ИМИДАЗО[1,2-а]ПИРАЗИН-1-ИЛ-БЕНЗАМИДЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ СПИНАЛЬНОЙ МЫШЕЧНОЙ АТРОФИИ
IMIDAZO[1,2-A]PYRAZIN-1-YL-BENZAMIDES FOR TREATING SPINAL MUSCULAR ATROPHY

В настоящем изобретении предложены соединения, которые являются модуляторами сплайсинга гена SMN2, их получению, содержащим их фармацевтическим композициям и их применению в качестве лекарственных средств для лечения состояний, связанных с дефицитом SMN, в частности для лечения спинальной мышечной атрофии (SMA).
В частности, настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I)
1
2
1
2
3
4
где X, X, A, R, R, R и R являются такими, как здесь описано, или их фармацевтически приемлемым солям.
Уровень техники
Спинальная мышечная атрофия (SMA), в самом широком смысле, представляет собой группу наследственных и приобретенных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), характеризующихся прогрессирующей потерей двигательных нейронов в спинном мозге и стволе головного мозга, вызывающей мышечную слабость и атрофию мышц. Наиболее распространенная форма спинальной мышечной атрофии является результатом мутаций в гене выживаемости двигательных нейронов (SMN) и обнаруживается, с различной степенью тяжести, как у детей младшего возраста, так и у взрослых людей (Crawford and Pardo, Neurobiol. Dis., 1996, 3:97).
Детская спинальная мышечная атрофия является наиболее тяжелой формой этого нейродегенеративного заболевания. Симптомы включают мышечную слабость, низкий мышечный тонус, слабый крик, слабость или склонность к падению, затруднения при сосании или глотании, накопление секретов в легких или горле, затруднения с кормлением и повышенную восприимчивость к инфекции дыхательных путей. Довольно часто ноги являются более слабыми, чем руки, и не достигаются основные этапы развития ребенка, такие как поднятие головы или способность сидеть прямо. Как правило, чем раньше проявляются симптомы, тем короче продолжительность жизни. Как только разрушаются клетки двигательных нейронов, так вскоре после этого начинают проявляться симптомы. Тяжелые формы заболевания заканчиваются смертельным исходом, и для всех форм не известны способы лечения. Младенцы с тяжелой формой спинальной мышечной атрофии часто подвержены респираторному заболеванию вследствие слабости мышц, которые поддерживают дыхание. Индивидуумы с более легкими формами спинальной мышечной атрофии живут значительно дольше, хотя и они могут нуждаться в экстенсивной медицинской помощи, в частности, те дети, которые страдают более тяжелой формой из многообразия форм этого заболевания. Клиническое многообразие заболеваний спинальной мышечной атрофией подразделяют на следующие пять групп.
(a) SMA типа 0 (внутриутробная спинальная мышечная атрофия) является наиболее тяжелой формой заболевания и возникает до рождения ребенка. Обычно первым симптомом SMA типа 0 является пониженная подвижность плода, которая может быть замечена первый раз между 30 и 36 неделями беременности. После рождения, новорожденные мало двигаются и имеют затруднения с глотанием и дыханием.
(b) SMA типа 1 (младенческая спинальная мышечная атрофия или болезнь Верднига-Гоффманна) проявляет первые симптомы между 0 и 6 месяцами. Этот тип SMA является также очень тяжелой формой. Пациенты никогда не достигают способности сидеть, и если не применяется вспомогательная искусственная вентиляция легких, то пациенты обычно погибают в течение первых 2 лет.
(c) SMA типа 2 (промежуточная форма спинальной мышечной атрофии) возникает в возрасте 7-18 месяцев. Пациенты достигают способности сидеть без поддержки, но никогда не могут стоять или ходить без посторонней помощи. Прогноз в этой группе зависит в основном от степени респираторного поражения.
(d) SMA типа 3 (спинальная юношеская мышечная атрофия или болезнь Кугельберга-Веландера) обычно диагностируется после 18 месяцев. Пациенты, страдающие SMA типа 3, способны в какой-то момент в процессе течения заболевания самостоятельно ходить, но часто становятся прикованными к инвалидному креслу в юношестве или в зрелом возрасте.
(e) SMA типа 4 (взрослая форма спинальной мышечной атрофии). Слабость обычно проявляется на последней стадии юношеского развития в мышцах языка, рук или ног, и затем прогрессирует в мышцах других областей организма. Течение взрослой формы спинальной мышечной атрофии идет значительно медленнее и мало влияет или не влияет на ожидаемую продолжительность жизни.
Ген SMN картирован с помощью анализа сцепления с комплексной областью на хромосоме 5q (Lefebvre S. et al, Cell (1995) 80:155). У людей, эта область содержит инвертированную дупликацию приблизительно 500 тысяч пар оснований (kb), дающую в результате две практически одинаковые копии гена SMN. Спинальная мышечная атрофия вызывается инактивирующей мутацией или делецией теломерной копии гена (SMN1) в обеих хромосомах, что приводит к потере функции гена SMN1. Однако у всех пациентов сохраняется центромерная копия гена (SMN2), и число копий гена SMN2 у пациентов, страдающих спинальной мышечной атрофией, находится в обратной зависимости от тяжести заболевания; то есть, пациенты с менее тяжелой формой спинальной мышечной атрофии имеют больше копий SMN2. SMN2 пре-мРНК подвергается альтернативному сплайсингу экзона 7, вызванного трансляционно молчащими С/Т мутациями в экзоне 7. В результате, большая часть транскриптов, продуцируемых из SMN2, испытывает недостаток в экзоне 7 (SMN2 А7) и кодирует процессированный белок Smn, который имеет нарушенную функцию и быстро разлагается.
Белок SMN играет роль в процессинге и метаболизме РНК, обладая хорошо выраженной функцией опосредования сборки специфического класса комплексов РНК- белок, называемых snRNP (малыми ядерными нуклеопротеидами). SMN может обладать другими функциями в двигательных нейронах, однако его роль в предотвращении в селективной дегенерации двигательных нейронов еще не достаточно изучена.
В большинстве случаев, спинальная мышечная атрофия (SMA) диагностируется на основе клинических симптомов и отсутствием экзона 7 гена SMN1. Однако, приблизительно в 5% случаев, спинальная мышечная атрофия вызывается в результате мутации в генах, а не инактивации SMN1, некоторые из которых известны, а другие еще не изучены. В ряде случаев, когда проведение теста на ген SMN1 затруднено или этот тест не обнаруживает никакого нарушения, могут быть рекомендованы другие тесты, такие как электромиография (EMG) или биопсия мышечной ткани.
В настоящее время лечение пациентов со спинальной мышечной атрофией ограничено поддерживающей терапией, включающей использование респираторных, диетологических и реабилитационных мер; и не известно лекарственное средство, которое устраняло бы причину возникновения заболевания. Общепринятое в настоящее время лечение спинальной мышечной атрофии включает предотвращение и терапию вторичных эффектов хронической потери нейромоторных единиц. Главным моментом в терапии SMA типа 1 является предотвращение и раннее лечение легочных осложнений, которые являются причиной смерти в большинстве случаев. Несмотря на то, что некоторые младенцы, страдающие спинальной мышечной атрофией, доживают до взрослого возраста, тем не менее, ожидаемая продолжительность жизни младенцев с SMA типа 1 составляет менее чем два года.
Были разработаны несколько моделей спинальной мышечной атрофии на мышах. В частности, модель SMN дельта экзон 7 (Δ7 SMN) (Le et al., Hum. Mol. Genet, 2005, 14:845) содержит как ген SMN2, так и несколько копий SMN2 Δ 7 кДНК, и повторяет многие из фенотипических особенностей SMA типа 1. Модель SMN Δ 7 может быть использована как для исследований экспрессии SMN2, так и для оценки двигательной функции и продолжительности жизни. Модель мышей с С/С-аллелем (Jackson Laboratory strain #008714, The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) предлагает модель менее тяжелой формы заболевания спинальной мышечной атрофии, но с отсутствием выраженной мышечной слабости. Эта мышиная модель содержит инактивированный ген Smn1 и несет какполный ген SMN2, так и гибридный ген mSmn1-SMN2, который подвергается альтернативному сплайсингу. Мыши с С/С-аллелем имеют пониженные уровни как полноцепочечной SMN2 мРНК, так и белка Smn. Модель мыши с С/С-аллелем используют для исследований экспрессии SMN2.
В результате более глубокого понимания генетических основ спинальной мышечной атрофии были исследованы несколько стратегий лечения, но ни одна из них не дала положительных результатов при клинических испытаниях.
Замещение гена SMN1, используя вирусные векторы для доставки, и замещение клеток, используя дифференцированные SMN1+/+ стволовые клетки, продемонстрировали эффективность на животных моделях спинальной мышечной атрофии. Перед тем как эти подходы могут быть применены на людях, необходимо проведение дальнейших исследований для определения безопасности и иммунного ответа и для обоснования требования инициирования лечения на неонатальной стадии.
Была также достигнута коррекция альтернативного сплайсинга SMN2 в культивированных клетках с использованием синтетических нуклеиновых кислот: (i) антисмысловых олигонуклеотидов, которые целенаправленно воздействуют на элементы последовательности в SMN2 пре-мРНК и сдвигают направление реакции сплайсинга в сторону образования полноразмерной SMN2 мРНК (Passini et al, Sci. Transl. Med., 2011, 3:72ra 18; и Hua et al, Nature, 2011, 478:123) и (ii) молекул РНК, подвергнутых транс-сплайсингу, которые обеспечивают полнофункциональную РНК последовательность, которая замещает мутантный фрагмент в процессе сплайсинга и образует полноразмерную SMN1 мРНК (Coady and Lorson, J Neurosci., 2010, 30:126).
Другие изучаемые подходы включают поиск лекарственных средств, которые повышают уровни Smn, усиливают остаточную функцию Smn или компенсируют его сниженный уровень. Было показано, что аминогликозиды усиливают экспрессию стабилизированного расширенного Δ7 белка Smn, продуцируемого из SMN2 Δ7 мРНК путем промотирования трансляционного сквозного прочитывания аберрантного стоп- кодона, но они характеризуются низким проникновением в центральную нервную систему и проявляют токсичность при повторном дозировании. Было показано, что химиотерапевтические средства, такие как акларубицин, повышают содержание Smn в клеточной культуре; однако токсические свойства этих лекарственных средств препятствуют их длительному использованию у пациентов со спинальной мышечной атрофией. Некоторые лекарственные средства, проходящие клинические испытания в отношении лечения спинальной мышечной атрофии, включают активаторы транскрипции, такие как ингибиторы гистондеацетилазы ("HDAC") (например, бутираты, вальпроевая кислота и гидроксимочевина), и стабилизаторы мРНК (ингибитор декапирования мРНК RG3039 фирмы Pfizer), предназначенные для повышения количества общей РНК, транскрибированной из гена SMN2. Однако применение ингибиторов HDAC или стабилизаторов мРНК не затрагивает первопричину возникновения спинальной мышечной атрофии и может вызывать у людей общее повышение транскрипции и экспрессии гена с возможными проблемами безопасности препаратов.
При альтернативном подходе, для исследований были выбраны нейропротективные средства, такие как олесоксим. Такие стратегии направлены не на продуцирование функционального Smn для лечения спинальной мышечной атрофии, а на поиск возможности защитить Smn-дефицитные двигательные нейроны от нейродегенерации.
Система, предназначенная для выявления соединений, которые повышают включение экзона 7 гена SMN в РНК, транскрибированную из гена SMN2, и выявленные с помощью этой системы конкретные соединения бензооксазола и бензоизоксазола описаны в международной патентной заявке WO 2009/151546 A1.
Система, предназначенная для выявления соединений, которые продуцируют стабилизированный белок Smn из SMN2 Δ7 мРНК, и выявленные с помощью этой системы конкретные соединения изоиндолинона описаны в международной патентной заявке WO 2010/019236 А1 и WO 2013/119916 А2.
Несмотря на достигнутый прогресс в понимании генетических основ и патофизиологии спинальной мышечной атрофии, тем не менее, все еще существует необходимость в выявлении соединений, которые изменяют течение спинальной мышечной атрофии, одного из самых тяжелых детских неврологических заболеваний.
Подробное описание изобретения
Если не определено иначе, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, обычно понимаемое специалистом в области техники, к которой относится данное изобретение. Несмотря на то, что способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным здесь, можно использовать на практике или при тестировании изобретения подходящие способы и материалы описаны ниже.
Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие источники, упоминаемые в настоящем изобретении включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.
Номенклатура, используемая в данной заявке, основана на систематической номенклатуре ИЮПАК, если не указано иное.
Все открытые валентности, появляющиеся на углероде, кислороде, сере или атоме азота в структуре в настоящем изобретении указывают на наличие водорода, если не указано иное.
1-7
1-7
Определения, описанные здесь, применяются независимо от того, используются ли они по отдельности или в комбинации. Предполагается, что определения, описанные здесь, могут быть добавлены с образованием химически-релевантных комбинаций, таких, как "гетероциклоалкиларил", "галогеналкилгетероарил", "арилалкилгетероциклоалкил", или "алкоксиалкил". Последний член комбинация представляет собой радикал, который связан с остатком молекулы. Другие члены комбинации присоединены к соединяющему радикалу в обратном порядке по отношению к литеральной последовательности, т.е. комбинация C-алкокси-гетероциклоалкил относится к гетероциклоалкилу, который является замещенным C-алкокси.
