ПРИГОДНЫЕ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПИЩУ БАКТЕРИИ LACTOBACILLUS RHAMNOSUS
LACTOPSILLUS RHAMNOSUS BACTERIA SUITABLE FOR EATING

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к пригодным для использования в пищу бактериям, предназначенным для повышения эффективности детоксикации. В частности, настоящее изобретение относится к пригодным для использования в пищу бактериям или их экстрактам, способным удалять ртуть из водной среды, которая подвергается воздействию пригодных для использования в пищу бактерий.
Уровень техники
Люди и животные в целом подвергаются воздействию многих токсичных соединений, которые загрязняют окружающую среду, системы производства и сбыта продовольственной продукции, системы водоснабжения и различные предметы, которые являются частью повседневной жизни. Указанные соединения разнообразны по количеству, виду и по типу их воздействия, начиная от ингредиентов, входящих в состав зубной пасты и шампуня, и кончая лекарствами и патогенами в родниковой воде. Для коренного населения Канады и эскимосов находящиеся в окружающей среде токсины являются факторами риска для развития многих широко распространенных заболеваний, в частности, диабета 2 типа [Sharp D. Environmental toxins, a potential risk factor for diabetes among Canadian Aboriginals, Int. J. Circumpolar Health, 2009; 68(4):316-26]. Возник большой потребительский рынок отпускаемых без рецепта лекарственных препаратов, которые обычно называют "средствами детоксикации", однако большинство указанных препаратов не имеет обоснованных или клинических доказательств в поддержку их использования. Концепция детоксикации весьма привлекательна для потребителей, как тех, которые заботятся о своем здоровье, так и тех, которые озабочены с растущим числом сообщений в средствах массовой информации о загрязнении окружающей среды и заболеваниях, связанных с токсичными веществами. Таким образом, существует значительный интерес в этой области, вызванный малочисленностью эффективных продуктов и растущей потребностью в них.
Пополнение или повышение активности полезных организмов путем введения пробиотиков стало возможным в Канаде относительно недавно и вызвало большой интерес среди потребителей и работников системы здравоохранения. Действительно, пробиотики являются одним из наиболее быстро растущих сегментов продуктов питания в Северной Америке. Тем не менее, представление о механизмах, посредством которых индигенные микробы и экзогенные пробиотики оказывают свое влияние на субъекта, носит ограниченный характер.
Было показано, что пробиотические лактобактерии и бифидобактерии способны справляться с рядом патологий кишечника. Например, в патенте США № 6641808 раскрывается использование лактобактерий для лечения ожирения; в патенте США № 5531988 раскрывается смесь иммуноглобулина и бактерии, такой как лактобактерия или бифидобактерия или их смеси, которые могут быть использованы для лечения диареи, запора и газов/коликов; в патенте США № 6080401 раскрывается комбинация пробиотиков, включающих Lactobacillus acidophilus и Bifidobacterium bifidus, и растительных препаратов для снижения веса и т.п.
Способность пробиотических продуктов снижать интенсивность симптомов воздействия токсинов изучена гораздо хуже, тем не менее, имеет под собой определенную основу. Например, было обнаружено, что лактобактерии и/или бифидобактерии изменяют метаболические особенности кишечника субъекта [Ndagijimana, M. Laghi L, Vitali B, Placucci G, Brigidi P, Guerzoni ME. Effect of synbiotic food consumption on human gut metabolic profiles evaluated by 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy. Int. J. Food Microbiol. 2009; 134: 147-153]; связывают афлатоксин (штаммы Lactobacillus) [Hernandez-Mendoza A, Garcia HS, Steele JL. Screening of Lactobacillus casei strains for their ability to bind aflatoxin B1. Food Chem. Toxicol. 2009; 47(6): 1064-8]; и оказывают детоксифицирующее действие или связывают и подавляют другие микотоксины (B. animalis) [Fuchs S, Sontag G, Sfidl R, Ehrlich V, Kundi M, Knasmüller S. Detoxication of patulin and ochratoxin A, two abundant mycotoxins, by lactic acid bacteria. Food Chem. Toxicol. 2008; 46(4): 1398-407].
Более кратко, проблема, связанная с токсичными соединениями, реальна и вызывает все большую озабоченность у потребителей.
Тяжелые металлы
Токсичность тяжелых металлов является одним из наиболее крупных факторов рисков для здоровья в 21-м веке. Попадание свинца и кадмия в организм за счет воздействия окружающей среды и из пищи напрямую отвечает за последствия, связанные с неудовлетворительным состоянием здоровья, в том числе с нарушением функции нервной системы и снижением IQ, остеопорозом, раком легких и раком почки.
Тяжелые металлы, такие как свинец и кадмий, присутствуют в окружающей среде, и поэтому многие бактерии со временем выработали механизмы сопротивляемости к указанным металлам, которые обычно включают активное внутри/внеклеточное осаждение и блокирование металлов или активное выделение металлов из цитоплазмы клеток. Было проведено изучение возможности использования не пригодных в пищу бактерий для связывания и детоксикации тяжелых металлов, и оно оказалось успешным.
