA) (плотность клеток: 1×10 клеток/мл), клетки добавляли в 24-луночный планшет в количествах 1×10 клеток/лунку, и культивирование проводили далее. После повторения такой процедуры от 4 до 6 раз через каждые 7 дней, стимулированные Т-клетки извлекали, и индукцию CD8+ Т-клеток подтверждали посредством проточной цитометрии.
В отношении пептидов от SEQ ID NO:72 до SEQ ID NO:76, которые по прогнозам способны связываться с молекулами HLA-A24, то также была предпринята попытка индукции CD8+ Т-клеток, реагирующих на пептидный эпитоп таким же образом, как описано выше, с использованием дендритных клеток и популяции Т-клеток, индуцированных из периферической крови HLA-A24-положительного здорового индивида.
В качестве отрицательного контроля использовали пептид, имеющий последовательность вне объема настоящего изобретения (SEQ ID NO:77).
Пример 6: Определение антигенного эпитопа цитотоксических Т-клеток
(1) Способность продукции IFN-γ
3
4
2
Для определения специфичности Т-клеток, которые по наблюдениям растут к пептидным эпитопам, среди Т-клеток, индуцированных в примере 5(2), 5×10 Т-клеток добавляли к 5×10 T2-клеток, экспрессирующих молекулы HLA-A0201 (Salter RD et al., Immunogenetics, 21: 235-246, 1985, T2-клетки были закуплены в ATCC), и подвергали импульсной обработке пептидами, прогнозируемыми как способные связываться с молекулами HLA-A0201 (пептиды добавляли к среде AIM-V в концентрации 10 мкг/мл и культивировали при 37°C в 5% CO в течение 4 часов), и полученный материал культивировали на 96-луночном планшете в среде AIM-V, содержащей 10% человеческую сыворотку AB, в течение 24 часов. Супернатанты собирали после культивирования, и количество продуцированного IFN-γ измеряли посредством ELISA (иммуноферментного анализа). В результате, продукция IFN-γ больше наблюдалась в культуральных супернатантах, полученных из лунок, в которых использовались T2-клетки, подвергнутые импульсной обработке пептидами от SEQ ID NO:43 до SEQ ID NO:71, чем в культуральных супернатантах, полученных из лунок, в которых использовались T2-клетки, не подвергнутые импульсной обработке пептидами (фиг.2). Эти результаты демонстрируют, что описанные выше пептиды представляют собой пептиды Т-клеточных эпитопов, способные специфически стимулировать пролиферацию HLA-A0201+ CD8+ Т-клеток для индукции продукции IFN-γ.
Таким же образом, как описано выше, специфичность реагирующих с пептидным эпитопом CD8+ Т-клеток, индуцированных с использованием пептидов от SEQ ID NO:72 до SEQ ID NO:76 в примере 5(2) к пептидным эпитопам определяли следующим образом. В частности, уровень продукции IFN-γ Т-клетками против подвергнутых импульсной обработке пептидом клеток JTK-LCL, экспрессирующих молекулы HLA-A24 (клетки JTK-LCL закупали у компании RIKEN, Japan), измеряли посредством ELISA. В результате продукция IFN-γ наблюдалась больше в культуральных супернатантах, полученных из лунок, в которых использовались клетки JTK-LCL, подвергнутые импульсной обработке пептидами от SEQ ID NO:72 до SEQ ID NO:76, чем культуральных супернатантах, полученных из лунок, в которых использовались клетки JTK-LCL, не подвергнутые импульсной обработке пептидами (фиг.3). Результаты демонстрируют, что пептиды от SEQ ID NO:72 до SEQ ID NO:76 представляют собой пептиды Т-клеточных эпитопов, способные специфически стимулировать пролиферацию HLA-A24+ CD8+ Т-клеток для индукции продукции IFN-γ.
