УНИВЕРСАЛЬНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ БОЛЕЗНИ ЛАЙМА ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ У ЛЮДЕЙ И В ВЕТЕРИНАРИИ И СПОСОБ ЕЕ ПРОИЗВОДСТВА
UNIVERSAL VACCINE FOR TREATING AND PREVENTING LYME DISEASE APPLICABLE IN HUMAN AND VETERINARY SCIENCE, AND METHOD FOR PREPARING IT

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к композиции универсальной вакцины для лечения и профилактики болезни Лайма для применения у людей и в ветеринарии и способу ее производства.
СОВРЕМЕННЫЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
"The biological and social phenomenon of Lyme disease" (Barbour AG, Fish D, Science. 1993 Jun 11;260(5114):1610-6)
Болезнь Лайма представляет собой хроническое инфекционное заболевание, характеризующееся множественным поражением систем органов. Это наиболее распространенное, переносимое членистоногими заболевание в Европе и Соединенных Штатах. Значимость этого заболевания показана в ряде публикаций в журналах, посвященных инфекционным заболеваниям. С этой точки зрения, в ряду болезней, за последнее десятилетие, болезнь Лайма становится сразу за приобретенным синдромом иммунодефицита, как описано, например, в .
Borrelia burgdorferi sensu lato
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia garinii
Borrelia afzeli
Заболевание вызывается группой спирохет с общим названием . Эта группа микроорганизмов, главным образом, включает три близкородственных подвида, т.е. ,  и . В то время как  является причиной практически всех случаев Болезни Лайма на Северо-Американском континенте, в Европе преобладают  и .
"Experimental immunization against Lyme borreliosis with recombinant Osp proteins: an overview" (Sadziene A, Barbour AG., Infecrion. 1996 Mar-Apr;24(2): 195-202)
Серьезные поражения организма-хозяина млекопитающего, а также проблемы, связанные с диагностикой и лечением болезни Лайма, являются существенными стимулами для разработки эффективных вакцин. С другой стороны, существуют сомнения в отношении разработки вакцин и их использования, особенно у человека. Основными причинами являются отсутствие контагиозности заболевания, то, что его довольно просто можно лечить антибиотиками, а клинические проявления с серьезными последствиями возникают только у части инфицированных пациентов. Более того, это заболевание редко заканчивается летальным исходом. Таким образом, опасение, связанное с возможными побочными эффектами новой вакцины, которая, в данных условиях, была бы с трудом разрешена к применению, не является неожиданностью, как описано в статье .
"Performance of a Borrelia burgdorferi bacterin in borreliosis-endemic areas" (Levy SA, Lissman BA, Ficke СМ., J Am Vet Med Assoc. 1993 Jun 1;202(11):1834-8) and "Immunization against Lyme Disease?" (Wormser, GP., Ann Intern Med 123,627-629,1995).
Первая ветеринарная вакцина против боррелиоза была разработана для собак в Соединенных Штатах в 1990 году. Лицензия для нее была получена в 1992 году, в соответствии со статьями
Цельноклеточную, химически инактивированную вакцину применяют с использованием носителя, содержащего вещество полимерного адъюванта. Вакцину применяют внутримышечно, дважды с интервалом в две или три недели. Поддерживающая доза (ревакцинация) рекомендована по прошествии года. Вакцинация домашних животных, особенно собак, рекомендована независимо от того, было ли животное инфицировано или заболевание как раз на стадии прогрессирования. Получение данной вакцины основано на знаниях, полученных в экспериментах на грызунах. Протективный эффект цельноклеточной вакцины впервые описан у хомяков.
"Molecular mimicry and Lyme borreliosis: a shared antigenic determinant between Borrelia burgdorferi and human tissue" (Aberer E et al., Ann Neurol. 1989 Dec; 26(6)732-7) или "Serologic response to the Borrelia burgdorferi flagellin demonstrates an epitope common to a neuroblastoma cell line". (Fikrig et al. 1993, Proc Nat Acad Sci USA. 1993 Jan 1;90(1): 183-7).
Разработке цельноклеточной вакцины для ветеринарных целей, главным образом, способствовали простой способ получения и низкая стоимость. Однако эта вакцина не была рекомендована для использования у людей из-за того, что некоторые антигены боррелии реагируют с антигенами человека, и, таким образом, нельзя исключить стимуляцию иммунопатологических процессов, как описано в
Borrelia burgdorferi
"Involvement of CD4+ T lymphocytes in induction of severe destructive Lyme arthritis in inbred LSH hamsters" (Lim LC et al., Infect Immun. 1995 Dec; 63(12):4818-25).
Получены данные, что некоторые антигены  активируют пул специфичных T лимфоцитов, принимающих участие в развитии артрита у хомяков, смотри
"Serum-mediated resolution of Lyme arthritis in mice" (Barthold SW et al, Lab. Invest. 1996, Jan;74(1):57-67)
"Protective and arthritis-resolving activity in sera of mice infected with Borrelia burgdorferi" (Barthold SW et al., Clin Infect Dis 1997 Jul; 25 Suppl 1:S9-17.)
