СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КРОВИ НА НАЛИЧИЕ ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПО ИЗМЕНЕНИЮ ЛЕЙКОГРАММЫ ПОСЛЕ УЛЬТРАЗВУКОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ
METHOD FOR BLOOD DIAGNOSTICS FOR PARASITARY DISEASES BASED ON LEUKOGRAM CHANGE AFTER ULTRASOUND IMPACT

Изобретение относится к ветеринарии и медицине и может использоваться при неинвазивном исследовании крови животных с помощью ультразвуковых волн.
Бабезиоз собак - протозойная природно-очаговая трансмиссивная болезнь, вызываемая простейшими отряда Piroplasmida, семейства Babesiidae, рода Babesia, протекающая сверхостро, остро и хронически. Заболевание широко распространено по всему миру и широта распространения определяется ареалом обитания иксодовых клещей, передающих заболевание через укус [1, 2, 3]. Род Babesia включает в себя большое количество видов. Для собак наиболее опасны: Babesia canis и менее распространенная в средней полосе России Babesia gibsoni. Бабезии являются внутриклеточными паразитами, поражающими эритроциты, иногда нейтрофилы. Возбудители внутри клеток имеют грушевидную, овальную или округлю форму и располагаются преимущественно попарно, но могут быть и одиночные бабезии в эритроцитах. Рамер Babesia canis составляет 3-5 мкм, Babesia gibsoni значительно меньше. У заболевания наблюдается сезонность, что в свою очередь, связано с циклом развития иксодового клеща [4, 5, 6,].
В последние 10 лет выявлена связь тяжести течения заболевания собак бабезиозом с формой, размером, расположением и количеством бабезий в клетках крови (эритроците, нейтрофиле) и плазме периферической крови. Не выявлено породной, половой и возрастной предрасположенности к бабезиозу [2, 4, 6-8]. Бабезии при лабораторном исследовании крови обнаруживают микроскопией окрашенных мазков по Романовскому-Гимзе [1, 6].
Дирофиляриоз - гельминтозное заболевание, вызываемое нематодами отряда Spirurida подотряда Filariata семейства Filariidae рода Dirofilaria. На территории Российской федерации распространены в основном D. immitis, половозрелая особь которой паразитирует в легочных артериях и сердце, вызывая сердечно-легочную форму заболевания; и D. repens, живущая в подкожной клетчатке и мышцах хозяина, вызывая кожную форму болезни. Длина взрослых особей доходит до 30-40 см. Дефинитивным хозяином для дирофилярий чаще всего бывают домашние собаки и другие псовые, также заболевание регистрируется и у представителей семейства кошачьих. Промежуточный хозяин - комары семейства Culicidae (роды Aedes, Culex, Anopheles) [9-11].
Кроме собак кровопаразитарным заболеваниям подвержены лошади и кошки. У лошадей встречается нутталиоз, вызываемый Nuttalliaequi из семейства Piroplasmatidae, и пироплазмоз, вызываемый Piroplasmacaballi из семейства Babesiidae. У кошек может быть диагностирован гемобартонеллез, вызываемый микоплазмами Mycoplasma haemofelis и Mycoplasma haemominutum. При диагностике гемобартонеллеза кошек микроскопия затруднена в связи с очень маленьким размером паразита. Дирофиляриоз у кошек вызывается теми же возбудителями, что и у собак.
Для постановки диагноза паразитарных заболеваний чаще всего используют методы непосредственной визуализации возбудителя, его яиц или личинок, реже - аллергические пробы, ПЦР диагностика.
При диагностике гельминтозов распространены следующее методы: гельминтоскопия, гельминтоовоскопия, гельминтолярвоскопия, а также внутрикожные пробы (эхинококкоз).
Для диагностики арахноэнтомозов используют непосредственную визуализацию паразита на теле животного или микроскопию соскоба кожи. Диагностика протозоозов сводится к исследованию нативного мазка смыва из прямой кишки, глаза или окрашенного мазка крови.
При локализации возбудителя инвазии в ЖКТ, мышцах, на коже при исследовании анализа крови общеклиническим методом также могут быть выявлены косвенные признаки, такие как анемия у молодых животных, эозинофилия. В случае, когда паразитирование происходит в клетках крови, анемия является непосредственным следствием патологического процесса [12].
Известен способ диагностики различных заболеваний, связанный с оценкой механической резистентности эритроцитов с использованием ультразвукового воздействия на суспензию эритроцитов (ультразвуковой гемолиз эритроцитов). Этот способ применяется для оценки патологических состояний организма по появлению на эритрограммах участков с высокоустойчивыми и низкоустойчивыми эритроцитами при различных патологиях. Недостатком данного способа является оценка состояния по одному виду клеток [13].
