КОМБИНАТОРНАЯ ТЕРАПИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ШОКА
COMBINATION THERAPY FOR TREATING HEMORRHAGIC SHOCK

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к лечению геморрагического шока и кровотечений с использованием комбинации антифибринолитика, выбранного из группы, включающей транексамовую, аминометилбензойную или ε-аминокапроновую кислоты, и полипептида, обладающего активностью SERPING1.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Тяжелые травмы являются одной из проблем здравоохранения. По статистике ВОЗ ежегодно в мире тяжелую травму получает 10 млн. человек, 250 тыс. из них погибает от шока («ВОЗ | Дорожно-транспортные травмы», WHO. [Online]. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs358/ru). Основной причиной смерти таких пациентов является неконтролируемое посттравматическое кровотечение («Интенсивная терапия», №6,2014 г, стр. 5). Уровень травматизма в РФ составляет 8730,3 случаев на 100 тыс. взрослого населения. При этом 80% смертей от травм на дорогах связаны с неоказанием помощи в течение первого часа («Травмы, первая медицинская помощь при травмах, виды травматизма, последствия травм». [Online], http://www.medicinform.net/medhelp/medhelp6.htm).
Геморрагический шок наступает, когда острая кровопотеря превышает примерно 20% от нормального объема крови. Главной особенностью геморрагического шока является уменьшение объема циркулирующей крови, что приводит к гипоперфузии основных систем органов. Гипоперфузия приводит к недостатку питательных веществ и вызывает локальную ишемию тканей, что ведет к прогрессирующему повреждению многих органов и их последующей дисфункции. (Keith 1986). При реанимации путем замещения внутрисосудистого объема кровью или физиологическими растворами, происходит дальнейшее повреждение, вызванное реперфузией (Keith 1986).
Коагулопатия, ассоциированная с травмой и геморрагическим шоком, диагностируется у одной трети пациентов с травматическими кровотечениями при поступлении в лечебные учреждения. Травмированные пациенты с коагулопатией имеют значительно более высокую смертность в сравнении с пациентами с похожими травмами без коагулопатии. При травме и индуцированной геморрагическим шоком коагулопатии, в ходе реанимационных предприятий, как правило, применяется инфузионно-трансфузионная терапия. Однако наиболее эффективные меры, такие как протокол 1:1:1, который представляет собой комбинацию эритроцитарной массы, свежезамороженной плазмы крови и тромбоцитов, доступен только в стационарных пунктах квалифицированной медицинской помощи, таких как больницы. Кроме того, применение протокола 1:1:1 ограничивается сроком хранения отдельных компонентов. Рекомендуемый срок хранения эритроцитарной массы составляет 8 дней, а тромбоцитов - 5 дней. Более эффективной является трансфузия теплой свежей донорской крови, однако ее доступность еще более ограничена. (Vymazal 2015). Между тем, при лечении геморрагического шока чрезвычайно важно предпринять терапевтические меры как можно скорее, как правило, не позднее чем через 3 часа после начала массивного кровотечения. Во многих обстоятельствах, таких как дорожно-транспортные происшествия или ранения в ходе боевых действий, квалифицированная медицинская помощь доступна слишком поздно для эффективного лечения геморрагического шока. Поэтому для неотложной медицинской помощи, в машинах скорой помощи или пунктах сбора раненых необходимо наличие эффективного терапевтического средства для лечения геморрагического шока и вызванной травмой коагулопатии.
Во время геморрагического шока и реанимации также сильно повреждается желудочно-кишечный тракт. Происходит некроз кишечника и наблюдаются последующая бактериальная транслокация с выбросом эндотоксинов (Tamion, Richard et al., 1997). Это, как правило, приводит к значительному увеличению уровня воспалительных цитокинов, которые могут усилить полиорганную дисфункцию.
Поэтому существует потребность в создании терапевтического средства, которое не только позволяет эффективно лечить геморрагический шок, но и противодействует таким угрожающим жизни проявлениям геморрагического шока, как коагулопатия и секреция воспалительных цитокинов, проницаемость эпителия кишечника для бактерий и бактериальных эндотоксинов, снижает общую смертность после значительных кровотечений, и при этом может применяться при лечении геморрагического шока в полевых условиях.
SERPING1, также известный как ингибитор эстеразы С1 или С1-ингибитор, является членом семейства ингибиторов сериновых протеаз, серпинов. Посредством ингибирования C1s и C1r, субкомпонентов комплекса С1 классического пути активации (Arlaud, Reboul, Sim & Colomb, 1979; Nilsson, Sjoholm & Wiman, 1983; Nilsson & Wiman, 1983; RatnoffSchena et al., 1980; 1969; Sim, Arlaud & Colomb, 1980), SERPING1 играет ключевую роль в регуляции активности системы комплемента. SERPING1 также регулирует кинин-калликриеновую систему, ингибирует калликреин, фактор XIa и фактор XIIa (Aasen, Erichsen, Gallimore & Amundsen, 1980; Cullmann, Kovary, Dick, Czarnetzki & Echternach-Happle, 1982; Harpel & Cooper, 1975; Harpel, 1970; Ratnoff, 1969; Revak & Cochrane, 1976; Schapira, Scott & Colman, 1981; van der Graaf, Koedam & Bouma, 1983). SERPING1 опосредованно предотвращает активацию плазминогена через ингибирование калликреина и фактора XIIa, а также напрямую ингибирует плазмин в крови (Beattie, Ogston, Bennett, & Douglas, 1976; Haselager, Goote & Vreeken, 1976), что, в свою очередь, снижает фибринолиз (Travis & Salvesen, 1983), который является ключевой особенностью поздней стадии коагулопатии при тяжелом, жизнеугрожающем геморрагическом шоке. Опосредованное SERPING1 ингибирование калликреина, в свою очередь, снижает концентрацию в плазме брадикинина, вазоактивного пептида, который увеличивает проницаемость капилляров и экстравазацию плазмы. Действуя таким образом, SERPING1 противодействует эдеме и уменьшает отек, а также снижает индуцированную геморрагическим шоком проницаемость эндотелиальной ткани (Cheng et al., 2008; Schmidt, Stenzel, Gebhard, Martin & Schmidt, 1999). В противном случае, проницаемость эндотелия часто приводит к повреждению тканей и сепсису.
В модели контролируемой кровопотери у свиней, SERPING1 существенно снижал повреждения тканей почек, кишечника и легких в дозозависимой манере (100 и 250 МЕ/кг). Кроме того, rhSERPING1 в дозе 250 МЕ/кг заметно снизил метаболический ацидоз и уровень циркулирующего TNF-α (Dalle Lucca, Li et al., 2012).
Указанные свойства С1-эстеразного ингибитора свидетельствуют о возможности его использования в заместительной терапии при ангионевротических отеках, для профилактики и лечения сепсиса, в том числе септического шока, для профилактики и лечения полиорганной дисфункции, синдрома повышенной проницаемости капилляров при сепсисе и септическом шоке, для профилактики и лечения острого респираторного дистресс-синдрома, для адъювантной терапии при атеросклеротическом поражении сосудов, для профилактики и лечения ишемического инсульта и его осложнений, острого нарушения мозгового кровообращения, профилактики и лечения шоковых состояний в операционном и послеоперационном периодах при аортокоронарном шунтировании, для предупреждения и лечения шоковых состояний при проведении транслюминальной ангиопластики, для профилактики и лечения синдрома реперфузии после аортокоронарного шунтирования и транслюминальной ангиопластики в комбинации с прямыми антикоагулянтами, для профилактики и лечения реакции отторжения при трансплантации органов и тканей (в том числе - костного мозга), для лечения или предупреждения системных ревматологических заболеваний, протекающих с активацией комплемента (системная красная волчанка, системная склеродеромия, дерматомиозит, ревматоидный артрит и т.д.), для профилактики и лечения осложнений у больных с травматологическими повреждениями различной локализации, для адъювантной терапии любых состояний, в том числе - новообразований, протекающих с активацией системы комплемента (Davis, Cai et al., 2007, Liu, Lu et al., 2007, Davis, Mejia et al., 2008, Davis, Lu et al., 2010, Vo, Zeevi et al., 2015).
Коммерчески доступные препараты Беринерт и Синрайз, на основе ингибитора С1-эстеразы выделенного из человеческой плазмы крови, одобрены для лечения ангионевротического отека.
Производство SERPING1 может быть осуществлено различными способами. Получение pdSERPING1 (плазменного SERPING1) путем последовательной очистки из плазмы крови человека подробно описано, например, в международной заявке WO 2001046219 или патенте RU 2256464. Также описано производство рекомбинантного человеческого SERPING1 (rhSERPING1) из молока трансгенных животных (van Veen, Koiter et al., 2012) (патент US 7067713). Кроме того, rhSERPING1 может быть произведен в различных хозяевах в культуре эукариотических клеток (как описано, например, в WO 2011116291) или в прокариотах, с использованием общепринятых в настоящее время методов генетической инженерии. При этом С1-ингибитор может быть использован как в нативной форме, так и в виде активного фрагмента, полученного рекомбинантным или иным способом и сохраняющего функциональные способности, а также в виде мутантных форм, например, таких, как предложены в WO 2010002453.
