Пептид, обладающий бронхопротекторным действием, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения
PEPTIDE HAVING BRONCHOPROTECTIVE ACTION, PHARMACEUTICAL COMPOSITION BASED THEREON AND METHOD FOR USE THEREOF

Изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтики, а именно к лекарственным средствам для улучшения функциональной активности клеток слизистой оболочки бронхов при хроническом бронхите. Изобретение может быть использовано как средство, снижающее апоптоз и активирующее пролиферацию и защитные функции клеток слизистой оболочки бронхов. Группа изобретений обеспечивает применение пептида β-аспартил-пролина в качестве средства для улучшения функциональной активности клеток слизистой оболочки бронхов, а также применения этого пептида для изготовления фармацевтической композиции, которая может использоваться в качестве средства дополнительной терапии при лечении хронического бронхита.
Изобретение относится к лекарственным средствам, улучшающим функциональную активность клеток слизистой оболочки бронхов при хроническом бронхите.
http://www.vidal.ru/
Хронический бронхит – диффузный прогрессирующий воспалительный процесс в бронхах, приводящий к морфологической перестройке бронхиальной стенки и перибронхиальной ткани. Обострения хронического бронхита возникают несколько раз в год и протекают с усилением кашля, выделением гнойной мокроты, одышкой, бронхиальной обструкцией, субфебрилитетом. Хронический бронхит является наиболее распространенным заболеванием из группы хронических неспецифических заболеваний легких (ХНЗЛ). В структуре ХНЗЛ хронический бронхит составляет около 90%. Распространенность хронического бронхита в России колеблется от 10% до 20%, а рост заболеваемости ХНЗЛ составляет 6-7% в год. Фармакотерапия хронического бронхита включает назначение противомикробных, муколитических, бронходилатирующих, иммуномодулирующих препаратов, обладающих побочными эффектами и вызывающих аллергические реакции [Федосеев Г.Б., Трофимов Б.И., Рогачева Н.Н., Разумовская Т.С. Роль нейтрофилов и бактериальной инфекции респираторного тракта у больных бронхиальной астмой и хронической обструктивной болезнью легких // Российский аллергологический журнал. 2011. № 2. С. 34-43]. Для проведения антибактериальной терапии используются пенициллины, макролиды, цефалоспорины, фторхинолоны, тетрациклины - внутрь, парентерально или эндобронхиально. Одними из самых распространенных антибиотиков для лечения хронического бронхита являются Амосин, Амоксициллин и Кларитромицин. При трудноотделяемой вязкой мокроте применяются муколитические и отхаркивающие средства (Амброксол, Ацетилцистеин и др.). С целью купирования бронхоспазма при хроническом бронхите показаны бронхолитики (Эуфиллин, Теофиллин, Салбутамол). Обязателен прием иммунорегулирующих средств (Левамизол, Метилурацил). Кроме того, общепринятая тактика лечения хронического бронхита часто не может быть применима вследствие наличия сопутствующих заболеваний [Чучалин А.Г. Хроническая обструктивная болезнь легких и сопутствующие заболевания //Пульмонология. - 2008. - № 2. - С. 5-14; Чучалин А.Г., Цой А.Н., Архипов В.В. Диагностика и лечение пневмоний с позиций медицины доказательств// Врачебный консилиум. 2002. Т. 4. № 12. С. 620-626; Справочник лекарственных средств VIDAL (рег. №: П N012626/01 от 23.08.10) ].
Пептид β-аспартил-пролин формулы H-Asp(Pro)-OH обладает направленным действием на клетки слизистой оболочки бронхов, повышая их пролиферативную активность и снижая уровень апоптоза, который резко возрастает при хроническом бронхите. При этом пептид β-аспартил-пролин формулы H-Asp(Pro)-OH не обладает побочными эффектами, которые описаны для известных бронхопротекторных препаратов.
Структурных аналогов и аналогов по механизму действия и биологической активности представленный пептид не имеет.
Настоящим изобретением поставлена и решена задача получения пептида, обладающего биологической активностью, проявляющейся в активации пролиферации, снижении апоптоза, а также активации защитной функции клеток слизистой оболочки бронхов, и применения этого пептида для изготовления фармацевтической композиции для лечения хронического бронхита.
Технический результат изобретения заключается в создании пептида, активирующего пролиферацию, снижающего апоптоз, а также активирующего защитные функции клеток слизистой оболочки бронхов, и применения этого пептида для изготовления фармацевтической композиции для лечения хронического бронхита за счет регуляции их пролиферации, апоптоза и функциональной активности.