1
2
3
Термин "остаток" относится к атому или группе химически связанных атомов, которые присоединены к другому атому или молекуле посредством одной или более химических связей, образуя таким образом часть молекулы. Например, переменные A, R, R и R в формуле (I) относятся к остаткам, которые присоединены к ядру структуры формулы (I) посредством ковалентной связи.
При указании числа заместителей, термин "один или более" обозначает диапазон от одного заместителя, до максимально возможного числа замещения, т.е. замену одного атома водорода до замены всех атомов водорода на заместители.
Термин "возможный" или "возможно" означает, что описанные далее события или обстоятельства, могут, но не обязательно должны присутствовать, и что описание включает случаи, когда события или обстоятельства присутствуют и случаи, в которых это не так
Термин "заместитель" обозначает атом или группу атомов, заменяющих атом водорода на родительской молекуле.
Термин "замещенный" означает, что указанная группа несет один или несколько заместителей. Если какая-либо группа может нести несколько заместителей и предложены разные возможные заместители, заместители выбраны независимо и не должны быть одинаковыми. Термин "незамещенный" означает, что указанная группа не несет заместителей. Термин "возможно замещенный" означает, что указанная группа является незамещенной или замещена одним или более заместителями, независимо выбранными из группы возможных заместителей. При указании числа заместителей, термин "один или более" означает от одного заместителя до максимально возможного числа замещения, т.е. от замены одного атома водорода до замены всех атомов водорода на заместители.
Термины "соединение (соединения) данного изобретения» и «соединение (соединения) настоящего изобретения» относятся к соединениям как раскрыто в настоящем изобретении и их стереоизомерам, таутомерам, сольватам и солям (например, фармацевтически приемлемым солям).
Когда соединения настоящего изобретения являются твердыми, квалифицированному специалисту понятно, что эти соединения, и их сольваты и соли, могут существовать в различных твердых формах, в частности различных кристаллических видах, каждый из которых находится в рамках объема настоящего изобретения и конкретных формул.
Термин "фармацевтически приемлемые соли" обозначает соли, которые не являются биологически или иным образом нежелательными. Фармацевтически приемлемые соли включают кислотно-аддитивные соли а также основно-аддитивные соли.
Термин "фармацевтически приемлемая кислотно-аддитивная соль" означает те фармацевтически приемлемые соли, которые образованы с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, угольная кислота, фосфорная кислота, и органическими кислотами, выбранными из алифатических, циклоалифатических, ароматических, аралифатических, гетероциклических, карбоновых и сульфоновых органических кислот, таких как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, глюконовая кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, яблочная кислота, малеиновая кислота, малеиновая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, винная кислота, лимонная кислота, аспарагиновая кислота, аскорбиновая кислота, глутаминовая кислота, антраниловая кислота, бензойная кислота, коричная кислота, миндальная кислота, эмбоновая кислота, фенилуксусная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота и салициловая кислота.
Конкретными фармацевтически приемлемыми солями настоящего изобретения являются соли, образованные соляной кислотой с получением хлорангидрида, дигидрохлорида, илитригирохлорида, более конкретно хлористоводородная соль.
Термин "фармацевтически приемлемые основно-аддитивная соль" означает те фармацевтически приемлемые соли, которые образованы с органическим или неорганическим основанием. Примеры приемлемых неорганических оснований, включают соли натрия, калия, аммония, кальция, магния, железа, цинка, меди, марганца и алюминия. Соли, полученные из фармацевтически приемлемых органических нетоксичных оснований включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, замещенных аминов, включая природные замещенные амины, циклических аминов и основных ионообменных смол, таких как изопропиламин-, триметиламин-, диэтиламин-, триэтиламин-, трипропиламин-, этаноламин-, 2-диэтиламиноэтанол-, триметамин-, дициклогексиламин-, лизин-, аргинин-, гистидин-, кофеин-, прокаин-, гидрабамин-, холин-, бетаин-, этилендиамин-, глюкозамин-, метилглюкамин-, теобромин-, пурин-, пиперазин-, пиперидин-, N-этилпиперидин-, и полиаминовые смолы.
Стереохимические определения и условные обозначения, используемые здесь, как правило, соответствуют S.P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; and Eliel, E. and Wilen, S., "Stereochemistry of Organic Compounds", John Wiley & Sons, Inc., New York, 1994. При описании оптически активного соединения префиксы D и L или R и S, используются для обозначения абсолютной конфигурации молекулы относительно ее хирального центра (ов). Заместители, присоединенные к рассматриваемому хиральному центру ранжируются в соответствии с Sequence Rule of Cahn, Ingold и Prelog. (Cahn etal. Angew. Chem. Inter. Edit. 1966, 5, 385; errata 517). Префиксы D и L или (+) и (-) используются для обозначения знака вращения плоскости поляризованного света соединением, причем (-) или L обозначает, что соединение является левовращающим. Соединение с префиксом (+) или D является правовращающим.
Термин "хиральный центр" означает атом углерода, связанный с четырьмя неодинаковыми заместителями. Термин "хиральный" означает способность неналожения на зеркальное отображение, хотя термин "ахиральный" относится к воплощениям, которые являются наложимыми на свое зеркальное изображение. Хиральные молекулы являются оптически активными, т.е. они обладают способностью вращать плоскость поляризованного света.
Соединения настоящего изобретения могут иметь один или несколько хиральных центров и могут существовать в форме оптически чистых энантиомеров, смесей энантиомеров, таких как, например, рацематы, оптически чистые диастереоизомеры, смеси диастереоизомеров, диастереоизомерных рацематов или смесей диастереоизомерных рацематов. В случае, когда хиральный центр присутствует в химической структуре, предполагается, что все стереоизомеры, связанные с этим хиральным центром, охватываются настоящим изобретением.
Термины "гало", "галоген", и "галид" используются в настоящем изобретении взаимозаменяемо и обозначают фтор, хлор, бром, или йод. Конкретными примерами галогена являются фтор и хлор.
Термин "алкил" означает одновалентную линейную или разветвленную насыщенную углеводородную группу, содержащую от 1 до 12 атомов углерода. В частных воплощениях алкил обладает от 1 до 7 атомами углерода, и в более конкретных воплощениях от 1 до 4 атомами углерода. Примеры алкила включают метил, этил, пропил, изопропил, н-бутил, изо-бутил, втор-бутил или трет-бутил. Конкретными примерами алкила являются метил, этил и изопропил.
Термин "галоалкил" означает алкильную группу, где по меньшей мере один из атомов водорода алкильной группы заменен одинаковыми или различными атомами галогена, в частности атомами фтора. Примеры галогеналкила включают монофтор-, дифтор- или трифторметил, этил или пропил, например, 3,3,3-трифторпропил, 2-фторэтил, 2,2,2-трифторэтил, фторметил или трифторметил и т.п.. Термин "пергалоалкил" означает алкильную группу, в которой все атомы водорода алкильной группы заменены одинаковыми или разными атомами галогена. Конкретными примерами галоалкила являются трифторметил и дифторметил.
Термин "алкокси" обозначает группу формулы -O-R', где R' представляет собой алкильную группу. Примеры алкоксигрупп включают метокси, этокси, изопропокси, и трет-бутокси. Конкретными примерами алкокси являются метокси и этокси.
Термин "бициклическая кольцевая система" обозначает два кольца, которые конденсированы друг с другом посредством общей одинарной или двойной связи (аннелированная бициклическая система), через последовательность из трех или более общих атомов (мостиковоые бициклические кольцевые системы) или через один общий атом (спиробициклическая кольцевая система). Бициклические системы могут быть насыщенными, частично ненасыщенными, ненасыщенными или ароматическими. Бициклические кольцевые системы могут содержать гетероатомы, выбранные из N, О и S. По аналогии, термин "трициклическая кольцевая система" обозначает три кольца, которые конденсированы друг с другом, как описано для бициклических кольцевых систем.
Термин "циклоалкил" означает одновалентную насыщенную моноциклическую или бициклическую углеводородную группу из от 3 до 10 атомов углерода в кольце. В частных воплощениях циклоалкил означает одновалентную насыщенную моноциклическую углеводородную группу из от 3 до 8 кольцевых атомов углерода. Бициклическая означает- состоящий из двух насыщенных карбоциклов, имеющих один или более общих атомов углерода. В частности, циклоалкильные группы представляют собой моноциклические. Примеры моноциклических циклоалкилов включают циклопропил, циклобутанил, циклопентил, циклогексил или циклогептил. Примерами бициклических циклоалкилов являются бицикло[2.2.1]гептанил или бицикло[2.2.2]октанил. Конкретным примером циклоалкила является циклопропил.
Термин "гетероциклоалкил" обозначает одновалентную насыщенную или частично ненасыщенную моно-, би- или трициклическую кольцевую систему, содержащую от 3 до 9 кольцевых атомов, включающих один, два или три кольцевых гетероатома, выбранных из N, О и S, а остальные кольцевые атомы являются углеродом. В частных воплощениях гетероциклоалкил представляет собой одновалентную насыщенную моноциклическую кольцевую систему из 4-7 кольцевых атомов, содержащую один, два или три кольцевых гетероатома, выбранных из N, О и S, а остальные кольцевые атомы являются углеродом. Примерами моноциклических насыщенных гетероциклоалкилов являются азиридинил, оксиранил, азетидинил, оксетанил, пирролидинил, тетрагидрофуранил, тетрагидро-тиенил, пиразолидинил, имидазолидинил, оксазолидинил, изоксазолидинил, тиазолидинил, пиперидинил, тетрагидропиранил, тетрагидротиопиранил, пиперазинил, морфолинил, 1,1-диоксо-тиоморфолин-4-ил, азепанил, диазепанила, гомопиперазинил или оксазепанил. Примерами бициклических насыщенных гетероциклоалкилов являются 8-аза-бицикло[3.2.1]октил, хинуклидинил, 8-окса-3-аза-бицикло[3.2.1]октил, 9-азабицикло[3.3.1]нонил, 3-окса-9-азабицикло[3.3.1]нонил, или 3-тиа-9-азабицикло[3.3.1]нонил. Примерами частично ненасыщенных гетероциклоалкилов являются дигидрофурил, имидазолинил, дигидро-оксазолил, тетрагидро-пиридинил или дигидропиранил. Конкретными примерами гетероциклоалкилов являются 1,4 диазепанил, гексагидропирроло[1,2а]пиразинил, пиперидинил, пиперащинил и пирролидинил. Более конкретными примерами гетероциклоалкила являются пиперазинил и пирролидинил.
Термин "N-гетероциклоалкил" обозначает гетероциклоалкильный радикал, содержащий по крайней мере один кольцевой атом азота и где точки присоединения гетероциклоалкильного радикала к остальной части молекулы проходят через кольцевой атом азота. Конкретными примерами N-гетероциклоалкила являются 1,4-диазепанил, гексагидропирроло[1,2-а] пиразинил, пиперидинил, пиперазинил и пирролидинил. Более конкретными примерами N-гетероциклоалкила являются пиперазинил и пирролидинил.
Термин "основность" по отношению к соединению, выражается в настоящем изобретении в виде отрицательного декадно-шаговым логарифмом константы кислотности сопряженной кислоты (рКа=-log Ka). Чем больше рКа сопряженной кислоты, тем сильнее основание (рКа+РКВ=14). В настоящем изобретении атом или функциональная группа обозначается "основной", если она может принимать протон и, если рассчитанная рКа сопряженной кислоты составляет по меньшей мере 7, в частности, если рассчитанная рКа сопряженной кислоты составляет по меньшей мере 7, 8, более конкретно, если рассчитанная рКа сопряженной кислоты составляет, по меньшей мере, 8. значения рКа были рассчитаны in silico, как описано у F.. Milletti et al., J. Chem. Inf. Model (2007) 47:2172-2181.
Термин "алкилен" обозначает линейную насыщенную двухвалентную углеводородную группу из 1-7 атомов углерода или разветвленную насыщенную двухвалентную углеводородную группу из 3-7 атомов углерода. Примеры алкиленовых групп включают метилен, этилен, пропилен, 2-метилпропилен, бутилен, 2-этилбутилен, пентилен, гексилен. Конкретными примерами алкилена являются этилен, пропилен, и бутилен.
Термин "амино" обозначает группу формулы-NR'R'', где R' и R'' независимо представляют собой водород, алкил, алкокси, циклоалкил, гетероциклоалкил, арил, гетероарил или как здесь описано. В качестве альтернативы, R' и R'' вместе с атомом азота, к которому они присоединены, могут образовывать гетероциклоалкил. Термин "первичный амино" обозначает группу, в которой как R', так и R'' представляют собой водород. Термин "вторичный амино" обозначает группу, в которой R' представляет собой водород, a R'' представляет собой группу, отличную от водорода. Термин "третичный амино" означает группу, в которой обе группы R' и R'' не являются водородом. Конкретными вторичными и третичными аминами являются метиламин, этиламин, пропиламин, изопропиламин, фениламин, бензиламин диметиламин, диэтиламин, дипропиламин и диизопропиламин.