В качестве антифибринолитических средств, применяемых при кровотечениях, в настоящее время используются три препарата, обладающих общими функциональными особенностями и механизмом действия. Это транексамовая, ε-аминокапроновая и аминометилбензойная кислоты.
Транексамовая кислота является синтетическим производным аминокислоты лизина и обладает антифибринолитической активностью вследствие обратимого связывания с плазминогеном, предотвращая его взаимодействие с фибрином и, таким образом, препятствует лизису фибринового сгустка. Лизиновые аминокислотные остатки белковой молекулы фибрина опосредуют связывание фибрина с лизин-связывающими сайтами молекулы плазминогена (Ferring Pharmaceuticals Inc. Lysteda (tranexamic acid) tablets: US prescribing information [online]. Available from URL: http://lvsteda.com/assets/pdf/PI_FERRING2010.pdf [Accessed 2012 Feb. 23], (Dunn and Goa 1999)). Транексамовая кислота связывается с высокой аффинностью (константа диссоциации [Kd]=1.1 ммоль/л) с одним из лизинсвязывающих сайтов плазминогена и с низкой аффинностью ([Kd]=1.1 ммоль/л) с другими 4 или 5 сайтами (Ferring Pharmaceuticals Inc. Lysteda (tranexamic acid) tablets: US prescribing information [online]. Available from URL: http://lvsteda.com/assets/pdf/PI_FERRING2010.pdf [Accessed 2012 Feb 23]).
2
Транексамовая кислота практически полностью блокирует связывание плазминогена или тяжелой цепи плазмина с фибрином, в основном путем связывания с высокоаффинным лизинсвязывающим сайтом плазминогена. Несмотря на то, в присутствие активатора плазминогена, такого как тканевый активатор плазминогена, плазминоген все еще может быть конвертирован в плазмин, после связывания с транексамовой кислотой он не может взаимодействовать и разрушать фибрин (Dunn and Goa 1999). Транексамовая кислота также блокирует связывание α-антиплазмина с плазмином и его инактивацию плазмина. Кроме ингибирования плазмина, транексамовая кислота также конкурентно ингибирует активацию трипсиногена энтерокиназой, неконкуретно ингибирует трипсин и слабо ингибирует тромбин (Dunn and Goa 1999).
По результатам различных фибринолитических тестов сила связывания транексамовой кислоты с плазминогеном примерно в 6-10 раз больше, чем у другого синтетического производного лизина, ε-аминокапроновой кислоты, также являющейся антифибринолитическим препаратом (Dunn and Goa 1999). Лизинсвязывающие сайты плазминогена находятся в разных, так называемых доменах kringle, которые являются областью полипептидной цепи, состоящих из бета-структур, которые стабилизируются тремя дисульфидными связями. Как транексамовая, так и ε-аминокапроновая кислоты взаимодействуют с низкоаффинным лизинсвязывающим сайтом пятого домена kringle, который, по всей видимости, нужен для начальной ассоциации плазминогена с фибрином (Dunn and Goa, 1999). Высокоаффинный лизинсвязывающий первый домен kringle необходим для связывания карбокси-концевого лизинового остатка, который присутствует в фибрине только после его частичного гидролиза (Anonick, Vasudevan et al., 1992).
Аминометилбензойная кислота («Амбен») по механизму действия близка к ε-аминокапроновой кислоте; угнетает фибринолиз путем конкурентного торможения плазминогенактивирующего фермента и угнетения образования плазмина (Реестр лекарственных средств РФ http://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_342.htm, (Langenbach, 2006)). По сравнению сеаминокапроновой кислотой аминометилбензойная кислота более активна, но в два раза менее активна, чем транексамовая кислота (DOBROKHOTOVA, DZHOBAVA et al., 2013) (Verstraete, 1985).
Таким образом, все три препарата оказывают сходное фармакологическое действие, являются синтетическими аналогами аминокислот, действуют по одному механизму, насыщая лизинсвязывающие сайты плазминогена, и имеют общие показания к применению и пути элиминации. Общим недостатком указанных препаратов является возможность появления тромбозов и тромбоэмболических заболеваний при их применении.
Наиболее эффективным средством лечения геморрагического шока для применения в условиях, когда стационарные медицинские учреждения недоступны, в настоящее время является транексамовая кислота.
Транексамовая кислота значительно снижает общую смертность и смерть из-за кровотечения у пациентов с сильными кровотечениями, вызванными травмами, особенно при введении в ранние сроки после травмы (collaborators, Shakur et al. 2010, collaborators, Roberts et al. 2011, Ker, Kiriya et al. 2012, Roberts, Prieto-Merino et al. 2014). Транексамовая кислота в настоящее время используется как препарат выбора военными медиками в США и Великобритании для лечения тяжелых боевых травм и кровотечений.
В США FDA (US Food and Drug Administration) транексамовая кислота также одобрена для перорального введения женщинам с тяжелыми менструальными кровотечениями и внутривенно для профилактики стоматологических кровотечений у пациентов с гемофилией. Однако транексамовая кислота часто используется не по прямому назначению, чтобы уменьшить кровотечение, вызванное различными причинами, в том числе травмой и хирургическими вмешательствами.
В РФ применение транексамовой кислоты одобрено по следующим показаниям: кровотечения или риск кровотечений на фоне усиления фибринолиза (злокачественные новообразования поджелудочной и предстательной желез, операции на органах грудной клетки, послеродовые кровотечения, ручное отделение последа, лейкоз, заболевания печени, предшествующая терапия стрептокиназой - случаи генерализованного фибринолиза; маточные, носовые, желудочно-кишечные кровотечения, гематурия, кровотечения после простатэктомии, конизации шейки матки по поводу карциномы, экстракции зуба у больных с геморрагическим диатезом - случаи местного фибринолиза), наследственный ангионевротический отек, аллергические заболевания (экзема, аллергические дерматиты, крапивница, лекарственная и токсическая сыпь), воспалительные заболевания (тонзиллит, фарингит, ларингит, стоматит, афты слизистой оболочки полости рта) (http://medi.ru/doc/x0937.htm).
Крупное рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое, многонациональное клиническое испытание CRASH-2 (Clinical Randomization of an Antifibrinolytic in Significant Hemorrhage 2 - клиническая рандомизации антифибринолитка при значительном кровотечении) оценивало эффективность раннего использования транексамовой кислоты на взрослых пациентах с травмой (collaborators, Shakur et al., 2010). Исходя из результатов данного исследования транексамовая кислота существенно снижала смертность по всем причинам в течение 4 недель (первичная конечная точка испытания) и риск смерти вследствие кровотечения. Смертность по всем причинам в группе плацебо составляла 16%, тогда как в группе с применением транексамовой кислоты - 14,5%. Смертность в результате кровотечения в группе плацебо составляла 5,7%, а в группе с применением транексамовой кислоты - 4,9%.
Вторичный анализ CRASH-2 (Roberts, Prieto-Merino et al., 2014), сфокусированный на механизме действия транексамовой кислоты у пациентов с кровотечением, позволил сделать заключение о том, что наибольший эффект транексамовая кислота оказывает на снижение смертности в первый день после травмы. Транексамовая кислота, будучи примененной в первые 3 ч после травмы, снижает общую смертность в первый день и увеличивает последующее выживание на 20%.
Тем не менее, несмотря на значительное количество проведенных исследований, до сих пор никто не изучал применение транексамовой кислоты в комбинации с С1-ингибитором.
К недостаткам известных средств относится недостаточное снижение смертности, нежелательные побочные эффекты, вызванные реперфузией при применении стандартной инфузионно-трансфузионной терапии, характеризующиеся ранней активацией нейтрофилов и формированием свободных радикалов (Ioannou, Dalle Lucca et al., 2011). Секреция протеолитических ферментов, продуцируемых нейтрофилами, может приводить к дальнейшему повреждению тканей. Более того, образующиеся кислородные радикалы играют существенную роль в повреждении эндотелия после реперфузии и могут приводить к удлинению периода лечения раны. Широкое применение SERPING1, полученного из плазмы крови человека, осложняется его высокой стоимостью.
Таким образом, сохраняется потребность в эффективных средствах лечения геморрагического шока и сопровождающих его явлений. В настоящее время отсутствует разработанный метод, включающий в себя совместное применение антифибринолитика, выбранного из группы, включающей транексамовую, аминометилбензойную или ε-аминокапроновую кислоты, и полипептида, обладающего активностью SERPING1, для терапии геморрагического шока. Насколько известно авторам изобретения, не опубликовано ни одного примера, доказывающих повышенную эффективность подобной комбинации или просто показывающих совместное использование антифибринолитика из группы аминокислот и SERPING1 для терапии геморрагического шока.