Указанный технический результат в отношении указанных объектов достигается за счет того, что предлагается пептид β-аспартил-пролин формулы H-Asp(Pro)-OH.
Обнаружено, что пептид β-аспартил-пролин формулы H-Asp(Pro)-OH обладает биологической активностью, заключающейся в активации пролиферации, снижении апоптоза, а также активации защитной функции слизистой оболочки бронхов. При повышении пролиферации и параллельном снижении апоптоза стабилизируется функциональная активность клеток слизистой оболочки бронхов, задача которых в организме заключается в защите дыхательной системы от действия негативных факторов, в том числе патологических агентов, вызывающих воспалительные заболевания, включая хронический бронхит.
Предлагается применение пептида β-аспартил-пролин формулы H-Asp(Pro)-OH для приготовления лекарственного средства для лечения хронического бронхита.
Другой аспект настоящего изобретения касается фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала эффективное количество пептида β-аспартил-пролин формулы H-Asp(Pro)-OH и фармацевтически приемлемый носитель.
При этом фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для парентерального, перорального, интраназального, ингаляционного, местного способа введения.
Следующий аспект настоящего изобретения касается способа профилактики и лечения дисфункции клеток слизистой оболочки бронхов, в том числе при хроническом бронхите, заключающегося во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид формулы H-Asp(Pro)-OH в дозе 0,1-100 мкг/кг массы тела, по крайней мере, один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. При этом введение осуществляют парентерально, перорально, интраназально, ингаляционно или местно.
Пептид β-аспартил-пролин формулы H-Asp(Pro)-OH получают классическим методом пептидного синтеза в растворе.
Регулирующее действие пептида H-Asp(Pro)-OH на пролиферацию, апоптоз и функциональную активность клеток слизистой оболочки бронхов выявлено при его экспериментальном изучении.
Изучение биологической активности проводили в органотипических и диссоциированных культурах клеток слизистой оболочки бронхов крыс в норме и при старении.
Понятие «фармацевтическая композиция» подразумевает различные лекарственные формы, содержащие пептид H-Asp(Pro)-OH, которые могут найти лечебное применение в медицине в качестве средства, стимулирующего функции клеток слизистой оболочки бронхов.
Для получения фармацевтических композиций по настоящему изобретению, эффективное количество пептида H-Asp(Pro)-OH, являющегося активным началом, смешивают с фармацевтически приемлемыми носителями согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования [см., например, Гаврилов А.С. Фармацевтическая технология. Изготовление лекарственных препаратов / А.С. Гаврилов - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2016. - 760 с.; Краснюк И.И. Фармацевтическая технология. Технология лекарственных форм: учебник / И. И. Краснюк, Г. В. Михайлова, Л. И. Мурадова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2016. - 560 с.; Технология изготовления лекарственных форм: учебник / В. А. Гроссман - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2018. - 336 с.0; Фармацевтическая технология. Изготовление лекарственных препаратов [Электронный ресурс]: учеб. пособие / Лойд В. Аллен, А. С. Гаврилов - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014. - 512 с.; Контроль качества лекарственных средств [Электронный ресурс]: учебник / под ред. Т. В. Плетенёвой - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2014.  - 560 с.; Фармацевтическая технология. Технология лекарственных форм [Электронный ресурс]: учебник / И. И. Краснюк, Г. В. Михайлова, Л. И. Мурадова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 560 с.].
Понятие «эффективное количество» подразумевает использование такого количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в лекарственной форме.
Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм.
Изобретение иллюстрируется примером синтеза пептида β-аспартил-пролин формулы H-Asp(Pro)-OH (пример 1), примером испытания токсичности (пример 2), оценки биологической активности и механизма действия пептида в культурах клеток слизистой оболочки бронхов крыс в норме и при старении, демонстрирующими его фармакологические свойства и подтверждающими возможность получения профилактического и/или лечебного эффекта (пример 3), примером клинического применения фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида β-аспартил-пролин формулы H-Asp(Pro)-OH, для лечения больных хроническим бронхитом (пример 4).
