Антагонистические эффекты изоформ рецептора интерлейкина-5 при бронхиальной астме

Медицинская Иммунология 2004, Т.6, № 1-2, стр 121-126 ©2004, СПбРОРААКИ

Краткие сообщения

АНТАГОНИСТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ИЗОФОРМ РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-5 ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ

Сазонов А.Э., Иванчук И.И., Огородова Л.М., Кобякова О.С., Попова И.С., Копьева А.П.

Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск, Россия

Резюме. Изучена экспрессия мРНК IL-5 и изоформ его рецептора в мокроте больных бронхиальной астмой. Исследование проведено в трех группах пациентов (с легкой, средиетяжелой и тяжелой бронхиальной астмой) и контрольной группе. Установлено, что наиболее высокая экспрессия мРНК IL-5 наблюдалась в группе тяжелых больных. Этот показатель снижался на фоне терапии кортикостероидами. У больных тяжелой и среднетяжелой астмой общий уровень мРНК растворимой изоформы а-субъединицы рецептора IL-5 в период обострения был ниже, чем при легкой астме. Лечение кортикостероидами приводило к повышению экспрессии мРНК растворимой изоформы а-субъединицы рецептора IL-5 при легкой и среднетяжелой БА, но не влияло на изменение этого показателя у тяжелых больных. Легкая и среднетяжелая Б А характеризуется преимущественной экспрессией мРНК S1 варианта растворимой изоформы, тогда как тяжелая БА - S2 варианта изоформы. Повышенная экспрессия мРНК мембраносвязанной изоформы а-субъединицы рецептора IL-5 по сравнению с другими группами и контролем наблюдалось только у пациентов с тяжелой бронхиальной астмой в период обострения и ремиссии.

Ключевые слова: интерлейкин 5, рецептор интерлейкина 5, бронхиальная астма.

Sazonov А.Е., Ivanchuk I.I., Ogorodova L.M., Kobjakova O.S., Popova I.S., Koljeva A.P.

ANTAGONISTIC EFFECTS OF INTERLEUKIN-5 RECEPTOR ISOFORMS IN BRONCHIAL ASTHMA

Abstract. Expression of mRNA of IL-5 and its receptor isoforms in induced sputum of asthmatics and healthy controls was studied. The highest expression of IL-5 mRNA was found in sputum of severe asthmatics. IL-5 in RNA expression decreased significantly after inhaled steroids treatment. In severe and moderate asthma total level of soluble IL-5 receptor alpha isoform mRNA was lower compared to mild asthma. Inhaled steroids effectively increased soluble IL-5 receptor alpha isoform mRNA expression in mild and moderate asthma but not in severe asthma. Mild and moderate asthmatics predominantly express SI variant of soluble IL-5 receptor alpha isoform when severe asthma is characterized by S2 soluble IL-5 receptor alpha isoform expression. High expression of membrane-linked IL-5 receptor alpha isoform mRNA was found only in severe asthma both before and thereafter treatment.

Введение

Бронхиальная астма (БА) является хроническим воспалительным заболеванием дыхательных путей, характеризуется обратимой бронхиальной обструкцией и гиперреактивносгыо бронхов [9]. Главная эффекторная клетка воспаления при БА

- эозинофил [4]. В созревании, дифференцировке

Адрес для переписки:

634050, г.Томск, Московский тракт 2, СибГМУЦНИЛ.

Тел/факс: (3822) 52-99-16.

E-mail: biotech@ssmu.nrt.ru; sazonov_al@mail.ru

и активации эозинофилов ключевым фактором является интерлейкин-5 (1Ь-5), поскольку рецепторы для этого цитокина экспрессируются преимущественно именно наэозинофилах [13,16]. 1Ъ-5 имеет важное патофизиологическое значение в формировании воспалительного процесса при астме [3, 5, 12, 15]. У больных БА выявлено увеличение концентрации этого цитокина в воздухоносных путях после стимуляции специфическим антигеном, а в биоптатах бронхов обнаружено возрастание экспрессии мРНК Ш-5, которое коррелирует с тяжестью заболевания, снижением ОФВ, и ПСВ [5].

