Определение природных антиоксидантов амперометрическим методом

СРЕДСТВА И МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ

| ТЕМА НОМЕРА

Определение природных антиоксидантов

амперометрическим методом

А.Я. Яшин, Я.И. Яшин, Н.И. Черноусова

НПО «Химавтоматика»

Основной причиной патологических процессов в человеческом организме, вызывающих преждевременное старение и развитие многих болезней (более 100), в том числе и самых опасных, служит избыточное накопление кислородных свободных радикалов в организме. Вследствие вредного воздействия свободных радикалов повреждаются стенки сосудов, мембраны, окисляются липиды. Это состояние называется окислительным стрессом [1].

Концентрация свободных радикалов в организме возрастает вследствие снижения эффективности естественной антиоксидантной системы человека, вызванной воздействием радиации, УФ-облучения, курения, алкоголя, лекарств, постоянных стрессов, некачественного питания.

Вредное действие свободных радикалов можно уменьшить путем систематического употребления пищевых продуктов и напитков, лекарственных растительных препаратов, биологически активных добавок, обладающих высокой антиоксидантной активностью. Ранее наиболее известными природными антиоксидантами считались витамины Е и С. Однако они не достаточно эффективны для коррекции антиоксидантного статуса человека. Массовые эксперименты, проводимые с использованием только витаминов Е и С, не дали сколько-нибудь значимых результатов [2, 3].

Особую значимость представляют биофлавоноиды, обладающие антиканцерогенными, антисклеротическими, противовоспалительными и антиаллергическими свойствами. По анти-оксидантной активности они в десятки раз превосходят витамины С, Е и каро-тиноиды. Особенно активно природное сочетание биофлавоноидов [4]. Основные источники этих антиокси-дантов - фрукты, овощи, ягоды, мед, чай и др.

При систематическом употреблении пищевых продуктов и напитков, содержащих природные антиоксиданты, заболеваемость населения опасными заболеваниями, в частности, сердечнососудистыми и онкологическими, значительно снижается. Исследования рас-

пространения сердечно-сосудистых заболеваний в европейских странах убедительно подтверждают роль антиоксидантной гипотезы. В странах Средиземноморского региона число сердечнососудистых и онкологических заболеваний значительно ниже, чем в северных европейских странах. Это связывают с особенностью местной диеты - повышенным потреблением фруктов, овощей, оливкового масла, рыбы, вина [5].

Общеизвестен так называемый «французский парадокс» [6]. В США более 30 лет назад ежегодно умирало от сердечно-сосудистых заболеваний более восьмисот тысяч мужчин в возрасте 40-65 лет. Для сокращения смертности была создана специальная программа оздоровления, включающая постоянную физическую нагрузку, употребление нежирной пищи, исключение курения (в настоящее время более 70 % мужчин в США не курят) и пр. Через 20-25 лет смертность от инфаркта в США уменьшилась в 2 раза! Во Франции мужчины умирают от инфаркта в 2 раза реже, чем в США, хотя никаких специальных программ оздоровления не было. Это связывают со значительным употреблением французами красного вина, в котором очень много антиоксидантов.

Во многих опубликованных работах [7, 8] было продемонстрировано, что регулярное потребление фруктов, овощей, оливкового масла, красного вина, чая значительно снижает риск сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний.

В настоящей работе определены природные антиоксиданты в основных ежедневно употребляемых пищевых продуктах и напитках в Российской Федерации.

В экспериментальных исследованиях все измерения проводили амперометрическим методом на приборе «Цвет-Яуза-01-АА». Амперометрический детектор работал в окислительном режиме. В ячейке детектора на поверхности рабочего электрода происходит окисление молекул исследуемого вещества, при этом возрастает электрический ток между двумя электродами. Величина электрического тока зависит от

природы анализируемого вещества, природы рабочего электрода и потенциала, приложенного к электроду.

