Композиционный биоматериал, обладающий гемостатической и регенеративной активностью (варианты)
COMPOSITE BIOMATERIAL WITH HEMOSTATIC AND REGENERATIVE ACTIVITY (OPTIONS)

Изобретение относится к материалам медицинского назначения, а именно, к композиционным биоматериалам, обладающим гемостатической и регенеративной активностью, предназначенным для обработки поврежденных и кровоточащих органов и тканей преимущественно человека.
Изобретение может быть использовано в различных областях медицины, фармацевтики и ветеринарии, например, для остановки кровотечений при хирургических операциях на внутренних органах, при травматических повреждениях тела, а также для сопутствующей регенерации поврежденных органов и/или тканей.
Под термином «биоматериал» заявителем подразумевается «синтетический или природный материал, используемый в медицинском устройстве или в контакте с биологическими системами» [ВП-П8-2322]. Комплексная программа развития биотехнологий в Российской Федерации на период до 2020 года (утв. Правительством РФ 24.04.2012 N 1853п-П8)].
Annals of Clinical and Laboratory Science
Rev. Adv. Mater. Sci.
Из исследованного заявителем уровня техники известно, что одним из наиболее широко используемых компонентов гемостатических биоматериалов является коллаген - белковое соединение, в нативной форме представляющее собой преимущественно структурированную спираль, образованную тремя цепями - полипептидами со средней молекулярной массой, как правило, не менее 100000 дальтон [A. Veis. The biochemistry of collagen. . 1975. Vol.5(2). P.123-131; T. Muthukumar, G. Sreekumar, T.P. Sastry, M. Chamundeeswari. Collagen as a potential biomaterial in biomedical applications.  2018. Vol.53. P.29-39].
Аналогом коллагена, состоящим из близких по составу неструктурированных полипептидов является желатин, называемый также денатурированным коллагеном.
Adv. Mater.
Будучи природными активаторами тромбоцитов, полипептиды коллагена, входящие в состав коллагена и желатина, как и содержащие эти полипептиды биоматериалы в контакте с кровью вызывают ее свертывание (коагуляцию) и, как следствие, остановку кровотечений (гемостаз) [D.A. Hickman, C.L. Pawlowski, U.D.S. Sekhon, J. Marks, A. Sen Gupta. Biomaterials and advanced technologies for hemostatic management of bleeding.  2018. Vol.30(4). 1700859]. В то же время известно, что биоматериалы, состоящие только из полипептидов коллагена, не обладают необходимой кровоостанавливающей активностью при значительных повреждениях органов и тканей [US7399483B2].
Для улучшения характеристик гемостатических биоматериалов, состоящих из полипептидов коллагена, используют химические модификации и/или композиции этих полипептидов. Заявителем выявлена группа сходных изобретений-аналогов по патентам WO2014205261, US20210213157, US20100318048, CN101284146, сущностью которых являются гемостатические биоматериалы на основе химически модифицированных полипептидов коллагена или композиций полипептидов коллагена. Общим недостатком изобретений WO2014205261, US20210213157, US20100318048, CN101284146 является пониженная эффективность действия по назначению вследствие отсутствия в их составе дополнительных биологических компонентов, обладающих специфической кровоостанавливающей активностью (например, за счет регуляции свертывания крови).
Известно изобретение «Нанокомпозитный гидрогель» по патенту WO2014205261, сущностью которого является: фармацевтическая композиция, включающая желатин или производное желатина и силикатные наночастицы, предназначенная для обработки ран и уменьшения времени образования сгустка крови.
Известно изобретение «Гибкая желатиновая закрывающая повязка с реакционно-способными компонентами» по патенту US20210213157, сущностью которого являются: гемостатический закрывающий материал, состоящий из: а) сжатого пористого субстрата (образованного коллагеном или желатином), б) содержащего электрофильную группу компонента (не являющегося коллагеном или желатином), в) содержащего нуклеофильную группу компонента, г) буферного агента, а также способ получения гемостатического закрывающего материала.
Известно изобретение «Гемостатическая губка» по патенту US20100318048, сущностью которого являются: гемостатическая пористая губка, включающая матрицу фибриллярного биоматериала, включающего коллаген и частицы партикулярного материала, включающего кросс-сшитый полимер, адгезированный к вышеупомянутой матрице, где губка далее включает адгезионный слой, состоящий из первого кросс-сшиваемого компонента и второго кросс-сшиваемого компонента, должного сшиваться с первым кросс-сшиваемым компонентом в условиях, способствующих реакции сшивки, и где губка предназначена для абсорбции жидкости абсорбирующим партикулярным материалом, тогда как фибриллярная матрица биоматериала остается интактной, а также способ получения гемостатической пористой губки.
Известно изобретение «Сухая гемостатическая композиция и способы ее приготовления» по патенту CN101284146, сущностью которого являются: композиция, включающая порошок кросс-сшитого желатина с содержанием влаги ≤20%, со средним размером частиц 150-750 микрометров и со скоростью регидратации не менее 3 грамм на грамм, где скорость регидратации порошка определяется как количество водного раствора, абсорбируемого в течение 30 секунд, где порошок кросс-сшит в присутствии способствующего регидриратации агента, который присутствует в количестве <1% массы композиции, где способствующий регидриратации агент - одно и более веществ, выбранных из группы, состоящей из полиэтиленгликоля со средней молекулярной массой от 400 до 1 000, поливинилпирролидона со средней молекулярной массой 50 000 и декстрана со средней молекулярной массой 40 000, а также способ получения порошка кросс-сшитого желатина.
