СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ РЕАКТИВНОСТИ МИТОХОНДРИЙ ЧЕЛОВЕКА ПОД ДЕЙСТВИЕМ ПРЕПАРАТОВ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО РЯДА В ПРОБАХ in vitro
METHOD FOR DETERMINING INDIVIDUAL RESPONSIVENESS OF HUMAN MITOCHONDRIA UNDER ACTION OF METABOLIC PREPARATIONS IN TESTS in vitro

Изобретение относится к области медицины, может быть использовано в терапии и кардиологии.
Оптимизация функций митохондрий обеспечивает эффективное лечение различных заболеваний [Асташкин Е.И. Коррекция энергетического обмена в миокарде - новое направление в лечении сердечно-сосудистых заболеваний // Сердце и метаболизм. 2008. - №21. - С.1-3.; Хазанов В.А., Васильев К.Ю. Возрастные особенности гепатопротекторного действия митохондриальных субстратов при стрессе и интоксикации // Бюллетень эксперим. биологии и медицины. - 2005. - приложение 1. - С.54-60], в связи с чем разрабатываются средства, направленные на индивидуальное регулирование митохондриальных процессов, что является предметом ряда изобретений [Элбакидзе Г.М., Элбакидзе А.Г. Средство тканеспецифического регулирования митохондриальных процессов и его применение при лечении заболеваний (варианты). Патент на изобретение №2304978, опубликовано 27.08.2007; Карсанов Н.В., Сукоян Г.В., Татулашвили Д.Р., Карсанов З.Н., Карсанов В.Н. Антигипоксическое и антиангинальное средство. Заявка на изобретение №94011780, опубликовано 10.07.1996; ЧэньЧиэнь-Хунг. Новая композиция для лечения метаболического синдрома. Патент на изобретение №2486902, опубликован 10.07.2013]. О функции митохондрий можно судить по уровню тканеспецифических ферментов в крови человека [Курашвили Л.В. Булавкин Ю.В. Способ диагностики нарушений энергообразования в митохондриях. Патент на изобретение №2465599, опубликовано 27.10.2012], что, однако, не является показателем интегральным.
Прототипом настоящего изобретения является способ количественной оценки биоэнергетических процессов человека и их коррекции при разных заболеваниях [Гулидова Г.П. Способ количественной оценки биоэнергетических процессов человека и их коррекции при разных заболеваниях. Заявка на изобретение №2010146389, опубликовано 20.05.2012]. Согласно прототипу количественную оценку биоэнергетических процессов человека определяют in vitro путем воздействия на суспензию изолированных из тканей животных митохондрий сывороткой крови пациента, затем полярографическим методом определяют интенсивность потребления кислорода митохондриями и образования АТФ в двух дыхательных цепочках - «сукцинатной», когда субстратом окисления является янтарная кислота, и НАД-зависимой, по разнице измеряемых параметров определяют степень нарушения соответствующих биоэнергетических показателей и выявляют нарушенное звено метаболизма, после чего на митохондрии с нарушенной таким образом функцией воздействуют препаратами с известными механизмами действия, которые потенциально могут ликвидировать предполагаемую причину нарушений, при этом в случае восстановления функциональной активности митохондрий количественно оценивают состояние процессов окисления и образования энергии у пациента и согласно полученным биохимическим данным разрабатывают способы персональной коррекции биоэнергетического обмена у человека, а по разнице параметров, измеряемых до и после лечения пациента, оценивают полноту нормализации его биоэнергетических процессов.
Недостатками прототипа являются, во-первых, методологическая сложность выполнения, состоящая из нескольких этапов, и, во-вторых, необходимость привлечения экспериментальных животных, что снижает достоверность результатов персонализации фармакотерапии у человека.
Задачей предлагаемого изобретения является определение индивидуальной реактивности митохондрий человека под действием препаратов метаболического ряда в пробах in vitro с целью последующего персонального выбора лекарственного препарата для лечения пациентов.
Предлагаемый способ определения индивидуальной реактивности митохондрий человека под действием препаратов метаболического ряда на основании изучения реакции митохондрий человека на введение метаболически активных лекарственных средств в пробах in vitro позволяет определять их потенциальное активирующее либо угнетающее действие на энергообмен. Применение предлагаемого способа в клинической практике позволит проводить индивидуальный выбор лекарственного препарата из группы метаболических корректоров, что приведет не только к сохранению здоровья человека, но и к определенному экономическому результату (в виде экономии финансовых средств на покупку ненужных препаратов).
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ определения индивидуальной реактивности митохондрий человека под действием препаратов метаболического ряда в пробах in vitro, включающий исследование крови и определение величины флюоресценции митохондрий как в исходном статусе, так и при добавлении к образцу крови in vitro исследуемого препарата в дозе, эквивалентной разовой дозе, рекомендуемой пациенту, с последующим расчетом показателей прироста величин флюоресценции по формуле:
метаболический препарат
метаболический препарат
исходн.
исходн.
∆F=(F-F)/F,
метаболический препарат
исходн.
метаболический препарат
метаболический препарат
где ∆ F- прирост флюоресценции митохондрий под действием метаболического препарата, F- флюоресценция митохондрий в исходном статусе, F- флюоресценция митохондрий при добавлении к образцу крови лекарственного препарата метаболического ряда. При значении показателей прироста (∆F)>0 делают заключение об активации митохондрий под влиянием метаболического препарата у конкретного пациента; при значении данных показателей <0 делают заключение об угнетении функционирования митохондрий под влиянием препарата метаболического ряда у конкретного пациента.
