НЕИНФЕКЦИОННЫЕ РЕКОМБИНАНТНЫЕ ПСЕВДОВИРИОНЫ ВИРУСА ГЕПАТИТА С "ИСВАК"ТМ, ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ИХ ОСНОВЕ

1. Изолированная комплементарная ДНК (кДНК) для транскрипции РНК репликона РНК-содержащего вируса типа IV по классификации Балтимора и экспрессии неструктурных белков этого вируса в культуре клеток ВНК21, характеризующаяся тем, что она включает как минимум пять фрагментов ДНК, кодирующих следующие биологические объекты:
а) 5'UTR последовательность РНК-содержащего вируса;
б) CMV промотор-энхансер, способный управлять репликацией и трансляцией последовательности ДНК;
в) IRES вакцинного штамма YFV-17D;
г) полипротеин неструктурных белков РНК-содержащего вируса;
д) 3'UTR последовательность вируса РНК-содержащего вируса.
2. Изолированная кДНК по п.1, характеризующаяся тем, что РНК-содержащим вирусом является вирус семества Picornaviridae.
3. Изолированная кДНК по п.2, характеризующаяся тем, что РНК-содержащим вирусом является вирус ящура.
4. Изолированная кДНК по п.3, характеризующаяся тем, что фрагменты ДНК кодируют, по крайней мере, один из следующих биологических объектов:
5'UTR последовательность вируса ящура, которая не включает в себя «упаковочный сайт» ("packaging site");
CMV промотор-энхансер, который включает в себя все сигнальные последовательности и имеет длину около 750 пар оснований;
IRES вакцинного штамма YFV-17D, который имеет длину 134 пар оснований;
ген, кодирующий зеленый флуоресцентный белок или иной репортерный полипептид.
5. Изолированная кДНК по 4, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 2.
6. Изолированная кДНК по 4, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 1.
7. Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая неструктурные белки РНК-содержащего вируса типа IV по классификации Балтимора в культуре клеток ВНК21, содержащая кДНК по любому из пп.1-5.
8. Рекомбинантная плазмида по п.7, представляющая собой плазмиду pDKIS-0107, которая имеет размер 10925 п.о. и состоит из фланкированного рестриктазными сайтами Glal-EcoRV «fusion» ПЦР-фрагмента размером 9045 п.о., включающего кДНК по п.5, с структурой, схема которой представлена на фиг.3 и которая состоит из следующих последовательно-соединенных элементов:
5'UTR последовательность вируса ящура, которая не включает в себя «упаковочный сайт» ("packaging site");
CMV промотор-энхансер, который включает в себя все сигнальные последовательности и имеет длину около 750 пар оснований;
IRES вакцинного штамма YFV-17D, который имеет длину 134 пар оснований; ген, кодирующий полипротеин «2B…2C…3A…3B1/3B2/3B3…3C…3D…GFP», который включает в себя полипротеин неструктурных белков вируса ящура «2B…2C…3A…3B1/3B2/3B3…3C…3D, а также зеленый флуоресцентный белок (GFP);
3'UTR последовательность вируса ящура и ПЦР-фрагмента коммерческого вектора pUC18 размером 2670 п.о., который обеспечивает репликацию плазмиды в клетках E.coli и придает ей устойчивость к ампициллину, пенициллину и карбенициллину.
9. Изолированная кДНК для экспрессии структурных белков РНК-содержащего гепатотропного вируса в культуре клеток ВНК21, характеризующаяся тем, что она включает как минимум пять фрагментов ДНК, кодирующих следующие биологические объекты:
а) 5'UTR последовательность РНК-содержащего вируса;
б) CMV промотор-энхансер, способный управлять репликацией и трансляцией последовательности ДНК;
в) IRES РНК-содержащего гепатотропного вируса;
г) полипротеин структурных белков РНК-содержащего гепатотропного вируса;
е) 3'UTR последовательность РНК-содержащего вируса.
10. Изолированная кДНК по п.9, характеризующаяся тем, что она включает в себя фрагменты ДНК, кодирующих, по крайней мере, один из следующих биологических объектов:
5'UTR последовательность вируса ящура, которая не включает в себя «упаковочный сайт» ("packaging site");
CMV промотор-энхансер, который включает в себя все сигнальные последовательности и имеет длину около 750 пар оснований;
IRES РНК-содержащего гепатотропного вируса взят из ВГС субтипа 1b, который имеет длину 280 пар оснований;
ген, кодирующий полипротеин структурных белков вируса гепатита субтипа С-1b;
ген, кодирующий альфа-пептид бета-галактозидазы или иной репортерный полипептид.
