НАНОВЕЗИКУЛЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ БАКТЕРИЙ РОДА SPHINGOMONAS, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
NANOVESICLES PRODUCED FROM BACTERIA OF THE GENUS SPHINGOMONAS AND APPLICATION THEREOF

Область техники
Данное изобретение относится к нановезикулам, полученным из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas, и к их применению, говоря конкретнее, к способу диагностирования цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма, атопического дерматита и др. с использованием нановезикул, полученных из бактерий принадлежащих к роду Sphingomonas, к композиции для предотвращения, ослабления или лечения указанных заболеваний, содержащей указанные везикулы, к композиции для доставки лекарственного средства с целью лечения заболеваний головного мозга, содержащей указанные везикулы, и др.
Данной заявкой испрашивается приоритет и преимущества на основании патентных заявок Кореи NO: 10-2018-0158623 и 10-2019-0132138, поданными в Корейсккое ведомство интеллектуальной собственности 10 декабря 2018 г. и 23 октября 2019 г. соответственно, содержание описания и иллюстраций которых полностью включается в настоящую заявку.
Уровень техники
С начала XXI в. острые инфекционные заболевания, в прошлом считавшиеся эпидемическими, становятся все менее важными, тогда как хронические заболевания, которые сопровождаются нарушениями деятельности иммунной системы, обусловленными утратой гармоничных отношений между человеческим организмом и его микробиомом, выдвинулись на первый план, определяя качество и продолжительность жизни людей. Такие трудноподдающиеся в 21 веке хронические болезни, как рак, сердечно-сосудистые, аллергические (в том числе затрагивающие легкие), метаболические и психоневрологические заболевания, влияя на качество и продолжительность жизни людей, создают огромные проблемы и важнейшие задачи для общественного здоровья в стране.
Известно, что с человеческим организмом сосуществует множество микроорганизмов: их численность оценивается в 100 триллионов, что в 10 раз превышает количество клеток в организме человека, а количество генов, принадлежащих этим микроорганизмам, превышает количество человеческих генов более чем в 100 раз. Термин «микробиота», или «микробиом» относится к сообществу микроорганизмов, включая бактерий, архей и эукариотические микроорганизмы, населяющих данное местообитание.
Бактерии – как сосуществующие с человеческим организмом, так и живущие в окружающей среде, выделяют везикулы размерами порядка нанометров, которые служат для обмена информацией в виде генов, низкомолекулярных соединений, белков и других материальных носителей с другими клетками. В человеческом организме слизистые оболочки образуют физический барьер, через который не могут проникнуть частицы с размерами не менее 200 нм, так что бактерии, живущие на слизистой оболочке, не проходят сквозь нее. Но происходящие из бактерий везикулы имеют размеры не более 100 нм и поглощаются тканями организма относительно, легко проникая через слизистую оболочку сквозь слои эпителиальных клеток. Везикулы, выделяемые бактериями локально, поглощаются эпителиальными клетками слизистой оболочки и вызывают местную воспалительную реакцию; везикулы, прошедшие сквозь эпителиальные клетки поглощаются системно: они попадают в лимфатические сосуды и таким образом достигают тех или иных органов, в которых, соответственно, развиваются иммунологическая и воспалительная реакции. Например, везикулы из патогенных грамотрицательных бактерий, например, Escherichia coli, вызывают локально воспалительную реакцию и рак и способствуют системным воспалительным реакциям и свертываемости крови через воспалительные реакции эндотелиальных клеток сосудов при всасывании через кровеносные сосуды. Кроме того, такие везикулы поглощаются мышечными клетками, на которые влияет инсулин, что ведет к резистентности к инсулину и диабету. В противоположность эффектам везикул патогенных бактерий, аналогичные продукты полезных бактерий противодействуют заболеваниям, регулируя иммунологические функции и нивелируя метаболические нарушения, вызванные везикулами патогенных бактерий.
На такие факторы, как бактериальные везикулы, возникает иммунные реакции с участием Th17, отличающиеся секрецией цитокина интерлейкина (здесь и далее IL)-7, и IL-6 секретируется эпителиальными клетками и клетками иммунной системы, когда подвергаются воздействию происходящих из бактерий везикул тем самым вызывая иммунный ответ, опосредованный Th17. Воспалительная реакция, обусловленная иммунным ответом Th17, характеризуется инфильтрацией нейтрофилов, и при этом клетки воспаления – нейтрофилы и макрофаги - выделяют фактор некроза опухолей (здесь и далее TNF-α), который играет важную роль в воспалении и онкогенезе.
Бактерии, принадлежащие роду Sphingomonas, являются анаэробными грам-отрицательными бактериями, широко распространенными в природе – они обитают, например, в воде, почве, корнях растений и др. У подавляющего большинства грамотрицательных бактерий во внешней клеточной мембране имеются липополисахариды (LPS), а в роде Sphingomonas вместо липополисахаридов в наружной мембране присутствуют гликосфинголипиды (GSL). Известны 20 видов рода Sphingomonas; в их числе Sphingomonas paucimobilis, которые, как сообщалось, оказываются возбудителями внутрибольничных инфекций у человека. Однако до сих пор не было сообщений о том, что везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, включая названный выше вид, применимы для диагностики и лечения таких неизлечимых болезней, как некоторые рак, сердечно-сосудистое заболевание и атопический дерматит.
Таким образом, данное изобретение демонстрирует, что диагностирование заболеваний, а именно: цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита - возможно путем установления факта пониженного по сравнению со здоровыми людьми содержания везикул бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, в клинических образцах больных с указанными заболеваниями. Также авторами данного изобретения в результате выделения везикул из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas бактерий, таких, как Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis, показано, что эти везикулы можно использовать в качестве композиции для профилактики или лечения таких заболеваний, как цирроз печени, рака печени, инфаркт миокарда, почечная недостаточность, диабет, опухоли головного мозга, умеренные нарушения когнитивных функций, деменция, депрессия, аутизм и атопический дерматит. Также было показано, что при пероральном приеме указанных везикул лекарственный препарат попадает в головной мозг.
