Способ получения препарата декстраназы и его применение
METHOD FOR OBTAINING A DEXTRANASE PREPARATION AND ITS USE

Область изобретения
Изобретение относится к способу получения препарата на основе декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342, непосредственно препарату, обладающему определенными характеристиками активности и стабильности, к применениям указанного препарата декстраназы (или декстраназы, восстановленной из препарата) для профилактики и лечения заболеваний пародонта, в том числе кариеса зубов, гингивитов и пародонтитов; для разрушения декстрана диффузионного сока в производстве сахара из сахарной свеклы, а также композициям и средствам определенного назначения использующим данный препарат.
Уровень техники
Первоначальный интерес к декстраназам был проявлен в отношении их возможного применения при коммерческом производстве клинического декстрана, то есть стерильного раствора декстрана с определенной молекулярной массой, который будет использоваться для восстановления объема крови у пациентов, страдающих от шока в результате кровопотери (Kim, D., and D. F. Day. 1994. A new process for the production of clinical dextran by mixed-culture fermentation of Lipomyces starkeyi and Leuconostoc mesenteroides. Enzyme Microb. Technol. 16:844-848; Lee, J.M., and P.F. Fox. 1985. Purification and characterization of Paecilomyces lilacinus dextranase. Enzyme Microb. Technol. 7:573-577). Относительно низкомолекулярные клинические декстраны ранее были получены из декстрана путем контролируемого кислотного гидролиза с последующим фракционированием органического растворителя. Однако выход низкий (10-12%) из-за потерь при гидролизе и фракционировании. Ферментативный метод, по-видимому, имел потенциал для замены кислотного гидролиза для клинического производства декстрана, и такие процессы были запатентованы в 1950-х годах. Ферментативный метод требует меньше энергии и более простого оборудования и приводит к более однородному продукту с выходом от 25% до 52%.
Наибольший выход клинического декстрана, 94% общего производства декстрана, был получен при смешанной культуральной ферментации Lipomyces mesenteroides и конститутивного декстраназного мутанта Lipomyces starkeyi в присутствии сахарозы. Простая промышленная ферментация была разработана для производства декстранов регулируемого размера с небольшим индексом полидисперсности (Kim, D., and D.F. Day. 1994. A new process for the production of clinical dextran by mixed-culture fermentation of Lipomyces starkeyi and Leuconostoc mesenteroides. Enzyme Microb. Technol. 16:844-848; Lee, J.M., and P.F. Fox. 1985. Purification and characterization of Paecilomyces lilacinus dextranase. Enzyme Microb. Technol. 7:573-577; US 5,229,277).
Зубная пластинка (бляшка), бактериальная пленка, прилипающая к поверхностям зубов, состоит из плотно упакованных бактерий и неклеточного материала. Примерно 20% сухой массы зубного налета - нерастворимые в воде глюканы. Было высказано предположение о деградации и удалении этих глюканов для профилактики заболеваний полости рта, таких как кариес. Декстраназа может ингибировать синтез нерастворимых глюканов (Marotta, М., A. Martino, A. Rosa, Е. Farina, М. Carteni, and М. Rosa. 2002. Degradation of dental plaque glucans and prevention of glucan formation using commercial enzymes. Process Biochem. 38:101-108), а также прилипание стрептококков (Schilling, К. M., and W. H. Bowen. 1992. Glucans synthesized in situ in experimental salivary pellicle function as specific binding sites for Streptococcus mutans. Infect. Immun. 60:284-295).
Фармакологические свойства декстраназы базируются на ее способности катализировать расщепления связей декстрана, входящего в состав зубного налета. Декстраназа интенсивно (до 94%) расщепляет декстран зубного налета, имеет ярко выраженную антибактериальное действие в отношении кариесогенной микрофлоры (US 6,254,856, US 4,438,093). Известно, что чем выше гигиена полости рта, тем лучше состояние пародонта. Но даже регулярная чистка зубов не избавляет полностью и надолго от зубного налета, тем более что сахар может оставаться в микротрещинах десен. Декстраназа является единственным средством, предупреждающим образование зубного налета и в этом смысле действие препарата можно считать прорывом в области лечения, профилактики кариеса и заболеваний пародонта, и именно это выгодно отличает декстраназу от других предлагаемых на рынке препаратов.
Применение препарата с профилактической целью обеспечивает полное снятие зубного налета. Предотвращает образование камней и кариеса, укрепляет десны, отбеливает зубы, обеспечивает 100% профилактику кариеса у детей (US 4,438,093).
Для лечения и профилактики образования зубного налета были предложены различные композиции, которые содержат ферменты, гидролизующие или ингибирующие глюканы (WO 01/66570; Schilling, К.М., and W.Н. Bowen. 1992. Glucans synthesized in situ in experimental salivary pellicle function as specific binding sites for Streptococcus mutans. Infect. Immun. 60:284-295; US 6,254,856; US 4,438,093).
Распространенной причиной порчи сахарной свеклы и сахарного тростника являются инфекции Leuconostoc mesenteroides, особенно во влажных и теплых условиях. L. mesenteroides образуют декстраны (α-(1→6)-α-d-глюканы) и другие продукты распада, включая маннит и D-молочную кислоту, что в случаях средней и тяжелой степени может нарушить нормальный производственный процесс. Заморозки и последующее оттаивание повреждают сахарную свеклу и делают ее уязвимой для заражения микробами, особенно L. mesenteroides, если затем следует теплая погода. Образование высокомолекулярного декстрана оказывает пагубное влияние на кристаллизацию (образование) карбоната кальция в процессе осветления. В результате формируются более мелкие частицы карбоната кальция, которые, увеличивая фильтрационное давление, отрицательно влияют на фильтрование сока 2-й сатурации. Это, в свою очередь, ведет к сокращению объема переработки свеклы. Повышенная вязкость, наблюдаемая при высоких концентрациях декстрана, также может привести к проблемам с кристаллизацией сахара, однако чаще это происходит на производстве с сахарным тростником.
Декстраны, выделенные из различных продуктов сахарного тростника, имеют очень похожую структуру, 95% α-1,6 связей и 5% разветвления, вероятно, через α-1,3-связи (Khalikova Е. Microbial dextran-hidrolyzing enzymes: fundamentals and application / E. Khalikova, P. Susi, T. Korpela // Microbiology and molecular biology reviews. Jue, 2005, p. 306-325).
Коммерческие декстраназы (1→6)-α-глюканогидролазы, EC 3.2.1.11) использовались на свекловичных и тростниковых заводах для расщепления декстрана при помощи гидролиза α-(1→6) связей в случайных эндогенных участках. Декстраназа Р. Lilacinum фирмы Novo (Дания) и декстраназа Hutten DL-2 Chaetomium gracile (Япония), были успешно использованы для гидролиза декстрана загрязненного сахара (Rogalski, J., J. Szczodrak, G. Gl'owiak, M. Pleszczynska, Z. Szczodrak, and A. Wiater. 1998. Purification and immobilization of dextranase. Acta Biotechnol. 18:63-75; Zinchenko, O.N., V.I. Shishlo, О.V. Krivosheeva, and A.G. Lobanok. 1993. Fungal and yeast dextranases: properties and prospects for application in sugar industry. Prikl. Biokh. Mikrobiol. 29:851-855). Декстраназа Hutten DL-2 Chaetomium gracile в жидком виде (56%-ный раствор в глицерине) испытана на Яготинском опытном производстве НПО «Сахар» (Очистка диффузионного сока в сахарном производстве / под ред. Ловкиса З.В. 2013. 232 с.). Декстраназа Chaetomium gracile фирмы Sugazym DX L (Германия) успешно использует в производстве сахара (Абрахам К., Хаген С., Шлюмбах К., Роде А., Флютер Е. Некоторые аспекты применения декстраназы в сахарных растворах. Сахар. - №5. - С. 34-42.). Концентрация фермента 1-5 г/т, время реакции 10-20 минут, оптимум действия - рН 4-8, t - 55-75°С. Эти условия в основном совпадают со свойствам декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342.
Большинство коммерческих декстраназ в США производятся из грибов Chaetomium gracile и Chaetomium erraticum, выпускаемых в жидком виде и признанных безопасными - статус GRAS (Эгглстон Д., Дилкз Э., Блоуэрс М., Уинтерс К. 2017. Успешное применение декстраназы на свеклоперерабатывающих заводах. Сахар. - №3. - С. 30-40).
Раскрытие изобретения
Предложенное изобретение решает задачу предоставления способа получения препарата декстраназы штамма Aspergillus insuetus ВКМП F - 342, обладающего повышенной активностью, а также применения препарата, полученного указанным способом для профилактики и лечения заболеваний пародонта, в том числе кариеса зубов, гингивитов и пародонтитов; а также для разрушения декстрана диффузионного сока в производстве сахара из сахарной свеклы. Кроме того, изобретение направлено на средства для ухода за полостью рта, использующие препарат.
Способ получения микробной декстраназы
Известно, что микромицеты являются наиболее распространенным источником внеклеточных эндодекстраназ (ЕС3.2.1.11) и проявляют более высокую активность фермента, чем декстраназы из бактерий и дрожжей.
