Особенности ТСХ-скрининга производных фенотиазина

УДК 543.544

ОСОБЕННОСТИ ТСХ-СКРИНИНГА ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОТИАЗИНА © 2005 г. Р.А. Клищенко, З.А. Темердашев, Н.В. Киселева

Chromatographic systems with different polarity eluents are studied in the wide composition range for screening of phenothiazine derived. Ammonia was used as a modificator of mobile and state phases for increase of separation efficiency. Regularity of R f variation of components are established, more effective eluents are selected and chromatographic conditions are optimized.

Процедура скрининга является неотъемлемой частью «ненаправленного» анализа, широко применяемого в практике судебно-химических, химико-токсикологических и других лабораторий. В этих случаях эффективным является групповая идентификация (адаптивный анализ) [1], которая часто осуществляется с использованием метода ТСХ.

Производные фенотиазина - вещества, обладающие нейролептическим действием и широко использующиеся в медицинской практике. Практический интерес представляет разработка унифицированной методики их контроля в терапевтической практике, а также при диагностике отравлений. Однако разделение и идентификация методом ТСХ соединений ряда фенотиазина представляет определенную сложность ввиду близости их физико-химических свойств и как следствие характеристик удерживания и характера взаимодействия с подвижной и неподвижной фазами.

В настоящее время используются несколько стандартных систем для ТСХ-анализа производных фено-тиазина [2]. В качестве элюентов применяют следующие смеси растворителей: 1 - бензол-диоксан-25 % аммиак (70:25:5), 2 - бензол-диоксан-25 % аммиак (60:35:5), 3 - этилацетат-ацетон-25 % аммиак в этаноле (1:1) (50:45:4), 4 - этанол-уксусная кисло-та(ледяная)-вода (50:30:20), 5 - хлороформ-этанол (70:30), 6 - бензол-диоксан-25 % аммиак (10:80:10). В работах [3-9] также описаны условия разделения многих фенотиазинов, однако часть из них уже не используется в практике, а условия определения других не являются оптимальными на новых хромато-графических сорбентах.

В данной работе проведены исследования по оптимизации условий элюирования для скрининга производных фенотиазина с использованием семи представителей данного класса соединений.

Экспериментальная часть

Экспериментальные исследования проводили на пластинках 8огЪШ (си-ликагель СТХ-1А, зернение 5-17 мкм, размер 10x10 см, подложка ПЭТФ). Перед нанесением образца пластины очищали смесью вода:ацетонитрил (8:2) в ненасыщенной камере. Экспериментальные исследования показали, что наносимые в солевой форме вещества не вымываются с линии старта элюентами и требуется использование пластин с рН > 8. Для этого предварительно проверяли значение рН пластин по индикаторной бумаге. При рН < 8 пластины пропитывали 0,1М раствором КОН, что можно сделать

как опрыскиванием, так и погружением в раствор. Эта процедура необходима для перевода солевой формы наносимого вещества в основную, поскольку щелочной силикагель нейтрализует кислоту, связанную с исследуемым веществом. При использовании элюентов, содержащих аммиак, проверка значения рН пластины не требуется. Отработку методик ТСХ-скрининга проводили на образцах, приготовленных из лекарственных форм, с приблизительной концентрацией растворов 2,5-20 мг/мл. Для этого таблетки измельчали и заливали 1 мл ацетонитрила. Извлечение веществ проводили в течение 1 ч. Для хроматографирования на линию старта наносили 1-5 мкг каждого вещества.

Разделение проводили в восходящем потоке в герметичных N-камерах, насыщенных парами растворителей, при комнатной температуре. Длина пути растворителя составляла каждый раз 9 см. По окончании хроматографирования пластины высушивали на нагревательном устройстве УСП-1.

Проявление проводили реактивом Марки, 5 % раствором хлорида железа (III) в 25 %-й серной кислоте и реактивом Драгендорфа. Результаты детектирования приведены в табл. 1. При проявлении 10 % азотной или 10 % серной кислотой результат был таким же, как при использовании реактива Марки.