Термин "защитная группа" обозначает группу, которая избирательно блокирует реакционноспособный сайт в многофункциональном соединении, так что химическую реакцию можно проводить избирательно в другом незащищенном реакционноспособном сайте в значении, которое обычно используют для нее в синтетической химии. Защитные группы могут быть удалены на подходящей стадии реакции. Иллюстративными защитными группами являются амино-защитные группы, карбокси-защитные группы или гидрокси-защитные группы.
Термин "амино-защитная группа" обозначает группы, предназначенные для защиты аминогруппы, и включает бензил, бензилоксикарбонил (карбобензилокси, CBZ), Fmoc (9-Флуоренилметилоксикарбонил), п-метоксибензилоксикарбонил, п-нитробензилоксикарбонил, трет-бутоксикарбонил (ВОС) и трифторацетил. Другие примеры этих групп можно найти в Т. W. Greene and P. G. M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd ed., John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1991, chapter 7; E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry", J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, New York, NY, 1973, Chapter 5, and T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, New York, NY, 1981. Термин "защищенная аминогруппа" обозначает аминогруппу, замещенную амино-защитной группой.
Термины "депротекция" или "депротектирование" обозначает способ, которым удаляют защитную группу после завершения селективного взаимодействия. Реагенты депротекции включают кислоты, основания или водород, в частности карбонаты калия или натрия, гидроксид лития в спиртовых растворах, цинк в метаноле, уксусную кислоту, трифторуксусную кислоту, палладиевые катализаторы, или трибромид бора.
Термин "активный фармацевтический ингредиент" (или "API") означает соединение или молекулу в фармацевтической композиции, которая обладает конкретной биологической активностью.
Термины "фармацевтическая композиция" и "фармацевтический препарат" (или "препарат") применяются взаимозаменяемо и обозначают смесь или раствор, содержащий терапевтически эффективное количество активного фармацевтического ингредиента вместе с фармацевтически приемлемыми эксципиентами для введения млекопитающему, например человеку, нуждающемуся в этом.
Термин "фармацевтически приемлемый" обозначает характеристику материала, который является полезным для получения фармацевтической композиции, который, как правило, безопасный, нетоксичный, и ни в биологическом, ни в каком-либо другом плане нежелательный и приемлемый для ветеринарии, а также в фармацевтике для человека.
Термины "фармацевтически приемлемый эксципиент", "фармацевтически приемлемый носитель" и "терапевтически инертный эксципиент" могут быть использованы взаимозаменяемо и означают любой фармацевтически приемлемый ингредиент в фармацевтической композиции, не обладающий терапевтической активностью и нетоксичный для субъекта, которому вводится, такой как разрыхлители, связующие вещества, наполнители, растворители, буферные агенты, изотонические агенты, стабилизаторы, антиоксиданты, поверхностно-активные вещества, носители, разбавители или смазочные средства, используемые в приготовлении фармацевтических продуктов.
Термины "индивид" или "субъект" относятся к млекопитающему. Млекопитающие включают, без ограничения, домашних животных (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматов (например, людей и приматов, отличных от человека, таких как обезьян), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых воплощениях, индивид или субъект является человеком.
Термин "терапевтически эффективное количество" означает количество соединения или молекулы по настоящему изобретению, которое при введении субъекту, (i) лечит или предотвращает конкретное заболевание, состояние или расстройство, (ii), смягчает, улучшает или устраняет один или более симптомов конкретного заболевания, состояния или расстройства, или (iii) предотвращает или задерживает начало одного или более симптомов конкретного заболевания, состояния или расстройства, описанных в настоящем изобретении. Терапевтически эффективное количество будет варьироваться в зависимости от соединения, состояния заболевания, которое лечат, тяжести или лечения при заболевании, возраста и относительного здоровья субъекта, пути и формы введения, мнения лечащего или ветеринарного врача, и других факторов.
Термин "лечить" или "лечение" болезненного состояния включает ингибирование болезненного состояния, т.е. приостановление развития болезненного состояния или его клинических симптомов, или облегчение болезненного состояния, т.е. наличие временной или постоянной регрессии болезненного состояния или его клинических симптомов.
Термин "состояния, связанные с дефицитом SMN" включают спинальную мышечную атрофию (SMA), нейрогенный врожденный множественный артрогрипоз (АМС), боковой амиотрофический склероз (ALS). Термин "спинальная мышечная атрофия" (или SMA) относится к заболеванию, вызванному инактивирующей мутацией или делецией в гене SMN1 на обеих хромосомах, приводящим к потере функции гена SMN1.
Симптомы спинальной мышечной атрофии включают мышечную слабость, низкий мышечный тонус, слабый крик, слабый кашель, вялость или тенденцию к падению, затруднение при сосании или глотании, затруднение с дыханием, накопление секрета в легких или горле, сжатые кулаки с потной рукой, трепетание/дрожание языка, часто наклон головы в одну сторону, даже в положении лежа, обычно ноги более слабые, чем руки, ноги часто принимающие положение "лягушачьих ножек", затруднения с кормлением, повышенную восприимчивость к инфекциям дыхательных путей, вялость кишечника/мочевого пузыря, массу тела ниже нормы, неспособность сидеть без посторонней помощи, неспособность ходить, неспособность ползать, и гипотонию, арефлексию и множественные врожденные контрактуры (артрогрипоз), связанные с потерей клеток передний рога спинного мозга.
Термин "лечение спинальной мышечной атрофии (SMA)" или "лечить спинальную мышечную атрофию (SMA)" включает один или более из следующих эффектов: (i) снижению или облегчению тяжести спинальной мышечной атрофии; (ii) откладыванию начала спинальной мышечной атрофии; (iii) замедлению развития спинальной мышечной атрофии; (iv) уменьшению частоты госпитализации субъекта; (v) снижению продолжительности госпитализации субъекта; (vi) увеличению выживаемости субъекта; (vii) улучшению качества жизни субъекта; (viii) уменьшению числа симптомов, связанных со спинальной мышечной атрофией; (ix) снижению или облегчению тяжести симптома (симптомов), связанного со спинальной мышечной атрофией; (х) уменьшению продолжительности симптома, связанного со спинальной мышечной атрофией; (xi) предотвращению рецидива симптома, связанного со спинальной мышечной атрофией; (xii) замедлению развития или начала симптома спинальной мышечной атрофии и/или (xiii) замедлению развития симптома, связанного со спинальной мышечной атрофией.
Более конкретно термин "лечение SMA" означает один или более из следующих благоприятных эффектов: (i) уменьшению потери мышечной силы; (ii) увеличению мышечной силы; (iii) уменьшению атрофии мышц; (iv) уменьшению потери двигательной функции; (v) увеличению количества двигательных нейронов; (vii) снижению потерь двигательных нейронов; (viii) защите SMN-дефицитных двигательных нейронов от дегенерации; (ix) увеличению двигательной функции; (х) увеличению функции легких и/или (xi) снижению потери функции легких.
Более подробно, термин "лечить SMA" относится к функциональной способности или сохранению функциональной способности младенцу или ребенку ясельного возраста, сидеть без посторонней помощи, младенцу, ребенку ясельного возраста, ребенку или взрослому человеку стоять без посторонней помощи, ходить без посторонней помощи, бегать без посторонней помощи, дышать без посторонней помощи, засыпать без посторонней помощи или глотать без посторонней помощи.
Термин "предотвращение" или "профилактика" болезненного состояния обозначает, что клинические симптомы болезненного состояния не развиваются у субъекта, который может быть подвержен или предрасположен болезненному состоянию, но еще не испытывает или проявляет симптомов болезненного состояния.
1.5х
1.5х
Термин "величина ЕС для продуцирования полноразмерного минигена SMN2 мРНК" (или "ЕС миниген") определяется как концентрация испытуемого соединения, при которой происходит эффективное увеличение количества полноразмерной SMN2 мРНК минигена до уровня в 1,5 раза выше, чем уровень в клетках, обработанных носителем.
1.5х
1.5х
Термин "величина ЕС для экспрессии белка Smn" (или "ЕС SMN белок") определяется как концентрация испытуемого соединения, при которой происходит эффективное продуцирование количества белка Smn в фибробластных клетках пациента, страдающего спинальной мышечной атрофией, в 1,5 раза выше, чем продуцируется в клетках, обработанных носителем.
Подробнее, настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I)
где
1
5
X представляет собой CR или N;
2
5
1
2
X представляет собой CR или N; при условии, что оба X и X не являются одновременно N;
1
1-7
R представляет собой водород или С-алкил;
2
1-7
1-7
3-8
R представляет собой водород, циано, C-алкил, C-галоалкил или С-циклоалкил;
3
1-7
1-7
R представляет собой водород, галоген, С-алкил, или C-алкокси;
4
1-7
1-7
R представляет собой водород, галоген, С-алкил, или С-алкокси;
5
1-7
1-7
R независимо выбран из водорода, галогена, С-алкила, или С-алкокси;
7
8
6
А представляет собой N-гетероциклоалкил или NRR, где N-гетероциклоалкил содержит 1 или 2 кольцевых атома азота и возможно замещен 1, 2, 3 или 4 заместителями, выбранными из R;
6
6
1-7
1-7
3-8
1-7
1-7
R независимо выбран из водорода, С-алкила, амино, амино-С-алкила, С-циклоалкила, гетероциклоалкила и С-алкокси-гетероциклоалкила или два R вместе образуют С-алкилен;
7
6
R представляет собой гетероциклоалкил, содержащий 1 кольцевой атом азота, где гетероциклоалкил возможно замещен 1, 2, 3 или 4 заместителями, выбранными из R;
8
1-7
3-8
R представляет собой водород, С-алкил или С-циклоалкил;
6
1-7
при условии, что если А представляет собой N-гетероциклоалкил, содержащий только 1 кольцевой атом азота, тогда по меньшей мере один R заместитель представляет собой амино или амино-С-алкил;
или их фармацевтически приемлемым солям.
Конкретными воплощениями настоящего изобретения являются соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли.
1
2
1
2
3
4
1
2
1
2
3
4
Кроме того, должно быть понятно, что каждое воплощение, относящееся к конкретным значениям X, X, A, R, R, R или R как здесь раскрыто может быть комбинировано с любым другим воплощением, относящимся к другим значениям X, X, A, R, R, R или R как здесь раскрыто.
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где
1
X представляет собой СН или N;
2
5
X представляет собой CR;
1
1-7
R представляет собой C-алкил;
2
1-7
1-7
3-8
R представляет собой водород, С-алкил, С-галоалкил или С-циклоалкил;
3
1-7
1-7
R представляет собой водород, галоген, С-алкил, или С-алкокси;
4
1-7
1-7
R представляет собой водород, галоген, С-алкил, или С-алкокси;
5
1-7
1-7
R представляет собой водород, галоген, С-алкил, или С-алкокси;
6
А представляет собой N-гетероциклоалкил, где N-гетероциклоалкил содержит 1 или 2 кольцевых атома азота и возможно замещен 1, 2, 3 или 4 заместителями, выбранными из R;
6
6
1-7
1-7
3-8
1-7
1-7
R независимо выбран из водорода, С-алкила, амино, амино-С-алкила, С-циклоалкила, гетероциклоалкила и С-алкокси-гетероциклоалкила или два R вместе образуют С-алкилен;
6
1-7
при условии, что если А представляет собой N-гетероциклоалкил, содержащий только 1 кольцевой атом азота, тогда по меньшей мере один R заместитель представляет собой амино или амино-С-алкил;
или их фармацевтически приемлемым солям.
1
1
2
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где X представляет собой N; при условии, что оба X и X не являются одновременно N.
1
5
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где X представляет собой CR.
1
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где X представляет собой СН.
2
1
2
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где X представляет собой N; при условии, что оба X и X не являются одновременно N.
2
5
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где X представляет собой CR.
2
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где X представляет собой СН.
1
1-7
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой С-алкил, в частности метил.
2
1-7
1-7
3-8
1-7
1-7
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой водород, С-алкил, С-галоалкил или С-циклоалкил; в частности водород или С-галоалкил; более конкретно Сгалоалкил.
2
Еще более конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой водород, метил, этил, дифторметил, трифторметил или циклопропил; в частности водород, дифторметил или трифторметил; более конкретно трифторметил.
3
1-7
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой водород, галоген или С-алкокси, в частности галоген.
3
Еще более конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой водород, фтор, метокси или этокси, в частности фтор.
4
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой водород или галоген, в частности водород.
4
Еще более конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой водород или фтор, в частности водород.
5
1-7
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой водород, галоген или С-алкокси, в частности водород.
5
Еще более конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой водород, фтор, хлор или метокси, в частности водород.
6
6
1-7
1-7
1-7
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R независимо выбран из С-алкила, гетероциклоалкила и С-алкокси-гетероциклоалкила, или два R вместе образуют С-алкилен.
6
6
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R независимо выбран из метила, этила, изопропила, метокси-азетидинила и пирролидинила, или два R вместе образуют этилен или пропилен.
7
6
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой пиперазинил, возможно замещенный 1, 2, 3 или 4 заместителями, выбранными из R.
8
1-7
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой водород или C-алкил, в частности водород или метил.
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I')
2
3
4
5
где A, R, R, R и R являются такими, как здесь описано; или их фармацевтически приемлемые соли.
