Внутриклеточный рН как фактор регуляции функции гладких мышц различных отделов желудочно-кишечного тракта

© МЕДВЕДЕВ М.А., СТУДНИЦКИЙ В.Б., ПОГУДИН Ю.А., КОЛЬЦОВ А.В., БАРМИН В.Ю., ЛЕГОМИНОВА Т.Г.

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЙ РН - КАК ФАКТОР РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИИ ГЛАДКИХ МЫШЦ РАЗЛИЧНЫХ ОТДЕЛОВ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА

М.А. Медведев, В.Б. Студницкий, Ю.А. Погудин,

А.В. Кольцов, В.Ю. Бармин, Т.Г. .Легоминова Сибирский государственный медицинский университет, ректор - д.м.н., проф. В.В. Новицкий, кафедра нормальной физиологии, зав. - акад. РАМН И. А. Медведев.

Резюме. Методом двойного «сахарозного мостика», была исследована электрическая и сократительная активность гладкой мускулатуры циркулярного слоя различных регионов желудочно-кишечного тракта котов в условиях изменений внутриклеточного рН, вызванных хлористым аммонием и ацетатом натрия. Показано, что внутриклеточное защелачивание вызывает подавление, а внутриклеточное закисление оказывает активирующий эффект на параметры электрической и сократительной активности гладких мышц, за исключением гладкомышечных клеток внутреннего анального сфиктера. Эти эффекты опосредуются изменением не только калиевой, но и кальциевой проводимости мембраны.

Ключевые слова: гладкая мышца, внутриклеточный рН, желудочно-кишечный тракт, калиевая и кальциевая проводимость.

Одним из основополагающих моментов функционирования гладких мышц, как и других видов возбудимых тканей, является поддержание постоянства внутриклеточного рН (рН;) [4]. Являясь продуктом метаболизма, ионы Н+ могут изменять течение биологического ответа всех клеток организма. Являясь одной из основных констант внутриклеточного гомеостаза, содержание водородных ионов внутри клетки может колебаться от 30 до100 нМ., отражая её функциональное состояние от рождении до апоптоза [7]. Как один из продуктов внутриклеточного метаболизма, ионы водорода могут определять функциональный ответ клеток под воздействием различных экстремальных факторов, таких как радиация, питательный дисбаланс, изменение внеклеточного рН в результате нарушения кровотока и другие [4]. Эти изменения рН; , оказывая влияние на уровень внутриклеточного кальция (Са;) как в покое, так и при возбуждении, определяют особенности электромеханического, фармакомеханического и

других видов сопряжения [5]. Не является исключением и влияние изменения рН; на активность Rho системы, которая регулирует активность миозина и изменение цитоскелета клетки. Определённый уровень метаболической активности клеток является источником Н+ ионов и, тем самым, определяет более кислое рН; к внеклеточному рН (в среднем 0,2 - 0,25 единиц рН).

Наиболее важная роль среди этих ион - транспортирующих систем регулирующих рН;, принадлежит катионному Na+/H+ - и анионному Cl-/HCO3- - обменнику.

В свою очередь, изменение рН; под воздействием внешних факторов влечёт за собой перестройку клеточного метаболизма, функции многих ферментативных систем и регуляторных белков, концентрации свободного цитозольного кальция (Са2+;), состояния потенциало- и рецепторзависимых ионных каналов и других ионтранспортирующих систем мембраны клеток [3,6].

В итоге это приводит к модулирующему или регулирующему влиянию на конечный функциональный ответ клеток, а именно: электромеханический, электросекреторный, фармакомеханический, механосекреторный, а также на другие виды сопряжения.

В этом плане не являются исключением гладкомышечные клетки (ГМК) желудочнокишечного тракта (ЖКТ). Особого внимания заслуживают сфинктерные образования ЖКТ, которые имеют ряд особенностей функционирования миогенной природы, а также регуляции со стороны нервной и гуморальной систем организма [2].

Сократительная активность гладких мышц различных отделов ЖКТ определяется не только видовой и регионарной специфичностью, но и существенно, зависит от особенностей нервной, гуморальной систем регуляции организма, а также от клеточных и межклеточных информационных посредников [2].