Раскрытие изобретения
Техническая задача
Обратившись к описанным выше проблемам, авторы данного изобретения в результате интенсивных исследований путем метагеномного анализа показали, что содержание везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, в образцах материала, полученного от больных с циррозом печени, раком печени, инфарктом миокарда, почечной недостаточностью, диабетом, опухолями головного мозга, умеренными нарушениями когнитивных функций, деменцией, депрессией, аутизмом и атопическим дерматитом значительно ниже, чем у здоровых людей. Также было показано, что обработка макрофагов выделенными везикулами из Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis, которые представляют собой бактерии, принадлежащие роду Sphingomonas, значительно подавляет секрецию интерлейкина -6 (IL-6) и альфа-фактора некроза опухолей TNF-α этими клетками, вызванную патогенными везикулами; тем самым дополняя данное изобретение, основанное на этих фактах.
Таким образом, объектом данного изобретения является способ диагностирования одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, или способ обеспечения информации для установления диагноза.
Также другим объектом данного изобретения является композиция для предотвращения, облегчения или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, содержащую в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas.
Кроме того, еще одним объектом данного изобретения является композиция для доставки лекарственного агента с целью лечения заболевания головного мозга, содержащую в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas.
Но техническая задача данного изобретения не ограничивается указанными выше проблемами – другие проблемы, не упомянутые в настоящем документе, но решаемые при помощи данного изобретения, должны быть ясны специалистам в данной области техники из следующего описания.
Решение технической задачи
Для достижения целей данного изобретения, указанных выше, предлагается способ обеспечения информации для диагностирования одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, который включает следующие этапы:
(a) выделение ДНК из везикул, полученных из образцов здорового индивида и субъекта;
(b) проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР ) с выделенной ДНК и парой праймеров, полученных на основе последовательности гена, имеющейся в 16S рДНК, для получения продуктов полимеразной цепной реакции; и
(c) идентификацию случая, в котором содержание везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, ниже, чем в образце, взятом у здорового индивида, как случая одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, путем количественного анализа продуктов полимеразной цепной реакции.
Также данным изобретением предлагается способ диагностирования одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, который включает следующие этапы:
(a) выделение ДНК из везикул, полученных из образцов здорового индивида и субъекта;
(b) проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР ) с выделенной ДНК и парой праймеров, полученных на основе последовательности гена, имеющейся в 16S рДНК, для получения продуктов полимеразной цепной реакции; и
(c) идентификация случая, в котором содержание везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, ниже, чем в образце, взятом у здорового индивида, как случая одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, путем количественного анализа продуктов полимеразной цепной реакции.
В одном из типичных воплощений данного изобретения образцом на этапе (а) служит кровь или моча;
В другом воплощении данного изобретения парой праймеров на этапе (b) является пара праймеров, содержащих нуклеотидные последовательности, представленные в настоящем документе как последовательности SEQ ID NO: 1 и 2.
Также данным изобретением предлагается композиция для предотвращения, ослабления или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, которая содержит в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas.
Эта композиция может представлять собой фармацевтическую, пищевую и косметическую композицию.
Также данным изобретением предлагается способ профилактики или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, который включает этап введения субъекту композиции, содержащей в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas.
Также данным изобретением предлагается применение везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas, для профилактики или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита.
Также данным изобретением предлагается применение композиции, содержащей в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas, для профилактики или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита.
Кроме того, данным изобретением предлагается применение везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas, для изготовления лекарственного средства, используемого для профилактики или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита.
Также данным изобретением предлагается композиция носителя лекарственного вещества, доставляющая лекарственное вещество в головной мозг (или композиция для доставки лекарственного вещества с целью лечения заболевания головного мозга), которая содержит в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas.
Также данным изобретением предлагается способ доставки лекарственного вещества для лечения заболевания головного мозга, который включает введение индивиду композиции, содержащей в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, которые несут лекарственное вещество для лечения данного заболевания головного мозга.
В дополнение к указанному данным изобретением предлагается применение везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, для доставки лекарственного вещества с целью лечения заболевания головного мозга.
В типичном воплощении данного изобретения указанные везикулы имеют диаметр в среднем 10 - 200 нм.
В другом типичном воплощении данного изобретения выделение указанных везикул из клеток бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, происходит естественным или искусственным путем.
В еще одном типичном воплощении данного изобретения выделение указанных везикул из клеток бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, осуществляется таким способом, как тепловая обработка бактерий и воздействие на них давлением.
В еще одном типичном воплощении данного изобретения везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, могут быть секретированы Sphingomonas paucimobilis.
В еще одном типичном воплощении данного изобретения везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, могут быть секретированы Sphingomonas koreensis.
Польза данного изобретения
Авторы данного изобретения показали, что в организме-хозяине всасываются не бактерии, а происходящие из них везикулы, которые проникают через эпителиальные клетки, распространяются кровотоком по всему телу и выделяются из него через почки, печень и легкие, и показали путем метагеномного анализа везикул, происходящих из бактерий, присутствующих в крови, что значительно снижено содержание везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, в крови и моче больных с циррозом печени, раком печени, инфарктом миокарда, почечной недостаточностью, диабетом, опухолями головного мозга, умеренными нарушениями когнитивных функций, деменцией, депрессией, аутизмом и атопическим дерматитом по сравнению со здоровыми индивидами. Также было обнаружено, что, если культивировать ex vivo бактерии, принадлежащих роду Sphingomonas, а именно Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis, и выделить их везикулы и добавить эти везикулы к клеткам воспаления ex vivo, то секреция медиаторов воспаления, вызываемая патогенными везикулами, значительно подавляется. Также было обнаружено, что везикулы Sphingomonas paucimobilis, будучи введены в организм перорально, попадают в головной мозг. Следовательно, везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, по данному изобретению можно использовать как средство для диагностирования цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита и как композицию для предотвращения, ослабления или лечения этих заболеваний, например, в виде косметического продукта, пищевого продукта или лекарственного препарата, а также везикулы по данному изобретению, как ожидается, можно использовать в качестве носителя лекарственного вещества для доставки его в головной мозг.
Описание иллюстраций
На фиг. 1A представлена серия фотографий, демонстрирующих изменение распределения в теле мыши бактерий и везикул, происходящих из бактерий, (EV) с течением времени после их перорального введения, и на фиг. 1B показан результат оценки in vivo профиля распределения бактерий и везикул, собранных из крови, почек, печени и различных органов через 12 часов после перорального введения бактерий и везикул.
На фиг. 2 представлен результат оценки относительно того, инфильтруются ли бактерии и везикулы, происходящие из бактерий, в эпителиальных клетках слизистой оболочки кишечника после введения бактерий и бактериальных везикул в кишечник мыши (Lu – просвет кишки, LP – собственная пластинка слизистой оболочки).
