Способ лечения хронического пародонтита с использованием мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани
METHOD FOR TREATMENT OF CHRONIC PERIODONTITIS USING MESENCHYMAL STEM CELLS OF ADIPOSE TISSUE

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии и предназначено для лечения хронического генерализованного пародонтита.
Хронический генерализованный пародонтит проявляется такими симптомами, как кровоточивость и припухание десен, неприятный запах изо рта и подвижность зубов, приводит к потере зубов и часто сопровождается снижением качества жизни пациентов. Причиной развития пародонтита является бактериальная биопленка и индивидуальная реакция организма-хозяина Немаловажными факторами в развитии заболевания является общесоматический статус и местные факторы, способствующие развитию воспаления, такие как кариозные полости и некариозные поражения, нависающие края пломб, некачественно изготовленные протезы, травматические узлы окклюзии и другое.
Высокая распространенность воспалительных заболеваний пародонта и отсутствие тенденции к их снижению является серьезной проблемой стоматологии, требующей поиска новых способов лечения на современном этапе. Существуют противовоспалительные препараты на основе антисептиков и антибактериальных средств с доказанной эффективностью, которые способствуют снижению кровоточивости десен и отечности тканей, позволяющие добиться клинически значимого улучшения у пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта. Препараты на основе бактериофагов рекомендованы для улучшения иммунного статуса, однако не оказывают противовоспалительного эффекта. Инъекционные препараты гиалуроновой кислоты и обогащенной аутоплазмы внедрены в пародонтологическую практику для стимуляции регенерации костной ткани после лазерного кюретажа пародонтальных карманов, однако для достижения ощутимого клинического эффекта требуется неоднократное повторение таких процедур.
В реальной клинической практике лечение пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом заключается в терапевтическом лечении, направленном на устранение бактериальной биопленки и факторов, обеспечивающих ее аккумуляцию на зубе; хирургическом лечении, направленном на ликвидацию очагов воспаления: закрытый и открытый кюретаж, гингивэктомию, пластику уздечек языка и губ, вестибулопластику и др.; ортодонтическое лечение; ортопедическое лечение и поддерживающую пародонтальную терапию. Согласно российским и международным клиническим рекомендациям поддерживающая пародонтальная терапия проводится каждые 3 или 6 месяцев в зависимости от тяжести заболевания (Клинические рекомендации (протоколы лечения) при диагнозе пародонтит, утверждены «СтАР» 23.04.2013, актуализированы 02.08.2018 г.).
К недостаткам такого ведения являются:
1. Неудовлетворенность пациентов, низкое качество жизни.
2. Симптоматический характер лечения, отсутствие влияния на регенерацию пародонтальной связки.
3. Высокий риск осложнений в виде появления рецессий десны.
4. Появление послеоперационных болей после хирургических вмешательств.
5. Появление гиперчувствительности зубов после пародонтологических вмешательств.
Известны методы реабилитации тканей пародонта, основанные на электронейростимуляции. У пациентов с хроническим пародонтитом чрескожная электростимуляция позволяет повысить качество жизни и снизить болевые ощущения и отечность тканей [1].
К недостаткам метода относятся:
1. Временный эффект.
2. Необходимость многократного повторения процедуры.
Новым перспективным направлением лечения воспалительных заболеваний пародонта относится клеточная терапия, в частности использование мультипотентных стволовых клеток жировой ткани.
Введение стромально-васкулярной фракции жировой ткани путем инъекций в зону наружного сфинктера мочевого пузыря показало свою эффективность для лечения недержания мочи [2], как путь доставки лекарств у пациентов, перенесших инсульт [3], для лечения ожогов кожи и «диабетической стопы» [4], инъекционное введение в связки суставов в травматологии и ортопедии при лечении дегенеративных процессов [5, 6], в постфибротической репарации печени [7, 8, 9].
В настоящее время в России и за рубежом проходит ряд исследований по применению полученных из жировой ткани стволовых клеток в лечении стоматологических заболеваний в экспериментах на лабораторных животных [10, 11].
В исследованиях на животных была доказана эффективность и безопасность использования полученных из жировой ткани аутологичных мезенхимальных клеток при лечении различных заболеваний [3, 12, 13].
