СОЕДИНЕНИЯ И КОМПОЗИЦИИ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ ITPKb
COMPOUNDS AND COMPOSITIONS AS ITPKb INHIBITORS

Ссылка на родственные заявки
Данная заявка испрашивает более ранний приоритет, основанный на предварительной заявке США сер. номер 60/832681, зарегистрированной 21 июля 2008 г., и предварительной заявке США сер. номер 60/893874, зарегистрированной 08 марта 2007 г. Полные описания этих заявок включено в описание настоящей заявки в виде ссылок в полном объеме.
Предпосылки создания изобретения
Область изобретения
В изобретении предлагается новый класс соединений, фармацевтические композиции, включающие такие соединения, и способы применения таких соединений для лечения или профилактики заболеваний или нарушений, ассоциированных с аномальной или нарушенной активностью В клеток, прежде всего заболеваний или нарушений, которые ассоциированы с аномальной активацией инозит-1,4,5-трифосфат-3-киназы В (ITPKb).
Предпосылки создания изобретения
Протеинкиназы представляют собой большое семейство белков, которые играют центральную роль в регуляции многих клеточных процессов и контроля клеточной функции. Неполный перечень таких киназ включает, без ограничения перечисленным, белок-неспецифичные киназы, такие как IPTKb, рецепторные тирозинкиназы, такие как рецепторная киназа фактора роста тромбоцитов (PDGF-R), рецептор фактора роста нервной ткани, trkB, Met и рецептор фактора роста фибробластов, FGFR3, нерецепторные тирозинкиназы, такие как Abl и гибридная киназа BCR-Abl, Lck, Csk, Fes, Bmx и c-src, и серин/треонинкиназы, такие как b-RAF, c-RAF, sgk, киназы MAP (например, МКК4, МКК6 и т.п.) и SAPK2α, SAPK2β и SAPK3. Нарушенная киназная активность наблюдается при многих патологических состояниях, включающих доброкачественные и злокачественные пролиферативные нарушения, а также заболевания, связанные с нарушенной активацией иммунной и нервной систем.
Новые соединения по настоящему изобретению ингибируют активность IPTKb и, следовательно, могут использоваться для лечения IPTKb-ассоциированных заболеваний.
Краткое описание сущности изобретения
Одним объектом настоящего изобретения являются соединения формулы I:
где
n выбирают из 0, 1, 2 и 3,
m выбирают из 0, 1, 2 и 3,
1
2
3
4
5
А содержит в цикле до трех групп, выбранных из группы, включающей -CR=, -CR=, -CR=, -CR= и -CR=, замененных на N,
1
2
3
4
5
1
6
1
6
1
6
1
6
3
8
0
4
1
10
0
4
2
11
2
11
12
2
11
12
11
11
12
11
12
11
11
11
12
11
12
11
12
11
11
12
11
12
12
2
11
12
11
11
12
11
11
12
11
12
1
4
11
1
6
12
1
6
6
10
11
12
11
12
3
8
1
2
3
4
5
1
6
1
6
1
6
1
6
R, R, R, R и R независимо выбирают из группы, включающей водород, гидрокси, галоген, циано, C-Салкил, галоген(С-С)алкил, гидрокси(С-С)алкил, циано(С-С)алкил, С-Сгетероциклоалкил(С-С)алкил, С-Сгетероарил(С-С)алкил, -XSOR, -XSONRR, -XSONRC(O)R, -XC(NR)NROR, -XCR=NOR, -XC(O)R, -XC(O)OR, -XNRR, -XC(O)NRR, -XOC(O)NRR, -XNRC(O)NRR, -XNRXOR, -XN(XOR), -XNRXC(O)OR, -XNRXNRR, -XNRXNRC(O)R, -XNRC(O)R, где каждый Х независимо выбирают из группы, включающей химическую связь и С-Салкилен, каждый R выбирают из группы, включающей водород и С-Салкил, a R выбирают из группы, включающей водород, С-Салкил и С-Сарил, или R и R вместе с атомом азота, к которому R и R присоединены, образуют С-Сгетероциклоалкил, причем указанный гетероарил или гетероциклоалкил R, R, R, R или R необязательно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, включающей галоген, гидрокси, циано, С-Салкил, галоген(С-С)алкил, гидрокси(С-С)алкил, циано(С-С)алкил и карбокси,
6
7
1
3
6
7
3
7
R и R независимо выбирают из группы, включающей водород и C-Салкил, или R и R вместе с атомом углерода, к которому они присоединены, образуют С-Сциклоалкил,
8
1
6
1
3
1
6
2
8a
8a
2
6
8
8
3
8
8a
1
6
R выбирают из группы, включающей С-Салкил, галоген(С-С)алкил, С-Салкокси, -CHOR-COOR и С-Салкенил, или две группы R, присоединенные к разным атомам углерода, вместе образуют алкильный мостик, или две группы R, присоединенные к одному атому углерода, образуют группу С-Сциклоалкил или карбонильную группу, где R выбирают из группы, включающей водород и С-Салкил,
9
6
10
1
10
9
1
3
1
3
1
3
1
3
13
13
14
13
14
1
6
R выбирают из группы, включающей С-Сарил и С-Сгетероарил, где указанный арил или гетероарил R необязательно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, включающей галоген, циано, гидрокси, C-Салкил, галоген(С-С)алкил, циано(С-С)алкил, гидрокси(С-С)алкил, -C(O)R, -C(O)NRR где каждый R и R независимо выбирают из группы, включающей водород и С-Салкил,
10
1
6
15
16
15
16
15
16
15
16
1
6
6
10
1
10
3
12
3
8
1
6
1
6
1
6
1
6
R выбирают из группы, включающей водород, С-Салкил, -NRR, -NRC(O)R и -C(O)NRR, где каждый R и R независимо выбирают из группы, включающей водород, С-Салкил, С-Сарил, С-Сгетероарил, С-Сциклоалкил и С-Сгетероциклоалкил, где указанный арил, гетероарил, циклоалкил и гетероциклоалкил необязательно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, включающей галоген, гидрокси, циано, С-Салкил, галоген(С-С)алкил, С-Салкокси и галоген(С-С)алкокси,
20
20
1
4
Y и Z независимо выбирают из группы, включающей CR и N, где Rвыбирают из группы, включающей водород и С-Салкил,
и их фармацевтически приемлемые соли, при условии, что соединения формулы I не включают соединения формулы II и N-оксиды, пролекарства, замещенные производные, индивидуальные изомеры и смеси изомеров, фармацевтически приемлемые соли и сольваты (например, гидраты) таких соединений.
Вторым объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая соединение формулы I или его N-оксид, индивидуальные изомеры и смеси изомеров или фармацевтически приемлемую соль в смеси с одним или более пригодными эксципиентами.
Третьим объектом настоящего изобретения является способ лечения заболевания у животного, при котором ингибирование киназной активности, прежде всего активности ITPKb, предотвращает, подавляет или смягчает патологические состояния и/или симптомы заболевания, причем указанный способ включает введение животному терапевтически эффективного количества соединения формулы I или его N-оксида, индивидуальных изомеров и смеси изомеров или фармацевтически приемлемой соли.
Четвертым объектом настоящего изобретения является применение соединения формулы I для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения заболевания у животного, при котором киназная активность, прежде всего активность ITPKb, вносит вклад в развитие патологического состояния и/или симптомов заболевания.
Пятым объектом настоящего изобретения является способ получения соединений формулы I и их N-оксидов, пролекарств, замещенных производных, индивидуальных изомеров и смесей изомеров и фармацевтически приемлемых солей.
Подробное описание изобретения
Определения (терминов)
1
4
"Алкил" в качестве группы или структурного элемента других групп, например галогеналкил и алкокси, означает углеводородный остаток с прямой или разветвленной цепью. С-Салкокси включает метокси, этокси и т.п. Галогеналкил включает трифторметил, пентафторэтил и т.п.