Возникающие электрические токи очень малы - в пределах 10-6 - 10-10 А. Эти аналоговые сигналы усиливаются, а затем, с помощью аналогоцифрового преобразователя (АЦП), преобразуются в цифровой сигнал, который регистрируется на дисплее компьютера. В случае необходимости выходные результаты можно распечатать на принтере.

Рабочий электрод выполнен из стек-лоуглерода, который наиболее универсален при определении полифе-нольных соединений. Потенциал может изменяться от 0 до +2 В, потенциалы ионизации фенольных соединений варьируют в пределах 100-1200 мВ.

В работе [9] указано, что электрохимическое окисление может быть использовано как модельное при измерении активности поглощения свободных радикалов в соответствии со следующими уравнениями:

флавоноид-О-НМфлавоноид-О' + + е +Н (окисление при максимальном потенциале);

флавоноид-О~Н^флавоноид-О' + + Н' (улавливание свободного радикала).

Таким образом, способность к захвату свободных радикалов флавонои-дами или другими полифенолами (т. е. их антиоксидантная активность) [9] может измеряться величиной окисляе-мости этих соединений на рабочем электроде амперометрического детектора. Сигнал регистрируется в виде дифференциальных выходных кривых. С помощью специального программного обеспечения производится расчет площадей или высот пиков (дифференциальных кривых) анализируемого и стандартного веществ. Для анализа используется среднее значение из 3-5 последовательных измерений. В качестве стандартных веществ можно использовать следующие общеизвестные антиоксиданты: рутин, кверцетин, ди-гидрокверцетин, мексидол, тролокс, аскорбиновую кислоту, галловую кислоту и др. Без учета пробоподготовки время отдельного определения занимает несколько минут. Анализ (регистрация и обработка результатов) проходит в реальном времени; правильность и воспроизводимость анализа обеспечивается точным дозированием шестиходового крана; объем дозируемой петли может меняться от 20 до 500 мкл; среднеквадратическое отклонение (СКО) дозирования краном менее 0,5 %; СКО последовательных измерений анализируемых проб < 3 %. Предел обнаружения амперометрического

MEANS AND METHODS OF MEASUREMENTS

детектора полифенолов, флавоноидов находится на уровне нано-пикограм-мов (10-9 - Ю-12 г). При таких малых концентрациях отмечается меньшая вероятность взаимного влияния разных антиоксидантов при их совместном присутствии, в частности, проявление синергизма.

Метод обладает высокой селективностью определения только антиоксидантов, т.е. соединений, способных к окислению; другие соединения, присутствующие в сложных смесях, не мешают их определению. Для анализа не требуется никаких химических реактивов (кроме стандартов), поэтому стоимость измерений очень низкая. Меняя величину приложенного потенциала, можно дифференцировать антиок-сиданты по классам. Дифференциация возрастает при применении имеющегося в приборе импульсного режима работы. Кроме того, можно определять в автоматическом режиме вольтампе-рограммы для идентификации антиок-сидантов. Отношение сигналов одного и того же антиоксиданта при разных приложенных потенциалах может быть также использовано для идентификации. Амперометрическое детектирование в импульсном режиме выполняется автоматически с помощью серии из нескольких кратковременных потенциалов. Детектирующий потенциал выбирается соответствующим для определения конкретных соединений. Он налагается в течение короткого времени. Типичное значение детектирующего времени 100-400 мс. После детектирования поверхность электрода очищается при высоком положительном потенциале в течение 50-200 мс и затем восстанавливается при отрицательном потенциале в течение 100-400 мс, прежде чем наступит новый цикл. В импульсном режиме амперометричес-кий детектор работает стабильно длительное время.