В предварительных исследованиях использовали растворители, применяемые в тонкослойной хроматографии на силикагеле: гексан (Hex), бензол (PhH), метанол (MeOH), этанол (EtOH), изопропанол (i-PrOH), ацетонитрил (MeCN), диэтиловый эфир (Et2O), ацетон (Me2CO), этилацетат (EtAc) и хлороформ (CHCl3). Первоначально были получены значения Rf исследуемых веществ в однокомпонентных элюентах, представленные в табл. 2.

Достаточно высокие значения Rf для всех исследуемых веществ наблюдаются при использовании метанола и этанола. Во всех остальных элюентах полученные значения Rf низкие и для практических це-

Таблица 1

Результаты детектирования исследуемых веществ некоторыми реагентами

Исследуемое соединение Реактивы и результаты реакций

р-в Марки FeCl3/H2SO4 р-в Драгендорфа

Аминазин Розовый Бордовый Темно-оранжевый

Перициазин Бледно-оранжевый Светло-красный Темно-оранжевый

Этаперазин Розовый Бордовый Темно-оранжевый

Нонахлазин Бледно-розовый - Темно-оранжевый

Сонапакс Сине-зеленый Зеленый Темно-оранжевый

Трифтазин Бледно-оранжевый Оранжевый Темно-оранжевый

Тизерцин Фиолетовый Фиолетовый Темно-оранжевый

Таблица 2

Rf веществ в однокомпонентных элюентах

Элюент Исследуемое соединение

Аминазин Перициазин Этаперазин Нонахлазин Сонапакс Трифтазин Тизерцин

Hex 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

PhH 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

MeOH 0,45 0,69 0,59 0,52 0,37 0,44 0,54

EtOH 0,29 0,48 0,37 0,24 0,21 0,24 0,32

i-PrOH 0,16 0,26 0,10 0,12 0,09 0,11 0,16

MeCN 0,09 0,07 0,03 0,01 0,03 0,02 0,12

Et2O 0,18 0,03 0,02 0,02 0,06 0,05 0,16

Me2CO 0,35 0,38 0,14 0,14 0,17 0,08 0,39

EtAc 0,11 0,06 0,03 0,05 0,07 0,04 0,20

CHCl3 0,03 0,01 0,01 0,01 0,02 0,02 0,04

Таблица 4

Rf исследуемых веществ в однокомпонентных элюентах с добавлением аммиака

Исследуемое соединение Элюент

Me2CO:NH3 MeCN:NH3

100:1 90:10 100:1 100:2.5 100:5 90:10

Аминазин 0,67 0,90 0,25 0,47 0,66 0,80

Перициазин 0,64 0,87 0,17 0,34 0,54 0,67

Этаперазин 0,36 0,83 0,08 0,20 0,42 0,58

Нонахлазин 0,39 0,87 0,06 0,16 0,43 0,63

Сонапакс 0,58 0,90 0,14 0,32 0,60 0,76

Трифтазин 0,39 0,87 0,08 0,22 0,50 0,68

Тизерцин 0,78 0,90 0,49 0,68 0,82 0,87

лей они не подходят. В ряду растворителей метанол, этанол, изопропанол наблюдается уменьшение значений Rf, поэтому в дальнейших исследованиях из рассмотренных спиртов применяли только метанол.

Из этих растворителей составлялись возможные бинарные элюенты, исключая гексан, для которого характерны только дисперсионные взаимодействия, при соотношении компонентов 1:1. В табл. 3 представлены полученные значения Rf исследуемых веществ, для которых Rf выше 0,20.

Только в 6 элюентах (при использовании метанола) из 21 возможной комбинации растворителей значения Rf исследуемых веществ достаточно высокие. Более детальное исследование показало, что эффективное разделение исследуемых веществ в бинарных элюентах, где одним из компонентов является метанол, не достигается. В остальных 15 случаях значения

Rf определяемых веществ низкие, и для дальнейшего повышения эффективности разделения требуется использование более сложных систем. Было изучено 20 вариантов тройных смесей растворителей (бензол, хлороформ, ацетонитрил, диэтиловый эфир, ацетон, этилацетат) при соотношении компонентов 1:1:1. В основном полученные значения Rf не превышали 0,10, и поэтому в данной работе возможность их аналитического применения не обсуждается.

