ПРОТИВОМИКРОБНЫЙ СОСТАВ
ANTIMICROBIAL COMPOSITION

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Синергический противомикробный состав, содержащий смесь органических кислот, α,β-ненасыщенных алифатических альдегидов и противомикробных терпенов.
ПРЕДПОСЫЛКИ
В недавнем исследовании, проведенном благотворительным фондом Пью Джорджтаунского университета, предположили, что вызванные продуктами питания болезни ежегодно обходятся Соединенным Штатам Америки в 152 миллиарда долларов по расходам, связанным со здравоохранением. Центрами по контролю и профилактике заболеваний США установлено, что 76 миллионов людей в США ежегодно заболевают болезнью, вызванной продуктами питания, а 5000 - умирают (Thomson Reuters 2010, 3/10/2010).
Существует потребность поиска большего количества природных и/или органических противомикробных средств, которая в результате привела к большому количеству исследований и к увеличившимся затратам на сырьевые материалы в связи с низкой коммерческой доступностью этих новых природных/органических продуктов.
В растениях было обнаружено несколько новых противомикробных средств. Авторы обнаружили, что при повреждении травянистых или других растений путем срезания, пикировки или подвергания воздействию патогенов активируется липоксигеназный путь, что приводит к выработке соединений, проявляющих противомикробную активность. Липоксигеназы являются широко распространенными в природе ферментами, которые катализируют окисление ненасыщенных жирных кислот, образуя гидропероксиды жирных кислот, действующие в качестве субстратов для синтеза соединений, имеющих важные функции в защите растений (Kishimoto, K.; Matsui, K.; Ozawa, R.; Takabayashi, J. “Direct fungicidal activities of C6-aldehydes are important constituents for defense responses in Arabidopsis against Botrytis cinerea.” Phytochemistry 2008, v. 69, 2127-2132; Gardini, F.; Lanciotti, R.; Guerzoni, M.E. “Effect of trans-2-hexenal on the growth of Aspergillus flavus in relation to its concentration, temperature and water activity.” Letters in App. Microbiology 2001, v. 33, 50-55).
Альдегиды представлены общей формулой HCHO, где R может быть водородом или алифатической, ароматической или гетероциклической группой. α,β-Ненасыщенные алифатические альдегиды, представляющие существенную промышленную важность, состоят из трех-десяти структурных единиц углерода. Они умеренно растворимы в воде, и растворимость снижается по мере увеличения молекулярной массы.
3
12
α,β-Ненасыщенные алифатические альдегиды включают пропеналь, транс-2-бутеналь, 2-метил-2-бутеналь, 2-метил-(E)-2-бутеналь, 2-пентеналь, транс-2-гексеналь, транс-2-гексен-1-ол, 2-метил-2-пентаналь, 2-изопропилпропеналь, 2-этил-2-бутеналь, 2-этил-2-гексеналь, (Z)-3-гексеналь, 3,7-диметил-6-октеналь, 3,7-диметил-2,6-октадиеналь, (2E)-3,7-диметил-2-6-октадиеналь, (2Z)-3,7-диметил-2,6-октадиеналь, транс-2-ноненаль, (2E, 6Z)-нонадиеналь, 10-ундеканаль, 2-додеценаль и другие. Настоящее изобретение включает α,β-ненасыщенные алифатические альдегиды C-C.
Разрушение жиров и фосфолипидов приводит к образованию трех шестиуглеродных и девятиуглеродных альдегидов, среди которых (2E, 6Z)-нонадиеналь, транс-2-нонаеналь и транс-2-гексеналь. Эти соединения вырабатываются под воздействием ферментов путем комбинированного действия двух различных ферментов липоксигеназного (LOX) пути растений. В первой реакции LOX катализирует оксигенацию полиненасыщенных жирных кислот, таких как линолевая и линоленовая кислоты, с последующим образованием 9- или 13-гидропероксидов. Эти соединения являются очень нестабильными и расщепляются на альдегиды и оксокислоты ферментом гидропероксидлиазой (HPL). Транс-2-нонаеналь и (2E, 6Z)-нонадиеналь получают, исходя из 9-гидропероксипроизводных, тогда как гексаналь и транс-2-гексеналь получают из 13-гидропероксипроизводных. Во второй реакции эти альдегиды можно превратить в соответствующие спирты путем воздействия алкогольдегидрогеназы (Hubert, J.; Munzbergova, Z.; Santino, A. “Plant volatile aldehydes as natural insecticides against stored-product beetles.” Pest Manag. Sci. 2008, v. 64, 57-64).
6
10
Летучее соединение, применяемое в настоящем изобретении, представляет собой транс-2-гексеналь, который является шестиуглеродным альдегидом с двойной связью, CHO и молекулярным весом, равным 98,14. Природный или синтетический транс-2-гексеналь, также известный как альдегид листьев, рассматривают как природное ароматизирующее вещество согласно директиве совета Европейского Союза 88/388/EEC и Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) США 21CFR101.22.
Транс-2-гексеналь присутствует во многих съедобных растениях, таких как яблоня, груша, виноград, земляника, киви, томат, маслина и т.д. Применение растений и растительных экстрактов было успешным в исследованиях по изысканию новых противомикробных средств. Например, анакардия была эффективной против Helicobacter pylori и S. cholerasuis (50-100 мкг/мл). Как было обнаружено, двумя главными компонентами являлись анакардиновая кислота и транс-2-гексеналь. Минимальная ингибирующая и минимальная биоцидная активности транс-2-гексеналя были определены, как составляющие 400 и 800 мкг/мл соответственно (Kubo, J.; Lee, J. R.; Kubo, I. “Anti-Helicobacter pylori Agents from the Cashew Apple.” J. Agric. Food Chem. 1999, v. 47, 533-537; Kubo, I. and K. Fujita, “Naturally Occuring Anti-Salmonella Agents”. J. Agric. Food Chem. 2001, v. 49, 5750-5754). Kim и Shin обнаружили, что транс-2-гексеналь (247 мг/л) был эффективным против B. cereus, S. typhimurium, V. parahaemolyticus, L. monocytogenes, S. aureus и E.coli O157:H7 (Kim, Y. S.; Shin, D. H. “Volatile Constituents from the Leaves of Callicarpa japonica Thunb. and Their Antibacterial Activities.” J. Agric. Food Chem. 2004, v. 52, 781-787). Nakamura и Hatanaka (“Green-leaf-derived C6-aroma compounds with potent antibacterial action that act on both gram-negative and gram-positive bacteria.” J. Agric. Food Chem. 2002, v. 50 no.26, 7639-7644) продемонстрировали, что (3E)-гексеналь был эффективным в контролировании Staphylococcus aureus, E.coli и Salmonella typhimurium на уровне 3-30 мкг/мл. Транс-2-гексеналь полностью ингибировал пролиферацию патоваров как P. syringae (570 мкг/л воздуха), так и E.coli (930 микрограммов/л воздуха) (Deng, W.; Hamilton-Kemp, T.; Nielsen, M.; Anderson, R.; Collins, G.; Hilderbrand, D. “Effects of Six-Carbon Aldehydes and Alcohols on Bacterial Proliferation.” J. Agric. Food Chem. 1993, v. 41, 506-510). Наблюдали, что транс-2-гексеналь при 250 мкг/мл был эффективным в ингибировании роста мицелия Phoma (Saniewska, S. and M. Saniewski, 2007. “The effect of trans-2-hexenal and trans-2-nonaenal on the mycelium growth of Phoma narcissi in vitro, Rocz. AR. Pozn. CCCLXXXIII, Ogrodn. V. 41,189-193”). В исследовании по контролю плесени на фруктах было обнаружено, что транс-2-гексеналь не был фитотоксичным по отношению к абрикосу, но был фитотоксичным по отношению к персикам и нектаринам при 40 мкл/л (Neri, F., M. Mari, S. Brigati and P. Bertolini, 2007, “Fungicidal activity of plant volatile compounds for controlling Monolinia laxa in stone fruit,” Plant Disease v. 91, no.1, 30-35). Транс-2-гексеналь (12,5 мкл/л) был эффективным в контролировании Penicillium expansum, вызывающего голубую плесень (Neri, F.; Mari, M.; Menniti, A.; Brigati, S.; Bertolini, P. “Control of Penicillium expansum in pears и apples by trans-2-hexenal vapours.” Postharvest Biol. and Tech. 2006, v. 41, 101-108. Neri, F.; Mari, M.; Menniti, A. M.; Brigati, S. “Activity of trans-2-hexenal against Penicillium expansum in 'Conference' pears.” J. Appl. Micrbiol. 2006, v. 100, 1186-1193). Hamilton-Kemp и соавт. (J. Agric. Food Chem. 1991, v. 39, no.5, 952-956) предположили, что пары транс-2-гексеналя ингибировали прорастание спор Botrytis и пыльцы яблони.