Cхема синтеза пептида H-Asp(Pro)-OH
1. Название соединения: β-аспартил-пролин
2. Структурная формула: H-Asp(Pro)-OH
9
14
2
5
3. Брутто-формула без противоиона: CHNO
4. Молекулярный вес без противоиона: 230,22
5. Противоион - ацетат
6. Внешний вид: белый аморфный порошок без запаха
7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме:
8. Характеристика готового препарата
— Растворимость: растворим в воде, изотоническом растворе хлорида натрия 0,9 % для инъекций; нерастворим в спирте 95 %, хлороформе, эфире и других органических растворителях.
— Прозрачность и цветность раствора: раствор 0,05 г препарата в 10 мл воды прозрачен и бесцветен.
— рН 0,001 % раствора: 4,0-5,0 (потенциометрически).
— Содержание влаги: не более 10 %.
D
2
22
—  Удельное оптическое вращение: [α]: от -30° до -34° (c=1, HO).
— Содержание основного вещества по ВЭЖХ: не менее 97 %.
f =
—  Тонкослойная хроматография: ТСХ-индивидуален, R 0,80 (ацетонитрил-вода 1:3)
Пример 1. Синтез пептида
1) Z-Asp(OSu)-OH (I), β-N-оксисукцинимидный эфир N-бензилоксикарбонил(α-бензил)-аспарагиновой кислоты. 2,21 г (6,2 ммоль) мелкоизмельченного порошка N-бензилоксикарбонил(α-бензил)-аспарагиновой кислоты растворяют в 50 мл диметилформамида и добавляют 0,71 г (6,2 ммоль) мелкоизмельченного порошка N-оксисукцинимида. 1,27 г (6,2 ммоль) порошка N, N'-дициклогексилкарбодиимида растворяют в 20 мл диметилформамида. Оба раствора охлаждают до температуры –15 °С. Растворы объединяют и перемешивают при охлаждении льдом в течение 24 часов. Полученный раствор активированного эфира используют на следующей стадии.
2) Z-Asp(Pro-OBzl)-OBzl (II), α-бензиловый эфир N-бензилоксикарбонил-(β-пролилбензилат)-аспарагиновой кислоты. К раствору активированного эфира Z-Asp(OSu)-OH (I), полученного на предыдущей стадии, добавляют 1,49 г (6,2 ммоль) мелкоизмельченного порошка тозилата бензилового эфира пролина и 0,86 мл триэтиламина. Перемешивают реакционную смесь при комнатной температуре в течение 2 суток. Затем в реакционную смесь при перемешивании постепенно вливают 150 мл 2н раствора серной кислоты, продукт выпадает в виде масла, который затем растворяют в 50 мл этилацетата.
Затем содержимое реакционной колбы расслаивают в делительной воронке, нижнюю водную фазу сливают в стакан вместимостью 250 мл, а верхнюю органическую фазу - в стакан вместимостью 500 мл. Процедуру повторяют трижды с новыми порциями этилацетата (по 30 мл), затем все этилацетатные порции объединяют в исходной делительной воронке, в которую добавляют 20 мл 2 н раствора серной кислоты и осуществляют экстракцию, повторяя процедуру дважды. Затем этилацетатный раствор промывают последовательно водой (30 мл), дважды раствором бикарбоната натрия (30 мл), дважды раствором серной кислоты (30 мл) и водой (30 мл). Затем в этилацетатный раствор добавляют около 20 мг безводного сульфата натрия и оставляют на 10-12 часов.
Отфильтрованный этилацетатный раствор упаривают в вакууме при температуре не выше 40 °С на вакуумном роторном испарителе (Buchi Rotavapor R-114 или аналогичном) до прекращения отгонки растворителя и образования на дне колбы густого сиропа, который растворяют в 20 мл этилацетата, добавляя к раствору при постоянном перемешивании порциями гексан до появления устойчивой мути (около 20 мл). Колбу с полученной мутной системой оставляют в холодильнике при температуре 4 °С в течение не менее 2 суток для завершения процесса кристаллизации.
Выпавший кристаллический продукт отфильтровывают под вакуумом через пористый фильтр Шота, 2 раза промывают гексаном (5 мл), далее продукт переносят в чашку Петри без крышки. Окончательно продукт высушивают над пятиокисью фосфора в вакууме при температуре не выше 40 °С до постоянного веса.
3) H-Asp(Pro)-OH (III), β-аспартил-пролин. α-Бензиловый эфир N-бензилоксикарбонил-(β-пролилбензилат)-аспарагиновой кислоты, полученный на предыдущей стадии, растворяют в смеси метанола (60 мл), дистиллированной воды (20 мл) и уксусной кислоты (20 мл) в присутствии 3 мл катализатора палладия на угле (Pd/C).
