СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОКИНОВ В БУЛЛЕЗНОМ СОДЕРЖИМОМ
METHOD OF DETECTING CYTOKINS IN BULLOUS CONTENT

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным болезням.
Известен способ определения цитокинов при рожистом воспалении, заключающийся в количественной оценке уровня цитокинов (ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-6) в сыворотке крови больных с помощью набора реагентов Pro Con ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНО-α методом твердофазного иммуноферментного анализа. (Бречка В.Г. Оценка клинико-иммунологической эффективности энтеросорбции в комплексном лечении рожи. Автореф. Дис. канд. мед. наук. Курск-2000, 18 с).
Недостатком данного способа является то, что при развитии воспалительной реакции без резкой интоксикации и непродолжительной или невысокой лихорадочной реакции вероятность обнаружения цитокинов в сыворотке крови крайне мала, либо они определяются в незначительном количестве, что не позволяет оценить динамику течения воспалительной реакции. Поэтому данный способ не может быть использован для оценки тяжести состояния, эффективности лечения и прогнозирования исхода воспалительного процесса.
Целью изобретения является расширение спектра исследования динамики воспалительного процесса путем оценки буллезного содержимого в буллах любого размера.
Указанная цель достигается тем, что для определения уровня цитокинов (ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-10) в буллезном содержимом у больного в асептических условиях с использованием шприца осуществляют забор буллезного содержимого в количестве 1-2 мл в случае булл большого размера, более 2 см в диаметре и распределяют по трем эпиндорфам. При наличии буллы маленького размера или высокой степени вязкости содержимого буллы прокалывают ее иглой шприца и, не используя поршень для забора содержимого внутрь шприца, пропитывают выступившее через прокол содержимое фильтровальной бумагой размером не менее чем 1,0×1,0 см. Далее фильтровальную бумагу помещают в эпиндорф, куда предварительно введено 0,1 мл физиологического раствора. В случае если имеются вскрывшиеся мокнующие буллы, фильтровальной бумагой промокают выступившее из буллы содержимое без предварительного прокола. Эпиндорфы с материалом доставляют в лабораторию, где методом твердофазного иммуноферментного анализа осуществляют определение уровня ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-10 в буллезном содержимом согласно инструкции производителя тест-систем.
Уровень в биологических жидкостях здоровых доноров не превышает: для ФНО-α 2,5 пг/мл; для ИЛ-1β 5 пг/мл. Для ИЛ-10 составляет 10±4,2 пг/мл.
Использование предлагаемого способа исследования буллезного содержимого в буллах малого размера, диаметр которых не превышает 2 см, с помощью предварительного нанесения содержимого булл на фильтровальную бумагу позволяет перейти от условного и субъективного способа определения степени воспалительной реакции по клиническим признакам к точной количественной оценке степени воспаления. С использованием предлагаемого способа нами установлено, что концентрация маркеров воспаления цитокинов (ИЛ-1β, ФНО-α, ИЛ-10) не зависит от размера булл. Данные таблицы подтверждают, что концентрация цитокинов на единицу объема биологической жидкости не имеет достоверных различий для булл большого (диаметром более 2 см) и малого (диаметром 2 см и менее) диаметров.
Проведенный корреляционный анализ подтверждает отсутствие взаимосвязи между клиническими проявлениями воспалительной реакции и размером булл и наличие статистически достоверной корреляционной связи между клиническими проявлениями воспалительной реакции, динамикой выздоровления и концентрацией цитокинов в единице объема буллезного содержимого.
Таблица
Сравнительная характеристика содержания цитокинов в буллах различного размера
Параметр
Диаметр булл
более 2 см (n=30)
2 см и менее (n=12)
До лечения
α-ФНО
41,7±11,0
45,7±12,3
ИЛ-1β
256,4±19,7
251,2±18,7
ИЛ-10
114,8±18,9
110,2±17,3
После лечения
α-ФНО
33,7±6,2
30,2±4,9
ИЛ-1β
217,3±19,2
212,4±18,9
ИЛ-10
129,3±17,8
131,4±18,4
Способ забора буллезного содержимого для исследования с использованием предлагаемого способа предварительного нанесения на фильтровальную бумагу незаменим и в том случае, когда содержимое буллы имеет очень вязкую консистенцию, что не позволяет осуществить забор биологической жидкости шприцем через иглу.