Ртуть
Ртуть является одним из наиболее токсичных из известных человеку веществ, и попадание ее в организм субъекта приводит к ухудшению здоровья, в том числе к изменению неврологического развития у детей. Тем не менее, по оценкам, североамериканцы и европейцы ежедневно потребляют 6,7 мкг неорганической ртути и метилртути (Всемирная организация здравоохранения, 1991).
Ртуть присутствует в естественной среде, а потому многие бактерии разработали механизмы резистентности к ней, которые в общем случае снижают уровень ртути в окружающей среде. Многие не пригодные в пищу бактерии были исследованы на предмет их использования, с целью связывания и детоксикации ртути и ее соединений в окружающей среде, однако применение пригодных в пищу бактерий пока не продемонстрировано.
Мышьяк
Мышьяк является неметаллическим элементом, который обычно находится в двух состояниях окисления: арсенат (As V) и арсенит (As III). Мышьяк широко распространен в земной коре по всему миру, он хорошо растворяется в воде и обнаружен в высоких концентрациях в грунтовых водах. Токсичность мышьяка связана с рядом заболеваний, и известно, что он приводит к недостаточности в работе органов, раку и смерти. Основным путем воздействия мышьяка является прием с пищей, т.к. часто загрязненная мышьяком вода используется для орошения сельскохозяйственных угодий, что в итоге приводит к накоплению указанного металла в растениях и продуктах питания.
Пестициды
Пестициды, такие как малатион и паратион, относятся к классу фосфорорганических соединений и действуют как ингибиторы холинэстеразы. Малатион является одним из наиболее широко используемых пестицидов в США, а применение паратиона недавно было ограничено, и он не используется во многих развитых странах вследствие его высокой токсичности. Тем не менее, в импортируемых продуктах все еще обнаруживаются уровни паратиона, а в некоторых редких случаях он применяется в Северной Америке.
Основным путем воздействия пестицидов на людей является потребление с пищей. Сельскохозяйственные работники и промышленные рабочие подвергаются повышенному риску воздействия на рабочих местах за счет поглощения или вдыхания, если требования безопасности должным образом не соблюдаются.
С учетом проблем, связанных с воздействием любого из вышеуказанных токсичных соединений, целесообразно разработать пригодные для использования в пищу бактерии, которые могут связывать токсичные соединения, в том числе тяжелые металлы, ртуть, мышьяк, пестициды, такие как малатион и паратион или их комбинации, в желудочно-кишечном тракте субъекта с тем, чтобы уменьшить количество токсичных соединений, которые могут быть поглощены субъектом, при этом детоксикация токсичных соединений напрямую снижает токсичность токсичных соединений, которые могут быть поглощены субъектом. Существует потребность в штаммах бактерий, которые обладают улучшенной способностью удалять тяжелые металлы, в частности, ртуть.
Сущность изобретения
Объектом настоящего изобретения являются пригодные для использования в пищу бактерии или их экстракты для удаления и/или нейтрализации токсичных продуктов из окружающей среды или веществ, подвергаемых воздействию пригодных для использования в пищу бактерий, которые способны устранять недостатки, присущие традиционным способам детоксикации.
В настоящем изобретении предлагается эффективная обработка, с целью удаления и/или нейтрализации токсичных веществ, находящихся в окружающей животных среде, и в среде, воздействию которой подвергается животное, или с целью удаления и/или нейтрализации вещества, попадающего в организм животных, которая позволяет избежать неблагоприятных побочных эффектов, имеет разумную стоимость и целесообразна для снижения риска заболеваний, связанных с указанными токсичными веществами. Кроме того, вещества по настоящему изобретению сравнительно легко приготовить и доставить субъекту.
Объектом настоящего изобретения являются пригодные для использования в пищу бактерии или их экстракты, пригодные для детоксикации и/или связывания токсичных соединений, в том числе тяжелых металлов, ртути, мышьяка и пестицидов, с целью их применения для снижения поглощения субъектом токсичных соединений.
Настоящее изобретение решает проблему усовершенствования пригодных для указанных целей штаммов бактерий, в частности, для удаления ртути, с помощью пригодного для использования в пищу штамма бактерий Lactobacillus rhamnosus, при этом указанный штамм депонирован в CNCM под номером I-4719.
Настоящее изобретение также касается способа получения штамма Lactobacillus rhamnosus, включающего стадию мутагенеза или генетической трансформации штамма Lactobacillus rhamnosus, депонированного с CNCM под номером I-4719. Полученный штамм может быть обозначен как "модифицированный" штамм, охватывающий мутантные штаммы и генетически трансформированные штаммы.
Настоящее изобретение также относится к модифицированному штамму Lactobacillus rhamnosus, который получен вышеуказанным способом. Модифицированный штамм, как правило, способен удалять ртуть из водной среды.
Настоящее изобретение также относится к способу получения фракции клеток, который включает следующие стадии:
a) культивирование вышеуказанного штамма Lactobacillus rhamnosus, и
b) выделение фракции клеток из культуральной среды со стадии a).
Настоящее изобретение также относится к фракции клеток, которую получают вышеуказанным способом. Фракция клеток, как правило, способна удалять ртуть из водной среды.
Настоящее изобретение также относится к композиции, содержащей вышеуказанный штамм Lactobacillus rhamnosus.
Далее, если не указано иное, пригодными для использования в пищу бактериями является штамм Lactobacillus rhamnosus, который представляет собой штамм, депонированный в CNCM под номером I-4719, или продукты его мутагенеза или генетической трансформации, или их клеточные фракции.