"Арил" означает моноциклическую или конденсированную бициклическую ароматическую систему, содержащую в цикле от шести до десяти атомов углерода. Например, арил означает фенил или нафтил, предпочтительно фенил. "Арилен" означает двухвалентный радикал, образованый арильной группой.
"Гетероарил" - насыщенную, ненасыщенную или частично насыщенную моноциклическую систему, содержащую в цикле 5-7 атомов, выбранных из С, О, N и S, включая, например, пиридил, индолил, имидазолил, пиримидинил, фуранил, оксазолил, изоксазолил, триазолил, тетразолил, пиразолил, тиенил, морфолино, пирролидинил, пирролидинил-2-он, пиперазинил, пиперидинил, пиперидинилон и т.п.
Термин "мостиковая или конденсированная бициклическая система, содержащая 8-14 атомов, выбранных из атомов С, О, N и S (которая является насыщенной, ненасыщенной или частично насыщенной), включает, например, индазолил, хиноксалинил, хинолинил, бензофуранил, бензопиранил, бензотиопиранил, бензо[1, 3]диоксол, бензимидазолил, 1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил и т.п.
"Соединения формулы II" представляют собой соединения, выбранные из группы, включающей 1-(2-этоксифенил)-4-((3-(4-метоксифенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)пиперазин, 1-(2-метоксифенил)-4-((3-(4-метоксифенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)пиперазин, 1-(4-фторфенил)-4-((3-(4-метоксифенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)пиперазин, 1-(2-этоксифенил)-4-((3-фенил-1Н-пиразол-4-ил)метил)пиперазин, 1-(2-метоксифенил)-4-((3-фенил-1Н-пиразол-4-ил)метил)пиперазин, 1-(2-этоксифенил)-4-((3-фенил-1Н-пиразол-4-ил)метил)пиперазин, 1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)-4-((3-(4-метоксифенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)пиперазин, 1-(3-хлор-5-(трифторметил)пиридин-2-ил)-4-((3-(4-метоксифенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)пиперазин, 1-((3-(4-метоксифенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)-4-(пиридин-2-ил)пиперазин, 1-(3-хлор-5-(трифторметил)пиридин-2-ил)-4-((3-фенил-1Н-пиразол-4-ил)метил)пиперазин, 1-((3-фенил-1Н-пиразол-4-ил)метил)-4-(пиридин-2-ил)пиперазин, 1-(2-этоксифенил)-4-((3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)пиперазин, 1-((3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)-4-(2-метоксифенил)пиперазин, 1-(4-(трифторметил)пиридин-2-ил)-4-((3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)пиперазин, 1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)-4-((3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)пиперазин, 1-(3-хлор-5-(трифторметил)пиридин-2-ил)-4-((3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)пиперазин, 1-((3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)-4-(пиридин-2-ил)пиперазин и 1-(4-фторфенил)-4-((3-(4-фторфенил)-1H-пиразол-4-ил)метил)пиперазин.
3
10
"Циклоалкил" означает насыщенную или частично ненасыщенную моноциклическую конденсированную бициклическую или связанную мостиковой связью полициклическую систему, содержащую в цикле указанное количество атомов. Например, С-Сциклоалкил включает циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т.п.
30
0-2
30
1
6
3
8
0
4
1
5
"Гетероциклоалкил" означает циклоалкил, указанный в описании заявки, в котором до трех атомов углерода в цикле заменены группой, выбранной из С(O), NR, О, S(O), где R выбирают из групп водород и С-Салкил. Гетероциклоалкил включает имидазолидин, пирролидин, пиперидин и т.п. Группа С-С гетероциклоалкил(С-С)алкил, используемый в описании заявки для описания заместителей R-R, включает пирролидинилметил, где метил является местом присоединения, например, к циклу А.
"Галоген" предпочтительно означает хлор или фтор, а также бром или иод.
"Лечение" означает способ снижения или ослабления интенсивности заболевания и/или сопутствующих ему симптомов.
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения.
В настоящем изобретении предлагаются соединения, композиции и способы лечения киназа-ассоциированного заболевания, прежде всего IPTKb-ассоциированных заболеваний. Например, такими являются аутоиммунные заболевания, прежде всего заболевания, ассоциированные с В клетками, такие как ревматоидный артрит, системная красная волчанка (SLE), иммунная тромбоцитопеническая пурпура (ITP) и гемолитическая анемия.
1
2
3
4
5
В одном варианте соединений формулы I n равно 1 или 2, m равно 0, 1 или 2, а А содержит в цикле до трех групп, выбранных из -CR=, -CR=, -CR=, -CR= и -CR=, замененных на N.
2
3
4
1
6
1
6
1
6
1
6
3
8
0
4
1
10
0
4
2
11
2
11
12
2
11
12
11
11
12
11
12
11
11
11
12
11
12
11
12
11
11
12
11
12
12
2
11
12
11
12
1
4
11
1
6
12
1
6
6
10
1
2
3
4
5
1
6
1
6
1
6
1
6
В другом варианте R, R и R независимо выбирают из группы, включающей водород, гидрокси, галоген, циано, С-Салкил, галоген(С-С)алкил, гидрокси(С-С)алкил, циано(С-С)алкил, С-С гетероциклоалкил(С-С)алкил, С-Сгетероарил(С-С)алкил, -XSOR, -XSONRR, -XSONRC(O)R, -XC(NR)NROR, -XCR=NOR, -XC(O)OR, -XC(O)OR, -XNRR, -XC(O)NRR, -XOC(O)NRR, -XNRC(O)NRR, -XNRXOR, -XN(XOR), -XNRXC(O)OR, -XNRC(O)R, где каждый Х независимо выбирают из группы, включающей химическую связь и C-Салкилен, каждый R выбирают из группы, включающей водород и С-Салкил, a R выбирают из группы, включающей водород, С-Салкил и С-Сарил, причем указанный гетероарил или гетероциклоалкил R, R, R, R или R необязательно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, включающей галоген, гидрокси, циано, С-Салкил, галоген(С-С)алкил, гидрокси(С-С)алкил, циано(С-С)алкил и карбокси.
1
5
6
7
8
1
2
1
3
1
6
2
8a
8a
2
6
8
8
3
8
8a
1
6
В другом варианте R, R, R и R означают водород, a R выбирают из группы, включающей С-Салкил, галоген(С-С)алкил, С-С алкокси, -CHOR, -COOR и С-Салкенил, или две группы R, присоединенные к разным атомам углерода, вместе образуют алкильный мостик, или две группы R, присоединенные к одному атому углерода, образуют группу С-Сциклоалкил или карбонильную группу, причем R выбирают из группы, включающей водород и С-Салкил.
9
6
10
1
10
9
1
3
1
3
1
3
1
3
13
13
14
13
14
1
6
10
В другом варианте R выбирают из группы, включающей С-Сарил и С-Сгетероарил, где указанный арил или гетероарил R необязательно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, включающей галоген, циано, гидрокси, С-Салкил, галоген(С-С)алкил, циано(С-С)алкил, гидрокси(С-С)алкил, -C(O)R, -C(O)NRR, где каждый R и R независимо выбирают из группы, включающей водород и С-Салкил, а R означает водород.
1
2
3
4
5
В другом варианте Y означает атом азота, а А содержит в цикле до трех групп, выбранных из группы, включающей -CR=, -CR=, -CR=, -CR= и -CR=, замененных на атом азота.
2
3
4
В другом варианте R, R и R независимо выбирают из группы, включающей водород, гидрокси, циано, цианометил, фтор, хлор, бром, иод, аминокарбонил, аминокарбонилметил, тетразолил, амидино, метилкарбонил, 1-(гидроксиимино)этил, аминометил, диметиламинометил, N-этилформамид, метиламинокарбонил, диметиламино, карбоксиметил, метиламинокарбокси, этиламинокарбокси, имидазолил, пиразолил, 3-этилуреидо, изопропиламинокарбокси, фениламинокарбокси, гидроксикарбонилметиламино, 2-гидроксиэтокси, 2-гидроксипропиламино, аминокарбокси, гидроксиэтиламино, пирролидинил, замещенный группой карбокси, изоксазолил, 2-гидроксиметилпирролидин-1-ил, 3-гидроксипирролидин-1-ил, 3-гидроксиазетидин-1-ил, пирролил, необязательно замещенный группой циано, метиламиносульфонил, метилсульфонил, метилкарбониламиносульфонил, карбокси, тетразолил, тетразолилметил, дигидроксиэтиламино, оксазолил, имидазолил, необязательно замещенный группой метил, пиразолил и 1,2,4-триазолил.
