Сравнительная характеристика различных способов криоконсервации спермы козла

Ретроспективная иммуноферментная диагностика гриппа птиц H5N1

mal Genetics, Inc», Южная Корея), а также испытуемые пробы от серопозитивных кур. Сыворотки крови кур были получены из районов Шахринав и Рашт Республики Таджикистан, где домашнюю птицу не вакцинировали против гриппа. В качестве дополнительного контроля применили моноклональные антитела против гемагглютинина Н5 вируса гриппа птиц из коммерческого набора «AniGen H5 AIV Ag ELISA» (фирмы «Animal Genetics, Inc», Южная Корея). Результаты показали, что исследуемые сыворотки, положительная контрольная сыворотка и специфические моноклональные антитела взаимодействуют с вирусным гликопротеином с молекулярной массой примерно 35 кДа, что соответствует молекулярной массе субъединицы гемагглюти-нина вируса гриппа (рис. 3).

Библиография

1. Махмадшоев М.М., Тошматов Н. Сайдарова М.М. Пособие для ветеринарных специалистов для борьбы с птичьим гриппом. — Душанбе.: Служба государственного ветеринарного надзора Министерства сельского хозяйства и охраны природы Республики Таджикистан при поддержке представительства ЮНИСЕФ, 2007.

2. Сайдарова М.М., Амирбеков М., Юров Г.К., Алексеенкова С.В., Аноятбеков М., Юров К.П. Иммунологический мониторинг гриппа птиц на территории Республики Таджикистан // Иммунология, 2009; 5: 309—312.

3. Салимов Т.М., Фатхудинова М.Ф., Тиллоев Т. Обзор: грипп птиц в Таджикистане. В кн. «Грипп человека, животных и птиц в Таджикистане». — Душанбе.: Душанбе, 2008.

4. Юров Г.К., Народицкий Б.С., Ганиев А. Межмолекулярные дисульфидные связи поверхностных полипептидов вируса ин-

Выводы

Обнаружение антител к типоспецифическому антигену нуклеопротеина вируса гриппа А птиц посредством ИФА и к поверхностным гликопротеинам вируса гриппа птиц Н5№ посредством ИФА и иммуноблоттинга указывает, что домашняя птица (куры) на территории Республики Таджикистан (район Шахринав) имела контакт с вирусом гриппа птиц Н5№. Наличие у домашней птицы специфических иммуноглобулинов к высокопатогенному вирусу НР5№ при отсутствии манифестной формы инфекции, очевидно, объясняется циркуляцией авирулентных штаммов возбудителя. Совпадающие результаты исследования при использовании трех отдельных методов регистрации иммунного ответа у птиц на типо- и субтипоспецифические антигены вируса гриппа птиц Н5№ свидетельствуют о достоверности полученных данных.

фекционного ларинготрахеита кур. // Вопросы вирусологии, 1993; 4: 174—176.

5. Burnette W.N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A // Anal Biochem, 1981; 112 (2): 195— 203.

6. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature, 1970; 227 (5259): 680—685.

7. Lipatov A.S., Krauss S., Guan Y., Peiris M., Rehg J.E., Perez D.R., Webster R.G. Neurovirulence in Mice of H5N1 Influenza Virus Genotypes Isolated from Hong Kong Poultry in 2001 // Journal of Virology, 2003; 77 (6): 3816—3823.

Summary

G.K. Yurov, M.M. Saidarova, S.V. Alexeyenkova, M. Amirbekov, K.P. Yurov. Retrospective diagnostic of avian influenza H5N1 by ELISA. In this article the methods of diagnostic of avian influenza H5N1 by ELISA and Western blotting were described.

БИОТЕХНИКА РАЗМНОЖЕНИЯ

УДК 636.32/38.082Ы

Сравнительная характеристика различных способов криоконсервации спермы козла

П.В. Аксенова, ГНУ «<Ставропольский НИИ животноводства и кормопроизводства» РАСХН

Ключевые слова: акросома, гранулы, козлы-производители, криоконсервация, пайеты, спермопродукция

Введение

После разработки и широкого внедрения в производство метода искусственного осеменения сельско-

хозяйственных животных возможности влияния на селекционный процесс коренным образом изменились. Благодаря массовому применению искусственного осеменения в период 30—70-х гг. прошлого столетия значительно повысилась продуктивность домашних животных всех видов [3, 4]. В условиях новых

П.В. Аксенова

экономических отношений и открытых международных связей метод искусственного осеменения как важнейший инструмент массового улучшения продуктивности приобрел еще большее значение.

