Способ приготовления жидкой питательной среды и способ получения жидкого микробиологического препарата на основе смеси штаммов спорообразующих бактерий-антагонистов фитопатогенных грибов р. Fusarium
METHOD FOR PRODUCING LIQUID NUTRITION MEDIUM AND METHOD FOR OBTAINING LIGUID MICROBIOLOGICAL AGENT BASED ON STRAINS MIXTURE OF SPORE-FORMING BACTERIA-ANTAGONISTS OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI OF G. FUSARIUM

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящая группа изобретений относится к способу приготовления жидкой питательной среды и способу получения жидкого микробиологического препарата, предназначенного для борьбы с фитопатогенными болезнями, в частности с фузариозом сельскохозяйственных культур.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Среди актуальных проблем в сельскохозяйственной отрасли известное место занимают грибковые болезни, главной из которых в регионах с умеренным климатом является фузариоз колоса озимой пшеницы. Заболевание наблюдается в большинстве регионов, где выращивается пшеница и обусловливает потери 25-30% урожая [Гагкаева и др, 2012.; Гагкаева, Гаврилова, 2014].
Возбудителями выступают грибы рода Fusarium, которые находятся в различных частях растения, как в колосковом стержне и чешуях, так и в семенах, особенно в зародышевой части семян.
На настоящий момент времени заражение грибами рода Fusarium сельскохозяйственных культур приобрело характер пандемии, при благоприятных условиях заболевание развивается на большинстве посевных площадей и представляет серьезную опасность для здоровья населения.
Существуют различные способы защиты от фитопатогенных грибов, при этом наиболее часто применяемым из них является использование фунгицидов. Однако, эффективность применения подобных веществ постоянно снижается. Так, например, в ряде работ было показано, что эффективность применения химических средств по борьбе с фитопатогенными грибами значительно уменьшается по причине постепенного развития резистентности к действию различных фунгицидных веществ. [Becker et al., 2010; Чекмарев и др., 2011]. По данным других авторов следует, что максимальный эффект, которого можно достигнуть при применении фунгицидов составляет не более 75 %, однако этого удается достичь, если применять комплексы из нескольких фунгицидных препаратов [Санин и др., 2011; Гасич и др., 2015].
В настоящее же время, вектор проводимых исследований сместился с поиска химических веществ на поиск и применение бактерий и их метаболитов, проявляющих антагонистические свойства к различным грибковым возбудителям болезней сельскохозяйственных культур [Сидоренко, 2012].
Одной из перспективных групп микроорганизмов, отличающихся как способностью эффективно противостоять фитопатогенам, так и проявлять фитостимулирующие свойства, является группа почвенных бактерий класса Bacilli.
В последнее время, бактерии данного семейства рассматриваются в качестве перспективных агентов биологического контроля болезней растений, а также в качестве организмов, проявляющих фитостимулирующую активность в силу их широкой распространенности, природного антагонизма ко многим фитопатогенным грибам и способности продуцировать вещества гормональной природы.
Зарубежный опыт указывает на высокую эффективность применения биопрепаратов на основе бацилл для биологического контроля патогенных грибов рода Fusarium. В частности, показана их эффективность на кукурузе, огурцах и картофеле [Cavaglieri, et al., 2005; Sadfi, et al., 2001; Chen et al., 2010].
Механизм действия заключается в колонизации бактериями-антагонистами корней растений в период прорастания семян и подавление патогенных грибов за счет выделения хитинолитических ферментов, сидерофоров и специфических антимикробных пептидов.
Из уровня техники известно изобретение, которое относится к биотехнологии, микробиологии и сельскому хозяйству и может быть использовано для получения бактериального препарата против болезней растений, вызываемых фитопатогенными грибами рода Fusarium, Microdochium, Pyrenophora и Puccinia. Штамм Bacillus subtilis BZR 517 обладает фунгицидной активностью в отношении фитопатогенных бактерий и грибов. Штамм Bacillus subtilis депонирован в Коллекции ГНУ ВНИИСХМ Россельхозакадемии под регистрационным номером RCAM01728 [Патент RU 2552146 С1, опубл. 10.06.2015].
Также из уровня техники известно изобретение, которое относится к сельскому хозяйству. Способ получения супрессивного компоста по отношению к возбудителю фузариоза растений Fusarium oxysporum и заключается в приготовлении компоста, полученного из сельскохозяйственных отходов, выделении из компоста штаммов микроорганизмов, приготовлении на основе выделенных штаммов биопрепарата, внесении биопрепарата в компост, оценке супрессивности компоста, причем проводят оценку супрессивных свойств штаммов по 4 механизмам супрессивности, оценку взаимной антагонистической активности штаммов, осуществляют двукратное внесение биопрепарата в компост, проводят оценку удобрительных свойств супрессивного компоста. Изобретение позволяет получить компосты, обладающие одновременно удобрительными свойствами и стабильными супрессивными свойствами по отношению к возбудителю фузариоза растений Fusarium oxysporum [Патент РФ № 2629776 С1, опубл. 04.09.2017].