6
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где А представляет собой насыщенный моно- или бициклический N-гетероциклоалкил, содержащий 1 или 2 атома азота и возможно замещенный 1, 2, 3 или 4 заместителями, выбранными из R.
7
6
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где N-гетероциклоалкил в А или гетероциклоалкил в R как здесь определено являются замещенными 1 или 2 заместителями, выбранными из R.
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где N-гетероциклоалкил в А как здесь определено дополнительно характеризуется тем, что один кольцевой атом азота является основным.
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где А представляет собой  или , где
Y представляет собой N или СН;
8
1-7
3-8
R представляет собой водород, С-алкил или С-циклоалкил;
9
14
15
1-7
2
m
R представляет собой водород, С-алкил, или-(CH)-NRR;
10
1-7
R представляет собой водород или С-алкил;
11
1-7
R представляет собой водород или С-алкил;
12
1-7
R представляет собой водород или С-алкил;
13
1-7
R представляет собой водород или С-алкил;
14
15
1-7
3-8
R и R независимо выбраны из водорода, С-алкила и С-циклоалкила;
n представляет собой 0, 1 или 2;
m представляет собой 0, 1, 2 или 3;
9
10
1-7
или R и R вместе образуют С-алкилен;
9
12
1-7
или R и R вместе образуют С-алкилен;
10
11
2-7
или R и R вместе образуют С-алкилен;
10
12
1-7
или R и R вместе образуют С-алкилен;
10
14
1-7
или R и R вместе образуют С-алкилен;
12
13
2-7
или R и R вместе образуют С-алкилен;
12
14
1-7
или R и R вместе образуют С-алкилен;
14
15
2-7
или R и R вместе образуют С-алкилен, который возможно замещен алкокси;
9
14
15
2
m
при условии, что если Y представляет собой СН, тогда R представляет собой-(CH)-NRR; и
9
14
15
2
m
при условии, что если Y представляет собой N, a R представляет собой-(CH)-NRR, тогда m представляет собой 2 или 3.
9
10
11
12
13
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где А представляет собой , где Y, n, R, R, R, R и R являются такими, как определено выше.
9
10
11
12
13
9
10
11
12
13
Было обнаружено, что проницаемость в мозг улучшается, когда по меньшей мере один из R, R, R, R и R не является водородом. В частном воплощении настоящего изобретения по меньшей мере один из R, R, R, R и R является отличным от водорода.
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где Y представляет собой N.
9
14
15
2
m
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где Y представляет собой СН и R представляет собой-(СН)-NRR.
9
14
15
2
m
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где Y представляет собой СН, R представляет собой-(CH)-NRR и m представляет собой 0.
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где п представляет собой 1.
9
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой водород, пирролидинил, или метокси-азетидинил, более конкретно водород.
10
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой водород, метил, этил или изопропил, более конкретно метил.
11
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой водород или метил, более конкретно водород.
12
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой водород или метил, более конкретно водород.
13
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R представляет собой водород.
9
10
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R и R вместе образуют пропилен.
10
11
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R и R вместе образуют этилен.
14
15
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R и R вместе образуют пропилен или бутилен.
14
15
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R и R вместе образуют пропилен.
14
15
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где R и R вместе образуют бутилен.
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где А выбран из группы:
8
9
10
11
12
13
16
17
1-7
1-7
где R, R, R, R, R, и R являются такими, как определено здесь, R представляет собой водород или С-алкил, и R представляет собой С-алкокси.
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где А выбран из группы:
8
9
10
11
12
13
17
1-7
где R, R, R, R, R, и R являются такими, как здесь определено, a R представляет собой С-алкокси.
6
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где А выбран из группы пиперазинила, диазепанила, пирролидинила и гексагидропирроло[1,2-а]пиразинила, каждый из которых возможно замещен 1, 2, 3 или 4 заместителями, выбранными из R как здесь определено.
6
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где А выбран из группы пиперазин-1-ила, 1,4-диазепан-1-ила, пирролидин-1-лиа и гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)-ила, каждый из которых возможно замещен 1 или 2 заместителями, выбранными из R как здесь определено.
7
8
7
8
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где А представляет собой NRR, где R и R являются такими, как здесь описано.
8
9
10
11
12
13
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где А представляет собой , где R, R, R, R, R и R являются такими, как здесь описано.
8
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где А представляет собой , где R представляет собой водород или метил.
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где А выбран из группы:
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I), где А выбран из группы:
Конкретные соединения формулы (I) настоящего изобретения являются выбранными из группы, состоящей из:
2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-пиперазин-1-илбензамид;
N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-пиперазин-1-илбензамид;
4-[(8aS)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
4-[(8aR)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-[(8aR)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-[(8aS)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-(1,4-диазепан-1-ил)-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-[(3S,5R)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фтор-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
,
4-[(8aS)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[12-а]пиразин-2-ил]-N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-этоксибензамид;
4-[(8aS)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фторбензамид;
N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2,6-дифтор-4-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-этокси-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
4-[(8aS)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-N-(8-этил-2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фторбензамид;
4-[(8aS)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-N-(8-циклопропил-2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фторбензамид;
4-[(8aS)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2,6-дифторбензамид;
N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-2-фторбензамид;
N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фтор-4-[(3S)-3-пирролидин-1-илпирролидин-1-ил]бензамид;
N-(8-этил-2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фтор-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
4-[(8aR)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-N-(8-циклопропил-2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фторбензамид;
N-(8-циклопропил-2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фтор-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3S)-3-пирролидин-1-илпирролидин-1-ил]бензамид;
2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
4-(4,7-диазаспиро[2.5]октан-7-ил)-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-[(3S,5R)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
2-хлор-6-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-пиперазин-1-илбензамид;
2,5-дифтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-(3-метилпиперазин-1-ил)бензамид;
2,3-дифтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-(3-метилпиперазин-1-ил)бензамид;
4-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-[(3R)-3-этилпиперазин-1-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R)-3-пирролидин-1-илпирролидин-1-ил]бензамид;
4-(4,7-диазаспиро[2.5]октан-7-ил)-2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-(3,3-диметилпиперазин-1-ил)-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
N-(8-циклопропил-2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R)-3-этилпиперазин-1-ил]-2-фторбензамид;
N-(8-циклопропил-2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-(3,3-диметилпиперазин-1-ил)-2-фторбензамид;
2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R)-3-пирролидин-1-илпирролидин-1-ил]бензамид;
4-[(3R)-3-этилпиперазин-1-ил]-2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-(3,3-диметилпиперазин-1-ил)-2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-[(3S)-3-этилпиперазин-1-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
2-фтор-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-N-[2-метил-8-(трифторметил)имидазо[1,2-а]пиразин-6-ил]бензамид;
N-[8-(дифторметил)-2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил]-2-фтор-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-(3-пропан-2-илпиперазин-1-ил)бензамид;
6-[(3R)-3-этилпиперазин-1-ил]-2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)пиридин-3-карбоксамид;
2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-6-пиперазин-1-илпиридин-3-карбоксамид;
N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фтор-4-(4-пирролидин-1-илпиперидин-1-ил)бензамид;
N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-этокси-4-[4-(3-метоксиазетидин-1-ил)пиперидин-1-ил]бензамид;
и их фармацевтически приемлемые соли.
Конкретные соединения формулы (I) настоящего изобретения являются выбранными из группы, состоящей из:
4-(4,7-диазаспиро[2.5]октан-7-ил)-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-[(3S,5R)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-[(3R)-3-этилпиперазин-1-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R)-3-пирролидин-1-илпирролидин-1-ил]бензамид;
4-[(3S)-3-этилпиперазин-1-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
2-фтор-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-N-[2-метил-8-(трифторметил)имидазо[1,2-а]пиразин-6-ил]бензамид;
2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-пиперазин-1-илбензамид;
4-[(8aS)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразцн-2-ил]-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
4-[(8aR)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-[(8aR)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-[(8aS)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-(1,4-диазепан-1-ил)-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-[(3S,5R)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3S)-3-пирролидин-1-ил пирролидин-1-ил]бензамид;
2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
2-хлор-6-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-пиперазин-1-илбензамид;
2,5-дифтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-(3-метилпиперазин-1-ил)бензамид;
2,3-дифтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-(3-метилпиперазин-1-ил)бензамид;
4-[(3R,5S)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-(4,7-диазаспиро[2.5]октан-7-ил)-2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-(3,3-диметилпиперазин-1-ил)-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R)-3-пирролидин-1-илпирролидин-1-ил]бензамид;
4-[(3R)-3-этилпиперазин-1-ил]-2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-(3,3-диметилпиперазин-1-ил)-2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
N-[8-(дифторметил)-2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил]-2-фтор-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид;
2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-(3-пропан-2-илпиперазин-1-ил)бензамид;
6-[(3R)-3-этилпиперазин-1-ил]-2-метокси-N-1-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)пиридин-3-карбоксамид;
2-метокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-6-пиперазин-1-илпиридин-3-карбоксамид;
и их фармацевтически приемлемые соли.
Конкретные соединения формулы (I) настоящего изобретения являются выбранными из группы, состоящей из:
4-(4,7-диазаспиро[2.5]октан-7-ил)-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-[(3S,5R)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-[(3R)-3-этилпиперазин-1-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R)-3-пирролидин-1-илпирролидин-1-ил]бензамид;
4-[(3S)-3-этилпиперазин-1-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
2-фтор-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]-N-[2-метил-8-(трифторметил)имидазо[1,2-а]пиразин-6-ил]бензамид;
и их фармацевтически приемлемые соли.
Соединения формулы (VIII) являются подходящими в качестве промежуточных соединений при получении соединений формулы (I).
Другое воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (VIII)
1
2
1
2
3
4
где X, X, R, R, R и R являются такими, как здесь описано;
Y представляет собой галоген или трифторметансульфонат; или их солям.
Конкретное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (VIII), где Y представляет собой фтор, хлор, бром, йод или трифторметансульфонат, в частности бром.
Конкретные соединения формулы (VIII) настоящего изобретения являются выбранными из группы, состоящей из:
4-бромо-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид;
4-бромо-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид; и
4-бромо-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид.
Способы получения
Соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли как определено выше могут быть получены в соответствии с обычными способами, известными у уровне техники.
2
3
1-7
2
3
1
2
3
4
18
1
2
Как показано на Схеме 1, соединение формулы (III) может быть получено реакцией аминирования Бухвальда-Хартвига между соединением формулы (II) и вторичным амином формулы А-Н в присутствии катализатора (например, трис (дибензилиден-ацетон)дипалладий(0) (Pd(dba))) и лиганда (например, 2,2'-бис(дифенилфосфино)-1,1'-бинафтил) и основания (например, карбонат цезия) и растворителя (например, толуол), где А, X, X, R и R являются такими, как здесь описано, a R представляет собой С-алкил. После эфирного гидролиза с образованием производного кислоты (IV) в присутствии водного основания (например, LiOH, NaOH и т.д.), конверсия в первичный амид (например, с помощью CDI и водного гидроксида аммония) дает соединения формулы (V). В заключение, реакция амидирования Бухвальда-Хартвига соединения формулы (V) с соединениями формулы (VI) в присутствии катализатора (например, трис (дибензилиден-ацетон)дипалладий(0) (Pd(dba))), лиганда (например, (дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен), основания (например, карбонат цезия) и растворителя (например, диоксан) при повышенной температуре (например, 100°С) дает финальное соединение формулы (I), где R и R являются такими, как здесь описано.
В случае, когда N-гетероциклоалкил А формулы А-Н содержит дополнительные первичные или вторичные аминогруппы, такие дополнительные первичные или вторичные аминогруппы защищают с использованием подходящих аминозащитных групп (таких как Boc или CBZ) и требуется дополнительная стадия депротекции (например, с использованием HCl в диоксане) после реакции амидирования Бухвальда-Хартвига соединения формулы (V) с соединением формулы (VI) с получением конечного продукта соединения формулы (I).
2
3
1
2
1
2
3
4
В одном воплощении, настоящее изобретение относится к способу получения соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей, как определено выше, содержащий взаимодействие соединения формулы (V) с соединением формулы (VI) в присутствии катализатора (например, трис (дибензилиден-ацетон)дипалладий(0) (Pd(dba))), лиганда (например, (дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен), основания (например, карбонат цезия) и растворителя (например, диоксан) при повышенной температуре (например, 100°С), где А, X, X, R, R, R и R являются такими, как здесь описано.
3
4
1
2
1
2
3
4
Альтернативно, соединения формулы (I) могут быть получены, как показано на Схеме 2 через реакцию связывания соединения формулы (VII) с производными формулы (VI) в присутствии катализатора (например, йодид меди (I)), лиганда (например, (1,10-фенантролин), основания (например, KPO) и растворителя (например, диоксан) при повышенной температуре (например, 120°С) с получением соединений формулы (VIII), где X, X, Y, R, R, R и R являются такими, как здесь описано.