Техническим результатом настоящего изобретения является расширение арсенала средств для лечения геморрагического шока посредством создания комбинации, включающей терапевтически эффективные количества полипептида, обладающего активностью SERPING1 и антифибринолитика, выбранного из группы, включающей транексамовую, аминометилбензойную или ε-аминокапроновую кислоты или их аналоги.
Указанная комбинация также позволяет предотвратить развитие или снизить остроту таких нежелательных явлений, непосредственно связанных с геморрагическим шоком, как коагулопатия, воспаление, отек, повреждение тканей, в частности эпителия кишечника, и связанную с этим транслокацию бактерий и бактериальных эндотоксинов. Заявленный способ позволяет проводить лечение геморрагического шока и сильных кровотечений в экстренных ситуациях и условиях, когда пациент не может быть доставлен в стационарное лечебное учреждение, то есть когда доступна только инфузионная терапия на основе кристаллоидов, коллоидов и другие инъекционные медикаменты, но не переливание донорской крови или комбинации эритроцитарной массы, свежезамороженной плазмы крови и тромбоцитов в условиях высококвалифицированной медицинской помощи.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Заявители впервые обнаружили, что комбинированное применение полипептида, обладающего активностью SERPING1 и антифибринолитика, выбранного из группы, включающей транексамовую, аминометилбензойную или ε-аминокапроновую кислоты или их аналоги, обеспечивает синергетический эффект, за счет которого улучшается выживаемость млекопитающих в условиях геморрагического шока.
В настоящем изобретении предложена комбинация, состоящая из терапевтически эффективных количеств полипептида, обладающего активностью SERPING1 и антифибринолитика, выбранного из группы, включающей транексамовую, аминометилбензойную или ε-аминокапроновую кислоты или их аналогов, применение данной комбинации для лечения геморрагического шока, а также способы лечения геморрагического шока с использованием данной комбинации и наборы для лечения, содержащие указанную комбинацию.
В соответствии с представленным изобретением, термин «полипептид, обладающий активностью SEPRING1» (далее SEPRING1 или C1INH) относится к белкам или их фрагментам, функционирующим как ингибиторы сериновых протеаз и ингибирующих протеазы, связанные с системой комплемента, предпочтительно протеазы C1r и C1s, а также протеазы MASP-1 и MASP-2, связанные с калликреин-кининовой системой, предпочтительно плазменный калликреин и фактор XIIa, и протеазы, связанные системой свертывания крови, предпочтительно фактор XIa. В настоящем изобретении «полипептид, обладающий активностью SEPRING1», может представлять собой С1-ингибитор как в нативной форме, так и в виде функционально активного фрагмента, или полипептида, содержащего мутации, и при этом сохраняющего функциональную активность.
В соответствии с представленным изобретением, в одном из вариантов SEPRING1 может быть модифицирован для улучшения биодоступности и/или периода полувыведения, для улучшения эффективности и/или снижения потенциальных побочных эффектов. Такие модификации могут быть выполнены рекомбинантным способом, химическим конъюгированием или другими известными специалисту в данной области способами. Примерами подобных модификаций могут быть гликозилирование, гибридный (химерный) белок, где С1-ингибитор слит с другим белком или полипептидом, таким как, например, альбумин или Fc-фрагмент иммуноглобулина. То есть речь идет о таких производных, которые сохраняют активность на уровне исходного белка. Примеры возможных модификаций описаны, например, в ЕР 1984503, US 20130108629.
Как понятно специалистам в данной области, любая форма SERPING1, которая сохраняет активность SERPING1, может быть использована в соответствии с настоящим изобретением.
Предпочтительно, терапевтически эффективное количество SERPING1 включает в себя дозировку от примерно 10 до примерно 900 ME/кг массы тела животного или человека и наиболее предпочтительно от около 80 до около 280 ME на кг массы тела.
Предпочтительно терапевтически эффективное количество антифибринолитика составляет от примерно 0,005 до 0,5 г/кг массы тела животного или человека и наиболее предпочтительно от около 0,01 г до 0,05 г/кг массы тела. Наиболее предпочтительно использование в качестве антифибринолитика транексамовой кислоты.
Комбинация может быть выполнена в виде фармацевтической композиции, включающей терапевтически эффективные количества SERPING1 и антифибринолитика, а также фармацевтически приемлемые добавки, разбавители, растворители, обычно используемые в фармацевтической химии.
Например, в качестве добавок могут применяться стабилизаторы, антиоксиданты, буферные агенты, наполнители, как это показано, например, в «Handbook of Pharmaceutical Excipients» (Rowe, Sheskey et al., 2012). Стандартные методы фармацевтических формуляций известны специалистам в данной области (Remington 1995).
В одном из вариантов фармацевтическая комбинация представляет собой раствор для внутривенного введения, содержащий терапевтически эффективные количества SERPING1 и транексамовой кислоты.
В другом варианте фармацевтическая комбинация представляет собой раствор для внутривенного введения, содержащий терапевтически эффективные количества SERPING1 и аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты.
В качестве дополнительных компонентов композиции могут содержать такие добавки как маннитол, крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, стеарат натрия, моностеарат глицерина, хлорид натрия, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. В определенных вариантах фармацевтическая комбинация может содержать стабилизирующие рН буферные агенты, такие как цитрат или фосфат натрия, увлажнители и эмульгаторы, такие как полисорбат или плюроник. В определенных вариантах фармацевтическая комбинация может содержать стабилизаторы, такие как гистидин, аргинин или консерванты, такие как бензиловый спирт, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или альфа-токоферол, технологические вспомогательные вещества, красители, разбавители, такие как физиологический раствор (0,9% хлорид натрия) и другие известные добавки.
В одном из вариантов фармацевтические комбинации по изобретению могут быть приготовлены в виде композиции путем смешивания растворов транексамовой и/или аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты и SEPvPING1 при подходящем рН, с физиологически приемлемыми носителями. рН композиции может варьировать от примерно 6 до примерно 8. Композиции готовят, дозируют и вводят в соответствии с принципами надлежащей медицинской практики. Учитываемые факторы в связи с этим включают конкретное расстройство и клиническое состояние индивидуального пациента, причину расстройства, способ введения, режим введения и другие факторы, известные практикующим врачам.
В качестве примера, композиция для внутривенного введения может быть приготовлена путем растворения соединений по изобретению в подходящем буферном растворе, например, в натрий-фосфатном буфере с рН=6,5-7,5, добавления регулятора осмолярности, например, хлорида натрия, а также маннита в качестве стабилизатора. Полученный раствор может быть профильтрован с использованием, например, фильтра 0,22 микрон для удаления примесей и загрязнений. Полученный раствор может использоваться как таковой или быть подвергнут лиофилизации с использованием стандартных методов.
Фармацевтическая композиция для применения может быть упакована множеством различных способов в зависимости от того, предназначена ли она для проведения экстренных мероприятий в амбулаторных или полевых условиях. Как правило, изделие для отпуска включает в себя набор, содержащий контейнер с помещенной в него фармацевтической композицией в подходящей форме и контейнер с растворителем. Подходящие контейнеры известны специалистам в данной области и включают флаконы (пластиковые и стеклянные), ампулы и т.п. Контейнер может также иметь устойчивое к внешним воздействиям приспособление для предотвращения неосторожного доступа к содержимому упаковки. Дополнительно, контейнер имеет закрепленную на нем этикетку, на которой описано содержимое контейнера. Этикетка может также содержать соответствующие предостережения.
Предпочтительно фармацевтическая комбинация представляет собой набор, состоящий из фармацевтической композиции, включающей лиофилизат С1-ингибитора в смеси с порошком транексамовой, аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты и необходимыми фармацевтически приемлемыми добавками, в комплекте с растворителем или разбавителем. Наиболее предпочтительно использование транексамовой кислоты.
2
4
2
4
Примером лиофилизата С1-ингибитора может быть лиофилизат раствора, состоящего из следующих компонентов: 20-40 мг/мл С1-ингибитора; 40-60 мг/мл трегалозы; 2-10 мг/мл NaCl; 1,78 мг/мл NaHPO; 1,38 мг/мл NaHPO, рН 6,8. Примером растворителя может быть вода для инъекций, а примерами разбавителя - 0,9% раствор хлорида натрия или раствор Рингера.
3
4
Другой предпочтительный вариант комбинации представляет собой набор, состоящий из фармацевтической композиции, включающей лиофилизат С1-ингибитора в комплекте с раствором транексамовой, аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты, где оба компонента набора также могут содержать фармацевтически приемлемые добавки. Например, лиофилизат С1-ингибитора может быть получен любым стандартным способом из раствора, содержащего 20-40 мг/мл С1-ингибитора; 40-60 мг/мл трегалозы; 2-10 мг/мл NaCl; 15-30 мМ NaPO, рН 6,8. Аминокислота, такая как транексамовая, аминометилбензойная и/или ε-аминокапроновая, может быть использована в качестве раствора в воде для инъекций с концентрацией от 10 до 150 мг/мл. Предпочтительно, 50-100 мг/мл. После растворения лиофилизата С1-ингибитора в растворе соответствующей кислоты, композиция может быть дополнительно разбавлена 0,9% раствором хлорида натрия или раствором Рингера.
