Формирование микрокапсул на основе фукоидана путем внешнего и внутреннего гелеобразования

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

«НАУКА. ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ», №2,2015

УДК 57.088.2 Денисова Е.В. [Denisova E.V.],

Супрунчук В.Е. [Suprunchuk V.E.], Горбачева А.А. [Gorbacheva А.А.], Ширинян М.Г. [Shirinjan M.G.]

ФОРМИРОВАНИЕ МИКРОКАПСУЛ НА ОСНОВЕ ФУКОИДАНА ПУТЕМ ВНЕШНЕГО И ВНУТРЕННЕГО ГЕЛЕОБРАЗОВАНИЯ

Formation of microcapsules with fukoidan by external and internal jellification

Проведено исследование взаимосвязи структуры и стабильности микрокапсул на основе полисахарида бурых водорослей фукоидана, различных сшивающих агентов и стабилизаторов при моделировании физиологических условий.

Ключевые слова: фукоидан, матрица, гелеобразование, моделирование, стабильность.

Investigated the relationship between structure and stability of the polysac-charide-based microcapsules kelp fucoidan, various crosslinking agents and stabilizers for modeling physiological conditions.

Keyword: fucoidan, matrix, gelling, modeling, stability.

Известно, что биодоступность лекарственных средств, вводимых иеррорально или энтерально, снижается в связи со многими факторами (разрушающее действие амилаз ЖКТ, рН среды и т.д.). Поэтому все более актуальной становится проблема разработки способов транспорта и защиты молекул фармацевтических препаратов, с одновременным усилением терапевтического эффекта, увеличением биодоступности и снижением побочного действия. В качестве подобных систем возможно использовать полисахаридные матрицы. Как правило, такие матрицы формируются либо из одного полисахарида (наиболее часто используемые - альгиновая кислота [9], хитазан, декстран, пектин [6] и т.д.), либо с использованием определенных сшивающих агентов (лимонная кислота, ионы металлов - Са2+, А13+, Ва2+, Возможно также формирование комплексов за счет сил электростатического притяжения с образованием систем вида «полисахарид-полисахарид», «полисахарид-белок» [8].

Интерес к фукоиданам обусловлен различными видами их биологической активности. Так они являются мощными антикоагулянтами [10], противоопухолевыми и противовирусными агентами [4]. Фукоида-ны относят к фуканам, группе высокосульфатированных полисахаридов, доминирующим мономерным звеном в которых выступает фукоза, а также могут содержаться различные количества остатков глюкозы, маннозы, ксилозы и глюкуроновой кислоты [2, 3]. Выделение фукоиданов осуществляется из бурых водорослей, где их содержание может достигать 20 %.

Структура фукоиданов разветвленная и зависит от ряда факторов (вид бурой водоросли, температура и время экстракции и т.д.), однако можно выделить два наиболее часто встречаемых структурных скелета, состоящих из повторяющихся a-L-фукопиранозных остатков связанных 1 —*3 гликозидными связями или 1 —* 3 и 1 —* 4 связями [8].

Более подробно структура фукоиданов выделенных из различных водорослей (Laminaria saccharina, Clodosiphon okamuranus, Fucus vesiculosus) охарактеризована в работах [5] и [7].

Использование фукоидана для создания полимерных матриц позволит формировать микрочастицы, устойчивые к воздействию ферментов желудочно-кишечного тракта. Целью работы является разработка метода формирования устойчивых во времени микрочастиц на основе фукоидана.

Экспериментальная часть

В работе использовался 1,5 % раствор фукоидана, выделенный нами из Fucus vesiculosus. При формировании микрочастиц применялись 0,5 М растворы СаС12, A12(S04), ZnCl2, ВаС12, и 0,5 М взвесь СаС03.

Получение частиц путем внешнего гелеобразования

Раствор фукоидана вносили в раствор сшивающего агента по каплям при постоянном перемешивании 600 об/мин в течение 30 мин. Частицы центрифугировали 10 мин при 2500 об/мин, промывали. Для определения стабильности взвешивали 0,1 г частиц и вносили в 10 мл буферного раствора (0,1 М НС1, 200 мМ Tns-HCl, 0,85% NaCl, 10 % сахарозы, Н20).

Получение частиц путем внешнего и внутреннего гелеобразования в гидрофобной среде Раствор полисахарида вносили в 25 мл гексана при постоянном перемешивании в течении 5 мин, добавляли 0,25 мл стабилизатора (циклометикон / Saleare SC 80) и продолжали промешивание в течении 30 мин. Центрифугировали 10 мин при 2500 об/мин, промывали. Для определения стабильности взвешивали 0,1 г частиц и вносили в 10 мл буферного раствора (0,1 М НС1, 200 мМ Tris-HCl, 0,85 % NaCl, 10 % сахарозы, Н20).

