ПРИМЕНЕНИЕ ЛЕПТИНА ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЗБЫТОЧНОЙ МАССЫ ТЕЛА И КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ЛЕПТИН
USING LEPTIN FOR PREVENTING OVERWEIGHT AND COMPOSITIONS CONTAINING LEPTIN

Область техники
Настоящее изобретение относится к области контроля массы тела с использованием соединений, которые предотвращают избыточную массу тела.
Предпосылки создания настоящего изобретения
Избыточная масса тела является нарушением, процент которого постоянно возрастает в развитых странах и действительно представляет важную проблему не только с эстетической точки зрения, но и представляет опасность для здоровья людей, а также является источником других социальных и экономических проблем. Избыточная масса тела связана с высоким риском развития осложнений, таких как респираторные заболевания, сердечные заболевания, диабет, гипертензия и т.п.
Лептин участвует в передаче одного из наиболее важных сигналов, которые способствуют поддержанию массы тела, и является циркулирующим белком, кодируемым геном ов, который был идентифицирован и клонирован в 1994 г. (Zhang Y., Proenca R., Maffei M., Barone M., Leopold L. and Friedman J.M., Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature 372: 425-423 (1994)). Лептин в основном экспрессируется в жировой ткани. На начальной стадии исследования считалось, что лептин является антижировым гормоном, так как у животных с мутантными генами ов, то есть у животных, у которых в генах ов отсутствует лептин, развивается ожирение и диабет. Например, мыши ов/ов, у которых отсутствует лептин, относятся к фенотипу с ожирением и диабетом. Если таким мышам вводят лептин, то у них наблюдается снижение потребления корма и увеличение потребления энергии, что, в свою очередь, приводит к снижению жира в организме, а также к снижению уровня циркулирующих глюкозы и инсулина. Следовательно, у таких мышей и аналогичных моделей животных лептин проявляет функцию регуляции размера жировых отложений в организме. И действительно уровень этого белка в плазме напрямую зависит от жировой массы у мышей и человека, однако на практике введение лептина людям с ожирением в большинстве случаев не эффективно.
Известно, что действие лептина, высвобождающегося в кровотоке в количестве, пропорциональном жировой массе, осуществляется на уровне центральной нервной системы, в основном за счет передачи сигнала в гипоталамус об уровне жировых запасов. Затем лептин за счет комбинации эффектов, которые он оказывает на центральную и периферическую систему, регулирует соответствующие скорость потребления и степень затраты энергии, что способствует поддержанию количества жира в организме в определенном диапазоне. Однако большинство людей с ожирением оказались устойчивыми к прямому действию лептина, который в основном продуцируется в жировой ткани. Несмотря на доказанное снижение массы тела и нормализацию метаболических нарушений в гене ов при введении гормона, в большинстве случаев ожирения такое введение гормона не оказывает прямого действия.
В настоящее время установлено, что несмотря на предварительные данные об адипоцитах как основном источнике лептина, этот гормон синтезируется также в других нежировых тканях, таких как плацента, эпителий молочной железы, скелетные мышцы и желудок (см. статьи Smith-Kirwin S.M., О'Connor D.M., De Johnston J., Lancey E.D., Hassink S.G. and Funanage V.L., Leptin expression in human mammary epithelial cells and breast milk, J. Clin Endocrinol metab, 83: 1810-1813 (1998); Wang J., Liu R., Hawkins M., Barzilai N. and Rossetti L., A nutrient-sensing pathway regulates leptin gene expression in muscle and fat, Nature 393: 684-688 (1998)). В настоящее время установлено также, что кроме действия лептина на процессы, регулирующие массу тела, лептин проявляет множество других функций: выявление периодов голодания и запуск процессов адаптации метаболизма, которые регулируют репродукцию и иммунную систему, и влияние на другие эндокринные и нейронные механизмы.
Заслуживает внимания тот факт, что нежировой лептин продуцируется в значительных количествах в желудке взрослых крыс и человека, а также в эпителии молочной железы, так как лептин присутствует в материнском молоке (Casabiel X. и др., Presence of leptin in colostrums and/or breast milk from lactating mothers: a potential role in the regulation of neonatal food intake, J Clin Endocrinol Metab 82: 4270-4273 (1997)). Лептин присутствует также в желудке грызунов во внутриутробный и неонатальный периоды, хотя и не синтезируется по эндогенному механизму, но поступает из организма матери и соответственно из клеток амниотической жидкости и клеток молочной железы, из которых он высвобождается и абсорбируется незрелой слизистой оболочкой желудка. Действительно, только через две недели после рождения продуцирование эндогенного лептина преобладает над лептином, полученным из внешних источников.
