Определение количества внеклеточных ДНК крови методом ПЦР, специфичной к B-АКТИНУ И LINE -1 последовательностям при раке легкого

Результаты. При исследовании слизистой оболочки бронхов «здорового» легкого у 20 пациентов патологических изменений не выявлено, у 22 - наблюдалось воспаление различной степени выраженности, у 5 - дисплазия средней степени тяжести. У одного пациента диагностирован рак в противоположном легком, диагноз был заподозрен на основании данных локальной спектроскопии, который был подтвержден при морфологическом исследовании, при ФБС в белом свете данных за опухолевую патологию не было. При анализе полученного массива спектров лазер-индуцированной АФ выявлены достоверные различия в интенсивно-

сти АФ между нормальной слизистой оболочки бронхов, очагами воспаления, дисплазии и рака. Наибольшая интенсивность АФ регистрируется в участках неизмененной слизистой, в зоне дисплазии и рака отмечается падение интенсивности аутофлюоресценции, при этом оно более выражено при опухолевой трансформации.

Выводы. Измерение в ходе ФБС спектров лазер-индуцированной АФ слизистой оболочки бронхов in vivo методом ЛФС позволяет выявлять предопухолевые изменения бронхиального эпителия и метахронный рак легкого на ранней стадии.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ДНК КРОВИ МЕТОДОМ ПЦР, СПЕЦИФИЧНОЙ К В-АКТИНУ И ЫЫЕ-1 ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЯМ ПРИ РАКЕ ЛЕГКОГО

А.А. ПОНОМАРЕВА1. Е.Ю. РЫКОВА2, Т.Э. СКВОРЦОВА2, А.В.ЧЕРЕПАНОВА2, Е.С. МОРОЗКИН2, В.А. МИЛЕЙКО2,Н.В.ЛИТВЯКОВ1, А.Ю. ДОБРОДЕЕВ1,

А.А. ЗАВЬЯЛОВ1, С.А. ТУЗИКОВ1, В.В. ВЛАСОВ2, П.П. ЛАКТИОНОВ2,

Н.В. ЧЕРДЫНЦЕВА1

НИИ онкологии СО РАМН, г. Томск1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск2

Важнейшим условием успешного лечения немелкоклеточного рака легкого (РЛ) является его обнаружение на ранних стадиях. Показано, что при развитии различных опухолей наблюдается изменение концентрации и состава внеклеточных ДНК (внДНК) в плазме крови. Для разработки чувствительного и специфичного метода детекции РЛ на основе анализа внДНК крови представляется актуальным выявление изменений количества внДНК в плазме и во внДНК фракции, связанной с клеточной поверхностью, на разных стадиях заболевания.

Цель исследования - сравнительный анализ в норме и при РЛ количества внДНК в различных фракциях крови методом ПЦР в реальном времени, специфичной к фрагментам однокопийного гена Р-актина и повторяющихся последовательностей LINE-1.

Материал и методы. В исследование включено 20 здоровых доноров и 60 больных

операбельным НМРЛ (Т1-3К0-3М0), диагноз морфологически верифицирован. Кровь разделяли на плазму и клетки крови, фракцию внДНК, связанных с клеточной поверхностью, получали последовательной обработкой клеток фосфатным буфером, содержащим ЭДТА, и раствором трипсина. В полученных фракциях крови определяли количество внДНК при помощи ПЦР

Результаты. По данным ПЦР-анализа фрагментов Р-актина и LINE-1 повторов количество внДНК в плазме крови достоверно не изменяется у больных НМРЛ по сравнению с нормой. При этом показано, что при НМРЛ количество внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, достоверно снижается (163±20 нг/мл - по Р-актину; 47±9 нг/мл - по LINE-1 и 294±56 нг/мл - по Р-актину; 171±28 нг/мл - по LINE-1) (р=0,009 и р=0,002). Методом ПЦР: специфичной к Р-актину, выявлены достоверные различия в количестве внДНК, связанных