11. Изолированная кДНК по п.10, включающая нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID N0:4.
12. Изолированная кДНК по п.10, характеризующаяся нуклеотидной последовательностью, представленной SEQ ID NO:3.
13. Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая структурные белки РНК-содержащего гепатотропного вируса в культуре клеток ВНК21, содержащая кДНК по любому из пп.8-12.
14. Рекомбинантная плазмида по п.13, представляющая собой плазмиду pISVAC-0905, которая имеет размер 8901 п.о. и состоит из фланкированного рестриктазными сайтами EcoRI-KpnI «fusion» ПЦР-фрагмента размером 6231 п.о., включающего кДНК по п.11, с структурой, схема которой представлена на фиг.3 и которая состоит из следующих последовательно соединенных элементов:
5'UTR последовательность вируса ящура, которая не включает в себя «упаковочный сайт» ("packaging site");
CMV промотор-энхансер, который включает в себя все сигнальные последовательности и имеет длину около 750 пар оснований;
IRES РНК-содержащего гепатотропного вируса взят ВГС субтипа 1b, который имеет длину 280 пар оснований;
αpep
ген, кодирующий полипротеин «C-E1-E2-p7-β-ga1», который включает в себя полипротеин структурных белков вируса гепатита С субтипа 16 со структурой «С-Е1-Е2-р7», а также альфа-пептид бета-галактозидазы 3'UTR последовательность вируса ящура
и фрагмента коммерческого вектора pUC19 размером 2670 п.о., полученного рестрикцией по сайтам EcoRI-KpnI полилинкера, который обеспечивает репликацию плазмиды в клетках E.coli и придает ей устойчивость к ампициллину, пенициллину и карбенициллину.
15. Способ получения псевдовирионов гепатотропного вируса, характеризующийся тем, что он включает следующие стадии:
а) стадию предварительного культивирования культуры клеток линии ВНК21, на которой проводят инкубацию клеток с индуктором цитохрома Р450 в условиях, обеспечивающих наращивание эндоплазматического ретикулума, достаточного для последующей эффективной самопроизвольной сборки псевдовирионов;
б) стадию трансформации культуры двумя экспрессионными плазмидами по пп.7 и 13, несущими ДНК, одна из которых кодирует РНК полипротеина неструктурных белков РНК-содержащего вируса типа IV по классификации Балтимора, а другая - РНК полипротеина структурных белков гепатотропного вируса, которые транскрибируются, в результате чего образуется два вида РНК, одна из которых кодирует неструктурные белки РНК-содержащего вируса типа IV по классификации Балтимора, которые способны реплицировать другой вид РНК, кодирующей структурные белки гепатотропного вируса;
в) стадию культивирования трансформированной культуры в условиях, обеспечивающих транскрипцию, трансляцию белка и самопроизвольную сборку псевдовирионов;
г) стадию выделения псевдовирионов.
16. Способ получения псевдовирионов гепатотропного вируса по п.15, характеризующийся тем, что гепатотропный вирус представляет собой вирус гепатита С (ВГС).
17. Способ по любому из пп.15-16, характеризующийся тем, что псевдовирионы выделяют на стадии выделения путем добавления в культуральную среду ПЭГ с молекулярной массой от 3000 до 8000 Да и подходящей соли, инкубирования клеток до просветления среды, добавления неионного детергента, центрифугирования или фильтрации полученного лизата, переосаждения осветленного лизата с помощью ПЭГ с молекулярной массой от 3000 до 8000 Да и отделения осадка, содержащего частицы, который при необходимости перерастворяют в приемлемом растворителе.
10
12
18. Способ по п.15, характеризующийся тем, что выделенные псевдовирионы имеют концентрацию 10-10частиц/мл.
19. Псевдовирион вируса гепатита С, характеризующийся тем, получен способом по любому из пп.15-17.
20. Фармацевтическая композиция для обработки цельной крови или компонента крови человека с целью повышения уровня ИФН-1-типа, характеризующаяся тем, что она содержит псевдовирионы по п.19 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.
21. Способ обработки мононуклеаров периферической крови или лейкоцитарной массы человека или цельной крови или компонента крови, характеризующийся тем, что к таким препаратам однократно или многократно добавляется фармацевтическая композиция по п.20 в эффективном количестве.
22. Способ по п.21, характеризующийся тем, что он используется для очистки препаратов крови или ее компонентов от вирусов для подготовки таких препаратов для переливания пациенту.
