Изоферментные маркеры в исследовании изменчивости сортов яровой мягкой пшеницы, районированных в Башкортостане

УДК 577.151.64: 633.111.1.

Сельдимирова О.А., Янбаев Ю.А., Зайцев Д.Ю.

Институт биологии Уфимского научного центра РАН, г. Уфа

ИЗОФЕРМЕНТНЫЕ МАРКЕРЫ В ИССЛЕДОВАНИИ ИЗМЕНЧИВОСТИ СОРТОВ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ, РАЙОНИРОВАННЫХ

В БАШКОРТОСТАНЕ

С использованием полиакриламидного гель-электрофореза исследована изменчивость изо-ферментных локусов 14 ферментных систем сортов яровой мягкой пшеницы, районированных в Башкортостане. Обсуждаются проблемы использования изоферментных маркеров при введении растений в культуру in vitro.

Ключевые слова: изоферменты, яровая мягкая пшеница, культура in vitro, мутации, сомаклональ-ная изменчивость.

Несмотря на длительную историю использования мировых генетических ресурсов культивируемых растений и их диких сородичей для улучшения сельскохозяйственных культур, успешное выявление и применение информативных признаков в этих целях, успех селекции пшеницы до сих пор определяется эффективностью имеющегося и создаваемого нового методического арсенала. Недавно [3, с. 91-92] была опубликована обзорная статья о сферах применения запасных белков в качестве признака на разных этапах работы с генетическими ресурсами сельскохозяйственных растений. Обширный перечень задач, решаемых с помощью этих молекулярных маркеров, в основном охватывает проблемы выявления и характеристики генетического разнообразия и идентификации растительного материала на разных этапах селекционной работы. Отмечается, что, по сравнению с запасными белками, многие изоферментные системы обладают нежелательной для маркеров онтогенетической, тканевой либо органной специфичностью, а также изменчивостью в зависимости от факторов среды [3, с. 93]. Справедливость этого заключения несомненна при характеристике растительного материала, осуществляемой в ходе отбора растительного материала и его селекции традиционными методами. В то же время изоферменты имеют большие перспективы при проведении интенсивно развивающихся биотехнологических исследований пшеницы. Недостатки этих маркеров, отмеченные выше, при исследовании растений в культуре in vitro оборачиваются несомненными достоинствами. Одной из главных причин этих достоинств является то, что изоферменты не являются нейтральными маркерами генома. Участвуя в различных биохимических процессах и физиологических реакциях, они определяют адаптации организмов к различным средовым факторам. Ю.П. Алтуховым [1, с. 908] проведен масштабный

анализ связи аллозимных данных со свойствами видов по 77 зоологическим и 30 растительным видам. Установлено, что гетерозиготность генома коррелирует со скоростью полового созревания (r=0.815, P<0.001) и продолжительностью жизни организмов (r=-0.793, P<0.001). Доказательства селективных различий различных изоферментов в настоящее время в основном поступают из области медицинской генетики. Тем не менее, такие данные получены и при исследованиях растений, в частности, пшеницы. Например, экологические ассоциации изоферментной изменчивости исследованы у дикорастущей Triticum dicoccum из Израиля и Турции [10, с. 73]. Выявлена клинальная изменчивость параметров популяционного разнообразия по направлению с севера на юг, связанная с градиентом климатических факторов. В экологически более изменчивых условиях полиморфизм изоферментных локусов был выше. Обнаружены различия разных локусов по вкладу в формирование дифференциации популяций. Для Triticum aestivum показано, что устойчивость к стрессу от воздействия кадмия связана с активностью отдельных изоформ глутати-онредуктазы [14, с. 505]. Установлено [9, с. 59], что кинетика пероксидаз и их физиологическая роль различаются в зависимости от изоформ фермента при добавлении в среду ионов кальция.

Регенерация растений посредством разных путей морфогенеза в культуре in vitro предоставляет исследователю различные возможности [4, с. 398]. Так, одноклеточное происхождение эмб-риоидов (зародышеподобных структур [2, с. 63]) делает возможным сохранение генетической однородности и является основой для биотехнологического клонирования полноценных плодоносящих гибридов яровой мягкой пшеницы с закрепленным гетерозисным эффектом. Получение растений-регенерантов через каллусную культуру целесообразно для индукции сомаклональной

