Генетические и эмбриологические аспекты получения трансгенных животных

1 1

34 ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ

к УДК 575.113:636.1/.9 N.M. Suraeva THE GENETIC AND EMBRYOLOGIC ASPECTS OF TRANSGENIC ANIMALS GROWING N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center RAMS, Moscow ABSTRACT Gene transfer technology provides the ability to genetically manipulate somatic and germ cells of domestic animals. The further investigations are directed to study the transgene uptake efficiencies in generation, and to increase the efficacy of these genes integration and expression. This could be achieved by improvements in transgene design and by selection the genetically modified cells in terms of transfection. Key words: transgenesis, integration, expression, transfection, domestic animals, genetic "knouck-out". Н.М. Cypaeea ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ЭМБРИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, Москва РЕЗЮМЕ Технология трансгенеза позволила изменять генотип соматических и половых клеток домашних животных. Дальнейшие исследования направлены на изучение характера наследования чужеродных генов в потомстве, а также на повышение эффективности интеграции и экспрессии, что может быть достигнуто подбором регуляторных участков генных конструкций и предварительной селекцией трансфецированных клеток в культуре. Ключевые слова: трансгенез, интеграция, экспрессия, трансфекция, домашний скот, генетический нокаут. ВВЕДЕНИЕ фундаментальных и прикладных научных исследова- Успехи в технологии получения рекомбинантных ний или как новых источников для получения фарма-ДНК открыли возможность создания новых генотипов цевтических продуктов и органов для трансплантации путем введения, удаления или изменения генома жи- человеку. вотного уже в первом поколении. Впервые трансгенез Однако чужеродная ДНК встраивается случай-у млекопитающих был достигнут в начале 1980-х гг. ным образом, каждое трансгенное животное является на мышах. J. Gordon et al. [24] показали, что экзоген- уникальным объектом в отношении как своего гено-ная ДНК может быть интегрирована путем инъекции ма, так и характера, и уровня экспрессии встроенного в пронуклеус зиготы мыши. Такие модифицированные гена. Некоторая степень определенности фенотипиче-животные были названы трансгенными. Другие ис- ского проявления встроенного гена в организме жи-следователи в короткие сроки повторили данные экс- вотного значительно повышается при использовании перименты, и метод микроинъекции длительное время технологии переноса гена посредством гомологичной использовался как единственный для создания транс- рекомбинации (gene targeting). Хотя данная техноло-генных мышей, а затем и других видов животных. гия не позволяет ограничить влияние на экспрессию В настоящее время различные виды животных экзогенного гена окружающих его эндогенных генов, (и растений), а именно, амфибии, крупный рогатый однако можно предположить, что все независимо по-скот, птицы, рыбы, насекомые, нематоды, свиньи, кро- лученные друг от друга трансгенные животные будут лики, козы подверглись генетической модификации. иметь примерно одинаковый и предсказуемый уро-Благодаря развитию методов введения ДНК в хромо- вень экспрессии, а их потомки будут передавать тот сомы зародыша появилась возможность использова- же самый изначально встроенный ген и в том же сания трансгенных животных в качестве моделей для мом месте генома [62]. ч

№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

1 1

ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ 35

>- 1. ИНТЕГРАЦИЯ ЧУЖЕРОДНЫХ ванной ДНК может значительно меняться от единиц до ГЕНОВ В ГЕНОМ ЖИВОТНЫХ сотен копий на клетку [1; 60]. Обычно множественные 1.1. Инфицирование эмбрионов животных копии ДНК молекул стабильно интегрируются в геном ретровирусными векторами хозяина в виде тандема, ориентируясь по отношению со встроенными структурными генами друг к другу по принципу голова к хвосту. Предполага-Интеграция экзогенного гена с помощью ретрови- ется, что инъецированные молекулы ДНК ассоцииру-русных векторов происходит путем инфекции, ются через гомологичную рекомбинацию до интегра-при этом только одна провирусная копия встраивается ции, а затем уже встраиваются в единственное место в определенное для вирусного генома место в хромосо- в хромосоме. Вероятно, местом интеграции служат ме хозяина [64]. С помощью данной технологии можно случайные разрывы в хромосоме, которые могут быть инфицировать путем добавления в среду культивирова- вызваны репарационными ферментами в ответ на ния ретровирусного вектора от 10 до 50 % эмбрионов. инъекцию молекул ДНК со свободными концами [10]. При этом структурный ген интегрируется случайным Особая ситуация возникает в случае, когда трансобразом по отношению к геному хозяина, что приводит генные родители оказываются мозаичными, то есть инк неконтролируемой экспрессии чужеродного гена. тегрированный ген присутствует только в части поло-Кроме того, при ретровирусной интеграции возникают вых (и соматических) клеток. Известно, что мозаицизм и другие нежелательные моменты, а именно: встраива- встречается у 85 % трансгенов после микроинъекции ние происходит сразу в нескольких местах хромосом- [78]. Так как интеграция происходит во время реплика-ной ДНК, и поэтому у животных увеличивается веро- ции ДНК, только одна из двух делящихся клеток может ятность генетических нарушений; в случае инфекции содержать инъецированную последовательность, а ес-эмбрионов на более поздних стадиях развития (морулы ли встраивание произойдет не на стадии зиготы, или бластоцисты) интеграция ретровирусных векторов а позднее, то вероятность передачи потомкам чужерод-происходит не во всех бластомерах, т. е. клетки, распо- ных генов становится еще ниже [2; 59; 65; 73]. ложенные внутри эмбрионов, оказываются недоступ- Так, после микроинъекции тимидинкиназного ге-ными для вируса, и животные получаются мозаичными на под контролем МТ промотора некоторые трансген-[7]; в связи с тем обстоятельством, что интеграция рет- ные мыши передали только 6 % своим потомкам инте-ровирусных последовательностей по своей природе тя- грированный ген [60]. Сами же потомки, только самки, готеет к транскрипционно активным участкам генома, передавали ген в соответствии с Менделевским рас-часто в местах встраивания встречаются различные пе- пределением. Трансгенные самцы хотя и были способ-рестройки, делеции, дубликации или транслокации по- ны к размножению, однако никогда не передавали ти-следовательностей ДНК хозяина [48], которые могут мидинкиназный ген своим потомкам. Предполагается, приводить к мутационным изменениям и нарушать что в процессе сперматогенеза происходит разруше-функционирование эндогенных генов, хотя большин- ние введенного гена. Аналогичная картина наблюда-ство таких мутаций, вызванных инфекцией эмбрионов лась и при микроинъекции альфа-фетопротеинового и ЕК-клеток ретровирусами или введением рекомби- гена [43]. Из 1200 родившихся мышей от 5 самцов од-нантной ДНК в пронуклеусы зигот, рецессивны или ной трансгенной линии только самки оказались транс-имеют эмбриональный летальный фенотип [65]; оказа- генными. лось, что ретровирусные векторы могут быть исполь- Нежелательным последствием процедуры микро-зованы для переноса только коротких последователь- инъекции чужеродного гена является также гибель эм-ностей трансгена не более 9-10 т.н.п. [34]. брионов на различных стадиях развития. При инъек-Были также опубликованы данные об эписомной ции гена гормона роста были получены две линии репликации у мышей и передаче потомкам плазмиды, мышей с рецессивной летальной мутацией, проявляю-кодирующей Т-антиген вируса полиомы. Эта плазмида щейся в ранний постимплантационный период [19], циркулировала в клетках различных тканей организма а при интеграции в-глобинового гена кролика была в виде автономных кольцевых молекул ДНК, встраива- выявлена линия мышей, в которой эмбриональные му-ющихся в хромосомную ДНК животного только во тантные гомозиготы прикреплялись к матке, но затем время мейоза [45]. погибали [50]. Кроме этого, было обнаружено, что ретровирусы В опытах М.И. Прокофьева и соавт. [3] 3 из 4 в естественных условиях могут трансдуцировать по- трансгенных линий самок кроликов с встроенным ге-тенциально онкогенные гены клетки-хозяина. Таким ном человеческого гранулоцитарного колониестиму-образом, несмотря на техническую простоту самой лирующего фактора утратили способность к размно-процедуры встраивания трансгена с помощью вирус- жению. Более того, в конце беременности погибали не ных векторов, ряд указанных выше недостатков не по- только плоды, но и беременные крольчихи. Возможно, зволяют широко использовать данный метод. в данном случае негативное влияние на трансгенов оказывал чужеродный белок. 1.2. Интеграция невирусных плазмид Очевидно, что упомянутые выше явления снижа-1.2.1. Микроинъекция ют эффективность интеграции чужеродных генов в ге-В отличие от ретровирусной интеграции, при мик- ном животных, особенно если учесть, что существует роинъекции гена число встроенных копий инъециро- определенный дефицит эмбриологического материала —(

