Динамика популяции тучных клеток в течении раневого процесса у крыс, подвергнутых гипобиотическим состояниям (голодание, гипотермия)

ДИНАМИКА ПОПУЛЯЦИИ ТУЧНЫХ КЛЕТОК В ТЕЧЕНИИ РАНЕВОГО ПРОЦЕССА У КРЫС, ПОДВЕРГНУТЫХ ГИПОБИОТИЧЕ-СКИМ СОСТОЯНИЯМ (ГОЛОДАНИЕ, ГИПОТЕРМИЯ).

БОБР О.А.. МЯДЕЛЕЦ О.Д.. ДУБОВСКИЙ В.В.

УО «Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет», кафедра гистологии, цитологии и эмбриологии

Резюме. Ранее было показано. что пролонгированная глубокая гипотермия является тем фактором. который стимулирует безрубцовое заживление ран. или органотипическую регенерацию. Гипотермию можно отнести к гипобиотическим факторам. К этой же группе факторов можно отнести и голодание. Поэтому представлялось интересным изучить как совместное. так и одиночное влияние этого фактора на процесс заживления раны.

В данной работе была поставлена задача изучить динамику популяции тучных клеток в процессе заживления раны у крыс. подвергнутых совместному и одиночному воздействию гипобиотических факторов (гипотермия. голодание).

Было выявлено повышение числа тучных клеток в группах. подвергнутых гипотермии. на 10-е сутки после нанесения раны. У этих же животных результатом заживления был регенерат кожного типа.

Ключевые слова: гипотемия. голодание. органотипическое заживление. тучные клетки.

Abstract. The work describes the influence of hypobiotic factors such as hypothermia and fasting on the wound healing. It was shown earlier that the influence of elongated hypothermia causes scarless wound healing (organotypic healing) in rats. It was interesting to investigate influence of the hypobiotic factor and the combination of hypobiotic factors on the wound healing. In this article the particular emphasis was made on the mast cells. Mast cells are very important in homeostasis maintaining in the connective tissue. The aim of the work is to investigate the dynamics of mast cell population in the skin dermis during the wound healing in rats subjected to hypobiotic conditions (hypothermia. fasting).

It was revealed that the groups subjected to hypothermia had the increasing of mast cells count on 10th day of healing. The result of the regeneration process in these rats was the scarless healing.

Key words: hypothermia. fasting. scarless healing. mast cells.

Адрес для корреспонденции: Республика Беларусь. 210023 г. Витебск. пр. Победы 5 корп.2 к 14. р.тел 24-96-19. e-mail: bo-brol@mail333.com - Бобру О.А.

Органотипическая регенерация - это такой вид регенерации. когда дефект органа замещается регенератом. соответствующим строению органа. Для кожи млекопитающих характерна тканетипическая регенерация. в результате которой в коже образуется рубцовая ткань. Ранее было показано. что пролонгированная глубокая гипотермия является тем фактором. который стимулирует безрубцовое заживление ран или органотипическую регенерацию. Гипотермию можно отнести к гипобиоти-ческим факторам. т.е. к факторам. которые ограничивают организм в важных компонентах необходимых для жизнедеятельности. в частности тепле. К этой же группе факторов можно отнести и голодание. Поэтому представлялось интересным изучить как совместное. так и одиночное влияние этих факторов на процесс заживления раны. Кроме того. выход из голодания активизирует многие метаболические процессы. в том числе и заживление ран.

Тучные клетки. или тканевые базофилы. представляют третий по численности дифферон рыхлой волокнистой неоформленной соединительной ткани. Наряду с функциями поддержания гомеостаза соединительной ткани и образования ряда компонентов межклеточного вещества. тучные клетки играют важную роль в процессах воспаления и регенерации. Последнее обстоятельство особенно интересно в ракурсе данной работы. Характерная морфологическая особенность тучных клеток

- наличие большого количества метахроматических гранул. Это позволяет достаточно легко определять их и оценивать популяцию при окраске базофильными красителями тиазинового ряда. В данной работе смоделированы гипобиотические состояния (глубокая пролонгированная гипотермия и голодание (6-дневное). как по отдельности. так и совместно. В работе была поставлена задача изучить динамику популяции тучных клеток в процессе заживления раны у крыс. подвергнутых совместному и одиночному воздействию гипобиотических факторов (гипотермия. голодание).