Кроме того, из уровня техники известно изобретение, которое относится к композиции и способам, предоставленных для комбинации нового штамма Bacillus amyloliquefaciens RTI301 и нового штамма Bacillus subtilis. RTI477, комбинации, обладающей активностью, стимулирующей рост, и активностью против патогенов растений. Композиции, содержащие штаммы RTI301 и RTI477, полезны для улучшения роста растений и / или обеспечения защиты от патогенной инфекции при нанесении на корни растений, семена, каллусную ткань, трансплантаты и черенки. Синергетические результаты наблюдаются для комбинации штаммов, и комбинация штаммов полезна для увеличения урожайности сельскохозяйственных культур, включая сою и кукурузу. Композиции, содержащие комбинацию штаммов, могут применяться отдельно или в комбинации с другими микробными, биологическими или химическими инсектицидами, фунгицидами, нематоцидами, бактериоцидами, гербицидами, экстрактами растений, регуляторами роста растений и удобрениями [Патент US 9622484 B2, опубл. 18.04.2017].
10
10
8
4
2
4
3
В патенте RU 2478290 С2 предложен способ получения биопрепарата, который содержит биомассу Bacillus amyloliquefaciens Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (ВКПМ) В-11008 и гуматы при следующем соотношении компонентов, в об.%: биомасса Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 - вегетативных клеток и спор (1,24÷1,30)×10 КОЕ/мл культуральной жидкости и содержанием спор 94% от общего количества КОЕ - 99,0, гуматы - 1,0. В качестве питательной среды для получения заявляемого биопрепарата используют дешевую среду на основе отходов зернового производства следующего состава, г/л: отруби пшеничные - 40,0; кукурузный экстракт - 0,5; MgSO - 0,9; KHPO - 0,5; СаСО - 1,0; рН 7,0±0,2. Указанный состав среды обеспечивает высокий уровень накопления биомассы B. amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 (5,6÷5,9 г/л), высокий титр жизнеспособных клеток и спор (1,24÷1,28)×10 КОЕ/мл) и интенсивность спорообразования (содержание спор - 94,0% от общего количества КОЕ). Штамм данного вида был проверен на следующих представителях рода: Fusarium: F. graminearum, F. solani, F. oxysporum, F. sambucinum. Данный штамм показал высокий уровень антагонистической активности. Неясной остается проверка действия данного штамма на фитопатогенные грибы. Так предлагается следующий метод: посевы с штаммом бактерий инкубируют при 28°С в течение 3 сут. К выросшей культуре B. amyloliquefaciens ВКПМ В-11008 подсевают штрихом суточные суспензии тест-культур фитопатогенных бактерий (титр суспензий 10 КОЕ/мл). Затем чашки инкубируют при температуре 28°С в течение 24 ч и снимают результаты. В реальных условиях данные группы находятся в соперничестве за колонизацию ризоплана, и более правильным является следующий способ оценки антагонистической активности: одновременный посев культуры гриба и бактерии на плотной среде. Также не проверена возможность применения данного препарата на озимой пшенице. Также фитопатогенные грибы в данном способе не выделяются в ходе работы, а берутся уже известные культуры фитопатогенных грибов из различных коллекций, что может сильно сказаться на эффективности действия данного препарата в различных регионах и странах.
Ближайшим решением к заявленному является биопрепарат, раскрытый в патенте на изобретение RU 2724464 С1 «Штаммы, биопрепарат, способ получения биопрепарата и способ биологической защиты сельскохозяйственных культур от фузариоза», опубл. 23.06.2020 г. Однако заявленная группа изобретений отличается тем, что является развитием предыдущей группы изобретений, созданной на основе результатов исследований тех же авторов и представляет жидкую форму биопрепарата на основе специально разработанной питательной среды, полученной определенным способом.
При разработке бактериальных препаратов весьма существенным является вопрос состава питательной среды, которая с одной стороны должна обеспечивать интенсивный рост культуры целевого микроорганизма, а с другой – быть достаточно дешевой для достижения экономической эффективности при производстве биопрепарата. Наиболее перспективным подходом является использование отходов других производств, что позволяет параллельно решать и задачу их утилизации, и создавать сырье для производства нового продукта. Одним из таких побочных продуктов является меласса, образующаяся в процессе производства сахара. В ней содержится 58-60% сахаров, 13-14% органических азотистых веществ, 8% несахаров, 3% пектиновых веществ, 15% безазотистых экстрактивных веществ [Терешко А. М. Перспективные направления использования отходов свеклосахарного производства. – 2016]. Более подробно состав мелассы представлен ниже в Таблице 1 согласно источнику [Егорова М. И., Широких Е. В., Кретова Я. А. Методологические аспекты пробоподготовки мелассы при определении содержания диоксида серы //Вестник Воронежского государственного университета инженерных технологий. – 2015. – №. 3 (65)].
Таблица 1. Компонентный состав мелассы
Вода
15-24 %
Сухие вещества
76-85 %
Сахароза
46-51 %
Несахара
25-34 %
Минеральные вещества
8-15 %
Калий
3,5-7,0 %
Натрий
1,0-1,2 %
Кальций
1,0-1,5 %
Магний
0,1-0,2 %
Хлориды
0,5-2,0 %
Фосфаты
0,05-0,08 %
Сульфаты
0,005-0,010 %
Микроэлементы
<0,005 %
Органические вещества
14-28 %
Азотистые вещества
11-17 %
Бетаин
4-8 %
Аминокислоты
4-6 %
Амиды и азотистые основания
3-4 %
Безазотистые вещества
3-9 %
Инвертный сахар (глюкоза+фруктоза)
0,3-0,7 %
Раффиноза
0,5-2,0 %
Кестоза
0,1-0,4 %
Пентозаны
0,25-0,5 %
Орг. кислоты
3-5 %
Белки
0,03-0,08%
В настоящий момент времени при производстве сахарного песка из свекловичного сырья достаточно важным является вопрос об экономически выгодной переработке получаемых побочных продуктов.