7
8
Для производства декстраназы использовали штамм - продуцент Aspergillus insuetus ВКМП F - 342, полученный из штамма Aspergillus insuetus Г-116 без применения мутагенов. Штамм Aspergillus insuetus ВКМП F - 342 проверяли на патогенность на двух видах лабораторных животных: крысах и мышах. Вводимые дозы составляли 10 и 10 клеток на одно животное. В результате испытаний гибель и диссеминация паренхиматозных органов у животных отсутствовали.
Схема получения декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342
Получение ферментного препарата декстраназы вели по следующим этапам:
- получение рабочей культуры на скошенном агаре (сусло-агар, среда Чапека);
- приготовление глубинной посевной культуры в колбах;
- приготовление глубинной посевной культуры в ферментере V=10 л;
- проведение процесса биосинтеза в ферментерах вместимостью 250 л;
- сепарирование на проточном сепараторе - Сера Z-61;
- концентрирование нативного раствора на ультрафильтрационной установке;
- смешивание с маннитом, стерилизующая фильтрация, замораживание;
- сублимационное высушивание.
Состав питательной среды для культивирования продуцента (г/л):
Полиглюкин 5,0
Дрожжевой автолизат (экстракт) 3,0
3
NaNO 3,0
2
4
КНРО 1,0
KCl 0,5
4
2
MgSO⋅7HO 0,5
Софэксил-1520 0,1 мл
рН=5,0-5,2.
Колбы помещают на качалку (190-220 об./мин), выращивание проводят при температуре 29±10 С в течение 48 часов. Объем среды в колбах - 200 мл.
Двумя колбами засевают посевной ферментер объемом 10 л, рабочий объем 6-7 л.
Процесс культивирования ведут при следующем режиме:
- температура 30±10°С
- аэрация сжатым воздухом 6 л/мин,
- перемешивание среды мешалкой 400 об./мин.
Затем 6-7 л посевного материала перемешали в ферментер типа БИОР-025 с рабочим объемом 160 л с вышеуказанном составом питательной среды.
Значения технологических параметров процесса культивирования микромицета: температура, °С 30+10°С
рН перемешивание, об/мин 350
аэрация, об/об/мин 0,5 первые 10 часов, далее
1,0
продолжительность выращивания продуцента 50-70 часов по значению активности фермента (50-80 ед/мл) при рН выше 8,0.
Сепарирование биомассы
Сепарирование биомассы осуществляли на проточном сепараторе Сера Z-61 при скорости вращения ротора 16000 об/мин. Скорость сепарирования подбирали такой, чтобы проба фильтрата на выходе из сепаратора была визуально прозрачной. Скорость подачи культуральной жидкости на сепаратор поддерживали в интервале 30-40 л/час.
Получают 150-155 л фильтрата культуральной жидкости с активностью 50-80 ед/мл.
Эти этапы получения декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342 проводились в соответствии с авторскими свидетельствами SU 1756355 и SU 1808873. Схема выделения и очистки декстраназы из культуральной жидкости в свидетельствах не описывается. Указано только, что препарат фермента получают известным способом путем осаждения этиловым спиртом.
Стадии получения очищенного препарата декстраназы
Ультрафильтрация фильтрата
Концентрирование нативного раствора вели на раствора на ультрафильтрационной установке с модулем АР-3-15 (НПК «Биотест», г. Кириши) с диаметром пор 15 кДа. Перепад давления - 0,18-0,20 мПа.
Скорость фильтрации - около 10-12 л/час. Конечный объем 7-8 л.
Выпаривание ведут до активности концентрата 600-800 ед/мл.
Известно, что глубокая очистка ферментов приводит к существенной потере активности препаратов, а также очень дорогостояща. Более того, высокоочищенные белки менее стабильны по сравнению с неочищенными. Поэтому при использовании растворимых ферментов редко пользуются полной очисткой. Тем более что в зависимости от сферы применения требования к чистоте ферментных препаратов различны [Биотехнология / Т.Г. Волова. - Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской Академии наук, 1999. - 252 с.].
Но, для сохранения стабильности фермента на стадии лиофилизации, как правило, необходимо вводить в нативные растворы вспомогательные ингредиенты, оптимизирующие технические характеристики лекарственных препаратов. Основным условием получения качественного препарата является подбор оптимального соотношения между вспомогательным и основным веществами.
Для ферментных и других белковых препаратов в качестве наполнителей используются компоненты, стабилизирующие белковые молекулы по отношению к внешним воздействиям.
Изучение гомогенной эндодекстраназы Penicillium fimiculosum 15 показало, что декстраназа является гликопротеином. Фермент содержит остатки маннозы, галактозы и фруктозы в соотношении 6:2:1. Углеводы ковалентно связаны с белковой частью декстраназы и играют важную роль в стабильности фермента.
Получены образцы гомогенной декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342.
Препараты гомогенной декстраназы характеризуются следующими показателями:
- молекулярная масса 71000±2000;
- изоэлектрическая точка 4,5±0,05;
- активность гомогенной декстраназы составляет 1700-2000 ед/мг, содержание белка - 48-50% белка;
- удельная активность - 900±100 ед/мг белка;
- фермент содержит 6,0±0,5% углеводов, ковалентно связанных через глюкозамин с белком, которые играют важную роль в стабильности фермента. Углеводный компонент содержит остатки маннозы, галактозы и фруктозы в соотношении 6:2:1. Очевидно, что большинство эндодекстраназ являются гликопротеинами. Данные исследования показывают, что наиболее перспективными наполнителями-стабилизаторами являются низкомолекулярные сахара или близкие к ним вспомогательные вещества. Среди известных наполнителей, разрешенных при получении лекарственных средств, используют маннит (маннитол) (Хабриев Р.У., Камаев Н О., Данилова Т.И., Кахоян Е.Г. Разработка технологии получения микробной гиалуронидазы и лекарственного средства на ее основе. - Вопросы биол. медиц. и фарм. Химии. - №1. - 2016. - С. 4-11). Этот сахароспирт очень близок по своей структуре к основному компоненту углеводной части молекулы декстраназы - маннозе. Экспериментально доказано, что стабилизатором эндодекстраназы Penicillium fimiculosum 15 являются продукты глубокого гидролиза декстрана, содержащие в основном моносахарид и дисахарид - глюкозу и изомальтозу соответственно. Маннит является стабилизатором декстраназы, сохраняя нативную структуру молекулы фермента при высушивании и дальнейшем использовании.
Стерилизующая фильтрация концентрата
В концентрат добавляют маннит из расчета 1 г на 8000-12000 ед активности. Стерилизующую фильтрацию концентрата проводят на микрофильтрационной установке с микрофильтрационным модулем Microza серии Р (фирма Pall) Площадь фильтрации 0,2 м2, диаметр пор - 0,1 мкм. В установке используют центробежный насос при давлении 2,8 бар.
3
Фильтрат с модуля принимают в стерильную емкость и передают в бокс для розлива в кюветы. Полупродукт разливают в поддоны (по 400-500 см) и замораживают при температуре минус 40°С в течение суток. Остатки концентрата из модуля передают на утилизацию.
Сушка ферментного препарата.
Сублимационную сушку ферментного препарата производят в вакуум-сушильных аппаратах марки КС-30. Кюветы с вмороженными в контрольные образцы датчиками устанавливают в середине полок. Все датчики подключают к регистрирующему устройству с самописцами, установленными на пульте управления.
После загрузки закрывают дверь камеры, открывают вентиль на вакуумной линии. По достижении рабочего вакуума, не превышающего 100 микрон, препарат должен быть охлажден до минус (30-35)°С и выдержан при указанной температуре в течение 45-60 минут.
При высушивании препарата регулируют температуру на полках таким образом, чтобы достигнуть 0°С в препарате к 16-18 часу сушки, затем, повышая постепенно температуру, достигнуть (27-30)°С в материале, при которой выдерживают препарат в течение 8-10 часов.
Длительность процесса высушивания составляет 24-28 часов. Стандартный препарат декстраназы имеет активность 50,0±5,0 ед/мг.
За единицу декстраназной активности принято такое количество декстраназы. которое, действуя в течение 1 мин на 0,15% раствор полиглюкина при температуре 37°С и рН 4,9-5,1, образует олигосахариды в количестве, эквивалентном 1 мкмолю глюкозы.
В 3 пробирки (2 опытные и 1 контрольную) вносят по 0.75 мл 0.15% раствора полиглюкина и термостатируют при 37°С в течение 1-2 мин. В контрольную пробирку вносят 0,25 мл воды, а в 2 опытные - по 0.25 мл 0,0004% раствора препарата с концентрацией 0,004 мг/мл. Смеси инкубируют 10 мин (по секундомеру) в термостате при 37°С, после чего в каждую пробирку прибавляют по 3 мл 0,06% раствора калия феррицианида. Пробирки помещают в кипящую водяную баню (по секундомеру) на 10 мин, затем охлаждают в бане с холодной водой. Оптическую плотность испытуемых и контрольного растворов измеряют на фотоэлектрическом колориметре при длине волны 400 нм в кювете с толщиной сдоя 5 мм. В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду.