Амперометрический метод - единственный непосредственно измеряющий содержание всех антиоксидантов в пробе. Другие методы - непрямые, в них измеряется ингибирование реакционных смесей (в частности, свободных радикалов), генерированных определенными реакциями. Метод восстановления Fe3+ до Fe2+ (метод FRAP) также может определять суммарно ан-тиоксиданты, однако он не может определять все антиоксиданты, в частности тиолы, так как их восстановительный потенциал значительно ниже потенциала превращения Fe3+ в Fe2+ [9]. Амперометрический метод был успешно применен для определения антиок-сидантной способности разных вин [10]. В работе [11] данный метод был

использован для определения антиок-сидантной способности оливковых масел из разных стран, т. е. он позволяет оценить качество, подлинность масел. Амперометрический (электрохимический) метод применяется также для определения антиоксидантного статуса человека [12]. Общие принципы электрохимического определения природных антиоксидантов рассмотрены в обзоре [13]. Амперометрический детектор в комбинации с высокоэффективной жидкостной хроматографией широко используется для определения полифенолов в пищевых продуктах и напитках [14] и кверцетина в плазме крови человека после употребления зеленого чая, аскорбиновой и дигидроаскорбиновой кислот в плазме крови и спинно-мозговой жидкости [15].

Так как различные фрукты и овощи содержат разные классы антиоксидан-тов, то необходимо знать их общую ан-тиоксидантную способность. Поглощение свободных радикалов связано с их кумулятивным действием. В работе [9] определено общее содержание антиок-сидантов в растительных пищевых продуктах, широко используемых во всем мире (фрукты, ягоды, овощи, злаки, орехи и корне-плоды). Были проанализированы три или более проб из трех разных географических регионов мира.

Общее содержание антиоксидантов определялось методом FRAP (восстановление Fe3+ до Fe2+). Содержание антиоксидантов в разных пищевых растениях различалось более чем в 1000 раз. Наибольшее количество оксидантов содержали шиповник, черная смородина, клубника, малина, черника, клюква.

В другой работе [16] была определена антиоксидантная способность (АС) пищевых продуктов, наиболее часто употребляемых в Италии: 34 различных овощей, 30 - фруктов, 34 - напитков и 6 - растительных масел.

Для измерения использовали три разных метода: TEAC, TRAP, FRAP. Среди овощей наибольшую антиоксидант-ную способность показывал шпинат в методах TEAC, FRAP и спаржа - в методе TRAP. Среди ягод наибольшую АС показали черная смородина, красная смородина и малина. Среди напитков наибольшей АС обладает кофе, затем идут цитрусовые соки. Среди масел наибольшая АС выявлена у соевого масла.

В работе [9] определена общая АС пищевых продуктов как сумма липо-фильных и гидрофильных антиокси-дантных величин, измеренных модифицированным методом поглощения кислорода (ORAC). Гидрофильную экстракцию проводили смесью раствори-

телей (ацетон, вода, уксусная кислота), а гидрофобную - смесью гексана и дихлорметана (1:1). Была определена общая АС 28 пищевых продуктов из четырех регионов США, включающих фрукты, овощи, орехи, сухие фрукты и зерна риса.

Доля гидрофильной АС в 5-50 раз больше. При тепловой обработке овощей АС обычно уменьшалась, за исключением томатов и картофеля, АС которых возрастала. В работе [17] оценена АС четырнадцати типов соков, употребляемых в европейских странах (яблочный, свекольный, черничный, морковный, лимонный, мультивитамин-ный, апельсиновый, розовый грейпфру-товый, томатный и др.). Соки изучали по их способности улавливания трех типов кислородных смесей (пероксид радикал, гидроксил радикал и перок-синитрит). Наибольшую АС показывали соки, содержащие антоцианины (черничный, вишневый и др.).

