АНТИТЕЛА К LAG3
ANTIBODIES TO LAG3

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителам к LAG3, способам получения указанных молекул и способам их применения.
Предпосылки создания изобретения
+
Ген активации лимфоцитов 3 (LAG3 или CD223) первоначально был открыт в эксперименте, запланированном для избирательного выделения молекул, экспрессируемых в IL-2-зависимой линии NK-клеток (Triebel F. и др., Cancer Lett. 235, 2006, сс. 147-153). LAG-3 представляет собой уникальный трансмембранный белок, структурно гомологичный CD4 с четырьмя внеклеточными доменами, подобными доменам суперсемейства иммуноглобулинов (D1-D4). Дистальный относительно мембраны домен IgG содержит короткую аминокислотную последовательность, так называемую дополнительную петлю, которая не обнаружена у других белков суперсемейства IgG. Внутриклеточный домен содержит уникальную аминокислотную последовательность (KIEELE), которая требуется для того, чтобы LAG-3 оказывал отрицательное воздействие на Т-клеточную функцию. LAG-3 может расщепляться металлопротеазами в соединительном пептиде (CP) с образованием растворимой формы, которая поддается обнаружению в сыворотке. Подобно CD4 белок LAG3 связывается с молекулами ГКГС класса II, но с более высокой аффинностью и в сайте, отличном от сайта связывания CD4 (Huard и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 1997, сс. 5744-5749). LAG3 экспрессируется Т-клетками, В-клетками, NK-клетками и плазмацитоидными дендритными клетками (pDC) и подвергается повышающей регуляции после активации Т-клеток. Он модулирует Т-клеточную функцию, а также гомеостаз Т-клеток. Субпопуляции обычных Т-клеток, которые являются анергичными или имеют нарушенные функции, экспрессируют LAG3. Обогащение LAG3 Т-клетками имеет место в областях опухолей и при хронических вирусных инфекциях (Sierro и др., Expert Opin. Ther. Targets 15, 2011, сс. 91-101). Было продемонстрировано, что LAG3 участвует в истощении CD8 Т-клеток (Blackburn и др., Nature Immunol. 10, 2009, сс. 29-37). Таким образом, существует необходимость в антителах, которые обладают антагонистическим действием в отношении активности LAG3 и которые можно применять для вызывания и восстановления иммунных ответов на опухоли.
Моноклональные антитела к LAG3 описаны, например, в WO 2004/078928, в которой заявлены композиция, содержащая антитела, специфически связывающиеся с CD223, и противораковая вакцина. В WO 2010/019570 описаны человеческие антитела, которые связываются с LAG3, например, антитела 25F7 и 26Н10. В US 2011/070238 представлено цитотоксическое антитело к LAG3, которое можно применять для лечения или предупреждения отторжения трансплантата органа и аутоиммунного заболевания. В WO 2014/008218 описаны антитела к LAG3, обладающие оптимизированными функциональными свойствами (а именно, уменьшенным количеством сайтов дезамидирования) по сравнению с антителом 25F7. Кроме того, антитела к LAG3 описаны в WO 2015/138920 (например, ВАР050), WO 2014/140180, WO 2015/116539, WO 2016/028672, WO 2016/126858, WO 2016/200782 и WO 2017/015560.
Краткое изложение сущности изобретения
В изобретении предложены антитела к LAG3 и способы их применения.
В изобретении предложено выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело содержит
A) (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и (е) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; или
Б) (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (e) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; или
В) (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (е) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; или
Г) (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; и (е) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; или
Д) (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37; и (е) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
В изобретении предложено также выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело содержит
А) (а) VH-домен, который содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3; и (б) VL-домен, который содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; или
Б) (а) VH-домен, который содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11; и (б) VL-домен, который содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; или
В) (а) VH-домен, который содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11; и (б) VL-домен, который содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; или
Г) (а) VH-домен, который содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 27; и (б) VL-домен, который содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; или
Д) (а) VH-домен, который содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 35; и (б) VL-домен, который содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37 и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
В изобретении предложено также выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело
I) содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 7 и VL-последовательность SEQ ID NO: 8;
II) содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 15 и VL-последовательность SEQ ID NO: 16;
III) содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 23 и VL-последовательность SEQ ID NO: 24;
IV) содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 31 и VL-последовательность SEQ ID NO: 32; или
V) содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 39 и VL-последовательность SEQ ID NO: 40.
В изобретении предложено также выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело:
I) конкурирует за связывание с LAG3 с антителом к LAG3, которое содержит VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и/или
II) связывается с LAG3 человека и обезьян циномолгус; и/или
III) ингибирует связывание молекул ГКГС-II, экспрессируемых на человеческих опухолевых клетках А375; и/или
IV) повышает высвобождение гранзима В или IL-2 по данным анализа реакции смешанных лимфоцитов (mMLR).
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3, предлагаемое в изобретении, представляет собой моноклональное антитело.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3, предлагаемое в изобретении, представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3, предлагаемое в изобретении, представляет собой фрагмент антитела, который связывается с LAG3.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3, предлагаемое в изобретении, представляет собой Fab-фрагмент.
В изобретении предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по одному из указанных выше пунктов.
В изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая указанную нуклеиновую кислоту.
В изобретении предложен способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина таким образом, чтобы продуцировалось антитело.
В изобретении предложен указанный способ получения антитела, дополнительно включающий выделение антитела из клетки-хозяина.
В изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая представленное в настоящем описании антитело и фармацевтически приемлемый носитель.
В изобретении предложено антитело, представленное в настоящем описании, предназначенное для применения в качестве лекарственного средства.
В изобретении предложено антитело, представленное в настоящем описании, предназначенное для применения для лечения рака.
В изобретении предложено применение антитела, представленного в настоящем описании, для приготовления лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для лечения рака, для лечения или замедления прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания, такого как опухолевый иммунитет, или для стимуляции иммунного ответа или функции, такой как Т-клеточная активность.
В изобретении предложен способ лечения индивидуума, имеющего рак, включающий введение индивидууму в эффективном количестве антитела, представленного в настоящем описании.
Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, обладают ценными свойствами, заключающимися в индукции высвобождения гранзима В, высвобождения IFN-γ и секреции IL-2 человеческими CD4 Т-клетками, и поэтому они могут стимулировать иммунный ответ посредством Т-клеток (повышенные специфические в отношении опухолевого антигена Т-клеточные эффекторные функции) либо индивидуально, либо в комбинации с ингибиторами PD1.
Краткое описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 воздействие антител к LAG-3 на высвобождение цитотоксического гранзима В и секрецию IL-2 человеческими CD4 Т-клетками, совместно культивируемыми с аллогенными зрелыми дендритными клетками:
фиг. 1А: секреция гранзима В,
фиг. 1Б: секреция IL-2;
на фиг. 2 - воздействие антител к LAG-3 на высвобождение цитотоксического гранзима В человеческими CD4 Т-клетками, совместно культивируемыми с линией лимфобластоидных В-клеток (ARH77);
на фиг. 3 - воздействие антител к LAG-3 на обусловленную Treg супрессию высвобождения гранзима В и IFN-γ человеческими CD4 Т-клетками, совместно культивируемыми с облученными аллогенными РВМС:
фиг. 3А: высвобождение гранзима В,
фиг. 3Б: высвобождение IFN-γ.
Подробное описание изобретения
В контексте настоящего описания понятие «акцепторный человеческий каркасный участок» представляет собой каркасный участок, содержащий аминокислотную последовательность каркасного участка вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасного участка вариабельного домена тяжелой цепи (VH), происходящую из каркасного участка человеческого иммуноглобулина или человеческого консенсусного каркасного участка, указанного ниже. Акцепторный человеческий каркасный участок, «происходящий из» каркасного участка человеческого иммуноглобулина или человеческого консенсусного каркасного участка, может содержать ту же самую их аминокислотную последовательность или он может содержать изменения в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество аминокислотных изменений составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2 или менее. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность акцепторного человеческого каркасного участка VL идентична последовательности каркасного участка VL человеческого иммуноглобулина или последовательности человеческого консенсусного каркасного участка.
D
Понятие «аффинность» или «аффинность связывания» относится к суммарной силе всех нековалентных взаимодействий между индивидуальным сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнера по связыванию (например, антигена). Если не указано иное, то в контексте настоящего описания понятие «аффинность связывания» относится к присущей компонентам связывающейся пары (например, антителу и антигену) аффинности связывания, отражающей взаимодействие по типу 1:1. Аффинность молекулы X к ее партнеру Y можно, как правило, характеризовать с помощью константы диссоциации (K). Аффинность можно оценивать общепринятыми методами, известными в данной области, включая представленные в настоящем описании методы. Ниже описаны конкретные представленные для иллюстрации и в качестве примеров варианты методов измерения аффинности связывания.
Антитело «с созревшей аффинностью» относится к антителу с одним или несколькими изменениями в одном или нескольких гипервариабельных участках (HVR) по сравнению с родительским антителом, которое не несет указанных изменений, указанные изменения приводят к повышению аффинности антитела к антигену.
Понятие «LAG3» в контексте настоящего описания относится к любому нативному LAG3 из любого служащего в качестве источника позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человека), и грызунов (например, мышей и крыс), если не указано иное. Понятие включает «полноразмерный» непроцессированный LAG3, а также любую форму LAG3, образующуюся в результате процессинга в клетке. Под понятие подпадают также встречающиеся в естественных условиях варианты LAG3, например, сплайсинговые варианты или аллельные варианты. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения понятие «LAG3», относится к человеческому LAG3. Аминокислотная последовательность приведенного в качестве примера процессированного (без сигнальных последовательностей) LAG3 представлена в SEQ ID NO: 54. Аминокислотная последовательность приведенного в качестве примера внеклеточного домена (ECD) LAG3 представлена в SEQ ID NO: 55.
D
D
D
D
-8
-8
-13
-9
-13
-8
-9
-9
-13
Понятия «антитело к LAG3» и «антитело, которое связывается с LAG3», относятся к антителу, которое обладает способностью связываться с LAG3 с аффинностью, достаточной для того, чтобы антитело можно было применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента для таргетирования LAG3. В одном из вариантов осуществления изобретения уровень связывания антитела к LAG3 с неродственным отличным от LAG3 белком составляет менее чем примерно 10% от уровня связывания антитела с LAG3 по данным измерений, например, с помощью радиоиммунноанализа (РИА). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, которое связывается с LAG3, характеризуется величиной константы диссоциации (K), составляющей ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ или ≤ 0,001 нМ (например, 10 М или менее, например, от 10 М до 10 М, например, от 10 М до 10 М). В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело к LAG3 связывается с эпитопом LAG3, который является консервативным среди LAG3 из различных видов. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения понятия «антитело к LAG3», «антитело, которое специфически связывается с человеческим LAG3» и «антитело, которое связывается с человеческим LAG3» относятся к антителу, которое специфически связывается с человеческим антигеном LAG3 или с его внеклеточным доменом (ECD) с аффинностью связывания, характеризующейся величиной K, составляющей 1,0×10 молей/л или ниже, в одном из вариантов осуществления изобретения величиной K, составляющей 1,0×10 молей/л или менее, в одном из вариантов осуществления изобретения величиной K, составляющей от 1,0×10 молей/л до от 1,0×10 молей/л. В этом контексте аффинность связывания определяют с помощью стандартного анализа связывания, такого как метод поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore, фирма GE-Healthcare, Уппсала, Швеция), например, с использованием внеклеточного домена LAG3.
В контексте настоящего описания понятие «антитело» используется в его наиболее широком смысле, и оно относится к различным структурам антител, включая (но, не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.
2
Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, обладающую способностью связываться с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примерами фрагментов антител являются (но, не ограничиваясь только ими) Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'), димерные антитела (диабоди), линейные антитела: одноцепочечные молекулы антител (например, scFv); и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
Понятие «эпитоп» обозначает сайт на антигене, либо белковый, либо небелковый, с которым связывается антитело к LAG3. Эпитопы могут быть образованы либо смежными аминокислотными сегментами (линейный эпитоп), либо могут содержать не являющиеся смежными аминокислоты (конформационный эпитоп), например, становящиеся пространственно близкими в результате фолдинга антигена, т.е. при образовании третичной структуры в результате фолдинга белкового антигена. Линейные эпитопы после контакта белкового антигена с денатурирующими агентами, как правило, все еще остаются связанными с антителом к LAG3, в то время как конформационные эпитопы, как правило, разрушаются при обработке денатурирующими агентами. Эпитоп содержит по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.
Скрининг в отношении связывания антител с конкретным эпитопом (т.е. антител, связывающихся с одним и тем же эпитопом) можно осуществлять с помощью методов, которые являются стандартными в данной области, такими, например, как (но, не ограничиваясь только ими) сканирование аланином, пептидные блоты (см. Meth. Mol. Biol. 248, 2004, сс. 443-463), анализ расщепления пептидов, вырезание эпитопа, экстракция эпитопа, химическая модификация антигенов (см. Prot. Sci. 9, 2000, сс. 487-496) и перекрестное блокирование (см. Harlow и Lane, «Antibodies», изд-во Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY).
Метод профилирования антител на основе структуры антигена (Antigen Structure-based Antibody Profiling, ASAP), известный также как профилирование с использованием модификации (Modification-Assisted Profiling, MAP), позволяет группировать (распределять по «корзинам») множество моноклональных антител, специфически связывающихся с LAG3, на основе профиля связывания каждого из множества антител с химически или ферментативно модифицированными поверхностями антигена (см., например, US 2004/0101920). Антитела в каждой группе связываются с одним и тем же эпитопом, который может либо представлять собой уникальный эпитоп, четко отличный от эпитопа, соответствующего другой группе, либо частично перекрываться с ним.
Для определения того, связывается ли антитело с тем же самым эпитопом LAG3, что и референс-антитело к LAG3, или конкурирует с ним за связывание, можно применять также анализ связывания в условиях конкуренции. Например, выражение «антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом», что и референс-антитело к LAG3, относится к антителу, которое по данным анализа в условиях конкуренции блокирует связывание референс-антитела к LAG3 с его антигеном на 50% или более, и наоборот, референс-антитело по данным анализа в условиях конкуренции блокирует связывание антитела с его антигеном на 50% или более. Также, например, для определения того, связывается ли антитело с тем же самым эпитопом, что и референс-антитело к LAG3, референс-антителу дают возможность связываться с LAG3 в насыщающих условиях. После удаления избытка референс-антитела к LAG3 оценивают способность рассматриваемого антитела к LAG3 к связыванию с LAG3. Если антитело к LAG3 обладает способностью к связыванию с LAG3, то можно сделать вывод о том, что рассматриваемое антитело к LAG3 связывается с эпитопом, отличным оттого, с которым связывается референс-антитело к LAG3. Однако, если рассматриваемое антитело к LAG3 не может связываться с LAG3 после связывания референс-антитела к LAG3 в насыщающих условиях, то это означает, что рассматриваемое антитело к LAG3 может связываться с тем же самым эпитопом, с которым связывается референс-антитело к LAG3. Для подтверждения того, связывается ли рассматриваемое антитело с тем же самым эпитопом или связывание затруднено по стерическим причинам, можно проводить стандартные эксперименты (например, осуществлять пептидные мутации и анализы связывания методами ELISA, РИА, поверхностного плазмонного резонанса, проточной цитометрии или любой количественный или качественный анализ связывания антитела, применимый в данной области). Этот анализ следует осуществлять в двух условиях, а именно, когда каждое из обоих антител применяют в качестве насыщающего антитела. Если в обоих условиях только первое (насыщающее) антитело может связываться с LAG3, то это позволяет сделать вывод о том, что рассматриваемое антитело к LAG3 и референс-антитело к LAG3 конкурируют за связывание с LAG3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения считается, что два антитела связываются с одним и тем же или с перекрывающим эпитопом, если 1-, 5-, 10-, 20- или 100-кратный избыток одного антитела ингибирует связывание другого по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 90% или даже на 99% или более по данным анализа связывания в условиях конкуренции (см., например, Junghans и др., Cancer Res. 50, 1990, сс. 1495-1502).
В некоторых вариантах осуществления изобретения считается, что два антитела связываются с одним и тем же эпитопом, если практически все аминокислотные мутации в антигене, которые снижают или элиминируют связывание одного антитела, приводят также к снижению или элиминированию связывания другого. Считается, что два антитела имеют «перекрывающиеся эпитопы», если только поднабор аминокислотных мутаций, которые снижают или элиминируют связывание одного антитела, приводит к снижению или элиминированию связывания другого.
Понятие «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из конкретного источника или конкретного вида, а остальная часть тяжелой и/или легкой цепи происходит из другого источника или другого вида.
1
2
3
4
1
2
Понятие «класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, входящего/входящей в тяжелую цепь. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы), например, IgG, IgG, IgG, IgG, IgA и IgA. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело имеет IgG4-изотип с мутацией S228P в шарнирной области для повышения стабильности антитела IgG4-изотипа. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно.
211
131
125
90
186
188
153
212
32
212
В контексте настоящего описания понятие «цитотоксический агент» относится к субстанции, которая ингибирует или препятствует клеточной функции и/или вызывает гибель или деструкцию клетки. Цитотоксические агенты включают (но, не ограничиваясь только ими) радиоактивные изотопы (например, At, I, I, Y, Re, Re, Sm, Bi, P, Pb и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарственные средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); ингибирующие рост агенты; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или обладающие ферментативной активностью токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты; и различные противоопухолевые или противораковые агенты, описанные ниже.
Понятие «эффекторные функции» относится к видам биологической активности, присущим Fc-области антитела, которые варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание с C1q и комплементзависимую цитотоксичность (CDC), связывание с Fc-рецептором, антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора) и активацию В-клеток.
Понятие «эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному при применении в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата.
Понятие «Fc-область» в контексте настоящего описания относится к С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Понятие включает имеющие нативную последовательность Fc-области и варианты Fc-областей. В одном из вариантов осуществления изобретения Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако С-концевой лизин (Lys447) Fc-области может либо присутствовать, либо отсутствовать. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3, указанное в настоящем описании, представляет собой антитело IgG1-изотипа и содержит константный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 52. В одном из вариантов осуществления изобретения оно дополнительно содержит С-концевой лизин (Lys447). В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3, указанное в настоящем описании, представляет собой антитело IgG4-изотипа и содержит константный домен тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 53. В одном из вариантов осуществления изобретения оно дополнительно содержит С-концевой лизин (Lys447). Если в настоящем описании не указано иное, то нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или в константной области соответствует системе нумерации EU, которую называют также EU-индексом, который описан у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-e изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
Понятие «каркасный участок» или «FR» относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельного участка (HVR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности HVR и FR, как правило, располагаются в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Понятия «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, практически сходную с нативной структурой антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат Fc-область, указанную в настоящем описании.
В контексте настоящего описания понятия «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые интродуцирована экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство указанных клеток. К клеткам-хозяевам относятся «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первичную трансформированную клетку, а также потомство, выведенное из нее, независимо от количества пересевов. Потомство может не быть строго идентичным родительской клетке по составу нуклеиновых кислот, а может нести мутации. Под данное понятие подпадает мутантное потомство, которое обладает такой же функцией или биологической активностью, что и отобранная путем скрининга или селекции исходная трансформированная клетка.
«Человеческое антитело» представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком или человеческой клеткой, или полученную из источника, отличного от человека, с использованием спектра человеческих антител или других кодирующих человеческое антитело последовательностей. Из указанного определения человеческого антитела специально исключено гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки. В некоторых вариантах осуществления изобретения человеческое антитело получают из трансгенного млекопитающего кроме человека, например, мыши, крысы или кролика. В некоторых вариантах осуществления изобретения человеческое антитело получают с использованием клеточной линии гибридомы.
«Человеческий консенсусный каркасный участок» представляет собой каркасный участок, который содержит наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в отобранных последовательностях каркасных участков VL или VH человеческого иммуноглобулина. Как правило, отобранные последовательности каркасных участков VL или VH человеческого иммуноглобулина выбраны из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, описанную у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд, изд-во NIH Publication, 91-3242, Bethesda MD, 1991, т.т. 1-3. В одном из вариантов осуществления изобретения для VL подгруппа представляет собой подгруппу каппа I, описанную у Kabat и др., выше. В одном из вариантов осуществления изобретения для VH подгруппа представляет собой подгруппу III, описанную у Kabat и др., выше.
Понятие «гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, которое содержит аминокислотные остатки из нечеловеческих HVR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело может содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все HVR (например, CDR) соответствуют участкам нечеловеческого антитела, а все или практически все FR соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, происходящей из человеческого антитела. Понятие «гуманизированная форма» антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое подвергали гуманизации.
Понятие «гипервариабельный участок» или «HVR» в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, последовательности которых являются гипервариабельными («определяющие комплементарность участки» или «CDR») и/или формируют петли определенной структуры («гипервариабельные петли»), и/или содержат контактирующие с антигеном остатки («контакты с антигеном»). Как правило, антитела содержат шесть HVR; три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3).
Примеры HVR включают:
(а) гипервариабельные петли, включающие аминокислотные остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917);
(б) CDR, включающие аминокислотные остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (Н3) (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, публикация NIH 91-3242);
(в) области контакта с антигеном, включающие аминокислотные остатки 27с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum и др., J. Mol. Biol. 262, 1996, сс. 732-745); и
(г) комбинации остатков, указанных в подпунктах (а), (б) и/или (в), включающие аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (Н2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).
В одном из вариантов осуществления изобретения остатки HVR содержат остатки, указанные ниже в разделе «Описание аминокислотных последовательностей».
Если не указано иное, то HVR-остатки и другие остатки в вариабельном домене (например, FR-остатки) нумеруют в настоящем описании согласно Kabat и др., выше.