В заключение, соединение формулы (VIII) взаимодействует с соединением N-А, либо в:
1
a) реакции ароматического нуклеофильного замещения (в частности, если Y представляет собой фтор или если Y представляет собой хлор, а X представляет собой азот) посредством нагревания при температуре от 80°С до 200°С в растворителе (например, диметилсульфоксид (ДМСО), N-метилпирролидон (NMP), или диметилформамид (DMF)); или
2
3
,
b) реакции аминирования Бухвальда-Хартвига в присутствии катализатора (например, трис(дибензилиден-ацетон)дипалладий(0) (Pd(dba))) лиганда (например, 2,2'-бис(дифенилфосфино)-1,1'-бинафтил)основания (например, карбонат цезия) посредством нагревания при температуре от 20°С до 100°С в растворителе (например, толуол);
с получением соединения формулы (I), где А является таким, как здесь определено, М представляет собой водород, натрий или калий, в частности водород, и где М связано с А через атом азота А.
В одном воплощении, настоящее изобретение относится к способу получения соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей, как определено выше, содержащий взаимодействие соединения формулы (VIII) с соединением N-А либо в:
1
a) реакции ароматического нуклеофильного замещения (в частности, если Y представляет собой фтор или если Y представляет собой хлор, а X представляет собой азот) посредством нагревания при температуре от 80°С до 200°С в растворителе (например, диметилсульфоксид (ДМСО), N-метилпирролидон (NMP), или диметилформамид (DMF)); или
2
3
b) реакции аминирования Бухвальда-Хартвига в присутствии катализатора (например, трис (дибензилиден-ацетон)дипалладий(0) (Pd(dba))) лиганда (например, 2,2'-бис(дифенилфосфино)-1,1'-бинафтил), основания (например, карбонат цезия) посредством нагревания при температуре от 20°С до 100°С в растворителе (например, толуол);
1
2
1
2
3
4
где А, X, X, Y, R, R, R и R являются такими, как здесь определено, М представляет собой водород, натрий или калий, в частности водород, и где М связано с А через атом азота А.
В частности, соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли могут быть получены в соответствии со способами, описанными в примерах настоящего изобретения.
Фармацевтические композиции
В другом воплощении настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции или лекарственные средства, содержащие соединения по изобретению и терапевтически инертный носитель, разбавитель или фармацевтически приемлемый эксципиент, а также способы применения соединений по изобретению для получения таких композиций и лекарственных средств.
Композиции изготавливают, дозируют и вводят в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы для рассмотрения в этом контексте включают конкретное заболевание, которое лечат, конкретное млекопитающее, подвергаемое лечению, клиническое состояние пациента, причину расстройства, место доставки агента, способ введения, режим введения и другие факторы, известные врачам.
Соединения по изобретению можно вводить любым подходящим способом, включая пероральный, топикальный (включая буккальный и подъязычный), ректальный, вагинальный, трансдермальный, парентеральный, подкожный, интраперитонеальный, внутрилегочный, внутрикожный, интратекальный и эпидуральный и интраназальный, и, при желании для местного лечения, внутриочагового введения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение.
Соединения настоящего изобретения могут быть введены в любой удобной форме, например в форме таблеток, порошков, капсул, растворов, дисперсий, суспензий, сиропов, аэрозолей, свечей, гелей, эмульсий, пластырей и т.д. Такие композиции могут содержать компоненты, подходящие для фармацевтических препаратов, например, разбавители, носители, модификаторы рН, консерванты, растворители, стабилизаторы, увлажняющие агенты, эмульгаторы, подсластители, красители, ароматизаторы, соли для изменения осмотического давления, буферы, маскирующие агенты, антиоксиданты и дополнительные активные агенты. Они также могут содержать другие терапевтически ценные вещества.
Обычные композиции готовят путем смешивания соединения по настоящему изобретению и носителя или эксципиента. Подходящие носители и эксципиенты хорошо известны специалистам в данной области техники и подробно описаны в, например, Ansel Н.С. и соавт, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (2004) Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia; Gennaro A.R. и соавт, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia; and Rowe R.C, Handbook of Pharmaceutical Excipients (2005) Pharmaceutical Press, Chicago. Композиции могут также включать один или более буферов, стабилизирующих агентов, поверхностно-активных веществ, увлажняющих агентов, любрикантов, эмульгаторов, суспендирующих агентов, консервантов, антиоксидантов, светозащитные агенты, скользящие вещества, технологические добавки, красители, подсластители, парфюмерные агенты, отдушки, растворители и другие известные добавки, чтобы обеспечить элегантную презентацию препарата (например, соединения по настоящему изобретению или его фармацевтической композиции) или помощь в производстве фармацевтического продукта (например, лекарственного препарата).
Доза, в которой могут быть введены соединения по изобретению может варьироваться в широких пределах и, конечно, соответствовать индивидуальным требованиям в каждом конкретном случае. В общем, в случае приема внутрь суточная доза от 0,01 до 1000 мг соединения общей формулы (I) на человека должна быть соответствующей, хотя верхний предел также может быть превышен в случае необходимости.
Примером подходящей пероральной лекарственной формы является таблетка, содержащая от 100 мг до 500 мг соединения по изобретению с от 30 до 90 мг безводной лактозы, от 5 до 40 мг натрия кроскармеллозы, от 5 до 30 мг поливинилпирролидона (ПВП) K30 и от 1 до 10 мг магния стеарата. Порошкообразные ингредиенты сначала смешивают вместе, а затем смешивают с раствором PVP. Полученная композиция может быть высушена, гранулирована, смешана со стеаратом магния и спрессована в форме таблеток с использованием обычного оборудования.
Пример аэрозольной композиции может быть получен путем растворения соединения, например, от 10 до 100 мг, по изобретению в соответствующем буферном растворе, например, фосфатном буфере, добавив вспомогательное вещество, например, соль, такую как хлорид натрия, если это необходимо. Раствор может быть отфильтрован, например, используя фильтр 0,2 мкм, для удаления примесей и загрязнений..
Применение
Как описано выше, соединения формулы (I) и их фармацевтически приемлемые соли обладают ценными фармакологическими свойствами и как обнаружено усиливают включение экзона 7 генов SMN1 и/или SMN2 в мРНК, транскрибируемую с генов SMN1 и/или SMN2, таким образом увеличивая экспрессию белка SMN у нуждающихся в этом пациентов.
Соединения настоящего изобретения могут применяться либо самостоятельно или в комбинации с другими лекарствами, для лечения или предотвращения заболевания, вызванного инактивирующей мутацией или делецией в гене SMN1 и/или связанного с потерей или дефектом функции гена SMN1. Эти заболевания включают, без ограничения, спинальную мышечную атрофию (SMA).
Частное воплощение настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединения формулы (I), как определено выше или их фармацевтически приемлемые соли, как определено выше, и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов.
Частное воплощение настоящего изобретения относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли, как определено выше и один или более фармацевтически приемлемых эксципиентов для лечения или предотвращения заболевания, вызванного инактивирующей мутацией или делецией в гене SMN1 и/или связанного с потерей или дефектом функции гена SMN1, в частности для лечения или предотвращения SMA.
Частное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I) или их фармацевтически приемлемым солям, как определено выше, для применения в качестве терапевтически активных веществ, особенно для применения в качестве терапевтически активных веществ для лечения или предотвращения заболевания, вызванного инактивирующей мутацией или делецией в гене SMN1 и/или связанного с потерей или дефектом функции гена SMN1, в частности для лечения или предотвращения спинальной мышечной атрофии (SMA).
Частное воплощение настоящего изобретения относится к соединениям формулы (I) или их фармацевтически приемлемым солям как определено выше для применения для лечения или предотвращения заболевания, вызванного инактивирующей мутацией или делецией в гене SMN1 и/или связанного с потерей или дефектом функции гена SMN1, в частности для применения для лечения или предотвращения спинальной мышечной атрофии (SMA).
Частное воплощение настоящего изобретения относится к способу лечения или предотвращения заболевания, вызванного инактивирующей мутацией или делецией в гене SMN1 и/или связанного с потерей или дефектом функции гена SMN1, в частности для лечения или предотвращения спинальной мышечной атрофии (SMA), который включает введение субъекту соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей, как определено выше.
Частное воплощение настоящего изобретения относится к применению соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей, как определено выше, для лечения или предотвращения заболевания, вызванного инактивирующей мутацией или делецией в гене SMN1 и/или связанного с потерей или дефектом функции гена SMN1, в частности для лечения или предотвращения спинальной мышечной атрофии (SMA).
Частное воплощение настоящего изобретения относится к применению соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей как определено выше для получения лекарственных средств для лечения или предотвращения заболевания, вызванного инактивирующей мутацией или делецией в гене SMN1 и/или связанного с потерей или дефектом функции гена SMN1, в частности для лечения или предотвращения спинальной мышечной атрофии (SMA). Такие лекарственные средства содержать соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли, как определено выше.
Примеры
Настоящее изобретение будет более понятным со ссылкой на следующие примеры. Они не должны расцениваться как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Использованные аббревиатуры
2
2
2
2
2
3
2
ACN: ацетонитрил; Boc: трет-бутилоксикарбонил; B(pin): бис(пинаколато)дибор; CBZ: бензилоксикарбонил; CDI: 1,1'-карбонилдиимидазол; CHCl: дихлорметан; dba: дибензилиденацетон; DIPEA: диизопропилэтиламин; DMA: диметилацетамид; DMF: диметилформамид; ДМСО: диметилсульфоксид; NMP: N-метилпирролидон; Pd(dba): трис (дибензилиден-ацетон)дипалладий(0); Pd(dppf)Cl: (1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен)палладий(II) дихлорид; PPTS: пиридиния п-толуолсульфонат; TEA: триэтиламин; КТ: комнатная температура; Ксантфос: (дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен.
Промежуточное соединениеА.1
Получение трет-бутил (2R)-4-(3-фтор-4-метоксикарбонилфенил)-2-метилпиперазин-1-карбоксилат
2
4
+
К смеси метил 4-бромо-2-фторбензоата (1.10 г, 4.7 ммоль), (R)-трет-бутил 2-метилпиперазин-1-карбоксилата (1.04 г, 5.2 ммоль), карбоната цезия (2.31 г, 7.1 ммоль) в толуоле (11 мл) добавили трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0) (0.13 г, 0.1 ммоль) и (rac)-2,2'-бис(дифенилфосфино)-1,1'-бинафтален (0.27 г, 0.4 ммоль) в атмосфере аргона и смесь нагревали до 100°С в закрытой пробирке в течение 20 ч. Реакционную смесь затем разбавили EtOAc, промыли водой, солевым раствором, высушили (NaSO) и сконцентрировали. Очистка с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле (EtOAc: Гепт 0:1-4:6) дала продукт, указанный в заголовке, в виде желтого осадка (0.99 г, 60%). MS (m/e): 352.0 (М+Н)
По аналогии с Промежуточным соединением А.1, Промежуточные соединения А.2-А.23 из следующей таблицы получили из соответствующих амина и арилбромида.
Промежуточное соединениеА.24
Получение трет-бутил 4-(2,5-дифтор-4-метоксикарбонилфенил)-2-метилпиперазин-1-карбоксилата
Стадия А:
2
2
2
2
4
Перемешанный раствор метил 2,4,5-трифторбензоата (1.393 г, 7.33 ммоль, Экв: 1.00) и 2-метилпиперазина (2.23 г, 21.8 ммоль, Экв: 2.98) в DMA (5 мл) нагревали при 100°С в микроволновой печи в течение 15 мин. Растворитель эвапорировали под вакуумом и остаток растворили в CHCl и промыли HO. Органическую фазу высушили над NaSO и сконцентрировали под вакуумом.
Стадия В:
2
2
2
2
2
4
2
+
Неочищенную смесь растворили в CHCl (10 мл) и триэтиламин добавили (1.23 мл, 8.79 ммоль, Экв: 1.2). Раствор охладили до 0°С и раствор ди-трет-бутил дикарбоната (2.41 г, 10.9 ммоль, Экв: 1.49) в CHCl (3.75 мл) добавили по каплям. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Воду добавили в реакционную смесь и слои разделили. Органическую фазу высушили над NaSO, и очистка посредством колоночной хроматографии (SiO, Гептан / EtOAc) дала соединения, указанного в заголовке, в виде белого осадка (1.77 г, 65%). MS (m/e): 371.1 (М+Н).
Промежуточное соединениеА.25
Получение трет-бутил 4-(4-этоксикарбонил-2,3-дифторфенил)-2-метилпиперазин-1-карбоксилата
Стадия А:
3
2
2
2
4
Раствор этил 2,3,4-трифторбензоата (1.51 г, 7.4 ммоль, Экв: 1.00) и 2-метилпиперазина (2.27 г, 22.2 ммоль, Экв: 3) в DMA (5 мл) нагревали при 100°С в микроволновой печи в течение 15 мин. Растворитель эвапорировали под вакуумом. EtOAc и водный раствор NaHCO добавили к остатку. Слои разделили и водный слой снова экстрагировали дважды с помощью CHCl. Объединенные органические фазы высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали под вакуумом с получением 2.15 г желтого осадка.
