ПРАЙМЕРЫ И ЗОНДЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА В ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦАХ
PRIMERS AND PROBES FOR DETECTION OF SEQUENCES OF HUMAN PAPILLOMA VIRUS IN TESTED SAMPLES

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к праймерам, зондам, наборам праймеров, наборам праймеров и зондов, способам и наборам реагентов для обнаружения вирусов папилломы человека, последовательностей бета-глобина человека и вирусов папилломы человека и последовательностей бета-глобина человека в исследуемом образце.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Папилломавирус представляет собой ДНК-вирус, инфицирующий кожу и слизистые оболочки человека и животных. Обнаружено примерно 130 типов вируса папилломы человека (human papillomaviruses, HPV), из которых 30-40 типов передаются половым путем и инфицируют аногенитальную область. Некоторые из этих HPV вызывают рост остроконечных кондилом, а для других характерно отсутствие очевидных признаков инфекции. По меньшей мере 14 типов HPV связаны с высоким риском развития рака шейки матки, а именно типы 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68. Обнаружение этих HPV высокого риска имеет значение для профилактики рака шейки матки.
Геном всех типов HPV имеет сходное строение. Специфично кодируются несколько ранних (early, E) и поздних (late, L) белков. Белки E1 и E2 необходимы для репликации ДНК. Белки E4 и E5 необходимы для репликации вирусного генома в верхних слоях эпителия. Белки E6 и E7 являются онкогенами, их объединение приводит к иммортализации клетки и индукции геномной нестабильности. Белки L1 и L2, образующие вирусный капсид, экспрессируются на поздней стадии инфекции в верхних слоях эпителия. В другой части генома, области LCR (long control region, длинная контрольная область), содержится большинство регуляторных последовательностей ДНК, необходимых для правильной репликации вирусного генома и экспрессии вирусных генов.
39
Разработаны различные способы обнаружения HPV высокого риска. Многие из них основаны на обнаружении уникальных геномных последовательностей HPV. Например, в патенте США 4849332 описаны ДНК- или РНК-зонды, комплементарные части генов HPV 35 типа, подходящие для скрининга исследуемых образцов на этот тип папилломавируса. Также последовательности-зонды, подходящие для обнаружения онкогенных типов HPV раскрыты в патенте США 6265154. В патенте США 5705627 описано использование для амплификации и обнаружения ДНК HPV полимеразной цепной реакции (polymerase chain reaction, PCR) с использованием вырожденных праймеров или смешанных консенсусных праймеров и последующим типированием с использованием ДНК-зондов, специфичных для генотипа. Другие примеры использования консенсусных праймеров описаны в патенте США 5364758 и Kleter et al., Am. J. of Pathology, 1998, 153 (6):1731-. Кроме того, многие способы, известные из уровня техники, включают обнаружение последовательностей бета-глобина человека в исследуемых образцах.
Как показано выше, из уровня техники известны различные способы обнаружения HPV высокого риска. Несмотря на это, в области техники существует потребность в новых методах, которые: (1) способны обнаруживать множественные геномы HPV в одной реакции и в то же время отличать обнаружение определенных конкретных генотипов от других (т.е., частичное генотипирование); (2) не выявляют перекрестных реакций между различными типами HPV; (3) обеспечивают высокую чувствительность и специфичность в условиях клиники; и (4) обеспечивают высокую пропускную способность и эффективность рабочего процесса.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к праймеру для амплификации вирусов папилломы человека (HPV) 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце. Последовательность праймера выбрана из группы, состоящей из: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 и комплементарных им последовательностей.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к зонду для обнаружения HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 или 66 типов в исследуемом образце. Последовательность зонда выбрана из группы, состоящей из: SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и комплементарных им последовательностей.
Еще в одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к праймеру для амплификации последовательности бета-глобина человека в исследуемом образце. Праймер имеет последовательность SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, последовательность, комплементарную SEQ ID NO:6, последовательность, комплементарную SEQ ID NO:7, или любую их комбинацию.
Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к зонду для обнаружения последовательности бета-глобина человека в исследуемом образце. Зонд имеет последовательность SEQ ID NO:22 или комплементарную ей последовательность.
Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору праймеров для амплификации HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце. Набор праймеров включает следующее:
(а) по меньшей мере один прямой праймер, последовательность которого выбрана из группы, состоящей из: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, комплементарных им последовательностей и любых их комбинаций; и
(b) по меньшей мере один обратный праймер, последовательность которого выбрана из группы, состоящей из: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, комплементарных им последовательностей и любых их комбинаций.
В частности, вышеописанный набор праймеров может включать прямые праймеры с последовательностями: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 или комплементарными им. Вышеописанный набор праймеров может включать обратные праймеры с последовательностями: SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 или комплементарными им. Альтернативно, набор праймеров может включать прямые праймеры с последовательностями: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 или комплементарными им и обратные праймеры с последовательностями: SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 или комплементарными им.
Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору праймеров и зондов для обнаружения HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце. Набор праймеров и зондов включает следующее:
(а) три прямых праймера с последовательностями: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 или комплементарными им и два обратных праймера с последовательностями: SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 или комплементарными им; и
(b) четырнадцать зондов с последовательностями: SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21 и комплементарными им.
Еще в одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к набору праймеров и зондов для обнаружения бета-глобина человека в исследуемом образце. Набор праймеров и зондов включает следующее:
(а) прямой праймер с последовательностью SEQ ID NO:6 или комплементарной ей и обратный праймер с последовательностью SEQ ID NO:7 или комплементарной ей; и
(b) зонд с последовательностью SEQ ID NO:22 или комплементарной ей.
Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу обнаружения одного или более HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце. Способ включает следующие стадии:
(а) приведение исследуемого образца в контакт с тремя прямыми праймерами с последовательностями: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 или комплементарными им и двумя обратными праймерами с последовательностями: SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 или комплементарными им в условиях амплификации для получения первой последовательности-мишени; и
(b) обнаружение гибридизации между первой последовательностью-мишенью и по меньшей мере одним зондом, что указывает на присутствие одного или более HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце, где зонд имеет последовательность: SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21 или комплементарные им.
В вышеописанном способе условия амплификации включают участие исследуемого образца в реакции амплификации, проводимой в присутствии соответствующих амплифицирующих реагентов. Кроме того, реакция амплификации может включать использование PCR, PCR в реальном времени (включая, но не ограничиваясь, системой Taq-Man ) или PCR с обратной транскрипцией (RT-PCR).
В вышеописанном способе по меньшей мере один из зондов мечен детектируемой меткой. Как известно из уровня техники, по меньшей мере к одному зонду возможно напрямую присоединить детектируемую метку. Альтернативно, детектируемая метка может присоединяться не напрямую по меньшей мере к одному зонду. Кроме того, детектируемая метка может детектироваться напрямую. Альтернативно, детектируемая метка может детектироваться не напрямую. Например, детектируемая метка может представлять собой флуоресцентную молекулу, присоединенную к 5'-концу по меньшей мере одного зонда. Кроме того, по меньшей мере один зонд может также включать молекулу-гаситель на 3'-конце.
Кроме того, вышеописанный способ может дополнительно включать следующие стадии:
(а) приведение исследуемого образца в контакт с прямым праймером с последовательностью SEQ ID NO:6 или комплементарной ей и обратным праймером с последовательностью SEQ ID NO:7 или комплементарной ей в условиях амплификации для получения второй последовательности-мишени; и
(b) обнаружение гибридизации между второй последовательностью-мишенью и зондом с последовательностью SEQ ID NO:22 или комплементарной ей, что указывает на присутствие бета-глобина человека в исследуемом образце.
Еще в одном варианте осуществления, настоящее изобретение относится к способу обнаружения и/или дифференцировки между HPV 16, 18 типов, или HPV как 16, так и 18 типов в исследуемом образце. Способ включает следующие стадии:
(a) приведение в контакт исследуемого образца с тремя прямыми праймерами с последовательностями: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 или комплементарными им и двумя обратными праймерами с последовательностями: SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 или комплементарными им в условиях амплификации для получения первой последовательности-мишени; и
(b) обнаружение гибридизации между первой последовательностью-мишенью и следующими:
(i) первый зонд с последовательностью SEQ ID NO:8 или комплементарной ей, что указывает на присутствие HPV 16 типа, где указанный первый зонд мечен первой детектируемой меткой;
(ii) второй зонд с последовательностью SEQ ID NO:9 или комплементарной ей, что указывает на присутствие HPV 18 типа, где указанный второй зонд мечен второй детектируемой меткой, и далее, где вторая детектируемая метка представляет собой детектируемую метку, отличную от первой детектируемой метки;
(iii) один или более дополнительных зондов с последовательностями: SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21 или комплементарными им, что указывает на присутствие HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 или 68 типов, где каждый из одного или более дополнительных зондов мечен идентичной третьей детектируемой меткой и далее, где указанная третья детектируемая метка представляет собой детектируемую метку, отличную от первой детектируемой метки и второй детектируемой метки.
В вышеописанном способе условия амплификации включают участие исследуемого образца в реакции амплификации, проводимой в присутствии соответствующих амплифицирующих реагентов. Кроме того, реакция амплификации может включать использование PCR, PCR в реальном времени (включая, но не ограничиваясь, системой Taq-Man) или RT-PCR.
Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу обнаружения бета-глобина человека в исследуемом образце. Способ включает следующие стадии:
(а) приведение исследуемого образца в контакт с прямым праймером с последовательностью SEQ ID NO:6 или комплементарной ей и обратным праймером с последовательностью SEQ ID NO:7 или комплементарной ей в условиях амплификации для получения первой последовательности-мишени; и
(b) обнаружение гибридизации между первой последовательностью-мишенью и зондом с последовательностью SEQ ID NO:22 или комплементарной ей, что указывает на присутствие бета-глобина человека в исследуемом образце.
В вышеописанном способе условия амплификации включают участие исследуемого образца в реакции амплификации, проводимой в присутствии соответствующих амплифицирующих реагентов. Кроме того, реакция амплификации может включать использование PCR, PCR в реальном времени (включая, но не ограничиваясь, системой Taq-Man) или RT-PCR.
В вышеописанном способе, по меньшей мере один из зондов мечен детектируемой меткой. Детектируемая метка может присоединяться напрямую по меньшей мере к одному зонду. Альтернативно, детектируемая метка может присоединяться не напрямую по меньшей мере к одному зонду. Кроме того, детектируемая метка может детектироваться напрямую. Альтернативно, детектируемая метка может детектироваться не напрямую. Например, детектируемая метка может представлять собой флуоресцентную молекулу, присоединенную к 5'-концу по меньшей мере одного зонда. Кроме того, по меньшей мере один зонд может также включать молекулу-гаситель на 3'-конце.
Кроме того, вышеописанный способ может дополнительно включать следующие стадии:
(а) приведение исследуемого образца в контакт с тремя прямыми праймерами с последовательностями: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 или комплементарными им и двумя обратными праймерами с последовательностями: SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 или комплементарными им в условиях амплификации для получения второй последовательности-мишени; и
(b) обнаружение гибридизации между второй последовательностью-мишенью и по меньшей мере одним зондом с последовательностью: SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21 или комплементарной ей, что указывает на присутствие одного или более HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к набору реагентов для обнаружения HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце. Набор реагентов включает:
(a) по меньшей мере один прямой праймер с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, комплементарных им последовательностей и любых их комбинаций;
(b) по меньшей мере один обратный праймер с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, комплементарных им последовательностей и любых их комбинаций; и
(c) амплифицирующие реагенты.
