СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АМИЛОИДОЗОВ
COMPOUNDS FOR TREATMENT OF AMYLOIDOSIS

Настоящее изобретение относится к профилактике, лечению и диагностике заболеваний, обусловленных образованием и(или) агрегацией β-амилоида (β-амилоидозы). А именно, настоящее изобретение относится к новым мимотопам, вызывающим иммунный ответ на В-амилоид и укороченные с N-конца и(или) посттрансляционно модифицированные фрагменты β-амилоида, и новым антителам, распознающим вышеупомянутые мимотопы и пептиды АВ для применения в профилактике, лечении и диагностике заболеваний, обусловленных образованием и(или) агрегацией β-амилоида.
Различные дегенеративные заболевания характеризуются аномальными процессами полимеризации и накопления определенных белков, это так называемые протеинопатии. Настоящее изобретение относится к профилактике, лечению и диагностике протеинопатии, обусловленных белками β-амилоида и объединенных термином β-амилоидозы. Самая известная форма β-амилоидозов - болезнь Альцгеймера (БА). Другие примеры включают, но не ограничиваются перечисленным, деменцию с тельцами Леви и деменцию при синдроме Дауна.
БА - самая частая форма деменции у человека. На сегодняшний день эффективного лечения, способного остановить прогрессирование нейродегенерации и сопутствующего нарушения когнитивных функций, не существует. Для БА характерно аномальное накопление внеклеточных бляшек амилоида, тесно связанное с обширным астроцитозом и микроглиозом, а также дистрофией и гибелью нейронов. Эти амилоидные бляшки состоят в основном из белков амилоида β (Aβ), производных БПА (gi:112927) пептидов Аβ40 и Aβ42, образующихся из белка-предшественника амилоида (БПА), который экспрессируется на различных типах клеток нервной системы. Считается, что пептиды Аβ принимают прямое участие в патогенезе и прогрессировании БА. Вследствие этого уменьшение объема Аβ в головном мозге должно замедлять или останавливать прогрессирование заболевания, а также, возможно, останавливать ухудшение когнитивных функций у больных с БА.
В норме БПА подвергается превращениям за счет двух этапов расщепления с образованием известных на сегодняшний день форм Абета ×-40/42/43. Первое расщепление происходит под воздействием ферментов 1 и 2, расщепляющих БПА в бета-сайте (ВАСЕ1 и ВАСЕ); второй этап протеолиза осуществляет комплекс гамма-секретазы.
Ферменты ВАСЕ распознают два сайта на N-концевой части предполагаемого пептида Аβ, и протеолитическая активность ВАСЕ ведет к образованию Abeta 1-Х и 11-Х соответственно. Таким образом, ВАСЕ, участвующие в превращениях БПА, создают ряд различных форм Аβ, где главным компонентом является Abeta 1-40/42. Активность гамма-секретазы ведет к образованию 3 основных фрагментов: Аβ 1-40/42/43. После образования эти белки подвергаются дальнейшей обработке аминопептидазами с последующим поэтапным разрушением. Эти дальнейшие этапы ведут к образованию других форм, таких как, например, Aβ3-40/42 соответственно.
Третье семейство протеолитических ферментов, участвующих в превращениях БПА, является так называемым семейством альфа-секретаз (семейство ADAM («дезинтегрин и металлопротеиназа»). Альфа-секретазы расщепляют белок - предшественник амилоида (БПА) в трансмембранном участке (между аа16 и аа17 в последовательности пептида Aβ) и препятствуют образованию пептидов Aβ. Таким образом, расщепление альфа-секретазами является ключевым этапом в не-амилоидогенных превращениях БПА. А именно, расщепление альфа-секретазами приводит к высвобождению секретируемой формы, называемой sAPPalpha. Как полагают, sAPPalpha достаточно для осуществления большинства физиологических функций БПА, и она может служить сигнальной молекулой. Как свидетельствуют факты, отщепленный эктодомен играет роль в росте фибробластов в культуре. Обнаружено, что сБПА обладает нейропротективным действием на первичные нейроны в культуре, предупреждая повышение внутриклеточной концентрации Са2+, обусловленной истощением глюкозы и повышая токсическую возбуждающую пороговую концентрацию глутамата, а также участвуя в росте нейронов и дендритов.
У человека в среднем 60-85% материала бляшек амилоида образованы производными Aβ40/42, укороченными с N-конца и часто модифицированными. Относительные количества укороченных с N-конца форм Aβ различаются по уровням Aβ, мутациям и активности ВАСЕ. Самые часто встречающиеся укороченные формы Аβ - это Aβ3-40/42 и Аβ11-40/42, на которые предположительно приходится до 50% всех укороченных форм. Это означает, что на эти изоформы приходится 25-40% всех пептидов амилоида - в головном мозге при БА. Оба пептида содержат на N-конце остаток глутамина, который часто превращен ферментами в пироглутамат, с образованием Аβ3(рЕ)-40/42 и Aβ11(рЕ)-40/42 соответственно. Поскольку аминоконец белков Abeta 3(рЕ) и 11(рЕ) блокирован внутренним лактамом, он защищен от протеолитического действия аминопептидаз, отличающихся от специфичных к пироглутамату, и, таким образом, он может оставаться в тканях стабильным. У больных с БА можно обнаружить дополнительные укороченные с N-конца варианты, начиная с положения 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 бета-амилоида. Эти формы часто являются посттрансляционно модифицированными, например, путем метилирования.
Ранее показано, что укороченные и модифицированные пептиды более стабильны в тканях нервной системы, чем полноразмерный Аβ. Кроме того, укороченные с N-конца формы Аβ имеют более выраженные амилоидогенные свойства, чем неизмененные пептиды Аβ, таким образом ускоряя образование бляшек, а также они проявляют нейротоксические свойства при воздействии на нейроны в культуре и экспериментах in vivo. Укороченные формы Аβ можно выявить в диффузных скоплениях Аβ уже на ранних стадиях БА, и они могут участвовать в раннем образовании бляшек, действуя как отдельные «затравки» in vivo. Вследствие этих эффектов предполагается, что пептиды Аβ х-40/42 могут запускать и(или) ускорять образование бляшек, возможно, действуя как «затравочные центры», от которых впоследствии отсеиваются относительно менее амилоидогенные, но явно более обильные полноразмерные пептиды Аβ. Кроме того, имеются убедительные доказательства, что присутствие форм Аβ, укороченных с N-конца, коррелирует с нарастанием тяжести и ранним началом нейродегенерации в спорадических и семейных случаях болезни Альцгеймера, а также у больных с синдромом Дауна. Данные по таким больным предполагают связь между начальным образованием укороченных форм Аβ и началом заболевания, а также его прогрессированием. В итоге, эти находки предполагают, что N-концевая гетерогенность пептидов АВ, которая выявлена in vitro и в головном мозге больных с БА, может ускорять отложение Aβ в виде бляшек. Таким образом, протеолитические события, происходящие при расщеплении БПА в N-концевом домене Аβ, могут играть значимую роль в патогенезе БА и схожих заболеваний.
В свете этих данных, видимо, важно уменьшить количество таких пептидных форм у больных с БА, чтобы замедлить прогрессирование заболевания, а также снизить токсичность и сопутствующее ухудшение когнитивных функций. Таким образом, оптимальная вакцина против БА должна вызывать иммунный ответ, направленный на большинство самых частых форм пептидов Ай, встречающихся в головном мозге больных БА - Аβ1-40/42, Аβ3-40/42, а также Аβ3(р)Е-40/42, Aβ11-40/42 и Аβ11(р)Е-40/42, - не нарушая физиологические функции передачи сигнала БПА, а именно функций sAPPalpha.
Иммунотерапия, где использовалась активная и пассивная иммунизация против полноразмерных Аβ, приводила к уменьшению бляшек Аβ и оказывала благоприятное действие в отношении прогрессирования заболевания у экспериментальных животных с моделью БА. Во всех методиках активной вакцинации, изученной на моделях у мышей, использовали полноразмерный Аβ40/42 или фрагменты, содержащие нативную последовательность Аβ.
