СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИФФУЗИИ
DIFFUSION DETERMINING METHOD

Область применения изобретения
Настоящее изобретение относится к способу и устройству для определения диффузии в пробе текучей среды с применением окислительно-восстановительных реакций в электрохимической ячейке. Изобретение также относится к способу и устройству для одновременного определения диффузии и роли редокс-активного (-ых) вещества (веществ) в пробе текучей среды с применением окислительно-восстановительных реакций.
Предпосылки создания изобретения
Для измерения концентрации аналита в пробах текучей среды (например, в цельной крови) применяются электрохимические датчики (например, полоски для самоконтроля уровня глюкозы в крови). Однако их точность может снижаться под действием мешающих диффузии факторов (DIF), которые влияют на перенос массы аналита в испытуемых текучих средах, например гематокрита крови (Hct), поскольку эритроциты блокируют пути диффузии аналита (например, глюкозы). Другим фактором, отрицательно влияющим на точность датчика, являются факторы редокс-помех (RIF), обусловленные любыми редокс-активными веществами, подвергающимися реакциям окисления-восстановления и, следовательно, создающими интерферирующие сигналы (например, мочевая кислота блокирует электрохимическое измерение концентрации глюкозы).
Известны технологии для уменьшения DIF. В них применяется активный подход, основанный на получении чувствительных к DIF сигналов, которые применяются для коррекции/компенсации DIF. Примеры активного снижения DIF описаны в патентных публикациях US2002125145A1, US20090184004A1 и US8016997B2. Эти способы для снижения DIF основаны на определении диффузии между двумя электродами, расположенными по бокам камеры для проб на полосках. Следовательно, на них могут влиять различия по высоте камеры для пробы на разных полосках.
Известны технологии для уменьшения RIF. Аналогично, в них применяется активный подход, основанный на получении чувствительных к RIF сигналов, которые применяются для коррекции/компенсации. Примеры активного снижения RIF при самоконтроле уровня глюкозы в крови описаны в патентных публикациях US2002125145A1 и WO2014037745A1.
Вышеупомянутые технологии ориентированы только на DIF или RIF, или изолированно ориентированы на DIF и RIF с применением различных методик/способов.
Снижение как DIF, так и RIF является обязательным для обеспечения соответствия предъявляемым к продукту требованиям по точности. Существует потребность в усовершенствованных способах достижения такого снижения.
Изложение сущности изобретения
Настоящее изобретение относится к технологии для одновременного определения диффузии и редокс-активного (-ых) вещества (веществ) в пробах текучей среды. Эта технология обладает потенциалом применения в самых разных сферах. Например, измеренные диффузия и редокс-активное (-ые) вещество (-а) могут быть использованы для активного снижения как DIF, так и RIF при электрохимических измерениях аналитов, например глюкозы. Под мешающим диффузии фактором (DIF) понимается свойство пробы текучей среды, влияющее на перенос массы, например гематокрит крови, вязкость, коэффициент диффузии. Под фактором редокс-помех (RIF) понимается любое (-ые) редокс-активное (-ые) вещество (вещества), подвергающееся (-иеся) реакции окисления-восстановления и, следовательно, создающее (-ие) интерферирующие сигналы.
В соответствии с одним аспектом изобретения предлагается способ определения диффузии пробы текучей среды с применением окислительно-восстановительных реакций в электрохимической ячейке, имеющей, по меньшей мере, два электрода, причем первый электрод имеет на своей поверхности или в непосредственной близости от своей поверхности, по меньшей мере, один редокс-медиатор, а второй электрод в начале теста имеет поверхность, свободную от редокс-медиатора (-ов), содержащий этапы, на которых: прикладывают электрический потенциал к пробе текучей среды в электрохимической ячейке для запуска окислительно-восстановительных реакций на двух поверхностях электродов; измеряют ток, ассоциированный с приложенным потенциалом, и применяют измеренный ток и ассоциированное с ним время исследования для определения диффузионного свойства или характеристики.
