Молекулярно- эпидемиологический анализ вспышки туляремии в Ставропольском крае в 2017 г.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Молекулярно-эпидемиологический анализ вспышки туляремии в Ставропольском крае в 2017 г

Гнусарева О.А., Котенев Е.С., Волынкина А.С., Чишенюк Т.И., Куличенко А.Н.

ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Цель работы - анализ результатов молекулярно-генетического типирования штаммов возбудителя туляремии, выделенных с января по апрель 2017 г. в Ставропольском крае.

Материал и методы. В работе использован 21 штамм F. tularensis holarctica биовар II, ery, изолированный в феврале-апреле 2017 г. из источников водоснабжения в с. Донская Балка и с. Константиновское (15 штаммов), от грызунов (5 штаммов) и из проб сена (1 штамм). Исследованные штаммы были выделены из материала, собранного в Петровском, Ипатовском и Шпаковском районах Ставропольского края. MLVA-типирование проводили на основании анализа 25 локусов, по методу, предложенному Johansson (2004 г.). Точный размер амплифицированных локусов определяли методом капиллярного секвенирования.

Результаты. Исследуемые штаммы F. tularensis относились к 8 MLVA-генотипам, отличавшимся по числу тандемных повторов в локусах FT-M3, FT-M6, FT-M10, FT-M20 и FT-M24. Анализ результатов MLVA-типирования показал генетические различия между штаммами, выделенными в пробах воды из источника водоснабжения с. Донская Балка, которые были отобраны до поступления в разводящую сеть, и взятыми из разводящей сети водопровода. Штаммы F. tularensis, изолированные из различных водопроводных систем в с. Константиновское, также принадлежали к разным MLVA-генотипам. Результаты MLVA-анализа штаммов F. tularensis, выделенных во время вспышки туляремии, подтверждают предположение о множественных источниках инфицирования воды в с. Константиновское и с. Донская Балка.

Ключевые слова:

туляремия, Francisella tularensis, молекулярно-генетическое типирование, MLVA-25, Ставропольский край

Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2018. Т. 7, № 3. С. 57-61.

doi: 10.24411/2305-3496-2018-13008 Статья поступила в редакцию: 18.10.2017. Принята в печать: 13.07.2018.

The outbreak of tularemia in the Stavropol Territory in 2017, molecular epidemiological analysis

Gnusareva O.A., Kotenev E.S., Volynkina A.S., Chishenyuk T.I., Kulichenko A.N.

Stavropol Research Anti-Plague Institute

Aim - molecular-genetic typing of tularemia strains, isolated during the period from January to April 2017 in the Stavropol Territory, the establishment of probable pathways and mechanisms of propagation of the pathogen.

Material and methods. In the work, 21 strains of F. tularensis holarctica biovar II, ery R were used, which isolated in February-April 2017 from water supply sources in the villages Donskaya Balka and Konstantinovs-koye (15), from rodents (5) and hay samples (1) collected in Petrovsky, Ipatovsky and Shpakovsky districts of the Stavropol Territory. MLVA typing was performed based on an analysis of 25 loci, according to the method proposed by Johansson, 2004. The exact size of the amplified loci was determined by capillary sequencing.

Results. The investigated strains of F. tularensis belonged to 8 MLVA-genotypes, differing in the number of tandem repeats in the loci of FT-M3, FT-M6, FT-M10, FT-M20 and FT-M24. Analysis of the results of MLVA-typing showed the presence of genetic differences between strains isolated in the source of water in Donskaya Balka, isolated from water samples taken before entering the breeding network, and water samples taken from the distributing water supply network. Strains F. tularensis, isolated from various water supply systems in the village. Konstantinovskoe also belonged to different MLVA-genotypes. The results of MLVA-analysis of strains of F. tularensis isolated during the period of tularemia outbreak confirm the assumption of multiple sources of infection of water sources in the villages Konstantinovskoe and Donskaya Balka.

Keywords:

biocenosis, infection, transmitters, natural foci, transmission, ecology, epidemiology

Infectious Diseases: News, Opinions, Training. 2018; 7 (3): 57-61.

doi: 10.24411/2305-3496-2018-13008 Received: 18.10.2017. Accepted: 13.07.2018.

