Введение в культуру in vitro вида Rhodiola rosea L. из популяции Кузнецкого Алатау

BIOLOGICAL SCIENCES

ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ IN VITRO ВИДА RHODIOLA ROSEA L. ИЗ ПОПУЛЯЦИИ

КУЗНЕЦКОГО АЛАТАУ

Бабич О.О.

главный научный сотрудник, Кемеровский государственный университет

Просеков А.Ю.

заведующий кафедрой Бионанотехнологии, Кемеровский государственный университет

Заушинцена А.В.

профессор кафедры Ботаники, Кемеровский государственный университет

Брюхачев Е.Н.

старший преподаватель, Кемеровский государственный университет

Куппер А.Е.

магистр, Кемеровский государственный университет

Ханьжина А.В.

магистр, Кемеровский государственный университет

Асякина Л.К.

научный сотрудник, Кемеровский государственный университет

INTRODUCTION IN VITRO CULTURE OF RHODIOLA ROSEA L. SPECIES FROM A POPULATION OF KUZNETSK ALATAU

Babich O.

Chief Researcher, Kemerovo State University

ProsekovA.

Head of the Department "Bionanotechnology", Kemerovo State University

Sauschinzena A.

Professor, Department of Botany, Kemerovo State University

Bryukhachev E.

Senior Lecturer, Kemerovo State University

Cooper A.

Master, Kemerovo State University

Hanjina A.

Master, Kemerovo State University

Asysakina L.

Researcher, Kemerovo State University

АННОТАЦИЯ

Для лечения многих заболеваний важно разрабатывать лекарственные средства растительного происхождения. В результате исследования научной литературы установлено, что в подземных органах Rhodiola rosea содержатся дубильные вещества пирогалловой группы, кумарины, антрахиноны, эфирные масла, органические кислоты, углеводы, флавоноиды, терпеноиды, фенольный гликозид салидрозид, коричный спирт и его гликозиды. Целью исследования являлась оценка биологически активных веществ в растениях Rhodiola rosea заповедника Алатау и введения вида в культуру in vitro.

ABSTRACT

To treat many diseases, it is important to develop herbal medicines. A study of the scientific literature found that the underground organs of Rhodiola rosea contain tannins of the pyrogallic group, coumarins, anthraquinones, essential oils, organic acids, carbohydrates, flavonoids, terpenoids, phenolic glycoside salidroside, cinnamon alcohol and its glycosides. The aim of the study was to evaluate biologically active substances in plants of Rhodiola rosea in the Alatau Reserve and introduce the species into an in vitro culture.

Ключевые слова: родиола розовая, биологически активные вещества, фармакология, культура каллуса.

^ywords: Rhodiola rosea, biologically active substances, pharmacology, callus culture.

Введение ния патологических опухолей разных органов, диа-

Фармакологические препараты растительного бета, заболеваний желудочно-кишечного тракта ле-

происхождения в медицинской практике очень вос- жит окислительный стресс. Ему предшествуют де-

требованы [10]. Известно, что в основе процессов фекты физиологической антиоксидантной защиты

старения, развития тяжелых заболеваний сердечно- [2,12].

сосудистой системы, щитовидной железы, появле- В практике фармацевтики активно применяют

множество видов растений, в том числе, Rhodiolae

roseae L. Он отнесен к лекарственным растениям [5]. В 2008 г. включен в Красную книгу России

(2008), категория 3 (редкий вид). В его корневищах с корнями исследованиями ученых установлено около 140 различных полезных для здоровья компонентов [13]. Это обусловлено тем, что местоби-тание приурочено к горным системам мира. Растения способны накапливать большое количество микро- и макроэлементов из геологических пород и расположенных на них фрагментарных почвах.

На территории России Rhodiola rosea простирается от Севера европейской части, Урала и Сибири до Дальнего Востока [8]. В азиатской части материка встречается в Монголии, Казахстане, Узбекистане, на Юго-Востоке Китая, в Гималаях [9]. В Европе его находят в горах Скандинавии, Исландии, на Британских островах и др. [8].

