МИКРОФЛЮИДНОЕ УСТРОЙСТВО ДЛЯ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ В УСЛОВИЯХ НЕВЕСОМОСТИ
MICROFLUID DEVICE FOR CRYSTALLISATION OF PROTEINS IN WEIGHTLESSNESS CONDITIONS

Заявляемое изобретение относится к устройствам для кристаллизации белковых макромолекул в наземных условиях и условиях микрогравитации (в космосе).
В настоящее время целый ряд направлений фундаментальной и прикладной биологии, медицины и фармакологии нуждаются в точном знании пространственной структуры белковых молекул (с атомным разрешением), из которых построены органы и ткани человека, болезнетворных микроорганизмов, биологических токсинов и которые осуществляют все основные процессы обмена веществ в организме. Знание пространственной структуры белковых молекул тканей больного органа позволяет находить лекарственные препараты с избирательным действием, без побочных явлений.
Для успешного лечения болезней необходимо знать как функционируют биомакромолекулярные комплексы в физиологических и патологических условиях - для того, чтобы подойти к целенаправленной регуляции важнейших медиаторов систем организма и на следующем этапе работы синтезировать необходимые фрагменты биомолекул, несущих базовые свойства, но не вызывающих побочных эффектов в организме.
На сегодня практически единственным методом изучения структуры молекул с атомным разрешением является рентгеноструктурный анализ монокристаллов исследуемого вещества. При этом точность определения изучаемой атомной структуры лежит в прямой зависимости от совершенства используемых монокристаллов. Долгое время, до появления возможности кристаллизации в условиях невесомости, именно качество кристаллов было главным сдерживающим фактором в развитии этой области. Как бы ни были совершенны методы выделения и очистки необходимых препаратов, многие белки в земных условиях не удается закристаллизовать вообще. Отсутствие гравитации в условиях космоса и, как следствие, отсутствие конвективных потоков в объеме, где растет кристалл, в значительной степени решают эту проблему.
Для кристаллизации белков наиболее применимы как в земных условиях, так и в невесомости, два метода. Это метод диффузии паров растворителя в варианте «висячей» и «сидячей» капли и метод свободной диффузии через поверхность раздела жидкость/жидкость. При использовании в невесомости метода диффузии паров в капле, содержащей белок и осадитель, возникает так называемая конвекция Марангони, связанная с изменением поверхностного натяжения, что отрицательно влияет на качество выращиваемых кристаллов. При использовании метода диффузии жидкость/жидкость свободная поверхность между диффундирующими растворами отсутствует, и конвекция Марангони не наблюдается.
Пространственную молекулярную структуру белков определяют, исследуя белковые кристаллы методом рентгеноструктурного анализа. Чем выше качество кристаллов, тем с большим разрешением можно расшифровать молекулярную структуру белков. Оценка расшифрованных структур в Международном банке данных по белкам показала, что 80-85% белков расшифрованы с разрешением 7-9 Å, 8-10% белков - с разрешением 4-6 Å, и только 5-6% белков - с разрешением 1-1.5 Å. Для определения точной структуры молекулы белка требуется разрешение порядка 1 Å, так как только при таком разрешении можно различить водородные связи в молекуле белка и определить точную структуру молекулы. Поэтому выращивание высококачественных белковых кристаллов требует совершенствования известных и поиска новых методов кристаллизации белков. В наземных условиях выращиванию высококачественных белков препятствует гравитация, из-за которой в процессе кристаллизации возникают конвективные потоки, приводящие к искажению кристалла. Среди методов, позволяющих улучшить качество белковых кристаллов, особое место занимает кристаллизация белков в условиях невесомости, когда отсутствие гравитации и конвективных потоков позволяет получить совершенную структуру кристаллов.
Известно устройство для кристаллизации белков в микрофлюидных каналах, которое может быть использовано в условиях микрогравитации, т.е. в космосе (Патент США №6.409.832 «Protein crystallization in microfluidic structures», МПК B01L 7/00, C30B 7/00, опубликовано 25 июня 2002 года).
Названное устройство содержит емкости с растворами различных белков и осадителей, попарно подключенные через отдельные каналы, в которых установлены микрозатворы, к кристаллизационным камерам.
Недостатками данного устройства являются:
1. Сложность конструкции и снижение надежности в результате наличия большого количества отдельных трубчатых элементов, в которых формируются отдельные кристаллизационные камеры.
2. Невозможность изменения режимов кристаллизации в каждой из отдельных камер вследствие того, что подача белков и осадителей во все камеры производится синхронно от одного источника давления.
