Динамика моделей зервамицинового канала

— Физика —

УДК 577.3

H.H. Николаев, О. В. Левцова, А. К. Шайтан. К.В. Шайтан

ДИНАМИКА МОДЕЛЕЙ ЗЕРВАМИЦИНОВОГО КАНАЛА

Проведено моделирование и сравнительное изучение трех моделей зервамицинового канала в мембране ПОФЭ/ПОФП Модели каналов собирались согласно BS-модели действия антимикробных пептидов и состояли из четырех (N4), пяти (N5) и шести (N6) молекул пептида.

Показано, что четыре молекулы зервамицина IIB не формируют устойчивый проводящий канал, но служат «предшественником» для формирования каналов из большего числа субъединиц. Пентамер и гексамер формируют ионные каналы с минимальным радиусом пор 2.5 А и 3,7 А соответственно.

Кчючевые слова: молекулярное моделирование, молекулярная динамика, аминокислотные остатки, пептид, мембраны, липид-ный бислой, ионный канал.

Антимикробные пептиды являются весьма перспективными объектами для разработки антимикробных препаратов нового поколения, к которым не вырабатывается устойчивость микроорганизмов. Механизм действия рассматриваемых пептидов обычно связан с формированием в биомембранах клеток прокариот каналов или тотальным разрушением клеточных стенок. Однако до сих пор нет ясности в том, какие структурные факторы являются критическими для такого действия. Вот почему в этом отношении весьма полезны методы динамического молекулярного моделирования [1-4].

Начальные структуры каналов собирались так, чтобы пептиды были расположены параллельно друг другу. Остаток Gin 11, предположительно участвующий в проведении ионов [5], был обращен в пору канала. Липидный состав биомембран клеток прокариот и эукариот существенно различается. Действие рассматриваемых антимикробных пептидов в случае клеток прокариот выражено наиболее сильно. Поэтому использовались модель мембраны бактериальной клетки, липидный бислой, который состоял из пальмитоилолеоилфосфатидилэтано-

Н И КОЛА ЕВ Иван Никитич - к.ф.-м.н., проректор по учебной работе ЯГУ имени М.К. Аммосова.

E-mail: n_ivan_n@mail.ru

ЛЕВЦОВА Ольга Владимировна - к.ф.-м.н., научный сотрудник биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

E-mail: shaytan49@yandex.ru

ШАЙТАН Алексей Константинович - к.ф.-м.н., ведущий инженер биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

E-mail: alexeyshaytan@gmail.com

ШАЙТАН Константин Вольдемарович - д.ф.-м.н., профессор, зам. зав. кафедрой биоинженерии МГУ имени М.В. Ломоносова.

E-mail: shaytan49 а yandex.ru

ламина (ПОФЭ) и пальмитоилолеофосфатидилглицеро-ла (ПОФГ) в соотношении 4:1. Далее структу ры каналов помещались в липидный бислой. В таблице приведены составы всех исследуемых систем. Полученные системы подвергались многоступенчатой релаксации. На первом этапе проводилась равновесная МД в течение 2 не при температуре 10 К для атомов молекул зервамицина и 300 К для остальных атомов системы так, чтобы молекулы липидов могли организоваться вокруг пептидных молекул. На втором этапе (2 не) температура всей системы составляла 300 К. На заключительном этапе на систему накладывалось внешнее электрическое поле. После процесса релаксации рассчитывалась рабочая траектория в течение не менее 10 не с целью, чтобы молекулы 2г\ПВ в канале имели возможность переориентироваться относительно друг друга и липидного окружения.

Таблица

Система Кол-во пептидов Кол-во липидов Кол-во молекул волы Кол-во про-тивоионов

Тетрамер (N4) 4 122 POPE 31 POPG 10193 31 Na+

Пентамер (N5) 5 122 POPE 31 POPG 10425 31 Na+

Гексамер (N6) 6 114 POPE 31 POPG 10513 31 Na+

При расчете траекторий использовался следующий МД-протокол:

• Программный пакет вготаез 3.2.1

• Потенциальное поле ОРЬВ-АА

• Длина рабочей траектории 10 не

• Температу ра термостата 300К

• Термостат: стохастическая динамика

• Постоянная термостатирования г - 0,2пс

• Баростат - Берендсена

• Постоянная баростатирования - 10 пс

• Давление баростата вдоль нормали мембраны: 1 бар

• Давление баростата перпендикулярно нормали мембраны: -50 бар

• Радиус обрезания для электростатических взаимодействии Яе=20А

• Радиус обрезания для взаимодействия Ван-дер-

Ваальса 1*%<т=20А

• Внешнее электрическое поле - 0,01 В/нм

Е

Q

СО

CZ

За 2 не КМ8С> для тетрамера выросло до 0.27 нм, в то время как КМ$0 для N5 и N6 каналов составило 0,17 и 0,16 нм соответственно.

