Способ клонального микроразмножения кирказона маньчжурского (Aristolochia manshuriensis Kom.)
METHOD FOR MICROPROPAGATION OF MANCHURIAN BIRTHWORT (ARISTOLOCHIA MANSHURIENSIS KOM.)

Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к способам размножения редких и исчезающих растений, и может быть использовано для массового получения качественного посадочного материала лекарственного и декоративного растения кирказона маньчжурского, трудно размножаемого генеративным и вегетативным способами. Полученные растения могут использоваться для реинтродукции кирказона маньчжурского в качестве ценного ресурса для медицинской промышленности и посадочного материала в ландшафтном дизайне.
Предлагаемое изобретение является новым, так как в патентной и научно-технической литературе не найдено решения с заявленной совокупностью отличительных признаков, то есть оно не известно из уровня техники, значит, соответствует критерию "новизна".
Реликтовые растения, в частности представитель семейства Aristolochiaceae (кирказоновые), к которому относится Aristolochia manshuriensis Kom. (кирказон маньчжурский), представляют особый интерес для клонального микроразмножения. Вид внесен в Красную книгу РФ, имеет категорию редкости 1(E). Таксоны и популяции, численность особей которых уменьшилась до критического уровня таким образом, что в ближайшее время они могут исчезнуть (таких видов насчитывается порядка сорока) [1, 2].
Специфически протекающие процессы опыления и оплодотворения у реликтов, которые изначально существовали в условиях, отличающихся от современных, обусловливают слабое завязывание плодов. К лимитирующим факторам также относится малая численность в популяции, слабая семенная продуктивность, отсутствие естественных агентов распространения семян, а также заготовка сырья для использования в народной медицине. С этим связано постоянное уменьшение численности кирказона маньчжурского. Все это делает необходимым проведение исследований по разработке методики клонального размножения и определяет актуальность данной работы [3, 4].
Известен способ размножения кирказона маньчжурского семенами. В литературе отмечено, что семена кирказона хорошо прорастают (всхожесть до 95%) при осеннем и весеннем посеве, однако завязываемость плодов является низкой из-за узкой специализации цветка кирказона маньчжурского к опылению [5]. Вегетативное размножение Aristolochia manshuriensis также затруднено, о чем свидетельствуют результаты по размножению кирказона в условиях интродукции и слабое укоренение черенков - 15% [6].
Альтернативой семенному размножению и зеленому черенкованию кирказона маньчжурского является метод клонального микроразмножения через культуру меристем. Однако до настоящего времени так и не определен оптимальный состав питательной среды, обеспечивающей интенсивное формирование микропобегов кирказона из изолированных меристем [7, 8].
Изобретение представляет собой способ размножения растений Aristolochia manshuriensis Kom. методом культуры in vitro, включающий вычленение апикальных и латеральных почек, стерилизацию, высаживание на питательные среды, размножение микропобегов, их последующее укоренение, адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro. После адаптации к нестерильным условиям и доращивания получают стандартные саженцы кирказона маньчжурского с закрытой корневой системой. Преимущества предлагаемой нами технологии и использование заявленного способа позволяет получить более 150 тысяч саженцев в год от одного экспланта.
Ход работы
В ходе наших исследований разработана методика клонального микроразмножения Aristolochia manshuriensis Kom.
В качестве первичных эксплантов использовали апикальные и латеральные почки, фрагменты стебля длиной 1 см с 1-2 пазушными почками, взятые как с молодых растений (1-2-летних), так и с взрослых (до 10 лет).
Стерилизацию эксплантов проводили с помощью хлорсодержащего (гипохлорит натрия) стерилизующего агента. Экспозиция составила 7-10 минут.
На стадии пролиферации используется питательная среда Мурасиге-Скуга (1962), дополненная регулятором роста 6-ВАР (6-бензиламинопурин) в различных концентрациях (0,3; 0,5; 0,8; 1; 2 мг/л). При культивировании на средах, сочетающих ауксины и цитокинины, для многих видов растений было установлено увеличение регенерационного потенциала [9], поэтому дополнительно были испытаны среды, содержащие регуляторы роста как цитокининовой природы - 6-БАП (0,3; 0,5; 0,8; 1; 2 мг/л), так и ауксиновой природы - ИУК (индолил-3-уксусная кислота) в концентрации 0,05 мг/л. Оптимальной средой для культивирования является среда с добавлением 6-БАП в концентрации 0,8 мг/л и ИУК 0,05 мг/л. На этой среде были отмечены максимальные морфометрические показатели: коэффициент размножения составил 14,84, а длина побега - 38,80±5,25 мм (фиг. 1-2). В условиях лаборатории микропобеги Aristolochia manshuriensis выращивают при искусственном освещении (3000 лк) и фотопериоде 16/8 ч, температуре 23-25°C и влажности 70%. Укореняют побеги на агаризированной среде  MS, содержащей 20 мг/л сахарозы. На данном этапе были испытаны два регулятора роста: ИУК и ИМК (индолилмасляная кислота) в концентрации 3; 5 мг/л. Наилучшие результаты были достигнуты на среде с добавлением ИМК, разница между сравниваемыми концентрациями (3 и 5 мг/л) оказалась недостоверной (фиг. 3). Затем растения-регенеранты высаживают на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°C в течение 1-2 ч.
Различные стадии клонального микроразмножения кирказона маньчжурского показаны на фиг. 4-6.
Источники информации
1. Красная книга Российской Федерации (растения и грибы). - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2008. - 855 с.
2. Красная книга. Дикорастущие виды флоры СССР, нуждающиеся в охране. Л.: 1975, С. 72-73.
3. Наконечная О.В. Репродуктивная биология Aristolochia manshuriensis (Aristolochiaceae) в условиях интродукции. / О.В. Наконечная, О.Г. Корень, B.C. Сидоренко // Растительные ресурсы. - Вып. 3. - 2005. - С. 14-24.
4. Растительные ресурсы СССР. М.: Наука, 2005. - С. 45-46.
5. Наконечная О.В. Биология размножения и генетическая изменчивость кирказона маньчжурского (Aristolochia manshuriensis Kom.) в Приморском крае: Автореф. … дис. д-ра биол. наук. - Владивосток, 2007. - 22 с.
6. Шульгина В.В. Древесные лианы и их культура в Ленинграде // Интродукция растений и зеленое строительство. - М. - Л.: Изд-во Академии наук СССР, 1955. - С. 157-194.
7. Доан Т.Т., Клональное микроразмножение редких и исчезающих видов растений. / Т.Т. Доан, Е.А. Калашникова, О.И. Молканова // Известия ТСХА. - Вып. 5. - 2012. - С. 48-52.
8. Демиденко Е.Н., Гафицкая И.В., Михеева (Бабикова) А.В. К вопросу микроклонального размножения видов рода кирказон (Aristolochia L.). Водные и экологические проблемы, преобразование экосистем в условиях глобального изменения климата: VI Дружининские чтения: Материалы Всероссийской конференции с международным участием. 28-30 сентября. Хабаровск, 2016. - С. 128-130.
9. Муратова С.А. Индукция морфогенеза из изолированных соматических тканей растений. - Мичуринск: МичГАУ, 2011. - 107 с.