Задачами настоящего изобретения являются:
1. Повышение надежности устройства для микрофлюидной кристаллизации белков.
2. Расширение функциональных возможностей по кристаллизации белков различных типов в рамках одного эксперимента.
Техническим результатом является создание микрофлюидного устройства для кристаллизации белков, которое позволяет проводить эксперименты как по подбору условий кристаллизации, так и по кристаллизации различных белков в одном канале - благодаря конструкции с параллельными и независимыми друг от друга микронасосами. При работе с устройством возможно без дополнительных действий по перемещению кристаллов сразу отправлять их на последующие исследования.
Поставленная задача и необходимый технический результат достигаются тем, что в микрофлюидном устройстве для кристаллизации белков, содержащем емкости с растворами различных белков и осадителей, попарно подключенные через отдельные каналы, в которых установлены микрозатворы, к кристаллизационным камерам, названные каналы подключены к одному трубчатому элементу, внутри которого формируют отдельные кристаллизационные камеры для каждого из белков. Один конец трубчатого элемента соединен через микрозатвор с микронасосом, подающим из резервуара в полость трубчатого элемента рабочую среду, служащую для разделения полостей кристаллизационных камер, а другой конец трубчатого элемента соединен со сборником рабочей среды, причем для подачи растворов белков и осадителей через отдельные каналы в кристаллизационные камеры применяют отдельные микронасосы, функционирующие по индивидуальным программам. В качестве рабочей среды, применяющейся для разделения кристаллизационных камер внутри трубчатого элемента, возможно применение масла, а в качестве микронасосов для подачи белков, осадителей и рабочей среды возможно использование системы шприцевых инфузионных микронасосов. Диаметр канала в трубчатом элементе находится в диапазоне 200-500 мкм.
Сущность предлагаемого изобретения поясняется схемой устройства, представленной на фигуре.
Устройство состоит из трубчатого элемента 1, диаметр канала внутри которого находится в диапазоне 200-500 мкм, с подведенными к нему вспомогательными каналами 2, 3, 4, через которые при помощи системы параллельно подключенных микронасосов 5 и 6 из емкостей 7-12 подаются рабочие растворы различных белков, находящихся в емкостях 7, 9, 11, и осадителей, находящихся в емкостях 8, 10, 12. Система микронасосов 5, 6 служит для подачи в канал трубчатого элемента 1 заданного количества растворов в требуемой последовательности и временных рамках. Система микрозатворов 13, расположенных в местах соединения канала трубчатого элемента 1 и вспомогательных каналов 2, 3, 4, устраняет возможность оттока вещества посредством диффузии, испарения и т.д. путем герметичного перекрытия вспомогательных каналов 2, 3, 4.
На одном конце трубчатого элемента 1 находится резервуар 14 с рабочей средой, например, маслом, которое подается в канал трубчатого элемента 1 с помощью микронасоса 15 при открытом микрозатворе 16, на другом - сборник для стока рабочей среды 17, отделяемый от канала трубчатого элемента 1 при помощи микрозатвора 18. Рабочая среда 19 в канале трубчатого элемента 1 используется для разделения объемов рабочих растворов 20-28 и препятствует их смешиванию. Рабочая среда не взаимодействует с белковыми препаратами и, соответственно, не влияет на происходящие в каплях процессы по образованию кристаллов. При этом она препятствует контакту различных по составу и концентрации объемов, подающихся в канал трубчатого элемента.
Между соседними парами вспомогательных каналов 2, 3, 4 в канале трубчатого элемента 1 установлена система микрозатворов 29, в закрытом состоянии исключающих возможность диффузии между объемами рабочих растворов, поданными в канал трубчатого элемента 1 через соседние пары вспомогательных каналов 2, 3, 4.
Работа с устройством происходит следующим образом. Канал трубчатого элемента 1 по всей длине заполняют рабочей средой из емкости 14 при помощи микронасоса 15 при открытых микрозатворах 16, 18 29. Рабочую среду прокачивают с необходимой скоростью в соответствии с заданной программой (за определенный период времени). Затем рабочие растворы белков из емкостей 7, 9, 11 и осадителей из емкостей 8, 10, 12, соответственно, в заданных объемах параллельно подают в названный канал через вспомогательные каналы 2, 3, 4 при помощи системы микронасосов 5, 6 при открытых микрозатворах 13. Система из параллельных емкостей с растворами 7-12 позволяет проводить эксперименты как с одним белком и различными осадителями, так и с несколькими, например, с тремя различными белками и тремя различными осадителями. При помощи микронасосов 5, 6, которые позволяют варьировать объемы подаваемых растворов, можно получать в канале трубчатого элемента 1 различные условия для кристаллизации белков. Избыток рабочей среды, образующийся при введении в этот канал 1 объемов с растворами белка и осадителя 20-28, через микрозатвор 18 попадает в сборник для стока рабочей среды 17.
