КРУПНОМАСШТАБНЫЕ МОНОКЛЕТОЧНЫЕ БИБЛИОТЕКИ ТРАНСКРИПТОМОВ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ

1. Способ получения библиотеки для секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты, происходящие из множества отдельных ядер или клеток, где указанный способ включает:
(a) получение множества ядер или клеток в первом множестве компартментов,
где каждый компартмент содержит субпопуляцию ядер или клеток;
(b) мечение вновь синтезированной РНК в субпопуляциях клеток или ядер, полученных из клеток;
(c) обработку молекул РНК в каждой субпопуляции ядер или клеток с получением индексированных ядер или клеток,
где обработка включает добавление к нуклеиновым кислотам РНК, присутствующим в каждой субпопуляции ядер или клеток, первой компартмент-специфической индексной последовательности с получением индексированных нуклеиновых кислот ДНК,
присутствующих в индексированных ядрах или клетках,
где обработка включает лигирование, удлинение праймера, гибридизацию или амплификацию; и
(d) объединение индексированных ядер или клеток с получением объединенных индексированных ядер или клеток.
2. Способ по п. 1, где обработка включает:
контактирование субпопуляций с обратной транскриптазой и праймером, которые гибридизуются с нуклеиновыми кислотами РНК, с образованием двухцепочечных нуклеиновых кислот ДНК, содержащих праймер, и соответствующей нуклеотидной последовательности ДНК из матричных молекул РНК, и необязательно
a) где праймер содержит поли-Т-нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с поли(А)-хвостом мРНК, где необязательно обработка также включает контактирование субпопуляций со вторым праймером, где второй праймер содержит последовательность, которая гибридизуется с предварительно определенной нуклеиновой кислотой ДНК, где необязательно второй праймер содержит компартмент-специфический индекс;
b) где праймер содержит последовательность, которая гибридизуется с предварительно определенное нуклеиновой кислотой РНК, где необязательно способ включает праймеры в различных компартментах, которые гибридизуются с различными нуклеотидами одной и той же предварительно определенной нуклеиновой кислоты РНК или
с) где праймер включает праймер переключения матрицы.
3. Способ по п. 1, где обработка для добавления первой компартмент-специфической индексной последовательности включает двухстадийный способ добавления нуклеотидной последовательности, содержащей универсальную последовательность, к нуклеиновым кислотам РНК с получением нуклеиновых кислот ДНК, а затем добавление первой компартмент-специфической индексной последовательности к нуклеиновым кислотам ДНК.
4. Способ получения библиотеки для секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты, происходящие из множества отдельных ядер или клеток, где указанный способ включает:
(a) получение множества ядер или клеток в первом множестве компартментов,
где каждый компартмент содержит субпопуляцию ядер или клеток;
(b) контактирование каждой субпопуляции с обратной транскриптазой и праймером, которые гибридизуются с предварительно определенной нуклеиновой кислотой РНК, с образованием двухцепочечных нуклеиновых кислот ДНК, содержащих праймер, и соответствующей нуклеотидной последовательности ДНК из матричных молекул РНК;
(c) обработку молекул ДНК в каждой субпопуляции ядер или клеток с получением индексированных ядер или клеток,
где обработка включает добавление к нуклеиновым кислотам ДНК, присутствующим в каждой субпопуляции ядер или клеток, первой компартмент-специфической индексной последовательности с получением индексированных нуклеиновых кислот, присутствующих в индексированных ядрах или клетках,
где обработка включает лигирование, удлинение праймера, гибридизацию или амплификацию; и
(d) объединение индексированных ядер или клеток с получением объединенных индексированных ядер или клеток.
5. Способ по п. 4, где а) праймер содержит первую компартмент-специфическую индексную последовательность,
b) дополнительно включает, перед контактированием, мечение вновь синтезированной РНК в субпопуляциях клеток или ядер, выделенных из клеток, или
c) где обработка для добавления первой компартмент-специфической индексной последовательности включает двухстадийный способ добавления нуклеотидной последовательности, содержащей универсальную последовательность, к нуклеиновым кислотам, а затем добавление первой компартмент-специфической индексной последовательности к нуклеиновым кислотам.
6. Способ по п. 2 или 5, где предварительно определенная нуклеиновая кислота РНК представляет собой мРНК.
