Способ определения риска трансформации стационарного невуса хориоидеи в прогрессирующий невус
METHOD FOR DETERMINING THE RISK OF TRANSFORMATION OF A STATIONARY CHOROIDAL NEVUS INTO A PROGRESSIVE NEVUS

Предлагаемое изобретение относится к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для минимально инвазивного скрининга пациентов с высоким риском трансформации стационарного невуса хориоидеи в прогрессирующий невус хориоидеи.
Невус хориоидеи является доброкачественной опухолью меланоцитарного генеза, которая может подвергаться злокачественной трансформации, что требует постоянного динамического контроля [Shields C.L., Furuta М., Berman E.L., et al. Choroidal nevus transformation into melanoma: Analysis of 2514 consecutive cases. Arch Ophthalmol.2009; 127(8):981-987]. Для обозначения нетипичных невусов, занимающих промежуточное место между стационарным невусом и меланомой хориоидеи, используют термин «прогрессирующий невус или подозрительный невус хориоидеи» [Бровкина А.Ф., Вальский В.В., Гусев Г.А. и др. Офтальмоонкология. Москва, Медицина. 2002]. Разделение невуса хориоидеи на стационарный и прогрессирующий имеет первостепенное значение для выбора тактики ведения пациента [Мякошина Е.Б. Начальная меланома хориоидеи и псевдомеланомы: методы дифференциальной диагностики. Часть 1. Офтальмоскопия. Российский офтальмологический журнал. 2019; 12(4):99-108]. Зачастую, по данным современных клинико-инструментальных методов исследования трудно дифференцировать прогрессирующий невус от начальной меланомы хориоидеи [Luke J., Grisanti S., Tura A. Current Diagnosis of Choroidal Nevi. Klin Monbl Augenheilkd. 2018; 235(6):730-739].
Ряд авторов уделяет большое внимание роли молекулярно-генетических предикторов. Для исследования молекулярно-генетических нарушений необходима ткань опухоли, однако при невусах хориоидеи биопсия опухолевой ткани затруднена и зависит от опыта хирургов [Augsburger J.J., , Schneider S. Diagnostic transvitreal fine-needle aspiration biopsy of small melanocytic choroidal tumors in nevus versus melanoma category. Trans Am Ophthalmol Soc. 2002; 100: 225-32]. «Жидкостная биопсия», основанная на исследовании циркулирующей опухолевой ДНК (цоДНК) в периферической крови, является альтернативой для данных групп пациентов. Молекулярно-генетическое исследование цоДНК в периферической крови позволяет оценить спектр генетических аберраций и может иметь как дифференциально-диагностическую, так и прогностическую значимость [Bryan С.U., Cloud P.P. Cell-Free DNA in Oncology: Gearing up for Clinic. Annals of Laboratory Medicine. 2018; 38(1): 1-8]. По данным литературы, например, частота встречаемости цоДНК (GNAQ/GNA11) составляет 84% случаев у пациентов с метастатической УМ [Bidard F.C., Madic J., Mariani P. Et al. Detection rate and prognostic value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in metastatic uveal melanoma. International journal of cancer. 2014; 134 (5):1207-1213].
Таким образом, в настоящий момент существует острая потребность в разработке минимально инвазивного способа молекулярно-генетической диагностики, который бы позволил провести скрининг пациентов с высоким риском трансформации стационарного невуса в прогрессирующий невус хориоидеи.
Ближайшим аналогом предлагаемого способа является способ того же назначения, при котором проводят определение антител к полиомавирусу ВК в сыворотке крови у пациентов со стационарным невусом хориоидеи методом иммуноферментного анализа с выявлением риска трансформации в прогрессирующий невус хориоидеи [Pietrobon S., Bononi L, Lotito F. et al. Specific Detection of Serum Antibodies against BKPyV, A Small DNA Tumour Virus, in Patients Affected by Choroidal Nevi. Front Microbiol. 2017; 8:2059]. Недостатком ближайшего аналога является необходимость проведения нескольких последовательных этапов, а также низкая специфичность метода (частота выявления указанных антител у пациентов с невусом хориоидеи и здоровых лиц составляет 87,3% и 62,1%, соответственно).
