Полиморфизм генов системы репарации ДНК при генитальном эндометриозе

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Евтушенко И.Д., Наследникова И.О., Новицкий В.В., Ильяди Е.Б., Ткачев В.Н., Уразова О.И., Кублинский К.С.

Сибирский государственный медицинский университет,

г. Томск

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ СИСТЕМЫ РЕПАРАЦИИ ДНК ПРИ ГЕНИТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ

С привлечением современных молекулярно-генетических методов проведено исследование распределения аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов XRCC1 (G280A, G399A, C194T) и XPD (A751C) у 200 женщин, страдающих генитальным эндометриозом, и 100 женщин без эндометриоза, проживающих на территории Томской области и г. Томска. У больных генитальным эндометриозом выявлено статистически значимое увеличение частоты встречаемости «патологических» аллелей генов XRCC1 G280A и XPD A751C. Установлено, что риск развития генитального эндометриоза статистически ассоциирован с наличием в генотипе женщины ТТ генотипа полиморфизма С194Т гена XRCC1 и СС генотипа гена XPD A751C.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: генитальный эндометриоз; полиморфизм генов системы репарации ДНК.

Evtushenko I.D., Naslednikova I.O., Novitsky V.V., Ilyadi E.B., Tkachev V.N., Urazova O.I., Kublinsky K.S.

Siberian State Medical University, Tomsk

POLYMORPHISM OF DNA REPAIR SYSTEM GENES IN GENITAL ENDOMETRIOSIS

With the help of up-to-date molecular-genetic methods the research of alleles and genotypes of polymorphous variants of genes XRCC1 (G280A, G399A, C194T) and XPD (A751C) distribution was accomplished at 200 females with genital endometriosis and 100 females without endometriosis from Tomsk and Tomsk region. At females with genital endometriosis statistically significant increase of frequency of «pathological» alleles of genes XRCC1 G280A and XPD A751C was registered. It was found that the risk of genital endometriosis is statistically associated with the presence in female genotype of TT genotype of C194T polymorphism of XRCC1 gene and CC genotype of XPD A751C gene.

KEY WORDS: genital endometriosis; polymorphism of DNA repair system genes.

Эндометриоз — генетически детерминированное, хроническое, дисгормональное, иммуно-зависимое заболевание с доброкачественным разрастанием ткани, идентичной по морфологическому строению и функции эндометрию, за пределами слизистой оболочки матки [1, 2]. По своей природе эндометриоз — мультифакториальное заболевание с хроническим, рецидивирующим течением: в его патогенез вовлека.тся множество функционально взаимосвязанных генов, включающих, наряду с главными, второстепенные гены (гены-модификаторы), эффект которых во многом определяется средовыми факторами. К главным генам относятся гены клеточного цикла и системы репа-ративного синтеза ДНК, участвующие в поддержании стабильности генома [2, 3].

Репарация — клеточный механизм коррекции повреждённой последовательности ДНК (точечные мутации, делеции, структурные нарушения и др.). Нарушение процесса репарации ДНК приводит к повреждению генетического кода. Наличие полиморфных изменений в генах, контролирующих процесс репарации, может привести к резкому замедлению восстановления целостности ДНК [4, 5].

Цель настоящего исследования — выявление ассоциации полиморфных вариантов генов системы репарации ДНК у женщин с генитальным эндометриозом.

Корреспонденцию адресовать:

ЕВТУШЕНКО Ирина Дмитриевна,

634050, г. Томск, Московский тракт, 2,

ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России.

Тел.: +7-913-829-77-80.

E-mail: evtushenko id@mail.ru

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В программу исследования вошли 300 женщин репродуктивного возраста, проживающих на территории Томской области и г. Томска, находившихся на стационарном лечении в гинекологической клинике ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России. Основную группу составили 200 женщин с наружным генитальным эндометриозом. В группу контроля включены 100 женщин, которым проводилась диагностическая лапароскопия по поводу синдрома хронической тазовой боли, бесплодия, и у которых не было выявлено органической патологии, а также женщины, которым проводилась добровольная хирургическая стерилизация.