Обсуждение результатов

Фу ко и дан относится к группе некрахмальных полисахаридов, т.е. не гидролизуется амилазами, не абсорбируется в кровь и частично или полностью подвергается ферментной деградации микрофлорой толстой кишки [1]. Поэтому при рассмотрении возможности формирования микрочастиц на основе фукоидана и определении их стабильности можно не учитывать ферменты желудочно-кишечного тракта. Однако существенную роль на растворение полисахаридных микрочастиц оказывает рН среды. В качестве системы, моделирующей условия желудка, мы использовали 0,1 М НС1 (рН 1,5), условия тонкого кишечника - 200 мМ Tris-HCl (рН 7,5). Многие лекарственные препараты готовят на физиологическом растворе, воде, поэтому была рассмотрена стабильность в 0,85% NaCl и в воде. Одним из криопротекторов, увеличивающих степень стабильности частиц полисахаридного и липидного происхождения выступает сахароза. В работе использовался ее 10% раствор.

Для определения оптимальных условий формирования и хранения фукоидановых микрочастиц, нами были рассмотрены кальциевые, алюминиевые, бариевые и цинковые соли фукоидана, полученные путем внешнего и внутреннего гелеобразования в перечисленных средах.

Формирование фукоидановых микрочастиц путем внешнего гелеобразования осуществлялось с использованием солей Са2+, Al3+, Ва2+, Zn2+. Было установлено, что стабильные во времени гелиевые структуры образуются с ионами Са2+, Ва2+, Zn2+ , а с ионом А13+ образуются растворимые комплексы. При этом все полученные матрицы имели неправильную форму (рис 1).

Исследование стабильности в различных средах представлены на рисунке 2.

Рисунок 1. Гелиевые матрицы на основе фукоидана

где: А - Са2+, Б - Ва2+, В - гп2+.

11x11

Н20 NaCI 10% СА рН 7,5 рН 1,5

|Са 2+ Ва 2+ Zn 2+

Стабильность солей фукоидана в различных средах.

Выявлено, что самыми устойчивыми матрицами являются частицы на основе бариевых солей фукоидана. их растворение происходит лишь по истечении часа. Самыми нестабильными оказались гелиевые матрицы на основе цинковых солей фукоидана. При этом самая высокая устойчивость рассматриваемых микросистем проявилась в системе с рН 7,5. Таким образом, использование катионов Ва2+ в качестве сшивавшего агента

60 50 40 30 20 10

Рисунок 2.

Рисунок 3. Микрочастицы фукоидана образованные в гидрофобном

растворителе путем внутреннего (А) и внешнего (Б) гелеоб-разования.

I_

30

25

20

I I

I I

н=о

ЫаС1

10% СА

рН 7,5

рН 1,5

образованные путем внутреннего гелеобразования; образованные путем внешнего гелеобразования.

Рисунок 4.

Стабильность кальциевых микрочастиц фукоидана

по методу внешнего гелеобразования привело к получению устойчивых во времени частиц, а применение ионов А13+ уменьшает степень устойчивости к эрозии частиц в представленных средах. Матрицы, сшитые с помощью ионов кальция, использовались для дальнейшего исследования.

Внесение водного раствора фукоидана в гидрофобную жидкость с последующей ковалентной сшивкой путем внешнего и внутреннего геле-

30

25

20

15

10

1111

I

Н;0

NaCI

10% СА

рН 7,5

рН 1,5

образованные путем внутреннего гелеобразования; образованные путем внешнего гелеобразования.

Рисунок 5. Стабильность кальциевых микрочастиц фукоидана в цикло-

метиконе.

12

10

Рисунок 6.

10% СА

рН 7,5

рН 1,5

образованные путем внутреннего гелеобразования; образованные путем внешнего гелеобразования.

Стабильность микрочастиц фукоидана в Saleare SC80.

образования ионами Са2+, привело к получению гелиевых структур неправильной формы, но и частиц правильной сферической структуры (рис 3). Однако существенного изменения стабильности не наблюдалось (рис 4).

Для увеличения степени стабильности полученных эмульсий были использованы стабилизатор циклометикон и Saleare SC80, который также выступает гелеобразователем. Введение циклометикона привело к увеличению стабильности микросфер полученных путем внутреннего гелеобразования (рис 5). Причем наибольшей стабильностью в водной

и щелочной среде обладали микрочастицы полученные с помощью внешнего гелеобразования. В кислой же среде все частицы проявили низкую стабильность.

