Получение трансгенных растений, экспрессирующих ген антимикробного пептида бомбинина

Известия Тульского государственного университета Естественные науки. 2013. Вып. 3. С. 287-296

Биология =

УДК 575.1:582.951.4

Получение трансгенных растений, экспрессирующих ген антимикробного пептида бомбинина *

Н. С. Захарченко, Е. В. Локтюшов, Е. Б. Рукавцова, Т. В. Шевчук,

О. В. Дьяченко, Я. И. Бурьянов

Аннотация. Получен рекомбинантный бинарный вектор с геном антимикробного пептида бомбинина (bom), с помощью которого проведена агробактериальная трансформация растений табака. Присутствие гена bom в геноме растений подтверждено методом ПЦР. Экспрессия гена гена bom в трансгенных растениях показана по ингибированию роста фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora экстрактами трансформированных растений. Трансгенные растения имели нормальный фенотип.

Ключевые слова: антимикробные пептиды, бомбинин,

трансформация растений.

Введение

Получение растений с повышенной устойчивостью к фитопатогенам, является важной задачей современной генно-инженерной биотехнологии. Перенос генов антимикробных пептидов в растения является одной из перспективных стратегий усиления их сопротивляемости различным микробным инфекциям [1-2]. Антимикробные пептиды обнаружены у всех эукариотических организмов, в том числе у млекопитающих, насекомых, земноводных, являясь интегральной частью их врожденной иммунной системы [3-4]. Катионные антимикробные пептиды (КАП) — класс макромолекулярных пептидных антибиотиков с широким спектром антимикробного действия. Отличительные черты КАП — суммарный положительный заряд и амфифильность, которые обеспечивают основной

* Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты № 12-08-00131, № 13-04-00636, № 14-04-00579) и Министерства образования и науки РФ в рамках Федеральной целевой программой «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2013 годы» ГК № 14.512.11.0121 от 10.10.2013 г.

механизм действия КАП — нарушение целостности биомембран и лизис клеток.

Целью нашей работы было клонирование в бинарном агробактериальном векторе гена бомбинина, кодирующего 27-членную аминокислотную последовательность, и генетическая трансформация растений табака полученной конструкцией.

1. Материалы и методы

Растительный материал. Семена табака Nicotiana tabacum L. сорта Самсун после поверхностной стерилизации в 1%-ном растворе гипохлорита натрия проращивали в культуре in vitro на агаризованной безгормональной среде МС, содержащей стандартный набор солей, включающей 7 г/л агара и 30 г/л сахарозы (рН 5,8) [5]. Растения культивировали при температуре 22-24°, 16-часовом дне и освещенности 2 клк.

Штаммы фитопатогенов. В работе использовали штамм Erwinia caro-tovora subsp. carotovora В15, полученный из Horticulture Centre (Канада) [6].

Получение плазмидных конструкций. Клонирование фрагментов ДНК в плазмидные векторы и ПЦР осуществляли по стандартным методикам [7]. Эндонуклеазы рестрикции, ДНК-лигазу фага Т4, ДНК-полимеразу Taq использовали согласно рекомендациям фирмы-производителя («СибЭнзим», Россия). В качестве источника целевого гена в работе использовали полученную ранее векторную плазмиду pET21d, которая содержит структурную часть синтетического гена бомбинина (bom), кодирующую аминокислотную последовательность зрелой формы бомбинина земноводных (кожа лягушки B. variegata) [8]. Ген bom синтезировали заново, используя праймеры, содержащие сайты рестрикции Bam HI (1) и Bgl II (2): 5’- CGGGATCCATGGGCATTGGC - 3’ f и 5’-CGAGATTT TAGTTGGCAAAATGTTCGG -3’ r и плазмидную ДНК pET21d::bom. Реакционная смесь содержала 0,1 мкг плазмидной ДНК pET21d в качестве матрицы, 0,67 М Трис-HCl (pH 8,8), 166 мМ (NH4)2SO4, 10 мМ в-меркаптоэтанола, 2,5 мМ MgCl2, 0,067 мМ ЭДТА, 0,2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата (USB, США), по 20 пмоль каждого праймера, 2 ед. ДНК полимеразы Taq (СибЭнзим, Россия). Реакцию проводили в объеме 25 мкл при следующих условиях: 94° — 5 мин; 30 циклов: 94° — 1 мин, 55° — 30 с, 72° — 30 с, затем 72° — 7 мин на амплификаторе «MJ Mini» (Personal Thermal cycler, Bio-Rad). Продукты амплификации анализировали с помощью электрофореза в 6%-ном ПААГе в трис-боратном буфере. ПЦР-продукт, содержащий структурную часть гена bom, размером 100 п.н., вырезали из геля, элюировали, очищали на колонке с целлюлозой DE-52 и использовали для клонирования. Для получения конструкций с геном бомбинина в прямой ориентации использовали плазмиду pBI121AGUS1 с удаленным геном GUS [4]. Ген bom встраивали в pBI121AGUS1 по сайту BamHI. Полученную конструкцию pBI121AGUS1::bom переносили в штамм

