БЫСТРЫЙ БИОСЕНСОР СО СЛОЕМ РЕАГЕНТА
FAST BIOSENSOR WITH REAGENT LAYER

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области биосенсоров. В частности, настоящее изобретение связано со способами и системами регистрации исследуемых веществ, используемыми, например, при качественной или количественной регистрации биологических, химических или биохимических частиц, а также со средствами совершенствования таких способов и систем регистрации.
Известный уровень техники
Обычно биосенсоры - это устройства, которые позволяют качественно или количественно регистрировать молекулы-мишени, также называемые аналитами, такие как, например, белки, вирусы, бактерии, клеточные компоненты, клеточные мембраны, споры, ДНК, РНК и т.д., в жидкостях, таких как, например, кровь, сыворотка крови, плазма, слюна, экстракт ткани, интерстициальная жидкость, экстракт клеточной культуры, питательный экстракт, питьевая вода.
Почти во всех случаях биосенсор включает в себя поверхность, на которой имеются специфические регистрирующие элементы для захвата аналита. Следовательно, поверхность сенсорного устройства может быть видоизменена путем присоединения к ней специфических молекул, способных связать молекулы-мишени, находящиеся в жидкости.
Один из способов измерения состоит в подсчете помеченных молекул, связавшихся с определенными участками биосенсора. К примеру, молекулы могут быть помечены магнитными частицами или частицами, а эти частицы или частицы могут быть обнаружены магнитным сенсором. В другом варианте количество аналита может быть определено с помощью флюоресценции. В этом случае сам аналит может нести флюоресцентную метку, или, в другом варианте, может быть проведена дополнительная инкубация с флюоресцентно помеченным вторичным регистрирующим элементом.
В большинстве биосенсоров сенсорный чип снабжен сухим реагентом, а поверхность детектора покрыта биологически активным поверхностным слоем. Реагент может, к примеру, включать в себя метки, связанные с биологически активными агентами, например антитела к медицинскому препарату. Когда тестируемая жидкость начинает поступать, сухой реагент растворяется и смешивается с жидкостью. После этого жидкость транспортируется к поверхности сенсора и смачивает поверхность сенсора. Метки, так же как сенсор, подвергаются действию молекул препарата. Это влияет на связывание регистрируемых меток с поверхностью сенсора.
Электрохимические биосенсоры известны, например, из US 20050016844 A1, в виде тестовых полосок, в которых сухой растворимый слой нанесен рядом с электродами или на них. Слой обычно включает в себя химические компоненты для реакции с аналитом или с молекулой-мишенью, чтобы создать электрохимический сигнал, свидетельствующий о наличии аналита в жидкости образца, такие как один или более ферментов, коферментов, кофакторов, буферных солей и вспомогательных веществ для усиления свойств или характеристик реагентов, таких как де- и регидротация. Последние обычно используются для регистрации аналитов, присутствующих в относительно высоких концентрациях в образце.
Сущность изобретения
Цель настоящего изобретения - получить хорошие способы и системы для регистрации биологических, химических и/или биохимических частиц.
Данная цель достигается с помощью описанных ниже устройств и способа.
Настоящее изобретение относится к регистрирующей системе для регистрации по меньшей мере одной молекулы-мишени, причем регистрирующая система содержит как минимум один сенсорный чип и предназначена для получения как минимум одной метки для возможности регистрации на основе метки, упомянутый сенсорный чип содержит регистрирующую поверхность как минимум с одним растворимым слоем, содержащим реагент, этот растворимый слой обеспечивает взаимодействие как минимум одной метки как минимум с одной молекулой-мишенью, таким образом обеспечивая возможность регистрации сигнала об регистрации на основе метки.
Преимущество вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что быстрая регистрация с высокой чувствительностью достигается путем использования биосенсоров на основе меток. Преимущество отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что может быть достигнуто быстрое растворение реагента. Также преимущество отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что может быть достигнуто быстрое смешивание реагента с жидкостью. Также преимущество отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что реагент располагается близко к области регистрации. Кроме того, преимущество отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что высокая концентрация мобильного реагента может быть получена в области регистрации, что позволяет достигнуть более высоких показателей связывания или несвязывания на поверхности сенсора.
Преимущество отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения заключается в простоте обработки. Так как сенсорный чип и регистрирующая система могут содержать все необходимое для регистрации, не нужно обеспечивать никакие жидкости, кроме образца.
Преимущество отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что для тестирования необходим очень маленький объем образца. Преимущество отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что эта регистрирующая система может содержать матрицу сенсорных чипов для так называемого сенсорного мультиплексирования, которое позволяет проводить независимые анализы параллельно. Различные сенсоры могут быть использованы для мультианалитной регистрации, например, чтобы служить в качестве положительного или отрицательного контроля, в калибровочных целях и/или для параллельного скрининга. Преимущество отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что проблемы перекрестной реактивности или перекрестного загрязнения устранены или уменьшены, поскольку у реагентов недостаточно времени, чтобы достигнуть соседних сенсоров благодаря ограниченной толщине слоя реагента и малой длительности проверки.
Система регистрации может содержать любой подходящий детектор для регистрации как минимум одной метки, при этом магнитный или оптический особенно предпочтительны. Преимущество такой системы в том, что образцы с низкой концентрацией аналита, то есть, например, ниже 1 ммоль/л, могут быть исследованы безошибочно. Регистрирующая система может содержать возбуждающее устройство для возбуждения меток. Возбуждающее устройство может представлять собой источник облучения. Возбуждающее устройство также может быть устройством для возбуждения электромагнитного поля.
Первый растворимый слой может иметь толщину в диапазоне с нижним пределом 0,1 мкм, желательно 1 мкм и верхним пределом в 150 мкм, более желательно 50 мкм, еще более желательно 15 мкм. Упомянутая толщина в данном применении может быть средней толщиной слоя. Толщина слоя зависит от пористости слоя, типа анализа, скорости растворения и скорости транспорта в жидкости (пассивного транспорта путем диффузии или активного транспорта с помощью возбуждения). В случае более пористых слоев эффективнее использовать более толстый слой, чем в случае менее пористых слоев, чтобы получить достаточно материала реагента на поверхности для биосенсорного анализа. В случае более толстых слоев эффективнее применять активный транспорт, чтобы ускорить достижение реагентом поверхности сенсора. В случае очень тонких растворимых слоев, вероятность столкновений метка-поверхность выгодно растет относительно столкновений метка-метка в жидкости. Уменьшение количества столкновений метка-метка снижает частоту возникновения агрегаций меток при проведении теста, что может повысить количественную точность и воспроизводимость анализа с метками размером с наночастицу.
Регистрирующая система может содержать матрицу сенсорных чипов для так называемого сенсорного мультиплексирования. Разные сенсоры могут быть использованы, к примеру, для того, чтобы регистрировать разные биологические молекулы, чтобы служить положительным или отрицательным контролем, или с целью калибровки. Благодаря очень тонкому слою и короткому времени проведения анализа, у реагентов недостаточно времени для того, чтобы достигнуть соседних сенсоров, что приводит к устранению или уменьшению проблемы перекрестной реактивности или перекрестного загрязнения.
Как минимум первый растворимый слой может быть однородным. В противном случае он может быть неоднородным слоем, например, состоящим из островков, полосок и других структур или узоров.
Слой также может быть нанопористым и/или микропористым, для лучшего растворения. Преимущество отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что требуется небольшое количество реагента.
Сенсорный чип, кроме того, может включать в себя второй слой для удержания или иммобилизации захватывающих зондов на регистрирующей поверхности сенсорного чипа. Такая регистрирующая система делает возможным отделение помеченных мишеней от непомеченных путем захвата либо связанных, либо несвязанных с регистрирующей поверхностью фракций. В работе с иммобилизованными зондами для захвата также есть преимущество более легкого мультиплексирования (то есть определения различных мишеней в одно и то же время) за счет их нанесения по образцу.
Зонды для захвата могут быть предназначены для удержания или иммобилизации по меньшей мере одной метки или продукта взаимодействия по меньшей мере одной метки как минимум с одной молекулой-мишенью. Такое удержание или иммобилизация может происходить на регистрирующей поверхности сенсорного чипа.
Сенсорный чип, кроме того, может включать в себя как минимум один калибровочный слой для обеспечения реагентов калибровки, при условии, что калибровочный слой растворимый и предназначен для обеспечения калибровки. Преимущество в том, что таким образом может быть получена точная регистрирующая система. Кроме того, преимущество состоит в том, система калибровки может быть включена в состав сенсорного чипа регистрирующей системы.
Сенсорный чип, кроме того, может включать в себя как минимум один защитный слой, расположенный поверх как минимум первого растворимого слоя, для обеспечения защиты, причем защитный слой должен быть растворимым.
Такая регистрирующая система делает возможным длительное сохранение сенсорного чипа, таким образом уменьшая количество нерабочих чипов после их хранения. Множественные слои обеспечивают многофункциональность, например, может быть изготовлен буферный слой, не содержащий биологически активных веществ, чтобы заблокировать связывание каких-либо меток с биологически активными веществами в процессе изготовления, или слой, содержащий калибровочные материалы, или покрывающий слой, действующий как защитный отделимый слой против загрязнения, например, органическими загрязнителями, выделяемыми окружающими материалами картриджа в процессе хранения.
По меньшей мере одна метка может содержаться как минимум в первом растворимом слое. Преимущество отдельных вариантов осуществления в том, что сенсорный чип включает в себя ограниченное число различных частей, таким образом сокращая требуемые при производстве усилия.
Как минимум первый растворимый слой регистрирующей системы в настоящем изобретении может включать в себя растворимую матрицу, содержащую один или более модуляторов вязкости, модуляторов поверхностного натяжения, регуляторов клейкости, регуляторов pH, блокирующие материалы, загустители, пленкообразователи, стабилизирующие агенты, буферы, детергенты, гелеобразующие агенты, наполнители, разрушающие пленки агенты, пигменты, тиксотропные агенты, защитные агенты, или гидратирующие агенты/растворители. Другие растворимые слои также могут включать в себя подобную растворимую матрицу.
Регистрирующая система может содержать сенсорный чип, включающий в себя как минимум один слой, обеспечивающий быстрое растворение, позволяющий избегать агрегации меток как минимум внутри первого слоя, сохранять биологическую активность по меньшей мере одной метки и обеспечивающий взаимодействие как минимум одной метки с мишенью в оптимальных или весьма благоприятных условиях.
Регистрирующая система в настоящем изобретении может включать в себя как минимум один реагент, который может представлять собой или содержать фермент, кофермент, кофактор, витамин, минерал, субстрат фермента или ингибитор фермента. Такая регистрирующая система может включать в себя сенсорный чип, содержащий по меньшей мере один слой, в свою очередь, содержащий реагенты для того, чтобы обеспечить взаимодействие как минимум одной метки с аналитом в оптимальных или весьма благоприятных условиях. Упомянутый фермент может быть активирующим.
Реагент может быть приспособлен к уменьшению потери биохимической активности благодаря сворачиванию, экранированию, нанесению защитного покрытия или маскированию. Взаимодействие как минимум одной метки с молекулой-мишенью может быть обеспечено с помощью любых подходящих способов анализа, например конкурентного анализа, реакции торможения, метода замещения, сэндвич-анализа, антикомплексного анализа, иммунологического анализа, метода образования кластеров, анализа методом гибридизации или анализа методом блокирования. Преимущество некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения в том, регистрация аналитов может быть основана на динамическом поведении сигнала регистрации.
Регистрирующая система, кроме того, может включать в себя сенсор для определения момента поступления образца на регистрирующую поверхность. Преимущество такого варианта осуществления в том, что регистрация аналитов может быть основана на динамическом поведении сигнала регистрации.
Кроме того, регистрирующая система может включать в себя сенсор, предназначенный для измерения объема жидкости образца или ее части. Такая регистрирующая система обеспечивает точную, например количественную, регистрацию молекулы-мишени, ставшей регистрируемой меткой после взаимодействия с меткой.
Кроме того, регистрирующая система может включать в себя сенсор, предназначенный для измерения локальной плотности как минимум одной метки. Такая система обеспечивает точную, например количественную, регистрацию молекулы-мишени, ставшей регистрируемой меткой после взаимодействия с меткой.
Как минимум одна молекула-мишень может быть продуктом ферментативного преобразования.
Регистрирующая система может кроме того, включать в себя средства анализа для определения количества как минимум одной молекулы-мишени. По меньшей мере одна молекула-мишень может указывать на наличие или отсутствие аналита в образце. Как минимум одна молекула-мишень может быть аналогична аналиту в образце. Регистрирующая система может предоставлять количественные результаты. Последние могут быть получены сравнением разных сигналов регистрации, исходящих от сенсорного чипа.
Средства анализа могут включать в себя средства подсчета ферментативной кинетики. Преимущество вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что может быть исследована ферментативная активность.
Регистрирующая поверхность может быть пористой поверхностью. Преимущество вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что отношение поверхности к объему может быть увеличено.
Как минимум одна метка может быть специфичной для мишени меткой. Специфичная для мишени метка может содержать специфичный для мишени зонд. Специфичный для мишени зонд может быть нуклеотидной последовательностью, содержащей последовательность, комплементарную последовательности внутри упомянутой молекулы. Специфичный для мишени зонд также может быть антителом к мишени.
Как минимум одна метка может быть связана с зондами захвата через молекулярную метку, например через биотиновую метку, способную взаимодействовать с другой молекулярной меткой, такой как стрептавидиновая метка на зондах захвата на регистрирующей поверхности.
Настоящее изобретение также связано со способом регистрации как минимум одной молекулы-мишени в образце, где способ включает в себя: контакт образца с сенсорным чипом, который включает в себя как минимум первый растворимый слой, содержащий реагент, и обеспечивает взаимодействие между как минимум первым растворимым слоем на регистрирующей поверхности и жидкостью образца, таким образом обеспечивая взаимодействие как минимум одной метки как минимум с одной молекулой-мишенью и регистрацию зависимого от метки сигнала регистрации. Способ, кроме того, может включать в себя возбуждение как минимум одной метки, например, путем ее облучения или путем воздействия электромагнитным полем на ее физические свойства. Способ может также включать в себя измерение сигнала сенсора перед взаимодействием, для того чтобы откалибровать чувствительность сенсорного чипа. Такая калибровка может быть калибровкой чувствительности, специфичной для метки и/или калибровкой толщины слоя реагента. Кроме того, способ может включать в себя обработку зависимого от метки сигнала, например для получения количества или концентрации аналита, присутствующего в образце. Способ, кроме того, может включать в себя разделение связанных и несвязанных меток.