Таким образом, общим признаком вышеуказанных изобретений WO2014205261, US20210213157, US20100318048, CN101284146 является то, что соответствующие композиции содержат химически модифицированные полипептиды коллагена и/или смеси полипептидов коллагена с некоторыми частицами или полимерами и не содержат биологические компоненты, активирующие гемостаз. Принципиальным недостатком вышеуказанных изобретений является пониженная кровоостанавливающая активность, поскольку используемые химические модификации полипептидов коллагена выполняют преимущественно вспомогательную функцию и не выполняют функцию активного гемостатического компонента.
10
11
Известно изобретение-аналог «Кровоостанавливающая губка» по патенту RU2122867, сущностью которого является: кровоостанавливающая губка, содержащая коллаген в качестве основы и лекарственное вещество, высушенное сублимационной сушкой, отличающееся тем, что в качестве лекарственного вещества губка содержит тромбоцитарную массу с содержанием тромбоцитов 10-10 при следующем соотношении компонентов, об.ч.: коллаген 1-10, тромбоцитарная масса 0,10-0,40.
J. Cutan. Aesthet. Surg.
Несмотря на то, что вышеуказанная композиция, наряду с коллагеном, содержит дополнительный биологический компонент, обладающий кровоостанавливающей активностью, а именно, тромбоцитарную массу, необходимость применения этого компонента обусловливает недостатки изобретения RU2122867. Известно, что тромбоцитарная масса является донорским продуктом, выделяемым из крови добровольцев [R. Dhurat, M.S. Sukesh. Principles and methods of preparation of platelet-rich plasma: A review and author's perspective.  2014. Vol.7(4). P.189-197]. Процесс выделения тромбоцитарной массы из крови включает поиск здоровых доноров, что, однако, не исключает риска присутствия в тромбоцитарой массе инфекционных и иммуногенных агентов. Забор крови и получение из нее тромбоцитарной массы проводят с участием медицинского персонала в специализированных условиях. Кроме того, различные партии выделяемой тромбоцитарной массы характеризуются вариабельностью свойств вследствие вариабельности свойств тромбоцитов, взятых у разных доноров и в разных условиях, а также низкой стабильностью, повышенной требовательностью к условиям хранения и транспортировки тромбоцитов. Эти недостатки существенно ограничивают применение изобретения RU2122867 в медицине и фармацевтике.
2
2
3
2
2
3
не менее одной
не менее двух
Наиболее близким аналогом заявленного изобретения, выбранным в качестве прототипа, является изобретение по патенту US7399483B2 «Носитель с твердым фибриногеном и твердым тромбином», сущностью которого являются: 1) носитель, покрытый фибриногеном 4,3-6,7 мг/см и тромбином 1,5-2,5 М.Е., где указанный носитель имеет силу адгезии около 84-110 мбар и  из следующих физических характеристик: модуль эластичности в диапазоне 5-100 ньютон/см, плотность 1-10 мг/см, диаметр камеры более 0,75 мм и менее 4 мм и средний диаметр камеры менее 3 мм, где указанные фибриноген и тромбин - это твердые фибриноген и тромбин, равномерно распределенные и зафиксированные на носителе; 2) носитель, покрытый фибриногеном 4,3-6,7 мг/см и тромбином 1,5-2,5 М.Е., где указанный носитель имеет силу адгезии около 84-110 мбар и  из следующих физических характеристик: модуль эластичности в диапазоне 5-100 ньютон/см, плотность 1-10 мг/см, диаметр камеры более 0,75 мм и менее 4 мм и средний диаметр камеры менее 3 мм, где указанные фибриноген и тромбин - это твердые фибриноген и тромбин, равномерно распределенные и зафиксированные на носителе.
Согласно описанию изобретения US7399483B2, носитель по прототипу представляет собой готовую абсорбирующую композицию для остановки кровотечений, состоящую из носителя с прочно зафиксированными фибриногеном (белок плазмы крови) и тромбином (фермент, участвующий в образовании фибринового сгустка в процессе коагуляции крови). Фибриноген и тромбин, предпочтительно, имеют происхождение из тканей млекопитающих, в том числе, человека, и могут быть природными или рекомбинантными.
Термин «рекомбинантный» относится к «лекарственным средствам, получаемым методами рекомбинантной ДНК» (общая фармакопейная статья ОФС.1.7.1.0007.15 «Лекарственные средства, получаемые методами рекомбинантной ДНК»). Согласно ОФС.1.7.1.0007.15 «указанные лекарственные средства (биологические фармацевтические субстанции) получают с помощью культур охарактеризованных клеток, используемых в качестве систем экспрессии, которыми могут быть бактерии, дрожжи, клетки млекопитающих и др. Полученные субстанции, являясь действующим веществом лекарственных средств, представляют собой белки и пептиды, а также их производные. К таким лекарственным средствам относятся цитокины, моноклональные антитела, вакцины с использованием рекомбинантных белков (HBsAg, белки вируса папилломы и др.), факторы плазмы крови человека, рецепторы клеток и другие рекомбинантные белки. Требования к конкретной фармацевтической субстанции и лекарственным препаратам на их основе изложены в соответствующих фармакопейных статьях или нормативной документации».
