ЛИПОСОМА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЕСТНЫХ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ КОЖИ, ПРИМЕНЕНИЕ ЛИПОСОМ И СПОСОБ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ МЕСТНЫХ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ КОЖИ
LIPOSOME, PHARMACEUTICAL COMPOSITION AND DRUG FOR TREATMENT OF LOCAL RADIATION SKIN LESIONS, LIPOSOME APPLICATION AND METHOD FOR LOCAL RADIATION SKIN LESIONS TREATMENT

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии и фармацевтике, в частности к липосомам, фармацевтической композиции и лекарственному средству для лечения местных радиационных поражений кожи, а также к способу лечения и/или профилактики местных радиационных поражений кожи. Указанные липосомы могут содержать альфа-фетопротеин человека и, в дополнение к нему, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека.
Предшествующий уровень техники
Радиационный дерматит является наиболее распространенным побочным эффектом радиационной терапии и обследований, производимых с применением радиоактивных изотопов (Козлова А.В. Возможные последствия повреждений органов и тканей при лучевой терапии злокачественных опухолей, Мед. Радиология, 1977, Вып. 12, с. 71-75), что делает необходимым разработку мероприятий по снижению повреждающего действия ионизирующей радиации на нормальные клетки и ткани. Случаи радиационных поражений кожи вероятны при авариях на атомных энергетических установках, среди персонала, работающего с радиоизотопами и связанного с утилизацией ядерных боеприпасов, а также в результате террористических актов с использованием так называемых "грязных бомб" (Goffman Т.Е. Nuclear terrorism and the problem of burns, Am J Emerg Med, 2011, v. 29(2), p. 224-228; Романович И.К. и др. Авария на АЭС «Фукусима-1»: организация профилактических мероприятий, направленных на сохранение здоровья населения Российской Федерации. Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко, СПб.: НИИРГ им. проф. П.В. Рамзаева, 2012, 336 с.; Радиационные поражения человека, Ильин Л.А., Кочетков О.А., Савкин М.Н. и др., М.: ИздАТ, 2002, 607 с.).
Выраженность лучевых поражений кожи определяется дозой, мощностью дозы облучения, видом и характеристиками ионизирующего излучения (Wilson C.W. Comparsion of the skin and depilatory reactions produced in the legs of mice by 2000 r of 200 kV and 2 MeV X-rays, Brit. J. Radiol., 1957, v. 115, p. 661-670). При радиационных авариях и инцидентах электромагнитные ионизирующие излучения могут дистанционно оказывать поражающее действие на людей даже на значительном расстоянии от источника облучения. Особенностью действия ионизирующих излучений электромагнитной природы, в отличие от α- и β-излучений, является их высокая проникающая способность и, как следствие, поражающее действие на все слои кожи.
Кроме того, ионизирующие излучения электромагнитной природы получили широкое применение в онкологической практике. В зависимости от используемого вида излучения различают электронную терапию, бета-терапию, нейтронную, протонную, пи-мезонную терапию, рентгенотерапию и гамма-терапию. Разрабатываются все новые современные установки для точной формы лучевой терапии, такие как Гамма-Нож, Кибер-Нож (CyberKnife). В настоящее время в мире установлено около 250 установок Кибер-Нож. Они используется в стереотаксической радиохирургии (СРХ) для лечения, удаления опухолей и других патологий мозга и позвоночника, лечения метастазов, лечения рака и опухолей паренхиматозных органов (рака предстательной железы (рака простаты), рака легких (не мелкоклеточного), рака печени, рака почек, рака поджелудочной железы. При использовании Гамма-Ножа и Кибер-Ножа применяют разовые дозы 2-4 Гр, а суммарные дозы составляет до 60-80 Гр (Малая медицинская энциклопедия, 1991-96). Повреждающему действию радиации при этом подвергаются все слои кожи. Так при гамма-терапии злокачественных опухолей внутренних органов, в частности, опухолей легких, мочевого пузыря, женских половых органов и других, лучевые повреждения кожи развиваются у 25-30% пациентов (Африканова Л.А. Острая лучевая травма кожи, М.: Медицина, 1975, с. 8-41).
Реакции кожи на облучение подразделяют на ранние и поздние. Поздние местные лучевые повреждения развиваются через 3-6 месяцев и позже после лучевого воздействия. Характеризуются образованием поздней лучевой язвы в зоне лучевого фиброза, которая не имеет четких границ. Морфологическими признаками зоны, где образуется поздняя лучевая язва, являются: хроническое неспецифическое воспаление, склероз и облитерация кровеносных и лимфатических сосудов, периваскулярная инфильтрация, демиелинизация нервных стволов, распространенный фиброз соединительной ткани.
В генезе поздних радиационных поражений кожи, развивающихся через месяцы-годы после облучения, помимо повреждения стволовых клеток базального слоя эпидермиса, существенную роль играет поражение эндотелия сосудов кожи. На пораженных участках наблюдается прогрессирующая облитерация капилляров, развитие атрофической аваскулярной неэластичной дермы, неспособной питать лежащий поверх нее эпидермис, что в свою очередь приводит к его атрофии, изъязвлению и некрозу.
В процессе развития лучевого поражения кожи выделяют две фазы: фазу деструкции, когда формируется очаг острого радиационного поражения, и фазу репарации, когда в очаге поражения идут процессы, направленные на ликвидацию этого очага.
Радиочувствительность клеточных элементов уменьшается в следующей последовательности: волосяные луковицы, эпидермис, сальные железы, подкожная соединительная ткань, эндотелий кровеносных сосудов (Devik F. Histological and cytological changes produces by alpha-particles in the skin of mice, Acta Radiol., 1961, v. 35, p. 150-164).
Таким образом, критическими структурами кожи при облучении являются стволовые клетки базального слоя эпидермиса и эпителия вокруг придатков кожи.
Особенностью лучевых поражений кожи является глубокое подавление всех регенеративных и репаративных процессов, поэтому лучевые язвы характеризуются торпидным длительным течением, а их лечение представляет трудноразрешимую задачу (Стрелин Г.С. Регенерационные процессы в развитии и ликвидации лучевого повреждения, М.: Медицина, 1978. 207 с.; Сосоновский А.Е. Лучевые дерматиты, Минск: Беларусь, 1974, 143 с.).
Деление формирования лучевой язвы на деструктивную и репаративную фазы носит условный характер. И в той, и в другой фазе явления деструкции и репарации неотделимы друг от друга, однако имеет место явное преобладание направленности тех или иных процессов в зависимости от фазы. Репаративная фаза клинически определяется как завершение стадии влажной эксквамации формированием струпа. В это время регистрируется эпителизация ожоговой раны. В процессе эпителизации принимают участие не только пролиферирующий эпидермис, но и эпителий придатков кожи (Африканова Л.А. Острая лучевая травма кожи, М.: Медицина, 1975, с. 8-41).
Имеются данные, что при заживлении ран в восстановлении эпителия участвуют клетки эпидермиса, а для восстановления популяции дермальных фибробластов привлекаются как местные мезенхимальные клетки дермы, так и стволовые клетки костного мозга (Fathke С, Wilson L, Hutter J, Kapoor V, Smith A, Hocking A, Isik F. Contribution of bone marrow-derived cells to skin: collagen deposition and wound repair, Stem Cells, 2004, 22(5):812-22).
Пролиферирующий эпидермис проявляет потенцию к росту пластом. Однако прочность связи его с подлежащими тканями и возможность его дальнейшего существования зависят от характера соединительной ткани на дне дефекта кожи. Пролиферирующий эпидермис прочно удерживается на соединительной ткани слоя дермы, на кожной жировой клетчатке и на молодой соединительной ткани, формирующейся за счет преобразования этого слоя. На месте ожоговой раны формируется рубец. Однако молодая соединительная ткань, формирующаяся за счет преобразования рыхлой соединительной ткани на границе с фасциями подлежащих мышц, не может обеспечить жизнеспособность пролиферирующего эпидермиса. В этом случае репарация приобретает неблагоприятное течение с возникновением трофических язв (Африканова Л.А. Острая лучевая травма кожи, М.: Медицина, 1975, с. 8-41).
Поражения кожи, вызванные воздействием ионизирующего излучения, относятся к разряду тяжелых и инвалидизирующих заболеваний и вносят существенный вклад в течение и исход лучевой болезни (Африканова Л.А. Острая лучевая травма кожи, М.: Медицина, 1975, с. 8-41; Ильин Л.А., Кочетков О.А., Савкин М.Н. и др. Радиационные поражения человека, М.: ИздАТ, 2002, 607 с.). Степень выраженности радиационного поражения кожи в зависимости от условий облучения может варьировать от легкой воспалительной реакции (ожог I степени) до полного поражения кожи и нижележащих тканей (ожог IV степени).
Как и простые термические повреждения участков кожи, лучевые ожоги по глубине делятся на четыре степени:
I степень характеризуется повреждением самого поверхностного слоя кожи (эпидермиса), состоящего из эпителиальных клеток. При этом появляется покраснение кожи, небольшая припухлость, сопровождающаяся болезненностью. Через два - три дня эти явления самостоятельно проходят, и после ожога не остается никаких следов, исключая незначительный зуд и шелушение кожи;
II степень отличается образованием пузырей с желтоватой жидкостью на фоне покраснения кожи. Пузыри могут образовываться сразу после ожога или спустя некоторое время. Если пузыри лопаются, то обнажается ярко-красная эрозия. Заживление при этой степени происходит обычно к 10-12 дню без образования рубцов;
III степень ожогов характеризуется большей глубиной поражения с омертвением тканей (некроз) и образованием ожогового струпа. Струп представляет собой сухую корку от светло-коричневого до почти черного цвета; при ошпаривании же струп бывает мягким, влажным, белесовато-серого цвета. Выделяют IIIA степень, при которой сохраняются эпителиальные элементы кожи, являющиеся исходным материалом для самостоятельного заживления раны, и IIIБ степень, при которой все слои кожи полностью погибают и образовавшаяся ожоговая рана заживает посредством рубцевания;
IV степень ожогов сопровождается обугливанием кожи и поражением глубжележащих тканей - подкожной жировой клетчатки, мышц и костей.
В соответствии с принятой в настоящее время концепцией, специальному лечению подлежат случаи с местными лучевыми поражениями II и выше степени тяжести (Инструкция по диагностике, медицинской сортировке и лечению острых радиационных поражений: Утв. Минздравом СССР 30.09.1977. Под ред. В.И. Пахомова, М.: Воениздат, 1980, 40 с.).