Контроль за полнотой деблокирования проводят в режиме ТСХ на пластинках Silu-fol в системе бензол-ацетон (2:1), деблокированный продукт имеет нулевую подвижность, исходный продукт имеет Rf=0,73. Реакция деблокирования считается законченной, если имеются только следовые количества исходного продукта (визуально).
Объединенный фильтрат упаривают в вакууме при температуре не выше 40 °С.
Для очистки 280 мг препарата растворяют в 4 мл 0,01 % трифторуксусной кислоты и подвергают высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50х250мм Diasorb-130-C16T, 7mkm. Хроматограф Beckman System Gold, 126 Sol-vent Module,168 Diode Array Detector Module. Условия хроматографирования - А: 0,1 % трифторуксусная кислота; В: 50 % раствор ацетонитрила в 0,1 % трифторуксусной кислоте; градиент В 0 → 5 % за 80 мин. Объем пробы 5 мл, детекция при длине волны 215 нм, сканирование при длинах волн 190-600 нм, скорость потока 10 мл/мин.
Отбирают фракции основного пика, свободного от примесей (в примерном интервале 50,0 мин. - 68,0 мин.), объединяют их и упаривают в вакууме до образования сиропа, повторяя упаривание ещё 5 раз каждый раз с новой порцией (10 мл) 10 % уксусной кислоты. Остаток в колбе сушат в вакууме при температуре не выше 40 °С над твердым КОН в течение не менее 2 суток. После сушки продукт не должен иметь запаха.
После упаривания и сушки в вакууме остаток растворяют в 20 мл деионизованной воды и лиофилизируют.
4)Анализ готового препарата.
Содержание основного вещества определяют методом ВЭЖХ на колонке Phenomenex C 18 LUNA 4,6x150 мм. A: 0,1 % TFA, B: MeCN; Градиент B 0-100 % – 10 мин. Скорость потока 1 мл/ мин. Детекция при длине волны 220 нм, сканирование при длинах волн 190-600 нм, проба 20 мкл. Содержание основного вещества не менее 97 %.
f
f
ТСХ: на хроматограммах образцов, обработанных раствором нингидрина, допускается наличие только двух пятен (препарата и ГСО) фиолетового цвета с совпадающими R; на хроматограммах образцов, обработанных раствором бензидина, допускается наличие только двух пятен (препарата и ГСО) темно-синего цвета с совпадающими R (ацетонитрил-вода 1:3, пластинки ПТСХ-П-В-УФ Sorbfil, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин).
Содержание влаги: не более 10 % (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при температуре 100 °C).
рН 0,01 % раствора: от 4,0 до 5,0 (потенциометрически).
Удельное оптическое вращение: от–30 до –34° в пересчете на сухое вещество (0,1 % водный раствор, температура 23 °С, D-линия спектра натрия).
Пример 2. Изучение токсичности пептида H-Asp(Pro)-OH
Общетоксическое действие пептида H-Asp(Pro)-OH исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств. ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоцразвития России. Часть 1» (Москва, Гриф и К, 2012. 944 с.) острой токсичности при однократном введении препарата, а также хронической токсичности при длительном введении пептида.
Исследование острой токсичности проведено на 110 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 20-24 г. Животные были рандомизированно разделены на 11 равных групп по 10 животных в каждой группе. Препарат вводили животным однократно внутримышечно или внутрижелудочно (через зонд) в дозах 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг (в несколько тысяч раз превышающих терапевтическую дозу (ТД), рекомендуемую для клинического изучения, которая составляет 0,0014 мг/кг) в объеме 0,25 мл изотонического 0,9 % раствора натрия хлорида. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9 % раствор NaCl.
В течение 72 часов и далее через 14 суток ни в одной группе животных гибели мышей не обнаружено. Не отмечено каких-либо изменений общего состояния, поведения, двигательной активности, волосяного и кожного покрова, физиологических отправлений животных.
Таким образом, дипептид H-Asp(Pro)-OH в дозах, превышающих терапевтическую, рекомендуемую для клинических испытаний, в несколько тысяч раз, не вызывает острых токсических реакций при внутримышечном или внутрижелудочном введении, что указывает на большую терапевтическую широту препарата.
