ГАЛОТОЛЕРАНТНЫЙ ШТАММ Rhodococcus wratislaviensis - ДЕСТРУКТОР ПОЛИХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ
HALOTOLERANT STRAIN Rhodococcus wratislaviensis - DESTRUCTOR OF POLYCHLORINATED BIPHENYLS

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой новый аэробный штамм бактерий, способный эффективно разлагать стойкие токсичные соединения - полихлорированные бифенилы (ПХБ), в том числе в условиях засоления.
Данные вещества включены в группу Стойких Органических Загрязнителей (СОЗ) [Стокгольмская конвенция, ФЗ-РФ №164 «О ратификации Стокгольмсокй конвенции…»] и подлежат полному уничтожению. Однако при реализации положений конвенции возникает проблема уничтожения соединений группы СОЗ, так как за длительный период производства и применения накоплены сотни тонн данных веществ, значительная часть которых попала в окружающую среду [Трегер Ю.А. Стойкие органические загрязнители. Проблемы и пути их решения // Вестник МИТХТ, 2011, т.6, №5].
Известен ряд способов термической и химической переработки ПХБ, однако эти способы являются высокозатратными и могут приводить к образованию более токсичных соединений - диоксинов [Полихлорбифенилы: Проблемы экологии, анализа и химической утилизации / отв. Ред. В.Н. Чарушин. - М.: КРАСАНД; Екатеринбург: УрО РАН, 2011. - 400 с.].
Наиболее экологически безопасным способом утилизации полихлорированных бифенилов (ПХБ) является их биологическая деструкция с использованием бактерий [Васильева Г.К., Стрижакова Е.П. Биоремедиация почв и седиментов, загрязненных полихлорированными бифенилами // Микробиология. 2007. Т.76. №6. С.725-741. и Beyer A., Biziuk М. Environmental fate and global distribution of polychlorinated biphenyls // Rev. Environ. Contamin. Toxic. 2009. V.201. P.137-158]. Известно, что в промышленных масштабах выпускались коммерческие смеси ПХБ, содержащие от 20 до 60 конгенеров с разной степенью хлорирования. Поэтому наибольший интерес представляют штаммы, способные утилизировать коммерческие смеси ПХБ.
В патентной литературе имеются сведения о бактериальных штаммах родов Pseudomonas, Burkcholderia и Rhodococcus [Патент US №4999300 А, 12.03.91; Патент US №6537797 В1, 25.03.2003; Патент РФ №2262531 С2, 20.10.2005], осуществляющих полное разложение отдельных конгенеров моно- и дихлорированных бифенилов.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому решению является «Штамм бактерий Rhodococcus ruber (ИЭГМ 896) - деструктор полихлорированных бифенилов» (Патент РФ №2262531 С2, 20.10.2005 г., МПК C12N 1/20; C02F 3/34).
Недостатками аналогов и прототипа является ограниченность эффективного разложения стойких токсичных соединений - в классе полихлорированных бифенилов (ПХБ), в том числе в условиях засоления почв.
Задачей создания изобретения является создание нового штамма - деструктора полихлорированных бифенилов, а также расширение арсенала средств для эффективного разложения стойких токсичных соединений - в классе полихлорированных бифенилов (ПХБ), в том числе в условиях засоления почв.
Поставленная задача решается с помощью Штамма Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7, депонированного во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ Ac-2623D - который является активным деструктором полихлорированных бифенилов.
Ниже приведен сопоставительный анализ эффективности предлагаемого Штамма по сравнению с прототипом.
Для штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ896 описан рост на трех конгенерах ПХБ (ПХБ1, ПХБ3, ПХБ8), наиболее «легких» для бактериального разложения и не содержащих заместителей в метаположении. О полной утилизации данных ПХБ судится по косвенным признакам: рост бактериальной культуры, способность штамма расти на продуктах разложения данных ПХБ, а именно на хлорбензойных кислотах.
Предлагаемый штамм Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 разлагает более широкий спектр конгенеров ПХБ (26 конгенеров), в том числе содержащих более 2 заместителей в молекуле и/или заместителей в метаположении (табл.1, 2). Четко показано, что происходит убыль каждого конкретного конгенера ПХБ (количества указаны в соответствующей концентрации), установлены промежуточные соединения для 11 конгенеров, позволяющие утверждать, что разложение происходит без накопления токсичных продуктов.
Для штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ896 описана «острая» деструкция 7 конгенеров ПХБ, содержащих от 1 до 3 заместителей в орто- и/или параположении, и показаны 2 возможных промежуточных продукта. Нет сведений об изменении концентрации начальных конгенеров ПХБ, а также не указано, будут ли проявляться данные свойства штамма в отношении остальных конгенеров ПХБ (их всего 209, содержащих от 1 до 10 заместителей).