"Experimental infection of the hamster with Borrelia Burgdorferi" (Johnson RC et al., Ann Acad Sci. 1988;539:258-63).
Кролики оказывались защищенными от инфекции, если перед проведением экспериментального заражения применяли иммунную сыворотку, полученную после иммунизации животных иммуногенными белками штамма боррелии. Введение иммунной сыворотки после возникновения инфекции не препятствовало развитию мигрирующей эритемы и висцеральных типов проявления инфекции. Аналогичные результаты также были получены для мышей и хомяков и описаны в или или
"Protection of mice against the Lyme Disease agent by immunizing with recombinant OspA" (Firking E et al., Science 1990 Oct 26; 250(4980):553-6)
"Long-term protection of mice from Lyme Disease by vaccination with OspA" (Firking E et al., Infect Immun. 1992 Mar; 60(3):773-7).
"Safety and immunogenicity of a recombinant outer surface protein A Lyme vaccine" (Keller D et al., JAMA. 1994 Jun 8;271(22): 1764-8)
"Elimination of Borrelia burgdorferi from vector ticks feeding on OspA-immunized mice" (Firking E et al.,Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Jun 15;89(12):5418-21)
Полученные экспериментальные данные подчеркивают возможность разработки безопасной субъединичной вакцины. Основными антигенами-кандидатами такой вакцины являются белки наружной мембраны (Osp), обозначенные как OspA, В, С и D. Особенно тщательно исследовали белок OspA. Протективный эффект данной субъединичной вакцины экспериментально подтвердили на мышах, хомяках и кроликах и описали в статьях и Лабораторные тесты подтвердили, что применение этого белка в форме очищенного рекомбинантного белка, полученного путем образования соединения с липидами, при парентеральном введении стимулирует защитный иммунитет и защищает от боррелиозной инфекции, внесенной посредством инъекции или через клещевого переносчика инфекции. Также было подтверждено, что зараженные клещи, присасавшиеся к иммунизированным животным, теряли свою инфективность, как описано в или .
"Role of attached lipid in immunogenicity of Borrelia burgdorferi OspA" (Erdile IF et al., Infect Immun. 1993 Jan;61(1):81-90).
В случае отсутствия липидных частиц, образование антител путем стимуляции требует адъювантного эффекта полного адъюванта Фрейнда или другого иммунного адъюванта, как описано в статье При этом отмечено на два возможных эффекта вакцинации:
(1) Спирохеты инактивированы уже в организме клеща и, таким образом, предотвращается передача инфекции,
(2) Спирохеты могут быть быстро инактивированы после попадания в организм хозяина, непосредственно перед антигенными вариациями и снижением выработки антигена OspA.
Для подтверждения протективного эффекта антигена OspA были получены две различные конструкции и составы вакцины:
"Recombinant outer surface protein A from Borrelia burgdorferi induces antibody protective against spirochetal infection in mice" (Simon MM et al.,.J Infect Dis. 1991 Jul;164(1):123-32).
1. Нативный и очищенный рекомбинантный OspA, описанный в
"Protective immunity elicited by rBCG viccines" (Stover CK et al., Dev Biol Stand. 1994; 82:163-70).
"Systemic and mucosal immunity induced by BCG vector expressing outer-surface protein A of Borrelia burgdorferi" (Langermann S et al., Nature. 1994 Dec 8;372(6506):552-5).
"Protective immunity elicited by recombinant bacille Calmette-Guerin (BCG) expressing outer surface protein A (OspA) lipoprotein: a candidate Lyme Disease vaccine" (Stover CK et al., J Exp Med. 1993 Jul 1;178(1):197-209).
2. OspA, включенный в геном BCG (Calmette, Guerin). OspA экспрессируется снаружи в качестве мембрано-связанного липопротеина, как следует из статьи В данной форме OspA исследовали при внутрибрюшинном и интраназальном введении, как опубликовано в При применении в данной форме, специфичные антитела IgG и IgA вырабатывались в течение длительного времени, что очевидно из статьи
"Vaccination against Lyme Disease with recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface lipoprotein A with adjuvant. Lyme Disease Vaccine Study Group" (Steere AC et al., N Engl J Med, 1998 Jul 23; 339(4):209-15).
"A vaccine, consisting of recombinant Borrelia burgdorferi outer-surface protein A to prevent Lyme Disease. Recombinant Outer-Surface protein A Lyme Disease Vaccine Study Consortium" (Sigal LH et al., N Engl J Med. 1998 Jul 23; 339(4):216-22. Erratum in: N Engl J Med 1998 Aug 20; 339(8):571).
