Биологическая активность лектинов морских гидробионтов

Научнаясмена

Вестник ДВО РАН. 2007. № 6

Черников Олег Викторович

Научно-исследовательскую деятель-

ность в лаборатории химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН начал, будучи студентом третьего курса отделения биоорганической химии и биотехнологии Дальневосточного государственного университета. В начале четвертого курса прошел стажировку по работе с культурами клеток в Институте цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск). После окончания университета в 2004 г. успешно сдал вступительные экзамены и был зачислен в очную аспирантуру Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН. Научные интересы Черникова -главным образом изучение лектинов морских беспозвоночных и водорослей, исследование их биологических функций и связывания лектинов с углеводными структурами, характерными для опухолевых клеток. Цель — поиск новых лектинов и разработка на их основе тест-систем для дифференциальной диагностики социально значимых заболеваний. Выполняет также работы по установлению аминокислотной последовательности белков и пептидов, выделенных в лабораториях ТИБОХ, на пептидном секвенаторе.

Дипломный проект Черникова, выполненный на базе ТИБОХ, получил оценку «отлично», автор стал лауреатом конкурса работ выпускников вузов Российской Федерации, учрежденного Министерством образования. Черников был также победителем конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Дальневосточного государственного университета, стипендиатом Дальневосточного отделения РАН, а также призером конкурса стипендий научно-образовательного центра «Морская биота» Дальневосточного государственного университета. В 2007 г. он стал лауреатом конкурса «Лучшие аспиранты РАН», призером конкурса молодых ученых и получил финансовую поддержку от организаторов XXI Тихоокеанского научного конгресса (12—18 июня 2007 г., Окинава, Япония).

Черников является соавтором свыше 20 научных работ, опубликованных в российских и международных изданиях. Исследования поддерживаются грантами, финансируемыми ДВО РАН. В течение четырех лет — участник гранта по Программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки — медицине».

О.В.ЧЕРНИКОВ, И.В.ЧИКАЛОВЕЦ, В.И.МОЛЧАНОВА, П.А.ЛУКЬЯНОВ

Биологическая активность лектинов морских гидробионтов

Впервые исследована биологическая активность лектинов из морских гидробионтов. Лектины из мидии и асцидии ингибируют рост тест-культур микрооганизмов и, вероятно, являются компонентами иммунной системы морских организмов. Все лектины вызывают повышение синтеза провоспалительных цитокинов, однако только лектины из мидии и красной водоросли способны снижать их сверхэкспрессию при стимуляции клеток липополисахаридом.

ЧЕРНИКОВ Олег Викторович, ЧИКАЛОВЕЦ Ирина Владимировна - кандидат химических наук, МОЛЧАНОВА Валентина Ильинична - кандидат химических наук, ЛУКЬЯНОВ Павел Александрович - доктор химических наук (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток).

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта ДВО РАН (№ 06-ІІІ-В-05-134).

Biological activity of lectins from marine hydrobionts. O.V.CHERNIKOV, I.V.CHIKALOVETS,

V.I.MOLCHANOVA, P.A.LUKYANOV (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry FEB RAS, Vladivostok).

Biological activity of lectins from marine hydrobionts was investigated for the first time. Lectins from mussel and ascidian inhibit the growth of test-cultures of microorganisms, and probably are the components of immune system of marine organisms. All lectins induce the increase of synthesis of proinflammatory cytokines, however only lectins from mussel and red alga are able to decrease their overexpression during stimulation of cells with lipopolysaccharide.

Лектины - широко распространенные белки и гликопротеины, способные специфически и обратимо нековалентно связывать моно- и олигосахариды, как находящиеся в растворе, так и локализованные на клеточной поверхности [9].

Лектины применяются в биотехнологической промышленности для производства гликопротеинов с определенными гликанами, в медицине для очистки костного мозга при трансплантации, для типирования групповых веществ крови [15].

Большинство изученных и охарактеризованных лектинов выделено из высших растений. Гораздо хуже исследованы лектины из морских беспозвоночных и водорослей. Известно, что лектины морского происхождения играют важную роль в таких неспецифических иммунных реакциях, как агглютинация, опсонизация, фагоцитоз и лизис [4]. Лектины морских организмов агглютинируют грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы, ассоциированные с ними в естественных условиях, обладают противоопухолевой, антивирусной, антибактериальной и антигрибковой активностью [6, 11, 12]. В настоящее время происходит интенсивный поиск и выделение лектинов из морских объектов.

