Тест-система для диагностики наследственных заболеваний и способ ее применения
TEST SYSTEM FOR DIAGNOSING HEREDITARY DISEASES AND METHOD FOR APPLICATION THEREOF

Область техники
[001] Настоящие изобретение относится к области генетического тестирования, в том числе генетического тестирования животных. Изобретение может быть использовано при выявлении мутаций, в том числе, рецессивных мутаций, вызывающих наследственные заболевания.
Уровень техники
[002] Генетическое тестирование в основном применяют для того, чтобы определить наличие в конкретном организме определенных генетических вариантов. Сочетание генетических вариантов определяет проявление наследственных признаков у конкретного организма.
[003] Информацию о генетических вариантах используют в медицине, сельском хозяйстве, при разведении домашних животных (Krontiras et al., 2018; Valente et al., 2018; Leeb et al., 2017; Bellone, 2017; Poland and Rutkoski, 2016). В частности, при разведении породистых собак заводчикам необходима информация о генотипе производителей. Дело в том, что длительный процесс отбора и селекции специфических признаков, составляющих стандарт пород собак, в совокупности с высокой частотой инбридинга, нередко приводит к закреплению мутантных генетических вариантов, вызывающих наследственные заболевания. На сегодняшний день известно более 400 наследственных заболеваний породистых собак (Farrell et al., 2015). Подавляющее большинство поддающихся диагностике наследственных заболеваний у собак возникают в результате точечных мутаций в определенном гене (Asher et al., 2009; Summers et al., 2010, OMIA, http://omia.angis.org.au/). Механизм передачи таких заболеваний – преимущественно аутосомно-рецессивный (Farrell et al., 2015). При аутосомно-рецессивном наследовании особь может быть фенотипически нормальной, но при этом быть носителем мутантного генетического варианта. В потомстве такой особи возможно появление животных, страдающих от данной болезни. В случае некоторых пород собак процент носителей рецессивных генетических вариантов, связанных с заболеваниями, может достигать угрожающих значений, и для охранения породы необходимо строго контролировать генотипы производителей. Для планирования племенного разведения собак заводчикам необходимо знать, какие особи являются носителями рецессивных генетических вариантов, чтобы исключить вероятность появления племенного брака. Генетическое тестирование позволяет выявлять как доминантные, так и рецессивные мутантные генетические варианты.
[004] Методы генетического тестирования, применяемые для исследования генотипов собак, принципиально не отличаются от методов, применяемых для исследования генотипа человека. Более того, в патентах и заявках, описывающих различные методы и тест-системы для генетического тестирования, нередко можно встретить термины «субъект» или «индивид», которые определяют широкий ряд различных организмов. Поэтому упомянутые далее в уровне техники заявки и патенты описывают изобретения, принципиально схожие с заявленным изобретением по какому-либо признаку без уточнения применимости исключительно к собакам.
[005] Тест-системы для генетического тестирования основаны на прямых и непрямых методах определения генетических вариантов. В прямых методах генетический вариант определяют непосредственно с помощью определения последовательности нуклеотидов участка ДНК, содержащего исследуемый генетический вариант. Классический прямой метод включает традиционное автоматическое секвенирование по Сэнгеру (Sanger and Coulson, 1975; Smith et al., 1986). Такой метод указан, например, в патенте AU2004249943B2 (опубл.: 29.12.2004, МПК: A23K1/18, C12N15/12, C12Q1/68, G06F19/22) для выявления SNP, характерных для определенных пород собак. Указанный метод позволяет точно исследовать участок генома, содержащий определенный генетический вариант, однако к его недостаткам относится высокая себестоимость отдельного анализа, длительность процедуры, и, следовательно, низкая производительность.
[006] Известны тест-системы, основанные на применении ДНК-микрочипов (например, US20150344959A1, опубл.: 03.12.2015, МПК: C12Q1/68; WO2010129937A2, опубл.: 11.11.2010, МПК: C12N15/11, C12Q1/68; WO2009035792A1, опубл.: 19.03.2009, МПК: C12Q1/68, G06F19/00). В таких тест-системах для выявления генетических вариантов, ассоциированных с различными фенотипическими признаками животных, ДНК исследуемых особей гибридизуют с ДНК-микрочипами. Использование ДНК-микрочипов позволяет одновременно исследовать множество генетических вариантов, расположенных в разных локусах генома одного организма или разных организмов. Такой подход оправдан, например, для параллельного исследования различных заболеваний у разных пород собак. Однако для исследования генотипа конкретной особи информация, полученная с использованием ДНК-микрочипа, может быть избыточной, а также требовать специального анализа данных с применением дополнительного программного обеспечения. Все это неоправданно увеличивает стоимость генетического тестирования с целью определения небольшого количества генетических вариантов у конкретной особи.
[007] В патенте US8862410B2 (опубл.: 14.10.2014:, МПК: C12Q1/68, G06F19/00, G06F19/18, G06F19/24) описано применение высоко производительного секвенирования для определения патогенных генетических вариантов, ассоциированных с определенными заболеваниями. Как и в случае с ДНК-микрочипами такой метод подходит для крупномасштабных аналитических задач, например, в научных целях, но не оправдан для выявления небольшого количества определенных генетических вариантов у конкретной особи. Кроме того, высокопроизводительное секвенирование требует дорогостоящего оборудования и высокой квалификации персонала, а потому доступен не всем организациям, специализирующимся на генетическом тестировании.
[008]  В случае непрямых методов генетического тестирования наличие определенного генетического варианта определяют по косвенным признакам, таким как кинетика протекания биохимической реакции, размер продукта реакции и так далее. Практически все применяемые в настоящее время непрямые методы основаны на ПЦР, что делает их гораздо проще в применении и существенно дешевле прямых методов генетического тестирования. ПЦР используют для того, чтобы избирательно амплифицировать отдельный участок ДНК (ампликон) из всего генома тестируемого организма, что позволяет прицельно проанализировать ампликон различными методами, такими как определение его длины, расщепление специфическими ферментами или определение термодинамических характеристик.
[009] Определение длины ампликона или расщепление его специфическими эндонуклеазами рестрикции по месту потенциально мутированной области были одними из первых непрямых методов генетического тестирования. Стоит отметить, что и сейчас эти методы применяются в ряде случаев, так как не требуют применения специального высокотехнологичного дорогостоящего оборудования, а также отличаются простой и относительно невысокой себестоимостью. Однако эти методы не могут использоваться как универсальный подход для анализа различных генетических вариантов. Выявление генетического варианта с помощью определения длины ампликона применимо только в том случае, когда генетические варианты существенно отличаются по длине (в случае делеций или инсерций). Причем отличие должно быть существенным, чтобы разница между ампликонами, содержащими разные генетические варианты легко детектировалась с помощью гель-электрофореза. При анализе с помощью специфического расщепления ампликона для каждого локуса необходимо подбирать специфическую эндонуклеазу рестрикции, что далеко не всегда возможно. К недостаткам этих непрямых методов также можно отнести потенциально высокий уровень ложных результатов, длительность процедуры, высокую трудоемкость при увеличении количества анализов. Применение указанных непрямых методов генетического тестирования неизбежно сопряжено с низкой производительностью и сложностью масштабирования.
[0010] Для определения термодинамических характеристик ампликона чаще всего используют количественную ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), позволяющую количественно измерять эффективность амплификации, температуру денатурации ампликона и т. д. Определение кинетики протекания ПЦР является одним из косвенных способов выявления мутантных генетических вариантов при генетическом тестировании.
[0011] ПЦР-РВ очень чувствительна к характеристикам ДНК-матрицы. С одной стороны, благодаря этой чувствительности ПЦР-РВ позволяет быстро и надежно выявлять различия между генетическими вариантами, вызванными даже точечными мутациями. Но с другой стороны, та же чувствительность ПЦР-РВ накладывает значительные ограничения на качество анализируемых образцов ДНК.
SOD1
[0012] На данный момент известен целый ряд тест-систем на основе ПЦР-РВ, причем во многих из них для определения кинетики реакции используют флуоресцентно меченые специфические зонды. Например, известна тест-система для выявления мутантного генетического варианта в локусе  у собак, ассоциированного с дегенеративной миелопатией (EP2247752B1, опубл. 05.11.2014, МПК: C12Q1/68). Также известна тест-система на основе ПЦР-РВ для определения представленность гена HER2 при выборе таргетированной терапии рака груди и рака кишечника (WO2018086263A1, опубл. 17.05.2018, МПК: C12Q1/68). Описана тест-система на основе ПЦР-РВ для для выявления мутантных генетических вариантов в локусе EGFR и K-ras (CN105624309B, опубл. 21.04.2020, МПК: C12Q 1/68, C12N 15/11). Однако в подавляющем большинстве случаев тест-системы на основе ПЦР-РВ предполагают одновременный анализ только одного-двух генетических вариантов.
[0013] Также известные системы требуют специальных условий хранения, сложной и длительной пробоподготовки, требовательной  к  навыкам исполнителя. В частности, известные способы выделения ДНК из биологического материала являются трудоемкими и/или дорогостоящими, могут требовать высокой квалификации исполнителя, значительных временных затрат и трудозатрат. Этим объясняется необходимость разработки простого и недорогого способа выделения ДНК из биологического материала, не требовательного к навыкам исполнителя. Кроме того, способ выделения ДНК должен занимать минимально возможное количество времени и обеспечивать возможность масштабирования процесса выделения для одновременной пробоподготовки большого количества образцов.
[0014] Соответственно, имеется необходимость разработки простой и удобной в применении тест-системы на основе ПЦР-РВ, позволяющей быстро и качественно анализировать десятки различных генетических вариантов.
Термины и сокращения
[0015] Аллель — различные формы одного и того же гена, расположенные в одинаковых участках гомологичных хромосом. Аллели отличаются друг от друга последовательностью нуклеотидов, причем эти отличия приводят к изменению аминокислотной последовательности белкового продукта гена и/или к изменению уровня экспрессии гена, что обусловливает фенотипические различия одного и того же наследственного признака организма.
[0016] Ампликон – участок ДНК, специфически амплифицируемый в ходе ПЦР.
[0017] Амплификация — увеличение числа копий определенной последовательности нуклеотидов во время ПЦР.
[0018] Генетический вариант — это вариант последовательности нуклеотидов конкретного участка ДНК, встречаемый в геноме конкретного вида. Как правило, генетические варианты затрагивают определенный ген или регуляторную область определенного гена. Различные генетические варианты могут приводить к различиям в уровне экспрессии определенного гена, к различиям в последовательности рибонуклеотидов в РНК, считываемой с этого гена, и/или аминокислотной последовательности белкового продукта этого гена, если этот ген кодирует белок. Однако различие генетических вариантов необязательно приводит к различиям продукта, кодируемого геном, или к различиям в уровне экспрессии гена.
[0019] Генетический вариант, который чаще всего встречается у определенного вида и ассоциирован с нормальным развитием и функционированием организма называют нормальным генетическим вариантом. Тот генетический вариант, который встречается в популяции с меньшей частотой, чем нормальный генетический вариант, называют мутантным генетическим вариантом. Некоторые мутантные генетические варианты ассоциированы с появлением полезных для организма признаков. Однако исследуются в большей степени патогенные генетические варианты, т.е. мутантные генетические варианты, ассоциированные с наследственными заболеваниями и нарушениями развития организма.
[0020] Если мутантный генетический вариант приводит к изменению аминокислотной последовательности белкового продукта определенного гена или изменению уровня экспрессии этого гена, то такой генетический вариант называют мутантным аллелем этого гена. А соответствующий нормальный генетический вариант называют нормальным аллелем этого гена.
[0021] Генетическое тестирование – лабораторная процедура, направленная на выявление определенного генетического варианта в ДНК, выделенной из какого-либо биологического образца.
[0022] Геном —  совокупность генетического материала гаплоидного набора хромосом данного вида.
[0023] Генотип —  совокупность генов данного организма. В более узком смысле под генотипом понимают комбинацию определенных генетических вариантов у конкретной особи.