Вышеописанный набор реагентов также может дополнительно включать по меньшей мере один зонд, где по меньшей мере один зонд выбран из группы, состоящей из: SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21 и комплементарных им последовательностей.
Вышеописанный набор реагентов дополнительно включает зонды с последовательностями: SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21 и комплементарные им последовательности.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к набору праймеров и зондов для обнаружения HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце. Набор реагентов включает следующее:
(а) три прямых праймера с последовательностями: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 или комплементарными им и два обратных праймера с последовательностями: SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 или комплементарными им;
(b) четырнадцать зондов с последовательностями: SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21 и комплеметарными им; и
(c) амплифицирующие реагенты.
Вышеуказанный набор реагентов может также включать прямой праймер с последовательностью SEQ ID NO:6 или комплементарной ей и обратный праймер с последовательностью SEQ ID NO:7 или комплементарной ей и зонд с последовательностью SEQ ID NO:22 или комплементарной ей для обнаружения бета-глобина человека в исследуемом образце.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к набору праймеров и зондов для обнаружения бета-глобина человека в исследуемом образце. Набор включает следующее:
(а) прямой праймер с последовательностью SEQ ID NO:6 или комплементарной ей, и обратный праймер с последовательностью SEQ ID NO:7 или комплементарной ей;
(b) зонд с последовательностью SEQ ID NO:22 или комплементарной ей; и
(c) амплифицирующие реагенты.
Вышеуказанный набор может также содержать:
(а) три прямых праймера с последовательностями: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 или комплементарными им и два обратных праймера с последовательностями: SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 или комплементарными им; и
(b) четырнадцать зондов с последовательностями: SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21 или комплеметарными им для обнаружения HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фигуре 1 приведена корреляция между сигналом бета-глобина и числом клеток, взятых из культивируемой HPV-положительной клеточной линии и распределение номеров цикла для бета-глобина для 1206 образцов ткани шейки матки пациентов, как описано в Примере 4.
На Фигуре 2 приведено распределение номеров цикла для бета-глобина для 1206 образцов ткани шейки матки пациентов, как описано в Примере 4. Квантили для корреляции описаны выше на Фигуре 1.
На Фигурах 3А-3D приведено сравнение аналитических характеристик смеси праймеров, содержащей SEQ ID NO:1-5 с праймерами GP5+ и GP6+ (SEQ ID NO:23-24), как описано в Примере 5.
На Фигурах 4А-4Е приведено сравнение аналитических характеристик зондов по настоящему изобретению, специфичных для HPV 16, 18, 31, 52 и 59 типов (SEQ ID NO:8-10, 16 и 19) с последовательностями зондов для тех же типов HPV, раскрытых в патенте США 6265154В1, как описано в примере 5.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к праймерам, зондам, наборам праймеров и наборам праймеров и зондов, подходящих для амплификации и/или обнаружения HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце. Настоящее изобретение также относится к способам обнаружения HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемых образцах с использованием наборов праймеров и зондов, описанных в настоящем документе. Кроме того, настоящее изобретение относится к праймерам, зондам и наборам праймеров и зондов, которые могут использоваться для амплификации и/или обнаружения последовательностей бета-глобина человека в исследуемом образце. Праймеры и зонды, используемые для амплификации и/или обнаружения бета-глобина человека в исследуемом образце, могут использоваться для образования ампликонов внутреннего контроля в тесте на HPV. Кроме того, настоящее изобретение также относится к способам обнаружения последовательностей бета-глобина человека в исследуемых образцах с использованием наборов праймеров и проб, описанных в настоящем документе. Настоящее изобретение также относится к наборам реагентов для обнаружения HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов и/или бета-глобина человека в исследуемом образце.
Наборы праймеров и зондов по настоящему изобретению характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью в условиях клиники. Кроме того, для наборов праймеров и зондов, описанных в настоящем документе, не показаны перекрестные реакции между различными типами HPV. Кроме того, наборы праймеров и зондов по настоящему изобретению позволяют обнаружить множественные генотипы HPV в одной реакции и одновременно дифференцировать обнаружение одних генотипов от других (т.е., частичное генотипирование). Наконец, наборы праймеров и зондов по настоящему изобретению обеспечивают высокую пропускную способность и эффективность рабочего процесса.
А. Определения
При употреблении в настоящем документе формы единственного числа включают множественные обозначаемые объекты, если из контекста явно не следует иначе. При использовании числовых интервалов в настоящем документе явно подразумевается каждое промежуточное число с той же степенью точности. Например, для интервала 6-9, помимо чисел 6 и 9, подразумеваются числа 7 и 8, а для интервала 6,0-7,0 явно подразумеваются числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 и 7,0.
а) Ампликон
Как используется в настоящем документе, термин «ампликон» обозначает продукт естественной или искусственной реакции амплификации. Примером ампликона является ДНК- или РНК-продукт (обычно сегмент гена, ДНК или РНК), полученный в результате PCR, PCR в реальном времени, RT-PCR, конкурентной RT-PCR, лигазной цепной реакции (LCR), модифицированноц лигазной цепной реакции (gap LCR), амплификации с вытеснением цепи (SDA), амплификации основанной на нуклеотидной последовательности (NASBA), транскрипционной амплификации нуклеиновых кислот (TMA) и подобных им.
b) Амплификация, способ амплификации или реакция амплификации
Как используется в настоящем документе, фразы «амплификация», «способ амплификации» или «реакция амплификации», используемые взаимозаменяемо в настоящем документе, означают способ или процесс, увеличивающий долю популяции определенных последовательностей (таких как последовательность-мишень или нуклеиновая кислота-мишень) конкретной нуклеиновой кислоты (все типы ДНК или РНК) в исследуемом образце. Примеры способов амплификации, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются PCR, PCR в реальном времени, RT-PCR, конкурентной RT-PCR, LCR, gap LCR, SDA, NASBA, TMA и подобные им способы, известные специалисту в данной области техники.
c) Условия амплификации
Как используется в настоящем документе, фраза «условия амплификации» означает условия, благоприятные для отжига и/или удлинения последовательностей праймеров. Такие условия хорошо известны из уровня техники и зависят от выбранного способа амплификации. Например, условия амплификации для PCR обычно включают температурный цикл, то есть цикл температуры реакционной смеси включающий две или более температуры. При изотермических реакциях амплификации амплификация проходит в отсутствие температурного цикла, хотя может потребоваться начальный подъем температуры для запуска реакции. Условия амплификации включают все условия реакции, включая, но не ограничиваясь температурой и температурным циклом, буфером, солью, ионной силой, pH и т.д.
d) Амплифицирующие реагенты
Как используется в настоящем документе, фраза «амплифицирующие реагенты» означает реагенты, используемые в реакции амплификации, которые могут включать, но не ограничиваться буферами, реагентами, ферментами, обладающими обратно-транскриптазной и/или полимеразной активностью или экзонуклеазной активностью; кофакторами ферментов, такими как магний или марганец; солями; и дезоксинуклеотидтрифосфатами (dNTP), такими как дезоксиаденозинтрифосфат (dATP), дезоксигуанозинтрифосфат (dGTP), дезоксицитидинтрифосфат (dCTP), дезокситимидинтрифосфат (dTTP) и дезоксиуридинтрифосфат (dUTP). Амплифицирующие реагенты выбираются специалистом в области техники соответственно с применяемым способом амплификации.
е) Детектируемые напрямую и детектируемые не напрямую
Как используется в настоящем документе, термин «детектируемый напрямую», относящийся к детектируемой метке или детектируемой молекуле, означает, что для того, чтобы быть детектируемой, детектируемая метка или детектируемая молекула не требует дальнейших реакций или манипуляций. Например, флуоресцентная молекула может быть детектирована напрямую с помощью методов флуоресцентной спектроскопии. Напротив, фраза «детектируемый не напрямую», относящийся к детектируемой метке или детектируемой молекуле, при использовании в настоящем документе означает, что для того, чтобы детектируемая метка или детектируемая молекула стала детектируемой, необходима дополнительная реакция или манипуляция. Например, гаптен становится детектируемым после реакции с соответствующим антителом, соединенным с репортером, таким как флуоресцентный краситель.
f) Флуорофор, флуоресцентная молекула, флуоресцентная метка или флуоресцентный краситель
В настоящем документе термины «флуорофор», «флуоресцентная молекула», «флуоресцентная метка» и «флуоресцентный краситель» употребляются взаимозаменяемо и означает молекулу, поглощающую квант электромагнитного излучения одной длины волны и в ответ испускающую один или более фотонов другой, обычно большей, длины волны. Для применения настоящего изобретения подходят многочисленные флуоресцентные красители, имеющие разнообразные структуры и свойства. Известны способы и материалы для флуоресцентного мечения молекул нуклеиновых кислот (см. R.P. Haugland, “Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 1992-1994”, 5 изд. 1994, Molecual Probes, Inc). Предпочтительно, если флуоресцентная метка или молекула поглощает и испускает свет с высокой эффективностью (например, имеет высокий коэффициент молярной абсорбции для возбуждающей длины волны и высокий квантовый выход флуоресценции), а также является фотостабильной (например, не деградирует значительно после испускания света в течение времени, необходимого для анализа). Некоторые флуоресцентные красители, не определяющиеся напрямую, переносят энергию на другой флуоресцентный краситель в процессе переноса энергии путем флуоресцентного резонанса (FRET), после чего второй флуоресцентный краситель испускает детектируемый сигнал. Термин «флуоресцентная молекула» также охватывает такие пары флуоресцентных красителей для FRET. Использование физически связанной молекулы флуоресцентного репортера/гасителя также входит в объем настоящего изобретения. В таких аспектах, когда молекулы флуоресцентного репортера/гасителя находятся в непосредственной близости друг от друга, например, на концах зонда, молекула-гаситель предотвращает детекцию сигнала молекулы-репортера. При физическом разделении молекул, таком как разрезание ДНК-полимеразой, флуоресцентный сигнал молекулы-репортера может быть детектирован.
g) Гибридизация
Как используется в настоящем документе, термин «гибридизация» означает образование комплекса между последовательностями нуклеиновых кислот, достаточно комплементарными для образования комплексов за счет связывания пар оснований по Уотсону-Крику или неканоническим образом. Например, когда праймер «гибридизуется» с последовательностью-мишенью (матрицей), такие комплексы (гибриды) достаточно стабильны, чтобы служить затравкой для синтеза ДНК, необходимой, например, для работы ДНК-полимеразы. Для специалиста в области техники очевидно, что для получения стабильных гибридов гибридизующиеся последовательности не должны быть строго комплементарны. Во многих случаях, стабильные гибриды образуются, если неспаренные основания составляют менее 10%. Соответственно, как используется в настоящем документе, термин «комплементарный» означает олигонуклеотид, образующий стабильный дуплекс с комплементарной нитью в условиях анализа, в общем, когда гомология составляет приблизительно 80%, приблизительно 81%, приблизительно 82%, приблизительно 83%, приблизительно 84%, приблизительно 85%, приблизительно 86%, приблизительно 87%, приблизительно 88%, приблизительно 89%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более. Для специалиста в области техники очевидно, как оценивать и изменять жесткость условий гибридизации с тем, чтобы последовательности со степенью гомологии, не менее заданной, могли гибридизоваться, а последовательности с меньшей степенью гомологии не могли. Примеры условий и параметров гибридизации можно найти, например, в Sambrook et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 1989, 2 изд., Cold Spring Harbor Press: Plainview, NY; F.M. Ausubel, “Current Protocols in Molecular Biology”, 1994, John Wiley & Sons: Secaucus, NJ.
