КОНТЕЙНЕР ДЛЯ ВВЕДЕНИЯ, ХРАНЕНИЯ ИЛИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК
CONTAINER FOR INTRODUCTION, STORAGE OR CULTIVATION OF CELLS

Область техники
3
2
6
[0001] Настоящее изобретение относится к контейнеру, используемому для введения, хранения или культивирования клеток млекопитающих, причем поверхность контейнера, соприкасающаяся с клетками млекопитающих, образована из фторкаучука с одной или более концевыми группами -CF, или фторкаучука с общим числом не содержащих фтор концевых групп и концевых групп -CFH во фторкаучуке не более 70×10 атомов углерода.
Уровень техники
[0002] Плюрипотентные стволовые клетки (ПСК), такие как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) являются клетками с неограниченными способностями пролиферации и мультипотентностью, по отношению к клеткам различных тканей. Ожидается, что человеческие ПСК будут применяться в регенеративной медицине, причем человеческие ПСК индуцируются дифференцированием in-vitro в клетки, обладающие различными типами функций, которые затем вводятся пациентам с целью получения предположительного эффекта от такого введения. Кроме того, ожидается, что соматические стволовые клетки (ССК), такие как мезенхимальные стволовые клетки (МСК), проявляют терапевтический эффект, получаемый за счет выброса трофических факторов и цитокинов, и эффект самонаведения на поврежденные участки тканей с последующим дифференцированием в составные клетки и дополнением / восстановлением участков, и потому попытки клинических исследований этих явлений были предприняты. Для достижения этого требуется стабильное культивирование или хранение большого количества высококачественных клеток, а также введения при сохранении качества.
[0003] В качестве контейнера для культивирования плавающих клеток разработан контейнер для культивирования в форме мешка (далее - мешок) (патентный документ 1). Такой мешок состоит из полимерного сплава, в котором смесь полимеров, состоящая из блок-сополимера поли(этиленбутилен)полистирола с полипропиленом, смешана с сополимером этилена и акриловой кислоты, который обладает превосходными свойствами в части прозрачности и газопроницаемости. С другой стороны, разработаны мешки для культивирования адгезивных клеток (патентные документы 2, 3). Мешок, раскрытый в патентном документе 2, представляет собой усовершенствованный мешок, в котором клетки с легкостью прикрепляются к его внутренней поверхности за счет улучшенной гидрофильности, создаваемой посредством обработки поверхности коронным разрядом. Кроме того, мешок, раскрытый в патентном документе 3, состоит из листа синтетического каучука с заранее заданной жесткостью при изгибе, чтобы исключить легкую деформацию мешка во время культивирования, также он обладает отличительной характеристикой, состоящей в предотвращении отслаивания и смерти клеток из-за деформации контейнера при его перемещении.
Далее, на рынке известны и имеются в наличии мешки, например, CultiLife Spin (производитель «Takara Рас Ltd.»), изготовленные из сополимера этилена (Э) и винилацетата (ВА) - ЭВА; VueLife FEP Bag 32-С (производитель «American Fluoroseal Corp.») из сополимера тетрафторэтилена (ТФЭ) и гексафторпропилена (ГФП) - ФЭП, т.е. из фторкаучука; и культуральный мешок A-1000NL (производитель «Nipro Corp.»).
Однако, все эти мешки не предотвращают адгезию адгезивных клеток к внутренней поверхности мешка и не поддерживают культивируемые клетки в плавающем состоянии.
[0004] В то же время известно, что поверхности бытовых приборов, используемых для разогрева и приготовления пищи, покрываются фторкаучуковой пленкой, в которой нестабильные концевые группы сополимера ТФЭ и перфторалкил-винилового эфира (ПФАВЭ) - ПФА - фторированы для удаления нестабильных концевых групп, улучшается возможность избежать пригорания (патентный документ 4). Однако адгезионные свойства клетки, проявляемые по отношению к фторкаучуку, концевые группы которого фторированы, не известны.
Документы уровня техники
Патентные документы
[0005]
Патентный документ 1: Японская нерассмотренная патентная заявка, публикация №03-65177
Патентный документ 2: Японская нерассмотренная патентная заявка, публикация №06-98756
Патентный документ 3: Японская нерассмотренная патентная заявка, публикация №2008-17839
Патентный документ 4: Патент Японии №3962153
Сущность изобретения
Проблема, которую должно решить изобретение
[0006] Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы предложить контейнер, пригодный для введения, хранения или приготовления раствора, содержащего клетки млекопитающих, с высокой концентрацией и с высокой долей живых клеток.
Средства решения указанных проблем
3
2
6
[0007] В результате исчерпывающего исследования, направленного на поиск решения проблемы, авторы настоящего изобретения обнаружили, что когда введение клеток млекопитающих осуществляется с использованием контейнера, поверхность которого, соприкасающаяся с клетками млекопитающих, образована из фторкаучука с одной или более концевыми группами -CF или фторкаучука, имеющего общее число нефторированных концевых групп и концевых групп -CFH в фторкаучуке не более 70 на 1×10 атомов углерода, и в таком контейнере хранятся или культивируются клетки млекопитающих, адгезия клеток к внутренней поверхности контейнера эффективно предотвращается, и коэффициент выживаемости клеток повышается; контейнеры могут использоваться для введения, хранения или приготовления раствора, содержащего клетки млекопитающих с высокой концентрацией и с высокой долей живых клеток. Этот результат привел к совершению настоящего изобретения.
[0008] Настоящее изобретение состоит в следующем.
2
6
(1) Контейнер для введения, хранения или культивирования клеток млекопитающих, в котором поверхность контейнера, соприкасающаяся с клетками млекопитающих, образована из фторкаучука с общим числом нефторированных концевых групп и концевых групп -CFH в фторкаучуке не более 70 на 1×10 атомов углерода.