В некоторых случаях комбинация может быть представлена в виде набора для последовательного введения, содержащего флакон с раствором транексамовой, аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты и флакон с раствором С1-ингибитора, где оба компонента набора присутствуют в эффективных количествах, указанных выше, а также могут содержать фармацевтически приемлемые добавки.
Формы, содержащие лиофилизат, являются предпочтительными для использования в сложных полевых условиях, т.к. потенциально обладают максимальным сроком хранения в сравнении с комбинацией в форме раствора/растворов для введения, которая, несмотря на большее удобство в применении, как правило, требует более строгих условий для хранения.
Одним из основных преимуществ предложенной комбинации является удобство одновременного использования двух активных компонентов, обладающих синергетическим действием в случае одновременного введения пациенту, то есть имеющими больший терапевтический эффект, выражающийся в снижении риска смерти в результате геморрагического шока, чем каждый из них по отдельности или если бы они были введены тому же пациенту, но с существенной (в несколько часов) разницей во времени. Важно отметить, что данная комбинация позволяет сохранять активные компоненты в течение длительного срока годности в недостаточно контролируемых условиях хранения. Более того, данная комбинация заранее включает в себя максимальную терапевтически эффективную и безопасную дозировку обоих компонентов, что позволяет снизить риск врачебной ошибки, связанной с дозировкой.
Указанная комбинация может применяться для введения пациентам с геморрагическим шоком, а также для лечения кровотечений, потенциально могущих привести к геморрагическому шоку.
В соответствии с настоящим изобретением, SERPING1 или его аналоги, или производные, такие как химерные или слитые белки, или его функционально активный фрагмент в сочетании с антифибринолитиком, выбранном из транексамовой, аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты, вводят пациентам, после появления симптомов, связанных с геморрагическим шоком.
Еще одним объектом настоящего изобретения является способ лечения геморрагического шока, который позволяет снизить риск смерти, включающий в себя введение млекопитающему (животному или человеку), испытывающему шок, комбинации терапевтически эффективных количеств SERPING1 и транексамовой кислоты. В другом варианте, млекопитающему, испытывающему шок, вводят комбинацию терапевтически эффективных количеств SERPING1 и аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты.
Введение может осуществляться посредством внутривенного введения путем трансфузии, вместе с кристаллоидными растворами в ходе стандартной терапии для замещения объема кровопотери, а также болюсным способом путем внутривенной инъекции.
В наиболее предпочтительном варианте способ предусматривает одновременное введение SERPING1 и транексамовой кислоты в виде раствора для инъекций.
Однако допустимо последовательное введение указанных препаратов в течение короткого промежутка времени в пределах 1 часа. Предпочтительно, интервал между введением препаратов составляет 0-30 мин.
Предпочтительно, терапевтически эффективное количество SERPING1, вводимое пациенту, включает в себя дозировку от примерно 10 до примерно 900 МЕ/кг массы тела животного или человека и наиболее предпочтительно от около 80 до около 280 МЕ/кг массы тела. Предпочтительно терапевтически эффективное количество транексамовой, аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты составляет от примерно 0,005 до 0,5 г/кг массы тела животного или человека и наиболее предпочтительно от около 0,01 г до 0,05 г/кг массы тела.
Авторы настоящего изобретения впервые показали, что комбинированное применение SERPING1 и антифибринолитика, выбранного из транексамовой, аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты имеет значительно более сильный защитный эффект при геморрагическом шоке и острой массивной кровопотере, чем SERPING1 или один из упомянутых антифибринолитиков, например, транексамовая кислота, используемые по отдельности. Комбинированное применение SERPING1 и транексамовой, аминометилбензойной и/или ε-аминокапроновой кислоты улучшает выживаемость при геморрагическом шоке путем нормализации гемостаза (препятствуя развитию коагулопатии), путем противодействия воспалению, предотвращения повреждения тканей, минимизации шока, а также минимизации связанной с геморрагическим шоком транслокации из кишечника бактерий и бактериальных эндотоксинов.
В подтверждение вышеизложенного авторы показали, что заявленная комбинация существенно более эффективна в повышении выживаемости опытных животных в модели острой кровопотери и геморрагического шока, чем стандартная инфузионная терапия кристаллоидами или каждый из активных компонентов комбинации по отдельности. Также авторы показали, что одним из возможных механизмов действия заявленной комбинации может быть подавление связанного с коагулопатией гиперфибринолиза, на модели вторичного фибринолиза in vitro. Далее, авторы продемонстрировали, на модели отека in vivo и индуцированного эндотоксинами выброса цитокинов ex vivo/in vitro, что дополнительным преимуществом данной терапии может быть противодействие SERPING1 воспалительному процессу, проницаемости сосудов и цитокиновому шторму. Наконец, авторы показали, что в модели геморрагического шока in vivo, на крысах, заявленная комбинация эффективно противодействует разрушению эпителия кишечника, что, как следствие, приводит к снижению риска транслокации бактерий и их токсинов и наступлению септического шока.
Краткое описание чертежей
23-500
120-500
23-122
465ART/VKV
Фиг. 1. Воздействие rhSERPING1 на выброс воспалительных цитокинов в модели ex vivo/in vitro на цельной крови. Гистограмма отражает общее количество (AUC, пг/мл за 24 ч) ИЛ-6 (А) или ИЛ-1β (Б), выброшенное за 24 ч после индукции с помощью ЛПС (ЛПС - бактериальные полисахариды); rhC1INH - зрелый полноразмерный rhSERPING1, аминокислотные остатки 23-500; C1INH - усеченный по амино-концу rhSERPING1, содержащий серпиновый домен, аминокислотные остатки 120-500; rhC1INH - усеченный по карбокси-концу rhSERPING1, без серпинового домена, аминокислотные остатки 23-122; rhC1INH - rhSERPING1 с мутациями в активном центре (аминокислотные остатки 465-467 Ala-Arg-Thr заменены на Val-Lys-Val), что привело к потери активности ингибитора сериновых протеаз; ЧСА - очищенный человеческий сывороточный альбумин.
Фиг. 2. Уменьшение отека лапы мыши, индуцированного каррагинаном, под воздействием rhSERPING1. Капиллярный кровоток в месте отека измеряли методом лазер-Допплеровской флоуметрии. Ось Y - 100% нормальный кровоток в здоровой лапе.
Фиг. 3. График выживаемости Каплана-Маейра для каждой экспериментальной группы: контроль - геморрагический шок без вмешательства (без инфузионной терапии); Раствор Рингера - инфузионная терапия раствором Рингера для компенсации гиповолемии; C1INH - rhSERPING1 (168 МЕ/кг); ТХА - транексамовая кислота (0,15 г/кг). Все крысы, прожившие 14 часов после геморрагического шока, были живы к 72 ч после геморрагического шока (время эвтаназии).
Фиг. 4. (А) Гистограмма выживания животных в каждой из экспериментальных групп геморрагического шока (группы приведены, как показано на Фиг. 3) через 72 ч после геморрагического шока. (С) Выживание животных на 72 ч после геморрагического шока, которым ввели комбинацию rhSERPING1 (C1INH) и транексамовой кислоты, зависит от дозы rhSERPING.
Фиг. 5. Типичные микрофотографии срезов тощей кишки, окрашенные гематоксилином и эозином. Стрелки указывают на бокаловидные клетки, наконечники - на полости Грюнхагена, являющиеся признаками дегенерации ворсинок. (А) - контроль, показывающий нормальный эпителий кишечника. (В) Группа с геморрагическим шоком, при реанимации раствором Рингера. (С) Группа с геморрагическим шоком, при реанимации раствором Рингера и транексамовой кислотой; (D) Группа с геморрагическим шоком, при реанимации раствором Рингера и rhSERPING1; (Е) Группа с геморрагическим шоком, при реанимации раствором Рингера и комбинацией rhSERPING1 с транексамовой кислотой.
Фиг. 6. Количественная оценка повреждения эпителия кишечника у животных с геморрагическим шоком и разными вариантами терапии. (А) Повреждения эпителия слизистой оболочки по шкале Чиу/Парк. (В) Количество бокаловидных клеток на срезе ворсинки. Экспериментальные группы обозначены как в Фиг. 3.
Фиг. 7. Тромбоэластограмма активированной нормальной плазмы крови человека. (А) Формирование сгустка в активированной плазме (контроль) (Б) Лизис сгустка, вызванный добавлением тканевого активатора плазминогена (t-РА/т-ПА). (В) Добавление транексамовой кислоты к активированной плазме крови человека не изменяет параметров свертываемости (образования сгустка) в активированной плазме.
