Суправитальное контрастирование лантаноидами для визуализации структуры биологических образцов на сканирующем электронном микроскопе

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

суправитальное контрастирование лантаноидами для визуализации структуры биологических образцов на сканирующем электронном микроскопе

И.А. Новиков 1, А.М. Суббот1, А.А. Федоров 1, И.Г.Гоибоедова 1, Е.Н. Антонов 2, И.В.Вахрушев 3

1 Научно-исследовательский институт глазных болезней, Москва, Россия

2 Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН, Московская область, Россия

3Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича, Москва, Россия

Supravital lanthanoid staining for scanning electron microscopy of biological objects

I.A. Novikov1, A.M. Subbot1, A.A. Fedorov1, I.G. Griboedova 1, E.N. Antonov 2, I.V.Vakhrushev 3

1 Research Institute of Eye Diseases, Moscow, Russia

2 Institute on Laser and Information Technologies of the RAS, Moscow Region, Russia

3 Institute of Biomedical Chemistry, Moscow, Russia

Технология современной сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) позволяет исследовать образцы при низком вакууме и в режиме детекции обратно-рассеянных электронов, что дает возможность отказаться от избыточных этапов пробоподготовки, если клеточные структуры контрастированы «тяжелыми» элементами . В качестве контрастирующего вещества нами использовались хлориды редкоземельных металлов . Исследовались образцы тканей глаза, клеточные культуры и мелкие беспозвоночные Показано, что адаптированное к современному уровню техники суправитальное контрастирование с использованием лантаноидов существенно увеличивает контрастность и информативность изображений в обратно-рассеянных электронах, позволяя исследователю получать информацию не только о микрорельефе образца, но и о его строении на глубине до 5—10 мкм, избегая при этом «классической» пробоподготовки Избирательное накопление лантаноидов в пространственной позиции клеточных мембран, вероятно, обусловлено их фиксацией в зоне кальциевых АТФаз . Разработанный метод контрастирования лантаноидами позволяет визуализировать на СЭМ структуру подповерхностного слоя биологических образцов

Ключевые слова: сканирующая электронная микроскопия, лантаноиды, контрастирующее вещество, клеточная культура

Введение

Первые работы, в которых описывалось применение сканирующего электронного микроскопа для изучения биологических препаратов, стали появляться сразу после его создания . Начиная с середины прошлого столетия и вплоть до 80-х гг . , электронные изображения можно было встретить почти в каждой серьезной медицинской или биологической публикации . Однако с момента появления оптических методов, позволяющих наблюдать иммуноспецифи-ческое окрашивание объектов, роль сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) заметно снизилась . Окончательное вытеснение СЭМ из перечня рутинных методов визуализации биологических объектов завершилось, когда были созданы оптические системы с разрешением, превышающим дифракционный предел, а также с развитием конфокальной и атомно-силовой микроскопий Неудовлетворительная информативность изображений, получаемых на сканирующих электронных микроскопах, отча-

е-таП: к^кадЬ@дтаН . сот

Since modern scanning electron microscopes are capable of low-vacuum mode and back-scattered electron detection, no other sample preparation, except for heavy metal staining, is necessary . Rare earth chlorides were used as contrast agents to study ocular tissues, cell cultures, and small invertebrates . it has been shown that supravital lanthanoid staining, if adjusted to meet the requirements of modern technology, significantly increases contrast of back-scattered electron images along with their informative value . Not only the microrelief but also internal structures (5—10 ^m beneath the surface) of the samples can be visualized without 'classical' sample preparation . Selective accumulation of lantanoids in cell membranes is likely to be due to their binding to calcium ATPases . The developed method of lanthanoid staining enables the use of scanning electron microscopy for subsurface examination of biological objects

Keywords: scanning electron microscopy, lanthanoids, contrast agent, cell culture

сти связана с тем, что данные приборы изначально разрабатывались как инструмент исключительно для изучения формы объектов, их микрорельефа . На старых, высоковакуумных приборах получение информации о внутренней структуре образцов было невозможным, так как классическая схема подготовки включала в себя процедуру напыления на поверхность образца токопроводящего слоя . Кроме этого, микроскопы первых поколений требовали предварительной сложной подготовки образцов, сопряженной с весьма существенными искажениями в наблюдаемой ткани

В настоящем исследовании предлагается концептуально изменить подход к применению сканирующего микроскопа В частности, используя его современные возможности, отказаться от избыточных этапов фиксации ткани и напыления препарата, а в качестве основного детектора микроскопа использовать не регистратор вторичных электронов CSE), а детектор обратно-рассеянных электронов CBSE),

позволяющий получать данные о распределении среднего атомного веса в объеме образца на глубине до 5—10 мкм . Таким образом, цель разработки данного метода — попытка получить информацию не о микрорельефе образца, а о химическом составе его подповерхностного слоя (рис . 1) .