3
(2) Контейнер для введения, хранения или культивирования клеток млекопитающих, в котором поверхность контейнера, соприкасающаяся с клетками млекопитающих, образована из фторкаучука с одной или более концевыми группами -CF.
6
(3) Контейнер для введения, хранения или культивирования клеток млекопитающих по п. (2), в котором поверхность контейнера, соприкасающаяся с клетками млекопитающих, образована из фторкаучука с числом нефторированных концевых групп не более 70 на 1×10 атомов углерода.
(4) Контейнер для введения, хранения или культивирования клеток млекопитающих по любому из п. (1)-(3), в котором фторкаучук представляет собой один из фторкаучуков, выбранных из следующей группы: сополимер на основе тетрафторэтилена и гексафторпропилена, сополимер на основе тетрафторэтилена и перфторалкил-винилового эфира.
(5) Контейнер для введения, хранения или культивирования клеток млекопитающих по любому из п. (1)-(4), при этом контейнер представляет собой мешок.
(6) Контейнер для введения, хранения или культивирования клеток млекопитающих по любому из п. (1)-(5), при этом клетки млекопитающих представляют собой адгезивные клетки.
(7) Контейнер для введения, хранения или культивирования клеток млекопитающих по любому из п. (1)-(6), при этом клетки млекопитающих представляют собой мезенхимальные стволовые клетки.
Технический результат изобретения
[0009] Когда при использовании контейнера для введения, хранения и культивирования в соответствии с настоящим изобретением выполняется введение или хранение жидкой среды, содержащей клетки млекопитающих, или осуществляется культивирование клеток млекопитающих, поскольку возможно эффективное предотвращение адгезии к внутренней поверхности контейнера и повышение коэффициента выживаемости клеток, обеспечивается введение, хранение или приготовление среды, содержащей клетки млекопитающих, с высокой концентрацией и высокой долей живых клеток, что способствует регенеративной медицине с использованием жидкой среды, содержащей клетки млекопитающих (суспензии).
Осуществление изобретения
3
2
6
[0010] Контейнер для введения, хранения или культивирования в соответствии с настоящим изобретением (далее в некоторых случаях «контейнер в соответствии с настоящим изобретением») не ограничен, при условии, что в контейнере для введения, хранения или культивирования клеток млекопитающих поверхность, соприкасающаяся с клетками млекопитающих (жидкой средой, содержащей клетки млекопитающих), образована из фторкаучука с одной или более концевыми группами -CF или фторкаучука с общим числом нефторированных концевых групп и концевых групп -CFH в фторкаучуке не более 70 на 1×10 атомов углерода (далее - «предлагаемый фторкаучук»); и контейнер в целом в некоторых случаях образован из предлагаемого фторкаучука. Контейнер в соответствии с настоящим изобретением обладает отличительной характеристикой, состоящей в том, что поверхность контейнера, соприкасающаяся с клетками млекопитающих, образована из предлагаемого фторкаучука. Когда выполняется введение или хранение жидкой среды, содержащей клетки млекопитающих, или культивирование клеток млекопитающих с использованием контейнера с такими признаками, поскольку клеточная адгезия эффективно предотвращена и коэффициент выживаемости клеток эффективно повышается, контейнер в соответствии с настоящим изобретением пригоден для использования для введения и/или хранения жидкой среды, содержащей плавающие клетки, и культивирования плавающих клеток, а также для введения и/или хранения жидкой среды, содержащей адгезивные клетки, и для плавающего культивирования адгезивных клеток. В случае с использованием для введения и/или хранения среды, содержащей клетки, и плавающего культивирования клеток, в предпочтительном варианте контейнер представляет собой контейнер, в котором внутренняя поверхность не покрыта веществом, демонстрирующим адгезивные свойства к клеткам, таким как матригель, энтактин, фибронектин, полимер, реагирующий на температуру (ПИПАА и т.д.), поликатион (полилизин и т.д.), желатин, лектин, полисахариды (гиалуроновая кислота и т.д.), полимолочная кислота, полигликолевая кислота, ε-аминокапролактон, коллаген I типа, коллаген IV типа, хитозан и ламинин. В данном случае, в настоящем изобретении «хранение» включает в себя хранение во время транспортировки.
[0011] Плавающие клетки включают в себя такие клетки, как красные кровяные тельца (эритроциты) и (получаемые из периферической крови) белые кровяные тельца (нейтрофильные лейкоциты, мононуклеарные лейкоциты (моноциты и лимфоциты), макрофаги и т.д.).
[0012] Примеры адгезивных клеток включают: стволовые клетки, в том числе плюрипотентные стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), эмбриональные половые клетки (ЭПК), зародышевые стволовые клетки (ЗСК) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК); мультипотентные стволовые клетки, такие как мезенхимальные стволовые клетки, гемопоэтические стволовые клетки и нервные стволовые клетки, и унипотентные стволовые клетки (клетки-предшественники), такие как клетки - предшественники миокарда, клетки - предшественники эндотелия сосудов, нейрональные клетки - предшественники; клетки - предшественники жировых клеток, фибробласты кожи, миобласты скелетной мускулатуры, остеобласты и одонтобласты; и зрелые клетки, такие как клетки миокарда, васкулярные эндотелиальные клетки, нервные клетки, жировые клетки, кожные фиброциты, скелетные миоциты, остеоциты, гепатоциты (клетки печени), эндотелиальные клетки пупочной вены; лимфатические эндотелиальные клетки кожных микроструктур, кератиноциты, бронхиальные эпителиальные клетки, меланоциты, гладкомышечные клетки и клетки зубов. В предпочтительном варианте имеются ввиду мезенхимальные стволовые клетки.