В канал трубчатого элемента 1, заполненный рабочей средой, одновременно из емкостей 7 и 8, 9 и 10, 11 и 12 подают растворы белка и осадителя так, чтобы в канале трубчатого элемента 1 (на выходе из вспомогательных каналов 2, 3, 4) образовывались капли с растворами белка и осадителя 20, 21, 22. Избыток рабочей среды, образующийся при вытеснении рабочей среды каплями, сливается в сборник 17. При этом микронасос 15 продолжает прокачивать рабочую среду из резервуара 14 в объем канала трубчатого элемента 1. Через заданный по программе временной интервал из емкостей 7 и 8, 9 и 10, 11 и 12 в канал трубчатого элемента 1 начинают подавать растворы белков и осадителей, которые, поступая внутрь канала трубчатого элемента 1, образуют капли 23, 24, 25 соответственно. Т.к. рабочая среда продолжает прокачиваться через канал трубчатого элемента 1, то между каплями с растворами образуется прослойка рабочей среды 19, которая препятствует их смешиванию, но при этом не влияет на процессы, происходящие в каплях. В результате образовавшиеся капли 20-25 перемещаются в канале трубчатого элемента 1 в направлении движения рабочей среды (справа налево, как обозначено стрелками на фигуре). Далее в канал трубчатого элемента 1 вводят дополнительные порции белков и осадителей, которые образуют капли 26, 27, 28. Операцию повторяют до тех пор, пока весь объем канала трубчатого элемента 1 будет заполнен каплями растворов белков и осадителей, разделенными прослойкой рабочей среды 19. Поскольку микронасосы 5, 6 позволяют в соответствии с заданной программой варьировать объем подаваемых в вспомогательные каналы 2, 3, 4 растворов, имеется возможность менять состав капель и получать различные условия для кристаллизации белков.
Таким образом, канал трубчатого элемента 1 заполняют каплями рабочих растворов 20-28, в которых должна происходить кристаллизация белков за счет диффузии в жидкости, и рабочей средой 19, которая разделяет капли растворов 20-28, а также препятствует их смешиванию. Канал трубчатого элемента 1, заполненный каплями кристаллизационных растворов и рабочей средой, показан на принципиальной схеме устройства, представленной на фигуре. После заполнения канала трубчатого элемента 1 всеми заданными объемами рабочих растворов микронасосы 5, 6 выключают, микрозатворы 13 закрывают. После этого прекращают подачу рабочей среды путем выключения микронасоса 15 и последовательно закрывают микрозатворы 29, 18. В каплях 20-28 с растворами белков и осадителей начинается кристаллизация белковых макромолекул.
Конструкция и материал данного устройства позволяют проводить последующие исследования кристаллов белков непосредственно в канале трубчатого элемента 1, который отсоединяют от всего устройства при закрытых микрозатворах 13, 16, 18. Это позволяет избежать лишних действий по извлечению кристаллов, которые могут привести к частичному или полному разрушению исследуемых образцов. Т.к. микрозатворы герметично закрывают необходимые технологические отверстия в канале трубчатого элемента 1, названный элемент с каплями 20-28, в которых произошло образование кристаллов белков, при соблюдении необходимых внешних условий (температура, освещение, влажность окружающей среды) можно хранить и транспортировать в течение длительного срока. Трубчатый элемент с каналом 1 покрыт сверху прозрачной биологически нейтральной пленкой-скотчем, которая позволяют наблюдать за кристаллами при помощи оптической микроскопии и проводить исследования при помощи синхротронного излучения.
Проведенные эксперименты показали, что размеры канала, в котором происходит формирование кристаллов, позволяют использовать нанообъемы белка и осадителя и получать кристаллы с линейным размером 100-150 мкм. Микрофлюидное кристаллизационное устройство также позволяет проводить эксперименты как по подбору условий кристаллизации, так и по кристаллизации различных белков в одном канале - благодаря конструкции с параллельными и независимыми друг от друга микронасосами.
Приведенные факты подтверждают промышленную применимость устройства.