Клеточные эффекты 1Ь-5 опосредуются через его рецептор (11,-511), который относится к семейству цитокиновых рецепторов первого типа (наряду с рецепторами к 1Ь-3 и СМ-К5Р). Этот рецептор является интегральным мембранным гликопротеином и состоит из двух нековалентно ассоциированных субъединиц: а-субъединицы (1Ь-5Яа), отвечающей за специфичное связывание с 1Ь-5 и ^-субъединицы (1Ь-5Й.Р), отвечающей за внутриклеточное проведение сигнала с комплекса 1Ь-5Иа/ 1Ь-5. Альтернативный сплайсинг мРНК 1Ь-5Яа может приводить к образованию различных изоформ рецептора, которые обладают антагонистическими свойствами: т1Ь-511а (мембраносвязанная изоформа) необходима для проведения сигнала внутрь клетки, тогда как sIL-5R.cc (растворимая изоформа, представленная в двух вариантах - Б1 и Б2) может связывать свободный 1Ь-5, блокируя его физиологическую активность [14, 7]. Было показано, что рекомбинантный растворимый рецептор ингибирует И-5 опосредованную активацию и продукцию воспалительных медиаторов, предотвращает тирозинфосфорилирование ^К2, освобождение лейкотриена СД10]. Альтернативный сплайсинг не является строго детерминированным, соотношение экспрессии ш1Ь-5Ка и эГЬ-бЯа может варьировать. В зависимости от преобладания продукции той или иной изоформы может изменяться конечная концентрация 1Ь-5 в тканях и периферической крови,

модулироваться сигнал в 1Ь-511а+-клетках. Патологический дисбаланс продукции изоформ рецептора может реализоваться в прогрессировании эозинофильного воспаления, поэтому представляет интерес изучение экспрессии мРНК IL-5 и изоформ его рецептора и их участие в процессе формирования тяжелых, сложноконтролируемых форм бронхиальной астмы.

Материалы и методы

Исследование проводили в трех группах больных Б А. Обследован 71 пациент (21с легкой степенью тяжести, 15 со среднетяжелой БА и 35 - тяжелых больных), средний возраст которых составил 38,4 ± 4,1 год. Верификация диагноза и определение степени тяжести проведены в соответствии с критериями документа GINA 2002 [Global Initiative for asthma. Global Strategy for Asthma Management and Prévention, 2002 // www.ginasthma.com.]. Группу контроля составили 12 добровольцев, не страдающих БА, другими атопическими заболеваниями, гельминтозами, с отрицательными результатами аллерготестирования.

Терапию назначали в соответствии со степенью тяжести заболевания: при легкой БА использовали монотерапию флютиказона пропионатом в суточной дозе 250 мкг, при среднетяжелой и тяжелой БА применяли комбинированную терапию

Табл.1. ЭКСПРЕССИЯ мРНК 11.-5 (в процентах) В МОКРОТЕ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТЯЖЕСТИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ

Контрольная группа п=12 Легкая астма, п=21 Среднетяжелая астма, п=15 Тяжелая астма,п=35

обострение ремиссия обострение ремиссия обострение ремиссия

IL-5 22,6±3,2 72,8±4,6 25,4±6,3*,*** 72,3±7,6 47,6±7,4* 152,0±8,6*‘ 58,0±8,7*

Примечание: * р < 0,05 - по сравнению с обострением; ** р < 0,05 - по сравнению с легкой и среднетяжелой астмой; *** р < 0,05 - по сравнению со среднетяжелой и тяжелой астмой

Табл. 2. ЭКСПРЕССИЯ мРНК (в процентах) МЕМБРАНОСВЯЗАННОЙ ИЗОФОРМЫ сс-СУБЪВДИНИЦЫ РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-5 (тИ-5Па), ОБЩЕЙ РАСТВОРИМОЙ ИЗОФОРМЫ а-СУБЪЕДИНИЦЫ РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-5 (вИ-бЯсх) В МОКРОТЕ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТЯЖЕСТИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ

мРНК Контрольная группа п=12 Легкая астма, п=21 Среднетяжелая астма, П=15 Тяжелая астма, п=35

