Патогенетическая значимость системы матриксных металлопротеиназ при плоскоклеточном раке головы и шеи

УДК: 617.51/.53-006.6-092.18

патогенетическая значимость системы матриксных металлопротеиназ при плоскоклеточном раке головы и шеи

И.в. Кондакова, Е.в. Клишо, о.в. Савенкова, д.А. шишкин, Е.л. чойнзонов

НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск 634050, г. Томск, пер. Кооперативный, 5, e-mail: kondakova@oncology.tomsk.ru

Изучена взаимосвязь компонентов системы ММП, включающей протеазы, их тканевые ингибиторы (ТИМП) и индуктор экстраклеточных матриксных металлопротеиназ (EMMPRIN), в опухолевых и стромальных клетках, а также изменение этих параметров при лимфогенном метастазировании. Материалом для исследования послужили 62 послеоперационных образца плоскоклеточных карцином головы и шеи. Исследование экспрессии ММП-1,-2,-9, ТИМП-1,-2 и EMMPRIN проводили иммуногистохимическим методом. Показано, что в плоскоклеточных карциномах головы и шеи экспрессия ММП-1, -2, -9 и ТИМП-1 была значительно выше в строме по сравнению с опухолевыми клетками, в то время как преимущественная экспрессия ТИМП-1 и EMMPRIN наблюдалась в злокачественных клетках. Обнаружены корреляционные связи между экспрессией компонентов системы ММП, позволяющие предположить важную роль EMMPRIN, локализованного на поверхности опухолевых клеток, в экспрессии ММП микроокружением. Зарегистрировано достоверное снижение уровня экспрессии ТИМП-2 в опухолевых клетках и ТИМП-1 в строме при наличии регионарных лимфогенных метастазов. На основании полученных результатов предложена схема вероятной регуляции прогрессии плоскоклеточных карцином головы и шеи компонентами системы ММП.

Ключевые слова: плоскоклеточный рак головы и шеи, лимфогенное метастазирование, матриксные металлопротеиназы, тканевые ингибиторы металлопротеиназ, индуктор экстраклеточных матриксных металлопротеиназ.

PATHOGENETIC SIGNIFICANCE OF THE MATRIX METALLOPROTEINASE SYSTEM IN SQUAMOUS CELL

HEAD AND NECK CANCER I.V Kondakova, E.V Klisho, O.V Savenkova, D.A. Shishkin, E.L. Choynzonov Cancer Research Institute, Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences, Tomsk 5, Kooperativnyper., 634050-Tomsk, e-mail: kondakova@oncology.tomsk.ru

The paper analyses the relationship between the components of the MMP system including proteases, their tissue inhibitors (TIMP) and extracellular matrix metalloproteinase inducter (EMMPRIN) in tumor and stroma cells as well as the changes in these parameters in cases with lymphogenic metastasis. Sixty-two postsurgical specimens of squamous-cell head and neck carcinoma were studied. Expressions of MMP-1,-2,-9, TIMP-1,-2 and EMMPRIN were studied using immunohistochemical method. It was shown that in squamous-cell head and neck carcinomas, the expressions of MMP-1,-2,-9 and TIMP-1were significantly higher in stroma than in tumor cells, while the increased expressions of TIMP-1 and EMMPRIN were observed in cancer cells. There was studied the correlation between expressions of the MMP system components allowing the important role of EMMPRIN located on the cell surface to be suggested. With the evidence of regional lymph nodes, the level of TIMP-2 expression in tumor cells and the level of TIMP-1expression in stromal cells were registered to be significantly decreased. Based on the results obtained, the scheme of regulation of squamous-cell head and neck carcinoma progression by the MMP system components was suggested.

Key words: squamous-cell head and neck carcinoma, lymphogenic metastasis, matrix metalloproteinases, tissue inhibitors of metalloproteinases, extracellular matrix metalloproteinases inductor.

Плоскоклеточный рак головы и шеи, который занимает шестое ранговое место в общей структуре онкологической заболеваемости и составляет в среднем 18-20 %, относится к числу социально значимой онкологической патологии. Несмотря на то, что указанные новообразования относятся к опухолям наружной локализации, они характеризуются частой запущенностью. связанной с бессимптомным течением, выяв-

ляемостью на поздних стадиях и более чем 50 % ежегодной смертностью из-за высоких показателей рецидивирования и метастазирования [2, 4]. Все это обусловливает важность исследования механизмов метастазирования плоскоклеточных карцином головы и шеи.

