ПОЛИПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ ИНГИБИТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ АГРЕГАЦИИ ТРОМБОЦИТОВ И/ИЛИ ИНГИБИТОРНОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ АДГЕЗИИ ТРОМБОЦИТОВ, ПОЛИНУКЛЕОТИД, КОДИРУЮЩИЙ ЕГО, КОМПОЗИЦИЯ И НАБОР, СОДЕРЖАЩИЕ ДАННЫЙ ПОЛИПЕПТИД
POLYPEPTIDE, POSSESSING INHIBITING ACTIVITY WITH RESPECT TO PLATELET AGGREGATION AND/OR INHIBITING ACTIVITY WITH RESPECT TO PLATELET ADHESION, ENCODING IT POLYNUCLEOTIDE, COMPOSITION AND SET, CONTAINING SAID POLYPEPTIDE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к полипептиду, обладающему ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов, или фармацевтической композиции, например ингибирующей агрегацию тромбоцитов композиции, содержащей в качестве активного компонента экспрессированный продукт (рекомбинантный полипептид), экспрессируемый кодирующим указанный полипептид полинуклеотидом.
Кроме того, настоящее изобретение относится к полипептиду, обладающему способностью связываться с коллагеном, или фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного компонента указанный полипептид.
Настоящее изобретение также относится к способу скринирования соединения (например, агониста), содействующего ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов, в качестве активного компонента фармацевтической композиции. Кроме того, настоящее изобретение относится к новому полипептиду, обладающему ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов, и к кодирующему его полинуклеотиду.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Тромбоциты агрегируют вследствие повреждения эндотелиальных клеток сосудов и различных других факторов. Окклюзия тромбоцитарным тромбом коронарного сосуда, церебрального сосуда или периферического сосуда является причиной инфаркта миокарда, инфаркта головного мозга или хронической обструкции артерий соответственно. Примеры тромботических заболеваний, которые следуют за такой активацией (стимуляцией агрегации) тромбоцитов, включают склероз артерий, ишемический инфаркт головного мозга, ишемические заболевания сердца, в том числе инфаркт миокарда и стенокардия, хроническую обструкцию артерий и тромбоз вен.
Ингибирующие агрегацию тромбоцитов лекарственные средства используют в качестве лекарственных средств для профилактики ишемических нарушений, сопровождающих вышеуказанные различные заболевания в виде осложнений, и в качестве лекарственных средств для профилактики патологических состояний после гипертензии, легочной гипертезии, инфаркта головного мозга, инфаркта легкого и субарахноидального кровоизлияния. Кроме того, вышеуказанные лекарственные средства используют для профилактики образования тромбов при чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластике (ЧТКА) и размещении стента, а также используют в качестве агентов для профилактики рестеноза после размещения стента путем включения с помощью нанесения на стент или заделывания в него такого лекарственного средства, ингибирующего агрегацию тромбоцитов.
Между тем, комар прокалывает кожу с помощью челюстей ротового аппарата, выполняющих функцию иглы, достигающих периферического кровеносного сосуда во время сосания крови, и для обнаружения периферического кровеносного сосуда часто повторяет поведение в виде прокалывания и извлечения челюстей, на которое делается ссылка как на «зондирование». Полагают, что одновременно комар секретирует слюну, содержащую содействующее вазодилатации вещество, для облегчения обнаружения кровеносного сосуда. Вследствие вышеуказанного зондирования периферический кровеносный сосуд часто повреждается, становясь застойным. Как правило, при повреждении кровеносного сосуда коллаген ткани под эндотелием сосудов становится незащищенным, из разрушенных клеток высвобождается аденозиндифосфат (АДФ), и активируются факторы свертывания с образованием тромбина. Тромбин сильно активирует тромбоциты с индуцированием адгезии тромбоцитов, агрегации тромбоцитов и высвобождением гранул и, в конечном счете, приводит к образованию стойкого тромба посредством свертывания крови с образованием фибрина (механизма гемостаза). Известно, что слюна комара содержит вещество, которое ингибирует такой механизм гемостаза (см. непатентный документ 1).
Aedes aegypti
Самым изученным белком слюнной железы комара является апираза. Этот фермент является ингибирующим агрегацию тромбоцитов веществом, впервые идентифицированным в слюне . Приводя к разложению АДФ, высвобождаемого из поврежденных эндотелиальных клеток сосудов, эритроцитов и адгезированных тромбоцитов, до АМФ (аденозинмонофосфата), апираза ингибирует агрегацию тромбоцитов и проявляет антигемостатическое действие. Для объяснения поведения различных являющихся вампирами насекомых помимо комара, по-видимому, является существенным анализ функции веществ их слюны.
Triatoma infestans
Предсказывается, что ряд веществ слюны вовлечен в ингибирование агрегации тромбоцитов, и сообщалось, например, о ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов белка, полученного из  (патентные документы 1 и 2).
Anopheles stephensi
Среди получаемых из слюнной железы белков  идентифицировали белок, обладающий ингибиторной активностью в отношении свертывания крови, но не был идентифицирован белок, обладающий ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов (см. патентный документ 3).
Anopheles stephensi
Кроме того, сообщалось о 33 новых белках при клонировании библиотеки кДНК слюнной железы , но в сообщении не описывается белок, обладающий ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов (см. непатентный документ 2).
Anopheles stephensi
Авторы настоящего изобретения ранее сообщали о белке (ААРР), имеющем GE (Gly Glu)-богатую последовательность, клонированную из слюнной железы  (см. непатентный документ 3). Белок кодируется открытой рамкой считывания (ORF) из 810 п.о. и является белком с М.м. 28,5 кДа, состоящим, по расчетам, из 269 аминокислотных остатков. Впоследствии обнаружено, что этот белок схож с антигеном с М.м. 30 кДа (номер доступа в GenBank - AY226454), раскрытым в непатентном документе 2, однако в непатентных документах 2 и 3 не описываются эффекты и функции белка.
[Патентный документ 1] JP 2004-121091-A
[Патентный документ 2] JP 2004-121086-A
[Патентный документ 3] JP 2003-116573-A
[Непатентный документ 1] Riberio, J.M., J. Exp. Biol., 108, 1-7 (1984)
[Непатентный документ 2] Valenzuela, J.G., et al., "Exploring the salivary gland transcriptome and proteome of the Anopheles stephensi mosquito", Insect Biochemistry
[Непатентный документ 3] Hiroyuki Watanabe et al., Medical Entomology and Zoology 55 Suppl., pp 41, 19 (2004).
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящим изобретением обеспечивается новая фармацевтическая композиция, в частности ингибитор агрегации тромбоцитов и/или ингибитор адгезии тромбоцитов.
Настоящим изобретением, кроме того, обеспечивается новая фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного компонента белок, обладающий способностью связываться с коллагеном.
Настоящим изобретением также обеспечивается способ скринирования вещества, такого как агонист, с помощью которого определяется ингибиторная активность в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторная активность в отношении адгезии тромбоцитов вещества.
Anopheles stephensi
В результате дополнительного обширного исследования, в дополнение к изучению белка (ААРР), о котором ранее сообщалось авторами настоящего изобретения, последние обнаружили новый белок, обладающий ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов, в слюнной железе, успешно выделили и идентифицировали ДНК, кодирующую этот белок, и недавно обнаружили, что белок обладает ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов.
Настоящее изобретение характеризуется признаками, содержащимися в следующих пунктах 1-14.
Пункт 1. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного компонента по меньшей мере один из следующих полипептидов (а)-(d):
(а) полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1;
(b) полипептид, включающий аминокислотную последовательность, включающую одну или несколько делеций, вставок, замен или добавлений аминокислот в аминокислотной последовательности вышеуказанного полипептида (а), и обладающий ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов;
(с) полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3; и
(d) полипептид, включающий аминокислотную последовательность, включающую одну или несколько делеций, вставок, замен или добавлений аминокислот в аминокислотной последовательности вышеуказанного полипептида (c), и обладающий ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов.
Пункт 2. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного компонента экспрессированный продукт, который экспрессируется по меньшей мере одним из следующих полинуклеотидов (е)-(j):
(е) полинуклеотидом, включающим ДНК-последовательность SEQ ID NO: 2 или ее комплемент;
(f) полинуклеотидом, который гибридизуется в жестких условиях с вышеуказанным полинуклеотидом (е) и способен экспрессировать полипептид, обладающий ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов;
(g) полинуклеотидом, включающим ДНК-последовательность, гомологичную вышеуказанному полинуклеотиду (е) на 80% или больше, и способным экспрессировать полипептид, обладающий ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов;
(h) полинуклеотидом, включающим ДНК-последовательность SEQ ID NO: 4 или ее комплемент;
(i) полинуклеотидом, который гибридизуется в жестких условиях с вышеуказанным полинуклеотидом (h) и способен экспрессировать полипептид, обладающий ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов;
(j) полинуклеотидом, включающим ДНК-последовательность, гомологичную вышеуказанному полинуклеотиду (h) на 80% или больше, и способным экспрессировать полипептид, обладающий ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов.
Пункт 3. Фармацевтическая композиция в соответствии с пунктом 1 или 2, в которой указанной ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов является ингибиторная активность в отношении агрегации тромбоцитов, индуцированной коллагеном, и/или ингибиторная активность в отношении адгезии тромбоцитов к коллагену.
Пункт 4. Фармацевтическая композиция в соответствии с пунктом 1 или 2, обладающая способностью связываться с коллагеном.
Пункт 5. Ингибитор агрегации тромбоцитов и/или ингибитор адгезии тромбоцитов, содержащий полипептид, описанный в пункте 1, или экспрессированный продукт, который экспрессируется полинуклеотидом, описанным в пункте 2.
Пункт 6. Способ скринирования агониста ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активности в отношении адгезии тромбоцитов, в котором уровень ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активности в отношении адгезии тромбоцитов полипептида, описанного в пункте 1, измеряют в присутствии или отсутствие исследуемого вещества, и величину, измеренную в присутствии исследуемого вещества, сравнивают с величиной, измеренной в отсутствии исследуемого вещества, для отбора исследуемого вещества, которое увеличивает ингибиторный эффект, в качестве агониста.
Пункт 7. Способ скринирования агониста ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активности в отношении адгезии тромбоцитов, в котором уровень ингибиторной активности экспрессированного продукта, который экспрессируется описанным в пункте 2 полинуклеотидом, измеряют в присутствии или отсутствие исследуемого вещества, и величину, измеренную в присутствии исследуемого вещества, сравнивают с величиной, измеренной в отсутствии исследуемого вещества, для отбора исследуемого вещества, которое увеличивает ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторную активность в отношении адгезии тромбоцитов, в качестве агониста.
Пункт 8. Способ скринирования вещества-кандидата, являющегося агонистом ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активности в отношении адгезии тромбоцитов полипептида, описанного в пункте 1, или экспрессированного продукта, описанного в пункте 2, который включает следующие стадии (1)-(4):
(1) стадию приготовления культуральной среды, содержащей клетку, трансформированную экспрессирующим вектором, который экспрессирует описанный в пункте 1 полипептид, или клетку, включающую описанный в пункте 2 экспрессированный продукт, и богатую в отношении тромбоцитов плазму;
(2) стадию добавления агрегирующего тромбоциты агента в культуральную среду вышеуказанной стадии (1) для индуцирования агрегации тромбоцитов в присутствии или отсутствие исследуемого вещества;
(3) стадию измерения уровня агрегации тромбоцитов в присутствии или отсутствие исследуемого вещества на вышеуказанной стадии (2); и
(4) стадию отбора исследуемого вещества в качестве вещества-кандидата, когда величина, измеренная в присутствии исследуемого вещества, больше величины, измеренной в отсутствии исследуемого вещества.
Пункт 9. Набор для скрининга агониста полипептида, описанного в пункте 1, или экспрессированного продукта, который экспрессируется описанным в пункте 2 полинуклеотидом, отличающийся тем, что в качестве компонентов он содержит богатую в отношении тромбоцитов плазму, один из полипептидов, описанных в пункте 1, и экспрессированный продукт, описанный в пункте 2, и агент, агрегирующий тромбоциты.
Пункт 10. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
Пункт 11. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.
Пункт 12. Выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5.
Пункт 13. Полинуклеотид, включающий ДНК-последовательность SEQ ID NO: 2 или ее комплемент.
Пункт 14. Полинуклеотид, включающий ДНК-последовательность SEQ ID NO: 4 или ее комплемент.
Пункт 15. Полинуклеотид, включающий ДНК-последовательность SEQ ID NO: 6 или ее комплемент.
На вышеуказанный по меньшей мере один полипептид (белок) (а)-(d) иногда дается ниже ссылка в виде "SY-001". На экспрессированный продукт вышеуказанного по меньшей мере одного полинуклеотида (е)-(j) иногда дается ниже ссылка в виде "экспрессированный продукт настоящего изобретения".
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 демонстрируется ингибиторная активность SY-001, продуцированного в примере 1, 3(1), в отношении агрегации тромбоцитов, индуцированной коллагеном.
На фиг.2 демонстрируется ингибиторная активность SY-001, продуцированного в примере 1, 3(2), в отношении агрегации тромбоцитов, индуцированной коллагеном.
На фиг.3 демонстрируется ингибиторная активность в отношении агрегации тромбоцитов SY-001, продуцированного в примерах 1 и 3, который ингибирует адгезию тромбоцитов к коллагену.
На фиг.4 демонстрируется, что SY-001, продуцированный в примерах 1 и 3, обладает способностью связываться с коллагеном.
ЛУЧШИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Представленные здесь сокращения аминокислот, пептидов, последовательностей оснований и нуклеиновых кислот находятся в соответствии с биологической номенклатурой IUPAC-IUB, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984), определенной IUPAC-IUB, "Guideline for preparing specifications comprising base sequences and amino acid sequences" (Патентное ведомство), и обычно используемыми в данной области техники обозначениями.
Полинуклеотид (молекула ДНК) здесь включает не только двухцепочечную ДНК, но также одноцепочечную ДНК, в том числе смысловые цепи и антисмысловые цепи, которые их составляют, и не ограничивается своей длиной. Следовательно, кодирующий SY-001 полинуклеотид включает двухцепочечную ДНК, в том числе геномную ДНК, и одноцепочечную ДНК (смысловую цепь), в том числе кДНК, и одноцепочечную ДНК (антисмысловую цепь), имеющую последовательность, комплементарную смысловой цепи, и их синтетические ДНК-фрагменты, если не упоминается иное.