Способ дополнительно может включать в себя применение измеренного тока и ассоциированного с ним времени исследования для определения роли редокс-активного вещества. Под редокс-активным веществом понимается вещество, присутствующее в исследуемой пробе, которое генерирует интерферирующие сигналы, подвергаясь окислительно-восстановительным реакциям на электроде под действием приложенного электрического потенциала и/или реагируя с редокс-медиатором для изменения окислительно-восстановительного состояния медиатора, который затем подвергается окислительно-восстановительной реакции на электроде (например, мочевая кислота в пробе крови).
Способ дополнительно может включать в себя применение информации о калибровке вместе с измеренным током и ассоциированным с ним временем исследования для определения диффузионного свойства или характеристики.
Диффузионное свойство или характеристика могут быть связаны с переносом массы в пробе текучей среды, включая коэффициент диффузии, гематокрит, вязкость.
Редокс-активное вещество может представлять собой, по меньшей мере, одно вещество, подвергающееся окислительно-восстановительной реакции на втором электроде под действием приложенного потенциала.
Потенциал может иметь постоянную величину, или величину, меняющуюся со временем, или комбинацию постоянной и переменной величин.
Ток может представлять собой единственное значение измеренного тока или среднее по нескольким последовательно измеренным значениям тока в течение периода 0,5 секунды, предпочтительно 0,1 секунды, более предпочтительно 0,03 секунды.
Электроды могут быть выполнены кофациально таким образом, что поверхности двух электродов расположены в пространстве так, что обращены друг к другу с минимальным расстоянием между поверхностями от 10 до 1000 мкм, предпочтительно от 35 до 500 мкм и более предпочтительно от 50 до 120 мкм.
Электроды могут быть выполнены копланарно таким образом, что поверхности двух электродов расположены в пространстве в одной плоскости с минимальным расстоянием от края до края от 10 до 2000 мкм, предпочтительно от 50 до 900 мкм и более предпочтительно от 100 до 500 мкм.
В соответствии с другим аспектом изобретения предлагается измеритель или устройство для определения диффузионной характеристики пробы текучей среды с применением окислительно-восстановительных реакций в электрохимической ячейке, имеющей, по меньшей мере, два электрода, причем первый электрод имеет на своей поверхности или в непосредственной близости от своей поверхности, по меньшей мере, один редокс-медиатор, а второй электрод в начале теста имеет поверхность, свободную от редокс-медиатора (-ов), каковой измеритель или устройство выполнены с возможностью: приложения электрического потенциала к пробе текучей среды в электрохимической ячейке для запуска окислительно-восстановительных реакций на двух поверхностях электродов; измерения тока, ассоциированного с приложенным потенциалом, в зависимости от времени; и применения точки измерения на переходной составляющей измеренного тока в точке поворота или после нее и ассоциированного с ним времени для определения диффузионной характеристики.
Точка поворота может представлять собой точку, в которой заканчивается первая переходная составляющая и начинается вторая переходная составляющая, причем первая переходная составляющая отклоняется от спада тока Коттрелла, а вторая переходная составляющая по существу совпадает со спадом тока Коттрелла.
t
turn+
Измеритель или устройство могут быть выполнены с возможностью идентификации точки поворота на переходной составляющей измеренного тока. Измеритель или устройство могут быть выполнены с возможностью применения выявленной точки поворота для определения точки измерения, которую следует применять для определения диффузионной характеристики, причем точка измерения смещена во времени от точки поворота (Δt=точка измерения).
Измеритель или устройство могут быть выполнены с возможностью применения тока в точке измерения и ассоциированного с ним времени исследования для одновременного определения диффузионной характеристики и роли, по меньшей мере, одного редокс-активного вещества.
Измеритель или устройство могут быть выполнены с возможностью хранения информации о калибровке и применения информации о калибровке вместе с данными об измеренном токе в точке измерения и ассоциированным с ним временем исследования для определения диффузионной характеристики.