А

Рис. 1. Схема, иллюстрирующая теоретическое положение визуализируемой зоны в разрезе образца при детекции электронов разных типов: SE — вторичные электроны, возникающие при взаимодействии электронного пучка микроскопа с поверхностью; BSE — обратно-рассеянные электроны, возникающие при взаимодействии электронного пучка микроскопа и объектов в объеме образца

Основная проблема, возникающая при попытке применения детекции обратно-рассеянных электронов — низкая природная вариабельность среднего атомного веса в большинстве биологических объектов (в их составе в основном «легкие» элементы). Таким образом, для реализации предлагаемого подхода и обеспечения оптимальной контрастности необходимо разработать метод насыщения отдельных клеточных и тканевых структур тяжелыми химическими элементами . Насыщение тяжелыми элементами будет обеспечивать большую интенсивность обратного рассеяния электронов при взаимодействии электронного пучка сканирующего микроскопа с объектами подповерхностного слоя исследуемого образца, делая насыщенные структуры контрастными на электронных BSE-изображениях . В то же время, метод насыщения не должен привносить заметных искажений в наблюдаемый объект .

В качестве кандидата для возможной реализации контрастирования такого типа были отобраны редкоземельные элементы (РЗЭ), а точнее группа лантаноидов, способных образовывать водорастворимые хлориды . Способность лантаноидов контрастировать некоторые структуры клетки известна с середины прошлого века, однако методика такого контрастирования не получила широкого дальнейшего распространения, вероятно, вследствие технического несовершенства самой методики и отсутствия возможности наблюдать ненапыленные образцы на сканирующих микроскопах первых поколений

В работах, на которые мы опирались при выборе контрастирующего вещества, было описано использование лантаноидов в форме нитратов и их коллоидных растворов [1—5]. Попытки использовать хлориды лантаноидов предпринимались только в схемах контрастирования для просвечивающего электронного микроскопа [6].

Цель работы: создание модифицированного метода контрастирования биологических тканей и клеточных культур с использованием лантаноидов, адаптированного под современный технический уровень низковакуумных сканирующих электронных микроскопов и задачи визуализации взаимодействия клеток и материала подложки в клеточной биологии .

Основная задача: оценить возможности применения СЭМ с использованием суправитального контрастирования лантаноидами для исследования структуры биологической ткани, а также двумерных и трехмерных клеточных культур

Материал и методы

Биологические образцы

Использованные в работе биологические образцы представлены ниже .

1. Интактные ткани, полученные из кадаверных глаз (время после смерти донора не более 24 ч . ): 4 образца конъюнктивального эпителия, 2 образца роговичного эпителия Образцы предоставлены глазным банком ФГБНУ «НИИГБ» .

2 . Клеточные культуры .

2 1 Первичные культуры конъюнктивального

Получение первичных культур выполнялось методом экспланта . Биоптаты размером 1,5 мм2 получали иссечением из зоны лимба корнео-склерального кольца (невостребованного после проведения кератопластики) или бульбарной конъюнктивы кадавер-ного глаза Материал размещали эпителиальной стороной вниз на поверхности культурального флакона (Greiner bio-one, Германия) в капле феталь-ной бычьей сыворотки (FBS, PAA, Австрия), через 2 ч . добавляли полную ростовую среду (DMEM/F12 с 10% FBS, 10 мМ HEPES, 100 Ед/мл пенициллин-стрептомицина, 2,5 мкг/мл антимикотика амфотери-цина В) с 10 нг/мл эпидермального фактора роста (ПанЭко, Россия) . Клетки культивировали в стандартных условиях СО2-инкубатора (37°С, 5% СО2), среду меняли каждые 2—3 дня, миграция клеток наблюдалась на 3—6 сут .

Контрастирование и съемку образцов проводили через 3 дня после начала миграции клеток из экс-планта на том же пластике, на котором они культивировались .

