СПОСОБ ПРИЖИЗНЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА
METHOD OF LIFE-TIME DIAGNOSTICS OF TUBERCULOSIS

Изобретение относится к биологии, а именно к разделу иммунологии. Оно может быть использовано для хемилюминесцентного (ХЛ) анализа в науке, ветеринарии, медицине, экологии.
Известна работа В.Ю. Куликова, Г.В. Данилевич, Э.Б. Фридмана, Л.А. Куликовой «Вопросы биофизики» (1967), которые изучали особенности индуцированной ХЛ сыворотки крови у больных с воспалительными и невоспалительными заболеваниями в кинетике внутренних болезней. В качестве индуктора ХЛ использовали 15%-ный раствор NaOH, который в объеме 0,1 мл добавляли к 1,0 мл исследуемой сыворотки. ХЛ регистрировали при Т +22°C квантометрической установкой, работающей в режиме счетчика квантов. В качестве детектора светового излучения использовали фотоэлектронный уловитель ФЭУ-39. Обследовано 147 больных, из них 40 - больных туберкулезом: а) больные с выраженной активностью воспалительного процесса - 21 чел.; б) больные с минимальной активностью - 19 чел. Наибольшей хемилюминесценцией обладали сыворотки крови больных с активными воспалительными процессами.
Также в литературе имеется работа Ф.К. Шарипова, Г.В. Киреева «Свободнорадикальное окисление сыворотки крови больных с опухолями головного мозга» (Республиканский онкологический научный центр МЗ РУз, Республика Узбекистан, г. Ташкент, 2003), в которой изучены закономерности свободнорадикального окисления сыворотки крови больных с опухолями головного мозга методом хемилюминесценции. После инкубации разведенной сыворотки крови с солями двухвалентного железа наблюдали типичную для липосодержащих систем картину развития свечения - быструю вспышку, угнетение свечения, медленную вспышку, переходящую в стационарное свечение. На каждой из этих стадий наблюдали положительную корреляцию между интенсивностью свечения и скоростью накопления продуктов перекисного окисления липидов - малонового диальдегада и концентрацией двухвалентного железа.
Недостатками этих способов является применение их только в медицине, а в качестве индуктора - использование 15%-ного раствора NaOH и двухвалентного железа, обладающих неспецифическим стимулирующим действием.
Наиболее близким техническим решением является «Способ прижизненной диагностики туберкулеза» (см. патент РФ №2389020 от 10 мая 2010 г., G01N 33/569). Способ прижизненной диагностики туберкулеза включает выделение полиморфноядерных лейкоцитов, сохранение их в стабилизирующем растворе, определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции с использованием в качестве индуктора «дыхательного взрыва» опсонизированного зимозана, а в качестве дополнительного индуктора - инактивированный вакцинный штамм БЦЖ.
Недостатком этого способа является трудоемкий процесс приготовления и короткий срок использования исследуемого материала - выделенные полиморфноядерные лейкоциты (где в цитоплазматической мембране клетки определяется уровень свободнорадикального окисления) остаются жизнеспособными и пригодными для исследований не более 3-4 часов. Диагностику можно проводить только при острой фазе туберкулеза. Также не обеспечивается дифференциальная диагностика туберкулеза, учет ХЛ проводится только по одному показателю интенсивности свободнорадикального окисления.
Техническим результатом способа является снижение трудоемкости и безопасности, увеличение срока пригодности объекта исследований, ведущее к повышению точности прижизненной дифференциальной диагностики неспецифических реакций на ППД-туберкулин у крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах, ускорению процесса дифференциальной диагностики и, как следствие, предотвращению необоснованного убоя продуктивных животных в хозяйствах различных форм собственности, в том числе фермерских.
Заявленный технический результат способа прижизненной диагностики туберкулеза включает определение индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции, в качестве объекта исследований используется сыворотка от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств, а инактивированную вакцину БЦЖ используют в качестве основного индуктора.