Измеритель или устройство могут быть выполнены с возможностью хранения функции, связывающей время исследования и диффузионную характеристику, и применения этой функции вместе со временем исследования тока в точке измерения для определения диффузионной характеристики.
Диффузионная характеристика может представлять собой диффузионное свойство или признак, связанный с переносом массы в пробе текучей среды, включая коэффициент диффузии, гематокрит, вязкость.
Редокс-активное вещество представляет собой, по меньшей мере, одно вещество, подвергающееся окислительно-восстановительной реакции на втором электроде под действием приложенного электрического потенциала.
Измеритель или устройство могут быть выполнены с возможностью применения электрического потенциала, который имеет постоянную величину или величину, меняющуюся со временем, или комбинацию постоянной и переменной величин.
Измеритель или устройство могут быть выполнены с возможностью измерения единственного значения тока в каждой точке измерения, или среднего по нескольким последовательным измеренным значениям тока в течение периода 0,5 секунды, предпочтительно 0,1 секунды, более предпочтительно 0,03 секунды.
Краткое описание рисунков
Различные аспекты изобретения будут далее описаны только в качестве примера и со ссылкой на следующие ниже рисунки, на которых:
Фиг. 1 демонстрирует окислительно-восстановительную реакцию на двух электродах, стимулированную путем приложения электрического потенциала между электродами;
t
i
turn
turn
Фиг. 2 демонстрирует график зависимости тока от времени для устройства с Фиг. 1 после прикладывания электрического потенциала, на котором показаны точка поворота в момент времени  и ток ;
t
turn
Фиг. 3a представляет собой диаграмму размаха для зависимости  от уровня глюкозы, мочевой кислоты и гематокрита для проб крови двух доноров;
t
turn
Фиг. 3b представляет собой диаграмму размаха для зависимости  от данных по гематокриту с Фиг. 3a; и
i
turn
Фиг. 4 представляет собой диаграмму размаха для зависимости  от гематокрита и концентрации мочевой кислоты при концентрации глюкозы около 75 мг/дл.
Подробное описание рисунков
На Фиг. 1 представлены окислительно-восстановительные реакции электрохимической тест-полоски, например тест-полоски для самоконтроля уровня глюкозы в крови. Полоска имеет два электрода, первый электрод E1 и второй электрод E2. Первый электрод E1 покрыт слоем реагента, содержащим редокс-медиатор (M) и другие материалы (например, фермент), а второй электрод E2 имеет поверхность, не покрытую слоем реагента. Первый и второй электроды E1 и E2 соответственно электрически подключены к стабилизатору напряжения (не показан). В процессе применения первый и второй электроды E1 и E2 соответственно контактируют с образцом цельной крови, и между двумя электродами прикладывают электрический потенциал (напряжение). Это приводит к окислительно-восстановительным реакциям на обоих электродах. Образующийся ток между первым и вторым электродами E1 и E2 измеряют в зависимости от времени.
ox
Чтобы протестировать полоску, прикладывают электрический потенциал между первым и вторым электродами E1 и E2 и измеряют ток. Величину и полярность электрического потенциала выбирают таким образом, чтобы запустить восстановление медиатора (-ов) на первом электроде E1 и окисление редокс-активного (-ых) вещества (веществ) на втором электроде E2. Нанесение пробы крови в камеру для пробы на полоске запускает физические и химические процессы/изменения, которые зависят от гематокрита и редокс-активного (-ых) вещества (веществ) в пробе крови. Физические процессы включают в себя гидратацию слоя реагента, растворение медиатора, зарядку двойного слоя (процесс нейтрализации дисбаланса зарядов вблизи поверхностей электрода путем перераспределения заряженных частиц в крови). Химические процессы включают окисление редокс-активного (-ых) вещества (веществ) на втором электроде E2 и восстановление окисленного медиатора M на первом электроде E1, как показано на Фиг. 1.
