ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ, ДНК-ЗОНД И СПОСОБ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ АНЕМИИ ЛОШАДЕЙ МЕТОДОМ ПЦР ИЛИ ОТ-ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ
OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS, DNA-PROBE AND METHOD FOR DETECTION OF VIRUS OF INFECTIOUS ANAEMIA IN HORSES BY METHOD OF PCR OR RT-PCR IN REAL TIME MODE

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для выявления РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей.
Инфекционная анемия лошадей (ИНАН) - вирусная болезнь однокопытных, характеризующаяся поражением органов кроветворения и проявляющаяся рецидивирующей или постоянной лихорадкой, анемией, явлениями геморрагического диатеза и нарушением функций сердечнососудистой системы, а также длительным вирусоносительством [1, 2, 5].
Возбудитель ИНАН лошадей - РНК-содержащий вирус семейства Retroviridae, рода Lentivirus [1, 2, 4, 6].
С 2010 г. по 2013 г. по данным Международного эпизоотического бюро ИНАН лошадей регистрируется во многих странах мира. 2011 год - Франция, Германия, Греция, Япония - 42 вспышки. 2012 год - Бельгия, Германия, Франция, Греция, Великобритания - 24 вспышки. За полгода 2013 - Бельгия, Франция, Германия - 21 вспышка заболевания.
Также ИНАН регистрируется в странах ближнего зарубежья, например, таких, как Украина [3].
На период 2012 года в нашей стране выявили положительно реагирующих на ИНАН лошадей в Омской, Челябинской, Нижегородской, Кировской, Иркутской, Свердловской, Ленинградской, Курской и Томской областях, республике Бурятия и республике Коми, Приморском и Красноярском крае. За первое полугодие 2013 года выявлены больные животные в Нижегородской, Кировской, Омской, Томской областях, Красноярском крае, республике Коми и республике Хакасия.
Лабораторная диагностика ИНАН в Российской Федерации основана на серологических методах (РДП, ИФА), которые выявляют вирусспецифические антитела в сыворотке крови больных лошадей, начиная с 14-38 дня, и не дают возможности диагностировать заболевание на ранних стадиях болезни до образования антител, а также не позволяют определить статус жеребят, полученных от инфицированных кобыл [1, 2].
Разработка тест-системы для выявления РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей в формате реального времени была обусловлена необходимостью раннего обнаружения болезни, повышения чувствительности диагностических тестов, сокращения времени анализа и трудозатрат.
Обнаружение ПЦР-продуктов основанное, на флуоресцентной регистрации накопления ДНК, значительно увеличило производительность теста и снизило риск контаминации. В настоящее время широко применяются тесты, основанные на ОТ-ПЦР в режиме реального времени для обнаружения отдельных вирусов, что в случае вспышки заболевания позволяет быстро и в каждом конкретном случае идентифицировать вирус [5, 6]. Все существующие способы и основанные на них тест-системы были разработаны за рубежом, поэтому существенным недостатком служит их дороговизна и длительный срок поставки в нашу страну.
Целью данного изобретения является разработка способа выявления РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей с помощью ПНР в режиме реального времени с использованием пары синтезированных олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда, комплементарных к консервативной области gag-гена вируса ИНАН.
Поставленная цель достигается за счет пары синтезированных олигонуклеотидных праймеров, ДНК-зонда и способа для обнаружения РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей в крови, пробах органов (селезенка, печень) от больных или погибших животных, при котором проводят амплификацию ДНК.
Специфические олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд для обнаружения РНК и пДНК вируса инфекционной анемии лошадей используется в полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции в режиме реального времени. Данная процедура включает следующие этапы:
1. Денатурация РНК вируса ИНАН.
2. Обратная транскрипция - синтез кДНК.
3. ПЦР РВ.