Неожиданно штамм CNCM I-4719 проявляет улучшенную способность удалять ртуть, по сравнению с другими штаммами Lactobacillus rhamnosus. Примерами сравниваемых штаммов, обладающих меньшей способностью удалять ртуть, являются штаммы, перечисленные в приведенной ниже таблице 1.
Таким образом, в одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаются пригодные для использования в пищу бактерии или их экстракты для удаления токсичных соединений из вещества или из среды, которые подвергаются воздействию пригодных для использования в пищу бактерий.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается композиция, включающая пригодные для использования в пищу бактерии и подходящий носитель, при этом указанная композиция содержит дозу пригодных для использования в пищу бактерий, эффективную для удаления токсичного соединения из вещества или среды, которые подвергаются воздействию пригодных для использования в пищу бактерий.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанное вещество представляет собой съедобное вещество или питье.
В другом варианте осуществления указанное вещество представляет собой исходное вещество, используемое для приготовления съедобного вещества или питья.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения средой является желудочно-кишечный тракт субъекта.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения средой является водная среда, в которой живет субъект.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предлагаются пригодные для использования в пищу бактерии или их экстракт в составе пищевой композиции, содержащей пригодные для использования в пищу бактерии или их экстракт и обогащенную углеводами среду.
В одном варианте осуществления композиция включает в себя комбинацию двух или нескольких различных видов пригодных для использования в пищу бактерии.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается также способ снижения усвоения субъектом токсичных соединений, поглощенных субъектом. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ включает введение субъекту эффективной дозы пригодных для использования в пищу бактерий или их экстракта, которая способна блокировать поглощенное субъектом токсичное соединение.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ удаления токсичного соединения из вещества, загрязненного указанным токсичным соединением, который включает контактирование указанного вещества с пригодными для использования в пищу бактериями или их экстрактами, способными удалять указанное токсичное соединение из указанного вещества.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предлагается способ снижения воздействия токсичного вещества на субъекта, при этом указанный способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества пригодных для использования в пищу бактерий, приведенных в таблице 1, или любых их комбинаций.
В одном варианте осуществления способов по настоящему изобретению, пригодные для использования в пищу бактерии представляют собой комбинацию двух или нескольких различных видов пригодных для использования в пищу бактерий.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, токсичное соединение включает тяжелые металлы.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, токсичное соединение включает тяжелый металл, а пригодные для использования в пищу бактерии представляют собой мертвые бактерии.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, токсичное соединение включает тяжелый металл, а пригодные для использования в пищу бактерии представляют собой живые бактерии.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, токсичное соединение включает тяжелый металл, а пригодные для использования в пищу бактерии представляют собой смесь мертвых бактерий и живых бактерий.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, тяжелым металлом является кадмий.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, тяжелым металлом является свинец.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, указанное токсичное соединение включает ртуть.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, ртуть представляет собой неорганическую ртуть.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, ртуть представляет собой органическую ртуть.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, токсичное соединение включает ртуть, а пригодные для использования в пищу бактерии представляют собой мертвые бактерии.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, токсичное соединение включает ртуть, а пригодные для использования в пищу бактерии представляют собой живые бактерии.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, токсичное соединение включает ртуть, а пригодные для использования в пищу бактерии представляют смесь мертвых бактерий и живых бактерий.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, указанное токсичное соединение включает мышьяк.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, токсичное соединение включает мышьяк, а пригодные для использования в пищу бактерии представляют собой мертвые бактерии.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, токсичное соединение включает мышьяк, а пригодные для использования в пищу бактерии представляют собой живые бактерии.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, указанное токсичное соединение включает пестицид.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, токсичное соединение включает пестицид, а пригодные для использования в пищу бактерии представляют собой мертвые бактерии.
В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, токсичное соединение включает пестицид, а пригодные для использования в пищу бактерии представляют собой живые бактерии.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, указанный пестицид выбран из малатиона или паратиона.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, указанное токсичное соединение включает эндотоксины.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, указанное токсичное соединение включает афлатоксин.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, указанное токсичное соединение включает гетероциклические ароматические амины.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, указанное токсичное соединение включает акриламид.
Краткое описание чертежей
Настоящее изобретение станет более понятным из приведенного подробного описания и прилагаемых чертежей, которые представлены лишь в качестве иллюстрации и не ограничивают предполагаемый объем настоящего изобретения.
2+
2+
На фиг. 1A приведена диаграмма, иллюстрирующая способность пригодной для использования в пищу бактерии по настоящему изобретению удалять Hg из раствора, содержащего 1 часть на миллион (м.д.) навески Hg ("усы" ± стандартная ошибка среднего; * означает значимое (р<0,05) различие в соответствии с непарным t-тестом).
2+
2+
На фиг. 1B приведена диаграмма, иллюстрирующая способность пригодной для использования в пищу бактерии по настоящему изобретению удалять Hg из раствора, содержащего 15 частей на миллиард (ppb) навески Hg ("усы" ± стандартная ошибка среднего; * означает значимое (р<0,05) различие в соответствии с непарным t-тестом).