Кроме того, настоящее изобретение относится к сенсорному чипу для регистрации как минимум одной молекулы-мишени в образце, причем сенсорный чип предназначен для получения как минимум одной метки для возможности регистрации метки; сенсорный чип содержит регистрирующую поверхность, имеющую как минимум первый растворимый слой, содержащий реагент; этот как минимум первый слой обеспечивает взаимодействие как минимум одной метки как минимум с одной молекулой-мишенью, таким образом, позволяя регистрировать сигнал регистрации на основе метки. Как минимум первый растворимый слой может содержать метку. Сенсорный чип может быть одноразовым.
Настоящее изобретение, кроме того, имеет отношение к комплекту элементов для регистрации как минимум одной молекулы-мишени в образце, где комплект включает в себя сенсорный чип, предназначенный для получения как минимум одной метки для возможности регистрации метки; сенсорный чип содержит регистрирующую поверхность как минимум с одним растворимым слоем, содержащим реагент; этот как минимум первый растворимый слой предназначен для взаимодействия как минимум одной метки как минимум с одной молекулой-мишенью, таким образом, позволяя регистрировать зависимый от метки сигнал и заданное количество по меньшей мере одной молекулы-мишени в буферном растворе. Заданное количество по меньшей мере одной молекулы-мишени в буферном растворе может служить положительным контролем и/или эталоном. Комплект может также включать в себя буферный раствор, не содержащий по меньшей мере одной молекулы-мишени, выступающий в роли отрицательного контроля.
Преимущество некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что используемые химические вещества и уровни их концентраций можно менять для оптимизации нужного биохимического процесса.
Отдельные и предпочтительные аспекты изобретения изложены в сопутствующих независимых и зависимых пунктах. Особенности из зависимых пунктов могут быть скомбинированы с особенностями независимых пунктов и с особенностями других зависимых пунктов по необходимости и не обязательно так, как прямо излагается в этих пунктах.
Принципы настоящего изобретения позволяют создание усовершенствованных способов и устройств для регистрации химических, биологических и/или биохимических частиц.
Упомянутые, и не только, свойства, особенности и преимущества настоящего изобретения станут очевидными из последующего детального описания, предоставленного в сочетании с сопутствующими чертежами, которые показывают, для примера, принципы изобретения. Это описание дано только ради примера, без ограничения объема изобретения. Фигуры, ссылки на которые приводятся ниже, находятся на приложенных чертежах.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 - схематическое изображение регистрирующей системы согласно отдельному воплощению первого аспекта настоящего изобретения.
Фиг.2 - схематическое изображение биосенсорного чипа с растворимым слоем реагента для регистрации, подходящего для регистрирующей системы, основанной на метках, согласно отдельному воплощению первого аспекта настоящего изобретения.
Фиг.3 - схематическое изображение биосенсорного чипа с растворимым слоем реагента для регистрации, подходящего для регистрирующей системы, основанной на метках, согласно другому отдельному воплощению первого аспекта настоящего изобретения.
C
l,m,s
Фиг.4 - график изменений во времени объемных концентраций подвижных меток рядом с регистрирующей поверхностью () как функции времени, получаемого/допустимого в способе регистрации согласно отдельному воплощению второго аспекта настоящего изобретения.
C
l,b,s
Фиг.5 - график изменений во времени локальной концентрации связанных/связывающих меток на поверхности сенсора () как функции времени, получаемого/допустимого в способе регистрации согласно другому отдельному воплощению второго аспекта настоящего изобретения.
Фиг.6 - схема способа регистрации молекул-мишеней в образце согласно настоящему изобретению.
Фиг.7 показывает результаты конкурентного анализа морфина в способе согласно настоящему изобретению.
Фиг.8 показывает эффект поверхностно-активного вещества в высыхающем буфере при конкурентном анализе морфина, основанном на настоящем изобретении.
На других фигурах одинаковые обозначения сносок относятся к таким же или аналогичным элементам.
Подробное описание вариантов осуществления изобретения
Настоящее изобретение будет охарактеризовано с точки зрения отдельных вариантов осуществления и со ссылкой на некоторые чертежи, однако изобретение этим не ограничивается, а только требованиями. Никакие ссылочные обозначения в формуле изобретения не следует интерпретировать как ограничивающие объем изобретения. Описанные чертежи - исключительно схематичные и не ограничивающие. Размер некоторых элементов на чертежах может быть преувеличен и изображен без соблюдения масштаба в иллюстративных целях. Когда в настоящем описании и в требованиях используется термин "содержащий", он не исключает другие элементы или этапы. Там, где используется какое-либо существительное в единственном числе, подразумевается неопределенное число этого существительного, пока обратное не оговорено специально.
Кроме того, термины "первый", "второй", "третий" и другие в описании и требованиях используются для различения схожих элементов и необязательно для описания порядка следования или хронологического порядка. Следует понимать, что такие термины взаимозаменяемы при определенных условиях и что варианты осуществления изобретения, описанные здесь, допускают работу не в таких последовательностях, как здесь описано или изображено.
Более того, термины "верх", "над" и подобные им в описании и требованиях используются в описательных целях и необязательно для описания относительного расположения. Следует понимать, что такие термины взаимозаменяемы при определенных условиях и что варианты осуществления изобретения, описанные здесь, способны работать не при таком пространственном расположении, как здесь описано или изображено.
Последующие термины или определения даются исключительно для того, чтобы помочь пониманию изобретения. Эти определения не следует интерпретировать как имеющие меньший объем, чем понятно среднему специалисту.
Термин "образец", используемый здесь, относится к смеси, которая может содержать как минимум один исследуемый аналит. Образец - это скорее всего жидкость, например, водная смесь. Следовательно, "образец" может интерпретироваться как "жидкость образца".
Термин "аналит", используемый здесь, относится к веществу, наличие, отсутствие или концентрация которого требуют определения согласно настоящему изобретению. К типичным аналитам могут относиться, без ограничения, малые органические молекулы, метаболиты, такие, как глюкоза или этанол, белки, пептиды, фрагменты нуклеиновых кислот, низкомолекулярные лекарственные препараты, антибиотики или медикаменты, молекулы с регуляторным эффектом в ферментативном процессе, такие как промоторы, активаторы, ингибиторы, или кофакторы; вирусы, бактерии, клетки, клеточные компоненты, споры, ДНК, РНК, микроорганизмы и их фрагменты и продукты, или любое вещество, для которого могут быть найдены сайты связывания, связывающие элементы или рецепторы (такие как антитела), или которое имеет антииммунные или антигенетические области связывания. Наличие, отсутствие или концентрация аналита может быть напрямую определена оценкой наличия, отсутствия или концентрации самого аналита, или, в другом варианте, определена косвенно оцениванием наличия, отсутствия или концентрации мишени или молекулы-мишени.
Термин "субстрат", используемый здесь, относится к молекуле или материалу, способному подвергаться ферментативному преобразованию.
Термин "мишень", или "молекула-мишень", используемый здесь, относится к веществу, наличие, отсутствие или концентрация которого определяется согласно настоящему изобретению. Термин "молекула-мишень" должен быть понят широко и может обозначать, к примеру, отдельную молекулу, может обозначать скопление молекул, может обозначать комплекс молекул, может обозначать молекулу, внедренную в другой материал, такой как субстрат, и т.д. Мишень и аналит могут быть идентичны, или мишень может свидетельствовать о наличии или отсутствии аналита. В частности, мишени, такие как белки или ДНК, могут быть характерным компонентом или продуктом аналитов, таких как вирусы, бактерии и другие организмы, и, следовательно, свидетельствовать об их наличии. В тех случаях, когда регистрация включает ферментативный анализ, цель может быть продуктом ферментативного преобразования субстрата ферментом и, следовательно, может свидетельствовать о количестве субстрата или об активности фермента. Молекулы-мишени также могут быть полимерами, ионами металлов и низкомолекулярными органическими веществами, такими как токсины, наркотические и взрывчатые вещества, которыми настоящее изобретение, естественно, не ограничивается. В процессе ферментативного анализа мишень может быть помечена для испускания сигнала регистрации, мишень также может быть иммобилизована на регистрирующей поверхности в составе биологически активного покрытия.
Термин "метка", используемый здесь, относится к молекуле или материалу, способным к испусканию сигнала регистрации. Генерация сигнала регистрации включает в себя изменение сигнала. Метки, подходящие для использования в различных системах и способах регистрации, относящихся к настоящему изобретению, многочисленны и подробно описаны в настоящей области техники. Такими метками могут быть оптические метки, радиоактивные метки, магнитные метки и т.д. Метки могут быть прямыми метками, которые могут быть непосредственно зарегистрированы сенсором. В противном случае метки могут быть непрямыми, становиться регистрируемыми в результате процесса последующего развития. Как правило, метка, используемая в способах настоящего изобретения - это специфичная для мишени метка, то есть способная к специфическому связыванию с мишенью. Тем не менее, также предусматривается, что в случаях, когда мишень находится в очищенной форме, этого достаточно для связывания метки с мишенью.
Термин "зонд", используемый здесь, относится к связывающей молекуле, которая специфически связывает молекулу-мишень. Зонды, предусмотренные в контексте настоящего изобретения, включают в себя биологически активные вещества, такие как целые антитела, участки антител, такие как Fab'-фрагменты (антигенсвязывающие домены), одноцепочечные переменные фрагменты, одиночные переменные домены, переменные домены тяжелой цепи (Variable heavy chain domains), антитела тяжелой цепи, пептиды, антигенные детерминанты (эпитопы), мембранные рецепторы или любой вид рецептора, или его часть, субстрат-захватывающие мутантные формы ферментов, целые молекулы антигенов (гаптены) или антигенные фрагменты, олигопептиды, олигонуклеотиды, мимитопы, нуклеиновые кислоты и/или их смеси, способные к селективному связыванию с потенциальной молекулой-мишенью. Антитела могут быть (подняты) до небелковых смесей так же, как до белков и до пептидов. Как правило, зонды являются членами иммунореактивных пар или пар связывания, реактивных по сродству. Природа зонда будет определяться природой регистрируемой мишени. Чаще всего зонд разрабатывается на основе специфического взаимодействия с мишенью, такой как, без ограничения, связь антиген-антитело, комплементарные нуклеотидные последовательности, углевод-лектин, комплементарные пептидные последовательности, лиганд-рецептор, фермент-кофермент, фермент-ингибитор и т.д. Зонды также включают в себя "зонды для захвата" для иммобилизации мишеней и/или помеченных мишеней на регистрирующей поверхности путем актов узнавания или связывания. Зонды и зонды для захвата могут помечаться. В тех случаях, когда молекула-мишень иммобилизована путем связывания с зондом захвата, полученный комплекс упоминается как мишень-захватывающий комплекс. В тех случаях, когда метка, используемая в устройствах и способах настоящего изобретения - специфичная для мишени, это может гарантироваться использованием специфичного для мишени зонда, связанного с меткой. Как правило, в тех случаях, когда мишенью является белок, специфичным для мишени зондом может быть антитело к мишени. В другом варианте, когда мишень представляет собой нуклеотидную последовательность, специфичным для мишени зондом может быть комплементарная олигонуклеотидная последовательность. Термин "аналог мишени", используемый здесь, относится к веществу, которое может связываться с зондом или с зондом захвата хуже, чем сама мишень. Аналог мишени используется в конкурентном анализе в тех случаях, когда мишень определяется на основании конкуренции с аналогом мишени, например при конкурентном связывании с зондом или зондом для захвата. В частности, аналог мишени связывается с зондом или зондом для захвата с уменьшенной силой связывания по сравнению со связыванием мишени с зондом или зондом для захвата.
Согласно первому аспекту, настоящее изобретение предоставляет систему регистрации и/или определения количества как минимум одной молекулы-мишени, и, следовательно, аналита в образце. Такая регистрирующая система может быть, к примеру, системой регистрации химических, биологических или биохимических частиц, чем настоящее изобретение не ограничивается. Регистрирующая система обычно предназначена для использования как минимум для одного сенсорного чипа, предназначенного для получения как минимум одной метки для создания возможности регистрации на основе метки. Сенсорный чип, кроме того, имеет регистрирующую поверхность, включающую в себя по меньшей мере первый слой, причем первый слой должен быть растворимым для того, чтобы предоставить как минимум один реагент для взаимодействия по меньшей мере одной метки по меньшей мере с одной мишенью, таким образом позволяя регистрировать сигнал регистрации на основе метки. Растворимый слой может быть упомянут как растворимый слой реагента, хотя помимо реагента в слое могут находиться также другие компоненты. Термин "растворимый слой", используемый здесь, может относиться к слою, состоящему из растворимой матрицы и, при желании, меток, проб, помеченных проб, мишеней и/или аналогов мишеней. Когда растворимый слой контактирует с жидкостью образца, образец, вероятно, резко подвергается действию мобильных реагентов, то есть в течение короткого времени.
Схематический обзор системы регистрации 100, включающей в себя обязательные и необязательные компоненты, проиллюстрирован на Фиг.1. Система регистрации 100 подходит для регистрации и/или определения количества как минимум одной молекулы-мишени и, таким образом, аналита в образце. Система 100 подходит для регистрации и, факультативно, для определения количества молекулы-мишени или, отсюда, аналита в образце, в силу чего подготовка растворимого слоя, содержащего реагент, на регистрирующей поверхности сенсорного чипа позволяет быстро регистрировать метку как прямой или непрямой показатель присутствия или активности аналита. Как показано на Фиг.1, система регистрации 100 приспособлена для использования как минимум с одним сенсорным чипом 1. Эти и другие дополнительные или необязательные компоненты иллюстративной системы регистрации 100, такие как показаны на Фиг.1, будут описаны ниже более подробно. Сенсорный чип 1 будет описан со ссылкой на Фиг.2 и Фиг.3 в качестве иллюстрации, чем сенсорный чип 1 не ограничивается.
