ЖИДКОСТЬ ДЛЯ ОТБОРА МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОБ ПРИ ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ
LIQUID FOR SELECTION OF MICROBIOLOGICAL SAMPLES AT SUBZERO TEMPERATURES

Изобретение относится к составам, используемым для установления присутствия и идентификации микроорганизмов, в том числе и в условиях отрицательных (до минус 30°С) температур. Изобретение может быть использовано в микробиологии, здравоохранении, ветеринарии, пищевой и фармацевтической промышленности, в интересах Министерства обороны и Министерства РФ по делам гражданской обороны, чрезвычайным ситуациям и ликвидации последствий стихийных бедствий, а также в других областях науки и производства, где возникает необходимость определять уровень микробного загрязнения объектов и контролировать качество дезинфекционных мероприятий.
Отбор микробиологических проб с поверхностей различных объектов методом смыва осуществляют с использованием тампонов (салфеток). Каждый тампон смачивают смывной жидкостью (стерильной водой, 0,85% раствором хлорида натрия или жидкой питательной средой). Если пробы отбирают после дезинфекции, то в смывную жидкость добавляют нейтрализатор для прекращения действия остатков дезинфектанта [1-3].
Смывная нейтрализующая жидкость (СНЖ) должна удовлетворять следующим требованиям: полностью нейтрализовывать в пробах остатки дезинфектанта для прекращения его микробоцидного и статического действия, обеспечивать сохраняемость микроорганизмов в пробах, быть нетоксичной, а при работах в зимних условиях - не замерзать [1-3].
Срок хранения микробиологической пробы с момента отбора до начала ее обработки в лаборатории не должен превышать 2-4 часов [1, 4]. При возникновении чрезвычайных ситуаций, связанных с распространением патогенных микроорганизмов, либо при массовых вспышках инфекционных заболеваний количество микробиологических проб может намного превышать возможности специализированных лабораторий по их обработке, в результате чего срок хранения проб значительно увеличится (от 1 до 10 суток). Кроме того, при возникновении подобных чрезвычайных ситуаций в удаленных и труднодоступных районах России срок транспортировки проб в даже в ближайшую лабораторию также может намного превысить предписанные 4 часа.
Проведение дезинфекционных мероприятий при отрицательных температурах сопряжено с большими трудностями, которые обусловлены, в частности, снижением обеззараживающей активности водных дезинфицирующих растворов и их замерзанием [5]. Перечень средств для дезинфекции при отрицательной температуре окружающей среды ограничен препаратами окислительного действия (хлорсодержащие препараты, перекись водорода и пероксокислоты) [5]. Известно, что для дезинфекции при отрицательных температурах применяют в зависимости от вида активнодействующего вещества в 2-15 раз более концентрированные растворы, чем при положительных температурах [5, 6].
Гипосульфит натрия широко применяют в качестве нейтрализатора дезинфектантов окислительного действия, количество его в СНЖ, по данным различных источников, составляет от 0,1 до 2,5% [1, 3, 4]. Указанное количество гипосульфита натрия рассчитано на нейтрализацию активнодействующих веществ в дезинфицирующих растворах, применяемых для обработки объектов при положительной температуре окружающей среды [1, 3, 4]. Чтобы добиться полной нейтрализации в микробиологической пробе остатка дезинфектанта, применяемого для «зимней» дезинфекции, необходимо увеличивать концентрацию гипосульфита натрия в СНЖ в несколько раз.
Для отбора проб при температурах до минус 30°С авторами William D. Won, Harold Ross [7] предложен состав жидкости, включающий смесь желатина и фосфата с водным раствором антифриза - этиленгликоля.
Алексеева М.И. с соавторами в ходе экспериментов по обеззараживанию различных поверхностей при отрицательных температурах добавляли 20-30% водные растворы глицерина в микробные суспензии для защиты микроорганизмов от неблагоприятных факторов окружающей среды [8]. Б.Л. Шура-Бура и М.А. Золочевский в своих экспериментах использовали смесь этиленгликоля с глицерином для предотвращения замерзания микробных суспензий [9].
