СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ МАРКЕРЫ, ХАРАКТЕРНЫЕ ДЛЯ ПАНКРЕАТИЧЕСКИХ ЭНДОКРИННЫХ КЛЕТОК
METHOD FOR OBTAINING CELLS EXPRESSING MARKERS CHARACTERISTIC FOR PANCREATIC ENDOCRINE CELLS

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Данная заявка истребует приоритет, предоставляемый в связи с подачей Предварительной заявки на патент США №61/747662, поданной 31 декабря 2012 года, которая в полном объеме содержится в настоящем документе в виде ссылки.
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к области дифференцировки клеток. Более детально, настоящее изобретение представляет способы, клеточные культуры и среду для получения панкреатических энтодермальных, панкреатических эндокринных клеток-предшественников и одногормонных панкреатических эндокринных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека путем культивирования клеток в воздушно-жидкой зоне взаимодействия.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка островков Лангерганса с возможностью трансплантации заставили обратить внимание на разработку источников инсулин-продуцирующих клеток, или бета-клеток, подходящих для приживления трансплантата. Один подход представляет собой получение функциональных бета-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, содержащих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и энтодерму), в ходе процесса, известного как гаструляция. Ткани, такие как ткань щитовидной железы, вилочковой железы, поджелудочной железы, кишечника и печени, будут развиваться из энтодермы через промежуточную стадию. Промежуточная стадия данного процесса представляет собой образование дефинитивной энтодермы.
К концу гаструляции энтодерма разделяется на передний и задний отделы, которые могут быть распознаны по экспрессии ряда факторов, однозначно выделяющих переднюю, среднюю и заднюю области энтодермы. Например, HHEX и SOX2 идентифицируют переднюю область, в то время как CDX1, 2 и 4 идентифицируют заднюю половину энтодермы.
Миграция ткани энтодермы приближает энтодерму к различным мезодермальным тканям, которые способствуют регионализации кишечной трубки. Это достигается за счет целого ряда секретируемых факторов, таких как FGFs, Wnts, TGF-Bs, ретиноевой кислоты (RA), лигандов BMP и их антагонистов. Например, FGF4 и BMP способствуют экспрессии CDX2 в предполагаемой энтодерме задней кишки и подавляют экспрессию передних генов Hhex и SOX2 (Development 2000 г., 127: 1563-1567). Было продемонстрировано, что сигнализация WNT также действует параллельно с сигнализацией FGF, способствуя развитию задней кишки и препятствуя зачаткам передней кишки (Development 2007 г., 134: 2207-2217). Наконец, ретиноевая кислота, секретируемая мезенхимой, регулирует границу между передней и задней кишкой (Curr Biol 2002 г., 12: 1215-1220).
Уровень экспрессии специфических факторов транскрипции может использоваться для определения типа ткани. Во время преобразования дефинитивной энтодермы в примитивную кишечную трубку кишечная трубка становится разделенной на широкие домены, которые можно наблюдать на молекулярном уровне с помощью ограниченных паттернов экспрессии генов. Например, регионализованный отдел поджелудочной железы в кишечной трубке демонстрирует очень высокую экспрессию PDX1 и очень низкую экспрессию CDX2 и SOX2. PDX1, NKX6.1, PTF1A и NKX2.2 высоко экспрессируются тканью поджелудочной железы; а экспрессия CDX2 высока в кишечной ткани.
Образование поджелудочной железы происходит при дифференцировании дефинитивной энтодермы в панкреатическую энтодерму. Дорсальный и вентральный домены поджелудочной железы формируются из эпителия передней кишки. Передняя кишка также дает начало формирования пищевода, трахеи, легких, щитовидной железы, желудка, печени, поджелудочной железы и системы желчных протоков.
Клетки панкреатической энтодермы экспрессируют панкреодуоденальный, содержащий гомеобокс ген PDX1. В отсутствие PDX1 поджелудочная железа не развивается дальше образования вентрального и дорсального зачатков. Следовательно, экспрессия PDX1 является важным этапом органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит как экзокринную, так и эндокринную ткани, которые образуются при дифференцировании панкреатической энтодермы.
D'Amour et al. описывает производство обогащенных культур дефинитивной энтодермы, полученной из эмбриональных стволовых клеток человека в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005 г., 23: 1534-1541; патент США №7704738). Трансплантация этих клеток под капсулу почки у мышей приводила к дифференцированию в более зрелые клетки с характеристиками ткани энтодермы (патент США №7704738). Клетки дефинитивной энтодермы, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека, могут быть далее дифференцированы в PDX1-положительные клетки после добавления FGF10 и ретиноевой кислоты (заявка на патент США №2005/0266554). Последующая трансплантация таких клеток-предшественников панкреатических клеток в жировое тело иммунодефицитных мышей привела к образованию функциональных панкреатических эндокринных клеток с последующей 3-4-месячной стадией созревания (патент США №7993920 и патент США №7534608).
Fisk et al. сообщают о системе получения клеток панкреатических островков из эмбриональных стволовых клеток человека (патент США №7033831). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Эмбриональные стволовые клетки человека сначала были дифференцированы в энтодерму при помощи комбинации бутирата натрия и активина A (патент США №7326572). Затем клетки культивировали с антагонистами BMP, такими как Noggin, в комбинации с EGF или бета-целлюлином для генерирования PDX1-положительных клеток. Конечное дифференцирование индуцировали никотинамидом.
Низкомолекулярные ингибиторы также применяли для индуцирования клеток-предшественников панкреатических эндокринных клеток. Например, низкомолекулярные ингибиторы рецептора TGF-β и рецепторов ВМР (Development 2011, 138: 861-871; Diabetes 2011, 60: 239-247) применялись для значительного увеличения количества эндокринных клеток поджелудочной железы. Кроме того, низкомолекулярные активаторы также применяли для генерирования клеток дефинитивной энтодермы или клеток-предшественников панкреатических клеток (Curr Opin Cell Biol 2009 г., 21: 727-732; Nature Chem Biol 2009, 5: 258-265).
НВ9 (также известный как HIXB9 и MNX1) является транскрипционным активаторным белком BHLH, экпрессируемым на ранней стадии развития поджелудочной железы, начинающейся приблизительно на 8 эмбриональный день. НВ9 также экспрессируется в нотохорде и спинном мозге. Экспрессия HB9 неравномерна и достигает пика примерно в день 10,5 в эпителии поджелудочной железы, будучи экспрессированной в клетках, экспрессирующих PDX1 и NKX6.1. Примерно в день 12,5 экспрессия HB9 снижается и на поздних стадиях ограничивается только β клетками. В гомозиготах мышей с нулевой мутацией HIXB9, дорсальная доля поджелудочной железы не развивается (Nat Genet 23: 67-70, 1999; Nat Genet 23: 71-75, 1999). HB9-/- бета-клетки экспрессируют низкие уровни глюкозного транспортера, GLUT2 и NKX6.1. Далее, HB9 -/- поджелудочной железы демонстрирует значительное снижение в количестве инсулин-положительных клеток в то же время, не оказывая значительного влияния на экспрессию прочих гормонов поджелудочной железы. Таким образом, временной контроль HB9 чрезвычайно важен для нормального развития и функционирования бета-клетки. В то время как немного известно о факторах, регулирующих экспрессию HB9 в бета-клетках, недавнее исследование на данио предполагает, что ретиноевая кислота может положительно регулировать экспрессию HB9 (Development, 138, 4597-4608, 2011).
Гормоны щитовидной железы, тироксин («T4») и трииодотиронин («Т3»), являются гормонами, основанными на тирозине, которые производятся щитовидной железой и первоначально отвечают за регулирование метаболизма. Основной формой гормонов щитовидной железы в крови является Т4, обладающий более длительным периодом полужизни, чем Т3. Соотношение Т4 и Т3, выделяемых в кровь, составляет точно 20 к 1. Т4 конвертируется в более активный Т3 (в три-четыре раза более мощный, чем Т4) внутри клеток с помощью деиодиназы.
Т3 прикрепляется к рецепторам гормонов щитовидной железы, TRα1 и TRβ1 (TR). TR является ядерным рецептором гормонов, который гетеродимеризуется с ретиноидным Х рецептором. Димеры связываются с отвечающими элементами щитовидной железы (TREs) в отсутствии лиганда и действуют как транскрипционные репрессоры. Прикрепление Т3 к TR понижает репрессию TRE-зависимых генов и стимулирует экспрессию различных целевых генов. В то время как многочисленные исследования предполагали, что роль Т3 состоит в увеличении пролиферации бета-клеток, снижении апоптоза и улучшении секреции инсулина, его роль в дифференцировке клеток не определена.
Трансформирующий фактор роста бета (TGF-β) относится к большому семейству плеотропных цитокинов, которые задействованы во многих биологических процессах, включая контроль роста, дифференцировку, миграцию, выживание клеток, фиброз и спецификацию процесса развития. Представители суперсемейства TGF-β передают сигнал посредством рецепторного комплекса, содержащего рецепторы типа I и типа II. Лиганды TGF-B (такие как активины и факторы дифференцировки роста(«GDF»)) связывают вместе рецептор типа II с рецептором типа I. Рецептор типа II фосфорилирует и активирует рецептор типа I в комплексе. Существует пять видов рецепторов типа II у млекопитающих: TβR-II, ActR-II, ActR-IIB, BMPR-II, и AMHR-II и семь рецепторов типа I (ALKs 1-7). Активин и родственные ему лиганды сигнализируют через комбинации ActR-II или ActR-IIB и ALK4 или ALK5, и BMP сигнализируют через комбинации ALK2, ALK3, и ALK6 с ActR-II, ActR-IIB, или BMPR-II. AMH сигнализирует через комплекс AMHR-II с ALK6, и лимфоузел, как выяснилось недавно, сигнализирует через комплекс ActR-IIB и ALK7 (Cell. 2003, 113(6): 685-700). После закрепления лиганда TGF-B на соответствующем рецепторе испускаемые сигналы передаются в ядро, первоначально через активацию комплексов Smad-белков. При активации рецепторы типа I фосфолирируют представителей рецептор-регулируемого подсемейства Smad-белков. Это активирует их и дает возможность формировать комплексы с обычными медиаторами Smad, Smad4. Smad 1, 5, и 8 являются субстратами для ALK 1, 2, 3, и 6, в то время как Smad 2 и 3 являются субстратами для ALK 4, 5, и 7 (FASEB J 13: 2105-2124). Активированные комплексы Smad аккумулируются в ядре, где они напрямую задействованы в транскрипции целевых генов, как правило, в ассоциации с другими специфическими ДНК-связывающими транскрипционными факторами. Составы, которые избирательно ингибируют рецепторы TGF-β, были разработаны для терапевтического применения и для изменения судьбы клетки в контексте репрограммирования и дифференцировки из различных популяций стволовых клеток. В частности, ингибиторы ALK5 ранее применялись для направления дифференцировки эмбриональных стволовых клеток к эндокринной судьбе (Diabetes, 2011, 60(1): 239-47).