Известно, что ключевую роль в развитии злокачественных опухолей играют протеоли-тические процессы, которые могут наделять

зо

опухолевые клетки способностью к инвазии и метастазированию [3]. Среди всего множества протеаз особое значение в онкогенезе занимает семейство матриксных металлопротеиназ (MMn), которое имеет большое значение в деградации структурных белков соединительной ткани, таких как коллагены, эластин, протеогликаны, гликопротеины и молекулы межклеточных и белково-клеточных контактов [1]. Кроме этого, MMn обладают способностью регулировать функции биологически активных молекул, включая ростовые факторы, молекулы адгезии и другие [б]. Благодаря этим свойствам MMn обеспечивают инвазивный рост опухолевых клеток в базальной мембране и строме, пенетрацию в лимфатические и кровеносные сосуды и метастазирование [1, б, 8].

Регуляция каталитической активности MMn осуществляется тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (THMn), а экспрессии - индуктором экстраклеточных матриксных метал-лопротеиназ (EMMPRIN, СD 147). В настоящее время известны 4 представителя семейства тканевых ингибиторов, из которых наиболее изученными являются TИMП-1 и TИMП-2. Они были идентифицированы во многих нормальных тканях и злокачественных опухолях, и их уровни были выше в неметастатических опухолях, чем метастатических [5]. Определяющее значение для осуществления протеолиза имеет нарушение баланса уровня протеаз и их ингибиторов. EMMPRIN является высоко гли-колизированной трансмембранной молекулой, локализованнной на плазматической мембране, и обладает способностью стимулировать продукцию MMn как опухолевыми клетками, так и клетками микроокружения [7, 9, 10]. Увеличенная продукция MMn клетками стромальной популяции способствует опухолевой инвазии и ангиогенезу.

MMn, их тканевые ингибиторы и EMMPRIN образуют систему MMn. Учитывая важную роль системы MMn в инвазии и метастази-ровании злокачественных опухолей, в данной работе исследовалась патогенетическая значимость протеаз и их регуляторных молекул при прогрессировании плоскоклеточных карцином головы и шеи.

Материал и методы

В исследование были включены 62 больных опухолями головы и шеи (гортань, ротоглотка, гортаноглотка, органы полости рта) стадии Т1-3^о_3М0 в возрасте от 31 до 77 лет, которые проходили лечение в НИИ онкологии СО РАМН с 2006 по 2009 г. Материалом для исследования служили послеоперационные образцы опухолевой ткани. Полученный материал подвергался рутинному гистологическому исследованию. Во всех случаях опухоли имели гистологическое строение плоскоклеточных карцином разной степени дифференцировки.

Иммуногистохимическое исследование экспрессии ММП-1,-2,-9, ТИМП-1,-2 и ЕММРЯШ было проведено с использованием антител фирмы «Новокастра» ММП-2 ^^-ММР2-507, для парафиновых блоков, высокотемпературная демаскировка антигена в 1мМ ЭДТА рН=8,0, рабочее разведение 1:40 - 1:80); МмП-9 ^^-ММР9, для парафиновых блоков, рабочее разведение 1:40); ТИМП-1 ^^-Т1МР1-485, для замороженной ткани и парафиновых блоков, рабочее разведение 1:200); ТИМП-2 ^^-Т1МР2-487, для парафиновых блоков, высокотемпературная демаскировка антигена в 1мМ ЭДТА, рН=8,0, рабочее разведение 1:20); ЕММРЯШ ^ 147) (NCL-СD147, для парафиновых блоков, высокотемпературная демаскировка антигена в 0,01 М цитратном буфере рН=6,0, рабочее разведение 1:20 - 1:40). Инкубацию с первыми антителами проводили 60 мин при температуре 25°С. Использовали полимерную систему визуализации фирмы «BioGenex». в качестве хромогена - диаминобензидин, препараты докрашивали гематоксилином. Оценку экспрессии маркеров проводили полуколиче-ственным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антигенпозитивных клеток в опухолевых структурах и строме и представляли в баллах. Реакция окрашивания оценивалась следующим образом: негативная -1 балл, слабая - 2 балла, средняя (умеренная) - 3 балла и выраженная - 4 балла.

Статистический анализ был проведен с использованием программы STATISTICA 6.0. Результаты исследования были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Колмагорова-Смирнова. При

зі

нормальном распределении значений применялся параметрический t-критерий Стьюдента. Для значений, закон распределения которых отличался от нормального, был применен непараметрический критерий Манна-Уитни. Наличие связи между изучаемыми признаками проводили с использованием корреляционного анализа и оценивали по коэффициенту корреляции Спирмена (R).

