Вьщеление и изучение биологических свойств бактериофагов Pseudomonas chlororaphis

гербицидов ЗАО «БАСФ» при возделывании сои в условиях Ульяновской области / А.Л. Тойгильдин, М.И. Подсевалов, A.B. Васин // Поволжье Arpo. - 2013. - № 1-2 (36-37). - С. 30-32.

19. Макеева-Гурьянова, Л.Т. Сульфо-нилмочевины - новые перспективные гербициды / Л.Т. Макеева-Гурьянова, Ю.Я. Спиридонов, В.Г. Шестаков // Агрохимия. -1987. -№ 2.-С. 115-128.

20. Спиридонов, Ю.Я.Современное состояние применения гербицидов (обзор публикаций за 2008-2009 гг.) / Ю.Я. Спиридонов, С.Г. Жемчужин // Агрохимия. - 2011. - № 9. - С. 82-94.

21. Рудая, Л.А. Биологическая активность и токсикологические свойства гербицидов производных сульфонилмочевины / Л.А. Рудая // Проблеми харчування. - 2009. - № 1-2. - С. 53-59.

22. Спиридонов, Ю.Я. К вопросу о последействии сульфонилмочевинных гербицидов в агроценозах / Ю.Я. Спиридонов, Г.Е. Ларина, Т.В. Захарова // Сборник тезисов докладов международной научно-практи-ческой конференции «Химический метод защиты растений. Состояние и перспектива повышения экологической безопасности» -Всероссийский институт защиты растений, Российская академия сельскохозяйственных наук. - Спб,2004. - С. 175-178.

УДН 619:579

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS

Викторов Денис Александрович, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Научно-исследовательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии при ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П. А. Столыпина»

Гринева Татьяна Алексеевна, соискатель кафедры «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ»

Васильев Дмитрий Аркадьевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой «Микробиология, вирусология, эпизоотология и ВСЭ» ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина» 432017, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1; тел.: 89084775573, e-mai: viktorov_da@mail.ru

Ключевые слова: псевдомонады, Pseudomonas chlororaphis, псевдомонозы рыб, бактериофаги, биологические свойства.

В результате комплекса проведённых исследований были выделены 6 изолятов бактериофагов Pseudomonas chlororaphis, изучены основные биологические свойства и рассмотрены перспективы их применения в целях индикации и идентификации бактерий Pseudomonas chlororaphis методом реакции нарастания титра фага, а также фагоиндикации названного вида бактерий в различных объектах санитарного надзора. Полученные результаты направлены на сокращение сроков выявления возбудителя до 18-24 часов.

Введение

Pseudomonas chlororaphis способна вызывать псевдомоноз рыб [1,2,3]. Гибель и уменьшение темпов роста рыбы наносят значительный экономический ущерб рыбоводческим хозяйствам. Бактериологические методы диагностики псевдомонозов, используемые в настоящее время, являются трудоемкими и продолжительным. Видовое типирование требует выделения чистой культуры возбудителя с дальнейшей поста-

новкой ряда биохимических тестов. Затраты времени могут составлять от 3,5 до 5 суток [3,4].

На основании выше изложенного актуальным является поиск перспективных бактериофагов, специфически инфицирующих Р. сЬ1огогарЬ1з, для индикации бактерий в объектах санитарного надзора методом реакции нарастания титра фага (РНФ) [4,5].

Методы фагоиндикации и фагоиден-тификации имеют следующие преимуще-

ф г

X

ш

С

с

о

ъг

га

индикаторная суточная культура 0,1-0,5 мп

иссл едуеь'ыи материал

1-50Г

:оо мл МП Б

5,0 м г

ибрабшка центрифугированием Зт.об/мин., 20мин.

фильтрование ^^

газон индикаторное бактериальной культуры

С пОТ-теСТ

-контоль

Ш

г га о ш

ё §.

га с

и

¡3-

Н

<

газсн индикаторном бактериальной иупьтуры

/

обработка центрифугированием. Зт.об/мин 20мин фильтрование пор = 0.2-0,22 нем) 1

инаик. бэк.

__культура

0.1-0.4 ИЛ

Сп от-тест +

обработка центрифугированием

Зт.об/мин, 20ми н фильтрование

индикаторная суточная культура, 0,2 мл

4.5мл МПБ 4-24 ч . опт Г)

Посев го мето;;у

Грациа

Рис. 1 - Схема выделения и пассирования бактериофагов Р. сЫогогарЫз

ства: не требуют наличия дорогостоящего оборудования и материалов, высококвалифицированных специалистов, реакция нарастания титра фага не требует выделения чистой культуры, позволяет сократить продолжительность исследования до 24 часов, обладает высокой специфичностью и чувствительностью (при применении надлежащих штаммов фагов); с помощью фагов можно осуществлять фаготипирование бактериальных штаммов [5].

Цели исследования: выделение бактериофагов Р. сН1огогар1п15 из водных источников, изучение их биологических свойств, селекция и отбор наиболее перспективных по критериям спектра литической активности и специфичности в целях конструирования

биопрепарата для индикации и идентификации Р. сИ1огогарН15.