2
2
2
3
2
6
6
6
6
[0013] Предлагаемый фторкаучук предпочтительно представляет собой каучук, не содержащий концевых групп -CFH, с общим числом нефторированных концевых групп в каучуке (например, функциональных групп типа -COF, -СООН, связанная с водой -СООН, -СНОН, -CONH и -COOCH) и концевых групп -CFH не более 70 на 1×10 атомов углерода, и в более предпочтительном варианте не более 35 на 1×10 атомов углерода. Далее, в еще более предпочтительном варианте их число составляет не более 20 на 1×10 атомов углерода, и в наиболее предпочтительном варианте не более 10 на 1×10 атомов углерода.
2
6
Т.е. один из объектов настоящего изобретения представляет собой контейнер для введения, хранения или культивирования клеток млекопитающих, в котором поверхность, соприкасающаяся с клетками млекопитающих, образована из фторкаучука с общим числом нефторированных концевых групп и концевых групп -CFH во фторкаучуке не более 70 на 1×10 атомов углерода.
2
2
3
2
6
[0014] Число групп -COF, -СООН, связанная с водой -СООН, -СНОН, -CONH, -СООСН и -CFH на 1×10 атомов углерода может быть рассчитано посредством инфракрасной спектроскопии на основе преобразования Фурье.
3
3
[0015] Кроме того, предлагаемый фторкаучук достаточен, если он содержит одну или более концевых групп -CF имеет более стабилизированную концевую структуру; и предлагаемый фторкаучук включает в себя фторкаучук, в котором часть нефторированных концевых групп фторирована и имеют -CF.
3
19
[0016] Анализ концевой группы -CF может быть выполнен посредством высокотемпературных измерений ядер F путем ядерно-магнитного резонанса (ЯМР).
2
2
3
[0017] В настоящем изобретении «нефторированная концевая группа» означает концевой элемент, обладающий некоторой степенью реакционной способности и, как правило, называемый «нестабильным концевым элементом», и в частности содержащий такие функциональные группы как -COF, -СООН, связанная с водой -СООН, -СНОН, -CONH и -СООСН.
2
2
3
6
6
6
6
6
6
6
[0018] Общее число нефторированных концевых групп (например функциональных групп, таких, как -COF, -СООН, связанная с водой -СООН, -СНОН, -CONH и -СООСН) в предлагаемом фторкаучуке в предпочтительном варианте составляет не более 70 на 1×10 атомов углерода, в более предпочтительном варианте не более 50 на 1×10 атомов углерода, в еще более предпочтительном варианте не более 35 на 1×10 атомов углерода, в еще более предпочтительном варианте не более 15 на 1×10 атомов углерода, в еще более предпочтительном варианте не более 10 на 1×10 атомов углерода, в еще более предпочтительном варианте не более 5 на 1×10 атомов углерода, в наиболее предпочтительном варианте не более 2 на 1×10 атомов углерода.
3
6
Т.е. один из объектов настоящего изобретения представляет собой контейнер для введения, хранения или культивирования клеток млекопитающих, в котором поверхность, соприкасающаяся с клетками млекопитающих, образована из фторкаучука с одной или более концевыми группами -CF, в котором число нефторированных концевых групп не более 70 на 1×10 атомов углерода.
[0019] Предлагаемый фторкаучук, в частности, включает в себя политетрафторэтилен (ПТФЭ), сополимер (ФЭП - сополимер фтор-этилен-пропилена) на основе тетрафторэтилена (ТФЭ) и гексафторпропилена (ГФП) и перфторалкокси сополимер (ПФА) на основе ТФЭ-перфторалкилвинилового эфира (ПФАВЭ); среди них ФЭП и ПФА могут быть использованы в предпочтительном примере, и ФЭП в менее предпочтительном примере.
[0020] «Сополимер на основе ТФЭ-ГФП» означает сополимер, содержащий по меньшей мере ТФЭ и ГФП. Т.е. «сополимер на основе ТФЭ-ГФП» содержит, в дополнение к двухкомпонентному сополимеру (сополимер ТФЭ / ГФП; ФЭП) ТФЭ и ГФП и к трехкомпонентному сополимеру, такому, как сополимер на основе ТФЭ, ГФП и винилфторида (ВФ) (сополимер ТФЭ/ГФП/ВФ), сополимер на основе ТФЭ, ГФП и винилиденфторида (ВДФ) (сополимер ТФЭ / ГФП / ВДФ) и сополимер на основе ТФЭ, ГФП и перфторалкил-винилового эфира (ПФАВЭ) (сополимер ТФЭ / ГФП / ПФАВЭ), а также к четырехкомпонентному сополимеру, такому как сополимер на основе ТФЭ, ГФП, ВФ и ВДФ (сополимер ТФЭ / ГФП / ВФ / ВДФ), сополимер на основе ТФЭ, ГФП, ВФ и ПФАВЭ (сополимер ТФЭ / ГФП / ВФ / ПФАВЭ) и к пятикомпонентному сополимеру, такому, как сополимер на основе ТФЭ, ГФП, ВФ, ВДФ и ПФАВЭ (сополимер ТФЭ / ГФП / ВФ / ВДФ / ПФАВЭ).