h) Мечен или мечен детектируемой меткой
Как используется в настоящем документе, термины «мечен» или «мечен детектируемой меткой (или агентом, или молекулой)» используются взаимозменяемо и означают, что объект (например, праймер или зонд) может быть виден, например, вследствие связывания с другим объектом (например, продукт амплификации или ампликон). Предпочтительно, если детектируемая метка выбрана таким образом, что она генерирует сигнал, который может быть измерен, и чья интенсивность зависит (например, пропорциональна) количеству связанного объекта. Из области техники известны разнообразные системы для мечения и/или обнаружения молекул нуклеиновых кислот, такие как праймеры и зонды. Меченые нуклеиновые кислоты могут быть получены путем включения или конъюгации с меткой, детектирующейся напрямую или не напрямую с помощью спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических, электрических, оптических, химических или других способов. Подходящие детектируемые агенты включают, но не ограничиваются радионуклидами, флуорофорами, хемилюминесцентными агентами, микрочастицами, ферментами, колориметрическими метками, магнитными метками, гаптенами, зондами с комплементарными концевыми последовательностями (Molecular Beacons), аптамерными метками и т.д.
i) Праймер
Термин «праймер» означает олигонуклеотид, способный выступать в роли точки инициации синтеза продукта удлинения праймера, представляющего собой комплементарную нить нуклеиновой кислоты (всех типов ДНК или РНК), в подходящих условиях амплификации (например, буфер, соль, температура и pH) в присутствии нуклеотидов и агента, полимеризующего нуклеиновые кислоты (например, ДНК-зависимую или РНК-зависимую полимеразу). Праймер может быть однонитевым или двунитевым. В случае двунитевого праймера, перед использованием для получения продуктов удлинения, праймер может быть особым образом обработан (например, денатурирован) для расхождения нитей. Обычно такая стадия денатурации проводится с помощью высокой температуры, но альтернативно может проводиться с помощью щелочи, с последующей нейтрализацией. Праймеры по настоящему изобретению имеют приблизительную длину от 15 до 50 нуклеотидов, предпочтительно, приблизительно от 20 до 40 нуклеотидов, наиболее предпочтительно, приблизительно от 22 до 30 нуклеотидов длиной. Праймеры по настоящему изобретению могут содержать дополнительные нуклеотиды, помимо детально описанных в настоящем документе. Например, праймеры, используемые в SDA, могут включать сайт распознавания рестрикционной эндонуклеазы на 5'-конце последовательности, связывающейся с мишенью (см. патенты США 5270184 и 5455166). Праймеры для NASBA и TMA могут включать промотер РНК-полимеразы, сцепленный с последовательностью праймера, связывающейся с мишенью. Способы сцепления таких особых последовательностей с последовательностью, связывающейся с мишенью, для использования в выбранной реакции амплификации хорошо известны специалистам в области техники. Кроме того, в определенных случаях праймер может быть мечен детектируемой меткой.
Фраза «прямой праймер» означает праймер, гибридизующийся (или отжигающийся) с последовательностью-мишенью (например, матричная нить). Фраза «обратный праймер» означает праймер, гибридизующийся (или отжигающийся) с комплементарной нитью последовательности-мишени. Прямой праймер гибридизуется ближе к 5'-концу последовательности мишени, чем обратный праймер.
j) Набор праймеров
Как используется в настоящем документе, термин «набор праймеров» означает два или более праймеров, которые в совокупности служат затравками для амплификации искомой последовательности-мишени или нуклеиновой кислоты-мишени (например, последовательности-мишени в составе HPV). В некоторых вариантах осуществления термин «набор праймеров» означает пару праймеров, включающую 5' “(upstream)”-праймер (или прямой праймер), гибридизующийся с 5'-концом амплифицируемой последовательности-мишени или нуклеиновой кислоты-мишени, и 3'-“(downstream)”-праймер (или обратный праймер), гибридизующийся с комплементарной нитью амплифицируемой последовательности-мишени или нуклеиновой кислоты-мишени. Такие наборы праймеров или пары праймеров в особенности пригодны для реакций амплификации PCR.
k) Зонд
Как используется в настоящем документе, термин «зонд» означает олигонуклеотд, способный селективно гибридизоваться по меньшей мере с частью последовательности-мишени в соответствующих условиях амплификации (например, амплифицированной части последовательности-мишени). В общем случае, последовательность-зонд определяется как «комплементарная» (т.е., комплементарная кодирующей, или смысловой, нити (+)), или «обратно-комплементарная» (т.е., комплементарная антисмысловой нити (-)). Зонды по настоящему изобретению имеют длину приблизительно 10-50 нуклеотидов, предпочтительно, приблизительно, 12-35 нуклеотидов и, наиболее предпочтительно, приблизительно, 14-25 нуклеотидов. В определенных случаях, проба может быть мечена детектируемой меткой.
l) Набор праймеров и зондов
Как используется в настоящем документе фраза «набор праймеров и зондов» означает комбинацию, включающую два или более праймеров, которые в совокупности служат затравкой для амплификации последовательности-мишени или нуклеиновой кислоты-мишени, и по меньшей мере одного зонда, способного обнаружить последовательность-мишень или нуклеиновую кислоту-мишень. В общем случае, зонд гибридизуется с нитью продукта амплификации (или ампликона), что приводит к образованию гибрида продукта апмлификации с зондом, который можно обнаружить с помощью стандартных способов, известных из уровня техники.
m) Последовательность-мишень или нуклеиновая кислота-мишень
Фразы «последовательность-мишень» или «нуклеиновая кислота-мишень» в настоящем документе используются взаимозаменяемо и означают объект, чье присутствие или отсутствие необходимо обнаружить. В контексте настоящего изобретения, последовательность-мишень, предпочтительно, включает нуклеотидную последовательность, с которой один или более праймеров могут образовывать комплекс. Последовательность-мишень также может включать область, гибридизующуюся с зондом, с которой зонд может образовывать стабильный гибрид в соответствующих условиях амплификации. Специалисту в области техники очевидно, что последовательность-мишень может быть однонитевой или двунитевой. В контексте настоящего изобретения, искомые последовательности-мишени локализованы в области L1 HPV или открытой рамки считывания гена бета-глобина человека.
n) Исследуемый образец
При использовании в настоящем документе термин «исследуемый образец» в общем случае означает исследуемый биологический материал, который тестируется или подозревается на содержание искомого объекта, такого как HPV, в особенности HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов, последовательностей бета-глобина человека или их комбинации. Исследуемый образец может быть получен из любого биологического источника, такого, как цервикальный, вагинальный или анальный мазок или соскоб, или физиологическая жидкость, включая, но не ограничиваясь цельной кровью, сывороткой, плазмой, соединительнотканной жидкостью, слюной, глазной жидкостью, спинномозговой жидкостью, потом, мочой, молоком, асцитной жидкостью, слизью, носовой жидкостью, мокротой, синовиальной жидкостью, перитонеальной жидкостью, вагинальной жидкостью, менструальными выделениями, амниотической жидкостью, спермой и т.д. Исследуемый образец может использоваться напрямую послед его получения из биологического образца или после предварительной обработки, изменяющей свойства образца. Например, такая предварительная обработка может включать получение плазмы из крови, разбавление вязких жидкостей и т.д. Способы предварительной обработки могут также включать фильтрацию, осаждение, разведение, дистилляцию, смешивание, концентрацию, инактивацию интерферирующих компонентов, добавление реагентов, лизирование и т.д. Кроме того, полезна модификация твердого образца с целью получения жидкости или высвобождения искомого объекта.
B. Праймеры, зонды и наборы праймеров и зондов
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к одному или более праймеров для амплификации вируса папилломы (HPV) человека 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце. Эти один или более праймеров могут включать праймер с последовательностью, состоящей из или включающей любую последовательность из приведенных ниже в таблице А последовательностей, комплементарных приведенным ниже в таблице А, и любых комбинаций последовательностей, приведенных ниже в таблице А и/или комплементарных им последовательностей.
Таблица А
SEQ ID NO:
последовательность
тип праймера
1
tatttgttac tgtggtagat actac
прямой праймер
2
caattgtttg ttactgttgt ggatactac
прямой праймер
3
tttttattac ctgtgttgat actac
прямой праймер
4
gaaaaataaa ctgtaaatca tattcctc
обратный праймер
5
gaaaaataaa ttgcaattca tactcttc
обратный праймер
В одном аспекте, настоящее изобретение относится к набору праймеров для амплификации HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце, содержащему один или более праймеров, описанных в таблице А. В частности, набор праймеров может включать следующее:
(a) по меньшей мере один прямой праймер с последовательностью, выбираемой из группы, состоящей из: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, комплементарных им последовательностей (например, одна или более последовательностей, комплементарных SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 или SEQ ID NO:3) и любых их комбинаций; и
(b) по меньшей мере один обратный праймер с последовательностью, выбираемой из группы, состоящей из: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, комплементарных им последовательностей (например, одна или более последовательностей, комплементарных SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5) и любых их комбинаций.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к одному или более зондов для обнаружения HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце. Эти один или более зондов могут включать зонд с последовательностью, состоящей из или включающей любую из последовательностей, приведенных ниже в таблице В, комплементарную любой из последовательностей, приведенных ниже в Таблице В, и любую комбинацию последовательностей, приведенных ниже в таблице В и/или комплементарных им последовательностей. Например, эти один или более зондов могут представлять собой единственный зонд, приведенный ниже в таблице В, или единственный зонд, комплементарный одному из зондов, приведенных ниже в таблице В (например, (а) SEQ ID NO:8; (b) зонд, комплементарный SEQ ID NO:10; (с) SEQ ID NO:12; или (d) SEQ ID NO:21), все зонды, приведенные ниже в таблице В (SEQ ID NO:8-21), зонды, комплементарные всем зондам, приведенным ниже в таблице В (зонды, комплементарные SEQ ID NO: 8-21), или любую комбинацию зондов, приведенных ниже в таблице В, и/или зондов, комплементарных зондам, приведенным ниже в таблице В (например, (a) SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:16; (b) SEQ ID NO:8, зонд, комплементарный SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:15 и SEQ ID NO:21; (c) зонд, комплементарный SEQ ID NO:8, зонд, комплементарный SEQ ID NO:9 и SEQ ID NO:16; (d) SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:17, зонд, комплементарный SEQ ID NO:18 и зонд, комплементарный SEQ ID NO:20; (е) SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, зонд, комплементарный SEQ ID NO:12, зонд, комплементарный SEQ ID NO:14 и SEQ ID NO:20); или (f) SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19 и SEQ ID NO:20).
Таблица В
SEQ ID NO:
последовательность (от 5' к 3')
специфичность к типу HPV
8
atgtgctgcc atatctactt ca
HPV типа 16
9
cacagtctcc tgtacctggg ca
HPV типа 18
10
taaaagtagt aattttaaag ag
HPV типа 31
11
atgcacacaa gtaactagt
HPV типа 33
12
ctgtgtgttc tgctgtgtc
HPV типа 35
13
tccatacctt ctac
HPV типа 39
14
cctactaagt ttaagcagta ta
HPV типа 45
15
ttagcactgc cactgctgc
HPV типа 51
16
aaaaaggaaa gcac
HPV типа 52
17
ctacagaaca gttaagtaa
HPV типа 56
18
atgcactgaa gtaa
HPV типа 58
19
attcctaatg tatacacacc tacc
HPV типа 59
20
caatcaatac cttcgccatg
HPV типа 66
21
ctttgtctac tactactga
HPV типа 68
В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору праймеров и зондов для обнаружения HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце, содержащему один или более праймеров, приведенных выше в таблице А, и один или более зондов, приведеных выше в таблице В. Например, набор праймеров и зондов может включать следующее:
(a) по меньшей мере один прямой праймер с последовательностью: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 или комплементарной им и по меньшей мере один обратный праймер с последовательностью: SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 или комплементарной им; и
(b) по меньшей мере один зонд с последовательностью SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21 или комплементарной им.
