СПОСОБ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ СПОР И ВЕГЕТАТИВНЫХ КЛЕТОК BACILLUS ANTHRACIS
METHOD OF NEUTRALISING BACILLUS ANTHRACIS SPORES AND VEGETATIVE CELLS

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способам дезинфекции, используемым при заражении окружающей среды бациллами сибирской язвы.
Используемые в настоящее время способы дезинфекции спор и вегетативных клеток Bacillus anthracis, как правило, основаны на применении химических дезинфицирующих средств, таких как, например, галогены и их производные (хлорная известь, гипохлорит кальция, ДП-2 и др.), окислители (пергидроль, перфторид калия и др.), альдегиды (формальдегид, глутаровый альдегид и др.), а также щелочи, фенолы, спирты, газы (окись этилена, бромид метилена и др.) [1].
Наиболее часто для дезинфекции используют перекись водорода, препараты хлора (хлорная известь, хлорамин), надуксусную кислоту, газы - диоксид хлора и окись этилена.
Большинство из разрешенных к применению химических дезинфицирующих средств токсичны, аллергенны, вызывают раздражение кожи и слизистых, раздражают верхние дыхательные пути (препараты хлора, альдегиды). Помимо этого, дезинфицирующие средства, обладающие спороцидной активностью, имеют короткий срок хранения (гипохлориты, альдегиды), низкую стабильность (препараты хлора, надуксусная кислота), обладают высокой коррозионной активностью (хлорсодержащие препараты), взрывоопасны и пожароопасны (надуксусная кислота).
Важно также, что применение химических дезинфицирующих средств требует многократной отмывки помещений и приборов после проведения дезинфекции, а обработка дорогостоящего оборудования химическими дезинфектантами, как правило, выводит такое оборудование из строя.
В 50-х годах XX века предпринимались попытки оздоровления зараженной почвы от Bacillus anthracis путем посева тех или иных культурных растений [2], однако обнадеживающих данных по «освобождению» почв от возбудителя сибирской язвы получено не было.
Сведений о способах дезинфекции, использующих биологические препараты, предназначенные для нейтрализации спор и вегетативных клеток Bacillus anthracis, нами в литературе не обнаружено.
Задачей заявляемого технического решения является расширение номенклатуры способов дезинфекции среды, зараженной спорами и вегетативными клетками Bacillus anthracis.
3
Поставленная задача решается тем, что предложен эффективный и экологически безопасный способ нейтрализации спор и вегетативных клеток Bacillus anthracis, включающий обработку зараженной поверхности дезинфицирующим средством, представляющим собой водный раствор, содержащий смесь бактериофагов Bacillus anthracis OZR-1, Bacillus anthracis Ф-2, Bacillus anthracis ФАУТ при соотношении активностей (БОЕ/см) Bacillus anthracis OZR-1:Bacillus anthracis Ф-2:Bacillus anthracis ФАУТ=1:(0,2-1):(0,1-1) и активатор прорастания спор L-аланин.
Существенным признаком изобретения является использование для дезинфекции смеси трех фагов, каждый из которых обладает литической активностью к прорастающим спорам и вегетативным клеткам Bacillus anthracis и действие которых при совместном использовании дополняет друг друга. Однако, так как бактериофаги не действуют на покоящиеся споры Bacillus anthracis, в раствор дополнительно вводят активатор прорастания спор L-аланин, который способствует переходу покоящихся спор в стадию активации и последующего прорастания в вегетативные клетки.
Раствор для дезинфекции готовят смешением в растворе раздельно хранящихся L-аланина и комплекса бактериофагов, выращенных по отдельности и смешанных в заданных соотношениях.
Для лучшего хранения и удобства использования комплекс бактериофагов дополнительно может содержать стабилизаторы и консерванты, в качестве которых могут быть использованы любые обычно применяемые для этих целей химические соединения, например сахароза, желатин и хинозол.
В качестве растворителя чаще всего используют физиологический раствор (0,9% раствор NaCl), однако могут быть использованы также буферные растворы, например фосфатный буфер, фосфатно-цитратный, трис-буфер и др.
Как правило, для удобства использования смешение осуществляют в растворе непосредственно перед применением.
10
12
Предпочтительно, используется водный раствор, содержащий смесь бактериофагов в концентрации 10-10 БОЕ/л и активатор прорастания спор в концентрации 0.05-0.15 моль/л.
Лизирующее действие бактериофагов проявляется уже через 30-60 минут, но для достижения полного эффекта и закрепления результата необходимо провести повторную обработку поверхности дезинфицирующим раствором через 60-180 минут после первой обработки.