По результатам проведенных экспериментов можно сделать вывод, что для получения эффективной системы элюирования необходим особый модификатор, аналогичный по природе разделяемым веществам и обладающий основными свойствами. Таким модификатором может быть аммиак, [2, 4]. В этом случае основная сложность связана с тем, что аммиак используется в виде водного раствора, а вода не смешивается со многими органическими растворителями, что требует использования гидрофильных растворителей как в чистом виде, так и в качестве добавки для повышения взаимной растворимости компонентов элюентов.

Нами проведены экспериментальные исследования с аммиаком в качестве модификатора с применением гидрофильных растворителей ацетона и ацето-нитрила. Данные по Rf исследуемых веществ при использовании их в смеси с водным раствором аммиака приведены в табл. 4.

Rf исследуемых веществ в бинарных элюентах

Таблица 3

Исследуемое соединение Элюент

PhH-MeOH MeCN-MeOH Et2O-MeOH Me2CO-MeOH EtAc-MeOH CHCl3-MeOH

Аминазин 0,71 0,37 0,37 0,43 0,39 0,60

Перициазин 0,80 0,54 0,57 0,67 0,62 0,71

Этаперазин 0,78 0,46 0,47 056 0,50 0,73

Нонахлазин 0,72 0,38 0,39 0,41 0,32 0,72

Сонапакс 0,68 0,31 0,34 0,42 0,32 60 0,56

Трифтазин 0,74 0,37 0,38 0,44 0,37 0,68

Тизерцин 0,77 0,47 0,47 0,56 0,51 0,69

Добавление аммиака к смеси гек-сан-ацетон приводит к уменьшению удерживания производных фенотиа-зина и улучшению их разделения. Так как аммиак с такой смесью смешивается ограниченно, ее насыщали аммиаком при контакте с его водным раствором в течение 30 мин. Хромато-графическое поведение исследуемых веществ изучили при двух составах элюентов. Предварительно были определены Rf веществ при составе элю-

ента гексан-ацетон (1:1). Полученные данные по значениям удерживания представлены в табл. 5, где для сравнения приведены результаты, полученные без использования аммиака.

Таблица 5

веществ в бинарных элюентах с добавлением аммиака

Исследуемое соединение Элюент

Hex:Me2CO Hex:Me2CO:NH3

6:4 5:5 6:4:насыщ 5:5:насыщ

Аминазин 0,22 0,25 0,48 0,70

Перициазин 0,08 0,11 0,17 0,36

Этаперазин 0,06 0,07 0,16 0,33

Нонахлазин 0,06 0,07 0,21 0,40

Сонапакс 0,10 0,12 0,39 0,61

Трифтазин 0,04 0,05 0,28 0,51

Тизерцин 0,21 0,26 0,63 0,74

Другим способом оптимизации разделения может быть модификация сорбента, которая достигается насыщением аммиаком объема камеры. Такой подход также приводит к положительному результату. В этом случае добавление его в элюент необязательно. Недостаток такого способа модификации хроматографиче-ской системы: для получения воспроизводимых результатов необходимо насыщение камеры перед каждым экспериментом. Кроме того устройство хромато-графической камеры должно позволять одновременно использовать две жидкости без их смешивания, т. е. необходимо как минимум два разделенных отдела для растворителей, что реализуется в специальных типовых камерах. Полученные данные для системы хлороформ-ацетон в таком варианте приведены в табл. 6.

Результаты и их обсуждение

В результате серии экспериментов были установлены составы элюентов, обеспечивающие приемлемое разделение компонентов: 1 - гексан-ацетон-25 % аммиак (60:40:насыщ); 2 - гексан-ацетон-25 % аммиак (50:50:насыщ); 3 - ацетонитрил-25 % аммиак (95:5); 4 - ацетонитрил-25 % аммиак (90:10); 5 - хлороформ-