Результаты и обсуждение

Иммуногистохимическое исследование показало, что экспрессия ММП-1 и ММП-2 в тканях опухолей головы и шеи была слабоположительной и отмечалась в 50 % образцов, в то время как ММП-9, ТИМП-1, ТИМП-2 и EMMPRIN определялись в большинстве тканей карцином головы и шеи.

Накопление ММП, ТИМП и EMMPRIN обнаруживалось как в опухолевых клетках, так и в клетках стромы, в частности фибробластах, макрофагах, сосудистых эндотелиоцитах. Наблюдалось неравномерное распределение всех исследуемых показателей между раковыми и стромальными клетками. В табл. 1 представлены обобщенные данные, характеризующие экспрессию изучаемых показателей в опухолевых и стромальных структурах. Показано, что в плоскоклеточных карциномах головы и

шеи экспрессия MMn-1, -2, -9 и TMMn-2 была значительно выше в строме по сравнению с опухолевыми клетками, наряду с этим преимущественная экспрессия TMMn-1 и EMMPRIN наблюдалась в злокачественных клетках.

Выраженная экспрессия TMMn-1 злокачественными клетками, по-видимому, необходима для ограничения локального протеолиза путем ингибирования каталитической активности MMn непосредственно в прилегающем пространстве к опухолевым клеткам, тогда как TMMn-2 структурно связан с клетками стромы. Корреляционный анализ связи экспрессии MMn и TMMn в стромальных и опухолевых клетках показал, что в опухолевых структурах повышение экспрессии MMn-2 и MMn-9 связано с увеличением экспрессии TMMn-2 (R=0,416, p=0,001 и R=0,267, p=0,036 соответственно), а TKMn-1 - с MMn-1 (R=0,371, p=0,003), тогда как в строме повышение экспрессии TKMn-1 также связано с MMn-1 (R=0,420, р=0,020) и с экспрессией MMn-1 опухолевыми клетками (R=0,484, р=0,000). Tаким образом, полученные в представленной работе данные свидетельствуют о сложной взаимосвязи между протеазами и их ингибиторами в опухолевых и стромальных структурах.

Вероятно, увеличение продукции MMn микроокружением происходит вследствие влия-

Таблица 1

экспрессия ммп и тимп в опухолевых структурах и в строме плоскоклеточных

карцином головы и шеи

Шказатель rnMn-1 TfflMn-2 MMn-1 MMn-2 MMn-9 EMMPRIN

Опухоль 3,06 ± 0,10 1,20 ± 0,06 1,61 ± 0,11 1,24 ± 0,07 1,58 ± 0,10 3,00 ± 0,12

Строма 2,63 ± 0,12 2,32 ± 0,12 2,02 ± 0,12 2,69 ± 0,13 2,34 ± 0,11 2,05 ± 0,11

р 0,017 0,001 0,015 0,001 0,001 0,001

Примечание: р - уровень значимости различий между опухолью и стромой.

Таблица 2

Корреляционные связи между экспрессией ммп и EMMPRIN

в ст ромальных и опухолевых клетках

Группы сравнения R при (р<0,05) р

Оп EMMPRIN & Стр MMn-2 0,298 0,019

Оп EMMPRIN & Стр MMn-9 0,279 0,028

Стр EMMPRIN & Оп MMn-1 0,316 0,012

Стр EMMPRIN & Стр MMn-9 0,346 0,005

Примечание: Оп - экспрессия показателей опухолевыми клетками, Стр - экспрессия показателей клетками стромы, R - коэффициент ранговой корреляции Спирмена, р - уровень значимости различий между показателями опухоли и стромы.

Рис.1. Экспрессия ММП, ТИМП и EMMPRIN в зависимости от лимфогенного метастазирования (^ в плоскоклеточных карциномах головы и шеи. Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с группой пациентов с N0

ния, оказываемого на него раковыми клетками путем секреции ЕММРЯШ. Это предположение подтверждается обнаруженной прямой корреляционной связью между экспрессией еМмРЯШ в опухолевых клетках и мМп-2, -9 (табл. 2). Экспрессия ЕММРЯШ на поверхности стромальных клеток была выражена в меньшей степени, чем на поверхности опухолевых клеток, и связана с экспрессией ММП-1 клетками опухоли и экспрессией ММП-9 в строме.

Анализ экспрессии компонентов системы ММП в зависимости от метастазирования является достаточно важным, так как считается, что эндотелиальные базальные мембраны в норме представляют непроницаемый барьер для миграции клеток. Деградация ЭКМ, особенно базальной мембраны, рассматривается как один из критических фенотипов, необходимый для инвазии опухолевых клеток [8].

Результаты исследования экспрессии ММП, ТИМП и ЕММРЯШ в зависимости от регионарного метастазирования представлены на рис. 1.