Полинуклеотид (молекула ДНК) здесь не определяется функциональным районом и может включать по меньшей мере один из следующих районов: супрессирирующий экспрессию район, кодирующий район, лидерную последовательность, экзон и интрон.
Полинуклеотид также включает РНК и ДНК. Полипептид, включающий определенную аминокислотную последовательность, и полинуклеотид, включающий определенную ДНК-последовательность, включают их фрагменты, гомологи, производные и мутанты.
Мутанты полинуклеотида (мутантная ДНК) включают встречающиеся в природе аллельные мутанты, не встречающиеся в природе мутанты и мутанты, имеющие делецию, замену, добавление и вставку. Но эти мутанты кодируют полипептид, обладающий по существу той же самой функцией, что и функция полипептида, кодируемого полинуклеотидом до мутации.
Мутация полипептида (модификация аминокислотной последовательности) необязательно происходит посредством встречающейся в природе, например, мутации или посттрансляционной модификации и может быть мутацией, искусственно произведенной при использовании встречающегося в природе белка (например, SY-001). Вышеуказанные мутанты полипептида включают аллельные варианты, гомологи и встречающиеся в природе мутанты, гомологичные полипептиду до мутации по меньшей мере на 80%, предпочтительно на 95% и более предпочтительно на 99%.
Гомологию полипептида или полинуклеотида можно проанализировать при измерении с использованием программы FASTA (Clustal, V., Methods Mol. Biol., 25, 307-318 (1994)). В качестве примера наиболее предпочтительного и простого метода анализа гомологи можно привести метод, при котором последовательность хранят на носителе (например, гибком диске, компакт-диске, накопителе на жестком диске, накопителе на диске для внешней связи, цифровом видео-диске и т.п.), способном считываться компьютером, и затем базы данных известных последовательностей подвергают поиску в соответствии с хорошо известной процедурой поиска с использованием сохраненной последовательности. Конкретные примеры баз данных известных последовательностей включают следующее:
- База данных ДНК Японии (DDBJ) (http://www/ddbj,nig.ac.jp/);
- Genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genebank./Index.htlm); и
- База данных последовательностей нуклеиновых кислот Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) (http://ebi.ac/uk/ebi docs/embl db.html).
Большинство алгоритмов поиска для анализа гомологии доступны квалифицированным в данной области техники специалистам. Один их пример включает программу, на которую дается ссылка в виде программы BLAST. В этой программе существует 5 BLAST-процедур. Среди них три (BLASTN, BLASTX и TBLASTX) предназначены для проверки нуклеотидной последовательности. Остающиеся две процедуры предназначены для проверки последовательности белка (Coulson, Trends in Biotechnology, 12: 76-80 (1994); Birren, et al., Genome Analysis, 1: 543-559 (1997)).
Кроме того, для анализа идентифицированной последовательности в данной области техники имеются дополнительные программы, например программа выравнивания последовательностей и программа для идентификации более отдаленных последовательностей.
Мутантная ДНК является молчащей (нет изменения аминокислотного остатка, кодируемого мутированной последовательностью нуклеиновой кислоты) или консервативной в отношении кодируемой ее аминокислоты. Примеры консервативных аминокислотных замен показаны ниже.
<b>Первоначальный аминокислотный</b><b>остаток</b>
<b>Консервативный замещенный</b><b>аминокислотный остаток</b>
AlaArgAsnAspCysGlnGluGlyHisIleLeuLysMetPheSerThrTrpTyrVal
SerLysGln или HisGluSerAsnAspProAsn или GlnLeu или ValIle или ValArg, Asn или GluLeu или IleMet, Leu или TyrThrSerTyrTrp или PheIle или Leu
Как правило, один или более кодонов, кодирующих остаток Cys, влияют на образование дисульфидной связи конкретного полипептида.
Замена аминокислотного остатка, которая, как обычно считают, влияет на свойства белка, включает следующие замены:
(a) замену гидрофобного остатка гидрофобным остатком, например замена Leu, Ile, Phe, Val или Ala остатком Ser или Thr;
(b) замену аминокислотного остатка, отличного от Cys и Pro, остатком Cys или Pro;
(c) замену остатка, имеющего несущую положительный заряд боковую цепь, например Lys, Arg или His, несущим отрицательный заряд остатком, например Glu или Asp; и
(d) замену аминокислотного остатка, имеющего чрезвычайно большую боковую цепь, например Phe, аминокислотным остатком, не имеющим боковой цепи, например Gly.
(1) SY-001
SY-001 включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 3 или аминокислотную последовательность, имеющую одну или несколько делеций, вставок, замен или добавлений аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 3, и обладает ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов, которая ингибирует адгезию тромбоцитов к коллагену и/или способность связываться с коллагеном.
Escherichia coli
SY-001 может быть полипептидом, экспрессируемым в системе экспрессии белков с использованием  или в системе экспрессии белков с использованием бакуловируса (AcNPV), продемонстрированных в описываемых позже примерах, с помощью метода рекомбинации генов, или полипептидом, получаемым химическим синтезом.
В качестве одного конкретного примера аминокислотной последовательности SY-001 можно привести одну из SEQ ID NO: 1 или 3. Аминокислотная последовательность SY-001 не ограничивается одной из SEQ ID NO: 1 или 3 и может быть последовательностями, имеющими с ними определенную гомологию, (гомологичными последовательностями). Гомологичные последовательности могут включать полипептиды, включающие аминокислотную последовательность, имеющую одну или несколько делеций, вставок, замен или добавлений аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 3, и обладающие ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов, которая ингибирует адгезию тромбоцитов к коллагену и/или способность связываться с коллагеном.
Ингибиторная активность в отношении агрегации тромбоцитов, которой обладает SY-001, включает эффекты ингибирования или блокирования состояния, при котором в кровеносном сосуде человека (в частности, в коронарной артерии, аорте и церебральной артерии) увеличивается содержание вещества, индуцирующего агрегацию тромбоцитов, или в кровеносном сосуде облегчается агрегационная способность тромбоцитов, или состояния, при котором при повреждении кровеносного сосуда тромбоциты чрезмерно агрегируют в месте повреждения.
Ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов можно обнаружить по ингибированию (супрессии) агрегации тромбоцитов, индуцированной агрегирующим тромбоциты агентом, в богатой в отношении тромбоцитов плазме (PRP) при добавлении SY-001 в плазму в эксперименте in vitro.
Более подробно, ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов SY-001 можно определить с помощью следующего способа. Т.е. сначала с помощью центрифугирования из цельной крови человека готовят PRP. Впоследствии эту приготовленную PRP предварительно инкубируют с раствором, например раствором PBS, содержащим SY-001, и для агрегации тромбоцитов к этому раствору далее добавляют агент, агрегирующий тромбоциты. Примеры агрегирующего тромбоциты агента включают АДФ (аденозиндифосфат), коллаген, CRP (родственный коллагену пептид), конвульксин, TRAP (пептид-активатор рецептора тромбина), эпинефрин, арахидоновая кислота, U-46619 (аналог тромбоксана А2, аналог TXA2) и А23187 (кальциевый ионофор). Скорость агрегации тромбоцитов в полученном в результате растворе измеряют с использованием турбидиметрического тромбоагрегометра с пропусканием света (MCM HEMA TRACER 313M, поставляемого MC Medical), и скорость ингибирования с помощью SY-001 агрегации тромбоцитов рассчитывают из полученной величины измерения на основе величины в контроле, не содержащем SY-001. Таким образом, можно обнаружить ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов SY-001.
Можно также определить ингибиторную активность в отношении адгезии тромбоцитов SY-001 с помощью следующего метода.
Раствор PBS, содержащий SY-001 в установленных концентрациях, добавляют в лунки 96-луночного планшета, покрытые раствором коллагена, и инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации в лунку добавляют суспензию тромбоцитов и инкубируют в течение 45 минут при комнатной температуре. После инкубации инкубационный раствор удаляют из лунки с помощью пипетки, и лунку промывают PBS.
В лунку добавляют раствор PBS, содержащий 1% SDS, и после покачивания и перемешивания лунку подвергают воздушной сушке. Затем в лунку добавляют дистиллированную воду, количество белка в каждой лунку измеряют с использованием набора для анализа белка Dc (BIO-RAD Laboratories). Скорость ингибирования адгезии тромбоцитов с помощью SY-001 рассчитывают из полученной величины измерения на основе величины в контроле, не содержащем SY-001, и ингибиторную активность в отношении адгезии тромбоцитов SY-001 рассчитывают из кривой адгезии тромбоцитов. Таким образом, можно обнаружить ингибиторную активность в отношении адгезии тромбоцитов SY-001, которая ингибируют адгезию тромбоцитов к коллагену.
Можно также определить способность SY-001 связываться с коллагеном с помощью следующего способа.
В каждую лунку 96-луночного планшета с или без покрытия коллагеном добавляют 300 мкл блокирующего раствора и инкубируют в течение 1 часа. После удаления из каждой лунки инкубационного раствора в каждую лунку добавляют 100 мкл раствора, содержащего SY-001 в установленных концентрациях, и инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре. После удаления из каждой лунки инкубационного раствора в каждую лунку затем добавляют 200 мкл 2% сахарозы и инкубируют в течение 5 минут при комнатной температуре. После удаления из каждой лунки инкубационного раствора лунки высушивают, в каждую лунку добавляют 100 мкл воссозданного раствора никель-HRP (KPP: Kirkegaard&Perry Laborator, Ltd) и инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре. После промывки буфером для промывок в каждую лунку добавляют 100 мкл субстрата для пероксидазы ABTS (KPL Ltd.), и 96-луночный планшет осторожно покачивают.
После завершения реакции в каждую лунку добавляют 100 мкл 1% SDS и затем лунку измеряют с использованием считывающего устройства Micro Plate Reader с вариацией абсорбции при 405-410 нм.
Способность SY-001 при установленных концентрациях связываться с коллагеном рассчитывают из полученной величины OD (оптической плотности) на основе величины в контроле, не содержащем SY-001, и способность SY-001 связываться с коллагеном рассчитывают из кривой связывания коллагена. Таким образом, можно обнаружить способность SY-001 связываться с коллагеном.
2
4
3
2
Можно также определить антитромбоцитарную активность, которой обладает SY-001, с помощью следующего способа. Т.е. PRP готовят с помощью центрифугирования из цельной крови, получаемой путем взятия с помощью шприца с антикоагулянтом образца крови у здорового донора. Затем полученную PRP разводят соответствующим буфером, например Tyrode-Hepes (134 мМ NaCl, 0,34 мМ NaHPO, 2,9 мМ KCl, 12 мМ NaHCO, 20 мМ Hepes, 5 мМ глюкозы, 1 мМ MgCl, pH 7,3), и к этому серийному разведению добавляют SY-001 в установленных концентрациях и предварительно инкубируют. К этому раствору добавляют флуоресцентно меченное антитело против селектина Р, антитело (поставляемое Becton Dickinson), которое узнает РАС-1 (комплекс GPIIb/GPIIIa), фибриноген и аннексин V, и впоследствии для активации тромбоцитов добавляют агрегирующий тромбоциты агент, например АДФ, коллаген или TRAP. Следовательно, для оценки активности (ингибиторной активности в отношении активации) SY-001 в отношении активации тромбоцитов измеряют интенсивность флуоресценции активированных тромбоцитов с помощью проточной цитометрии. Эта ингибиторная активность в отношении активации тромбоцитов является ингибиторной активностью в отношении активации тромбоцитов.
В вышеуказанном методе при использовании флуоресцентно меченных антител, узнающих тромбоцит и лейкоцит, можно также оценить эффект соединения на взаимодействие тромбоцита и лейкоцита (тромбоцит-лейкоцит адгезию).
В отношении подробностей способа измерения ингибиторной активности SY-001 в отношении агрегации тромбоцитов, в котором используется турбидиметрический тромбоагрегометр с пропусканием света, в настоящем изобретении приводится ссылка, например, на Born, G.V.R., "Aggregation of blood platelets by adenosine diphosphate and its reversal", Nature, 1962, 194, 927-8 и Sudo, T., et al., "Potent effects of novel anti-platelet aggregatory cilostamide analogues on recombinant cyclic nucleotide phosphodiesterase isozyme activity", Biochem. Pharmacol., 2000, 59, 347-56. В отношении измерения активации тромбоцитов в настоящем изобретении приводится ссылка, например, на Ito, H., et al., "Cilostazol inhibits platelet-leukocyte interaction by suppression of platelet activation", Platelets, 2004, 15, 293-301.
Следовательно, существует вероятность использования SY-001, имеющего ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторную активность в отношении адгезии тромбоцитов, в качестве терапевтического агента против распространения или для профилактики связанных с кровью заболеваний и их осложнений, оказывая действие на кровь и кровеносный сосуд являющихся млекопитающими животных с ингибированием или предотвращением образования тромба или эмбола.
Соответственно предполагается эффективное использование SY-001, имеющего ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторную активность в отношении адгезии тромбоцитов, в качестве терапевтического агента или профилактического агента для патологических состояний после заболеваний и их осложнений, например инфаркта миокарда, эмболии сосудов головного мозга, хронической обструкции артерий, склероза артерий, ишемического инфаркта головного мозга, стенокардии, тромбоза вен, гипертензии, легочной гипертезии, инфаркта головного мозга, инфаркта легкого, сердечной недостаточности, нефрита, почечной недостаточности и субарахноидального кровоизлияния, вызванных образованием тромба или эмбола.
Также предполагается эффективное использование SY-001, имеющего ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторную активность в отношении адгезии тромбоцитов, для профилактики образования тромба при ЧТКА и размещении стента и в качестве агента, предотвращающего рестеноз после размещения стента путем включения с помощью нанесения на стент или заделывания в него самого лекарственного средства, содержащего SY-001.
Степень и положение модификации, т.е. "делеции, вставки, замены или добавления" аминокислотных остатков, в SY-001, представленного в виде вышеуказанного полипептида (b) и (d), особенно не ограничивается при условии, что полипептид (эквивалентный полипептид), включающий модифицированную аминокислотную последовательность, имеет по существу ту же самую активность, что и активность полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 3. Предпочтительно, чтобы указанная модификация обычно затрагивала приблизительно от одного до нескольких аминокислотных остатков.