Предпочтительно, если набор праймеров и проб включает:
(a) три прямых праймера с последовательностями: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3 или комплементарными им и два обратных праймера с последовательностями: SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5 или комплементарными им; и
(b) четырнадцать зондов с последовательностями: SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21 или комплементарными им.
Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к праймеру для амплификации последовательности бета-глобина человека в исследуемом образце. Один или более праймеров может быть праймером с последовательностью, представляющей собой или включающей любую из последовательностей, приведенных ниже в таблице С, комплементарную любой из последовательностей, приведенных ниже в таблице С, и любую комбинацию последовательностей, приведенных ниже в таблице С и/или комплементарных им.
Таблица С
SEQ ID NO:
последовательность
тип праймера
6
ggcaggttgg tatcaaggtt ac
прямой праймер
7
cctaagggtg ggaaaataga cc
обратный праймер
Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к зонду для обнаружения последовательности бета-глобина человека в исследуемом образце. Зонд имеет последовательность, состоящую из или включающую последовательность actgggcatg tggagacaga (SEQ ID NO:22) или комплементарную ей последовательность.
Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору праймеров для амплификации эндогенного бета-глобина человека в исследуемом образце, включающему по меньшей мере два праймера, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, последовательности, комплементарные SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7. Предпочтительно, если набор праймеров содержит SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7.
Еще в одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к набору праймеров и зондов для обнаружения эндогенного бета-глобина человека в исследуемом образце, включающему один или более праймеров, приведенных выше в таблице С или комплементарных им, и зонда с последовательностью SEQ ID NO:22 или комплементарной ей. Например, набор праймеров и зондов может включать:
(а) по меньшей мере один праймер с последовательностью SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, последовательностью, комплементарной SEQ ID NO:6 или SEQ ID NO:7; и
(b) зонд с последовательностью SEQ ID NO:22 или комплементарной ей.
Предпочтительно, если набор праймеров и зондов включает:
(a) прямой праймер с последовательностью SEQ ID NO:6 или комплементарной ей и обратный праймер с последовательностью SEQ ID NO:7 или комплементарной ей; и
(b) зонд с последовательностью SEQ ID NO:22 или комплементарной ей.
Вышеописанные праймеры и зонд для амплификации и обнаружения бета-глобина человека в исследуемом образце могут использоваться для образования ампликонов внутреннего контроля (IC) в тесте на HPV. Обнаружение бета-глобина человека в тесте на HPV служит контролем качества образца с точки зрения клеточного соответствия, выделения образца и эффективности амплификации. В частности, такой внутренний контроль служит для подтверждения того, что каждый исследуемый образец содержит достаточное количество клеток для точного обнаружения HPV, подвергался корректной обработке и также показывает, присутствуют ли в исследуемом образце ингибиторы амплификации.
На основе праймеров и зондов по настоящему изобретению можно получить один или несколько олигонуклеотидных аналогов. Такие аналоги могут включать альтернативные структуры, такие как пептидные нуклеиновые кислоты (PNA) (например, молекулы с пептидоподобным остовом, а не с фосфатно-сахарным, как у нуклеиновых кислот природного происхождения) и другие. Такие альтернативные структуры также включены в объем настоящего изобретения. Также очевидно, что праймеры и зонды по настоящему изобретению могут содержать делеции, вставки и/или замены нуклеотидов, если эти изменения не влияют негативно на свойства этих последовательностей. В частности, изменения не должны приводить к значительному ослаблению гибридизационных свойств праймеров и зондов, описанных в настоящем документе.
Праймеры и зонды по настоящему изобретению могут быть получены с помощью любого из множества способов, известных из уровня техники (см., например, Sambrook et al. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 1989, 2 доп. изд., Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York, NY; “PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”, 1990, под ред. M.A. Innis, Academis Press: New York, NY; P. Tijssen “Hybridization and Nucleic Acid Probes - Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (части I и II), 1993, Elsevier science; “PCR Strategies, 1995, под ред. M.A. Innis, Academic Press: New York, NY; и “Short Protocols in Molecular Biology”, 2002, под ред. F.M. Ausubel, 5 доп. изд., John Wiley and Sons, Secaucus, NJ). Например, праймеры и зонды, описанные в настоящем документе, могут быть получены путем химического синтеза и полимеризации на основе матрицы, как описано, например, в Narang et al., Meth. Enzymol., 1979, 68:90-98; Brown et al., Meth. Enzymol., 1979, 68: 109-151 и Belousov et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25: 3440-3444).
Например, праймеры и зонды могут быть получены с помощью автоматизированной твердофазной процедуры, основанной на фосфорамидитах. В этом способе каждый отдельный нуклеотид добавляется к 5'-концу растущей олигонуклеотидной цепочки, прикрепленной на 3'-конце к твердой подложке. Нуклеотиды добавляют в форме тривалентных 3'-фосфорамидитов, защищенных в 5'-положении диметокситритиловой (DMT) группой. После фосфорамидитного спаривания, индуцированного основаниями, мягкое окисление для получения промежуточного пентавалентного фосфотриэфира и удаление DMT приводит к образованию нового сайта элонгации олигонуклеотида. Далее праймер или зонд отделяют от подложки и депротектируют фосфодиэфирные и экзоциклические аминогруппы гидроксидом аммония. Такие синтезы могут проводиться в коммерческих олигосинтезаторах, например, производства Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA), DuPont (Wilmington, DE) или Milligen (Bedford, MA). Альтернативно, праймеры и зонды по настоящему изобретению могут производиться на заказ различными коммерческими фирмами, включая, например, Midland Certified Reagent Company (Midland, TX), ExpressGen, Inc. (Chicago, IL), Oregon Technologies, Inc. (Huntsville, AL), BioSearch Technologies, Inc (Novato, CA) и многими другими.
Необходимая или желательная очистка праймеров и зондов по настоящему изобретению может проводиться с помощью любых способов из многих известных из уровня техники. Очистка праймеров и зондов может проводиться с помощью нативного акриламидного гель-электрофореза, анионообменной HPLC, как описано, например, в Pearson et al., J. Chrom., 1983, 255: 137-149 или обратнофазной HPLC (см. McFarland et al., Nucleic Acids Res., 1979, 7: 1067-1080).
Последовательность праймеров и зондов может быть подтверждена с помощью любого подходящего способа секвенирования, известного из уровня техники, включая, но не ограничиваясь, химической деградацией (см. Maxam et al., Methods of Enzymology, 1980, 65: 499-560), матричной лазерной десорбционной времяпролетной масс-спектрометрией (MALDI-TOF) (см. Pieles et al., Nucleic Acids Res., 1993, 21: 3191-3196), масс-спектрометрией после комбинации расщепления щелочной фосфатазой и экзонуклеазой (Wu et al., Anal. Biochem., 2001, 290: 347-352) и подобными им.
Как было указано выше, модифицированные праймеры и зонды могут быть получены любыми из нескольких способов, известных из уровня техники. Неограничивающие примеры таких модификаций включают метилирование, «кэпы», замену одного или более нуклеотидов природного происхождения на аналоги, и межнуклеотидные модификации, такие как, например, незаряженные связи (например, метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфороамидаты, карбаматы и т.д.) или заряженные связи (например, фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.). Праймеры и зонды могут включать одну или более ковалентно связанные молекулы, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), интеркалирующие агенты (например, акридин, псорален и т.д.), хелаторы (например, для хелирования металлов, радиоактивных металлов, окисляющих металлов и т.д.) и алкилирующие агенты. Праймеры и зонды также можно дериватизовать путем образования метилового или этилового фосфотриэфира или алкил-фосфорамидатной связи. Далее, праймеры, зонды или праймеры и зонды по настоящему изобретению также можно модифицировать детектируемой меткой.
Как указано выше, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретении, праймеры, зонды или праймеры и зонды по настоящему изобретению можно метить детектируемой меткой или молекулой перед использованием в способах амплификации/обнаружения. Предпочтительно, если для использования в способах, описанных в настоящем документе, один или более зондов мечен детектируемой меткой или молекулой. Детектируемая метка служит для визуализации и обнаружения амплифицированных последовательностей-мишеней (например, ампликонов). Предпочтительно, если детектируемая метка выбрана таким образом, что она испускает сигнал, который может быть измерен, и чья интенсивность зависит (например, пропорциональна) количеству продукта амплификации в анализируемом исследуемом образце.
Ассоциации, образуемые одним или более зондами и детектируемой меткой, могут быть ковалентными и нековалентными. Меченые зонды можно получать путем включения или конъюгации с детектируемой молекулой. Метки могут прикрепляться к нуклеотидной последовательности напрямую или не напрямую (т.е., посредством линкера). Линкерные или спейсерные цепочки различной длины известны из уровня техники, коммерчески доступны, и могут выбираться для уменьшения стерических несоответствий или для придания других полезных или желаемых свойств получающимся меченым молекулам (см., например, Mansfield et al., Mol Cell Probes, 1995, 9: 145-156).
Способы мечения олигонуклеотидов, таких как зонды, хорошо известны специалистам в уровне техники. Обзоры протоколов мечения и методик обнаружения меток см. например, в работах L. J. Kricka, Ann. Clin. Biochem., 2002, 39: 114-129; van Gijlswijk et al., Expert Rev. Mol. Diagn., 2001, 1: 81-91; and Joos et al., J. Biotechnol., 1994, 35: 135-153. Стандартные способы мечения нуклеиновых кислот включают: включение радиоактивных агентов, прямое присоединение флуоресцентных красителей (см. Smith et al., Nucl. Acids Res., 1985, 13: 2399-2412) или ферментов (см., Connoly et al., Nucl. Acids. Res., 1985, 13: 4485-4502); химические модификации молекул нуклеиновых кислот, обеспечивающие их обнаружение иммунохимическим способом или с помощью других реакций, основанных на сродстве (см., Broker et al., Nucl. Acids Res., 1978, 5: 363-384; Bayer et al., Methods of Biochem. Analysis, 1980, 26: 1-45; Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78: 6633-6637; Richardson et al., Nucl. Acids Res., 1983, 11: 6167-6184; Brigati et al., Virol., 1983, 126: 32-50; Tchen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81: 3466-3470; Landegent et al., Exp. Cell Res., 1984, 15: 61-72; и A. H. Hopman et al., Exp. Cell Res., 1987, 169: 357-368); и способы мечения, опосредованного ферментами, такие как метод рассеянной затравки, ник-трансляция, PCR и присоединение концевой трансферазы (см. обзор ферментативного мечения Temsamani et al., Mol. Biotechnol., 1996, 5: 223-232).