№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

1 1

36 ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ

к сельскохозяйственных животных, хотя в настоящее как правило, не происходит мутаций в геноме хозяина, время уже известны методы контроля периода овуля- может быть встроено в отличие от микроинъекции ог-ции и созревания in vitro ооцитов домашних животных раниченное количество копий на геном (от 1 до 20) [4; 8; 30; 63]. и могут быть перенесены большие молекулы трансгена (более 150 т.н.п.). К ограничениям использования 1.2.2. Липофекция данного метода относят: Липосомы представляют собой искусственно со- 1) потребность в специальном оборудовании для зданные везикулы, которые обладают способностью электропорации; транспортировать в клетки животных чужеродные ге- 2) небходимость подбора оптимальных условий ны, в том числе и половые. Липосомы состоят из двой- для каждого типа клеток; ного слоя липидов. Размеры липосом варьируют от 3) низкая эффективность интеграции (обычно 100 нм до нескольких мкм. Они могут нести отрица- только у 0,01 % обработанных клеток удается полу-тельный или положительный заряд. Для трансгенеза чить геномную интеграцию трансгена) [13]. обычно смешивают двухслойные липосомы и водный Например, низкая эффективность интеграции не раствор ДНК [23]. позволяет использовать данный метод для электропо- При контакте с клеткой-мишенью липосомы могут рации зигот млекопитающих, т. к. для получения одно-взаимодействовать с клеточной мембраной различны- го трансгенного теленка или овцы потребуется пример-ми способами: но 1000 животных-доноров. Более оптимистические 1) абсорбировать на клеточной мембране; прогнозы высказываются в отношении таких видов 2) проникать путем эндоцитоза; животных, у которых можно выделить большое коли- 3) встраиваться в мембрану [70]. чество половых клеток, например, у рыб или птиц [32]. Трансгенные молекулы проникают в цитоплазму С другой стороны, электропорация является эф- только в двух последних случаях. Недавно стали ис- фективным способом введения экзогенной ДНК в ES пользовать, в том числе и для коммерческих целей, по- клетки [16] и при использовании технологии клониро-ликатионные липиды, например, Lipofectin™, вания в сочетании с gene targeting [51]. LipofectinAMINE™, Transfectace™, DOTAP и др. [14]. Эти липиды стабильны и обладают высокой эффектив- 1.3. Интеграция чужеродных генов путем ностью трансфекции. гомологичной рекомбинации (gene targeting) Однако, несмотря на эффективный перенос с по- В связи с тем, что при использовании вышеопи-мощью липосом трансгена в цитоплазму соматичес- санных методов введения чужеродных генов интегра-ких клеток, лишь в очень небольшое количество ядер ция в хромосому хозяина происходит случайно, экс-чужеродная ДНК будет встроена, поэтому трансгенная прессия трансгена оказывается или невысокий, или экспрессия со временем исчезает. временной, или может совсем отсутствовать. Главной Проводятся исследования и по получению полово- причиной таких нарушений является влияние округо трансгенеза с использованием липидов [21; 58], од- жающих генов и промоторов на функции встроенно-нако интеграция трансгена также остается низкой го гена, так называемый эффект положения. По-види-у кур, хотя некоторый успех был достигнут при пере- мому, решением проблем трансгенной экспрессии носе липидами трансгена в сперматозоиды [69]. могло бы быть устранение этого эффекта на этапе ин- В перспективе, скорее всего, усилия по эффективно- теграции экзогенных генов. И такое решение было му использованию липофекции для получения половых найдено с помощью использования технологии gene трансгенов будут направлены на встраивание в липосо- targeting [17]. мный ДНК-комплекс белков, локализованных в ядре [6], Большинство стратегий gene targeting основано на что позволит повысить уровень экспрессии и увеличить гомологичной рекомбинации. При этом в вектор обыч-частоту встраивания в хромосому. Такие же возможнос- но включают 2 области, комплементарные выбранной ти могут открыться, если с помощью липосом перене- генной последовательности хозяина, между которыми сти большие молекулы ДНК (более 150 т.н.п.) [72], находятся негомологичные участки и маркер устойчи-а именно, искусственные минихромосомы c центроме- вости к антибиотикам. Возможности данной технолорами, теломерами и областями репликации вдобавок гии позволяют выключать эндогенный ген (gene к структурным генам, промоторам и энхансерам. ‘knockout’), регулировать уровень экспрессии эндогенных генов или заменять эндогенный ген гомоло- 1.2.3. Электропорация гичным другого вида. Метод электропорации основан на процессе вре- В настоящее время данный подход применяется менной перфорации клеточной мембраны с помощью в отношении стволовых эмбриональных клеток и при мощного электрического импульса и проникновения клонировании, но не при микроинъекции, так как в по-молекул ДНК из окружающей среды через как цито- следнем случае исключена возможность селекции кле-плазматическую, так и ядерную мембраны [47]. Элек- ток с интегрированным геном. Более того, в отличие от тропорация представляет собой быстрый и недорогой инъекции в пронуклеус, при использовании технологии метод введения чужеродной ДНК в культивируемые gene targeting интегрированный ген обычно оказывается клетки млекопитающих и других животных. При этом, рецессивным. Поэтому для получения фенотипического ч