Так по данным белорусских авторов [Тарасова Г. И. Научные основы и методология комплексной переработки и утилизации многотоннажных кальцийкарбонат-, кальцийсульфат-и металлсодержащих отходов. – 2014] при выходе сахара 12-13%, свеклосахарное производство республики Беларусь дает: 80-83% сырого свекловичного жома; 5-5,5% мелассы; 10-12% фильтрационного осадка; 1,4% отсева известнякового камня; боя и хвостиков – до 3%.
Спектр применения мелассы достаточно широк. Меласса является сырьем для производства пищевого этилового спирта, хлебопекарных дрожжей, лимонной и молочной кислот, глицерина, бутанола, ацетона, глютамата натрия, аминокислот, декстрана, антибиотиков и витаминов. Кроме того, меласса может стать одним из возобновляемых сырьевых источников для производства экологически чистого автомобильного биоэтанола. Мелассу используют для получения ряда химических соединений, применяющихся в фармацевтической, химической и других отраслях промышленности [Файзуллина Н. Р., Абдрашитов Я. М., Шукаев А. В. Получение мелассного концентрата с целью длительного хранения //Доклады Башкирского университета. – 2016. – Т. 1. – №. 4. – С. 675].
Помимо описанных выше сфер применения мелассы в литературе имеется достаточно большое количество работ, посвященных применению свекловичной мелассы в качестве питательной среды для создания на ее основе жидкого биопрепарата [Воронкович Н. В., Ананьева И. Н., Коломиец Э. И. Оптимизация состава питательной среды и условий глубинного культивирования бактерий Bасillus subtilis 17–основы биопрепарата для защиты картофеля от грибных и бактериальных болезней //Сборник представляет интерес для микробиологов и биотехнологов, а также работников промышленности и агропромышленного комплекса. – С. 178]; [Маметова А.З., Оразова Н.Ш. ИЗУЧЕНИЕ СОСТАВА ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ BACILLUS SUBTILIS ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОЙ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ ДОБАВКИ // Материалы VIII Международной студенческой научной конференции «Студенческий научный форум»];[Царенко И. Ю., Рой А. А., Курдиш И. К. Оптимизация питательной среды для культивирования Bacillus subtilis ИМВ В-7023 //Мікробіологічний журнал. – 2011. – №. 73, № 2. – С. 13-19].
Помимо публикаций можно также привести в пример патенты RU 2412612 C1,  опубл.27.02.2011 и RU 2654604 C1, опубл.21.05.2018.
РАСКРЫТИЕ ГРУППЫ ИЗОБРЕТЕНИЙ
Задача, решаемая заявленной группой изобретений, состоит в разработке способа приготовления жидкой питательной среды, а также в разработке способа получения на основе данной питательной среды жидкого микробиологического препарата, содержащего смесь штаммов споробразующих бактерий-антагонистов с антифузариозной активностью.
Технический результат заявленной группы изобретений заключается в расширении арсенала фунгицидных средств, т.е. создании нового эффективного жидкого биопрепарата на основе смеси штаммов споробразующих бактерий-антагонистов с антифузариозной активностью, выращенных на жидкой питательной среде, основанной на свекловичной мелассе, а также в оптимизации условий культивирования данных штаммов для достижения максимальной численности бактерий в препарате.
Указанный технический результат достигается за счет предложенного способа приготовления стерильной питательной среды для получения жидкого микробиологического препарата на основе смеси  штаммов спорообразующих бактерий-антагонистов фитопатогенных грибов р. Fusarium, который содержит этапы:
- смешивания 1,5-2,5% свекловичной мелассы и растворенной в воде нитроаммофоски с концентрацией 1,625-2,43 г/л;
- дробной стерилизации.
При этом дробную стерилизацию проводят по схеме: нагрев до 90-95 °С, охлаждение до 30-35 °С, выдержка 18-24 ч,  нагрев до 90-95 °С, охлаждение до 30-35 °С, выдержка 18-24 ч,  нагрев до 90-95 °С, охлаждение до 30-35 °С.
Кроме того, технический результат достигается за счет способа получения жидкого микробиологического препарата на основе смеси  штаммов спорообразующих бактерий-антагонистов фитопатогенных грибов р. Fusarium, выращенных по отдельности на жидкой питательной среде посредством инкубации чистых культур в стерильной питательной среде на шейкере-инкубаторе в течение 3-5 суток, инокуляции, перемешивания и культивирования при 30-35 °С в течение 48-72 часов при постоянной аэрации; последующего смешивания полученных жидких монокультур штаммов в равных пропорциях.
9
При этом смесь штаммов содержит не менее 10 КОЕ/г жизнеспособных бактерий-антагонистов фитопатогенных грибов р. Fusarium.
Вышеуказанные и другие задачи, особенности, преимущества, а также техническая значимость данного изобретения будут более понятны из нижеследующего подробного описания изобретения и чертежей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигуре 1 показан график кривых роста для штамма О 1.27 в зависимости от концентрации мелассы, где *Х6 – 1% мелассы в среде; Х7 – 1,5% мелассы; Х8 – 2% мелассы; Х9 – 2,5% мелассы; Х10 – 3% мелассы.
