Влияние длительных и коротких циклов замораживания-размораживания почвы на нитрифицирующую активность микроорганизмов

УДК: 579.266.4.

ВЛИЯНИЕ ДЛИТЕЛЬНЫХ И КОРОТКИХ ЦИКЛОВ ЗАМОРАЖИВАНИЯ-РАЗМОРАЖИВАНИЯ ПОЧВЫ НА НИТРИФИЦИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ

А.С. Черобаева, А.Л. Степанов, И.К. Кравченко

Проведен инкубационный эксперимент на микрокосмах каштановой почвы с целью оценки воздействия длительного и кратковременного холодового шока на интенсивность нитрификации аммоний-окисляющих бактерий и архей. Существенное снижение нитрифицирующей активности отмечено после 2-недельного холодового шока, в то время как 24-часовая инкубация при низкой температуре не повлияла на уровень нитрификации микроорганизмов. Мы предполагаем, что преобладание психротолерантных или мезофильных с широкой нормой реакции групп микроорганизмов в каштановой почве способствует сохранению высокого уровня процесса в условиях частых колебаний высоких и низких температур. Снижение нитрифицирующей активности после длительного замораживания указывает на гибель небольшого пула наименее устойчивых микроорганизмов, что связано с особенностями географического положения каштановых почв и отсутствием периодов длительного промерзания почвы. Состав сообщества бактерий и архей в ходе проведенных экспериментов не изменялся, что удалось определить с помощью электрофореза в денатурирующем геле (ДГГЕ).

Ключевые слова: аммоний-окисляющие микроорганизмы, нитрификация, циклы замораживания—размораживания, холодовый шок.

Введение

На фоне постоянно происходящих изменений природной среды все более очевидными становятся прогнозы о глобальном потеплении климата (1РСС, 2007), которое продолжается уже более 100 лет [1]. В соответствии с долгосрочными климатическими прогнозами можно ожидать общее повышение средней глобальной температуры воздуха к концу текущего столетия более чем на 4° [2]. Глобальное потепление может оказать существенное влияние на частоту периодов осенне-весенних оттепелей, что приведет к изменению почвенных условий, сделав их менее устойчивыми. Таким образом, прогнозируемые изменения могут иметь более глубокие последствия, чем постепенное увеличение средней температуры. Значительно больший стресс оказывают частые изменения температурного режима в периоды замерзания и оттаивания почвы [8].

Ответы микроорганизмов на температурные колебания обычно носят нелинейный характер, поэтому предполагается, что изменения температурных и климатических условий будут иметь диспропорциональные эффекты на состав и функционирование микробных сообществ [16]. Известно, что температура влияет на скорость биохимических реакций, ферментативную активность, а также влечет за собой изменение других факторов среды — физических (растворимость газов в воде) и биологических (рост микробной популяции) [4]. Следовательно, резкие перепады температур, которые наблюдаются при замерзании и оттаивании почвы, влекут за собой изменения активности газовой эмиссии, вызывают гибель микроорганизмов, приводя к увеличению количества доступных субстратов в почве и как следствие росту микробной активности [21].

Спорным остается вопрос о влиянии краткосрочных сезонных перепадов температур на состав сообщества микроорганизмов. Например, M.K. Mahendrappa с соавт. [10] изучили температурные оптимумы некоторых микроорганизмов тропических широт, выявив корреляцию между составом сообщества микроорганизмов и климатическим регионом, в котором они представлены. S.S. Mahli и W.B. McGill [11] сравнили почвы из тропических (Австралия, средняя ежегодная температура 25°), умеренных (Айова, США, средняя ежегодная температура 10°) зон, северных широт (Альберта, Канада, средняя ежегодная температура 2,5°) и показали, что оптимальные температуры для сообществ микроорганизмов этих почв отличаются, составляя 35°, 30° и 25° соответственно. С другой стороны, J.M. Stark и M.K. Firestone [19] исследовали влияние длительных и временных изменений температур и предположили, что состав сообщества микроорганизмов разных климатических зон отличается не вследствие разных средних ежегодных температур этих зон, а скорее как результат разных температур во время весенне-осенних периодов. Кроме того, важным фактором является наличие на поверхности почвы растительного покрова летом или снежного покрова зимой. Так, было показано, что для сообщества нитрифицирующих микроорганизмов в почве под покровом дубовой рощи оптимальная температура 31,8°, на открытых пространствах — 35,9° [5].

