СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНСОДЕРЖАЩЕЙ МАТРИЦЫ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ
METHOD FOR PRODUCTION OF COLLAGEN-CONTAINING MATRIX FOR BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES IMMOBILISATION

Изобретение относится к переработке сырья животного происхождения, в частности к производству пищевых ингредиентов для мясной промышленности.
Способ предусматривает получение коллагенсодержащей матрицы из модифицированных некондиционных шкур и/или отходов, на основе запатентованного способа [5] и изучение теплофизических свойств, что подтверждает возможность использования в качестве носителя биологически активных веществ.
В частности, в процессе переработки свиней образовавшиеся отходы при съемке и контурировании шкуры не вовлекаются в производство пищевых продуктов, а утилизируются.
Свиная колбасная шкурка как источник дополнительного сырья в виде белково-жировых эмульсий, стабилизаторов и отдельных ингредиентов используется в производстве мясных продуктов разных ассортиментных групп (в основном классов эконом и медиум).
Обрезки свиных шкур, образующиеся в процессе съемки с туш или дальнейшем их контурировании, после соответствующей обработки также можно использовать в производстве мясных продуктов. Интерес к использованию свиных шкур оправдан, прежде всего, из-за соединительнотканных белков, основным из которых является коллаген, отличающийся от других протеинов соединительной ткани физико-химической активностью вследствие реакционной способности функциональных групп, а также специфической последовательностью расположения аминокислот в полипептидных цепях.
Все эти сведения могут служить теоретической основой для разработки технологий рационального использования вторичного сырья животного происхождения и производства комбинированных продуктов питания, содержащих модифицированные белки. Использование вторичных источников белков соединительной ткани позволит согласно теории адекватного питания решить задачи создания нового поколения продуктов повышенной пищевой, в т.ч. биологической, ценности.
Одним из направлений рационального использования отходов и малоценного коллагенсодержащего сырья мясной промышленности является перевод его в жидкообразное состояние и последующее получение из продуктов растворения коллагеновых материалов. Известен способ, заключающийся в последовательной обработке коллагенсодержащего сырья щелочно-солевой смесью, нейтрализации борной кислотой, промывке водой и растворении в кислой среде, имеющей рН не выше 2,5 [1].
Однако этот способ длителен (до 7-8 сут), требует применения в работе растворов щелочей, солей и кислот в высоких концентрациях и больших затрат на очистку сточных вод. Кроме того, данный способ предназначен для получения продуктов растворения коллагена, используемых в медицине, клеежелатиновой промышленности.
Известен способ получения полифункционального коллагенового препарата, включающий механическую обработку и измельчение коллагенсодержащего сырья, его щелочную обработку, подкисление коллагеновой массы и сушку препарата, отличающийся тем, что перед щелочной обработкой сырье дополнительно промывают водой и щелочно-солевым раствором с содержанием хлорида натрия не более 0,3% при рН не более 12, щелочную обработку осуществляют 1-7%-ным раствором щелочи при температуре от минус 40°С до 25°С и рН более 13 в течение от 10 ч до 7 сут, а перед сушкой дополнительно проводят гомогенизацию препарата [2].
По данному способу можно получить сухой коллагеновый продукт, но он не предполагает создание в перспективе коллагенсодержащей матрицы-носителя биологически активных веществ на его основе. Кроме того, сложно провести обработку коллагенсодержащего сырья раствором при температуре, заявляемой в изобретении, - минус 40°С.
Способ получения коллагена из отходов кожевенного производства включает промывку водой, золение и нейтрализацию, отличается тем, что перед термообработкой проводят обессоливание 0,1-0,5%-ным раствором серной кислоты, а гидротермическую обработку осуществляют в течение 10-15 мин в 2-3%-ном пероксиде водорода, золение в течение 8-10 ч раствором едкого натра 2,0-2,5%-ной концентрации, с последующей промывкой в проточной воде, нейтрализацией среды ледяной уксусной кислотой до рН 7,0, измельчением, гомогенизацией и консервацией [3].
Приведенный способ требует дополнительных исследований для определения возможности использования полученного коллагена в пищевой промышленности.
