Способ подготовки свежего хлорофиллсодержащего лекарственного растительного сырья для определения подлинности микроскопическим исследованием
METHOD FOR PREPARATION OF FRESH CHLOROPHYLL-CONTAINING HERBAL RAW MATERIAL FOR AUTHENTICITY DETERMINATION BY MICROSCOPIC EXAMINATION

Изобретение относится к фармации, а именно к фармакогнозии, и может быть использовано для подготовки свежего лекарственного растительного сырья (ЛРС), богатого хлорофиллом, к микроскопическому анализу и определению его подлинности при проведении фармакогностического анализа микроскопированием с помощью светового микроскопа.
В настоящее время, согласно действующей нормативной документации (НД) [ОФС.1.5.3.0003.15 Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов.-22 с], пробоподготовка к микроскопированию высушенного ЛРС, содержащего хлорофилл (трава, листья) проводится двумя способами. Первый способ заключается в кипячении ЛРС в 5% водном растворе натрия гидроксида с последующим промыванием объектов дистиллированной водой. Второй способ подготовки объектов к микроскопированию осуществляется с помощью кипячения анализируемого ЛРС в растворе хлоралгидрата, разбавленного водой (1:1), в течение 5-10 мин (до просветления) [ОФС.1.5.3.0003.15 Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов.-22 с]. Для микроскопирования плотных кожистых листьев, а также объектов с грубой гистологической структурой (коры, корни) используют замачивание в течение 3-5 дней в растворе состава спирт этиловый - глицерин - вода (1:1:1). При обработке свежего сырья подобным способом, удаления хлорофилла не происходит, объект приобретает серовато-коричневый оттенок.
Пробоподготовка свежего растительного сырья в НД не описана [ОФС.1.5.3.0003.15 Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья и лекарственных растительных препаратов.-22 с], однако, согласно [Прозина М.Н. Ботаническая микротехника/ М.Н. Прозина.-М: Высшая школа, 1960.-207 с.], перед микроскопированием, в ботанической практике, для восстановления структуры клеток (при потере объектом влаги и появлении увядания) используют намачивание водой очищенной с последующей препарацией тканей свежих объектов. Данный способ не позволяет освободить объект от хлорофилла, что затрудняет анализ.
В качестве недостатков, описанных выше способов пробоподготовки высушенного ЛРС, выступают воздействие температуры и агрессивной жидкости на растительный объект, что влечет за собой повреждение некоторых диагностически - значимых структур, а также, биологически активные вещества (БАВ), присутствующие в растении, могут взаимодействовать с натрия гидроксидом с образованием окрашенных продуктов (черного, красновато-бурого, коричневого цвета), мешающих проведению анализа, кроме того, объект, подготовленный с помощью кипячения в щелочи должен быть проанализирован в течение ограниченного времени (максимум суток), ввиду агрессивного ее воздействия на анатомические структуры. При выполнении поперечных срезов для анализа стеблей, черешков и жилок листа, объект после обработки кипячением в растворе щелочи теряет форму, становится слишком мягким, что влечет за собой не возможность анализа структур на поперечном срезе. При кипячении раствора натрия гидроксида возможно раздражение верхних дыхательных путей, а при отравлении хлоралгидратом наблюдается угнетение возбудимости нервных клеток.
Близким аналогом предлагаемого способа является способ фиксации и консервирования различных морфологических органов растений с целью их сохранения и последующей подготовки к микроскопическому анализу [Прозина М.Н. Ботаническая микротехника/ М.Н. Прозина.-М: Высшая школа, 1960.-207 с.]. В аналоге авторы помещают для долгосрочного хранения заранее фиксированный материал в 70% спирт этиловый, а также используют 96% этанол как один из компонентов фиксирующих жидкостей.