Однако первую На фазу клинического испытания у больных с БА с использованием полноразмерного Aβ42 в качестве антигена пришлось прервать из-за тяжелых побочных эффектов, обусловленных воспалением тканей нервной системы, включая инфильтрацию головного мозга аутореактивными Т-лимфоцитами (Nicoll, J.A. et al. 2003 Nat Med 9: 448-452; Bayer, A.J., et al. 2005 Neurology 64: 94-101). Тем не менее, исследования, где изучали клинические эффекты у больных, леченых AN-1792, выявили, что у больных, у которых развился антительный ответ на Аβ42, но не развился менингоэнцефалит, результаты тестов когнитивных функций были лучше, чем у больных, у которых иммунный ответ отсутствовал, что указывает на то, что иммунотерапия может оказаться полезным методом лечения БА.
Очень важно, что недавние результаты, полученные при аутопсии больных, подвергнутых вакцинации AN1792, продемонстрировали исчезновение полноразмерных форм АВ из головного мозга, но формы А6, укороченные с N-конца, сохранялись (Nicoll, J.A., et al. 2006 J Neuropathol Exp Neurol 65: 1040-1048). Этот факт подчеркивает необходимость в изобретении новых вакцин, которые направлены против полноразмерных Aβ, а также форм, укороченных с N-конца, и модифицированных форм этой молекулы.
Индукция иммунного ответа на пептиды Aβ40/42 у человека может влиять на снижение когнитивных функций у больных с БА, но безопасная вакцина против болезни Альцгеймера не должна вызывать образование аутореактивных Т-лимфоцитов. Вакцинация нативными пептидами Аβ40/42 или их фрагментами несет риск аутоиммунного заболевания у больных, так как иммунный ответ не может быть направлен исключительно на Ар.
Цель настоящего изобретения - получение соединений и лекарственных средств, которые можно применять для лечения и(или) профилактики болезни Альцгеймера. Эти соединения не должны нести никакого риска или нести существенно сниженный риск аутоиммунных заболеваний при введении субъекту. Согласно другому аспекту настоящего изобретения, вышеуказанные соединения могут быть способны вызывать in vivo образование антител у субъекта к укороченным и(или) стабилизированным формам Аβ, которые обычно являются главными компонентами отложений амилоида.
Таким образом, настоящее изобретение относится к применению по крайней мере одного соединения, содержащего аминокислотную последовательность
<mrow><msub><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><msub><mi>X</mi><mn>1</mn></msub></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mi>m</mi></msub><mi>H</mi><msub><mi>X</mi><mn>2</mn></msub><msub><mi>X</mi><mn>3</mn></msub><msub><mi>X</mi><mn>4</mn></msub><msub><mi>X</mi><mn>5</mn></msub><mi>F</mi><msub><mi>X</mi><mn>6</mn></msub><msub><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><msub><mi>X</mi><mn>7</mn></msub></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mi>n</mi></msub><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>Ф</mi><mi>о</mi><mi>р</mi><mi>м</mi><mi>у</mi><mi>л</mi><mi>а</mi><mtext> </mtext><mi>I</mi><mi>I</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow>
где:
1
X - серин (S), треонин (Т) или цистеин (С),
2
X - глутамин (Q), треонин (Т) или метионин (М),
3
Х - лизин (К) или аргинин (R),
4
Х - лейцин (L), метионин (М),
5
X - триптофан (W), тирозин (Y), фенилаланин (F) или изолейцин (I),
6
X - аспарагин (N), глутаминовая кислота (Е), аланин (А) или цистеин (С),
7
Х - цистеин (С),
n и m - независимо друг от друга 0 или 1,
причем вышеуказанное соединение обладает связывающей способностью антитела, специфичного к эпитопу бета-пептида амилоида (Аβ), содержащему аминокислотную последовательность HQKLVF и(или) HQKLVFFAED.
для производства лекарственного средства для профилактики и(или) лечения болезни Альцгеймера.
Изобретение, описанное в данной заявке, относится к антигенам, которые не содержат последовательности нативного пептида Аβ, но, однако, имитируют структуру неоэпитопов Aβ, не выявляющихся мимотопами, такими как описанные в WO 2004/062556. Такие вакцины против БА, основанные на мимотопах, будут, следовательно, индуцировать антительные ответы, направленные исключительно против аномальных молекул Аβ, упомянутых в данном документе, но не против родительских структур. Важно, чтобы иммунный ответ, индуцируемый этими мимотопами, не влиял на полноразмерный БПА и секретируемый БПАальфа (sAPPalpha), и вследствие этого вакцинация не должна нарушать нормальные физиологические функции обеих молекул. Кроме того, мимотопы не содержат потенциальные эпитопы Т-лимфоцитов и не вызывают образование вредных аутореактивных Т-лимфоцитов.
Удивительно, но оказалось, что соединение, содержащее аминокислотную последовательность формулы I, способно вызывать образование in vivo антител к укороченной форме Аβ - Aβ1-40/42, укороченных с N-конца форм, таких как Аβ3-40/42, Aβ(рЕ)3-40/42, неизмененного Aβ11-40/42, модифицированных Aβp(E)11-40/42 и Аβ14-40/42 соответственно, а также к укороченным с N′-конца и посттрансляционного модифицированных вариантов амилоида, начиная с положения 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 в Aβ. Важно, что эти мимотопы не вызывают перекрестную реактивность с неоэпитопами, присутствующими на sAPP альфа после отщепления от БПА и, таким образом, не нарушали нормальную передачу сигнала sAPP альфа.
Антитела, образующиеся после вакцинации молекулами (мимотопами) настоящего изобретения, способны связывать вышеперечисленные фрагменты Аβ с последующим разрушением бляшек Аβ.
Формула I и II и все другие пептидные молекулы, описанные в данной заявке, имитируют естественные пептиды Aβ и варианты Аβ1-40/42, АβрЕ3-40/42, Аβ3-40/42, Aβ11-40/42, AβpE11-40/42 и Aβ14-40/42 так, что соединения, содержащие аминокислотные последовательности, описанные в данном документе, способны индуцировать образование соответствующих антител. С помощью таких антител также можно выявлять дополнительные укороченные с N-конца и посттрансляционно модифицированные варианты амилоида, начиная с положения 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 в Aβ.
«β-амилоидозы», согласно употреблению в данном документе, означают различные нейродегенеративные заболевания, которые характеризуются аберрантной полимеризацией и накоплением специфических белков, - так называемые протеинопатии. Настоящее изобретение относится к профилактике, лечению и диагностике протеинопатий, обусловленных белками β-амилоида и объединенных термином β-амилоидозы. Самая известная форма β-амилоидозов болезнь Альцгеймера (БА). Другие примеры включают, но не ограничиваются перечисленным, деменцию с тельцами Леви и деменцию при синдроме Дауна. Другие примеры - деменция с тельцами Леви, миозит, спорадический миозит с тельцами включения, наследственное кровоизлияние в мозг с амилоидозом (голландского типа), церебральная амилоидная ангиопатия, Аβ-ассоциированный ангиит.
Введение соединения, содержащего аминокислотную последовательность формулы II, вызывает иммунный ответ на те же самые не укороченные и укороченные и посттрансляционно модифицированные формы Аβ, как и соединения, содержащего аминокислотную последовательность формулы I.
Согласно конкретному предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения, соединение является пептидом, содержащим аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей SHTRLYF(C), HMRLFFN(C), SHQRLWF(C), HQKMIFA(C), HMRMYFE(C), THQRLWF(C) и HQKMIF(C), предпочтительно из группы, включающей SHTRLYF(C), HMRLFFN(C), HQKMIFA(C), HMRMYFE(C), THQRLWF(C) (все из которых способны вызывать in vivo образование антител к пептидам Аβ).
Согласно дополнительному предпочтительному варианту настоящего изобретения, по крайней мере одно соединение является пептидом, содержащим аминокислотную последовательность SHTRLYF(C), SGEYVFH(C), SGQLKFP(C), SGQIWFR(C), SGEIHFN(C), HMRLFFN(C), GELWFP(C), HQKMIFA(C), GEIWFEG(C), GEIYFER(C), THQRLWF(C), GEIRFGS(C), GEIKFDH(C) или GEIQFGA(C), в частности HQKMIFA(C).
