СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ КОМПЕНСАЦИИ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ОСЛОЖНЕНИЙ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 2 ТИПА С ПОМОЩЬЮ ОЦЕНКИ АПОПТОЗА ЛИМФОЦИТОВ
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR METABOLIC COMPENSATION DISTURBANCES AND METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF DEVELOPING IN PATIENTS WIT TYPE 2 DIABETES MELLITUS BY LYMPHOCYTE APOPTOSIS ASSESSMENT

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии и иммунологии, клинической лабораторной диагностике нарушений компенсации обмена веществ и прогнозированию риска развития осложнений у больных сахарным диабетом 2 типа (СД 2 типа).
СД 2 типа - одна из ведущих медико-социальных проблем, которая касается значительной части населения не только России, но и всего мира. В настоящий момент СД рассматривают как заболевание, при котором отмечена преимущественная инсулинорезистентность с относительным дефицитом инсулина [5]. Эта форма диабета часто остается вовремя не диагностированной на протяжении многих лет, так как гипергликемия может быть не достаточно выраженной для развития явных симптомов диабета. Большинство пациентов с СД 2 типа страдают ожирением, которое вызывает или усиливает инсулинорезистентность, при этом наблюдается преимущественно абдоминальное распределение жировой ткани. Диабет опасен на любом этапе своего течения внезапными, быстро развивающимися осложнениями в виде нефропатии, ретинопатии, атеросклероза коронарных и периферических артерий, в виде диабетической стопы, периферической и вегетативной нейропатии, часто приводящих к инвалидизации и летальным исходам.
При постановке диагноза СД 2 типа учитывают фазу нарушений углеводного обмена: компенсации, субкомпенсации, декомпенсации. Под компенсацией понимают сохранение нормогликемии в течение суток (натощак 4,4÷6,1 ммоль/л, после еды - 5,5÷8 ммоль/л) и отсутствие глюкозы в моче. При субкомпенсации уровень глюкозы в крови натощак колеблется в пределах 6,2÷7,8 ммоль/л, после еды не превышает 10 ммоль/л, концентрация глюкозы в моче не выше 0,5%. В период декомпенсации у больных отмечается увеличение содержания глюкозы в крови натощак более 7,8 ммоль/л, после еды - свыше 10 ммоль/л; наблюдается усиливающаяся глюкозурия (более 0,5%). Нередко увеличивается печень, что обусловлено ее жировой инфильтрацией; функциональные пробы печени при этом обычно не нарушены. Кроме того, наблюдается преходящее повышение функций ряда желез внутренней секреции: увеличение секреции гормона роста, катехоламинов, глюкокортикоидов. При длительно декомпенсированном СД повышение процессов распада и снижение синтеза белка приводят к атрофическим изменениям в мышцах. Наблюдается уменьшение их массы, дряблость при пальпации, мышечная слабость и повышенная утомляемость [3].
Заявленный способ диагностики нарушений компенсации обмена веществ и прогнозирования риска развития осложнений у больных СД 2 типа путем оценки уровня апоптоза лимфоцитов позволит повысить точность прогнозирования, объективизировать тактику лечебных мероприятий, снизить риск развития хронической патологии, предупредить инвалидизацию пациентов.
1c
На данный момент также известны способы диагностики диабета и его компенсации по содержанию гликолизированного гемоглобина (HbA), исследованию спектра липидов (общий холестерин, триглицериды) [2]. Наиболее близким аналогом (прототипом) является способ длительного мониторинга за состоянием больных сахарным диабетом и развитием неврологических и сосудистых его осложнений, который заключается в том, что многократно определяют иммунореактивность сыворотки крови по отношению к инсулину, к антиинсулиновым антителам или их антигенсвязывающим фрагментам [12]. Кроме длительности и многократности обследования, этот способ не может рассчитывать на долговременность прогнозирования, так как период активности антителообразования и полураспада является коротким.
