СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО РАКА ЖЕЛУДКА
METHOD OF INDUCED GASTRIC CARCINOMA SIMULATION

Изобретение относится к медицине, к экспериментальной онкологии и может быть использовано для изучения в экспериментальных условиях механизмов желудочного канцерогенеза и разработки новых методов лечения рака желудка, в частности метастатического рака желудка.
Экспериментальное моделирование рака желудка имеет большое значение в изучении механизмов желудочного канцерогенеза и разработке новых методов лечения этой патологии. Многие способы экспериментального моделирования рака желудка связаны с высокой стоимостью проводимых исследований, требуют дорогостоящего оборудования, сложны в техническом отношении. По этой причине модель экспериментального рака желудка, полученная путем прививки ксенографтов (клеток рака желудка) иммунодефицитным животным, в настоящее время используется исключительно для определения чувствительности опухолевых клеток к различным цитотоксическим факторам [8]. Способ моделирования рака желудка путем инфицирования подопытных животных культурой Helicobacter pylori или сочетанным введением бактериальной культуры и химических канцерогенов [7, 9, 11] также существенно ограничен в применении по причине очень высокой стоимости метода, технических сложностей культивирования Helicobacter pylori и невозможности индуцировать метастатический рак желудка.
Среди экспериментальных моделей широко распространены способы индукции рака желудка с использованием химических канцерогенов. Известны способы моделирования рака желудка у мышей путем перорального введения полициклических ароматических углеводородов, таких как бензпирен, метилхолантрен, дибензантрацен [4, 5, 15]. Главным недостатком указанных способов является то, что с их помощью возможно моделировать только плоскоклеточный рак преджелудка. Опухоли возникали лишь у мышей определенных линий и не давали метастазов. Получить железистый рак желудка указанными способами не удавалось.
Из всех известных химических канцерогенов, используемых для экспериментального моделирования рака желудка, наиболее широко используют N-нитрозосоединения [13, 14, 15, 16], в частности N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидин (МННГ) [1,6].
В качестве прототипа выбран модифицированный способ [3], при котором подопытным крысам внутрижелудочно вводили по 1,0-2,0 мл водного раствора ММНГ (5 мг/мл) в течение 2-3 дней. Введения повторяли каждые 4-10 дней в зависимости от состояния животного на протяжении 25 недель. Способ позволяет получить злокачественные опухоли желудочно-кишечного тракта у 100% подопытных животных через 25 недель от начала введения препарата.
Серьезными недостатками указанного способа являются: высокая токсичность (гибель животных к концу эксперимента составила 35,5%); очень низкий процент опухолей железистого отдела желудка (19,2%); часто множественное поражение желудочно-кишечного тракта (около 50% животных), отсутствии метастазов в лимфатических и кровеносных сосудах. Кроме этого, следует отметить, что имеются значительные юридические сложности в приобретении и использовании канцерогенных веществ. Нередко требуется синтез канцерогенов в химических лабораториях, создание специальных условий для работы с ними и для их хранения.
Новизной исследования является разработанная возможность использования в качестве канцерогена смеси формальдегида и перекиси водорода для экспериментального моделирования рака желудка.
Существенным отличием предложенного способа является то, что моделирование экспериментального рака желудка достигается путем введения экспериментальным животным каждые две недели, в 1 и 3 день, по 1,0 мл смеси, состоящей из 0,4% раствора формальдегида и 0,4% раствора перекиси водорода в отношении 1:1 на протяжении 6 месяцев.
Предложенный способ позволяет через 6 месяц от начала эксперимента у 80% животных индуцировать ранний железистый рак желудка. Через 7,5 месяцев железистый рак желудка с метастазами в лимфатических и кровеносных сосудах подслизистой оболочки индуцируется у 100% экспериментальных животных.
Основанием для предлагаемого способа являются результаты экспериментального исследования, выполненного на 30 белых беспородных крысах самцах, массой 180-220 г. Животным по указанной выше методике проводилось пероральное введение смеси формальдегида и перекиси водорода. 4 крысы погибли после 2 введения смеси ФА и ПВ на 4-6 сутки от начала эксперимента от явлений острой интоксикации. Интоксикация была обусловлена атонией желудка и кишечника, явлениями дыхательной недостаточности (возможно, за счет того, что при введении смеси часть ее попадала в дыхательные пути). Все остальные крысы оставались живыми до конца эксперимента. Смертность животных составила 13,3%. Первые 5 крыс были забиты через 6 месяцев от начала эксперимента. Через 7,5 месяцев были забиты все оставшиеся в живых животные (21 крыса). После наркотизации животных эфиром выполняли лапаротомию, острым путем извлекали желудок, который вскрывали по большой кривизне. Препараты преджелудка, тела и пилорического отдела желудка изучали гистологически с использованием световой микроскопии при увеличении ×150 и ×600. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином Майера и эозином. Контролем служили 10 интактных крыс, находившихся на обычном пищевом и водном режиме.