Хроническую токсичность дипептида H-Asp(Pro)-OH, полученного заявляемым способом, изучали при длительном введении его крысам с массой тела 150-250 мг. Животным ежедневно вводили внутримышечно или внутрижелудочно (через зонд) препарат в дозах 0,1 мг/кг (70 ТД), 1,0 мг/кг (700 ТД), 3 мг/кг (2000 ТД) в 0,5 мл физиологического раствора в течение 30 дней. Наблюдение за животными вели в течение 60 дней после начала эксперимента. Отмечали поведение животных, потребление корма и воды, состояние волосяного покрова и слизистых оболочек. Взвешивание животных проводилось еженедельно. В начале и при завершении эксперимента проводили гематологические и биохимические исследования. Оценивали функции сердечно-сосудистой системы, печени, поджелудочной железы, почек и надпочечников. После окончания введения препарата животных подвергали патоморфологическому исследованию с целью оценки состояния различных отделов головного и спинного мозга, сердца, аорты, легких, печени, почек, органов эндокринной и иммунной систем.
При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.
Изучение острой и хронической токсичности дипептида H-Asp(Pro)-OH свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата внутримышечно или внутрижелудочно в дозах, превышающих терапевтическую в 70-2000 раз.
Пример 3. Влияние пептида H-Asp(Pro)-OH на пролиферацию, апоптоз и защитные функции клеток слизистой оболочки бронхов крыс в органотипической и диссоциированной культурах при их старении.
3
2
2
Органотипическое культивирование ткани слизистой оболочки бронхов молодых 3-месячных (n=60) и старых 20-месячных крыс линии Wistar (n=60) проводили в питательной среде следующего состава из расчёта на 100 мл: раствор Хенкса 38 мл, среда Игла 36 мл, фетальная бычья сыворотка 25 мл, глюкоза 40 % – 1,0 мл, гентамицин 100 Ед/мл. После извлечения слизистой оболочки бронхов ткань помещали в стерильную чашку Петри с коллагеновым покрытием дна и разделяли на эксплантаты (фрагменты величиной около 1 мм). Эксплантаты культивировали 3 суток в 3 мл питательной среды в СО-инкубаторе при температуре 36,7 °С в среде с 5 % содержанием СО. Пептид H-Asp(Pro)-OH добавляли в культуры в концентрации 0,05 нг/мл, т.к. ранее она оказалась наиболее эффективной в этом эксперименте. В контрольные культуры добавляли аналогичное количество питательной среды. В качестве группы сравнения в культуры добавляли аминокислоты, входящие в состав пептида H-Asp(Pro)-OH: аспарагиновая кислота (Asp) и пролин (Pro) в концентрации 0,05 нг/мл.
В эксплантатах слизистой оболочки бронхов после 3 суток культивирования определяются две зоны: центральная и периферическая. Центральная зона представлена клетками, исходно размещёнными на коллагеновой подложке. Периферическая зона (зона роста) состоит из выселившихся по окружности вновь образованных клеток. Для количественной оценки роста эксплантатов определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали, как отношение площади всего эксплантата к площади центральной зоны.
2
3
Диссоциированную культуру клеток получали из слизистой оболочки бронхов молодой крысы лини Wistar (3 мес.). Кусочки слизистой оболочки бронхов подвергали действию 0,2 % коллагеназы II в течение 10 минут при температуре 37°С в термостате и центрифугировали в течение 5 мин при скорости вращения 400 g. В клетки добавляли 2 мл среды RPMI c добавлением 20 % фетальной бычьей сыворотки, HEPES 1,5 % и антибиотиков 50 000 ЕД/фл пенициллина G и 50 мг/фл стрептомицина. Клетки выращивали во флаконах с обработанной поверхностью вместимостью 50 мл в 5 мл культуральной среды (20 % фетальной бычьей сыворотки, 82,5 % RPMI, 1,5 % НЕРЕS, L-глутамин) при температуре 36,7 °С в среде с 5 % содержанием СО. Через 5-7 дней, когда первичная культура достигала монослоя, проводилось процедура ее пересеивания в концентрации 5х10 клеток на флакон 50 мл.При каждом пересеве раствор с пептидом добавляли в культуральную среду в концентрации 100 нг/мл. Пассирование проводили через 3 дня на четвертый, когда культура достигала монослоя. Культивирование проводили до 3 пассажа.
