ВЛИЯНИЕ НАРУШЕННОЙ ЭКСПРЕССИИ HNF4α НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОК ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЫ К ДЕЙСТВИЮ ИНГИБИТОРОВ ПРООПУХОЛЕВЫХ СИГНАЛЬНЫХ КАСКАДОВ

Влияние нарушенной экспрессии HNF4a на чувствительность клеток гепатоцеллюлярной карциномы к действию ингибиторов проопухолевых сигнальных каскадов

А.С. Макарова1, О.М. Кривцова1, 2, М.С. Чесноков1, Н.Л. Лазаревич1, 2

1НИИ канцерогенеза ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24; 2биологический факультет ФГБОУВО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова»;

Россия, 119234 Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12

Контакты: Наталия Леонидовна Лазаревич lazarevich.nl@gmail.com

Введение. Гепатоцеллюлярная карцинома (ГК) характеризуется агрессивным течением, высокой частотой случаев летальности и устойчивостью к существующим схемам терапии. Исследование ассоциированных с патогенезом ГК молекулярных нарушений, которые влияют на биологические свойства клеток ГК, позволяет оценить потенциальную эффективность ингибирования конкретных проопухолевых сигнальных каскадов. Настоящая работа посвящена изучению действия снижения экспрессии ключевого регулятора гепатоцитарной дифференцировки HNF4a, которое часто происходит в ГК, на чувствительность клеток культур ГК к ингибиторам важных проопухолевых сигнальных путей mTOR, CDK4/6-pRb и ROCK.

Материалы и методы. В культурах ГК человека HepG2 и Huh7 со стабильным нокдауном гена HNF4A определяли изменение пролиферативного и миграционного потенциалов клеток, а также изменение данных свойств при действии ингибиторов mTOR (рапамицина), CDK4/6 (PD0332 991, палбоциклиба) и ROCK 1/2 (Y27632). Уровни экспрессии генов определяли методом полиме-разной цепной реакции в реальном времени.

Результаты. Нокдаун гена HNF4Á вызывает изменение миграционной способности клеток HepG2 и Huh7, ассоциированное с изменением экспрессии Е-кадгерина и N-кадгерина. Снижение экспрессии HNF4a ослабляет опосредованное У27632-подавление миграционного потенциала в клетках ГК. Нокдаун гена HNF4Á приводит к возникновению устойчивости клеток Huh7 и увеличению чувствительности клеток HepG2 к действию рапамицина и PD0332991, блокирующих миграционную способность клеток. Заключение. Уровень экспрессии HNF4a влияет на миграционную способность клеток ГК и их чувствительность к действию ингибиторов mTOR, CDK4/6 и ROCK1/2на миграционную активность.

Ключевые слова: HNF4a, гепатоцеллюлярная карцинома, определение действия противоопухолевых ингибиторов, рапамицин, палбоциклиб, Y27632

DOI: 10.17650/2313-805X-2017-4-3-83-91

cv

CS

и ш u

X ш

и

Impact of HNF4a disrupted expression on hepatocellular carcinoma cells sensitivity to oncogenic pathways inhibitors

A.S. Makarova1, O.M. Krivtsova1,2, M.S. Chesnokov1, N.L. Lazarevich1,2

1Research Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia;

24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia; Biological Faculty, M.V. Lomonosov Moscow State University; Build. 12, 1 Leninskie Gory, Moscow 119234, Russia

Introduction. Hepatocellular carcinoma (HCC) is characterized by aggressive course, high lethality rate and resistance to current systemic treatment. Analysis of molecular aberrations associated with HCC pathogenesis that control biological properties of HCC allows to evaluate potential efficacy of inhibiting certain oncogenic cascades. The present study is focused on investigation of the impact of reduced expression of the key hepatocyte differentiation regulator, HNF4a, often downregulated in HCC, that influences sensitivity of HCC cells to inhibitors of the major oncogenic pathways mTOR, CDK4/6-pRb and ROCK.

Materials and methods. Changes in cells proliferation and migration caused by HNF4A gene stable knockdown were tested in human HCC cell cultures HepG2 and Huh7 followed by examination of these cellular properties under mTOR (rapamycin), CDK4/6 (PD0332991, pal-bociclib) and ROCK 1/2 (Y27632) inhibitors treatment. Gene expression levels were estimated by the real-time polymerase chain reaction method (Real-Time PCR).

Results. HNF4A gene knockdown alters HepG2 and Huh7cell migration associated with E-cadherin and N-cadherin expression changes. The HNF4a repression weakens Y27632-induced blockade of HCC cells migration potential. HNF4A gene knockdown causes resistance of Huh7cells and increase of HepG2 cells sensitivity to rapamycin and PD0332991 that block cells migration ability. Conclusions. Expression level of HNF4a renders influence on migration of HCC cells and contributes to their sensitivity to mTOR, CDK4/6 and ROCK1/2 inhibitors' impact on cell migration activity.