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению по крайней мере одного соединения, содержащего аминокислотную последовательность
<mrow><msub><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><msub><mi>X</mi><mn>1</mn></msub></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mi>m</mi></msub><mi>G</mi><msub><mi>X</mi><mn>2</mn></msub><msub><mi>X</mi><mn>3</mn></msub><msub><mi>X</mi><mn>4</mn></msub><mi>F</mi><msub><mi>X</mi><mn>5</mn></msub><msub><mi>X</mi><mn>6</mn></msub><msub><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><msub><mi>X</mi><mn>7</mn></msub></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mi>n</mi></msub><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mtext> </mtext><mrow><mo>(</mo><mrow><mi>Ф</mi><mi>о</mi><mi>р</mi><mi>м</mi><mi>у</mi><mi>л</mi><mi>а</mi><mtext> </mtext><mi>I</mi></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow>
,
где:
1
X - серии (S), аланин (А) или цистеин (С),
2
X - серин (S), треонин (Т), глутаминовая кислота (Е), аспарагиновая кислота (D), глутамин (Q) или метионин (М),
3
Х - изолейцин (I), тирозин (Y), метионин (М) или лейцин (L),
4
Х - лейцин (L), аргинин (R), глутамин (Q), триптофан (W), валин (V), гистидин (Н), тирозин (Y), изолейцин (I), лизин (K), метионин (М) или фенилаланин (F),
5
Х - аналанин (А), фенилаланин (F), гистидин (Н), аспарагин (N), аргинин (R), глутаминовая кислота (Е), изолейцин (I), глутамин (Q), аспарагиновая кислота (D), пролин (Р) или триптофан (W), глицин (G),
6
Х - любой аминокислотный остаток,
7
X - цистеин (С),
m и n - независимо друг от друга 0 или 1,
причем вышеуказанное соединение обладает связывающей способностью антитела, специфичного к эпитопу бета-пептида амилоида (Ар), содержащему аминокислотную последовательность HQKLVF и(или) HQKLVFFAED.
для производства лекарственного средства для профилактики и(или) лечения болезни Альцгеймера.
Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения, соединение содержит пептид, имеющий аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей SGEYVFH(C), SGQLKFP(C), SGQIWFR(C), SGEIHFN(С), GQIWFIS(С), GQIIFQS(C), GQIRFDH(C), GEMWFAL(C), GELQFPP(C), GELWFP(C), GEMQFFI(C), GELYFRA(C), GEIRFAL(C), GMIVFPH(C), GEIWFEG(C), GDLKFPL(C), GQILFPV(C), GELFFPK(C), GQIMFPR(C), GSLFFWP(C), GEILFGM(C), GQLKFPF(C), GTIFFRD(C), GQIKFAQ(C), GTLIFHH(C), GEIRFGS(C), GQIQFPL(C), GEIKFDH(C), GEIQFGA(C), GELFFEK(C), GEIRFEL(C), GEIYFER(C), SGEIYFER(C), AGEIYFER(C) и (C)GEIYFER.
Конкретные предпочтительные соединения настоящего изобретения включают или состоят из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где С-конец вышеуказанного пептида может содержать или не содержать остаток цистеина (указанный скобками) так, что получающееся соединение может быть связано, например, с молекулой-носителем. Однако разумеется, также возможно связать цистеиновый остаток с N-концом вышеуказанного пептида.
Согласно особенно предпочтительному варианту настоящего изобретения, аминокислотную последовательность выбирают из группы, включающей GELWFP(C), GEIWFEG(C), GEIYFER(C), GEILFGM(C), GEIKFDH(C), GEIQFGA(C) (все из которых являются пептидами-конкурентами) и GEIKFDH(C), GEIRFGS(С), SGQLKFP(C), SGQIWFR(C), SGEIHFN(C), GELWFP(C), GEIWFEG(C), GEIYFER(C), GEIQFGA(C), SGEYVFH(C) (все из которых способны вызывать in vivo образование антител к вышеперечисленным пептидам Аβ).
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению по крайней мере одного соединения, содержащего аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, включающей AIPLFVM(C), KLPLFVM(C), QLPLFVL(C) и NDAKIVF(C), для производства лекарственного средства для профилактики и(или) лечения болезни Альцгеймера.
Каждое из соединений настоящего изобретения способно вызывать in vivo образование антител к пептидам - производным Аβ40/42, включая Aβ1-40/42 и укороченные с N-конца формы, такие как Аβ3-40/42, Аβ(рЕ)3-40/42, неизмененный Aβ11-40/42, модифицированные Aβp(E)11-40/42 и Аβ14-40/42 соответственно. Поскольку соединения настоящего изобретения выделяют с помощью антитела к аминокислотным остаткам Аβ от 14 до 19, соединения настоящего изобретения способны вызывать образование антител, которые связываются с укороченными формами пептида Аβ, начиная с аминокислот в положении 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 пептидов Аβ. Таким образом, эти соединения особенно хорошо подходят для лечения и(или) профилактики БА, поскольку введение по крайней мере одного из вышеуказанных соединений ведет к образованию антител, способных распознавать основные формы Аβ, например, Аβ1-40/42, АβрЕ3-40/42 и Аβ3-40/42. Кроме того, эти мимотопы не вызывают перекрестную реактивность с ноэпитопами, присутствующими на sAPP альфа после отщепления от БПА, и вследствие этого не нарушают нормальную передачу сигнала sAPP альфа.
Соединения настоящего изобретения, в частности пептиды настоящего изобретения, могут быть дополнительно модифицированы на N-конце с помощью реакции ацилирования и(или) ацетилирования. Например, особенно предпочтительное соединение содержит аминокислотную последовательность AC-GEIYFER(С).
Согласно настоящему изобретению, термин «мимотоп» означает молекулу, которая имеет конформацию, являющуюся топологическим эквивалентом эпитопа, который она имитирует. Мимотоп связывается с тем же самым антигенсвязывающим участком антитела, с которым специфически связывается нужный антиген. Мимотоп будет вызывать иммунный ответ у хозяина, проявляющийся в реакции на антиген, который он имитирует. Также мимотоп может действовать как конкурент за связывание эпитопа, который он имитирует в анализах торможения in vitro (например, в твердофазном иммуноферментном анализе), где участвуют эпитоп и антитело, связывающее вышеуказанный эпитоп. Однако мимотоп настоящего изобретения необязательно может предотвращать связывание эпитопа или конкурировать за связывание эпитопа, который он имитирует в анализах торможения in vitro, хотя он способен вызывать иммунный ответ при введении млекопитающему.
Согласно использованию в данном документе, термин «эпитоп» означает иммуногенный участок антигена, который распознается молекулой определенного антитела. Как правило, антиген имеет один или несколько эпитопов, каждый из которых способен связывать антитело, способное распознавать определенный эпитоп.
Мимотопы настоящего изобретения можно получать синтетическим путем с помощью методик химического синтеза, известных в данной области техники, либо в виде отдельного пептида, либо как часть другого пептида или полипептида. Или пептидный мимотоп можно получать в микроорганизме, вырабатывающем этот пептидный мимотоп, который затем выделяют и, при необходимости, подвергают дополнительной очистке. Пептидный мимотоп можно получать в таких микроорганизмах, как бактерии, дрожжи или грибы, в клетках эукариотов, таких как клетки млекопитающих или насекомых, или с помощью рекомбинантного вирусного вектора, такого как аденовирус, поксивирус, вирус герпеса, вирус леса Семлики, бакуловирус, бактериофаг, вирус синдбис или вирус сендаи. Пригодные для получения пептидного мимотопа бактерии включают Е. coli, В. subtilis или любые другие бактерии, которые способны вырабатывать пептиды, такие как пептидный мимотоп. Пригодные для получения пептидного мимотопа типы дрожжей включают Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida spp., Pichia pastoris или любые другие дрожжи, способные вырабатывать пептиды. Соответствующие методики известны в данной области техники. Также методики выделения и очистки пептидов, получающихся рекомбинантным путем, хорошо известны в данной области техники и включают, например, гель-фильтрацию, аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию и т.д.