При лечении лучевых ожогов комплекс терапевтических процедур включает в себя системное введение препаратов для уменьшения воспалительной реакции (глюкокортикоиды), обезболивающих средства, препаратов антипротеолитического действия и антибиотиков. Местное лечение направлено на предотвращение инфицирования пораженных поверхностей. В более поздние сроки при активации регенерационных процессов применяются лекарственные средства, содержащие стимуляторы регенерации и адаптогены.
Одним из стратегических направлений лечения ожоговых ран является хирургический. Основными недостатками аутодермопластики являются: дополнительная кожная рана в месте забора лоскута и невозможность применения этой технологии при обширных поражениях (Valencia I.C., Falabella AF, Eaglstein WH. Skin grafting, Dermatol Clin., 2000, 18(3), p. 521-32; Qaryoute S. et al. Usage of autograft and allograft skin in treatment of burns in children, Burns, 2001, 27 (6), p. 599-602). Важное место в этой области исследований отводится использованию клеточных технологий (Котенко К.В., Смирнов С.В. и др. Современные методы клеточной терапии при лечении ожогов, Хирургия, 2003, вып. 12, с. 58-62).
Для лечения глубоких ожогов, хронических язв и обширных повреждений постоянно разрабатываются новые покрытия, заменяющие кожу: трансплантаты из культивированных аутокератиноцитов (Teepe R.G, Kreis R.W., Koebrugge E.J. et all. The use of cultured autologous epidermis in the treatment of extensive burn wounds, J Trauma., 1990, v. 30(3), p. 269-275; Terskikh V.V., Vasiliev A.V. Cultivation and transplantation of epidermal keratinocytes, Int Rev Cytol, 1999, v. 188, p. 41-72) и аллогенных кератиноцитов (De Luca M., Albanese E., Bondanza S. et al. Multicentre experience in the treatment of burns with autologous and allogenic cultured epithelium, fresh or preserved in a frozen state, Burns, 1989, v. 15(5), p. 303-309; Oshima H., Inoue H., Matsuzaki K. et all. Permanent restoration of human skin treated with cultured epithelium grafting - wound healing by stem cell based tissue engineering, Hum Cell, 2002, v. 15(3), p. 118-128), эквиваленты кожи (Dvorankova В., Holikova Z., Vacik J. et all. Reconstruction of epidermis by grafting of keratinocytes cultured on polymer support-clinical study, Int J Dermatol., 2003, v. 42(3), p. 219-223; Ehrlich H.P. Understanding experimental biology of skin equivalent: from laboratory to clinical use in patients with bums and chronic wounds, Am J Surg., 2004, v. 187(5A), p. 29-33), которые включают не только культивированные кератиноциты, но и дермальный эквивалент, состоящий из коллагена, гликозамин-гликанов и др.).
Применения трансплантатов из культивированных аутокератиноцитов имеет ряд недостатков: использование аутокератиноцитов не дает возможности создать банк клеток; сроки, необходимые для изготовления достаточного по площади трансплантата, велики и составляют 3-4 недели (Navsaria НА, Myers SR, Leigh IM, McKay IA. Culturing skin in vitro for wound therapy, Trends Biotechnol., 1995, Mar; 13(3):91-100; Туманов В.П., Алексеев А.А., Будкевич Л.И. Десятилетний опыт использования культивированных клеток кожи человека для лечения термических ожогов. Архив патологии, 1999, №4. с. 14-21); длительные сроки получения трансплантатов увеличивают риск развития инфекционных осложнений ожоговой болезни и удлиняют время пребывания пациентов в стационаре; аутокератиноциты практически не приживаются при трансплантации на гранулирующие ожоговые раны (De Luca М., Albanese Е., Bondanza S. et al. Multicentre experience in the treatment of burns with autologous and allogenic cultured epithelium, fresh or preserved in a frozen state. Burns, 1989, v. 15(5), p. 303-309; Туманов В.П., Алексеев А.А., Будкевич Л.И. Десятилетний опыт использования культивированных клеток кожи человека для лечения термических ожогов. Архив патологии, 1999, №4. с. 14-21); высока стоимость специальных ростовых сред и биологически активных стимуляторов роста кератиноцитов.
В последние несколько лет начаты исследования по возможностям применения мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Поскольку такой клеточный материал аутологичен (в отличие от аллофибробластов), легко культивируется и дифференцируется (в отличие от кератиноцитов), то этот метод в будущем может стать хорошей альтернативой прочим клеточным методам лечения кожных поражений (Шумаков В.И., Расулов М.Ф., Крашенинников М.Е. и др. Сравнительная оценка эффективности применения аллогенных эмбриональных фибробластов и мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для терапии глубоких ожоговых ран. Вестник трансплантологии и искусственных органов, 2002, Вып. 4, с. 7-11; Ai G., Su Y., Yan G. et all. The experimental study of bone marrow mesenchymal stem cells on the repair of skin wound combined with local radiation injury. Zhonghua Yi Xue Za Zhi., 2002, v. 82(23), p. 1632-1636; Badiavas E.V. The potential of bone marrow cells to orchestrate homeostasis and healing in skin. Blood Cells Mol Dis., 2004, v. 32(1), p. 21-23).
Определенные успехи достигнуты на пути использования в лечении лучевых поражений цитокинов (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы. СПб: Гиппократ, 1992, 256 с.; Рождественский Л.М. Радиобиологические аспекты применения интерлейкина-1 бета как средства скорой помощи при остром радиационном воздействии. Труды Междунар. симпозиума "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии", 1997, Дубна, т. 2, с. 15-22), в частности при использовании колониестимулирующих факторов (КСФ) - гранулоцитарного (Г-КСФ) и гранулоцитарно-макрофагального (ГМ-КСФ) (Легеза В.И., Селезнев А.Б., Загарова Н.И., Кондаков А.Ю. Экспериментальное исследование лечебно-профилактического применения интерлейкина-1β при сочетанных радиационных поражениях. Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях, 2010, №4 (2), с. 41-45; Dainiak N., Waselenko J.K., Armitage J.O. et al. The Hematologist and Radiation Casualties. Hematology, 2003, v. 1). К настоящему времени разработан целый ряд препаратов такого рода, к числу которых относятся, прежде всего, интерлейкины и колониестимулирующие факторы: беталейкин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (нейпоген, филграстим, пегфилграстим, лейкостим), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (молграмостим, сарграмостим, лейкомакс), тромбопоэтин и другие. Именно это направление и, в частности, изучение возможности комплексного применения различных цитокинов с целью стимуляции восстановления костномозгового кроветворения, является наиболее перспективным подходом к существенному повышению эффективности терапии острых радиационных поражений мирного и военного времени.
Перспективными являются исследования, направленные на использование антиоксидантов с целью снижения деструкции после лучевого воздействия за счет инактивации окислительных радикалов, возникающих преимущественно при взаимодействии ионизирующего излучения с водой пораженной ткани (Kouvaris J.R., Kouloulias V.E., Vlahos L.J. Amifostine: the first selective-target and broad-spectrum radioprotector. Oncologist, 2007, 12:738-747; Montana G.S., Anscher M.S., Mansbach C.M 2nd, Daly N., Delannes M., Carke-Pearson D, Gaydica E.F. Topical application of WR-2721 to prevent radiation-induced proctosigmoiditis. A phase I/II trial. Cancer, 1992; 69: 2826-2830; Kumar S, Juresic E, Barton M, Shafiq J. Management of skin toxicity during radiation therapy: a review of the evidence. J Med Imaging Radiat Oncol., 2010 Jun; 54(3):264-79; Greenberger J.S., Clump D., Kagan V., Bayir H., Lazo J.S., Wipf P., Li S., Gao X., Epperly M.W. Strategies for discovery of small molecule radiation protectors and radiation mitigators. Front Oncol., 2012 Jan., 13; 1:59).
Наиболее близким аналогом настоящего изобретения является решение, описанное в Евразийском патенте №010058. В указанном патенте, в частности, описан пептид, соответствующий активному центру альфа-фетопротеина человека. Также указано, что указанный пептид может применяться для снижения цитотоксических эффектов после химио- и лучевой терапии.
Несмотря на большой опыт по изучению способов консервативного лечения лучевых поражений, проблема создания средств экстренной профилактики и лечения лучевых ожогов остается крайне актуальной.
Краткое описание настоящего изобретения
Целью настоящего изобретения является разработка нового эффективного средства для экстренной профилактики и лечения местных радиационных поражений кожи.
Указанная цель была достигнута путем установления того факта, что альфа-фетопротеин человека (АФП) увеличивает жизнеспособность облученных клеток и снижает напряженность апоптотических процессов. Далее было показано, что использование липосомального препарата, содержащего рекомбинантный альфа-фетопротеин человека (рчАФП), липосомального препарата, содержащего, в дополнение к рчАФП, рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (рчГКСФ), а также липосомального препарата, состоящего из «пустых» липосом ускоряет процессы репарации и эпителизации ожоговой раны и в целом укорачивает время заживления лучевого ожога.
Первый аспект настоящего изобретения предоставляет липосомы, содержащие альфа-фетопротеин человека, для лечения местных радиационных поражений кожи.
Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет указанную выше липосому, в которой указанным альфа-фетопротеином человека является рекомбинантный альфа-фетопротеин человека.
Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет указанную выше липосому, в которой указанная липосома содержит от 0,1 мг/мл до 1,0 мг/мл альфа-фетопротеина человека.
Следующий аспект настоящего изобретения предоставляет указанную выше липосому, в которой указанная липосома дополнительно содержит гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека.
Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет указанную выше липосому, в которой указанным гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека является рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека.
Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет указанную выше липосому, в которой указанная липосома содержит от 0,004 мг/мл до 0,06 мг/мл гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека.
Следующий аспект настоящего изобретения указывает на возможность применения указанных выше липосом для лечения местных радиационных поражений кожи.
Еще один аспект настоящего изобретения указывает на возможность применения так называемых «пустых» липосом, то есть липосом, не содержащих каких-либо активных веществ, для лечения местных радиационных поражений кожи.
Следующий аспект настоящего изобретения предоставляет фармацевтическую композицию для лечения местных радиационных поражений кожи, содержащую эффективное количество указанных выше липосом.
Следующий аспект настоящего изобретения предоставляет лекарственное средство для лечения местных радиационных поражений кожи, содержащее указанную выше фармацевтическую композицию.
Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет указанное выше лекарственное средство, которое является средством трансдермального действия.
Еще один аспект настоящего изобретения предоставляет указанное выше лекарственное средство в виде пластины, пластыря, пленки, крема, раствора, эмульсии, мази или спрея.
Следующий аспект настоящего изобретения предоставляет способ лечения и/или профилактики местных радиационных поражений кожи, включающий стадию нанесения указанной выше фармацевтической композиции на пораженный или подвергающийся поражению участок кожи.