Key words: HNF4a, hepatocellular carcinoma, cancer drug tests, rapamycin, palbociclib, Y27632

CV

со

es

и ш u

X ш

и

Введение

По данным Всемирной организации здравоохранения на 2015 г., опухоли печени занимают 2-е место по уровню смертности среди онкологических заболеваний [1]. Гепатоцеллюлярная карцинома (ГК) — самый распространенный тип рака печени, который диагностируют в основном на поздних стадиях. Для ГК характерно агрессивное течение, обусловливающее крайне неблагоприятный прогноз. Высокая генетическая гетерогенность ГК определяет низкую чувствительность к стандартной химиотерапии и невысокую эффективность таргетных препаратов [2].

При гепатоканцерогенезе, как и при других злокачественных процессах, нарушается дифференцировка клеток, ускоряется их пролиферация, и трансформированные клетки приобретают способность к метастази-рованию [3, 4]. Регуляция этих событий, формирующих злокачественный фенотип опухоли, осуществляется на разных уровнях.

Система гепатоцитарных транскрипционных факторов, в которой ключевую роль играет гепатоцитар-ный ядерный фактор альфа (HNF4a), осуществляет тканеспецифическую регуляцию дифференцировки, морфогенеза и пролиферации гепатоцитов [4]. Транскрипция гена HNF4A с 2 альтернативно регулируемых промоторов обусловливает генерацию групп изоформ НОТ4аР1 и НОТ4аР2 [5, 6]. Прогрессия ГК ассоциировано с подавлением экспрессии HNF4aР1, которое вызывает дедифференцировку клеток и нарушение эпителиальной морфологии [4]. При развитии ГК индуцируется экспрессия эмбриоспецифичных изоформ HNF4aР2 [7]. На поздних этапах опухолевой прогрессии может происходить репрессия обеих групп изоформ [8]. На модельных системах ГК показано, что HNF4a выполняет функцию опухолевого супрессора, а его экзогенная экспрессия в клетках ГК способствует снижению их пролиферативной активности и уменьшению метастатического потенциала [8—10]. Временный нокдаун HNF4A в клетках культур ГК повышает их пролиферативный потенциал и способность к инвазии [11].

Прогрессия ГК сопровождается активацией про-опухолевых сигнальных путей Wnt/ß-катенин, PI3K/AKT/mTOR и нарушением контроля клеточного цикла вследствие инактивации его негативных регуляторов — р53, pRb и p21WAF1/CIP1 [2, 3]. При гепато-канцерогенезе приобретение трансформированными клетками подвижности и способности к метастазиро-ванию происходит вследствие активации сигнальных путей с участием малых ГТФаз: Rac1, RhoA/ROCK и Cdc42 [12].

Происходящее при прогрессии ГК нарушение перечисленных регуляторных систем определяет изменение биологических свойств опухолевых клеток, однако совместное влияние репрессии HNF4a и активации онкогенных каскадов на свойства клеток ГК не изучено. Стабильное подавление экспрессии HNF4a

в дифференцированных культурах ГК может быть моделью этапа прогрессии ГК, ассоциированного с нарушением опухолесупрессорной функции HNF4a. Мы провели исследование влияния нокдауна гена HNF4A на биологические свойства культур ГК и оценили в данной системе эффекты ингибирования проопухо-левых сигнальных каскадов на ключевые свойства клеток, формирующие опухолевый фенотип.

Материалы и методы

Культивирование клеточных линий. В работе использовали культуры ГК человека HepG2 (получена из американской коллекции клеточных культур) и Huh7 (получена из Европейского банка клеточных культур). Клетки HepG2 культивировали в среде игла (Invitrogen, США), содержащей 10 % фетальной бычьей сыворотки (HyClone, США), заменимые аминокислоты (Invitrogen, США), 110 мг/л пирувата натрия (ПанЭко, Россия), 300 мг/л глутамина (Пан-Эко, Россия) и смесь антибиотиков пенициллина и стрептомицина (Invitrogen, США). Клетки Huh7 культивировали в среде DMEM (Sigma-Aldrich, США) с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки, глутамина и антибиотиков в дозах, указанных выше. Клетки культивировали при температуре 37 °С в атмосфере 5 % СО2. Каждые 2—3 дня клетки обрабатывали 0,25 % раствором трипсина и пересевали. Для проведения функциональных тестов количество клеток в суспензии подсчитывали с помощью автоматического счетчика Bio Rad TC10 (Bio Rad Laboratories, США) в присутствии трипанового синего.

Для обработки клеток применяли ингибиторы: рапамицин (Calbiochem, США), PD0332991 (Sellek-chem, США), Y27 632 (Calbiochem, США), растворенные в диметилсульфоксиде (ДМСО). Для выбора оптимальных концентраций ингибиторов использовали МТТ-тест по протоколу, описанному ранее [13]. Клетки культур ГК, посеянные в количестве 16 тыс./ лунка 96-луночного планшета, каждые сутки обрабатывали ингибиторами или ДМСО в течение 48 ч, затем инкубировали клетки с МТТ в течение 3 ч и измеряли оптическую плотность полученных растворов формазана с помощью планшетного считывателя SpectraMax M5e (Molecular Devices, США) при длине волны 570 нм. Для всех концентраций ингибиторов рассчитывали долю жизнеспособных клеток относительно контроля, обработанного ДМСО. На основании кривых «доза—эффект» и с учетом данных литературы об используемых концентрациях и действии изучаемых ингибиторов были выбраны эффективные концентрации, которые составили 100 нм, 1 мкМ и 10 мкМ для рапамицина, PD0332991 и Y27 632 соответственно.

