ПРОФИЛАКТИКА И ЛЕЧЕНИЕ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ ГЛАЗ, ВЫЗВАННЫХ КОМПЛЕМЕНТОМ
PREVENTING AND TREATING COMPLEMENT-CAUSED OCULAR PATHOLOGIES

Область техники изобретения
Настоящее изобретение относится к профилактике и лечению патологических состояний глаз, вызванных комплементом, таких как хороидальная неоваскуляризация (CNV) и возрастная дегенерация макулы (AMD).
Уровень техники изобретения
Система комплемента представляет собой сложный ферментативный каскад, составленный из серии сывороточных гликопротеинов, которые обычно существуют в неактивной форме проферментов. Активация комплемента может происходить двумя основными путями, классическим и альтернативным, которые сливаются на уровне C3, где две одинаковых C3-конвертазы расщепляют C3 на C3a и C3b.
Макрофаги являются специализированными клетками, у которых развилась характерная способность распознавать едва уловимые различия в структуре экспрессированных на поверхности клеток идентификационных маркеров, так называемые молекулярные паттерны (Taylor et al., Eur. J. Immunol. 33, 2090-2097 (2003); Taylor et al., Annu. Rev. Immunol. 23, 901-944 (2005)). В то время как прямое узнавание данных поверхностных структур является фундаментальным аспектом врожденного иммунитета, опсонизация позволяет типичным макрофагальным рецепторам опосредовать поглощение, повышая эффективность и диверсифицируя репертуар узнавания фагоцита (Stuart and Ezekowitz, Immunity 22, 539-550 (2005)). Процесс фагоцитоза включает множественные взаимодействия лиганд-рецептор, и в настоящее время известно, что различные опсонины, включая иммуноглобулины, коллектины и компоненты комплемента, стимулируют клеточные функции, необходимые для интернализации патогена посредством взаимодействия с рецепторами клеточной поверхности макрофагов (обзор в Aderem and Underhill, Annu. Rev. Immunol. 17, 593-623 (1999); Underhill and Ozinsky, Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002)). В то время как природные иммуноглобулины, кодируемые генами зародышевой линии, могут узнавать множество различных патогенов, большинство опсонизирующих IgG производятся в процессе развития приобретенного иммунитета, и вследствие этого эффективное выведение патогенов с помощью Fc-рецепторов не является быстродействующим (Carroll, Nat. Immunol. 5, 981-986 (2004)). С другой стороны, комплемент быстро распознает поверхностные молекулы патогена и готовит частицу для поглощения при помощи рецепторов комплемента (Brown, Infect. Agents Dis. 1, 63-70 (1991)).
Комплемент состоит из более 30 сывороточных белков, которые опсонизируют множество различных патогенов для узнавания рецепторами комплемента. В зависимости от инициации каскада различают три пути (обзор в (Walport, N. Engl. J. Med. 344, 1058-1066 (2001))). Для всех трех общим является этап активации центрального компонента C3, но они различаются по природе узнавания и начальным биохимическим этапам, приводящим к активации C3. Классический путь активируется антителами, связанными с поверхностью патогена, которые, в свою очередь, связывают компонент комплемента C1q, запуская каскад сериновой протеазы, которая в конечном итоге расщепляет C3 до его активной формы, C3b. Лектиновый путь активируется после узнавания углеводных мотивов лектиновыми белками. В настоящее время идентифицированы три участника данного пути: связывающие маннозу лектины (MBL), SIGN-R1 семейство лектинов и фиколины (Pyz et al. Ann. Med. 38, 242-251 (2006)). Как MBL, так и фиколины связаны с сериновыми протеазами, которые действуют как C1 в классическом пути, активируя компоненты C2 и C4, ведущие к центральному этапу C3. Альтернативный путь отличается как от классического, так и от лектинового путей тем, что он активируется в результате прямой реакции внутреннего сложного эфира C3 с узнаваемыми мотивами на поверхности патогена. Начальное связывание C3 с активирующей поверхностью приводит к быстрому увеличению накопления C3b в результате действия протеаз альтернативного пути фактора B и фактора D. Важно отметить, что C3b, накопленный либо при классическом, либо при лектиновом пути, также может приводить к увеличению накопления C3b в результате действия фактора B и фактора D. Во всех трех путях активации комплемента главным этапом в опсонизации является превращение компонента C3 в C3b. Расщепление C3 ферментами каскадов комплемента открывает тиоэфир для нуклеофильной атаки, делая возможным ковалентное присоединение C3b на поверхности антигена через тиоэфирный домен. Это является первым этапом в комплементной опсонизации. Последующий протеолиз связанного C3b приводит к образованию iC3b, C3c и C3dg, фрагментов, которые узнаются различными рецепторами (Ross and Medof, Adv. Immunol. 37, 217-267 (1985)). Данное расщепление отменяет способность C3b к дальнейшему увеличению накопления C3b и активирует поздние компоненты каскада комплемента, включая атакующий мембрану комплекс, способный непосредственно повреждать мембрану. Однако макрофагальные фагоцитарные рецепторы преимущественно узнают C3b и его фрагменты; из-за неустойчивости образования сложноэфирной связи опосредованная C3 опсонизация является центральным моментом узнавания патогена (Holers et al., Immunol. Today 13, 231-236 (1992)), и вследствие этого рецепторы для различных продуктов деградации C3 играют важную роль в иммунном ответе хозяина.
C
U
B
Собственно C3 представляет собой сложный и гибкий белок, состоящий из 13 отдельных доменов. Центр молекулы составлен из 8 так называемых макроглобулиновых (MG) доменов, которые представляют собой плотно упакованные α и β цепи C3. В данную структуру встроены CUB (lr/Cls, egf и one mophogenetic protein-1 (костный морфогенетический белок-1)) и TED домены, при этом последний содержит тиоэфирную связь, которая делает возможной ковалентную ассоциацию C3b с поверхностями патогенов. Оставшиеся домены содержат C3a или действуют как линкеры и спейсеры центральных доменов. Сравнение структур C3b и C3c с C3 свидетельствует о том, что молекула претерпевает крупные конформационные перестройки при каждом протеолизе, при котором обнажается не только TED, но и новые дополнительные поверхности молекулы, которые могут взаимодействовать с клеточными рецепторами (Janssen and Gros, Mol. Immunol. 44, 3-10 (2007)).
Возрастная дегенерация макулы (AMD) во всем мире является основной причиной слепоты у пожилых людей. AMD характеризуется прогрессивной потерей центрального зрения, связанной с дегенеративными и неоваскулярными изменениями в макуле, высокоспециализированной области сетчатки глаза, ответственной за хорошую остроту зрения. Согласно последним оценкам 14 миллионов человек ослепли или страдают от серьезных нарушений зрения вследствие AMD. Данное заболевание оказывает колоссальное влияние на физическое и психическое здоровье людей старческого возраста и членов их семей и становится основной нагрузкой на общественное здравоохранение.
Новые открытия, однако, начинают проливать свет на общую картину соответствующих клеточных процессов, генетических факторов и биохимических процессов, связанных с ранней AMD. Ген фактора H комплемента является первым геном, идентифицированным благодаря множеству независимых исследований, который обуславливает значительный генетический риск развития AMD. Так, три независимые исследовательские группы сообщили, что полиморфизм тирозина-гистидина на аминокислотной позиции 402 фактора H связан с развитием AMD (Klein et al., Science 308: 385-389 (2005); Haines et al., Science 308: 419-421 (2005) и Edwards et al., Science 308: 421-424 (2005)). Было высказано предположение, что нарушенное ингибирование альтернативного пути связанным с заболеванием аллелем фактора H либо вызывает, либо вносит существенный вклад в развитие AMD (Thurman and Holers, J. Immunol. 176: 1305-1310 (2006)).
Сущность изобретения
В одном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения патологического состояния глаз, вызванного комплементом, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества антагониста фактора D.
В различных вариантах осуществления нуждающийся субъект представляет собой млекопитающее, такое как человек, и антагонист фактора D выбирают из группы, состоящей из антител против фактора D и их фрагментов, связывающих полипептидов, пептидов и малых молекул непептидной природы.
В предпочтительном варианте осуществления антагонист фактора D представляет собой антитело или фрагмент антитела. В различных вариантах осуществления данное антитело может связываться с активным центром фактора D либо может связывать эпитоп, включающий остатки активного центра фактора D.
Специфические антитела, входящие в объем данного изобретения, включают, но не ограничиваются ими, антитела 20D12, 31A9, 25A1 и 32H12, а также их варианты. В предпочтительном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела связывается в основном с тем же эпитопом, что и антитело 20D12, либо содержит последовательности CDR тяжелой и/или легкой цепи антитела 20D12 (SEQ ID NO:1 и 2), либо представляет собой антитело 20D12 или его фрагмент.
Антитела против фактора D включают человеческие, гуманизированные или химерные антитела.
2
2
Фрагменты антител могут представлять собой, например, Fab, Fab', F(ab'), scFv, (scFv), dAb, фрагменты определяющей комплементарность области (CDR), линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител, минитела, диатела или мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
Патологические состояния глаз, вызванные комплементом, включают, например, возрастную дегенерацию макулы (AMD), хороидальную неоваскуляризацию (CNV), увеит, диабетическую и другие вызванные ишемией ретинопатии, диабетический макулярный отек, патологическую миопию, болезнь Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаз, окклюзию центральной ретинальной вены (CRVO), неоваскуляризацию роговицы и неоваскуляризацию сетчатки.
В другом аспекте изобретение относится к набору, включающему антагонист фактора D и инструкции по введению указанного антагониста для лечения патологического состояния глаз, вызванного комплементом.
В еще одном аспекте изобретение относится к применению антагониста фактора D в создании лекарственного средства для лечения патологического состояния глаз, вызванного комплементом.
В дополнительном аспекте изобретение относится к применению антагониста фактора D в лечении патологического состояния глаз, вызванного комплементом.
Краткое описание рисунков
Фиг.1. A: Уровни фактора D в стекловидном теле и оболочке Бруха, полученных из нормальных и с заболеванием AMD донорских глаз. Уровни фактора D измеряли методом ELISA, специфичным для фактора D, как описано. B: общие уровни фактора D в глазе определяли, рассчитывая общий вклад фактора D, экспрессированного в оболочке Бруха, и общее количество фактора D, обнаруженного в стекловидном теле.
Фиг.2. Иммуногистохимическое определение фактора D в поперечном срезе оболочки Бруха из донорского глаза с AMD. На врезке показано окрашивание фактора D в друзе, наслоенной на поверхность оболочки Бруха. В дополнение к друзе оболочка Бруха и хориоид были положительны по фактору D.
Фиг.3. Характеристика 12D20 в гемолитическом анализе, избирательном для альтернативного пути активации комплемента. Значения IC50 указаны ниже, и анализ выполнен, как описано в разделе «Методы».
Фиг.4. Последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей мышиного моноклонального антитела 12D20 (SEQ ID NO:1 и 2).
Фиг.5. Картирование эпитопов различных антител против фактора D. Указаны их относительные активности в анализе гемолиза.
Фиг.6. Аминокислотная последовательность природного полипептида фактора D человека (SEQ ID NO:3).
Таблица 1. Анализ компонентов комплемента при AMD.
Таблица 2. Донорские ткани, используемые в исследованиях.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ПРЕДПОЧТИТЕЛЬНОГО ВАРИАНТА ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
1. Определения
Термины «фактор D» и «фактор D комплемента» используются взаимозаменяемо и относятся к полипептидам с природной последовательностью и вариантам фактора D.
Фактор D с «природной последовательностью» представляет собой полипептид, обладающий той же аминокислотной последовательностью, что и полипептид фактора D, полученный из природных источников, независимо от способа его получения. Таким образом, фактор D с природной последовательностью можно выделять из природных источников или получать при помощи рекомбинантных методов и/или синтеза. В дополнение к зрелому белку фактора D, такому как зрелый белок фактора D человека (NM_001928, SEQ ID NO:3), термин «фактор D с природной последовательностью», в частности, охватывает существующие в природе формы предшественника фактора D (например, неактивный белок-предшественник, который протеолитически расщепляется с образованием активной формы), существующие в природе вариантные формы (например, альтернативно сплайсированные формы) и существующие в природе аллельные варианты фактора D, а также структурные конформационные варианты молекул фактора D, обладающие той же аминокислотной последовательностью, что и полипептид фактора D, полученный из природных источников. В частности, данное определение охватывает полипептиды фактора D животных, отличных от человека, включая высших приматов и млекопитающих, отличных от человека.
«Вариант фактора D» или «вариант фактора D комплемента» означает полипептид активного фактора D, как определено ниже, имеющий как минимум примерно 80% идентичность аминокислотной последовательности с полипептидом фактора D с природной последовательностью, таким как полипептид человеческого фактора D с природной последовательностью, обладающий SEQ ID NO:3. Как правило, вариант фактора D будет иметь как минимум примерно 80% идентичность аминокислотной последовательности, или как минимум примерно 85% идентичность аминокислотной последовательности, или как минимум примерно 90% идентичность аминокислотной последовательности, или как минимум примерно 95% идентичность аминокислотной последовательности, или как минимум примерно 98% идентичность аминокислотной последовательности, или как минимум примерно 99% идентичность аминокислотной последовательности со зрелой аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3 человека. Предпочтительно максимальная степень идентичности последовательности имеет место в активном центре фактора D.
«Активный центр» фактора D определяется His-57, Asp-102 и Ser-195 (химотрипсиногенная нумерация) в последовательности человеческого фактора D. В факторе D Asp 189 (химотрипсиновая нумерация) находится на дне кармана первичной специфичности и расщепляет пептидную связь Arg. Каталитическая триада состоит из His-57, Asp-102 и Ser-195. Asp-102 и His57 обладают нетипичными конформациями по сравнению с другими сериновыми протеазами (Narayana et al., J. Mol. Biol. 235 (1994), 695-708). Уникальный солевой мост наблюдается между Asp 189 и Arg 218 на дне кармана S1, который поднимает петлю 214-218 и создает глубокий и узкий карман S1 (Jing et al., J. Mol. Biol. 282 (1998) 1061-1081). Эта петля и несколько других остатков вокруг активного центра, как показано с помощью мутационного анализа, являются ключевыми структурными детерминантами эстеролитической активности фактора D (Kim et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 24399-24405). На основании данных результатов предположили, что фактор D может претерпевать конформационное изменение при связывании связанного с C3b фактора B, что приводит к проявлению протеолитической активности (Volanakis and Narayana, Protein Sci. 5 (1996) 553-564).
«Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей» определяют как процентное содержание аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными с аминокислотными остатками в контрольной последовательности фактора D после выравнивания последовательностей и внесения разрывов, если необходимо, чтобы достигнуть максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривая никакие консервативные замены как часть идентичности последовательностей. Выравнивание с целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно выполнять различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, используя общедоступные компьютерные программы, такие как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания на протяжении всей длины сравниваемых последовательностей. Затем идентичность последовательностей рассчитывают относительно более длинной последовательности, то есть, если даже более короткая последовательность демонстрирует 100% идентичность последовательности с частью более длинной последовательности, общая идентичность последовательностей будет составлять менее 100%.
«Процент (%) идентичности нуклеотидной последовательности» определяют как процентное содержание нуклеотидов в последовательности-кандидате, которые являются идентичными с нуклеотидами в контрольной последовательности, кодирующей фактор D, после выравнивания последовательностей и вставки разрывов, если необходимо, чтобы достигнуть максимального процента идентичности последовательности. Выравнивание с целью определения процента идентичности нуклеотидных последовательностей можно выполнять различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, используя общедоступные компьютерные программы, такие как программы BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания на протяжении всей длины сравниваемых последовательностей. Затем идентичность последовательностей рассчитывают относительно более длинной последовательности, то есть, если даже более короткая последовательность демонстрирует 100% идентичность последовательности с частью более длинной последовательности, общая идентичность последовательностей будет составлять менее 100%.
«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена, как минимум, от одной примесной молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в природном источнике нуклеиновой кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты находится в иной форме или окружении, чем те, в которых она встречается в природе. Вследствие этого выделенные молекулы нуклеиновой кислоты отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты включает молекулы нуклеиновой кислоты, содержащиеся в клетках, которые обычно экспрессируют кодируемый полипептид, если, например, молекула нуклеиновой кислоты имеет хромосомную локализацию, отличную от локализации в природных клетках.
«Выделенная» молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид фактора D, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая идентифицирована и отделена, как минимум, от одной примесной молекулы нуклеиновой кислоты, с которой она обычно связана в природном источнике нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор D. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид фактора D, находится в иной форме или окружении, чем те, в которых она встречается в природе. Вследствие этого выделенные молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид фактора D, отличаются от молекулы (молекул) кодирующей нуклеиновой кислоты, существующей в природных клетках. Однако выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор D, включает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей фактор D, содержащиеся в клетках, которые обычно экспрессируют фактор D, если, например, молекула нуклеиновой кислоты имеет хромосомную локализацию, отличную от локализации в природных клетках.
Термин «антагонист» используется в самом широком смысле и включает любую молекулу, которая способна нейтрализовать, блокировать, частично или полностью ингибировать, отменять, снижать или препятствовать биологической активности фактора D. Антагонисты фактора D включают, без ограничений, антитела против фактора D и их антигенсвязывающие фрагменты, другие связывающие полипептиды, пептиды и малые молекулы непептидной природы, которые связываются с фактором D и способны нейтрализовать, блокировать, частично или полностью ингибировать, отменять, снижать или препятствовать биологической активности фактора D, такой как способность фактора D вносить вклад в патологию состояния глаз, вызванного комплементом.
«Малую молекулу» определяют в данном документе как имеющую молекулярную массу ниже примерно 600, предпочтительно ниже примерно 1000 дальтон.
Термины «активный», или «активность», или «биологическая активность» в контексте антагониста фактора D по настоящему изобретению относятся к способности противодействовать (частично или полностью ингибировать) биологической активности фактора D. Предпочтительной биологической активностью антагониста фактора D является способность приводить к ощутимому улучшению состояния, например патологических признаков, вызванного фактором D заболевания или состояния, например, такого как патологическое состояние глаз, вызванное комплементом. Активность можно определять в тестах in vitro или in vivo, включая анализы связывания, использование соответствующей модели на животных или клинические испытания на людях.
Термин «патологическое состояние глаз, вызванное комплементом» используется в самом широком смысле и включает все состояния глаз, патология которых обусловлена комплементом, включая классический и альтернативный пути активации, в частности, альтернативный путь активации комплемента. Патологические состояния глаз, вызванные комплементом, включают, без ограничения, дегенеративные заболевания макулы, такие как все стадии возрастной дегенерации макулы (AMD), включая сухую и влажную (неэкссудативную и экссудативную) формы, хороидальную неоваскуляризацию (CNV), увеит, диабетическую и другие вызванные ишемией ретинопатии, а также другие внутриглазные неоваскулярные заболевания, такие как диабетический макулярный отек, патологическая миопия, болезнь Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаз, окклюзия центральной ретинальной вены (CRVO), неоваскуляризация роговицы и неоваскуляризация сетчатки. Предпочтительная группа патологических состояний глаз, вызванных комплементом, включает возрастную дегенерацию макулы (AMD), включая неэкссудативную (влажную) и экссудативную (сухую или атрофическую) AMD, хороидальную неоваскуляризацию (CNV), диабетическую ретинопатию (DR) и эндофтальмит.
«Лечение» представляет собой вмешательство, произведенное с целью предотвращения развития или изменения патологии заболевания. Соответственно, термин «лечение» относится как к терапевтическому воздействию, так и к профилактическим или превентивным мерам. Те, кто нуждается в лечении, включают тех, кто уже имеет заболевание, а также тех, у которых заболевание должно быть предотвращено. При лечении заболевания, связанного с иммунной системой, терапевтическое средство может напрямую изменять силу ответной реакции компонента иммунного ответа или делать заболевание более восприимчивым к лечению другими терапевтическими средствами, например антибиотиками, противогрибковыми препаратами, противовоспалительными средствами, химиотерапевтическими средствами и так далее.
Термин «патология» заболевания, такого как патологическое состояние глаз, вызванное комплементом, включает все симптомы, которые нарушают нормальное течение жизни пациента. Он включает, без ограничения, ненормальный или неконтролируемый рост клеток (нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов, лимфоцитов), продукцию антител, продукцию аутоантител, продукцию комплемента, препятствие нормальному функционированию соседних клеток, высвобождение цитокинов или других секреторных продуктов в аномальных количествах, подавление или ухудшение любой воспалительной или иммунологической ответной реакции, инфильтрацию воспалительных клеток (нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов, лимфоцитов) в клеточное пространство и так далее.
Термин «млекопитающее», как используют в данном документе, относится к любому животному, классифицированному как млекопитающее, включая, без ограничений, людей, высших приматов, домашних и сельскохозяйственных животных, а также животных в зоопарке, животных для занятий спортом или домашних любимцев, таких как лошади, свиньи, крупный рогатый скот, собаки, кошки и хорьки и так далее. В предпочтительном варианте осуществления млекопитающее является человеком.
Введение «в сочетании с» одним или большим количеством дополнительных терапевтических средств охватывает одновременное (совместное) или последовательное введение в любом порядке.
«Терапевтически эффективное количество» представляет собой количество «антагониста фактора D», которое необходимо для достижения заметного улучшения состояния, например патологии намеченного заболевания или состояния, например, такого как патологическое состояние глаз, вызванное комплементом.
Термин «контрольные последовательности» означает последовательности ДНК, необходимые для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Контрольные последовательности, подходящие для прокариот, например, включают промотор, необязательно, операторную последовательность и центр связывания рибосомы. Известно, что в эукариотических клетках используются промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.
Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», если она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК предпоследовательности или секреторной лидерной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если он экспрессируется в виде белка-предшественника, который принимает участие в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает влияние на транскрипцию последовательности; или центр связывания рибосомы оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что это облегчает трансляцию. Как правило, «функционально связанные» означает, что последовательности ДНК, которые связаны, являются смежными и в случае секреторной лидерной последовательности смежными и в фазе считывания. Однако энхансеры необязательно должны быть расположены рядом. Связывание осуществляется за счет лигирования по подходящим сайтам рестрикции. Если такие сайты не существуют, используют синтетические олигонуклеотидные адапторы или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.
«Строгость условий» реакций гибридизации может легко определять рядовой специалист в данной области, и она, как правило, представляет собой эмпирический расчет, основанный на длине зонда, температуре отмывки и концентрации соли. Как правило, для более длинных зондов необходимы более высокие температуры для правильного отжига, тогда как для более коротких зондов нужны более низкие температуры. Обычно гибридизация зависит от способности денатурированной ДНК повторно ренатурировать, когда комплементарные нити присутствуют в среде при температуре ниже их температуры плавления. Чем выше степень желательной гомологии между зондом и гибридизуемой последовательностью, тем выше относительная температура, которую можно использовать. Из этого следует, что более высокие относительные температуры имеют тенденцию делать условия реакции более строгими, тогда как более низкие температуры делают их менее строгими. Для дополнительных подробностей и объяснения строгости условий реакций гибридизации смотрите Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
«Строгие условия» или «очень строгие условия», как определено в данном документе, можно определить как условия, при которых: (1) используют низкую ионную силу и высокую температуру для отмывки, например, смесь 0,015 M хлорид натрия/0,0015 M цитрат натрия/0,1% додецилсульфат натрия при 50°C; (2) используют во время гибридизации денатурирующее средство, такое как формамид, например, 50% (v/v) формамид со смесью 0,1% бычий сывороточный альбумин/0,1% фиколл/0,1% поливинилпирролидон/50 мМ натриево-фосфатный буфер при pH 6,5 с 750 мМ хлоридом натрия, 75 мМ цитратом натрия при 42°C; или (3) используют 50% формамид, 5×SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия (pH 6,8), 0,1% пирофосфат натрия, 5×раствор Денхардта, фрагментированную ультразвуком ДНК спермы лосося (50 мкг/мл), 0,1% SDS и 10% сульфат декстрана при 42°C, с отмывками при 42°C в 0,2×SSC (хлорид натрия/цитрат натрия) и 50% формамиде при 55°C, с последующей отмывкой в очень строгих условиях, заключающихся в использовании 0,1×SSC, содержащей EDTA, при 55°C.
«Умеренно строгие условия» можно определить как условия, описанные в Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, заключающиеся в использовании промывающего раствора и условий гибридизации (например, температуры, ионной силы и %SDS) менее строгих, чем описанные выше. Примером умеренно строгих условий является инкубация в течение ночи при 37°C в растворе, содержащем: 20% формамид, 5×SSC (150 мМ NaCl, 15 мМ тринатриевый цитрат), 50 мМ фосфат натрия (pH 7,6), 5×раствор Денхардта, 10% сульфат декстрана и 20 мг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося, с последующим промыванием фильтров в 1×SSC примерно при 37-50°C. Квалифицированный специалист знает, как следует регулировать температуру, ионную силу и так далее, чтобы привести их в соответствие с такими факторами, как длина зонда и тому подобное.
Термин «маркированный эпитопом», как используют в данном документе, означает химерный полипептид, представляющий собой полипептид по изобретению, слитый с «маркировочным полипептидом». Маркировочный полипептид содержит достаточно остатков для образования эпитопа, против которого можно получать антитело, но является достаточно коротким, чтобы не мешать проявлению активности полипептида, с которым он слит. Предпочтительно маркировочный полипептид также является совершенно уникальным, так что антитело существенно не реагирует перекрестно с другими эпитопами. Подходящие маркировочные полипептиды, как правило, содержат как минимум шесть аминокислотных остатков и обычно содержат примерно от 8 до 50 аминокислотных остатков (предпочтительно примерно от 10 до 20 аминокислотных остатков).
Термин «антитело» используется в самом широком смысле и конкретно охватывает, без ограничений, простые моноклональные антитела против фактора D (включая агонистические, антагонистические и нейтрализующие антитела), а также композиции антитела против фактора D с полиэпитопной специфичностью. Термин «моноклональное антитело», как используют в данном документе, означает антитело, полученное из популяции в основном гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, если не считать возможных естественных мутаций, которые могут встречаться в незначительных количествах.
Термин «моноклональное антитело», как используют в данном документе, означает антитело, полученное из популяции в основном гомогенных антител, то есть отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными, если не считать возможных естественных мутаций, которые могут встречаться в незначительных количествах. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными, будучи направлены против одного антигенного участка. Кроме того, в отличие от препаратов обычных (поликлональных) антител, которые, как правило, содержат различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против одной детерминанты антигена. Определение «моноклональное» указывает на характер антитела, как полученного из гомогенной, в основном, популяции антител, и его не следует истолковывать, как необходимость получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, используемые по настоящему изобретению, можно получать методом гибридом, впервые описанным Kohler et al. (1975) Nature 256: 495, или можно получать методами рекомбинантных ДНК (смотрите, например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» можно также выделять из фаговых библиотек антител при помощи методов, описанных, например, в Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 и Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597.
В данном документе моноклональные антитела, в частности, включают «химерные» антитела (иммуноглобулины), в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретных видов или принадлежащих к определенному классу или подклассу антител, тогда как оставшаяся цепь(пи) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из других видов, или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагменты таких антител, при условии, что они обладают желаемой биологической активностью (патент США № 4816567 и Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).
