СПОСОБ ВЫБОРА МИТОХОНДРИЙ ДЛЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ МЕЛАНОМЫ В16-F10
METHOD FOR SELECTING MITOCHONDRIA FOR EXPERIMENTAL THERAPY OF B16-F10 MELANOMA

Изобретение относится к онкологии, а именно к экспериментальной онкологии, и может быть использовано для выбора митохондрий из внутренних органов для дальнейшей митохондриальной терапии экспериментальных опухолей.
Митохондрии играют ключевую роль в аэробном дыхании и производстве аденозинтрифосфата (АТФ) и составляют «энергетическое ядро» эукариотических клеток. Функционирование клетки зависит от гомеостаза митохондрий, нарушение которого приводит к  патологических процессам, включая рак.
Прошло более двух десятилетий с тех пор, как Кларк и Шей открыли процесс переноса митохондрий. В 2006 году Spees J.L. и его коллеги сообщили о первых доказательствах, подтверждающих горизонтальный (от клетки к клетке) перенос митохондрий между клетками млекопитающих (Spees J.L., Olson S.D., Whitney M.J.,  Prockop D.J. Mitochondrial Transfer between Cells Can Rescue Aerobic Respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2006;103:1283-1288. https://doi.org/10.1073/pnas.0510511103).
Известно, что спонтанный перенос митохондрий от клетки к клетке обладает определенным терапевтическим потенциалом, который был показан при трансплантации изолированных метаболически активных митохондрий на нескольких экспериментальных патологических моделях в опытах in vitro и in vivo (см. Nascimento-Dos-Santos G., de-Souza-Ferreira E., Linden R., Galina A., Petrs-Silva H. Mitotherapy: unraveling a promising treatment for disorders of the central nervous system and other systemic conditions. Cells. 2021; 10(7): 1827. https://doi.org/10.3390/cells10071827). Совместное культивирование мутантных и истощенных клеток линии A549 с мезенхимальными стволовыми клетками человека (МСК) успешно восстанавливало митохондриальную функцию первых, о чем свидетельствовало увеличение содержания АТФ, повышение мембранного потенциала и потребления кислорода (см. Spees J.L., Olson S.D., Whitney M.J., Prockop D.J. Mitochondrial Transfer between Cells Can Rescue Aerobic Respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2006;103:1283-1288. https://doi.org/10.1073/pnas.0510511103). В подтверждение этого открытия, другие авторы выявили, что изолированные митохондрии также спонтанно поглощались клетками линии A549p0, успешно восстанавливая митохондриальное дыхание (см. E., D’Souza G., Boddapati S.V., Kulawiec M., Singh K.K., Bigger B., Weissig V. Xenogenic Transfer of Isolated Murine Mitochondria into Human ρ0 Cells Can Improve Respiratory Function. Rejuvenation Res. 2007;10:561–570. doi: 10.1089/rej.2007.0575.). За последние два десятилетия несколько исследований in vitro обнаружили способность к перемещению митохондрий путем горизонтального переноса  и через включения изолированных органелл другими клетками (см. Burridge MV, McConnell MJ, Grasso S, Baizikova M, Kovarova J, Nazil J. Horizontal transfer of mitochondria between mammalian cells: approaches beyond co-culture. Well. Gene's opinion. Dev. 2016; 38:75–82. doi: 10.1016/j.gde.2016.04.003.). Эти исследования подтвердили динамизм митохондрий и заложили основу для современного научного направления по митохондриальной терапии, т.е. лечению изолированными митохондриями.