32
35
3
14
125
131
TM
В настоящем изобретении могут использоваться разнообразные детектируемые метки. Подходящие детектируемые метки включают, но не ограничиваются различными лигандами, радионуклидами (например, P, S, H, C, I, I и другими); флуоресцентными красителями; хемилюминесцентными агентами (например, сложными эфирами акридина, стабилизированными диоксетанами и другими); спектрально разрешимыми неорганическими флуоресцентными нанокристаллами-полупроводниками (например, квантовыми точками), металлическими наночастицами (например, золотом, серебром, медью и платиной) или нанокластерами; ферментами (например, пероксидазой хрена, бета-галактозидазой, люциферазой, щелочной фосфатазой); колориметрическими метками (например, красителями, коллоидным золотом и другими); магнитными метками (например, Dynabeads); и биотином, диоксигенином и другими гаптенами и белками для доступных сывороток и моноклональных антител.
TM
TM
TM
TM
TM
TM
В определенных вариантах осуществления патентоспособные зонды для обнаружения мечены флуоресцентно. Для применения настоящего изобретения, в качестве метки подходят многие известные флуоресцентные молекулы, имеющие разнообразные химические структуры и физические характеристики. Подходящие флуоресцентные красители включают, но не ограничиваются красителями Quasar производства BioSearch Technologies (Novato, CA), флуоресцеином и флуоресцеиновыми красителями (например, флуоресцеин изотиоцианином или FITC, нафтофлуоресцеином, 4',5'-дихлоро-2',7'-диметоксифлуоресцеином, 6-карбоксифлуоресцеинами (например, FAM), VIC, NED, карбоцианином, мероцианином, стириловыми красителями, оксоноловыми красителями, фикоэритрином, эритрозином, эозином, родаминовыми красителями (например, карбокситетраметилродамином или TAMRA, карбоксиродамином 6G, карбокси-X-родамином (ROX), лиссамин родамином В, родамином 6G, родаминовым зеленым, родаминовым красным, тетраметилродамином или TMR), кумарином и кумариновыми красителями (например, метоксикумарином, диалкиламинокумарином, гидроксикумарином и аминометилкумарином или AMCA), красителями Oregon Green (например, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514), Texas Red, Texas Red-X, Spectrum Red, Spectrum Green, цианиновыми красителями (например, Cy-3, Cy-5, Cy-3.5, Cy-5.5), красителями Alexa Fluor (например, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660 и Alexa Fluor 680), красителями BODIPY (например, BODIPY FL, BODIPY R6G, BODIPY TMR, BODIPY TR, BODIPY 530/550, BODIPY 558/568, BODIPY 564/570, BODIPY 576/589, BODIPY 581/591, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665), красителями IRDyes (например, IRD40, IRD 700, IRD 800) и другими. Примеры других флуоресцентных красителей, подходящих для использования, и способов присоединения или включения флуоресцентных красителей в олигонуклеотиды, такие как зонды, можно найти в RP Haugland, "The Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals", изд. Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg. (June 1992)). Существуют также коммерческие флуоресцентные красители, такие как наборы реагентов для мечения, например, производства Amersham Biosciences, Inc. (Piscataway, N.J.), Molecular Probes Inc. (Eugene, Oreg.), и New England Biolabs Inc. (Beverly, Mass.).
Некоторые флуоресцентные группы (доноры), не определяющиеся напрямую, переносят энергию на другую флуоресцентную группу (акцептор) в процессе переноса энергии путем флуоресцентного резонанса (FRET), после чего вторая флуоресцентная группа испускает детектируемый флуоресцентный сигнал. В таких вариантах осуществления зонд может становиться детектируемым, например, после связывания с амплифицированной последовательностью-мишенью. Примеры пар доноров/акцепторов для FRET для использования в настоящем изобретении включают, но не ограничиваются флуоресцеином/тетраметилродамином, IAEDANS/FITC, IAEDANS/5-(йодоацетамидо)-флуоресцеином, В-фикоэритрином/Cy-5 и EDANS/Dabcyl.
Использование пар физически связанных молекул флуоресцентного репортера/гасителя также входит в объем настоящего изобретения. Использование таких систем, в частности, TaqMan (как описано, например, в Патентах США 5210015; 5804375; 5487792 и 6214979) или Molecular Beacons (как описано, например, в Tyagi et al., Nature Biotechnol., 1996, 14: 303-308; Tyagi et al., Nature Biotechnol., 1998, 16: 49-53; Kostrikis et al., Science, 1998, 279: 1228-1229; Sokol et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95: 11538-11543; Marras et al., Genet. Anal., 1999, 14: 151-156; и патентах США 5846726, 5925517, 6277581 и 6235504) хорошо известно специалистам в области техники. При использовании зондов типа TaqMan продукты реакции амплификации могут обнаруживаться в реальном времени по мере образования. В результате, гибриды продукта амплификации и зонда образуются и обнаруживаются, пока реакционная смесь находится в условиях амплификации.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, зонды для обнаружения PCR представляют собой зонды вида TaqMan, меченные на 5'-конце флуоресцентной молекулой, а на 3'-конце - молекулой-гасителем. Подходящие флуорофоры и гасители для мечения зондов вида TaqMan описаны в патентах США 5210015; 5804375; 5487792; и 6214979; и WO 01/86001, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки. Примеры гасителей включают, но не ограничиваются, DABCYL (например, сукцинимидиловым эфиром 4-(4'-диметиламинофенилазо)-бензоевой кислоты), сукцинимидиловым эфиром диарилродаминкарбоксикислоты (или QSY-7) и сукцинимидиловым эфиром 4',5'-динитрофлуоресцеинкарбоксикислоты (или QSY-33) (все производства Molecular Probes, (которая является частью Invitrogen, Carlsbad, CA)), quencher1 (Q1 производства Epoch Biosciences, Bothell, WA) или “Black hole quenchers” BHQ-1, BHQ-2 и BHQ-3 (производства BioSearch Technologies, Inc., Novato, CA). В определенных вариантах осуществления, зонды для обнаружения PCR представляют собой зонды вида TaqMan, меченные на 5'-конце FAM, а на 3'-конце - Black Hole Quencher или Black Hole Quencher Plus (оба производства BioSearch Technologies, Novato, CA).
Также для обнаружения зондов к ним может добавляться «хвост» из нормальных или модифицированных нуклеотидов. Вторая гибридизация с нуклеиновой кислотой, комплементарной хвосту и включающей одну или более детектируемых меток (таких как, например, флуорофоры, ферменты или основания, меченные радиоактивной меткой), обеспечивает визуализацию гибридов ампликона и зонда.
Выбор конкретной методики мечения зависит от ситуации и определяется несколькими факторами, такими как простота и стоимость способа мечения, спектральные интервалы между различными используемыми детектируемыми метками, желаемое качество мечения образца, влияние детектируемой молекулы на реакцию гибридизации (например, на скорость и/или эффективность процесса гибридизации), природа используемого способа амплификации, природа системы обнаружения, природа и интенсивность сигнала, испускаемого детектируемой меткой, и других.
С. Способы амплификации
Использование праймеров или наборов праймеров по настоящему изобретению для амплификации последовательностей-мишеней HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов и последовательностей-мишеней бета-глобина человека в исследуемых образцах не ограничивается конкретной методикой амплификации нуклеиновых кислот или любой ее конкретной модификацией. Фактически, праймеры и наборы праймеров по настоящему изобретению могут использоваться в любом из множества способов амплификации нуклеиновых кислот, известных из уровня техники (см., например, Kimmel et al., Methods Enzymol., 1987, 152: 307-316; Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 1989, 2 доп. изд., Cold Spring Harbour Laboratory Press: New York, N.Y.; "Short Protocols in Molecular Biology", ред. F. M. Ausubel, 2002, 5 доп. изд., John Wiley & Sons: Secaucus, N.J.).
Такие способы амплификации нуклеиновых кислот включают, но ими не ограничиваются полимеразной цепной реакцией (PCR). PCR описана в ряде источников, включая, но не ограничиваясь, "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", ред. M. A. Innis, 1990, Academic Press: New York; "PCR Strategies", ред. M. A. Innis, 1995, Academic Press: New York; "Polymerase chain reaction: basic principles and automation in PCR. A Practical Approach", ред. McPherson и др., 1991, IRL Press: Oxford; Saiki et al., Nature, 1986, 324: 163; и патентами США 4683195, 4683202 и 4889818, каждый из которых полностью включен в настоящий документ путем ссылки. Также включаются варианты PCR, такие как реакции, основанные на системе TaqMan (см., например, Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1991, 88: 7276-7280), и обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция (или RT-PCR, например, описанная в патентах США 5322770 и 5310652, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки).
Thermus aquaticus
Thermus thermophilus
Bacillus stereothermophilus
Thermus thermophilus
Thermococcus litoralis
В общем случае, при проведении PCR к исследуемому образцу, полученному от индивида добавляют пару праймеров (т.е., приводят в контакт с исследуемым образцом) в избытке для гибридизации с комплементарными нитями нуклеиновой кислоты-мишени. ДНК-полимераза удлиняет каждый из праймеров, используя последовательность-мишень в качестве матрицы. Продукты удлинения сами становятся матрицами после диссоциации (денатурации) от оригинальной нити-мишени. Далее полимераза удлиняет новые гибридизовавшиеся праймеры, и цикл повторяется для экспоненциального увеличения числа копий ампликонов. Примеры ДНК-полимераз, способных к образованию продукта удлинения праймеров в реакции PCR, включают, но не ограничиваются, ДНК-полимеразой I E. coli, фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I, ДНК-полимеразой Т4, термостабильными ДНК-полимеразами, выделенными из  (Taq), доступными из различных источников, (например, Perkin Elmer, Waltham, MA),  (USB Corporation, Cleveland, OH),  (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), ферментом AmpliTaq Gold (Applied Biosystem, Foster City, CA), рекомбинантной ДНК-полимеразой  (rTth) (Applied Biosystem, Foster City, CA), или  («Vent»-полимераза производства New England Biolabs, Ipswich, MA). Последовательности-мишени РНК могут амплифицироваться путем обратной транскрипции (RT) мРНК в кДНК, с последующей PCR (RT-PCR) как описано выше. Альтернативно, для обеих стадий может использоваться один и тот же фермент, как описано в патенте США 5322770, включенном в настоящий документ путем ссылки.
В дополнение к способам ферментативной термальной амплификации, описанным выше, для амплификации последовательностей-мишеней HPV или бета-глобина человека с использованием праймеров и наборов праймеров по настоящему изобретению, могут использоваться изотермальные ферментативные реакции амплификации (Andras et al., Mol. Biotechnol., 2001, 19: 29-44). Такие способы включают, но не ограничиваются транскрипционной амплификацией (TMA, описанной в Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86: 1173-1177; Giachetti et al., J. Clin. Microbiol., 2002, 40: 2408-2419; и патенте США 5399491, самоподдерживающаяся репликация последовательностей (self-sustained sequence replication (3SR), описанной в Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87: 1874-1848; и Fahy et al., PCR Methods and Applications, 1991, 1: 25-33); амплификацией, основанной на нуклеотидной последовательности (NASBA, описанная в Kievits et al., J. Virol. Methods, 1991, 35: 273-286; и патенте США 5130238) и амплификации с вытеснением цепи (strand displacement amplification, SDA, описанной в Walker et al., PNAS, 1992, 89: 392-396; EP 0 500 224 A2).