6
2
11
12
Норма расхода раствора зависит от уровня зараженности. Нами показано, что при максимальной обычно наблюдаемой обсемененности 10 спор/см эффективной дезинфекции можно добиться, используя раствор из расчета 10-10 фаговых частиц на 10 м зараженной поверхности.
Бактериофаги, используемые для дезинфекции, депонированы в коллекции микроорганизмов ОАО "Институт инженерной иммунологии" (Россия, 142380, Московская область, Чеховский район, пос. Любучаны) и имеют следующие регистрационные номера: Bacillus anthracis OZR-1 - регистрационный номер Jn-08, дата депонирования 15.01.2007, Bacillus anthracis Ф-2 - регистрационный номер номер Jn-09, дата депонирования 05.02.2007, Bacillus anthracis ФАУТ - регистрационный номер номер Jn-10, дата депонирования 19.02.2007.
Штамм бактериофага OZR-1 (регистрационный номер Jn-08, дата депонирования 15.01.2007) получен из лизогенной культуры Bacillus cereus, штамм №ИИИ-32, методом индукции профага воздействием ультрафиолетового облучения, с помощью облучателя Viber Lourmat, при длине волны 260 нм в течение 105 секунд по методу Lwoff А. [3].
Морфологические признаки.
Головка 51-53 нм, хвостовой отросток 20-40 нм.
На газоне чувствительных бактериальных культур Bacillus anthracis фаг OZR-1 образует круглые, прозрачные пятна лизиса 2 мм в диаметре. Центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.
Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК.
Физико-химические свойства.
Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течение 30 мин при 56°С. Пределы допустимых значений рН, при которых литическая активность фага не изменяется, составляют 6,4-8,7. Устойчив к облучению ультрафиолетом в течение 5 мин при длине волны 260 нм. Литический спектр бактериального вируса.
Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция вакцинных штаммов Bacillus anthracis и близкородственных микроорганизмов, всего 32 штамма: В. anthracis СТИ-1, В. anthracis Sterne 34F2, В. anthracis 2-я вакцина Ценковского, пять штаммов В. thuringiensis, 3 штамма В. brevis, 3 штамма В. subtilis, 11 штаммов В. cereus, В. antracoides №217, В. megaterium №1412.
Бактериофаг OZR-1 лизирует вакцинные сибиреязвенные штаммы Bacillus anthracis СТИ-1, Bacillus anthracis Ценковского II, Bacillus anthracis Sterne 34F2. Диапазон специфичности - лизирует Bacillus anthracis.
Бактериальный штамм для поддержания и размножения бактериофага - вакцинный штамм Bacillus anthracis СТИ-1 (депонирован 01.10.1993 г. в коллекции микроорганизмов ОАО "Институт инженерной иммунологии" (Россия, 142380, Московская область, Чеховский район, пос. Любучаны), регистрационный номер номер 1/10-93).
Оптимальные условия размножения.
Штамм фага размножается на чувствительной культуре Bacillus anthracis СТИ-1 в жидкой и на плотной питательных средах, включающих 1,5% панкреатического перевара мяса (ГРМ-бульон [4]), при температуре 35±0,5°С, вызывая при этом просветление среды после 4-6-часовой инкубации, а на простом питательном агаре [5] образуя негативные прозрачные колонии правильной формы после 16-18-часовой инкубации.
Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 30-35 мин, урожайность - 200-220 частиц на одну клетку. Условия хранения.
Бактериофаг Bacillus anthracis OZR-1 сохраняет литические свойства в течение 3 лет при температуре хранения (4-6)°С в лиофилизированном состоянии в герметически закрытой ампуле.
Штамм бактериофага Ф-2 (регистрационный номер Jn-09, дата депонирования 05.02.2007) получен из сточных вод г. Пущино.
Морфологические признаки.
Головка икосаэдрической формы 82-94 нм, сокращающийся хвостовой отросток 158-162 нм. На газоне чувствительных бактериальных культур Bacillus anthracis фаг Ф-2 образует круглые, прозрачные, пятна лизиса диаметром 2-3 мм. Центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.
Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК.
Физико-химические свойства.
Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течение 30 мин при 56°С. Пределы значений рН, при которых литическая активность фага не изменяется, составляют 6,0-8,5. Устойчив к облучению ультрафиолетом в течение 10 мин при длине волны 260 нм.
Литический спектр бактериального вируса.
Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция вакцинных штаммов Bacillus anthracis и близкородственных микроорганизмов, всего 32 штамма: В. anthracis СТИ-1, В. anthracis Sterne 34F2, В. anthracis 2-я вакцина Ценковского, пять штаммов В. thuringiensis, 3 штамма В. brevis, 3 штамма В. subtilis, 11 штаммов В. cereus, В. antracoides №217, В. megaterium №1412.
Бактериофаг Ф-2 лизирует сибиреязвенные штаммы: Bacillus anthracis СТИ-1, Bacillus anthracis Sterne 34F2, Bacillus anthracis 2-я вакцина Ценковского.
Диапазон специфичности: лизирует Bacillus anthracis.
Бактериальный штамм для поддержания и размножения бактериофага - вакцинный штамм Bacillus anthracis СТИ-1.
Оптимальные условия размножения.
Штамм фага размножается на чувствительной к нему культуре Bacillus anthracis СТИ-1 в жидкой и на плотной питательных средах, включающих 1,5% панкреатического перевара мяса (ГРМ-бульон), при температуре 37±0,5°С, вызывая при этом просветление среды после 6-8 часовой инкубации, а на плотной питательной среде - образуя негативные прозрачные колонии правильной формы после 16-18- часовой инкубации.
Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине (штамм СТИ-1) продолжительность латентного периода составляет 40-50 мин, урожайность - 130-160 частиц на одну клетку.
Условия хранения.
Бактериофаг Ф-2 сохраняет литические свойства при температуре хранения (4-6)°С в лиофильно высушенном состоянии в герметически закрытой ампуле в течение 3 лет.
Периодичность пересевов 3 года.
Штамм бактериофага Bacillus anthracis ФАУТ (регистрационный номер Jn-10, дата депонирования 19.02.2007) получен из лизогенной культуры Bacillus cereus штамм №ИИИ-47 методом индукции профага воздействием ультрафиолетового облучения, с помощью облучателя Viber Lourmat, при длине волны 260 нм в течение 70 секунд по методу Lwoff А.
Морфологические признаки.
Головка икосаэдрической формы 80-82 нм, хвостовой отросток 270-280 нм. На газоне чувствительных бактериальных культур Bacillus anthracis фаг ФАУТ образует круглые, прозрачные, пятна лизиса 2 мм в диаметре. Центр прозрачный, край четкий, вторичный рост отсутствует.
Тип нуклеиновой кислоты штамма фага - ДНК.
Физико-химические свойства.
Фаг не инактивируется при нагревании суспензии в течение 30 мин при 56°С. Пределы значений рН, при которых литическая активность фага не изменяется, составляют 6,0-8,0. Устойчив к облучению ультрафиолетом в течение 10 мин при длине волны 260 нм.
Литический спектр бактериального вируса.
Для оценки круга штаммов-хозяев фага была использована коллекция вакцинных штаммов В. anthracis и близкородственных микроорганизмов, всего 32 штамма: В. anthracis СТИ-1, В. anthracis Sterne 34F2, В. anthracis 2-я вакцина Ценковского, пять штаммов В. thuringiensis, 3 штамма В. brevis, 3 штамма В. subtilis, 11 штаммов В. cereus, В. antracoides №217, В. megaterium №1412.
Бактериофаг Bacillus anthracis ФАУТ лизирует сибиреязвенные штаммы: Bacillus anthracis СТИ-1, Bacillus anthracis Sterne 34F2, Bacillus anthracis 2-я вакцина Ценковского.
Диапазон специфичности: лизирует Bacillus anthracis. Бактериальный штамм для поддержания и размножения бактериофага - вакцинный штамм Bacillus anthrtacis СТИ-1.
Оптимальные условия размножения.
Штамм фага размножается на чувствительной культуре Bacillus anthracis СТИ-1 в жидкой и на плотной питательных средах, включающих 1,5% панкреатического перевара мяса (ГРМ-бульон), при температуре 33±0,5°С, вызывая при этом просветление среды после 6-8-часовой инкубации, а на простом питательном агаре образуя негативные прозрачные колонии правильной формы после 16-18-часовой инкубации.
Способ размножения: при воспроизведении фага в клетке-хозяине продолжительность латентного периода составляет 48-60 мин, урожайность - 140-160 частиц на одну клетку.
Условия хранения.
Бактериофаг Bacillus anthracis ФАУТ сохраняет литические свойства в течение 3 лет при температуре хранения (4-6)°С в лиофилизированном состоянии, в герметически закрытой ампуле. Периодичность пересевов 3 года.
Пример №1. Получение комплекса бактериофагов.
Бактериофаги Bacillus anthracis OZR-1, Bacillus anthracis Ф-2 и Bacillus anthracis ФАУТ культивируют по отдельности с использованием культуры Bacillus anthracis СТИ-1 в жидкой питательной среде (ГРМ-бульон).