E.coli HB101 [7]. Трансформированные клетки отбирали на селективной среде с канамицином и выделенную из них ДНК анализировали методом ПЦР и секвенированием. Были отобраны клоны с прямой ориентацией гена бомбинина относительно промотора. Векторную плазмиду переносили в штамм агробактерий Agrobacterium tumefaciens CBE21(pTiBo542) [9] и использовали для трансформации растений табака.

Приготовление компетентных клеток Agrobacterium tumafaciens и их трансформация. Клетки A. tumefaciens выращивали в 50 мл среды LB до логарифмической фазы (ODgoo = 0, 8 — 1, 0) при 28 °С и интенсивной аэрации. Культуру охлаждали во льду и центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. Клетки ресуспендировали в 20мМ CaCl2, выдерживали во льду 15 мин и фасовали в пробирки по 100 мкл. Для трансформации к компетентным клеткам агробактерий добавляли 1 мкг плазмидной ДНК и помещали пробирки в жидкий азот на несколько секунд. Затем пробирки помещали на водяную баню 37 °С на 5 мин, после этого в пробирки добавляли по 1 мл среды LB и подращивали клетки 2-4 ч. Затем аликвоту высевали на чашки, содержащие селективные антибиотики. Колонии агробактерий появлялись через 2-3 дня.

Агробактериальная трансформация растений. Трансформацию растений проводили методом инокуляции листовых дисков агробактериями [10]. Фрагменты листьев 0,5—1,0 см, полученные из выращенных in vitro 3-4-недельных растений, инокулировали с агробактериями (ночная культура, разбавленная в 5 раз). Через 2—3 недели после трансформации на эксплантах на селективной среде МС с канамицином (50 мг/л) наблюдали регенерацию побегов. Затем побеги пересаживали в стеклянные пробирки и анализировали. Проростки выращивали при интенсивности света 2000 люкс, фотопериоде 16 часов и температуре 25 °С. Каждый опыт проводили в 10-15 чашках Петри по 10 эксплантов в каждой из чашек.

Выделение растительной ДНК. Для ПЦР анализа трансгенных растений ДНК выделяли из молодых листьев [11]. Листья (пробы по 100—200 мг) растирали в микропробирках, добавляли 0,4 мл буфера для экстракции, перемешивали и осветляли центрифугированием при 12000 g (10 мин). Затем проводили экстракцию ДНК смесью фенол-хлороформ, хлороформом, осаждали 2,5 объема этанола, осадок промывали 70 % этанолом и после этого осадок растворяли в 100 мкл буфера ТЕ. Полученную растительную ДНК использовали в качестве матрицы в ПЦР.

Выделение белковых экстрактов из растений. Листья анализируемых растений табака растирали в пробирке, затем добавляли экстракционный буфер (10 % глицерина, 40 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 100 мМ NH 4Cl, 4 мМ фенилметилсульфонилфторид, 10,0 мМ трис-HCl, pH 7,5; 3,0 мг/мл дитиотрейтола, 0,2 мг/мл лейпептина, 0,2 мг/мл ингибитора трипсина; 2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина) [10]. Полученный экстракт центрифугировали 10 мин при 10 000 g, и супернатант использовали для определения антибиотической активности экстрактов

методом радиальной диффузии. Для этого предварительно измеряли концентрацию белка по методу Бредфорд [12].