2 . 2 . Мультипотентные мезенхимальные стро-мальные клетки

3 . Тканеинженерные конструкции на основе ММСК и трехмерных носителей из полилактоглико-лида в комплексе с трикальцийфосфатом (n = 2) .

Первичные культуры ММСК пульпы молочного зуба человека, а также тканеинженерные конструкции были предоставлены ИБМХ, где их получили и охарактеризовали по методу, описанному ранее [7].

Носители были изготовлены в ИПЛИТ РАН по технологии поверхностного селективного лазерного спекания

4 . Целые взрослые особи беспозвоночных Dinophilus gyrociliatus О . Schmidt (n = 2) . Образцы любезно предоставлены лабораторией нейробиоло-гии развития ФГБУН ИБР им . Н . К. Кольцова РАН .

Протокол подготовки к исследованию

1. Каждый образец промывали в 0,9% NaCl (Па-нэко, Россия). Иначе часть РЗЭ, будучи тропными к фосфатам, могли образовать нерастворимые соединения с компонентами ростовых сред и жидкостью основного вещества ткани, сорбировавшимися на поверхность образца, что могло помешать дальнейшим наблюдениям

2 Каждый образец размещали в емкость с водным изотоническим раствором и экспонировали в растворе от 20 мин . до 6 ч .

2 1 Экспериментальные (контрастированные) образцы — в растворе одного из хлоридов редкоземельных элементов (Sigma-Aldrich, США) или их смеси, для насыщения образца контрастирующим веществом . В настоящее время протокол апробирован для Nd, Sm, Pr и La . Все эти элементы проявили весьма сходные свойства и для решения поставленной задачи могут быть взаимозаменяемы без ограничений

2 . 2 . Контрольные (неконтрастированные) образцы — в изотоническом растворе NaCl .

3 . Все образцы промывали в дистиллированной воде (1—10 сек . ) для удаления излишков растворов .

4 . Подготовленные объекты размещали на предметном столике микроскопа

Наилучшие результаты удается получить, если объект исследования во время процедуры окрашивания находится в условиях, максимально приближенных к физиологическим

Дальнейшее изучение экспериментальных и контрольных образцов проводили на микроскопе EVO LS-10 (Zeiss, Германия), снабженном детектором вторичных электронов (SE), обратно-рассеянных электронов (BSE) и энергодисперсионным рентгеновским спектрометром Oxford X-Max50 (Oxford, Великобритания) Наблюдения велись в режиме низкого вакуума (EP, 70 Па) при ускоряющем напряжении от 5 до 30 кВ, силе тока на образце 400—520 пА .

Полуколичественный химический микроанализ с использованием энергодисперсионного рентгеновского спектрометра был проведен на участке поверхности культуры роговичного эпителия после контрастирования его хлоридом неодима По результатам измерений в 135 случайных точках на площади 200 мкм2 была построена диаграмма соотношения фосфора и неодима

Результаты

Наибольшая контрастность структуры подповерхностного слоя образца достигается в режиме обратно-рассеянных электронов при ускоряющем напряжении 15—30 кВ .

На рис . 2а показано, что ММСК, культивируемые в трехмерных условиях в составе тканеинженерных конструкций, плохо визуализируются на поверхности минерал-полимерного носителя, при этом единственными объектами в поле зрения, обладающими достаточным контрастом, являются включения три-кальцийфосфата Контрастирование лантаноидами в этом случае значительно повышает информатив-

ность получаемых изображений, позволяя оценить степень покрытия поверхности носителя клетками, взаимодействие клеток между собой и с поверхностью материала (рис. 2б) .

На рис . 3 представлены два снимка одного и того же участка поверхности контрастированного образца роговичного эпителия. В режиме детекции обратно-рассеянных электронов весьма контрастными выглядят межклеточные границы и ядра, а в режиме вторичных электронов — удовлетворительно визуализируется рельеф клеток, покрытых муцино-вым слоем . Несмотря на большую зависимость интенсивности образования вторичных электронов от микрорельефа поверхности образца, даже при съемке в режиме SE, подповерхностные структуры, обогащенные РЗЭ, имеют повышенную контрастность и визуализируются

На рис . 4 показан результат наложения двух изображений конъюнктивального эпителия, полученных с разных детекторов . По мере обезвоживания образца в камере микроскопа (в том числе, за счет активной абляции, провоцируемой электронным пучком) микроструктура нативной ткани открывается более полно . Так, на представленном изображении можно увидеть характерные для этого типа клеток микроворсинки

