СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОТИПИЧЕСКИ НЕВЫРАЖЕННЫХ ФОРМ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ
METHOD OF DETERMINATION OF PHENOTYPIC LATENT FORMS OF POULTRY

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к селекции сельскохозяйственной птицы.
Известно, что основным критерием, по которому можно прогнозировать продуктивные качества птицы, является порода-линия-кросс (формы). В последнее время некоторые виды птиц, считавшихся ранее дикими, приобрели сельскохозяйственное значение. Но не везде ведется строгий контроль их происхождения. В связи с этим затруднено не только прогнозирование продуктивных качеств, но и селекционная работа. Внешние (фенотипические) признаки не всегда четко проявляются. Классическим методом выяснения происхождения животных является генетическая экспертиза как непосредственная, основанная на анализе ДНК (заявка №2004126246/13), так и опосредованная - по иммунологическим реакциям (заявка №97121627/13). Но она может быть использована только в том случае, если известны маркеры. В этом ее основной недостаток. Определение по другим показателям (по продолжительности периода эмбрионального развития - заявка №96101232/13), возможно лишь у тех видов животных, у которых выявлена их жесткая взаимосвязь с теми или иными формами, а величина различия достаточно велика.
2
В предлагаемом изобретении разработан способ определения фенотипически невыраженных форм сельскохозяйственных птиц, простой для использования и дающий однозначный ответ. В основе изобретения лежит обнаруженный нами факт, что суммарное содержание нитро- и нитрозосоединений (RNO+RNO) в амниотической жидкости эмбрионов сельскохозяйственной птицы тесно связано со скоростью роста птенцов после вылупления. У быстрорастущих (мясных) форм этот показатель многократно ниже, чем у исходных, а также яичных. Это позволяет использовать его для прогнозирования мясной продуктивности фенотипически невыраженных особей, а также для подбора пар в селекционной работе.
Пример конкретного выполнения
Эксперименты проводились на амниотической жидкости эмбрионов птиц, полученных в ООО "Генофонд" (г.Сергиев Посад) - куры, перепела и цесарки, в парке птиц "Воробьи" (Калужская область) - страусы. Отборы амниотической жидкости брались на 7 и 11 сутки инкубации у куриных эмбрионов, на 10 - у перепелиных, на 9 и 15 - у цесариных и на 15 и 18 - у страусиных. В каждом случае было исследовано от 10 до 30 эмбрионов.
2
В амниотической жидкости определялось суммарное содержание нитрата, нитрита, высокомолекулярных нитрозо- и нитросоединений (то есть высоко- и низкомолекулярных нитрозо- и нитросоединений (RNO+RNO)). Этот показатель был относительно (±10%) стабилен в течение всего периода развития эмбриона.
2
Определение содержания RNO+RNO осуществлялось при помощи метода, основанного на способности нитрозосоединений ингибировать фермент каталазу. Он подробно описан в следующих работах: [Титов В.Ю., Петренко Ю.М. (2003) Биохимия, 68, 769-776; Титов В.Ю., Петренко Ю.М. (2005) Биохимия, 70, 575-587; Титов В.Ю., Петренко Ю.М., Ванин А.Ф. Вестник Гродненского Государственного Университета им. Янки Купалы, 2007, серия 2, №2(52), с.93-100].
2
Порядок определения RNO+RNO и необходимые реактивы
2
4
2
4
40 мМ р-р КНРО (или NaHPO);
1,5 М маточный раствор NaCl;
25 мкМ маточный водный раствор нитрита (натрия либо калия) - для калибровки;
3
30 мМ маточный водный раствор хлорида ванадия (VCl) - восстановитель нитросоединений в нитрозо-.
Гемолизированные эритроциты коровы, полученные путем разбавления крови дистиллированной водой в 10 раз;
Перекись водорода (3% р-р).
Порядок проведения анализа
1. Определяется активность каталазы в реакционной среде, содержащей 40 мМ фосфатный буфер, рН 6,0, 150 мМ NaCl, 9 нМ фирменного препарата каталазы, либо гемолизированные эритроциты коровы (можно крысы, человека), содержащие эндогенную каталазу. Это - контрольный образец.
2. Проводится калибровка. Определяется активность каталазы в вышеуказанной среде в присутствии 125, 250 и 500 нМ нитрита.
3
2
3. Образец амниотической жидкости (200 мкл) инкубируется в течение 15 минут с равным объемом 30 мМ р-ра VCl. Затем переносится в основную среду (см п.1). Суммарное содержание RNO+RNO определяется по степени снижения активности каталазы в соответствии с калибровкой (см. п.2).