Стадия В:
2
2
2
2
2
2
2
4
2
+
Это неочищенное масло растворили в CHCl (10 мл) и добавили триэтиламин (1.24 мл, 8.88 ммоль, Экв: 1.2). Раствор охладили до 0°С и раствор ди-трет-бутил дикарбоната (2.45 г, 11.1 ммоль, Экв: 1.5) в CHCl (3.75 мл) добавили по каплям. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. Воду добавили в реакционную смесь и слои разделили. Водный слой снова экстрагировали дважды с помощью CHCl. Объединенные органические слои высушили над NaSO, отфильтровали и сконцентрировали под вакуумом. Продукт очистили с помощью колоночной флеш-хроматографии (SiO, Гептан / EtOAc), которая позволила разделить два региоизомера, второе элюируемое соединение представляло собой необходимое производное, указанное в заголовке, полученное в виде светло-желтого масла (1.54 г, 54%). MS (m/e): 385.3 (М+Н).
Промежуточное соединениеВ.1
Получение трет-бутил (2R-4-(4-карбамоил-3-фторфенил)-2-метилпиперазин-1-карбоксилата
+
+
2
4
К раствору трет-бутил (2R)-4-(3-фтор-4-метоксикарбонилфенил)-2-метилпиперазин-1-карбоксилата (0.95 г, 2.7 ммоль, Промежуточное соединение А.1) в МеОН (6 мл) добавили гидроксид натрия (1.4 мл, 6М в воде, 6.1 ммоль) и реакционную смесь нагревали до 55°С в течение 7 ч. Затем реакционную смесь подкислили посредством добавления смолы IR120, отфильтровали и сконцентрировали с получением неочищенной (R)-4-(4-(трет-бутоксикарбонил)-3-метилпиперазин-1-ил)-2-фторбензойной кислоты (0.82 г, 90%) в виде белого порошка. Неочищенную кислоту затем перерастворили в ДМФ (6 мл) и добавили 1,1-карбонилдиимидазол (0.51 г, 3.2 ммоль) и смесь перемешивали в течение 1 ч перед добавлением гидроксида аммония (1.3 мл, 25% водный, 8.4 ммоль). Через 0.5 ч реакционную смесь влили в воду, экстрагировали EtOAc, объединенные органические слои промыли солевым раствором, высушили (NaSO) и сконцентрировали с получением соединения, указанного в заголовке, в виде белого осадка (0.74 г, 90%). MS (m/e): 282.1 (M-tBu+H).
По аналогии с Промежуточным соединением В.1, Промежуточные соединения В.2-В.17 из следующей таблицы получили из соответствующего эфира.
Промежуточное соединение В.18
Получение 4-[(8aR)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-фторбензамида
2
4
+
К раствору (R)-метил 2-фтор-4-(гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)-ил)бензоата (0.12 г, 0.4 ммоль, Промежуточное соединениеА.5) в МеОН (2 мл) добавили гидроксид натрия (0.1 мл, 6М в воде, 0.6 ммоль) и реакционную смесь нагревали до 55°С в течение 4 ч. Реакционную смесь затем сконцентрировали с получением неочищенного (натрий (R)-2-фтор-4-(гексагидропирроло[1,2-а]пиразин-2(1Н)-ил)бензоата, который затем перерастворили в ДМФ (2 мл) и добавили N,N,N',N'-тетраметил-O-(бензотриазол-1-ил)урония тетрафторборат (0.17 г, 0.5 ммоль) и смесь перемешивали в течение 1 ч перед добавлением гидрокисда аммония (0.9 мл, 25% водный, 22.5 ммоль). Через 0.5 ч реакционную смесь влили в воду, экстрагировали с помощью EtOAc, Объединенные органические слои промыли солевым раствором, высушили (NaSO) и сконцентрировали. Очистка с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле (DCM: МеОН 95:5-9:1) дала продукт, указанный в заголовке, в виде белого порошка (0.2 г, колич.). MS (m/e): 264.2 (М+Н)
По аналогии с Промежуточным соединением В.18, Промежуточные соединения В.19-В.24 из следующей таблицы получили из соответствующего эфира.
Промежуточное соединение В.25
Получение трет-бутил 4-(4-карбамоил-3-хлор-5-фторфенил)пиперазин-1-карбоксилата
Стадия А:
2
2
2
2
Раствор 4-бромо-2-хлор-6-фторбензойной кислоты (1.00 г, 3.95 ммоль, Экв: 1.00), трет-бутил пиперазин-1-карбоксилата (882 мг, 4.73 ммоль, Экв: 1.2), BINAP (491 мг, 0.789 ммоль, Экв: 0.2) и карбоната цезия (3.86 г, 11.8 ммоль, Экв: 3), Pd(OAc) (177 мг, 0.789 ммоль, Экв: 0.2) в диоксане (15 мл) нагревали при 100° и перемешивали в течение ночи. Реакционную смесь сконцентрировали под вакуумом. Остаток растворили в EtOAc и промыли водным раствором лимонной кислоты. Неочищенный остаток очистили посредством колоночной хроматографии (SiO, CHCl / МеОН 95/5 до 8/2) с получением 0.308 г (22%) 4-(4-трет-бутоксикарбонилпиперазин-1-ил)-2-хлор-6-фтор-бензойной кислоты в виде светло-коричневого осадка.
Стадия В:
2
2
2
4
2
2
2
+
4-(4-(трет-бутоксикарбонил)пиперазин-1-ил)-2-хлор-6-фторбензойную кислоту (190 мг, 530 ммоль, Экв: 1.00) и CDI (0.112 г, 0.688 ммоль, Экв: 1.3) объединили в ДМФ (2.5 мл) с получением светло-желтого раствора. Реакционную смесь перемешивали в течение 1.5 часов. Дополнительное количество CDI (85.9 мг, 0.530 ммоль, Экв: 1.00) добавили и реакционную смесь перемешивали в течение дополнительных 1.5 часов. Гидроксид аммония (1.03 мл, 26.5 ммоль, Экв: 50) добавили и реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа. Реакционную смесь экстрагировали CHCl и высушили над NaSO, и сконцентрировали под вакуумом. Колоночная хроматография (SiO, CHCl / МеОН 98/2) дала соединение, указанное в заголовке (0.12 г, 62%), в виде светло-желтого осадка. MS (m/e): 302.1 (M-fBu+H).
Промежуточное соединениеВ.26
Получение трет-бутил (2R)-4-(5-карбамоил-6-метоксипиридин-2-ил)-2-этилпиперазин-1-карбоксилат
Стадия А:
2
4
2
+
К раствору (R)-трет-бутил 2-этилпиперазин-1-карбоксилата (0.208 г, 0.971 ммоль, Экв: 1.00) и триэтиламина (0.135 мл, 0.971 ммоль, Экв: 1.00) в ДМФ (2 мл) добавили метил 2,6-дихлорникотинат (0.200 г, 0.971 ммоль, Экв: 1.00) и реакционную смесь перемешивали при 30°С в течение 4.5 часов. Реакционную смесь разбавили EtOAc и промыли водой и солевым раствором, органическую фазу высушили над NaSO и растворитель эвапорировали. Неочищенный остаток очистили посредством колоночной хроматографии (SiO, EtOAc/Гептан, 1/4) с получением 160 мг (43%) трет-бутил (2R)-4-(6-хлор-5-метоксикарбонил-2-пиридил)-2-этил-пиперазин-1-карбоксилата в виде белого осадка. MS (m/e): 384.2 (М+Н).
Стадия В:
2
2
2
4
+
В закрытой пробирке, трет-бутил (2R)-4-(6-хлор-5-метоксикарбонил-2-пиридил)-2-этил-пиперазин-1-карбоксилат (161 мг, 0.419 ммоль, Экв: 1.00) растворили в МеОН (2 мл), добавили метоксид натрия (0.388 мл, 2.1 ммоль, Экв: 5) и смесь нагревали до 90°С и перемешивали в течение 4.5 часов. Реакционную смесь подкислили водным раствором лимонной кислоты, экстрагировали CHCl, промыли водой и высушили над NaSO с получением 6-[(3R)-4-трет-бутоксикарбонил-3-этил-пиперазин-1-ил]-2-метокси-пиридин-3-карбоновой кислоты. MS (m/e): 366.2 (М+Н). Неочищенный продукт сразу использовали на следующей стадии без дополнительной очистки.
Стадия С:
2
4
+
Раствор 6-[(3R)-4-трет-бутоксикарбонил-3-этил-пиперазин-1-ил]-2-метокси-пиридин-3-карбоновой кислоты (135 мг, 0.369 ммоль, Экв: 1.00) и CDI (71.9 мг, 0.443 ммоль, Экв: 1.2) в ДМФ (3 мл) перемешивали при КТ в течение 1 ч. Гидроксид аммония (0.719 мл, 18.5 ммоль, Экв: 50) добавили и перемешивали в течение дополнительных 2 часов. Реакционную смесь разбавили водой и экстрагировали EtOAc, высушили над NaSO и растворитель эвапорировали. Неочищенный остаток очистили посредством колоночной хроматографии с получением продукта, указанного в заголовке, трет-бутил (2R)-4-(5-карбамоил-6-метоксипиридин-2-ил)-2-этилпиперазин-1-карбоксилата, в виде белого осадка (20 мг, 15%). MS (m/e): 365.2 (М+Н).
Промежуточное соединение В.27
Получение трет-бутил 4-(5-карбамоил-6-метоксипиридин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилата
+
По аналогии с Промежуточным соединением В.26, трет-бутил 4-(5-карбамоил-6-метоксипиридин-2-ил)пиперазин-1-карбоксилат получили из метил 2,6-дихлорникотината и трет-бутил пиперазин-1-карбоксилата. MS (m/e): 337.2 (М+Н).
Промежуточное соединение С.1
Получение 6-бромо-2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразина
2
4
+
К суспензии 5-бромо-3-метилпиразин-2-амина (4.63 г, 24.6 ммоль) в iPrOH (30 мл) добавили 1-бромо-2,2-диметоксипропан (3.66 мл, 27.1 ммоль), пиридиния пара-толуолсульфоновую кислоту (0.62 г, 2.5 ммоль) и смесь нагревали до 65°С в закрытой пробирке в течение 36 ч. Реакционную смесь разбавили с помощью ДХМ, промыли насыщенным раствором гидрокарбоната натрия, высушили (NaSO) и сконцентрировали. Очистка с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле (EtOAc: Гепт 1:4-1:1) дала продукт, указанный в заголовке, в виде светло-желтого кристаллического осадка (3.96 г, 71%). MS (m/e): 226.1 (М+Н, Br)
Промежуточное соединениеС.2
Получение 6-бромо-8-этил-2-метилимидазо[1,2-а]пиразина
2
4
К суспензии 5-бромо-3-этилпиразин-2-амина (0.68, 3.37 ммоль) в iPrOH (10 мл) добавили 1-бромо-2,2-диметоксипропан (0.54 мл, 4.04 ммоль), пиридиния пара-толуолсульфоновую кислоту (0.084 г, 0.337 ммоль) и смесь нагревали до 90°С в течение 4 ч. Реакционную смесь разбавили с помощью ДХМ, промыли насыщенным раствором гидрокарбоната натрия, высушили (NaSO) и сконцентрировали. Очистка с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле (EtOAc: Гепт 1:4-1:1) дала продукт, указанный в заголовке, в виде светло-коричневого осадка (0.51 г, 63%). MS (m/e): 240.1 (M+hT, Br).
Промежуточное соединениеС.3
Получение 6-бромо-8-циклопропил-2-метилимидазо[1,2-а]пиразина
Стадия А:
2
К раствору 3-циклопропилпиразин-2-амина (275 мг, 2.03 ммоль, Экв: 1.00) в ацетонитриле (10 мл), охлажденном на ледяной бане, по порциям добавили N-бромосукцинимид (362 мг, 2.03 ммоль, Экв: 1.00). Через 20 минут растворитель эвапорировали, и очистка посредством колоночной хроматографии (SiO, гептан / EtOAc 2/1) дала (279 мг, 64%) 5-бромо-3-циклопропил-пиразин-2-амина в виде светло-желтого осадка. MS (m/e): 214.1 (М+Н+, Br).
Стадия В:
2
4
+
К суспензии 5-бромо-3-циклопропилпиразин-2-амина (0.274, 1.28 ммоль) в iPrOH (5 мл) добавили 1-бромо-2,2-диметоксипропан (0.207 мл, 1.54 ммоль), пиридиния пара-толуолсульфоновую кислоту (0.032 г, 0.128 ммоль) и смесь нагревали до 90°С в течение 3 ч. Реакционную смесь разбавили с помощью ДХМ, промыли насыщенным раствором гидрокарбоната натрия, высушили (NaSO) и сконцентрировали. Очистка с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле (EtOAc: Гепт 1:4-1:1) дала продукт, указанный в заголовке, 6-бромо-8-циклопропил-2-метилимидазо[1,2-а]пиразин, в виде светло-коричневого осадка (0.158 г, 48%). MS (m/e): 252.1 (М+Н, Br).