«Гуманизированные» формы антител, отличных от человеческих (например, мышиных), представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулина, отличного от человеческого. По большей части гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (реципиентное антитело), в которых остатки гипервариабельной области реципиента заменены остатками из гипервариабельной области видов, отличных от человека (донорское антитело), таких как мышь, крыса, кролик или нечеловекообразные приматы, имеющими нужную специфичность, аффинность и потенциал. В некоторых случаях остатки каркасной области (FR) Fv человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, отличными от человеческих. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые отсутствуют в реципиентном антителе или в донорском антителе. Такие модификации осуществляют с целью дальнейшего усовершенствования функции антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит в основном все, как минимум, из одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или в основном все из гипервариабельных петель соответствуют петлям из иммуноглобулина, отличного от человеческого, и все или в основном все из FR-областей являются областями последовательности иммуноглобулина человека. Также гуманизированное антитело, необязательно, содержит, как минимум, часть константной области (Fc) иммуноглобулина, обычно таковую из человеческого иммуноглобулина. Для дополнительных деталей смотрите Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525, Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-329 и Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596.
d
-7
-8
-9
«Видоспецифичное антитело» представляет собой антитело, которое обладает более сильной аффинностью связывания в отношении антигена из первого вида млекопитающих, чем оно обладает в отношении гомолога данного антигена из второго вида млекопитающих. Как правило, видоспецифичное антитело «связывает специфически» антиген человека (то есть обладает величиной аффинности связывания (K) не более примерно 1×10 M, предпочтительно не более примерно 1×10 M и наиболее предпочтительно не более примерно 1×10 M), но обладает аффинностью связывания в отношении гомолога данного антигена из второго вида млекопитающих, отличного от человека, которая как минимум примерно в 50 раз, или как минимум примерно в 500 раз, или как минимум примерно в 1000 раз слабее, чем его аффинность связывания в отношении человеческого антигена. Видоспецифичное антитело может относиться к любому из различных типов антител, как определено выше, но предпочтительно представляет собой гуманизированное или человеческое антитело.
Как используют в данном документе, «мутантное антитело» или «вариант антитела» означает вариант аминокислотной последовательности видоспецифичного антитела, где один или более аминокислотных остатков видоспецифичного антитела модифицированы. Такие мутанты неизбежно имеют менее 100% идентичности или сходства последовательностей с видоспецифичным антителом. В предпочтительном варианте осуществления мутантное антитело будет обладать аминокислотной последовательностью, имеющей как минимум 75% идентичности или сходства аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью вариабельного домена либо тяжелой, либо легкой цепи видоспецифичного антитела, более предпочтительно как минимум 80%, более предпочтительно как минимум 85%, более предпочтительно как минимум 90% и наиболее предпочтительно как минимум 95%. Идентичность или сходство в отношении данной последовательности определено в данном документе как процентное содержание аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными (то есть теми же самыми остатками) или сходными (то есть аминокислотными остатками из той же самой группы по принципу общих свойств боковых цепей, смотрите ниже) с остатками видоспецифичного антитела после выравнивания последовательностей и внесения разрывов, если необходимо, чтобы достигнуть максимального процента идентичности последовательностей. Ничто из N-концевых, C-концевых или внутренних удлиняющих сегментов, делеций или вставок в последовательность антитела за пределами вариабельного домена не должно быть истолковано как влияющее на идентичность или сходство последовательностей.
«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое идентифицировано и отделено и/или извлечено из компонентов его естественного окружения. Примесные компоненты его естественного окружения являются материалами, которые препятствовали бы диагностическому или терапевтическому применению антитела, и могут включать ферменты, гормоны и другие белковые и небелковые растворенные вещества. В предпочтительных вариантах осуществления антитело будет очищено (1) до более 95% содержания антитела по массе, что определяют методом Лоури, и наиболее предпочтительно более 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения как минимум 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности при помощи секвенатора с вращающимся стаканом, либо (3) до гомогенности при SDS-PAGE в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях с применением Кумасси голубого либо предпочтительно окрашивания серебром. Выделенное антитело включает антитело in situ внутри рекомбинантных клеток, поскольку как минимум один компонент естественного окружения антитела не будет присутствовать. Однако обычно выделенное антитело получают при помощи как минимум одной стадии очистки.
H
L
Как используют в данном документе, «вариабельный домен антитела» означает части легкой и тяжелой цепей молекул антител, которые содержат аминокислотные последовательности определяющих комплементарность областей (CDR, то есть CDR1, CDR2 и CDR3), а также каркасные области (FR). V означает вариабельный домен тяжелой цепи. V означает вариабельный домен легкой цепи. Согласно способам, применяемым в данном изобретении, позиции аминокислот, относящихся к CDR и FR, можно определять по Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 и 1991)). Нумерация аминокислот антител или антигенсвязывающих фрагментов также выполнена согласно Kabat.
Как используют в данном документе, термин «определяющие комплементарность области» (CDR, то есть CDR1, CDR2 и CDR3) означает аминокислотные остатки вариабельного домена антитела, наличие которых необходимо для связывания антигена. В каждом вариабельном домене обычно имеется три области CDR, обозначенные CDR1, CDR2 и CDR3. Каждая определяющая комплементарность область может содержать аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области» согласно Kabat (то есть примерно остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 31-35 (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) и/или остатки из «гипервариабельной петли» (то есть примерно остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (H1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) в вариабельном домене тяжелой цепи; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). В некоторых случаях определяющая комплементарность область может включать аминокислоты как из области CDR согласно Kabat, так и из гипервариабельной петли. Например, CDRH1 тяжелой цепи антитела 4D5 включает аминокислоты 26-35.
«Каркасные области» (далее FR) представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков CDR. Каждый вариабельный домен обычно содержит четыре FR, обозначенные FR1, FR2, FR3 и FR4. Если CDR имеют нумерацию по Kabat, остатки FR легкой цепи позиционируются примерно на остатках 1-23 (LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3) и 98-107 (LCFR4), а остатки FR тяжелой цепи позиционируются примерно на остатках 1-30 (HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94 (HCFR3) и 103-113 (HCFR4) остатков тяжелой цепи. Если CDR содержат аминокислотные остатки из гипервариабельных петель, остатки FR легкой цепи позиционируются примерно на остатках 1-25 (LCFR1), 33-49 (LCFR2), 53-90 (LCFR3) и 97-107 (LCFR4) в легкой цепи, а остатки FR тяжелой цепи позиционируются примерно на остатках 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) и 102-113 (HCFR4) остатков тяжелой цепи. В некоторых случаях, если CDR содержит аминокислоты как из CDR по принципу Kabat, так и аминокислоты гипервариабельной петли, остатки FR будут должным образом приведены в соответствие. Например, если CDRH1 содержит аминокислоты H26-H35, остатки FR1 тяжелой цепи находятся на позициях 1-25 и остатки FR2 находятся на позициях 36-49.
Как используют в данном документе, «набор кодона» означает набор различных нуклеотидных триплетных последовательностей, используемых для кодирования нужных вариантных аминокислот. Можно синтезировать набор олигонуклеотидов, например, твердофазным синтезом, включая последовательности, которые представляют все возможные сочетания триплетов нуклеотидов в соответствии с набором кодонов и которые будут кодировать нужную группу аминокислот. Стандартным способом обозначения кодонов является код IUB, который известен в данной области и описан в данном документе. Набор кодона обычно представлен 3 заглавными буквами курсивом, например NNK, NNS, XYZ, DVK и тому подобное. Таким образом, «неслучайный набор кодона», как используют в данном документе, означает набор кодона, который кодирует выбранные аминокислоты, которые соответствуют частично, а предпочтительно полностью критериям выбора аминокислот, как описано в данном документе. Синтез олигонуклеотидов с выбранной «вырожденностью» нуклеотидов на определенных позициях хорошо известен в данной области, например подход, называемый TRIM (Knappek et al. (1999) J. Mol. Biol. 296: 57-86), Garrard & Henner (1993) Gene 128: 103). Такие наборы олигонуклеотидов, содержащие определенные наборы кодонов, можно синтезировать, используя коммерческие синтезаторы нуклеиновых кислот (поставляются, например, Applied Biosystems, Foster City, CA), либо можно закупать (например, у Life Technologies, Rockville, MD). Вследствие этого набор синтезированных олигонуклеотидов, имеющих определенный набор кодонов, как правило, включает множество олигонуклеотидов с различными последовательностями, различия определяются за счет набора кодонов в составе всей последовательности. Олигонуклеотиды, как используют в данном изобретении, обладают последовательностями, которые делают возможной гибридизацию с полинуклеотидной матрицей вариабельного домена и которые также могут включать, но необязательно, сайты ферментов рестрикции, полезные, например, для целей клонирования.
2
2
Термин «фрагмент антитела» используется в данном документе в самом широком смысле и включает, без ограничения, фрагменты Fab, Fab', F(ab'), scFv, (scFv), dAb и определяющей комплементарность области (CDR), линейные антитела, одноцепочечные молекулы антител, минитела, диатела и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
H
L
«Fv»-фрагмент представляет собой фрагмент антитела, который содержит целый центр узнавания и связывания антигена. Данная область состоит из димера вариабельного домена одной тяжелой и одной легкой цепи в прочной ассоциации, которая может быть ковалентной по своей природе, например в scFv. Именно в данной конфигурации три CDR каждого вариабельного домена взаимодействуют с образованием антигенсвязывающего центра на поверхности димера V-V. Взятые вместе, шесть CDR, или их субпопуляция, определяют специфичность связывания антигена данным антителом. Однако даже один вариабельный домен (или половина Fv, содержащая только три CDR, специфичных для антигена) обладает способностью узнавать и связывать антиген, хотя, как правило, с меньшей аффинностью, чем целый центр связывания.
2
«Fab»-фрагмент содержит вариабельный и константный домен легкой цепи, а также вариабельный домен и первый константный домен (CH1) тяжелой цепи. F(ab')-фрагменты антитела содержат пару Fab-фрагментов, которые обычно ковалентно связаны вблизи своих карбоксильных концов через шарнирные остатки цистеина, находящиеся между ними. Другие виды химического соединения фрагментов антител также известны в данной области.
H
L
H
L
«Одноцепочечные Fv» или «scFv» фрагменты антитела содержат V и V домены антитела, где данные домены расположены на одной полипептидной цепи. Как правило, полипептид Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между V и V доменами, что позволяет scFv образовывать нужную структуру для связывания антигена. Для обзора scFv смотрите Pluckthun в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
H
L
H
L
Термин «диатела» означает небольшие фрагменты антитела с двумя антигенсвязывающими центрами, каковые фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V), связанный с вариабельным доменом легкой цепи (V) в одной и той же полипептидной цепи (V и V). При использовании линкера, который является слишком коротким, чтобы допускать спаривание между двумя доменами на одной цепи, домены вынужденно образуют пары с комплементарными доменами другой цепи с образованием двух антигенсвязывающих центров. Более подробно диатела описаны, например, в EP 404097, WO 93/11161 и Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448.
H
H
H
H
Выражение «линейные антитела» означает антитела, описанные в Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10): 1057-1062). Вкратце данные антитела содержат пару тандемных Fd-сегментов (V-C1-V-C1), которые совместно с комплементарными полипептидами легкой цепи образуют пару антигенсвязывающих областей. Линейные антитела могут быть биспецифическими или моноспецифическими.
Как используют в данном документе, «библиотека» означает множество последовательностей антител или фрагментов антител (например, полипептидов по данному изобретению) либо нуклеиновых кислот, которые кодируют данные последовательности, где последовательности различаются по сочетаниям вариантных аминокислот, которые вводят в данные последовательности согласно способам данного изобретения.
«Фаговый дисплей» означает метод, с помощью которого вариантные полипептиды экспонируются в виде слитых белков как минимум с частью белка оболочки на поверхности частиц фага, например нитевидного бактериофага. В основе практичности применения фагового дисплея лежит тот факт, что большие библиотеки рандомизированных белковых вариантов можно быстро и эффективно сортировать в поисках тех последовательностей, которые связывают целевой антиген с высокой аффинностью. Дисплей пептидных или белковых библиотек на фагах использовали для скрининга миллионов полипептидов в поисках тех из них, которые обладают свойствами специфичного связывания. Методы поливалентного фагового дисплея использовали для экспонирования малых рандомизированных пептидов и малых белков посредством слияния либо с геном III, либо с геном VIII нитевидного бактериофага. Wells and Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3: 355-362, и ссылки, приведенные в данной работе. В моновалентном фаговом дисплее проводят слияние белковой или пептидной библиотеки с геном III или его частью и экспрессируют ее на низких уровнях в присутствии белка гена III дикого типа так, что фаговые частицы экспонируют одну копию или вообще не экспонируют слитые белки. Эффекты авидности снижены относительно поливалентных фагов так, что отбор происходит на базе истинной лигандной аффинности, и используются фагмидные векторы, которые упрощают манипуляции с ДНК. Lowman and Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3: 205-0216.
«Фагмид» представляет собой плазмидный вектор, имеющий бактериальную точку начала репликации, например Co1E1, и копию межгенной области бактериофага. Фагмид можно использовать на любом известном бактериофаге, включая нитевидный бактериофаг и лямбдовидный бактериофаг. Как правило, плазмида также содержит селектируемый маркер на устойчивость к антибиотику. Сегменты ДНК, клонированные в данные векторы, можно размножать как плазмиды. Когда клетки, содержащие данные векторы, имеют все необходимые гены для продукции фаговых частиц, способ репликации плазмиды изменяется на репликацию по типу «катящегося кольца» с производством копий одной нити плазмидной ДНК и упаковкой фаговых частиц. Фагмид может образовывать инфекционные и неинфекционные фаговые частицы. Данный термин включает фагмиды, которые содержат ген белка оболочки фага или его фрагмент, присоединенный к гену гетерологичного полипептида в виде слитого гена так, что гетерологичный полипептид экспонируется на поверхности фаговой частицы.
Термин «фаговый вектор» означает двунитевую репликативную форму бактериофага, содержащую гетерологичный ген и способную к репликации. Фаговый вектор имеет фаговую точку начала репликации, делающую возможным репликацию фага и образование фаговых частиц. Фаг предпочтительно представляет собой нитевидный бактериофаг, такой как фаг M13, fl, fd, Pf3 или их производные, либо лямбдовидный фаг, такой как фаг лямбда, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434 и так далее, или их производные.
