Пробиотическая кормовая добавка для пушных зверей

УДК577.152.579.6:636.93

ПРОБИОТИЧЕСКАЯ КОРМОВАЯ ДОБАВКА ДЛЯ ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ

Н. А. ГОЛОВНЕВА, Л. В. РОМАНОВА

Институт микробиологии НАН Беларуси, г. Минск, Республика Беларусь

А. С. АНДРУСЕВИЧ, М. М. МИСТЕЙКО, А. Ю. ФИНОГЕНОВ

РУП «Институт экспериментальной ветеринарии им. С. Н. Вышелесского», г. Минск, Республика Беларусь

В статье представлены данных с оптимальными значениями технологических параметров процесса получения бактериальных компонентов пробиотической кормовой добавки для пушных зверей.

Ключевые слова: бифидобактерии, лактобациллы, пробиотические свойства, кормовая добавка, пушные звери.

The article presents data with optimal values of technological parameters of the process of obtaining the bacterial components ofprobiotic feed additives for fur animals.

Key words: bifidobacteria, lactobacilli, probiotic properties, feed additive, fur-bearing animals.

Введение. Среди всех патологий пушных зверей, связанных с технологией содержания, кормления и использования, наибольший удельный вес занимают заболевания, обусловленные контаминацией корма патогенными и условно патогенными микроорганизмами и их токсинами. Широкое применение в звероводстве антибактериальных препаратов часто приводит к возникновению дисбиозов различной степени интенсивности и, как следствие, к значительным экономическим потерям в результате снижения продуктивности, непроизводительного выбытия и падежа пушных зверей, особенно молодняка. Для решения этой проблемы перспективными являются бактериальные препараты и кормовые добавки на основе пробиотических штаммов микроорганизмов.

Анализ источников. В настоящее время известно значительное количество препаратов-пробиотиков, включающих в свой состав те или иные штаммы молочнокислых бактерий рода Lactobacillus: L.acidophilus, L.plantarum, L.fermentum, L.casei и др., лечебно-профилактический эффект которых связан, прежде всего, с подавлением роста патогенных и условно патогенных микроорганизмов [1]. Антагонистическая активность лакто-бактерий обусловлена не только продукцией метаболитов, обладающих антимикробной активностью (бактериоцинов, лизоцима, перекиси водорода, молочной, уксусной и других органических кислот), но и конкурен-

цией за сайты связывания на слизистых оболочках различных отделов желудочно-кишечного тракта животных, а также сорбцией солей тяжелых металлов и токсинов. Бактериальные препараты пробиотики являются многофакторным средством, обладающим иммуностимулирующим действием, связанным с поддержанием в активном состоянии специфических и неспецифических гуморальных и клеточных механизмов иммунитета. Установлено, что под влиянием пробиотических бактерий усиливается активность клеток моноцитарно-макрофагального ряда, фагоцитоз, активность натуральных киллеров, увеличивается продукция сывороточных иммуноглобулинов и интерферона, стимулируются реакции Т-клеточного иммунитета [2].

Следует отметить, что, несмотря на наличие в арсенале ветеринарных специалистов ряда лечебно-профилактических пробиотиков, во всем мире актуально создание новых биопрепаратов с использованием активных штаммов-продуцентов. Особый интерес представляют штаммы молочнокислых бактерий, способные сдерживать контаминацию кормов патогенными, условно патогенными микроорганизмами и их токсинами.

С точки зрения терапевтической эффективности и технологичности наиболее значимыми критериями для включения в состав препаратов пробиотиков являются экологическая принадлежность штаммов бактерий к физиологическим симбионтам организма-хозяина, устойчивость к физиологическим стрессам желудочно-кишечного тракта, высокая антагонистическая активность по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. В норме бактерии-симбионты заселяют слои эпителия, прилежащие к клеткам ворсинок в нижних отделах тонкого кишечника и в толстом кишечнике. Механизмы положительного эффекта пробиотических микроорганизмов связаны с синтезом ряда ферментов, витаминов, способностью к нейтрализации токсинов, стимуляцией иммунитета, участием в утилизации кальция и железа [3, 4]. Исследование воздействия представителей нормофлоры желудочно-кишечного тракта на состояние макроорганизма в целом позволило установить, что продукты и препараты, изготовленные с применением указанных микроорганизмов, обладают противоопухолевым, антихолестериногенным, иммуностимулирующим и другими позитивными свойствами [5, 6].