В настоящее время в области биотехнологии (тканевой инженерии) создана клеточная матрица кожи in vitro, которая, благодаря присутствию в ней коллаген-хитозанового биополимера, обладает свойствами, повышающими адгезию клеток, что исключает цитогенотоксичность подложки, и пригодна для прямой трансплантации [6].
Можно отметить, что существенное развитие получило направление изготовления медицинских или ветеринарных препаратов, в которых в качестве основы использовались фибриллярные белки, в т.ч. коллаген [6, 7, 8]. Тем не менее, видимо, будут также востребованы белковые носители для иммобилизации биологически активных веществ, которые могут найти применение в производстве функциональных пищевых продуктов.
В качестве прототипа был выбран способ получения белкового продукта из коллагенсодержащего сырья, включающий измельчение сырья, обработку щелочно-солевым раствором, содержащим гидроксид натрия концентрацией 5-15% и хлорид натрия концентрацией 6%, обработку проводят в течение 13-25 ч. Затем сырье подвергают солевой промывке раствором хлорида натрия концентрацией 6%, нейтрализации раствором соляной кислоты концентрацией 0,5-3% до рН 5,0-6,5 и проводят дополнительную промывку сырья раствором хлорида натрия концентрацией 6% [5].
Задачей данного изобретения является разработка способа получения солюбилизированной коллагенсодержащей матрицы для подтверждения возможности использования ее в качестве носителя биологически активных веществ. Результаты исследований могут быть экстраполированы и на применение белкового продукта из свиных шкур [5] как носителя биологически активного вещества. С этой целью необходимо выделить коллагенсодержащую матрицу из белкового продукта из свиных шкур путем дополнительного его растворения.
2
Поставленная задача решается в предлагаемом способе получения коллагенсодержащей матрицы для изучения возможности использования ее в качестве носителя биологически активных веществ (как компонента белкового продукта из свиных шкур или их отходов). Способ включает измельчение сырья до кусков 25×25 мм, обработку щелочно-солевым раствором, содержащим гидроксид натрия концентрацией 8-13% и хлорид натрия - 5-8%. Обработку проводят в течение 13-30 ч, солевую промывку раствором хлорида натрия концентрацией 6%, нейтрализацию согласно изобретению проводят в 9% растворе уксусной кислоты в присутствии 6% раствора хлорида натрия до величины рН 5,5-6,8. Далее раствор сливают, а массу заливают 6% раствором уксусной кислоты, жидкостный коэффициент 2-3, затем проводят ее гомогенизацию и фильтрование через капроновую ткань, после чего добавляют аскорбиновую кислоту, смесь перемешивают.
Способ от прототипа отличается тем, что для нейтрализации и последующего растворения коллагенсодержащего сырья используют уксусную кислоту, являющуюся одной из лучших для растворения фибриллярных белков соединительной ткани и образования водорастворимой пищевой соли. Далее проводят гомогенизацию и фильтрацию.
Продолжение исследований белкового продукта согласно способу [5] показало, что использование уксусной кислоты, при различной продолжительности ее воздействия, несущественно влияло на функционально-технологические свойства белкового продукта, на основе которого была получена коллагенсодержащая матрица (таблица 1).
Таблица 1
Функционально-технологические свойства белкового продукта в зависимости от параметров нейтрализации
Показатель
Параметры нейтрализации (вид кислоты/продолжительность обработки, τ, ч)
уксусная
соляная
τ=13
τ=24
τ=13
τ=24
Влагосвязывающая способность, % к общей влаге
76,63±0,25
65,83±0,30
69,88±0,24
70,75±0,35
Влагоудерживающая способность, % к сухому веществу
434,0±4,2
395,0±4,0
446,0±4,4
440,0±4,0
Жироудерживающая способность, % к жиру в системе
96,41±0,30
96,32±0,30
95,20±0,35
96,96±0,40
Получение коллагенсодержащей матрицы необходимо для подтверждения процесса комплексообразования коллагена с биологически активным веществом. В результате этого доказывается возможность создания матрицы-носителя биологически активных веществ.
Уникальная молекулярная структура коллагена, наличие на его поверхности большого количества активных функциональных групп позволяют использовать этот белок для иммобилизации различных биологически активных веществ, одним из которых может являться термолабильный витамин С, выполняющий in vivo многообразные функции, потери которого при тепловой обработке (варке) пищевых продуктов животного происхождения достигают 70%.