Преимущество Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7.
Ниже показана убыль 11 конгенеров ПХБ, содержащих от 1 до 3 заместителей в орто-, мета-, параположениях при деструкции каждого конгенера индивидуально, установлены основные промежуточные соединения, подтверждающие, что разложение происходит без накопления токсичных продуктов. Кроме того, показана убыль 26 конгенеров ПХБ в составе коммерческой смеси «Совол», содержащих от 3 до 6 заместителей. Приведенные результаты демонстрируют более высокий деградативный потенциал штамма Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7.
В прототипе нет сведений о способности штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ896 разлагать коммерческие смеси ПХБ, содержащие конгенеры с количеством заместителей больше трех. Способность разлагать отдельные (моно-три)-хлорированные бифенилы не позволяет предполагать, что штамм проявит деградативные свойства в отношении коммерческих смесей ПХБ.
Преимущество Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7.
Показана способность разлагать коммерческую смесь ПХБ марки «Совол». Деструкция составляет 93.8%.
По прототипу нет сведений о способности штамма Rhodococcus ruber ИЭГМ896 разлагать коммерческие смеси ПХБ в почве, а также при повышенном уровне засоления среды.
Преимущество Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7.
Показана способность разлагать коммерческую смесь ПХБ марки «Совол» в почве, а также при содержании хлорида натрия в концентрации 30 г/л. Данные свойства уникальны и ранее описаны не были.
Технический результат от предлагаемого решения - Штамм R. wratislaviensis КТ112-7 осуществляет разложение индивидуальных конгенеров ПХБ: монозамещенных на 96.7-96.9%, ди- и трихлорированных (заместители расположены в одном кольце молекулы в орто-, мета- или параположении) на 69.4-89.0%, дихлорированных с заместителями в каждом кольце в положениях орто- и/или пара- на 78.0-96.4%, трихлорированных (расположение заместителей два в одном кольце и один во втором кольце в орто- или параположении) на 67.0-88.9% за 24 часа и коммерческой смеси ПХБ торговой марки «Совол» на 93.8% за 5 суток.
4
3
4
2
2
4
2
4
2
2
2
3
Предлагаемый штамм Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7, обладающий способностью к деструкции широкого спектра токсичных веществ, выделен из отходов (техногенно-минеральных образований) производства калийно-магниевых солей ОАО «Уралкалий» (г. Березники, Пермский край) методом накопительного культивирования на среде Раймонда состава (г/л): NHNO - 2.0, MgSO×7НO - 0.2, КНРO - 2.0, NaHPO - 3.0, СаСl×6НO - 0.01, NaCO - 0.1, с добавлением ортофталевой кислоты - 1 г/л. Полученный штамм бактерий депонирован 07.05.2013 г. во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ Ac-2623D.
Характеристика предлагаемого штамма.
Аэроб. Хемоорганотроф. В состав клеточной стенки входят миколовые кислоты. Клетки грамположительные, неподвижные, не образуют спор, каталазоположительные. При развитии бактериальная культура характеризуется жизненным циклом кокк-палочка-кокк. Штамм растет при температуре 10-45°C с оптимумом роста 28°C.
На богатой агаризованной среде Раймонда (состав среды см. выше), содержащей (г/л): триптон - 5, дрожжевой экстракт - 2.5, NaCl - 10, агар - 1, образует непрозрачные округлые, матовые, светло-розовые колонии. Штамм способен к росту в диапазоне концентрации NaCl от 0 до 10% в среде культивирования. При росте на минеральной среде Раймонда не нуждается в дополнительных факторах роста. Использует в качестве источника углерода нафталин, бифенил, бензол, толуол, фенол, opтoфталевую кислоту, бензойную кислоту.
T
По нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК наиболее близок к штамму Rhodococcus wratislaviensis NCIMB 13082. На основании морфофизиологических и молекулярно-генетических признаков штамм идентифицирован как Rhodococcus wratislaviensis. Методом ВОХ-ПЦР [Versalovic J., Schneider М., de Bruijn F.J., Lupski J.R. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence based-polymerase chain reaction // Methods Cell. Mol. Biol. 1994. V.5. P.25-40] и последующей разгонки в агарозном геле получен набор фрагментов ДНК, характерный только для штамма R. wratislaviensis КТ112-7 (=ВКМ Ac-2623D). Изучение генома штамма показало наличие двух плазмид размером около 470 т.п.н. и 500 т.п.н. Штамм содержит гены «верхнего» пути разложения бифенила/ПХБ, а также гены, кодирующие ферменты деструкции бензойной и opтoфталевой кислот, а также хлоркатехола. Анализ показал, что штамм КТ112-7 по морфофизиологическим, биохимическим, генетическим характеристкам имеет существенные отличия от других представителей данного вида.
