СПОСОБЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1. Способ определения относительного количества по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты-мишени в образце, который включает стадии:
(a) амплификация каждой из по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты-мишени, которая содержится в образце, и одновременное получение сигналов, коррелирующих с амплификацией каждой из по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты-мишени,
(b) амплификация каждого из по меньшей мере одного образца нуклеиновой кислоты для сравнения и одновременное получение сигналов, коррелирующих с амплификацией каждой из по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты для сравнения,
(c) введение поправки в полученные сигналы для учета фоновых сигналов, состоящее в том, что фоновую составляющую вычитают из регистрируемых сигналов,
(d) вычисление эффективности амплификации для смежных циклов Ê(C) для каждого цикла амплификации нуклеиновой кислоты-мишени и нуклеиновой кислоты для сравнения, где эффективность амплификации для смежных циклов Ê вычисляют, используя
Ê(C)=[Ĩ(C+1)/Ĩ(C)]-1,
где Ê = эффективность амплификации для смежных циклов,
C = число циклов,
Ĩ = интенсивность сигнала, скорректированная с учетом фонового сигнала,
(e) вычисление меры беспорядочности M эффективности амплификации для смежных циклов Ê(C) для нуклеиновой кислоты-мишени и нуклеиновой кислоты для сравнения, где вычисляемую меру беспорядочности выбирают из группы, состоящей из: спектральной энтропии, остаточной ошибки полиномиальной аппроксимации кривой, подсчета пересечений нуля, вычисления энергии (RMS) после высокочастотной фильтрации,
M
(f) идентификация числа циклов C, где M имеет минимальную величину для нуклеиновой кислоты-мишени и нуклеиновой кислоты для сравнения,
C
M
(g) вычисление характеристических чисел циклов C по величинам C для того, чтобы сделать поправку на ширину любых интервалов, используемых при вычислении меры беспорядочности.
C
(h) определение относительных количеств каждой из по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты-мишени в образце по отношению к нуклеиновым кислотам для сравнения посредством сравнения C мишени и образцов для сравнения.
2. Способ определения абсолютного количества по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты-мишени в образце, который включает стадии:
(a) амплификация каждой из по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты-мишени, которая содержится в образце, и одновременное получение сигналов, коррелирующих с амплификацией каждой из по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты-мишени,
(b) амплификация образцов серии разведений стандарта нуклеиновой кислоты с известной концентрацией и одновременное получение сигналов, коррелирующих с амплификацией нуклеиновых кислот в образцах стандарта,
(c) введение поправки в полученные сигналы для учета фоновых сигналов, состоящее в том, что фоновую составляющую вычитают из регистрируемых сигналов,
(d) вычисление эффективности амплификации для смежных циклов Ê(C) для каждого цикла амплификации мишеней и образцов стандарта, где эффективность амплификации для смежных циклов Ê вычисляют, используя
Ê(C)=[Ĩ(C+1)/Ĩ(C)]-1,
где Ê = эффективность амплификации для смежных циклов,
C = число циклов,
Ĩ = интенсивность сигнала, скорректированная с учетом фонового сигнала,
(e) вычисление меры беспорядочности M эффективности амплификации для смежных циклов Ê(C) для мишеней и образцов стандарта, где вычисляемую меру беспорядочности выбирают из группы, состоящей из: спектральной энтропии, остаточной ошибки полиномиальной аппроксимации кривой, подсчета пересечений нуля, вычисления энергии (RMS) после высокочастотной фильтрации,
M
(f) идентификация числа циклов C, где M имеет минимальную величину для мишеней и образцов стандарта,
C
M
(g) вычисление характеристических чисел циклов C по величинам C для того, чтобы сделать поправку на ширину любых интервалов, используемых при вычислении меры беспорядочности,
C
(h) определение исходных количеств каждой из по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты-мишени в образце посредством сравнения C мишеней и образцов стандарта.
t
3. Способ определения величины C по меньшей мере одой нуклеиновой кислоты-мишени в образце, который включает стадии:
(a) амплификация каждой из по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты-мишени, которая содержится в образце,
(b) одновременное получение сигналов, коррелирующих с амплификацией каждой из по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты-мишени,
(c) введение поправки в полученные сигналы для учета фоновых сигналов, состоящее в том, что фоновую составляющую вычитают из регистрируемых сигналов,
(d) вычисление эффективности амплификации для смежных циклов Ê(C) для каждого цикла амплификации каждой нуклеиновой кислоты-мишени, где эффективность амплификации для смежных циклов Ê вычисляют, используя
Ê(C)=[Ĩ(C+1)/Ĩ(C)]-1,
где Ê = эффективность амплификации для смежных циклов,
C = число циклов,
Ĩ = интенсивность сигнала, скорректированная с учетом фонового сигнала,
(e) вычисление меры беспорядочности M эффективности амплификации для смежных циклов Ê(C) для каждой нуклеиновой кислоты-мишени, где вычисляемую меру беспорядочности выбирают из группы, состоящей из: спектральной энтропии, остаточной ошибки полиномиальной аппроксимации кривой, подсчета пересечений нуля, вычисления энергии (RMS) после высокочастотной фильтрации
M
(f) идентификация числа циклов C, где M имеет минимальную величину для мишеней и образцов стандарта,
C
M
(g) вычисление характеристических чисел циклов C по величинам C для того, чтобы сделать поправку на ширину любых интервалов, используемых при вычислении меры беспорядочности
t
C
(h) вычисление величин C по величинам C.
C
M
C
M
4. Способ по любому из пп.1-3, где характеристические числа циклов C определяют как равные соответствующим величинам C (C=C).
M
5. Способ по любому из пп.1-3, где стадию «идентификации числа циклов C, где M минимально для каждой нуклеиновой кислоты-мишени», заменяют следующей стадией:
M
«идентификация первых чисел циклов C, где M достигает минимума для нуклеиновой кислоты-мишени и нуклеиновой кислоты для сравнения».
6. Способ по любому из пп.1-3, где полученные сигналы представляют собой сигналы флуоресценции.
7. Способ по любому из пп.1-3, где амплификацию нуклеиновых кислот определяют с помощью по меньшей мере одного из следующих: флуоресцентно меченные зонды для гибридизации, зонды для гибридизации FRET, молекулярные маяки, праймеры-“скорпионы”, праймеры Lux, зонды TaqMan, связывающиеся с ДНК красители.
8. Способ по любому из пп.1-3, где в одно и то же время анализируют более чем одну нуклеиновую кислоту-мишень в образце.
9. Способ по любому из пп.1-3, где в одно и то же время анализируют одну нуклеиновую кислоту-мишень в образце.
10. Способ по любому из пп.1-3, где все стадии осуществляют полностью автоматизированным образом, т.е. без взаимодействия с человеком.
11. Машиночитаемая среда, которая содержит инструкции для осуществления стадий с (c) по (h) способов по любому из пп.1-3.
12. Устройство для анализа образцов нуклеиновых кислот, которое содержит машиночитаемое запоминающее средство, которое содержит информацию для осуществления способов по любому из пп.1-10.