СПОСОБ ОЦЕНКИ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЭНДОТЕЛИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ЖИВОТНЫХ ПОСЛЕ РЕКОНСТРУКТИВНЫХ ОПЕРАЦИЙ НА БРЮШНОЙ АОРТЕ
METHOD FOR ASSESSING FUNCTIONAL STATUS OF ENDOTHELIUM IN EXPERIMENTAL ANIMALS AFTER RECONSTRUCTIVE SURGERIES OF ABDOMINAL AORTA

Изобретение относится к медицине, а именно к сосудистой хирургии, и может быть использовано при лечении облитерирующего атеросклероза артерий нижних конечностей (ОААНК).
В настоящее время функциональному состоянию эндотелия придается большое значение в изучении этиологии, патогенеза облитерирующего атеросклероза, прогрессировании заболевания, развитии осложнений [1]. Основным активным метаболитом, определяющим функциональное состояние эндотелия, большинством авторов признается оксид азота (II) (NO), являющейся локальным тканевым гормоном с множественными эффектами - от противовоспалительного до сосудистых эффектов и стимуляции ангиогенеза [2]. Также в комплексной оценке ФСЭ целесообразно учитывать компоненты перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты [3, 4]. Одним из проявлений эндотелиальной дисфункции в послеоперационном периоде является гиперплазия неоинтимы в зоне реконструкции [1]. Актуальным представляется возможность интерпретации биохимических показателей, отражающих влияние изменений ФСЭ на артериальную стенку, в которой, по сути, и развиваются основные процессы. К сожалению, in vivo выполнить подобное исследование не представляется возможным по объективным причинам.
Цель изобретения - оценка функционального состояния эндотелия экспериментальных животных после реконструктивного хирургического вмешательства на брюшной аорте.
Способ заключается в следующем: экспериментальным животным (беспородные кошки, 20 животных массой от 3,0 до 4,5 кг) в соответствии с этическими нормами после оперативного вмешательства (аллопластика инфраренального отдела брюшной аорты) с лабораторным контролем биохимических показателей, оценкой клинических исходов и компьютерной морфометрией зоны реконструкции (анастомозов) при помощи стереометрического анализа. В процессе наблюдения в различные сроки (до операции, через 10 дней после, через 1 месяц и 6 месяцев после вмешательства) проводится лабораторный контроль биохимических показателей с целью оценки функционального состояния эндотелия (определение малонового диальдегида (МДА) колориметрическим методом по реакции 2-тиобарбитуровой кислотой [7]; определение активности супероксиддисмутазы (СОД) спектрофотометрическим (кверцитиновым) методом (Бурмистров C.O., 1997 в модификации); количественное определение стабильных конечных метаболитов оксида азота (II) (NO) [8]. Через шесть месяцев животные наркотизируются и выводятся из исследования, зона пластики изучается макро и микроскопически с применением стереометрического анализа, компьютерной морфометрии. Для гистологических исследований и стереометрии применяется: микроскоп Leica DM3000 с камерой Leica DFC360 FX и программным обеспечением, позволяющим архивировать и анализировать (в т.ч., проводить морфометрические исследования) изображения. Функции анализа изображений включают: измерения (расстояние, угол, периметр, площадь, точки, линии и области гистограммы со статистикой). Стандартная окраска препаратов (гематоксилином и эозином, пикрофуксином, фукселином). Для заключения препаратов под покровное стекло применяется монтирующая среда Био Маунт.
Схема способа: исходный анализ биохимических показателей крови (NO, СОД, МДА) → операция (аллопластика брюшной аорты) → биохимический контроль через 6 месяцев → выведение животных из эксперимента → гистологическое исследование зоны аллопластики аорты (компьютерная морфометрия) → расчет корреляции.
Таблица №1
Морфометрические показатели толщины оболочек сосудов артериального типа
Оболочка сосуда
Размер (мкм)
Средняя толщина интимы
73,3±5,7
Средняя толщина средней оболочки
205,7±14,9
Средняя толщина адвентиции
123,6±28,4
По нашим данным показатели у неоперированных животных следующие: средняя толщина нормальной интимы 41,2±3,1 мкм, медии - 195,5±12,2 мкм, адвентиции - 103,7±24,1 мкм. Как видно из представленных данных определяется достоверное увеличение средней толщины интимы в группе оперированных животных. Как известно, основные изменения в стенки магистральных артерий, связанные с утолщением, изменением объема клеток развиваются именно в интиме сосуда [1].