«Иммуноконъюгат» представляет собой антитело, конъюгированное с одной или несколькими гетерологичной(ными) молекулой(ами), включая (но, не ограничиваясь только им) цитотоксический агент.
«Индивидуум» или «субъект» представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают (но, не ограничиваясь только ими) одомашненных животных (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматов (например, люди и приматы кроме человека, такие как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мыши и крысы). В некоторых вариантах осуществления изобретения индивидуум или субъект представляет собой человека.
«Выделенное» антитело представляет собой антитело, отделенное от компонента его естественного окружения. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело очищают до чистоты, превышающей 95% или 99% по данным, например, электрофоретических анализов (например, ДСН-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), капиллярный электрофорез) или хроматографических анализов (например, как ионообменная хроматография или ЖХВР с обращенной фазой). Обзор методов оценки чистоты антител см., например, у Flatman и др., J. Chrom. В, 848, 2007, сс. 79-87.
Понятие «выделенная» нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, отделенной от компонента ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или в положении на хромосоме, отличном от ее естественного положения на хромосоме.
Понятие «выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к LAG3» относится к одной или нескольким молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая такую(ие) молекулу(ы), присутствующую(ие) в одном векторе или отдельных векторах, и такую(ие) молекулу(ы), присутствующую(ие) в одном или нескольких положениях в клетке-хозяине.
Понятие «моноклональное антитело» в контексте настоящего описания относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, входящие в популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих мутации, встречающиеся в естественных условиях или возникающие в процессе производства препарата моноклонального антитела, указанные варианты, как правило, присутствуют в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело из препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, прилагательное «моноклональный» относится к характеристике антитела, указывающей на получение из практически гомогенной популяции антител, и его не следует рассматривать как требование, ограничивающее получение антитела с помощью какого-либо конкретного метода. Например, моноклональные антитела, предназначенные для применения согласно настоящему изобретению, можно получать различными методиками, включая (но, не ограничиваясь только ими) метод гибридом, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы, включающие применение трансгенных животных, содержащих все локусы человеческого иммуноглобулина или их часть, указанные методы и другие, приведенные в качестве примера методы создания моноклональных антител, представлены в настоящем описании.
Понятие «голое антитело» относится к антителу, не конъюгированному с гетерологичным фрагментом (например, цитотоксическим фрагментом) или с радиоактивной меткой. Голое антитело может присутствовать в фармацевтической композиции.
Понятие «Нативные антитела» относится к встречающимся в естественных условиях молекулам иммуноглобулина с различными структурами. Например, нативные антитела IgG-класса представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидами. В направлении от N- к С-концу каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), также называемую доменом тяжелой цепи или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которым следуют три константных домена (CH1, СН2 и СН3). Аналогично этому, в направлении от N- к С-концу каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), также называемую доменом легкой цепи или вариабельным доменом легкой цепи, за которым следует константный домен легкой цепи (CL). Легкая цепь антитела может относиться к одному из двух типов, которые обозначают каппа (κ) и лямбда (λ) на основе аминокислотной последовательности их константного домена.
Понятие «листовка-вкладыш в упаковку» в контексте настоящего описания относится к инструкциям, которые обычно помещают в поступающие в продажу упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или мерах предосторожности при применении указанных терапевтических продуктов.
«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно полипептидной референс-последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в полипептидной референс-последовательности, после выравнивания последовательностей и интродукции при необходимости брешей для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и при этом какие-либо консервативные замены не учитываются при оценке идентичности последовательностей. Сравнительный анализ для определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными путями, которые находятся в компетенции специалиста в данной области, например, с использованием публично доступных компьютерных программ, таких как программа BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) или пакет программ FASTA. Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения величину % идентичности аминокислотных последовательностей получают с использованием программы ggsearch из пакета программ FASTA, версия 36.3.8 с или более поздняя версия, с использованием матрицы для сравнения BLOSUM50. Пакет программ FASTA был разработан W.R. Pearson и D.J. Lipman, "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85, 1988, cc. 2444-2448; W.R. Pearson "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzymol. 266, 1996, cc. 227-258; и Pearson и др. Genomics 46, 1997, cc. 24-36, и публично доступен на сайте http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml. Альтернативно этому, для сравнения последовательностей можно использовать публичный сервер, доступный на сайте http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi, с использованием программы ggsearch (global protein : protein) и задаваемых по умолчанию опций (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup = 2) для обеспечения осуществления глобального, а не локального выравнивания. Процент идентичности аминокислот выдается в виде заголовка в качестве выходного результата выравнивания.
Понятие «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в такой форме, что он обеспечивает биологическую активность входящего в его состав действующего вещества, которое должно обладать эффективностью, и который не содержит дополнительные компоненты, обладающие неприемлемой токсичностью для индивидуума, которому следует вводить композицию.
«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от действующего вещества, который является нетоксичным для индивидуума. Фармацевтически приемлемый носитель включает (но, не ограничиваясь только ими) буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.
В контексте настоящего описания понятие «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «процесс лечения») относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения болезни у индивидуума, подлежащего лечению, и его можно осуществлять либо для профилактики, либо в процессе развития клинической патологии. Требуемыми действиями лечения являются (но, не ограничиваясь только ими) предупреждение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий болезни, предупреждение метастазов, снижение скорости развития болезни, облегчение или временное ослабление болезненного состояния и ремиссия или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы, предлагаемые в изобретении, применяют для задержки развития заболевания или замедления прогрессирования заболевания.
Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (HVR) (см., например, Kindt и др., Kuby Immunology, 6-ое изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, с. 91). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена. Кроме того, можно выделять антитела, которые связываются с конкретным антигеном, с использованием VH- или VL-домена из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных VH- или VL-доменов соответственно (см., например, Portolano и др., J, Immunol. 150, 1993, сс. 880-887; Clarkson и др., Nature, 352, 1991, сс. 624-628).
Понятие «вектор» в контексте настоящего описания относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной осуществлять размножение другой нуклеиновой кислоты, с которой она сцеплена. Понятие включает вектор, представляющий собой самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, встроенный в геном клетки-хозяина, в которую он интродуцирован. Некоторые векторы обладают способностью направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящем описании обозначены как «экспрессионные векторы».
I. Композиции и способы
Одним из объектов изобретения являются выделенные антитела, которые связываются с LAG3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения предложены антитела, которые связываются с человеческим LAG3. Антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять, например, для диагностирования или лечения рака, для лечения или замедления прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания, такого как опухолевый иммунитет, или для стимуляции иммунного ответа или функции, такой как Т-клеточная активность; или для применения в качестве иммуностимулятора или для стимуляции секреции/высвобождения гранзима В (GrzB), интерферона-гамма (IFN-гамма) и/или интерлейкина 2 (IL-2).
А. Примеры антител к LAG3
В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено антитело к LAG3, где антитело:
I) конкурирует за связывание с LAG3 с антителом к LAG3 (содержащим VH и VL антитела aLAG3(0414)), которое содержит VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и/или
II) связывается с LAG3 человека и обезьян циномолгус; и/или
III) ингибирует связывание молекул ГКГС-II, экспрессируемых на человеческих опухолевых клетках А375; и/или
IV) повышает высвобождение гранзима В или IL-2 по данным анализа с использованием реакции смешанных лимфоцитов (mMLR) (как продемонстрировано в примере 3).
Одним из объектов изобретения является антитело к LAG3, содержащее по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, которые выбраны из (а) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; (г) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (д) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и (е) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
Одним из объектов изобретения является антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, которые выбраны из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В следующем варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, и HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В следующем варианте осуществления изобретения антитело содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; и (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, которые выбраны из (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (б) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (б) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и (в) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В другом объекте изобретения антитело содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, которые выбраны из (I) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (II) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (III) HVR-H3 содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три последовательности HVR VL, которые выбраны из (I) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, (II) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
В другом объекте изобретения антитело содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и (е) HVR-L3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 6.
В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3 является человеческим или гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3 содержит HVR, указанные в любом из представленных выше вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержит акцепторный человеческий каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок.
В другом объекте изобретения антитело к LAG3 содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность VH, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с референс-последовательностью, но антитело к LAG3, содержащее эту последовательность, сохраняет способность к связыванию с LAG3. В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей сложности от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции имеют место в областях, находящихся вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антитело к LAG3 содержит последовательность VH, представленную в SEQ ID NO: 7, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VH содержит один, два или три HVR, которые выбраны из: (а) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
Другим объектом изобретения является антитело к LAG3, где антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), идентичный по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность VL, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с референс-последовательностью, но антитело к LAG3, содержащее эту последовательность, сохраняет способность к связыванию с LAG3. В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей сложности от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции имеют место в областях, находящихся вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антитело к LAG3 содержит последовательность VH, представленную в SEQ ID NO: 8, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH содержит один, два или три HVR, которые выбраны из: (а) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (б) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
Другим объектом изобретения является антитело к LAG3, где антитело содержит VH, указанную в любом из представленных выше вариантов осуществления изобретения, и VL, указанную в любом из представленных выше вариантов осуществления изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательности VH и VL, представленные в SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно, включая пост-трансляционные модификации этих последовательностей.
Другим объектом изобретения является антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело к LAG3, представленное в настоящем описании. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, предложено антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело к LAG3, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 7 и последовательность VL SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено антитело, которое связывается с эпитопом из кластера эпитопов Е3 в LAG3 (см. пример 2).
Одним из объектов изобретения является антитело к LAG3, содержащее по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, которые выбраны из (а) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; (г) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (д) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (е) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.
Одним из объектов изобретения является антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, которые выбраны из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, и HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, которые выбраны из (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (б) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (б) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (в) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.
В другом объекте изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, которые выбраны из (I) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (II) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (III) HVR-Н3, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11; и (б) VL-домен содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, которые выбраны из (I) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, (II) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (е) HVR-L3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 14.
В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3 является человеческим или гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3 содержит HVR, указанные в любом из представленных выше вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержит акцепторный человеческим каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок.
В другом объекте изобретения антитело к LAG3 содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность VL, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с референс-последовательностью, но антитело к LAG3, содержащее эту последовательность, сохраняет способность к связыванию с LAG3. В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей сложности от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции имеют место в областях, находящихся вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антитело к LAG3 содержит последовательность VH, представленную в SEQ ID NO: 15, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH содержит один, два или три HVR, которые выбраны из: (а) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
Другим объектом изобретения является антитело к LAG3, где антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), идентичный по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность VL, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с референс-последовательностью, но антитело к LAG3, содержащее эту последовательность, сохраняет способность к связыванию с LAG3. В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей сложности от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции имеют место в областях, находящихся вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антитело к LAG3 содержит последовательность VH, представленную в SEQ ID NO: 16, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH содержит один, два или три HVR, которые выбраны из (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (б) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.
Другим объектом изобретения является антитело к LAG3, где антитело содержит VH, указанную в любом из вариантов осуществления изобретения, представленных выше, и VL, указанную в любом из вариантов осуществления изобретения, представленных выше. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит VH- и VL-последовательности SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 соответственно, включая пост-трансляционные модификации этих последовательностей.
Следующим объектом изобретения является антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело к LAG3, представленное в настоящем описании. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, предложено антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело к LAG3, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 15 и последовательность VL SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено антитело, которое связывается с эпитопом из кластера эпитопов Е3 в LAG3 (см. пример 2).
Одним из объектов изобретения является антитело к LAG3, содержащее по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, которые выбраны из (а) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; (г) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (д) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (е) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.
Одним из объектов изобретения является антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, которые выбраны из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19. В другом варианте осуществления изобретения, антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В следующем варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, и HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18. В следующем варианте осуществления изобретения антитело содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; и (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, которые выбраны из (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (б) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (б) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (в) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.
В другом объекте изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, которые выбраны из (I) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (II) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (III) HVR-Н3 содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 19; и (б) VL-домена, содержащего по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, которые выбраны из (I) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, (II) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (е) HVR-L3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 22.
В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3 является человеческим или гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3 содержит HVR, указанные в любом из представленных выше вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержит акцепторный человеческим каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок.
В другом объекте изобретения антитело к LAG3 содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления изобретения, последовательность VH, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с референс-последовательностью, но антитело к LAG3, содержащее эту последовательность, сохраняет способность к связыванию с LAG3. В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей сложности от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции имеют место в областях, находящихся вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антитело к LAG3 содержит последовательность VH, представленную в SEQ ID NO: 23, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH содержит один, два или три HVR, который(е) выбран(ы) из: (а) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19.
В другом объекте изобретения антитело к LAG3 содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность VL, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с референс-последовательностью, но антитело к LAG3, содержащее эту последовательность, сохраняет способность к связыванию с LAG3. В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей сложности от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции имеют место в областях, находящихся вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антитело к LAG3 содержит последовательность VL, представленную в SEQ ID NO: 24, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретных вариантах осуществления изобретения VL содержит один, два или три HVR, который(е) выбран(ы) из (а) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (б) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (в) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.
Другим объектом изобретения является антитело к LAG3, где антитело содержит VH, указанную в любом из вариантов осуществления изобретения, представленных выше, и VL, указанную в любом из вариантов осуществления изобретения, представленных выше. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательности VH и VL, представленные в SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24 соответственно, включая пост-трансляционные модификации этих последовательностей.
Другим объектом изобретения является антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело к LAG3, представленное в настоящем описании. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, предложено антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело к LAG3, содержащее последовательность VH SEQ ID NO: 23 и последовательность VL SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено антитело, которое связывается с эпитопом из кластера эпитопов Е3 в LAG3 (см. пример 2).
Одним из объектов объектом изобретения является антитело к LAG3, содержащее по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, которые выбраны из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; (г) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (д) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; и (е) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
Одним из объектов объектом изобретения является антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, которые выбраны из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В одном из вариантов осуществления изобретения, антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30, и HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; и (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, которые выбраны из (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (б) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. В одном из вариантов осуществления изобретения, антитело содержит (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (б) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; и (в) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
В другом объекте изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, которые выбраны из (I) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (II) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (III) HVR-Н3 содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 27; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, которые выбраны из (I) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28, (II) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
Другим объектом изобретения является антитело, которое содержит (а) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; и (е) HVR-L3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 30.
В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3 является человеческим или гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3 содержит HVR, указанные в любом из представленных выше вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержит акцепторный человеческим каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок.
В другом объекте изобретения антитело к LAG3 содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность VH, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с референс-последовательностью, но антитело к LAG3, содержащее эту последовательность, сохраняет способность к связыванию с LAG3. В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей сложности от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции имеют место в областях, находящихся вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антитело к LAG3 содержит последовательность VH, представленную в SEQ ID NO: 31, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH содержит один, два или три HVR, которые выбраны из: (а) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
Другим объектом изобретения является антитело к LAG3, где антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), последовательность которого идентична по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность VL, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с референс-последовательностью, но антитело к LAG3, содержащее эту последовательность, сохраняет способность к связыванию с LAG3. В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей сложности от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции имеют место в областях, находящихся вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антитело к LAG3 содержит последовательность VL, представленную в SEQ ID NO: 32, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретных вариантах осуществления изобретения VL содержит один, два или три HVR, который(е) выбран(ы) из (а) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (б) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30.
Другим объектом изобретения является антитело к LAG3, где антитело содержит VH, указанную в любом из вариантов осуществления изобретения, представленных выше. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательности VH и VL SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32 соответственно, включая пост-трансляционные модификации этих последовательностей.
Другим объектом изобретения является антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело к LAG3, представленное в настоящем описании. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения предложено антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом, что и антитело к LAG3, содержащее последовательность VH, представленную в SEQ ID NO: 31, и последовательность VL, представленную в SEQ ID NO: 32. В некоторых вариантах осуществления изобретения предложено антитело, которое связывается с эпитопом из кластера эпитопов Е3 в LAG3 (см. пример 2).
Другим объектом изобретения является антитело к LAG3, содержащее по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть HVR, которые выбраны из (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; (г) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (д) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37; и (е) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, которые выбраны из последовательностей (a) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; (б) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; и (в) HVR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35. В другом варианте осуществления изобретения, антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38, и HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34. В другом варианте осуществления изобретения антитело содержит (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; и (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
Другим объектом изобретения является антитело, содержащее по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, которые выбраны из (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (б) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37; и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит (a) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (б) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37; и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
В другом объекте изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VH, которые выбраны из (I) HVR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (II) HVR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и (III) HVR-Н3 содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 35; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере одну, по меньшей мере две или все три последовательности HVR VL, которые выбраны из (I) HVR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, (II) HVR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и (в) HVR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
Другим объектом изобретения является антитело, которое содержит (а) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37; и (е) HVR-L3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 38.
В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3 является человеческим или гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3 содержит HVR, указанные в любом из представленных выше вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержит акцепторный человеческий каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок.
В другом объекте изобретения антитело к LAG3 содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность VH, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с референс-последовательностью, но антитело к LAG3, содержащее эту последовательность, сохраняет способность к связыванию с LAG3. В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей сложности от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции имеют место в областях, находящихся вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антитело к LAG3 содержит последовательность VH, представленную в SEQ ID NO: 39, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH содержит один, два или три HVR, которые выбраны из: (а) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35.
В другом объекте изобретения антитело к LAG3 содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности (VL), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность VL, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по сравнению с референс-последовательностью, но антитело к LAG3, содержащее эту последовательность, сохраняет способность к связыванию с LAG3. В некоторых вариантах осуществления изобретения в общей сложности от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 40. В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции имеют место в областях, находящихся вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антитело к LAG3 содержит последовательность VL, представленную в SEQ ID NO: 40, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH содержит один, два или три HVR, которые выбраны из (a) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (б) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37; и (в) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
Другим объектом изобретения является антитело к LAG3, где антитело содержит VH, указанную в любом из вариантов осуществления изобретения, представленных выше, и VL, указанную в любом из вариантов осуществления изобретения, представленных выше. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательности VH и VL SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40 соответственно, включая пост-трансляционные модификации этих последовательностей.
2
В другом объекте изобретения антитело к LAG3, представленное в любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения, представляет собой моноклональное антитело, включая химерное, гуманизированное или человеческое антитело. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3 представляет собой фрагмент антитела, например, Fv-, Fab-, Fab'-, scFv-фрагмент, димерное антитело (диабоди) или F(ab')-фрагмент. В другом варианте осуществления изобретения антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, с заменами L234A, L235A и P329G (LALA-PG) в Fc-области, происходящей из Fc-области человеческого IgG1 (см., например, WO 2012/130831 А1).
В другом объекте изобретения антитело к LAG3, представленное в любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения, может обладать индивидуально или в комбинации любой из характерных особенностей, описанных ниже в разделах 1-7:
1. Аффинность антитела
-8
-8
-13
-9
-13
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, представленное в настоящем описании, имеет константу диссоциации (Kd), составляющую ≤ 1 мкМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нММ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ или ≤ 0,001 нМ (например, 10 М или менее, например, от 10 М до 10 М, например, от 10 М до 10 М).
125

125

В одном из вариантов осуществления изобретения величину Kd измеряют с помощью анализа связывания несущего радиоактивную метку антигена (RIA). В одном из вариантов осуществления изобретения RIA осуществляют с использованием версии Fab представляющего интерес антитела и его антигена. Например, аффинность связывания Fab-фрагментов с антигеном в растворе измеряют путем уравновешивания Fab минимальной концентрацией меченного I антигена в присутствии титрованных серии немеченого антигена и последующего захвата связанного антигена антителом к Fab, иммобилизованным на планшете (см., например, Chen и др., J. Mol. Biol. 293, 1999, сс. 865-881). Для создания условий для анализа многолуночные планшеты MICROTITER (фирма Thermo Scientific) сенсибилизируют в течение ночи с использованием 5 мкг/мл захватывающего антитела к Fab (фирма Cappel Labs) в 50 мМ карбоната натрия (рН 9,6) и затем блокируют с помощью 2% (мас./об) бычьего сывороточного альбумина в ЗФР в течение 2-5 ч при комнатной температуре (примерно 23°С). В планшете без адсорбирующего покрытия (фирма Nunc, №269620) смешивают 100 пМ или 26 пМ [I]-антиген с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, применяемого для оценки антитела к VEGF, Fab-12, описанного у Presta и др., Cancer Res. 57, 1997, сс. 4593-4599). Затем представляющий интерес Fab инкубируют в течение ночи; однако инкубацию можно продолжать и в течение более длительного периода времени (например, в течение примерно 65 ч) для того, чтобы гарантировать достижение равновесия. После этого смеси переносят в планшет для захвата для инкубации при комнатной температуре (например, в течение 1 ч). Затем раствор удаляют, и планшет промывают восемь раз 0,1%-ным раствором полисорбата 20 (TWEEN-20) в ЗФР. После высушивания планшетов добавляют по 150 мкл/лунку сцинтилляционной жидкости (MICROSCINT-20™; фирма Packard) и планшеты анализируют с использованием гамма-счетчика TOPCOUNT™ (фирма Packard) в течение 10 мин. Для применения в анализе связывания в условиях конкуренции отбирают концентрации каждого Fab, обеспечивающие уровень связывания, меньший или равный 20% от максимального.