В настоящем изобретении "делеции, вставки, замены или добавления множества аминокислотных остатков" относятся к тому, что делетируются, вставляются, замещаются или добавляются 2 или более и 20 или менее аминокислот. Предпочтительно множество аминокислот составляют 2 или более и 10 или менее аминокислот, более предпочтительно 2 или более и 7 или менее и еще более предпочтительно 2 или более и 5 или менее. Эта модифицированная аминокислотная последовательность гомологична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 3, например, на приблизительно 70% или более, предпочтительно на приблизительно 80% или более, более предпочтительно на приблизительно 95% или более и еще более предпочтительно на приблизительно 98% или более.
Конкретные примеры полипептида (SY-001), являющегося активным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения, продемонстрированы в описываемых позже примерах.
SY-001 обладает присущей ему ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов.
SY-001 также обладает присущей ему способностью связываться с коллагеном.
Следовательно, фармацевтическая композиция настоящего изобретения, содержащая в качестве активного компонента SY-001, применима в качестве терапевтического агента или профилактического агента для патологического состояния после заболеваний и их осложнений, например острого коронарного синдрома, инфаркта миокарда, эмболии сосудов головного мозга, хронической обструкции артерий, склероза артерий, ишемического инфаркта головного мозга, стенокардии, тромбоза вен, гипертензии, легочной гипертезии, инфаркта головного мозга, инфаркта легкого, сердечной недостаточности, нефрита, почечной недостаточности и субарахноидального кровоизлияния, вызванных образованием тромба или эмбола. Фармацевтическая композиция настоящего изобретения также применима для профилактики образования тромба при ЧТКА и размещении стента и в качестве агента, предотвращающего рестеноз после размещения стенда с помощью нанесения на стент или заделывания в него фармацевтической композиции.
(2) Полинуклеотид (ДНК-молекула), кодирующая SY-001
Один конкретный пример полинуклеотида, кодирующего SY-001 (на который иногда дается ссылка в виде "ДНК-молекула SY-001"), может включать полинуклеотид (ДНК-молекулу), включающую ДНК-последовательность SEQ ID NO: 2, или 4, или ее комплемент.
Другой пример ДНК-молекулы SY-001 включает полинуклеотид, гибридизующийся в жестких условиях с полинуклеотидом, включающим комплемент ДНК-последовательности SEQ ID NO: 2 или 4, и способный экспрессировать полипептид, обладающий ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов.
"Жесткими условиями" здесь могут являться условия, при которых гибридизация происходит в 2×SSC, содержащем 0,1% SDS, при 50°С и не прекращается после отмывки в 1×SSC, содержащем 0,1% SDS, при 60°С.
Кроме того, другой пример ДНК-молекулы (полинуклеотида) SY-001 включает полинуклеотид, включающий ДНК-последовательность, гомологичную наиболее близкородственной последовательности среди полинуклеотидов, включающих ДНК-последовательность SEQ ID NO: 2 или 4 или ее комплемент, на 80% или более, предпочтительно на 95% или более и более предпочтительно на 98% или более, и способный экспрессировать полипептид, обладающий ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов.
Существенным требованием для ДНК-молекул (на которые иногда дается ссылка в виде модифицированные ДНК-молекулы), способных экспрессировать обладающие требуемыми эффектами полипептиды, продемонстрированные в качестве других примеров, является то, чтобы полипептид с аминокислотной последовательностью, кодируемой такой ДНК-молекулой, мог проявлять ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторную активность в отношении адгезии тромбоцитов (в частности, ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов, индуцированной коллагеном, и/или ингибиторную активность в отношении адгезии тромбоцитов к коллагену). Другими словами, требование состоит в том, чтобы трансформант, трансформированный рекомбинантным экспрессирующим вектором, в который встроен полинуклеотид (модифицированная ДНК-молекула), мог экспрессировать белок, обладающий ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов, в качестве его экспрессируемого продукта.
Вышеуказанная модифицированная ДНК-молекула включает ДНК-молекулы, включающие ДНК-последовательности, кодирующие аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 1 или 3, в частности аминокислотные последовательности (модифицированные аминокислотные последовательности), имеющие одну или несколько делеций, вставок, замен или добавлений аминокислот, и ДНК-последовательности, кодирующие ее комплемент. Модифицированные ДНК могут быть последовательностями, которые могут использоваться для обнаружения ДНК-молекулы настоящего изобретения до ее модификации.
ДНК-молекула, гомологичная полинуклеотиду (ДНК SY-001 или ее фрагментам), включенному в ДНК-молекулу SY-001 и включающему ДНК-последовательность SEQ ID NO: 2 или 4, означает ряд родственных ДНК-молекул, между которыми и ДНК-последовательностью SEQ ID NO: 2 или 4 существует гомология последовательностей и которые признаны согласно их структурным свойствам, общности их картин экспрессии и схожести их биологических функций в качестве одного семейства ДНК-молекул.
Такой гомологичной ДНК-молекулой могут быть молекулы, искусственно полученные на основе встречающихся в природе ДНК-молекул (например, ДНК-фрагмента SY-001). Примеры метода такого искусственного получения включают генно-инженерные методы, такие как сайт-направленный мутагенез [Methods in Enzymology, 154, 350, 367-382 (1987); там же 100, 468 (1983); Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984); "Zoku Seikagaku Jikken Kouza 1", "Idenshi Kenkyuho II" edited by the Japanese Biochemical Society, p105 (1986)], методы химического синтеза, такие как фосфотриэфирный метод и фосфорамидитный метод [J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967); там же 91, 3350 (1969); Science, 150, 178 (1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981); там же 24, 245 (1983)] и их комбинации. Более конкретно, ДНК-молекулу можно также синтезировать с помощью фосфорамидитного метода или фосфотриэфирного метода, а также можно синтезировать с использованием коммерчески доступного автоматического синтезатора олигонуклеотидов. Двухцепочечный фрагмент можно получить с помощью синтеза комплементарной цепи и отжига комплементарной цепи к химически синтезированной одноцепочечной цепи при соответствующем условии или добавления комплементарной цепи к химически синтезированной одноцепочечной цепи с использованием ДНК-полимеразы с соответствующими праймерами.
ДНК-последовательность SEQ ID NO: 2 или 4, которая является одним конкретным вариантом ДНК-молекулы SY-001, представляет собой один из примеров комбинации кодонов, кодирующих аминокислотные остатки полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 3. ДНК-молекула SY-001 не ограничивается ДНК-молекулой, имеющей такую конкретную ДНК-последовательность, и может иметь комбинацию оптимальных кодонов и ДНК-последовательность, выбранную для каждого аминокислотного остатка. Кодон можно выбрать в соответствии со стандартным способом. В это время можно принять во внимание частоту использования кодонов в используемом хозяине [Nucleic Acids Res., 9, 43(1981)].
(3) Получение ДНК-молекулы SY-001
ДНК-молекулу SY-001 можно легко продуцировать и получить с помощью синтеза на основе раскрытой здесь информации о последовательности нуклеиновой кислоты полинуклеотида, кодирующего SY-001, или прямого синтеза ДНК-молекулы, соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислотную последовательность, на основе информации об аминокислотной последовательности SY-001 (химического синтеза ДНК). Для такого получения можно применять общие генно-инженерные методы [например, см. Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); "Zoku Seikagaku Jikken Kouzs 1", "Idenshi Kenkyuho II" edited by the Japanese Biochemical Society (1986)].
В качестве примера метода химического синтеза ДНК, с помощью которого непосредственно синтезируют ДНК-молекулу SY-001, можно привести метод твердофазного синтеза с помощью фосфорамидитного метода. Для этого метода синтеза можно использовать автоматический синтезатор.
Получение ДНК-молекулы SY-001 с помощью генно-инженерного метода можно более конкретно осуществить с помощью приготовления библиотеки кДНК из соответствующего источника, в котором экспрессировалась ДНК-молекула SY-001, в соответствии со стандартным методом и отбора из библиотеки требуемого клона, используя соответствующий зонд или специфичное в отношении ДНК-молекулы SY-001 антитело [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983)].
Anopheles stephensi
В вышеуказанном методе в качестве примера источника кДНК можно привести различные клетки и ткани, в которых экспрессируется ДНК-молекула SY-001, и происходящие от них культивируемые клетки. В частности, желательно получить слюнную железу , который является насекомым-террористом. Все из ниже перечисленного: экстракцию и выделение общей РНК из источника, отделение и очистку мРНК и получение и клонирование кДНК - можно осуществить в соответствии со стандартными методами.
Anopheles stephensi
ДНК-молекулу SY-001 можно получить, используя библиотеку кДНК слюнных желез, полученной с помощью экстракции, отделения и очистки мРНК слюнных желез. Помимо этого ДНК-молекулу SY-001 можно также получить, используя библиотеку фагов, приготовленную с помощью экстракции вышеуказанной мРНК слюнной железы, добавления поли-А к РНК, затем сбора РНК с поли-А, получения кДНК с использованием обратной транскриптазы и впоследствии добавления сайтов рестрикционных ферментов с обоих концов кДНК, которую встраивают в фаг.
Anopheles stephensi
Метод скринирования ДНК-молекулы SY-001 из библиотеки кДНК особенно не ограничивается, и его можно осуществить в соответствии со стандартными методами. В качестве примера конкретного метода можно привести метод, в котором соответствующий кДНК-клон отбирают с помощью иммунологического скрининга с использованием антитела (например, антитела против слюны ), специфичного в отношении продуцируемого кДНК белка, метод гибридизации бляшек с использованием зонда, который избирательно связывается с целевой ДНК-последовательностью, метод гибридизации колоний и их комбинации.
Зонд, используемый в каждом из вышеуказанных методов гибридизации, представляет собой, как правило, ДНК-фрагмент, химически синтезированный на основе информации о ДНК-последовательности ДНК-молекулы SY-001. В качестве вышеуказанного зонда можно выгодно использовать уже полученные ДНК-молекулу SY-001 и ее фрагмент. Кроме того, в качестве зондов для вышеуказанного скрининга можно также использовать смысловой праймер и антисмысловой праймер, полученные на основе информации о ДНК-последовательности ДНК-молекулу SY-001.
Используемая в качестве зонда ДНК (нуклеотиды) представляет собой частичную ДНК (нуклеотиды), соответствующую последовательности ДНК SY-001, и включает по меньшей мере 15 последовательных ДНК, предпочтительно по меньшей мере 20 последовательных ДНК и более предпочтительно по меньшей мере 30 последовательных ДНК. В качестве зонда можно использовать сам клон, положительный в отношении вышеуказанной продукции ДНК-молекулы настоящего изобретения.
После получения ДНК-молекулы SY-001 можно подходящим образом использовать метод амплификации ДНК/РНК с помощью ПЦР-метода [Science, 230, 1350 (1985)]. В частности, когда из библиотеки трудно получить полноразмерную кДНК, можно подходящим образом использовать RACE-метод [быструю амплификацию концов кДНК; Jikken Igaku, 12(6), 35(1994)], в частности 5'-RACE-метод [M. A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)].
Используемый для ПЦР-метода праймер можно необязательно сконструировать на основе информации о последовательности ДНК-молекулы SY-001, как продемонстрировано в описываемых позже примерах, и синтезировать в соответствии со стандартным методом. В качестве такого праймера можно использовать части ДНК (праймер для промотора SP6 и праймер для терминатора T7), добавленные с обоих концов кДНК плазмидного вектора, в который встроена кДНК SY-001, как продемонстрировано в описываемом позже примере.
Амплифицированный с помощью ПЦР-метода фрагмент ДНК/РНК можно выделить и очистить в соответствии со стандартными методами, например методом гель-электрофореза.
ДНК-молекулу SY-001 и ее различные ДНК-фрагменты, полученные, как указано выше, можно секвенировать в соответствии со стандартным методом, например дидезокси-методом [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)], или методом Максама-Джильберта [Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)], или просто с использованием коммерчески доступного набора для секвенирования.
(4) Получение методами генной инженерии экспрессированного продукта настоящего изобретения
Экспрессированный продукт (рекомбинантный SY-001) настоящего изобретения можно легко и стабильно получать в большом количестве в виде экспрессированного продукта ДНК-молекулы или белка, содержащего SY-001, используя информацию о последовательности ДНК-молекулы SY-001, в соответствии с общими методами генной инженерии [например, Science, 224, 1431 (1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 130, 692 (1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80, 5990 (1983)]. Более конкретно, экспрессированный продукт настоящего изобретения можно получить с помощью приготовления рекомбинантной ДНК (экспрессирующего вектора), способной экспрессировать ДНК, кодирующую требуемый белок, в клетке-хозяине, трансформации клетки-хозяина этим вектором с получением трансформанта, культивирования трансформанта и сбора целевого белка из полученной в результате культуры.
Escherichia coli, Bacillus subtilis
Escherichia coli
Escherichia coli
При получении экспрессированного продукта настоящего изобретения в качестве клетки-хозяина можно использовать любой из прокариотических организмов и эукариотических организмов. Например, прокариотическими организмами в качестве хозяина могут быть любой из  и подобных, обычно используемых. Подходяще, если используется , в частности штамм К12. Клетки-хозяева эукариотических организмов включают клетки позвоночных и дрожжей. Примеры подходящих клеток позвоночных включают клетки COS обезьяны [Cell, 23: 175 (1981)], клетки яичника китайского хомячка и их линии с делецией гена редуктазы дигидрофолиевой кислоты [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 77: 4216 (1980)], а примеры подходящих клеток дрожжей включают клетки, принадлежащие роду Saccharomyces. Конечно, клетки-хозяева не ограничиваются ими.
Escherichia coli
Escherichia coli
Когда в качестве хозяина используется прокариотическая клетка с применением вектора, способного реплицироваться в клетке-хозяине, можно подходящим образом использовать экспрессирующую плазмиду, полученную встраиванием промотора и SD-последовательности (последовательности Шайна-Дальгарно) и инициирующего кодона (например, ATG), требуемых для инициации синтеза белка, 5' от гена настоящего изобретения так, чтобы ген мог экспрессироваться в этом векторе. В качестве вышеуказанного вектора часто используют плазмиды, такие как pET-16b, pET-32, pBR322, pBR325, pUC12 и pUC13, происходящие из . Не ограничиваясь ими, можно использовать различные известные векторы. Примеры коммерчески доступного вектора, используемого для экспрессирующей системы с использованием , включают pGEX-4T (Amersham Pharmacia Biotech), pMAL-C2, pMAL-P2 (New England Biolabs), pET-16, pET-32, pET-21, pET-21/lacq (Invitrogen) и pBAD/His (Invitrogen).
