АНАЛОГИ ИНСУЛИНА ДЛИТЕЛЬНОГО ДЕЙСТВИЯ И ИХ ПРОИЗВОДНЫЕ

1. Аналог инсулина, содержащий вариант В-цепи инсулина, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2, аргинин (Arg) в положении аминокислоты 22 В-цепи инсулина заменен лизином (Lys) в нативном инсулине.
2. Аналог инсулина по п. 1, где аналог инсулина демонстрирует устойчивость к расщеплению ферментом клострипаином.
3. Аналог инсулина по п. 1, где аналог инсулина дополнительно содержит одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из:
замены валина (Val) на лейцин (Leu) в положении аминокислоты 3 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4;
замены треонина (Thr) на аспарагиновую кислоту (Asp) в положении аминокислоты 8 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4;
замены изолейцина (IIe) на лизин (Lys) в положении аминокислоты 10 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4;
замены тирозина (Tyr) на глутаминовую кислоту (Glu) в положении аминокислоты 14 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4;
замены тирозина (Tyr) на фенилаланин (Phe) в положении аминокислоты 19 А-цепи инсулина, представленной аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 4;
замены гистидина (His) на треонин (Thr) в положении аминокислоты 5 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2;
замены серина (Ser) на аспарагиновую кислоту (Asp) в положении аминокислоты 9 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2;
замены глутаминовой кислоты (Glu) на аланин (Ala) в положении аминокислоты 13 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2;
замены лейцина (Leu) на глутамин (Gln) в положении аминокислоты 17 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2; и
замены фенилаланина (Phe) на серии (Ser) в положении аминокислоты 24 варианта В-цепи инсулина, представленного аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 2.
4. Аналог инсулина по п. 3, где аналог инсулина имеет увеличенный in vivo период полувыведения, по сравнению с нативным инсулином.
5. Полинуклеотид, кодирующий аналог инсулина по любому из пп. 1-4.
6. Рекомбинантный вектор, содержащий полинуклеотид по п. 5.
7. Рекомбинантный микроорганизм, имеющий введенный в него рекомбинантный вектор по п. 6.
8. Производное аналога инсулина длительного действия, в котором альбумин-связывающий домен слит с аналогом инсулина по любому из пп. 1-4.
9. Производное аналога инсулина длительного действия по п. 8, в котором альбумин-связывающий домен содержит альбумин-связывающий мотив, представленный следующей аминокислотной последовательностью:
a
b
c
GVSDFYKKLIXKAKTVEGVEALKXXl, где:
a
X независимо выбран из D и Е,
b
X независимо выбран из D и Е, и
с
Х независимо выбран из А и Е.
10. Производное аналога инсулина длительного действия по п. 9, в котором альбумин-связывающий домен содержит следующую аминокислотную последовательность:
3
6
7
10
14
43
44
LAXAKXXANXELDXY-[BM]-LXXLP,
где:
[ВМ] представляет собой альбумин-связывающий мотив, как определено в п. 9,
3
Х независимо выбран из С, Е, Q и S;
6
Х независимо выбран из С, Е и S;
7
Х независимо выбран из А и S;
10
X независимо выбран из A, R и S;
14
Х независимо выбран из А, С, K и S;
43
Х независимо выбран из А и K; и
44
Х независимо выбран из А, Е и S.
11. Производное аналога инсулина длительного действия по п. 10, в котором альбумин-связывающий домен представлен аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-13.
12. Производное аналога инсулина длительного действия по п. 11, в котором альбумин-связывающий домен представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6.
13. Производное аналога инсулина длительного действия по п. 8, в котором аналог инсулина и альбумин-связывающий домен связаны друг с другом посредством пептидной связи; полипептидного линкера; или непептидильного линкера, выбранного из группы, состоящей из полиэтиле нгликоля, пол и про пилен гликоля, сополимера этиленгликоля и пропиленгликоля, полиоксиэтилированного полиола, поливинилового спирта, полисахаридов, декстрана, простого поливинилэтилового эфира, биоразлагаемых полимеров, жирных кислот, нукпеотидов, липидных полимеров, хитина, гиалуроновой кислоты и их комбинаций.
n
14. Производное аналога инсулина длительного действия по п. 13, в котором полипептидный линкер представляет собой (GGGGS) (где n представляет собой целое число, находящееся в интервале от 1 до 6).
15. Производное аналога инсулина длительного действия по п. 14, в котором полипептидный линкер представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 5.
16. Рекомбинантный вектор, который содержит: полинуклеотид по п. 5; и полинуклеотид, кодирующий альбумин-связывающий домен, содержащий альбумин-связывающий мотив, представленный следующей аминокислотной последовательностью:
a
b
c
GVSDFYKKLIXKAKTVEGVEALKXXl,
где:
a
X независимо выбран из D и Е,
b
X независимо выбран из D и Е, и
c
X независимо выбран из А и Е.
17. Рекомбинантный вектор по п. 16, в котором альбумин-связывающий домен содержит следующую аминокислотную последовательность:
3
6
7
10
14
43
44
LAXAKXXANXELDXY-[BM]-LXXLP,
где:
[ВМ] представляет собой альбумин-связывающий мотив, как определено в п. 16,
3
Х независимо выбран из С, Е, Q и S;
6
Х независимо выбран из С, Е и S;
7
Х независимо выбран из А и S;
10
Х независимо выбран из A, R и S;
14
Х независимо выбран из А, С, K и S;
43
Х независимо выбран из А и K; и
44
Х независимо выбран из А, Е и S.
18. Рекомбинантный вектор по п. 17, в котором альбумин-связывающий домен представлен аминокислотными последовательностями, выбранными из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6-13.
19. Рекомбинантный вектор по п. 18, в котором альбумин-связывающий домен представлен аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 6.
20. Рекомбинантный микроорганизм, имеющий введенный в него рекомбинантный вектор по п. 16.
21. Способ получения активной формы производного аналога инсулина длительного действия, имеющего увеличенный период полувыведения in vivo, причем способ включает следующие стадии:
(a) культивирование рекомбинантного микроорганизма по п. 20;
(b) лизис культивируемого рекомбинантного микроорганизма, с получением, таким образом, производного аналога инсулина длительного действия;
(c) индукция повторного сворачивания полученного производного аналога инсулина длительного действия, с получением, таким образом, препроформы производного аналога инсулина;
(d) превращение препроформы производного аналога инсулина в активную форму посредством обработки клострипаином и СрВ; и
(e) очистка активной формы производного аналога инсулина длительного действия.