6
-1
-1
Согласно другому варианту осуществления изобретения величину Kd измеряют с помощью анализа связывания методом поверхностного плазмонного резонанса BIACORE. Например, осуществляют анализ с помощью устройства BIACORE-2000 или BIACORE-3000 (фирма BIAcore Inc., Пискатавей, шт. Нью-Джерси) при 25°С с использованием СМ5-чипов с иммобилизованным антигеном при уровне иммобилизации, соответствующем ~10 единицам ответа (RU). В одном из вариантов осуществления изобретения биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (СМ5, фирма BIACORE, Inc.) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разводят с использованием 10 мМ ацетата натрия, рН 4,8, до 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед осуществлением инъекции при скорости потока 5 мкл/мин до достижения примерно 10 единиц ответа (RU) связанного белка. После инъекции антигена инъецируют 1М этаноламин для блокирования непрореагировавших групп. Для кинетических измерений инъецируют двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 до 500 нМ) в ЗФР с 0,05% поверхностно-активного вещества полисорбата 20 (TWEEN-20™) (в ЗФРТ) при 25°С при скорости потока примерно 25 мкл/мин. Скорости реакции ассоциации (коп) и скорости реакции диссоциации (koff) рассчитывают с использованием простой модели связывания 1:1 Ленгмюра (программа оценки BIACORE, версия 3.2) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия реакции диссоциации (Kd) рассчитывают как отношение koff/kon (см., например, Chen и др., J. Mol. Biol. 293, 1999, сс. 865-881). Если по данным указанного выше анализа методом поверхностного плазмонного резонанса скорость ассоциации превышает 10 М с, то скорость ассоциации можно определять с помощью метода гашения флуоресценции, в котором измеряют увеличение или уменьшение интенсивности испускания флуоресценции (длина волны возбуждения = 295 нм; длина волны испускания = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С с использованием 20 нМ антитела к антигену (Fab-форма) в ЗФР, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, которое измеряют с помощью спектрофотометра, такого как спектрофотометр с устройством для остановки потока (фирма Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-AMINCO™ 8000-серии (фирма ThermoSpectronic) с перемешиваемой кюветой.
2. Фрагменты антител
2
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, указанное в настоящем описании, представляет собой фрагмент антитела. Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая сохраняет способность к специфическому связыванию с антигеном. Фрагменты антител включают (но, не ограничиваясь только ими) Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab'), Fv, одноцепочечный Fab (scFab); одноцепочечные вариабельные фрагменты (scFv) и однодоменные антитела (dAb). Обзор некоторых фрагментов антител представлен у Holliger и Hudson, Nature Biotechnology 23, 2005, сс. 1126-1136.
2
2
2
В одном из вариантов осуществления изобретения фрагмент антитела представляет собой Fab-, Fab'-, Fab'-SH- или F(ab')-фрагмент, прежде всего Fab-фрагмент. Расщепление интактных антител папаином приводит к образованию двух идентичных антигенсвязывающих фрагментов, которые называют «Fab»-фрагментами, каждый из которых содержит вариабельные домены тяжелой и легкой цепей, а также константный домен легкой цепи и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Таким образом, в контексте настоящего описания понятие «Fab-фрагмент» относится к фрагменту антитела, содержащему фрагмент легкой цепи, который содержит VL-домен и константный домен легкой цепи (CL), и VH-домен и первый константный домен (СН1) тяжелой цепи. Fab'-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением остатков на карбоксильный конец СН1-домена тяжелой цепи, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела. Fab'-SH обозначает Fab'-фрагменты, в которых остаток(ки) цистеина константных доменов несет(ут) свободную тиольную группу. Обработка пепсином позволяет получать F(ab')-фрагменты, которые имеют два антигенсвязывающих сайта (два Fab-фрагмента) и часть Fc-области. Обсуждение Fab- и F(ab')-фрагментов, содержащих остатки связывающего рецептор спасения эпитопа и обладающих увеличенным временем полужизни, представлено в U.S. №5869046.
В другом варианте осуществления изобретения фрагмент антитела представляет собой димерное антитело (диабоди), тримерное антитело (триабоди) или четырехмерное антитело (тетрабоди). Диабоди представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими (см., например, ЕР 404097; WO 1993/01161; Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134; и Hollinger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 6444-6448). Триабоди и тетрабоди описаны также у Hudson и др., Nat. Med. 9, 2003, сс. 129-134.
В другом варианте осуществления изобретения фрагмент антитела представляет собой одноцепочечный Fab-фрагмент. «Одноцепочечный Fab-фрагмент» или «scFab» представляет собой полипептид, состоящий из вариабельного домена тяжелой цепи (VH) антитела, константного домена 1 (СН1) антитела, вариабельного домена легкой цепи (VL) антитела, константного домена легкой цепи (CL) антитела и линкера, в котором указанные домены антитела и указанный линкер имеют один из следующих порядков расположения в направлении от N-конца к С-концу: а) VH-CH1-линкер-VL-CL, б) VL-CL-линкер-VH-CH1, в) VH-CL-линкер-VL-СН1 или г) VL-СН1-линкер-VH-CL; и в котором указанный линкер представляет собой полипептид, состоящий по меньшей мере из 30 аминокислот, предпочтительно примерно от 32 до 50 аминокислот. Указанные одноцепочечные Fab-фрагменты стабилизируют с помощью встречающейся в естественных условиях дисульфидной связи между CL-доменом и CH1-доменом. Кроме того, указанные одноцепочечные молекулы Fab можно дополнительно стабилизировать посредством создания межцепочечных дисульфидных связей путем встраивания остатков цистеина (например, в положение 44 в вариабельной тяжелой цепи и в положение 100 в вариабельной легкой цепи согласно нумерации Кэбота).
H
L
H
L
В другом варианте осуществления изобретения фрагмент антитела представляет собой одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv). «Одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv)» представляет собой слитый белок вариабельных областей тяжелой (V) и легкой (V) цепей антитела, соединенных коротким линкером. В частности, линкер представляет собой короткий полипептид, который содержит от 10 до примерно 25 аминокислот, и, как правило, он представляет собой богатый глицином линкер для придания гибкости, а также богатый серином или треонином линкер для обеспечения растворимости, и он может соединять либо N-конец V с С-концом V, либо наоборот. Указанный белок сохраняет специфичность исходного антитела, несмотря на удаление константных областей и интродукцию линкера. Обзор scFv-фрагментов приведен, например, у  в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т. 113, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, New York, 1994, cc. 269-315; см. также WO 93/16185; и U.S. №5571894 и 5587458.
В другом варианте осуществления изобретения фрагмент антитела представляет собой однодоменное антитело. Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь вариабельный домен тяжелой цепи или его часть или весь вариабельный домен легкой цепи антитела или его часть. В некоторых вариантах осуществления изобретения однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (фирма Domantis, Inc., Валтам, шт. Массачусетс; см., например, US №6248516 В1).
Фрагменты антитела можно создавать с помощью различных методов, включая (но, не ограничиваясь только ими) протеолитическое расщепление интактного антитела, а также получение с использованием рекомбинантных клеток-хозяев (например, Е. coli или фага), представленных в настоящем описании.
3. Химерные и гуманизированные антитела
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, указанное в настоящем описании, представляет собой химерное антитело. Некоторые химерные антитела описаны, например, в U.S. №4816567; и у Morrison и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1984, сс. 6851-6855. В одном примере химерное антитело содержит нечеловеческую вариабельную область (например, вариабельную область, полученную из антитела мыши, крысы, хомяка, кролика или примата кроме человека, такого как обезьяна), и человеческую константную область. В другом примере химерное антитело представляет собой антитело «переключенного класса», класс или подкласс которого был изменен по сравнению с родительским антителом. Химерные антитела включают их антигенсвязывающие фрагменты.
В некоторых вариантах осуществления изобретения химерное антитело представляет собой гуманизированное антитело. Как правило, нечеловеческое антитело гуманизируют для снижения иммуногенности для человека, сохраняя при этом специфичность и аффинность родительского нечеловеческого антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или несколько вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR, (или их части) получают из нечеловеческого антитела, a FR (или их части) получают из последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать также по меньшей мере часть человеческой константной области. В некоторых вариантах осуществления изобретения некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены на соответствующие остатки из нечеловеческого антитела (например, антитела, из которого получают остатки HVR), например, для восстановления или повышения специфичности или аффинности антитела.
Обзор гуманизированных антител и методов их получения представлен, например, у Almagro и Fransson, Front Biosci 13, 12008, сс. 1619-1633, и они описаны также, например, у Riechmann и др., Nature 332, 1988, сс. 323-329; Queen и др., Proc Natl Acad Sci USA 86, 1989, сс. 10029-10033; US, №№5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri и др., Methods 36, 2005, сс. 25-34) (описание трансплантации определяющих специфичность участков SDR); Padlan, Mol Immunol 28, 1991, сс. 489-498 (описание метода изменения поверхности («повторное покрытие»));  и др., Methods 36, 2005, сс. 43-60 (описание «перестановки FR») и Osbourn и др., Methods 36, 2005, сс. 61-68, и Klimka и др., Br J Cancer 83, 2000, сс. 252-260 (описание подхода на основе «целенаправленной селекции» для перестановки FR).
Человеческие каркасные участки, которые можно применять для гуманизации, включают (но, не ограничиваясь только ими): каркасные участки, выбранные на основе метода «наилучшего подбора» (см., например, Sims и др., J. Immunol. 151, 1993, с. 2296); каркасные участки, полученные из консенсусной последовательности человеческих антител конкретной подгруппы вариабельных областей легких или тяжелых цепей (см., например, Carter и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1992, с. 4285; и Presta и др., J. Immunol., 151, 1993, с. 2623); человеческие зрелые (подвергнутые соматической мутации) каркасные участки или каркасные участки человеческой зародышевой линии (см., например, Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13, 2008, сс. 1619-1633); и каркасные участки, полученные в результате скрининга FR-библиотек (см., например, Васа и др., J. Biol. Chem. 272, 1997, сс. 10678-10684) и Rosok и др., J. Biol. Chem. 271, 1996, сс. 22611-22618).
4. Человеческие антитела
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, указанное в настоящем описании, представляет собой химерное антитело. Человеческие антитела можно получать с помощью различных методов, известных в данной области. Человеческие антитела в целом описаны у van Dijk и van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5, 2001, cc. 368-374 и у Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20, 2008, cc. 450-459.
Человеческие антитела можно получать путем введения иммуногена трансгенному животному, которое модифицировано таким образом, что продуцирует интактные человеческие антитела или интактные антитела с человеческими вариабельными областями в ответ на контрольное заражение антигеном. Указанные животные, как правило, содержат все или часть локусов человеческого иммуноглобулина, которыми заменены эндогенные локусы иммуноглобулина, или которые присутствуют вне хромосом или интегрированы произвольно в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей эндогенные локусы иммуноглобулина, как правило, инактивированы. Обзор методов получения человеческих антител в трансгенных животных см. у Lonberg, Nat. Biotech. 23, 2005, сс. 1117-1125. Они описаны также, например, в US №№6075181 и 6150584 в которых описана технология XENOMOUSE™; US №5770429, в котором описана технология HuMab; US 7041870, в котором описана технология K-М MOUSE и в публикации заявки на патент США №2007/0061900, в котором описана технология VelociMouse. Человеческие вариабельные области интактных антител, полученные в таких животных, можно дополнительно модифицировать, например, объединяя с другой человеческой константной областью.
Человеческие антитела можно получать также с помощью методов, основанных на применении гибридом. Описаны клеточные линии человеческой миеломы и мышиной-человеческой гетеромиеломы, предназначенные для получения человеческих моноклональных антител (см., например, Kozbor, J. Immunol., 133, 1984, с. 3001; Brodeur и др., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 1987, cc. 51-63 (изд-во Marcel Dekker, Inc., New York); и Boerner и др., J. Immunol., 147, 1991, c. 86). Человеческие антитела, созданные с помощью технологии, основанной на применении человеческих В-клеточных гибридом, описаны также у Li и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 2006, сс. 3557-3562. Дополнительные методы представляют собой методы, описанные, например, в US №7189826 (описание получения моноклональных человеческих антител IgM-класса из клеточных линий гибридом) и у Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4), 2006, сс. 265-268 (описание человеческих-человеческих гибридом). Технология, основанная на применении человеческих гибридом (Trioma-технология), описана также у Vollmers и Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3), 2005, сс. 927-937 и Vollmers и Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3), 2005, cc. 185-191.
Человеческие антитела можно создавать также путем выделения последовательностей вариабельного домена клона Fv, отобранных из полученных из человека фаговых дисплейных библиотек. Затем такие последовательности вариабельного домена можно объединять с требуемым человеческим константным доменом. Методы отбора человеческих антител из библиотек антител описаны ниже.
5. Антитела, полученные из библиотек
Антитела, применяемые согласно изобретению, можно выделять путем скрининга комбинаторных библиотек в отношении антител с требуемой(ыми) активностью или видами активности. Обзор методов скрининга комбинаторных библиотек представлен, например, у Lerner и др. в Nature Reviews 16, 2016, сс. 498-508. Например, в данной области известны различные методы создания фаговых дисплейных библиотек и скрининга указанных библиотек в отношении антител, обладающих требуемыми характеристиками связывания. Обзор таких методов представлен, например, у Frenzel и др. в mAbs 8, 2016, сс. 1177-1194; Bazan и др. в Human Vaccines and Immunotherapeutics 8, 2012, сс. 1817-1828 и Zhao и др., в Critical Reviews in Biotechnology 36, 2016, сс. 276-289, а также у Hoogenboom и др. в Methods in Molecular Biology, под ред.  и др., изд-во Human Press, Totowa, 178, 2001, сс. 1-37 и у Marks и Bradbury в Methods in Molecular Biology, под ред. Lo, изд-во Human Press, 248, 2003, сс. 161-175.
При осуществлении некоторых методов фагового дисплея популяции VH- и VL-генов клонируют по отдельности с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и рекомбинируют произвольно в фаговых библиотеках, которые затем подвергают скринингу в отношении антигенсвязывающего фага согласно методу, описанному у Winter и др., Ann. Rev. Immunol., 12, 1994, сс. 433-455. Фаг, как правило, экспонирует фрагменты антител либо в виде одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv), либо в виде Fab-фрагментов. Библиотеки, полученные из иммунизированных источников, включают антитела, обладающие высокой аффинностью к иммуногену, при этом отсутствует необходимость в создании гибридом. Альтернативно этому, можно клонировать необработанную («наивную») популяцию (например, из организма человека), получая один источник антител к широкому спектру чужих, а также своих антигенов без какой-либо иммунизации, что описано у Griffiths и др., EMBO J, 12, 1993, сс. 725-734. И, наконец, «наивные» библиотеки можно получать также методами синтеза путем клонирования неперегруппированных сегментов V-гена из стволовых клеток и с помощью ПЦР-праймеров, содержащих случайную последовательность, для кодирования обладающих высокой вариабельностью CDR3-участков и для осуществления перегруппировки in vitro согласно методу, описанному у Hoogenboom и Winter, J. Mol. Biol., 227, 1992, cc. 381-388. Фаговые библиотеки человеческих антител описаны, например, в следующих патентных публикациях: US №№5750373; 7985840; 7785903 и 8679490, а также в публикациях патентов США №№. 2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 и 2007/0292936.
Другие примеры известных в данной области методов скрининга комбинаторных библиотек в отношении антител с требуемой(ыми) активностью или видами активности включают рибосомный и мРНК-дисплей, а также методы дисплея и селекции антител на бактериях, клетках млекопитающих, клетках насекомых или клетках дрожжей. Обзор методов дисплея на поверхности дрожжей представлен, например, у Scholler и др. в Methods in Molecular Biology 503, 2012, cc. 135-156 и у Cherf и др. в Methods in Molecular biology 1319, 2015, cc. 155-175, а также у Zhao и др., в Methods in Molecular Biology 889, 2012, cc. 73-84. Методы рибосомного дисплея описаны, например, у Не и др., в Nucleic Acids Research 25, 1997, сс. 5132-5134 и у Hanes и др., в PNAS 94, 1997, сс. 4937-4942.
Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, в контексте настоящего описания рассматриваются как человеческие антитела или фрагменты человеческих антител.
6. Мультиспецифические антитела
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, указанное в настоящем описании, представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые имеют специфичности, связывающиеся по меньше мере с двумя различными сайтами, т.е. различными эпитопами на различных антигенах или различными эпитопами на одном и том же антигене. В некоторых вариантах осуществления изобретения мультиспецифическое антитело имеет три или большее количество связывающих специфичностей. В некоторых вариантах осуществления изобретения одна из специфичностей связывается с LAG3, а другие (две или большее количество) специфичностей связываются с любым другим антигеном. В некоторых вариантах осуществления изобретения биспецифические антитела могут связываться с двумя (или с большим количеством) различных эпитопов LAG3. Мультиспецифические (например, биспецифические) антитела можно применять также для локализации цитотоксических агентов или клеток в клетках, которые экспрессируют LAG3. Мультиспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.
Методики создания мультиспецифических антител включают (но, не ограничиваясь только ими) рекомбинантную совместную экспрессию двух пар тяжелых цепей-легких цепей иммуноглобулинов, обладающих различными специфичностями (см. Milstein и Cuello, Nature 305, 1983, сс. 537), и технологию конструирования «knob-in-hole» («выступ-во впадину») (см., например, US №5731168 и Atwell и др., J. Mol. Biol. 270, 1997, с. 26). Мультиспецифические антитела можно получать также путем создания регулируемых электростатическими силами воздействий для получения молекул антитела с гетеродимерными Fc (см., например, WO 2009/089004); перекрестного связывания двух или большего количества антител или фрагментов (см., например, US №4676980 и Brennan и др., Science 229, 1985, сс. 81-83); применения лейциновых молний для получения биспецифических антител (см., например, Kostelny и др., J. Immunol. 148(5), 1992, сс. 1547-1553 и WO 2011/034605); применения технологии общей легкой цепи для преодоления проблемы, связанной с ошибочным спариванием легких цепей (см., например, WO 98/50431); применения технологии «диабоди» для создания фрагментов биспецифических антител (см., например, Holliger и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 6444-6448); и применения димеров одноцепочечных Fv (sFv) (см., например, Gruber и др., J. Immunol. 152, 1994, с. 5368); и получения триспецифических антител согласно методу, описанному, например, у Tutt и др., J. Immunol. 147, 1991, с. 60).
Под объем настоящего изобретения подпадают также сконструированные антитела с тремя или большим количеством антигенсвязывающих сайтов, включая, например, «антитела-осьминоги» или DVD-Ig (см., например, WO 2001/77342 и WO 2008/024715). Другие примеры мультиспецифических антител с тремя или большим количеством антигенсвязывающих сайтов описаны в WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2013/026831. Биспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может включать также «Fab двойного действия» или «DAF», содержащий антигенсвязывающий сайт, который связывается с LAG3, а также с другим антигеном или двумя различными эпитопами LAG3 (см., например, US 2008/0069820 и WO 2015/095539).
Мультиспецифические антитела могут находиться также в асимметричной форме с кроссовером доменов в одном или нескольких связывающих плечах одной и той же антигенной специфичности, т.е. в результате обмена VH/VL-доменов (см., например, WO 2009/080252 и WO 2015/150447), CH1/CL-доменов (см., например, WO 2009/080253) или полных Fab-плечей (см., например, WO 2009/080251, WO 2016/016299, см. также Schaefer и др., PNAS, 108, 2011, сс. 1187-1191 и Klein и др., MAbs 8, 2016, сс. 1010-1020). В одном из вариантов осуществления изобретения мультиспецифическое антитело содержит кросс-Fab-фрагмент. Понятие «кросс-Fab-фрагмент» или «xFab-фрагмент» или «кроссовер-Fab-фрагмент» относится к Fab-фрагменту, в котором обменены либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепи. Кросс-Fab-фрагмент содержит полипептидную цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области тяжелой цепи (СН1), и полипептидную цепь, состоящую из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области легкой цепи (CL). Асимметричные Fab-плечи можно конструировать также путем интродукции мутаций заряженных или незаряженных аминокислот в поверхность раздела доменов для правильного спаривания Fab (см., например, WO 2016/172485).
В данной области для мультиспецифических антител известны различные другие форматы молекул, и они включены в настоящее описание (см., например, Spiess и др., Mol Immunol 67, 2015, сс. 95-106).
7. Варианты антител
В некоторых вариантах осуществления изобретения рассматриваются варианты аминокислотных последовательностей антител, представленных в настоящем описании. Например, может оказаться желательным повышать аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотных последовательностей антитела можно получать путем интродукции соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Указанные модификации включают, например, делеции и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечной конструкции можно использовать любую комбинацию делеций, инсерций и замен, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, способностью связываться с антигеном.
а) Варианты, полученные путем замены, инсерции и делеции
В некоторых вариантах осуществления изобретения предложены варианты антител, имеющие одну или несколько аминокислотных замен. Представляющие интерес сайты для замещающего мутагенеза включают HVR и FR. Консервативные замены представлены в таблице 1 под заголовком «предпочтительные замены». Более общие замены представлены в таблице 1 под заголовком «Приведенные в качестве примера замены» и дополнительно описаны ниже со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены можно интродуцировать в представляющее интерес антитело и продукты подвергать скринингу в отношении требуемой активности, например, сохранения/повышения способности к связыванию антигена, пониженной иммуногенности или улучшенной ADCC или CDC.
Аминокислоты можно группировать на основе общих свойств боковых цепей следующим образом:
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) кислотные: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe.
Под неконсервативными заменами подразумевают замену представителя одного из указанных классов на представителя из другого класса.
Один из типов полученного путем замен варианта включает замену одного или нескольких остатков в гипервариабельном участке родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(е) вариант(ы), отобранный(е) для дальнейшего исследования, должен(ы) иметь модификации (например, улучшения) некоторых биологических свойств (например, повышенную аффинность, пониженную иммуногенность) по сравнению с родительским антителом и/или должны практически сохранять некоторые биологические свойства родительского антитела. Примером полученного путем замен варианта является антитело с созревшей аффинностью, которое можно легко создавать, например, с использованием представленных в настоящем описании методов созревания аффинности на основе фагового дисплея. В целом, метод заключается в том, что подвергают мутации один или несколько остатков HVR и варианты антител экспонируют на фаге и подвергают скринингу в отношении конкретной биологической активности (например, в отношении аффинности связывания).