В проведенных исследованиях не было получено убедительных данных об изменениях экспрессии ММП в зависимости от лимфогенного метастазирования. Это несколько расходится с литературными данными. Так, S. Wieqand et а1. была показана связь экспрессии ММП-2, ММП-3 и ММП-14 в плоскоклеточных карциномах головы и шеи с метастазированием [8]. Следует заметить, что в это исследование вошла гораздо более значительная группа пациентов, которая составляла 710 больных, что, вероятно,

и позволило повысить достоверность полученных данных.

В представленном исследовании было зарегистрировано достоверное снижение уровня экспрессии ТИМП-2 в опухолевых клетках при

Рис. 2. Схема возможной регуляции опухолевой прогрессии плоскоклеточных карцином головы и шеи матриксными метал-лопротеиназами

зз

наличии метастазов в регионарные лимфатические узлы (рис. 1). Уровень экспрессии ТИМП-1 стромальными клетками также достоверно снижался в опухолях с регионарными метастазами по сравнению с неметастатическими опухолями. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли ингибиторов ММП в метастазирова-нии плоскоклеточных карцином головы и шеи. По-видимому, при метастазировании снижается ингибирующее влияние исследуемых ингибиторов на каталитическую активность ММП в злокачественных опухолях. На основании полученных результатов мы предлагаем схему вероятной регуляции прогрессии плоскоклеточного рака головы и шеи компонентами системы ММП (рис. 2).

Согласно предложенной схеме, клетки карциномы экспрессируют ЕММРЯШ, который, находясь на цитоплазматической мембране опухолевых клеток, может увеличивать продукцию ММП-2 и ММП-9 клетками микроокружения. Сама опухоль также способна к продукции ММП-1 и ММП-9, уровень и активность которых регулируются ингибиторами. Сниженный уровень ингибиторов в опухоли и строме способствует повышению каталитической активности ММП, что, в свою очередь, приводит к усилению инвазии и метастазирования опухолевых клеток. Таким образом, представленные в данной работе результаты свидетельствуют о важной роли стромального микроокружения в продукции ММП, что, вероятно, вносит существенный вклад в механизмы инвазивного роста

и метастазирования злокачественных карцином головы и шеи.

Работа выполнена в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. (ГК№ П320).

ЛИТЕРАТУРА

1. Клишо Е.В., Кондакова И.В., Чойнзонов Е.Л., Шишкин Д.А. Оценка содержания металлопротеиназы ММП-9 и ее эндогенного ингибитора ТИМП-1 в плазме больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи // Сибирский онкологический журнал. 2005. № 3. С. 54-57.

2. Чойнзонов Е.Л., Писарева Л.Ф., Бояркина А.П. и др. Онкологическая заболеваемость населения Томской области // Томск: Изд-во Том. ун-та, 2004. 254 с.

3. Auf dem Keller U., Doucet A., Overall CM. Protease research in the era of system biology // Biol. Chem. 2007. Vol. 388 (11). P. 1159-1162.

4. Grandis J.R., Pietenpol JA., Greenberger J.S. et al. Head and neck cancer: meeting summary and research opportunities // Cancer Res. 2004. Vol. 64. P. 26-29.

5. Jiang Y, Goldberg I.D., Shi Y.E. Complex roles of tissue inhibitors of metalloproteinases in cancer // Oncogene. 2002. Vol. 21. P. 2245-2252.

6. Linch C.C., Matrisian L.M. Matrix metalloproteinases in tumor-host cell communication // Differentiation. 2002. Vol. 70. P. 561-573.

7. Tang Y, KesavanP., NakadaM., Yan L. Tumor-stroma interaction: positive feedback regulation of extracellular matrix metalloprotei-nase inducer (EMMPRIN) expression and matrix metalloproteinase-dependent generation of soluble EMMPRIN // Mol. Cancer Res. 2004. Vol. 2. P. 73-80.

8. WiegandS., DunneAA., MullerH.H. et al. Metaanalysis of the significance of matrix metalloproteinases for lymph node disease in pations with head and neck squamous cell carcinoma // Cancer. 2005. Vol. 104. P. 94-100.

9. YanL., Zucker S., Toole B.P. Roles of the multifuntional glico-protein, EMMPRIN (basigin, CD 147), in tumor progression // Thromb Haemost. 2005. Vol. 93. P. 199-204.

10. Zucker S., HymowitzM., Rollo E.E. et al. Tumorigenic potential of extracellular matrix metalloproteinase inducer // Am. J. Pathol. 2001. Vol. 158. P. 1921-1928.

Поступила 12.01.11