обострение ремиссия обострение ремиссия обострение ремиссия

slL-5R<x (si + s2) 27,6±3,9 25,4±3,7 39,7±5,8* 16,9±2,5*‘ 27,1 ±6,7* 17,4±3,3" 21,8±4,7‘*

mlL-5Ra 32,1 ±1,1 34,1±3,6*** 33,1±2,5"* 30,1±2,9*** 37,7±5,5 46,0±4,6 55,0±6,8

Примечание: * р < 0,05 - по сравнению с обострением; ** р < 0,05 - по сравнению с легкой астмой (обострение и ремиссия соответственно); *** р < 0,05 - по сравнению с тяжелой астмой

серетидом; суточная доза флютиказона пропионата составила 500 и 750 мкг соответственно. Объектом исследования служила индуцированная мокрота, которую получали до лечения (в период обострения) и после двенадцати недель лечения (в период медикаментозной ремиссии заболевания). Все диагностические и клинические манипуляции осуществляли на базе Областного астмацентра.

Индуцированную мокроту получали по методике в модификации Попова [11]. Образцы мокроты объемом до 2 мл собирали в пластиковые контейнеры с последующей обработкой «Муколизином» (раствор дитиотритиола, Центральный НИИ эпидемиологии М3 РФ, Москва) согласно приложенной инструкции и отбирали по 200 мкл суспензии клеток на анализ. Помимо этого в клеточной суспензии подсчитывали относительное содержание эози-нофилов.

Тотальную РНК из 200мкл суспензии клеток выделяли, используя наборы «TR1ZOL» (Gibco BRL) согласно приложенной инструкции. Затем, применяя процесс обратной транскрипции тотальной РНК, получали кДНК.

РТ-ПЦР выполняли с использованием праймеров: для мРНК IL-5: прямой -5' - GCT ТСТ GCA ТТТ GAG ТТТ GCT AGC Т; обратный - 3’ - TGG CCG ТСА AT G TAT TTC ТТТ ATT AAG; для мРНК mIL-5Ra: прямой -5'- GCC СТТ САС GCC ATT GAT CAT -3', обратный 5'- АТС СТС CAG GGT СТС ААС ТСС -3'; для мРНК sIL-5Ra (SI): прямой-5'- TTG СТС TAC TAT AGG TAT GGC -3’, обратный- 5’- TCT TG A GAA CCC CAT АТС GAT-3', для мРНК sIL-5Ra (S2): прямой-5'- TGC CAA GAA TAC AGC AGA GAC -3', обратный- 5'-CTT ACC САС АТС GAT AGG CTG -3. В результате получали продукты длиной 271 п.о., 550 п.о., 500 п.о. и 450 п.о. соответственно. Экспрессию мРНК оценивали полуколичественно в сравнении с экспрессией гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH), относящегося к постоянно экспрессирующим генам, для которого были подобраны следующие праймеры: прямой-5’-ССС AAG СТС ACT GGC ATG GCC TTC С-3'; обратный - 5’-САТ GTG GGC CAT GAG GTC САС САС-3'. Степень экспрессии мРНК выражали в процентах. Все праймеры были синтезированы на автоматическом ДНК-синтезаторе («Биос сет», Новосибирск).

Форез ПЦР-продуктов проводили на 2% агарозном геле и оценивали при помощи адаптированной компьютерной программы «Biotest D».

Статистическую обработку проводили с использованием программы «Statistica 5.0». Значимость различий между сравниваемыми группами устанавливали с использованием критериев Вилкоксона и Манна-Уитни. Зависимость между отдельными по-

казателями оценивали с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена.

Результаты и обсуждение

Ранее нами было показано, что уровень продукции IL-5 в мокроте пациентов с БА был достоверно выше контроля. Кроме того, наблюдались определенные различия по этому показателю у пациентов с разной степенью тяжести Б А [1]. В настоящей работе исследована экспрессия мРНК IL-5 и установлено, что она достоверно различалась в зависимости от тяжести заболевания: наиболее высокая экспрессия наблюдалась в группе тяжелых больных, у больных с легкой и среднетяжелой формами заболевания этот показатель был ниже. Активность экспрессии мРНК этого цитокина значительно снижалась на фоне адекватной терапии ингаляционными кортикостероидами. Как и в случае с оценкой экспрессии самого цитокина, экспрессия мРНК IL-5 у больных БА была достоверно выше, чем у здоровых во всех случаях, за исключением данных, полученных при ремиссии легкой астмы (табл. 1).

