СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ХРОНИЧЕСКОЙ ТОКСИЧЕСКОЙ НЕФРОПАТИИ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ
METHOD FOR MODELING OF CHRONIC TOXIC NEPHROPATHY IN EXPERIMENTAL ANIMALS

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано для моделирования хронической токсической нефропатии у экспериментальных животных.
Человек в повседневной жизни довольно часто встречается с сурьмой, в виду чего встает вопрос о безопасности ее применения для популяции людей и окружающей их среды. Сурьма используется в процессе производства различных бытовых предметов, таких как, например, свинцовые аккумуляторные батареи, краски, в тормозных накладках в качестве смазки. (Sundar S., 2010, Bredsdorff L. 2015).Препараты сурьмы глюкантим (меглюминаантимониат) и пентостам (стибоглюконат натрия), используются в лечении лейшманиоза - инфекционного заболевания, возбудителем которого является внутриклеточный паразит рода Leishamania. (Шекеева К К. 2017, Oliveira L.F.G., 2017).
Вместе с тем, сурьма может оказывать токсическое воздействие практически на все внутренние органы. Описана способность вызывать повреждение, дегенерацию и воспаление миокарда и эпикарда (BalzanM, FenechF. AcuterenalfailureinvisceralleishmaniasistreatedwithsodiumStibogluconate // TransRSocTropMedHyg. 1992. №86. 515.; Kimutai R, Musa AM, Njoroge S, et al. Safety and Effectiveness of Sodium Stibogluconate and Paromomycin Combination for the Treatment of Visceral Leishmaniasis in Eastern Africa: Results from a Pharmacovigilance Programme // Clin Drug Investig. 2017. №37(3). 259-272. doi:10.1007/s40261-016-0481-0), дерматит (Рыбкина Т.И. 1999; SundarS. 2010), также при воздействии высоких доз сурьмы происходит снижение количества эритроцитов и тромбоцитов (PoonR. 1998).
Почки являются одним из основных органов выведения тяжелых металлов из организма, и являются основным органом их токсического воздействия. Актуальной является проблема создания удобной модели хронической токсической нефропатии, для разработки эффективных способов профилактики и лечения хронической интоксикации соединениями сурьмы.
В научной литературе содержится недостаточное количество информации о действие сурьмы на водно-солевой обмен и функцию почек, отдельные наблюдения противоречивы.
Есть данные, указывающие на способность сурьмы вызывать повышение уровня мочевины крови, креатинина (VikrantS., GuptaD., KaushalSS. Sodium stibogluconate-associated acute interstitial nephritis in a patient treated for visceral leishmaniasis // Saudi J Kidney Dis Transpl. 2015. №26(4). 757-60. doi: 10.4103/1319-2442.160203. PMID: 26178551; Kashani M. N. 2007); Rashedy Ahmed H., Solimany Adnan A., Ismail Ayman K., Wahdan Mohamed H., Saban Khalid A. Histopathological and functional effects of antimony on the renal cortex of growing albino rat // International Journal of Clinical & Experimental Pathology. 2013. №6(8). 1467-1480).
Другими авторами описано снижение активности щелочной фосфатазы и креатинина после воздействия на организм сурьмы. (Poon R., Chu I., Lecavalier P., Valli V.E., Foster W., Gupta S., Thomas B. Effects of antimony on rats following 90-day exposure via drinking water. FoodChemToxicol. 1998 Jan;36(l):21-35.).
Эти факты обозначили целесообразность использования соединений сурьмы для создания модели хронической токсической нефропатии.
Известен метод развития токсической нефропатии (RashedyAH, SolimanyAA, IsmailAK, WahdanMH, SabanKA. Histopathological and functional effects of antimony on the renal cortex of growing albino rat. Int J ClinExpPathol. 2013; 6(8):1467-1480. Published 2013 Jul 15.) путем введения трисульфида сурьмы самцам крыс в дозе 6 мг / кг ежедневно в течение 8 и 12 недель с питьевой водой.
Недостатком данного метода является то, что автор использовал нерастворимое в воде вещество, поэтому неизвестно какой объем сурьмы попадал в организм крыс.
Наиболее близким к заявляемому является метод с введением глюкантима (меглуминантимониат) или пентостама (стибоглюконат натрия) (VeigaJP, KhanamR, RosaTT, JunqueiraJuniorLF, BrantPC, RaickAN, FriedmanH, MarsdenPD. Pentavalent antimonial nephrotoxicity in the rat. Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 1990 Jul-Aug; 32(4):304-9. doi: 10.1590/s0036-46651990000400012. PMID: 2101525.). Крысам вводилась доза 30 мг глюкантима на 100 мг веса в день в течение 30 дней. Автором описаны изменения в работе почек, выражающиеся в нарушении концентрирующей способности мочи. Такие нарушения выражались значительно более низкими значениями осмоляльности мочи по сравнению с базовыми значениями до приема препаратов. Снижение осмоляльности мочи было связано со значительным увеличением потока мочи и отрицательным клиренсом свободной воды. Осмолярный клиренс и фракционная экскреция натрия не изменились.