7. Способ по п. 1 или 5, где а) уже существующие нуклеиновые кислоты РНК и вновь синтезированные нуклеиновые кислоты РНК помечены одинаковыми индексами в одном и том же компартменте,
b) где мечение включает инкубирование множества ядер или клеток в композиции, содержащей нуклеотидную метку, где нуклеотидная метка включена во вновь синтезированную РНК, необязательно
i) где нуклеотидная метка содержит нуклеотидный аналог, меченный гаптеном нуклеотид, мутагенный нуклеотид или нуклеотид, который может быть модифицирован посредством химической реакции, или
ii) где более чем одна нуклеотидная метка включена во вновь синтезированную РНК, где необязательно отношения нуклеотидной метки или меток отличаются для различных компартментов или моментов времени,
c) также включает обработку субпопуляций ядер или клеток в предварительно определенных условиях перед мечением, необязательно
где предварительно определенное условие включает обработку агентом, необязательно
i) где агент включает белок, не-рибосомный белок, поликетид, органическую молекулу, неорганическую молекулу, молекулу РНК или РНКи, углевод, гликопротеин, нуклеиновую кислоту или их комбинацию, или
ii) где агент включает терапевтическое лекарственное средство,
где предварительно определенные условия двух или более компартментов являются различными,
где обработку и мечение проводят одновременно или обработку проводят до мечения.
8. Способ по п. 1 или 4, дополнительно включающий: распределение субпопуляций объединенных индексированных ядер или клеток по второму множеству компартментов и добавление к индексированным нуклеиновым кислотам, присутствующим в субпопуляциях ядер или клеток, второй индексной последовательности с получением ядер или клеток с двумя индексами, содержащих фрагменты нуклеиновой кислоты с двумя индексами, где добавление включает лигирование, удлинение праймера, гибридизацию, амплификацию или транспозицию;
объединение ядер или клеток с двумя индексами с получением объединенных ядер или клеток с двумя индексами.
9. Способ по п. 8, дополнительно включающий:
распределение субпопуляций объединенных ядер или клеток с двумя индексами по третьему множеству компартментов и добавление к индексированным нуклеиновым кислотам, присутствующим в субпопуляциях ядер или клеток, третьей индексной последовательности с получением ядер или клеток с тремя индексами, содержащих фрагменты нуклеиновой кислоты с тремя индексами, где добавление включает лигирование, гибридизацию, удлинение праймера, амплификацию или транспозицию;
объединение ядер или клеток с тремя индексами с получением объединенных ядер или клеток с тремя индексами, необязательно
a) где распределение включает разведение,
b) где распределение включает сортинг,
c) где добавление включает контактирование субпопуляций со шпилечным лигирующим дуплексом в условиях, подходящих для лигирования шпилечного лигирующего дуплекса с концом фрагментов нуклеиновой кислоты, содержащих одну или две индексных последовательности,
d) где добавление включает контактирование фрагментов нуклеиновой кислоты, содержащих одну или более индексных последовательностей, с транспосомным комплексом, где транспосомный комплекс в компартментах содержит транспозазу и универсальную последовательность, где контактирование также включает условия, подходящие для фрагментации фрагментов нуклеиновой кислоты и включения универсальной последовательности во фрагменты нуклеиновой кислоты.
10. Способ по п. 1 или 4, где добавление включает лигирование первой компартмент-специфической индексной последовательности, а также включает добавление второй индексной последовательности с получением ядер или клеток с двумя индексами, содержащих фрагменты нуклеиновой кислоты с двумя индексами, где добавление включает транспозицию.
11. Способ по п. 8, где добавление включает лигирование второй компартмент-специфической индексной последовательности, а также включает добавление третьей индексной последовательности с получением ядер или клеток с двумя индексами, содержащих фрагменты нуклеиновой кислоты с тремя индексами, где добавление включает транспозицию.
12. Способ по любому из пп. 1, 8 или 9, а) где компартмент включает лунку или каплю, b) где компартменты первого множества компартментов содержат от 50 до 100000000 ядер или клеток,
необязательно по п. 8 i) где компартменты второго множества компартментов содержат от 50 до 100000000 ядер или клеток, ii) также включает получение нуклеиновых кислот с двумя индексами из объединенных ядер или клеток с двумя индексами и тем самым получение библиотеки для секвенирования из множества ядер или клеток,
необязательно по п. 9, i) где компартменты третьего множества компартментов содержат от 50 до 100000000 ядер или клеток, ii) также включает получение нуклеиновых кислот с тремя индексами из объединенных ядер или клеток с тремя индексами и тем самым получение библиотеки для секвенирования из множества ядер или клеток.