При изучении действия ингибиторов на клетки культур ГК с подавленной экспрессией HNF4a в течение суток перед постановкой функциональных тестов

и при их проведении клетки культивировали в среде с ингибиторами или ДМСО в качестве контроля.

Получение культур ГК HepG2 и Huh7 с подавленной экспрессией HNF4a. Для получения культур с подавленной экспрессией HNF4a были использованы лен-тивирусные векторы, экспрессирующие 4 разных малых шпилечных РНК (мшРНК; short hairpin RNA, shRNA), комплементарные участкам матричной РНК HNF4A (shHNF4a), - pLKO.1-shHNF4a (SHDNA-NM_000 457, Sigma, США). Для получения контрольных культур использовали лентивирусный вектор, кодирующий мшРНК к последовательности зеленого флуоресцентного белка GFP (shGFP), — pLKO. 1-shGFP (Sigma, США). Используемые векторы содержат ген устойчивости к пуромицину. Для получения лентивирусных частиц использовали систему ViraPower (Invitrogen, США), включающую векторы pLP1, pLP2 и pCMV—VSVg и пакующие клетки HEK293T, как описано ранее [14]. После трансдукции была проведена селекция в среде с антибиотиком: для HepG2 при концентрации пуромицина 5,5 мкг/мл, для Huh7 — 7,0 мкг/мл. По завершении селекции, когда неинфи-цированные клетки исходных культур погибли, были получены культуры HepG2-shGFP, Huh7-shGFP и 4 варианта культур HepG2-shHNF4a и Huh7-shHNF4a.

Анализ экспрессии генов. Для выделения РНК использовали набор RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN, Германия). Для получения комплементарной ДНК проводили обратную транскрипцию с использованием случайных гексамерных олигонуклеотидов (Синтол, Россия) и обратной транскриптазы MMLV-RT (Promega, США). В реакцию брали 2,5 мкг тотальной РНК.

Количественное определение уровня экспрессии генов проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) в присутствии красителя SYBR Green I (Синтол, Россия) с применением амплификатора Bio Rad IQ5 (Bio Rad Laboratories, США). Были использованы специфические праймеры: TBP-прямой 5'-gcacaggagccaagagtga-3', TBP-обратный 5'-acttcacatcacagctcccca-3', HNF^A-прямой 5'-gcgtgcgg-aagaaccaca-3', HNF4A-обратный 5'-tgatccggtcccgctcat-3', HNF4AP1-прямой 5'-atgtgcaggtgttgacgatg-3', HNF4AP1-обратный 5'-ctcgaggcaccgtagtgttt-3', HNF4AP2-прямой 5'-ggccatggtcagcgtgaa-3', HNF4AP2-обратный 5'-ctcgagg-caccgtagtgttt-3', CDHl-прямой 5'-cggaggagagcggtggtc-3', CDHl-обратный 5'-ggcagggcggggaagata-3', CDH2-прямой 5'-acccaggaaaggtggcaggt-3', CDH2-обратный 5'-gcggga-tgacccagtctct-3'. Температуры отжига для реакций с праймерами к генам: TBP - 62,8 °С, HNF4A - 62,7 °С, HNF4AP1 - 62,7 °С, HNF4AP2 — 62,7 °С, CDH1 - 68,0 °С, CDH2 - 63,5 °С. Количество комплементарной ДНК в образцах нормировали по уровню экспрессии гена ТВР. Постановку ПЦР-РВ и обработку данных выполняли, как описано ранее [15].

Определение пролиферативного потенциала опухолевых клеток проводили путем оценки ДНК-синтети-

ческой активности клеток методом включения 5-бром -дезоксиуридина (5-BrdU) по протоколу, описанному ранее [14].

Определение миграционной активности клеток.

Оценку способности клеток к направленной миграции выполняли в камерах Бойдена с диаметром пор 8,0 мкм (BD Falcon Cell Culture Insert, BD Biosciences, США) по схеме, описанной ранее [14]. В качестве аттрактан-та для клеток использовали фетальную бычью сыворотку (HyClone, США), добавляя ее в культуральную среду до концентрации 7 %. В камеры Бойдена высевали по 30 тыс. клеток. Время теста составляло 24 ч.

Обработка данных. Эксперименты проведены не менее чем в 3 независимых повторах. Данные обрабатывали в программах Microsoft Office Excel 2007 (Microsoft Corporation, США) и Origin Pro 9.0 (Origin Lab Corporation, США). Для определения достоверности различий (порогр <0,05) между группами данных использовали U-тест Манна—Уитни. Графическое представление результатов выполнено с применением программы GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, США).