Полученные данные свидетельствуют о том, что лептин играет важную роль на ранних стадиях жизни новорожденного в качестве компонента материнского молока, однако в настоящее время известно, что несмотря на его роль в поддерживании соответствующего контроля массы тела, в литературе отсутствуют данные о предупредительном действии лептина на наращивание массы тела после его введения в средние и длительные сроки.
Описание вариантов осуществления изобретения
Настоящее изобретение относится к применению лептина для получения композиции, предназначенной для кормления новорожденных и детей вплоть до подросткового возраста, причем указанные композиции содержат лептин в количестве более 50 нг/кг, для предотвращения избытка массы тела и/или осложнений, которые развиваются при указанном состоянии в более поздние годы. В качестве указанного лептина используют рекомбинантный лептин, который можно получить из различных источников, включая человека, причем используют полноцепной рекомбинантный лептин или частично гидролизованный лептин. Термин «частично гидролизованный лептин» означает любой фрагмент указанной молекулы, который сохраняет функциональные свойства лептина.
Настоящее изобретение также относится к применению лептина для получения препарата композиции, причем указанная композиция является продуктом детского питания.
Кроме того, настоящее изобретение относится к применению указанной пищевой композиции, которое характеризуется тем, что указанную композицию получают в виде порошкообразного молока для кормления грудных детей или заменителей материнского молока для кормления детей. В предпочтительном варианте осуществления изобретения указанная пищевая композиция является пастой или детским питанием или усовершенствованным составом. В этих случаях пищевая композиция содержит лептин при концентрации от 0,1 до 30 мкг/л молока. В предпочтительном варианте указанная концентрация лептина составляет 2,5 мкг/л.
С другой стороны, объектом настоящего изобретения является применение пищевой композиции, причем пищевую композицию получают в виде продукта детского питания или пищевой добавки для кормления детей. Кроме того, настоящее изобретение характеризуется тем, что указанная пищевая композиция в любой ее форме включает суточную дозу лептина в диапазоне от 25 до 60000 нг. В предпочтительном варианте настоящего изобретения указанная пищевая добавка содержит суточную дозу 1650 нг в течение первого месяца жизни, 2300 нг в течение второго месяца и 2650 нг в течение третьего-пятого месяцев.
Указанную пищевую добавку выбирают из жидкой пищевой композиции (сироп или напиток) и твердой пищевой композиции (пероральная пищевая таблетка, пероральная пищевая капсула или растворяемый порошок).
С другой стороны, настоящее изобретение относится к пищевой композиции для кормления новорожденных и детей вплоть до подросткового возраста, которая включает лептин в количестве более 50 нг/кг композиции или обеспечивает суточную дозу лептина более 25 нг.
В предпочтительном варианте указанную композицию получают в виде продукта детского питания или порошкообразного молока для кормления грудных детей, или жидкого состава материнского молока для кормления грудных детей, или в виде пасты или продукта детского питания, или усовершенствованного состава молока. В наиболее предпочтительном варианте пищевая композиция содержит лептин при концентрации в диапазоне от 0,1 до 30 мкг/л молока и предпочтительно 2,5 мкг/л.
В другом предпочтительном варианте указанную композицию получают в виде пищевой добавки для кормления детей, которая обеспечивает суточную дозу лептина от 25 до 60000 нг. Предпочтительно указанная пищевая добавка обеспечивает суточную дозу лептина 1650 нг в течение первого месяца жизни, 23000 нг в течение второго месяца и 2650 нг в течение третьего-пятого месяцев жизни.
В предпочтительном варианте указанную пищевую добавку для кормления детей получают в виде жидкой пищевой композиции, выбранной из сиропа или напитка, или в виде твердой пищевой композиции, выбранной из следующих форм: прессованная таблетка, пероральные таблетки, пероральные капсулы и растворяемый порошок.
Иными словами, пищевая композиция включает лептин, который предпочтительно является рекомбинантным лептином из различных источников, например полноцепным рекомбинантным лептином или частично гидролизованным лептином.
Вариант осуществления настоящего изобретения
Результаты, полученные при лабораторных испытаниях на мышах, можно обобщить на человека и другие виды животных. Указанные результаты свидетельствуют о том, что впервые при введении лептина перорально в течение грудного периода появилась возможность защитить субъект от наращивания избыточной массы тела в период его взросления (как в случае приема суперкалорийной диеты, так и стандартной диеты).