Краткое описание чертежей
На Фиг. 1 показано влияние рчАФП на жизнеспособность NIH3T3 клеток после облучения. NIH3T3 клетки облучали и инкубировали с добавлением рчАФП. Подсчет клеток осуществляли через 72 часа после фиксации и окрашивания. Для анализа использовали данные, полученные в 3-х независимых полях зрения. График демонстрирует результат одного из трех независимых экспериментов. Данные представлены в виде среднего значения ± среднеквадратичное отклонение.
На Фиг. 2 показано влияние рчАФП на напряженность апоптотического процесса в культуре облученных NIH3T3 клеток. NIH3T3 клетки облучали и инкубировали с добавлением рчАФП. Подсчет клеток осуществляли через 72 часа после фиксации и окрашивания красителем DAPI. Для анализа использовали данные, полученные в 3-х независимых полях зрения. График демонстрирует результат одного из трех независимых экспериментов. Данные представлены в виде среднего значения ± среднеквадратичное отклонение.
На Фиг. 3 показан способ фиксации кожной складки на спине животного при проведении экспериментов по облучению.
На Фиг. 4 показана схема эксперимента по оценке эффективности липосомального препарата при подкожном и трансдермальном введении. А2 - сроки введения препарата А2 (липосомальный белковый препарат); A0 - сроки введения препарата A0 (комплекс антиоксидантов).
На Фиг. 5 показана клиническая картина лучевого ожога: А - стадия сухого радиоэпидермита (эритема, отек); Б - стадия влажного радиоэпидермита; В - стадия струпа; Г - стадия после отпадения последней корочки (струпа); Д - в конце периода восстановления эпителия.
На Фиг. 6 приведены показатели клинической картины течения радиационного поражения кожи в экспериментах по сравнительной оценке эффективности трансдермального и подкожного способа введения исследуемых препаратов.
На Фиг. 7 приведены схемы эксперимента по оценке эффективности препарата при лечении и профилактике лучевых поражений кожи с использованием мышей в моделях «Профилактика», «Лечение», «Профилактика + Лечение».
На Фиг. 8 показаны результаты различных схем применения липосомального белкового препарата (рчАФП, рчГКСФ) на течение лучевого ожога кожи IIIA степени у мышей по клиническим показателям.
На Фиг. 9 приведена схема эксперимента по оценке эффективности липосомального препарата с разной концентрацией рчАФП при лечении лучевых поражений кожи.
На Фиг. 10 показаны результаты оценки влияния концентрации рчАФП в липосомальном препарате на течение лучевого ожога кожи IIIA степени у мышей по клиническим показателям. Примечание: * - достоверные отличия от группы облученного контроля, р≤0,05.
На Фиг. 11 показаны зависимости длительностей различных стадий лучевого ожога кожи IIIA степени у мышей от концентрации рчАФП в липосомальном препарате: А - длительность скрытого периода; Б - длительность стадии сухого эпидермита; В - длительность стадии влажного эпидермита; Г - длительность деструктивного периода.
На Фиг. 12 показаны данные по длительности периодов течения лучевого поражения кожи после использования исследуемого липосомального препарата с активными веществами и «пустых» липосом.
Подробное описание настоящего изобретения
Авторы настоящего изобретения установили, что альфа-фетопротеин человека АФП увеличивает жизнеспособность облученных клеток и снижает напряженность апоптотических процессов в клетках. Затем авторы настоящего изобретения в ходе длительных и тщательных исследований установили, что использование липосомального препарата, содержащего рекомбинантный альфа-фетопротеин человека (рчАФП), липосомального препарата, содержащего, в дополнение к рчАФП рекомбинантный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (рчГКСФ), а также липосомального препарата, состоящего из «пустых» липосом, ускоряет процесс заживления лучевого ожога, репарации и эпителизации ожоговой раны. Таким образом, было выполнено настоящее изобретение.
В настоящем изобретении термин "липосома" означает сферическую везикулу, имеющую один или несколько липидных бислоев. Липосомы образуются в смесях фосфолипидов с водой. Внутри липосом может содержаться вода или раствор, в котором проводилось их получение. Также внутри липосом могут находиться активные вещества, в частности различные биологически активные белки.
В настоящее время разработан целый ряд способов приготовления различных типов липосом и протеолипосом, а также их стандартизации по размерам, структуре, гомогенности, стабильности и другим характеристикам. Однослойные липосомы можно получать различными методами, например из суспензии многослойных липосом, если обработать их ультразвуком. Диаметр однослойных липосом, полученных этим методом, составляет 25-30 нм. Разработаны и другие методы получения однослойных липосом, в том числе диаметром до 400 нм и более.
Липосомы, искусственные фосфолипидные везикулы, являются универсальным контейнером для доставки лекарственных препаратов непосредственно в клетку. Они защищают включенное соединение от разрушающего действия ферментов плазмы, снижают токсичность инкапсулируемых веществ и пролонгируют их действие в организме. Методы получения существенным образом влияют на свойства липосом. От технологии приготовления зависит размер везикул, степень окисления липидов (ПОЛ), входящих в состав оболочки (липосомы с высоким соединением продуктов ПОЛ могут быть токсичными для организма), их внутренний объем, стабильность при хранении и др. свойства.
Существуют разные способы получения липосом и выбор метода, как правило, зависит от задач, поставленных при разработке той или иной липосомальной формы. Наиболее просто получаются мультиламеллярные липосомы, так как липиды, используемые для получения липосом, самопроизвольно образуют при гидратировании подобные бислойные структуры (V.P. Torchilin and V. Weissig, Liposomes A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press, 2003).
Близким к инкапсулированию методом иммобилизации можно считать включение водных растворов целевых белков в липосомы, представляющие собой сферические или ламеллярные системы двойных липидных бислоев. Впервые данный способ был применен для иммобилизации ферментов Дж. Вайсманом и Дж. Сессом в 1970 г. Для получения липосом из растворов липида (чаще всего лецитина) упаривают органический растворитель. Оставшуюся тонкую пленку липидов диспергируют в водном растворе, содержащем белок. В процессе диспергирования происходит самосборка бислойных липидных структур липосомы, содержащих включенный раствор целевого белка.
Липосомальные препараты согласно настоящему изобретению готовили на специализированной установке ЛЭМП (электромагнитный смеситель-диспергатор) из раствора рчАФП, раствора рчГ-КСФ и раствора фосфолипидов Lipoid S80 в пропиленгликоле с добавлением, в случае необходимости, консервантов.
Данная установка позволяет получать липосомальные системы с заданными показателями размеров дисперсной фазы (медианный размер от 5 мкм до 50 нм) и высокой однородностью получаемой эмульсии. Препараты, полученные для профилактики и лечения радиационных ожогов кожи, характеризовались содержанием липидной фазы 1,0-1,4%, рН 7,3-7,5. Медианный размер препаратов составлял для различных партий от 130 до 100 нм.
В настоящем изобретении термин "альфа-фетопротеин человека" (чАФП) означает гликопротеин с молекулярным весом 69000 Да, состоящий из одной полипептидной цепи, включающей ~600 аминокислот и содержащей около 4% углеводов (Tomasi ТВ. Structure and function of alpha-fetoprotein. Annual review of medicine, 1977, v. 28, p. 453-65.), который образуется при развитии эмбриона и плода. По структуре и физико-химическим свойствам АФП очень близок главному белку сыворотки крови взрослых - сывороточному альбумину (СА). Функция СА - транспортная, перенос низкомолекулярных веществ в ткани. АФП как бы заменяет СА у эмбриона, его часто называют эмбриональным СА, и его функция, скорее всего, тоже транспортная. АФП обладает исключительно высоким сродством к полиненасыщенным жирным кислотам (ПНЖК), веществам, необходимым для построения клеточных мембран и особого класса биологически активных веществ - простагландинов. Наиболее вероятная функция АФП - избирательное связывание ПНЖК в плаценте и перенос их из крови матери в кровь и клетки эмбриона.
АФП человека согласно настоящему изобретению может быть натуральным сывороточным эмбриональным АФП, получаемым из абортивного материала или пуповинной сыворотки (RU 2170586, RU 2100031, RU 2010113136). АФП человека согласно настоящему изобретению предпочтительно является рекомбинантным чАФП (рчАФП) (US 2011/0077208, ЕА 011606 В1).
Последовательность аминокислот АФП человека, последовательность нуклеотидов гена, кодирующего АПФ человека, а также свойства указанного белка описаны, например, в базе данных Uniprot: http://www.uniprot.org/uniprot/P02771.
В настоящем изобретении термин "гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека" (ГКСФ), также известный как колониестимулирующий фактор 3 (КСФ 3), это колониестимулирующий фактор, стимулирующий в культуре клеток формирование колоний гранулоцитов (Metcalf, D. Hematopoietic regulators: Redundancy or subtlety? Blood, 1993, v. 82, p. 3515-23). Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор является главным гемопоэтическим фактором роста, регулирующим гранулоцитопоэз. ГКСФ стимулирует пролиферацию и дифференцировку поздних клеток-предшественников в нейтрофилы. Под действием цитокинов Г-КСФ и колониестимулирующий фактор макрофагов (М-КСФ) происходит образование нейтрофилов и моноцитов, соответственно, из колониеобразующих единиц гранулоцитов-макрофагов (КОЕ-ГМ). Оба эти фактора в дальнейшем, как и другие цитокины, стимулируют дифференцировку моноцитов в макрофаги.
ГКСФ человека согласно настоящему изобретению предпочтительно является рекомбинантным чГКСФ (рчГКСФ) (RU 2326169, RU 2278870, RU 2207373, RU 2201962, RU 2157846, US 2010/0227818).
Последовательность аминокислот ГКСФ человека, последовательность нуклеотидов гена, кодирующего ГКСФ человека, а также свойства указанного белка описаны, например, в базе данных Uniprot: http://www.uniprot.org/uniprot/P09919.
Рекомбинантные белки, обладающие активностью зрелого АФП человека или зрелого ГКСФ человека, представляют собой белки с аминокислотной последовательностью, соответствующей природным белкам, или с модифицированной аминокислотной последовательностью, имеющей делеции, добавления, вставки или замены одного или нескольких аминокислотных остатков, что приводит к образованию соответствующих модифицированных белков, последовательность которых по крайней мере на 80% соответствует аминокислотным последовательностям зрелых природных белков, с сохранением у указанных продуктов с модифицированной структурой функциональной биологической активности зрелого АФП человека или зрелого ГКСФ человека, соответственно.
Способы получения рекомбинантных белков, в частности рчАФП и рчГКСФ согласно настоящему изобретению, хорошо известны специалистам в данной области техники. Указанные способы включают, например, экспрессию рекомбинантных плазмид, содержащих гены, кодирующие целевые белки, в подходящих клетках-продуцентах указанных целевых белков. В указанных способах клетки-продуценты целевых белков выращивают в питательной среде и выделяют полученные целевые белки из, например, культуральной жидкости или телец включения.