Нами была предпринята попытка изучения влияния изменения рН; на функциональную активность гладких мышц различных регионов ЖКТ.

Материалы и методы

Объектом исследования служили гладкомышечные (ГМ) препараты циркулярных мышц пищевода, дистального отдела тонкого и проксимального отдела толстого кишечника, прямой кишки, нижнего пищеводного (НПС) и внутреннего анального (ВАС) сфинктеров котов, шириной 0,5- 0,7 мм и длинной 10-12 мм.

Применяемые растворы: нормальный раствор Кребса, использовавшийся в опытах, включал следующие компоненты (мМ): NaCl - 120,4; KCl - 5,9; MgCl2 - 1,2; CaCl2 - 2,5; NaHCO3 - 15,5; NaH2PO4 - 1,2; глюкоза - 11,5.

Бескальциевый раствор готовился с добавлением ЭГТА (“Serva”, ФРГ) в концентрации 1,5-2 мМ.

Используемые препараты: никардипин - “Sigma” (США), изоптин (верапамил) -“Knoll” (ФРГ), тетраэтиламмоний, NH4Cl и ацетат натрия «Реахим» (Россия).

Все растворы готовились на бидистилированной воде из солей марки ХЧ, рН растворов поддерживали в пределах 7,35-7,4, температуру - в диапазоне 36,5-37,0 С0, изотонический раствор сахарозы готовился на деионизованной воде.

Исследование электрических и сократительных свойств изучаемых отделов гладких мышц ЖКТ проводили методом двойного “сахарозного мостика”[1]. Спонтанные и вызванные потенциалы действия (ПД) оценивались по амплитуде и длительности, сопротивление мембраны определяли по величине анэлектротонических ответов, сократительную активность - по изменению мышечного напряжения, амплитуде и длительности вызванных сокращений. Полученные результаты экспериментов выражали в абсолютных и относительных величинах. Проводилась статистическая обработка данных, достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента.

В качестве основного стандартного методического приёма для изменения рН в выше перечисленных отделах ЖКТ, применяли добавление NH4Cl (10 - 20 мМ) в раствор Кребса. Особенностью этого методического приёма является то, что NH3 проходит через мембрану клеток быстрее и легче, чем NH4+, и связывает свободные внутриклеточные Н+ ионы. Это приводит к первоначальному защелачиванию рН Удаление из раствора Кребса NH4Cl сопровождается тем, что образованный катион NH4+ отдаёт Н+ в окружающее внутри пространство и вызывает последующее внутриклеточное закисление.

Результаты и обсуждение

В нормальном растворе Кребса гладкомышечные клетки вышеперечисленных отделов ЖКТ не обладали исходной спонтанной электрической и сократительной активностью, за исключением ГМК ВАС, которые генерировали потенциалы действия продолжительностью до трёх секунд и фазные сокращения. Гиперполяризующие импульсы электрического тока приводили к развитию анэлектротонических потенциалов (АЭП), а деполяризующие импульсы пороговой величины - катэлектротонических потенциалов (КЭП), с генерацией на их плато 2 - 3 ПД и одновременным развитием фазного сократительного ответа, за исключением ГМК НПС. У последних генерация ПД не возникала даже при очень больших силах тока, но КЭП характеризовался развитием сокращения. Все виды электрической и сократительной активности эффективно

подавлялись блокаторами кальциевых каналов никардипином и изоптином (10-5 - 10"4 М) и исчезали в бескальциевом растворе (0,5 мМ ЭГТА).

Первоначальное внутриклеточное защелачивание, вызванное применением КН4С1 (20 мМ) в нормальный раствор Кребса, осуществляло достоверное снижение сопротивления мембраны и понижению вызванной электрической и сократительной активности изучаемых гладкомышечных препаратов. Исключение составляли ГМК ВАС, в которых внутриклеточное защелачивание приводило к деполяризации мембраны ГМК, возникновению, либо усилению спонтанной электрической и сократительной активности, повышению базального тонуса и снижению сопротивления мембраны. Деполяризующие импульсы тока увеличивали числа генерируемых ПД и силы вызванных сокращений (рис. 1).