Пример: Больная Я.С.Г., 55 лет, История болезни № 3655, заболела 19.09.04, поступила в 1-е отделение ГУЗ ОКИБ 21.09.04 г., с диагнозом: Рожа левой голени, эритематозно-буллезная форма, повторная. Объективно: состояние средней тяжести. Сознание ясное, ориентирована. Токсикоз умеренно выражен. Температура тела 37,8°С. Язык влажный. В легких везикулярное дыхание, хрипов нет, ЧДД - 18 в минуту. Границы сердца расширены влево на 1 см. Тоны сердца ритмичны, глухие. АД 140/90 мм рт.ст., Ps - 84 удара в минуту с удовлетворительным качеством. Живот мягкий, безболезненный по всем отделам. Дизурии нет. Стул оформлен, регулярный. Status localis: на коже левой голени яркая, с четкими и неровными контурами эритема, горячая на ощупь, умеренно болезненная, отек стопы и голени умеренно выражен, на левой голени две буллы с серозным содержимым, в диаметре 1,5 и 2 см. Паховый лимфаденит слева, лимфангоит. В день поступления в стационар у больной из булл до лечения был забран буллезный экссудат для определения цитокинов (ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-10) следующим способом: в асептических условиях производим забор буллезного путем прокалывания буллы, промокания выступившего содержимого на фильтровальную бумагу и распределения по 3-м эпиндорфам. Эпиндорфы доставлены в лабораторию, помещены в морозильную камеру температурой -18-20°С. Методом твердофазного иммуноферментного анализа определены уровни трех цитокинов в буллезном содержимом. Исходные данные цитокинов до лечения: ФНО-α 42,4+/-11,2 пг/мл; ИЛ-10β 258,7+/-21,4 пг/мл; ИЛ-10 112,9+/-19,7 пг/мл. На фоне проводимой традиционной терапии (бензилпенициллин 500000 ЕД 6 раз в день в/м курс 10 дней, индометацин 0,25 перорально 3 раза в день в течение 5 дней, кларифер 0,01 перорально 1 раз в день 10 дней) наблюдалось незначительное снижение концентрации ФНО-α до 34,3+/-6,3 пг/мл и ИЛ-1β до 212,3+/-19,1 пг/мл по сравнению с исходными данными, что свидетельствует о медленном купировании воспалительного процесса. Иная тенденция отмечена при оценке уровня ИЛ-10. Зарегистрировано незначительное повышение его на фоне стандартной терапии по сравнению с соответствующими значениями до лечения до 127,4+/-17,3 пг/мл. Больная выписана в удовлетворительном состоянии 6.10.04 г. Осложнений нет.
Пример. Больная Г.Л.В., 54 года, История болезни № 4185, поступила в диагностическое отделение ГУЗ ОКИБ г. Воронежа 06.10.2006 года на четвертый день болезни с диагнозом: Рожа левой голени, эритематозно-буллезная форма, первичная. Объективные данные: общее состояние средней тяжести, сознание ясное, вялая, адинамичная. Умеренный токсикоз. Температура тела 37,9°С. Зев без особенностей. Язык чистый, влажный. Живот мягкий, безболезненный во всех отделах, печень и селезенка не увеличены. АД 145/90 мм рт.ст., пульс 80 ударов в минуту, удовлетворительных качеств. Тоны сердца приглушены, ритм правильный. ЧДД 16 в минуту, дыхание жесткое, хрипов нет. Status localis: левая голень отечна. В области нижней трети голени яркая, горячая, напряженная, умеренно болезненная эритема с четкими контурами. На фоне эритемы булла диаметром 4 см, заполненная серозным экссудатом. Слева паховый лимфаденит. В день поступления в стационар у больной осуществлен забор буллезного содержимого с целью определения содержания цитокинов (ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-10). Забор осуществлен следующим способом: в асептических условиях шприцем эвакуировалось из буллы серозное содержимое в количестве 3 мл, затем материал распределен по 1 мл в три эпиндорфа. Поскольку буллезное содержимое не подвергалось анализу в день доставки в лабораторию, эпиндорфы с материалом помещались в морозильную камеру с температурным режимом -18-20°С. Определение содержания цитокинов ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-10 в буллезном содержимом осуществлялось методом твердофазного иммуноферментного анализа. Нами получены следующие данные: исходный уровень цитокинов до комплексного лечения: ИЛ-1β 256,4±22,7 пг/мл, ФНО-α 54,3±9,2 пг/мл, ИЛ-10 118,8±17,3 пг/мл. Пациентке проводилось комплексное лечение - традиционная терапия (бензилпенициллин 500000 ЕД 6 раз в день в/м курс 10 дней, индометацин 0,25 перорально 3 раза в день в течение 5 дней, кларифер 0,01 перорально 1 раз в день 10 дней) в сочетании с системной озонотерапией (ежедневная однократная инфузия 400 мл озонированного физиологического раствора с концентрацией озона 4 мг/л, курс 5 дней). На 4 день проводимого комплексного лечения осуществлен повторный забор экссудата с эрозированной поверхности вскрытой буллы. Забор материала осуществлен следующим способом: стерильная фильтровальная бумага размером 1,0×1,0 см пропитывалась экссудатом с эрозированной поверхности вскрытой буллы, затем она помещалась в эпиндорф, куда предварительно вводился 0,1мл физиологического раствора. Материал распределялся по трем эпиндорфам и доставлялся в лабораторию, где помещался в морозильную камеру с температурным режимом -18-20°С. Определение содержания цитокинов ФНО-α, ИЛ-1β, ИЛ-10 в буллезном содержимом осуществлялось методом твердофазного иммуноферментного анализа. Нами получены следующие данные: на фоне проводимого лечения (традиционная терапия в сочетании с системной озонотерапией) в динамике заболевания отмечено существенное снижение уровней ФНО-α и ИЛ-1β по сравнению с исходными данными соответственно: ИЛ-1β 142,3±12,7 пг/мл, ФНО-α 16,2±3,4 пг/мл, что расценивается как уменьшение воспалительного процесса. Уровень ИЛ-10 на 4 день лечения значительно повышался по сравнению с соответствующими значениями до лечения: ИЛ-10 210±21,2 пг/мл. Пациентка выписана 20.10.2006 года в удовлетворительном состоянии. Осложнений не было.
Использование предложенного способа позволяет оценить выраженность воспалительной реакции и динамику ее течения, а также осуществить контроль эффективности лечения.