Оценка риска развития рака желудка кишечного типа у носителей полиморфных аллелей генов цитокинов

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Новиков Д.Г., Кононов А.В., Поморгайло Е.Г., Мозговой С.И.

Омская государственная медицинская академия,

г. Омск

К настоящему времени описаны ассоциации полиморфизма генов цитокинов с повышенным риском развития рака желудка. Однако они значительно варьируют в разных странах и этнических группах, что требует проведения отдельных исследований.

Цель исследования:определить риск развития рака желудка на основании анализа полиморфизма генов интерлейкина-1р (IL-1P), интерлейкина-10 (IL-10) и фактора некроза опухолей-а (TNF-а) у населения юга Западной Сибири (Омский регион). Материалы и методы: исследована венозная кровь 49 больных раком желудка кишечного типа. Группу контроля составили 84 донора без отягощенного онкологического анамнеза. Определяли носительство полиморфных аллелей генов IL-1P C+3953T (rs1143634), TNF-а G-308A (rs1800629), IL-10 G-1082A (rs1800896). Вычисляли отношение шансов (OR) с доверительным интервалом (CI).

Результаты: равновесию Харди-Вайнберга соответствовали только частоты генотипов полиморфного локуса гена IL-10 G-1082A. Обнаружено, что носительство аллеля IL-10-1082A и генотипа -1082A/A ассоциировано с повышенным риском развития рака желудка кишечного типа (OR = 1,69; CI = 1,02-2,80; p < 0,05 и OR = 3,52; CI = 1,16-10,65; p < 0,05, соответственно).

Выводы: носительство аллеля гена IL-10-1082A и генотипа -1082A/A ассоциировано с повышенным риском развития рака желудка кишечного типа у населения юга Западной Сибири (Омский регион).

Ключевые слова: рак желудка кишечного типа; полиморфизм генов цитокинов.

Novikov D.G., Kononov A.V., Pomorgailo E.G., Mozgovoy S.I.

Omsk State Medical Academy, Omsk

ASSESSMENT OF INTESTINAL TYPE OF GASTRIC CANCER RISK IN POLYMORPHIC ALLELES OF CYTOKINE GENES CARRIERS

It is strong association of cytokine gene polymorphism with increased risk of gastric cancer developing. However, risk vary greatly in different countries and ethnic groups, which requires a separate study.

Aim of the study:to identify the association between polymorphic alleles interleukin-1p (IL-1P), interleukin-10 (IL-10) and tumor necrosis factor-а (TNF-а) genes and the risk of intestinal type of gastric cancer in the southern West Siberia population. Materials and methods: venous blood of 49 patients with intestinal type of gastric cancer was studied. The control group included 84 donors, without cancer history. We determined the polymorphic alleles of IL-1P C+3953T (rs1143634), TNF-а G-308A (rs1800629), IL-10 G-1082A (rs1800896) carrier. We calculated the odds ratio (OR) with confidence intervals (CI).

Results: only polymorphic loci of IL-10 G-1082A was in Hardy-Weinberg equilibrium. It was found that the allele IL-10-1082A and genotype-1082A/A was associated with increased risk of intestinal type of gastric cancer (OR = 1,69; CI = 1,02-2,80; p < 0,05 and OR = 3,52; CI = 1,16-10,65; p < 0,05, respectively).

Conclusions: allele IL-10-1082A and genotype-1082A/A carriers had increased risk of intestinal type of gastric cancer in the population of southern West Siberia.

Key words: intestinal type of gastric cancer; cytokine gene polymorphism.

Современные представления о канцерогенезе рака желудка кишечного типа указывают на ведущую роль в этом процессе длительного течения хронического воспаления в слизистой оболочке желудка, вызываемого Helicobacter pylori. Хроническое воспаление приводит к развитию атрофических изменений в слизистой оболочки желудка, повреждению генома эпителиоцитов активными формами азота и кислорода [1]. Несмотря на почти повсеместную инфицированность этой бактерией, рак желудка развивается у 2 человек из 100. Этот факт указывает на наличие некоторых особенностей генотипа больного, предопределяющих риск развития этого заболевания [2]. Описаны ассоциации полиморфизма ряда генов цитокинов, участвующих в регуляции воспалительной реакции организма, таких как интерлейкин-ip (IL-1P), фактор некроза опухо-лей-а (TNF-а), интерлейкин (IL-10). Наличие такого полиморфизма приводит к измененной активности белка, кодируемого этим геном, что обеспечивает более выраженный и продолжительный иммунный ответ на H. pylori-инфекцию. Такой фенотип воспалительной реакции определяет повышенный риск развития рака желудка кишечного типа. [2, 3]. Однако ассоциации полиморфных аллелей с риском развития рака желудка кишечного типа значительно варьируют в разных странах и этнических группах, что требует проведения отдельных исследований.