Для иммуноцитохимического исследования органотипических и диссоциированных культур слизистой оболочки бронхов клетки фиксировали 96° спиртом. Блокаду эндогенной пероксидазы проводили 3 % водным раствором перекиси водорода в течение 15 мин. Пермеабилизацию мембран клеток проводили 0,5 % раствором Triton Х100. Затем использовали первичные моноклональные антитела к CXCL12 (1:200, Vectorlab), Ki67 (1:150, Vectorlab), p53 (1:50, Dako). Инкубацию со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (EnVision Detection System, Peroxidase/DAB, Rabbit, Mouse), проводили в течение 30 минут. Для оценки результатов иммуноцитохимического окрашивания проводили морфометрическое исследование с использованием системы компьютерного анализа микроскопических изображений, состоящей из микроскопа Nikon Eclipse E400, цифровой камеры Nikon DXM1200, персонального компьютера на базе Intel Pentium 4 и программы «Видеотест-Морфология 5.2». В каждом случае анализировали 5 полей зрения при увеличении 100. Площадь экспрессии рассчитывали, как отношение площади, занимаемой иммунопозитивными клетками, к общей площади клеток в поле зрения и выражали в процентах. Этот параметр характеризует количество клеток, в которых экспрессируется исследуемый маркер.
Статистическая обработка данных включала в себя подсчет среднего арифметического, стандартного отклонения и доверительного интервала для каждой выборки и проводилась в программе Statistica. Для анализа вида распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. Для проверки статистической однородности нескольких выборок были использованы непараметрические процедуры однофакторного дисперсионного анализа (критерий Крускала–Уоллиса). Критический уровень достоверности нулевой гипотезы принимали равным 0,05.
В органотипических культурах клеток слизистой оболочки бронхов молодых крыс под действием пептида H-Asp(Pro)-OH ИП достоверно повышался по сравнению с контролем на 28±3%. В органотипических культурах клеток слизистой оболочки бронхов старых крыс под действием пептида H-Asp(Pro)-OH ИП статистически значимо повышался по сравнению с контролем на 40±1%. Добавление в органотипические культуры слизистой оболочки бронхов молодых и старых крыс аминокислот (Asp, Pro) не приводило к достоверному повышению ИП – соответственно, на 4±1% и 8±2% по сравнению с контролем. Таким образом, пептид H-Asp(Pro)-OH стимулирует рост органотипической культуры тканей слизистой оболочки бронхов крыс, причем его эффект более выражен при воздействии на культуры, полученные от старых животных. При этом аминокислоты, входящие в состав изучаемого пептида, не влияют на ИП зоны роста эксплантатов тканей слизистой оболочки бронхов молодых и старых крыс, что указывает на важную роль пептидной связи в структуре пептида H-Asp(Pro)-OH в стимуляции роста клеток слизистой оболочки бронхов.
— В контрольных культурах клеток слизистой оболочки бронхов, полученных от старых крыс, площадь экспрессии пролифератропного протеина Ki67 была в 3,1 раза ниже по сравнению с культурами, выделенными из ткани молодых животных. Пептид H-Asp(Pro)-OH в 3,58 раза повышал площадь экспрессии Ki67 в органотипических культурах слизистой оболочки бронхов молодых крыс. В органотипических культурах слизистой оболочки бронхов старых крыс пептид H-Asp(Pro)-OH повышал площадь экспрессии Ki67 в 1,91 раза. Результаты изучения влияния пептида H-Asp(Pro)-OH на индекс площади зоны роста эксплантатов слизистой оболочки бронхов коррелируют с данными по экспрессии белка Ki67, который является маркером пролиферации клеток. Таким образом, влияние дипептида H-Asp(Pro)-OH на зону роста эксплантатов слизистой оболочки бронхов может быть связано с его стимулирующим действием на экспрессию белка Ki67.
В контрольных культурах клеток слизистой оболочки бронхов, полученных от молодых и старых крыс, площадь экспрессии хемокина CXCL12 не различалась. В органотипических культурах слизистой оболочки бронхов молодых крыс пептид H-Asp(Pro)-OH повышал площадь экспрессии хемокина CXCL12 в 4,62 раза по сравнению с контролем и не влиял на площадь экспрессии хемокина CXCL12 в органотипических культурах слизистой оболочки бронхов старых крыс.
В контрольных культурах клеток слизистой оболочки бронхов, полученных от старых крыс, площадь экспрессии проапоптотического белка р53 была в 2,7 раза выше по сравнению с культурами, выделенными из ткани молодых животных. Пептид H-Asp(Pro)-OH в 13 раз снижал площадь экспрессии р53 в органотипических культурах слизистой оболочки бронхов молодых крыс и в 1,8 раза - в органотипических культурах клеток бронхов старых крыс.