8
8
8
В другом варианте R выбирают из группы, включающей метил, этил, метоксикарбонил, карбокси, трифторметил и фторметил, или две группы R, присоединенные к одному атому углерода, образуют группу циклоалкил, или две группы R вместе образуют алкильный мостик, например, метил, этил или пропил, в составе двухвалентного радикала, такого как (а), (b) или (с), соответственно
9
В другом варианте R выбирают из группы, включающей фенил, пиридинил, пиразинил, пиримидинил и фуро[3,2-с]пиридин-4-ил, где указанный фенил, пиридинил, пиразинил, пиримидинил или фуро[3,2-с]пиридин-4-ил необязательно замещен 1-3 заместителями, независимо выбранными из группы, включающей трифторметил, циано, бром, хлор, гидроксиметил, метилкарбонил, метил, аминокарбонил, нитро, иод, фтор, метоксикарбонил, гидрокси, амино, карбокси и метокси.
В другом варианте соединения формулы I выбирают из группы, включающей 4-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил, 4-{4-[3-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}фениловый эфир метилкарбаминовой кислоты, 4-[3-(4-имидазол-1-илфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-2-метил-1-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин, 4-[3-(6-хлорпиридин-3-ил)-1Н-пиразол-4-илметил]-2-метил-1-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин, 1-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-4-(4-трифторметилфенил)пиперазин, 6-{4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин-1-ил}никотинонитрил, 1-(5-бромпиридин-2-ил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 1-(5-хлорпиридин-2-ил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, (6-{4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин-1-ил}пиридин-3-ил)метанол, 1-(6-{4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин-1-ил}пиридин-3-ил)этанон, 1-(3,5-дихлорпиридин-4-ил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-3,4,5,6-тетрагидро-2Н-[1,2']бипиразинил, 2-{4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин-1-ил}никотинонитрил, 1-(6-хлорпиридин-2-ил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 2-{4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин-1-ил}-4-трифторметилпиримидин, 1-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-4-(6-метилпиридин-2-ил)пиперазин, 2-{4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин-1-ил}пиримидин, 1-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)-[1,4]диазепан, 1-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-2,6-диметил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин, 1-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-4-пиридин-2-илпиперазин, 1-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-4-(3-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин, 6-{4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин-1-ил}никотинамид, 4-{4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин-1-ил}фуро[3,2-с]пиридин, 1-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-4-(5-нитропиридин-2-ил)пиперазин, 4-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензамид, 1-{3-[4-(1Н-тетразол-5-ил)фенил]-1Н-пиразол-4-илметил}-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин, N-гидрокси-4-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1H-пиразол-3-ил}бензамидин, 1-(4-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}фенил)этанон, оксим 1-(4-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}фенил)этанона, метиловый эфир 4-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензойной кислоты, 1-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-4-(5-иодпиридин-2-ил)пиперазин, 1-(4-хлор-3-трифторметилфенил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 1-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-4-(3-трифторметилфенил)пиперазин, 1-(4-бромфенил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 4-{4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин-1-ил}фенол, 6-{4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин-1-ил}пиридин-3-иламин, 1-(3, 4-диметилфенил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 1-(2-фторфенил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 6-{4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин-1-ил}никотиновая кислота, 4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-2-метил-1-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин, 1-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-2-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин, 1-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-4-(5-метилпиридин-2-ил)пиперазин, 1-(3-хлорпиридин-2-ил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 2-{4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин-1-ил}изоникотинонитрил, 2-фтор-5-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил, 2-фтор-5-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)-пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензамид, 4-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)-[1, 4]диазепан-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил, 2-фтор-5-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензиламин, (2-фтор-5-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензил)диметиламин, N-(2-фтор-5-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензил)формамид, 1-(4-хлорфенил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 1-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-4-(4-метоксифенил)пиперазин, 1-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-4-пара-толилпиперазин, 1-(3-хлорфенил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 1-(2,4-дифторфенил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 1-(3,4-дихлорфенил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 1-(2,3-дихлорфенил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 1-(3,5-дихлорфенил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 1-(2,3-диметилфенил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 1-(2,4-диметилфенил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 4-{4-[4-(5-хлорпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил, 2-{4-[3-(4-цианофенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин-1-ил}изоникотинонитрил, 4-{4-[4-(4-хлор-3-трифторметилфенил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил, 4-{4-[4-(3,4-диметилфенил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил, 1-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-4-(4-метилпиридин-2-ил)пиперазин, 1-(2,4-дихлорфенил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 1-(4-хлор-2-фторфенил)-4-[3-(4-фторфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]пиперазин, 2-циано-5-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензамид, 2-циано-5-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)[1,4]диазепан-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензамид, 2-циано-N-метил-5-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)-[1,4]диазепан-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензамид, 4-{4-[3-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил, 4-{4-[3-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил, 4-{4-[2-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил, 4-{4-[5-(5-трифторметилпиридин-2-ил)-2,5-диазабицикло[2.2.1]гепт-2-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил, 4-{4-[2-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1H-пиразол-3-ил}бензонитрил, 4-{4-[3,5-диметил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил, 4-{4-[4-(6-трифторметилпиридин-3-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил, 4-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}фенол, 1-[3-(4-бромфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин, 4-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}фениловый эфир этилкарбаминовой кислоты, 1-[3-(4-имидазол-1-илфенил)-1H-пиразол-4-илметил]-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин, 2-метил-4-{3-[4-(1Н-пиразол-4-ил)фенил]-1Н-пиразол-4-илметил}-1-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин, 4-{4-[3,3-диметил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1H-пиразол-3-ил}бензонитрил, 4-{4-[2,5-диметил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил, 4-{4-[3-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}фениловый эфир этилкарбаминовой кислоты, 4-{4-[3-этил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1H-пиразол-3-ил}бензонитрил, 1-этил-3-(4-{4-[3-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1H-пиразол-3-ил}фенил)мочевина, 4-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}фениловый эфир метилкарбаминовой кислоты, (4-{4-[3-метил-4-(6-трифторметилпиридин-3-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}фенил)ацетонитрил, 2-(4-{4-[3-метил-4-(6-трифторметилпиридин-3-ил)пиперазин-1-илметил]-1H-пиразол-3-ил}фенил)ацетамид, диметил(5-{4-[3-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}пиридин-2-ил)амин, (4-{4-[3-метил-4-(6-трифторметилпиридин-3-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}фенил)уксусная кислота, 4-{4-[3-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1H-пиразол-3-ил}фениловый эфир изопропилкарбаминовой кислоты, 4-{4-[3-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}фениловый эфир фенилкарбаминовой кислоты, 5-{4-[3-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}пиридин-2-карбонитрил, 6-{4-[3-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}никотинонитрил, 2-(5-{4-[3-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1H-пиразол-3-ил}-пиридин-2-ил)ацетамид, 5-{4-[3-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1H-пиразол-3-ил}пиридин-2-иловый эфир карабаминовой кислоты, (S)-метил 