В качестве прототипа выступает способ подготовки хвои для микроскопического исследования устьиц, относящийся к вопросам общей ботаники, а именно физиологии растений [Пат. 519165 СССР Способ подготовки хвои для микроскопического исследования устьиц / Н.Е. Косиченко. - №2080968/15; заявл. 26.11.1974; опубл. 11.08.1976, Бюл. №24. - 2 с.]. Метод [Пат. 519165 СССР Способ подготовки хвои для микроскопического исследования устьиц / Н.Е. Косиченко. - №2080968/15; заявл. 26.11.1974; опубл. 11.08.1976, Бюл. №24. - 2 с.] включает удаление экстракцией спиртом этиловым в концентрации 96% из целых кусочков хвои хлорофилла, окрашивание в спиртовом растворе акридинового оранжевого в концентрации 1:200 и микроскопирование с изучением устьичного аппарата с помощью люминесцентного микроскопа в отраженном фиолетовом свете.
Недостатком данной методики [Пат. 519165 СССР Способ подготовки хвои для микроскопического исследования устьиц / Н.Е. Косиченко. - №2080968/15; заявл. 26.11.1974; опубл. 11.08.1976, Бюл. №24. - 2 с.] является ограниченность области применения в пределах общей ботаники и физиологии растения, так как исследованию в данном случае подлежит только одна анатомическая структура - устьица, в то время как другие (трихомы, кристаллические включения, выделительные органы (железки, вместилища)), имеющие более важное значение для идентификации объекта, остаются без внимания. Это делает прототип бесполезным для контроля качества растительного сырья в фармакогнозии. В отличие от описанной методики, предлагаемые изменения направлены на экспрессное определение подлинности объекта при проведении фармацевтического анализа без многостадийной пробоподготовки и дополнительного окрашивания объекта с использованием обычного светового микроскопа, преимуществом которого, кроме экономической составляющей, является простота использования и отсутствие необходимости применения труднодоступных реагентов. В основе методики, взятой за прототип, лежит узконаправленный (на исследование устьичного аппарата) и многостадийный процесс пробоподготовки.
Задача настоящего изобретения заключается в разработке неразрушающего, экспрессного, технологически выгодного способа пробоподготовки свежего ЛРС богатого хлорофиллом для определения подлинности с помощью микроскопического анализа без воздействия агрессивных условий с сохранением всех диагностически значимых структур в нативном виде, что может быть использовано как в фармацевтической, так и косметической, и пищевой промышленности.
Технический результат заключается в повышении точности результатов микроскопического исследования и возможности определения подлинности свежих хлорофиллсодержащих растительных объектов (листья, трава) с помощью микроскопического анализа после их полного обесцвечивания без действия агрессивных условий (высокая температура, агрессивные жидкости) и без использования многостадийного и узконаправленного процесса пробоподготовки, специфического оборудования (люминисцентный микроскоп) и труднодоступного реагента (акридиновый оранжевый), при сохранении диагностически значимых анатомических структур в нативном виде, с одновременным консервированием объекта.
Область применения предлагаемого способа обусловлена тем, что для анализа качества свежезаготовленного ЛРС и определения его подлинности при проведении фармакогностического анализа на настоящий момент нет способа его пробоподготовки, а использование кипячения в щелочи, применимо исключительно для высушенных объектов.
Технический результат достигается тем, что в способе подготовки свежего хлорофиллсодержащего лекарственного растительного сырья к микроскопироскопическому исследованию, включающем экстракцию хлорофилла этанолом с концентрацией 96%, согласно изобретению, обесцвечивание лекарственного растительного сырья проводят в герметично закрытой таре, так, чтобы фрагменты растений были скрыты под слоем этанола («до зеркала»), не большие листья, цветки берутся в цельном виде, крупные части растения частично измельчаются руками или ножницами до размера, необходимого исследователю, экстракция хлорофилла проводится в течение 5-12 часов, помещение поперечного среза черешков, стеблей, плотных кожистых листьев или препарата листа (цветка, раструба) с поверхности анализируемого объекта в каплю хлоралгидрата на предметном стекле, микроскопирование с использованием светового микроскопа.
Изобретение проиллюстрировано микрофотографиями, на которых представлены результаты микроскопического анализа некоторых морфологических групп свежего ЛРС, богатого хлорофиллом (фиг. 1-3).