В Ставропольском крае (СК) туляремия известна с 1938 г., когда впервые были выделены культуры туляремий-ного микроба от грызунов и выявлены 2 больных человека [1]. Многолетнее изучение показало, что на этой территории существует обширный и стойкий природный очаг туляремии, имеющий полигостальный и поливекторный характер и располагающийся на территории 4 ландшафтно-географических зон: лесостепной, степной, предгорной и полупустынной [2, 3].

В энзоотию туляремии в основном вовлекаются высоковосприимчивые к туляремии дикие млекопитающие 1-11 групп. Из 18 видов грызунов, обследованных на туляремию в СК в 1979-2015 гг., от 15 были выделены штаммы возбудителя туляремии: полевка обыкновенная, хомячок серый, мыши рода БуЫаетив (5. /иМре^ив и 5. ткгорв), мышь полевая, белозубка малая, ондатра, серая крыса, заяц-русак. Основная роль в поддержании природных очагов туляремии, зарегистрированных на территории края, принадлежит 3 видам иксодовых клещей с пастбищным типом питания: й. тагдтаЬив, й. геИсиЫив и Я. говвкив, а также гнездово-норовым - I. геё^копеу! и гамазовым клещам [4, 5].

Из 26 административных районов СК 18 находятся на энзоотичной по туляремии территории, в разные годы здесь регистрировались эпизоотии различной интенсивности или были зарегистрированы случаи заболевания людей [1]. С 1990 по 2016 г. в СК выявлено 62 больных туляремией в 12 из 26 административных районов. Наибольшее количество больных было в Ипатовском и Красногвардейском (11 человек), Грачевском (10 человек) и Петровском (7 человек) районах. Спорадическая заболеваемость людей туляремией в СК регистрируется практически ежегодно с увеличением количества заболевших в отдельные годы (2003-2005 гг., заболели 28 человек, в 2007 г. - 8 случаев заболевания, в 2012 г. - 10 заболевших туляремией) [3].

С декабря 2016 г. по март 2017 г. зарегистрировано 39 больных туляремией (в том числе 8 детей до 17 лет) в 7 административных районах СК и в Ставрополе. Наибольшее количество случаев заболевания туляремией выявлено в Петровском (15 человек), Ипатовском (10 человек) и Красногвардейском районах (5 человек). По данным эпидемиологического расследования случаи заболевания обусловлены реализацией контактного (при разделке зайцев, добытых на охоте в энзоотичных районах, и домашних кроликов) и фе-кально-орального механизмов передачи возбудителя туляремии (в том числе с возможной реализацией водного пути заражения среди жителей населенных пунктов Петровского района). Больным, заражение которых связано с употреблением инфицированной воды или продуктов питания, был поставлен предварительный диагноз «лакунарная ангина, фолликулярная ангина с лимфаденитом» [6, 7].

В результате лабораторного исследования образцов, собранных при проведении эпизоотологического обследования энзоотичных территорий с января по март 2017 г., был изолирован 21 штамм Е Ыагепв^в, в том числе 15 штаммов из проб воды, отобранных в населенных пунктах Петровского района, 5 штаммов от грызунов Ипатовского и Шпаковского районов, 1 штамм из пробы сена, отобранной в Петровском районе [6, 7].

Цель работы - анализ результатов молекулярно-генети-ческого типирования штаммов туляремии, выделенных с января по апрель 2017 г. в СК с установлением вероятных путей и механизмов распространения возбудителя.

Материал и методы

В работе использована 21 культура Е. 1и1агепв!в Ьо1агШса биовар II, егу Я (см. таблицу).

Выделение геномной ДНК проводили с использованием набора реагентов «Рибо-Преп» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия).

Результаты молекулярно-генетического типирования штаммов Е Магвпв1в, выделенных в январе-апреле 2017 г. в Ставропольском крае

№ £ Источник выделения Дата забо- Населен- Админи- Локусы мьл/л-

га н Я 1и!агвпв1в ра матери- ный пункт стративный РТ- РТ- РТ- рт- РТМ24 тип

3 ала район М3 М6 М10 М20

1 154 Вода - с. Донская Балка Петровский 20 5 2 3 2 1

Вода перед поступле-

2 137 нием в разводящую сеть на водопроводе «Нижний» 24.02.2017 с. Донская Балка Петровский 20 5 2 3 2 1

3 1 Вода питьевая из источника ХПВ «Хмыров» 26.01.2017 с. Донская Балка Петровский 20 5 2 3 2 1

