Молекулярные маркеры в защите сельскохозяйственных растений от вредных насекомых

УДК 575.595:577.633

Молекулярные маркеры в защите сельскохозяйственных растений от вредных насекомых

В.И. КИЛЬ,

заведующий лабораторией Всероссийского НИИ биологической защиты растений

Для успешной защиты сельскохозяйственных растений от вредителей необходимо знание генетической структуры популяций, миграционных процессов (динамики), акклиматизации, поведенческих реакций, условий размножения, отношения полов и трофических связей как вредных, так и полезных насекомых.

Значительный прогресс в изучении их биологии и генетики был достигнут в 1950-1960-е годы благодаря использованию классических генетических принципов и подходов. Изучение популяционных процессов у насекомых исследователи проводили, главным образом, с помощью видимых и хорошо различимых фенотипических маркеров (морфологических и фенетичес-ких), таких, как цвет глаз, полосы и пятна, волоски или шипы на теле особи. Это приблизилоученых кпо-ниманию закономерностей распространения насекомых, их поведенческих реакций, включая половые отношения, и наследования отдельных генов, контролирующих те или иные признаки.

Несмотря на то, что фенотипи-ческие маркеры просты для использования, они имеют ряд существенных недостатков. Так, их мо-дификационная изменчивость, как правило, весьма значительна, идентификация таких маркеров должна базироваться на знании генов, контролирующих этот признак, и их наследовании, хорошо различимые фены относительно

редки и встречаются далеко не у всех видов насекомых.

Решению этих проблем во многом способствовало использование молекулярно-генетических подходов в популяционных исследованиях насекомых, начиная с белковых маркеров в 1970-х годах, главным образом изоферментов (продуктов различных локусов, но со сходной функцией), и позже - ДНК-маркеров. Большинство ДНК-маркеров, используемых сегодня, - это продукты полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые могут быть получены из экстремально малого количества биоматериала (из яйца, куколки, имаго насекомого или его отдельных органов).

Они позволяют анализировать структуру популяций насекомых, разделить их таксоны - биотипы, подвиды, близкородственные виды, а также виды-двойники, т.е. виды, которые трудно различить морфологически или каким-то другим способом.

Большинство этих маркеров можно легко визуализировать в геле, используя диазо-красители (для аллозимов), окрашивание серебром (для микросателлитов, SSR-маркеры), этидиум бромид (в ультрафиолетовом свете для большинства ДНК-маркеров) или авторадиографию (RFLP).

Для использования некоторых ДНК-маркеров необходимо знание первичной последовательности ДНК отдельных участков генома. Как правило, эту информацию можно найти в научных журналах или в интернете и сконструировать соответствующие праймеры.

Идентификация вида. Для боль-

шинства насекомых с успехом используют идентификацию по морфологическим признакам. Однако для видов с неявными морфологическими отличиями, а также для анализа внутривидовых групп особей или только преимагинальных стадий с успехом могут быть использованы молекулярные маркеры. Часто в таких случаях применяются простые маркерные системы, такие как аллозимы и RAPD-марке-ры. Различия в группах особей, как правило, наблюдаются по одному или небольшому числу фрагментов в одном локусе или по многим фрагментам большого числа локусов. Для разделения популяций одного и того же вида часто используют, например, статистические методы, базирующиеся на отсутствии или присутствии аллелей отдельных локусов.

Так, ученые разных стран использовали RAPD-маркеры для разделения видов жуков-хищников (Coccinella septempunctata, Hippo-damia variegate и Propylea quatu-ordecimpunctata) различного географического происхождения или трудноразличимых видов Age-niaspis spp. (видов-двойников), RFLP-маркеры - для дифференциации видов при анализе динамики лёта африканской пчелы (Apis mellifera scutellata) из Центральной в Северную Америку.

Использование молекулярных маркеров позволяет выявлять паразитов в теле их хозяев. Так, с помощью электрофореза энзимов было проведенотаксономическое разделение паразитов злаковых тлей рода Sitobion, установлен процент их паразитизма в природной популяции тлей. RAPD-маркеры использовали для выявления и идентификации двух видов наездников Diaeretiella rapae и Lysiiphlebus testaceipes, паразитирующих внутри их хозяев - тлей, PCR-RFLP-мар-керы - для идентификации видов наездников рода Peristenus, эндо-

паразитов клопов Lygus lineolaris и мониторинга уровня паразитизма в поле.

Видоспецифические ITS2 и 16S праймеры использовали для определения эффективности биологического контроля русской тли Diuraphis noxia на пшенице с помощью ее паразита Aphelinus hordei. Использование метода ПЦР увеличило чувствительностьтаких экспериментов, позволило проводить исследования на отложенных паразитами яйцах, повысило точность оценок при мониторинге популяций вредителей и их паразитов. Однако проводимая таким методом оценка степени паразитизма не позволяет полностью прогнозировать конечную эффективность энтомофага, поскольку не может определить жизнеспособность инкапсулированных яиц паразитов.