Фиг. 8. Тромбоэластограмма активированной нормальной плазмы крови человека при добавлении т-ПА и rhSERPING1. (A) rhSERPING1 по отдельности не оказывает влияния на идуцированный т-ПА фибринолиз in vitro. (Б) Частичное ингибирование фибринолиза, индуцированного т-ПА, с помощью транексамовой кислоты (ТХА). (В) Ингибирование транексамовой кислотой лизиса сгустка, вызванного т-ПА, потенциируется добавлением rhSERPING1.
120-500
Фиг. 9. Усеченный по амино-концу rhSERPING1 (rhC1INH), сохраняющий серпиновый домен, также имеет способность усиливать антифибринолитический эффект транексамовой кислоты. Наложение тромбоэластограмм. Каждая тромбоэластограмма была записана из активированной нормальной плазмы крови человека, в которй лизис сгустка был инициирован с помощью т-ПА.
Фиг. 10. Количественная оценка тромбоэластограмм. Показано время лизиса сгустка, от R (время реакции начала образования сгустка) до полного лизиса сгустка.
Перечень последовательностей
SEQ ID №1 - последовательность полноразмерного rhSERPING1, белка-предшественника с отщепляемым лидерным пептидом. Лидерный пептид - аминокислотные остатки 1-22; зрелый белок аминокислотные остатки 23-500.
23-122
SEQ ID №2 - последовательность rhC1INH, усеченного по карбокси-концу rhSERPING1, без серпинового домена. Белок-предшественник с отщепляемым лидерным пептидом. Лидерный пептид аминокислотные остатки 1-22; зрелый белок - аминокислотные остатки 23-122
120-500
SEQ ID №3 - C1INH - усеченный по амино-концу rhSERPING1, содержащий серпиновый домен. Белок-предшественник с отщепляемым лидерным пептидом. Лидерный пептид - аминокислотные остатки 1-22; зрелый белок соответствует аминокислотным остаткам 120-500 в предшественнике полноразмерного rhSERPING1
465ART/VKV
SEQ ID №4 - последовательность rhC1INH - rhSERPING1 с мутациями в активном центре (аминокислотные остатки 465-467 Ala-Arg-Thr заменены на Val-Lys-Val). Белок-предшественник с отщепляемым лидерным пептидом. Лидерный пептид - аминокислотные остатки 1-22; зрелый белок - аминокислотные остатки 23-500.
Настоящее изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами.
ПРИМЕР 1. Получение рекомбинантного человеческого SERPING1 (rhSERPING1) и его вариантов
Экспрессия рекомбинантного человеческого SERPING1 (rhSERPING1) и его модифицированных форм (см. Таблицу 1) осуществлялась путем введения экспрессионной плазмиды pRA810, содержащей последовательность ДНК, кодирующую человеческий SERPING1 под контролем сильного промотора, в клеточную линию-хозяина, посредством трансфекции клеток. В качестве способа трансфекции применяли электропорацию. В результате чего введенная последовательность стабильно интегрирована в геном хозяина. Клеточная линия-хозяин представляла собой субклон линии клеток яичников китайского хомячка СНО-К1, приспособленный к выращиванию в виде суспензии в бессывороточной среде. Экспрессионная плазмида также несла ген устойчивости к пуромицину и обеспечивала устойчивость трансфицированной клеточной линии к селективному маркеру - антибиотику пуромицину.
Для идентификации и выделения клеток, продуцирующих rhSERPING1, после трансфекции и добавления селективного антибиотика в культуральную среду, суспензия клеток разбавлялась и рассевалась таким образом, чтобы изолировать популяции, выросшие из единичных клеток, то есть клеточные клоны. После выделения клоны выращивались до состояния конфлюэнтности, и содержание rhSERPING1 в супернатанте оценивалось методом иммуноферментного анализа, для идентификации клеток, секретирующих rhSERPING1.
Клеточные клоны, секретирующие rhSERPING1 на высоком уровне, размножали и хранили с помощью криоконсервации.
Для производства белка rhSERPING1 клон клеток, стабильно экспрессирующий rhSERPING1, выращивали в одноразовом пластиковом мешке-биореакторе, который перемешивался с помощью качающейся платформы. Использовался биоректор Cultibag 20L Perf (Sartorius, Германия). Для роста клеток и продукции белка использовалась бессывороточная среда SFM4CHO (HyClone, США), содержащая 6 мМ L-глутамин, 0,1% Pluronic F68. Для культивирования использовали режим перфузии, где в процессе фильтрации примерно 80% культуральной среды в течение 24-часового цикла заменялось на свежую среду. В течение 22 дней производственного процесса клеткам непрерывно подавалась свежая ростовая среда, а использованная среда, содержащая rhSERPING1, отделялась от клеточной биомассы и сохранялась. При этом клетки оставались в мешке-биореакторе. Отделенная от клеток среда, содержащая rhSERPING1, собиралась каждый день и использовалась для очистки rhSERPING1 с помощью четырехступенчатой хроматографии. Этапы хроматографии приведены ниже.
2
I. Аффинная хроматография на основе иммобилизованных ионов металлов (IMAC - Immobilized metal ion affinity chromatography). Собранную с разных дней процесса биосинтеза культуральную среду загружали в хроматографическую колонку IMAC Sepharose, предварительно промытую 100 мМ ZnCl в количестве 2 объемов колонки и уравновешенную 20 мМ Tris, рН 7.2. Далее колонку промывали сначала 5 объемами 20 мМ Tris, рН 7.2 и затем 5 объемами 50 мМ Tris, 15 мМ имидазол, рН 7.5. Белки, связанные с колонкой, элюировали раствором 20 мМ Tris, 150 мМ имидазол, рН 7.2.
II. Хроматография на гепариновой сефарозе. Белковую фракцию с этапа I загружали на колонку гепарин-сефароза, предварительно промытую 20 мМ Tris, 5 мМ фосфатом натрия, рН 7.2. Затем колонку промывали тремя объемами 20 мМ Tris, 5 мМ фосфата натрия. Далее, связавшиеся с колонкой белки элюировали 20 мМ Tris, 0.2 М NaCl, рН 7.2.
III. СНТ-хроматография на керамическом гидроксиапатите. Собранные фракции с этапа II загружали на колонку СНТ, предварительно промытую одним объемом 0.5 М NaOH, одним объемом 200 мМ Tris, рН 7.2 и уравновешенную 20 мМ Tris, 5 мМ фосфат натрия, рН 7.2. Далее колонку промывали тремя объемами 20 мМ Tris, 5 мМ фосфат натрия, рН 7.2. Затем белки, связанные с колонкой, элюировали 4 объемами 200 мМ Tris, 5 мМ фосфата натрия, 200 мМ NaCl, рН 8.5.
IV. Анионобменная хроматография на Q-сефарозе. Фракцию элюции с этапа III разводили водой для достижения проводимости раствора 6 mS/cm и загружали на колонку с Q-сефарозой, предварительно уравновешенную двумя объемами 20 мМ фосфата натрия, рН 6.8. Далее колонку промывали тремя объемами of 20 мМ фосфата натрия, рН 6.8 и затем связанные белки элюировали 20 мМ фосфата натрия, 0.25 М NaCl, рН 6.8.
После IV стадии очистки и соответствующего разбавления раствор rhSERPING1 имел следующие характеристики (Табл. 2):
Аналогичным образом получали и очищали модифицированные формы SERPING1, приведенные в Таблице 1. Полученные составы использовались для проведения дальнейших экспериментов и введения животным.
ПРИМЕР 2. Ингибирование сериновой протеазы
23-500
Для определения специфической активности rhC1INH и его модифицированных форм, полученных в Примере 1, и оценки способности ингибировать эстеразу C1q использовали стандартную методику хромогенного анализа. Для проведения эксперимента использовали набор TECHNOCHROM C1INH, # 5345003 (Technoclone Gmbh). Данный способ основан на ингибировании избыточного количества образующегося комплекса С1-эстеразы с С1 эстеразным ингибитором, за которым следует гидролиз хромогенного субстрата избытком С1-эстеразы. Количество паранитроанилина, высвобождающееся при гидролизе, и измеренного при длине волны 405 нм, обратно пропорционально активности С1-ингибитора, присутствующего в реакционной среде.
23-500
120-500
23-122
465ART/VKV
Специфическая активность очищенных rhC1INH, и rhC1INH, полученных в Примере 1, составляла 5,0-12,0 МЕ/мг общего белка. Специфическая активность белков rhC1INH и rhC1INH равнялась нулю, что являлось результатом делеции серпинового домена или мутации его активного центра.
ПРИМЕР 3. Ингибирование воспалительных цитокинов на ex vivo модели септического шока.
23-500
Для каждого отдельного эксперимента использовали 25 мл цельной крови, взятой у 6 здоровых добровольцев. В качестве антикоагулянта к цельной крови добавляли 5 мМ ЭДТА. Цельную кровь равномерно распределяли в тестовые пробирки, куда заранее были добавлены либо растворы белков, либо эквивалентный объем физиологического раствора. В качестве контроля использовали человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) (Baxter). Конечная концентрация белков (альбумина (контрольный белок), pdSERPING1 (Беринерт), rhC1INH, а также модифицированных (усеченных или с аминокислотными заменами) вариантов rhSERPING1 (полученных в Примере 1), приведенных в Таблице 1, в цельной крови составляла 22 нМ.