[0021] В предпочтительном варианте сополимер на основе ТФЭ и ГФП представляет собой сополимер ТФЭ / ГФП или сополимер ТФЭ / ГФП / ПФАВЭ. Соотношение масс ТФЭ и ГФП в таком сополимере ТФЭ / ГФП в предпочтительном варианте составляет от 80 до 97 / от 3 до 20, в более предпочтительном варианте от 84 до 92 / от 8 до 16. Далее, соотношение масс ТФЭ, ГФП и ПФАВЭ в сополимере ТФЭ / ГФП / ПФАВЭ в предпочтительном варианте составляет от 70 до 97 / от 3 до 20 / от 0,1 до 10, в более предпочтительном варианте от 81 до 92 / от 5 до 16 / от 0,3 до 5.
[0022] «Сополимер на основе ТФЭ-ПФАВЭ» означает сополимер, содержащий по меньшей мере ТФЭ и ПФАВЭ. Т.е. понятие «сополимер на основе ТФЭ-ПФАВЭ» охватывает, в дополнение к двухкомпонентному сополимеру ТФЭ и ПФАВЭ (сополимер ТФЭ/ПФАВЭ; ПФА), также и трехкомпонентный сополимер, такой как сополимер на основе ТФЭ, ПФАВЭ и гексафторпропилена (ГФП) (сополимер ТФЭ / ПФАВЭ / ГФП), сополимер на основе ТФЭ, ПФАВЭ и винилиденфторида (ВДФ) (сополимер ТФЭ / ПФАВЭ / ВДФ) и сополимер на основе ТФЭ, ПФАВЭ и хлортрифторэтилена (ХТФЭ) (сополимер ТФЭ / ПФАВЭ / ХТФЭ), четырехкомпонентный сополимер, такой, как сополимер на основе ТФЭ, ПФАВЭ, ГФП и ВДФ (сополимер ТФЭ / ПФАВЭ / ГФП / ВДФ), сополимер на основе ТФЭ, ПФАВЭ, ГФП и ХТФЭ (сополимер ТФЭ / ПФАВЭ / ГФП / ХТФЭ) и сополимер на основе ТФЭ, ПФАВЭ, ВДФ и ХТФЭ (сополимер ТФЭ / ПФАВЭ / ВДФ / ХТФЭ), и пятикомпонентный сополимер, такой как сополимер на основе ТФЭ, ПФАВЭ, ГФП, ВДФ и ХТФЭ (сополимер ТФЭ / ПФАВЭ / ГФП / ВДФ / ХТФЭ).
[0023] ПФАВЭ, представляющий собой фрагмент ПФАВЭ, не ограничен, и его примеры могут включать в себя перфтор(метилвиниловый эфир) (ПФМВЭ), перфтор(этилвиниловый эфир) (ПФЭВЭ), перфтор(пропилвиниловый эфир) (ПФПВЭ), перфтор(бутилвиниловый эфир), перфтор(пентилвиниловый эфир), перфтор(гексилвиниловый эфир) и перфтор(гептилвиниловый эфир).
[0024] Соотношение масс ТФЭ и ПФАВЭ в сополимере на основе ТФЭ-ПФАВЭ предпочтительно составляет от 90 до 98 / от 2 до 10, и в более предпочтительном варианте от 92 до 97 / от 3 до 8.
[0025] Предлагаемый фторкаучук может быть изготовлен посредством фторирования концевых групп фторкаучука, синтезированного в соответствии с обычным способом суспензионной полимеризации, эмульсионной полимеризации и т.д., используя известный способ, такой как способ фторирования, в котором перед тем, как фторкаучук экструдируют в расплаве, фторкаучук и фторсодержащее соединение (например, источник фтор-радикалов) контактируют друг с другом для выполнения стабилизационной обработки, и способ, в котором гранулы фторкаучука, полученные после того, как экструдированный в расплаве фторкаучук, и фторсодержащее соединение контактируют друг с другом для выполнения фторирования. Далее, предлагаемый фторкаучук также может быть получен с использованием агента передачи цепи и катализатора полимеризации, способного контролировать концевые группы, вместе с мономером фтора в производстве (реакция полимеризации) фторкаучука. Далее, в качестве предлагаемого фторкаучука могут быть использованы продукты, доступные на рынке. Фторирование также может быть выполнено посредством введения фторсодержащего вещества в контакт с отливками из фторкаучука, например, пленки, отлитые из расплава фторкаучука, контейнеры из пленок, контейнеры, отлитые из фторкаучука. Далее, возможно сочетание этих способов обработки.
2
3
3
3
6
6
Т.е. не требуется, чтобы общее число нефторированных концевых групп и общее число нефторированных концевых групп и концевых групп -CFH было не более 70 на 1×10 атомов углерода на каждом этапе использования фторкаучуков, гранул или пленок в качестве сырья; достаточно, чтобы на поверхности готового контейнера, соприкасающейся с клетками, общее их число не превышало 70 на 1×10 атомов углерода. Кроме того, в случае с фторкаучуком с одной или более концевыми группами -CF, отсутствует необходимость в том, чтобы число концевых групп -CF составляло один или более на каждом этапе использования фторкаучуков, гранул и пленок в качестве сырья; достаточно, чтобы на поверхности готового контейнера, соприкасающейся с клетками, фторкаучук содержал одну или более концевых групп -CF.
5
3
2
3
2
6
2
2
2
3
2
[0026] Источник фтор-радикалов конкретно не ограничен, но примеры могут включать в себя фторгалогенид, такой как IF, ClF, газообразный F, CoF, AgF, UF, OF, NF и CFOF. Газообразный F в некоторых случаях может быть использован в концентрации 100%, но из соображений безопасности используется в смеси с инертным газом и разбавляется до диапазона от 5 до 50 масс. %, предпочтительно от 15 до 30 масс. %. Примеры инертного газа включают в себя азот, гелий, аргон, но с точки зрения экономической эффективности предпочтительно использование азота.