На фигуре 2 показан график кривых роста для штамма О 2.11 в зависимости от концентрации солей, где *Х13 – соотношение 1:30 – 1,625 г/л; Х14 – 1:25 – 1,95 г/л; Х15 – 1:20 – 2,43 г/л; Х16 – 1:15 – 3,25 г/л; Х17 – 1:10 – 4,875 г/л; Х18 – среда на основе 2,5% мелассы без добавления солей.
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ГРУППЫ ИЗОБРЕТЕНИЙ
Для разработки способа приготовления жидкого биопрепарата использовали 10 выделенных наиболее эффективных штаммов спорообразующих бактерий-антагонистов:
1. Штамм Paenibacillus jamilae K 1.14 (ВКПМ В-13016).
2. Штамм Paenibacillus peoriae O 1.27 (ВКПМ В-13017).
3. Штамм Paenibacillus peoriae O 2.11 (ВКПМ В-13018).
4. Штамм Paenibacillus peoriae R 3.13 (ВКПМ В-13019).
5. Штамм Paenibacillus peoriae R 4.5 (ВКПМ В-13020).
6. Штамм Bacillus amyloliquefaciens R 4.6 ВКПМ В-13021).
7. Штамм Paenibacillus jamilae R 4.24 (ВКПМ В-13022).
8. Штамм Paenibacillus polymyxa R 5.31 (ВКПМ В-13023).
9. Штамм Paenibacillus peoriae R 6.14 (ВКПМ В-13048).
10. Штамм Bacillus amyloliquefaciens V 3.14 (ВКПМ В-13024).
Характеристика 10 штаммов бактерий-антагонистов, используемых при разработке способа изготовления жидкого биопрепарата представлена в Таблице 2.
Указанные выше штаммы были депонированы 7 ноября 2017 г. (национальное патентное депонирование) и 18 ноября 2019 г. (международное патентное депонирование) в Биоресурсном Центре Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов  (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика (адрес: 117545, г. Москва, 1-ый Дорожный проезд, 1) – далее ВКПМ.
ВКПМ осуществляет депонирование для целей патентной процедуры в российской коллекции, уполномоченной на депонирование для целей патентной процедуры и удовлетворяет соответствующим для таких коллекций требованиям, а также гарантирует поддержание жизнеспособности депонируемых объектов в течение по меньшей мере срока действия патента, в том числе является Международным органом по депонированию согласно Будапештскому договору о международном признании депонирования микроорганизмов.
Таблица 2. Характеристика штаммов бактерий-антагонистов, используемых при разработке способа изготовления жидкого биопрепарата с антифузариозной активностью.
Согласно заключению ВКПМ, работа с данными штаммами не требует специальных мер предосторожности.
В качестве питательного субстрата для данных бактериальных культур использовали среду следующего состава (г/л):
Меласса – 10-30 г/л;
Азофоска (нитроаммофоска) – 1,625-4,875 г/л (используется удобрение, соответствующее ГОСТ 19691-84 Нитроаммофоска. Технические условия (Кочетков В.Н. Фосфорсодержащие удобрения. Справочник, М.: Химия, 1982.);
Водопроводная вода – 1 л.
Среда стерилизовалась методом дробной стерилизации по схеме: прогревалась до 90-95° С, затем выдерживалась 18 часов при 30-35 °С. Далее нагрев до  90-95° С повторялся, и среда вновь выдерживалась при 30-35 °С 18 часов, после чего нагревалась до 90-95 °С в последний раз.
Такой подход позволяет достичь практически полного удаления посторонних бактерий из среды.
Метод подбора оптимальных концентраций мелассы для культивирования бактерий.
Для подбора оптимальной концентрации мелассы пользовались планшетным ридером FLUOstar Omega (BMG LABTECH Co).
В лунки планшета вносили питательную среду на основе мелассы с различной концентрацией (100 мкл). Так в работе были использованы среды с концентрацией мелассы от 1 до 3%.
Затем в лунки с питательной средой вносили суспензию бактериальных клеток исследуемого штамма (10 мкл). После чего планшет загружали в данный прибор и культивировали в нем в течение 18 часов при температуре 36,7-37,0 °С с периодическим покачиванием планшета, для получения кривых роста. Об оптимальной концентрации мелассы для того или иного штамма судили по скорости выхода штаммов в стационарную фазу.
Метод подбора оптимальной концентрации солей в питательной среде.
Подбор оптимальной концентрации солей для питательной среды осуществляли по аналогичной изложенной выше схеме. В качестве источника солей (а именно азота) использовали минеральное удобрение Азофоска (по ГОСТ 19691-84). Концентрацию подбирали так, чтобы получить соотношение 1:20, где на одну часть N (азота) должно приходиться 20 частей C (углерода), данное соотношение в ряде статей указывается в качестве оптимального. Для того чтобы выявить оптимальную концентрацию солей для каждого из штаммов использовали 5 точек, а именно: 1:10, 1:15, 1:20, 1:25 и 1:30 соответственно. Данные концентрации солей вносили в 2,5% среду на основе мелассы, который после этого автоклавировали для стерилизации полученной среды.
После чего среды вносили в 96-луночный планшет по схеме описанной выше и также вносили культуры исследуемых штаммов. Затем в планшетном ридере FLUOstar Omega (BMG LABTECH Co) снимали кривые роста в течение 18 часов культивирования.
