Способ ранней диагностики тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом герпеса 6 типа у новорожденных детей
METHOD FOR EARLY DIAGNOSIS OF SEVERE INFECTION CAUSED BY TYPE 6 HERPES VIRUS IN NEWBORNS

Изобретение относится к медицине, а именно к неонатологии, и может быть использовано для ранней диагностики тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом герпеса 6 типа, у новорожденных детей.
Внутриутробная инфекция является одной из важнейших медико-социальных проблем современного акушерства и перинатологии (Лобзин Ю.В., Васильев В.В., Скрипченко Н.В. Актуальные аспекты врожденных инфекций в России // Журнал инфектологии. - 2010. - №2. - Т. 2. - С. 14-24; Ожегов A.M., Тарасова Т.Ю., Петрова И.Н. Клинико-иммунологические особенности внутриклеточных внутриутробных инфекций у новорожденных с задержкой внутриутробного развития // Детская больница. - 2011. - №1(43). - С. 31-36).
Заболевания, вызываемые вирусами семейства HERPESVIRIDAE, принадлежат к числу социально значимых, что определяется не только широким распространением герпесвирусной инфекции, но и разнообразием ее клинических проявлений, вплоть до летальных форм. Внутриутробное инфицирование герпесвирусами не редко приводит к гибели плода либо рождению ребенка с клинической картиной течения инфекционного процесса, пороками развития, в том числе центральной нервной системы (Akhtar J., Shukla D. Viral entry mechanisms: cellular and viral mediators of herpes simplex virus entry // FEBS J. - 2009.- vol. 276. - P. 722-736).
Кроме того, все герпесвирусы имеют выраженное иммуносупрессивное действие, подавляют клеточные и гуморальные реакции иммунитета (Bertelsen L.В., Petersen С.С., Kofod-Olsen E. etal. Human herpesvirus 6 В induces phenotypic maturation without IL-10 and IL-12p70 production in dendritic cells // Scand. J. Immunol. - 2010. - N 71. - P. 431-439.).
В последние годы отмечена широкая распространенность герпесвирусной инфекции 6 типа среди детей и значительной ее роли в патогенезе тяжелых клинических состояний. Учитывая, что реализация инфекции определяется свойствами возбудителя и эффективностью иммунных реакций организма, особая роль отводится состоянию иммунной системы ребенка (Gustafsson R.K., Engdahl Е.Е., Hammarfjord O. et al. Human herpesvirus 6A partially suppresses functional properties of DC without viral replication // PLoS ONE 8. - 2013. - Ne58122).
Все вышеизложенное определяет необходимость разработки критериев прогноза тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом герпеса 6 типа у новорожденных детей, что позволит снизить тяжесть заболевания путем ранней диагностики и своевременного назначения адекватной патогенетической терапии.
На сегодняшний день ранней диагностике и прогнозированию внутриутробной инфекции посвящено значительное количество работ.
3
1-2
Известен способ диагностики внутриутробных вирусных инфекции у детей (патент РФ №2310851, 20.11.2007) путем морфологического исследования плаценты, определения IgM и IgG антител в реакции мРСK в ретроплацентарной крови, крови ребенка и матери, определения вирусных антигенов, специфических иммунных комплексов специфических низкоавидных антител IgG, IgG.
К недостаткам способа можно отнести необходимость проведения комплексного вирусологического исследования ретроплацентарной крови, крови новорожденного и матери, так как обследование только одного из вышеперечисленных объектов не дает полной картины инфицирования плода.
Известен способ диагностики внутриутробной инфекции новорожденных путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что в сыворотке пуповинной крови определяют уровень гликозаминогликанов (ГАГ) и уроновых кислот (УК) и при их значениях 225,1-286,1 мкмоль/л и 282,0-518,6 мкмоль/л соответственно ребенка признают инфицированным, а при значении ГАГ ниже 225,1 мкмоль/л и УК ниже 282,0 мкмоль/л ребенка признают больным (патент РФ№2231791, 27.06.2004).
