Влияние засухи и солевого стресса на содержание сахаров в стадиях активного развития кукурузы

Алыева Н.Ф. ©

Докторант, кафедра физиологии растений, Бакинский государственный университет

ВЛИЯНИЕ ЗАСУХИ И СОЛЕВОГО СТРЕССА НА СОДЕРЖАНИЕ САХАРОВ В СТАДИЯХ АКТИВНОГО РАЗВИТИЯ КУКУРУЗЫ

Аннотация

Статья посвящена влиянию засухи и солевого стресса на содержание сахаров в стадиях активного развития кукурузы. Было изучено влияние искуственно созданой в почве засухи и 200тМ-ной концентраций NaCl и Na2SO4 на содержание сахаров в сменах кукурузы. В процессе изучения влияния кратковременно созданной в почве засухи и 200мМ-ных концентраций NaCl и Na2SO4 было выявлено некоторое уменьшение количества углеводов в листьях кукурузы. В результате даны рекомендации играющие маркерную роль при селекции засухоустойчивых и солеустойчивых сортов кукурузы. Полученные данные могут быть использованы в выявлении засухоустойчивых и солеустойчивых сортов растений.

Ключевые слова: Zea mays, засуха, солевой стресс, сахара.

Keywords: Zea mays, drought, salt stress, sugars.

Введение

В процессе эволюции в растениях были выработаны адаптационные механизмы для приспособления к воздействию абиотических и биотических условий внешней среды. В последнее время ведутся интенсивные исследования для выявления ответных реакций растений на возможные стрессовые ситуации (засуха, солевой стресс, низкие и высокие температуры и др.) [11, 13]. В настоящие время 25% почв Земного шара в той или иной степени засолены [7]. Засоленность почв приводит к глобальному изменению климата, уменьшению урожайности, обеднению биоразнообразия, что в конечном счёте приводит к значительным потерям в экономике [1, 8]. В связи с этим, создание сортов устойчивых к различным неблагоприятным условиям внешней среды, является одним из основных задач, стоящих перед селекционерами. Под термином «Адаптация» понимается изменения в структурах и функциях органов, дающих возможность выживания в экстремальных условиях среды [6].

В деле адаптации растений к неблагоприятным условиям среды большое значение имеет количество и качество синтезируемых в семенах растений биополимеров. Заботин с сотрудниками показали, что одна группа углеводов-физиологически активные

олигосахариды накапливаются, в основном, в корнях растений, повышая устойчивость растений к низким температурам среды, другая группа приводит к снижению адаптационных способностей. Это говорит о том, что физиологически активные олигосахариды играют значительную роль в деле регулирования адаптационных свойст против абиотических стрессовых факторов среды [3].

Растения, произрастающие в засоленных почвах, путем изменения осмотического потенциала могут уменьшить содержание воды в сменах. Это происходит путем поглощения неорганических ионов и синтезом осмотиков. Недостаточное количество углеводов, как основных метаболитов, при сублетальнам засолении могут затормозить рост растений [20, 22].

Известно, что во время солевого стресса, образующиеся углеводы используются для поддержания осмотического статуса. Ратхерт [22], изучая солеустойчивость растений риса, сои и хлопк обнаружил необыкновенное сходство между изменениями уровней сахарозы и крахмала. Веимберг [26] показал, что сахароза в листьях пшеницы накапливается прямо

© Алыева Н.Ф., 2016 г.

пропорционально засоленности почвы и заключил, что сахароза используется лишь для осмотической адаптации.

Считают, что накопление углеводов в листьях происходит, в первую очередь, за счёт приостановки их оттока из листьев [19]. Количество углеводов в различных органах и тканях значительно различается. Если углеводы, накопившиеся в листьях не будут оттекать в другие органы и использоваться, то это приведет к ослаблению фотосинтеза [16, 19]. Криснараж и Торпе [17] выявили, что у солеустойчивых сортов пентозофосфатные и гликолитические пути утилизации глюкозы активируются. Они пришли к заключению, что глюкоза листьев растений, произрастающих в солевой среде не используется эффективно. Кроме этого различные ткани по разному реагируют на засолениие [18, 19], в результате засоление может влиять на распределение углеводов среди органов [21].