[0027] Фторирование выполняют при температуре предпочтительно от 20 до 220°C, и более предпочтительно от 100 до 200°C. Фторирование выполняют предпочтительно в течение от 5 до 30 ч, и более предпочтительно - от 10 до 20 ч.
2
[0028] Контейнер, полученный в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой, как вариант, контейнер, в котором контролируются среднеарифметическая шероховатость (Ra) поверхности, среднеквадратическая шероховатость (RMS) поверхности и свободная энергия поверхности. Примеры контейнера включают в себя контейнеры с шероховатостью Ra внутренней поверхности контейнера от 3,5 до 6,5 нм, шероховатостью RMS поверхности от 4,5 до 8,0 нм, свободной энергией поверхности от 16,5 до 18,5 мДж/м.
[0029] Примеры форм контейнера в соответствии с настоящим изобретением включают в себя чашку, луночный планшет, мешок, бутыль, центрифужную пробирку, колбу, шприц, трубку; при этом если контейнер, в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой контейнер для введения клеток, то он предпочтительно представляет собой шприц, мешок (для капельницы), бутыль (для капельницы) и трубка; если контейнер, в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой контейнер для хранения клеток, то он предпочтительно представляет собой чашку, луночный планшет, мешок, бутыль, центрифужную пробирку и колбу; если контейнер, в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой контейнер для культивирования клеток, то он предпочтительно представляет собой планшет, луночный планшет, мешок и бутыль. В частности, контейнер в соответствии с настоящим изобретением, в форме мешка можно привести в качестве примера, поскольку он может применяться для любой области: введение, хранение и культивирование.
[0030] Чашка, луночный планшет, мешок, бутыль, центрифужная пробирка, колба, шприц, трубка и т.д. могут быть изготовлены способами формования, в том числе литье под давлением, экструзия, трансферное прессование, прессование, литье с раздувом, инжекционное литье, центробежное литье, экструзия пенопласта в сочетании со средствами уплотнения, такими как заварка, запайка, ультразвуковая сварка.
[0031] В частности, мешок может быть изготовлен складыванием пленок (листов) из предлагаемого фторкаучука и нагревом краев с использованием машину для импульсной сварки.
[0032] В качестве пленки, используемой для изготовления мешка, может быть использована однослойная пленка или многослойная пленка, состоящая из двух или более слоев; при этом если пленка состоит из нескольких слоев, достаточно изготовить мешок так, чтобы, по меньшей мере, внутренняя поверхность, соприкасающаяся с клетками млекопитающих, была слоем из предлагаемого фторкаучука, при этом остальные пленочные слои могут быть изготовлены из материала, отличного от предлагаемого фторкаучука (например, из полиолефинового каучука). Склеивание слоев выполняется с использованием таких способов, как способ горячего ламинирования, способ горячего прессования, способ высокочастотного нагрева, формование окунанием в раствор, ламинирование способом экструзии.
[0033] Кроме того, контейнер в соответствии с настоящим изобретением также может быть получен посредством обработки базового материала, такого как чашка, луночный планшет, мешок, бутыль, центрифужная пробирка, колба, шприц и трубка из стекла, металла, каучука и т.д. с нанесением покрытия, состоящего из предлагаемого фторкаучука. Любые способы могут быть применены в зависимости от формы базового материала. Примеры обработки с нанесением покрытия включают в себя нанесение покрытия методом центрифугирования, напыление, нанесение покрытия с удалением излишков с помощью планки, нанесение покрытий валиком, окунание, нанесение покрытия кистью, ротационная футеровка и электростатическое нанесение покрытия. На базовый материал наносится покрытие из фторкаучукового покрывающего агента, после этого выполняется сушка и высокотемпературная обработка для получения слоя покрытия. Толщина слоя подбирается по необходимости, с возможностью нанесения фторкаучукового покрытия из настоящего фторкаучука в два слоя.
[0034] Контейнер в соответствии с настоящим изобретением может быть использован, например, для криоконсервации жидкой среды, содержащей клетки млекопитающих, при этом среда, содержащая клетки млекопитающих, хранится (по меньшей мере 6 ч) при температуре, при которой жидкая среда на замерзает (обычно в диапазоне от 0 до 37°C, предпочтительно от 0 до 25°C (комнатная температура)), для производства культуры плавающих или адгезивных клеток млекопитающих в больших количествах посредством способа суспензионной культивации, или для ввода (трансплантации) жидкой среды, содержащей клетки млекопитающих, без перемещения в другой контейнер после ее хранения при температуре, при которой жидкая среда не замерзает.
[0035] Далее настоящее изобретение будет раскрыто более подробно на примерах, однако объем настоящего изобретения не ограничен этими примерами.
Пример 1
[0036] 1. Изготовление культуральных мешков
Три вида пленки размером 16 см × 15 см, толщиной 100 мкм запаивают посредством машины для импульсной сварки в условиях выдержки в течение 50 с, давления 0,2 МПа, с шириной свариваемой области 5 мм, чтобы получить 12 видов культуральных мешков (мешки от А до С (образцы сравнительных примеров 1-3), мешки от D до G (образцы примеров 1-4), мешок Н (образец сравнительного примера 4), мешки от I до K (образцы примеров 5-7) и мешок L (образец сравнительного примера 5)) (см. таблицу 2). В данном случае для культурального мешка М (образец сравнительного примера 6) используется культуральный мешок из поливинилхлорида (полученный посредством обработки квадратного мешка АСР-АМР Kawasumi, изготовленного компанией «Kawasumi Laboratories, Inc.») (см. таблицу 2).
2
[0037] 1.1. Измерение числа нефторированных концевых групп и числа концевых групп -CFH
Образцы соответствующих каучуков толщиной около 250-300 мкм были изготовлены и проанализированы инфракрасной спектроскопией с использованием преобразования Фурье на спектрометре 1760Х (изготовлен компанией «PerkinElmer, Inc.»).