Цель исследования — определить риск развития рака желудка на основании анализа полиморфизма генов интерлейкина-ip (IL-ip), интерлейкина-10 (IL-10) и фактора некроза опухолей-а (TNF-а) у населения юга Западной Сибири (Омский регион).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования явилась венозная кровь 49 больных раком желудка кишечного типа, забранная за период с 01.08.2009 г. по 25.03.2010 г. в Омском областном клиническом онкологическом диспансере. При морфологическом исследовании во всех случаях опухоль соответствовала тубулярной аденокарциноме: в 28 случаях — высокодифференцированной, у 16 больных — умереннодифференцированной, у 5 больных — низкодифференцированной. В 9 случаях опухоль соответствовала I стадии рака по

классификации TNM (Т^0_1М0), в 22 случаях — II стадии (Т^2М0, Т2_з^М0), в 13 случаях — III стадии (Т2^Мо, Тз^М0), в 5 случаях — IV стадии (ВД-зМо, T1.4N1.4M1).

Группу контроля составили 84 донора без отягощенного онкологического анамнеза. Группы были сопоставимы по полу и возрасту, исследуемые лица не состояли в родстве и не имели отягощенного семейного онкологического анамнеза. Все лица признавали себя этнически русскими.

Исследование носило характер когортного, одномоментного, сравнительного, контролируемого. Исследование одобрено локальным комитетом по этике при ГОУ ВПО «ОмГМА Росздрава». От всех пациентов получено информированное согласие на проведение исследования.

Определялось носительство полиморфных аллелей генов ^-1Р С+3953Т (ге1143634), ТОТ-а G-308A (ге1800629), ^-10 G-1082A (^1800896).

Для определения полиморфных локусов TNF-а G-308A и ^-10 G-1082A проводилась аллель-специ-фичная полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием коммерческих наборов реагентов «SNP-экспресс». Этапы амплификации ДНК выполнялись в соответствии с требованиями, указываемыми производителем. Амплификация проводилась на термоциклере «Терцик». Детекцию продуктов амплификации осуществляли в 3 % агарозном геле.

Определение полиморфного локуса ^-1р С+3953Т проводилось при помощи ПДРФ-анализа (анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов) с использованием олигонуклеотидных праймеров, синтезированных в институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск). Структуры праймеров и программа амплификации приведены в таблице 1. Выделение ДНК проводилось при помощи фенол-хлороформной экстракции из взвеси предварительно отмытых лейкоцитов. Продукты амплификации обрабатывались эндонуклеазой рестрикции TаqI. Последующая детекция продуктов рестрикции проводилась в 1,5 % агарозном геле. Фрагмент длиной 550 п.н. соответствовал аллелю +3953Т, фрагменты размером 146 п.н. и 404 п.н. соответствовали аллелю +3953С ^-1р.

В исследуемой и контрольной группах определялось соответствие соотношения частот аллелей равновесию Харди-Вайнберга. Для определения риска заболевания у носителей определенных аллелей и генотипов вычислялось отношение шансов (OR) с доверительным интервалом (И). Для вычисления этих показателей использовался он-лайн калькулятор, доступный по ссылке: http://ihg2.helmholtz-muenchen.de /cgi-bin/hw/hwa1.pl. Для сравнения частот аллелей вычислялся угловой коэффициент Фишера.

Корреспонденцию адресовать:

НОВИКОВДмитрий Георгиевич,

644099, г. Омск, ул. Партизанская, 20,

ГОУ ВПО «ОмГМА Росздрава».

Тел.: раб. 8 (3812) 23-48-30; моб. +7-913-977-19-86. E-mail: acarina@yandex.ru

Мп л чтп СУущщта

22 №- 4 2010 вКузбассе

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Tаблица 1

Структура олигонуклеотидных праймеров и условия амплификации

Название гена Полиморфный локус Последовательность праймеров

!Ь-1Р (и)5ТССТАСТССТСТТСТСАТСАС3' С+3953Т ^)5'СТТСССТССАСАТССТССТС3'

Условия амплификации

95 С 3 мин 1 цикл

95 С 10 с

60 С 10 с 40 циклов

72 С 15 с

72 С 2,5 мин 1 цикл

10 С Хранение

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При оценке соответствия равновесию Харди-Вай-нберга в исследуемой группе было выявлено, что данному равновесию соответствует соотношение частот генотипов только полиморфного локуса ^-10 G-1082A. Соотношение частот полиморфных аллелей других локусов не соответствовало равновесию Хар-ди-Вайнберга. В контрольной группе частоты генотипов соответствовали данному равновесию.