4-((3-(4-цианофенил)-1H-пиразол-4-ил)метил)-1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-2-карбоксилат, (S)-4-((3-(4-цианофенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)-1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-2-карбоновая кислота, (S)-4-(4-((3-(метоксиметил)-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)бензонитрил, (R)-2-(4-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1Н-пиразол-3-ил)фениламино)этанол, (R)-5-(4-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1Н-пиразол-3-ил)фенил)изоксазол, (R)-4-((3-(4-(1Н-пиррол-1-ил)фенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)-2-метил-1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин, (R)-2-метил-4-((3-(4-(метилсульфонил)фенил)-1H-пиразол-4-ил)метил)-1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин, (R)-N-(4-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)фенилсульфонил)ацетамид, (R)-4-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)бензойная кислота, (R)-4-((3-(4-(1Н-тетразол-5-ил)фенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)-2-метил-1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин, (R)-4-((3-(4-((1Н-тетразол-5-ил)метил)фенил)-1H-пиразол-4-ил)метил)-2-метил-1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин, (R)-2-(5-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)пиридин-2-иламино)этанол, (R)-2,2'-(5-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)пиридин-2-илазандиил)диэтанол, (S)-4-(4-((3-(трифторметил)-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1Н-пиразол-3-ил)бензонитрил, (R)-4-{4-[3-трифторметил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил, (S)-4-(4-((2-(трифторметил)-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)бензонитрил, (R)-4-(4-((2-(трифторметил)-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)бензонитрил, (R)-4-(4-((2-(фторметил)-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)бензонитрил, (S)-4-(4-((2-(фторметил)-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1Н-пиразол-3-ил)бензонитрил, 4-(4-((1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперидин-4-ил)метил)-1Н-пиразол-3-ил)бензонитрил, 4-(4-((4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперидин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)бензонитрил, (R)-5-(4-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)фенил)оксазол, (R)-4-((3-(4-(1H-пиразол-1-ил)фенил)-1Н-пиразол-4-ил)метил)-2-метил-1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин, (R)-4-((3-(4-(1Н-1,2,4-триазол-1-ил)фенил)-1H-пиразол-4-ил)метил)-2-метил-1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин, (R)-2-(4-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)фениламино)уксусная кислота, (R)-N-метил-4-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)бензолсульфонамид, (R)-1-(4-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)фенил)-1H-пиррол-2-карбонитрил, 4-(4-((3-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)-3,8-диазабицикло[3.2.1]октан-8-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)бензонитрил, 4-(4-((8-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)-3,8-диазабицикло[3.2.1]октан-3-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)бензонитрил, (R)-2-метил-4-((3-(4-(2-метил-1H-имидазол-1-ил)фенил)-1H-пиразол-4-ил)метил)-1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин, (R)-2-метил-4-((3-(4-(5-метил-1H-имидазол-1-ил)фенил)-1H-пиразол-4-ил)метил)-1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин, (R)-2-метил-4-((3-(4-(4-метил-1Н-имидазол-1-ил)фенил)-1H-пиразол-4-ил)метил)-1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин, (R)-N-(2-(5-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1Н-пиразол-3-ил)пиридин-2-иламино)этил)ацетамид, (R)-N1-(5-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1Н-пиразол-3-ил)пиридин-2-ил)этан-1,2-диамин, (R)-4-(5-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)пиридин-2-ил)морфолино, (R)-5-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)-N-(2-(пиперидин-1-ил)этил)пиридин-2-амин, (R)-4-(5-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)пиридин-2-ил)пиперазин-2-он, (R)-2-гидрокси-4-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1Н-пиразол-3-ил)бензойная кислота, 1-(5-(4-(((R)-3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)пиридин-2-ил)пирролидин-3-ол, 4-(4-((7-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)-4,7-диазаспиро[2.5]октан-4-ил)метил)-1Н-пиразол-3-ил)бензонитрил, 4-(4-((4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)-4,7-диазаспиро[2.5]октан-7-ил)метил)-1Н-пиразол-3-ил)бензонитрил, 1-(5-(4-(((R)-3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1Н-пиразол-3-ил)пиридин-2-иламино)пропан-2-ол, ((S)-1-(5-(4-(((R)-3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)пиридин-2-ил)пирролидин-2-ил)метанол, (R)-1-(5-(4-(((R)-3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1Н-пиразол-3-ил)пиридин-2-иламино)пропан-2-ол, (S)-1-(5-(4-(((R)-3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)пиридин-2-иламино)пропан-2-ол, (R)-2-(5-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)пиридин-2-илокси)этанол и (R)-1-(5-(4-((3-метил-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)пиперазин-1-ил)метил)-1Н-пиразол-3-ил)пиридин-2-ил)азетидин-3-ол.
Другие соединения по изобретению подробно описаны в примерах и в таблице.
Фармакология и промышленная применимость
Соединения по изобретению модулируют активность IPTKb и как таковые используются для лечения заболеваний или нарушений, при которых нарушенная активность IPTKb вносит вклад в развитие патологии и/или симптомов заболеваний.
Благодаря подавлению активации и развития В клеток ингибиторы ITPKb по настоящему изобретению находят различное терапевтическое применение. Ингибирование ITPKb фармакологическими средствами представляет собой способ подавления нарушенной функции В клеток при патологических состояниях. Например, В клетки играют патологическую роль при хроническом отторжении трансплантата и в развитии аутоиммунных заболеваний (например, ревматоидного артрита, SLE, обыкновенной волчанки и т.п.), псориаза, аллергии (астмы, ринита, COPD, дерматита) и др., включая анафилаксию и многие заболевания, опосредовнные комплементом. Соединения по изобретению, ингибирующие ITPKb, могут представлять собой эффективные агенты для лечения указанных заболеваний, где ITPKb инициирует патогенез.
Другие заболевания и состояния, которые можно лечить указанными соединениями, включают заболевания, ассоциированные или опосредуемые аномальной пролиферацией, например, лимфому В клеток. Кроме того, такие заболевания включают другие нарушения, опосредованные антителами, например аллергии, системную красную волчанку (SLE), первичный билиарный цирроз (РВС) и идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру (ITP). Кроме лечения указанных заболеваний или состояний ингибиторы ITPKb по настоящему изобретению можно также использовать для профилактики или модулирования развития таких заболеваний или нарушений у субъекта (включая человека и животных, таких как другие млекопитающие), подозреваемых в наличии заболеваний или предрасположенных к таким заболеваниям или нарушениям. Модуляторы В клеток, которые могут использоваться в способах лечения по изобретению, включают конкретные ингибиторы ITPKb, описанные ниже в примерах и приведенные в таблице.
В изобретении также предлагается способ модулирования развития и функции лимфоцитов В у субъекта (человека или других млекопитающих) для лечения аутоиммунных заболеваний, включающий введение субъекту соединения формулы I или его фармацевтической композиции в количестве, эффективном для модулирования киназной активности или клеточного уровня ITPKb (таким образом, как показано ниже в анализах in vitro), модулируя тем самым дифференциацию и функционирование В лимфоцитов в организме субъекта. Соединения могут понижать клеточный уровень ITPKb благодаря ингибированию киназной активности ITPKb.
В соответствии с вышеизложенным, в настоящем изобретении предлагается также способ предупреждения, лечения и/или уменьшения интенсивности симптомов любого описанного выше заболевания или нарушения у субъекта, который нуждается в таком лечении, причем указанный способ заключается в том, что указанному субъекту вводят терапевтически эффективное количество (см. ниже в разделе Способы введения и фармацевтические композиции) соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли. Соединения формулы I могут понижать клеточный уровень ITPKb благодаря ингибированию киназной активности ITPKb таким образом, как описано ниже в анализах in vitro. При любом вышеуказанном применении требуемые дозы могут изменяться в зависимости от способа введения, конкретного состояния, подлежащего лечению, и ожидаемого действия.
Способы введения и фармацевтические композиции
В общем случае, соединения по изобретению вводят в терапевтически эффективных количествах любыми обычными и приемлемыми известными способами, отдельно или в комбинации с одним или более терапевтическими агентами. Терапевтически эффективное количество может изменяться в зависимости от тяжести заболевания, возраста и относительного состояния здоровья субъекта, активности используемого соединения и других факторов. В общем случае удовлетворительные результаты достигаются при системном введении суточных доз от приблизительно 0,03 до 2, 5 мг/кг массы тела. Для более крупного млекопитающего, например человека, назначаемая суточная доза составляет от приблизительно 0,5 мг до приблизительно 100 мг, которую можно вводить, например, раздельными дозами до четырех раз в сутки или в виде формы с замедленным высвобождением. Пригодные стандартные лекарственные формы для перорального введения включают от приблизительно 1 до 50 мг активного ингредиента.