На фиг. 2 приведена диаграмма, иллюстрирующая способность пригодной для использования в пищу бактерии по настоящему изобретению удалять органическую ртуть из раствора ("усы" ± стандартная ошибка среднего; * означает значимое (р<0,05) различие в соответствии с непарным t-тестом).
На фиг. 3 приведена диаграмма, иллюстрирующая способность живой и мертвой пригодной для использования в пищу бактерии по настоящему изобретению удалять неорганическую ртуть из раствора ("усы" ± стандартная ошибка среднего; * означает значимое (р<0,05) различие в соответствии с непарным t-тестом).
2+
На фиг. 4 приведена диаграмма, иллюстрирующая изменчивость резистентности к ртути в группе пригодных для использования в пищу бактерий вида Lactobacillus rhamnosus в градиенте Hg.
Подробное описание изобретения
Определения
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном описании, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Кроме того, если не указано иное, за исключением формулы изобретения, использование "или" включает "и" и наоборот. Не ограничивающие термины не следует рассматривать как ограничивающие, если не указано иное или из контекста явно не следует иное (например, "включающий", "имеющий" и "содержащий", как правило, означают "включающий без ограничений"). Единственное число, в том числе в формуле изобретения, включает ссылку на множественное число, если не указано иное.
Выражение "пригодные для использования в пищу бактерии" относится к любым бактериям, живым или мертвым, которые не оказывают вредного воздействия на здоровье человека или которые имеют статус GRAS (общепризнанный безопасным).
Термин "пробиотик" в данном описании относится к пригодным для использования в пищу бактериям, которые выполняют полезные функции в организме субъекта, когда они присутствуют и находятся в живой и жизнеспособной форме.
Термин "животное для производства продуктов питания" используется здесь для описания любого животного, которое подготовлено и используется для потребления человеком. Животным для производства продуктов питания может быть, однако этим не ограничиваясь, жвачное животное, такое как мясной и молочный крупный рогатый скот, свиньи, овца, курица, индейка или любая другая птица, или водные животные, в том числе креветка, омар или рыба, используемые для потребления человеком.
"Субъект" или "субъекты" используются для описания члена животного мира, в том числе животных для производства продуктов питания и человека.
Штамм CNCM I-4716 и модификации пригодных для использования в пищу бактерий Lactobacillus rhamnosus
Штамм Lactobacillus rhamnosus депонирован в соответствии с Будапештским договором в CNCM (Национальная коллекция культур микроорганизмов, 25 rue du Docteur Roux, Paris) 5 марта 2013 года, под регистрационным номером CNCM I-4716. Данный штамм обозначают также как "DN 116-060" или R37.
Указанный штамм CNCM I-4716 имеет следующие характеристики:
2
- Структура колонии (на твердом нейтральном MRS + цистеин, 72 час при 37°С, анаэробные условия в CO): неоднородные, блестящие колонии белого цвета 2 мм.
- Морфология под микроскопом (на жидком нейтральном MRS + цистеин, 16 час при 37°С, аэробные условия): маленькие, тонкие, биполярные палочки, в коротких цепочках или в кластере.
- Ферментация (и идентификация) следующих субстратов (API 50 СН стрип, в среде API MRS при 37°С в течение 48 час): D-рибоза, D-галактоза, D-глюкоза, D-фруктоза, D-манноза, L-сорбоза, L-рамноза, инозотол, D-маннит, D-сорбит, метил-альфаD-маннопиранозид, метил-альфаD-глюкопиранозид, N-ацетилглюкозамин, амигдалин, арбутин, эскулин, салицин, D-целлюлоза, D-мальтоза, D-лактоза, D-сахароза, D-трегалоза, D-мелезитоза, гентиобиоза, D-тураноза, D-тагатоза, глюконат калия.
Указанный штамм способен удалять ртуть из водной среды.
В данном описании термин "удаление ртути из водной среды" относится к удалению ртути, которое может быть установлено в испытаниях, как описано, по меньшей мере, в одном из приведенных ниже примеров.
Настоящее изобретение также охватывает мутантные штаммы или генетически трансформированные штаммы, полученные из родительского штамма CNCM I-4716. Указанные мутантные или генетически трансформированные штаммы могут быть штаммами, в которых подвергли мутации один или несколько эндогенных генов родительского штамма, например, с целью изменить некоторые из их метаболических свойств (например, способность к ферментации сахаров, устойчивость в кислой среде, выживаемость при транспортировании в желудочно-кишечном тракте, свойства после подкисления или продуцирование метаболита). Они также могут представлять собой штаммы, получаемые в результате генетической трансформации родительского штамма CNCM I-4716 одним или несколькими представляющими интерес генами, например, с тем, чтобы придать указанным генетически трансформированным штаммам дополнительные физиологические особенности, или с тем, чтобы позволить им экспрессировать белки, представляющие интерес для терапии или вакцинации, которые кто-либо желает ввести с помощью указанных штаммов. Указанные штаммы могут быть получены из штамма CNCM I-4716 с помощью обычных методов случайного или сайт-направленного мутагенеза и генетической трансформации молочнокислых бактерий, как описано у Gury et al. (2004) или у Perea Vélez et al., 2007, или с помощью метода, известного как "перетасовка генома" (Patnaik et al., 2002 и Wang et al., 2007).