В начальной кон формации каналов молекулы 7г\11В были параллельны оси канала, после 10 не в канале N5 пептиды повернулись под небольшим углом к оси канала и сформировали суперспираль (рис. 2А,Б). Рост КМ8Г) для пентамера в первые 500 пс до значения 0,14 нм связан с поворотом пептидов относительно оси канала. Дальнейший более медленный рост обусловлен поворотом пептидов вокруг своей оси. В N6 канале молекулы /т\ПВ остались параллельно оси канала (рис. 2В, Г) что приводит к разной динамике изменения ЯМЭО для каналов N5 и N6. В этом случае присутствует только фаза медленного роста ЯМ80 соответствующая поворот)' пептидов вокруг своей оси. Вероятно, что формирование суперспирали стабилизирует канал и увеличивает время жизни. Предположительно, не только пентамер способен формировать суперспираль, но и каналы, состоящие из большего количества субъе-

У

диниц. Но на такой процесс требуется больше времени,

• Для численного интегрирования использовался алгоритм Leap-frog.

• Начальные скорости определялись с помощью генератора случайных чисел по распределению Максвелла.

• Шаг интегрирования 1 фс.

• Шаг записи в траекторный файл 1 пс.

Конформационная стабильность молекул ZrvIIB в каналах была оценена с помощью среднеквадратичного отклонения (RMSD) относительно начального положения Са-атомов пептидов в течение первых 2 не динамики (рис. 1).

так как в согласованном повороте участвует большее количество молекул.

У

Большее по сравнению с каналами N5 и N6 значение ЯУ^Э для тетрамера обусловлено отсутствием непрерывного ряда молекул воды в полости канала (рис. ЗА).

Водородные связи, образованные молекулами воды в поре и гидрофильными аминокислотными остатками, стабилизируют положение пептидов в связке относительно другу друга. При отсутствии непрерывного ряда молекул воды, между пептидами могут образовываться полости, которые, будучи изолированными от водного окружения, вызывают дополнительную подвижность аминокислотных остатков. По этой причине, как видно из рис. ЗА, одна из субъединиц тетрамера утратила спиральную структуру на С-конце, а в каналах N5 и N6 непрерывная колонна молекул воды хорошо выражена (рис. ЗБ, В). В узких областях канала N5 количество молекул воды недостаточно для формирования гидрат-нон «шубы» проводимых ионов. На данных участках, вероятнее всего, роль молекул воды гидратной оболочки выполняют атомы кислорода полярных остатков.

0 30

А

Л

0 70-

0 15-

/ i

0 10

0 05

О 00—

о

-Г

200

7 I I-1-1-Г

Т-1-1-1-Г-1-!-1-Г

400

600

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

Time, ps

Рис. 1. Среднеквадратичное отклонение от начальной положения для Cu-атомов молекул Zг\ 11В

И Н Николаев. О В Левцова. А К Шайтан. К В Шайтан ДИНАМИКА МОДЕЛЕЙ 3 Е Р В А МИ 11И НОВОГО КАНАЛА

А

В

В

(

Рис. 2. Положение молекул зервамицина НВ в канале N5 (А - нил сбоку. Б - вид сверху) и в канале N6 (В - вид сбоку, Г - вил сверх} ). Прямыми и стрелками указаны направления молекул пептидов от 1М-конца к С-конц.\

I

Рис. 3. Положение молекул воды в поре каналов N4 (А). N5 (Б) и N6 (В). Кругом выделена область молекулы зервамицина. утратившая начальную спиральную структуру

В полости канала N 6 молекул воды достаточно, чтобы проводимые ионы могли двигаться сквозь него, не нарушая целостность гидратной оболочки. Так как молекулы воды существенно влияют на движение ионов через пору канала, N 4 не может формировать ионный канал и. вероятно, наименьший уровень проводимости зервамииинового канала соответствует пентамеру. При этом структура тетрамера достаточно стабильна и мо-

жет являться «предшественницей» проводящей формы

каналов.