Рис. 2. ММСК пульпы молочного зуба, культивируемые на трехмерном минерал-полимерном носителе:

А — контрольный (неконтрастированный) образец; Б — экспериментальный (контрастированный) образец

Рис. 3. Роговичный эпителий (интактная ткань) после контрастирования лантаноидами: А — изображение в режиме BSE, монослой клеток не нарушен, видны ядра, межклеточные контакты; Б — изображение в режиме SE

Рис. 4. Конъюнктивальный эпителий (интактная ткань) после контрастирования лантаноидами (суперпозиция изображений в режиме BSE (розовый) и SE (серый)). Монослой клеток не нарушен, видны микроворсинки, ядра, межклеточные контакты

Рис . 5 демонстрирует различную интенсивность окрашивания лантаноидами свободного края первичной культуры конъюнктивального эпителия, который активно мигрирует, и переходной зоны, где клетки уже сформировали монослой . Такая же картина наблюдалась и при исследовании первичной культуры роговичного эпителия

Рис. 5. Первичная культура конъюнктивального эпителия на пластике после контрастирования лантаноидами (изображение в режиме BSE): А — общий вид; Б — отдельная клетка. Монослой клеток не нарушен, видны ядра, ядрышки, клеточные мембраны, псевдоподии, свободный край более яркий

На препарате двумерной культуры ММСК на пластике после контрастирования наблюдали распластанные клетки, обладавшие характерной для клеток этого типа морфологией, визуализировались клеточные мембраны и ядра с несколькими ядрышками . Участки клеточных мембран окрашивались более ярко в местах активного контакта с поверхностью культурального пластика или другими клетками (рис . 6).

На рис . 7 представлен результат окрашивания лантаноидами целой взрослой особи йторЫ1иэ дугосШа^э . Зоны предполагаемого расположения ресничных шнуров, обеспечивающих движение в толще воды, окрасились более яркими полосками Это наблюдение, вместе с предыдущими (более яркое окрашивание свободного края клеточной культуры и зон контакта псевдоподий ММСК с подложкой) позволяют нам сделать предположение, что зоны, функционально более активные, при предлагаемом протоколе окрашивания будут более яркими на изображении, и, наоборот, по интенсивности окрашивания можно косвенно сделать заключение о функциональном состоянии наблюдаемой клетки

Рис. 6. ММСК пульпы молочного зуба в двумерной культуре на пластике после контрастирования лантаноидами (изображение в режиме BSE): А — общий вид;

Б — отдельная клетка. Видны ядра, ядрышки, клеточные мембраны. Стрелками отмечены яркие зоны в местах прикрепления псевдоподий

Можно отметить дополнительный эффект предлагаемой принципиальной схемы контрастирования, заключающийся в том, что лантаноиды, по-видимому, обнаруживают свойства мягкого фиксирующего агента, повышающего устойчивость ткани при наблюдении в СЭМ . Отчетливо обнаруживается лучшая сохранность клеток в низком вакууме микроскопа после экспозиции культуры ММСК в растворе ШС1д по сравнению с группой контроля . У 50 из 50 наблюдаемых клеток после суправитально-го окрашивания неодимом ядра имели правильную круглую и овальную форму, которая сохранялась в течение 4 ч при нахождении клеток в условиях давления 50Па . В то же время в группе контроля из 50 клеток, экспонированных в изотоническом растворе хлорида натрия, у 47 за это же время ядра приобрели неправильную форму и уменьшились в размерах

Обсуждение

Особенность визуализации биологических тканей при СЭМ связана с их химическим составом . Такие образцы преимущественно состоят из различных соединений «легких» химических элементов и воды, что делает их изображение низко контрастным .

Вода, преобладающая в образцах тканей и клеток, исключала изучение препаратов в нативном виде при использовании СЭМ первых поколений Это было связано с обязательным использованием в камере микроскопа вакуума пх10-3 — пх10-7 Па . Попытки поместить нативную ткань или клеточную культуру в такие условия приводили к ее быстрому обезвоживанию с недопустимым искажением структуры, что делало наблюдения бессмысленными Именно этот факт послужил основой для разработки «классической» схемы пробоподготовки биологических образцов и предопределил необходимость либо химической фиксации ткани с последующим высушиванием, либо быстрого замораживания и лиофилизации [8]. Подготовленные таким образом