В настоящее время существует единственный производитель данной вакцины для применения у человека в Соединенных Штатах Америки. Вакцина была одобрена управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA) 21-го декабря 1998 и описана в исследовании Продукт LYMErix производится SmithKline Beecham. Согласно третьей фазе клинических испытаний, вакцина обеспечивает 80-90% защиту, что подтверждено в статье
"Guarded endorsement for Lyme Disease vaccine" (Marwick C, JAMA. 1998 Jun 24;279(24):1937-8).
Хотя вакцина уже получила распространение, из-за минимальных сведений о ее долговременном применении, она находится под постоянным контролем. Для достижения максимального иммунного ответа, вакцину применяют инъекционно три раза в течение 12-месячного периода (0, 1, 12). Эффективность вакцины описал, например, Wahlberg, который утверждал, что эффективность вакцины составляла 50% (1 год) после двух доз рекомбинантного белка OspA, связанного с гидроксидом алюминия в фосфатном буфере, и 79% после трех доз вакцины (20 месяцев). Титр антител достаточно быстро снижался и через два года достигал уровня первого года вакцинации (50% эффективность). Данные о вторичном иммунном ответе отсутствуют. Согласно данным, не разрешено применение вакцины у детей в возрасте до 15 лет и у людей, страдающих аутоиммунными заболеваниями, в частности артритом. В группе из 5765 вакцинированных людей артрит развился у двух человек с фенотипом HLA-DR4, как опубликовано в статье
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Borrelia burgdorferi sensu stricto
"Protective immunization with plasmid DNA containing the outer surface lipoprotein A gene of Borrelia burgdorferi is independent of an eukaryotic promoter" (Simon MM et al., Eur J Immunol. 1996 Dec;26(12):2831-40)
"DNA vaccines expressing a fusion product of outer surface proteins A and С from Borrelia burgdorferi induce protective antibodies suitable for prophylaxis but not for resolution of Lyme Disease" (Wallich R. et al., Infect Immun. 2001 Apr;69(4):2130-6).
Коммерчески доступную вакцину получают из белка OspA из . В связи с тем, что эта бактерия является доминантным инфекционным возбудителем болезни Лайма на Северо-Американском континенте, вакцина может быть достаточно эффективной в отношении населения США. В Европе, однако, это заболевание, главным образом, вызывают следующие три патогенных подвида, т.е. , и . На Европейском континенте антигенная вариабельность была описана для всех данных видов. Таким образом, вакцина для применения у людей и в ветеринарии, полученная только из вида  является непригодной для применения в Европе. Для разработки эффективной формы вакцины применяли новые направления технологий вакцинации. Например, об эффективной ДНК вакцине опубликовано в или
"Protective immunization with plasmid DNA containing the outer surface lipoprotein A gene of Borrelia burgdorferi is independent of an eukaryotic promoter" (Simon MM et al., Eur. J. Immunol. 26, 2831-2840, 1996).
Другой возможностью является получение вакцины из белка OspC, экспрессируемого на поверхности микроорганизмов, находящихся в организме хозяина. По данным литературы, гуморальный иммунитет против данного белка носит протективный характер, как описано в
Borrelia burgdorferi sensu stricto
"Four clones of Borrelia burgdorferi sensu stricto case invasive infection in humans" (Seinost G et al., Infect. Immun. 67, 3518-3524, 1999).
OspC является основным мембранным антигеном, экспрессируемым на ранней стадии инфекции. В случае , антиген OspC является высоко вариабельным. Двадцать одна аллельная группа, известная как A-U, была обнаружена для этого антигена с помощью эпидемиологического анализа и секвенирования генов OspC конкретных штаммов и с использованием GeneBank, как описано в
Borrelia burgdorferi
,
"Induction of an outer surface protein of Borrelia burgdorferi during tick feeding" (Schwan TG et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 2909-2913. 1995).
Наружный поверхностный антиген A (OspA) является основным поверхностным антигеном, который  экспрессирует вовнекогда находится внутри клеща. В момент, когда клещ начинает сосать кровь млекопитающего, синтез этого антигена возобновляется, а синтез антигена OspC наоборот усиливается. Таким образом, OspC становится основным антигеном наружной поверхности мембраны на ранней стадии инфекции, который описан, например, в Хотя и было показано, что OspC ограниченно присутствует на поверхности, он является мощным иммуногеном. Иммунизация с помощью OspC защищает от боррелиозной инфекции. Однако защита связана с конкретным аллелем OspC, который контролирует синтез конкретного белка. Инфекция другим видом боррелии вызывает заболевание у индивида, подвергнутого иммунизации. Это, естественным образом, ограничивает использование данного антигена, полученного только из одного геновида боррелии, при получении универсальной вакцины.
Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii
Borrelia garinii
"Canine borreliosis" (Littman MP, Vet Clin Small Anim 33, 2003, 827-862),
"Equine Abortion Associated with the Borrelia parker i- B. turicatae Tick-Borne Relapsing Fever Spirochete Group" (Walker RL et al., Journal of Clinical Microbiology, 2002, 40, 4, 1558-1562).