[0024] Генотипический статус – заключение о представленности мутантного генетического варианта в генотипе тестируемой особи.
[0025] Гомозигота — особь, в генотипе которой присутствует один генетический вариант в двух копиях. Такая особь от обоих родителей получила одинаковые генетические варианты на гомологичных хромосомах.
[0026] Гетерозигота — особь, в генотипе которой присутствует два разных генетических варианта, каждый в одной копии. Такая особь от каждого из родителей получила различные генетические варианты на гомологичных хромосомах. В случае наследования генетических вариантов на половых хромосомах такие особи называют гемизиготами.
[0027] ДНК-полимераза — имеется в виду ДНК-зависимая ДНК-полимераза — фермент, катализирующий полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль уже существующей цепи нуклеотидов, которую фермент использует в качестве шаблона. Тип нового нуклеотида определяется комплементарностью с нуклеотидом в составе уже существующей цепи. Таким образом, ДНК-полимераза участвует в синтезе новой одноцепочечной молекулы ДНК, полностью комплементарной уже существующей одноцепочечной молекуле ДНК. При полимеризации нуклеотидов ДНК-полимераза способна катализировать только присоединение нуклеотида к 3’-концу уже существующей цепи нуклеотидов, поэтому для начала полимеризации ДНК-полимеразе необходим праймер, по крайней мере частично комплементарный участку существующей цепи нуклеотидов, причем критически важной для полимеризации является комплементарность крайнего нуклеотида, находящегося на 3’-конце праймера. ДНК-полимераза начинает синтез второй цепи ДНК от 3'-конца праймера, который связался с уже существующей цепью ДНК, синтезируя новую цепь ДНК в направлении от 5'- к 3'-концу.
[0028] Зонд – здесь: модифицированные олигонуклеотиды, которые на 5´-конце содержат флуорофор, а на 3´-конце – гаситель флуоресценции. Пока флуорофор и гаситель ковалентно связаны с зондом, и соответственно, находятся вблизи друг от друга, свечение от флуорофора не детектируется. Во время отжига праймеров и элонгации, зонд с связывается с комплементарным участком ДНК. Во время элонгации ДНК-полимераза, дойдя до места отжига зонда, начинает последовательно отщеплять от него нуклеотиды, начиная с 5´-конца зонда. Таким образом, первым ДНК-полимераза отщепляет нуклеотид, с которым связан флуорофор. После отщепления флуорофора из-за увеличения расстояния гаситель оказывается неспособен поглощать свет, испускаемый флуорофором. Возникающее свечение улавливается детектором, встроенным в амплификатор для ПЦР-РВ, после каждого цикла реакции. Соответственно, по мере течения ПЦР, увеличивается общий уровень свечения реакционной смеси.
[0029] Под нормальным зондом понимается зонд, нуклеотидная последовательность которого полностью комплементарна нуклеотидной последовательности нормального генетического варианта. Под мутантным зондом понимается зонд, нуклеотидная последовательность которого полностью комплементарен, по меньшей мере, части нуклеотидной последовательности анализируемого мутантного генетического варианта.
[0030] Локус – местоположение определённого гена на генетической карте хромосомы. В некоторых случаях локус включает не только сам ген, но и близко расположенные регуляторные элементы, контролирующие экспрессию этого гена.
[0031] Мутация – любое изменение последовательности нуклеотидных остатков конкретного участка ДНК. Основные виды мутаций включают замены одних нуклеотидов другими с сохранением количества нуклеотидов, делеции — удаление нуклеотидов, инсерции — вставки нуклеотидов. При этом мутации, которые затрагивают один нуклеотид, называют точечными.
[0032] нт – нуклеотид, обозначает количество нуклеотидов, используется для обозначения длины одноцепочечной ДНК, в том числе длины праймеров и зондов.
[0033] Отжиг – реакция ренатурации праймера или зонда с комплементарным участком одноцепочечной ДНК.
[0034] ОФ – относительная флюоресценция.
[0035] пн – пара нуклеотидов, используется для обозначения длины участка двуцепочечной ДНК, в том числе длины ампликона.
[0036] Праймеры — здесь: короткие одноцепочечные молекулы ДНК с заданной последовательностью нуклеотидов, которые используются в реакции ПЦР и определяют начало и конец фрагмента ДНК, амплифицируемого в ходе ПЦР. Как правило, в ПЦР используется два праймера — прямой и обратный. Прямой праймер соответствует крайним N нуклеотидам одной цепи амплифицируемого фрагмента ДНК, где N равно длине прямого праймера. Обратный праймер соответствует крайним М нуклеотидам комплементарной цепи амплифицируемого фрагмента ДНК, где М равно длине праймера.
[0037] Представленность мутантного генетического варианта – отражает количество копий генетического варианта в генотипе одной особи. Так, гомозигота по мутантному генетическому варианту содержит в генотипе две копии этого мутантного генетического варианта. Гетерозигота по мутантному генетическому варианту содержит в генотипе одну копию этого мутантного генетического варианта. Гомозигота по нормальному генетическому варианту не содержит в генотипе ни одной копии мутантного генетического варианта.
[0038] Премикс – здесь: смесь ингредиентов, необходимых для проведения ПЦР-РВ.
[0039] ПЦР – полимеразная цепная реакция, метод молекулярной биологии, позволяющий амплифицировать определенный участок ДНК, который называется продуктом ПЦР. Границы продукта ПЦР задаются специфическими праймерами. Амплификация происходит в результате многократного повторения циклов изменения температуры реакционной смеси. Каждый цикл состоит из трех стадий: 1) на стадии денатурации реакционную смесь нагревают до 94-98 °C, при этом происходит разрушение водородных связей между двумя цепями ДНК; 2) на стадии отжига праймеров температуру реакционной смеси понижают, чтобы праймеры могли связаться с денатурированной одноцепочечной ДНК, при этом температура отжига зависит от состава и длины праймеров; 3) на стадии элонгации ДНК-полимераза, используя праймер в качестве затравки, синтезирует новую цепь ДНК по шаблону уже имеющейся цепи ДНК, которая называется ДНК-матрицей, при этом температура реакционной смеси зависит от используемой ДНК-полимеразы. Анализ продукта классической ПЦР проводят после окончания реакции. Как правило, для анализа используют электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле с красителем, интеркалирующим в ДНК. Такой анализ является полуколичественным  и позволяет приблизительно оценить размер и количество полученного продукта ПЦР.
[0040] ПЦР-РВ – количественная ПЦР в реальном времени (Real-time PCR), лабораторный метод, который используется для измерения количества исходной ДНК-матрицы путем измерения кинетики прохождения ПЦР. Как и в классической ПЦР, сначала количество специфического продукта ПЦР увеличивается экспоненциально. Экспоненциальный рост количества продукта ПЦР ограничен количеством реагентов, присутствием в реакционной смеси ПЦР-ингибиторов, образованием побочных, неспецифических продуктов реакции. На последних циклах реакции рост замедляется, эта стадия ПЦР называется «стадией плато». Основное отличие количественной ПЦР от классической ПЦР состоит в том, что после каждого цикла амплификации косвенным образом измеряется количество амплифицированной ДНК. Для определения количества амплифицированной ДНК используют либо флуоресцентные красители, испускающие свет при интеркаляции в двуцепочечные молекулы ДНК, либо флуоресцентно меченые олигонуклеотиды (зонды) — например, TaqMan-зонды, которые флуоресцируют после их расщепления ДНК-полимеразой во время синтеза ДНК. И в том, и в другом случае флуоресценция усиливается с каждым циклом реакции по мере накопления продукта ПЦР в реакционной смеси. Для определения количества амплифицированной ДНК после каждого цикла измеряется общая флуоресценция, исходящая от реакционной смеси. Измерение флуоресценции, исходящей от реакционной смеси, происходит во время ПЦР в автоматическом режиме. По результатам измерений строится кривая, характеризующая зависимость флуоресценции в реакционной смеси от номера цикла амплификации. Тот цикл, на котором флуоресценция достигает заданного порогового уровня, называется пороговым циклом, или Ct (от англ. threshold cycle). Сравнивая величину Ct, полученную в ПЦР с исследуемым образцом ДНК, и величину Ct, полученную в ПЦР с референсным образцом ДНК, можно судить о наличии и количестве ДНК с определенной последовательностью нуклеотидов в исследуемом образце ДНК. При анализе данных количественной ПЦР помимо величины Ct важно учитывать профиль описанной кривой флуоресценции. Профиль кривой говорит об эффективности амплификации, которая зависит от таких параметров, как активность ДНК-полимеразы, эффективность гибридизации праймеров, чистота ДНК-матрицы от ПЦР-ингибиторов, исходная концентрация ДНК-матрицы, сложность ДНК-матрицы, конформационные особенности ДНК-матрицы.
[0041] Секвенирование — метод молекулярной биологии, позволяющий определять последовательность нуклеотидов в ДНК.
[0042] dNTP – deoxynucleotide, или дезоксинуклеозидтрифосфаты, имеется в виду смесь эквимолярный раствор высокоочищенных 2’-дезоксинуклеозид5’-трифосфатов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP).
[0043] EDTA – еthylenediaminetetraacetic acid.
[0044] EGTA – ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid.
[0045] m/v – относится к процентам, отражающим отношение массы к объему.
[0046] RFU – relative fluorescence units, относительные единицы флуоресценции.
[0047] SNP – Single Nucleotide Polymorphism, или однонуклеотидный полиморфизм (ОНП), отличие последовательности ДНК размером в один нуклеотид (A, T, G или C) в геноме представителей одного вида или между гомологичными участками гомологичных хромосом.
[0048] v/v – относится к процентам, отражающим отношение объема к объему.
Сущность изобретения
[0049] Задачей настоящего изобретения является разработка надежной и удобной в применении системы генетического тестирования, пригодной для одновременного выявления различных мутантных генетических вариантов, в том числе, рецессивных мутантных генетических вариантов, в генотипе одной или нескольких особей.
[0050] Данная задача решается заявляемым изобретением за счет достижения такого технического результата, как создание тест-системы на основе ПЦР в реальном времени, обеспечивающей возможность быстро и надежно анализировать один генотип или несколько генотипов на наличие и представленность одного или нескольких мутантных генетических вариантов, а также разработка доступного способа применения указанной тест-системы, включающая пробоподготовку, проведение ПЦР в реальном времени и анализ результатов ПЦР в реальном времени.
[0051] Заявленный технический результат достигается за счет того, что заявленная тест-система включает не менее пяти премиксов, включающих буфер, ДНК-полимеразу и дезоксинуклеозидтрифосфаты, праймеры, первый зонд (далее: нормальный зонд), нуклеотидная последовательность которого полностью комплементарна нуклеотидной последовательности нормального генетического варианта, содержащий первый флуорофор и первый гаситель флуоресценции, и мутантный зонд, содержащий второй флуорофор и второй гаситель флуоресценции. При этом первый и второй флуорофоры зондов испускают свет в разном волновом диапазоне. Это позволяет легко идентифицировать свечение от каждого зонда в одной реакционной смеси. Нуклеотидные последовательности зондов выбраны так, что температура отжига зонда на комплементарный генетический вариант (например, мутантный) отличается от температуры отжига зонда на второй генетический вариант (соответственно, нормальный) не менее чем на 4°С; зонд комплементарен той цепи ДНК, которая в районе мутантного генетического варианта содержит меньшее количество гуанидина.
[0052] Буфер, ДНК-полимераза и дезоксинуклеозидтрифосфаты являются стандартными, подходящими для любой ПЦР-РВ.
[0053] Праймеры имеют нуклеотидные последовательности, разработанные специально для специфической амплификации участка ДНК, содержащего определенный генетический вариант.
[0054] Один из указанных премиксов дополнительно включает нормальный референсный образец ДНК, по нуклеотидная последовательность которого соответствует геномной ДНК, полученной от гомозиготы по нормальному генетическому варианту. Этот премикс служит для проведения нормальной контрольной реакции, в которой превалирующим будет свечение от нормального зонда.