Соединения по изобретению можно вводить в виде фармацевтических композиций любым приемлемым способом, прежде всего энтерально, например, пероральным способом, например, в форме таблеток или капсул, или парентеральным способом, например, в форме инъекционных растворов или суспензий, местным способом, например, в форме лосьонов, гелей, мазей или кремов, или интраназальным способом, или в форме суппозиториев. Фармацевтические композиции, включающие соединение по настоящему изобретению в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли в смеси по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, получают обычным способом с использованием процессов смешивания, гранулирования или нанесения покрытия. Например, пероральные композиции могут представлять собой таблетки или желатиновые капсулы, включающие активный ингредиент в смеси с а) разбавителями, например лактозой, декстрозой, сахарозой, маннитом, сорбитом, целлюлозой и/или глицином, б) замасливателями, например диоксидом кремния, тальком, стеариновой кислотой, ее кальциевой или магниевой солью и/или полиэтиленгликолем, а таблетки могут также включать в) связующие агенты, например силикат магния/алюминия, крахмальную пасту, желатин, трагакант, метилцеллюлозу, Na-соль карбоксиметилцеллюлозы и/или поливинилпирролидон, и при необходимости г) дезинтегрирующие агенты, например крахмалы, агар, альгиновую кислоту или ее натриевую соль, или шипучие смеси, и/или д) абсорбенты, красители, ароматизаторы и подсластители. Инъекционные композиции могут представлять собой водные изотонические растворы или суспензии, а суппозитории получают из жировых эмульсий или суспензий. Композиции можно стерилизовать и/или они могут содержать адъюванты, такие как консервирующие, стабилизирующие, смачивающие или эмульгирующие агенты, способствующие растворению агенты, соли для регуляции осмотического давления и/или буферные вещества. Кроме того, они могут содержать другие терапевтически ценные соединения. Пригодные составы для чрескожного применения включают эффективное количество соединения по настоящему изобретению в смеси с носителем. Носитель может включать абсорбируемые фармакологически приемлемые растворители для обеспечения всасывания через кожу пациента. Например, системы для чрескожного введения представляют собой повязку, включающую основу, резервуар, содержащий соединение необязательно в смеси с носителем, необязательно мембрану, регулирующую доставку соединения к поверхности кожи с заданной скоростью в течение продолжительного времени, и слой, обеспечивающий удерживание устройства на поверхности кожи. Можно также использовать матричные чрескожные составы. Пригодные составы для местного нанесения, например, на кожу и в глаза, предпочтительно представляют собой водные растворы, мази, кремы или гели, известные в данной области. Такие составы могут содержать солюбилизирующие, стабилизирующие, тонизирующие агенты, буферные вещества и консерванты.
Соединения по изобретению можно вводить в терапевтически эффективных количествах в комбинации с одним или более терапевтических агентов (фармацевтические комбинации). Например, синергическое действие достигается при использовании комбинации с другими иммуномодулирующими или противовоспалительными веществами, например, при использовании в комбинации с циклоспорином, рапамицином или аскомицином, или их иммунодепрессантными аналогами, например, циклоспорином A (CsA), циклоспорином G, FK-506, рапамицином, или аналогичными соединениями, кортикостероидами, циклофосфамидом, азатиоприном, метотрексатом, бреквинаром, лефлуномидом, мизорибином, микофеноловой кислотой, микофенолятом мофетила, 15-дезоксиспергуалином, иммунодепрессантными антителами, прежде всего моноклональными антителами к рецепторам лейкоцитов, например МНС, CD2, CD3, CD4, CD7, CD25, CD28, В7, CD45, CD58, или к их лигандам, или другими иммуномодулирующими соединениями, такими как CTLA41g. Если соединения по изобретению вводят совместно с другими терапевтически активными агентами, дозы совместно вводимых соединений варьируют в зависимости от типа совместно используемого лекарственного средства, от конкретного лекарственного средства, от состояния, подлежащего лечению и т.п.
Изобретение также относится к фармацевтическим комбинациям, например, набору, включающему а) первый агент, который представляет собой соединение по изобретению, указанное выше, в свободной форме или в форме фармацевтически приемлемой соли, и б) по меньшей мере один второй агент. Набор включает инструкции по введению лекарственных средств.
Термины "совместное введение" или "комбинированное введение" или аналогичные термины, используемые в описании, означают введение выбранных терапевтических агентов одному пациенту, а также курс лечения, согласно которому агенты необязательно вводятся одновременно и одним и тем же способом.
Термин "фармацевтическая комбинация", используемый в описании заявки, означает продукт, который образуется при смешивании или комбинирования более одного активного ингредиента и включает фиксированные и нефиксированные комбинации активных ингредиентов. Термин "фиксированная комбинация" означает, что активные ингредиенты, например соединение формулы I и сопутствующий агент, вводятся пациенту одновременно в форме одного продукта или дозы. Термин "нефиксированные комбинации" означает, что активные ингредиенты, например соединение формулы I и сопутствующий агент, вводятся пациенту раздельно, одновременно, вместе или последовательно, без ограничений по времени, причем такое введение обеспечивает достижение терапевтически эффективного уровня двух соединений в организме пациента. Последнее относится также к комбинированному лечению растворами, например, к введению трех или более активных ингредиентов.
Способы получения соединений по изобретению
Настоящее изобретение включает также способы получения соединений по изобретению. В описанных реакциях необходимо защищать реакционноспособные функциональные группы, например гидрокси, амино, имино, тио или карбоксигруппы, если они должны присутствовать в конечном продукте. Введение защитных групп позволяет исключить участие таких функциональных групп в проводимых реакциях. Соответствующие защитные группы используются в соответствии с принятой практикой, например, см. T.W.Greene и Р.G.M.Wuts, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley and Sons (1991).
6
7
Соединения формулы I, в которых Y означает N, a R и R - оба означают водород, получают, как показано на схеме 1.
1
2
3
4
5
8
9
10
На схеме 1 n, m, A, R, R, R, R, R, R, R и R имеют значения, указанные в разделе Краткое описание сущности изобретения.
3
3
Соединение формулы I получают при взаимодействии соединения формулы 3 с соединением формулы 4 в присутствии пригодного растворителя (например, ДХМ) и соответствующего восстановителя (например, NaCNBH). Соединение формулы 3 получают по реакции соединения формулы 2 с комплексом POCl/ДМФА с последующим добавлением соответствующего основания (например, NaOH).
Подробные примеры синтеза соединения формулы I приводятся ниже в разделе Примеры.
Дополнительные способы получения соединений по изобретению
Соединение по изобретению можно получить в виде фармацевтически приемлемой кислотно-аддитивной соли по реакции свободного основания соединения с фармацевтически приемлемой неорганической или органической кислотой. В другом варианте фармацевтически приемлемую основно-аддитивную соль соединения по изобретению можно получить по реакции свободной кислоты соединения с фармацевтически приемлемым неорганическим или органическим основанием.
В другом варианте соли соединений по изобретению можно получить с использованием солей исходных материалов или промежуточных соединений.
Свободные кислоты или свободные основания соединений по изобретению получают из соответствующих основно-аддитивной соли или кислотно-аддитивной соли соответственно. Например, соединение по изобретению в форме кислотно-аддитивной соли можно превратить в соответствующее свободное основание при обработке соответствующим основанием (например, раствором гидроксида аммония, гидроксида натрия и т.п.). Соединение по изобретению в форме основно-аддитивной соли можно превратить в соответствующую свободную кислоту при обработке соответствующей кислотой (например, соляной кислотой и т.п.).
Соединения по изобретению в неокисленной форме можно получить из N-оксидов соединений по изобретению при обработке восстанавливающим агентом (например, серой, диоксидом серы, трифенилфосфином, боргидридом лития, боргидридом натрия, трихлоридом фосфора, трибромидом фосфора или т.п.) в пригодном инертном органическом растворителе (например, ацетонитриле, этаноле, водном диоксане или т.п.) при температуре от 0°С до 80°С.
