СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРИОННОГО АНТИГЕНА ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
METHOD OF OBTAINING VIRION ANTIGEN OF TICK-BORNE ENCEPHALITIS VIRUS

Изобретение относится к способам получения вирионного антигена вируса клещевого энцефалита (КЭ) из антигенсодержащего материала, включающего, главным образом, антигенные частицы вируса клещевого энцефалита мельче полноразмерных вирионов КЭ.
Способы получения вирионного антигена вируса КЭ из антигенсодержащего материала, включающего, главным образом, антигенные частицы вируса КЭ мельче полноразмерных вирионов КЭ, заявителю неизвестны.
Технический результат от использования предлагаемого способа заключается в возможности получения вирионного антигена вируса КЭ из антигенсодержащего материала, включающего, главным образом, антигенные частицы вируса КЭ мельче полноразмерных вирионов КЭ.
Указанный технический результат достигается центрифугированием антигенсодержащего материала с угловым ускорением не менее 15000 g, g - ускорение свободного падения.
Указанный технический результат достигается также тем, что до или после центрифугирования антигенсодержащий материал подвергают барьерному электрофорезу.
На практике вирионный антиген вируса КЭ получают из антигенсодержащего материала, содержащего значительное количество полноразмерных вирионов КЭ путем его хроматографирования, дающего возможность извлечения из антигенсодержащего материала лишь полноразмерных вирионов КЭ.
При хроматографии на широкопористых носителях распределение надмолекулярных белковых структур и макромолекул осуществляется в зависимости от другого параметра - размера структур. При этом частицы, превышающие размер пор носителя, выходят в эксклюзионном объеме, не задерживаясь при хроматографии, тогда как частицы, сопоставимые с размером пор носителя и меньшие по размеру, распределяются по фракциям в соответствии с размером - чем меньше та или иная структура, тем позже она выходит с хроматографической колонки.
Используемая в настоящее время хроматографическая технология получения вакцины против вируса КЭ [1] состоит из следующих этапов:
1. Концентрация вируссодержащего инактивированного формалином культурального материала с помощью ультрафильтрации.
2. Хроматография полученных концентратов на широкопористых носителях. При этом материал концентратов распределяется на три области фракций. Фракции первого пика оптической плотности содержат основное количество интактных вирионных структур вируса КЭ и примеси, сопоставимые по размеру с вирионами и превышающие их по этому параметру. Фракции второго пика оптической плотности содержат, в основном, низкомолекулярные примеси невирусного характера. Третья область фракций объединяет материал, распределяющийся при хроматографии между двумя пиками. Для этой области характерно не только низкое количество примесей невирусного характера, но низкое содержание антигенного материала, обладающего вирионной специфичностью.
3. Для изготовления вакцины против вируса КЭ используется антигенный вирионный материал первого пика оптической плотности.
Антигенный материал третьей области хроматографических фракций не используется в производстве вакцины против вируса КЭ, поскольку он содержит вирионный антиген в концентрациях, не позволяющих применять их для изготовления вакцины. Этот материал содержит также значительные количества примесных белковых структур. Эти вирионные структуры имеют меньшие размеры, чем полноценные интактные вирионы [2] и поэтому не отделяются при повторной хроматографии от примесей.
В этом антигенсодержащем материале присутствуют, главным образом, антигенные частицы вируса КЭ мельче полноразмерных вирионов КЭ, способы выделения которых неизвестны. Поэтому такой антигенсодержащий материал не используют.
Способ получения вирионного антигена вируса КЭ из антигенсодержащего материала, включающего, главным образом, антигенные частицы вируса КЭ мельче полноразмерных вирионов КЭ, осуществляют следующим образом.
Антигенсодержащий материал загружают в центрифужные пробирки, которые помещают в центрифужные роторы. Роторы устанавливают в центрифугу и вращают с угловым ускорением не менее 15000 g в любой части пробирок, g - ускорение свободного падения. По окончании центрифугирования роторы извлекают из центрифуги, вынимают из них пробирки. Удаляют из пробирок надосадочную жидкость. Для получения конечного продукта осадок суспендируют в буферном растворе, например, в трис-боратном [3]. Количество полученного антигенсодержащего материала увеличивается с увеличением времени центрифугирования.
