БАКТЕРИЯ РОДА Escherichia - ПРОДУЦЕНТ L-АРГИНИНА, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАНЫ ОДИН ИЛИ НЕСКОЛЬКО ГЕНОВ КЛАСТЕРА artPIQM-artJ, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА
Escherichia BACTERIA - PRODUCER OF L-ARGININE WHERE ONE OR MORE artPIQM-artJ CLUSTER GENES ARE INACTIVATED, AND METHOD OF PRODUCING L-ARGININE

Область техники
Настоящее изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу получения L-аргинина. В способе используют бактерию семейства Enterobacteriaceae, модифицированную таким образом, что экспрессия генов, кодирующих траспортер L-аргинина, ослаблена.
Описание предшествующего уровня техники
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов. Обычно микроорганизмы модифицируют для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.
Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4,278,765). Другие методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к ингибированию по типу обратной связи продуцируемой L-аминокислотой (см., например, патенты США 4,346,170; 5,661,012 и 6,040,160).
Другими методами увеличения продукции L-аминокислот являются ослабление экспресии одного или нескольких генов, вовлеченных в деградацию целевой L-аминокислоты; генов, экспрессия которых ведет к отвлечению предшественников целевой аминокислоты от пути биосинтеза L-аминокислоты; генов, вовлеченных в перераспределение потоков углерода, азота и фосфора; генов, кодирующих токсины и т.д.
Зависимая от связывающего белка, специфичная по отношению к аргинину система транспорта в Escherichia coli охарактеризована генетически и биохимически. Систему составляют пять расположенных подряд генов, artPIQMJ ("art" обозначает «транспорт аргинина (arginine transport)»), организованных в две транскриционных единицы (artPIQM. artJ). Продукты генов artI artJ, ArtI и ArtJ, периплазматические связывающие белки с последовательностью, сходной с последовательностью белков, связывающих полярные или основные аминокислоты. Продукты генов artQ, artM и artP сходны с известными трансмембранными белками и АТФазами транспортеров, активность которых зависит от связывания с белками (binding-protein-dependent carriers). Зрелые белки ArtI и ArtJ локализованы в периплазме, и в них отсутствует сигнальный пептид из 19 аминокислотных остатков. ArtI и ArtJ были выделены из штаммов - сверхпродуцентов. ArtJ специфически связывает L-аргинин с высокой аффинностью, и сверхпродукция ArtJ стимулировала поглощение L-аргинина бактериями. Субстрат для ArtI не известен, выделенный ArtI не связывал наиболее распространенные аминокислоты, различные основные нераспространенные аминокислоты или амины. Было сделано заключение о том, что гены artPIQM artJ кодируют третью систему поглощения аргинина в дополнение к известной системе argT hisJQMP в Salmonella typhimurium и Е.coli и переносчику аргинина (орнитина) (aps) в Е.coli (Wissenbach U. et al., Mol Microbiol.; 17(4):675-86(1995)).
В настоящее время нет сообщений, описывающих использование ослабления экспрессии генов, кодирующих траспортер L-аргинина, для получения L-аргинина.
Описание изобретения
Целями настоящего изобретения являются повышение продуктивности штаммов-продуцентов L-аргинина и предоставление способа получения L-аргинина с использованием этих штаммов.
Настоящее изобретение предоставляет бактерию, принадлежащую к семейству Enterobacteriaceae, обладающую повышенной способностью к продукции L-аргинина.
Целью настоящего изобретения является предоставление бактерии-продуцента L-аргинина, принадлежащей к семейству Enterobacteriaceae, модифицированной таким образом, что экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих транспортер L-аргинина, в указанной бактерии ослаблена.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что экспрессия гена artI в указанной бактерии ослаблена.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что экспрессия гена artI в указанной бактерии ослаблена за счет инактивации гена artI.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия кластера artPIQM-artJ в ней ослаблена.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия кластера artPIQM-artJ в ней ослаблена за счет инактивации кластера artPIQM-artJ.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Escherichia.
Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, отличающейся тем, что указанная бактерия принадлежит к роду Pantoea.
Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аргинина, включающего:
- выращивание описанной выше бактерии в питательной среде, вызывающее продукцию и секрецию L-аргинина в культуральную жидкость; и
- выделение L-аргинина из культуральной жидкости.
Более детально настоящее изобретение описано ниже.