2+
Денатурацию РНК осуществляют при температуре 94°C в течение 5 минут в реакционной смеси со специфической парой олигонуклеотидных праймеров. Синтез кДНК осуществляют при температуре 42°C в течение 60 минут в реакционной смеси для обратной транскрипции, включающей дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (ДНТФ), буфер для обратной транскрипции и фермент ревертазу (обратную транскриптазу). Полученную кДНК используют для проведения полимеразной цепной реакции. Или для постановки ПЦР можно использовать провирусную ДНК вируса ИНАН, то есть без этапов денатурации и обратной транскрипции. Готовят стандартную смесь для ПЦР, включающую буфер для ПЦР, ДНТФ, Mg, пару спецефических олигонуклеотидных праймеров, ДНК-зонд и фермент ДНК-полимеразу. Профиль реакции следующий: удержание температуры - 94°C - 4 мин; циклирование: 94°C - 10 с, 56°C - 15 с, 72°C - 15 с. Цикл повторить 5 раз без детекции продуктов амплификации. Затем циклирование: 94°C - 10 с, 56°C - 15 с, 72°C - 15 с. Цикл повторить 35 раз с детекцией продуктов амплификации.
В основе используемого способа - ПЦР в режиме реального времени, применение специфических олигонуклеотидов и технологии гибридизационных зондов TaqMan. Для детекции использовали зонд, несущий флуорофор и тушитель, комплементарный части амплифицируемого со специфическими праймерами фрагмента. Выбор и анализ вирусспецифических праймеров и зондов (табл.1) проводили при помощи пакета прикладных программ «Bio Edit 7.0.8», «Oligo 6.0» на основании анализа нуклеотидных последовательностей gag-гена, референтных штаммов и изолятов вируса ИНАН, опубликованных в информационной базе данных GenBank. В качестве источника флуоресценции на 5′ конце зонда применяли краситель FAM, а для тушения флуоресценции на 3′ конце RTQ1.
Таблица 1
Специфические праймеры и ДНК-зонд для выявления РНК и пДНК вируса ИНАН
ПЦР-мишень
Праймеры /ДНК-зонд
Нуклеотидная последовательность, 5′-3′
Локализация (NC_001450.1)
gag-ген
EIA/q2/F
gTC-TTC-Tgg-Agg-TgT-TCC-T
480-498
EIA/q2/R
CCg-TCA-CCT-TCT-CTA-ACT-TC
560-579
EIA/q2/Z
FAM - Agg-ARg-ACA-ggT-ARg-ATg-ggR-gA - RTQ1
510-532
Техническим результатом изобретения является возможность обнаружения РНК и пДНК вируса ИНАН с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени, а также повышение специфичности и чувствительности, что позволит существенно сократить материальные затраты и время проведения работ по выявлению генома вируса ИНАН в образцах исследуемого биологического материала.
Сущность изобретения состоит в том, что при помощи указанных вирусспецифических олигонуклеотидных праймеров проводят ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющую выявить РНК и пДНК вируса ИНАН. Использование данной методики позволяет повысить специфичность и чувствительность реакции.
Пример конкретного выполнения
Выявление РНК и пДНК вируса ИНАН проводится в образцах биологического материала: кровь от инфицированных вирусом ИНАН животных, 10%-ная суспензия внутренних органов инфицированных животных, лиофилизированный культуральный материал, а также в образцах интактных культур клеток, крови от интактных животных и культуральном материале гетерологичных вирусов.
Из представленных образцов были выделены нуклеиновые кислоты с использованием следующей методики.
3
Исследуемый материал в объеме 100-200 микролитров (далее - мкл) вносят в 1,5 см пробирки, в которые предварительно внесено 800 мкл лизирующего буфера на основе гуанидинтиоционата. Пробирки перемешивают и инкубируют при температуре 56°C в течение 5-10 мин. Затем добавляют 35 мкл нуклеосорбента, который предварительно тщательно ресуспендируют. Смесь инкубируют в течение 7 мин при комнатной температуре с периодическим перемешиванием на смесителе типа «Vortex». Осаждают сорбент центрифугированием при 7 тыс об/мин - 15 сек. При помощи вакуумного отсасывателя с колбой-ловушкой отдельным для каждой пробы наконечником удаляют надосадок.