При использовании в качестве хозяина клетки позвоночного экспрессирующий вектор включает векторы, обычно содержащие промотор, сайт сплайсинга РНК, сайт полиаденилирования и терминирующую транскрипцию последовательность, расположенные 5' от экспрессируемого гена настоящего изобретения. Они могут, кроме того, содержать начало репликации, если требуется. Конкретно, примеры экспрессирующего вектора включают pSV2dhfr [Mol. Cell. Biol., 1: 854 (1981)], имеющий ранний промотор SV40. Помимо вышеуказанного можно использовать различные известные коммерчески доступные векторы. Примеры коммерчески доступных векторов, используемых для экспрессирующей системы с использованием клетки животного, включают такие векторы, как pEGFP-N, pEGFP-C (Clontrech), pIND (Invitrogen) и pcDNA3.1/His (Invitrogen), для клеток животных и такие векторы, как pFastBac HT (GibcoBRL), pAcGHLT (PharMingen), pAc5/V5-His, pMT/V5-His и pMT/Bip/V5-His (Invitrogen), для клеток насекомых.
Bombyx mori
Autographa californica
Spodoptera frugiperda
Trichoplusia ni
В качестве примера вектора для клеток насекомых можно привести бакуловирусный вектор (Takara), в который встроена кДНК SY-001. Конкретно экспрессированный продукт настоящего изобретения можно получить путем введения бакуловирусного экспрессирующего вектора, в который встроена кДНК SY-001, в культивируемые клетки BmN4 или личинки тутового шелкопряда () с использованием вируса ядерного полиэдроза (BmNPV) тутового шелкопряда с экспрессией и выделения из культуральной среды или жидкой массы тутового шелкопряда с помощью хроматографии. Экспрессированный продукт настоящего изобретения можно также получить путем встраивания кДНК SY-001 в вирус ядерного полиэдроза (AcNPV) , экспрессии его в клетках Sf9  или клетках Tn5  и также очистки из супернатанта культуры с помощью хроматографии.
При использовании в качестве хозяина клетки дрожжей конкретные примеры экспрессирующего вектора включают pAM82 [Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 80: 1 (1983)], имеющий промотор гена кислой фосфатазы. Примеры коммерчески доступного экспрессирующего вектора для дрожжевой клетки включают pPICZ (Invitrogen) и pPICZα (Invitrogen).
Промотор особенно не ограничивается. При использовании в качестве хозяина бактерии, принадлежащей роду Escherichia, можно предпочтительно использовать триптофановый (trp) промотор, lpp-промотор, lac-промотор, recA-промотор и PL/RL-промотор. Когда хозяин принадлежит роду Bacillus, предпочтительными являются SP01-промотор, SP02-промотор, penP-промотор и т.п. При использовании в качестве хозяина дрожжей можно подходящим образом использовать pH05-промотор, PGK-промотор, GAP-промотор, ADH-промотор и т.п. При использовании в качестве хозяина клетки животного предпочтительными промоторами являются промотор, происходящий из SV40, промотор ретровируса, промотор металлотионеина, промотор теплового шока, цитомегаловирусный промотор, SRα-промотор и т.п. При использовании в качестве хозяина клетки насекомого можно привести в качестве примера промотор бакуловируса р10, промотор полиэдрина и т.п.
В качестве экспрессирующего ДНК-молекулу SY-001 вектора можно предпочтительно использовать экспрессирующий слитый белок вектор. Конкретные примеры вектора включают pGEX (Promega) для экспрессии в виде слитого с глутатион-S-трансферазой (GST) белка.
В качестве примера полинуклеотидной последовательности, соответствующей кодирующей зрелый полипептид последовательности, что помогает экспрессии и секреции полипептида из клетки-хозяина, можно привести секреторную последовательность и лидерную последовательность. Эти последовательности включают маркерные последовательности (гексагистидиновый маркер, гистидиновый маркер), например гемагглютининовый маркер в случае клетки животного, используемые для очистки слитого зрелого полипептида из бактериального хозяина.
Метод введения требуемой рекомбинантной ДНК (экспрессирующего вектора) в клетку-хозяина и метод трансформации с использованием этой ДНК особенно не ограничиваются, и можно использовать различные общие методы.
Получаемый в результате трансформант можно культивировать в соответствии со стандартными методами, и при культивировании целевой белок (экспрессированный продукт), кодируемый ДНК-молекулой SY-001, сконструированной, как требуется, экспрессируется и продуцируется (накапливается и секретируется) внутриклеточно, или внеклеточно, или на клеточной мембране трансформанта.
В качестве среды, используемой для культивирования, можно произвольно выбрать и использовать в зависимости от применяемой клетки-хозяина различные обычно используемые среды.
st
st
Полученный таким способом экспрессированный продукт (рекомбинантный белок) настоящего изобретения можно отделить и очистить с помощью различных приемов отделения [смотри Biochemistry Data Book II, pages 1175-1259, 1 edition 1 printing published by Tokyo Kagaku Dojin on June 23, 1980; Biochemistry, 25 (25), 8274 (1986); Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987)], используя физическую и химическую сущности продукта, как требуется.
В частности, такие методы включают обычную перегруппировочную обработку, обработку (высаливание) с помощью осаждающего белок агента, центрифугирование, осмотический шок, разрушение ультразвуком, ультрафильтрацию, различные жидкостные хроматографии, такие как хроматография на молекулярных ситах (гель-фильтрация), адсорбционная хроматография, ионообменная хроматография, аффинная хроматография и жидкостная хроматография высокого разрешения (HPLC), диализ и их комбинации. Особенно предпочтительный метод включает аффинную хроматографию с использованием колонки, с которой связано антитело, специфичное в отношении SY-001.
При конструировании полинуклеотида, кодирующего SY-001, можно использовать ДНК-последовательность ДНК-молекулы SY-001 SEQ ID NO: 2. В этой последовательно также можно произвольно отобрать, изменить и использовать кодон для каждого аминокислотного остатка, как требуется.
Для аминокислотной последовательности SY-001, когда часть аминокислотных остатков или аминокислотной последовательности модифицируют с помощью замены, вставки, делеции или добавления, можно использовать различные методы, такие как сайт-направленный мутагенез, описанный выше.
(5) Экспрессированный продукт настоящего изобретения, являющийся активным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения
Экспрессированный продукт (и тот же самый экспрессированный продукт, используемый в способе скрининга настоящего изобретения) настоящего изобретения, являющийся активным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения, можно получить с помощью генно-инженерных методов, представленных в приведенном выше разделе (4).
Ингибиторная активность экспрессированного продукта настоящего изобретения в отношении агрегации тромбоцитов является той же самой ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов, определенной для SY-001 и описанной выше в приведенном выше разделе (1). Эту ингибиторную активность можно определить в соответствии с публично известным методом проверки агрегации тромбоцитов, например, с помощью метода определения агрегации в богатой в отношении тромбоцитов плазме (PRP) с использованием турбидиметрического тромбоагрегометра с пропусканием света.
Более конкретно, ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов экспрессированного продукта настоящего изобретения можно определить и оценить путем измерения уровня агрегации тромбоцитов при добавлении агрегирующего тромбоциты агента в PRP, приготовленную из крови человека, в присутствии или отсутствие SY-001, используя турбидиметрический тромбоагрегометр с пропусканием света, и расчета скорости ингибирования с помощью SY-001 агрегации тромбоцитов из кривой агрегации тромбоцитов.
Ингибиторная активность экспрессированного продукта настоящего изобретения в отношении адгезии тромбоцитов является той же самой ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов (т.е. ингибирует адгезию тромбоцитов к коллагену), определенной для SY-001 и описанной выше в приведенном выше разделе (1). Эту ингибиторную активность можно определить в соответствии с публично известным методом проверки адгезии тромбоцитов к коллагену, например, с помощью метода определения адгезии тромбоцитов к коллагену с использованием набора для анализа белка Dc (BIO-RAD Laboratories).
Более конкретно, ингибиторную активность в отношении адгезии тромбоцитов экспрессированного продукта настоящего изобретения в отношении адгезии тромбоцитов к коллагену можно определить и оценить путем измерения уровня адгезии тромбоцитов к коллагену при добавлении суспензии тромбоцитов, приготовленной из крови человека, в присутствии или отсутствии SY-001, используя набор для анализа белка Dc, и расчета ингибиторной активности в отношении адгезии тромбоцитов SY-001 из кривой адгезии тромбоцитов.
Способность экспрессированного продукта настоящего изобретения связываться с коллагеном является той же самой способностью связываться с коллагеном (т.е. SY-001 связывается с коллагеном), определенной для SY-001 и описанной выше в приведенном выше разделе (1). Эту способность связываться с коллагеном можно определить в соответствии с публично известным методом проверки связывания с коллагеном, например, с помощью метода определения способности связываться с коллагеном, используя считывающее устройство Micro Plate Reader с вариацией абсорбции при 405-410 нм.
Более конкретно, способность экспрессированного продукта настоящего изобретения связываться с коллагеном можно определить и оценить путем измерения уровня связывания SY-001 с коллагеном при добавлении SY-001 в установленных концентрациях в присутствии или отсутствие коллагена, используя считывающее устройство Micro Plate Reader с вариацией абсорбции при 405-410 нм, и расчета способности SY-001 связываться с коллагеном из кривой связывания с коллагеном.
Композиция настоящего изобретения применима в качестве терапевтического агента или профилактического агента для патологических состояний после заболеваний и их осложнений, например острого коронарного синдрома, инфаркта миокарда, эмболии сосудов головного мозга, хронической обструкции артерий, склероза артерий, ишемического инфаркта головного мозга, стенокардии, тромбоза вен, гипертензии, легочной гипертезии, инфаркта головного мозга, инфаркта легкого, сердечной недостаточности, нефрита, почечной недостаточности и субарахноидального кровоизлияния, вызванных образованием тромба или эмбола, согласно ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов и/или адгезии тромбоцитов экспрессированного продукта настоящего изобретения, включенного в качестве активного компонента. Композиция настоящего изобретения также применима для профилактики образования тромба при ЧТКА и размещении стента и в качестве агента, предотвращающего рестеноз после размещения стенда путем включения с помощью нанесения на стент или заделывания в него самого этой композиции.
(6) Химический синтез SY-001, являющегося активным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения
Полипептид (SY-001), являющейся активным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения, можно также получить с помощью общего метода химического синтеза в соответствии с информацией об аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 3. Метод включает методы синтеза пептидов с помощью обычного жидкофазного метода или твердофазного метода. Методы синтеза пептидов включают так называемый пошаговый метод элонгации, при котором каждую аминокислоту последовательно синтезируют и связывают одну за другой для элонгации цепи, и метод конденсации фрагментов, при котором синтезируют фрагменты, включающие несколько аминокислот, и затем соответствующие фрагменты соединяют. SY-001 можно синтезировать одним из этих двух методов.
Метод конденсации, применяемый для синтеза пептидов, можно также выполнить в соответствии со стандартными методами. Примеры стандартных методов включают азидный метод, метод с использованием смешанных ангидратов карбоновых кислот, DCC-метод, метод с использованием активных сложных эфиров, метод окисления и восстановления, DPPA (дифенилфосфорилазид)-метод, метод с использованием DDC + добавка (1-гидроксибензотриазол), метод с использованием N-гидроксисукцинамида, N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксиимида и метод Вудварда.
При вышеуказанной реакции синтеза пептида аминокислоту, не вовлеченную в реакцию или карбоксильную группу в пептиде, можно защитить в виде сложного эфира низших алкильных спиртов, таких как метиловый сложный эфир, этиловый сложный эфир и сложный эфир трет-бутилового спирта, и в виде аралкилового сложного эфира, такого как бензиловый сложный эфир, пара-метоксибензиловый сложный эфир и пара-нитробензиловый сложный эфир, обычно с помощью эстерификации.
Гидроксильную группу в аминокислоте, такой как остаток тирозина, имеющий функциональную группу в боковой цепи, можно защитить с помощью ацетильной группы, бензильной группы, бензилоксикарбонильной группы или трет-бутильной группы, но защита требуется не всегда. Кроме того, например, гуанидиногруппу в остатке аргинина можно защитить с помощью соответствующей защитной группы, такой как нитрогруппа, тозильная группа, пара-метоксибензолсульфонильная группа, метилен-2-сульфонильная группа, бензилоксикарбонильной группы, изоборнилоксикарбонильной группы или адамантилоксикарбонильной группы.
Реакцию снятия защиты с этих защитных групп в имеющих защитную группу аминокислоте, пептиде и полипептиде, который является активным компонентом получаемой, в конечном счете, фармацевтической композиции настоящего изобретения, можно выполнить в соответствии с обычно используемыми методами, такими как контактный метод восстановления и метод с использованием жидкого аммиака/натрия, фтороводорода бромоводорода, хлороводорода, трифторуксусной кислоты, уксусной кислоты, муравьиной кислоты, метансульфокислоты и т.п.
Полученный таким способом SY-001, который является активным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения, можно произвольно очистить в соответствии с различными методами, такими как методы с использованием ионообменной смолы, распределительной хроматографии и гель-хроматографии и метод распределения способом противотока, обычно используемыми в области химии пептидов.
(7) Фармацевтическая композиция настоящего изобретения
Важно, чтобы фармацевтическая композиция настоящего изобретения содержала в качестве активного компонента SY-001 или экспрессированный продукт настоящего изобретения. Фармацевтическая композиция применима в качестве фармацевтической композиции, в частности в качестве ингибитора агрегации тромбоцитов для ингибирования или блокирования состояния, при котором в кровеносном сосуде человека (в частности, в коронарной артерии, аорте и церебральной артерии) увеличивается вещество, индуцирующее агрегацию тромбоцитов, или в кровеносном сосуде облегчается агрегационная способность тромбоцитов, или состояния, при котором при повреждении кровеносного сосуда тромбоциты чрезмерно агрегируют в месте повреждения.