[0055] Другой из указанных премиксов дополнительно включает мутантный референсный образец ДНК, нуклеотидная последовательность которого соответствует геномной ДНК, полученной от гомозиготы по мутантному генетическому варианту. Этот премикс служит для проведения мутантной контрольной реакции, в которой превалирующим будет свечение от мутантного зонда.
[0056] Третий из указанных премиксов дополнительно включает гетерозиготный референсный образец ДНК, по термодинамическим характеристикам соответствующий геномной ДНК, полученной от гетерозиготы, содержащей в своем генотипе нормальный и мутантный генетические варианты. Этот премикс служит для проведения гетерозиготной контрольной реакции, в которой уровни свечения от нормального зонда и от мутантного зонда будут приблизительно равны.
[0057] Еще, по меньшей мере, два премикса не включают какой-либо ДНК. Один премикс, не содержащий какой-либо ДНК, служит для проведения негативной контрольной реакции, в которой уровни свечения от нормального зонда и от мутантного зонда будут иметь фоновый значения.
[0058] Второй премикс, не содержащий какой-либо ДНК, служит для проведения тестовой реакции с добавлением ДНК тестируемой особи. Уровни свечения первого и второго флуорофора в тестовой реакции сравнивают с соответствующими уровнями в контрольных реакциях. При этом сравнение результата тестовой реакции с результатом негативной контрольной реакции позволяет говорить о качестве проведенной ПЦР-РВ. То есть позволяет судить о том, можно ли в принципе, использовать результаты тестовой реакции для заключения о генотипическом статусе тестируемой особи. Сравнение результата тестовой реакции с результатами нормальной, мутантной и гетерозиготной контрольных реакций позволяют сделать вывод о генотипическом статусе тестируемой особи, т.е. сделать вывод о наличии и представленности определенного мутантного генетического варианта в генотипе тестируемой особи. Наличие четырех контрольных реакций с заведомо известными результатами, позволяет сделать надежный вывод о генотипическом статусе тестируемой особи.
[0059] В одном варианте реализации заявленная вся тест-система состоит из описанных пяти премиксов. Такая тест-система позволяет проанализировать генотип одной особи на наличие и представленность одного мутантного генетического варианта.
[0060] В другом варианте реализации тест-система включает более, чем пяти премиксов. При этом один премикс, не содержащий какой-либо ДНК, служит для проведения негативной контрольной реакции. Три других премикса содержат референсные ДНК и служат для проведения нормальной, мутантной и гетерозиготной контрольных реакций. А оставшиеся премиксы, не содержащие какой-либо ДНК, служат для анализа генотипов различных особей на наличие и представленность одного мутантного генетического варианта.
[0061] В некоторых случаях тест-система может состоять из нескольких групп премиксов. При этом каждая группа премиксов может включать свой набор праймеров и зондов. Каждая группа премиксов включает один премикс без ДНК для проведения негативной контрольной реакции и три премикса, включающих референсные образцы ДНК, для проведения нормальной, мутантной и гетерозиготной контрольных реакций. При этом в одном варианте реализации каждая группа премиксов включает один премикс, не содержащей какой-либо ДНК, для проведения тестовой реакции. Такая тест-система позволяет, например, одновременно проанализировать генотип одной особи на наличие и представленность нескольких мутантных генетических вариантов. В другом варианте реализации каждая группа премиксов включает несколько премиксов, не содержащих какой-либо ДНК, для проведения нескольких тестовых реакций. Такая тест-система позволяет одновременно анализировать генотипы нескольких разных особей на наличие и представленность нескольких мутантных генетических вариантов.
[0062] Таким образом, описанная базовая структура тест-системы, включающая четыре контроля для каждого мутантного генетического варианта, позволяет масштабировать заявленную тест-систему для одновременного анализа множества генетических вариантов в генотипах разных особей. При этом наличие адекватных контролей обеспечивает надежность полученных результатов генетического тестирования.
[0063] В одном из вариантов реализации премиксы в составе тест-системы могут быть лиофилизированы, что позволяет хранить и транспортировать такую тест-систему в самых разных условиях. Это значительно расширяет круг пользователей заявленной тест-системы. Генетическое тестирование как коммерчески доступная услуга, как правило, подразумевает не только проведение ПЦР-РВ и анализ результатов, но и пробоподготовку. При этом пробоподготовка включает два основных этапа – это сбор биологического материала и выделение ДНК. Наиболее сложным, длительным этапом, обеспечивающим саму возможность генетического тестирования, является выделение ДНК. Заявленное изобретение включает способ выделения ДНК, который позволяет быстро и эффективно извлекать ДНК из биологического материала различной природы. В частности, заявленный способ позволяет выделять ДНК из соскобов буккального эпителия. Этот вариант биологического материала отличается тем, что может быть собран практически любым неподготовленным человеком с использованием широкого диапазона подручных средств. При этом извлечение ДНК заявленным способом не требует специальных условий хранения и транспортировки соскобов буккального эпителия. Заявленный способ позволяет из одного образца биологического материала выделить ДНК высокого качества в таком количестве, которого достаточно для анализа десятков генетических вариантов.
[0064] Для эффективного и надежного генетического тестирования с применением заявленной тест-системы необходимо, чтобы образец ДНК тестируемой особи был очищен от примесей, в том числе, нуклеаз и ПЦР-ингибиторов.
[0065] Заявленный способ подходит для выделения ДНК из биологического материала, который может представлять собой кровь, волосы, кожу, части внутренних органов и различных тканей организма. В предпочтительном варианте реализации биологический материал представляет собой клетки буккального эпителия из ротовой полости. Процедура сбора буккального эпителия максимально проста, неинвазивна и не требует специальных навыков, условий и оборудования.
[0066] Заявленный способ выделения ДНК включает следующие этапы:
а) биологический материал помещают в первый раствор, включающий протеазу и инкубируют при 50-66ºС. Инкубация может длиться от 15 до 120 минут. В предпочтительном варианте реализации инкубацию в первом растворе проводят при постоянном перемешивании. Первый раствор также включает буферный агент, соль щелочного металла, хелатный агент и детергент;
б) к полученной на этапе а) смеси добавляют РНКазу и инкубируют при температуре 18-40ºС. Инкубация с РНКазой может длиться в течение 3-30 минут;
в) к полученной на этапе б) смеси добавляют осаждающий реагент и тщательно перемешивают. В качестве осаждающего реагента может быть использован ацетат калия или этанол. В том случае, когда осаждающий реагент представляет собой ацетат калия, смесь инкубируют при температуре от -5 до + 5ºС в течение 5-30 минут, после чего осадок отделяют от супернатанта с помощью центрифугирования. Центрифугирование проводят с ускорением 13000-22000 в течение 5-15 минут. Полученный супернатант используют далее на этапе г);
[0067] г) к полученной на этапе в) смеси добавляют второй раствор, который включает буферный агент и хелатный агент. В одном варианте реализации второй раствор включает хаотропный агент, который денатурирует и переводит в растворимую форму белковые молекулы, что позволяет в дальнейшем избавиться от белковых примесей в растворе ДНК. В предпочтительном варианте реализации в качестве хаотропного агента используют гуанидин изотиоцианат в концентрации 30-65% m/v. В одном варианте реализации, когда биологический материал представляет собой буккальный эпителий, второй раствор не включает хаотропного агента. Это значительно снижает себестоимость процедуры выделения ДНК, а также снижает опасность процедуры выделения ДНК для исследователя и для окружающей среды;
д) полученную на этапе г) смесь фильтруют через сорбент, после чего фильтрат удаляют. Сорбент может представлять собой частицы мелкодисперсного стекла  или магнитные частицы, имеющие силикатную поверхность. В предпочтительном варианте изобретения сорбент представляет собой фильтр, выполненный из стекловолкна. В еще более предпочтительном варианте реализации указанный фильтр расположен в микроколонке, которая может быть помещена в стандартную пробирку для центрифугирования. После фильтрации удаляют фильтрат. При этом ДНК остается связанной с сорбентом;
е) промывают обработанный на этапе д) сорбент третьим раствором, включающим хаотропный агент, 25-50 % v/v этанол и буферный агент. В предпочтительном варианте реализации третий раствор в качестве хаотропного агента используют гуанидин изотиоцианат в концентрации 12-30% m/v. Такое количество хаотропного агента, с одной стороны, позволяет дополнительно очистить ДНК от белковых примесей, а с другой стороны, позволяет легко избавиться от него в конечном препарате ДНК. После промывания порцию третьего раствора удаляют;
ж) обработанный на этапе е) сорбент промывают четвертым раствором, включающим 70-80 % v/v этанола, соль и буферный агент. Соль в составе раствора повышает растворимость белков, что позволяет лучше очистить выделяемую ДНК от белковых примесей. Этанол в высокой концентрации способствует связывванию ДНК с сорбентом. После промывания порцию четвертого раствора удаляют;
з) к обработанному на этапе ж) сорбенту добавляют пятый раствор, инкубируют при температуре 18-40ºС в течение 3-10 минут. Пятый раствор содержит воду и буферный агент для поддержания pH 8.5. При таком рН ДНК теряет связь с сорбентом и переходит в раствор, который отделяют от сорбента путем центрифугирования. При этом пятый раствор не содержит дополнительных компонентов, например, хелатных агентов, которые защищают ДНК от расщепления нуклеазами, однако могут ингибировать ПЦР. После инкубации сорбента с пятым раствором, ДНК элюируют с помощью центрифугирования. Полученный раствор содержит образец ДНК для дальнейшего анализа.
[0068] Сочетание использования сорбента и указанных растворов, а также тщательно подобранные температурные и временные режимы каждого этапа заявленного способа позволяют быстро выделять ДНК, очищенную от ПЦР-ингибиторов и нуклеаз, пригодную для использования в ПЦР-РВ. При этом даже из небольшого количества биологического образца можно выделить достаточно ДНК для проведения не менее десяти тестовых реакций с использованием заявленной тест-системы. Например, ДНК, выделенной заявленным способом из соскоба буккального эпителия, может быть достаточно для определения наличия и представленности десяти различных мутантных генетических вариантов в генотипе тестируемой особи. Заявленный способ выделения ДНК не требует применения какого-то специфического, дорогостоящего лабораторного оборудования, а также высокой квалификации исполнителя. Это позволяет пользователю с квалификацией лаборанта выделять ДНК, подходящую для применения с заявленной тест-системой, в обычной лаборатории. Все вместе это обеспечивает возможность масштабирования процесса выделения для одновременной пробоподготовки большого количества образцов.
[0069] Для того чтобы сделать вывод о генотипическом статусе тестируемой особи, может использоваться визуальное сравнение кинетических кривых, полученных в тестовой реакции, с кинетическими кривыми, полученными в контрольных реакциях. При этом вывод о генотипическом статусе тестируемой особи делают на основании максимального сходства кинетических кривых, полученных в одной из контрольных реакций с кинетическими кривыми, полученными в тестовой реакции.
F1
F2
F1
F2
[0070] Также определенный генотипический статус может быть присвоен тестируемой особи на основе вычислений проведенных с использованием таких численных параметров тестовой реакции и контролей, как свечение первого и второго флюорофоров. При этом для каждой реакции вычисляют значение относительной флуоресценции (ОФ) по следующей формуле: (RFU-RFU)/(RFU+RFU). Затем вычисляют модуль разницы ОФ между тестовой реакцией и каждым из контролей. Выбирают ту контрольную реакцию, для которой модуль разницы ОФ с тестовой реакцией составляет не более 0,2. Генотипический статус тестируемой особи определяют по референсному образцу ДНК, участвующему в выбранной контрольной реакции. Например, если была выбрана нормальная контрольная реакция, то делают заключение, что тестируемая особь является гомозиготой по нормальному генетическому варианту, то есть не содержит в своем генотипе ни одной копии мутантного генетического варианта. Если была выбрана мутантная контрольная реакция, то делают заключение, что тестируемая особь является гомозиготой по мутантному генетическому варианту. Если была выбрана гетерозиготная контрольная реакция, то делают заключение, что тестируемая особь является гетерозиготой по мутантному генетическому варианту, то есть содержит в своем генотипе как нормальный, так и мутантный генетический вариант.