Наилучший способ осуществления изобретения
1. Бактерия согласно настоящему изобретению
Бактерия, согласно настоящему изобретению, - это бактерия-продуцент L-аргинина, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae, модифицированная таким образом, что экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих транспортер L-аргинина, в указанной бактерии ослаблена.
"Бактерия-продуцент L-аргинина" означает бактерию, обладающую способностью к продукции и секреции L-аргинина в питательную среду, когда бактерия согласно настоящему изобретению выращивается в указанной питательной среде.
Используемый здесь термин «бактерия-продуцент L-аминокислоты» также означает бактерию, которая способна к продукции L-аргинина и вызывает накопление L-аргинина в ферментационной среде в больших количествах по сравнению с природным или родительским штаммом Е.coli, таким как штамм Е.coli K-12, и, предпочтительно означает, что указанный микроорганизм способен накапливать в среде L-аргинин в количестве не менее, чем 0.5 г/л, более предпочтительно не менее, чем 1.0 г/л.
Семейство Enterobacteriaceae включает в себя бактерии, принадлежащие к родам Escherichia, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Serratia, Shigella, Morganella, Yersinia и т.д. Более конкретно, могут быть использованы бактерии, классифицируемые как принадлежащие к семейству Enterobacteriaceae в соответствии с таксономией, используемой в базе данных NCBI (National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpos/Taxonomy/wgetorg?mode=Tree&id=1236&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock). Предпочтительна бактерия, принадлежащая к роду Escherichia или Pantoea.
Термин "бактерия, принадлежащая к роду Escherichia", означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (Е.coli).
Круг бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, не ограничен каким-либо образом, однако, например, бактерии, описанные в книге Neidhardt, F.C. et al. (Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D.C., 1208, Таблица 1), могут быть включены в число бактерий согласно настоящему изобретению.
Термин «бактерия, принадлежащая к роду Pantoea» означает, что бактерия относится к роду Pantoea в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. Недавно несколько видов Enterobacter agglomerans были классифицированы как Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis, Pantoea stewartii или подобные им, на основе анализа нуклеотидной последовательности 16S рРНК и т.д.
Термин «бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих транспортер L-аргинина, ослаблена» означает, что указанная бактерия была модифицирована таким образом, что в результате модификации такая бактерия содержит пониженное количество транспортера L-аргинина или любой его субъединицы по сравнению с немодифицированной бактерией, или это также может означать, что указанная бактерия не способна синтезировать транспортер L-аргинина или любую его субъединицу.
Транспортная система L-аргинина кодируется пятью сопряженными генами artPIQMJ, организованным в две транскрипционные единицы, artPIQM и artJ. Продукты генов artI и artJ, белки ArtI и ArtJ, являются периплазматическими связывающими белками и имеют последовательность, сходную с белками, связывающимися с полярными или основными аминокислотами. Продукты генов artQ, artM, и artP сходны с известными трансмембранными белками и АТФазой связывающих белков-переносчиков.
Фраза «инактивация гена» означает, что модифицированный ген кодирует полностью неактивный белок. Возможно также, что естественная экспрессия модифицированного участка ДНК невозможна из-за делеции части гена, сдвига рамки считывания, введения миссенс/нонсенс мутации(-ий) или модификации примыкающих к гену областей, которые включают последовательности, контролирующие экспрессию гена, такие как промоторы, энхансеры, аттенуаторы, и т.д.
Наличие или отсутствие гена на хромосоме может быть определено хорошо известными методами, включая ПЦР, блоттинг по Саузерну и т.п. Кроме того, уровень экспрессии гена можно оценить определением количества транскрибируемой с гена РНК с использованием различных известных методов, включая блоттинг по Нозерну, количественную ОТ-ПЦР, и т.п. Количество и молекулярную массу белков, кодируемых генами, можно определить известными методами, включая электрофорез в SDS-ПААГ с последующим иммуноблоттингом (Вестерн-блоттинг) и т.д.
Ген artP (синонимы: ECK0855, b0864) кодирует белок ArtP - субъединицу переносчика аргинина ABC (синоним В0864), локализованную в цитоплазме. Ген artP (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 902,229 по 902,957 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi:49175990, SEQ ID NO:1) расположен между геном ybjP и геном artI на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена artP и аминокислотная последовательность белка ArtP, кодируемого геном artP, приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2, соответственно.