Фармацевтическая композиция также применима, в частности, в качестве ингибитора адгезии тромбоцитов для ингибирования или блокирования адгезии тромбоцитов к веществу в виде агрегирующего агента, такого как коллаген, состояния, при котором в кровеносном сосуде человека (в частности, в коронарной артерии, аорте и церебральной артерии) увеличивается вещество, индуцирующее адгезию тромбоцитов, или в кровеносном сосуде облегчается способность тромбоцитов к адгезии, или состояния, при котором при повреждении кровеносного сосуда тромбоциты чрезмерно агрегируют в месте повреждения.
Фармацевтическая композиция настоящего изобретения применима в качестве терапевтического агента или профилактического агента для патологического состояния после заболеваний и их осложнений, например острого коронарного синдрома, инфаркта миокарда, эмболии сосудов головного мозга, хронической обструкции артерий, склероза артерий, ишемического инфаркта головного мозга, стенокардии, тромбоза вен, гипертензии, легочной гипертезии, инфаркта головного мозга, инфаркта легкого, сердечной недостаточности, нефрита, почечной недостаточности и субарахноидального кровоизлияния, вызванных образованием тромба или эмбола, посредством использования ее ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов и/или адгезии тромбоцитов.
Фармацевтическая композиция применима для профилактики образования тромба при ЧТКА и размещении стента и для предотвращения рестеноза после размещения стента путем включения с помощью нанесения на стент или заделывания в него самого композиции, рассчитывая на ингибиторную активность SY-001 в отношении агрегации тромбоцитов и/или адгезии тромбоцитов.
SY-001 или экспрессированный продукт настоящего изобретения, являющийся активным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения, обладает ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или адгезии тромбоцитов и может использоваться для манипуляции с заболеванием, связанным с агрегацией тромбоцитов и/или адгезией тромбоцитов, в клетке- или ткани-мишени посредством использования его эффекта или активности. Примеры клетки-мишени, на которую оказывает влияние такая агрегация тромбоцитов и/или адгезия тромбоцитов, могут включать клетки крови и тромбоциты. Примеры тканей, включающих эти клетки, могут включать коронарный артериальный сосуд, церебральный артериальный сосуд, артериальный сосуд шеи, артериальный сосуд, венозный сосуд, периферический артериальный сосуд, периферический венозный сосуд, почечный артериальный сосуд почек и печеночный артериальный сосуд.
В соответствии с ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов или эффектом ингибирования агрегации тромбоцитов и/или эффектом ингибирования адгезии тромбоцитов в клетке-мишени, которой(ым) обладает фармацевтическая композиция настоящего изобретения, можно лечить или предотвращать патологические состояния после заболеваний и их осложнений, например инфаркта миокарда, эмболии сосудов головного мозга, хронической обструкции артерий, склероза артерий, ишемического инфаркта головного мозга, стенокардии, тромбоза вен, гипертензии, легочной гипертезии, инфаркта головного мозга, инфаркта легкого, сердечной недостаточности, нефрита, почечной недостаточности и субарахноидального кровоизлияния, вызванных образованием тромба или эмбола.
В соответствии с ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов SY-001 в отношении агрегации тромбоцитов и/или адгезии тромбоцитов можно предотвращать образование тромба при ЧТКА и размещении стента и предотвращать рестеноз после размещения стента путем включения с помощью нанесения на стент или заделывания в него фармацевтической композиции настоящего изобретения.
Фармацевтическую композицию настоящего изобретения для предотвращения рестеноза после размещения стента можно использовать в виде циклодекстрина клатрата. Фармацевтическую композицию настоящего изобретения можно также использовать при нанесении (нанесении толстым слоем или распылении) на биоразлагаемую пластмассу, являющуюся материалом стента, или заделывании в стент.
SY-001 или экспрессированный продукт, являющийся активным компонентом фармацевтической композиции настоящего изобретения, также включает его фармацевтически приемлемые соли. Примеры такой соли включают нетоксичные соли щелочных металлов, таких как натрий, калий, литий, кальций, магний, барий, и аммонийные соли, соли щелочноземельных металлов и аммонийные соли. Эти соли можно приготовить в соответствии со стандартными методами. Вышеуказанные соли, кроме того, включают нетоксичные кислотно-аддитивные соли, полученные в результате реакции SY-001 или экспрессированного продукта настоящего изобретения с соответствующей органической или неорганической кислотой. Примеры типичных представителей нетоксичных кислотно-аддитивных солей включают гидрохлорид, гидробромид, сульфат, бисульфат, ацетат, оксалат, валерат, олеат, лаурат, борат, бензоат, лактат, малат, пара-толуолсульфонат (тозилат), цитрат, фумарат, сукцинат, тартрат, сульфонат, гликолят, аскорбат, бензолсульфонат и напсилат.
Фармацевтическую композицию настоящего изобретения готовят в форме фармацевтического препарата, получая SY-001, экспрессированный продукт настоящего изобретения или его соль в качестве активного компонента, и она содержит фармацевтически эффективное количество активного компонента вместе с соответствующим фармацевтическим носителем или разбавителем.
В качестве примера фармацевтического носителя, используемого для приготовления фармацевтической композиции, можно привести наполнители и разбавители, такие как наполнители, загустители, связующие вещества, смачивающие вещества, дезинтеграторы, поверхностные активаторы и смазывающие вещества. Их произвольно выбирают и используют в зависимости от формы стандартной дозы получаемой в результате композиции. Особенно предпочтительную фармацевтическую композицию готовят необязательно с использованием различных ингредиентов, например стабилизатора, бактерицидного агента, буфера, изотонизирующего агента, хелатообразующего агента, регулирующего рН агента, поверхностно-активного вещества и т.п., используемых для обычных белковых композиций.
Примеры стабилизатора в вышеуказанной композиции включают сывороточный альбумин человека, обычные L-аминокислоты, сахариды и производные целлюлозы. Их можно использовать отдельно или в комбинации с поверхностно-активным веществом. В частности, с помощью этой комбинации в некоторых случаях дополнительно увеличивается стабильность активного компонента.
L-аминокислота особенно не ограничивается, и можно использовать любую аминокислоту из глицина, цистеина, глутаминовой кислоты и т.п.
Сахариды особенно не ограничиваются. Например, можно использовать моносахариды, такие как глюкоза, манноза, галактоза и фруктоза, сахароспирт, такой как маннит, инозит и ксилит, дисахариды, такие как сахароза, мальтоза и лактоза, полисахариды, такие как декстран, гидроксипропилкрахмал, хондроитинсульфат и гиалуроновая кислота, и их производные.
Поверхностно-активное вещество особенно не ограничивается, и можно использовать любое из ионных поверхностно-активных веществ и неионных поверхностно-активных веществ. Их конкретные примеры включают поверхностно-активные вещества на основе полиоксиэтиленгликоля, сорбитана алкильного эфира, полиоксиэтилена алкильного эфира, сорбитана моноацильного эфира и глицерида жирных кислот.
Производное целлюлозы особенно не ограничивается. Можно использовать метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу и натрий карбоксиметилцеллюлозу и т.п.
Добавляемое количество вышеуказанных сахаридов составляет приблизительно 0,0001 мг или более и предпочтительно приблизительно 0,01-10 мг относительно 1 мкг активного компонента. Добавляемое количество поверхностно-активного вещества составляет приблизительно 0,00001 мг или более и предпочтительно приблизительно 0,0001-0,01 мг относительно 1 мкг активного компонента. Добавляемое количество сывороточного альбумина человека составляет приблизительно 0,0001 мг или более и предпочтительно приблизительно 0,001-0,1 мг относительно 1 мкг активного компонента. Подходяще, если добавляемое количество L-аминокислоты составляет приблизительно 0,001-10 мг относительно 1 мкг активного компонента. Добавляемое количество производного целлюлозы составляет приблизительно 0,0001 мг или более и предпочтительно приблизительно 0,001-0,1 мг относительно 1 мкг активного компонента.
Количество активного компонента, содержащегося в фармацевтической композиции настоящего изобретения, произвольно выбирают из широкого диапазона. Подходяще, чтобы в композиции количество активного компонента обычно составляло приблизительно 0,00001-70% в весовом отношении и предпочтительно приблизительно 0,0001-5% в весовом отношении.
В фармацевтическую композицию можно добавить различные добавки, такие как буферы, изотонизирующие агенты и хелатообразующие агенты. Примеры буфера включают борную кислоту, фосфорную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, ε-аминокапроновую кислоту, глутаминовую кислоту и/или их соли (например, соли щелочных металлов, такие как соли натрия, калия, кальция и магния, и соли щелочноземельных металлов). Примеры изотонизирующего агента включают натрия хлорид, калия хлорид, сахариды и глицерин. Примеры хелатообразующего агента включают натрия эдетат и лимонную кислоту.
Фармацевтическую композицию можно приготовить в виде раствора и, кроме того, в лиофилизированной дозированной форме, получаемой при лиофилизации фармацевтической композиции, которую готовят для использования в соответствующей концентрации с помощью растворения в буфере, содержащем соль.
Форму стандартной дозы фармацевтической композиции можно произвольно выбрать в зависимости от терапевтической цели. Примеры ее типичных представителей включают твердые дозированные формы, такие как таблетки, драже, порошкообразные лекарственные средства, порошки, гранулы и капсулы, и жидкие дозированные формы, такие как растворы, суспензии, эмульсии, сиропы и эликсиры. Они далее в зависимости от способов введения классифицируются на пероральные агенты, парентеральные агенты, назальные агенты, вагинальные агенты, суппозитории, подъязычные агенты и мази, и их можно объединить, сформировать и приготовить в соответствии с общими методами. Если требуется, в фармацевтической композиции настоящего изобретения могут также содержаться красящие агенты, консерванты, ароматизирующие агенты, корригенты и подсластители и другие фармацевтические препараты.
Способ введения фармацевтической композиции особенно не ограничивается и определяется в зависимости от различных форм композиции, возраста, пола, других состояний и тяжести заболевания больного. Например, таблетку, драже, жидкость, суспензию, эмульсию, гранулу и капсулу вводят орально. Инъецируемый агент вводят отдельно или в смеси с обычным заменителем жидкости, таким как глюкоза и аминокислота, внутривенно, если требуется, внутримышечно, внутрикожно, подкожно или внутрибрюшинно отдельно. Суппозиторию вводят интраректально. Вагинальный агент вводят во влагалище, назальный агент вводят в нос, подъязычный агент вводят в ротовую полость, а мазь, действующую чрескожно, применяют местно.
Доза фармацевтической композиции особенно не ограничивается, и ее произвольно выбирают из широкого диапазона в зависимости от требуемого терапевтического эффекта, способа введения, времени лечения, возраста, пола и других состояний больного. Как правило, предпочтительно, когда доза определяется так, что количество активного компонента обычно составляет приблизительно от 0,01 мкг до 10 мг, предпочтительно приблизительно от 0,1 мкг до 1 мг на кг веса тела в день. Композицию можно вводить с помощью раздельных введений от одного до нескольких раз в день или с перерывами.
(8) Скрининг веществ (агониста), содействующих ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов и/или адгезии тромбоцитов
Настоящим изобретением также обеспечивается способ скринирования соединений-кандидатов, содействующих ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов и/или адгезии тромбоцитов.
Способ характеризуется измерением уровня ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активности в отношении адгезии тромбоцитов полипептида, включающего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 3, или полипептида, включающего аминокислотную последовательность, имеющую одну или несколько делеций, вставок, замен или добавлений аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 или 3, и обладающего ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов, в присутствии или отсутствие исследуемого вещества и отбором исследуемого вещества, влияющего на ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторную активность в отношении адгезии тромбоцитов в качестве агониста, посредством сравнения величины, измеренной в присутствии исследуемого вещества, с величиной, измеренной в отсутствие исследуемого вещества.
Уровень ингибиторного в отношении агрегации тромбоцитов эффекта можно определить по скорости ингибирования агрегации тромбоцитов, рассчитанной из величин измерений, полученных с использованием турбидиметрического тромбоагрегометра с пропусканием света. Более конкретно, образец крови человека берут с помощью шприца с антикоагулянтом, и из взятой цельной крови с помощью центрифугирования готовят богатую в отношении тромбоцитов плазму (PRP). К PRP, которую затем предварительно инкубируют при 37°С, добавляют раствор очищенного SY-001, предварительно растворенного в PBS. Впоследствии для агрегации тромбоцитов к ним добавляют раствор коллагена (поставляемый NYCOMED) в качестве агрегирующего тромбоциты агента, и инкубацию продолжают в течение установленного периода времени. Затем, используя турбидиметрический тромбоагрегометр с пропусканием света (MCM HEMA TRACER 313M, поставляемый MC Medical), измеряют пропускание раствора с построением кривой агрегации тромбоцитов. Скорость ингибирования агрегации тромбоцитов можно рассчитать из этой кривой в каждом случае SY-001 или SY-001 + исследуемое вещество. В качестве вышеуказанного агрегирующего агента помимо коллагена можно использовать АДФ (аденозиндифосфат), CRP (родственный коллагену пептид), конвульксин, TRAP (пептид-активатор рецептора тромбина), эпинефрин, арахидоновую кислоту, U-46619 (аналог тромбоксана А2, аналог TXA2), А23187 (кальциевый ионофор) и т.п.
Уровень ингибиторной активности в отношении адгезии тромбоцитов можно также определить по скорости ингибирования адгезии тромбоцитов, рассчитанной из величин измерений, полученных с использованием набора для анализа белка Dc (метод Лоури [Lowry, O. et al., J. Biol. Chem., 193, 265 (1951)] (BIO-RAD Laboratories). Более конкретно, образец крови человека берут с помощью шприца с антикоагулянтом, и суспензию тромбоцитов человека готовят из PRP, полученной с помощью центрифугирования цельной крови. Раствор очищенного SY-001, предварительно растворенного в PBS, добавляют в лунки 96-луночного планшета, покрытые коллагеном, и инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации в лунку добавляют суспензию тромбоцитов и инкубируют в течение 45 минут при комнатной температуре. После инкубации инкубационный раствор удаляют из лунки с помощью пипетки, и лунку промывают PBS.
