Способ получения каллусной культуры мачка жёлтого (Glaucium flavum Grantz) в условиях in vitro
METHOD FOR OBTAINING A CALLUS CULTURE OF YELLOW (GLAUCIUM FLAVUM GRANTZ) IN VITRO

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеток растения мачка желтого и может быть использовано в фармацевтической и косметической промышленности для получения ценных биологически активных соединений.
Растение мачек желтый (глауциум желтый), (Glaucium flavum Grantz.) - относится к семейству Маковые (Papaveraceae). Является двулетним растением, которое может вырастать до 1 метра. Корень оранжево-коричневый, стержневого типа. Одиночные, верхушечные желтые цветки достигают в диаметре до 5 сантиметров. Розетку составляют крупные сизые, густо опушенные, перисторассеченные листья. Плодом является стручковидная линейная коробочка длиной 15-25 см. Семена почковидные, коричневые или почти черного цвета. Все части растения содержат млечный сок. Местами произрастания являются дренированные песчаные почвы, галечники, реже скалистые и щебнистые склоны. Мачек желтый произрастает в европейской части СНГ вдоль побережья Черного моря - в Крыму, на Кавказе. Растение занесено в Красную книгу СССР и России. Культивируется в Краснодарском крае, Крыму, Молдове, на юге Украины и в Южном Казахстане. Заготовки сырья мачка желтого в природных зарослях экономически нецелесообразно, так как встречается рассеяно. Как сырье используется трава культивируемого мачка желтого первого и второго года жизни, собранная в период стеблевания, бутонизации, начала цветения.
Надземная часть растения содержит алкалоиды изохинолинового ряда (до 3-4%), среди которых наибольший интерес представляет глауцин (около 1,8-2%), обладающий противокашлевым и бронхолитическим действием и, в отличие от кодеина, не обладает наркотическим действием, не оказывает угнетающего действия на дыхательный центр, не оказывает тормозящего влияния на моторику кишечника, не вызывает привыкания, пристрастия, как это выражено у кодеина.
Помимо противокашлевого эффекта, глауцин обладает противовоспалительным, анальгетическим, гипотензивным, спазмолитическим, адренолитическим эффектом. У него широкий диапазон применения в медицине: при инфекционно-воспалительных заболеваниях верхних отделов дыхательных путей, бронхов и легких, плеврите, коклюше, бронхиальной астме, туберкулезе, раке легких. Все эти свойства подтверждены экспериментальными и клиническими данными в научных работах специалистов, занимающихся исследованием глауцина. Было также показано, что глауцин обладает бронходилатирующей активностью. Он действует как антагонист кальциевых каналов в бронхах и ингибитор фосфодиэстеразы в гранулоцитах [Scholar, Eric Glaucine / Eric Scholar // The Comprehensive Pharmacology Reference. - 2007. - №3. - C. 1-4.].
Известен способ получения каллусной культуры мачка желтого [Получение каллусных культур Glaucium flavum Crantz (Papaveraceae) / E.A. Гумерова, A.B. Плотникова, K.P. Шкильменская, Р.Г. Тухбатуллина, Н.И. Румянцева // Биотехнология и общество в XXI ВЕКЕ. -2015. - №1. - С. 26-31], включающий стерилизацию семян спиртом и белизной, отличающиеся комбинациями, но время экспозиции в белизне составляет во всех вариантах 15 минут.Получение каллусной культуры осуществляли из семян сразу после стерилизации и из части полученных растений, выращенных в возрасте двух недель и одного месяца в условиях in vitro. Для получения каллуса использовали различные варианты гормональных агаризованных сред Гамборга и Мурасиге Скуга с различным содержанием гидролизата казеина (ГК) в количестве 1,2 г/л. Отличительной особенностью всех эксплантов из семян было образование только гетерогенного каллуса с проэмбриональным клеточным комплексом (ПЭКК). При получении каллуса из настоящих листьев первичный каллус формировался лучше на вторых листьях.
Недостатком примененного способа получения каллусной культуры является стерилизация семян с использованием агрессивных соединений (спиртом и белизной), требующих защиты дыхательных путей персонала при выполнении экспериментальных работ из-за раздражающего действия белизны и опьяняющего действия этанола на организм человека. Для индукции каллуса предпочтительной средой оказалась среда Гамборга(RX)ГК1 - это среда с добавлением гидролизата казеина. Недостатком является то, что ГК - это соединение дорогостоящее.