На фиг. 3 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови везикул, происходящих из бактерий, у больных с циррозом печени, больных раком печени и здоровых индивидов.
На фиг. 4 представлен результат сравнения распределения везикул бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови везикул, происходящих из бактерий, у больных с инфарктом миокарда и здоровых индивидов.
На фиг. 5 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови везикул, происходящих из бактерий, у больных с почечной недостаточностью и у здоровых индивидов.
На фиг. 6 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови везикул, происходящих из бактерий, у больных с диабетом и у здоровых индивидов.
На фиг. 7 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови везикул, происходящих из бактерий, у больных с опухолями мозга и у здоровых индивидов.
На фиг. 8 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови везикул, происходящих из бактерий, у больных с умеренными нарушениями когнитивных функций, у больных с деменцией при болезни Альцгеймера и у здоровых индивидов.
На фиг. 9 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови везикул, происходящих из бактерий, у больных с депрессией и у здоровых индивидов.
На фиг. 10 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в моче везикул, происходящих из бактерий, у больных с аутизмом и у здоровых индивидов.
На фиг. 11 представлен результат сравнения распределения везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после метагеномного анализа присутствующих в крови и моче везикул, происходящих из бактерий, у больных с атопическим дерматитом и у здоровых индивидов.
На фиг. 12 представлен результат оценки апоптоза после обработки макрофагов (клеток Raw264.7) везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis, чтобы оценить апоптический эффект везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis (EV, внеклеточная везикула).
На фиг. 13A и 13B представлен результат сравнения уровней секреции медиаторов воспаления, вызванной EV E. coli, которые являются патогенными везикулами, путем обработки макрофагов (клеток Raw264.7) везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis, чтобы оценить эффект везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis, на индукцию воспаления, фиг. 13А сравнивает уровни секреции IL-6, а на фиг. 13В сравнивает уровни секреции TNF-α (EV: внеклеточная везикула).
На фиг. 14A и 14B представлен результат оценки эффекта E. coli EV на секрецию воспалительных медиаторов после предварительной обработки везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis, произведенной до обработки E. coli EV, которые являются патогенными, чтобы оценить противовоспалительный эффект везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis, фиг. 14А сравнивает уровни секреции IL-6, фиг. 14В сравнивает уровни секреции TNF-α (SPC101, Sphingomonas paucimobilis EV; EV, внеклеточная везикула).
На фиг. 15A и 15B представлен результат оценки эффекта E. coli EV на секрецию воспалительных медиаторов после предварительной обработки везикулами, происходящими из Sphingomonas koreensi, произведенной до обработки E. coli EV, которые являются патогенными, чтобы оценить противовоспалительный эффект везикул, происходящих из Sphingomonas koreensis, фиг. 15А сравнивает уровни секреции IL-6, 15В сравнивает уровни секреции TNF-α (SPC102, Sphingomonas koreensis EV; EV, внеклеточная везикула).
На фиг. 16 представлена серия фотографий, демонстрирующая профиль распределения везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis, с течением времени после их перорального введения мышам.
На фиг. 17 представлена серия фотографий, демонстрирующая профиль распределения везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis, в ткани головного с течением времени после их перорального введения мышам.
Воплощения изобретения
Данное изобретение относится к везикулам, происходящим из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas, и к их применению.
Авторы настоящего изобретения за счет метагеномного анализа подтвердили, что содержание везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, было значительно уменьшено в образцах, полученных от больных с циррозом печени, раком печени, инфарктом миокарда, почечной недостаточностью, диабетом, опухолями головного мозга, умеренными нарушениями когнитивных функций, деменцией, депрессией, аутизмом и атопическим дерматитом по сравнению с образцами, полученным от здоровых индивидов, тем самым завершив основанное на этом настоящее изобретение.
Таким образом, данным изобретением предлагается способ диагностирования одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, или способ обеспечения информации для установления диагноза, который включает следующие этапы:
(a) выделение ДНК из везикул, полученных из образцов здорового индивида и субъекта;
(b) проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР ) с выделенной ДНК и парой праймеров, полученных на основе последовательности гена, имеющейся в 16S рДНК, для получения продуктов полимеразной цепной реакции; и
(c) идентификация случая, в котором содержание везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, ниже, чем у здорового индивида, как случая одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, путем количественного анализа продуктов полимеразной цепной реакции.
В настоящем документе термин «диагноз» относится к определению состояния или заболевания у данного индивида во всех отношениях, в широком смысле. В это определение входят сущность заболевания, его этиология, патогенез, степень тяжести, специфика и конкретная клиническая картина, наличие/отсутствие осложнений, прогноз и проч. Диагноз по данному изобретению означает установление того, является ли заболевание у данного индивида циррозом печени, раком печени, инфарктом миокарда, почечной недостаточностью, диабетом, опухолями головного мозга, умеренными нарушениями когнитивных функций, деменцией, депрессией, аутизмом или атопическим дерматитом, какова выраженность заболевания и проч.
Термин «нановезикула» или «везикула» в настоящем документе относится к структуре, состоящей из мембранного образования с нанометровыми размерами, которая секретируется различными бактериями. Везикулы, происходящие из грамотрицательных бактерий, или везикулы, образующиеся из наружной клеточной мембраны (OMV) содержат эндотоксины (липополисахариды) или гликосфинголипиды, токсичные белки и бактериальные нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК), а везикулы, происходящие из грамположительных бактерий, помимо белков и нуклеиновых кислот содержат также пептидогликаны или липотейхоевые кислоты, являющиеся компонентами клеточной стенки бактерий. В контексте данного изобретения нановезикулы/везикулы секретируются естественным путем бактериями, принадлежащими к роду Sphingomonas, или образуются искусственным путем в результате тепловой обработки бактерий, или воздействия на них давлением, или иных воздействий и имеют размеры от 10 нм до 200 нм.
Термин «метагеном» в настоящем документе относится также к микробиому и подразумевает совокупность геномов микроорганизмов, включая вирусы, бактерии, грибки и др., выделенные из области, например из почвы или кишечника животного, и, как правило, употребляется для геномной характеристики, позволяющей идентифицировать большое множество микроорганизмов одновременно с помощью секвенатора для анализа некультивируемых микроорганизмов. В частности, термин «метагеном» относится не к геному одного отдельно взятого вида, а к смешанному геному всех видов, обитающих в некоторой единице окружающей среды. О метагеноме говорят тогда, когда вид рассматривается в процессе развития, как это делается в тех областях биологии, название которых оканчивается на «-омика» (например, протеомика), то есть полная характеристика вида включает как его функциональную роль, так и взаимодействие с другими видами. Методологически метагеном является объектом исследования, дающего информацию о всех видах в данной единице окружающей среды, их взаимодействиях и метаболизме посредством анализа ДНК и РНК независимо от их видовой принадлежности с помощью методов быстрого секвенирования нуклеотидных последовательностей.