Объекты и методы исследований Для выделения бактериофагов Р. сН1огогар1п15 исследовано 30 проб из водных источников Ульяновской области. В качестве индикаторной культуры использовали референс-штамм Р. сН1огогар1п15 В-1246, полученный во Всероссийской коллекции микроорганизмов (г. Пущино).

Первичное выделение бактериофагов проводили методом накопления [5] по усовершенствованной нами схеме, представленной на рисунке 1.

В колбы с 50 мл концентрированного мясопептонного бульона добавляли исследуемую воду в количестве 50 мл, доводя

концентрацию среды до обычной, и 1 мл 18-часовой бульонной культуры индикаторного штамма Р. сН1огогар1п15 В-1246. После 24 часов культивирования при 289С (оптимум роста Р. сН1огогарН1) полученную суспензию в количестве 5 мл переносили в стерильные пробирки и центрифугировали 20 минут при 3000 об/мин. Супернатант фильтровали через бактериальные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм (ММПроге - МППуас). Наличие бактериофагов в фильтрате определяли методом спот-теста. На чашки Петри с мясо-пептонным агаром проводили посев 18-ча-совой бульонной культуры индикаторного штамма Р. сН1огогар1п15 В-1246 сплошным газоном. После подсыхания газона на поверхность агара наносили 20 мкл исследуемого фильтрата. Контроль бактериального загрязнения фильтрата проводили на чашках Петри со стерильным мясопептонным агаром. Посевы просматривали через 24, 36, 48 часов. Присутствие в исследуемом материале бактериофагов определяли по наличию зон лизиса бактериального газона или отдельных негативных колоний в области нанесения капли фаголизата.

Для усиления активности выделенных бактериофагов и для получения чистых линий проводили пассирование с последующим пересевом типичных колоний методом агаровых слоев по Грациа до получения чистых линий бактериофага [5]. Всего для каждого из выделенных бактериофагов проводилось от 5 до 9 последовательных пассажей.

На втором этапе исследований были изучены следующие основные биологические свойства выделенных бактериофагов [7,8]:

- морфология негативных колоний,

-литическая активность,

- спектр литической активности,

- специфичность действия,

- температурная устойчивость.

Литическую активность определяли по

методам Аппельмана и Грациа [6]. Для определения спектра литической активности использовали референс-штамм Р. сН1огогар1п15 В-1246 и выделенные нами ранее 16 поле-

вых штаммов [9,11]. При определении специфичности использовали следующие штаммы: Pseudomonas putida №901 IV-89; АТСС 12633 IV-87, В-1292, В-899, Pseudomonas fluorescens 13525 IV-96, B-896, B-970, В-1470, полученные во Всероссийской коллекции микроорганизмов (г. Пущино), Р. aeruginosa №128, №381, №1677 и 14 штаммов бактерий других родов: Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis, Morganella morganii, Klebssiella pneumoniae, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus spp., Bacillus cereus, E. coli, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia entero-colitica, Stenotrophomonas maltophila, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина».

Результаты исследований

С использованием разработанной схемы было выделено 6 культур бактериофагов P. chlororaphis и изучены их основные биологические свойства [5,7,10]. Полученные бактериофаги на газоне индикаторной культуры образовывали негативные колонии округлой формы диаметром до 1 мм, с прозрачным центром, без зоны вторичного лизиса. Все изучаемые бактериофаги являлись термолабильными, полностью инактивиро-вались после воздействия температуры от 47 до 51?С в течение 20 минут (таблица 1). Литическая активность фагов по методу Грациа составила от 0,8(±0,2) х 103 до 4,0(±0,1) х 107 БОЕ/мл. Спектр литической активности выделенных нами бактериофагов составил от 47,0 до 82,3 % из 17 имеющихся у нас штаммов бактерий вида P. chlororaphis (таблица 2).

Отсутствие лизиса на газоне бактерий гетерологичных родов и видов свидетельствовало о строгой специфичности выделенных бактериофагов по отношению к бактериям P. chlororaphis (таблица 3).

Негативные колонии выделенных бактериофагов имели диаметр от 0,5 мм (PclF-УГСХА, Pcl4F-yrCXA) до 1,0 мм (РсбР-УГСХА, PcllF-УГСХА, Pcl2F-yrCXA, Pc25F-yrCXA), полностью прозрачные, без зоны вторичного лизиса.

Таблица 1

Чувствительность выделенных бактериофагов к температурному воздействию

Штамм бактериофага Температура воздействия,

42 44 45 47 49 51

Титр бактериофагов по Грациа, БОЕ/мл

PclF-УГСХА 1,0(±0,3) х 104 4,9(±0,2) х 103 0,9 (±0,3) х 102 0 0 0

Pc6F-yrCXA 1,2(±0,3) х 104 1,0(±0,3) х 104 0,7(±0,3) х 104 4,9(±0,4) х 103 0,6(±0,4) х 102 0