Рис. 1. Действие NН4С1 (20 мМ) на параметры электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток внутреннего анального сфинктера котов. Регистрация записи проводилась на спаренных самопишущих потенциометрах КСП - 4. Нижняя запись - электрическая активность, верхняя - механическая активность. Сила тока 0,1 мкА (а - гиперполяризующие и, к - деполяризующие импульсы тока), продолжительность импульса 5 секунд.

Окончание действия КН4С1 сопровождалось восстановлением и усилением вызванной электрической и сократительной активности, возвращением величины АЭП к исходному уровню. В ГМК ВАС развивалась гиперполяризация, снижалось сопротивление и мышечное напряжение, подавлялась спонтанная и вызванная электрическая и сократительная активность (рис. 1).

Для изучения роли калиевой проводимости мембраны ГМК использовался селективный блокатор калиевых каналов - тетраэтиламмоний, который оказывал активирующее влияние на электрофизиологические параметры гладких мышц изучаемых отделов ЖКТ, приводя к частичной деполяризации, увеличению сопротивления мембраны и электровозбудимости, усилению вызванной электрической и сократительной активности, а также появлению или усилению спонтанной электрической и сократительной активности.

На фоне действия тетраэтиламмония (ТЭА), в концентрации 10 мМ, применение КН4С1 характеризовалось ослаблением ингибирующего и усилением активирующего влияния в изучаемых ГМ образованиях ЖКТ (рис. 2).

Рис. 2. Эффекты ЫН4С1 на фоне действия тетраэтиламмония (10 мМ) на показатели вызванной электрической и сократительной активности гладкомышечных полосок циркулярного слоя проксимального отдела толстого кишечника. ОР - размыкательный ответ. Обозначения аналогичны рис. 1.

Однако исключение составляли ГМК ВАС, у которых на фоне ТЭА (10мМ) при внутриклеточном защелачивании регистрировалась активация как электрической, так и сократительной активности. При этом внутриклеточное закисление сопровождалось полным подавлением указанных электрофизиологических параметров.

Применение ацетата натрия (10 - 50 мМ) характеризовалось противоположными изменениями параметров электрической и сократительной активности гладкомышечных препаратов.

Анализ полученных результатов показывает, что существенную роль в эффектах внутриклеточного защелачивания или закисления играет изменение калиевой проводимости мембраны ГМК ЖКТ. Выраженность этих эффектов в существенной мере определяется физиологическими свойствами ГМК различных регионов ЖКТ.

Для изучения роли кальциевой проводимости ГМК нами был использован методический приём с модификацией проводимости кальциевых каналов. В бескальциевых ЭГТА - содержащих растворах теряется ионоспецифическая проницаемость кальциевых каналов Ь - типа и они становятся №+ - проводящими. При этом сохраняется их потенциалочувствительность, но теряется Са2+ потенциалозависимость. В этих условиях определяющей функцией мембраны клеток остаётся работа модифицированных потенциалозависимых кальциевых каналов, по характеристике которых можно судить о роли влияния изменения рН;. На фоне действия бескальциевого ЭГТА - содержащего раствора (1,5 - 2 мМ) развивалась первоначальная, хорошо выраженная деполяризация, которая сопровождалась достоверным снижением сопротивления, тонуса ГМ препаратов и полным подавлением вызванной электрической и сократительной активности. В дальнейшем, на фоне действия такого модифицирующего раствора, появлялись как вызванные, так и спонтанные параметры электрической активности, которые были как время, так и потенцеалозависимыми.

В этих условиях следует отметить, что применение КН4С1 резко снизило уровень деполяризации, сопротивления и частичной потере электровозбудимости. Окончание действия КН4С1 характеризовалось частичным, но не всегда полным восстановлением электрофизиологических параметров ГМК (рис. 3).

Рис. 3. Влияние NH4Cl (20 мМ) на параметры модифицированной электрической активности гладкомышечных клеток циркулярного слоя пищевода котов. Обозначения аналогичны рис. 1.

