КОЛОНОЧНЫЕ СПОСОБЫ ОЧИСТКИ ВЕКТОРА НА ОСНОВЕ AAV

1. Способ очистки векторных частиц на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), указанный способ включает стадии:
(a) сбора клеток и/или супернатанта клеточной культуры, содержащего векторные частицы на основе rAAV, для получения урожая клеток;
(b) необязательно концентрирования вышеупомянутого урожая клеток, полученного на стадии (a), для получения концентрированного урожая клеток;
(c) лизиса вышеупомянутого урожая клеток, полученного на стадии (a), или вышеупомянутого концентрированного урожая клеток, полученного на стадии (b), для получения лизата;
(d) обработки лизата, полученного на стадии (c), для уменьшения контаминации нуклеиновыми кислотами в лизате и получения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами;
(e) необязательно фильтрации вышеупомянутого лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), для получения очищенного лизата, и необязательно разбавления вышеупомянутого очищенного лизата для получения разбавленного очищенного лизата;
(f) нанесения вышеупомянутого лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), очищенного лизата, полученного на стадии (e), или разбавленного очищенного лизата, полученного на стадии (e), на колонку для катионообменной хроматографии для получения элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно разбавления вышеупомянутого элюата с колонки для получения разбавленного элюата с колонки;
(g) нанесения вышеупомянутого элюата с колонки или вышеупомянутого разбавленного элюата с колонки, полученного на стадии (f), на колонку для анионообменной хроматографии для получения второго элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования вышеупомянутого второго элюата с колонки для получения концентрированного второго элюата с колонки;
(h) нанесения вышеупомянутого второго элюата с колонки или вышеупомянутого разбавленного второго элюата с колонки, полученного на стадии (g), на колонку для эксклюзионной хроматографии (SEC) для получения третьего элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования вышеупомянутого третьего элюата с колонки для получения концентрированного третьего элюата с колонки; и
(i) фильтрации вышеупомянутого третьего элюата с колонки или вышеупомянутого концентрированного третьего элюата с колонки, полученного на стадии (h), для получения очищенных векторных частиц rAAV.
2. Способ очистки векторных частиц на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), указанный способ включает стадии:
(a) сбора клеток и/или супернатанта клеточной культуры, содержащего векторные частицы на основе rAAV для получения урожая клеток;
(b) необязательно концентрирования вышеупомянутого урожая клеток, полученного на стадии (a), для получения концентрированного урожая клеток;
(c) лизиса вышеупомянутого урожая клеток, полученного на стадии (a), или вышеупомянутого концентрированного урожая клеток, полученного на стадии (b), для получения лизата;
(d) обработки лизата, полученного на стадии (c), для уменьшения контаминации нуклеиновыми кислотами в лизате и получения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами;
(e) необязательно фильтрации вышеупомянутого лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), для получения очищенного лизата, и необязательно разбавления вышеупомянутого очищенного лизата для получения разбавленного очищенного лизата;
(f) нанесения вышеупомянутого лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), очищенного лизата, полученного на стадии (e), или разбавленного очищенного лизата, полученного на стадии (e), на колонку для катионообменной хроматографии для получения элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования вышеупомянутого элюата с колонки для получения концентрированного элюата с колонки;
(g) нанесения вышеупомянутого элюата с колонки или вышеупомянутого концентрированного элюата с колонки, полученного на стадии (f), на колонку для эксклюзионной хроматографии (SEC) для получения второго элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно разбавления вышеупомянутого второго элюата с колонки для получения концентрированного второго элюата с колонки;
(h) нанесения вышеупомянутого второго элюата с колонки или вышеупомянутого разбавленного второго элюата с колонки, полученного на стадии (g), на колонку для анионообменной хроматографии для получения третьего элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно разбавления вышеупомянутого третьего элюата с колонки для получения разбавленного третьего элюата с колонки; и
(i) фильтрации вышеупомянутого третьего элюата с колонки или вышеупомянутого концентрированного третьего элюата с колонки, полученного на стадии (h), для получения очищенных векторных частиц rAAV.