Результаты генотипирования исследуемых тран-зиций представлены в таблице 2. При анализе полиморфных локусов ^-1р С+3953Т и TNF-а G-308A было выявлено, что в исследуемой выборке наиболее распространенны гомозиготные генотипы по аллелям генов ^-1р +3953С и TNF-a -308G генотипы. Носительство гетерозиготных генотипов встречалось значительно реже. Гомозиготные по полиморфным аллелям генотипы встречались крайне редко или не встречались вообще (табл. 2). В обоих локусах существенно преобладало носительство нормального аллеля (р < 0,05). Аналогичное распределение частот генотипов и аллелей наблюдалось и в группе контроля.

Иные результаты были получены при анализе полиморфного локуса гена ^-10 G-1082A. Наиболее распространено было носительство гетерозиготного генотипа, тогда как гомозиготные генотипы встречались с меньшей частотой. При этом аллели ^-10 -1082G и -1082A встречались с достоверно не различающейся частотой (р > 0,05). В группе контроля аллель ^-10 -1082G встречался значительно чаще (р < 0,05). Сравнивая полученные результаты между группами, выявлена более высокая распространенность аллеля -1082A в исследуемой группе, в сравнении с группой контроля (р < 0,05).

При вычислении значения показателя отношения шансов было обнаружено, что носительство аллеля ^-10 -1082А генотипа было ассоциировано с повышенным риском развития рака желудка кишечного типа (OR = 1,69; И = 1,02-2,80; р < 0,05, соответственно), а также носительство генотипа, гомозиготного по данному аллелю, было ассоциировано с более высоким риском развития этого заболевания (OR = 3,52; И = 1,1610,65; р < 0,05).

Несоответствие равновесию Харди-Вайнберга распределения частот генотипов полиморфных ло-кусов ^-1р С+3953T и TNF-a G-308A в исследуемой группе объясняется относительно небольшим объемом исследуемой выборки. По данным ряда исследовательских групп, частота генотипов ^-1р +3953T/T и TNF-a -308A/A в различных популяциях достаточно низка [4]. В исследованиях с числом наблюдений более 100 случаев эти показатели колебались от 0 % до 10 % для ^-1р +3953 T/T и от 0 % до 16 % для TNF-a -308 A/A [4]. Таким образом, ввиду малого объема выборки и редкой встре-

Таблица 2 Результаты генотипирования полиморфных локусов генов ^-1Р C+3953T, TNF-a G-308A и ^-10 G-1082A

Генотипы Частота %

и аллели Рак желудка, п = 49 Контроль, п = 84

!Ь-1Р С+3953Т

С/С 69,3 65,4

с/т 26,9 30,1

т/т 3,8 4,5

С 82,7 80,4

т 17,3 19,6

TNF-a G-308A

G/G 61,2 59,5

G/A 38,8 33,3

А/А 0 7,2

G 80,6 76,2

А 19,4 23,8

!Ь-10 G-1082A

G/G 22,4 34,5*

G/A 53,1 54,8

А/А 24,5 10,7*

G 49,0 61,9*

А 51,0 38,1*

Примечание: * достоверность различия между группами р < 0,05 (угловой коэффициент Фишера).

Сведения об авторах:

НОВИКОВ Дмитрий Георгиевич, очный аспирант кафедры патологической анатомии с курсом клинической патологии, ГОУ ВПО «ОмГ-МА Росздрава», г. Омск, Россия..

КОНОНОВ Алексей Владимирович, доктор мед. наук, профессор, зав. кафедрой патологической анатомии с курсом клинической патологии, ГОУ ВПО «ОмГМА Росздрава», г. Омск, Россия.

ПОМОРГАЙЛО Елена Геннадьевна, канд. биол. наук, доцент кафедры патологической анатомии с курсом клинической патологии, ГОУ ВПО «ОмГМА Росздрава», г. Омск, Россия.

МОЗГОВОЙ Сергей Игоревич, канд. мед. наук, доцент кафедры патологической анатомии с курсом клинической патологии, ГОУ ВПО «ОмГМА Росздрава», г. Омск, Россия.

^М^ицит Мп „

вКузбассе № 4 2010 23

чаемости в популяции, вероятно, в исследуемую группу не вошли носители генотипа TNF-а -308A/A.

Напротив, генотип ^-10 -1082A/A, гомозиготный по полиморфному аллелю, достаточно распространен в различных популяциях [4]. В исследованиях с числом наблюдений более 100 случаев были показаны значения частот встречаемости этого генотипа, находящиеся в интервале от 7 % до 89 % [4], что поднимает вопрос о том, какой из генотипов ^-10 -1082A/A или -1082G/G является полиморфным. В результате, даже относительно небольшая выборка больных, рассматриваемая в нашем исследовании, по распределению частот генотипов полиморфного ло-куса ^-10 G-1082A соответствовала равновесию Хар-ди-Вайнберга.