Сенсорный чип 1 может содержать некоторые компоненты, такие как носитель чипа 2, имеющий поверхность 3. Как минимум часть поверхности 3 может быть предназначена для того, чтобы быть местом регистрации с использованием детектора 30. Другими словами, поверхность 3 может содержать регистрирующую поверхность 33, где может осуществляться регистрация на основе метки. Носитель чипа 2 может быть сделан из материала, позволяющего носителю чипа 2 поддерживать различные компоненты, находящиеся в и/или на носителе чипа 2. Он может включать в себя изоляционный материал, хотя настоящее изобретение этим не ограничивается. Пластмассы, такие как виниловые полимеры, полиимиды, полиэфиры и стиролы, могут обеспечивать требуемые структурные свойства. Так как желательно, чтобы сенсорный чип был пригоден для массового производства, его можно изготавливать, например, из достаточно эластичного материала, который можно прокатывать, вместе с тем придающего законченному чипу подходящую жесткость. Носитель чипа 2, следовательно, может содержать гибкий органический материал, например полимерный материал, такой как полиэфир, в особенности высокотемпературные полиэфирные материалы, нафтолят полиэтилена и полиимид, или композиции двух или более из них. Другой особенно желательный материал носитель чипа - это неорганический материал, например полупроводник, такой как кремний, или такие материалы, как стекло.
Поверхность 3 сенсорного чипа обычно может содержать материал носителя чипа, с которым может связываться биологически активный слой зондов для захвата, мишеней или аналоги мишеней, или на котором биологически активный слой иммобилизуется. Поверхность 3 сенсорного чипа 2 может быть пористой поверхностью для того, чтобы увеличить показатель отношения поверхности к объему.
Термин "биологически активное покрытие" может относиться к слою биологически активных веществ, таких как зонды для захвата и/или молекулы-мишени, удержанные или прикрепленные к твердой поверхности, такой как регистрирующая поверхность сенсорного чипа, и способные к связыванию или реагирующие с мишенью или помеченным зондом соответственно. Зонды для захвата и/или молекулы-мишени биологически активного слоя могут быть удержаны или иммобилизованы на поверхности любым известным в настоящей области способом. Эти биологически активные вещества могут быть удержаны или прикреплены к регистрирующей поверхности в сайт-специфическом порядке, что означает, что в соединение включены специфические сайты на этих агентах, например, через непроницаемый для белков слой на субстрате. В другом варианте, поверхность3 может содержать слой металла, например слой благородного металла, покрывающий носитель чипа или его часть.
В соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения, поверхность 3 на носителе чипа 2 включает в себя как минимум один растворимый слой, содержащий реагент, также упоминаемый как растворимый слой реагента 5, принимающий участие в регистрации аналита на основе метки. Такой слой может быть сухим слоем. Обычно как минимум один слой реагента 5 сенсорного чипа 1 может содержать реагенты химической или биохимической природы для реакции с мишенью, чтобы сформировать сигнал регистрации, означающий присутствие аналита в образце. Термин "реагент", используемый здесь, обозначает химический, биологический или биохимический реагент, вступающий в реакцию с аналитом и/или с мишенью, с тем, чтобы произвести регистрируемый сигнал, означающий присутствие аналита в образце. Подходящие реагенты для использования в различных регистрирующих системах и способы настоящего изобретения включают в себя ряд активных компонентов, выбранных с целью определения наличия и/или концентрации различных аналитов. Внутри данного ноу-хау желателен выбор соответствующих реагентов. Как хорошо известно в данной области, существует множество химических веществ, доступных для применения с каждой из различных целей. Их выбор производится в отношении определяемой цели.
Реагент может включать в себя, к примеру, фермент, кофермент, ингибитор фермента, субстрат фермента, кофактор, такой как АТФ, НАДН и т.д. для содействия ферментативным превращениям, витамин, минерал, чем настоящее изобретение не ограничивается. К примеру, в одном предпочтительном варианте осуществления сенсорный чип в настоящем изобретении может включать в себя один или более ферментов, коферментов и кофакторов, которые могут быть выбраны для того, чтобы определить присутствие метаболитов или малых молекул в образце. Кроме того, как минимум первый слой сенсорного чипа 1 может помимо этого содержать метки, буферные соли, детергенты, сахара и т.д.
Как минимум первый слой реагента 5 может быть тонким слоем. Как минимум первый слой реагента 5 должен быть достаточно тонким, чтобы жидкость образца быстро гидратировала или растворила тонкий слой реагента 5. Желательно, чтобы как минимум первый слой реагента 5 имел толщину в диапазоне с нижней границей в 0,1 мкм, желательно 1 мкм и верхней границей в 150 мкм, более желательно 50 мкм, еще более желательно 15 мкм. Толщина, упоминаемая в настоящем изобретении, может быть средней толщиной слоя. Слой реагента 5 может быть фактически однородным, или он может включать структуры или узоры, такие как структура в виде островков или полос, или может в других случаях или дополнительно быть пористым для лучшей растворимости. Далее толщина относится к средней толщине материала в узорах, структурах, островках, полосах и т.д. Слой реагента также может быть пористым для лучшего растворения, например, он может быть микропористым или нанопористым слоем. В процессе производства слой реагента может быть, к примеру, нанесен на охлажденный субстрат для уменьшения взаимодействия между слоем реагента и регистрирующей поверхностью на момент производства. Слой реагента, к примеру, также может быть нанесен с использованием лиофилизации. В предпочтительном варианте осуществления метки 6 содержатся в слое реагента 5 и диффундируют сквозь и внутрь слоя реагента 5 к регистрирующей поверхности 33 при контакте последней с жидкостью образца. Метки 6 будут находиться на маленьком расстоянии для диффузии через тонкий слой реагента, следовательно, диффузия на регистрирующую поверхность произойдет быстро. Кроме того, эффективность захвата будет больше в случае тонкого, чем в случае толстого слоя. Толстому слою нужно будет больше времени, чтобы жидкость образца гидратировала или растворила его, и больше времени потребуется реагенту или меткам 6, чтобы достигнуть регистрирующей поверхности 33. Это может увеличить время определения концентрации аналита и ввести в определение ошибки. Когда используется относительно толстый слой, выгодно применять активный транспорт, чтобы ускорить достижение реагентом поверхности сенсора.
L
L
Dt
1/2
В целях иллюстрации, не ограничивающей теоретически варианты осуществления настоящего изобретения, подходящая толщина растворимого слоя реагента 5 может быть определена на основе закона диффузии. Быстрое растворение и диффузия реагентов - это процесс, носящий характер всплеска. В случае, если диффузия - это основной механизм транспорта (то есть активный транспорт не используется), подходящая толщина слоя  может быть приблизительно вычислена, как указано ниже: ≈().
D
t
L
D
t
D
Где  - константа диффузии реагента в растворенном слое,  - требуемое время реакции. Другими словами, подходящая толщина слоя  может быть приблизительно вычислена как квадратный корень произведения константы диффузии реагента  в растворенном слое и требуемого времени реакции . Константа диффузии , как правило, будет разной для разных (био)химических веществ.
D
D
T
L
D
L
D
T
D
L
T
p
t
p
dp/dt
-10
2
-12
2
2
2
-12
2
b
b
b
Если  порядка 10 м/с, когда реагент высвобожден в жидкость, например, в виде маленького белка, выступающего в роли субстрата для фермента, а требуемое время реакции составляет 1 с, то подходящая толщина слоя примерно равна 10 мкм. Намного более тонкий слой даст сильную временную зависимость от концентрации реагента в процессе реакции. Намного более толстый слой расходует излишне большое количество реагента и, кроме того, создает распределение молекул-мишеней, удаленных от регистрирующей поверхности. Когда реагент в слое реагента 5 связан с более крупным объектом, например, с наночастицей размером в 300 нм,  составляет порядка 10 м/с. При требуемом времени реакции 10 с подходящая толщина слоя составляет около 3 мкм. В варианте осуществления, в котором метки 6 содержатся в слое реагента 5, можно произвести аналогичный расчет. Если диффузия - основной механизм транспорта, продолжительность всплеска или диффузии, таким образом, можно приближенно вычислить как =/, где  - толщина слоя (в метрах),  - константа диффузии меток в жидкости (в м/с), а  - время диффузии слоя, в соответствии с чем можно пренебречь усиленным трением, возникающим благодаря наличию поверхности. К примеру, такие метки, как наночастицы диаметром 300 нм, в жидкости на водной основе обычно могут иметь константу диффузии  порядка 10 м/с. При толщине слоя , равной 3,2 мкм, расчетное время диффузии  составляет примерно 10 с. Отсюда становится очевидным, что продолжительность всплеска Tb зависит от квадрата расстояния, что придает особое значение использованию ультратонких слоев при необходимости сократить время регистрации. Скорость проведения теста, кроме того, ограничена скоростью связывания мишени и пробы захвата. Для данного зонда захвата, такого как антитело, вероятность , что образуется мишень-захватывающий комплекс, например, связь антиген-антитело, возрастает линейно со временем  в пределе <1. Рост вероятности за единицу времени  приводится в уравнении
dp/dt
k
T
on
= [],
k
T
k
T
dp/dt
on
on
5
-1
где  - константа ассоциации для связывания молекулы-мишени с пробой захвата (в л/(моль×с)),  - концентрация мишени в жидкости (в моль/л). К примеру,  = 10 л/моль×с для связи препарат-антитело, а []= 100 нмоль/л дают  = 0,01 с. Это означает, что при вышеуказанных параметрах комплекс мишень-захватчик образуется через 10 с вероятностью 10%.
Как минимум один растворимый слой реагента 5 сенсорного чипа 1 может включать в себя растворимую матрицу 7 или высушенный пористый материал, содержащий реагенты и/или метки, и/или ряд вспомогательных веществ для усиления свойств или характеристик реагента, и/или защитные агенты для сохранения компонентов внутри растворимого слоя 5 на протяжении обработки и хранения. Матрица 7, как правило, может производить быстрое растворение, избегать слипания меток и сохранять биологическую активность веществ. Химический состав может включать в себя вещества, нужные для того, чтобы облегчить размещение смеси реагента на поверхности 3 носителя чипа 2 и для того, чтобы улучшить ее сцепление с поверхностью чипа 3, или для увеличения скорости гидрирования смеси реагента жидкостью образца. Кроме того, слой реагента 5 может содержать компоненты, выбранные с целью усиления физических свойств получаемого в результате высушенного слоя реагента и поглощения жидкого образца для анализа. Примеры вспомогательных материалов, подходящих для использования в смеси реагента, включают в себя модуляторы вязкости, модуляторы поверхностного натяжения, регуляторы адгезии, регуляторы pH, блокирующие материалы, уплотнители, пленкообразователи, стабилизаторы, буферы, детергенты, гелеобразующие агенты, наполнители, агенты, вскрывающие пленки, красители, агенты, обеспечивающие тиксотропию, силикагель и агенты, способствующие растворению и гидратации.
Желательно, чтобы сенсорный чип 1 содержал механизм возбуждения для возбуждения жидкости, в которой имеет место предусмотренная реакция. Возбуждение благоприятно, к примеру, для увеличения скорости, точности, чувствительности и/или специфичности теста, путем смешивания агента в жидкости, транспортировки реагента к области регистрации и/или увеличения его концентрации, а также с помощью строгости теста, которая достигается, например, путем очистки или путем приложения сил электромагнитного напряжения. Следовательно, процесс возбуждения желательно использовать для приготовления реагентов вблизи биосенсорного чипа. Весьма предпочтительный способ возбуждения основывается на магнитном возбуждении. Магнитное возбуждение возможно, если зонды или другие соединения, играющие роль в наблюдаемой реакции, связаны с магнитной частицей, и/или когда нереагирующие магнитные частицы добавлены в реакционную камеру. Следовательно, в весьма предпочтительном варианте осуществления сенсорный чип 1 и/или считывающая система включают в себя как минимум один компонент магнитного возбуждения, такой как электромагнит или токопровод, для создания электромагнитного поля вблизи поверхности сенсора. В случае использования магнитного возбуждения, регистрация тем не менее может осуществляться путем магнитной и/или оптической регистрации с использованием дополнительной оптической метки. Более подробно это описано ниже.