4 58 Общественная полевка 03.02.2017 с. Донская Балка Петровский 20 5 2 3 2 1

5 26 Вода до хлорирования (ОСВ «Хлораторная») 30.01.2017 с. Донская Балка Петровский 20 5 2 3 2 1

Вода до поступления

6 115 в резервуар чистой воды водопровода «Калужская Балка» 18.02.2017 с. Констан-тиновское Петровский 20 5 2 3 2 1

7 126 Вода из источника на водопроводе «Калужская Балка» 24.02.2017 с. Констан-тиновское Петровский 20 5 2 3 2 1

Вода из резервуара

8 121 чистой воды водопровода «Калужская Балка» 20.02.2017 с. Констан-тиновское Петровский 20 5 2 3 2 1

Вода питьевая из во-

9 88 допровода «Калужская Балка», разводящая сеть 08.02.2017 с. Констан-тиновское Петровский 20 5 2 3 2 1

10 52 Сено 01.02.2017 с. Шведено Петровский 20 5 2 3 2 1

11 7 Вода питьевая из разводящей сети 26.01.2017 с. Донская Балка Петровский 20 4 2 3 2 2

12 21 Вода питьевая из разводящей сети 30.01.2017 с. Донская Балка Петровский 20 4 2 3 2 2

13 23 Вода питьевая из разводящей сети 30.01.2017 с. Донская Балка Петровский 20 5 11 3 1 3

14 17 Вода питьевая из разводящей сети 30.01.2017 с. Донская Балка Петровский 20 5 11 3 2 4

Вода до поступления

15 114 в резервуар чистой воды водопровода «Церковная Балка» 18.02.2017 с. Констан-тиновское Петровский 12 4 2 3 2 5

16 130 Вода из источника на водопроводе «Церковная Балка» 24.02.2017 с. Констан-тиновское Петровский 12 4 2 3 2 5

Вода из резервуара

17 120 чистой воды водопровода «Церковная Балка» 20.02.2017 с. Констан-тиновское Петровский 12 4 2 3 2 5

18 63 Белозубка малая 03.02.2017 с. Николи-на Балка Петровский 11 4 11 4 2 6

19 25 Полевка общественная с. Золото-ревка Ипатовский 11 4 2 4 2 7

20 21 6 145 Белозубка малая Заяц-русак - с. Николи-на Балка с. Надежда Петровский Шпаковский 11 11 4 4 2 2 4 3 2 2 7 8

Генетическое типирование выполняли методом MLVA на основании анализа 25 локусов, в соответствии с методикой Johansson (2004 г.) [8]. Определение точного размера амплифицированных локусов проводили методом капиллярного секвенирования на автоматическом секвенаторе ABI 3130 Genetic Analyser (Applied Biosystems, США) с набором реагентов Big Dye Terminator Kit v.3.1 MLVA-генотип штамма определяли на основании совокупности числа тан-демных повторов в локусах.

Биоинформационный анализ результатов MLVA-типирования штаммов F. tularensis выполняли в программе Start 2, для сравнения использовали MLVA-профили, полученные из международной базы данных MLVAbank for Microbes Genotyping (http://microbesgenotyping.i2bc.pans-saclay.fr/databases/view/524/2?panel=911).

Результаты и обсуждение

Проведено MLVA-типирование 21 штамма F. tularensis, выделенных в феврале-апреле 2017 г. из источников водоснабжения в с. Донская Балка Петровского района: вода из источника хозяйственно-питьевого водоснабжения (ХПВ) «Хмыров», вода до поступления в разводящую сеть водопровода «Нижний», вода до хлорирования, вода из разводящей сети; из источников водоснабжения в с. Констаниновское Петровского района: из водопроводов «Калужская балка» и «Церковная балка»; от грызунов, отловленных в с. Донская Балка Петровского района, с. Николина Балка Петровского района, с. Золотаревка Ипатовского района и с. Надежда Шпаковского района; из пробы сена, отобранного в с. Шве-дино Петровского района.

Исследуемые штаммы относились к 8 MLVA-генотипам, отличавшимся по числу тандемных повторов в локусах FT-M3, FT-M6, FT-M10, FT-M20 и FT-M24 (см. таблицу). Анализ результатов MLVA-типирования показал, что в источнике водоснабжения с. Донская Балка до поступления в разводящую сеть (штамм № 1, изолированный из источника ХПВ «Хмыров», штамм № 26 - очистные сооружения воды «Хлора-торная», штамм № 137 - из воды перед поступлением в разводящую сеть на водопроводе «Нижний») выявлен возбудитель туляремии, относящийся к MLVA-генотипу 1. К этому же генотипу принадлежал штамм № 58, выделенный от полевки, отловленной в с. Донская Балка. Штаммы возбудителя туляремии, выделенные из проб воды, отобранных из разводящей сети водопровода в с. Донская Балка, относились к MLVA-генотипам 2, 3 и 4.