В лунку добавляют раствор PBS, содержащий 1% SDS, и после покачивания и перемешивания лунку подвергают воздушной сушке. Затем в лунку добавляют дистиллированную воду, количество белка в каждой лунке измеряют с использованием набора для анализа белка Dc (BIO-RAD Laboratories), и скорость ингибирования адгезии тромбоцитов с помощью SY-001 рассчитывают из полученной величины измерения на основе величины в контроле, не содержащем SY-001, и ингибиторную активность в отношении адгезию тромбоцитов SY-001 рассчитывают из кривой адгезии тромбоцитов. Скорость ингибирования адгезии тромбоцитов можно рассчитать из этой кривой в каждом случае SY-001 или SY-001 + исследуемое вещество. В качестве вышеуказанного индуктора адгезии тромбоцитов можно использовать коллаген.
Настоящим изобретением также обеспечивается способ скринирования вещества-кандидата, увеличивающего ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов SY-001, который включает следующие стадии (1)-(4):
(1) стадию приготовления культуральной среды, содержащей клетку, трансформированную экспрессирующим SY-001 вектором, и богатую в отношении тромбоцитов плазму (PRP);
(2) стадию индуцирования агрегации тромбоцитов добавлением агрегирующего тромбоциты вещества в культуральную среду вышеуказанной стадии (1) в присутствии или отсутствие исследуемого вещества;
(3) стадию измерения уровней ингибирования агрегации тромбоцитов в присутствии исследуемого вещества и отсутствие исследуемого вещества на вышеуказанной стадии (2); и
(4) стадию отбора исследуемого вещества в качестве вещества-кандидата, когда величина, измеренная в присутствии исследуемого вещества, больше величины, измеренной в отсутствие исследуемого вещества.
Настоящим изобретением также обеспечивается способ скринирования вещества-кандидата, увеличивающего ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов экспрессированного продукта настоящего изобретения, который включает следующие стадии (1)-(4):
(1) стадию приготовления культуральной среды, содержащей клетку, содержащую экспрессированный продукта настоящего изобретения, и богатую в отношении тромбоцитов плазму (PRP);
(2) стадию индуцирования агрегации тромбоцитов добавлением агрегирующего тромбоциты вещества в культуральную среду вышеуказанной стадии (1) в присутствии или отсутствие исследуемого вещества;
(3) стадию измерения уровней ингибирования агрегации тромбоцитов в присутствии исследуемого вещества и отсутствие исследуемого вещества на вышеуказанной стадии (2); и
(4) стадию отбора исследуемого вещества в качестве вещества-кандидата, когда величина, измеренная в присутствии исследуемого вещества, больше величины, измеренной в отсутствие исследуемого вещества.
Настоящим изобретением также обеспечивается способ скринирования вещества-кандидата, с помощью которого определяется ингибиторная активность в отношении адгезии тромбоцитов SY-001, который включает следующие стадии (1)-(4):
(1) стадию приготовления культуральной среды (или лунки), содержащей клетку, трансформированную экспрессирующим SY-001 вектором, и луночный планшет, покрытый адгезирующим тромбоциты веществом (т.е. коллагеном);
(2) стадию индуцирования адгезии тромбоцитов добавлением суспензии тромбоцитов в культуральную среду вышеуказанной стадии (1) в присутствии или отсутствие исследуемого вещества;
(3) стадию измерения уровней ингибирования адгезии тромбоцитов в присутствии исследуемого вещества и отсутствие исследуемого вещества на вышеуказанной стадии (2); и
(4) стадию отбора исследуемого вещества в качестве вещества-кандидата, когда величина, измеренная в присутствии исследуемого вещества, больше величины, измеренной в отсутствие исследуемого вещества.
Настоящим изобретением, кроме того, обеспечивается способ скринирования вещества-кандидата, с помощью которого определяется ингибиторная активность в отношении адгезии тромбоцитов экспрессированного продукта настоящего изобретения, который включает следующие стадии (1)-(4):
(1) стадию приготовления культуральной среды (или лунки), содержащей клетку, содержащую экспрессированный продукт настоящего изобретения, и луночный планшет, покрытый адгезирующим тромбоциты веществом (т.е. коллагеном);
(2) стадию индуцирования адгезии тромбоцитов добавлением суспензии тромбоцитов в культуральную среду вышеуказанной стадии (1) в присутствии или отсутствие исследуемого вещества;
(3) стадию измерения уровней ингибирования адгезии тромбоцитов в присутствии исследуемого вещества и отсутствие исследуемого вещества на вышеуказанной стадии (2); и
(4) стадию отбора исследуемого вещества в качестве вещества-кандидата, когда величина, измеренная в присутствии исследуемого вещества, больше величины, измеренной в отсутствие исследуемого вещества.
Метод скринирования настоящего изобретения можно проводить, практически применяя технологию высокомасштабного скринирования. В соответствии с практическим применением этой технологии, например, при скринировании на катализатор ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активности в отношении адгезии тромбоцитов препарат (в том числе SY-001 и меченный лиганд полипептида) инкубируют с любым из следующего: синтетической реакционной смесью, клеточной фракцией, фракцией крови, например богатой в отношении тромбоцитов плазмой, или суспензией тромбоцитов - в присутствии или отсутствие исследуемого вещества, подвергаемого скринированию. Является ли исследуемое вещество агонистом SY-001 или антагонистом SY-001, определяют по уменьшению количества связанного меченого лиганда. Уровень активности SY-001 можно определить с помощью репортерной системы колориметрического маркера (не ограничиваясь этим), встраивания репортерного гена, отвечающего на изменение активности полинуклеотида или полипептида, или анализа связывания, публично известного в данной области техники.
Для скрининга соединения-кандидата в качестве катализатора ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов можно использовать конкурентный анализ, в котором SY-001 или другой мутант [например, SY-001(151-269), SY-001(21-269)] и другой ингибитор агрегации тромбоцитов (например, ацетилсалициловую кислоту, цилостазол) объединяют с соединением, которое связывается с ними.
Для скрининга соединения-кандидата в качестве катализатора ингибиторной активности в отношении адгезии тромбоцитов можно использовать конкурентный анализ, в котором SY-001 или другой мутант [например, SY-001(151-269), SY-001(21-269)] и другой ингибитор адгезии тромбоцитов (например, тиклопидин) объединяют с соединением, которое связывается с ними.
Исследуемое вещество (соединение-кандидат), проскринированное с помощью метода скрининга настоящего изобретения, является с высокой вероятностью агонистом SY-001 в виде катализатора ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активности в отношении адгезии тромбоцитов.
Агонист может быть веществом, увеличивающим ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторную активность в отношении адгезии тромбоцитов при его присутствии в системе скринирования настоящего изобретения.
Конкретные примеры этих исследуемых веществ включают олигопептиды, белки, антитела, молекулы РНК, миРНК (маленькие интерференционные РНК), непептидные соединения (синтетические соединения), ферментированные продукты, клеточные экстракты (экстракты растений, экстракты животных) и плазма. Эти вещества могут быть веществами, недавно разработанными, или известными веществами.
Примеры вещества, ингибирующего агрегацию тромбоцитов, и/или вещества, ингибирующего адгезию тромбоцитов, включают неорганические или органические низкомолекулярные соединения, встречающиеся в природе, или синтетические пептиды и полипептиды или пептиды и полипептиды, полученные с помощью технологии рекомбинации генов, которые увеличивают активность SY-001 путем связывания с ним. Смысловая ДНК-молекула для кодирующей SY-001 ДНК-молекулы, вводимая in vivo непосредственно или вводимая в встроенной в рекомбинантный вектор форме, также включена в вышеуказанное вещество, ингибирующее агрегацию тромбоцитов, и/или вещество, ингибирующее адгезию тромбоцитов.
Вещество-кандидат, увеличивающее ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторную активность в отношении адгезии тромбоцитов, проскринированное в соответствии с методом скрининга настоящего изобретения, оценивают следующим образом. Т.е. вещество-кандидат, которое увеличивает ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторную активность в отношении адгезии тромбоцитов или содействует такой активности на приблизительно 20% или больше, предпочтительно на приблизительно 30% или больше и более предпочтительно на приблизительно 50% или больше по сравнению с контролем (с отсутствием исследуемого вещества), можно оценить в качестве соединения, содействующего ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активности в отношении адгезии тромбоцитов.
Полагают, что соединение, содействующее ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активности в отношении адгезии тромбоцитов, применимо в качестве терапевтического агента или профилактического агента для патологического состояния после заболеваний и их осложнений, например инфаркта миокарда, эмболии сосудов головного мозга, хронической обструкции артерий, склероза артерий, ишемического инфаркта головного мозга, стенокардии, тромбоза вен, гипертензии, легочной гипертезии, инфаркта головного мозга, инфаркта легкого, сердечной недостаточности, нефрита, почечной недостаточности и субарахноидального кровоизлияния, вызванных образованием тромба или эмбола.
Среди веществ, содействующих ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов и/или ингибиторной активности в отношении адгезии тромбоцитов, полученных методом скрининга настоящего изобретения, как полагают, существует также вещество, само обладающее ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов, индуцированной агрегирующим тромбоциты веществом in vivo, и/или ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов, индуцированной адгезирующим тромбоциты веществом in vivo, и такое вещество, как полагают, применимо в качестве ингибитора агрегации тромбоцитов и/или ингибитора адгезии тромбоцитов в различных областях, в том числе фармацевтической области.
(9) Набор для скрининга
Настоящим изобретением также обеспечивается набор для скрининга агониста SY-001, характеризующийся тем, что в качестве составных частей он содержит богатую в отношении тромбоцитов плазму, SY-001 (в том числе экспрессированный продукт настоящего изобретения) и агрегирующий тромбоциты агент.
Набор для скрининга настоящего изобретения в качестве существенных ингредиентов содержит (1) SY-001 (например, полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 3) или экспрессированный продукт настоящего изобретения (например, экспрессированный продукт кодирующей SY-001 ДНК-молекулы, ДНК-последовательности SEQ ID NO: 2 или 4), (2) клеточную культуральную среду, включающую богатую в отношении тромбоцитов плазму, и (3) агрегирующий тромбоциты агент. В качестве других необязательных ингредиентов набор, подобный наборам для скрининга этого типа, может содержать различные реагенты, такие как клеточные культуральные среды, разбавители реакции, окрашивающие агенты, буферы, фиксирующие растворы и растворы для промывок.
Escherichia coli
ο
5
2,
Конкретные примеры набора настоящего изобретения включают наборы, содержащие следующие составные части 1-3: составную часть 1: клетки (экспрессирующие SY-001 клетки, культивируемые клетки, включающие клетки  или клетки насекомых, трансформированные полинуклеотидом (ДНК-молекулой), кодирующим SY-001), культивируемые в 60 мм-чашке при 37C в 5% СОпри 0,5-1×10 клеток/ячейку, используя MOPS-буфер, содержащий EGTA-Na; составную часть 2: вещество (например, коллаген, ADP), индуцирующее агрегацию тромбоцитов; и составную часть 3: богатую в отношении тромбоцитов плазму.
В способе скринирования с использованием набора для скрининга настоящего изобретения скорость ингибирования агрегации тромбоцитов определяют в богатой в отношении тромбоцитов плазме на видимую область единичной ячейки, в которую добавлено проверяемое вещество (исследуемое вещество, лекарственное вещество-кандидат). Затем определяют скорость ингибирования агрегации тромбоцитов в ячейке, в которую проверяемое вещество не добавлялось. Впоследствии проверяют значительную разницу между первой скоростью и второй скоростью. Эти измерение и оценку можно выполнить в соответствии со стандартными методами.
Настоящим изобретением также обеспечивается набор для скрининга агониста SY-001, характеризующийся тем, что в качестве составных частей он содержит адгезирующий тромбоциты агент (т.е. коллаген), SY-001 (в том числе экспрессированный продукт настоящего изобретения) и суспензию тромбоцитов.
Набор для скрининга настоящего изобретения в качестве существенных ингредиентов содержит (1) SY-001 (например, полипептид, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 3) или экспрессированный продукт настоящего изобретения (например, экспрессированный продукт кодирующей SY-001 ДНК-молекулы, ДНК-последовательности SEQ ID NO: 2 или 4), (2) адгезирующий тромбоциты агент (т.е. коллаген) и (3) суспензию тромбоцитов. В качестве других необязательных ингредиентов набор, подобный наборам для скрининга этого типа, может содержать различные реагенты, такие как клеточные культуральные среды, разбавители реакции, окрашивающие агенты, буферы, фиксирующие растворы и растворы для промывок.
Escherichia coli
2,
5
Конкретные примеры набора настоящего изобретения включают наборы, содержащие следующие составные части 1-3: составную часть 1: клетки (экспрессирующие SY-001 клетки, культивируемые клетки, включающие клетки  или клетки насекомых, трансформированные полинуклеотидом (ДНК-молекулой), кодирующим SY-001), культивируемые в 60 мм-чашке при 37°C в 5% СОпри 0,5-1×10 клеток/лунку, используя PBS-буфер; составную часть 2: адгезирующее тромбоциты вещество (например, коллаген, ADP) для индукции адгезии тромбоцитов; и составную часть 3: суспензию тромбоцитов.
В способе скринирования с использованием набора для скрининга настоящего изобретения скорость ингибирования адгезии тромбоцитов определяют в виде уровня адгезии тромбоцитов к коллагену на видимую область единичной лунки, в которую добавлено проверяемое вещество (исследуемое вещество, лекарственное вещество-кандидат). Затем определяют скорость ингибирования адгезии тромбоцитов в лунке, в которую проверяемое вещество не добавлялось. Впоследствии проверяют значительную разницу между первой скоростью и второй скоростью. Эти измерение и оценку можно выполнить в соответствии со стандартными методами.
ПРИМЕРЫ
Далее настоящее изобретение описывается более подробно со ссылкой на следующие примеры. Эти примеры приведены только с целью пояснения примером и не ограничивают настоящее изобретение
Пример 1
Anopheles stephensi
1. Приготовление библиотеки кДНК из слюнной железы
Anopheles stephensi
Самку  (штамм SDA500) на 3-7 день после вылупления вынуждали сосать кровь у мыши (штамм BALD/c, приобретенный у CLEA Japan Inc.). Спустя 6 часов после сосания крови у комара удаляли крылья, ножки, головную часть и брюшную часть, и только грудную часть, в том числе слюнную железу, сохраняли в жидком азоте. В то время, когда собирали грудные части от 300 комаров, экстрагировали РНК с использованием набора RNeasy Midi Kit (QIAGEN). Библиотеку получали путем сбора полиА-добавленной РНК, получения кДНК с использованием обратной транскриптазы, добавления сайтов для рестрикционных ферментов (сайтов для EcoRI и HindIII) на обоих концах и встраивания в фаги с использованием наборов для клонирования λSCREEN-1 Cloning Kits (Novagen).