Определение антимикробной активности растительных экстрактов. Для определения влияния экстрактов трансгенных растений на рост клеток фитопатогенных бактерий Erwinia carotovora использовали метод радиальной диффузии [13]. Экстракты, содержащие равное количество общего белка (1 мг/мл) из листьев трансгенных и контрольных (нетрансформированных) растений, вносили в лунки диаметром 5 мм и 10 мм глубины, приготовленные в 1,5 % LB-агаре с бактериями (10 8 клеток/мл). Агаровые блоки инкубировали 8 ч при 4 0С для диффузии экстрактов в агар, затем блоки переносили на 25 °С и через 2 дня локализовали стерильные зоны вокруг лунок. Каждый опыт проводили с одним листом среднего яруса растения в трех биологических повторностях.

2. Результаты и обсуждение

Для получения конструкций с геном бомбинина в прямой ориентации использовали плазмиду pBI121AGUS1CT удаленным геном GUS [14]. Ген bom встраивали в pBI121AGUS1 по сайту BamHI (рис. 1). Полученную конструкцию pBI121AGUS1::bom анализировали методом ПЦР и секвенированием. Были отобраны клоны с прямой ориентацией гена бомбинина относительно промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты. Плазмиду переносили в штамм агробактерий Agrobacterium tumefaciens CBE21(pTiBo542) и использовали для трансформации растений табака.

Перед трансформацией растений агробактерии Agrobacterium tumefaciens CBE21(pTiBo542) проверяли на наличие рекомбинантного вектора методом ПЦР с праймерами к гену бомбинина (100 п.н.). Все колонии, выросшие на селективной среде с канамицином дали положительный сигнал (рис. 2).

Для трансформации табака использовали классический метод кокультивации агробактерий с сегментами листьев. Регенеранты длиной 2—3 см переносили в широкие пробирки со средой МС, с уменьшенной в два раза концентрацией антибиотиков (25 мг/л канамицина (селективный антибиотик) и 250 мг/л цефотаксима (используется для элиминации агробактерий). На этой среде растения хорошо укоренялись и дорастали до длины 10—15 см (рис. 3). Такие растения использовали для анализа и затем переносили в теплицу.

ПЦР -анализ препаратов ДНК исследуемых растений показал наличие селективного гена неомицинфосфотрансферазы II (nptII), размер амплифицированного фрагмента 600 п.н. (рис. 4) и бомбинина (bom) размер амплифицированного фрагмента 100 п.н в геноме растений (рис. 5). В препаратах ДНК контрольных нетрансформированных растений такие сигналы отсутствовали.

Рис. 1. Схема клонирования гена bom в вектор pBI121AGUS

Рис. 2. Анализ трансформированных агробактерий A. tumefaciens CBE21 (pTiBo542, рBI121AGUS::bom) на присутствие гена bom. М — маркер молекулярного веса (Медиген, 100 bp); 1-10 — ДНК трансформированных агробактерий; 11 — ДНК нетрансформированных агробактерий;

12

положительный контроль

Рис. 3. Трансгенные растения табака, экспрессирующие ген антимикробного пептида бомбинина. 1 — контроль (нетрансформированное растение); 2-4 — трансгенные растения

1 2 345 6 789 10 11

Рис. 4. ПЦР — анализ ДНК трансгенных растений на присутствие гена ^Ш. 1, 7 — плазмида рВ1121ДСи81 (положительный контроль);

2, 8 — ДНК нетрансформированного растения (отрицательный контроль); 3-5, 10, 11 — ДНК трансгенных растений; 6 — маркер молекулярного веса

(ЕегтеПа 1 кЬ); 9 — вода

Частоту регенерации растений табака определяли в процентах как отношение числа эксплантов, образовавших побеги, к общему числу культивируемых эксплантов. Эффективность трансформации определяли как отношение числа оставшихся зелеными на селективной среде побегов-регенерантов к общему числу побегов. В наших экспериментах частота трансформации табака составила 49 %.