Специфические ДНК-маркеры также с успехом применяют для детекции видов, ставших жертвами нападения хищных членистоногих (насекомых, клещей и пауков), анализируя содержимое пищеварительного тракта хищников. Так, SCAR-маркеры, полученные из RAPD-маркеров, использовали для детекции хлопковой совки Heli-coverpa armigera и белокрылки Trialeurodes vaporariorum в кишечнике хищных насекомых, специфические митохондриальные ДНК-маркеры - для детекции яблоневой тли Rhopalosiphum insertum, являющейся объектом нападения хищного клеща Anystis baccarum.

Генетика популяций. Технологию молекулярных маркеров сегодня с успехом используют для изучения генетики популяций членистоногих, что позволяет глубже понимать поведенческие реакции, динамику численности и трофические связи между насекомыми, являющимися объектами биологического контроля или биоагентами, используемыми в программах защиты растений. Существующие маркерные систе-

мы могут быть ранжированы по степени их популярности в энтомологических популяционных исследованиях следующим образом: микросателлиты > митохондриальная ДНК > RAPD > AFLP и др.

Наиболее часто в последнее время в генетике популяций членистоногих используют микросателлит-ный анализ ДНК (по SSR-марке-рам). И хотя изоляция микросателлитов и создание к ним пар прайме-ров зачастую представляют некоторую сложность, тем не менее их продолжают наиболее широко применять в энтомологических исследованиях. Например, при анализе структуры и динамики численности популяций как полезных насекомых, в частности, наездников, жуков и пчел, так и вредных - молей, совок и других.

Использование митохондриаль-ной ДНК в популяционной генетике членистоногих обусловлено также выявляемым этими маркерами значительным генетическим полиморфизмом. Данный подход применяли в исследованиях популяций бра-конид, пчел Aphis mellifera и юкко-вой моли Prodoxus quinque-punctellus.

RAPD-технологию с успехом применяли в подобного рода экспериментах, особенно при изучении асексуальных организмов, в частности тлей, и гаплоидных видов, проявляющих относительно низкую генетическую изменчивость. Этот метод также выявляет значительный генетический полиморфизм популяций. При этом он наиболее прост в техническом отношении и не требует знания первичной последовательности ДНК. Так, RAPD-маркеры с успехом применяли, в частности, при анализе структуры популяций перепончатокрылых паразитов Aphidius ervi и Diaretiella rapae, используемых в программах интегрированной защиты растений, и популяций вредителей сельскохозяйственных культур, являющихся

объектом биологического контроля.

С 1994 г. в практику молекулярного маркирования вошел ISSR-PCR-анализ (межмикросателлитный ПЦР анализ ДНК). Его основой является ПЦР с праймерами, состоящими из нуклеотидных повторов. Этот метод не требует предварительного знания последовательности анализируемой ДНК, но по сравнению с RAPD-PCR обеспечивает более высокую воспроизводимость результатов, которая достигается за счет большей длины прай-мера и более высокой температуры отжига.

ISSR-маркеры доступны, воспроизводимы и полиморфны, что делает их удобным инструментом для молекулярно-генетического анализа популяций. В настоящее время ISSR-метод широко используется для выявления внутривидового полиморфизма, анализа филогенетических отношений и таксономической принадлежности различных видов насекомых.

Рассмотрим несколько конкретных примеров. Как правило, основной целью таких исследований является выявление изменчивости структуры популяций и динамики численности насекомых в агроэко-системах. Vaughn T.T & Antolin M.E. [10] исследовали структуру и динамику популяции паразита D. rapae, для которого были доступны в той местности два объекта (хозяина) для яйцекладки: капустная тля (Brevicoryne brassicae) и русская тля пшеницы (D. noxia). С использованием RAPD-PCR маркеров они показали, что популяция паразита D. rapae уже менее, чем через один километр генетически отличалась от соседней субпопуляции в строгом соответствии с расселением их хозяев. Был сделан вывод, что данные взрослые особи паразитов поселялись вместе с их хозяевами, которые перемещались, в данном случае, только на короткие расстояния.

В исследованияхпопуляций наездников в Англии для этих целей применяли микросателлитные маркеры [8]. Было показано, что в выборках насекомых, расположенных недалеко друг от друга в пределах одного вида растений, наблюдалась отчетливая генетическая гетерогенность популяции паразитов, что свидетельствовало о многочисленных атаках разных самок паразитов на колонию тлей. В другом обширном исследовании популяции паразита D. rapae на русской тле пшеницы с помощью тех же самых мик-росателлитных маркеров показали, что популяции паразита генетически различались в зависимости от их географического расположения [2].