Известны также способы неинвазивного диагностического исследования, в которых широко применяются методы ультразвуковой диагностики, отражающие структурные изменения в исследуемых тканях животных и человека. Недостатками этих способов является разрешающая способность систем диагностики, ограниченная минимальной длиной волны, применяемой в аппаратуре.
Вопросам функционального изменения нормальных и патологически измененных клеток под действием ультразвука для использования этих изменений в качестве диагностического критерия уделено недостаточно внимания. Степень выраженности данных изменений зависит от типа излучателя, несущей частоты, интенсивности УЗ воздействия, времени воздействия.
2
Прототипом предлагаемого изобретения, наиболее близким ему по совокупности существенных признаков, является способ получения культуры клеток животных (SU 1597387 A1, опубл. 07.10.1990) при помощи воздействия на клетки ультразвуком с частотой 880 кГц и интенсивностью 0,02-0,08 Вт/см в течение 5-30 с с целью увеличения прироста клеточной массы.
Недостатком данного прототипа является невозможность проведения анализа функционального состояния всех типов клеток из-за последовательного воздействия ультразвука на разные типы клеток, находящиеся в питательных средах. При этом существенными отличиями заявленного изобретения от указанного аналога являются: обработка проб бегущей, а не стоячей акустической волной, импульсно модулированным, а не непрерывным УЗ, иная интенсивность применяемого УЗ, увеличение экспозиции и назначение способа не для получения большего количества клеток, а для избирательного и направленного воздействия на клетки и клеточные структуры только больных или инвазированных животных.
В заявленном способе проводится более глубокая и быстрая диагностика состояния клеток крови.
Целью предлагаемого изобретения является определение процентного соотношения клеток крови и их морфологических особенностей при оптимальных условиях воздействия импульсно модулированным УЗ терапевтической интенсивности, несущей частоты 880 кГц на живую систему in vitro, приводящих к изменению лейкограммы, которая является основой для определения состояния здоровья животного.
Поставленная цель осуществляется путем нахождения оптимальных условий ультразвукового воздействия, приводящего к изменению лейкограммы больных животных, избирательному разрушению клеточных структур у животных с интенсивностью инвазий разной степени тяжести и сохранению у здоровых животных клеток крови и лейкограммы в целом.
Показано, что в большинстве случаев получаемые эффекты воспроизводимы на практически всех тестируемых объектах. Результаты демонстрируют возможности и направления использования подобных методик в ветеринарной медицине.
Задачей заявляемого изобретения является создание способа экспресс-диагностики наличия/отсутствия паразитарных заболеваний в крови при помощи определения цитологических изменений в мазках крови и особенностей клеточного ответа на действие акустических (УЗ) волн терапевтической интенсивности in vitro. Выявление закономерностей взаимодействия клеток крови инвазированных и здоровых животных с УЗ безопасного диапазона: минимальной терапевтической интенсивности и предельно низкого времени экспозиции. Способ позволяет регистрировать ухудшение гематологических показателей и строения клеток крови животных с паразитемией при моноинвазиях и при смешанных инвазиях, а следовательно, диагностировать наличие или отсутствие заболевания по изменению лейкограммы, вызванному действием ультразвука определенных интенсивности и частот на клетки крови.
2
Указанная задача осуществляется тем, что на образцы крови объемом от 1 мл до 1,5 мл, помещенные в кювету, воздействуют бегущей импульсно модулированной УЗ волной с несущей частотой 880 кГц, диапазонами частот модуляции 10-20 Гц или 800-1000 Гц, интенсивностью 0,4 Вт/см с экспозицией воздействия на кровь животных от 10-30 с. Образцы крови обрабатывают в абсолютно одинаковых условиях, поддерживают постоянную температуру образцов в кюветах с проточным охлаждением, а также проводят анализ морфологического состояния клеток методами световой микроскопии. При начале гемолиза эритроцитов через 18-30 с, значительном уменьшении количества лимфоцитов и гранулоцитов, деформации и разрушении ядер и изменении структуры цитоплазмы, ее вакуолизации, а также при ядерном сдвиге лейкограммы влево диагностируют наличие паразитарного заболевания.
УЗ воздействие производится одновременно на все типы клеток крови различных животных, находящиеся в одинаковой среде культивирования. Это позволяет наблюдать наличие сдвига в лейкограмме, а также изменения вида лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов здоровых и инвазированных животных и по этим изменениям прогнозировать состояние здоровья животных. Таким образом, предлагаемый нами способ позволяет получить объективную, многокомпонентную, важную и достоверную информацию для диагностики.
