ПОЛНОСТЬЮ МАСШТАБИРУЕМЫЙ СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА rAAV НА ОСНОВЕ КОЛОНОК

1. Способ очистки частиц рекомбинантного вектора аденоассоциированного вируса (rAAV), включающий стадии:
(a) сбора клеток и супернатанта культуры клеток, содержащего частицы вектора rAAV для получения сбора;
(b) необязательно, концентрирования указанного сбора, полученного на стадии (а), для получения концентрированного сбора;
(c) лизирования указанного сбора, полученного на стадии (а), или указанного концентрированного сбора, полученного на стадии (b), для получения лизата;
(d) обработки лизата, полученного на стадии (с), для снижения содержания контаминирующей нуклеиновой кислоты в лизате и, таким образом, получения лизата со сниженным содержанием нуклеиновой кислоты;
(e) фильтрации указанного лизата со сниженным содержанием нуклеиновой кислоты, полученного на стадии (d), для получения очищенного лизата и, необязательно, разведения указанного очищенного лизата для получения разведенного очищенного лизата;
(f) подвергания указанного очищенного лизата или разведенного очищенного лизата, полученного на стадии (е), анионообменной хроматографии на колонках для получения колоночного элюата, состоящего из частиц вектора rAAV, и, необязательно, концентрирования указанного колоночного элюата для получения концентрированного колоночного элюата;
(д) подвергания указанного колоночного элюата или указанного концентрированного колоночного элюата, полученного на стадии (f), эксклюзионной хроматографии на колонках для получения второго колоночного элюата, состоящего из частиц вектора rAAV, и, таким образом, разделения частиц вектора rAAV и белковых примесей и, необязательно, разведения указанного второго колоночного элюата для получения разведенного второго колоночного элюата;
(h) подвергания указанного второго колоночного элюата или указанного разведенного второго колоночного элюата, полученного на стадии (g), катионообменной хроматографии на колонках для получения третьего колоночного элюата, состоящего из частиц вектора rAAV, и, таким образом, разделения частиц вектора rAAV и белковых или других производственных примеси, и, необязательно, концентрирования указанного третьего колоночного элюата для получения концентрированного третьего колоночного элюата; и
(i) фильтрации указанного третьего колоночного элюата или указанного концентрированного третьего колоночного элюата, полученного на стадии (h), и, таким образом, получения очищенных частиц вектора rAAV.
2. Способ по п. 1, где указанное концентрирование на стадии (b), и/или стадии (f), и/или стадии (h) осуществляют посредством ультрафильтрации/диафильтрации, необязательно, посредством фильтрации тангенциальным потоком.
3. Способ по п. 1, где посредством указанного концентрирования на стадии (b) снижают объем указанных собранных клеток и супернатанта культуры клеток приблизительно в 2-10 раз.
4. Способ по п. 1, где посредством указанного концентрирования на стадии (f) снижают объем указанного колоночного элюата приблизительно в 5-20 раз.
5. Способ по п. 1, где указанное лизирование указанного сбора, полученного на стадии (а), или указанного концентрированного сбора, полученного на стадии (b), осуществляют посредством микрофлюидизации.
6. Способ по п. 1, где стадия (d) включает обработку нуклеазой и, таким образом, снижение содержания контаминирующей нуклеиновой кислоты.
7. Способ по п. 6, где нуклеаза включает бензоназу.
8. Способ по п. 1, где указанную фильтрацию указанного очищенного лизата или указанного разведенного очищенного лизата на стадии (е) осуществляют с помощью фильтра, имеющего диаметр пор приблизительно от 0,1 до 0,8 мкм включительно.
9. Способ по п. 1, где указанное разведение указанного очищенного лизата или указанного разведенного очищенного лизата на стадии (е) осуществляют с помощью водного забуференного раствора ацетата.
10. Способ по п. 1, где указанное разведение указанного второго колоночного элюата на стадии (д) осуществляют с помощью водного забуференного раствора ацетата.
11. Способ по п. 10, где указанный водный забуференный раствор ацетата имеет рН приблизительно от 4,0 до 7,0 включительно.
12. Способ по п. 1, где указанные частицы вектора rAAV, полученные на стадии (i) и/или стадии (i), составляют с помощью поверхностно-активного вещества для получения состава вектора AAV.
13. Способ по п. 1, где указанная анионообменная хроматография на колонках на стадии (f) включает полиэтиленгликоль (PEG)-модулируемую хроматографию на колонках.
