СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ РАСЩЕПЛЕНИЯ ГЕМИЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ ГЕТЕРОПОЛИСАХАРИДОВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ РАСТЕНИЙ И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ (ВАРИАНТЫ)
METHOD OF PRODUCING ENZYMATIC AGENT FOR DEGRADATION OF HEMICELLULOSE HETEROPOLYSACCHARIDES OF HERBAL CYTODERM AND ENZYMATIC AGENT (VERSIONS)

Изобретение в области биотехнологии относится к микробиологической промышленности и представляет собой способ получения ферментных препаратов с арабиноксилан-арабинофурангидролазной активностью, α-L-арабинофуранозидазной активностью, α-галактозидазной активностью, ферулоил-эстеразной активностью и ксилоглюканазной активностью путем культивирования различных штаммов мицелиального гриба Penicillium canescens, полученных в результате генетической трансформации фрагментами ДНК с клонированными гомологичными и гетерологичными генами.
Ферментативная деградация гемицеллюлозных гетерополисахаридов растений (арабиноксиланов, глюкуроноксиланов, ксилоглюканов, маннанов, галактоманнанов, галактанов, арабинанов и т.д.) ферментными системами мицелиальных грибов состоит из цепи последовательных реакций, в которой участвуют различные ферменты, гидролизующие гликозидные связи в основной полисахаридной цепи, а также ферменты, гидролизующие связи, соединяющие боковые группы и основную полисахаридную цепь. Ферменты, осуществляющие деградацию гемицеллюлозных полисахаридов, могут быть использованы в виде кормовых добавок для разрушения некрахмальных полисахаридов и увеличения питательной ценности кормового сырья в промышленном животноводстве. Эти ферменты могут быть использованы также в пищевой промышленности для обработки растительного сырья с целью улучшения качества пищевых продуктов и увеличения сроков их хранения, для увеличения выхода экстрактивных веществ, создания новых видов функциональной пищи. Кроме того, гемицеллюлозолитические ферменты могут превращать гемицеллюлозы растительного сырья до моносахаридов и наряду с целлюлозолитическими ферментами, осуществляющими гидролиз целлюлозы, использоваться для наиболее полного расщепления полисахаридного матрикса растительного сырья до сбраживаемых сахаров в целях получения топливного биоэтанола и других полезных продуктов микробного синтеза. В этой связи поиск продуцентов среди новых видов микроскопических грибов и увеличение экспрессии их перспективных гемицеллюлолитических ферментов является весьма актуальной задачей.
У штамма P. canescens F178 (ВКПМ) в цепи ферментативного катаболизма арабинозы из-за мутации в гене арабитол-дегидрогеназы имеется дефект, в связи с чем, при росте на арабинозе (продукте расщепления гемицеллюлаз и пектина), в грибных клетках накапливается значительное количество арабинозы и арабитола, являющимся индуктором синтеза секретируемых ферментов. На избыточное внутриклеточное содержание индуктора P. canescens реагирует увеличенным синтезом двух основных секретируемых ферментов - эндо-β-1,4-ксиланазы и β-галактозидазы. В мультикопийных по генам β-галактозидазы и ксиланазы штаммах P. canescens синтез этих ферментов увеличивался в 7-10 раз по сравнению с исходным штаммом P. canescens F178, так как регуляторный механизм клетки не испытывает лимита в индукторе.
Мажорный секретируемый белок эндо-β-1,4-ксиланаза, кодируемый у P. canescens геном xylA, воздействует на основную цепь ксилана по механизму эндо-деполимеризации, расщепляя ксилан на олигосахариды. Среди других ферментов интерес с позиций полноты гидролиза природных полисахаридов (гемицеллюлоз, пектинов, ксиланов и др.) вызывают арабиноксилан-арабинофурангидролаза, α-L-арабинофуранозидаза, α-галактозидаза, ферулоил-эстераза и ксилоглюканаза.
Арабиноксилан-арабинофурангидролаза осуществляет глубокий гидролиз арабиноксиланов злаков по процессивному механизму и расщепляет гликозидные связи как между двумя остатками ксилозы, так и остатками ксилозы и арабинозы. α-L-арабинофуранозидаза гидролизует боковые α-1,2-, α-1,3-, и α-1,5-арабинозидные остатки и отщепляет арабинозу от арабинанов различной природы, входящих в состав гемицеллюлоз и пектинов злаков и бобовых, α-галактозидазы удаляют боковые D-галактозные остатки пектина, а также галактоманнанов, кроме того, они гидролизуют галактоолигосахариды, которыми богаты соя, горох и другие бобовые. Активность ферулоил-эстераз направлена на удаление ферулоильных остатков, прикрепленных к O5-остаткам арабинозы в ксилане и О3-остаткам арабинозы в пектине, связывающих между собой полимерные цепи ксиланов в злаках и цепи пектинов в бобовых. Ксилоглюканаза гидролизует ксилоглюкан - полисахарид, имеющий в основной цепи β-1,4-глюкозидные остатки, а в боковой цепи - остатки ксилозы и галактозы. В клеточной стенке растений молекулы ксилоглюкана осуществляют связь между гемицеллюлозным и целлюлозным матриксом, а также играют роль запасных полисахаридов.