Известен способ прогнозирования внутриутробной инфекции путем определения в пуповинной крови новорожденных β2-микроглобулина (Павлютенкова Ю.А., Пустотина О.А., Екимова Е.В. с соавт. Прогностическое значение определения концентрации β2-микроглобулина в сыворотке крови беременных группы высокого инфекционного риска // «Мать и дитя»: материалы VIII всероссийского форума. - Москва. - 2006. - С. 191-192). Недостатком этих способов является невозможность осуществить прогнозирование развития или же отсутствия у новорожденного конкретной нозологической патологии, т.е. отсутствует специфичность способа.
Известен способ диагностики генерализованной герпетической инфекции у детей первых месяцев жизни путем выявления повышения уровней IgM, IgA в сыворотке крови (Яценко Н.А. Клинико-иммунологические аспекты врожденной герпетической инфекции у детей первых месяцев жизни: автореф. дис. … канд. мед.наук. - Ставрополь, 2000. - 17 с.).
К недостаткам способа можно отнести то, что диагностическая ценность лабораторных методов, основанных на оценке гуморального иммунитета (специфические антитела IgG и IgM класса), является низкой, в связи с особенностями антителогенеза в период ранней неонатальной адаптации, Отсутствие специфических антител нередко не означает отсутствия инфекционного процесса, т.к. исследование могло проводиться в фазе формирования иммунного ответа.
Известен способ прогнозирования генерализованной формы герпесвирусной инфекции у детей первых месяцев жизни, инфицированных герпесвирусами, путем определения в сыворотке крови уровеня субпопуляции В-лимфоцитов с рецепторами СД20+СД40 и при выявлении повышения субпопуляции В-лимфоцитов с рецепторами СД20+СД40 выше 14,8% прогнозируют развитие генерализованной формы герпесвирусной инфекции у детей первых месяцев жизни (патент РФ№2341797, 20.12.2008). Недостатком способа является то, что он не позволяет проводить дифференциальный диагноз между внутриутробной инфекцией и инфицированием.
Известен способ ранней диагностики тяжелой формы герпесвирусной инфекции у новорожденных детей (патент РФ№2542467, 20.02.2015) путем исследования крови ребенка, отличающийся тем, что в крови новорожденных от матерей с персистирующейгерпесвирусной инфекцией определяют уровень CD16+CD25+ и IL-6 и при значениях CD16+CD25+3,5% и ниже, а IL-6 32,6 пг/мл и выше диагностируют развитие тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 1 и 2 типа.
Способ обладает рядом несовершенств:
1) Невозможно осуществить раннюю диагностику формирования у новорожденного конкретной нозологической патологии (тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом герпеса 6 типа).
2) Недостатком данного способа является то, что для повышения точности прогнозирования исследуется два маркера: CD16+CD25+ и IL-6, тогда как наши исследования показали, что достаточно исследовать один значимый маркер CD 124+.
3) Не позволяет проводить дифференциальный диагноз между внутриутробной инфекцией и инфицированием.
4) Исследование уровня CD16+CD25+ и IL-6 отражает их участие в развитии врожденного неспецифическогоиммунного ответа на патоген.
Данный способ выбран нами за прототип.
Недостатки прототипа устраняются в заявляемом способе.
Задачей изобретения является разработка высокочувствительного способа ранней диагностики тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом герпеса 6 типа у новорожденных детей.
Поставленная задача решается тем, что в крови новорожденных от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией определяют уровень CD 124+ и при значениях CD 124+ 4,0% и выше диагностируют развитие тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом герпеса 6 типа у новорожденных детей.
Технический результат- способ позволяет сократить время, стоимость исследования, повысить информативность индивидуального прогноза. Нами доказано, что данный способ обладает высокой точностью, чувствительностью и специфичностью.
В доступной литературе не выявлено использование определения уровня экспрессии CD 124+ в качестве маркера для ранней диагностики тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом герпеса 6 типа у новорожденных детей.