Методы получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные методы могут быть стандартными методами, хорошо известными специалисту в данной области техники. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).
Липосомы согласно настоящему изобретению содержат от 0,1 мг/мл до 1,0 мг/мл альфа-фетопротеина человека (АФП). Указанный альфа-фетопротеин человека предпочтительно является рекомбинантным альфа-фетопротеином человека (рчАФП).
Также липосомы согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать от 0,004 мг/мл до 0,06 мг/мл гранулоцитарного колониестимулирующего фактора человека. Указанный гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека является рекомбинантным гранулоцитарным колониестимулирующим фактором человека (рчГКСФ).
Фармацевтическая композиция для лечения местных радиационных поражений кожи согласно настоящему изобретению содержит эффективное количество липосом согласно настоящему изобретению, описанных выше. Термин "эффективное количество" означает количество, способное уменьшить тяжесть и/или сократить время восстановления пораженного участка кожи. Указанная фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые добавки, наполнители и носители, известные специалисту в данной области техники.
Лекарственное средство для лечения местных радиационных поражений кожи, согласно настоящему изобретению, содержит фармацевтическую композицию, описанную выше. Указанное лекарственное средство может предназначено для трансдермального или подкожного введения. Трансдермальное введение является предпочтительным, поскольку трансдермальное введение препарата является не инвазивным способом введения, по сравнению с подкожным. Трансдермальное введения снижает вероятность инфекционных осложнений и исключает дополнительную травматизацию вблизи ожоговой раны.
Для преодоления барьерных свойств кожи и усиления трансдермальной доставки лекарственных средств дополнительно могут применяться различные приемы, заключающиеся например, в использовании в составе лекарственного средства дополнительных химических веществ, усилителей транспорта, и увеличения его проницаемости для лекарственных средств. В качестве таких химических «усилителей» используется широкий спектр веществ, включающий многоатомные спирты, жирные кислоты и их эфиры, поверхностно-активные вещества, терпены (патент США №6444234). Трансдермальная доставка лекарственных средств в инкапсулированном виде, в частности внутри липосом, как это сделано в настоящем изобретении, является одним из таких приемов.
Лекарственные средства согласно настоящему изобретению могут быть в форме пластины, пластыря, пленки, крема, пасты, раствора, эмульсии, мази или спрея. Предпочтительным является использование лекарственных средств согласно настоящему изобретению в виде крема, пасты, раствора, эмульсии, мази или спрея.
Способ лечения и/или профилактики местных радиационных поражений кожи согласно настоящему изобретению включает стадию нанесения фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению на пораженный или подвергающийся поражению участок кожи. В случае лечения пораженного участка в соответствии с указанным способом кожи фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению наносят на пораженный участок кожи ежедневно один или несколько раз в зависимости от тяжести поражения. Схема лечения подбирается соответствующим практикующим врачом в соответствии с методами, хорошо известными специалистам в данной области. В случае профилактики подвергающегося возможному поражению участка кожи в соответствии с указанным способом согласно настоящему изобретению фармацевтическую композицию наносят на участок кожи ежедневно один или несколько раз в зависимости от возможного уровня облучения и предполагаемой тяжести поражения. Схема профилактической обработки также подбирается соответствующим практикующим врачом в соответствии с методами, хорошо известными специалистам в данной области.
Примеры
Последующие примеры приведены исключительно в иллюстративных целях для разъяснения сущности настоящего изобретения и никоим образом не ограничивают рамки настоящего изобретения.
Пример 1. Усиление устойчивости фибробластов к действию ионизирующего облучения в присутствии рчАФП
2
2
5
60
14
4
Влияние рчАФП на восстановление фибробластов после сублетального гамма-облучения анализировали на культуре клеток NIH3T3. NIH3T3 - клеточная культура фибробластов мыши, полученная из American Type Culture Collection, культивировалась в полной среде ДМЕМ (с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной сыворотки теленка (ЭСТ)), при 37°C и 5% CO в 25 см матрасах. В день эксперимента клетки снимали с матраса с помощью раствора трипсин - версен, отмывали и переносили в пробирки со свежей полной средой ДМЕМ. Клетки NIH3T3 (10/мл) облучались при помощи Со гамма - терапевтического аппарата "Агат-Р" (Россия) с начальной мощностью 1,9×10 Бк, поглощенная доза соответствовала 30 Гр. Облучение проводили на холоду. В качестве контроля использовали клетки без облучения, которые инкубировали (клетки находились в суспензии на холоду) аналогично экспериментальным клеткам. Затем облученные (эксперимент) и контрольные клетки вносили в лунки 4-камерной системы для клеточной культуры (Chamber Slides) по 4×10 кл/лунку в 400 мкл среды ДМЕМ, через 30 минут к клеткам добавляли рчАФП. Препарат рчАФП был получен, как описано в Евразийском патенте №011606. Контрольные клетки инкубировали в присутствии растворителя рчАФП - забуференного физиологического раствора (ЗФР). Через 72 часа среду удаляли, лунки промывали 1 раза ЗФР (400 мкл), ЗФР удаляли и вносили в лунки 96% этанол (400 мкл) и инкубировали при -20°C в течение 10 минут. После инкубации содержимое лунок удаляли и лунки просушивали при комнатной температуре. Слайд-камеры с зафиксированными клетками хранили при +4-8°C. Для подсчета клеток слайды обрабатывали красителем Гимза. Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Imager D1 (Германия). Подсчет клеток после окраски проводили в 3-х независимых полях зрения. Согласно проведенным экспериментам в присутствии рчАФП наблюдалось достоверное увеличение числа облученных клеток, в среднем на 30-50% (Фиг. 1).
Известно, что при воздействии ионизирующей радиации наблюдается апоптотическая гибель клеток (Ryan, J.L. Ionizing radiation: the good, the bad, and the ugly / Ryan J.L. // The Journal of Investigative Dermatology. - 2012. - Vol. 132, №3, part 2. - P. 985-993). Поэтому мы проводили анализ выраженности апоптотических процессов в культуре клеток, подвергнутых ионизирующему излучению, и оценивали защитные свойства рчАФП по степени угнетения апоптоза в культуре облученных клеток. Для анализа апоптотических процессов слайд-камеры с зафиксированными клетками обрабатывали красителем DAPI (Sigma, США) с последующим подсчетом количества ядер и анализом морфологии ядер клеток. Слайд-камеры инкубировали с 200 мкл 0,1 мкМ раствора DAPI, в течение 1 минуты при комнатной температуре. После интенсивной отмывки красителя избытком дистиллированной воды препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Zeiss Imager D1 (Германия) и фотографировали с помощью камеры CoolSNAP (США). Для анализа исследовались снимки 3-4 независимых полей зрения, индекс выраженности апоптотических процессов оценивали по формуле А/В×100%, где А - число ядер с характерными апоптотическими признаками, В - общее число ядер в поле зрения.
Эксперименты показали, что необлученные NIH3T3 клетки демонстрируют нормальную морфологию ядер, для которой характерна четкая овальная или округлая форма, относительная гомогенность по размерам и отсутствие деформации ядер. Воздействие ионизирующего излучения на клетку приводит к запуску апоптотического процесса, который характеризуется: деформацией ядер, присутствием многочисленных апоптотических телец и гиперконденсацией хроматина (Techbiques in apoptosis. A user guide. Edited by T.G. Cotter and S.J. Martin. 1996 Portland Press Ltd, London). Как видно из Фиг. 2, в отсутствие ионизирующего облучения в культуре клеток NIH3T3 почти не наблюдается апоптотических процессов, под действием ионизирующей радиации количество клеток с апоптотическими ядрами, наблюдаемых в поле зрения, достигает 80-90%. Обработка облученных клеток препаратом рчАФП приводит к снижению травматического действия ионизирующей радиации, к снижению интенсивности апоптотических процессов, что выражается в снижение доли клеток с аномальной формой ядер и клеток с апоптотическими тельцами. Наиболее достоверно снижение доли клеток с признаками апоптоза наблюдается при добавлении в культуру NIH3T3 клеток рчАФП в концентрации 300 мкг/мл.
Таким образом, показано, что рчАФП, являющийся действующим компонентом липосомального препарата согласно настоящему изобретению, увеличивает жизнеспособность облученных клеток и снижает напряженность апоптотических процессов.
Пример 2. Получение липосом, содержащих рчАФП и рчГКСФ, и «пустых» липосом
Липосомальные препараты готовили на специализированной установке ЛЭМП из раствора рчАФП, раствора рчГ-КСФ и раствора фосфолипидов Lipoid S80 в пропил енгликоле с добавлением консервантов. Раствор рчАФП готовили путем растворения навески лиофилизированного рчАФП. Для инкапсулирования в липосомы рчГ-КСФ использовали готовый стерильный раствор рчГ-КСФ, для чего отбирали расчетный объем субстанции рчГ-КСФ, содержащий белок. Липосомальные препараты изготавливали путем смешивания раствора фосфолипидов Lipoid S80 в пропиленгликоле и водных растворов рчАФП и рчГ-КСФ в пропорциях, определенных в рецептуре. Пропорция определяется условием устойчивости липосом и характеристиками готового препарата. В случае получения «пустых» липосом использовали раствор фосфолипидов Lipoid S80 в пропиленгликоле без добавления растворов белков.
Подготовка рабочего места.
- Батист стерилизовать в контейнере для стерилизации в стерилизационном шкафу при 100°C.
- Положить батист на воронку, вставленную предварительно в промежуточные стерильные флаконы емкостью 500 мл.
- Предварительно простерилизованный фильтрующий блок соединить с подготовленной стерильной приемной емкостью.
- Входной шланг насоса для органической фазы подсоединить к емкости со стерильным раствором фосфолипидов Lipoid S80 в пропиленгликоле.
- Входной шланг насоса для водной фазы подсоединить к емкости со стерильными растворами белков.
- Выходной шланг ЛЭМП подсоединить к фильтрующему выходному устройству.
- Включить установку в соответствии с Инструкцией по эксплуатации и установить подачу экстракта и растворов белков в соответствии с расчетными соотношениями в конечной рецептуре.
- По окончанию процесса приготовления провести техническое обслуживание установки в соответствии с Регламентом.
- В полученный липосомальный препарат при необходимости ввести расчетное количество стерильного раствора консерванта.
Пример 3. Выбор и обоснование наиболее эффективного способа введения препарата
В экспериментах проводили сравнительных анализ эффективности трансдермального (путем разбрызгивания препарата на кожу с помощью дозатора) и подкожного способа введения препарата.