Таким образом, вопрос об успешной вакцинации против болезни Лайма остается открытым. Более того, в Европе это осложняется существованием трех различных геновидов (и) и возникновением болезни Лайма не только у людей, но также у разных видов домашних животных и скота. Проблемы, касающиеся этого заболевания у собак и кошек, описаны в а заболеваемость лошадей рассмотрена в
"OspC vaccine candidate" (Abstract of the Symposium on the Pathogenesis and Management of Tick-borne Diseases. 1998 Sept. 28-30. Vienna, Austria. 1998).
Livey et al. попытались преодолеть эти проблемы получением так называемой "вакцины-коктейля". Их результаты опубликованы в
Borrelia burgdorferi sensu lato
Borrelia burgdorferi,
E. coli
Вместе с существующими проблемами диагностики и лечения болезни Лайма, а также из-за невозможности эффективно контролировать и сокращать распространение векторов боррелий, существует экстренная необходимость в вакцине, способной осуществлять эффективную иммунизацию восприимчивых видов домашних животных и скота, а также людей против инфекции, вызываемой . Вакцины, созданные на основе цельноклеточной бактериальной вакцины из  были разработаны для домашних животных, как, например, описано в патентных документах US 4721617, US 6316005. Аналогично, вакцины, содержащие OspA, OspC или другие иммуногенные белки наружной поверхности, полученные из культур культивируемых боррелий, вырабатываемые в качестве рекомбинантных белков в различных клетках-хозяевах (), или полученные синтетически, были разработаны как описано в документах WO 094/25596, WO 96/05313, WO 9749812, US 6716574, US 2004067517, US 6676942, WO 0216422, US 5530103, US 6486130, US 6464985, EP 633028).
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia garinii
Borrelia afzelii
Borrelia burgdorferi sensu stricto.
Однако эти цельноклеточные или субъединичные вакцины не включали защиту от полного спектра патогенных боррелий всех геновидов, главным образом, ,  и  и других, в зависимости от конкретного случая. Вакцины всегда производят из единственного геновида -
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia garinii
Borrelia afzelii
Задачей по данному изобретению является предоставление новой универсальной вакцины, содержащей основные иммуногенные белки OspA и OspC в различных комбинациях из одного двух или, предпочтительно, всех трех широко известных патогенных геновидов, т.е. , и , или, возможно, других, которую можно успешно применять без каких-либо территориальных ограничений.
ОБЪЕКТ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Упомянутая выше цель достигается созданием универсальной вакцины для лечения и профилактики болезни Лайма для использования у людей и в ветеринарии, созданной на основе цельноклеточной бактериальной вакцины или бактериальных лизатов или очищенных препаратов из, по меньшей мере, одного или нескольких геновидов боррелий, суть чего заключается в том факте, что каждый геновид боррелии, предпочтительно выбранный из группы ,  и , содержит, как минимум, один иммуногенный протективный белок наружной мембраны, либо OspA или OspC или одновременно оба иммуногенных протективных белка OspA и OspC, или, возможно, другие иммуногенные протективные белки наружной мембраны.
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garrinii
Предпочтительный вариант вакцины включает все три наиболее патогенных геновида - ,  и , каждый из которых содержит одновременно оба иммуногенных протективных белка наружной мембраны OspA и OspC.
Более того, объектом по настоящему изобретению является то, что иммуногенные протективные белки наружной мембраны OspA и OspC включены в вакцину предпочтительно в соотношении 1:1, то, что вакцину выпускают в лиофилизированной или жидкой форме или применяют в буферном физиологическом растворе или с минеральным или масляным иммунологическим адъювантом, или, возможно, с другими иммуномодулирующими средствами, и то, что величина pH вакцины находится в диапазоне 4-9.
В заключение, объектом по настоящему изобретению является способ производства универсальной вакцины для лечения и профилактики болезни Лайма у людей и применения в ветеринарии по пп.1-5, в течение которого каждый производственный штамм боррелии, культивируют, инактивируют и независимо проверяют перед составлением смеси, где культура пролиферирует и воспроизводится предпочтительно при 26-35°C в течение 6-18 суток (каждый этап) для экспрессии антигена OspA и при 36-38°C в течение 6-18 суток (каждый этап) для экспрессии антигена OspC.