В заявке на патент США №2007/0087094 предложено применение по меньшей мере двух микробиоцидно активных признанных безопасными (GRAS) соединений в комбинации с менее 50% спирта (изопропанола или изопропанола/этанола) в качестве микробицида. Транс-2-гексеналь может быть одним из GRAS соединений. Также Archbold и соавт. наблюдали, что применение транс-2-гексеналя при 0,86 или 1,71 ммоль (100 или 200 микролитров чистого соединения на контейнер на 1,1 л соответственно) в течение 2 недель в отношении послеуборочного окуривания бессемянного столового винограда показывало перспективу в отношении контроля плесени (Archbold, D.; Hamilton-Kemp, T.; Clements, A.; Collins, R. “Fumigating 'Crimson Seedless' Table Grapes with (E)-2-Hexenal Reduces Mold during Long-term Postharvest Storage.” HortScience. 1999, v. 34, no. 4, 705-707).
5
o
В патенте США № 5698599 предложен способ ингибирования выработки микотоксинов в пищевых продуктах путем обработки транс-2-гексеналем. Транс-2-гексеналь полностью ингибировал рост A. flavus, P. notatum, A. alternate, F. oxysporum, видов рода Cladosporium, B. subtilis и A. tumerfaciens при концентрации в 8 нг/л воздуха. При сравнении транс-2-гексеналя с цитралем в контролировании дрожжей (10 КОЕ/бутылка) в напитках, было обнаружено, что 25 частей на миллион транс-2-гексеналя при термической обработке (56C в течение 20 мин) были эквивалентны 100-120 частям на миллион цитраля. В напитках, которые не обрабатывали термически, была необходимо 35 частей на миллион транс-2-гексеналя для их стабилизации (Belletti, N.; Kamdem, S.; Patrignani, F.; Lanciotti, R.; Covelli, A.; Gardini, F. “Antimicrobial Activity of Aroma Compounds against Saccharomyces cerevisiae and Improvement of Microbiological Stability of Soft Drinks as Assessed by Logistic Regression.” AEM. 2007, v. 73, no. 17, 5580-5586). Не только транс-2-гексеналь применяли в качестве противомикробного средства, но он также, как наблюдалось, был эффективным в контроле насекомых. Летучие вещества (т.е. транс-2-гексеналь) были эффективными против жуков, таких как Tibolium castaneum, Rhyzopertha dominica, Sitophilus granaries, Sitophilus orazyzae и Cryptolestes perrugineus (Hubert, J.; Munzbergova, Z.; Santino, A. “Plant volatile aldehydes as natural insecticides against stored-product beetles.” Pest Manag. Sci. 2008, v. 64, 57-64). В патенте США № 6201026 предложен органический альдегид, состоящий из трех или более атомов углерода, для контроля тлей.
В нескольких патентах предложено применение транс-2-гексеналя в качестве отдушки или душистого вещества. В патенте США № 6596681 предложено применение транс-2-гексеналя в качестве отдушки в салфетке для очищения поверхности. В патентах США № 6387866, № 6960350 и № 7638114 предложено применение эфирных масел или терпенов (например, транс-2-гексеналя) в качестве душистых веществ для противомикробных продуктов. В патенте США №6479044 раскрывается антибактериальный раствор, содержащий анионное поверхностно-активное вещество, поликатионное антибактериальное вещество и воду, где эфирное масло добавляют в качестве душистого вещества. Этим душистым веществом может быть терпен, такой как транс-2-гексеналь или другой представитель класса терпенов. В патентах США № 6323171, № 6121224 и № 5911915 раскрываются противомикробные целевые микроэмульсии, содержащие катионное поверхностно-активное вещество, где эфирное масло добавляют в качестве душистого вещества. Этим душистым веществом могут быть разнообразные терпены, включая транс-2-гексеналь. В патенте США № 6960350 раскрывается противогрибковая отдушка, где синергический эффект обнаруживали, когда применяли различные терпены в комбинации (например, транс-2-гексеналь с бензальдегидом).
Механизм действия транс-2-гексеналя, как полагают, осуществляется посредством изменения клеточной мембраны в связи с реакцией транс-2-гексеналя с сульфгидрильными частями или цистеиновыми остатками или образованием оснований Шиффа с аминогруппами пептидов и белков (Deng, W.; Hamilton-Kemp, T.; Nielsen, M.; Anderson, R.; Collins, G.; Hilderbrand, D. “Effects of Six-Carbon Aldehydes and Alcohols on Bacterial Proliferation.” J. Agric. Food Chem. 1993, v.41, 506-510). Транс-2-гексеналь, как сообщают, действует в качестве поверхностно-активного вещества, но, вероятно, проникает путем пассивной диффузии через плазматическую мембрану. Как только он проникает в клетки, его α,β-ненасыщенная альдегидная часть реагирует с важными в биологическом отношении нуклеофильными группами. Известно, что α,β-ненасыщенная альдегидная часть реагирует с сульфгидрильными группами в основном путем 1,4-присоединения в физиологических условиях (Patrignani, F.; Lucci, L.; Belletti, N.; Gardini, F.; Guerzoni, M. E.; Lanciotti, R. “Effects of sub-lethal concentrations of hexanal и 2-(E)-hexenal on membrane fatty acid composition and volatile compounds of Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enteritidis and Escherichia coli.” International J. Food Micro. 2008, v.123, 1-8).
Транс-2-гексеналь является ингибитором фосфолипазы D, фермента, который катализирует гидролиз фосфолипидов мембраны, происходящий во время созревания и вызревания многих типов фруктов и овощей. Следовательно, предполагается, что транс-2-гексеналь должен ингибировать вызревание (опубликованная заявка США №2005/0031744 A1). Предполагается, что ингибирование Salmonella typhimurim и Staphylococcus aureus транс-2-гексеналем связано с образованием гидрофобной и водородной связи его сегмента в липидном бислое. Деструкция системы транспорта электронов и возмущение проницаемости мембраны предполагались как другие механизмы действия (Gardini, F.; Lanciotti, R.; Guerzoni, M.E. “Effect of trans-2-hexenal on the growth of Aspergillus flavus in relation to its concentration, temperature and water activity.” Letters in App. Microbiology. 2001, v. 33, 50-55). Ингибирование гниения, вызванного P. expansum, может быть связано с повреждением грибковых мембран прорастающих конидий (Neri, F.; Mari, M.; Menniti, A.; Brigati, S.; Bertolini, P. “Control of Penicillium expansum in pears и apples by trans-2-hexenal vapours.” Postharvest Biol. and Tech. 2006, v. 41, 101-108; Neri, F.; Mari, M.; Menniti, A. M.; Brigati, S. “Activity of trans-2-hexenal against Penicillium expansum in 'Conference' pears.” J. Appl. Micrbiol. 2006, v.100, 1186-1193).
6
9
Провели исследования для сравнения транс-2-гексеналя с другими сходными соединениями. Deng и соавт. показали, что ненасыщенные летучие вещества, транс-2-гексеналь и транс-2-гексен-1-ол, проявляли больший ингибирующий эффект, чем насыщенные летучие вещества, гексаналь и 1-гексанол (Deng, W.; Hamilton-Kemp, T.; Nielsen, M.; Anderson, R.; Collins, G.; Hilderbrand, D. “Effects of Six-Carbon Aldehydes and Alcohols on Bacterial Proliferation.” J. Agric. Food Chem. 1993, v. 41, 506-510). Транс-2-гексеналь был более активным, чем гексаналь, нонаналь и транс-2-октеналь, против всех бактериальных штаммов из Американской коллекции типовых культур (ATCC) (Bisignano, G.; Lagana, M. G.; Trombetta, D.; Arena, S.; Nostro, A.; Uccella, N.; Mazzanti, G.; Saija, A. “In vitro antibacterial activity of some aliphatic aldehydes from Olea europaea L.” FEMS Microbiology Letters. 2001, v. 198, 9-13). Было обнаружено, что (E)-2-гексеналь имел более низкие минимальные ингибирующие рост грибка концентрации, чем гексаналь, 1-гексанол, (E)-2-гексен-1-ол и (Z)-3-гексен-1-ол, как определено для нескольких видов плесени, собственно альдегиды>кетоны>спирты (Andersen, R. A.; Hamilton-Kemp, T.; Hilderbrand, D. F.; McCraken Jr., C. T.; Collins, R. W.; Fleming, P. D. Structure-Antifungal Activity Relationships among Volatile Cand C Aliphatic Aldehydes, Ketones, and Alcohols. J. Agric. Food Chem. 1994, v. 42, 1563-1568). Транс-2-гексеналь и гексановая кислота были более эффективными, чем гексанол, в ингибировании сальмонеллы (Kubo, I. and K. Fujita, “Naturally Occuring Anti-Salmonella Agents.” J. Agric. Food Chem. 2001, v. 49, 5750-5754).