Материалы и методы исследования

Работа была выполнена на материале от 120 белых беспородных крыс самок.

Животные были разбиты на 4 группы. Животные первой группы подвергались воздействию глубокой гипотермии. второй группы - 6-дневному полному голоданию. а четвёртой группы - совместному воздействию этих факторов. Животные третьей группы использовались в качестве контроля.

Для проведения голодания крыс рассаживали по одной в клетке. Из клеток убиралось всё. что в последствии могло стать источником пищи. Потребность в жидкости не ограничивалась. Голодание продолжалось в течение шести дней. В течение этого времени клетки крыс тщательно вымывали для удаления экскрементов и исключения возможности поедания их крысами. что может привести к усилению интоксикации. По прошествии шести дней проводили эксперимент по глубокой пролонгированной гипотермии. Сразу после эксперимента крыс начинали отпаивать сладкой водой. На следующий день животных. всё ещё находящихся в клетках по одной. начинали кормить в половину обычного рациона. На второй день после эксперимента крысам давали полный рацион и пересаживали в общую клетку. Необходимость нахождения крыс в клетках по одной объясняется их возрастающей во время голодания агрессив-

ностью и возможностью взаимонанесения травм и увечий вплоть до смертельного исхода.

Для осуществления гипотермии животных наркотизировали в эксикаторе с помощью диэтилового эфира. Далее их охлаждали до ректальной температуры 18 С. после этого продляли состояние гипотермии в течении 6 часов согласно методике [1.2]. Рану наносили в межлопаточной области с помощью пробойника диаметром 10 мм. после достижения ректальной температуры 18-20 С. В группах. где гипотермия не проводилась. раны наносились под эфирным наркозом.

Животных декапитировали под эфирным наркозом через 3. 10 и 20 суток после нанесения раны. Материалом для гистологического исследования служил участок ткани регенерата и окружающей его кожи из межлопаточной области. Образцы фиксировали в фиксаторе ФСУ (формалин. этиловый спирт. уксусная кислота) по Лилли. Парафиновые срезы окрашивали азур-11-эозином. Подсчёт количества тучных клеток осуществляли с помощью сетки Автандилова раздельно в тканях регенерата и в окружающей его коже. При этом в окружающей регенерат коже содержание тучных клеток оценивали в дерме и гиподерме. а в регенерате - в поверхностных и глубоких слоях. Полученные показатели вносили в базу данных и обрабатывали статистически с использованием критерия Вилкосона-Манна-Уитни (критерий и).[4]

Результаты

На 20-е сутки после нанесения раны исход регенерации в различных экспериментальных группах был разным. В группах. подвергнутых гипотермиче-скому воздействию (1 и 4). на месте раны формировался органотипический регенерат с присущими ему волосами и сальными железами. В группе голодания (2) и контрольной группе (3) формировалась рубцовая ткань. в которой отсутствовали придатки кожи.

У подвергнутых охлаждению животных (группа 1. 4) к концу наблюдения в области раны полностью восстанавливался волосяной покров и при визуальном наблюдении отсутствовал рубец. тогда как у контрольных крыс и крыс. повергнутых только голоданию. в области регенерата волосы практически отсутствовали и выявлялся отчётливый рубец. При гистологическом исследовании установлено. что у крыс. перенесших гипотермию. эпидермис регенерата на 10е сутки утолщался и давал интенсивный погружной рост вглубь регенерата с образованием зачатков волос и желез. из которых позже формировались дефинитивные волосы и железы. (Рис. 1.2.3). Дерма регенерата приобретала нормальное строение. в ней наблюдалось характерное подразделение на сосочковый и сетчатый слои и мелкие сосуды (Рис. 4). В то же время у контрольных крыс и крыс. повергнутых только голоданию. дерма регенерата имела строение рубцовой ткани. а погружной рост эпидермиса отсутствовал (Рис. 5).