Изменения (например, замены) можно осуществлять в HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Такие изменения можно осуществлять в «горячих точках» HVR, т.е. остатках, кодируемых кодонами, которые с высокой частотой подвергаются мутации в процессе соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207, 2008, сс. 179-196), и/или остатках, контактирующих с антигеном, при этом полученные в результате варианты VH или VL тестируют в отношении аффинности связывания. Созревание аффинности путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек описано, например, у Hoogenboom и др. в Methods in Molecular Biology под ред.  и др., изд-во Humana Press, Totowa, NJ, 178, 2001, сс. 1-37). В некоторых вариантах осуществления созревания аффинности в вариабельные гены, выбранные для созревания, интродуцируют разнообразие с помощью различных методов (таких, например, как ПЦР пониженной точности, перестановка цепи или олигонуклеотид-направленный мутагенез). Затем создают вторичную библиотеку. После этого осуществляют скрининг библиотеки для идентификации любых вариантов антител с требуемой аффинностью. В другом методе для интродукции разнообразия применяют HVR-направленные подходы, в которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, одновременно 4-6 остатков). Остатки HVR, участвующие в связывании антигена, можно специфически идентифицировать, например, с использованием аланин-сканирующего мутагенеза или моделирования. Наиболее часто мишенью являются CDR-H3 и CDR-L3.
В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции могут затрагивать один или несколько HVR, если указанные изменения не снижают существенно способность антитела связываться с антигеном. Например, в HVR могут быть сделаны консервативные изменения (например, консервативные замены, указанные в настоящем описании), которые не снижают существенно аффинность связывания. Такие изменения могут иметь место, например, вне контактирующих с антигеном остатков в HVR. В некоторых вариантах последовательностей VH и VL, представленных выше, каждый HVR либо остается неизмененным, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.
Ценным методом идентификации остатков или областей антитела, которые можно подвергать мутагенезу, является так называемый «аланин-сканирующий мутагенез», описанный у Cunningham и Wells, Science 244, 1989, сс. 1081-1085. При осуществлении этого метода остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) идентифицируют и заменяют на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (например, аланин или полиаланин) для решения вопроса о том, будет ли это влиять на взаимодействие антитела с антигеном. Дополнительные замены можно интродуцировать в те положения аминокислот, для которых продемонстрирована функциональная чувствительность к начальным заменам. В альтернативном или дополнительном варианте изучают кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Указанные контактирующие остатки и соседние остатки можно рассматривать в качестве мишеней или исключать из рассмотрения в качестве кандидатов для замены. Варианты можно подвергать скринингу для решения вопроса о том, обладают ли они требуемыми свойствами.
Аминокислотные инсерции включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих 100 или большее количество остатков, а также инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков внутрь последовательности. Примеры результата осуществления концевых инсерции включают антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние N- или С-конца антитела с ферментом (например, для ADEPT) или полипептидом, который удлиняет время полужизни антитела в сыворотке.
б) Варианты гликозилирования
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, представленное в настоящем описании, изменяют с целью повышения или понижения степени гликозилирования антитела. Добавление или удаление путем делеции сайтов гликозилирования антитела легко можно осуществлять путем такого изменения аминокислотной последовательности, которое позволяет создавать или удалять один или несколько сайтов гликозилирования.
Если антитело содержит Fc-область, то можно изменять присоединенный к ней олигосахарид. Нативные антитела, которые продуцируются клетками млекопитающих, как правило, содержат разветвленный биантенный олигосахарид, который, как правило, присоединен с помощью N-связи к Asn297 СН2-домена Fc-области (см., например, Wright и др., TIBTECH 15, 1997, сс. 26-32). Олигосахарид может включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стебле» биантенной олигосахаридной структуры. В некоторых вариантах осуществления изобретения модификации олигосахарида в антителе, предлагаемом в изобретении, можно осуществлять для создания вариантов антител с определенными улучшенными свойствами.
Одним из вариантов осуществления изобретения являются варианты антитела, имеющие нефукозилированный олигосахарид, т.е. имеющие олигосахаридную структуру, в которой отсутствует фукоза, присоединенная (прямо или косвенно) к Fc-области. Указанный нефукозилированный олигосахарид (который обозначают также как «афукозилированный» олигосахарид), прежде всего представляет собой N-сцепленный олигосахарид, в котором отсутствует остаток фукозы, присоединенный к первому GlcNAc в «стебле» биантенной олигосахаридной структуры. Одним из вариантов осуществления изобретения являются варианты антител, имеющие повышенную долю нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с нативным или родительским антителом. Например, доля нефукозилированных олигосахаридов может составлять по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 80% или даже примерно 100% (т.е. отсутствие фукозилированных олигосахаридов). Процент нефукозилированных олисахаридов представляет собой (среднее) количество олигосахаридов, лишенных остатков фукозы, относительно суммы всех олигосахаридов, присоединенных к Asn 297 (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), которое измеряют с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии согласно методу, описанному, например, в WO 2008/077546. Asn297 обозначает остаток аспарагина, локализованный примерно в положении 297 в Fc-области (EU-нумерация остатков Fc-области); однако вследствие минорных вариаций последовательности антитела Asn297 может располагаться также примерно на ±3 аминокислоты в прямом или обратном направлении относительно положения 297, т.е. между положениями 294 и 300. Указанные антитела, имеющие повышенную долю нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области, могут обладать повышенной способностью связываться с FcγRIIIa-рецептором и/или повышенной эффекторной функцией, прежде всего повышенной ADCC-функцией (см., например, US 2003/0157108; US 2004/0093621).
Примерами клеточных линий, которые обладают способностью продуцировать антитела с пониженным фукозилированием, являются СНО-клетки Lec13 с дефицитом белкового фукозилированиея (Ripka и др., Arch. Biochem. Biophys. 249, 1986, сс. 533-545; US 2003/0157108 и WO 2004/056312, см., прежде всего, пример 11), и клеточные линии с «выключенным» геном, например, СНО-клетки с «выключенным» геном альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki и др., Biotech. Bioeng. 87, 2004, с. 614-622); Kanda Y. и др., Biotechnol. Bioeng., 94(4), 2006, сс.680-688; и WO 2003/085107), или клетки с пониженной или аннулированной активностью синтеза GDP-фукозы или белка-транспортера (см., например, US 2004/259150, US 2005/031613, US 2004/132140, US 2004/110282).
Следующим вариантом осуществления изобретения являются варианты антител с бисекционными олигосахаридами, например, в которых биантенный олигосахарид, присоединенный к Fc-области антитела, бисекционнируется с помощью GlcNAc. Указанные варианты антител могут отличаться пониженным фукозилированием и/или повышенной ADCC-функцией, что описано выше. Примеры указанных вариантов антител описаны, например, у Umana и др., Nat Biotechnol 17, 1999, cc. 176-180; Ferrara и др., Biotechn Bioeng 93, 2006, cc. 851-861; WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878.
Предложены также варианты антител по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc-области. Указанные варианты антител могут обладать повышенной CDC-функцией. Указанные варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087; WO 1998/58964 и WO 1999/22764.
в) Варианты Fc-области
Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения можно интродуцировать в Fc-область антитела, представленного в настоящем описании, одну или несколько аминокислотных модификаций, создавая тем самым вариант Fc-области. Вариант Fc-области может содержать последовательность человеческой Fc-области (например, Fc-области человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), включающую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или нескольких аминокислотных положениях).

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к варианту антитела, которое обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его перспективным кандидатом для путей применения, для которых является важным время полужизни in vivo, однако некоторые эффекторные функции (такие как комплементзависимая цитотоксичность (CDC) и ADCC) не являются необходимыми или являются вредными. Можно осуществлять анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo для подтверждения снижения/истощения CDC- и/или ADCC-активности. Например, можно осуществлять анализы связывания Fc-рецептора (FcR) для гарантии того, что у антитела отсутствует способность к связыванию с FcγR (и поэтому, вероятно, отсутствует ADCC-активность), но сохраняется способность связываться с FcRn. Первичные клетки, опосредующие ADCC, т.е. NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Данные об экспрессии FcR на гематопоэтических клетках обобщены в таблице 3 на с. 464 у Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9, 1991, cc. 457-492. Примерами анализов in vitro ADCC-активности представляющей интерес молекулы являются (но, не ограничиваясь только ими) анализы, описанные в US №5500362 (см., например, Hellstrom I. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 1986, cc. 7059-7063 и Hellstrom I. и др., Proc.  Acad. Sci. USA 82, 1985, cc. 1499-1502); US №5821337 (см. Bruggemann M. и др., J. Exp. Med. 166, 1987, cc. 1351-1361). В альтернативном варианте можно применять нерадиоактивные методы анализа (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности ACTI™ на основе проточной цитометрии (фирма CellTechnology, Inc. Маунтин-Вью, шт. Калифорния); и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96 (фирма Promega, Мэдисон, шт. Висконсин). Пригодными для таких анализов эффекторными клетками являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные клетки-киллеры (NK). В альтернативном или дополнительном варианте ADCC-активность представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, на животной модели, например, как описано у Clynes и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 1998, cc. 652-656. Можно осуществлять также анализы связывания C1q для подтверждения того, что антитело не может связывать C1q и поэтому у него отсутствует CDC-активность (см., например, описание ELISA для оценки связывания C1q и С3с в WO 2006/029879 и WO 2005/100402). Для оценки активации комплемента можно осуществлять CDC-анализ (см., например, Gazzano-Santoro и др., J. Immunol. Methods 202, 1996, cc. 163-171; Cragg M.S. и др., Blood 101, 2003, cc. 1045-1052; и Cragg M.S. и M.J. Glennie, Blood 103, 2004, cc. 2738-2743). Определение FcRn-связывания и клиренса/времени полужизни in vivo можно осуществлять также с использованием методов, известных в данной области (см., например, Petkova S.B. и др.,  Immunol. 18(12), 2006, cc. 1759-1769); WO 2013/120929 A1).
Антитела с пониженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или нескольких следующих остатков Fc-области, таких как 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (см., например, US №6737056). К указанным мутантам Fc относятся мутанты Fc с заменами в двух или большем количестве из следующих аминокислотных положений: 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант «DANA» Fc-области, несущий замену остатков 265 и 297 на аланин (US №7332581).
Описаны некоторые варианты антител с повышенной или пониженной способностью связываться с FcR (см., например, US №6737056; WO 2004/056312 и Shields и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, cc. 6591-6604).
Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения вариант антитела содержит Fc-область с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые повышают ADCC, например, с заменами в положениях 298, 333, и/или 334 Fc-области (EU-нумерация остатков).
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант антитела содержит Fc-область с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые повышают связывание FcRn, например, с заменами в положениях 252 и/или 254, и/или 256 Fc-области (EU-нумерация остатков). В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант антитела содержит Fc-область с аминокислотными заменами в положениях 252, 254, и 256. В одном из вариантов осуществления изобретения замены представляют собой M252Y, S254T и Т256Е в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант антитела содержит Fc-область с аминокислотными заменами, которые снижают связывание FcγR, например, замены в положениях 234 и 235 Fc-области (EU-нумерация остатков). В одном из вариантов осуществления изобретения замены представляют собой L234A и L235A (LALA). В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант антитела дополнительно содержит D265A и/или P329G в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG1. В одном из вариантов осуществления изобретения замены представляют собой L234A, L235A и P329G (LALA-PG) в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG1 (см., например, WO 2012/130831 А1). В другом варианте осуществления изобретения замены представляют собой L234A, L235A и D265A (LALA-DA) в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG1.
В некоторых вариантах осуществления изобретения в Fc-области осуществляют изменения, которые приводят к измененной (т.е. либо повышенной, либо пониженной) способности связывать C1q и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), что описано, например, в US №6194551, WO 99/51642 и у Idusogie и др., J. Immunol. 164, 2000, сс. 4178-4184.
Антитела с удлиненным временем полужизни и повышенной способностью к связыванию с неонатальным Fc-рецептором (FcRn), который ответствен за перенос материнских IgG эмбриону (Guyer и др., J. Immunol. 117, 1976, сс. 587-593 и Kim и др., J. Immunol. 24, 1994, сс. 2429-2434), описаны в US 2005/0014934 А1 (на имя Hinton и др.). Эти антитела содержат Fc-область с одной или несколькими заменами, которые повышают связывание Fc-области с FcRn. Указанные варианты Fc-области включают варианты с заменами одного или нескольких следующих остатков Fc-области: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замену остатка 434 в Fc-области (US №7371826);  W.F., и др., J. Biol. Chem. 281, 2006, сс. 23514-23524).
С помощью сайтнаправленного мутагенеза были идентифицированы остатки в Fc-области, имеющие решающее значение для взаимодействия: мышиная Fc-область-мышиный FcRn (см., например,  W.F. и др., J. Immunol 169, 2002, сс. 5171-5180). Во взаимодействии участвуют остатки I253, Н310, Н433, N434 и Н435 (EU-нумерация согласно Кэботу) (Medesan С. и др., Eur. J. Immunol. 26, 1996, с. 2533; Firan М. И др., Int. Immunol. 13, 2001, с. 993; Kim J.K. и др., Eur. J. Immunol. 24, 1994, с. 542). Было установлено, что остатки I253, Н310 и Н435 имеют решающее значение для взаимодействия человеческой Fc с мышиным FcRn (Kim J.K. и др., Eur. J. Immunol. 29, 1999, с. 2819). Исследования комплекса человеческая Fc-человеческий FcRn продемонстрировали, что остатки I253, S254, Н435 и Y436 имеют решающее значение для взаимодействия (Firan М. и др., Int. Immunol. 13, 2001, с. 993; Shields R.L. и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, сс. 6591-6604). У Yeung Y.A. и др., J. Immunol. 182, 2009, сс. 7667-7671 описаны и исследованы различные мутанты остатков с 248 по 259 и с 301 по 317, и с 376 по 382, и с 424 по 437.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант антитела содержит Fc-область с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые снижают связывание FcRn, например, с заменами в положениях 253 и/или 310, и/или 435 Fc-области (EU-нумерация остатков). В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант антитела содержит Fc-область с аминокислотными заменами в положениях 253, 310 и 435. В одном из вариантов осуществления изобретения замены представляют собой I253A, Н310А и Н435А в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG1 (см. например, Grevys А. и др., J. Immunol. 194, 2015, сс. 5497-5508.
В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант антитела содержит Fc-область с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые снижают связывание с FcRn, например, замены в положениях 310 и/или 433, и/или 436 Fc-области (EU-нумерация остатков). В некоторых вариантах осуществления изобретения вариант антитела содержит Fc-область с аминокислотными заменами в положениях 310, 433 и 436. В одном из вариантов осуществления изобретения замены представляют собой Н310А, Н433А и Y436A в Fc-области, полученной из Fc-области человеческого IgG1 (см., например, WO 2014/177460 А1).
Дополнительные примеры, касающиеся других вариантов Fc-области, описаны также у Duncan и Winter, Nature 322, 1988, cc. 738-740; в US №5648260; US №5624821 и WO 94/29351.
Б. Методы рекомбинации и композиции
Антитела можно получать с использованием методов рекомбинаций и композиций, например, описанных в US 4816567. Для этих методов получают одну выделенную аминокислоту или несколько выделенных аминокислот, кодирующую(их) антитело.
В случае нативного антитела или фрагмента нативного антитела требуются две нуклеиновые кислоты, одна для легкой цепи или ее фрагмента и одна для тяжелой цепи или ее фрагмента. Такая(ие) нуклеиновая(ые) кислота(ы) кодирует(ют) аминокислотную последовательность, содержащую VL и/или аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела (например, легкую и/или тяжелую цепь(и) антитела). Эти нуклеиновые кислоты могут находиться в одном и том же экспрессионном векторе или в различных экспрессионных векторах.
В случае биспецифического антитела с гетеродимерными тяжелыми цепями требуются четыре нуклеиновые кислоты, одна для первой легкой цепи, одна для второй легкой цепи содержащего первую гетеромономерную Fc-область полипептида, одна для второй легкой цепи и одна для второй тяжелой цепи содержащего вторую гетеромономерную Fc-область полипептида. Четыре нуклеиновые кислоты могут содержаться в одной или нескольких молекулах нуклеиновой кислоты или экспрессионных векторах. Такая(ие) нуклеиновая(ые) кислота(ы) кодирует(ют) аминокислотную последовательность, содержащую первую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую первую VH, включая первую гетеромономерную Fc-область, и/или аминокислотную последовательность, содержащую вторую VL, и/или аминокислотную последовательность, содержащую вторую VH, включая вторую гетеромономерную Fc-область антитела (например, первую и/или вторую легкую, и/или первую, и/или вторую тяжелую цепи антитела). Эти нуклеиновые кислоты могут находиться в одном и том же экспрессионном векторе или в различных экспрессионных векторах, в норме эти нуклеиновые кислоты находятся в двух или трех экспрессионных векторах, т.е. один вектор может содержать более одной из указанных нуклеиновых кислот. Примерами таких биспецифических антител являются CrossMab и активирующие Т-клетки биспецифические антитела (см., например, Schaefer W. и др, PNAS, 108, 2011, сс. 11187-1191). Например, одна из гетеромономерных тяжелых цепей содержит так называемые «мутации, приводящие к образованию выступа» (T366W и необязательно одну из S354C или Y349C) а другая содержит так называемые «мутации, приводящие к образованию впадины» (T366S, L368A и Y407V и необязательно Y349C или S354C) (см., например, Carter Р. и др., Immunotechnol. 2, 1996, с. 73).
Одним из вариантов осуществления изобретения являются выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело, применяемое в способах, представленных в настоящем описании.
Другим вариантом осуществления изобретения являются один или несколько векторов (например, экспрессионных векторов), содержащих такую(ие) нуклеиновую(ые) кислоту(ы).
Другим вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин, содержащая такую(ие) нуклеиновую(ые) кислоту(ы).
В одном из таких вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин содержит (например, трансформирована):
- в случае антитела, состоящего из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, которые связаны дисульфидной связью, или его фрагмента, содержащего VH и VL:
(1) вектор, содержащий нуклеиновые кислоты, которые кодируют аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела, или
(2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, который кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела;
- в случае биспецифического антитела с гетеродимерными тяжелыми цепями:
(1) первый вектор, содержащий первую пару нуклеиновых кислот, которые кодируют аминокислотные последовательности, одна из которых содержит первую VL, а другая содержит первую VH антитела, и второй вектор, содержащий вторую пару нуклеиновых кислот, которые кодируют аминокислотные последовательности, одна из которых содержит вторую VL, а другая содержит вторую VH антитела, или
(2) первый вектор, содержащий первую нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую один из вариабельных доменов (предпочтительно вариабельный домен легкой цепи), второй вектор, содержащим пару нуклеиновых кислот, которые кодируют аминокислотные последовательности, одна из которых содержит вариабельный домен легкой цепи, а другая содержит вариабельный домен первой тяжелой цепи, и третий вектор, содержащий пару нуклеиновых кислот, которые кодируют аминокислотные последовательности, одна из которых содержит соответствующий вариабельный домен легкой цепи, отличный от того, который указан для второго вектора, а другая содержит вариабельный домен второй тяжелой цепи, или
(3) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую первую VL антитела, второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую первую VH антитела, третий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую вторую VL антитела, и четвертый вектор содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую вторую VH антитела.
В одном из вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО) или лимфоидную клетку (например, Y0-, NS0-, Sp20-клетку). В одном из вариантов осуществления изобретения предложен способ получения антитела к LAG3, где способ включает культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело, указанное выше, в условиях, пригодных для экспрессии антитела, и необязательно выделение антитела из клетки-хозяина (или культуральной среды для клетки-хозяина).
Для рекомбинантного получения антитела к LAG3 нуклеиновые кислоты, кодирующие антитело, например, описанное выше, выделяют и встраивают в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такие нуклеиновые кислоты можно легко выделять и секвенировать с применением общепринятых процедур (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые обладают способностью специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела) или получать методами рекомбинации, или получать путем химическогог синтеза.
Приемлемые клетки-хозяева для клонирования или экспрессии кодирующих антитело векторов включают прокариотические или эукариотические клетки, представленные в настоящем описании. Например, антитела можно получать в бактериях, в частности, когда не требуется гликозилирование и связанная с Fc эффекторная функция. Сведения об экспрессии фрагментов антитела и полипептидов в бактериях см. например, в US №5648237, US №5789199 и US №5840523 (см. также у Charlton K.А. в: Methods in Molecular Biology, под ред. Lo В.K.С., изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, cc. 245-254 описание экспрессии фрагментов антител в Е. coli.). После экспрессии антитело можно выделять из пасты бактериальных клеток в растворимой фракции и можно дополнительно очищать.
Помимо прокариотических организмов в качестве хозяев, пригодных для клонирования или экспрессии векторов, которые кодируют антитело, можно использовать эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», что позволяет получать антитело с частично или полностью человеческой схемой гликозилирования (см. Gerngross T.U., Nat. Biotech. 22, 2004, сс. 1409-1414 и Li и др., Nat. Biotech. 24, 2006, сс. 210-215).
Клетки-хозяева, которые можно применять для экспрессии гликозилированного антитела, получают также из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных животных). Примерами клеток беспозвоночных являются клетки насекомых, а также можно применять клетки растений. Были выявлены многочисленные штаммы бакуловирусов и соответствующие пригодные для них в качестве хозяев клетки насекомых, прежде всего для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
В качестве хозяев можно применять также культуры растительных клеток (см., например, US №5959177, US №6040498, US №6420548, US №7125978 и US №6417429 (описание технологии PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях).