3. Способ очистки векторных частиц на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), указанный способ включает стадии:
(a) сбора клеток и/или супернатанта клеточной культуры, содержащего векторные частицы на основе rAAV для получения урожая клеток;
(b) необязательно концентрирования вышеупомянутого урожая клеток, полученного на стадии (a), для получения концентрированного урожая клеток;
(c) лизиса вышеупомянутого урожая клеток, полученного на стадии (a), или вышеупомянутого концентрированного урожая клеток, полученного на стадии (b), для получения лизата;
(d) обработки лизата, полученного на стадии (c), для уменьшения контаминации нуклеиновыми кислотами в лизате и получения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами;
(e) необязательно фильтрации вышеупомянутого лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), для получения очищенного лизата, и необязательно разбавления вышеупомянутого очищенного лизата для получения разбавленного очищенного лизата;
(f) нанесения вышеупомянутого лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), очищенного лизата, полученного на стадии (e), или разбавленного очищенного лизата, полученного на стадии (e), на колонку для катионообменной хроматографии для получения элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно разбавления вышеупомянутого элюата с колонки для получения разбавленного элюата с колонки;
(g) нанесения вышеупомянутого элюата с колонки или вышеупомянутого разбавленного элюата с колонки, полученного на стадии (f), на колонку для анионообменной хроматографии для получения второго элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования вышеупомянутого второго элюата с колонки для получения концентрированного второго элюата с колонки;
(h) фильтрации вышеупомянутого второго элюата с колонки или вышеупомянутого концентрированного второго элюата с колонки, полученного на стадии (g), для получения очищенных векторных частиц rAAV.
4. Способ очистки векторных частиц на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), указанный способ включает стадии:
(a) сбора клеток и/или супернатанта клеточной культуры, содержащего векторные частицы на основе rAAV для получения урожая клеток;
(b) необязательно концентрирования вышеупомянутого урожая клеток, полученного на стадии (a), для получения концентрированного урожая клеток;
(c) лизиса вышеупомянутого урожая клеток, полученного на стадии (a), или вышеупомянутого концентрированного урожая клеток, полученного на стадии (b), для получения лизата;
(d) обработки лизата, полученного на стадии (c), для уменьшения контаминации нуклеиновыми кислотами в лизате и получения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами;
(e) и необязательно разбавления вышеупомянутого очищенного лизата для получения разбавленного очищенного лизата, и необязательно разбавления вышеупомянутого очищенного лизата для получения разбавленного очищенного лизата;
(f) нанесения вышеупомянутого лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), или очищенного лизата или разбавленного очищенного лизата, полученного на стадии (e), на колонку для AAV аффинной хроматографии для получения элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно разбавления вышеупомянутого элюата с колонки для получения разбавленного элюата с колонки;
(g) нанесения вышеупомянутого элюата с колонки или вышеупомянутого разбавленного элюата с колонки, полученного на стадии (f), на колонку для анионообменной хроматографии для получения второго элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования вышеупомянутого второго элюата с колонки для получения концентрированного второго элюата с колонки;
(h) необязательно нанесения вышеупомянутого второго элюата с колонки или вышеупомянутого концентрированного второго элюата с колонки, полученного на стадии (g), на колонку для эксклюзионной хроматографии (SEC) для получения третьего элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования вышеупомянутого третьего элюата с колонки для получения концентрированного третьего элюата с колонки; и
(i) фильтрации вышеупомянутого второго элюата с колонки или вышеупомянутого разбавленного второго элюата с колонки, полученного на стадии (g), или фильтрации вышеупомянутого третьего элюата с колонки или вышеупомянутого концентрированного третьего элюата с колонки, полученного на стадии (h), для получения очищенных векторных частиц rAAV.