Результаты основных экспериментов подробно описаны ниже.
Эксперимент 1
Исследование абсорбции лептина незрелым эпителием желудка и возможное функциональное действие
Предварительный эксперимент включал введение единой дозы лептина новорожденным крысам на стадии их кормления материнским молоком с целью определения степени абсорбции лептина и оценки его физиологического действия на крыс в стадии кормления материнским молоком. Данный эксперимент свидетельствовал об абсорбции лептина по функциональному механизму. Затем проводили другой эксперимент, который включал введение дозы лептина новорожденным крысам в течение всего периода кормления материнским молоком (21 сутки). После завершения этого периода крыс забивали для определения дополнительного физиологического действия пищевого лептина по сравнению с найденным в материнском молоке на ранней стадии развития, предпочтительно на потребление или на массу тела.
В ходе первой стадии эксперимента и для оценки абсорбции лептина единую дозу лептина вводили перорально в соответствии с пятикратным ежесуточным потреблением лептина, содержащегося в материнском молоке, крысам в возрасте 4 дней, а затем у крыс отбирали образцы крови и желудка до и после введения указанной дозы. Концентрацию лептина в образцах крови и желудка определяли методом ИФА. Через 1 ч после введения пероральной дозы лептина крысам в возрасте 4 дня уровни лептина в крови и желудке увеличиваются (см. табл.1), что свидетельствует об абсорбции лептина незрелым эпителием желудка. Этот лептин оказывает действие, так как потребление снижается.
Массы содержимого желудка и количество лептина, найденного в сыворотке крови и в желудке у контрольных крыс в возрасте 4 дней и у крыс, которым вводили единую пероральную дозу лептина, через 1 ч после введения (использовали крыс из 5 различных пометов и величины, полученные для каждого помета, выражали в процентах в каждом случае по сравнению с контролем, результаты представлены в виде средних величин ± стандартное отклонение (СО)).
Таблица 1
Контрольные крысы
Крысы после введения лептина
Содержимое желудка (%)
99,93±9,8
66,11±11,54*
Лептин в сыворотке крови(%)
100,05±9,98
200,24±20,96*
Лептин в желудке (%)
100,04±16,73
173,11±17,71*
* статистическая значимость по сравнению с контрольными крысами
Новорожденным крысам, использованным для эксперимента, вводили в течение стадии их кормления материнским молоком (в течение первых 21 дня после рождения) одну пероральную дозу лептина, эквивалентную пятикратному ежесуточному потреблению лептина, содержащегося в материнском молоке. Этих животных забивали при завершении периода их кормления материнским молоком. Лептин вводили пипеткой перорально в период 1-20 дней кормления материнским молоком и в течение двух первых часов светового цикла. Контрольные крысы получали эксципиент (воду). В качестве лептина использовали рекомбинантный крысиный лептин. Количество введенного животным лептина увеличивали в первый день от 1 нг до 43,5 нг в день 20. Указанную дозу рассчитывали как пятикратное количество лептина, потребляемого ежесуточно из материнского молока, которое, в свою очередь, рассчитывали с учетом концентрации лептина в материнском молоке (предварительно рассчитанной по данным группы из 10 кормящих крыс на трех различных стадиях кормления материнским молоком в день 7, 14 и 21) и с учетом рассчитанного общего ежесуточного потребления молока в течение периода кормления молоком, как описано в статье Kojima, Т., Nishimura, М., Yajima, Т., Kuwata, Т., Suzuki, Y., Goda, Т., Takase, S. and Harada, E., Effect of intermittent feeding on the development of disaccharidase activities in artificially reared rat pups, Comp Biochem Physiol A Mol Integr Phsyiol, 121: 289-297 (1998)).
У указанных животных отбирали образцы сыворотки и желудка. Содержание эндогенного лептина, обнаруженного в желудках детенышей крыс, получавших перорально экзогенный лептин в течение периода кормления материнским молоком, снижается по сравнению с количеством лептина, обнаруженного в желудках контрольных животных. Содержимое желудка у крыс, получавших лептин, также снижается. Что касается содержания лептина в желудке, то наблюдается значительное снижение этой величины у крыс, получавших лептин, на 23%, то есть от 1,080±0,073 г до 0,831±0,031 г. Лечение не влияет на массу тела.
Следовательно, можно сделать вывод о том, что при введении экзогенного лептина происходит его абсорбция в желудке в течение периода кормления материнским молоком и что лептин оказывает влияние на эндогенное продуцирование лептина и дополнительно снижает потребление корма. Следовательно, вполне возможно, что лептин будет влиять на массу тела в период взросления.