Материалом носителя по прототипу является коллаген или желатин или другие природные и синтетические полимеры. Твердое покрытие носителя, состоящее из фибриногена и тромбина, будучи в контакте с кровью или другими жидкостями, переходит в раствор и вступает в реакцию образования фибринового сгустка в результате активации фибриногена тромбином, и эта реакция способствует уменьшению течения крови или иной жидкости в контакте с носителем. Таким образом, в изобретении по прототипу в качестве активного компонента носителя, обладающего специфической гемостатической активностью, использованы биологические компоненты - белки фибриноген и тромбин, усиливающие образование фибринового сгустка.
Гематология и трансфузиология
Известно, что основным источником природных фибриногена и тромбина является донорская кровь [Хурдин В.В., Берковский А.Л., Сергеева Е.В., Суворов А.В. Получение очищенного концентрата фибриногена. . 2019. 64(1). P.73-78]. Также известно, что выделение и очистка фибриногена и тромбина из крови является трудоемким, многоэтапным, дорогостоящим процессом, в ходе которого возможно попадание инфекционных и иммуногенных агентов из крови в препараты фибриногена и тромбина. Выделение тромбина из крови в промышленном масштабе затруднительно вследствие низкой концентрации. Поэтому известные коммерческие продукты, изготовленные с использованием изобретения по прототипу, содержат рекомбинантные фибриноген и тромбин.
ChemBioEng Reviews
Curr. Protoc. Protein Sci.
Согласно вышеуказанной ОФС.1.7.1.0007.15, рекомбинантные фибриноген и тромбин получают из клеток-продуцентов. Известно, что получение рекомбинантного белка из клеток-продуцентов является трудоемким, многоэтапным и затратным процессом, включающим, по меньшей мере: получение рекомбинантной ДНК; генетическую модификацию, отбор и поддержание клеток-продуцентов; культивирование генетически модифицированных клеток-продуцентов в питательных средах; разрушение клеток-продуцентов; многоэтапное выделение и очистку целевого рекомбинантного белка. В совокупности, это обусловливает высокую себестоимость известных препаратов рекомбинантных белков [N.K. Tripathi. Production and purification of recombinant proteins from Escherichia coli. . 2016. Vol.3. P.116-133; P.T. Wingfield. Overview of the purification of recombinant proteins.  2015. Vol.80. P.6.1.1-6.1.35]. Препараты рекомбинантных белков, зачастую, содержат примеси из клеток-продуцентов, способные вызывать побочные иммунные и аллергические реакции, включая анафилактический шок. Полная очистка рекомбинантного белка от примесей из клеток-продуцентов, зачастую, труднореализуема и/или существенно повышает трудоемкость получения высокочистого препарата белка.
Таким образом, основными недостатками биоматериала по прототипу являются:
1. Необходимость применения в качестве активного компонента рекомбинантных белков, характеризующихся повышенной трудоемкостью и затратностью получения (многоэтапность, необходимость использования клеток-продуцентов, необходимость многоступенчатой очистки), а также присутствием иммуногенных примесей (вследствие вышеуказанных особенностей технологии получения рекомбинантных белков).
2. Необходимость, по меньшей мере, двухэтапного изготовления биоматериала, которое включает отдельный технологический этап формирования матрицы, например, коллагеновой губки, и отдельный технологический этап поверхностной модификации матрицы активными компонентами (рекомбинантными фибриногеном и тромбином).
3. Отсутствие у биоматериала, как и у его отдельных компонентов, регенеративных свойств (термин «регенеративные свойства» относится к «специфической способности стимулировать рост и восстановление поврежденных тканей организма на клеточном и тканевом уровнях»).
Техническим результатом заявленного технического решения
является устранение вышеуказанных недостатков биоматериала по прототипу US7399483B2 посредством создания композиционного биоматериала, характеризующегося:
не
1. Отсутствием необходимости применения в качестве активного компонента рекомбинантных белков благодаря использованию активных пептидов рекомбинантной природы (производных полипептидов коллагена), отличающихся пониженными трудоемкостью и затратностью получения (меньшее количество этапов получения целевых пептидовбез необходимости использования клеток-продуцентов и многоступенчатой очистки) и отсутствием иммуногенных примесей.
2. Меньшей трудоемкостью изготовления благодаря одноэтапному формированию композиционного биоматериала посредством включения активных пептидов в матрицу в процессе ее изготовления (без использования дополнительного технологического этапа поверхностной модификации матрицы).
3. Повышенной терапевтической эффективностью благодаря использованию активных пептидов, обладающих комбинированной активностью (гемостатической и регенеративной), не характерной для рекомбинантных фибриногена и тромбина.
