Математическое моделирование и оптимизация процесса роста микробной популяции на основе фазовой гетерогенности клеточного цикла

УДК 577.1:663.13:576.8

МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОЦЕССА РОСТА МИКРОБНОЙ ПОПУЛЯЦИИ НА ОСНОВЕ ФАЗОВОЙ ГЕТЕРОГЕННОСТИ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

© А.А. Арзамасцев, А.А. Андреев

Arzamastsev A. A., Andreyev A. A. The mathematical modelling and optimisation of micro-organism population growth process on the basis of cellular cycle phase heterogeneity. On the basis of cellular cycle structure analysis, mathematical models of micro-organism population phase heterogeneity were constructed. With the help of this model, ways of industrial cultivation mi-cro-organism optimisation are proposed.

ВВЕДЕНИЕ

Результаты многочисленных исследований говорят о довольно разнообразных подходах к построению моделей роста микробиологических популяций. Вместе с тем, в настоящее время так и не выработано единой точки зрения относительно того базиса, на который должен опираться процесс построения такой модели. Не вполне ясно, рассмотрение каких явлений: биохимических (метаболитические пути, механизм реакции, процессы регуляции), физических (диффузионные процессы) или биологических (возрастная, морфологическая и др. виды гетерогенности популяции) наиболее существенно для ее построения. Тщательный анализ математических моделей, используемых в настоящее время для описания процессов биосинтеза, позволяет сделать вывод о существенных недостатках и ограниченности такого описания [1, 2]. По этой причине, было бы необходимо осуществлять поиск новой, более стационарной основы для разработки моделей биотехнологических и микробиологических процессов, одновременно учитывающей их стохастичность, различные виды гетерогенностей и фазовых сдвигов на популяционном уровне. Учитывая, что в действительности базовую роль в большинстве биологических процессов, сопутствующих росту популяции, имеют процессы, происходящие в различшлх фазах клеточного цикла (репликация ДНК и др.), то наиболее важно учитывать именно фазовую гетерогеннность популяции.

Целью данной работы является построение и анализ моделей фазовой гетерогенности роста популяции прокариотических и эукариотических микроорганизмов. Для проверки адекватности моделей и их сравнения с другими была разработана программа на языке ТигЬо Разса1 7.0. Программа реализует безградиент-ный метод покоординатного спуска и позволяет рассчитывать по экспериментальным данным коэффициенты моделей, минимизирующие взвешенную сумму квадратов отклонений экспериментальных и расчетных значений. Для проверки адекватности построенных моделей были использованы экспериментальные данные, взятые из литературных источников и полу-

ченные авторами на ОАО «Биохим» г. Рассказово Тамбовской области (дня эукариот). Для сравнения использовалась модель Ферхюльста [3]:

-^ = аЛг

1. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ ФАЗОВОЙ ГЕТЕРОГЕННОСТИ ПОПУЛЯЦИИ ПРОКАРИОТ

В нескольких предыдущих работах [4-6] нами был проведен общий анализ процессов, происходящих в клеточном цикле микроорганизмов. Как было отмечено в [5], у медленно растущих бактерий (с продолжительностью клеточного цикла Т > 1 часа) в клеточном цикле выделяют три фазы: 5-период (время между делением клетки и репликацией ДНК), (.'-период (время репликации ДНК) и .О-период (время между терми-нацией репликации ДНК и делением клетки) с продолжительностями ?с и соответственно. Для быстро растущих популяций (Т < 1 часа) фаза В отсутствует и возможно перекрытие фаз клеточного цикла. Анализ показывает, что множество всех продолжительностей клеточного цикла прокариот можно разбить на следующие классы:

1. Т> 1;

2. Т = 1;

3. - < Т< 1;

3

4. Т=--

3

5. — < Г < —;

2 3

6. Г = —;

2

7. -4т<~.

3 2

Для каждого из этих классов в процессе роста клеток можно выделить либо три (случаи 1, 3, 5 и 7), либо

две (случаи 2, 4, 6) фазы клеточного цикла. Поэтому кинетику роста популяции прокариот можно описать одной из следующих систем уравнений: а) для случая трех фаз:

dN]

= 2 kN - nun 7V3 (T) -

4N3~

~kN  min Nj

1 t-tw<x<t 1

dN2

dt

= kN - min N, (t) —

~kN  min N2(x)-kN -N2(t) 2

= k

,N - min N2(i)-kN  min

N2

(Щ dt

Ь) для случая двух фаз:

^Г = 2кщ- т1п ^2^)~кыл- пип ^(т)-

dt 2 <х<( 1

;

1n2-

dNn

= kN  min NAi)-1

;

-kN  min N2

2 t-tN2<-z<t 2

где кы - коэффициенты пропорциональности при изменении численности фазы М за счет развития, а кы - коэффициенты смертности в соответствующей

фазе. Длительности фаз клеточного цикла определяются для каждого случая отдельно. Функция пип N1 (т) (наименьшее значение функции М (/) на

1-Щ йхй!