НТЦ «Хроматография» НПО «Химав-томатика» выполнен большой объем измерений антиоксидантной активности разных пищевых продуктов и напитков [18, 19]: фруктов, ягод, овощей, соков, чая, кофе, пива, вин, коньяков, бальзамов, меда, растительных масел, витаминов и др. Антиоксидантная активность пчелиного меда разных сортов составляла 0,5-1,2 мг/г. В табл. 1, 2, 3 приведена относительная антиок-сидантная активность свежевыжатых соков фруктов и овощей, приобретенных на рынке, урожая 2005 г. В качестве стандарта применяли кверцетин. Нужно отметить, что их антиоксидант-

Таблица 1

Суммарное содержание природных антиоксидантов в соке ягод, мг/г

Ягода Содержание

Черная смородина 9,7

Черная вишня 7,7 5 7

Боярышник Черноплодная рябина Цог^и\А 5, 7 4,6 2 9

черн и ка Клюква 2,7

Калина 2,5

Барбарис ЦрПМЯЯ ЦРПР1 1 11_1 сз 2,3 2 2

псипал пс.рс.ц_1Пл Луговая клубника к ПЭГиЭО п \ Л 1 1 2,1 2 0

красная смородина Малина Паги аа эаь4 паи м^з 1,7 1 7

лесная земляника Садовая клубника Кизил 1 / 1,6 1,4

Ежевика 0,9

Белая черешня 0,6

Крыжовник 0,5

Облепиха 0,4

СРЕДСТВА И МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЯ

I ТЕМА НОМЕРА

Таблица 2 Суммарное содержание природных антиоксидантов в соке фруктов, мг/г

Фрукт Содержание

Цедра лимона 2,85

Яблоко (Жигулевское) Яппок'о (ДНТПНПЙ^Л ) 0,64 0 62

/1 1 ^ 14^ \ гЛП / Яблоко (Семиренко) Груша 0,57 0,50

Киви КИсц^ПТк П1/1 КИП 1-1Я 0,45 0 43

IV1 л 1чи 1 о 11 м и п а Чернослив 0,40

Дыня (Колхозница) 0,37

Яблоко (Декабренок) 0,31

Яблоко (Мартовское) 0,29

Яблоко (Бреберн) Яблоко (Уэлси) 0,21 0,18

Нектарин Абрикос 0,17 0,14

Персик 0,12

Банан 0,07

Таблица 4

Суммарное содержание антиоксидантов в некоторых напитках

Напиток Содержание

Зеленый китайский чай «Драгоценность Фудзяня» 379,9 мг/г

Зеленый китайский чай «Зеленая улитка» K'orhp N/loffon^ i~ontinpnt^l ("nolH ( прч к'огЬрммя ) 327,1 мг/г 43 7 мг/г

ixvjujc 1V1 I а VwVJi 1LI MCI i ш i VJVJIU yucj ivwujc.i'inci/ Кофе «Нескафе Голд» (растворимый) Ка као то ( / Ivl 1 /1 39,8 мг/г

Соки ягод ^ ~> 1 D 1 /1 II ГЛ // Пли I ûn/u (Цыпи 1 4 3 мг/г 5-7 мг/г J J ллг /клп

красное вино «дон се1ундо» (чили) Красное вино «Санрайз Мерло» (Чили) Бальзам «Первопрестольный» 2,2 м1 / мл 1 1,9 мг/мл 2 8 мг/мп

uaj юза IVI \jj i DnDii'i'' Бальзам «Иммунал» ¿.|U IVI 1 / IVI J 1 1,7 мг/мл

Коньяк «Кутузов» 0,3 мг/мл

Коньяк «Ахтамар» rii/iRO «Оия^тшп ППРММ\/М Чрпмор ПРГК'ОР» 0,2 мг/мл П "7 м г /м п

пиво «очаково. премиум. черное. ЛС1 кое» Пиво «Очаково. Премиум. Светлое» Квас «Очаковский» 0,/ м1/ мл 1 0,6 мг/мл 0,1 мг/мл

Таблица 5

Суммарное содержание антиоксидантов в растительных маслах, мг/г

Таблица 3 Суммарное содержание природных антиоксидантов в соке овощей, мг/г

Овощ Содержание

Свекла 2,17

Сладкий перец красный 1,88 1 35

Петрушка 1,06

Капуста белокочанная 0,69

Томат 0,64 П F.1

Редис Баклажан к Э ПТЛ ГПО П 1— 0,62 0,54 0 43

кар 1 офел ь Кабачок Ревень U,43 0,35 0,32

Укроп Огурец 0,27 0,22

у исц Морковь 0,19

Патиссон 0,04

ная активность зависит от сорта и времени хранения. В табл. 4 приведена антиоксидантная активность напитков.