На фиг. 1 приведены микрофотографии фрагмента раструба горца перечного: А - после использования спирта этилового 96%, Б - после кипячения в 5% растворе щелочи.
На фиг. 2 приведены микрофотографии фрагмента листовой пластинки горца малого: А - после использования спирта этилового 96%, Б - после кипячения в 5% растворе щелочи
На фиг. 3. приведены микрофотографии фрагмента поперечного среза черешка (А) и главной жилки (Б) горца земноводного после обработки спиртом этиловым 96%, В - давленный препарат после кипячения в 5% растворе щелочи.
Способ подготовки свежего ЛРС, содержащего хлорофилл, к микроскопическому исследованию реализуется следующим образом.
Необходимое количество свежего ЛРС помещается в герметично закрывающуюся тару, заливается 96% спиртом этиловым так, чтобы фрагменты растений были скрыты под слоем жидкости («до зеркала»), количество экстрагента зависит от формы и размера исследуемых объектов. Настаивание проводится в течение 5-12 часов до полного экстрагирования хлорофилла с обесцвечиванием сырья, до момента, когда части растений становятся прозрачными. При этом, тонкие, свежесобранные листья достаточно выдержать в спирте в течение 5 часов, стебли, черешки и плотные листья не менее 5 часов. Не большие листья, цветки берутся в цельном виде, крупные части растений, такие как стебли, длинные листья необходимо частично измельчить. После обесцвечивания ЛРС извлекается из спиртового раствора и подвергается микроскопированию с помощью светового микроскопа. В случае исследования тонких листьев и цветков, готовится препарат с поверхности, то есть объект помещается на предметное стекло в каплю хлоралгидрата, накрывается покровным стеклом и просматривается в проходящем свете. При изучении плотных, кожистых листьев и стеблей, после извлечения объекта из спиртового раствора, делают поперечные срезы, которые также помещаются в каплю хлоралгидрата на предметном стекле, сверху накрываются покровным стеклом и микроскопируются.
Предлагаемый способ позволяет установить основные диагностически значимые признаки ЛРС при микроскопировании в нативном виде без воздействия агрессивных факторов, температуры на БАВ и анатомические структуры для определения подлинности ЛРС в фармакогностическом анализе. При этом, данная методика проста в исполнении, экспрессна, технологически и экономически выгодна и позволяет в удобное для аналитика время осуществлять детектирование за счет консервирования образца.
Способ иллюстрируется следующими конкретными примерами.
Пример 1. Свежезаготовленная трава горца перечного помещается в герметично закрывающуюся тару, заливается 96% спиртом этиловым так, чтобы фрагменты растений были скрыты под слоем жидкости. Настаивание проводится в течение 5 часов до момента обесцвечивания сырья. После подобной подготовки необходимая часть ЛРС извлекается из спиртового раствора, помещается в каплю хлоралгидрата и подвергаются микроскопированию с помощью светового микроскопа.
Пример 2. Свежезаготовленная трава горца малого помещается в герметично закрывающуюся тару, заливается 96% спиртом этиловым так, чтобы фрагменты растений были скрыты под слоем жидкости. Настаивание проводится в течение 5 часов до момента обесцвечивания сырья. После подобной подготовки необходимая часть ЛРС извлекается из спиртового раствора, помещается в каплю хлоралгидрата и подвергаются микроскопированию с помощью светового микроскопа.
Пример 3. Свежезаготовленная трава горца земноводного помещается в герметично закрывающуюся тару, заливается 96% спиртом этиловым так, чтобы фрагменты растений были скрыты под слоем жидкости. Настаивание проводится в течение 12 часов до момента обесцвечивания сырья и приобретения хрупкости стеблей, черешков и жилок, после чего проводится смена растворителя на чистый. После подобной подготовки необходимая часть ЛРС извлекается из спиртового раствора, делаются поперечные срезы в медиальной части стебля, черешка или главной жилки и далее объекты подвергаются микроскопированию с помощью светового микроскопа.