В последнее десятилетие широкое распространение получили мультикопийные грибные суперпродуценты ферментов, у которых амплификация генов, кодирующих секретируемые ферменты, позволила резко увеличить продуктивность промышленных штаммов. К известным мультикопийным продуцентам эндо-β-1,4-глюканаз относятся штаммы на основе Trichoderma longibrachiatum [Clarkson et al., 1995, US Patent 5419778], Tr.reesei [Saloheimo et al., 1994, WO Patent 94/28117] и Humicola insolens [Rasmussen et al., 1991, Patent WO 91/17243]. Известны различные грибные мультикопийные продуценты ксиланаз - Aspergillus niger [van den Broek et al., 1994, US Patent 5358864], Tr.reesei [Nevalainen et al., 1994, US Patent 5298405], Thermoascus auranticus [Yu et al., 1990, US Patent 4966850], H.insolens [Schulein et al., 1997, US Patent 5610048]. Среди продуцентов фитаз имеются мультикопийные продуценты Tr.reesei [Barendse et al., 1998, Patent WO 98/55599] и грибов рода Aspergillus [van Gorcom et al., 1990, EP 0420358 А1].
Гриб P. canescens F178 представляется весьма эффективным в качестве объекта для создания штаммов с увеличенной продукцией ферментов. Как отмечалось, при росте гриба на арабинан-содержащих субстратах (например, на свекловичном жоме) в клетках P. canescens наблюдается сильная индукция синтеза ксиланазы и Р-галактозидазы. Промоторы генов ксиланазы и β-галактозидазы можно использовать для экспрессии в P. canescens других гомологичных и гетерологичных генов, отвечающих за синтез различных целевых ферментов. Задачей заявляемой группы изобретений является разработка способа получения ферментных препаратов с активностью арабиноксилан-арабинофурангидролазы, α-L-арабинофуранозидазы, α-галактозидазы, ферулоил-эстеразы и ксилоглюканазы при ферментации мультикопийных штаммов, полученных при трансформации реципиентного штамма P. canescens клонированными участками ДНК с гомологичными и гетерологичными генами, кодирующими перечисленные ферменты.
Прототипом настоящей группе изобретений может служить патент РФ №2288267 "Способ получения кормового комплексного ферментного препарата (варианты) и штамм Penicillium canescens (варианты)", в котором описан способ получения препаратов с высокой эндоглюканазной, ксиланазной, фитазной и пектин-лиазной активностью при ферментации мультикопийных штаммов P. canescens, в которых методом плазмидной трансформации были включены копии генов эндоглюканазы III P. verruculosum, а также генов, кодирующих ксиланазу, фитазу и пектин-лиазу P. canescens, в которых регуляторная область была представлена промоторами гена β-галактозидазы или гена ксиланазы P. canescens.
Целью настоящей группы изобретений является расширение номенклатуры ферментных препаратов, производимых мицелиальным грибом P. canescens за счет ферментации новых штаммов, обладающих арабиноксилан-арабинофурангидролазной, α-L-арабинофуранозидазной, α-галактозидазной, ферулоил-эстеразной и ксилоглюканазной активностью и полученных путем трансформации грибных клеток фрагментами ДНК с клонированными гомологичными и гетерологичными генами.
Схема разработки способа получения каждого из ферментных препаратов, обладающего одной из активностей, а именно арабиноксилан-арабинофурангидролазы, α-L-арабинофуранозидазы, α-галактозидазы, ферулоил-эстеразы и ксилоглюканазы при ферментации мультикопийных штаммов P. canescens, складывается из выполнения нескольких типовых этапов.
Этап 1. Путем клонирования в фаговом векторе или путем PCR-синтеза получают фрагмент ДНК P. canescens, кодирующий ген каждого из перечисленных ферментов с полной регуляторной областью. Включают этот фрагмент ДНК в структуру векторной молекулы. Получают экспрессионную плазмиду, в которой нуклеотидная последовательность структурной частью целевого гена P. canescens совмещена с нуклеотидной последовательностью, кодирующей промоторную область и сигнальный пептид гена β-галактозидазы P. canescens или с нуклеотидной последовательностью, кодирующей промоторную область и сигнальный пептид гена ксиланазы P. canescens (в отдельных случаях проводят трансформацию линейным фрагментом ДНК, содержащим только нуклеотидную последовательность гена и указанные выше регуляторные области).
Этап 2. Каждой экспрессионной плазмидой с включенным геном (или фрагментом ДНК в линейной форме) проводят трансформацию реципиентного штамма P. canescens PCA (niaD - мутант штамма P. canescens F178) в условиях котрансформации вместе с плазмидой (или фрагментом ДНК в линейной форме), несущей последовательность niaD гена, как маркера селекции, и осуществляют отбор трансформантов, секретирующих в культуральную жидкость искомую активность. Проводят ферментацию отобранных трансформантов в качалочных колбах на среде со свекловичным жомом и среди них выбирают наиболее продуктивный вариант(-ы) штамма-продуцента.
Этап 3. Проводят процесс ферментации отобранного наиболее активного варианта штамма-продуцента P. canescens в ферментерах на среде со свекловичным жомом, получают и характеризуют ферментные препараты с высокой активностью целевого фермента.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение ферментных препаратов с арабиноксилан-арабинофурангидролазной (α-L-арабинофуранозидазной) активностью при ферментации штаммов P. canescens, мультикопийных по гомологичному гену ab/A (51-е семейство гликозид-гидролаз, молекулярная масса 70 кДа).