Подбор оптимальных концентраций мелассы и солей для культивирования штаммов бактерий-антагонистов на среде с мелассой.
Для того чтобы определить оптимальные концентрации для культивирования каждого из штаммов бактерий, проводили культивирование в 96-луночном планшете в течение 18 часов.
В каждую лунку планшета, как было написано выше, вносили по 100 мкл среды с различной концентрацией сначала мелассы, а затем с различной концентрацией нитроаммофоски. В полученную среду вносили 10 мкл суспензии клеток и культивировали в ридере FLUOstar Omega (BMG LABTECH Co) с периодическим помешиванием при температуре 36,7-37,0 °С, с периодическим снятием спектров поглощения пропускаемого света длиной волны 600 нм (каждые 10 минут).
Для каждого из штаммов строился график (см. фиг. 1) для определения оптимальной концентрации мелассы.
Так на фигуре 1 можно отчетливо видеть, что концентрация мелассы 3% оказывает негативное действие на штамм Paenibacillus peoriae O 1.27, ингибируя рост данного штамма. Хороший рост данного штамма наблюдался в диапазоне концентраций мелассы от 1,5% до 2,5%. Оптимальной концентрацией для данного штамма является 2,5% мелассы, поскольку при этой концентрации бактерии раньше вышли в стационарную фазу и при этом оптическая плотность в растворе была выше, чем при других концентрациях мелассы.
На основе анализа всех полученных данных, было выявлено что оптимальной для культивирования всех штаммов является концентрация мелассы в диапазоне от 1,5% до 2,5%.
Аналогичная работа была проделана и для определения  диапазона оптимальной концентрации солей в питательной среде. При работе с концентрациями солей использовали среднюю концентрацию мелассы в среде из установленного оптимального диапазона (2%), изменяя лишь концентрацию солей в питательной среде.
При определении количества сахаров и сахара-подобных веществ использовали ареометр. Так при измерении с помощью ареометра выявили, что в мелассе содержалось 78% углеводов. В дальнейшем полученные данные по количеству сахаросодержащих веществ понадобились нам для расчета необходимой для внесения концентрации солей (1:20 как оптимум, что было описано выше).
В результате расчетов по содержанию сахаров- и подобных им веществ, содержащих углерод, и соответственно учитывая, что в Азофоске лишь 16% азота, были получены следующие значения по концентрации солей, необходимых для внесения в питательную среду:
При соотношении 1:10 (N:C) – необходимо внести 4,875 г нитроаммофоски на 1 литр.
1:15 – 3,25 г/л;
1:20 – 2,43 г/л;
1:25 – 1,95 г/л;
1:30 – 1,625 г/л.
Данные концентрации, как было описано выше, вносились в жидкую питательную среду на основе 2% раствора мелассы. После чего данные среды по 100 мкл вносили в лунки 96-луночного планшета в последующем добавляя к ним 10 мкл суспензии бактерий. Также для выявления различий по отношению к среде без мелассы в лунки нижнего ряда вносили среду без солей с 2% раствором мелассы. Затем данный планшет также загружали в ридер и инкубировали в течение 18 часов для построения кривых роста (см. фиг. 2).
Как можно понять исходя из данных, представленных на фигуре 2, заметна ярко выраженная разница между средой, в которую добавляли соли с той, в которою не привносили соли извне (Х13, Х14 против Х18). Стоит также отметить, что для данного штамма по мере роста концентрации нитроаммофоски в среде очевидным становится угнетение его скорости размножения, а при соотношении 1:10 размножение бактерий данного штамма вообще не наблюдается в течение 18 часов. Исходя из данных графика можно также сделать вывод, что для данного штамма наиболее оптимальной для развития является соотношение углерода к азоту на уровне от 1:15 до 1:25.
В последующем анализе было выявлено, что такое соотношение является оптимальным для 7 штаммов из 10 (Paenibacillus jamilae  К 1.14, Paenibacillus peoriae О 1.27, Paenibacillus peoriae О 2.11, Paenibacillus peoriae R 3.13, Paenibacillus peoriae R 4.5, Paenibacillus jamilae R 4.24, Paenibacillus polymyxa R 5.31), для оставшихся 3 штаммов (Bacillus amyloliquefaciens V 3.14, Bacillus amyloliquefaciens R 4.6, Paenibacillus peoriae  R 6.14) оптимальным было соотношение 1:30.
Для экспериментальной проверки выводов были заложены 9 экспериментальных вариантов (см. Таблицу 3).
Таблица 3. Схема опыта по наработке жидкого биопрепарата на среде с разным содержанием мелассы и нитроаммофоски
Содержание мелассы, %
Отношение С:Nсодержание нитроаммофоски, г/л
20:12,43 г/л
25:11,95 г/л
30:11,625 г/л
1,5%
Вариант 1
Вариант 2
Вариант 3
2%
Вариант 4
Вариант 5
Вариант 6
2,5%
Вариант 7
Вариант 8
Вариант 9
После приготовления 9 вариантов питательной среды среда в объеме 100 мл в 250 мл Эрленмейеровских колбах подвергалась дробной стерилизации, а именно проводился трехкратный прогрев питательной среды с 1,5 - 2,5% мелассы при температуре свыше 90 °С в течение 2,5 часов с последующим охлаждением до 30 °С и выдержкой 18 часов. Контрольный бактериологический посев показал эффективность проведенной стерилизации (полное отсутствие роста бактерий при посеве 1 мл неразбавленной среды на питательный агар глубинным способом).