14. Способ по п. 13, где указанная анионообменная хроматография на колонках на стадии (f) включает промывку указанной колонки раствором PEG перед элюцией указанных частиц вектора rAAV из колонки.
15. Способ по п. 14, где PEG в указанном растворе PEG имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне приблизительно от 1000 до 50000 включительно.
16. Способ по п. 1, где указанная анионообменная хроматография на колонках на стадии (f) включает промывку указанной колонки водным раствором поверхностно-активного вещества перед элюцией указанных частиц вектора rAAV из колонки.
17. Способ по п. 1, где указанная катионообменная хроматография на колонках на стадии (h) включает промывку указанной колонки раствором поверхностно-активного вещества перед элюцией указанных частиц вектора rAAV из колонки.
18. Способ по любому из пп. 14-17, где указанный раствор PEG и/или указанный раствор поверхностно-активного вещества содержит водный буфер Трис-Cl/NaCl или водный буфер фосфат/NaCl.
19. Способ по п. 18, где указанный буфер NaCl содержит приблизительно 20-250 мМ NaCl включительно или приблизительно 50-200 мМ NaCl включительно.
20. Способ по п. 1, где указанные частицы вектора rAAV элюируют из указанной анионообменной колонки на стадии (f) в водный буфер Трис-Cl/NaCl.
21. Способ по п. 20, где указанный буфер Трис-Cl/NaCl содержит 50-200 мМ NaCl.
22. Способ по п. 1, где указанные частицы вектора rAAV элюируют из указанной катионообменной колонки на стадии (h) в водный буфер фосфат/NaCl.
23. Способ по п. 22, где указанный буфер фосфат/NaCl содержит приблизительно 100-500 мМ NaCl включительно.
24. Способ по п. 1, где указанная анионообменная колонка на стадии (f) содержит функциональную группу четвертичного аммония, такую как кватернизированный полиэтиленимин.
25. Способ по п. 1, где указанная эксклюзионная колонка на стадии (g) имеет диапазон разделения (по молекулярной массе) приблизительно от 10000 до 600000 включительно.
26. Способ по п. 1, где указанная катионообменная колонка на стадии (h) содержит сульфоновую кислоту или функциональную группу, такую как сульфопропил.
27. Способ по любому из пп. 1-26, где способ исключает стадию ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия.
28. Способ по любому из пп. 1-27, где указанные частицы вектора rAAV содержат трансген, кодирующий нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из миРНК, антисмысловой молекулы, мкРНК, рибозима и shRNA.
29. Способ по любому из пп. 1-28, где указанные частицы вектора rAAV содержат трансген, кодирующий продукт гена, выбранный из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, гормона роста (GH), паратиреоидного гормона (РТН), соматолиберина
(GRF), фолликулостимулирующего гормона (FSH), лютеинизирующего гормона (LH), хорионического гонадотропина человека (hCG), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиопоэтинов, ангиостатина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора
(Г-КСФ), эритропоэтина (ЕРО), фактора роста соединительной ткани (CTGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), кислого фактора роста фибробластов (aFGF), эпидермального фактора роста (EGF), трансформирующего фактора роста α (ФНО), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), инсулино-подобных факторов роста I и II (IGF-I и IGF-II), TGFβ, активинов, ингибинов, морфогенетического белка кости (BMP), фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротрофинов NT-3 и NT4/5, цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF), нейртурина, агрина, нетрина-1 и нетрина-2, фактора роста гепатоцитов (HGF), эфринов, ноггина, Sonic Hedgehog и тирозингидроксилазы.
30. Способ по любому из пп. 1-28, где указанные частицы вектора rAAV содержат трансген, кодирующий продукт гена, выбранный из группы, состоящей из тромбопоэтина (ТРО), интерлейкинов (ИЛ-1-ИЛ-17), моноцитарного белка-хемоаттрактанта, лейкоз-ингибирующего фактора, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, Fas-лиганда, факторов некроза опухоли α и β, интерферонов α β и γ, фактора стволовых клеток, лиганда flk-2/flt3, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, химерных иммуноглобулинов, гуманизированных антител, одноцепочечных антител, Т-клеточных рецепторов, химерных Т-клеточных рецепторов, одноцепочечных Т-клеточных рецепторов, молекул МНС класса I и класса II.