С использованием технологии молекулярных маркеров исследовали трофические связи в популяциях различных видов жуков-хищников. В 1980-х годах исследователи традиционно для этих целей применяли изоферменты, тогда как в более поздние годы - ДНК-маркеры, особенно SSR-маркеры.

Так, микросателлиты применяли для анализа генетической структуры популяций жуков Carabus nemoralis, имеющих общую специализацию, и C. punctatoauratus, живущих в лесах [3]. Авторы выявили значительную генетическую дифференциацию между видами, имеющими различную пищевую специализацию и расположенными друг от друга на расстоянии более 13 км. Тем не менее, было отмечено, что популяции с более узкой специализацией (лесной регион) были более структурированы, чем жуки с общей специализацией. По мнению авторов, это указывало на существующий более высокий барьер, препятствующий потоку генов лесного вида C. punctatoauratus, тогда как C. nemoralis обладал относительно большей миграционной способностью.

Микросателлитные маркеры позволят также вести мониторинг

миграционных процессов у вредных насекомых. Так, в Чили с их помощью исследовали молекулярно-ге-нетическую структуру различных географических популяций яблонной плодожорки Cydia pomonella [5]. Несмотря на значительную географическую изоляцию, генетическая изменчивость между популяциями была очень незначительной и составляла только 2 % от общей изменчивости. Был сделан вывод, что, вероятно, существовал значительный обмен генетическим материалом между садами посредством переноса насекомых человеком в процессе выращивания фруктов.

Нами с применением RAPD- и ISSR-PCR были изучены ДНК-полиморфизм, изменчивость молеку-лярно-генетической структуры, генетическое сходство и генетическое разнообразие различных видов, популяций и внутрипопуляци-онных групп наиболее опасных вредителей основных сельскохозяйственных культур (клоп вредная черепашка, колорадский жук, картофельная минирующая моль, хлопковая совка, яблонная плодожорка) и полезных насекомых -клопов-хищников. Изданы методические рекомендации по оценке молекулярно-генетической структуры и генетического разнообразия насекомых с использованием метода ПЦР.

Эти исследования расширили представления ученых о биологии и генетике многих видов вредных и полезных насекомых и позволили создать новые методы мониторинга и прогноза резистентности вредителей к инсектицидам.

Резистентность к инсектицидам. Молекулярно-генетический анализ позволяет маркировать интересующие исследователя признаки (в том числе и резистентность к инсектицидам) по ДНК-фрагментам и на этой основе проводить мониторинг резистентности в популяциях вредных и полезных членистоногих.

Широкое использование химических инсектицидов привело к тому, что около 500 видов насекомых и клещей приобрели к ним резистентность, биохимические и молекулярные механизмы формирования которой исследуют ученые всего мира.

Так, основными факторами развития резистентности вредителей к фосфорорганическим соединениям считают усиление защитной роли покровов членистоногих (ингибиторы синтеза хитина), снижение чувствительности к препаратам основной мишени их действия -ацетилхолинэстеразы (ингибиторы АХЭ), усиление процессов ферментативной детоксикации инсектицидов (увеличение эстеразной,транс-феразной и оксигеназной активности и, в частности, Р450 цитохро-моксидаз). Резистентность к пирет-роидам и ДДТ, как принято считать, обусловлена в первую очередь уменьшением чувствительности нервной системы насекомых. Выявлен ответственный за этот механизм рецессивный ген kdr. Kdr-по-добный тип резистентности к пи-ретроидам обнаружен также у яблонной плодожорки. Показано, что он связан с точечными мутациями в гене para натриевого канала, вызывающего аминокислотные замены, в частности у яблонной плодожорки - лейцина на фенилаланин.

Тестирование генетического разнообразия с помощью ДНК-маркеров резистентности к инсектицидам позволяет проводить более точный мониторинг состояния популяций вредителей, а также проследить динамику частот отдельных генетических элементов. Для разных видов насекомых предпринимались и попытки поиска молекулярных маркеров резистентности к инсектицидам, в частности, методом RAPD-PCR.

Продолжающееся повсеместное использование химических инсектицидов (особенно пиретроидов и

ФОС) в некоторых агроэкосистемах привело к развитию резистентности не только у целевых фитофагов, но и в природных популяциях энто-мофагов и акарифагов, контролирующих их численность. Использование ДНК-маркеров позволяет проводить мониторинг резистентности и у этих насекомых.

Пионерской работой в этом отношении можно считать исследования Edwards O.R. & Hoy M.A. [4]. Авторы использовали RAPD-маркеры для разделения резистентных и чувствительных биотипов Trioxys pallidus - паразита ореховой тли Chromaphis juglandicola в садах грецкого ореха в Калифорнии. В этой работе резистентный к инсектициду азинфосметилу биотип паразита, искусственно отселектиро-ванный в лаборатории и впоследствии выпущенный в ореховые сады, позволил проводить биоконтроль вредителя в течение следующих трех лет после выпуска. Скрещивания между резистентным и природным биотипами приводили к промежуточному уровню полевой резистентности у потомства. Пестициды влияют на поведенческие реакции и эффективность биоагентов в агроэкосистемах, и это необходимо учитывать в стратегиях интегрированной защиты растений.