огрезке (£ - /д, ; г)) показывает количество клеток,

потенциально возможных перейти в следующую фазу клеточного цикла (в том числе это может быть и ноль).

Для решения полученных систем уравнений их необходимо дополнить соответствующими начальными условиями. Рассмотрим клеточный цикл, состоящий из трех фаз - уравнения (2) - (4). Предполагаем, что распределение по фазам клеточного цикла является равномерным (см. [4], с. 462, уравнение (3)):

/(f) =

0, t < 0;

0 <t<T;

Т

0, t >Т.

Тогда начальные условия выразятся следующими уравнениями:

а) г- <0:

— tNi) — N0  I f (t)dt;

6)t-<0:

* h\ ^N2

N2(t-tNi) = N0- \f(t)dt ;

гл>, _

в)t- tN <0:

Для случая двух фаз рассуждения аналогичны. Общее количество клеток вычисляется как сумма значений в каждой из фаз.

Для проверки адекватности модели были взяты экспериментальные данные по росту синхронизированной культуры [7]. Результаты представлены в табл. 1 и на рис. 1.

Таблица 1

Описание экспериментальных данных моделями Ферхюльста и фазовой гетерогенности роста прокариотической популяции

Объект исследования Модель Ферхюльста* Модель фазовой гетерогенности* *

кв = 0,7099; кв = 0,0299; кс = 5,9029;

Культура а = 0,05776; кс = 0 8795-

Bacillus brevic Э = 0;

var. G.-B. Д= 15,5 %; ко = 2,8274;

[7, рис. 5] £ = 4459,35 кв =0,2631; Г=4ч; Д = 4,8 %; £ = 499,49

* - здесь а, (3 - параметры модели;

** - км,, кдг , Т - параметры модели (Т - среднее время

генерации (величина клеточного цикла)); расчеты проведены с предположением, что все клетки находятся в фазе репликации ДНК (С); Д - относительная приведенная погрешность, X, - сумма квадратов отклонений расчетных и экспериментальных данных.

N. млн. 1сл. N. млн. кл.

1,4 Ч

Рис. 1. Описание экспериментальных данных моделями Ферхюльста (А) и фазовой гетерогенности роста прокариотической популяции (В): ° — экспериментальные данные (7]; непрерывные кривые - расчеты по моделям, буквами В, С и О - обозначено количество клеток в соответствующих фазах, N - общее количество клеток

Анализ табл. 1 и рис. 1 показывает, что модель фазовой гетерогенности позволяет описывать рост синхронной культуры, хотя тенденция синхронного роста для используемых экспериментальных данных по эксперименту и модели отличаются. Модель также позволяет проследить кинетику роста клеток в каждой из фаз клеточного цикла и оценить среднее время генерации клеток.

2. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ ФАЗОВОЙ

ГЕТЕРОГЕННОСТИ ПОПУЛЯЦИИ ЭУКАРИОТ

В клеточном цикле эукариотических клеток выделяют четыре фазы: фаза в! (основной период роста клетки и подготовка к репликации генетического материала), фаза 5 (репликация хромосомной ДНК), фаза Ог (синтез белков и РНК, необходимых для митоза и цитокинеза), фаза М (период митоза) с продолжительностями /(?1, 1(}^ и гм соответственно [6]. Основы-

ваясь на результатах исследований некоторых авторов [8-10], введем еще одну фазу - йо (в ней находятся клетки, утратившие способность реплицировать ДНК и делиться).

Тогда аналогично случаю прокариот, кинетику роста эукариотической популяции можно описать следующей системой уравнений:

-^- = 2км  тш М(х) — ка  пип О, (х) -Л г-(м<т<( 1 г-ц <т<<

;

— (^О, + ^<3, ) ' ^1 (0

— = ка • тш

1 г-ц <х<г г-г4.<т<<

= к8  111111 8

Ж г-(,£х<( 2 <-г02<х<г

-------ка  1ШП С2

сИ 2 г-/02<т<г г-гм<-с</

^ — к-Оу ' ^1

где кх - коэффициенты пропорциональности при изменении численности фазы X за счет развития, а кх -коэффициенты смертности в соответствующей фазе (данный коэффициент присутствует только в фазах С\ и Со, т. к. если клетка перешла в фазу репликации, то она обязательно завершит свой клеточный цикл [6]). Длительности фаз клеточного цикла будем определять следующим образом (см. [6, с. 469]):

= 0,4Г;

°1 ’ ’

ь = 0,37";

1Г =0,2 Г;

2 ’ *

1м = 0,17,

где Т - продолжительность всего клеточного цикла.