Berridge M.V. с соавторами в опытах in vitro смогли определить процессы митохондриального переноса в злокачественные клетки и между ними  (см. M.V.,  Dong L.F.,  Neuzil J. Mitochondrial DNA in tumor initiation, progression and metastasis: role of horizontal mtDNA transfer. Cancer Res. 2015;75: 3203-3208). В другом исследовании клетки-реципиенты подвергались воздействию УФ-излучения, повреждающего ДНК, чтобы стимулировать межклеточный митохондриальный перенос из здоровых клеток или стволовых клеток и способствовать выживанию (см. X.,  Gerdes H.H. Transfer of mitochondria via tuneling nanotubes rescues apoptotic PC12 cells Cell Death Diff. 2015; 22: 1181-1191). Сообщалось также о моделях in vitro с применением митохондриального переноса между клетками линии hMSCs и злокачественными клетками без мтДНК или с нарушенной дыхательной функцией митохондрий (см. HLin Y.,  Liou C.W.,  Chen S.D.,  Hsu T.Y ,  Chuang J.H.,  Wang P.W.,  Huang S.T.,  Tiao M.M.,  Chen J.B.,  Lin T.K.,  Chuang Y.C. Mitochondrial transfer from Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells to mitochondria-defective cells recaptures impaired mitochondrial function Mitochondrion. 2015;22:31-34).
Таким образом, представленные доказательства поддерживают горизонтальный перенос митохондрий и мтДНК между клетками млекопитающих в культуре, предполагая, что эти явления, независимо от точных вовлеченных механизмов, могут быть фундаментальным физиологическим процессом, заслуживающим изучения в условиях целого организма.
Исследования моделей in vivo на патологиях печени показывают, что трансплантированные митохондрии могут способствовать метаболическому восстановлению гепатоцитов. Например, интраселезеночная инфузия изолированных митохондрий снижала окислительный стресс, гибель клеток и сывороточные уровни ферментов печени в модели ишемии-реперфузии печени крысы (см. Lin H.C., Liu S.Y., Lai H.S., Lai I.R. Isolated Mitochondria Infusion Mitigates Ischemia-Reperfusion Injury of the Liver in Rats. Shock. 2013;39:304–310. doi: 10.1097/SHK.0b013e318283035f.). Кроме того, системное введение изолированных митохондрий восстанавливало функцию печени за счет снижения активности аминотрансфераз в сыворотке, уровня холестерина, накопления липидов и окислительного стресса в мышиной модели неалкогольной жировой болезни печени (см. Fu A., Shi X., Zhang H., Fu B. Mitotherapy for fatty liver by intravenous administration of exogenous mitochondria in male mice. Front. Pharmacol. 2017;8:241. doi: 10.3389/fphar.2017.00241.).
Аналогичная эффективность митохондриальной трансплантации была отмечена в экспериментах с мышиной моделью повреждения печени, вызванной ацетаминофеном (см. Shi X., Bai H., Zhao M., Li X., Sun X., Jiang H., Fu A. Treatment of acetaminophen-induced liver injury with exogenous mitochondria in mice. Transl. Res. 2018;196:31–41. doi: 10.1016/j.trsl.2018.02.003.), что позволяет предположить трансплантацию митохондрий в качестве возможного подхода к терапии заболеваний, связанных с патологиями печени.
Проводились исследования в области респираторных заболеваний и было определено, что интратрахеальная инъекция митохондрий ослабляла гиперреактивность дыхательных путей, стимулированную липополисахаридами, за счет ингибирования усиленной АФК эпителиальной холинергической гиперактивности (см. Su Y., Zhu L., Yu X., Cai L., et al. Mitochondrial transplantation attenuates airway hyperresponsiveness by inhibition of cholinergic hyperactivity. Theranostics. 2016;6:1244–1260.doi: 10.7150/thno.13804.). Трансплантация митохондрий через легочную артерию или аэрозольное распыление также улучшила динамическую податливость и инспираторную способность и уменьшила повреждение тканей после ишемии-реперфузии у мышей (см. Moskowitzova K., Orfany A., Liu K., Ramirez-Barbieri G., Thedsanamoorthy J.K., Yao R., Guariento A., Doulamis I.P., Blitzer D., Shin B., et al. Mitochondrial transplantation enhances murine lung viability and recovery after ischemia-reperfusion injury. Am. J.  Physiol.-Lung Cell. Mol. Physiol. 2020;318:L78–L88.doi: 10.1152/ajplung.00221.2019.).
