Особенности действия загрязнителей различной химической природы на содержание водорастворимых белков в тканях водного погруженного растения Egeria densa

УДК 574.24

ОСОБЕННОСТИ ДЕЙСТВИЯ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ РАЗЛИЧНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ НА СОДЕРЖАНИЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ БЕЛКОВ В ТКАНЯХ ВОДНОГО ПОГРУЖЕННОГО РАСТЕНИЯ

EGERIA DENSA

© 2010 И.Р. Мурзин, А.А. Косицына,1 О.Н. Макурина? О.А. Розенцвет3

Проведены исследования влияния различных концентраций синтетических моющих средств (содержащих анионные и катионные поверхностно активные вещества) и ионов двух тяжелых металлов (Cd2+ и Cu2+) на содержание водорастворимых белков в тканях водного погруженного растения Egeria densa. Выявлены достоверные отличия в содержании белков. Предположены возможные механизмы ответной реакции объекта исследования на воздействия поллютантов разной химической природы

Ключевые слова: водорастворимые белки, тяжелые металлы, различные детергенты, поверхностно-активные вещества.

Введение

Антропогенная составляющая нагрузки на окружающую среду с каждым годом увеличивается. Особенно это касается водоемов, основными источниками загрязнения которых являются промышленные, сельскохозяйственные, а также хозяйственно-бытовые стоки. Водосбросы содержат целый спектр химических веществ, в том числе различных органических соединений: пестицидов, минеральных удобрений, детергентов. Помимо этого они являются источником поступления некоторых неорганических соединений, многие из которых являются токсичными. Ввиду сложившейся ситуации ученым следует обратить особое внимание на проблему самоочищения водоемов от продуктов активной хозяйственной деятельности человека.

В связи с тем, что первыми принимают на себя удар этого нового специфического воздействия поллютантов водные растения, целью нашей работы явилось исследование влияния двух концентраций ионов тяжелых металлов (ТМ) (водные

1Мурзин Илья Радикович (ilmurzin@mail.ru), Косицына Арина Алексеевна (a.a.kositsyna@gmail.com), кафедра биологии Самарского государственного областного университета (Наяновой), 443001, Россия, г. Самара, ул. Молодогвардейская, 196.

2Макурина Ольга Николаевна (dekanat.05.54@mail.ru), кафедра биохимии Самарского государственного университета, 443011, Россия, г. Самара, ул. Акад. Павлова, 1.

3Розенцвет Ольга Анатольевна (olgarozen@pochta.ru), Институт экологии Волжского бассейна РАН, 445003, Россия, г. Тольятти Самарской обл., ул. Комзина, 10.

растворы нитрата кадмия и меди — 10 и 100 мг/моль) и синтетических поверхностно-активных веществ (СПАВ) на содержание водорастворимых белков в тканях водного погруженного растения Egeria densa.

Материалы и методы исследования

Опыт проводился в лабораторных условиях в резервуарах с водой, отгороженных от внешнего воздействия, при постоянной интенсивности и регулярности светового потока.

Объектом исследования был выбран пресноводный макрофит Элодея бразильская (Elodea brazilian, Egeria densa), принадлежиащий к семейству водокрасо-вых (Hydrocharitaceae), порядку частуховых (Alismatales), подклассу алисматид (Alismatidae), классу однодольных (Monocotyledones). Это многолетнее растение с длинным облиственным, ветвистым стеблем, достаточно ломким, который стелется по дну (укореняется) или плавает в толще воды. Листья удлиненные, ланцетные, обычно по 4-6 в мутовке [1].

Для проведения эксперимента растения были разделены на несколько групп: контрольная группа находилась в среде отфильтрованной водопроводной воды; опытные помещались в водные растворы солей нитрата кадмия и меди с концентрациями 100 и 10 мг/моль соответственно и водные растворы катионных и анионных СПАВ в концентрациях 0,01, 0,1 и 1 %. В исследованиях были использованы общедоступные синтетические моющие средства широкого применения: средство для мытья посуды "Dosya" (в состав которого входят только анионные СПАВ) и ополаскиватель для белья "Dosya" (содержащий в себе только катионные СПАВ). Непосредственно перед началом исследований фрагменты растений до 50 мм, считая от точки роста, были помещены в емкости объемом 1 дм3. В качестве опытных точек эксперимента были выбраны первые, третьи и десятые сутки, после чего половину растений из каждой группы забирали на исследование, а вторую половину помещали на реабилитацию в отстоянную отфильтрованную воду без металлов и СПАВ. Длительность реабилитации составляла 5 суток.