Результаты и обсуждение

Влияние подавления экспрессии HNF4a на биологические свойства культур ГК HepG2 и Huh7. Для исследования эффектов подавления экспрессии HNF4a на свойства культур ГК человека мы получили культуры HepG2 и Huh7, в которых транскрипция HNF4a стабильно подавлена путем трансдукции лентивирусных векторов, экспрессирующих 4 разных варианта мшРНК, комплементарных последовательности матричной РНК HNF4A — HepG2-shHNF4a и Huh7-shHNF4a. В качестве контрольных использовали полученные аналогичным образом культуры HepG2 и Huh7, экспрессирующие мшРНК к последовательности гена GFP, — HepG2-shGFP и Huh7-shGFP. После инфекции клеток указанными лентивирусными векторами, содержащими ген устойчивости к пуромицину, проводили селекцию клеток в среде с пуромицином. По завершении селекции культуры HepG2-shGFP, Huh7-shGFP и 4 варианта культур HepG2-shHNF4a и Huh7-shHNF4a использовали для оценки уровня подавления экспрессии гена и синтеза белка HNF4a методами обратной транскрипции — ПЦР-РВ и иммуноблоттинга соответственно. По результатам сравнения (данные не представлены) для каждой из культур ГК были выбраны варианты с наиболее выраженным подавлением HNF4a, в которых методом ПЦР-РВ количественно определяли уровень снижения экспрессии HNF4a и групп изоформ HNF4aР1 и HNF4aР2 по сравнению с контрольными культурами. В культурах ГК с нокдауном гена HNF4A произошло примерно двукратное подавление экспрессии HNF4a и групп его изоформ (рис. 1).

Далее в экспериментах на культурах HepG2-shHNF4a и Huh7-shHNF4a исследовано влияние сниженной экспрессии HNF4a на пролиферативную активность клеток

CV

CS

и ш u

ж ш

и

CV

со

ев

и ш u

х ш

и

HepG 2-s hG FP HepG 2-s hH NF 4а

Huh7-shGFP Huh7-shHNF4a

о

X

120 T

100

с;

80

60--

С

X

ф

ей

о

и >

с; о

н

X

о

40

20

120

iD ^ 100

80

и >s 60

40

2 20

HNF4A

HNF4AP1 HNF4AP2

HNF4A HNF4AP1 HNF4AP2

Рис. 1. Относительные уровни экспрессии HNF4a и групп изоформ HNF4a в клетках HepG2-shHNF4a (а) и Huh7-shHNF4a (б). Метод полиме-разной цепной реакции в реальном времени. Формат данньа: среднее значение ± стандартное отклонение; и-тест Манна—Уитни. *р <0,05.

и их миграционную способность — ключевых свойств, обеспечивающих формирование злокачественного фенотипа опухолевых клеток.

Определение влияния нокдауна гена ИЫЕ4А на пролиферативный потенциал культур ГК, проведенное методом оценки включения 5-ВгёИ; показало, что в культурах Ыер02-8ИЫКР4а и ЫиЬ7-8ИЫКР4а ДНК-синтетическая активность клеток по сравнению с контролем не изменилась (рис. 2а, б). Это может быть связано с тем, что в культурах Ыер02 и ЫиИ7 выявлена экспрессия мутантных вариантов онкогена К-ИаБ с активирующей мутацией Р61Ь и опухолевого супрессо-ра р53 с инактивирующей мутацией У220С соответственно [16], влияние которых может обусловливать исходно высокий пролиферативный потенциал этих культур.

Исследование миграционного потенциала культур ГК с подавленной экспрессией ЫКР4а показало, что способность к направленной миграции в камере Бойдена клеток культуры Ыер02-8ИЫКР4а в среднем почти в 4 раза выше по сравнению с Ыер02-8И0РР (рис. 2в), при этом ЫиЬ7-8ИЫКР4а мигрируют более чем в 2 раза менее интенсивно, чем в контроле (рис. 2г).

Одним из механизмов регуляции миграционной активности клеток ГК является изменение состава кад-гериновых клеточных контактов. Из литературы известно, что репрессия ЫКР4а в культурах ГК может вызывать подавление экспрессии Е-кадгерина [8] и появление других кадгериновых контактов [17]. Ранее было показано, что повышение миграционной активности в им-мортализованных гепатоцитах мыши с кратковременным нокдауном ЫКР4а ассоциировано с подавлением экспрессии Е-кадгерина и увеличением экспрессии К-кадгерина [18]. Поэтому мы предположили, что на-

блюдающееся при нокдауне гена ИЫЕ4А изменение миграционного потенциала клеток ГК опосредовано нарушением экспрессии данных типов кадгеринов.