Ген artI (синонимы: ECK0854, b0863) кодирует белок ArtI - субъединицу переносчика аргинина ABC (синоним В0863), локализованную в периплазматическом пространстве. Ген artI (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 901,480 по 902,211 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi:49175990, SEQ ID NO:3) расположен между геном artQ и геном artP на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена artI и аминокислотная последовательность белка ArtI, кодируемого геном artI, приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4, соответственно.
Ген artQ (синонимы: ECK0853, b0862) кодирует белок ArtQ - субъединицу переносчика аргинина ABC (синоним В0862), локализованную на внутренней мембране. Ген artQ (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 900,757 по 901,473 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi:49175990, SEQ ID NO:5) расположен между геном artI и геном artM на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена artQ и аминокислотная последовательность белка ArtQ, кодируемого геном artQ, приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6, соответственно.
Ген artM (синонимы: ECK0852, b0861) кодирует белок ArtM - субъединицу переносчика аргинина ABC (синоним В08631), локализованную на внутренней мембране. Ген artM (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 900,089 по 900,757 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi:49175990, SEQ ID NO:1) расположен между геном artQ и геном artJ на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена artM и аминокислотная последовательность белка ArtM, кодируемого геном artM, приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:7 и SEQ ID NO:8, соответственно.
Ген artJ (синонимы: ECK0851, b0860) кодирует белок ArtJ - субъединицу переносчика аргинина ABC (синоним В08630), локализованную в периплазматическом пространстве. Ген artJ (нуклеотиды, комплементарные нуклеотидам с 899,067 по 899,798 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.2 в базе данных GenBank; gi:49175990, SEQ ID NO:9) расположен между геном artM и геном rlmC на хромосоме штамма Е.coli K-12. Нуклеотидная последовательность гена artJ и аминокислотная последовательность белка ArtJ, кодируемого геном artJ, приведены в Перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:10, соответственно.
Поскольку у представителей различных родов и штаммов семейства Enterobacteriaceae возможны некоторые вариации в нуклеотидных последовательностях, понятие инактивируемого гена не ограничивается геном, последовательность которого приведена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 или 9, но также может включать и гены, гомологичные SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 или 9, кодирующие соответствующие белки. Термин "вариант белка", используемый в настоящем изобретении, означает белок с изменениями в последовательности, будь то делеции, вставки, добавления или замены аминокислот, в котором сохраняется активность этого белка. Число изменений в варианте белка зависит от положения или типа аминокислотного остатка в третичной структуре белка. Оно может быть от 1 до 30, предпочтительно от 1 до 15, более предпочтительно от 1 до 5. Данные изменения в вариантах могут иметь место в областях, не критичных для функции белка. Данные изменения возможны потому, что некоторые аминокислоты имеют высокую гомологию друг другу, поэтому такие изменения не влияют на третичную структуру или активность. Следовательно, вариант белка, кодируемого геном artI, может быть представлен белками с гомологией не менее 80%, предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно не менее 95%, по отношению к полной аминокислотной последовательности, приведенной в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, или 10 при условии, что до инактивации белок способен во взаимодействии с остальными 4 или 5 белками дикого типа, входящими в состав транспортера L-аргинина, функционировать в качестве переносчика аргинина ABC.
Гомология между двумя аминокислотными последовательностями может быть определена с использованием известных методов, например, компьютерной программы BLAST 2.0, которая считает три параметра: число аминокислот, идентичность и сходство.
Кроме того, любой из генов artP, artI, artQ, artM или artJ может быть вариантом, который гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью, приведенной в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1, 3, 5, 7 или 9, соответсвтенно, или с зондом, который может быть синтезирован на основе указанной нуклеотидной последовательности, при условии, что до инактивации он кодирует функциональный белок. «Жесткие условия» включают такие условия, при которых специфические гибриды, например гибриды с гомологией не менее 60%, предпочтительно не менее 70%, более предпочтительно не менее 80%, еще более предпочтительно не менее 90%, и наиболее предпочтительно не менее 95%, образуются, а неспецифические гибриды, например гибриды с меньшей гомологией, чем указано выше, - не образуются. Практическим примером жестких условий является однократная отмывка, предпочтительно двух- или трехкратная, при концентрации солей 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS, при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от типа используемой для блоттинга мембраны и, как правило, такова, как рекомендовано производителем. Например, рекомендуемая продолжительность отмывки для нейлоновой мембраны Hybond™ N+(Amersham) при строгих условиях - 15 минут. Предпочтительна двух- трехкратная отмывка. Длина зонда может быть выбрана в зависимости от условий гибридизации и обычно составляет около 100-1000 п.н.
