МОДУЛИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНОГО РОСТА И ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ГЛИКОПРОТЕИНОВ

1. Способ получения рекомбинантного гликопротеина в условиях ферментационной культуры в эукариотической клетке, включающий регуляцию концентрации каждого металла, а именно железа, меди, цинка и марганца, в культуральной среде в процессе культивирования так, чтобы влиять на образование биомассы и/или зрелость N-гликанов в экспрессируемом гликопротеине, в котором регуляция предусматривает:
- повышение концентрации каждого металла, а именно железа, меди, цинка и марганца, для увеличения биомассы и/или
- повышение концентрации каждого металла, а именно цинка и марганца, и необязательно понижение концентрации каждого металла, а именно железа и меди, для повышения зрелости экспрессируемого гликопротеина, или
- понижение концентрации каждого металла, а именно железа, меди, цинка и марганца, или повышение концентрации каждого металла, а именно меди и железа, и понижение концентрации каждого металла, а именно цинка и марганца, для повышения производства незрелых нефукозилированных гликопротеинов.
2. Способ по п. 1, в котором экспрессируемый гликопротеин представляет собой зрелый N-гликозилированный гликопротеин, зрелый нефукозилированный гликопротеин или незрелый нефукозилированный гликопротеин.
3. Способ по п. 1, в котором углеводный фрагмент экспрессируемого гликопротеина имеет G0-, G1- или G2-структуру.
4. Способ по п. 1, в котором для увеличения концентрации биомассы концентрации регулируют так, чтобы они составляли:
(а) железо: от 15 до более чем 80 мкМ;
(б) медь: от 0,3 до более чем 2,5 мкМ;
(в) цинк: от 20 до более чем 50 мкМ и
(г) марганец: от 0,01 до более чем 3 мкМ.
5. Способ по п. 1, в котором для повышения зрелости экспрессируемого гликопротеина концентрации регулируют так, чтобы они составляли:
(а) железо: от 0 до 25 мкМ;
(б) медь: от 0 до 0,1 мкМ;
(в) цинк: от 20 до более чем 50 мкМ и
(г) марганец: от 0,01 до более чем 3 мкМ.
6. Способ по п. 1, в котором для повышения зрелости экспрессируемого гликопротеина концентрации регулируют так, чтобы они составляли:
(а) цинк:- от 20 до более чем 50 мкМ и
(б) марганец:- от 0,01 до более чем 3 мкМ.
7. Способ по п. 1, в котором для повышения получения незрелых нефукозилированных гликопротеинов концентрации регулируют так, чтобы они составляли: либо
(I)
(а) железо: от 0 до 35 мкМ;
(б) медь: от 0 до 1 мкМ;
(в) цинк: от 0 до 20 мкМ и
(г) марганец: от 0 до 0,01 мкМ, или
(II)
(а) железо: от 15 до более чем 80 мкМ;
(б) медь: от 0,3 до более чем 2,5 мкМ;
(в) цинк: от 0 до 20 мкМ и
(г) марганец: от 0 до 0,01 мкМ.
8. Способ по одному из п.п. 1-7, в котором гликопротеин является экзогенным или эндогенным для эукариотической клетки, в котором необязательно гликопротеин представляет собой структурный гликопротеин, гормон, антитело или фермент.
9. Способ по п. 8, в котором гликопротеин представляет собой антитело, в котором необязательно антитело представляет собой терапевтическое или
диагностическое антитело, необязательно химерное, гуманизированное или человеческое антитело.
10. Способ по одному из п.п. 1-9, в котором эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, клетку дрожжей или клетку насекомого.
11. Способ по одному из п.п. 1-9, в котором концентрации железа, меди, цинка и марганца регулируют при культивировании в процессе фаз роста и/или производства.
12. Способ по одному из п.п. 1-11, в котором повышение концентрации любого металла, а именно железа, меди, цинка и марганца, или их всех, в культуральной среде обеспечивают путем дополнения среды, в которой культивируют клетки, и/или путем расщепления клеток посредством переноса в свежую среду, дополненную любым металлом, а именно железом, медью, цинком и марганцем, или ими всеми.
13. Способ по одному из п.п. 1-11, в котором снижение биодоступной концентрации любого металла, а именно железа, меди, цинка и марганца, или их всех, обеспечивают путем образования комплекса железа, меди, цинка и марганца с хелатором и/или путем посева клеток в свежую среду, содержащую любой металл, а именно железо, медь, цинк и марганец, или их все, в пониженной концентрации по сравнению со средой на непосредственно предшествующей фазе культивирования.
14. Способ по одному из п.п. 1-13, в котором концентрации каждого металла, а именно железа, меди, цинка и марганца, в культуральной среде регулируют в процессе культивирования сначала так, чтобы оказывать благоприятное воздействие на образование биомассы, а затем так, чтобы повышать зрелость экспрессируемых N-гликопротеинов или повышать получение незрелых нефукозилированных гликопротеинов.
15. Среда, пригодная для получения рекомбинантного гликопротеина в условиях ферментационной культуры в эукариотической клетке, где среда содержит каждый металл, а именно железо, медь, цинк и марганец, в концентрации, влияющей на образование биомассы; в которой концентрации железа, меди, цинка и марганца составляют:
(а) железо: от 15 до более чем 80 мкМ;
(б) медь: от 0,3 до более чем 2,5 мкМ;
(в) цинк: от 20 до более чем 50 мкМ и
(г) марганец: от 0,01 до более чем 3 мкМ.
16. Применение среды по п. 15 для получения рекомбинантного гликопротеина в условиях ферментационной культуры в эукариотической клетке, для оказания благоприятного воздействия на повышенное образование биомассы.
17. Среда, пригодная для получения рекомбинантного гликопротеина в условиях ферментационной культуры в эукариотической клетке, где среда содержит каждый металл, а именно железо, медь, цинк и марганец, в концентрации, влияющей на зрелость N-гликанов, в которой концентрации железа, меди, цинка и марганца составляют:
(I)
(а) железо:- от 0 до 25 мкМ;
(б) медь: от 0 до 0,1 мкМ;
(в) цинк: от 20 до более чем 50 мкМ и
(г) марганец: от 0,01 до более чем 3 мкМ или
(II)
(а) цинк: от 20 до более чем 50 мкМ и
(б) марганец: от 0,01 до более чем 3 мкМ.
18. Применение среды по п. 17 для получения рекомбинантного гликопротеина в условиях ферментационной культуры в эукариотической клетке, для повышения зрелости экспрессируемых N-гликопротеинов.
19. Среда, пригодная для получения рекомбинантного гликопротеина в эукариотической клетке в условиях ферментационной культуры, где среда содержит каждый металл, а именно железо, медь, цинк и марганец, в концентрации, оказывающей благоприятное воздействие на получение незрелых нефукозилированных N-гликопротеинов, в которой концентрации железа, меди, цинка и марганца составляют: либо
(I)
(а) железо: от 0 до 35 мкМ;
(б) медь: от 0 до 1 мкМ;
(в) цинк: от 0 до 20 мкМ и
(г) марганец: от 0 до 0,01 мкМ, либо
(II)
(а) железо: от 15 до более чем 80 мкМ;
(б) медь: от 0,03 до более чем 2,5 мкМ;
(в) цинк: от 0 до 20 мкМ и
(г) марганец: от 0 до 0,01 мкМ.
20. Применение среды по п. 19 для получения рекомбинантного гликопротеина в условиях ферментационной культуры в эукариотической клетке, для оказания благоприятного воздействия на получение незрелых нефукозилированных гликопротеинов.