Промежуточное соединение С.4
Получение 6-хлор-8-трифторметил-2-метилимидазо[1,2-а]пиразина
Стадия А:
2
4
+
К раствору трифторметансульфоната натрия (1.2 г, 7.7 ммоль) в воде (12 мл) добавили раствор 5-хлорпиразин-2-амина (1.0 г, 7.7 ммоль) в ДХМ (30 мл). Трет-бутилгидропероксид (1.0 мл, 5.5 М в нонане, 5.5 ммоль) добавили по каплям в течение 2 ч. Вторую порцию трифторметансульфоната натрия (1.2 г, 7.7 ммоль) затем добавили с последующей второй порцией трет-бутилгидропероксида (1.0 мл, 5.5 М в нонане, 5.5 ммоль) добавили по каплям в течение 6 ч. Реакционную смесь повторно экстрагировали с помощью ДХМ и объединенные органические экстракты промыли солевым раствором, высушили (NaSO) и сконцентрировали. Очистка с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле (DCM) дала 5-хлор-3-(трифторметил)пиразин-2-амин в виде желтых кристаллов (0.9 г, 57%). MS (m/e): 198.0. (М+Н,CI)
Стадия В:
2
4
+
К суспензии 5-хлор-3-(трифторметил)пиразин-2-амина (0.77 г, 3.8 ммоль) в iPrOH (6 мл) добавили 1-бромо-2,2-диметоксипропан (0.57 мл, 4.2 ммоль), пиридиния пара-толуолсульфоновую кислоту (0.1 г, 0.4 ммоль) и смесь нагревали до 100°С в закрытой пробирке в течение 96 ч. Реакционную смесь разбавили с помощью ДХМ, промыли насыщенным раствором гидрокарбоната натрия, высушили (NaSO) и сконцентрировали. Очистка с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле (EtOAc: Гепт 3:7-1:0) дала продукт, указанный в заголовке, в виде коричневого порошка (0.15 г, 17%). MS (m/e): 236.1. (М+Н, CI)
Промежуточное соединение С.5
Получение 6-хлор-8-дифторметил-2-метилимидазо[1,2-а]пиразина
Стадия А:
3
3
2
2
4
+
К раствору 5-хлорпиразин-2-амина (1.0 г, 7.7 ммоль) в ДХМ (60 мл) добавили суспензию бис(дифторметилсульфинилокси)цинка (2.3 г, 7.7 ммоль) и Fe(NO).9HO (0.3 г, 0.8 ммоль) в воде (24 мл) и смесь перемешали. Трет-бутилгидропероксид (2.2 мл, 5.5 М в нонане 12.1 ммоль) добавили 0.2 мл порциями каждый 45 мин в течение общего времени реакции 8 ч. Реакционную смесь разбавили с помощью ДХМ, промыли водой, высушили (NaSO) и сконцентрировали. Очистка с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле (DCM:MeOH 1:0-4:1) дала 5-хлор-3-(дифторметил)пиразин-2-амин в виде желтых кристаллов (0.6 г, 40%). MS (m/e): 180.0. (М+Н, CI).
Стадия В:
2
4
+
К суспензии 5-хлор-3-(дифторметил)пиразин-2-амина (0.5 г, 2.8 ммоль) в iPrOH (10 мл) добавили 1-бромо-2,2-диметоксипропан (1.1 мл, 8.4 ммоль), пиридиния пара-толуолсульфоновую кислоту (0.1 г, 0.3 ммоль) и смесь нагревали до 65°С в закрытой пробирке в течение 18 ч. Реакционную смесь разбавили с помощью ДХМ, промыли насыщенным раствором гидрокарбоната натрия, высушили (NaSO) и сконцентрировали. Очистка с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле (EtOAc: Гепт 1:4-1:0) дала продукт, указанный в заголовке, в виде коричневого порошка (0.20 г, 40%). MS (m/e): 218.1. (М+Н, CI)
Промежуточное соединение D.1
4-бромо-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид
3
4
2
2
2
+
В закрытой пробирке, 4-бромо-2-фторбензамид (150 мг, 0.688 ммоль), 6-бромо-2-метилимидазо[1,2-а]пиразин (146 мг, 0.688 ммоль), йодид меди (I) (13.1 мг, 0.068 ммоль, 0.1 экв.), KPO (307 мг, 1.44 ммоль, 2.1 экв.) и 1,10-фенантролин (14.9 мг, 0.138 ммоль, 0.2 экв.) в диоксане (5 мл) нагревали при 120°С в течение ночи. Реакционную смесь отфильтровали на целите, сконцентрировали под вакуумом, и очистка колоночной хроматографией (SiO, CHCI / МеОН 99/1-98/2) дала 24 мг (10%) 4-бромо-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида. MS (m/e): 349.1 (М+Н, Br).
Промежуточное соединение D.2
4-бромо-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид
3
4
2
2
2
+
В закрытой пробирке, 4-бромбензамид (94.3 мг, 0.472 ммоль), 6-бромо-2-метилимидазо[1,2-а]пиразин (100 мг, 0.472 ммоль), йодид меди (I) (8.9 мг, 0.047 ммоль, 0.1 экв.), KPO (210 мг, 0.99 ммоль, 2.1 экв.) и 1,10-фенантролин (17 мг, 0.094 ммоль, 0.2 экв.) в диоксане (5 мл) нагревали при 120°С в течение ночи. Реакционную смесь отфильтровали на целите, сконцентрировали под вакуумом, и очистка колоночной хроматографией (SiO, CHCl / МеОН 99/1-98/2) дала 42 мг (18%) 4-бромо-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида в виде белого осадка. MS (m/e): 331.1 (М+Н, Br).
Промежуточное соединение D.3
4-бромо-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид
3
4
2
2
2
+
В закрытой пробирке, 4-бромо-2-этоксибензамид (288 мг, 0.1.18 ммоль), 6-бромо-2-метилимидазо[1,2-а]пиразин (275 мг, 1.30 ммоль), йодид меди (I) (22.5 мг, 0.118 ммоль, 0.1 экв.), KPO (526 мг, 2.48 ммоль, 2.1 экв.) и 1,10-фенантролин (42.5 мг, 0.236 ммоль, 0.2 экв.) в диоксане (5 мл) нагревали при 120°С в течение ночи. Реакционную смесь отфильтровали на целите, сконцентрировали под вакуумом, и очистка колоночной хроматографией (SiO, CHCl / МеОН 99/1-98/2) дала 159 мг (36%) продукта, указанного в заголовке, в виде белого осадка. MS (m/e): 375.2 (М+Н, Br).
Общая Методика 1
Реакция аминирования Бухвальда
2
3
Раствор производного арилбромида (1 экв.), вторичный амин (2 экв.), трис (дибензилиден-ацетон)дипалладий(0) (Pd(dba)) (0.08 экв.), трет-бутоксид натрия (1.5 экв.) и дифенилфосфино)-9,9-диметилксантен (Ксантфос) (0.12 экв.) в толуоле нагревали при 80-130°С в течение ночи. Растворитель эвапорировали и продукт сразу очистили посредством колоночной хроматографии на силикагеле.
Общая Методика 2
Депротекция Boc
Вос-защищенный амин перевели в раствор в смеси МеОН - диоксан. Раствор HCl в диоксане (4М, 10 экв.) добавили и перемешивание продолжили до завершения (0.2 ч до 4 часов). Необходимый продукт собрали посредством фильтрации и высушили под вакуумом.
Пример 1
Получение 2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-пиперазин-1-илбензамида гидрохлорида
+
В соответствии с Общей Методикой 1 (аминирование Бухвальда) с последующей Общей Методикой 2 (Boc депротекция), 2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-пиперазин-1-илбензамида гидрохлорид получили из 4-бромо-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида (Пример D.1) и трет-бутил пиперазин-1-карбоксилата. MS (m/e): 391.8 (М+Н).
Пример 2
Получение N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-пиперазин-1-илбензамида гидрохлорида
+
В соответствии с Общей Методикой 1 (аминирование Бухвальда) с последующей Общей Методикой 2 (Вое депротекция), N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-пиперазин-1-илбензамида гидрохлорид получили из 4-бромо-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида (Пример D.2) и трет-бутил пиперазин-1-карбоксилата. MS (m/e): 337.1 (М+Н).
Пример 3
Получение 4-[(8aS)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида
+
В соответствии с Общей Методикой 1 (аминирование Бухвальда), 4-[(8aS)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид получили из 4-бромо-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида (Пример D.3) и (8aS)-1,2,3,4,6,7,8,8а-октагидропирроло[1,2-а]пиразина. MS (m/e): 421.4 (М+Н).
Пример 4
Получение 2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамида
+
В соответствии с Общей Методикой 1 (аминирование Бухвальда) с последующей Общей Методикой 2 (Boc депротекция), 2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3S)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид получили из 4-бромо-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида (Пример D.3) и трет-бутил (2S)-2-метилпиперазин-1-карбоксилата. MS (m/e): 395.3 (М+Н).
Пример 5
Получение 2отокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамида
+
В соответствии с Общей Методикой 1 (аминирование Бухвальда) с последующей Общей Методикой 2 (Boc депротекция), 2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамид получили из 4-бромо-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида (Пример D.3) и трет-бутил (2Р)-2-метилпиперазин-1-карбоксилата. MS (m/e): 395.3 (М+Н).
Пример 6
Получение 4-[(8aR)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида
+
В соответствии с Общей Методикой 1 (аминирование Бухвальда), 4-[(8aR)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид получили из 4-бромо-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида (Пример D.3) и (8aR)-1,2,3,4,6,7,8,8a-октагидропирроло[1,2-а]пиразина. MS (m/e): 421.4 (М+Н).
Пример 7
Получение 4-[(8aR)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида
+
В соответствии с Общей Методикой 1 (аминирование Бухвальда), 4-[(8aR)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид получили из 4-бромо-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида (Пример D.1) и (8aR)-1,2,3,4,6,7,8,8а-октагидропирроло[1,2-а]пиразина. MS (m/e): 395.3 (М+Н).
Пример 8
Получение 4-[(8aS)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида
+
В соответствии с Общей Методикой 1 (аминирование Бухвальда), 4-[(8aS)-3,4,6,7,8,8а-гексагидро-1Н-пирроло[1,2-а]пиразин-2-ил]-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид получили из 4-бромо-2-фтор-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида (Пример D.1) и (8aS)-1,2,3,4,6,7,8,8а-октагидропирроло[1,2-а]пиразина. MS (m/e): 395.3 (М+Н).
Пример 9
Получение 4-(1,4-диазепан-1-ил)-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида
+
В соответствии с Общей Методикой 1 (аминирование Бухвальда), 4-(1,4-диазепан-1-ил)-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид получили из 4-бромо-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида (Пример D.3) и 1,4-диазепана. MS (m/e): 395.3 (М+Н).
Пример 10
Получение 4-[(3S,5R)-3,5-диметилпиперазин-1-ил]-2-этокси-1N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида
+
В соответствии с Общей Методикой 1 (аминирование Бухвальда), 4-(1,4-диазепан-1-ил)-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамид получили из 4-бромо-2-этокси-N-(2-метилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)бензамида (Пример D.3) и (2R,6S)-2,6-диметилпиперазина. MS (m/e): 409.3 (М+Н).
Пример 11
Получение N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фтор-4-[(3R)-3-метилпиперазин-1-ил]бензамида
Стадия А:
2
4
1-7
+
В пробирке суспензию (R)-трет-бутил 4-(4-карбамоил-3-фторфенил)-2-метилпиперазин-1-карбоксилата (0.10 г, 0.3 ммоль, Промежуточное соединение В.1), 6-бромо-2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразина (0.08 г, 0.4 ммоль, Промежуточное соединение С.1), (дифенилфосфино)-9,9-диметилксантена (0.03 г, 0.04 ммоль), карбоната цезия (0.14 г, 0.4 ммоль) в диоксане (2 мл) дегазировали ультразвуком с аргоновым барботированием. Трис(дибензилиденацетон) дипалладий(0) (0.01 г, 0.1 ммоль) затем добавили, пробирку закрыли и смесь нагревали до 100°С в течение 3 ч. Реакционную смесь затем разбавили с помощью ДХМ, промыли водой, высушили (NaSO) и сконцентрировали. Очистка с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле (EtOAc: Гепт 1::3) дала (R)-трет-бутил 4-(4-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-илкарбамоил)-3-фторфенил)-2-метилпиперазин-1-карбоксилат (0.11 г, 77%), в виде светло-коричневого порошка. MS (m/e): 483.4 (М+Н).
Стадия В:
+
(R)-трет-бутил 4-(4-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-илкарбамоил)-3-фторфенил)-2-метилпиперазин-1-карбоксилат (0.10 г, 0.2 ммоль) суспендировали в соляной кислоте в диоксане (4 мл, 4 М) и перемешивали в течение 20 минут. Реакционную смесь затем эвапорировали досуха, перерастворили в воде, промыли с помощью ДХМ, затем водную фазу защелачили посредством добавления насыщенного раствора гидрокарбоната натрия, снова экстрагировали с помощью ДХМ:МеОН (95:5) и сконцентрировали с получением продукта, указанного в заголовке (0.08 г, колич.) в виде желтого порошка, (m/e): 383.3 (М+Н).
По аналогии с примером 11, Примерами 12-47 из следующей таблицы получили из соответствующего карбоксамида и гетероарилгалида с последующей необходимостью депротекции, если требуется..