2. Иммуноскрининг библиотеки кДНК слюнной железы
Escherichia coli
Anopheles stephensi
Anopheles stephensi
Anopheles stephensi
(ER-1647, Takara) инфицировали каждым фагом вышеуказанной библиотеки и скринировали с использованием антитела против слюнной железы  в качестве зонда. Антитело против слюнной железы  получали иммунизацией кролика гомогенатом слюнной железы  вместе с адъювантом Фрейнда.
Escherichia coli
ER-1647 инфицировали положительным клоном, полученном при скрининге, и фаги амплифицировали. Затем фаги извлекали и встроенную часть клонировали в плазмиду pSCREEN-1b(+) (Novagen) с использованием вырезания из плазмид CreMediated Plasmid Excision (Novagen). Последовательность оснований встроенной части секвенировали с использованием ДНК-частей (праймера для промотора SP6: SEQ ID NO: 10, кодовый номер продукта - TKR3867, Takara Bio, и праймера для терминатора Т7: SEQ ID NO: 11, кодовый номер продукта - NV432, Novagen), добавленных с обоих концов pSCREEN, используя анализатор 310 Genetic Analyzer, поставляемый ABI.
В результате анализа последовательности оснований обнаружено, что фрагмент клонированного гена содержит стоп-кодон, но в нем отсутствует инициирующий кодон. Для получения отсутствующего 5'-района кДНК SY-001 выполнили 5'-RACE-метод [Frohman, M. A., et al., PNASC, 8, 8998-9002 (1988)], используя ДНК фага λSCREEN, экстрагированную из библиотеки кДНК слюнной железы, в качестве матрицы и праймеры, праймер для промотора SP6 (SEQ ID NO: 10) и праймер pAnS-1 (SEQ ID NO: 12) для клонирования ДНК-фрагмента размером приблизительно 470 п.о. Этот ДНК-фрагмент перекрывал ДНК-фрагмент, полученный при вышеуказанном скрининге, и, кроме того, содержал инициирующий кодон. Два ДНК-фрагмента лигировали для определения полной последовательности оснований ДНК-молекулы, кодирующей SY-001.
Открытая рамка считывания, обнаруженная в кДНК, кодировала предполагаемый белок с М.м. 28,5 кДа из 269 аминокислотных остатков и содержала 807 п.о. Этот белок, как предсказывалось, является белком, секретируемым в виде слюны, поскольку, как предсказывалось из выведенной аминокислотной последовательности, этот белок является кислым белком с pI=3,8, 21 аминокислот на N-конце являются гидрофобными и демонстрируют подобную сигнальному пептиду последовательность, а С-конец не имеет прикрепляемого к мембране района.
Эта выведенная аминокислотная последовательность продемонстрирована в SEQ ID NO: 5. Последовательность оснований ДНК-молекулы, кодирующей аминокислотную последовательность, продемонстрирована в SEQ ID NO: 6.
3. Экспрессия SY-001 с помощью рекомбинантной ДНК и его очистка
(1) Получение SY-001 (22-269)
ДНК-фрагмент, кодирующий аминокислотные остатки в положениях 22-269 SY-001 (SEQ ID NO: 5), амплифицировали с помощью ПЦР. В качестве матрицы использовали кДНК слюнной железы, представленную выше в 1. Использованный праймер pAnSG-F7 (SEQ ID NO: 13) имел сайт для NcoI (CCATGGG) в 3-8 положениях от 5'-конца, а использованный праймер pAnSG-R1 (SEQ ID NO: 14) имел сайт для NotI (GCGGCCGC) в 2-9 положениях от 5'-конца. Затем ДНК-фрагмент клонировали в pENTR/D-TORO (Invitrogen) для конструирования плазмиды pENTR-SY-001-экзон 1-4.
Впоследствии ДНК-фрагмент SY-001 (приблизительно 760 п.о.), полученный в результате расщепления плазмиды pENTR-SY-001-экзон 1-4 с помощью NcoI и NotI, встраивали в сайт NcoI/NotI pET32-b(+) (Novagen) для конструирования плазмиды pET32-SY-001-экзон 1-4.
Escherichia coli
BL21 (DE3) трансформировали этой плазмидой pET32-SY-001-экзон 1-4, и полученный в результате трансформант культивировали с покачиванием в 6 мл LB-среды (LBA), содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 15 часов при 37°С. Затем культуральную среду добавляли в 600 мл LBA, которую затем культивировании с покачиванием в течение 4 часов при 37°С. Впоследствии к культуральной среде добавляли 6 мл 100 мМ IPTG, и среду дополнительно культивировали с покачиванием в течение 4 часов при 37°С. Полученную в результате культуральную среду центрифугировали при 6000×g в течение 15 минут, и супернатант отбрасывали. Полученный в результате осадок лизировали добавлением к нему 40 мл 6 М гуанидина гидрохлорида. Полученный в результате бактериальный раствор центрифугировали при 30000×g в течение 25 минут и собирали супернатант. К нему добавляли 1,8 мл никель-NTA (QIAGEN), затем смесь перемешивали в течение 15 часов при 4°С. Смесь центрифугировали при 3000×g в течение 3 минут, супернатант отбрасывали и собирали никель-NTA. К собранной никель-NTA добавляли раствор TBS (150 мм NaCl, 50 мМ Tris-HCl [pH 7,5]), содержащий 6 М мочевину и 10 мМ имидазол. Полученную в результате смесь центрифугировали при 3000×g в течение 3 минут и супернатант отбрасывали. Полученную в результате никель-NTA упаковывали в колонку.
Белок SY-001-экзон 1-4 элюировали с колонки следующим образом. Т.е. через колонку последовательно пропускали 2 мл TBS-растворов, содержащих 6 М мочевину и 20 мМ, 50 мМ, 100 мМ или 200 мМ имидазола соответственно, и собирали соответствующие фракции. Часть каждой фракции подвергали электрофорезу в 12% SDS-ПААГ и затем окрашивали с помощью красителя кумасси для определения фракции, содержащей белок SY-001-экзон 1-4. Эту фракцию диализовали против PBS в течение 48 часов. Количество белка определяли с использованием набора BSA Protein Assay Kit (PIERCE), и выход составлял 5 мг.
Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка, полученного таким способом, показана в SEQ ID NO: 7. Аминокислотная последовательность в положениях 1-162 и аминокислотная последовательность в положениях 410-420 являются аминокислотными последовательностями, происходящими из белка тиоредоксина и плазмиды pET32-b(+), содержащей последовательность His-маркера соответственно. Аминокислотная последовательность SY-001 (22-269) настоящего изобретения находится в положениях 162-409.
(2) Получение SY-001 (148-269)
ПЦР с использованием в качестве матрицы плазмиды pET32-SY-001-экзон 1-4, приготовленной, как описано выше в (1), проводили, используя праймеры pAnSG-F8 (SEQ ID NO: 15) и pAnSG-R1 (SEQ ID NO: 14). Полученный в результате ДНК-фрагмент (382 п.о.) клонировали в pENTR/D-TORO (Invitrogen) для конструирования плазмиды pENTR-SY-001-экзон 3-4. Плазмиду pENTR-SY-001-экзон 3-4 расщепляли с помощью NcoI/NotI с получением ДНК-фрагмента размером 372 п.о. Этот фрагмент встраивали в сайты NcoI/NotI pET32-b(+) (Novagen) для конструирования плазмиды pET32-SY-001-экзон 3-4.
Escherichia coli
BL21 (DE3) трансформировали этой плазмидой pET32-SY-001-экзон 3-4, и полученный в результате трансформант культивировали с покачиванием в 6 мл LB-среды (LBA), содержащей 50 мкг/мл ампициллина, в течение 15 часов при 37°С. Затем культуральную среду добавляли в 600 мл LBA, которую затем культивировании с покачиванием в течение 4 часов при 37°С. Впоследствии к культуральной среде добавляли 6 мл 100 мМ IPTG и среду дополнительно культивировали с покачиванием в течение 4 часов при 37°С. Полученную в результате культуральную среду центрифугировали при 6000×g в течение 15 минут и супернатант отбрасывали. Полученный в результате осадок лизировали добавлением к нему 40 мл 6 М гуанидина гидрохлорида. Полученный в результате бактериальный раствор центрифугировали при 30000×g в течение 25 минут и собирали супернатант. К нему добавляли 1,8 мл никель-NTA (QIAGEN), затем смесь перемешивали в течение 15 часов при 4°С. Смесь центрифугировали при 3000×g в течение 3 минут, супернатант отбрасывали и собирали никель-NTA. К собранной никель-NTA добавляли раствор TBS (150 мм NaCl, 50 мМ Tris-HCl [pH 7,5]), содержащий 6 М мочевину и 10 мМ имидазол. Полученную в результате смесь центрифугировали при 3000×g в течение 3 минут и супернатант отбрасывали. Полученную в результате никель-NTA упаковывали в колонку.
Белок SY-001-экзон 3-4 элюировали с колонки следующим образом. Т.е. через колонку последовательно пропускали 2 мл TBS-растворов, содержащих 6 М мочевину и 20 мМ, 50 мМ, 100 мМ или 200 мМ имидазола соответственно, и собирали соответствующие фракции. Часть каждой фракции подвергали электрофорезу в 12% SDS-ПААГ и затем окрашивали с помощью красителя кумасси для определения фракции, содержащей белок SY-001-экзон 3-4. Эту фракцию диализовали против PBS в течение 48 часов. Количество белка определяли с использованием набора BSA Protein Assay Kit (PIERCE), и выход составлял 1,8 мг.
Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка, полученного таким способом, показана в SEQ ID NO: 8, и эта последовательность содержит 293 аминокислотных остатка. В этой аминокислотной последовательности аминокислотная последовательность в положениях 1-160 и аминокислотная последовательность в положениях 283-293 являются аминокислотными последовательностями, происходящими из белка тиоредоксина и плазмиды pET32-b(+), содержащей последовательность His-маркера соответственно. Аминокислотная последовательность SY-001 (148-269) находится в положениях 161-282.
Пример 2
Получение рекомбинантного SY-001 (21-269) с использованием бакуловирусной экспрессирующей системы
(1) Получение SY-001 (21-269) бакуловируса
ДНК-фрагмент, кодирующий полипептид в положениях 21-269 SY-001 (SEQ ID NO: 1), амплифицировали с помощью ПЦР, используя в качестве матрицы кДНК слюнной железы, представленную выше в примере 1, 1. Использованный праймер pAnSG-F10 (SEQ ID NO: 16) имел сайт для BamHI (GGATCC) в 5-10 положениях от 5'-конца и FLAG-последовательность в 12-41 положениях. Использованный праймер pAnSG-R1 (SEQ ID NO: 14) имел сайт для NotI (GCGGCCGC) в 2-9 положениях от 5'-конца. ДНК-фрагмент клонировали в pENTR/D-TORO (Invitrogen) для конструирования плазмиды pENTR-SY-001-экзон 1-4.
Впоследствии ДНК-фрагмент SY-001 (780 п.о.), полученный в результате расщепления плазмиды pENTR-SY-001-экзон 1-4 с помощью BamHI/NotI, встраивали в сайты BamHI/NotI pBACgus-1 (Novagen) для конструирования векторной плазмиды для переноса бакуловируса pBACgus-SY-001-экзон 1-4.
Рекомбинантный бакуловирус получали с использованием набора для получения рекомбинантного бакуловируса (BacVector-2000 Transfection Kit, Novagen) посредством котрасфекции клеток Sf9 с помощью вышеуказанной векторной плазмиды для переноса бакуловируса pBACgus-SY-001-экзон 1-4 и ДНК BacVector-2000. Полученный рекомбинантный бакуловирус обозначили в виде AcNPV-SY-001-экзон 1-4.
7
ο
Т.е. клетки Sf9 культивировали при 1×10 клеток на 150 мм-чашку Петри и инфицировали AcNPV-SY-001-экзон 1-4 со множественностью инфекции, составляющей приблизительно 5. Спустя 3-4 дня собирали приблизительно 250 мл культурального супернатанта из 10-150 мм-чашек Петри и к нему добавляли 1,5 мл никель-NTA (QIAGEN), затем смесь перемешивали в течение 15 часов при 4С. Смесь центрифугировали при 3000×g в течение 3 минут, супернатант отбрасывали. Собирали никель-NTA и к ней добавляли 50 мл раствора TBS (150 мм NaCl, 50 мМ Tris-HCl [pH 7,5]), содержащего 10 мМ имидазол. Полученную в результате смесь центрифугировали при 3000×g в течение 3 минут и супернатант отбрасывали. Полученную в результате никель-NTA упаковывали в колонку.
Белок SY-001-экзон 1-4 элюировали с колонки следующим образом. Т.е. через колонку последовательно пропускали 2 мл TBS-растворов, содержащих 20 мМ, 50 мМ, 100 мМ или 200 мМ имидазола соответственно, и собирали соответствующие фракции. Часть каждой фракции подвергали электрофорезу в 12% SDS-ПААГ и затем окрашивали с помощью красителя кумасси для определения фракции, содержащей белок SY-001-экзон 1-4. Эту фракцию диализовали против PBS в течение 48 часов. Количество белка определяли с использованием набора BSA Protein Assay Kit (PIERCE), и выход составлял 0,8 мг.
Аминокислотная последовательность рекомбинантного белка SY-001 (21-269), полученного таким способом, показана в SEQ ID NO: 9. В этой последовательности последовательность в положениях 1-10 представляет собой FLAG-последовательность, аминокислотная последовательность в положениях 11-259 является последовательностью SY-001 (21-269), и последовательность в положениях 260-270 является последовательностью, происходящей из pBACgus-1, содержащей последовательность His-маркера.
Пример 3
Ингибиторный эффект SY-001 в отношении агрегации тромбоцитов оценивали путем измерения агрегации тромбоцитов в богатой в отношении тромбоцитов плазме (PRP), используя турбидиметрический тромбоагрегометр с пропусканием света.