№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 I

1 1

ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ 37

>- признака необходимо скрещивание трансгенных живот- ских тканях [75] или на определенной стадии развития ных с целью получения особей с изменениями в обеих [37; 39]. Так, при культивировании 8-клеточных эм-аллелях. Такая селекция на мышах не вызывает особых брионов мыши на монослое клеток, продуцирующих технических трудностей, тогда как при работе с домаш- рекомбинантный ретровирус, были получены транс-ними животными могут потребоваться годы, хотя недав- генные животные с геном вируса полиомы. Трансгенно было предложено с помощью клонирования полу- ные мыши были мозаичными и экспрессировали ви-чить трансгенные эмбрионы сначала с одной аллелью, русные 35 s и 21 s РНК только в селезенке, 35 s и 30 s а затем трансфецировать клетки из этих эмбрионов дру- РНК только в мозгу [75]. гой аллелью и снова провести клонирование [44]. После инфекции эмбрионов мышей вирусом лейкемии мышей Молони интегрированный ретровирус 2. ЭКСПРЕССИЯ ВСТРОЕННЫХ экспрессировался в эмбриогенезе после рождения ГЕНОВ У ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ и в конце онтогенеза [37]. В этих случаях на актив-2.1. Экспрессия трансгена, интегрированного ность вируса, по-видимому, оказывало влияние хромов составе ретровирусных векторов сомное окружение в месте его интеграции. Первые эксперименты по интеграции ретровирус- Чужеродные гены были впервые успешно внедре-ных векторов в геном мышей показали, что они не спо- ны в зародышевую линию кур при использовании реп-собны к экспрессии и репликации [35; 36]. Причина ликативно нормального вируса лейкоза птиц ALV или этих неудач скрывалась в структуре самого провируса. вируса ретикулоэндотелиоза (REV) [66; 67]. Векторы Провирус состоит из следующих регуляторных были инъецированы в бластодерму или внутрибрю-и структурных элементов: на обоих концах провируса шинно вылупившемуся цыпленку, и были получены расположены длинные терминальные повторяющиеся трансгенные животные, которые передавали потом-последовательности (LTR), содержащие сигналы для ству интегрированный провирус. Последующая пере-инициации и терминации транскрипции, следующие дача провируса происходила по законам Менделя, что последовательности необходимы для обратной тран- свидетельствовало о возможности получения транс-скрипции и вирусной интеграции, затем идут участки генных птиц с помощью вирусных векторов. ДНК, кодирующие белки упаковки. Необходимость получения домашней трансгенной Оказалось, что вирусные LTR в клетках ранних птицы привело к созданию репликативно дефектных эмбрионов препятствуют вирусной репликации, так вирусных векторов. Трансгенные цыплята были полу-как содержат вирусный промотор и элементы контро- чены с помощью репликативно дефектного REV-век-ля транскрипции, которые не функционируют на этой тора, инъецированного под бластодерму [5]. Около стадии развития. Вероятно, этот белок можно убрать 8 % вылупившихся самцов несли ген устойчивости путем замены вирусного LTR промотора в ретровирус- к неомицину и передавали вектор потомству в 2-8 % ном векторе собственным промотором структурного случаев. Тот же REV-вектор использовался для посто-гена. Такие эксперименты по введению 2 ретровирус- янной экспрессии гормона роста кур в эмбрионах. ных векторов были проведены с в-глобиновым геном Около 50 % эмбрионов имели повышенные концентра-под контролем его собственного промотора и промото- ции гормона роста, но цыплята не вылупились. ра тимидинкиназного гена. При этом экспрессия была Таким образом, экспрессия трансгена, интегриро-зафиксирована в гемопоэтических клетках и во всех ванного ретровирусным вектором, нестабильна и, ско-видах тканей трансгенных мышей, соответственно для ре всего, непредсказуема, т. к. встраивание чужерод-каждого промотора [38]. ной ДНК происходит случайно [40]. При культивировании инфицированных эмбрио- Однако совсем недавно появилась работа об нальных клеток также наблюдалась транскрипционная успешном использовании репликативно-дефектного пассивность, которая была связана с тем, что происхо- ретровирусного вектора в качестве переносчика экзо-дило метилирование пронуклеусов [41]; не функцио- генных генов и получении нескольких поколений нировал вирусный энхансер [77]; возможно, присут- трансгенных птиц, стабильно передающих экспресси-ствовала супрессорная активность или не было акти- рующий ген бактериальной в-галактозидазы в соответ-вирующих факторов [76] в эмбриональных клетках. ствии с Менделеевским распределением [54]. Ранее Вероятно, аналогичные явления имеют место и при было показано, что данный вектор может быть получен интеграции ретровирусных векторов в геном живот- с высоким титром, он не способен к репликации, не ных. Например, при трансфекции с помощью ретрови- имеет вируса-помощника, функционирует в различных русов бактериального гена gpt предымплантирован- линиях клеток, способен инфицировать большое колиных эмбрионов мышей было обнаружено, что прови- чество клеток кур, инфекция не влияет на клеточную русная последовательность высоко метилирована и не пролиферацию, но обеспечивает у вылупившихся цып-экспрессируется у трансгенных животных [41]. Одна- лят экспрессию бактериальной в-галактозидазы [53]. ко после инъекции этим животным 5-азацитидина была зафиксирована транскрипция (мРНК) интегриро- 2.2. Регуляция экспрессии трансгена, ванного гена. интегрированного в составе невирусных плазмид Известны также провирусы, которые после инте- В первых экспериментах по микроинъекции была грации в геном мышей экспрессируются в специфиче- зафиксирована только слабая и очень изменчивая ак- —(