Всем женщинам была проведена лапароскопия по стандартной методике и последующим гистологическим исследованием операционного материала. У всех женщин было получено добровольное информированное согласие на забор венозной крови и использование её для проведения исследований. Кровь для исследования получали из кубитальной вены в стандартных условиях, утром в день операции. Выделение ДНК из периферической крови проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору «ДНК-сорб-В». Анализ полиморфных вариантов С194Т гена XR.CC!; G280A гена XRCC1; G399A гена XRCC1 и А751С гена XPD осуществляли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием олигонуклеотидных праймеров к участку гена и зондов, комплиментарных участку в амплифици-руемой ДНК. Смесь для амплификации (15 мкл) содержала 100-200 нг ДНК, 2,5 нМ каждого прайме-

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ СИСТЕМЫ РЕПАРАЦИИ ДНК ПРИ ГЕНИТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ______________

ра, 2,0 нМ каждого зонда, 1 мМ смесь четырёх dNTP, 1 мМ MgCl2, 0,8 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы и 10хбуфер, поставляемый производителем в наборе с ферментом. Программа амплификации включала 1 мин предварительной денатурации при 94С° и 42 цикла: 94с° — 10 с, 58С° —15 с, 72С° — 10 с. Кривые накопления флуоресцентного сигнала анализировались с помощью программного обеспечения амплифика-тора ДТ-96.

Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных алгоритмов биометрии. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с эндометриозом сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах больных и здоровых индивидов, используя критерий х2 с поправкой Йетса на непрерывность. При численностях генотипов менее пяти использовали точный тест Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сохранение целостности и первоначальной структуры ДНК невозможно без участия регуляторов клеточного цикла, обеспечивающих баланс в продвижении клетки по циклу и смены одной фазы на другую. Сбалансированное регулирование смены клеточного цикла обеспечивает нормальное функционирование всех систем клетки [4-6].

Система эксцизионной репарации ДНК является самой ранней из существующих систем восстановительного синтеза генетического аппарата. Это обусловлено, прежде всего, высокой частотой возникающих в клетках повреждений нуклеотидов и оснований ДНК [6]. Репаративный комплекс ДНК — сложно организованная система, основными компонентами которой, в зависимости от разновидности репарируемых повреждений (основания или нуклеотиды), являются белковые продукты, кодируемые генами XRCC1 и XPD. Эти два компонента обладают множеством ге-

нетических форм, широко распространенных в популяции [5, 7, 8].

Нами было проведено исследование распределения полиморфного варианта G280A гена системы экс-цизионной репарации ДНК ХИССІ (9 экзон). Минорный вариант данного гена (А) характеризуется увеличением времени синтеза и, как следствие, уменьшением количества белкового продукта, участвующего в исправлении повреждений ДНК. Результаты проведенного нами исследования позволили зарегистрировать у женщин без эндометриоза преобладание генотипа GG (92 %) над GА (8 %), при этом гомозиготный генотип по аллелю Аполиморфизма G280A гена ХИССІ выявлен не был (табл. 1).

У женщин с генитальным эндометриозом распределение генотипов полиморфного сайта G280A гена ХИССІ оказалось аналогичным: преобладал генотип GG (87,5 %), реже встречался генотип GА (10,5 %). Однако обращало на себя внимание, что редкий генотип АА был выявлен у 2 % женщин с генитальным эндометриозом.

При сравнительной оценке распределения частот генотипов и аллелей полиморфного участка G280A гена ХИССІ статистически значимых различий среди женщин с генитальным эндометриозом и без такового нами обнаружено не было.