Индийские ученые изучали изменения качественного и количественного содержания углеводов в семенах различных растений в процессе хранения. Они выявили, что в процессе хранения в различных условиях, прорастание семян, содержание растворимых углеводов и сахарозы выше с начала сбора в течение 45 дней, а после начинает снижаться. Количество растворимых сахаров независимо от условий хранения, увеличивается в течение 45-180 дней, количество же редуцирующих сахаров увеличиваясь в течение 45 дней, затем начинает снижаться. Количество малондиальдеринина в течение 45-180 дней хранения тоже увеличивается. Повышение пероксидного окисления линидов семян в процессе хранения связано с уменьшением активности антиоксидантных ферментов каталазы и пероксидазы [25].

Основная цель данной работы сравнительное изучение механизма засухоустойчивости и солеустойчивости на основе изменения содержания сахаров в листьях кукурузы при нормальном орошении и в условиях засухи и солевого стресса.

Материал и методы

Объект исследования. Для исследований были использованы листья кукурузы (Zea mays L.). Кукуруза принадлежащая к растениям с С4-фотосинтезирующим механизмам, относится к НАДФ-ферментом. Отделившийся в это время углекислый газ (СО2) переносясь в центры карбоксилирования обеспечивает нормальное прохождение реакций цикла кальвина. Этот механизм является одним из факторов предотвращения гибели растения в стессовых ситуациях.

Посадка и выращивание семян растения. Для избавления семян кукурузы от различных болезнетворных микробов, они были помещены для дезинфекции на 15 минут в 3% раствор перекси водорода. Далее семена 2-3 раза промывались дистиллированой водой для избавления от перекси водорода и в вегетационных сосудах сажались в почву. После получения первичных проростков вегетационные сосуды переносились в камеру с искусственным климатом: температура 25-280С, фотопериод 14 часов, интенсивность освещения 15-20 клюкс, влажность 60-70%. После появления 1-го листа, растения в контрольном варианте орошались до окончания эксперимента, а в опытных вариантах в первом - полностью прекращался полив растений, во втаром - путем добавления 200мМ раствора NaCl, а в третьем - путем добавления 200мМ раствора Na2SO4, создавалось искусственое засоление.

Взятие образцов листьев. Через каждые 5 дней в 12 часов после 3-4 часовых освещений брались образц листьев. Это необходимо для активизации метаболических процессов и активизации фотосинтетического аппарата.

Получение экстракта листьев. Листья промывались, высушивались

фильтровальной бумагой, взвешивались и добавлялся гомогенизирующий раствор из расчета 5 мл на 1 грамм листьев и при температуре +40С с испорзованием кварцевого песка гомогенизировались в гомогенизаторе. Состав гомогенизирующего раствора: 5мМ

дитиотрейтол (ДТТ), 1мм этилендиамин тетраацетат (ЕДТА), 20мМ MgCl2, 0,5% поливинилпирролидон (РУР) и 0,5% Тритон Х-100 100мМ, рН Трис-HCl буфера 7,8-8,0. После фильтрации полученного гомогената через 4-х слойный капрон, для очищения от не

разрушенных клеток и тканей фильтрат осаждался в центрифуге сначала при 300г 5 минут, затем при 1000г 10 минут. Осадок отбрасывался. Надосадогная жидкость использовалось для различных целей.

Определение количества сахаров в различных органах растений. Количество сахаров в листьях и семенах определялось методом Бертрана [2]. Этот метод основан на редукцирующей способности сахаров, имеющих свободную карбонильную группу. Они в щелочной среде сульфата меди (CuSO4 4H2O) из окисленной формы переходят в редукцированную форму. В это время медь редукцируется из Cu2+ и Cu1+. Для определения количества сахаров вначале требуется кислотный или ферментативный гидролиз сахарозы и других олигосахаридов. Основная цель здесь точное определение количества осадка Cu(OH)2 соответствующее наличию растворимых сахаров в растворе. Ход процесса широко и ясно освещается в указанной литературе [2].