После предварительного инкубирования при 37°С в течение 30 мин на орбитальном шейкере (60° угол поворота оси и скорость вращения 9 об/мин), к смеси, состоящей из цельной крови и белков, добавляли бактериальные липополисахариды (ЛПС E.coli O55 : В5 (#L6629, Сигма)) до конечной концентрации 1 нМ. Таким образом, индуцировали воспалительное высвобождение цитокинов из макрофагов и нейтрофилов. После этого всю смесь оставляли в одинаковых условиях инкубации (описанных выше) и образцы для анализа отбирали после 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 24 ч.
23-500
120-500
23-500
23-122
Плазму крови отделяли центрифугированием и хранили при -20°С. Концентрацию цитокинов в замороженной плазме определяли методом ИФА (Quantikine SixPak, R&D Systems). Для анализа цитокинового шторма определялись концентрации следующих цитокинов: ФНО-альфа, ИЛ-1β/ИЛ-1F2, ИЛ-6. Добавление rhC1INH или C1INH к цельной крови значительно снижало ЛПС-индуцированный выброс ИЛ-6 (Фиг. 1). Несмотря на то, что выброс ИЛ-1β не подавлялся полноразмерным rhSERPING (rhC1INH), амино-концевой фрагмент rhSERPING (rhC1INH) значительно снизил уровень ИЛ-1β. Уровень ФНО-альфа не изменялся значительно после добавления rhSERPING1 (или его вариантов) в модели цитокинового шторма.
23-500
Таким образом, добавление rhC1INH или его вариантов, сохраняющих функциональную активность, подавляет высвобождение определенных воспалительных цитокинов, а именно ИЛ-6 и ИЛ-ip, которые привлекают нейтрофилы в места инфекции и воспаления, вызывая дальнейшее увеличение воспаления. Более того, выше перечисленные провоспалительные цитокины играют важную роль в развитии септического шока, который часто является последствием геморрагического шока.
ПРИМЕР 4. Модель индуцированного каррагинаном отека задней лапы мыши.
Для изучения противовоспалительного и противоотечного действия rhSERPING1 была использована модель воспалительного отека задней лапы мыши, вызванного введением каррагинана. В данной модели основные признаки воспаления, такие как отек, гипералгезия, и эритема - проявляются сразу же после подкожной инъекции каррагинана. Данные симптомы обусловлены действием таких провоспалительных агентов, как брадикинин, гистамин, тахикинины, система комплемента, а также реактивные формы кислорода и азота. Такие агенты могут образовываться непосредственно в месте воспаления, при этом нейтрофилы охотно мигрируют в участки воспаления и могут выделять реактивные формы кислорода и другие провоспалительные вещества. В используемой модели воспалительная реакция обычно определяется по увеличению в размере задней лапки (по отеку), в которую вводился каррагинан. Максимальный отек развивается уже через 10 мин после введения каррагинана и в это же время происходит выброс специфических молекул, характерных для воспалительного каскада. Степень отека также может оцениваться путем измерения капиллярного кровотока в лапе - чем сильнее отек, тем слабее кровоток. В проведенных экспериментах отек индуцировали путем подкожной инъекции 100 мкл 1% каррагинана (λ-каррагинан тип IV, Sigma) в физиологическом растворе в правую заднюю лапу. Левая задняя лапа была использована в качестве контроля. Сразу после инъекции каррагинана, внутривенно вводили rhSERPING1 (500 МЕ/кг) или pdSERPING1 (500 МЕ/кг, препарат Беринерт, производства Behring) или диклофенак (3 мг/кг, производства Хемофарм АД, Сербия) или раствор Рингера в качестве отрицательного контроля. Динамика капиллярного кровотока в лапе в течение 3 ч измерялась с методом лазер-Допплера. Через 24 ч после введения каррагинана измеряли уровень провоспалительного цитокина ИЛ-6.
У животных, получившие в качестве терапии rhSERPING1 или pdSERPING1, отек спадал существенно быстрее, чем в случае применения нестероидного противовоспалительного препарата диклофенак. У животных в контроле, инъецированных только раствором Рингера, снижение отека не наблюдалось (Фиг. 2). Кроме того, у животных, получившие в качестве терапии rhSERPING1 или pdSERPING1, наблюдался более низкий уровень (в 10 раз меньше) ИЛ-6, по сравнению с контрольной группой животных, которым вводился раствор Рингера.
ПРИМЕР 5. Фармацевтическая комбинация SERPING1 и транексамовой кислоты.
Фармацевтические композиции для введения были приготовлены следующим образом.
А. Раствор для введения
Готовят следующий состав:
Рассчитанное количество трегалозы и хлорида натрия взвешивают и растворяют при перемешивании в необходимом количестве 20 мМ натрий-фосфатного буфера с рН=6,8. Затем к раствору добавляют рассчитанное количество порошка транексамовой, аминометилбензойной или ε-аминокапроновой кислоты, перемешивают и проверяют рН. При необходимости рН доводят до значения 6,8 с использованием раствора 1М NaOH или 1М HCl. К полученному раствору добавляют необходимое количество rhSERPING1, полученного в Примере 1, и осторожно перемешивают. Раствор доводят до определенного объема водой для инъекций, фильтруют через 0,22-микронный мембранный фильтр и собирают в контейнер в стерильных условиях.
Полученная жидкая композиция может вводиться любым способом внутривенно: струйно, капельно, болюсно; композиция может быть разбавлена раствором Рингера и другими кристаллоидами. Таким образом, последующее введение может осуществляться либо параллельно с инфузионной терапией (капельница), либо независимо от инфузионной терапии.
Б. Растворы для последовательного введения.
Готовят раствор препарата, способом, описанным в разделе А, но без добавления транексамовой, аминометилбензойной или ε-аминокапроновой кислоты, помещают в стерильные флаконы и запечатывают. Отдельно готовят раствор транексамовой, аминометилбензойной или ε-аминокапроновой кислоты в концентрации 50 мг/мл. Препарат вводится внутривенно, последовательно (до или после) или одновременно с внутривенным введением раствора транексамовой, аминометилбензойной или ε-аминокапроновой кислоты.
В. Лиофилизированный порошок
Раствор для внутривенного введения, полученный в разделе А, лиофилизируют с использованием следующего способа:
Аликвоты раствора по 45 мл помещаются в стеклянные апирогенные флаконы, которые не плотно закрываются апирогенными пробками, чтобы допустить выход воздуха. Флаконы далее помещаются в камеру лиофильной сушки (Labconco FreeZone 6 Plus), где происходит лиофилизация при минус 40°С в течение 16 часов. Дополнительный цикл сушки происходит в течение 8 часов в той же камере с выключенным охлаждением. Флаконы далее укупориваются бутиловыми резиновыми пробками и запечатываются алюминиевыми колпачками.
Восстановление раствора проводят при комнатной температуре добавлением во флакон необходимого количества воды для инъекций, физиологического раствора или раствора Рингера и тщательного взбалтывания до полного растворения содержимого флакона. Дальнейшее введение пациенту осуществляется, как описано в разделе А.
Г. Набор с растворителем
Готовят раствор препарата, способом, описанным в разделе А, но без добавления транексамовой, аминометилбензойной или ε-аминокапроновой кислоты, и проводят его лиофилизацию в условиях, описанных в разделе Б. Готовый лиофилизат помещают в стерильные флаконы и запечатывают.
Раствор транексамовой, аминометилбензойной или ε-аминокапроновой кислоты с концентрацией 10-100 мг/мл готовят путем растворения порошка соответствующей кислоты в воде для инъекций при перемешивании. Полученный раствор фильтруют через стерильный фильтр и разливают по флаконам.
Для получения раствора rhSERPING1 с аминокислотой, при помощи шприца набирают раствор соответствующей кислоты, вводят во флакон с лиофилизатом и осторожно перемешивают до полного растворения содержимого флакона.
Во всех случаях (А, Б, В, Г) приготовленный раствор rhSERPING1 с аминокислотой может быть дополнительно разбавлен 0,9% раствором хлорида натрия или раствором Рингера до требуемой концентрации.
ПРИМЕР 6. Оценка эффективности заявленной композиции на крысиной модели геморрагического шока.
Для проведения эксперимента использовали крыс породы Sprague-Dawley, полученных в питомнике SPF-категории «Пущино» (Пущино, РФ), возрастом 12-16 недель, с массой 350-400 г.
Крыс вводили в наркоз и вызывали геморрагический шок путем надреза бедренной артерии. Объем кровопотери, длившейся 20-25 минут, составлял 50% от расчетного общего объема циркулирующей крови (ОЦК). ОЦК для крыс вычисляли по уравнению:
ОЦК в миллилитрах = 0.77 + (0.06 × вес тела в граммах)
Кровотечение останавливали путем наложения лигатуры после эксфузии 50% ОЦК. Через 30 минут после завершения эксфузии начинали процесс реперфузии (инфузионной терапии). Все крысы путем рандомизации были поделены на 7 экспериментальных групп, минимальное количество животных в каждой группе составляло 10 особей.