На первом этапе для клонирования гена ab/A гена P. canescens синтезировали олигонуклеотидные праймеры, вычисленные на основе консенсусных последовательностей, обнаруженных при сравнении гомологичных областей ДНК этого гена с одноименными генами грибов Neurospora crassa и Magnaporthe grisea. В дополнение к этому олигонуклеотиды синтезировали на базе последовательности аминокислот в двух пептидах этих же областей (MNTGFWGIDV и YGHPQP), полученных из выделенного и очищенного белка арабиноксилан-арабинофураногидролазы (α-L-арабинофуранозидазы A) P. canescens:
АХ Т3: 5' ATGAA Т/С ACIGGITT Т/С TGGGG 3'
АХ ВЗ: 5' TCCAIGG Т/С TGIGG A/G TGICC 3'.
Праймеры использовали для синтеза PCR фрагмента (0,9 kb) на геномной ДНК P. canescens. Этот фрагмент использовали для скрининга фаговых клонов из фаговой библиотеки геномной ДНК P. canescens. В результате анализа нескольких клонов Smal фрагмент размером 5 kb был клонирован в плазмидный вектор pUC21, и ДНК вставки была секвенирована с abfA-специфическими праймерами:
АХ Т4: 5' GCCGAGCTTGACGTTTATGTCC 3'
АХ В4: 5' GAGTAGAAGCAAAGACTTCGCCG 3'.
Нуклеотидная последовательность в 3033 bp включала 2306 bp кодирующей части и 8 интронов (фиг.1.1).
На базе сравнения аминокислотных последовательностей, представленных в GeneBank Databases, было установлено, что клонированный ген должен кодировать арабиноксилан-арабинофурангидролазу (α-L-арабинофуранозидазу AbfA) с молекулярной массой 70 kD, отнесенную к 51 семейству гликозид-гидролаз. Сравнение последовательностей аминокислот показало, что этому ферменту наиболее близки α-L-арабинофуранозидазы аспергиллов A. fumigatus и A. oryzae с 80% гомологией (фиг.1.2).
Анализ первичной структуры гена AbfA показал, что позиция 17 занята последней аминокислотой сигнального пептида. Начиная с 18-й аминокислоты, зрелая часть AbfA была слита с последовательностью сигнального пептида гена bgaS β-галактозидазы P. canescens. Для этой цели для PCR использовали праймеры:
4
АХТ6: 5' Р0 GGGCAGTGACGATTTCTGTTGCTAAGTCAGGTGG 3'
АХВА: 5' GCTCTAGACTAGTTAGTCGTAAGCACAGCAACACTCAAG 3'.
XbaI фрагмент полученного продукта клонировали в Eco47III-SpeI сайт предварительно конструированного экспрессионного вектора pVIN3, не несущего гена резистентности к ампициллину bla, в результате чего получали экспрессионный вектор pAbfAl (фиг.1.3).
На втором этапе экспрессионную плазмиду pAbfAl включали в клетки реципиентного штамма P. canescens PCA(niaD). Плазмидой pAbfAl (5-10 мкг) проводили котрансформацию P. canescens PCA10(niaD) с векторной плазмидой pSTAura3ABLA (2-5 мкг), несущей селективный niaD признак. Трансформанты анализировали на увеличение α-L-арабинофуранозидазной активности после 96-часового роста на чашках с минимальной твердой агаризованной средой и 0,5% фруктозой, 5 мМ арабинозой и 0,1% дрожжевого экстракта.
2
4
2
3
Среди 32 тестированных трансформантов в 8 клонах была обнаружена увеличенная α-L-арабинофуранозидазная активность. Отобранные клоны ферментировали в качалочных колбах в течение 96 ч в водной среде с 3% свекловичного жома, 3% пептона и 2,5% КНРО, при 30°С и рН 4,5 в течение 120 ч. α-L-Арабинофуранозидазную активность в культуральной жидкости измеряли, проводя гидролиз 0,5 мг/мл п-нитрофенил-α-L-арабинофуранозида в 30 мМ Na-ацетатном буфере, рН 5,0 при 40°С в течение 10 мин. Реакцию останавливали с 1 М NaCO, после чего измеряли оптическую плотность при 400 нм. За единицу α-L-арабинофуранозидазной активности принимали такое количество фермента, которое освобождало 1 микромоль п-нитрофенола в указанных выше условиях реакции.
При анализе в ДДС-электрофорезе было обнаружено, что полипептид AbfA в денатурирующих условиях занимал зону, соответствующую 70 кДа.
Этот фермент обладал высокой арабиноксилан-арабинофурангидролазной активностью и эффективно гидролизует арабиноксилан. За единицу арабиноксилан-арабинофурангидролазной активности принимали такое количество фермента, которое в течение 1 мин при температуре 50°С и рН 5,0 при гидролизе раствора арабиноксилана пшеницы концентрацией 10 г/л освобождает 1 мкмоль редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмоль глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона.
2
4
На третьем этапе проводили ферментации наиболее продуктивного из трансформированных штаммов P. canescens Abf6 (ВКМ №F-3935D) в 10-литровом ферментере в водной среде с 3% свекловичного жома, 3% пептона и 2,5% КНРО при 30°С и рН 4,5 в течение 120-144 ч, с помощью ультрафильтрации культуральной жидкости на полых волокнах (с пределом отсечения 10 кДа) и последующего лиофильного высушивания получали сухие ферментные препараты и характеризовали их по уровню арабиноксилан-арабинофурангидролазой (α-L-арабинофуранозидазной) активности.