Наиболее стабильными оказались микросферы образованные после внесения в систему Salcare SC80 (рис. 6), что возможно обусловлено взаимодействием между молекулой фукоидана и стабилизатора за счет сил различной природы или образованием микрочастицы, гелеобразова-телем с фиксированием молекул полисахарида. Из рисунка видно, что большей стабильностью обладают микрочастицы полученные путем внутреннего гелеобразования. Причем в условиях, моделирующих желудок, малостабильны оба вида гелиевых структур, в то время как при нейтральных значениях рН стабильность колеблется от 7 до 10 дней. Частицы, полученные по первой методике, аналогично проявили высокую стабильность в 10% растворе сахарозы.

Таким образом, микрочастицы, полученные путем внутреннего гелеобразования в условиях введения стабилизатора/гелеобразователя Salcare SC80, имеют самую высокую из рассмотренных микрочастиц стабильность. При этом оптимальной средой для хранения таких матриц является вода или 10% раствор сахарозы. В качестве сшивающего агента предпочтительно использование ионов Са2+, Ва2+, Zn2+.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Хотимченко Ю. С. и др. Фармогология некрахмальных полисахаридов // Вестник ДВО РАН. 2005. №1.

2. Ale М. Т. et al. Fucoidan from Sargassum sp. and Fucus vesiculosus reduces cell viability of lung carcinoma and melanoma cells in vitro and activates natural killer cells in mice in vivo // International journal of biological macromolecules. 2011. T. 49. №3. C. 331-336.

3. Berteau O., Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide // Glycobiology. 2003. Vol. 13, №6. C. 29-40/

4. Bilan M. I. etal. Structure of a fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C. Ag // Carbohydrate research. 2002. Vol. 337, №8 C. 719-730.

5. Cumashi A. et al. A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds//Glycobiology. 2007. Vol. 17, №5. C. 541-552.

6. Fullana S. G. etal. Controlled release properties and final macroporosity of a pectin microspheres-calcium phosphate composite bone cement// Acta biomaterialia. 2010. Vol. 6, №6. C. 2294-2300.

7. Holtkamp A. D. et al. Fucoidans and fucoidanases - focus on techniques for molecular structure elucidation and modification of marine polysaccharides //Applied microbiology and biotechnology. 2009. Vol. 82, №1. C. 1-11.

8. Li F., Li J., Zhang S. S. Molecularly imprinted polymer grafted on polysaccharide microsphere surface by the sol-gel process for protein recognition //Talanta. 2008. Vol. 74. №5. C. 1247-1255.

9. Martins S. et al. Insulin-loaded alginate microspheres for oral delivery-effect of polysaccharide reinforcement on physicochemical properties and release profile // Carbohydrate Polymers. 2007. Vol. 69, №4. C. 725-731.

10. Nagumo Т., Nishino T. Fucan sulfates and their anticoagulant activities // Polysaccharides in medicinal applications. 1996. C. 545-574.

ОБ АВТОРАХ: Денисова Евгения Владимировна, кандидат биологических наук, доцент кафедры медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации Северо-Кавказского федерального университета. Адрес: 355009, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1, корп. 3. Тел. (8652) 33-08-53. E-mail: den_ev@mail.ru. Denisova Evgenija Vladimirovna, candidate of biological sciences, the associate professor of department of the medical biochemistry, clinical laboratory diagnostics and pharmacy North-Caucasus federal university. Telephone (8652) 33-08-53. E-mail: den_ev@mail.ru. Супрунчук Виктория Евгеньевна, инженер-лаборант кафедры медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации Института живых систем Северо-Кавказского федерального университета. Адрес: 355006, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1, корп. 3. Тел. (8652) 35-50-68.

Suprunchuk Viktoria Evgen'evna, engineer of department of the medical biochemistry, clinical laboratory diagnostics and pharmacy North-Caucasus federal university.

Telephone (8652) 33-08-53. E-mail: vikasuprunchuk@gmail.ru. Горбачева Анастасия Александровна, студент 4 курса Института живых систем группы МБС-112 (2) Северо-Кавказского федерального университета. Адрес: 355006, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1, корп. 3. Телефон (8652) 35-50-68.

Gorbacheva Anastasia Aleksandrovna, student 4 course North-Caucasus federal university group MBS-112(2). Telephone (8652) 33-08-53. Ширинян Маргарита Григорьевна, студент 4 курса Института живых систем группы МБС-112 (2) Северо-Кавказского федерального университета. Адрес: 355006, г. Ставрополь, ул. Пушкина, 1, корп. 3. Тел. (8652) 35-50-68.

Shirinjan Margarita Grigorjevna, student 4 course North-Caucasus federal university group MBS-112(2). Telephone (8652) 33-08-53.