В целом, процесс дифференцировки прогениторных клеток в функциональные бета-клетки проходит через различные стадии; и протоколы получения панкреатических клеток из прогениторных клеток, таких как плюрипотентные стволовые клетки человека, были в значительной степени улучшены. Несмотря на эти продвижения в расследованиях, каждый шаг в процессе дифференцировки прогениторных клеток является уникальной задачей. Таким образом, сохраняется необходимость в протоколе, который бы привел к получению функциональных эндокринных клеток и, в частности, функциональных бета-клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1А-Н показаны фазовые контрастные образцы клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением способа, описанного в Примере 1 на следующих временных точках: День 1 (Фиг. 1A); день 5 (Фиг. 1B); день 6 (Фиг. 1C); день 7(Фиг. 1D); день 9 (Фиг. 1E); день 13 (Фиг. 1F); день 16 (Фиг. 1G); и день 21 (Фиг. 1H).
На Фиг. 2А-К показаны образы клеток, дифференцированных на протяжении одной недели в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением способов, описанных в примере 1 и иммуноокрашенных для следующего: DAPI (Фиг. 2A); инсулин (Фиг. 2B); HB9 (Фиг. 2С), DAPI (Фиг. 2D); глюкагон (Фиг. 2E); инсулин (Фиг. 2F); DAPI (Фиг. 2G); инсулин (Фиг. 2H); соматостатин (Фиг. 2I); NKX6.1 (Фиг. 2J); инсулин (Фиг. 2K). Панели A-C, D-F, G-I и J-K были взяты из того же поля.
На Фиг. 3А-Н показаны образы клеток, дифференцированных на протяжении двух недель в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением способов, описанных в примере 1 и иммуноокрашенных для следующего: инсулин (Фиг. 3А); глюкагон (Фиг. 3В); инсулин (Фиг. 3С); соматостатин (Фиг. 3D); инсулин (Фиг. 3Е); NKX6.1 (Фиг. 3F); НВ9 (Фиг. 3G); и NKX6.1 (Фиг. 2Н). Панели А-В, С-D, E-F и G-H были взяты из того же поля.
На Фиг. 4А-D показаны образы клеток, дифференцированных на протяжении трех недель в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением способов, описанных в примере 1 и иммуноокрашенных для инсулина (Фиг. 4А); глюкагона (Фиг. 4В); инсулина (Фиг. 4С) и соматостатина (Фиг. 4D). Панели А-В и С-D были взяты из того же поля.
На Фиг. 5А-R представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 1: PDX1 (Фиг. 5A); NKX6.1 (Фиг. 5B); PAX4 (Фиг. 5C); PAX6 (Фиг. 5D), NGN3 (Фиг. 5E); NKX2.2 (Фиг. 5F); ABCC8 (Фиг. 5G); хромогранин-А (Фиг. 5H); PCSK1 (Фиг. 5I); IAPP (Фиг. 5J); инсулин (Фиг. 5К); глюкагон (Фиг. 5L); соматостатин (Фиг. 5М); грелин (Фиг. 5N); PTFIA (Фиг. 5О); ZIC1 (Фиг. 5Р); CDX2 (Фиг. 5Q) и SOX9 (Фиг. 5R). Клетки культивировались в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия после стадии 5.
На Фиг. 6А-L представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 2: PDX1 (Фиг. 6A); NKX6.1 (Фиг. 6B); PAX4 (Фиг. 6C); PAX6 (Фиг. 6D), NGN3 (Фиг. 6E); NKX2.2 (Фиг. 6F); ABCC8 (Фиг. 6G); хромогранин-А (Фиг. 6Н); PCSK1 (Фиг. 6I); IAPP (Фиг. 6J); инсулин (Фиг. 6) и глюкагон (Фиг. 6L).
На Фиг. 7А-L представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 3: PDX1 (Фиг. 7А); NKX6.1 (Фиг. 7В); PAX4 (Фиг. 7C); PAX6 (Фиг. 7D), NGN3 (Фиг. 7E); NKX2.2 (Фиг. 7F); ABCC8 (Фиг. 7G); хромогранин-А (Фиг. 7Н); PCSK1 (Фиг. 7I); IAPP (Фиг. 7J); инсулин (Фиг. 7K) и глюкагон (Фиг. 7L).
На Фиг. 8А-H представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 4: PDX1 (Фиг. 8A); NKX6.1 (Фиг. 8B); NGN3 (Фиг. 8C); ABCC8 (Фиг. 8D); PCSK1 (Фиг. 8E); грелин (Фиг. 8F); глюкагон (Фиг. 8G); и инсулин (Фиг. 8Н).
На Фиг. 9А-F представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 4: PDX1 (Фиг. 9А); NKX6.1 (Фиг. 9B); NGN3 (Фиг. 9C); ABCC8 (Фиг. 9D); глюкагон (Фиг. 9E); и инсулин (Фиг. 9F).
На Фиг. 10А-В описаны результаты иммуноокрашивания клеток стадии 6, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в соответствии с примером 4 и обработанных либо 1 микромолярным SD208 ингибитором (Фиг. 10А), либо 1 микромолярным ALK5 ингибитором II (Фиг. 10В) и окрашенным для хромогранина-А (пан-эндокринный маркер) и NKX6.1 (панкреатический прекурсорный маркер и специфический маркер бета-клеток).
На Фиг. 11А-Н представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека Н1, дифференцированных как описано в примере 6: ABCC8 (Фиг. 11A), глюкагон (Фиг. 11B), амилин (Фиг. 11C), инсулин (Фиг. 11D), NGN3 (Фиг. 11Е), NKX2.2 (Фиг. 11F), NKX6.1 (Фиг. 11G) и PDX1 (Фиг. 11H). Данные представлены как кратное возрастание по сравнению с недифференцированной линией Н1.
На Фиг. 12А-Н представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 7 и культивированных в ВЖЗВ: ABCC8 (Фиг. 12A), глюкагон (Фиг. 12B), амилин (Фиг. 12C), инсулин (Фиг. 12D), NGN3 (Фиг. 12Е), NKX2.2 (Фиг. 12F), NKX6.1 (Фиг. 12G) и PDX1 (Фиг. 12H).
На Фиг. 13А-Н представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 8 и культивированных в ВЖЗВ: ABCC8 (Фиг. 13A), глюкагон (Фиг. 13B), амилин (Фиг. 13C), инсулин (Фиг. 13D), NGN3 (Фиг. 13Е), NKX2.2 (Фиг. 13F), NKX6.1 (Фиг. 13G) и PDX1 (Фиг. 13H).
На Фиг. 14А-Н представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 9 и культивированных в ВЖЗВ: ABCC8 (Фиг. 14A), глюкагон (Фиг. 14B), амилин (Фиг. 14C), инсулин (Фиг. 14D), ISL-1 (Фиг. 14Е), MNX1 (Фиг. 14F), NKX6.1 (Фиг. 14G) и SLC30A8 (Фиг. 14H).
На Фиг. 15А-J показаны профили FACS клеток стадии 5 день 3, дифференцированных как описано в примере 10 и окрашенных для следующего: Изотипический контроль (Фиг. 15А); NKX6.1 (Фиг. 15В); NKX2.2 (Фиг. 15С); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 15D); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 15Е); PAX6 (Фиг. 15F); ISL-1 (Фиг. 15G); FOXA2 (Фиг. 15Н); NeuroD (Фиг. 15I) и глюкагон (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 15J).
На фиг. 16А-I показаны профили FACS клеток стадии 6 день 5, дифференцированных как описано в примере 10 и окрашенных для: Изотипический контроль (Фиг. 16А); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 16В); NKX2.2 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 16С); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 16D); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 16Е); PAX6 (Фиг. 16F); ISL-1 (Фиг. 16G); FOXA2 (Фиг. 16Н) и NeuroD (Фиг. 16I).
На Фиг. 17А-I показаны профили FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток) клеток стадии 6 день 15, дифференцированных как описано в примере 10 и окрашенных для: Изотипический контроль (Фиг. 17А); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 17В); NKX2.2 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 17С); глюкагон (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 17D); NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 17Е); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 17F); ISL-1 (Фиг. 17G); FOXA2 (Фиг. 17Н) и NeuroD (Фиг. 17I).
На Фиг. 18А-С показаны профили FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток) клеток стадии 4 день 4, дифференцированных как описано в примере 1 и окрашенных для: NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 18А); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 18В); и NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 18С).
На Фиг. 19А-С показаны профили FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток) клеток стадии 6 день 6, дифференцированных как описано в примере 11 и окрашенных для: NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с хромогранином-А (ось Х) (Фиг. 19А); PDX1 (ось Х) со-окрашенный с KI-67 (ось Y) (Фиг. 19В); и NKX6.1 (ось Y) со-окрашенный с инсулином (ось Х) (Фиг. 19С).
Фиг. 20 показывает кинетику производства человеческого С-пептида в условиях in vivo в NOD-SCID мыши, куда трансплантированы различные популяции клеток, как описано в примере 11.
На Фиг. 21А -F представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 12: Амилин (Фиг. 21А); инсулин (Фиг. 21В), MAFA (Фиг. 21C), NKX6.1 (Фиг. 21D), PTF1a (Фиг. 21E) и SOX9 (Фиг. 21F).
На Фиг. 22А-D представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека Н1, дифференцированных как описано в примере 13: MAFA (Фиг. 22А); инсулин (Фиг. 22В); Амилин (Фиг. 22С) и NKX6.1 (Фиг. 22D).
На Фиг. 23А-F представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 5: PDX1 (Фиг. 23А); NKX6.1 (Фиг. 23B); NGN3 (Фиг. 23C); ABCC8 (Фиг. 23D); глюкагон (Фиг. 23E); и инсулин (Фиг. 23F).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Приведенное ниже подробное описание настоящего изобретения, будет более понятно при изучении вместе с приложенными рисунками. Рисунки предоставлены с целью иллюстрации определенных вариантов осуществления настоящего изобретения. Однако настоящее изобретение не ограничивается только приведенными точными конструкциями, примерами и устройствами. Для четкости описания, а не для ограничения настоящего изобретения, подробное описание настоящего изобретения разделено на подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Настоящее изобретение направлено на дифференцировку энтодермальных прогениторных клеток, таких как плюрипотентные стволовые клетки, в клетки, демонстрирующие характеристики панкреатических эндокринных клеток путем культивирования упомянутых прогениторных клеток, по меньшей мере частично, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, которая существует в открытом культуральном сосуде или культуральном сосуде, частично заполненном субстратом. Хотя термин «воздух» применяется здесь для удобства, изобретение не ограничено смесью газов и составляющих, находящихся в нормальной окружающей среде. Изобретение детально рассматривает и включает газообразные смеси, обладающие составом, отличным от нормальной окружающей среды, включая, например, смеси, обогащенные определенным компонентом или в которых содержание определенного компонента понижено или исключено.
Дополнительно, настоящее изобретение представляет клеточные культуры для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки, демонстрирующие характеристики панкреатических эндокринных клеток, так же как и дифференцировочную среду, которая инициирует и упрощает подобную дифференцировку. Преимуществом является то, что эти клеточные культуры и дифференцировочная среда могут применяться в сочетании с дифференцировкой в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия для обеспечения не полученных ранее урожаев клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток.
Культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия может производиться на всех стадиях, задействованных в дифференцировке от плюрипотентных стволовых клеток до панкреатических эндокринных клеток, или может включать культивирование планарной культуры, погруженной в субстрат на ранних стадиях дифференцировки, и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия во время поздних стадий дифференцировки. В предпочтительном варианте процесс изобретения включает комбинацию культивирования плюрипотентных стволовых клеток на поддерживающей поверхности, погруженной в среду, на ранних стадиях, и затем культивирование в воздушно-жидкостной среде на поздних стадиях дифференцировки. В таких вариантах осуществления клетки могут быть первоначально посеяны на твердую поверхность для погруженного культивирования, а затем удалены с твердой поверхности и пересеяны на пористую поверхность для культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Альтернативно, клетки могут быть изначально посеяны на пористую поддерживающую поверхность, которая затем погружается в субстрат, на ранних стадиях дифференцировки и затем перемещены в воздушно-жидкостную зону взаимодействия на поздних стадиях дифференцировки. Культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на поздних стадиях дифференцировки в значительной степени улучшает экспрессию эндокринных маркеров по сравнению с культивированием клеток в погруженном состоянии на протяжении всего процесса, указывая, что больший процент клеток был дифференцирован в панкреатические эндокринные клетки.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение направлено на дифференцировку энтодермальных прогениторных клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия культурального сосуда, частично заполненного субстратом, в панкреатические энтодермальные клетки, положительные для NKX6.1, PDX1, и НВ9. Это изобретение частично основано на открытии того, что культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия значительно улучшает экспрессию эндокринных маркеров. Более того, было открыто, что панкреатические эндокринные клетки-предшественники могут быть быстро получены в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, что приводит к получению предоминантных одногормонных инсулин-положительных клеток. Было обнаружено, что одноклеточный посев в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия улучшает консистенцию производства инсулина.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые как обладающие способностью на одноклеточном уровне к самообновлению и дифференциации. Стволовые клетки могут производить клетки-потомки, включая самообновляющиеся прогениторные клетки, необновляющиеся прогениторные клетки и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются своей способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных линий дифференцирования из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы). Стволовые клетки также дают начало тканям множества зародышевых листков после трансплантации и вносят значительный вклад в образование большинства, если не всех тканей после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируются по потенциалу развития. Плюрипотентные клетки способны преобразовываться во все виды эмбриональных клеток.
Дифференцировка представляет собой процесс, посредством которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например нервной клетки или мышечной клетки. Дифференцированная клетка представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцировки клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования относится к клетке, дошедшей в ходе процесса дифференцирования до стадии, с которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до конкретного типа клеток или подмножества типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться к менее дифференцированному типу. «Дедифференцировка» обозначает процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированной (или коммитированной) позиции в клеточной линии дифференцировки. Применяемый в настоящем документе термин «клеточная линия дифференцировки» означает наследственность клетки, т.е. из каких клеток произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В клеточной линии дифференцировки клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцировки. Маркер, специфичный для линии дифференцирования, относится к характеристике, специфически ассоциированной с фенотипом клеток интересующей линии дифференцирования, и его можно использовать для оценки дифференцирования некоммитированной клетки в клетки интересующей линии дифференцирования.
В настоящем документе термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в исследуемых клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией понимают повышенный уровень положительного маркера и пониженный уровень отрицательного маркера по сравнению с недифференцированной клеткой. Обнаруживаемый уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет идентифицировать интересующую клетку и отличить ее от других клеток с помощью любого из множества способов, известных в данной области.
В настоящем документе клетка «положительна по» заданному маркеру или «положительна», если заданный маркер явно обнаруживается в клетке. Аналогично клетка «отрицательна по» заданному маркеру или «отрицательна», если заданный маркер не обнаруживают в клетке. В частности, положительность по FACS как правило выше, чем 2%, в то время как отрицательный предел по FACS, как правило, менее 1%. Положительность по ПЦР, как правило, менее 34 циклов (Cts): в то время как отрицательность по ПЦР, как правило, более 34,5 циклов.
В попытках воспроизвести дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в функциональные клетки энтодермы поджелудочной железы в статичных клеточных культурах в условиях in vitro, процесс дифференцировки часто рассматривается как прогрессирование через несколько последовательных стадий. В частности, процесс дифференцировки в целом рассматривается как прогрессирование через шесть стадий. В этой постадийной прогрессии «стадия 1» относится к первому шагу в процессе дифференцировки, дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 1»). «Стадия 2» относится ко второму шагу, дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 2»). «Стадия 3» относится к третьему шагу, дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 3»). «Стадия 4» относится к четвертому шагу, дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки кишечной трубки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток-предшественников панкреатической передней кишки (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 4»). «Стадия 5» относится к пятому шагу, дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток-предшественников панкреатической передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток и/или панкреатических эндокринных клеток-предшественников (здесь и далее упоминаются как «панкреатические энтодермальные клетки/эндокринные клетки-предшественники» или альтернативно как «клетки стадии 5»). «Стадия 6» относится к дифференцировке клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных клеток и/или эндокринных панкреатических клеток-предшественников, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток (здесь и далее упоминаются как «клетки стадии 6»).
Однако следует отметить, что не все клетки в отдельно взятой популяции прогрессируют через эти стадии с одинаковой скоростью. Вследствие этого, в клеточных культурах в условиях in vitro нередко обнаруживается присутствие клеток, которые прогрессировали менее или более по пути дифференцировки, чем большинство клеток, присутствующих в популяции, в особенности на поздних стадиях дифференцировки. Например, нередко наблюдается появление маркеров, характерных для панкреатических энтодермальных клеток, во время стадии 5 культивирования клеток. Для иллюстративных нужд настоящего изобретения характеристики различных типов клеток ассоциированы с определенными выше стадиями, как описано в настоящем документе.
«Клетки дефинитивной энтодермы», как используется в настоящем документе, относится к клеткам, которые несут в себе характеристики клеток, появившиеся из эпибласта во время гаструляции, и которые формируют желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: FOXA2 (также известный как гепатоцитный ядерный фактор 3-β (HNF3β)), GATA4, SOX17, CXCR4, брахиурия, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99, и MIXL1. Маркерные характеристики клеток дефинитивной энтодермы включают CXCR4, FOXA2 и SOX17. Таким образом, клетки дефинитивной энтодермы могут быть охарактеризованы их экспрессией CXCR4, FOXA2 и SOX17. Дополнительно, в зависимости от длительности времени, на протяжении которого клеткам позволяется оставаться на стадии 1, можно наблюдать рост в HNF4α.
«Клетки кишечной трубки», как используется в данном документе, относится к клеткам, произошедшим от дефинитивной энтодермы, которые могут дать начало всем энтодермальным органам, таким как легкие, печень, поджелудочная железа, желудок и кишечник. Клетки кишечной трубки могут быть охарактеризованы их постоянно растущей экспрессией HNF4α, выше, чем экспрессия клеток дефинитивной энтодермы. Например, рост экспрессии HNF4α в мРНК в десять-сорок раз можно наблюдать на стадии 2.
«Энтодерма передней кишки», как используется в данном документе, относится к клеткам энтодермы, которые дают начало пищеводу, легким, желудку, печени, поджелудочной железе, желчному пузырю и части двенадцатиперстной кишки. Клетки энтодермы передней кишки экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, FOXA2, CDX2, SOX2 и HNF4α. Клетки энтодермы передней кишки могут быть охарактеризованы ростом экспресии PDX1 по сравнению с клетками кишечной трубки. Например, более пятидесяти процентов клеток в культурах стадии 3 типично экспрессируют PDX1.
«Клетка-предшественник панкреатической передней кишки», как используется в данном документе, относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF6, NGN3, SOX9, PAX4, PAX6, ISL1, гастрин, FOXA2, PTF1a, PROX1 и HNF4α. Клетки-предшественники панкреатической передней кишки поджелудочной железы можно охарактеризовать как положительные по отношению к экспрессии PDX1, NKX6.1 и SOX9.
Используемый в настоящей заявке термин, «панкреатическая энтодермальная клетка» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1 β, PTF1 α, HNF6, HNF4 α, SOX9, NGN3; гастрин; HB9, или PROX1. Панкреатические энтодермальные клетки могут характеризоваться отсутствием у них значительной экспрессии CDX2 или SOX2.
«Панкреатическая эндокринная клетка-предшественник», как используется в настоящем документе, относится к клеткам энтодермы поджелудочной железы, обладающим возможностью стать клеткой, экспрессирующей гормон поджелудочной железы. Панкреатические эндокринные клетки-предшественники экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров: NGN3, NKX2.2, NeuroD1, ISL1, PAX4, PAX6 или ARX. Панкреатические эндокринные клетки-предшественники могут быть охарактеризованы их экспрессией NKX2.2 и NeuroD1.
Используемый в настоящей заявке термин «панкреатическая эндокринная клетка» относится к клеткам, способным к секреции по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин или панкреатический полипептид. В дополнение к этим гормонам, маркерные характеристики панкреатических эндокринных клеток включают один или несколько из NGN3, NeuroD1, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, ARX, NKX2.2, и PAX6. Панкреатические эндокринные клетки, экспрессирующие маркеры бета-клеток, могут характеризоваться их экспрессией инсулина и по меньшей мере одного из следующих транскрипционных факторов: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, ISL1, HNF3β, MAFA и PAX6.
В настоящем документе используются попеременно «д1», «1д», и «день1», «д2», «2д», и «день 2» и так далее. Эти комбинации цифр и букв относятся к конкретному дню инкубации на различных стадиях в процессе поэтапного протокола дифференцировки настоящей заявки.
В настоящем документе термин «глюкоза» применяют относительно декстрозы, сахару, обычно встречающемуся в природе.
В настоящем документе термин «NeuroD1» применяют для обозначения белка, экспрессируемого в прогениторных клетках панкреатических эндокринных клеток, и гена, кодирующего его.
«LDN-193189» относится к ((6-(4-(2-(пиперидин-1-ил)этокси)фенил)-3-(пиридин-4-ил)пиразоло[1,5-a]пиримидин, гидрохлорид; DM-3189)), ингибитору рецептора BMP, доступному по торговой маркой STEMOLECULE™ от Stemgent, Inc., Cambridge, MA, USA.
Характеристики, источник, размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток
А. Характеристики плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать одно или несколько определенных TRA-1-60 и TRA-1-81 антител (Thomson et al. 1998, Science 282:1145-1147). Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии TRA-1-60 и TRA-1-81. Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки, как правило, имеют щелочнофосфатазную активность, которую можно обнаружить путем обработки клеток 4%-м раствором параформальдегида, а затем выращивая с щелочнофосфатазным набором субстратов, который продается под торговой маркой VECTOR Red, как описано производителем (Vector Laboratories, штат Калифорния, США). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ОТ-ПЦР.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных клеток является потенциал дифференцировки в клетки всех трех зародышевых листков: в эндодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность стволовых клеток можно подтвердить, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и их последующего гистологического исследования на наличие клеточных типов, происходящих от этих трех зародышевых листков. Плюрипотентность можно альтернативно определить по созданию эмбриоидных телец и анализа эмбриоидных телец на наличие маркеров, ассоциирующихся с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток можно кариотипировать с использованием стандартного способа G-бэндинга и сравнить с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», т.е. эуплоидные клетки, в которых все хромосомы человека присутствуют и не имеют видимых изменений.