13. Способ по п. 1 или 4, дополнительно включающий получение индексированных нуклеиновых кислот из объединенных индексированных ядер или клеток, и тем самым получение библиотеки для секвенирования из множества ядер или клеток.
14. Способ по любому из пп. 1-11, дополнительно включающий:
получение поверхности, содержащей множество сайтов амплификации,
где сайты амплификации включают по меньшей мере две популяции связанных одноцепочечных олигонуклеотидов для захвата, имеющих свободный 3'-конец, и
контактирование поверхности, содержащей сайты амплификации, с фрагментами нуклеиновой кислоты, содержащими одну, две или три индексных последовательности, в условиях, подходящих для получения множества сайтов амплификации, каждый из которых содержит клональную популяцию ампликонов, из отдельного фрагмента, содержащего множество индексов.
15. Способ по любому из пп. 8 или 9, где добавление компартмент-специфической индексной последовательности включает двухстадийный способ добавления нуклеотидной последовательности, содержащей универсальную последовательность, к нуклеиновым кислотам, а затем добавление компартмент-специфической индексной последовательности к нуклеиновым кислотам.
16. Способ получения библиотеки для секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты, происходящие из множества отдельных ядер или клеток, где указанный способ включает:
(a) получение множества ядер или клеток в первом множестве компартментов,
где каждый компартмент содержит субпопуляцию ядер или клеток;
(b) контактирование каждой субпопуляции с обратной транскриптазой и праймером с получением двухцепочечных нуклеиновых кислот ДНК, содержащих праймер, и соответствующей нуклеотидной последовательности ДНК из матричных молекул РНК;
(c) обработку молекул ДНК в каждой субпопуляции ядер или клеток с получением индексированных ядер или клеток,
где обработка включает добавление к нуклеиновым кислотам ДНК, присутствующим в каждой субпопуляции ядер или клеток, первой компартмент-специфической индексной последовательности с получением индексированных нуклеиновых кислот, присутствующих в индексированных ядрах или клетках,
где обработка включает лигирование, удлинение праймера, гибридизацию, амплификацию или транспозицию; и
(d) объединение индексированных ядер или клеток с получением объединенных индексированных ядер или клеток;
(e) распределение объединенных индексированных ядер или клеток по второму множеству компартментов,
где каждый компартмент содержит субпопуляцию ядер или клеток;
(f) обработку молекул ДНК в каждой субпопуляции ядер или клеток с получением ядер или клеток с двумя индексами,
где обработка включает добавление к нуклеиновым кислотам ДНК, присутствующим в каждой субпопуляции ядер или клеток, второй компартмент-специфической индексной последовательности с получением нуклеиновых кислот с двумя индексами, присутствующих в индексированных ядрах или клетках,
где обработка включает лигирование, удлинение праймера, гибридизацию, амплификацию или транспозицию; и
(g) объединение ядер или клеток с двумя индексами с получением объединенных ядер или клеток с двумя индексами;
(h) распределение объединенных ядер или клеток с двумя индексами по третьему множеству компартментов,
где каждый компартмент содержит субпопуляцию ядер или клеток;
(i) обработку молекул ДНК в каждой субпопуляции ядер или клеток с получением ядер или клеток с тремя индексами,
где обработка включает добавление к нуклеиновым кислотам ДНК, присутствующим в каждой субпопуляции ядер или клеток, третьей компартмент-специфической индексной последовательности с получением нуклеиновых кислот с тремя индексами, присутствующих в индексированных ядрах или клетках,
где обработка включает лигирование, удлинение праймера, гибридизацию, амплификацию или транспозицию; и
(j) объединение ядер или клеток с тремя индексами с получением объединенных ядер или клеток с тремя индексами.