В лаборатории химии неинфекционного иммунитета ТИБОХ ДВО РАН из морских организмов был выделен и частично охарактеризован ряд лектинов: GalNAc/Gal - специфичный лектин (CGL) из мидии Crenomytilus grayanus [7], GlcNAc-специфичный (DTL) и GlcNAc/GalNAc-специфичный (DTL-A) лектины из асцидии Didemnum ternatanum [8, 14], маннан-специфичный (SVL-1) и GlcNAc-специфичный (SVL-2) лектины из морского червя Serpula vermicularis [5] и специфичный к гликопротеинам PSM (porcin stomach mucin) и фетуину лектин TCL из красной водоросли Tichocarpus crinitus [10]. Исследована анти-ВИЧ активность этих лектинов и показано, что способность ингибировать взаимодействие ВИЧ с клеткой хозяина in vitro возрастает в ряду CGL, DTL-A, SVL-2, DTL [5].

Известно, что лектины содержат два и более углевод-связывающих участка. Соединяясь с поверхностью клетки микроорганизма, лектин способен агглютинировать их и препятствовать, по некоторым данным, распространению патогенов внутри организма хозяина [12].

Было изучено взаимодействие выделенных нами лектинов с некоторыми видами представителями грамположительных (Bacillus subtilis, Salinibacterium amurskyense, Staphylococcus aureus) и грамотрицательных (Arenibacter troitsensis, Chryseobacterium scophthalmum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) бактерий, а также гриба (Candida albicans), любезно предоставленных старшим научным сотрудником ТИБОХ ДВО РАН О.И. Недашковской.

Суспензию микрооганизмов в постоянной концентрации смешивали с раствором лек-тина и после инкубации визуально оценивали степень агрегации по трехбалльной системе (табл. 1).

Сопоставимые результаты показали CGL и DTL, которые агглютинировали одни и те же штаммы. Наличие агглютинации может говорить о вероятной защитной функции лек-тинов. Намного слабее агглютинировал DTL-A, а TCL не вызывал агрегации микробных клеток.

Также было исследовано влияние лектинов на рост тест-культур. Микроорганизмы выращивали в культуральном планшете в присутствии лектинов, а результат регистрировали

Взаимодействие лектинов с микроорганизмами

Микроорганизм CGL DTL DTL-A TCL

B. subtilis +++ /113 ++/ 117 + / - - / 143

S. amurskyense - / 13 - / 24 - / - - / -

S. aureus ++ / 32 +++ / 51 - / 113 - / 119

A. troitsensis - / - - 14 - / - - / -

C. scophthalmum - / - - / - - / - - / -

E. coli +++ / 154 +++ / 79 - / 119 - / -

P. aeruginosa - / - - / 33 - / 116 - / -

C. albicans +++ / - ++ / 130 - / - - / -

Примечание. В числителе - данные агглютинации (+++, ++, + - отличная, хорошая и слабая соответственно), в знаменателе - данные турбидиметрии, % (за 100% принят рост культуры микроорганизмов без лектинов); прочерк - отсутствие взаимодействия.

измерением мутности клеточной суспензии (турбидиметрия). Как видно из представленных результатов (табл. 1), лектины обладали как стимулирующим (> 100 %), так и ингибирующим эффектами (< 100 %). Наличие ингибирующего эффекта, особенно в отношении морских бактерий X атипкуетв (СвЬ, БТЬ) и А. ^оИзетгз (БТЬ), подтверждает ранее высказанное нами предположение о выполнении защитных функций этими лектинами в организме животных. Такую роль отводят большинству лектинов морских гидробионтов. Интересно, что агглютинация не всегда сопровождается ингибированием роста тест-культуры, а в некоторых случаях даже наоборот. Возможно, взаимодействие лектинов с поверхностными рецепторами микроорганизмов приводит к изменению потока питательных веществ, в зависимости от этого проявляется ингибирующий или стимулирующий эффект.

Некоторые лектины являются митогенами, активируя лимфоциты и индуцируя их деление. Такие лектины проявляют свойства поликлональных активаторов, т.е. они активируют лимфоциты, не различая их антигенной специфичности [13]. Из изученных лектинов только ТСЬ и 8УЬ-1 стимулировали рост лимфоцитов, однако в гораздо меньшей степени, чем известный растительный лектин конканавалин А.

В последние годы внимание ученых сосредоточено на регуляторных белках, секрети-руемых клетками организма человека. Широко обсуждается их роль в регуляции клеток иммунной системы и модуляции воспалительной реакции. Известно, что в очагах воспаления присутствует большое количество цитокинов. Важность и перспективность изучения этих цитокинов заключается в их значительной роли в пато- и иммуногенезе. Фактор некроза опухоли альфа (ФНО-а), интерлейкин-6 (ИЛ-6) и интерферон-у объединяют в группу воспалительных цитокинов, так как они легко и быстро включаются в воспалительный процесс, секретируя большое количество эффекторов воспаления. Изменение продукции цитокинов в организме имеет огромное клиническое значение, оказывает либо протективное, либо патогенное действие. Сверхэкспрессия всех указанных белков вызывает превращение локального воспаления в генерализованный сепсис и тяжелую полиор-ганную недостаточность [3].