-
В качестве хозяев можно применять также клетки позвоночных. Например, можно использовать клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы к росту в суспензии. Другими примерами приемлемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная с помощью ОВ40 (COS-7); линия клеток почки эмбриона человека (HEK 293-клетки или клетки линии 293, описанные, например, у Graham F.L. и др., J. Gen. Virol., 36, 1977, сс. 59-74); клетки почки детеныша хомяка (ВНК); клетки Сертоли мыши (ТМ4-клетки, описанные, например, у Mather J.P., Biol. Reprod., 23, 1980, сс. 243-251); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76,); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени бычьей крысы (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, описанные, например, у Mather J.Р. и др., Annals N.Y. Acad. Sci., 383, 1982, сс. 44-68); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другими ценными линиями клеток-хозяев млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая DHFR-CHO-клетки (Urlaub G. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, cc. 4216-4220); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор конкретных линий клеток-хозяев млекопитающих, которые можно применять для производства антител, см., например, у Yazaki Р. и Wu A.M., в: Methods in Molecular Biology под ред. В.K.С. Lo, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, cc. 255-268.
В. Анализы
Антитела к LAG3, представленные в настоящем описании, можно идентифицировать, подвергать скринингу или характеризовать их физические/химические свойства и/или виды биологической активности с помощью различных анализов, известных в данной области.
1. Анализы связывания и другие анализы
В одном из объектов изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, тестируют в отношении его антигенсвязывающей активности, например, с помощью известных методов, таких как ELISA, вестерн-блоттинг и т.д.
В другом объекте изобретения можно применять анализы в условиях конкуренции для идентификации антитела, которое конкурирует с aLAG3(0414) за связывание с LAG3. В некоторых вариантах осуществления изобретения такое конкурирующее антитело связывается с тем же самым эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), с которым связывается aLAG3(0414). Подробное описание приведенных в качестве примеров методов картирования эпитопа, с которым связывается антитело, представлено у Morris, «Epitope Mapping Protocols» в Methods in Molecular Biology, т. 66, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, 1996.
В представленном в качестве примера анализе в условиях конкуренции иммобилизованный LAG3 инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с LAG3 (например, aLAG3(0414)), и второе немеченое антитело, которое тестируют в отношении его способности конкурировать с первым антителом за связывание с LAG3. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля инкубируют иммобилизованный LAG3 в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не содержащем второе немеченное антитело. После инкубации в условиях, пригодных для связывания первого антитела с LAG3, удаляют избыток несвязанного антитела и измеряют количество метки, ассоциированной с иммобилизованным LAG3. Если количество метки, ассоциированной с иммобилизованным LAG3, значительно снижено в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это свидетельствует о том, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с LAG3. См. Harlow и Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, глава 14, изд-во Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988.
2. Анализы активности
В одном из объектов изобретения предложены анализы для идентификации антител к LAG3, обладающих биологической активностью. Биологическая активность может включать, например, воздействие антител к LAG3 (индивидуально или в комбинации с антителами к PDL1) на высвобождение цитотоксического гранзима В и секрецию IL-2 человеческими CD4 Т-клетками в по данным анализа реакции смешанных лимфоцитов (mMLR) или воздействие антител к LAG-3 на опосредуемое Treg подавление высвобождения гранзима В и IFN-γ человеческими CD4 Т-клетками; или ингибирование антителами к LAG3 связывания LAG-3 с молекулами ГКГС-II, экспрессируемыми на человеческих опухолевых клетках. Предложены также антитела, обладающие такой биологической активностью in vivo и/или in vitro.
В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, тестируют в отношении указанной биологической активности, что более подробно описано ниже в примерах 2 и 3.
Г. Способы и композиции для диагностирования и детекции
В некоторых вариантах осуществления изобретения любое из антител к LAG3, представленных в настоящем описании, можно применять для детекции присутствия LAG3 в биологическом образце. Понятие «детекция (обнаружение, определение)» в контексте настоящего описания включает количественную и качественную детекцию. В некоторых вариантах осуществления изобретения биологический образец содержит клетку или ткань, такую как опухолевая ткань.
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело к LAG3, предназначенное для применения в способе диагностирования или детекции. Другим объектом изобретения является способ обнаружения присутствия LAG3 в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ включает приведение в контакт биологического образца с антителом к LAG3, указанным в настоящем описании, в условиях, в которых происходит связывание антитела к LAG3 с LAG3, и определение того, образуется ли комплекс между антителом к LAG3 и LAG3. Указанный способ может представлять собой способ in vitro или in vivo. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к LAG3 применяют для отбора пациентов, которых можно подвергать терапии с использованием антитела к LAG3, например, когда LAG3 является биомаркером для отбора пациентов.
Примеры нарушений, которые можно диагностировать с использованием антитела, предлагаемого в изобретении, включают рак в различных формах, такой как хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL), рак молочной железы и т.д. (см. также приведенный ниже перечень видов рака)
32
14
125
3
131
Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются меченые антитела к LAG3. Метки включают (но, не ограничиваясь только ими) метки или фрагменты, которые можно обнаруживать непосредственно (такие как флуоресцентные, хромоформные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также фрагменты, такие как ферменты или лиганды, которые определяют косвенно, например, посредством ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия. Примеры меток включают (но, не ограничиваясь только ими) радиоактивные изотопы Р, С, I, Н, и I, флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люциферазу светлячка и бактериальную люциферазу (U.S. №4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу из хрена (HRP), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, оксидазы сахаридов, например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, оксидазы гетероциклических соединений, такие как уриказа и ксантиноксидаза, сшитая с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления предшественника красителя, такого как HRP, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, метки бактериофагов, стабильные свободные радикалы и т.п.
Д. Фармацевтические композиции

Фармацевтические композиции антитела к LAG3, представленного в настоящем описании, получают путем смешения указанного антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями ( Pharmaceutical Sciences, 16-е изд. под ред. Osol А., 1980) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, они включают (но, не ограничиваясь только ими): буферы, такие как фосфатный, цитратный буферы, а также буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и мета-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (содержащие менее приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поли(винилпирролидон); аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; содержащие металл комплексы (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). В контексте настоящего описания примеры фармацевтически приемлемых носителей включают также диспергирующие агенты интерстициальных лекарственных средств, такие как растворимые активные в нейтральной среде гликопротеины гиалуронидаз (sHASEGP), например, человеческие растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20, такие как rHuPH20 (HYLENEX, фирма Baxter International, Inc.). Некоторые примеры sHASEGP и методы их применения, в том числе rHuPH20, описаны в US 2005/0260186 и US 2006/0104968. Согласно одному из объектов изобретения sHASEGP объединяют с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.
Примеры лиофилизированных композиций антител описаны в US №6267958. Водные композиции антител включают композиции, описанные в US №6171586 и WO 2006/044908, последние композиции включают гистидин-ацетатный буфер.
Композиция, предлагаемая в изобретении, может содержать также более одного действующего вещества, если это необходимо для конкретного подлежащего лечению показания, предпочтительно вещества с дополнительными видами активности, которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга. Например, может оказаться желательным дополнительно применять антитела к PD1 или к PDL1, или антитела к TIM3. Такие действующие вещества должны присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для решения поставленной задачи.
Действующие вещества можно включать также в микрокапсулы, например, полученные с помощью методов коацервации или межфазной полимеризации, например в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы введения лекарственного средства (например в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в  Pharmaceutical Sciences, 16-е изд., под ред. Osol А., 1980.
Можно приготавливать препараты с замедленным высвобождением. Приемлемыми примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, включающие кольцевой слитый полипептид, такие матрицы представляют собой изделия определенной формы, например, пленки или микрокапсулы.
Композиции, предназначенные для применения in vivo, как правило, должны быть стерильными. Стерильность можно легко обеспечивать, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
Е. Терапевтические способы и композиции
Любое из антител к LAG3, представленных в настоящем описании, можно применять в терапевтических способах.
Одним из объектов изобретения является антитело к LAG3, предназначенное для применения в качестве лекарственного средства. Другими объектами изобретения являются антитело к LAG3 или его применение для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления изобретении предложено антитело к LAG3 для применения в способе лечения. В некоторых вариантах осуществления изобретении предложено антитело к LAG3 для применения в способе лечения индивидуума, имеющего рак, включающем введение индивидууму в эффективном количестве антитела к LAG3. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело предназначено для применения для лечения или замедления прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания, такого как опухолевый иммунитет. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело предназначено для применения для стимуляции иммунного ответа или функции, такой как Т-клеточная активность.
В других вариантах осуществления изобретения предложено антитело к LAG3 для применения в качестве иммуностимулятора или для стимуляции секреции/высвобождения гранзима В (GrzB), интерферона-гамма (IFN-гамма) и или интерлейкина 2 (IL-2). В некоторых вариантах осуществления изобретения, предложено антитело к LAG3 для применения в способе секреции/высвобождения гранзима В (GrzB), интерферона-гамма (IFN-гамма) и или интерлейкина 2 (IL-2) у индивидуума, включающем введение индивидууму в эффективном количестве антитела к LAG3 для секреции/высвобождения гранзима В (GrzB), интерферона-гамма (IFN-гамма) и или интерлейкина 2 (IL-2).
«Индивидуум» согласно любому из указанных выше вариантов осуществления изобретения предпочтительно представляет собой человека. В другом объекте изобретения предложено применения антитела к LAG3 для приготовления или получения лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для лечения рака. В другом варианте осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения рака, включающем введение индивидууму, имеющему рак, в эффективном количестве лекарственного средства. В другом варианте осуществления изобретения лекарственное средство предназначено для индукции опосредуемого клетками лизиса раковых клеток у индивидуума, страдающего раком, включающем введение индивидууму в эффективном количестве лекарственного средства для индукции апоптоза раковых клеток или ингибирования пролиферации раковых клеток. «Индивидуум» согласно любому из указанных выше вариантов осуществления изобретения может представлять собой человека.
Понятие «рак», используемое в настоящем описании, может обозначать, например, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCL), бронхоальвеолярно-клеточный рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичника, ректальный рак, рак анальной области, рак желудка, гастральный рак, рак ободочной кишки, рак молочной железы, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркому мягких тканей, рак мочеиспускательного канала, рак пениса, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, почечно-клеточную карциному, карциному почечной лоханки, мезотелиому, печеночно-клеточный рак, билиарный рак, неоплазмы центральной нервной системы (ЦНС), опухоли позвоночника, глиому ствола головного мозга, мультиформную глиобластому, астроцитомы, шванномы, эпендимомы, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденому гипофиза, лимфому, лимфоцитарный лейкоз, включая рефрактерные варианты любого из указанных выше видов рака или комбинации одного или нескольких из указанных выше видов рака. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения указанный рак представляет собой рак молочной железы, колоректальный рак, меланому, рак головы и шеи, рак легкого или рак предстательной железы. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения указанный рак представляет собой рак молочной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак легкого или рак предстательной железы. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения указанный рак представляет собой рак молочной железы, рак легкого, рак ободочной кишки, рак яичника, меланому, рак мочевого пузыря, ренальный рак, рак почки, рак печени, рак головы и шеи, колоректальный рак, рак поджелудочной железы, гастральную карциному, рак пищевода, мезотелиому, рак предстательной железы, лейкоз, лимфому, миеломы. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения указанные виды рака дополнительно характеризуются наличием экспрессии или сверхэкспрессии LAG3.
В другом объекте изобретения предложен способ лечения рака. В одном из вариантов осуществления изобретения способ включает введение индивидууму, имеющему рак, в эффективном количестве антитела к LAG3. «Индивидуум» согласно любому из указанных выше вариантов осуществления изобретения может представлять собой человека.
Другим объектом изобретения является способ индукции опосредованного клетками лизиса раковых клеток у индивидуума, страдающего раком. В одном из вариантов осуществления изобретения способ включает введение индивидууму в эффективном количестве антитела к LAG3 для индукции опосредованного клетками лизиса раковых клеток у индивидуума, страдающего раком. В одном из вариантов осуществления изобретения «индивидуум» представляет собой человека.
Другим объектом изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие любое из антител к LAG3, представленных в настоящем описании, например, для применения в любом из указанных выше терапевтических способов. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит любое из антител к LAG3, представленных в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.
Следующим объектом изобретения являются фармацевтические композиции, содержащие любое из антител к LAG3, представленных в настоящем описании, например, для применения в любом из указанных выше терапевтических способов. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит любое из антител к LAG3, представленных в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит любое из антител к LAG3, представленных в настоящем описании, и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, например, описанный ниже.
Антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять в терапии либо индивидуально, либо в комбинации с другими агентами. Например, антитело, предлагаемое в изобретении, можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительный терапевтический агент представляет собой антитело к LAG3 или антитело к PDL1, или антитело к TIM3.
В дополнение к антителу к LAG3 можно вводить также химиотерапевтическое средство. В одном из вариантов осуществления изобретения такие дополнительные химиотерапевтические средства, которые можно вводить в сочетании с антителом к LAG3, представленным в настоящем описании, включают (но, не ограничиваясь только ими) антинеопластические средства, такие как алкилирующие вещества, включая: азотистые производные горчичного газа, такие как мехлорэтамин, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан и хлорамбуцил; нитрозомочевины, такие как кармустин (BCNU), ломустин (CCNU) и семустин (метил-CCNU); Temodal™ (темозоламид), этиленимины/метилмеламины, такие как триэтиленмеламин (ТЕМ), триэтилен, тиофосфорамид (тиотепа), гексаметилмеламин (НММ, алтретамин; алкилсульфонаты, такие как бусульфан; триазины, такие как дакарбазин (DTIC)); антиметаболиты, включая аналоги фолиевой кислоты, такие как метотрексат и триметрексат, аналоги пиримидина, такие как 5-фторурацил (5FU), фтордезоксиуридин, гемцитабин, цитозинарабинозид (AraC, цитарабин), 5-азацитидин, 2,2'-дифтордезоксицитидин, аналоги пурина, такие как 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, азатиоприн, Т-дезоксикоформицин (пентостатин), эритрогидроксинониладенин (EHNA), флударабина фосфат и 2-хлордезоксиаденозин (кладрибин, 2-CdA); антимитотические лекарственные средства, полученные из природных продуктов, такие как паклитаксел, алкалоиды барвинка, включая винбластин (VLB), винкристин и винорелбин, таксотер, эстрамустин и эстрамустина фосфат; эпиподофилотоксины, такие как этопозид, тенипозид; антибиотики, такие как актиномицин D, дауномицин (рубидомицин), доксорубицин, митоксантрон, идарубицин, блеомицины, пликамицин (митрамицин), митомицин С и актиномицин; ферменты, такие как L-аспарагиназа; модификаторы биологического ответа, такие как интерферон-альфа, IL-2, G-CSF, GM-CSF; смешанные вещества, включая координированные комплексы на основе платины, такие как оксалиплатин, цисплатин и карбоплатин, антраценодионы, такие как митоксантрон, замещенная мочевина, такая как гидроксимочевина, производные метилгидразина, включая N-метилгидразин (MIH) и прокарбазин, адренокортикальные депрессанты, такие как митотан (o,p'-DDD) и аминоглутетимид; гормоны и антагонисты, включая адренокортикостероидные антагонисты, такие как преднизон и его эквиваленты, дексаметазон и аминоглутетимид; Gemzar™ (гемцитабин), прогестин, такой как гидроксипрогестерона капроат, медропрогестерона ацетат и мегестрола ацетат; эстрогены, такие как диэтилстилбесртол и эквиваленты этинилэстрадиола; антиэстроген, такой как тамоксифен; андрогены, включая тестостерона пропионат и флуоксиместерон/эквиваленты; антиандрогены, такие как флутамид, аналоги гонадотропинвысвобождающего гормона и леупролид; и нестероидные антиандрогены, такие как флутамид. Терапии, мишенью которых является эпигенетический механизм, включают (но, не ограничиваясь только ими) применение ингибиторов гистондеацетилаз, деметилирующих агентов (например, вайдаза) и терапий, обеспечивающих высвобождение факторов репрессии транскрипции (ATRA (полностью транс-ретиноевая кислота), можно объединять также с антигенсвязывающими белками. В одном из вариантов осуществления изобретения химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей таксаны (например, паклитаксел (таксол), доцетаксел (таксотер), модифицированный паклитаксел (например, абраксан и опаксио, доксорубицин, сунитиниб (сутент), сорафениб (нексавар) и другие мультикиназные ингибиторы, оксалиплатин, цисплатин и карбоплатин, этопозид, гемцитабин и винбластин. В одном варианте осуществления изобретения химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей таксаны (такие, например, как таксол (паклитаксел), доцетаксел (таксотер), модифицированный паклитаксел (например, абраксан и опаксио)). В одном варианте осуществления изобретения химиотерапевтическое средство выбирают из 5-фторурацила (5-FU), леоковорина, иринотекана или оксалиплатина. В одном варианте осуществления изобретения химиотерапевтическое средство представляет собой 5-фторурацил, леуковорин и иринотекан (FOLFIRI (фолфири)). В одном варианте осуществления изобретения химиотерапевтическое средство представляет собой 5-фторурацил и оксалиплатин (FOLFOX (фолфокс)).
Такие указанные выше комбинированные терапии включают совместное введение (при котором два или большее количество терапевтических средств включены в одну и ту же или раздельные препаративные формы), и раздельное введение, при котором введение антитела, предлагаемого в изобретении, можно осуществлять до, одновременно или после введения дополнительного(ых) терапевтического(их) средства или средств. В одном из вариантов осуществления изобретения введение антитела к LAG3 и введение дополнительного терапевтического средства осуществляют в пределах примерно одного месяца или в пределах примерно одной, двух или трех недель, или в пределах примерно одного, двух, трех, четырех, пяти или шести дней между введениями каждого из средств. Антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять также в комбинации с лучевой терапией.
Антитело, предлагаемое в изобретении (и любое дополнительное терапевтическое средство), можно вводить любыми приемлемыми путями, включая парентеральную, внутрилегочную и внутриназальную и при необходимости местную обработку, введение в повреждение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Введение доз можно осуществлять с помощью любого приемлемого пути, например, с помощью инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, в зависимости, в том числе, от того, является ли введение кратковременным или хроническим. В настоящем изобретении предусматриваются различные схемы дозирования, включая (но, не ограничиваясь только ими) однократные или многократные введения в различные моменты времени, болюсное введение и импульсную инфузию.
Антитела, предлагаемые в изобретении, можно включать в состав препаратов, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы, которые должны учитываться в этом контексте, включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние конкретного пациента, причину нарушения, область доставки агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим медицинским специалистам. Антитело можно (но это не является необходимым) включать в состав препаративной формы в сочетании с одним или несколькими агентами, применяемыми в настоящее время для предупреждения или лечения рассматриваемого нарушения. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в препаративной форме, типа нарушения или лечения и других описанных выше факторов. Как правило, их применяют в тех же дозах и с использованием тех же путей введения, которые описаны выше, или в дозах, составляющих примерно от 1 до 99% от доз, указанных в настоящем описании, и с использованием любого пути введения, который является пригодным с эмпирической/клинической точки зрения.
Пригодная для предупреждения или лечения заболевания доза антитела, предлагаемого в изобретении (при его применении индивидуально или в комбинации с одним или несколькими другими дополнительными терапевтическими средствами), должна зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, серьезности и протекания заболевания, от того, вводят антитело в профилактических или терапевтических целях, предшествующей терапии, клинической истории пациента и ответа на антитело, и от решения лечащего врача. Антитело можно вводить пациенту однократно или путем серии обработок. В зависимости от типа и серьезности заболевания возможная начальная доза антитела для введения пациенту, например, с использованием одного или нескольких индивидуальных введений или с помощью непрерывной инфузии, может составлять примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1-10 мг/кг). Типичная суточная доза может составлять от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от отмеченных выше факторов. Для повторных введений в течение нескольких дней или более продолжительного периода в зависимости от состояния лечение, как правило, должно продолжаться до достижения требуемого подавления имеющихся симптомов заболевания. В качестве примера, доза антитела может составлять от примерно 0,05 до примерно 10 мг/кг. Так, пациенту можно вводить одну или несколько доз, составляющих примерно 0,5, 2,0, 5,0 или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Указанные дозы можно вводить прерывисто, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, чтобы пациент получал от примерно двух до примерно двадцати или, например, примерно шесть доз антитела). Можно вводить начальную более высокую ударную дозу, после которой применять одну или несколько более низких доз. Однако можно использовать другие схемы введения доз. Успех такой терапии легко оценивать с помощью общепринятых методик и анализов.
Следует понимать, что любой из указанных выше препаратов или терапевтических методов можно применять с использованием иммуноконъюгата, предлагаемого в изобретении, вместо антитела к LAG3 или в дополнение к нему.