Способ осуществляют следующим образом: проводят забор крови от положительно реагирующего на ППД-туберкулин крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств; получают сыворотку стандартным способом путем отстаивания крови в термостате, обводки образовавшегося сгустка и дальнейшего центрифугирования образовавшейся сыворотки. В качестве основного индуктора используют инактивированную вакцину БЦЖ.
Добавляют: 20 мкл раствора люминола, 400 мкл сыворотки, 50 мкл инактивированной вакцины БЦЖ, 50 мкл стабилизирующего раствора для отрицательного контроля антигена.
Приготовление люминола - люминол-гидразид-3-фталевой кислоты, 40 мг люминола растворяют горячим (~100°C) раствором 0,01 н. NaOH. Определяют pH 7,2, доводят общий объем до 20 мл 1-кратным раствором Хэнкса без фенолового красного.
Приготовление основного индуктора - инактивированный вакцинный штамм БЦЖ.
Исходя из того, что вакцинный штамм БЦЖ имеет филогенетическое родство с патогенными микобактериями туберкулеза, в качестве антигена использовали вакцину БЦЖ (Медгамал вакцина Имурон) - производства Государственное учреждение НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, утвержденную Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 26.12.2003 г.
Для получения стандартного разведения сухую вакцину (в 1 ампуле содержится 25 мг лиофилизированной живой бактериальной массы штамма БЦЖ) растворяли в 5,0 мл изотонического раствора NaCl, т.е. в 0,2 мл раствора содержится 1 мг сухого вещества.
Для использования in vitro в ХЛ реакции вакцинный штамм БЦЖ в стандартном разведении инактивировали автоклавированием при режимах: 1 атм 130-150°C - 2 ч и 2 атм 130-150°C - 1 ч. Контрольный посев инактивированного вакцинного штамма БЦЖ на питательные среды Левенштейна-Йенсена и ФАСТ-3Л показал отсутствие роста культуры при вышеуказанных режимах инактивации.
В РСК провели проверку специфической активности различных разведений вакцинного штамма БЦЖ. В качестве эталона (контроля) использовали показатели аналогичной титрации в РСК антигена ВНИИБТЖ.
Таблица 1.
Титрация туберкулезного антигена (вакцинный штамм БЦЖ)
Стандартное разведение БЦЖ
1:10
1:20
1:40
1:60
1:80
1:100
1:120
++
+
-
-
-
-
-
Из таблицы 1 видно, что оптимальным разведением является стандартное разведение вакцинного штамма БЦЖ, применяемое для вакцинации in vivo и способное индуцировать ХЛ реакцию in vitro.
Оценку спонтанной и индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции проводили в течение 180 мин на 36-канальном хемилюминесцентном анализаторе CL3604 (Россия). Регистрацию результатов и управление хемилюминесцентным анализатором осуществляли посредством микроЭВМ IBM/PC/AT.
В исследуемых объектах определяли следующие показатели: максимальное значение концентрации свободных радикалов (интенсивность сигнала) - Imax; интегральный показатель генерации активных форм кислорода (площадь кривой - светосумма) - S; антиоксидантный показатель, коррелирующий со скоростью падения хемилюминесценции и обратно пропорциональный скорости свободнорадикального окисления - tg L.
Результаты исследований регистрировали, записывали и обрабатывали на ЭВМ (ПК), по максимуму свечения, в абсолютных значениях - импульсах в секунду. Оценку проводили в относительных значениях превышения уровня ХЛ опытных и контрольных проб, т.е. метаболический статус кислородзависимых процессов полиненасыщенных липопротеидов лимфокинов в сыворотке крови оценивали по динамике индуцированной ХЛ, сопоставляли скорость подвижного равновесия свободнорадикального окисления (Imax) и антиоксидантной системы (tg L) у здоровых и зараженных животных.
Проведена математическая обработка с определением средней арифметической, ошибки средней арифметической, коэффициента достоверности.
Учет результатов реакции.