[0071] , для которой модуль разницы ОФ с тестовой реакцией составляет не более 0,2.
[0072] В предпочтительном варианте реализации указанные вычисления сопоставляют с визуальным сравнением кинетических кривых.
[0073] Использование заявленного способа выделения ДНК обеспечивает скорость и простоту пробоподготовки. Архитектура заявленной тест-системы, включающая премиксы для проведения четырех контрольных реакций на каждый анализируемый мутантный генетический вариант, позволяет не только надежно выявлять мутантный генетический вариант в генотипе одной особи, но также масштабировать заявленную тест-систему для одновременного выявления мутантного генетического варианта в генотипе множества особей. Особенности нуклеотидных последовательностей зондов, обеспечивающие существенное различие сочетания уровней свечения первого и второго флуорофора в контрольных реакциях, а также Доступный метод анализа результатов ПЦР-РВ определяют надежность выявления мутантных генетических вариантов в генотипе тестируемой особи.
[0074] Все вместе это позволяет значительно сократить время,повысить доступность и надежность генетического тестирования с применением заявленной тест-системы.
Описание чертежей
[0075] На Фиг. 1 представлена электрофореграмма образцов ДНК, выделенных из клеток буккального эпителия согласно заявленному способу выделения ДНК.
[0076] На Фиг. 2 представлена электрофореграмма препаратов ДНК, выделенных согласно заявленному способу выделения ДНК, в рамках теста на извлечения.
[0077] На Фиг. 3 представлена электрофореграмма продуктов амплификации фрагмента гена SLC2A9 с использованием различных образцов ДНК.
[0078] На Фиг. 4А-Д показаны кинетические кривые, полученные в результате анализа образца ДНК собаки на наличие и представленность мутантного генетического варианта, ассоциированного с  недостаточностью фактора VII.
[0079] На Фиг. 5А-Д показаны кинетические кривые, полученные в результате анализа образца ДНК собаки на наличие и представленность мутантного генетического варианта, ассоциированного с  ганглиозидозом GM1.
[0080] На Фиг. 6А-Д показаны кинетические кривые, полученные в результате анализа образца ДНК собаки на наличие и представленность мутантного генетического варианта, ассоциированного с  прогрессирующей атрофией сетчатки rcd3-PRA.
[0081] На Фиг. 7А-Д показаны кинетические кривые, полученные в результате анализа образца ДНК собаки на наличие и представленность мутантного генетического варианта, ассоциированного с прогрессирующей атрофией сетчатки PAP1-PRA.
Подробное описание изобретения
[0082] В приведенном ниже подробном описании реализации изобретения приведены многочисленные детали реализации, призванные обеспечить отчетливое понимание настоящего изобретения. Однако, квалифицированному в предметной области специалисту, очевидно, каким образом можно использовать настоящее изобретение, как с данными деталями реализации, так и без них. В других случаях хорошо известные методы, процедуры и компоненты не описаны подробно, чтобы не затруднять излишне понимание особенностей настоящего изобретения.
[0083] Кроме того, из приведенного изложения ясно, что изобретение не ограничивается приведенной реализацией. Многочисленные возможные модификации, изменения, вариации и замены, сохраняющие суть и форму настоящего изобретения, очевидны для квалифицированных в предметной области специалистов.
[0084] Заявленное изобретение описывает тест-систему, позволяющую одновременно выявлять от одного до нескольких десятков разных генетических вариантов у одной особи или тестировать сразу десятки особей на наличие одного конкретного генетического варианта.
[0085] Тест система включает премиксы, содержащие буфер, ДНК-полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), праймеры, нормальный зонд, содержащий первый флуорофор и первый гаситель, и мутантный зонд, содержащий второй флуорофор и второй гаситель.
[0086] При этом буфер, ДНК-полимераза и дезоксинуклеозидтрифосфаты представляют собой стандартные коммерчески доступные компоненты реакции ПЦР.
[0087] Праймеры включают прямой праймер и обратный праймер, позволяющие эффективно и специфически амплифицировать участок ДНК, включающий интересующий генетический вариант. При этом пару праймеров (прямой праймер + обратный праймер) подбирают исходя из следующих принципов:
• продукт ПЦР, получаемый с данной парой праймеров должен иметь длину 50-180 пн;
• мутация, определяющая генетический вариант, должна располагаться на расстоянии не менее, чем 2 пн, от места отжига 3´-конца каждого праймера;
• температура плавления праймеров составляет 59.0-64.0°С;
• максимальная разница между температурами плавления прямого праймера и обратного праймера составляет не более 2°С;
• не менее 3 нуклеотидов каждого праймера должны не совпадать с любыми возможными неспецифическими продуктами ПЦР, причем не менее 2 несовпадающих нуклеотидов должны располагаться в пределах последних 5 нуклеотидов на 3´-конце праймера;
• 3´-конец праймера содержит гуанидин или цитозин, что значительно повышает специфичность отжига праймеров.
[0088] Из списка предложенных пар праймеров выбрают те, что имеют минимальное число неспецифических частично-комплементарных участков в геноме. Работоспособность  и специфичность праймеров  проверяют  при  помощи  ПЦР и выбирают те пары  праймеров, которые приводят к получению продукта ПЦР требуемого размера.
[0089] Нормальный зонд полностью комплементарен части нуклеотидной последовательности нормального генетического варианта. Мутантный зонд полностью комплементарен, по меньшей мере, части нуклеотидной последовательности анализируемого мутантного генетического варианта. При этом нормальный зонд содержит на 5´-конце первый флуорофор, а на 3´-конце – первый гаситель флуоресценции. Мутантный зонд содержит на 5´-конце второй флуорофор, а на 3´-конце – второй гаситель флуоресценции. Флуорофоры могут быть выбраны из группы, включающей, но не ограничивающейся этим, FAM, R6G, TAMRA, ROX, Cy5, Cy5.5. Гасители флуоресценции могут быть выбраны из группы, включающей, но не ограничивающейся этим, VIC,RTQ-1, BHQ-1, BHQ-2, BHQ-3, RTQ-2. Важно, что первый флуорофор и второй флуорофор испускают свет в разном волновом диапазоне, что позволяет легко идентифицировать свечение от каждого зонда в одной реакционной смеси. Гаситель флуоресценции подбирается на каждый зонд так, чтобы максимально эффективно поглощать свет от выбранного флуорофора.
[0090] Последовательность нуклеотидов каждого зонда подбирают исходя из следующих принципов:
• последовательность, комплементарная мутантному генетическому варианту или части мутантного генетического варианта (например, в случае значительной инсерции) должна располагаться не более чем в 4 нт от середины зонда. Таким образом, образом не менее половины зонда комплементарна участку ДНК, не затронутому мутацией в мутантном генетическом варианте.
• нуклеотид, связанный с флуорофором не должен быть гуанидином. Это связано с тем, что гуанидин может ингибировать свечение флуорофоров;
• температура отжига зонда на комплементарный генетический вариант (например, мутантный) должна отличаться от температуры отжига зонда на второй генетический вариант (соответственно, нормальный) не менее чем на 4°С;
• зонд комплементарен той цепи ДНК, которая в районе мутации содержит меньшее количество гуанидина, так как гуанидин значительно снижает интенсивность флуоресценции флуорофора в реакции.
[0091] Каждый из двух зондов более эффективно связывается с тем генетическим вариантом, которому он полностью комплементарен. Так, если тестируемая особь является гомозиготой по нормальному генетическому варианту, то амплификатор в первую очередь будет детектировать свечение первого флуорофора от нормального зонда. Свечение второго флуорофора в этом случае не будет превышать фоновый уровень, наблюдаемый в негативной контрольной реакции. Если тестируемая особь является гомозиготой по мутантному генетическому варианту, то амплификатор в первую очередь будет детектировать свечение второго флуорофора от мутантного зонда. В этом случае свечение первого флуорофора не будет превышать фоновый уровень, наблюдаемый в негативной контрольной реакции. Если тестируемая особь является гетерозиготой по мутантному генетическому варианту (т.е. носителем болезни), то уровень свечения обоих флуорофоров будет схожим.
[0092] Для того чтобы делать заключение о наличии и представленности мутантного генетического варианта в генотипе тестируемой особи, нужно с чем-то сравнивать уровень свечения каждого флуорофора в тестовой реакции, проведенной с ДНК тестируемой особи. Для сравнения используют уровень свечения флуорофоров в контрольных реакциях. Негативная контрольная реакция проводится без какой-либо ДНК-матрицы. Соответственно, уровень свечения обоих флуорофоров в этой реакции является фоновым и определяется редким случайным отщеплением флуорофоров от нормального и мутантного зондов.
[0093]  Три других контрольных реакции проводятся с использованием премиксов, дополнительно включающих  референсные образцы ДНК. Нормальная контрольная реакция включает нормальный референсный образец ДНК, нуклеотидная последовательность которого соответствует нуклеотидной последовательности геномной ДНК особи, гомозиготной по нормальному генетическому варианту. Мутантная контрольная реакция включает мутантный референсный образец ДНК, нуклеотидная последовательность которого соответствует нуклеотидной последовательности геномной ДНК особи, гомозиготной по мутантному генетическому варианту. Гетерозиготная контрольная реакция включает гетерозиготный референсный образец ДНК, который по нуклеотидной последовательности соответствует геномной ДНК особи, содержащей в своем генотипе нормальный и мутантный генетические варианты. Именно наличие четырех указанных контролей позволяет делать надежное заключение о генотипическом статусе тестируемой особи. Таким образом, заявленная тест-система позволяет выявлять гомозигот по мутантному генетическому варианту, гомозигот по нормальному генетическому варианту, а также гетерозиготных носителей мутантного генетического варианта.
[0094] В качестве референсных образцов ДНК могут быть использованы естественные референсные образцы ДНК, представляющие собой геномные ДНК, полученные от особей с соответствующим генотипом. Однако в предпочтительном варианте реализации используют искусственные референсные образцы ДНК, представляющие собой референсные фрагменты ДНК, клонированные в генетический вектор (описаны в RU2724504C1, опубл.: 23.06.20, МПК: C12N15/00). Референсные фрагменты ДНК, клонированные в генетические векторы, удобны для наработки в больших количествах (при создании большого количества тест-систем), с меньшей вероятностью содержат нуклеотидные замены, чем, например, ПЦР-фрагменты, которые также могут использоваться в качестве референсных образцов ДНК.
[0095] В предпочтительном варианте реализации нормальный искусственный референсный образец представляет собой генетический вектор с клонированным в него нормальным фрагментом ДНК, включающим нормальный генетический вариант. Мутантный искусственный референсный образец представляет собой генетический вектор с клонированным в него мутантным фрагментом ДНК, включающим, по меньшей мере, часть мутантного генетического варианта. Гетерозиготный искусственный референсный образец представляет собой смесь генетических векторов с клонированными в них нормальным фрагментом ДНК и мутантным фрагментом ДНК. Причем оба генетических вектора входят в состав смеси приблизительно в эквимолярных количествах, что имитирует геномную ДНК гетерозиготной особи, которая на одной гомологичной хромосоме несет нормальный генетический вариант, а на другой гомологичной хромосоме несет мутантный генетический вариант. Важно, что все указанные искусственные референсные образцы ДНК характеризуются такой же кинетикой ПЦР, что и естественные референсные образцы ДНК.
[0096] Таким образом, специфичность последовательности прямого и обратного праймеров, специфичность последовательности каждого зонда и различие светового диапазона флуорофоров, а также наличие адекватных контролей, позволяют с помощью заявленной тест-системы надежно определять наличие и представленность мутантного генетического варианта в генотипе тестируемой особи.
