Способ диагностики обструкции бронхов у реципиентов легочного трансплантата
METHOD FOR DIAGNOSING BRONCHIAL OBSTRUCTION IN LUNG TRANSPLANT RECIPIENTS

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантации органов и клинической лабораторной диагностике, может быть использовано при мониторинге состояния реципиентов легких для диагностики обструкции бронхов трансплантированных легких.
Стабильно возрастает ежегодное количество выполняемых трансплантаций легких (ТЛ) во всем мире. Развитие программы ТЛ содействовало решению новых задач - обеспечение длительного выживания и улучшения качества жизни пациентов с трансплантированными легкими. Одним из основных патологических факторов, ограничивающих отдаленную выживаемость реципиентов после ТЛ, выступает хроническая дисфункция трансплантированных легких, гетерогенность механизмов которой привела к формированию новой классификации данной патологии.
Диагностика и лечение дисфункции трансплантата, ассоциированной с развитием обструктивных изменений дыхательных путей, представляются крайне сложной задачей ввиду отсутствия явных признаков данного патологического процесса на ранних стадиях, таким образом, раннее выявление риска ее развития позволит эффективно корректировать стратегию лечения до наступления необратимых структурных изменений.
Для стратификации риска необходимы надежные биомаркеры характерных признаков, позволяющих диагностировать развитие патологии; к числу таковых относятся обструкция бронхов, отражающая течение обструктивных процессов в тканях трансплантата.
Разработка малоинвазивных методов выявления признаков посттрансплантационных осложнений и поиск новых биомаркеров, сигнализирующих об их развитии после трансплантации легких, направлена на повышение качества и продолжительности жизни реципиентов легких до уровня, соответствующего показателям при трансплантации других солидных органов.
В настоящее время ведутся активные исследования биологических агентов, способных быть индикаторами риска негативных событий, связанных с развитием обструктивных процессов, приводящих к хронической дисфункции легочного трансплантата.
МикроРНК - это семейство малых эндогенных некодирующих одноцепочечных РНК длиной от 18 до 25 нуклеотидов, выступающих в качестве посттранскрипционных регуляторов, играющих ключевую роль во множестве биологических процессов. Исследования последних лет позволили выявить участие микроРНК в развитии и дифференцировке кроветворных клеток, пролиферации и апоптозе, нарушениях обмена веществ, аутоиммунных заболеваниях, канцерогенезе и отторжении трансплантированных органов; в том числе в развитии воспалительных процессов в легких [MicroRNAs in the lung / A. Sittka, B. Schmeck. // Adv Exp Med Biol. - 2013. - Vol. 774. - P. 121-134].
Показана роль микроРНК в патогенезе хронической обструктивной болезни легких [Preliminary studies: differences in microRNA expression in asthma and chronic obstructive pulmonary disease / M. Pietrusinska, A. Pajak, P. Gorski et al. // Postepy Dermatol Alergol. - 2016. - 33(4). - P. 276-280].
В ряде работ отмечается участие микроРНК-339 при раке легких в качестве ингибитора пролиферации клеток [MicroRNA-339 inhibits human hepatocellular carcinoma proliferation and invasion via targeting ZNF689 / Hui Zeng, Jiaping Zheng, Song Wen et al. // Drug Des Devel Ther. - 2019. Vol. 13. - P. 435-445.].
Одним из новых профиброгенных биомаркеров является галектин-3, относящийся к семейству лектинов и играющий важную роль в регуляции процессов воспаления, иммунного ответа, дегенерации нервной ткани и фиброза. Через активацию фибробластов, прежде находящихся в покое, галектин-3 секретируется в поврежденном участке и способствует фиброзированию ткани.
Галектин-3 может иметь прогностическое значение в отношении развития идиопатического легочного фиброза и структурных изменений дыхательных путей. Отмечается повышение концентрации галектина-3 в плазме крови пациентов на ранних доклинических стадиях фиброза и ассоциировано со снижением показателей функции легких и нарушениями газообмена [Galectin-3 is associated with restrictive lung disease and interstitial lung abnormalities / Jennifer E. Ho, Wei Gao., Daniel Levy et al. // Am J Respir Crit Care Med. - 2016. - 194 (1): 77-83].
Галектин-3 выступает в качестве перспективного биомаркера модуляции ремоделирования дыхательных путей при заболеваниях бронхолегочной системы. У пациентов с тяжелой формой бронхиальной астмы в образцах бронхиальной биопсии выявлена связь между уровнем галектина-3 и изменением толщины ретикулярного слоя базальной мембраны, являющейся объективным отражением тяжести заболевания [Galectin-3: an early predictive biomarker of modulation of airway remodeling in patients with severe asthma treated with omalizumab for 36 months / Riccio A.M., Mauri P., De Ferrari L. et al. // Clin Transl Allergy. - 2017. - 7: 6].