Образцы соответствующих каучуков толщиной около 250-300 мкм изготовлены посредством «раскатывания» гранул в гидравлическом прессе. Измерения были выполнены с использованием пленок (изготовленных из гранул посредством формования из расплава), представляющих собой культуральные мешки как они есть, если при этом толщина оказывалась недостаточной, то пленки накладывались друг на друга в несколько слоев.
2
2
6
[0038] Получены дифференциальные спектры стандартных образцов (образцов, фторированных достаточно до тех пор, пока по существу не исчезнет разность спектров); зафиксированы поглощения каждого пика; и рассчитано число нефторированных концевых групп и число концевых групп -CFH на 1×10 атомов углерода для каждого образца с использованием следующего уравнения. Число нефторированных концевых групп и число концевых групп -CFH в каждом культуральном мешке А-М показано в таблице 2.
2
6
[0039] Число нефторированных концевых групп и концевых групп -CFH (на 1×10 атомов углерода) = ,
где : поглощение,
k: поправочный коэффициент (см. таблицу 1),
t: толщина образца (мм).
Столбец «До изготовления культурального мешка» в таблице означает, что образцы получены посредством «раскатывания» фторкаучуковых гранул, используемых для изготовления культурального мешка.
Столбец «После изготовления культурального мешка» в таблице означает, что образцы получены из пленок (изготовленных посредством формования из расплава из гранул), образующих культуральные мешки.
3
[0042] 1.2. Измерение наличия / отсутствия концевой группы -CF
19
Соответствующие каучуковые пленки были расплавлены при температуре 370°C, и из них изготовили нити; затем их спектры были измерены посредством высокотемпературного ядерно-магнитного резонанса на ядрах F на ЯМР-спектрометре AVANCE 300WB (изготовлен компанией «Bruker Corp.»).
3
3
3
3
[0043] Получены разностные спектры от нитей, изготовленных посредством расплава каучуков с тем же самым составным соотношением, как и у соответствующих смол, и в которых отсутствуют концевые группы -CF; когда пик наблюдался при δ=-82 ppm, принималось решение о присутствии концевых групп -CF, и когда пик не наблюдался при δ=-82 ppm, принималось решение об отсутствии концевых групп -CF. Наличие / отсутствие концевых групп -CF в каждом из культуральных мешков А-М показано в таблице 3.
Пример 2
[0045] 2. Хранение в культуральном мешке человеческих костномозговых мезенхимальных стволовых клеток (чМСК)
В случае хранения клеток в культуральном мешке, изготовленном по примеру 1, было проанализировано, происходит ли предотвращение адгезии, чтобы обеспечить возможность хранения клеток в плавающем состоянии.
[0046] 2.1. Способ
2.1.1. Приготовление жидкой среды для хранения клеток
Инъекция Lactec, содержащая 6,0 масс. / об. % трегалозу (изготовлена компанией «Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.») и инъекция низкомолекулярного декстрана L (инъекция Lactec, содержащая 10 масс. / об. % декстрана) (изготовлена компанией «Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.») были смешаны в соотношении 1:1 для приготовления жидкой среды для хранения клеток.
[0047] 2.1.2. Приготовление клеток млекопитающих
5
2
2
[1] 4×10 чМСК (изготовлены компанией «Lonza Ltd.», РТ-2501) были культивированы в присутствии культуральной среды мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) (изготовлена компанией Lonza Ltd.», РТ-3001) в колбе 75 см, в инкубаторе при температуре 37°C в 5% CO, и субкультивированы с конфлюэнтностью ок. 90% обычным способом.
[2] Культуральную среду для субкультивированных чМСК (клетки субкультивированы три раза, конфлюэнтность ок. 100%) был удален аспиратором; чМСК промыли фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБР, изготовлен компанией «Invitrogen Corp.») в количестве 8 мл на колбу.
[3] ФСБР был удален аспиратором; и был добавлен трипсин-ЭДТА (изготовлен компанией «Lonza Ltd.», СС-3232) в количестве 3,75 мл на колбу и выдержан при комнатной температуре в течение 5 мин.
[4] Полученное было медленно встряхивали, пока ок. 90% чМСК не было очищено под наблюдением под микроскопом.
[5] Культуральная среда МСК в количестве 3,75 мл на колбу была добавлена, чтобы остановить реакцию с трипсином; чМСК извлекли капельно и перенесли в центрифужную пробирку объемом 50 мл.
[6] Полученное было подвергнуто центрифугированию при 600×g в течение 5 мин. при температуре 25°C.
[7] Надосадочную жидкость была удаена аспиратором; добавлена жидкая среда для хранения клеток в количестве 3 мл на колбу, и осадочные чМСК были суспензиронаны.
5
[8] Было отобрано 10 мкл жидкой суспензии чМСК-КМ; количество клеток было измерено с использованием пластины для подсчета клеток; жидкая среда для хранения клеток была добавлена так, что количество клеток доведено до 5×10 клеток/мл, затем полученное было охлаждено льдом.
[0048] 2.1.3. Хранение клеток млекопитающих
5
[1] Был выполнен посев 3 мл жидкой среды для хранения клеток, содержащей 5×10 клеток чМСК / мл в каждый из 13 типов культуральных мешков А-М.