Другой и более современный метод - это метод предлагаемый Фаррар [12]. Для этого самые молодые и завершившие своё развитие листья для экстракции углеводов выдерживаются в 5 мл горячего (800С) 95%-го этанола в течение 30 минут. После фильтрации спиртового экстракта продолжают экстракцию в 5 мл горячего этапола в течение 45 минут. Полученные экстракты объединяют и переносят в сосуд с закрытием пробкой. Оставшийся материал сушат при температуре 560С и снова суспензируют в 6 мл ацетатного буфера с рН 4,5. Испытуемые сосуды закрываются и инкубируются при коинатной температуре в течение 24 часов. Далее экстракт фильтруется и сохраняется для анализов. Остаточный материал протирается в 5,4 мл ацетатного буфера с рН 4,5 и добавляется, полученная из 12,4 v Rhirobus (100 v/g Sigma, CША) фермент амилоглюкозидаза [9]. Испытуемые сосуды закрываются пробкой и инкубируются при 450С в течение 24 часов. Для отделения амилоглюкозидазы раствор фильтруется через бумажный фильтр, изготовленным из стекляных валокон. Во всех фракциях углеводы определялись фенольным методом. В 1 мл экстракта добавляют 1 мл 5% водного раствора фенола (м/v) и 5 мл концентрированной (99%) серной киалоты. Раствор аккуратно мешается со стекляной палочкой. После 30минут измеряется сравнительная оптическая плотность раствора и контроля при 483 пм . В качестве контроля берутся вода, 5% фенол и серная кислота.

Количество фруктанов, растворимых сахаров и крахмала в листьях и зрелых семенах определялось калорометрическим способом при 483 пм и вычислялось на основе калибровогной кривой, построенной для гдюкозы и выражалось количественным эквивалентом глюкоза (мг/ш на сырой вес).

Статистика: Данные, приведенные в таблице и графиках показывают среднее арифметическое от квадратичесных отклонений. При анализе результатов исследований были приняты во внимание средне-арифметические ошибки и отклонения (М± м).

Анализ результатов

В результате ухудшения экологическог состояния и в связи с природными климатическими условиями в весенний и летний периоды повышается температура и увеличивается засоленность почв, дефицит воды и засуха приводятк уменьшению урожайности культурных растений на 30-35% по сравнению с растениями получающие нормальное орошение [10]. По литературным даным из пригодных для земледелия почв, приблизительно 20% засолены. [4]. Для успешного решения этой проблемы на основе физиологических и биохимических механизмов с выявлением защитных и адаптационных реакций, изучение морфо-физиологических факторов является также одним из важных условий.

Известно, что в реакциях адаптации у растений отмечаются 2 этапа: мгновеннопервичный этап (реакция стресса) и сравнительно долго длящийся этап. На данном этапе в условиях длительного солевого стресса создаются более надежные и более эффективные защитные реакции [5]. Если влияние стресса превышает защитные возможности организма, тогда начинается разрушение и организм соприкасается с гибелью. В условиях факторов стресса в организме растений путем различных метаболитических реакций синтезируются и

накапливаются различного рода и свойств биополимеры, играющие защитную роль. К такого рода биополимерам можно отнести белки, жиры, угдеводы и др. По степени накопления этих биополимеров отдельные растительные генотипы различаются друг от друга. Если бобовые растения и их смена богаты белками, то зерновые и значительное количество представителей семейств крестоцветных и разоцветных богаты углеводами, а большинство технических растений богаты маслами (хдопок, подсолнух, соя и др.).

В литературе показано, что по мере увеличения в среде концентрации солей до 200 мМ, увеличивается и количество растворимых углеводов. Так, в листьях пишенцы максимальное количество фруктанов, крахмала и общих углеводов наблюдается при концентрации в среде NaCl 200-300 мМ. В листьях пшеницы основными углеводами являются растворимые углеводы и крахмал. Фруктаны составляют 10% от общего количества углеводов [4].

В условиях засоления накопление углеводов в листьях может быть ответной реакцией на накопление одновалентных ионов в вакуолях растений. Накопившиеся в цитоплазме органические соединения, например, растворимые углеводы и пролин, в отличие от одновалентных ионов, не оказывая отрицательного действия на мембраны и ферменты, уравновешивают осмотический потенциал в вакуолях [24]. Одной из причин накопления углеводов в молодых листьях является расстройство в распределении их между запасающими и развивающими организмами [14].

Накопление крахмала в листьях, как временного вещества для роста и дыхания растений, может быть следствием нврушения метаболизма сахарозы под действием NaCl.

Муннс и Термат показывают, что при концентрациях 0-200 мМ NaCl, количество растворимых углеводов в корнях и листьях одинаково. Это говорит о том, что засоление в этих концентрациях не нарушает процесс миграции белков из листьев в корни. При более высоких концентрациях засоления наблюдается уменьшение количества растворимых углеводов в корнях. Это явнее прослеживается в менее устойчивых сортах [18].