Недостатком данного способа является то, что воздействие сурьмы на организм в течение короткого времени (один месяц) не позволяет получить способ профилактики хронической сурьмяной нефропатии. Эксперимент проводимый в течение двух месяцев является более приближенным к натуральным условиям, моделирует поступление сурьмы в организм с пищей и водой из окружающей среды в условиях антропогенного загрязнения. Более информативно в разные сроки (один и два месяца) в динамике, изучение механизмов развития нефропатии. Известно, что разные соединения сурьмы обладают разными биологическими свойствами и токсичностью, некоторые используются даже в медицине (BalzanM, FenechF. AcuterenalfailureinvisceralleishmaniasistreatedwithsodiumStibogluconate // TransRSocTropMedHyg. 1992. №86. 515).
Цель предлагаемого изобретения - создание модели хронической токсической нефропатии.
Решение этой задачи позволяет расширить представление о действии избытка сурьмы на организм, повреждающем действии на структуру почечной ткани и ее функции при длительном воздействии хлорида сурьмы, позволяет создать способ моделирования хронической токсической нефропатии, повышающий воспроизводимость, удобный для проведения эксперимента на животных и экономически выгодный.
Для достижения этого технического результата заявляемое изобретение способа моделирования хронической токсической нефропатии включает следующие существенные признаки: в качестве токсического вещества используют раствор хлорида сурьмы, вводимый через зонд в желудок один раз в сутки ежедневно в течение двух месяцев в дозе 3 мг/кг в пересчете на металл, где на единицу раствора равную 1 мл приходится 0,3 мг сурьмы.
Предлагаемый способ отличается от прототипа использованием токсического вещества - хлорид сурьмы, а также длительностью введения для создания модели хронической токсической нефропатии. Между отличительными признаками заявляемого изобретения и техническим результатом существует следующая причинно-следственная связь: длительное введениераствора хлорида сурьмы в дозе 3 мг/кг приводит к возникновению хронической токсической нефропатии, что является более удобной и приближенной к натуральным условиям моделью.
По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».
По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа моделирования хронической токсической нефропатии, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».
Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использован в эксперименте с получением результата, заключающегося в эффективноми легко воспроизводимом способе развития хронической токсической нефропатии, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».
Данный способ осуществляется следующим образом.
3+
Для получения токсического вещества хлорид сурьмы растворяется в дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 0,3 мг вещества. На каждые 100 г. веса крысы вводится 1 мл раствора (0,3 MrSb), что не является водной нагрузкой на организм животного. Раствор хлорида сурьмы вводится через зонд в желудок каждый день в течение двух месяцев.
По истечении времени эксперимента (60 дней) крысы забиваются с использованием тиопенталового наркоза для исследования плазмы крови и тканей. Функциональное состояние почек оценивается с применением общепринятых методов исследования (Наточин Ю.В. Физиология почки: формулы и расчеты. Л. «Наука». 1974. - 56 с.), с использованием биохимических наборов реагентов для исследования мочи и плазмы крови фирмы «Ольвекс» и «Агат-Мед», Россия на спектрофотометре «Solar» (Беларусь).
Для проведения гистологических исследований образцы тканей почки фиксируются в 10% нейтральном формалине, после чего подвергаются заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 4-5 микрон. Срезы окрашиваются гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводится в проходящем свете при помощи микроскопа ZeissPrimoStar под увеличением 40×100×400.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью программ MICROSOFT EXCEL и «STATISTICA». Данные были представлены в виде медианы (Me) и [Q25÷Q75] интерквартильного размаха. Различия между показателями в экспериментальных группах определяли с применением U-критерия Манна Уитни. Различия считались достоверными при р<0,05.
Сущность способа подтверждается результатами исследования функционального состояния почек (нарушения электролито-водовыделительнойфункции почек, протеинурия) и морфологического исследования тканей почки, демонстрирующих развитие токсической нефропатии.
Фиг. 1. - Ткань почек при хронической интоксикации сурьмой.
Краткое описание чертежа: (а)- свободные эозинофильные белковые массы в полости капсулы Боумена-Шумлянского с увеличением ее просвета, (б) признаки компрессии капиллярного аппарата на фоне гидропической дистрофии эндотелия, (в) почечные канальцы с выраженной гиалиново-капельной белковой дистрофией и частичным некрозом эпителия, в просветах определяются эозинофильные белковые массы, строма отечная, сосуды с признаками гиалиноза. кр. эозином и гематоксилином, х 400.
Пример 1.