3
4
Сенсорный чип 1, как правило, может принимать как минимум одну метку для регистрации на основе метки после взаимодействия с молекулой-мишенью. В предпочтительном варианте осуществления метки могут находиться как минимум в первом растворимом слое. В противном случае метки могут быть прикреплены к поверхности сенсора в качестве так называемого второго растворимого слоя. Метки также могут доставляться извне сенсорного чипа, например, если жидкость на водной основе содержит метки в соответствующих концентрациях, или как компонент жидкости образца. Метки также могут доставляться из другого положения в камере регистрации или картридже, желательно под контролем механизма возбуждения. Метка(и) предназначена(-ы) для взаимодействия с молекулой-мишенью, которое обычно может осуществляться путем связывания. Путем использования помеченных связывающих молекул, каждый акт связывания или регистрации обычно создает сигнал регистрации и свидетельствует о наличии или отсутствии активности молекулы-мишени. Связывающие и несвязывающие способы, как предусмотрено в настоящем изобретении, включают в себя иммунологический анализ, анализ гибридизации ДНК и анализ на основе рецепторов, которые широко используются в медицинском сообществе как диагностические тесты для широкого спектра молекул-мишеней. Применимые способы анализа также включают в себя сэндвич-анализ, антикомплексный анализ, а также анализ с помощью блокирующих агентов, смотреть к примеру "Immunoassay Handbook", опубликованную Elsevier Science под редакцией Дэвида Уайлда. В сэндвич-анализе с использованием капельных зондов 61 метки 6 обычно держатся близко к регистрирующей поверхности, например, за счет электрических и/или магнитных полей, так чтобы присоединить капельные зонды 61 к регистрирующей поверхности 33 для формирования структур "молекулярных сандвичей" в процессе взаимодействия мишеней с капельными зондами 61 и регистрирующей поверхностью 33. Различные виды (не)связывающих анализов могут задействовать оптические метки, такие как, к примеру, флюоресцентные, хромогенные, рассеивающие, абсорбирующие, преломляющие, отражающие, SERRS-активные или (био)хемилюминесцентные метки, молекулярные маяки, могут использовать радиоактивные метки, могут использовать ферментативные метки или могут использовать магнитные частицы в качестве меток. Оптические метки, как правило, могут испускать свет, различаемый детектором, например, в видимом, инфракрасном или ультрафиолетовом волновом диапазоне. Тем не менее, изобретение этим не ограничивается, и оптические метки в данном применении могут относиться к меткам, излучающим в любом подходящем и регистрируемом волновом диапазоне электромагнитного спектра. Магнитные метки, предусмотренные в контексте настоящего изобретения, включают в себя, без ограничения, металлические или магнитные частицы или наночастицы. Магнитная метка может содержать любые подходящие формы одной или более магнитных частиц, к примеру, магнитных, диамагнитных, парамагнитных, суперпарамагнитных, ферромагнитных, обладающих любыми формами магнетизма, создающего магнитный момент в магнитном поле, либо перманентно, либо временно. Примером подходящего материала магнитных меток могут служить частицы FeO. Размер магнитных меток не принципиально важен в большинстве вариантов осуществления, но для многих применений биосенсоров весьма желательно, чтобы метки были небольшого размера. Предпочитаемые магнитные метки могут иметь размер, в целом выражаемый наибольшим диаметром, в диапазоне от 5 до 5000 нм, желательно от 10 до 2000 нм, более желательно от 20 до 1000 нм, еще более желательно от 50 до 500 нм. Регистрация магнитной метки обычно производится путем применения электрического, магнитного или электромагнитного поля и использования магнитного или немагнитного сенсора. Метка относится к молекулам или материалам, нековалентно связанным с образцом, если не оговорено другое. Метка может быть присоединена к образцу, зонду для захвата, субстрату, мишени или аналиту, желательно ковалентными связями, хотя другие виды связей, такие как водородные связи, также возможны. В зависимости от вида проводимого анализа, помеченные молекулы-мишени либо связываются с неподвижными зондами для захвата (сэндвич-анализ), либо конкурируют с аналогами мишеней за зонды для захвата (конкурентный анализ). После удаления лишних (несвязанных) меток, количество связанных меток измеряется. Таким образом, связывающие виды анализа могут, как правило, вовлекают сцепление помеченных связывающих молекул с твердым субстратом в количествах, отражающих концентрацию или присутствие мишени. В другом варианте помеченные связывающие молекулы, такие как помеченные аналоги мишеней могут быть связаны с регистрирующей поверхностью и вытеснение помеченных аналогов мишеней молекулами-мишенями может приводить к снижению количества меток вблизи регистрирующей поверхности. Описано большое число вариантов методологий связывающего анализа и все они входят в объем настоящего изобретения.
В сенсорном чипе 1, к примеру, возможно, на его регистрирующую поверхность, могут быть нанесены дополнительные слои, например, слой, выполняющий роль защитного слоя, калибровочного слоя или буферного слоя. Защитный слой может обеспечивать защиту отдельных частей сенсорного чипа 1 от внутренних или внешних химических или механических влияний. Калибровочный слой может применяться для калибровки сенсорного чипа в отношении применяемых специфических меток, толщины слоев и т.д. Можно, к примеру, добавить известное количество молекул-мишеней или схожих с мишенями молекул в растворимый слой на сенсорном чипе для достижения такой калибровки. Последнее, таким образом, дает возможность внутричиповой калибровки. Кроме того, может быть применен слой для положительного тестового контроля и/или отрицательного тестового контроля. Такие слои обычно могут обеспечивать необходимые компоненты для проверки сенсорного чипа, вызывая четкий положительный и/или четкий отрицательный ответ, позволяя, таким образом, контроль качества сенсорного чипа 1. Слой буфера обычно обеспечивает буферность между двумя разными слоями, которые не должны или первоначально не должны взаимодействовать друг с другом. Подробные примеры таких слоев будут обсуждаться более подробно в различных вариантах осуществления.
Жидкость образца, которая должна контактировать с регистрирующей поверхностью, может вызывать гидрофильные/гидрофобные силы на смачиваемой регистрирующей поверхности 33. Дополнительный защитный слой может быть нанесен для защиты от сил, вводимых жидкостью образца.
С целью регистрации сигнала на основе метки в систему регистрации 100 может быть включен, кроме того, как минимум один детектор 30 для регистрации меток на поверхности сенсорного чипа 1 или вблизи нее. Такой детектор 30 регистрирующей системы 100 может, таким образом, быть способен регистрировать метки или, точнее, ответ на их возбуждение на регистрирующей поверхности 33. Детектор 30 может быть встроен в носитель чипа 2, в результате чего, таким образом, может быть получен биосенсор технологии "лаборатория-на-чипе", или, в другом варианте, он может быть встроен в систему регистрации 100, приспособленную для включения в нее сенсорного чипа 1. В противном случае система регистрации может быть автономной системой, помещенной на нужную позицию для регистрации на регистрирующей поверхности носителя чипа. В случае системы "лаборатория-на-чипе" активные элементы детектора 30 могут быть расположены на носителе чипа 2 сенсорного чипа, причем зарегистрированный сигнал может быть преобразован и перенесен на внешнее по отношению к сенсорному чипу 1 считывающее устройство. В другом варианте активные элементы детектора 30 могут быть расположены в системе регистрации 100 вне сенсорного чипа. Детектор 30 в этом случае предназначен для регистрации сигнала с регистрирующей поверхности 33. К примеру, при оптической регистрации последнее может быть достигнуто фокусировкой на регистрирующей поверхности 33 и сборе данных с нее.
Как минимум один детектор 30 может быть любым подходящим детектором, например, оптическим детектором для оптической регистрации меток, таких как оптические или магнитные метки и/или магнитным детектором для регистрации магнитных меток. Оптический детектор для регистрации оптических сигналов, например люминесцентных сигналов от оптических меток или непрямых люминесцентных меток от магнитных меток, может представлять собой фотодетектор, прибор с зарядовой связью (ПЗС), прибор с инжекцией заряда (ПЗИ), комплементарный металло-оксидный проводник (КМОП), фотоэлектронный умножитель, лавинный фотодиод, полупроводниковое устройство оптической регистрации, микроскоп или видеокамеру. Как минимум один детектор 30 может быть рядом детекторов, предназначенных для регистрации различных лучей люминесцентного излучения, собираемых с сенсорного чипа 1. Как минимум один детектор 30 может представлять собой многопиксельный детектор или ряд из множества однопиксельных детекторов. Такой детектор может быть, к примеру, прибором с зарядовой связью (ПЗС) или прибором с инжекцией заряда (ПЗИ), рядом фотонных умножителей, рядом лавинных фотодиодов или другим детектором излучения, включающим в себя набор отдельных детекторных пикселов. Желательно, чтобы ширина по крайней мере одного детектора 30 или, в случае применения многопиксельных детекторов, детекторного элемента детектора 30, была такой, чтобы регистрация могла осуществляться на всем сенсорном чипе 1 или сенсорных чипах, или на пространственно определенных областях на сенсорном чипе 1, при этом пространственно определенные области таковы, чтобы почти всегда не более одной полоски или пятна слоя реагента оказывалось внутри зоны, регистрируемой одним пикселом при проверке, позволяющей определить, вызывает ли полоса или пятно на слое(ях) реагента 5 регистрацию метки во время контакта с жидкостью образца.
Как минимум один детектор 30 также может быть магнитным детектором, таким как, например, детектор на основе холловского сопротивления или магнитно-резистивный детектор, такой как, например, АМР (анизотропный магнитнорезистентный) детектор, супермагнитно-резистентный детектор, или ТМР (туннельный магнитно-резистентный) детектор. Магнитные сенсорные элементы на основе других принципов, таких как SQUIDS (сверхпроводящие квантовые интерферометры), также возможно применять в заявленной регистрирующей системе 100. Детектор 30 также может быть основан на других принципах регистрации магнитных частиц и, таким образом, может также быть биосенсором на основе силового датчика (force-amplified biosensor), консольным силовым датчиком, микровесами, измерителем полного сопротивления, или атомно-силовым микроскопом, с помощью которого определяются силы, исходящие от магнитных частиц или на магнитных частицах.
Регистрация магнитных частиц также может осуществляться на основе оптических явлений, таких как рефракция, поглощение, рассеяние, флюоресценция и т.д. Таким образом, детектор 30 может быть оптическим детектором для регистрации магнитных частиц. Обычно детектор 30 может быть связан с детектородвижущим устройством 32 для перемещения детектора 30. Детектородвижущее устройство 32 обычно может быть предназначено для управления детектором 30. Как правило, оно может располагаться вне носителя чипа 2 и даже вне сенсорного чипа и может быть соединяемо с детектором 30. Тем не менее, оно также может быть включено в носитель чипа 2 или в сенсорный чип 1. Детектор может быть приспособлен, например, с помощью установки в правильном положении или при обеспечении дополнительных фокусирующих элементов к регистрации меток или исходящих от них сигналов регистрации на регистрирующей поверхности 33.
Регистрирующая система 100, кроме того, может содержать возбуждающее устройство 31, предназначенное для возбуждения используемых меток. В зависимости от того, какие используются метки, возбуждающее устройство 31 может быть, к примеру, оптическим устройством для возбуждения или магнитным устройством для возбуждения. Возбуждающее устройство 31 можно контролировать устройством для перемещения возбуждающего устройства 34. Оно, вероятно, может располагаться вне носителя чипа 2 и даже вне сенсорного чипа 1 и может быть соединяемо с устройством возбуждения. Тем не менее, оно также может быть включено в носитель чипа или в сенсорный чип 1. Устройство оптического возбуждения может представлять собой, к примеру, установку для облучения, включающую в себя один или более источников облучения, генерирующих луч для облучения образца на сенсорном чипе, содержащем оптические метки. Как минимум одно устройство для облучения 31 может быть любым подходящим для использования в системе оптической регистрации источником облучения, таким как, например, источник света. Устройство для облучения 31 также может содержать источник белого света, который может быть фильтрован на несколько лучей со специфической длиной волны или в специфическом волновом диапазоне. Устройство для облучения 31 также может содержать один или более монохроматических оптических источников, таких как лазеры. Устройство для облучения 31 может включать в себя аргоновые лазеры, диодные лазеры, гелиевые лазеры, лазеры на красителях, титан-сапфировые лазеры, АИГ-неодимовые лазеры (лазеры на алюмоиттриевом гранате с неодимом) и др. Устройство для облучения 31 может содержать настраиваемый источник облучения, такой как, например, настраиваемый полупроводниковый лазер, для последовательной генерации как минимум одного луча, или как минимум один полупроводниковый лазер для одновременной или последовательной генерации одного или более лучей. Можно использовать множество устройств облучения 31 для создания возможности мультиплексирования. Установка для облучения может быть предназначена для генерирования электромагнитного излучения, подходящего для возбуждения меток. К примеру, в том случае, если генерируемое излучение - это флюоресцентное излучение, длина оптической волны возбуждающего излучения обычно может находиться, к примеру, в диапазоне от 200 до 2000 нм, или, к примеру, в диапазоне от 400 до 1100 нм, без ограничения настоящего изобретения. Такая установка может быть встроена в носитель чипа 2 или может быть внешней по отношению к нему; также она может быть встроена в сенсорный чип 1 или быть внешней по отношению к нему. Магнитное устройство для возбуждения может, к примеру, представлять собой электромагнитную установку для генерирования электромагнитного поля для применения электрического или магнитного поля к образцу, содержащему магнитные метки с целью ориентировки магнитных частиц. Магнитное устройство для возбуждения 31 может быть, например, генератором магнитного поля, который создает магнитное поле для намагничивания и ориентирования магнитных меток. Магнитное устройство для возбуждения может быть встроено в носитель чипа 2 или может быть внешним по отношению к нему, также оно может быть встроено в сенсорный чип 1 или быть внешним по отношению к нему. Магнитное устройство для возбуждения может представлять собой электромагнит, катушку с обмоткой без сердечника, прямую проволоку, микропроводник, постоянный магнит, катушку индуктивности. Оно может быть внешним магнитным устройством для возбуждения или может быть объединено с носителем чипа 2.
Как упоминалось выше, детектор 30, устройство для возбуждения 31 и/или перемещающие их устройства 32, 34 могут (необязательно) быть внешними по отношению к сенсорному чипу, или даже внешними по отношению к картриджу 50, содержащему сенсорный чип 1 и устройство для подачи жидкости образца 20 и/или устройство, предназначенное для содержания в себе жидкости образца 11, или устройство, предназначенное для содержания в себе тестовой жидкости 12. Если детектор 30 или устройство для возбуждения 31 находятся вне картриджа 50, в картридже 50 могут быть предусмотрены окна, так чтобы регистрирующее устройство 30 могло производить регистрацию в образце и т.д.
Сигналы, свидетельствующие о регистрации, могут доставляться на схему для анализа, которая может предназначаться для выполнения любых описанных ниже алгоритмов анализа настоящего изобретения.