На сегодняшний день объективными методами верификации степени и характера структурных изменений дыхательных путей легочного трансплантата являются трансбронхиальная биопсия и рутинные методы рентгенологической и эндоскопической визуализации [Early identification of chronic lung allograft dysfunction: the need of biomarkers / Tissot A., Danger R., Claustre J., Magnan A. and Brouard S. // Front. Immunol. - 2019. - 10:1681] - (прототип). Мультиспиральная компьютерная томография является одним из самых эффективных неинвазивных методов диагностики обструктивных процессов бронхолегочной системы, однако будучи разновидностью рентгенологических исследований, имеет ряд противопоказаний и ограничений в применении. Методика выполнения видеобронхоскопии и трансбронхиальной биопсии отличается инвазивностью, что становится существенным недостатком данных видов исследований.
Трансбронхиальная биопсия выполняется в сроки после трансплантации, предусмотренные протоколом, а также при проявлении признаков нарушения функции трансплантированных легких. Однако трансбронхиальная биопсия имеет ряд ограничений и рисков, характерных для инвазивных методов диагностики. Получение биоптата подразумевает исследование локального участка трансплантата, что не гарантирует исчерпывающей характеристики состояния всего органа [Characteristic patterns in the fibrotic lung. Comparing idiopathic pulmonary fibrosis with chronic lung allograft dysfunction / Fernandez I. E., Heinzelmann K., Verleden S., Eickelberg O. // Ann Am Thorac Soc. - 2015. - №12. - Vol. S1. - P. 34-41]. Трудоемкость реализации и высокий риск осложнений при применении данного метода подтверждаются многочисленными публикациями как отечественных, так и зарубежных исследователей.
Очевидна необходимость разработки новых неинвазивных диагностических технологий, позволяющих не только выявить наличие обструктивных изменений бронхов у реципиентов после трансплантации легких, но и осуществлять мониторинг и раннюю диагностику развития обструктивных процессов с возможностью эффективной коррекции.
Нами поставлена задача - разработать доступный, достоверный способ неинвазивной диагностики обструктивных процессов в бронхиальных путях у реципиентов после трансплантации легких.
Технический результат, достигаемый при осуществлении изобретения, заключается в обеспечении неинвазивности диагностики, снижении ее трудоемкости и времени проведения, доступности ранней диагностики развития обструктивных процессов бронхов у реципиентов трансплантированных легких при одновременном достижении эффективной диагностики бронхиальных осложнений у данного контингента пациентов, а также повышении ее объективности за счет возможности вынесения суждения с учетом показателя, отражающего состояние всего трансплантата.
Предлагаемый способ позволяет повысить выживаемость пациентов с трансплантированными легкими и улучшить результаты трансплантации за счет своевременного определения показаний к выполнению трансбронхиальной биопсии и коррекции терапии путем определения уровня экспрессии микроРНК-339 и концентрации галектина-3 в плазме венозной крови.
Нами эмпирически установлен диагностически эффективный показатель развития обструктивных изменений бронхов легочного трансплантата, основанный на оценке уровня экспрессии микроРНК-339 и концентрации галектина-3 в плазме венозной крови реципиента трансплантированных легких.
Использование предполагаемого теста позволяет ограничить круг пациентов, которым требуется проведение инвазивных методов трансбронхиальной биопсии для уточнения диагноза обструктивных изменений трансплантированных легких.
Сущность изобретения состоит в следующем.
Для диагностики обструкции бронха у реципиента трансплантированного легкого/легких определяют в плазме его венозной крови уровень концентрации галектина-3 и экспрессии микроРНК-339 по формуле
-(Ct1-Ct2)
Э=2,
где
Э - уровень экспрессии микроРНК-339,
Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-339,
Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39.
При и концентрации галектина-3 более 11,7 нг/мл и величине Э более 0,02 диагностируют наличие обструкции бронха легочного трансплантата.
Способ осуществляется следующим образом.
В качестве материала для исследования концентрации/уровня экспрессии биомаркера используется плазма венозной крови. Взятие крови для исследования производят, как правило, одновременно с плановым обследованием пациентов.
Кровь собирают в одноразовые пробирки с антикоагулянтом ЭДТА (BD Vacutainer, Becton Dickinson, США) и центрифугируют в течение 10 минут при 3500/1500 g оборотах при комнатной температуре. Полученную плазму замораживают и хранят при температуре -20°С.
Определение уровня экспрессии микроРНК-339 и концентрации галектина-3 проводят с использованием реагентики, входящей в состав наборов и в соответствии с прилагаемой к ним инструкцией.
Уровень экспрессии микроРНК-339 определяют методом полимеразной цепной реакции, например, с помощью наборов реагентов SerumPlasma (Qiagen, США).
8
РНК выделяют из 100 мкл плазмы крови с использованием наборов SerumPlasma (Qiagen, США). После инкубации плазмы с фенольной смесью Qiazol добавляют 1,6×10 копий синтетической микроРНК Caenorhabditis elegans (Cel-miR-39) (Qiagen) в качестве внутреннего контроля экстракции РНК.