При амплификации с вытеснением цепи способность рестрикционной эндонуклеазы к разрезанию немодифицированной цепи ее ДНК-мишени сочетается с действием ДНК полимеразы, не обладающей экзонуклеазной активностью, обеспечивающим удлинение 3'-конца на месте рестрикции и вытеснение нижележащей нити ДНК при постоянной температуре (см. Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1992). Праймеры, используемые в SDA, включают сайт распознавания рестрикционной эндонуклеазой к 5'-концу от последовательности, связывающейся с мишенью (см. патенты США 5270184 и 5344166, каждый из которых включен в настоящий документ путем ссылки).
При амплификации, основанной на нуклеотидной последовательности (NASBA), используют три фермента (например, РНКазу H, обратную транскриптазу вируса миелобластоза птиц (AMV) и РНК-полимеразу T7), работающих сообща при постоянной низкой температуре, обычно 41°С (см. Compton, Nature, 1991, 350: 91-92; Chan et al., Rev. Med. Microbiol., 1999, 10: 185-196). Продут реакции NASBA обычно представляет собой одноцепочечную РНК.
Самоподдерживающаяся реакция репликации последовательностей(3SR) представляет собой высокоэффективный способ амплификации последовательностей-мишеней ДНК или РНК. Система 3SR включает активности обратной транскриптазы AMV, РНКазы H E. coli и ДНК-зависимой РНК-полимеразы (например, РНК-полимеразы T7).
При транскрипционной амплификации (TMA) используют РНК-полимеразу для синтеза РНК с промотора, находящегося в области праймера, обратную транскриптазу для синтеза комплементарной ДНК с матриц РНК и РНКазы H для удаления РНК с кДНК (см. Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990).
Для праймеров NASBA, 3SR и TMA необходим РНК-полимеразный промотор, сцепленный с последовательностью праймера, связывающейся с мишенью. Промоторы или промоторные последовательности для включения в праймеры представляют собой нуклеотидные последовательности (природного происхождения, синтетического происхождения или представляющие собой продукт рестрикционного расщепления), которые специфически распознаются РНК-полимеразой, распознающей такую последовательность и связывающуюся с ней и начинающей процесс транскрипции, в результате которого синтезируются РНК-транскрипты. Примеры подходящих промоторов включают промоторы, распознаваемые определенными полимеразами бактериофагов, таких как полимеразы бактериофагов T3, T7 или SP6, или промотор E. coli.
D. Способы обнаружения
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения, зонды, описанные в настоящем документе, используются для обнаружения продуктов амплификации, полученных в ходе реакции амплификации. Зонды, описанные в настоящем документе, могут использоваться в различных известных гомогенных или гетерогенных способах.
Способы гомогенного обнаружения включают, но не ограничиваются, использование меток FRET, присоединенных к зондам, которые испускают сигнал в присутствии последовательности-мишени, меток Molecular Beacons (см. Tyagi et al., Nature Biotechnol., 1996, 14: 303-308; Tyagi et al., Nature Biotechnol., 1998, 16: 49-53; Kostrikis et al., Science, 1998, 279: 1228-1229; Sokol et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95: 11538-11543; Marras et al., Genet. Anal., 1999, 14: 151-156; и патенты США 5846726, 5925517, 6277581 и 6235504) и анализ TaqMan (см. патенты США 5210015; 5804375; 5487792 и 6214979 и WO 01/86001). При использовании этих методик обнаружения, возможно обнаружение продуктов амплификации по мере их образования, то есть, в реальном времени. В результате, гибриды продуктов реакции амплификации и зондов образуются и обнаруживаются пока реакционная смесь находится в условиях амплификации.
В определенных вариантах осуществления, зонды по настоящему изобретению используются в анализе TaqMan. В анализе TaqMan одновременно с циклами температур проводится анализ путем отслеживания испускания флуоресцентных сигналов. Такая система дает возможность получения количественных данных, исходя из которых, возможно определить количество копий мишени. Например, с использованием последовательных разведений суспензий одного или более типов HPV или последовательностей бета-глобина человека с заранее известной концентрацией, можно построить стандартные кривые, с которыми можно сравнивать образцы с неизвестной концентрацией. Анализ TaqMan удобно проводить с использованием, например, ДНК-полимеразы AmpliTaq Gold, обладающей эндогенной 5'-нуклеазной активностью, для разрезания зонда, меченного как флуоресцентным репортерным красителем, так и молекулой-гасителем, как описано выше. Количественные результаты реакции получают, измеряя изменения флуоресценции, возникающие на протяжении цикла амплификации по мере разрезания зонда, приводящего к разделению флуоресцентной молекулы и молекулы-гасителя, и возрастанию флуоресцентного сигнала пропорционально амплификации последовательности-мишени.
Другие примеры способов гомогенного обнаружения включают анализ гибридизационной защиты (HPA). В таком анализе, зонды метят сложным эфиром акридина (AE) - сильно хемилюминесцирующей молекулой (см. Weeks et al., Clin. Chem., 1983, 29: 1474-1479; Berry et al., Clin. Chem., 1988, 34: 2087-2090), используя не нуклеотидный линкер (см. патенты США 5585481 и 5185439). В результате гидролиза АЕ щелочным пероксидом водорода образуется хемилюминесцирующий возбужденный N-метилакридон, который затем испускает фотон и инактивируется. В отсутствие последовательности-мишени АЕ гидролизуется быстро. Однако, скорость гидролиза АЕ резко снижается, если зонд связывается с последовательностью-мишенью. Таким образом, гибридизованные и негибридизованные зонды, меченные АЕ, могут быть обнаружены напрямую в растворе без физического их разделения.
Также хорошо известны из уровня техники системы гетерогенного обнаружения, обычно включающие агент захвата для отделения амплифицированных последовательностей от других веществ в реакционной смеси. Агенты захвата обычно представляют собой подложку из твердого материала (например, лунки микропланшетов, бусины, чипы и т.д.), на которую нанесены одна или более специфически связывающихся последовательностей. Связывающаяся последовательность может быть комплементарна последовательности хвоста, присоединенного к олигонуклеотидным зондам по изобретению. Альтернативно, связывающаяся последовательность может быть комплементарна последовательности олигонуклеотида захвата, таким образом представляя собой последовательность, комплементарную последовательности хвоста зонда. После отделения гибридов продукта амплификации и зонда, связавшихся с агентами захвата, от реакционной смеси, гибриды продукта амплификации и зонда могут быть обнаружены с помощью любого способа обнаружения, такого как способы, описанные в настоящем документе.
E. Обнаружение HPV и бета-глобина человека в исследуемых образцах
Еще в одном варианте осуществления, в настоящем изобретении представлены способы для: (a) обнаружения присутствия HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце; (b) обнаружения последовательностей человеского бета-глобина в исследуемом образце; и (c) обнаружения присутствия HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов и последовательностей бета-глобина человека в исследуемом образце.
Обычно способы по изобретению включают первую стадию - получение исследуемого образца от индивида. Индивид, у которого получают образец, может представлять собой любое млекопитающее. Предпочтительно, если млекопитающее включает, но не ограничивается собаками, кошками, кроликами, мышами, крысами, козами, овцами, коровами, свиньями, лошадьми, приматами, кроме человека, и людьми. Исследуемый образец может быть получен от индивида с помощью обычных методик, известных из уровня техники. Предпочтительно, если исследуемый образец содержит или предполагается, что содержит: (i) по меньшей мере один HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов и/или (ii) по меньшей мере одну последовательность бета-глобина человека.
После взятия у индивида, исследуемый образец приводят в контакт с праймерами (и необязательно с одним или более зондов) из по меньшей мере одного набора праймеров или набора праймеров и зондов, раскрываемых в настоящем документе, для получения реакционной смеси. Далее реакционную смесь помещают в условия амплификации. Праймеры гибридизуются с любой нуклеиновой кислотой HPV и любой нуклеиновой кислотой бета-глобина человека в исследуемом образце. Нуклеиновая кислота HPV или бета-глобина человека, присутствующая в образце, амплифицируется, в результате чего образуется по меньшей мере один продукт амплификации (то есть по меньшей мере одна последовательность-мишень).
По меньшей мере один продукт амплификации обнаруживают путем обнаружения гибридизации по меньшей мере одного продукта амплификации и по меньшей мере одного зонда по настоящему изобретению (таких как один или более зондов из набора праймеров и зондов, описанного в настоящем документе). В частности, обнаружение по меньшей мере одного продукта амплификации с помощью одного или более зондов с последовательностью SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21 или комплементарной им указывает на присутствие по меньшей мере одного HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов в исследуемом образце. Обнаружение гибридизации продукта амплификации и зонда с последовательностью SEQ ID NO:22 или комплементарной ей указывает на присутствие последовательности бета-глобина человека в исследуемом образце. Предпочтительно, если способы по настоящему изобретению включают обнаружение по меньшей мере одного HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов и последовательность бета-глобина человека (добавленную в качестве контроля) в исследуемом образце. Наиболее предпочтительно, если обнаружение по меньшей мере одного типа HPV и последовательности бета-глобина человека происходит одновременно.
Кроме того, способы по настоящему изобретению могут использоваться для частичного генотипирования (т.е., дифференциации) типов HPV, присутствующих и обнаруженных в исследуемом образце. Например, каждый зонд, используемый в способах, описываемых в настоящем документе, может быть мечен различными детектируемыми метками, испускающими свет различных цветов для облегчения идентификации различных типов HPV, присутствующих в исследуемом образце. Однако, для использования в способах по настоящему изобретению, предпочтительно, если зонд с последовательностью SEQ ID NO:8 мечен первой детектируемой меткой, испускающей свет одного цвета (например, красный), а зонд с последовательностью SEQ ID NO:9 мечен второй детектируемой меткой, отличающейся от первой детектируемой метки и испускающей свет другого цвета (например, зеленый). Если в способе помимо SEQ ID NO:8 и 9 используются один или более других зондов с последовательностью SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21 или комплементарными им, каждый из этих зондов может быть мечен одной и той же детектируемой меткой (то есть каждый зонд может быть мечен третьей детектируемой меткой, испускающей свет третьего цвета (например, желтый)). Таким образом, использование различных типов меток с различными HPV-зондами, описанными в настоящем документе (см. таблицу В) позволяет не только обнаружить присутствие HPV в исследуемом образце, но и специфически идентифицировать определенные типы HPV, присутствующие в образце. Обнаружение и/или дифференциация HPV 16 и 18 типов в исследуемом образце (такие как использование зондов с последовательностями SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9) представляется нужным и важным, поскольку эти два типа HPV являются причиной по меньшей мере 70% опухолей шейки матки.
F. Наборы реагентов
Еще в одном варианте осуществления в настоящем изобретении представлены наборы, включающие материалы и реагенты, подходящие для обнаружения HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 типов и последовательностей бета-глобина человека в соответствии со способами, описанными в настоящем документе. Наборы реагентов могут быть использованы диагностическими лабораториями, экспериментальными лабораториями или практикующими врачами. В определенных вариантах осуществления наборы реагентов включают по меньшей мере один набор праймеров или набор праймеров и зондов, описанных в разделе “В” настоящего документа и, необязательно, амплифицирующие реагенты. Предпочтительно, если каждый набор реагентов включает амплифицирующие реагенты для определенного способа амплификации. Таким образом, набор реагентов, предназначенный для NASBA, предпочтительно, содержит праймеры с промотором РНК-полимеразы, сцепленным с последовательностью, связывающейся с мишенью, в то время как набор реагентов для SDA, предпочтительно, содержит праймеры, включающие сайт распознавания рестрикционной эндонуклеазы к 5'-концу от последовательности, связывающейся с мишенью. Сходным образом, если набор реагентов предназначен для реакции с использовании 5'-нуклеазы, такой как анализ TaqMan, зонды по настоящему изобретению могут включать по меньшей мере одну флуоресцентную репортерную молекулу и по меньшей мере одну молекулу-гаситель.