5. Способ очистки векторных частиц на основе рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV), указанный способ включает стадии:
(a) сбора клеток и/или супернатанта клеточной культуры, содержащего векторные частицы на основе rAAV для получения урожая клеток;
(b) необязательно концентрирования вышеупомянутого урожая клеток, полученного на стадии (a), для получения концентрированного урожая клеток;
(c) лизиса вышеупомянутого урожая клеток, полученного на стадии (a), или вышеупомянутого концентрированного урожая клеток, полученного на стадии (b), для получения лизата;
(d) обработки лизата, полученного на стадии (c), для уменьшения контаминации нуклеиновыми кислотами в лизате и получения лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами;
(e) и необязательно разбавления вышеупомянутого очищенного лизата для получения разбавленного очищенного лизата, и необязательно разбавления вышеупомянутого очищенного лизата для получения разбавленного очищенного лизата;
(f) нанесения вышеупомянутого лизата, обедненного нуклеиновыми кислотами, полученного на стадии (d), или очищенного лизата или разбавленного очищенного лизата, полученного на стадии (e), на колонку для AAV аффинной хроматографии для получения элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно концентрирования вышеупомянутого элюата с колонки для получения концентрированного элюата с колонки;
(g) нанесения вышеупомянутого элюата с колонки или вышеупомянутого концентрированного элюата с колонки, полученного на стадии (f), на колонку для эксклюзионной хроматографии (SEC) для получения второго элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно разбавления вышеупомянутого второго элюата с колонки для получения разбавленного второго элюата с колонки;
(h) необязательно нанесения вышеупомянутого второго элюата с колонки или вышеупомянутого разбавленного второго элюата с колонки, полученного на стадии (g), на колонку для анионообменной хроматографии для получения третьего элюата с колонки, содержащего векторные частицы rAAV, то есть для отделения векторных частиц rAAV от белковых примесей или других примесей, связанных с процессом производства, и необязательно разбавления вышеупомянутого третьего элюата с колонки для получения разбавленного третьего элюата с колонки; и
(i) фильтрации вышеупомянутого второго элюата с колонки или вышеупомянутого разбавленного второго элюата с колонки, полученного на стадии (g), или фильтрации вышеупомянутого третьего элюата с колонки или вышеупомянутого концентрированного третьего элюата с колонки, полученного на стадии (h), для получения очищенных векторных частиц rAAV.
6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором вышеупомянутое концентрирование на стадии (b) и/или на стадии (f) и/или на стадии (g) и/или на стадии (h) осуществляется посредством ультрафильтрации/диафильтрации, необязательно путем тангенциальной поточной фильтрации (TFF).
7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором вышеупомянутое концентрирование на стадии (b) приводит к уменьшению объема вышеупомянутых собранных клеток и супернатанта клеточной культуры примерно в 2-20 раз.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором вышеупомянутое концентрирование на стадии (f) и/или на стадии (g) и/или на стадии (h) приводит к уменьшению объема вышеупомянутого элюата с колонки примерно в 5-20 раз.
9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором вышеупомянутый лизис вышеупомянутого урожая клеток, полученного на стадии (a), или вышеупомянутого концентрированного урожая клеток, полученного на стадии (b), осуществляется физическим или химическим способом.
10. Способ по пункту 9, в котором физические способы включают микрофлюидизацию и гомогенизацию.
11. Способ по п. 9, в котором химические способы включают детергент, необязательно неионный детергент, такой как Тритон X-100, необязательно в концентрации в диапазоне примерно от 0,1 до 1,0%, включительно.
12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором стадия (d) включает обработку нуклеазой, что приводит к уменьшению контаминации нуклеиновыми кислотами.
13. Способ по п. 12, в котором нуклеаза включает бензоназу.
14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором вышеупомянутая фильтрация вышеупомянутого очищенного лизата или вышеупомянутого разбавленного очищенного лизата, полученного на стадии (e), осуществляется с помощью фильтра, имеющего диаметр пор в диапазоне примерно от 0,1 до 10 микрон, включительно.
15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором вышеупомянутое разбавление вышеупомянутого очищенного лизата, полученного на стадии (e), осуществляется водным фосфатным, ацетатным или Tris буферным раствором.
16. Способ по любому из пп. 1-15, в котором вышеупомянутое разбавление вышеупомянутого элюата с колонки, полученного на стадии (f), или вышеупомянутого второго элюата с колонки, полученного на стадии (g), осуществляется водным фосфатным, ацетатным или Tris буферным раствором.
17. Способ по п. 15 или 16, в котором вышеупомянутый водный фосфатный или ацетатный буферный раствор имеет pH в диапазоне примерно от 4,0 до 7,4, включительно.
18. Способ по п. 15 или 16, в котором вышеупомянутый водный Tris буферный раствор имеет pH выше 7,5, необязательно примерно от 8,0 до 9,0, включительно.
