Способ комбинированного макромикроскопического препарирования и гистологической окраски в комплексной оценке морфологических изменений тканей глаза после лазерного, фотодинамического и термотерапевтического воздействия

Шацких А.В., Белый Ю.А., Терещенко А.В., Иванов А.М.

ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии», г Москва, Калужский филиал ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова

Росмедтехнологии», г. Калуга

СПОСОБ КОМБИНИРОВАННОГО МАКРОМИКРОСКОПИЧЕСКОГО ПРЕПАРИРОВАНИЯ И ГИСТОЛОГИЧЕСКОЙ ОКРАСКИ В КОМПЛЕКСНОЙ

ОЦЕНКЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ ТКАНЕЙ ГЛАЗА ПОСЛЕ ЛАЗЕРНОГО, ФОТОДИНАМИЧЕСКОГО И ТЕРМОТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО

ВОЗДЕЙСТВИЯ

Описан способ послойного макромикроскопического препарирования оболочек глаза с применением методов гистологической окраски и пространственной характеристики полученных результатов после ФДТ, ТТТ или отграничительной ЛК, примененных при экспериментальном моделировании вколоченного инородного тела. Данный способ позволяет дать сравнительную характеристику границ воздействия, особенностей сосудистых изменений и хориоретинальных взаимоотношений, различий в выраженности процессов фиброзирования и развития соединительнотканной капсулы вокруг инородного тела.

Ключевые слова: макромикроскопическое препарирование, оболочка глаза

Актуальность

При выполнении ряда экспериментальных работ нередко для подтверждения результатов необходимо проведение морфологических исследований. Наиболее частыми методиками в этих исследованиях являются анатомическое препарирование и изготовление гистологических препаратов. Препарирование дает послойную характеристику и пространственную топографию структур тканей. Гистология направлена на изучение изменений на тканевом и клеточном уровне, при этом информативность этой методики ограничена плоскостным уровнем среза. В некоторых случаях необходимо совмещение целей этих двух методик.

Цель исследования

Оценка эффективности способа послойного макромикроскопического препарирования с применением методов гистологической окраски и пространственной характеристики полученных результатов.

Материал и методы

Материалом послужили энуклеирован-ные глазные яблоки кроликов после проведения экспериментального моделирования вколоченного инородного тела в область заднего полюса с последующим применением ФДТ, ТТТ или отграничительной ЛК. Энуклеацию выполняли через 3 недели после проведения эксперимента.

Правые глазные яблоки фиксировали в растворе нейтрального формалина, промывали проточной водой, обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин, затем выполняли серии меридиональных гистологических срезов с применением окраски гематоксилин-эозином, а также по методике Ван-Гизон.

Левые глазные яблоки после фиксации подвергали макромикроскопическому препарированию. Для этого трепанировали задний отдел глазного яблока и вырезали участок стенки глазного яблока, центром которого являлся канал инородного тела. Производили послойное разделение внутренних оболочек, предварительно бережно удалив кортикальные слои стекловидного тела. Далее каждую оболочку исследовали по отдельности. Склеру исследовали гистологически, данные, полученные при этом, совпадали с описанием гистологических срезов правых глазных яблок. Сетчатку без окраски просветляли и заключали в бальзам с изготовлением тотального препарата. Хориоидея претерпевала ряд последовательных воздействий. Первоначально ее тотально окрашивали по методике Ван-Гизон, просветляли и подвергали микроскопированию, с целью изучения областей воздействия на пигментный эпителий. Затем эту оболочку депигментировали и препарат вновь окрашивали той же окраской, заключали в бальзам с изготовлением тотального препарата аналогично сетчатке. После обесц-

вечивания пигмента обзору открывалась сосудистая сеть этой оболочки.

Препараты изучали под микроскопом фирмы Ьеюа БМ ЬВ2 при х50, х100, х200, х400-крат-ном увеличении с последующим фотографированием.

Результаты и обсуждение

При гистологическом исследовании правых глазных яблок определяли канал инородного тела с различными морфологическими проявлениями терапевтических воздействий. При этом по меридиональным срезам стенки глазного яблока мы можем только косвенно судить об изменениях в структуре хориоидеи и состоянии ее сосудов. Для получения этих данных и было применено макромикроскопи-ческое препарирование оболочек левых глазных яблок.