К настоящему времени имеется много работ о влиянии сезонной динамики температур в почвах на процессы денитрификации, дыхания, азотфиксации [3, 5, 8, 17]. Тем не менее кинетика процесса нитрификации в ходе замораживания и оттаивания почвы остается не до конца изученной. Известно, что активность нитрифицирующих микроорганизмов останавливается

при температуре ниже +4°, хотя появляется все больше примеров того, что нитрификация возможна и при более низких температурах, порядка -5°. Это относится к исследованиям активных сточных вод [22]. Открытыми остаются вопросы о влиянии резких перепадов температуры на нитрифицирующую активность всего сообщества нитрификаторов и отдельных его представителей, о скорости восстановления нитрифицирующей активности после холодового шока и пределах низких температур, при которых начинается гибель микроорганизмов или резкое снижение активности.

В данной работе мы сконцентрировались на кинетике процесса нитрификации, не пытаясь разделить процессы, выполняемые автотрофными бактериями, автотрофными археями или гетеротрофными бактериями. Была рассмотрена общая тенденция изменения концентрации оксидов азота и аммония в ходе модулируемых экспериментов резкого замораживания и размораживания почвы в микрокосмах.

Цель работы — изучение влияния длительного замораживания и чередующихся циклов замораживания и размораживания почвы на кинетику процесса нитрификации.

Объекты и методы исследования

Образцы каштановой почвы отбирали в мае 2010 г. на сельскохозяйственном поле культуры картофеля с глубины 7 см в 10 км от г. Волгограда. Район города характеризуется умеренно континентальным климатом с резкими перепадами температур. Среднегодовое количество осадков — 220 мм. Средняя температура января —7,3° (макс. —32,6°), июля +24,2° (макс. +41,1°). Уровень нитрификации в почве после отбора образцов составлял 2,89 мкг К03/г-сут, концентрация аммония — 0,02 мкг/г, уровень рН — 7,2 (слабощелочной).

Образцы общей массой 1200 г просеивали через сито размером 3,35 мм и хранили до начала эксперимента в холодной комнате при температуре +4° в течение трех месяцев, что соответствует температурным условиям весеннего периода года.

Микрокосмы содержали 10 г предварительно просеянной почвы, помещенной в 30-миллиметровые универсальные флаконы с закручивающимися крышками. В каждый микрокосм добавляли дистиллированную воду для увлажнения почвы до 30%. Всего было установлено 190 микрокосмов, на каждую анализируемую точку приходилось три микрокосма (трехкратная повторность). Дополнительно микрокосмы в трех повторах были заморожены непосредственно перед началом эксперимента (после транспортировки из холодной комнаты — +4°) и хранились при —20° до его окончания; они были приняты за нулевую точку эксперимента (Д0).

Для последующего химического и молекулярного анализов производили деструкцию микрокосмов и исключение их из последующей инкубации. Из каждого микрокосма брали 4 г почвы для химического анализа, оставшиеся 6 г почвы были немедленно заморожены

при —20° для последующего молекулярного анализа. Концентрацию нитратов и аммония определяли ко-лометрически с помощью поточного инъекционного анализа (FIA star Analyzer, США). Для этого подготавливали образец: к 4 г почвы добавляли 32 мл 1M KCl.

Для стимуляции сезонных изменений применяли два метода температурного и временного воздействия на почву в микрокосмах: длительная заморозка и повторяющиеся циклы замораживания—размораживания. Кроме того, была проанализирована почасовая динамика изменения кинетики процесса нитрификации непосредственно после начала этапа размораживания почвы.

Длительное замораживание почвы. После транспортировки почвы из холодной комнаты и установки всех микрокосмов образцы инкубировали в течение одной недели при температуре +30° для активации процесса нитрификации (рис. 1). После этого микрокосмы были перенесены в холодильную камеру (—10°) на две недели. Последующая инкубация продолжалась при +30° в течение трех недель. Параллельно 15 микрокосмов были оставлены в инкубаторе на +30° в качестве контроля для отслеживания уровня нитрификации в начале, середине эксперимента и по окончании трех недель инкубации. Химический анализ микрокосмов проводили в первую неделю на 1, 5, 7-й день инкубации при +30°, далее на 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21-й день в период трехнедельной инкубации при +30°. Химический анализ контрольных микрокосмов был выполнен на 7, 14, 21, 38, 42-й день инкубации при +30°.