изменчивости, которая является основой для получения новых признаков. В то же время введение растений в культуру in vitro является для них сильнейшим стрессовым фактором, вызывающим изменения в самой ДНК, структурные изменения хромосом и их числа (миксоплоидию и другие аномалии). При этом индуцируется селективная экспрессия генов, изменяется синтез ферментов, в том числе участвующих в физиологическом и биохимическом ответах на стресс и каллусообразо-вание [5, с. 920]. Геном растений при каллусообра-зовании и пролиферации значительно перестраивается, в том числе de novo [5, с. 919]. Такие факторы, как механические повреждения, другие физические, а также химические (добавляемые в среду фитогормоны, минеральные вещества) воздействия часто превышают норму реакции клеточных популяций и являются мутагенными. Частота этих генетических изменений превышает фоновые значения на несколько порядков и доходит до 10-2. В связи с этим, оценка генетической однородности растений-регенерантов, полученных посредством различных путей морфогенеза in vitro представляется актуальной. Изоферменты позволяют оценивать частоты мутаций [7, с. 157], в том числе при культивировании растительных эксплантов в условиях in vitro. И, наконец, явным преимуществом изоферментов является возможность оперирования терминами «аллели» и «ло-кусы», без чего полноценное описание генофонда невозможно. Они имеют моногенный генетический контроль, кодоминантны, в отличие от некоторых типов ДНК-маркеров. При этом их разрешающая способность является достаточно высокой. Недавнее сравнение трех типов признаков Aegilops cylindrica (RAPD-, микросателлитные и изоферментные маркеры) показало [10, с. 610], что все они позволили успешно дифференцировать выборки различного происхождения.

Приведенные доказательства обуславливают актуальность и практическую значимость изучения фонового изоферментного состава сортов пшеницы, вводимых в культуру in vitro, что составило цель данной работы. В качестве объектов исследования служила яровая мягкая пшеница. Изучали сорта (Башкирская 4, Башкирская 28, Воронежская 12, Жница, Московская 35, Омская 35, Саратовская 29, Саратовская 55, Симбирка, Скала, Соналика, Тулайков-ская золотистая, Экада 53, Экада 70), линии (Фотос, 76/98а, Л 42864, Л 42875) и их гибриды (ГП 15, ГП 42, ГП 43, ГП 91, ГП 94, ГП 95, ГП 139,

ГП 176, ГП 180), районированные в Башкортостане и используемые в регионе в селекционной работе Башкирского НИИ СХ РАСХН в качестве родительских для создания новых гибридов и линий. В лаборатории экспериментальной эмбриологии растений Института биологии Уфимского научного центра РАН на их базе проводятся исследования по разработке биотехнологических способов клонирования гибридов с закрепленным гетерозисным эффектом.

В качестве молекулярных маркеров использовали изоферменты аланинаминопептидазы (AAP, кодовый номер фермента 3.4.11.2), аспар-татаминотрансферазы (ААТ, 2.6.1.1), глутамат-дегидрогеназы (GDH, 1.4.1.2), глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (G6PDH, 1.1.1.49.), диафоразы (DIA, 1.6.4.3), кислой фосфатазы (APH, 3.1.3.2), лейцинаминопептидазы (LAP, 3.4.11.1), малатде-гидрогеназы (MDH, 1.1.1.37), малик-энзима (МЕ, 1.1.1.40), НАДН-дегидрогеназы (NADHDH, 1.6.99.1.), неспецифических эстераз (EST, 3.1.1...), супероксиддисмутазы (SOD, 1.15.1.1), формиат-дегидрогеназы (FDH, 1.2.1.2) и шикиматдегидро-геназы (SKDH, 1.1.1.25). Растительным материалом для выделения ферментов служили этиолированные 7-дневные проростки. В роли основного метода лабораторных анализов выбран полиакриламидный диск-электрофорез изоферментов в щелочном разделяющем геле. Детальное описание метода и способов гистохимического выявления ферментов в гелях после электрофореза было приведено ранее [6, с. 1566].

У некоторых ферментов (SKDH, LAP, AAP, ADH, DIA) на фоне мономорфизма зон активности выявлена множественность изоформ. В некоторых случаях (MDH-1, AAT-1, AAT-3) из нескольких областей активности изменчивость выявлена у 1-2 из них. Этот феномен может быть следствием гетерозиготно-сти соответствующих локусов и полиплоидии исследованного таксона.

Наибольший интерес при изучении пшеницы в культуре in vitro имеют следующие ферментные системы и группы их изоформ.

Ряд ферментов в гелях у растений образовывали однополосные фенотипы в единственной зоне активности. На этой основе постулировано, что они контролируются гомозиготными локусами Gdh-1, Fdh-1, G6pdh-1 и Me-1. Некоторые ферменты всех исследованных образцов проявляют изменчивость, но у них наблюдается мономорфизм в отдельных областях окрашивания (AAT,

Aat-2; SOD, Sod-1; MDH, Mdh-2). Эти локусы являются кандидатами для оценки темпа мутирования в условиях in vitro. В этих целях использовать гетерозиготные локусы не рекомендуются, так как у них образуются не только истинные мутации, но и мутациеподобные события из-за внутрицистронной рекомбинации [7, с. 159] и, таким образом, частота мутаций может быть завышена. Окрашивание NADH-дегидрогеназы показало, что основная часть исследованных сортов, линий и гибридов были мономорфными в двух выявленных зонах активности NADHDH-1 и NADHDH-2, а у отдельных образцов обнаруживался полиморфизм и дифференциальная активность изоформ, зависящая от эффекта «дозы генов» из-за полиплоидности растения. В случае этого фермента частоты мутаций возможно изучать только у гомозиготных генотипов.