Новый эффект представленного изобретения заключается в том, что специфичные антитела к OspA и OspC вырабатываются в организме подвергнутых вакцинации животных и людей после применения вакцины, которая предотвращает перенос патогенных боррелий из клеща в подвергнутый вакцинации организм (антитела к OspA) и обеспечивают гибель боррелий вскоре после возможного переноса патогенных боррелий в подвергнутый вакцинации организм (антитела к OspC) и, возможно, в образовании других поствакцинационных протективных антител, это не определено в деталях, и в стимуляции иммунных механизмов. Другим полезным эффектом является то, что помимо общепринятого применения у взрослых особей, вакцину можно применять у молодых домашних животных (предпочтительно, собак и кошек) и молодого скота (предпочтительно, лошадей) в возрасте от 3 недель для индукции активного протективного иммунитета против болезни Лайма. Аналогично, вакцину можно применять одновременно с другими препаратами, лекарственными средствами и вакцинами против вирусных, бактериальных, грибковых и других заболевания у собак, кошек, лошадей и других видов животных, для которых предназначена вакцина.
ПРИМЕРЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
Пример № 1:
Borrelia burgdorferi sensu lato
Данный пример осуществления демонстрирует подтверждение протективности универсальной вакцины после иммунизации экспериментальных кошек, собак и лошадей против инфекции, вызываемой вирулентными штаммами , однако, ни в одном из случаев не ограничивает патентные права, относящиеся к данной патентной заявке.
Получение экспериментального образца вакцины и результаты эксперимента:
A) Культивирование производственных штаммов боррелий, экспрессирующих антиген OspA:
Во время культивирования производственных штаммов боррелий, экспрессирующих антиген OspA, в качестве исходных составляющих на начальном этапе использовали следующие средства:
- среда BSK-H + кроличья сыворотка
- среда BSK-H, полная
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Borrelia burgdorferi sensu stricto
вместе с производственными штаммами ,  и  согласно следующей схеме технологии производства:
Приготовление среды для культивирования
↓
Производственные штаммы
↓
Воспроизведение
→
Контроль роста и очистки
↓
Размножение отдельных штаммов
→
Контроль роста и очистки, Определение количества, Определение присутствия OspA
↓
Инактивирование отдельных штаммов
→
Проверка на инактивирование
↓
Концентрация, очистка антигена
→
Определение отсутствия сыворотки
↓
Стабилизация антигена
→
Контроль стерильности, определение и регулирование pH
↓
Завершение создания вакцины и адсорбирование на гидроксиде алюминия
→
Контроль стерильности, определение pH
↓
Наполнение, упаковка, заключительный контроль
Примечание: каждый штамм боррелии (<i>Borrelia afzelii</i>, <i>garinii</i> и <i>burgdorferi sensu stricto</i>) культивируют, контролируют, инактивируют и проверяют по отдельности до того как смешивают все штаммы (включая штаммы, экспрессирующие антиген OspC).
Собственно культивирование осуществляют в пластиковых или стеклянных матрасах Ру, предназначенных для культивирования культур боррелий. Культуральную среду BSK обогащают 6% стерильной кроличьей сывороткой, подходящей для культивирования боррелий, перед самим культивированием, или можно использовать полную среду BSK-H, содержащую 6% кроличью сыворотку. Исходный и рабочий производственные штаммы поддерживают в жидком азоте при -196°C.
Для восстановления культуры, ампулу с культурой достают из жидкого азота и размораживают приблизительно при 30°C. Сразу после размораживания культуру пересевают в пробирку с питательной средой, нагретую до приблизительно 28°C в соотношении 1+9 (1 часть культуры + 9 частей среды). Каждый штамм культивируют отдельно. Инкубацию осуществляют при 26-35°C в течение от 6 до 18 суток.
При размножении культуры, за хорошо растущей, жизнеспособной культурой (когда красный цвет среды изменяется на желтый) наблюдают в микроскоп и в стерильных условиях пересевают в питательную среду в соотношении 1 часть культуры + 9 частей среды. Культивирование проводят при 26-35°C в течение 6-10 суток. Дальнейшие пассажи хорошо растущих боррелий проводят в соотношении 1 часть культуры: от 10 до 100 частей культуральной среды. Число дальнейших пассажей зависит от количества боррелий, необходимого для получения вакцины.
При получении культуры для производства вакцины, взрослые культуры после предыдущих культивирований в стерильных условиях используют в качестве посевной культуры, применяемой в бульоне во флаконах объемом 1000-мл в соотношении 1 часть культуры: от 10 до 100 частей культуральной среды. Культивирование проводят при 26-35°C в течение 6-10 суток.
Количество боррелий определяют в темном поле микроскопа с помощью значений счетной камеры Петрова-Хауссера.
В ходе процесса, контроль за ростом культуры и чистотой осуществляют макроскопически, микроскопически и наблюдением за культивированием. Макроскопическое наблюдение состоит в визуальном наблюдении за тем, изменяет ли соответствующая культура красный цвет культуральной среды на желтый, и присутствует ли в среде осадок. При микроскопическом наблюдении за темными полями в микроскопе осуществляют контроль за достаточной подвижностью боррелий и наличием небольшого количества детрита, без каких-либо признаков бактериальной контаминации. При наблюдении за культивированием, 0,5 мл оцениваемой культуры боррелий переносят на предварительно высушенный кровяной агар и проводят культивирование при 35-37°C в течение 48 часов.