i
t
turn
turn
В результате этих физических и химических процессов зарегистрированный ток имеет переходную составляющую, имеющую уникальный характер и отклоняющуюся от спада тока Коттрелла. Это показано на Фиг. 2. Каждый переходный токовый сигнал имеет точку поворота, отмеченную «X» на Фиг. 2, которая задает токовый параметр и временной параметр . Точка поворота представляет собой точку, в которой первая переходная составляющая с низкоуровневыми колебаниями завершается и начинается вторая переходная составляющая с плавным спадом тока (NB на Фиг. 2 ток показан как отрицательный, и поэтому восходящий наклон справа от низкоуровневых колебаний представляет собой токовый спад). Первая переходная составляющая отклоняется от спада тока Коттрелла, а вторая переходная составляющая по существу совпадает со спадом тока Коттрелла. Вторая переходная составляющая заканчивается, как только ток достигает стационарного состояния или когда редокс-медиатор приходит ко второму электроду E2 в результате диффузии из слоя реагента. Точку поворота можно идентифицировать при помощи процесса (-ов)/алгоритма (-ов), которые можно создавать с применением различных математических подходов/методик.
t
turn
Отклонение переходного токового сигнала от спада тока Коттрелла, в частности первой переходной составляющей, главным образом обусловлено физическими процессами, играющими преобладающую роль на этом этапе и изменяющими активную площадь поверхности первого электрода E1 и/или доступность медиатора для восстановления на первом электроде E1. Эти физические процессы зависят от диффузии пробы крови и не зависят от концентрации редокс-активных веществ. Следовательно, время, в которое переходный ток переходит от первой переходной составляющей ко второй переходной составляющей, , зависит от диффузии.
i
turn
На ранней стадии теста с полоской восстановленный медиатор не диффундировал через камеру для пробы для достижения поверхности второго электрода E2. Следовательно, ток окисления преимущественно генерируется окислением редокс-активного вещества. В то же время окисление редокс-активных веществ зависит от переноса массы редокс-активных веществ в пробе текучей среды. Следовательно,  является функцией как редокс-активных веществ, так и их диффузии.
t
i
t
i
turn
turn
turn
turn
Функцию для  и функцию для  можно получить из лабораторных данных, полученных при исследовании проб текучей среды с заданным диффузионным параметром и уровнем редокс-активного (-ых) вещества (веществ). В настоящем изобретении исследование пробы текучей среды при помощи электрохимической ячейки, запись переходного токового сигнала, идентификация точки поворота, определение  и  и решение двух функций/уравнений позволяет одновременно определять диффузию и роль/влияние редокс-активных веществ в пробе текучей среды.
Под термином «определение/измерение» понимается количественная, полуколичественная или качественная оценка диффузионного свойства исследуемой пробы (например, гематокрита) или содержания редокс-активного (-ых) вещества (веществ) (например, мочевой кислоты) в исследуемой пробе. В случае количественной или полуколичественной оценки результат представляет собой числовое представление сигнала, созданного одним или более диффузионными свойствами или редокс-активными веществами, присутствующими в исследуемой пробе. В качестве результата измерения содержания редокс-активного (-ых) вещества (веществ) он оценивает общий вклад редокс-активных веществ.
Способ также может применяться для одновременного измерения диффузии и любого (-ых) редокс-активного (-ых) вещества (веществ), подвергающегося (-ихся) восстановлению у второго электрода E2. В этом случае слой реагента на первом электроде E1 содержит медиатор в восстановленном состоянии и электрический потенциал прикладывают для запуска восстановления редокс-активного (-ых) вещества (веществ) у второго электрода E2.
t
t
t
turn
turn
turn
Чтобы зависящие от диффузии характеристики или влияющие на диффузию характеристики можно было измерить в соответствии с настоящим изобретением, интересующую диффузионную характеристику необходимо откалибровать в зависимости от времени поворота .Альтернативно, интересующую диффузионную характеристику можно представить математической функцией, зависящей от времени поворота . В любом случае, как только стало известно соотношение между диффузионной характеристикой и временем поворота , его можно применять при дальнейших измерениях для обеспечения меры диффузионной характеристики. Диффузионная характеристика может представлять собой, например, коэффициент диффузии, гематокрит (который влияет на диффузию), свертывание или вязкость.
