Анализ инфекций, переносимых клещами, в Республике Алтай

Анализ инфекций, переносимых клещами, в Республике Алтай

А.Е. Гришечкин1

1ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России 2Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН, Новосибирск

3 Управление Роспотребнадзора по Республике Алтай, г. Горно-Алтайск 4ГОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет» Росздрава

Резюме

Для оценки эпидемической опасности природного очага клещевого энцефалита проведен анализ имаго 404-х иксо-довых клещей, собранных с растительности весной 2007 года в Республике Алтай. Детекцию ДНК боррелий, эрли-хий и анаплазм проводили с применением лицензированных ПЦР-тест-систем производства ООО «Омникс»

Analysis of Infections Transmitted by Ticks in the Altai Republic

А.Е. Grishechkin1

1D.I. Ivanovsky Institute of Virology of Russian Ministry of Health Care and Social Development

2Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk 3'Territorial Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Well-Being of the Republic of Altai, Gorno-Altaisk 4The Irkutsk State Medical University of Russian Ministry of Health Care and Social Development Abstract

For epidemiological estimations 404 imago of ixodid ticks collected from vegetation in spring2007 in Altay region have been analyzed. Borrelia, Ehrlichia and Anaplasma spp. DNA were detected by using PCR-based detection system ООО «Omnix» (Saint Peterburg, Russia). DNA of Borrelia burgdorferi sensu lato complex were revealed in 20.9 ± 2.0% of samples studied. DNA of Ehrlichia chaffeensis -ethiological agent of human monocytic ehrlichiosis - in 5.2 ± 1.1% tick suspensions. DNA of Anaplasma phagocytophilum - human granulocytic anaplasmosis - in 1.5 ± 0.6%. Infection of ixodid ticks with the tick-borne encephalitis virus (TBEV) was studied by means of ELISA for the TBEV E antigen («VectoVKE-antigen», «Vector-Best», Novosibirsk). From 402 analyzed tick suspensions from Ixodes persulcatus Schulze 68 samples appeared to be positive in ELISA (16.9 ± 1.9%). In ticks Haemaphysalis concinna Koch Borrelia, Ehr-lichia, Anaplasma DNA and the TBEV antigen E were not detected. Mixed infections of B. burgdorferi s.l. and the TBEV were found in 2.96 ± 1.62% ticks, B. burgdorferi s.l. and Ehrlichia chaffeensis - in 1.74 ± 1.27%, B. burgdorferi s.l. and Anaplasma phagocytophilum - in 0.51 ± 0.71%, that coincided with theoretical estimations based on the suggestion about independent distribution of the infection agents among ixodid ticks (3.5, 1.1 и 0.3% respectively). Key words: lime disease, spirochetes of Borrelia burgdorferi sensu lato complex, human granulocytic anaplasmosis, Anaplasma phagocytophilum, human monocytic ehrlichiosis, Ehrlichia chaf-feensis, tick-borne encephalitis virus, PCR, ELISA

Введение

Клещи как переносчики инфекционных заболеваний человека находятся на втором месте после комаров. В настоящее время известно более 20-ти инфекционных агентов (бактерии, вирусы и простейшие), переносимых клещами.

Одними из наиболее изученных инфекций, передающихся клещами, являются иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ). Возбудители ИКБ у людей -спирохеты комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.). До настоящего времени специфической профилактики ИКБ не существует, несмотря на мно-

гочисленные попытки создания рекомбинантных субъединичных вакцин в США и Западной Европе. В компании «ГлаксоСмитКляйн» (США) была разработана вакцина LYMErix на основе антигена OspA (outer surface protein A) [3, 9]. Клинические испытания рекомбинантной вакцины показали ее имму-ногенность для большинства взрослых добровольцев и всех детей, но при этом иммунизация приводила к аутоиммунным осложнениям и патологиям суставов. Поэтому попытки создания новых вакцин основаны на использовании других антигенов бор-релий - рекомбинантных белков OspC и гликопро-теинов [3, 4, 6, 9].

Методы детекции боррелий включают культивирование in vitro, темнопольную или флуоресцентную микроскопию, иммуноферментный анализ (ИФА) и ПЦР с электрофоретической или гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов реакций. Лечение ИКБ основано на применении антибиотиков (тетрациклина, доксициклина, амоксициллина, пенициллина или цефтриаксона).