Рис. 1. Схема эксперимента с длительным замораживанием микрокосмов

Повторяющиеся циклы замораживания—размораживания почвы. Первая часть эксперимента, включающая инкубацию почвы в течение недели при +30°, была аналогична вышеописанному эксперименту. Далее следовали три последовательных цикла замораживания при —10° в течение одного дня и размораживания при +30° в ходе двух дней (рис. 2). После последнего цикла инкубация микрокосмов продолжалась три недели при +30°. Химический анализ проводили в течение первой недели инкубации на 1, 5, 7-й день, затем на 1-й и 2-й день разморозки для каждого цикла и в ходе трехнедельной инкубации на 1, 2, 3, 5, 7, 14, 21-й день.

Выделение ДНК и амплификация фрагментов генов атоА. Молекулярный анализ почвы из деструктирован-ных микрокосмов начинали с выделения ДНК, избегая момента размораживания. Все манипуляции проводи-

Рис. 2. Схема эксперимента с циклами замораживания-размораживания почвы

ли на льду для сохранения постоянной температуры. Препарат ДНК из почвенного образца массой 0,5 г выделяли в соответствии с протоколом производителя при помощи набора реактивов (FastDNA spin kit for soil, «Qbiogene», Канада). Затем препарат растворяли в 50 мкл дистиллированной воды и очищали с помощью коммерческого набора реактивов (UltraClean 15 DNA purification Kit, «MoBio», Канада).

Для амплификации фрагментов гена amoA аммо-ний-окисляющих бактерий использовали систему оли-гонуклеотидных праймеров amoA-1F и amoA-2R [15]. Функциональный ген amoA аммоний-окисляющих архей был амплифицирован с помощью праймеров CrenamoA23f и CrenamoA616r [20]. Для всех ПЦР-реакций общий объем реакционной смеси составлял 50 мкл и включал 10хПЦР-буфер (17 мМ (NH4)2SO4; 67 мМ Трис-HCl, pH 8,8; 2мМ MgCl2), 2 мкл dNTP, 10 пмоль каждого из праймеров, 2 единицы Taq ДНК-полимеразa [13]. Для всех ПЦР-реакций использовали следующий температурно-временной протокол: 5 мин. при 95°, следующие 10 циклов — 30 с при 94°, 30 с при 55°, 1 мин. при 72°; следующие 25 циклов — 30 с при 92°, 30 с при 55°, 1 мин. при 72°; элонгация 10 мин. при 72° [20]. Амплификацию проводили на приборе MyCycler («BioRad», США).

Продукты ПЦР анализировали в 1,0%-м ага-розном геле, окрашенном бромистым этидием до концентрации 1 мкг/мл.

Электрофорез в денатурирующем геле (ДГГЕ). ДГГЕ-анализ состава сообщества аммоний-окисляющих бактерий и архей выполнен в соответствии с ранее описанным методом G.W. Nicol с соавт. [14]. Сообщество аммоний-окисляющих бактерий охарактеризовано с помощью ДГГЕ-анализа фрагментов гена amoA по методике T.E. Freitag с соавт. [6]. Продукты амплификации фрагментов гена amoA аммоний-окисляющих бактерий содержали GC-кламп на нуклеотидных последовательностях праймера amoA1F (amoA1F-GC) и amoA2R-GG [6]. ДГГЕ-анализ функционального гена amoA аммоний-окисляющих архей не требовал наличия GC-клампа, были использованы ПЦР-продукты, полученные непосредственно после амплификации с праймерами CrenamoA23f и CrenamoA616r.