CD124+ является рецепторной субьединицей для интерлейкина 4 (IL 4R), экспрессируется на активированных Т лимфоцитах и играет важную роль в стимуляции продукции IL-4 и сдвиге иммуннного баланса в сторону Th2-реакций, что способствует нарушению эффекторной функции иммунокомпетентных клеток, нарушению режима иммунорегуляциии формированию супрессивного иммунофенотипа, не обеспечивающих формирование эффективного противовирусного иммунного ответа [Tundup S., Srivastava L., Harn D.A. Polarization of host immune responses by helminth-expressed glycans // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2012. - V. 1253. - N. E1-E13). В этой связи все вышеуказанное явилось основанием к исследованию изменений количества лимфоцитов, экспрессирующих CD124+, в крови новорожденных для прогноза тяжелой формы инфекции, вызванной вирусом герпеса 6 типа. Наши исследования позволили установить очень важные количественные величины CD124+, которые являются определяющими для отбора новорожденных в группу риска, а именно то, что при значениях 4,0% и выше, диагностируют тяжелую форму внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 6 типа у новорожденных детей. Способ осуществляют следующим образом: У новорожденных от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией во время беременности исследуют кровь, собранную в количестве 0,5 мл в пробирки с гепарином натрия. Затем из этой пробы отбирали по 100 мкл крови и вносили в пробирки, после чего в каждую пробирку добавляли по 20 мкл моноклональных антител (CD124+) фирмы IMMUNOTECH (Франция) и инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. В каждую пробирку добавляли по 500 мкл гемолизирующего буфера из набора реагентов сложных диагностических для иммунологии и инкубировали 20 минут при комнатной температуре. Затем в каждую пробирку добавляли по 1 мл фосфатно-солевого буфера из набора реагентов сложных диагностических для иммунологии и центрифугировали 3 минуты при 1500 оборотах в минуту, и так 2 раза. К осадку лимфоцитов добавляли в каждую пробирку по 1 мл фосфатно-солевого буфера из набора реагентов сложных диагностических для иммунологии. Ресуспензировали 3 секунды каждую пробирку. Величину экспрессии мембранных маркеров лимфоцитов СД124+ крови определяли на проточном цитометре «BeckmanCOULTER» EpicsXLII. Выделение лимфоидного региона проводили окрашиванием CD45/CD14 по графикам светорассеивания. При выявлении в крови количества лимфоцитов, экспрессирующих CD124+ 4,0% и выше диагностируют тяжелую форму внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 6 типа у новорожденных детей, что позволяет неонатологу своевременно назначить адекватную терапию.
Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1.
Ребенок Т-ко родился 22.03.2013 года, история болезни №2541.
1,7
Беременность - 3-я. (1-я беременность - роды, 2-я - медицинский аборт, 3-я настоящая). Беременность протекала на фоне хронической фетоплацентарной недостаточности.Во время беременности у женщины отмечалась острая респираторно-вирусная инфекция. При ПНР диагностике в мазке из цервикального канала был выделен вирус герпеса 6 типа. Роды 2 в сроке гестации 39 недель, через естественные родовые пути, с обвитием пуповины вокруг шеи. Масса при рождении 3600,0. Ребенок родился в удовлетворительном состоянии, оценка по шкале Апгар 8-9 баллов и на 5 сутки был выписан домой. Однако через 7 дней состояние ребенка ухудшилось за счет появления неврологической симптоматики, и ребенок был госпитализирован в отделение патологии новорожденных Ростовского НИИ акушерства и педиатрии. При проведении ПЦР диагностики крови был выделен вирус герпеса 6 типа 10. Проведено исследование содержания рецепторов к IL-4(CD124+).Уровень уровень рецепторов к ИЛ-4 (CD 124+) составил 4,0%.
Состояние ребенка при поступлении было тяжелым и характеризовалось вялостью, сниженным аппетитом, бледностью кожи, «мраморным» рисунком кожных покровов. Большой родничок на уровне костей черепа 3,0×3,0 см, не напряжен. В легких ослабленное дыхание, хрипы не выслушивались. Тоны сердца ритмичные, приглушены. Живот мягкий безболезненный. Пупочная рана эпителизирована. Печень выступает из-под края реберной дуги на 2 см, селезенка не пальпируется. Ребенок беспокоен, гипертонусмышщ конечностей, тремор конечностей и подбородка, срыгивания. Сухожильные рефлексы повышены. Рефлексы орально-спинального автоматизма вызываются, быстро угасают.