образцы имеют меньшие искажения, чем при неуправляемом обезвоживании в высоком вакууме, но даже при такой схеме объемная контракция ткани весьма велика

Вторая проблема, связанная с химическим составом биологических тканей, которую пришлось решать при «классической» подготовке — низкая контрастность . Действительно, их «легкий» элементный состав (преимущественно, соединения водорода, кислорода и углерода) определяет низкую эффективность взаимодействия электронного пучка с веществом образца. Поэтому для контрастирования всегда пытались применять схемы избирательного утяжеления среднего атомного веса структур ткани Это достигалось либо пропиткой образца солями тяжелых катионов с халькофильными свойствами (чаще всего свинца) или сложных анионов с тяжелым элементом (чаще всего уранил-иона и воль-фрамата), либо выдерживанием образца в парах тетроксида осмия, тропного преимущественно к липидам

Для отведения избыточного заряда с поверхности образца

Таким образом, применительно к исследованию биологической ткани при помощи современного сканирующего электронного микроскопа можно выделить следующую совокупность «некорректных» приемов классической схемы подготовки:

1) очевидная избыточность обезвоживания образцов, так как современные сканирующие микроскопы позволяют наблюдать ткани в режиме низкого вакуума во влажном состоянии и исключить при этом артефакты, связанные с предварительной лиофилизацией или химическим замещением воды в структурах биологических объектов;

2) агрессивность контрастирующих веществ по отношению к биологическим тканям . Используемые в классической схеме контрастирующие вещества (ацетаты, вольфраматы, уранил-ацетаты, соли халь-кофильных катионов и т . п . ) не являются химически нейтральными по отношению к большинству органических веществ, входящих в состав тканей . При вымачивании биологических образцов в их растворах, или экспонировании в парах этих веществ, происходит частичное изменение структуры ткани за счет того, что все эти реагенты имеют окислительно-восстановительный потенциал и рН, далеко выходящие за пределы химической устойчивости структур кон-трастируемого материала;

3) высокая токсичность и летучесть наиболее популярного красителя — тетроксида осмия, определяющего сложность выполнения подготовки тканей;

4) избыточность напыления . Современные микроскопы позволяют отводить заряд с поверхности образца посредством ионизации газов в камере микроскопа

Очевидно, что применение классических схем подготовки образцов избыточно, учитывая способность современных электронных микроскопов работать с образцами без обезвоживания, однако и совсем не подготовленные образцы, в своем нативном состоянии, будут иметь слишком низкую контрастность для наблюдения, что определяется их «легким» составом

Предлагаемый нами способ, направленный на насыщение отдельных структур ткани лантаноидами, позволяет решить эту проблему

В некоторых работах было указано, что в присутствии высоких концентраций редкоземельных элементов не происходит мгновенной гибели и лизиса клеток, а токсический эффект на клеточном уровне приводит к апоптозу, что подтверждает включенность РЗЭ в метаболические цепочки и позволяет использовать их соединения в качестве суправи-тального красителя [8].

Гипотетическое замещение кальция лантаноидом дает увеличение плотности обратно-рассеянных электронов приблизительно в два раза

ге а о

си н

ш

Ш щ

г *

I ^

и л

X

он

о £

200

150

100

50

к N

/с )а

_ь.

0 20 40 60 80

Атомный номер И

Рис. 8. График изменения яркости

при гипотетическом замещении кальция

лантаноидом

Депонирование лантаноидов в пространственной позиции клеточных мембран не имеет характера специфического связывания Однако в основе такой фиксации лежит качественная реакция, определяющая локальность контрастирования и, соответственно, — информативность получаемых изображений . Практически полная конверсия кальция на лантаноид во внутриклеточных позициях возможна в результате тождественности двойного катиона кальция с суммарным зарядом 4+, двойному катиону, состоящему из трехвалентного лантаноида и одновалентного щелочного металла или протона С позиции изоморфизма, обменную реакцию можно записать как: [Са2+ + Са2+]^[и-|3+ + Ме+]

На тех участках метаболических цепочек, где предполагается одновременный транспорт двух ионов кальция (а это, в частности, хорошо изученные кальциевые АТФазы), система захватывает лантаноид в паре с щелочным металлом . Но в точке деления на две ветви с независимым транспортом Са2+ система уже не способна обработать чужеродный катион В результате этого лантаноиды накапливаются в пространственной позиции преимущественно Са-АТФаз клетки . [8-12].

