Способ доступа к телу желудка иммунодефицитных мышей при ортотопической трансплантации фрагмента опухоли желудка человека
METHOD FOR ACCESSING THE BODY OF THE STOMACH OF IMMUNODEFICIENCY MICE WITH ORTHOTOPIC TRANSPLANTATION OF A FRAGMENT OF A HUMAN STOMACH TUMOR

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной онкологии, и касается способа обеспечения доступа к телу желудка иммунодефицитных мышей во время осуществления ортотопической трансплантации фрагмента опухоли желудка человека.
Рак желудка является четвертой причиной смертности от рака во всем мире (см. Sung H. et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries // CA: a cancer journal for clinicians. – 2021. – V. 71. – №. 3. – P. 209-249). Отчасти это связано с бессимптомным характером заболевания, что часто приводит к поздней диагностике, когда возможности лечения ограничены (см. Li J. et al. Repression of PES1 expression inhibits growth of gastric cancer //Tumor Biology. – 2016. – V. 37. – №. 3. – P. 3043-3049). Однако даже при успешном лечении больные раком желудка имеют высокий риск рецидива опухоли и приобретения лекарственной устойчивости.
Известно, что рецидивы данного заболевания возникают у 50% пациентов (см. Choi Y. Y., Cheong J. H. Beyond precision surgery: molecularly motivated precision care for gastric cancer //European Journal of Surgical Oncology. – 2017. – V. 43. – №. 5. – P. 856-864). Кроме того, за последние 20 лет доля больных раком желудка с возникновением метастаз выросла с 24 до 44%, что указывает на острую потребность в оптимизированном подходе как к лечению, так и к диагностике (см. Bernards N. et al. No improvement in median survival for patients with metastatic gastric cancer despite increased use of chemotherapy //Annals of oncology. – 2013. – V. 24. – №. 12. – P. 3056-3060). Таким образом, раннее выявление и мониторинг ответа опухоли на лечение имеют центральное значение в улучшении выживаемости пациентов.
Крайне важно лучше понимать молекулярные механизмы, лежащие в основе патогенеза рака желудка, чтобы облегчить разработку новых методов лечения, которые могут позволить улучшить выживаемость пациентов. Геномное секвенирование мыши и человека позволило определить их высокое сходство (см. Yannan Jiang, Yingyan Yu. Transgenic and gene knockout mice in gastric cancer research // Oncotarget. – 2017. – V. 8. – № 2. – P. 3696–3710). Кроме того, поскольку мыши показали превосходство над другими видами лабораторных животных в отношении различных факторов, они привлекли внимание в качестве полезных моделей для раскрытия механизмов развития рака (см. Doyle A, McGarry MP, Lee NA, Lee JJ. The construction of transgenic and gene knockout/knockin mouse models of human disease // Transgenic research. – 2012. – V. 21. – P. 327–349). Ряд полученных моделей рака желудка на лабораторных животных позволил получить существенное представление о вкладе генетических факторов и факторов окружающей среды в возникновение и прогрессирование заболевания. На данный момент важно разработать аутентичную животную модель для имитации процесса канцерогенеза желудка человека.
Известен способ имплантации опухоли желудка человека под кожу иммунодефицитным мышам после осуществления разреза при помощи операционного ножа на расстоянии 10 мм от хвоста (см. Yan Ping, Xu Gang, Kang Lingling Zhao Hui, Li Yan and Tang Zhijiao, CN Patent No. 102380105A (21 March 2012)). Однако гетеротопическая трансплантация не обеспечивает создание реального микроокружения (см. Killion J. J., Radinsky R., Fidler I. J. Orthotopic models are necessary to predict therapy of transplantable tumors in mice //Cancer and Metastasis Reviews. – 1998. – V. 17. – №. 3. – P. 279-284.).
Известен способ имплантации опухоли при помощи инъекции суспензии опухолевых клеток рака желудка иммунодефицитным мышам в серозную часть желудка при помощи стеклянной микропипетки (см. Takaishi S. et al. Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44 //Stem cells. – 2009. – V. 27. – №. 5. – P. 1006-1020.). Однако суспензионный опухолевый материал не моделирует гетерогенность опухоли, в результате чего данная модель не отражает реальную картину клинического развития рака желудка человека (см. Lu J. et al. Establishment of gastric cancer patient-derived xenograft models and primary cell lines // Journal of Visualized Experiments. – 2019. – №. 149. – P. e59871).
Существует метод имплантации гомогенной измельченной опухоли в желудок лабораторной мыши (см. Kang W. et al. Development of a novel Orthotopic gastric Cancer mouse model //Biological procedures online. – 2021. – V. 23. – №. 1. – P. 1-12.). Данный способ отличается высокой результативностью, однако характеризуется чрезмерной сложностью хирургических манипуляций при имплантации опухоли иммунодефицитным мышам.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа доступа к телу желудка иммунодефицитным мышам при ортотопической трансплантации фрагмента опухоли желудка человека, который позволит выполнить манипуляцию с наименьшими трудозатратами и наибольшей эффективностью.