Декстраназную активность (А) выражают числом единиц на I мг препарата (ед/мг) и вычисляют по формуле:
где Ух - содержание глюкозы в опытной пробе, определяемое по калибровочному графику, построенному но D-глюкозе, в микрограммах:
Гк - содержание глюкозы в контрольной пробе, определяемое по калибровочному графику, построенному по D-глюкозе, в микрограммах;
- коэффициент разбавления реакционной смеси,
ISO - молекулярная масса глюкозы,
10 - время гидролиза, в минутах;
m - концентрация раствора препарата декстраназы, мг/мл.
Декстраназная активность 1 мг препарата должна быть 50 ед ± 5 ед.
Построение калибровочного графика. Стандартные растворы Д-глюкозы готовят разбавлением исходного раствора водой согласно таблице 1. Для приготовления исходного раствора точно 0,075 г Д-глюкозы безводной (ГОСТ 6038-79) растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 500 мл и доводят объем раствора до метки.
Приготовление стандартных растворов глюкозы
В пробирки со стандартными растворами прибавляют по 3 мл 0,06% раствора калия феррицианида, помешают на 10 мин (по секундомеру) в кипящую водяную баню, затем охлаждают в бане с холодной водой. Измеряют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре при длине волны 400 нм ± 2 нм в кювете с толщиной слоя 5 мм.
В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду.
Калибровочный график строят, откладывая по оси абсцисс - содержание Д-глюкозы в микрограммах в 1 мл стандартных растворов, а но оси ординат-соответствуюшие им оптические плотности.
Полученная зависимость оптической плотности от концентрации является линейной (коэффициент корреляции /у/=0,998). По калибровочному графику находят значения Ух и Ук, соответствующие оптическим плотностям опытного и контрольного раствора, измерянным при длине волны 400 нм ± 2 нм. и подставляют эти значения в формулу расчета декстраназной активности.
В таблице 1 приведена характеристика предлагаемого способа получения очищенной декстраназы.
В таблице 2 представлена схема производства очищенной декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342 по стадиям
Также препарат исследовался в стоматологической практике и при переработке сахарной свеклы, о чем подробнее ниже.
Декстраназа может применяться при переработке сахарной свеклы, пораженной слизистым бактериозом, а также для переработки сахара-сырца с целью повышения выработки и качества белого сахара, экономии затрат на сырье (сахарная свекла); увеличения срока службы оборудования и снижения износа фильтров.
Важной проблемой для свеклосахарного производства является большой объем сырья (корнеплодов), пораженного слизистым бактериозом.
В результате жизнедеятельности микроорганизмов (бактерий) образуются высокомолекулярные полисахариды - декстраны, которые повышают вязкость сахарных растворов, значительно снижая их технологические качества. Удалить декстран из растворов сахара-песка фильтрованием или химическими добавками практически невозможно. Являясь мощным биокатализатором декстраназа разрывает молекулы декстрана на более короткие цепочки, затем появляются олигосахариды и конечный продукт - глюкоза. При этом вязкость сиропа снижается до значения соответствующего вязкости чистого сахарного раствора, исчезает слизь и муть, восстанавливается фильтрация.
Декстраназу используют на первых стадиях технологического процесса, после получения сока из диффузионной установки.
Расход препарата составляет 2,5-5,0 г на 1 кубический метр сока при температуре 45-50°С, продолжительность действия 5-10 минут. Использование декстраназы при переработке сырца осуществляется во время первой фазы растворения при температуре 45-50°С. Продолжительность действия 10-15 минут.
В результате использования препарата скорость фильтрации соков увеличивается в 2,5-3 раза. Ускорение кристаллизации сахарозы повышается в 1,5-3 раза. Экономия сырья до 20% от общего объема за счет возможности переработки ослизненной свеклы. Дополнительная выработка сахара из свеклы увеличивается на 9-11% от общего объема выхода. Сложение активной прибыли от продажи дополнительного объема сахара и экономии затрат на сырье и замене фильтров увеличивает рентабельность.
3
Присутствие в сахарной свекле даже небольших количеств декстрана осложняет технологический процесс сахарного, а затем и рафинадного производства. Среди технологических процессов сахарного производства значительное место занимает процесс фильтрования. При большом содержании полисахаридов в сахарной свекле и диффузионном соке наблюдаются затруднения при фильтровании соков I и II сатурации. Затруднения при фильтровании увеличиваются, когда на переработку поступает подмороженная и оттаявшая свекла длительного срока хранения. Из свеклы такого качества в диффузионный сок переходит высокомолекулярный декстран, который препятствует образованию крупных агрегатов СаСО, а на фильтровальной поверхности оставляет слизистый осадок. Разрушить декстран в соках можно с помощью энзима декстраназы.
3
5
7
4
При известково-углекислотной очистке диффузионного сока удаляется 20-25% декстрана, остальное количество переходит в очищенный сок. Декстран, обладая положительным зарядом, не сорбируется на карбонате кальция, лишь незначительная его часть образует с частицами последнего желатинозный, плохо фильтруемый осадок. При этом в присутствии декстрана скорость образования зародышей карбоната кальция значительно превышает скорость их роста, в результате последний выпадает в виде мелкозернистого, слабоагломерированного осадка, затрудняющего фильтрование. Так, при переработке замороженной и оттаявшей сахарной свеклы, хранившейся в течение 7 сут., полученный из нее сок II сатурации содержал кристаллы осадка СаСО размером 1-3 мкм, в то время как из свеклы, не содержащей декстран - 5.7 мкм. Замедлению процесса фильтрования способствует адсорбция декстрана поверхностью фильтровальной ткани. В основном фильтрование замедляют высокомолекулярные фракции декстрана с молекулярной массой 10-10, а фракции с массой 10 и ниже практически не влияют на ее скорость.
Далее по технологическому потоку декстран приводит к замедленной кристаллизации сахарозы и центрифугированию утфелей, не способствует истощению мелассы, ухудшает качество белого сахара. При кристаллизации сахарозы из сахарных растворов, содержащих декстран, происходит деформация кристаллов сахара, образуются кристаллы удлиненной, иглообразной формы. При кристаллизации сахарозы выпариванием кристаллами утфеля I ступени кристаллизации удерживается от 18 до 25% декстрана к исходному содержанию его в растворе. Такой утфель плохо центрифугируется, ухудшаются условия отделения оттеков, возрастают потери сахара в мелассе.
Перекристаллизацией сахара удаляется примерно 80% декстрана. Кристаллический сахар может содержать декстрана до 100 мг/кг, а в мелассе иногда содержится несколько тысяч мг/кг.
20
Наличие декстрана в белом сахаре, используемом для производства безалкогольных и ликероводочных напитков, кондитерских изделий, отрицательно влияет как на качество продукта, так и на процессы его производства. Так, наличие декстрана в сахаре вызывает ослизнение напитков, кваса, квасного сусла; затрудняется или полностью останавливается процесс фильтрования сахарного сиропа, забиваются трубопроводы. Иногда в трубопроводе может образовываться слизистая пробка, которая полностью перекрывает поток. Из-за разложения сахарозы снижается количество сахара, необходимого по рецептуре, уменьшается выход продукта. Декстран устойчив к воздействию щелочей, трудно гидролизуется. Фермент декстраназа расщепляет декстран до изомальтозы и высших изомальтосахаридов. При получении декстраназы используются различные штаммы плесневых грибов Penicillium и Chaetomium, которые выращивают на питательной среде, содержащей декстран, азотное, фосфорное и минеральное питание. Присутствие в питательной среде декстрана индуцирует образование в плесенях фермента декстраназы. Полный гидролиз декстрана обеспечивается при следующих условиях: введение декстраназы в количестве 0,04%, обеспечение pH 5,5 и температуры 50°С в течение 35 мин.
Влияние температуры и рН сахарных растворов на ферментативное разрушение декстрана
5
3
Влияние температуры на эффективность действия ферментного препарата декстраназы изучали путем определения скорости уменьшения вязкости диффузионного сока, содержащего декстран и имеющего СВ=10%; рН=5,5 при изотермических условиях в диапазоне температур 30-70°С. В диффузионный сок добавляли 0,5% декстрана с молекулярной массой 5×10 Да, нагревали до требуемой температуры, вводили декстраназу в количестве 1 мг/дм, термостатировали в течение 5-40 мин при заданной температуре непосредственно в трубке вискозиметра и определяли вязкость. Результаты определения представлены в таблице.
Результаты исследований свидетельствуют, что исследуемый препарат декстраназы является относительно нетермоустойчивым ферментным препаратом, активность которого проявляется в диапазоне температур 30-50°С, и полностью инактивируется при температуре выше 60°С.