Сущностью заявленного технического решения
является композиционный биоматериал, обладающий гемостатической и регенеративной активностью, кросс-сшитый из полипептидов коллагена со средней молекулярной массой не менее 100 000 дальтон и фракции активных пептидов с молекулярной массой от 3 600 до 10 000 дальтон, образованных при ферментативном расщеплении полипептидов коллагена, в соотношении, мас.%: полипептиды коллагена: 90-95; фракция активных пептидов: 1-4; вспомогательные вещества: остальное. Композиционный биоматериал, обладающий гемостатической и регенеративной активностью, кросс-сшитый из полипептидов коллагена со средней молекулярной массой не менее 100 000 дальтон и фракции активных пептидов с молекулярной массой от 3 600 до 10 000 дальтон, образованных при ферментативном расщеплении полипептидов коллагена, и цинка в соотношении, мас.%: полипептиды коллагена: 90-94; фракция активных пептидов: 1-4; цинк: не более 1; вспомогательные вещества: остальное.
Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг. 1 - Фиг. 7.
На Фиг. 1
представлена электрофоретическая полоса, соответствующая фракции активных пептидов (ФАП) с молекулярной массой от 3 600 до 10 000 дальтон (ряд 1), выделенных из полипептидов коллагена, а также электрофоретические полосы, соответствующие стандартам молекулярных масс в диапазоне от 10 000 до 250 000 дальтон (ряд 2).
Таким образом, Фиг. 1 характеризует активный компонент биоматериала (ФАП) по молекулярной массе.
На Фиг. 2
представлены электрофоретические полосы, соответствующие полипептидам коллагена (альфа-, бета-, гамма-фракции) со средней молекулярной массой более 100 000 дальтон (ряд 1), а также электрофоретические полосы, соответствующие стандартам молекулярных масс в диапазоне от 10 000 до 250 000 дальтон (ряд 2).
Таким образом, Фиг. 2 характеризует структурообразующий компонент биоматериала (полипептиды коллагена) по молекулярной массе.
На Фиг. 3
представлена зависимость модуля упругости (G', паскаль) от угловой частоты (ω, радиан в секунду) налагаемых круговых осцилляций для контрольного биоматериала (3А), композиционного биоматериала, содержащего ФАП (3Б), и композиционного биоматериала, содержащего ФАП-Zn (3В), при деформации 10% и температуре 20°С.
Таким образом, Фиг. 3 подтверждает включение ФАП и ФАП-Zn в состав композиционного биоматериала.
На Фиг. 4
представлены типичные микрофотографии среза контрольного биоматериала (4А), композиционного биоматериала, содержащего ФАП (4Б), композиционного биоматериала, содержащего ФАП-Zn (4В), после культивирования с фибробластами мыши линии NIH ЗТЗ в течение 72 часов.Среднее значение числа клеток в поле зрения: 95±12 (4А), 205±26 (4Б), 280±21 (4В).
in vitro
Таким образом, Фиг. 4 подтверждает регенеративную активность композиционного биоматериала .
На Фиг. 5
представлена Таблица со средними значениями оптического поглощения контрольного биоматериала (1), композиционного биоматериала, содержащего ФАП (2), композиционного биоматериала, содержащего ФАП-Zn (3), и биоматериала по прототипу (губки Тахокомб) (4) после контакта с кровью человека.Приведенные значения оптического поглощения при длине волны 542 нм показывают количество кровяного сгустка в биоматериале.
in vitro
Таким образом, Фиг. 5 подтверждает гемостатическую активность композиционного биоматериала .
На Фиг. 6
представлены фотография области интактной печени крысы, подвергаемой резекции (6А), фотография брюшной полости после повторного вскрытия с указанием стрелкой зоны контакта композиционного биоматериала с поврежденной печенью (6Б), фотография брюшной полости после повторного вскрытия с указанием стрелкой зоны контакта биоматериала по прототипу (губки Тахокомб) с поврежденной печенью (6В).
in vivo
Таким образом, Фиг. 6 иллюстрирует  модель применения композиционного биоматериала по назначению и подтверждает отсутствие признаков воспаления в брюшной полости и частичную деградацию биоматериала.
На Фиг. 7
представлены типичные микрофотографии окрашенного криосреза раневой поверхности печени в контакте с композиционным биоматериалом (7А) и криосреза раневой поверхности печени в контакте с биоматериалом по прототипу (губкой Тахокомб) (7Б).
in vivo
Таким образом, Фиг. 7 подтверждает гемостатическую и регенеративную активность композиционного биоматериала .
Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.
В заявленном изобретении в качестве активного компонента композиционного биоматериала вместо рекомбинантных фибриногена и тромбина использована фракция активных пептидов (далее ФАП), образующихся при ферментативном расщеплении полипептидов коллагена, в двух вариантах исполнения:
- ФАП с молекулярной массой от 3 600 до 10 000 дальтон (Фиг. 1);
- композиция ФАП с цинком (далее ФАП-Zn).
Активность ФАП и ФАП-Zn связана с их гемостатическим действием (за счет усиления коагуляции крови) и регенеративным действием (за счет стимуляции роста клеток организма).
ФАП или ФАП-Zn вводят в биоматериал, состоящий из кросс-сшитых полипептидов коллагена, которые содержатся в известных препаратах нативного коллагена или денатурированного коллагена (желатина) и которые имеют среднюю молекулярную массу не менее 100 000 дальтон (Фиг. 2). Заявленный биоматериал на основе полипептидов коллагена имеет преимущественно пористую структуру для улучшения взаимодействия с биологическими тканями и клетками.