При терапии злокачественных опухолей было определено, что митохондрии, изолированные из печени, успешно ингибировали рост опухоли легких у мышей за счет уменьшения гликолиза и окислительного стресса (см. Fu A., Hou Y., Yu Z., Zhao Z., Liu Z. Healthy mitochondria inhibit the metastatic melanoma in lungs. Int. J. Biol. Sci. 2019;15:2707–2718. doi: 10.7150/ijbs.38104.).
Источник митохондрий для митохондриальной терапии имеет решающее значение и зависит от легкости получения органелл, возраста ткани, состояния здоровья донора, метаболических характеристик органа происхождения, а также гистосовместимости. Так группа ученых при выборе печени в качестве донора митохондрий принимала во внимание следующие параметры: высокая плотности органеллы, легкий доступ к ткани, высокий регенеративный потенциал и относительно высокий индекс сопряжения окислительного фосфорилирования (см. Nascimento-Dos-Santos G., De-Souza-Ferreira E., Lani R., Faria C., de Araujo V.G., Teixeira-Pinheiro L.C., Vasconcelos T., Gonçalo T., Santiago M.F., Linden R., et al. Neuroprotection from optic nerve injury and modulation of oxidative metabolism by transplantation of active mitochondria to the retina. Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis. 2020;1866:165686. doi: 10.1016/j.bbadis.2020.165686.). Ряд ученых при изучении вариаций биоэнергетических характеристик митохондрий, таких как высокий мембранный потенциал, среди митохондрий ряда органов и тканей, показали, что по мембранному потенциалу митохондрии в мышцах, мозге, бурой и белой жировых тканях качественно не отличались друг от друга (см. Nakamura Y., Park J.H., Hayakawa K. Therapeutic use of extracellular mitochondria in CNS injury and disease. Exp. Neurol. 2020;324:113114. doi: 10.1016/j.expneurol.2019.113114.). Недавнее исследование показало, что возраст донорской ткани может иметь значение при выборе донорских митохондрий (см. Fu A., Hou Y., Yu Z., Zhao Z., Liu Z. Healthy mitochondria inhibit the metastatic melanoma in lungs. Int. J. Biol. Sci. 2019;15:2707–2718. doi: 10.7150/ijbs.38104.), поскольку митохондрии молодых и здоровых мышей эффективнее сдерживали пролиферацию опухолевых клеток по сравнению со старыми митохондриями, что может быть связано с более высоким мембранным потенциалом и антиоксидантной способностью. Митохондрии, взятые от крыс с диабетом содержат меньше АТФ, чем контрольные крысы после тепловой глобальной ишемии (см. Doulamis I.P., Guariento A., Duignan T., Orfany A., Kido T., Zurakowski D., Del Nido P.J., McCully J.D. Mitochondrial transplantation for myocardial protection in diabetic hearts. Eur. J. Cardio-Thoracic Surg. 2020;57:836–845. doi: 10.1093/ejcts/ezz326.). Эти сообщения указывают на важность биологических условий донорской ткани, влияющих на биоэнергетические характеристики органелл и могут объяснять их терапевтический потенциал. Приведенные выше результаты экспериментов показывают, что аутологичная трансплантация может быть не лучшим выбором для митохондриальной терапии при некоторых заболеваниях, поскольку их терапевтический потенциал может быть ограничен здоровьем пациента.