Количественная оценка экспрессии Е-кадгерина (CDH1) и N-кадгерина (CDH2) методом ПЦР-РВ показала, что в клетках HepG2-shHNF4a (рис. 3а) увеличилась экспрессия CDH2, при этом экспрессия CDH1 не изменилась. В клетках культуры Huh7-shHNF4a (рис. 3б) снизилась экспрессия обоих типов кадгеринов. Известно, что N-кадгерин играет важную роль в увеличении миграционной активности опухолевых клеток [19], поэтому мы предполагаем, что увеличение миграционной способности клеток HepG2-shHNF4a может быть связано с повышением уровня экспрессии N-кадгерина, а уменьшение миграционного потенциала клеток Huh7-shHNF4a опосредовано снижением экспрессии Е-кадгерина и N-кадгерина.

Влияние активности проопухолевых сигнальных каскадов на биологические свойства культур ГК с подавленной экспрессией HNF4a. На основании данных литературы для анализа влияния нарушенной экспрессии HNF4a на проопухолевое действие сигнальных путей, ассоциированных с патогенезом ГК, мы выбрали ряд молекулярных каскадов, активность которых можно блокировать с помощью низкомолекулярных ингибиторов.

Активация mTOR-регулируемого сигнального пути является частым событием при гепатоканцерогене-зе, что обусловливает включение ингибиторов mTOR в клинические испытания для выбора терапии ГК [2, 3]. В опытах in vitro при ингибировании mTOR наибольшая эффективность блокирования пролиферации клеток HepG2 и Huh7 среди структурных аналогов показана для рапамицина [20].

б

а

0

0

ф

с; ^

ос с; о Ч

Ч

х s

Я

s со Ф н

I

706050403020100

х s

3

СС ф

Н

О I

5 0 "I

40-

30-

20-

10-

CV

ев

HepG 2-shGFP HepG2-shHNF4 а

Huh7-shGFP

Huh7-shHNF4 а

о. >-

7006005004003002001000

p = 0,02857

о

s ^

та

О x н

О

HepG 2-shGFP HepG2-s hHNF4 а

160 140 120 100 80 60 40 20 0

и ш u

p = 0,00699

Huh7-shGFP

Huh7-shHNF4 а

Рис. 2. Определение доли клеток, активно синтезирующих ДНК, методом включения метки 5-BrdU: HepG2-shGFP и HepG2-shHNF4a (а), Huh7-shGFP и Huh7-shHNF4a (б). Миграционный потенциал клеток HepG2-shHNF4a (в) и Huh 7-shHNF4a (г), измеренный относительно контрольных культур HepG2-shGFP и Huh 7-shGFP соответственно. Формат данных: среднее значение ± стандартное отклонение; U-тест Манна— Уитни. *р <0,05; **p <0,01.

X ш

и

200

180

160

.Q

^ 140

ф о

О. 1

О

120 100 80 60 40 20 0

HepG 2-s hG FP HepG 2-s hHNF4a

p =0,00058

Huh7-shGFP Huh7-shHNF4a

Ф

a.

о a.

C DH1

C DH2

160 т 140 120 100 80 60 40 20 0

CD H1

CD H2

Рис. 3. Относительные уровни экспрессии E-кадгерина (CDH1) и N-кадгерина (CDH2) в клетках культур HepG2-shHNF4a (а) и Huh 7-shHNF4a (б). Метод полимеразной цепной реакции в реальном времени. Формат данных: среднее значение ± стандартное отклонение; U-тест Манна—Уитни. *р <0,05; ***p <0,001.

б

а

0

в

г

*

CV

со

ев

и ш u

х ш

и

Вследствие частых мутаций регуляторов клеточного цикла в ГК [2, 3] ингибирование pRb-зависимого пути регуляции пролиферации представляется перспективным подходом для терапии этого типа опухолей [3]. Для терапии ГК зарегистрировано клиническое испытание II фазы ингибитора CDK4/6 PD0332991 (палбоциклиба), который препятствует CDKl/6-зави-симой инактивации pRb [21]. В исследовании D.B. Rivadeneira и соавт. продемонстрирован значительный антипролиферативный эффект PD0332991 для культур HepG2 и Huh7 [22].

Ингибирование киназ ROCK1/2, одних из основных регуляторов клеточной подвижности, показало значительную эффективность для блокирования миграционной активности клеток ГК и уменьшения их метастатического потенциала. Одним из наиболее эффективных ингибиторов ROCK1/2 in vitro является Y27632 [12].

Таким образом, ингибиторы рапамицин, PD0332991 и Y27632 были выбраны как наиболее специфические и потенциально эффективные в отношении блокирования пролиферации и миграции культур HepG2 и Huh7. Для постановки экспериментов на культурах ГК in vitro мы определили оптимальные концентрации ингибиторов, руководствуясь данными о дозах и инги-бирующих эффектах веществ на свойства клеток HepG2 и Huh7 [20, 22, 23], а также оценкой выживаемости клеток ГК при действии рапамицина, PD0332991 и Y27632, выполненной по результатам МТТ-теста (данные не приведены).

Следующим этапом работы стало проведение экспериментов по определению действия ингибиторов сигнальных путей mTOR, CDK4/6 и ROCK1 /2 на биологические свойства культур HepG2 и Huh7 с подавленной экспрессией HNF4a — пролиферативную активность и миграционную способность.