Экспрессия гена может быть ослаблена введением в ген такой мутации, что внутриклеточная активность кодируемого геном белка снижается по сравнению с немодифицированным штаммом. Мутации, результатом которых является ослабление экспрессии гена, включают замену одного или более оснований для аминокислотной замены в кодируемом геном белке («миссенс»-мутация), введение стоп-кодона («нонсенс»-мутация), делецию одного или более оснований для сдвига рамки считывания, вставку гена устойчивости к антибиотику, или делецию гена или его части (Qiu. Z. and Goodman, M.F., J. Biol. Chem., 272, 8611-8617 (1997); Kwon, D. H. et al., J. Antimicrob. Chemother., 46, 793-796 (2000)). Экспрессия гена также может быть ослаблена модификацией экспрессии регуляторных последовательостей, таких как промотор, последовательность Shine-Dalgarno (SD) и т.д. (заявка РСТ WO95/34672; Carrier, T.A. and Keasling, J.D., Biotechnol Prog 15, 58-64 (1999)).
Например, для введения мутаций путем генной рекомбинации могут применяться следующие методы. Конструируется мутантный ген, кодирующий мутантный белок со сниженной активностью, и бактерия для ее модификации трансформируется фрагментом ДНК, содержащим мутантный ген. Затем нативный ген на хромосоме замещается путем гомологичной рекомбинации мутантным геном, отбирается полученный штамм. Замещение гена с использованием гомологичной рекомбинации может быть проведено методом с использованием линейной ДНК, известным как "Red-зависимая интеграция" или "интеграция посредством Red-системы" (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, 6640-6645(2000)) или методом с использованием плазмиды, репликация которой чувствительна к температуре (патент США 6,303,383 или патентная заявка Японии JP 05-007491 А). Кроме того, введение сайт-специфической мутации путем замещения гена с использованием вышеупомянутой гомологичной рекомбинации может также быть осуществлено с использованием плазмиды с пониженной способностью к репликации в клетке хозяина.
Экспрессия гена также может быть ослаблена вставкой транспозона или IS фактора в кодирующую область гена (патент США 5,175,107), или традиционными методами, такими как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин).
Инактивация гена также может быть осуществлена такими традиционными методами, как мутагенез с использованием УФ-излучения или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), сайт-специфический мутагенез, разрушение гена с использованием гомологичной рекомбинации или/и мутагенеза за счет вставки-делеции (Yu, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 5978-83 and Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12: 6640-45), также называемого "Red-зависимая интеграция".
Методы приготовления плазмидной ДНК, рестрикции и лигирования ДНК, трансформации, выбора нуклеотидов в качестве праймера и т.п. могут быть обычными методами, известными специалисту в этой области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Бактерия-продуцент L-аргинина
Может быть использована бактерия, модифицированная таким образом, что экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих транспортер L-аргинина, в указанной бактерии ослаблена, и способная к продукции L-аргинина.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем инактивации одного или нескольких генов, кодирующих транспортер L-аргинина, в бактерии, уже обладающей способностью к продукции L-аргинина. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания способности к продукции L-аргинина бактерии, в которой уже инактивирован один или несколько генов, кодирующих транспортер L-аргинина.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина согласно настоящему изобретению, включают в себя, но не ограничиваются штаммами, принадлежащими к роду Escherichia, такими как штамм Е.coli 237 (ВКПМ В-7925) (патентная заявка США 2002/058315 А1) и его производные, содержащие мутантную N-ацетилглутаматсинтазу (патентная заявка РФ 2001112869), штамм Е.coli 382 (ВКПМ В-7926) (Европейская патентная заявка ЕР1170358А1), штамм-продуцент аргинина, в который введен ген argA, кодирующий N-ацетилглутаматсинтетазу (Европейская патентная заявка ЕР1170361А1), и подобные им.
Примеры родительских штаммов, используемых для получения бактерии-продуцента L-аргинина, согласно настоящему изобретению, также включают в себя штаммы, в которых усилена экспрессия одного или нескольких генов, кодирующих ферменты биосинтеза L-аргинина. Примеры ферментов биосинтеза L-аргинина включают N-ацетилглутамилфосфатредуктазу (argC), орнитинацетилтрансферазу (argJ), N-ацетилглутаматкиназу (argB), ацетилорнитинтрансаминазу (argD), орнитинкарбамоилтрансферазу (argF), синтетазу аргининсукциниловой кислоты (argG), лиазу аргининсукциниловой кислоты (argH), и карбамоилфосфатсинтетазу (carAB).