31. Способ по любому из пп. 1-28, где указанные частицы вектора rAAV содержат трансген, кодирующий белок, применимый для коррекции врожденных нарушений метаболизма, выбранный из группы, состоящей из карбамоилсинтетазы I, орнитинтранскарбамилазы, аргиносукцинатсинтетазы, аргиносукцинатлиазы, аргиназы, фумариацетацетатгидролазы, фенилаланигидроксилазы, альфа-1-антитрипсина, глюкоза-6-фосфатазы, порфобилиногендезаминазы, фактора V, фактора VIII, фактора IX, цистатион бета-синтазы, декарбоксилазы разветвленных альфа-кетокислот, альбумина, изовалерил-КоА-дегидрогеназа, пропионил-КоА-карбоксилазы, метилмалонил-КоА-мутазы, глутарил-КоА-дегидрогеназы, инсулина, бета-глюкозидазы, пируваткарбоксилазы, печеночной фосфорилазы, фосфорилаза-киназы, глициндекарбоксилазы, RPE65, Н-белка, Т-белка, последовательности трансмембранного регулятора кистозного фиброза (CFTR) и последовательность кДНК дистрофина.
32. Способ по любому из пп. 1-28, где указанные частицы вектора rAAV содержат трансген, кодирующий фактор VIII или фактор IX.
33. Способ по любому из пп. 1-32, где с помощью способа выделяют приблизительно 4 0-70% общего количества частиц вектора rAAV из сбора, полученного на стадии (а), или указанного концентрированного сбора, полученного на стадии (b).
34. Способ по любому из пп. 1-33, где способом получают частицы вектора rAAV, имеющие более высокую чистоту, чем частицы вектора rAAV, полученные или очищенные посредством очистки на AAV-аффинной колонке.
35. Способ по любому из пп. 1-34, где способом получают частицы вектора rAAV, имеющие более высокую чистоту, чем частицы вектора rAAV, получаемые или очищенные посредством очистки с помощью AAV-аффинной колонки в комбинации с очисткой с помощью анионообменной колонки.
36. Способ по любому из пп. 1-34, где способом получают частицы вектора rAAV, имеющие более высокую чистоту, чем частицы вектора rAAV, полученные или очищенные посредством очистки с помощью AAV-аффинной колонки в комбинации с очисткой с помощью анионообменной и катионообменной колонки.
37. Способ по любому из пп. 1-36, где указанные частицы вектора получают из AAV, выбранного из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 и AAV10.
38. Способ очистки частиц рекомбинантного вектора аденоассоциированного вируса (rAAV), включающий стадии:
(a) сбора клеток и супернатанта культуры клеток, содержащего частицы вектора rAAV, для получения сбора;
(b) необязательно, концентрирования указанного сбора, полученного на стадии (а), для получения концентрированного сбора;
(c) лизирования указанного сбора, полученного на стадии (а), или указанного концентрированного сбора, полученного на стадии (b), для получения лизата;
(d) обработки лизата, полученного на стадии (с), для снижения содержания контаминирующей нуклеиновой кислоты в лизате и, таким образом, получения лизата со сниженным содержанием нуклеиновой кислоты;
(e) фильтрации указанного лизата со сниженным содержанием нуклеиновой кислоты, полученного на стадии (d), для получения очищенного лизата и, необязательно, разведения указанного очищенного лизата для получения разведенного очищенного лизата;
(f) подвергания указанного очищенного лизата или разведенного очищенного лизата, полученного на стадии (е), катионообменной хроматографии на колонках для получения колоночного элюата, состоящего из частиц вектора rAAV и, таким образом, разделения частиц вектора rAAV и белковых или других производственных примесей и, необязательно, концентрирования указанного колоночного элюата для получения концентрированного колоночного элюата;
(g) подвергания указанного колоночного элюата или указанного концентрированного колоночного элюата, полученного на стадии (f), эксклюзионной хроматографии на колонках для получения второго колоночного элюата, состоящего из частиц вектора rAAV, и, таким образом, разделения частиц вектора rAAV и белковых примесей и, необязательно, разведения указанного второго колоночного элюата для получения разведенного второго колоночного элюата;
(h) подвергания указанного второго колоночного элюата или указанного разведенного второго колоночного элюата, полученного на стадии (g), анионообменной хроматографии на колонках для получения третьего колоночного элюата, состоящего из частиц вектора rAAV, и, необязательно, концентрирования указанного третьего колоночного элюата для получения концентрированного третьего колоночного элюата; и
(i) фильтрации указанного третьего колоночного элюата или указанного концентрированного третьего колоночного элюата, полученного на стадии (h), и, таким образом, получения очищенных частиц вектора rAAV.