[0097] В одном варианте реализации премиксы, входящие в тест-систему представляют собой водные растворы. В другом варианте реализации премиксы представляют собой сухую смесь указанных компонентов, полученную путем лиофилизации соответствующих растворов. Тест-система из лиофилизированных премиксов менее требовательна к условиям хранения и транспортировки, что значительно расширяет границы ее применения. Однако стоит отметить, что указанные преимущества лиофилизации премиксов в большей степени касаются тех тест-систем, где в качестве референсных образцов ДНК используются указанные искусственные референсные образцы ДНК. Это связано с тем, что векторная ДНК более устойчива к лиофилизации и последующему растворению, к различным условиям хранения, чем геномная ДНК в составе естественных референсных образцов ДНК.
[0098] В одном варианте реализации заявленная тест-система состоит из указанных пяти премиксов. При этом один премикс служит для анализа ДНК тестируемой особи, а остальные премиксы входят в состав указанных контролей. Такая тест-система позволяет проанализировать генотип одной особи на наличие и представленность одного мутантного генетического варианта.
[0099] В другом варианте реализации тест-система включает более пяти премиксов. При этом один три премикса содержат референсные ДНК и используются для проведения нормальной, мутантной и гетерозиготной контрольных реакций. Один премикс не содержит какой-либо ДНКы и используется для проведения негативной контрольной реакции. Оставшиеся премиксы, не содержащие какую-либо ДНК, служат для анализа генотипов различных особей на наличие и представленность одного мутантного генетического варианта. При этом максимальное количество особей, генотипы которых можно проанализировать с использованием такой тест-системы, на четыре меньше общего количества премиксов в этой тест-системе. Например, тест-система может включать 8 премиксов, и позволяет проанализировать генотипы четырех разных особей на наличие и представленность одного мутантного генетического варианта. Или тест-система может включать 96 премиксов, и позволяет проанализировать генотипы 92 разных особей на наличие и представленность одного мутантного генетического варианта.
[00100] В некоторых случаях тест-система может состоять из нескольких групп премиксов. При этом каждая группа премиксов может включать свой набор праймеров и зондов. При этом важно, что в каждой группе премиксов есть один премикс, не содержащий какой-либо ДНК для, проведения негативной контрольной реакции и три премикса, включающих референсные образцы ДНК, для проведения нормальной, мутантной и гетерозиготной контрольных реакций. Также каждая группа премиксов включает один премикс для проведения тестовой реакции. Такая тест-система позволяет одновременно проанализировать генотип одной особи на наличие и представленность нескольких мутантных генетических вариантов. Например, тест-система, включающая 95 премиксов, позволяет одновременно проанализировать генотип одной особи на наличие и представленность 19 различных мутантных генетических варианта. Понятно, что указанная тест-система позволяет тестировать генотипы разных особей на наличие и представленность разных генетических вариантов.
[00101] еще в одном варианте реализации, когда тест-система состоит из нескольких групп премиксов, в каждой группе премиксов может быть более одного премикса для проведения тестовой реакции. Такая тест-система позволяет одновременно анализировать генотипы нескольких разных особей. Причем генотип каждой особи может быть проанализирован на наличие и представленность более чем одного мутантного генетического варианта. Такая тест-система удобна в применении, например, когда требуется проанализировать несколько особей одной породы собак на наличие и представленность нескольких мутантных генетических вариантов, ассоциированных с наиболее характерными заболеваниями собак данной породы.
[00102] В некоторых случаях, когда различные мутантные генетические варианты находятся в одном локусе, в переделах 50-180 пн, разные группы премиксов в одной тест-системе могут включать одинаковые праймеры. При этом нормальный и мутантный зонды в каждой группе будут свои.
[00103] Приведенные выше в примерах количества премиксов – 8, 95 и 96 – определяются стандартным количеством пробирок в стрипе или количеством лунок в стандартной плашке, подходящих для большинства существующих на рынке амплификаторов для ПЦР-РВ. Однако количество премиксов в заявленной тест-системе может быть любым, но не менее 5.
[00104] Метод ПЦР-РВ крайне чувствителен к качеству ДНК-матрицы. Поэтому для эффективного и надежного генетического тестирования с применением заявленной тест-системы необходимо, чтобы образец ДНК тестируемой особи был очищен от примесей и ПЦР-ингибиторов. Чистота образца ДНК от примесей определяется с помощью спектрофоторметра. Так, спектрофотометрические параметры образца ДНК при соотношении длины волны A260/280 должны составлять 1.7-2.0. Наличие ПЦР-ингибиторов в растворе образца ДНК определяется по эффективности ПЦР. Так, скорость увеличения флуоресценции по одному из флуорофоров должна составлять не менее 10% за цикл. При этом также важна концентрация выделенной ДНК в растворе, полученном при выделении. При небольшой концентрации требуется увеличить количество раствора ДНК в реакционной смеси для ПЦР. Соответственно, может увеличиваться и количество ПЦР-ингибиторов, попадающих в реакционную смесь. Известные способы выделения ДНК из биологического материала являются трудоемкими и/или дорогостоящими, могут требовать высокой квалификации исполнителя, значительных временных затрат и трудозатрат, особенно если речь идет об одновременном выделении ДНК нескольких десятков особей. Этим объясняется необходимость разработки простого и недорогого способа выделения ДНК из биологического материала, не требовательного к навыкам исполнителя. Кроме того, способ выделения ДНК должен занимать минимально возможное количество времени и обеспечивать возможность масштабирования процесса выделения для одновременной пробоподготовки большого количества образцов.
[00105] Заявленный способ подходит для выделения ДНК из биологического материала, который может представлять собой кровь, волосы, кожу, части внутренних органов и различных тканей организма. В предпочтительном варианте реализации биологический материал представляет собой клетки буккального эпителия из ротовой полости. Процедура сбора буккального эпителия максимально проста, неинвазивна и не требует специальных навыков, условий и оборудования. Кроме того, образцы буккального эпителия достаточно стабильны и не нуждаются в специальных условиях хранения и транспортировки.
[00106] На первом этапе а) заявленного способа выделения ДНК биологический материал помещают в первый раствор, включающий протеазу, и инкубируют при 50-66°С в течение 15-120 минут. В предпочтительном варианте реализации инкубацию в первом растворе проводят при постоянном перемешивании с интенсивностью до 120 оборотов в минуту. Первый раствор также включает буферный агент, соль щелочного металла, хелатный агент и детергент. Соль щелочного металла повышает растворимость белков, что способствует очищению выделяемой ДНК от белковых примесей. В предпочтительном варианте реализации в качестве соли щелочного металла может быть использован NaCl, например, в количестве 250-600 мМ. Буферный агент поддерживает pH первого раствора на уровне около 7.5. В качестве буферного агента могут быть использованы, например, различные соли трис(гидроксиметил)аминометана или фосфатный буфер. В предпочтительном варианте реализации в качестве буферного агента используют Tris-HCl, как наиболее доступный буферный агент. Хелатный агент связывает ионы металлов, таким образом ингибируя действие многих металлозависимых нуклеаз. В некоторых вариантах реализации в качестве хелатного агента может быть использована EGTA (ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid). В предпочтительном варианте реализации в качестве хелатного агента используют EDTA (еthylenediaminetetraacetic acid). EDTA связывает ионы двухвалентных металлов, в частности ионы магния, что ингибирует активность многих ДНКаз. В качестве детергента могут быть использованы, например, Тween 20 или NP-40. В предпочтительном варианте реализации в качестве детергента используют SDS. Детергент осуществляет солюбилизацию биомембран и быструю денатурацию протеинов, что способствует инактивации нуклеаз. В качестве протеазы может быть использована любая подходящая часто щепящая протеаза, например, Dispase II. В предпочтительном варианте реализации используют протеиназу К как наиболее доступную часто щепящую протеазу.
[00107] б) Затем добавляют РНКазу и инкубируют в течение 3-30 минут при температуре 18-40ºС. Этот этап позволяет избавиться от РНК в итоговом образце ДНК. Если не избавиться от РНК, будет сложно определить качество и количество выделенной ДНК в итоговом образце. Кроме того, в некоторых случаях РНК может снижать эффективность ПЦР.
[00108] в) Затем к полученной на этапе б) смеси добавляют осаждающий реагент и тщательно перемешивают. В качестве осаждающего реагента может быть использован ацетат калия или этанол. В том случае, когда осаждающий реагент представляет собой ацетат калия, смесь инкубируют при температуре от -5 до + 5ºС в течение 5-30 минут, после чего осадок отделяют от супернатанта с помощью центрифугирования. Центрифугирование проводят с ускорением 13000-22000 в течение 5-15 минут. Затем осадок удаляют. Полученный супернатант используют далее на этапе г).
[00109] г) К полученной на этапе в) смеси добавляют второй раствор и тщательно перемешивают. В одном варианте реализации второй раствор включает хаотропный агент, хелатный агент и буферный агент, поддерживающий рН 6.0-6.8. «Кислый» рН необходим для связывания ДНК с сорбентом на следующем этапе способа. Хаотропный агент денатурирует и переводит в растворимую форму белковые молекулы, что позволяет в дальнейшем избавится от белковых примесей в растворе ДНК. В качестве хаотропного агента могут быть использованы различные соли гуанидина. В предпочтительном варианте реализации в качестве хаотропного агента используют гуанидин изотиоцианат. При этом второй раствор включает 30-65% m/v гуанидин изотиоцианата. В предпочтительном варианте реализации в качестве хелатного агента используют EDTA в количестве 15-40 mM, а в качестве буферного агента Tris-ацетат в количестве 15-40 mM. В еще одном варианте реализации, когда биологический материал представляет собой буккальный эпителий, второй раствор не включает хаотропного агента. Это значительно снижает себестоимость процедуры выделения ДНК, а также снижает опасность процедуры выделения ДНК для исследователя и для окружающей среды.
[00110] д) Полученную на этапе г) смесь фильтруют через сорбент. В одном варианте реализации сорбент представляет собой отдельные частицы, выполненные из мелкодисперсного стекла. В другом варианте реализации сорбент представляет собой фильтр, выполненный из стекловолокна. В еще одном варианте изобретения сорбент представляет собой магнитные частицы, имеющие силикатную поверхность. В предпочтительном варианте изобретения сорбент представляет собой фильтр, выполненный из стекловолкна, и расположенный в микроколонке, которая может быть помещена в стандартную пробирку для центрифугирования. Такая микроколонка называется спин-микроколонка. Использование спин-микроколонки значительно ускоряет процедуру выделения ДНК. При этом использование вакуумного нанесения образца и вакуумной фильтрации через микроколонку дополнительно сокращают временные затраты на выделение ДНК на 20-30%. После фильтрации удаляют фильтрат. При этом ДНК остается связанной с сорбентом.
[00111] е) Сорбент со связанной ДНК промывают третьим раствором, который содержит хаотропный агент, 25-50 % v/v этанол, буферный агент, поддерживающий рН 5.5-6.8. При этом третий раствор содержит значительно меньше хаотропного агента, чем второй раствор. С одной стороны, наличие хаотропного агента позволяет дополнительно очистить ДНК от белковых примесей. С другой стороны, относительно невысокое содержание хаотропного агента, позволяет легко избавиться от него в конечном препарате ДНК. В предпочтительном варианте реализации третий раствор содержит 12-30% m/v гуанидин изотиоцианата в качестве хаотропного агента, а также 10-20 mM Tris-HCl в качестве буферного агента. Благодаря «кислому» рН и присутствию этанола в третьем растворе ДНК остается нерастворимой и связанной с сорбентом. После промывания порцию третьего раствора удаляют.
[00112] ж) Затем сорбент промывают четвертым раствором, который включает 70-80 % v/v этнола, соль и буферный агент, поддерживающий рН от приблизительно 7,0 до приблизительно 7,7. Соль в составе раствора повышает растворимость белков, что позволяет лучше очистить выделяемую ДНК от белковых примесей. В одном варианте реализации в качестве соли может быть использован NaCl в количестве около 0,05-0,15  М, в качестве буферного агента – 10-20 mM Tris-HCl. В другом варианте реализации в качестве соли и буферного агента используют фосфатный буфер. После промывания порцию четвертого раствора удаляют. Благодаря присутствию этанола в четвертом растворе ДНК остается связанной с сорбентом. В некоторых случаях сорбент инкубируют с порцией четвертого раствора 1-5 мин при температуре 18-40ºС перед центрифугированием.