Подходящие амплифицирующие реагенты дополнительно включают, например, один или более из следующих: буферы, реагенты, ферменты, обладающие обратно-транскриптазной и/или полимеразной активностью или экзонуклеазной активностью, кофакторы ферментов, такие как магний или марганец; соли; дезоксинуклеотидтрифосфаты (dNTP), подходящие для проведения реакции амплификации. Например, набор реагентов для NASBA может содержать необходимые количества обратной транскриптазы, РНКазы H и ДНК-полимеразы T7. В наборы реагентов для реакций транскрипционной амплификации, таких как NASBA, могут входить буферы, например, содержащий DMSO, который, как известно, ускоряет реакцию амплификации.
В зависимости от процедуры наборы реагентов могут также содержать один или более из: буферов для отмывки, буферов для гибридизации, буферов для мечения, способов обнаружения и других реагентов. Предпочтительно, если буферы и/или реагенты оптимизированы для конкретной методики амплификации/обнаружения, для которой предназначен набор реагентов. Также набор реагентов может включать протоколы использования этих буферов и реагентов для проведения различных стадий процедуры.
Кроме того, наборы реагентов могут включать внутренний контроль для проверки эффективности амплификации, чтобы предотвратить получение ложноотрицательных результатов в случае неудачной амплификации, для проверки адекватности клеток, получения образца и т.д. Последовательность, оптимальная для внутреннего контроля, выбрана таким образом, чтобы она не конкурировала с нуклеотидной последовательностью-мишенью в реакции амплификации. Предпочтительно, если внутренний контроль включает праймеры бета-глобина (то есть, по меньшей мере один из SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, последовательности, комплементарной SEQ ID NO:6 или последовательности, комплементарной SEQ ID NO:7) и зонд (то есть, SEQ ID NO:22 или последовательность, комплементарная SEQ ID NO:22), описанные ранее в настоящем документе в разделе “В”.
Наборы реагентов также могут включать реагенты для выделения нуклеиновых кислот из исследуемых образцов до амплификации до извлечения нуклеиновых кислот.
Реагенты могут поставляться в твердой (например, лиофилизированной) или жидкой форме. Наборы реагентов по настоящему изобретению могут необязательно содержать различные контейнеры (например, пузырек, ампула, пробирка, флакон или бутылка) для каждого отдельного буфера и/или реагента. Каждый компонент может быть разлитым в соответствующий контейнер готовым к употреблению или находиться в концентрированной форме. Могут также предоставляться другие контейнеры, подходящие для проведения определенных стадий реакции амплификации/обнаружения. Для коммерческих продаж предпочтительно, если отдельные контейнеры находятся в непосредственной близости.
Наборы реагентов также могут включать инструкции по использованию амплифицирующих реагентов и наборов праймеров или праймеров и зондов, как описано в настоящем документе: для обработки исследуемого образца, выделения молекул нуклеиновых кислот и/или проведения анализа; и для интерпретации полученных результатов, а также сообщение в форме, предписанной правительственной организацией. Эти инструкции необязательно могут быть в печатном виде или на CD, DVD или в другом мультимедийном формате.
Ниже приведены примеры настоящих раскрытий для пояснения, но не ограничения настоящего изобретения.
Пример 1: Материалы и способы
А. Дизайн HPV- и бета-глобиновых праймеров и зондов.
Все олигонуклеотиды, используемые в примерах 2-6, синтезировали с использованием стандартной методологии синтеза олигонуклеотидов, известной специалистам в области техники. Все зонды представляют собой однонитевые олигонуклеотиды, меченные с помощью общепринятых методик, известных из уровня техники, несущие флуорофор на 5'-конце и молекулу-гаситель на 3'-конце. 5'-концевая метка представляет собой VIC (этот зеленый краситель использовали для мечения зонда, специфичного для HPV 16 (то есть, SEQ ID NO:8; см. таблицу В в разделе “В”), NED (эту желтую метку использовали для мечения зонда, специфичного для HPV 18 (то есть SEQ ID NO:9; см. таблицу В в разделе “В”), FAM (этот синий краситель использовали для мечения зондов, специфичных для HPV 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68 (например, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21; см. таблицу В в разделе “В”), или Quasar (для бета-глобина человека; SEQ ID NO:22). 3'-концевая метка представляет собой Black Hole Quencher (BHQ), такой как BHQ1-dT (используемый для мечения зондов, специфичных для HPV 16, 31, 33, 35, 45, 51, 56, 59, 66 или 68; см. таблицу В в разделе “В”), BHQ2-dT (используемый для мечения зонда, специфичного для HPV18; см. таблицу В в разделе “В”), бета-глобина человека (SEQ ID NO:22) или BHQ1 plus (используемый для мечения зондов, специфичных для мечения HPV 39, 52 или 58; см. таблицу В в разделе B).
B. PCR в реальном времени
ДНК HPV выделяли из образцов, концентрировали и очищали с использованием технологии магнитных микрочастиц, захватывающих нуклеиновые кислоты, с последующим промыванием частиц для удаления несвязанных компонентов образца (см. например, патент США 5234809). Связанные нуклеиновые кислоты после элюирования были готовы к амплификации. Для амплификации мишеней HPV использовали смесь 3 прямых праймеров, специфичных для HPV (то есть, SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:3; см. таблицу А в разделе “В”) и 2 обратных праймера (то есть, SEQ ID NO:4 и SEQ ID NO:5; см. таблицу А в разделе “В”), направленные на консервативную область L1. Совокупность 3 прямых праймеров (SEQ ID NO:1-3) и 2 обратных праймеров (SEQ ID NO:4-5) обозначается в настоящем документе как «смесь праймеров для HPV». Сигнал четырнадцати (14) генотипов HPV человека (HR) (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68) получали с помощью зондов, специфичных для генотипов (а именно, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 и SEQ ID NO:21; см. таблицу В в разделе “В”). Совокупность всех четырнадцати зондов обозначается в настоящем документе как «набор зондов для HPV». Последовательность-мишень бета-глобина человека амплифицировали с помощью набора праймеров (SEQ ID NO: 6 и 7), направленных на эндогенную последовательность бета-глобина человека, и обнаруживали с помощью бета-глобинового зонда (SEQ ID NO:22). Помимо праймеров и зондов, реакция PCR состояла из: 14 единиц фермента AmpliTaq Gold, 7 мМ хлорида магния (в качестве активирующего реагента) и других амплифицирующих реагентов (включающих 0,6 мМ dNTP, 73,5 нМ референсного красителя ROX в буфере Tris).
Амплификацию/обнаружение в реальном времени проводили в приборе Abbott m2000rt (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) со следующими параметрами циклов: 1 цикл при 92°С 10 минут; 4 цикла при 91°С 30 секунд и 54°С 30 секунд; 38 циклов при 91°С 30 секунд, 52°С 30 секунд (с автоматическим удлинением на 1 секунду за цикл) и 50°С 40 секунд. Измерение флуоресценции проводили на стадии считывания (50°С) 38 циклов.
Пример 2: Охват генотипов и частичное генотипирование
В данном примере тестировали по отдельности или в комбинации пятьдесят один (51) образец, содержащий ДНК-мишени HPV каждого из 14 генотипов, с использованием смеси праймеров для HPV и набора зондов для HPV согласно примеру 1. Проводили PCR в реальном времени, как описано в примере 1. Каждую ДНК-мишень HPV тестировали в количестве 400000 копий на реакцию. Как показано ниже в таблице 1, в составе 51 образца были 14 образцов, содержащих один генотип, 25 образцов, содержащих два генотипа, и 12 образцов, содержащих три генотипа. Также в таблице 1 показано, что полученные результаты соответствовали заданным условиям, и в каждом случае присутствие или отсутствие ДНК HPV 16 и HPV 18 было определено безошибочно. Этот пример иллюстрирует способность смеси уникальных праймеров для HPV и набора зондов для HPV обнаруживать 14 генотипов HR HPV (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 и 68), а также отличать HPV 16 и HPV 18 от остальных 12 генотипов HR HPV.
Таблица 1
номер образца
генотип HPV
результат
1
16
HPV 16
2
18
HPV 18
3
31
другой HR HPV
4
33
другой HR HPV
5
35
другой HR HPV
6
39
другой HR HPV
7
45
другой HR HPV
8
51
другой HR HPV
9
52
другой HR HPV
10
56
другой HR HPV
11
58
другой HR HPV
12
59
другой HR HPV
13
66
другой HR HPV
14
68
другой HR HPV
15
16+18
HPV 16; HPV 18
16
16+31
HPV 16; другой HR HPV
17
16+33
HPV 16; другой HR HPV
18
16+35
HPV 16; другой HR HPV
19
16+39
HPV 16; другой HR HPV
20
16+45
HPV 16; другой HR HPV
21
16+51
HPV 16; другой HR HPV
22
16+52
HPV 16; другой HR HPV
23
16+56
HPV 16; другой HR HPV
24
16+58
HPV 16; другой HR HPV
25
16+59
HPV 16; другой HR HPV
26
16+66
HPV 16; другой HR HPV
27
16+68
HPV 16; другой HR HPV
28
18+31
HPV 18; другой HR HPV
29
18+33
HPV 18; другой HR HPV
30
18+35
HPV 18; другой HR HPV
31
18+39
HPV 18; другой HR HPV
32
18+45
HPV 18; другой HR HPV
33
18+51
HPV 18; другой HR HPV
34
18+52
HPV 18; другой HR HPV
35
18+56
HPV 18; другой HR HPV
36
18+58
HPV 18; другой HR HPV
37
18+59
HPV 18; другой HR HPV
38
18+66
HPV 18; другой HR HPV
39
18+68
HPV 18; другой HR HPV
40
16+18+31
HPV 16; HPV 18; другой HR HPV
41
16+18+33
HPV 16; HPV 18; другой HR HPV
42
16+18+35
HPV 16; HPV 18; другой HR HPV
43
16+18+39
HPV 16; HPV 18; другой HR HPV
44
16+18+45
HPV 16; HPV 18; другой HR HPV
45
16+18+51
HPV 16; HPV 18; другой HR HPV
46
16+18+52
HPV 16; HPV 18; другой HR HPV
47
16+18+56
HPV 16; HPV 18; другой HR HPV
48
16+18+58
HPV 16; HPV 18; другой HR HPV
49
16+18+59
HPV 16; HPV 18; другой HPV
50
16+18+66
HPV 16; HPV 18; другой HR HPV
51
16+18+68
HPV 16; HPV 18; другой HR HPV
Пример 3: Специфичность гибридизации зондов
Проводили два исследования для демонстрации специфичности гибридизации набора зондов для HPV, описанного в примере 1. Проводили PCR в реальном времени, как описано в примере 1, с индивидуальными зондами для HR HPV (см. таблицу 2) или коктейлем, включающим все 14 зондов для HR HPV (см. таблицу 3), в присутствии индивидуальных плазмидных ДНК-мишеней HPV в концентрации приблизительно 10000000 копий на реакцию. Результаты двух исследований, приведенные в таблицах 2 и 3, демонстрируют специфичность выбранных зондов для HPV.