Рис. 1. Формирование придатков кожи. Прорастание формирующегося зачатка волоса в дерму у крыс 1-й (гипотермия) группы на 10-е сутки. Азур II-эозин. Ув. х400. 1 - формирующийся зачаток волоса

Рис. 2. Тучные клетки у формирующихся волосяных фолликулов и сальных желез у крыс 4-й (гипотермия+голодание) группы на 10-е сутки. Азур-11-

эозин. Ув. х400. 1- тучные клетки

Рис. 3. Тучные клетки у недавно сформированных волосяных фолликулов у крыс 4-й (гипотермия+голодание) группы на 20-е сутки. АзурП-эозин. Ув.

х400. 1- тучные клетки

Рис. 4. Инфильтрация сосудов дермы тучными клетками у крыс 4-й (гипотермия+голодание) группы 10-е сутки. АзурП-эозин. Ув. х400. 1- тучные клетки.

Рис 5. Рубцовая ткань в дерме кожи у крыс 3 группы на 20-е сутки наблюдения. АзурП-эозин. Ув. х400.

Следует отметить особенности расположения тучных клеток, характерные для всех экспериментальных групп. Тучные клетки в граничащей с раной коже преимущественно локализовались в гиподерме. В регенерате эти клетки находились в его глубоких слоях. Наблюдалось нарастание количества этих клеток от сосочкового слоя к сетчатому и гиподерме. При этом одновременно нарастали размеры клеток и интенсивность их окрашивания. Скопления тучных клеток были обнаружены вокруг сосудов как в граничащей с раной коже, так и в регенерате.

У крыс первой (гипотермия) и четвёртой (голодание+гипотермия) групп отмечались следующие особенности расположения клеток (Таблица 1) На 10-е сутки обнаруживались скопления тучных клеток, окружающих пласты эпителиальных клеток, из которых впоследствии формировались придатки кожи (волосы, железы).

Таблица 1

Содержание тучных клеток в регенерате и коже, окружающей рану, в разные сроки постгипобиотического периода в экспериментальных группах.

Сутки после ранения 1 группа 4 группа 3 группа 2 группа

интакт регенерат интакт регенерат интакт регенерат интакт реге- нерат

3 329,4±94,8 289,8±138,3 354±170 238±148,3 161±48 102±67,8 218±58,7 141±35,8

10 209,2±48,7 208,4±98,8 325±158 501±180,3 316±129,6 164±90,1 259±61,5 157±19,5

20 315,4±170,6 203,1±101 280±54,3 198±48,6 211±55,6 125±41,2 241±35 96±30,6

Примечание: интакт - кожа, окружающая рану; регенерат - ткани регенерата.

В граничащей с раной коже крыс 1-й и 4-й групп на 20-е сутки отмечались скопления тканевых базофилов в области волосяного сосочка. В ряде препаратов отмечалось увеличение числа тучных клеток у края пролиферирующего эпителиального пласта, а также рядом с новообразованными сальными железами. Наибольшее количество тучных клеток в околораневой области наблюдалось на 10-е сутки после нанесения раны. Отмечалась чёткая зависимость количества тучных клеток в околораневой области от расстояния от раны: чем дальше от раны, тем количество их становилось меньше. Интересен факт, что в группе крыс, подвергнутых предварительному голоданию и гипотермии, количество тучных клеток на 10 день было выше, чем у крыс, подвергнутых только гипотермии. Это может служить свидетельством более интенсивно протекающих регенераторных процессов в организме животных, подвергнутых голоданию.

Во второй группе (голодание) наблюдались следующие особенности расположения тучных клеток. Клетки были расположены диффузно, без образования скоплений. В формирующейся рубцовой ткани тучные клетки обнаруживались редко. Общее количество клеток было меньшим по сравнению с другими группами, подвергнутым гипотермии.