Полученные нами результаты свидетельствуют о повышенном риске развития рака желудка кишечного типа у носителей аллеля ^-10 -1082A и генотипа -1082A/A. При этом у последних имеется более высокий риск развития этого заболевания. По данным биохимических исследований, у носителей гомозиготного по аллелю -1082G генотипа наблюдается больший уровень сывороточного ^-10 в сравнении с лицами, гомозиготными по аллелю -1082A

[5]. Показано, что после стимуляции клеток мезоте-лия брюшины липополисахаридом у носителей генотипа -1082G/G наблюдается более выраженная секреция ^-10 [5]. Учитывая биологические эффекты ^-10, способствующие подавлению продукции про-воспалительных цитокинов [5], можно предположить, что у носителей генотипа -1082A/A и аллеля -1082A имеется склонность к несбалансированному, более продолжительному провоспалительному иммунному

ЛИТЕРАТУРА:

ответу. Соответственно, при колонизации H. pylori слизистой оболочки желудка носители такого генотипа будут иметь предрасположенность к хроническому течению воспалительного процесса, что, согласно современным представлениям, в дальнейшем способно привести к развитию рака желудка кишечного типа [2].

Однако полученные нами данные не согласуются с данными, полученными другими исследовательскими группами. В целом ряде популяций: финской

[6], ирландской [7], корейской [8], костариканской

[9] ассоциации полиморфного аллеля с риском развития рака желудка обнаружено не было. Напротив, в китайской популяции (народность хань) был показан повышенный риск заболевания раком желудка у носителей генотипов IL-10-1082G/G и -1082G/A

[10]. При этом данные мета-анализа указывают, что носительство генотипа -1082G/A незначительно повышает риск заболевания только в азиатских популяциях, тогда как носительство генотипа -1082A/A снижает этот риск [11]. Возможно, что подобные отличия объясняются особенностями рассматриваемой нами популяции юга Западной Сибири, формирование которой происходило из различных этнических групп, представителей европеоидной и монголоидной расы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, с повышенным риском развития рака желудка кишечного типа у населения юга Западной Сибири (Омский регион) ассоциировано но-сительство аллеля IL-10 -1082А и генотипа -1082A/A.

1. Correa, P. Carcinogenesis of Helicobacter pylori / P. Correa, J. Houghton //Gastroenterology. - 2007. - V. 133, N 2. - P. 659-672.

2. Кононов, А.В. Генетическая регуляция и фенотип воспаления при Helicobacter pylori-инфекции /А.В. Кононов //Арх. патологии. -2009. - Т. 71, № 5. - С. 57-63.

3. A systematic review of meta-analyses on gene polymorphisms and gastric cancer risk /F. Gianfagna, E. De Feo, C.M. van Duijn et al. //Current genomics. - 2008. - V. 9, N 6. - P. 361-374.

4. Allele Frequencies in Worldwide Populations [Электронный ресурс]. -Режим доступа: http://www.allelefrequencies.net/cyt6001a.asp. (2010).

5. Smith, A.J. Cytokine and cytokine receptor gene polymorphisms and their functionality /A.J. Smith, S.E. Humphries / Cytokine and growth factor reviews. - 2009. - V. 20, N 1. - P. 43-59.

6. Polymorphisms in inflammation-related genes and risk of gastric cancer (Finland) /F. Kamangar, C.C. Abnet, A.A. Hutchinson et al. //Cancer causes and control: CCC. - 2006. - V. 17, N 1. - P. 117-125.

7. Association of gastric disease with polymorphisms in the inflammatory related genes IL-1B, IL-1RN, IL-10, TNF and TLR4 /G. Murphy, J. Thornton, R. McManus et al. //Eur. J. gastroenterology and hepatology. -2009. - V. 21, N 6. - P. 630-635.

8. Association of polymorphism of IL-10 and TNF-A genes with gastric cancer in Korea /J.Y. Lee, H.Y. Kim, K.H. Kim et al. //Cancer letters. -2005. - V. 225, N 2. - P. 207-214.

9. Association of IL-1B and interleukin - 1 RN polymorphism with gastric cancer in a high-risk population in Costa-rica /P. Alpisar-Alpisar, G.I. Pe-rez-Perez, C. Une et al. //Clinical and experimental medicine. - 2005. -V. 5. - P. 169-176/

10. Association of IL-10 gene polymorphisms with gastroduodenal diseases in Hubei Han population /H. Xiao, Y. Jiang, R. Li et al. //Chinese J. Medical genetics. - 2009. - V. 26, N 4. - P. 423-426.

11. Interleukin-10 -1082 promoter polymorphism associated with gastric cancer among Asians /Y. Zhou, N. Li, W. Zhuang et al. //Eur. J. Cancer. - 2008. - V. 44, N 17. - P. 2648-2654.

Mn /I опт С'УШтна

24 №- 4 2010 вКузбассе