В. Источники плюрипотентных стволовых клеток
Примерные типы плюрипотентных стволовых клеток, которые можно применять, включают в себя устойчивые линии плюрипотентных клеток, в том числе преэмбриональной ткани (такой как, например, бластоцист), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент во время беременности, как правило, но не обязательно перед сроком приблизительно от 10 до 12 недель беременности. Не имеющими ограничительного характера примерами являются устойчивые линии эмбриональных стволовых клеток человека, такие как, например, эмбриональные стволовые клетки человека линий H1, H7 и H9 (WiCell Research Institute, Мэдисон, штат Висконсин, США). Клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток, также пригодны для использования. Индуцибельные плюрипотентные клетки (IPS) или перепрограммированные плюрипотентные клетки, полученные из взрослых соматических клеток с помощью принудительной экспрессии ряда факторов, относящихся к плюрипотентным транскрипционным факторам, таким как OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 и ZFP42 (Annu Rev Genomics Hum Genet 2011 г., 12: 165-185, см. также IPS, Cell, 126(4): 663-676) также могут использоваться. Эмбриональные стволовые клетки человека, применяемые в способах настоящего изобретения, также могут быть подготовлены, как описано Thomson и др. (патент США №5,843,780; Science, 1998 г.; 282: 1145-1147; Curr Top Dev Biol, 1998 г.; 38: 133-165; Proc Natl Acad Sci USA 1995, 92: 7844-7848). Мутантные линии эмбриональных стволовых клеток человека, такие как BG01v (BresaGen, Athens, Ga.), или клетки, полученные из зрелых соматических клеток человека, такие как клетки, описанные в Takahashi et al., Cell 131: 1-12 (2007) также могут применяться. В определенных вариантах осуществления плюрипотентные стволовые клетки, пригодные для применения в настоящем изобретении, могут быть получены с помощью способов, описанных в: Li et al. (Cell Stem Cell 4: 16-19, 2009); Maherali et al. (Cell Stem Cell 1: 55-70, 2007); Stadtfeld et al. (Cell Stem Cell 2: 230-240); Nakagawa et al. (Nature Biotechnol 26: 101-106, 2008); Takahashi et al. (Cell 131: 861-872 (2007), и в заявке на патент США №2011/0104805. В определенных вариантах осуществления плюрипотентные клетки могут иметь не-эмбриональное происхождение. Все эти ссылки, патенты и приложения к патентам включены в настоящий документ способом ссылок во всей их полноте, в частности, поскольку они относятся к выделению, культуре, размножению и дифференцировке плюрипотентных клеток.
С. Размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, культивируются на слое питающих клеток, которые оказывают разностороннюю поддержку плюрипотентным клеткам. Альтернативно, плюрипотентные стволовые клетки культивируют в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но тем не менее поддерживающей пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток и не допускающей существенной дифференцировки. Рост плюрипотентных стволовых клеток в не содержащей питающих клеток культуральной системе без дифференцировки часто поддерживают путем использования среды, кондиционированной посредством предварительного культивирования клеток иного типа. Альтернативно, рост плюрипотентных стволовых клеток в не содержащей питающих клеток культуральной системе без дифференцировки поддерживают путем использования среды с определенным химическим составом.
Плюрипотентные клетки можно легко размножить в культуре путем использования различных питательных слоев или с помощью сосудов, покрытых матриксными белками. Альтернативно, химически определенные поверхности в сочетании с определенными средами, такими как среды, которые продаются под торговыми марками mTESR1 (StemCell Technologies, Ванкувер, Канада), могут использоваться для обычного размножения клеток. Плюрипотентные клетки можно легко удалить из культуральных планшетов посредством ферментативного расщепления, механического разделения или с применением различных кальцийхелатирующих агентов, таких как EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). Альтернативно, плюрипотентные клетки можно размножить в суспензии в отсутствие каких-либо матриксных белков или питательного слоя.
Множество различных способов размножения и культивирования плюрипотентных стволовых клеток могут применяться в описываемом изобретении. Например, способы изобретения могут использовать способы Reubinoff et al., Thompson et al., Richard et al. и заявки на патент США №2002/0072117. Reubinoff et al. (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)) и Thompson et al. (Science 282: 1145-1147 (1998) описывают культивирование линий плюрипотентных стволовых клеток из человеческих бластоцист с применением слоя питающих клеток из мышиных эмбриональных фибробластов. Richards et al. (Stem Cells 21: 546-556, 2003) оценивает панель из одиннадцати слоев различных человеческих взрослых, эмбриональных и неонатальных питающих клеток по их способности поддерживать культуру плюрипотентных стволовых клеток человека, замечая, что линии человеческих эмбриональных стволовых клеток, культивированных на питательных фибробластах взрослой кожи достигают морфологии эмбриональных стволовых клеток человека и остаются плюрипотентными. заявке на патент США №2002/0072117 описаны линии клеток, продуцирующие среду, которая поддерживает рост плюрипотентных стволовых клеток приматов в не содержащей питающих клеток культуре. Использованные клеточные линии представляют собой мезенхимальные и фибробластоподобные клеточные линии, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В заявке на патент США №2002/072117 также описано использование клеточных линий в качестве первичного слоя питающих клеток.
Прочие пригодные способы размножения и культивирования плюрипотентных стволовых клеток описаны, к примеру, в Wang et al., Stojkovic et al., Miyamoto et al. и Amit et al. Wang et al. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005 г.), описаны способы длительного выращивания плюрипотентных стволовых клеток человека на слоях питающих клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека. Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005 г.), описана система питающих клеток, полученная в результате спонтанного дифференцирования эмбриональных стволовых клеток человека. Miyamoto et al. (Stem Cells 22: 433-440, 2004 г.), описан источник питающих клеток из плаценты человека. Amit et al. (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003 г.) описывает слой питающих клеток, полученных из крайней плоти человека.
Другие подходящие способы размножения и культивирования плюрипотентных стволовых клеток описаны, к примеру, в Inzunza et al., патенте США No. 6642048, WO 2005/014799, Xu et al. и заявке на патент США №2007/0010011. Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005 г.), описывает слой питающих клеток, полученных из фибробластов постнатальной крайней плоти человека. В патенте США №6642048 описана среда, поддерживающая рост плюрипотентных стволовых клеток приматов в не содержащей питающих клеток среде, а также клеточные линии, которые можно использовать для производства такой среды. Патент США №6642048 сообщает о мезенхимальных и фибробластоподобных клеточных линиях, полученных из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток; так же как и способах получения таких клеточных линий, обработки среди и выращивания стволовых клеток с применением подобной среды. В международной заявке WO 2005/014799 описана кондиционированная среда для поддержания, пролиферации и дифференцирования клеток млекопитающих. В заявке на патент WO 2005/014799 сообщает, что культуральная среда, изготовленная в соответствии с настоящим изобретением, кондиционируется при помощи секреторной активности клеток мыши, в частности, активности дифференцированных и иммортализованных трансгенных гепатоцитов, именуемых MMH (Met Murine Hepatocyte). Xu et al. (Stem Cells 22: 972-980, 2004 г.), описана кондиционированная среда, полученная из производных эмбриональных стволовых клеток человека, генетически модифицированных для сверхэкспрессии обратной транскриптазы теломеразы человека. В заявке на патент США №2007/0010011 описана культуральная среда с определенным химическим составом для поддержания плюрипотентных стволовых клеток.
В альтернативной культуральной системе используют бессывороточную среду, обогащенную факторами роста, способными стимулировать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток. Примеры подобных культуральных систем включают, без ограничения, Cheon et al., Levenstein et al. и патентом США №2005/0148070. Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005) описана не содержащая питающих клеток и сыворотки культуральная система, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной, заменяющей сыворотку среде (SR), обогащенной различными факторами роста, способными запустить самообновление эмбриональных стволовых клеток. Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006 г.), описаны способы длительного культивирования эмбриональных стволовых клеток человека в отсутствие фибробластов или кондиционированной среды с применением среды, обогащенной основным фактором роста фибробластов (bFGF). В заявке на патент США №2005/0148070, описывается способ культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток в среде с определенным составом без сыворотки и без питающих клеток-фибробластов, где данный способ включает: культивирование стволовых клеток в культуральной среде, содержащей альбумин, аминокислоты, витамины, минеральные вещества, по меньшей мере один трансферрин или заменитель трансферрина, по меньшей мере один инсулин или заместитель инсулина, культуральную среду, в основном, не включающую эмбриональную сыворотку млекопитающих и содержащую по меньшей мере приблизительно 100 нг/мл фактора роста фибробластов, способного активировать сигнальный рецептор фактора роста фибробластов, при этом фактор роста фибробластов происходит из источника, иного, чем просто слой питающих клеток-фибробластов, среду, поддерживающую пролиферацию стволовых клеток в недифференцированном состоянии без слоя питающих клеток или кондиционированной среды.
Другие пригодные способы культивирования и размножения плюрипотентных стволовых клеток описаны в заявке на патент США №2005/0233446, патенте США №6800480, заявке на патент США №2005/0244962 и WO 2005/065354. В заявке на патент США №2005/0233446, описана среда с определенным составом, которую можно использовать при культивировании стволовых клеток, включая недифференцированные зародышевые стволовые клетки приматов. Среда в растворе по существу является изотонической по сравнению с культивируемыми стволовыми клетками. В данной культуре конкретная среда содержит основную среду и количество каждого из bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, необходимое для поддержки по существу недифференцированного роста зародышевых стволовых клеток. В патенте США №6800480, отмечено, что культуральная среда для выращивания зародышевых стволовых клеток приматов по существу в недифференцированном состоянии, включающая в себя основную среду с низким содержанием эндотоксина и низким осмотическим давлением, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов. В описании в патенте 6800480 далее сообщается, что основную среду объединяют с питательной сывороткой, которая эффективно поддерживает рост зародышевых стволовых клеток приматов, и субстратом, выбранным из группы, состоящей из питающих клеток и компонента внеклеточного матрикса, полученного из питающих клеток. Эта среда дополнительно включает в себя аминокислоты, не относящиеся к незаменимым, антиоксидант и первый фактор роста, выбранный из группы, состоящей из нуклеозидов и соли пировиноградной кислоты. В заявке на патент США №2005/0244962 сообщает, что один из аспектов раскрытия представляет способ культивирования эмбриональных стволовых клеток приматов и что стволовые клетки в культивируют в культуре, по существу не содержащей эмбриональную сыворотку млекопитающих (предпочтительно также по существу не содержащей сыворотку любого животного) и при наличии фактора роста фибробластов, полученного из источника, отличного от просто питающего слоя фибробластов.
Международная заявка WO 2005/065354 раскрывает определенную, изотоническую культуральную среду, которая по существу не содержит питающих клеток и сыворотки, и содержит: базальную среду; bFGF; инсулин; и аскорбиновую кислоту в количествах, достаточных для поддержания роста по существу недифференцированных стволовых клеток млекопитающих. Подробнее, в международной заявке № WO 2005/086845, описан способ поддержания недифференцированной стволовой клетки, причем указанный способ включает воздействие на стволовую клетку представителем семейства белков трансформирующего ростового фактора-бета (TGF-β), представителем семейства белков фактора роста фибробластов (FGF) или никотинамидом (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клетки в недифференцированном состоянии в течение периода времени, достаточного для получения необходимого результата.