Таблица 2

Достоверность данных о содержании тучных клеток в тканях регенерата и кожи, окружающей рану, в группах экспериментальных животных

4/1 4/2 4/3 1/2 1/3 2/3

Интакт. 3 сутки (С) Не достоверны Не достоверны Не достоверны ри<0.01 ри<0.01 Не достоверны

Интакт. 3 сутки (Г) Не достоверны ри<0.01 ри<0.01 Не достоверны ри<0.01 ри<0.05

Интакт 10 сутки (С) Не достоверны Не достоверны Не достоверны Не достоверны ри<0.05 Не достоверны

Интакт 10 сутки (Г) ри<0.01 Не достоверны Не достоверны ри<0.01 Не достоверны Не достоверны

Интакт 20 сутки (С) Не достоверны Не достоверны Не достоверны Не достоверны Не достоверны Не достоверны

Интакт 20 сутки (Г) Не достоверны Не достоверны Не достоверны Не достоверны Не достоверны Не достоверны

Регенерат 3 сутки (С) Не достоверны Не достоверны Не достоверны Не достоверны ри<0.05 Не достоверны

Регенерат 3 сутки (Г) Не достоверны ри<0.05 ри<0.05 Не достоверны Не достоверны Не достоверны

Регенерат 10 сутки (С) ри<0.05 ри<0.05 ри<0.01 Не достоверны ри<0.01 Не достоверны

Регенерат 10 сутки (Г) Не достоверны ри<0.05 Не достоверны Не достоверны Не достоверны Не достоверны

Регенерат 20 сутки (С) Не достоверны ри<0.01 Не достоверны ри<0.01 Не достоверны Не достоверны

Регенерат 20 сутки (Г) Не достоверны ри<0.05 Не достоверны ри<0.05 Не достоверны Не достоверны

Примечание: В столбцах показаны сравниваемые группы животных. в строках - сутки и область изучения (интакт - кожа. окружающая рану; регенерат - ткани регенерата). (С) - сетчатый слой дермы; (Г) - гиподерма.

В третьей группе (контроль) закономерности расположения клеток были схожи с таковыми у крыс второй группы.

При сравнении содержания тучных клеток в области раны и в области ин-тактной кожи были получены следующие результаты (Таблица 2).

В группе крыс, подвергнутых только гипотермическому воздействию (1 группа), количество тучных клеток в регенерате и в интактной коже достоверно не различалось. Исключением являлось достоверное снижение тучных клеток в сетчатом слое регенерата на 20-е сутки после нанесения раны. Схожие результаты наблюдались и в третьей (контрольной) группе. У животных этой группы наблюдалось снижение количества тучных клеток в области регенерата на 10-е сутки. В остальные сроки во всех слоях дермы кожи содержание тучных клеток в интактной коже и регенерате достоверно не различалось.

В четвёртой группе (гипотермия+голодание) и на третьи, и на десятые сутки количество тучных клеток в регенерате, как в сетчатом слое, так и в гиподерме было достоверно меньшим, чем в интактной коже. Схожая картина наблюдалась и во второй (голодание) группе, где различия между интактной кожей и раной были достоверными на 3-и, 10-е и 20-е сутки. Количество тучных клеток в этой группе в области раны было меньшим, чем в интактной коже.

При сравнении содержания тучных клеток в различных группах были получены следующие результаты.

В четвёртой группе (гипотермия+голодание) по сравнению со 2 и 3 группами как в интактной коже, так и в регенерате наблюдалось увеличение содержания тучных клеток в гиподерме на 3-е сутки заживления. На 10-е сутки после нанесения раны в этой же группе содержание тучных клеток в сетчатом слое регенерата было выше по сравнению со всеми группами. По сравнению со второй группой это справедливо и по отношению к гиподерме. Такое же увеличение, но только в интактной коже, выявлено и при сравнении показателей 1 (гипотермия) группы с показателями 2 (голодание) и 3 (контроль) групп. В первой группе по сравнению со 2 и 3 группами содержание тучных клеток было выше в сетчатом слое интактной кожи на 3-и сутки, а в регенерате такое различие выявлялось только при сравнении с 3 группой. Количество тучных клеток в третьей группе было выше по отношению к четвёртой только на 10-е сутки в сетчатом слое интактной кожи.

