СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГИПЕРАГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR THROMBOCYTE HYPERAGGREGATION

Область применения
Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано врачами других специальностей для оценки риска развития патологического тромбообразования.
Описание изобретения
Уровень техники
Аналоги
Аналогом данного изобретения являются описанные в отечественной и иностранной литературе методы исследования функциональной активности тромбоцитов.
Применяемые в клинической практике исследования функциональной активности тромбоцитов на основании методологического подхода можно подразделить на две группы: ориентировочные и количественные.
1. Ориентировочные методы. Прямая оценка (визуальная морфофункциональная дифференциация по внешнему виду клеток) и косвенная: о функциональном состоянии тромбоцитов можно предположить по результатам исследования взаимодействия кровеносных сосудов in vivo при стандартизированных повреждениях микрососудов кожи. Методы трудоемки, субъективны, требуют специального оборудования, инвазивны и психологически травматичны для пациента.
2. Количественные методы. Функциональная активность тромбоцитов оценивается в количественных характеристиках процесса образования агрегатов тромбоцитов под действием стимуляторов. Количественные методы более информативны как с точки зрения получаемой диагностической информации, так и с точки зрения корректности качества выполнения исследований, но требуют специфической пробоподготовки, реактивов и специальной аппаратуры для стимуляции тромбоцитов с помощью индукторов агрегации и для регистрации агрегационного процесса. Кроме этих методов применяют электронно-микроскопические (изучение ультраструктуры тромбоцитов), радиоизотопные (продолжительность жизни «меченых» тромбоцитов), иммунологические (определение антитромбоцитарных антител). Методы не получили широкого применения (2, 6, 7, 8). Все перечисленные выше методы по исследованию агрегационной активности тромбоцитов объединяет повышенная сложность в организации диагностического процесса и трудоемкость в исполнении. Методы дорогостоящи, требуют специфической аппаратуры, расходных материалов для пробоподготовки и регистрации агрегационного процесса.
Прототип
Прототипом предложенного способа является унифицированный рефресный метод определения функциональной активности тромбоцитов по флуктуации светопропускания тромбоконцентрата по Born (12) на агрегометре. Преимуществом этого метода является исследование агрегации в стандартизированных условиях.
Метод дорогостоящ и трудоемок в исполнении, требует наличия специфической аппаратуры для организации и регистрации агрегационного процесса: моделирования специальных условий реологии сосудистой стенки in vitro: выделения «живого» тромбоконцентрата, количественного приведения диагностических проб тромбоцитов в соответствие с требованиями производителей диагностической аппаратуры, приобретения диагностических наборов реагентов.
Сущность изобретения
Цель изобретения заключается в разработке способа диагностики гиперагрегации тромбоцитов, не требующего специальных условий, а следовательно, и больших материальных затрат, способа, простого и удобного в практическом применении, быстрого по времени исполнения.
Способ осуществляют следующим образом.
Материалом для исследования служит венозная кровь, полученная из локтевой вены пациента стандартизированным способом вакуумной венепункции для гемостазиологических лабораторных исследований с использованием первичных тест-систем с наполнителем (9 NC 0,129М) типа Vacuteiner, Monovette, Venoject в объеме, указанном производителем для данного типа тест-систем.
Для получения бедной тромбоцитами плазмы используют стандартный протокол проведения процедуры центрифугирования для данного типа плазмы крови (центрифугирование при 3000-4000 об/мин (1200g) в течение 15 мин). Возможно использование центрифуги любой модели с достаточной величиной относительной центробежной силы центрифугирования конкретного ротора; с учетом соблюдения соответствия установки времени и условий центрифугирования (9, 11, 14).
Подготовленные таким образом анализируемые образцы исследуют для определения величины pH. (Известна доказанная зависимость функциональных и морфологических изменений клеток от pH (концентрации водородных ионов) окружающей физиологической среды (1, 3, 4, 5, 10, 13)).
Для измерения pH может быть использован любой анализатор кислотно-щелочного состояния и газового состава крови третьего поколения. Бедную тромбоцитами плазму в соответствии с инструкцией к прибору набирают в капилляры установленного производителем объема. (Объем капилляров зависит от количества пробы, необходимой для проведения pH-анализа, и указывается в Паспорте прибора; капилляры для исследования прилагаются к прибору). Процедуру pH-метрии производят в соответствии с инструкцией к прибору. Интерпретацию результатов производят на основании подсчета диагностического индекса.