Оценка эксплуатационных запасов лекарственного сырья (подземных органов) Rhodiola rosea показала, что за последние два десятилетия XX в. их объем сократился в 8 раз [6] в Алтай-Саянской горной области они близки к уничтожению.

Лечебные свойства Rhodiola rosea известны в восточной медицине более 2000 лет. Растения активно применяют китайские, монгольские и тибетские врачи для повышения когнитивных функций человека. Исследованиями японских специалистов установлена высокая антиоксидантная и противоопухолевая активность биологических веществ данного вида растений [1].

В результате исследования научной литературы установлено, что в подземных органах Rhodi-ola rosea содержатся дубильные вещества пирогал-ловой группы, кумарины, антрахиноны, эфирные масла, органические кислоты, углеводы, флавоно-иды, терпеноиды, фенольный гликозид салидрозид, коричный спирт и его гликозиды [3].

В горных системах Кемеровской области, также произрастают популяции Rhodiola rosea. Они существенно различаться по степени развития морфологических органов, содержанию биологически активных веществ. Это связано с элементным составом горных минералов, почв, теплового и водного режима.

Цель исследований: Оценка биологически активных веществ в растениях Rhodiola rosea Заповедника Алатау и введения вида в культуру in vitro.

Материалы и методы исследования

Для реализации проекта отобрана популяция растений с корневищами и корнями, надземной биомассой. Оценку содержания биологически активных веществ в биомассе корней и побегов осуществили методами высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), ТСХ, ИК. Для этого предварительно провели экстракцию и подготовку проб.

После высушивания растительных проб до воздушно-сухого состояния (0,5 кг) выделили усредненную пробу надземной части растений (побег, листья, цветки) или подземной части (корни, корневища). Растительный материал измельчили и подвергали экстракции метилкарбинолом (соотношение растительный материал/экстрагент 1:10 при

температуре 10 °С до полного извлечения биологически активных веществ. Продолжительность экстракции 2 суток. Полученное извлечение, представляет собой прозрачную жидкость темного зеленовато-коричневого цвета с характерным запахом. Перед использованием экстракты хранили в темноте при температуре 4-6 °С.

Для использования ВЭЖХ-анализа измельченное растительное сырье (0,5 кг) экстрагировали 70%-ным этанолом в соотношении 1:10 в ультразвуковой ванне (100 Вт, частота 35 кГц) при 40 °С дважды по 30 минут в течение 2 часов. Спиртовое извлечение фильтровали через мембранные фильтры с размером пор 0,2 мкм. Фильтрат концентрировали до водного остатка с использованием роторного испарителя под вакуумом. Далее фильтрат подвергали жидкофазной экстракции гексаном (фракция 1) и смесью этилацетат-этанол в соотношении 5:1. Фракцию 2 хроматографировали на сорбенте Sephadex LH-20 (колонка 10х350 мм) на жидкостном хроматографе Bio-Logic («Bio-Rad», США) с элюцией изопропанолом при градиенте от 20 до 90%.

Полученное извлечение фильтровали и сгущали на роторном испарителе IKA8 при вакууми-ровании 72 Мбар до густой консистенции. Сгущенную сумму разбавляли 4-кратным объёмом воды и оставляли при+40С на 12 часов. Выпавший после охлаждения смолистый осадок отфильтровывали. Фильтрат последовательно обрабатывали хлороформом и этилацетатом. Этилацетатное извлечение осушали безводным натрия сульфатом, и упаривали на роторном испарителе при 40 0С при ваку-мировании 240Мбар и подвергали фракционированию на колонке с сефадексом LH-20 (Pharmacia, Schveden). Фракцию предварительно смешивали с небольшим количеством сорбента, загружали в колонку и элюировали водными спиртами в соотношениях 5:5, 6:4, 7:3, 8:2, 9:1 и чистым спиртом этиловым. Фракции собирали по 10-15 мл. Состав элюата контролировали с помощью тонкослойной хроматографии. Фракции, содержащие одинаковые компоненты, объединяли и сгущали под вакуумом на роторном испарителе при вакуумировании. После объединения были выделены вещества, которые на основании качественных реакций и изучения хроматограмм отнесены к соответствующим классам растительных биологически активных веществ.