Плюрипотентные стволовые клетки можно высевать на соответствующий культуральный субстрат. В одном варианте осуществления соответствующий культуральный субстрат представляет собой компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, полученный из базальной мембраны или компонент, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с адгезивными молекулами. Подходящим культуральным субстратом является восстановленная базальная мембрана, которая продается под торговой маркой MATRIGEL™ (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). МАТРИГЕЛЬ™ представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель и образует восстановленную базальную мембрану.
В качестве альтернативы допустимо использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток данные компоненты могут включать в себя по отдельности или в различных комбинациях ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п.
Плюрипотентные стволовые клетки можно высевать на субстрат с соответствующим распределением и при наличии среды, поддерживающей выживаемость, размножение и сохранение желательных характеристик клеток. Все данные характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению при посеве и могут быть без труда определены специалистом в данной области. Подходящая культуральная среда может быть создана из следующих компонентов: модифицированная среда Дюльбекко по способу Игла (DMEM), которая продается под торговой маркой Gibco™ (часть №11965-092) от Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; модифицированная среда Дюльбекко по способу Игла нокаут (KO DMEM), которая продается под торговой маркой Gibco™ (часть №10829-018) от Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; базальная среда Хэма F12/50% DMEM; 200 мМ L-глютамин, который продается под торговой маркой Gibco™ (часть №15039-027) от Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; непервостепенный раствор аминокислоты, который продается под торговой маркой Gibco™ (часть №11140-050) от Life Technologies Corporation, Grand Island, NY; бета-меркаптоэтанол (часть № М7522), которые продает компания Sigma-Aldrich, Company, LLC, Saint Louis, MO; и фактор роста человеческого рекомбинантного базисного фибробласта (bFGF), которые продается под торговой маркой Gibco™ (часть №13256- 029) компании Life Technologies Corporation, Grand Island, NY.
Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток
По мере того как плюрипотентные клетки дифференцируются в бета-клетки, они дифференцируются через различные стадии, каждая из которых может быть охарактеризована присутствием или отсутствием определенных маркеров. Дифференцировка клеток на этих стадиях достигается путем создания специфических условий культивирования, в том числе присутствие или отсутствие определенных факторов, добавленных в культуральную среду. В целом, эта дифференцировка может задействовать дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в дефинитивные клетки энтодермы. Эти дефинитивные клетки энтодермы могут быть затем дифференцированы в клетки кишечной трубки, которые в свою очередь могут затем быть дифференцированы в клетки энтодермы передней кишки. Клетки энтодермы передней кишки могут быть дифференцированы в клетки-предшественники передней кишки поджелудочной железы, которые, в свою очередь, дифференцируются в клетки энтодермы поджелудочной железы, панкреатические эндокринные клетки-предшественники или и те, и другие. Эти клетки могут быть затем дифференцированы в клетки, продуцирующие гормоны поджелудочной железы (такие как бета-клетки). Это изобретение представляет разбитую на стадии дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в панкреатические эндокринные клетки путем культивирования клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, существующей внутри культуральных сосудов, частично заполненных субстратом, особенно культивирование клеток стадий 4-6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для эндокринных клеток поджелудочной железы
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или более из следующих маркеров: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81.
Примеры плюрипотентных стволовых клеток включают линию эмбриональных стволовых клеток человека H9 (код NIH: WA09), эмбриональные стволовые клетки человека линии H1 (код NIH: WA01), эмбриональные стволовые клетки человека линии H7 (код NIH: WA07), а также эмбриональные стволовые клетки человека линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также подходящими для применения являются клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 и TRA-1-81.
Также подходящими для применения в рамках настоящего изобретения являются клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии дефинитивной энтодермы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В альтернативном варианте осуществления клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцирования дефинитивной энтодермы, представляет собой мезэнтодермальную клетку. В альтернативном варианте осуществления клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцирования дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку дефинитивной энтодермы.
Также подходящими для применения в рамках настоящего изобретения являются клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии панкреатической энтодермы. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, представляют собой клетки панкреатической энтодермы, в которых экспрессия PDX1 и NKX6.1 значительно превышает экспрессию CDX2 и SOX2. В некоторых вариантах осуществления более тридцати процентов клеток экспрессируют PDX1 и NKX6.1 и менее тридцати процентов клеток экспрессируют CDX2 или SOX2, согласно измерениям FACS. Особенно пригодными являются клетки, в которых экспрессия PDX1 и NKX6.1 по меньшей мере в два раза превышает экспрессию CDX2 или SOX2.
Также подходящими для применения в рамках настоящего изобретения являются клетки с экспрессией по меньшей мере одного из маркеров, характерных для линии панкреатической эндокринной железы.. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. В одном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин, или панкреатический полипептид. В предпочтительном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка являются бета-клеткой, производящей инсулин.
В определенных вариантах осуществления для получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, применяется протокол, согласно которому процесс начинается с плюрипотентных стволовых клеток или индуцибельных плюрипотентных клеток, предпочтительно плюрипотентных стволовых клеток. Данный протокол включает следующие стадии:
Стадия 1: Плюрипотентные стволовые клетки, такие как эмбриональные стволовые клетки, полученные из культуры клеточных линий, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для дефинитивных энтодермальных клеток.
Стадия 2: Клетки, полученные на стадии 1, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки.
Стадия 3: Клетки, полученные на стадии 2, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки.
Стадия 4: Клетки, полученные на стадии 3, обрабатываются соответствующими факторами для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки. Клетки не в обязательном порядке культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в конце стадии 4.
Стадия 5: Клетки, полученные на стадии 4, обрабатываются соответствующими факторами и культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников.
Стадия 6: Клетки, полученные на стадии 5, обрабатываются соответствующими факторами и культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия для стимулирования дальнейшей дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток.
В то время как настоящее изобретение, в определенных вариантах осуществления, включает дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток (например, клеток, предшествующих стадии 1) в клетки стадии 6, изобретение также включает дифференцировку клеток, являющуюся результатом других промежуточных стадий, ведущую к стадии 6. В частности, изобретение включает дифференцировку клеток стадии 4-6. Более того, хотя процесс описан в отдельных стадиях, обработка, так же как и прогресс клеток через процесс дифференцировки, может быть как последовательным, так и непрерывным.
Стадия 1: Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы
Плюрипотентные стволовые клетки можно дифференцировать в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, с использованием любого способа, известного специалистам в данной области, или любого способа, предложенного в настоящем изобретении. Способы, пригодные для дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, обнародованы в: заявке на патент США №2007/0254359; заявке на патент США №2009/0170198; заявке на патент США №2009/0170198; заявке на патент США №2011/0091971; заявке на патент США №2010/0015711; заявке на патент США №2010/0015711; заявке на патент США №2012/0190111; заявке на патент США №2012/0190112; заявке на патент США №2012/0196365; заявке на патент США №20100015711; заявке на патент США №2012/0190111; заявке на патент США №2012/0190112; заявке на патент США №2012/0196365; заявке на патент США №20100015711; заявке на патент США №2012/0190111; заявке на патент США №2012/0190112; заявке на патент США №2012/0196365; предварительной заявке на патент США №61/076900; предварительной заявке на патент США №61/076908 и предварительной заявке на патент США №61/076915, которые полностью включены в настоящий документ путем ссылки, поскольку они относятся к плюрипотентным стволовым клеткам и дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы.
В одном из вариантов осуществления плюрипотентные стволовые клетки обрабатываются средой, обогащенной активином А и WNT3A для получения поколения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы. Обработка может задействовать контакт плюрипотентных стволовых клеток средой, содержащей от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 150 нг/мл, альтернативно от приблизительно 75 нг/мл до приблизительно 125 нг/мл, альтернативно около 100 нг/мл активина А. Обработка также может включать контакт клеток с от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 50 нг/мл, альтернативно от приблизительно 15 нг/мл до приблизительно 30 нг/мл, альтернативно приблизительно 20 нг/мл WNT3A. Плюрипотентные клетки могут культивировать на протяжении приблизительно двух-пяти дней, предпочтительно около трех дней, для обеспечения удобства их дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы. В одном из вариантов осуществления плюрипотентные клетки культивируются в присутствии активина А и WNT3A на протяжении одного дня, после чего культивирование продолжается в присутствии активина А (без присутствия WNT3A).
В другом варианте осуществления изобретения плюрипотентные стволовые клетки обрабатывают средой, обогащенной дифференцированным фактором роста 8 («GDF8») и ингибитором гликоген синтазы киназы-3 β («GSK3β») (таким как циклические анилино-пиридинотриазиновые композиции, раскрытые в заявке на патент США №2010/0015711, полностью включенной в данный документ путем ссылки) для стимулирования дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы. Предпочтительным ингибитором GSK3β является 14-проп-2-ен-1-ил-3,5,7,14,17,23,27-гептаазатетрацикло[19.3.1.1~2,6~.1~8,12~]гептакоза-1(25),2(27),3,5,8(26),9,11,21,23-нонаен-16-он, далее именуемый «Композиция MCX». Обработка может включать контакт плюрипотентных стволовых клеток со средой, обогащенной от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 150 нг/мл, альтернативно от приблизительно 75 нг/мл до приблизительно 125 нг/мл, альтернативно приблизительно 100 нг/мл GDF8. Обработка может также включать контакт клеток с от приблизительно 0,1 до 5 мкМ, альтернативно от приблизительно 0,5 до приблизительно 2,5 мкМ, предпочтительно примерно 1 мкМ композиции МСХ. Плюрипотентные клетки могут культивировать на протяжении приблизительно двух-пяти дней, предпочтительно приблизительно два-три дня, для обеспечения удобства их дифференцировки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы.
В одном из вариантов осуществления плюрипотентные клетки культивируются в присутствии GDF8 и композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 и более низкой концентрации композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 на протяжении одного дня в отсутствии композиции МСХ. В частности, клетки могут культивироваться в присутствии GDF8 и приблизительно 1мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 и примерно 0,1 мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 на протяжении одного дня в отсутствии композиции МСХ. В альтернативном варианте осуществления клетки могут культивироваться в присутствии GDF8 и приблизительно 1мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня, затем культивируются в присутствии GDF8 и примерно 0,1 мкМ композиции МСХ на протяжении одного дня.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, можно определить путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют данных маркеров. Таким образом, дифференцировка плюрипотентных клеток может быть обнаружена, когда клетки начинают экспрессировать маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы. Способы оценки экспрессии белковых маркеров и маркеров нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. Эти способы включают в себя количественную полимеразную цепную реакцию с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР), Нозерн-блот, гибридизацию in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., ред. 2001 г., дополнение)), а также иммунологические анализы (такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, - способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998 г.)).
Дополнительно, эффективность дифференцирования можно определить путем воздействия на обрабатываемую популяцию клеток веществом (таким как антитело), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный интересующими дифференцированными клетками.