Патофизиологические эффекты IL-5 зависят не только от общего количества этого цитокина, но и от степени экспрессии его рецептора, а именно от экспрессии IL-5Ra, специфически связывающей свободный интерлейкин. В работе Sehmi с соавторами было показано, что уровень тотальной мРНК IL-5R повышен у больных БА по сравнению со здоровыми волонтерами [13]. Однако остается открытым вопрос о том, продукция какой изоформы преобладает. В нашей работе мы исследовали экспрессию мРНК всех изоформ рецептора в мокроте больных. Оказалось, что в зависимости от тяжести заболевания мембраносвязанная и растворимая изоформы рецептора экспрессируются по-разному (табл. 2).

У больных тяжелой и среднетяжелой астмой суммарный уровень мРНК sIL-5Ra в мокроте в период обострения был на 32% ниже, чем при легкой астме, в ремиссии данные показатели у больных легкой и среднетяжелой БА стали сопоставимы, тогда как различие между пациентами с легкой и тяжелой астмой стало еще более значительным за счет повышения уровня мРНК sIL-5Ra в мокроте больных с легкой БА. При этом лечение кортикостероидами приводило к достоверному повышению экспрессии мРНК sIL-5Ra в случае легкой и среднетяжелой БА, но не влияло на изменение этого показателя у тяжелых больных. Что касается мРНК mIL-5Ra, то ее уровень до и после лечения тяжелой, среднетяжелой и легкой астмы достоверно не различался, однако было замечено, что в группе тяжелых больных в ремиссии данный показатель незначительно увеличивался. При этом,

в отличие от динамики экспрессии суммарной мРНК з1Ь-5Ка, повышенная экспрессия мРНК т1Ь-5Яапо сравнению с другими группами и контролем наблюдалась только у тяжелых пациентов, как в период обострения, так и в период ремиссии. Корреляционный анализ продемонстрировал положительную связь между степенью тяжести астмы и уровнем мРНК ш1Ь-5Ка (г=0,62; р=0,001) и обратную зависимость тяжести астмы и экспрессии мРНК sIL-5R.cc (г-0,79; р-0,001).

По результатам нашего исследования, низкие дозы кортикостероидов, назначаемые при легкой астме, способствовали уменьшению экспрессии мРНК 1Ь-5 и увеличению экспрессии мРНК б1Ь-5Ra, но не влияли на уровень мРНК mIL-5Ra. Известно, что ингаляционные кортикостероиды оказывают прямое действие на экспрессию генов про-воспалительных цитокинов, в частности 1Ь-5, снижая их гиперпродукцию [2]. Возможно, кортикостероиды параллельно с основным действием опосредованно влияют на посттрансляционный сплайсинг мРНК рецептора таким образом, что происходит переключение с образования шIL-5Ra-изoфop-мы белка на sIL-5Ra-изoфopмy, приводя к увеличению количества той формы рецептора, которая может ингибировать действие 1Ь-5 через конкурентное связывание с ним. Кроме того, ранее была выдвинута гипотеза, что мРНК sIL-5Ra-изoфopмы могут быть продуктом протеолитического расщепления мРНК ш!Ь-5На [8]. Однако в этом случае при повышении уровня мРН К з1Ь-5Иа мы должны были наблюдать снижение мРНК т1Ь^а, чего не происходит. Результаты данного исследования показывают, что это хоть и взаимосвязанные, но различные процессы.