Таблица №2
Значение исследуемых показателей в различные сроки.
До операции
Через 10 дней
Через 1 мес.
Через 6 мес.
МДА ((уе) на MgHb)
19,8861±2,7753
34,5057±5,1141
21,11±1,5010
14,8498±6,1212
СОД (уе) на MgHb
0,1522±0,0267
0,2081±0,0225
0,968±0,0172
1,0092±0,0395
NO (ye)
13,8855±5,6775
24,9168±9,2995
9,423±4,641
8,7±6,783
Из таблицы №2 наглядно представлена тенденция биохимических изменений в различные сроки до и после оперативного лечения. Между результатами биохимических анализов в срок 6 месяцев от выполнения операции и показателями морфометрии проводится корреляционный анализ в различных вариантах по Пирсону, Кендаллу, Спирмену. Изучалась корреляционная связь между изучаемыми биохимическими показателями (МДА, СОД, NO) и средней толщиной интимы (СТИ), для оценки влияния биохимических показателей на реакцию сосудистой стенки. Получены следующие результаты:
Таблица №3
Коэффициенты корреляции по анализируемым показателям.
Коэффициент корреляции Пирсона
Значимость ненулевой корреляции
Коэффициент корреляции Кендалла
Значимость ненулевой корреляции
Коэффициент корреляции Спирмена
Значимость ненулевой корреляции
NO/СТИ
-0,89
Есть
-0,87
Есть
-0,83
Есть
СОД/СТИ
0,57
Есть
0,53
Есть
0,49
Есть
МДА/СТИ
0,75
Есть
0,69
Есть
0,65
Есть
Полученные результаты свидетельствуют об обратной зависимости между уровнем NO и СТИ, прямой зависимости между СОД и СТИ, МДА и СТИ. Корреляция значима. Таким образом, в случае высокого уровня метаболитов NO развитие утолщения интимы менее выражено и не превышает физиологических значений восстановления стенки артерии после операционного воздействия, при низком уровне метаболитов NO -развивается гиперплазия интимы. Чем выше активность СОД и уровень МДА, тем активнее развивается утолщение интимы (гиперплазия).
Представленный способ позволяет реализовать интерпретацию биохимических изменений характеризующих ФСЭ на артериальную стенку, оценить влияние NO, СОД, МДА на послеоперационное утолщение интимы, прогнозировать развитие гиперплазии интимы in vivo путем анализа представленных показателей в крови лабораторных животных и определения тенденции биохимических изменений в соответствии с корреляционной зависимостью.
Приводим экспериментальное наблюдение.
До операции проводился забор крови из вен тыльной поверхности передней лапы. Были получены следующие результаты: NO=13,2 уе; СОД=0,151 (уе) на Mg Hb, МДА=18,3 (уе) на Mg Hb. Через 2 дня выполнялось оперативное вмешательство.
Под наркозом выполнялась полная срединная лапаротомия, выделялась брюшная аорта, продольная аортотомия, аллопластика брюшной аорты (Рис.1-3). Послойное ушивание раны.
Животные содержались в виварии с соблюдением необходимых условий содержания и пищевого рациона.
Через 10 дней после операции повторно произведен забор крови, получены следующие результаты: NO=8,68 уе; СОД=0,2 (уе) на Mg Hb, МДА=34,5 (уе) на Mg Hb.
Через 1 месяц после операции значение исследуемых показателей было следующим: NO=20,1 уе; СОД=0,962 (уе) на Mg Hb, МДА=21,7 (уе) на Mg Hb.
Через 6 месяцев проводился последний забор крови с целью оценки уровня биохимических показателей: NO=8,4 уе; СОД=0,96 (уе) на Mg Hb, МДА=13,8 (уе) на Mg Hb.
