СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ОБЛИГАТНЫХ ПРЕДРАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И CA IN SITU
METHOD FOR DIAGNOSTICS AND TREATMENT OF OBLIGATE PRECANCER DISEASES AND CA IN SITU

Известно, что раковые заболевания занимают одно из ведущих мест среди других нозологии. По данным ряда исследователей в области медицинской статистики смертность от онкологической патологии занимает второе место, уступая лишь сердечно-сосудистым заболеваниям. Ведущим путем решения данной проблемы в настоящее время является выявление начальных форм онкологических заболеваний. Это способствовало уменьшение смертности, но радикально это проблему не решило.
Рутинные методы исследования, которые проводятся в 1 фазе исследования- ФГДС. ФКС, ФБС, УЗИ, МСКТ и МРТ позволяют установить проблемный орган.
ФГДС, ФБС, и ФКС являются оптическими методами, которые позволяют выявить визуально патологию органов дыхания и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ). УЗИ позволяет получить информацию посредством оценки данных вследствие анализа информации от отраженных ультразвуковых волн. МРТ - современный диагностический метод, обеспечивающий глубокую визуализацию внутренних органов и тканей. Метод базируется на явлении магнитного резонанса различных электромагнитных полей в организме. Источником резонанса во время исследования выступает организм обследуемого. Томограф фиксирует слабые радиосигналы, исходящие от различных структур исследуемой области. Зарегистрированные сигналы записывают специальный компьютер и преобразует их в томограммы - снимки с изображением обследуемого участка тела. МРТ выполняет послойное сканирование органов и тканей.
МСКТ - в основе метода заложено сочетание спиральной компьютерной томографии и многорядной системы принимающих датчиков. Аппараты МСКТ снабжены одной или двумя рентгеновскими трубками, устройствами для принятия сигнала неподвижной кушетки. При запуске сканирования стол пациентки начинает непрерывно перемещаться внутрь гентри с заданной скоростью. Рентгеновская трубка вращается вокруг исследуемого объекта на 360 градусов и испускает лучи, которые проходят сквозь тело больного к датчикам, расположенных на противоположной стороне. Рентгеновские лучи поглощаются тканями в разной степени. Датчики регистрируют ослабление сигнала, затем передают информацию на станцию обработки и анализа.
Ограничение рутинных методов исследования является тот факт, что данные технологии не обеспечивают определение некоторых форм рака на начальном этапе развития. Классическим примером является инфильтративный рак желудка, который практически невозможно обнаружить на начальной стадии -0-1 стадия, что характерно для европейской формы рака желудка.
Новую тактику предложили американский ученый Cassasent (2015) и российский врач В.А Хайленко (2018), которые доказали принципиальную общность в мутациях доброкачественных и злокачественных опухолей. По современным концепциям развития развитие онкологических заболеваний отмечается линейность перехода «нормальная ткань- предопухолевая ткань-са in situ - опухолевая ткань". Предопухолевая ткань подразделяется на факультативный и облигатный предрак. Факультативный предрак- это форма заболевания, которая переходит в рак менее 5% случаев. Облигатный предрак-патология, которая переходит в рак в 80-90% случаев. Са in situ отличается от инвазивного рака тем, что процесс не распространяется через базальную мембрану.
Исследование мутаций в генах TP 53, PIC3CA, NCOA2, ABL2, PDE4DIP, AHNAK, RUNX 1 показало, что вся "злокачественность" возникла уже в предраковом состоянии, до развития способности к инвазии. Это дало толчок к изучению микро-РНК, как предиктора неопластической трансформации (К.А. Гришина, В.А. Хайленко, 2018). Выделяют несколько механизмов активации пролиферативной активности эпителиальных клеток при предопухолевых состояниях. Первый механизм активации связан с воспалительными цитокинами (интерлейкин -1, фактор некроза опухоли), которые активизируют ядерный фактор транскрипции, определяющей активное клеточное деление. Постоянная низкодозовая продукция фактора некроза опухоли стимулирует активность циклооксигеназы 2 типа - основного фермента биосинтеза простагландина Е2, которые, в свою очередь, поддерживают высокую экспрессию EGF, FGF, VEGF, IGF.