Засуха и засоление в 200 мМ NaCl и Na2SO4 оказывают различное влияние на синтез и накопление углеводов в живых организмах. Результаты проведенных экспериментов приведены в таблице 1. Как видно из таблицы в зернах кукурузы количество сахаров в контрольных вариантах независимо от времени развития составляет 16-18% на грамм свежего веса. Этот показатель в контрольных вариантах в листьях составляет 2-4%. В условиях засухи и солевого стресса наблюдается незначительное уменьшение количества сахаров мг на 1 грамм свежих листьев. Это уменьшение можно объяснить нарушением оттока в другие органы, в том числе и запасные, синтезированных в листьях в процессе фотосинтеза углеводов, активацией ферментов, ответственных за синтез углеводов условиях засухи и солевого стресса, а также ингибированием активности ферментов, ответственных за деградацию углеводов.

Таблица 1

Влияние засухи и солевого стресса на содержание сахаров в листьях и зернах кукурузы на ранних стадиях развития

Вариант Количество сахаров

5 дней 10 дней 15 дней

Листья

контроль 37,5 38,0 38,0

засуха 37,0 36,0 25,0

200 mM NaCl 37,5 33,5 32,5

200 mM NaiSO4 37,5 35,0 30,0

Зерна

Общее 157,0 168,0 176,0

Weise с сотрудниками выявили факторы приводящие к распаду крахмалов в хлоропластах фасоли и Arabidopsis thaliana.Y фасоли в нормальном темно-световом цикле днем в хлоропластах происходит накопление крахмала, а ночью происходит распад. Этот ритм сохраняется несколько суток при непрерывном освещении, т.е.регулируется циркадным (часовым) ритмом. Через час после затемнения количество мальтозы увеличивается на 50% количество вес крахмала и глюкоза-6-фосфата не меняется. При благоприятных условиях для фотодыхания, через час количество мальтозы и глюкоза-6-фосфата увеличивается в 3 раза, а количество крахмала умерьшается на 25%. В среде N2, где полностью исключается дыхание листьев, количество мальтозы, крахмала и глюкоза-6-фосфата не меняется. При добавлении в среду N2 2% кислорода, при стимуляции дыхания, происходит незначительное уменьшение мальтозы, а количество вес крахмала и глюкоза-6-фосфата не меняется.

Таким образом, гидролитическая и фосфоролитическая деградация крахмала зависит от условий внешней среды [27].

Используя также литературные данные можно придти к заключению, что засуха и солевой стресс приводят к уменьшению количества сахаров в листьях кукурузы.

Литература

1. Баят Ф., Ширан Б., Беляев Д.В. и др. Повышенная устойчивость к засолению растений картофеля, трансформированных геном вакуолярного №+/Н+-антипортера ячменя HvNHX2 // Физиология растений, 2010, Том 57, с. 744-755.

2. Ермакова А.И. Методы биохимического исследования растений. Ленинград, Изд-во Колос, 1972, с. 220-224.

3. Заботина О.А., Аюпова Д.А., Ларская И.А., Николаева О.Е., Петровичева Г.А., Заботин А.И. Физиологически активные олигосахариды, накапливающиеся в корнях озимой пшеницы в ходе низкотемпературной адаптации // Физиология растений, 1998, Том 45, № 2, с. 262-267.

4. Кафи М., Стюарт В.С., Борланд А. Содержание углеводов и пролина в листьях, корнях и апексах сортов пшеницы, устойчивых и чувствительных к засолению // Физиология растений, 2003, ^м 50, № 2, c. 174-182.

5. Пахомова В.М. Основные положения современной теории стресса и неспецифический адаптационный синдром у растений // Цитология, 1995, Том 37, №1/2, с. 66-75.

6. Петункина Л.О., Свиркова С.В., Маевская Н.А., Старцев А.А. Физиологическая оценка устойчивости овса // Вестник Кем. ГУ, 2012, Том 1, № 4 (52), c. 20-24.

7. Хасан Д., Ковтун И.С., Ефимова М.В. Влияние хлоридного засоления на прорастание семян и рост проростков BrassicanapusL. // Вестник Томского Гос. Университета, 2011, № 4, с. 108-112.