6
Для облегчения выделения пептидного мимотопа может быть изготовлен гибридный полипептид, где пептидный мимотоп трансляционно слит (ковалентно связан) с гетерологичным полипептидом, который обеспечивает выделение с помощью аффинной хроматографии. Типичные гетерологичные полипептиды - His-Tag (например, His: 6 остатков гистидина), GST-Tag (глутатион-S-трансфераза) и т.д. Гибридный полипептид не только облегчает очистку мимотопов, но и предупреждает разрушение полипептида мимотопа в процессе очистки. Если требуется удалить гетерологичный полипептид после очистки, гибридный полипептид может содержат сайт расщепления в месте соединения между пептидным мимотопом и гетерологичным полипептидом. Участок расщепления состоит из аминокислотной последовательности, которая расщепляется ферментом, специфичным для этой аминокислотной последовательности в данном сайте (например, протеазами).
Мимотопы настоящего изобретения также могут быть модифицированы в или вблизи их N- и(или) С-конца так, чтобы с ними в вышеуказанным положениях был связан остаток цистеина. В предпочтительном варианте концевые остатки цистеина (расположенные на N- и С-концах пептида) используются для циклизации пептидов за счет дисульфидной связи.
Мимотопы настоящего изобретения также могут быть использованы в различных анализах и наборах, в частности, в иммунологических анализах и наборах. Таким образом, особенно предпочтительно, чтобы мимотоп мог быть частью другого пептида или полипептида, в частности, фермента, который используется как репортер в иммунологических анализах. Такие ферменты-репортеры включают, например, щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена обыкновенного.
Мимотопы, согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой антигенные полипептиды, которые в своей аминокислотной последовательности отличаются от аминокислотной последовательности Ар или от фрагментов Аβ. В этом отношении мимотопы настоящего изобретения могут включать не только аминокислотные замены одного или нескольких естественных остатков аминокислот, но также одну или несколько аминокислот, не встречающихся в естественных условиях (например, не относящихся к 20 «классическим» аминокислотам), или они могут быть полностью собраны из аминокислот, не встречающихся в естественных условиях. Кроме того, антигены настоящего изобретения, которые вызывают образование антител к и связывающих Aβ1-40/42, AβpE3-40/42, Аβ3-40/42, Aβ11-40/42, AβpE11-40/42 и Аβ14-40/42 (и другие укороченные с N-конца формы Аβ, начиная с положений аминокислотных остатков 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 и 13), могут быть собраны из D- или L-аминокислот или комбинаций DL-аминокислот и, на выбор, их можно подвергнуть дальнейшим модификациями, замыканию в кольцо или получению производных. Подходящие антигены, индуцирующие образование антител, можно получить из пептидных библиотек, имеющихся в продаже. Предпочтительно эти пептиды должны состоять по крайней мере из 7 аминокислот, и предпочтительно их длина должна составлять до 16 аминокислот, предпочтительно до 14 или 20 аминокислот (например, от 5 до 16 аминокислотных остатков). Однако согласно настоящему изобретению более длинные пептиды тоже могут быть успешно использованы в качестве антигенов, индуцирующих образование антител. Кроме того, мимотопы настоящего изобретения также могут быть частью какого-либо полипептида и, следовательно, содержать на N- или С-конце по крайней мере один дополнительный аминокислотный остаток.
Для получения мимотопов настоящего изобретения (например, антигенов, индуцирующих образование антител, описанных в данном документе), конечно же, также пригодны библиотеки фагов и библиотеки пептидов, например, полученных с помощью методик комбинаторной химии или полученных путем высокопроизводительных методик скрининга наиболее меняющихся структур (Display: A Laboratory Manual by Carlos F.Barbas (Editor), et al.; Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec.; 50(6):837-54).
2
Кроме того, согласно настоящему изобретению также могут быть использованы антигены, индуцирующие образование антител к Аβ1-40/42, АβрЕ3-40/42, Aβ3-40/42 и Aβ11-40/42 и основанные на нуклеиновых кислотах («аптамеры»), и их тоже можно найти с помощью большинства различных библиотек (олигонуклеотидов) (например, из 2-180 остатков нуклеиновых кислот) (например, Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5(5) (2002), 690-700; Famulok et al., Ace. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, и т.д.). В антигенах на основе нуклеиновых кислот, индуцирующих образование антител, цепь нуклеиновой кислоты может быть получена, например, из естественных фосфорнодиэфирных соединений, или также из фосфотиоатов или комбинаций или химических вариантов (например, таких как пептид-нуклеиновая кислота), где в качестве нуклеотидов, согласно настоящему изобретению, могут использованы в основном U, Т, А, С, G, Н и mC. 2'-Остатки нуклеотидов, которые могут быть использованы согласно настоящему изобретению, предпочтительно представляют собой Н, ОН, F, Cl, NH, O-метил, O-этил, O-пропил или O-бутил, где нуклеиновые кислоты также могут быть модифицированы различным образом, например, с использованием защитных групп, как они традиционно используются в синтезе олигонуклеотидов. Таким образом, антигены на основе аптамеров, индуцирующие образование антител, также являются предпочтительными антигенами, индуцирующими образование антител в объеме настоящего изобретения.
Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения соединение связывают с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно KLH (гемоцианином фиссуреллы), столбнячным токсином, альбуминсвязывающим белком, бычьим сывороточным альбумином, дендримером (MAP; Biol. Chem. 358: 581), пептидными линкерами (или фланкирующими участками regions), а также веществами-адъювантами, описанными в Singh et al., Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081 (в частности, в таблице 1 этого документа) и O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 (в частности, эндогенные иммуномодулирующие соединения и системы доставки, описанные там), или их смесями. Конъюгированные химические соединения (например, с участием гетерофункциональных соединений, таких как GMBS и, конечно, других, таких как описаны в «Bioconjugate Techniques», Greg T.Hermanson) в данном контексте могут быть выбраны из реакций, известных специалисту в данной области техники. Кроме того, состав вакцин может быть дополнен адъювантом, предпочтительно малорастворимым алюминийсодержащим веществом, в частности, гидроксидом алюминия. Конечно, также могут быть использованы такие адъюванты, как гидрофосфат алюминия MF59, фосфат кальция, цитокины (например, ИЛ-2, ИЛ-12, ГМ-КСФ), сапонины (например, QS21), производные мурамил-1-аланил-d-изоглутамина, олиго-CpG, ЛПС, МПС, полифосфазены, эмульсии (например, эмульсия Фройнда, SAF), липосомы, виросомы, искомы, кохлеаты, полилактид-когликолидные микрочастицы, полоксамерные частицы, вирусоподобные частицы, термолабильный энтеротоксин (ЛТ), холерный токсин (XT), мутантные токсины (например, ., LTK63 и LTR72), микрочастицы и(или) полимеризованные липосомы.
4
Соединение настоящего изобретения предпочтительно связано с носителем или адъювантом через линкер, который выбирают из группы, состоящей из NHS-поли(этиленоксида) (РЭО) (например, NHS-PEO-малеимид).
Вакцину, которая содержит настоящее соединение (мимотоп) и фармацевтически приемлемый носитель, можно вводить любым подходящим путем, например, внутрикожно, внутривенно, интраперитонеально, внутримышечно, интраназально, внутрь, подкожно и т.д., и в любом подходящем инжекторном устройстве (O′Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735). Соединение настоящего изобретения предпочтительно выпускать в фармацевтической форме для внутривенного, подкожного, внутрикожного или внутримышечного введения (см., например, «Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations», Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc. 2004).
Лекарственное средство (вакцина) согласно настоящему изобретению содержит соединение настоящего изобретения в количестве от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно от 10 нг до 1 мг, в частности, от 100 нг до 100 мкг, или же, например, от 100 фмоль до 10 мкмоль, предпочтительно до 10 пмоль до 1 мкмоль, в частности, от 100 пмоль до 100 нмоль. Типично вакцина может также содержать вспомогательные вещества, например, буферные растворы, стабилизаторы и т.д.