Техническим результатом заявленного изобретения является:
1) повышение надежности диагностики наличия заболевания на начальной стадии, когда клиническая картина еще не выражена, и лейкограмма находится в пределах нормы;
2) определение любой стадии паразитемии при моноинвазиях и при инвазиях смешанного типа;
3) быстрое получение результатов лабораторной диагностики, не требующих больших затрат на биологический материал (достаточно одной капли крови) и затрат на стоимость обработки;
4) одновременная, быстрая, дифференцированная окраска и мазка крови, и возбудителя после УЗ воздействия на пробу крови in vitro;
5) универсальность - возможность ее применения для всех видов животных и для выявления любой стадии заболевания (латентной, персистирующей, острой, подострой).
Заявленный способ осуществляется следующим образом.
SATA
2
Воздействовали ультразвуком in vitro (фиг. 1). Экспозиция УЗ: время от 10 с до 30 с, I - средняя по пространству и времени интенсивность - 0,4 Вт/см, с несущей частотой 880 кГц, диапазоны частот модуляции 10-20 Гц или 800-1000 Гц. Аппараты: УЗТ - 1-01Ф; Ультразвук Т-5 и УЗТ-1.02С (фиг. 1.5). Импульсный режим, амплитудная модуляция со скважностью 2, модулятор Г3-112 (или любой аналогичный генератор). Объем образцов крови 1-1,5 мл. Кровь брали из периферических вен: вены Сафена и подкожной вены предплечья. Образцы крови (собаки, кошки, лошади) озвучивались в абсолютно одинаковых условиях (площадь излучателя, охлаждение, циркуляция жидкости). Ультразвуковое воздействие на клетки крови (фиг. 1; 1.2), находящейся в кювете (1.1), термостатируемой с помощью водяного ультратермостата, осуществлялось с помощью терапевтического излучателя (1.4). Стенки кюветы выполнены из пластика или пластмассы, но могут быть изготовлены из любых, проводящих ультразвук, материалов. В качестве охлаждающей жидкости применялась непрерывно циркулирующая дистиллированная вода (1.3) (т.н. «проточное охлаждение»). Результат воздействия УЗ на клетки сразу же наблюдали в световой микроскоп. Число клеток в единице объема крови определяли с помощью камеры Горяева и светового микроскопа. Делали мазки и окрашивали по методу быстрого дифференциального окрашивания биопрепаратов ДИФФ-КВИК: мазки фиксировали в абсолютном метаноле 15 с, выдерживали в растворах красителей в течение 10 с, промывали в забуференной воде, высушивали и микроскопировали (микроскоп «Микмед-5», объектив 100х/1,25, окуляр 10х/18). Подсчет лейкоцитов вели по линии «Меандра»: 3-5 полей зрения вдоль края мазка, 3-5 полей зрения под прямым углом к середине мазка, потом 3-5 полей зрения параллельно краю мазка и вновь под прямым углом к краю мазка. Так продолжали до тех пор, пока не было подсчитано 100 целых клеток [14]. Считали все лейкоциты, находящиеся в 25 больших квадратах, содержащих по 16 малых квадратов (т.е. в 400 квадратах). Для расчета в 1 мл использовали формулу
,
где X - количество лейкоцитов в 1 мл крови; М - количество лейкоцитов, подсчитанное в 25 квадратах; 20 - разведение крови; 400 - количество квадратов [15]. Лейкограмма отражает соотношение между различными видами лейкоцитов периферической крови и в клинической практике выражается в процентах.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0». Достоверность различий средних значений определяли, используя парный t-критерий Стъюдента; достоверными считали различия при р<0,05.
В результате данного этапа работы была отработана оптимальная схема озвучивания крови in vitro. Были определены восприимчивость и резистентность клеток крови здоровых и больных животных к УЗ воздействию, а также отслежены возможные изменения структуры и жизнеспособности клеток крови и гематологических показателей в поле бегущей ультразвуковой волны. Применяемый нами метод окраски Дифф-квик позволил выявить наличие возбудителей как микрофилярии D. repens, так и бабезиоза В. canis в крови животных. Поэтому необходимость использования более длительного метода окраски по Романовскому-Гимзе отпала, и мы во всех исследованиях пользовались набором для быстрого дифференцированного окрашивания мазков крови.