В России одной из наиболее распространенных и изученных природно-очаговых инфекций является клещевой энцефалит. Для иммунизации населения на эндемичных территориях применяют шесть инактивированных формалином вакцин против КЭ. При производстве таких вакцин российские производители (Предприятие Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Московская область, и НПО «Микроген», г. Томск) традиционно используют штаммы ВКЭ дальневосточного генетического типа («Софьин» и 205 соответственно), а зарубежные фирмы Baxter (Австрия) и Novartis (Германия) - европейские штаммы «Найдорф» и К23 соответственно. Детекцию ВКЭ можно проводить при помощи разнообразных традиционных вирусологических методов: заражения пермиссивных культур клеток или мышей-сосунков, реакции гемагглюти-нации и реакции торможения гемагглютинации, -а также молекулярно-биологических методов - обратной транскрипции с ПЦР и иммуноферментного анализа. Лечение клещевого энцефалита основано на применении специфического иммуноглобулина из сывороток крови доноров, препаратов интерфе-ронового ряда - виферона, реаферона-ЕС-липинта (человеческий рекомбинантный интерферон аль-фа-2 и альфа-2Ь), индукторов интерферона - лари-фана, неовира, тилорона, амиксина, циклоферона, ремантадина, ридостина, камедона, йодантипири-на, цитофлавина, энериона, маннитола, ноотропи-ла, пентоксифиллина и др.), а также рибонуклеазы А из поджелудочной железы быка. Дополнительно назначаются искусственная вентиляция легких при нарушении сознания, панангин при нарушениях ритма и проводимости, а также общеукрепляющие растворы глюкозы.

При смешанных инфекциях (ВКЭ + боррелии) дополнительно назначаются антибиотики амокси-циллин, доксициклин, цефтриаксон,азитрокс и би-циллин-5.

Анаплазмы и эрлихии являются переносимыми клещами внутриклеточными грамотрицатель-ными бактериями. Возбудитель гранулоцитар-ного анаплазмоза человека (ГАЧ) - Anaplasma phagocytophilum паразитирует на гранулоцитах периферической крови млекопитающих. Первые вакцины для профилактики анаплазмозов появились в 1998 году - Anaplaz фирмы Fort Dodge и вакцина Plazvax фирмы Mallinkrodt (новое название -Schering-Plough). Несмотря на эффективность, вакцины не получили широкого применения в силу малой заинтересованности фирм-производителей.

Экспериментальные ДНК-вакцины против эр-лихиоза были разработаны в Университете штата Флорида в 2001 году (US Patent US6251872). Клонированные в плазмидных векторах под контролем промотора и энхансера предраннего гена цитомегаловируса человека гены основных антигенов (major antigenic protein MAPI и MAP2) и вариабельных поверхностных антигенов (variable surface antigens VSA1-5) E. chaffeensis обеспечивали протективный иммунитет против Ehrlichia chaffeensis в результате внутримышечного введения мышам рекомбинантных плазмид (US Patent US6251872). До настоящего времени генные вакцины находятся на различных стадиях клинических испытаний и пока не получили разрешения на применение ни в одной из стран мира.

В настоящее время диагностика МЭЧ и ГАЧ основана на серологических методах выявления антител в крови с помощью лицензированных систем иммуноферментного анализа (ИФА): KS-020 МЭЧ-ИФА-IgM, KS-021 МЭЧ-ИФА-IgG, KS-010 ГАЧ-ИФА-IgM, KS-010 ГАЧ-ИФА-IgG, - а также на ПЦР с наборами KS-003 «Ампли-ГАЧ» и KA-004 «Ампли-МЭЧ» производства ООО «Омникс» (Санкт-Петербург). Неспецифические симптомы инфекционных заболеваний, такие как повышенная температура, головная боль, лихорадка, боли в мышцах и суставах, общая слабость, у части больных - тошнота и рвота, затрудняют диагностику и могут приводить к хро-низации инфекции из-за неверной стратегии лечения. В качестве основного терапевтического средства ГАЧ широко применяют антибиотики - доксициклин, тетрациклин, левомицетин и рифампин. На ранних стадиях МЭЧ также эффективно лечение антибиотиками тетрациклинового ряда, хлорамфе-николом, левомицетином или доксициклином.

При смешанных инфекциях (ВКЭ + эрлихии или анаплазмы) применяют антибиотики тетрациклинового ряда и хлорамфеникол, при противопоказаниях - рифампицин или левомицитин.

Цель работы заключалась в детекции борре-лий, анаплазм, эрлихий и вируса клещевого энцефалита среди имаго иксодовых клещей, собранных с растительности в Горном Алтае.