Обсуждение полученных данных.

Тучные клетки играют важную роль в регуляции регенераторных процессов [3]. Количество и функциональная активность (дегрануляция) тучных клеток может служить маркером интенсивности этих процессов. Особенно важную роль тучные клетки играют в процессах трансформации дифференцированных клеток в менее дифференцированные, но способные к делению клетки.

Данное обстоятельство может служить объяснением увеличения содержания тучных клеток в сетчатом слое дермы регенерирующей области на 10-е сутки после нанесения раны. Как известно, на десятые сутки приходится пик активации фиб-робластов для синтеза в последующем компонентов межклеточного вещества [6,7]. Представляется возможным предположение, что регулирующее влияние тучных клеток не позволяет формироваться рубцовой ткани, а также ведёт к формирова-

нию дериватов кожи. Кроме того, протеолитические ферменты гранул тучных клеток (хемотрипсин и др.) оказывают лизирующие воздействие на фибрин и коллаген в течение всего процесса заживления [9], поэтому активация тучных клеток на 10-е сутки может являться фактором, препятствующим формированию рубцовой ткани. Перестройка коллагена является функцией фибробластов, которые наряду с образованием волокон выделяют фермент коллагеназу, разрушающий волокна. Возможно, что тучные клетки изменяют баланс этих процессов в пользу лизиса волокон, позволяя, таким образом, синтезировать мене плотную соединительную ткань.

Известно, что серотонин и гистамин (главные компоненты гранул тучных клеток) могут стимулировать пролиферацию клеток эпидермиса [8]. Тучные клетки играют большую роль в процессах роста и дифференцировки волос. Особенно большое их количество обнаруживается в меняющихся волосах [5]. Данные факты позволяют предположить важную роль тучных клеток в активации процессов погружного роста и формирования дериватов кожи.

Г олодание, как другой гипобиотический фактор, напротив, приводило к снижению числа тучных клеток. Хотя процесс заживления раны после голодания проходил быстрее, исходом регенерации было формирование рубцовой ткани.

Таким образом, полученные данные могут служить подтверждением важной роли тучных клеток в процессе органотипичиского заживления раны.

Литература

1. Бобр, О.А., Модель гипобиотического состояния организма, вызванного совместным действием голода и глубокой пролонгированной гипотермии / О. А. Бобр, А.В. Шахов, О.В. Морозова // Материалы конференции, посв. 40-летию ЦНИЛ ВГМУ. - Витебск, 2003. - С.241.

2. Борисов, В. А. Методика исскуственной гипотермии на мелких лабораторных животных / В. А. Борисов, О. Д. Мяделец, В.Н. Бринкевич // Криобиология. - 1989. - №4. - С. 49-50.

3. Быков, В. Л. Развитие и гетерогенность тучных клеток / В. Л. Быков // Морфология. - 2000. - Т.117, № 2 - С.86-92.

4. Гублер, Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов / Е.В Гублер. - М.: Медицина, 1978. - 296 с.

5. Загорученко, Е.А. Исследования тучных клеток людей различного возраста / Е.А Загорученко // Тучные клетки соединительной ткани: сб. научн. трудов.

- Новосибирск., 1968. - С 39.

6. Мяделец, О.Д. Исследование органотипической регенерации кожи при нанесении раны на фоне общей глубокой гипотермии организма. /О.Д. Мяделец // Патол. физиол. и экспериментальная терапия. - 1994. - №2. - С.33-36.

7. Мяделец, О.Д. Клеточные основы баръерно-защитных функций кожного региона при изменено температурном гомеостазе: диссертация ... доктора медицинских наук: 14.00.23: защищена 6.01.1994 / Олег Д.анилович Мяделец. - Витебск, 1993. - 388 с. - Библиогр.: с.354-388

8. Проценко, В. А. Тканевые базофилы и базофильные гранулоциты крови / В.А Проценко, С.И. Шпак, С.М. Доценко. - М.: Мединина, 1987. - 128 с.

9. Фенчин, К.М. Заживление ран / К.М. Фенчин. - Киев: «Здоров’я», 1979. - 168 с.