Задачей предлагаемого изобретения является создание скринингового способа определения трансформации стационарного невуса в прогрессирующий невус хориоидеи.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является возможность выбора адекватной тактики лечения в результате скрининга пациентов с высоким риском трансформации стационарного невуса в прогрессирующий невус хориоидеи.
Технический результат достигается за счет определения цоДНК с мутациями генов GNAQ/GNA17 в периферической крови пациента со стационарным невусом хориоидеи.
Нами было проведено исследование на 47 ранее не леченных пациентах со стационарным и прогрессирующим невусом хориодеи, выявленным клинически и по данным оптической когерентной томографии. С учетом характера патологического процесса больные были распределены на следующие группы:
I. Пациенты со стационарным невусом хориоидеи (n=23);
II. Пациенты с прогрессирующим невусом хориоидеи (n=24).
Для мутаций в генах GNAQ/GNA11 в качестве контрольной группы использовали выборку лиц без онкологических заболеваний, сопоставимую по возрасту и полу (n=31). Геномная цоДНК выделена из плазмы периферической крови с помощью протеиназы К с последующей фенольно-хлороформной экстракцией и осаждением этанолом. Выделенные образцы ДНК хранили при температуре -20°C. Качественную оценку ДНК проводили с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000 (NanoDrop, США). Изучение мутаций в генах GNAQ/GNA11 выполняли с помощью ПЦР в режиме реального времени на амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США) методом анализа кривых плавления. Амплификацию проводили в согласно протоколу амплификации для использованного набора и программным настройкам Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System в 25 мкл реакционной смеси, содержащей lx qPCRmix-HS SYBR, по 0,4 мкМ каждого праймера (Таблица 1), 50-100 нг ДНК матрицы; в 96-луночных планшетах «Optical Reaction Plate» по следующей программе: предварительная денатурация: 1 цикл, 950С, 5 мин; ПНР: 40 циклов {950С - 30 с; 600С - 30 с; 720С - 30 с}. Плавление продуктов амплификации выполняли в диапазоне 55-95°C с увеличением температуры на 0,5°C каждые 10 с. Обработку полученных данных осуществляли в программной среде Precision Melt Analysis Software (Bio-Rad).
Проведенное исследование позволило выявить связь мутаций в экзонах 4 и 5 генов GNAQ/GNA11 с высоким риском прогрессировать невуса хориоидеи у пациента. В контрольной группе указанные мутации не были найдены (табл. Характеристика праймеров и условий ПЦР).
Способ осуществляют следующим образом.
В плазме периферической крови пациента со стационарным невусом определяют геномную цоДНК с мутациями в 4 и/или 5 экзоне генов GNAQ/GNA1/с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени. При их наличии определяют риск трансформации.
Пример 1. Пациентка А., в возрасте 70 лет направлена с диагнозом меланоцитарное внутриглазное новообразование хориоидеи левого глаза. При осмотре установлено зрение обоих глаз - 1,0. Внутриглазное давление обоих глаз в пределах нормы, передний отрезок глаза без видимой патологии. При офтальмоскопии на средней периферии выявлено плоское пигментированное образование с четкими границами и единичными друзами на поверхности опухоли. По данным ультразвукового исследования «плюс-ткань» не определили. Морфометрическое исследование показало ровный ретино-хориоидальный профиль, где ниже комплекса «ретинального пигментного эпителия (РПЭ) - мембраны Бруха (МБ)» определяли участок повышенной однородной высокой рефлективности, вызывающий эффект экранирования подлежащих структур. Также, диагностировали умеренно рефлективный материал расположенный под волнообразным РПЭ и соответствующий зонам друз при офтальмоскопии. По данным клинико-инструментальных методов исследования поставлен диагноз стационарный невус хориоидеи. Проведено молекулярно-генетическое исследование периферической крови: определена мутация в 5 экзоне гена GNA11. Пациентка находилась под наблюдением. Через 1 год выявлено прогрессирование стационарного невуса хориоидеи, что свидетельствовало о значимости выявления указанной мутации как предиктора трансформации стационарного невуса в прогрессирующий.