Профили радиусов для исследуемых каналов были определены с помощью программы HOLE [6, 7], которая использует алгоритм Монте-Карло для нахождения максимального радиуса пробной сферы, способной пройти через пору канала. На рис. 4 представлены профили радиусов для каналов N 4, 5 и 6 после 10 не динамики.

5.0

4.5-

4.0-

35-

3 о-

G3 2 0-

1 о-

0 54

0.0

С)

N4

N5

N6

/ V

\

Л/

\

V—X

г

\ у

V

V

/

10 15 о

z coordinate, А

20

25

Рис. 4. Профили радиусов для каналов N4. N5 и N6 после релаксации

Канал N 4 имеет радиус поры -0,2А, что слишком модействуют с молекулами воды в поре. Самую узкую

мало для прохождения иона. Это так же подтверждает факт, что гетрамер не может формировать проводящий ионный канал. Каналы N5 и 6 после Ю не релаксации имеют по две области с минимальным радиусом (2.7 А и 2.5 А \ N5; 3.8 А и 3.7 А у N6). Обе эти области сформированы глутаминовыми кольцами (Gln3 и GinII). Гомологичные остатки в аламетицине (Gln7, Gin 18 и Glu 18), направленные вдоль радиуса в пору канала, предположительно формируют кольца водородных связей и играют ключевую роль в поддержании стабильности структуры канала и в проведении ионов [8]. В канале N5 боковые радикалы аминокислотных остатков G In 11 направлены в полос! ь канала и образуют самую узкую область - 2.5 А. Боковые радикалы Gln3 направлены под углом к радиусу поры, в сторону соседнего пептида и формируют л окал ь-ное сужение 2,7А.

область канала, как и в случае канала N5, формируют боковые радикалы остатков Gin 11. Минимальный радиус поры канала N6 составляет 3.7 А. Такого размера поры достаточно для проведения иона вместе с гидратной оболочкой.

Согласно теоретическим представлениям о структу ре зервамициновых каналов, молекулы пептидов должны бьпь обращены полярной (выпуклой) стороной в полость канала, а гидрофобной (вогнутой) в область гидрофобных хвостов. На рис. 5 показано положение полярных остатков в каналах N5 и 6 после 10 не динамики. В молекуле зервамицина есть три типа полярных остатков: Gin, Hyp и Thr. В пентамере все полярные аминокислотные остатки обращены в полость канала или к соседним пептидам. К липидным хвостам направлены только боковые радикалы гидрофобных аминокислотных остат-

В случае канала N6 первый локальный минимум на ков. Положение двух остатков Gin было описано выше,

профиле радиуса поры состоит из двух областей, первая Остаток Thr повернут в сторону соседнего пептида так,

образуется гидрофобными остатками Div4, а вторая по- что ОН гру ппа взаимодействует с молекулами воды в

лярными остатками Gln3. Благодаря тому, что в канале канале, а СНЗ с боковыми радикалами аминокислотных

N 5 пептиды повернуты относительно друг друга так, остатков другого пептида. Hyp 10 как и Gin 11 направлен в

чтобы образовывать суперспираль, неполярные остатки пору канала. Ближе всего из полярных остатков к липид-

Div4 обращены в сторону соседнего пептида и не взаи- ным хвостам расположен остаток Нур13.

И Н Николаев. О В Левцова. А К Шайтан. KB Шайтан ДИНАМИКА МОДЕЛЕЙ ЗЕРВАМИЦИНОВОГО КАНАЛА

А

Б

Рис. 5. Положение полярных аминокислотных остатков в каналах N5 (А) и N6 (Ь).