Другой механизм стимуляции пролиферации эпителия осуществляется многочисленными факторами роста. Третий путь стимуляции пролиферации является взаимодействие стероидных гормонов с соответствующими рецепторами приводит к активации транскрипции с увеличением пролиферативной активности. Важно отметить, что риск развития онкологической трансформации ткани молочной железы положительно коррелирует с образованием очаговых пролифератов. Так, при наличии более 3 фокусов атипии рак развивается в 47% случаев, а при наличии 1 фокуса в 25% случаев.
Ведущим звеном в развитии мутаций является передача информации с использованием экзосом, в состав которой входят микро-РНК. Микро-РНК - небольшие молекулы нуклеиновых кислот, способные регулировать экспрессию генов на посттранскрипционном уровне, вызывая деградацию микро-РНК мишеней или нарушение трансляции как специфически так и нет. В последние годы было показано, что микро-РНК являются критическими регуляторами (передача сигналов) глобальной экспрессии мРНК в нормальных и патологических биологических процессах, в том числе и при раке.
Состав микро-РНК- объединенных в онкопанели, позволяет сделать заключение о возможности возникновения онкопатологии. Так, miR-199a-влияя на сверхэкспрессию АроЕ, ответственна за метастазирование, стимулируя ангиогенез; hsa-let-7a-5p увеличивает уровень интегрина В-3, ассоциирован с фактором некроза опухоли (ФНО), в том числе применительно к щитовидной железе, осуществляя контроль пролиферации. MiR-21-5p подавляет PTEN за счет чего происходит активация PI3-K/Akt- пути, что повышает уровень блокирования ФНО путем снижения фактора Тар 63, активируя PI3-K/Akt- пути, что способствует усилению пролиферации. Эмпирическим путем составлена общая онкопанель по определению риска развития рака: miR-199a-3p, miR-214-3р, miR25, miR26a, miR99a, miR -184, miR-222-3р, let-7a-5p, miR 24-3p, miR-195, miR-21-5p, miR-155. Повышение или понижение активности данных микро-РНК может свидетельствовать о риске развития рака. Выделение микро-РНК проводится по следующей методике: в образец добавляют 5 мкМ протеиназы К, ингибируя при 56 градусов Цельсия в течение 1 часа, затем используют колонки Exigon для очистки микро-РНК-образец наносят на колонку, после чего проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге Eppendorf 5104, затем колонку 3 раза промывают промывочным буфером, после каждого промывания проводят центрифугирование при 2000 g на центрифуге 5104 после чего проводят реакцию обратной транскриптазы (Exigon), для этого к 8 мкл образца добавляют 8 мкл реагента и инкубируют в течение 1 часа при температуре 60 градусов Цельсия, после чего реакцию останавливают нагреванием до 95 градусов Цельсия в течение 5 минут. Затем проводят полимеразную цепную реакцию с детекцией в реальном времени на приборе 7500 Applied Biosystems с праймерами на следующие микро-РНК: hsa-miR-199a, hsa-miR-214-3р, miR-25, miR-26a, hsa-let-7a-5p, miR-99a, miR-184, miR- 24-3р, микро-PHK-195, hsa-miR-21-5p, has-miR-195.
Результаты анализируются с помощью компьютерной программы GenEx qPCR software и оформляют в виде таблицы (см. таб.1 - распределение микро-РНК, выделенной из ватного зонда с биологической жидкостью). Концентрация представлена как log основанием 2 копий микро-РНК в микролитре
Превышение нормы на 1,5-2 единицы - это незначительное повышение, на 2-5 повышение, на 5 и более-значительное повышение.