Как используют в данном документе, «доступная для растворителя позиция» означает позицию аминокислотного остатка в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей исходного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которая определена, исходя из структуры, совокупности структур и/или смоделированной структуры антитела или антигенсвязывающего фрагмента, как потенциально открытая для доступа растворителя и/или контакта с молекулой, такой как специфический для антитела антиген. Такие позиции обычно находятся в CDR и на внешней стороне белка. Доступные для растворителя позиции в антителе или антигенсвязывающем фрагменте, как определено в данном документе, можно выявлять при помощи любого из целого ряда алгоритмов, известных в данной области. Предпочтительно доступные для растворителя позиции определяют при помощи координат из 3-мерной модели антитела, предпочтительно используя компьютерную программу, такую как программа InsightII (Accelrys, San Diego, CA). Доступные для растворителя позиции можно также определять, используя алгоритмы, известные в данной области (например, Lee and Richards (1971) J. Mol. Biol. 55, 379 и Connolly (1983) J. Appl. Cryst. 16, 548). Определение доступных для растворителя позиций можно проводить, используя программное обеспечение, подходящее для моделирования белков, и информацию о 3-мерной структуре, полученную для антитела. Программное обеспечение, которое можно использовать для данных целей, включает программное обеспечение SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Обычно и предпочтительно, если алгоритм (программа) требует ввода пользователем размерного параметра, «размер» зонда, который используют в расчетах, задают примерно 1,4 ангстрема или менее в радиусе. Кроме того, определение доступных для растворителя областей и программное обеспечение с использованием методов площадей для персональных компьютеров, описано в Pacios (1994) Comput. Chem. 18(4): 377-386.
II. Подробное описание
Комплемент играет ключевую роль в защитной реакции организма и совместно с другими компонентами иммунной системы защищает индивидуума от патогенов, проникающих в организм. Однако при неправильной активации или контроле комплемент может также вызывать поражение тканей хозяина. Неправильная активация комплемента вносит вклад в патогенез множества заболеваний, известных как болезни или нарушения, вызванные комплементом, такие как связанные с иммунными комплексами и аутоиммунные заболевания, а также различные воспалительные состояния, включая опосредованное комплементом воспалительное поражение тканей. Патология вызванных комплементом заболеваний варьирует и может включать активацию комплемента в течение длительного или короткого периода времени, активацию всего каскада, только одного из каскадов (например, классического или альтернативного пути), только некоторых компонентов каскада и так далее. При некоторых заболеваниях комплементные биологические активности фрагментов комплемента приводят к поражению тканей и болезни. Соответственно, ингибиторы комплемента обладают высоким терапевтическим потенциалом. Избирательные ингибиторы альтернативного пути будут особенно полезными, поскольку выведение патогенов и других микроорганизмов из крови посредством классического пути останется незатронутым.
Антагонисты фактора D по настоящему изобретению применимы для профилактики и лечения патологических состояний глаз, вызванных комплементом (все патологические состояния и заболевания глаз, в патологии которых играет роль комплемент, включая классический и альтернативный пути, и в частности, альтернативный путь активации комплемента), таких как, например, дегенеративные заболевания макулы, такие как все стадии возрастной дегенерации макулы (AMD), включая сухую и влажную (неэкссудативную и экссудативную) формы, хороидальную неоваскуляризацию (CNV), увеит, диабетическую и другие вызванные ишемией ретинопатии, эндофтальмит, а также другие внутриглазные неоваскулярные заболевания, такие как диабетический макулярный отек, патологическая миопия, болезнь Гиппеля-Линдау, гистоплазмоз глаз, окклюзия центральной ретинальной вены (CRVO), неоваскуляризация роговицы и неоваскуляризация сетчатки. Предпочтительная группа патологических состояний глаз, вызванных комплементом, включает возрастную дегенерацию макулы (AMD), включая неэкссудативную (влажную) и экссудативную (сухую или атрофическую) AMD, хороидальную неоваскуляризацию (CNV), диабетическую ретинопатию (DR) и эндофтальмит.
AMD представляет собой возрастную дегенерацию макулы, которая является преобладающей причиной необратимой зрительной дисфункции у индивидуумов старше 60 лет. Существует два типа AMD, неэкссудативная (сухая) и экссудативная (влажная) AMD. Сухая, или неэкссудативная форма включает атрофические и гипертрофические изменения в ретинальном пигментном эпителии (RPE), находящемся под центральной сетчаткой (макулой), а также отложения (друзы) на RPE. У пациентов с неэкссудативной AMD может развиваться влажная или экссудативная форма AMD, при которой под сетчаткой развиваются аномальные кровеносные сосуды, называемые хороидальными неоваскулярными мембранами (CNVM), происходит утечка жидкости и крови, и это в конечном итоге приводит к образованию вызывающего слепоту дисковидного шрама в сетчатке и под ней. Неэкссудативная AMD, которая обычно предшествует экссудативной AMD, является более широко распространенной. Картина неэкссудативной AMD варьирует, могут присутствовать твердые друзы, мягкие друзы, географическая атрофия RPE и скопление пигмента. Компоненты комплемента откладываются на RPE на ранней стадии AMD и являются основными составляющими друз.
Настоящее изобретение относится конкретно к лечению AMD высокого риска, включая AMD категории 3 и категории 4. AMD категории 3 характеризуется отсутствием прогрессирующей AMD в обоих глазах, как минимум один глаз сохраняет остроту зрения 20/32 или лучше, при наличии как минимум одной большой друзы (например, 125 мкм), большого количества (по измеренной площади друз) друз среднего размера или географической атрофии (GA), которая не затрагивает центр макулы, или при любом сочетании перечисленного. Существует высокая степень риска преобразования AMD 3 категории (которая все еще считается «сухой» AMD) в хороидальную неоваскуляризацию (CNV).
AMD категории 4 с высокой степенью риска (классифицируемая как «влажная» AMD) характеризуется остротой зрения 20/32 или лучше и отсутствием прогрессирующей AMD (GA с затрагиванием центра макулы или признаки хороидальной неоваскуляризации) в индексном глазе. Второй глаз характеризуется прогрессирующей AMD или остротой зрения менее 20/32, связанной с макулопатией AMD. Как правило, AMD высокого риска, если ее не лечить, быстро прогрессирует в хороидальную неоваскуляризацию (CNV) со скоростью примерно в 10-30 раз большей, чем скорость прогрессирования для AMD категории 1 или 2 (невысокого риска).
Антагонисты фактора D находят конкретное применение для профилактики прогрессирования AMD (в частности, AMD категории 3 или категории 4) в CNV и/или профилактики развития/прогрессирования AMD или CNV в непораженном или менее пораженном втором глазе. В данном контексте термин «профилактика» используется в самом широком смысле и включает полное или частичное блокирование и замедление прогрессирования заболевания, а также отсрочку развития более серьезной формы заболевания. Пациенты с высокой степенью риска развития или прогрессирования в AMD высокого риска (категории 4) или CMV получают наибольшую пользу от данного аспекта изобретения.
Известно, что полиморфизм фактора H комплемента (CFH) связан с риском развития AMD и/или CNV у индивидуума. Мутации в CFH могут активировать комплемент, что, в свою очередь, может приводить к AMD/CNV. Недавно сообщалось, что полиморфизм фактора H комплемента (CFH) отвечает за 50% риска развития AMD (Klein et al., Science 308: 385-9 (2005)). Установлено, что общий гаплотип в CFH (HF1/CFH) предрасполагает индивидуумов к возрастной дегенерации макулы (Hageman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102(2): 7227-7232 (2005)). AMD разделяется как аутосомно-доминантный признак, при этом локус данного заболевания картируют на хромосоме 1q25-q31 между маркерами D1S466 и D1S413, с максимальным количественным показателем сцепления генов примерно 3,20 (Klein et al., Arch. Opthalmol. 116(8): 1082-9 (1998); Majewski et al., Am. J. Hum. Genet. 73(3): 540-50 (2003); Seddon et al., Am. J. Hum. Genet. 73(4): 780-90 (2003); Weeks et al., Am. J. Ophthalmol. 132(5): 682-92 (2001); Iyengar et al., Am. J. Hum. Genet. 74(1): 20-39 (2004)); хромосоме 2q3/2q32 между маркерами D12S1391 и D2S1384, с максимальным количественным показателем сцепления генов 2,32/2,03 (Seddon et al., выше); 3p13, между маркерами D12S1300 и D12S1763, с максимальным количественным показателем сцепления генов 2,19 (Majewski et al., выше; Schick et al., Am. J. Hum. Genet. 72(6): 1412-24 (2003)); 6q14 между маркерами D6S1056 и DS249 с максимальным количественным показателем сцепления генов 3,59/3,17 (Kniazeva et al., Am. J. Ophthlmol. 130(2): 197-202 (2000)); 9q33 на маркере D9S934, с максимальным количественным показателем сцепления генов 2,06 (Mejwski et al., выше); 10q26 на маркере D10S1230, с максимальным количественным показателем сцепления генов 3,06 (Majewski et al., выше; Iyengar et al., выше; Kenealy et al., Mol. Vis. 10: 57-61 (2004); 17q25 на маркере D17S928, с максимальным количественным показателем сцепления генов 3,16 (Weeks et al., выше); и 22q12 на маркере D22S1045, с максимальным количественным показателем сцепления генов 2,0 (Seddon et al., выше). Соответственно, генетический скрининг является важной частью выявления пациентов, которые являются особенно подходящими кандидатами для профилактического лечения, включая профилактику прогрессирования заболевания в более серьезную форму, как например, из AMD в CNV.
1. Антитела против фактора D
Данное изобретение охватывает получение и использование антител против фактора D. Типичные способы получения антител описаны более подробно в следующих разделах.
Антитела против фактора D отбирают, используя антиген фактор D из видов млекопитающих. Предпочтительно антиген является человеческим фактором D. Однако фактор D из других видов, такой как мышиный фактор D, также можно использовать как целевой антиген. Антигены фактора D из различных видов млекопитающих можно выделять из природных источников. В других вариантах осуществления антиген получают рекомбинантными методами или создают, используя другие способы синтеза, известные в данной области.
d
Выбранное антитело обычно обладает достаточно сильной аффинностью связывания в отношении антигена фактора D. Например, антитело может связывать человеческий фактор D с величиной K не более примерно 5 нМ, предпочтительно не более примерно 2 нМ и более предпочтительно не более примерно 500 пМ.
Аффинность антитела можно определять, например, при помощи анализа на основе поверхностного плазмонного резонанса (такого, как анализ BIAcore, описанный в разделе примеров), иммуноферментного анализа (ELISA) и конкурентных анализов (например, RIA).
Кроме того, антитело можно подвергать другим анализам на биологическую активность, например, чтобы оценивать его эффективность в качестве терапевтического средства. Такие анализы известны в данной области и зависят от целевого антигена и планируемого применения антитела. Примеры включают ингибиторный анализ HUVEC (как описано ниже в разделе примеров), анализы ингибирования роста раковых клеток (как описано, например, в WO 89/06692), анализы антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC) и опосредованной комплементом цитотоксичности (CDC) (патент США 5500362), а также анализы in vitro и in vivo, описанные ниже, для идентификации антагонистов фактора D.
Для скрининга антител, которые связывают конкретный эпитоп на интересующем антигене, можно проводить обычный анализ перекрестного блокирования, такой как тот, что описан в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Альтернативно, можно проводить картирование эпитопов, например, как описано в Champe et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 1388-1394, для определения, связывает ли антитело интересующий эпитоп.
В предпочтительном варианте осуществления антитела против фактора D выбирают при помощи уникального подхода с фаговым дисплеем. Данный подход включает получение фаговых библиотек синтетических антител на основе одной каркасной матрицы, разработку достаточного разнообразия внутри вариабельных доменов, дисплей полипептидов, обладающих разнообразными вариабельными доменами, отбор антител-кандидатов с высокой аффинностью к целевому антигену фактору D и выделение выбранных антител.
Подробности методов фагового дисплея можно найти, например, в WO 03/102157, опубликованном 11 декабря 2003 года.
В одном аспекте библиотеки антител можно получать, подвергая мутациям доступные для растворителя и/или сильно различающиеся позиции как минимум в одном CDR вариабельного домена антитела. Некоторые или все CDR можно подвергать мутациям при помощи способов, предложенных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления может быть предпочтительным получение различных библиотек антител, подвергая мутациям позиции в CDRH1, CDRH2 и CDRH3 с образованием одной библиотеки, либо подвергая мутациям позиции в CDRL3 и CDRH3 с образованием одной библиотеки, либо подвергая мутациям позиции в CDRL3 и CDRH1, CDRH2 и CDRH3 с образованием одной библиотеки.
Библиотеку вариабельных доменов антител можно получать, например, подвергая мутациям доступные для растворителя и/или сильно различающиеся позиции в CDRH1, CDRH2 и CDRH3. Другую библиотеку можно получать, внося мутации в CDRL1, CDRL2 и CDRL3. Такие библиотеки можно также использовать в сочетании друг с другом для получения связывающих молекул с нужной аффинностью. Например, после одного или более циклов селекции библиотек тяжелой цепи на связывания с целевым антигеном можно заменять библиотеку легкой цепи в популяции связывающих молекул тяжелой цепи для следующих циклов селекции для увеличения аффинности связывающих молекул.
Предпочтительно библиотеку создают, заменяя оригинальные аминокислоты на вариантные аминокислоты в области CDRH3 вариабельной области последовательности тяжелой цепи. Полученная библиотека может содержать множество последовательностей антител, где вариабельность последовательностей имеет место главным образом в области CDRH3 последовательности тяжелой цепи.
7
6
5
6
В одном аспекте библиотеку создают в контексте последовательности гуманизированного антитела 4D5 либо последовательности каркасных аминокислот последовательности гуманизированного антитела 4D5. Предпочтительно библиотеку создают, замещая как минимум остатки 95-100a тяжелой цепи аминокислотами, кодируемыми набором кодона DVK, где набор кодона DVK используют для кодирования набора вариантных аминокислот для каждой из данных позиций. Пример набора олигонуклеотидов, который является полезным для создания таких замещений, представляет собой последовательность (DVK). В некоторых вариантах осуществления библиотеку создают, замещая остатки 95-100a аминокислотами, кодируемыми наборами кодонов как DVK, так и NNK. Пример набора олигонуклеотидов, который является полезным для создания таких замещений, представляет собой последовательность (DVK)(NNK). В другом варианте осуществления библиотеку создают, замещая как минимум остатки 95-100a аминокислотами, кодируемыми наборами кодонов как DVK, так и NNK. Пример набора олигонуклеотидов, который является полезным для создания таких замещений, представляет собой последовательность (DVK)(NNK). Другой пример набора олигонуклеотидов, который является полезным для создания таких замещений, представляет собой последовательность (NNK). Другие примеры подходящих олигонуклеотидных последовательностей может определять специалист в данной области с учетом критериев, описанных в данном документе.