Для решения полученных систем уравнений их необходимо дополнить соответствующими начальными условиями. Аналогично случаю прокариот, предполагаем, что распределение по фазам клеточного цикла является равномерным (7). Тогда начальные условия определяются уравнениями:

а) Г - 1(. < 0:

'о,

= Х0 ' 1/

-

б) / - < 0:

‘с/1+Ь

$

1о\

в) г- 1Сг <0:

1в1 +13+102

°2

г<31 +Ь~

г) г - гм < 0:

М

101+15+10г~

Предполагаем, что первоначально все клетки способны делиться, т. е.

0о,о = 0.

Общее количество клеток вычисляется как сумма значений в каждой из фаз.

Для проверки адекватности модели были взяты экспериментальные данные, полученные авторами. Культивирование велось в лабораторных условиях на ОАО «Биохим» г. Рассказово. Объектом исследования является штамм Засскаготусея сегеуеягае У-563 на двух различных средах: 1) на 1 л воды: глюкоза -5 г, ЫНдСЛ - 1 г, К2НР04 - 1 г, М^ОЛНгО - 200 мг, РеБО^НгО - 10 мг, СаСЬ - 10 мг [3]; 2) меласса: СВ - 76 %, pH - 6,71, сахар - 46,2 %. Культивирование осуществлялось в термостате ТГУ-01-200 при 30-31 °С. В ходе эксперимента велся подсчет количества клеток в камере Горяева: глубина 0,1 мм; площади

малой и большой ячейки ---------- и — мм соответст-

400 25

венно. Методика подсчета изложена в [11]. Результаты представлены в табл. 2 и на рис. 2.

Анализ табл. 2 показывает, что по относительным приведенным погрешностям обе модели приблизительно одинаково описывают экспериментальные данные. Исходя из рис. 2, можно сделать вывод, что модель фазовой гетерогенности позволяет учесть колебания в росте клеток в случае 1. Следует также отметить, что значения Т в обоих случаях очень близки, что говорит об адекватности модели. Об этом же свидетельствует и то, что полученные значения среднего времени генерации клеток хорошо согласуются с экспериментальными измерениями, полученными другими авторами [12-14]. Так же стоит обратить внимание, что в течение роста культуры увеличивается количество клеток, находящихся в фазе Со, т. е. утративших способность делиться, тем самым модель учитывает старение культуры. Как известно, это происходит и в реальности, - на биохимических заводах по культивированию дрожжей в процессе производства культуру всегда подмолаживают [15-18].

Таблица 2

Описание экспериментальных данных моделями Ферхюльста и фазовой гетерогенности роста эукариотической популяции

№ п/п Объект исследования Модель Ферхюльста* Модель фазовой гетерогенности* *

1 Культура БассИаготусея сегеуе$1ае У-563 на среде с глюкозой а= 1,56043; Р = 0,04005; А = 13,8 %; X = 1263,20 к,, =99,1007; о, к,. =0,00013; а, к', = 3,93724; о, к$ = 30,34053; к,- =2,12687; о2 км = 2,16242; кг =0,25273; С>о Т = 4,325 ч; А = 12,3 %; Х= 929,53

2 Культура Басскаготусея сегеуе$1ае У-563 на мелассе « = 0,60152; Р = 0,01606; А = 8,3 %; 2= 139,74 кг = 16,13094; о, к,-. =0; к' = 7,5606; о, к3= 13,52453; кг = 14,094; 2 км = 14,534; к,- = 0,30552; Т= 3 ч; А = 8,6 %; 1= 138,03

* - здесь а, р - параметры модели;

** - , &Д1. , Т - параметры модели (Г - среднее

время генерации (величина клеточного цикла)); Д - относительная приведенная погрешность, Е - сумма квадратов отклонений расчетных и экспериментальных данных.

ВЫВОДЫ

Таким образом, полученные модели позволяют адекватно характеризовать не только кинетику роста культуры в целом, но и кинетику роста клеток в каждой из фаз клеточного цикла, описывать синхронный рост культуры, ее старение и оценивать среднее время генерации клеток. Тем самым с помощью данной модели можно корректировать промышленное культивирование микроорганизмов, а именно рассчитывать время подмолаживания культуры и скорость разбавления среды в ферментаторах, так как с целью стабильности культивирования скорость подачи среды в ферментатор должна быть приблизительно равна среднему времени генерации клеток [17].