[00113] Добавляют пятый раствор и инкубируют при температуре 18-40ºС в течение 3-10 мин. Пятый раствор содержит воду и буферный агент для поддержания pH 8.5. При таком рН ДНК теряет связь с сорбентом и переходит в раствор, который отделяют от сорбента путем центрифугирования. Буферный агент не должен ингибировать дальнейшую ПЦР, в которой используют выделенную ДНК. В предпочтительном варианте реализации буферный агент представляет собой 10-20 mM Tris-HCl. При этом пятый раствор не содержит дополнительных компонентов, например, EDTA, которые призваны защищать ДНК от расщепления нуклеазами, однако могут ингибировать ПЦР. После инкубации сорбента с пятым раствором, ДНК элюируют с помощью центрифугирования. Полученный раствор содержит образец ДНК для дальнейшего анализа.
[00114] Заявленный способ позволяет выделять ДНК высокого качества из разных типов биологического материала. Например, заявленный способ позволяет выделять ДНК из клеток буккального эпителия ротовой полости, собранных с использованием буккального зонда, представляющего собой пластиковый стержень с волокнистым наконечником, деревянной палочки, косметической палочки с ватным наконечником и т.д. Причем собранные образцы могут быть отправлены на анализ в лабораторию обычной почтой. При этом заявленный способ позволяет из одного образца биологического материала выделить ДНК высокого качества с концентрацией от приблизительно 5 нг/мкл до приблизительно 120 нг/мкл в количестве, достаточном для анализа десятков генетических вариантов у одной особи. Причем выделение ДНК указанным способом занимает около одного часа. Кроме того, выделенная ДНК оказывается очищенной не только от ПЦР-ингибиторов, но и от нуклеаз. Благодаря этому ДНК, выделенная заявленным способом, может храниться при температуре ниже -20ºС на протяжении нескольких лет.
[00115] Заявленное изобретение включает способ применения описанной тест-системы. Как уже отмечалось выше, ПЦР-РВ очень чувствительна к качеству ДНК-матрицы. Соответственно, качество, надежность и скорость получения результатов генетического тестирования с применением заявленной тест-системы зависит от качества пробоподготовки, в первую очереди от качества и эффективности выделения ДНК из биологического материала тестируемой особи. Поэтому в предпочтительном варианте способ применения заявленной тест-системы включает в себя выделение ДНК из биологического материала заявленным способом выделения ДНК. Именно этот способ позволяет выделять ДНК высокого качества и в таком количестве, которого достаточно для анализа не одного, а десятков генетических вариантов. При этом не требуются большие количества биологического материала. Так из одного соскоба буккального эпителия, может быть выделено достаточное количество ДНК для анализа 20 и более разных генетических вариантов.  Кроме того, заявленный способ отличается высокой скоростью выделения ДНК, что позволяет легко масштабировать применение заявленной тест-системы для одновременного тестирования десятков разных особей.
[00116] Способ применения заявленной тест-системы включает, собственно, проведение ПЦР-РВ. Для этого в один из премиксов, не содержащих референсных образцов ДНК, добавляют не более 50 нг образца ДНК тестируемой особи для проведения тестовой реакции. При этом объем образца ДНК составляет не более 40% v/v от общего объема реакционной смеси. При необходимости к этому же премиксу добавляют воду до получения необходимого объема реакционной смеси. В том случае, если тест-система содержит лиофилизированные премиксы, ко всем премиксам добавляют воду до получения необходимого объема реакционной смеси.
[00117] В одном из вариантов реализации, когда вся тест-система состоит из пяти премиксов, образец ДНК тестируемой особи добавляют только к одному премиксу, не содержащему референсных образцов ДНК. Это позволяет провести одну тестовую реакцию для определения наличия и представленности одного мутантного генетического варианта в генотипе одной особи.
[00118] В другом варианте реализации образец ДНК тестируемой особи добавляют к нескольким премиксам, не содержащим референсных образцов ДНК. Это позволяет провести  несколько тестовых реакций для определения наличия и представленности нескольких мутантных генетических вариантов в генотипе одной особи.
[00119] Еще в одном варианте реализации образцы ДНК нескольких тестируемых особей добавляют к нескольким премиксам, не содержащим референсных образцов ДНК. При этом к каждому из указанных премиксов, не содержащих референсных образцов ДНК, добавляют один образец ДНК. Это позволяет провести  несколько тестовых реакций, которые могут служить для определения наличия и представленности как одного, так и нескольких мутантных генетических вариантов в генотипах нескольких разных особей.
[00120] После добавления к соответствующим премиксам образца ДНК тестируемой особи, а также после добавления к премиксам воды при необходимости, проводят тестовую и контрольные реакции с использованием амплификатора, пригодного для проведения ПЦР-РВ.
[00121] Для анализа результатов ПЦР-РВ используют численные данные о параметрах реакции, а также их визуальное представление в виде кинетических кривых. При этом отрицательный контроль используют для того, чтобы убедиться в специфичности, как тестовой реакции, так и остальных контролей.
[00122] Для того чтобы сделать вывод о наличии и представленности мутантного генетического варианта в генотипе тестируемой особи, используют две основных методики. В одном варианте реализации визуально сравнивают кинетические кривые, полученные в тестовой реакции, с кинетическими кривыми, полученными в контрольных реакциях. Наибольшее сходство с одной из контрольных реакций – нормальной, мутантной или гетерозиготной – позволяет говорить о том, что тестируемая особь является гомозиготой по нормальному генетическому варианту, мутантному генетическому варианту или гетерозиготой, соответственно.
F1
F2
F1
F2
F1
F1
[00123] В другом варианте реализации вывод о наличии и представленности мутантного генетического варианта в генотипе тестируемой особи делают на основе численных параметров тестовой реакции и контрольных реакций. При этом для каждой реакции вычисляют значение относительной флуоресценции (ОФ) по следующей формуле: (RFU-RFU)/(RFU+RFU), где RFU соответствует уровню свечения первого флуорофора, а RFU соответствует уровню свечения второго флуорофора, измеренного в относительных единицах светимости (RFU). Затем вычисляют модуль разницы ОФ между тестовой реакцией и каждой из контрольных реакций. Выбирают ту контрольную реакцию, для которой модуль разницы ОФ с тестовой реакцией составляет не более 0,2. Исходя из этого, заключают, что по представленности мутантного генетического варианта тестируемая ДНК соответствует референсному образцу ДНК в выбранном контроле. Таким образом, делают вывод о генотипическом статусе тестируемой особи.
[00124] В предпочтительном варианте реализации используют как визуальное сравнение кинетических кривых, так и метод вычислений, описанный выше.
[00125] Использование заявленного способа выделения ДНК, архитектура заявленной тест-системы и применение заявленного алгоритма для анализа результатов ПЦР-РВ позволяют значительно сократить время генетического теста. Например, время полного цикла анализа одного генотипа на наличие и представленность одного мутантного генетического варианта составляет менее 2,5 часов. При этом полный цикл тестирования включает пробоподготовку, постановку и проведение ПЦР-РВ и анализ полученных результатов. Время полного цикла анализа, с применением тест-системы, включающей 96 премиксов, составляет менее 5 часов.
Описание реализации изобретения
[00126] Пример 1. Варьирование параметров способа выделения ДНК.
[00127] В данном примере выделяли геномную ДНК из соскобов буккального эпителия, взятых с помощью буккального зонда. Было опробовано несколько протоколов выделения ДНК, отвечающих заявленному способу выделения ДНК, но отличающихся некоторыми деталями. Во всех протоколах использовали микроколонки, содержащие сорбент в виде фильтра, выполненного из стекловолокна.
[00128] Согласно протоколу №1 в пробирку вносили  порцию первого раствора, включающего 250 мМ NaCl. Добавляли раствор протеиназы К и тщательно перемешивали. Затем в указанную пробирку вносили буккальный зонд, содержащий клетки буккального эпителия. Удаляли верхнюю часть зонда, закрывали крышку пробирки и инкубировали при 65ºС в течение 30 минут при постоянном перемешивании. Кончик буккального зонда удаляли из пробирки. К смеси, оставшейся в пробирке добавляли раствор РНКазы А и инкубировали 5 минут при комнатной температуре.
[00129] Затем в пробирку добавляли раствор ацетата калия, тщательно перемешивали и инкубировали на льду 5 минут. Затем центрифугировали 5 минут при 15000 g. Супернатант переносили в новую пробирку.
[00130] К супернатанту добавляли равный объем второго раствора, включающего гуанидин изотиоцианат, и тщательно перемешивали. Полученную смесь переносили в микроколонку, вставленную в пробирку-приемник, и центрифугировали. Фильтрат из пробирки-приемника удаляли.
[00131] Микроколонку дважды промывали третьим раствором, каждый раз удаляя фильтрат. Затем микроколонку дважды промывали четвертым раствором, каждый раз удаляя фильтрат. Микроколонку дополнительно центрифугировали один раз без внесения новых порций растворов, чтобы избавиться от остатков четвертого раствора.Затем в микроколонку внесли порцию пятого раствора и инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Элюировали ДНК путем центрифугирования и удалили микроколонку. Полученный раствор содержал очищенную геномную ДНК.
[00132] Согласно протоколу №2 в пробирку вносили порцию первого раствора, включающего 420 мМ NaCl. Добавляли раствор протеиназы К и тщательно перемешивали. Затем в указанную пробирку вносили буккальный зонд, содержащий клетки буккального эпителия. Удаляли верхнюю часть зонда, закрывали крышку пробирки и инкубировали при 65ºС в течение 30 минут при постоянном перемешивании. Кончик буккального зонда удаляли из пробирки. К смеси, оставшейся в пробирке добавляли раствор РНКазы А и инкубировали 5 минут при комнатной температуре.
[00133] Затем в пробирку добавляли порцию мкл 96% v/v этанола и тщательно перемешивали. К полученной смеси добавляли второй раствор, включающего 65% m/v гуанидин изотиоцианата, 15 mM EDTA и 15 mM Tris-ацетат, и тщательно перемешивали. Полученную смесь переносили в микроколонку, вставленную в пробирку-приемник, и центрифугировали. Фильтрат из пробирки-приемника удаляли.
[00134] Микроколонку дважды промывали третьим раствором, каждый раз удаляя фильтрат. Затем микроколонку дважды промывали четвертым раствором, каждый раз удаляя фильтрат. Микроколонку дополнительно центрифугировали один раз без внесения новых порций растворов, чтобы избавиться от остатков четвертого раствора.Затем в микроколонку внесли порцию пятого раствора и инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Элюировали ДНК путем центрифугирования и удалили микроколонку. Полученный раствор содержал очищенную геномную ДНК.
[00135] Согласно протоколу №3 в пробирку вносили порцию первого раствора, включающего 600 мМ NaCl. Добавляли раствор протеиназы К и тщательно перемешивали. Затем в указанную пробирку вносили буккальный зонд, содержащий клетки буккального эпителия. Удаляли верхнюю часть зонда, закрывали крышку пробирки и инкубировали при 65ºС в течение 30 минут при постоянном перемешивании. Кончик буккального зонда удаляли из пробирки. К смеси, оставшейся в пробирке добавляли раствор РНКазы А и инкубировали 5 минут при комнатной температуре.
[00136] Затем в пробирку добавляли 96% v/v этанол и тщательно перемешивали. К полученной смеси добавляли второй раствор, включающийо 35% m/v гуанидин изотиоцианата, 40 mM EDTA и 40 mM Tris-ацетат, и тщательно перемешивали. Полученную смесь переносили в микроколонку, вставленную в пробирку-приемник, и центрифугировали. Фильтрат из пробирки-приемника удаляли.