23. Способ по п.22, характеризующийся тем, что препарат крови или ее компонентов очищается от следующих вирусов:
1) вирусы гепатитов, включая ВГС, вирус гепатита А, В, Д, Е, Ф и другие,
2) ВИЧ,
3) цитомегаловирус,
4) вирус краснухи,
5) вирус лихорадки западного Нила,
6) вирус полиомиелита,
7) вирус ящура,
8) вирус Эпштейн-барра,
9) папилломавирус,
10) герпесвирус.
24. Фармацевтическая композиция для повышения уровня ИФН-I-типа у индивида, нуждающегося в этом, характеризующаяся тем, что она содержит псевдовирионы по п.19 в эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.
25. Фармацевтическая композиция по 24, характеризующаяся тем, что индивидом является животное, отличное от человека, выбранное из группы, состоящей из млекопитающих, птиц и насекомых, а также тем, что состояние, при котором желательно повышение уровня ИФН-I-типа у индивида, выбрано из группы, состоящей из состояний, связанных со следующими вирусами:
1) ящур,
2) чума свиней,
3) энцефаломиелит лошадей,
4) реовирусная инфекция свиней, овец, коз, оленей, собак, кошек и т.д.,
5) желтая лихорадка,
6) болезнь Ньюкасла,
7) полиэдроз,
8) чума крупного рогатого скота,
9) цитомегаловирусная инфекция,
10) герпесвирусная инфекция.
26. Фармацевтическая композиция по п.24, характеризующаяся тем, что индивидом является человек.
27. Фармацевтическая композиция по 26, характеризующаяся тем, что состояние, при котором желательно повышение уровня ИФН-I-типа у индивида, выбрано из группы:
1) гепатит А;
2) острый гепатит В;
3) острый гепатит B+D (дельта);
4) хронический активный гепатит В или B+D (дельта), в т.ч. с циррозом печени (положительный по HBV-ДНК, ДНК-полимеразе или HBeAg);
5) хронический гепатит В, осложненный гломерулонефритом;
6) хронический гепатит С (гепатит "ни А, ни В", положительный по HCV-PHK антителам к вирусу гепатита С);
7) остроконечные кондиломы (кандиломатоз);
8) респираторный папилломатоз гортани - ларингопапилломатоз;
9) энцефалит и менингоэнцефалит: вирусный (клещевой, гриппозный, аденовирусный, энтеровирусный, герпетический, паротитный), вирусно-бактериальный и микоплазменный;
10) вирусный конъюнктивит, кератоконъюнктивит, кератит, кератоувеит;
11) цитомегаловирусная инфекция;
12) гнойносептические послеоперационные осложнения;
13) острый лимфобластный лейкоз;
14) волосатоклеточный лейкоз (трихолейкоз);
15) неходжкинская лимфома низкой степени злокачественности;
16) кожная Т-клеточная лимфома;
17) грибовидный микоз и синдром Сезари (язвенная стадия);
18) хронический миелолейкоз и миелофиброз;
19) множественная миелома (генерализованная форма миеломной болезни);
20) ретикулосаркома;
21) первичный (эссенциальный) и вторичный (при миелопролиферативных заболеваниях) тромбоцитоз;
22) саркома Капоши на фоне СПИДа (у пациентов, не имеющих в анамнезе острых инфекций);
23) карцинома (рак) почки (в т.ч. при метастазах в легкие);
24) рак яичников;
25) поверхностный рак мочевого пузыря (ползущая форма и карцинома in situ);
26) злокачественная меланома; адъювантная терапия у пациентов, которым произведено удаление опухоли; при риске рецидива;
27) базальноклеточная карцинома (рак) кожи (поверхностная и узелково-язвенная формы);
28) плоскоклеточный рак кожи;
29) ревматоидный артрит;
30) рассеянный склероз;
31) пневмония различной этиологии (бактериальная, вирусная, хламидийная);
32) менингит;
33) сепсис;
34) специфическая внутриутробная инфекция: хламидиоз, герпес, цитомегаловирусная инфекция, уреаплазмоз, энтеровирусные инфекции, висцеральный кандидоз, микоплазмоз;
35) ОРВИ;
36) грипп;
37) птичий грипп;
38) пиелонефрит;
39) бронхопневмония;
40) папилломавирусная инфекция;
41) хламидиоз;
42) уреаплазмоз;
43) токсоплазмоз;
44) микоплазмоз;
45) гарднереллез;
46) трихомониаз;
47) бактериальный вагиноз;
48) рецидивирующий вагинальный кандидоз;
49) эрозии шейки матки;
50) цервицит;
51) вульвовагинит;
52) бартолинит;
53) аднексит;
54) простатит различной этиологии;
55) уретрит;
56) баланит;
57) баланопостит;
58) менингеальной формы клещевого энцефалита;
59) цервикальных эндометриозов;
60) геморрагической лихорадки с почечным синдромом;
61) вторичных клеточных иммунодефицитных состояний;
62) аллергический риноконъюнктивит, атоническая бронхиальная астма - при проведении специфической иммунотерапии для дополнительной иммуномодуляции;
63) вирусное заболевание глаз (кератит, кератоувеит, конъюнктивит), вызываемое Herpes simplex или Herpes zoster;
64) герпес (в т.ч. хроническая рецидивирующая инфекция, в т.ч. половая и генерализованная формы);
65) острый герпетический стоматит;
66) герпетический гингивит (воспаление десен);
67) полиомиелит;
68) ящур.