19. Способ по любому из пп. 1-18, в котором вышеупомянутые векторные частицы rAAV, полученные на стадии (i), составлены с сурфактантом для получения композиции вектора на основе AAV.
20. Способ по любому из пп. 1-19, в котором вышеупомянутая анионообменная колоночная хроматография на стадии (f), (g) и/или (h) включает колоночную хроматографию с полиэтиленгликолем (ПЭГ).
21. Способ по п. 20, в котором вышеупомянутая анионообменная колоночная хроматография на стадии (g) и/или (h) включает промывку вышеупомянутой колонки раствором ПЭГ перед элюцией вышеупомянутых векторных частиц rAAV с колонки.
22. Способ по п. 20 или 21, в котором ПЭГ имеет среднюю молекулярную массу в диапазоне примерно от 1000 до 80000 г/моль, включительно.
23. Способ по любому из пп. 20-22, в котором ПЭГ имеет концентрацию от примерно 4% до примерно 10%, включительно.
24. Способ по любому из пп. 1-23, в котором вышеупомянутая анионообменная колоночная хроматография на стадии (g) и/или (h) включает промывку вышеупомянутой колонки водным раствором сурфактанта перед элюцией вышеупомянутых векторных частиц rAAV с колонки.
25. Способ по любому из пп. 1-24, в котором вышеупомянутая катионообменная колоночная хроматография на стадии (f) включает промывку вышеупомянутой колонки водным раствором сурфактанта перед элюцией вышеупомянутых векторных частиц rAAV с колонки.
26. Способ по любому из пп. 21-25, в котором вышеупомянутый раствор ПЭГ и/или вышеупомянутый раствор сурфактанта включает водный Tris-Cl/NaCl буфер, водный фосфат/NaCl буфер или водный ацетат/NaCl буфер.
27. Способ по п. 26, в котором вышеупомянутый NaCl буфер содержит примерно 20-300 мМ NaCl, включительно, или примерно 50-250 мМ NaCl, включительно.
28. Способ по любому из пп. 24-26, в котором вышеупомянутый сурфактант включает катионный или анионный сурфактант.
29. Способ по любому из пп. 24-28, в котором вышеупомянутый сурфактант включает сурфактант с двенадцатью углеродами в цепи.
30. Способ по любому из пп. 24-29, в котором вышеупомянутый сурфактант включает хлорид додецилтриметиламмония (DTAC) или саркозил.
31. Способ по любому из пп. 1-30, в котором вышеупомянутые векторные частицы rAAV элюируют с вышеупомянутой анионообменной колонки на стадии (f), (g) и/или (h) водным Tris-Cl/NaCl буфером.
32. Способ по п. 31, в котором вышеупомянутый Tris-Cl/NaCl буфер содержит 100-400 мМ NaCl, включительно, и необязательно имеет pH в диапазоне от примерно 7,5 до примерно 9,0, включительно.
33. Способ по любому из пп. 1-32, в котором вышеупомянутую анионообменную колонку на стадии (f), (g) и/или (h) промывают водным Tris-Cl/NaCl буфером.
34. Способ по п. 33, в котором вышеупомянутый NaCl в вышеупомянутом водном Tris-Cl/NaCl буфере имеет концентрацию в диапазоне примерно 75-125 мМ, включительно.
35. Способ по любому из пп. 31-33, в котором вышеупомянутый водный Tris-Cl/NaCl буфер имеет pH от примерно 7,5 до примерно 9,0, включительно.
36. Способ по любому из пп. 1-35, в котором вышеупомянутую анионообменную колонку на стадии (f), (g) и/или (h) промывают один или несколько раз для уменьшения количества пустых капсидов AAV во втором или третьем элюате с колонки.
37. Способ по п. 33 или 36, в котором промывка вышеупомянутой анионообменной колонки приводит к удалению пустых капсидов AAV с колонки перед удалением rAAV и/или вместо rAAV, что приводит к уменьшению количества пустых капсидов AAV во втором или третьем элюате с колонки.
38. Способ по п. 33 или 36, в котором промывка вышеупомянутой анионообменной колонки приводит к удалению, по меньшей мере, примерно 50% от общего количества пустых капсидов AAV с колонки перед удалением rAAV и/или вместо rAAV, что приводит к уменьшению количества пустых капсидов AAV во втором или третьем элюате с колонки примерно на 50%.