[00137] Микроколонку дважды промывали третьим раствором, каждый раз удаляя фильтрат. Затем микроколонку дважды промывали четвертым раствором, каждый раз удаляя фильтрат. Микроколонку дополнительно центрифугировали один раз без внесения новых порций растворов, чтобы избавиться от остатков четвертого раствора.Затем в микроколонку внесли порцию пятого раствора и инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Элюировали ДНК путем центрифугирования и удалили микроколонку. Полученный раствор содержал очищенную геномную ДНК.
[00138] Согласно каждому из описанных протоколов было выделено по 4 образца геномной ДНК. Также для сравнения эффективности протоколов из клеток буккального эпителия было выделено 4 образца геномной ДНК стандартным методом фенол-хлороформной экстракции (ФХ).
[00139] Аликвоты некоторых образцов были проанализированы на гель-электрофорезе (TAE, 1% агароза) (Фиг. 1). На дорожки 1-8 были нанесены образцы N03, N04, N07, N08, N11, N12, N15, N16, соответственно. M – маркер (М11, «СибЭнзим», Россия). Концентрации и чистоту полученных образцов ДНК измеряли при помощи спектрофотометра Nanodrop 2000. Характеристики полученных образцов выделенной ДНК приведены в Таблице 2. Видно, что протоколы 1-3 позволяют выделять значительное количество ДНК с хорошими спектрофоретическими параметрами.
[00140] Таблица  1.  Характеристики  препаратов  геномной  ДНК,  выделенной  из  буккального эпителия согласно протоколам 1-3.
Образец, №
Протокол
Концентрация ДНК, нг/мкл
A260/280
Суммарное количество выделенной ДНК, нг
N01
1
15.9
1.86
1590
N02
1
9.7
1.96
970
N03
1
9.9
1.99
990
N04
1
8.1
1.92
810
N05
2
14.6
1.94
1460
N06
2
10.3
1.91
1030
N07
2
12
1.85
1200
N08
2
5.5
1.89
550
N09
3
12.8
1.91
1280
N10
3
10
1.97
1000
N11
3
15.6
1.91
1560
N12
3
7.9
1.93
790
N13
ФХ
35.6
1.99
3560
N14
ФХ
24.5
1.92
2460
N15
ФХ
17.3
1.83
1730
N16
ФХ
8.9
1.82
890
[00141] Пример 2. Исследование эффективности извлечения ДНК заявленным способом.
[00142] Для того, чтобы установить, насколько эффективно описанные протоколы 1-3 позволяют извлекать ДНК из раствора был выполнен следующий тест. В каждом из протоколов в пробирку с первым раствором и протеиназой К вместо биологического образца вносили известное количество ДНК. Для этой цели использовали препарат ДНК-маркера (М11, «СибЭнзим», Россия) в количестве 2 мкг на каждое выделение. Тест на извлечение в трех повторах был проведен для протоколов 1-3.
[00143] Равные аликвоты препаратов ДНК, выделенных протоколами 1-3 были проанализированы на гель-электрофорезе (TAE, 1% m/v агароза) (Фиг. 2). Дорожки помечены цифрами согласно протоколам, по которым были выделены нанесенные образцы. На дорожку, обозначенную M, нанесен тот же маркер, который использовался в тесте. Концентрации полученных препаратов ДНК измеряли при помощи спектрофотометра Nanodrop 2000. Характеристики препаратов ДНК, извлеченных с помощью протоколов 1-3, приведены в Таблице 2.
[00144] В результате было установлено, что все три протокола позволяют извлекать не менее 80% ДНК, причем протокол №3 дает чуть превосходящие остальные протоколы результаты.
[00145] Таблица 2. Эффективность извлечения ДНК при использовании протоколов 1-3.
Протокол
Концентрация, нг/мкл
A260/280
Эффективность извлечения, %
Эффективность извлечения, %
№3
17.9
1.92
89.5
89.00±1.80
17.4
1.87
87.0
18.1
1.91
90.5
№2
17.6
1.89
88.0
87.83±0.76
17.4
1.88
87.0
17.7
1.93
88.5
№1
16.5
1.82
82.5
84.50±1.80
17.0
1.75
85.0
17.2
1.83
86.0
[00146] Пример 3. Исследование наличия ПЦР-ингибиторов в растворе ДНК, выделенной заявленным способом.
[00147] В примере 1 показано, что протоколы 1-3 позволяют выделить ДНК с хорошими спектрофотометрическими параметрами. Однако спектрофотометрический анализ не позволяет оценить присутствие ПЦР-ингибиторов, наличие которых в реакционной смеси может приводить к снижению эффективности, либо к полной остановке ПЦР.
[00148] Для проверки наличия ПЦР-ингибиторов, были проведены ПЦР, где в качестве матрицы использовались образцы геномной ДНК, выделенные в Примере 1. Для каждого образца ДНК было поставлено по три реакции, в которых объем исходного образца занимал одну 1/20, 1/4 и 1/2 от общего объема реакционной смеси. Общий объем реакционной смеси составлял 20 мкл, смесь была приготовлена с использованием смеси БиоМастер HS-qPCR для проведения ПЦР («Биолабмикс», Россия) и праймеров для амплификации фрагментов генов SLC2A9. По завершении ПЦР половина каждой реакционной смеси была нанесена на гель-электрофорез (Фиг. 3).
[00149] На дорожки 1-8 были нанесены аликвоты реакционных смесей, в которых использовалось по 1 мкл образцов геномной ДНК N03, N04, N07, N08, N11, N12, N15, N16, соответственно. На дорожки 9-16 были нанесены аликвоты реакционных смесей, в которых использовалось по 5 мкл образцов геномной ДНК N03, N04, N07, N08, N11, N12, N15, N16, соответственно. На дорожки 17-24 были нанесены аликвоты реакционных смесей, в которых использовалось по 10 мкл образцов геномной ДНК N03, N04, N07, N08, N11, N12, N15, N16, соответственно. К – отрицательный контроль, который представляет собой аликвоту реакционной смеси, в которую вместо раствора ДНК добавляли чистую воду. Видно, что ПЦР прошли во всех случаях. Важно отметить, что 1 мкл исходных образцов было достаточно для получения специфического продукта. При этом в случае образца N8 количество геномной ДНК составляло 5.5 нг. Вместе с тем, даже при значительном превышении необходимого количества матрицы не происходит ингибирования ПЦР, что означает, что ДНК, выделенная согласно заявленному способу не содержит значимых количеств ПЦР-ингибиторов.
[00150] Пример 4. Исследование пригодности ДНК, выделенной заявленным способом, для использования в ПЦР-РВ.
SOD1
Canis lupus
[00151] Для проведения ПЦР-РВ использовали заявленную тест-систему, содержащую премиксы, включающие праймеры, специфические для локуса  собаки (), а также нормальный и мутантный зонды, специфические для генетического варианта, ассоциированного с проявлением дегенеративной миелопатии. При этом нормальный зонд содержал флуорофор FAM, а мутантный зонд – флуорофор VIC. Три премикса дополнительно включали искусственные референсные образцы ДНК на основе плазмидных векторов. К этим премиксам не добавляли никакие дополнительные компоненты. К другому премиксу, не содержащему какой-либо ДНК-матрицы, добавляли воду (вместо ДНК) для получения негативного контроля. Остальные премиксы использовали для получения тестовых реакций путем добавления к каждому премиксу 1-5 мкл одного из образцов ДНК, выделенных в примере 1. Результаты ПЦР-РВ представлены в Таблице 3. Нумерация реакций совпадает с нумерацией образцов ДНК, выделенных в Примере 1. Мутантная контрольная реакция обозначена М/M, гетерозиготная контрольная реакция обозначена WT/M, нормальная контрольная реакция обозначена WT/WT. Ct – пороговый цикл. Видно, что во всех тестовых реакциях первым достигает порогового уровня свечение по каналу FAM. Причем разница между пороговыми циклами для FAM и VIC в тестовых реакциях составляет не менее 4. Это говорит о том, что все тестируемые особи являются гомозиготами по нормальному генетическому варианту. Кроме того можно видеть, что в случае всех тестируемых образцов ДНК, пороговый цикл был достигнут до 30 цикла, что свидетельствует в пользу надежности результатов. Также можно видеть, что в мутантной контрольной реакции первым достигает порогового уровня свечение по каналу VIC. При этом Сt для VIC менее 30, а разница между пороговыми циклами для FAM и VIC составляет около 10. В нормальной контрольной реакции первым достигает порогового уровня свечение по каналу FAM. При этом Сt для FAM также менее 30, а разница между пороговыми циклами для FAM и VIC составляет около 4. А в гетерозиготной контрольной реакции пороговые циклы для FAM и VIC приблизительно равны, что говорит о примерно равном содержании нормального и мутантного генетических варинатов в реакционной смеси. Из представленных результатов можно сделать два вывода. Во-первых,  ДНК, выделенная заявленным способом, пригодна для использования в ПЦР-РВ. Во-вторых, заявленная тест-система позволяет надежно отличать гомозиготу по нормальному генетическому варианту от гомозиготы по мутантному генетическому варианту, и обе гомозиготы отличать от гетерозиготного носителя.
[00152] Таблица 3. Проверка пригодности образцов геномной ДНК, выделенной заявленным способом.
Реакция
FAM, Ct
VIC, Ct
ΔCt
N03
26.82
32.13
-5.31
N04
27.16
32.36
-5.2
N07
26.63
31.24
-4.61
N08
28.05
32.76
-4.71
N11
26.15
30.65
-4.5
N12
27.40
31.88
-4.48
N15
26.44
30.82
-4.38
N16
27.69
32.17
-4.48
M/M
35.92
25.77
10.15
WT/M
28.03
28.02
0.01
WT/WT
25.24
29.45
-4.21
[00153] Из результатов, представленных в Примерах 1-4, видно, что все протоколы, отвечающие заявленному способу, позволяют получить образцы ДНК надлежащего качества и в количестве, достаточном для проведения дальнейшего анализа. Вместе с тем, протоколы, основанные на использовании микроколонок ожидаемо оказались значительно быстрее и удобнее для исполнения, нежели классическая методика фенол-хлороформной экстракции, что позволило снизить временные затраты на пробоподготовку более чем в два раза (Таблица 4).
[00154] Кроме того, в серийных выделениях, количество ДНК в образцах, полученных по описанным протоколам, воспроизводились значительно лучше, чем при выделении методом фенол-хлороформной экстракции. Важно отметить, что при работе с соскобами буккального эпителия, количество материала, содержащегося на отдельном зонде, может варьироваться в широких пределах, что зависит от множества факторов, в частности от качества проведенного забора материала. Поэтому получение воспроизводимых результатов в отношении качества и эффективности извлечения ДНК может быть важнее для стандартизованной постановки анализов, чем абсолютное количество полученного материала. Описанные протоколы №1-3 оказались достаточно близки по конечным характеристикам, но при этом протокол №3 показал наилучшие результаты и является наиболее предпочтительным вариантом реализации заявленного способа.
[00155] Таблица 4. Сравнительные характеристики протоколов выделения ДНК.
Протокол выделения
Концентрация ДНК, нг/мкл
A260/280
Эффективность извлечения ДНК, %
Наличие ПЦР-ингибиторов
Время процедуры, мин
Протокол 1
10.9±3.4
1.93±0.05
84.50±1.80
-
70
Протокол 2
10.6±3.8
1.89±0.03
87.83±0.76
-
55
Протокол 3
11.6±3.35
1.93±0.02
89.00±1.80
-
55
ФХ
21.5±11.31
1.89±0.08
Не опеределяли
-
115
[00156] Пример 5. Использование заявленной тест-системы для генетического тестирования на наличие и представленность мутантного генетического варианта, ассоциированного с недостаточностью фактора VII.