ДГГЕ-анализ выполняли на приборах DCode Universal Mutation Detection System (Bio-RAd, Hertfordshire, UK) в соответствии с ранее описанной методикой. Использовали гели, содержащие 8% (w/v) полиакриламида и разные количества линейного

градиента денатуранта (40—65% для фрагментов гена amoA аммоний-окисляющих бактерий и 15—55% для фрагмента гена amoA аммоний-окисляющих архей). Были заданы следующие условия проведения анализа ДГГЕ: электрофорез в 6,5 л 1*ТАЕ-буфере при постоянной температуре 60° в течение 900 мин при напряжении 100 В. Процедуры окрашивания нитратом серебра были выполнены согласно методике [14], сканирование произведено с помощью сканера Epson GT9600.

Результаты и обсуждение

Динамика изменения нитрифицирующей активности при длительном замораживании. На рис. 3, А приведены данные о динамике изменения концентрации нитратов/нитритов в ходе эксперимента с длительным замораживанием микрокосмов. В начале эксперимента микрокосмы инкубировали в течение одной недели при +30°, что было необходимо для активации процесса нитрификации в почве, которая до этого хранилась при +4° три месяца. Начальная концентрация оксидов азота в почве составляла 2,9 мкг К—К03/г-сут; в течение первой недели инкубации она оставалась практически на том же уровне. Подобную динамику процесса нитрификации наблюдали и другие исследователи, которые отмечали, что в течение первых двух недель инкубации при температурах +25...300 значительных изменений в концентрации нитритов/нитратов не происходит [21].

Размораживание почвы, находившейся до этого в течение двух недель при —10°, началось с концентрации нитратов 3,81 мкг К—К03/гсут, что примерно соответствовало уровню нитрификации до момента обработки микрокосмов длительным холодовым шоком. Увеличение нитрифицирующей активности в ходе первой недели оттаивания почвы происходило достаточно медленно. В последующие дни инкубации

Рис. 3. Изменение концентрации нитратов (А) и аммония (Б) при длительной заморозке микрокосмов: 0 — начало эксперимента (15 мин после извлечения почвы из холодной комнаты, +4°); П — прединкубационный период до замораживания почвы; Р — размораживание почвы при +30° после двухнедельного воздействия низкой температуры

уровень нитрификации в обработанных холодом образцах оставался ниже уровня таковой в контроле.

Концентрация аммония (рис. 3, Б) в контрольных микрокосмах в течение первых двух недель инкубации при +30° постепенно увеличивалась и достигла пика в точке, соответствующей трем неделям инкубации, а затем стремительно уменьшилась до значений менее 1 мкг/г к концу эксперимента. В образцах, обработанных холодом, пик концентрации аммония пришелся на второй день после размораживания и к концу первой недели приблизился к уровню контрольных образцов.

Таким образом, замораживание на две недели оказало влияние на последующий рост уровня нитрификации в каштановой почве. Концентрация нитритов/ нитратов в обработанных холодом образцах к концу третьей недели инкубации при +30° была ниже уровня нитрификации в контрольных образцах этого же срока инкубации (точка инкубации контрольных микрокосмов в течение трех недель соответствует «1, +30°» на рис. 3, А). Кроме того, нарастание нитрифицирующей активности в обработанных холодом образцах происходило медленнее, чем в контроле.

Результаты химического анализа показали резкое увеличение концентрации аммония на начальных этапах инкубации контрольных образцов, что связано с активным процессом минерализации. Высокая температура и влага значительно ускоряют этот процесс [10]. Пик концентрации аммония для обработанных образцов приходится на первую неделю после начала размораживания почвы, когда под действием температуры активируется минерализация. Контрольные и обработанные холодом микрокосмы продемонстрировали сходную кинетику, но разные сроки проявления минерализации, что связано с несовпадением периодов инкубации при высокой температуре.

Динамика изменения нитрифицирующей активности в ходе повторяющихся циклов замораживания-размораживания почвы. Кратковременная заморозка почвы и последующее размораживание при высокой температуре привели к колебаниям концентрации нитратов. Наиболее существенные изменения кинетики нитрификации произошли после первого цикла замораживания—размораживания почвы (рис. 4, А), когда ко второму дню инкубации при +30° концентрация оксидов азота увеличилась в 4 раза; в ходе дальнейших циклов она повышалась незначительно. После последнего цикла замораживания—размораживая концентрация оксидов азота составила 5,27 мкг К—К03/гсут, к концу первой недели инкубации при +30° — 6,1 мкг К—К03/гсут. В ходе дальнейшей двухнедельной инкубации нитрифицирующая активность в обработанных образцах интенсивно нарастала и к концу эксперимента практически достигла уровня нитрификации в контроле.