С использованием метода RAPD-PCR картированы генетические ло-кусы у долгоносика Rhyzopertha dominica, детерминирующие высокий уровень резистентности к фос-фину [9], с помощью AFLP - локусы колорадского жука, контролирующие резистентность к пиретроидам [6], и капустной моли - к ßt-токси-нам [7].

Нами выявлены RAPD-маркеры, которые могут быть в дальнейшем использованы для мониторинга резистентности популяций клопа вредная черепашка к инсектициду Би-58 Новый [1].

Таким образом, изучение ДНК-полиморфизмов позволяет марки-

ровать популяции насекомых. До настоящего времени такого эффективного средства маркировки отдельных генотипов и популяций вредителей и полезных насекомых не существовало. У исследователей появился универсальный инструмент - метод ПЦР, позволяющий работать с микроколичеством ДНК и способствующий прояснению важных аспектов поведения и эко-

логической генетики членистоногих.

Данные популяционной генетики насекомых вместе с технологией молекулярных маркеров могут существенно повысить эффективность биологической и интегрированной защиты растений.

Работа поддержана РФФИ и администрацией Краснодарского края (гранты №№ 09-04-96514 и 09-04-96556).

ЛИТЕРАТУРА

1. Киль В.И., Исмаилов В.Я. Идентификация резистентных к инсектицидам генотипов в популяции клопа вредная черепашка по фенам рисунка и RAPD-маркерам // Агрохимия, 2009, № 1, с. 38-49.

2. Baker D.A., Loxdale H.D., Edwards O. Genetic variation and founder effects in the parasitoid wasp, Diaeretiella rapae (M'Intosh) (Hymenoptera: Braconidae: Aphidiidae), affecting its otential as a biological control agent // Molecular Ecology, 2003, v. 12, p. 33033311.

3. Brouat C., Sennedot F., Audiot P. et al. Fine-scale genetic structure of two carabid species with contrasted levels of habitat specialization // Molecular Ecology, 2003, v. 12, p. 1731-1745.

4. Edwards O.R., Hoy M.A. Polymorphism in two parasitoids detected using random amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction // Biological Control, 1993, v. 3, p. 243-257.

5. Fuentes-Contreras E., Espinoza J.L., Lavandero B., RamHrez C.C. Population Genetic Structure of Codling Moth (Lepidoptera: Tortricidae) from Apple Orchards in Central Chile // Journal of Economic Entomology, 2008, v. 101, № 1, p. 190-198.

6. Hawthorne D.J. AFLP-based genetic linkage map of the Colorado potato beetle Leptinotarsa decemlineata: sex chromosomes and a pyrethroid-resistance candidate gene // Genetics, 2001, v. 158, p. 695-700.

7. HeckelD.G., Gahan L.J., Liu Y.B. et al. Genetic mapping of resistance to Bacillus thur-ingiensis toxins in diamondback moth using biphasic linkage analysis // PNAS USA, 1999, v. 96, p. 8373-8377.

8. Loxdale H.D., MacDonald C. Tracking parasitoids at the farmland field scale using microsatellite markers // Biological Resources & Migration. Proceedings of the international conference and OECD workshop (Phiiipps-University, Marburg, Germany, 5-8th October, 2003) / Eds. D. Werner. Springer-Verlag, Berlin, 2004, pp. 107-126.

9. Schihalius D.I. Cheng Q., Reilly P.E., et.al. Genetic linkage analysis of the lesser grain borer Rhyzopertha dominica identifies two loci that confer high-level resistance to the fumi-gant phosphine // Genetics, 2002, v. 161, p. 773-782.

10. Vaughn T. T., Antolin M.F. Population genetics of an opportunistic parasitoid in an agricultural landscape // Heredity, 1998, v. 80, p. 152-162.

Аннотация. В обзоре рассматривается практическое применение технологии молекулярных маркеров для целей защиты растений от вредителей. Показано применение ДНК-маркеров для идентификации видов, изучения генетики популяций полезных и вредных видов насекомых, а также мониторинга резистентности вредителей к инсектицидам.

Ключевые слова. Насекомые, ДНК-маркеры, популяция, резистентность к инсектицидам.

Abstract. In this review it was shown practical approach of molecular markers' technology for the aims of plant protection from pests. It was shown using DNA markers for identification of species, genetic studies of populations of beneficial and injurious insects and for monitoring of pest resistance to insecticides.

Keywords. Insects, DNA markers, population, resistance to insecticides.