Muroi и соавт. предположили, что транс-2-гексеналь проявлял широкую противомикробную активность, однако его биологическая активность (50-400 мкг/мл), как правило, не является достаточно сильнодействующей, чтобы быть рассмотренной для практических применений (Muroi, H.; Kubo, A.; Kubo, I. “Antimicrobial Activity of Cashew Apple Flavor Compounds,” J. Agric. Food Chem. 1993, v. 41, 1106-1109). Исследования показали, что транс-2-гексеналь может усиливать эффективность определенных представителей класса противомикробных средств. В нескольких патентах предложено применение усилителей аминогликозидных антибиотиков (патент США № 5663152) и усилителей полимиксинового антибиотика (патенты США № 5776919 и № 5587358). Эти усилители могут включать индол, анетол, 3-метилиндол, 2-гидрокси-6-R-бензойную кислоту или транс-2-гексеналь. Сильный синергический эффект наблюдали, когда транс-2-гептеналь, транс-2-ноненаль, транс-2-деценаль и (E,E)-2,4-декадиеналь тестировали вместе (соотношение 1:1:1:1) против микробных штаммов из ATCC и клинически выделенных микробных штаммов (Bisignano, G.; Lagana, M. G.; Trombetta, D.; Arena, S.; Nostro, A.; Uccella, N.; Mazzanti, G.; Saija, A. ”In vitro antibacterial activity of some aliphatic aldehydes from Olea europaea L.” FEMS Microbiology Letters. 2001, v. 198, 9-13).
Люди ежедневно подвергались воздействию транс-2-гексеналя посредством потребления пищи и напитков. Воздействие транс-2-гексеналя на людей составляет ~350 мкг/кг/сутки, с 98% полученными из натуральных источников и 2% - из искусственных ароматизирующих веществ. Маловероятно, что транс-2-гексеналь является токсичным для людей, поскольку уровни токсичности у крыс являются в 30 раз более высокими, чем нормальные, поглощаемые людьми (Stout, M. D.; Bodes, E.; Schoonhoven, R.; Upton, P. B.; Travlos, G. S.; Swenberg, J. A. “Toxicity, DNA Binding, and Cell Proliferation in Male F344 Rats following Short-term Gavage Exposures to Trans-2-Hexenal.” Soc. Toxicologic. Pathology March 24 2008, 1533-1601 онлайн-версия). В другом исследовании на крысах кормление транс-2-гексеналем при уровнях питания в 0, 260, 640, 1600 или 4000 частей на миллион, скармливаемых в течение 13 нед., не вызывало никаких изменений гематологических параметров или показателей веса органов. При 4000 частей на миллион было уменьшение веса тела и поглощения, но это не было значительным (Gaunt, I. F.; Colley, J. “Acute and Short-term Toxicity Studies on trans-2-Hexenal.” Fd Cosmet. Toxicol. 1971, v. 9, 775-786).
Даже во фруктах круглосуточное подвергание груш и яблок воздействию транс-2-гексеналя (12,5 мкл/л) в течение семи суток не повлияло на внешний вид фруктов, цвет, твердость, содержание растворимых твердых веществ или титруемую кислотность. Квалифицированная дегустационная комиссия не наблюдала значительных различий в органолептических качествах необработанных и обработанных транс-2-гексеналем яблок “Golden Delicious”, тогда как во фруктах “Bartlett”, “Abate Fetel” и “Royal Gala” ощущалось сохранение привкусов (Neri, F.; Mari, M.; Menniti, A.; Brigati, S.; Bertolini, P. Control of Penicillium expansum in pears and apples by trans-2-hexenal vapours. Postharvest Biol. and Tech. 2006, 41, 101-108; Neri, F.; Mari, M.; Menniti, A. M.; Brigati, S. Activity of trans-2-hexenal against Penicillium expansum in 'Conference' pears. J. Appl. Micrbiol. 2006, v.100, 1186-1193).
Концентрация транс-2-гексеналя в 1,8 мкг/мл воздуха ингибировала прорастание семян сои практически на 100%. Порядком ингибирования роста был транс-2-гексеналь>гексаналь>транс-2-ноненаль, когда прорастающие семена подвергались воздействию насыщенных паров альдегидов (Gardner, H. W.; Dornbos Jr., D. L.; Desjardins, A. E. Hexenal, trans-2-Hexenal, and trans-2-Nonenal Inhibit Soybean, Glycine max, Seed Germination. J. Agric. Food Chem. 1990, v. 38, 1316-1320).
В известном уровне техники не предполагалось и не наблюдалось, чтобы применение транс-2-гексеналя в комбинации с органическими кислотами синергически улучшало противомикробную активность любого из компонентов самостоятельно. Предполагалась синергия с комбинацией эфирных масел и в качестве усилителей антибиотиков.
-
+
Коммерческие ингибиторы плесени и бактерициды состоят из одинарной органической кислоты или смеси органических кислот и формальдегида. Эти кислоты являются главным образом пропионовой, бензойной кислотой, масляной кислотой, уксусной и муравьиной кислотами. Органические кислоты были основными добавками для уменьшения частоты заболеваний инфекциями, вызванными продуктами питания. Механизм, по которому короткоцепочечные жирные кислоты выявляют их противомикробную активность, состоит в том, что недиссоциированные (RCOOH=неионизированная) кислоты способны проникать через липидный бислой и, таким образом, они могут пересекать микробную клеточную стенку и диссоциировать в более щелочной внутренней среде микроорганизма (RCOOH->RCOO+H), что делает цитоплазму нестабильной для выживания (Van Immerseel, F., J.B. Russell, M.D. Flythe, I. Gantois, L. Timbermont, F. Pasmans, F. Haesebrouck, and R. Ducatelle. 2006, “The use of organic acids to combat Salmonella in poultry: a mechanistic explanation of the efficacy,” Avian Pathology. v. 35, no.3, 182-188; Paster, N. 1979, “A commercial study of the efficiency of propionic acid and calcium propionate as fungistats in poultry feed,” Poult. Sci. v. 58, 572-576).
Пропионовая кислота является более сильнодействующим ингибитором плесени, чем уксусная, валериановая, масляная, молочная и бензойная кислоты. Пропионовая кислота имеет эффективную дозу от 0,05% до 0,25% в противоположность другим органическим кислотам, для которых требовалось больше 0,5% (Higgins C. and F. Brinkhaus, 1999, “Efficacy of several organic acids against mold,” J. Applied Poultry Res. v.8, 480-487).
Кормовая кукуруза, обработанная 0,5% смеси, содержащей 80% пропионовой кислоты и 20% уксусной кислоты, не имела пагубных эффектов в отношении продуктивности поросят-отъемышей (Rahnema, S. and S. M. Neal, 1992, Preservation and use of chemically treated high-moisture corn by weanling pigs, J. Prod. Agric. v. 5, no. 4, 458-461). У цыплят-бройлеров добавление 0, 0,1, 0,2, 0,3 и 0,4% уксусной кислоты к воде не влияло на продуктивность или значения микробного числа кишечника цыплят-бройлеров (Akbari, M.R., H. Kermanshani and G.A. Kalidari, 2004, “Effect of acetic acid administration in drinking water on performance growth characteristics and ileal microflora of broiler chickens,” J. Sci. & Technol. Agric. & Natur. Resour. 8 (3): 148).
Пеларгоновая кислота (нонановая кислота) является встречающейся в природе жирной кислотой. Это маслянистая, бесцветная жидкость, которая при низкой температуре становится твердым веществом. Она имеет слабый запах по сравнению с масляной кислотой и почти нерастворима в воде. Пеларгоновая кислота применялась в качестве неселективного гербицида. Scythe (57% пеларгоновой кислоты, 3% родственных жирных кислот и 40% инертного материала) является гербицидом широкого спектра, послевсходовым или сплошного действия, производимым Mycogen/Dow Chemicals. Гербицидный механизм действия пеларгоновой кислоты связан, во-первых, с просачиванием сквозь мембрану в темноте и при дневном свете и, во-вторых, с перекисным окислением, обусловленным радикалами, образованными при дневном свете светочувствительным хлорофиллом, перемещенным из тилакоидной мембраны (B. Lederer, T. Fujimori., Y. Tsujino, K. Wakabayashi and P. Boger, 2004 “Phytotoxic activity of middle-chain fatty acids II: peroxidation and membrane effects.” Pesticide Biochemistry and Physiology 80, 151-156).
6
10
8
9
19
Chadeganipour и Haims (2001) показали, что минимальная ингибирующая концентрация (MIC) среднецепочечных жирных кислот для предупреждения роста M. gypseum составляла 0,02 мг/мл каприновой кислоты и для пеларгоновой кислоты - 0,04 мг/мл на твердых средах и 0,075 мг/мл каприновой кислоты и 0,05 мг/мл пеларгоновой - на жидких средах. Эти кислоты протестировали независимо и не в виде смеси (Chadeganipour and Haims, 2001 “Antifungal activities of pelargonic and capric acid on Microsporum gypseum” Mycoses v. 44, no 3-4, 109-112). N. Hirazawa и соавт. (“Antiparasitic effect of medium-chain fatty acids against ciliated Cryptocaryon irritans infestation in the red sea bream Pagrus major,” 2001, Aquaculture v. 198, 219-228) обнаружили, что нонановая кислота, а также жирные кислоты C-C были эффективными в контролировании роста паразита C. irritans и что C, C и C были более сильнодействующими. Было обнаружено, что Trichoderma harzianum, биоконтроль растений какао, продуцирует пеларгоновую кислоту в качестве одного из многих химических веществ, которые были эффективными в контролировании прорастания и роста патогенов какао (Aneja, M., Gianfagna, T. J., and Hebbar, K. P. 2005. “Trichoderma harzianum produces nonanoic acid, an inhibitor of spore germination and mycelial growth of two cacao pathogens”. Physiol. Mol. Plant Pathol. 67, 304-307).