Для водорастворимых проб в качестве стандарта использовали кверце-тин (фирмы «Флука»). Перед измерениями строили градуировочный график зависимости сигналов кверцетина (площади пиков) от концентрации кверцетина. Значение суммарного содержания антиоксидантов в соках, в частности, в черной смородине - 9,7 мг/ мл, означает, что антиоксидантная активность 1 мл сока равна 9,7 мг кверцетина.

Масло Содержание

Масло кукурузное «Олейна» 543

Масло рисовое «Масло и лецитин» 260 251

Смесь масел (соевое 60 %, сафлоровое 20 %, масло грецкого ореха 15 %, арахисовое 5 %) 245

Масло оливковое (Греция) 124

Для определения содержания антиоксидантов в жирорастворимых пробах, в частности, в растительных маслах в качестве стандарта использовали ионол (табл. 5).

Значения суммарного содержания природных антиоксидантов в основных пищевых продуктах и напитках, определенные в настоящей работе, позволяют использовать их для антиокси-дантной терапии, а также для создания новых продуктов с повышенной анти-оксидантной активностью.

ЛИТЕРАТУРА

1. Болдырев А.А.//Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. № 4. С. 21-28.

2. Pocker L, Weber S.U., Rimbach G.// J. Nutr. 2001. V. 131. P. 369S-373S.

3. McCall M.R., Frei B.//Free Radical. Biol. Med. 1999. V. 26. P. 1034-1053.

4. Kaur C. Kapoor H.C.//lntern. Journal. of Food Sci.and Techn. 2001. V. 36. №7. P. 703.

5. Simopoulos A.P.//J. Nutr. 2001 V. 131. P. 3065-73.

6. Renaud S., De Lorgeril M.//Lancet, 1992. V. 339. P. 1523-1526.

7. La Vecchia C., Altieri A., Tovani A.// Eur. J. Nutr. 2001. V. 40. P. 261-267.

8. Serafini M, Bellocco R, Wolk A.J.// Gastroenterology. 2002. V. 123. P. 985999.

9. Halvorsen B.L., Holte K, Myhrstad M.C.W. e.t ol.//J. Nutr. 2002. V. 132. P. 461-471.

10. Mannino S, Brenna O, Buratti S, Cosio M.S.//Electroanalysis. 1998. V. 10. P. 908-912.

11. Mannino S, Buratti S, Cosio M.S., Pellegrini N.//Analyst. 1999. V. 124. P. 1115-1118.

12. Hensley K. J.//High Resolut. Chromat. 1999. V. 22. P. 429-437.

13. Kilmartin P.A.//Antioxidants and Redox Signaling. 2001. V. 3. № 6. P. 941-955.

14. Buratti S, Pellegrini N, Brenna O.V., Mannino S.//J.Agric Food Chem. 2001. V. 49. № 11. P. 5136-5141.

15. Kusu F., Jin D.//Biomed Chromatog. 2004. V. 18. P. 25.

16. Pellegrini N, Serafini M, Colombi B. e.t ol.//J. Nutr. 2003. V. 133. P. 28122819.

17. Reyrat-Maillard M.N., Bonnely S, Berset C.//Talanta. 2000. V. 51. P. 709-716.

18. Пахомов В.П., Яшин Я.И.//Перс-пективы традиционной медицины. 2003. №3. C. 14-18.

19. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Черноусо-ва Н.И., Пахомов В.П.//Пиво и напитки. 2004. № 6. C. 44-46.