Материалы и методы

Имаго иксодовых клещей собирали с растительности на флаг в окрестностях поселка Ман-

жерок Майминского района Республики Алтай в мае 2007 года. Видовую принадлежность клещей определяли по морфологическим признакам [1]. Нуклеиновые кислоты из индивидуальных клещевых суспензий выделяли с использованием набора «РИБО-сорб» производства «ИнтерЛаб Сервис» (Москва) в соответствии с инструкцией производителя.

Иммуноферментный анализ (ИФА) клещевых суспензий выполняли с применением тест-системы «Векто ВКЭ-антиген» производства ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск), серия № 01154, в соответствии с инструкцией производителя. Измерение оптической плотности проводили на планшетном фотометре «Униплан» (производства фирмы «Пикон», Россия) при длине волны 450 нм. ИФА использован для тестирования 404 проб. Детекцию ДНК боррелий, анаплазм и эрлихий проводили посредством ПЦР с коммерческими тест-системами #КА-002-2 «Ампли-Лайм», #КБ-003 «Ампли-ГАЧ», #КА-004 «Ампли-МЭЧ» производства ООО «Омникс» (Санкт-Петербург) в соответствии с инструкцией производителя.

Результаты и обсуждение

В России заболеваемость бактериальными инфекциями, переносимыми клещами, остается высокой из-за несовершенства методов диагностики и отсутствия специфической профилактики в большинстве эндемичных областей. Так, заболеваемость ИКБ в 2007 году составила 7247 случаев, что соответствовало среднему показателю 5,09 на 100 тыс. населения. При этом в Республике Алтай показатели заболеваемости за этот год достигли 47 случаев на 100 тыс. населения и превысили средние показатели по стране более чем в 9 раз. Клещевым энцефалитом в России в 2007 году болели 3138 человек (2,2 на 100 тыс. населения). В Республике Алтай в том году было выявлено 53 слу-

чая клещевого энцефалита (25,86 на 100 тыс. населения), что более чем в 10 раз превысило средние показатели по стране. В РФ тогда же зарегистрировано 1745 случаев клещевого риккетсиоза, или 1,22 случая на 100 тыс. населения, в Республике Алтай - 145 случаев, или 70,76 на 100 тыс. населения, что в 2,7 раза выше, чем по России.

В Республике Алтай выявлено 10 видов иксо-довых клещей, 90 видов млекопитающих и 300 видов птиц, участвующих в циркуляции инфекционных агентов, переносимых клещами [2]. Обилие фауны Горного Алтая может создавать напряженность очагов инфекций, передающихся клещами, и обуславливать высокую заболеваемость населения. По данным за 1995 - 2007 годы, в Республике Алтай в структуре инфекций, переносимых клещами, ведущее место занимал клещевой риккетсиоз (68 ± 1,7% случаев), второе - клещевой энцефалит (25,6% ± 1,6%), третье - иксодовый клещевой бор-релиоз (6,1 ± 0,9%), четвертое место - гранулоци-тарный анаплазмоз человека (0,3 ± 0,16%) [2].

Среди имаго иксодовых клещей, собранных с растительности в окрестностях поселка Манже-рок в мае 2007 года, преобладали таежные клещи Ixodes persulcatus Schulze. Всего исследовано 402 образца I. persulcatus Schulze и два образца Haemaphysalis concinna Koch. ДНК боррелий комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato обнаружены в 20,8 ± 2,0% исследованных образцов; ДНК возбудителя моноцитарного эрлихиоза человека (МЭЧ) - Ehrlichia chaffeensis - в 5,2 ± 1,1% проб; ДНК Anaplasma phagocytophilum - гранулоцитар-ного анаплазмоза человека (ГАЧ) - в 1,5 ± 0,6%; антиген вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) -в 16,9 ± 1,9% проб (рис. 1а).

Смешанные формы инфекций B. burgdorferi s.l. и ВКЭ выявлены в 2,96 ± 1,62% образцов клещей, B. burgdorferi s.l. и Ehrlichia chaffeensis -в 1,74 ± 1,27%, B. burgdorferi s.l. + Anaplasma

Рисунок 1.

Частота встречаемости «клещевых» инфекций (в том числе и случаев смешанных инфекций) в клещах из природного очага в окрестностях поселка Манжерок Майминского района Республики Алтай

Anaplasma phagocytophilum

Ehrlichia chaffeensis

B. burgdorferi s.l.

ВКЭ

Б

Смешанная инфекция ВКЭ + Anaplasma phagocytophilum Смешанная инфекция ВКЭ + Ehrlichia chaffeensis Смешанная инфекция ВКЭ + B. burgdorferi s.l. Смешанная инфекция B. burgdorferi s.l.+ Anaplasma phagocytophilum Смешанная инфекция B. burgdorferi s.l.+ Ehrlichia chaffeensis

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

%

1

I

0 5 10

%

Примечание: Доля клещей, содержащих ДНК B. burgdorferi s.l ошибка (%, ±).