9
18
8
22
9
10
6
18
6
18
6
18
В нескольких патентах США раскрывается применение пеларгоновой кислоты в качестве фунгицида и бактерицида: в опубликованной заявке США № 2004/026685 раскрывается фунгицид для применения в сельском хозяйстве, который состоит из одной или нескольких жирных кислот и одной или нескольких органических кислот, отличных от жирной кислоты. В смеси органических кислот и жирных кислот органическая кислота действует в качестве сильнодействующего синергиста жирной кислоты для функционирования в качестве фунгицида. В патенте США № 5366995 раскрывается способ уничтожения грибковых и бактериальных инфекций растений и повышения активности фунгицидов и бактерицидов в растениях посредством применения жирных кислот и их производных. Этот состав включает 80% пеларгоновой кислоты или ее солей для контроля грибков у растений. Применяемые жирные кислоты представляют собой главным образом C-C. В патенте США №5342630 раскрывается новый пестицид для применения на растениях, содержащий неорганическую соль, которая повышает эффективность жирных кислот C-C. В одном из примеров показан порошковый продукт с 2% пеларгоновой кислоты, 2% каприновой кислоты, 80% талька, 10% карбоната натрия и 5% карбоната калия. В патенте США № 5093124 раскрывается фунгицид и артропоцид для растений, содержащие альфа-монокарбоновые кислоты и их соли. Предпочтительно фунгицид содержит жирные кислоты C-C, частично нейтрализованные активным щелочным металлом, таким как калий. Описанная смесь включает 40% активного ингредиента, растворенного в воде, и включает 10% пеларгоновой, 10% каприновой кислоты и 20% жирных кислот кокосового масла, все из которых нейтрализованы гидроксидом калия. В патенте США № 6596763 раскрывается способ контроля кожной инфекции с применением жирных кислот C-C или их производных. В патенте США № 6103768 и № 6136856 раскрывается исключительная польза жирных кислот и производных в уничтожении существующих грибковых и бактериальных инфекций в растениях. Этот способ не является профилактическим, но показывал эффективность при уже установившихся инфекциях. Sharpshooter, коммерчески доступный продукт с 80% пеларгоновой кислоты, 2% эмульгатора и 18% поверхностно-активного вещества показывал эффективность против видов родов Penicillium и Botrytis. В патенте США №6638978 раскрывается противомикробный консервант, состоящий из глицеринового сложного эфира жирной кислоты, двухкомпонентной смеси жирных кислот (C-C) и второй жирной кислоты (C-C), где вторая жирная кислота является отличной от первой жирной кислоты, для консервирования пищи. В WO 01/97799 раскрывается применение среднецепочечных жирных кислот в качестве противомикробных средств. Это показывает, что с увеличением pH от 6,5 до 7,5 увеличивалась MIC короткоцепочечных жирных кислот, содержащих 6-8 углеродных цепей.
Пеларгоновую кислоту применяют в качестве компонента раствора для дезинфекции контактирующих с пищей поверхностей в учреждениях по обработке пищевых продуктов. Продукт из EcoLab, содержащий 6,49% пеларгоновой кислоты в качестве активного ингредиента, можно применять в качестве дезинфицирующего средства для всех контактирующих с пищей поверхностей (12 CFR 178.1010 b). Пеларгоновую кислоту очищали с помощью FDA в качестве синтетического пищевого ароматизирующего средства (21 CFR 172.515), в качестве вспомогательного средства, производственной добавки и дезинфицирующего средства для применения в контакте с пищей (12 CFR 178.1010 b) и в промывании или для содействия очистке раствором щелочи фруктов и овощей (12 CFR 173.315). Пеларгоновая кислота включена в перечень разрешенных веществ USDA (министерства сельского хозяйства США), 1990, раздел 5.14, соединения для промывания овощей и фруктов.
Эмульгатор или этоксилированное неионное поверхностно-активное вещество наподобие этоксилированного касторового масла получают в результате реакции масла с этиленоксидом. Эмульгаторы на основе этоксилированного касторового масла характеризуются разнообразными длинами цепей в зависимости от количества этиленоксида, применяемого во время синтеза. Молярное соотношение может варьировать от 1 молекулы касторового масла и от 1 до 2000 молекул этиленоксида, которые дают эмульгатор на основе этоксилированного касторового масла, также называемый PEG-x (полиэтиленгликолевый) эмульгатор на основе касторового масла, где “x” представляет собой число молекул этиленоксида (Fruijtier-Polloth, Claudia, 2005, “Safety assessment on polyethylene glycols (PEGs) and their derivatives as used in cosmetic products” Toxicology, v. 214, 1-38). Эти эмульгаторы широко применяли для солюбилизации нерастворимых в воде лекарственных средств для лечения людей и животных. Они являются нелетучими, стабильными соединениями, которые не гидролизуются и не портятся при хранении. Касторовое масло получают из семян Ricinus communis, и оно включает, главным образом, триглицериды рицинолеиновой, изорицинолеиновой, стеариновой и дигидроксистеариновой кислот. Касторовое масло представляет собой на 90% рицинолеиновую кислоту (12-гидроксиолеиновую кислоту), нетоксичный, способный к биодеградации и возобновляемый источник.
Были поданы несколько заявок PCT касательно применений поверхностно-активных веществ на основе этоксилированного касторового масла. WO 99/60865 относится к водным эмульсиям поверхностно-активных веществ, добавляемых в корм для животных перед или после тепловой обработки. Этот патент относится к эмульсии для способствования удержанию или уменьшению потери воды во время тепловой обработки. Эмульсия включает 1-8 частей воды и 0,005-0,5 частей поверхностно-активного вещества. WO 97/28896 относится к применению поверхностно-активного вещества для облегчения дисперсии мелассы. WO 96/11585 относится к применению этоксилированного касторового масла в корме для животных с целью улучшения питательной ценности корма. WO 95/28091 относится к добавлению этоксилированного касторового масла в корм для улучшения доступности питательных веществ в традиционном сухом корме для животных с целью увеличения роста животных и снижения смертности. В этих четырех патентах упоминается добавление поверхностно-активного вещества на основе этоксилированного касторового масла, предпочтительно эмульсии, для улучшения перевариваемости гидрофобных веществ, присутствующих в корме для животных, и не показана какая-либо выгода в производстве корма или профилактике роста плесени в корме.
5
8
n
Терпены, признанные безопасными (GRAS), являются широко распространенными в природе, в основном в растениях, в качестве составляющих эфирных масел. Их структурным элементом является углеводород, изопрен (CH). Примеры терпенов включают цитраль, пинен, нерол, бета-ионон, гераниол, карвакрол, эвгенол, карвон, терпениол, анетол, камфору, ментол, лимонен, неролидол, фарнезол, фитол, каротин, сквален, тимол, токотриенол, периллиловый спирт, борнеол, мирцен, симен, карен, терпенен, линалоол и другие. Гераниол, токотриенол, периллиловый спирт, бета-ионон и d-лимонен подавляют активность HMG-CoA-редуктазы печени, лимитирующей стадию синтеза холестерина и умеренно низкие уровни холестерина у животных (Elson C. E. and S. G. Yu, 1994, “The Chemoprevention of Cancer by Mevalonate-Derived Constituents of Fruits и Vegetables,” J. Nutr. v.124, 607-614). D-лимонен и гераниол уменьшали опухоли молочной железы (Elgebede, J. A., C. E. Elson, A. Qureshi, M. A. Tanner and M. N. Gould, 1984, “Inhibition of DMBA-Induced Mammary Cancer by Monoterpene D-limonene,” Carcinogensis v.5, no.5, 661-664; Elgebede, J. A., C. E. Elson, A. Qureshi, M. A. Tanner and M. N. Gould, 1986, “Regression of Rat Primary Mammary Tumors Following Dietary D-limonene,” J. Nat'l Cancer Institute v.76, no. 2, 323-325; Karlson, J., A. K. Borg, R. Unelius, M. C. Shoshan, N. Wilking, U. Ringborg and S. Linder, 1996, “Inhibition of Tumor Cell Growth By Monoterpenes In Vitro: Evidence of a Ras-Independent Mechanism of Action,” Anticancer Drugs v. 7, no.4, 422-429) и подавляли рост трансплантированных опухолей (Yu, S. G., P. J. Anderson and C. E. Elson, 1995, “The Efficacy of B-ionone in the Chemoprevention of Rat Mammary Carcinogensis,” J. Agri. Food Chem. v. 43, 2144-2147).