В отличие от пациентов с легкой БА, у пациентов с тяжелой БА не было различий экспрессии мРНК рецептора 1Ь-5. Незначительное повышение экспрессии мРНК обеих форм рецептора вполне укладывается в рамки статистической погрешности. Отсутствие влияния глюкокортикои-дов на посттранскрипционные процессы заставляет предположить, что при тяжелой БА имеется дисфункция внутриклеточных молекулярных механизмов, обеспечивающих регуляцию соотношения экспрессии мембраносвязанной и растворимой форм рецептора. Об этом же говорит тот факт, что соотношение между продукцией мРНК ш1Ь-5Иа и мРНК sIL-5Ra, которое при легкой БА составляет приблизительно 1:1, в случае тяжелой формы заболевания становится 2,7:1 (табл. 2). Превалирование продукции mIL-5Ra-фopмы естественным путем ведет к большей восприимчивости эозинофилов (как и других мРНК клеток) к действию 1Ь-5 и уменьшению антивос-палительного эффекта sIL-5Ra.

Растворимая форма рецептора может быть представлена еще двумя изоформами (Б1 и Б2), которые отличаются тремя аминокислотами на С-конце пептида, и имеют различную способность к гликозили-рованию [6]. Однако неизвестно, какова их биологическая функция и какая из них преобладает при тяжелой БА.

Исследование показало, что в случае легкой и среднетяжелой астмы, как и в контрольной группе, преимущественно экспрессируется Б1-изоформа, тогда как тяжелая БА характеризуется сдвигом в сторону 82-изоформы (рис. 1).

Смысл такого перераспределения не до конца понятен, однако можно предположить, что в связи

Б2-изоформа  в 1-изоформа

Рис. 1. Процентное распределение экспрессии мРНК и Б2 изоформ растворимой а-субъединицы рецептора И-5, * р < 0,05 - по сравнению с остальными исследуемыми группами

с заменой аминокислот фолдинг S2- и S1- изоформы белка различается, следствием чего является формирование рецепторов с разной степенью аффинности к IL-5.

Выводы

Продукция IL-5 в мокроте больных БА связана со степенью тяжести БА, экспрессия мРНК IL-5 в мокроте больных с тяжелой астмой выражена в большей степени, что свидетельствует о важной роли этого цитокина в процессе воспаления при БА. Адекватное лечение приводит к снижению экспрессии мРНК этого цитокина.

Действие IL-5 опосредуется через рецепторный аппарат и регулируется соотношением мембраносвязанной и двух растворимых форм сс-субъедини-цы рецептора. В случае легкой и среднетяжелой БА лечение приводит к повышению экспрессии мРНК растворимой изоформы рецептора, тогда как при тяжелой форме заболевания этого не происходит. Легкая и среднетяжелая БА характеризуется преимущественной экспрессией мРНК S1 варианта растворимой изоформы, тогда как тяжелая БА - S2 варианта изоформы. Предполагается, что нарушение механизма сложных лиганд-рецепторных взаимодействий может приводить к формированию тяжелой БА. Снижение экспрессии IL-5 характеризует ремиссию заболевания, в связи с чем использование препаратов, ингибирующих патологическое действие IL-5, может являться перспективным направлением в лечении БА. Однако aimi-IL-5 терапия может быть направлена не только на уменьшение эффектов самого IL-5, но и на регуляцию экспрессии различных изоформ его рецептора.

Список литературы

1. Сазонов А.Э., Петровский Ф.И., Иванчук И.И., Геренг Е.А., Огородова Л.М. Экспрессия ИЛ-5 в мокроте больных бронхиальной астмой // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2003.-Т.135.-№ 4.-С. 437-440.

2. Bloom J.W. New insights into the molecular basis of glucocorticoid action // Immunology and Allergy Clinics of North America. - 1999. - Vol.19. -N. 4. -P.653 - 670.

3. Bradley B.L., Azzawi М., Jacobson М., Assoufi B, Collins JV, Irani AM, Schwartz LB, Durham SR, Jeffery PK, Kay AB. Eosinophils, T-lymphocytes, mast cells, neutrophils, and macrophages in bronchial biopsy specimens from atopic subjects with asthma: comparison with biopsy specimens from atopic subjects without asthma and normal control subjects and relationship to bronchial hyperresponsiveness //J. Allergy. Clin. Immunol. - 1991. - Vol.88. - P.661-674.

4. Gleich G.J. Mechanisms of eosinophil-associated inflammation //J. Allergy. Clin. Immunol. - 2000. -Vol.105. - N.4. - P.651-663.