При оценке теста, наличие какого-либо видимого нежелательного бактериального роста влечет за собой отбраковывание культур с бактериальной контаминацией.
Присутствие OspA определяют с помощью электрофореза белков в ПААГ в присутствии ДСН (SDS) после окрашивания голубым Кумасси или иммунологическим способом вестерн-блоттинг с использованием антисыворотки против OspA.
B) Культивирование производственных штаммов боррелии для экспрессии антигена OspC:
Для осуществления культивирования использовали те же самые исходные составляющие, производственные штаммы и схему технологии производства, что и при выработке антигена OspA, описанного в A).
Аналогично, собственно культивирование протекает таким же образом с той лишь разницей, что при восстановлении культуры, ампулу с размораживаемой культурой пересевают в пробирку с жидкой средой, нагретой до приблизительно 37°C в соотношении 1+9 (1 часть культуры + 9 частей среды) и проводят инкубирование при 36-38°C в течение от 6 до 18 суток. Точно так же, размножение культуры проводят аналогичным способом, но с разницей в том, что культивирование проводят при 36-38°C в течение 6-10 суток. Получение культуры для производства вакцины, определение количества боррелий, контроль за ходом процесса, контроль за ростом и чистотой культуры и определение присутствия OspC проводят таким же образом, как описано в A).
C) Надлежащий способ получения окончательного вида вакцины:
Borrelia burgdorferi senzu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Концентрированные, очищенные, устойчивые и инактивированные бактериальные штаммы ,  и , для которых доказана выработка белка наружной мембраны OspA, и концентрированные, очищенные, устойчивые и инактивированные бактериальные штаммы ,  и , для которых доказана выработка белка наружной мембраны OspC, смешивали вместе таким образом, что OspA и OspC отдельного геновида боррелии присутствовали в одинаковом соотношении. Далее компонент боррелий (90% объема) смешивали с гелеобразным гидроксидом алюминия (10% объема). После тщательной гомогенизации проверяли pH и доводили до величины между 7,5 и 8,0. Флаконы для хранения наполняли вакциной и проводили пробу на стерильность. Далее, флаконы для отправки наполняли вакциной, упаковывали и отправляли для окончательной проверки.
D) Результаты иследования
a) Проверка эффективности у кошек:
Ixodes ricinus
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Шесть кошек подвергали вакцинации и ревакцинации с помощью экспериментального образца вакцины и через 90 суток их заражали клещами (), естественным образом инфицированными геновидами ,  и . В качестве контроля использовали трех кошек, не подвергнутых вакцинации.
Ixodes ricinus
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Кошек вакцинировали подкожно с помощью 1 мл вакцины и спустя 3 недели таким же образом проводили ревакцинацию. Кровь брали перед вакцинацией и ревакцинацией. В дальнейшем кровь брали спустя 1 месяц после ревакцинации. Спустя три месяца после ревакцинации кошек заражали собранными естественным образом клещами (), которые были естественным образом заражены всеми тремя наиболее патогенными геновидами - ,  и . Степень инфицированности клещей проверяли перед началом экспериментального заражения.
После заражения, каждый день всем экспериментальным животным (подвергнутым и не подвергнутым вакцинации, служащих контролем кошкам) проводили клинический осмотр и регистрировали состояние их здоровья, включая измерение температуры тела. После заражения, кровь всех экспериментальных животных брали для проверки на 14, 28, 42 и 60 сутки. Кровь также брали в день заражения, сразу после заражения клещами. На 7, 28 и 60 сутки после заражения, брали образцы кожи для биопсии в тех местах, где присасывались клещи для того, чтобы заново выделить боррелии из этих образцов. На 60 сутки после заражения всех экспериментальных животных умерщвляли и проводили патолого-анатомическое вскрытие и в качестве образцов брали мышцу, суставную жидкость, лимфатический узел, кожу и почки для того, чтобы заново выделить боррелии из этих предрасполагающих участков.
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Полученные результаты представлены в сводных таблицах № 1, 2, 3 и 4. Из полученных результатов однозначно следует, что вакцина против боррелиоза, полученная из производственных штаммов ,  и , экспрессирующих поверхностные белки OspA и OspC, является безвредной для кошек и способствует выработке у них протективного иммунитета против природной клещевой инфекции всех трех наиболее патогенных геновидов ,  и , и, возможно, вследствие перекрестного иммунитета, других известных геновидов боррелий.