Выделены полярные аминокислотные остатки: Gin, Hyp, Ihr

В канале N 6 нет такого четкого как в N 5 разделения му узкому месту канала - кольцу Gin 11, где ион теряет аминокислотных остатков: полярные остатки направле- часть молекул воды своеП гидратной оболочки, и их мены в пору, а неполярные к липидным хвостам. Hyp 13 его занимают атомы кислорода бокового радикала остат-и ТЬгб взаимодействуют с гидрофобными липидными ка Gin. Изменение энергии взаимодействия иона Na-r с хвостами. Из полярных остатков только Gin 11 направлен молекулами зервамицина 1IB и молекулами воды пока-непосредственно в пору канала и взаимодействует с мо- зано на рис. 6Б. Энергия взаимодействия иона с окру-

лекулами воды внутри поры.

Так как тетрамер не формирует проводящий канал, а радиус поры канала N6 достаточно большой и внутренний «интерьер» его не так сильно влияет на движение иона, был выбран канал N5 для исследования прохождения иона. Исследования проводились с помощью метода управляемой молекулярной динамики. К иону N3+ прикладывалась внешняя сила, равная 4.38 ккал/(моль-А), и под ее действием ион двигался от С-конна к Ы-концу пептидов.

На рис. 6А представлена динамика изменения т. координаты (вдоль оси канала). Как видно, динамика движения не линейна, есть области, где скорость движения иона падает до нуля. Первая область соответствует само-

30--------------------

2Ь

?0

..

f vf V

rV

03

gio-t

t*A rv

V

N1

•4

0

100

200

3(i0 '100 soo

Время. ПС

жением рассчитывалась как сумма Ван-дер-ваадьсовых и кулоновских взаимодействий иона со всеми атомами окружения. Через 250 пс энергия взаимодействия с молекулами воды выросла на - 100 кДж/моль, что свидетельствует о потере молекул воды в гидратной оболочке. Далее на 450 пс траектории ион преодолевает кольцо С1п11 и переходит в более широкую область канала, где восстанавливает гидратную оболочку, о чем свидетельствует уменьшение энергии взаимодействия нона с водой. На 660 пс траектории ион попадает в зону второго глутаминового кольца, где также происходит частичная потеря гидратной оболочки, и в этой области снова наблюдается увеличение энергии взаимодействия с

200 -Т------------

ZrvllB

---вода

#«

о

i

* {

\

| j. I •. * /,

, У

4 '

¿Л

«'

I S

• •

* *

•200

с

с

1400

с; s

с-

£ -600 т С)

800

•V

Ш

М0Щ

7<

600

700

800

• тгхю] о

100

200

А

ЗСО 100 Время пс

500

С 00

(-U

В

Рис. 6. Изменение / коодинаты

молекулами воды. Изменения энергии взаимодействия иона с молекулами ¿г\ ИВ противоположны изменениям энергии взаимодействия с водой, что свидетельствует о том. что атомы 2гу11В замешают утерянные молекулы воды гидратной оболочки. Каждая реорганизации гидрат ной «шубы» является потенциальным барьером для движения иона через пору канала. Поэтому в этих областях наблюдается замедление движения.

Таким образом, согласно полученным данным четыре молекулы зервамицина ИВ не формируют устойчивый проводящий канал, но служат «предшественником» для формирования каналов из большего числа субъединиц. Пентамер и гексамер формируют ионные каналы с минимальным радиусом пор 2.5 А и 3.7 А соответственно. Поры обоих каналов заполнены молекулами воды, однако в пентамере их количество не достаточно для проведения ионов без нарушения целостности гидратной оболочки. В случае гексамера одновалентные ионы могут проходить через пору канала без потери молекул воды в гидратной оболочке. Молекулы зервамицина НВ в пентамере поворачиваются относительно оси канала и формируют суперспираль, которая предположительно дополнительно стабилизирует канал. В гексамере все

молекулы пептидов остаются параллельно оси кана-

10

л а. Вероятно, что в природе каналы из большего числа субъединиц также образуют суперспираль, однако на это требуется значительно большее время. При формировании суперспирали в пентамере все боковые радикалы полярных аминокислотных остатков направлены в полость канала или в сторону соседнего пептида, а неполярные остатки в область липидных хвостов. В случае гексамера такого четкого разделения полярных и неполярных аминокислотных остатков не наблюдается, вероятно, для этого необходим поворот пептидов относительно оси канала с формированием суперспирали.