PcllF-УГСХА 0,7(±0,1) х 107 3,8(±0,2) х 106 0,7(±0,2) х 104 0 0 0

Pcl2F-yrCXA 1,0(±0,2) х 106 2,9(±0,2) х 105 1,0(±0,3) х 105 0,6(±0,3) х 103 0 0

Pcl4F-yrCXA 0,8(±0,2) х 103 3,4(±0,2) х 102 0,6(±0,2) х 102 2,8(±0,2) х 101 0 0

Pc25F-yrCXA 4,0(±0Д)х107 1,2(±0,3) х 107 1,8(±0,3) х 106 1,0(±0,7) х 104 3,1(±0,5) х 102 0

Таблица 2

Различия в свойствах выделенных бактериофагов P. chlororaphis

Свойства Штаммы бактериофагов

PclF-УГСХА Pc6F-yrCXA PcllF-УГСХА Pcl2F-yrCXA Pcl4F-yrCXA Pc25F-yrCXA

Литическая

активность по 1,0(±0,3) х 104 1,2(±0,3) х 104 0,7(±0,1) х 107 1,0(±0,2) х 106 0,8(±0,2) х 103 4,0(±0,1) х 107

Грациа

Спектр литиче-ской активности 52,9 % 76,4 % 82,3% 47,0% 58,8% 76,4%

Таблица 3

Специфичность выделенных бактериофагов

Вид бактерий (колич. штаммов) Штаммы бактериофагов

PclF-УГСХА Pc6F-УГСХА PcllF-УГСХА Pcl2F-УГСХА Pcl4F-УГСХА Pc25F-УГСХА

P. putida (4) - - - - - -

P. aeruginosa (3) - - - - - -

P. fluoresceins (4) - - - - - -

A. hydrophila - - - - - -

P. mirabilis - - - - - -

M. morganii - - - - - -

К. pneumoniae - - - - - -

Salmonella spp. - - - - - -

S. aureus - - - - - -

Streptococcus - - - - - -

B. cereus - - - - - -

E.coli - - - - - -

E. cloacae - - - - - -

C. freundii - - - - - -

Y. pseudotuberculosis - - - - - -

Y. enterocolitis - - - - - -

S. maltophila - - - - - -

Примечание: «-» - отсутствие лизиса.

Выводы

1. В результате проведённых исследований нами было выделено 6 культур бактериофагов P. chlororaphis, изучены их основные биологические свойства.

2. По результатам полученных данных, в целях конструирования биопрепарата для индикации и идентификации P. chlororaphis, наиболее перспективным является бактериофаг PcllF-УГСХА с титром 0,7(±0Д) х 107 БОЕ/мл, спектром литической активности 82,3% и выраженной специфичностью в отношении бактерий P. chlororaphis.

Библиографический список

1. Hatai, К. Pseudomonas chlororaphis as а Fish Pathogen. Bulletin of the Japenese Society of Scientific Fisheries. 1975. Volume 41:11. P. 1203

2. Anzai, et al.; Kim, H; Park, JY; Waka-bayashi, H; Oyaizu, H (2000, Jul). Phylogenese affiliation of the pseudomonads based on 16S rRNA sequence. Int J Syst Evol Microbiol 50 (4): 1563-89.

3. Методические указания по лабораторной диагностике псевдомоноза рыб. Ут-верждёны Департаментом ветеринарии Министерств сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации 22.09.1998. N 13-4-2/1403.

4. Palleroni N. Genus I. Pseudomonas. In Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 2nd edition. 2005. Volume 2. p. 323-379.

5. Викторов, Д.А. Усовершенствование методов выделения, идентификации и индикации бактерий Pseudomonas putida : автореферат дис. ... канд. биологических наук / Д.А.Викторов. - Саратов, 2011. - 22 с.

6. Характеристика биологических

свойств бактериофагов вида Bacillus subtilis / Д.А. Васильев, С.Н. Золотухин, И.Н. Хай-руллин, H.A. Феоктистова, А.И. Калдырка-ев, М.А. Юдина, А.Х. Мустафин // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - 2011. - N° 1 (13). -С.79-83.

7. Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации псевдомоноза рыб. Утверждёны Департаментом ветеринарии Министерств сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации 18.09.1998. N 13-4-2/1394.

8. Васильев, Д.А. Выделение бактериофагов бактерий Pseudomonas putida и их селекция в целях создания биопрепарата для диагностики псевдомоноза рыб / Д.А. Васильев, Д.А. Викторов, И.И. Богданов // Естественные и технические науки. - 2011. -№2(52).-С. 79-82.

9. Викторов, Д.А. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов Pseudomonas fluorescens / Д.А. Викторов, А.М. Артамонов, Д.А. Васильев // Ветеринария и кормление. «ВЕТКОРМ» .-2012. - №5. -С. 8-9.

10. Золотухин Сергей Николаевич. Создание и разработка схем применения диагностических биопрепаратов на основе выделенных и изученных бактериофагов эн-теробактерий : автореферат дис. ... доктора биологических наук / С.Н. Золотухин. "Ульяновск, 2007.-39 с.

11. Гринева, Т.А. Схема выделения Pseudomonas chlororaphis / Т.А. Гринева, Д.А. Викторов, Д.А. Васильев // Вестник ветеринарии. - Ставрополь: «Энтропос», 2013. -№64(1/2013).-С. 18-20.