Пробиотики используются для стимуляции неспецифического иммунитета и восстановления нормофлоры желудочно-кишечного тракта после лечения антибиотиками и другими антибактериальными химиотерапевти-ческими средствами; для замены антибиотиков в комбикормах для молодняка животных, пушных зверей и птицы; для ускорения адаптации животных к высокоэнергетическим рационам и небелковым азотистым веществам; для повышения эффективности использования корма и про-

дуктивности животных. Помимо этого нормальная микрофлора, прежде всего кишечника, оказывает выраженное детоксицирующее действие как в отношении соединений, попадающих извне, так и образующихся в организме хозяина. Процесс детоксикации с участием нормальной микрофлоры идет по нескольким направлением: биотрансформация с образованием нетоксичных конечных продуктов, микробная трансформация, сопровождающаяся образованием метаболитов, подвергающихся быстрой деструкции в печени, изменение полярности соединений таким образом, что изменяется скорость их экскреции в окружающую среду или транслокации в кровяное русло. Нормальная микрофлора, как "естественный биосорбент", способна также аккумулировать значительное количество токсичных продуктов, включая металлы, фенолы, яды растительного, животного и микробного происхождения, ксенобиотики. Все процессы детоксикации с вовлечением нормальной микрофлоры идут преимущественно в условиях анаэробиоза за счет гидролитических и восстановительных реакций [7].

Наиболее полно в ветеринарной практике требованиям безопасности и эффективности отвечают препараты, в состав которых входят микроорганизмы из числа основных представителей нормального кишечного биоценоза.

Современные лечебно-профилактические препараты создаются на основе бактериальных культур, выделенных от здоровых организмов, идентифицированных до вида, безопасных, обладающих широким спектром антагонистической активности в отношении патогенных микроорганизмов, не угнетающих представителей нормофлоры организма хозяина. Важнейшей характеристикой производственных штаммов является также стабильность биологической активности, соответствие технологическим требованиям производства. Готовый для перорального применения препарат должен содержать в своем составе живые микробные клетки, способные к выживанию и размножению в условиях кишечного микроокружения, устойчивые к низким значениям рН и органическим кислотам, к физиологической концентрации желчи и солей натрия [3, 4].

Данные литературы свидетельствуют о том, что регулярное введение живых бактерий - представителей нормальной кишечной микрофлоры с целью профилактики и лечения желудочно-кишечных болезней животных, направленное на восстановление кишечного биоценоза, экономически обосновано, позволяет снизить потребление антибиотиков, повысить качество продукции [8].

Цель исследования - создание пробиотической кормовой добавки для пушных зверей.

Материал и методика исследований. Объектами исследований служили бифидобактерии Bifidobacterium adolescentis и молочнокислые бак-

терии рода Lactobacillus. Культуры бактерий поддерживали на модифицированной среде MRS c 1 % лактозы методом субкультивирования, хранили при температуре + 4 - 6о С. Культивирование бифидо- и молочнокислых бактерий проводили в термостате при 30-370 С.

Морфологию молочнокислых бактерий изучали на препаратах живых и фиксированных окрашенных клеток с использованием светопольной и фазово-контрастной микроскопии.

Биомассу бактерий определяли нефелометрически, путем измерения оптической плотности суспензии бактерий при 590 нм после 24 ч инкубации, выражали в мг сухих клеток на мл среды. Для расчета использовали калибровочную кривую зависимости оптической плотности культураль-ной жидкости от биомассы.

Количество жизнеспособных клеток бактерий в 1 мл суспензии (число колониеобразующих единиц КОЕ) определяли методом предельных разведений при высеве на полуагаризованные питательные среды с 0,2 % агара.

Активную кислотность среды определяли потенциометрически с помощью мембранного рН-метра HI-8314 (Hanna instruments, Португалия), титруемую кислотность культуральной жидкости - титрометрическим методом, после 24 ч культивирования при оптимальной температуре. Результат выражали в градусах Тернера (°Т).