Везикулы можно выделить из культуральной среды, которая содержит бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, применяя один или более методов, выбираемых из группы, состоящей из центрифугирования, ультра- и высокоскоростного центрифугирования, воздействия высоким давлением, экструдирования, воздействия ультразвуком, лизиса клеток, гомогенизации, лиофилизации, электропорации, механического разрушения, химической обработки, фильтрации через фильтры/мембраны, гель-фильтрационной хроматографии, электрофореза в свободном потоке и капиллярного электрофореза. Кроме того, для удаления загрязнений и концентрирования полученных везикул можно дополнительно применять такой метод, как промывание.
Согласно данному изобретению образцом на этапе (а) может быть кровь или моча, но не ограничиваются ими.
Согласно данному изобретению парой праймеров на этапе (b) может быть пара праймеров, содержащих нуклеотидные последовательности, представленные в настоящем документе как SEQ ID No 1 и 2, но не ограничиваются ими.
В другом аспекте данного изобретения предлагается композиция для предотвращения, ослабления или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, которая содержит в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas.
Эта композиция представляет собой фармацевтическую, пищевую или косметическую композицию.
В другом аспекте данного изобретения предлагается способ профилактики или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, который включает этап введения индивиду композиции, содержащей в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas.
В другом аспекте данного изобретения предлагается применение везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, для профилактики или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита.
В другом аспекте данного изобретения предлагается применение композиции, содержащей в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, для профилактики или лечения одного или более заболеваний, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита.
В другом аспекте данного изобретения предлагается применение везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, для изготовления лекарственного средства, используемого при одном или более заболеваниях, выбираемых из группы, состоящей из цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита.
В другом аспекте данного изобретения предлагается способ доставки лекарственного вещества для лечения заболевания головного мозга, который включает введение индивиду композиции, содержащей в качестве активного ингредиента везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, которые несут лекарственное вещество для лечения данного заболевания головного мозга.
В другом аспекте данного изобретения предлагается применение везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, для доставки лекарственного вещества с целью лечения заболевания головного мозга.
Термин «предотвращение» в настоящем документе относится ко всем мероприятиям, подавляющим цирроз печени, рак печени, инфаркт миокарда, почечную недостаточность, диабет, опухоли головного мозга, умеренные нарушения когнитивных функций, деменцию, депрессию, аутизм, атопический дерматит и др., или задерживающим возникновение этих заболеваний путем введения в организм композиции по данному изобретению.
Термин «лечение» в настоящем документе относится ко всем мероприятиям, ослабляющим или изменяющим в положительную сторону симптомы цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма, атопического дерматита и др., путем введения в организм композиции по данному изобретению.
Термин «ослабление» в настоящем документе применительно к заболеваниям относится ко всем мероприятиям, которые по меньшей мере снижают значения показателей, связанных с подлежащим лечению состоянием, например, снижают выраженность/степень тяжести симптомов.
Термин «носитель лекарственного вещества» в настоящем документе относится ко всем средствам или действиям, которые служат для загрузки и доставки лекарственного вещества в составе композиции по данному изобретению, чтобы оно попало в определенный орган, ткань, клетку или клеточную органеллу.
В одном из воплощений данного изобретения мышам вводили перорально бактерии и бактериальные везикулы и наблюдали in vivo за профилями всасывания, распределения в организме и выведения из него бактерий и везикул, в результате чего было показано, что в то время как бактерии не проникают через слизистую оболочку кишечника, происходящие из бактерий везикулы всасываются за пять минут после перорального введения, распределяются с кровотоком по всему организму и выводятся из него через почки, печень и др. (см. пример 1).
В другом типичном воплощении данного изобретения определяли, проникают ли бактериальные клетки и везикулы, введенные прямо в кишечник, через защитную мембрану слизистой, и было установлено, что бактериальным клеткам не удается преодолеть защитную мембрану слизистой, тогда как везикулы, происходящие из бактерий, проникают через нее (см. Пример 2).
В еще одном типичном воплощении данного изобретения проводили метагеномный анализ бактерий, используя везикулы, выделенные из крови или мочи больных с циррозом печени, раком печени, инфарктом миокарда, почечной недостаточностью, диабетом, опухолями головного мозга, умеренными нарушениями когнитивных функций, деменцией, депрессией, аутизмом и атопическим дерматитом и здоровых индивидов, соответствующих больным по возрасту и полу. В итоге было показано, что содержание везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, в клинических образцах, взятых у больных с циррозом печени, раком печени, инфарктом миокарда, почечной недостаточностью, диабетом, опухолями головного мозга, умеренными нарушениями когнитивных функций, деменцией, депрессией, аутизмом и атопическим дерматитом, значительно ниже, чем в образцах от здоровых индивидов (см. Примеры 4 - 12).
В еще одном типичном воплощении данного изобретения оценивали влияние везикул, секретируемых бактериями Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis, на индукцию воспаления путем культивировали штаммов, и результатом сравнения уровней секреции медиаторов воспаления после обработки макрофагов указанными везикулами, происходящими из бактерий, в различных концентрациях и везикулами, происходящими из Escherichia coli, являющимися патогенными, была значительно уменьшенная секреция медиаторов воспаления, подлежащих секреции, вызванная везикулами, происходящими из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, по сравнению с секрецией IL-6 и TNF-α в случае везикул, происходящих из E. coli (см. пример 14).
В еще одном типичном воплощении данного изобретения определяли противовоспалительный эффект везикул, происходящих из бактерий Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis, и было показано, что если макрофаги обрабатывают везикулами Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis в различных концентрациях до обработки их везикулами, происходящими из E. coli, которые являются патогенными, то эффективно подавляется секреция IL-6 и TNF-α, вызываемая индуцирующими воспалительную реакцию везикулами, происходящими из E. coli (см. примеры 15 и 16).