Эксперимент 2
Исследование действия лептина при его введении в период кормления материнским молоком на массу тела у взрослых крыс возрастом 12 недель
После подтверждения данных об абсорбции лептина при его пероральном введении в период кормления материнским молоком в его функциональной форме в незрелом желудке новорожденных крыс, авторы проводили другой эксперимент для определения возможного влияния дополнительного количества пищевого лептина в период кормления материнским молоком на возрастание массы тела у взрослых животных.
10 новорожденных крыс одного помета распределяли рандомизацией в две группы: контрольную группу и группу, получавшую лептин. Животным в период кормления материнским молоком от 1 до 20 дней перорально вводили пипеткой по 20 мкл эксципиента (воды) или рекомбинантного лептина крысы. Количество введенного лептина увеличивали от 1 нг в день 1 до 43,8 нг в день 20 (см. эксперимент 1). Указанную дозу рассчитывали с учетом пятикратного количества лептина, потребляемого ежесуточно из материнского молока, которое, в свою очередь, рассчитывали с учетом концентрации лептина в материнском молоке (предварительно рассчитанной по данным группы из 10 кормящих крыс на трех различных стадиях кормления материнским молоком в день 7, 14 и 21) и с учетом рассчитанного общего ежесуточного потребления молока в течение периода кормления молоком, как описано в статье Kojima, Т., Nishimura, M., Yajima, Т., Kuwata, Т., Suzuki, Y., Goda, Т., Takase, S. and Harada, E., Effect of intermittent feeding on the development of disaccharidase activities in artificially reared rat pups, Comp Biochem Physiol A Mol Integr Phsyiol, 121: 289-297 (1998)). В эксперименте использовали самцов крыс.
В день 21 после отъема детенышей от материнских сосков контрольных крыс и крыс, получавших лептин, разделяли на две группы: нормолипидную группу, которая получала стандартный сухой корм (3,8 ккал/г), в котором 10% калорий составляет жир, и гиперлипидную группу, которая получала сухой корм (4,7 ккал/г), в котором 45% калорий составляет жир.
Массу тела и потребление корма регистрировали три раза в неделю в течение периода от дня отъема до 12 недель. В течение всего эксперимента выполняли все инструкции и требования по уходу и использованию лабораторных животных, разработанные в университете de Ie Illes Balears.
В возрасте 12 недель у крыс не наблюдается значительного действия лечения лептином в период кормления материнским молоком на массу тела у взрослых крыс в обеих группах: в группе, получавшей нормолипидную диету или в группе крыс, получавших гиперлипидную диету (см. табл.2, отдельные примеры), и, следовательно, регистрацию массы тела продолжали в более длительный период. Следует отметить, что у крыс некоторых пометов, которые получали лептин, наблюдается некоторая тенденция к потере массы.
Масса тела самцов крыс возрастом 12 недель в контрольной группе и в группе, получавшей лептин в период кормления материнским молоком. Представлены два специфических примера для особей из одного помета (1-2 особи в группе). Показаны также средние величины для животных из всех пяти пометов. Результаты представлены в виде средних величин ± СО.
Таблица 2
Диета
Лечение
Масса тела для помета 1(г)
Масса тела для помета 2 (г)
Средние величины для животных из всех 5 пометов
Нормолипидная
Контроль
392
359
375±14
Лептин
392
325
364±13
Гиперлипидная
Контроль
416
415
412±16
Лептин
414
377
392±6
Эксперимент 3
Исследование действия лептина при его введении в период кормления материнским молоком на массу тела взрослых животных в возрасте 25 недель
Данный эксперимент проводили в аналогичных условиях, как описано в эксперименте 2, но время регистрации массы тела продлевали до достижения крысами возраста 25 недель. В этом возрасте у крыс, получавших дополнительное количество лептина в период кормления материнским молоком, снижается масса тела по сравнению с контрольными крысами как для группы, получавшей нормолипидную диету, так и для группы, получавшей гиперлипидную диету, хотя у крыс, получавших гиперлипидную диету, наблюдается более значительный эффект (см. табл.3, отдельные примеры). С учетом общих данных, полученных для крыс из всех пометов, следует отметить, что снижение массы тела у крыс, получавших лептин и нормолипидную диету, составляет приблизительно 7%, а у крыс, получавших лептин и гиперлипидную диету, составляет 8%. Такое снижение имеет большое значение, так как известно, что даже незначительное снижение массы тела (прежде всего у субъектов с ожирением) оказывает положительное действие на состояние субъекта, прежде всего, наблюдается снижение возможности развития вторичных осложнений, связанных с ожирением.