Через 6 месяцев от начала эксперимента у 4 из 5 опытных крыс обнаружен ранний рак железистой части желудка. Опухоли локализовались преимущественно в пределах слизистой оболочки пилорического отдела желудка крыс или на границе пилорического и фундального отделов. Атипически измененные участки были представлены беспорядочными скоплениями железистых структур, с расширениями и кистами неправильной формы, выстланными кубическим или уплощенным эпителием. В донных отделах слизистого слоя встречались микрокомплексы клеток с выраженной атипией: анизоцитозом, анизокариоцитозом, полихромазией ядер, патологическими митозами. Иногда отмечалась инвазия базальных отделов желез желудка в собственную пластинку слизистой оболочки, вследствие чего базальная мембрана на таких участках не прослеживалась. Характерным было наличие в собственной пластинке крупных «светлых» клеток, часто со смещенным к периферии ядром. Описанные клетки нередко располагались свободно в собственной пластинке слизистой. Существуют данные литературы, что подобные «светлые» клетки могут иметь опухолевую природу [2].
Через 7,5 месяцев злокачественные опухоли зафиксированы у всех животных. Кроме описанных изменений встречались участки, где на фоне разрастания соединительной ткани в базальных отделах резко измененных желудочных желез, с большим количеством крупных неправильной формы сосудов, отмечались скопления беспорядочно расположенных атипических клеток, с выраженным ядерным и клеточным полиморфизмом, многоядерными клетками и атипическими митозами. Атипические клетки образовывали тяжи и скопления в собственной пластинке, подслизистой и даже мышечной оболочке. Базальная мембрана на таких участках не определялась. У всех животных к концу эксперимента наблюдались метастазы в кровеносных и лимфатических сосудах подслизистой оболочки как в виде отдельных опухолевых клеток, так и их скоплений. У 4-х животных выявлены опухоли в легких, по гистологической картине соответствующие злокачественному карциноиду. Причиной их возникновения могло быть попадание смеси формальдегида и перекиси водорода при введении в дыхательные пути. У двух крыс в брыжейке толстой кишки обнаружены плотные лимфоузлы с изменениями по типу злокачественной лимфомы. У 15 из 21 крысы по серозной оболочке тонкой кишки отмечались множественные белесоватые узелки. При гистологическом исследовании данные изменения были оценены как гиперплазия лимфоидных фолликулов, но для более точной оценки их гистогенеза требуются иммуногистохимические исследования. У контрольных животных возникновения злокачественных новообразований не отмечено.
Думаем, что механизм индукции опухолей желудка под воздействием формальдегида и перекиси водорода связан с мутагенным и канцерогенным эффектом указанной смеси. Считается, что канцерогенный эффект формальдегида может быть обусловлен его алкилирующими свойствами. Существуют данные [10] о резком усилении мутагенных свойств формальдегида в присутствии перекиси водорода, индуцирующей мутации, разрывы хромосом и образование свободных радикалов.
Пример 1
Гистопрепарат слизистой оболочки пилорического отдела желудка опытных крыс через 6 мес от начала эксперимента (ок. 15, об. 10). Высоко дифференцированная аденокарцинома желудка в пределах слизистой оболочки желудка представлена атипическими железами с расширениями и кистами неправильной формы, выстланными кубическим эпителием с признаками атипии: анизоцитозом, анизокариоцитозом, полихромазией ядер, патологическими митозами (см. фиг.1). В подслизистой оболочке (см. фиг.2) разрастания атипичных железистых структур (ок. 15, об. 40).
Пример 2
Гистопрепарат слизистой оболочки пилорического отдела желудка опытных крыс через 7,5 месяцев от начала эксперимента (ок. 15, об. 40). Высоко дифференцированная аденокарцинома желудка с инвазией опухоли в собственную пластинку слизистой оболочки (см. фиг.3) и микрометастазами в лимфатических и кровеносных сосудах. Группа опухолевых клеток (см. фиг.4) в подслизистой оболочке желудка (ок. 15, об. 40).
Пример 3
Гистопрепарат слизистой оболочки пилорического отдела желудка опытных крыс через 7,5 месяцев от начала эксперимента. Умеренно дифференцированная аденокарцинома желудка (см. фиг.5) в пределах слизистой желудка (ок. 15, об. 10) с инвазией опухоли в собственную пластинку слизистой оболочки и микрометастазами (см. фиг.6) в лимфатических и кровеносных сосудах подслизистой оболочки (ок. 15, об. 40).
Таким образом, предложенный способ моделирования экспериментального рака желудка отличается низкой токсичностью, возникновением железистого рака желудка у 100% животных с метастазами в лимфатических и кровеносных сосудах подслизистой оболочки через 7,5 месяцев от начала эксперимента, он значительно дешевле и проще в техническом отношении.