В еще одном типичном воплощении данного изобретения было показано, что при пероральном введении везикул, происходящих из бактерий Sphingomonas paucimobilis, они через 1 час после введения распределяются в желудке, через 3 часа после введения – по тонкому кишечнику и толстой кишке, причем было показано, что указанное распределение в этих органах поддерживалось до 72 часов. Также было показано, что везикулы, происходящие из Sphingomonas paucimobilis, несущие флуоресцентную метку, по истечении 3 часов специфично перемещаются в головной мозг, и содержание их там нарастает до 32-го часа, а затем постепенно снижается до окончания 72-го часа (см. пример 17).
Фармацевтическая композиция по данному изобретению может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Этот фармацевтически приемлемый носитель является таким, который обычно применяют в лекарственных препаратах, и включает, не ограничиваясь перечисленным, физиологический раствор, стерильную воду, раствор Рингера, забуференный солевой раствор, циклодекстрин, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин, этиловый спирт, липосомы и проч., и при необходимости может также включать другие обычно используемые дополнительные компоненты, например, антиоксиданты и буфер. Кроме того, композиция может быть включена в состав препарата для введения путем инъекций, например, водный раствор, суспензию и эмульсию, пилюли, капсулы, гранулы или таблетки, для чего в нее добавляют дополнительно разбавитель, диспергирующий агент, поверхностно-активное вещество, связующий агент, агент, улучшающий скольжение, и проч. Что касается пригодных фармацевтически приемлемых носителей и составов, то каждый такой ингредиент вводят в состав композиции по данному изобретению предпочтительно методами, описанными в ремингтоновских фармацевтических руководствах. Лекарственная форма и состав композиции по данному изобретению как-либо конкретно не ограничены; она может представлять собой препарат для инъекций, для ингаляций, для наружного применения, для перорального приема и др.
Фармацевтическую композицию по данному изобретению могут вводить перорально или парентерально (например, внутривенно, подкожно, интрадермально) соответственно избранному пути и способу введения, а вводимая доза может варьироваться в зависимости от состояния пациента, его массы тела, степени тяжести заболевания, лекарственной формы композиции, пути и режима введения, и может быть адекватно подобрана специалистом в данной области техники.
Фармацевтическую композицию по данному изобретению вводят индивиду в фармацевтически эффективном количестве. Согласно данному изобретению термин «фармацевтически эффективное количество» относится к такому количеству композиции, которое достаточно для лечения заболеваний с разумным соотношением риск/польза, используемым при медикаментозном лечении; уровень эффективной дозировки определяют в зависимости от таких факторов, как характер данного заболевания, наличие других заболеваний у данного индивида, степень тяжести заболевания, активность лекарственного препарата, чувствительность индивида к лекарственному препарату, время и путь введения, скорость выведения препарата из организма, продолжительность лечения, принимаемые данным индивидом другие лекарственные препараты, и иных факторов, известных в других областях медицины. Композицию по данному изобретению вводят пациенту как отдельный терапевтический агент или в комбинации с другими терапевтическими агентами, одновременно или последовательно с этими другими препаратами в родственной области в виде единичной дозы или множества доз. Важно вводить композицию по данному изобретению в минимально возможном количестве, которое обеспечит максимально возможный эффект без каких-либо побочных явлений и с учетом указанных выше факторов, что без труда может определить рядовой специалист в данной области техники.
В частности, эффективное количество фармацевтической композиции по данному изобретению варьирует в зависимости от возраста, пола и массы тела индивида; оно может быть больше или меньше в зависимости от пути введения в организм, степени тучности индивида, его пола, массы тела, возраста и проч.
Пищевая композиция по данному изобретению включает функциональный оздоровительный продукт для питания. Пищевая композиция по данному изобретению используется путем добавления активного ингредиента к пищевому продукту или вместе с другими пищевыми продуктами или пищевыми ингредиентами; ее адекватное использование достигается обычными способами. Количество активного ингредиента, смешиваемого с пищевым продуктом, определяют в зависимости от целей применения – для предотвращения или для ослабления заболевания. Как правило, при изготовлении пищевого продукта, включая напитки, композицию по данному изобретению добавляют в него в количестве 15% (масса/масса) или меньше, предпочтительно 10% (масса/масса) или меньше относительно массы исходных материалов. Однако в случаях длительного приема в оздоровительных и гигиенических целях или для поддержания здорового состояния индивида это количество может быть меньше указанного.
Другие ингредиенты особо не ограничиваются, за тем исключением, что пищевая композиция по данному изобретению содержит в качестве основного компонента активный ингредиент в указанном относительном количестве, а также в качестве дополнительных ингредиентов различные ароматизирующие агенты, природные углеводы и прочие обычные компоненты напитков. Примеры упомянутых природных углеводов включают обычные сахара, например, моносахариды, например, глюкозу, фруктозу и др., дисахариды, например, мальтозу, сахарозу и др., полисахариды, например, декстрин, циклодекстрин и др., сахарные спирты, например, ксилит, сорбит, эритрит. Из числа агентов, придающих вкус и/или аромат, помимо описанных выше в композиции по данному изобретению предпочтительно использовать природные агенты (тауматин, экстракт стевии (например ребаудиозид А, глицирризин и др.) и синтетические (сахарин, аспартам и др). Относительное количество природных углеводов в композиции по данному изобретению может определить по своему выбору рядовой специалист в данной области техники.
Пищевая композиция по данному изобретению может дополнительно содержать различные питательные вещества, витамины и минеральные вещества (электролиты), природные и синтетические ароматизирующие агенты, красители и наполнители (сыр, шоколад и др.), пектиновые кислоты и их соли, альгиновые кислоты и их соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, агенты для подведения рН, стабилизирующие агенты, консерванты, глицерин, спирты, карбонизаторы (в газированных напитках) и др. Эти ингредиенты используются как по отдельности, так и в сочетаниях. Относительное количество таких добавок в композиции может подобрать рядовой специалист в данной области техники.
Косметическая композиция по данному изобретению может включать не только везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, но также ингредиенты, обычно используемые в косметических композициях, например такие привычные в косметике дополнительные компоненты, как антиоксиданты, стабилизирующие агенты, солюбилизирующие агенты, витамины, пигменты, продукты растительного происхождения и носители.