В ходе работы определяли содержание белков в тканях растения. Сначала белки экстрагировали из растительной ткани. Этот метод обеспечивает получение экстрактов, выделенных в мягких условиях, при которых сохраняется природная структура белковых молекул. Затем проводили исследование количественного содержания белков по методу, разработанному Мэрион Брэдфорд [2].

Определение количества белка в пробе проводили с помощью калибровочных кривых.

Результаты исследований и их обсуждение

Белки относятся к основным органическим веществам всех живых организмов, они играют важную роль в обмене веществ, выполняют структурную и механическую функции, участвуют в защитных процессах и клеточном цикле. Одна из важнейших групп белков — это ферменты, катализирующие химические реакции в клетках. Выбор исследовать количественное содержание белков был не случаен и закономерен, так как этот параметр является показательным в исследованиях токсических реакций и процессов адаптации.

В результате проведенных исследований нами было установлено достоверное влияние СПАВ и ТМ на содержание водорастворимых белков в тканях Egeria densa. На рис. 1 представлены данные по влиянию синтетических моющих средств, содержащих анионные СПАВ.

Рис. 1. Содержание водорастворимых белков в тканях водного растения Egeria densa, выращенного на растворе синтетического моющего средства, содержащего анионные СПАВ различных концентраций в разные дни эксперимента, в процентах по отношению к контролю

За первые сутки влияния молекул анионных поверхностно-активных веществ общий пул водорастворимых белков одинаково возрос (в пределах 0, 5 ± 0,1 мг/г сырой массы растения) в пробах с добавлением разных концентраций моющего средства относительно растений контрольных групп. Это, возможно, объясняется активацией ферментативных защитных механизмов, противодействующих негативному влиянию СПАВ, и подтверждается тем, что уровень водорастворимых белков снижается после прохождения реабилитации (рис. 2). Исключение составляет действие СПАВ высоких концентраций. Данные по реабилитации за первые сутки не показывают достоверного изменения количества белков, что является следствием глубокого влияния СПАВ высоких концентраций даже за столь короткий срок, как одни сутки. Воздействие ксенобиотика средних и высоких концентраций со временем угнетает синтез ферментов, блокируя межклеточный транспорт веществ, разрушая мембраны органоидов [3-7].

Уже к третьим суткам эксперимента (рис. 1) содержание белков в тканях начинает снижаться, кроме случая с растениями, находившимися в среде с низкими концентрациями молекул СПАВ, где содержание белков повышается.

У растений, подвергшихся влиянию ионов анионных СПАВ и прошедших реабилитацию (рис. 2), просматривается тенденция к восстановлению содержания белков до уровня контрольных групп, а значит, тенденция к восстановлению нормальной жизнедеятельности. Это особенно заметно по гистограмме, описывающей влияние низких концентраций. Здесь снижение происходит практически в два раза.

На десятые сутки эксперимента (см. рис. 1) содержание белков меньше на 100 % по сравнению с их количеством в тканях Egeria densa на третьи сутки, и, что характерно, оно продолжает снижаться и после пяти дней реабилитации растений опытных групп.

Рис. 2. Содержание водорастворимых белков в тканях водного растения Egeria densa, выращенного на растворе синтетического моющего средства, содержащего анионные СПАВ различных концентраций, и отправленного на реабилитацию после контрольных точек эксперимента, в процентах по отношению к контролю

Рис. 3. Содержание водорастворимых белков в тканях водного растения Egeria densa, выращенного на растворе синтетического моющего средства, содержащего катионные СПАВ различных концентраций в разные дни эксперимента, в процентах по отношению к контролю

Исходя из данных (рис. 3) по влиянию синтетических моющих средств, содержащих катионные СПАВ в различных концентрациях и в разные дни эксперимента, очевидно, что схема влияния моющих средств, в составе которых находятся разные классы ионов поверхностно-активных веществ, одинакова. Существует ряд различий, например: на третьи сутки эксперимента содержание водорастворимых белков в тканях растений, которые находились в среде с высокой и средней концентрацией катионных молекул, выше, чем у растений, находившихся в среде с ионами анионных СПАВ (см. рис. 1).

