СПОСОБ АМПЛИФИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

1. Способ получения меченых амплификационных фрагментов нуклеиновой кислоты-матрицы, включающий стадии:
обеспечения такой матрицы нуклеиновой кислоты,
отжига по меньшей мере одного олигонуклеотидного праймера с данной матрицей нуклеиновой кислоты,
элонгации по меньшей мере одного олигонуклеотидного праймера специфичным для матрицы образом, получая при этом продукт элонгации, причем такая реакция элонгации останавливается при достижении продуктом элонгации (a) 5'-конца матрицы нуклеиновой кислоты или (b) стоппера элонгации нуклеиновой кислоты, загибридизованного на матрице нуклеиновой кислоты ниже продукта элонгации,
обеспечения адаптерной нуклеиновой кислоты, содержащей идентификационную последовательность на своем 5'-конце, причем данная идентификационная последовательность не гибридизуется со стоппером элонгации или с матрицей,
лигирования адаптерной нуклеиновой кислоты по её 5'-концу с 3'-концом продукта элонгации, причем для лигирования продукты элонгации гибридизируют с матрицей, получая при этом меченый амплификационный фрагмент.
2. Способ по п. 1, при этом, когда продукт элонгации достигает 5'-конца матрицы нуклеиновой кислоты, нуклеотидная полимераза получает возможность добавлять нематричные нуклеотиды к продукту элонгации, предпочтительно за счет терминальной трансферазной активности полимеразы, и/или предпочтительно при этом добавляется от 1 до 15 нематричных нуклеотидов по меньшей мере в 70% продуктов элонгации.
3. Способ по п. 1 или 2, при этом обеспечивается множество адаптерных нуклеиновых кислот, которые используются на стадии лигирования, причем адаптеры из этого множества имеют разные идентификационные последовательности, а предпочтительно на стадии лигирования обеспечивается и используется по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 50 адаптерных нуклеиновых кислот с различными идентификационными последовательностями.
4. Способ по любому из пп. 1-3, при этом идентификационная последовательность представляет собой случайную последовательность.
5. Способ по любому из пп. 1-4, при этом стопперы элонгации обладают активностью праймеров и тоже подвергаются элонгации на стадии элонгации, причем предпочтительно используется по меньшей мере 9, более предпочтительно по меньшей мере 49 стопперов элонгации, которые имеют разные последовательности отжига для гибридизации с матрицей и поэтому могут гибридизоваться с различными участками матрицы нуклеиновой кислоты.
6. Способ по п. 5, при этом последовательность отжига представляет собой случайную последовательность.
7. Способ по любому из пп. 1-6, при этом адаптерная нуклеиновая кислота связывается, гибридизуется или же не связывается или не гибридизуется со стоппером элонгации, а предпочтительно, когда адаптерная нуклеиновая кислота связывается или гибридизуется со стоппером элонгации, то идентификационная последовательность не зависит от последовательности отжига стоппера элонгации для гибридизации стоппера элонгации с матрицей.
8. Способ по любому из пп. 1-7, при этом матрица представляет собой РНК, а для элонгации предпочтительно используется обратная транскриптаза.
9. Способ по любому из пп. 1-8, при этом олигонуклеотидный праймер, а предпочтительно также и стоппер элонгации, содержит универсальную амплификационную последовательность и/или адаптерная нуклеиновая кислота содержит универсальную амплификационную последовательность адаптера.
10. Способ по любому из пп. 1-9, при этом олигонуклеотидный праймер содержит последовательность отжига для посадки на матрицу, которая включает последовательность олиго(T) для отжига с последовательностью олиго(A) в матрице, причем предпочтительно такая последовательность олиго(T) содержит один или несколько якорных 3'-нуклеотидов, отличных от последовательности олиго(T).
11. Способ по любому из пп. 1-10, при этом реакция лигирования проводится в присутствии краудинг агента, предпочтительно полимера или содержащего полимер соединения типа полиалкилгликоля, предпочтительно ПЭГ, октоксинола или Triton X, или полисорбата, предпочтительно Tween, а/или стоппер элонгации и предпочтительно также олигонуклеотидный праймер содержит один или несколько модифицированных нуклеотидов, повышающих температуру плавления отжигаемой последовательности при отжиге с матрицей.
12. Способ по любому из пп. 1-11, при этом по меньшей мере один, а предпочтительно по меньшей мере 9 стопперов элонгации обладают активностью праймеров и тоже подвергаются элонгации на стадии элонгации, а также используется по меньшей мере две, а предпочтительно по меньшей мере 10 адаптерных нуклеиновых кислот, содержащих разные идентификационные последовательности, при этом образуются по меньшей мере два, а предпочтительно по меньшей мере 10 различных меченых фрагментов, которые необязательно подвергаются амплификации, а также включает сборку тех последовательностей амплификационных фрагментов, которые являются уникальными, причем для идентификации уникальных амплификационных фрагментов используются метки.
13. Способ по любому из пп. 1-12, при этом на матрицу нуклеиновой кислоты садятся по меньшей мере два олигонуклеотидных праймера, которые подвергаются элонгации специфичным для матрицы образом, образуя по меньшей мере два продукта элонгации, причем такие реакции элонгации останавливаются при достижении продуктами элонгации (a) 5'-конца матрицы нуклеиновой кислоты или (b) олигонуклеотидного праймера в качестве стоппера элонгации нуклеиновой кислоты, загибридизованного на матрице нуклеиновой кислоты ниже от продукта элонгации.
14. Набор для выполнения способа по любому из пп. 1-13, содержащий:
по меньшей мере один олигонуклеотидный праймер, способный гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-матрицей и запускать реакцию элонгации на своем 3'-конце,
один или несколько стопперов элонгации, способных гибридизироваться с нуклеиновой кислотой-матрицей, предпочтительно способных запускать реакцию элонгации на своем 3'-конце,
одну или несколько адаптерных нуклеиновых кислот, содержащих идентификационную последовательность на своем 5'-конце, причем такая идентификационная последовательность не гибридизуется со стоппером элонгации, а адаптерная нуклеиновая кислота предпочтительно связывается, гибридизуется или же не связывается или не гибридизуется со стоппером элонгации,
обратную транскриптазу и лигазу олигонуклеотидов.
15. Набор по п. 14, содержащий по меньшей мере 10, более предпочтительно по меньшей мере 50 адаптерных нуклеиновых кислот с разными идентификационными последовательностями.
16. Набор по п. 14 или 15, при этом по меньшей мере один олигонуклеотидный праймер содержит последовательность отжига для гибридизации с матрицей, которая включает последовательность олиго(T) для отжига с последовательностью олиго(A) в матрице, причем предпочтительно такая последовательность олиго(T) содержит один или несколько якорных 3'-нуклеотидов, отличных от последовательности олиго(T).