Известно, что бактериальные липополисахариды, полигликаны, другие цитокины, регуляторные пептиды и множество иных разнообразных субстанций могут влиять на продукцию цитокинов [2]. В настоящее время в литературе отсутствуют данные о влиянии лектинов морских беспозвоночных и водорослей на индукцию цитокинов.

Уровень продукции цитокинов (пг/мл) клетками периферической крови донора под действием лектинов в различной концентрации без добавления ЛПС

Лектин Концентрация лектина, мкг/мл ФНО-а ИЛ-6 Интерферон-у

соь 0 419,14 ± 3,59 1011,77 ± 20,61 3,46 ± 0,36

5 599,19 ± 32,21 933,60 ± 5,11 27,05 ± 3,80

100 1840,76 ± 40,19 1377,28 ± 31,98 869,46 ± 21,28

БТЬ 0 419,14 ± 3,59 1011,77 ± 20,61 3,46 ± 0,36

5 1849,72 ± 108,15 1342,39 ± 135,78 21,43 ± 6,75

100 1365,39 ± 14,80 1418,79 ± 10,21 141,47 ± 35,82

БТЬ-Л 0 419,14 ± 3,59 1011,77 ± 20,61 3,46 ± 0,36

5 1735,22 ± 34,44 1285,76 ± 27,90 32,37 ± 2,35

100 1670,02 ± 52,16 1329,03 ± 221,02 134,00 ± 6,27

ТСЬ 0 419,14 ± 3,59 1011,77 ± 20,61 3,46 ± 0,36

5 1121,38 ± 13,19 1100,02 ± 56,26 18,09 ± 6,24

100 735,39 ± 152,93 1277,38 ± 57,19 21,62 ± 1,22

8УЬ-2 0 419,14 ± 3,59 1011,77 ± 20,61 3,46 ± 0,36

5 1786,91 ± 27,64 1352,95 ± 5,32 42,08 ± 1,85

100 1584,19 ± 135,15 1398,24 ± 56,79 47,75 ± 8,93

8УЬ-1 0 419,14 ± 3,59 1011,77 ± 20,61 3,46 ± 0,36

5 1789,89 ± 53,90 1233,20 ± 36,86 3,50 ± 0,02

100 1048,94 ± 52,40 1297,04 ± 47,66 3,45 ± 0,12

Таблица 3

Уровень продукции цитокинов (пг/мл) клетками периферической крови донора под действием лектинов в различной концентрации с добавлением ЛПС

Лектин Концентрация лектина, мкг/мл ФНО-а ИЛ-6 Интерферон-у

СОЬ 0 1245,23 ± 66,64 1373,70 ± 101,25 190,02 ± 45,10

5 1131,68 ± 43,56 1329,05 ± 27,51 275,41 ± 5,75

100 1599,39 ± 42,36 1295,85 ± 101,56 1182,85 ± 28,96

БТЬ 0 1245,23 ± 66,64 1373,70 ± 101,25 190,02 ± 45,10

5 1278,27 ± 70,82 1343,05 ± 24,16 96,73 ± 11,41

100 1589,72 ± 31,41 1490,17 ± 196,47 237,37 ± 30,73

БТЬ-Л 0 1245,23 ± 66,64 1373,70 ± 101,25 190,02 ± 45,10

5 1377,7 ± 18,857 1298,39 ± 37,07 224,83 ± 39,77

100 1359,69 ± 12,10 1268,98 ± 157,98 248,14 ± 75,73

ТСЬ 0 1245,23 ± 66,64 1373,70 ± 101,25 190,02 ± 45,10

5 1099,97 ± 30,28 1280,72 ± 47,59 219,81 ± 8,86

100 1135,79 ± 36,00 1139,331 ± 48,52 308,68 ± 18,43

8УЬ-2 0 1245,23 ± 66,64 1373,70 ± 101,25 190,02 ± 45,10

5 1372,06 ± 24,22 1284,13 ± 55,30 119,98 ± 13,71

100 1733,87 ± 25,25 1301,84 ± 61,16 170,00 ± 15,51

8УЬ-1 0 1245,23 ± 66,64 1373,70 ± 101,25 190,02 ± 45,10

5 1266,84 ± 20,03 1617,67 ± 73,49 2,46 ± 0,21

100 1558,89 ± 61,34 1359,47 ± 28,07 115,81 ±35,11

В эксперименте использовали клетки периферической крови доноров. Опыты проводили по методике, описанной в работе [1]. Уровень цитокинов определяли в супернатантах, полученных после инкубации клеток с лектинами в присутствии и отсутствие ЛПС - липо-полисахарида, который является известным индуктором цитокинов и представляет собой основной компонент клеточных стенок грамотрицательных бактерий. Концентрацию цитокинов определяли с помощью специфических тест-систем (DuoSet ELISA Development System, R&D Systems). Все эксперименты проводили в 3-кратной повторности, результаты обрабатывали статистически.