9
12
При осмотре окулиста была выявлена ангиопатия сосудов сетчатки 1 степени обоих глаз. По данным ЭХОКС была выявлена функционирующая фетальная коммуникация - открытое овальное окно. На нейросонограмме отмечалось расширение передних рогов боковых желудочков (S:D 5,3:5,3 мм), слева в проекции переднего рога бокового желудочка - субэпендимальная псевдокиста диаметром 1,6 мм. Венозный отток был не затруднен. В общем анализе крови определялся лейкоцитоз (14,7×10/л), моноцитоз (16%), эозинофилия (9%), снижение уровня гемоглобина до 99 г/л, эритроцитов до 2,7×10/л. В общем анализе мочи определялась лейкоцитурия. В иммунограмме имело место повышение уровня иммуноглобулина А (0,66 г/л). Заболевание протекало в тяжелой форме. На основании клинических симптомов, данных ДНК диагностики крови, свидетельствующих об обнаружении ДНК вируса герпеса 6 типа, ребенку был выставленосновной клинический диагноз: инфекция, вызванная вирусом герпеса 6 типа, тяжелая генерализованная форма: церебральная ишемия, гипертензионный синдром, синдром вегетовисцеральных нарушений; нормохромная, номоцитарная анемия легкой степени.
Назначена антибактериальная, ноотропная противовирусная, имунсзаместительная терапия, интерферонотерапия. Таким образом, прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Пример 2.
1,1
9
12
Ребенок Б-ко родился 03.05.2013 года, история болезни №2981. Беременность вторая (1-я беременность - роды). Беременность протекала на фоне вегетососудистой дистонии сочетанного генеза, токсикоза, кольпита, острой респираторно-вирусной инфекции, хронического фаринготонзиллита. При ПЦР диагностике в мазке из цервикального канала был выделен вирус герпеса 6 типа. Роды 2 в сроке гестации 40 недель, через естественные родовые пути. Масса при рождении 3800,0. Ребенок родился в удовлетворительном состоянии, оценка по шкале Апгар 7-8 баллов. На 2-е сутки состояние ухудшилось за счет появления беспокойства, кратковременных апноэ, багрово-цианотичной окраски кожных покровов при крике. На 5 сутки жизни ребенок был переведен в отделение патологии новорожденных Ростовского НИИ акушерства и педиатрии. При проведении ДНК диагностики крови. Выделена ДНК вируса геперса 6 типа 10. Методом иммуноферментного анализа определялся повышенный уровень IgG к вирусу герпеса 6 типа. Проведено исследование содержания рецепторов к IL -4 (CD 124+). Уровень рецепторов к IL-4(CD 124+) составил 4,2%. Состояние ребенка при поступлении было тяжелым. Кожа бледно-розовая, чистая. Большой родничок на уровне костей черепа 2,0×2,0 см, напряжен. Дыхание без участия вспомогательной мускулатуры. В легких пуэрильное дыхание, хрипы не выслушивались. Тоны сердца ритмичные, приглушены. Живот мягкий безболезненный. Пупочная рана эпителизирована. Печень выступает из-под края реберной дуги на 0,5 см, селезенка не пальпируется. Ребенок беспокоен, мышечная дистония с тенднцией к гипертонусу сгибателей, спонтанный рефлекс Бабинского, периоральный и акроцианоз при плаче. Тремор подбородка и конечностей. Сухожильные рефлексы живые S=D. Рефлексы орально-спинального автоматизма вызываются. При осмотре окулиста была выявлена ангиопатия сосудов сетчатки 1 степени обоих глаз. Нестабильность носослезных каналов обоих глаз. По данным ЭХОКС была выявлена функционирующая фетальная коммуникация - открытое овальное окно. При ультразвуковом исследовании печени и почек патологии выявлено не было. На нейросонограмме отмечалось расширение передних рогов боковых желудочков (S:D 5,4:6,3 мм), повышенная эхогенность паренхимы мозга. Рисунок борозд и извилин в норме. Венозный отток был не затруднен. В общем анализе крови уровень лейкоцитов в норме (10,1×10/л), моноцитоз (10%), уровень гемоглобина в норме (183 г/л), эритроцитов в норме (5,4×10/л) и лимфоцитов в норме (54%). В общем анализе мочи патологии не выявлено. В иммунограмме признаков активного иммунного реагирования выявлено не было. Заболевание протекало в тяжелой форме. На основании клинических симптомов, данных ДНК диагностики крови, свидетельствующих об обнаружении ДНК вируса герпеса 6 типа, ребенку был выставлен основной клинический диагноз: инфекция, вызванная вирусом герпеса 6 типа, тяжелая форма: дакриоцистит, церебральная ишемия, гипертензионный синдром, синдром нервно-рефлекторной возбудимости. Назначена антибактериальная, ноотропная противовирусная, имунозаместительная терапия, интерферонотерапия. Таким образом, прогноз по заявляемому способу подтвердился.