Крысам-самцам линии Вистар массой 300-350 г вводили раствор хлорида сурьмы через атравматичный зонд в желудок в дозе 3 мг/кг каждый день в течение одного (10 крыс) и двух месяцев (10 крыс). Конролем служили интактные крысы. Животные в период исследований содержались на обычном рационе в условиях свободного доступа к пище и воде, с естественным световым режимом.
Изучение основных процессов мочеобразования, анализ содержания электролитов в крови (натрия, калия и кальция) и их почечной обработки проводили в условиях спонтанного 6-часового диуреза через один и два месяца. Для изучения функции почек в условиях спонтанного диуреза животные помещались в обменные клетки, где в течение 6 часов у них производился сбор мочи.
После окончания эксперимента эвтаназия крыс производилась под тиопенталовым наркозом для исследования плазмы и тканей. Содержание натрия и калия в биологическом материале определяли ионселективным методом на анализаторе электролитов «АЭК-1», Кверти-Мед, Россия.
Концентрацию кальция и креатинина в моче и плазме крови, общего белка в моче определяли спектрофотометрически. Измерения выполнялись на спектрофотометре «PV1251C», Solar, Беларусь.
Расчеты скорости клубочковой фильтрации, величины канальцевой реабсорбции воды, экскреции натрия, калия, кальция, фильтрационного заряда катионов и относительной канальцевой реабсорбции натрия, кальция производились по формулам Ю. В. Наточина (1974).
Эксперименты осуществляли в соответствии с «Международные рекомендации по проведению медикобиологических исследований с использованием лабораторных животных» (1985), 11-ой статьей Хельсинской декларации Всемирной медицинской ассоциации и правилами лабораторной практики в РФ (приказ МЗ РФ от 01.04.2016 г. №199).
Опыты показали, что при внутрижелудочном введении хлорида сурьмы в дозе 3 мг/кг массы тела в течение одного и двух месяцев выявляется нарушение процессов мочеобразования. Через один месяц экспериментов у крыс происходило достоверное увеличение объема 6-часового спонтанного диуреза (р<0,001) вследствие уменьшения относительной канальцевой реабсорбции воды (р<0,001) (Таблица 1.).
Через 2 месяца объем диуреза снижался как относительно одного месяца интоксикации, так и относительно контроля (р<0,001), вследствие снижения скорости клубочковой фильтрации (р<0,001), несмотря на достоверное уменьшение канальцевой реабсорбции воды (р<0,01), но существенно меньшее, чем через 1 месяц. Нарушения деятельности почек проявлялись выраженной протеинурией как через 1 месяц интоксикации, так, особенно, через 2 месяца, когда содержание белка в моче возрастало в 7 раз (р<0,001).
Изучение электролитовыделительной функции почек выявило увеличение экскреции натрия через один месяц вследствие понижения канальцевой реабсорбции катиона. Вместе с тем через два месяца на фоне снижения канальцевой реабсорбции экскреция натрия от контрольных значений достоверно не отличалась, вероятно вследствие развивающейся патологии клубочкового аппарата. Уменьшение фильтрационного заряда натрия было обусловлено уменьшением скорости клубочковой фильтрации воды и уменьшением концентрации катиона в плазме крови.
Экскреция калия увеличивалась через один месяц экспериментов, вероятно, из-за тенденции к увеличению фильтрационного заряда и вследствие изменения канальцевой обработки катиона в условиях гиперкалиемии.
Повышению содержания калия в плазме могло также способствовать и развитие некробиотического процесса в ткани почек. Через два месяца эксперимента росту содержания калия в плазме крови способствовало падение фильтрационного заряда катиона.
Экскреция кальция с мочой достоверно возрастала через один месяц, что было обусловлено уменьшением канальцевой реабсорбции катиона. Более длительное воздействие нефротоксиканта через два месяца также вызывало подавление канальцевой реабсорбции катиона, но при одновременном уменьшении фильтрационной загрузки нефронов изменений в экскреции кальция не выявлялось (таблица).
Функциональные изменения почек при хронической интоксикации подтверждались данными гистологических исследований, выявившими признаки токсической нефропатии (Фигура 1.). У крыс с введением хлорида сурьмы в течение двух месяцев отмечалось (а) появление свободных эозинофильных белковых масс в полости капсулы Боумена-Шумлянского с увеличением ее просвета и (б) признаками компрессии капиллярного аппарата на фоне гидропической дистрофии эндотелия. Почечные канальцы с выраженной гиалиново-капельной белковой дистрофией и частичным некрозом эпителия, в просветах определяются эозинофильные белковые массы (в). Строма отечная, сосуды с признаками гиалиноза.
Предлагаемый способ моделирования хронической токсической нефропатии является эффективным, позволяет изучать эту патологию в динамике развития и может способствовать разработке и поиску средств для лечения и профилактики хронической токсической нефропатии.