Механизм действия стволовых клеток связан как с клеточной дифференцировкой в хондроциты и остеобласты [4, 14, 15], так и с секрецией биологически активных веществ [2, 16].
Сведения об использовании мезенхимальных стволовых клеток для лечения пародонтита, а также введении стромально-васкулярной фракции в область пародонтальной связки в научно-технической, литературе отсутствуют.
3
В качестве ближайшего аналога предлагаемого способа выбран способ лечения дегенеративных и травматических заболеваний костной ткани челюстно-лицевой области с применением биотрансплантата, содержащего аутологичные и донорские мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки костного мозга или жировой ткани взрослых доноров, которые распределены в фибриновом (Патент РФ №2380105 С1, 2010). Способ заключается в том, что выделенные из костного мозга или жировой ткани мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК), ферментативно дезагригируют трипсином и вносят из расчета 5-7 млн. клеток на 1 мл аутогенной обогащенной тромбоцитами плазмы, перемешивают, при необходимости с добавлением дополнительных компонентов, полученную суспензию смешивают с материалом матрицы-носителя, представляющей собой коллаген-минеральный комплекс в виде блоков, стружки или крошки, отмытым раствором Хэнкса с цефазолином (1 г/л), затем по каплям добавляют раствор тромбина 50 Ед/мл на 10% хлорида кальция до загустения и полимеризуют при температуре 37°С в течение от 3 до 30 суток в остеогенной культуральной среде. Используя стандартные хирургические доступы, в дефект костной ткани вводят биотрансплантат в объеме, соответствующем дефекту, то есть по 1 мл биотрансплантата на 1 см дефекта, после чего закрытие раневой поверхности также осуществляется по стандартным методикам.
Недостатки данного метода:
1. Высокие биологические риски при использовании ММСК из костного мозга.
2. Сложность получения ММСК из костного мозга при трепанобиопсии и малое количество клеток в полученном пунктате.
3. Интраоперационное введение травматичнее, чем инъекционное.
4. Отсутствие данных о влиянии на регенерацию костной ткани пародонта, и соответственно об эффективности при лечении хронического пародонтита.
Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, является создание нового способа лечения хронического пародонтита, обеспечивающего повышение эффективности лечения.
Существенными отличиями заявленного способа являются:
1. Инновационность.
2. Использование регенераторного потенциала собственного организма пациента за счет применения аутологичной стромально-васкулярной фракции.
3. Наличие продолжительного лечебного эффекта.
4. Возможность снизить число посещений в ходе комплексного лечения.
Преимущество заявленного способа заключается в возможности добиться состояния стойкой ремиссии хронического пародонтита у пациентов любого пола.
Технический результат заявляемого изобретения - снижение кровоточивости и припухания десен, восстановление зубо-десневого пародонтального прикрепления, восстановление уровня минерализации костной ткани межзубных перегородок альвеолярных отростков челюстей по данным комплексного стоматологического обследования.
Заявляемый способ лечения хронического генерализованного пародонтита апробирован на экспериментальной модели хронического пародонтита и заключается в инъекционном введении в мягкие ткани пародонта стромально-васкулярной фракции (СВФ), полученной из аутологичной жировой ткани на 4 сутки после операции лазерного кюретажа.
Моделирование хронического пародонтита на кроликах породы Советская Шиншилла проводили в соответствии с авторской методикой (Патент РФ №2654598, 2018). Способ моделирования экспериментального пародонтита включает использование инфекционного агента и механическое повреждение тканей пародонта. Для этого создают дефект десны путем разрыва круговой связки нижних зубов. Вводят в это дефект инфицированные зубные отложения - зубной налет и зубной камень, заранее взятые у пациента с тяжелой формой пародонтита. Далее на зубы наносят самопротравливающую адгезивную систему, отсвечивают ее при помощи фотополимерной лампы, накладывают ортодонтическую проволоку и фиксируют ее при помощи жидкотекучего композиционного материала. Способ обеспечивает получение адекватной модели заболевания. На 28 сутки после моделирования хронического пародононтита у лабораторных животных проводили осмотр, общеклинические анализы крови, конусно-лучевую компьютерную томографию (КЛКТ), морфологическое исследование.