В образцах воды, отобранных из водопровода «Калужская Балка» с. Константиновского Петровского района выделены штаммы туляремии MLVA-генотипа 1 (штамм № 88, изолированный из разводящей сети водопровода, № 115 - вода до поступления в резервуар чистой

воды водопровода, № 121 - вода из резервуара чистой воды водопровода и № 126 - вода из источника водопровода).

В пробах воды из водопровода «Церковная Балка» с. Константиновского Петровского района изолированы культуры возбудителя туляремии MLVA-генотипа 5, отличавшиеся от остальных штаммов по числу повторов в локусе FT-M3 - они характеризовались наличием 12 повторов (штамм № 114 - вода до поступления в резервуар чистой воды водопровода, № 120 - вода из резервуара чистой воды водопровода, № 130 - вода из источника водопровода).

Из образца сена, отобранного в с. Шведино Петровского района, выделена культура возбудителя туляремии MLVA-генотипа 1 (штамм № 52).

От грызунов, отловленных в с. Николина Балка Петровского района (штаммы № 6 и 63), с. Золотаревка Ипатовского района (штамм № 25) и с. Надежда Шпаковского района (штамм № 145), изолированы штаммы F. tularensis MLVA-генотипов 6, 7 и 8, отличавшиеся от других выделенных штаммов возбудителя туляремии по локусу FT-M3 - содержали 11 повторов.

Эпидемиологический анализ вспышки туляремии в Петровском районе Ставропольском крае, протекавшей с декабря 2016 г. по апрель 2017 г., позволил предположить, что случаи заболевания туляремией связаны с позднеосенней эпизоотией среди мелких мышевидных грызунов и контаминацией воды возбудителем туляремии.

Результаты MLVA-анализа штаммов F. tularensis, выделенных во время вспышки туляремии, подтверждают предположение о различных источниках инфицирования системы водоснабжения в с. Константиновское, так как в пробах воды, отобранных из разных водопроводов, выделены генетически отличающиеся штаммы.

Различия MLVA-генотипов культур возбудителя туляремии, изолированных в пробах воды до поступления в разводящую сеть водопровода в с. Донская Балка и в пробах воды из разводящей сети, могут свидетельствовать о множественных источниках контаминации водопроводной системы и циркуляции на данной территории разных геновариантов F. tularensis.

Методы молекулярно-генетического типирования возбудителей инфекционных болезней находят широкое применение для идентификации штаммов, их использование позволяет выявлять минимальные различия между изолятами и дает возможность решать задачи эпидемиологии на молекулярном уровне, в том числе выявлять источник инфекции и возможные пути и механизмы распространения возбудителя [9]. Внедрение их в практику эпидемиологического анализа позволяет получать объективную информацию об эпизоотической и эпидемической ситуации по туляремии и способствует эпидемиологической расшифровке случаев заболевания и возникающих эпизоотий.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспотребнадзора:

Гнусарева Ольга Александровна - научный сотрудник лаборатории природно-очаговых инфекций E-mail: gnusarevao@mail.ru

Котенев Егор Сергеевич - кандидат биологических наук, заведующий лабораторией природно-очаговых инфекций E-mail: egor_kotenev@mail.ru

Волынкина Анна Сергеевна - научный сотрудник лаборатории природно-очаговых инфекций E-mail: volyn444@mail.ru

Чишенюк Татьяна Ивановна - лаборант-исследователь лаборатории природно-очаговых инфекций E-mail: snipchi@mail.stv.ru

Куличенко Александр Николаевич - член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, директор E-mail: kulichenko_an@list.ru

ЛИТЕРАТУРА

1. Гнусарева О.А., Зайцев А.А., Котенев Е.С., Агапитов Д.С. Исторические аспекты проявления эпизоотической и эпидемической активности природного очага туляремии в Ставропольском крае // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции специалистов Ро-спотребнадзора. Ставрополь, 2017. С. 123-125.