Также было обнаружено, что терпены in vitro ингибируют рост бактерий, и грибков (Chaumont J. P. and D. Leger, 1992, “Campaign Against Allergic Moulds in Dwellings, Inhibitor Properties of Essential Oil Geranium "Bourbon," Citronellol, Geraniol and Citral,” Ann. Pharm. Fr v. 50, no.3, 156-166), и некоторых внутренних и внешних паразитов (Hooser, S. B., V. R. Beasly and J. J. Everitt, 1986, Effects of an Insecticidal Dip Containing D-limonene in the Cat, J. Am. Vet. Med. Assoc. v. 189, no.8, 905-908). Было обнаружено, что гераниол ингибирует рост штаммов Candida albicans и Saccharomyces cerevisiae путем повышения степени просачивания калия и нарушения текучести мембраны (Bard, M., M. R. Albert, N. Gupta, C. J. Guuynn and W. Stillwell, 1988, Geraniol Interferes with Membrane Functions in Strains of Candida and Saccharomyces, Lipids v. 23, no.6, 534-538). Бета-ионон имел противогрибковую активность, которую определяли по ингибированию прорастания спор и ингибированию роста на агаре (Mikhlin E. D., V. P. Radina, A. A. Dmitrossky, L. P. Blinkova, and L. G. Button, 1983, Antifungal and Antimicrobial Activity of Some Derivatives of Beta-Ionone and Vitamin A, Prikl Biokhim Mikrobiol, v. 19, 795-803; Salt, S. D., S. Tuzun and J. Kuc, 1986, Effects of B-ionone and Abscisic Acid on the Growth of Tobacco and Resistance to Blue Mold, Mimicry the Effects of Stem Infection by Peronospora Tabacina, Adam Physiol. Molec. Plant Path v.28, 287-297). Тепренон (геранилгеранилацетон) оказывает антибактериальный эффект на H. pylori (Ishii, E., 1993, Antibacterial Activity of Teprenone, a Non Water-Soluble Antiulcer Agent, Against Helicobacter Pylori, Int. J. Med. Microbiol. Virol. Parasitol. Infect. Dis. v.280, no.1-2, 239-243). Растворы 11 различных терпенов были эффективными в ингибировании роста патогенных бактерий в тестах in vitro (Kim, J., M. Marshall and C. Wei, 1995, Antibacterial Activity of Some Essential Oil Components Against Five Foodborne Pathogens, J. Agric. Food Chem. v.43, 2839-2845). Дитерпены, т.е. трихорабдал A (из R. trichocarpa), показали очень сильный антибактериальный эффект против H. pylori (Kadota, S., P. Basnet, E. Ishii, T. Tamura and T. Namba, 1997, Antibacterial Activity of Trichorabdal A from Rabdosia Trichocarpa Against Helicobacter Pylori, Zentralbl. Bakteriol v.287, no.1 63-67). Owawunmi в 1989 году (Evaluation of the Antimicrobial Activity of Citral, Letters in Applied Microbiology v. 9, no.3, 105-108) показал, что в средах для роста с более чем 0,01% цитраля уменьшалась концентрация E.coli, и при 0,08% проявлялся бактерицидный эффект. В патенте США №5673468 сообщается о составе терпенов на основе соснового масла, применяемого в качестве дезинфектанта или антисептического очистителя. В патенте США №5849956 сообщается, что терпен, обнаруживаемый в рисе, имеет противогрибковую активность. В патенте США №5939050 сообщается о противомикробном продукте для гигиены полости рта с комбинацией из 2 или 3 терпенов, которые показывали синергический эффект.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Целью настоящего изобретения является улучшение микробицидного эффекта органических кислот, оказываемого на корм для животных, путем включения по меньшей мере 10 вес.% альдегида, транс-2-гексеналя, на основе общего веса органических кислот. Противомикробная композиция может быть водным раствором, содержащим одну органическую кислоту или смесь нескольких органических кислот в комбинации с альдегидом.
Композиция может дополнительно содержать этоксилированное неионное поверхностно-активное вещество.
Композиция может дополнительно содержать противомикробные терпены или эфирные масла.
Органические кислоты могут иметь длину цепи в 1-24 атома углерода и могут быть насыщенными, ненасыщенными, циклическими и могут быть замещенными функциональными группами, содержащими галогеновые, гидроксильные, амино, эфирные или сложноэфирные части.
Поверхностно-активное вещество может быть поверхностно-активным веществом на основе этоксилированного касторового масла с HLB (гидрофильно-липофильным балансом) от 4 до 18. Оно может также содержать другие неионные, ионные или амфотерные поверхностно-активные вещества или другое поверхностно-активное вещество со сходными свойствами, такое как твин.
Терпены композиции могут содержать аллилдисульфид, тимол, цитраль, эвгенол, карвакрол, лимонен и карвон или их смеси.
В дополнение к транс-2-гексеналю композиция может содержать летучий альдегид, полученный в результате липоксигеназного пути, включая (2E, 6Z)-нонадиеналь, транс-2-ноненаль и другие α,β-ненасыщенные алифатические альдегиды, т.е. пропеналь, транс-2-бутеналь, 2-метил-2-бутеналь, 2-метил-(E)-2-бутеналь, 2-пентеналь, транс-2-гексен-1-ол, 2-метил-2-пентаналь, 2-изопропилпропеналь, 2-этил-2-бутеналь, 2-этил-2-гексеналь, (Z)-3-гексеналь, 3,7-диметил-6-октеналь, 3,7-диметил-2,6-октадиеналь, (2E)-3,7-диметил-2-6-октадиеналь, (2Z)-3,7-диметил-2,6-октадиеналь, транс-2-ноненаль, (2E, 6Z)-нонадиеналь, 10-ундеканаль, 2-додеценаль и другие α,β-ненасыщенные алифатические альдегиды с противомикробными и ароматизирующими свойствами, а также их соответствующие спиртовые и кислотные формы.
Смесь согласно настоящему изобретению содержит 1-90 вес.% органических кислот и 5-99% транс-2-гексеналя.
Смесь может содержать 0-90 вес.% уксусной кислоты, предпочтительно 10-55 вес.%.
Смесь может содержать 0-90 вес.% масляной кислоты, предпочтительно 10-55 вес.%.
Смесь может содержать 0-90 вес.% пропионовой кислоты, предпочтительно 10-55 вес.%.
Смесь может содержать 0-90 вес.% пеларгоновой кислоты, предпочтительно 5-10 вес.%.
Смесь может содержать 0-90 вес.% молочной кислоты, предпочтительно 10-40 вес.%.
Смесь может содержать 0-90 вес.% муравьиной кислоты, предпочтительно 10-55 вес.%.
Смесь может содержать 0-90 вес.% янтарной кислоты, предпочтительно 20-30 вес.%.
Смесь может содержать 0-90 вес.% лауриновой кислоты, предпочтительно 1-10 вес.%.
Смесь может содержать 0-90 вес.% миристиновой кислоты, предпочтительно 1-5 вес.%.
Смесь может содержать 0-90 вес.% каприловой кислоты, предпочтительно 5-20 вес.%.
Смесь может содержать 0-90 вес.% левулиновой кислоты, предпочтительно 1-20 вес.%.
Смесь может содержать 0-90 вес.% летучих α,β-ненасыщенных алифатических альдегидов, предпочтительно 1-30 вес.%.
Смесь может содержать 0-50 вес.% по объему терпенов, предпочтительно 0,5-7 вес.%.
Смесь может содержать 0-50 вес.% противомикробного терпена, предпочтительно 0,5-7 вес.%.
Смесь может содержать 0-20 вес.% по объему поверхностно-активного вещества, предпочтительно 0,5-10 вес.%.
Смесь может содержать 0,5-10 вес.% поверхностно-активного вещества на основе этоксилированного касторового масла с 1-200 молекулами этилена, предпочтительно 1-5,0 вес.%.
Смесь согласно настоящему изобретению может содержать 0,5-10 вес.% поверхностно-активного вещества со свойствами, сходными с таковыми у поверхностно-активного вещества на основе этоксилированного касторового масла, предпочтительно 1-5,0 вес.%.
Смесь согласно настоящему изобретению может содержать 0-97 вес.% воды, предпочтительно 1-20 вес.%.
Композиция является эффективной против разнообразных грибков, присутствующих в корме и основных ингредиентах корма.
Композиция является эффективной против разнообразных бактерий, присутствующих в корме и основных ингредиентах корма.
Композиция является эффективной против разнообразных бактерий и грибков, присутствующих в воде.
Композиция является эффективной против микробов, вредных в отношении выработки спирта путем брожения целлюлозы, крахмала или сахаров.
1
24
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение способа обработки корма для животных, включающего этап, на котором корм для животных смешивают с эффективным количеством противомикробной композиции, содержащей 1-90 вес.% органической кислоты C-C на основе общего веса, 10-55 вес.% α,β-ненасыщенного алифатического альдегида на основе общего веса, например, транс-2-гексеналя, при условии, что он составляет по меньшей мере 5 вес.% от смеси органической кислоты и альдегида, 0-30 вес.% терпенов на основе общего веса, 0-10 вес.% поверхностно-активного вещества на основе общего веса и воду.
ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Определения
«Объемный процент» компонента основан на общем объеме состава или композиции, в которую включен компонент.
2
24
1
24
«Органическая кислота» композиции может быть муравьиной, уксусной, пропионовой, масляной, пеларгоновой, молочной и другими жирными кислотами C-C или моно-, ди- или триглицеридами, содержащими жирные кислоты C-C. Эти жирные кислоты включают короткоцепочечные, среднецепочечные, длинноцепочечные жирные кислоты или короткоцепочечные, среднецепочечные, длинноцепочечные триглицериды.
α,β-Ненасыщенные алифатические альдегиды композиции могут представлять собой пропеналь, транс-2-бутеналь, 2-метил-2-бутеналь, 2-метил-(E)-2-бутеналь, транс-2-гексеналь, 2-пентеналь, транс-2-гексен-1-ол, 2-метил-2-пентаналь, 2-изопропилпропеналь, 2-этил-2-бутеналь, 2-этил-2-гексеналь, (Z)-3-гексеналь, 3,7-диметил-6-октеналь, 3,7-диметил-2,6-октадиеналь, (2E)-3,7-диметил-2-6-октадиеналь, (2Z)-3,7-диметил-2,6-октадиеналь, транс-2-ноненаль, (2E, 6Z)-нонадиеналь, 10-ундеканаль, 2-додеценаль и другие α,β-ненасыщенные алифатические альдегиды с противомикробными и ароматизирующими свойствами, а также их соответствующие спиртовые и кислотные формы.
«Противомикробный терпен» композиции может включать аллилдисульфид, цитраль, пинен, нерол, гераниол, карвакрол, эвгенол, карвон, анетол, камфору, ментол, лимонен, фарнезол, каротин, тимол, борнеол, мирцен, терпенен, линалоол или их смеси. Более конкретно, терпены могут включать аллилдисульфид, тимол, цитраль, эвгенол, лимонен, карвакрол и карвон или их смеси.
Выражение «эффективное количество» соединения означает такое количество, которое способно к выполнению функции соединения или свойства, для которого выражают эффективное количество, как например, нетоксическое, но достаточное количество для обеспечения желательных противомикробных выгод. Таким образом, надлежащее эффективное количество может определить специалист в данной области техники, применяя только обычный порядок проведения экспериментов.
Составы могут варьировать не только по концентрации основных компонентов, т.е. органических кислот, но также по типу альдегидов, терпенов, поверхностно-активных веществ и применяемой концентрации воды. Настоящее изобретение можно модифицировать несколькими способами путем добавления или удаления из состава терпена, типа органических кислот, альдегида и типа поверхностно-активных веществ.
Выражение «синергический эффект» или «синергия» означает улучшенный консервирующий эффект при добавлении ингредиентов в качестве смеси, а не в качестве отдельных компонентов.
Композиция
Композиция согласно настоящему изобретению содержит эффективное количество органических кислот с 1-24-углеродными цепями и α,β-ненасыщенные алифатические альдегиды, например транс-2-гексеналь.
Можно применять противомикробные терпены, растительные экстракты или эфирные масла, содержащие терпены, а также более очищенные терпены. Терпены являются коммерчески легкодоступными или могут производиться с помощью разнообразных способов, известных из уровня техники, таких как экстракция растворителем или паровая экстракция/дистилляция и химический синтез.
Поверхностно-активное вещество является неионным, включая поверхностно-активное вещество на основе этоксилированного касторового масла с 1-2000 звеньями полиэтилена, предпочтительно от 20 до 100.
Предпочтительная композиция содержит 1-90 вес.% органических кислот и 1-30% транс-2-гексеналя, где органической кислотой может быть 10-55 вес.% уксусной кислоты, 10-55 вес.% пропионовой кислоты, 10-40 вес.% молочной кислоты или 5,0-10 вес.% пеларгоновой кислоты и их смеси. Предпочтительная композиция может также содержать 0,5-7 вес.% терпенов, 0,5-10 вес.% поверхностно-активного вещества и 1,0-10 вес.% воды.
Способы
Настоящее изобретение является эффективным против бактерий и грибков. Его применяют в такой форме, которая обеспечивает равномерное и однородное распределение смеси по всему корму.
Настоящее изобретение можно применять к воде.
Настоящее изобретение можно применять к сырьевому материалу перед поступлением в мешалку.
Настоящее изобретение можно применять к несмешанным сырьевым материалам в мешалке.
Настоящее изобретение можно применять во время смешивания сырьевых ингредиентов.
Настоящее изобретение можно применять с помощью распылителя.
Одной из целевых функций является контроль уровня микробов в корме и кормовых продуктах. Несколько смесей органических кислот, терпенов и альдегидов дают в результате составы, которые показывали эффективность против бактерий в буферном растворе и корме. Другой целевой функцией является составление противомикробного средства со встречающимися в природе соединениями или безопасными в применении соединениями. Все химические вещества, применяемые в настоящем изобретении, в настоящее время одобрены для путей применения в отношении людей в качестве противомикробных средств, усилителей вкуса и аромата и парфюмерных изделий.
Были непредвиденные результаты, т.е. синергизм вне аддитивных эффектов, когда транс-2-гексеналь добавляли к органическим кислотам и терпенам.
По всему данному раскрытию ссылаются на разнообразные публикации, все из которых настоящим включены в данную заявку ссылкой в их полноте.
ПРИМЕРЫ
Примеры 1 и 2
Способ: следующие составы получали для двойных исследований in vitro. Все реактивы были наивысшей чистоты и предназначались для лабораторного использования. Для уксусной кислоты получили 56% раствор. Янтарную кислоту разбавляли в воде до 5% раствора в связи с проблемами растворимости. Два коммерческих продукта, сочетание муравьиной/пропионовой кислоты и сочетание формальдегида/пропионовой кислоты, тестировали в целях сравнения.
ХИМИЧЕСКИЕ СОСТАВЫ ДЛЯ ПРИМЕРОВ 1 И 2
ХИМИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО
% химического вещества в составе
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Эвгенол
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
0
Карвакрол
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
0
CO60*(поверхностно-активное вещество)
5,00
5,00
5,00
5,00
5,00
5,00
5,00
5,00
5,00
5,00
5,00
0
Пеларгоновая кислота
10,0
10,0
10,0
10,0
10,0
10,0
10,0
10,0
10,0
10,0
10,0
0
Уксусная кислота (56%)
22,5
32,5
22,5
22,5
22,5
37,5
22,5
12,5
32,5
12,5
0
0
Молочная кислота
20,0
0
0
0
0
0
0
10,0
40,0
0
0
0
Пропионовая кислота
30,0
30,0
30,0
30,0
30,0
30,0
30,0
50,0
0
40,0
42,5
10,0
Муравьиная кислота
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
70,0
Янтарная кислота (5%)
0
0
0
0
0
0
0
0
0
20,0
30,0
0
Лауриновая кислота
0
0
0
0
0
0
20,0
0
0
0
0
0
Миристиновая кислота
0
0
0
0
0
5,0
0
0
0
0
0
0
Каприловая кислота
0
0
0
0
20,0
0
0
0
0
0
0
0
Левулиновая кислота
0
0
0
20,0
0
0
0
0
0
0
0
20,0
Транс-2-гексеналь
0
10,0
20,0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
ВСЕГО
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
100,0
*CO-60 представляет собой поверхностно-активное вещество на основе этоксилированного касторового масла с 60 структурными единицами этилена.
Суспензию Salmonella typhimurium добавляли в две контрольные пробирки, содержащие 0,05% (500 частей на миллион) каждого состава. Пробирки встряхивали, инкубировали при комнатной температуре в течение 24 часов и затем раствор высевали на SMA (агар для стандартного способа) на 48 часов перед подсчетом колоний Salmonella.
Результаты: в следующей таблице показано, что несколько составов были эффективными в контролировании роста Salmonella.
Результаты: исследования 1 и 2.
24 ч. КОЕ/мл (0,05%)
Обработка
Исследование 1
%уменьшения
Исследование 2
%уменьшения
Контроль
1093
1900
Формула 1
0
100,0
37
98,1
Формула 2
7
99,4
10
99,5
Формула 3
13
98,8
0
100,0
Формула 4
33
97,0
130
93,2
Формула 5
27
97,5
133
93,0
Формула 6
83
92,4
163
91,4
Формула 7
143
86,9
240
87,4
Формула 8
20
98,2
70
96,3
Формула 9
3
99,7
0
100,0
Формула 10
147
86,6
160
91,6
Формула 11
197
82,0
283
85,1
Формула 12
0
100,0
0
100,0
Муравьиная/пропионовая кислота
0
100,0
0
100,0
Формальдегид (33%)
0
100,0
0
100,0
Выводы: составы давали в результате различные ответы против Salmonella. Составы с более высокими уровнями транс-2-гексеналя и молочной кислоты имеют лучшие качества, чем все другие, за исключением продуктов на основе формальдегида и муравьиной кислоты.