В общих чертах способ представляет собой следующее. Т.е. сначала образец крови брали у здорового донора с помощью шприца с антикоагулянтом и богатую в отношении тромбоцитов плазму (PRP) готовили с помощью центрифугирования взятой цельной крови. Приготовленную PRP смешивали и предварительно инкубировали с раствором SY-001 [раствором PBS, в котором растворен SY-001, имеющий аминокислотную SEQ ID NO: 7, приготовленный в примере 1, 3-(1)] или PBS в качестве контроля и впоследствии тромбоциты агрегировали при добавлении агрегирующего тромбоциты агента. В качестве агрегирующего тромбоциты агента использовали АДФ (поставляемый Sigma), коллаген (поставляемый NYCOMED), CRP (поставляемый Peptide Institute Inc.), конвульксин (поставляемый Alexis), TRAP (поставляемый Sawaday Technology Co.), эпинефрин (поставляемый Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd.), арахидоновую кислоту (поставляемую Sigma), U-46619 (поставляемый Cayman) или А23187 (поставляемый Sigma) соответственно.
Затем, используя турбидиметрический тромбоагрегометр с пропусканием света (MCM HEMA TRACER 313M, поставляемый MC Medical), измеряли скорость агрегации тромбоцитов на протяжении 5 минут, и максимальную скорость агрегации получали при измерении в течение 5 минут. Скорость ингибирования с помощью SY-001 агрегации тромбоцитов (%) рассчитывали в соответствии со следующей формулой.
Скорость ингибирования агрегации тромбоцитов (%)=(1-As/Ac)×100
As: максимальная скорость агрегации тромбоцитов в PRP с SY-001
Ac: максимальная скорость агрегации тромбоцитов в одной PRP в качестве контроля
Подробности вышеуказанной процедуры представлены в следующих пунктах (а)-(с).
8
(а) Сначала 60 мл крови брали у здорового донора с помощью шприца с 6 мл 3,8% натрия цитрата в качестве антикоагулянта. Впоследствии кровь центрифугировали при 1100 оборотов/мин в течение 10 минут, слой богатой в отношении тромбоцитов плазмы (PRP) в виде верхнего слоя переносили в другую тестируемую пробирку. Остающуюся часть нижнего слоя центрифугировали при 3000 оборотов/мин в течение 10 минут, и получающийся в результате верхний прозрачный желтый слой (бедную в отношении тромбоцитов плазму, РРР) переносили в другую тестируемую пробирку. Смесь, в которой число тромбоцитов доведено до 3×10/мл, получали смешиванием PRP и РРР, полученных, как указано выше, и использовали для последующего измерения. На эту смесь делается ссылка в виде "PRP-образец для измерения" в последующем измерении.
Для скорости агрегации тромбоцитов тромбоагрегометра установили, что пропускание света в РРР составляет 100% скорости агрегации тромбоцитов, а пропускание света в PRP составляет 0% скорости агрегации тромбоцитов.
(b) Определение концентрации коллагена и измерение ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов
ο
ο
Сначала в тромбоагрегометр устанавливали кювету для агрегации, в которую было добавлено 200 мкл PRP-образца для измерения, не содержащего SY-001, и инкубировали в течение 2 минут при 37С. Впоследствии в нее добавляли 22,2 мкл раствора коллагена (поставляемого NYCOMED GmBH, Moriya Sangyo), и скорость агрегации тромбоцитов постоянно измеряли на протяжении 5 минут при 37С. За максимальную скорость агрегации тромбоцитов принимали самую высокую скорость агрегации тромбоцитов в пределах 5 минут. Использовали концентрации раствора коллагена, составляющие 5-20 мкг/мл (конечные концентрации в PRP-образце для измерения составляли 0,5-2 мкг/мл), в качестве субмаксимальных концентраций, которые индуцировали 70% максимальной скорости агрегации тромбоцитов.
2
4
2
4
(с) Затем в каждую кювету, в которую добавлено 200 мкл PRP-образца для измерения, добавляли (i) SY-001 (22-269) [имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, приготовленный в примере 1, 3-(1)], приготовленный в концентрации 30 нМ, 100 нМ и 300 нМ соответственно, (ii) SY-001 (148-269) [имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, приготовленный в примере 1, 3-(2)], приготовленный в концентрации 100 нМ, 300 нМ и 1000 нМ соответственно, или (iii) PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 8,1 мМ NaHPO, 1,5 мМ KHHPO) в качестве контроля. Каждую смесь устанавливали в тромбоагрегометр и инкубировали в течение 2 минут при 37°С. Впоследствии в нее добавляли 22,2 мкл раствора коллагена в установленной концентрации, определенной выше, и скорость агрегации тромбоцитов измеряли на протяжении 5 минут от момента добавления раствора коллагена.
На фиг.1 демонстрируется результат ингибиторной активности SY-001 (22-269) в отношении агрегации тромбоцитов, индуцированной коллагеном. На фиг.2 демонстрируется результат ингибиторной активности SY-001 (148-269) в отношении агрегации тромбоцитов, индуцированной коллагеном.
На каждой из этих фигур горизонтальная ось представляет собой временной курс (-0,5-5 минут), начиная с 30 секунд до добавления коллагена, а вертикальная ось представляет собой скорость агрегации тромбоцитов (%).
На фиг.1 кривая (1) демонстрирует результат в случае добавления SY-001 (22-269) в концентрации 300 нМ, кривая (2) демонстрирует результат в случае добавления SY-001 (22-269) в концентрации 100 нМ, кривая (3) демонстрирует результат в случае добавления SY-001 (22-269) в концентрации 30 нМ и кривая (4) демонстрирует результат контроля.
На фиг.2 кривая (1) демонстрирует результат в случае добавления SY-001 (148-269) в концентрации 1000 нМ, кривая (2) демонстрирует результат в случае добавления SY-001 (148-269) в концентрации 300 нМ, кривая (3) демонстрирует результат в случае добавления SY-001 (148-269) в концентрации 100 нМ и кривая (4) демонстрирует результат контроля.
Из результатов, представленных на этих фигурах, очевидно, что SY-001 настоящего изобретения, как показано, уменьшает агрегацию тромбоцитов, индуцированную коллагеном, по мере увеличения добавленного количества, т.е. SY-001 обладает ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов.
Те же самые эксперименты, что и вышеуказанные, выполнили с использованием рекомбинантного белка SY-001 (21-269), продуцированного в бакуловирусной экспрессирующей системе в примере 2. В результате были получены по существу те же самые результаты, что и результаты, представленные на фиг.1. Следовательно, очевидно, что SY-001 настоящего изобретения обладает ингибиторной активностью в отношении агрегации тромбоцитов.
50
50
В экспериментах с использованием вышеуказанного SY-001 (21-269) скорости агрегации тромбоцитов получали при изменении концентраций SY-001 (21-269) от 3 нМ до 1000 нМ. Затем, используя программное обеспечение SAS (SAS Institute, Japan, версия 8.1), выполняли анализ - лог-логит-преобразование ингибиторной активности в отношении агрегации тромбоцитов (IC) SY-001 (21-269). В результате рассчитано, что ICSY-001 (21-269) составляет 25 нМ.
На основании вышеуказанных результатов предположили, что эпитопная часть, присутствующая на С-концевом участке между положениями 148-269 аминокислотной последовательности SY-001 SEQ ID NO: 5, может вносить вклад в ингибиторную активность в отношении агрегации тромбоцитов SY-001 настоящего изобретения.
Пример 4
Синтез мутанта SY-001
SY-001 синтезируют ниже с помощью метода твердофазного синтеза с использованием Fmoc (9-флуоренилметилоксикарбонил)-метода.
Синтетический полипептид, имеющий требуемое число аминокислотных остатков с N-конца до С-конца аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, можно получить осуществлением реакции в модели непрерывного потока с использованием в качестве активных реагентов TBTU [2-(1Н-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний тетрафторборат] и HOBt [1-гидроксибензотриазол гидрат].
Если необходимо, полученный в результате синтетический полипептид можно растворить в диметилсульфоксиде и далее разбавить ацетонитрилом.
Пример 1 композиции
(1) Фармацевтическую композицию настоящего изобретения в инъецируемой форме можно приготовить добавлением и смешиванием 100 мкг/мл SY-001 (имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8), 0,01 мг/мл твина-80 (полиоксиэтилен(20) сорбитан моноолеат; полисорбат 80), 15 мг/мл декстрана 40, 0,1 мг/мл цистеина и 1 мг/мл HSA (сыворотного альбумина человека) в 0,01 М буфере лимонная кислота - натрия цитрат (рН 6,0), фильтрованием смеси (используя мембранный фильтр 0,22 мкм), затем распределения стерильно фильтрата по 1 мл в ампулу и его лиофилизацией. Композицию можно использовать путем растворения в 1 мл используемого солевого раствора.
(2) Фармацевтическую композицию настоящего изобретения в инъецируемой форме можно приготовить добавлением 10 мкг/0,1 мл SY-001 (имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8), 5 мг цистеиновой кислоты и 1 мг HSA (сыворотного альбумина человека) на ампулу в дистиллированную воду для инъекции, фильтрованием полученного в результате раствора по 1 мл в одну ампулу и его лиофилизацией.
Эффект SY-001 на адгезию тромбоцитов к коллагену
8
Раствор SY-001 (50 мкл) в концентрации 3, 10, 30, 100, 300, 1000 или 3000 нМ добавляли в лунки 96-луночного планшета, покрытые 40 мкг/мл коллагена (NYCOMED GMBH), и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации в каждую лунку добавляли 50 мкл суспензии тромбоцитов (6×10клеток/мл) и инкубировали в течение 45 минут при комнатной температуре. После инкубации из каждой лунки удаляли раствор с использованием пипетки и лунки промывали 200 мкл PBS. Впоследствии в каждую лунку добавляли 20 мкл PBS, содержащего 1% SDS, затем перемешивали покачиваем и подвергали воздушной сушке при 45°С. Затем в каждую лунку добавляли 5 мкл дистиллированной воды и концентрацию белка в лунке измеряли с использованием набора для анализа белка dc (BIO-RAD).
Результаты продемонстрированы на фиг.3.
Как видно на фиг.3, определено, что SY-001 настоящего изобретения ингибирует адгезию тромбоцитов к коллагену зависимым от дозы способом и что SY-001 проявляет сильный ингибиторный эффект в отношении адгезии тромбоцитов, особенно в дозах 300 мкг/мл или более.
Способность SY-001 связываться с коллагеном
В каждую лунку 96-луночного планшета (NUNC, 152038), покрытого коллагеном, или 96-луночного планшета (NUNC, 260895), не покрытого коллагеном, добавляли блокирующий раствор (300 мкл) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Из каждой лунки удаляли раствор и в каждую лунку добавляли 100 мкл раствора белка SY-001 в концентрации 3, 10, 30, 100 или 300 нМ и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Из каждой лунки удаляли раствор и в лунку добавляли 200 мкл 2% сахарозы и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре. Из каждой лунки удаляли раствор, лунку высушивали. Впоследствии в каждую лунку добавляли 100 мкл воссозданного раствора никель-HRP (ExpressDetector Nickel-HRP, поставляемый KPL) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. После промывки буфером для промывок в каждую лунку добавляли 100 мкл субстрата для пероксидазы ABTS и осторожно перемешивали покачиванием. После окончания реакции добавляли 100 мкл 1% SDS и измеряли абсорбцию при длине волны 405-410 с использованием считывающего устройства Micro Plate Reader.
Результаты продемонстрированы на фиг.4. Треугольники представляют реакционную кривую пустого вектора в качестве контроля. Как показано на фиг.4, определено, что SY-001 обладает способностью связываться с коллагеном.
Как указано выше, смогли определить, что SY-001 настоящего изобретения обладает не только ингибиторным эффектом в отношении агрегации тромбоцитов, но также ингибиторной активностью в отношении адгезии тромбоцитов к коллагену. Также смогли определить, что SY-001 настоящего изобретения обладает способностью связываться с коллагеном.
На основании этих результатов фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного компонента SY-001 настоящего изобретения, может быть фармацевтической композицией, применимой в качестве терапевтического агента и профилактического агента для инфаркта миокарда, эмболии сосудов легких, инфаркта головного мозга и т.п.
Ингибиторный в отношении адгезии тромбоцитов эффект и способность связываться с коллагеном рекомбинантного SY-001
Фиг.3: SY-001 ингибирует адгезию тромбоцитов к коллагену.
Фиг.4: SY-001 обладает способностью связываться с коллагеном.
Список последовательностей, свободный текст
SEQ ID NO: 10 представляет последовательность праймера для промотора SP6, SEQ ID NO: 11 представляет последовательность праймера для терминатора Т7, SEQ ID NO: 12 представляет последовательность праймера pAnS-1, SEQ ID NO: 13 представляет последовательность праймера pAnSG-F7, SEQ ID NO: 14 представляет последовательность праймера pAnSG-R1, SEQ ID NO: 15 представляет последовательность праймера pAnSG-F8 и SEQ ID NO: 16 представляет последовательность праймера pAnSG-F10.
ПРОМЫШЛЕННАЯ ПРИМЕНИМОСТЬ
В соответствии с настоящим изобретением можно обеспечить фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного компонента SY-001 или экспрессированный продукт настоящего изобретения. Полагают, что композиция настоящего изобретения применима в качестве терапевтического агента или профилактического агента для патологических состояний после различных заболеваний, например заболеваний и осложнений, вызванных тромбом или эмболом, например острого коронарного синдрома, инфаркта миокарда, эмболии сосудов головного мозга, хронической обструкции артерий, склероза артерий, ишемического инфаркта головного мозга, стенокардии, тромбоза вен, гипертензии, легочной гипертезии, инфаркта головного мозга, инфаркта легкого, сердечной недостаточности, нефрита, почечной недостаточности и субарахноидального кровоизлияния, в которые вовлекаются SY-001 и полинуклеотид (ДНК-молекула), кодирующий полипептид SY-001.
Кроме того, полагают, что композиция настоящего изобретения применима для профилактики образования тромбов при ЧТКА и размещении стента и для предотвращения рестеноза после размещении стента путем включения SY-001 с помощью нанесения SY-001 на стент или заделывания SY-001 в стент.
Используя SY-001 и кодирующую SY-001 ДНК-молекулу, обеспечиваемые настоящим изобретением, можно скринировать агонист полипептида или продукта, экспрессированного с помощью ДНК-молекулы (экспрессированного продукта настоящего изобретения), т.е. скринировать вещество, содействующее ингибиторной активности, присущей этим белкам, в отношении агрегации тромбоцитов и/или адгезии тромбоцитов, в качестве вещества-кандидата.