Диагностический индекс получен путем математической обработки результатов pH-метрии и степени агрегации тромбоцитов методом кластерного и пошагового дискриминантного анализа с помощью пакета прикладных программ «Квазар-Плюс». Выведено решающее правило
Д=const1×PPP-const2,
где Д - диагностически значимый индекс,
PPP - значение показателя pH бедной тромбоцитами плазмы исследуемого пациента,
const1=18,877,
const2=139,381.
При Д менее - 0,25 делают достоверное заключение (p<0,001) о гиперагрегации тромбоцитов.
При Д более - 0,25 делают достоверное заключение (p<0,001) об отсутствии признаков гиперагрегации тромбоцитов.
Предлагаемый способ дает вероятность правильного выявления здоровых в 96% и больных в 80% случаев при уровне значимости P<0,001.
Чувствительность алгоритма к наличию гиперагрегации тромбоцитов составляет 96,0%, специфичность 80,3%.
Эффективность метода составляет -88,15%.
Примеры
Пример 1. Больная Г., 32 лет. Соматически ВСД по гипертоническому типу. В анамнезе сверхранние оперативные роды в 26-27 недель беременности в 2009 г. в связи с тяжелой преэклампсией. Ребенок, родившийся весом 970 гр, умер в 2 мес. Направлена на обследование в лабораторию ФГУ "НИИ ОММ Росмедтехнологий" в связи с планированием беременности с консультативного приема акушером-гинекологом научно-консультативной поликлиники института.
Проведено исследование pH бедной тромбоцитами плазмы, которое составило 7,331. Диагностический индекс Д, вычисленный по формуле Д=const1×PPP-const2 (Д=18,877×7,331-139,381), равен 0,994; что указывает на наличие гиперагрегации тромбоцитов. Для верификации результата проведено исследование унифицированным методом по Born на агрегометре. Агрегация тромбоцитов с АДФ (2,5 мкмоль/л): степень 98,7%, скорость 98%/мин, время 8 мин, двухфазная кривая. Выявлена гиперагрегация тромбоцитарного звена гемостаза: Что подтверждает правильность диагностического индекса.
Для профилактики неполноценной инвазии трофобласта и явлений гиперкоагуляции в межворсинчатом пространстве пациентке была назначена антиагрегантная терапия.
Пример 2. Больная Ш., 38 лет (история болезни №489/532). В анамнезе первичное бесплодие в течение 15 лет. Соматически хронический холецистопанкреатит, хронический бронхит, хронический пиелонефрит, мочекаменная болезнь, распространенный остеохондроз, поливалентная аллергия, хроническая никотиновая интоксикация.
Обратилась на консультативный прием отделения ЭКО ФГУ "НИИ ОММ Росмедтехнологий" по поводу длительного бесплодия.
Проведено исследование рН бедной тромбоцитами плазмы, которое составило 7,359.
Диагностический индекс Д, вычисленный по формуле Д=const1×PPP-const2 (Д=18,877×7,359-139,381), равен -0,465, что указывает на наличие гиперагрегации тромбоцитов.
Для верификации результата проведено исследование унифицированным методом по Воrn на агрегометре. Агрегация тромбоцитов с АДФ (2,5 мкмоль/л): степень 123,5%, скорость 97%/мин, время 10 мин, монофазная кривая. Выявлена гиперагрегация тромбоцитарного звена гемостаза. Что подтверждает правильность диагностического индекса. Пациентке было проведено лечение бесплодия методом вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО-ПЭ и ИКСИ).
Для профилактики осложнений и исходов беременности женщин с тромбофилией пациентке была подобрана адекватная антикоагулянтная, антиагрегантная терапия с первого триместра беременности.
Пример 3. Больная З. (история болезни №3469). Поступила в отделение ОПБ ФГУ "НИИ ОММ Росмедтехнологий" на плановую повторную госпитализацию с диагнозом: беременность 23-24 н. В анамнезе привычное невынашивание. В сроке (17-18 н.) проведен циркляж шейки матки мерсиленовой лентой, угроза выкидыша. На момент осмотра состояние удовлетворительное, жалоб нет.