28. Фармацевтическая композиция по любому из пп.26 и 27, характеризующаяся тем, что выполнена в форме подходящей для ректального введения.
29. Способ профилактики или лечения состояния, в том числе связанного с ВГС, при котором полезным является увеличение уровня ИФН-I-типа, состоящий в однократном или многократном введении индивиду, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции по любому из пп.24-27.
30. Способ по п.29, характеризующийся тем, что индивидом является животное, отличное от человека, выбранное из группы, состоящей из млекопитающих, птиц и насекомых.
31. Способ по п.30, характеризующийся тем, что состояние выбрано из группы, связанной со следующими вирусами:
1) ящур,
2) чума свиней,
3) энцефаломиелит лошадей,
4) реовирусная инфекция свиней, овец, коз, оленей, собак, кошек и т.д.,
5) желтая лихорадка,
6) болезнь Ньюкасла,
7) полиэдроз,
8) чума крупного рогатого скота,
9) цитомегаловирусная инфекция,
10) герпесвирусная инфекция.
32. Способ по п.29, характеризующийся тем, что индивидом является человек.
33. Способ по п.32, характеризующийся тем, что предварительно подтверждают наличие позитивного ответа индивида на применяемую фармацевтическую композицию на основании изучения индукции ИФН-I-типа в цельной крови или компоненте крови указанного индивида.
34. Способ по п.32, в котором состояние выбрано из группы, состоящей из следующих заболеваний:
1) гепатит А;
2) острый гепатит В;
3) острый гепатит B+D (дельта);
4) хронический активный гепатит В или B+D (дельта), в т.ч. с циррозом печени (положительный по HBV-ДНК, ДНК-полимеразе или HBeAg);
5) хронический гепатит В, осложненный гломерулонефритом;
6) хронический гепатит С (гепатит "ни А, ни В", положительный по HCV-PHK антителам к вирусу гепатита С);
7) остроконечные кандиломы (кандиломатоз);
8) респираторный папилломатоз гортани - ларингопапилломатоз;
9) энцефалит и менингоэнцефалит: вирусный (клещевой, гриппозный, аденовирусный, энтеровирусный, герпетический, паротитный), вируснобактериальный и микоплазменный;
10) вирусный конъюнктивит, кератоконъюнктивит, кератит, кератоувеит;
11) цитомегаловирусная инфекция;
12) гнойносептические послеоперационные осложнения;
13) острый лимфобластный лейкоз;
14) волосатоклеточный лейкоз (трихолейкоз);
15) неходжкинская лимфома низкой степени злокачественности;
16) кожная Т-клеточная лимфома;
17) грибовидный микоз и синдром Сезари (язвенная стадия); внутритканевое введение;
18) хронический миелолейкоз и миелофиброз;
19) множественная миелома (генерализованная форма миеломной болезни);
20) ретикулосаркома;
21) первичный (эссенциальный) и вторичный (при миелопролиферативных заболеваниях) тромбоцитоз.