5. Huang J.C., Martinez-Moczygemba M., Nguyen A.P., Huston D.P. IL-5 and eosinophils in asthma and atopy: time for a new paradigm // Therapeutic targets of airway inflammation / ed: Huston D.P., Eissa T., - New York, Marcel-Dekker, Inc, 2003. P.495-518.

6. Huston D.P. Interleukin-5: a therapeutic target in asthma// International Journal on Immunorehabil-itation. - 1997. - N.7. - P.7-12.

7. Johanson K., Appelbaum E., Doyle M., Hensley P., Zhao B., Abdel-Meguid S.S., Young P., Cook R., Carr S., Matico R., Cusimano D., Dul E„ Angelichio M., Brooks I., Winborne E„ McDonnell P., Morton T„ Bennett D., Sokoloski T„ McNulty D., Rosenberg M., Chaiken I. Binding Interactions of Human Interleukin 5 with Its Receptor a- Subunit // Am. Soc. Biochem. Mol. Biol. - 1995. - Vol.270. - N.16. -P.9459-9471.

8. Liu L.Y., Sedgwick J.B., Bates M.E., Vrtis R.F., Gern J.E., Kita H., Jarjour N.N., Busse W. W., Kelly E.A.B. Decreased Expression of Membrane IL-5 Receptor-a on Human Eosinophils: II. IL-5 Down-Modulates Its Receptor Via a Proteinase-Mediated Process //J. Immunol. - 2002. - Vol.169. - P.6459-6466.

9. McFadden E.R. Jr., Gilbert I.A. Asthma // New Engl. J. Med. - 1992. - Vol.327. -P.1928-1937.

10. Monahan J., Siegel N., Keith R., Caparon M„ Christine L.,Compton R., Cusik S., Hirsch J., Huynh M., Devine C., Polazzi J., Rangwala S., Tsai B„ Por-tanova J. Attenuation of IL-5-mediated signal transduction, eosinophil survival, and inflammatory mediator release by a soluble human IL-5 receptor //J. Immunol. - 1997. - Vol.159. - P.4024-4034.

11. Popov T.A., Pizzichini M.M.M., Pizzichini E„ Kolendowicz R., Punthakee Z., Dolovich J., and Har-greave F.E. Some technical factors influencing the induction sputum for cells analysis // Eur. Respir. J. -1995. - Vol.8. - P.559-565.

12. Robinson D.S., Hamid Q., Ying S., Tsicopoulos A., Barkans J., Bentley A.M., Corrigan C., Durham S.R., Kay A.B. Predominant TH2-like bronchoalveolar T-lymphocyte population in atopic asthma // New Engl. J. Med. - 1992. - Vol.326. - P.298-304.

13. Sehmi R., Wood L.J., Watson R„ Foley R., Hamid Q., O’Byrne P.M., Denburg J.A. Allergen-induced increases in IL-5 receptor alpha-subunit expression on bone marrow-derived CD34+cells from asthmatic subjects. A novel marker of progenitor cell commitment towards eosinophilic differentiation //J. Clin. Invest.

- 1997. - Vol.100. - P.2466-2475.

14. Tavernier J., Tuypens T., Plaetinck G„ Verhee A., Fiers W., and Devos R. Molecular basis of the membrane-anchored and two soluble isoforms of the human

interleukin 5 receptor subunit // Proc. Nat. Acad. Sci.

- 1992. - Vol. 89. - P.7041-7045.

15. Walker C., Kaegi M.K., Braun P., Blaser K. Activated T cells and eosinophilia in bronchoalveolar lavages from subjects with asthma correlated with disease severity //J. Allergy. Clin. Immunol. - 1991. -Vol.88. -P.935-942.

16. Yamada Т., Sun Q., Zeibecoglou K., BungreJ., North J„ Kay A.B., Lopez A.F., and Robinson D.S. IL-

3, IL-5, granulocyte-colony-stimulating factor receptor alpha-subunit, and common beta-subunit expression by peripheral leukocytes and blood dendritic cells //J. Allergy. Clin. Immunol. - 1998. - Vol.101. - P.677-682.

поступила в редакцию 15.12.2003 отправлена на доработку 13.02.2004 принята к печати 25.02.2004