F7
F7
[00157] Для проведения анализа использовали заявленную тест-систему, содержащую премиксы, включающие праймеры, специфические для локуса  собаки, а также нормальный зонд и мутантный зонд, специфический для мутантного генетического варианта (замена c.407G>A в гене ). При этом нормальный зонд содержал флуорофор FAM, а мутантный зонд – флуорофор VIC. Три премикса дополнительно включали искусственные референсные образцы ДНК на основе плазмидных векторов. К этим премиксам не добавляли никакие дополнительные компоненты. К другому премиксу, не содержащему какой-либо ДНК-матрицы, добавляли воду (вместо ДНК) для получения негативного контроля. К еще одному премиксу, не содержащему какой-либо ДНК-матрицы, добавляли 1 мкл раствора геномной ДНК, выделенной из соскоба буккального эпителия собаки согласно заявленному способу.
[00158] На Фиг. 4А-Д показаны кинетические кривые, отражающие свечение флуорофоров в каждой реакционной смеси. По оси абсцисс отмечены циклы амплификации, по оси ординат – уровень свечения в реакционной смеси, измеренный в относительных единицах флуоресценции (RFU). Кривые, отмеченные кружками, соответствуют свечению FAM, кривые, отмеченные крестиками, соответствуют свечению VIC. На Фиг. 4А показаны кривые, полученные в тестовой реакции, на Фиг. 4Б –в нормальной контрольной реакции, на Фиг. 4В – в мутантной контрольной реакции, на Фиг. 4Г – в гетерозиготной контрольной реакции, на Фиг. 4Д – в негативной контрольной реакции.
[00159] Визуально сравнивая кривые, полученные в тестовой реакции, с кривыми, полученными в контрольных реакциях, легко определить, что тестируемая особь является гомозиготой по нормальному генетическому варианту, то есть вообще не содержит мутантный генетический вариант в своем генотипе.
[00160] Пример 6. Использование заявленной тест-системы для генетического тестирования на наличие и представленность мутантного генетического варианта, ассоциированного с ганглиозидозом GM1.
GLB1
GLB1
[00161] Для проведения анализа использовали заявленную тест-систему, содержащую премиксы, включающие праймеры, специфические для локуса  собаки, а также нормальный зонд и мутантный зонд, специфический для мутантного генетического варианта (делеция c.297delC в гене ). При этом нормальный зонд содержал флуорофор FAM, а мутантный зонд – флуорофор VIC. Три премикса дополнительно включали искусственные референсные образцы ДНК на основе плазмидных векторов. К этим премиксам не добавляли никакие дополнительные компоненты. К другому премиксу, не содержащему какой-либо ДНК-матрицы, добавляли воду (вместо ДНК) для получения негативного контроля. К еще одному премиксу, не содержащему какой-либо ДНК-матрицы, добавляли 1 мкл раствора геномной ДНК, выделенной из соскоба буккального эпителия собаки согласно заявленному способу.
[00162] На Фиг. 5А-Д показаны кинетические кривые, отражающие свечение флуорофоров в каждой реакционной смеси. По оси абсцисс отмечены циклы амплификации, по оси ординат – уровень свечения в реакционной смеси, измеренный в относительных единицах флуоресценции (RFU). Кривые, отмеченные кружками, соответствуют свечению FAM, кривые, отмеченные крестиками, соответствуют свечению VIC. На Фиг. 5А показаны кривые, полученные в тестовой реакции, на Фиг. 5Б – в нормальной контрольной реакции, на Фиг. 5В – в мутантной контрольной реакции, на Фиг. 5Г – в гетерозиготной контрольной реакции, на Фиг. 5Д – в негативной контрольной реакции.
[00163] Визуально сравнивая кривые, полученные в тестовой реакции, с кривыми, полученными в контрольных реакциях, можно заключить, что тестируемая особь является гетерозиготой по мутантному генетическому варианту. Таким образом, проведенный генетический анализ показал, что тестируемая особь является носителем мутации, и соответственно, при скрещивании с таким же носителем с вероятностью 25% будет производить потомков, больных ганглиозидозом.
[00164] Пример 7. Использование заявленной тест-системы для генетического тестирования на наличие и представленность мутантного генетического варианта, ассоциированного с прогрессирующей атрофией сетчатки rcd3-PRA.
PDE6A
PDE6A
[00165] Для проведения анализа использовали заявленную тест-систему, содержащую премиксы, включающие праймеры, специфические для локуса  собаки, а также нормальный зонд и мутантный зонд, специфический для мутантного генетического варианта (делеция c.1940delA в гене ). При этом нормальный зонд содержал флуорофор FAM, а мутантный зонд – флуорофор VIC. Три премикса дополнительно включали искусственные референсные образцы ДНК на основе плазмидных векторов. К этим премиксам не добавляли никакие дополнительные компоненты. К другому премиксу, не содержащему какой-либо ДНК-матрицы, добавляли воду (вместо ДНК) для получения негативного контроля. К еще одному премиксу, не содержащему какой-либо ДНК-матрицы, добавляли 1 мкл раствора геномной ДНК, выделенной из соскоба буккального эпителия собаки согласно заявленному способу.
[00166] На Фиг. 6А-Д показаны кинетические кривые, отражающие свечение флуорофоров в каждой реакционной смеси. Кривые, отмеченные кружками, соответствуют свечению FAM, кривые, отмеченные крестиками, соответствуют свечению VIC. На Фиг. 6А показаны кривые, полученные в тестовой реакции, на Фиг. 6Б –  в нормальной контрольной реакции, на Фиг. 6В – в мутантной контрольной реакции, на Фиг. 6Г – в гетерозиготной контрольной реакции, на Фиг. 6Д – в негативной контрольной реакции.
[00167] Визуально сравнивая кривые, полученные в тестовой реакции, с кривыми, полученными в контрольных реакциях, можно заключить, что тестируемая особь является гомозиготой по нормальному генетическому варианту, то есть вообще не содержит мутантный генетический вариант в своем генотипе.
[00168] Пример 8. Использование заявленной тест-системы для генетического тестирования на наличие и представленность мутантного генетического варианта, ассоциированного с прогрессирующей атрофией сетчатки PAP1-PRA.
CNGB1
CNGB1
[00169] Для проведения анализа использовали заявленную тест-систему, содержащую премиксы, включающие праймеры, специфические для локуса  собаки, а также нормальный зонд и мутантный зонд, специфический для мутантного генетического варианта (мутация c.2685delA2687_2688insTAGCTA в гене ). При этом нормальный зонд содержал флуорофор FAM, а мутантный зонд – флуорофор VIC. Три премикса дополнительно включали искусственные референсные образцы ДНК на основе плазмидных векторов. К этим премиксам не добавляли никакие дополнительные компоненты. К другому премиксу, не содержащему какой-либо ДНК-матрицы, добавляли воду (вместо ДНК) для получения негативного контроля. К еще одному премиксу, не содержащему какой-либо ДНК-матрицы, добавляли 1 мкл раствора геномной ДНК, выделенной из соскоба буккального эпителия собаки согласно заявленному способу.
[00170] На Фиг. 7А-Д показаны кинетические кривые, отражающие свечение флуорофоров в каждой реакционной смеси. Кривые, отмеченные кружками, соответствуют свечению FAM, кривые, отмеченные крестиками, соответствуют свечению VIC. На Фиг. 7А показаны кривые, полученные в тестовой реакции, на Фиг. 7Б в нормальной контрольной реакции, на Фиг. 7В – в мутантной контрольной реакции, на Фиг. 7Г – в гетерозиготной контрольной реакции, на Фиг. 7Д – в негативной контрольной реакции.
[00171] Визуально сравнивая кривые, полученные в тестовой реакции, с кривыми, полученными в контрольных реакциях, можно заключить, что тестируемая особь является гетерозиготой по мутантному генетическому варианту, то есть носителем мутации ассоциированной с прогрессирующей атрофией сетчатки.
[00172] Пример 9. Использование заявленной тест-системы для генетического тестирования собак.
[00173] В данном примере представлены результаты, полученные с использованием заявленных тест-систем для выявления рецессивных мутантных генетических вариантов, ассоциированных с определенными наследственными заболеваниями собак. В качестве тестового образца ДНК использовали геномную ДНУ, выделенную из клеток буккального эпителия. При этом нормальный зонд содержал флуорофор FAM, а мутантный зонд – флуорофор VIC.
[00174] Результаты тестирования представлены в Таблице 5. В крайнем левом столбце указаны данные о заболеваниях и ассоциированных с ними мутантных генетических вариантах. Во втором столбце указаны типы реакций. Названия реакций следующие: тест – тестовая реакционная смесь, норма – нормальная контрольная реакция, мутант – мутантная контрольная реакция, гетерозигота – гетерозиготная контрольная реакция. Далее приведены численные параметры реакций. Обозначения следующие: FAM-VIC – разница в уровнях свечения флуорофоров FAM и VIC в одной реакции, измеренных в относительных единицах светимости (RFU). FAM+VIC – суммарное свечение флуорофоров FAM и VIC в одной реакции. ОФ – относительная флуоресценция, вычисленная для каждой реакции по формуле (FAM-VIC)/(FAM+VIC). ΔОФ – разница значений относительной флуоресценции в тестовой реакции и в контроле. Жирным шрифтом выделено значение ΔОФ, которое определяет вывод о генотипическом статусе тестируемой особи в каждом из приведенных примеров.
[00175] Таблица 5. Сравнительные характеристики кинетики реакций в примерах заявленной тест-системы.
Заболевание (мутация)
Реакция
FAM - VIC,FU
FAM + VIC,RFU
ОФ
ΔОФ
Вывод
недостаточность фактора VII(c.407G>A в гене F7)
Тест
1606
2228
0,721
Норма
Норма
1376
2382
0,578
0,143
Мутант
-1583
1647
-0,961
1,682
Гетерозигота
69
2375
0,029
0,692
ганглиозидоз GM1(c.297delC в гене GLB1)
Тест
703
2877
0,244
Гетерозигота
Норма
2150
2392
0,899
0,654
Мутант
-1418
1444
-0,982
1,226
Гетерозигота
653
2593
0,252
0,007
прогрессирующая атрофия сетчатки rcd3-PRA(c.1940delA в гене PDE6A)
Тест
255
423
0,603
Норма
Норма
327
561
0,583
0,020
Мутант
-999
1005
-0,994
1,597
Гетерозигота
-538
952
-0,565
1,168
прогрессирующая атрофия сетчатки PAP1-PRA(c.2685delA2687_2688insTAGCTA в гене CNGB1)
Тест
-41
2839
-0,014
Гетерозигота
Норма
2203
2213
0,995
1,010
Мутант
-1899
1903
-0,998
0,983
Гетерозигота
-332
2948
-0,113
0,098
нефропатия с потерей белка (P626R в гене KIRREL2)
Тест
-1061
1897
-0,559
Гетерозигота
Норма
1696
1720
0,986
1,545
Мутант
-1807
1801
-1,003
0,444
Гетерозигота
-825
1993
-0,414
0,145
наследственный энцефалит мопсов(c.172C>T в гене DQB1)
Тест
-4191
4239
-0,989
Мутант
«Норма»
4604
4634
0,994
1,982
Мутант
-3142
3286
-0,956
0,032
Гетерозигота
1518
6292
0,241
1,230
прогрессирующая атрофия сетчатки GR-PRA2(c.669delA в гене TTC8)
Тест
6223
6219
1,001
Норма
Норма
7591
7693
0,987
0,014
Мутант
-5653
5707
-0,991
1,991
Гетерозигота
524
5504
0,095
0,905
ихтиоз золотистых ретриверов(c.1445_1447delinsTACTACTA в гене PNPLA1)
Тест
310
2916
0,106
Гетерозигота
Норма
1996
2140
0,933
0,826
Мутант
-5653
5707
-0,991
1,097
Гетерозигота
482
2678
0,180
0,074
[00176] Все выводы, сделанные в данном примере на основе вычислений, приведенных в Таблице 5, соответствовали выводам, полученным на основе визуального сравнения кинетических кривых, полученных для этих же образцов.
[00177] В настоящих материалах заявки представлено предпочтительное раскрытие осуществления заявленного технического решения, которое не должно использоваться как ограничивающее иные, частные воплощения его реализации, которые не выходят за рамки испрашиваемого объема правовой охраны и являются очевидными для специалистов в соответствующей области техники.