Для получения более чистого препарата вирионного антигена вируса КЭ до или после центрифугирования антигенсодержащий материал подвергают барьерному электрофорезу в микроустройстве, описанном ранее [4].
Способ получения вирионного антигена вируса КЭ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение вирионного антигена вируса КЭ центрифугированием.
Антигенсодержащий материал хроматографических фракций концентрировали с помощью ультрафильтрации через фильтр РВМК (Millipore) в 150 раз, затем концентрат центрифугировали в пробирках бакетного ротора 3×35 мл в центрифуге VAC-25 при скорости 21000 оборотов в минуту в течение 4 часов (угловое ускорение составляло около 40000 g на уровне середины пробирки). Осадок суспендировали в трис-боратном буферном растворе в 1/10 исходного объема концентрата, а надосадочную жидкость дополнительно концентрировали в 2,5 раза с помощью ультрафильтрации. Детекцию антигенной активности проводили с помощью иммуноферментного анализа при использовании моноклональных антител к поверхностному гликопротеиду Е [5]. Концентрацию белка в пробах измеряли спектрофотометрически с помощью красителя Coomassie G.
Из данных, приведенных в таблице 1, видно, что в результате центрифугирования получен существенно очищенный препарат вирионного антигена - соотношение белка Е и суммарного белка в препарате осадка составляло 1:4,6. При этом концентрация белка Е увеличилась более чем в 8 раз и количество его в препарате осадка составляло 75% от исходного количества. Основное количество примесных белков осталось в надосадочной жидкости.
Пример 2. Получение вирионного антигена вируса КЭ центрифугированием с последующим барьерным электрофорезом.
Антигенсодержащий материал хроматографических фракций концентрировали с помощью ультрафильтрации через фильтр РВМК (Millipore) в 150 раз, затем концентрат центрифугировали в центрифуге VAC-25 бакетном роторе 3×35 мл при скорости 21000 оборотов в минуту в течение 4 часов (угловое ускорение составляло около 40000 g на уровне середины пробирки). Осадок суспендировали в трис-боратном буферном растворе в 1/10 исходного объема концентрата и подвергали барьерному электрофорезу в микроустройстве при 70 вольт в течение 12 часов. Для электрофоретического разделения белкового материала в микроустройстве также использовали трис-боратный буфер.
Из данных, приведенных в таблице 2, видно, что препарат вирионного антигена, полученный в результате ультрацентрифугирования, существенно дополнительно очищается в результате электрофореза. Соотношение белка Е и суммарного белка в антигенных препаратах достигает величин 1:4-1:6 и основное количество примесей перемещается в анодную камеру устройства.
Пример 3. Получение вирионного антигена вируса КЭ барьерным электрофорезом с последующим центрифугированием.
Антигенсодержащий материал хроматографических фракций концентрировали с помощью ультрафильтрации через фильтр РВМК (Millipore) в 200 раз и подвергали барьерному электрофорезу в микроустройстве при 70 вольт в течение 12 часов. Для последующей работы использовали препарат, полученный из камеры введения микроустройства, поскольку вирионные структуры вируса КЭ, синтезирующиеся в первичных культурах клеток куриных эмбрионов, в основном, неподвижны в электрическим поле [6, см. также табл.2]. Антигенный препарат разводили в трис-боратном буфере в три раза и центрифугировали в пробирках бакетного ротора 3×5 мл в центрифуге MSE-65 при скорости 30000 оборотов в минуту в течение 2 часов (угловое ускорение составляло около 80000 g на уровне середины пробирки). Осадок суспендировали в трис-боратном буферном растворе в 1/10 исходного объема концентрата. Из данных, приведенных в таблице 3, видно, что препарат вирионного антигена, полученный в результате электрофореза, существенно дополнительно очищается в результате ультрацентрифугирования. Соотношение белка Е и суммарного белка в антигенном препарате достигает величины 1:1,17, при этом 75% белка Е перераспределяется в осадок и не менее 80% суммарного белка остается в надосадочной жидкости.