Оценивали эффективность препарата по клиническим критериям течения раневого процесса и по данным гистологических исследований после локального облучения кожи мышей. Для облучения кожи мышей использовали систему ускорителя Elekta Synergy (Elekta Limited, Великобритания), ГБУЗ "Челябинский областной клинический онкологический диспансер".
1. Объект исследований
В экспериментах были использованы самцы мышей стока CD1 в возрасте 3-4 мес, массой 24-26 г, полученные из питомника НПП Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН (ветеринарное свидетельство 250 №0543060). Животных содержали в оптимальных для данного вида условиях: температура воздуха в помещении +22°C; влажность воздуха - 50-60%; регулируемая длина светового дня - 12 ч; подстилочный материал - гранулят из стержней початков кукурузы (ООО «Реттенмайер Рус», Германия). Животные содержались на стандартном рационе (гранулированный комбикорм для лабораторных животных «Чара», г. Сергиев Посад, Московская обл.) с неограниченной подачей питьевой воды. В эксперименте использовали здоровых животных, не подвергавшихся ранее другим экспериментальным процедурам. Группы формировали методом сплошной выборки.
Условия содержания и процедура эксперимента соответствовали общим правилам работ с использованием экспериментальных животных (Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Страсбург, 1986. - European Community Directive 86/606/ЕС). При проведении исследований соблюдались правила гуманного обращения с экспериментальными животными в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных», утвержденными приказом Минздрава СССР (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г №775) и стандартами этического комитета УНПЦ РМ (Протокол №7 от 04.07.2014 г. Этического комитета ФГБУН УНПЦ РМ; Протокол №7 от 04.07.2014 г. Этического комитета ФГБУН УНПЦ РМ и Протокол №1 от 18.03.2015 г.
2. Фиксация животных и формирование кожной складки для локального облучения кожи
За день до облучения у животных выщипывали шерсть пинцетом с браншами, покрытыми резиновыми или латексными трубками, небольшими пучками на участке кожи в центре спины размером 3×3 см, не допуская травмирования кожи. В каждой группе животным присваивали индивидуальный номер и метили стандартными способами.
Перед облучением животное размещали в положении спиной кверху на планшете путем фиксирования задних конечностей с использованием марлевых повязок (самозатягивающаяся петля) и головы (фиксация петлей из лески за верхние резцы). Размер планшета - 170×25 мм. Отверстия диаметром 5 мм для фиксации задних конечностей расположены на расстоянии 10 мм от одного края планшета; стержень с резьбой для фиксации головы мыши расположен на расстоянии 15 мм от противоположенного края планшета. Прототипом способа фиксации является способ обездвиживания крыс на операционном столе (Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях. Страсбург, 1986. - European Community Directive 86/606/ЕС).
Планшет с зафиксированной мышью помещали на подставку из оргстекла так, чтобы животное располагалось горизонтально (Фиг. 3). На вертикальной стенке подставки имеется металлический зажим с латексным покрытием. На спине животного формируют складку кожи и закрепляют ее между стенкой подставки и металлическим зажимом. С обеих сторон вертикальной стенки и на металлическом зажиме нанесена разметка для позиционирования складки кожи по отношению к пучку ионизирующего излучения. Такой способ фиксации кожи не нарушает кровообращение и не вызывает гипоксии кожи.
Поскольку введение мышам химических веществ, в том числе и наркотизирующих, может модифицировать радиобиологические эффекты, были выполнены эксперименты по оценке влияния данного вида фиксации на физиологическое состояние мышей. Исследования показали, что иммобилизация мышей указанным способом в течение 20 мин не приводит к значимым изменениям самочувствия животных, не приводит к непереносимым болевым ощущениям и не вызывает стойких изменений в кровообращении конечностей и кожной складки. Длительность всех процедур, связанных с облучением кожи в дозе 60 Гр составляет не более 15 мин. В связи с этим фиксация животных на время облучения проводилась без наркотизации.
3. Условия облучения
Оптимальной моделью для экспериментальной оценки радиационного поражения кожи является лучевой ожог IIIA степени, так как при этом происходит повреждение эпидермиса и собственно кожи, но сохраняются эпителиальные элементы кожи, являющиеся исходным материалом для самостоятельного заживления раны, и в то же время клинические проявления ожога выглядят достаточно ярко.
2
Облучение кожи спины площадью 1,5 см на установке Elekta Synergy проводили рентгеновским лучами с мощностью дозы 5,5 Гр/мин и номинальной энергией фотонов 6 МэВ. Мышь, зафиксированную на подставке из оргстекла (Фиг. 3), помещали на стол установки комплекса Elekta Synergy и проводили локальное облучение кожи.
4. Характеристики ускорителя Elekta Synergy
Ускоритель включает в себя многолепестковый коллиматор MLCi2, систему портальной визуализации iViewGT, высокоэнергетичный линейный ускоритель с широким диапазоном энергий как для пучков фотонов (6 МэВ, 10 МэВ, 15 МэВ), так и для электронов (6-22 МэВ). Фотонное излучение используют для проведения лучевой терапии глубоко расположенных опухолей, тогда как электроны имеют меньшую проникающую способность и применяются для лечения опухолей, непосредственно прилежащих к коже.
5. Характеристика исследуемых препаратов
В серии экспериментов для проведения сравнительного анализа способа введения препаратов испытывали комплекс антиоксидантов (препарат A0) и липосомальный белковый препарат (препарат А2):
- препарат A0 - микроэмульсия комплекса антиоксидантов (1% бутилированного гидрокситолуола (БГТ) + 1% гидроксикверцетина (ДГК) + 0,17% астаксантин + 4,5% эмульгатор гидрогенизированный лецитин + 0,3% консерванты + 30% масло растительное + вода дистиллированная до 100 мл).
Препарат А2 - липосомы, содержащие 0,5 мг/мл рчАФП, 0,02 мг/мл рекомбинантный дрожжевой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (рчГКСФ), 10 мг/мл фосфолипидов.
6. Схема эксперимента
Препарат А2 применяли на 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 11, 13, 18 и 25-е сутки после облучения (Фиг. 4). Микроэмульсию антиоксидантов (препарат A0) применяли в течение первых 3-х суток после облучения.
В соответствии со схемой эксперимента были сформированы группы мышей по оценке эффективности испытуемых препаратов для экстренной профилактики и лечения лучевых поражений кожи. Всего сформировано 2 группы мышей численностью по 20 животных в каждой:
1 группа - локальное облучение кожи + эмульсия антиоксидантов + липосомы с белками, трансдермальное введение;
2 группа - локальное облучение кожи + эмульсия антиоксидантов (трансдермально) + липосомы с белками, подкожное введение.
Трансдермальное нанесение 180-200 мкл липосомальных препаратов А2 (доза соответствует единичной терапевтической дозе рчАФП и рчГКСФ препарата) проводили с использованием дозатора-распрыскивателя с расстояния 1 см от поверхности кожи. Подкожное введение препарата А2 проводили, отступая на 0,2-0,3 см от места ожоговой раны с помощью инсулинового шприца в объеме 200 мкл.
При одновременном использовании липосом с белками (препарат А2) и микроэмульсии антиоксидантов (препарат A0) сначала на кожу наносили липосомы с белками, а затем через 30 минут наносили 1 каплю микроэмульсии с антиоксидантами с помощью дозатора-капельницы. Вес одной капли препарата A3, получаемой с помощью данного дозатора при температуре 20-22°C, соответствует 35-40 мг.
У животных всех групп проводили в динамике ежедневные клинические наблюдения за ожоговой раной в течение 60 суток после облучения, гистологические исследования кожи проводили на 7, 21 и 35 сутки после облучения в соответствии со схемой эксперимента (Фиг. 4). Для гистологических исследований случайным образом отбирали по 4 животных из каждой экспериментальной группы.
7. Клиническое обследование экспериментальных животных
Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно после облучения в течение 60 суток. Выполняли тщательный осмотр животного, оценивали и регистрировали в журнале визуальные признаки локального радиационного поражения кожи. Проводили ежедневное фотографирование ожоговой раны в течение 60 суток. Фотографирование мышей после облучения производилось каждый день с целью выявления клинических проявлений.
Для каждого животного по визуальным наблюдениям и фотоматериалам отмечали время появления следующих изменений:
1. Время появления эритемы и отека. Эритема - покраснение кожи на месте облучения. Кожа становится уплотненной, сухой, красного, розового, розово-коричневого или желто-коричневого цвета, увеличивается толщина эпидермиса, нарушается нормальный тонус кожи (кожа дряблая) (Фиг. 5А). Период со дня появления эритемы до дня формирования влажного экссудата - период сухого эпидермита;
2. Время появления влажного экссудата. Кожа начинает шелушиться, образуются мелкие поверхностные пузырьки, наполненные прозрачной желтоватой жидкостью серозно-геморрагического отделяемого, ссыхающиеся в тонкие корочки. Через некоторое время отдельные корочки сливаются в одну, розовато-коричневого цвета, блестящую, влажную корочку, под которой формируется крупный, наполненный жидкостью пузырь (Фиг. 5Б). Период со дня появления влажного экссудата до дня формирования струпа - период влажного эпидермита;
3. Время появления струпа - сухой, плотной, твердой, матовой корки темно-красного, коричневого или светло-коричневого цвета и значительной толщины (Фиг. 5В);
4. Время отслоения струпа. Края струпа достаточно быстро (через день-два после формирования) начинают шелушиться и отслаиваться, вся корка может отслаиваться и образовываться вновь несколько раз, при этом с каждой сменой корочки зона краевой эпителизации увеличивается. Период с первого дня формирования струпа до дня последнего отслоения струпа - период струпа. Регистрируется день отслоения последней корочки, когда вместо нее остается блестящая, розовая, очень гладкая кожа (характерный рисунок эпидермиса отсутствует), пронизанная большим количеством сосудов (Фиг. 5Г). Площадь поврежденной кожи меньше, чем площадь первоначальной ожоговой раны, и со временем размер повреждений еще больше уменьшается и восстанавливается;
5. Время полного исчезновения дефекта кожи - окончание процесса эпителизации, формируется эпителий, сходный по структуре и рисунку с эпителием непораженного участка кожи. Кожа в месте ожога приобретает обычный цвет и структуру, либо длительное время после облучения сохраняет мелкие пятна нежной тонкой кожи с гиперпигментацией или более низким уровнем пигментации кожи, телеангиоэктазиями (Фиг. 5Д). Период со дня отпадения последней корочки до появления эпителия, сходного по структуре и рисунку с эпителием непораженного участка кожи - период восстановления эпителия.
Для каждого животного рассчитывали длительность периодов деструктивной и репаративной фаз.