39. Способ по любому из пп. 33 или 36-38, в котором вышеупомянутый NaCl в вышеупомянутом водном Tris-Cl/NaCl буфере имеет концентрацию в диапазоне примерно 110-120 мМ, включительно.
40. Способ по любому из пп. 33-39, в котором соотношение и/или количество вышеупомянутых элюируемых векторных частиц rAAV и пустых капсидов AAV контролируется вышеупомянутым промывочным буфером.
41. Способ по любому из пп. 1-40, в котором вышеупомянутые векторные частицы rAAV элюируют с вышеупомянутой катионообменной колонки на стадии (f) в водном фосфат/NaCl буфере или в водном ацетат/NaCl буфере.
42. Способ по п. 41, в котором вышеупомянутый фосфат/NaCl буфер или водный ацетат/NaCl буфер содержит примерно 125-500 мМ NaCl, включительно.
43. Способ по п. 41, в котором вышеупомянутый фосфат/NaCl буфер или водный ацетат/NaCl буфер имеет pH в диапазоне от примерно 5,5 до примерно 7,5, включительно.
44. Способ по любому из пп. 1-43, в котором вышеупомянутая анионообменная колонка на стадии (f), (g) и/или (h) содержит функциональную группу четвертичного аммония, такую как кватернизованный полиэтиленимин.
45. Способ по любому из пп. 1-44, в котором диапазон разделения/фракционирования (молекулярная масса) вышеупомянутой колонки для эксклюзионной (SEC) хроматографии на стадии (g) и/или (h) составляет от примерно 10000 до примерно 600000, включительно.
46. Способ по любому из пп. 1-45, в котором вышеупомянутая катионообменная колонка на стадии (f) содержит функциональную группу сульфоновой кислоты, такую как сульфопропиловая группа.
47. Способ по любому из пп. 3-46, в котором колонка для AAV аффинной хроматографии содержит белок или лиганд, который связывается с капсидным белком AAV.
48. Способ по п. 47, в котором белок включают антитело, которое связывается с капсидным белком AAV.
49. Способ по п. 48, в котором антитело, которое связывается с капсидным белком AAV, включает одноцепочечное антитело Llama (Camelid).
50. Способ по любому из пп. 1-49, в котором способ исключает стадию ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия.
51. Способ по любому из пп. 1-50, в котором вышеупомянутые векторные частицы rAAV содержат трансген, который кодирует нуклеиновую кислоту, выбранную из группы, состоящей из миРНК, антисмысловой молекулы, микроРНК, рибозима и малых РНК, образующих шпильки shRNA.
52. Способ по любому из пп. 1-50, в котором вышеупомянутые векторные частицы rAAV содержат трансген, который кодирует продукт гена, выбранный из группы, состоящей из инсулина, глюкагона, гормона роста (СТГ), паратиреоидного гормона (ПТГ), рилизинг-фактора гормона роста (СРФ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ), хорионического гонадотропина человека (ХГЧ), фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), ангиопоэтинов, ангиостатина, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (GCSF), эритропоэтина (EPO), фактора роста соединительной ткани (CTGF), основного фактора роста фибробластов (bFGF), кислого фактора роста фибробластов (aFGF), эпидермального фактора роста (EGF), трансформирующего фактора роста α (TGFα), тромбоцитарного фактора роста (PDGF), инсулиноподобных факторов роста I и II (IGF-I и IGF-II), TGFβ, активинов, ингибинов, костного морфогенетического белка (BMP), фактора роста нервов (NGF), нейротрофического фактора головного мозга (BDNF), нейротрофинов NT-3 и NT4/5, цилиарного нейротрофического фактора (CNTF), нейротрофического фактора глиальной клеточной линии (GDNF), нейротурина, агрина, нетрина-1 и нетрина-2, фактора роста гепатоцитов (HGF), эфринов, ноггина, sonic hedgehog и тирозингидроксилазы.