ФАП или ФАП-Zn включают в биоматериал на основе полипептидов коллагена посредством химического сшивания смеси, содержащей полипептиды коллагена, ФАП или ФАП-Zn. Следовательно, ФАП или ФАП-Zn включают в заявленный биоматериал на основе полипептидов коллагена одноэтапно в процессе получения самого биоматериала, что не требует дополнительной иммобилизации активного компонента (ФАП или ФАП-Zn). При этом ФАП или ФАП-Zn участвуют в формировании полимерной сетки полипептидов коллагена, образуя композиционные биоматериалы новых составов, включающих полипептиды коллагена, а также ФАП или ФАП-Zn.
Использование в качестве активного компонента композиционного биоматериала ФАП или ФАП-Zn обусловливает преимущества заявленного изобретения по сравнению с прототипом, которые связаны с отсутствием в составе биоматериала рекомбинантных белков. ФАП получают из полипептидов коллагена аналогичных тем, что составляют структурную основу биоматериала. ФАП получают посредством ферментативной фрагментации полипептидов коллагена с последующим выделением целевой ФАП с использованием стандартного метода выделения белков.
Chemico-Biological Interactions
Ферментативная фрагментация полипептидов коллагена является природным процессом, при котором образуются пептиды, обладающие положительной биологической активностью [P. Banerjee, A. Mehta, C. Shanthi. Investigation into the cyto-protective and wound healing properties of cryptic peptides from bovine Achilles tendon collagen. . 2014. Vol.211. P.1-10]. Данные о негативных биологических эффектах фрагментов полипептидов коллагена отсутствуют.
Процесс получения ФАП характеризуется значительно меньшей трудоемкостью по сравнению с получением рекомбинантного фибриногена и рекомбинантного тромбина как в совокупности, так и по отдельности, поскольку процесс получения ФАП не требует применения рекомбинантных методов (Пример 1). Следовательно, процесс получения ФАП имеет пониженную трудоемкость и затратность, а сам препарат ФАП имеет пониженную себестоимость.
Процесс получения ФАП исключает работу с потенциально опасными веществами/клетками и, следовательно, исключает попадание иммуногенных примесей клеток-продуцентов в конечный препарат, что обусловливает одно из преимуществ ФАП по сравнению с рекомбинантными белками.
Biol Trace Elem Res.
Будучи продуктом значительной фрагментации полипептидов коллагена, которые сами по себе имеют достаточно стабильную структуру, ФАП обладает еще большей стабильностью, недостижимой для сложных по структуре белков, к которым относятся фибриноген и тромбин. ФАП и ФАП-Zn имеют сходную коагулирующую и регенеративную активности, которые, однако, могут быть более выражены для ФАП-Zn вследствие благотворных эффектов цинка на процессы гемостаза и регенерации [S. Tubek, P. Grzanka, I. Tubek. Role of zinc in hemostasis: A Review.  2008. Vol.121, P.1-8].
in vitro
Согласно проведенным испытаниям  (Пример 3), гемостатическая (коагулирующая) активность заявленного композиционного биоматериала превосходит гемостатическую (коагулирующую) активность коммерческой гемостатической губки Тахокомб (Takeda) по прототипу. Кроме того, у заявленного композиционного биоматериала выявлена регенеративная активность (Пример 2, Пример 4), не характерная для губки Тахокомб по прототипу.
примеры осуществления заявленного технического решения.
Далее заявителем приведены
Пример 1.
Получение и характеристика композиционного биоматериала.
В качестве активного компонента композиционного биоматериала используют фракцию активных пептидов (ФАП) или композицию ФАП с цинком (ФАП-Zn).
ФАП выделяют согласно изобретению RU2669933, сущностью которого является пептидный препарат (ФАП) из коллагена, состоящий из фракции активных пептидов с молекулярной массой в диапазоне от 3 600 до 10 000 дальтон и способ получения ФАП. Молекулярную массу пептидов в ФАП подтверждают стандартным методом, например, методом электрофореза в полиакриламидном геле (Фиг. 1) с использованием электрофоретического оборудования Bio-Rad Laboratories согласно рекомендациям производителя [A guide to polyacrylamide gel electrophoresis and detection, https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf] или масс-спектрометрическим методом.
Для получения ФАП-Zn фракцию активных пептидов, растворенную в буферном растворе с нейтральным рН (рН≈7), смешивают с водорастворимой солью цинка, например, хлоридом цинка, в массовом соотношении не более 0.25 г цинка на 1 г ФАП. В условиях смешивания в присутствии ФАП соль цинка не выпадает в осадок и выпадает в осадок в аналогичных условиях в отсутствие ФАП, что свидетельствует о взаимодействии цинка с ФАП в растворе. Полученную смесь, содержащую ФАП и цинк, инкубируют, например, 30 минут при комнатной температуре и таким образом получают требуемую композицию ФАП-Zn.
Полученные ФАП или ФАП-Zn включают в состав композиционного биоматериала. В качестве структурообразующего компонента биоматериала используют полипептиды коллагена млекопитающего, например, бычьего коллагена, без ограничения им, с преобладающей молекулярной массой отдельных полипептидов не менее 100 000 дальтон. Полипептиды коллагена растворяют в буферном растворе в химически инертном реакторе. Присутствие полипептидов коллагена в растворе дополнительно подтверждают стандартным методом электрофореза в полиакриламидном геле [A guide to polyacrylamide gel electrophoresis and detection, https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf] по наличию одной или нескольких типичных полос, соответствующих типичным альфа-, бета- и/или гамма-фракциям препарата коллагена (Фиг. 2).