По результатам тестов по оценке пролифератив-ного потенциала клеток методом включения 5-BrdU при действии рапамицина, PD0332991 и Y27632 значимого влияния подавления экспрессии HNF4a на интенсивность синтеза ДНК в клетках HepG2-shHNF4a и Huh7-shHNF4a относительно соответствующих контрольных культур не выявлено (данные не представлены).

Результаты теста на определение способности клеток к направленной миграции в камерах Бойдена для культур HepG2-shHNF4a и Huh7-shHNF4a при воздействии ингибиторов представлены на рис. 4. Действие рапамицина в концентрации 100 нМ вызывает большее снижение миграционной способности клеток культуры HepG2-shHNF4a по сравнению с HepG2-shGFP (р = 0,02 857) (см. рис. 4а). Клетки культуры Huh7-shHNF4a оказались устойчивыми к ингибирующему миграцию действию рапамицина по сравнению с Huh7-shGFP (р = 1,19 х 10-5) (см. рис. 4б).

Действие PD0332991 в концентрации 1 мкМ существенно уменьшает миграционный потенциал клеток

культуры Ыер02-8ИЫКР4а по сравнению с контрольными (р = 0,00 622) (см. рис. 4в). В клетках ЫиЬ7-8ЪИКР4а ингибирование активности СБК4/6 вызвало достоверно меньшее снижение миграционной способности по сравнению с культурой ЫиЬ7-8ИОРР (р = 1,03 х 10-4) (см. рис. 4г).

Подавление экспрессии ЫКР4а в исследуемых культурах ГК приводит к снижению чувствительности клеток к действию У27632 при концентрации 10 мкМ, блокирующему миграционную активность клеток. Миграционная способность клеток ЫиЬ7-$ЬЫКР4а под действием У27632 оказалась достоверно выше, чем в контрольной культуре ЫиЬ7-8ИОРР (р = 0,01 399) (см. рис. 4д). Сравнение миграционных потенциалов культур Ыер02-8И0РР и Ыер02-$ЬЫКР4а выявило меньшую чувствительность Ыер02-$ЬЫКР4а к инги-бирующему действию У27632 (см. рис. 4е), однако статистическая достоверность в этом случае не была достигнута (р = 0,05 714).

Таким образом, подавление экспрессии ЫКР4а привело к уменьшению чувствительности клеток ЫиИ7 к действию ингибиторов шТОЯ и СБК4/6, вызывающих снижение миграционной активности клеток. Это может быть объяснено сочетанием влияния мутантно-го варианта р53 с эффектами подавления экспрессии ЫКР4а в клетках ЫиИ7. По данным литературы, нарушение функции р53 вызывает активацию сигнального пути АЙ/шТОЯ, которая обусловливает повышение клеточной подвижности [24]. Вследствие того, что ген СБКЫ1А является транскрипционной мишенью р53 [25], инактивация последнего может приводить к ослаблению р21тР1/С1Р1-зависимого подавления активности комплексов циклин В—СБК4 [26], для которых описана неканоническая функция контроля клеточной подвижности [27]. Такие молекулярные нарушения способствуют поддержанию высокого миграционного потенциала клеток ЫиИ7 при ингибировании шТОЯ и СБК4/6. При нокдауне гена ИЫЕ4А в культуре ЫиИ7 указанные эффекты могут усиливаться, поскольку снижение уровня ЫКР4а в клетках ЫиИ7 вызывает активацию шТОЯ [28], и подавление экспрессии ЫКР4а может привести к снижению экспрессии гена СБКЫ1А, который является его прямой транскрипционной мишенью [29].

В культуре Ыер02 при действии ингибиторов шТОЯ и СБК4/6 миграционная активность клеток с подавленной экспрессией ЫКР4а по сравнению с контрольной культурой значительно снижается. Таким образом, вызванное нокдауном гена ИЫЕ4А повышение миграционной способности культуры Ыер02 (см. рис. 2в) может быть обусловлено влиянием шТОЯ-и СБК4/6-зависимых механизмов.

Заключение

Результаты проведенного исследования демонстрируют роль экспрессии ЫКР4а в регуляции миграционной активности клеток ГК. Нокдаун гена ИЫЕ4А

Ф т О ^ л *

° О

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Г

X

А<о /V

Ф т О ^

о о

200 180 160 14012010080 60 40 20

0

X

лс<

СУ ^ чу с*4

Л' Л' ^

см

ев

и ш и

Ф т О ^

° о

Ф т О ^ п

О о

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Г X

**

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

(У ч

Ж

(у чу

/со /V * ^

Х V

X

(у

(у

(У л

// Л^

о о

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

^ I

Ф т

200' 180' 160' 140' 120' 100' 80 60 40 20 0

,0 ¿с?

Л» ^ Л»

У У ^

ч^ Х^ ч^

о?'