Проведено исследование pH бедной тромбоцитами плазмы, которое составило 7,372.
Диагностический индекс Д, вычисленный по формуле Д=const1×PPP-const2 (Д=18,877×7,372-139,381), равен - 0,219; что указывает на отсутствие признаков гиперагрегации тромбоцитов.
Для верификации результата проведено исследование унифицированным методом по Воrn на агрегометре. Агрегация с АДФ (2,5 мкмоль/л.): степень 78,85%, скорость 55,4%/мин, время 10 мин, нормальный тип кривой. Патология тромбоцитарного звена гемостаза не выявлена. Что подтверждает правильность диагностического индекса.
Пациентке проведена комплексная терапия привычного невынашивания беременности. Женщина в удовлетворительном состоянии с прогрессирующей маточной беременностью выписывается домой.
Таким образом, предлагаемый способ диагностики гиперагрегации тромбоцитов позволяет с высокой точностью проводить оценку состояния тромбоцитарного звена гемостаза и выявлять группу риска на развитие тромбофилии (доказано, что в основе развития сосудистой катастрофы любой локализации лежит повышенная агрегационная способность тромбоцитов); позволяет своевременно решить вопрос о необходимости проведения комплексного параклинического обследования с последующей терапевтической коррекцией выявленных нарушений, особенно на начальных стадиях заболевания.
Данный способ диагностики может быть предложен для широкого применения.
Способ не требует дорогостоящей материально-технической базы, специальных реактивов, удобен в исполнении при использовании минимального количества исследуемого материала, обеспечивает получение необходимой информации в течение часа с момента забора крови пациента, воспроизводим в лаборатории любого уровня.
Источники информации
1. Абрамочкина И.Г. Клиническая оценка морфологических особенностей эритроцитов мочи у детей с гематурией различного генеза: Автореф. дис.…канд. мед. наук, - Самара, 1998 г.
2. Баркаган З.С., Мамот А.П. Диагностика и контролируемая терапия нерушений гемостаза, - М.: Ньюдиамед - АО, - 2001. - С.296.
3. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика - М.: Мир, - 1991. - С.347-373.
4. Джорджеску П., Пэунеску Е. Биохимические методы диагноза и исследования. - Бухарест, - 1963. - 84-106.
5. Делевский Ю.П. Влияние pH среды на агглютинирующую способность анти-а-моноклональных антител и их ингибирование а-гликоконъюгатами липидной и протеиновой природы с разными изоэлектрическими свойствами // Клин. лаб. диагн. - 2008. - №8. - С.29-32.
6. Иванов Е.П. Диагностика нарушений гемостаза (Практическое пособие для врачей) - Мн.: Беларусь, - 1983. - С.107-119.
7. Козловская Л.В., Николаев А.Ю. Учебное пособие по клиническим лабораторным методам исследования - 2-е изд - М.: Медицина - 1984, с.88-98.
8. Меньшиков В.В., Делекторская Л.Н., Золотницкая Р.П. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник под ред. В.В.Меньшикова - М.: Медицина - 1987. - С.152-154.
9. Мошкин А.В., Долгов В.В. Обеспечение качества в клинической лабораторной диагностике - М. - 2004. - С.14-23, 38-39.
10. Холманских Н.А., Пестряева Л.А. Диагностика функциональных нарушений сосудисто-тромбоцитарного звена гемостаза при беременности // Мать и дитя: мат. Х юбилейного Всерос. Форума. - М. - 2009. - С.227.
11. ISO 151189:2003. Медицинские лаборатории - специфические требования к качеству и компетентности (проект русского варианта). Стандартизация в клинической лабораторной медицине. Организационные и метрологические аспекты - М. - 2005. - С.37-105.
12. Born C.V.R. // Nature. - 1962. - Vol.189, N 1-2. - Р.927-929.
13. Marchetti P. Et al. // Diabetologia. - 1986. - Vol.29, N10. - P.695-698.
14. NCCLS, document H18-A2. Procedures for the Handing and processing of Blood Specimens, 2nd Ed, Approved Guideline, NCCLS, 1999.