В другом варианте осуществления используют различные конструкции CDRH3, чтобы выделять высокоаффинные связывающие молекулы и выделять связывающие молекулы для различных эпитопов. Диапазон длин CDRH3, полученных в данной библиотеке, составляет от 11 до 13 аминокислот, хотя можно также получать длину, отличающуюся от указанной. Вариабельность H3 можно повысить, используя наборы кодонов NNK, DVK и NVK, а также более ограниченную вариабельность на N- и/или C-конце.
Можно также создавать вариабельность в CDRH1 в CDRH2. Конструкции разнообразных вариантов CDR-H1 и H2 следуют стратегии нацеливания, чтобы имитировать природный репертуар антител, как описано, с модификациями, которые фокусируются на вариабельности, более точно совпадающей с природной вариабельностью, чем предыдущая конструкция.
Для вариабельности в CDRH3 можно отдельно конструировать множество библиотек с различными длинами H3, а затем комбинировать для отбора на связывающие молекулы к целевым антигенам. Множество библиотек можно собирать воедино и сортировать при помощи методов селекции на твердой подложке и сортировки в растворе, как описано ранее и далее в данном документе. Можно использовать множество стратегий сортировки. Например, один вариант включает сортировку на мишень, связанную с твердой подложкой, с последующей сортировкой на маркер, который может присутствовать на слитом полипептиде (например, маркер анти-gD), и со следующей далее другой сортировкой на мишень, связанную с твердой подложкой. Альтернативно, библиотеки можно сначала сортировать на мишень, связанную с твердой подложкой, элюированные связывающие молекулы затем сортируют при помощи фазы связывания в растворе с понижающимися концентрациями целевого антигена. Использование сочетания различных способов сортировки обеспечивает минимизацию селекции только высокоэкспрессированных последовательностей и обеспечивает селекцию ряда различных высокоаффинных клонов.
4
5
Высокоаффинные связывающие молекулы для целевого антигена фактора D можно выделять из библиотек. Лимитирующая вариабельность в области H1/H2 снижает вырожденность примерно в 10-10 раз и, давая возможность для большей вариабельности H3, обуславливает более высокоаффинные связывающие молекулы. Использование библиотек с различными типами вариабельности в CDRH3 (например, использование DVK или NVT) обеспечивает выделение связывающих молекул, которые могут связывать различные эпитопы целевого антигена.
В другом варианте осуществления получают библиотеку или библиотеки с вариабельностью в областях CDRH1, CDRH2 и CDRH3. В данном варианте осуществления вариабельность в CDRH3 получают, используя множество различных длин областей H3 и используя преимущественно наборы кодонов XYZ и NNK или NNS. Библиотеки можно создавать, используя отдельные олигонуклеотиды, и собранные в пул или олигонуклеотиды можно собирать в пул с образованием субпопуляции библиотек. Библиотеки по данному варианту осуществления можно сортировать против мишени, связанной с твердой подложкой. Клоны, выделенные из множества разновидностей, можно подвергать скринингу на специфичность и аффинность при помощи анализов ELISA. Можно проводить скрининг клонов на специфичность против нужных целевых антигенов, а также других нецелевых антигенов. Связывающие молекулы для целевого антигена NRP1 затем можно скринировать на аффинность в анализе конкурентного связывания в растворе ELISA или в анализе конкурентного связывания иммобилизованного антигена. Высокоаффинные связывающие молекулы можно выделять из библиотеки, используя наборы кодонов XYZ, полученные, как описано выше. Эти связывающие молекулы можно легко продуцировать в виде антител или антигенсвязывающих фрагментов с большим выходом в культуре клеток.
В некоторых вариантах осуществления может оказаться желательным получение библиотек с большей вариабельностью длин области CDRH3. Например, может оказаться желательным получение библиотек с областями CDRH3 длиной в диапазоне примерно от 7 до 19 аминокислот.
Высокоаффинные связывающие молекулы, выделенные из библиотек по данным вариантам осуществления, легко получать с большим выходом в культуре бактериальных или эукариотических клеток. Можно разработать векторы для легкого удаления последовательностей, таких как маркеры gD, последовательности белковых компонентов оболочки вируса, и/или для внесения дополнений в последовательности константной области для обеспечения продукции полноразмерных антител или антигенсвязывающих фрагментов с большим выходом.
Библиотеку с мутациями в CDRH3 можно объединять с библиотекой, содержащей вариантные модификации других CDR, например CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 и/или CDRH2. Таким образом, например, в одном варианте осуществления библиотеку CDRH3 объединяют с библиотекой CDRL3, созданной в контексте последовательности гуманизированного антитела 4D5 с вариантными аминокислотами на позициях 28, 29, 30, 31 и/или 32, используя предетерминированные наборы кодонов. В другом варианте осуществления библиотеку с мутациями в CDRH3 можно объединять с библиотекой, содержащей вариантные вариабельные домены CDRH1 и/или CDRH2 тяжелой цепи. В одном варианте осуществления создают библиотеку CDRH1 с последовательностью гуманизированного антитела 4D5 с вариантными аминокислотами на позициях 28, 30, 31, 32 и 33. Можно создавать библиотеку CDRH2 с последовательностью гуманизированного антитела 4D5 с вариантными аминокислотами на позициях 50, 52, 53, 54, 56 и 58, используя предетерминированные наборы кодонов.
Антитело против фактора D, полученное из фаговых библиотек, можно дополнительно модифицировать для получения мутантных антител с улучшенными физическими, химическими и/или биологическими свойствами относительно исходного антитела. Если используемый анализ представляет собой анализ на биологическую активность, мутантное антитело предпочтительно обладает биологической активностью в выбранном анализе, которая как минимум примерно в 10 раз выше, предпочтительно примерно в 20 раз выше, более предпочтительно примерно в 50 раз выше и иногда как минимум примерно в 100 раз или в 200 раз выше, чем биологическая активность исходного антитела в данном анализе. Например, мутантное антитело против фактора D предпочтительно обладает аффинностью связывания для NRP, которая как минимум примерно в 10 раз сильнее, предпочтительно как минимум примерно в 20 раз сильнее, более предпочтительно как минимум примерно в 50 раз сильнее и иногда как минимум примерно в 100 раз или в 200 раз сильнее, чем аффинность связывания исходных антител против фактора D, таких как любое из антител, представленных на фиг.5, и в частности, антитело 20D12.
L
H
Для получения мутантного антитела одно или более изменений аминокислот (например, замен) вносят в одну или более гипервариабельных областей исходного антитела. Альтернативно или в дополнение к этому, можно вносить одно или более изменений аминокислот (например, замен) в остатки каркасной области исходного антитела, если это приводит к улучшению аффинности связывания мутантного антитела в отношении антигена из других видов млекопитающих. Примеры остатков каркасной области для модификаций включают те, которые непосредственно нековалентно связывают антиген (Amit et al. (1986) Science 233: 747-753), взаимодействуют с/влияют на конформацию CDR (Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917) и/или находятся на границе соприкосновения V-V (EP 239400 B1). В определенных вариантах осуществления модификация одного или более таких остатков каркасной области приводит к усилению аффинности связывания антитела для антигена из других видов млекопитающих. Например, в данном варианте осуществления изобретения можно изменять примерно от одного примерно до пяти каркасных остатков. Иногда этого может быть достаточно для получения мутантного антитела, которое подходит для использования в доклинических испытаниях, даже если ни один из остатков гипервариабельной области не был изменен. Однако, как правило, мутантное антитело будет содержать дополнительное изменение(я) в гипервариабельной области.
Остатки гипервариабельной области, подвергающиеся изменениям, можно изменять случайным образом, особенно если начальная аффинность связывания исходного антитела такова, что можно легко проводить скрининг таких полученных случайным образом мутантных антител.
Один полезный метод получения таких мутантных антител называется «сканирующий аланином мутагенез» (Cunningham and Wells (1989) Science 244: 1081-1085). При этом один или более остатков гипервариабельной области заменяют остатком(ами) аланина или полиаланина, чтобы повлиять на взаимодействие аминокислотных остатков с антигеном из других видов млекопитающих. Те остатки(ток) гипервариабельной области, которые демонстрируют функциональную чувствительность к заменам, затем оптимизируют путем введения дополнительных или других мутаций на участки замены или для их создания. Таким образом, в то время как участок для внесения изменения аминокислотной последовательности заранее определен, природа мутации как таковая необязательно должна быть заранее определена. Полученные таким образом ala-мутанты подвергают скринингу на их биологическую активность, как описано в данном документе.
Как правило, начинают с консервативной замены, такой как те, что приведены ниже под заголовком «предпочтительные замены». Если такие замены приводят к изменению биологической активности (например, аффинности связывания), то тогда вносят более существенные изменения, называемые «типичные замены», приведенные в следующей далее таблице или дополнительно описанные ниже в ссылках на классы аминокислот, и проводят скрининг продуктов. Предпочтительные замены приведены ниже в таблице.
Исходный остаток
Типичные замены
Предпочтительные замены
Ala (A)
val, leu, ile
val
Arg (R)
lys, gln, asn
lys
Asn (N)
gln, his, lys, arg
gln
Asp (D)
glu
glu
Cys (C)
ser
ser
Gln (Q)
asn
asn
Glu (E)
asp
asp
Gly (G)
pro, ala
ala
His (H)
asn, gln, lys, arg
arg
Ile (I)
leu, val, met, ala, phe, норлейцин
leu
Leu (L)
норлейцин, ile, val, met, ala, phe
ile
Lys (K)
arg, gln, asn
arg
Met (M)
leu, phe, ile
leu
Phe (F)
leu, val, ile, ala, tyr
leu
Pro (P)
ala
ala
Ser (S)
thr
thr
Thr (T)
ser
ser
Trp (W)
tyr, phe
tyr
Tyr (Y)
trp, phe, thr, ser
phe
Val (V)
ile, leu, met, phe, ala, норлейцин
leu
Выполняют даже более существенные модификации биологических свойств антител, выбирая замены, которые значительно отличаются по своему эффекту на поддержание (a) структуры полипептидного остова в области замены, например, складчатой или спиральной конформации, (b) заряда или гидрофобности молекулы в целевом участке или (c) основной массы боковой цепи. Существующие в природе остатки делят на группы на основании общих свойств боковой цепи:
(1) гидрофобные: норлейцин, met, ala, val, leu, ile;
(2) нейтральные гидрофильные: cys, ser, thr, asn, gln;
(3) кислые: asp, glu;
(4) основные: his, lys, arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: gly, pro; и
(6) ароматические: trp, tyr, phe.
Неконсервативные замены влекут за собой замену члена одного из данных классов на другой класс.
В другом варианте осуществления участки, выбранные для модификации, подвергают созреванию аффинности при помощи фагового дисплея (смотрите выше).
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие мутантные аминокислотные последовательности, получают множеством различных способов, известных в данной области. Данные способы включают, но не ограничиваются ими, опосредованный олигонуклеотидами (или сайт-специфический) мутагенез, ПЦР-мутагенез и кассетный мутагенез ранее полученного мутанта или немутантного варианта исходного антитела. Предпочтительным способом получения мутантов является сайт-специфический мутагенез (смотрите, например, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488).
В определенных вариантах осуществления в мутантном антителе будет заменен только один остаток гипервариабельной области. В других вариантах осуществления будут заменены два или более остатков гипервариабельной области исходного антитела, например, примерно от двух примерно до десяти замен в гипервариабельной области.
Как правило, мутантное антитело с улучшенными биологическими свойствами будет обладать аминокислотной последовательностью, имеющей как минимум 75% идентичность или сходство аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью вариабельного домена либо тяжелой, либо легкой цепи исходного антитела, более предпочтительно как минимум 80%, более предпочтительно как минимум 85%, более предпочтительно как минимум 90% и наиболее предпочтительно как минимум 95%. Идентичность или сходство в отношении данной последовательности определяют в данном документе как процентное содержание аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые являются идентичными (тот же самый остаток) или сходными (то есть аминокислотный остаток из той же группы на основании общих свойств боковых цепей, смотрите выше) с остатками исходного антитела после выравнивания последовательностей и внесения разрывов, если необходимо, чтобы достигнуть максимального процента идентичности последовательностей. Ничто из N-концевых, C-концевых или внутренних удлиняющих сегментов, делеций или вставок в последовательность антитела за пределами вариабельного домена не должно быть истолковано как влияющее на идентичность или сходство последовательностей.
После получения мутантного антитела определяют биологическую активность данной молекулы в сравнении с исходным антителом. Как указано выше, сюда может входить определение аффинности связывания и/или других биологических активностей антитела. В предпочтительном варианте осуществления изобретения получают панель мутантных антител и проводят скрининг на аффинность связывания для антигена, такого как NRP1 или его фрагмент. Один или более мутантных антител, выбранных при таком первичном скрининге, по желанию подвергают одному или большему количеству дополнительных анализов на биологическую активность для подтверждения того, что мутантное антитело(ла) с повышенной аффинностью связывания действительно являются пригодными, например, для доклинических испытаний.