варианта
Для получения  композиционного биоматериала, содержащего ФАП, к раствору полипептидов коллагена в диапазоне концентраций приблизительно от 2 до 20 мас.% добавляют ФАП в количестве, приблизительно соответствующему от 1 до 4% массы полипептидов коллагена, при перемешивании раствора. Молекулы полипептидов коллагена и ФАП в полученной смеси сшивают с использованием стандартных сшивающих агентов, реагирующих с функциональными группами белков, из числа, глутаровый диальдегид (CAS 111-30-8), карбодиимид (CAS 25952-53-8), диметилсуберимидат (CAS 34490-86-3), без ограничения ими, путем добавления в реакционную смесь.
Таким способом проводят кросс-сшивку реакционной смеси, содержащей полипептиды коллагена и ФАП при перемешивании, например, в течение 60 минут с получением кросс-сшитого композиционного биоматериала, состоящего из полипептидов коллагена и ФАП. Термин «кросс-сшивка» обозначает формирование множественных межмолекулярных связей, преимущественно ковалентных, между сшиваемыми компонентами матрицы с образованием полимерной сетки.
варианта
Для получения  композиционного биоматериала, содержащего ФАП-Zn, в аналогичных условиях проводят реакцию кросс-сшивки реакционной смеси, содержащей полипептиды коллагена и ФАП-Zn с получением кросс-сшитого композиционного биоматериала, состоящего из полипептидов коллагена и ФАП-Zn.
Materials Science and Engineering C
Для придания композиционному биоматериалу пористой структуры применяют один из стандартных способов формирования пор [H. Janik, M. Marzec. A review: Fabrication of porous polyurethane scaffolds // . 2015. Vol.48. P.586-591], например, основанный на замораживании реакционного раствора путем помещения реактора в термостат при отрицательной температуре (ниже 0°С) или в жидкий азот (при минус 196°C). Образующиеся при замораживании растворителя кристаллы льда после оттаивания образуют поры в сформированном композиционном биоматериале. Способы формирования пор в композиционном биоматериале не ограничиваются вышеуказанным.
В зависимости от формы и геометрических размеров реактора получают композиционный биоматериал с разными геометрическим размерами, например, в форме пластин требуемой толщины и площади.
Присутствие ФАП или ФАП-Zn в композиционном биоматериале подтверждают по изменению его физико-химических свойств, например, методом ротационной реометрии в режиме осцилляционных колебаний с использованием анализатора MCR 302 (Anton Paar). По данным ротационной реометрии, варианты композиционного биоматериала, содержащего ФАП или ФАП-Zn, имеют повышенный модуль упругости (G') по сравнению с контрольным биоматериалом, получаемым аналогично без использования ФАП или ФАП-Zn, то есть, модуль упругости сравниваемых биоматериалов возрастает в ряду: контрольный биоматериал, композиционный биоматериал с ФАП, композиционный биоматериал с ФАП-Zn (Фиг. 3).
Эти результаты демонстрируют, что ФАП и ФАП-Zn образуют дополнительные сшивки (например, ковалентные и/или ионные) в композиционном биоматериале, повышая его механическую прочность, и, следовательно, ФАП и ФАП-Zn участвуют в формировании композиционного биоматериала.
Содержание цинка в композиционном биоматериале, содержащем ФАП-Zn, дополнительно определяют методом атомно-абсорбционной спектроскопии, например, с использованием спектрометра AAnalyst-400 (PerkinElmer). По данным атомно-абсорбционного анализа содержание цинка в композиционном биоматериале не превышает 1.0±0.1 мас.%.
Таким образом, получают заявленный композиционный биоматериал в двух вариантах исполнения. Композиционный биоматериал в первом варианте содержит (мас.%, в пересчете на сухое вещество):
- полипептиды коллагена: 90-95;
- фракция активных пептидов: 1-4;
- вспомогательные вещества: остальное.
Композиционный биоматериал во втором варианте содержит (мас.%, в пересчете на сухое вещество):
- полипептиды коллагена: 90-94;
- фракция активных пептидов: 1-4;
- цинк: не более 1;
- вспомогательные вещества: остальное.
К «вспомогательным веществам» относятся дополнительные вещества органической или неорганической природы, используемые при изготовлении препарата (биоматериала) с целью стабилизации или придания особых технологических и органолептических свойств [И. А. Мурашкина, В. В. Гордеева. Вспомогательные вещества в фармацевтической технологии: учебное пособие. ФГБОУ ВО ИГМУ Минздрава России, кафедра фармацевтической технологии. Иркутск: ИГМУ. 2018. 64 с.]. В заявленном композиционном биоматериале вспомогательными веществами, не обладающими специфической биологической активностью, являются, например, кросс-сшивающие агенты и неорганические компоненты без ограничения ими.
Пример 2.
Усиление роста клеток в композиционном биоматериале.
2
Исследуют фибробласты мыши линии NIH ЗТЗ (ATCC) в качестве стандартных клеток, используемых для оценки регенеративной активности биоматериалов. Фибробласты культивируют в стандартных стерильных условиях: питательная среда альфа-МЕМ, 10% эмбриональная телячья сыворотка, 5% CO, температура 37°С.