(2) Оценка цитотоксичности
6
3
4
2
Затем исследовали то, были или нет пептиды от SEQ ID NO:43 до SEQ ID NO:71, использованные в настоящем изобретении, представлены на молекулах HLA-A0201 на опухолевых клетках HLA-A0201+, экспрессирующих человеческий полипептид CAPRIN-1, и способны ли были или нет CD8+ Т-клетки, стимулированные пептидами, разрушать опухолевые клетки HLA-A0201+, экспрессирующие человеческий полипептид CAPRIN-1. 10 клеток глиомы человека U-87MG (закупленных у ATCC), которые были верифицированы как экспрессирующие человеческий полипептид CAPRIN-1, собирали в центрифужную пробирку емкостью 50 мл, добавляли 100 мкКи хрома-51, и инкубацию проводили при 37°C в течение 2 часов. Затем клетки промывали 3 раза средой RPMI (Gibco), содержащей 10% фетальную телячью сыворотку (далее именуемую «FBS», Gibco) и добавляли в 96-луночный планшет с V-образным дном в количествах 10 клеток/лунку. Далее, добавляли 5×10HLA-A0201+ и реагирующих с пептидным эпитопом CD8+ Т-клеток, стимулированных пептидами, суспендированных в среде RPMI, содержащей 10% FBS, и культивирование проводили при 37°C в 5% CO в течение 4 часов. После культивирования измеряли количество хрома-51 в супернатанте культуры, высвободившееся из разрушенных опухолевых клеток, для определения цитотоксической активности стимулированных пептидом CD8+ Т-клеток. В результате было обнаружено, что стимулированные пептидом HLA-A0201+ CD8+ Т-клетки обладают цитотоксической активностью против клеток U-87MG (фиг.4). Напротив, CD8+ Т-клетки, индуцированные с использованием пептида отрицательного контроля (SEQ ID NO:77) не проявляли цитотоксической активности. Таким образом, было обнаружено, что пептиды, используемые в настоящем изобретении (т.е. пептиды от SEQ ID NO:43 до SEQ ID NO:71), представлены на молекулах HLA на опухолевых клетках HLA-A0201+, экспрессирующих человеческий полипептид CAPRIN-1. Далее, было также обнаружено, что пептиды способны индуцировать цитотоксические CD8+ Т-клетки, которые могли разрушать такие опухолевые клетки.
Затем таким же образом, как описано выше, исследовали то, представлены ли или нет пептиды от SEQ ID NO:72 до SEQ ID NO:76 на молекулах HLA-A24 на опухолевых клетках HLA-A24+, экспрессирующих человеческий полипептид CAPRIN-1, способны или нет CD8+ Т-клетки, стимулированные пептидами, разрушать опухолевые клетки HLA-A24+, экспрессирующие человеческий полипептид CAPRIN-1. Хром-51 был включен в клетки HLA-A24+ JTK-LCL, экспрессирующих человеческий полипептид CAPRIN-1, добавляли HLA-A24+ и CD8+ Т-клетки, реагирующих с пептидным эпитопом. Проводили культивирование и измеряли количества хрома-51 в супернатанте культуры, высвобожденного из разрушенных клеток. В результате было обнаружено, что HLA-A24+ CD8+ Т-клетки, стимулированные пептидами от SEQ ID NO:72 до SEQ ID NO:76, обладают цитотоксической активностью против клеток JTK-LCL (фиг.5). Таким образом, было обнаружено, что пептиды от SEQ ID NO:72 до SEQ ID NO:76 представлены на молекулах HLA-A24 на клетках HLA-A24+, экспрессирующих человеческий полипептид CAPRIN-1, и было обнаружено, что пептиды способны индуцировать цитотоксические CD8+ Т-клетки, способные разрушать такие клетки. CD8+ Т-клетки, индуцированные с использованием пептида отрицательного контроля (SEQ ID NO:77) не проявляли цитотоксичность.
4
3
Для определения цитотоксической активности, 5×10 CD8+ Т-клеток, стимулированных и индуцированных пептидами, используемыми в настоящем изобретении. Смешивали с 10 клеток U-87MG или JTK-LCL, в которые был включен хром-51, культивировали в течение 4 часов и измеряли количество хрома-51, высвободившегося в среду после культивирования. Используемый в настоящем описании термин «цитотоксическая активность» означает цитотоксическую активность CD8+ Т-клеток против клеток U-87MG или клеток JTK-LCL (т.е. клеток-мишеней), определенную в соответствии со следующим уравнением*.
Уравнение*: Цитотоксическая активность (%) = количество хрома-51, высвободившееся из клетки U-87MG или JTK-LCL после добавления CD8+ Т-клетки/количество хрома-51, высвободившееся из клетки-мишени после добавления 1 н. хлористоводородной кислоты ×100
Промышленная применимость
Настоящее изобретение промышленно применимо с целью лечения и профилактики рака.
Настоящее описание включает часть или все описание и/или чертежи заявки на патент Японии № 2008-202065, приоритет которой испрашивает настоящая заявка. Также, все публикации, патенты и патентные заявки, приведенные в настоящем описании, полностью включены в него путем ссылки.
Текст без списка последовательностей
SEQ ID NO:31: праймер T3
SEQ ID NO:32: праймер T7
SEQ ID NO:33-34: праймеры
SEQ ID NO:35-36: праймер GAPDH
SEQ ID NO:37-42 и 80-81: праймеры