Другой аспект настоящего изобретения относится к применению соединения согласно определению выше для лечения и(или) уменьшения симптомов синуклеопатии.
Удивительно, но оказалось, что соединения настоящего изобретения также можно использовать для лечения или уменьшения симптомов, обусловленных синуклеопатиями.
Амилоидозы и синуклеопатии обусловлены накоплением в головном мозге β-амилоида и α-синуклеина соответственно. У некоторых больных имеются клинические и морфологические проявления обоих заболеваний, что предполагает перекрывание механизмов патогенеза. Этих больных относят к страдающим вновь открытым синдромом, называемым деменцией с тельцами Леви или болезнью Паркинсона с деменцией (ДТЛ/БПД). Недавно на модели ДТЛ/БПД у трансгенных животных установлено, что суперэкспрессия и синуклеина, и белка-предшественника амилоида (hAPP) у мышей ведет к развитию когнитивных и двигательных нарушений, сопровождающихся утратой холинергических нейронов и уменьшением количества синаптических пузырьков, образованием обширных амилоидных бляшек и фибриллярных включений в нейронах, вступающих в иммунологическую реакцию с haSYN. Все эти признаки также обнаруживают при синдроме ДТЛ/БПД. Недавно описано, что обе молекулы способны взаимодействовать и образовывать гибридные олигомеры in vitro. Также обнаружено, что суперэкспрессия БПА может усугублять некоторые морфологические эффекты суперэкспрессии α-синуклеина. И наоборот, α-синуклеин способен усиливать секрецию и токсичность бета-пептидов амилоида и, возможно, также усиливать эффекты β-амилоида, что свидетельствует в поддержку перекрывания механизмов патогенеза при нейродегенеративном процессе.
Установлено, что при обеих протеинопатиях прогрессирующее накопление пептидных олигомеров является одним из главных проявлений токсичности, ведущим к различным изменениям, которые типичны либо для синуклеопатии, либо для амилоидозов. Несмотря на механическое сходство, предполагается, что α-синуклеин и Aβ вызывают разные, а также сходящиеся, патологические эффекты в отношении структурной целостности и функции головного мозга. Считается, что синуклеины влияют на моторную функцию гораздо сильнее, чем на когнитивную, в то время как пептиды β-амилоиды вызывают противоположные эффекты. Причина такого расхождения на сегодняшний день не установлена, но оно мешает точному выяснению взаимозависимости и эффектов обеих молекул.
Методика лечения, представленная в настоящем изобретении, описана как иммунотерапия, направленная на Aβ, что приведет к удалению главного внеклеточного амилоида. Такое лечение должно уменьшить изменения, вызванные амилоидом - от образования бляшек до гибели нейронов, - а также нарушения памяти и снижение когнитивных функций. Однако субклеточная локализация синуклеинов указывает, что эти внутриклеточные белки в основном активны на уровне синапсов, в частности, в синаптических пузырьках. Любопытно также, что скопления синуклеина, которые являются типичным морфологическим признаком синуклеопатий, в основном обнаруживаются внутри клеток. Кроме того, полагают, что механизм патогенеза синуклеопатий включает изменения внутри нейронов, начиная с нарушения функции митохондрий, накопления неправильно свернутых убиквитинированных или фосфорилированных белков, а также накопления альфа-синуклеина. Такие изменения в итоге приводят к изменениям функции синапсов, нарушению синаптической передачи и гибели дофаминергических нейронов с классическими проявлениями синуклеопатий. Aβ, наоборот, обнаруживается в основном во внеклеточном пространстве, и бляшки амилоида, а также волокна, протофибриллы и олигомеры бета-амилоида могут оказывать нейротоксическое воздействие при внесении во внеклеточное пространство или в ткань головного мозга. Таким образом, для опытного специалиста будет удивительным, что методика, направленная в основном на внеклеточный амилоид, будет уменьшать симптомы синуклеопатий, таких как болезнь Паркинсона, которые влияют главным образом на внутриклеточные процессы, ведущие к развитию типичных симптомов, описанным ниже. Еще удивительнее, что, как считается в настоящее время, перекрывающиеся эффекты обеих молекул обусловлены прямым взаимодействием двух белков, что должно происходить преимущественно внутри клеток.
Согласно настоящему изобретению, термин «синуклеопатия» включает все нейродегенеративные заболевания, характеризующиеся аномальными скоплениями синуклеина. Несколько нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона (БП), болезнь телец Леви (БТЛ), диффузную болезнь телец Леви (ДБТЛ), деменцию с тельцами Леви (ДТЛ), паркинсонизм с деменцией (ПД), множественную системную атрофию (МСА) и нейродегенерацию с отложением железа в головном мозге I типа (НОЖГМ I типа) объединены под названием синуклеопатии.
«Симптомы синуклеопатии» согласно употреблению в данном документе означают те симптомы синуклеопатии, в частности болезни Паркинсона, которые касаются двигательных и «немоторных» функций у больного, страдающего вышеуказанным заболеванием. «Двигательные симптомы» включают тремор в покое, брадикинезию, ригидность, нарушения равновесия, сгорбленную позу, дистонию, повышенную утомляемость, нарушения мелких движений и их координации, грубые нарушения координации, скудость движений (уменьшенный размах рук), акатизию, расстройства речи, такие как тихий голос или неразборчивая речь, вызванная отсутствием мышечного контроля, утрату выражения лица, или «лицо-маска», микрографию, трудности при глотании, нарушения половой функции, слюнотечение и т.д. «Немоторные» симптомы включают боль, деменцию или спутанность сознания, нарушения сна, запоры, кожные болезни, депрессию, страх или тревожность, нарушения памяти или заторможенность мышления, нарушения мочеиспускания, повышенную утомляемость и ноющие боли, потерю энергии, навязчивое поведение, судороги и т.д.
Согласно предпочтительному варианту настоящего изобретения, синуклеопатию выбирают из группы, включающей болезнь Паркинсона, деменцию с тельцами Леви, множественную системную атрофию и нейродегенерацию с накоплением железа в головном мозге. Особенно предпочтительна болезнь Паркинсона.
Другой аспект настоящего изобретения относится к пептиду, имеющего или состоящего из аминокислотной последовательности, которую выбирают из группы, включающей SHTRLYF(C), SGEYVFH(C), SGQLKFP(C), SGQIWFR(C), SGEIHFN(C), GQIWFIS(С), NDAKIVF(C), GQIIFQS(C), GQIRFDH(C), HMRLFFN(C), GEMWFAL(C), GELQFPP(C), GELWFP(C), SHQRLWF(C), HQKMIFA(C), GEMQFFI(C), GELYFRA(C), GEIRFAL(C), GMIVFPH(C), GEIWFEG(C), GEIYFER(C), AIPLFVM(C), GDLKFPL(C), GQILFPV(C), GELFFPK(C), GQIMFPR(C), HMRMYFE(C), GSLFFWP(C), GEILFGM(C), GQLKFPF(C), KLPLFVM(C), GTIFFRD(C), THQRLWF(C), GQIKFAQ(C), GTLIFHH(C), GEIRFGS(C), GQIQFPL(C), GEIKFDH(C), GEIQFGA(C), QLPLFVL(C), HQKMIF(C), GELFFEK(C), GEIRFEL(C), AcGEIYFER(C), SGEIYFER(C), AGEIYFER(C) and (C)GEIYFER. Как указано путем использования скобок, пептиды настоящего изобретения могут содержать или не содержать остаток цистеина на С- или N-конце. Вследствие этого в объем настоящего изобретения также входят следующие аминокислотные последовательности: SHTRLYF, SGEYVFH, SGQLKFP, SGQIWFR, SGEIHFN, GQIWFIS, NDAKIVF, GQIIFQS, GQIRFDH, HMRLFFN, GEMWFAL, GELQFPP, GELWFP, SHQRLWF, HQKMIFA, GEMQFFI, GELYFRA, GEIRFAL,- GMIVFPH, GEIWFEG, GEIYFER, AIPLFVM, GDLKFPL, GQILFPV, GELFFPK, GQIMFPR, HMRMYFE, GSLFFWP, GEILFGM, GQLKFPF, KLPLFVM, GTIFFRD, THQRLWF, GQIKFAQ, GTLIFHH, GEIRFGS, GQIQFPL, GEIKFDH, GEIQFGA, QLPLFVL, HQKMIF, GELFFEK, GEIRFEL, SGEIYFER и AGEIYFER.