Кроме того, регистрирующая система 100 может включать в себя схему для анализа 40, предназначенную для обработки сигналов регистрации, или сигналов, соответствующих им. Как правило, она может быть предназначена для выполнения заданных алгоритмов для обработки полученных от детектора результатов. Схема для анализа 40 может быть предназначена для определения концентрации или распределения аналита в образце и/или для обработки полученных сигналов детектора, например, для определения активности фермента. Кроме того, схема для анализа традиционно включает в себя соединение с детекторным устройством 30 для оценки сигнала регистрации, соответствующего концентрации мишени. Концентрация аналита может быть рассчитана путем сравнения сигналов регистрации, исходящих от сенсорного чипа, например, в разные моменты времени при обеспечении образцом сенсорного чипа 1. Схема для анализа 40 может выдать цифровое двоичное значение, показывающее, есть ли помеченная мишень. Система 100, а конкретно схема для анализа 40, может, кроме того, производить статистическую обработку полученных результатов регистрации, например, чтобы сопоставить два различных измерения с целью проверки, повлияли ли слабосвязанные метки на регистрацию. Схема для анализа 40 может также включать устройство, нужное для определения того, что образец был получен сенсором и что количество образца достаточно для тестирования. Схема для анализа 40 может включать в себя устройство для обработки 42, такое как, например, микропроцессор и/или элемент памяти для хранения полученной и/или обработанной информации об оценке. Кроме того, могут быть использованы обычные устройства ввода-вывода. Схема для анализа 40 может контролироваться путем использования соответствующего программного обеспечения или специализированного оборудования для выполнения этапов оценивания. Схема для анализа 40 может, таким образом, быть реализована любым подходящим способом, например, с помощью специализированного оборудования, или с помощью нужным образом запрограммированного компьютера, микроконтроллера или встроенного процессора, такого как микропроцессор, программируемая матрица логических элементов, такая, как PAL, PLA или FPGA или сходная с ними. Схема для анализа 40, как правило, может хранить и отображать результаты анализа на любом подходящем внешнем устройстве 44, таком как устройство визуального отображения, графическое регистрирующее устройство, принтер и т.д., или в другом варианте может передавать данные на отдельное устройство. Схема для анализа 40 также может иметь соединение с локальной вычислительной сетью или глобальной вычислительной сетью для передачи результатов на отдаленный пункт. Схема для анализа 40 может как минимум частично находиться в картридже 50 или при желании может быть расположена вне картриджа 50. Схема для анализа 40 может быть связана с картриджем 50 с помощью подходящих контактов на поверхности картриджа, например с помощью терминалов.
Кроме того, регистрирующая система 100 может включать в себя устройство 10 для содержания жидкостей, например жидкости образца, которая может поступать в одном или более контейнеров, выполняющих роль источников ресурсов для регистрирующей системы. Такое устройство для содержания жидкости 10 может представлять собой устройство 11, предназначенное для содержания исследуемой жидкости образца, то есть специализированный источник 11 образца, в котором предположительно содержится аналит. Устройство 10 для содержания жидкости также может в необязательном порядке содержать как минимум одно устройство 12, предназначенное для содержания контрольного образца, например образца, содержащего в предопределенной концентрации аналит или мишень, служащие, к примеру, в качестве положительного контроля или в качестве эталонного образца, и/или образец, не содержащий исследуемый аналит или мишень, к примеру, "бланк" или отрицательный контроль. Образец - это, вероятнее всего, жидкий образец. Водная смесь весьма подходит для использования в данной регистрирующей системе. В случае если метка предоставляется отдельно, регистрирующая система может (необязательно) включать в себя как минимум один источник меток, не показанный на Фиг.1.
Регистрирующая система 100 может, кроме того, содержать устройство для доставки образца 20 от устройства для содержания образца к сенсорному чипу 1, например, для контакта сенсорного чипа 1 с жидкостью образца. Устройство для доставки образца 20 может включать в себя гравиметрическое питание жидкости и также может включать в себя систему трубок и клапанов, например выбираемых и регулируемых клапанов, для того чтобы обеспечить доставку жидкостей от устройства 11 для содержания жидкости образца и устройства 12 для содержания контрольного образца к сенсорному чипу 1. В другом варианте жидкости могут активно или пассивно выкачиваться из устройств 11, 12 к сенсорному чипу 1. Описанная выше система элементов может быть расположена на картридже 50, например на одноразовом картридже 50. Также можно использовать управляющую схему 22 для управления устройством 20 для доставки образца.
Регистрирующая система 100 может, но не обязана, включать в себя, кроме того, облегчающее растворение устройство 60, для того чтобы способствовать растворению растворимого уровня(ей) и диффузии растворенных компонентов на сенсорный чип 1 или близко к нему. Облегчающее растворение устройство 60 может включать в себя магнитное устройство для возбуждения, нагревательный элемент, или любые другие механические или акустические средства для облегчения растворения и диффузии.
Регистрирующая система 100 может, но не обязана, включать в себя устройство для управления температурой 62, для того чтобы обеспечить соответствующую температуру на сенсорном чипе 1 или вблизи него. Устройство для управления температурой 62 может включать в себя нагревательный и/или охлаждающий элемент, позволяя таким образом управлять температурой сенсорного чипа 1, или жидкостью образца, находящейся в сенсорном чипе 1. Устройство для управления температурой 62 может быть внешним или внутренним по отношению к сенсорному чипу 1, а также внешним или внутренним по отношению к картриджу 50. Можно использовать различные варианты нагревательных и охлаждающих элементов, удобных внутри регистрирующих систем, в том числе, без ограничения, электрические нагреватели, резистивные нагреватели, термоэлектрические нагреватели и охладители (устройства Пельтье), радиочастотные нагреватели с емкостной связью, теплопоглощающие устройства, нагреватели на жидкостных схемах, теплопроводы, химические нагреватели и другие виды устройств. В некоторых вариантах осуществления жидкость внутри регистрирующей системы 100 нагревается путем применения внешнего нагревающего механизма. Также можно применять нагрев с помощью излучения. Устройство для управления температурой также может включать в себя температурный датчик для определения температуры на регистрирующей поверхности 33 или температуры образца вблизи регистрирующей поверхности 33.
В регистрирующей системе 100 может содержаться устройство очистки 64 для очистки регистрирующей системы или ее частей, таких как, к примеру, сенсорного чипа 1 или регистрирующей поверхности33 в сенсорном чипе 1. Очищаемость регистрирующей системы 100 обычно зависит от наличия гладких поверхностей. Поверхности при контакте с биологически активными соединениями желательно могут быть гладкими, доступными для очищающих растворов и легкомоющимися. Выбор материалов для частей регистрирующей системы, которые должны быть устойчивы к широкому спектру уровней pH, позволяет использовать стандартные чистящие растворы для биологических материалов, часто имеющих крайние значения pH. Очищаемость поверхностей также включает в себя их стерилизуемость. В случае плоских систем, стерилизация ультрафиолетом отчасти подходит, но предполагает соответствующую устойчивость системы к ультрафиолетовому излучению. Выбор устойчивых к ультрафиолетовому излучению материалов, составляющих сенсорный чип 1, позволяет применять его обработку ультрафиолетовым излучением в целях стерилизации перед использованием.
В регистрирующую систему 100, кроме того, при необходимости может быть включен датчик для измерения объема, а также поверхностной плотности жидкости, содержащей метки, на поверхности биосенсора. Последнее может осуществляться путем оптического измерения, измерения давления, измерения объема в устройстве 10 для доставки жидкости или путем определения наличия жидкости и/или расхода жидкости в различных частях устройства доставки жидкости 20. Время доставки жидкости к поверхности сенсора может также быть определено, например, с помощью изменений емкостного сопротивления или температуры. Последние могут предоставлять дополнительную информацию о времени реакции люминесцентных меток и/или они могут быть служить вкладом в управление детектором 30, возбуждающим устройством 31 или в ответный сигнал контроллеру 22 для управления устройством 20 для доставки жидкости. Время доставки жидкости на регистрирующую поверхность 33 также может быть учтено схемой для анализа 40.
Также можно использовать возбудитель, предназначенный для дальнейшей стимуляции взаимодействия как минимум одной метки как минимум с одной молекулой-мишенью. Таким возбудителем может быть магнитное, электрическое или акустическое поле. Оно может улучшать динамические характеристики анализа, повышая интенсивность связывания. Возбудитель также может быть применен при процессах удаления или повышения точности, для того чтобы повысить специфичность и чувствительность анализа.
Dt
D
t
1/2
Сенсорный чип 1 может содержать матрицу сенсоров, для так называемого сенсорного мультиплексирования. Различные сенсоры могут быть использованы для регистрации различных биологических молекул, могут применяться в качестве положительного или отрицательного контроля или могут применяться в калибровочных целях. В современных биосенсорах различные сенсоры обычно подвергаются воздействию одних и тех же реагентов. Это создает проблемы перекрестной реактивности или перекрестного загрязнения, например из-за того, что одни и те же метки могут связываться с разными поверхностями сенсора. Благодаря ограниченному количеству реагентов, ввиду того, что слой реагента, как правило, может быть тонким и благодаря малому времени анализа, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения у реагентов может быть недостаточно времени для того, чтобы достигнуть соседних сенсоров по субстрату. Путь составит примерно (), где  - коэффициент диффузии,  - время. Благодаря малому времени реагенты, таким образом, не достигнут соседних сенсоров, что устраняет проблемы перекрестной реактивности и перекрестного загрязнения. Это увеличивает потенциал мультиплексирования биосенсора.
Настоящее изобретение, таким образом, также предусматривает скрининг образца. Неограничивающим примером скринингового исследования может служить следующий. Ряд сенсоров снабжен реагентами, характеризующимися тем, что эти реагенты различаются по отсутствующему в каждом из них (био)химическому компоненту, и тем, что сенсор дает положительный сигнал, когда образец обеспечивает недостающий компонент, и тем, что сенсор дает отрицательный сигнал, когда образец не содержит недостающий компонент. Так, образец может быть проверен, к примеру, на наличие кофакторов.
Дальнейшие варианты осуществления и примеры согласно первому аспекту представлены ниже.
Согласно второму аспекту, настоящее изобретение предоставляет способ регистрации как минимум одной молекулы-мишени в образце. Этот способ обычно позволяет посчитать количество молекул-мишеней в образце. Такой способ регистрации мишени обычно включает в себя контакт образца с сенсорным чипом 1, содержащим как минимум один слой с реагентом. Характерно что способ, кроме того, включает в себя обеспечение взаимодействия между как по меньшей мере первым слоем реагента и жидкостью образца, что приводит к растворению первого слоя реагента и взаимодействию как минимум одной метки как минимум с одной молекулой-мишенью. Последнее изображается в качестве примера на Фиг.6, показывающей схему способа 200 согласно второму аспекту настоящего изобретения, иллюстрирующую как установленные, так и необязательные этапы примерного способа регистрации.
На первом этапе 202, образец и сенсорный чип, содержащий как минимум первый растворимый слой реагента 5, приводятся в соприкосновение друг с другом. Как правило, это включает в себя соприкосновение жидкости образца, например капли жидкости образца, с сенсорным чипом 1 с помощью гравитационных или капиллярных сил. В другом варианте, жидкость образца также может быть активно или пассивно подведена к сенсорному чипу 1. Соприкосновение образца с сенсорным чипом 1, таким образом, может включать в себя управление устройством подачи образца.
На втором этапе 204, способ включает в себя обеспечение взаимодействия между как минимум первым растворимым слоем реагента 5 и жидкостью образца, что приводит к растворению первого растворимого слоя реагента 5 и к взаимодействию как минимум одной метки 6 как минимум с одной молекулой-мишенью. Реакция между как минимум первым растворимым слоем 5 и жидкостью образца, таким образом, - это, как правило, реакция между растворимым слоем реагента 5 на регистрирующей поверхности и жидкостью образца. Последняя, следовательно, делает возможным возникновение свободного реагента на/вблизи регистрирующей поверхности 33 сенсорного чипа 1. Это, как правило, делает возможным взаимодействие как минимум одной метки 6 как минимум с одной молекулой-мишенью. Этот способ может, кроме того, включать в себя обеспечение взаимодействия между другими растворимыми слоями и жидкостью образца, таким образом, обеспечивая выполнение остальных этапов взаимодействия. Метки могут находиться в растворимом слое реагента или в другом растворимом слое, приводя, таким образом, к образованию свободных меток для взаимодействия как минимум с одной молекулой-мишенью. В противном случае метки могут появляться другим путем, например при введении жидкости, содержащей метки, в сенсорный чип 1. Как правило, для появления возможности взаимодействия между растворимыми слоями и жидкостью образца, мениск жидкости образца должен пройти растворимый слой. Последнее, скорее всего, занимает намного меньшее время, чем общее время анализа. Как правило, смачивание происходит при прохождении мениска жидкости образца через регистрирующую поверхность.
На третьем этапе 206, регистрация сигнала регистрации на основе метки может выполняться с помощью любого подходящего способа регистрации в соответствии с выбранными метками. Предусмотренные подходящие способы регистрации включают в себя способы оптической регистрации, такие как, без ограничения, флюоресцентная регистрация и усиленное поверхностью резонансное комбинационное рассеяние (surface-enhanced resonance Raman scattering, SERRS), а также способы магнитной регистрации, например, использующие датчик Холла, эффект супермагнитнорезистивности, туннельной магниторезистивности (ТМР) или анизотропной магниторезистивности (АМР). Характерно, что такой способ, следовательно, может включать в себя, на что указывает этап 208, возбуждение меток, позволяющее создать сигнал от метки, требующий определения. В зависимости от вида использованных меток, такое возбуждение может представлять собой облучение образца или возбуждение в образце электромагнитного поля для того, чтобы сориентировать магнитные метки. Если возбуждение - это этап облучения, то обычно используемый луч подходит, например, по длине волны или интенсивности, для возбуждения оптических меток, используемых в сенсорном чипе 1. Если возбуждение - это этап возбуждения электромагнитного поля, то электромагнитное поле обычно выбирается так, чтобы вызывать ориентацию магнитных меток, регистрируемых магнитным сенсором в регистрирующей системе.
Способ регистрации 200 для регистрации и/или количественного определения может, кроме того, включать в себя этап обработки сигнала регистрации на основе метки. Последнее иллюстрируется на этапе 210. Обработка может включать в себя получение качественного или, вероятнее, количественного результата от сигнала регистрации на основе метки. Обработка может быть основана на предопределенных алгоритмах, использующих нейронную сеть или любым другим подходящим путем. Такая обработка может быть автоматизирована.