Дополнительно композиция по данному изобретению может включать помимо везикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, смесь органических веществ, защищающих от ультрафиолетового излучения, которые используются в тех пределах, в которых из-за взаимодействия с везикулами, происходящими из бактерий, не ухудшается защита кожи. Органические вещества, защищающие от ультрафиолетового излучения, в композиции по данному изобретению могут быть представлены одним или более агентам, выбираемыми из группы, состоящей из глицерил PABA, дрометризол-трисилоксана, дрометризола, дигаллоилтриолеата, дифенила натрия, дибензимидазол-тетрасульфоната, диэтилгексилбутамидотриазона, диэтиламиногидроксибензоилгексилбензоата, диэтаноламинметоксициннамата, смеси лавсона и дигидроксиацетона, метилен-бис-бензотриазолилтетраметилбутилфенола, 4-метилбензилидена камфоры, метилантранилата, бензофенона-3 (оксибензона), бензофенона-4, бензофенона-8 (диоксибензона), бутилметоксидибензоилметана, бис-этилгексилоксифенолметоксифенилтриазина, циноксата, этилдигидроксипропил PABA, октокрилена, этилгексилдиметил PABA, эилгексилметоксициннамата, этилгексисалицилата, этилгексилтриазона, изоамил-пара-метоксициннамата, полисиликона-15 (диметикодиэтилбензальмалоната), терефталилиден-дикамфора-сульфоновой кислоты (экамсула) и ее солей, триэтаноламина салицилата и пара-аминобензойной кислоты (PABA).
Примеры продуктов, в которые можно добавлять косметическую композицию по данному изобретению, включают такие косметические средства, как вяжущие средства, мягчительные средства для кожи, питательные тоники, различные кремы, эссенции, маски, тональные кремы, очищающие средства, в том числе, очищающие средства для лица, мыло, средства ухода, косметическая жидкость и проч. В частности, продукты, содержащие косметическую композицию по данному изобретению, включают лосьоны для кожи, мягчительные средства для кожи, тоники для кожи, вяжущие средства, лосьоны, косметическое молочко, увлажняющие лосьоны, питательные лосьоны, массажные кремы, питательные кремы, увлажняющие кремы, кремы для рук, эссенции, питательные эссенции, маски, мыло, шампуни, очищающую пену, очищающие лосьоны, очищающие кремы, лосьоны для тела, очищающие средства для детей, эмульсии, губную помаду, основы для макияжа, тональные кремы, компактную пудру, рассыпную пудру, тени для век и проч.
Далее в настоящем документе приводятся предпочтительные примеры, разъясняющие данное изобретение. Однако приведенные далее примеры служат лишь для облегчения понимания данного изобретения, и содержание настоящего изобретения не ограничивается представленными далее примерами.
Примеры
Пример 1. Анализ всасывания, распределения и выведения бактерий и происходящих из бактерий везикул in vivo
Чтобы определить, всасываются ли бактерии и происходящие из бактений везикулы в желудочно-кишечном тракте и попадают ли оттуда в кровь, был проведен следующий эксперимент. Мышам вводили через рот в желудок флуоресцентно меченные бактериальные клетки и везикулы, происходящие из бактерий, в дозе 50 мкг; через 0 минут, 5 минут, 3 часа, 6 часов и 12 часов измеряли флуоресценцию. Как можно видеть на изображения всего тела мыши, показанного на фиг. 1А, бактерии не проникали из пищеварительного тракта в кровоток, тогда как везикулы, происходящие из бактерий, всасывались и попадали в кровь через 5 минут после введения; через 3 часа после введения наблюдалась отчетливая флуоресценция в мочевом пузыре, откуда следует, что везикулы выводились из организма через мочевые пути. Также видно, что везикулы находились в организме вплоть до 12 часов после введения (смотри на фиг. 1А).
Чтобы выяснить распределение бактерий и происходящих из бактерий везикул из кровотока по различным органам, мышам вводили флуоресцентно меченные бактериальные клетки и везикулы, происходящие из бактерий в дозе 50 мкг, как описано выше, и через 12 часов после введения брали у них кровь, извлекали сердце, легкие, печень, почки, селезенку, жировую ткань и мышцы. Из результатов измеренной флуоресценции можно видеть, что везикулы, происходящие из бактерий, присутствовали в крови, сердце, легких, печени, селезенке, жировой ткани, мышцах и почках, а бактерии не были абсорбированы (смотри фиг.1В).
Пример 2. Оценка того, проникают ли бактерии и происходящие из бактерий везикулы через защитный барьер слизистой оболочки кишечника
Чтобы определить, проникают ли бактерии и происходящие из бактерий везикулы сквозь защитную мембрану слизистой в ткани, после введения непосредственно в кишечники бактерий и везикул, происходящих из бактерий оценивали иммуногистохимическим методом инфильтрацию в ткани кишечника сквозь защитную мембрану слизистой. Для определения присутствия бактерий и везикул в тканях слизистой получали и использовали направленные против бактерий и везикул антитела, конъюгированные с зеленым флуоресцентным белком (GFP), и после окрашивания 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) изучали под микроскопом.
Полученные результаты подтвердили, что бактерии не преодолевают защитную мембрану слизистой, в то время как везикулы, происходящие из бактерий, проникали через слизистую в ткани кишечника (смотри фиг.2).
Пример 3. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий, в клинических образцах
После помещения крови или мочи в пробирку объемом 10 мл и осаждения суспендированного материала путем центрифугирования (3,500 x g, 10 min, 4°C), только супернатант помещали в новую пробирку объемом 10 мл. После удаления бактерий и примесей с помощью фильтра на 0,22 мкм, их помещали в пробирку Centriprep (фильтр для центрифугирования на 50 кДа) и центрифугировали при 1500 х g и температуре 4°С в течение 15 минут, причем материал мельче 50 кДа отбрасывали, а остаток концентрировали до объема 10 мл. После повторного удаления бактерий и примесей с помощью фильтра на 0,22 мкм супернатант удаляли ультрацентрифугированием при 150 000 х g и температуре 4°C в течение 3 часов, используя ротор Type 90Ti, а собранный осадок растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS).
Внутреннюю ДНК экстрагировали из липидного окружения путем кипячения 100 мкл везикул, полученных методом, описанным выше, при 100°C и затем охлаждали на льду в течение 5 минут. А затем, чтобы удалить оставшийся суспендированный материал, ДНК центрифугировали при 10 000 х g и температуре 4°C в течение 30 минут, и собирали полученный супернатант. А количество ДНК определяли с помощью Nanodrop. Затем, чтобы определить, присутствует ли бактериальная ДНК в экстрагированной ДНК, проводили ПЦР с праймерами к 16S рДНК, представленными в таблице 1 ниже, и было показано, что в экстрагированных генах присутствуют гены, происходящие из бактерий.