Технический результат изобретения достигается тем, что рассекают кожу и ткани брюшной стенки на протяжении 20 мм вдоль оси туловища, начиная от окончания мечевидного отростка, отступая от средней линии 5 мм в сторону левого подреберья, конец разреза находится на расстоянии 25 мм от уретры, выделяют желудок, делают надрез в серозно-мышечном слое желудка длиной 3 мм, пришивают фрагмент опухоли к желудку в месте надреза при помощи лигатуры, после чего осуществляют последовательное ушивание тканей брюшной стенки и кожи непрерывным швом.
Способ осуществляют следующим образом.
3
Фрагмент опухоли, выделенный во время операции у пациента, помещают в питательную среду DMEM с содержанием 10 % гентамицина до момента операции. Начало имплантации опухоли производят не позднее 10-15 минут от момента получения фрагмента опухоли донора. Выделенный фрагмент осторожно очищают от некротизированных тканей при помощи хирургического лезвия и пинцета, после чего отрезают необходимый для имплантации материал объемом 3 мм.
Реципиентом опухолевого материала служат иммунодефицитные мыши Balb/c Nude. Животное наркотизируют при помощи седативного препарата «Ксилазин» в концентрации 20 мг/мл и препарата для общей анестезии «Золетил 100» в концентрации 22,57 мг/мл внутримышечно.
После наркотизации производят послойное рассечение кожи и ткани брюшной стенки животного на протяжении 20 мм. Начало разреза находится в месте окончания мечевидного отростка, отступая 5 мм от срединной линии в сторону левого подреберья, конец разреза расположен на расстоянии 25 мм от уретры. Осуществляя расширение операционной раны при помощи анатомических пинцетов, визуализируют желудок, после чего выполняют его тупое отделение от тканей рядом расположенных органов. Далее делают надрез в серозно-мышечном слое желудка длиной 3 мм. Затем полученный фрагмент опухоли донора пришивают при помощи лигатуры к стенке желудка в месте создания разреза. Далее послойно зашивают брюшную полость и кожу животного.
Способ иллюстрируется следующими фигурами:
На Фиг 1 изображено рассечение кожи, мышц и ткани брюшной стенки иммунодефицитной мыши линии Balb/c Nude.
На Фиг 2 изображена имплантация фрагмента опухоли человека в тело желудка иммунодефицитной мыши линии Balb/c Nude.
На Фиг 3 изображено ушитие ткани брюшной стенки иммунодефицитной мыши линии Balb/c Nude.
На Фиг 4 изображен конечный вид после трансплантации фрагмента опухоли желудка человека в тело желудка иммунодефицитной мыши линии Balb/c Nude.
На Фиг 5 изображен результат ортотопической трансплантации опухоли желудка человека иммунодефицитной мыши линии Balb/c Nude.
Данным способом произведена трансплантация фрагмента опухоли желудка человека в стенку тела желудка 30 иммунодефицитным мышам линии Balb/c Nude.
Приводим пример применения способа.
Приведенным способом была прооперирована самка иммунодефицитной мыши Balb/c Nude возрастом 7 недель массой 24 г. Для трансплантации использовался фрагмент опухоли желудка человека, помещенный в питательную среду DMEM, содержащую 10% гентамицина, сразу после ее выделения из организма пациента. От момента выделения материала из организма-донора до имплантации опухоли реципиенту прошло 14 минут. Для премедикации мыши использовали препарат «Ксилазин» в концентрации 20 мг/мл. Далее наркотизировали животное-реципиента при помощи препарата для общей анестезии «Золетил 100» в концентрации 22,57 мг/мл внутримышечно (см. патент на изобретение RU № 2712916 С1, опубл. 03.02.2020 г., Бюл. № 4). Далее послойно рассекали кожу, мышцы и ткани на брюшной части мыши на протяжении 20 мм от окончания мечевидного отростка, отступая 5 мм от срединной линии в сторону левого подреберья. Конец разреза располагался на расстоянии 25 мм от уретры. Осуществляя расширение операционной раны при помощи анатомических пинцетов, визуализировали желудок и отделяли его от тканей рядом расположенных органов. Далее производили рассечение серозно-мышечного слоя тела желудка по большой кривизне длиной 3 мм для последующей имплантации. Затем выделенный фрагмент опухоли донора пришивали, используя хирургический шовный материал, к стенке желудка в месте создания разреза. Оперативное вмешательство завершили послойным ушитием брюшной полости и кожи животного.
Трансплантацию опухоли мышь-реципиент перенесла без осложнений и благополучно вышла из наркоза. В результате операции была получена модель ортотопического ксенографта опухоли желудка.
Технико-экономическая эффективность данного способа заключается в обеспечении доступа к телу желудка животного, и после ушивания операционной раны позволяет получить ортотопическую пациентоподобную модель рака желудка, которая сохраняет характеристики, свойственные первичному новообразованию у человека, а также не доставляет мыши дискомфорт после перенесенной операции. Данный способ позволяет с минимальным количеством вмешательств получить опухолевую модель для использования в доклинических исследованиях.