Резкое увеличение концентрации аммония было зафиксировано на 3-й день после последнего цикла замораживания—размораживания микрокосмов (рис. 4, Б). Интересно, что в точке пика активности для данного эксперимента она была значительно

Рис. 4. Изменение концентрации нитратов (А) и аммония (Б) в ходе циклов замораживания—размораживания микрокосмов: 0 — начало эксперимента (15 мин после извлечения почвы из холодной комнаты, +4°); П — прединкубационный период до замораживания почвы; Ц — номер цикла; Р — размораживание почвы при +30° после последнего цикла

выше, чем в первом в аналогичной точке к концу первой недели инкубации.

На основании результатов второго эксперимента было сделано предположение о том, что высокий уровень нитрифицирующей активности связан с большим количеством высвобождающихся субстратов в ходе повторяющихся циклов замораживания—размораживания микрокосмов. Наличие легкодоступных субстратов приводит к увеличению интенсивности метаболизма и нарастанию нитрифицирующей активности микроорганизмов [12]. Работы разных исследователей продемонстрировали 50%-ю гибель популяции микроорганизмов и уменьшение содержания ДНК в почве на 33% после первого цикла замораживания—размораживания. Кроме того, подобные циклы уменьшают численность культивируемых микроорганизмов в почве и редуцируют разнообразие сообщества [18]. Наши результаты показали, что воздействие отрицательных температур в ходе повторяющихся циклов замораживания—размораживания почвы приводит к временному снижению бактериальной активности, однако также быстро микроорганизмы способны к восстановлению активности после размораживания почвы. Наиболее значимые изменения уровня нитрификации в ответ на температурные колебания наблюдаются только на ранних стадиях эксперимента. Низкий уровень нитрификации после первого цикла является результатом возможной гибели микроорганизмов, которые не приспособлены к холодовому стрессу в ходе замораживания—размораживания почвы. Известно, что психрофильные бактерии преобладают в постоянно холодных арктических почвах, они имеют широкий спектр адаптаций к холоду, таких, как адаптивные к холоду ферменты, протеины холодового шока, антифризы и криопро-текторы [9]. Все это позволяет психрофилам быть

Обработанные образцы

0

7Р

14Р

т

в а а

щ

U U ы

S S =

Uli -йй

ш

я с с

доминирующими членами сообщества в арктических почвах [9, 12]. Поскольку каштановые почвы характерны для полупустынь и умеренных континентальных степей, можно предположить, что сообщество микроорганизмов в них представлено не психрофильными, а психротолерантными или мезофильными с широкой нормой реакции видами, которые способны к быстрой адаптации в условиях резко флуктуирующих температур.

ДГГЕ-анализ фрагментов функционального гена amoA аммоний-окисляющих бактерий и архей после длительного замораживания почвы. Поскольку наиболее значимые различия в уровне нитрификации между контрольными и обработанными холодом микрокосмами были обнаружены после длительной заморозки, ДГГЕ-анализ проводили только для первого эксперимента

(рис. 5, А, Б). Сравнительный ДГГЕ-анализ полученных продуктов амплификации фрагментов функционального гена amoA показал, что состав аммоний-окисляющих бактерий существенно не изменился после замораживания почвы. Кроме того, не удалось выявить изменений ДГГЕ-паттернов и в контрольных микрокосмах, что свидетельствует об отсутствии влияния длительного срока инкубации при высокой температуре на состав сообщества нитрификаторов. Анализ сообщества нетермофильных автотрофных аммоний-окисляющих архей после 2-недельного замораживания почвы или инкубации при высокой температуре также не обнаружил изменений интенсивности ДГГЕ-полос для обработанных и контрольных микрокосмов. Полученные нами результаты совпадают с данными M.K. Männistö с соавт. [12]: им удалось зафиксировать незначительные изменения в составе микробного сообщества после замораживания почвы. Наши результаты также сходятся с опубликованными в 2006 г. данными о том, что структура сообщества микроорганизмов не изменяется под воздействием на почву низких температур, повторяющихся в течение 2 мес. [7]. Эти исследования были проведены с применением липидных биомаркеров и использовались для изучения циклов замораживания—размораживания почвы впервые. Таким образом, члены сообщества нитрификаторов, устойчивых к флуктуациям температур, проявляются на ДГГЕ-геле в виде стабильных интенсивных полос, что указывает на широкое разнообразие данных микроорганизмов в каштановой почве. Также нам не удалось выявить различий в