Арабиноксилан-арабинофурангидролазная активность в конце ферментации в культуральной жидкости наиболее активного трансформанта P. canescens Abf6 (ВКМ №F-3935D) составляла 800-1000 ед./мл (по субстрату арабиноксилану), α-L-арабинофуранозидазная - 100-125 ед./мл (по субстрату п-нитрофенил-α-L-арабинофуранозиду).
Арабиноксилан-арабинофурангидролазная активность в сухих препаратах составляла 20000-25000 ед./г, α-L-арабинофуранозидазная активность - 2500-2800 ед./г.
Пример 2. Получение ферментных препаратов с α-L-арабинофуранозидазной активностью при ферментации штаммов P. canescens, мультикопийных по гомологичному гену abfB2 (54-е семейство гликозид-гидролаз, молекулярная масса 60 кДа).
На первом этапе для клонирования гена abfB2 гена P. canescens были синтезированы олигонуклеотидные праймеры, вычисленные на основе консенсусных последовательностей, обнаруженных при сравнении гомологичных областей ДНК этого гена со сходными областями одноименными генов других грибов:
AFT1: 5' GC Т/С GGI СС С/Т TG Т/С GA С/Т АТСТА 3'
AFB2: 5' GCTGTT G/A ТС A/G CCGCC A/G AT 3'.
С помощью этих праймеров синтезировали PCR продукт размером 0.8 kb, который был клонирован, после чего проводили анализ клонированных последовательностей. Обнаружили две нуклеотидные последовательности, которые идентифицировали как abfBl и abfB2, которые имели высокую степень нуклеотидной гомологии с геном А. niger ab/B (около 72% и 65%). Клон, несущий полную последовательность гена abfB2 был выделен из фаговой библиотеки генов P. canescens. Рестрикционная карта и нуклеотидная последовательность abfB2 гена P. canescens представлена на фиг.2.1 и фиг.2.2. Для конструкции экспрессионной плазмиды pAbfB2 PCR синтезом получали кодирующий район гена abfB2 без сигнальной последовательности с помощью праймеров:
AB Т: 5' GGGCACCCTGTGACATCTACGCCTCTGGCGGCACAC 3'
(фосфорилированный)
AB В: 5' GCTCTAGATTAGGCAAAGCTAGCACTCACCACCCAGC 3'.
PCR продукт разрезали Xbal, лигировали в сайты Eco47III и Spei экспрессионного вектора pVIN3 и получали экспрессионный вектор pAbfB2 (фиг.2.3).
2
4
На втором этапе экспрессионную плазмиду pAbfB2 включали в клетки реципиентного штамма P. canescens PCA(niaD), проводя котрансформацию P. canescens РСА10 с векторной плазмидой pSTA10, несущей селективный niaD признак (используя 5-10-кратный избыток плазмиды pXFA3 вместе с 1-3 мкг плазмиды pSTA10). Трансформанты анализировали на увеличение α-L-арабинофуранозидазной активности после 96-часового роста на чашках с твердой агаризованной минимальной средой и 0,5% фруктозой, 5 мМ арабинозой и 0,1% дрожжевого экстракта. Шесть отобранных клонов ферментировали в качалочных колбах в течение 96 ч в водной среде с 3% свекловичного жома, 3% пептона и 2,5% КНPO, при 30°С и рН 4,5 в течение 120 ч. α-L-Арабинофуранозидазную активность в культуральной жидкости определяли по гидролизу п-нитрофенил-α-L-арабинофуранозида, как описано в примере 1.
При анализе в ДДС-электрофорезе было обнаружено, что полипептид АЫВ2 в денатурирующих условиях занимал зону, соответствующую 60 кДа. Этот фермент не обладал способностью гидролизовать арабиноксилан.
2
4
На третьем этапе проводили ферментации наиболее продуктивного из трансформированных штаммов P. canescens AbfB6 (ВКМ №F-3937D) в 10-литровом ферментере в водной среде с 3% свекловичного жома, 3% пептона и 2,5% КНРО при 30°С и рН 4,5 в течение 120-144 ч, с помощью ультрафильтрации культуральной жидкости на полых волокнах (с пределом отсечения 10 кДа) и последующего лиофильного высушивания получали сухие ферментные препараты и характеризовали их по уровню α-L-арабинофуранозидазной активности.
α-L-Арабинофуранозидазная активность в конце ферментации в культуральной жидкости наиболее активного трансформанта P. canescens Abffio (ВКМ №F-3937D) составляла 50-60 ед./мл, в сухих препаратах - 550-600 ед./г.
Пример 3. Получение ферментных препаратов с α-галактозидазной активностью при ферментации штаммов Р. canescens, мультикопийных по гомологичному гену α-галактозидазы aglA (27-е семейство гликозид-гидролаз, молекулярная масса 61 кДа).
На первом этапе получали нуклеотидную последовательность, кодирующую agi А. ген P. canescens. Для этой цели использовали праймеры, гомологичные agil гену близкородственного гриба P. simplicissimum:
AG Т20 - 5' CCATGGTGACTTCGCTGTCTTTGACCGCACTG 3'
AG В1327 - 5' AAGCTTAACAAGCCTCCTTTACCACAAGCACAGCAACATC 3'.