При изучении пространственных препаратов ЛК проявлялась в появлении пигментированных ограниченных очагов звездчатой формы. Иногда связанных в виде тонких перемычек между «лучиками». При большем увеличении этих очагов определяли, что среди гранул пигмента различного размера просматриваются и контуры клеток, с ядром и мелкозернистым пигментом в цитоплазме. Это может свидетельствовать о предположительной миграции трансформированного пигментного эпителия на внутреннюю поверхность сетчатки.

После ФДТ и ТТТ характер пигментации сетчатки носил кольцевой характер, с радиусом, соответствующим области облучения. Границы пигментации при ТТТ в некоторых участках были размытыми. Клеточные элементы можно было встретить редко и в основном после ТТТ на границе перехода в неизмененную сетчатку.

Тотальные препараты хориоидеи с сохраненным пигментом дополняли представление о формах и границах воздействия. Стенка канала инородного тела интенсивно прокрашивалась фуксином (ярко-малиновый цвет), что подтверждало выраженность процессов фибро-зирования и развития соединительнотканной капсулы вокруг инородного тела.

В препаратах после ЛК коагуляты повторяли место расположения таковых на сетчатке. Были представлены скоплением клеток пигментного эпителия - уменьшенными в размерах, частично разрушенными.

После фотодинамического и термотерапевтического воздействий аналогично сетчатке просматривалась кольцевая зона. При большем увеличении видны были различия в качественном составе пигментации. После ФДТ гранулы пигмента различного размера сплошь распространялись по площади облучения, и только в пограничной зоне стали появляться единичные сохраненные, но уменьшенные в размерах клетки. После ТТТ картина выглядела следующим образом: гранулы пигмента в основном оседали вдоль стенок сосудов крупного и среднего диаметра, формируя подобие «муфт», на остальном протяжении просматривали скопление видоизмененных пигментных клеток.

После депигментации обзору открывалась сосудистая сеть хориоидеи, а о границах зон облучения можно было дополнительно судить по интенсивности прокрашивания фуксином фиброзно-измененных участков этой оболочки. На препаратах были хорошо различимы просветы сосудов, скопление в просветах эритроцитов.

В области коагулятов после ЛК были видны очаговые разрушения стенки сосудов с выходом форменных элементов крови в ткани и пропитывание ими стромы хориоидеи. Просвет мелких поврежденных сосудов после коагулята по направлению тока крови запустевал, и происходила его облитерация. В краевой зоне коагулятов, а также если коагулят проходил над сосудом крупного диаметра, отмечали неполное разрушение сосудистой стенки, которое впоследствии приводило к сладжированию форменных элементов крови и образованию тромбов.

После фотодинамической терапии в процессе фибротизации гранулы разрушенного пигмента достаточно глубоко проникли в строму хориоидеи. Количество сосудов в области канала инородного тела значительно меньше, просветы их сужены, без эритроцитов. Эти изменения имеют четкую границу, определенную зоной воздействия лазера.

После ТТТ эти изменения сосудистой сети носили менее выраженный характер. Отмечали незначительное сужение просветов, появление тромбов. Ярких проявлений органического поражения стенок сосудов выявлено не было.

Необходимо отметить, что при макромик-роскопическом препарировании и расслаивании оболочек между собой наибольшее затруднение возникло в случае, где в виде терапевти-

ческого воздействия применяли ТТТ. При детальном изучении поверхности хориоидеи, обращенной к сетчатке, на тотальных препаратах были выявлены множественные фиброволокнистые структуры за пределами зоны облучения. Ни после ЛК, ни после ФДТ в аналогичных зонах подобных структур не обнаружено.

Выводы

Способ послойного макромикроскопического препарирования с применением методов гистологической окраски позволил провести комп-

лексную оценку пространственных морфологических изменений после ФДТ, ТТТ или отгра-ничительной ЛК в оболочках глаза. Плоскостные препараты способствуют исследованию границ и форм лазерного, фотодинамического и термотерапевтического воздействия, оценке поражения сосудистого русла, поведения пигментного эпителия. Гистологическая окраска тотальных препаратов в совокупности с депигментацией меланинсодержащих клеток дает возможность визуализации и дифференцировки различных структур оболочек глазного яблока.