53. Способ по любому из пп. 1-50, в котором вышеупомянутые векторные частицы rAAV содержат трансген, который кодирует продукт гена, выбранный из группы, состоящей из тромбопоэтина (TPO), интерлейкинов (от IL1 до IL-17), моноцитарного хемоаттрактантного белка, фактора, ингибирующего лейкемию, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, Fas лиганда, факторов некроза опухоли α и β, интерферонов α, β и γ, фактора стволовых клеток, лиганда flk-2/flt3, IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, химерных иммуноглобулинов, гуманизированных антител, одноцепочечных антител, Т-клеточных рецепторов, химерных Т-клеточных рецепторов, одноцепочечных Т-клеточных рецепторов, молекул MHC I класса и II класса.
54. Способ по любому из пп. 1-50, в котором вышеупомянутые векторные частицы rAAV содержат трансген, кодирующий белок, необходимый для коррекции врожденных нарушений метаболизма, выбранный из группы, состоящей из карбамоилсинтетазы I, орнитинтранскарбамилазы, аргининосукцинат-синтетазы, аргининосукцинат-лиазы, аргиназы, фумарилацетоацетат-гидролазы, фенилаланин-гидроксилазы, альфа-1 антитрипсина, глюкозо-6-фосфатазы, порфобилиногендезаминазы, фактора V, фактора VIII, фактора IX, цистатион бета-синтазы, декарбоксилазы кетокислот с разветвленной цепью, альбумина, изовалерил-СоА-дегидрогеназы, пропионил-КоА-карбоксилазы, метилмалонил-КоА-мутазы, глутарил-КоА-дегидрогеназы, инсулина, бета-глюкозидазы, пируваткарбоксилазы, печеночной фосфорилазы, киназы фосфорилазы, глициндекарбоксилазы, RPE65, H-белка, T-белка, последовательности трансмембранного регулятора муковисцидоза (CFTR) и последовательности кДНК дистрофина.
55. Способ по любому из пп. 1-54, в котором вышеупомянутые векторные частицы rAAV содержат трансген, который кодирует фактор VIII или фактор IX.
56. Способ по любому из пп. 1-55, в котором этим способом получают приблизительно 50-90% от общего количества векторных частиц rAAV из урожая, полученного на стадии (a), или концентрированного урожая клеток, полученного на стадии (b).
57. Способ по любому из пп. 1-56, в котором этим способом получают векторные частицы rAAV более высокой степени чистоты, чем векторные частицы rAAV, получаемые или очищаемые однократной очисткой на аффинной AAV колонке.
58. Способ по любому из пп. 1-57, в котором стадии (c) и (d) осуществляются по существу одновременно.
59. Способ по любому из пп. 1-58, в котором концентрация NaCl регулируется таким образом, чтобы она находилась в диапазоне примерно 100-400 мМ NaCl, включительно, или в диапазоне примерно 140-300 мМ NaCl, включительно, после стадии (c) но перед стадией (f).
60. Способ по любому из пп. 1-59, в котором вышеупомянутые векторные частицы rAAV созданы на основе AAV, выбранного из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10 и Rh74.
61. Способ по любому из пп. 1-60, в котором вышеупомянутые векторные частицы rAAV содержат капсидную последовательность, на 70% или больше идентичную капсидной последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10, Rh74.
62. Способ по любому из пп. 1-61, в котором вышеупомянутые векторные частицы rAAV содержат последовательность ITR, на 70% или больше идентичную последовательности ITR AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, Rh10 или Rh74.
63. Способ по любому из пп. 1-62, в котором вышеупомянутые клетки представляют собой суспензию или прикрепленные клетки.
64. Способ по любому из пп. 1-63, в котором вышеупомянутыми клетками являются клетки млекопитающих.
65. Способ по любому из пп. 1-64, в котором вышеупомянутые клетки представляют собой клетки HEK-293.
66. Способ по любому из пп. 1-65, в котором способ реализуется в соответствии с любым из вариантов колонок, условий, концентраций, молярности, объема, емкости, скорости потока, давления, материала, температуры, pH или стадии, приведенных в любом из примеров 1-3.
67. Способ по любому из пп. 1-66, в котором лизис клеток и/или подготовка перед очисткой на колонке осуществляется в соответствии с любым из вариантов условий, концентраций, молярности, объема, емкости, скорости потока, давления, материала, температуры, pH или стадии, приведенных в примере 4.