Таблица № 1
Схема эксперимента заражения кошки
Кошка №
Вакци-нация
Ревакцинация
Заражение
Образцы биологического материала после заражения, сутки
Пометка
7
14
28
35
42
49
56
60
1V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневнов клинике
2V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
BKP
Ежедневнов клинике
3V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневнов клинике
4V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневнов клинике
5V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневнов клинике
6V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневнов клинике
7KO
-
-
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневнов клинике
8KO
-
-
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневнов клинике
9KO
-
-
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневнов клинике
Пояснения:V - вакцинацияКО - не подвергнутые вакцинации контроли+ - действие выполняли- - действие не выполнялиВ - биопсия кожиК - забор кровиP - патолого-анатомическое вскрытие
Таблица № 2
Клиническая оценка после заражения
Кошка №
Клинические изменения после заражения, сутки
Пометка
7
14
21
28
35
42
49
56
60
1V
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ежедневный клинический осмотр
2V
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ежедневный клинический осмотр
3V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
Ежедневный клинический осмотр
4V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
Ежедневный клинический осмотр
5V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
Ежедневный клинический осмотр
6V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
Ежедневный клинический осмотр
7KO
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
+
+
+
Ежедневный клинический осмотр
8KO
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
+
+
Ежедневный клинический осмотр
9KO
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
+
Ежедневный клинический осмотр
Пояснения:+ - наличие клинических симптомов- - отсутствие клинических симптомов
Таблица № 3
Обнаружение боррелий в биоптатах кожи после заражения
Кошка №
Период взятия биоптатов кожи, сутки
Пометка
7
28
60
1V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
2V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
3V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
4V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
5V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
6V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
7KO
+
<b>-</b>
<b>-</b>
8KO
+
<b>-</b>
<b>-</b>
9KO
+
+
<b>-</b>
Пояснения:+ - положительный результат- - отрицательный результат
Таблица № 4
Обнаружение боррелий в органах
Кошка №
Органы, подверженные предрасположенности (вскрытие на 60 сутки)
Пометка
Мышца
Кожа
Лимфатический узел
Суставная жидкость
Почка
1V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
2V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
3V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
4V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
5V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
6V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
7KO
<b>-</b>
<b>-</b>
+
+
<b>-</b>
PA- полож.
8KO
+
<b>-</b>
+
+
<b>-</b>
PA- полож.
9KO
+
<b>-</b>
+
+
<b>-</b>
PA- полож.
Пояснения:+ - положительный результат- - отрицательный результатPA - патолого-анатомическое вскрытие
b) Проверка эффективности у собак:
Ixodes ricinus
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Шесть собак подвергали вакцинации и ревакцинации с помощью экспериментального образца вакцины и через 90 суток их заражали клещами (), естественным образом инфицированными геновидами ,  и . В качестве контроля использовали трех собак, не подвергнутых вакцинации. Вакцинацию, ревакцинацию, забор крови, клиническую оценку, взятие образцов для исследования и другие манипуляции проводили так же как в исследовании для кошек.
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Полученные результаты представлены в сводных таблицах № 5, 6, 7 и 8. Из полученных результатов однозначно следует, что вакцина против боррелиоза, полученная из производственных штаммов ,  и , экспрессирующих поверхностные белки OspA и OspC, является безвредной для собак и способствует выработке у них протективного иммунитета против природной клещевой инфекции всех трех наиболее патогенных геновидов ,  и , и, возможно, вследствие перекрестного иммунитета, других известных геновидов боррелий.
Таблица № 5
Схема эксперимента заражения собаки
Собака №
Вакци-нация
Ревакци-нация
Заражение
Образцы биологического материала после заражения, сутки
Пометка
7
14
28
35
42
49
56
60
1V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
2V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
BKP
Ежедневно в клинике
3V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
4V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
5V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
6V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
7KO
-
-
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
8KO
-
-
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
9KO
-
-
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
Пояснения:V - вакцинацияКО - не подвергнутые вакцинации контроли+ - действие выполняли
- - действие не выполнялиВ - биопсия кожиК - забор кровиP - патолого-анатомическое вскрытие
Таблица № 6
Клиническая оценка после заражения
Собака №
Клинические изменения после заражения, сутки
Пометка
7
14
21
28
35
42
49
56
60
1V
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ежедневный клинический осмотр
2V
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ежедневный клинический осмотр
3V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
Ежедневный клинический осмотр
4V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
Ежедневный клинический осмотр
5V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
Ежедневный клинический осмотр
6V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
Ежедневный клинический осмотр
7KO
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
+
+
Ежедневный клинический осмотр
8KO
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
+
+
Ежедневный клинический осмотр
9KO
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
+
+
Ежедневный клинический осмотр
Пояснения:+ - наличие клинических симптомов- - отсутствие клинических симптомов
Таблица № 7
Обнаружение боррелий в биоптатах кожи после заражения
Собака №
Период взятия биоптатов кожи, сутки
Пометка
7
28
60
1V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
2V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
3V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
4V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
5V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
6V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
7KO
+
<b>-</b>
<b>-</b>
8KO
+
+
<b>-</b>
9KO
+
+
<b>-</b>
Таблица № 8
Обнаружение боррелий в органах
Собака №
Органы, подверженные предрасположенности (вскрытие на 60 сутки)
Пометка
Мышца
Кожа
Лимфатический узел
Суставная жидкость
Почка
1V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
2V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
3V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
4V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
5V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
6V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
7KO
+
<b>-</b>
+
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- полож.