Дифференцированные клетки в дальнейшем также могут быть очищены. Например, после обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов настоящего изобретения дифференцированные клетки можно очистить путем воздействия на обрабатываемую популяцию клеток веществом (таким как антитело), специфически распознающим белковый маркер, характерно экспрессируемый очищенными дифференцированными клетками.
Стадия 2: Дифференцирование клеток экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток дефинитивной эндодермы, могут далее дифференцироваться в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки. В одном из вариантов осуществления формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, включает культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы со средой, содержащей фактор роста фибробластов («FGF»)7 или FGF10 для дифференцировки этих клеток. Например, культуральная среда может включать от приблизительно 25 нг/мл до приблизительно 75 нг/мл, альтернативно от приблизительно 30нг/мл до приблизительно 60 нг/мл, альтернативно приблизительно 50 нг/мл FGF7 или FGF10, предпочтительно FGF7. Клетки можно культивировать при этих условиях на протяжении двух-трех дней, предпочтительно примерно два дня.
В другом варианте осуществления дифференцировка в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, включает культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток дефинитивной энтодермы, с FGF7 или FGF10 и аскорбиновой кислотой (витамином С). Культуральная среда может содержать от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 0,5 мМ аскорбиновой кислоты, альтернативно от приблизительно 0,2 мМ до приблизительно 0,4 мМ, альтернативно приблизительно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты. Культуральная среда также может включать от приблизительно 10 нг/мл до приблизительно 35 нг/мл, альтернативно от приблизительно 15нг/мл до приблизительно 30 нг/мл, альтернативно приблизительно 25 нг/мл FGF7 или FGF10, предпочтительно FGF7. Например, культуральная среда может содержать приблизительно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и приблизительно 25 нг/мл FGF7. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 1 обрабатываются FGF7 и аскорбиновой кислотой на протяжении 2 дней.
Стадия 3: Дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток кишечной трубки, могут далее дифференцироваться в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки. В одном из вариантов осуществления, клетки стадии 2 далее дифференцируются в клетки стадии 3 путем культивирования этих клеток в культуральной среде, обогащенной сглаженным ингибитором рецепторов («SMO») (таким «MRT10» (N-[[[3-бензойламино)фенил]амино]тиоксометил]-3,4,5-триметоксибензамид)) или Sonic Hedgehog («SHH») антагонистом, сигнализирующим о траектории (таким как сглаженный антагонист 1 («SANT-1») ((Е)-4-бензил-N-((3,5-диметил-l-фенил-lH-пиразол-4-ил)метилен-пиперазин-l-амин)), Hedgehog ингибитор траектории 1 («HPI-l) (2-метоксиэтил 1,4,5,6,7,8-гексагидро-4-(3-гидроксифенил)-7-(2-метоксифенил)-2-метил-5-оксо-3-хинолдинкарбоксилат), ретиноевой кислотой и Noggin. Альтернативно, клетки стадии 2 могут быть дифференцированы в клетки стадии 3 путем культивирования этих клеток в культуральной среде, дополненной SMO ингибитором рецептора, SHH, сигнализирующим о траектории антагонистом, ретиноевой кислотой и Noggin. Клетки можно культивировать на протяжении приблизительно двух-четырех дней, предпочтительно примерно два дня. В одном из вариантов осуществления среда обогащена от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 0,3 мкМ SANT-1, от приблизительно 0,5 мкМ до приблизительно 3 мкМ ретиноевой кислоты и от приблизительно 75 нг/мл до приблизительно 125 нг/мл Noggin. В другом варианте осуществления среда обогащена приблизительно 0,25 мкМ SANT-1, приблизительно 2 мкМ ретиноевой кислоты и приблизительно 100 нг/мл Noggin.
В альтернативном варианте осуществления, клетки стадии 2 далее дифференцируются в клетки стадии 3 путем обработки клеток стадии 2 средой, обогащенной FGF7 или FGF10, ретиноевой кислотой, ингибитором SMO (таким как MRT10 или циклопамин), или антагонистом, сигнализирующим о траектории, SHH (таким как SANT-1 или HPI-1), активатором протеинкиназы С («РКС») (таким как ((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(трифторометил)фенил)-2,4-пентадиенойламино)бензолактам) («ТРВ»); EMD Chemicals Inc., Gibbstown NJ), форбол-12,13-дибутират («PDBu»), форбол-12-миристат-13-ацетат («PMA») или индолактам V («ILV»), ингибитором морфогенического белка кости («BMP») (таким как LDN-193189, Noggin или Chordin) и аскорбиновой кислотой. В другом варианте осуществления среда может быть обогащена FGF7 или FGF10, ретиноевой кислотой, ингибитором SMO, SHH антагонистом, сигнализирующим о траектории (таким как SANT-1), активатором РКС (таким как ТРВ), ингибитором ВМР (таким как LDN-193189), и аскорбиновой кислотой. Клетки могут культивироваться в присутствии этих факторов роста, низкомолекулярных антагонистов и антагонистов на протяжении приблизительно двух-четырех дней, предпочтительно около двух-трех дней.
В одном из вариантов осуществления среда обогащена от приблизительно 15 нг/мл до приблизительно 35 нг/мл FGF7, от приблизительно 0,5 мкМ до приблизительно 2 мкМ ретиноевой кислоты, от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 0,4 мкМ SANT-1, от приблизительно 100 нМ до приблизительно 300 нМ ТРВ, от приблизительно 50 нМ до приблизительно 200 нМ LDN-193189 и от приблизительно 0,15 мкМ до приблизительно 0,35 мкМ аскорбиновой кислоты. В другом варианте осуществления среда обогащена приблизительно 25 нг/мл FGF7, приблизительно 1 мкМ ретиноевой кислоты, приблизительно 0,25 мкМ SANT-1, приблизительно 200 нМ ТРВ, приблизительно 100 нМ LDN-193189 и приблизительно 0,25 мкМ аскорбиновой кислоты.
Получение клеток стадии 4-6 путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Хотя настоящее изобретение рассматривает культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на всех стадиях пути от плюрипотентной клетки до панкреатической эндокринной клетки, изобретение предпочтительно представляет формирование клеток стадии 1-3 в погруженной культуре, и клеток стадии 4-6 путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение представляет пошаговый способ дифференцировки плюрипотентных клеток, включающий культивирование во время стадий 4-6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В определенных вариантах осуществления клетки могут культивироваться в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на всем протяжении стадий 4-6. В других вариантах осуществления, только на поздней стадии 4 по стадию 6, или только стадии 5-6, или только стадии 4-5, или только стадии 4-6 включают культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
2
2
2
2
2
2
Когда клетки культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия (воздушно-жидкостной зоне взаимодействия), клетки могут культивироваться на пористом субстрате, так что клетки находятся в контакте с воздухом сверху и с культуральной средой внизу. Например, достаточный объем среды может быть добавлен снизу культурального сосуда, содержащего пористый субстрат (например, вкладыш фильтра), так что среда контактирует с нижней поверхностью клеток, расположенных на субстрате, но не инкапсулирует и не покрывает их. Подходящие пористые субстраты могут быть сформированы из любого материала, который не окажет отрицательного влияния на рост и дифференцировку клеток. Примеры пористых субстратов изготовлены из полимеров, таких как полиэтилен терефталат (РЕТ), полиэфир или поликарбонат. Подходящие пористые субстраты могут обладать или не обладать покрытием. В одном из вариантов осуществления пористый субстрат может быть покрыт MATRIGEL™. В одном из вариантов осуществления изобретения пористым субстратом является пористый вкладыш фильтра, который может быть покрыт MATRIGEL™. Предпочтительно, однако, чтобы пористым субстратом являлся вкладыш фильтра без покрытия. Пористость субстрата должна быть достаточной для поддержания жизнеспособности клетки и стимуляции дифференцировки клеток. Подходящие субстраты включают фильтрующие вкладыши, обладающие размером пор от около 0,3 до около 3,0 мкм, от около 0,3 до около 2,0 мкм, от около 0,3 до около 1,0 мкм, от около 0,3 до около 0,8 мкм, от около 0,3 до около 0,6 мкм, от около 0,3 до около 0,5 мкм, от около 0,5 до около 3,0 мкм, от около 0,6 до около 3,0 мкм, от около 0,8 до около 3,0 мкм, от около 1,0 до около 3,0 мкм, от около 2,0 мкм до 3,0 мкм, предпочтительно около 0,4 мкм, и плотностью пор от около 50 до около 120 миллионов пор/см, от около 60 до около 110 миллионов пор/см, от около 70 до около 100 миллионов пор/см, предпочтительно от 80 до 100 миллионов пор/см, от около 90 до около 100 миллионов пор/см, более предпочтительно около 100 миллионов пор/см
Среду следует заменять или освежать ежедневно или через день. Клетки, выросшие на верхней части пористого субстрата, как правило, не являются одиночными клетками, скорее они формируют лист или существуют в агрегатном кластере клеток. Клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, могут испытывать значительно большее воздействие кислорода по сравнению с клетками, погруженными в среду.
Настоящее изобретение таким образом включает получение клеток стадий 4-6, предпочтительно клеток стадий 5-6, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Клетки стадии 4 могут быть культивированы полностью в планарных культурах, полностью в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, или клетки могут культивироваться в погруженной планарной культуре во время ранней части стадии 4, а затем культивироваться в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия во время поздней части стадии 4. Эти клетки могут быть получены путем дифференцировки плюрипотентных столовых клеток или путем дальнейшей дифференцировки клеток стадий 3, 4 или 5, полученный иными путями.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, предпочтительно бета-клеток, из плюрипотентных стволовых клеток, включающий культивирование плюрипотентных стволовых клеток, дифференцировку плюрипотентных в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки; и дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных/бета-клеток, путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, предпочтительно бета-клеток, из плюрипотентных стволовых клеток, включающий культивирование плюрипотентных стволовых клеток, дифференцировку плюрипотентных в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки; и дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Способ может включать обработку средой, обогащенной трииодотиронином (Т3), тироксином (Т4), аналогов Т3 или Т4 или их сочетаний (общее название здесь и далее «Т3/Т4», или ингибитором активина рецептороподобной киназы («ALK») 5, или одновременно Т3/Т4 и ингибитором ALK5. Пригодные для применения аналоги гормонов щитовидной железы могут включать: GC-1 (Собертиром), доступный от R & D Systems, Inc. кат. №4554; DITPA (3,5-дииодотиропропионовоая кислота); КВ-141, обсуждаемый в J. Steroid Biochem. Мол. Biol. 2008, 111; 262-267 и Proc. Natl. Acad. Sci. США 2003, 100: 10067-10072; MB07344, обсужденный в Proc. Natl. Acad. Sci. США 2007, 104: 15490-15495; T0681, обсужденный в PLoS One, 2010, 5e8722 и J. Lipid Res. 2009, 50; 938-944; и GC-24, обсужденный в PLoS One, 2010, e8722 и Endocr. Pract. 2012; 18(6): 954-964, содержание которого полностью включено в настоящий документ. Пригодные ALK5 ингибиторы включают: ALK5 ингибитор II (Enzo, Farmingdale, NY); ALK5i (Axxora, San Diego, CA); SD208 (R & D systems (MN)); TGF-B ингибитор SB431542 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); ITD-1 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); LY2109761 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); A83-01 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); LY2157299 (Xcess Biosciences (San Diego, CA)); TGF-β рецептор ингибитор V (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор I (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор IV (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор VII (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор VIII (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор II (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор VI (EMD Chemicals, Gibstown, NJ); TGF-β рецептор ингибитор III (EMD Chemicals, Gibstown, NJ). Способ может включать дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем обработки культуральной средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5, и культивированием в планарной культуре. Способ может также включать дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для бета-клеток, путем обработки культуральной средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5, или обоими, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В одном из вариантов осуществления способ включает обработку средой, обогащенной Т3/Т4 и ингибитором ALK5. В другом варианте осуществления способ включает обработку клеток стадии 3 средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5. Способ также может включать обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, средой, обогащенной Т3/Т4 и ингибитором ALK5.