Подготовленные таким образом варианты питательной среды инокулировались 0,5 мл жидкой суточной культуры тестируемого штамма, после чего колбы помещались на термостатируемый шейкер-инкубатор и культивировались при 200 об/мин и 30 °С в течение 48 часов. После завершения культивирования производился посев полученной на тестируемой среде культуре штамма на среду МПА в трехкратной повторности с последующим учетом числа колоний. Таким образом, определялось число жизнеспособных клеток штамма на каждом из 9 вариантов среды. Поскольку именно бактерии-антагонисты являются действующим началом создаваемого биопрепарата, их число после культивирования отражает степень пригодности того или иного состава питательной среды для получения биопрепарата. Аналогичные исследования были последовательно проведены для всех 10 штаммов бактерий-антагонистов. Результаты проведенных испытаний приведены в Таблице 4.
Таблица 4. Число жизнеспособных клеток штаммов бактерий-антагонистов при культивировании на питательных средах с разным содержанием мелассы и нитроаммофоски
Вариант питательной среды
Число жизнеспособных клеток бактерий, КОЕ/мл
Штамм Paenibacillus jamilae K 1.14
Вариант 1
(1,156±0,1)*10<sup>9</sup>
Вариант 2
(5,91±0,28)*10<sup>9</sup>
Вариант 3
(3,19±0,30)*10<sup>9</sup>
Вариант 4
(4,52±0,32)*10<sup>9</sup>
Вариант 5
(5,04±0,36)*10<sup>9</sup>
Вариант 6
(5,13±0,12)*10<sup>9</sup>
Вариант 7
(1,62±0,13)*10<sup>9</sup>
Вариант 8
(6,21±0,28)*10<sup>9</sup>
Вариант 9
(3,39±0,23)*10<sup>9</sup>
Штамм Paenibacillus peoriae O 1.27
Вариант 1
(1,65±0,17)*10<sup>9</sup>
Вариант 2
(2,25±0,29)*10<sup>9</sup>
Вариант 3
(6,12±0,79)*10<sup>9</sup>
Вариант 4
(6,32±0,27)*10<sup>9</sup>
Вариант 5
(3,79±0,30)*10<sup>9</sup>
Вариант 6
(3,53±0,31)*10<sup>9</sup>
Вариант 7
(1,12±0,27)*10<sup>9</sup>
Вариант 8
(2,29±0,26)*10<sup>9</sup>
Вариант 9
(5,93±0,22)*10<sup>9</sup>
Штамм Paenibacillus peoriae O 2.11
Вариант 1
(6,31±0,24)*10<sup>9</sup>
Вариант 2
(3,77±0,07)*10<sup>9</sup>
Вариант 3
(5,58±0,15)*10<sup>9</sup>
Вариант 4
(5,06±0,28)*10<sup>9</sup>
Вариант 5
(1,14±0,06)*10<sup>9</sup>
Вариант 6
(5,69±0,18)*10<sup>9</sup>
Вариант 7
(4,43±0,25)*10<sup>9</sup>
Вариант 8
(2,46±0,31)*10<sup>9</sup>
Вариант 9
(3,88±0,14)*10<sup>9</sup>
Штамм Paenibacillus peoriae R 3.13
Вариант 1
(3,61±0,27)*10<sup>9</sup>
Вариант 2
(6,29±0,12)*10<sup>9</sup>
Вариант 3
(5,88±0,24)*10<sup>9</sup>
Вариант 4
(5,71±0,11)*10<sup>9</sup>
Вариант 5
(3,71±0,31)*10<sup>9</sup>
Вариант 6
(1,88±0,23)*10<sup>9</sup>
Вариант 7
(5,95±0,24)*10<sup>9</sup>
Вариант 8
(5,31±0,06)*10<sup>9</sup>
Вариант 9
(2,98±0,07)*10<sup>9</sup>
Штамм Paenibacillus peoriae R 4.5
Вариант 1
(5,08±0,29)*10<sup>9</sup>
Вариант 2
(3,00±0,30)*10<sup>9</sup>
Вариант 3
(6,01±0,17)*10<sup>9</sup>
Вариант 4
(5,80±0,28)*10<sup>9</sup>
Вариант 5
(3,47±0,16)*10<sup>9</sup>
Вариант 6
(4,81±0,14)*10<sup>9</sup>
Вариант 7
(2,22±0,12)*10<sup>9</sup>
Вариант 8
(2,94±0,27)*10<sup>9</sup>
Вариант 9
(3,98±0,16)*10<sup>9</sup>
Штамм Bacillus amyloliquefaciens R 4.6
Вариант 1
(5,32±0,32)*10<sup>9</sup>
Вариант 2
(4,20±0,08)*10<sup>9</sup>
Вариант 3
(6,24±0,22)*10<sup>9</sup>
Вариант 4
(5,53±0,29)*10<sup>9</sup>
Вариант 5
(3,41±0,32)*10<sup>9</sup>
Вариант 6
(6,29±0,20)*10<sup>9</sup>
Вариант 7
(5,88±0,23)*10<sup>9</sup>
Вариант 8
(5,71±0,06)*10<sup>9</sup>
Вариант 9
(3,70±0,29)*10<sup>9</sup>
Штамм Paenibacillus jamilae R 4.24
Вариант 1
(1,88±0,28)*10<sup>9</sup>
Вариант 2
(5,95±0,18)*10<sup>9</sup>
Вариант 3
(5,31±0,19)*10<sup>9</sup>
Вариант 4
(2,98±0,08)*10<sup>9</sup>
Вариант 5
(5,08±0,10)*10<sup>9</sup>
Вариант 6
(3,00±0,31)*10<sup>9</sup>
Вариант 7
(6,00±0,19)*10<sup>9</sup>
Вариант 8
(5,80±0,25)*10<sup>9</sup>
Вариант 9
(3,47±0,30)*10<sup>9</sup>
Штамм Paenibacillus polymyxa R 5.31
Вариант 1
(4,81±0,31)*10<sup>9</sup>
Вариант 2
(2,22±0,22)*10<sup>9</sup>
Вариант 3
(2,93±0,21)*10<sup>9</sup>
Вариант 4