2
Стерильные пластины композиционного биоматериала площадью 1 см помещают в лунки 24-луночного планшета, содержащие питательную среду. На поверхность пластин высевают по 100 000 фибробластов, которые далее культивируют в течение 72 часов. Выявляют фибробласты в срезах композиционных биоматериалов методом оптической микроскопии, например, светлопольной микроскопии после химической фиксации клеток и их окрашивания красителем толуидиновым синим.
Результаты показывают, что композиционный биоматериал с ФАП и композиционный биоматериал с ФАП-Zn содержат, соответственно, в 2.2 и 2.9 раз больше фибробластов по сравнению с контрольным биоматериалом (Фиг. 4).
J. Tissue Eng. Regen. Med.
Повышение количества фибробластов, являющихся важным типом клеток соединительной ткани, участвующих в процессах регенерации [R. Costa-Almeida, R. Soares, P.L. Granja. Fibroblasts as maestros orchestrating tissue regeneration.  2018. Vol.12. P.240-251], свидетельствует о способности композиционного биоматериала, содержащего ФАП или ФАП-Zn, стимулировать клеточный рост. Эта способность является показателем регенеративной активности композиционного биоматериала на клеточном уровне, которая связана с присутствием активного компонента (ФАП или ФАП-Zn).
Пример 3.
Гемостатическая активность композиционного биоматериала
.
in vitro
in vitro
Гемостатическую активность композиционного биоматериала  оценивают по способности коагулировать цельную кровь. Используют свежевыделенную венозную кровь здорового пациента.
2
2
4
Стерильные пластины композиционного биоматериала площадью 1 см или мембраны биоматериала по прототипу (губка Тахокомб) с аналогичными размерами помещают в лунки 24-луночного планшета, на поверхность каждой мембраны наносят аликвоту крови, кровь инкубируют 10 минут при температуре 37°С. Обработанные кровью мембраны далее промывают буферным раствором, например, фосфатно-солевым буфером (ФСБ, 0.14 M NaCl, 0.01 M NaHPO, рН=7.4) и с помощью типового планшетного анализатора регистрируют оптическое поглощение биоматериала при длине волны 542 нм, которое соответствует гемоглобину эритроцитов в объеме кровяного сгустка.
Как показано на Фиг. 5, композиционный биоматериал с ФАП или ФАП-Zn содержит большее количество кровяного сгустка (пропорционально величине оптического поглощения), следовательно, заявленный композиционный биоматериал обладает повышенной способностью коагулировать кровь вследствие присутствия активного компонента (ФАП или ФАП-Zn).
Пример 4.
Гемостатическая и регенеративная активность композиционного биоматериала при травме печени.
Исследуют крыс-самцов линии Вистар со средней массой 340 грамм в соответствии с европейскими правилами защиты экспериментальных животных (Директива 2010/63/EU) и российскими правилами (№ 742 от 13.11.1984, Министерство образования и науки).
Surgical Innovation
Крыс анестезируют внутримышечным введением смеси тилетамина/золазепама/ксилазина (соответственно, 30/20/10 миллиграмм на 1 килограмм массы крысы). С помощью хирургического скальпеля наносят надрез на депилированной верхней брюшной стенке крысы для предоставления доступа к печени. Проводят резекцию (удаление части) левой доли печени для формирования кровоточащей поверхности печени, моделирующей тяжелую форму паренхиматозного кровотечения [A.K. Jaiswal, H. Chhabra, S. Narwane, N. Rege, J.R. Bellare. Hemostatic efficacy of nanofibrous matrix in rat liver injury model. . 2017. Vol.24(1). P.23-28].
2
Используют заявленный композиционный биоматериал, содержащий ФАП, в форме пластины площадью 2 см и биоматериал по прототипу (губка Тахокомб) с аналогичными геометрическими размерами. Сравниваемые биоматериалы налагают на кровоточащую поверхность и выдерживают в течение 5 мин. Проводят визуальный анализ проявления крови на противоположной поверхности пластины, констатируют, что композиционный биоматериал и биоматериал по прототипу полностью останавливают выделение крови в условиях эксперимента. Проводят оценку механического сцепления пластин с кровоточащей поверхностью печени, констатируют, что композиционный биоматериал и биоматериал по прототипу характеризуются сходной адгезирующей способностью к кровоточащей поверхности. Далее стандартными хирургическими приемами сшивают края раны.
Проводят повторное хирургическое вскрытие брюшной полости крыс в динамике в течение 30 суток после наложения биоматериалов, фотографируют брюшную полость и поврежденную поверхность печени (Фиг. 6). С использованием скальпеля вырезают участок обработанной печени, включающий раневую поверхность в контакте с биоматериалом, с последующим выведением крысы из эксперимента. Вырезанный участок печени подвергают стандартной обработке для проведения гистологического анализа криосрезов [P. Dey. Frozen section: principle and procedure, in basic and advanced laboratory techniques in histopathology and cytology. Editor P. Dey. 2018. Springer Singapore: Singapore. P.51-55]. Получают криосрезы раневой поверхности печени толщиной около 10 микрометров, криосрезы окрашивают, например, трихромным красителем и анализируют методом светлопольной микроскопии (Фиг. 7).