Предлагаемое изобретение характеризует системное изменение проницаемости клеточных мембран, в том числе ядерных, что проявляется долговременными и отдаленными последствиями. Продукты генов-регуляторов апоптоза (р53, bc1-2, bc1-x1, mc1-1, bak, bax и др.) являются весьма консервативными и одинаковыми для представителей различных млекопитающих, что позволяет ограничиться одним исследуемым параметром. Изменение экспрессии белков-регуляторов апоптоза имеет долговременный эффект, поэтому прогнозирование риска развития осложнений осуществляется на более длительный период. Это облегчает пробоподготовку, повышает точность и достоверность результатов, снижает риск лабораторных отклонений.
Ранее с помощью апоптоза осуществляли оценку повреждающего действия вирусных инфекций [1, 9], прогнозирование неонатальной смертности детей [11] и развития раннего рецидива основного заболевания после трансплантации стволовых клеток [13], производили диагностику метастазирования [8] и течения псориаза [6], хронической плацентарной недостаточности [7]. Известны различные способы и средства стимулирования апоптоза [10, 15], скрининга про- и антиапоптогенной активности терапевтических препаратов [4].
Отличительным признаком заявленного способа является установление диагностических критериев процентного содержания апоптотических лимфоцитов An+/PI- в периферической венозной крови у больных СД 2 типа. При значении исследуемого параметра ниже 3,5% диагностируется состояние компенсации углеводного обмена и прогнозируется благоприятное течение заболевания на ближайший год. При содержании лимфоцитов An+/PI- в пределах от 3,5 до 6% диагностируется состояние субкомпенсации и прогнозируется умеренный риск развития осложнений. Уровень лимфоцитов An+/PI- выше 6% характеризует состояние декомпенсации и высокий риск развития хронических осложнений сахарного диабета 2 типа.
Способ осуществляется стандартно следующим образом.
1. У больных СД 2 типа забирают 1 мл венозной крови в пробирку Vacutainer, содержащую стабилизатор - литиевую соль гепарина, путем пункции локтевой вены.
5
6
2. Выделить суспензию лимфоцитов путем градиентного центрифугирования в концентрации от 10 до 10 клеток на пробу.
3. Однократно отмыть клетки (7÷10 мин, 150 g) забуференным фосфатами 0,15 М раствором хлорида натрия, рН 7,2÷7,4 (PBS).
4. Ресуспендировать 500 мкл лимфовзвеси в 500 мкл 1% связывающего буфера (10% связывающий буфер довести до 1% добавлением дистиллированной воды 1:10, поставить на лед в холодильник).
5. В 100 мкл образца из п.4 внести 1 мкл аннексина V (AnV) и 5 мкл йодистого пропидия (250 мкг порошка PI развести добавлением 1 мл приготовленного связывающего буфера 1%, поставить на лед в холодильник). Смесь аккуратно перемешать.
6. Инкубировать 15 мин в темноте на льду.
7. Добавить к суспензии 400 мкл охлажденного 1% связывающего буфера, аккуратно перемешать.
8. Произвести анализ клеток на проточном цитофлуориметре, оценивая интенсивность зеленой флуоресценции FITC-аннексина-V (FL1, 530 нм) и красной флуоресценции йодистого пропидия (FL3, свыше 600 нм) [14].
Обследование проводили с письменного согласия респондентов. Указанным способом обследованы 32 больных СД 2 типа, диагноз поставлен врачами городского эндокринологического консультативного центра г.Архангельска: 6 человек в стадии компенсации, 7 - субкомпенсации, 17 - декомпенсации. В качестве группы сравнения обследованы 25 практически здоровых лиц г.Архангельска. Результаты обработаны с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6» («StatSoft», США). Тип исследования ретроспективный, выборки случайные, одномоментные. Генеральная совокупность - жители севера европейской территории России. Границы нормального распределения количественных показателей определяли при помощи критерия Шапиро - Уилка. Распределение процентного содержания лимфоцитов An+/PI- отличалось от нормального, поэтому представлено в виде медианы, нижнего и верхнего квартилей. Достоверность различий между группами оценивали с помощью параметрического t-критерия Стьюдента для независимых выборок и непараметрического критерия Уилкоксона. Статистическая достоверность присваивалась при значении р<0,05.