Ehrlichia chaffeensis, Anaplasma phagocytophilum и антиген ВКЭ (в %);

б

а

phagocytophilum - в 0,51 ± 0,71%, что соответствует теоретическим оценкам, основанным на предположении о независимом распределении этих инфекционных агентов среди иксодовых клещей (см. рис. 1б).

Клещевой энцефалит (КЭ). Регистрация клещевого энцефалита в Республике Алтай проводится с 1950 года (рис. 2). Заболеваемость носит сезонный характер и регистрируется со второй декады апреля по август [2]. Показатель заболеваемости в 2007 году составил 25,86 на 100 тыс. населения. С 1992 года здесь проводятся исследования вирусофорности отдельных особей клещей методом ИФА. За 16 лет наблюдений (1992 - 2007 гг.) антиген Е ВКЭ у клещей, снятых с людей, детектировали в 13 ± 2% случаев.

Индивидуальная инфицированность собранных с растительности клещей ниже, чем у клещей, снятых с людей, и составляет 7,8 ± 1,9%. Однако, по результатам наших исследований, в природном очаге в окрестностях поселка Манжерок уровень вирусофорности клещей оказался существенно выше и составил 16,9 ± 1,9%. Отличия сред-немноголетнего уровня инфицированности иксо-довых клещей объясняются неоднородностью распределения ВКЭ в природных популяциях эндемичных территорий (Майминский район - один из самых неблагополучных районов по «клещевым» инфекциям в Республике Алтай).

Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ). Регистрация ИКБ в Республике Алтай ведется с 1997 года. Средняя заболеваемость ИКБ за 2004 - 2007 годы составляла 10,4 ± 4,3 на 100 тыс. населения (рис. 3). Диагноз первоначально устанавливали на основании клинических данных. Лабораторная диагностика ИКБ введена в 2004 году. Всего за 1997 - 2007 годы в республи-

ке ИКБ перенесли 164 человека. Исследование сывороток крови людей методом ПЦР выявило, что на данной территории циркулируют два вида бор-релий - B. garinii и B. afzelii [2], что совпадало с данными молекулярного типирования видов комплекса B. burgdorferi s.l. для большинства эндемичных областей России [5, 7, 9].

Моноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ). Впервые масштабное исследование на моноцитарный эрлихиоз было проведено в 2007 году в вирусологической лаборатории ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Республике Алтай». Для определения IgM и IgG МЭЧ применяли тест-систему производства ООО «Омникс». Из 123-х исследованных парных сывороток четыре (3,3 ± 3,1%) содержали антитела к МЭЧ. Во всех четырех случаях больные перенесли смешанную инфекцию: у одного человека МЭЧ сочетался с клещевым сыпным тифом, у второго - с клещевым энцефалитом, у третьего - с ИКБ и ГАЧ, у четвертого - с ИКБ, клещевым сыпным тифом и ГАЧ.

Гранулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ). Первые случаи этого заболевания были зарегистрированы в республике в 2004 году. Тогда сыворотки крови 29 человек, заболевших после присасывания клеща, были впервые исследованы на ГАЧ методом ИФА в Омском НИИ природно-очаговых инфекций. Из 29-ти исследованных сывороток положительными оказались три [2]. За 2005 - 2007 годы было исследовано 706 парных сывороток от больных «клещевыми» инфекциями, 41 из них (5,8 ± 1,7%) содержала антитела к ГАЧ. Как моноинфекция ГАЧ зарегистрирован только у шести больных. На территории Республики Алтай ДНК A. phagocytophilum была выявлена в клещах одного вида - I. persulcatus, но анализ заболеваемости показал, что заражение гранулоци-

Рисунок 2.

Динамика заболеваемости клещевым энцефалитом в Республике Алтай

i

(U ^

(U

0 л

1

о .о I-

о

0

л

1 .о I-

о о

2

л со

tu ^

о ю л со

50 40 -30 -20 -10 -

Годы

Рисунок 3.

Динамика заболеваемости клещевым энцефалитом в Республике Алтай

аз аз со аз с; о VO о <В о

со

аз

I

18 16 -14 12 -10 -8 6 4 2 0

# # # с?4 # # ^ # # ^ ^ ^ ^ ф> ф> ф> ф> ф> ф> ф> ф>

Годы

тарным анаплазмозом происходило по всей территории республики, даже в тех районах, где эти клещи не встречались.