3
Влияние рН на активность декстраназы также изучали по темпу падения динамической вязкости при термостатировании непосредственно в трубке вискозиметра в течение 30 мин при температуре 40°С в диффузионном соке (СВ=12%) и в растворе сахара (СВ=10%). Диапазон значений рН был предварительно установлен в пределах 4,3-7,0 для диффузионного сока и 3,0-8,0 - для растворов сахара с помощью цитратного буфера. Концентрация добавленного декстрана составляла 0,4%, а доза декстраназы - 0,4 мг/дм. Результаты определения представлены в таблицах
Судя по темпу падения вязкости, как в диффузионном соке, так и в растворах сахара, наибольшая активность декстраназы проявляется в районе рН=4. При рН более и менее 4 темп снижения вязкости замедлялся и был наименьшим при 3 < рН < 7, что следует учитывать при определении дозы препарата, необходимой для разрушения декстрана.
3
3
Известно, что чем выше содержание декстрана в сахарном растворе, тем больше доза, необходимая для его разрушения до заданной концентрации. Изучалось влияние содержания декстрана в диффузионном соке в диапазоне (500-5000 мг/дм), продолжительности ферментной обработки (5 и 15 мин) и рН (5,1-6,6) на остаточные концентрации декстрана при дозе декстраназы, вводимой в диффузионный сок, в пределах 0,1-8,0 мг/дм. В опытах добавляли декстран в диффузионный сок; затем после термостатирования при 45°С проводили определение остаточного содержания декстрана с помощью турбидиметрического метода. Результаты в Таблице ниже.
Как видно из полученных данных; расход ферментного препарата значительно возрастает при увеличении исходного содержания декстрана в диффузионном соке; уменьшении длительности термостатирования и повышении рН.
3
На основании полученных данных; исходя из того; что остаточное количество декстрана в диффузионном соке не должно превышать 100 мг/дм; нами были рассчитаны ориентировочные дозы изучаемого препарата, которые необходимо ввести в диффузионный сок содержащий декстран (таблица 6).
3
3
3
3
При содержании декстрана в диффузионном соке 500 мг/дм и длительности обработки 15 минут расход ферментного препарата составил 0,2-0,6 мг/дм; при возрастании содержания декстрана до 2000-5000 мг/дм доза декстраназы увеличивается до 2,0-4,0 мг/дм. Таким образом, расход исследуемого препарата оказался в 5-15 раз меньше, чем известных препаратов декстраназы других фирм, что свидетельствует о его высокой активности.
Указанные дозы являются ориентировочными, поскольку зависят от многих факторов, в том числе от длительности ферментативной обработки, температуры, рН, химического состава диффузионного сока и других факторов, влияющих на ход ферментного разложения декстрана.
3
3
3
Для того, чтобы проверить эффективность действия декстраназы в диффузионном соке, максимально приближенному к производственному, в лаборатории получали диффузионный сок из здоровой сахарной свеклы и из свеклы, инфицированной бактериями Leuconostoc - продуцентами декстрана. Содержание декстрана в диффузионном соке из пораженной бактериями свеклы составило 6000 мг/дм. Далее готовили пробы диффузионного сока с содержанием декстрана от 600 до 6000 мг/дм и рН 4,5-5,0 путем смешивания в различных пропорциях сока здоровой свеклы и сока пораженной свеклы. Пробы подвергли ферментной обработке при дозе декстраназы 0,2-8,0 мг/дм в течение 15 мин при температуре 45°С, после чего в них определили остаточное количество декстрана. Результаты исследований представлены в таблице 7.
5
Из данных, представленных в таблице, видно, что наблюдаемые закономерности аналогичны закономерностям, полученным при разрушении декстрана с молекулярной массой 5×10 Да при его добавке в диффузионный сок (таблица 5).
Такие же закономерности наблюдаются и при определении ориентировочных доз расхода ферментного препарата, рассчитанного на основании данных, полученных для инфицированного диффузионного сока (таблица 8).
3
3
5
3
При содержании декстрана в диффузионном соке 500-1000 мг/дм расход ферментного препарата декстраназы был в тех же пределах 0,2-0,6 мг/дм, что в опытах с диффузионным соком, в который добавляли декстран с молекулярной массой 5×10 Да (таблица 6). При более высоком содержании декстрана в диффузионном соке (более 2000 мг/дм) расход ферментного препарата для инфицированного диффузионного сока был выше, что, по- видимому, объясняется изменением химического состава инфицированного сока и ухудшением условий для ферментного разрушения декстрана.
Также было исследовано влияние препарата на заболевания полости рта
Фармакологические свойства декстраназы основаны на ее способности катализировать расщепление связей декстрана, входящего в состав зубного налета. Декстраназа интенсивно (до 94%) расщепляет декстран зубного налета, обладает ярко выраженным антибактериальным действием в отношении кариесогенной микрофлоры, а также высоким антикариесным эффектом. Известно, что чем выше гигиена ротовой полости, тем лучше состояние парадонта. Но даже регулярная чистка зубов не избавляет полностью и надолго от зубного налета, тем более что сахара остаются и в микротрещинах десен. Именно отсутствие зубного налета просто не дает образовываться кариесу. Декстраназа является единственным средством, подавляющим образование зубного налета Применение препарата в профилактических целях обеспечивает полное снятие зубного налета. Предотвращает образование камней и кариеса, укрепляет десны, отбеливает зубы, дает 100% профилактику кариеса у детей.
При заболеваниях парадонта позволяет в кратчайшие сроки прекратить кровоточивость десен, остановить воспалительный процесс, закрыть «карманы», восстановить парадонт вокруг шейки зубов и прекратить шатание и выпадение зубов, отбелить зубы и избавить от неприятного запаха изо рта
Как известно, ведущим этиологическим и патогенетическим фактором развития кариеса зубов и гингивита является образование зубного налета, состоящего главным образом из микроорганизмов, белков и полисахаридов, в частности декстранов, обеспечивающих адгезию зубного налета к поверхности зуба с последующим разрушением эмали.
При экспериментальном изучении субстанции и лекарственной формы декстраназы (таблетки, содержащие 0,006 г - 30 ед.) в опытах in vitro in vivo на экспериментальных моделях установлено, что препарат интенсивно гидролизует декстран зубного налета (до 94%), обладает выраженным антибактериальным действием в отношении кариесов генной микрофлоры. На основании выявленного в эксперименте воздействия препарата на зубной налет, он был рекомендован разработчиками к его клиническому изучению в стоматологической практике.
Клиническое изучение препарат «Декстраназа» проходил в ЦНИИ стоматологии в отделении терапевтической стоматологии (действующим началом препарата «Декстраназа» является декстраназа).
Материал и методика исследования
Изучение действия декстраназы в клинике было проведено у 53 пациентов в возрасте от 25 до 55 лет с заболеваниями пародонта, из них с гингивитом - 38, с пародонтитами - 20, у 38 пациентов был диагностирован катаральный генерализованный гингивит легкой формы, у 20 пациентов - хронический генерализованный пародонтит средней тяжести.
Все больные перед получением препарата были обучены гигиене полости рта (чистка зубов 2 раза в день после еды).
Предварительно у всех групп пациентов был снят зубной налет и зубной камень механическим путем.
Схема назначения препарата «Декстраназа» была следующей: пациентам рекомендовалось сосание таблеток препарата в течение 18-20 минут после чистки зубов зубной пастой два раза в сутки - утром и вечером по 1 таблетке; курс - 1 месяц.
Контрольные осмотры проводили сразу после проведения курса профилактики декстраназой (через один месяц после начала применения препарата), через 1, 3 и 6 месяцев после окончания курса профилактики декстраназой. Другого лечения пациенты не получали.
Критерии оценки действия декстраназы: 1. состояние клинических признаков; 2. количество зубного налета определялось гигиеническими индексами Грина-Вермиллиона; 3. состояние пародонта определялось по показателям индекса ПМА м ПИ.
Контрольную группу (20 человек) составили пациенты с аналогичными заболеваниями (10 человек с гингивитом и 10 человек с пародонтитом), которые после снятия зубных отложений не получали декстраназу, а проводили регулярную гигиеническую чистку зубов пастой 2 раза в день по общепринятой методике. Контрольные осмотры проводили сразу после снятия зубных отложений, через 1, 3 и 6 месяцев после этой процедуры.
Изучалась также биодоступность декстраназы - выход в слюну.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Результаты проведенного лечения представлены в таблицах 1 и 2. У больных гингивитом при первичном обследовании гигиенический индекс Грина-Вермиллиона составил от 2,5 до 3,0 баллов, у больных с пародонтитом соответственно от 2,8 до 3,0 баллов.
Состояние пародонта при первичном осмотре у больных опытной и контрольной групп по данным пародонтальных индексов характеризовалось следующими показателями:
у больных с гингивитом - ПМА 100%, ПИ 2,0
у больных с пародонтитом - ПМА 100%, ПИ 2,5.
Проба Шиллера-Писарева у пациентов с этими заболеваниями была положительной.
Все больные с заболеваниями пародонта отмечали кровоточивость десны после чистки зубов, запах изо рта, неприятный привкус во рту, зуд в деснах. Клинически отмечались отек, гиперемия десневого края.