2. Способ согласно настоящему изобретению
Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аргинина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и секреции L-аминокислоты в питательную среду, и выделения L-аргинина из культуральной жидкости.
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка L-аргинина из культуральной или подобной ей жидкости могут быть осуществлены способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислоту получают с использованием бактерии.
Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста микроорганизмов. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции выбранного микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной среде.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и/или кристаллизации.
Краткое описание чертежей
На Фигуре 1 изображены относительные положения пар праймеров Р1 и Р2, Р5 и Р6 на плазмиде pMW118-attL-Cm-attR.
На Фигуре 2 изображено конструирование фрагмента хромосомной ДНК, содержащего инактивированный ген artI или artPIQM-artJ кластер.
Примеры
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.
Пример 1. Конструирование штамма с инактивированным геном artI
1. Делеция гена artI
Делеция гена artI была выполнена с использованием методики, разработанной Datsenko, K.A. и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), известной как "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой были сконструированы праймеры P1 (SEQ ID NO:11) и Р2 (SEQ ID NO:12), гомологичные областям, прилегающим к гену artI, и к гену в составе плазмиды-матрицы, обеспечивающему устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175). Использовали следующий температурный профиль для ПЦР: начальная денатурация при 95°С в течение 5 мин; последующие 25 циклов: денатурация в течение 30 сек при 95°С, отжиг в течение 30 сек при 54°С, элонгация в течение 40 сек при 72°С; и заключительная элонгация в течение 5 мин при 72°С.
araB
Полученный ПЦР-продукт длиной 1.7 т.п.н. (Фиг.1) очищали в агарозном геле и использовали для электропорации в штамм Е.coli MG1655 (АТСС 700926), содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Wanner, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645) содержит ДНК-фрагмент фага λ длиной 2154 п.н. (позиции с 31088 по 33241 нуклеотидной последовательности с инвентарным номером J02459 в базе данных GenBank), а также содержит гены λ Red-гомологичной системы рекомбинации (гены γ, β, ехо) под контролем промотора P, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.
600
2
R
Электрокомпетентные клетки были получены следующим образом: ночную культуру штамма Е.coli MG1655 выращивали при 30°С в среде LB с добавкой ампициллина (100 мг/л), разводили в 100 раз, добавив 5 мл среды SOB (Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), содержащей ампициллин и L-арабинозу (1 мМ). Полученную культуру растили с перемешиванием при 30°С до достижения OD≈0.6, после чего делали клетки электрокомпетентными, путем концентрирования в 100 раз и трехкратного отмывания ледяной деионизированной HO. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С, и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.
2. Подтверждение делеции гена artI c помощью ПЦР
+
Мутанты с делегированным геном artI, содержащие ген устойчивости Cm, были проверены с помощью ПЦР с использованием локус-специфичных праймеров Р3 (SEQ ID NO:13) и Р4 (SEQ ID NO:14). Для этого свежевыращенные колонии суспендировали каждую в 20 мкл воды и 1 мкл полученной суспензии использовали в ПЦР. Использовали следующие температурные условия: денатурация при 95°С в течение 5 мин; профиль для 30 циклов: денатурация в течение 30 сек при 95°С, отжиг в течение 30 сек при 55°С, элонгация в течение 1 мин при 72°С; заключительный элонгация в течение 5 мин при 72°С. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток родительского штамма artI MG1655, составляла 803 п.н. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма MG1655 ΔartI::cat, составляла 1453 п.н. (Фиг.2).
Пример 2. Конструирование штамма с инактивированным artPIQM-artJ-кластером
1. Делеция artPIQM-artJ-кластера
Делеция кластера artPIQM-artJ была выполнена с использованием методики, разработанной Datsenko, K.A. и Wanner, B.L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12), 6640-6645), известной как "Red-зависимая интеграция". В соответствии с этой процедурой были сконструированы праймеры Р5 (SEQ ID NO:15) и Р6 (SEQ ID NO:16), гомологичные областям, прилегающим к кластеру artPIQM-artJ и гену в составе плазмиды-матрицы, обеспечивающему устойчивость к антибиотику. В качестве матрицы для ПЦР использовали плазмиду pMW118-attL-Cm-attR (WO 05/010175). Использовали температурный профиль для ПЦР, описанный выше.