Пример 3
o
Способ: из предыдущих исследований in vitro выбрали шесть составов для тестирования их эффективности против Salmonella в корме. Сочетание формальдегида/пропионовой кислоты тестировали в целях сравнения. Мешанку для домашней птицы дополняли инокулятом Salmonella typhimurium с мясокостной кормовой мукой. Зараженный корм затем обработали любой из 1, 2 и 3 кг/т составов, перечисленных ниже. Через 24 часа 10 г навесок обработанного корма суспендировали в 90 мл буфера Баттерфилда. Разведения высевали на агар XLT-4 и инкубировали при 37C в течение 48 часов перед подсчетом колоний Salmonella. Формулы, применяемые для этого эксперимента, показаны в следующей таблице.
ХИМИЧЕСКИЕ СОСТАВЫ ДЛЯ ПРИМЕРА 3
Химическиеформулы
% химического вещества в составе
1
2
3
8
9
12
Эвгенол
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
0
Карвакрол
6,25
6,25
6,25
6,25
6,25
0
CO60*
5,00
5,00
5,00
5,00
5,00
0
Пеларгоновая кислота
10,00
10,00
10,00
10,00
10,00
0
Уксусная кислота (56%)
22,50
32,50
22,50
12,50
32,50
0
Молочная кислота
20,00
0
0
10,00
40,00
0
Пропионовая кислота
30,00
30,00
30,00
50,00
0
10,00
Муравьиная кислота
0
0
0
0
0
70,00
Левулиновая кислота
0
0
0
0
0
20,00
Транс-2-гексеналь
0
10,00
20,00
0
0
0
Всего
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
*CO-60 представляет собой поверхностно-активное вещество на основе этоксилированного касторового масла с 60 структурными единицами этилена.
Результаты: в следующей таблице показано, что несколько составов были эффективными в контролировании роста Salmonella.
Обработка
кг/т
КОЕ/г
% уменьшения
Формула 1
0
2540
1
2010
21
2
1730
32
3
1385
45
Формула 2
0
1860
1
895
52
2
583
69
3
273
85
Формула 3
0
2220
1
815
63
2
420
81
3
80
96
Формула 8
0
2080
1
1670
20
2
1540
26
3
1325
36
Формула 9
0
2005
1
1313
34
2
1470
27
3
1150
43
Формула 12
0
2080
1
1010
51
2
230
89
3
93
96
Формальдегид (33%)
0
1180
1
0
100
2
0
100
3
0
100
Выводы: формулы, содержащие транс-2-гексеналь, показывали большую эффективность против Salmonella. Составы с высоким уровнем транс-2-гексеналя в сравнении с продуктами на основе формальдегида (33% формальдегида) и муравьиной кислоты давали в результате сходную эффективность.
Пример 4
o
Способ: выбрали пять составов для тестирования их эффективности против Salmonella typhimurium. Мешанку для домашней птицы дополняли инокулятом Salmonella typhimurium с мясокостной кормовой мукой. Зараженный корм затем обработали любой из 1, 2 и 3 кг/т составов, перечисленных ниже. Через 24 часа 10 г навесок обработанного корма суспендировали в 90 мл буфера Баттерфилда. Разведения высевали на агар XLT-4 и инкубировали при 37C в течение 48 часов перед подсчетом колоний Salmonella. Дополнительные образцы для подсчитывания Salmonella отобрали через 7 и 14 суток после обработки. Применяемые формулы показаны в следующей таблице.
ХИМИЧЕСКИЕ СОСТАВЫ ДЛЯ ПРИМЕРА 4
Химическое вещество
% химического вещества в составе
16
17
18
19
20
Эвгенол
5,00
0,00
0,00
0,50
1,00
Карвакрол
5,00
0,00
0,00
0,50
1,00
CO60*
5,00
0,00
0,00
0,50
1,00
Пеларгоновая кислота
5,00
5,00
5,00
5,00
5,00
Уксусная кислота (56%)
30,00
45,00
20,00
47,50
53,00
Пропионовая кислота
20,00
20,00
50,00
26,00
24,00
Транс-2-гексеналь
30,00
30,00
25,00
20,00
15,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
*CO-60 представляет собой поверхностно-активное вещество на основе этоксилированного касторового масла с 60 структурными единицами этилена.
Результаты: в следующей таблице показано, что несколько составов были эффективными в контролировании Salmonella.
Эффект химических веществ в отношении Salmonella на 1, 7 и 14 сутки после обработки
Формула
Степень обработки
Salmonellaна 24 ч
Salmonellaна 7 сутки
Salmonellaна 14 сутки
кг/т
КОЕ/гкорма
%уменьшения
КОЕ/гкорма
%уменьшения
КОЕ/гкорма
%уменьшения
Формула №16
0
1,2E+05
1,8E+05
6,4E+04
1
2,8E+04
77
2,3E+04
86,9
1,5E+04
77,1
2
1,2E+04
90
6,3E+03
96,4
4,3E+03
93,2
3
2,0E+03
98
1,0E+03
99,4
3,3E+02
99,5
Формула №17
0
1,5E+05
1,5E+05
1,4E+05
1
5,0E+04
66
3,5E+04
76,9
3,5E+04
75,8
2
1,4E+04
91
6,0E+03
96,0
2,3E+03
98,4
3
3,3E+02
100
3,3E+02
99,8
1,0E+03
99,3
Формула №18
0
1,3E+05
1,5E+05
1,4E+05
1
3,7E+04
72
2,7E+04
82,3
2,5E+04
81,4
2
7,3E+03
94
1,2E+04
92,1
7,7E+03
94,4
3
7,3E+03
94
3,3E+03
97,8
6,7E+02
99,5
Формула №19
0
1,4E+05
1,8E+05
8,2E+04
1
5,5E+04
59
7,2E+04
60,8
2,7E+04
66,9
2
6,3E+03
95
2,0E+04
88,9
1,1E+04
86,5
3
3,7E+03
97
4,0E+03
97,8
6,3E+03
92,2
Формула №20
0
1,3E+05
2,0E+05
8,0E+04
1
6,5E+04
48
7,5E+04
62,4
4,0E+04
49,8
2
2,8E+04
77
2,7E+04
86,4
1,2E+04
85,5
3
9,7E+03
92
1,4E+04
93,2
1,0E+04
87,6
Выводы: все составы давали в результате уменьшение показателей числа Salmonella в корме. Формулы с низким уровнем транс-2-гексеналя (<15%) не были такими эффективными, как другие.
Пример 5
o
Способ: составы №17 и №18, содержащие транс-2-гексеналь, сравнивали с шестью другими составами, содержащими меньшие количества этого альдегида, но с увеличенными уровнями молочной кислоты. Мешанку для домашней птицы дополняли инокулятом Salmonella typhimurium с мясокостной кормовой мукой. Зараженный корм затем обработали любой из 1, 2 и 3 кг/т составов, перечисленных ниже. Через 24 часа 10 г навесок обработанного корма суспендировали в 90 мл буфера Баттерфилда. Разведения высевали на агар XLT-4 и инкубировали при 37C в течение 48 часов перед подсчетом колоний Salmonella. Дополнительные образцы для подсчитывания Salmonella отобрали через 7 и 14 сутки после обработки. Применяемые формулы показаны в следующей таблице.
ХИМИЧЕСКИЕ СОСТАВЫ ДЛЯ ПРИМЕРА 5
Химическиеформулы
% химического вещества в составе
17
18
21
22
23
24
25
26
Эвгенол
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,75
0,00
0,00
Карвакрол
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,75
0,00
0,00
CO-60*
0,00
0,00
0,00
5,00
5,00
5,00
8,00
0,00
Пеларгоновая кислота
5,00
5,00
5,00
5,00
5,00
5,00
5,00
0,00
Уксусная кислота (56%)
45,00
20,00
38,00
40,00
35,00
30,00
36,00
0,00
Транс-2-гексеналь
30,00
25,00
5,00
5,00
5,00
10,00
10,00
0,00
Пропионовая кислота
20,00
50,00
12,00
15,00
10,00
10,00
15,00
10,00
Молочная кислота
0,00
0,00
40,00
30,00
40,00
38,50
26,00
0,00
Муравьиная кислота (88%)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
90,00
ВСЕГО
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
*CO-60 представляет собой поверхностно-активное вещество на основе этоксилированного касторового масла с 60 структурными единицами этилена.
Результаты: в следующей таблице показано, что несколько составов были эффективными в контролировании Salmonella.