Выбранное таким образом мутантное антитело(ла) может быть подвергнуто дополнительным модификациям, часто зависящим от планируемого применения антитела. Такие модификации могут включать дополнительные изменения аминокислотной последовательности, слияние с гетерологичным полипептидом(ами) и/или ковалентные модификации, такие как те, что конкретизированы ниже. Что касается изменений аминокислотной последовательности, типичные модификации конкретизированы выше. Например, любой остаток цистеина, не вовлеченный в поддержание надлежащей конформации антитела, в мутантном антителе также можно заменять, обычно серином, для повышения окислительной устойчивости молекулы и предотвращения аберрантных перекрестных сшивок. И наоборот, цистеиновый мост(ы) можно добавлять в антитело для повышения его стабильности (особенно если антитело представляет собой фрагмент антитела, такой как Fv-фрагмент). Другой тип аминокислотных мутантов имеет измененную картину гликозилирования. Этого можно достичь путем делеции одного или более углеводных фрагментов, присутствующих в антителе, и/или добавления одного или более сайтов гликозилирования, которые отсутствуют в антителе. Гликозилирование антител, как правило, бывает либо N-связанным, либо O-связанным. N-связанное означает присоединение углеводного фрагмента к боковой цепи остатка аспарагина. Трипептидные последовательности аспарагин-X-серин и аспарагин-X-треонин, где X представляет собой любую аминокислоту за исключением пролина, являются узнаваемыми последовательностями для ферментативного присоединения углеводного фрагмента к боковой цепи аспарагина. Таким образом, наличие любой из данных трипептидных последовательностей в полипептиде создает потенциальный сайт гликозилирования. O-связанное гликозилирование означает присоединение одного из сахаров N-ацетилгалактозамина, галактозы или ксилозы к гидроксиаминокислоте, чаще всего серину или треонину, хотя 5-гидроксипролин или 5-гидроксилизин также можно использовать. Добавление сайтов гликозилирования к антителу удобно осуществлять, изменяя аминокислотную последовательность таким образом, чтобы она содержала одну или большее количество из вышеописанных трипептидных последовательностей (для N-связанных сайтов гликозилирования). Изменения можно также вносить путем добавления (или замены на них) одного или более остатков серина или треонина к последовательности исходного антитела (для O-связанных сайтов гликозилирования).
Антитела против фактора D по данному изобретению можно получать рекомбинантными способами, используя легко доступные методы и материалы.
Для рекомбинантной продукции антитела против фактора D нуклеиновую кислоту, кодирующую его, выделяют и встраивают в реплицируемый вектор для дальнейшего клонирования (амплификация ДНК) или для экспрессии. ДНК, кодирующую антитело, легко выделять или синтезировать при помощи общепринятых методов (например, используя олигонуклеотидные зонды, которые способны связываться специфически с молекулами ДНК, кодирующими тяжелую и легкую цепи антитела). Множество векторов являются доступными. Компоненты вектора, как правило, включают, но не ограничиваются ими, одно или более из следующего: сигнальную последовательность, точку начала репликации, один или более маркерных генов, энхансерный элемент, промотор и последовательность терминации транскрипции.
(i) Компонент сигнальной последовательности
Антитело по данному изобретению можно получать рекомбинантным способом не только непосредственно, но также и как слитый полипептид с гетерологичным полипептидом, который предпочтительно является сигнальной последовательностью или другим полипептидом, обладающим специфическим сайтом расщепления на N-конце зрелого белка или полипептида.
Выбранная гетерологичная сигнальная последовательность предпочтительно является последовательностью, которую узнает и процессирует (то есть расщепляет сигнальной пептидазой) клетка-хозяин. Для прокариотических клеток-хозяев, которые не узнают и не процессируют сигнальную последовательность природного антитела, сигнальную последовательность заменяют на прокариотическую сигнальную последовательность, выбранную, например, из группы, состоящей из щелочной фосфатазы, пенициллиназы, lpp или лидерных последовательностей термостабильного энтеротоксина II. Для секреции в дрожжах природную сигнальную последовательность можно заменять, например, на лидерную последовательность дрожжевой инвертазы, лидерную последовательность α-фактора (включая лидерные последовательности α-фактора Saccharomyces и Kluyveromyces) или лидерную последовательность кислой фосфатазы, лидерную последовательность глюкоамилазы C. albicans либо на сигнальную последовательность, описанную в WO 90/13646. Для экспрессии в клетках млекопитающих доступны сигнальные последовательности млекопитающих, а также вирусные секреторные лидерные последовательности, например сигнальная последовательность gD вируса простого герпеса. ДНК для такой области-предшественника лигируют в рамке считывания с ДНК, кодирующей антитело.
(ii) Компонент точки начала репликации
Как экспрессионные, так и клонирующие векторы содержат последовательность нуклеиновой кислоты, которая позволяет вектору реплицироваться в одном или большем количестве избирательных типов клеток-хозяев. Как правило, в клонирующих векторах данная последовательность является такой, которая позволяет вектору реплицироваться независимо от хромосомной ДНК хозяина, и включает точки начала репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны для множества бактерий, дрожжей и вирусов. Точка начала репликации из плазмиды pBR322 является подходящей для большинства грамотрицательных бактерий, точка начала репликации плазмиды 2μ подходит для дрожжей и точки начала репликации различных вирусов (SV40, полиомы, аденовируса, VSV или BPV) подходят для клонирующих векторов в клетках млекопитающих. Как правило, компонент точки начала репликации не является необходимым для экспрессионных векторов млекопитающих (обычно можно использовать точку начала репликации SV40 только потому, что она содержит ранний промотор).
(iii) Компонент селектируемого гена
Экспрессионные и клонирующие векторы могут содержать селектируемый ген, также называемый селектируемый маркер. Обычные селектируемые гены кодируют белки, которые (a) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например ампициллину, неомицину, метатрексату или тетрациклину, (b) восполняют ауксотрофные дефициты или (c) снабжают необходимыми питательными веществами, недоступными из комплексных сред, например ген, кодирующий D-аланинрацемазу для Bacilli.
В одном из примеров схемы селекции используют лекарственное средство для подавления роста клетки-хозяина. Те клетки, которые успешно трансформированы гетерологичным геном, продуцируют белок, придающий устойчивость к лекарственному средству и, таким образом, способствующий выживанию в режиме селекции. В примерах такой доминантной селекции используют лекарственные средства неомицин, микофеноловую кислоту и гигромицин.
Другими примерами подходящих селектируемых маркеров для клеток млекопитающих являются такие, которые позволяют идентифицировать клетки, способные принимать нуклеиновую кислоту антитела, например гены DHFR, тимидинкиназы, металлотионеина-I и -II, предпочтительно металлотионеина млекопитающих, аденозиндезаминазы, орнитиндекарбоксилазы и так далее.
Например, клетки, трансформированные селектируемым геном DHFR, сначала идентифицируют культивированием всех трансформантов в культуральной среде, которая содержит метотрексат (Mtx), конкурентный антагонист DHFR. Подходящими клетками-хозяевами при использовании DHFR дикого типа является линия клеток яичника китайского хомячка (CHO), дефицитных по активности DHFR.
Альтернативно, клетки-хозяева (в частности, хозяева дикого типа, которые содержат эндогенную DHFR), трансформированные или ко-трансформированные последовательностями ДНК, кодирующими антитело, белок DHFR дикого типа и другой селектируемый маркер, такой как аминогликозид-3'-фосфотрансфераза (APH), можно отбирать путем выращивания клеток в среде, содержащей селекционное средство для селектируемого маркера, такое как аминогликозидный антибиотик, например канамицин, неомицин или G418. Смотрите патент США № 4965199.
Подходящим селектируемым геном для использования в дрожжах является ген trp1, присутствующий в дрожжевой плазмиде YRp7 (Stinchcomb et al. (1979) Nature 282: 39). Ген trp1 является селектируемым маркером для мутантного штамма дрожжей, лишенного способности расти на триптофане, например ATCC № 44076 или PEP4-1. Jones (1977) Genetics 85: 12. Наличие повреждения гена trp1 в геноме дрожжевой клетки-хозяина, таким образом, создает эффективное окружение для выявления трансформации путем роста в отсутствие триптофана. Аналогично, Leu2-дефицитные штаммы дрожжей (ATCC 20622 или 38626) дополняются известными плазмидами, несущими ген Leu2.
Кроме того, векторы, происходящие из 1,6 мкм кольцевой плазмиды pKD1, можно использовать для трансформации дрожжей Kluyveromyces. Альтернативно, сообщается об экспрессионной системе для крупномасштабного производства рекомбинантного телячьего химозина в K. lactis. Van den Berg (1990) Bio/Technology 8: 135. Также описаны стабильные многокопийные экспрессионные векторы для секреции зрелого рекомбинантного человеческого сывороточного альбумина промышленными штаммами Kluyveromyces. Fleer et al. (1991) Bio/Technology 9: 968-975.
(iv) Компонент промотора
Экспрессионные и клонирующие векторы обычно содержат промотор, который узнается организмом-хозяином и является функционально связанным с нуклеиновой кислотой антитела. Промоторы, подходящие для использования с прокариотическими хозяевами, включают промотор phoA, промоторные системы β-лактамазы и лактозы, щелочной фосфатазы, промоторную систему триптофана (trp) и гибридные промоторы, такие как промотор tac. Однако подходящими являются и другие известные бактериальные промоторы. Промоторы для использования в бактериальных системах также содержат последовательность Шайна-Дальгарно (S. D.), функционально связанную с ДНК, кодирующей антитело.
Известны промоторные последовательности для эукариот. Практически все гены эукариот имеют AT-богатую область, расположенную примерно на 25-30 нуклеотидов выше сайта, где инициируется транскрипция. Другая последовательность, находящаяся на 70-80 нуклеотидов выше от точки начала транскрипции многих генов, представляет собой область CNCAAT, где N может быть любым нуклеотидом. На 3'-конце большинства эукариотических генов находится последовательность AATAAA, которая может являться сигналом для добавления поли-A хвоста к 3'-концу кодирующей последовательности. Все эти последовательности надлежащим образом встраиваются в эукариотические экспрессионные векторы.
Примеры подходящих промоторных последовательностей для использования с хозяевами-дрожжами включают промоторы для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, таких как энолаза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, гексокиназа, пируватдекарбоксилаза, фосфофруктокиназа, глюкоза-6-фосфатизомераза, 3-фосфоглицератмутаза, пируваткиназа, триозафосфатизомераза, фосфоглюкозоизомераза и глюкокиназа.
Другие дрожжевые промоторы, которые являются индуцируемыми промоторами, имеющими дополнительное преимущество в том, что транскрипция контролируется условиями роста, представляют собой промоторные области для алкогольдегидрогеназы 2, изоцитохрома C, кислой фосфатазы, деструктивных ферментов, связанных с метаболизмом азота, металлотионеина, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и ферментов, ответственных за утилизацию мальтозы и галактозы. Подходящие векторы и промоторы для использования в дрожжевой экспрессии дополнительно описаны в EP 73657. Дрожжевые энхансеры также преимущественно используют с дрожжевыми промоторами.
Транскрипция антитела с векторов в клетке-хозяине млекопитающих контролируется, например, промоторами, получаемыми из геномов вирусов, таких как вирус полиомы, вирус оспы кур, аденовирус (такой, как аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирус, вирус гепатита B и наиболее предпочтительно обезьяний вирус 40 (SV40), из гетерологичных промоторов млекопитающих, например промотора актина или промотора иммуноглобулина, из промоторов белков теплового шока, при условии что такие промоторы совместимы с системами клеток-хозяев.
Ранний и поздний промоторы вируса SV40 обычно получают как рестрикционный фрагмент SV40, который также содержит точку начала репликации вируса SV40. Предранний промотор человеческого цитомегаловируса обычно получают как рестрикционный фрагмент HindIII E. Система для экспрессии ДНК в млекопитающих-хозяевах с использованием вируса папилломы крупного рогатого скота в качестве вектора описана в патенте США № 4419446. Модификация данной системы описана в патенте США № 4601978. Смотрите также Reyes et al. (1982) Nature 297: 598-601 относительно экспрессии кДНК β-интерферона человека в клетках мыши под контролем промотора тимидинкиназы из вируса простого герпеса. Альтернативно, в качестве промотора можно использовать длинный концевой повтор вируса саркомы Рауса.
(v) Компонент энхансерного элемента
Транскрипцию ДНК, кодирующей антитело по данному изобретению, высшими эукариотами часто повышают путем встраивания энхансерной последовательности в вектор. Известно множество энхансерных последовательностей из генов млекопитающих (глобин, эластаза, альбумин, α-фетопротеин и инсулин). Однако, как правило, используют энхансер из вируса эукариотической клетки. Примеры включают энхансер SV40 на «поздней» стороне точки начала репликации (bp 100-270), ранний промотор/энхансер цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы на «поздней» стороне точки начала репликации и энхансеры аденовируса. Смотрите также Yaniv (1982) Nature 297: 17-18 относительно энхансерных элементов для активации эукариотических промоторов. Энхансер может быть сплайсирован в вектор на позиции 5' или 3' к последовательности, кодирующей антитело, однако он предпочтительно расположен на сайте 5' от промотора.
(vi) Компонент терминации транскрипции
Экспрессионные векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (клетках дрожжей, грибов, насекомых, растений, животных, человека или содержащих ядро клетках других многоклеточных организмов), также содержат последовательности, необходимые для терминации транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доступны из 5'- и, иногда, 3'-нетранслируемых областей эукариотических или вирусных молекул ДНК или кДНК. Такие области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые как полиаденилированные фрагменты в нетранслируемой части мРНК, кодирующей антитело. Один полезный компонент терминации транскрипции представляет собой полиаденилированную область гормона роста крупного рогатого скота. Смотрите WO 94/11026 и раскрытый в данном документе экспрессионный вектор.
(vii) Селекция и трансформация клеток-хозяев
Подходящими клетками-хозяевами для клонирования или экспрессии ДНК в векторах по данному документу являются клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот, описанные выше. Подходящие прокариоты для данной цели включают эубактерии, такие как грамотрицательные или грамположительные микроорганизмы, например энтеробактерии, такие как Escherichia, например E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например Salmonella typhimurium, Serratia, например Serratia marcescans и Shigella, а также бациллы, такие как B. siibtilis и B. licheniformis (например, B. licheniformis 41P, описанные в DD 266710, дата публикации 12 апреля 1989 года), Pseudomonas, такие как P. aeruginosa и Streptomyces. Одним из предпочтительных хозяев для клонирования из E. coli является E. coli 294 (ATCC 31446), хотя подходят и другие штаммы, такие как E. coli B, E. coli X 1776 (ATCC 31537) и E. coli W3110 (ATCC 27325). Приведенные примеры являются иллюстративными, а не ограничивающими.