Здоровое животное - с повышенной чувствительностью к туберкулину (сенсибилизированное)
Коэффициент достоверности значений Imax Р>0,1 («недостоверно» - нет увеличения уровня свечения исследуемой пробы от здорового животного по сравнению с контролем при взаимодействии с туберкулезным антигеном)
Антиоксидантный потенциал (tg L) исследуемой пробы здорового животного по абсолютному показателю выше контрольной пробы.
Инфицированное животное
Положительной на туберкулез считается проба, где коэффициент достоверности значений Imax Р<0,01; («достоверно» - есть увеличение уровня свечения опытной пробы по сравнению с контрольной при взаимодействии с туберкулезным антигеном).
Антиоксидантный показатель (tg L) исследуемой пробы ниже контрольной.
Опыт 1. В опыте на морских свинках, зараженных Mycobacterium bovis штамм 14, определены критерии оценки результата ХЛ сыворотки - максимальное значение концентрации свободных радикалов (интенсивность сигнала) - Imax, интегральный показатель генерации активных форм кислорода (площадь кривой - светосумма) - S; антиоксидантный показатель, коррелирующий со скоростью падения хемилюминесценции и обратно пропорциональный скорости свободнорадикального окисления - tg L.
Результаты представлены в таблице 2.
Таблица 2
Результаты ХЛ исследований сыворотки крови морских свинок, экспериментально зараженных М. bovis штамм 14
Интенсивность сигнала (I), абсолют. значения (имп./с)
Светосумма (S), относит. значения
Антиоксидантный показатель (tg L), относит. значения
Контроль - сыворотка от здоровых морских свинок
М±m
1190,6±24,8
1,52±0,18
0,22±0,024
P
Опыт, дни после заражения
3-й день
М±m
1169,4±10,3
1,14±0,002
0,195±0,03
P
0,454
7-й день
М±m
1190,2±33,81
1,87±0,003
0,141±0,017
P
0,993
14-й день
М±m
1325,9±52,7
2,09±0,018
0,164±0,014
P
0,037
21-й день
М±m
1423,2±87,02
1,40±0,006
0,204±0,026
P
0,023
При анализе таблицы 2 видно, что в эксперименте в динамике развития туберкулезного процесса у лабораторных животных изменяются и абсолютные, и относительные значения. В частности, на 3-й и 7-й дни нет изменений в абсолютных значениях, но есть изменения в относительных показателях - изменяется антиоксидантный потенциал (tg L) в сторону уменьшения по сравнению с контролем. На 14-й и 21-й дни достоверные различия в абсолютных показателях - превышение уровня свечения ХЛ у опытных групп по сравнению с контролем.
На 28-й день опыта получены недостоверные результаты и абсолютных, и относительных значений. Такие результаты ХЛ реакции последнего срока исследования мы предположительно связываем с тем, что с наступлением генерализованной формы туберкулезного процесса, что подтверждается патологоанатомической экспертизой, выявляется феномен хемилюминесцентной анергии, который проявляется отсутствием адекватного ответа в ХЛ реакции на контакт со специфическим индуктором - антигеном (нарушение антигенспецифического ответа).
Патологоанатомическая экспертиза опытных животных дала следующие результаты.
На 3-й и 7-й дни после заражения при патологоанатомической экспертизе внутренних органов изменений нет;
на 14-й день: в месте введения - сосудистая реакция, ограниченный абсцесс, селезенка не увеличена;
на 21-й день - в месте введения туберкулезный абсцесс, в печени всех опытных животных творожистые узелки, селезенка увеличена в 1,5-2 раза;
к 28-му дню при патологоанатомической экспертизе внутренних органов отмечена выраженная форма генерализованного туберкулеза - увеличение селезенки в 3-4 раза, множественные узелки желтоватого цвета в селезенке и печени, в месте введения - язвы.
Полученные результаты ХЛ измерений биоматериала здоровых и больных туберкулезом животных также оценивались по общепринятым статистическим критериям достоверности - при бактериологическом исследовании при посеве патологического материала внутренних органов опытных свинок на стандартные питательные среды выделена исходная заражающая культура M.bovis штамм 14.