Сразу же после снятия зубных отложений гигиенический индекс у пациентов обеих групп выражался в следующих данных:
у больных с гингивитом - Грина-Вермиллиона 0,5-0,6,
у больных с пародонтитом - соответственно 0,5 и 0,6 балла. Пародонтальные индексы оставались в первоначальных цифровых показателях. Результаты действия препарата «Декстраназа» в опытной группе пациентов с заболеваниями пародонта в динамике на зубной налет и ткани пародонта
Состояние гигиены полости рта и состояние тканей пародонта у пациентов контрольной группы
Как видно из таблиц 1 и 2 состояние тканей пародонта находится в прямой зависимости от гигиенического состояния полости рта - чем выше гигиена, тем менее выражены признаки воспаления в пародонте.
Профилактический прием препарата «Декстраназа» удерживает хорошее состояние полости рта до 3-х месяцев после снятия зубных отложений. После аналогичного лечебного вмешательства в контрольной группе пациентов хорошее гигиеническое состояние полости рта сохранялось только в течение 1 месяца.
Отсутствие зубного налета в этот период благоприятно действует на ткани пародонта. Что выявлено и клинически - десна становится бледнорозового цвета, отсутствует кровоточивость.
Результаты изучения у пациентов биодоступности препарата подтвердили данные, полученные в эксперименте - наибольшую концентрацию декстраназы в слюне мы наблюдали через 18-20 минут сосания таблетки.
Клинические испытания препарата «Декстраназы» в таблетированной форме проведены в отделении профилактики поликлиники детского и подросткового возраста ЦНИИС на 113 подростках 12-15 лет.
Методика применения. Все испытуемые были распределены на 3 группы в зависимости от гигиены полости рта и вида применяемого препарата: 1 группу составили 42 подростка с высоким уровнем гигиены полости рта, которые получали плацебо-таблетки; 2 группу составили 43 подростка с высоким уровнем гигиены полости рта, которые получали таблетки декстраназы; 3 группу составили 28 подростков с низким уровнем гигиены (с резистентным к обычной чистке зубов зубным налетом), которые получали таблетки декстраназы.
Предварительно все испытуемые прошли специальный курс обучения правилам гигиены полости рта, в результате которого выявлены лица с повышенным налетообразованием, которые и были включены в группу 3.
Всем обследованным согласно программе назначалось по 1 таблетке декстраназы или плацебо для сосания в течение 10 минут после чистки зубов 2 раза в сутки - утром и вечером. Стоматологические осмотры проводились перед началом применения препарата (исходные данные), через одну неделю и месяц применения препарата, а также через одну неделю и один месяц и три месяца после окончания курса.
Оценку эффективности действия таблеток декстраназы проводили по индексам OHI-S (по его компоненту DI-S) и РМА. Особое внимание уделялось выявлению аллергических реакций и неприятных ощущений в полости рта.
После завершения исследований, полученный цифровые данные подвергались статистической обработке по методу Стьюдента.
Результаты. Анализ результатов динамического наблюдения свидетельствует о том, что состояние пародонта и гигиены полости рта у подростков первой и второй групп существенно не отличалось друг от друга и практически не изменялось на протяжении всего периода наблюдения (см. табл. 1). Что касается пациентов третьей группы, то у них через одну неделю и один месяц применения декстраназы отмечено улучшение гигиенического состояния полости рта и уменьшение воспалительных явлений в области десневого края. Установлено достоверное снижение индексов DI-S и РМА уже после недельного применения препарата, а после завершения курса (1 месяц) эти показатели снизились почти в 2 раза, что свидетельствует о высокой эффективности декстраназы в снижении налетообразования у подростков с резистентным к обычной чистке зубов зубным налетом.
Однако через месяц после окончания применения препарата было отмечено ухудшение гигиенического состояния полости рта и нарастание воспалительных явлений в области альвеолярного края, а через три месяца состояние подростков этой группы практически не отличалось от исходного уровня. Это указывает на необходимость повторения курса применения таблеток декстраназы с интервалом не более 3 месяцев.
В результате клинической апробации таблеток декстраназы установлено значительное ингибирующее действие этого препарата на образование зубного налета, особенно у лиц с плохой гигиеной полости рта. В связи с этим этот препарат может рассматриваться как средство для профилактики кариеса и гингивитов, а также как вспомогательное средство при лечении воспалительных заболеваний пародонта, способствующее поддержанию стойкого эффекта благодаря снижению налетообразования у больных с гингивитами и пародонтитами. Интервалы между курсами приема таблеток декстраназы не должны превышать 3 месяцев.
Клиническая апробация препарата декстраназа проводилась в поликлинике и стационаре кафедры госпитальной терапевтической стоматологии ММСИ им. Н.А. Семашко.
Обследовано 112 больных в возрасте от 22 лет и старше (50 мужчин и 62 женщины). Из них изучение действия декстраназы проведено у 61 больного с кариесом и заболеваниями пародонта (хронический катаральный гингивит - 36, хронический генерализованный пародонтит легкой степени - 25, в том числе у 18 больных препарат применяли для гидролиза налета в послеоперационном периоде). Кроме того, декстраназа была использована у 4 больных с красным плоским лишаем. Контрольная группа составляла 51 человек.
Применению препарата предшествовало обучение больным методам рациональной гигиены полости рта. Назначение декстраназы проводилось согласно инструкции по клиническому изучению препарата. Больные контрольной группы получали плацебо.
Ранние признаки воспаления в пародонте выявляли по данным анализа и клиническим методам обследования, определялись индексы гигиены по Федорову-Володкиной и Г рин-Вермиллиону, а также ПМА и ИК.
Анализ результатов клинического испытания декстраназы, основанных на данных клинического обследования и субъективных ощущениях больных, показал следующее:
после применения создается впечатление чистоты рта,
поверхность зубов становится гладкой, больные отмечают побеление зубов,
переносимость препарата удовлетворительная, таблетки приятны на вкус,
таблетированная форма лекарства устойчива к свету и влажности, не меняет окраски, запаха, вкуса, консистенции.
Под влиянием препарата (таблица) наблюдалось достоверное снижение индексов гигиены полости рта и состояния тканей пародонта в конце лечения.
1
ИГ по Федорову-Володкиной - 36,5%
2
ИГ по Грин-Вермиллиону - 47,96%
ПМА - 35,2%
ИК - 64,7%.
Следует отметить, что у нескольких больных наблюдалось появление тошноты в процессе лечения, которое не требовало отмены препарата. Иногда больные отмечали неудобства от необходимости достаточно долго (18-20 мин) держать таблетку в полости рта, не сглатывая слюны.
При заболеваниях пародонта, осложненных красным плоским лишаем (4 больных), сопровождающимся нарушением целостности слизистой, после однократного применения декстраназы наблюдалось появление кровоточивости и чувство жжения, что требовало отмены препарата. Данных больных исключили из общей оценки эффективности действия декстраназы.
ВЫВОДЫ
Учитывая все вышеизложенное, препарат декстраназа может быть рекомендован для широкого медицинского применения в профилактике и лечения кариеса и заболеваний пародонта.
При красном лишае, сопровождающимся нарушение целостности слизистой оболочки, препарат следует использовать с осторожностью.
Целесообразно создание новых лекарственных форм препарата (зубной пасты, жевательной резинки и т.п.).
Сотрудники кафедры терапевтической стоматологии ОГМИ провели первый этап испытаний декстраназы.
Задача испытания:
Выявить влияние декстраназы на зубной налет.
Материал и методика:
Общее число больных в опытной группе составило 34 человека. В контрольной группе 7 человек.
Длительность одного курса лечения - 30 дней. В течение года предполагается повторить курс через 6 месяцев.
Отбор больных
Препарат применяли у студентов ОГМИ в возрасте от 18 до 27 лет с целью профилактики кариеса зубов и гингивита, а также в составе комплексной терапии при лечении заболеваний пародонта.
Критерии включения больных в испытания
Наличие у пациентов зубного налета на гладких поверхностях коронок зубов в пришеечной области, что определяется гигиеническими индексами Г рина-Вермиллиона и Федорова-Володкиной.
Предрасположенность к кариесу зубов (индекс КПУ - не менее 3).
Наличие ранних признаков воспаления в пародонте (жалобы на зуд в деснах, кровоточивость при чистке зубов и пр.).
Критерии для исключения больных из испытаний
В испытания не включали больных с развившейся стадией пародонтита - с глубоким зубо-десневым карманом (более 3 мм) и явлениями гноетечения.
Схема назначения препарата
Применению препарата предшествует обучение больных методам рациональной гигиены полости рта.
Препарат назначали по 1 таблетке 2 раза в день (утром и вечером) после чистки зубов в течение 30 дней.
Контрольные осмотры проводили сразу после окончания курса лечения.
Пациенты были санированы.
Проведены общепринятые способы лечения гингивита.
Схема обследования больного
Заполнение медицинской карты стоматологического больного (форма №043/у).