Пример 3.
Ребенок Р-па родился 06.04.2013 года, история болезни №3019. Ребенок родился от 1 беременности, протекавшей на фоне острой респираторновирусной инфекции в 1 триместре, гестоза в 37 недель. Роды 1 в сроке гестации 40 недель, через естественные родовые пути. Масса при рождении 3450,0, состояние удовлетворительное, оценка по шкале Апгар 8-9 баллов. На 5 сутки жизни ребенку проведена ПЦР диагностика крови. ДНК вируса герпеса 6 типа не выделена. Методом иммуноферментного анализа антитела IgG к вирусу герпеса 6 типа не определялись. Проведено исследование содержания рецепторов к IL-4(CD 124+). Уровень рецепторов к IL-4(CD 124+) составил 0,6%. При обследовании ребенка в возрасте 1 месяца выявлено, что ребенок здоров и на первом месяце жизни ничем не болел.
Достоверность предлагаемого способа подтверждена клинико-лабораторными исследованиями. По заявляемому способу было обследовано 40 новорожденных от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией во время беременности.
У 24 из них (1 группа) количество лимфоцитов, экспрессирующих CD 124+, было 4,0% и выше, что свидетельствовало о риске тяжелой формы внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 6 типа и было подтверждено в процессе дальнейшего клинико-лабораторного наблюдения. У 16 новорожденных (II группа) данные показатели были ниже, что предполагало благоприятное течение неонатального периода.
В первой группе процент реализации инфекции, вызванной вирусом герпеса 6 типа составил 91,7%, в сравнении с 6,25% во 2-й группе.
Результаты статистического анализа в среде пакета прикладных программ STATISTIKA 6 позволили разработать прогностическое правило формирования групп риска среди новорожденных детей от матерей с персистирующей герпесвирусной инфекцией во время беременности с использованием метода логистической регрессии (Ребров 0.10. Статистический анализ медицинских данных, Москва. - Медиа сфера. - 2003). Полученное правило обеспечивает высокую точность, чувствительность и специфичность метода.
ТОЧНОСТЬ (ИП+ИО)/(ИП+ИО+ЛП+ЛО) 77,9% ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ИП(ИП+ЛО) 91,00% СПЕЦИФИЧНОСТЬ ИО/(ИО+ЛП) 65,13%.
Таким образом, по количеству лимфоцитов, экспрессирующих CD 124+, в крови новорожденных было возможно проводить раннюю диагностику тяжелой формы внутриутробной инфекции, вызванной вирусом герпеса 6 типа в периоде новорожденности. Предложенный нами способ достаточно прост, позволяет проводить раннюю диагностику тяжелой формы заболевания, на основании этого назначать противовирусную терапию не всем новорожденным из группы риска, а дифференцированно. Способ апробирован в родильном доме и отделении патологии новорожденных РНИИАП.
Преимущество заявляемого метода состоит в том, что на основании высокочувствительных современных лабораторных маркеров производится ранняя диагностика тяжелой формы внутриутробной инфекции, вызванной вирусом простого герпеса 6 типа, с целью своевременного назначения патогенетической терапии. В клинической практике это позволит снизить процент инвалидизации за счет своевременного формирования новорожденных группы риска и начала адекватных лечебных мероприятий. Проведенные исследования свидетельствуют о том, что заявляемый способ обладает быстротой исполнения с использованием стандартных тест-систем, может быть рекомендован для широкого клинического применения в практическом здравоохранении.