39. Способ по п. 38, где указанное концентрирование на стадии (b), и/или стадии (f), и/или стадии (h) осуществляют посредством ультрафильтрации/диафильтрации, необязательно, посредством фильтрации тангенциальным потоком.
40. Способ по п. 38, где посредством указанного концентрирования на стадии (b) снижают объем указанных собранных клеток и супернатанта культуры клеток приблизительно в 2-10 раз.
41. Способ по п. 38, где посредством указанного концентрирования на стадии (f) снижают объем указанного колоночного элюата приблизительно в 5-20 раз.
42. Способ по п. 38, где указанное лизирование указанного сбора, полученного на стадии (а), или указанного концентрированного сбора, полученного на стадии (b), осуществляют посредством микрофлюидизации.
43. Способ по п. 38, где стадия (d) включает обработку нуклеазой и, таким образом, снижение содержания контаминирующей нуклеиновой кислоты.
44. Способ по п. 43, где нуклеаза включает бензоназу.
45. Способ по п. 38, где указанную фильтрацию указанного очищенного лизата или указанного разведенного очищенного лизата на стадии (е) осуществляют с помощью фильтра, имеющего диаметр пор приблизительно от 0,1 до 0,8 мкм включительно.
46. Способ по п. 38, где указанное разведение указанного очищенного лизата или указанного разведенного очищенного лизата на стадии (е) осуществляют с помощью водного забуференного раствора ацетата.
47. Способ по п. 38, где указанное разведение указанного второго колоночного элюата на стадии (д) осуществляют с помощью водного забуференного раствора ацетата.
48. Способ по п. 47, где указанный водный забуференный раствор ацетата имеет рН приблизительно от 4,0 до 7,0 включительно.
49. Способ по п. 38, где указанные частицы вектора rAAV, полученные на стадии (i), составляют с помощью поверхностно-активного вещества для получения состава вектора AAV.
50. Способ по п. 38, где указанная анионообменная хроматография на колонках на стадии (h) включает полиэтиленгликоль (PEG)-модулируемую хроматографию на колонках.
51. Способ по п. 38, где указанная анионообменная хроматография на колонках на стадии (h) включает промывку указанной колонки раствором PEG перед элюцией указанных частиц вектора rAAV из колонки.
52. Способ по п. 51, где PEG в указанном растворе PEG имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне приблизительно от 1000 до 50000 включительно.
53. Способ по п. 38, где указанная анионообменная хроматография на колонках на стадии (h) включает промывку указанной колонки водным раствором поверхностно-активного вещества перед элюцией указанных частиц вектора rAAV из колонки.
54. Способ по п. 38, где указанная катионообменная хроматография на колонках на стадии (f) включает промывку указанной колонки раствором поверхностно-активного вещества перед элюцией указанных частиц вектора rAAV из колонки.
55. Способ по любому из пп. 50-54, где указанный раствор PEG и/или указанный раствор поверхностно-активного вещества содержит водный буфер Трис-Cl/NaCl или водный буфер фосфат/NaCl.
56. Способ по п. 55, где указанный буфер NaCl содержит приблизительно 20-250 мМ NaCl включительно или приблизительно 50-200 мМ NaCl включительно.
57. Способ по п. 38, где указанные частицы вектора rAAV элюируют из указанной анионообменной колонки на стадии (h) в водный буфер Трис-Cl/NaCl.
58. Способ по п. 57, где указанный буфер Трис-Cl/NaCl содержит 50-200 мМ NaCl.
59. Способ по п. 38, где указанные частицы вектора rAAV элюируют из указанной катионообменной колонки на стадии (f) в водный буфер фосфат/NaCl.
60. Способ по п. 59, где указанный буфер фосфат/NaCl содержит приблизительно 100-500 мМ NaCl включительно.
61. Способ по п. 38, где указанная анионообменная колонка на стадии (h) содержит функциональную группу кватернизированного полиэтиленимина.
62. Способ по п. 38, где указанная эксклюзионная колонка на стадии (g) имеет диапазон разделения (по молекулярной массе) приблизительно от 10000 до 600000 включительно.
63. Способ по п. 38, где указанная катионообменная колонка на стадии (f) содержит сульфопропильную функциональную группу.
64. Способ по любому из пп. 38-63, где способ исключает стадию ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия.