Таким образом, с помощью предлагаемого способа можно получать высокоочищенные препараты вирионного антигена вируса КЭ в количествах, необходимых для создания диагностических препаратов.
Литература
1. Эльберт Л.Б., Красильников И.В., Дроздов С.Г. и соавт. Концентрированная и очищенная вакцина против клещевого энцефалита, приготовленная методом ультрафильтрации и хроматографии. Вопр. вирусол., 1985, №1, с.90-93.
2. Ляпустин В.Н., Ворович М.Ф., Куринная О.Н. и соавт. Распределение антигенных структур вируса клещевого энцефалита при седиментации и хроматографии. В кн.: Медицинская вирусология, Том XXV, Труды Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН, 2008, с.91-102.
3. Фармакопейная статья ФС42-3874-99. Физико-химические, химические и иммунологические методы контроля медицинских и иммунобиологических препаратов. Фармакопейный государственный комитет, 1999, с.49.
4. Ляпустин В.Н., Карганова Г.Г., Соболев С.Г. и соавт. Препаративное разделение структур вируса клещевого энцефалита с помощью электрофореза в жидкой фазе. Вопр. вирусол, 1988, №1, с.98-102.
5. Тимофеев А.В., Эльберт Л.Б., Терлецкая Н.Н. и соавт. Применение прямого твердофазного иммуноферментного анализа для оценки иммунохимической активности вакцины против клещевого энцефалита. ЖМЭИ, 1987, №9, с.89-93.
6. Ляпустин В.Н., Лашкевич В.А., Мустафина А.Н. и соавт. Зависимость синтеза вирионных структур вируса клещевого энцефалита от вида клеточных культур. Вопр. вирусол., 1987, №6, с.701-709.
Табл. 1.
Характеристики антигенных вирионных материалов вируса КЭ, полученного из концентрата хроматографических фракций с помощью ультрацентрифугирования
Концентрат хроматографических фракций
Препарат осадка концентрата хроматографическихфракций после ультрацентрифугирования
Концентрат надосадочной жидкости концентрата хроматографических фракций после ультрацентрифугирования
Концентрация белка Е (мкг/мл)
40
350
20
Концентрация суммарного белка (мкг/мл)
3200
1600
6900
Соотношение белка Е и суммарного белка
1:80
1:4,6
1:345
Табл. 2
Параметры антигенного вирионного хроматографического материала вируса КЭ, полученного с помощью ультрацентрифугирования и последующей очистки барьерным электрофорезом
Концентрат хроматографических фракций, полученный с помощью ультрацентрифугирования
Препарат катодной камеры электрофоретического устройства
Препарат камеры введения электрофоретического устройства
Препарат анодной камеры электрофоретического устройства
Концентрация белка E (мкг/мл)
45
6
16
7
Концентрация общего белка (мкг/мл)
1050
27
95
520
Соотношение белка Е и суммарного белка
1:23,3
1:4,5
1:5,9
1:52
Табл.3.
Параметры антигенного вирионного хроматографического материала вируса КЭ, полученного из предварительно электрофоретически очищенного концентрата хроматографических фракций с помощью ультрацентрифугирования
Препарат камеры введения после электрофоретической очистки концентрата хроматографических фракций
Препарат осадка электрофоретически очищенного концентрата хроматографических фракций после ультрацентрифугирования
Надосадочная жидкость электрофоретически очищенного концентрата хроматографических фракций после ультрацентрифугирования
Концентрация белка E (мкг/мл)
80
600
2,5
Концентрация суммарного белка (мкг/мл)
450
700
380
Соотношение белка Е и суммарного белка
1:5,6
1:1,17
1: 152