№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

1 1

38 ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ

к тивность встроенных генов, которая, по-видимому, за- линии мышей 2-го типа, клонированных глобиновых висела от места этих генов в хромосоме. Вскоре выяс- генов человека — зародышей и взрослых особей, экс-нилось, что присутствие в составе вводимых плазмид прессировались точно в соответствующей стадии раз-прокариотических векторных последовательностей вития [12], а специфическая активация на каждой ста-оказывает ингибирующее действие на соответствую- дии зависела от энхансерных элементов, расположен-щую экспрессию некоторых генов, таких, как в-гло- ных как на 3’, так и 5’концах. При этом на экспрессию бин, а-актин и а-фетопротеин [12; 38; 45]. Поэтому этих генов, вероятно, влияло хромосомное окружение в настоящее время исследователи убирают прокарио- в месте интеграции, так как уровень экспрессии не за-тическую последовательность, избавляясь тем самым висел от числа копий встроенного гена, и трансгены от возможных нежелательных воздействий этих по- никогда не синтезировали чужеродный в-глобин в кон-следовательностей на экспрессию, и добавляют раз- центрациях, сравнимых с эндогенным в-глобином. Ко-личные регуляторные последовательности с целью по- гда же с обоих концов гена были удалены нуклеотид-лучения контролируемой экспрессии. С другой сторо- ные последовательности, расположенные на расстоя-ны, гены, кодирующие иммуноглобулин, эластазу нии от 20 до 50 т.н.п., то инъецированный ген и коллаген, по-видимому, менее чувствительны к при- в-глобина стал экспрессироваться на том же уровне, сутствию прокариотических ДНК и часто экспресси- что и эндогенный, и даже выше, в прямой зависимос-руются независимо от хромосомного положения [29; ти от числа копий [29]. На основе этих данных было 46; 56]. сделано предположение, что эти последовательности Получить у трансгенных животных направленную контролируют доступность к в-глобиновому локусу и специфичную экспрессию невозможно без изучения активирующих тканеспецифических факторов или механизмов регуляции генной активации. В генах мле- они являются основными связывающими местами копитающих на 5’ концах были обнаружены очень по- и представляют собой энхансорные элементы, которые хожие последовательности, названные блоком ОоИЬег могут воздействовать на структурные гены даже на Но§пе$Б. Предполагается, что они являются местами значительном расстоянии. связывания для РНК-полимеразы II, то есть местами инициации транскрипции. Очевидно, блок ОоИЬег 2.2.1. Использование тканеспецифичных Но§пе$Б является важнейшим компонентом составно- промоторов го промотора, который постоянно находится в актив- По-видимому, каждый ген имеет свои регуляторном состоянии, обеспечивая у большинства генов мле- ные последовательности (промотор и энхансеры), копитающих очень низкий базальный уровень тран- и они расположены в специфических местах структур-скрипции. Затем были открыты другие специфические ного гена. В опытах, в которых микроинъецировали регуляторные элементы. Эти элементы, названные эн- в эмбрионы мышей пары генов с интронами и без них, хансерами, были связаны со специфическим усилени- было продемонстрировано, что регуляторные после-ем транскрипции генов вирусов и млекопитающих довательности, определяющие уровень транскрипции, [22; 42]. Считается, что энхансеры облегчают связыва- расположены в интронах [11]. ние РНК-полимеразы II с блоком ОоИЬег Но§пе$Б Так, гены эластазы [73], у-кристаллина [26] и про-и тем самым повышают эффективность транскрипции. тамина [61], имеют компактный промотор с энхансер-Предполагается, что энхансеры отвечают за тканеспе- ными элементами, где вся необходимая информация цифичную активность структурных генов, так как при для тканеспецифичной генной экспрессии содержится введении этих элементов в плазмиды у трансгенных внутри нескольких сотен нуклеотидных пар, располо-животных наблюдалась тканеспецифичная экспрессия женных в месте инициации транскрипции. У других интегрированных генов [28]. генов тканеспецифические энхансерные элементы Было показано для некоторых генов, что энхансер- удалены на значительные расстояния от их промото-ные элементы расположены в 3’ и 5’ фланкирующих ров. Например, элемент, находящийся в 10 т.н.п. последовательностях структурного гена, при этом на от альбуминового промотора, необходим для специфи-5’ конце они или непосредственно соединялись с про- ческой экспрессии этого гена в печени, а элемент, уда-мотором, или были на некотором расстоянии от него. ленный на 5 т.н.п. от 3’ конца гена Т-клеточного реНекоторые энхансерные последовательности иденти- цептора, контролирует специфическую экспрессию фицировались с помощью трансгенных мышей, когда в Т-лимфоцитах [74]. 3 различных энхансерных эле-в их эмбрионы последовательно вводили ДНК кон- мента ответственны за тканеспецифичную экспрес-струкции с различными длинами фланкирующих по- сию гена б-фетопротеина, они расположены в 7 т.н.п. следовательностей. от 5’ конца генной последовательности [43]. Так, им-Так, идентификация энхансерных последователь- муноглобулиновый энхансер обеспечивает экспрес-ностей у семейства в-глобулиновых генов позволила сию в В-лимфоцитах [71], а энхансеры гена 8У 40 детально разобраться в механизме активации этих ге- Т-антигена в различных тканях [9]. нов. В процессе развития организма различные глоби- Известны несколько генов, которые экспрессиру-новые гены — эмбриональные, зародышевые и взрос- ются одновременно в нескольких тканях. К ним отно-лые, — последовательно экспрессируются в эритроид- сится МТ ген, экспрессирующийся во многих тканях ных клетках. Интегрированные в наследственные клеток при их контакте с тяжелыми металлами (таки- Ч