(3,98±0,19)*10<sup>9</sup>
Вариант 5
(5,33±0,26)*10<sup>9</sup>
Вариант 6
(4,20±0,09)*10<sup>9</sup>
Вариант 7
(6,24±0,23)*10<sup>9</sup>
Вариант 8
(5,53±0,19)*10<sup>9</sup>
Вариант 9
(3,41±0,15)*10<sup>9</sup>
Штамм Paenibacillus peoriae R 6.14
Вариант 1
(4,41±0,32)*10<sup>9</sup>
Вариант 2
(1,45±0,11)*10<sup>9</sup>
Вариант 3
(1,41±0,32)*10<sup>9</sup>
Вариант 4
(5,42±0,20)*10<sup>9</sup>
Вариант 5
(5,68±0,24)*10<sup>9</sup>
Вариант 6
(4,25±0,24)*10<sup>9</sup>
Вариант 7
(3,15±0,22)*10<sup>9</sup>
Вариант 8
(5,68±0,19)*10<sup>9</sup>
Вариант 9
(2,01±0,21)*10<sup>9</sup>
Штамм Bacillus amyloliquefaciens V 3.14
Вариант 1
(6,28±0,14)*10<sup>9</sup>
Вариант 2
(2,91±0,29)*10<sup>9</sup>
Вариант 3
(1,67±0,07)*10<sup>9</sup>
Вариант 4
(5,80±0,14)*10<sup>9</sup>
Вариант 5
(1,41±0,11)*109
Вариант 6
(4,89±0,27)*10<sup>9</sup>
Вариант 7
(2,21±0,10)*10<sup>9</sup>
Вариант 8
(5,12±0,18)*10<sup>9</sup>
Вариант 9
(2,01±0,11)*10<sup>9</sup>
9
9
По итогам исследований ясно, что разные штаммы по-разному реагируют на содержание мелассы и минеральных солей в составе среды. Тем не менее, при диапазоне концентраций мелассы от 1,5 до 2,5% и содержании нитроаммофоски 1,625 -  2,43 г/л общее содержание жизнеспособных клеток во всех случаях превышает 10 КОЕ/мл, что обеспечивает средний титр препарата свыше 10 КОЕ/мл при составлении композиции из 10 штаммов. Такой титр является достаточным и обеспечивает заявляемые в изобретении свойства получаемого биопрепарата.
Таким образом, в ходе проделанной работы была определена оптимальная схема стерилизации: трехкратный прогрев питательной среды с мелассой и азофоской при температуре 90-95 °С в течение порядка 2,5 часов с последующим охлаждением до 30-35 °С и выдержкой порядка 18 часов.
При подборе оптимальных концентраций мелассы и минеральных веществ (Азофоска) для создания жидкой питательной среды было выявлено:
- Оптимальной концентрацией мелассы для всех штаммов является концентрация мелассы в диапазоне 1,5 – 2,5%  (15-25 г/л).
- Оптимальной концентрацией нитроаммофоски является концентрация в диапазоне 1,625 -  2,43 г/л.
Ниже приведены примеры осуществления способа получения жидкого микробиологического препарата на основе 10 штаммов спорообразующих бактерий-антагонистов фитопатогенных грибов р. Fusarium посредством специального способа приготовлении жидкой питательной среды на основе свекловичной мелассы.
Пример 1
9
Способ получения жидкого микробиологического препарата включает в себя способ приготовления жидкой питательной среды на основе мелассы следующим образом: с водопроводной водой смешивают 1,5% свекловичной мелассы и вносят нитроаммофоску в концентрации 1,625 г/л. Питательную среду подвергают дробной стерилизации по следующей схеме: нагрев до 90 °С, охлаждение до 30 °С, выдержка 18 ч,  нагрев до 90 °С, охлаждение до 30 ° С, выдержка 18 ч,  нагрев до 90 °С, охлаждение до 30 °С. Стерилизация среды проводится параллельно в 10 котлах из нержавеющей стали объемом 50 л каждый с встроенными ТЭНами и термостатом, при этом объем среды в каждом  котле составляет 20 л. По окончании стерилизации в каждый из котлов вводят жидкие стартерные культуры штаммов в объеме 100 мл, полученные путем инкубации чистых культур в стерильной питательной среде того же состава на шейкере-инкубаторе в течение 3 суток. После инокуляции стартерных культур в котлы погружают стерильные барботеры на силиконовых трубках для перемешивания и аэрации. Барботеры и трубки предварительно стерилизуют автоклавированием в закрытых биксах при 121°С в течение часа. Культивирование ведут при 30 °С в течение 48 часов при постоянной аэрации. По окончании культивирования, полученные жидкие монокультуры штаммов бактерий-антагонистов смешиваются в равных пропорциях для получения итогового биопрепарата. В результате содержание жизнеспособных бактерий-антагонистов в биопрепарате составляет не менее 10 КОЕ/мл.