Антагонистическую активность бактерий по отношению к тест-штаммам исследовали общепринятыми методами [9], определяя диаметр (в мм) зон задержки роста, образовавшихся вокруг лунок.

Результаты исследований и их обсуждение. В состав пробиотиче-ской кормовой добавки для пушных зверей отобраны культуры бифидо-бактерий B.adolescentis и молочнокислых бактерий L.casei, L.acidophilus, L.plantarum, Lactobacillus sp., обладающие высокой скоростью роста и кислотообразования (табл. 1).

Таблица 1. Рост и кислотообразование молочнокислых бактерий на среде MRS

Микроорганизмы мг/мл КОЕ/мл рН 0-j-

Lactobacillus acidophilus 1,81 1,5-109 4,15 110

Lactobacillus sp. 1,94 7,2-109 4,27 82

Lactobacillus plantarum 2,18 1,Ы010 4,32 98

Lactobacillus casei 1,76 9,3-109 4,16 102

Bifidobacterium adolescentis 1,82 1,81010 4,7 98

Проведено исследование кислото- и желчеустойчивости бактерий и показано, что жизнеспособность клеток исследуемых штаммов снижается на 21-38 % после 90-120 мин экспозиции при рН 2,0. При добавлении в среду 0,2-0,5 % желчи численность молочнокислых бактерий не снижает-

ся, в то время как бифидобактерии в этих условиях не развиваются, но не теряют способность к пролиферации в стандартных условиях (табл. 2).

Таблица 2. Количество жизнеспособных клеток

Состав среды: Bifidobacterium Lactobacillus

М RS 2 109 - 14 109 2 109 - 4 109

+ 0,25% желчи - 3,1 109; 1 109

+ 0,5% желчи - 1,9 109

Одним из основных требований к штаммам, используемым в составе пробиотических препаратов, является высокая антагонистическая активность по отношению к патогенным и условно патогенным микроорганизмам. В табл. 3 приведены данные об антагонистической активности исследуемых культур в отношении патогенных микроорганизмов родов Salmonella, Staphylococcus, Streptococcus и E. coli.

Таблица 3 . Антагонистическая активность пробиотических бактерий

Бактерии Salmonella typhimurium Staphylococcus sp. E. coli Streptococcus sp.

Lactobacillus acidophilus 10±2 9±2 12±1,5 10±2

Lactobacillus plantarum 5±1,5 6±2 8±2 4±1,5

Lactobacillus casei 2±0,5 2±0,5 2±0,5 2±0,5

Lactobacillus sp. 8±2 7±2 5±1,5 8±2

Bifidobacterium adolescentis 6±2 8±3 10±2 8±3

С учетом исследованных свойств бактерий составлены консорциумы и наработаны экспериментальные образцы препаратов, включающие штаммы бифидобактерий и лактобацилл:

1. B. adolescentis + L. casei + L. acidophilus 1

2. B. adolescentis + L. casei + L. acidophilus 2

3. B. adolescentis + L. plantarum+ L. acidophilus1

4. B. adolescentis + L. acidophilus 1 + L. acidophilus 2

5. B. adolescentis + Lactobacillus sp. 1 + L. acidophilus 2

6. B. adolescentis + Lactobacillus sp. 2 + L. acidophilus 2

7. B. adolescentis + Lactobacillus sp. 3 + L. acidophilus 2

Показано усиление антагонистической активности экспериментальных образцов комплексных препаратов, содержащих бактерии разных видов, по сравнению с монокультурами (табл. 4).

Подобраны состав сред и оптимальные параметры культивирования бактерий - компонентов биопрепарата.