В одном варианте осуществления, на этапе, предшествующем регистрации, может быть выполнен необязательный этап отделения 212, на котором происходит отделение несвязанных или слабосвязанных меток от связанных меток. Последнее может быть преимуществом для достижения более точных измерений, так как позволяет избегать влияния несвязанных или слабосвязанных меток на результаты регистрации. Устранение несвязанных или слабосвязанных меток может гарантироваться в случае устранения несвязанных или слабосвязанных меток от связанных меток, связанных с регистрирующей поверхностью через биологически активное вещество или молекулярную метку. Последнее может быть выполнено путем приложения физических или химических сил, таких как поле потока/обтекания, акустическое поле, сила гравитации, электромагнитное поле, для перемещения и/или удаления несвязанных меток. Примерная техника отделения включает в себя очистку, осаждение, центрифугирование, обработку ультразвуком, применение магнитных и/или электромагнитных полей и градиентов/напряженностей полей.
В некоторых вариантах осуществления этап отделения связанных меток от несвязанных может не требоваться. Это может достигаться, например, путем обеспечения зонда, представляющего собой молекулярный маяк, который содержит олигонуклеотидные последовательности, комплементарные последовательности ДНК мишени и который двойственно помечен пигментом и гасителем люминесценции (например, Dabcyl) на каждом из двух своих концов. В его рабочем состоянии сигнал от пигмента гасится гасителем люминесценции. Когда комплементарная последовательность гибридизирует с ДНК мишени, маяк включается, и сигнал может быть зарегистрирован. Одним из примеров молекулярных маяков могут служить маяки усиленного поверхностью резонансного комбинационного рассеяния, которые представляют собой двойственно помеченные зонды с разными красителями на каждом из их двух концов. Второй пигмент специально создан так, чтобы быть способным иммобилизовывать олигонуклеотидные зонды на регистрирующей поверхности, представляющей собой соответствующую металлическую поверхность. В отсутствие ДНК мишени, маяк иммобилизуется в "выключенном состоянии" на металлической поверхности, что позволяет зарегистрировать спектр усиленного поверхностью резонансного комбинационного рассеяния (SERRS), соответствующего обоим красителям. Когда комплементарная последовательность гибридизирует с ДНК мишени, маяк включается и один из пигментов удаляется с поверхности. Это приводит к изменению сигнала SERRS. В другом отдельном варианте осуществления, в котором не требуется разделение связанных и несвязанных меток, могут быть представлены по меньшей мере две флюоресцентных метки, образующих пару резонансного переноса энергии флюоресценции (РПЭФ), причем одна метка связывается с меткой регистрации, а другая остается подвижной в жидкости. Только когда две метки, находящиеся в непосредственной близости друг к другу, флюоресцируют на комбинационной длине волны РПЭФ, пара регистрируется.
Способ регистрации 200 может также включать в себя стадию калибровки. Следовательно, сенсорный сигнал может быть измерен перед смачиванием и после смачивания, для того чтобы откалибровать чувствительность сенсорного чипа к метке и/или толщину слоя реагента. Такой этап калибровки может быть выполнен с использованием предопределенных алгоритмов, и результаты такого этапа калибровки могут быть приняты во внимание на этапе обработки сигнала, например, при подсчете результатов регистрации.
Способ регистрации 200, в котором раствор предварительно инкубирован с магнитными частицами, согласно настоящему изобретению, может быть скомбинирован с магнитной экстракцией и анализа методом захвата. Непосредственно после смачивания частицы переносятся к поверхности сенсора. Всплеск реагента может усилить процесс регистрации, к примеру, путем локального обеспечения биохимических условий (например, pH, солей, органических молекул), оптимизирующих скорость, чувствительность и специфичность (не)связывания с поверхностью сенсора.
Согласно третьему аспекту, настоящее изобретение предоставляет сенсорный чип 1 для регистрации одного или более аналитов в образце. Конкретнее, сенсорный чип 1 предусмотрен для использования в регистрирующей системе 100, как описано выше. Сенсорный чип 1 для регистрации и/или подсчета количества как минимум одной молекулы-мишени в образце может быть предназначен для того, чтобы содержать как минимум одну метку 6 для предоставления возможности регистрации на основе метки, а также для того, чтобы содержать регистрирующую поверхность 33 для обеспечения как минимум первого растворимого слоя. Первый растворимый слой 5 обычно включает в себя как минимум один реагент и, как правило, также может быть назван растворимым слоем реагента 5. Растворимый слой реагента 5, как правило, расположен на регистрирующей поверхности 33. Когда растворимый слой реагента 5 приводится в контакт с жидкостью образца, он обычно позволяет как минимум одной метке 6 осуществить взаимодействие как минимум с одной молекулой-мишенью, таким образом создавая возможность регистрации сигнала регистрации на основе метки. Другие свойства, особенности и преимущества, вероятно, такие же, как описано для сенсорного чипа в первом аспекте настоящего изобретения.
Согласно четвертому аспекту, настоящее изобретение предоставляет комплект элементов, включающий в себя не менее одного сенсорного чипа, аналогичного описанному в первом аспекте настоящего изобретения, в сочетании с количеством, например, предопределенным, по крайней мере одной молекулы-мишени в буферном растворе. Последнее может служить положительным контролем и/или эталоном. Выбираемая молекула-мишень, или выбираемые молекулы-мишени, в буферном растворе обычно зависят от вида проводимого с сенсорным чипом анализа. Такой сенсорный чип 1, к примеру, подходит для анализа ферментативной активности фермента, который может преобразовывать субстрат фермента, внедренный в слой реагента на сенсорном чипе, хотя настоящее изобретение этим не ограничивается и может применяться при любых подходящих методах анализа, описанных в любых аспектах настоящего изобретения и/или в любых представленных вариантах осуществления и/или примерах. Кроме того, такой комплект элементов (необязательно) включает в себя другие компоненты, такие как предопределенное количество контрольной жидкости, предусматривающей измерение отрицательного контроля, при котором сенсорный чип должен специфически обеспечивать отрицательный ответ регистрации, показывающий отсутствие регистрируемой молекулы-мишени. Различные аспекты настоящего изобретения сейчас будут показаны рядом отдельных вариантов осуществления и примеров, которыми настоящее изобретение не ограничивается.
В первом отдельном варианте осуществления представлена регистрирующая система, описанная выше для первого аспекта, причем регистрирующая система 100 предназначена для использования как минимум с одним сенсорным чипом 1, сенсорный чип 1 включает в себя первый растворимый слой реагента 5 и второй растворимый слой. Отчасти ссылаясь на Фиг.2, предпочтительный вариант осуществления сенсорного чипа 1 представлен в соответствии с настоящим изобретением. Сенсорный чип 1 включает в себя носитель чипа 2, имеющий поверхность 3 с регистрирующей поверхностью 33, а первый растворимый слой реагента включает в себя растворимую матрицу 7 и как минимум одну метку 6. Метка 6 снабжена зондом 61. Подходящий первый растворимый слой реагента 5 обычно может налегать на регистрирующую поверхность 33, обеспечивая близость меток к регистрирующей поверхности 33, сокращая, таким образом, время регистрации. Этот первый растворимый слой 5 может быть приведен в соприкосновение с жидкостью образца соответствующими устройствами, например, с помощью гравитационного или капиллярного воздействия, или, выборочно, с помощью сжатия, или под действием вакуума. Регистрирующая поверхность 33 сенсорного чипа 1 в данном варианте осуществления покрыта вторым слоем 4, представляющим собой биологически активный слой, например, содержащий зонды захвата 41, такие как антитела или олигонуклеотиды, мишени или аналоги мишеней. Носитель чипа 2 в данном примере включает в себя регистрирующее устройство 30 для регистрации опознаваемого сигнала, свидетельствующего о наличии аналита в образце.
Второй отдельный вариант осуществления описывает регистрирующую систему, описанную выше для первого аспекта, причем такая регистрирующая система предназначена для того, чтобы включать в себя как минимум один сенсорный чип 1, содержащий первый растворимый слой 5, второй, биологически активный поверхностный слой 4 и как минимум третий растворимый слой. Отчасти со ссылкой на чертеж на Фиг.3, желаемый вариант осуществления сенсорного чипа 1 показан для использования в соответствии с настоящим изобретением. Сенсорный чип 1, вероятно, может включать в себя носитель чипа 2 с поверхностью 3, включающей в себя регистрирующую поверхность 33, первый растворимый слой реагента 5, содержащий растворимую матрицу 7 и как минимум одну метку 6; второй слой, который представляет собой поверхностный биологически активный слой 4, и как минимум один третий, промежуточный, слой.
C
l,m,s
Примерами как минимум одного третьего слоя служат слой 8 и слой 9, выполняющие роль защитного и/или калибровочного, и/или буферного слоев. Другими словами, могут использоваться защитные слои, могут использоваться слои, вспомогательные при калибровке и относящиеся к калибровочным слоям, а также могут использоваться буферные слои. Применять множественные слои на биосенсоре может быть выгодно. В качестве примера слой 8 может быть внесен как буферный слой, к примеру, как слой, не содержащий биологически активных компонентов, чтобы подавить связывание меток 6 с зондами захвата 41, прикрепленными к поверхностному слою 4, в процессе изготовления биосенсора. В качестве другого примера материалы для калибровки могут быть добавлены в сенсорный чип для того, чтобы обеспечить калибровку регистрации с помощью сенсорного чипа 1. В качестве еще одного примера можно добавить покрывающий слой 9, который действует как защитный и отделимый слой против загрязнений, например, органическими загрязнителями, выделенными окружающими материалами картриджа в процессе обработки или хранения. Когда сенсорный чип 1 входит в соприкосновение с жидкостью образца, растворимая матрица слоя обычно может растворяться, таким образом предоставляя реагенты, метки и (необязательно) калибровочные реагенты. Приготовление дополнительных слоев, как показано в настоящем изобретении, может позволить хранение меток 6 в растворимой матрице 7 без их связывания с зондами захвата 41, присоединенными к поверхностному слою, в процессе изготовления биосенсора. Последнее желательно, так как биологические молекулы и/или связи могут изменяться при хранении и обработке, например, приводя к образованию неспецифических связей между метками 6 и поверхностью сенсора 3, которые делают биосенсор непригодным для анализов методом замещения, реакции торможения, конкурентного анализа или других видов анализа. Следовательно, преимущество отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения состоит в том, что связи метка-поверхность фактически образуются непосредственно в процессе анализа с тестовой жидкостью. В третьем отдельном варианте осуществления представлен сенсорный чип, аналогичный описанному, согласно первому аспекту или согласно либо первому, либо второму варианту осуществления, причем биосенсор представляет собой многослойный биосенсор, а молекула-мишень регистрируется с помощью анализа типа анализов методом замещения, реакции торможения или конкурентного анализа. Образцом может быть, к примеру, слюна для испытания неправильного применения препарата, чем настоящее изобретение не ограничивается. Поверхность сенсора 3 может обеспечиваться аналогами препарата 41 на регистрирующей поверхности 33. Сенсорный чип 1, как правило, содержит первый растворимый слой реагента 5, при этом метки 6 могут быть внедрены в его растворимую матрицу 7. Метки 6 могут быть снабжены одним или более антител к лекарственным препаратам 61. Когда жидкость образца поступает на сенсорный чип, матрица 7, как правило, растворяется в жидкости и метки 6 становятся подвижными. Фиг.4 схематически изображает изменение объемной концентрации  подвижных меток 6 вблизи поверхности сенсора 3 как функцию времени. Длительность и форма реакционного пика определяется, к примеру, толщиной слоя 5, скоростью растворения материала слоя 5, а также скоростью перемещения меток 6 в жидкости образца.
C
p
p
dp/dt
l,b,s
На Фиг.4 стрелка 150 показывает момент смачивания регистрирующей поверхности, а стрелка 152 показывает момент, в который метки становятся подвижными. Став подвижными, метки 6 попадают на поверхность сенсора 3 в очень высокой концентрации. Время, нужное меткам 6 для того, чтобы связаться с регистрирующей поверхностью 33, очень короткое, благодаря высокой кратковременной концентрации меток и высокому биологическому сродству меток 6 к аналогам лекарственных препаратов на регистрирующей поверхности 33. Стрелка 154 показывает момент, в который метки в большой степени рассеиваются от регистрирующей поверхности или связываются с ней. При этом антитела 61 подвергаются воздействию молекул лекарственного препарата, то есть молекул-мишеней, в растворе. Когда молекулы препарата связываются с антителами 61, связывание меток 6 с аналогами препаратов 41 на регистрирующей поверхности 33 ослабляется и/или происходит отсоединение меток 6 от аналогов препарата на регистрирующей поверхности 33. Изменения во времени для меток 6, связанных с регистрирующей поверхностью 33, схематически изображены на Фиг.5 для низких, умеренных и высоких концентраций молекул-мишеней в растворе. Образец смачивается в первый момент времени, показанный стрелкой 150. Для данного слоя реагента 5 и данных меток 6 продолжительность и форма поверхностной концентрации связанных меток , связанных с поверхностью сенсора, как функция времени для разных концентраций аналитов показана на Фиг.5. Кривая 162 показывает концентрацию связанных меток для низких концентраций аналитов, показывая, что концентрация связанных меток остается высокой. Кривая 164 показывает концентрацию связанных меток для более высоких концентраций аналитов, показывая, что концентрация мобильных меток несколько падает после достижения пика. Кривая 166 показывает ожидаемую концентрацию связанных меток для еще более высокой концентрации аналитов, показывая, что падение концентрации связанных меток еще сильнее после достижения пика. Когда поверхностная концентрация меток 6 измерена сенсором, концентрация мишени может быть получена из временной зависимости от сигнала и/или величины сигнала через некоторое время. Регистрация меток 6, как правило, может происходить на регистрирующей поверхности 33 способом оптической или магнитной регистрации. К примеру, магнитный сенсор 30, такой как холловский сенсор, может быть встроен в носитель чипа 2 для регистрации связывания магнитной метки 6 с регистрирующей поверхностью 33. Количество зарегистрированных меток 6 прямо или обратно пропорционально количеству молекул-мишеней и отсюда может быть определена концентрация мишени. Скорость проверки ограничена скоростью ассоциации между препаратом и антителом. Для данного антитела, вероятность  того, что образуется связь препарат-антитело возрастает линейно со временем в пределе <1. Рост вероятности за единицу времени  дан в уравнении:
dp/dt
k
T
on
= []
k
T
dp/dt
on
5
где  - константа ассоциации для связывания препарата с антителом, равная, к примеру, 10 л/(моль×с) для связи препарат-антитело, [] - концентрация препарата в жидкости, равная, к примеру, 100 нмоль/л дают  = 0,01/с. Это означает, что через десять секунд связи препарат-антитело образуются с вероятностью 10%.