Контроль О 14Р

Обработанные образцы

ййН

им»

Ii Ни

CSU

т

аан

7Р

II

нК

г» И

**

14Р

Контроль О 14Р

ийа

М Г» «

!

и и

и И

Рис. 5. Результаты ДГГЕ-анализа фрагментов функционального гена amoA аммоний-окисляющих архей (А) и бактерий (Б) в эксперименте с длительным замораживанием микрокосмов

степени большей устойчивости бактерий или архей к температурным перепадам, что указывает на отсутствие преимущества той или иной группы нитрифи-каторов при воздействии низких температур на почву по итогам данного изучения.

Выводы

В ходе исследований было показано снижение активности нитрификации после 2-недельного замораживания почвы при температуре —10°. Мы предполагаем, что причиной низкого уровня нитрификации явилась гибель определенного количества микроорганизмов при замораживании почвы. Следовательно, уровень нитрификации после размораживания поддерживался микроорганизмами, выдержавшими воздействие отрицательных температур в течение двух недель. Очевидно, что при низких температурах микроорганизмы не проявляли нитрифицирующей активности, поскольку изменения агрегатного состояния мембранных липидов в таких условиях приводят к снижению или торможению транспорта протеинов [9]. Так как сообщество микроорганизмов в каштановой почве не подвергается постоянному воздействию низких температур, можно предположить, что адаптивные механизмы на генетическом уровне (например, адаптационные к холоду аминокислотные замены) у них не сформированы. Следовательно, резкое длительное понижение температуры является холодовым шоком для сообщества микроорганизмов каштановой почвы и приводит к значительным внутримембранным изменениям или к гибели их наиболее уязвимого к холоду пула.

При этом изменения состава сообщества нитрифицирующих бактерий и архей не происходит, что было выяснено при помощи метода ДГГЕ-анализа фрагмента функционального гена amoA. Показаны сходные ответы сообщества нитрифицирующих бактерий и архей на воздействие низких температур,

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Касимов Н.С., Клиге Р.К. Современные глобальные изменения природной среды. Т. 1. М., 2006.

2. Степанов А.Л. Микробное образование и поглощение парниковых газов в почвах. М., 2009.

3. Степанов А.Л., Лысак Л.В. Методы газовой хроматографии в почвенной микробиологии. М., 2002.

4. Степанов А.Л., Судницын И.И., Умаров М.М., Гали-манге Б. // Почвоведение. 1996. № 11.

5. Avrahami S., Conrad R. Patterns of community change among ammonia oxidizers in meadow soils upon long-term incubation at different temperatures // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol. 69, N 10.

6. Freitag T.E., Chang L., Prosser J.I. Changes in the community structure and activity of betaproteobacterial ammonia-oxidizing sediment bacteria along a freshwater-marine gradient // Environ Microbiol. 2006. Vol. 8.

7. Koponen H., Jaakkola T., Keinanen-Toivola M.M. et al. Microbial communities, biomass, and activities in soils as affected by freeze thaw cycles // Soil Biol. Biochem. 2006. Vol. 38.

8. Kurganova I., Teepe R.., Loffeld N. Influence of freeze-thaw events on carbon dioxide emission from soils at different moisture and land // Carbon Balance and Management. 2007. Vol. 2, N 2.

9. Mackey B.M. Lethal and sublethal effects of refrigeration, freezing, and freeze—drying on microorganisms // Revival of injured microbes / M.H.E. Andrew, A.D. Russell (Eds.). Orlando. Fla, 1984.

10. Mahendrappa M.K., Smith R.L., Christiansen A.T. Nitrifying organisms affected by climate region in western United States // Soil Sci. Soc. Amer. J. 1986. Vol. 30.