Ж. Изделия
Другим объектом изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения, предупреждения и/или диагностирования указанных выше нарушений. Изделие представляет собой контейнер и этикетку или листовку-вкладыш в упаковку, которая размещена на контейнере или прилагаются к нему. Приемлемыми контейнерами являются, например банки, пузырьки, шприцы, пакеты для внутривенного (IV) раствора и т.д. Контейнеры можно изготавливать из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в сочетании с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностирования состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или пузырек, снабженный пробкой, которую можно прокалывать с помощью иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой антитело, предлагаемое в изобретении. На этикетке или листовке-вкладыше в упаковку указано, что композицию применяют для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может включать (а) первый контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит антитело, предлагаемое в изобретении; и (б) второй контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит дополнительное цитотоксическое или иное терапевтическое средство. Согласно этому варианту осуществления изобретения изделие может содержать листовку-вкладыш в упаковку, которая содержит информацию о том, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. В альтернативном или дополнительном варианте изделие может дополнительно включать второй (или третий) контейнер с фармацевтически приемлемым буфером, таким как бактериостатическая вода для инъекций (БСВИ), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать другие материалы, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в частности, другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Описание аминокислотных последовательностей и нуклеотидных последовательностей
SEQ ID NO: 1 HVR-H1 тяжелой цепи, aLAG3(0414)
SEQ ID NO: 2 HVR-H2 тяжелой цепи, aLAG3(0414)
SEQ ID NO: 3 HVR-H3 тяжелой цепи, aLAG3(0414)
SEQ ID NO: 4 HVR-L1 легкой цепи, aLAG3(0414)
SEQ ID NO: 5 HVR-L2 легкой цепи, aLAG3(0414)
SEQ ID NO: 6 HVR-L3 легкой цепи, aLAG3(0414)
SEQ ID NO: 7 вариабельный домен тяжелой цепи VH, aLAG3(0414)
SEQ ID NO: 8 вариабельный домен легкой цепи VL, aLAG3(0414)
SEQ ID NO: 9 HVR-H1 тяжелой цепи, aLAG3(0403)
SEQ ID NO: 10 HVR-H2 тяжелой цепи, aLAG3(0403)
SEQ ID NO: 11 HVR-H3 тяжелой цепи, aLAG3(0403)
SEQ ID NO: 12 HVR-L1 легкой цепи, aLAG3(0403)
SEQ ID NO: 13 HVR-L2 легкой цепи, aLAG3(0403)
SEQ ID NO: 14 HVR-L3 легкой цепи, aLAG3(0403)
SEQ ID NO: 15 вариабельный домен тяжелой цепи VH, aLAG3(0403)
SEQ ID NO: 16 вариабельный домен легкой цепи VL, aLAG3(0403)
SEQ ID NO: 17 HVR-H1 тяжелой цепи, aLAG3(0411)
SEQ ID NO: 18 HVR-H2 тяжелой цепи, aLAG3(0411)
SEQ ID NO: 19 HVR-H3 тяжелой цепи, aLAG3(0411)
SEQ ID NO: 20 HVR-L1 легкой цепи, aLAG3(0411)
SEQ ID NO: 21 HVR-L2 легкой цепи, aLAG3(0411)
SEQ ID NO: 22 HVR-L3 легкой цепи, aLAG3(0411)
SEQ ID NO: 23 вариабельный домен тяжелой цепи VH, aLAG3(0411)
SEQ ID NO: 24 вариабельный домен легкой цепи VL, aLAG3(0411)
SEQ ID NO: 25 HVR-H1 тяжелой цепи, aLAG3(0417)
SEQ ID NO: 26 HVR-H2 тяжелой цепи, aLAG3(0417)
SEQ ID NO: 27 HVR-H3 тяжелой цепи, aLAG3(0417)
SEQ ID NO: 28 HVR-L1 легкой цепи, aLAG3(0417)
SEQ ID NO: 29 HVR-L2 легкой цепи, aLAG3(0417)
SEQ ID NO: 30 HVR-L3 легкой цепи, aLAG3(0417)
SEQ ID NO: 31 вариабельный домен тяжелой цепи VH, aLAG3(0417)
SEQ ID NO: 32 вариабельный домен легкой цепи VL, aLAG3(0417)
SEQ ID NO: 33 HVR-H1 тяжелой цепи, aLAG3(0416)
SEQ ID NO: 34 HVR-H2 тяжелой цепи, aLAG3(0416)
SEQ ID NO: 35 HVR-H3 тяжелой цепи, aLAG3(0416)
SEQ ID NO: 36 HVR-L1 легкой цепи, aLAG3(0416)
SEQ ID NO: 37 HVR-L2 легкой цепи, aLAG3(0416)
SEQ ID NO: 38 HVR-L3 легкой цепи, aLAG3(0416)
SEQ ID NO: 39 вариабельный домен тяжелой цепи VH, aLAG3(0416)
SEQ ID NO: 40 вариабельный домен легкой цепи VL, aLAG3(0416)
SEQ ID NO: 41 вариабельный домен тяжелой цепи VH, BMS-986016 (WO 2014/008218 и US 2016/0326248)
SEQ ID NO: 42 вариабельный домен легкой цепи VL BMS-986016 (WO 2014/008218 и US 2016/0326248)
SEQ ID NO: 43 вариабельный домен тяжелой цепи VH, MDX25F7 (25F7) (US 2011/0150892 и WO 2014/008218)
SEQ ID NO: 44 вариабельный домен легкой цепи VL, MDX25F7 (25F7) (US 2011/0150892 и WO 2014/008218)
SEQ ID NO: 45 вариабельный домен тяжелой цепи VH, гуманизированное ВАР050 (LAG525) (US 2015/0259420)
SEQ ID NO: 46 вариабельный домен легкой цепи VL, гуманизированное ВАР050 (LAG525) (US 2015/0259420)
SEQ ID NO: 47 вариабельный домен тяжелой цепи VH, MDX26H10 (26Н10) (US 2011/0150892)
SEQ ID NO: 48 вариабельный домен легкой цепи VL, MDX26H10 (26Н10) (US 2011/0150892)
SEQ ID NO: 49 константная область человеческой легкой каппа-цепи
SEQ ID NO: 50 константная область человеческой легкой лямбда-цепи
SEQ ID NO: 51 константная область человеческой тяжелой цепи, происходящая из IgG1
SEQ ID NO: 52 константная область человеческой тяжелой цепи, происходящая из IgG1. с мутациями L234A, L235A и P329G
SEQ ID NO: 53 константная область человеческой тяжелой цепи, происходящая из IgG4
SEQ ID NO: 54 пример последовательности человеческого LAG3 (без сигнальной последовательности)
SEQ ID NO: 55 внеклеточный домен (ECD) человеческого LAG3 (ECD)
SEQ ID NO: 56 праймер rbHC.up
SEQ ID NO: 57 праймер rbHCf.do
SEQ ID NO: 58 праймер BcPCR_FHLC_leader.fw
SEQ ID NO: 59 праймер BcPCR_huCkappa.rev
Ниже перечислены аминокислотные последовательности VH- и VL-доменов, включая отмеченные HVR (HVR выделены жирным шрифтом и подчеркнуты) антител к LAG3 с aLAG3(0403) по aLAG3(0417):
1) aLAG3(0403)
2) aLAG3(0411)
3) aLAG3(0414)
4) aLAG3(0416)
5) aLAG3(0417)
Ниже перечислены конкретные варианты осуществления изобретения:
1. Выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело содержит
A) (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и (е) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; или
Б) (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и (е) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; или
В) (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и (е) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; или
Г) (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29; и (е) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; или
Д) (a) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33; (б) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; (в) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; (г) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (д) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37; и (е) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
2. Выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело содержит
A) (а) VH-домен, который содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3; и (б) VL-домен, который содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; или
Б) (а) VH-домен, который содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11; и (б) VL-домен, который содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; или
B) (а) VH-домен, который содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11; и (б) VL-домен, который содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; или
Г) (а) VH-домен, который содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 27; и (б) VL-домен, который содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; или
Д) (а) VH-домен, который содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 35; и (б) VL-домен, который содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37 и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
3. Выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело
I) содержит VH-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 7, и VL-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 8;
II) содержит VH-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 15, и VL-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 16;
III) содержит VH-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 23, и VL-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 24;
IV) содержит VH-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 31, и VL-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 32; или
V) содержит VH-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 39, и VL-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 40.
4. Выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело содержит
A) (а) VH-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 7 и VL-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 8; где VH-домен содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 3; и (б) VL-домен содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; или
Б) (а) VH-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 15 и VL-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 16; где VH-домен содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 11; и (б) VL-домен содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; или
B) (а) VH-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 23 и VL-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 24; где VH-домен содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 19; и (б) VL-домен содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21 и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; или
Г) (а) VH-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 31 и VL-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 32; где VH-домен содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 27; и (б) VL-домен содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29 и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30; или
Д) (а) VH-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 39 и VL-домен, аминокислотная последовательность которого идентична на 95%, 96%, 97% или 98% последовательности SEQ ID NO: 40; где VH-домен содержит (I) HVR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, (II) HVR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, и (III) HVR-H3 содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 35; и (б) VL-домен содержит (I) HVR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (II) HVR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37, и (III) HVR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38.
5. Выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело
I) содержит последовательность VH SEQ ID NO: 7, и последовательность VL SEQ ID NO: 8;
II) содержит последовательность VH SEQ ID NO: 15, и последовательность VL SEQ ID NO: 16;
III) содержит последовательность VH SEQ ID NO: 23, и последовательность VL SEQ ID NO: 24;
IV) содержит последовательность VH SEQ ID NO: 31, и последовательность VL SEQ ID NO: 32; или
V) содержит последовательность VH в SEQ ID NO: 39, и последовательность VL SEQ ID NO: 40.
6. Выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело содержит последовательность VH SEQ ID NO: 7, и последовательность VL SEQ ID NO: 8.
7. Выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело содержит последовательность VH SEQ ID NO: 15 и последовательность VL SEQ ID NO: 16.
8. Выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело содержит последовательность VH SEQ ID NO: 23, и последовательность VL SEQ ID NO: 24.
9. Выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело содержит последовательность VH SEQ ID NO: 31, и последовательность VL SEQ ID NO: 32.
10. Выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело содержит последовательность VH SEQ ID NO: 39, и последовательность VL SEQ ID NO: 40.
11. Антитело к LAG3 по одному из предыдущих вариантов осуществления изобретения, где антитело характеризуется независимо одним или несколькими из следующих свойств:
антитело к LAG3
I) конкурирует за связывание с LAG3 с антителом к LAG3, содержащим VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и/или
II) связывается с LAG3 человека и обезьян циномолгус; и/или
III) ингибирует связывание молекул ГКГС-II, экспрессируемых на человеческих опухолевых клетках А375; и/или
IV) повышает высвобождение гранзима В или IL-2 по данным анализа реакции смешанных лимфоцитов (mMLR) (что описано в примере 3).
12. Выделенное антитело, которое связывается с человеческим LAG3, где антитело:
I) конкурирует за связывание с LAG3 с антителом к LAG3, содержащим VH, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, и VL, имеющую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, и/или
II) связывается с LAG3 человека и обезьян циномолгус; и/или
III) ингибирует связывание молекул ГКГС-II, экспрессируемых на человеческих опухолевых клетках А375; и/или
IV) повышает высвобождение гранзима В или IL-2 по данным анализа реакции смешанных лимфоцитов (mMLR) (что описано в примере 3).
13. Антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления изобретения, которое представляет собой моноклональное антитело.
14. Антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления изобретения, которое представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело.
15. Антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления изобретения, которое представляет собой фрагмент антитела, который связывается с LAG3.
16. Антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления изобретения, которое представляет собой полноразмерное антитело IgG1-изотипа.
17. Антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления изобретения, которое представляет собой полноразмерное антитело IgG1-изотипа с мутациями L234A, L235A и P329G (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
18. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления изобретения.
19. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по варианту осуществления изобретения 18.
20. Способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по варианту осуществления изобретения 19 таким образом, чтобы продуцировалось антитело.
21. Способ по варианту осуществления изобретения 20, дополнительно включающий выделение антитела из клетки-хозяина.
22. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело по одному из вариантов осуществления изобретения 1-17 и фармацевтически приемлемый носитель.
23. Антитело по одному из вариантов осуществления изобретения 1-17, предназначенное для применения в качестве лекарственного средства.
24. Антитело по одному из вариантов осуществления изобретения 1-17, предназначенное для применения для лечения рака.
25. Применение антитела по одному из вариантов осуществления изобретения 1-17 для приготовления лекарственного средства.
26. Применение по варианту осуществления изобретения 25, где лекарственное средство предназначено для лечения рака.
27. Способ лечения индивидуума, имеющего рак, где способ включает введение индивидууму в эффективном количестве антитела по варианту осуществления изобретения 1.
28. Способ лечения или замедления прогрессирования связанного с иммунной системой заболевания, такого как опухолевый иммунитет, где способ включает введение индивидууму в эффективном количестве антитела по варианту осуществления изобретения 1.
29. Способ стимулирования иммунного ответа или функции, такой как Т-клеточная активность, где способ включает введение индивидууму в эффективном количестве антитела по варианту осуществления изобретения 1.
III. Примеры
Ниже представлены примеры способов и композиций, предлагаемых в изобретении. Как должно быть очевидно, можно воплощать на практике различные другие варианты осуществления изобретения в целом с учетом представленного выше описания изобретения.
Хотя представленное выше изобретение было подробно описано с использованием иллюстраций и примеров для ясности понимания, описания и примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения. Описания всех патентов и научных публикаций специально полностью включены в настоящее описание в качестве ссылки.
Пример 1:
Создание антител к LAG3
Иммунизация кроликов
Трансгенных кроликов, являющихся собственностью фирмы Roche, в организме которых экспрессировался спектр гуманизированных антител, иммунизировали плазмидной ДНК, экспрессирующей LAG3.
Группу из 3 кроликов генетически иммунизировали с использованием плазмидного экспрессионного вектора, кодирующего полноразмерный человеческий LAG3 (15352_pIntronA_fl-hLag3_DNA-IMS), путем внутрикожного введения 400 мкг векторной ДНК, после чего осуществляли электропорацию (5 квадратных импульса по 750 В/см, продолжительность 10 мс, интервал 1 с). Осуществляли 7 последовательных иммунизации кроликов в дни 0, 14, 28, 49, 70, 98 и 126. Образцы крови (10% от оцененного общего объема крови) брали в дни 35, 77, 105 и 133. Получали сыворотку, которую использовали для определения титра с помощью ELISA (см. ниже), и выделяли мононуклеарные клетки периферической крови, которые использовали в качестве источника антигенспецифических В-клеток в описанном ниже процессе клонирования В-клеток.
Определение титров в сыворотке (ELISA)
Человеческий рекомбинантный белок LAG3 в концентрации 2 мкг/мл, 100 мкл/лунку, в ЗФР иммобилизовали на 96-луночном планшете NUNC Maxisorp, после чего: блокировали планшет, используя 2% кротеина С в ЗФР, 200 мкл/лунку; вносили с дублированием серийные разведения антисыворотки в 0,5% кротеина С в ЗФР, 100 мкл/лунку; проводили обнаружение с использованием либо (1) конъюгированного с HRP ослиного антитела к кроличьему IgG (фирма Jackson Immunoresearch/Dianova 711-036-152; 1/16000), либо (2) конъюгированного с HRP кроличьего антитела к человеческому IgG (фирма Pierce/Thermo Scientific 31423; 1/5000), либо (3) биотинилированного козьего антитела к человеческой каппа-цепи (фирма Southern Biotech/Biozol 2063-08, 1/5 000) и стрептавидина-HRP; каждого, разведенного в 0,5% кротеина С в ЗФР, 100 мкл/лунку. Для всех стадий планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С. В промежутке между всеми стадиями планшеты промывали 3 раза с использованием 0,05% Твин 20 в ЗФР. Сигнал генерировали путем добавления растворимого субстрата ВМ Blue POD (фирма Roche), 100 мкл/лунку; и реакцию прекращали путем добавления 1М HCl, 100 мкл/лунку. Абсорбцию считывали при 450 нм, длину волны 690 нм принимали в качестве референс-длины волны. Титр определяли как разведение антисыворотки, при котором уровень сигнала составлял половину от максимального.
Выделение мононуклеарных клеток периферической крови кролика (РВМС)
У иммунизированных трансгенных кроликов брали образцы крови. ЭДТК, содержащую цельную кровь, двукратно разводили 1×ЗФР (фирма РАА, Пашинг, Австрия) перед осуществлением центрифугирования в градиенте плотности с использованием среды Лимфолит для клеток млекопитающих (Lympholyte Mammal, фирма Cedarlane Laboratories, Бурлингтон, Онтарио, Канада) согласно спецификациям производителя. РВМС промывали дважды 1×ЗФР.
Среда EL-4 В5
Применяли среду RPMI 1640 (фирма Pan Biotech, Айденбах, Германия), дополненную 10% FCS (фирма Hyclone, Логан, шт. Юта, США), 2 мМ глутамином, 1%-ным раствором пенициллина/стрептомицина (фирма РАА, Пашинг, Австрия), 2 мМ пируватом натрия, 10 мМ HEPES (фирма Pan Biotech, Айденбах, Германия) и 0,05 мМ b-меркаптоэтанолом (фирма Gibco, Пейсли, Шотландия).
Сенсибилизация планшетов белковым антигеном
Стерильные 6-луночные планшеты для клеточных культур сенсибилизировали человеческим ECD LAG3, конъюгированным с человеческим Fc-фрагментом (2 мкг/мл) в карбонатном буфере (0,1М бикарбонат натрия, 34 мМ вторичный кислый карбонат натрия, рН 9,55) в течение ночи при 4°С. Планшеты трижды промывали стерильным ЗФР перед применением.
Истощение клеток
(а) Стерильные 6-луночные планшеты (пригодной для клеточных культур чистоты), покрытые конфлюэнтным монослоем клеток СНО, применяли для истощения макрофагов/моноцитов посредством неспецифической адгезии, а также неспецифического связывания лимфоцитов.
(б) Пустые стерильные 6-луночные планшеты (пригодной для клеточных культур чистоты) применяли для истощения макрофагов и моноцитов, а также других клеток посредством неспецифической адгезии.
Половину образца РВМС использовали для осуществления истощения согласно п. (а) и половину для истощения согласно п. (б).
6
Каждую лунку заполняли до максимума, внося в 4 мл среды по 6×10 РВМС из иммунизированных кроликов, и давали связываться в течение 1 ч при 37°С в инкубаторе. Клетки, находящиеся в супернатанте (лимфоциты периферической крови (PBL)), использовали для стадии пэнинга антигена.
Обогащение В-клеток на антигене LAG3
Белковый антиген
6
В 6-луночные планшеты для культур ткани, сенсибилизированные белком LAG3-ECD-huFc, высевали по 6×10 PBL на 4 мл среды, полученных на стадиях истощения с использованием пустого 6-луночного планшета, и давали связываться в течение 1 ч при 37°С в инкубаторе. Непрекрепившиеся клетки удаляли путем осторожной 1-2-кратной промывки лунок 1×ЗФР. Оставшиеся прилипшие клетки отделяли путем обработки трипсином в течение 10 мин при 37°С в инкубаторе. Обработку трипсином прекращали путем добавления среды EL-4 В5. Клетки выдерживали на льду до осуществления иммунофлуоресцентного окрашивания.
Антиген клеточной поверхности
6
В 6-луночные планшеты для культур ткани, покрытые монослоем человеческих LAG3-позитивных клеток СНО, высевали по 6×10 PBL на 4 мл среды, полученных на стадиях истощения с использованием 6-луночных планшетов, покрытых СНО, и давали связываться в течение 1 ч при 37°С в инкубаторе. Непрекрепившиеся клетки удаляли путем осторожной 1-2-кратной промывки лунок 1×ЗФР. Оставшиеся прилипшие клетки отделяли путем обработки трипсином в течение 10 мин при 37°С в инкубаторе. Обработку трипсином прекращали путем добавления среды EL-4 В5. Клетки выдерживали на льду до осуществления иммунофлуоресцентного окрашивания.
Иммунофлуоресцентное окрашивание и проточная цитометрия
Для сортинга одиночных клеток использовали антитело анти-IgG FITC (фирма AbD Serotec, Дюссельдорф, Германия) и анти-huCk РЕ (фирма Dianova, Гамбург, Германия). Для окрашивания поверхности клетки, полученные после стадии истощения и обогащения, инкубировали с антителом анти-IgG FITC и анти-huCk РЕ в ЗФР и инкубировали в течение 45 мин в темноте при 4°С. После окрашивания РВМС двукратно промывали охлажденным на льду ЗФР. В завершение РВМС ресуспендировали в охлажденном на льду ЗФР и сразу же подвергали FACS-анализу. Перед осуществлением FACS-анализа добавляли йодид пропидия в концентрации 5 мкг/мл (фирма BD Pharmingen, Сан-Диего, шт. Калифорния, США) для того, чтобы различить мертвые и живые клетки.
Для сортинга одиночных клеток применяли устройство Becton Dickinson FACSAria, снабженное компьютером и программным обеспечением FACSDiva (фирма BD Biosciences, США).
Культивирование В-клеток
5
Культивирование кроличьих В-клеток осуществляли согласно методу, описанному у Seeber с соавторами (S. Seeber и др., PLoS One 9 (2), е86184., 4 февраля 2014 г.). В целом, метод состоял в следующем. Отсортированные одиночные кроличьи В-клетки инкубировали в 96-луночных планшетах с 200 мкл/лунку среды EL-4 В5, содержащей клетки Pansorbin (1:100000) (фирма Calbiochem (фирма Merck), Дармштадт, Германия), 5%-ный супернатант кроличьих тимоцитов (фирма MicroCoat, Бернрид, Германия) и обработанные гамма-излучением мышиные клетки тимомы EL-4 В5 (5×10 клеток/лунку) в течение 7 дней при 37°С в инкубаторе. Супернатанты В-клеточной культуры отбирали для скрининга, а оставшиеся клетки сразу немедленно и замораживали при -80°С в 100 мкл буфера RLT (фирма Qiagen, Гильден, Германия).