Полученные данные свидетельствуют об индуцирующем действии всех лектинов, за исключением SVL-1, без ЛПС на синтез цитокинов (табл. 2).

При активировании клеток ЛПС добавление лектинов CGL и TCL приводит к некоторому уменьшению продукции ФНО-а и ИЛ-6, лектин SVL-1 значительно снижает уровень интерферона-у при концентрации 5 мкг/мл (табл. 3).

Из представленных результатов видно, что все исследуемые лектины вызывают повышение синтеза провоспалительных цитокинов, что может быть связано как с изменением их внутриклеточного синтеза, так и с их ускоренным высвобождением. Наибольший интерес представляют лектины CGL и TCL, иммуномодулирующее действие которых обусловлено не только способностью вызывать продукцию цитокинов, но и снижать их сверхэкспрессию при стимуляции клеток ЛПС.

Таким образом, показано, что все исследуемые нами лектины обладают биологической активностью и представляют интерес для дальнейших исследований.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ермак И.М., Давыдова В.Н., Горбач В.И., Бердышев Е.Л., Кузнецова ТА., Иванушко И.А., Гажа А.К., Смолина Т.П., Запорожец Т.С., Соловьева Т.Ф. Модификация биологических свойств липополисахарида при образовании им комплекса с хитозаном // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2004. Т. 137, № 4. С. 430-433.

2. Запорожец Т.С., Иванушко Л.А., Звягинцева Т.Н., Молчанова В.И., Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М. Ци-токининдуцирующая активность биополимеров морских гидробионтов // Мед. иммунологии. 2004. Т. 6, № 1/2. С. 89-96.

3. Кулинский В.И. Биохимические аспекты воспаления // Биохимия. 2007. Т. 72, вып. 6. С. 733-746.

4. Лоенко Ю.Н., Глазкова В.Е., Артюхов А.А., Оводова Р.Г. Лектины морских беспозвоночных // Успехи соврем. биологии. 1992. T. 112, № 5-6. C. 785-794.

5. Лукьянов П.А., Черников О.В., Кобелев С.С., Чикаловец И.В., Молчанова В.И., Ли В. Углеводсвязываю-щие белки морских беспозвоночных // Биоорган. химия. 2007. Т. 33, № 1. С. 172-181.

6. Полевщиков А.В. Лектины в защитных реакциях хордовых животных // Иммунология. 1996. Vol. 1. P. 48-56.

7. Belogortseva N.I., Molchanova VI., Kurika A.V., Skobun A.S., Glazkova V.E. Isolation and characterization of new GalNAc/Gal-specific lectin from the sea mussel Crenomytilus grayanus // Comp. Biochem. Physiol. 1998. Vol. 119. P. 45-50.

8. Belogortseva N., Molchanova V., Glazunov V., Evtushenko E., Luk'yanov P. N-Acetyl-D-glucosamine-specific lectin from the ascidian Didemnum ternatanum // Biochim. Biophys. Acta. 1998. Vol. 1380 (2). P. 249-256.

9. Beuth J., Ko H.L., Pulverer G., Uhlenbruck G., Pichlmaier H. Importance of lectins for the prevention of bacterial infections and cancer metastases // Glycoconj. J. 1995. Vol. 12. P. 1-6.

10. Chernikov O., Chikalovets I., Molchanova V., Pavlova M., Lukyanov P. Algae of Peter the Great Bay of the Sea of Japan as a source of lectins // Russ. J. Mar. Biol. 2007. Vol. 33 (5). P. 329-332.

11. Hori K., Miyazawa K., Ito K. Some common properties of lectins from marine algae // Hydrobiologia. 1990. Vol. 204/205. P. 561-566.

12. Kamiya H. Possible multiple functions of the invertebrate humoral lectins // Fish Pathology. 1995. Vol. 30 (2). P. 129-139.

13. Lis H., Sharon N. Lectins: carbohydrate-specific proteins that mediate cellular recognition // Chem. Rev. 1998. Vol. 98. P. 637-674.

14. Molchanova V, Chikalovets I., Li W., Kobelev S., Kozyrevskaya S., Bogdanovich R., Howard E., Belogortse-va N. New GlcNAc/GalNAc-specific lectin from the ascidian Didemnum ternatanum // Biochim. Biophys. Acta. 2005. Vol. 1723 (1-3). P. 82-90.

15. Sharon N., Lis H. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules // Glycobiology. 2004. Vol. 14(11). P. 53R-62R.