^ >> ^ хл

Ж ш

и

б

а

*

в

г

* * *

* * *

д

е

V:

Рис. 4. Влияние ингибирования тТОЯ, СБК4/6 и КОСК1/2 на миграционную активность клеток гепатоцеллюлярной карциномы со сниженной экспрессией Н^¥4а. Относительное изменение миграционной способности культур Нер02-зННМР4а (а, в, д) и Ник7^кНЫ¥4а (б, г, е) под действием 100 нМ рапамицина (а, б), 1 мкМРБ0332991 (в, г) и 10мкМ У27632 (д, е). Для каждой культуры проведено сравнение действия ингибитора относительно контроля (+ диметилсульфоксид (ДМСО)). Формат данных: среднее значение ± стандартное отклонение; и-тест Манна—Уитни. *р <0,05; **р <0,01; ***р <0,001.

в исследованных культурах ГК человека вызывает изменение миграционной способности клеток, ассоциированное с нарушением экспрессии Е-кадгерина и К-кадгерина. Полученные данные указывают на то,

что уровень экспрессии НКБ4а является фактором, влияющим на чувствительность клеток ГК к действию ингибиторов проопухолевых сигнальных путей шТОЯ, СБК4/6 и ЯОСК1/2 на миграционную активность.

CV

со

es

Повышение устойчивости клеток ГК с нокдауном гена ИЫЕ4А к ЯОСК-зависимому ингибированию миграционной активности характеризует участие ЫКР4а в негативной регуляции миграционной способности клеток, что указывает на его опухолесупрессорную

функцию. Различная чувствительность изучаемых культур ГК к блокированию миграционной активности клеток при ингибировании шТОЯ и СБК4/6, вероятно, определяется спектром онкогенных мутаций, характерных для каждой культуры.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

и ш u

X ш

и

1. http://www.who.int/mediacentre/fact-sheets/fs297/en/.

2. Llovet J.M., Zucman-Rossi J., Pikarsky E. et al. Hepatocellular carcinoma.

Nat Rev Dis Primers 2016;2:16018. DOI: 10.1038/nrdp.2016.18. PMID: 27158749.

3. Aravalli R.N., Cressman E.N., Steer C.J. Cellular and molecular mechanisms

of hepatocellular carcinoma: an update. Arch Toxicol 2013;87(2):227-47. DOI: 10.1007/s00204-012-0931-2. PMID: 23007558.

4. Лазаревич Н.Л., Флейшман Д.И. Тка-неспецифические транскрипционные факторы в прогрессии эпителиальных опухолей. Биохимия 2008;73(5):735—50. [Lazarevich N.L., Fleishman D.I. Tissue-specific transcription factors in the progression of epithelial tumors. Biochimiya = Biochemistry 2008;73(5):735-50. (In Russ.)]. DOI: 10.1134/S0006297908050106. PMID: 18605982.

5. Thomas H., Jaschkowitz K., Bulman M. et al. A distant upstream promoter of the HNF4a gene connects the transcription factors involved in maturity-onset diabetes of the young. Hum Mol Genet 2001;10(19):2089-97. PMID: 11590126.

6. Torres-Padilla M.E., Fougere-Descha-trette C., Weiss M.C. Expression

of HNF4a isoforms in mouse liver development is regulated by sequential promoter usage and constitutive 3 end splicing. Mech Dev 2001;109(2):183-93. PMID: 11731232.

7. Lazarevich N.L., Shavochkina D.A., Fleishman D.I. et al. Deregulation

of hepatocyte nuclear factor 4 (HNF4) as a marker of epithelial tumors progression. Exp Oncol 2010;32(3):167-71.

8. Lazarevich N.L., Cheremnova O.A., Varga E.V. et al. Progression of HCC

in mice is associated with a downregula-tion in the expression of hepatocyte nuclear factors. Hepatology 2004;39(4): 1038-47. DOI: 10.1002/hep.20155. PMID: 15057908.

9. Yin C., Lin Y., Zhang X. et al. Differentiation therapy of hepatocellular carcinoma in mice with recombinant adenovirus carrying hepatocyte nuclear factor 4 alpha gene. Hepatology 2008;48(5):1528-39. DOI: 10.1002/hep.22510.

PMID: 18925631. 10. Ning B.F., Ding J., Yin C. et al. Hepato-cyte nuclear factor 4 alpha suppresses

the development of hepatocellular carcinoma. Cancer Res 2010;70(19):7640-51. DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-10-0824. PMID: 20876809.

11. Hatziapostolou M., Polytarchou C., Ag-gelidou E. et al. An HNF4a-miRNA inflammatory feedback circuit regulates hepatocellular oncogenesis. Cell 2011;147(6):1233—47. DOI: 10.1016/j. cell.2011.10.043. PMID: 22153071.

12. Wong C.C., Wong C.M., Au S.L. et al. RHOGTPases and RHO-effectors in he-patocellular carcinoma metastasis: ROCK N'RHO move it. Liver Int 2010;30(5):642-56.

DOI: 10.1111/j.1478-3231.2010.02232.x. PMID: 20726051.

13. Omar H.A., Tolba M.F., Hung J.H. et al. OSU-2S/Sorafenib synergistic antitumor combination against hepatocellular carcinoma: the role of PKC5/p53. Front Pharmacol 2016;(7):463. DOI: 10.3389/ fphar.2016.00463. PMID: 27965580.