Выделение V-доменов антител к LAG3
ПЦР-амплификация V-доменов
Получали общую РНК из В-клеточных лизатов (ресуспендированных в буфере RLT, фирма Qiagen, каталожный №79216) с использованием набора NucleoSpin 8/96 RNA (фирма Macherey&Nagel; 740709.4, 740698) согласно протоколу производителя. РНК элюировали с использованием 60 мкл свободной от РНКазы воды. Использовали 6 мкл РНК для получения кДНК с помощью реакции с обратной транскриптазой с применением Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (фирма Invitrogen, 18080-400) и олиго dT-праймера согласно инструкциям производителя. Все стадии осуществляли с использованием системы Hamilton ML Star. Использовали 4 мкл кДНК для амплификации вариабельных областей тяжелой и легкой цепей (VH и VL) иммуноглобулина с применением AccuPrime Supermix (фирма Invitrogen, 12344-040) в конечном объеме 50 мкл с использованием праймеров rbHC.up и rbHC.do для тяжелой цепи и BcPCR_FHLC_leader.fw и BcPCR_huCkappa.rev для легкой цепи (таблица 1.1). Все прямые праймеры обладали специфичностью в отношении сигнального пептида (соответственно VH и VL), в то время как обратные праймеры обладали специфичностью в отношении константных областей (соответственно VH и VL). Условия ПЦР для RbVH были следующими: горячий старт при 94°С в течение 5 мин; 35 циклов по 20 с при 94°С, 20 с при 70°С, 45 с при 68°С и конечное удлинение при 68°С в течение 7 мин. Условия ПЦР для HuVL были следующими: горячий старт при 94°С в течение 5 мин; 40 циклов по 20 с при 94°С, 20 с при 52°С, 45 с при 68°С и конечное удлинение при 68°С в течение 7 мин.
8 мкл из 50 мкл раствора для ПЦР загружали на 2%-ный гель 48 E-Gel (фирма Invitrogen, G8008-02). Позитивные ПЦР-продукты очищали с использованием набора NucleoSpin Extract II (фирма Macherey&Nagel; 740609250) согласно протоколу производителя и элюировали с помощью 50 мкл буфера для элюирования. Все стадии очистки осуществляли с использованием системы Hamilton ML Starlet.
Рекомбинантная экспрессия кроличьих моноклональных двухвалентных антител
Для осуществления рекомбинантной экспрессии кроличьих моноклональных двухвалентных антител ПЦР-продукты, кодирующие VH или VL, клонировали в виде кДНК в экспрессионных векторах методом клонирования с выступающими концами (R.S. Haun и др., Biotechniques, 13, 1992, сс. 515-518; M.Z. Li и др., Nature Methods, 4, 2007, сс. 251-256). Экспрессионные векторы содержали кассету экспрессии, состоящую из 5'-промотора CMV, включающего интрон А, и 3'-последовательности полиаденилирования BGH. Помимо кассеты экспрессии плазмиды содержали сайт инициации репликации из pUC18 и ген бета-лактамазы, обусловливающий устойчивость к ампициллину, для амплификации плазмиды в E.coli. Использовали три варианта основной плазмиды: одна плазмида содержала константную область кроличьего IgG, предназначенную для включения VH-областей, и при этом содержала константную область человеческой легкой каппа-цепи LC, предназначенную для включения VL-областей.
Линеаризованные экспрессионные плазмиды, кодирующие константные области каппа- или гамма-цепи и VL/VH-вставки, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием перекрывающихся праймеров.
Очищенные ПЦР-продукты инкубировали с ДНК-полимеразой Т4, которая создавала одноцепочечные выступы. Реакцию прекращали путем добавления дЦТФ.
На следующей стадии объединяли плазмиду и вставки и инкубировали с recA, которая индуцировала сайтспецифическую рекомбинацию. Рекомбинантными плазмидами трансформировали E.coli. На следующий день выросшие колонии отбирали и тестировали в отношении правильности рекомбинантной плазмиды, осуществляя получение препарата, рестрикционный анализ и ДНК-секвенирование.
Для экспрессии антител выделенными плазмидами для НС и LC кратковременно трансфектировали клетки HEK293 и через 1 неделю собирали супернатант.
Пример 2:
Характеризация антител к LAG3
ELISA для человеческого Lag3
Планшеты Nunc maxisorp (фирма Nunc, 464718) сенсибилизировали из расчета 25 мкл/лунку химерным белком рекомбинантный человеческий LAG-3-Fc (фирма R&D Systems, 2319-L3) при концентрации белка 800 нг/мл и инкубировали при 4°С в течение ночи или в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки (3×90 мкл/лунку ЗФРТ-буфера) каждую лунку инкубировали с 90 мкл блокирующего буфера (ЗФР + 2% БСА + 0,05% Твин 20) в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывки (3×90 мкл/лунку ЗФРТ-буфера) добавляли 25 мкл образцов антитела к Lag3 в концентрации 1-9 мкг/мл (разведения в соотношении 1:3 в буфере OSEP) и инкубировали в течение 1 ч при КТ. После промывки (3×90 мкл/лунку ЗФРТ-буфера) добавляли 25 мкл/лунку конъюгата козье антитело к κ-цепи человеческого Ig-HRP (фирма Milipore, АР502Р) в разведении 1:2000 и инкубировали при КТ в течение 1 ч. После промывки (3×90 мкл/лунку ЗФРТ-буфера) добавляли 25 мкл/лунку субстрата ТМВ (фирма Roche, 11835033001) и инкубировали в течение 2-10 мин. Измерения проводили с использованием устройства Tecan Safire 2 при 370/492 нм.
ELISA для оценки связывания Lag3 с клеточной поверхностью
Высевали по 25 мкл/лунку несущие Lag3 клетки (рекомбинантные СНО-клетки, экспрессирующие Lag3, 10000 клеток/лунку) в обработанные 384-луночные планшеты для тканевой культуры (фирма Corning, 3701) и инкубировали при 37°С в течение одного или двух дней. На следующий день после удаления среды добавляли 25 мкл образцов антител к Lag3 (разведения в соотношении 1:3 в буфере OSEP, начиная с концентрации 6-40 нМ) и инкубировали в течение 2 ч при 4°С. После промывки (1×90 мкл/лунку ЗФРТ) клетки фиксировали путем добавления по 30 мкл/лунку глутарового альдегида до конечной концентрации 0,05% (фирма Sigma, каталожный №: G5882) в течение 10 мин при комнатной температуре. После промывки (3×90 мкл/лунку ЗФРТ-буфера) добавляли по 25 мкл/лунку конъюгата козье антитело к κ-цепи человеческого Ig (фирма Milipore, АР502Р) в разведении 1:1000 и инкубировали при КТ в течение 1 ч. После промывки (3×90 мкл/лунку ЗФРТ-буфера) добавляли по 25 мкл/лунку субстрат ТМВ (фирма Roche, 11835033001) и инкубировали в течение 6-10 мин. Измерения проводили с использованием устройства Tecan Safire 2 при 370/492 нм.
Характеризация антител к LAG3 методом SPR (фирма Biacore)
Анализ на основе метода поверхностного плазмонного резонанса (SPR) применяли для определения кинетических параметров связывания между антителом к Lag3 в виде одновалентных Fab-фрагментов и меченными человеческим Fc внеклеточными доменами (ECD) человеческого Lag3 при 25°С.
Для этого подготавливали две проточные ячейки биосенсорного чипа С1 в устройстве Biacore Т200 путем иммобилизации нейтравидина, разведенного до концентрации 25 мкг/мл ацетатным буфером, рН 4,5, с использованием «мастера иммобилизации» («immobilization wizard»). Это приводило к достижению уровней иммобилизации, соответствующих примерно 1900 RU. Затем связывали конъюгат биотин-антитело к IgG-Fc (человеческий) CaptureSelect™ с нейтравидином, используя разведение 20 мкг/мл в подвижном буфере (HBS-EP+, фирма GE Healthcare).
Сам метод состоял в выполнении четырех команд на цикл. Первая команда: захват ~46 RU huLag3-Fc (20 с, 10 мкл/мин). Вторая команда: инъекция образца в течение 120 с с последующей диссоциацией продолжительностью 1200 с при скорости потока 30 мкл/мин. Третья и четвертая команда: регенерация посредством инъекции глицин-HCl, рН 1,5, в течение 30 с.
Затем с помощью ранее описанного метода осуществляли измерения для серийных разведений (3,13-200 нМ, двукратные разведения в подвижном буфере) каждого Fab-фрагмента антитела и дополнительных пустых циклов. После этого применяли программу оценки для Biacore Т200 для получения кинетических величин, используя аппроксимацию на основе модели связывания 1:1 Лэнгмюра, устанавливая параметр для аппроксимации Rmax: «локальный», поскольку уровни захвата не были идеально воспроизводимыми. Результаты представлены в таблице 2.
Анализ на основе метода поверхностного плазмонного резонанса (SPR) применяли для определения кажущихся аффинностей, характеризующих взаимодействие между связывающими агентами aLag3 в их двухвалентном формате и внеклеточными доменами (ECD) человеческого Lag3 при 25°С.
Для этого подготавливали биосенсорный чип фирмы Biacore для анализа с использованием устройства Biacore Т200 путем иммобилизации содержащего точечную мутацию специфического антитела до уровня, соответствующего как минимум примерно 800 RU, в стандартных условиях аминного сочетания.
После этого в каждом цикле осуществляли захват образца антитела и в систему вносили ECD huLag3 в одной из концентраций из серии концентраций (состоящей в общей сложности из четырех концентраций) на период времени, составляющий 200 с, за которым следовал период диссоциации продолжительностью 1200 с. Затем осуществляли регенерацию биосенсорного чипа.
Полученные экспериментальные данные оценивали с использованием характеристик «Карты взаимодействий», полученной с помощью программы Ridgeview Diagnostics TraceDrawer, для расчета индивидуального вклада в кажущуюся аффинность связывания каждого образца.
Результаты представлены в таблице 2.
Картирование эпитопов
Группировка эпитопов (разделение на группы, «корзины») осуществляли с помощью анализа на основе метода поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Для этого связывающие агенты aLag3 связывали с huLag3 в устройстве Biacore Т200. Затем оценивали доступность ранее сформированного комплекса связывающий агент aLag3-huLag3 для других связывающих агентов.
Для осуществления этого анализа использовали набор SA САР (фирма GE Healthcare). Если не указано иное, то этот анализ осуществляли согласно руководству для набора SA САР.
Анализ включал только один тип цикла. После гибридизации давали возможность биотинилированному меченному huFc huLag3 в концентрации 10 нМ связываться со стрептавидином на сенсорном чипе в течение 20 с при скорости потока 10 мкл/мин. Затем инъецировали первый образец, разведенный до 200 нМ в подвижном буфере, в течение 180 с при скорости потока 30 мкл/мин, после чего немедленно инъецировали второй образец в тех же самых условиях. После этого поверхность регенерировали.
Затем образцы приписывали к различным эпитопным группам со сходными схемами конкуренции. Первую грубую категоризацию осуществляли на основе относительного ответа на вторую инъекцию с использованием порогового уровня, составляющего 6,1 RU, который был чуть выше наибольшей величины, полученной в том случае, когда связывающий агент инъецировали в качестве первого и второго образца. Все величины и результаты окончательно валидировали после визуального обследования сенсограмм.
Результаты представлены в таблице 2. Идентифицированы три основные эпитопные группы (E1, Е2 и Е3) на основе схем конкуренции. Поскольку aLag3-0416 и гуманизированное ВАР 050 были отнесены к одной и той же группе, но не полностью ингибировали друг друга, их отнесли к подгруппам E2b и Е2с.
Связывание антител к Lag3, выделенных из tg-кроликов, с рекомбинантными позитивными по cyno-Lag3 HEK-клетками
5
В дополнение к анализу связывания с использованием HEK-клеток, рекомбинантно экспрессирующих на своей поверхности человеческий Lag3, оценивали также связывание с позитивными по Lag3 обезьян циномолгус HEK-клетками. Для этого эксперимента замороженные HEK293E-клетки, ранее кратковременно трансфектированные cyno-LAG-3, подвергали оттаиванию, центрифугировали и дополняли ЗФР/2% FBS. Высевали по 1,5×10 клеток/лунку в 96-луночные планшеты. Добавляли антитела к Lag3 до достижения конечной стандартизованной концентрации 10 мкг/мл. В этом эксперименте для сравнения и в качестве контролей получали антитела, применяемые в качестве положительного контроля (Medarex 25F7), а также контроля изотипа (huIgG1 фирмы Sigma, каталожный номер I5154, данные не представлены), и проводили измерения автофлуоресценции. HEK-клетки инкубировали с указанными антителами в течение 45 мин на льду, промывали дважды 200 мкл/лунку охлажденного на льду буфера ЗФР, содержащего 2% FBS, перед добавлением вторичного антитела (меченное АРС козье антитело к каппа-цепи человеческого IgG, фирма Invitrogen, каталожный № МН10515) (разведенное в соотношении 1:50 в FACS-буфере) и и инкубировали еще в течение 30 мин на льду. Клетки снова дважды промывали 200 мкл охлажденного на льду буфера ЗФР/2% FBS, после чего образцы окончательно ресуспендировали в 150 мкл FACS-буфера и измеряли связывание с использованием модуля FACS CANTO-II HTS.
Результаты
В представленной ниже таблице приведены данные о связывании различных антител к Lag3 с HEK293-клетками, экспрессирующими cyno-LAG3, и их перекрестной реактивности либо в виде % позитивных клеток, либо в виде средней геометрической величины (GeoMean) интенсивности сигнала:
Связывание антител к Lag3, выделенных из tg-кроликов, с (активированными) РВМС/Т-клетками обезьян циномолгус, экспрессирующими Lag3
После связывания с рекомбинантным белком Lag3 и Lag3, рекомбинантно экспрессируемым на клетках млекопитающих, оценивали/подтверждали связывание с Lag3, экспрессируемым на активированных Т-клетках обезьян циномолгус.
5
Характеристики связывания вновь созданных антител к Lag3 (полученных с использованием трансгенных кроликов фирмы Roche) с Lag3, экспрессируемым на клеточной поверхности Т-клеток или РВМС обезьян циномолгус, подтверждали с помощью FACS-анализа. В то время как Lag3 не экспрессировался на наивных Т-клетках, он подвергался повышающей регуляции после активации и/или на истощенных Т-клетках. Таким образом, получали мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) из свежей крови обезьян циномолгус и затем активировали путем предварительной обработки с помощью CD3/CD28 (1 мкг/мл) в течение 2-3 дней. После этого активированные клетки анализировали в отношении экспрессии Lag3. В целом, метод состоял в следующем: 1-3×10 активированных клеток окрашивали в течение 30-60 мин на льду с указанными антителами к Lag3 и соответствующими контрольными антителами в конечной концентрации 10 мкг/мл. Связанные антитела к Lag3 обнаруживали с использованием конъюгированных с флуорохромом вторичных антител к человеческому IgG или к кроличьему IgG. После окрашивания клетки промывали дважды ЗФР/2% FCS и анализировали с помощью FACS Fortessa (фирма BD).
Результаты
В представленной ниже таблице обобщены данные о проценте Lag3-позитивных клеток среди активированных РВМС обезьян циномолгус:
+
Продемонстрировано, что на активированных Т-клетках обезьян циномолгус все кроличьи антитела к Lag3 значимо связывались с Lag3-клетками. При этом для всех вновь созданных антител имел место более высокий процент позитивных клеток по сравнению с человеческими референс-антителами к Lag3 (такими, например, как MDX25F7, BMS-986016).
Ингибирование связывания LAG-3 с молекулами ГКГС-II, экспрессируемыми на человеческих опухолевых клетках А375 (по данным ELISA)
Клетки А375 высевали в объеме 25 мкл/лунку (10000 клеток/лунку) в обработанные 384-луночные планшеты для культур тканей (фирма Corning, 3701) и инкубировали при 37°С в течение ночи. Антитела к Lag3 предварительно инкубировали в течение 1 ч с биотинилированным Lag3 (250 нг/мл) в среде для клеточной культуры с использованием разведений в соотношении 1:3, начиная с концентрации антитела 3 мкг/мл. После удаления среды из лунок с высеянными клетками переносили в лунки по 25 мкл предварительно инкубированных смесей антитело-Lag3 и инкубировали в течение 2 ч при 4°С. После промывки (1×90 мкл в ЗФРТ) клетки фиксировали путем добавления по 30 мкл/лунку глутарового альдегида до конечной концентрации 0,05% (фирма Sigma, каталожный № G5882) в течение 10 мин при комнатной температуре. После промывки (3×90 мкл ЗФРТ-буфером) добавляли по 25 мкл/лунку поли-HRP40-стрептавидина (фирма Fitzgerald, 65R-S104PHRPx) в разведении 1:2000 или 1:8000 и инкубировали при КТ в течение 1 ч. После промывки (3×90 мкл ЗФРТ-буфером) добавляли по 25 мкл/лунку субстрата ТМВ (фирма Roche, 11835033001) и инкубировали в течение 2-10 мин. Измерения проводили с использованием устройства Tecan Safire 2 при 370/492 нм.
Ингибирование связывания LAG-3 с молекулами ГКГС-II, экспрессируемыми на человеческих опухолевых клетках А375 (по данным FACS-анализа)
Принцип анализа
+
6
Для исследования антагонистической функции антител к Lag3 проводили анализ ГКГСII:Lag3 в условиях конкуренции. Человеческие ГКГСII-А375-клетки окрашивали созданным в лаборатории заявителя биотинилированным слитым белком Lag3:Fc с предварительно инкубированными антителами к Lag3 или без них. Этот анализ осуществляли в условиях конкуренции методом FACS: А375-клетки (АТСС, № CRL-1619) культивировали, осуществляя 2-3 пересева, в среде Игла ЕМ, дополненной EBSS (фирма PAN, каталожный № Р04-00509), 10% FBS, 2 мМ L-глутамином, 1×NEAA и 1-кратным пируватом натрия. Все антитела разводили в FACS-буфере до конечной концентрации 20 мкг/мл в объеме 25 мкл (в 96-луночных планшетах с U-образным дном). Добавляли 25 мкл созданного в лаборатории заявителя биотинилированного рекомбинантного слитого белка LAG-3:Fc до достижения конечной концентрации 10 мкг/мл либо к среде, либо к антителам к Lag3 или контролям и осуществляли предварительную инкубацию в течение 30 мин при комнатной температуре. А375-клетки промывали ЗФР и плотность клеток доводили до 3×10 клеток/мл в ЗФР. Высевали по 100 мкл на лунку в 96-луночный планшет с V-образным дном. Планшеты центрифугировали и удаляли супернатант. Затем к клеткам добавляли предварительно инкубированную смесь слитый белок LAG-3:Fc/антитело (50 мкл/лунку) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После этого клетки промывали 200 мкл FACS-буфера. Для обнаружения биотинилированного белка Lag3:Fc, связанного с присутствующими на клетках молекулами ГКГСII, использовали конъюгированное с АРС козье антитело к биотину из расчета 3 мкл/образец (фирма Miltenyi Biotec, каталожный №130-090-856) и инкубировали еще в течение 10-15 мин. После окрашивания клетки снова промывали и затем переносили в 150 мкл FACS-буфера (ЗФР/2% FBS) в планшет с U-образным дном и анализировали с помощью устройства FACS Canto-II использованием модуля HTS.
Два антитела к Lag3 (клоны 25F7 и 26Н10; фирма Medarex) служили в качестве положительных контролей, а человеческий IgG1 (фирма Sigma, каталожный номер I5154) в качестве соответствующего контроля изотипа. Все антитела применяли в конечной концентрации 10 мкг/мл.
Результаты
В представленной ниже таблице приведены результаты FACS-анализа, демонстрирующие процент ингибирования связывания белка Lag3 с молекулами ГКГС-II на клетках (рассчитанный по уменьшению сигнала связывания по сравнению с максимальной величиной в отсутствии блокирующего антитела):
Эти данные подтверждают функциональное взаимодействие всех протестированных антител с Lag3 и блокаду клеточного взаимодействия.
Нейтрализующая способность новых антител к Lag3 по данным стандартного био/репортерного анализа блокады LAG3
+
+
+
Для тестирования нейтрализующей способности новых антител к Lag3 в отношении восстановления подавленного Т-клеточного ответа in vitro применяли поступающую в продажу репортерную систему. Эта система состоит из эффекторных Lag3 NFAT Jurkat-клеток (фирма Promega, каталожный № CS194801), ГКГС-II Raji-клеток (АТСС, № CLL-86) и суперантигена. В целом, репортерная система основана на осуществлении трех стадий: (1) индуцированной суперантигеном активации NFAT-клеток, (2) ингибировании сигнала активации, опосредуемого ингибирующим взаимодействием между ГКГСII (Raji-клетки) и эффекторными Lag3 NFAT Jurkat-клетками и (3) восстановления сигнала активации NFAT с помощью антагонизирующих/нейтрализующих Lag3 слитых конструкций aVH-Fc.
+
5
+
4
2
Для этого эксперимента Raji-клетки и эффекторные Lag-3 Jurkat/NFAT-luc2 Т-клетки культивировали согласно инструкциям поставщика. Приготавливали серийные разведения (40 пг/мл-50 мкг/мл) нескольких антител к Lag3 и референс-антител в среде дла анализа (RPMI 1640 (фирма PAN Biotech, каталожный № Р04-18047), 1% FCS) в 96-луночных культуральных планшетах с белым плоским дном (фирма Costar, каталожный №3917). К раствору антител добавляли по 1×10 Lag3 NFAT-Jurkat-клеток/лунку. После этой стадии к смеси Jurkat-клетки/антитело добавляли по 2,5×10 Raji-клеток/лунку, а также суперантиген SED (фирма Toxin technology, каталожный № DT303) в конечной концентрации 50 нг/мл. После инкубации в течение 6 ч при 37°С и 5% СО нагревали до комнатной температуры субстрат Bio-Glo (фирма Promega, каталожный № G7940) и добавляли по 75 мкл на лунку, инкубировали в течение 5-10 мин перед измерением общей люминесценции с помощью ридера Tecan Infinite согласно рекомендациям производителя набора.