В дополнение к прокариотам эукариотические микроорганизмы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, являются подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии кодирующих антитело векторов. Saccharomyces cerevisiae, или обычные пекарские дрожжи, наиболее широко используются среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев. Однако целый ряд других родов, видов и штаммов легко доступны и применимы по данному изобретению, такие как Schizosaccharomyces pombe, хозяева Kluyveromyces, такие как, например, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans и K. marxianus; yarrowia (EP 402226); Pichia pastoris (EP 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, такие как Schwanniomyces occidentalis, и мицелиальные грибы, такие как, например, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium и хозяева Aspergillus, такие как A. nidulans и A. niger.
Подходящими клетками-хозяевами для экспрессии гликозилированного антитела являются такие, которые происходят из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Идентифицированы многочисленные штаммы и варианты бакуловирусов и соответствующих пермиссивных клеток-хозяев насекомых из таких хозяев, как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes aegypti (москит), Aedes albopictus (москит), Drosophila melanogaster (плодовая мушка) и Bombyx mori. Множество штаммов вирусов для трансфекции являются общедоступными, например вариант L-1 Autographa californica NPV и штамм Bm-5 Bombyx mori NPV, и такие вирусы можно использовать в качестве описанных в данном документе вирусов по настоящему изобретению, особенно для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Культуры растительных клеток хлопчатника, кукурузы, картофеля, соевых бобов, петунии, томата и табака также можно использовать в качестве хозяев.
Однако наибольший интерес представляют клетки позвоночных, и размножение клеток позвоночных в культуре (культуре тканей) стало рутинной процедурой. Примерами применимых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток CV1 почки обезьяны, трансформированных SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); линия клеток эмбриональной почки человека (клетки 293 или 293, субклонированные для роста в суспензионной культуре, Graham et al. (1977) J. Gen Virol. 36: 59); клетки почки новорожденного хомячка (BHK, ATCC CCL 10); клетки яичника китайского хомячка/-DHFR (CHO, Urlaub et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216); мышиные клетки Сертоли (TM4, Mather (1980) Biol. Reprod. 23: 243-251); клетки почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76, ATCC CRL-1587); клетки карциномы шейки матки человека (HELA, ATCC CCL 2); клетки почки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клетки печени крысы Буффало (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клетки легкого человека (W 138, ATCC CCL 75); клетки печени человека (Hep G2, HB 8065); клетки опухоли молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клетки TRI (Mather et al. (1982) Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68); клетки MRC 5; клетки FS4 и клетки линии гепатомы человека (Hep G2).
Клетки-хозяева трансформируют описанными выше экспрессионными или клонирующими векторами для продукции антител и культивируют в общепринятых питательных средах, модифицированных соответствующим образом для индукции промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих нужные последовательности.
(viii) Культивирование клеток-хозяев
Клетки-хозяева, используемые для продукции антитела по данному изобретению, можно культивировать во множестве разных сред. Для культивирования клеток хозяев подходят коммерчески доступные среды, такие как среда Хэма F10 (Sigma), минимальная поддерживающая среда (MEM) (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM) (Sigma). Кроме того, любую из сред, описанных в Ham et al. (1979) Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al. (1980) Anal. Biochem. 102: 255, патентах США № 4767704, 4657866, 4927762, 4560655 или 5122469, WO 90/03430, WO 87/00195 или ответе на патент США 30985, можно использовать как среду культивирования для клеток-хозяев. В любую из данных сред можно добавлять при необходимости гормоны и/или другие ростовые факторы (такие, как инсулин, трансферрин или эпидермальный ростовой фактор), соли (такие, как хлорид натрия, кальция, магния, а также фосфаты), буферные растворы (такие, как HEPES), нуклеотиды (такие, как аденозин и тимидин), антибиотики (такие, как лекарственное средство гентамицин™), микроэлементы (определяемые как неорганические соединения, обычно присутствующие в микромолярных конечных концентрациях) и глюкозу или эквивалентные источники энергии. Любые другие необходимые добавки также можно включать в соответствующих концентрациях, которые известны специалистам в данной области. Условия культивирования, такие как температура, pH и тому подобное, являются такими же, как те, что использовали ранее для селекции клеток-хозяев для экспрессии, и хорошо известны любому квалифицированному специалисту в данной области.
(ix) Очистка антитела
При использовании рекомбинантных методов антитело может продуцироваться внутри клетки в периплазматическом пространстве либо непосредственно секретироваться в среду. Если антитело продуцируется внутри клетки, в качестве первого этапа, твердые частицы, либо клетки-хозяева, либо лизированные фрагменты удаляют, например, центрифугированием или ультрафильтрацией. Carter et al. (1992) Bio/Technology 10: 163-167 описывают способ выделения антител, которые секретируются в периплазматическое пространство E. coli. Вкратце клеточную массу размораживают в присутствии ацетата натрия (pH 3,5), EDTA и фенилметилсульфонилфторида (PMSF) в течение примерно 30 минут. Клеточный детрит можно удалять центрифугированием. Если антитело секретируется в среду, супернатанты от таких систем экспрессии, как правило, сначала концентрируют при помощи коммерчески доступного фильтра для концентрирования белков, например устройства для ультрафильтрации Amicon или Millipore Pellicon. Ингибитор протеаз, такой как PMSF, можно включать на любом из вышеуказанных этапов для ингибирования протеолиза и антибиотики можно включать для предотвращения роста случайных примесей.
H
Композицию антител, полученную из клеток, можно очищать при помощи, например, хроматографии на гидроксилапатите, электрофореза в геле, диализа и аффинной хроматографии, при этом аффинная хроматография является предпочтительным методом очистки. Возможность применения белка A в качестве аффинного лиганда зависит от вида и изотипа любого Fc-домена иммуноглобулина, имеющегося в антителе. Белок A можно использовать для очистки антител, обладающих тяжелыми цепями γ1, γ2 или γ4 человека (Lindmark et al. (1983) J. Immunol. Meth. 62: 1-13). Белок G рекомендован для всех изотипов мыши и для γ3 человека (Guss et al. (1986) EMBO J. 5: 1567-1575). Матрица, к которой прикреплен аффинный лиганд, чаще всего представляет собой агарозу, однако доступны и другие виды матрицы. Механически стабильные матрицы, такие как стекло с контролируемым размером пор или поли(стирендивинил)бензол, позволяют использовать повышенные скорости потока и сокращать время процесса по сравнению с тем, что можно достичь, применяя агарозу. Если антитело содержит домен C3, для очистки полезно использовать смолу Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ). В зависимости от того, какое антитело необходимо выделять, доступны и другие методы очистки белков, такие как фракционирование на ионообменной колонке, осаждение этанолом, ВЭЖХ с обращенной фазой, хроматография на силикагеле, хроматография на гепарине, хроматография на SEPHAROSE™ с использованием анионообменной или катионообменной смолы (например, колонки с полиаспарагиновой кислотой), хроматофокусирование, SDS-PAGE и осаждение сульфатом аммония.
После любого предварительного этапа(ов) очистки смесь, содержащую интересующее антитело и примеси, можно подвергать хроматографии гидрофобного взаимодействия при низких значениях pH, используя буфер элюции при pH примерно 2,5-4,5, предпочтительно проводимой при низких концентрациях соли (например, примерно 0-0,25 M соль).
2. Тесты для скрининга и модели на животных для идентификации антагонистов фактора D
Антагонисты фактора D можно оценивать с помощью множества клеточных тестов и животных моделей вызванных комплементом заболеваний или нарушений. Так, например, можно создавать модели на рекомбинантных (трансгенных) животных путем встраивания кодирующей части интересующих генов в геном интересующих животных, используя стандартные методы получения трансгенных животных. Животные, которых можно использовать для трансгенных манипуляций, включают, без ограничения, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, овец, коз, свиней и приматов, отличных от человека, например павианов, шимпанзе и других обезьян. Методы, известные в данной области, для введения трансгена в таких животных включают микроинъекцию в пронуклеус (Hoppe and Wanger, патент США № 4873191), опосредованный ретровирусом перенос гена в зародышевые линии (например, Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 6148-615 [1985]), направленное воздействие на гены в эмбриональных стволовых клетках (Thompson et al., Cell 56, 313-321 [1989]), электропорацию эмбрионов (Lo, Mol. Cell Biol. 3, 1803-1814 [1983]), опосредованный спермой перенос гена (Lavitrano et al., Cell 57, 717-73 [1989]). Для обзора смотрите, например, патент США № 4736866.
Для целей настоящего изобретения трансгенные животные включают таких животных, у которых трансген присутствует только в части клеток («мозаичные животные»). Трансген можно интегрировать либо как одиночный трансген, либо в конкатамерах, например тандемах типа «голова к голове» или «голова к хвосту». Избирательное введение трансгена в клетки определенного типа также возможно, например, при помощи метода Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 623-636 (1992).
Экспрессию трансгена в трансгенном животном можно контролировать обычными методами. Например, можно использовать блоттинг по Саузерну или ПЦР-амплификацию для подтверждения интеграции трансгена. Затем уровень экспрессии мРНК можно анализировать при помощи таких методов, как гибридизация in situ, нозерн-блоттинг, ПЦР или иммуноцитохимические методы.
Затем животных можно изучать на наличие патологических признаков иммунного заболевания, например, путем гистологического исследования для определения инфильтрации иммунных клеток в конкретные ткани. Можно также проводить эксперименты по блокированию, в которых трансгенных животных подвергают воздействию потенциальным антагонистом фактора D для определения степени влияния на комплемент и активацию комплемента, включая классический и альтернативный пути, либо на пролиферацию T клеток. В данных экспериментах животному вводят блокирующие антитела, которые связываются с полипептидом по изобретению, и контролируют интересующий биологический эффект.
Альтернативно, можно создавать «нокаутных» животных, которые имеют дефектный или измененный ген, кодирующий фактор D, как результат гомологичной рекомбинации между эндогенным геном, кодирующим полипептид фактора D, и измененной геномной ДНК, кодирующей тот же полипептид, введенной в эмбриональную клетку животного. Например, кДНК, кодирующую фактор D, можно использовать, чтобы клонировать геномную ДНК, кодирующую фактор D, согласно общепринятым методам. Часть геномной ДНК, кодирующей фактор D, можно делетировать или заменять другим геном, таким как ген, кодирующий селектируемый маркер, который можно использовать для контроля интеграции. Как правило, в вектор включены несколько килобаз неизмененной фланкирующей ДНК (как на 5'-, так и на 3'-конце) (смотрите, например, Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) для описания векторов гомологичной рекомбинации). Вектор вводят в линию эмбриональных стволовых клеток (например, при помощи электропорации) и отбирают клетки, в которых произошла гомологичная рекомбинация введенной ДНК с эндогенной ДНК (смотрите, например, Li et al., Cell, 69: 915 (1992)). Затем выбранные клетки вводят инъекцией в бластоцисту животного (например, мыши или крысы) для образования агрегационных химер (смотрите, например, Bradley, в Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152). Затем химерный эмбрион можно имплантировать подходящей псевдобеременной приемной самке животного, которая доносит эмбрион до срока, в результате чего получится «нокаутное» животное. Потомство, имеющее гомологично рекомбинированную ДНК в своих зародышевых клетках, можно идентифицировать стандартными методами и использовать для скрещивания, чтобы получать животных, у которых все клетки содержат гомологично рекомбинированную ДНК. Нокаутных животных можно характеризовать по их способности не поддаваться определенным патологическим состояниям и по развитию у них патологических состояний из-за отсутствия полипептида фактора D.
Таким образом, биологическую активность потенциальных антагонистов фактора D можно дополнительно изучать на мышах с нокаутом мышиного фактора D.
Животная модель возрастной дегенерации макулы (AMD) представляет собой мышей с нулевой мутацией в генах Ccl-2 или Ccr-2. У таких мышей развиваются основные признаки AMD, включая скопление липофусцина в ретинальном пигментном эпителии и друз под ним (RPE), атрофию фоторецепторов и хороидальную неоваскуляризацию (CNV). Данные признаки развиваются после 6 месяцев жизни. Потенциальные антагонисты фактора D можно проверять в тестах на образование друз, атрофию фоторецепторов и хороидальную неоваскуляризацию.
3. Фармацевтические композиции
Антагонисты фактора D по настоящему изобретению, включая антитела против фактора D и другие молекулы, идентифицированные при помощи скрининговых тестов, описанных выше, можно вводить в форме фармацевтических композиций для лечения патологических состояний глаз, вызванных комплементом.
Терапевтические препараты антагониста фактора D по изобретению получают для хранения путем смешивания активных молекул, имеющих нужную степень чистоты, с необязательными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]) в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях и включают буферные растворы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие, как октадецилдиметилбензиламмоний хлорид; гексоний хлорид; бензалконий хлорид, бензетоний хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глютамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннитол, трегалоза или сорбитол; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные сурфактанты, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (ПЭГ) (PEG).
Липофекцию или липосомы также можно использовать для доставки полипептида, антитела или фрагмента антитела в клетки. Если используют фрагменты антитела, то предпочтительным является наименьший фрагмент, который специфически связывается со связывающим доменом целевого белка. Например, исходя из последовательностей вариабельной области антитела, можно разработать пептидные молекулы, которые сохраняют способность связывать последовательность целевого белка. Такие пептиды можно синтезировать химически и/или получать при помощи методов рекомбинантной ДНК (смотрите, например, Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]).
Активные молекулы можно также заключать в микрокапсулы, полученные, например методом коацервации или межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) либо в макроэмульсиях. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Препараты, используемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко осуществить путем фильтрации через мембраны для стерильной фильтрации.
Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Соответствующие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, при этом матрицы находятся в форме профилированных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с замедленным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели, например поли(2-гидроксиэтилметакрилат), или поли(виниловый) спирт, полилактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глютаминовой кислоты и γ-этил-L-глютамата, неразлагающийся этиленвинилацетат, разлагающиеся сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъецируемые микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и леупролидацетата), а также поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту. В то время как такие полимеры, как этиленвинилацетат и сополимер молочной кислоты и гликолевой кислоты, обеспечивают высвобождение молекул на протяжении более 100 дней, определенные гидрогели высвобождают белки в течение более коротких периодов времени. Если инкапсулированные антитела остаются в организме в течение длительного времени, они могут денатурировать или агрегировать в результате того, что находятся в условиях влажности при 37°C, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям иммуногенности. Можно разрабатывать рациональные стратегии для стабилизации в зависимости от задействованных механизмов. Например, если установлено, что механизм агрегации представляет собой образование межмолекулярных S-S связей путем тио-дисульфидного обмена, стабилизации можно достигнуть при помощи модификации сульфгидрильных остатков, лиофилизации из кислых растворов, контроля за содержанием влаги, использования соответствующих добавок и разработки определенных композиций полимерных матриц.