Объектом настоящего изобретения являются также фракции клеток, которые можно получить из вышеуказанного штамма Lactobacillus rhamnosus, предпочтительно, штамма CNCM I-4716. Они, в частности, представляют собой препараты ДНК или препараты стенок бактерий, полученные из культур указанного штамма. Они также могут представлять собой культуральные супернатанты или фракции указанных супернатантов. В качестве примера, свободный от клеток супернатант (CFS) штамма CNCM I-4716 может быть получен с использованием метода получения CFS из другого штамма Lactobacillus rhamnosus.
Объектом настоящего изобретения является также способ получения фракции клеток, включающий следующие стадии:
a) культивирование вышеуказанного штамма L. bulgaricus, предпочтительно, штамма CNCM I-4716, и
b) получение и/или выделение фракции клеток из культуральной среды со стадии a).
В композициях по настоящему изобретению указанный штамм может быть использован в виде целых бактерий, которые могут быть живыми или мертвыми. В качестве альтернативы, указанный штамм может быть использован в виде лизата бактерий или в форме бактериальных фракций; пригодные для указанного использования бактериальные фракции могут быть выбраны, например, путем проверки их способности удалять ртуть из водной среды. Предпочтительно, бактериальные клетки присутствуют как живые, жизнеспособные клетки.
Пригодные для использования в пищу бактерии для удаления токсичных соединений
В соответствии с одним вариантом его осуществления, настоящее изобретение относится к пригодным для использования в пищу бактериям или их экстрактам, в том числе пробиотикам, способным удалять или связывать токсичные соединения из окружающей среды, которая подвергается воздействию пригодных для использования в пищу бактерий, или из вещества. Вещества могут включать пищевые композиции, такие как продукты из овощей или продукты животного происхождения, а также могут включать пригодные для питья растворы, в том числе воду, молоко, сиропы, экстракты и другие напитки. Вещества могут также включать сырые сельскохозяйственные продукты, используемые для производства продуктов питания и пригодных для питья растворов. Таким образом, настоящее изобретение относится также к способам применения пригодных для использования в пищу бактерий по настоящему изобретению для предотвращения усвоения токсичных соединений субъектом или к способам отфильтровывания токсичных соединений из веществ перед тем, как субъект будет подвергнут воздействию указанных веществ.
Пригодные для использования в пищу бактерии могут быть любым типом бактерий, которые могут обладать способностью удалять токсичные соединения из продуктов питания или растворов, которые может потреблять субъект, или из ингредиентов, используемых в производстве указанных продуктов питания или растворов. В таблицу 1 включены пригодные для использования в пищу бактерии, которые могут применяться в настоящем изобретении. В соответствии с предпочтительным аспектом, пригодные для использования в пищу бактерии могут быть выращены аэробно, микроаэрофильно или анаэробно или могут быть выбраны из группы, состоящей из пригодных для использования в пищу бактерий, представленных в таблице 1. Введение субъекту пригодных для использования в пищу бактерий или их экстракта можно осуществить любым способом, который подходит для введения организмов в желудочно-кишечный тракт субъекта. Бактерии можно смешать с носителем и добавить в жидкую или твердую пищу или питьевую воду. Вещество-носитель должно быть нетоксичным для субъекта. При использовании живых пригодных для использования в пищу бактерий вещество-носитель должно быть также нетоксично для пригодных для использования в пищу бактерий. При использовании живых пригодных для использования в пищу бактерий носитель, предпочтительно, может включать ингредиент, который способствует жизнеспособности бактерий при хранении. Пригодные для использования в пищу бактерии можно также приготовить в виде затравочной пасты для непосредственного введения через ротовую полость субъекта. Композиция может включать дополнительные ингредиенты для улучшения вкусовых качеств, повышения срока годности, придания питательной ценности и т.п. Если необходимо получить воспроизводимую и отмеренную дозу, то пригодные для использования в пищу бактерии могут быть введены с помощью канюли или шприца. Количество пригодных для использования в пищу бактерий, которое необходимо ввести, регулируется факторами, влияющими на эффективность. При введении в пищу или питьевую воду дозу можно распределить на период в несколько дней или даже недель. Кумулятивный эффект меньших доз, которые вводят в течение нескольких дней, может быть больше, чем эффект одной большой дозы. Один или несколько штаммов пригодных для использования в пищу бактерий могут быть введены вместе. Сочетание штаммов может оказаться предпочтительным, поскольку отдельные субъекты могут отличаться и по отношению к штамму, который является наиболее стойким для данного индивида.
Настоящее изобретение также относится к экстрактам или фрагментам пригодных для использования в пищу бактерий, которые могут быть способны удалять или связывать токсичные соединения в веществе или образце. Как указано в данном описании, авторы настоящего изобретения обнаружили, что мертвые пригодные для использования в пищу бактерии могут быть использованы для блокирования ртути из образца. Таким образом, настоящее изобретение направлено на фрагменты пригодных для использования в пищу бактерий, способные связывать токсичные соединения, которые обнаружены в представляющем интерес веществе.
Приложения
Пригодные для использования в пищу бактерии по настоящему изобретению могут быть введены в качестве превентивной меры, с целью предотвратить субъект, которые в данный момент не имеет токсичное соединение, от приобретения токсичного соединения под воздействием потребляемых веществ или сред, в которых присутствуют токсичные соединения.