Амплифицировали только структурную часть гена. В процессе амплификации в последовательность были введены NcoI и HindIII рестрикционные сайты в ATG-кодоне и в стоп-кодоне для их использования в процессе клонирования. Последовательности трех независимых клонов были одинаковы и близки к последовательности cDNA agli гена P. simplicissimum (фиг.3.1 А и Б).
Сравнение последовательностей генов algA грибов P. canescens и P. simplicisimum показало, что в кодирующем районе находится только 13 замен. У соответствующего гена P. purpurogenum нуклеотидная гомология составляет менее 60%. Сходная ситуация в практической идентичности генов P. canescens и P. simplicissimum была обнаружена на примере генов xylA, что дополнительно подтверждает близость между этими видами грибов.
Подобно aglB гену A. niger, рамка чтения agi А гена P. canescens прервана шестью короткими нитронами. В последовательности из 435 аминокислот у P. canescens в сравнении с aglA геном P. simplicissimum обнаружено 2 замены. Сигнальный пептид у обеих последовательностей одинаков и включает первые 18 аминокислот.
Сравнение аминокислотных последовательностей различных α-галактозидаз показывало, что AglA из P. canescens должна быть отнесена к 27-й семье гликозил-гидролаз (фиг.3.2).
Для получения экспрессионных плазмид создавали конструкции, в которых структурная часть aglA гена была состыкована с промоторными областями генов bgaS или xylA генов P. canesnens. Для этого использовали вектор pBluescript SK+, в который был клонирован 1.7 kb Hindlll фрагмент со структурной частью гена aglA. Далее эта структурная часть была окружена промоторным и терминаторным районами гена xylA, которые получали с помощью специфических праймеров PCR синтезом на геномной ДНК. Экспрессионная плазмида была обозначена как pXAGA3 (фиг.3.3 А).
Для того чтобы заместить xylA промотор на промоторный район гена β-галактозидазы, последний был амплифицирован PCR синтезом на геномной ДНК с помощью праймеров, которые содержали сайты узнавания для рестрикционных эндонуклеаз Apal и BbrPl на 5' and 3' концах:
Pbga T57-5' TCAGGGCCCAGCCTGAGACCCCCGGCAGCGTCA 3'
Pbga B2726-5' GCACACGTGAGCAAAGTCGACGATGAAAAGAATAGACGA 3'.
После обработки этими нуклеазами PCR продукта последний клонировали в векторную плазмиду pXAGA3, разрезанную эндонуклеазой Ncol, концы которой были достроены Кленов-фрагментом ДНК-полимеразы I и затем обработаны ApaI. Экспрессионная плазмида pBAXlc геном α-галактозидазы под контролем bgaS промотора представлена на фиг.3.3 Б. В обеих плазмидах была использована сигнальная последовательность AglA P. canescens.
На втором этапе проводили котрансформацию штамма P. canescens PCA(niaD), экспрессионным вектором pXAGA3 и векторной плазмидой pSTA10, несущей селективный niaD признак (используя 5-10-кратный избыток плазмиды pXFA3 вместе с 1-3 мкг плазмиды pSTA10). Трансформанты анализировали на увеличение α-галактозидазной активности после 96-часового роста на чашках с твердой агаризованной минимальной средой и 0,5% фруктозой, 5 мМ арабинозой и 0,1% дрожжевого экстракта.
2
4
2
3
Пять отобранных клонов ферментировали в жидкой среде в качалочных колбах в течение 96 ч в водной среде с 3% свекловичного жома, 3% пептона и 2,5% КНРО, при 30°С и рН 4,5 в течение 120 ч. Активность α-галактозидазы в культуральной жидкости измеряли, проводя гидролиз 0,5 мг/мл п-нитрофенил-α-галактозида в 30 мМ Na-ацетатном буфере, рН 5,0 при 40°С в течение 10 мин. Реакцию останавливали с 1 M NaCO, после чего измеряли оптическую плотность при 400 нм. За единицу α-галактозидазной активности принимали такое количество фермента, которое освобождало 1 микромоль п-нитрофенола в указанных выше условиях реакции.
При анализе в ДДС-электрофорезе было обнаружено, что полипептид AglA в денатурирующих условиях занимал зону, соответствующую 61 кДа.
а-Галактозидаза 27-го семейства гликозид-гидролаз обладала способностью гидролизовать галактоманнан. Галактоманнаназную активность в культуральной жидкости измеряли, проводя гидролиз галактоманнана акации. За единицу галактоманнаназной активности принимали такое количество фермента, которое при гидролизе раствора галактоманнана концентрацией 10 г/л в течение 1 мин при температуре 50°С и рН 5,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмоль глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона.
2
4
На третьем этапе проводили ферментации наиболее продуктивного из трансформированных штаммов P. canescens AglA33 (ВКМ №F-3936D) в 10-литровом ферментере в водной среде с 3% свекловичного жома, 3% пептона и 2,5% КНРО при 30°С и рН 4,5 в течение 120-144 ч. С помощью ультрафильтрации культуральной жидкости на полых волокнах (с пределом отсечения 10 кДа) и последующего лиофильного высушивания получали сухие ферментные препараты и характеризовали их по уровню α-галактозидазной активности.
Активность α-галактозидазы в конце ферментации в культуральной жидкости наиболее активного трансформанта P. canescens AgLA33 (ВКМ №F-3936D) составляла 1200-1400 ед./мл (по п-нитрофенил-α-галактозиду) и 350-420 ед./мл (по галактоманнану). Активность α-галактозидазы в сухих препаратах составляла 17000-18500 ед./г (по п-нитрофенил-α-галактозиду) и 4200-4900 ед./г (по галактоманнану).