11. Mahli S.S., McGill W.B. Nitrification in three Alberta soils: effect of temperature, moisture and substrate concentrations // Soil Biol. Biochem. 1982. Vol. 14, N 4.

12. Mannisto M.K., Tiirola M., Haggblom M.M. Effect of freeze—thaw cycles on bacterial communities of arctic tundra soil // Microbiol. Ecol. 2009. Vol. 58, N 3.

13. Muyzer G., Waal E.C. de, Uitterlinden A.G. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel

выражающиеся в крайней устойчивости и приспособляемости выживших микроорганизмов к холодо-вому шоку. Повторяющиеся циклы замораживания-размораживания почвы не повлияли на уровень нитрифицирующей активности.

electrophoresis analysis of polymerase chain reactionamplified genes coding for 16S rRNA // Appl. Environ. Microbiol. 1993. Vol. 59, N 1.

14. Nicol G.W., Tscherko D, Embley T.M., Prosser J.I. Primary succession of soil Crenarchaeota across a receding glacier foreland // Environ. Microbiol. 2005. Vol. 7, N 3.

15. Ochsenreiter T., Selezi D., Quaiser A. et al. Diversity and abundance of Crenarchaeota in terrrestrial habitats studied by 16S RNA surveys and real time PCR // Environ. Microbiol. 2003. Vol. 5.

16. Schernm H., Bruggen A.H.C. van. Global warming and nonlinear growth: how important are changes in average temp-etature // Phytopathol. 1994. Vol. 84.

17. Sharma S., Szele Z, Schilling R. et al. Influence of freeze—thaw stress on the structure and function of microbial communities and denitrifying populations in soil // Appl. Environ. Microbiol. 2006. Vol. 72, N 3.

18. Soulides DA., Allison F.E. Effect of drying and freezing soils on carbon dioxide production, available mineral nutrients, aggregation, and bacterial population // Soil Sci. 1961. Vol. 91, N 5.

19. Stark J.M., Firestone M.K. Kinetic characteristics of ammonium-oxidizer communities in a California oak woodland-annual grassland // Soil Biol. Biochem. 1996. Vol. 28, N 4.

20. Tourna M., Freitag T.E., Nicol G.W. et al. Growth, activity, and temperature responses of ammonia-oxidising ar-chaea and bacteria in soil microcosms // Environ. Microbiol. 2008. Vol. 10, N 5.

21. Yergeau E., Kowalchuk G.A. Responses of Antarctic soil microbial communities and associated functions to temperature and freeze—thaw cycle frequence // Appl. Environ. Microbiol. 2008. Vol. 10, N 9.

22. Wells G.F., Park H.D., Yeung C.-H. et al. Ammonia-oxidizing communities in a highly aerated full-scale activated sludge bioreactor: betaproteobacterial dynamics and low relative abundance of Crenarchaea // Appl. Environ. Microbiol. 2009. Vol. 11, N 9.

Поступила в редакцию 12.03.2011

INFLUENCE OF LONG AND SHORT CYCLES OF FREEZING-THAWING ON SOIL NITRIFUING ACTIVITY OF MICROORGANISMS

A.S. Cherobaeva, A.L. Stepanov, I.K. Kravchenko

The incubation experiment has been performed on microcosms of chestnuts soil to estimate the influence of long and short cold shocks on the nitrification activity of ammonia-oxidizing bacteria and archaea. Significant reduction of the nitrification activity were reported two weeks later after applying cold shock, while the incubation for 24 hours had not effect on the level of nitrification. We supposed the dominance of psychrophiles and mesophiles microorganisms with a broad range of adaptation can lead to a high level of nitrification in conditions with different frequency of temperature fluctuation. Decreasing nitrification activity after long-term cold shock could be a result of the death of less resistance microorganisms, which occurs in particular geographic condition of chestnuts soil without frozen state of soil for a long time. The community structure of ammonia-oxidizing bacteria and archaea has not changed significant according to DGGE analysis.

Key words: ammonia-oxidizing microorganisms, nitrification, freeze—thaw cycles, cold shock.

Сведения об авторах.

Черобаева Анна Сергеевна, аспирант каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Степанов Алексей Львович, докт. биол. наук, профессор каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова. Кравченко Ирина Константиновна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. Ин-та микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН.