Галектин-3 модулирует продукцию цитокинов Th-лимфоцитами in vitro

«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017

Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya

ровали методом Сэнгера, при этом были получены отдельные сиквенсы генов иммуноглобулинов.

Выводы. Были отработаны некоторые этапы технологии получения человеческих моноклональных антител путем секвенирования генов иммуноглобулина из единичных клеток.

ГАЛЕКТИН-3 МОДУЛИРУЕТ ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ Th-ЛИМФОЦИТАМИ IN VITRO

Васильева О.А., Прохоренко Т.С., Зима А.П., Новицкий В.В.

ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, Томск, Россия

Введение. Галектин-3 функционирует как экстра-целлюлярная регуляторная молекула и принимает участие в активации различных типов клеток, таких как моноциты, макрофаги, тучные клетки, нейтрофилы и лимфоциты.

Цель. Оценить влияние рекомбинантного галектина-3 на продукцию профильных цитокинов Th-лимфоцитами здоровых доноров in vitro.

Материалы и методы. Исследование проведено на лимфоцитах, выделенных методом градиентного центрифугирования из крови здоровых доноров (n = 25), с дальнейшим культивированием в течение 72 ч в питательной среде с добавлением рекомбинантного галектина-3 в дозах 0,5 и 1 мкг/мл (R&D, США). Для создания in vitro условий, близких к естественным, использовали моно-клональные активирующие антитела — анти-CD3/анти-CD28 (BD Pharmingen™, США). За 4 ч до окончания инкубации к клеткам добавляли стимуляторы синтеза цитокинов ФМА (50 нг/мл) и кальция иономицин (1 мкг/мл). Определение уровня продукции интерлейкинов (IL) 17А, IL-10, интерферона (IFN) у и IL-13, IL-22, TGF-Pp TNFa в культуральных супернатантах осуществляли методом твердофазного иммуноферментного анализа типа «сэндвич» согласно протоколам фирмы-производителя (R&D, США).

Результаты. Установлено, что при действии галек-тина-3 на лимфоциты здоровых доноров концентрация Thl-цитокинов — IFNy и TNFa — достоверно увеличивалась относительно соответствующих значений в контрольной группе. Стимулирующее влияние отмечалось при исследовании влияния галектина-3 на продукцию IL-13, свойственного 1Ь2-лимфоцитам. При анализе влияния галектина-3 на Th-17 лимфоциты регистрировалось статистически значимое повышение концентрации профильных цитокинов — IL-17A и IL-22 (при дозе галектина-3 0,5 мкг/мл). Увеличение дозы данного лек-тина до 1 мкг/мл приводило к снижению концентрации IL-17 и IL-22 относительно значений соответствующих показателей в культуре с меньшей концентрацией галек-тина-3 и было достоверно ниже значений в контрольной группе (только для IL-17). Влияние галектина-3 на функциональную активность субпопуляции Т-регуляторных лимфоцитов проводили путем анализа продукции IL-10 и TGF-P1. В результате экспериментов наблюдалось достоверное уменьшение концентрации IL10 и TGF-P1 относительно значений данных показателей в группе контроля.

Заключение. Проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что влияние рекомбинантного галектина-3 является дозозависимым, и с увеличением его концентрации до 1 мкг/мл степень стимулирующего влияния на Th-лимфоциты становится менее выраженной, и преоб-

ладает ингибирующее действие на лимфоциты, что может быть обусловлено активацией апоптотической гибели клеток.

Исследование выполнено при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации (№ НШ-7906.2016.7, МД-3455.2017.7).

Breg ПРИ ГУМОРАЛЬНОМ ИММУННОМ ОТВЕТЕ

Гаврилова М.В., Чернышова И.Н., Снегирева Н.А.

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», Москва, Россия

Введение. В последние годы выяснилось, что В-клетки, также как и Т-лимфоциты, обладают регуля-торными функциями. В основном их роль сводится к угнетению воспалительных и аутоиммунных процессов. Влияние регуляторных В-клеток (Breg) на патологические процессы, главным образом, обусловлено синтезируемым ими IL-10. Основным источником Breg являются, по-видимому, В1-лимфоциты. Роль Breg в развитии гуморального иммунного ответа практически не изучена. Исследования такого рода удобно проводить в системе in vitro. Ранее нами была разработана модельная система, позволяющая использовать минимальное количество В1-лимфоцитов при изучении их взаимодействий с другими клетками in vitro. В этой системе в качестве клеток-«филлеров» используются спленоциты XID-мышей CBA/N, не имеющих В1-клеток. С другой стороны, адоптивный перенос Breg мышей линии СВА мышам конген-ной линии CBA/N позволяет исследовать влияние этих клеток на гуморальный иммунный ответ in vivo.

Цель. Изучение роли Breg в гуморальном иммунном ответе. В задачи исследования входило: определение влияния Breg на иммунный ответ субпопуляций В-лимфоцитов на Т-зависимый антиген (ТЗ АГ) в модельной системе in vitro и на модели адоптивного переноса in vivo.

Материалы и методы. В1-лимфоциты выделяли из перитонеальной полости, В2 — из селезенки мышей линии СВА методом иммуномагнитной сепарации. При культивировании in vitro В1- и В2-клетки смешивали со спленоцитами линии мышей CBA/N в соотношении 1:9 соответственно. Breg выделяли из перитонеальной полости мышей линии СВА с использованием Regulatory B cell isolation kit. Методом проточной цитометрии было определено, что > 90% Breg синтезировало IL-10. Контрольные В-лимфоциты (Вконтр), получали так же, как и Breg, за исключением добавления активаторов. Вконтр содержали не более 4% синтезирующих IL-10 В-клеток. В качестве ТЗ АГ использовали водорастворимый антиген бараньих эритроцитов (ВРАБЭ), который добавляли в конечной концентрации 25 мкг/мл. Для раздельного культивирования Breg использовали мембранные вставки с полупроницаемой мембраной. Breg или Вконтр вносили в верхнюю камеру в количестве 1 х 106, в нижнюю помещали 5 х 106 клеток смешанных культур. Клетки инкубировали в полной среде в СО2-инкубаторе при 37 °С в течение 4 дней с АГ или без него. Функциональную активность В-лимфоцитов оценивали по числу АТ-и ИГ-образующих клеток (АОК и ИГОК соответственно) в культурах методом ELISPOT.

В опытах in vivo Breg вводили конгенным XID-мышам линии CBA/N по 1,5 млн внутривенно (в/в). Одновременно мышей иммунизировали в/в ВРАБЭ в дозе 50 мкг/мышь. В качестве контроля использовали нормальных мышей линии CBA/N и мышей CBA/N, получивших Вконтр и ВРАБЭ, и только Вконтр. На 4-й день