t
i
t
i
t
i
turn
turn
turn
turn
turn
turn
Чтобы можно было измерить роль любого (-ых) редокс-активного (-ых) вещества (веществ), интересующее (-ие) редокс-активное (-ые) вещество (-а) необходимо откалибровать в зависимости от времени поворота и дополнительно в зависимости от тока поворота . Альтернативно, интересующие редокс-активные вещества можно представить математической функцией, зависящей от времени поворота  и от тока поворота . В любом случае после того, как стало известно соотношение между редокс-активным (-и) веществом (-ами), временем поворота  и током поворота , его можно применять при дальнейших измерениях для получения показателя уровня редокс-активного (-ых) вещества (веществ) или вклада, вносимого редокс-активным (-и) веществом (-ами) в измеренный ток.
Показатель редокс-активного (-ых) вещества (веществ) может представлять собой показатель концентрации вещества в пробе. Показатель вклада, вносимого редокс-активным (-и) веществом (-ами), может быть показателем его вклада в ток. Это может быть использовано на последующих этапах или способах для коррекции любых вычислений на основании измерений тока, если данные вычисления требуют исключения влияния редокс-активного (-ых) вещества (веществ). Например, мочевая кислота блокирует электрохимические измерения уровня глюкозы, и настоящее изобретение позволит определить эффекты мочевой кислоты и исключить их из любого вычисления уровня глюкозы.
Методология изобретения была протестирована с применением серийно производимых полосок. Тесты проводили при комнатной температуре. Прикладывали потенциал -400 мВ и регистрировали результирующие токовые сигналы. Использовали пробы крови от двух разных доноров, имеющих разные уровни глюкозы в крови. Пробы представляли собой венозную кровь, с которой манипулировали по схеме 2×6 x 4 (глюкоза/донор x гематокрит x мочевая кислота). Для каждой пробы крови тесты повторяли восемь - десять раз. Результаты этих тестов графически представлены на Фиг. 3a, 3b и 4.
t
t
turn
turn
Фиг. 3a представляет собой диаграмму размаха для зависимости  от различных показателей пробы крови, включая концентрацию глюкозы, концентрацию введенной/добавленной мочевой кислоты (редокс-активное вещество, блокирующее измерение глюкозы) и гематокрит (который влияет на диффузию). В этом примере использовали пробы двух разных доноров, чтобы можно было протестировать пробы с двумя разными концентрациями глюкозы (на оси x на Фиг. 3a «1» и «2» означают Донор1 и Донор2 соответственно). В этом случае концентрации глюкозы составили приблизительно 75 мг/дл для Донора1 и 125 мг/дл для Донора2. Исходные (до добавления) концентрации мочевой кислоты составили 4,47 мг/дл для Донора1 и 4,79 мг/дл для Донора2 соответственно. Фиг. 3b представляет собой диаграмму размаха для зависимости  от гематокрита. Здесь показаны те же данные по гематокриту, что и на Фиг. 3a, но без данных по глюкозе и мочевой кислоте, для ясности.