Следует отметить, что на животных из некоторых пометов лептин оказывает более значительное действие по сравнению с другими пометами, что вероятно связано с концентрацией лептина, уже присутствующего в материнском молоке, и что дозировку вводимого в ходе эксперимента лептина следует подбирать в соответствующих пределах.
Масса тела самцов крыс в возрасте 25 недель в контрольной группе и в группе, получавшей лептин в период кормления материнским молоком. Представлены два специфических примера для особей из одного помета (1-2 особи в группе). Показаны также средние величины для животных из всех пяти пометов. Результаты представлены в виде средних величин ± СО.
Таблица 3
Диета
Лечение
Масса тела для помета 1 (г)
Масса тела для помета 2 (г)
Средние величины для животных из всех 5 пометов
Нормолипидная
Контроль
540
481
528±21
Лептин
519
479
492±17
Гиперлипидная
Контроль
595
564
572±17
Лептин
525
506
526±10
*Статистическая значимость по сравнению с величиной, полученной для контрольных крыс, получавших диету, аналогичную диете для крыс, получавших лептин.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что рекомбинантпый пищевой лептин, введенный пероралыю, оказывает действие, проявляя возможную роль в предотвращении наращивания массы тела в период после взросления субъектов. Кроме того, можно заключить, что действие оказывают продукты частичного переваривания лептина (продукты гидролиза), так как лептин попадает в пищеварительную полость, где он частично переваривается.
Следовательно, полагают, что можно использовать пищевые препараты, содержащие рекомбинантные лептины из материнского молока, специфичные для различных видов, как в форме полноцепного белка, так в форме частично гидролизованного белка. Рекомендуется также использовать лептин из одного и того же вида животного, которому предполагается включать в диету указанные пищевые продукты, однако данные рекомендации не ограничивают объем изобретения, так как можно использовать лептин из одного вида для включения в пищевые продукты, предназначенные для включения в диету других видов.
В связи в указанным выше следующий пример представлен только для иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивает объем изобретения.
Пример молока, содержащего добавку лептина
Состав композиции «молока для грудных детей» (infant milk) удовлетворяет требованиям к продуктам питания для детей в течение первых 4-6 месяцев жизни. Указанное молоко для грудных детей характеризуется энергетической ценностью в диапазоне от 60 до 75 ккал/100 мл, и в его состав входят следующие компоненты: белки, липиды, углеводы, минеральные вещества и витамины, как указано в табл.4 (подробное описание композиции см. статью Official Journal of the European Communities, N° L 175, p.40-42 (4. 7, 1991)).
Таблица 4
Компонент
Энергетическая ценность (нижний и верхний пределы)
Тип компонента
Белки
2,25-3 г/100 ккал
Белки молока коровы
Белки сои
Углеводы
3,3-6,5 г/100 ккал
Лактоза
Мальтоза
Сахароза
Мальтодекстрины
Сироп глюкозы
Крахмал
Минеральные вещества
20-60 мг/100 ккал
Натрий
60-145 мг/100 ккал
Калий
50-125 мг/100 ккал
Хлор
50 мг/100ккал
Кальций
25-90 мг/100ккал
Фосфор
5-15 мг/100 ккал
Магний
0,5-1 мг/100 ккал
Железо
0,5-1 мг/100 ккал
Цинк
20-80 мкг/100 ккал
Медь
5 мкг/100 ккал
Иод
Витамины
60-180 мкг/100 ккал
Витамин А
1-2,5 мкг/100 ккал
Витамин D
40 мкг/100 ккал
Тиамин
60 мкг/100 ккал
Рибофлавин
250 мкг/100 ккал
Никотинамид
300 мкг/100 ккал
Пантотеновая кислота
35 мкг/100 ккал
Витамин В6
1,5 мкг/100 ккал
Биотин
4 мкг/100 ккал
Фолиевая кислота
0,1 мкг/100 ккал
Витамин В 12
8 мкг/100 ккал
Витамин С
4 мкг/100 ккал
Витамин К
0,5 мг/г линолевой кислоты
Витамин Е
Согласно настоящему изобретению лептин добавляют в качестве добавки в указанную композицию молока до концентрации 2500 нг/л, или 2,5 мкг/л.
Аналогичную методику можно использовать для получения усовершенствованного состава молока (подробное описание композиции см. статью Official Journal of the European Communities, N° L 175, p.40-42 (4. 7, 1991)).