Представлены средние арифметические значения результатов трех независимых экспериментов и их стандартные отклонения

Ml 2345 6 7 M

Рис. 5. ПЦР - анализ ДНК трансгенных растений на присутствие гена bom. М — маркер молекулярного веса (Медиген, 100 bp); 1 — плазмида pBI121AGUS1::bom; 2 — ДНК нетрансформированного растения;

3-7 — ДНК трансформированных растений

Таблица 1

Частота трансформации Nicotiana tabacum штаммом A.tumefaciens CBE21

Вариант Общее количество инокулиро- ванных эксплантов Количество эксплантов, образующих побеги Частота регенериро- вавших побегов

Контроль2 110 ± 20.0 110 ± 10.0 100 ± 15.4 2 ± 0.5 0

Опыт 170 ± 10.0 170 ± 10.0 100 ± 6.0 83 ± 7.0 48.8

Дифференциация побегов была отмечена на 14-16-й день после инокуляции; контроль — листовые экспланты сначала были культивированы 5 дней на неселективной среде, затем перенесены на среду МС с добавлением 50 мг/л канамицина и 500 мг/л цефотаксима

Антибактериальную активность тестируемых экстрактов растений оценивали методом радиальной диффузии в агаровых блоках [13]. Экстракты трансгенных растений разных линий проявляли заметную антибактериальную активность по отношению к штамму Е. carotovora, о чем свидетельствовало появление чистой зоны ингибирования бактериального роста вокруг лунок, с добавленными экстрактами. Радиус зоны лизиса составлял 4-9 мм, в зависимости от линии растений. Экстракты контрольных растений антибактериальной активностью практически не обладали (рис. 5).

Таким образом, нами впервые получены трансгенные растения с геном бомбинина. Показано, что экстракты трансгенных растений, обладают высокой антибиотической активностью по отношению к

Рис. 6. Антибиотическая активность экстрактов трансгенных растений по отношению к фитопатогену E. carotovora: 1,2 — экстракты трансформированных растений разных линий; 3 — экстракционный буфер;

4 — контроль

фитопатогену Erwinia carotovora. Планируется исследование устойчивости трансгенных растений по отношению к различным бактериальным и грибным фитопатогенным микроорганизмам. Полученные векторные конструкции с синтетическим геном bom можно в дальнейшем использовать для исследования физиологических ффектов этого гена в различных трансформированных растениях.

Авторы выражают глубокую благодарность д.б.н., А.Т. Гудкову за предоставленный штамм — источник гена бомбинина pET21d::bom, а также д.б.н., проф. И.Д. Волотовскому и к.б.н. Т.А. Гапеевой за любезно предоставленный вектор pBI121AGUS1.

Список литературы

1. Boman H. Peptide antibiotics and their role in innate immunity // Annu. rev. Immunol. 1995. V. 13. P. 61-92.

2. Terras F.R.G., Eggermont K., Kovaleva V. Small Cystein-Rich Antifungal Proteins from Radish: Their Role in Host Defense // The Plant Cell. 1995. V. 7. P. 573-588.

3. Harden J., Bartels J., Christophers E. Isolation and Characterization of Human в-Defensin-3, a Novel Human Inducible Peptide Antibiotic // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 5707-5713.

4. Вутто Н.Л., Гапеева Т.А., Пундик А.Н. Трансгенные растения картофеля белорусских сортов, экспрессирующие гены антимикробных пептидов цекропин-меллитинового типа // Генетика. 2010. Т. 46. № 12. С. 1626-1634.

5. Murashige T, Skoog F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Cultures // Physiol. Plant. 1962. V. 15. P. 473-497.

6. Dye D.M. A Taxonomic Study of the Genus Erwinia the «Carotovora» Group // New Zealand J. Sci. 1969. V. 12. P. 81-97.

7. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. С. 344-350.