2. Гнусарева О.А., Зайцев А.А., Котенев Е.С., Рыбалко Т.И. Итоги эпизоотологического мониторинга природного очага туляремии на территории Ставропольского края в 2015 г. // Материалы научно-практической конференции «Здоровье населения и среда обитания»: 20-я Ежегодная неделя медицины Ставрополья. Ставрополь, 2016. С. 47-52.

3. Зайцев А.А., Гнусарева О.А., Чишенюк Т.И., Котенев Е.С. Оценка современной эпизоотической активности природного очага туляремии в Ставропольском крае // Материалы научно-практической конференции «20-я Ежегодная Неделя медицины Ставрополья». Ставрополь, 2016. С. 54-59.

4. Гнусарева О.А., Зайцев А.А. Совершенствование эпидемиологического надзора за туляремией в природном очаге степного типа путем расширения показаний для специфической профилактики // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции специалистов Роспотребнадзора. Ставрополь, 2017. С. 121-123.

5. Зайцев А.А., Гнусарева О.А., Остапович В.В., Дубянский В.М. Определение инфицированности иксодовых клещей возбудителем туляремии с помощью полимеразной цепной реакции // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции специалистов Роспотребнадзора. Ставрополь, 2017. С. 217-219.

6. Методические указания (МУ) 3.1.2007-05. Эпидемиологический надзор за туляремией. М., 2005. 36 с.

7. Методические указания (МУК) 4.2.2939-11. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики туляремии для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней. М., 2012. 59 с.

8. Johansson A., Farlow J., Larsson P., Dukerich M. et al. Worldwide genetic relationships among Francisella tularensis isolates determined by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis // J. Bacteriol. 2004. Vol. 186, N 17. P. 5808-5818.

9. Чекрыгина, Е.В., Волынкина А. С., Котенев Е.С., Лисицкая Я.В. и др. Генетическое типирование возбудителей природно-очаговых инфекций, выявленных в Ставропольском крае в 2016-2017 гг. // Материалы II Всероссийской научно-практической конференции специалистов Роспотребнадзора. Ставрополь, 2017. С. 281-282.

REFERENCES

1. Gnusareva O.A., Zaytsev A.A., Kotenev E.S., Agapitov D.S. Historical aspects of the manifestation of epizootic and epidemic activity of the natural focus of tularemia in the Stavropol Territory. In: Proceedings of the II All-Russian Scientific and Practical Conference of Specialists of Rospotreb-nadzor. Stavropol'; 2017: 123-5.

2. Gnusareva O.A., Zaytsev A.A., Kotenev E.S., Rybalko T.I. Results of epizootological monitoring of the natural focus of tularemia in the Stavropol Territory in 2015. In: Materials of the scientific-practical conference "Health of the population and habitat": the 20th Annual Medicine Week of Stavropol. Stavropol', 2016: 47-52.

3. Zaytsev A.A., Gnusareva O.A., Chishenyuk T.I., Kotenev E.S. Evaluation of modern epizootic activity of the natural focus of tularemia in the Stavropol Territory. In: Materials of the scientific-practical conference "The 20th Annual Medicine Week of Stavropol". Stavropol', 2016: 54-9.

4. Gnusareva O.A., Zaytsev A.A. Improvement of epidemiological surveillance of tularemia in a natural source of steppe type by expanding indications for specific prevention. In: Proceedings of the II All-Russian Scientific and Practical Conference of Specialists of Rospotrebnadzor. Stavropol', 2017: 121-3.

5. Zaytsev A.A., Gnusareva O.A., Ostapovich V.V., Dubyanskiy V.M. Determination of infection of ixodid ticks with tularemia pathogen by polymerase chain reaction. In: Proceedings of the II All-Russian Scientific and Practical Conference of Specialists of Rospotrebnadzor. Stavropol', 2017: 217-9.

6. Methodical Guidelines

7. Methodical Guidelines

8. Johansson A., Farlow J., Larsson P., Dukerich M., et al. Worldwide genetic relationships among Francisella tularensis isolates determined by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. J Bacteriol. 2004; 186 (17): 5808-18.

9. Chekrygina E.V., Volynkina A.S., Kotenev E.S., Lisitskaya Ya.V., et al. Genetic typing of pathogens of natural focal infections revealed in the Stavropol Territory in 2016-2017. In: Proceedings of the II All-Russian Scientific and Practical Conference of Rospotrebnadzor Specialists. Stavropol', 2017: 281-2.