8. Шевякова Н.И., Бакулина Е.А., Кузнецов Вл.В. Антиоксидантная роль пролина у галофита Mesembryanthemumcrystallinum при действии засоления и параквата, иницирующих окислительный стресс // Физиология растений, 2009, № 5, с. 736-742.

9. Borland A.M., Farrar J.F. Duel patterns of carbohydrate-metabolism in leaf blades and leaf sheaths of Poa annua and Poa x Jemtlandica (Almg) Richt // New Phytol., 1985, Vol. 100, p. 519-531.

10. Boyer J. Plant productivity and environment potential for increasing crop plant productivity, genotypic selection // Science, 1982, Vol. 218, p. 443-448

11. Chaves M.M., Oliveira M.M. Mechanisms underlying plant resilience to water deficits: prospwekts for water-saving agriculture // Journal of Experimental Botany. 2004, Vol. 55, p. 2365-2384.

12. Farrar J.F. Carbon partitioning // Photosynthesis and Production in a Changing Environment // Eds Hall D.O. et al. London: Chapman and Hall, 1993.

13. Flexas J., Bota J., Galmes J., Medrano H., Ribas-Carbo M. Keeping a positive carbon balance under adverse conditions: Responses of photosynrhesis and respiration to water stress // Physiol. Plant, 2006, Vol. 127, p. 343-352.

14. Gorham J., Wyn Jones R.G., McDonnell E. Some mechanism of salt tolerance in crop plants // Plant Soil., 1985, Vol. 89, p.15-40.

15. Greenway H., Munns R. Mechanisms of salt tolerance in Nonhalophytes // Annu. Rev. Plant Physiol, 1980, Vol. 31, p. 141-190.

16. Hall A.G., Milthorpe F.L. Assimilate source-sink relationship in Capsicum annuum L.: 3. Effects of fruit excision on photosynthesis and leaf and stem carbohydrates // Aust. J. Plant Physiol, 1978, Vol. 5, p. 1-13.

17. Krishanraj S., Thorpe T.A. Salinity stress effects on [14C-1] and [14C-6]-glucose of a salt-tolerant and a salt susceptible variety of wheat // Int. J. Plant Sci. 1996, Vol. 157, p. 110-116.

18. Munns R., Termat A. Whole-plant responses to salinity // Aust. J. Plant Physiol, 1986, Vol. 13, p. 143160.

19. Munns R., Greenway H., Delane R., Gibbs J. Ion content and carbohydrate status of theelongating leaf tissue of Hordeum vulgare growing at high external NaCl: Cause of the growth reduction // J. Exp. Bot., 1982, Vol. 33, p. 574-583.

20. Naidu P.B. Separation of sugars, polyols, proline analogues, and betaines in stressed plant extracts by high performance liquid chromatography and quantification by ultraviolet detection // Aust. J. Plant Physiol., 1998, Vol. 25, p. 793-800.

21. Poustini K. Salinity and translocation of carbohydrates to growing grains. PhD Thesis: London University, 1990.

22. Rathert G. Sucrose and starch content of plant parts a possible indicator for salttolerance of crops // Aust. J. Plant Physiol., 1984, Vol. 11, p. 491-495.

23. Rathert G. Influence of extreme K:Na ratios and high substrate salinity on plant metabolism of crops differing in salt-tolerance: 7. Realations between carbohydrates and degradative enzymes in salt tolerant and salt-sensitive cotton genotypes during initial salinity stress // J. Plant Nutr., 1982, Vol. 5, p. 14011413.

24. Singh A.K., Chakravarthy D., Singh T.P.K., Singh H.N. Evidence for a role for L-proline as a salinity protectant in the Cyanobacterium Nostoc muscorum // Plant Cell Envir., 1996, Vol. 19, p. 490-494.

25. Sharma N., Kaur N., Gupta A.K. Effect of salicylic acid on the carbohydrate composition and activities of sucrose metabolizing enzymes in potato // Indian J. Agr. Biochem., 2005, Vol. 18, № 1, p. 43-45.

26. Weimberq R. Solute adjustment in leaves of two species of wheat at two different stages of growth in response to salinity // Physiol. Plant, 1987, Vol. 13, p. 381-388.

27. Weise Sean E., Schrader Stephen M., Kleinbeck Kyle R., Sharkey Thomas D. Carbon balance and circadian regulation of hydrolityc and phosphorolytic breakdown of transitory starch // Plant Physiol., 2006, Vol. 141, № 3, p. 879-886