Таблица 4. Антагонистическая активность разработанных бактериальных консорциумов

№ TecT-mTaMMbi Образцы кормовых добавок

п/п 1 2 3 4 5 6 7

1 Salmonella dublin 10 12 12 12 10 10 12

2 Salmonella typhimurium 13 13 13 11 13 11 12

3 Salmonella choleraesuis 10 13 12 11 12 11 12

4 Pseudomonas fluorenscens 0 7 7 7 0 0 0

5 Proteus mirabilis 0 8 7 6 0 0 0

6 Streptococcus egui 0 13 12 11 0 0 0

7 Streptococcus suis 10 13 14 0 10 0 0

8 Staphylococcus aureus 10 11 10 10 10 10 10

9 Pasteurella multocida 14 14 13 14 12 13 12

10 Escherichia coli 0 0 10 10 0 0 0

11 Candida famata 10 0 0 0 0 10 0

12 Pseudomonas aeruginosa 13 12 11 11 11 10 11

13 Escherichia fergusonii 0 7 7 6 0 0 0

14 Klebsiella oxytoca 10 11 10 10 10 10 10

Оптимальной температурой роста бифидобактерий и Lactobacillus acidophilus является 370 С, L.casei - 300 С. Бифидобактерии активно развивались на среде КЛД и модифицированной среде MRS, молочнокислые бактерии L.casei - на среде MRS. В этих условиях обеспечивается максимальный уровень накопления биомассы бактерий (до 2 мг/мл) с высоким содержанием жизнеспособных клеток - не менее 109, продолжительность культивирования бактерий не превышала 24 часов (рисунок).

мг/мл

Рис. Накопление биомассы при культивировании бифидо- и молочнокислых бактерий: 1 - бифидобактерии, 2 - молочнокислые бактерии

На основании полученных данных определены оптимальные значения технологических параметров процесса получения бактериальных компонентов пробиотической кормовой добавки для пушных зверей.

Заключение. 1. В состав пробиотической кормовой добавки для пушных зверей отобраны культуры микроорганизмов родов Bifidobacterium и Lactobacillus, соответствующие требованиям безопасности, безвредности, наличия пробиотических свойств. Отобранные культуры бифидобактерий и молочнокислых бактерий B.adolescentis, L.casei, L.acidophilus, L.plantarum, Lactobacillus sp. характеризуются кислото- и желчеустойчи-востью, обладают высокой скоростью роста и кислотообразования, проявляют антагонизм по отношению к тест-культурам Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Salmonella typhimurium, Listeria monocytogenes.

2. С учетом исследованных свойств бактерий составлены консорциумы, включающие штаммы бифидобактерий и лактобацилл, показано усиление антагонистической активности комплексных препаратов по сравнению с монокультурами.

3. Подобраны состав сред и оптимальные параметры культивирования бактерий - компонентов биопрепарата.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бондаренко, В. М. Дисбиозы и препараты с пробиотической функцией /

B. М. Бондаренко, А. А. Воробьев // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 2004. - № 1. - С. 84-92.

2. Pamer, E. G. Immune responses to commensal and environmental microbes / E. G. Pamer // Nature immunology. - 2007. - Vol. 8, N 11. - Р. 1173-1178.

3. Yeoman, C .J. Gastrointestinal tract microbiota and probiotics in production animals /

C. J. Yeoman, B. A. White // Annu Rev AnimBiosci. -2014. - N 2. - P. 469-486.

4. Characterization of the intestinal microbiota and its interaction with probiotics and health impacts / C .N. de Almada[et al.] // ApplMicrobiolBiotechnol. - 2015. - Vol. 99, N 10. - P. 41754199.

5. Influence of the gastrointestinal microbiota on development of the immune system in young animals / E. Bauer [et al.] // Curr Issues IntestMicrobiol. - 2006. - Vol. 7, N 2. - P. 35-45.

6. The microbiome: the trillions of microorganisms that maintain health and cause disease in humans and companion animals / H. A. Rodrigues [ et al.] // Vet Pathol. - 2016. - Vol. 53, N 1. -P. 10-21.

7. Functional modulation of human intestinal epithelial cell responses by Bifidobacteriuminfantis and Lactobacillus salivarius / A.M. O'Hara [et al.] // Immunology. - 2006. - Vol. 118, N2. - P. 202-215.

8. Chaucheyras-Durand, F. Probiotics in animal nutrition and health / F. Chaucheyras-Durand, H. Durand // Benef Microbes. - 2010. - Vol.1, N 1. - P. 3-9.

9. Егоров, Н. С. Микробы-антагонисты и биологические методы определения антибиотической активности. - М.: Высшая школа, 1965. - 211 с.