Пример 2. Пациент С., в возрасте 62 лет направлен с диагнозом меланоцитарное внутриглазное новообразование хориоидеи левого глаза. При осмотре установлено зрение обоих глаз - 0,8. Внутриглазное давление обоих глаз в пределах нормы, передний отрезок глаза без видимой патологии. При офтальмоскопии на крайней периферии определено сероватое плоское образованием с четкими границами. По данным эхографии «плюс»-ткань отсутствовала. По данным морфометрии определен ровный хорио-ретинальный профиль, где ниже комплекса «РПЭ - МБ» определяли участок повышенной однородной высокой рефлективности, вызывающий эффект экранирования подлежащих структур. Под волнообразным РПЭ определяли умеренный рефлективный материал. В соответствии с полученными данными установлен диагноз стационарный невус хориоидеи. Проведено молекулярно-генетическое исследование периферической крови: выявлена мутация в 4 экзоне гена GNAQ. После 2 лет наблюдений отмечено прогрессирование новообразования хориоидеи с визуализацией изменений по данным инструментальных методов исследования, что свидетельствовало о прогностической значимости выявленных молекулярно-генетических изменений в генах GNAQ/GNA11.
Пример 3. Пациентка Н., в возрасте 54 лет направлена с диагнозом меланоцитарное внутриглазное новообразование хориоидеи правого глаза. При осмотре установлено зрение обоих глаз - 0,9-1,0. Внутриглазное давление обоих глаз в пределах нормы, передний отрезок глаза без видимой патологии. При офтальмоскопии на средней периферии выявлен плоский сероватого цвета очаг с четкими границами, единичными друзами на поверхности. При проведении эхографии «плюс»-ткань не выявлена. По данным ОКТ выявили характерные для стационарного невуса изменения хориоидального профиля. По данным клинико-инструментальных методов исследования поставлен диагноз стационарный невус хориоидеи. Проведено молекулярно-генетическое исследование периферической крови: определены две мутация в 4 и 5 экзоне гена GNA11. Пациентка находилась под наблюдением. Через 1,5 год отмечено прогрессирование стационарного невуса хориоидеи, при этом изменения по данным ОКТ и УЗИ были характерны для прогрессирующего невуса хориоидеи, что свидетельствует о значимости выявления молекулярно-генетических изменений в генах GNAQ/GNA11 как факторов прогноза течения стационарного невуса хориоидеи и его трансформации в прогрессирующий невус хориоидеи.
Пример 4. Пациент К., в возрасте 59 лет направлен с диагнозом меланоцитарное внутриглазное новообразование хориоидеи правого глаза. При осмотре установлено зрение обоих глаз с коррекцией - 1,0. Внутриглазное давление обоих глаз в пределах нормы, передний отрезок глаза без видимой патологии. При офтальмоскопии на крайней периферии определено сероватое плоское образованием с четкими границами. По данным эхографии «плюс»-ткань отсутствовала. По данным морфометрии определен ровный хорио-ретинальный профиль, где ниже комплекса «РПЭ - МБ» определяли участок повышенной однородной высокой рефлективности, вызывающий эффект экранирования подлежащих структур. Под волнообразным РПЭ определяли умеренный рефлективный материал. В соответствии с полученными данными установлен диагноз стационарный невус хориоидеи. Проведено молекулярно-генетическое исследование периферической крови: мутации в генах GNAQ/GNA11 не выявлены. Пациент находился под динамическим наблюдением. Через 3 года прогрессирование стационарного невуса не определяли, что свидетельствовало о благоприятном прогнозе в отношении прогрессирования меланоцитарного образования при отсутствии мутаций в генах GNAQ/GNA11.
Таким образом, предложенный способ обеспечивает получение данных для адекватного выбора тактики лечения у пациентов с высоким риском трансформации стационарного невуса в прогрессирующий невус хориоидеи с помощью молекулярно-генетического исследования цоДНК в периферической крови.