Rf веществ в бинарных элюентах с насыщением силикагеля аммиаком

Таблица 6

Исследуемое соединение CHCl3:Me2CO CHCl3:Me2CO; NH3

8:2 5:5 8:2; насыщ 5:5; насыщ

Аминазин 0,06 0,18 0,74 0,78

Перициазин 0,03 0,13 0,24 0,53

Этаперазин 0,05 0,08 0,29 0,46

Нонахлазин 0,04 0,11 0,62 0,69

Сонапакс 0,07 0,15 0,74 0,77

Трифтазин 0,06 0,11 0,65 0,69

Тизерцин 0,09 0,35 0,81 0,83

ацетон-25 % аммиак (80:20:насыщ); 6 - хлороформ-ацетон-25 % аммиак (50:50:насыщ); 7 - ацетон-25 % аммиак (100:1); 8 - метанол. Значения Rf исследуемых веществ в системах 1-8 приведены в табл. 7. Приведенные семь систем ранее для подобных разделений

не использовались. Эффективным оказалось использование однокомпонентного элюента метанола.

В системах 3, 4 и 7 было установлено монотонное возрастание значений Rf с увеличением количества аммиака в элюенте для всех исследуемых компонентов. Особенно резкое увеличение Rf наблюдалось в системе 7. Полученный характер зависимости удерживания от состава элюента совпадает с видом теоретической кривой (рис. 1).

1 и

0,5

0,1

Рис. 1. Зависимость Rf производных фенотиазина от состава подвижной фазы:  - система ацетонитрил- аммиак (аминазин);  - система ацетонитрил- аммиак (тизерцин) • - система ацетон - аммиак (сонапакс); ♦ - теоретическая кривая

Проведенное системное исследование возможных хроматографических систем элюирования позволило установить составы элюентов, обеспечивающие наибольшую эффективность разделения производных фенотиазина, определить условия детектирования исследуемых веществ и обосновать перспективность использования аммиака в качестве модификатора адсорбента и элюента в нормально-фазовом варианте ТСХ. Примеры хроматограмм смеси веществ, полученных в условиях, обеспечивающих приемлемое разделение, представлены на рис. 2.

1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

I

S

0

1

Рис. 2. Схема ТСХ-хроматограмм смеси семи представителей ряда фенотиазинов: 1 - система ацетонитрил - аммиак

0

Таблица 7

Значения Rf соединений в различных системах элюирования

Исследуемое соединение Элюент

1 2 3 4 5 6 7 8

Аминазин 0,48 0,70 0,66 0,80 0,74 0,78 0,67 0,45

Перициазин 0,17 0,36 0,54 0,67 0,24 0,53 0,64 0,69

Этаперазин 0,16 0,33 0,42 0,58 0,29 0,46 0,36 0,59

Нонахлазин 0,21 0,40 0,43 0,63 0,62 0,69 0,39 0,52

Сонапакс 0,39 0,61 0,60 0,76 0,74 0,77 0,58 0,37

Трифтазин 0,28 0,51 0,50 0,68 0,65 0,69 0,39 0,44

Тизерцин 0,63 0,74 0,82 0,87 0,81 0,83 0,78 0,54

Учитывая совместное применение исследованных препаратов в клинической практике, подобранные условия разделения могут быть рекомендованы для лабораторных исследований реальных образцов.

Литература

1. Саломатин Е.М., Николаева Э.Г. // Суд.-мед. эксп. 1999. № 3. С. 21-22.

2. Саломатин Е.М. Методические рекомендации по химико-токсикологическому определению психотропных соединений фенотиазинового ряда. Казань 1988.

3. Kofoed J., Fabierkiewicz C., Lucas G.H. W. // J. of Cromatography. 1966. Т. 23. С. 410-416.

4. Zingales I. // J. of Cromatography. 1967. Т. 31. С. 405-419.

5. Paulus W., Hoch W., Keymer R. // Arzneim.-Forsch. 1963. Т. 13. С. 609.

6. Mellinger T.J., Keller C.E. // J. Pharm. Sci. 1962. Т. 51. С. 1169-1173.

7. Cochin J., Daly J.W. // J. Pharm. Exp. Therap. 1963. Т. 139. С. 160-165.

8. Ojanpera I. // Trends in Analytical Chemistry. 1992. Т. 11. № 6. С. 222-230.

9. Карташов В.А. и др. // Суд.-мед. эксп. 1982. № 3. С. 39-41.

Кубанский государственный университет_11 марта 2005 г.