Согласно предпочтительному варианту пептид связан с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно гемоцианином фиссуреллы.
Другой аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической форме, предпочтительно вакцине, содержащей по крайней мере один пептид согласно настоящему изобретению. Вышеуказанная дозированная фармацевтическая форма может использоваться для лечения субъектов, страдающих болезнью Альцгеймера, или профилактики образования бляшек АВ у субъекта для замедления развития болезни Альцгеймера.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими рисунками и примерами, однако не налагающих каких-либо ограничений.
Фиг.1 отображает связывание моноклонального антитела MV-002 со специфическими пептидами и рекомбинантными белками.
Фиг.2 отображает типичные анализы связывания с мимотопами В-амилоида и укороченных с N-конца и(или) посттрансляционно модифицированных фрагментов В-амилоида.
Фиг.3 отображает типичные анализы торможения с мимотопами В-амилоида и укороченных с N-конца и(или) посттрансляционно модифицированных фрагментов В-амилоида.
Фиг.4 отображает примеры характеристик иммунного ответа in vivo, вызванного вакцинацией мимотопами (введенный пептид/посторонний пептид).
Фиг.5 отображает примеры характеристик иммунного ответа in vivo, вызванного вакцинацией мимотопами против фрагментов бета-амилоида и sAPP альфа.
Фиг.6 отображает примеры характеристик иммунного ответа in vivo, вызванного вакцинацией мимотопами против полноразмерного АВ40/42.
Фиг.7 отображает области, покрытые бляшками амилоида. Тд2576 вводили 6-кратно с вакцинами из мимотопов, где в качестве адъюванта использован гидроксид алюминия, путем подкожного введения с месячными интервалами. Контрольные мыши получали только фосфатно-солевой буфер с гидроксидом алюминия. Области, покрытые бляшками амилоида, представлены в виде процента от контрольной группы. Gr1…контрольная группа; Gr2…получавшие р4675.
ПРИМЕРЫ:
Методики
Антитела, использованные для идентификации мимотопов согласно настоящему изобретению, выявляют аминокислотные последовательности - производные человеческого Аβ, но не связываются с полноразмерным человеческим БПА. Выявляющиеся последовательности включают EVHHQKLVFFAED (=оригинальный эпитоп aa11-24 Aβ) и p(E)VHHQKLVF (p4374 = оригинальный эпитоп aa11-19 Aβ с пироглутаматной модификацией на N-конце). Антитело может быть моноклональным или поликлональным антителом или какой-либо частью антитела или его производным; единственное условие - эта молекула антитела должна специфически распознавать по крайней мере один из вышеупомянутых эпитопов (производных человеческого Aβ), но не связываться с полноразмерным человеческим БПА.
Мимотопы идентифицированы и дополнительно исследованы с помощью таких моноклональных антител и библиотек пептидов.
Пример 1: Получение моноклональных антител для специфического распознавания β-амилоида и укороченных с N-конца и(или) посттрансляционно модифицированных фрагментов β-амилоида.
Создано моноклональное антитело, полученное в эксперименте Alz-9 с гибридизацией: Мышей С57/В16 многократно иммунизировали оригинальным эпитопом Aβ HQKLVFC, связанным с гемоцианином фиссуреллы и гидроксидом алюминия в качестве адъюванта. Специфичную для пептида р4377 антителопродуцирующую гибридому выявляли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (плашки для твердофазного иммуноферментного анализа, покрытые пептидом р4377). Человеческий Аβ40/42 (рекомбинантный белок) использовали в качестве положительного контроля: включали гибридомы, распознающие рекомбинантный белок, иммобилизованный на плашках для твердофазного иммуноферментного анализа, так как они специфически связывали и пептид, и полноразмерный Аβ. р1454 (человеческий А6 33-40) использовали в качестве отрицательного контроля. Кроме того, гибридомы исследовали на активность против p4374, р1323 и sAPP-альфа. Только гибридомы, значимо связывающие p4374 и р1323 и не связывающие sAPP-альфа, использовали для дальнейшего получения антител.
Клон гибридомы (MV-002 (внутреннее наименование А115; IgG2b) очищали и анализировали на специфическое выявление р1323, р4374, р4377, р1454, Аβ и sAPP-альфа соответственно. MV-002 распознавало эпитопы р1323 и р4377 и полноразмерный белок Аβ (рекомбинантный белок; получен от Bachem AG, Бубендорф, Швейцария) в твердофазном иммуноферментном анализе. Однако оно не выявляло р1454 в твердофазном иммуноферментном анализе. Кроме того, антитела MV-002 не выявляли sAPP-альфа, но специфически связывались с пептидом р4374, кодируемым пируглутаматным вариантом Aβ11-19.
Пример 2: Фаговое отображение твердофазный иммуноферментный анализ связывания и торможения in vitro
Библиотеки фагового отображения, использованные в примере, включают: Ph.D. 7: New England BioLabs E8102L (библиотека 7-мерных линейных). Фаговое отображение выполнено согласно инструкции производителя (http://www.neb.com/).
После 2 или 3 последовательных циклов пэннинга собирали клоны отдельных фагов и проводили твердофазный иммуноферментный анализ с надосадочной жидкостью фагов на плашках, покрытых антителом, которое использовалось для процедуры пэннинга. Клоны фагов, которые давали положительный результат в этом твердофазном иммуноферментном анализе (сильный сигнал мишени, но отсутствие сигнала неспецифического контроля), подвергали секвенированию. По последовательностям ДНК определяли последовательности пептидов. Эти пептиды синтезировали и исследовали с помощью твердофазного иммуноферментного анализа связывания и торможения. Кроме того, создавали некоторые новые мимотопы путем комбинирования данных о последовательностях мимотопов, обнаруженных при скрининге, для идентификации консенсусной последовательности для вакцинации мимотопами.
1. Анализ связывания in vitro (твердофазный иммуноферментный анализ)
Пептиды, полученные с помощью фагового отображения, а также их варианты связывали с бычьим сывороточным альбумином и фиксировали на плашках для твердофазного иммуноферментного анализа (1 мкмоль; как указано соответствующими значениями), а затем инкубировали с моноклональным антителом, которое использовали для процедуры скрининга для анализа связывающей способности идентифицированных пептидов.
2. Анализ торможения in vitro (твердофазный иммуноферментный анализ)
Различные количества пептидов (концентрации в пределах от 5 мкг до 0,03 мкг; серийные разведения), полученные с помощью фагового отображения, инкубировали с моноклональным антителом, которое использовали в процедуре скрининга. Пептиды, уменьшающие последующее связывание антитела с оригинальным эпитопом, нанесенным на плашки для твердофазного иммуноферментного анализа, считали в этом анализе ингибирующими.
Пример 3: Исследование мимотолов in vivo: анализ игшуногенности и перекрестной реактивности
1. Исследование мимотопов In vivo
Ингибирующие, а также неингибирующие пептиды связывали с гемоцианином фиссуреллы и вводили мышам (мыши дикого типа С57/В16; подкожное введение в бедро) вместе с соответствующим адъювантом (гидроксид алюминия). Животных вакцинировали 3-6 раз с двухнедельными интервалами и сыворотку брали также каждые 2 недели. В каждой пробе сыворотки определяли титры антител к введенным пептидам, а также титры антител к посторонним пептидам. Кроме того, определяли титры антител к рекомбинантному человеческому белку Aβ и к оригинальным пептидам соответственно. Как правило, сыворотки анализировали с использованием реакции с пептидами, связанными с бычьим сывороточным альбумином, и рекомбинантными полноразмерными белками, иммобилизованными на плашках для твердофазного иммуноферментного анализа. Титры определяли, используя специфические антитела к мышиному IgG. Подробные результаты приведены на рисунках 4, 5 и 6 соответственно.
2. Результаты
2.1. Идентификация специфических моноклональных антител (мАТ), направленных против укороченных с N-конца и модифицированных форм Aβ:
На рисунке 1 отображены характеристики моноклонального антитела MV-002 (внутреннее наименование А115; IgG2b), полученного в эксперименте Alz-9, демонстрирующие специфичность к полноразмерному Аβ и фрагментам Ай, укороченного в положениях E11 и Н14 и модифицированного в положениях от Е11 до pE11.
2.2. Скрининг специфическими мАТ, направленными против укороченных с N-конца и модифицированных форм Аβ:
2.2.2. Библиотека фагового отображения Ph.D. 7
2.2.1.1. Скрининг моноклональным антителом к р1323
Сорок семь последовательностей идентифицированы путем скрининга библиотек фагового отображения PhD 7 в этом скрининге:
В таблице 1 суммированы идентифицированные пептиды и их связывающая способность в сравнении с оригинальным эпитопом.
Таблица 1.
Связывание мимотопов с родительским антителом MV-002
Внутренний номер пептида
Идентификационный номер последовательности:
Последовательность
Связывающая способность
р4403
1
SHTKLYFC
1
р4404
2
SGEYVFHC
1
р4413
3
SGQLKFPC
1
р4414
4
SGQIWFRC
1
р4415
5
SGEIHFNC
1
р4666
6
GQIWFISC
1
р4667
7
NDAKIVFC
3
р4668
8
GQIIFQSC
2
р4669
9
GQIRFDHC
3
р4670
10
HMKLFFNC
3
р4671
11
GEMWFALC
3
р4672
12
GELQFPPC
3
Внутренний номер пептида
Идентификационный номер последовательности:
Последовательность
Связывающая способность
р4673
13
GELWFPC
3
р4674
14
SHQKLWFC
3
р4675
15
HQKMIFAC
3
р4676
16
GEMQFFIC
3
р4677
17
GELYFRAC
3
р4678
18
GEIRFALC
3
р4679
19
GMIVFPHC
3
р4680
20
GEIWFEGC
3
р4681
21
GEIYFERC
3
р4682
22
AIPLFVMC
1
р4683
23
GDLKFPLC
3
р4684
24
GQILFPVC
3
р4685
25
GELFFPKC
3
р4686
26
GQIMFPRC
3
р4687
27
HMRMYFEC
3
р4688
28
GSLFFWPC
2
р4689
29
GEILFGMC
3
р4690
30
GQLKFPFC
3
р4691
31
KLPLFVMC
1
р4692
32
GTIFFRDC
1
р4693
33
THQRLWFC
3
р4694
34
GQIKFAQC
3
р4695
35
GTLIFHHC
2
р4696
36
GEIRFGSC
3
р4697
37
GQIQFPLC
3
р4698
38
GEIKFDHC
3
р4699
39
GEIQFGAC
3
р4700
40
QLPLFVLC
1
р4794
41
HQKMIFC
2
р4795
42
GELFFEKC
2
р4796
43
GEIRFELC
2
Внутренний номер пептида
Идентификационный номер последовательности:
Последовательность
Связывающая способность
р4804
44
Ас-GEIYFERC
2
р4805
45
SGEIYFERC
1
р4806
46
AGEIYFERC
1
р4807
47
CGEIYFER
1
Условные обозначения в таблице 1: связывающая способность обозначена одним из следующих шифров: 1:Х означает коэффициент разведения родительского AT. Ac - указывает ацетилированный АА.
шифр связывания
ОД ½ макс. 1:Х
0
связывание отсутствует
:0
1
слабое связывание
:<40000
2
среднее связывание
:40000-320000
3
сильное связывание
:>320000
2.3. Исследование in vitro характеристик мимотопов, идентифицированных при скрининге библиотек фагового отображения с помощью моноклональных антител к укороченным с N-конца и модифицированным формам Аβ:
На рисунках 2 и 3 представлены репрезентативные примеры анализов связывания и торможения, использованных для исследования характеристик мимотопов in vitro. Полученные данные суммированы в таблицах 1 и 2 соответственно.
Мимотопы MV-002: Из 47 последовательностей представлены 11 последовательностей, тормозящих связывание моноклонального антитела MV-002 в экспериментах с конкурированием in vitro. Идентифицированы еще 36 последовательности, которые не тормозили связывание моноклонального антитела в экспериментах с конкурированием связыванием in vitro, но сохраняли связывающую способность родительского антитела (таблица С). Важно, как отображено на фиг.4-6, что способность конкурировать с оригинальным эпитопом за связывание с родительским антителом in vitro не являлась обязательным условием индукции специфического иммунного ответа с перекрестной реактивностью со специфическими пептидами in vivo. Таким образом, ингибирующие и неингибирующие пептиды можно использовать для индукции иммунных ответов, выявляющих пептиды in vivo (подробнее см.: фиг.4-6), что может приводить к выведению пептидов амилоида из головного мозга.
Таблица 2.
Мимотопы, описанные в настоящем изобретении, давшие положительные результаты в анализах торможения; мимотопы MV-002
Внутренний номер пептида
Идентификационный номер последовательности:
Последовательность
Ингибирующая способность
р4667
7
NDAKIVFC
1
р4670
10
HMRLFFNC
1
р4673
13
GELWFPC
1
р4674
14
SHQRLWFC
1
р4675
15
HQKMIFAC
2
р4680
20
GEIWFEGC
2
р4681
21
GEIYFERC
2
р4689
29
GEILFGMC
1
р4698
38
GEIKFDHC
2
р4699
39
GEIQFGAC
1
р4794
41
HQKMIFC
1
Условные обозначения в таблице 2: ингибирующая способность обозначена одним из следующих шифров:
Слабое торможение означает, что для уменьшения связывания AT требуется больше пептида, чем оригинального эпитопа; сильное торможение означает, что для уменьшения связывания AT требуются одинаковые количества пептидов - мимотопа и оригинального пептида. Мимотопы сравнивают с оригинальным пептидом в качестве стандарта. Для расчета конкурентной способности в сравнении с оригинальным пептидом использовано ОД при 5 мкг пептида, использованного в данном анализе.
шифр конкурентной способности
0
отсутствие торможения (ОД пептида больше чем в 4,6 раз, чем у оригинального пептида)
1
Слабее, чем у оригинального пептида (ОД пептида в 4,6 раз меньше, чем у оригинального пептида)
2
Сильное торможение (как у оригинального пептида; ОД пептида в 2,3 раза меньше, чем у оригинального пептида)
2.4. Исследование in vivo характеристик мимотопов, идентифицированных при скрининге библиотек фагового отображения с использованием моноклонального антитела к амилоиду-бета:
Самок мышей С57/bl6, 5-6 на группу, подкожно иммунизировали 30 мкг пептида, связанного с гемоцианином фиссуреллы. В контрольных группах соответственно вводили оригинальный эпитоп, связанный с гемоцианином фиссуреллы. В качестве адъюванта применяли гидроксид алюминия (всегда 1 мг на одну мышь). Все введенные пептиды проявили способность специфично связываться с моноклональными антителами, хотя некоторые пептиды не тормозили связывание оригинального эпитопа с родительским антителом in vitro (в анализах торможения in vitro). Для измерения титра антител проводили твердофазный иммуноферментный анализ с сыворотками мышей после каждой вакцинации с двухнедельными интервалами (см. Фиг.6 и 7 соответственно). На всех рисунках титры рассчитывали как ОД макс/2. Лунки на плашке для твердофазного иммуноферментного анализа покрывали мимотопом, связанным с бычьим сывороточным альбумином, и посторонним пептидом, связанным с бычьим сывороточным альбумином (отрицательный контроль). Положительный контроль проводили с помощью реакции родительского антитела с соответствующим конъюгатом мимотопа с бычьим сывороточным альбумином. Детекцию выполняли с использованием IgG к мышиным антителам. Кроме того, рекомбинантные белки иммобилизовывали на плашках для твердофазного иммуноферментного анализа и проводили соответствующие реакции с сыворотками. На Фиг.4, 5 и 6 отображены репрезентативные примеры анализов, использованных для исследования характеристик мимотопов in vivo. Представленные результаты получены в отношении пептидов, активных в анализах торможения in vitro, таких как р4670, р4675, р4680 и р4681, и пептида р4403, не обладающего ингибирующей активностью.
