Исследование патогенных свойств бактерий «Мокрой древесины»

УДК 632.3

ИССЛЕДОВАНИЕ ПАТОГЕННЫХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ «МОКРОЙ ДРЕВЕСИНЫ»

INVESTIGATION OF PATHOGENIC PROPERTIES OF BACTERIA OF "WET

WOOD"

Черпаков В.В.

Cherpakov V.V.

Рассмотрены результаты изучения патогенных свойств штаммов бактерий Erwinia multivora, Erwinia herbi^la, Clostridium spp., ассоциированных с мокрой древесиной бактериальной водянки in vivo и in vitro методами инокуляции.

The results of studying of pathogenic properties of strains of bacteria Erwinia multivora, Erwinia herbi^la, Clostridium spp., associated with wet wood bacterial dropsy in vivo and in vitro methods of inoculation.

Ключевые слова: бактериальная водянка, бактерия, патогенные свойства

Keywords: bacterial dropsy, bacteria, pathogenic properties

Сосудисто-паренхиматозный бактериоз древесных пород, связанный с обводнением тканей древесины стволов, ветвей и рядом других специфических симптомов изучается фитобактериологами уже 70 лет. В 1945 г. J.C. Carter на ильмовых породах был описан бактериоз под названием wetwood» (мокрая древесина) и его возбудитель - Erwinia nimipressuralis Carter [9]. В 1963 г. в СССР А.Л. Щербин-Парфененко описан аналогичный бактериоз на 22 видах хвойных и лиственных пород под названием бактериальная водянка, возбудитель - грамотрицательная, неспороносная бактерия Erwinia multivora Scz.-Parf. [6]. В 1979 - 2013 гг. список поражаемых бактериальной водянкой пород для этой бактерии расширил В.В. Черпаков [3,4,5]. На Украине Р.И. Гвоздяк, Л.М. Яковлева к 1979 г. выявили бактериальную водянку на буке, дубе, тополе, подробно изучен возбудитель - Erw. nimipressuralis [2]. В 1985 г. Т.М. Рыбалко, А.Б. Гукасян на хвойных породах Средней Сибири изучена бактериальная водянка, описан возбудитель Erw. nimipressuralis [1]. За рубежом, в США, Европе, Японии бактериоз, получивший устоявшееся клише «wetwood», поражает десятки видов хвойных и лиственных пород. Исследованиями была подтверждена патогенность описанных видов, что не вызывает сомнения в их причастности к развитию патологического процесса. Вместе с тем, в результате изучения биологических свойств у этих бактерий выявились существенные различия в свойствах, контролирующих ключевые факторы патогенности, специфичность патогенеза, позволяющие считать их разными видами. Это тема отдельного исследования, современное систематическое положение указанных видов в данной статье не обсуждается,

В объяснении этиологии бактериальной водянки в последнее время за рубежом проявились новые тенденции. Обильные потёки забродившей жидкости и слизи из трещин и сучков - весьма заметный и яркий симптом, который всегда привлекает и бросается в глаза, сопровождается также запахом масляно-кислого брожения. В связи с этим, у бактериоза в западной литературе появилось второе название - «slime flux» (слизевый поток, поток слизи),

которое стало употребляться гораздо позднее чем «wetwood». Используется этот штамп примерно последние 15-20 лет, когда бактериоз уже был выявлен на многих хвойных и лиственных породах и стала ясна его вредоносность для коммерчески важных деревьев в США. Повышенное внимание к бактериозу проявилось в более тщательных и скрупулёзных подходах не только к известному на Западе возбудителю Erw. nimipressuralis, который выделяли из поражённой древесины, но и вообще ко всей микрофлоре, присутствующей в пораженных участках. Возможно, это объяснялось прагматическим интересом американских исследователей в поиске истинного патогена и выявлении роли выделяющейся микрофлоры для установления объекта борьбы с болезнью. В результате, в качестве причины «wetwood» («slime flux»), стали выдвигать очень часто всю совокупность бактерий в различном сочетании, которые изолировались из мокрой древесины. В этом составе иногда упоминается и бактерия Erw. nimipressuralis.