В первичной диссоциированной культуре клеток слизистой оболочки бронхов молодых крыс пептид H-Asp(Pro)-OH повышал экспрессию пролифератропного протеина Ki67 в 1,5 раза и снижал экспрессию проапоптотического протеина р53 в 1,4 раза по сравнению с контролем. Пептид H-Asp(Pro)-OH не влиял на экспрессию хемокина CXCL12 в диссоциированной культуре клеток слизистой оболочки бронхов молодых крыс.
Таким образом, пептид H-Asp(Pro)-OH активирует пролиферацию (увеличение ИП, экспрессии Ki67), защитные функции клеток слизистой оболочки бронхов (повышение экспрессии хемокина CXCL12), снижает апоптоз (уменьшение экспрессии р53) у крыс разного возраста. Описанные эффекты пептида могут быть обусловлены его структурой, а именно наличием пептидной связи, так как отдельно взятые аминокислоты в составе пептида не влияют на рост органотипической культуры слизистой оболочки бронхов крыс. Эти данные указывают на геропротекторные и бронхопротекторные свойства пептида H-Asp(Pro)-OH.
Пример 4. Клиническое применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида H-Asp(Pro)-OH, для лечения больных хроническим бронхитом
Клиническое исследование проводили с участием 116 больных в возрасте от 35 до 76 лет, в том числе 63 мужчины и 53 женщины, с диагнозом хронический бронхит, фаза ремиссии, которых разделили на 7 групп.
В контрольную группу вошли 15 человек, сопоставимых по диагнозу, полу и возрасту с пациентами основной группы. Пациенты контрольной группы получали только общепринятую терапию: бромгексин по 1 таблетке 3 раза в день, грудной сбор № 1 (корни алтея, листья мать-и-мачехи, трава душицы) по ½ стакана настоя 3 раза в день в течение 2 недель.
Пациенты основной группы (101 человек) дополнительно к общепринятому лечению получали фармацевтическую композицию, содержащую эффективное количество пептида H-Asp(Pro)-OH. Они были разделены на 2 группы: пациенты группы 1 (n=54) получали фармацевтическую композицию перорально 2 раза в день в течение 30 дней, пациенты группы 2 (n=47) – внутримышечно 1 раз в день в течение 15 дней. Были использованы фармацевтические композиции с различной концентрацией пептида H-Asp(Pro)-OH: 0,1 мкг/кг массы тела (подгруппа 2.1), 1,0 мкг/кг массы тела (подгруппа 1.1), 2,0 мкг/кг массы тела (подгруппа 2.2), 10,0 мкг/кг массы тела (подгруппы 1.2 и 2.3) и 100,0 мкг/кг (подгруппа 1.1).
Пациенты из всех групп предъявляли жалобы на кашель с мокротой, преимущественно в утренние часы, общую слабость, потливость, одышку при физической нагрузке, периодически возникающие приступы удушья, нарушение сна, головные боли. Все обследуемые пациенты злоупотребляли курением.
Установлено, что применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида H-Asp(Pro)-OH, дополнительно к общепринятой терапии у больных хроническим бронхитом в 82% случаев способствовало улучшению самочувствия, снижению частоты приступов кашля, приступов удушья, уменьшению количества отделяемой мокроты. Положительная динамика субъективных показателей в контрольной группе отмечалась у 63% больных. Аускультация легких больных всех групп в динамике свидетельствовала об уменьшении сухих свистящих и жужжащих хрипов.
Исследование функции внешнего дыхания показало, что на фоне лечения с применением фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида H-Asp(Pro)-OH, показатели внешнего дыхания улучшаются достоверно больше, чем у больных контрольной группы (табл. 1).