Полиморфизм G399A гена ХИССІ, вследствие замены G на А, характеризуется изменением конфи-

Таблица 1

Распределение генотипов и аллелей полиморфизма G280A гена XRCC1 (абс., %) у женщин с генитальным эндометриозом

Генотипы и аллели полиморфизма G280A гена XRCC1 Характеристика обследованных лиц Женщины Женщины без эндометриоза с эндометриозом

GG 92

GA 8

AA 0 4

G 192

Примечание: Здесь и в таблицах 2-4: n - количество человек в группе; анализ

качественных независимых данных проводили с помощью критерия %2 Пирсона; р - уровень статистической значимости различий между группами; Статистически

значимые различия считали при р < 0,05; OR - критерий отношения шансов, отражающий относительный риск развития заболевания при определенном генотипе по сравнению с группой контроля с 95% доверительным интервалом.

Сведения об авторах:

ЕВТУШЕНКО Ирина Дмитриевна, доктор мед. наук, профессор, зав. кафедрой акушерства и гинекологии, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск, Россия. E-mail: evtushenko_id@mail.ru

НАСЛЕДНИКОВА Ирина Олеговна, доктор мед. наук, профессор, кафедра патофизиологии, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск, Россия. E-mail: ira_naslednikova@mail.ru

НОВИЦКИЙ Вячеслав Викторович, доктор мед. наук, профессор, академик РАМН, ректор, зав. кафедрой патофизиологии, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск, Россия.

ИЛЬЯДИ Екатерина Борисовна, аспирант, кафедра патофизиологии, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск, Россия. E-mail: ketyru@mail.ru ТКАЧЕВ Владимир Николаевич, канд. мед. наук, доцент, кафедра акушерства и гинекологии, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск, Россия. E-mail: volnikt@mail.ru

УРАЗОВА Ольга Ивановна, доктор мед. наук, профессор, кафедра патофизиологии, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск, Россия. E-mail: ira_naslednikova@mail.ru. Телефон +79138223020.

КУБЛИНСКИЙ Константин Сергеевич, врач, канд. мед. наук, гинекологическая клиника, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России, г. Томск, Россия. E-mail: kublinskiy@sibmail.com

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

гурации белкового продукта в области взаимодействия XRCC1 с поли(ADP-рибоза) полимеразой. Предположительно, изменение конфигурации данной области понижает сродство XRCC1 к PARP-1 и, как следствие, замедляет сборку репарационного комплекса. Фенотипически, на уровне клетки, наличие данного полиморфизма проявляется снижением репара-тивной активности всего комплекса [9, 10].

В ходе анализа распределения генотипов полиморфизма G399A гена XRCC1 у женщин без эндо-метриоза было установлено, что генотип GG встречался чаще (69 %), чем гетерозиготный GА (24 %) и гомозиготный генотип по аллелю А (7 %) (табл. 2).

У женщин с генитальным эндометриозом сходную тенденцию имело распределение генотипов полиморфного сайта G399A гена XRCC1: преобладал генотип GG (63,5 %), реже встречался генотип GА (29 %), редкий генотип АА был обнаружен в 7,5 % случаев. Следует отметить, что статистически значимых различий в распределении частот генотипов и аллелей полиморфного участка G399A гена XRCC1 среди женщин с генитальным эндометриозом и без эндометрио-за не было выявлено.

Нами также было проведено исследование распределения полиморфных вариантов гена XRCC1 С194Т (6 эк-зон). Фенотипически наличие полиморфного варианта Т-генотипа проявляется заменой аргинина на триптофан. Белковый продукт, содержащий триптофан вместо аргинина, характеризуется изменением конформации и снижением активности комплекса эксцизионной репарации [8].

В ходе анализа было показано, что у женщин без эндометриоза гомозиготный генотип СС встречался в 91 % случаев, гетерозиготный СТ — в 9 %, при этом гомозиготный генотип ТТ выявлен не был (табл. 3). У женщин с генитальным эндометриозом также преобладал генотип СС (80,5 %), реже определялся гетерозиготный генотип СТ (16 %), «патологический» генотип ТТ полиморфного сайта С194Т гена XRCC1 был обнаружен у 7 женщин (3,5 %).