Индукция соматического эмбриогенеза в Glaucium flavum Grantz описана в научной литературе (Iva Doycheva, Somatic embryogenesis induction in Glaucium flavum Grantz (Papaveraceae)/ Iva Doycheva, Elina Yankova-Tsvetkova, Marina Stanilova // Comptes rendus de l'Acad'emie bulgare des Sciences, Tome 70, №4, 2017.). Для достижения стерильности семян их подвергали поверхностной стерилизации замачиванием в 70% - ном этаноле в течение 1-2 мин, затем 10 мин в разбавленном коммерческом отбеливателе (хлор <2,5%), а затем 3 раза промывали стерильным раствором дистиллированной воды. Проростки получали на базальной среде В5, содержащая двойное количество макросолей, которую дополняли 20 г/л сахарозы и отверждали 6,5 г/л растительного агара. Также получение каллуса осуществляли с использованием среды Мурасиге Скуга (MS) с добавлением регуляторов роста растений-ауксинов и цитокинов в различных комбинациях и добавляли активированный уголь. Использовали температуру 10±2° и 23±2°.
Недостатком данного способа также является то, что используются агрессивные компоненты, обладающие раздражающим действием на организм человека, в частности, коммерческого отбеливателя с содержанием хлора <2,5%. В зависимости от применения экзогенных химических соединений зависела индукция соматического эмбриогенеза в большей степени, чем рост растений и каллусных культур in vitro. Непрямой соматический эмбриогенез был достигнут на среде MS с добавлением 1,0 мг/л 2,4 Д (2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота), 0,5 мг/л ТДЗ (Тидиазурон) и 0,2 мг/л БАП (бензил аминопурин).
В другой научной статье описан способ стерилизации семян мачка желтого, состоящий из следующих операций: выдерживание семян в 70%-ном этиловом спирте в течение 1 минуты, а затем встряхивание в 50%-ном коммерческом растворе гипохлорита и 2 каплями раствора Твина-20 в течение 20 мин с последующей промывкой семян стерильной дистиллированной водой [М.Е. Mohamed, Plant germination and production of callus from the yellow hornpoppy (Glaucium flavum): the first stage of micropropagation / M.E. Mohamed, A.M. Arafa, S.S. Soliman, S.I. Eldahmy // Pharmazie 69. - 2014 - 715-720.]. Здесь также использованы для стерилизации семян агрессивные компоненты спирт и коммерческий раствор гипохлорита, обладающего раздражающим действием на дыхательные пути человека. В статье описывается способ получения каллуса из проросших семян при температуре 15°С с использованием 50 мг/л GA3 (гиббереллиновая кислота) для нарушения покоя семян. Наилучшими условиями для индукции каллуса было использование MS-среды (Мурасиге-Скуга) при 15°С и использование NAA (нафталинуксусной кислоты) и БАП (бензиламинопурин) (1:0,5 мг/л) или БАП (бензиламинопурин), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота) и ТДЗ (тидиазурон) (0,1:1:0,5 мг/л) и К (кинетина) в качестве комбинаций фитогормонов, с добавлением аскорбиновой кислоты (15 мг/л) для удаления потемнения каллусной культуры.
Известен способ получения глауцина гидрохлорида (варианты) (Патент RU №2259829, МПК А61К 31/4738, C07D 235/06, А61Р 11/14 - 10.09.2005, Бюл. №25), включающий экстракцию надземной части мачка желтого (Glaucium flavum Crantz) органическим растворителем, последующей фильтрации, подщелачивания водно-кислотного раствора, экстракции алкалоидов органическим растворителем, удаления органического растворителя в вакууме, обработки полученного основания глауцина хлористоводородной кислотой и очистки продукта.
Недостатком данного способа является то, что глауцин здесь добывается из лекарственного растительного сырья. В настоящее время мачок желтый не образует зарослей, занесен в Красную книгу и введен в культуру. Культивирование зависит от времени года, площадей, техники, ручного труда, что не позволяет получать сырье круглогодично, в отличие от биотехнологического способа, предлагаемого авторами.
Задачей настоящего изобретения является получение каллусной культуры клеток мачка желтого (Glaucium flavum Grantz) в условиях in vitro для дальнейшего использования в получении суспензионной культуры и выделения глауцина как сырья биологически активных веществ для дальнейшего производства лекарственных средств, содержащих глауцин, в фармацевтической и косметической промышленности.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение каллусной культуры мачка желтого (Glaucium flavum Grantz).