Преимуществом данного изобретения является способность штамма R. wratislaviensis КТ112-7 эффективно разлагать без накопления токсичных продуктов моно-, ди- и тризамещенные хлорбифенилы (ПХБ1, ПХБ2, ПХБ3, ПХБ8, ПХБ12, ПХБ15, ПХБ17, ПХБ28, ПХБ29, ПХБ30) и коммерческую смесь ПХБ торговой марки «Совол» как в качестве субстрата, так и в качестве загрязняющего вещества в почве. R. wratislaviensis КТ112-7 является галотолерантным штаммом, способным эффективно осуществлять разложение ПХБ (индивидуально и в составе коммерческой смеси) в условиях повышенной солености среды (30 г/л NaCl).
Данные свойства штамма описываются впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемого изобретения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».
Ниже приведены примеры осуществления изобретения.
Пример 1. Разложение конгенеров ПХБ штаммом R. wratislaviensis КТ112-7
4
3
2
2
4
2
4
2
2
2
3
600
600
Деструкцию ПХБ штаммом R. wratislaviensis КТ 112-7 проводили в экспериментах с «отмытыми клетками». Штамм выращивали в жидкой среде Раймонда состава (г/л): NHNO - 2.0, MgSO4×7НO - 0.2, КНРO - 2,0, NaHPO - 3.0, СаСl×6НO - 0.01, NaCO - 0.1, содержащей 30 г/л NaCl и бифенил (1 г/л) в качестве источника углерода и энергии при 28°C до ОП=1.0. Отмытые дважды в среде Раймонда клетки (1 мл, ОП=2.0) переносили во флаконы с тефлоновыми крышками.
В качестве субстрата вносили ацетоновый раствор хлорбифенилов до конечной концентрации: моноХБ - 94.25 мг/л, диХБ - 22.3 мг/л, триХБ - 12.5 мг/л (табл.1).
2
4
2
4
Для выделения хлорированных бифенилов культуральную жидкость экстрагировали смесью конц. НSO - 12.5%-ный додецил-сульфат-натрия (ДДС-Na)-гексан (1:10:25) в течение 60 мин при 30°C, скорость перемешивания 200 об/мин. Экстракты обезвоживали NaSO и анализировали на газовом хроматографе GC6890N ("Agilent Technology", США) с масс-селективным детектором MSD5973N ("Agilent Technology", США).
Количественное содержание выделенных хлорбифенилов оценивали на основании сравнения величины полученных пиков и стандартных соединений.
Продукты деградации хлорбифенилов определяли спектрофотометрически и методом ВЭЖХ.
Для выделения и идентификации продуктов биодеструкции хлорированных бифенилов культуральную жидкость очищали от бактериальных клеток методом центрифугирования (9660 g в течение 3 мин на центрифуге miniSpin ("Eppendorf", Германия)). Для дальнейших анализов использовали надосадочную жидкость.
макс
Образование продуктов метарасщепления ароматического кольца хлорбифенилов-2-гидроксо-6-оксо-(хлорфенил)гекса-2,4-диеновые кислоты (ГОФДК) определяли методом спектроскопии на спектрофотометре UV-Visible BioSpec-mini ("Shimadzu", Япония) при λ от 390 нм до 440 нм.
3
4
Наличие в надосадочной жидкости хлор- и гидрокси-бензойных кислот (ХБК, (ОН)БК), а также катехолов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе LC-20A ("Shimadzu", Япония) с колонкой Discovery С18 (150×4.6 мм) ("Supelco", "Sigma-Aldrich", США) и УФ-детектором при 205 нм. Анализ проводили в системе ацетонитрил - 0.1%-ый НРO (70:30). Идентификацию проводили с помощью сравнения времени удержания на колонке исследуемых и стандартных соединений. Количество образовавшихся продуктов оценивали по величине площади и высоты пиков на хроматограмме относительно данных величин стандартных соединений.