Было выявлено, что среди пациенток, страдающих генитальным эндометриозом, имелись значимые различия в распределении аллелей (х2 = 7,85; р = 0,005) и генотипов (х2 = 6,77; р = 0,03) данного полиморфного сайта относительно группы контроля: отмечалось значимое снижение частоты встречаемости генотипа СС и увеличение генотипа ТТ полиморфизма С194Т гена XRCC1. Выявлена также положительная ассоциация генитального эндометриоза с генотипом ТТ (OR = 7,79) полиморфизма С194Т гена XRCC1. Генотип СС и аллель С имели протектив-ное значение в отношении генитального эндометри-оза (OR = 0,41 и OR = 0,36, соответственно).

На заключительном этапе исследования была осуществлена оценка распределения аллельных вариантов гена эксцизионной репарации нуклеотидов гена XPD, известного также как ERCC2 (19q13.2). Ген XPD характеризуется наличием нескольких функционально значимых полиморфизмов, одним из наиболее малоизученных является полиморфизм в экзо-

Таблица 2

Распределение генотипов и аллелей полиморфизма G399A гена XRCC1 (абс., %) у женщин с генитальным эндометриозом

Генотипы и аллели полиморфизма G399A гена XRCC1 Характеристика обследованных лиц Женщины Женщины без эндометриоза с эндометриозом

GG 69

GA 24

AA 7

G 162

Таблица 3 Распределение генотипов и аллелей полиморфизма С194Т гена XRCC1 (абс., %) у женщин с генитальным эндометриозом

Генотипы и аллели полиморфизма С194Т гена XRCC1 Характеристика обследованных лиц Женщины Женщины без эндометриоза с эндометриозом

СС 91

СТ 9

ТТ 0 7

С 162

Information about authors:

EVTUSHENKO Irina Dmitrievna, doctor of medical sciences, professor, head of the chair of obstetrics and gynecology, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia. E-mail: evtushenko_id@mail.ru

NASLEDNIKOVA Irina Olegovna, doctor of medical sciences, professor, chair of a pathophysiology, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia. E-mail: ira_naslednikova@mail.ru

NOVITSKY Vyacheslav Viktorovich, doctor of medical sciences, professor, academician of the RAMS, rector, head of the chair of a pathophysiology, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia.

ILYADI Ekaterina Borisovna, post-graduate student, chair of a pathophysiology, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia. E-mail: ketyru@mail.ru TKACHEV Vladimir Nikolaevich, candidate of medical sciences, docent, chair of obstetrics and gynecology, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia. E-mail: volnikt@mail.ru

URAZOVA Olga Ivanovna, doctor of medical sciences, professor, chair of a pathophysiology, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia. E-mail: ira_naslednikova@mail.ru

KUBLINSKY Konstantin Sergeyevich, doctor, candidate of medical sciences, gynecologic clinic, Siberian State Medical University, Tomsk, Russia. E-mail: kublinskiy@sibmail.com

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ СИСТЕМЫ РЕПАРАЦИИ ДНК ПРИ ГЕНИТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ_______________

Таблица 4

Распределение генотипов и аллелей полиморфизма А751С гена XPD (абс., %) у женщин с генитальным эндометриозом

Генотипы и аллели полиморфизма А751С гена XPD Характеристика обследованных лиц Женщины Женщины без эндометриоза с эндометриозом

АА 79

АС 19

СС 2

А 177

не 23 - А751С (А2251С). А751С вариантный генотип находится в домене связывания активатора хели-казной активности белка XPD. Кон-формационное состояние данного района влияет на стабильность четвертичной структуры репарирующего комплекса TFIIH. Функционально данный полиморфизм, при наличии минорного аллеля А, проявляется снижением эффективности эксцизионной репарации нуклеотидов [4-6].