Жировую ткань забирали интраоперационно из брызжейки. Выделение стромально-васкулярной фракции проводили неферментным методом. Общий объем полученной в ходе операции жировой ткани от одного животного достигал 20 мл. Далее производили центрифугирование шприцов с липоаспиратом в течение 4 минут при скорости 2500 оборотов/мин, без остановки. После центрифугирования жировую фракцию извлекали с помощью верхнего шприца АСР. Заготовленный центрифугированный жир медленно переносили в один из 10 мл шприцов через коннектор 2.4 мм. Затем эту порцию жира интенсивно «перегоняли» 30 раз с максимальной скоростью между двумя 10 мл шприцами через коннектор 1,4 мм. Далее вновь переносили данную эмульгированную жировую фракцию в шприцы АСР и производили повторное центрифугирование в течение 4 мин при 2500 оборотах/минуту. После повторного центрифугирования на дне шприцов выявлялся клеточный осадок (стромально-васкулярная фракция) в объеме 5 мл. Введение стромально-васкулярной фракции проводили на 4 сутки после операции лазерный кюретаж. СВФ вводили с помощью иглы G30 в маргинальную десну экспериментального животного в 10 точках из расчета 0,5 мл/точка. Через 1 и 4 недели после вмешательства проводили клиническую оценку результатов, анализы крови. Через 28 дней после введения СВФ кролику проводили конусно-лучевую компьютерную томографию челюстных костей и морфологическое исследование.
Способ лечения хронического пародонтита с использованием мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани продемонстрировал эффективность и безопасность в комплексном лечении хронического пародонтита на экспериментальной модели хронического пародонтита. Механизм действия стволовых клеток связан как с клеточной дифференцировкой в остеобласты [5, 11, 13], так и с секрецией биологически активных веществ [4, 9, 12, 16]. Процессы клеточной регенерации и активации метаболических процессов в тканях пародонта приводят к восстановлению пародонтального прикрепления и костной ткани межзубной перегородки. Клинически это проявляется улучшением состояния десны, снижением кровоточивости и отечности маргинальной и папиллярной десны, десна плотно охватывает шейки зубов.
Клинический пример. В качестве примера применения способа лечения приводим данные обследования лабораторного животного кролика породы Советская Шиншилла, у которого смоделирован экспериментальный пародонтит.
Результаты обследования до лечения: Кролик породы Советская Шиншилла весом 2850 гр. Внешний вид без особенностей. В полости рта слизистая маргинального края десны отечна, гиперемирована, кровоточит при зондировании.
На Фиг. 1 - Экспериментальный пародонтит на лабораторном животном: А - Клиническая картина на 28 сутки после моделирования экспериментального пародонтита. В - Конусно-лучевая компьютерная томография экспериментального животного на 28 сутки после моделирования экспериментального пародонтита.
9
9
9
Лейкоциты крови - 7,13×10/л, нейтрофилы - 1,33×10/л, гемоглобин - 141 г/л, тромбоциты - 501×10/л, АлТ - 33,2 Е/л, АсТ - 24,2 Е/л, гидроксипролин в сыворотке крови - 72 нг/мл, «костная» щелочная фосфатаза - 48 Е/л, С-реактивный белок в сыворотке крови - 10,3 г/мл.
КЛКТ: в области резцов нижней челюсти определяется воспалительная деструкция костной ткани межзубных костных перегородок до ¼ длины корней зубов.
Лечение:
1. Забор жировой ткани для приготовления стромально-васкулярной фракции: в условиях общего наркоза (препараты Золетил-100 и Ксила) проведен забор жировой ткани из брызжейки в объеме 20 мл. Материал отправлен в лабораторию для приготовления стромально-васкулярной фракции.
2. Приготовление стромально-васкулярной фракции в объеме 5 мл - в объеме 5 мл по описанной выше методике.
3. В условиях наркоза препаратами Ксила и Золетил-100 кроликам проводилась операция лазерный кюретаж пародонтальных карманов с применением высокоинтенсивного диодного лазера SiroLaser (Sirona) мощность 2,8 Вт, длина волны 980 нм, оптоволокно 320 мкм, по 10 секунд на каждый пародонтальный карман.