Пример 4. Получение штаммов P. canescens - продуцентов мультикопийных по гетерологичному гену α-галактозидазы aglC из A. awamori (36-е семейство гликозид-гидролаз, молекулярная масса 80 кДа).
На первом этапе получали плазмиды с геном α-галактозидазы из A. awamori. Отличительной чертой этого этапа было создание экспрессионных плазмид, не несущих маркеры резистентности к бактериальным антибиотикам.
В процессе конструирования штамма-продуцента α-галактозидазы А создавали экспрессионную плазмиду, не несущую маркеров резистентности к антибиотику в которой:
а) вместо бактериального гена устойчивости к ампициллину bla для размножения плазмиды в бактериальном хозяине был вставлен селективный маркер ura3 и
б) для селекции niaD+ трансформантов при плазмидной трансформации был вставлен ген niaD.
Для экспрессии α-галактозидазы С из A. awamori получали PCR-синтезированный фрагмент при амплификации геномной ДНК A. awamori с участием специфических праймеров:
AglC Т68:
5'GGGAGCATGCGGATCCCGCGAAGCGGGCACCCGCAATTGGGGCTTCGAAT TCACAGAGTA 3'
AglC B2374:
5' GCTCTAGATCATTGCCTCTCCAGGAAAACTACC lTGCTTCC 3'
Для подстыковки лидерного пептида bgaS гена P. canescens был амплифицирован соответствующий участок с помощью праймеров:
BgaT956:
5' TTAGCCGGCGCATCGAGCCCACCGGCAAGGAG 3'
BgaB:
5' TACTCTGTGAATTCGAAGCCCCAATTGCGGGTGCCCGCTTCGCGGGATCCG CATGCTCCC 3'
PCR продукты были соединены по NaeI and XbaI рестрикционным сайтам и клонированы в уникальные Nael и Spei сайты вектора pRS316-Term. На последней стадии bla ген из плазмиды pRS316-Term был удален при разрезании рестриктазой DraI. Экспрессионная конструкция с геном aglC была получена в результате лигирования концов и в окончательном виде как плазмида pAglC представлена на фиг.4.1.
-
2
4
На втором этапе экспрессионную плазмиду pAglC включали в клетки реципиентного штамма P. canescens PCA10(niaD), проводя котрансформацию с плазмидой pSTA10, несущей селективный niaD признак (используя 5-10-кратный избыток плазмиды pXFA3 вместе с 1-3 мкг плазмиды pSTA10). Трансформанты анализировали на увеличение α-галактозидазной активности после 96-часового роста на чашках с твердой агаризованной минимальной средой и 0,5% фруктозой, 5 мМ арабинозой и 0,1% дрожжевого экстракта. Восемь отобранных клонов ферментировали в качалочных колбах в течение 96 ч в водной среде с 3% свекловичного жома, 3% пептона и 2,5% КНРО, при 30°С и рН 4,5 в течение 120 ч. В культуральной жидкости измеряли активность α-галактозидазы (активность определяли по гидролизу п-нитрофенил-α-галактозида, как описано в примере 3). Наибольшей активностью клон AgLC1 - 140-160 ед./мл.
При анализе в ДДС-электрофорезе было обнаружено, что полипептид Ag1C в денатурирующих условиях занимал зону, соответствующую 80 кДа.
2
4
На третьем этапе проводили ферментации наиболее продуктивного из трансформированных штаммов P. canescens AgLC4 (ВКМ №F-3934D) в 10-литровом ферментере в водной среде с 3% свекловичного жома, 3% пептона и 2,5% КНРО при 30°С и рН 4,5 в течение 120-144 ч. С помощью ультрафильтрации культуральной жидкости на полых волокнах (с пределом отсечения 10 кДа) и последующего лиофильного высушивания получали сухие ферментные препараты и характеризовали их по α-галактозидазной активности.
Активность α-галактозидазы в конце ферментации в культуральной жидкости наиболее активного трансформанта P. canescens AgLC4 (ВКМ №F-3934D) составляла 140-160 ед./мл, в сухих препаратах - 1600-1800 ед./г.
Пример 5. Получение ферментных препаратов с ферулоил-эстеразной активностью при ферментации штаммов P. canescens, мультикопийных по гетерологичному гену ферулоил-эстеразы faeA P. funiculosum (1-е семейство карбоксил-эстераз, молекулярная масса 45 кДа).
На первом этапе получали нуклеотидную последовательность P. canescens, кодирующую ген faeA. Для выбора PCR праймеров использовали способ сравнения аминокислотных и нуклеотидных последовательностей белков FAE А грибов A. niger, A. tubingensis и A. awamori, а также P. funiculosum. доступных в банке данных GeneBank (фиг.5.1). Несколько праймеров были синтезированы, исходя из областей, наиболее близких по гомологии. Праймер В1640 был вычислен на основе последовательности аминокислот в пептиде DTFVRDDHC выделенной и очищенной ферулоил-эстеразы FAE А P. canescens. Использованные праймеры приведены в табл.1.
Таблица 1. Олигонуклеотиды, использованные для PCR синтез гена ферулоил- эстеразы А.