Пример 2
9
Способ включает приготовление жидкой питательной среды на основе мелассы следующим образом: с водопроводной водой смешивают 2,5% свекловичной мелассы и вносят нитроаммофоску в концентрации -2,43 г/л. Питательную среду подвергают дробной стерилизации по следующей схеме: нагрев до 95 °С, охлаждение до 35 °С, выдержка 24 ч,  нагрев до 95 °С, охлаждение до 35 °С, выдержка 24 ч,  нагрев до 95° С, охлаждение до 35 °С. Стерилизация среды проводится параллельно в 10 котлах из нержавеющей стали объемом 50 л каждый с встроенными ТЭНами и термостатом, при этом объем среды в каждом  котле составляет 20 л. По окончании стерилизации в каждый из котлов вводят жидкие стартерные культуры штаммов в объеме 100 мл, полученные путем инкубации чистых культур в стерильной питательной среде того же состава на шейкере-инкубаторе в течение 5 суток. После инокуляции стартерных культур в котлы погружают стерильные барботеры на силиконовых трубках для перемешивания и аэрации. Барботеры и трубки предварительно стерилизуют автоклавированием в закрытых биксах при 121°С в течение часа. Культивирование ведут при 35 °С в течение 72 часов при постоянной аэрации. По окончании культивирования, полученные жидкие монокультуры штаммов бактерий-антагонистов смешиваются в равных пропорциях для получения итогового биопрепарата. В результате содержание жизнеспособных бактерий-антагонистов в биопрепарате составляет не менее 10 КОЕ/мл.
Пример 3
9
Способ включает приготовление жидкой питательной среды на основе мелассы следующим образом: с водопроводной водой смешивают 2 % свекловичной мелассы и вносят нитроаммофоску в концентрации -1,95 г/л. Питательную среду подвергают дробной стерилизации по следующей схеме: Нагрев до 93 °С, охлаждение до 33 °С, выдержка 20 ч,  нагрев до 93 °С, охлаждение до 33 ° С, выдержка 20 ч,  нагрев до 93 °С, охлаждение до 33 °С. Стерилизация среды проводится параллельно в 10 котлах из нержавеющей стали объемом 50 л каждый с встроенными ТЭНами и термостатом, при этом объем среды в каждом  котле составляет 20 л. По окончании стерилизации в каждый из котлов вводят жидкие стартерные культуры штаммов в объеме 100 мл, полученные путем инкубации чистых культур в стерильной питательной среде того же состава на шейкере-инкубаторе в течение 4 суток. После инокуляции стартерных культур в котлы погружают стерильные барботеры на силиконовых трубках для перемешивания и аэрации. Барботеры и трубки предварительно стерилизуют автоклавированием в закрытых биксах при 121°С в течение часа. Культивирование ведут при 33 °С в течение 60 часов при постоянной аэрации. По окончании культивирования, полученные жидкие монокультуры штаммов бактерий-антагонистов смешиваются в равных пропорциях для получения итогового биопрепарата. В результате содержание жизнеспособных бактерий-антагонистов в биопрепарате составляет не менее 10КОЕ/мл.
В ходе весенне-летнего сезона 2019 года было проведено исследование эффективности обработки полученным жидким биопрепаратом посевов озимой пшеницы и проведена оценка фунгицидного действие препарата в отношении фитопатогенных грибов р. Fusarium на растениях и в почве.
Было наработано в общей сложности 30 л жидкого биопрепарата в виде культур бактерий-антагонистов на специально подобранной питательной среде на основе свекловичной мелассы.
30 га озимой пшеницы были дважды обработаны жидкой формой биопрепарата в ходе плановых обработок посевов (препарат добавлялся в баковую смесь непосредственно перед опрыскиванием). Перед обработкой, а также после каждой из обработок проводились анализы почвы и растений на частоту встречаемость фитопатогенных грибов р. Fusarium. В растениях анализу подвергался колос и стебель. В качестве контроля использовались образцы почв и растений, взятые на том же поле, в той его части, где в баковую смесь биопрепарат не добавлялся. Также были проведены морфобиометрические исследования растений пшеницы на контроле и в опыте.
По результатам проведенных исследований, после первой обработки в колосе озимой пшеницы наблюдалось достоверное снижение встречаемости грибов р. Fusarium на 40,4% после первой обработки и на 34,1% поле второй обработки. В стеблях снижение встречаемости составило 2% после первой обработки и 9,3% после второй обработки. В почве снижение составило 5,3% после первой обработки и 17,4% после второй обработки.
Таким образом, при внесении жидкого биопрепарата на растения сверху с помощью опрыскивателя, прежде всего, наблюдается снижение численности фитопатогенов именно в колосе, что является наиболее значимым для сдерживания развития фузариоза колоса и снижения доли зерна, пораженного микотоксинами.