В настоящее время остается актуальным вопрос по гистосовместимости для трансплантации митохондрий, который до конца все еще не определен. Предполагая, что существуют серьезные ограничения для включения экзогенных митохондрий в клетки был проведен эксперимент in vitro, который показал, что после введения митохондрий мыши в клеточную линию человека резистентность со стороны клеток-хозяев не возникала (см. Clark M.A., Shay J.W. Mitochondrial transformation of mammalian cells. Nature. 1982;295:605–607.doi: 10.1038/295605a0.). Первые свидетельства успешной ксеногенной трансплантации показали, что митохондрии, выделенные из алжирской мыши Mus spretus, индуцировали трансформацию митохондриальной зиготы мышей Domesticus после микроинъекции (см. Pinkert C., Irwin M.H., Johnson L.W., Moffatt R.J. Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection. Transgenic Res.1997;6:379– 383.doi:10.1023/A:1018431316831.). В соответствии с полученными результатами оказалось, что инкубация с митохондриями мышей улучшала дыхательную функцию в человеческих p0- клетках (см. Katrangi E., D’Souza G., Boddapati S.V., Kulawiec M., Singh K.K., Bigger B., Weissig V. Xenogenic Transfer of Isolated Murine Mitochondria into Human ρ0 Cells Can Improve Respiratory Function. Rejuvenation Res. 2007;10:561-570. doi: 10.1089/rej.2007.0575.).
В первом исследовании на крысах, митохондрии, выделенные из клеточной линии хомяка, успешно обеспечивали защиту нейронов от ишемического стресса у крыс (см. Huang P.J., Kuo C.C., Lee H.C., Shen C.I., Cheng F.C., Wu S.F., Chang J.C., Pan H.C., Lin S.Z., Liu C.S., et al. Transferring xenogenic mitochondria provides neural protection against ischemic stress in ischemic rat brains. Cell Transplant. 2016;25:913–927. doi: 10.3727/096368915X689785.). Кроме того, как аллогенные, так и ксеногенные митохондрии улучшали двигательную активность и ослабляли гибель дофаминергических нейронов в крысиной модели болезни Паркинсона. Тем не менее, ксеногенный трансплантат был менее эффективен, чем аллогенный в долгосрочной перспективе (см. Chang J.C., Wu S.L., Liu K.H., Chen Y.H., Chuang C.S., Cheng F.C., Su H.L., Wei Y.H., Kuo S.J., Liu C.S. Allogeneic/xenogeneic transplantation of peptide-labeled mitochondria in Parkinson’s disease: Restoration of mitochondria functions and attenuation of 6-hydroxydopamine–induced neurotoxicity. Transl. Res. 2016;170:40–56. doi: 10.1016/j.trsl.2015.12.003.). При этом ни сингенные, ни аллогенные инъекции не приводили к аллореактивности, аллораспознаванию или реакциям, зависимым от связанных с повреждением молекулярных паттернов (DAMPs) (см. Ramirez-Barbieri G., Moskowitzova K., Shin B., Blitzer D., Orfany A., Guariento A., Iken K., Friehs I., Zurakowski D., del Nido P.J., et al. Alloreactivity and allorecognition of syngeneic and allogeneic mitochondria. Mitochondrion. 2019;46:103-115.doi: 10.1016/j.mito.2018.03.002.).
В совокупности представленные данные показывают, что источник митохондрий имеет значение в зависимости от цели трансплантации. Однако, поскольку тканевые, аутологичные, аллогенные и ксеногенные трансплантаты индуцируют защиту клетки или тканей в различных экспериментальных моделях, предпочтение в каждом случае может основываться главным образом на простоте выделения митохондрий и выборе критериев оценки повреждающего действия митохондрий.
Техническим результатом настоящего изобретения является выбор тех митохондрий, которые в системе in vitro оказывали наибольший повреждающий эффект на культуру клеток меланомы, включая уровень гликолиза и клеточного дыхания.
Поставленная цель достигается тем, что в культуру клеток меланомы B16-F10 вносят митохондрии сердца интактных крыс и при степени зарастания царапины менее 25%, среднем фоновом значении скорости потребления кислорода - OCR между контролем и вариантом с добавлением митохондрий не менее 206,7 пмоль/мин при разнице между максимальными значениями не менее 230,9 пмоль/мин, при снижении базового уровня активности гликолиза - ECAR не менее, чем на 14,36 мрН/мин, выбирают митохондрии для дальнейшего использования в митохондриальной терапии меланомы.