Затем к осадку добавляют 300 мкл отмывочного буфера и тщательно ресуспендируют сорбент. Центрифугируют пробу при 7 тыс об/мин - 30 сек. Удаляют, используя отдельный наконечник для каждой пробы, надосадочную жидкость с помощью вакуумного насоса с колбой-ловушкой.
Дважды промывают сорбент 75%-ным этиловым спиртом, в количестве 500 мкл на каждую пробу, тщательно ресуспендируют. Центрифугируют пробу при 13 тыс. об/мин - 30 сек. Надосадок удаляют при помощи вакуумного отсасывателя с колбой-ловушкой и отдельного наконечника для каждой пробы.
Осадок в пробирках подсушивают при 56°C в течение 5-10 мин, при этом крышки пробирок должны быть открыты.
К осадку добавляют 50 мкл элюирующего буфера. Перемешивают на смесителе типа «Vortex» и инкубируют 10 мин при 56°C в пробирках с закрытой крышкой.
Центрифугируют пробирки в течение 60 сек при 13 тыс об/мин и переносят надосадочную жидкость в новые пробирки.
Супернатант используют в дальнейшем в качестве матрицы для постановки реакции обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени.
Затем для выявления РНК вируса ИНАН препараты нуклеиновых кислот использовали в реакции обратной транскрипции: 8 мкл образца добавляли к реакционной смеси для денатурации РНК. В пробирку с денатурированной РНК добавляли смесь для реакции обратной транскрипции. Препарат кДНК или пДНК (нуклеиновые кислоты после выделения без этапа обратной транскрипции) в количестве 8 мкл использовали для постановки собственно ПЦР (результаты представлены в таблице 2).
Проведение реакции обратной транскрипции
В подготовленные пробирки вносят по 7 мкл смеси для денатурации РНК, сверху наслаивают 40 мкл минерального масла. Под масло вносят 8 мкл препарата выделенных нуклеиновых кислот. Реакцию денатурации проводят при температуре 94°C в течение 5 минут.
Готовят смесь для реакции обратной транскрипции, для этого в отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов. На одну пробу смешивают: 9,8 мкл смеси для обратной транскрипции и 0,2 мкл MMLV-ревертазы, смесь перемешивают. В пробирки с денатурированной РНК вносят по 10 мкл смеси для обратной транскрипции с ферментом. Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°C в течение 60 минут. После окончания реакции к ДНК используют для постановки ПНР.
Проведение ПЦР
3
В отдельной пробирке готовят общую реакционную смесь на необходимое количество образцов, для этого на одну пробу добавляют 13 мкл смеси для ПЦР, 2 мкл смеси праймеров, 0,3 мкл ДНК-зонда и 0,2 мкл (1 ед) Taq-полимеразы. Смесь перемешивают, избегая образования пены, и раскапывают по 16 мкл в пробирки объемом 0,2 см. На поверхность смеси вносят воск в объеме 15 мкл.
В подготовленные для ПЦР пробирки на воск вносят по 8 мкл кДНК или пДНК.
Помещают пробирки в амплификатор со следующей программой:
Профиль реакции:
1. Удержание температуры / Hold
94°C - 4 мин
2. Циклирование / Cycling (без детекции
94°C- 10 с
продуктов амплификации)
56°C - 15 с
72°C - 15 с
Цикл повторить / Cycle repeats 5 раз (5 times)
3. Циклирование / Cycling (с
94°C - 10 с
детекцией продуктов амплификации
56°C - 15 с - детекция!
72°C - 15 с
Цикл повторить / Cycle repeats 35 раз (35 times)
Флуоресценцию измеряют по каналу Green при температуре 56°C.