Метод неразрывно связан с технологией криокон-сервации спермы. Спермии млекопитающих сохраняют генетическую информацию и биологическую полноценность после хранения в глубокозамо-роженном (-196°С) состоянии, благодаря чему стало возможно накапливать большие запасы генетического материала, длительно хранить и перевозить его на любые расстояния [1]. Более целесообразно, и с экономической, и с ветеринарной точек зрения, не закупать генетически ценных животных, т. к. при этом возникает ряд трудностей (сложность транспортировки, необходимость содержать завезенных животных в карантине и их слабая адаптируемость), а обмениваться генетическим материалом. Поскольку эффективность селекционно-племенной работы в первую очередь зависит от интенсивности использования наиболее ценных в генетическом отношении производителей, стойко передающих свои продуктивные качества потомству, значение метода искусственного осеменения кри-оконсервированной спермой будет непрерывно возрастать.

Для длительного хранения спермы производителей применяют метод глубокого замораживания в жидком азоте. В настоящее время в различных регионах России активно создаются генетические банки для накопления и реализации спермы высокоценных животных, в т. ч. козлов высокопродуктивных молочных пород.

Сперму можно замораживать двумя способами: в гранулах и пайетах [2, 5]. В настоящее время все большую популярность приобретает метод замораживания спермы в пайетах. Тем не менее, мы считаем, что нельзя однозначно говорить о преимуществе последнего, т. к. у каждого метода есть свои достоинства и недостатки.

В Советском Союзе, а затем в России наибольшее распространение получил метод замораживания в гранулах. Суть метода заключается в том, что разбавленную и охлажденную до 4°С сперму ручным способом при помощи приспособлений раскапывают в лунки на поверхности фторопластовой пластины. К преимуществам этого метода можно отнести его предельную простоту, отсутствие сложного оборудования, мобильность и универсальность при достаточной эффективности. Немаловажным является и низкий расход жидкого азота. В то же время метод имеет существенные недостатки, главные из которых — возможность тотального загрязнения как микроорганизмами, так и механическими частичками, а также высокая степень влияния человеческого фактора.

К преимуществам замораживания спермы в пайетах относят возможность подбора оптимального автоматического режима замораживания, обеспечивающего максимальное сохранение спермиев;

маркировка каждой дозы спермы и более высокая результативность осеменения при экономном расходовании ценнейшего генетического материала. Вместе с тем, в отличие от метода криоконсерва-ции в гранулах, для замораживания в пайетах требуется комплект сложного и дорогостоящего стационарного оборудования, включающего в себя автоматы для маркировки, заполнения и запаивания соломинок.

Цель исследования

Сравнить качество спермы и ее оплодотворяющую способность при криоконсервации в гранулах и пайетах.

Материалы и методы

Сперму получали от зааненских козлов на искусственную вагину. Подвижность спермиев оценивали по десятибалльной шкале, концентрацию определяли в фотометре ACCUCELL IMV. Для эксперимента отбирали эякуляты с подвижностью спермиев 8...8,5 баллов и концентрацией не менее 2,5 млрд./мл. Эякуляты разбавляли глюкозо-трис-желточным разбавителем с глицерином в соотношении 1:3 и эквилибрировали при 3...4°С в течение 3 ч. Далее часть эякулятов замораживали в гранулах, часть — в пайетах.

Для криоконсервации в гранулах сперму раскапывали в лунки фторопластовой платины по 0,2.0,4 мл. Пластину предварительно охлаждали путем погружения в пенопластовую емкость, заполненную жидким азотом, затем поднимали над поверхностью азота на 3.5 см, так, чтобы пластина находилась в его парах (при -80...90°С). Раска-панную сперму оставляли в парах азота на 1.2 мин до изменения цвета гранул. Затем пластину с гранулами опускали в емкость с азотом и выдерживали там до прекращения кипения (1.1,5 мин), гранулы собирали в мешочки и помещали в сосуд Дьюара для хранения.

Вторую часть эякулятов обрабатывали на автоматизированной линии по криоконсервации французской фирмы «IMV Technologies». После оценки качества разбавленную сперму расфасовывали в разноцветные маркированные соломинки по 0,25 мл с хлопковой пробкой-поршнем. После фасовки свободный край соломинки запаивали ультразвуком. Сперму консервировали в замораживателе IMV при следующем режиме: от 4 до -5°С со скоростью 4°С/мин, от -5 до -110°С со скоростью 25°С/мин, от -110 до -140оС со скоростью 35°С/мин.

Оттаивание спермы, замороженной в гранулах, проводили в специальном оттаивателе ОГСБ-2М, спермы, замороженной в пайетах, — в оттаивателе CITO IMV.

Каплю оттаянной спермы смешивали в равной пропорции с 3,1%-м цитратом натрия и определяли подвижность спермиев сразу после оттаивания и через 2 ч. Для исследования целостности акросом клетки обездвиживали добавлением 1%-го раствора фто-

Сравнительная характеристика различных способов криоконсервации спермы козла

рида натрия в соотношении 9:1. Всего за половой сезон (вторая половина сентября — декабрь) было исследовано 288 эякулятов.