Реакционная способность коллагена обусловлена наличием комплексообразующих групп, природа и пространственное расположение которых объясняются его строением на молекулярном и надмолекулярном уровнях. Это свойство коллагена может быть использовано как один из путей его стабилизации и модифицирования. Создание биологически активной матрицы на основе белкового продукта из шкур [5] с добавлением аскорбиновой кислоты может снизить потери этого витамина в процессе тепловой обработки и, соответственно, способствовать созданию функциональных продуктов питания широкого ассортимента.
Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.
2
Коллагенсодержащее сырье (шкуры и/или их отходы) измельчают на куски размером 25×25 мм, помещают в щелочно-солевой раствор, содержащий гидроксид натрия концентрацией 8-13% и хлорид натрия - 5-8%. Продолжительность обработки - 13-30 ч, ЖК - 2-3, температура 17±2°С. Перемешивание полученной субстанции проводят каждый час в течение 10-15 мин. Далее выполняют солевую промывку раствором хлорида натрия концентрацией 5-8%, продолжительностью 3 ч, ЖК - 2-3. Нейтрализация проводится в растворе, содержащем 9% уксусной кислоты в присутствии 6% хлорида натрия, до величины рН 5,5-6,8 с целью снижения величины рН, подавления осмотического набухания и дальнейшего гидролиза коллагена, затем раствор сливают, а субстанцию заливают 6% раствором уксусной кислоты для растворения фибриллярных белков соединительной ткани. Жидкостный коэффициент равен 2-3, что обеспечивает полное погружение массы в раствор и возможность равномерного взаимодействия уксусной кислоты с белком.
По завершении процесса проводится гомогенизация полученной коллагенсодержащей матрицы и фильтрование через капроновую ткань, после чего добавляют аскорбиновую кислоту, смесь перемешивают.
Для подтверждения комплексообразования коллагена с биологически активными веществами был использован метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (ДСК). Этот метод позволяет по величине теплопоглощения установить изменения структуры коллагена после добавления аскорбиновой кислоты при учете, что предварительно были определены пики для коллагенсодержащей матрицы и аскорбиновой кислоты по отдельности. Метод ДСК основан на измерении разности мощностей, подводимых к ячейкам, прогреваемым со строго одинаковой скоростью, что позволяет выделить и измерить теплопоглощение исследуемого образца на фоне в тысячи раз большего теплопоглощения растворителя, благодаря тому, что измеряется не абсолютная теплоемкость раствора, а разность теплоемкостей раствора и растворителя, залитых в тождественные ячейки. Измерения теплоемкости образцов проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4А.
3
3
Изобретение поясняется термограммой (фиг.), на которой показана температурная зависимость избыточного теплопоглощения коллагенсодержащей матрицы (КМ) в присутствии различных количеств аскорбиновой кислоты (содержание белка 12 мг/см в 0,5 М уксусной кислоте): кривая 1 - контроль (КМ); КМ+аскорбиновая кислота концентрацией (мг/см): кривая 2 - 0,1; кривая 3 - 0,6; кривая 4 - 1,4; кривая 5 - 1,8
Термограмма избыточного теплопоглощения (фиг. - кривая 1) по своей форме и положению максимума пика теплопоглощения (35°С) полностью совпадает с профилем плавления «мономерного» коллагена. Следует отметить, что в интервале температур 40-50°С присутствует небольшой размытый пик теплопоглощения, который всегда появляется после денатурации коллагена и может указывать на начало формирования фибрилл. Однако величина этого пика незначительна.
3
Введение в коллагенсодержащую матрицу с постоянной концентрацией белка различных количеств аскорбиновой кислоты (от 0,1 до 1,8 мг/см) приводит к небольшому смещению пика теплопоглощения фибриллярных белков (в основном коллагена) в сторону более низких температур (кривые 2-5). При этом смещение положения температурного максимума пика теплопоглощения этих белков невелико и не превышает 0,3°С. Таким образом, данные показатели являются подтверждением взаимодействия коллагена с аскорбиновой кислотой.
Примеры осуществления изобретения приведены далее.