Также из данных, полученных в первые сутки эксперимента (рис. 3), видно, что динамика снижения количества белков выше у растений, находившихся в среде с добавлением катионных СПАВ. Это свидетельствует, на наш взгляд, о большей токсичности ионов катионных СПАВ и подтверждается нашими прошлыми исследованиями [8]. В исследованиях других авторов [9] показано изме-

нение активности ферментов в зависимости от поверхностной плотности заряда мембран. С увеличением плотности отрицательного заряда активность некоторых ферментов увеличивается. Различие в зарядах ионов поверхностно-активных веществ, на наш взгляд, является причиной различного воздействия СПАВ разных классов на содержание белков, а именно увеличение содержания в тканях после влияния анионных СПАВ и уменьшение после влияния катионных СПАВ.

Рис. 4. Содержание водорастворимых белков в тканях водного растения Egeria densa, выращенного на растворе синтетического моющего средства, содержащего катионные СПАВ различных концентраций, и отправленного на реабилитацию после контрольных точек эксперимента, в процентах по отношению к контролю

Нами также обнаружено (рис. 4) достоверное увеличение содержания белка в тканях опытного растения, прошедшего пятидневную реабилитацию после од-носуточного воздействия синтетического моющего средства, в состав которого входят ионы катионных СПАВ. Увеличение составило два раза в случае низких и высоких концентраций соответственно, и 3,5 раза у растений, находившихся в растворе с концентрацией синтетического моющего средства 0,1 %.

Что касается данных по содержанию белков в тканях растений, подвергшихся воздействию ксенобиотика в течение трех и десяти суток и отправленных на реабилитацию (рис. 4), то можно отметить большую адаптивную устойчивость к катионным СПАВ. Так как содержание белков по сравнению с контрольными точками эксперимента (рис. 3) максимально приблизилось к содержанию у контрольных групп, это свидетельствует о нормализации стрессового состояния у организма.

В результате проведенных экспериментов с добавлением в среду ионов кадмия было установлено, что содержание водорастворимых белков контрольной группы достоверно выше такового всех опытных групп растений в течение всего эксперимента (рис. 5). Нами выявлено, что в присутствии относительно высоких концентраций ионов кадмия в среде произрастания растений наблюдаются более существенные отличия от показателей их контрольной группы. Так, в первые сутки эксперимента содержание водорастворимых белков опытной группы, находящейся в среде с концентрацией ионов металла 10 мкМ, на 54,0 % ниже, чем в контрольной группе; содержание белков в тканях опытной группы, находящейся в среде с концентрацией ионов металла 100 мкМ, ниже на 87,2 %. К третьим суткам разница между содержанием белков в тканях растений контрольной и опытной групп (100 мкМ) немного сокращается, а к десятым суткам снова увеличивается. Так,

количество белков тканей контрольной группы растений на 94,2 и 72,3 % достоверно превышает содержание их в тканях опытных групп, которые находились в среде с добавлением ионов кадмия 100 и 10 мкМ соответственно. Вероятно, снижение содержания водорастворимых белков является следствием неспецифической токсичности ТМ, которые, как известно, способны угнетать метаболизм растений.

Сроки отбора проб Е 100 мкМ  10 мкМ

0,0

я -20,0

§

о

| -60,0 -

§

° -100,0 -120,0

1 сутки 3 сутки 10 сутки

У -Чг-

ЩР

-I-

Рис. 5. Содержание водорастворимых белков в тканях водного растения Egeria densa в период инкубации с добавлением соли кадмия, в процентах по отношению к контролю

Как видно из рис. 6, после периода реабилитации содержание водорастворимых белков в тканях контрольной группы растений также остается выше, чем в тканях опытных групп. Различие в содержании белков после реабилитации от первых суток эксперимента более значительно, особенно в случае с тканями растений, которые находились в среде с меньшей концентрацией кадмия. В случае реабилитации от третьих и десятых суток содержание белков в тканях растения, которые подвергались действию ионов кадмия большей концентрации (100 мкМ), превышает содержание в тканях растений, находившихся в среде с добавлением ионов металла 10 мкМ. Из полученных результатов можно сделать вывод, что реабилитация проходит более эффективно для опытной группы растений, которая подвергалась действию металла большей концентрации. Возможно, это связано с большей элиминацией ионов металла обратно в среду.