Количество зубного налета определялось гигиеническими индексами Грина-Вермиллиона (ОН 1-5 с учетом его составляющей DI-S, характеризующей количество мягких зубных отложений) и индекса Федорову-Володкиной.
Состояние твердых тканей зубов определялось индексом КПХ.
Состояние пародонта определяли по показаниям индекса ПМА.
Полученные данные позволяют заключить:
Пациенты, принимавшие декстраназу отмечают снижение кровоточивости или полное ее исчезновение, уменьшение количества зубного налета.
Четыре человека предъявили жалобы на появление гиперостезии твердых тканей зубов после приема препарата.
Статистическая обработка предварительных результатов клинических испытаний позволила установить следующее:
Индекс ПМА в контрольной (плацебо) и опытной (декстраназа) группах не различался.
1
M±ш=13,007±2,026 (контроль)
2
М±ш=13,918±1,480 (опыт) р>0,05
В ходе испытаний препарата (через 30 дней) установлено незначительное (статистически недостоверное) снижение значений индекса ПМА в контрольной до 10,932±2,026 (р>0,05) в опытной индекс ПМА достоверно снизился до 7,906±0,987 (исходные значения его 13,918±1,480) р<0,001.
Сравнивая значения индекса ПМА в контрольной и опытной группах через определенный срок от начала испытаний препарата (30 дней), следует отметить, что хотя и произошло уменьшение значений ПМА в обеих группах, однако статистически достоверных различий при повторном осмотре групп не отмечено.
1
M±ш=10,392±2,026 (контроль)
2
М±ь=7,906±1,480 (опыт) р>0,05
При сравнении индекса гигиены полости рта (индекс Федорова-Володкиной) в контрольной и опытной (декстраназа) группах отмечено следующее:
Исходные показатели индекса гигиены полости рта в контрольной и опытной группах статистически достоверно не различались.
В ходе испытаний препарата (через 30 дней) установлено статистически достоверное (р<0,001) снижение показателей индекса гигиены в опытной группе (декстраназа), тогда как в контрольной (плацебо) значения его достоверно не изменились.
При сравнении значений индекса гигиены полости рта (индекс гигиены по Грину-Вермиллиону).
Исходные значения индекса гигиены по Грину-Вермиллиону в контрольной и опытной группах не различались.
В ходе испытаний препарата (через 30 дней) установлено статистически достоверное уменьшение значений изучаемого показателя как в контрольной (р<0,01), так и в опытной группах (р<0,001).
Не отмечено статистически достоверных различий в уровне гигиенического состояния полости рта (индекс Грина-Вермиллиона) между опытной и контрольной группой после 30 дней клинических испытаний препарата (р>0,05).
Заключение
Клинические испытания позволили выявить влияние декстраназы на зубной налет. Это подтверждается уменьшением накопления налета на зубах (снижение значений индексов гигиены Федорова-Володкиной, Грина-Вермиллиона) и уменьшением воспаления пародонта (отмечено снижение или полное исчезновение кровоточивости десен).
Также настоящее изобретение направлено на средство для ухода за полостью рта.
Средство для ухода за полостью рта может представлять собой зубную пасту, эликсир или жевательную резинку, содержащие предлагаемый препарат.
Основные компоненты зубных паст.
Многоатомные углеводородные спирты.
6
8
6
Маннитол или маннит (лат. mannitum, англ. mannitol) - шестиатомный углеводородный спирт из группы Сахаров. Маннитол - стереоизомер сорбитола. Эмпирическая формула маннитола - СН(ОН). Молярная масса 182,172 моль-1.
Маннитол широко применяется в фармацевтической и пищевой промышленности. В современной медицине маннитол рассматривается, в основном, как вводимый внутривенно осмотический диуретик, средство, способствующее выведению из организма жидкости. В фармацевтике маннитол часто используется как вспомогательное, неактивное вещество (Маалокс, Панум, Тальцид, Гастрозол, Омепразол-акри, Гастал, Гастрацид, Гевискон, Мотилиум, Париет, Омез, Имодиум, Рабелок, Зульбекс и других).
Маннитол (маннит) - пищевая добавка Е421, разрешенная к применению в России, Украине и других странах. В пищевой промышленности маннитол используется в качестве подсластителя и вещества, препятствующие комкованию. Применяется при изготовлении зубных паст и жевательной резинки и других средств по уходу за полостью рта.
Маннитол и сорбитол используются в качестве стабилизаторов-наполнителей ферментных препаратов на стадии лиофилизации [патент №2111426 (РФ), 1998 «Способ лиофильной сушки биопрепаратов / Е.Ю. Шалаев, Франке Феликс, Н.А. Вараксин, М.Ю. Руковишников]. В наших исследованиях в качестве наполнителя-стабилизатора лекарственной формы на основе микробной гиалуронидазы был в выбран маннитол. Препараты с маннитолом позволяют получить препараты гиалуронидазы с достаточно высоким выходом по активности на стадии лиофилизации [Хабриев Р.У., Камаев Н.О., Данилова Т.И., Кахоян Е.Г. Разработка технологии получения микробной гиалуронидазы и лекарственного средства на ее основе. - Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - №1. - 2016. - С. 4-11].
Маннитол является основным компонентом разработанной нами рецептуры лекарственного препарата для профилактики и лечения кариеса зубов на основе декстраназы. Препарат применяется в таблетированной форме. Каждая таблетка содержи 0.006 г (30 ед.) декстраназы.
Сорбитол - пищевая добавка Е421. В основном применяется как подсластитель и комплексообразователь, текстуратор (назначение - улучшение структуры продукта), а также как влагоудерживающий агент (предохраняет продукты от высыхания и появления грубой сухой корочки на поверхности изделий). В зубных пастах сорбитол используется в качестве вкусовой добавки. Это синтетический заменитель сахара, который придают зубной пасте приятный вкус, не создавая при этом угрозы кариеса. Кроме того, сорбитол добавляют с целью предупреждения высыхания пасты. Обычно и зубных пастах используют сорбитол 70% в концентрации 20-40 мас. %.
Глицерол (глицерин) - пищевая добавка Е422 используется в кондитерской промышленности. Широко применяется в составе средств по уходу за полостью рта. Медицинский препарат на основе глицерина используется в качестве слабительного средства. Глицерин не рекомендуется употреблять людям, имеющим заболевания почек и сердечно сосудистой системы. В зубных пастах глицерин используется в качестве загустителя. Концентрация - 10-50 мас. %
5
7
5
Ксилитол (ксилит) пищевая добавка Е967 используется в пищевой промышленности как подсластитель. Эмпирическая формула ксилитол а - CH(OH). Применяется в качестве заменителя сахара при диабете. Ксилит сдерживает рост бактерий в ротовой полости, обладает реминерализующим действием (важно для создания рецептур по уходу за полостью рта). Такое действие на зубной налет обусловлено наличием ОН-групп, ксилит предотвращает разрушение зубов, увеличивает слюноотделение, что помогает восстановить кислотно-щелочной баланс, препятствует развитию микроорганизмов, и не приносит вреда при взаимодействии с эмалью. При этом для достижения ощутимого результата от использования противокариозной зубной пасты содержание ксилита в ней должно составлять 5-20, например, около 10 мас. %.
Исследования показывают, что все выше перечисленные многоатомные спирты обеспечивают высокую стабильность декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342.
Низкомолекулярные вещества, такие как сорбитол, маннитол, ксилитол, проникают в зубной налет, но вследствие малой активности фермента, превращающего их во фруктозу, молочная кислота образуется в незначительных количествах и не снижает рН.
Абразивные вещества (чистящий компонент) - мел, фосфаты Са, например, дикальций фосфатдигидрат, диоксид кремния, гидроксид алюминия, оксид алюминия, метил метакрилат натрия.
Индекс абразивности зубной пасты (или RDA) должен быть в пределах 60-80. В последнее время наблюдается тенденция к снижению допустимой абразивности зубных паст, поэтому ниже 60 это тоже хорошо.
Пасты на меловой основе имеют щелочное значение рН (до 11,0), что не подходит для дексраназы и гиалуронидазы.
Известно, что избыток алюминия снижает задержку кальция в организме, уменьшает адсорбцию фосфора и приводит к нарушениям нервной и регуляторной систем. И поэтому главная опасность алюминия в составе зубной пасты заключается в том, что возможно его скапливание в организме, которое отслеживается довольно трудно, не приводит к «быстрым» последствиям, но наносит ощутимый вред здоровью.
2
2
Диоксид кремния (гидратированный кремнезем) хорошо совместим с соединениями фтора и другими активными компонентами, обладает контролируемой абразивностью, позволяющей создавать пасты с широким диапазоном заданных свойств. Он также обеспечивает оптимальный рН - 6,8 7,0 (оптимальный для декстраназы), за счет которого пасты на основе диоксида кремния нормализуют кислотно-щелочной баланс. Чаще применяется гидратированний диоксид кремния (SiO × НО) в количестве 15-25% по весу.