2
Пример 1. Коллагенсодержащее сырье (шкуры и/или их отходы) измельчают на куски размером 25×25 мм, обрабатывают щелочно-солевым раствором, содержащим гидроксид натрия концентрацией 10% и хлорид натрия - 6%. Продолжительность обработки - 20 ч, жидкостный коэффициент (ЖК) -3, температура 17±2°С. Перемешивание раствора проводят каждый час в течение 10-15 мин. Далее выполняют солевую промывку раствором хлорида натрия концентрацией 6%, продолжительностью 3 ч, ЖК - 3. Полуфабрикат нейтрализуют в 9% растворе уксусной кислоты в присутствии 6% раствора хлорида натрия до величины рН 5,5-6,8, затем раствор сливают, а массу заливают 6% раствором уксусной кислоты, жидкостный коэффициент 2-3, затем проводят гомогенизацию полученной коллагенсодержащей матрицы и фильтрование через капроновую ткань, после чего добавляют аскорбиновую кислоту, смесь перемешивают.
Пример 2. Способ осуществляют в соответствии с п.1, коллагенсодержащее сырье обрабатывают щелочно-солевым раствором, содержащим гидроксид натрия концентрацией 8% и хлорид натрия - 8%. Продолжительность обработки -30 ч.
Пример 3. Способ осуществляют в соответствии с пп.1 и 2, коллагенсодержащее сырье обрабатывают щелочно-солевым раствором, содержащим гидроксид натрия концентрацией 13% и хлорид натрия - 5%. Продолжительность обработки -13 ч.
Техническим результатом является получение продукта, обеспечивающего иммобилизацию различных биологически активных веществ, в частности, витамина С, снизить потери этого витамина и способствовать получению функциональных продуктов питания широкого ассортимента.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. А.с. СССР №162280. С14С 1/08. Способ растворения коллагена шкур животных / Е.В.Минкин, И.С.Шестакова. Опубл. 1964.
2. Патент РФ 2059383, A23J 1/10, С09Н 1/00, С09Н 3/00). Способ получения полифункционального коллагенового препарата / Е.С.Вайнерман, Е.А.Курская, В.К.Кулакова, Л.А.Павлова, Л.Г.Дамшкалн, Л.Н.Крайнюк. Заявл. 26.11.1992. - №92008487/13. Опубл. 10.05.1996.
3. Патент РФ 2173709. 2S3/16, A23J 1/10. Способ получения коллагена из отходов кожевенного производства / Ю.В.Фурман, О.Б.Сеин, Д.О.Сеин и др. // Курская государственная сельскохозяйственная академия им. проф. И.И.Иванова; заявл. 05.01.2000. - 2000100149/13. Опубл. 20.09.2001.
4. Патент РФ 2209556. A23L 1/314, A23L 1/317, A23L 1/312. Способ получения структурообразователей для пищевых продуктов, преимущественно мясных / Л.В.Антипова, И.А.Глотова, А.Н.Кузнецов // ВГТА. Заявл. 21.03.2001. - 2001107616/13. Опубл. 10.08.2003.
5. Патент РФ 2227507. A23J 1/10. Способ получения белкового продукта из коллагенсодержащего сырья / Е.И.Титов, С.К.Апраксина, Л.Ф.Митасева, А.Ю.Соколов // МГУПБ. Заявл. 05.07.2002. - 2002117932/13. Опубл. 27.04.2004.
6. Патент РФ 2391399. C12N 5/071, C12R 1/91. Способ получения клеточной матрицы кожи / А.В.Еремеев, Н.В.Зотова, А.А.Власов и др. // ГОУ ВПО «Красноярский государственный медицинский университет им. В.Ф.Войно-Ясенецкого». Заявл. 31.07.2008. - 2008131742/13. Опубл. 10.06.2010.
7. Патент РФ 2396984. A61L 15/32. Антимикробная гемостатическая губка / Л.П.Истранов, Р.К.Абоянц, Е.В.Истранова. Заявл. 25.09.2008. - 2008138154/15. Опубл. 20.08.2010.
8. Патент РФ 2375877. А22С 13/00. Протеинсодержащая рукавообразная оболочка для пищевых продуктов с внутренним усилением / Й.Феглер, X.Горд, М.Зеельген // Кале ГМБХ; заявл. 11.11.2004. - 2006126056/13. Опубл. 20.12.2009.