№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 1

1 1

ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ 39

>- ми, как цинк или кадмий) и гликокортикоидами [20]. учен механизм гормональной регуляции генной экс-Или, например, экспрессия генов главного комплекса прессии [55]. Стероидные гормоны соединяются гистосовместимости обнаружена в большинстве тка- с белковыми рецепторами в цитоплазме специальных, ней взрослого организма, тогда как на ранних эмбрио- чувствительных к гормонам клеток, а затем весь ком-логических стадиях эти гены неактивны [57]. Если плекс транспортируется в ядро. В ядре образовавший-регуляторные последовательности таких генов соеди- ся комплекс гормона с рецептором узнает специфиче-нить с кодирующими последовательностями интере- скую последовательность ДНК, ответственную за гор-сующих генов и интегрировать в геном животного, то мональную регуляцию, и соединяется с ней, таким гены будут экспрессироваться в большинстве тканей образом усиливая активность этих генов. Так, у транс-полученных трансгенных животных. генных мышей после инъекции дексаметазона Впервые такие эксперименты были проведены в 4-6 раз увеличился в крови уровень чужеродного с МТ геном при инъекции в пронуклеусы зигот мышей гормона роста и в 4 раза повышалась концентрация плазмиды, состоящей из промотора гена МТ и гена матричной РНК этого белка в печени животных [20]. гормона роста крысы. В результате были получены Гормоны оказывали активирующее действие и на «гигантские» трансгенные мыши [59], у которых син- некоторые другие промоторы LTR вируса опухоли мо-тез соматотропина крысы осуществлялся не в специа- лочной железы [15], гена трансферина [52]. Эти ре-лизированном для продукций этого белка органе (ги- зультаты вселяют надежды на получение у трансгенов пофизе), а во многих и больше всего в печени. Чуже- регулируемой in vivo внешними сигналами экспрессии родный белок нарабатывался в очень высоких интегрированных генов. количествах и был биологически активным, хотя, как Значительные успехи в осуществлении контроля оказалось, для получения животных с повышенной над генной экспрессией были достигнуты с использо-массой совсем не требуется таких высоких концентра- ванием тетрациклиновых регуляторных компонентов ций гормона роста. Суперпродукция чужеродного бел- [27]. Для этой системы необходимо иметь 2 различных ка оказывала неблагоприятное воздействие и на весь трансгена, от которых при скрещивании можно полу-организм трансгенного животного, наблюдались мор- чить потомков, в том числе и двойных гетерозигот. фологические изменения клеток гипофиза, а некото- Первый трансген (трансген 1) включает структурный рые трансгенные мыши были бесплодны [31]. ген, под контролем tet операторной последовательнос- Очевидно, что при получении трансгенных живот- ти и минимальной промоторной последовательности, ных с повышенной живой массой более желательной другой трансген (трансген 2) состоит из гибридного была бы тканеспецифичная экспрессия соматотропи- транскрипционного гена трансактиватора и вирусного на, например, в печени, и в невысоких концентрациях, тетрациклиносвязаюшего домена, соединенного с пода для суперпродукции биологически ценных препара- ходящим тканеспецифическим промотором. Система тов лучше всего использовать молочные железы, на- может находиться в 2 режимах: включена или выклю-пример, у крупного рогатого скота. Регуляторные по- чена. Эти варианты основываются на поочередной ак-следовательности нескольких специфичных молочных тивности функционально различных трансактивато-генов были выделены, охарактеризованы и использо- ров. При этом экспресия структурного гена может ваны для специфической экспрессии чужеродных ге- быть выключена при введении тетрациклина транснов в лактирующих молочных железах сначала транс- генным мышам и включена с его удалением. В после-генных мышей [25], а затем и домашних животных. дующих исследованиях удалось соединить оба конт-Так были проведены работы с использованием овечье- ролирующих элемента в одной плазмиде. При этом го в-лактоглобулинового гена, кроличьих WAP генов, при прекращении введения антибиотика уровень экс-а-лактоальбуминового и a-sl-казеиновых генов круп- прессии репортерного гена у трансгенных мышей возного рогатого скота [49]. растал в 800 раз [68]. 2.2.2. Использование промоторов, активирую- 2.2.3. Использование gene targeting технологии щих экспрессию в ответ на внешние стимулы Разработанная в последние годы технология соВ целях практического использования трансген- здания плазмид на основе гомологичной рекомбина-ных животных было бы желательно модулировать экс- ции [33] открыла принципиально новый подход к со-прессию трансгенов с помощью определенных внеш- зданию трансгенных животных. Встраивание экзоген-них стимулов. МТ промотор, например, использовался ного гена в данном случае не происходит по принципу со многими структурными генами, так как позволял случайной мутации, а является направленной (неслу-управлять экспрессией этих генов путем введения чайной) модификацией одного из эндогенных генов. в организм животного тяжелых металлов или глико- Например, в молоке трансгенных коз или коров проду-кортикоидов. Хотя воздействие на организм животных цируются не собственные белки, а человека [17], или больших доз металлов может оказать токсичное дей- осуществляется замена собственного промотора но-ствие, регуляция экспрессии с помощью гормонов яв- вым, который позволит модулировать экспрессию эн-ляется естественной. догенного гена [18]. Известно, что стероидные гормоны участвуют Однако технология gene targeting не только расшив генной регуляции. В настоящее время детально из- ряет методы контроля и регуляции экспрессии встро- —(