22) саркома Капоши на фоне СПИДа (у пациентов, не имеющих в анамнезе острых инфекций);
23) карцинома (рак) почки (в т.ч. при метастазах в легкие);
24) рак яичников;
25) поверхностный рак мочевого пузыря (ползущая форма и карцинома in situ);
внутрипузырное введение;
26) злокачественная меланома; адъювантная терапия у пациентов, которым произведено удаление опухоли; при риске рецидива;
27) базальноклеточная карцинома (рак) кожи (поверхностная и узелково-язвенная формы);
28) плоскоклеточный рак кожи;
29) ревматоидный артрит;
30) рассеянный склероз;
31) пневмония различной этиологии (бактериальная, вирусная, хламидийная);
32) менингит;
33) сепсис;
34) специфическая внутриутробная инфекция: хламидиоз, герпес, цитомегаловирусная инфекция, уреаплазмоз, энтеровирусные инфекции, висцеральный кандидоз, микоплазмоз;
35) ОРВИ;
36) грипп;
37) птичий грипп;
38) пиелонефрит;
39) бронхопневмония;
40) папилломавирусная инфекция;
41) хламидиоз;
42) уреаплазмоз;
43) токсоплазмоз;
44) микоплазмоз;
45) гарднереллез;
46) трихомониаз;
47) бактериальный вагиноз;
48) рецидивирующий вагинальный кандидоз;
49) эрозии шейки матки;
50) цервицит;
51) вульвовагинит;
52) бартолинит;
53) аднексит;
54) простатит различной этиологии;
55) уретрит;
56) баланит;
57) баланопостит;
58) менингеальной формы клещевого энцефалита;
59) цервикальных эндометриозов;
60) геморрагической лихорадки с почечным синдромом;
61) вторичных клеточных иммунодефицитных состояний;
62) аллергический риноконъюнктивит, атопическая бронхиальная астма - при проведении специфической иммунотерапии для дополнительной иммуномодуляции;
63) вирусное заболевание глаз (кератит, кератоувеит, конъюнктивит), вызываемые Herpes simplex или Herpes zoster;
64) герпес (в т.ч. хроническая рецидивирующая инфекция, в т.ч. половая и генерализованная формы);
65) острый герпетический стоматит;
66) герпетический гингивит (воспаление десен);
67) полиомиелит;
68) ящур.
35. Система направленной доставки биологически активного вещества к клетке-мишени, характеризующаяся тем, что доставляемое вещество нековалентно связано с частицей псевдовириона по п.19.
36. Система п.35, характеризующаяся тем, что доставляемым веществом является фрагмент РНК.
37. Система по п.36, характеризующаяся тем, что доставляемым веществом является фрагмент РНК, выбранный из списка:
5) рибозим;
6) аптамер;
7) малая интерферирующая РНК (siPHK);
8) антисмысловая РНК.
38. Система по п.36, характеризующаяся тем, что доставляемым веществом является РНК-последовательность АГП, представленная SEQ ID NO 5.
39. Система по п.36, характеризующаяся тем, что доставляемым веществом является РНК-последовательность, характеризующаяся свойством селективной индукции апоптоза в клетках, зараженных вирусом ящура, по механизму, схожему с механизмом действия АГП против клеток, зараженных ВГС.
40. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, связанного с ВГС, включающая систему по п.38 в фармакологически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.
41. Способ лечения состояния, связанного с ВГС, включающий однократное или многократное введение в организм индивида фармацевтической композиции по п.40.
42. Фармацевтическая композиция для лечения состояния, связанного с вирусом ящура, включающая систему по п.39 в фармакологически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.
43. Способ лечения состояния, связанного с вирусом ящура, включающий однократное или многократное введение в организм индивида фармацевтической композиции по п.42.
44. Способ получения системы по любому из пп.35-37, включающий следущие стадии:
а) стадию предварительного культивирования культуры клеток линии ВНК21, на которой проводят инкубацию клеток с индуктором цитохрома Р450 в условиях, обеспечивающих наращивание эндоплазматического ретикулума, достаточного для последующей эффективной самопроизвольной сборки частиц;
б) стадию трансформации культуры тремя экспрессионными плазмидами: первой и второй по пп.7 и 13 соответственно, несущими ДНК, одна из которых кодирует РНК полипротеина неструктурных белков РНК-содержащего вируса типа IV по классификации Балтимора, а другая - РНК полипротеина структурных белков гепатотропного вируса, которые транскрибируются, в результате чего образуется два вида РНК, одна из которых кодирует неструктурные белки репликативвного комплекса РНК-содержащего вируса типа IV по классификации Балтимора, которые способны реплицировать вторую РНК, кодирующую структурные белки гепатотропного вируса, а также третьей плазмидой, кодирующей последовательность доставляемой РНК, которая нековалентно включается в образующиеся псевдовирионы, образуя, таким образом, систему;
в) стадию культивирования трансформированной культуры в условиях, обеспечивающих транскрипцию, трансляцию белка и самопроизвольную сборку системы;
г) стадию выделения системы.
45. Способ получения системы по п.44, характеризующийся тем, что гепатотропный вирус представляет собой вирус гепатита С (ВГС).
46. Способ получения системы по любому из пп.44-45, характеризующийся тем, что выделяют на стадии выделения путем добавления в культуральную среду ПЭГ с молекулярной массой от 3000 до 8000 Да и подходящей соли, инкубирования клеток до просветления среды, добавления неионного детергента, центрифугирования или фильтрации полученного лизата, переосаждения осветвленного лизата ПЭГ с молекулярной массой от 3000 до 8000 Да и отделения осадка, содержащего частицы, который при необходимости перерастворяют в приемлемом растворителе.