8. Martemyanov K.A., Spirin A.S., Gudkov A.T. Synthesis, Cloning and Expression of Genes for Antibacterial Peptides: Cecropin, Magainin, and Bombinin // Biotechnology Lett. 1996. V. 18. P. 1357-1362.

9. Revenkova E.V., Kraev A.S., Skryabin K.S. Construction of a disarmed derivative of the supervirulent Ti plasmid pTiBo542. Plant biotechnology and molecular biology. Moscow, 1993. P. 67-76.

10. Draper J., Scott R., Hamil J. Transformation of Dicotyledonous Plant Cells Using the Ti Plasmid of Agrobacterium tumefaciens and the Ri plasmid of A. rhizogenes. Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual / Eds Draper J., Scott R., Armitage P., Walden R. Oxford: Blackwell Sci. Publ., 1988. 408 р.

11. Edwards K., Johnstone C., Thompson C. A Simple and Rapid Method for the Preparation of Plant Genomic DNA for PCR Analysis // Nucl. Acids Res. 1991. V. 19. P. 1349.

12. Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method of the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein Dye Binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

13. Ohshima M., Mitruhara I., Okamoto M. Enhanced Resistance to Bacterial Diseases of Transgenic Tobacco Plants Overexpressing Sarcotoxin IA, a Bactericidal Peptide of Insect // J. Biochem. 1999. V. 125. P. 431-435.

14. Jefferson R.A. GUS Fusions: в-Glucuronidase as a Sensitive and Versatile Gene Fusion Marker in Higher Plants / R.A. Jefferson, Т.А. Kavanagh, M.W. Bevan // EMBO J. 1987. V. 6. P. 3901-3907.

Захарченко Наталья Сергеевна (znata_2004@rambler.ru), к.б.н., старший научный сотрудник, Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Российская академия наук, Пущино.

Локтюшов Евгений Владимирович (loktushov@rambler.ru), аспирант, Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Российская академия наук, Москва.

Рукавцова Елена Борисовна (шк@ЫЬЛ.ш), д.б.н., старший научный сотрудник, Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Российская академия наук, Пущино.

Шевчук Тарас Валерьевич (taras5656@yahoo.com), д.б.н., старший научный сотрудник, Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Российская академия наук, Пущино.

Дьяченко Ольга Владимировна (ovdyachenko@bibch.ru), к.б.н., научный сотрудник, Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Российская академия наук, Пущино.

Бурьянов Ярослав Иванович (buryanov@bibсh.ru), д.б.н., профессор, зав. лабораторией, лаборатория биотехнологии растений, Филиал Института

биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Российская академия наук, Пущино.

Obtaining of transgenic plants expressing the antimicrobial

peptide bombinin

N.S. Zakharchenko, E.V. Loktushov, E.B. Rukavtsova, T. V. Shevchuk, O.V. Dyachenko, Ya. I. Buryanov

Abstract. Recombinant binary vector with gene antimicrobial peptide bombinin were obtained with which agrobacterial transformation of tobacco plants was conducted. The presence of gene bom in the plant genome was confirmed by PCR. The expression of gene bom in transgenic plants was shown by inhibition of growth of phytopathogenic bacteria Erwinia carotovora by extracts transgenic plants. Transgenic plants had the normal phenotype.

Keywords: antimicrobial peptide, bombinin, transformation plants.

Zakharchenko Natalia (znata_2004@rambler.ru), candidate of biological sciences, senior research assistant, Branch of Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Pushchino.

Loktushov Evgenii (loktushov@rambler.ru), postgraduate student, Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow.

Rukavtsova Elena (ruk@bibсh.ru), doctor of biological sciences, senior research assistant, Branch of Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Pushchino.

Shevchuk Taras (taras5656@yahoo.com), doctor of biological sciences, senior research assistant, Branch of Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Pushchino.

Dyachenko Olga (ovdyachenko@bibch.ru), candidate of biological sciences, senior research assistant, Branch of Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Pushchino.

Buryanov Yaroslav (buryanov@bibсh.ru), doctor of biological sciences, professor, head of laboratory, plant biotechnology laboratory, Branch of Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Pushchino.

Поступила 11.09.2013