В экспериментальной группе номер 1 (10 животных): реанимация проводилась внутривенным введением раствора Рингера в соотношении 2:1 (объем раствора Рингера: объем кровопотери).
В экспериментальной группе номер 2 (11 животных): реанимация проводилась внутривенным введением раствора Рингера в соотношении 2:1 (объем раствора Рингера: объем кровопотери), содержащим человеческий SERPING1 очищенный из плазмы крови (препарат Berinert) в дозировке 168 МЕ/кг.
23-500
В экспериментальной группе номер 3 (11 животных): реанимация проводилась внутривенным введением раствора Рингера в соотношении 2:1 (объем раствора Рингера: объем кровопотери), содержащим рекомбинантный человеческий SERPING1 (rhC1INH) в дозировке 168 МЕ/кг.
В экспериментальной группе номер 4 (11 животных): реанимация проводилась внутривенным введением раствора Рингера в соотношении 2:1 (объем раствора Рингера: объем кровопотери), содержащим транексамовую кислоту в дозировке 0,015 г/кг.
23-500
В экспериментальной группе номер 5 (11 животных): реанимация проводилась внутривенным введением раствора Рингера в соотношении 2:1 (объем раствора Рингера: объем кровопотери), содержащим рекомбинантный человеческий SERPING1 (rhC1INH) в дозировке 168 МЕ/кг и транексамовую кислоту в дозировке 0,015 г/кг.
23-500
В экспериментальной группе номер 6 (10 животных): реанимация проводилась внутривенным введением раствора Рингера в соотношении 2:1 (объем раствора Рингера: объем кровопотери), содержащим рекомбинантный человеческий SERPING1 (rhC1INH) в дозировке 84 МЕ/кг и транексамовую кислоту в дозировке 0,015 г/кг
В экспериментальной группе номер 7 (10 животных): реанимационные предприятия не проводились.
Реперфузию животных осуществляли через бедренную вену либо раствором Рингера, либо раствором Рингера, содержащим SERPING1 или транексамовую кислоту, либо раствором Рингера содержащим вместе SERPING1 и транексамовую кислоту. Объем реперфузии равнялся примерно 200% объема эксфузии. Скорость реперфузии составляла примерно 1,2 мл/мин. Контрольную группу животных подвергали эксфузии без последующей реперфузии. После окончания реперфузии на бедренную вену также была наложена лигатура.
С момента наступления наркоза, во время эксфузии, во время и после реперфузии мониторингу подвергались следующие физиологические параметры: частота дыхания и сердечных сокращений, насыщение кислородом, электрокардиограмма. В случае, когда физиологические параметры свидетельствовали о наступающем коллапсе животного, эксфузия временно прекращалась и животным проводилась искусственная вентиляция легких. После стабилизации физиологических параметров, эксфузия завершалась.
Параллельные группы животных, после пробуждения от наркоза, и в случае, если смерть не наступала под наркозом, наблюдали в течение 72 часов после завершения эксфузионно-реперфузионных предприятий. Фиксировали смертность в течение 72 часов, после чего животных подвергали эвтаназии.
90% животных, получавших комбинацию SERPING1 и транексамовой кислоты в растворе Рингера, выживало по крайней мере (более) 72 часов, в то время как только 20% животных из группы, получавшей раствор Рингера, выжило в течение такого же времени. В группе, получавшей транексамовую кислоту в растворе Рингера, в течение 72 часов выжило 36,4%. В группах, получавших раствор Рингера, содержащий SERPING1 из плазмы крови человека или рекомбинантный SERPING1, в течение 72 часа выжило 54,5% животных, при этом разницы между группами, получавшими рекомбинантный и плазменный SERPING1, обнаружено не было. В группе без реанимации ни одно из животных не выжило более 1 часа. Двукратное снижение дозы rhSERPING1 (с 168 МЕ/кг до 84 МЕ/кг) в комбинации с транексамовой кислотой, привело к примерно двукратному снижению выживаемости (с 90 до 50%) (Фиг. 3, 4).
Таким образом был показан синергетический эффект комбинации rhSERPING1 и транексамовой кислоты, которая имеет наибольший эффект снижения смертности в модели геморрагического шока на крысах.
ПРИМЕР 7. Эффективность заявленной комбинации в снижении повреждения эпителия кишечника в модели геморрагического шока на крысах.
Крысы были рандомизированно разделены на 5 экспериментальных групп по 5 животных в каждой. Крыс вводили в наркоз и вызывали геморрагический шок в четырех группах, способом, описанным в Примере 6. Контрольная группа, без геморрагического шока, была наркотизирована, но у нее не вызывалось кровотечение и геморрагический шок. Описание терапии экспериментальных групп приведено в Таблице 4.
Животные в каждой экспериментальной группе были подвергнуты эвтаназии через 4 часа после окончания эксфузионно-инфузионных мероприятий. Сегменты тонкого кишечника, включающие тощую и подвздошную кишку, были промыты холодным физиологическим раствором, зафиксированы в 20% забуференном формалине и 3% глутаровом альдегиде.
Вырезанные сегменты тонкой кишки заливали парафином, делали срезы (5 мкм) и окрашивали гематоксилин-эозином. Срезы анализировали с помощью светового микроскопа. Окрашенные срезы были закодированы и проанализированы. Повреждения кишечного эпителия классифицировались в соответствии со шкалой Чиу-Парк (Chiu, McArdle et al. 1970): 1-я степень - появление субэпителиальных полостей Грюнхагена и вакуолизация кончиков ворсинок; 2-я степень - расширение субэпителиального пространства с умеренным отслоением эпителия от lamina propria; 3-я степень - массивное отслоение эпителия и увеличение вакуолизации от кончика к середине ворсинок; 4-я степень - отслоение эпителия и вакуолизация от кончика до нижней части ворсинок; 5 степень - полное оголение ворсинки, изъязвление слизистой оболочки и lamina propria. Кроме того, два других признака кишечного повреждения были приняты во внимание - уменьшение количества или исчезновение бокаловидных клеток, и уменьшение длины при увеличении толщины ворсинки. Бокаловидные клетки выделяют слизь, которая образует защитный барьер кишечника. Уменьшение в длине ворсинок и увеличение толщины ворсинки является указанием отека.
Кишечник из группы 2 (геморрагический шок и реанимация раствором Рингера) показал наиболее серьезное повреждение (Средняя степень 4±1,2) (Фиг. 5), с часто встречающимся полным оголением или потерей ворсинок, увеличенной целлюляризацией или распадом lamina propria; уменьшением количества или полной потерей бокаловидных клеток. При применении транексамовой кислотой значительно снижался ущерб кишечника (средняя степень 1,9±0,7). Применение rhSERPING1 также снижало повреждение кишечника, примерно в такой же степени (средняя степень 1,7±0,5). Несмотря на в основном сохранившийся слизистый эпителий, ворсинки в группе с терапией rhSERPING1 были заметно короче и тоньше, чем в группе контроля без геморрагического шока или в группе с терапией транексамовой кислотой. В группе с комбинированным применением rhSERPING1 и транексамовой кислоты, повреждение слизистой оболочки было наименее выражено среди групп с геморрагическим шоком (средняя степень 0,4±0,7) (Фиг. 5, 6).
Таким образом, комбинация rhSERPING1 и транексамовой кислоты защищает кишечный эпителий значительно лучше, чем rhSERPING1 (Р=0,012) или транексамовая кислота (Р=0,038) в одиночку.
ПРИМЕР 8. Синергетический эффект комбинации rhSERPING1 и транексамовой кислоты в отношении фибринолиза in vitro.
Для того чтобы проверить, достигается ли синергетический эффект комбинации rhSERPING1 и транексамовой кислоты в отношении вторичного фибринолиза, было проведено исследование in vitro методом тромбоэластографии на объединенных пробах человеческой плазмы крови здоровых доноров.
2
Для инициации образования сгустка по пути контактной активации, 20 мкл 0,5 М CaCl и 20 мкл каолин-кефалиновой смеси (производства РЕНАМ, РФ) добавляли к 260 мкл цитрированных образцов плазмы (нормальная плазма крови собранная и объединенная от здоровых доноров, РЕНАМ, РФ) в кювете для тромбоэластографии. После добавления 60 мкл фосфатно-солевого буфера, кювету помещали для немедленного измерения в тромбоэластограф Mono ТЕМ-А (Framar Hemologix, Италия).
На Фиг. 7А приведена типичная тромбоэластограмма образования сгустка в активированной человеческой плазме. Добавление транексамовой кислоты до концентрации 1,43 мкг/мл к активированной плазме не изменило значимо параметров тромоэластограммы (Фиг. 7С).