4
3
3
2
2
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
4
3
3
2
2
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
Технический результат заявленного изобретения достигается за счет того, что для получения каллусной культуры мачка желтого (Glaucium flavum Grantz) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян мачка желтого, раствором антибактериального мыла при перемешивании магнитной мешалкой в течение 10-15 минут, трехкратное ополаскивание в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов следующего состава, в мг/л: вода - 1000 мл, агар-агар - 6500, появление у семян трещин на 4 день, на 7 день появление всходов, на 12-15 день появление зеленых ростков, далее, проростки культивировались на питательной среде следующего состава, мг/л: вода - 1000 мл, NHNO - 825, KNO - 950, CaCl x 2HO - 220, MgSO х 7HO -185, KHPO - 85, KI - 0,415, НВО - 3,1, MnSO х 4HO - 11,15, ZnSO х 7HO - 4,3, NaMoO х 2HO - 0,125, CuSO х 5HO - 0,0125, CoCl х 6HO - 0,0125, FeSO х 7HO - 13,9, Na-ЭДТА - 18,65, мезоинозит - 100, тиамин - 0,5, пиридоксин - 0,5, никотиновая кислота - 0,5, сахароза - 15000, агар - 6500, при температуре 24±1°С с фотопериодом 16/8 часов (свет/темнота), до третьего-пятого настоящих листьев в течение трех недель до получения листовых эксплантов, которые разрезались на мелкие кусочки и помещались в питательную среду следующего состава, мг/л.: вода - 1000 мл, NHNO - 1650, KNO - 1900, CaCl х 2HO - 440, MgSO х 7HO - 370, KHPO - 170, KI - 0,83, НВО - 6,2, MnSO х 4HO - 22,3, ZnSO х 7HO - 8,6, NaMoO х 2HO - 0,25, CuSO х 5HO - 0,025, CoCl х 6HO - 0,025, FeSO х 7HO - 27,8, Na-ЭДТА (трилон Б) - 37,3, мезоинозит - 100, тиамин - 0,5, пиридоксин - 0,5, никотиновая кислота - 0,5, сахароза - 30000, НУК - 1, БАП - 0,5, агар - 6500; культивирование каллусной культуры проводили в темноте, при температуре 24±1°С, влажности камеры 70±5%, цикл субкультивирования составляет 5 недель, начало формирования каллуса наблюдалось на 14-18 день с момента посадки экспланта, значительный рост каллуса наблюдался на 27 день с момента высадки листовых эксплантов на перечисленные гормональные питательные среды до истечения срока субкультивирования.
Совокупность существенных признаков обеспечивает решение заявленной технической задачи, а именно, получение каллусной культуры мачка желтого (Glaucium flavum Grantz) in vitro.
Детали, признаки, а также преимущества настоящего изобретения следуют из нижеследующего описания реализации заявленного технического решения с использованием чертежей, на которых показано:
Фиг. 1 - культивирование семян на питательной среде;
Фиг. 2 - культивирование семян на питательной среде с появлением зеленых проростков;
Фиг. 3 - каллусообразование на питательной среде;
Фиг. 4 - каллусообразование на питательной среде;
Фиг. 5 - каллусообразование на питательной среде.
Осуществление изобретения.
Предлагаемое решение получения каллусной культуры состоит в том, что за основу взяты стерильные свежие проростки, полученные культивированием в контролируемых условиях климатической камеры из семян интактного растения, выращенного в ботаническом саду КГМУ на территории Республики Татарстан в фенофазах «конец цветения, начало плодоношения».
При этом отобранные семена стерилизовали раствором антибактериального мыла (жидкое мыло «Защитное» с антибактериальным эффектом, изготовитель - ООО «Русская косметика») следующего состава: Вода, Лаурилсульфат натрия, Хлорид натрия, Кокамидопропилбетаин, Глицерет-2 Кокоат, Триклозан, Масло чайного дерева, Декспантенол, Глицерин, Динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, Лимонная кислота, Метилхлоризотиазолинон, Метилизотиазолинон, парфюм, Гексилкоричный альдегид, Краситель «Бриллиантовый синий» (Е113, CI42090) (раствор в соотношении 3:30, 4:30, 3:40 и 4:40 мл) с использованием магнитной мешалки при перемешивании при оборотах 300 об/мин с магнитным мешальником размером 3×10 мм в течении 10-15 минут, с последующей промывкой семян стерильной дистиллированной водой не менее 3-х раз и ополаскиванием семян стерильной дистиллированной водой с использованием магнитной мешалки в течение 5 минут.