Все указанные аналоги не в полной мере удовлетворяют предъявляемым к смывной нейтрализующей жидкости условиям и имеют следующие недостатки:
- низкое содержание гипосульфита натрия, недостаточное для полной нейтрализации остатков дезинфектантов, используемых для обеззараживания объектов в «зимних» условиях, либо полное его отсутствие;
- отсутствие в составе антифриза, что приводит к замерзанию СНЖ при отрицательных температурах, либо наличие токсичного компонента - этиленгликоля, который является ядовитой технической жидкостью [10].
Цель изобретения - создание смывной нейтрализующей жидкости с нетоксичными компонентами, обеспечивающей возможность отбора проб микроорганизмов в условиях отрицательных (до минус 30°С) температур, а также сохранение микроорганизмов в СНЖ в жизнеспособном состоянии и увеличение срока хранения проб более 4 часов с момента их отбора.
Данная цель достигается тем, что в составе СНЖ ядовитая техническая жидкость этиленгликоль, используемая в качестве антифриза, заменена на нетоксичный пропиленгликоль; концентрация гипосульфита натрия, нейтрализующего дезинфектанты окислительного действия, по сравнению с аналогами, увеличена в три раза. Дополнительно, при необходимости хранения проб более трех суток и защиты микроорганизмов от воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды, в СНЖ добавляют глицерин.
Сущность изобретения заключается в получении смывной нейтрализующей жидкости путем смешивания с водой гипосульфита натрия пятиводного, пропиленгликоля и глицерина в расчетных количествах.
3
Определяют необходимый для проведения работ объем смывной нейтрализующей жидкости (СНЖ) из расчета 5 см жидкости на одну микробиологическую пробу. Зная общий объем СНЖ, рассчитывают количество каждого компонента в отдельности с учетом состава жидкости (мас. %), планируемой температуры ее использования и сроков хранения проб:
- гипосульфит натрия пятиводный - 7,5%;
- пропиленгиколь - 30,0% для использования при температуре до минус 18°С или 40,0% для использования при температуре от минус 18°С до минус 30,0°С;
- глицерин - 10,0% (добавляют при необходимости хранения микробиологических проб более трех суток);
- вода - остальное.
Для приготовления СНЖ используют вещества с квалификацией по степени чистоты не хуже, чем чистый (ч.) или чистый для анализа (ч.д.а.).
В рассчитанном количестве водопроводной питьевой воды растворяют навеску гипосульфита натрия, затем добавляют пропиленгликоль и глицерин (если необходимо). Полученную жидкость перемешивают, разливают в стеклянную тару и стерилизуют автоклавированием при 1,1 атм (121°С) в течение 20 минут.
3
Для отбора проб микроорганизмов с поверхности методом смыва используют стерильные ватно-марлевые тампоны, укрепленные на стержнях, которые вмонтированы в пробки пробирок. Допускается использовать вместо тампонов стерильные марлевые салфетки и емкости небольшого объема с пробками (по одной на каждую пробу) [1, 3]. Перед началом работы в каждую пробирку с тампоном (емкость с пробкой) наливают по 5 см стерильной СНЖ.
В процессе отбора пробы соблюдают следующую последовательность операций: тампон увлажняют СНЖ, находящейся в пробирке, и дважды во взаимно перпендикулярных направлениях со сменой поверхности соприкосновения тампона протирают контрольный участок поверхности объекта. Затем тампон возвращают в ту же пробирку и полностью погружают в жидкость. В случае использования салфеток каждую берут индивидуальным стерильным пинцетом. Салфетку смачивают СНЖ, находящейся в емкости, так же, как и тампоном, протирают контрольный участок поверхности объекта, затем возвращают в емкость, погружают в жидкость и закрывают пробкой.