Лечебно-профилактическая процедура по отношению к субъекту, имеющему токсичное соединение, может быть осуществлена, с целью уменьшить или полностью устранить количество токсичного соединения у субъекта, путем введения пригодных для использования в пищу бактерий или их экстрактов субъекту, имеющему токсичное соединение.
Способы введения пригодных для использования в пищу бактерий практически те же, что и для профилактики или лечения. За счет введения эффективной дозы субъекту риск загрязнения нежелательным токсином может быть существенно снижен или полностью устранен сочетанием профилактики и лечения.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения пригодные для использования в пищу бактерии по настоящему изобретению могут быть использованы в способах отфильтровывания токсичных соединений из вещества. Способ, в соответствии с одним вариантом осуществления настоящего изобретения, может включать контактирование вещества с пригодными для использования в пищу бактериями в течение достаточного количества времени и удаление пригодных для использования в пищу бактерий и токсина из образца.
Чтобы осуществить указанное отфильтровывание токсичных соединений из вещества, пригодные для использования в пищу бактерии, экстракты или фрагменты указанных пригодных для использования в пищу бактерий, способных связываться с указанными токсичными соединениями, могут быть прикреплены к фильтру или к твердому носителю, такому как аффинная колонка, а затем вещество можно пропустить через фильтр или аффинную колонку.
Пригодные для использования в пищу бактерии также могут быть использованы, в соответствии с другим вариантом осуществления настоящего изобретения, для кормления водных животных, таких как рыбы и креветки. В одном варианте осуществления настоящего изобретения пригодные для использования в пищу бактерии по настоящему изобретению могут быть добавлены в резервуары и пруды, содержащие водное животное. Пригодные для использования в пищу бактерии, используемые для водных животных, предпочтительно, могут представлять собой бактерии, которые встречаются в естественном окружении в пресной и морской воде.
Приготовление и введение препаратов
Хотя настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным способом применения, предпочтительным является пероральное введение композиций. Одну пригодную для использования в пищу бактерию можно вводить отдельно или в сочетании со второй, отличной пригодной для использования в пищу бактерией. В виде сочетания может быть использовано любое количество различных пригодных для использования в пищу бактерий. Термин "в сочетании с" означает вместе, практически одновременно или последовательно. Композиции можно вводить, например, в форме таблетки, пилюли или капсулы. Одна из предпочтительных форм применения включает приготовление капсулы, содержащей композицию по настоящему изобретению, путем сублимационной сушки. Другая предпочтительная форма применения включает приготовление лиофилизованной капсулы по настоящему изобретению. Еще одна предпочтительная форма применения включает приготовление капсулы по настоящему изобретению методом термической сушки.
"Эффективное количество" в настоящем описании означает количество пригодной для использования в пищу бактерии или бактерий, например, лактобактерии, достаточно большое, чтобы изменить в существенно положительную сторону состояние, лечение которого проводят, но достаточно низкое, чтобы избежать серьезных побочных эффектов (при разумном соотношении польза/риск) в соответствии с заключением врача, сделанным после осмотра пациента. Эффективное количество лактобактерий будет меняться в зависимости от конкретной достигаемой цели, возраста и физического состояния субъекта, лечение которого проводят, продолжительности лечения, типа сопутствующей терапии и конкретной используемой лактобактерии. Таким образом, эффективное количество лактобактерии представляет собой минимальное количество, которое обеспечит требуемую детоксикацию.
Решающее практическое преимущество заключается в том, что пригодные для использования в пищу бактерии, например, лактобактерии, могут быть введены в удобном виде, например, путем перорального, внутривенного (в случае нежизнеспособных бактерий) введения или в виде суппозитория (вагинального или ректального). В зависимости от пути введения может потребоваться, чтобы активные ингредиенты, которые включают пригодные для использования в пищу бактерии, были покрыты веществом, с целью защитить указанные организмы от действия ферментов, кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать указанные организмы. Для того чтобы ввести пригодные для использования в пищу бактерии путем, отличным от парентерального введения, их необходимо покрыть веществом или вводить вместе с веществом, предотвращающим инактивацию. Например, пригодные для использования в пищу бактерии могут быть введены совместно с ингибиторами ферментов или в составе липосом. Ингибиторы ферментов включают ингибитор трипсина поджелудочной железы, диизопропилфторфосфат (DFP) и тразилол. Липосомы включают эмульсии P40 типа вода-в масле-в воде, а также обычные и специально разработанные липосомы, которые транспортируют лактобактерии или их побочные продукты к мишени внутри субъекта-хозяина.
Пригодные для использования в пищу организмы могут быть также введены парентерально или внутрибрюшинно. Могут быть также приготовлены дисперсии, например, в глицерине, жидких полиэтиленгликолях и их смесях, а также в маслах.