p
dp/dt
В четвертом отдельном варианте осуществления представлен такой сенсорный чип, как показано на Фиг.2, причем биосенсор покрыт растворимым слоем реагентов, а молекула-мишень регистрируется с помощью ферментативного анализа. Слой реагентов вероятно может быть тонким слоем, как описано выше; также может быть обеспечено множество слоев. Образец может, к примеру, быть жидким образцом, в котором содержится фермент для регистрации ферментативной активности этого фермента. Обычно активность фермента может быть выражена в единицах, определяемых как количество фермента, необходимое для преобразования определенного количества субстрата за определенный период времени. Специфическая активность также может быть выражена в единицах на объем образца. Фермент может быть отщепляющим ферментом, таким как протеаза или нуклеаза, причем активность отщепления можно определить. В контексте настоящего изобретения, ферменты определяются как биологически активные агенты, которые усиливают расщепление, например с помощью эндопептидаз или эндонуклеаз, дробление, например с помощью экзопептидаз или экзонуклеаз, или модификации (например, с помощью киназ или фосфатаз, с помощью оксидаз или редуктаз) субстрата с образованием продукта, т.е. продукта расщепления. Фермент также может быть модифицирующим ферментом, таким как киназа или фосфатаза, который добавляет или удаляет биохимические агенты, такие как фосфатная группа. Другими словами, молекула-мишень также может быть специфически преобразована ферментом оксидазой или редуктазой. Таким образом, фермент может, к примеру, находиться в тонкой пленке высушенного реагента на регистрирующей поверхности. После смачивания мишень, как правило, подвергается преобразованию и один из продуктов реакции регистрируется или обрабатывается далее. Таким образом может быть определена модификационная активность. Как правило, расщепление может приводить к высвобождению как минимум двух частей продукта. Субстрат фермента может представлять собой белок или пептид, так как они могут легко быть преобразованы в продукт путем ферментативной реакции. Альтернативные субстраты ферментов могут быть другими биологическими и химическими веществами, такими как нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы и хелаторы. Субстрат фермента может быть частью слоя реагента 5 или может быть иммобилизован на поверхности сенсора 3. Слой реагента 5, как правило, способен растворяться в жидкости образца, действию которой он подвергается. Реакция, протекающая вблизи поверхности сенсора 3, представляет собой показатель активности специфического фермента в жидкости образца. Скорость ферментативного преобразования может быть оценена следующим образом. Для данного субстрата фермента в устройстве, вероятность p того, что субстрат преобразуется под действием фермента, растет линейно со временем в пределе <1. Рост вероятности за единицу времени  дается в уравнении:
dp/dt
k
E
on
= [],
k
E
dp/dt
E
dp/dt
L
L
Dt
D
t
D
on
6
1/2
-10
2
-12
2
где  - константа конверсии, равная, к примеру, 10 л/(моль×с), [] - концентрация фермента в жидкости образца, равная, к примеру, 100 нмоль/л, дают  = 0,1/с. Это означает, что вероятность преобразования субстрата через одну секунду составляет 10%. Когда концентрация фермента [] в жидкости образца составляет, к примеру, 1 мкмоль/л,  = 1/с, что означает, что через 1 с субстрат фермента вблизи регистрирующей поверхности подвергается преобразованию с вероятностью почти 100%. Как описано выше, быстрое растворение и диффузия реагентов - это процесс, имеющий характер всплеска. Когда диффузия представляет основной механизм транспорта, подходящая толщина слоя  может быть вычислена по формуле ≈(), где  - константа диффузии активного компонента в растворенном реагенте, а  - искомое время реакции. Когда субстрат фермента - малый белок, D составляет порядка 10 м/с, после того как белок выделяется в раствор. При необходимом времени реакции, равном 1 с, подходящая толщина слоя составляет около 10 мкм. Существенно более тонкий слой даст сильную временную зависимость от концентрации субстрата фермента в процессе реакции. Существенно более толстый слой поглотит чрезмерно большое количество реагента и, кроме того, создаст распределение молекул-мишеней, например, продуктов ферментативного преобразования субстрата, удаленных от поверхности сенсора 3. Когда фермент связан с более крупным объектом, например с наночастицей размером в 300 нм,  составляет порядка 10м/с. При требуемом времени реакции 10 с, подходящая толщина L составляет примерно 3 мкм.
В первом отдельном примере четвертого варианта осуществления реагент может содержать помеченный субстрат фермента (6, 61). Поверхность сенсора 3 обычно покрыта субстрат-связывающим агентом 4, например, противосубстратными антителами. Такие агенты могут быть внедрены в растворимый защитный слой, например, содержащий молекулы сахаров для гидратации. Обычно после смачивания сенсорного чипа 1 жидкостью образца два события могут происходить параллельно. Ферменты из образца обычно могут отщеплять метку 6 от помеченного субстрата фермента (6, 61), таким образом освобождая субстрат, в то время как противосубстратные антитела 41 на поверхности сенсора 3 захватывают и помеченный субстрат фермента (6, 61), и (расщепленный, лишенный метки) субстрат фермента 61. Таким образом, расщепляющая активность исследуемого фермента сокращает возможность связывания меток 6 с поверхностью сенсора 3 и/или освобождает почти все связанные метки 6 с поверхности сенсора 3.
Во втором отдельном примере четвертого варианта осуществления поверхность сенсора 3, как правило, покрыта продукт-связывающими агентами 41, избирательно связывающими продукт ферментативного преобразования.
В третьем отдельном примере четвертого варианта осуществления субстрат фермента 61 в слое реагента 5 предварительно связан с меткой 6 и несет молекулярную метку, такую как биотин. Поверхность сенсора 3 может быть покрыта связывающимся с молекулярной меткой агентом, таким как стрептавидин.
В четвертом отдельном примере четвертого варианта осуществления слой реагента 5 может содержать метку 6, предварительно связанную с субстрат-связывающим агентом 61, таким как противосубстратное антитело. Поверхность сенсора 3 покрыта субстратом фермента 41. Метка 6 может быть молекулярно помеченной меткой, например биотином. Поверхность сенсора 3, как правило, может быть связана с субстратом фермента 41, который снабжен доступным связывающимся с молекулярной меткой агентом, таким как стрептавидин.
В пятом отдельном примере четвертого варианта осуществления слой реагента 5 содержит субстрат фермента 61 с первой и второй молекулярной метками, а также включает в себя метку 6, снабженную агентом, способным связать первую молекулярную метку. Поверхность сенсора 3 связана с зондом захвата 41, который может связать вторую молекулярную метку. Подходящими парами молекулярная метка/связывающий агент могут быть, к примеру, авидин/биотин, стрептавидин/биотин, гаптен/антитело, белок/антитело, пептид/антитело, белок/углевод, белок/белок, нуклеиновая кислота/нуклеиновая кислота, белок/нуклеиновая кислота, гаптен/нуклеиновая кислота.
В шестом отдельном примере четвертого варианта осуществления слой реагента 5 содержит субстрат фермента и продукт ферментативного преобразования регистрируется в конкурентном анализе - анализе методом замещения - реакции торможения, как описано выше.
В седьмом отдельном примере четвертого варианта осуществления слой реагента 5 содержит аналит-специфичный фермент и продукт-чувствительный компонент, предварительно связанный с меткой 6. К примеру, искомым аналитом в образце может быть глюкоза. После смачивания сенсорного чипа молекулы глюкозы в образце подвергаются преобразованию в пероксид водорода под действием глюкозооксидазы, присутствующей в слое реагента 5. Этот продукт окислительной реакции последовательно взаимодействует с чувствительными к окислению агентами, например с остатком цистеина, встроенным в белок, такой как фосфатаза. Иммунноанализ, проведенный с антителами 41, чувствительными к степени окисления легкоокисляемого агента, показывает уровень содержания глюкозы в жидкости образца.
В следующем примере искомый аналит обладает реуляторным действием на ферментативное преобразование и представляет собой, к примеру, промотор, активатор, ингибитор или кофактор. Сухой мультислой реагента содержит фермент и его субстрат. После смачивания биосенсора фермент и субстрат фермента рассредоточиваются в растворе. Следующим шагом образуется продукт фермента со скоростью, зависящей от концентрации аналита в растворе. После чего продукт может быть зарегистрирован. Вероятно, субстрат фермента предварительно связан с меткой регистрации 6, и регистрирующая поверхность 33 снабжена антителами к продукту 41. В другом варианте аналог продукта предварительно связан с меткой регистрации 6 или с регистрирующей поверхностью 33. Вероятно, метка регистрации 6 представляет собой магнитную частицу.
В следующем примере продукт-связывающий агент 61 предварительно связан с метками 6 и аналог продукта 41 находится на поверхности сенсора 3. В дальнейшем примере аналог продукта 61 предварительно связан с метками 6, а поверхность сенсора 3 покрыта продукт-связывающим агентом 41. Как упоминалось выше, применимы также структуры с одной или более молекулярных меток.
Применение следующего желательного варианта осуществления состоит в магнитном возбуждении при процессе диспергирования. Этот процесс также упоминается как процесс ресуспендирования или редиспергирования. В данном варианте осуществления высушенные реагенты диспергируют, в то время как магнитное возбуждение применяется при и/или после редиспергирования. В наиболее предпочтительном варианте осуществления к поверхности сенсора путем применения магнитного поля присоединены реагенты, связанные с магнитными частицами. Оказалось, что такое магнитное возбуждение ускоряет процесс связывания с поверхностью сенсора.
При желании, на следующем этапе возбуждения, несвязанные или неспецифически связанные магнитные частицы могут быть последовательно удалены с поверхности сенсора. Это магнитное возбуждение может нужным образом быть проведено с сенсорным чипом; система считывания, включающая в себя устройство для магнитного возбуждения, расположена на одной стороне поверхности сенсора, а второе устройство магнитного возбуждения расположено на другой стороне поверхности сенсора.
В еще одном примере молекула-мишень представляет собой малую органическую молекулу, как правило, слишком маленькую для того, чтобы быть зарегистриранной с помощью доступных молекул захвата, таких как антитела. В этом случае слой реагента может содержать ферменты и подходящий агент для синтеза, такой, что после смачивания фермент создает комплекс субстрат-мишень, который проще зарегистрировать, например, используя специфичные к мишень-субстратному комплексу антитела.
Согласно пятому воплощению настоящего изобретения, исследуемый аналит - это нуклеотид, а способы изобретения вовлекают использование как минимум одного помеченного аналит-специфичного зонда, представляющего собой нуклеотидный зонд, последовательность которого комплементарна или соответствует хотя бы части исследуемого аналита, в особенности специфичной для аналита последовательности. Этот нуклеотидный зонд связан с меткой для того, чтобы позволить специфическую регистрацию аналита, как описано выше. В регистрирующие устройства также может быть включено управление температурой для регистрации таких нуклеотидов, что определенные температурные условия могут быть благоприятными для соответствующих реакций гибридизации.
В очередном отдельном варианте осуществления, в соответствии с любыми описанными выше вариантами осуществления, растворимый слой на сенсорном чипе может включать в себя известное количество молекул-мишеней или аналогов мишеней для внутричипового калибровочного анализа. Последний позволяет калибровать сенсорный чип, таким образом позволяя получать более точные результаты.
В очередном отдельном варианте осуществления, в соответствии с любыми описанными выше вариантами осуществления, растворимый слой 4, 5 на сенсорном чипе может содержать неактивные вещества 41, 61 и/или ингибитор, и/или блокирующий агент.
В очередном отдельном варианте осуществления, в соответствии с любыми описанными выше вариантами осуществления, растворимый слой на сенсорном чипе может включать в себя зонды для захвата 41, 61, которые взаимно биологически активны, но неактивны для компонентов, в норме присутствующих в исследуемом образце.
В очередном отдельном варианте осуществления, в соответствии с любыми описанными выше вариантами осуществления, растворимый слой на сенсорном чипе может содержать как минимум один компонент, биохимическая активность которого уменьшена, например, благодаря сворачиванию, экранированию, нанесению защитного покрытия или маскированию, или благодаря присутствию защитного агента. Защитный агент может, к примеру, служить для сохранения компонента в процессе обработки и хранения. Растворимый слой на сенсорном чипе также может включать в себя активирующий фермент, например, для того, чтобы отменить действие защитного агента. К примеру, когда поверхность смачивается, этот активирующий фермент диспергирует в растворе и активирует биологически активный компонент.
Различные варианты осуществления настоящего изобретения предусматривают проведение большого количество удобных биотестов быстрым и оправдывающим затраты способом. Множественные хромогенные метки могут быть использованы в технике микрочипов, в проточной цитометрии, в регистрации на основе резонансного переноса энергии флюоресценции (РПЭФ), которая осуществляется благодаря взаимодействию между возбужденными состояниями электронов двух хромогенных молекулах пигмента; в технике регистрации на основе молекулярных маяков, такой как, к примеру, регистрация нуклеиновой кислоты в реальном времени и количественный анализ методом ПЦР в реальном времени, в технике усиленной поверхностью регистрации, такой как усиленная поверхностью (рамановская) комбинационная спектроскопия (SERS, surface-enhanced Raman spectroscopy), техника усиленной поверхностью флюоресценции (SEF, surface-enhanced fluorescence) или техника усиленного поверхностью резонансного комбинационного рассеяния (SERRS); в технике микрожидкостной регистрации и т.д. В некоторых вариантах осуществления регистрирующая система настоящего изобретения представляет собой эпифлюоресцентный биосенсор, что означает, что возбуждающий свет падает на поверхность сверху, но она (система) также может представлять собой трансмиссионный биосенсор, что означает, что возбуждающий свет падает на поверхность снизу и проходит через биосенсор.