Указанный способ основан на визуализации флюоресценции митохондрий, который выполняют с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (lsCM - laserscanningConfocalMicroscopy, КЛСМ) [Methodsincellbiology. Vol.70. Cell biological applications of confocal microscopy. 2-nd ed. Ed. B.Matsumoto. Acad.Press. - 2002.- 507 p.]. Благодаря устройству современных lsCM-микроскопов используют широкий набор спектральных линий когерентного освещения и становится возможной параллельная регистрация флюоресценции с различными длинами волн, одновременно разделяющая сигналы нескольких флуоресцентных красителей на одном образце. Метод позволяет визуализировать объект в объеме, наблюдать процессы непосредственно внутри клетки. Высокая скорость сканирования обеспечивает получение данных в динамике по времени, что важно для регистрации физиологических процессов в клетках.
Способ осуществляют следующим образом.
Лейкоциты отбирают из цельной крови после центрифугирования. Для каждой пробы подготавливают 5 препаратов: контроль с пиреном, т.е. клетки, которые не подвергают инкубации, и опытные препараты - лейкоциты, к которым добавляют тестируемые лекарственные вещества метаболического ряда, например триметазидин, милдронат, цитофлавин, фосфокреатин, окрашенные пиреном.
16
10
Пирен - химическое соединение с формулой CH, полициклический ароматический углеводород. Белое кристаллическое вещество. Растворим в этаноле, диэтиловом эфире, бензоле, не растворим в воде. В растворенном состоянии флюоресцирует голубым цветом. Установлено, что пирен способен связываться с фосфолипидами мембран [Doolittle M.H., Reue K. Lipase and phospholipase protocols // HumanaPress. - 1999. - 109 p.]. При этом в спектре флюоресценции пирена, встроенного в мембрану, обнаруживаются 3 пика (в области 370-390 нм), характерные для мономерной формы пирена, и один пик (в области 460-470 нм), характерный для эксимерапирена - димера, состоящего из одной возбужденной и одной невозбужденной молекулы зонда. Поэтому этот флюоресцентный зонд может быть использован для определения структурно-функционального состояния мембран энергетической системы клетки - митохондрий, в частности их текучесть и погруженность [Doolittle M.H., Reue K. Lipase and phospholipase protocols // HumanaPress. - 1999. - 109 p.].
Пирен готовят в концентрации 0,0006 г пирена в 100 мл спирта. Из клеток, инкубированных в плазме с лекарственными веществами, готовят мазки. Препараты окрашивают пиреном в темноте в течение 30 минут. После чего препараты исследуют при помощи КЛСМ. В каждом мазке исследуют по 10 клеток, для которых определяют интенсивность флюоресценции (в условных единицах).
Пример использования способа
В ходе исследования использовали конфокальный лазерный сканирующий микроскоп NikonEclipseTi. Сканирование осуществляли при длине волны 460 нм. Для визуализации изображения использовали специализированную программу Nikon С1.
Исследование было выполнено у 61 больного со стабильной стенокардией напряжения в динамике лечения: неотон исследовали у 56 пациентов, триметазидин - у 56 человек, милдронат - у 56 больных и цитофлавин - у 48 пациентов (у большинства пациентов тестировали сразу несколько препаратов).
Обнаружили два варианта реагирования митохондрий лейкоцитов пациентов с ИБС на введение метаболических корректоров - в виде их активации либо угнетения. На фигурах 1, 2, 3, 4, 5 показано, что у одного и того же пациента П., 58 лет, наблюдается различная реакция митохондрий на введение лекарственных препаратов метаболического ряда: на фоне неотона и милдроната - усиление интенсивности свечения, а на фоне триметазидина и цитофлавина - уменьшение флюоресценции. А именно на фигуре 1 показана флюоресценция митохондрий лейкоцитов крови пациента П., 58 лет, в исходном статусе, т.е. краситель - пирен, 298,4 усл.ед. На фигуре 2 - флюоресценция митохондрий лейкоцитов крови пациента П., 58 лет, после введения в пробу неотона, т.е. краситель - пирен, 424,3 усл.ед. На фигуре 3 -флюоресценция митохондрий лейкоцитов крови пациента П., 58 лет, после введения в пробу милдроната, т.е. краситель - пирен, 354,5 усл.ед. На фигуре 4 - флюоресценция митохондрий лейкоцитов крови пациента П., 58 лет, после введения в пробу триметазидина, т.е. краситель - пирен, 172,9 усл.ед. На фигуре 5 - флюоресценция митохондрий лейкоцитов крови пациента П., 58 лет, после введения в пробу цитофлавина, т.е. краситель - пирен, 292,3 усл.ед.
неотон
милдронат
триметазидин
цитофлавин=
При определении величины флюоресценции митохондрий вычисляли среднюю величину из показателей свечения 10 лейкоцитов крови пациента. Прирост флюоресценции у пациента П., 58 лет, составил: ∆F=(424,3-298,4)/298,4=0,42; ∆F=(354,5-298,4)/298,4=0,18; ∆F=(172,9-298,4)/298,4=-0,42; ∆F(292,3-298,4)/298,4=-0,02. По величине ∆F судили не только о характере влияния препаратов на функциональную активность митохондрий (активация либо угнетение), но и о силе влияния метаболического корректора на энергетическую систему клетки. Так, у пациента П., 58 лет, наиболее сильное влияние на энергообмен оказывают неотон (активируя его) и триметазидин (угнетая), в то время как милдронат действует умеренно положительно, а цитофлавин практически не изменяет энергетический обмен клетки.
Заявляемый способ позволяет определить индивидуальную чувствительность пациента к тому или иному препарату и в последующем проводить персонализированный выбор наиболее подходящего метаболического корректора для эффективного лечения пациентов с ишемической болезнью сердца.