Фармацевтические формы, пригодные для применения в виде инъекций, включают стерильные водные растворы (когда фармацевтическая форма растворима в воде) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций, рассчитанных для немедленного приема. Во всех случаях форма должна быть стерильной и должна быть жидкой, так чтобы ее можно было поместить в шприц. Она должна быть стабильной в условиях производства и хранения. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) их подходящие смеси, а также растительные масла. Нужную текучесть можно поддерживать, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, и путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии. Во многих случаях предпочтительным является включение изотонических агентов, например, сахара или хлорида натрия. Пролонгированное всасывание композиций для инъекций может быть осуществлено путем использования в композициях агентов, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
Стерильные растворы для инъекций готовят путем введения пригодных для использования в пищу бактерий в требуемом количестве в соответствующий растворитель, если необходимо, вместе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, с последующей стерилизацией фильтрованием. Как правило, дисперсии готовят путем введения различных стерилизованных пригодных для использования в пищу бактерий в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков, предназначенных для приготовления стерильных растворов для инъекций, предпочтительными способами приготовления являются методы вакуумной сушки и сублимационной сушки, которые позволяют получить порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный требуемый ингредиент из предварительно стерилизованного фильтрацией раствора. Дополнительные предпочтительные способы получения включают, однако этим не ограничиваясь, лиофилизацию и термическую сушку.
Когда пригодные для использования в пищу бактерии подходящим образом защищены, как указано выше, активное соединение можно вводить перорально, например, вместе с инертным разбавителем или вместе с усваиваемым съедобным носителем, или же его можно заключить в твердые или мягкие желатиновые капсулы, или же активное соединение можно спрессовать в таблетки, предназначенные для прохождения через желудок (т.е. покрытых энтеросолюбильной оболочкой), или его можно ввести непосредственно с пищей в составе диеты. Для перорального терапевтического введения пригодные для использования в пищу бактерии могут быть объединены с инертными наполнителями и использованы в виде удобных для глотания таблеток, трансбуккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п.
Вышеуказанные таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и т.п. могут также содержать следующее: могут быть добавлены связующее вещество, такое как камедь трагаканта, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатин; наполнители, такие как дикальцийфосфат; разрыхлитель, такой как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и т.п.; лубрикант, такой как стеарат магния; и подсластитель, такой как сахароза, лактоза или сахарин или отдушка, такая как мята перечная, масло грушанки или отдушка вишни. Когда готовая лекарственная форма представляет собой капсулу, она может содержать жидкий носитель в дополнение к указанным выше веществам. Различные другие вещества могут присутствовать в виде покрытий или быть введены с целью физического модифицирования готовой лекарственной формы. Например, таблетки, пилюли или капсулы или лактобактерии в суспензии могут быть покрыты шеллаком, сахаром или и тем и другим.
Сироп или эликсир может содержать активное соединение, сахарозу в качестве подсластителя, метил- и пропилпарабены в качестве консервантов, краситель и ароматизатор, например, вишневую или апельсиновую отдушку. Конечно, любое вещество, используемое для получения любой готовой лекарственной формы, должно быть фармацевтически чистым и практически нетоксичным в используемых количествах. Кроме того, пригодный для использования в пищу организм может быть включен в препараты и составы с пролонгированным высвобождением.
Наиболее предпочтительно, когда для простоты введения и однородности дозировки парентеральные композиции готовят в виде готовой лекарственной формы. Готовая лекарственная форма в данном описании относится к физически дискретным единицам, пригодным в качестве единичных доз для субъектов-млекопитающих, лечение которых проводят; причем каждая указанная единица содержит предварительно установленное количество пригодных для использования в пищу бактерий, которое рассчитано на получение желаемого профилактического или терапевтического эффекта, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Технические характеристики новых готовых лекарственных форм по настоящему изобретению могут быть продиктованы и могут непосредственно зависеть от (a) уникальных характеристик пригодных для использования в пищу бактерий и конкретного достигаемого профилактического, детоксикационного или терапевтического эффекта, и от (b) имеющихся в данной области техники ограничений для способов получения композитов из подобных пригодных для использования в пищу бактерий, с целью формирования и поддержания здоровой флоры в желудочно-кишечном тракте.
9
Из пригодного для использования в пищу организма готовят композит для удобного и эффективного введения в эффективных количествах с подходящим фармацевтически приемлемым или приемлемым для пищи носителем в готовой лекарственной форме, как указано выше. Готовая лекарственная форма может содержать основное активное соединение, например, лактобактерии, в количестве приблизительно 10 жизнеспособных или нежизнеспособных бактерий на миллилитр. В случае композиций, содержащих дополнительные ингредиенты, такие как пробиотики, дозировки определяют с учетом обычной дозы и способа введения указанных ингредиентов.
Фармацевтически приемлемый носитель может быть в виде молока или его частей, включая йогурт. Могут быть использованы обезжиренное молоко, обезжиренное сухое молоко, отличное от молока вещество или не содержащие лактозу вещества. Порошок обезжиренного молока обычно суспендируют в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), выдерживают в автоклаве или фильтруют, чтобы уничтожить белковоподобные и живые загрязняющие вещества, а затем сушат сублимационным способом, сушат путем нагревания, сушат в вакууме или сушат путем лиофилизации.