Таблица 1
Праймер
Последовательность
SEQ ID No.
16S рДНК
16S_V3_F
5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3'
1
16S_V4_R
5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC
2
ДНК, экстрагированную, способом, описанным выше, амплифицировали, используя праймеры к 16S рДНК, а затем секвенировали (секвенатор MiSeq производства Illumina), причем полученные данные выгружали в стандартный файл формата потоковой диаграммы (SFF), причем файл SFF конвертировали в файл для последовательностей (.fasta), а файл оценки качества прочитанных нуклеотидов конвертировали с помощью программы GS FLX (v2.9), а затем подтверждали достоверность прочтений и исключали ту часть, для которых средняя точность определения нуклеотида для окна (20 пар оснований) была меньше 99% (оценка качества Phred <20). Для анализа оперативных таксономических единиц (OTU) проводили кластеризацию соответственно сходству последовательностей с использованием алгоритма UCLUST в USEARCH, причем кластеризацию родов, семейств, порядков, классов и типов делали на основании сходства нуклеотидных последовательностей на 94%, 90%, 85%, 80% и 75% соответственно, классифицировали на уровне типа, класса, порядка, семейства и рода каждую OTU, и бактерии при сходстве последовательностей 97% или больше идентифицировали на уровне рода, используя базу данных последовательностей РНК 16S (108 453 последовательности) BLASTN и GreenGenes (QIIME).  Пример 4. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий,
в крови индивидов с заболеванием печени
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови 97 больных с циррозом печени, 76 больных с раком печени и 171 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови больных с циррозом печени и раком печени значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 3).
Пример 5. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий,
в крови индивидов с инфарктом миокарда
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови 69 больных с инфарктом миокарда и 159 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови больных инфарктом миокарда значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 4).
Пример 6. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий, в крови индивидов с почечной недостаточностью
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови 36 больных с почечной недостаточностью и 72 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови больных с почечной недостаточностью значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 5).
Пример 7. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий,
в крови индивидов с диабетом
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови 81 больного с диабетом и 126 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови больных с диабетом значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 6).
Пример 8. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий, в крови индивидов с опухолями головного мозга
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови 80 больных с опухолями головного мозга и 121 здорового индивида, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови больных с опухолями головного мозга значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 7).
Пример 9. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий, в крови индивидов с умеренными нарушениями когнитивных функций и деменцией
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови 76 больных с умеренными нарушениями когнитивных функций, 70 больных с деменцией (болезнью Альцгеймера) и 146 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови больных с умеренными нарушениями когнитивных функций и деменцией (болезнью Альцгеймера) значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 8).
Пример 10. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий,
в крови индивидов с депрессией
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови 70 больных с депрессией и 140 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови больных с депрессией значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 9).
Пример 11. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий,
в моче индивидов с аутизмом
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа мочи 30 больных с аутизмом и 40 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в моче, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в моче больных с аутизмом значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 10).
Пример 12. Метагеномный анализ везикул, происходящих из бактерий,
в крови и моче индивидов с атопическим дерматитом
После проведенного с помощью способа, описанного в примере 3, метагеномного анализа крови и мочи от 61 больного с атопическим дерматитом и 52 здоровых индивидов, соответствовавших больным по возрасту и полу, используя экстракцию генов из везикул, присутствующих в крови и моче, оценивали распределение визикул, происходящих из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas. В результате установили, что содержание везикул, происходящих из тех, что принадлежат роду Sphingomonas, в крови и моче больных с атопическим дерматитом значительно ниже, чем у здоровых индивидов (смотри фиг. 11).
Пример 13. Выделение везикул из культуральной среды Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis
Исходя из описанных выше примеров, культивировали бактерии Sphingomonas paucimobilis и Sphingomonas koreensis, а затем выделили из них везикулы и характеристики выделенных везикул изучили. Штаммы культивировали в среде де Мана, Рогоссы и Шарпе (MRS) в инкубаторе при температуре 37°C до оптической плотности при 600 нм (OD 600) 1,0-1,5, а затем субкультивировали в среде Лурия-Бертани (LB). Затем супернатант культуры, включавший штамм извлекали и центрифугировали при 10 000 х g и температуре 4°С в течение 20 минут, и затем штамм удаляли и фильтровали с помощью фильтра на 0,22 мкм. Профильтрованный супернатант концентрировали до объема 50 мл или меньше, используя микрофильтрацию с помощью насосной установки MasterFlex (Cole-Parmer; США) и кассетного мембранного фильтра Pellicon 2 с порогом отсечения 100 кДа (Merck Millipore; США). Сконцентрированный супернатант еще раз пропускали через фильтр на 0,22 мкм. Затем в полученном материале определяли содержание белка методом с бицинхиноновой кислотой (BCA), и последующие эксперименты проводили с полученными везикулами.
Пример 14. Индукция воспаления везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis
Чтобы выяснить, как влияют везикулы, полученные из Sphingomonas paucimobilis (Sphingomonas paucimobilis EV, SPC101), на секрецию медиаторов воспаления (IL-6 и TNF-α) мышиными макрофагами линии Raw 264.7, эти клетки обрабатывали происходящими из Sphingomonas paucimobilis везикулами в различных концентрациях (0,1; 1 или 10 мкг/мл), после чего следовали апоптоз и ELISA.
4
А именно, в лунки 48-луночного культурального планшета вносили по 5 x 10 клеток Raw 264.7 и обрабатывали везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis, в различной концентрации, разведенными в бессывороточной среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM), и обработанные клетки культивировали в течение 12 часов. Затем определяли апоптоз, используя EZ-CYTOX (Dogen, Корея), причем среду, в которой культивировались клетки, собирали в пробирки объемом 1,5 мл и центрифугировали при 3,000 g в течение 5 минут, полученный супернатант извлекали и хранили при температуре -80°C, а затем проводили ELISA.