EST, APH, а также SOD (кроме зоны SOD-1) образовывали несколько областей активности, активность которых зависела от возраста проростка. Эти ферменты рекомендуются нами для изучения процессов тканевой диф-

ференциации и дедифференциации в культуре in vitro. Известно, что изоферменты способны маркировать этапы развития тканей растений [8, с. 207]. Например, в эндоспермах Triticum aestivum выявлены различия активности разных форм ферментов, регулирующих метаболизм крахмала на разных стадиях формирования растения [11, с. 201]. У Triticum aestivum cv. Kundan активность Fe-зависимой изоформы супероксиддисмутазы возрастала на этапе развития листа [13, с. 1037].

Таким образом, электрофоретический скрининг 14 ферментных систем позволил выявить ферменты и локусы, перспективные для выявления генетических изменений (мутаций, сомак-лональной изменчивости) при регенерации растений пшеницы в культуре in vitro и для маркирования отдельных этапов дифференциации и дедифференциации тканей. Следующим этапом работы является проведение таких исследований в отношении районированных в Республике Башкортостан сортов, линий и гибридов яровой мягкой пшеницы.

Список использованной литературы:

1. Алтухов Ю.П. Аллозимная гетерозиготность, скорость полового созревания и продолжительность жизни // Генетика. -1998. - Т. 34. - № 7. - С. 908-919.

2. Батыгина Т.Б. Хлебное зерно: атлас. - Л.: Наука, 1987. - 103 с.

3. Конарев А.В., Конарев В.Г., Губарева Н.К. и др. Белки семян как маркеры в решении проблем генетических ресурсов растений, селекции и семеноводства // Цитология и генетика. - 2000. - Т. 34. - С. 91-104.

4. Круглова Н.Н., Сельдимирова О.А., Катасонова А.А. и др. Биотехнология экспериментальной андроклинной гаплоидии яровой мягкой пшеницы in vitro на основе комплекса цитоэмбриологических и физиологических данных // Сб. научн. трудов IV междунар. научн. конф. «Факторы экспериментальной эволюции организмов». Т. 5. - Алушта, 2008. - С. 397-402.

5. Кунах В.А. Изменчивость растительного генома в процессе дедифференцировки и каллусообразования // Физиология растений. - 1999. - Т. 46. - № 7. - С. 919-929.

6. Янбаев Ю.А., Байрамгулов Н.Р., Редькина Н.Н. и др. Межпопуляционная дифференциация родиолы иремельской (Rhodiola iremelica Boriss., ^ass-u^eae) на Южном Урале / // Генетика. - 2007. - Т. 43. - С. 1565-1570.

7. Bakhtiyarova R.M., Starova N.V., Yanbayev Yu. A. Genetic changes in populations of Scots pine growing under industrial air pollution conditions// Silvae Genetica. - 1995. - V. 44. - P. 157-160.

8. Bhatia C.R., Nilson J.P. Isoenzyme changes accompanying germination of wheat seeds // Biochem. Genet. - 1969. - V. 3. - № 3. - P. 207-214.

9. Converso D.A., Fernбndez M.E. Ca2+ activation of wheat peroxidase: a possible physiological mechanism of control // Arch. Biochem Biophys. - 1996. - V. 333. - № 1. - P. 59-65.

10. Guadagnuolo R., Bianchi D.S., Felber F. Specific genetic markers for wheat, spelt, and four wild relatives: comparison of isozymes, RAPDs, and wheat microsatellites // Genome. - 2001. - V. 44. - № 4. - P. 610-621.

11. Jaradat A.A. Spatial and temporal genetic structure of wild emmer wheat in Jordan. High-molecular-weight glutenins and allozymes // Israel Journal of Plant Sciences. - 2001. - V. 49. - № 1. - P. 65-76.

12. Morell M.K., Blennow A., Kosar-Hashemi B. et al. Differential expression and properties of starch branching enzyme isoforms in developing wheat endosperm // Plant Physiol. - 1997. - V. 113. - № 1. - P. 201-208.

13. Srivalli B., Khanna-Chopra R. Induction of new isoforms of superoxide dismutase and catalase enzymes in the flag leaf of wheat during monocarpic senescence // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2001. - V. 288. - № 9. - P. 1037-1042.

14. Yannarelli G.G., Fernбndez-Alvarez A.J., Santa-Cruz D.M. et al. Glutathione reductase activity and isoforms in leaves and roots of wheat plants subjected to cadmium stress // Phytochemistry. - 2007. - V. 68. - № 4. - P. 505-512.

Исследования поддержаны Российским фондом фундаментальных исследований (проекты № 05-04-97911, № 05-04-08114, № 08-04-97045), Академией наук Республики Башкортостан (проект № 40/40-П), а также программой «Ведущие научные школы Российской Федерации» (проекты НШ 4834.2006.4, НШ 2096.2008.4, лидер Школы - член-корр. РАН Т.Б. Батыгина).