23-500
23-500
23-500
120-500
120-500
Чтобы инициировать фибринолиз, фармакологический препарат рекомбинантного тканевого активатора плазминогена, т-ПА (t-PA) (Ревелиза, производства Генериум, Россия) был добавлен до конечной концентрации 55 мкг/мл (0,57 МЕ/мл). При этом тромбоэластография показала быстрый фибринолиз после начального формирования сгустка (Фиг. 7Б). Добавление rhSERPING (rhC1INH) до конечной концентрации 2,5 мг/мл не изменило активированный т-ПА фибринолиз (Фиг. 8А), в то время как добавление транексамовой кислоты (1,43 мкг/мл) значительно ингибировало т-ПА-зависимый фибринолиз (Фиг. 8Б), что нашло свое отражение в длительности стабильности сгустка на тромбоэластограмме. Когда rhSERPING (rhC1INH) был использован в сочетании с транексамовой кислотой (конечные концентрации 2,5 мг/мл и 1,43 мкг/мл соответственно), степень ингибирования фибринолиза была примерно в два раза сильнее по сравнению применением одной только транексамовой кислоты (Фиг. 8С). При сочетанном применении rhSERPING1 (rhC1INH) и транексамовой кислоты время до полного растворения сгустка было в два раза больше, что хорошо видно на Фиг. 10. RhSERPING1 (CIINH), усеченный по амино-концу, содержащий серпиновый домен, имел схожий эффект, а именно: в случае фибринолиза, инициированного т-ПА, время лизиса сгустка, в случае добавления вместе с транексамовой кислотой, было существенно больше, чем в случае применения транексамовой кислоты или RhSERPING1 (C1INH), усеченный по амино-концу, по отдельности (Фиг. 9, 10).
Таким образом, пример показывает:
1. Установлено действие антифибринолитика, например, такого как транексамовая кислота, выраженное в замедлении процесса фибринолиза, вызванного т-ПА (0,57 МЕ/мл).
2. Вышеуказанный эффект не наблюдается при добавлении rhSERPING1.
3. rhSERPING1 и транексамовая кислота, примененные вместе, обладают синергетическим действием по ингибированию вторичного фибринолиза в плазме крови.
120-500
4. RhSERPING1 (C1INH), усеченный по амино-концу, содержащий серпиновый домен, также эффективно потенциирует антифибринолитическое действие транексамовой кислоты.
Список литературы
Anonick, Р.K., J. Vasudevan and S.L. Gonias (1992). "Antifibrinolytic activities of alpha-N-acetyl-L-lysine methyl ester, epsilon-aminocaproic acid, and tranexamic acid. Importance of kringle interactions and active site inhibition." Arterioscler Thromb 12(6): 708-716.
Chiu, C.J., A.H. McArdle, R. Brown, H.J. Scott and F.N. Gurd (1970). "Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal." Arch Surg 101(4): 478-483.
collaborators, С.-., I. Roberts, H. Shakur, A. Afolabi, K. Brohi, T. Coats, Y. Dewan, S. Gando, G. Guyatt, B. J. Hunt, C. Morales, P. Perel, D. Prieto-Merino and T. Woolley (2011). "The importance of early treatment with tranexamic acid in bleeding trauma patients: an exploratory analysis of the CRASH-2 randomised controlled trial." Lancet 377(9771): 1096-1101, 1101 e1091-1092.
collaborators, C.-t, H. Shakur, I. Roberts, R. Bautista, J. Caballero, T. Coats, Y. Dewan, H. El-Sayed, T. Gogichaishvili, S. Gupta, J. Herrera, B. Hunt, P. Iribhogbe, M. Izurieta, H. Khamis, E. Komolafe, M.A. Marrero, J. Mejia-Mantilla, J. Miranda, C. Morales, O. Olaomi, F. Olldashi, P. Perel, R. Peto, P.V. Ramana, R.R. Ravi and S. Yutthakasemsunt (2010). "Effects of tranexamic acid on death, vascular occlusive events, and blood transfusion in trauma patients with significant haemorrhage (CRASH-2): a randomised, placebo-controlled trial." Lancet 376(9734): 23-32.
Dalle Lucca, J.J., Y. Li, M. Simovic, A.E. Pusateri, M. Falabella, M.A. Dubick and G.C. Tsokos (2012). "Effects of CI inhibitor on tissue damage in a porcine model of controlled hemorrhage." Shock 38(1): 82-91.
Davis, A.E., 3rd, S. Cai and D. Liu (2007). "CI inhibitor: biologic activities that are independent of protease inhibition." Immunobiology 212(4-5): 313-323.
Davis, A.E., 3rd, F. Lu and P. Mejia (2010). "C1 inhibitor, a multi-functional serine protease inhibitor." Thromb Haemost 104(5): 886-893.
Davis, A.E., 3rd, P. Mejia and F. Lu (2008). "Biological activities of C1 inhibitor." Mol Immunol 45(16): 4057-4063.
DeLano, F.A., D.B. Hoyt and G.W. Schmid-Schonbein (2013). "Pancreatic digestive enzyme blockade in the intestine increases survival after experimental shock." Sci Transl Med 5(169): 169ra111.
DOBROKHOTOVA, Y., E. DZHOBAVA, S. DANELYAN and S. ZALESSKAYA (2013). "Послеродовые кровотечения. Обоснование оптимальной гемостатической фармакотерапии."
Dunn, С.J. and K.L. Goa (1999). "Tranexamic acid: a review of its use in surgery and other indications." Drags 57(6): 1005-1032.
Ioannou, A., J. Dalle Lucca and G.C. Tsokos (2011). "Immunopathogenesis of ischemia/reperfusion-associated tissue damage." Clin Immunol 141(1): 3-14.
Keith, J.C, Jr. (1986). "Effect of lidocaine pretreatment on acute hemorrhagic shock in the anesthetized rat." Circ Shock 19(3): 283-292.
Ker, K., J. Kiriya, P. Perel, P. Edwards, H. Shakur and I. Roberts (2012). "Avoidable mortality from giving tranexamic acid to bleeding trauma patients: an estimation based on WHO mortality data, a systematic literature review and data from the CRASH-2 trial." BMC Emerg Med 12: 3.
Langenbach, C. (2006). "Misoprostol in preventing postpartum hemorrhage: A meta-analysis." International Journal of Gynecology & Obstetrics 92(1): 10-18.
Liu, D., F. Lu, G. Qin, S.M. Fernandes, J. Li and A.E. Davis, 3rd (2007). "C1 inhibitor-mediated protection from sepsis." J Immunol 179(6): 3966-3972.
Remington, J.P. (1995). Remington, the science and practice of pharmacy. Easton, Pa.
London, UK, Mack Pub. Co.
Pharmaceutical Press: v.
Roberts, I., D. Prieto-Merino and D. Manno (2014). "Mechanism of action of tranexamic acid in bleeding trauma patients: an exploratory analysis of data from the CRASH-2 trial." Crit Care 18(6): 685.
Rowe, R.C, P.J. Sheskey, W.G. Cook, M.E. Fenton and American Pharmacists Association. (2012). Handbook of pharmaceutical excipients / edited by Raymond C. Rowe, BPharm, PhD, DSC. FRPharmS. FRSC. CPhvs. MlnstP. chief scientist. Paul J. Sheskev. BSc, RPh. principal research scientist, the Dow Chemical Company. Midland. ML USA, Walter G. Cook, BSc, PhD, research fellow. Materials Science group of Pharmaceutical R&D, Pfizer, Sandwich, Kent. UK. Marian E. Fenton. BSc. MSc, development editor. Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, London. UK. London, APhA/Pharmaceutical Press.
Tamion, F., V. Richard, S. Lyoumi, M. Daveau, G. Bonmarchand, J. Leroy, C. Thuillez and J.P. Lebreton (1997). "Gut ischemia and mesenteric synthesis of inflammatory cytokines after hemorrhagic or endotoxic shock." Am J Physiol 273(2 Pt 1): G314-321.
van Veen, H.A., J. Koiter, C.J.M. Vogelezang, N. van Wessel, T. van Dam, I. Velterop, K. van Houdt, L. Kupers, D. Horbach, M. Salaheddine, J.H. Nuijens and M.L.M. Mannesse (2012). "Characterization of recombinant human CI inhibitor secreted in milk of transgenic rabbits." Journal of Biotechnology 162(2-3): 319-326.
Verstraete, M. (1985). "Clinical application of inhibitors of fibrinolysis." Drugs 29(3): 236-261.
Vo, A.A., A. Zeevi, J. Choi, K. Cisneros, M. Toyoda, J. Kahwaji, A. Peng, R. Villicana, D. Puliyanda, N. Reinsmoen, M. Haas and S.C. Jordan (2015). "A phase I/II placebo-controlled trial of CI-inhibitor for prevention of antibody-mediated rejection in HLA sensitized patients." Transplantation 99(2): 299-308.
Vymazal, T. (2015). "Massive hemorrhage management-a best evidence topic report." Ther Clin Risk Manag 11: 1107-1111.