Одним из вариантов осуществления изобретения является способ формирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для бета-клеток, включая дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для бета-клеток, путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии β-клеток, экспрессирует инсулин и по меньшей мере один из следующих факторов транскрипции: PDX1, NKX2.2, NKX6.1, NeuroD1, 1SL1, HNF3β, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном из вариантов осуществления способы изобретения приводят к формированию клеток, которые положительны для NKX6.1, PDX1 и НВ9. Соответственно, изобретение представляет способ индуцирования экспрессии PDX1, NKX6.1 и НВ9 в человеческих клетках путем культивирования панкреатических энтодермальных клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в условиях, достаточных для индуцирования такой экспрессии. Изобретение также представляет способ индуцирования экспрессии PDX1, NKX6.1 и NGN3 в человеческих клетках путем культивирования панкреатических энтодермальных клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Способ может включать обработку средой, обогащенной Т3, ALK5, или обоими. Таким образом, в одном из вариантов осуществления, среда может быть обогащена Т3, в то время как в другом варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором ALK5. В другом варианте осуществления среда может быть обогащена как T3, так и ингибитором ALK5. Клетки стадии 6 могут быть клетками, положительными для NKX6.1, PDX1 и НВ9. В других вариантах осуществления клетки стадии 6 являются положительными для одного гормона. Например, клетки стадии 6 могут быть клетками, которые (а) соэкспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А или (b) соэкспрессируют NKX6.1 и инсулин.
6
7
2
6
7
2
6
7
2
6
7
2
6
7
2
7
7
2
7
7
2
7
7
2
7
7
2
7
7
2
7
7
2
6
7
2
6
7
2
6
7
2
6
7
2
6
6
2
6
6
2
6
6
2
6
6
2
6
7
2
6
7
2
6
7
2
7
2
Культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия включает посев клеток на пористый субстрат, такой как пористый вкладыш фильтра. В определенных вариантах осуществления размер пор в субстрате может быть от примерно 0,4 до примерно 3 микрон, или любого другого размера, упомянутого в настоящем документе. Посев может быть выполнен путем выделения отдельных клеток или кластеров клеток из однослойных культур в суспензию и затем аликвотирования клеточной суспензии на пористый субстрат, помещенный в воздушно-жидкостную зону взаимодействия. Клетки могут быть посеяны на пористый субстрат из суспензии, содержащей от около 1000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 90,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 80,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 70,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 60,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 50,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 40,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 30,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 20,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 10,000 клеток/мкл, от около 1000 клеток/мкл до около 5000 клеток/мкл, от около 5000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 10,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 20,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 30,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 40,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 50,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 60,000 клеток/мкл до около 100,000 клеток/мкл, от около 20,000 клеток/мкл до около 80,000 клеток/мкл, от около 30,000 клеток/мкл до около 70,000 клеток/мкл, от около 40,000 клеток/мкл до около 60,000 клеток/мкл, предпочтительно около 50,000 клеток/мкл. Клетки могут быть посеяны в виде капель клеточной суспензии, содержащих отдельные клетки или скопления клеток. Полученный клеточный депозит может содержать от около 5×10 до около 5×10 клеток/см, от около 6×10 до около 5×10 клеток/см, от около 7×10 до около 5×10 клеток/см,от около 8×10 до около 5×10 клеток/см,от около 9×10 до около 5×10 клеток/см, от около 1×10 до около 5×10 клеток/см,от около 2×10 до около 5×10 клеток/см, от около 2×10 до около 5×10 клеток/см, от около 3×10 до около 5×10 клеток/см, от около 3×10 до около 5×10 клеток/см, от около 4×10 до около 5×10 клеток/см, от около 5×10 до около 4×10 клеток/см, от около 5×10 до около 3×10 клеток/см, от около 5×10 до около 2×10 клеток/см, от около 5×10 до около 1×10 клеток/см, от около 5×10 до около 9×10 клеток/см, от около 5×10 до около 8×10 клеток/см, от около 5×10 до около 7×10 клеток/см, от около 5×10 до около 6×10 клеток/см, от около 7×10 до около 4×10 клеток/см, от около 8×10 до около 3×10клеток/см, от около 9×10 до около 2×10 клеток/см, предпочтительно порядка около 1×10 клеток/см.
В одном варианте осуществления изобретение относится к способу повышения экспрессии белка НВ9 путем культивирования и дифференцировки популяции панкреатических энтодермальных клеток-предшественников, со-положительных для PDX1 и NKX6.1, в панкреатические эндокринные клетки, со-положительные для PDX1 и NKX6.1 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на пористом субстрате. Альтернативно, экспрессия белка НВ9 может быть понижена путем культивирования и дифференцировки популяции энтодермальных клеток передней кишки, состоящей первоначально из клеток, положительных для PDX1, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В некоторых вариантах осуществления популяцию клеток панкреатической энтодермы получают путем поэтапной дифференцировки плюрипотентных клеток, по меньшей мере частично, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В другом варианте осуществления изобретение представляет способ повышения количества клеток, положительных для одного гормона (например, клеток, которые со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин, или клетки, которые производят NKX6.1 и хромогранин-А), путем культивирования и дифференцировки популяции клеток, со-экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В другом варианте осуществления панкреатические энтодермальные клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, затем дифференцируются в панкреатические эндокринные клетки путем обработки составом, выбранным из следующих: ингибитор ALK5, ингибитором ВМР, ингибитор гамма-секретазы, Эфрин лиганды, ингибитор EphB, ингибитор РКС, ингибитор EGFr, ретиноевая кислота, витамин С Т3/Т4, глюкоза, регуляторы клеточного цикла, регуляторы WNT, ингибитор SHH или сочетание вышеперечисленного.
В другом варианте осуществления панкреатические энтодермальные клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, затем дифференцируются в панкреатические эндокринные клетки-предшественники и клетки, экспрессирующие гормоны поджелудочной железы. В альтернативном варианте осуществления изобретение включает клетки, подготовленные способами настоящего изобретения, которые экспрессируют инсулин, но не NKX6.1. В некоторых вариантах осуществления популяция панкреатической энтодермальной клеточной линии, полученная в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, трансплантируется в животное, больное диабетом, для дальнейшего созревания in vivo до функциональных панкреатических эндокринных клеток.
Стадия 4: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки
В одном из вариантов осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 3 дифференцировочной средой, содержащей ростовую среду, обогащенную одним или несколькими компонентами из следующих: а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из ингибитор TGF-β рецептора V, ингибитор TGF-β рецептора I, ингибитор TGF-β рецептора IV, ингибитор TGF-β рецептора VII, ингибитор TGF-β рецептора VIII, ингибитор TGF-β рецептора II, ингибитор TGF-β рецептора VI, ингибитор TGF-β рецептора III, ингибитор TGF-B SB431542, SD208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитор ALK5i и ALK5 II; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из T3, T4, аналогов T3, аналогов T4 и их сочетаний; (c) сглаженный ингибитор рецептора, выбранный из MRT10 или циклопамина; (d) SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранный из SANT-1 или HPI-1; (e) ингибитор BMP рецептора, выбранный из LDN-193189, Noggin или Chordin; (f) активатор PKC, выбранный из TPB, PDBu, PMA, и ILV; (g) фактор роста фибробластов, выбранный из FGF7 или FGF10; (h) ретиноевая кислота; (i) аскорбиновая кислота; (j) гепарин; и (k) сульфат цинка. Например, ростовая среда, такая как MCDB131 или BLAR, может быть обогащена ингибитором SMO (таким как MRT10 или циклопамин), или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории (например, SANT-1 или HPI-1), ингибитором ВМР (например, LDN-193189, Noggin или Chordin), аскорбиновой кислотой и активатором РКС (таким как TPB, PDBu, PMA или ILV) для обеспечения полезной среды для дифференцировки. Культивирование клеток стадии 3 в такой среде на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно около трех дней, как правило, достаточно для дифференцировки клеток стадии 3 в клетки стадии 4. В другом варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. В предпочтительном варианте осуществления клетки стадии 3 могут быть обработаны средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1; примерно 100 нМ ретиноевой кислоты; примерно 2 нг/мл FGF7; примерно 100 нМ LDN-193189; и примерно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и примерно около 100 нМ ТРВ, на протяжении трех дней. В другом варианте осуществления среда далее обогащена Т3, к примеру, от около 5 нМ до около 25 нМ, альтернативно около 10 нМ Т3.
На стадии 4 клетки могу культивироваться в планарной культуре или в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В частности, настоящее изобретение представляет клеточную культуру в условиях in vitro для дифференцировки клеток, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, включающую: (а) культуральный сосуд; (b) объем ростовой среды внутри указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух внутри указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, дополняя указанную среду; (d) пористый субстрат, расположенный в зоне взаимодействия между указанной средой и указанным воздухом; и (е) клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные на поверхности указанного субстрата таким образом, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток. Альтернативно, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для энтодермальных клеток передней кишки, могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки путем обработки средой, обогащенной, как описано выше, в планарной культуре.
В последующем варианте воплощения, клетки в конце стадии 4 могут быть обработано ингибитором Rho-ассоциированной киназы («ROCK»), таким как Y27632 ((1R,4r)-4-((R)-1-аминоэтил)-N-(пиридин-4-ил)цикоргексанкарбоксамид), GSK269962 (N-[3-[[2-(4-амино-1,2,5-оксадиазол-3?-ил)-1-этил-1H-имидазо[4,5-c]пиридин-6-ил]окси]фенил]-4-[2-(4-морфолинил)этокси]бензамид), H1152 ((S)-(+)-2-метил-1-[(4-метил-5-изохинолинил)сульфонил]гомопиперазин, 2HCl,) и, SR3677 (N-[2-[2-(диметиламино)этокси]-4-(1H-пиразол-4-ил)фенил-2,3-дигидро-1,4-бензодиоксин-2-карбоксамид дигидрохлорид). В определенных вариантах осуществления может быть использовано около 10 мкМ ингибитора ROCK.