N, млн. кл./мл

N, млн. кл ./мл

о -I-1-1-1-1-1--1-1-1--1-н О

0X23456789 Ю

ч

1, ч

Рис. 2. Описание экспериментальных данных роста культуры ЗассИаготусея сегеуеыае У-563 на среде с глюкозой (1) и на мелассе (2) моделями Ферхюльста (А) и фазовой гетерогенности роста эукариотической популяции (В): ° - экспериментальные данные; непрерывные кривые - расчеты по моделям, буквами 0\, £, 02, Ми Со - обозначено количество клеток в соответствующих фазах, N ~ общее количество клеток

N, млн. кл./мл

50 45 40

35 30 25 20

N, млн.

ЛИТЕРАТУРА

1. Арзамасцев А.А., Андреев А.А. Математические модели кинетики микробиологического синтеза: возможности использования и новые подходы к разработке // Вестн. ТГУ. Сер. Естеств. и технич. науки. Тамбов, 2000. Т. 5. Вып. 1. С. 111-123.

2. Арзамасцев А.А., Андреев А.А. О возможности использования различных моделей кинетики биосинтеза // Биофизика. 2001. Т. 46. Вып. 6. С. 1048-1061.

3. Бейли Дж., ОллисД. Основы биохимической инженерии: В 2 ч. М.: Мир, 1989. Ч. 1. 692 с.; Ч. 2. 590 с.

4. Арзамасцев А.А., Андреев А.А. Информационная модель роста

клеток и их популяций с учетом фазовой гетерогенности: I. Основные положения // Вестн. ТГУ. Сер. Естеств. и технич. науки. Тамбов, 2001. Т. 6. Вып. 4. С. 461-463.

5. Арзамасцев А.А., Андреев А.А. Информационная модель роста

клеток и их популяций с учетом фазовой гетерогенности: II. Прокариоты //Вестн. ТГУ. Сер. Естеств. и технич. науки. Тамбов, 2001. Т. 6. Вып. 4. С. 464-466.

6. Арзамасцев А.А., Андреев А.А. Информационная модель роста

клеток и их популяций с учетом фазовой гетерогенности: III. Эука-

риоты //Вестн. ТГУ. Сер. Естеств. и технич. науки. Тамбов, 2001 Т. 6. Вып. 4. С. 467-471.

7. Лыков В.П., Боднар И.В., Ховрычев М.П., Полин А.Н. Биосинтез антибиотика грамицидина культурой Bacillus brevic в связи с изменением кинетики роста // Микробиология. 1986. Т. 55. Вып. 5. С. 792-795.

8. Альберте Б., Брей Д., Льюис Дою., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: В 3 т. М.: Мир, 1994. Т. 1,2.

9. Талоко С.А. Возможная роль рецепторных доменов плазматических мембран в механизмах дифференцировки и деления клеток и регуляция этих процессов специфическими рецепторными лигандами // Биофизика. 1997. Т. 42. Вып. 6. С. 1247-1259.

10. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология: В 3 т. М.: Мир, 1982. Т. 1. 368 с.; Т. 2. 440 с.; Т. 3. 344 с.

11. Инструкция по технологическому контролю спиртового производства. М.: Пищевая пром-сть, 1967. 392 с.

12. Иванов В.Н., Угодчиков Г.А. Клеточный цикл микроорганизмов и гетерогенность их популяций. Киев: Наукова Думка, 1984. 280 с.

13. Johnston G.C., Singer R.A., Sharrow S.О., Slater M.L. Cell division in the yeast Saccharomyces cerevesiae growing at different rates // J. Gen. Microbiol. 1980. V. 118. № 2. P. 479-489.

14. Tyson C.B., Lord P.C., Wheals A.E. Dependency of size of Saccharomyces cerevesiae cells on growth rate // J. Bacteriol. 1979. V 138. № I P. 92-98.

15. Андреев A.A., Брызгалов Л.И. Производство кормовых дрожжей. М.: Лесная пром-сть, 1986. 248 с.

16. Buecmyp У.З., Кузнецов А.М., Савенков В.В. Системы ферментации. Рига: Зинатне, 1986. 368 с.

17. Мосичев М.С., Складнее А.А., Котов В.Б. Общая технология микробиологических производств. VI.: Легкая и пищевая пром-сть, 1982. 264 с.

18. Справочник по производству спирта. Сырье, технология и техно-химконтроль / В.Л. Яровенко, Б.А. Устинников, Ю.П. Богданов, С .И. Громов. М.: Легкая и пищевая пром-сть, 1981. 336 с.

Поступила в редакцию 25 июня 2002 г.

кл./мл