Приведённые результаты показывают, что существенную роль в эффектах внутриклеточного защелачивания и закисления играет изменение кальциевой проводимости мембраны ГМК ЖКТ. Выраженность этих эффектов определяется физиологическими свойствами ГМК различных регионов ЖКТ.

Таким образом, представленные экспериментальные данные подтверждают высказанную нами гипотезу о том, что изменение рН; существенно влияет на электромеханическое сопряжение в гладких мышцах ЖКТ, которое зависит от регионарного расположения. Выраженность этого влияния определяется изменениями не только калиевой проводимости мембраны (возможно, включая все ее виды), но так же и кальциевой проводимости, не исключая повышение кальциевой чувствительности актин-миозинового взаимодействия.

Полученные результаты требуют дальнейшего экспериментального изучения.

INTRACELLULAR PH AS A FACTOR OF REGULATION OF NONSTRIATED MUSCLES IN DIFFERENT PARTS OF GASTROINTESTINAL TRACT M.A. Medvedev, V.B. Studnitskij, YU.A. Pogudin, A.V. Koltsov, V.YU. Barmin, T.G.

Legominova Siberian state medical university

Electrical and retractive activity of nonstriated muscle of circular layer on different part of gastrointestinal tract of cats in the conditions of change of intracellular pH caused by sal ammonia and natrium acetate was researched by the method of “sugary bridge”. It was revealed that intracellular bucking causes suppression and intracellular oxidation has activating effect on parameters of electrical and retractive activity of nonstriated muscle except for nonstriated cells of internal anal sphincter. These effects are mediated by not only potassium but also calcium membrane conductivity.

Литература

1. Артеменко Д.М.,Шуба М.Ф. Методика дослежения електрических еластивостей нервных та м, язових волокон за допомогою поверхнев позаклитинних електродив // Физиол.журнал АН УССР. - 1964. - Т. 10, №3. - С. 403-407.

2. Баскаков М.Б., Медведев М. А. Механизмы межклеточной и внутриклеточной сигнализации в гладких мышцах // Мембранные и молекулярные механизмы регуляции функций гладких мышц. - Томск, 2004. - С. 7-24.

3. Batlle D.C., Peces R., LaPonte M.S. et al. Citosolic free calcium regulation in response to acute changes in intracellular pH in vascular smooth muscle // Am. J. Physiol. - 1993. - Vol. 264 (4Pt1). - P. 932-943.

4. Boron W.F. Regulation of intracellular pH // Advan. Physiol. Edu. - 2004. - Vol. 28. - P. 160-179.

5. Clare A., Susan W. Interactions Between Ca2+ and H+ and Functional Consequences in Vascular Smooth Muscle // Circulation Research. - 2000. - Vol. 86. - P. 355.

6. Korbmacher Ch., Helbik H.,Blank M. Charakterization of CI-\HCO3- exchenge in A 10 vascular smooth muscle cells using CI- // Biochim. et biophys. acta. Biomembranes. - 1989. -Vol. 958, N 1. - P. 67-74.

7. Roos A., W.F. Boron. Intracellular Ph // Physiol. Rev. - 1981. - Vol. 61. - P. 269-434.

Рис. 1. Действие ЫИ4С1 (20 мМ) на параметры электрической и сократительной активности гладкомышечных клеток внутреннего анального сфинктера котов. Регистрация записи проводилась на спаренных самопишущих потенциометрах КСП - 4. Нижняя запись - электрическая активность, верхняя - механическая активность. Сила тока 0,1 мкА (а - гиперполяризующие импульсы тока, к - деполяризующие импульсы тока), продолжительность импульса 5 секунд.

ЮОтН

V

ТЭА

и

ч#

X

2

Т1

о

X

ШШДг

•г

5тВ

Рис. 2. Эффекты ЫИ4С1 на фоне действия тетраэтиламмония (10 мМ) на показатели вызванной электрической и сократительной активности гладкомышечных полосок

циркулярного слоя проксимального отдела толстого кишечника. ОР - размыкательный ответ. Обозначения аналогичны рис. 1.

Рис. 3. Влияние ЫИ4С1 (20 мМ) на параметры модифицированной электрической активности гладкомышечных клеток циркулярного слоя пищевода котов. Обозначения аналогичны рис. 1.