С помощью программы "BioEdit 7.0.8" выравнены доступные в базе данных GenBank нуклеотидные последовательности полного генома и участков gag-гена вируса ИНАН. При анализе построенного элайнмента внутри gag-гена вируса ИНАН выбран консервативный участок, на который и были подобраны специфические олигонуклеотиды. С помощью программы "Oligo 6.0" рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома, размером 99 п.о. Для детекции продуктов амплификации подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд, комплементарный участку нуклеотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров EIA/q2/F и EIA/q2/R.
С использованием программы "Oligo 6.0" описаны основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПЦР.
Свойства олигонуклеотидов, рассчитанные с помощью программы
"Oligo 6.0.
Названиеолигонуклеотида
Температураплавления, °С
AG гибридизации олигонуклеотида на матрицу, kcal/mol
3AG образования шпилечной структуры, kcal/mol
Эффективность отжига олигонуклеотида на матрицу (Priming efficiency number)<sup>1</sup>
EIA/q2/F
57,5
-33,6
-8,2
365
EIA/q2/Z
68,2
-42,3
-7,9
417
EIA/q2/R
58,5
-35,1
-9,6
393
Примечание:
1- Priming efficiency number - это величина, определяющая эффективность гибридизации данного праймера (зонда) с заданным участком матрицы, рассчитывается по уникальному алгоритму, разработанному создателями программы "Oligo". Минимальное значение Priming efficiency number, при котором праймер (зонд) в ходе ПЦР эффективно гибридизуется со специфическим участком матрицы.
Определение аналитической чувствительности ПЦР в режиме реального времени при выявлении пДНК вируса ИНАН и ОТ-ПЦР в режиме реального времени при выявлении РНК вируса ИНАН.
0,253*10
,
г/мл
0,77×10
молекул ДНК/мкл.
1,593*10
г/мл,
1,18  ×10
молекул
/мкл.
-6
8
-6
9
Аналитическую чувствительность метода определяли с использованием рекомбинантной плазмиды со встройкой фрагмента генома вируса ИНАН и in vitro транскрипта, синтезированного на матрице рекомбинантной плазмиды со встройкой фрагмента генома вируса ИНАН. Концентрация очищенного препарата плазмидной ДНК измеренная спектрофотометрически составила  что соответствует  Спектрофотометрически измеренная концентрация in vitro транскрибированной РНК составила что соответствует  РНК
in vitro
2
2
2
2
Десятикратные разведения (в трех повторах) препарата рекомбинантной плазмиды и транскрибированной РНК известной концентрации использовали для определения аналитической чувствительности ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Пределом чувствительности считали максимальное разведение, при котором регистрировали положительный результат. Рассчитанное значение аналитической чувствительности метода ПЦР в режиме реального времени составило 0,77*10 молекул ДНК /мкл, что соответствует 6,16×10 молекулам ДНК в реакционной смеси. Рассчитанное значение аналитической чувствительности метода ПЦР в режиме реального времени составило 1,18*10 молекул РНК /мкл, что соответствует 9,44×10 молекулам ДНК в реакционной смеси.
Учет и интерпретация результатов амплификации
t
Результаты интерпретируют на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с установленной на уровне пороговой линией (Threshold), что соответствует наличию/отсутствию значения C в соответствующей графе в таблице результатов. Результаты идентификации вируса ИНАН методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанных специфических олигонуклеотидов представлены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты идентификации вируса ИНАН методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием разработанных специфических олигонуклеотидов в различных образцах биологического материала.