17. Способ получения библиотеки для секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты, происходящие из множества отдельных ядер или клеток, где указанный способ включает:
(a) получение множества ядер или клеток;
(b) контактирование множества ядер или клеток с обратной транскриптазой и праймером, с получением двухцепочечных нуклеиновых кислот ДНК, содержащих праймер, и соответствующей нуклеотидной последовательности ДНК из матричных нуклеиновых кислот РНК;
(c) распределение ядер или клеток по первому множеству компартментов,
где каждый компартмент содержит субпопуляцию ядер или клеток;
(d) обработку молекул ДНК в каждой субпопуляции ядер или клеток с получением индексированных ядер или клеток,
где обработка включает добавление к нуклеиновым кислотам ДНК, присутствующим в каждой субпопуляции ядер или клеток, первой компартмент-специфической индексной последовательности с получением индексированных нуклеиновых кислот, присутствующих в индексированных ядрах или клетках,
где обработка включает лигирование, удлинение праймера, гибридизацию, амплификацию или транспозицию; и
(e) объединение индексированных ядер или клеток с получением объединенных индексированных ядер или клеток;
(f) распределение объединенных индексированных ядер или клеток по второму множеству компартментов,
где каждый компартмент содержит субпопуляцию ядер или клеток;
(g) обработку молекул ДНК в каждой субпопуляции ядер или клеток с получением ядер или клеток с двумя индексами,
где обработка включает добавление к нуклеиновым кислотам ДНК, присутствующим в каждой субпопуляции ядер или клеток, второй компартмент-специфической индексной последовательности с получением нуклеиновых кислот с двумя индексами, присутствующих в индексированных ядрах или клетках,
где обработка включает лигирование, удлинение праймера, гибридизацию, амплификацию или транспозицию; и
(h) объединение ядер или клеток с двумя индексами с получением объединенных ядер или клеток с двумя индексами;
(i) распределение объединенных ядер или клеток с двумя индексами по третьему множеству компартментов,
где каждый компартмент содержит субпопуляцию ядер или клеток;
(j) обработку молекул ДНК в каждой субпопуляции ядер или клеток с получением ядер или клеток с тремя индексами,
где обработка включает добавление к нуклеиновым кислотам ДНК, присутствующим в субпопуляциях ядер или клеток, третьей компартмент-специфической индексной последовательности с получением нуклеиновых кислот с тремя индексами, присутствующих в индексированных ядрах или клетках,
где обработка включает лигирование, удлинение праймера, гибридизацию, амплификацию или транспозицию; и
(k) объединение ядер или клеток с тремя индексами с получением объединенных ядер или клеток с тремя индексами.
18. Способ по п. 16 или 17,
а) где праймер гибридизуется с нуклеиновыми кислотами РНК с образованием двухцепочечных нуклеиновых кислот ДНК, содержащих праймер, и соответствующей нуклеотидной последовательности ДНК из матричных молекул РНК, необязательно
i) где праймер содержит поли-Т-нуклеотидную
последовательность, которая гибридизуется с поли(А)-хвостом мРНК, необязательно, где контактирование также включает контактирование субпопуляций со вторым праймером, где второй праймер содержит последовательность, которая гибридизуется с предварительно определенной нуклеиновой кислотой ДНК, необязательно где второй праймер содержит компартмент-специфический индекс, или
ii) где праймер содержит последовательность, которая гибридизуется с предварительно определенной нуклеиновой кислотой РНК, необязательно где предварительно определенной нуклеиновой кислотой РНК является мРНК, или
b) где праймер включает праймер переключения матрицы, или
c) где обработка для добавления одной или более первой, второй или третьей компартмент-специфической индексной последовательности включает двухстадийный способ добавления нуклеотидной последовательности, содержащей универсальную последовательность, к нуклеиновым кислотам, а затем добавление первой компартмент-специфической индексной последовательности к нуклеиновым кислотам ДНК, или
d) где праймер содержит первую компартмент-специфическую индексную последовательность,
или е) дополнительно включающий, перед контактированием, мечение вновь синтезированной РНК в субпопуляциях клеток или ядер, выделенных из клеток, необязательно, i) где уже существующие нуклеиновые кислоты РНК и вновь синтезированные нуклеиновые кислоты РНК помечены одинаковыми индексами в одном и том же компартменте, или
ii) где мечение включает инкубирование множества ядер или клеток в композиции, содержащей нуклеотидную метку, где нуклеотидная метка включена во вновь синтезированную РНК, или
iii) где нуклеотидная метка содержит нуклеотидный аналог, меченный гаптеном нуклеотид, мутагенный нуклеотид или нуклеотид, который может быть модифицирован посредством химической реакции, или
iv) где более чем, одна нуклеотидная метка включена во вновь синтезированную РНК, необязательно, где отношения нуклеотидной метки или меток отличаются для различных компартментов или моментов времени, или