65. Способ по любому из пп. 38-64, где указанные частицы вектора rAAV содержат трансген, кодирующий нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из миРНК, антисмысловой молекулы, мкРНК, рибозима и shRNA.
66. Способ по любому из пп. 38-64, где указанные частицы вектора rAAV содержат трансген, кодирующий продукт гена, выбранный из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, гормона роста (GH), паратиреоидного гормона (РТН), соматолиберина (GRF), фолликулостимулирующего гормона (FSH), лютеинизирующего гормона (LH), хорионического гонадотропина человека (hCG), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиопоэтинов, ангиостатина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), эритропоэтина (ЕРО), фактора роста соединительной ткани (CTGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), кислого фактора роста фибробластов (aFGF), эпидермального фактора роста (EGF), трансформирующего фактора роста а (ФНО), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), инсулино-подобных факторов роста I и II (IGF-I и IGF-II), TGFβ, активинов, ингибинов, морфогенетического белка кости (BMP), фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротрофинов NT-3 и NT4/5, цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), нейротрофического фактора глиальных клеток (GDNF), нейртурина, агрина, нетрина-1 и нетрина-2, фактора роста гепатоцитов (HGF), эфринов, ноггина, Sonic Hedgehog и тирозингидроксилазы.
67. Способ по любому из пп. 38-64, где указанные частицы вектора rAAV содержат трансген, кодирующий продукт гена, выбранный из группы, состоящей из тромбопоэтина (ТРО), интерлейкинов (ИЛ-1-ИЛ-17), моноцитарного белка-хемоаттрактанта, лейкоз-ингибирующего фактора, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, Fas-лиганда, факторов некроза опухоли α и β, интерферонов α, β и γ, фактора стволовых клеток, лиганда flk-2/flt3, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, химерных иммуноглобулинов, гуманизированных антител, одноцепочечных антител, Т-клеточных рецепторов, химерных Т-клеточных рецепторов, одноцепочечных Т-клеточных рецепторов, молекул МНС класса I и класса II.
68. Способ по любому из пп. 38-64, где указанные частицы вектора rAAV содержат трансген, кодирующий белок, применимый для коррекции врожденных нарушений метаболизма, выбранный из группы, состоящей из карбамоилсинтетазы I, орнитинтранскарбамилазы, аргиносукцинатсинтетазы, аргиносукцинатлиазы, аргиназы, фумариацетацетатгидролазы, фенилаланигидроксилазы, альфа-1-антитрипсина, глюкоза-6-фосфатазы, порфобилиногендезаминазы, фактора V, фактора VIII, фактора IX, цистатион бета-синтазы, декарбоксилазы разветвленных альфа-кетокислот, альбумина, изовалерил-КоА-дегидрогеназа, пропионил-КоА-карбоксилазы, метилмалонил-КоА-мутазы, глутарил-КоА-дегидрогеназы, инсулина, бета-глюкозидазы, пируваткарбоксилазы, печеночной фосфорилазы, фосфорилаза-киназы, глициндекарбоксилазы, RPE65, Н-белка, Т-белка, последовательности трансмембранного регулятора кистозного фиброза (CFTR) и последовательность кДНК дистрофина.
69. Способ по любому из пп. 38-64, где указанные частицы вектора rAAV содержат трансген, кодирующий фактор VIII или фактор IX.
70. Способ по любому из пп. 38-64, где с помощью способа выделяют приблизительно 4 0-70% общего количества частиц вектора rAAV из сбора, полученного на стадии (а), или указанного концентрированного сбора, полученного на стадии (b).
71. Способ по любому из пп. 38-64, где способом получают частицы вектора rAAV, имеющие более высокую чистоту, чем частицы вектора rAAV, полученные или очищенные посредством очистки на AAV-аффинной колонке.
72. Способ по любому из пп. 38-64, где способом получают частицы вектора rAAV, имеющие более высокую чистоту, чем частицы вектора rAAV, получаемые или очищенные посредством очистки с помощью AAV-аффинной колонки в комбинации с очисткой с помощью анионообменной колонки.
73. Способ по любому из пп. 38-64, где способом получают частицы вектора rAAV, имеющие более высокую чистоту, чем частицы вектора rAAV, полученные или очищенные посредством очистки с помощью AAV-аффинной колонки в комбинации с очисткой с помощью анионообменной и катионообменной колонки.
74. Способ по любому из пп. 38-64, где указанные частицы вектора получают из AAV, выбранного из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 и AAV10.