Соединения по данному изобретению для профилактики или лечения глазного заболевания или патологического состояния, как правило, вводят глазной, внутриглазной инъекцией и/или инъекцией в стекловидное тело. Можно использовать и другие способы введения, которые включают, но не ограничиваются ими, локальное, парентеральное, подкожное, внутрибрюшинное, внутрилегочное, интраназальное введение и введение внутрь пораженных тканей. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение.
Препараты для глазного, внутриглазного введения или введения в стекловидное тело можно получать при помощи способов и с использованием ингредиентов, известных в данной области. Основным требованием для эффективного лечения является надлежащее проникновение в глаз. В отличие от заболеваний фронтальной части глаза, куда лекарственные средства можно доставлять локально, для лечения заболеваний сетчатки требуется более специфический подход. Глазные капли и мази редко проникают к задней части глаза, и гемоофтальмический барьер препятствует проникновению лекарственных средств в ткань глаза при системном введении. Соответственно, обычно предпочтительным способом доставки лекарственных средств для лечения заболевания сетчатки, такого как AMD и CNV, является прямая инъекция в стекловидное тело. Как правило, инъекции в стекловидное тело повторяют с интервалами, которые зависят от состояния пациентов, а также от свойств и времени полужизни доставляемого лекарственного средства. Для проникновения внутрь глаза (например, внутрь стекловидного тела), как правило, предпочтительными являются молекулы небольшого размера.
Эффективность лечения патологических состояний глаз, вызванных комплементом, таких как AMD или CNV, можно определять по различным критериям ожидаемого результата, обычно применяемым для оценки состояния при глазных заболеваниях. Например, можно оценивать потерю зрения. Потерю зрения можно оценивать, например, но не ограничиваясь этим, измеряя среднее изменение наилучшей коррекции остроты зрения (BCVA) от базовой линии до нужного момента времени (например, когда BCVA основана на таблице для определения остроты зрения в исследовании раннего лечения диабетической ретинопатии (ETDRS) и оценке при тестировании на расстоянии 4 метра), измеряя пропорциональную долю субъектов, чья потеря остроты зрения составила менее 15 знаков в нужный момент времени относительно базовой линии, измеряя пропорциональную долю субъектов, чья острота зрения улучшилась на 15 знаков или более в нужный момент времени относительно базовой линии, измеряя пропорциональную долю субъектов, чья острота зрения в эквиваленте Снеллена составляет 20/2000 или менее в нужный момент времени, проводя измерения на основе опросного листа по зрительным функциям NEI, измеряя размер CNV и величину подтекания CNV в нужный момент времени, например, при помощи флуоресцеиновой ангиографии и так далее. Можно проводить, например, оценки состояния глаз, которые, например, включают, но не ограничиваются ими, проведение исследования глаз, измерение внутриглазного давления, оценку остроты зрения, измерение давления при помощи щелевой лампы, оценку внутриглазного воспаления и так далее.
Приведенные ниже примеры предложены только для иллюстративных целей, и никоим образом не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
Полное содержание всех патентных документов и литературных источников, процитированных в настоящем описании, специально включено в данный документ посредством ссылок.
Примеры
Коммерчески доступные реагенты, перечисленные в примерах, использовали в соответствии с инструкциями производителей, если не указано особо. Источником клеток, идентифицированных в следующих далее примерах и на протяжении всего описания с помощью входящего номера ATCC, является Американская коллекция типовых культур, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201 10-2209.
Пример 1
Получение и тестирование антитела против фактора D
Методы:
Получение жидкости из стекловидного тела и оболочки Бруха для белкового анализа
Глаза от трупов людей с AMD и без AMD оттаивали и передний сегмент удаляли вместе со стекловидным телом, сетчаткой и RPE. Стекловидное тело собирали в микротрубки, замораживали в сухом льду и хранили при -70°C до дальнейшего использования. Сосудистый слой оболочки Бруха отделяли от задней половины глазного яблока (Crabb, J.W. et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 99: 14682-7 (2002)) и либо 4-мм, либо 6-мм трепанированные образцы выделяли из макулярной и окружающей центральной области для последующего анализа. Смотрите прилагающуюся сводную таблицу (таблица 2) данных о препаратах оболочки Бруха, возрасте, половой принадлежности, стадии AMD, примечаниях при вскрытии и количестве, используемом для протеомического анализа. Один трепанированный образец диаметром 4 мм использовали для анализа уровней белка фактора D комплемента. Образец обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин в разбавителе для анализа (PBS/0,5% BSA/0,5% Tween-20) и растворимые фракции отделяли от нерастворимых центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин. Растворимую фракцию использовали для анализов методом ELISA.
Получение моноклональных антител к фактору D человека
Моноклональные антитела к фактору D человека получали путем инъекции 2 мкг фактора D (Comptech, Taylor, TX) в адъюванте монофосфориловый липид A/дикориномиколат трегалозы (Corixa, Hamilton, MT) в подушечки лап мышей линии Balb/c 11 раз. Проводили слияние клеток подколенных лимфатических узлов с клетками миеломы P3X63Ag.U.1. Клетки гибридомы подвергали скринингу на аффинность связывания в отношении мышиного фактора D. Линии клеток, продуцирующие антитела, клонировали методом серийных разведений.
Анализы гемолиза
9
2
Для определения активности альтернативного пути эритроциты кролика (Er, Colorado Serum) промывали 3× в GVB и ресуспендировали до концентрации 2×10/мл. Ингибиторы (50 мкл) и 20 мкл суспензии Er смешивали 1:1 со смесью GVB/0,1 M EGTA/0,1 M MgCl. Активацию комплемента запускали добавлением свободной от C1q человеческой сыворотки (Quidel; 30 мкл, разведение 1:3 в GVB). После 30-минутной инкубации при комнатной температуре добавляли смесь 200 мкл GVB/10 мМ EDTA для остановки реакции и образцы центрифугировали в течение 5 мин при 500 g. Гемолиз определяли в 200 мкл супернатанта, измеряя поглощение при 412 нм. Данные выражали как % гемолиза, индуцированный в отсутствие ингибитора. Для определения эффекта антитела к фактору D на классический путь активации комплемента использовали аналогичный способ, за исключением того что Er заменяли на покрытые IgM эритроциты овцы (E-IgM, CompTech) и анализ выполняли в дефицитной по фактору B сыворотке человека в GVB++.
ELISA фактора D человека
Поликлональное антитело козы против человеческого фактора D комплемента (пАТ) (pAb) (R&D Systems, Minneapolis, MN) разводили до 1 мкг/мл в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) и наносили на планшеты для ELISA (384-луночные планшеты с высоким уровнем связывания, Greiner Bio One через VWR International, Bridgeport, New Jersey) при инкубации в течение ночи при 4°C. После промывания 3 раза промывочным буфером (PBS/0,05% Tween-20) планшеты блокировали смесью PBS/0,5% бычий сывороточный альбумин (BSA) в течение 1-2 часов. Эту и все последующие инкубации выполняли при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Образцы лизатов жидкости из стекловидного тела и оболочки Бруха человека разводили, используя разбавитель для анализа (PBS/0,5% BSA/0,5% Tween-20). При помощи того же буфера готовили серийные разведения фактора D (Complement Technology, Inc., Tyler, Texas) для калибровочной кривой (15,6-1000 пг/мл). Оттаивали замороженные контрольные образцы, заранее разведенные так, чтобы количественно соответствовать области высокой, средней и низкой концентрации на калибровочной кривой. После этапа блокирования планшеты промывали и добавляли образцы, стандарты и контроли с последующей инкубацией в течение 2 часов. Планшеты промывали, биотинилированное моноклональное антитело 9G7.1.16 против человеческого фактора D разбавляли до 62,5 нг/мл и добавляли в планшеты для инкубации в течение 1-2 часов. Конъюгат стрептавидин-пероксидаза хрена (SA-HRP) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) разбавляли 1/10000 в разбавителе для анализа и добавляли в промытые планшеты. После 30-минутной инкубации и заключительного этапа промывки добавляли тетраметилбензидин (TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) и оставляли для развития окраски на 5-7 минут. В конечном итоге реакцию останавливали добавлением 1 M фосфорной кислоты. Оптическую плотность измеряли при помощи микропланшетного ридера (450 нм, референсная длина волны 650 нм) и концентрации образцов рассчитывали на основании 4-параметрических подгонок калибровочных кривых. Минимальные поддающиеся количественному определению концентрации фактора D в образцах жидкости стекловидного тела и лизатов оболочки Бруха человека составляли 780 пг/мл (минимальное разведение 1/50) и 156 пг/мл (минимальное разведение 1/10) соответственно.
Иммуногистохимия
2
2
2
Образцы оболочки Бруха замораживали в соединении OCT и криомикротомом нарезали 7-мкм срезы. Иммунное окрашивание. Срезы фиксировали в ацетоне в течение 5 минут после нарезания и хранили при -80°C до состояния готовности для окрашивания. Замороженные слайды промывали в PBS 2 раза с последующими 2 промывками солевым Tris-буфером, содержащим 0,1% Tween (TBST). Эндогенные авидин и биотин блокировали набором для блокирования авидина и биотина Vector Avidin Biotin Blocking Kit (SP-2001) при комнатной температуре, следуя инструкциям производителя. Срезы промывали в TBST, 2 смены по 5 минут каждая, и эндогенные иммуноглобулины блокировали 10% лошадиной сывороткой в смеси 3% BSA/PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. Срезы инкубировали с антителом против человеческого фактора D (9G7.1.16), разведенным до 10 мкг/мл в 10% лошадиной сыворотке в течение 60 минут при комнатной температуре. В качестве отрицательного контроля использовали не подвергнутые воздействию антитела мыши IgG2a в концентрации 10 мкг/мл (Pharmingen). После промывания в TBST, 2 смены по 5 минут каждая, срезы инкубировали с биотинилированным антителом лошади против антител мыши (Vector), разведенным до 2,5 мкг/мл (1:200) в лошадиной сыворотке, в течение 30 минут. Срезы промывали в TBST, 2 смены по 5 минут каждая, и инкубировали с реагентом Vectastain ABC-AP Elite Reagent в течение 30 минут при комнатной температуре, промывали в TBST (2 смены по 5 минут каждая) и инкубировали в свежеприготовленном растворе Vector Red. Vector Red готовили следующим образом: для 200 мМ Tris HCl, разводили 1 M Tris HCl 1:5 в дHO (1 часть Tris HCl и 4 части дHO). Смешивали 1 каплю левамизола в каждых 5 мл 200 мМ раствора свежеприготовленного Tris HCl. Смешивали 2 капли реагентов 1, 2 и 3 из набора Vector Red отдельно в каждых 5 мл 200 мМ раствора Tris HCl-левамизол. Использовали в течение 5-10 минут поле добавления реагента 3 из набора Vector Red. Срезы промывали в HO и окрашивали гематоксилином Майера путем погружения в гематоксилин 10-15 раз (20-30 секунд), промывали водой до синей окраски и хорошо промывали водопроводной водой в течение 5 минут до отмывания окрашивающего в синий цвет реагента. На срезы наносили раствор Crystal Mount и оставляли на ночь для высыхания. Высушенные покрытые Crystal mount слайды погружали в ксилол и заклеивали препарат покровным стеклом при помощи заливочной среды Permamount.
Клонирование тяжелой и легкой цепей 20D12
Суммарную РНК экстрагировали из клеток гибридомы, продуцирующих моноклональное антитело 20D12 мыши против фактора D человека, используя набор RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany). Вариабельные домены легкой (VL) и вариабельные домены тяжелой (VH) цепей амплифицировали при помощи ОТ-ПЦР, используя следующие вырожденные праймеры:
Легкая цепь (LC), прямой:
5'GATCGATATCGTRATGACHCARTCTCA3' (SEQ ID NO:4)
Легкая цепь, обратный:
5'TTTDAKYTCCAGCTTGGTACC3' (SEQ ID NO:5)
Тяжелая цепь (HC), прямой:
5'GATCCGTACGCTCAGGTYCARYTGCARCARTCTGG3' (SEQ ID NO:6)
Тяжелая цепь, обратный:
5'ACAGTGGGCCCTTGGTGGAGGCTGMRGAGACDGTGASHRDRGT3' (SEQ ID NO:7)
Прямые праймеры являлись специфичными для N-концевой аминокислотной последовательности области VL и VH. Соответственно, обратные праймеры LC и HC были разработаны для отжига с областью в константном домене легкой (CL) и константном домене 1 тяжелой цепи (CH1), которая является высококонсервативной у разных видов.
Амплифицированный VL клонировали в экспрессионный вектор pRK клеток млекопитающего (Shields et al., J. Biol. Chem. 2000; 276: 6591-604), содержащий константный домен каппа-цепи человека. Амплифицированный VH встраивали в экспрессионный вектор pRK клеток млекопитающего, кодирующий полноразмерный константный домен IgG1 человека. Таким образом, 20D12 было преобразовано в химерный мышино-человечекий IgG1.
Вышеизложенное письменное описание считается достаточным, чтобы специалист в данной области мог применять на практике данное изобретение. Объем настоящего изобретения не должен быть ограничен депонированной конструкцией, поскольку депонированный вариант осуществления предназначен являться лишь одной из иллюстраций определенных аспектов изобретения, и любые конструкции, которые являются функционально эквивалентными, входят в объем данного изобретения. Депонирование материала по данному документу не является признанием того, что содержащееся в данном документе письменное описание является недостаточным для применения на практике любого аспекта изобретения, включая его лучший вариант осуществления, его также не следует расценивать как ограничивающее объем формулы изобретения конкретными иллюстрациями, которые оно представляет.
В действительности, различные модификации изобретения в дополнение к тем, что представлены и описаны в данном документе, очевидны для специалистов в данной области из вышеприведенного описания и входят в объем прилагающейся формулы изобретения.