2
[2] После успокоения клеточной суспензионной массы и выдержки в течение 6 ч в инкубаторе (25°C, 5% CO) (изготовлен компанией «As One Co., Ltd.», PIC 100), часть ее (20 мкл) была извлечена и смешана с 20 мкл 0,4% трипанового синего (изготовлен компанией «Gibco»); концентрацию клеток и число живых клеток в клеточной суспензии измерили под микроскопом (ECLIPSE TS100, изготовлен компанией «Nikon Corp.») с использованием пластин для подсчета клеток; рассчитали соответствующие коэффициент извлечения клеток (см. таблицу 4, 7 и 10) и коэффициент выживаемости клеток (см. таблицу 5, 8 и 11). Затем часть мешка была разрезана ножницами и положена на 6-луночный планшет; и было выполнено наблюдение за адгезией клеток к мешку под микроскопом (IX-70, изготовлен компанией «Olympus Corp.»). В данном случае результаты, представленные в таблицах 4-6, 7-9 и 10-12, были получены в результате независимых экспериментов (с различным временем приготовления чМСК).
Коэффициент извлечения клеток (%) обозначает отношение общего числа клеток в суспензии после хранения и общего числа клеток в суспензии сразу после начала хранения («До») ([общее число клеток в суспензии после хранения / общее число клеток в суспензии сразу после начала хранения («До») × 100]) (среднее значение ± стандартное отклонение, n=3). В данном случае в этой таблице значки «**» и «***» указывают на статистически значимое расхождение (р<0,01 и р<0,001 соответственно) от культурального мешка L (образец сравнительного примера 5) по методу Даннетта.
Коэффициент выживаемости клеток (%) указан как отношение числа живых клеток и общего числа клеток в клеточной суспензии ([число живых клеток в клеточной суспензии / общее число клеток в клеточной суспензии × 100]) (среднее значение ± стандартное отклонение, n=3). В данном случае в этой таблице значок «*» указывает на статистически значимое расхождение (р<0,05) от культурального мешка L (образец сравнительного примера 5) по методу Даннетта.
Коэффициент извлечения живых клеток указан как значение коэффициента извлечения клеток, умноженное на значение коэффициента выживаемости клеток (среднее значение ± стандартное отклонение, n=3). В данном случае в этой таблице значки «**» и «***» указывают на статистически значимое расхождение (р<0,01 и р<0,001 соответственно) от культурального мешка L (образец сравнительного примера 5) по методу Даннетта.
[0052] 2.2. Результаты
Коэффициент извлечения чМСК после хранения, как показано в таблице 4, в случае с использованием культуральных мешков А, В, С, Н, L и М (образцы сравнительных примеров 1, 2, 3, 4, 5 и 6), составил 39%, 43%, 34%, 40%, 38%) и 36% соответственно, а при использовании культуральных мешков D, F, G, J и K (образцы примеров 1, 3, 4, 6 и 7) соответственно 50%, 69%, 99%, 70% и 80%.
[0053] Далее, коэффициент выживаемости чМСК после хранения, как показано в таблице 5, в случае использования культуральных мешков D, F, G, J и K (образцы примеров 1, 3, 4, 6 и 7), составил соответственно 93%, 96%, 93%, 95% и 96%, в любом случае показатель достиг значения 90% и выше.
[0054] Следовательно, коэффициенты извлечения (коэффициент выживаемости клеток × коэффициент извлечения клеток) чМСК после хранения, как показано в таблице 6, оказались выше (46%, 66%, 92%, 66% и 77% соответственно) при хранении в культуральных мешках D, F, G, J и K (примерные образцы 1, 3, 4, 6 и 7) по сравнению с (34%, 37%, 31%, 37%, 31% и 32% соответственно) хранением в культуральных мешках А, В, С, Н, L и М (образец сравнительного примера 1, 2, 3, 4, 5 и 6).
Коэффициент извлечения клеток (%) указан как отношение общего числа клеток в клеточной суспензии после хранения и общего числа клеток в суспензии сразу после начала хранения («До») ([общее число клеток в клеточной суспензии после хранения / общее число клеток в суспензии сразу после начала хранения («До») × 100]) (среднее значение ± стандартное отклонение, n=3). В данном случае в этой таблице значок «***» указывает на статистически значимое расхождение (р<0,001) относительно культурального мешка L (образец сравнительного примера 5) по методу Даннетта.
Коэффициент выживаемости клеток (%) указан как отношение числа живых клеток и общего числа клеток в клеточной суспензии ([число живых клеток в клеточной суспензии / общее число клеток в клеточной суспензии × 100]) (среднее значение ± стандартное отклонение, n=3).
Коэффициент извлечения живых клеток указан как значение коэффициента извлечения клеток, умноженное на значение коэффициента выживаемости (среднее значение ± стандартное отклонение, n=3). В данном случае в этой таблице значок «***» указывает на статистически значимое расхождение (р<0,001) относительно культурального мешка L (образец сравнительного примера 5) по методу Даннетта.
[0058] 2.3. Результаты
Коэффициент извлечения чМСК после хранения, как показано в таблице 7, составил в случае использования культуральных мешков В и L (образцы сравнительных примеров 2 и 5) 30% и 25% соответственно, а при использовании культурального мешка G (образец примера 4) - 80%.
[0059] Кроме того, коэффициент выживаемости чМСК после хранения, как показано в таблице 8, при использовании культурального мешка G (образец примера 4) составил 95%.
[0060] Следовательно, коэффициенты извлечения (коэффициент выживаемости клеток × коэффициент извлечения клеток) чМСК, выживших после хранения, как показано в таблице 9, оказались выше (76%) при хранении в культуральном мешке G (образец примера 4), чем при хранении в культуральном мешке В и L (27% × 22% соответственно) (образцы сравнительных примеров 2 и 5).