araB
Полученный ПЦР-продукт длиной 1.7 т.п.н. (Фиг.1) очищали в агарозном геле и использовали для электропорации в штамм Е.coli MG1655 (АТСС 700926), содержащий плазмиду pKD46 с термочувствительным репликоном. Плазмида pKD46 (Datsenko, K.A. and Warmer, B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645) содержит ДНК-фрагмент фага λ длиной 2154 п.н. (позиции с 31088 по 33241 нуклеотидной последовательности с инвентарным номером J02459 в базе данных GenBank), а также содержит гены λ Red-гомологичной системы рекомбинации (гены γ, β, ехо) под контролем промотора P, индуцируемого арабинозой. Плазмида pKD46 необходима для интеграции продукта ПЦР в хромосому штамма MG1655.
R
Электрокомпетентные клетки были получены с помощью описанного выше метода. Электропорацию проводили с использованием 70 мкл клеток и ≈100 нг ПЦР-продукта. После электропорации клетки инкубировали в 1 мл среды SOC (Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) при 37°С в течение 2.5 часов, после чего высевали на чашки с L-агаром, содержащим 30 мкг/мл хлорамфеникола, и выращивали при 37°С для отбора Cm-рекомбинантов. Затем для удаления плазмиды pKD46 проводили 2 пассажа на L-агаре с Cm при 42°С, и полученные колонии проверяли на чувствительность к ампициллину.
2. Подтверждение делеции artPIQM-кластера с помощью ПЦР
Мутанты с делегированным геном artI, содержащие ген Cm-устойчивости, были проверены методом ПЦР с использованием локус-специфичных праймеров Р7 (SEQ ID NO:17) и Р8 (SEQ ID NO:18), как описано выше. Длина продукта ПЦР, полученного в результате реакции с использованием в качестве матрицы клеток мутантного штамма MG1655 ΔartPIQM-artJ::cat, составляла 1,5 т.п.н. (Фиг.2).
Пример 3. Продукция L-аргинина штаммом Е.coli 382ΔartI
Для оценки влияния инактивации гена artI или artPIQM-artJ-кластера на продукцию L-аргинина ДНК-фрагменты хромосомы описанных выше штаммов Е.coli MG1655 Δartl::cat и Е.coli MG1655ΔartPIMQ-artJ перенесли в штамм-продуцент L-аргинина E.coli 382 с помощью P1-трансдукции (Miller, J.H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) с целью получения штаммов Е.coli 382ΔartI и 382ΔartPIMQ-artJ, соответственно.
Штаммы 382, 382-ΔartI и 382ΔartPIMQ-artJ, выращивали с перемешиванием при 37°С в течение 18 часов в 3 мл питательного бульона, по 0.3 мл полученных культур вносили в 3 мл ферментационной среды в пробирки размером 20×200 мм, и культуры выращивали при 32°С в течение 48 часов на роторной качалке.
2
После выращивания количество накопленного в среде L-аргинина определяли с помощью бумажной хроматографии, при этом использовали следующий состав подвижной фазы: бутанол: уксусная кислота: вода=4:1:1 (v/v). Раствор нингидрина (2%) в ацетоне использовали для визуализации. Пятно, содержащее L-аргинин, вырезали; L-аргинин элюировали 0.5% водным раствором CdCl, после чего количество L-аргинина определяли спектрофотометрическим методом при длине волны 540 нм.
Состав ферментационной среды (г/л):
Глюкоза
48.0
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
35.0
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
2.0
MgSO<sub>4</sub> 7H<sub>2</sub>O
1.0
Тиамин HCl
0.0002
Дрожжевой экстракт
1.0
L-изолейцин
0.1
СаСО<sub>3</sub>
5.0
3
Глюкозу и сульфат магния стерилизуют раздельно. СаСО стерилизуют сухим жаром при 180°С в течение 2 часов. рН доводили до 7.0.
Результаты ферментации в пробирках представлены в таблице. Как видно из таблицы, в штаммах с инактивированным геном artI или кластером artPIMQ-artJ наблюдался более высокий уровень накопления L-аргинина по сравнению с родительским штаммом Е.coli 382 - продуцентом L-аргинина.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на наилучший способ осуществления изобретения, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения. Каждому из упомянутых выше документов соответствует ссылка, и все цитируемые документы являются частью описания настоящего изобретения.
Штамм
Количество L-аргинина, г/л
382
12.0±0.1
382ΔartI
14.3±0.1
382ΔartPIMQ-artJ
13.4±0.1