При прохождении иона через пору канала, образованного пятью субъединицами, происходит реорганизация гидратной оболочки в областях глутаминовых колец. В этих зонах движение иона значительно заменяется. Атомы кислорода боковых радикалов остатков 01п замешают потерянные молекулы воды гидратной оболочки.

Кинетика формирования кластеров из N молекул зервамицина требует особого рассмотрения. Однако здесь можно указать на принципиальную возможность использования простых вероятностных моделей. Критическим пунктом является оценка вероятности формирования кластера из 5 или 6 молекул зервамицина. В случае, если формирование кластера осуществляется случайным об-

разом при встрече молекул пептида, диффу ндирующих в мембране и вероятность присоединения молекулы к кластеру не зависит от его состояния, то вероятность агрегации N молекул дается распределением Пуассона:

SN

Р =

-с

N1

где Б - средняя степень агрегации.

В самом неблагоприятном случае отсутствия выигрыша в энергии при агрегации молекул 5=1 и вероятность формирования кластера из 5 молекул пептида составляет порядка 0,3%. В случае формирования устойчивых ди-меров (5=2) вероятность повышается до 4%. При увеличении сродства и 5=3 вероятность повышается до 30%. В любом случае вероятность формирования кластера будет достаточно большой при поверхностной концентрации пептида (размер клетки принимаем 1 мкм) 109молекул/с м2 (ил и 10'15 м ол ь/с м2).

Л и т е ра тура

1. Николаев И.П., Шайтан К В. Молекулярное моделирование сложных биоструктур, содержащих мембранный компонент // Вестник Якутского государственного университета. - 2008. - Т. 5. - № 2. - С. 32-39.

2. Shaitan K.V., Antonov M.Yu., Tourleiqh Ye.V.. Levtsova О. V., Tereshkina КВ., Nikolaev I.N. and Kirpichnikov MP. Comparative Studv of Molecular Dynamics, Diffusion, and Permeability for Ligands in Biomembranes of Different Lipid Composition. Biochemistry (Moscow) supplement series A: Membrane and Cell Biology, 2008. - Vol. 2 - No. 1. - P. 73-81.

3. Николаев И.Н.. Левцова О.В.. Шайтан К В. Динамика зервамицина IIB в воде и в метаноле // Вестник Якутского государственного v ниверситета. - 2009. - 1. 6. - № 2. - С. 18-24.

4. Николаев И.Н.. Левцова О.В., Шайтан А.К.. Шайтан К.В. Взаимодействие зервамицина IIB с липидными бислоями // Вестник Якутского государственного университета. - 2010. -Г. 7. -№ 1.-С. 52-64.

5. Agarwalla S., Mellor I.R.. Sansom M.S., Karle I.L., Flippen-Anderson .1.1... Uma K.. Krishna K.. Sukumar M.. Balaram P. Zer\ amicins, a structurally characterised peptide model for membrane ion channels. Biochem. Biophys. Res. Commun., 186. 1992, 8-15.

6. Smart O.S., Goodfellow J.M.. Wallace B.A. The pore dimensions of gramicidin A. Biophys. J., 65. 1993. 2455-2460.

7. Smart O.S., Neduvelil J.G., Wang X., Wallace B.A.. Sansom M.S. I lOLE: a program for the analysis of the pore dimensions of ion channel structural models. J. Mol. Graph.. 14. 1996. 354-60. 376.

8. Fox R.O.. Jr.. Richards F.M. A voltage-gated ion channel model inferred from the cry stal structure of alamethicin at 1.5-A resolution. Nature, 300. 1982. 325-330.

/.A. Nikolaev, OA. Levtsova, A.K. Shaitan, A. V. Shaitan

Dynamics of models of the zervamitional channel

1 he authors made modeling and a comparative study of three models of the zervamitional channel in the membrane POFE /' POFG.

I he model channels were constructed according to the BS-model of antimicrobial peptides and were composed of four (N4). five (N5) and six (N6) peptide molecules.

It i> shown that four molecules of PV zervamition do not form a stable conducting channel, but serve ¿is "a condition" for the formation of channels in a larger number of subunits. Pentamer and hexamer form ion channels with a minimum pore radius of 2,5 A and 3.7 A, respectively Key words: molecular modeling, molecular dynamics, amino acid remains, peptide, membranes, lipid bi-layer. ion channel