В результате проведенных исследований было установлено, что штамм R. wratislaviensis КТ112-7 эффективно разлагает конгенеры ПХБ, содержащие заместителей в одном из колец молекулы (табл.1). Уровень деструкции составил 69.0-96.9%. При этом эффективность разложения зависела не от положения заместителя (орто-, мета-, пара-), а от количества заместителей во втором кольце молекулы бифенила. Так, уровень деструкции монозамещенных ХБ (ПХБ1, ПХБ2, ПХБ3) составил 96.7-96.9%, а ди- и тризамещенных (ПХБ12, ПХБ29, ПХБ30) - 69.0-89.0%. Также показано, что образующиеся при этом хлорбензойные кислоты не являются конечным продуктом (табл.1), а разлагаются через стадию образования гидрокси-производных ((ОН)БК) до соединений основного обмена.
Анализ деградационной активности по отношению к дихлорированным бифенилам, содержащим по одному заместителю в каждом кольце в орто- и/или параположении (ПХБ4, ПХБ8, ПХБ15), а также по отношению к трихлорированным бифенилам, у которых в одном из колец также располагается один заместитель в орто- или параположении, показал, что штамм КТ112-7 предпочтительнее окисляет ортохлорированное кольцо молекулы ПХБ (табл.1). На эффективность деструкции, в случае если заместители располагаются в обоих кольцах молекулы, влияют оба фактора: и расположение заместителей, и их количество.
Таким образом, эффективность разложения ПХБ штаммом КТ112-7 изменяется в ряду не замещенное > ортозамещенное > паразамещенное кольцо и моноХБ > диХБ ≥ триХБ.
Таблица 1.
Разложение отдельных конгенеров ПХБ штаммом R. wratislaviensis КТ112-7
Промежуточные продукты
ГОФДК
№ ПХБ (по IUPAK)
Положение заместителей в молекуле
Время, ч
ПХБ, мг/л
Длина волнымакс,н.м.
ОП, о.е.
Хлорбензойные кислоты, мкг/л
Гидрокси-бензойные кислоты, мкг/л
1
2
3
4
5
6
7
8
ПХБ1
2-(орто-)
0
94.25
-
-
-
-
2
20.6
390
0.268
-
-
24
3.0
390
0.247
-
-
ПХБ2
3-(мета-)
0
94.25
-
-
-
-
2
26.2
392
0.401
-
-
24
2.9
392
0.235
-
-
ПХБ3
4-(пара-)
0
94.25
-
-
-
-
2
41.7
416
0.196
18.7
25.9
24
3.1
416
0.291
23.0
19.2
ПХБ12
3,4-
0
22.3
-
-
-
-
2
7.68
390
0.372
5.51
0.48
24
5.57
390
0.235
0.53
0.19
Продолжение табл.1
1
2
3
4
5
6
7
8
ПХБ29
2,4,5-
0
12.5
-
-
-
-
2
-
394
0.652
7.9
-
24
1.37
394
0.292
4.8
-
ПХБ30
2,4,6-
0
12.5
-
-
-
2
-
449
0.249
-
-
24
3.87
449
0.297
-
-
ПХБ4
2,2′-
0
22.3
-
-
-
-
2
1.42
394
0.962
86.8
-
24
0.81
394
0.761
12.3
-
ПХБ8
2,4′-
0
22.3
-
-
-
-
2
15.4
390
0.246
1.2
2.5
24
2.2
390
0.245
0.7
0.6
ПХБ15
4,4′-
0
22.3
-
-
-
-
2
11.6
428
0.274
3.2
0.5
24
4.9
428
0.508
0.3
0.3
ПХБ17
2,4,2′-
0
12.5
-
-
-
-
2
6.25
449
0.277
3.8
-
24
1.38
449
0.209
2.4
-
ПХБ28
2,4,4′-
0
12.5
-
-
-
-
2
-
392
0.067
0.2
4.7
24
4.12
392
0.271
0.1
2.7
«- » - вещества не определены
Пример 2. Разложение штаммом Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 коммерческой смеси ПХБ торговой марки «Совол»
Деструкцию смеси ПХБ «Совол» штаммом R. wratislaviensis КТ 112-7 проводили в экспериментах с «отмытыми клетками» по схеме, описанной в примере 1.
В эксперименте использовали коммерческую смесь ПХБ марки «Совол» (ГСО №7821-2000), основной состав которой представлен тетра- (22%), пента- (53%) и гекса- (23%) замещенными конгенерами. «Совол» вносили в виде ацетонового раствора до конечной концентрации 0.8 г/л.
Экстракцию и анализ ПХБ, анализ возможных метаболитов проводили как описано в примере 1.
В результате проведенных исследований установлено, что штамм R. wratislaviensis КТ 112-7 эффективно разлагает коммерческую смесь ПХБ марки «Совол». За 5 суток концентрация «Совола» снизилась на 93.8%, при этом отмечена деградационная активность ко всем представленным в смеси конгенерам (таблица 2).