Проведенное исследование показало, что преобладающим генотипом у женщин без эндометриоза был гомозиготный по аллелю А генотип полиморфизма А751С гена XPD, обнаруженный у 79 % женщин, у 19 % пациенток определялся гетерозиготный генотип АС, а гомозиготный по аллелю С генотип встречался лишь в 2 % случаев (табл. 4).

У женщин с генитальным эндометриозом генотип АА полиморфного участка А751С гена XPD был выявлен в 52 % случаев, АС — в 29 %, СС — в 19 %. При сравнительной оценке частот генотипов и аллелей полиморфизма А751С гена XPD у женщин с эн-дометриозом наблюдалось снижение частоты генотипа АА (х2 = 25,01; р = 0,00001) и значимое преобладание редкого генотипа СС. Была показана положительная ассоциация генитального эндометриоза с генотипом СС (ОИ = 11,49) полиморфизма А751С гена XPD, при этом генотип АА (ОИ = 0,29) обладал протективным эффектом.

Таким образом, проведенный анализ распределения вариантных генотипов генов XRCC1 и XPD выявил наличие статистически значимого увеличения частоты встречаемости двух «патологических» аллелей генов XRCC1 С194Т и XPD А751С у больных генитальным эндометриозом, по сравнению с аналогичными показателями у женщин без эндометриоза. Согласно результатам исследования, носительство ТТ генотипа полиморфизма С194Т гена XRCC1 увеличивает риск развития генитального эндометриоза поч-

ти в 8 раз. Наличие в геноме СС генотипа гена XPD А751С увеличивает риск развития генитального эн-домериоза в 11,5 раз. На основании полученных данных можно сделать заключение, что в условиях формирования генитального эндометриоза значимыми являются как повреждения оснований, так и дефекты нуклеотидов, обусловленные генетически детерминированным снижением скорости сборки и уровня активности репарационного комплекса.

В заключение следует отметить, что изучение влияния генных полиморфизмов генов XRCC1 ^280А, G399A, С194Т) и XPD (А751С) на формирование повышенного риска развития генитального эндомет-риоза является весьма актуальной проблемой, продиктованной несколькими существующими задачами, требующими решения. Прежде всего, участие системы эксцизионной репарации в поддержании генетической константы организма не может не обратить на себя внимания с точки зрения понимания патогенеза генитального эндометриоза. Другим важным аспектом изучения является увеличивающаяся вследствие индустриализации мутагенная нагрузка на генетический аппарат клетки. Кроме того, с точки зрения профилактической медицины, гены, кодирующие систему эксцизионной репарации ДНК, могут быть положены в основу разработки программ скрининга, целью которых может явиться формирование групп повышенного риска развития генитального эндомет-риоза среди женщин репродуктивного возраста.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Медицинские и социальные аспекты генитального эндометриоза /Л.В. Адамян, М.М. Сонова, Е.С. Тихонова и др. //Пробл. реп-род. - 2011. - № 6. - С. 78-81.

2. Pathogenesis of endometriosis /Nisolle M., Alvarez M.L., Colombo M., Foidart J.M. //Gynec. Obstet. Fertil. - 2007. - V. 35(9) -Р. 898-903.

3. Полиморфизм генов метаболизма эстрогенов у женщин с аденомиозом /Н.В. Артымук, Л.Ф. Гуляева, О.А. Зотова, Е.П. Хвостова

//Журн. акуш. и жен. болезней. - 2012. - Т. 61, № 6. - С. 18-24.

4. Polymorphisms in the thymidylate synthase promoter and the DNA repair genes XRCC1 and XPD in a Brazilian population /R. Canalle, V. da Sil-

va, S. Andrade, C.A. Scrideli //J. of Thorac. Oncol. - 2010. - V. 5, N 9. - P. 1337-1345.