Затем животное наркотизировалось и выводилось из исследования, зона пластики изучалась макро и микроскопически с применением стереометрического анализа, компьютерной морфометрии. Были получены следующие результаты (рис.4): толщина интимы 72,7 мкм (толщина интимы не оперированного животного 41,2±3,1 мкм); средней оболочки 203,4 мкм; толщина адвентиции 122,1 мкм.
На обзорных срезах отчетливо видна гиперплазированная интима, лишенная или частично лишенная эндотелиальной выстилки (рис.4). Волокна в интиме рыхло расположены, внутренняя эластическая мембрана сформирована, местами утолщена. Волокна, ее образующие разнонаправленные, местами истончены (рис.5).
Обозначения: 1 - гиперплазированная неоинтима с воспалительной инфильтрацией.
Развитие неоинтимы физиологический послеоперационный процесс, определяемый взаимным влиянием биохимических показателей. Основными служат СОД, МДА и NO, которые отражают функциональное состояние эндотелия и изменения активности про- и антиоксидантных систем, нарушение баланса которых приводит к патологическому разрастанию неонтимы, т.е. ее гиперплазии. Представленное наблюдение служит иллюстрацией изменений изучаемых показателей в послеоперационном периоде. Выводы о прогностической значимости уровня СОД, МДА и NO сделаны на основании соотношения уровня определяемых показателей со средней толщиной интимы, а не их изолированном колебании в различные сроки после операции. Срок развития гиперплазии интимы различен, так по некоторым данным, формирование неоинтимы происходит в срок от одной недели до одного месяца (W. Van der Giessen, 2007). А.В. Протопоповым (2003) показано, что через 6 месяцев происходила дальнейшая организация неоинтимы и эндотелиального слоя внутренней оболочки сосуда, толщина неоинтимы уменьшалась вследствие стихания воспалительных и пролиферативных явлений. Поэтому образование гиперплазированной неоинтимы могло проходить в различные периоды наблюдения.
Согласно полученным данным уровень МДА через 10 дней после операции увеличился почти в 2 раза (34,5 (уе) на Mg Hb), что является предиктором развития гиперплазии интимы. Через 1 месяц уровень МДА оставался выше исходного значения (21,7 (уе) на Mg Hb). К 6 месяцу уровень МДА снизился ниже дооперационного уровня (13,8 (уе) на Mg Hb), однако, гиперплазия интимы уже развилась, что выявлено при морфометрии зоны реконструкции.
Источники информации
1) Киричук В.Ф., Глыбочко П.В., Пономарева А.И. Дисфункция эндотелия. - Саратов: Изд-во Саратовского мед. ун-та, 2008. - 129 с.
2) Ланкин В.З. Свободнорадикальные процессы при заболевании сердечно-сосудистой системы / В.З. Ланкин, А.К. Тихазе, Ю.Н. Белен- ков // Кардиология.- 2000.- №7.- С.48-61.
3) Enhanced superoxide production in experimental venous bypass graft intimal hyperplasia: role of NAD (P)H oxidase / N. West [et al.] // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. - 2001.- Vol.21, №2.- P.189-194.
4) Клиническая ангиология: Руководство / Под ред. А.В. Покровского. В двух томах. - М: ОАО «Издательство «Медицина», 2004. - 1400 с: ил.
5) Napoli С, Ignarro LJ. Nitric oxide and atherosclerosis. Nitric Oxid - 2001 - Vol.5 - P.88-97.
6) Palmer R.M.J., Ferrige A.G., Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature. 1987; Vol.327; 534-536.
7) Коробойникова Э.Н. Модификация определения продуктов ПОЛ в реакции с тиобарбитуровой кислотой // Лаб. дело - 1989 - №7. - С.8-9.
8) Звягина В.И., Калинин Р.Е., Пшенников А.С., Сучков И.А., Матвеева И.В. Фотоколориметрический метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови.// Астраханский медицинский журнал. Астрахань - 2010. Т.5, №1. С.188-189.
9) Швальб П.Г. и др. Сравнительная оценка влияния открытых артериальных реконструкций и эндоваскулярных вмешательств на функциональное состояние эндотелия. // Кардиология и сердечнососудистая хирургия. 2008. №6. С.44-46.