Таблица 2.
Разложение смеси ПХБ «Совол» штаммом R. wratislaviensis КТ 112-7
№ пика
№ ПХБ по классификации IUPAK
Площадь пика
% деструкции
1 сут.
3 сут.
5 сут.
1
28
23521
8740
3812
83,8
2
52
8142
2391
1019
87,5
3
49
2476
0
0
100,0
4
44
10954
3706
1553
85,8
5
41\64
6132
2205
865
85,9
6
74
7139
2902
1087
84,8
7
70
21149
8209
3371
84,1
8
66\95
34511
12668
5279
84,7
9
91
5986
2475
1019
83,0
10
60\56
8942
2980
1137
87,3
11
84\101
45555
15421
6321
86,1
12
99
29093
9531
3866
86,7
13
97
12424
4046
1681
86,5
14
87
12685
6934
2837
77,6
15
85
45049
4267
1729
96,2
16
110
6324
15500
6247
1,2
17
82
3152
2427
423
86,6
18
119
2229
0
0
100,0
19
118
33262
0
0
100,0
20
153
1904
1773
641
66,3
21
105
17875
5613
2205
87,7
22
138
25900
9267
3347
87,1
23
128
7725
0
0
100,0
24
156
2487
1060
100,0
25
180
29789
9700
3734
87,5
26
170
6472
2090
674
89,6
Общий % деструкции смеси «Совол»
51,3
84,2
93,8
При этом, как и в случае разложения индивидуальных конгенеров, происходит снижение концентрации образовавшихся метаболитов (табл.3).
Таблица 3.
Разложение смеси ПХБ «Совол» штаммом R. wratislaviensis КТ112-7 при разных концентрациях хлорида натрия в среде
NaCl, г/л
Время деструкции, сут.
Совол, г/л
Промежуточные соединения
ГОФДК, ОП452
ХБК, мг/л
(ОН)БК, мг/л
0
0
0.8
-
-
-
1
0.39
0.145
25.1
46.2
3
0.13
0.100
21.8
35.4
5
0.05
0.091
20.4
31.9
30
0
0.8
-
-
-
1
0.41
0.288
31.5
45.4
3
0.12
0.259
28.4
25.4
5
0.03
0.180
12.5
11.1
«-» - вещества не определены
Динамика изменения концентрации метаболитов свидетельствует об их утилизации штаммом R. wratislaviensis КТ112-7. Разложение метаболитов происходит до соединений основного обмена клетки, при этом повышение осмолярности среды не оказывает негативного влияния на данный процесс.
Пример 3. Разложение ПХБ в почве штаммом R. wratislaviensis КТ112-7
6
7
4
3
4
2
2
4
2
4
2
2
2
3
Для разложения ПХБ, содержащихся в почве, штамм R. wratislaviensis КТ112-7 вносили в почву, содержащую ПХБ (марка «Совол»), отобранную с промышленной площадки г. Чапаевск Самарской области из расчета 10 и 10 клеток на грамм. Бактерии выращивали на среде Раймонда состава (г/л): NHNO - 2,0, MgSO×7НO - 0,2, КНРO - 2,0, NaHPO - 3,0, СаСl×6НO - 0,01, NaCO - 0,1, бифенил - 1,0. Через 3 месяца оценивали содержание ПХБ в почве с использованием хромато-масс-спектрометра Agilent 6890N (Agilent Technology, США).
6
7
Через 3 месяца обработка загрязненной почвы бактериями R. wratislaviensis КТ112-7 привела к значительной убыли ПХБ (табл.4). Снижение концентрации ПХБ в загрязненной почве с внесенными бактериями относительно почвы без обработки составило в варианте с внесением 10 кл/г почвы в 4,2 раза, а в варианте с внесением 10 кл/г почвы в 4,1 раза.
Таблица 4.
Концентрация смеси ПХБ «Совол» в почве после ее обработки бактериальным штаммом R. wratislaviensis КТ112-7
Соединение
Количество бактерий штамма КТ112-7, внесенных в почву, количество кл/г почвы
0
10<sup>6</sup>
10<sup>7</sup>
смесь ПХБ, мг/кг
0,997
0,235
0,241
Таким образом, штамм R. wratislaviensis КТ112-7 эффективно разлагает моно-, ди- и трихлорированные конгенеры орто-, мета- и паразамещенных бифенилов, а также промышленную смесь ПХБ марки «Совол» как в виде единственного источника углерода, так и в виде загрязнителя в почве.