14. Чесноков М.С., Кустова И.Ф., Шавоч-кина Д .А. и др. Частичная редиффе-ренцировка и понижение выраженности черт злокачественного фенотипа клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека при экспрессии ядерного рецептора HNF4a. Российский биотерапевтический журнал 2012;(3):17—23. [Chesno-kov M.S., Kustova I.F., Shavochkina D.A. et al. Partial redifferentiation and decrease in the severity of the malignant phenotype of cells of human pancreatic ductal adenocarcinoma in the expression of the nuclear receptor HNF4a. Rоssiyskiy bioterape-vticheskiy zhurnal = Russian Biotherapeu-tic Journal 2012;(3):17-23. (In Russ.)].

15. Chesnokov M.S., Krivtsova O.M., Skovo-rodnikova P.A. et al. Transcriptome-based identification of PDGFA as a candidate secreted biomarker for hepatocellular carcinoma. Biopolymers and Cell 2016;32(6):418-28. DOI: http://dx.doi. org/10.7124/bc.000939.

16. Barretina J., Caponigro G., Stransky N. et al. The cancer cell line encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature 2012;483(7391): 603-7. DOI: 10.1038/nature11003. PMID: 22460905.

17. Späth G.F., Weiss M.C. Hepatocyte nuclear factor 4 provokes expression of epithelial marker genes, acting as a morphogen

in dedifferentiated hepatoma cells. J Cell

Biol 1998;140(4):935-46. PMID: 9472044.

18. Santangelo L., Marchetti A., Cicchini C. et al. The stable repression of mesenchymal program is required for hepatocyte identity: a novel role for hepatocyte nuclear factor 4a. Hepatology 2011;53(6):2063-74. DOI: 10.1002/hep.24280. PMID: 21384409.

19. Hazan R.B., Phillips G.R., Qiao R.F. et al. Exogenous expression of N cadherin

in breast cancer cells induces cell migration, invasion, and metastasis. J Cell Biol 2000;148(4):779-90. DOI: 10.1002/ hep.24280. PMID: 21384409.

20. Pivonello C., Negri M., De Martino M.C. et al. The dual targeting of insulin and insulin-like growth factor 1 receptor enhances the mTOR inhibitor-mediated antitumor efficacy in hepatocellular carcinoma. Oncotarget 2016;7(9):9718-31.

DOI: 10.18632/oncotarget.6836. PMID: 26756219.

21. https://clinicaltrials.gov/ct2/show/ NCT01356628.

22. Rivadeneira D.B., Mayhew C.N., Than-gavel C. et al. Proliferative suppression by CDK4/6 inhibition: complex function of the retinoblastoma pathway in liver tissue and hepatoma cells. Gastroenterology 2010;138(5):1920-30. DOI: 10.1053/j. gastro.2010.01.007. PMID: 20100483.

23. Lontay B., Kiss A., Gergely P. et al. Oka-daic acid induces phosphorylation and translocation of myosin phosphatase target subunit 1 influencing myosin phosphoryla-tion, stress fiber assembly and cell migration in HepG2 cells. Cell Signal 2005;17(10):1265-75. DOI: 10.1016/j. cellsig.2005.01.008. PMID: 16038801.

24. Guo F., Gao Y., Wang L. et al. p19Arf-p53 tumor suppressor pathway regulates cell motility by suppression of phosphoinosit-ide 3-kinase and Rac1 GTPase activities.

J Biol Chem 2003;278(16):14414-9. DOI: 10.1074/jbc.M300341200. PMID: 12578823.

25. el-Deiry W.S., Tokino T., Velculescu V.E. et al. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. Cell 1993;75(4): 817-25. PMID: 8242752.

26. Paternot S., Bockstaele L., Bisteau X. et al. Rb inactivation in cell cycle and cancer: the puzzle of highly regulated activating phosphorylation of CDK4 versus constitu-tively active CDK-activating kinase. Cell Cycle 2010;9(4):689-99. DOI: 10.4161/ cc.9.4.10611. PMID: 20107323.

27. Fusté N.P., Fernández-Hernández R., Cemeli T. et al. Cytoplasmic cyclin D1 regulates cell invasion and metastasis through the phosphorylation of paxillin. Nat Commun 2016;7:11581. DOI: 10.1038/ncomms11581. PMID: 27181366.

28. Yang Y.M., Lee C.G., Koo J.H. et al. Ga12 overexpressed in hepatocellular carcinoma reduces microRNA-122 expression via HNF4a inactivation, which causes c-Met induction. Oncotarget 2015;6(22):19055-69. DOI: 10.18632/on-cotarget.3957. PMID: 25965999.

29. Chiba H., Itoh T., Satohisa S. et al. Activation of p21CIP1/WAF1 gene expression and inhibition of cell proliferation by overexpression of hepatocyte nuclear factor 4 alpha. Exp Cell Res 2005;302(1):11-21. DOI: 10.1016/j.yexcr.2004.08.014. PMID: 15541721.

cv

CS

и ш u

X ш

и