4. В условиях наркоза препаратами Ксила и Золетил-100 кролику на 4 сутки после лазерного кюретажа проводили инъекции СВФ в 10 точках маргинальной десны по 0,5 мл/точка.
На Фиг. 2 представлены фото: А - Лазерный кюретаж пародонтальных карманов животному с экспериментальным пародонтитом, проводится диодным лазером. В - Проведение инъекций СВФ экспериментальному животному на 4 сутки после лазерного кюретажа.
Результаты обследования после лечения: Вес кролика 2830 гр. Внешний вид без особенностей. На 7 сутки после операции слизистая альвеолярного отростка бледно-розовая, гладкая, блестящая, по маргинальному краю фибриновый налет. На 28 сутки наблюдения десна бледно-розовая, гладкая, блестящая, плотно охватывает корни зубов животного, соответствует состоянию здоровой десны (Фиг. 3А).
9
9
9
Лейкоциты крови - 5,52×10/л, нейтрофилы - 1,11×10/л, гемоглобин - 140 г/л, тромбоциты - 450×10/л, АлТ - 32,7 Е/л, АсТ - 24,5 Е/л, гидроксипролин в сыворотке крови - 75 нг/мл, «костная» щелочная фосфатаза - 42 Е/л, С-реактивный белок в сыворотке крови - 5,4 г/мл.
КЛКТ: в области резцов нижней челюсти определяется межзубная костная перегородка минерализованна на всю длину корней зубов.
Результаты наблюдения за животными после лазерного кюретажа и введения СВФ представлены на Фиг. 3: А - Фото клинической картины на 28 сутки наблюдения. В - КЛКТ животного на 28 сутки комплексного лечения. С - Микрофотография фрагмента зуба, связочного аппарата и фрагмента костной перегородки без структурных изменений на 28 сутки после лазерного кюретажа и инъекции СВФ. Ув. 100. Окраска гематоксилин и эозин.
Морфологическое исследование на 28 сутки: полное восстановление связочного аппарата (зрелые коллагеновые волокна) и костной перегородки. Зубной сосочек представлен плотной волокнистой соединительной тканью (Фиг. 3С).
Результат: восстановление зубо-десневого пародонтального прикрепления, восстановление плотности костной ткани межзубной перегородки.
Таким образом, предлагаемый способ повышает эффективность хронического генерализованного пародонтита за счет стимулирующего влияния аутологичной стромально-васкулярной фракции жировой ткани, содержащей мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки на восстановление пародонтального зубо-десневого прикрепления после лазерного кюретажа. Клинически это проявляется восстановлением пародонтального зубо-десневого пародонтального прикрепления и костной ткани межзубной перегородки. Из анализа научно-технической, патентной литературы и материалов следует, что заявляемое техническое решение соответствуют критериям «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».
Список литературы
1. Мандра Ю.В., Жегалина Н.М., Григорьев С.С., Светлакова Е.Н., Костина И.Н., Иощенко Е.С., Ваневская Е.А. Опыт применения динамической электронейростимуляции в комплексном лечении стоматологических заболеваний. Проблемы стоматологии. - 2014. - №3. - С. 21-24.
2. Зырянов А.В., Бердюгин К.А., Борзунов И.В., Цветков А.И., Баженов И.В., Филиппова Е.С. Способ лечения гипотонии мочевого пузыря с использованием мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани. Патент на изобретение Ru 2712029 С1, 24.01.2020. Заявка №2019119277 от 19.06.2019.
3. Павлова С.В., Сергеевичев Д.С., Чепелева Е.В., Козырева B.C., Малахова А.А., Захарова И.С., Григорьева Е.В., Покушалов Е.А., Закиян С.М. Сравнение мезенхимальных стромальных клеток костного мозга и региональных стволовых клеток сердца и фибробластов кожи человека. Патология кровообращения и кардиохирургия. - 2015. - Т. 19. - №4-2. - С. 12-19.
4. Свистушкин В.М., Старостина С.В., Свистушкин М.В., Тимашев С.Ф., Шехтер А.Б., Файзуллин A.M., Побиванцева А.А., Луничева А.А., Лебедева Г.В. Влияние мезенхимальных стромальных клеток на восстановление структуры голосовых складок при рубцовых изменениях. Контролируемое экспериментальное исследование. Фарматека. - 2020. - Т. 27. - №5. - С. 65-71.