Распространенность смешанных инфекций.

В 2007 году всего инфекциями, переносимыми клещами, переболели 220 человек. Как моноинфекция клещевой энцефалит был диагностирован у 34 больных (15,4 ± 4,8%), клещевой сыпной тиф - у 133 (60,4 ± 6,5%), иксодовый клещевой боррелиоз - у 16 (7,3 ± 3,4%), гранулоцитарный анаплазмоз - у 3 больных (1,4 ± 1,5%). У 34 человек (15,5 ± 4,8%) обнаружены антитела к нескольким возбудителям: ВКЭ и риккетсии - у 8 человек, риккетсии и боррелии - у 7, ВКЭ и бор-релии - у 4, риккетсии и анаплазмы - у 2, риккетсии, боррелии и анаплазмы - у 2, ВКЭ, боре-лии, риккетсии, анаплазмы и эрлихии - у 2 человек, остальные девять вариантов смешанных инфекций - по 1 случаю. Из 34 больных со смешанными формами инфекций, переносимых клещами, 23 человека отмечали присасывание только одно-

го клеща, 4 - двух, 2 человека снимали с себя ползающих клещей, а множественные присасывания были лишь у 5 человек.

Смешанные инфекции наиболее распространены на севере Республики Алтай (30 ± 5% от общего числа больных «клещевыми» инфекциями), в то время как для остальной части республики их доля равна 8 ± 2% (Р < 0,05). Поскольку северные таежные районы Алтая являются ареалом клещей I. регзиСаЮэ, обнаружение у трети больных смешанных инфекций может указывать на вероятность высокой частоты микст-инфицирования таежных клещей (см. рис. 1б).

Однако высокая частота смешанных инфекций среди больных намного превышает теоретические оценки, основанные на гипотезе о независимом распределении патогенов, и выше аналогичных показателей для клещей (см. рис. 1б), что, возможно, свидетельствует о клинических проявлениях инфекций преимущественно у лиц с врожденными или приобретенными иммунодефицитами. ш

Литература

1. Коклягина А.Т. Географическое распределение иксодовых клещей в Алтайском крае / Материалы к краевой конференции микробиологов, эпидемиологов и инфекционистов по природно-очаговым заболеваниям в Алтайском крае. - Барнаул, 1967. С. 31 - 37.

2. Щучинова Л.Д. Эпидемиологический надзор и контроль инфекций, передающихся клещами, в Республике Алтай: Автореф. дис. ... к.м.н. -Омск, 2009.

3. Abbott A. Lyme disease: uphill struggle // Nature. V. 439. P. 524 - 525. doi:10.1038/439524a

4. Alverson J., Bundle S.F., Sohaskey C.D. et al. Transcriptional regulation of the ospAB and ospC promoters from Borrelia burgdorferi // Mol. Microbiol. 2003. V. 48 (6). P. 1665 - 1677.

5. Baranton G., Postic D. Multi Locus Sequence Analysis (MLSA) as alternative to Whole DNA/DNA hybridization (WDDH) in Borrelia burgdorferi sensu lato taxonomy. Chapter in the book «Molecular Biology of Spirochetes». NATO Science series: life and behavioral sciences. Edi-

tors: F.C. Cabello, D. Hullnska and H.P. Hodfrey. October 2006. V. 373. P. 135 - 145.

Earnhart C.G., Marconi R.T. An octavalent Lyme disease vaccine Induces antibodies that recognize all incorporated OspC type-specific sequences // Hum. Vaccin. 2007. V. 3 (6). P. 281 - 289.

Morozova O., Rar V., Igolkina Y., Dobrotvorsky A. et al. Infection of Ixodid Ticks, Mosquitoes and patients with Borrelia, Bartonella, Rickettsia, Anaplasma, Ehrlichia and Babesia in Western Siberia, Russia / In book: Molecular biology of spirochetes. NATO Science Series: life and behavioural sciences. Editors.: F.C. Cabello, D. Hulinska and H.P. Godfrey, IOS Press, 2006. V. 373. P. 221 - 231.

Rar V.A., Fomenko N.V., Dobrotvorsky A.K. et al. Tickborne pathogen detection, Western Siberia, Russia // Emerg. Infect. Dis. 2005. V. 11 (11). P 1708 - 1715. on-line http://www.cdc.gov/ncidod/EID/vol-11no11/04-1195.htm

Pozsgay V., Kubler-Kielb J. Synthesis of an experimental glycolipopro-tein vaccine against Lyme disease // Carbohydr. Res. 2007. V. 342 (3-4). P. 621 - 626.

9