Микро-РНК представляет собой « глобальный переключатель генома», регулирующие множественные метаболические пути и образование белковых продуктов. Доказано, что ряд микро-РНК имеют онкогенное действие, к которым относят микро-РНК-21,155,182,10b, 27а, 9. Уровни ряда микро-РНК изменяются при доброкачественной патологии. Поданным Chan, экспрессия miR 221/222 относят к онкогенным микро-РНК, сверхэкспрессия которых в разных типах опухолей приводит к усилению клеточной пролиферации, ингибирование апоптоза, индукции ангиогенеза. Подавление и низкий уровень экспрессии miR 221/222 в опухолях молочной железы коррелирует с положительным статусом эстрогенных рецепторов и более благоприятным прогнозом заболевания.
Следовательно, блокирование механизмов патологического ангиогенеза, повышение дифференцировки онкологических клеток и стимуляция механизмов апоптоза и геморрагического некроза опухоли способствует регрессу тех облигатных предопухолевых процессов и са in situ, которые способны перейти к инвазивным злокачественным процессам. Наше внимание привлекло использование рефнота, лазерной фотоиммунотерапии (ФИТ) и таурина.
Прототипом нашей работы является диссертация В.В. Козлова, в которой изучено несколько микро-РНК у пациенток с диагнозом: фиброаденома молочной железы. Изучались микро-РНК 21,155, 221, 222, 205. Автором отмечено десятикратное увеличение микро-РНК, индуцирующих апоптоз и клеточный рост. В отличии отданной работы мы увеличили платформу исследуемой микро-РНК, включив в нее микро-РНК 136,137,196 а-3р, hsa-let-7a-5p, hsa-miR -21-5р, роль которых отражается прежде всего в индикации противоопухолевых возможностей организма, позволяет получить более информативный анализ резистентности организма к опухолевой агрессии, что повышает диагностическую ценность исследований.
Рефнот - препарат, который обладает противоопухолевым действием. Это проявляется прямым воздействием на опухолевую клетку через рецепторы на ее поверхности, что приводит к апоптозу данной клетки или аресту ее клеточного цикла- локальное действие препарата. Арест клеточного цикла приводит к повышению дифференцировки клетки, что уменьшает ее агрессивность. Действие рефнота стимулирует каскад химических реакций, активирующих коагуляционную систему крови.
Рефнот воздействует на активированные клетки эндотелия и лимфоциты. Это приводит к «геморрагическому некрозу» опухоли. Важным свойством рефнота является повышение противовирусной активности в 1000 раз.
Другим свойством рефнота является способность к блокированию ангиогенеза опухолей. Стимуляция естественных киллеров, клеток, стимулирующих фагоцитоз, активация CD-4 и CD-8 - фактора дифференцировки Т- хелперов и Т-киллеров. Таким образом проявляется системное действие препарата.
Потенциирующим действием для рефнота является Лазерная фотоиммунотерапия в красном диапазоне -одлина волны 662 нм. Клетки с высоким пролиферативным потенциалом используют фотосенсибилизатор как строительный материал в S- фазе деления. Как фотосенсибилизатор мы использовали радахлорин 0,35%. Этот агент не воспринимался клетками как токсический агент. Нормальные интерфазные клетки не нуждаются в тетрапиррольных кольцах. Поэтому основное накопление препарата наблюдается в пролиферирующих клетках-предопухолевых и опухолевых. Наблюдается закономерность-чем агрессивнее пролиферативный процесс, тем выше концентрация Хлорина Е6 в данных клетках. При фотоактивации лазерным излучением длиной волны 662 нм происходит фотохимическая реакция в клетке облигатного предрака. Усиление синтеза ДНК и РНК, увеличение редокс-потенциала, увеличение синтеза и накопления АТФ, высвобождение N0 и активных форм кислорода, изменяется внутриклеточный отклик на действие гормонов, происходит активация эндо-и экзоцитоза, поддерживает уровень ионов кальция в аппарате Гольджи за счет работы Са 2+- АТФ-азы является решающим в регуляции секреции и клеточных контактов.