По результатам повторного вскрытия устанавливают, что как в случае заявленного композиционного биоматериала, так и биоматериала по прототипу отсутствуют признаки внутреннего кровотечения в брюшной полости (Фиг. 6), что подтверждает способность обоих биоматериалов эффективно останавливать паренхиматозное кровотечение. Также констатируют визуальные признаки разложения заявленного композиционного биоматериала и биоматериала по прототипу, что подтверждает биодеградируемые свойства обоих биоматериалов.
По результатам гистологического анализа криосрезов констатируют, что сравниваемые биоматериалы обладают сопоставимым гемостатическим действием, выявляемым по формированию сходного слоя фибринового сгустка (ФС)между налагаемым биоматериалом (БМ) и раневой поверхностью (РП) (Фиг. 7). Однако, при использовании заявленного композиционного биоматериала, по сравнению с биоматериалом по прототипу, обработанные ткани более структурированы и почти не содержат фибриновых сгустков, что свидетельствует об улучшенной регенерации поврежденной печени (Фиг. 7).
Таким образом, на тканевом уровне, заявленный композиционный биоматериал, содержащий ФАП, эффективно способствует как остановке паренхиматозного кровотечения, так и регенерации поврежденной печени. Гистологический анализ не выявляет выраженной регенеративной активности у биоматериала по прототипу. Сходные результаты получают при использовании заявленного композиционного биоматериала, содержащего ФАП-Zn, в сравнении с биоматериалом по прототипу.
in vitro
in vivo
Приведенные примеры осуществления заявленного технического решения показывают, что композиционный биоматериал, полученный по Примеру 1, обладает высокой гемостатической активностью в контакте с кровью  (Пример 3) и кровоточащими тканями  (Пример 4), а также выраженной регенеративной активностью на клеточном уровне (Пример 2) и тканевом уровне (Пример 4).
Приведенные примеры показывают, что заявленный композиционный биоматериал обладает комбинированной гемостатической и регенеративной активностью, которая обусловлена присутствуем в них активного компонента, а именно, ФАП или ФАП-Zn. ФАП или ФАП-Zn включают в состав биоматериала в процессе его получения, поэтому это включение не требует применения отдельного этапа (этапов) по модификации биоматериала активным компонентом (компонентами) в отличие от изобретения по прототипу.
ФАП или ФАП-Zn получают с использованием более простого процесса по сравнению с процессом получения рекомбинантных фибриногена и тромбина, используемых для изготовления биоматериала по прототипу, что обусловливает пониженную себестоимость заявленного биоматериала, содержащего ФАП или ФАП-Zn. Процесс получения ФАП или ФАП-Zn не требует применения клеток-продуцентов, являющихся источником иммуногенных примесей, что повышает биологическую безопасность заявленного биоматериала, содержащего ФАП или ФАП-Zn. Благодаря применению в качестве активного компонента ФАП или ФАП-Zn заявленный биоматериал обладает не только высокой гемостатической активностью, но также регенеративной активностью, не характерной для биоматериала по прототипу.
Кроме того, применение в качестве активного компонента ФАП или ФАП-Zn обусловливает дополнительные преимущества заявленного биоматериала. Пептиды ФАП имеют меньшую молекулярную массу (3 600-10 000 дальтон) и более простую структуру, чем сложные высокомолекулярные белки-гликопротеины фибриноген (~340 000 дальтон) и тромбин (~36 000 дальтон). Поэтому ФАП и ФАП-Zn характеризуются повышенной стабильностью, например, по данным заявителя препараты ФАП и ФАП-Zn сохраняют свои свойства при хранении при комнатной температуре (от +15 до +25°C), тогда как фибриноген и тромбин хранят при температуре -20°С [см. свойства белков на сайте производителя: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/134/230/f3879pis.pdf; https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/599/516/t6884pis.pdf].
Повышенная стабильность ФАП и ФАП-Zn дополнительно улучшает функциональные качества заявленных биоматериалов при получении и хранении.
заявителем достигнут заявленный технический результат
Таким образом, изложенное выше позволяет сделать вывод о том, что , а именно, создан композиционный биоматериал, характеризующийся:
1. Отсутствием необходимости применения рекомбинантных белков благодаря использованию в качестве активного компонента ФАП или ФАП-Zn, отличающихся пониженными трудоемкостью и затратностью получения и отсутствием иммуногенных примесей.
2. Меньшей трудоемкостью изготовления благодаря одноэтапному формированию композиционного биоматериала посредством включения активного компонента ФАП или ФАП-Zn в матрицу на основе полипептидов коллагена в процессе ее изготовления.
3. Повышенной терапевтической эффективностью благодаря использованию в качестве активного компонента ФАП или ФАП-Zn, обладающих комбинированной активностью (гемостатической и регенеративной), не характерной для рекомбинантных фибриногена и тромбина.
Заявленный композиционный биоматериал устраняет недостатки биоматериала по прототипу US7399483B2.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного заявителем уровня техники не выявлены технические решения, обладающие заявленной совокупностью признаков и полученными техническими результатами.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, так как не является очевидным для специалистов в данной области науки и техники, а в существующем уровне техники не были известны композиционные биоматериалы заявленного состава, обладающие гемостатической и регенеративной активностью.
Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как заявленное техническое решение может быть реализовано в различных химических, медицинских и фармацевтических предприятиях с применением известных материалов и технологического оборудования.