11
3
Полученные фаголизаты осветляют центрифугированием, фильтруют через стерилизующие фильтры с диаметром пор 1,2 мкм, 0,45 мкм и 0,22 мкм и концентрируют на установке системы Pellicon 3 Micro Millipore до получения препарата каждого бактериофага со специфической активностью не менее 10 БОЕ/см.
После концентрирования титры штаммов по Грациа [6] составили:
11
3
фага Bacillus anthracis OZR-1 - 7,0×10 БОЕ/см,
11
3
фага Bacillus anthracis Ф-2 - 4,0×10БОЕ/см,
11
3
фага Bacillus anthracis ФАУТ - 5,0×10 БОЕ/см.
3
Для приготовления смеси берут сконцентрированные суспензии каждого бактериофага в количестве по 25 см. Соотношение активностей в препарате составляет Bacillus anthracis OZR-1: Bacillus anthracis Ф-2:Bacillus anthracis ФАУТ=1:0,6:0,7.
3
3
11
При непрерывном перемешивании в смесь вводят стабилизаторы и консервант: сахарозу (30 г), желатин (7,5 г), хинозол (0,045 г). Полученный жидкий комплекс разливают по 0,2 см в ампулы объемом 2 см, лиофильно высушивают в ампулах, ампулы заполняют инертным газом (в данном случае аргоном) и запаивают. Одна ампула содержит 10 фаговых частиц.
Пример №2. Дезинфекция поверхности.
Одну ампулу препарата по примеру 1 разводят в 1 литре физиологического раствора и добавляют L-аланин (AppliChem, Германия) в количестве 8,909 г (100 мМ).
11
Получают дезинфицирующее средство, представляющее собой водный раствор, содержащий смесь бактериофагов в концентрации около 10БОЕ/л и активатор прорастания спор в концентрации 0.1 моль/л.
3
6
2
2
Участки лабораторного помещения (пол, стены, столы), а также поверхностные участки имеющегося оборудования (спектрофотометр СФ-56М, ФЭК 56М, центрифуга Т-23) обсемененные спорами Bacillus anthracis СТИ-1 в концентрации от 10 до 10 спор/см обрабатывают полученным раствором из пульверизатора (NiTO MiniSpray). Общая площадь обрабатываемой поверхности составляет примерно 10 м.
Обработку проводят двукратно с интервалом 120 мин.
6
2
2
Через 2 часа после повторной обработки смывы с обработанной контаминированной поверхности высевают на плотную питательную среду и подсчитывают количество колоний. При первоначальной обсемененности поверхности 10 спор/см после двукратной обработки остается 1-2 живые споры/см, что соответствует международным требованиям к способам дезинфекции [7].
В силу природы используемого дезинфицирующего средства предложенный способ обладает пролонгированным действием, так как концентрация действующего начала - бактериофагов не уменьшается, а увеличивается в 150-200 раз каждые 35-50 мин в геометрической прогрессии за счет их размножения в прорастающих спорах и вегетативных клетках Bacillus anthracis. Дезинфицирующее действие начинает проявляться через 20-30 мин с момента начальной обработки и действует до полного уничтожения спор, поскольку действие фагов проявляется до тех пор, пока присутствует возбудитель инфекции. При этом при отсутствии объекта дезинфекции бактериофаги самоликвидируются и, следовательно, после проведения дезинфекции не требуется, в отличие от химических средств, дополнительной очистки.
Безопасность предложенного способа обеспечивается тем, что используемые при его осуществлении специфические бактериофаги не взаимодействуют с другими микроорганизмами и клетками макроорганизмов, поэтому, попадая в окружающую среду, они не оказывают негативного воздействия.
Проведенная проверка показала, что используемая при осуществлении заявляемого способа смесь экологически безопасна, не токсична, не вызывает местного раздражения кожи и слизистых, не вызывает аллергических реакций, не действует на эукариотические клетки.
Список литературы.
1. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)».
2. Ветеринария, 1951, №3, с.33-35.
3. Мейнелл Дж., Мейнелл Э. Экспериментальная микробиология. М., 1967.
4. ТУ 9398-021-78095326-2006.
5. ТУ 9398-020-78095326-2006.
6. М.А.Адамс. Бактериофагия. М., 1961.
7. Современные средства и методы дезинфекции, применяемые при работе с патогенами. Материалы международного семинара (под ред. Т.Н.Лепешкина). - Киров: ООО НПЦ ЭМ «РАЦЕМ», 2006. 291 с.