Таурин-2-аминоэтансульфоновая кислота. Данная аминокислота является конечным продуктом обмена серосодержащих аминокислот. Таурин является основным осморегулятором клетки, мембранным протектором, регулятором внутриклеточного кальция, обладающей свойствами антиоксиданта, детоксикатор, который участвует в обмене жиров и жирорастворимых витаминов, оказывает влияние на воспалительные процессы. Ее важнейшим фармакологическим свойством является проявление активности только в том случае, когда в организме формируется ее дефицит. Данная аминокислота является «предохранителем» при токсичности других лекарственных средств. Это объясняется тем, что отмечается влияние на митохондриальный синтез белка, препятствие развитию окислительного стресса и предотвращение эндотелиальной дисфункции.
С целью повышения эффективности лечения предопухолевых заболеваний молочной железы - кист, фиброаденом, внутрипротоковых папилом, проводилось введение локально в патологический очаг фотосенсибилизатора радахлорина 0,35% 0,01 - 0,1 мл и внутривенно раствор радахлорина и 1 мл рефнота и проводят лазерную фотоиммунотерапию. Данная сочетанная технология системного и локального введения фотосенсибилизатора и проведения лаазерной фотоиммунотерапии на фоне введения рефнота и таурина позволяет получить практически полный регресс кист молочных желез, уменьшение фиброаденомы и регресс внутрипротоковых папилом.
Таким образом, совместное воздействие локального и системного воздействия рефнота, Фотоиммунротерапии и таурина, реализующееся через механизм влияния на каналы клеточных мембран, позволяет реализовать сочетанное онкопрофилактическое действие.
Описание методики
1 этап: С целью уточнения диагноза у пациентов берется слюна и проводится исследование онкопанели микро-РНК. Данное исследование позволяет определить вероятность развития рака
2 этап: Проведение по показаниям рутинных исследований и составляется план лечения
3 этап: при отсутствии верифицированного инвазивного рака проводится комплексное исследование, включающее в себя применение рефнота, Фотоммунотерапии,которая проводится на проекцию органа или сам орган при его наружном расположении (молочная железа, щитовидная железа, шейка матки, легкие, желудок и др.
Клинический случай:
Пациентка К., 45 лет, поступила с жалобами на уплотнение в правой молочной железе в верхне-наружнем квадранте, его болезненность при пальпации. Из семейного анамнеза: у матери и тети рак молочной железы.
Проведенная маммография показала следующее BR3 справа и BR1 слева. По данным УЗИ молочных желез получены аналогичные показатели. Исходя из рекомендаций американского Радиологического Колледжа BR 3 показано наблюдение в течение 3-6 месяцев. К сожалению, отечественный и зарубежный опыт показывает, что за 3 месяца может проявить себя интервальный рак молочной железы. С целью исключения данной возможности проводилось исследование онкопанели микро-РНК. Получены следующие данные:
1 hsa-miR-199a-3p - норма
2. hsa -miR-214-3р - незначительное повышение
3. hsa-let-7a-5p-l - незначительное снижение - фактор риска
4. микро-РНК-25  - норма
5. hsa-miR-26a - норма
6. hsa-miR 21-5-p - незначительное снижение - фактор риска
7. hsa- miR-184 - незначительное снижение-фактор риска
8. hsa- miR-195 - повышен - фактор риска
9. miR-24-3р - норма
10. miR-222-3р - норма
11. miR-99a - норма
Проведен курс сочетанного лечения с использованием лазерной фотоиммунотерапии с использованием радахлорина 0,35% и длиной волны 662 нм, рефнота, а также таурина в форме препарата Дибикор 0,5 г 2 раза в день. Цикл лечения 1 месяц. После проведенного лечения через 1 месяц был взят повторный анализ на микро-РНК
1. Hsa- miR-199a-3p - норма
2. Hsa- miR-214-3р - норма
3. Hsa-let-7a-5p - норма
4. Микро-РНК-25 - норма
5. Hsa- miR-26a - норма
6. Has-miR-21-5p - незначительное снижение-фактор риска
7. Hsa-miR-184 - норма
8. Hsa-miR-24 - норма
9. miR-24-3р - норма
10. miR-222-3р - норма
11. miR-99a - норма
Таким образом, после комплексного лечения, в состав которого входили рефнот, фотоиммунотерапия с радахлорином и таурина определяется тенденция к нормализации онкопанели микро-РНК. Маммографическая картина - правая молочная железа - BR 2, левая молочная железа - BR 1
В заключение можно сказать, что у пациентки был получен регресс предопухолевых изменений и перевод облигатного предрака в факультативный предрак.