Установление строения выделенных веществ проводили на основании анализа УФ- и ИК-ФТ, спектров. УФ-спектры регистрировали на приборе СФ-2000, фотометрировали как чистые компоненты, так и с добавлением реактивов, позволяющих выявить расположение гидроксильных групп и место гликозидирования.

Подготовку проб для ИК-ФТ осуществили следующим образом. Пробу высушенного образца (навеской 2 мг) перетирали в агатовой ступке с калия бромидом («Fluka», Германия) в весовых соотношениях 1:100. В пресс-форме формировали диск при усилении 4000psi. Спектры ИК регистрировали на однолучевом интерференционном (с обратным

преобразованием Фурье) приборе ФСМ-1202 («Ин-фраспек», Санкт-Петербург, Россия). Запись спектров проводили в диапазоне 4000-400 см-1 с разрешением 4 см-1. Обработку результатов осуществляли с использованием прибора «ПО FSpec 4.0.0.2».

ТСХ - хроматографию выполнили на пластинах Sorbfil ПТСХ-АФ-А с последующей денсито-метрией ТСХ пластины Sorbfil. Использовали денситометр с системой фотофиксации Sony

В препаративном варианте хроматографиче-ские зоны вырезали и подвергали дальнейшему анализу.

Для соблюдения условий ВЭЖХ разделение веществ проводили на хроматографе Shimadzu LC-20 Prominence с диодно-матричным и рефрактометрическим детектором Shimadzu SPD20MA и колонкой Kromasil С-18 (250*4,6 мм, размер частиц фазы 5 мкм). В качестве компонентов подвижной фазы использовали смесь растворителей - ацетонитрил (растворитель А) и 0,1% водный раствор муравьиной кислоты кислоты (В). При разделении использовали градиентной режим с и изократической составляющими: 0 мин - 20% А, 4 мин - 55% А, 14 мин - 55% А, 16 мин - 20% А. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин, температура колонки 24°С; объем пробы - 20 мкл. Опорная длинна волны -254, 330 нм.

Для идентификации соединений использовали два подхода.

а) идентификацию при помощи сравнения УФ-спектров и времени удерживания, получаемых на хроматограммах пиков с соответствующими параметрами стандартов хроматографически чистых образцов. Хроматограммы обрабатывали в программе «LabSolutions».

б) идентификацию с использованием ВЭЖХ и или ТСХ, в тандеме с ИК-ФТ. Температура колонки составляла 40 °С, объемная скорость потока подвижной фазы - 0,4 мл/мин. В качестве подвижной фазы использовали 0,1% (по объему) раствор муравьиной кислоты в воде (растворитель А) и 0,1% (по объему) раствор муравьиной кислоты в ацетонит-

риле (растворитель Б). Хроматографическое разделение веществ проводили в режиме градиентного элюирования. В процессе анализа состав подвижной фазы изменяли следующим образом (растворитель Б, % по объему): 0-1 мин - 15%, 1-5 мин -15^30%, 5-15 мин - 30^38%, 15-15,5 мин -48^45%, 15,5-23 мин - 45%, 23-23,5 мин -45^-95%. Анализ хроматографической фракции осуществляли после накопления.

Количественный анализ исследуемых вторичных метаболитов (флавонов) определяли с помощью калибровочных кривых, построенных в диапазоне концентраций 1,9-235 мкг/мл. [7,14].

Эксперименты проведены в трехкратной по-вторности. Количественное содержание исследуемых растительных биологически активных веществ определяли с помощью калибровочных кривых, построенных в диапазоне концентраций 0,5-150 мкг/мл.

Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы Microsoft Excel. В таблицах приведены средние арифметические величины полученных параметров.

Для введения эксплантов Rhodiola rosea в культуру in vitro модифицировали питательную среду T. Murashige, F. Skoog (1962) [11]. Она отличается тем, что макро- и микроэлементы вносили в дозе 'У от предложенной авторами. В состав среды ввели 0,5 мг/л 2.4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и 0,5 мг/л индолилуксусной кислоты.