Пробирку (емкость) в течение 10 минут встряхивают для перевода смытых микроорганизмов с поверхности тампона (салфетки) в жидкость. Затем отобранные пробы доставляют в специализированную лабораторию, в которой проводят посев СНЖ из проб в питательный бульон или на плотную питательную среду с последующим культивированием в термостате для определения наличия и подсчета в них живых микроорганизмов.
Пример 1. Температуру кристаллизации смывных нейтрализующих жидкостей определяли при помощи аппарата АТКт-02 (производства ООО «Спецнефтехимавтоматика», г. Уфа), предназначенного для определения температуры начала кристаллизации низкозамерзающих жидкостей и тосола. Определение проводили по методике, изложенной в руководстве по эксплуатации прибора.
Температуру кристаллизации определяли для СНЖ следующего состава (мас.%):
- 7,5% гипосульфита натрия пятиводного, 30,0% пропиленгликоля;
- 7,5% гипосульфита натрия пятиводного, 30,0% пропиленгликоля, 10,0% глицерина;
- 7,5% гипосульфита натрия пятиводного, 40,0% пропиленгликоля;
- 7,5% гипосульфита натрия пятиводного, 40,0% пропиленгликоля, 10,0% глицерина.
3
Каждую жидкость готовили в количестве 100 см, в качестве растворителя использовали водопроводную питьевую воду.
Перед началом работ в охлаждающей камере задавали температуру стабилизации на (12±5)°С ниже предполагаемой температуры начала кристаллизации СНЖ (минус 30°С и минус 40°С для жидкостей с содержанием пропиленгликоля 30,0% и 40,0% соответственно). За предполагаемую температуры начала кристаллизации СНЖ принимали температуру замерзания водного раствора пропиленгликоля соответствующей концентрации минус 13,0°С и минус 23°С [10]. Во внутреннюю пробирку охлаждающей камеры заливали 20 см испытываемой СНЖ, подготавливали аппарат к работе и проводили измерения. Испытания проводили в трех-пяти кратной повторности, для каждого измерения использовали новую порцию жидкости.
В результате испытаний (таблица 1), установлено, что температура кристаллизации смывной нейтрализующей жидкости, содержащей 30,0% и 40,0% пропиленгликоля, составляет, соответственно, минус (18,0±0,6)°С и минус (28,7±1,5)°С. Добавка 10,0% глицерина снижает температуру кристаллизации СНЖ на 5°С.
Пример 2. Оценку сохраняемости микроорганизмов в пробах-смывах, отобранных с поверхности после дезинфекции, в зависимости от состава СНЖ, срока и условий хранения проводили с использованием агаровых споровых культур Bacillus subtilis (штамм 3) и Bacillus anthracis (штамм СТИ-1). Содержание зрелых спор в культурах составляло не менее 90%. Испытания проводили в натурных условиях при температуре минус (15,0±3,0)°С и в климатической камере при температуре минус (28,0±2,0)°С. В испытаниях использовали смывные нейтрализующие жидкости, состав которых представлен в примере 1.
-2
На листах из окрашенного металла размечали квадраты 10×10 см и на их поверхность наносили суспензию спор одной из культур из расчета получения плотности заражения n·10 спор·см.
3
-2
После высыхания поверхности ее орошали дезинфицирующим раствором, содержащим 10% пероксида водорода и 40% изопропанола, используемого в качестве антифриза, с нормой расхода 300 см·м. Раствор рекомендован для обработки санитарного транспорта при отрицательной температуре [6].
Чтобы получить достаточное для изучения сохраняемости количество живых спор в пробах, их отбор начинали через 5 минут после окончания орошения листов металла дезинфицирующим раствором. Отбор проб проводили методом смыва с использованием ватно-марлевых тампонов. Одновременно проводили опыт по определению контроля полноты нейтрализации дезинфицирующего раствора в пробах-смывах по методике, изложенной в Руководстве Р 4.2.2643-10 [1].