№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

I 1

1 1

40 ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ

к енных генов, но и создает новые возможности в этом DNA into vice by microinjecting eggs // Proc. Nat 1. Acad. направлении. Так, например, эта технология позволяет Sci. USA. — 1985. — Vol. 82. — P. 4438-4442. выключать функции эндогенных генов (gene ‘knock- 11. Brinster R.L., Allen J.M., Behringer R.R. et al. outs’). Благодаря gene targeting открывается обширная Intron increase transcriptional efficiency in transgenic область практического применения для пересадки mice // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. — 1988. — Vol. 85. — трансгенных органов от животных человеку. P. 836-840. 12. Chada K., Magram J. and Costantini F. An ЗАКЛЮЧЕНИЕ embryonic pattern of expression оf human fetal globin Эффективность получения трансгенных животных gene in transgenic mice // Nature. — 1986. — Vol. 319. — наиболее часто используемыми в настоящее время ме- P. 685-688. тодами микроинъекции и клонирования остается низ- 13. Chang, C.C., Saunders, J.A., Chassy, B.M., кой. Кроме того, во многих экспериментах трансген- Sowers, A.E. Overview of electroporation and electrofu-ные животные имели повышенный вес при рождении, sion. In: Chang, C.C., et al. (Ed.).Guide to electroporation аномалии в развитии или вовсе не доживали до поло- and electrofusion. Academic Press Inc. San Diego, 1992. возрелости. Поэтому, очевидно, необходимо тщатель- 14. Chisholm V. High efficiency gene transfer into ное изучение и подбор как состава генных конструк- mammalian cells. In: Glover, D.M., Hames, B.D.,(Eds.), ций, так и мест интеграции, трансгенной экспрессии DNA Cloning 4-a Practical Approach: Mammalian (интервал, уровень, тканеспецифичность) и, наконец, Systems, second ed., IRL Press, Oxford, 1995. характеристики самого трансгенного продукта. 15. Choi Y., Henrerd D., Lee I. and Ross S.R. The mouse mammary tumor virus long terminal repeat directs ЛИТЕРАТУРА expression in epithelial and lumphoid cells of different tis- 1. Ениколопов Г.Н., Захарченко В.И., Гращук sues in transgenic mice // J. Virol. — 1987. — Vol. 61. — М.А. и др. Получение трансгенных кроликов, содержа- P. 3013-3019. щих и экспрессирующих ген соматотропина человека 16. Chu G., Hayakawa H., Berg P. Electroporation // Доклады Академии Наук. — 1988. — Т. 299, №5. — for the efficient transfection of mammalian cells with C. 1246-1249. DNA // Nucleic Acids Res. — 1987. — Vol. 15(3). — P. 2. Прокофьев М.И. Получение человеческого 1311-1326. гранулоцитарного колониестимулирующего факто- 17. Clark A.J.Gene expression in the mammary ра с молоком трансгенных кроликов // Российский gland of transgenic animals // Biochem. Soc Symp. — биотерапевтический журнал. — 2004. — Т.3, № 2. — 1998. — Vol. 63. — P. 133-140. 3. 7-8. 18. Clark A.J., Burl S., Denning C., Dickinson P. 3. Прокофьев М.И., Городецкий С.И., Мезина Gene targeting in livestock: a preview // Transgenic М.Н. и др. Создание трансгенных кроликов, продуци- Research. — 2000. — Vol. 9. — P. 263-275. рующих с молоком человеческий гранулоцитарный 19. Covarrubias L., Hishida Y. and Mints B. Early колониестимулирующий фактор // Сельскохозяйствен- postimplantation embryo lethality due to DNA rearrange-ная биология. — 2003. — № 6. — С. 49-54. mente in a transgenic mouse strain // Proc. Natl. Sci. USA. 4. Сураева Н.М., Кесян А.З., Прокофьев М.И. — 1986. — Vol. 83. — P. 6020-6024. Оптимальные приемы капацитации спермы быков для 20. Durnan L.M., Hoffman J.S., Quaife C.J. et al. оплодотворения яйцеклеток // Вестник РАСХН. — Induction of mouse metallothionein-1 mRNAby bacterial 1993. — №4. — C. 49-51. endotoxin is independent of metals and glucocorticoid 5. Bosselman RA, Hsu RY, Boggs T et al. Germline hormones // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1984. — Vol. transmission of exogenous genes in the chicken // Science. 81. — P. 1053-1056. — 1989. — Vol. 243. — P. 533-535. 21. Ebara F and Fujihara ^.Reproductive charac- 6. Boulikas T. Nuclear localization signal peptids teristics of transgenic (TG) chickens carrying an exoge-for the import of plasmid DNA in gene therapy // Int. nous gene // Asian J. Androl. — 1999. — Vol. 1. — P. J. Oncol. — 1997. — Vol. 10(2). — P. 301-309. 139-144. 7. Braas G., Searle P.F., Slater N.K., Lyddiatt A. 22. Eprussi A., Church G.M., Tonewa S. and Strategies for the isolation and purification of retroviral Cibbert W. Linege-specific interaction of an vectors for gene therapy // Bioseparation. — 1996. — Vol. immunologlobulin enhancer with cellular factors in vitro // 6(4). — P. 211-228. Science. — 1985. — Vol. 27. — P. 134-140. 8. Brackett B.G., Bousguet D., Boice M.L. et al. 23. Felgner P.L. Improvements in cationic liposomes Normal development following in vitro fertilization the for in vivo gene transfer // Hum. Gene Therapy. — 1996. cow // Biol.Reprod. — 1982. — Vol. 27. — P. 147-158. — Vol. 7(15). — P. 1791-1793. 9. Brinster R.L., Chen H.Y., Messing A. et al. 24. Gordon J.W., Scangos G.A., Plotkin D.J. et al. Transgenic mice harboring SV40 t-antigen genes develop Genetic transformation of mouse embryos by microinjec-characteristic brain tumors // Cell. — 1984. — Vol. 37. — tions of purified DNA // Proc.Natl.Acad. USA. — 1980. P. 367-379. — Vol. 77. — P. 7380-7384. 10. Brinster R.L., Chen Y.Y., Trumbaner M.F. et al.. 25. Gordon K, Lee E., Vitale I.A. et al. Production of Factors effecting the efficiency of introducing foreign human tissue plasminogen activator in transgenic mouse ч