Изобретение «Способ выбора митохондрий для экспериментальной терапии меланомы В16» является новым, так как оно неизвестно в области экспериментальных исследований в онкологии.
Новизна изобретения заключается в том, что культуру клеток меланомы культивируют с митохондриями клеток выделенных из различных тканей и для дальнейшего исследования выбирают те митохондрии, которые оказали наибольшее повреждающее действие на клетки меланомы, включая уровень гликолиза и клеточного дыхания.
Изобретение «Способ выбора митохондрий для экспериментальной терапии меланомы В16» является промышленно применимым, так как может быть использовано в научно-исследовательских учреждениях онкологического профиля для выбора митохондрий, обладающих наибольшим повреждающим действием на опухолевые клетки.
«Способ выбора митохондрий для экспериментальной терапии меланомы В16» осуществляется следующим образом.
2
Клетки культуры B16-F10 выращивают в стандартной среде культивирования, состояшей из среды DMEM (Gibco, США) с добавлением 10% FBS (HyClone, США) и 1% раствора антибиотика-антимикотика (Gibco, США), при температуре 37°С и содержании СО 5,0%. Всего закладывают три эксперимента, с целью определить влияние митохондрий, полученных из печени и сердца крысы, на различные биологические особенности клеток мышиной меланомы. Митохондрии выделяют по методу Егоровой М.В., Афанасьева С.А. (2011) с применением хладагентов и дифференциального центрифугирования на высокоскоростной рефрижераторной центрифуге.
Для определения влияния митохондрий на жизнеспособность клеток культуры B16-F10 производили посев по 5*104 клеток на лунку 24х-луночного планшета. Через 2 часа, когда происходила адгезия клеток ко дну планшета среду культивирования заменяли на стандартную среду с тестируемыми объектами в следующих вариантах: 1) митохондрии сердца (1 мкг/мл, в пересчёте на общий белок); 2) митохондрии печени (1 мкг/мл, в пересчёте на общий белок); 3) контроль без воздействия. Всего на каждый вариант опыта - по 4 повтора. Далее через каждые 24 часа среду с тестируемыми объектами обновляют и производят фотографирование клеток. Влияние митохондрий на подвижность клеток B16-F10 проводят в тесте на зарастание царапины. В каждую лунку 24х- луночного планшета вносят по 15*104 клеток B16-F10, через 2 часа среду заменяют на среду с тестируемыми объектами, как и в первом эксперименте, но количество митохондрий уменьшают в 2 раза. Всего на каждый вариант опыта - по 4 повтора.
Через 24 часа на образовавшийся монослой наносят царапину и среду заменяют на стандартную среду культивирования, после чего клетки культивируют в имиджере Lionheart FX (BioTek) при температуре 37°С и содержании СО2 5,0% с автоматическим измерением площади царапины через каждые 5 часов. Степень зарастания царапины указана, как разница между площадью царапины через 15 часов культивирования и начальным моментом в процентах от площади царапина на начальный момент. Для оценки влияния митохондрий на энергетический метаболизм клеток культуры B16-F10 производят посев по 2×104 клеток на лунку картриджа SeaHorse XFp Analyzer (Agilent, США). После прикрепления клеток B16-F10, среду заменяют на среду с тестируемыми объектами, как и в первом эксперименте, но количество митохондрий уменьшают в 2 раза. Всего на каждый вариант опыта - по 6 повторов. На следующий день производят измерение основных параметров клеточного дыхания и гликолиза в стресс-тестах с добавлением метаболических ядов. Оценку интенсивности дыхания производят по измерению скорости потребления кислорода (oxygen consumption rate – OCR), а уровень гликолиза определяют по скорости закисления среды (extracellular acidification rate – ECAR).