Пролекарства соединений по изобретению получают известными методами (например, см. Saulnier и др., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 4, 1985 (1994)). Например, соответствующие пролекарства можно получить при взаимодействии немодифицированного соединения по изобретению с пригодным карбамилирующим агентом (например, 1,1-ацилоксиалкилкарбонилхлоридом, пара-нитрофенилкарбонатом или т.п.).
Соединения по изобретению, содержащие защитные группы, можно получить известными методами. Подробное описание методик введения защитных групп и их удаления можно найти в монографии T.W.Greene, "Protecting Groups in Organic Chemistry", 3 изд., John Wiley и Sons, Inc., (1999).
Соединения по изобретению можно получить, в том числе способом по изобретению, в виде сольватов (например, гидратов). Гидраты соединений по настоящему изобретению получают при перекристаллизации из смеси вода/органический растворитель, такой как диоксан, тетрагидрофуран или метанол.
Соединения по изобретению можно получить в виде индивидуальных стереоизомеров при взаимодействии рацемической смеси соединения с оптически активным разделяющим агентом с образованием пары диастереоизомерных соединений, разделении диастереомеров и выделении оптически чистых энантиомеров. Хотя разделение энантиомеров проводят с использованием ковалентных диастереомерных производных соединений по изобретению, предпочтительными являются диссоциирующие комплексы (например, кристаллические диастереомерные соли). Диастереомеры обладают разными физическими свойствами (например, температурой плавления, температурой кипения, растворимостью, реакционноспособностью и т.п.) и благодаря этому их можно разделить простыми методами. Диастереомеры разделяют хроматографией, или предпочтительно по методике, основанной на различии в растворимости. Затем оптически чистый энантиомер выделяют с использованием разделяющего агента любым способом, исключающим рацемизацию. Более подробное описание методик, используемых для разделения стереоизомеров соединений, присутствующих в виде рацемических смесей, можно найти в монографии Jean Jacques, Andre Collet, Samuel H. Wilen, "Enantiomers, Racemates and Resolutions", John Wiley And Sons, Inc. (1981).
В итоге, соединения формулы I можно получить способом, который заключается в том, что:
(а) проводят реакцию, как показано на схеме 1, и
(б) необязательно превращают соединения по изобретению в фармацевтически приемлемую соль,
(в) необязательно превращают соль соединения по изобретению в несолевую (свободную) форму,
(г) необязательно превращают неокисленную форму соединения по изобретению в фармацевтически приемлемый N-оксид,
д) необязательно превращают N-оксид соединения по изобретению в его неокисленную форму,
(е) необязательно выделяют индивидуальный изомер соединения по изобретению из смеси изомеров,
(ж) необязательно превращают немодифицированное соединение по изобретению в фармацевтически приемлемое пролекарство, и
(з) необязательно превращают пролекарство соединения в немодифицированную форму.
Получение исходных материалов подробно не описано, поскольку соединения известны или их можно получить известными методами, или как описано ниже в разделе Примеры.
Для специалиста в данной области представляется очевидным, что вышеуказанные синтезы и модификации приводятся для иллюстрации методов получения соединения по настоящему изобретению, и что их можно получить с использованием других известных методов.
Примеры
Настоящее изобретение иллюстрируется, без ограничения перечисленным, следующими примерами получения соединений формулы I по изобретению.
Пример 1
4-{4-[4-(5-Трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1H-пиразол-3-ил)бензонитрил
Стадия 1
В раствор ацетата натрия (51,5 г, 381 ммоль) и гидрохлорида семикарбазида (23 г, 207 ммоль) в воде (50 мл) добавляли раствор 4-ацетилбензонитрила (25 г, 173 ммоль) в этаноле (35 мл) и реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 3 ч. Затем смесь охлаждали до комнатной температуры, полученное кристаллическое вещество отделяли фильтрованием и высушивали в вакууме, при этом получали 4-ацетилбензонитрилсемикарбазон в виде твердого вещества белого цвета.
1
Н-ЯМР (400 МГц, d-ДМСО): δ 9,60 (s, 1Н), 8,06 (d, 2H, J 8,8 Гц), 7,81 (d, 2H, J 8,8 Гц), 6,50 (s, ушир., 2H), 3,41 (s, ушир., 1Н), 2,20 (s, 3H).
Стадия 2
4
Комплекс фосфор/диметилформамид получали при медленном добавлении оксихлорида фосфора (10,25 мл, 110 ммоль) при температуре менее 5°С в диметилформамид (25 мл, 220 ммоль). В полученный комплекс фосфор/диметилформамида при перемешивании порциями добавляли 4-ацетилбензонитрил (10,1 г, 50 ммоль) и реакционную смесь нагревали при 65°С в течение 4 ч. Смесь выливали в лед, охлаждали и нейтрализовали при добавлении раствора гидроксида натрия (20 г в 80 мл воды). Затем смесь нагревали при 55°С в течение 10 мин, охлаждали, подкисляли конц. соляной кислотой и инкубировали в течение ночи. Твердое вещество отделяли фильтрованием и высушивали в вакууме, при этом получали продукт в виде твердого вещества темно-желтого цвета (3,4 г). Фильтрат трижды экстрагировали EtOAc (50 мл), объединенные органические экстракты промывали водой и солевым раствором и сушили над MgSO. Остаток фракционировали экспресс-хроматографией на колонке (элюент: EtOAc/гексан, 2:5), при этом получали 4-(4-формил-1Н-3-ил)бензонитрил в виде твердого вещества желтого цвета (2,0 г).
1
H-ЯМР (400 МГц, d-ДМСО): δ 9,93 (s, 1Н), 8,70 (s, 1Н), 8,12 (d, 2H, J 8 Гц), 7,92 (d, 2H, J 8 Гц).
Стадия 3
Раствор 4-(4-формил-1Н-3-ил)бензонитрила (60 мг, 0, 3 ммоль), 1-[5-(трифторметил)пирид-2-ил]пиперазина (34,7 мг, 0, 15 ммоль) и ледяной уксусной кислоты (25 мкл) в метаноле (5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. В смесь добавляли одной порцией триацетоксиборгидрид натрия (127 мг, 0,6 ммоль), полученную смесь нагревали при 40°С в течение 1 ч, а затем охлаждали до комнатной температуры. Неочищенный остаток фракционировали методом препаративной ЖХВР. Полученный трифторацетат нейтрализовали конц. водным раствором бикарбоната натрия, при этом получали 4-{4-[4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-илметил]-1Н-пиразол-3-ил}бензонитрил в виде твердого вещества белого цвета.
1
3
H-ЯМР (400 МГц, CDCl): δ 8,32 (s, 1H), 7,98 (d, 2H, J 8,4 Гц), 7,65 (d, 2H, J 8,4 Гц), 7,56-7,54 (m, 2H), 6,56 (d, 1H, J 8,8 Гц), 3,59-3,56 (m, 4H), 3,44 (s, 2H), 2,52-2,50 (m, 4H).
Пример 2
Получение 4-(4-(((R)-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)-3-метилпиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)фенилового эфира метилкарбаминовой кислоты
Стадия 1
Смесь 1-(4-гидроксифенил)этанона ((3), 544 мг, 4 ммоль) и метилизоционата (500 мг, 8,8 ммоль) в толуоле (5 мл) перемешивали в герметично закрытой пробирке. Затем в смесь добавляли триэтиламин (404 мг, 4 ммоль) и смесь нагревали при 100°С в течение 2 ч, при этом данные ЖХ/МС указывали на полное потребление исходного соединения (3). Реакцию останавливали при добавлении насыщенного раствора бикарбоната натрия и смесь экстрагировали EtOAc (20 мл ×5). Объединенную органическую фазу сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Неочищенный продукт очищали экспресс-хроматографией, при этом получали 4-ацетилфениловый эфир метилкарбаминовой кислоты (4) в виде твердого вещества белого цвета. 100% (ELSD), m/e: 194 (M+1).