Клинический случай №2
Пациент О., 45 ЛЕТ, обратился с жалобами на дискомфорт в зоне эпигастрия через1 час после еды, слабость, тошноту.
Проведена ФГДС-получены данные за поверхностный гастрит, дисплазия 2-3 степени. Учитывая отягощенный семейный анамнез-отец, мать, дядя со стороны отца перенесли рак желудка, пациенту было предложено сдать общую онкопанель микро-РНК.
Данные микро-РНК до лечения:
1. hsa-miR-199a-3p - повышение 2+
2. hsa- miR-214-3р - незначительное повышение - фактор риска развития рака
3. hsa-let-7a-5p - выраженное повышение 3+
4. микро-РНК-25 - норма
5. hsa-miR-26a - норма
6. hsa-miR-21-5p - норма
7. hsa- miR-184 - незначительное снижение
8. hsa-miR-24-3р - повышение 2+
9. miR-24-3р - норма
ю. miR-222-3р - повышение 2+
11. miR 99а - норма
При анализе результатов выявлен высокий риск развития рака. Проведено комплексное лечение с использованием рефнота, фотоиммунотерапии с использованием радахлорина 035%% и длиной волны 662 нм и препарата Дибикор 0,5 2 раза вдень. Через 3 месяца проведена повторная ФГДС с морфологическим исследованием слизистой желудка-выявлен поверхностный гастрит-гистология-дисплазия 1 степени в одном из участков слизистой. Других подозрительных участков не выявлено. Проведение контрольной панели микро-РНК через 1 мес. после лечения показало следующее:
1 hsa-miR-199a-3p - повышение 1+
2. hsa- miR-214-3р - норма
3. hsa-let-7a-5p - повышение 1+
4. микро-РНК-25 - норма
5. hsa-miR-26a - норма
6. hsa-miR-21-5p - норма
7. hsa- miR-184 - норма
8. hsa-miR-24-3р - повышение 1+
9. miR -24-3р - норма
10. miR-222-3р - повышение 1+
11. miR 99а - норма
Повторные ФГДС и проведение исследование общей онкопанели 4 раза в год не выявили прогрессирования патологии желудка.
Таким образом, проведение современного диагностического комплекса с подключением определения онкопанели микро-РНК и комплекса лечебных мероприятий с использованием рефнота, лазерной фотоиммунотерапии в красном диапазоне с длиной волны 662 нм с использованием радахлорина 0,35% и таурина (в виде таблеток дибикора) в течение 3 месяцев позволило перевести облигатный предрак в факультативный предрак. Это будет способствовать повышению эффективности вторичной онкопрофилактики.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Degnim А.С., Dupont W.D., Radisky D.C., et all Extent of atypical heptrplasia stratifies breast cancer risk in 2 independent cohorts of women. Cancer. 2016 Oct: 122 (19): 2971-8,
2. Козлов В.В. Роль молекулярных маркеров в диагностике и лечении рака молочной железы, Автореферат дисс. На соискание ученой степени к.м.н., Новосибирск 2014- прототип
3. Экспрессия микро-РНК при раке желудка: от молекулярных основ до новых подходов- диагностика и лечение - Молодой ученый №8 (112) апрель -2-2016
4. Рубцов В.А., Федотова Ю.А. Микро-РНК-молекулярный маркер предикции риска развития рака желудка кишечного типа - Фундаментальная медицина СТМ 2018. ТДО №2,151
5. Nikitina E.G., Urazova L.N. -micro-RNAs and human cancer// Experimental oncology-2012-#34-p.2-8.