Деструктивная фаза включает:
латентный период - со дня облучения до дня появления эритемы и отека (день обнаружения эритемы не учитывается, не входит в расчет длительности латентного периода). Рассчитывается как разница между днем появления эритемы и отека за вычетом 1 суток;
период сухого эпидермита - с первого дня обнаружения эритемы включительно до дня появления влажной блестящей корочки (влажного экссудата), день появления экссудата не входит в расчет длительности периода сухого эпидермита. Рассчитывается как разница между днем появления влажной блестящей корочки и днем появления эритемы и отека;
период влажного эпидермита - с первого дня обнаружения экссудата (влажной корочки) до формирования твердой сухой корочки (струпа), день появления струпа не входит в расчет длительности периода. Рассчитывается как разница между днем появления струпа и днем появления влажной блестящей корочки.
Деструктивная фаза заканчивается формированием струпа.
Репаративная фаза включает:
период струпа - с первого дня обнаружения сухой плотной корочки (струпа) до полного его отслоения (если струп отслаивается несколько раз - до последнего отслоения, когда после отпадения корочки уже не образуется новых влажных отделений). Первый день, когда струп полностью отпадает, не входит в длительность этого периода. Рассчитывается как разница между днем отпадения последней корочки и днем появления струпа;
период восстановления - со дня отслоения струпа до восстановления эпителия сходного по внешнему виду с неповрежденным эпителием. Этот период заканчивается, когда вся кожа в месте ожога имеет обычный цвет, рисунок и структуру и не отличается от окружающей кожи или же сохраняет длительное время небольшие пятна более темного или светлого цвета. Рассчитывается как разница между днем регистрации эпителия сходного по внешнему виду с неповрежденным эпителием и днем отслоения струпа.
Затем в каждой группе проводили расчет средней арифметической величины длительности каждого периода и ошибки средней арифметической величины. Определяли достоверность отличий показателей в экспериментальных группах с использованием t-критерия Стьюдента (р≤0,05).
Критерием эффективности испытываемых химических веществ служит сокращение длительности периодов лучевого поражения кожи (например, более быстрое восстановление), или снижение тяжести повреждения, например, формирование более легкой степени ожога, более длинный латентный период, отсутствие периодов влажного эпидермита, струпа в группах облученных мышей, получающих испытываемое вещество.
8. Гистологические исследования
Для сопоставления и интерпретации результатов гистологических исследований кроме указанных выше экспериментальных групп формировали дополнительную группу животных, которые не подвергались никакому воздействию (биологический контроль). В этом случае результаты гистологических исследований характеризовали состояние нормальной интактной кожи.
Гистологические исследования кожи проводили на 7-е (деструктивная фаза местных лучевых поражений кожи), 21-е (репаративная фаза местных лучевых поражений кожи) и 35-е (период эптелизации) сутки после облучения животных.
Мышь взвешивали, затем умерщвляли методом дислокации шейных позвонков, иссекали участок облученной кожи. Исследовались фрагменты кожи мышей, взятые из зоны облученной кожи и граничащие с ней участки. Материал фиксировался в 10% растворе забуференного формалина (рН=7,2) и заливались в специальную среду «Гистомикс». С каждого блока-кассеты были изготовлены серийные плоскопараллельные срезы толщиной 4-5 мкм. Серийные гистологические срезы депарафинировали, окрашивали по общепринятым рутинным и специальным методикам, изложенным в ряде известных руководств, далее проводили и заключали препараты по методу Гвинн-Воона и Барнса. Анализ линейных значений и площадей исследуемых структур оценивали при помощи программно-аппаратного комплекса для анализа и обработки изображений в микроскопии - «ВидеоТест - Морфология 5.0». При помощи программно-аппаратного комплекса для анализа и обработки изображений в микроскопии - «ВидеоТест - Морфология 5.0» проводили измерение толщины эпидермиса, подсчет слоев эпидермиса, количества придатков кожи (волосяных фолликулов) в зоне ожоговой раны, определяли площадь срезов.
Для проведения обзорной микроскопии все срезы окрашивались гематоксилином-эозином. Для выявления тучных клеток серийные парафиновые срезы окрашивались по Романовскому-Гимзе. Подсчет исследуемых критериев проводился в 10 полях зрения при увеличении 400*.
9. Результаты клинических наблюдений
В экспериментах по определению наиболее эффективного способа введения липосомального белкового препарата, включающего рчАФП + рчГКСФ, для получения у мышей ожога IIIA степени проводили локальное облучение кожи спины в дозе 60 Гр. Результаты наблюдений клинической картины лучевого ожога представлены на Фиг. 6.
Применение микроэмульсии антиоксидантов и липосомального препарата А2, содержащего рчАФП и рчГКСФ не привело к достоверным изменениям длительности различных этапов течения ожога при трансдермальном введении препарата, по сравнению с подкожным введением (группы 1 и 2 соответственно). Следует отметить, что при трансдермальном способе введения препарата длительность репаративной фазы (длительность периода струпа и периода восстановления) были несколько короче, по сравнению с эффектом подкожного введения препарата, но достоверно не отличались в группах.
Таким образом, по клиническим признакам трансдермальный способ введения препарата не уступает эффекту подкожного введения.
10. Результаты гистологических исследований
При анализе гистологических изменений в зоне ожога (Таблицы 1-3) не было выявлено достоверных различий при использовании трансдермального и подкожного способов введения липосомального препарата, за исключением количества волосяных фолликулов на 35-е сутки после облучения. В этот период количество придатков кожи приблизительно в группе с трансдермальным введением препарата в 2 раза превышало показатель в группе с подкожным введением (Таблица 3).
Таким образом, по гистологическим показателям можно заключить, что трансдермальный способ введения липосомального препарата не уступает подкожному введению.
Заключение
Данные клинических наблюдений и гистологические исследования показывают, что трансдермальный способ введения липосомального препарата по эффективности не уступает подкожному способу введения. Одновременно с этим трансдермальное введение препарата является не инвазивным способом, по сравнению с подкожным, что снижает вероятность инфекционных осложнений и исключает дополнительную травматизацию вблизи ожоговой раны. Все это позволяет определить трансдермальный способ введения как более преимущественный по сравнению с подкожным введением липосомального белкового препарата.
Пример 4. Выбор и обоснование наиболее эффективной схемы применения липосомального препарата
В экспериментах была проведена оценка эффективности препаратов для профилактики и лечения радиационных поражений кожи в зависимости от времени нанесения препарата на пораженный участок кожи относительно облучения.
В экспериментах были использованы самцы мышей стока CD1 в возрасте 3-4 мес на начало эксперимента, массой 24-26 г, полученные из питомника НПП Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН (ветеринарное свидетельство 250 №0543060). (см. Пример 3, раздел 1).
Для облучения мышей использовали систему ускорителя Elekta Synergy (Elekta Limited, Великобритания), ГБУЗ "Челябинский областной клинический онкологический диспансер". Условия облучения подробно описаны в разделе 3, Пример 3.
Оценивали эффективность препарата по клиническим критериям течения раневого процесса после локального облучения кожи мышей в дозе 60 Гр (ожог IIIA степени) (см. Пример 3, раздел 7). У животных всех групп проводили в динамике ежедневные клинические наблюдения за ожоговой раной в течение 60 суток после облучения (Фиг. 7).
Для каждого животного рассчитывали длительность периодов деструктивной и репаративной фаз, а также отдельных стадий: латентной стадии, стадии сухого и влажного эпидермита, стадии струпа, стадии эпителизации. Для исследуемых показателей проводили расчет средней арифметической величины и ошибки показателей средней арифметической величины. Определяли достоверность отличий показателей в экспериментальных группах с использованием t-критерия Стьюдента (р≤0,05).
1. Характеристика препарата и способа применения
Тестировали препарат - липосомы, содержащие 0,5 мг/мл рчАФП, 0,02 мг/мл рчГКСФ, 10 мг/мл фосфолипидов.
Трансдермальное нанесение 180-200 мкл липосомального препарата (доза соответствует единичной терапевтической дозе рчАФП и рчГКСФ препарата) проводили с использованием дозатора-распрыскивателя с расстояния 1 см от поверхности кожи.
Разовые дозы и дозы рчАФП на курс представлены на Фиг. 7.
2. Схема эксперимента
В эксперименте тестировали 3 схемы трансдермального (с помощью дозатора-распрыскивателя) нанесения препарата на кожу мышей (Фиг. 7).
1) Схема «Профилактика» - препарат ежедневно наносили на эпилированный участок кожи спины мышей в течение 5 суток до облучения.
2) Схема «Лечение» - препарат наносили на эпилированный участок локально облученной кожи спины мышей на 1-5 сутки, а затем на 6-10 сутки и на 13, 18, 25 сутки после облучения кожи. Нанесение препарата непосредственно после облучения и до появления симптомов лучевого дерматита является экстренной профилактикой, поэтому схема «Лечение» включает в себя применение препарата в качестве экстренной профилактики и лечения.
3) Схема «Профилактика + Лечение» - ежедневно наносили препарат на эпилированный участок кожи спины мышей в течение 5 суток до облучения, а затем на 1-5 суток, на 6-10 сутки и на 13, 18, 25 сутки после облучения.
В соответствии со схемой эксперимента были сформированы 4 группы мышей численностью по 20 животных в каждой (Табл. 4).
3. Результаты клинических наблюдений
Результаты наблюдений за клинической картиной патогенеза ожога кожи у мышей представлены на Фиг. 8. Общее время с момента облучения и до восстановления эпителия у мышей, у которых было проведено локальное облучение кожи в дозе 60 Гр без лечения (группа 1), составило 48,2±3,7 суток. Длительность латентного периода формирования лучевого ожога составила 5±0,3 суток. Длительность стадии сухого и влажного эпидермита до формирования струпа составила 11,3±0,3 суток. Репаративный период (период струпа и эпителизации) составил 31,8 суток.
При оценке влияния липосом, содержащих 0,5 мг рчАФП + 0,02 мг рчГКСФ на патогенез лучевого ожога кожи IIIА степени были получены следующие результаты. При использовании всех трех схем «Профилактика», «Лечение» и «Профилактика + Лечение» (группы 2, 3, 4 соответственно) регистрировалось достоверное сокращение времени восстановления эпителия на месте лучевого ожога, и этот показатель составил соответственно 33,8+2,5; 30,0+1,7; 28,8+1,5 суток при 48,2+3,7 суток у облученных нелеченых мышей. Длительность деструктивного периода составила соответственно 12,6+0,9; 14,4+0,2; 13,8+0,5 суток при 16,3+0,4 суток в группе облученных нелеченых мышей; длительность репаративного периода - соответственно 21,2+2,2; 15,6+1,8; 15,0+2,0 суток при 31,8+3,9 суток в группе облученных нелеченых мышей.