Для ELISA антитела для захвата разводили фосфатно-солевым раствором (PBS) и вносили аликвоты по 50 мкл в лунки 96-луночного полистиролового планшета соответственно рабочей концентрации и затем оставляли для протекания реакции на ночь при температуре 4°С. Затем промывали три раза по 100 мкл раствора PBSТ (PBS, содержащего 0,05% твин-20), и после этого вносили раствор RD (PBS, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA)) аликвотами по 100 мкл, блокировали при комнатной температуре в течение 1 часа, и затем вносили образец и стандарт аликвотами по 50 мкл соответственно концентрации и оставляли для протекания реакции на 2 часа при комнатной температуре. Затем образец и контроль промывали раствором PBST три раза по 100 мкл, а затем антитела для обнаружения разводили раствором RD и вносили разбавленный раствор аликвотами по 50 мкл соответственно рабочей концентрации и оставляли для протекания реакции на 2 часа при комнатной температуре. Затем промывали образец и контроль раствором PBST три раза по 100 мкл, и после этого пероксидазу хрена, конъюгированную со стрептавидином (HRP) (R&D Systems, США) разводили раствором RD в соотношении 1/40, и разведенный раствор вносили аликвотами по 50 мкл и оставляли для протекания реакции на 20 минут при комнатной температуре.
Наконец, промывали образец и контроль раствором PBST три раза по 100 мкл, вносили 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (TMB) (SurModics, США) аликвотами по 50 мкл и оставляли на 5-20 минут для появления окраски, для прекращения реакции прибавляли серную кислоту (1M) аликвотами по 50 мкл, и измеряли поглощение на длине волны 450 нм с помощью микропланшетного ридера SpectraMax M3 (Molecular Devices, США).
Как можно видеть из результатов, представленных на фиг. 12, при обработке везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis (SPC 101), апоптоз не наблюдался. Далее, результатами оценки профиля секреции медиаторов воспаления в клетках воспаления было показано, что секреция макрофагами таких медиаторов воспаления, как интерлейкин-6 (фиг. 13А) и TNF-α (фиг.13В) при обработке везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis (SPC 101), было значительно слабее, чем при обработке везикулами, происходящими из E. coli (E. coli EV 1 мкг/мл), служившими положительным контролем (смотри фиг. 13A и 13B).
Пример 15. Противовоспалительный эффект везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis
Чтобы оценить, исходя из результатов, полученных в Примере 14, противовоспалительное действие везикул из бактерий Sphingomonas paucimobilis, клетки мышиных линий макрофагов сначала обрабатывали везикулами, происходящими Sphingomonas paucimobilis (SPC 101), в различных концентрациях (0,1; 1 и 10 мкг/мл) в течение 12 часов, а затем эти клеточные линии были обработаны 1 мкг/мл везикул, происходящих из E.coli, которые представляют собой патогенный фактор, а затем через 12 часов измеряли секрецию цитокинов воспаления методом ELISA
Полученные результаты показали, что после обработки везикулами, происходящими из Sphingomonas paucimobilis, секреция макрофагами IL-6 (На фиг. 14A) и TNF-α (На фиг. 14B), вызванная везикулами, происходящими из E. coli, значительно снижена (фиг 14A и 14B).
Пример 16. Противовоспалительный эффект везикул, происходящих из Sphingomonas koreensis
Чтобы оценить, исходя из результатов, полученных в Примере 14, противовоспалительное действие везикул из других бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, после обработки клеток мышиных линий макрофагов обрабатывали везикулами, происходящими из Sphingomonas koreensis (SPC 102), в различных концентрациях (0,1; 1 и 10 мкг/мл) в течение 12 часов, эти клеточные линии обрабатывали 1 мкг/мл везикул, происходящих из E.coli, которые представляют собой патогенный фактор, а затем через 12 часов измеряли секрецию цитокинов воспаления методом ELISA
Полученные результаты показали, что после обработки везикулами, происходящими из Sphingomonas koreensis, секреция макрофагами IL-6 (фиг. 15A) и TNF-α (фиг. 15B), вызванная везикулами, происходящими из E. coli, значительно снижена (фиг. 15A и 15B).
Пример 17. Профиль распределение везикул, происходящих Sphingomonas paucimobilis
Чтобы установить картину абсорбции и распределения в органах везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis, с течением времени, был проведен следующий эксперимент. Вводили перорально 10 мкг флуоресцентно меченных везикул, происходящих из Sphingomonas paucimobilis, и через 1, 3, 6, 32, 48 и 72 часа, соответственно, после введения измеряли флуоресценцию. В результате измерения флуоресценции тела мыши было показано, что везикулы, происходящие из Sphingomonas paucimobilis, через 1 час после перорального введения распределяются в желудке и через 3 часа– в тонком кишечнике и толстой кишке, и было показано, что указанное распределение по органам сохраняется до 72 часов. (смотри фиг. 16).
Также было показано, что флуоресцентно меченные везикулы, происходящие из Sphingomonas paucimobilis, по истечении 3 часов после введения перемещаются специфически в головной мозг, и было показано, что степень распределения внеклеточных везикул, которые переместились в головной мозг увеличивалась вплоть до 32, а затем постепенно снижалась вплоть до 72-го часа (смотри фиг. 17).
Приведенное выше описание данного изобретения представлено в иллюстративных целях, и рядовым специалистам в данной области техники должно быть понятно, что в настоящее изобретение можно с легкостью вносить изменения, получая другие конкретные воплощения, не отклоняясь от технического существа и существенных признаков настоящего изобретения. Таким образом, следует учитывать, что описанные выше примеры являются лишь иллюстрацией изобретения и не ограничивают его объем.
Промышленная применимость изобретения
Показано, что везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas по данному изобретению, in vivo проникают через эпителиальные клетки, распределяются с кровотоком по всему организму и выводятся из него через почки, печень и легкие, и было показано, что содержание этих везикул в крови или моче больных с циррозом печени, раком печени, инфарктом миокарда, почечной недостаточностью, диабетом, опухолями головного мозга, умеренными нарушениями когнитивных функций, деменцией, депрессией, аутизмом и атопическим дерматитом значительно понижено, и секреция медиаторов воспаления, вызванная патогенными везикулами, может быть значительно подавлена благодаря везикулам, происходящим из бактерий, принадлежащих к роду Sphingomonas. Следовательно, можно ожидать, что везикулы, происходящие из бактерий, принадлежащих роду Sphingomonas, по данному изобретению имеют высокую промышленную применимость, поскольку могут использоваться в способе диагностирования цирроза печени, рака печени, инфаркта миокарда, почечной недостаточности, диабета, опухолей головного мозга, умеренных нарушений когнитивных функций, деменции, депрессии, аутизма и атопического дерматита, а также в качестве композиции для предотвращения, ослабления или лечения указанных заболеваний, которая может быть представлена косметическим, пищевым или фармацевтическим продуктом, и еще могут быть эффективно использованы в качестве средства доставки лекарственных веществ в головной мозг.