Результаты и обсуждение

Объем заготовки сырья Rhodiola rosea значительно меньше, чем потребности химико-фармацевтической промышленности и экспорта. Промышленные заготовки уже привели к уничтожению популяций растений на большей части местообитаний. Важно научиться ввести в культуру растение, в составе которого большое количество биологически активных веществ.

Анализ исследованного растительного сырья из Кузнецкого Алатау позволил установить высокое содержание в корневищах с корнями Rhodiola rosea салидрозида, розеина, дафнетицина, галловой кислоты (таблица 1, рисунок 1).

Наличие в составе подземной биомассы биологически активного соединения гликозида салидро-зида подтверждает возможность использования биоматериалов для приготовления препаратов со стимулирующими и адаптогенными свойствами (рисунок 1, пик 18).

Таблица 1

Содержание биологически активных веществ в корневищах и корнях_

Вещество Время удерживания, сек. Номер пика хромато-граммы Относительное содержание, мкг/мг

Триандрин 497,64 4 4,85

Гербацетин 777,66 6 0,42

Галловая кислота 892,92 7 10,26

Розеин 1080,60 8 20,45

Дафнетицин 1158,42 9 13,8

Плантамайозид 1284,60 10 2,74

Розарин 1303,68 11 2,47

Сирингин 1394 12 4,86

Кемпферол 1463 13 2,2

Розавин 1516 14 1,63

Гербацитин 1661,1 9 16 1,13

Салидрозид 2205,12 18 28,16

мди

со

г

г- т—

-

Ч- 1 \ О 1 .т

ю1 и £ (Л л гГ" ю ^ иб N Я

0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 МИН

Рисунок 1 Хроматограмма этанольного извлечения БАВ из корневищ с корнями

Установлено, что адаптогенные свойства са-лидрозида реализуются через большие полушария головного мозга при участии эндокринных и половых желез. Терапевтическое влияние экстракты ро-диолы оказывают на проявление болезней Пар-кинссона и астении. В первом случае наблюдается снижение в мозге дофамина за счет энергетичен-ского воздействия.

Содержание розавина и розарина (гликозидов коричного спирта) вместе составляет 21,08 мкг/мг и будет положительно влиять на защиту от гепатитов.

Галловая кислота наряду с другими органическими кислотами может быть активно использована для получения лекарственных форм против вируса Эболы [15].

На микроклонирование растений большое отрицательное влияние оказывают: режимы освещения, температуры и влажности, которые можно регулировать специальными приборами. Кроме этого

органы растений могут быть кантаминированы патогенной микрофлорой, в том числе на внутриклеточном уровне. Поэтому важными элементами технологии являются стерилизация биоматериала и состав питательных сред/

Стерилизацию живых эксплантов (листьев, побегов, корней) мы провели с предварительной обработкой эмульсией мыльного раствора с хлором (7%) в течение 1 часа, после ополаскивания дистил-лированой водой выдержали 1 минуту в ультразвуковой ванне с водой, затем 1 минуту в растворе 70% этилена, и 5 минут в 10% растворе Н2О2 с последующей промывкой дистиллированной водой между всеми предшествующими операциями.

Результаты выращивания на модифицированной среде ^ Murashige, F. Skoog (1962) подтвердили высокую эффективность. Превышение по выходу морфогенного каллуса составило 43%.

Таблица 2

Эффективность модифицированной питательной среды при выращивании каллусной культуры Rhodiola

rosea

Среда для культивирования Количество экс-плантов, шт. Количество каллусов, шт. Выход морфогенных каллусов, %

морфогенных не морфо генных

MS (контроль) 80 32±1,5 15±0,41 40,0

MS (модификация) 80 67±3,2 6±0,25 83,7

Заключение

В результате проведенных исследований выделены из природной среды растения Rhodiola rosea с высоким содержанием биологически активных веществ. Они перспективны для использования в биотехнологиях получения новых адаптогенных, им-муногенных лекарственных средств.

Разработана новая питательная среда по микроклонированию данного вида с высоким выходом каллусной культуры.