50
На диаграммах продемонстрировано восстановление опосредуемой ГКГСII/Lag3 супрессии люциферазного сигнала NFAT различными антителами к Lag3 после стимуляции SED (данные представлены в виде величин ЕС):
Пример 3: Биологическая активность по данным различных анализов: воздействие различных антител к LAG3 (индивидуально или в комбинации с антителами к PD1)
Воздействие блокады PD-1 и LAG-3 на высвобождение цитотоксического гранзима В и секрецию IL-2 человеческими CD4 Т-клетками при совместном культивировании с аллогенными зрелыми дендритными клетками
При создании изобретения для скрининга блокирующих антител к LAG-3 в комбинации с антителом к PD-1 в аллогенных условиях был разработан анализ, в котором свежеочищенные CD4 Т-клетки совместно культивировали в течение 5 дней в присутствии происходящих из моноцитов аллогенных зрелых дендритных клеток (mDC). Моноциты выделяли из свежих РВМС за одну неделю до этого посредством их прикрепления к пластику и последующего удаления неприкрепившихся клеток. После этого из моноцитов получали незрелые DC путем культивирования в течение 5 дней в среде, содержащей GM-CSF (50 нг/мл) и IL-4 (100 нг/мл). Для индукции созревания iDC к культуральной среде добавляли TNF-альфа, IL-1-бета и IL-6 (каждый по 50 нг/мл) и культивировали еще в течение 2 дней. Затем оценивали созревание DC путем измерения экспрессии на их поверхности молекул главного комплекса гистосовместимости класса II (ГКГСII), CD80, CD83 и CD86 методом проточной цитометрии (фирма LSRFortessa, BD Biosciences).
8
5
В день минимальной реакции смешанных лимфоцитов (mMLR) проводили обогащение CD4 Т-клеток с использованием набора микрогранул (фирма Miltenyi Biotec) из 10 РВМС, полученных из организма неродственного донора. Перед культивированием CD4 Т-клетки метили с помощью 5 мкМ сложного карбоксифлуоресцеинсукцинимидилового эфира (CFSE). Затем высевали 10 CD4 Т-клеток в 96-луночный планшет вместе со зрелыми алло-DC (5:1) в присутствии или в отсутствии блокирующего антитела к PD-1 aPD1(0376) (т.е. PD1-0103-0312, описанного в заявке РСТ РСТ/ЕР2016/073248) индивидуально или в комбинации с химерными антителами к LAG-3 (с aLAG3(0403) по aLAG(0418) (с (0403) по (0418)) или референс-антителами (гуманизированное ВАР050 (LAG525) и BMS 986016) в концентрации 10 мкг/мл. DP47 представляет собой несвязывающийся человеческий IgG с мутацией LALA в Fc-области во избежание его распознавания FcγR, и его применяли в качестве отрицательного контроля.
Через 5 дней собирали супернатанты клеточных культур, которые позднее использовали для измерения уровней IL-2 с помощью ELISA (фирма R&D systems), и оставляли клетки при 37°С еще на 5 ч в присутствии Golgi Plug (бркфелдин А) и Golgi Stop (монензин). Затем клетки промывали, окрашивали поверхность антителом к человеческому CD4 и фиксирующим красителем Live/Dead Aqua (фирма Invitrogen) перед осуществлением фиксации/пермеабилизации Fix/Perm-буфером (фирма BD Bioscience). Осуществляли внутриклеточное окрашивание в отношении гранзима В (фирма BD Bioscience) и IFN-γ (фирма eBioscience). Результаты представлены на фиг. 1А и 1Б.
Воздействие блокады PD-1 и LAG-3 на высвобождение цитотоксического гранзима В человеческими CD4 Т-клетками, совместно культивируемых с В-клеточной лимфобластоидной клеточной линией (ARH77).
При создании изобретения для проведения функциональных анализов осуществляли совместное культивирование CD4 Т-клеток с опухолевой линией клеток ARH77, В-клеточной лимфобластоидной клеточной линией, которая отличается более низкими уровнями экспрессии PDL-1, чем mDC, для того, чтобы лучше характеризовать антагонистический вклад LAG-3 в блокаду PD-1. Остальные условия эксперимента и считывания данных были такими же, что и в случае осуществления mMLR. Для предлагаемых в изобретении антител к LAG-3 (aLAG3(0414) и aLAG3(0416), выбранных на основе их способности совместно секретировать IL-2 и гранзим В при осуществлении mMLR), в комбинации с антителом к PD-1 было установлено значимое увеличение секреции гранзима В CD4 Т-клетками по сравнению с референс-антителами к LAG-3 ((гуманизированное ВАР050 (LAG525) и BMS 986016)) (Р<0,05) и только антителом к PD-1 (Р<0,01), см. фиг. 2.
Воздействие блокады PD-1 и LAG-3 на опосредуемую Treg супрессию высвобождения гранзима В и IFN-γ человеческими CD4 Т-клетками, совместно культивируемыми с облученными аллогенными РВМС.
+
high
low
При осуществлении функциональных исследований с использованием анализа обусловленной регуляторными Т-клетками (Treg) супрессии выделенные из одного и того же донора РВМС разделяли на два образца: один, обогащали CD4 Т-клетками, а другой обогащали Treg, которые определяли как CD4CD25 CD127 Т-клетки с помощью набора микрогранул (фирма Miltenyi Biotec). После очистки двух популяций CD4 Т-клетки метили 5 мкМ сложным карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловым эфиром (CFSE), в то время как Treg метили 5 мкМ красителем Cell-Trace-Violet (CTV) для того, чтобы позднее различать их при проведении FACS-анализа.
5
5
5
5
5
Затем как CD4 Т-клетки (10), так и Treg (10), совместно культивировали в 96-луночном планшете в соотношении 1:1 вместе с облученными РВМС (10), полученными из организма неродственного донора, в присутствии или в отсутствии предлагаемых в изобретении антител к LAG-3 (aLAG3(0414) и aLAG3(0416) или референс-антител к LAG-3 (гуманизированное ВАР050 (LAG525) и BMS 986016) в комбинации с предлагаемым в изобретении антителом к PD-1 в концентрации 10 мкг/мл. В качестве контроля для оценки уровня супрессии эффекторных функций CD4 Т-клеток Treg-клетками, CD4 Т-клетки (10) культивировали также совместно с облученными РВМС (10) в отсутствии Treg.
Через 5 дней собирали супернатанты клеточных культур, которые позднее использовали для измерения уровней IFN-γ с помощью ELISA (фирма R&D systems), и клетки выдерживали при 37°С еще в течение 5 ч в присутствии Golgi Plug (брефелдин А) и Golgi Stop (монензин). Затем клетки промывали, окрашивали поверхность антителом к человеческому CD4 и фиксирующим красителем Live/Dead Aqua (фирма Invitrogen) перед осуществлением фиксации/пермеабилизации Fix/Perm-буфером (фирма BD Bioscience). Осуществляли внутриклеточное окрашивание в отношении гранзима В (фирма BD Bioscience) и IFN-γ (фирма eBioscience). Результаты представлены на фиг. 3А и 3Б.
Антитела к LAG-3 (aLAG3(0414) и aLAG3(0416) в комбинации с антителом к PD-1 aPD1(0376) (т.е. PD1-0103-0312, описанное в заявке РСТ РСТ/ЕР2016/073248) приводили к ускользанию Tconv от строгого контроля, осуществляемого регуляторными Т-клетками, о чем свидетельствовала секреция ими значительно большего количества гранзима В, чем Tconv-клетками в присутствии только антитела к PD-1 (Р<0,05) или в отсутствии ингибиторов контрольных точек (Р<0,001). Референс-антитела к LAG-3 (гуманизированное ВАР050 (LAG525) и BMS 986016) в комбинации с антителом к PD-1 не приводили к значимому спасению эффекторных функций Tconv от супрессорного действия Treg. Сходные результаты были получены для IFN-γ, даже несмотря на то, что разница не была статистически значимой, поскольку в анализе использовали лишь 4 донора.
Воздействие блокады PD-1 и LAG-3 на секрецию гранзима В и IFN-гамма CD4 Т-клетками из РВМС пациента с меланомой после повторной обработки пептидными пулами иммуногенных антигенов, ассоциированных с меланомой.
Ранее было описано, что РВМС пациента с меланомой содержат в поддающихся обнаружению количествах специфические в отношении опухолевого антигена Т-клетки. Поэтому при создании изобретения для целей проверки концепции (РОС) тестировали антитело к LAG-3 (0414) плюс антитело к PD-1 или только антитело к PD-1 на РВМС пациента с меланомой, повторно стимулированных в течение ночи пептидными пулами иммуногенных антигенов, ассоциированных с меланомой.
5
6
От 10 до 10 РВМС из организма пациентов с меланомой инкубировали при комнатной температуре в присутствии и в отсутствии насыщающих концентраций (10 мкг/мл) антитела к PD-1 (0376) индивидуально или в комбинации с антителом к LAG-3 (aLAG3(0414)=(0414), 10 мкг/мл). Затем Т-клетки повторно стимулировали в течение ночи пулом иммуногенных связанных с опухолью антигенов, таких как MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4, Melan-A/MART-1, NYESO-1, белок меланоцитов Pmel 17 gp100, тирозиназа, родственный тирозиназе белок 2 в присутствии ингибиторов транспорта белков Golgi Plug (брефелдин сА) и Golgi Stop (монензин).
После этого клетки промывали, окрашивали поверхность антителом к человеческому CD4 и фиксирующим красителем Live/Dead Aqua (фирма Invitrogen) перед осуществлением фиксации/пермеабилизации с помощью буфера Fix/Perm (фирма BD Bioscience). Осуществляли внутриклеточное окрашивание в отношении гранзима В (фирма BD Bioscience) и IFN-γ (фирма eBioscience).
Комбинация антител к LAG-3 и к PD-1 (Р<0,01 и Р<0,001) значимо (Р<0,01 и Р<0,0001) повышала эффекторные функции специфических в отношении опухолевых антигенов Т-клеток (т.е. секрецию гранзима В и IFN-γ), в то время как блокада только PD-1 не оказывала никакого действия (данные не представлены).
Специалист в данной области по аналогии с вышеизложенным может распространить описанные выше в примере 3 исследования, проведенные на клеточной культуре/животных, на методы лечения человека.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  F. Hoffmann-La Roche AG
<120>  ANTI-LAG3 ANTIBODIES
<130>  P34228
<150>  EP17164917.1
<151>  2017-04-05
<160>  59
<170>  PatentIn version 3.5
<210>  1
<211>  5
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  1
Asp Tyr Thr Met Asn
1               5
<210>  2
<211>  17
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  2
Val Ile Ser Trp Asp Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  3
<211>  12
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  3
Gly Leu Thr Asp Thr Thr Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr
1               5                   10
<210>  4
<211>  11
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  4
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  5
<211>  7
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  5
Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser
1               5
<210>  6
<211>  9
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  6
Gln Gln Thr Tyr Ser Ser Pro Leu Thr
1               5
<210>  7
<211>  121
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  7
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Trp Asp Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Phe Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Gly Leu Thr Asp Thr Thr Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  8
<211>  107
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Ser Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  9
<211>  5
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  9
Asp Tyr Thr Met His
1               5
<210>  10
<211>  17
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  10
Leu Val Ser Trp Asp Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Asn Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  11
<211>  12
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  11
Ala Ile Thr Asp Thr Ser Leu Tyr Gly Tyr Asp Tyr
1               5                   10
<210>  12
<211>  11
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  12
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  13
<211>  7
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  13
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>  14
<211>  9
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  14
Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210>  15
<211>  121
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  15
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Leu Val Ser Trp Asp Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Thr Asn Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Lys Ala Ile Thr Asp Thr Ser Leu Tyr Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  16
<211>  107
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  17
<211>  5
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  17
Asp Tyr Thr Met Asn
1               5
<210>  18
<211>  17
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  18
Val Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  19
<211>  12
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  19
Gly Leu Thr Asp Asp Thr Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr
1               5                   10
<210>  20
<211>  11
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  20
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Val Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  21
<211>  7
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  21
Ala Ser Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>  22
<211>  9
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  22
Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210>  23
<211>  121
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  23
Glu Val His Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Val Asp Asp Tyr
20                  25                  30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Val Ile Ser Trp Asp Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Phe Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Gly Leu Thr Asp Asp Thr Leu Tyr Gly Ser Asp Tyr Trp Gly
100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  24
<211>  107
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Val Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ser Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  25
<211>  5
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  25
Asp Tyr Ala Met Ser
1               5
<210>  26
<211>  17
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  26
Gly Ile Asp Asn Ser Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  27
<211>  13
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  27
Thr His Ser Gly Leu Ile Val Asn Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210>  28
<211>  11
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  28
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  29
<211>  7
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  29
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>  30
<211>  9
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  30
Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210>  31
<211>  122
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Asp Asn Ser Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Val Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys
85                  90                  95
Thr Lys Thr His Ser Gly Leu Ile Val Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  32
<211>  107
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Thr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  33
<211>  5
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  33
Asp Tyr Ala Met Ser
1               5
<210>  34
<211>  17
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  34
Gly Ile Asp Asn Ser Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>  35
<211>  13
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  35
Thr His Ser Gly Leu Ile Val Asn Asp Ala Phe Asp Ile
1               5                   10
<210>  36
<211>  11
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  36
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>  37
<211>  7
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  37
Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1               5
<210>  38
<211>  9
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  38
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210>  39
<211>  122
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Gly Ile Asp Asn Ser Gly Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Val Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Leu Cys
85                  90                  95
Thr Lys Thr His Ser Gly Leu Ile Val Asn Asp Ala Phe Asp Ile Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  40
<211>  107
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  40
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  41
<211>  120
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  heavy chain variable domain VH, BMS-986016 (WO2014/008218 and
US2016/0326248)
<400>  41
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn His Arg Gly Ser Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  42
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  light chain variable domain VL BMS-986016 (WO2014/008218 and
US2016/0326248)
<400>  42
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  43
<211>  120
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  heavy chain variable domain VH, MDX25F7 (25F7) (US2011/0150892
and WO2014/008218)
<400>  43
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Glu Ile Asn His Asn Gly Asn Thr Asn Ser Asn Pro Ser Leu Lys
50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Leu Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85                  90                  95
Phe Gly Tyr Ser Asp Tyr Glu Tyr Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln
100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  44
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  light chain variable domain VL, MDX25F7 (25F7) (US2011/0150892
and WO2014/008218)
<400>  44
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Leu
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys
100                 105
<210>  45
<211>  125
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  heavy chain variable domain VH, humanized BAP050 (LAG525)
(US2015/0259420)
<400>  45
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Leu Thr Asn Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Thr Asp Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Ser
65                  70                  75                  80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85                  90                  95
Ala Arg Asn Pro Pro Tyr Tyr Tyr Gly Thr Asn Asn Ala Glu Ala Met
100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120                 125
<210>  46
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  light chain variable domain VL, humanized BAP050 (LAG525)
(US2015/0259420)
<400>  46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ser Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20                  25                  30
Leu Met Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Val Leu Ile
35                  40                  45
Tyr Tyr Thr Ser Thr Leu His Leu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Leu
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Leu Pro Trp
85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  47
<211>  122
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  heavy chain variable domain VH, MDX26H10 (26H10) (US
2011/0150892)
<400>  47
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Glu Trp Ala Val Ala Ser Trp Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp
100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115                 120
<210>  48
<211>  108
<212>  PRT
<213>  Artificial
<220>
<223>  light chain variable domain VL, MDX26H10 (26H10) (US
2011/0150892)
<400>  48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85                  90                  95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100                 105
<210>  49
<211>  107
<212>  PRT
<213>  Homo Sapiens
<400>  49
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35                  40                  45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50                  55                  60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85                  90                  95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210>  50
<211>  105
<212>  PRT
<213>  Homo Sapiens
<400>  50
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35                  40                  45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50                  55                  60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65                  70                  75                  80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85                  90                  95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100                 105
<210>  51
<211>  329
<212>  PRT
<213>  Homo Sapiens
<400>  51
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210>  52
<211>  329
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  52
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225                 230                 235                 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
325
<210>  53
<211>  326
<212>  PRT
<213>  Homo Sapiens
<400>  53
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100                 105                 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115                 120                 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130                 135                 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145                 150                 155                 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165                 170                 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180                 185                 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195                 200                 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210                 215                 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225                 230                 235                 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245                 250                 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260                 265                 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275                 280                 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290                 295                 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305                 310                 315                 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly
325
<210>  54
<211>  497
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  54
Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys
1               5                   10                  15
Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly
20                  25                  30
Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro
35                  40                  45
Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp
50                  55                  60
Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly
65                  70                  75                  80
Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu
85                  90                  95
Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg
100                 105                 110
Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg
115                 120                 125
Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr
130                 135                 140
Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn
145                 150                 155                 160
Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg
165                 170                 175
Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His
180                 185                 190
Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser
195                 200                 205
Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser
210                 215                 220
Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu
225                 230                 235                 240
Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu
245                 250                 255
Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro
260                 265                 270
Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe
275                 280                 285
Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr
290                 295                 300
Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu
305                 310                 315                 320
Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu
325                 330                 335
Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe
340                 345                 350
Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro
355                 360                 365
Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys
370                 375                 380
Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr
385                 390                 395                 400
Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala
405                 410                 415
Leu Pro Ala Gly His Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Gly Val Leu Ser
420                 425                 430
Leu Leu Leu Leu Val Thr Gly Ala Phe Gly Phe His Leu Trp Arg Arg
435                 440                 445
Gln Trp Arg Pro Arg Arg Phe Ser Ala Leu Glu Gln Gly Ile His Pro
450                 455                 460
Pro Gln Ala Gln Ser Lys Ile Glu Glu Leu Glu Gln Glu Pro Glu Pro
465                 470                 475                 480
Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Gln
485                 490                 495
Leu
<210>  55
<211>  422
<212>  PRT
<213>  homo sapiens
<400>  55
Val Pro Val Val Trp Ala Gln Glu Gly Ala Pro Ala Gln Leu Pro Cys
1               5                   10                  15
Ser Pro Thr Ile Pro Leu Gln Asp Leu Ser Leu Leu Arg Arg Ala Gly
20                  25                  30
Val Thr Trp Gln His Gln Pro Asp Ser Gly Pro Pro Ala Ala Ala Pro
35                  40                  45
Gly His Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Pro Ala Ala Pro Ser Ser Trp
50                  55                  60
Gly Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Thr Val Leu Ser Val Gly Pro Gly Gly
65                  70                  75                  80
Leu Arg Ser Gly Arg Leu Pro Leu Gln Pro Arg Val Gln Leu Asp Glu
85                  90                  95
Arg Gly Arg Gln Arg Gly Asp Phe Ser Leu Trp Leu Arg Pro Ala Arg
100                 105                 110
Arg Ala Asp Ala Gly Glu Tyr Arg Ala Ala Val His Leu Arg Asp Arg
115                 120                 125
Ala Leu Ser Cys Arg Leu Arg Leu Arg Leu Gly Gln Ala Ser Met Thr
130                 135                 140
Ala Ser Pro Pro Gly Ser Leu Arg Ala Ser Asp Trp Val Ile Leu Asn
145                 150                 155                 160
Cys Ser Phe Ser Arg Pro Asp Arg Pro Ala Ser Val His Trp Phe Arg
165                 170                 175
Asn Arg Gly Gln Gly Arg Val Pro Val Arg Glu Ser Pro His His His
180                 185                 190
Leu Ala Glu Ser Phe Leu Phe Leu Pro Gln Val Ser Pro Met Asp Ser
195                 200                 205
Gly Pro Trp Gly Cys Ile Leu Thr Tyr Arg Asp Gly Phe Asn Val Ser
210                 215                 220
Ile Met Tyr Asn Leu Thr Val Leu Gly Leu Glu Pro Pro Thr Pro Leu
225                 230                 235                 240
Thr Val Tyr Ala Gly Ala Gly Ser Arg Val Gly Leu Pro Cys Arg Leu
245                 250                 255
Pro Ala Gly Val Gly Thr Arg Ser Phe Leu Thr Ala Lys Trp Thr Pro
260                 265                 270
Pro Gly Gly Gly Pro Asp Leu Leu Val Thr Gly Asp Asn Gly Asp Phe
275                 280                 285
Thr Leu Arg Leu Glu Asp Val Ser Gln Ala Gln Ala Gly Thr Tyr Thr
290                 295                 300
Cys His Ile His Leu Gln Glu Gln Gln Leu Asn Ala Thr Val Thr Leu
305                 310                 315                 320
Ala Ile Ile Thr Val Thr Pro Lys Ser Phe Gly Ser Pro Gly Ser Leu
325                 330                 335
Gly Lys Leu Leu Cys Glu Val Thr Pro Val Ser Gly Gln Glu Arg Phe
340                 345                 350
Val Trp Ser Ser Leu Asp Thr Pro Ser Gln Arg Ser Phe Ser Gly Pro
355                 360                 365
Trp Leu Glu Ala Gln Glu Ala Gln Leu Leu Ser Gln Pro Trp Gln Cys
370                 375                 380
Gln Leu Tyr Gln Gly Glu Arg Leu Leu Gly Ala Ala Val Tyr Phe Thr
385                 390                 395                 400
Glu Leu Ser Ser Pro Gly Ala Gln Arg Ser Gly Arg Ala Pro Gly Ala
405                 410                 415
Leu Pro Ala Gly His Leu
420
<210>  56
<211>  37
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer rbHC.up
<400>  56
aagcttgcca ccatggagac tgggctgcgc tggcttc                                37
<210>  57
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer rbHCf.do
<400>  57
ccattggtga gggtgcccga g                                                 21
<210>  58
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer BcPCR_FHLC_leader.fw
<400>  58
atggacatga gggtccccgc                                                   20
<210>  59
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
<220>
<223>  primer BcPCR_huCkappa.rev
<400>  59
gatttcaact gctcatcaga tggc                                              24
<---