На рисунке 4 приведены примеры исследования характеристик иммунного ответа in vivo, вызванного вакцинацией мимотопами, путем анализа иммунного ответа против введенного пептида и постороннего пептида, содержащего отличающуюся последовательность. В представленных примерах эпитоп р4377 и мимотопы р4670, р4675, р4680, р4681 и р4403 вызывают иммунный ответ против введенных пептидов, но не вызывают соответствующий иммунный ответ против отличающейся последовательности (р1454).
На рисунке 5 приведены примеры исследования характеристик иммунного ответа in vivo, вызванного вакцинацией мимотопами, направленного на соответствующий оригинальный эпитоп родительского антитела (р4377), а также пептидов - производных других форм укороченных форм Аβ (р1323 и р4374) и против sAPP альфа.
р4377 и мимотопы р4670, р4675, р4680, р4681 и р4403 вызывали выявляющиеся иммунные ответы на оригинальный эпитоп р4377. Схожее явление можно было выявить, анализируя перекрестную реактивность с модифицированной формой, такой как представленный р4374. Любопытно, что оригинальный эпитоп и вакцины с мимотопами вызывали значимые титры антител к модифицированной форме р4374 оригинального эпитопа. Удивительно, что мимотопы оказались способны вызывать, но необязательно вызывали более эффективный иммунной ответ против р1323, что указывало на возможность вызывать более широкую иммунную реактивность в сравнении с оригинальным фрагментом Aβ. Кроме того, не выявлялась активность против sAPP альфа.
Рисунок 6 отображает примеры исследования характеристик иммунного ответа на полноразмерный Аβ in vivo, вызванного вакцинацией мимотопами. Удивительно, но мимотопы, отобранные с использованием MV-002, вызывали перекрестную реактивность не только с укороченными или модифицированными короткими эпитопами, использованными для получения антител, но также и с полноразмерными, немодифицированными формами Аβ с той же эффективностью, что и оригинальная последовательность, и даже эффективнее, чем р4377.
Интересно, что конкурирующие и неконкурирующие пептиды оказались способны вызывать схожие иммунные ответы, проявляющиеся в специфическом взаимодействии с пептидами, содержащими оригинальные последовательности Aβ. Таким образом, мимотопы настоящего изобретения представляют собой оптимизированные новые кандидаты для применения в вакцинах против более широкого спектра естественных форм пептидов Aβ, таких как обнаруживают в головном мозге больных с БА. Эти формы включают, но не ограничиваются перечисленным, Аβ1-40/42 и укороченные с N-конца формы, такие как Аβ3-40/42 и Аβ(рЕ) 3-40/42, а также немодифицированный Aβ11-40/42, модифицированный Aβp(E)11-40/42 и Аβ14-40/42 соответственно. Важно, что представленные мимотопы также не вызывали перекрестную реактивность к неоэпитопами, присутствующими на sAPP альфа после отщепления от БПА, и вследствие этого не нарушают нормальную передачу сигнала sAPP альфа (подробнее см. рисунок 5).
Таблица 3.
Пептиды - не мимотопы
Внутренний номер пептида:
Идентификационный номер последовательности:
Последовательность
р1253
48
DAEFRHDSGYC
Внутренний номер пептида:
Идентификационный номер последовательности:
Последовательность
р1323
49
CHQKLVFFAED
р4374
50
p(E)VHHQKLVFC
р4377
51
EVHHQKLVFC
р1454
52
CGLMVGGVV
Aβ1-40
53
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA IIGLMVGGVV; производное человеческого БПА (gi:112927)
Aβ1-42
54
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA IIGLMVGGVVIA; производное человеческого БПА (gi:112927)
sAPP альфа
55
Альфа-секретаза давала продукт расщепления - производное человеческого БПА (gi:112927)
В таблице 4 приведены дополнительные примеры иммунного ответа на полноразмерный Аβ, вызванного вакцинацией мимотопами, с использованием мимотопов - производных MV-002. Все пептиды, перечисленные в таблице 4, вызывают специфические иммунологические реакции с полноразмерными и(или) укороченными и модифицированными формами АВ или их фрагментами.
Таблица 4.
Исследование характеристик мимотопов in vivo: MV-002
Внутренний номер пептида
Идентификационный номер последовательности:
Выявление АВ/укороченных/модифицированных форм
р4403
1
+
р4404
2
+
р4413
3
+
р4414
4
+
р4415
5
+
р4670
10
+
р4673
13
+
р4675
15
+
р4680
20
+
р4681
21
+
р4693
33
+
р4696
36
+
р4698
38
+
р4699
39
+
2.5: Исследование характеристик мимотопов in vivo в отношении эффективности, проявляющейся уменьшением признаков модели болезни Альцгеймера, у трансгенных животных
Для изучения доклинической эффективности вакцин с мимотопами использовали модель БА у мышей Tg2576. У этой линии трансгенных мышей экспрессируется человеческий БПА, несущий двойную шведскую мутацию 670/671 в положении аа под контролем промотора белка приона хомячка (БПр), что ведет к суперэкспрессии этого белка. В настоящее время это самые широко применяющиеся модели БА в научных исследованиях. В модели Tg2576 воспроизводятся различные основные морфологические признаки БА, включая характерное отложение бляшек амилоида и астроцитоз. Как и все другие модельные системы БА, существующие на сегодняшний день, эта модель не отражает все кардинальные нейропатологические признаки БА.
Чтобы оценить, может ли лечение мимотопами предупреждать накопление Ай в головном мозге, мышам Tg2576 вводили подкожно 6 раз с месячными интервалами конъюгаты пептид-гемоцианин фиссуреллы, адсорбированный на гидроксиде алюминия (адъювант) или фосфатно-солевой буфер, адсорбированный на гидроксиде алюминия (обозначенный как ФСБ или контроль). В срок до 8 недель после последней иммунизации животных забивали, извлекали головной мозг и анализировали массу АВ (патологические изменения, схожие с БА). Мышей забивали под глубокой анестезией. Затем извлекали головной мозг, фиксировали в 4% параформальдегиде и обезвоживали пошагово в серии растворов этилового спирта, а затем инкубировали в ксилене и заливали парафином. Головной мозг, залитый парафином, разрезали на срезы толщиной 7 мкм с помощью микротома, и срезы помещали на предметные стекла.
В качестве методики оценки патологии, схожей с БА, у животных Tg2576 мы анализировали относительную площадь, занятую отложениями амилоида в головном мозге леченых животных. Этот анализ проводили с помощью программы автоматического распознавания областей. Для идентификации бляшек срезы окрашивали моноклональным антителом (мАТ) ЗА5 (специфичным к Аβ40/42). Животных, леченых мимотопами, сравнивали с контрольными животными. Всех животных забивали в возрасте 13,5-14 месяцев. Для анализа выбирали 3 стекла на одно животное с препаратами коры головного мозга гиппокампа, окрашенными мАТ 3А5, а затем документировали с использованием системы Mirax (Zeiss). Для расчета площади, занятой бляшками амилоида, мы анализировали до четырех отдельных срезов на один препарат, и срезы, имеющие в тканях артефакты и аномальную интенсивность окрашивания, исключали после просмотра полученных изображений.
В отношении мимотопов MV002 мы проводили анализ площади, используя один типичный кандидат: Анализ выполняли после многократной вакцинации вакцинами с конъюгатом пептид-гемоцианин фиссуреллы. В контрольной группе выявлена средняя занятая относительная площадь 0,35%, а у животных, леченых мимотопами, 0,24%. Это соответствует уменьшению на 31% во 2-й группе, леченой мимотопами.
Таким образом, эти данные четко указывают на благоприятный эффект вакцинации вакцинами с мимотопами при лечении модели БА у трансгенных животных.