Кроме того, в группе мышей, где липосомальный препарат с белками применяли по схемам «Лечение» и «Лечение + Профилактика», регистрировалось достоверное увеличение скрытого периода и достоверное сокращение длительности периода эпидермита, что является положительным эффектом в лечении лучевых ожогов. Поскольку эти эффекты не наблюдались при использовании схемы «Профилактика», то можно предположить, что они в большей мере обусловлены нанесением препарата по схеме «Лечение».
Заключение
Таким образом, анализ результатов исследования показал следующее:
- трансдермальное применение липосомального препарата, содержащего 0,5 мг рчАФП + 0,02 мг рчГКСФ, оказывают благоприятное действие на течение лучевого ожога: сокращение общего времени заживления лучевого ожога при использовании схемы «Профилактика» относительно облученных нелеченых животных составило 28%; при использовании схем «Лечение» и «Профилактика + Лечение» составило соответственно 38% и 40%. При нанесении препарата по схеме «Лечение» регистрируется достоверное увеличение длительности латентного периода, уменьшение длительности стадии эпидермита и репаративного периода;
- наиболее оптимальным, как с точки зрения биологического эффекта, так и с точки зрения практического проведения процедуры нанесения препарата на место радиационного поражения кожи, является применение липосомальных препаратов по схеме «Лечение».
Пример 5. Выбор и обоснование наиболее эффективной концентрации рчАФП в липосомальном препарате
В исследовании выполнена оценка влияния концентрации рчАФП в липосомальном препарате при трансдермальном нанесении (с помощью дозатора-распрыскивателя) по схеме «Лечение» на течение лучевого ожога кожи IIIA степени.
В экспериментах были использованы самцы мышей стока CD1 в возрасте 3-4 мес на начало эксперимента, массой 24-26 г полученные из питомника НПП Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН (ветеринарное свидетельство 250 №0543060) (см. Пример 3, раздел 1).
Для облучения кожи мышей использовали систему ускорителя Elekta Synergy (Elekta Limited, Великобритания), ГБУЗ "Челябинский областной клинический онкологический диспансер". Условия облучения подробно описаны в разделе 3, Пример 3.
Оценивали эффективность препарата по клиническим критериям течения раневого процесса и данным гистологических исследований после локального облучения кожи мышей в дозе 60 Гр (ожог IIIA степени) (см. Пример 3, раздел 7, 8). У животных всех групп проводили в динамике ежедневные клинические наблюдения за ожоговой раной в течение 60 суток после облучения, гистологические исследования кожи (см. Пример 3, раздел 8) на 7, 21 и 35 сутки после облучения в соответствии со схемой эксперимента (Фиг. 9).
Для каждого животного рассчитывали длительность периодов деструктивной и репаративной фаз, а также отдельных стадий: латентной стадии, стадии сухого и влажного эпидермита, стадии струпа, стадии эпителизации (см. Пример 3, раздел 7).
Для исследуемых показателей проводили расчет средней арифметической величины и ошибки показателей средней арифметической величины. Определяли достоверность отличий показателей в экспериментальных группах с использованием t-критерия Стьюдента (р≤0,05). Для оценки зависимости анализируемых показателей от концентрации рчАФП в липосомальном препарате проводили регрессионный анализ.
1. Характеристика препаратов и способа применения
Тестировали липосомальные препараты, имеющие следующий состав:
1) 0,1 мг/мл рчАФП + 0,02 мг/мл рчГКСФ;
2) 0,5 мг/мл рчАФП + 0,02 мг/мл рчГКСФ;
3) 1 мг/мл рчАФП + 0,02 мг/мл рчГКСФ.
Трансдермальное нанесение 180-200 мкл липосомальных препаратов проводили с использованием дозатора-распрыскивателя с расстояния 1 см от поверхности кожи.
Сроки нанесения препаратов, разовые дозы и дозы на курс представлены на Фиг. 9.
2. Схема эксперимента
Тестирование проводили по схеме «Лечение» - препарат наносили на эпилированный участок локально облученной кожи спины мышей на 1-5 сутки, а затем на 6-10 сутки и на 13, 18, 25 сутки после облучения кожи (Фиг. 9). Нанесение препарата непосредственно после облучения и до появления симптомов лучевого дерматита является экстренной профилактикой, поэтому схема «Лечение» включает в себя применение препарата в качестве экстренной профилактики и лечения.
В соответствии со схемой эксперимента были сформированы 5 групп мышей численностью по 20 животных в каждой (табл. 1).
3. Результаты клинических наблюдений
Общее время с момента облучения и до восстановления эпителия у облученных нелеченых мышей (Фиг. 10, группа 2) составило 47,8±1,4 суток; длительность периода деструкции составила 14,2±0,2 суток, а периода репарации и эпителизации - 33,6±1,2 суток.
Применение для лечения радиационного ожога кожи липосомального препарата, содержащего белки рчАФП + рчГКСФ, привело к достоверному сокращению длительности восстановления эпителия после облучения кожи в дозе 60 Гр практически в 1,5 раза по отношению к облученному нелеченому контролю во всех трех дозовых группах по рчАФП.
Однако динамика формирования и заживления ожоговой раны имела свои особенности в зависимости от содержания в липосомальном препарате рчАФП. При трансдермальном нанесении липосомального препарата, содержащего рчАФП в концентрациях 0,1 мг/мл и 0,5 мг/мл не выявлено изменения длительности скрытого периода и стадий сухого и влажного эпидермита, но регистрировалось укорочение длительности репарации и эпителизации ожоговой раны. В период воспаления важным является перевод влажного некроза в сухой струп, что уменьшает вероятность микробной обсемененности ожоговой раны. В нашем исследовании наиболее выраженное сокращение экссудативной стадии регистрируется при нанесении на лучевой ожог кожи липосомального препарата, содержащего 1 мг/мл рчАФП. В этом случае наблюдается увеличение скрытого периода на 20% (недостоверно) и достоверное уменьшение длительности экссудативной стадии (сухой и влажный эпидермит) на 35% по сравнению с показателями у облученных нелеченых мышей.
На Фиг. 11 приведены графики зависимости длительности стадий течения лучевого ожога от концентрации рчАФП в липосомальном препарате. С увеличением содержания рчАФП в липосомальном препарате, наблюдалось дозозависимое удлинение скрытого периода и укорочение стадий сухого и влажного эпидермита, а также в целом деструктивного периода. Наиболее выраженный эффект наблюдался в группе, где применяли препарат, содержащий 1 мг/мл рчАФП.
Регрессионный анализ показал, что увеличение концентрации рчАФП в липосомальном препарате приводит к снижению длительности скрытого периода (р=0,05; F=4,1), стадии сухого эпидермита (р<0,0001; F=16,2), влажного эпидермита (р<0,024; F=5,7), в целом деструктивного периода (р<0,0001; F=24,4) и не влияло на длительность стадии струпа (р=0,77; F=0,390).
4. Гистологические исследования
2
2
cт
cт
Гистологические исследования позволили получить дополнительную информацию, подтверждающую выявленные клинические эффекты исследуемого липосомального препарата. Четкие и достоверные результаты были получены при изучении состояния эпидермиса в зоне лучевого ожога у мышей во все сроки гистологического обследования. На 7-е сутки после облучения толщина и количество слоев эпидермиса в зоне ожога увеличивались с повышением концентрации рчАФП в липосомальном препарате (Табл. 6, 3). Толщина эпидермиса на 7-е сутки после локального облучения кожи в группе, где животные получали липосомальный препарат с концентрацией рчАФП 1 мг/мл была достоверно на 50% больше, а количество слоев эпидермиса на 70% достоверно превышало значение показателя в гамма-контроле. Проведение регрессионного анализа показало высокодостоверное влияние фактора "концентрация рчАФП в липосомальном препарате" на толщину эпидермиса (R=0,09; t=12,01; р=0,00073) и количество слоев эпидермиса (R=0,08; t=10,12; р=0,0019) в зоне лучевого ожога.
На 21-е сутки после локального облучения кожи в группе гамма-контроля регистрировалось существенное увеличение толщины и количества слоев эпидермиса по сравнению с биологическим контролем и значением показателя на 7-е сутки после облучения, что еще раз подтверждает, что увеличение толщины и количества слоев эпидермиса является признаком и определенным этапом восстановления повреждения кожи в зоне ожога. На 35-е сутки после локального облучения кожи в группе гамма-контроля наблюдалось восстановление архитектоники эпидермиса кожи, что проявлялось в снижении, приблизительно, в 2 раза толщины и количества слоев эпидермиса по отношению к значению показателя на 21-е сутки после облучения. Одновременно с этим на 35-е сутки эксперимента толщина и количество слоев эпидермиса в ожоговой ране было все еще, приблизительно, 4 раза больше, чем в интактной коже и в 2-3 раза больше, чем на 7-е сутки обследования.
ст
ст
ст
ст
ст
ст
2
2
2
2
Анализ динамики этого показателя в группах, где использовали липосомальный препарат с различной концентрацией рчАФП, позволяет четко определить направленность биологического действия липосомального препарата. В целом, эффект препарата можно охарактеризовать как более быстрое включение и более быстрое течение процессов восстановления эпидермиса в лучевой ране. Так, на примере состояния эпидермиса в зоне лучевого ожога после применения липосомального препарата с концентрацией рчАФП 1 мг/мл видно, что после быстрого включения процессов восстановления эпидермиса на 7-е сутки после локального облучения кожи, вскоре наступает и более быстрое восстановление эпидермиса: на 21-е сутки регистрируется достоверное, практически двукратное снижение толщины и количества слоев эпидермиса в зоне поражения, по сравнению с гамма-контролем. По этим показателям состояние ожоговой раны на 21-е сутки при применении липосомального препарата (1 мг/мл рчАФП) фактически соответствует состоянию раны в группе гамма-контроля на 35 сутки. И далее, на 35 сутки состояние эпидермиса в группах с липосомальными препаратами существенно ближе к значению в группе биологического контроля: в это время уже толщина (t=1,76; р=0,12) и количество слоев эпидермиса (t=1,97; р=0,08) уже достоверно не отличаются от значения показателей в группе биологического контроля. Крайне важно отметить, что и на 21-е, и на 35-е сутки была выявлена высоко достоверная зависимость показателей состояния эпидермиса в зоне повреждения от концентрации рчАФП в липосомальном препарате: на 21-е сутки (R=0,18; t=31,73; р=8,7Е-08) и на 35 сутки (R=0,10; t=13,37; р=0,00038) было зарегистрировано достоверное влияние концентрации рчАФП на толщину эпидермиса и на количество его слоев в зоне поражения - (R=0,19; t=34,04; р=3,3Е-08), (R=0,13; t=18,00; р=4,4Е-5) на 21-е и 35-е сутки, соответственно.