9
9
Установлено, что у обследуемых больных в стадии компенсации содержание лимфоцитов An+/PI- составляет 2,3 (0,8-3,4)%, при изменении углеводного баланса в стадии субкомпенсации - 4,8 (3,8-5,9)%, в состоянии декомпенсации содержание лимфоцитов, подвергшихся апоптозу, равняется 8,45 (5,95-11,6)%. В группе практически здоровых людей данный показатель составил 1,6 (0,8-5,42)%, что соответствует указанным значениям компенсации углеводного обмена. Данный факт подтверждается увеличением концентрации лимфоцитов с маркером готовности к апоптозу CD95+ с 0,53±0,05 до 0,65±0,06×10 кл/л на фоне повышения содержания лимфоцитов CD10+ с 0,55±0,05 до 0,75±0,09×10 кл/л у лиц с декомпенсированной стадией СД 2 типа по сравнению с практически здоровыми людьми.
Инициация апоптозного сигнала при взаимодействии лиганда апоптоза с рецептором приводит к формированию комплекса сигнальных белков, активирующего каспазный каскад реакций, который приводит к характерной конденсации хроматина, ядерной фрагментации, сморщиванию ядра, пузырчатости плазматических мембран и другим ультраструктурным изменениям клетки [16]. В норме апоптоз клетки ингибируется после присоединения инсулина к своему рецептору. В результате рецептор аутофосфорилируется при участии тирозинкиназы, активизируется фосфатидилинозитол-3-киназа, стимулирующая переход ГЛЮТ-4 через мембрану клетки, чем обеспечивается транспорт глюкозы и синтез ДНК [2]. Усугубление течения заболевания СД 2 типа можно характеризовать сначала повышением уровня инсулина в плазме (при уменьшении чувствительности к нему со стороны клеток), а затем снижением содержания инсулина вследствие секреторной дисфункции β-клеток поджелудочной железы. Именно этим можно объяснить увеличение в крови уровня апоптотических лимфоцитов An+/PI-.
Частные примеры использования способа.
1. Больная С., 53 года. Диагноз: сахарный диабет 2 типа, легкое течение на фоне ожирения VI степени смешанного генеза, абдоминальный вариант. Больна в течение 4 лет. При лабораторном обследовании установлено, что содержание в периферической венозной крови лимфоцитов An+/PI-, находящихся на стадии апоптоза, составляет 1,3%. На основании полученных данных сделан вывод о компенсации углеводного обмена и благоприятном течении заболевания в ближайшем году, что подтверждает эффективность диетотерапии.
2. Больная Ф., 55 лет. Диагноз: сахарный диабет 2 типа, средней тяжести, ожирение III степени, абдоминальный вариант. Больна в течение 6 лет. При проведении дифференциальной диагностики установлено, что содержание в крови апоптотирующих лимфоцитов An+/PI- составляет 4,2%. Сделан вывод о субкомпенсации состояния углеводного обмена, что подтверждено дальнейшим течением заболевания и выявлением через год микроангиопатий сосудов шеи, нижних конечностей, коронарных артерий.
3. Больная Б., 57 лет. Диагноз: сахарный диабет 2 типа, среднетяжелое течение, отягощенная наследственность со стороны матери (СД 2 типа, ожирение). Больна в течение 4 лет. При лабораторном обследовании установлено, что содержание в крови лимфоцитов An+/PI- соответствует 11,9%. Сделан вывод о декомпенсации состояния углеводного обмена и высоком риске развития осложнений сахарного диабета, что подтверждено недостаточно выраженными результатами лечебных мероприятий и возникновением диабетической ретинопатии.