Пример 48
Получение N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фтор-4-(4-пирролидин-1-илпиперидин-1-ил)бензамид
Стадия А:
+
2-фтор-4-(1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]декан-8-ил)бензамид (А.22) взаимодействовал с 6-бромо-2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразином (С.1) по аналогии с примером 1 с получением N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фтор-4-(1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]декан-8-ил)бензамида. MS (m/e): 426.3 (М+Н)
Стадия В:
2
4
N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фтор-4-(1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]декан-8-ил)бензамид (0.14 г, 0.3 ммоль) растворили в диоксане (2.5 мл) и добавили водную 6М HCl (2.3 мл, 13.8 ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч, по прошествии этого времени ее нейтрализовали посредством добавления насыщенного водного гидрокарбоната натрия и экстрагировали EtOAc. Органическую фазу промыли солевым раствором, высушили (NaSO) и сконцентрировали с получением N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фтор-4-(4-оксопиперидин-1-ил)бензамида (0.13 г, колич.) в виде желтого порошка.
Стадия С:
2
4
1-7
+
К раствору N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фтор-4-(4-оксопиперидин-1-ил)бензамида (0.12 г, 0.3 ммоль) в ДХМ (2 мл) добавили пирролидин (0.03 мл, 0.4 ммоль) с последующим триацетоксиборогидридом натрия (0.1 г, 0.5 ммоль) и реакционную смесь перемешивали в течение 0.5 ч. Реакционную смесь затем разбавили EtOAc, промыли насыщенным водным гидрокарбонатом натрия, солевым раствором, высушили (NaSO) и сконцентрировали. Очистка с помощью колоночной флеш-хроматографии на силикагеле (ДХМ: МеОН 9::3+NH4OH) дала N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фтор-4-(4-пирролидин-1-илпиперидин-1-ил)бензамид (0.11 г, 82%) в виде белого порошка. MS (m/e): 437.4 (М+Н)
Пример 49
N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-этокси-4-[4-(3-метоксиазетидин-1-ил)пиперидин-1-ил]бензамид
+
Соединение, указанное в заголовке получили по аналогии с примером 48 (Стадия С), посредством взаимодействия N-(2,8-диметилимидазо[1,2-а]пиразин-6-ил)-2-фтор-4-(4-оксопиперидин-1-ил)бензамида (Пример 48, Стадия В) с 3-метоксиазетидина гидрохлоридом. MS (m/e): 479.4 (М+Н)
Биологические примеры
Для более подробного описания и облегчения понимания изобретения, далее приводятся следующие неограничивающие примеры испытания биологической активности, более полно иллюстрирующие объем изобретения, но эти примеры не следует истолковывать в качестве конкретных ограничений объема изобретения. Для специалиста в этой области является очевидным, что такие варианты настоящего изобретения, которые могут быть известными на настоящий момент или будут созданы в дальнейшем, входят в объем настоящего изобретения, определяемого пунктами формулы изобретения. Эти примеры иллюстрируют испытание биологической активности in vitro и/или in vivo конкретных описанных в изобретении соединений и демонстрируют применимость соединений для лечения спинальной мышечной атрофии путем усиления включения экзона 7 гена SMN2 в мРНК, транскрибируемую из гена SMN2. Соединения формулы (I) усиливают включение экзона 7 гена SMN2 в мРНК, транскрибируемую из гена SMN2, и повышают уровни белка Smn, продуцируемого из гена SMN2, и, следовательно, могут применяться для лечения спинальной мышечной атрофии у нуждающихся в этом пациентов. Эти примеры дополнительно иллюстрируют тестирование некоторых соединений, описанных здесь, in vitro и/или in vivo и демонстрируют полезность заявленных соединений для усиления включения 7 экзона SMN1 в мРНК, транскрибируемую с SMN1 гена. Соответственно, соединения формулы (I) также усиливают включение 7 экзона SMN1 в мРНК, транскрибируемую с SMN1 гена и увеличивают уровни белка Smn, получаемого с гена SMN1.
Пример 1
Исследование в культивируемых клетках сплайсинга минигена SMN2 пре-мРНК с помощью ОТ-колПЦР
Исследование на основе количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-колПЦР) используют для количественного определения уровня полноразмерного минигена SMN2 мРНК, содержащего SMN2 экзон 7 в клеточной линии HEK293H, стабильно трансфицируемой с помощью указанного минигена и обработанной испытуемым соединением. Применяемые материалы и соответствующие источники показаны в Таблице 1.
Конструкт минигена SMN2-A получили как описано международной заявке WO 2009/151546 A1 с. 145 абзац [00400] до с. 147 абзац [00412] (включая Фиг. 1 и Фиг. 3).
Клетки HEK293H (10000 клеток/лунка), стабильно трансфицируемые с помощью конструкта минигена SMN2-A, высевают в 200 мкл среды для культивирования клеток (DMEM плюс 10% FBS с 200 мкг/мл гидромицина) в 96-луночных планшетах с плоским дном, и планшет тут же начинают вращать, для того чтобы обеспечить соответствующее диспергирование клеток с образованием равномерного монослоя клеток. Клетки срастаются в течение, по меньшей мере, 4-6 часов. Испытуемые соединения последовательно разбавляют в 3,16 раза в 100% DMSO для получения концентрационной кривой по 7 точкам. Раствор испытуемого соединения (1 мкл, 200х в DMSO) добавляют в каждую лунку, содержащую клетки, и планшет инкубируют в течение 24 часов в инкубаторе для культивирования клеток (37°С, 5% ССЦ, 100% относительная влажность). Проводят по два повтора для каждой концентрации испытуемого соединения. Клетки затем лизируют в буфере для лизиса Cells-To-Ct, и лизат хранят при- 80°С.
Полноразмерный миниген SMN2-A и GAPDH мРНК количественно определяют, используя следующие праймера и зонды, приведенные в Таблице 2. Праймер SMN прямой A (SEQ ID N0:1) осуществляет гибридизацию нуклеотидной последовательности в экзоне 7 (от нуклеотида 22 до нуклеотида 40), праймер SMN обратный A (SEQ ID N0:2) осуществляет гибридизацию нуклеотидной последовательности в кодирующей последовательности люцифиразы светляка, SMN зонд A (SEQ ID N0:3) осуществляет гибридизацию нуклеотидной последовательности в экзоне 7 (от нуклеотида 50 до нуклеотида 54) и в экзоне 8 (от нуклеотида 1 до нуклеотида 21). Комбинация этих трех олигонуклеотидов детектирует только SMN1 или минигены SMN2 (ОТ-колПЦР) и не будет детектировать эндогенные гены SMN1 или SMN2.
SMN прямой и обратные праймеры используют при конечных концентрациях 0,4 мкМ. SMN зонд используют при конечной концентрации 0,15 мкМ. GAPDH праймеры используют при конечных концентрациях 0,2 мкМ и зонд при 0,15 мкМ.
Смесь SMN2-миниген GAPDH (15 мкл суммарного объема) приготавливают путем смешения 7,5 мкл 2х буфера для проведения ОТ-ПЦР, 0,4 мкл 25х смеси ферментов для проведения ОТ-ПЦР, 0,75 мкл 20х смеси GAPDH праймер-зонд, 4,0075 мкл воды, 2 мкл разбавленного в 10 раз клеточного лизата, 0,06 мкл 100 мкМ SMN прямого праймера, 0,06 мкл 100 мкМ SMN обратного праймера и 0,225 мкл 100 мкМ SMN зонда
ПЦР проводят при следующих температурах в течение указанного времени: стадия 1: 48°С (15 мин); стадия 2: 95°С (10 мин); стадия 3: 95°С (15 сек); стадия 4: 60°С (1 мин); затем повторяют стадии 3 и 4 в совокупности в течение 40 циклов.
Каждая реакционная смесь содержит наборы как SMN2-A минигена, так и GAPDH праймеров/зондов (мультиплексный метод), что позволяет одновременно измерять уровни двух транскриптов.
-Ct
Увеличение SMN2mini FL мРНК относительно количества в клетках, обработанных плацебо для контроля, определяется из данных полимеразной цепной реакции в реальном времени, используя модифицированный метод ΔΔCt (описанный в публикации Livak and Schmittgen, Methods, 2001, 25:402-8). Эффективность аплификации Е рассчитывают из наклона кривой амплификации для SMN2mini FL и GAPDH для каждого в отдельности. Затем рассчитывают относительные содержания SMN2mini FL и GAPDH по формуле (1+E), где Ct представляет собой пороговое значение для каждого ампликона. Относительное содержание SMN2mini FL нормализуют относительно содержания GAPDH. Нормализованное содержание SMN2mini FL в образцах, подвергнутых обработке испытуемым соединением, затем делят на нормализованное содержание SMN2mini мРНК FL в клетках, подвергнутых обработке контролем, для определения уровня SMN2 FL мРНК относительно контроля.
1.5x
В Таблице 3 показаны концентрации EC для продукции полноцепочечной мРНК минигена SMN2, которые получили из 7-точечной кривой данных, полученных в соответствии с вышеприведенной методикой для конкретных соединений настоящего изобретения.
1.5х
Конкретные соединения настоящего изобретения показали концентрацию для получения полноцепочечной концентрации ЕС для получения полноцепочечной мРНК минигена SMN ≤ 5 мкМ.
1.5x
Более конкретные соединения настоящего изобретения показали концентрацию для получения полноцепочечной концентрации ЕС для получения полноцепочечной мРНК минигена SMNR ≤ 1 мкМ.
1.5x
Наиболее конкретные соединения настоящего изобретения показали концентрацию для получения полноцепочечной концентрации EC для получения полноцепочечной мРНК минигена SMNR<0.1 мкМ.
Пример 2
Анализ белка SMN в культивируемых клетках
Исследование SMN с помощью разрешенной во времени гомогенной флуоресценции (HTRF) используют для количественного определения уровня белка Smn в фибробластных клетках пациента, страдающего спинальной мышечной атрофией, обработанных испытуемыми соединениями. Применяемые материалы и соответствующие источники показаны в Таблице 4 ниже.
Клетки размораживают и культивируют в среде DMEM-10% FBS в течение 72 часов. Клетки трипсинизируют, подсчитывают и ресуспендируют до концентрации 25000 клеток/мл в среде DMEM-10% FBS. Суспензии клеток высевают при плотности 5000 клеток на лунку в 96-луночном титрационном микропланшете и инкубируют в течение от 3 до 5 часов. Испытуемые соединения последовательно разбавляют в 3,16 раза в 100% DMSO для получения концентрационной кривой по 7 точкам. 1 мкл раствора испытуемого соединения переносят в лунки, содержащие клетки, и клетки инкубируют в течение 48 часов в инкубаторе для культивирования клеток (37°С, 5% ССЦ, 100% относительная влажность). Для каждой концентрации испытуемого соединения используется образец в трех экземплярах. Через 48 часов, удаляют из лунок надосадочную жидкость и в лунки добавляют 25 мкл буфера для лизиса RIPA, содержащего ингибиторы протеазы, и инкубируют при встряхивании при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляют 25 мкл разбавителя и затем 35 мкл полученного лизата переносят в 384- луночный планшет, в котором каждая лунка содержит 5 мкл раствора антитела (разбавление 1:100 анти-SMN d2 и анти-SMN криптата в буфере для растворения SMN). Планшет центрифугируют в течение 1 минуты, для того чтобы раствор мог достичь дна лунок, затем инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Измеряют флуоресценцию для каждой лунки планшета при 665 нм и 620 нм на планшет-ридере Envision Multilabel (Perkin-Elmer).
1.5x
Рассчитывают нормализованный флуоресцентный сигнал для каждого образца, чистой лунки и контроля - носителя путем деления сигнала при 665 нм на сигнал при 620 нм. Нормализация сигнала учитывает возможное гашение флюоресценции вследствие влияние матрицы лизата. Рассчитывают величину ΔF (измерение содержания белка Smn) для каждой лунки с образцом путем вычитания нормализованной средней флуоресценции для чистых лунок из нормализованной флуоресценции для каждой лунки с образцом и затем деления этой разницы на нормализованную среднюю флуоресценцию для чистых лунок. Полученная величина ΔF для каждой лунки с образцом представляет содержание белка Smn в образцах, обработанных испытуемым соединением. Величину ΔF для каждой лунки с образцом делят на величину ΔF для лунок контроля-носителя для расчета кратности увеличения содержания белка Smn относительно контроля носителя. В Таблице 5 приведены значения концентрации EC для экспрессии белка Smn, которые оценивали из данных по 7 концентрациям, полученным для каждого испытуемого соединения в соответствии с вышеприведенной методикой испытания биологической активности для конкретных соединений настоящего изобретения.
1.5x
Конкретные соединения настоящего изобретения показали концентрацию EC для экспрессии белка SMN ≤ 10 мкМ.
1.5x
Более конкретные соединения настоящего изобретения показали концентрацию EC для экспрессии белка SMN ≤ 1000 нМ.
1.5x
Более конкретные соединения настоящего изобретения показали концентрацию EC для экспрессии белка SMN ≤ 500 нМ.
В Таблице 6 приведены значения максимальной кратности увеличения белка SMN, которые оценивали из данных по 7 полученным для каждого испытуемого соединения в соответствии с вышеприведенной методикой испытания биологической активности для конкретных соединений настоящего изобретения.
Конкретные соединения настоящего изобретения показали максимальную кратность увеличения > 1.5.
Конкретные соединения настоящего изобретения показали максимальную кратность увеличения > 1.7.
Конкретные соединения настоящего изобретения показали максимальную кратность увеличения > 1.8.