Из мокрой древесины и потёков слизи выделяют виды родов Clostridium, Bacteroides, Erwinia, Edwardsiella, Klebsiella, Lactobacillus, Xanthomonas, Agrobacterium, Acinetobacter [14], в других наборах -Xanthomonas, Agrobacterium, Bacillus, Clostridium, Acinetobacter, Pseudomonas и Enterobacter cloacae (Erwinia nimipressuralis) [12]. И далее, в самых разных сочетаниях, иногда привязанных к конкретным древесным породам упоминаются: Corynebacterium spp., Bacillus megaterium, Pseudomonas fluorescens, Methanobacter arbophilicum, Corynebacterium humiferum, Erwinia herbicola (Enterobacter agglomerans), Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Serratia fonica, Streptococcus mitis, Staphylococcus spp., Bacteroides spp., Edwardsiella spp., Lactobacillus spp. [7-11,13]. Подобный подход породил идею о комплексной причине бактериальной водянки древесных пород. Анализ многочисленных источников показывает, в определённой степени, безосновательность такого взгляда на этиологию бактериоза. В приводимом составе бактерий упоминается только два вида - Erw. nimipressuralis и Corynebacterium humiferum, имеющих фитопатогенные свойства, доказанные экспериментально. Остальные представляют конгломерат большей частью сапрофитных видов, облигатных анаэробов, облигатных и факультативных аэробов, явно не имеющих отношения к внутренней патологии древесины ствола. Более того, ряд видов являются патогенными или условно-патогенными для человека (Enterobacter cloacae, Klebsiella oxytoca , Klebsiella pneumoniae и др.). Это уводит проблему этиологии бактериоза в сторону от главного вопроса лесо-патологической диагностики, - какой вид (виды) вызывают патологический процесс у древесных растений.

Мокрая древесина ядровой и частично заболонной части ствола - представляет собой мертвую древесину, выполняющую в стволе механическую функцию, поэтому субстрат обоснованно может быть насыщен бактериальным комплексом сапрофитов, причастность которых к патогенезу сомнительна. Среди упомянутых таксонов до сих пор не были известны возбудители бактериальной водянки и мокрых гнилей древесных и травянистых растений с мацерацией тканей за исключением Erw. multivora и Erwinia carotovora.

Критерием истины становятся опыты по искусственному заражению (выполнение основных принципов Коховской триады), которые могут либо подтвердить, либо опровергнуть причастность указанных таксонов к возникновению симптомов бактериальной водянки. Однако, в массе изученных публикаций зарубежной научной литературы нам не удалось найти сведения по данному вопросу, похоже, что он не актуален.

В исследованиях патогенеза бактериальной водянки, из внутренней древесины ствола и ветвей не только с признаками поражения, но и внешне не пораженных тканей, кроме Erwinia multivora, мы неоднократно выделяли, также грамотрицательные жёлтопигметные бактерии Erw. herbicola (Pantoea agglomerans), грамположительные, облигатно анаэробные, спороносные бактерии Clostridium spp., грамположительные, спороносные, аэробные (факультативно анаэробные) Bacillus spp., другие виды. Поскольку изначально было известно, что это сапрофиты, мы принимали их за загрязнители, появлявшиеся при изоляции возбудителей в природе. Но, впоследствии, при максимально тщательном выполнении всех правил асептики, мы убедились, что эти сапрофитные виды нередко сопровождают патогены и, не находясь с ними в антагонизме, составляют бактериальную ассоциацию. Какова роль этих видов во внутренних здоровых тканях древесины неизвестно. Опыты по искусственному заражению в лабораторных и полевых условиях не подтвердили пато-генность штаммов исследуемых чистых культур этих видов. Поражённая мокрая древесина бактериальной водянки внутри ствола представляет собой своеобразную экологическую нишу для развития ассоциаций анаэробной сапрофитной микрофлоры, способствующей разжижению срединной пластинки и разложению целлюлозы. Бактерии, изолируемые из вытекающей наружу пенящейся жидкости и внутренних обводненных слоев древесины, участвуют в процессах масляно-кислого брожения и могут вообще не иметь никакого отношения к внутреннему патогенезу бактериальной водянки.