v) также включающий обработку субпопуляции ядер или клеток компартментов в предварительно определенных условиях перед мечением, необязательно а) где предварительно определенное условие включает обработку агентом, b) где предварительно определенные условия двух или более компартментов являются различными, или с) где обработку и мечение проводят одновременно или обработку проводят до мечения, необязательно, где агент включает белок, не-рибосомный белок, поликетид, органическую молекулу, неорганическую молекулу, молекулу РНК или РНКи, углевод, гликопротеин, нуклеиновую кислоту или их комбинацию,
где агент включает терапевтическое лекарственное средство,
f) где одно или более распределений включают разведение, g) где одно или более распределений включают сортинг,
h) где добавление одной или более из первой, второй или третьей компартмент-специфических индексных последовательностей включает контактирование субпопуляций со шпилечным лигирующим дуплексом в условиях, подходящих для лигирования шпилечного лигирующего дуплекса с концом фрагментов нуклеиновой кислоты,
i) где добавление одной или более из первой, второй или третьей компартмент-специфических индексных последовательностей включает контактирование фрагментов нуклеиновой кислоты с транспосомным комплексом, где транспосомный комплекс в компартментах содержит транспозазу и универсальную последовательность, где контактирование также включает условия, подходящие для фрагментации фрагментов нуклеиновой кислоты и включения нуклеотидной последовательности во фрагменты нуклеиновой кислоты,
j) где добавление первого или второго компартмент-специфического индекса включает лигирование, а добавление последующей компартмент-специфической индексной
последовательности включает транспозицию,
k) где компартмент включает лунку или каплю,
1) где компартменты первого множества компартментов содержат от 50 до 100000000 ядер или клеток,
m) где компартменты второго множества компартментов содержат от 50 до 100000000 ядер или клеток,
n) где компартменты третьего множества компартментов содержат от 50 до 100000000 ядер или клеток,
о) дополнительно включающий получение нуклеиновых кислот с тремя индексами из объединенных ядер или клеток с тремя индексами, и тем самым получение библиотеки для секвенирования из множества ядер или клеток,
р) дополнительно включающий:
получение поверхности, содержащей множество сайтов амплификации,
где сайты амплификации включают по меньшей мере две популяции связанных одноцепочечных олигонуклеотидов для захвата, имеющих свободный 3'-конец, и
контактирование поверхности, содержащей сайты амплификации, с фрагментами нуклеиновой кислоты с тремя индексами в условиях, подходящих для получения множества сайтов амплификации, каждый из которых содержит клональную популяцию ампликонов, из отдельного фрагмента, содержащего множество индексов.
19. Способ получения библиотеки для секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты, из множества отдельных клеток, где указанный способ включает:
(a) получение ядер из множества клеток;
(b) распределение субпопуляций ядер по первому множеству компартментов и контактирование каждой субпопуляции с обратной транскриптазой и праймером, где праймер в каждом компартменте содержит первую индексную последовательность, которая отличается от первых индексных последовательностей в других компартментах, с получением индексированных ядер, содержащих индексированные фрагменты нуклеиновых кислот;
(c) объединение индексированных ядер с получением объединенных индексированных ядер;
(d) распределение субпопуляций объединенных индексированных ядер по второму множеству компартментов и контактирование каждой субпопуляции со шпилечным лигирующим дуплексом в условиях, подходящих для лигирования шпилечного лигирующего дуплекса с концом индексированных фрагментов нуклеиновой кислоты, содержащих первую индексную последовательность, с получением ядер с двумя индексами, содержащих фрагменты нуклеиновой кислоты с двумя индексами, где шпилечный лигирующий дуплекс содержит вторую индексную последовательность, отличающуюся от вторых индексных последовательностей в других компартментах;
(e) объединение ядер с двумя индексами с получением объединенных ядер с двумя индексами;
(f) распределение субпопуляций объединенных ядер с двумя индексами по третьему множеству компартментов и обработку фрагментов нуклеиновой кислоты с двумя индексами в условиях, подходящих для синтеза второй цепи;
(g) контактирование фрагментов нуклеиновой кислоты с двумя индексами с транспосомным комплексом, где транспосомный комплекс в каждом компартменте содержит транспозазу и универсальную последовательность, где контактирование включает условия, подходящие для фрагментации фрагментов нуклеиновой кислоты с двумя индексами и включения универсальной последовательности во фрагменты нуклеиновой кислоты с двумя индексами с получением фрагментов нуклеиновой кислоты с двумя индексами, содержащих первый и второй индексы на одном конце и универсальную последовательность на другом конце;
(i) включение во фрагменты нуклеиновой кислоты с двумя индексами в каждом компартменте третьей индексной последовательности с получением фрагментов с тремя индексами;
(j) объединение фрагментов с тремя индексами с получением библиотеки для секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты транскриптома, из множества отдельных клеток.