Использование диоксида кремния имеет ряд преимуществ:
- эти абразивы практически индифферентны к большому количеству активных компонентов. Современные технологии позволяют производить достаточно качественную очистку от следов ионов Са, Mg, Al, Fe и других, в связи, с чем при необходимости совместимость с фторосодержащими веществами достигается максимума;
- возможность регулирования абразивности и очищающей способности в широком диапазоне;
- разрушение зубного камня, регулирование кислотно-щелочного баланса;
- возможность разработки прозрачных зубных паст, т.е. таких паст, в которых коэффициент рефракции абразива равен коэффициенту рефракции жидкой фазы, в которой он суспензирован. Гелеобразные пасты обладают высокой пенообразующей способностью, имеют приятный вкус и привлекательный внешний вид. Кроме того, благодаря образованию водных внутренних структур, гель позволяет включить в его состав химически несовместимые вещества, так как водная оболочка препятствует химической реакции между ними. Однако очищающая способность таких паст ниже, чем паст на основе абразивных систем. При незрелости или повышенной стираемости твердых тканей зубов низкая абразивность гелеобразных паст делает их более предпочтительными.
Дикальций фосфат дигидрат (ДКФДГ) является единственным из широко применяемых абразивов, который по своему составу близок к составу зубной эмали. Способствует поддержанию постоянства состава тканей зубов за счет предотвращения растворения ионов кальция и фосфора зубной эмали и регуляции рН. Использование дикальция фосфатдигидрата является наиболее привлекательным с точки зрения высокой полирующей способности и хорошей совместимости с отдушками. К тому же в пастах на основе ДКФДГ улучшается стабильность запаха. Величина водородного показателя зубной пасты с ДКФДГ находится в интервале 6,0-8,0. Правда, в присутствии ионов фтора велика вероятность изменения рН в сторону повышения кислотности, вплоть до 5,0. В связи с этим это абразивное вещество следует использовать в составе зубной пасты без фтора. Концентрация этого компонента в пасте колеблется от 30 до 40 мас. %.
Дикальций фосфат дигидрат и диоксид кремния относятся к полимерным носителям, которые благодаря своим свойствам обеспечивают обратимую связь (иммобилизацию) с белками, в частности ферментами, содержащимися в композиции по изобретению.
Таким образом, наиболее подходящими для декстраназы являются и диоксид кремния и дикальций фосфат дигидрат.
Детергенты (ПАВ) или тензиды в концентрации 0,5-2,0% используются для стимуляции процессов образования пены. Для этих целей чаще всего используют лаурилсульфат натрия, лаурилсаркозинат натрия.
Лаурилсульфат натрия обеспечивает пенообразование и уничтожает бактерии в полости рта, препятствует последующее размножение бактерий. Высокие концентрации этого вещества опасны для организма человека: могут вызвать катаракту, способствуют выпадению волос, способны накапливаться в организме человека. Кроме того, это сильнейший абразив, применение которого приводит к истончению эмали.
Лаурилсульфат натрия практически не используется в составе детских зубных паст, поскольку происходит раздражение слизистых оболочек.
Лаурилсульфат натрия с успехом можно заменить сапонином, ксилитолом. Хорошим пенообразующим эффектом обладает касторовое масло.
Сапонин - экстракт коры квилайи - вечнозеленого дерева родом из Латинской Америки. Средняя молекулярная масса 1800-2000 дальтон. Экстракт квилайи считается более мягкой заменой поверхностно-активным веществам, которые используются в производстве продуктов для гигиены рта. Экстракт квилайи приемлем по многим характеристикам: он отличается приятным вкусом во рту, а сапонины из квилайи, как правило, хорошо совместимы с другими ингредиентами, используемыми в зубных пастах, например, ксилитолом, глицерином и сорбитолом. При этом остается оптимальным качество пены: экстракт коры этого дерева образует маленькие аккуратные однородные пузырьки и сохраняет отличные реологические свойства продукта. Экстракт квилайи применяется и в качестве вспомогательного ингредиента - как загуститель, стабилизатор, а также агент обеспечивающий адгезию косметики с кожей и слизистой оболочкой рта. При этом наибольший потенциал экстракт коры квилайи проявляет в сложных смесях.
Разбавители (глицерин, полиэтиленгликоль) - обеспечивают эластичность, вязкость пасты. В нашем случае наиболее целесообразно использовать глицерин в концентрации 10-50 мас. %.
Загустители (лактат алюминия, сорбитол, этиленгликоль).
Лактат алюминия - соль алюминия и молочной кислоты. Это вещество уменьшает чувствительность, уплотняет десны и останавливает кровоточивость.
По вышеуказанным причинам соединения алюминия не желательно использовать в составе зубных паст.
В нашем случае наиболее целесообразно для стабилизации декстраназы использовать сорбитол в концентрации 20-40 мас. %.
Гелеобразующие агенты. Наиболее известным гелеобразующим веществом является NaKMЦ - натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы. Это продукт взаимодействия целлюлозы с монохлоруксусной кислотой. Белое порошкообразное вещество без запаха и вкуса. Получают как побочный продукт переработки хлопка. Обладает эмульгирующими, загущающими, пенообразующими, стабилизирующими, смягчающими, гелеобразующими, пленкообразующими свойствами. ЫаКМЦ широко используется в зубных пастах, кремах и косметических масках, шампунях, кремах для бритья. Нетоксична, хорошо растворима в воде. Вязкость ее растворов практически не зависит от рН. Хорошо связывает воду, растворы устойчивы к одновалентным солям.
NaKMЦ и каррагинан относятся к полимерным носителям, которые благодаря своим свойствам обеспечивают обратимую связь (иммобилизацию) с белками, в частности ферментами, содержащимися в композиции по изобретению.
Концентрация NaKMЦ в нашем изобретении 0,5-2,0 например, 1,1 мас. %.
Соединения фтора. Противокариозные зубные средства делятся на две группы: содержащие фториды и не содержащие фториды. Из соединений фтора в зубных пастах используют монофторфосфат натрия, фторид натрия, фторид олова, органические фторсодержащие соединения. В зубной пасте соединения фтора используются потому, что ионы фтора останавливают гликолиз (брожение) и укрепляют зубную эмаль. Однако при взаимодействии с водой фториды, входящие в состав зубных паст, диссоциируют, а фторид-ионы относятся по параметрам острой токсичности к веществам первого класса опасности, их попадание в дыхательные пути или пищеварительный тракт может привести к смертельному исходу [Матело С.К. Клинико-экспериментальное изучение новых лечебно-профилактических зубных паст и гелей, не содержащих фтора и обладающих реминерализующим действием: автореферат диссертации кандидата медицинских наук: - Санкт-Петербург, 2009. - 23 с.]. Заметим, что смертельная доза фторида натрия для человека при весе 70 кг составляет 5-10 г, а допустимое законом содержание этого соединения в зубной пасте - 150 мг/100 г для взрослых и 50 мг/100 г для детей. Следовательно, смертельная доза (при приеме внутрь человеком, вес которого 70 кг) взрослой зубной пасты - около 3 кг, а детской - 10 кг. Но, тем не менее, рекомендуется выбирать детскую зубную пасту без фтора, так как у детей сильно развит глотательный рефлекс, и во время чистки зубов ребенок непременно проглатывает часть пены.
2
3
В некоторых регионах России отмечается высокое содержание фтора в воде (Башкортостан, Краснодарский край, Москва, Московская и Рязанская области). Концентрация фтора в питьевой воде на уровне 1 мг/дм3 является оптимальной. Пасты с содержанием фтора 1000 ч/млн (ppm) т.е. 0,1% приемлемы для ежедневной чистки зубов. Данная концентрация относится к содержанию ионов фтора, следовательно, концентрация вещества, в составе которого этот ион вводится в пасту, должна быть выше. Так, концентрация натрия монофторфосфата (NaPOF) может достигать 0,80%
В отсутствие фтора за укрепление эмали в зубной пасте отвечают соединения кальция: кальция глицерофосфат, лактат и цитрат кальция, синтетический гидроксиапатит и многие другие. Пасты, содержащие кальций отлично подходят для постоянного применения.
Глицерофосфат кальция - кальциевая соль 1,2,3-пропантриол моногидрогенфосфата обеспечивает процесс реминерализации. Это вещество выпускается в форме таблеток для применения внутрь, восполняет дефицит кальция и стимулирует анаболические процессы. Противопоказание - гиперкальцемия, и все, что с этим связано. В отличие от фтора, глицерофосфат кальция является природным полуфабрикатом фосфорно-кальциевого обмена, соответственно в составе зубной пасты противопоказаний нет, его концентрация колеблется от 0,1 до 0,15 в среднем около 0,13 мас. %.
Отбеливающие вещества бывают высокоабразивными и содержащими пероксиды [[Матело С.К. Клинико-экспериментальное изучение новых лечебно-профилактических зубных паст и гелей, не содержащих фтора и обладающих реминерализующим действием: автореферат диссертации кандидата медицинских наук: - Санкт-Петербург, 2009. - 23 с.]