5. Смышляев И.А., Гильфанов С.И., Еремин И.И., Пулин А.А., Гильмутдинова И.Р. Возможности лечения дегенеративнодистрофических заболеваний коленного сустава при помощи стромально-васкулярной фракции из жировой ткани. Гены и Клетки. - 2019. - Т. 14. - №S. - С. 217.
6. Kholodenko I.V., Kurbatov L.K., Kholodenko R.V., Manukyan G.V., Yarygin K.N. Mesenchymal stem cells in the adult human liver: hype or hope? Cells. - 2019. - T.8 (10). - P. 1127. DOI: 11.2290/cells8101127.
7. Марченко Л.Н., Чекина А.Ю., Федулов A.C., Джумова М.Ф., Качан Т.В., Волотовский И.Д., Квачева З.Б., Василевич И.Б. Клеточная терапия воспалительно-дистрофических заболеваний роговицы. Российский общенациональный офтальмологический форум. - 2020. - Т. 2. - С. 472-475.
8. Еремин П.С., Супруненко Е.А., Мурзабеков М.Б., Голиченков В., Беспятых А.Ю., Котенко К.В., Еремин И.И. Разработка экспериментальной модели терапии фиброза печени с помощью стромально-васкулярной фракции жировой ткани. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2013. - Т.8. - №3. - С. 22-23.
9. Маклакова И.Ю., Гребнев Д.Ю., Юсупова В.Ч., Петрунина Е.М. Влияние трансплантации мультипотентных мезенхимальных стролальных клеток на морфометрические показатели печени зрелых и старых лабораторных животных в условиях токсического гепатита. Морфология. - 2020. - Т. 157. - №1. - С. 55-60.
10. Venkataiah V.C., Yahata Y., Kitagata A., Inagaki M., Kakiuchi Y., Nakano M., Suzuki S., Handa K., Saito M. Clinical applications of Cell-Scaffold constructs for bone regenerarion therapy. Cells. - 2021. - 10 (10). - P. 2687. DOI 10.3390/cells10102687.
11. Денисова Ю.Л., Рубникович С.П., Кузьменко Е.В., Андреева В.А. Анализ показателей восстановления костной ткани при применении мезенхимальных стволовых клеток. Сборник: Достижения фундаментальной, клинической медицины и фармации. Материалы 76-ой научной сессии ВГМУ. Под ред. А.Т. Щастного. УО «Витебский государственный медицинский университет». - 2021. - С. 75-76.
12. Sakuma R., Takahashi A., Nakano-Doi A., Sawada R., Kamachi S., Beppu M., Takagi Т., Yoshimura S., Matsuyama Т., Nakagomi T. Comparative characterization of ischemia-induced brain multipotent stem cells with mesenchymal stem cells: similarities and differences. Stem Cells Dev. - 2018. - 27 (19). - P. 1322-1338. DOI: 10.1089/scd.2018.0075.
13. Sekiya I., Katano H., Mizuno M., Koga H., Masumoto J., Tomita M., Ozeki N. Alterations in cartilage quantification before and after injections of mesenchymal stem cells into osteoarthritic knees. Sci. Rep. - 2021. - 11(1). - P. 13832. DOI: 10.1038/s41598-021093462-8.
14. Yeo E.F., Markides H., Schade A.T., Studd A.J., Oliver J.M., Waters S.L., El Haj A.J. Experimental and mathematical modelling of magnetically labelled mesenchymal stromal cell delivery. J.R. Soc. Interface. - 2021. - 18(175): 20200558. DOI: 10.1098/rsif.2020.0558.
15. Шехтер А.Б., Курков А.В., Файзуллин А.Л. Морфологические аспекты тканевой инженерии. Гены и Клетки. - 2017. - Т. 12(3). - С. 268-269.
16. Ranganath S.H., Levy О., Inamdar M.S., Karp J.M. Harnessing the mesenchymal stem cell secretome for the treatment of cardiovascular disease. Cell Stem Cell. - 2012. - 10(3). - P. 244-258. DOI: 10.1016/j.stem.2012.02.005.