№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1 I

1

ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ 41

>- milk // BioTechnology. — 1987. — Vol. 5. — P. 41. Jahner D., Haase R., Mulligan R. and 1188-1189. Jaenisch R. Insertion of the bacterial gpt gene into the 26. Goring D.R., Rossant J., Claroff S. et al. In situ germ line of mice by retroviral infection // Prog. Natl. expression of (3-galactosidase in lenses of transgenic mice Acad. Sci. USA. — 1985. — Vol. 82. — P. 6927-6931. with a y-crystallin lac z gene // Science. — 1987. — Vol. 42. Khoury G. and Gruss P. Enhancer elements // 235. — P. 456-458. Cell. — 1973. — Vol. 33. — P. 313-314. 27. Gossen M., Freundlieb S., Bender G. et al. 43. Krumlauf R., Chapman V.M., Hammer R.E. et al. Trascriptional activation by tetracyclines in mammalian Differential regulation of б-fetoprotein genes on the inac-cells // Science. — 1995. — Vol. 268. — P. 1766-1769. tive X chromosome in exstraembryonic and somatic tis- 28. Grosveld F., Assendelft G.B., Greaves D.R. and sues of transgenic mice // Nature. — 1985. — Vol. 319. — Kollias G. Position independent high-level expression of P. 224-226. the human-globin gene in transgenic mice // Cell. — 1987. 44. Kubota C, Yamakuchi H, Todoroki J et al. Six — Vol. 51. — P. 975-985. cloned calves produced from adult fibroblast cells after 29. Grosschedl R., Weaver D., Baltimore D., long-term culture // Proc. Natl. Sci USA. — 2000. — Vol. Conctantini C. Introduction of a in immunoglobulin gene 97. — P. 990-995. into the mouse germ line: Specific expression in lymphoid 45. Leopold F., Vailly J et al. Germ line maintenance cell and synthesis of functional antibody // Cell. — 1984. of plasmids in transgenic mice // Cell. — 1987. — Vol. 51. — Vol. 38. — P. 647-658. — P. 885-886. 30. Grozet N., Huneau D., Desinedt V. et al. In vitro 46. Lovrll-Badge R.H., Bygrave A.E., Bradley A. et fertilization with normal development in the sheep // al. Transformation of embryonic stem cells with the Gamete Res. — 1987. — Vol. 52. — P. 308-314. human type-II collagen gene and its expression in 31. Hammer R.E.J, Palmiter R.D. and Brinster chimeric mice // Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. — R.L. Partial correction of murine hereditary growth disor- 1985. Vol. 50. — P. 707-711. der by germ-line incorporation of a new gene // Nature. — 47. Lurquin P.F. Gene transfer by electroporation // 1984. — Vol. 311. — P. 65-67. Mol. Biotechnol. — 1997. — Vol. 7(1). — P. 5-35. 32. Hong Y.H., Moon Y.K., Jeong D.K., Han J.Y. 48. Mahon K.A., Overbeek P.A. and Westhal H. Improved transfection efficiency of chicken gonadal pri- Prenatal lethality in a transgenic mouse line in the result of mordial germ cells for the production of transgenic poul- a chromosomal translocation // Proc. Natl. Acad. Sci. try // Transgenic Research. — 1998. — Vol. 7. — P. USA. — 1988. — Vol. 85. — P. 1165- 1168. 247-252. 49. Maga E.A. and Murray J.D. Mammary gland 33. Hooper M.L. Embryonal Stem Cells: Introducing expression of transgenes and potential for altering the Planned Changes into the Germline. In: Evans HJ (ed.) properties of milk // Bio/Technology. — 1995. — Vol. 13. Harwood Academic Publishers, Switzeland, 1992. — P. 1452. 34. Hu W.S., Pathak V.K. Design of retroviral vectors 50. Mark W.H., Signorelli К and Lacy E. An inser-and helper cells for gene therapy // Pharmacol. Rev. — tional mutation in a transgeniC mouse line result in devel-2000. — Vol. 52(4). — P. 493-511. opmental arrest at day 5 of gestation // Cold Spring 35. Jaenisch R. and Mintz A. Simian virus 40 DNA 54.Harb. Symp. Quant. Biol. — 1985. — Vol. 50. — P. sequences in DNA of health adult mice derived from 453-464. preimplantation blastocysts injected with viral DNA // 51. Mccreath K.J., Howcroft J., Campbell K.H.S. et Proc Natl. Acad. Sci. USA. — 1974. — Vol. 71. — P. al. Production of genetargeted sheep by nuclear transfer 1250-1254. from cultured somatic cells // Nature. — 2000. — Vol. 36. Jaenisch R. Germ line integration and Mendelian 405(6790). — P. 1066-1069. transmission of exogenous Moloney leukemia virus // 52. McKnight G.S., Hammer R.E, Kuenzel E.A. and Prog. Natl. Acad. Sci. USA. — 1976. — Vol. 73. — P. Brinster R.L. Expression of the chicken transferrin gene in 1260-1264. transgenic mice // Cell. — 1983. — Vol. 34. — P. 37. Jaenisch R., Jahner L., Nobis P et al. 335-441. Chromosomal position and activation of retroviral 53. Mikawa T., Cohen-GouldL., FischmanD.A. Clonal genomes inserted into the germ line of mice // Cell. — analysis of cardiac morphogenesis in the chicken embryo 1981. — Vol. 24. — P. 519-529. using a replication-defective retrovirus. III: Polyclonal origin 38. Jaenisch R. Transgenic animals // Science. — of adjacent ventricular myocytes // Developmental 1988. — Vol. 240. — P. 1468-1474. Dynamics. — 1992. — Vol. 195. — P. 133-141. 39. Jahner D., Stuhmann H., Stewart C.L. et al. De 54. Mozdziak P.E., Borwornpinyo S., McCoy D.W., novo methylation and expression of retroviral genomes and Petitte J.N. Development of transgenic chickens during mouse embryogenesis // Nature. — 1982. — Vol. expressing bacterial ß-galactosidase // Developmental 298. — P. 623-628. Dynamics. — 2003. — Vol. 226. — P. 439-445. 40. Jahner D. and Jaenisch R. Retrovirus-induced de 55. O’Malley B.W. Steroid hormone action in eukary-novo methylation of flanking host sequences correlates otic cells // Clin. Inv. — 1984. — Vol. 74. — P. 307-312. with gene inactivity // Nature. — 1985. — Vol. 315(6020). 56. Ornitz D.M., Palmiter R.D., Hammer R.E. et al. — P. 594-597. Specific expression of an elastase-humaN growth hor- ч