Затем вначале стерильные семена помещали в твердую питательную среду без гормонов следующего состава для прорастания и формирования проростка растения, мг/л.: вода - 1000 мл, агар-агар - 6500.
Семена начали давать трещины на 4 день, на 7 день появились всходы (Фиг. 1). На 12-15 день появились зеленые ростки (Фиг. 2). Всходы появились у 80-83% всех посаженных семян.
4
3
3
2
2
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
Полученные проростки в дальнейшем культивировались на питательной среде следующего состава, мг/л: вода - 1000 мл, NHNO - 825, KNO - 950, CaCl х 2HO - 220, MgSO х 7HO - 185, KHPO - 85, KI - 0,415, HBO - 3,1, MnSO x 4HO - 11,15, ZnSO х 7HO - 4,3, NaMoO х 2HO - 0,125, CuSO х 5HO - 0,0125, CoCl х 6HO - 0,0125, FeSO x 7HO - 13,9, Na-ЭДТА (трилон Б) - 18,65, мезоинозит - 100, тиамин - 0,5, пиридоксин - 0,5, никотиновая кислота - 0,5, сахароза - 15000, агар - 6500.
Проростки культивировались при температуре 24±1°С с фотопериодом 16/8 часов (свет/темнота). Культивирование проростков проводилось до третьего-пятого настоящих листьев в течение трех недель.
Из полученных проростков получали листовые экспланты, которые разрезались на мелкие кусочки и помещались в питательную среду с добавлением альфа-нафтилуксусной кислоты (НУК), 6-бензиламинопурина (БАП).
4
3
3
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
На среде с содержанием фитогормонов с содержанием 1,0 мг/л НУК и 0,5 мг/л БАП наблюдалось наиболее интенсивное каллусообразование: вода - 1000 мл, NHNO - 1650, KNO - 1900, CaCl2 х 2H2O - 440, MgSO х 7HO - 370, KHPO - 170, KI - 0,83, HBO - 6,2, MnSO х 4HO - 22,3, ZnSO х 7HO - 8,6, NaMoО х 2HO - 0,25, CuSO х 5HO - 0,025, CoCl х 6HO - 0,025, FeSO х 7HO - 27,8, Na-ЭДТА (трилон Б) - 37,3, мезоинозит - 100, тиамин - 0,5, пиридоксин - 0,5, никотиновая кислота - 0,5, сахароза - 30000, НУК - 1, БАП - 0,5, агар - 6500.
Формирование каллуса было заметным на 14-18 день с момента посадки экспланта - разрезанного растения. Значительный рост каллуса был заметным на 27 день с момента высадки листовых эксплантов на перечисленные гормональные питательные среды до истечения срока субкультивирования (5 недель) (Фиг. 3).
Листовые экспланты в количестве 33 единиц помещались на 3 чашки Петри с данной средой. Каллус был индуцирован у 21 экспланта, что составляет 63,6% (Фиг. 4). В дальнейшем образовавшийся каллус 5 раз подвергался последовательному субкультивированию путем разрезания на мелкие части в количестве 21 единиц. В результате из 21 эксплантов, пересаженных на среду этого же состава, был получен 21 каллус, что составляет 100%. В процессе субкультивирования в течение 5 недель появились экземпляры каллуса (Фиг. 5). Таким образом, эксперименты показали, что более качественный каллус образовывался в процессе многократного субкультивирования и имел тенденцию к увеличению своей массы.
Культивирование каллуса проводили в темноте, при 24±1°С, влажности климатостата 70±5%, на чашках Петри с диаметром 90 мм, цикл субкультивирования составляет 5 недель. Полученный вначале каллус характеризовался следующими признаками. Культуральные признаки: каллусные культуры плотные, оформленные, имеют темную, коричнево-серую окраску. После субкультивирования каллусы имели разнообразную окраску и рыхлую структуру (Фиг. 5).
Таким образом, предложен способ получения каллусных культур мачка желтого (Glaucium flavum Grantz) из листовых эксплантов - проростков, полученных in vitro в климатостате.