Через 15 часов после нанесения царапины, площадь царапины в контроле уменьшилась более, чем на 50%, в то время как с добавлением митохондрий сердца и печени степень зарастания царапины была менее 25% и не имела статистически значимых отличий от показателя контроля.
Для оценки основных параметров клеточного дыхания производят измерение OCR на начальном этапе (фон) и после добавления карбонилцианид-m-хлорфенилгидразон (КЦХГ). Добавление КЦХГ приводило к падению протонного градиента на внутренней мембране митохондрий опухолевых клеток, что вело к росту потребления кислорода до максимально возможных значений, которые определяются количеством белков электронно-транспортной цепи и их состоянием. Новый уровень OCR при этом определял запасную ёмкость митохондриального дыхания. Добавление митохондрий сердца привело к значительному снижению как фонового, так и максимального уровней потребления кислорода клетками B16-F10 по сравнению с контрольными образцами без добавления митохондрий.
Разница в средних значениях фоновой OCR между контролем и вариантом с добавлением митохондрий сердца составила ΔOCR = 206,7 пмоль/мин (t=11,15), разница между максимальными значениями - 230,9 пмоль/мин (t=8,71). Полученные результаты были достоверными на уровне значимости р<0.05 (tкрит=2,23, df=10). Добавление митохондрий печени вызвало менее выраженное (ΔOCR = 68.32 пмоль/мин), но достоверное (t=2,9) снижение фонового уровня клеточного дыхания при отсутствии достоверных различий в средних значениях OCR на максимальном уровне потребления кислорода (ΔOCR = 28,46 пмоль/мин, t=0,79, df=10).
Основные параметры гликолиза – фоновые значения и гликолитический резерв, - определяли в тесте с добавлением олигомицина. Добавление олигомицина приводило к подавлению образования АТФ в митохондриях и полному подавлению дыхания, что отражалось в снижении OCR до минимальных значений, при этом уровень гликолиза и ECAR, как правило, рос до максимальных значений для компенсации падения производства АТФ клеткой. Новый уровень ECAR свидетельствует о гликолитическом резерве клеток. Добавление митохондрий привело не только к подавлению клеточного дыхания, но и к подавлению гликолиза. Так, добавление митохондрий сердца привело к статистически значимому снижению базового уровня ECAR на 14,36 мрН/мин (t=3,12, df=10) по сравнению с контролем без митохондрий. Добавление митохондрий печени также привело к уменьшению среднего значения ECAR в фоне на 4,8 мрН/мин.
На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что экзогенные митохондрии в среде культивирования вызывают сильный клеточный стресс B16-F10, который приводит к снижению жизнеспособности клеток, подавлению их подвижности и снижению основных показателей энергетического метаболизма. Возможно, именно митохондриальный стресс и вызванный им энергетический голод является основой цитостатической активности добавленных в среду митохондрий, так как он фиксируется раньше двух других эффектов и является более чувствительным к условиям эксперимента - митохондрии, полученные из сердца, обладали намного более выраженной способность к подавлению клеточного дыхания, чем митохондрии, полученные из печени, при менее выраженной разнице в других показателях.
Таким образом, при выборе митохондрий для возмжно дальнейшей экспериментальной терапии меланомы В16 необходимо учитывать следующие параметры: степень зарастания царапины менее 25%, средние значения фоновой OCR между контролем и вариантом с добавлением митохондрий не менее 206,7 пмоль/мин при разнице между максимальными значениями не менее 230,9 пмоль/мин, снижение базового уровня ECAR (активность гликолиза) не менее, чем на 14,36 мрН/мин.
Технико-экономическая эффективность «Способ выбора митохондрий для экспериментальной терапии меланомы В16» заключается в том, что после внесения митохондрий из различных объектов (органов) в среду культивирования меланомы В16, производят выбор митохондрий для возможного дальнейшего проведения митохондриальной терапии оценивая степень зарастания царапины, средние значения фоновой OCR между контролем и вариантом с добавлением митохондрий, снижение базового уровня активности гликолиза.