№2/том5/2006 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

1

ОБЗОРЫ ЛИТЕРАТУРЫ

mone fusion gene in pancreatic acinar cells of transgenic mice // Nature. — 1985. — Vol. 313. — P. 600-603.

57. Ozato K., Wan Y.J. and Orrison B.M. Mouse major histocompatibily class 1 gene expression begins at midsomite stage and is inducible in earlier-stage embryos by interferon // Prog. Natl. Acad. Sci. USA. — 1985. — Vol. 82. — P. 2427-2431.

58. Pain B., Chenevier P., Samarut J. Chicken embryonic stem cells and transgenic strategies // Cells Tissues Organs. — 1999. — Vol. 165(3-4). — P. 212-219.

59. Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer R.E. et al. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes // Nature. — 1982. — Vol. 300. — P. 611-615.

60. Palmiter R.D. and Brinster R.L. Germline transformation of mice // Ann. Rev. of Genetics. — 1986. — Vol. 20. — P. 3-60.

61. PeshonJ.J., Behringer R.R. et al. Spermatid-specific expression of protamine 1 in transgenic mice // Proc. Acad. Sci. USA. — 1987. — Vol. 84. — P. 5316-5319.

62. Robl G.M., Cibelli P.G. Golueke J.J. et al. Embryonic stem cells chimeras and somatic cell nuclear transfer for production of transgenic cattle. — Transgenic Animals in Agriculture. — CAB International, Wallingford, Oxon, UK, 1999. — P. 79-86.

63. Prokofiev M.I., Ernst L.K., Suraeva N.M. et al. Bovine oocyte maturation, fertilization and further development in vitro and after transfer into recipient // Theriogenology. — 1992. — Vol. 38. — P. 461-469.

64. Rubinstein J.L.R., Nicolas I.F. and Jacob F. Introduction of nes into preimplantation mouse embryos by use of a detective recombinant retrovirus // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1986. — Vol. 8. — P. 366-368.

65. Rusconi S, Kohler G. Transmission and expression of a specific pair of rearranged immimoglobulin u and k genes in a transgenic mouse line // Nature. — 1985. — Vol. 314. — P. 330-334.

66. Salter D.W., Smith E.J., Hughes S.H. et al. Transgenic chickens: insertion of retroviral genes into the chick germline // Virology. — 1987. — Vol. 157. — P. 236-240.

67. Salter D.W., Smith E.J., Hughes S.H. et al. Gene insertion into the chick germline by retroviruses // Polt. Sci. — 1986. — Vol. 65. — P. 1445-1458.

68. Schultze N., Burki Y., Lang Y et al. Efficient control of gene expression by single step of the tetracycline system in transgenic mice // Nat. Biotechnol. — 1996. — Vol. 14. — P. 499-503.

69. Smith K.R. Sperm cell mediated trasgenesis // Anim. Biotechnol. — 1999. — Vol. 10(1/2). — P. 1-14.

70. Smith K.R. Gene transfer in higher animals: theoretical consideration and key concepts // J. of Biotechnolgy. — 2002. — Vol. 99. — P. 1-22.

71. Storb U., OtBrien R.L., McMullen M.D. et al. High exspression of cloneimmunoglobulin kappa gene in transgenice is restricted to В lymphocytes // Nature. — 1984. — Vol. 310. — P. 238-241.

72. Strauss W.M., Dausman J., Beard C., Jonson C. Germ line transmission of yeast artificial chromosome spanning the murine б-1 (I) collagen locus // Science-New York then Washington. — 1993. — Vol. 259(5103). — P. 1904.

73. Swift G.H, Hammer R.E, Mc.Donald R.J. et al. Tissue-specific expression of the rat pancreatic elastase 1 gene in transgenic mice // Cell. — 1984. — Vol. 38. — P. 639-646.

74. Ulmatsu Y., Ryser S., Dembic Z. et.al. In transgenic mice the introduce functional cell receptor gene prevents expression of endogenous genes // Cell. — 1988. — Vol. 52. — P. 831-841.

75. Van der Putten, Botteri H, Miller F.M et al. Efficient insertion of genes into the mouse germ line via retroviral vectors // Proc. Natl.Acad. USA. — 1985. — Vol. 82. — P. 6148-6152.

76. Walker S.K., Seamark R.F., Quinn P. et al. Culture of pronuclear embryos of sheep in a simple medium // Proc. 1th Int. Cong. Anim. Reprod. — 1988. — Vol. 5. — P. 483.

77. Weiher H, Barklis E et al. Two cistinct sequence elements mediate retroviral gene expression in embryonal carcinoma cell // J. Virol. — 1987. — Vol. 61. — P. 2742-2746.

78. Whitelaw C.B.A., Springbett A.J., Webster J., Clark J. The majority of G0 transgenic mice are derived from mosaic embryos // Transgenic Res. — 1993. — Vol. 2(1). — P. 29.

Поступила 01.10.2004.

№2/том5/2006

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