Таблица 2
мишень
Зонд
16
18
31
33
35
39
45
51
52
56
58
59
66
68
HR<sup>1</sup>
16 (SEQ ID NO:8)
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
HR
18 (SEQ ID NO:9)
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
HR
31 (SEQ ID NO:10)
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
HR
33 (SEQ ID NO:11)
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
HR
35 (SEQ ID NO:12)
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
-
HR
39 (SEQ ID NO:13)
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
-
HR
45 (SEQ ID NO:14)
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
-
HR
51 (SEQ ID NO:15)
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
-
HR
52 (SEQ ID NO:16)
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
-
HR
56 (SEQ ID NO:17)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
-
HR
58 (SEQ ID NO:18)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
HR
59 (SEQ ID NO:19)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
HR
66 (SEQ ID NO:20)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
HR
68 (SEQ ID NO:21)
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
LR<sup>2</sup>
6
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
LR
11
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
LR
42
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
LR
43
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
LR
44
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Примечание: «+» означает «обнаружен HR HPV»; «-» означает «не обнаружено».1 - высокий риск (HR)2 - низкий риск (LR)
Таблица 3
мишень
результат
LR
6
не обнаружен
LR
11
не обнаружен
LR
13
не обнаружен
LR
26
не обнаружен
LR
30
не обнаружен
LR
32
не обнаружен
LR
40
не обнаружен
LR
42
не обнаружен
LR
43
не обнаружен
LR
44
не обнаружен
LR
53
не обнаружен
LR
54
не обнаружен
LR
55
не обнаружен
LR
57
не обнаружен
LR
61
не обнаружен
Пример 4: Обнаружение бета-глобина как контроль адекватности клеток
Для использования бета-глобина как контроля адекватности клеток, сигнал бета-глобина, такой как номер цикла (CN), полученный в ходе анализа PCR в реальном времени, должен указывать на количество клеток в клинических образцах.
Проводили исследование для оценки корреляции количества клеток культивируемой HPV-положительной клеточной линии, взятых для опыта, и бета-глобиновым сигналом. Корреляция между бета-глобиновым сигналом и количеством клеток приведена на фигуре 1. Исследование показало, что повышение концентрации клеток коррелирует с повышенной эффективностью обнаружения бета-глобина, на что указывает более ранний CN.
Кроме того, проводили отдельное исследование для оценки распределения CN бета-глобина в клинических образцах. Анализировали совокупность из 1206 образцов ткани шейки матки пациентов, помещенных в раствор PreservCyt (Cytyc Corporation, Marlborough, MA), результаты исследования приведены на фигуре 2. 25%-, 50%- и 75%- квантилям совокупности соответствуют CN бета-глобина 21,29, 22,41 и 23,78 соответственно, в то время как минимальный CN составляет 17,47, а максимальный CN - 36,01. Это исследование показывает, что бета-глобин может служить контролем адекватности клеток.
Для получения результатов, приведенных на фигурах 1 и 2 в PCR в реальном времени использовали праймеры и зонды для бета-глобина человека, описанные в примере 1.
Пример 5: Аналитические характеристики дизайнов праймеров и зондов
В этом примере описываются результаты двух исследований. Первое исследование показывает улучшение аналитических характеристик смеси праймеров для HPV согласно примеру 1 по сравнению с широко употребляемыми консенсусными праймерами GP5+/GP6+ (праймер GP5+: 5'-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3' (SEQ ID NO:23). Праймер GP6+: 5'-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3' (SEQ ID NO:24)). Это исследование проводили с использованием PCR в реальном времени, как описано в примере 1. Для оценки характеристик уникальной смеси праймеров для HPV по настоящему изобретению и консенсусных праймеров GP5+/GP6+ использовали величины CN. Результаты приведены в таблице 4 и на фигурах 3A-3D. Для 10/13 генотипов HPV наблюдали улучшение характеристик (значение улучшения CN >1) (таблица 4). Значительные улучшения наблюдали для генотипов HPV 39, 51, 52 и 68 (значение улучшения CN >10), что показано на фигурах 3A-3D.
Таблица 4
генотип HPV
SEQ ID NO:1-5
праймеры GP5+/GP6+(SEQ ID NO:23-34)
улучшение CN заявленныхпоследовательностей*
16
14,67
14,62
-0,1
18
11,84
11,80
0,0
31
14,45
22,05
7,6
33
15,58
15,03
-0,6
35
11,92
13,36
1,4
39
15,14
28,44
13,3
45
12,74
15,32
2,6
51
11,47
26,37
14,9
52
13,89
32,25
18,4
56
14,95
19,44
4,5
58
16,86
18,30
1,4
59
11,55
18,26
6,7
68
13,29
28,41
15,1
* положительные значения указывают на более высокую эффективность амплификации в PCR в реальном времени для заявленных последовательностей.
Во втором исследовании анализировали аналитические характеристики нескольких уникальных зондов по настоящему изобретению, специфичных для HPV 16, 18, 31, 35, 39, 45, 51, 52, 58 и 59 типов (SEQ ID NO: 8-10, 12-16 и 18-19) по сравнению с последовательностями зондов для тех же типов HPV, раскрытыми в патенте США 6265154 В1 (см. таблицу 5). Зонды согласно патенту США 6265154 помечали как описано в примере 1 для прямого сравнения в условиях тестирования в PCR в реальном времени. Характеристики оценивали по величинам CN и флуоресцентным сигналам. Результаты приведены в таблице 6, таблице 7 и на фигурах 4A-4E. Для 5/10 генотипов HPV наблюдали улучшение характеристик (величина улучшения CN>1 и флуоресцентный сигнал > 0,1) (таблица 6 и таблица 7). Значительные улучшения CN и флуоресцентного сигнала наблюдали для генотипов HPV 16, 18, 31, 52 и 59, что показано на фигурах 4А-4Е.
Таблица 5
SEQ ID NO из патента США 6265154
специфичность к HPV
4
16
7
18
10
31
16
35
19
39
22
45
25
51
28
52
34
58/33
37
59
Таблица 6
ГенотипHPV
последовательности понастоящему изобретению
последовательности в патентеСША 6265154
улучшение CN заявленнойпоследовательности*
16
14,59 (SEQ ID NO:8)
17,59 (SEQ ID NO:4)
3,0
18
11,84 (SEQ ID NO:9)
16,88 (SEQ ID NO:7)
5,0
31
14,45 (SEQ ID NO:10)
16,79 (SEQ ID NO:10)
2,3
35
11,92 (SEQ ID NO:12)
11,99 (SEQ ID NO:16)
0,1
39
15,14 (SEQ ID NO:13)
15,57 (SEQ ID NO:19)
0,4
45
12,74 (SEQ ID NO:14)
13,36 (SEQ ID NO:22)
0,6
51
11,47 (SEQ ID NO:15)
10,71 (SEQ ID NO:25)
-0,8
52
13,89 (SEQ ID NO:16)
14,99 (SEQ ID NO:28)
1,1
58
16,86 (SEQ ID NO:18)
16,25 (SEQ ID NO:34)
-0,6
59
11,55 (SEQ ID NO:19)
18,69 (SEQ ID NO:37)
7,1
* положительные значения указывают на более высокую эффективность амплификации в PCR в реальном времени для заявленных последовательностей.
Таблица 7
ГенотипHPV
Последовательностипо настоящему изобретению
Последовательностив патенте США 6265154
усиление флуоресцентногосигнала заявленнойпоследовательности*
16
0,153 (SEQ ID NO:8)
0,028 (SEQ ID NO:4)
0,125
18
0,265 (SEQ ID NO:9)
0,062 (SEQ ID NO:7)
0,203
31
0,235 (SEQ ID NO:10)
0,051 (SEQ ID NO:10)
0,184
35
0,220 (SEQ ID NO:12)
0,280 (SEQ ID NO:16)
-0,060
39
0,301 (SEQ ID NO:13)
0,522 (SEQ ID NO:19)
-0,221
45
0,234 (SEQ ID NO:14)
0,279 (SEQ ID NO:22)
-0,045
51
0,317 (SEQ ID NO:15)
0,295 (SEQ ID NO:25)
0,022
52
0,316 (SEQ ID NO:16)
0,103 (SEQ ID NO:28)
0,213
58
0,365 (SEQ ID NO:18)
0,469 (SEQ ID NO:34)
-0,104
59
0,204 (SEQ ID NO:19)
0,088 (SEQ ID NO:37)
0,116
Пример 6: Клинические характеристики праймеров и зондов по настоящему изобретению
Чувствительность и специфичность реакции с использованием смеси праймеров для HPV и набора зондов для HPV, описанных в примере 1, для обнаружения HR HPV оценивали путем тестирования 441 образцов ткани шейки матки пациентов, помещенных в раствор PreservCyt (Cytyt Corporation, Marlborough, MA). Статус образцов по HPV высокого риска определяли по совпадению результатов теста Abbott RealTime на HR HPV (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois) и ДНК-теста hc2 High-Risk HPV («HC2») (производства Quiagen, Inc., Valencia, CA) и дальнейшего анализа образцов, с несогласующимися результатами с помощью теста для генотипирования HPV LINEAR ARRAY (производства Roche Diagnostics, Basel, CH; «linear array»). Все три реакции или теста проводили согласно инструкциям производителей. 227 образцов определялись обоими тестами, а 179 не определялись ни одним тестом. Несогласующиеся результаты 35 образцов определяли с помощью Linear Array. Из 238 положительных образцов, 231 определили с помощью теста Abbott RealTime на HR HPV, и 234 определили с помощью HC2. Из 203 определенно отрицательных образцов, 203 не определялись с помощью Abbott RealTime на HR HPV и 179 не определялись с помощью HC2. Как показано ниже в таблице 8, чувствительность Abbott RealTime на HR HPV для обнаружения HR HPV составляла 97%, а чувствительность HC2 составляла 98%. Специфичность Abbott RealTime на HR HPV assay составляла 100%, а специфичность HC2 составляла 88%.
Таблица 8
тест
чувствительность
специфичность
Abbott RealTime HR HPV
97%
100%
HC2
98%
88%
Специалисту в данной области техники очевидно, что настоящее изобретение хорошо адаптировано для решения задач и достижения целей и преимуществ, упомянутых и подразумеваемых в настоящем документе. Молекулярные комплексы и способы, процедуры, обработки, молекулы, специфические вещества, описанные в настоящем документе, являются примерными и не ограничивают объем изобретения. Специалисту в области техники очевидно, что в изобретение, раскрываемое в настоящем документе, могут вноситься различные замены и модификации без изменения сущности и объема изобретения.
Все патенты и публикации, упомянутые в описании изобретения, указывают на уровень специалистов в области техники, к которой относится изобретение. Все патенты и публикации включены в настоящий документ полностью путем ссылки точно так же, как если бы каждая отдельная публикация была бы явно и по отдельности включена в настоящий документ путем ссылки.
Изобретение, описанное в примерах в настоящем документе, может применяться в отсутствие любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, не раскрытых отдельно в настоящем документе. Приведенные термины и выражения используются как термины и выражения, а не в качестве ограничений, данные термины и выражения используются без намерения исключить какие-либо эквиваленты свойств, описанных и проиллюстрированных в настоящем документе, или их частей. Очевидно, что возможны различные модификации изобретения, не выходящие за пределы его заявленного объема. Таким образом, следует понимать, что несмотря на то, что настоящее изобретение конкретно раскрывается посредством предпочтительных воплощений, специалист в области техники может применять дополнительные возможности, модификации и варианты идей, изложенных в настоящем документе, и такие модификации и варианты входят в объем настоящего изобретения, определяемый приложенной формулой изобретения.