Изменения в лейкограмме у животных, зараженных дирофиляриозом и имеющих микрофиляремию, не выявлены. Число лейкоцитов могло превышать норму в 1,4 раза или "укладываться" в ее верхний предел. Лейкограмма у животных с бабезиозом также укладывалась в пределы физиологической нормы для данного вида животных. Таким образом, по лейкограмме диагностировать наличие инвазии у животных практически невозможно, если самого возбудителя не видно под микроскопом. В случае Babesia canis возбудитель виден при микроскопии внутри клеток. Dirofilaria repens может попасть в поле зрения микроскопа в мазке крови, а может нет, в зависимости от степени микрофиляремии, а при аскаридозе возбудитель в крови отсутствует.
Изменение в анализах крови животных со смешанной инвазией (р<0,05) бабезиоз и дирофиляриоз. Количество лейкоцитов, эритроцитов - в пределах нормы, тромбоцитов - в 4-5 раз меньше нормы. Лейкограммы (таблица) отличались уменьшением в 2-4 раза количества сегментоядерных нейтрофилов, а лимфоцитов в 1,7-3,5 раз по сравнению со здоровыми животными (р>0,05). Сильный разброс данных объясняется значительными колебаниями референсного ряда для каждого вида животных и невозможностью в большинстве случаев сравнения лейкограмм одних и тех же особей до инвазирования и после лечения: большинство хозяев делают анализ крови питомцам только в острый период болезни и после выздоровления. У всех животных, наблюдаемых ранее с бабезиозом или дирофиляриозом, не выявлено такого выраженного сдвига ядра влево (юных форм нейтрофилов в лейкограмме более 25%), как у собак со смешанной инвазией. При микрофиляремии у больных животных наблюдался сдвиг ядра влево, но не так сильно выраженный.
2
Изменение в анализах крови животных со смешанной инвазией после УЗ обработки. При микроскопии окрашенных мазков были выявлены микофиляремия и бабезии в эритроцитах. После 10 с УЗ обработки проб крови больных животных смешанной инвазией в ряде случаев может наблюдаться изменение формы и структуры эритроцитов (фиг. 4, 5). Начало лизиса клеток белой крови регистрируется уже на 10-й секунде облучения, а через 15 с клеточная деформация и лизис отмечаются практически во всех лейкоцитах (фиг. 4, 5, 8, 10), что осложняет их идентификацию. Импульсная модуляция 800-1000 Гц в течение 15 с вызывает агрегацию лейкоцитов, разрыхление их ядер и цитоплазматических мембран. Увеличение экспозиции до 30 с приводит к появлению в мазках теней клеток и почти полному (>97%) лизису всех видов лимфоцитов. УЗ интенсивности 0,4 Вт/см УЗ с частотой модуляции 10-20 Гц также вызывает клеточную агрегацию, изменяя лейкограмму (таблица) и структуру лейкоцитов животных с паразитемией (фиг. 2, 3). Глубина изменений напрямую зависит от интенсивности инвазии. У нейтрофилов происходят последовательно «вакуолизация» цитоплазмы, деформация и разрыв ядер и цитоплазмы. Фотографии клеток крови животных с моноинвазиями после облучения УЗ даны на Фиг. 2, 3, 7, 9, 11. На Фиг. 2 показаны лизис юных и сегментоядерных нейтрофилов и деформация лимфоцита после 15-секундной УЗ обработки проб крови зараженных микрофиляриями D. repens животных (частота модуляции 10 Гц), а на фиг. 4 - «вспенивание» ядра палочкоядерного (4.1) и сегментоядерного (4.2) нейтрофила после воздействия 30 с. На Фиг. 9 показана кровь собаки, больной бабезиозом. Клетки после 25 с обработки УЗ. Частота модуляции 20 Гц. Лизис ядер лейкоцитов. На фиг. 11. Кровь собаки, больной микрофиляремией. Агрегация лейкоцитов и лизис ядер нейтрофилов в УЗ поле (Частота модуляции 800 Гц. 20 с) Фотографии изменений, вызываемых модуляционной частотой 900 Гц при экспозиции 30 с в крови больных бабезиозом собак, наблюдается лизис лейкоцитов, сложность клеточной идентификация из-за разрушений ядер (8.1), разрыва цитоплазмы (8.2), даны на фиг. 7, 8. В контроле (фиг. 6) в клетках крови здоровой собаки после 15 с обработки УЗ (сегментоядерные нейтрофилы в центре) изменений нет. Лейкограмма в целом претерпевала значительные изменения (таблица). После 15 с действия