Далее изобретение предоставляет способ изготовления системы в соответствии с настоящим изобретением, способ включает в себя этапы:
a) снабжения сенсорного чипа регистрирующей поверхностью,
b) приведения поверхности в контакт с жидкой смесью, содержащей реагент, причем жидкая смесь представляет собой буферную смесь, практически не содержащую поверхностно активных веществ,
c) высушивание буферной смеси с действующим веществом для образования слоя на регистрирующей поверхности.
Неожиданно было обнаружено, что использование высушенной буферной смеси, практически не содержащей поверхностно-активных веществ, таких как Tween, приводит к повышенному специфичному связыванию компонентов-мишеней, таких как магнитные частицы, с поверхностью сенсора. В данном контексте "практически не содержащая поверхностно-активных веществ" означает менее 0,01%, желательно менее 0,001% поверхностно-активного вещества, еще более желательно 0,0001% поверхностно-активного вещества.
Настоящее изобретение также предлагает твердофазную микротехнологию, подходящую для высокопараллельного микропроизводства и высокопараллельной обработки. Это предусматривает мультиплексирование в диагностических тестах. Техника позволяет быстрый отбор параметров реагента, например толщины слоя, состав реагента, комбинации различных слоев. Регистрация может осуществляться сенсорами, встроенными в носитель чипа или с помощью внешних приспособлений (например, путем визуализации).
Преимущество отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что оптимальные условия для анализа создаются мгновенно при контакте жидкости образца и растворимого слоя (слоев) реагента, что уменьшает время, необходимое для анализа и повышает чувствительность и специфичность анализа. Преимущество отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что достигнута оправдывающая затраты регистрация, например, благодаря использованию тонких слоев реагента и, в конечном счете, потребности в минимальных количествах реагентов.
Преимущество отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что на сенсоре или метке в процессе анализа может происходить новообразование поглощающих слоев. Реагент может, к примеру, содержать захватывающий или регистрирующий агент с молекулярной меткой, например биотинилированное антитело или биотинилированный молекулярный маяк, тогда как метка или сенсор содержат агент, связывающийся с молекулярной меткой. Новообразование биологических комплексов может иметь преимущества для короткоживущих комплексов и для комплексов, склонных к образованию неспецифических связей на больших отрезках времени (например, склонных к образованию скоплений частиц, неспецифически связывающихся с поверхностью сенсора).
Преимущество отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения в том, что биосенсор снабжен тонким слоем реагентов на поверхности сенсора. Когда сенсорный чип смачивается жидкостью, реагенты быстро растворяются и поверхность сенсора подвергается действию всплеска реагентов, т.е. поверхность сенсора резко подвергается воздействию реагентов в высокой концентрации. Благодаря тонкому слою и высокой скорости теста, матрица сенсоров может быть получена с использованием различных реагентов и независимых тестов. Применение множественных слоев позволяет проведение внутричиповых калибровочных тестов. Предлагаемый биосенсор имеет потенциал для быстрых тестов, малых затрат реагентов, для мультиплексирования, калибровки и использованию малого объема образца. Другими словами, могут быть достигнуты короткое время проведения тестов и практически мгновенная регистрация метки.
Преимуществом отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения является возможность регистрации малых органических молекул в магнитных биосенсорах. Обычно малые органические молекулы могут быть слишком маленькими для того, чтобы быть зарегистрированными с помощью доступных молекул захвата, таких как антитела, в то время как благодаря ферментативным преобразованиям, к примеру, благодаря слиянию, образуются регистрируемые комплексы. Обеспечивая фермент и/или подходящие агенты для слияния, в слое реагента, можно достигнуть быстрой и чувствительной регистрации.
Другие возможные для достижения соответствующих целей схемы биосенсора с растворимыми слоями реагентов, осуществляющие настоящее изобретение, будут очевидны специалистам в данной области.
Следует понимать, что, хотя предпочтительные, специфичные конструкции и структуры, также как материалы, обсуждались здесь в применении к устройствам, соответствующим настоящему изобретению, различные изменения или модификации формы и деталей могут быть произведены без выхода за рамки сущности и объема настоящего изобретения.
Изобретение проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами.
Пример 1
В качестве модельной системы был использован морфиновый конкурентный анализ, в котором морфин из жидкости образца конкурирует с морфином, иммобилизованным на поверхности сенсора, за сайты связывания на магнитных частицах, соединенных с противоморфиновыми антителами. Нарушенное полное внутреннее отражение (frustrated total internal reflection, FTIR) было использовано для регистрации магнитных частиц на поверхности сенсора, изготовленной методом литья под давлением из циклоолефиновых полимеров. FTIR годно для наблюдения связывания магнитных частиц на поверхности сенсора в реальном времени.
Буферы и реагенты
2
4
2
4
2
3
3
3
MES солевой буфер (25 мМ MES, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 0,05 % Tween20 pH 7,4), боратный буфер (50 мМ бората натрия, 0,05 % Tween20, pH 9), покрывающий буфер (15 мМ карбоната натрия, 35 мМ бикарбоната натрия, 0,05 % азида натрия, pH 9,6 ), высыхающий буфер (50 мМ TRIS-HCl (гидрохлорид), 1 %/5 % БСА (бычий сывороточный альбумин), 5 % трегалоза/сахароза), буфер редиспергирования (50 мМ TRIS-HCl (2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол), 0,1 % БСА, 0,05 % Tween20 pH 8) или (76 мМ NaHPO, 4 мМ KHPO, 400 мМ NaCl, азид, 0,1 % Triton X405, pH 8). БСА-морфиновый раствор (10 мкг/мл БСА-морфина в 15 мМ NaCO, 35 мМ NaHCO, 0,03 % NaN при pH 9,6) и противоморфиновые антитела 1 мг/мл были любезно предоставлены Cozart Bioscience (Oxfordshire, UK). Карбоксил-adembeads 300 нм и буфер хранения были приобретены у Ademtech (Pessac, France). EDC(гидрохлорид N-3-диметиламинопропил-N-этилкарбодимида) и NHS(N-гидроксисукцининимид) были приобретены у Pierce (IL, USA).
Субстрат
Эксперименты были проведены на циклоолефиновом полимере (COP/Zeonex) и полистирольных (литых) субстратах прозрачного пластика с показателем преломления около 1,52. Водные растворы показывают большой угол контакта на этих субстратах (более 90°), который свидетельствует о гидрофобном характере поверхности, что обеспечивает четко определенное расположение растворов.
Биосопряжение
300 нм Магнитные Частицы Carboxyl-Adembeads (Ademtech) были два раза промыты в одном объеме MES солевого буфера с помощью концентратора магнитных частиц (Dynal MPC-1, Концентратор Магнитных Частиц, Dynal Biotech ASA). Частицы были ресуспендированы в MES солевом буфере в соотношении 10 мг/мл (1% твердого веса). С целью активации карбоксильных групп, частицы были проинкубированы в течение 30 минут при температуре 37°C (при взбалтывании на 1000 об/мин) (Termomixer Comfort, Eppendorf, USA) c 40 мг/мл EDC и 40 мг/мл NHS, смешанными в соотношении 1:1 с водой. Активированные частицы были промыты один раз MES солевым буфером, один раз боратным буфером и окончательно ресуспендированы в боратном буфере в соотношении 10 мг/мл. Перед связыванием, во избежание агрегирования, частицы были обработаны звуком три раза по три секунды с 40%-ной амплитудой с помощью ультразвукового зонда (VCX 130, Sonics Vibra-cell, Sonics&Materials, Inc. USA). Противоморфиновые антитела были добавлены к раствору, содержащему частицы в соотношении 2,8 мкг/мл и инкубированы в течение одной ночи (при взбалтывании на 1000 об/мин) при 20°С, после чего обработаны звуком три раза по три секунды с 40%-ной амплитудой с помощью ультразвукового зонда. Для того чтобы инактивировать активные карбоксильные группы, частицы инкубировались с 0,1 М глицином в течение 30 минут (при взбалтывании на 1000 об/мин) при 20°C. После этого покрытые частицы были промыты боратным буфером 2 раза, перенесены в новую пробирку и промыты последний раз в двух объемах буфера хранения. Частицы хранились в буфере хранения в концентрации 10 мг/мл при 4°C.
Анализ
Покрытие поверхности.
Полистироловые субстраты были проинкубированы в течение одной ночи в кондиционированной атмосфере при 4°C с нанесенными на них двумя мкл БСА-морфина с концентрацией 10 мкг/мл в покрывающем буфере. После инкубации поверхность была высушена на воздухе после того, как была промыта 3 раза со 100 мкл PBS (фосфатно-солевой буферный раствор).
Процесс высушивания.
Магнитные частицы, связанные с противоморфиновыми антителами ресуспендировались путем интенсивного перемешивания, и определенное количество было перенесено в чистую пробирку. Магнитные частицы были промыты три раза в высушивающем буфере с использованием концентратора магнитных частиц. Частицы были ресуспендированы при окончательной концентрации 2 % в высушивающем буфере, 1 мкл которого был помещен сверху на БСА-морфиновое покрытие. Высушивание было произведено с использованием силикагелевых пакетов в закрытом контейнере за одну ночь.
Процесс редиспергирования.
Высушенные реагенты редиспергировались путем добавления 13 мкл тестового буфера. После редиспергирования, для ускорения процесса связывания, магнитные частицы притягивались к поверхности путем применения магнитного поля, возбуждаемого электромагнитом, помещенным под поверхностью сенсора. Несвязанные частицы удалялись с поверхности с помощью электромагнита, расположенного над поверхностью. Процессы редиспергирования, связывания магнитных частиц с поверхностью и очистки сопровождались их визуализацией.
3. Результаты
Эксперименты были выполнены с помощью сверхбыстрого морфинового конкурентного анализа с очень тонким слоем сухих реагентов на поверхности субстрата. Для этих экспериментов 2%-ный раствор связанных с антителами магнитных частиц был высушен на покрытом БСА-морфином полистироловом субстрате.
Ресуспендирование 2%-ного слоя магнитных частиц (2 %-ная концентрация магнитных частиц, связанных с противоморфиновыми антителами в 1 %-ном БСА, 5 %-ном (Trehalose), 50 мМ Tris при pH 8,5) в буфере, содержащем 0 нг/мл морфина привело к связыванию магнитных частиц с поверхностью сенсора в процессе редиспергирования. Было обнаружено, что магнитное возбуждение после редиспергирования приводило к росту показателей связывания. Такие связи оказались специфичными, что видно из разницы в количестве магнитных частиц, удержанных на поверхности между ресуспендированием, возбуждением и магнитной очисткой в буфере, не содержащем морфина по сравнению с ресуспендированием, возбуждением и магнитной очисткой в буфере, содержащем 10 нг/мл морфина.
Результаты показали, что для антител, связанных с наночастицами суперпарамагнетиков, расположенных на поверхности, покрытой антигеном, два реагирующих слоя могут быть расположены друг над другом без взаимодействия друг с другом. Кроме того, показан принцип сверхбыстрого (измеряемого секундами) редиспергирования, который представляет легкоосуществляемый способ взаиморасположения биослоев, удобный для биосенсоров требующих короткого времени проведения тестов.
Фиг.7 показывает кривую доза-эффект для зависимости оптического сигнала вследствие связывания магнитных частиц от концентрации морфина.
Было обнаружено, что редиспергирование магнитных частиц в растворе, содержащем морфин показало зависимый от дозы спад сигнала после начала диспергирования и магнитной очистки. Данные результаты показывают, что такая система анализа весьма подходит для расположения слоя связанных с антителами магнитных частиц точно на функционализированной поверхности субстрата.
Пример 2
В качестве модельной системы был использован конкурентный анализ морфина, в котором морфин из образца конкурирует с морфином, иммобилизованном на поверхности сенсора за сайты связывания на магнитных частицах, связанных с противоморфиновыми антителами. FTIR было использовано для регистрации магнитных частиц на поверхности сенсора, отлитой из полистирола.
2
3
3
3
2
2
4
2
4
Для этих экспериментов полистирольные субстраты покрывались двумя мкл БСА-морфинового раствора (10 мг/мл БСА-морфина в 15 мМ NaCO, 35 мМ NaHCO, 0,03 % NaN при pH 9,6) в течение одной ночи в кондиционированной атмосфере при 4°C. После инкубации поверхность промывалась три раза 1 мл HO, и 1 мкл 1 %-ных w/v магнитных частиц, связанных с противоморфиновыми антителами был помещен сверху на БСА-морфиновое покрытие. Частицы были предварительно разведены 1:1 в высыхающем буфере (1 % БСА, 5% трегалозы, 50 мМ Tris при pH 8,5) в присутствии или при отсутствии 0,1 %-ных неионных ПАВ (Tween20). Высушивание магнитных частиц производилось в сухих условиях (силикагелевые пакеты) в течение 12 часов. верхний жидкостный картридж был приклеен на верх оптического картриджа, и редиспергирование сухих реагентов производилось путем добавления 13 мкл тестового буфера (NaHPO 10,76 г/л, KHPO 0,577 г/л, NaCl 23,38 г/л, 0,01 % Na-азид). Оптический сигнал наблюдался в течение одной минуты с использованием камеры на основе ПЗС.
Фиг.8 показывает сигнал FTIR в процессе редиспергирования, возбуждения и магнитной очистки. Было обнаружено, что скорость и уровень редиспергирования 1 %-ного слоя высушенных частиц сравнимо для обоих сушащих буферов и близко к 90 %. Этот результат может быть получен путем измерения оптического сигнала чистой необработанной поверхности и ее сравнения с областью, на которой расположены частицы.
На этапе притягивания магнитные частицы, высушенные в (БТ) буфере, не содержащем Tween20 (тм), достигают поверхности в большем количестве по сравнению с магнитными частицами, высушенными в (Т) буфере, содержащем Tween20 (тм), которые оказываются на поверхности в очень низкой концентрации. Важно отметить, что больше частиц притягиваются к функционализированной поверхности и больше частиц имеют шанс связать антиген.