Активность каталазы определяется любым известным методом, не требующим использования перекиси водорода в концентрации более 9 мМ.
Установлено, что линии и кроссы птиц, отличающиеся высокой скоростью прироста живой массы, содержат в амниотической жидкости многократно меньше нитро- и нитрозосоединений, чем исходные и яичные формы.
Анализ амниотической жидкости указанных в таблице пород, линий и кроссов показал, что все формы кур, перепелов и цесарок, считающиеся мясными, содержат многократно меньшую концентрацию нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости, чем исходные и яичные - десятки и сотни микромоль против тысяч (таблицы 1-3).
Таблица 1
Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости куриных эмбрионов на 11-й день инкубации (Х±m<sub>x</sub>)
Породы, линии, кроссы
RNO+RNO<sub>2</sub>, мМ
Медленнорастущие (ЯИЧНЫЕ)
Русская белая
6,8±1,5
Юрловская (мясояичная)
7,5±2,0
Кросс "Радонеж"
5,4±1,5
Кросс "Хайсекс белый"
5,5±1,5
Его родительская линия Х3
5,5±1,5
Г8 - родительская линия кросса "Смена"
5,5±1,0
Быстрорастущие (МЯСНЫЕ) бройлеры и некоторые их родительские линии
Кросс "Смена"
0,2±0,05
Его родительская линия Г6
0,02±0,005
Кросс "Конкурент АК839"
0,04±0,015
Его родительская линия К3
0,06±0,02
Его родительская линия К8
0,04±0,015
Его родительская линия К9
0,06±0,02
Кросс "Кобб-500"
0,15±0,05
Таблица 2
Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости эмбрионов цесарокразличных пород и линий на 15-й день инкубации (Х±m<sub>x</sub>)
Цесарки (породы и линии)
RNO+RNO<sub>2</sub>, мМ
ИСХОДНЫЕ
Серо-крапчатая
7,5±1,2
Кремовая
8,4±2,0
Загорская белогрудая (ЗБ)
5,5±1,0
Медленнорастущие (ЯИЧНЫЕ)
ЗБ-2 (линия ЗБ)
5,5±1,0
Быстрорастущие (МЯСНЫЕ)
ЗБ-1 (линия ЗБ)
0,04±0,015
Таблица 3
Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости эмбрионов перепелов различных пород на 10-й деньинкубации (X±m<sub>x</sub>)
Породы
RNO+RNO<sub>2</sub>, мМ
Медленнорастущие (ЯИЧНЫЕ)
Японская серая
5,5±1,0
Быстрорастущие (МЯСНЫЕ)
Эстонская
0,03±0,01
Фараон
0,2±0,05
Эта закономерность наблюдается и на страусах. В страусоводческих хозяйствах разводят две разновидности страусов: черношеяя и голубошеяя. Потомство, полученное в результате скрещивания этих разновидностей, отличается более высокой, чем родительские формы, скоростью прироста живой массы. Анализ содержания нитро- и нитрозосоединений в амниотической жидкости эмбрионов страусов показал ту же закономерность, которая наблюдалась у кур, перепелов и цесарок: эмбрионы гибридов содержали более чем на порядок меньше нитрозо- и нитросоединений, чем родительские формы (таблица 4).
Таблица 4
Содержание метаболитов NO в амниотической жидкости эмбрионов различных форм черного африканского страуса на 18-й день инкубации (Х±m<sub>х</sub>)
ФОРМЫ
RNO+RNO<sub>2</sub>, мМ
ИСХОДНЫЕ
Черношеяя (Ч)
70±20
Голубошеяя (Г)
70±20
Быстрорастущая (МЯСНАЯ)
Потомство Ч Х Г
5,0±1,0
В таблице 5 представлены факты идентификации фенотипически невыраженных форм страуса при помощи теста на содержание нитро- и нитрозосоединений в амнионе. Тест во всех случаях давал однозначные ответы.
Таблица 5
Определение фенотипически невыраженных форм страуса при помощи теста на содержание метаболитов NO в амнионе
Самец
Самка
СодержаниеRNO+RNO<sub>2</sub> в амнионе, мМ
Вывод
№
Формы
№
Формы
1
Черношеий
1
невыражена
80
Самка черношеяя
2
Голубошеий
2
невыражена
5
Самка черношеяя
Самец 2 или 3? неизвестно
Голубошеий или черношеий - необходимо определить
3
черная
90
Черношеий самец №3
3
Черношеий
4
невыражена
4-5
Самка голубошеяя
3
Черношеий
5
невыражена
6
Самка голубошеяя
3
Черношеий
6
невыражена
85
Самка черношеяя