Результаты

По результатам лабораторных исследований было отмечено преимущество метода замораживания спермы в пайетах: хотя количество выживших спермиев в обоих случаях различалось незначительно, клеток с ненарушенной акросомой было больше (на 41,4 %) (табл. 1). По характеру повреждения акросомы существенных различий между группами не было. По степени повреждения отмечено некоторое преимущество спермы, замороженной в соломинках.

Лучшая выживаемость спермиев в пайетах отчасти объясняется геометрической формой пайет, которая обеспечивает равномерное нагревание при оттаивании и одновременную разморозку клеток.

Несмотря на важность лабораторных тестов по оценке качества спермы, о биологической полноценности замороженной-оттаянной спермы в конечном итоге можно судить только по результатам осеменения коз.

Чтобы выяснить оплодотворяющую способность спермы, замороженной двумя способами, осеменили две группы коз. Предварительно оплодотворяемость определяли по учету повторно пришедших в состояние половой охоты («перегул»), окончательно — по результатам козления.

По результатам производственного опыта доказано, что имеется некоторое преимущество пайетирования спермодоз (табл. 2), однако разница незначительна и недостоверна, чтобы на ее основании делать какие-либо выводы.

На основании экономических расчетов, где принимали во внимание расход жидкого азота, электроэнергии и амортизацию оборудования, стоимость пайетированной спермодозы превышала стоимость гранулы в 5,2 раза.

Выводы

Таким образом, можно констатировать, что технологические параметры криоконсервации спермы козлов как в гранулах, так и в пайетах, обеспечивают высокую сохранность ее биологической полноценности. Оплодотворяющая способность замороженной

Библиография

1. Качество спермы козла, замороженной в пайетах и гранулах

Показатели Метод замораживания

в гранулах

Подвижность клеток, баллы, сразу после оттаивания/ через 2 ч 4,64±0,13/4,23 ±0,16 5,17±0,18/4,72 ±0,14

Клетки без повреждений, %, сразу после оттаивания/ через 2 ч 18,13±0,18/14,19±0,25 22,27±0,13 /20,68±0,65

Клетки с повреждениями, %, сразу после оттаивания/ через 2 ч 81,67±1,01/86,74±1,40 77,72±1,21 /79,32±2,07

Характер и степень повреждений, %, сразу после оттаивания/через 2 ч набухание акросомы отслоение акросомы потеря акросомы потеря головки 45,13±1,18/47,55±1,02 13,33±0,08/14,17±0,45 12,63±0,43/13,67±0,25 10,58±0,11/11,35±0,06 44,74±1,55/43,01±1,57 12,13±0,24/14,29±0,98 12,33±0,27 /12,13±0,35 8,53±0,10/9,70±0,45

Примечание: выделены значения с достоверной разницей между группами

2. Результаты осеменения коз спермой, замороженной в пайетах и гранулах

Показатели Метод замораживания

в гранулах

Осеменено коз, гол. 28 26

Перегуляло, гол. 14 11

Окозлилось, гол. 13 14

Получено козлят, гол. 20 22

Предполагаемая эмбриональная смертность 2,8 2,6

Оплодотворяемость, % 50,0 53,8

Плодовитость,% 153,8 157,1

спермы остается достаточно высокой, поэтому оба метода можно рекомендовать для широкого производственного применения. Вместе с тем, к преимуществам метода замораживания в пайетах можно отнести лучшие выживаемость клеток и оплодотворяющую способность спермы, высокую технологичность и культуру обработки, возможность международной сертификации продукта. Преимущества замораживания в гранулах — простота, возможность замораживать сперму непосредственно на месте ее получения (на кошаре или ферме) и низкая стоимость спермодозы. Эти факторы следует учитывать при выборе метода криоконсервации для получения наибольшего эффекта.

3. Касымов К.Т., Ашимов Ж.Б. Глубокое замораживание спермы баранов в жидком азоте // Пути повышения продуктивности животноводства в Казахстане.— Алма-Ата, 1975.

4. Лопырин А.И. Краткие итоги и перспективы дальнейших исследований по замораживанию семени барана // Овцеводство, 1970; 9:29—32.

5. Salamon S., Lightfoot R. Fertility of ram spermatozoa frozen by the pellet method. III. The effect of insemination technique, oxitocin and lambing // J. Reprod. Fertil., 1970; 22: 114.

1. Айбазов В.М., Трубникова П.В. Биологическая полноценность криоконсервированной спермы разного срока хранения 08.11-04Я4.32 // Генетика и селекция сельскохозяйственных животных, 2008; 11:4.

2. Желтобрюх Н.А., Ивахненко В.К., Айбазов А.-М.М. Повышение эффективности использования ценных баранов в весенне-летние месяцы // Овцеводство, 1990; 1:17—18.

Summary

P.V. Aksenova. Comparative description of various buck semen cryopreservation methods. Character of damages and fertilizing ability of sperm cryopreserved in different ways are investigated. The efficiency of freezing methods (in straws and in granules) is compared.