20. Способ по п. 19,
где праймер содержит поли-Т-последовательность, которая гибридизуется с поли(А)-хвостом мРНК, или
где праймер каждого компартмента содержит последовательность, которая гибридизуется с предварительно определенной мРНК, необязательно, где способ включает праймеры в различных компартментах, которые гибридизуются с различными нуклеотидами одной и той же предварительно определенной мРНК.
21. Способ получения библиотеки для секвенирования транскриптома, содержащей нуклеиновые кислоты, из множества отдельных клеток, где указанный способ включает:
(a) получение объединенных ядер из множества клеток;
(b) контактирование объединенных ядер с обратной транскриптазой и праймером, содержащим последовательность олиго-dT, которая гибридизуется с поли(А)-хвостом мРНК с образованием объединенных ядер, содержащих фрагменты нуклеиновой кислоты;
(c) распределение субпопуляций объединенных ядер по множеству компартментов и контактирование каждой субпопуляции со шпилечным лигирующим дуплексом в условиях, подходящих для лигирования шпилечного лигирующего дуплекса с концом фрагментов нуклеиновой кислоты с получением индексированных ядер, содержащих индексированные фрагменты нуклеиновой кислоты, где шпилечный лигирующий дуплекс содержит индексную последовательность, отличающуюся от индексных последовательностей в других компартментах;
(d) объединение индексированных ядер с получением объединенных индексированных ядер;
(e) распределение субпопуляций объединенных индексированных ядер по второму множеству компартментов и обработку индексированных фрагментов нуклеиновой кислоты в условиях, подходящих для синтеза второй цепи;
(f) контактирование индексированных фрагментов нуклеиновой кислоты с транспосомным комплексом, где транспосомный комплекс в каждом компартменте содержит транспозазу и универсальную последовательность, где контактирование включает условия, подходящие для фрагментации индексированных фрагментов нуклеиновой кислоты и включения универсальной последовательности в индексированные фрагменты нуклеиновой кислоты с получением индексированных фрагментов нуклеиновой кислоты, содержащих индекс на одном конце и универсальную последовательность на другом конце;
(i) включение в индексированные фрагменты нуклеиновой кислоты в каждом компартменте второй индексной
последовательности с получением фрагментов с двумя индексами;
(j) объединение фрагментов с двумя индексами с получением библиотеки для секвенирования, содержащей нуклеиновые кислоты транскриптома, из множества отдельных клеток.
22. Способ выделения ядер, включающий:
(a) мгновенное замораживание ткани в жидком азоте;
(b) уменьшение размера ткани для получения обработанной ткани; и
(c) извлечение ядер из обработанной ткани путем инкубирования в буфере, который стимулирует лизис клеток и сохраняет целостность ядер в отсутствии одного или более экзогенных ферментов.
23. Способ по п. 22, i) где уменьшение включает измельчение ткани, воздействие на ткань физической силы или их комбинацию, или ii) также включающий:
(d) обработку извлеченных ядер перекрестно-сшивающим агентом с получением фиксированных ядер; и
(e) промывку фиксированных ядер.
24. Набор для его применения в целях получения библиотеки для секвенирования, где указанный набор включает нуклеотидную метку по пп. 7 или 18 и по меньшей мере один фермент, который опосредует лигирование, удлинение праймера или амплификацию.
25. Набор для его применения в целях получения библиотеки для секвенирования, где указанный набор включает праймер по пп. 2 или 4, который гибридизуется с предварительно определенной нуклеиновой кислотой, и по меньшей мере один фермент, который опосредует лигирование, удлинение праймера или амплификацию.