В случае с растениями, подвергшимися действию ионов кадмия меньшей концентрацией, произошло образование новых белковых и, в том числе, ферментативных комплексов, связывающих ионы металла, которые нарушили привычный белковый синтез. Ведь, как известно, кадмий по своим химическим свойствам очень близок к цинку [10] и вследствие этого может заменять важный для растений микроэлемент во многих биохимических процессах, происходящих в клетках, тем самым нарушая многие физиологические процессы.

На рис. 7 представлены данные по влиянию ионов меди на содержание водорастворимых белков в тканях растения. Содержание белков в контрольной группе достоверно выше такового всех опытных групп растений в течение всего эксперимента и после периода реабилитации. В целом полученные нами результаты схожи с данными эксперимента с кадмием. Выявлено, что в присутствии относительно высоких концентраций ионов меди в воде наблюдаются более существенные отличия от показателей контрольной пробы растений, чем при наличии меньших кон-

центраций. Так, в первые, третьи и десятые сутки содержание водорастворимых белков в тканях растения Egeria densa контрольной группы больше, чем содержание их в группе растений, инкубируемых в среде с добавлением ионов меди в концентрации 100 мкМ, на 86,1; 95,0 и 93,8 %. Разница в содержании белков контрольной и опытной (с концентрацией ионов металла 10 мкМ) групп растений в первые, третьи и десятые сутки составляет 34,7; 64,5 и 55,8 %.

и

Сроки отбора проб 1 сутки

0,0 -10,0 -20,0 -30,0 -40,0 -50,0 -60,0 -70,0 -80,0 -90,0 -100,0

ЮОмкМ  10 мкМ

3 сутки 10 сутки

Рис. 6. Содержание водорастворимых белков в тканях водного растения Egeria densa в период реабилитации (после действия соли кадмия), в процентах по отношению к контролю

Сроки отбора проб  ЮОмкМ Щ0 мкМ

0,0

п

J "2°'°

g -40,0

Ü -60,0

аг

э

б -80,0 -100,0 -120,0

Рис. 7. Содержание водорастворимых белков в тканях водного растения Egeria densa в период инкубации с добавлением соли меди, в процентах по отношению к контролю

После периода реабилитации от суточной инкубации разница в содержании водорастворимых белков тканей опытных и контрольной групп растений сокращается (рис. 8). Содержание белков в тканях растений, находящихся в среде с большей концентрацией меди (100 мкМ), повышается по сравнению с периодом до реабилитации от первых и третьих суток. Содержание белков опытной группы, которая находилась в среде с концентрацией ионнов металла 10 мкМ, ниже содержания в тканях контрольной группы на 23,6; 39,5 и 91,8 % после периода реабилитации от первых, третьих и десятых суток экспозиции растений.

1 сутки 3 сутки 10 сутки

чч -i- ч- -i-

i

—i—i

В целом реабилитация проходит тем эффективнее, чем меньше растения находились в среде с содержанием меди. После десятисуточной затравки растений сказывается сильное неблагоприятное влияние ионов меди на растения, поэтому реабилитация менее результативна, что подтверждается даже и внешним видом водных организмов.

Сроки отбора проб

1 сутки

0,0 %

i

' -20,0 а -40,0

<8

Й -60,0 d, >

а

а -8о,о -100,0 -120,0

100 мкМ

3 сутки

10 мкМ

10 сутки

-i-

Рис. 8. Содержание водорастворимых белков в тканях водного растения Egeria densa в период реабилитации (после действия соли меди), в процентах по отношению к контролю

Из полученных результатов можно сделать вывод, что поллютанты различной химической природы оказывают неодинаковое влияние на содержание водорастворимых белков в тканях водного погруженного растения Egeria densa. СПАВ особенно в невысоких концентрациях и при более короткой экспозиции увеличивает содержание белков, а при добавлении в среду ТМ, напротив, происходит уменьшение содержания пула белков. Закономерны различия и после действия реабилитационного периода. В случае эксперимента с добавлением соли кадмия реабилитация проходит менее эффективно, чем при добавлении в среду различных концентраций СПАВ. А при затравке растений медью после периода реабилитации растения не возвращаются к нормальной жизнедеятельности, и можно говорить об очень высокой токсичности данного ТМ, которую невозможно нейтрализовать и обратить последующим помещением опытных растений в чистую воду.