Возбудитель бактериальной водянки - фитопатогенная грамотрицатель-ная, неспороносная бактерия Erwinia multivora Scz.-Parf., активно сбраживает углеводы с образованием газа и кислоты, вырабатывает пектолитические ферменты при росте на питательных средах in vitro [2,6]. Эти два важных идентификационных признака проявляются в природе: в зоне мокрого патологического ядра в стволах и ветвях происходит активное газообразование с радиальным разрывом тканей заболони и образованием трещин под напором скопившихся газов, истечением жидкости и слизи из трещин и сучков; в поражённых мягких тканях семян, шишек, плодов, луба происходит разжижение срединной пластинки, возникает мацерация тканей, развивается мягкая гниль. Возбудитель - полифаг, аэроб, факультативный анаэроб, хорошо выживает в почве, что способствует развитию корневых заражений. Прямые и перекрестные опыты по искусственному заражению, проводимые нами в лабораторных и полевых условиях штаммами из лиственных и хвойных пород, доказали не только патогенность чистых культур, но и подтвердили типичную симптоматику бактериоза, полифагию возбудителя.

В опытах по искусственному заражению в природе стволов и ветвей изоляты Erw. multivora: из пихты кавказской свободно заражали бук восточный и другие лиственные породы; из сосны обыкновенной, вызывали водослой на других видах сосен. Изоляты из береста, при инокуляции разных видов ильмовых пород в природе, вызвали развитие водослоя в древесине и её потемнение до светло-коричневого цвета, не только в местах внесения инокулюма, но и распространение общей зоны поражения в древесине более чем на 0,5 м превосходящей распространение видимого поражения вверх по сосудам, до вершины тонких веток, а также на 20-25 см по сосудам вниз по ветке против движения водотока. Последнее свидетельствовало о самостоятельном активном продвижении бактерий внутри водотока благодаря пере-трихиальным жгутикам и хемотропизму (движение постоянно делящихся клеток в сторону больших концентраций питательных веществ в водотоках сосудов с преодолением внутреннего тургора и направления движения растворов). Таким образом, in vivo искусственно были вызваны симптомы бактериальной водянки, подтверждающие истинность патогена.

Выработка пектиназ и протопектиназ проверялась in vitro на ломтиках картофеля и моркови - в местах внесения инокулюма Erw. multivora, в результате распада срединной пластинки, произошло загнивание и разложение тканей с их последующей мацерацией. Кроме того, во влажной камере проводились опыты по заражению семян различных древесных пород методами опрыскивания и введения шприцем инокулюма в эндосперм семени в разных вариантах. В опытах произошло загнивание семян с изменением цвета эндосперма и мокрым разложением тканей, что также подтверждало пектоли-тическую активность бактерий.

В лабораторных условиях in vitro, методом заражения побегов через сосудистую систему, проверялась вирулентность штаммов Clostridium spр. и Erw. herbicola (Pantoea agglomerans), выделенных из древесины дуба. Результаты опытов оказались отрицательными, т.е. заражений побегов не произошло. На испытуемых побегах дуба бактерии проникли через сосудистую систему стволиков и черешки в листья и по центральной жилке в точку роста, в которой произошло отмирание точки роста и части прилегающей ткани шириной 1-2 мм, по типу реакции сверхчувствительности, после чего поражение было купировано защитными веществами (возможно фитоалексинами) иммунной системы побега. Увядания побегов, изменения цвета листьев, не произошло. Для контроля ставились опыты с дистиллированной водой, в которых побеги остались неизменными. Кроме того, в целях контроля, одновременно заражались побеги сильновирулентной культурой возбудителя бактериального ожога дуба (Erwinia spp.) у которых через 6-10 часов произошло сплошное увядание, а ещё через сутки они полностью засохли, будучи зелеными. Таким образом, сапрофитные виды бактерий, присутствующие в древесине стволов - Clostridium spр/ и Erw. herbicola, в опытах по инокуляции подтвердили свою сапрофитную сущность и индифферентность в патогенезе древесных растений. Все опыты по инокуляции ставились в многократной повторности с постановкой контроля с использованием в качестве инокулюма

дистиллированной воды. Во всех случаях проводилась реизоляция патогенов с последующим параллельным тестированием биологических свойств, которая подтвердила идентичность исходных и реизолированных штаммов. Пато-генность этой бактерии, в своё время, была также тщательно изучена и доказана изначально её первооткрывателем А.Л. Щербин-Парфененко [6].