t
t
d
turn
turn
Фиг. 3a и 3b четко показывают сильную корреляцию между  и гематокритом при хорошем разрешении, тогда как глюкоза и мочевая кислота мало влияют на . По таким данным (например, показанным на Фиг. 3b) можно получить математическое калибровочное уравнение и применять его для измерения диффузии  или связанного с диффузией свойства (например, гематокрита) при анализе пробы текучей среды. Калибровочное уравнение можно представить следующим образом:
t
f(d)
turn=
[1]
i
i
i
turn
turn
turn
Фиг. 4 представляет собой диаграмму размаха для зависимости  от гематокрита и концентрации мочевой кислоты при концентрации глюкозы около 75 мг/дл (данные по Донору1). График четко показывает сильную корреляцию между  и гематокритом при хорошем разрешении. График также показывает четкую корреляцию между  и концентрацией мочевой кислоты при разных уровнях гематокрита. На основании лабораторных данных (например, представленных на Фиг. 4) можно получить математическое калибровочное уравнение. Калибровочное уравнение можно представить следующим образом:
i
f(d, r)
turn=
[2]
d
r
Измерения диффузии  или связанного с диффузией свойства (например, гематокрита) и вклад редокс-активного (-ых) вещества (веществ)  (например, мочевой кислоты) можно получить, решив уравнения [1] и [2]. При наличии множества редокс-активных веществ определяемый вклад может представлять собой показатель тока, связанный более чем с одним редокс-активным веществом. Этот показатель можно применять в качестве поправочного коэффициента для всех измерений/вычислений, зависящих от тока. Там, где присутствует только одно редокс-активное вещество, уравнения [1] и [2] можно применять для определения концентрации редокс-активного вещества в пробе текучей среды.
Изобретение описано применительно к определению параметров тока и времени в точке поворота. Однако параметр тока и/или параметр времени можно получить из других частей переходного токового сигнала, в частности, после точки поворота. Например, можно применять параметр тока и параметр времени из секции значения тока, отмеченной точкой Y на Фиг. 2. В действительности можно применять любой параметр тока и ассоциированного времени из второй переходной составляющей.
Преимущество применения точки поворота состоит в том, что этот ток и время можно легко идентифицировать с применением простой методики обработки. Если применяются параметры тока и времени, отстоящие от точки поворота, то их положение можно определять по отношению к точке поворота. Например, если решено, что оптимальные параметры тока и времени были в момент t
+Δt, то эти параметры можно идентифицировать, сначала найдя t
, а затем применять его как эталон для нахождения времени t
+Δt.
turn
turn
turn
Настоящее изобретение предлагает простой и эффективный способ одновременного измерения как диффузии (например, гематокрита), так и вклада/влияния редокс-активного (-ых) вещества (веществ) (например, помех) в пробах текучей среды (например, крови). Его можно применять в самых разных областях применения (например, гематокрит, вязкость, свертывание и т. п.). Также его можно применять для определения поправочных коэффициентов для повышения точности исследования уровня глюкозы в крови при самостоятельном его контроле за счет снижения DIF (например, гематокрита) и RIF (например, мочевой кислоты), которые являются двумя главными источниками ошибок при эпизодическом контроле уровня глюкозы в крови. В этом случае методология изобретения не зависит от концентрации глюкозы в пробах крови. Следовательно, она является более достоверной и надежной, чем многие методики предшествующего уровня техники. Дополнительным преимуществом является отсутствие фундаментальных ограничений по высоте камеры для пробы на полоске, в результате чего уменьшаются ошибки измерений, обусловленные различиями между полосками и/или партиями.
Специалисту в данной области будет понятно, что в пределах области изобретения возможны варианты описанных конструкций. Например, хотя изобретение описано со ссылкой на тест-полоску только с двумя электродами, изобретение может быть равным образом применимо к тест-полоскам с тремя или более электродами. Кроме этого, хотя тест-полоска, показанная на Фиг. 1, имеет параллельные пластинчатые электроды (т. е. кофациальную конфигурацию электродов), изобретение может применяться к полоскам с копланарной конфигурацией электродов, т. е. когда все поверхности электродов находятся в одной плоскости. Кроме того, хотя сигнал, показанный на Фиг. 2, является реакцией на потенциал постоянной величины, приложенный потенциал может иметь величину, изменяющуюся со временем, или может представлять собой комбинацию постоянной и переменной величин. Соответственно, предшествующее описание конкретного варианта осуществления выполнено в качестве примера и не накладывает никаких ограничений. Специалисту в данной области будет ясно, что можно вносить малые модификации без существенного изменения описанных рабочих процессов.