№ проб
Характеристика биологического материала
Результат ОТ-ПЦР в режиме реального времени
1
культура клеток синовиальной мембраны ягненка (СМЯ), зараженная вирусом висна-маеди, шт. «М-88» 3,5-4,5 lg ТЦД<sub>50</sub>/мл
-
2
культура клеток синовиальной мембраны козленка (СМК), зараженная вирусом АЭК, шт. «75G-63» 5,0-5,5 lg ТЦД<sub>50</sub>/мл
-
3
культура клеток CV, зараженная вирусом африканской чумы лошадей, штамм «452» (8 серотип)
-
4
10% суспензия легкого овцы с клиническими и патологическими признаками аденоматоза легких овец №12 (г. Пермь)
-
5
кровь от клинически здоровой лошади
-
6
кровь от клинически здоровой овцы, искусственно контаминированная вирусом висна-маеди, шт. «М-88» в разведении 1:10
-
7
кровь от клинически здоровой козы, искусственно контаминированная вирусом АЭК, шт. «75G-63» в разведении 1:10
-
8
культура клеток лейкоцитов лошади, интактная
-
9
10% суспензия печени лошади, серопозитивной по инфекционной анемии лошадей
+
10
10% суспензия селезенки лошади, серопозитивной по инфекционной анемии лошадей
+
11
антиген (штамм «3-К-ВНИиТИБП-ВИЭВ») из «Набора для диагностики инфекционной анемии лошадей в реакции диффузионной преципитации (РДП) (организация-производитель ФГУП «Щелковский биокомбинат»)
+
12
кровь от экспериментально зараженной вирусом ИНАН лошади на 2 сутки наблюдения
+
13
кровь от экспериментально зараженной вирусом ИНАН лошади на 14 сутки наблюдения
+
14
кровь от экспериментально зараженной вирусом ИНАН лошади на 35 сутки наблюдения
+
Синтетические олигонуклеотидные праймеры были проверены на специфичность. Установлено, что тест-система не амплифицирует РНК и ДНК других вирусов.
Таким образом, подобраны специфические олигонуклеотидные праймеры и ДНК-зонд, а также разработан способ, позволяющий с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени с использованием специфических олигонуклеотидов обнаруживать РНК и пДНК вируса ИНАН.
Основными преимуществами заявляемого изобретения являются:
- высокая специфичность и чувствительность способа идентификации вируса ИНАН с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени, благодаря избирательному выявлению уникальной нуклеотидной последовательности gag-гена генома вируса ИНАН;
- быстрота и относительная дешевизна метода, благодаря использованию ОТ-ПЦР в режиме реального времени для идентификации вируса ИНАН, благодаря исключению ряда процедур, необходимых для регистрации продуктов амплификации в классической ПНР;
- простота выполнения методики, исключающая необходимость привлечения высококвалифицированного персонала.
Источники информации
1. Архипов, Н.И. Медленные инфекции животных / Н.И Архипов, И.А. Бакулов, Л.И. Соковых. - М.: Агропромиздат, 1987. - 191 с.
2. Юров, К.П. Вирусные болезни лошадей / К.П. Юров, В.Т. Заблоцкий, Н.Е. Косминков. - М.: Зоомедлит, 2010. - 256 с.
3. Эпизоотологический мониторинг, лечение и профилактика заразных болезней лошадей в Украине / А.Е. Галатюк, В.Л. Бегас, А.И. Каневский [и др.] // Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития: материалы Международной научно-практической конференции. - Саратов, 2010. - С.109-113.
4. An EIAV field isolate reveals much higher levels of subtype variability than currently reported for the equine lentivirus family / J.K. Craigo, S. Barnes, B. Zhang [et al.] // J. Retrovirology. - 2009. - №6 - P 95.
5. Momtaz, H. Detection of proviral sequences of equine infectious anemia virus in peripheral blood cell of horses in Iran / H. Momtaz, S. Nejat // Bulgarian Journal of Veterinary Medicine. - 2010. - Vol.13, №1, P.18-22.
6. Nagarajan, M.M. Detection of horses infected naturally with equine infectious anemia virus by nested polymerase chain reaction / M.M. Nagarajan, C. Simard // Journal of Virological Methods. - 2001. - Vol.94. - P.97-109.