Стадия 2
Смесь 4-ацетилфенилового эфира метилкарбаминовой кислоты ((4), 750 мг) гидрохлорида семикарбазида (669 мг, 6 ммоль) перемешивали в этаноле (10 мл). Затем в смесь добавляли каталитическое количество уксусной кислоты (0,1 мл) и реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 3 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры, полученное кристаллическое вещество отделяли фильтрованием и высушивали в вакууме, при этом получали 4-(1-семикарбазидоэтил)фениловый эфир метилкарбаминовой кислоты (5) в виде твердого вещества белого цвета. 100% (ELSD), m/e: 251 (M+1).
1
H-ЯМР (400 МГц, d-метанол): δ 7,84-7,81 (m, 2H), 7,13-7,11 (m, 2H), 2,79 (s, 3Н), 2,24 (s, 3Н).
Стадия 3
4
Комплекс фосфор/диметилформамид получали при медленном добавлении оксихлорида фосфора (0,41 мл, 4,5 ммоль) при температуре менее 5°С в диметилформамид (0,71 мл, 9,0 ммоль). В полученный комплекс фосфор/диметилформамида при перемешивании порциями добавляли 4-(1-семикарбазидоэтил)фениловый эфир метилкарбаминовой кислоты (5,330 мг, 1,32 ммоль) и реакционную смесь нагревали при 65°С в течение 4 ч. Смесь выливали в лед, охлаждали и нейтрализовали при добавлении раствора гидроксида натрия (20 г в 80 мл воды). Затем смесь нагревали при 55°С в течение 10 мин, охлаждали, подкисляли конц. соляной кислотой и трижды экстрагировали EtOAc (50 мл). Объединенные органические слои промывали водой, солевым раствором и сушили над MgSO. Остаток фракционировали экспресс-хроматографией на колонке (элюент: EtOAc/гексан, 2:5), при этом получали 4-(4-формил-1Н-пиразол-3-ил)фениловый эфир метилкарбаминовой кислоты в виде твердого вещества желтого цвета. 96% (ELSD). m/e: 246 (M+1).
Стадия 4
Раствор 4-(4-формил-1Н-пиразол-3-ил)фенилового эфира метилкарбаминовой кислоты ((6), 35 мг, 0,142 ммоль), (R)-1-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)-2-метилпиперазина ((7), 34 мг, 0,14 ммоль) и ледяной уксусной кислоты (17 мкл) в ДХМ (5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем в смесь добавляли одной порцией триацетоксиборгидрид натрия (120 мг, 0,6 ммоль), полученную смесь нагревали при 40°С в течение 4 ч и охлаждали до комнатной температуры. Неочищенный остаток фракционировали методом препаративной ЖХВР (элюент: уксусная кислота), при этом получали 4-(4-(((R)-4-(5-(трифторметил)пиридин-2-ил)-3-метилпиперазин-1-ил)метил)-1H-пиразол-3-ил)фениловый эфир метилкарбаминовой кислоты в виде твердого вещества белого цвета. 100 (ELSD), m/e: 475 (M+l).
1
Н-ЯМР (400 МГц, d-метанол): δ 8,25 (s, 1Н), 7,67 (d, 2H, J 8,0 Гц), 7,63 (m, 1H), 7,12 (d, 2H, J 8,4 Гц), 7,74 (d, 1H J 9,2 Гц), 4,62 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 3,78 (s, 2H), 3,10 (t, 2H, J 12 Гц), 2,97 (m, 1H), 2,70 (s, 3Н), 2,56 (s, 3H, примесь ацетата-элюента при проведении ЖХВР), 2,52 (m, 1H), 2,32 (m, 1H), 1,14 (d, 3H, J 6,8 Гц).
Пример 3
4-[3-(4-Имидазол-1-илфенил)-1H-пиразол-4-илметил]-2-метил-1-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин
Стадия 1
4
4
3
2
2
В раствор трет-бутилового эфира 3-метил-4-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин-1-карбоновой кислоты ((9), 200 мг, 0, 58 ммоль) в дихлорметане (3 мл) добавляли ТФУ (1 мл) и реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель удаляли в вакууме и остаток растворяли в 1,2-дихлорэтане (3 мл). В раствор добавляли 3-(4-бромфенил)-1Н-пиразол-4-карбоксальдегид (132 мг, 0,53 ммоль) и триацетоксиборгидрид натрия (223 мг, 1,05 ммоль) и реакционную смесь нагревали при 50°С в течение ночи. Затем смесь охлаждали, реакцию останавливали при добавлении насыщенного раствора NHCl, экстрагировали AcOEt, экстракт сушили (NaSO) и концентрировали. Продукт очищали методом ТСХ (элюент: EtN/MeOH/CHCl, 3:5:92), при этом получали 4-[3-(4-бромфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-2-метил-1-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин.
Стадия 2
2
2
3
3
Высушенную в сушильном шкафу колбу Шленка, снабженную магнитной мешалкой, несколько раз вакуумировали и заполняли сухим и чистым аргоном. Затем в колбу помещали CuO (2,1 мг, 0,01 ммоль), гидразон салицилового альдегида (7,9 мг, 0,06 ммоль), имидазол (30 мг, 0,44 ммоль), CsCO (171 мг, 0,52 ммоль) и 4-[3-(4-бромфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-2-метил-1-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин (140 мг, 0, 29 ммоль), колбу вакуумировали и заполняли аргоном. Затем в смесь добавляли безводный и дегазированный ацетонитрил (1 мл) в атмосфере аргона, колбу герметично закрывали под давлением аргона и смесь нагревали при 85°С в течение 2 сут. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, разбавляли AcOEt, суспезию фильтровали через слой целита и фильтрат концентрировали. Неочищенный остаток фракционировали методом препаративной ЖХВР. Полученную соль ТФУ нейтрализовали раствором NaHCO, при этом получали (R)-4-[3-(4-имидазол-1-илфенил)-1Н-пиразол-4-илметил]-2-метил-1-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин.
1
4
Н-ЯМР (400 Гц, MeOH-d): δ 8,24 (s, 1H), 8,17 (s, 1H), 8,02 (d, 2H, J 8,8 Гц), 7,62-7,56 (m, 5H), 7,13 (s, 1H), 6,72 (d, 2H, J 9,2 Гц), 4,52 (s, 1H), 4,07 (d, 1H, J 12,8), 3,41 (s, 2H), 3,08 (td, 1H, J 12,8, J 3,2), 2,96 (d, 1H, J 11,2), 2,83 (d, 1H, J 11,2), 2,21 (dd, 1H, J 11,2, J 4,0), 2,02 (td, 1H, J 11,2, J 3,2), 1,15 (d, 3H, J 6,4).
Пример 4
4-[3-(6-Хлорпиридин-3-ил)-1Н-пиразол-4-илметил]-2-(R)-метил-1-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин
Стадия 1
В раствор 5-ацетил-2-бромпиридина (1 г, 5 ммоль) в безводном этаноле (20 мл) добавляли гидрохлорид семикарбазида (0,61 г, 5,5 ммоль) и уксусную кислоту (1 мл) и реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 3 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры, осадок отделяли фильтрованием и высушивали в вакууме, при этом получали 5-ацетил-2-бромпиридинсемикарбазон. МС: m/е 257 (М+1).
Стадия 2
3
3
2
3
2
4
ДМФА (0,54 мл, 7 ммоль) и POCl (0,65 мл, 7 ммоль) отдельно охлаждали при 0°С, а затем POCl добавляли по каплям в ДМФА. В полученную реакционную смесь медленно добавляли раствор 5-ацетил-2-бромпиридинсемикарбазона (600 мг, 2,33 ммоль) в ДМФА (5 мл). Полученную суспензию нагревали до комнатной температуры, а затем при 70°С в течение 3 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры, выливали в лед и подщелачивали раствором NaCO. Затем смесь нагревали при 60°С в течение 10 мин, охлаждали и экстрагировали EtOAc. Объединенный органический слой промывали водой, сушили над NaSO, фильтровали и упаривали. Остаток фракционировали экспресс-хроматографией (элюент: EtOAc/гексан, 1:1), при этом получали 3-(6-хлорпиридин-3-ил)-1Н-пиразол-4-карбальдегид. МС: m/е 208 (М+1).