Опыт 2. Проведен научно-производственный опыт на взрослом поголовье крупного рогатого скота, показавшего при плановых аллергических исследованиях на туберкулез положительный результат при внутрикожном введении стандартного ППД-туберкулина для млекопитающих. Коровы и нетели из неблагополучного по туберкулезу хозяйства Омской области.
Полученные результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
ХЛ сыворотки крови крупного рогатого скота из неблагополучного по туберкулезу хозяйства (СПК «Украинский» Исилькульского района Омской области).
Хоз-во
Исслед. проб
Интенсивность сигнала (I), абсолют. значения (имп./с)
Светосумма (S), относит. значения
Антиоксидантный потенциал (tg L), относит. значения
контроль
опыт
контроль
опыт
контроль
опыт
60
М±m
1151±12,9
1187,75±43,72
6,31±1,64
6,25±1,61
0,287±0,055
0,278±0,059
Р
0,069
0,941
0,010
Из таблицы 3 следует, что в абсолютных значениях исследуемых проб в данном хозяйстве значения коэффициента достоверности P «достоверно» - есть превышение уровня ХЛ свечения исследуемых проб по сравнению с контролем; антиоксидантный показатель (tg L) в исследуемых пробах ниже контрольных значений. Результат ХЛ исследования - положительный, диагноз на туберкулез - положительный.
При посеве на стандартные питательные среды Левенштейна-Йенсена и ФАСТ-3Л биоматериала от положительно реагировавших коров выделены полевые штаммы микобактерий бычьего вида. Биопробы на морских свинках - положительные.
Таким образом, ХЛ исследования сыворотки крови от положительно реагирующих на ППД-туберкулин животных из неблагополучного по туберкулезу хозяйства можно использовать в комплексе ветеринарно-диагностических мероприятий при постановке первичного диагноза.
Опыт 3. Проведен научно-производственный опыт на взрослом поголовье крупного рогатого скота, показавшего при плановых аллергических исследованиях на туберкулез положительный результат при внутрикожном введении стандартного ППД-туберкулина для млекопитающих. Коровы и нетели из длительно благополучных по туберкулезу (более 10 лет) хозяйств Омской и Новосибирской областей.
Полученные результаты представлены в таблице 4. Из таблицы 4 следует, что в абсолютных значениях исследуемых проб во всех перечисленных хозяйствах значения коэффициента достоверности Р «недостоверно» - нет превышения уровня ХЛ свечения исследуемых проб по сравнению с контролем; антиоксидантный показатель (tg L) в исследуемых пробах выше значений контрольных. Результат - отрицательный, туберкулез крупного рогатого скота исключен, реакции на ППД-туберкулин ложноположительные.
При бактериологическом исследовании биоматериала от положительно реагировавших коров выделены атипичные микобактерии 3-4 группы по классификации Раньона, которые являются одними из основных факторов сенсибилизации. Биопробы на морских свинках - отрицательные.
Таблица 4
Результаты ХЛ исследований сыворотки крови крупного рогатого скота из благополучных по туберкулезу хозяйств
Хоз-во
Иссл. проб
Интенсивность сигнала (I), абсолют. значения (имп./с)
Светосумма (S), относит. значения
Антиоксидантный показатель (tg L), относит. значения
контроль
опыт
контроль
опыт
контроль
опыт
ЗАО Дружба Марьяновского района Омской обл.
79
М±m
1172,64±45,41
1164,21±33,44
1,35±0,002
1,33±0,002
0,227±0,042
0,327±0,046
P
0,882
ЗАО «Азовское» Азовского района Омской обл.
26
М±m
1392,75±206,8
1405±211,4
7,19±0,4
7,22±0,4
0,288±0,124
0,341±0,1 24
P
0,768
ОАО «Неудачино» Татарского района Новосибирской обл.