Финансовая поддержка предоставлена Мино-брнауки России в рамках выполнения работ ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы», соглашение о предоставлении субсидии от 14.06.2019 г. № 07515-2019-1362 (уникальный идентификатор проекта RFMEFI57718X0285).

Литература

1. Абрамчук А.В., Шингарева Н.И. Морфологические признаки родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) в зависимости от плотности посадки / Вестник Биотехнологии: Изд-во Уральский государственный университет. - 2018.- №2(16).- С.1.

2. Жусупова Г.Е. и др. Антиоксидантная активность некоторых препаратов, полученных на основе растений Казахстана / Г.Е. Жусупова, Т.М. Шалахметова, М.К. Мурзахметова, А.В. Гадецкая, А.И. Жусупова //Электронный журнал «Вестник Новосибирского педагогического университета». -2013. - №.5(15). - С. 43-65.

3. Ким Е.Ф., Гришина Е.Н. Содержание са-лидрозида в корневищах и корнях родиолы розовой (Алтай) / Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений // Материалы меж-дународн. совещания. - Новосибирск, 1998. - С. 30.

4. Родиола розовая (золотой корень), стандартизация и создание лекарственных препаратов: Монография / В.А. Куркин. - Самара: ООО «Офорт»: ГБОУ ВПО СамГМУ Минздрава России, 2015.240 с.

5. Министерство здравоохранения Российской Федерации. Фармакопейная статья Родиолы розовой корневища и корни ФС.2.5.0036.15 Rhodi-olae roseae rhizomata et radices. Взамен ГФ XI, вып. 2, ст. 75.

6. Некратова Н.А., Шарапова М.Н. Расчет периодичности заготовок лекарственного сырья в целях рационального использования растительных

ресурсов // Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии: XIV Международн. научн-практ. конф. - Барнаул: Изд-во Алтайского гос. ун-та, 2015. - С. 209-2013.

7. Определение гидроксикоричных кислот в лекарственном растительном сырье и объектах растительного происхождения /Медведев Ю.В., Пере-деряев О.И., Арзамасцев А.П., Эллер К.И., Прокофьева В.И.// Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2010. Т. 8. № 3. С. 2531.

8. Перинская Ю.С., Саканян Е.И. Современное состояние и перспективы разработки лекарственных средств на основе корневищ с корнями родиолы розовой (Rhodiola rosea L.) / Химико-фармацевтический журнал. - Т.48. №8. 2014. С. 28-32

9. Саратиков А.С., Краснов Е.А. Родиола розовая (золотой корень). -Томск: Изд-во Томского университета, 2004. 292 с.

10. Темирбулатова А.М. и др. Исследования по расширению спектра использования экстрактов ро-диолы розовой, липы сердцевидной и астрагала эс-парцетного в медицинской практике / А.М. Темир-булатова, Э.Ф. Степанова, Д.В. Веселова, Л.П. Лежнева // Научные результаты биомедицинских исследований. 2019. Т.5, №1. С. 84-93.

11. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 1962. - 15, 473-497.

12. Valko M., Leibfritz D., Moncola J., Cronin M. T. D., Mazur M., Telser J. Free radicals and antioxi-dants in normal physiological functions and human disease // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. - 2007. - Vol. 39. - Р. 44-84.

13. Pannossian A., Wikman G., Sarris J. Rosen-root (Rhodiola rosea): traditional use, chemical composition, pharmacology and clinical efficacy // Phytomed-icine: журнал. - 2010. - Vol.17 (7). - P. 481- 493).

14. Simultaneous metabolite fingerprinting of hy-drophilic and lipophilic compounds in Echinacea pal-lida by high-performance liquid chromatography with diode array and electrospray ionization-mass spectrom-etry detection / F. Pellati, G. Orlandini, S. Benvenuti / / J. Chromatography A., 2012. V.1242 P.43- 58.

15. Qinghua Cui, Ruikun Du, Manu Anantpadma. Adam Schafer, Lin Hou, Jingzhen Tian, Robert A. Davey, Han Cheng and Lijun Rong Identification of El-lagic Acid from Plant Rhodiola rosea L. as an Anti-Ebola Virus Entry Inhibitor / Viruses 2018, 10, 152; doi:10.3390/v10040152