Таким образом, можно констатировать, что исследованные штаммы Erw. multivora, в опытах по инокуляции проявили не только патогенные свойства возбудителя, но и вызвали специфические симптомы бактериальной водянки, подтвердив истинность патогена. Это проявилось в образовании водослоя в древесной паренхиме, поражении сосудов, активном продвижении бактериальной инфекции по сосудам, в т. ч. против направления водотока, в проявлении пектолитических свойств выделенных бактерий. При изучении биологических свойств, штаммы вызывали активное газообразование и способность образовывать кислоту на многих углеводных средах. Кроме того, не в пользу теории комплексной инфекции свидетельствует и тот факт, что при изоляции патогенов в природе в большинстве случаев, в зависимости от исследуемых тканей, возбудитель выделялся в чистом виде без примесей другой микрофлоры. Как правило, это была свежепоражённая древесина (либо внешне здоровая прилегающая, где проходит линия продвижения бактерий) молодых тонких веток с внутренней насыщенной водянкой, при которой ещё не произошёл разрыв древесины и не образовались трещины, т.е. отсутствовал открытый контакт с внешней средой, эпифитной и сапрофитной микрофлорой. В то же время вблизи открытых и закрытых ран, язв, трещин всегда могут выделяться различные виды типичных сапрофитов, аэробов, эпифитов, не имеющих отношение к патологическому процессу, но участвующих в освоении отработанных, мёртвых тканей при доступе воздуха. В этой же среде активно развиваются различные формы бактерий, для которых питательной средой служит вытекающий под давлением сок бактериальной водянки и, которые, участвуют в его сбраживании. В закрытых, глубинных слоях древесины они встречаются редко (за исключением Clostridium spр.), а типичные аэробы (Pseudomonas spp.) в этих тканях не выживают, если не нарушена каким-либо образом «герметичность» внутренних тканей.

Обильные выделения бактериальной слизи и пенящейся забродившей жидкости, как один из заметных симптомов бактериальной водянки, в зарубежной литературе получил ещё одно клише - «^cohoMc flux» («алкогольный поток») [11]. В сбраживании этих выделений также участвуют дрожжевые грибки [12]. Микрофлора мокрой древесины, несомненно, играет соответствующую роль в бактериальных ассоциациях, но к возбуждению патологического процесса в живых тканях флоэмы и ксилемы могут иметь отношение только виды, обладающие патогенными свойствами.

Список использованных источников

1. Рыбалко Т.Н., Гукасян А.Б. Бактериозы хвойных Сибири. -Новосибирск: Наука, 1986.- 80 с.

2. Гвоздяк Р.И., Яковлева Л.М. Бактериальные болезни лесных древесных пород. -Киев: Наукова думка, 1979. -244 с.

3. Черпаков В.В. Бактериальный ожог лиственных пород Северо-Западного Кавказа и обоснование мер борьбы с ним. Автореф. дис. канд. биол. наук: 06.01.11. -Тбилиси, 1979. - 25 с.

4. Черпаков В.В. Изучение причин усыхания и гибели ильмовых пород на Дальнем Востоке// Актуальные проблемы лесного комплекса/ Под общей редакцией Е.А. Памфилова. Сборник научных трудов. Выпуск 30. -Брянск: БГИТА, 2011. -С.104-108.

5. Черпаков В. В. Бактериальная водянка: поражаемые виды хвойных пород России //Актуальные проблемы лесного комплекса/ Под общей редакцией Е.А.Памфилова. Сборник научных трудов. Выпуск 33. - Брянск: БГИТА, 2012. -С.111-115.

6. Щербин-Парфененко А.Л. Бактериальные заболевания лесных пород. М.: Гос-лесбумиздат, 1963. - 148 с.

7. Bacterial wetwood and slime flux of landscape trees. Report on Plant disease. RPD No. 656, September, 1999. Рр. 1-5.

8. Barrows A. Wetwood in Elms - University of Idaho Extension www.extension.uidaho.edu/

9. Carter J.C. (1945) Wetwood of elms. Bull Illinois Nat Hist Surv 23: 401-448.

10. Gary M., W. Bacterial Wetwood Or Slime Flux. http://agsci.psu.edu/

11. Hanson W. Bacterial Wetwood and Alcoholic Flux. http://www.unce.unr.edu/

12. Johnson D.W.. Riffle J.W. Wetwood (Slime Flux) of Elm, Cottonwood and Mulberry. Diseases of trees in the Great Plains - U S D A Forest Service, www.fs.fed.us

13. Murdoch. C. W., Catnpana. R. J. Bacterial species associated with wetwood of elm. Phytopathology, l983. T3:1270-l273.

14. Shink B., Ward J.C., Zeikus G. Microbiology of Wetwood Role of Anaerobic Bacterial Populations in Living Trees. Journal of Gneral Microbiology (1981) 123, pp. 313-322.