модулированного УЗ с частотой 800-1000 Гц количество сегментоядерных нейтрофилов по сравнению с контролем сокращалось в 1,5-2,4 раза, а число юных и палочкоядерных нейтрофилов составляло до 50% от общего числа лейкоцитов. Было обнаружено, что молодые и незрелые формы клеток (5.1 - юный нейтрофил без разрушений) в мазках больных животных сохраняются значительно дольше в поле бегущей УЗ волны (5.2 - группа из юных нейтрофилов и деформированного лимфоцита; 5.3, 5.4 - лизис сегментоядерных нейтрофилов. Смешанная инвазия. После 15 с обработки УЗ. Частота модуляции 900 Гц). Строение гранулоцитов меняется в зависимости от экспозиции, вплоть до полного лизиса клеток. Так, после 30 с у нейтрофилов (юный - 5.1; сегментоядерный - 5.2) отмечают разрыхление ядер и цитоплазмы. 10 Гц модуляция также приводит к существенному сдвигу лейкограммы влево. При этом клетки сложно идентифицировать, у >20% из них лизированы или разорваны ядра и/или цитоплазма, а их окраска неоднородна и неспецифична. Ядра могут быть "вакуолизированы" или содержать зернистость. На фиг. 10. Кровь собаки. Дирофилириоз и бабезиоз. Клетки после 19 с обработки УЗ. Частота модуляции 1000 Гц. Начало гемолиза. Во всех случаях отмечена иктеричность сыворотки крови, вызванная УЗ гемолизом эритроцитов. Во всех мазках крови, обработанной УЗ, в поле зрения микроскопа обнаружено большое количество тромбоцитов разного размера (Фиг. 4). По нашему мнению, это следствие более глубокой окраски клеток крови после УЗ воздействия, но возможно, и влияние процесса двойной инвазии. Начало УЗ гемолиза эритроцитов при обработке крови больных дирофиляриозом животных наступало через 25 с; бабезиозом - через 30 с, смешанной инвазией - через 18-20 с.
Библиография
1. Кошелева, М.И. Бабезиоз собак в условиях Московской области (эпизотоогия, иммунитет, терапия): автореф. дис. … кандидата вет. наук // Кошелева М.И. - М., 2006, 17 с.
2. Белименко, В.В. Бабезиоз собак в Оренбургской и Московской областях: дис. … канд. биол. наук. Защищена 16.00.03, 03.00.19 // В.В. Белименко. - М., 2008. - 141 с.
3. Taboada, J. Babesiosis of Companion Animals and Man / J. Taboada, S. Merchant // Veterinary Clinics of North America - 1991 Jan. - Vol. 21. - No. 1. - P. 103-123.
4. Белименко, В.В. Бабезиоз собак / В.В. Белименко, Заболоцкий В.Т., Саруханян А.Р., Христиановский П.И. // РВЖ. МДЖ. - 2012. - №2. - С. 42-46.
5. Василевич Ф.И., Есаулова Н.В., Акбаев P.M. Паразитарные болезни плотоядных животных. // Монография. - М., 2010. - 149 с.
6. Василевич Ф.И., Георгиу X., Белименко В.В., Гулюкин М.И. Практическое руководство по борьбе с кровопавразитарными болезнями домашних животных. - М.: ЗооВетКнига, 2015. - 86 с.
7. Ettinger, Stephen DVM, Edward С. Feldman DVM. "Canine Babesiosis". Textbook of Veterinary Internal Medicine. 6th Edition. Vol. 1. St. Louis, Missouri, 2005. - 700 p.
8. Wetzel, Linda Marie. "Vector-Transmitted Diseases in Companion Animals: Trends, Risks, Controls." DVM News. April 2007, p. 10-11.
9. Василевич Ф.И., Пьянова A.M. Особенности патогенеза при дирофиляриозе собак. // Ветеринарная медицина. 2008. №4. - С. 27-28.
10. Медведев А.Ю. Распространение дирофиляриоза собак в Краснодарском крае и разработка его диагностики иммуноферментной реакцией. Автореферат диссертации, 2010.
11. Ястреб В.Б. Морфологические и биохимические показатели крови при дирофиляриозе собак / Ястреб В.Б. // Тр. Всерос. ин-та гельминтол. - 2006. - Т. 42. - С. 468-473.
12. Антипин Д.Н., Егоров B.C., Золотарев Н.А., Саляев В.А. «Паразитология и инвазионные болезни сельскохозяйственных животных». С. 30, 34, 248, 346.
13. T.N. Pashovkin, D.G. Sadikova, M.S. Pashovkina, G.V. Shil'nikov // Use of ultrasonic standing wave in biological studies and cell technologies. // Bull ExpBiol Med 144(1): 118-22 (2007) PMID 18256768.
14. Кудрявцев, A.A. Клиническая гематология животных / A.A. Кудрявцев, Л.А. Кудрявцева. - М.: «Колос» 1974. - 399 с.
15. Бурмистров Е.Н. Шанс Био: Лабораторная диагностика. М., 2006. – 154 с.