Эффект химических веществ в отношении Salmonella на 1, 7 и 14 сутки после обработки
Способы обработки
Степеньобработки
Salmonellaна 1 сутки
Salmonellaна 7 сутки
Salmonellaна 14 сутки
кг/т
КОЕ/гкорма
%уменьшения
КОЕ/гкорма
%уменьшения
КОЕ/гкорма
%уменьшения
Формула №17
0
1,75E+05
1,11E+05
1,07E+04
1
3,93E+04
77,52
2,67E+03
97,60
3,33E+03
68,75
2
1,00E+03
99,43
3,33E+02
99,70
1,00E+03
90,63
3
6,70E+02
99,62
0,00E+00
100,00
6,67E+02
93,75
Формула №18
0
1,87E+05
6,77E+04
8,33E+03
1
7,07E+04
62,21
1,13E+04
83,25
1,00E+03
88,00
2
9,67E+03
94,83
4,00E+03
94,09
3,33E+02
96,00
3
6,00E+03
96,79
6,67E+02
99,01
0,00E+00
100,00
Формула №21
0
1,17E+05
1,31E+05
1,40E+04
1
6,60E+04
43,59
3,40E+04
74,05
7,33E+03
47,62
2
2,30E+04
80,34
2,30E+04
82,44
3,50E+03
75,00
3
8,67E+03
92,59
8,67E+03
93,38
1,33E+03
90,48
Формула №22
0
2,30E+05
2,08E+05
7,00E+03
1
1,65E+05
28,41
4,13E+04
80,13
3,33E+03
52,38
2
6,97E+04
69,71
1,30E+04
93,75
1,50E+03
78,57
3
2,13E+04
90,72
4,33E+03
97,92
1,00E+03
85,71
Формула №23
0
1,13E+05
1,66E+05
5,33E+03
1
1,01E+05
10,88
7,07E+04
57,52
2,00E+03
62,50
2
5,95E+04
47,50
2,83E+04
82,97
1,33E+03
75,00
3
3,00E+04
73,53
5,67E+03
96,59
1,00E+03
81,25
Формула №24
0
1,75E+05
9,70E+04
5,00E+03
1
5,73E+04
67,14
3,70E+04
61,86
1,00E+03
80,00
2
3,10E+04
82,23
1,27E+04
86,94
1,00E+03
80,00
3
2,20E+04
87,39
4,00E+03
95,88
6,67E+02
86,67
Формула №25
0
2,36E+05
8,20E+04
2,27E+04
1
1,11E+05
52,97
2,37E+04
71,14
6,67E+03
70,59
2
9,13E+04
61,30
7,00E+03
91,46
4,00E+03
82,35
3
4,10E+04
82,63
3,00E+03
96,34
6,67E+02
97,06
Формула №26
0
1,53E+05
5,15E+04
1,13E+04
1
8,40E+04
45,10
1,17E+04
77,35
3,67E+03
67,65
2
3,37E+04
78,00
6,00E+03
88,35
2,33E+03
79,41
3
1,53E+04
89,98
6,67E+02
98,71
1,33E+03
88,24
Выводы: путем снижения уровня транс-2-гексеналя (до 5%-25%) и увеличения уровня молочной кислоты (до 26%-40%) в сравнении с высокими уровнями транс-2-гексеналя (30%) получили сходный ответ.
Пример 6
o
Способ: четыре из семи тестируемых составов из примера 5 демонстрировали удовлетворительный эффект против Salmonella typhimurium. В данном исследовании тестировали новый состав (формула 27) и противомикробное средство на основе формальдегида (33% формальдегида). Мешанку для домашней птицы дополняли инокулятом Salmonella typhimurium с мясокостной кормовой мукой. Зараженный корм затем обработали любой из 1, 2 и 3 кг/т составов, перечисленных ниже. Через 24 часа 10 г навесок обработанного корма суспендировали в 90 мл буфера Баттерфилда. Разведения высевали на агар XLT-4 и инкубировали при 37C в течение 48 часов перед подсчетом колоний Salmonella. Дополнительные образцы для подсчитывания Salmonella отобрали на 7, 14 и 21 сутки после обработки. Применяемые формулы показаны в следующей таблице.
ХИМИЧЕСКИЕ СОСТАВЫ ДЛЯ ПРИМЕРА 6
Химическиеформулы
% химического вещества в составе
17
18
22
25
27
HCHO
CO60*
0,00
0,00
5,00
8,00
10,00
0,00
Пеларгоновая кислота
5,00
5,00
5,00
5,00
5,00
0,00
Уксусная кислота (56%)
45,00
20,00
40,00
36,00
40,00
0,00
Транс-2-гексеналь
30,00
25,00
5,00
10,00
5,00
0,00
Пропионовая кислота
20,00
50,00
15,00
15,00
10,00
10,00
Молочная кислота
0,00
0,00
30,00
26,00
30,00
0,00
Формальдегид (37%)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
90,00
Всего
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
100,00
*CO-60 представляет собой поверхностно-активное вещество на основе этоксилированного касторового масла с 60 структурными единицами этилена.
Результаты: в следующей таблице показано, что несколько составов были эффективными в контролировании Salmonella.
Эффект химических веществ в отношении Salmonella на 1, 7 и 14 сутки после обработки
Обработка
Степень
Salmonellaна 24 час
Salmonellaна 7 сутки
Salmonellaна 14 сутки
Salmonellaна 21 сутки
Формула
Дозакг/т
КОЕ/г
%уменьшения
КОЕ/г
%уменьшения
КОЕ/г
%уменьшения
КОЕ/г
%уменьшения
17
0
56408
11969
25889
4150
1
14600
74,1
4550
62,0
11400
56,0
1633
60,7
2
3900
93,1
1400
88,3
4833
81,3
267
93,6
3
2900
80,1
1150
90,4
1300
95,0
0
100,0
18
0
56408
11969
25889
4150
1
18400
67,4
2200
81,6
10533
59,3
1300
68,7
2
5400
90,4
2900
75,8
5133
80,2
200
95,2
3
1800
96,8
1317
89,0
1767
93,2
33
99,2
22
0
56408
11969
25889
4150
1
43000
23,8
10217
14,6
17667
31,8
2567
38,1
2
31000
45,0
6450
46,1
15167
41,4
800
80,7
3
26600
52,8
2133
82,2
11500
55,6
233
94,4
25
0
56408
11969
25889
4150
1
19450
65,5
7217
39,7
13233
48,9
1300
68,7
2
9500
83,2
1967
83,6
9333
63,9
367
91,2
3
5900
89,5
767
93,6
8867
65,7
450
89,2
27
0
56408
11969
25889
4150
1
33000
41,5
10017
16,3
13600
47,5
633
84,7
2
24150
57,2
9367
21,7
11933
53,9
367
91,2
3
17150
69,6
4983
58,4
7367
71,5
267
93,6
HCHO*
0
56408
11969
25889
1
150
99,7
0
100,0
0
100,0
2
150
99,7
0
100,0
0
100,0
3
0
100,0
0
100,0
0
100,0
*Сочетание формальдегида (33%)/пропионовой кислоты
Выводы: все составы через 2 или 3 недели после обработки давали в результате эффективность больше 90%.
Пример 7
o
o
Данный эксперимент заключался в определении того, имела ли формула №18 остаточную активность после обработки. Коммерческий корм для домашней птицы размололи с помощью мельницы от Romer до размера тонкодисперсных частиц, чтобы гарантировать равномерное смешивание инокулята с кормом. Корм (навески по 1 кг) перенесли в стеклянную посуду на 1 галлон, где случайным образом была назначена обработка. Содержимое стеклянной посуды на 1 галлон добавили в кормомешалку лабораторного масштаба и перемешивали в течение 1-2 минут перед обработкой 0, 1, 2, или 3 кг/т формулы №18. Была однократная повторность внесения на уровень обработки. После обработки корм повторно заражали 10 г инокулята Salmonella и перемешивали в течение дополнительных 2-3 минут. Содержимое мешалки перенесли в исходный стеклянный сосуд на 1 галлон, закупорили и дали возможность находиться при комнатной температуре (23-24C) в течение 1 суток. Образцы корма (три навески в 10 г/обработка) получили на 24 ч, 7 и 14 сутки после повторного заражения при помощи стерильных способов. Навески перенесли в колбы для разбавления, содержащие 100 мл буфера Баттерфилда. Серийные разведения высевали на 2 разделенные чашки с агаром XLT-4. Чашки с агаром инкубировали при 37C в течение 48 часов перед подсчетом Salmonella.
Уровень Salmonella из трех повторностей образец/обработка на различных промежутках времени усреднили, и об этом сообщают в следующей таблице.
% эффективности против повторного заражения Salmonella
Формула №18(доза)
Сутки 1
Сутки 7
Сутки 14
1 кг/т
63
70
54
2 кг/т
75
45
87
3 кг/т
82
73
98
Наблюдали, что формула №18 удерживала эффективность через 14 суток после того, как корм заразили Salmonella.
Специалистам в данной области техники будет очевидно, что в настоящее изобретение можно внести ряд модификаций и вариаций, не отступая от объема настоящего изобретения. Подразумевается, что описание и примеры рассматриваются только как иллюстративные и не являются ограничительными, при этом истинный объем и сущность настоящего изобретения указаны в следующей формуле изобретения.