4. Больная К., 59 лет. Диагноз: сахарный диабет 2 типа, диабетическая нефропатия, выраженные отеки на стопах и голени, сухость во рту. Больна в течение 14 лет. При лабораторном обследовании установлено, что содержание в крови апоптотических лимфоцитов An+/PI- соответствует 10,9%. Сделан вывод о декомпенсации состояния углеводного обмена, что в дальнейшем подтверждено прогрессированием заболевания и развитием диабетической сенсорной полинейропатии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Берлим А.А. Способ прогнозирования предраковых заболеваний шейки матки у женщин с папиллома-вирусной инфекцией / А.А.Берлим, В.И.Орлов, С.Н.Панченко и др. // Патент №2310197 РФ, опубл. 10.11.2007.
2. Бокарев И.Н. Сахарный диабет: руководство для врачей / И.Н.Бокарев, В.К.Беликов, О.И.Шубина. - М.: ООО «Медицинское информационное агенство». - 2006. - 400 с.
3. Большая медицинская энциклопедия / Под ред. Б.В.Петровского, изд-е 3, Т.7. - М.: Советская энциклопедия, 1977. - С.227-232.
4. Дыгало Н.Н. Способ скрининга про- или антиапоптогенной активности терапевтических препаратов / Н.Н.Дыгало, Т.С.Калинина, Г.Т.Шишкина // Патент №2388065 РФ, опубл. 27.04.2010.
5. Зыкова Т.А. Диагностика и классификация сахарного диабета / Т.А.Зыкова, Б.А.Савенко // Пособие для врачей. - Архангельск, 2001. - 30 с.
6. Корсунская И.М. Способ оценки состояния апоптотической системы в коже у больных псориазом / И.М.Корсунская, И.В.Голденкова, С.А.Брускин и др. // Патент №2311643 РФ, опубл. 27.11.2007.
7. Липатов И.С. Способ диагностики хронической плацентарной недостаточности / И.С.Липатов, Мельников В.А., Тезиков Ю.В. и др. // Патент №2313795 РФ, опубл. 27.12.2007.
8. Лихванцева В.Г. Способ прогнозирования метастазирования увеальной меланомы на основе маркеров апоптоза Вах и BCL-2 / В.Г.Лихванцева, М.Р.Личиницер, М.Е.Абрамов и др. // Патент №2244934 РФ, опубл. 10.09.2004.
9. Луценко М.Т. Способ оценки повреждающего действия герпес-вирусной инфекции на развитие апоптоза в ядрах симпласта ворсинок плаценты у беременных / М.Т.Луценко, Андриевская И.А. // Патент №2370772, РФ, опубл. 20.10.2009.
10. Македонов Г.П. Способ стимулирования апоптоза / Г.П.Македонов, Цховребова Л.В. // Патент №2340349 РФ, опубл. 20.02.2008.
11. Плеханов Л.А. Способ прогнозирования неонатальной смертности у детей с перинатальным поражением центральной нервной системы / Л.А.Плеханов, Г.Н.Бельская // Патент №2287162 РФ, опубл. 10.01.2006.
12. Полетаев А.Б. Способ мониторинга за состоянием больных сахарным диабетом и развитием неврологических и сосудистых его осложнений / А.Б.Полетаев, А.А.Абросимова, М.А.Соколов // Патент №2291437, РФ, опубл. 10.04.2006.
13. Пронкина Н.В. Способ прогноза развития раннего рецидива основного заболевания после аутологичной трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток у больных гемобластозами / Н.В.Пронкина, B.C.Кожевников, И.А.Лисуков и др. // Патент №2337712 РФ, опубл. 10.11.2008.
14. Сибиряк С.В. Оценка апоптоза в иммунологических исследованиях: краткое методическое руководство / С.В.Сибиряк, С.В.Хайдуков, А.В.Зурочка и др. - Екатеринбург: УрО РАН, 2008. - 59 с.
15. Федоров С.Н. Средство, стимулирующее апоптоз клеток лейкемии человека / С.Н.Федоров, Л.К.Шубина, И.И.Капустина // Патент №2360692 РФ, опубл. 10.07.2009.
16. Цыган В.Н. Актуальные проблемы иммунологии. - СПб., 2004. - С.12-16.