Некоторыми другими примерами веществ, которые могут служить в качестве фармацевтических носителей, являются сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлоза и ее производные, такие как натриевое производное карбоксиметилцеллюлозы, этилцеллюлоза и ацетаты целлюлозы; порошок трагаканта; солод; желатин; тальк; стеариновые кислоты; стеарат магния; сульфат кальция; карбонат кальция; растительные масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и масло какао; полиолы, такие как пропиленгликоль, глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; агар; альгиновая кислота; апирогенная вода; изотонический солевой раствор; экстракты клюквы и фосфатный буферный раствор; сухое обезжиренное молоко; а также другие совместимые нетоксичные вещества, используемые в фармацевтических препаратах, такие как, например, витамин С, эстроген и эхинацеа. Могут также присутствовать смачивающие агенты и лубриканты, такие как лаурилсульфат натрия, а также красители, ароматизаторы, лубриканты, инертные наполнители, вещества, применяемые для изготовления таблеток, стабилизаторы, антиоксиданты и консерванты.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, субъекту может быть перорально введено терапевтически эффективное количество, по меньшей мере, одного типа пригодных для использования в пищу бактерий и фармацевтически приемлемый носитель.
Таблица 1Сравниваемые штаммы Lactobacillus rhamnosus
Код штамма 1
Код штамма 2
HN001
R37
DN 116-0060
R38
DN 116-0063
R22
DN 116-0009
R17
DN 116-0136
R29
DN 116-0064
R3
DN 116-0061
R10
DN 116-0032
R11
DN 116-0141
Настоящее изобретение в общих чертах рассмотрено в приведенном выше описании. Изменения в форме и замена эквивалентов рассматриваются как возможные и целесообразные при определенных обстоятельствах. Хотя в данном описании были использованы специфические термины, подобные термины предназначены лишь для описания, а не для ограничения настоящего изобретения.
Примеры
Примеры приведены в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Пример 1 - Демонстрация удаления неорганической ртути из водной среды
2
1%-ный инокулят 24-часовой культуры Lactobacillus rhamnosus DN116-060 добавляют в бульон для культивирования по Ману, Рогозе и Шарпу (MRS), содержащий HgCl, и инкубируют в течение 24 час при температуре 37°С. После инкубирования клетки удаляют центрифугированием при 5000 g. Общую концентрацию ртути в надосадочной жидкости анализируют методом атомной абсорбции с использованием низкотемпературного пара (CVAAS). Как показано на фиг. 1, лактобактерии удаляют 94,4% из навески 1 м.д. ртути (фиг. 1А) и 85% навески 15 части на миллиард (фиг. 1B). Оба примера удаления признаны значимыми (р<0,05) по результатам непарного t-теста.
Пример 2 - Демонстрация удаления органической ртути из водной среды
2
1%-ный инокулят 24-часовой культуры L. rhamnosus DN116-060 добавляют в бульон для культивирования по Ману, Рогозе и Шарпу (MRS), содержащий MeHgCl, и инкубируют в течение 24 час при температуре 37°С. После инкубирования клетки удаляют центрифугированием при 5000 g. Общую концентрацию ртути в надосадочной жидкости анализируют методом атомной абсорбции с использованием низкотемпературного пара (CVAAS).
2+
2
Фиг. 2 показывает способность пригодной для использования в пищу бактерии удалять MeHg из раствора при начальной навеске 1 м.д. MeHgCl. ("усы" ± стандартная ошибка среднего). Как показано на фиг. 2, лактобактерии удаляют 23,2% 1 м.д. навески ртути (р<0,05 по непарному t-тесту).
Пример 3 - Удаление неорганической ртути живыми и мертвыми Lactobacillus rhamnosus DN116-060
2
Анализ проводят, как описано ранее в примере 1, при концентрации 500 частей на миллиард HgCl. Жизнеспособные клетки Lactobacillus rhamnosus DN116-010 сравнивают с клетками, которые были убиты путем нагревания при температуре 80°C в течение 10 минут, для эквивалентного инокулята с конечной плотностью клеток для жизнеспособных клеток.
2+
2
Фиг. 3 иллюстрирует способность живых и мертвых Lactobacillus rhamnosus DN116-060 удалять Hg из раствора с исходной навеской 500 частей на миллиард HgCl. Как показывает фиг. 3, жизнеспособные клетки способны удалять значительно больше ртути, чем убитые под действием тепла клетки (р<0,05 по непарному t-тесту), что заставляет предположить пассивное связывание ртути, а также потенциальную метаболическую детоксикацию.
Пример 4 - Изменчивость резистентности пригодных для использования в пищу бактерий Lactobacillus rhamnosus по отношению к ртути
2
Анализ проводят, как описано ранее в примере 1 с использованием ряда концентраций HgCl. Рост измеряют через 24 часа при температуре 37°С по оптической плотности культуры на длине волны 600 нм. Спектр резистентности к ртути наблюдается у обоих видов, доказывая, что резистентность к ртути является переменным признаком у пригодных для использования в пищу бактерий.
2+
Фиг. 4 иллюстрирует рост 40 различных штаммов Lactobacillus rhamnosus, в том числе сравниваемых штаммов из таблицы 1, в градиенте Hg, который определяют по OD600 через 24 час инкубирования при 37°С. Каждый набор соединенных между собой точек представляет один штамм. Резистентность является переменным для штамма признаком и приводит к получению ряда профилей резистентности для обоих видов. Фиг. 4 показывает, что штамм Lactobacillus Rhamnosus DN 116-060, также обозначаемый как "R37", обладает значительно более высокой резистентностью, по сравнению с остальными штаммами, включая штамм HN001.