Литература

[1] Цвелёв Н.Н. Семейство Водокрасовые (Hydrocharitaceae) Жизнь растений: в 6 т. / под ред. А.Л. Тахтаджяна. М.: Просвещение, 1982. Т. 6. 275 с.

[2] Bredford M.M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantity of protein utilizing the principle of protein dye binding // Ann. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

[3] Айздайчер Н.А., Маркина Ж.В. Токсическое действие детергентов на водоросль Plagioselmis prolonga (Cryptophyta) // Биология моря. 2006. Т. 32. № 1. С. 50-54.

[4] Гуминовые кислоты: связь между поверхностной активностью и стимуляцией роста растений / Д.Б. Вахмистров [и др.] // Докл. АН СССР. 1987. Т. 293. № 5. С. 1277-1280.

[5] Волченко Н.Н., Самков А.А. Локализация биопав в культуре Rhodococcus sp. F1, влияние состава среды на ее поверхностно-активные свойства // Биология — наука XXI века: тез. докл. 8-й международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, Пущино, 17-21 мая 2004 г. Пущино: Пущинский науч. центр РАН, 2004, С. 144.

[6] Proteoliposomes and plant transport proteins / G. Hanke [et al.] //J. Exp. Bot. 1999. V. 50. P. 1715-1726.

[7] Helenius А., Simons K. Solubilization of membranes by detergents // Biochim Biophys Acta. 1975. V. 415. No. 1. P. 29-79.

[8] Мурзин И.Р. Особенности влияния различных моющих средств на полифе-нолоксидазную активность тканей элодеи бразильской (Egeria densa) // Физиологические механизмы становления и поддержания функций организма: материалы Международной научно-практич. конфер., 5-6 января 2010 г. Су-хум, 2010. С. 220-226.

[9] Гринштейн С.В., Кост О.А. Структурно-функциональные особенности мембранных белков // Успехи биологической химии. 2001. Т. 41. C. 77-104.

[10] Алексеев Ю.В. Тяжелые металлы в почвах и растениях. Л.: Агропромиздат, 1987. 140 с.

Поступила в редакцию 9//V/2010;

в окончательном варианте — 9//V/2010.

PECULIARITIES OF INFLUENCE OF POLLUTANTS OF DIFFERENT CHEMICAL NATURE ON THE CONTENT OF WATER-SOLUBLE PROTEINS IN THE TISSUES OF THE HYDROPHYTE WEED EGERIA DENSA

© 2010 I.R. Murzin, A.A. Kositsyna4 O.N. Makurina5 O.A. Rozencvet6

The research of influence of different concentrations of detergents (containing anionic and cationic surfactants) and ions of two heavy metals (Cd2+ and Cu2+) for the maintenance of water-soluble proteins in the tissues of the hy-drophete weed Egeria densa. is held. Reliable destictions in the content of proteins are singled out. This article describes the possible mechanisms of the test subject of the research on the influence of pollutants of different chemical nature are supposed.

Key words: water-soluble proteins, heavy metals, different detergents, surfactants.

Paper received 9//V/2010.

Paper accepted 9//V/2010.

4Murzin Ilya Radikovich (ilmurzinamail.ru), Kositsyna Arina Alexeevna (aakositsynaagmail.com), the Dept. of Biology, Samara State Region Nayanova University, Samara, 443001, Russia.

5Makurina Olga Nikolaevna (dekanat.05.54 a mail.ru), Department of Biochemistry, Samara State University, Samara, 443011, Russia.

6Rozencvet Olga Anatolievna (olgarozen@pochta.ru), Institute of Ecology of the Volga pool, Togliatti, 445003, Russia.