с поверхностью клеток, между пациентами с различным гистотипом НМРЛ: плоскоклеточном раке и аденокарциномой (р=0,04). У больных НМРЛ с первичной опухолью Т1-2 и без лимфогенных метастазов количество внДНК по данным анализа Р-актина достоверно выше, чем при Т3 с метастазами (р=0,02). При умереннодифференцированном плоскоклеточным РЛ количество внДНК достоверно выше, чем при низкодифференцированном РЛ - 214±39 нг/мл и 133±20 нг/мл соответственно (р=0,03). Соотношение количества внДНК по анализу фрагментов гена Р-актина и последовательностей LINE-1 в плазме крови у здоровых и больных НМРЛ значимо не отличается (1,6 и 1,9 р=0,06). При этом во внДНК, связанных с поверхностью клеток крови, соотношение Р-актина к LINE-1

повторам при НМРЛ достоверно выше, чем в норме - 3,4 и 1,7, соответственно (р=0,007).

Выводы. Изменение количества внДНК по данным ПЦР, специфичной к фрагментам одно-копийного гена Р-актина и LINE-1 повторов во внДНК крови, связанных с клеточной поверхностью, может служить дополнительным критерием при выявлении рака легкого. Полученные данные о взаимосвязи количества этих ДНК-маркеров с клинико-морфологическими параметрами опухоли говорят о перспективности дальнейших исследований в плане оценки их прогностической значимости.

Работа выполнена при поддержке гранта СО РАН N 12, выполняемого совместно со сторонними научными организациями, гранта РФФИ 09-04-01334а.

КОРРЕЛЯЦИОННАЯ И ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗАВИСИМОСТЬ ПЛОИДНОСТИ И СТЕПЕНИ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ ПРОЦЕССА ПРИ ПОЧЕЧНО-КЛЕТОЧНОМ РАКЕ

В.В. ПОПОВ, В.Н. БОГАТЫРЕВ

Отделение оперативной гинекологии Воронежского областного клинического онкологического диспансера, лаборатория клинической цитологии ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, г. Москва

Цель работы - оценить корреляционную взаимосвязь распространенности опухолевого процесса (TNM) и плоидности клеток опухоли, а также влияние данных факторов на выживаемость при почечно-клеточном раке.

Материал и методы. В исследование включено 40 больных раком почки. Возраст пациентов колебался от 31 до 71 года, медиана - 53 года. Из них мужчин было 28 (70%) человек, женщин - 12 (30%). Исследования ДНК в клеточной популяции производили на проточном анализаторе EPICS-XL (Coulter, США). В каждом образце анализировались не менее 15000 клеток. Полученные данные изучались с помощью компьютерных программ: System II™ (version 3.0, Coulter, США) и MultiCycle (Phoenix Flow Systems, США), позволяющих точно установить плоидность и распределение опухолевых клеток по фазам клеточного цикла и детализировать число опухолевых клеток в S-фазе и G2+M-фазах клеточного цикла.

Результаты. При определении содержания ДНК в опухоли при Т2 стадии количество анеуплоидных клеток составило 57,4±7,2%, тогда как диплоидных 42,6±7,2%, а в стадии Т3 - 64,0±4,9% и 36,0±4,9%, соответственно (р<0,01). При изучении плоидности клеток в зависимости от состояния регионарных лимфатических узлов оказалось, что количество клеток с анеуплоидией достоверно увеличивалось по мере увеличения индекса N. Так, при отсутствии метастазов в лимфатических узлах (К0) на долю анеуплоидных клеток приходилось 48,7±6,3%, а при индексе КХ, N 71,9±4,3% (р<0,01). Максимальное количество диплоидных клеток наблюдалось при отсутствии метастазов - 51,3±6,4%. При индексе КХ, N - 28,6±4,3%. Различия статистически достоверны (р<0,01).

Количество диплоидных и анеуплоидных клеток в опухоли при раке почки в зависимости от наличия или отсутствия отдаленных метастазов также достоверно отличалось. Так, при отсутствии