8KO
+
<b>-</b>
+
+
<b>-</b>
PA- полож.
9KO
+
<b>-</b>
+
+
<b>-</b>
PA- полож.
Пояснения:+ - положительный результат- - отрицательный результатPA - патолого-анатомическое вскрытие
c) Проверка эффективности у лошадей:
Ixodes ricinus
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Шесть лошадей подвергали вакцинации и ревакцинации с помощью экспериментального образца вакцины и через 90 суток их заражали клещами (), естественным образом инфицированными геновидами ,  и . В качестве контроля использовали трех лошадей, не подвергнутых вакцинации.
Вакцинацию, ревакцинацию, забор крови, клиническую оценку, взятие образцов для исследования и другие манипуляции проводили так же, как в исследовании для кошек и собак.
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Borrelia burgdorferi sensu stricto
Borrelia afzelii
Borrelia garinii
Полученные результаты представлены в сводных таблицах № 9, 10, 11 и 12. Из полученных результатов однозначно следует, что вакцина против боррелиоза, полученная из производственных штаммов ,  и , экспрессирующих поверхностные белки OspA и OspC, является безвредной для лошадей и способствует выработке у них протективного иммунитета против природной клещевой инфекции всех трех наиболее патогенных геновидов ,  и , и, возможно, вследствие перекрестного иммунитета, других известных геновидов боррелий.
Таблица № 9
Схема эксперимента заражения лошади
Лошадь №
Вакци-нация
Ревакцинация
Заражение
Образцы биологического материала после заражения, сутки
Пометка
7
14
28
35
42
49
56
60
1V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
2V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
BKP
Ежедневно в клинике
3V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
4V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
5V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
6V
+
+
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
7KO
-
-
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
8KO
-
-
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
9KO
-
-
+
B
K
BK
-
K
-
-
ВКР
Ежедневно в клинике
Пояснения:V - вакцинацияКО - не подвергнутые вакцинации контроли+ - действие выполняли- - действие не выполнялиВ - биопсия кожиК - забор кровиP - патолого-анатомическое вскрытие
Таблица № 10
Клиническая оценка после заражения
Лошадь №
Клинические изменения после заражения, сутки
Пометка
7
14
21
28
35
42
49
56
60
1V
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ежедневный клинический осмотр
2V
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Ежедневный клинический осмотр
3V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
Ежедневный клинический осмотр
4V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
Ежедневный клинический осмотр
5V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
Ежедневный клинический осмотр
6V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
Ежедневный клинический осмотр
7KO
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
+
Ежедневный клинический осмотр
8KO
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
+
+
Ежедневный клинический осмотр
9KO
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
+
Ежедневный клинический осмотр
Пояснения:+ - наличие клинических симптомов- - отсутствие клинических симптомов
Таблица № 11
Обнаружение боррелий в биоптатах кожи после заражения
Лошадь №
Период взятия биоптатов кожи, сутки
Пометка
7
28
60
1V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
2V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
3V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
4V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
5V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
6V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
7KO
+
<b>-</b>
<b>-</b>
8KO
+
<b>-</b>
<b>-</b>
9KO
+
<b>-</b>
<b>-</b>
Пояснения:+ - положительный результат- - отрицательный результат
Таблица № 12
Обнаружение боррелий в органах
Лошадь №
Органы, подверженные предрасположенности (вскрытие на 60 сутки)
Пометка
Мышца
Кожа
Лимфатический узел
Суставная жидкость
Почка
1V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
2V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
3V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
4V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
5V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
6V
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
<b>-</b>
PA- отр.
7KO
<b>-</b>
<b>-</b>
+
+
<b>-</b>
PA- полож.
8KO
<b>-</b>
<b>-</b>
+
+
<b>-</b>
PA- полож.
9KO
+
<b>-</b>
+
+
<b>-</b>
PA- полож.
Пояснения:+ - положительный результат- - отрицательный результатPA - патолого-анатомическое вскрытие
Описанные примеры получения вакцины не являются единственным способом осуществления по изобретению, но цельноклеточные бактериальные вакцины или бактериальные лизаты или очищенные соединения, содержащие иммуногенные протективные белки, можно применять без какого-либо влияния на субъект по изобретению в буферных физиологических растворах или с помощью минерального или масляного иммунологического адъюванта или с помощью иммунологических комплексов (ISCOM), липосом и других природных или синтетических иммунологических адъювантов.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
Универсальную вакцину для лечения и профилактики болезни Лайма можно применять в качестве лекарственного препарата у людей и в ветеринарии и можно успешно применять внутримышечно, подкожно, внутрикожно или чрескожно.