3
По окончании испытаний пробы транспортировали в микробиологическую лабораторию, где проводили их обработку чашечным методом в соответствии с Руководством Р 4.2.2643-10 [1]. По результатам первого высева отбирали пробы, содержащие в 1 см от 600 до 1500 живых спор, и только их оставляли для дальнейшего хранения. При этом 50% проб помещали в холодильник при температуре (6±1)°С, оставшиеся пробы - в термостат при температуре (20±1)°С. Испытания проводили в трехкратной повторности, результаты представлены в таблице 2.
Полнота нейтрализации дезинфицирующего раствора (таблица 2) при использовании всех испытанных смывных нейтрализующих жидкостей составляет от (82,5±5,1) до (99,1±3,7) %, что соответствует требованиям п. 5.1.2.3 Руководства Р 4.2.2643-10. Количество колоний микроорганизмов, выросших на чашках Петри после посева нейтрализованной пробы, должно быть примерно одинаковым с количеством колоний, выросших после посева контрольной пробы (но не менее 70% от количества колоний в контрольной пробе) [1, 3].
Представленные в таблице 2 данные показывают, что растворы, содержащие 7,5% тиосульфата натрия пятиводного и 30% или 40% пропиленгликоля, обеспечивают отбор проб при температурах до минус 18°С и до минус 30°С соответственно, а также сохранение спорами Bacillus subtilis, штамм 3 своей жизнеспособности до 10 суток. Выживание спор Bacillus anthracis, штамм СТИ-1 зависит от концентрации пропиленгликоля. В СНЖ, содержащей 30% пропиленгликоля, популяция сохраняет свою жизнеспособность до 7 суток при температуре хранения 6°С и до 3 суток - при 20°С. В смывной нейтрализующей жидкости, содержащей 40% пропиленгликоля, споры Bacillus anthracis, штамм СТИ-1 начинают терять свою способность к прорастанию до окончания трех суток хранения. Если дополнительно добавить в СНЖ 10% глицерина, то срок хранения в ней спор Bacillus anthracis, штамм СТИ-1 без изменения жизнеспособности увеличивается до 10 суток независимо от температуры хранения (6°С или 20°С).
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Методы лабораторных исследований и испытаний медико-профилактических дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности: Руководство Р 4.2.2643-10. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2010.
2. Красильников А.П. Справочник по антисептике. - Минск: Высшая школа, 1995.
3. Временные методические указания по типовым методам микробиологических исследований эффективности и оценке средств и способов дезинфекции: Утв. начальником ЦВМУ МО СССР 11.07.7972 г. - Л.: Медицина, 1978.
4. Руководство по военной микробиологии / Под общей редакцией Мельниченко П.И. - М.: Военное издательство, 2005.
5. Костин А.П., Подкорытов Ю.А. Основы войсковой дезинфекции: Учебное пособие для слушателей и войсковых врачей. - Куйбышев: Медицина, 1977.
6 Инструкция по дезинфекции санитарного автотранспорта при различных температурных условиях: Утв. Начальником главного санитарно-эпидемиологического управления Министерства здравоохранения СССР 06.01.1970 №835-70.
7. W.D. Won, H. Ross Behavior of microbial aerosols in a -30°C environment // Cryobiology - 1968 - Vol. 4, №6. - P. 337-340.
8. Алексеева М.И., Жданникова E.H., Павловская Л.Г., Савельева А.Р. Обеззараживание различных поверхностей при минусовых температурах // Проблемы дезинфекции и стерилизации. Труды центрального научно-исследовательского дезинфекционного института. - М., 1969. Выпуск 20. - С. 185-189.
9. Шура-Бура Б.Л., Золочевский М.А. Эффективность обеззараживания поверхностей транспорта и техники электролизованными растворами хлористого натрия при отрицательных температурах // Военно-медицинский журнал. №1. - 1962. - С. 51-53.
10. О.Н. Дымент, К.С. Казанский, A.M. Мирошников. Гликоли и другие производные окисей этилена и пропилена. - М.: Издательство «Химия», 1976.