53
М±m
1132
1133
9,22±0,4
9,26±0,4
0,130±
0,132±
Р
0,816
ЗАО «Знамя» Марьяновского района
12
Омской обл.
M±m
1129,11±8,21
1143,55±22,38
0,178±0,008
0,182±0,005
P
0,185
СПК «Титан» Исилькульского района Омской обл.
21
М±m
1255,6±6,12
1253±6,63
1,22±0,003
1,22±0,002
0,416±0,004
0,419±0,004
P
0,806
ОАО ПКЗ «Омский» Марьяновского района Омской обл.
12
М±m
1374,33±10,27
1374,9±11,306
1,54±0,001
1,54±0,002
0,406±0,007
0,418±0,005
P
0,970
ИТОГО
193
Таким образом, прижизненный ХЛ метод исследования сыворотки крови от положительно реагирующих на ППД-туберкулин животных из благополучных по туберкулезу хозяйств можно использовать в комплексе дифференциальной диагностики неспецифических реакций.
Пример 1. В соответствии с календарным планом работ исследовано на туберкулез 836 коров и нетелей, принадлежащих ОАО «Неудачино» Татарского района Новосибирской области. Положительную реакцию на ППД-туберкулин дали 53 головы, из них 6 голов - повторно реагирующие. С целью уточнения диагноза проведен контрольно-диагностический убой 8 голов крупного рогатого скота. При патологоанатомической экспертизе внутренних органов и лимфатических узлов убитых животных изменений, характерных для туберкулеза, не обнаружено.
Проведено лабораторное исследование биоматериала от 8 голов крупного рогатого скота - посев на стандартные питательные среды Левенштейна-Йенсена, ФАСТ-3Л, полужидкую среду ПС-1 для выявления L-форм. Проведены биопробы на лабораторных животных.
При бактериологическом исследовании во всех случаях возбудителей бычьего, человеческого и птичьего видов не выделено. Из биоматериала от 3-х голов выделены атипичные микобактерии 4-й группы по классификации Раньона.
При исследовании методом ПЦР смывов культур с питательных сред с использованием видоспецифичных праймеров (тест-система «МТБ-КОМ» производства НИИ эпидемиологии, г. Москва) результат - отрицательный.
Результаты биологической пробы на морских свинках отрицательные.
Для повышения точности дифференциальной диагностики неспецифических реакций исследовано хемилюминесцентным методом 58 проб сывороток крови. Результаты ХЛ исследований - отрицательные.
На основании проведенных комплексных исследований в 2008 г. подтверждено благополучие ЗАО «Неудачино» Татарского района по туберкулезу крупного рогатого скота.
Таким образом, предотвращен убой 39 голов крупного рогатого скота, что способствовало сохранению поголовья животноводческой фермы и повышению объема производства мясо-молочной продукции.
Получение продукции от сохраненных коров:
Удой от 1 коровы в 2008 г. - 5304 кг.
Реализационная цена 1 кг молока - 9, 37 руб.
Получено от 1 коровы молока в год на 49698,48 руб. (9,37×5304=49698,48 руб.).
Получено от 39 коров молока в год на 1938240,72 руб. (49698,48×39=1938240,72 руб.).
Получено телят от 39 коров - 30 гол. (39 гол.×0,78=30 гол.)
Стоимость 30 рожденных телят 3480 руб.×30=104400 руб
Всего произведено продукции оставленными в стаде коровами (39 гол.) на сумму 2042640,72 руб. (1938240,72 руб.+104400 руб.)
Анализ показал, что в отличие от известного способа, использование предлагаемого способа прижизненной диагностики туберкулеза позволяет дифференцировать неспецифические реакции на ППД-туберкулин у крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах, снижает трудоемкость и более технологичен, увеличивает срок пригодности объекта исследований, снижает материальные затраты в 10 и более раз. При использовании предлагаемого способа в общем комплексе противотуберкулезных мероприятий создаются условия для предотвращения необоснованного убоя животных, сохранения поголовья животноводческих ферм и повышения объема производства мясо-молочной продукции.