Олигонуклео-тид
Последовательность 5'-3'
Длина оснований
Т738
ATGGTGAAATCGTACATTATCGGGG
25
Т1205
TCTTCGGCTATCACTGGCKCGGCGG
25
Т1210
GGCYWNCACTGGCKCGRCGGNAMYATG
27
Т1291
GCNATCTTYGTNGCSCCYMASGG
23
Т1324
GGNTGGGSMAACANCRRYGGCGASGA
26
В1352
ATRTCSTCGCCRYYGNYRTTKSCCCA
26
В1508
CCRSWCAKNACRGNNACRGCNNKGAA
26
В1640
CAATGRTCRTCCTSACRAACTRTC
24
В1761
CGGTTCATGCGGACCATCGAACGCAA
26
В1836
TTAGTGGAARAGAGAGAAGAAACTCC
26
Олигонуклеотиды были использованы для получения PCR продукта на геномной ДНК P. canescens. Четыре PCR продукта, полученные от использования в реакции олигонуклеотидных пар, а именно Т1205+В1640, Т1205+В1836, Т1291+В1761, Т1324+В1761, клонировали и секвенировали. При анализе нуклеотидных гомологий исследованные последовательности не показали принадлежности к гену faeA. Более того, в PCR продукте, полученном на геномной ДНК P. Funiculosum, также не обнаружили гомологии в условиях гибридизации при 52-58°С с ДНК P. canescens. В этой связи предпочтительным кандидатом для клонирования и создания мультикопийного штамма был выбран ген близкородственного гриба P. funiculosum.
PCR синтез гена faeA осуществляли на геномной ДНК P. funiculosum F293. PCR продукт клонировали в pCR Bluntll вектор (Invitrogen) и последовательность двух независимых клонов секвенировали по обеим цепям ДНК. Полученная последовательность faeA гена P. funiculosum F293 была на 88% идентична последовательности faeA гена P. funiculosum, представленной в GeneBank (фиг.5.2).
В нуклеотидной последовательности faeA гена P. funiculosum F293 имеется один интрон. В аминокислотной последовательности из 341 аминокислоты на 4 аминокислоты меньше, чем в последовательности, опубликованной ранее (фиг.5.3). Последовательность одного из секвенированных пептидов очищенной ферулоил-эстеразы FAE А P. canescens гомологична участку 274-293 аминокислот обоих белков из P. funiculosum.
Для того чтобы экспрессировать ген faeA 293 P. funiculosum использовали гомологичный xylA промотор P. canescens. С этой целью экспрессионную плазмиду pXAGLA3 (см. пример 2) использовали как исходный вектор, в котором ген aglA, кодирующий α-галактозидазу, был замещен геном faeA 293.
2 мкг ДНК плазмиды pXAGLA3 обрабатывали рестриктазами HindIII и Ncol, концы достраивали с 2 ед. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I и дефосфорилировали с 6 ед. щелочной фосфатазы. 0,1 мкг вектора лигировали с 0,5 мкг PCR продукта faeA 293, амплифицированного с Pfui полимеразой и фосфорилированного с 20 ед. полинуклеотидкиназы Т4. В результате была получена векторная экспрессионная плазмида pXFA3, представленная на фиг.5.4.
-
На втором этапе экспрессионную плазмиду pXFA3 включали в клетки реципиентного штамма P. canescens РСА10(niaD), проводя котрансформацию с плазмидой pSTA10, несущей селективный niaD признак (используя 5-10-кратный избыток плазмиды pXFA3 вместе с 1-3 мкг плазмиды pSTA10).
+
2
4
2
3
Полученные 22 niaDтрансформанта анализировали на увеличение ферулоил-эстеразной активности после 96-часового роста на чашках с твердой агаризованной минимальной средой и 0,5% фруктозой, 5 мМ арабинозой и 0,1% дрожжевого экстракта. Отобранные 9 клонов с увеличенной ферулоил-эстеразной активностью ферментировали в качалочных колбах в течение 96 ч в водной среде с 3% свекловичного жома, 3% пептона и 2,5% КНРО, при 30°С и рН 4,5 в течение 120 ч. В культуральной жидкости измеряли активность ферулоил-эстеразы, проводя гидролиз 0,5 мг/мл п-нитрофенил-бутирата в 30 мМ Na-ацетатного буфере, рН 5,0 при 40°С в течение 10 мин. Реакцию останавливали 1 М NAСО, после чего измеряли оптическую плотность при 400 нм. За единицу ферулоил-эстеразной активности принимали такое количество фермента, которое освобождало 1 мкмоль п-нитрофенола в указанных выше условиях реакции.
При анализе в ДДС-электрофорезе было обнаружено, что полипептид FAE А в денатурирующих условиях занимал зону, соответствующую 45 кДа.
2
4
На третьем этапе проводили ферментации наиболее продуктивного из трансформированных штаммов P. canescens FAE9 (ВКМ №F-3938D) в 10-литровом ферментере в водной среде с 3% свекловичного жома, 3% пептона и 2,5% КНРО при 30°С и рН 4,5 в течение 120-144 ч. С помощью ультрафильтрации культуральной жидкости на полых волокнах (с пределом отсечения 10 кДа) и последующего лиофильного высушивания получали сухие ферментные препараты и характеризовали их по ферулоил-эстеразной активности.
Активность ферулоил-эстеразы в конце ферментации в культуральной жидкости наиболее активного трансформанта P. canescens FAE9 (ВКМ №F-3938D) составляла 50-70 ед./мл, в сухих препаратах - 500-600 ед./г.