Высокоабразивные компоненты содержат бикарбонат натрия, т.е. пищевую соду, карбонат кальция, лактат кальция, тексапон, диоксид титана, их использование приводит к тому, что стирается эмаль, и зубы становятся более светлыми. Во втором случае используется пероксид водорода, который при взаимодействии с эмалью выступает в роли окислителя. Долговременный контакт с полостью рта способен вызывать раздражение, и даже ожоги. То есть, достигнув желаемого результата, вы сталкиваетесь с такими последствиями, как повышенная чувствительность эмали, раздражение или даже потеря вкусовых ощущений. Не рекомендуется длительное время использовать отбеливающие зубные пасты, т.к. они нарушают структуру эмали. Кроме того, первоначальный оттенок эмали редко бывает идеально белым.
Консерванты (антимикробные компоненты). Существует общепринятая практика добавлять консерванты в состав зубных паст для защиты от микроорганизмов. Обычно для этих целей применяют метиловый, пропиловый эфиры параоксибензойной кислоты, или бензонат натрия.
В качестве консерванта применяемого при изготовлении композиции в соответствии с настоящим изобретением, используют бензоат натрия, который может быть включен в количестве от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% по весу.
Отдушки сами по себе обладают некоторыми антибактериальными действием, также как и некоторые используемые в настоящее время активные компоненты (например, триклозан).
Хлоргексидин - 1,6-ди-(пара-хлорфенилгуанидо)-гексан. Препятствует образованию налета на зубах, активен в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий (кроме микобактерий туберкулеза), простейших и вируса герпеса, также применяется для промывки операционных ран. Но он не предназначен для приема внутрь! И, кроме того, естественная микрофлора также подвергается антисептическому действию хлоргексидина, что отрицательно сказывается на здоровье полости рта.
Что касается триклозана, он обладает схожими свойствами в составе зубной пасты, но более активен химически, чем хлоргексидин. Представляет собой эфир, углеводородные радикалы в котором - дихлорбензил и хлорфенил. Исследования показали опасность этого соединения заключается в том, что оно может вызывать мутации микроорганизмов, поэтому не рекомендуется использовать триклозан содержащие для гигиены полости рта.
Хлорофилл принимает непосредственное участие в процессе фотосинтеза в зеленой части растений, успешно заменяет триклозан. Преимущество перед триклозаном заключается в том, что хлорофилл - природное вещество, а не синтетическое, и поэтому его действие направлено не на уничтожение бактерий, а на взращивание естественной микрофлоры. Препараты хлорофилла способствуют прекращению кровоточивости и активируют процессы регенерации тканей. То же касается экстрактов трав: органические несинтетические вещества ближе нам, и наиболее безопасны, но они менее активны, а их содержание в зубной пасте крайне мало. Хлорофилл используют в концентрации 4,2-5,0 мас. %.
Примеры подсластителей, применимых при изготовлении средства по уходу за зубами в соответствии с настоящим изобретением, могут включать аспартам, сахарин, сукралозу или их смесь в количестве от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% по весу.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является зубные пасты (прототипы) по патенту RU № RU 2407512 и патенту №2535045
Изобретение охватывает композиции для ухода за полостью рта и способы их применения, которые эффективны для ингибирования или снижения накопления налета на зубах, снижения содержания кислоты, продуцируемой (кариогенными) бактериями, реминерализации зубов и ингибирования или ослабления гингивита. Изобретение также охватывает композиции и способы для очистки полости рта и относится к улучшенным способам укрепления здоровья полости рта и/или общего состояния здоровья (включая состояние сердечнососудистой системы) путем уменьшения возможности получения системной инфекции через ткани полости рта, снизить воспалительные явления в полости рта на 80-85%.
Поэтому изобретение включает в себя композицию для ухода за полостью рта (композицию по изобретению), например, средство для чистки зубов, содержащее фермент декстраназу микробного происхождения.
Эффективное количество фермента, например, декстраназы например, присутствующей в количестве, по меньшей мере, примерно 0,03%, например, от примерно 0,03 (около 1500 ед.) до примерно 0,1% (около 5000 ед.).
Вещество в виде частиц, например, диоксид кремния или дикальция фосфат, которое имеет рН в незабуференном растворе меньше примерно 7,5, например, от примерно 6,5 до примерно 7,4, например, от примерно 6,8 до примерно 7,4, например, приблизительно нейтральный рН. Это важно для сохранения активности и стабильности фермента в составе композиции.
Многоатомные спирты, например, глицерин, сорбитол, ксилитол, или их смесь, используются в настоящем изобретении в качестве увлажняющих средств, обеспечивающих сохранение активности и стабильности фермента декстраназы в концентрации по меньшей мере, приблизительно 10 мас. %, например приблизительно от 10 до 50 мас. %.
Детергенты (поверхностно активные вещества), например, лаурилсульфат натрия или сапонин в концентрации по меньшей мере, приблизительно 0,5 мас. %, например приблизительно от 0,5 до 2,0 мас. %
Композиция по изобретению содержит гелеобразующие соединения, например, натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы.
Натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы обеспечивает иммобилизацию декстраназы и соответственно стабильность фермента.
Композиция по изобретению содержит натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы или каррагинан в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,5 мас. % например, приблизительно от 0,5 до 2,0 мас. %
Композиция по изобретению не обязательно содержит соединение фтора, например, монофторфосфат натрия меньше примерно 0,80, например, от примерно 0,40 до примерно 0,75 мас. %.
Композиция по изобретению не обязательно содержит, например, глицерофосфат кальция, в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 мас. % например, приблизительно от 0,1 до 0,15 мас. %
Указанную зубную пасту по примерам 1,2 готовят следующим образом: деминерализованной воде последовательно растворяют все компоненты, кроме натрий КМЦ, дикальций фосфат дигидрата и диоксида кремния затем добавляют натрий КМЦ и дикальций фосфат дигидрат или диоксид кремния перемешивают до образования геля. Полученную зубную пасту перемешивают, вакуумируют и гомогенизируют.
Тщательный подбор ингредиентов композиции по изобретению и способа приготовления зубной пасты обеспечивают высокую остаточную активность и стабильность декстраназы в течение 2 лет.
Именно зубные пасты, содержащие декстраназу, рекомендуется применять для гигиены полости рта при лечении заболеваний пародонта и слизистой оболочки полости рта. Пасты содержащие декстраназу - обеспечивают снижение воспалительных явлений в полости рта на 85,8%.
После 5-минутной чистки зубов зубные пасты состава 1-2 с положительным эффектом приводили к снижению микроорганизмов по сравнению с исходным значением на 45-97% для десневой борозды, на 78-96% для вестибулярной и язычной поверхностей зубов и на 94-98% для вестибулярной и язычной поверхностей десен. На слизистой оболочке щеки наблюдали снижение микроорганизмов на 60-95%.
Положительный эффект после чистки зубов сохранялся в течение 2 часов.
Изменение рН ротовой жидкости в область нейтральных и слабо щелочных значений также можно рассматривать в качестве положительного эффекта пасты, так как это действие способствует процессам реминерализации зубной эмали. Изменение времени чистки зубов с 5-ти до 3-х минут снижало эффективность используемых паст.
Зубные пасты состава 1-2 уменьшать образование налета как минимум на 70%, а также безвредны и безопасны при длительном применении.
Клинические испытания специфического действия таблеток декстраназы Aspergillus insuetus ВКМП F - 342 в качестве средства профилактики кариеса зубов. Обследовано 114 человек. Из этих людей были сформированы три группы. В первую вошли люди, которым была проведена только санация полости рта. Второй группе в течение десяти дней на зубные ряды наносили фторсодсржаший гель. Профилактика в третьей группе осуществлялась с помощью препарата "Декстраль". Каждая таблетка содержала 0.006 г (30 ед.) декстраназы. Препарат "Декстраназа" применялся 1 раз в день утром после чистки зубов в течении 30 дней. Таблетка держалась пациентом в полости рта до 20 минут, перемещалась языком и после полного рассасывания таблетки исследуемому не рекомендовали полоскать рот до 1 часа.
Проведенное исследование позволило установить следующее. В первом группе, то есть у лиц, которым была проведена только санация полости рта, прирост кариеса за год по индексу КПУ составил 1,556+0,239, по индексу КПУП - 2,204+0,301.
У лиц третьей группы, где в качестве кариеспрофилактичсского использован препарат "Декстраназа" темп прироста кариеса за год был самым невысоким. Прирост кариеса по индексу КПУ (ДКПУ) составил 0,588+0,125, а по индексу КПУП (ДКПУП) -1,353+0,166.
Таким образом, сравнение эффективности изучаемых кариеспрофилактических средств позволило установить следующее. Наибольший кариеспрофнлактнческий эффект получен при санации полости рта и назначении препарата "Декстраль", наименьший - у лиц, которым проводилась только санация полости рта. Применение в качестве кариеспрофилактического препарата фторсодержащего геля оказало незначительный эффект.
В результате рекомендует использовать таблетки «Декстраль», содержащие декстраназу в терапевтической дозе 30 ед как кариеспрофилактическое средство для лиц со средним, низким и очень низким уровнями резистентности зубов.