Избыточный кальций в ионной форме пассивно выводится из клетки по мере ингибирования систем его транспортировки лантаноидами, но сумма зарядов остается практически неизменной, что весьма важно для сохранности клеточных структур при контрастировании Деплетирование клетки кальцием оказывается настолько полным, что конечное его содержание лежит ниже предела обнаружения

энергодисперсионного рентгеновского спектрометра Косвенным подтверждением депонирования лантаноидов в позиции Са-АТФаз клетки, является высокая корреляционная связь Ш = 0,91; р = 0,0012; N = 403) содержания лантаноида с содержанием фосфора в объеме клетки после контрастирования и их фиксированное соотношение, проиллюстрированное на рис 9

Выводы

В нашем исследовании показано, что разработанный метод контрастирования биологических образцов лантаноидами существенно увеличивает контрастность и информативность изображений в обратно-рассеянных электронах, позволяя визуализировать при СЭМ структуру подповерхностного слоя клетки . Процедура суправитального окрашивания дает возможность изучать образец в максимально нативном состоянии, избегая при этом «классической» пробоподготовки .

Требуется дальнейшее изучение механизма локализации лантаноидов в структурах клетки для более точной интерпретации полученных изображений

Nd/P=i/1

О 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

N[1,

Рис. 9. Диаграмма атомных отношений Nd/P по данным измерений с помощью энергодисперсионного рентгеновского спектрометра в 135 случайных точках поверхности культуры клеток роговичного эпителия после контрастирования его хлоридом неодима. Статистическое сгущение точек характеризует две вероятные фосфоросодержащих фазы, в которых накапливается Ш в клетках

ЛИТЕРАТУРА:

1. Miller Т .W ., Tormey J . M . Calcium displacement by lanthanum in subcellular compartments of rat ventricular myocytes: characterisation by electron probe microanalysis . Cardiovasc . Res . 1993; 27(12): 2106-12 .

2 . Shaklai M ., Tavassoli M . Lanthanum as an electron microscopic stain . J . Histochem . Cytochem . 1982; 30(12): 1325-30 .

3 . Doggenweiler C . F . , Frenk S . Staining properties of lanthanium on cell membranes . PNAS USA 1965; 53(2): 425-30 .

4 . Zancanaro C ., Sbarbati A., Franceschini F . et al . The chemoreceptor surface of the taste disc in the frog, Rana esculenta An ultrastructural study with lanthanum nitrate . Histochem . J . 1990; 22(9): 480-6 .

5 Leslie R A The effects of ionic lanthanum and hypertonic physiological salines on the nervous systems of larval and adult stick insects . J . Cell Sci . 1975; 18(2): 271-86 .

6 . Mills C . J ., Buhl A. E ., Ulrich R . G . et al . Ultrastructural localization and quantification of extracellular calcium binding sites in mouse vibrissa and human scalp follicles . Skin Pharmacol . 1993; 6(4): 259-67 .

7 . Вахрушев И . В ., Антонов Е . Н ., Попова А . В . и др . Разработка тканеинженерных имплантов для регенерации костной ткани на основе полилактогликолидных скаффолдов нового поколения и мультипотентных мезенхимальных клеток пульпы молочного зуба tSHED-кпеток), Клеточные технологии в биологии и медицине 2012; 1: 29-33 .

8 . Kuo J ., editor. Electron microscopy: methods and protocols . Third Edition . New York: Humana Press; 2014 .

9 . Wu J . , Yang J . , Liu Q . et al . Lanthanum induced primary neuronal apoptosis through mitochondrial dysfunction modulated by Ca2 and Bcl-2 family . Biol . Trace Elem . Res . 2013; 152(1): 125-34 .

10 . Ferreira-Gomes M . S ., González-Lebrero R . M ., de la Fuente M . C . et al . Calcium occlusion in plasma membrane Ca2 + -ATPase . J . Biol . Chem . 2011; 286(37): 32018-25 .

11. Moreira О . C . , Rios P . F ., Barrabin H . Inhibition of plasma membrane Ca(2 + )-ATPase by CrATP . LaATP but not CrATP stabilizes the Ca(2 + )-occluded state . BBA 2005; 1708(3): 411-9 .

12 . Glynn I . M . , Karlish S . J . Occluded cations in active transport . Annu . Rev . Biochem . 1990; 59:171-205 .

Поступила: 11.03.2015