Выделенные образцы с тотальной РНК конвертируют путем проведения реакции обратной транскрипции в кДНК: при t°=37°C в течение 60 минут с последующей инкубацией при 95°С в течение 5 минут, охлаждением на льду и доведением объема образца деионизированной водой до 200 мкл. Далее для выявления исследуемых микроРНК выполняют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с детекцией в режиме реального времени. Условия реакции ПЦР: 15 минут при t°=95°С с последующим проведением 40 циклов по 15 секунд при t°=94°C, 30 секунд при t°=55°C и 30 секунд при t°=70°C в амплификаторе.
Значение уровня экспрессии микроРНК исследуемых образцов плазмы венозной крови выражают в относительных единицах (отн. ед.) и рассчитывают по формуле
-(Ct1-Ct2)
Э=2,
где
Э - уровень экспрессии микроРНК-339,
Ct1 - значение порогового цикла ПЦР для образца микроРНК-339 (то есть значение порогового цикла микроРНК-339 на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе),
Ct2 - значение порогового цикла ПЦР для внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39 (то есть значение порогового цикла внутреннего контроля, представленного Cel-miR-39, на анализаторе нуклеиновых кислот или амплификаторе).
Концентрация галектина-3 может быть измерена иммуноферментным методом, например, с помощью наборов реагентов Human Galectin-3 Platinum ELISA (Bender MedSystems GmbH, Vienna, Austria).
Определение проводят с использованием реагентики, входящей в состав наборов и в соответствии с прилагаемой к ним инструкцией. В подготовленные для работы планшеты с фиксированными на дне лунок моноклональными антителами к галектину-3, добавляют заранее подготовленные калибраторы, контроли и разведенные в 2 раза буфером образцы плазмы венозной крови пациентов. Инкубируют микропланшет при комнатной температуре (18-25°С) в течение 60 минут при встряхивании в термо-шейкере со скоростью 400 оборотов в минуту. После четырехкратного отмывания планшета от несвязавшихся компонентов реакции в каждую лунку вносят по 100 мкл рабочего раствора конъюгата (стрептавидин-HRP). Инкубируют планшет при комнатной температуре (18-25°С) в течение 60 минут при встряхивании со скоростью 400 оборотов в минуту.
Для выявления ферментной метки в планшет вносят по 100 мкл субстрата, предварительно отмыв 4-х кратно планшет. Время инкубации составляет 30 минут в темноте. Реакцию останавливают с помощью стоп-реагента, также предусмотренного производителем набора (по 100 мкл в лунку). Интенсивность изменения цвета реагентной смеси прямо коррелирует с концентрацией галектина-3 в исследуемом образце. Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 450 нм.
У реципиентов легких с величиной экспрессии микроРНК-339 Э выше 0,02 отн. ед. и концентрацией галектина-3 выше 11,7 нг/мл в плазме венозной крови определяют наличие обструкции бронха/бронхов после трансплантации.
Для доказательств возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим следующие данные.
Пример 1
Пациенту Б., 45 лет, выполнена последовательная двусторонняя трансплантация легких. Послеоперационный период протекал гладко. Измеренный на 441 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-339 в плазме венозной крови составил 0,46 отн. ед., концентрация галектина-3 составила 25,8 нг/мл. В соответствии с предлагаемым способом у пациента диагностировано развитие обструкции бронхов трансплантированных легких. Методом видеобронхоскопии был выявлен рубцовый стеноз нижнедолевого бронха левого легкого. Проведена коррекция иммуносупрессивной терапии, назначено лечение по показаниям.
Пример 2
Пациенту М., 56 лет, выполнена последовательная двусторонняя трансплантация легких. В течение периода наблюдения (с первых суток и до 1,5 года после трансплантации) послеоперационный период протекал без осложнений. Измеренный на 273 сутки после операции уровень экспрессии микроРНК-339 в плазме крови составил 0,004 отн. ед., концентрация галектина-3 составила 1,66 нг/мл. По результатам рентгенографического исследования органов грудной клетки признаков обструкции бронхов трансплантата не выявлено.
Предложенный способ апробирован в клинической практике на 17 реципиентах легких. Величина экспрессии микроРНК-339 после трансплантации выше установленного нами порогового значения - 0,02 отн. ед. и концентрации галектина-3 более 11,7 нг/мл установлена у 6 реципиентов легких, у 5 (83,3%) из них развились бронхиальные осложнения после трансплантации, связанные с обструкцией бронха, что подтверждено результатами рентгенологического, эндоскопического и функциональных исследований. Чувствительность предлагаемого способа диагностики составила 83,3%, его специфичность - 81,8%. Диагностическая эффективность разработанного способа составила 82,4%.
Использование в клинической практике патентуемого способа дает возможность у реципиентов трансплантированных легких диагностировать течение обструктивных процессов в бронхах, приводящих к дисфункции легочного трансплантата.