Коэффициент извлечения клеток (%) указан как отношение общего числа клеток в клеточной суспензии после хранения к общему числу клеток в клеточной суспензии сразу после начала хранения («До») (общее число клеток в клеточной суспензии после хранения / общее число клеток в клеточной суспензии сразу после начала хранения («До») × 100) (среднее значение ± стандартное отклонение, n=3). В данном случае в таблице «*» указывает на статистически значимое расхождение (р<0,05) относительно культурального мешка В (образец сравнительного примера 2) по методу Даннетта.
Коэффициент выживаемости клеток (%) указан как отношение числа живых клеток и общего числа клеток в клеточной суспензии (число живых клеток в клеточной суспензии / общее число клеток в клеточной суспензии × 100) (среднее значение ± стандартное отклонение, n=3).
Коэффициент извлечения живых клеток указан как значение коэффициента извлечения клеток, умноженное на значение коэффициента выживаемости клеток (среднее значение ± стандартное отклонение, n=3). В данном случае в таблице «*» указывает на статистически значимое расхождение (р<0,05) относительно культурального мешка В (образец сравнительного примера 2) по методу Даннетта.
[0064] 2-4 Результаты
Коэффициент извлечения чМСК после хранения, как показано в таблице 10, при использовании культурального мешка В (образец сравнительного примера 2), составил 49%, а при использовании культуральных мешков Е, F, I и K (образцы примеров 2, 3, 5 и 7) - 83%, 75%, 84% и 67% соответственно.
[0065] Кроме того, коэффициенты выживаемости чМСК после хранения, как показано в таблице 11, в случае использования культуральных мешков Е, F, I и K (образцы примеров 2, 3, 5 и 7), были равны 93%, 93%, 91% и 92% соответственно, в любом случае показатель достиг значения 90% и выше.
[0066] Следовательно, коэффициенты извлечения (коэффициент выживаемости клеток × коэффициент извлечения клеток) чМСК, выживших после хранения, как показано в таблице 12, оказались выше (77%, 69%, 76% и 61% соответственно) при хранении в культуральных мешках Е, F, I и K (образцы примеров 2, 3, 5 и 7), чем при хранении в культуральном мешке В (45%) (образец сравнительного примера 2).
[0067] Кроме того, чМСК после хранения прилипают к внутренней поверхности культуральных мешков А-С, Н, L и М (образцы сравнительных примеров 1-3, 4, 5 и 6), и, наоборот, адгезивность к внутренней поверхности культуральных мешков D-G и I-K предотвращена (образцы примеров 1-4, 5-7); в частности, чМСК практически не прилипали к внутренней поверхности культуральных мешков Е-G и I-K (образцы примеров 2-4 и 5-7).
Результаты показывают, что адгезивность живых клеток в значительной степени снижена при хранении клеток в культуральных мешках D-G и I-K (образцы примеров 1-4 и 5-7) по сравнению с хранением клеток в культуральных мешках А-С, Н, L и М (образцы сравнительных примеров 1-3, 4, 5 и 6).
Пример 3
[0068] 3. Культивирование клеток 10Т1/2, полученных из мезенхимальных стволовых клеток мышей, с использованием культурального мешка
При выполнении культивирования клеток с использованием культуральных мешков, изготовленных по примеру 1, проанализирована возможность предотвращения адгезии, чтобы обеспечить культивирование клеток в плавающем состоянии.
[0069] 3.1. Способ
5
[1] Клетки 10Т1/2, полученные из мезенхимальных стволовых клеток мышей, взвесили в культуральной среде DMEM (изготовлена компанией «Nacalai Tesque, Inc.», 08458-45), содержащей 10% FBS (изготовлено компанией technologies Corp.» по стандарту компании «Gibco»), с доведением концентрации до уровня 1,0×10 клеток / мл; выполнили посев 3 мл суспензии в два вида культуральных мешков: В (образец сравнительного примера 2) и G (образец примера 4).
2
[2] Культивирование выполняли в инкубаторе (37°C, 5% CO); часть (10 мкл) каждой клеточной суспензии извлекли через 4 ч, 1, 2, 3 и 6 дней и смешали с 10 мкл 0,4%-го трипанового синего (изготовлен компанией «Gibco»); число живых клеток измерили с использованием пластины для подсчета клеток, рассчитали коэффициент выживаемости клеток. Далее, наблюдение за клетками, прилипшими к культуральным мешкам, выполняли через оптический микроскоп (изготовлен компанией «Nikon Corp.»).
[0070] 3.2. Результаты
Коэффициент выживаемости клеток 10Т1/2 после культивирования составил 70% и выше в обоих случаях с использованием культурального мешка G (образец примера 4) и культурального мешка В (образец сравнительного примера 2). А доля клеток 10Т1/2, прилипших к внутренней поверхности мешка после культивирования, оказалась ниже при использовании культурального мешка G по сравнению с культуральным мешком В.
Результат показывает, что адгезивность живых клеток может быть значительно снижена при культивировании клеток в культуральном мешке G (образец примера 4) по сравнению с культивированием клеток в культуральном мешке В (образец сравнительного примера 2).
[0071] Результаты примеров 1-3 показывают, что при введении, хранении или культивировании с использованием культуральных мешков D-G и I-K (образцы примеров 1-7) клеточная адгезия к внутренней поверхности контейнера может быть эффективно предотвращена, и коэффициент выживаемости клеток может быть эффективно улучшен, при этом возможно введение, хранение или приготовление среды, содержащей клетки, с высокой концентрацией клеток и с высокой долей живых клеток.
Промышленная применимость
[0072] В соответствии с настоящим изобретением возможно введение, хранение или приготовление среды, содержащей высокую концентрацию клеток и высокую долю живых клеток, что способствует регенеративной медицине с использованием сред (суспензий), содержащих клетки млекопитающих.