Сочетание нескольких факторов (достоверные отличия по показателям состояния эпидермиса в зоне поражения в экспериментальных группах, где применяли липосомальный препарат; четкая достоверное влияние концентрации рчАФП в липосомальном препарате на показатели состояния эпидермиса во все сроки обследования), а также сопоставление показателей в группе гамма-контроля и группы, где животные получали липосомальный препарат с концентрацией 1 мг/мл рчАФП, позволяет уверенно заключить, что липосомальный препарат обладает выраженным эффектом, проявляющимся в более быстром восстановлении эпидермиса в зоне локального лучевого ожога кожи. При этом результатов гистологических исследований следует, что при применении липосомального препарата с концентрацией рчАФП 1 мг/мл восстановление эпидермиса происходит на 2 недели быстрее, по сравнению с динамикой восстановления эпидермиса в группе гамма-контроля.
Кроме состояния эпидермиса, количество придатков кожи в ожоговой ране является важным показателем, отражающим выраженность радиационного поражения кожи. Анализ количества волосяных фолликулов в зонге поражения в группах, где применяли липосомальный препарат с разной концентрацией рчАФП показал, что при концентрации рчАФП 1 мг/мл регистрируется достоверное увеличение количества этого вида придатков кожи на 7-е и 35-е сутки, по сравнению с группой гамма-контроля. Кроме этого, еще было выявлено достоверно более высокое количество волосяных фолликулов в зоне лучевого поражения на 35-е сутки при применении липосомального препарата с концентрацией рчАФП 0,1 мг/мл. Для этого показателя не было выявлено четкой зависимости от концентрации рчАФП в липосомальном препарате.
Выводы
1. Трансдермальное нанесение липосомального препарата, содержащего рчАФП в концентрациях 1,0; 0,5 и 0,1 мг/мл, по схеме «Лечение» ускоряют процесс заживления лучевого ожога кожи IIIA степени по сравнению с показателями у облученных нелеченых животных.
2. Трансдермальное нанесение липосомального препарата, содержащего рчАФП в концентрации 0,1 мг/мл, по схеме «Лечение» не влияет на длительность скрытого периода и стадий сухого и влажного эпидермита, ускоряет процесс репарации и эпителизации ожоговой раны.
3. При трансдермальном нанесении по схеме «Лечение» липосомального препарата, содержащего рчАФП в концентрации 0,5 мг/мл, не выявлено достоверного изменения показателей длительности скрытого и экссудативного периодов, регистрируется достоверное ускорение процесса репарации и эпителизации ожоговой раны.
4. При трансдермальном нанесении по схеме «Лечение» липосомального препарата, содержащего рчАФП в концентрации 1,0 мг/мл, выявлено достоверное снижение длительности деструктивного периода, периода репарации и эпителизации.
5. При проведении регрессионного анализа показано, что увеличение концентрации рчАФП в липосомальном препарате приводит к дозозависимому увеличению длительности скрытого периода, снижению длительности деструктивного периода.
6. Сопоставляя результаты гистологических исследований и данных клинических наблюдений, можно заключить, что в период альтерации защитное действие липосомального препарата зависит от концентрации в нем рчАФП и проявляется в увеличении слоев эпидермиса в зоне лучевого поражения кожи. При этом, наиболее выраженные благоприятные изменения были зарегистрированы при применении липосомального препарата с концентрацией рчАФП 1 мг/мл как по критериям клинических наблюдений, так и по данным гистологических исследований.
Пример 6. Оценка влияния фосфолипидов («пустые» липосомы) на патогенез местных радиационных поражений кожи
В экспериментах была проведена сравнительная оценка эффективности «пустых» липосом и липосом, содержащих рекомбинантные белки человека рчАФП и рчГКСФ, при использовании их для экстренной профилактики и лечения местных радиационных поражений кожи.
В экспериментах были использованы самцы мышей стока CD1 в возрасте 3-4 мес. на начало эксперимента, массой 24-26 г., полученные из питомника НПП Питомник лабораторных животных ФИБХ РАН (ветеринарное свидетельство 250 №0543060). (см. Пример 3, раздел 1).
Для облучения мышей использовали систему ускорителя Elekta Synergy (Elekta Limited, Великобритания), ГБУЗ "Челябинский областной клинический онкологический диспансер". Условия облучения подробно описаны в разделе 3, Пример 3.
Оценивали эффективность препаратов по клиническим критериям течения раневого процесса после локального облучения кожи мышей в дозе 60 Гр (ожог ША степени) (см. Пример 3, раздел 7). У животных всех групп проводили в динамике ежедневные клинические наблюдения за ожоговой раной в течение 60 суток после облучения.
Для каждого животного рассчитывали длительность периодов деструктивной и репаративной фаз, а также отдельных стадий: латентной стадии, стадии сухого и влажного эпидермита, стадии струпа, стадии эпителизации. Для исследуемых показателей проводили расчет средней арифметической величины и ошибки показателей средней арифметической величины. Определяли достоверность отличий показателей в экспериментальных группах с использованием t-критерия Стьюдента (р<0,05).
1. Характеристика препаратов и способа применения
В эксперименте тестировали липосомальные препараты. Препараты представляли собой стерильную липосомальную суспензию на основе фосфолипидов и рекомбинантных белков, нетоксичную, с рН 7,4. В состав препаратов входили в различных комбинациях рекомбинантный дрожжевой альфа-фетопротеин человека (рчАФП), рекомбинантный дрожжевой гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (рчГ-КСФ), консервант парабены (концентрация 0,4%), фосфолипид Lipoid S80 (концентрация 1%).
Препарат №1 - липосомы, содержащие 1 мг/мл рчАФП; 10 мг/мл фосфолипидов.
Препарат №2 - липосомы, содержащие 0,2 мг/мл рчАФП; 0,015 мг/мл Г-КСФ; 10 мг/мл фосфолипидов.
Препарат №3 - «пустые» липосомы, содержащие 10 мг/мл фосфолипидов.
Ведение проводили с помощью инсулинового шприца подкожно в объеме 0,1 мл, отступая на 0,5 см от края ожоговой раны.
2. Схема эксперимента
Было сформировано 3 группы мышей стока CD1 по 14 самцов каждая:
группа 1 - гамма-контроль (облучение кожи в дозе 60 Гр);
группа 2 - облучение кожи в дозе 60 Гр + «пустые» липосомы по схеме «Лечение»;
группа 3 - облучение кожи в дозе 60 Гр + липосомальный препарат рчАФП и рчГКСФ, по схеме «Лечение».
Мыши 1 группы (гамма-контроль) после облучения кожи спины не получали лечения.
Животным 2 группы вводили препарат №3 («пустые» липосомы») по схеме «Лечение»: препарат вводили в тот же день после облучения, затем на 2, 5, 7, 9, 11, 13, 18, 25-е сутки после облучения. Схема «Лечение» включает в себя экстренную профилактику (введение препарата сразу после облучения до появления клинических симптомов ожога) и лечение (введение препарата после появления симптомов ожога).
Животным 3 группы по схеме «Лечение» в первые 3 срока (0, 2, 5 сутки после облучения) вводили препарат №1 (липосомы, содержащие 1 мг/мл рчАФП), затем на 7, 9, 11, 13, 18, 25-е сутки вводили препарат №2 (липосомы, содержащие 0,2 мг/мл рчАФП + 0,015 мг/мл ГКСФ).
3. Результаты клинических наблюдений
В эксперименте общее время с момента облучения и до восстановления эпителия у животных, у которых было проведено локальное облучение кожи в дозе 60 Гр без лечения (группа 1), составило 63,5±1,5 суток (Фиг. 12). При этом фаза деструкции (латентный период + стадии сухого и влажного эпидермита) составила 14,54±0,19 суток, а репаративная фаза (стадии струпа и восстановления эпителия) - 48,9±0,5 суток.
При анализе длительности восстановительного периода выявлены отличия в течение заживления ожоговой раны в группе, где животные не получали лечения (группа 1), и в группе 3, где животным вводили липосомальные препараты, содержащие рчАПФ и рчГ-КСФ (Фиг. 12). При введении препаратов, содержащих рчАПФ и рчГ-КСФ по схеме «Лечение», регистрировалось достоверное снижение длительности репаративной фазы до 32,1±3,5 суток (против 48,9±0,5 суток в группе гамма-контроля). Это реализовалось в достоверном ускорении заживления ожоговой раны на 35% по отношению к гамма-контролю - от момента облучения до полного заживления раны потребовалось соответственно 47,4±5,0 суток при показателе в группе гамма-контроля 63,5±1,5 суток. Длительность деструктивной фазы у животных этой группы не отличалась от показателя в группе гамма-контроля.
При введении «пустых» липосом (группа 2) по схеме «Лечение» также наблюдался благоприятный эффект, хотя и менее выраженный, чем при введении липосомальных препаратов, содержащих рчАФП и рчГКСФ (группа 3). Общее время заживления раны в группе 2 составило 57,3±1,0 суток, длительность репаративного периода 41,3±1,5 суток. При этом выявлено достоверное снижение стадии восстановления эпителия по сравнению с группой гамма-контроля на 25%. Длительность деструктивной фазы у животных этой группы не отличалась от показателя в группе гамма-контроля.
То есть применение «пустых» липосом для экстренной профилактики и лечения радиационных поражений кожи не влияет на длительность деструктивного периода, но приводит к более быстрому заживлению ожоговой раны за счет укорочения репаративной фазы.
Выявленные эффекты могут быть обусловлены как снижением уровня поражения кожи в деструктивный период, так и ускорением регенеративных процессов в репаративной фазе.
Таким образом, результаты клинических наблюдений показали следующее:
1. Подкожное введение липосом, содержащих белки рчАПФ и рчГ-КСФ, животным с лучевыми ожогами кожи ША степени по схеме «Лечение» привело к сокращению общего времени заживления ожоговой раны на 35% относительно облученных нелеченых животных; сокращению репаративной фазы на 35%.
2. Подкожное введение «пустых» липосом животным с лучевыми ожогами кожи ША степени по схеме «Лечение» привело к сокращению общего времени заживления ожоговой раны на 11% относительно облученных нелеченых животных; сокращению репаративной фазы - на 25%.
3. «Пустые» липосомы могут быть использованы для экстренной профилактики и лечения радиационных поражений кожи.
Хотя настоящее изобретение было подробно описано со ссылкой на предпочтительные варианты его осуществления, для специалиста в данной области техники ясно, что могут быть сделаны различные замены и применены эквивалентные средства, которые не выходят за рамки настоящего изобретения. Все процитированные здесь документы полностью включены в описание настоящей заявки посредством ссылки.