Стадия 3
2
2
2
4
3
1
Раствор 3-(6-хлорпиридин-3-ил)-1Н-пиразол-4-карбальдегида (110 мг, 0,53 ммоль), 2-(R)-метил-1-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазина (120 мг, 0,49 ммоль) и ледяной уксусной кислоты (0,2 мл) в безводном 1,2-дихлорэтане (3 мл) перемешивали при 50°С в течение 30 мин. Затем в смесь добавляли триацетоксиборгидрид натрия (210 мг, 1 ммоль) и полученную смесь нагревали при 50°С в течение 3 ч. Смесь охлаждали до комнатной температуры, добавляли ледяную воду и раствор экстрагировали CHCl. Объединенные органические экстракты промывали водой, сушили над NaSO, фильтровали и упаривали. Остаток фракционировали методом молекулярно-ситовой ЖХВР. Полученный трифторацетат нейтрализовали раствором карбоната натрия, при этом получали 4-[3-(6-хлорпиридин-3-ил)-1Н-пиразол-4-илметил]-2-(R)-метил-1-(5-трифторметилпиридин-2-ил)пиперазин. МС: m/е 437 (М+1). Н-ЯМР (400 МГц, CDOD): δ 9,0 (s, 1H), 8,45 (d, 1H, J 8,0 Гц), 8,33 (s, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,70 (d, 1H, J 8,0 Гц), 7,53 (d, 1H, J 8,0 Гц), 6,81 (d, 1H, J 8 Гц), 4,62 (ушир., 1H), 4,20 (ушир., d, 1H), 3,6-2,8 (т, 5Н), 2,4-2,0 (m, 2Н), 1,16 (d, 3Н, J 7 Гц).
Соединения формулы I, приведенные в таблице, получали по методикам, описанным в вышеуказанных примерах, из соответствующих исходных материалов.
Методы анализа
Соединения по настоящему изобретению анализировали по способности ингибировать ITPKb по следующей методике.
Очистка ITPKb
Последовательность ДНК, кодирующей фрагмент ITPKb мыши (аминокислоты 640-942), амплифицировали из полноразмерного конструкта в вектор экспрессии млекопитающих pKDNZ методом ПЦР. Последовательность 3'-праймера включала стоп-кодон и выступающий сайт, доступный рестриктазе PacI, Продукт гидролизовали ферментом PacI перед встраиванием в плазмиду МН4, которую получали гидролизом ферментами PmlI и PacI. При клонировании в плазмиду МН4 к N-концевому участку области трансляции присоединяли последовательность MGSDKIHHHHHH. Мутантные ферменты получали сайт-специфичным мутагенезом с использованием набора реагентов Stratagene Quikchange.
600
ITPKb экспрессировали в Escherichia coli (штамм НК100). Обычно партию клеток объемом 4 л культивировали в среде LB, содержащей ампициллин (0,1 мкг/мл), при 30°С до плотности 0,5 А, а затем индуцировали L-арабинозой (0,02%) в течение 6 ч. Клетки собирали центрифугированием, осадок ресуспендировали в 50 мл буферного раствора следующего состава: 50 мМ трис, рН 8, 100 мМ NaCl, 1 мМ ТСЕР и 0,1 мг/мл лизоцим, содержащего одну таблетку полного набора ингибиторов протеаз (фирма Roche). Клетки разрушали при обработке ультразвуком и дебрис удаляли центрифугированием при 35000 g в течение 40 мин.
Первичную очистку проводили с использованием трех последовательно соединенных колонок, заполненных Ni-сефарозой (Hi-Trap HP, объем 1 мл, фирма Amersham). После нанесения супернатантов колонки промывали буферным раствором (20 мМ трис, рН 8,0, 20 мМ имидазол, 10 об.% глицерин и 1 мМ ТСЕР), а затем элюировали продукт в градиенте концентрации имидазола (до конечной концентрации 200 мМ).
2
3
Фракции, содержащие ITPKb, идентифицировали электрофорезом в ДСН/ПААГ, фракции а-е, содержащие очищенный продукт, концентрировали и с использованием колонок centriprep 20 (15 кДа) заменяли буферный раствор на раствор следующего состава: 20 мМ трис, рН 8, 200 мМ KCl, 5 мМ MgCl, 0,5 мМ ДТТ, 10% глицерин, 1 мкМ IP и 20 мкМ АТФ, при этом конечная концентрация белка составляла 7 мг/мл.
Определение активности ITPKb биохимическими методами
2
Активность ITPKb оценивали по снижению уровня АТФ с использованием набора реагентов Kinase-Glo (фирма Promega). Реакцию проводили в буферном растворе следующего состава: 50 мМ трис, рН 8,0, 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 10% гдицерин, 5 мМ MgCl, 1 мкМ АТФ и 10 мкМ 1Рз (фирма Alexis Biochemicals). В реакционную смесь объемом 40 мкл добавляли 50 нл раствора ингибитора, а затем 10 мкл раствора очищенной киназы ITPKb (конечная концентрация 60 нМ). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 60 мин и реакцию останавливали при добавлении равного объема реагента Kinase-Glo (фирма Promega). Люминесценцию измеряли на люминометре (фирма Molecular Devices Acquest).
50
По результатам ингибирования фосфорилирования IP3 соединения формулы I предпочтительно характеризуются величинами IC менее 500 нМ, предпочтительно менее 250 нМ, более предпочтительно менее 100 нМ.
Измерение внутриклеточного уровня IP3, IP4 и IP5 методом ЖХВР
4
2
4
3
4
4
2
4
3
4
Клетки Jurkat получали из коллекции АТСС (клон Е6-1) (www.ATCC.org Cat#TIB-152). Суспензию 10 клеток в 1 мл среды RP Ml-1640, не содержащей инозита, инкубировали в присустввии 3Н-миоинозита (15 мкКи) в инозите при 37°С в течение 6 ч. Затем суспензию клеток разбавляли 4 мл среды RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС, и инкубировали в течение ночи при 37°С. Суспензию клеток концентрировали, клетки ресуспендировали в 1 мл среды RPMI-1640, содержащей 10% ЭТС, и добавляли 1 мкл раствора ингибитора в ДМСО. Затем добавляли 50 мкг ОКТ3 и 10 мкг анти-СВ28-человека (фирма BD Pharmingen, клон CD28.2) и инкубировали в течение 5 мин при 37°С. Суспензию клеток концентрировали и реакцию останавливали при ресуспендировании клеток в 100 мкл ФСБ в 350 мМ HCl. Затем экстракты центрифугировали для удаления белков и клеточного дебриса. Содержание в экстрактах меченых инозит-полифосфатов определяли методом ЖХВР (колонка Partisphere SAX, 15 см×4,6 мм, элюент: градиент от буферного раствора А (10 мМ (NH)HPO+HPO, рН 3,35), до буферного раствора В (1,7 М (NH)HPO, рН 3,35, +HPO), по следующей программе: 0-100% В (0-12.5 мин), 100% В (12-5-25 мин), 0-100% А (25-30 мин), 100% А (30-45 мин). Радиоактивность определяли на проточном детекторе β-Ram системы IN/US.
50
По результатам ингибирования превращения IP3 в IP4 соединения формулы I предпочтительно характеризуются величинами IC менее 1 мкМ, более предпочтительно менее 500 нМ.
Подразумевается, что примеры и варианты осуществления изобретения приводятся только для иллюстрации, а их различные модификации или изменения в пределах сущности и объема указанной заявки и прилагаемых пунктов формулы изобретения представляются очевидными для специалиста данной области. Все публикации, патенты и заявки, цитированные в описании, включены в описание в качестве ссылки в полном объеме.