Пример 6. Получение ферментных препаратов с ксилоглюканазной активностью при ферментации штаммов P. canescens, мультикопийных по гомологичному гену xegA (12-е семейство гликозил-гидролаз, молекулярная масса 25 кДа).
На первом этапе для клонирования гена P. canescens, кодирующего ксилоглюканазу, синтезировали пару вырожденных праймеров, выбранных для консервативных участков в последовательностях гликозил-гидролаз 12-й семьи (фиг.6.1):
ХТ2: 5' GTA С/Т GAGAT С/Т ATG G/A Т C/G TGG 3'
ХВ1: 5'СС A/G G/A Т/С G/A АА G/T GGCTC G/A GT A/G СС 3'.
Полученный PCR продукт размером 0,4 kb секвенировали и обнаружили высокую степень гомологии с консервативными областями. Этот фрагмент использовали в радиоактивно-меченом виде для скрининга библиотеки фаговых клонов P. canescens. Xhol фрагмент ДНК-вставки одного из выделенных фагов клонировали в вектор pDlueScript SK+ и секвенировали с специфическим праймером:
ХТ1017: 5' GCTTGCCTTCTTCACCTACCTCATC 3'.
Рамка считывания в последовательности из 1201 bp в этом гене прервана одним интроном (фиг.6.2).
Нуклеотидная последовательность генов xegA грибов P. canescens и А. aculeatus, доступная в банке данных GeneBank, оказалась гомологична на 67% (фиг.6.3).
Для экспрессии в P. canescens структурную часть гена xegA совмещали с участком гена, кодирующего β-галактозидазу и несущего промоторную область и последовательность лидерного пептида, и затем клонировали в экспрессионный вектор pVINl. С этой целью последовательность xegA была амплифицирована с помощью следующих праймеров, начиная с 21-го триплета:
XegTNru: 5' GCTCGCGAGCTACTATCCCAACCAAATCCCTGACTC 3'
XegBXba: 5' GCTCTAGATTAGGCAACATCGGCAGAGTAAGAAGAG 3'.
Фрагмент PCR разрезали Xbal, клонировали в Eco47III-SpeI сайт плазмиды pVINl и получали экспрессионный вектор pVTNXG5 (фиг.6.4).
Этот вектор был использован для трансформации как в виде плазмиды, так и в виде линейного PCR фрагмента с последовательностью гена xegA под контролем промотора и сигнального пептида гена bgaS, а также терминатора гена xylA. Для получения последнего использовали пару специфических праймеров:
BgaT956 5' TTAGCCGGCGCATCGAGCCCACCGGCAAGGAG 3'
Ху1 В3886 5' ACGCGTCGACTACCTAGCATAGTTCCCTCTGGCCC 3'.
+
Для котрансформации по niaD признаку с геномной ДНК штамма P. canescens PCA(niaD) был амплифицирован niaD фрагмент размером 4,5 kb с использованием следующей пары праймеров:
NT7: 5' ATAGGTCCTCAATCTTTCGGTGTTCGAAG 3'
NB8: 5' CCTCCCAGGGAGGACACATTTAGCCCA 3'.
7
На втором этапе полученными линейными PCR фрагментами трансформировали штамм P. canescens PCA(wmD"). 200-500 нг каждого фрагмента добавляли к 10 протопластов. Первичный отбор трансформантов проводили на чашках с твердой агаризованной минимальной средой с 20 мМ сорбитола, 5 мМ L-арабинозы и Xgal. Отбирали колонии с наименьшей интенсивностью окраски по Xgal. β-Галактозидазная активность в этих клонах уменьшалась вследствие титрования промотора резидентного гена β-галактозидазы промоторными последовательностями конструкции bgaSr.XegA.
2
4
Были обнаружены одиннадцать клонов с увеличенной ксилоглюканазной активностью. Отобранные клоны ферментировали в качалочных колбах в водной среде с 3% свекловичного жома, 3% пептона и 2,5% КНРО, при 30°С и рН 4,5 в течение 120 ч. Ксилоглюканазную активность в культуральной жидкости измеряли проводя гидролиз ксилоглюкана из тамариска. За единицу ксилоглюканазной активности принимали такое количество фермента, которое при гидролизе раствора ксилоглюкана концентрацией 10 г/л в течение 1 мин при температуре 50°С и рН 5,0 освобождает 1 мкмоль редуцирующих сахаров, эквивалентных 1 мкмоль глюкозы и определяемых методом Сомоджи-Нельсона.
При анализе в ДДС-электрофорезе было обнаружено, что полипептид XegA в денатурирующих условиях занимал зону, соответствующую 25 кДа.
2
4
На третьем этапе проводили ферментации наиболее продуктивного из трансформированных штаммов P. canescens XG9 (ВКМ №F-3939D) в 10-литровом ферментере в водной среде с 3% свекловичного жома, 3% пептона и 2,5% КНРО при 30°С и pH 4,5 в течение 120-144 ч. С помощью ультрафильтрации культуральной жидкости на полых волокнах (с пределом отсечения 10 кДа) и последующего лиофильного высушивания получали сухие ферментные препараты и характеризовали их по ксилоглюканазной активности.
Ксилоглюканазная активность в конце ферментации в культуральной жидкости наиболее активного трансформанта P. canescens XG9 (ВКМ №F-3939D) составляла 60-80 ед./мл, в сухих препаратах - 3500-4500 ед./г.