5. Polymorphisms of the DNA repair genes XPD and XRCC1 and the risk of age-related macular degeneration /E. Gorgun, M. Guven, M. Unal

//Invest. Ophthalm. and Visual Science. - 2010. - V. 51, N 9. - P. 4732-4737.

6. Gangwar, R. Implications of XRCC1, XPD and APE1 gene polymorphism in North Indian population: a comparative approach in different ethnic groups worldwide /R. Gangwar, P.K. Manchanda, R.D. Mittal //Genetica. - 2009. - V. 136, N 1. - P. 163-169.

7. Brem, R. XRCC1 is required for DNA single-strand break repair in human cells /R. Brem, J. Hall //Nucleic Acids Research. - 2005. - V. 33, N 8. - Р. 2512-2520.

8. Thompson, L.H. XRCC1 keeps DNA from getting stranded /L.H. Thompson, M.G. West //Mutation Research. - 2000. - V. 459. -Р. 1-18.

9. Role of XRCC1 in the coordination and stimulation of oxidative DNA damage repair initiated by the DNA glycosylase hOGG1 /S. Marsin,

A.E. Vidal //J. of Biol. Chem. - 2003. - V. 278, N 45. - Р. 44068-44074.

10. Campalans, A. XRCC1 interactions with multiple DNA glycosylases: A model for its recruitment to base excision repair /A. Campalans, S. Marsin, Y. Nakabeppu //DNA Repair. - 2005. - V. 4. - Р. 826-835.

СЛУЧАЙ ИЗ ПРАКТИКИ

REFERENCES:

1. Adamyan L.V., Sonova M.M., Tikhonov E.S., Zimin E.V., Antonova S.O. Medical and social aspects genital endometriosis. Problemyi repro-duktsii. 2011; 6: 78-81 (In Russian).

2. Pathogenesis of endometriosis /Nisolle M., Alvarez M.L., Colombo M., Foidart J.M. //Gynec. Obstet. Fertil. 2007; 35(9): 898-903.

3. Artymuk N.V., Guljaev L.F., Zotova O.A., Hvostova E.P. Polymorphism of genes of a metabolism of an estrogen at women with adenomiozy. Zhurnal akusherstva i zhenskih bolezney. 2012; 6: 18-24 (In Russian).

4. Polymorphisms in the thymidylate synthase promoter and the DNA repair genes XRCC1 and XPD in a Brazilian population / R. Canalle, V. da Silva, S. Andrade, C.A. Scrideli //J. of Thorac. Oncol. 2010; 5(9): 1337-1345.

5. Polymorphisms of the DNA repair genes XPD and XRCC1 and the risk of age-related macular degeneration /E. Gorgun, M. Guven, M. Unal //Invest. Ophthalm. and Visual Science. 2010; 51(9): 4732-4737.

6. Gangwar, R. Implications of XRCC1, XPD and APE1 gene polymorphism in North Indian population: a comparative approach in different ethnic groups worldwide /R. Gangwar, P.K. Manchanda, R.D. Mittal //Genetica. 2009; 136(1): - P. 163-169.

7. Brem, R. XRCC1 is required for DNA single-strand break repair in human cells /R. Brem, J. Hall //Nucleic Acids Research. 2005; 33(8): 2512-2520.

8. Thompson, L.H. XRCC1 keeps DNA from getting stranded /L.H. Thompson, M.G. West //Mutation Research. 2000; 459: 1-18.

9. Role of XRCC1 in the coordination and stimulation of oxidative DNA damage repair initiated by the DNA glycosylase hOGG1 /S. Marsin, A.E. Vidal //J. of Biol. Chem. 2003; 278(45): 44068-44074.

10. Campalans, A. XRCC1 interactions with multiple DNA glycosylases: A model for its recruitment to base excision repair /A. Campalans, S. Marsin, Y. Nakabeppu //DNA Repair. 2005; 4: 826-835.