Результаты исследования функции внешнего дыхания свидетельствуют о достаточно скомпенсированном патологическом процессе в легких, но, вместе с тем, имеются явления нарушенной бронхиальной проходимости, в основном, за счет спазма мелких бронхиол. Так, показатель жизненной емкости легких (ЖЕЛ) у мужчин до начала лечения составлял 77,1% от нормального показателя (5000 мл в среднем для мужчин), у женщин – 76,8% от нормального значения (3700 мл в среднем для женщин). При этом форсированный объем легких (ФЖЕЛ) был на 10,1% и 15,7% у мужчин и женщин, соответственно, ниже показателя ЖЕЛ. Снижение ЖЕЛ почти на 25% относительно нормальных показателей и ФЖЕЛ на 10-15% относительно ЖЕЛ свидетельствует о патологическом процессе в легких и бронхах легкой или средней степени тяжести, что коррелирует с клиническими проявлениями хронического бронхита у пациентов. Применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида H-Asp(Pro)-OH при обоих способах введения и при разных дозировках, оказывало положительное воздействие на динамику развития этого процесса. Как следует из таблицы 1, показатели ЖЕЛ и ФЖЕЛ у пациентов основной группы, получавших пептид H-Asp(Pro)-OH перорально в дозах 100 мкг, 1 мг и 10 мг, приближались к нижней границе нормальных значений, при этом они были достоверно выше по сравнению с показателями до лечения. По результатам, представленным в таблице 2, у пациентов, получавших пептид H-Asp(Pro)-OH внутримышечно в дозировках 200 мкг и 1,0 мг, показатели ЖЕЛ и ФЖЕЛ достоверно не отличались от нормальных значений для мужчин и женщин, соответственно, а в дозировке 10 мкг были достоверно выше показателей до лечения и после лечения общепринятыми средствами.
В то же время, у пациентов контрольной группы, получавших только общепринятое лечение, показатели внешнего дыхания улучшились по сравнению с исходными значениями, но данные изменения не были статистически достоверны.
Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о терапевтической эффективности фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида H-Asp(Pro)-OH от 10 мкг (0,1 мкг/кг) до 10 мг (100 мкг/кг), и целесообразности ее применения в комплексном лечении хронического бронхита, в том числе и бронхита курильщиков.
В процессе применения фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида H-Asp(Pro)-OH, побочного действия, осложнений, противопоказаний и лекарственной зависимости не выявлено.
Таблица 1 - Влияние фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида H-Asp(Pro)-OH, на показатели внешнего дыхания у больных хроническим бронхитом при применении per os
<b>Показатель</b>
<b>До лечения, мужчины / женщины</b>
<b>После лечения с применением общепринятых средств, мужчины / женщины</b>
<b>После лечения с применением пептида H-Asp(Pro)-OH, мужчины / женщины</b>
<b>Применение per os, группа</b>
<b>1.1</b>
<b>1.2</b>
<b>1.3</b>
Жизненная емкость легких (ЖЕЛ), мл
М=3856,8±198,6
М=4319,9±221,3
М=4623,1±202,6*
М=4789,9±196,9*
М=4956,4±182,1*
Ж=2843,6±174,1
Ж=3145,6±207,1
Ж=3396,4±195,4*
Ж=3513,8±189,5*
Ж=3628,7±176,8*
Форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), мл
М=3429,6±197,3
М=4037,5±205,1
М=4422,3±182,7*
М=4621,7±194,9*
М=4689,6±169,8*
Ж=2398,1±176,1
Ж=2985,6±185,4
Ж=3275,6±172,5*
Ж=3388,3±194,2*
Ж=3431,4±203,6*
* - р<0,05 по сравнению с показателем до лечения.
Таблица 2 – Влияние фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида H-Asp(Pro)-OH, на показатели внешнего дыхания у больных хроническим бронхитом при применении внутримышечно
<b>Показатель</b>
<b>До лечения, мужчины / женщины</b>
<b>После лечения с применением общепринятых средств, мужчины / женщины</b>
<b>После лечения с применением пептида H-Asp(Pro)-OH, мужчины / женщины</b>
<b>Применение внутримышечно, группа</b>
<b>2.1</b>
<b>2.2</b>
<b>2.3</b>
Жизненная емкость легких (ЖЕЛ), мл
М=3856,8±198,6
М=4319,9±221,3
М=4611,6±198,5*
М=4883,4±207,3*
М=4936,1±191,5*
Ж=2843,6±174,1
Ж=3145,6±207,1
Ж=3396,4±195,4*
Ж=3638,3±194,7*
Ж=3689,2±192,9*
Форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), мл
М=3429,6±197,3
М=4037,5±205,1
М=4531,7±201,9*
М=4783,5±187,2*
М=4805,8±191,5*
Ж=2398,1±176,1
Ж=2985,6±185,4
Ж=3348,4±186,6*
Ж=3529,8±174,3*
Ж=3664,7±185,5*
* - р<0,05 по сравнению с показателем до лечения.