В определенных вариантах осуществления в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия культивируются только клетки поздней стадии 4. В одном из вариантов осуществления в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия культивируются только клетки поздней стадии 4, обработанные ингибитором ROCK. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть обработаны клеткоотделяющим раствором, например, раствором, содержащим протеолитические и коллагенолитические ферменты, перед культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В альтернативном варианте осуществления клетки стадии 3 могут быть обработаны дифференцировочной средой, содержащей ростовую среду, обогащенную ингибитором ALK5, Noggin и РКС активатором (таким как ТРВ). В некоторых вариантах осуществления среда может быть обогащена около 0,1 мкМ ингибитора ALK5, около 100 нг/мл Noggin и около 500 нМ ТРВ. Клеточная культура может быть в однослойном формате. Обработка может длиться около полных трех дней. В определенных вариантах осуществления клетки могут обрабатываться на протяжении двух дней, а затем в последний день клетки могут быть обработаны протеолитическими ферментами, коллагенолитическими ферментами или и теми и другими, такими как диспаза, и разбиты на клеточные кластеры диаметром менее чем 100 микрон, а затем культивированы в присутствии ингибитора ALK5 и LDN-193189. В определенных вариантах осуществления клеточные кластеры с диаметром меньшем, чем около 100 микрон, могут культивироваться в среде, обогащенной около 200 нМ ингибитора ALK5 и около 100 нМ LDN-193189.
Стадия 5: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников
В одном из вариантов осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 дифференцировочной средой, содержащей ростовую среду, обогащенную одним или несколькими компонентами из следующих: а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из ингибитор TGF-β рецептора V, ингибитор TGF-β рецептора I, ингибитор TGF-β рецептора IV, ингибитор TGF-β рецептора VII, ингибитор TGF-β рецептора VIII, ингибитор TGF-β рецептора II, ингибитор TGF-β рецептора VI, ингибитор TGF-β рецептора III, ингибитор TGF-B SB431542, SD208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитор ALK5i и ALK5 II; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из T3, T4, аналогов T3, аналогов T4 и их сочетаний; (c) сглаженный ингибитор рецептора, выбранный из MRT10 или циклопамина; (d) SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранный из SANT-1 или HPI-1; (e) ингибитор BMP рецептора, выбранный из LDN-193189, Noggin или Chordin; (f) активатор PKC, выбранный из TPB, PDBu, PMA, и ILV; (g) фактор роста фибробластов, выбранный из FGF7 или FGF10; (h) ретиноевая кислота; (i) аскорбиновая кислота; (j) гепарин; и (k) сульфат цинка, и культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно около трех дней, для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В другом варианте осуществления ростовая среда обогащена ингибитором SMO (таким как MRT10 или циклопамин) или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории (таким как SANT-1 или HPI-1), ретиноевой кислотой, Т3, аскорбиновой кислотой, ингибитором ВМР рецептора (таким как LDN-193189, Noggin или Chordin) и ингибитором ALK5. В другом варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной ингибитором SMO. SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ретиноевой кислотой, Т3, аскорбиновой кислотой, ингибитором рецептора ВМР и ингибитором ALK5, и культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно на протяжении трех дней, для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 4 дифференцируются в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, примерно 50нМ LDN-193189, примерно 10 нМ Т3 и примерно 1000 нМ ингибитора ALK5. В некоторых вариантах осуществления ингибитором ALK5 является SD208 (2-(5-хлоро-2-фторофенил)птеридин-4-ил]пиридин-4-ил-амин). В одном из вариантов осуществления среда обогащена около 1000 нМ SD208.
В другом варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной гепарином, ингибитором SMO или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ретиноевой кислотой, ингибитором рецептора ВМР и ингибитором ALK5, и культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно на протяжении трех дней, для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена как ингибитором SMO, так и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, вместе с ретиноевой кислотой, ингибитором рецептора ВМР и ингибитором ALK5.
4
4
4
Среда может также быть обогащена ZnSO. Например, может быть добавлено около 10 мкМ ZnSO. Таким образом, в одном из вариантов осуществления клетки стадии 4 могут дифференцироваться в клетки стадии 5 путем обработки клеток стадии 4 средой, обогащенной гепарином, ZnSO, ингибитором SMO или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ретиноевой кислотой, LDN-193189 и ингибитором ALK5 II. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 4 дифференцируются в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, обогащенной примерно 10 мкг/мл гепарина, примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 50 нМ LDN-193189, примерно 10нМ Т3 и примерно 1000 нМ ингибитора ALK5. Подходящие ингибиторы ALK5 включают, не ограничиваясь, SD208, ингибитор ALK5 II, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III и их сочетания.
В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ALK5-ингибитор II. В другом варианте осуществления использовано около 1000 нМ ингибитора ALK5. В альтернативно варианте осуществления клетки стадии 4 обрабатываются средой, обогащенной примерно 10 мкг/мл гепарина, примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 100 нМ LDN-193189 и примерно 10000 нМ ингибитора ALK5 II.
В другом варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной гепарином, ингибитором SMO или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ретиноевой кислотой и ингибитором ALK5, и культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении примерно двух дней для дифференцировки клеток в клетки стадии 5. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 4 дифференцируются в клетки стадии 5 путем обработки клеток средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 50 нМ LDN-193189 и примерно 1000 нМ ингибитора ALK5 (такого как SD208 или ингибитор ALK5 II). В определенных вариантах осуществления средой может быть MCDB-131 (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY).
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
Количество клеток, посеянных для культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, может варьировать. Например, для культивирования клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, капли клеточной суспензии, содержащие от около 2×10 клеток/мкл до около 6×10 клеток/мкл, 3×10 клеток/мкл до около 6×10 клеток/мкл, 4×10 клеток/мкл до около 6×10 клеток/мкл, 5×10 клеток/мкл до около 6×10 клеток/мкл, 2×10 клеток/мкл до около 5×10 клеток/мкл, 2×10 клеток/мкл до около 4×10 клеток/мкл, или около 3×10 клеток/мкл, могут быть посеяны на пористый субстрат, такой как фильтр, расположенный в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В некоторых вариантах осуществления капли клеточной суспензии, содержащие от около 0,5×10 клеток/мкл до около 0,75×10клеток/мкл, от около 0,6×10 клеток/мкл до около 0,75×10клеток/мкл, или от около 0,5×10 клеток/мкл до около 0,6×10клеток/мкл высеваются на пористый субстрат для культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В другом варианте осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 4 средой, обогащенной ингибитором рецептора ВМР (например, LDN-193189, Noggin или Chordin) и ингибитором ALK5, на протяжении примерно одного дня для дифференцировки клеток стадии 4 в клетки стадии 5. Например, среда может быть обогащена примерно 100 нМ LDN-193189 и примерно 200 нМ ингибитора ALK5. Предпочтительно этот вариант осуществления также включает предварительную обработку клеток диспазой. Клетки могут быть сформированы в кластеры. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть обработаны клеткоотделяющим раствором, например, раствором, содержащим протеолитические и коллагенолитические ферменты, перед культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 4, полученные согласно вариантам осуществления изобретения используются и дифференцируются в клетки стадии 5, в то время как в других вариантах осуществления могут использоваться клетки 4, полученные в соответствии с другими протоколами.
В соответствии с последующим способом, изобретение также представляет клеточную культуру для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников, включающую: (а) культуральный сосуд; (b) объем ростовой среды внутри указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух внутри указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, дополняя указанную среду; (d) пористый субстрат, расположенный в зоне взаимодействия между указанной средой и указанным воздухом; и (е) клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные на поверхности указанного субстрата таким образом, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток.
В определенных вариантах осуществления культивирование клеток на стадии 5 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия может улучшить экспрессию гормонов поджелудочной железы. Соответственно, изобретение также представляет способы повышения экспрессии гормонов поджелудочной железы путем культивирования клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В некоторых вариантах осуществления клетки на стадии 5 могут быть обработаны согласно приведенному описанию и в таблицах VIII-XIII ниже. В определенных вариантах осуществления способ также моет понизить экспрессию PTF1a, SOX9, CDX2 (маркер кишечника), ZIC1 (маркер эктодермы) и SOX2 (фронтальный маркер энтодермы).
В одном из вариантов осуществления способ также включает дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических клеток-предшественников передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, путем обработки культуральной средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5, или обоими, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Стадия 6: Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток
В одном из вариантов осуществления способы изобретения включают обработку клеток стадии 5 дифференцировочной средой, содержащей ростовую среду, обогащенную одним или несколькими компонентами из следующих: а) ингибитор ALK5, выбранный из группы, состоящей из ингибитор TGF-β рецептора V, ингибитор TGF-β рецептора I, ингибитор TGF-β рецептора IV, ингибитор TGF-β рецептора VII, ингибитор TGF-β рецептора VIII, ингибитор TGF-β рецептора II, ингибитор TGF-β рецептора VI, ингибитор TGF-β рецептора III, ингибитор TGF-B SB431542, SD208, ITD-1, LY2109761, A83-01, LY2157299, ингибитор ALK5i и ALK5 II; (b) гормон щитовидной железы, выбранный из группы, состоящей из T3, T4, аналогов T3, аналогов T4 и их сочетаний; (c) сглаженный ингибитор рецептора, выбранный из MRT10 или циклопамина; (d) SHH антагонист, сигнализирующий о траектории, выбранный из SANT-1 или HPI-1; (e) ингибитор BMP рецептора, выбранный из LDN-193189, Noggin или Chordin; (f) активатор PKC, выбранный из TPB, PDBu, PMA, и ILV; (g) фактор роста фибробластов, выбранный из FGF7 или FGF10; (h) ретиноевая кислота; (i) аскорбиновая кислота; (j) гепарин; и (k) сульфат цинка, и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении двух-четырех дней, предпочтительно около трех дней, для дифференцировки клеток стадии 5 в клетки стадии 6. В одном из вариантов осуществления ростовая среда обогащена ингибитором SMO (таким как MRT10 или циклопамин) или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории (таким как SANT-1 или HPI-1), ретиноевой кислотой, аскорбиновой кислотой, Т3/Т4 и ингибитором ALK5. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. Клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, примерно 500 мМ ингибитора ALK5 и 0,1 нМ T3, на протяжении трех дней. Альтернативно, клетки стадии 5 можно дифференцировать в клетки стадии 6 путем обработки клеток средой, обогащенной примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 50 нМ ретиноевой кислоты, примерно 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, примерно 500 нМ ингибитора ALK5 и 10 нМ T3, на протяжении трех дней. Клетки могут культивироваться в подобной среде на протяжении дополнительных двух дней, или более, если это желательно.
Альтернативно, клетки стадии 5 могут быть дифференцированы в стадию 6 путем обработки средой, обогащенной гепарином, SMO ингибитором или SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории, ингибитором ВРМ, Т3/Т4 и ингибитором ALK5, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении шести-четырнадцати дней, альтернативно около 6 дней, альтернативно около 7 дней, альтернативно около 8 дней, альтернативно около 9 дней, альтернативно около 10 дней, альтернативно около 11 дней, альтернативно около 12 дней, альтернативно около 13 дней и альтернативно около 14 дней. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. Например, клетки могут культивироваться в среде, обогащенной около 10 мкг/мл гепарина, около 0,25 мкМ SANT-1, около 100 нМ LDN-193189, около 1000 нМ T3 и от около 500 до около 10,000 нМ, от около 1000 до около 10,000 нМ, от около 5000 до около 10,000 нМ, от около 600 до около 5000 нМ, от около 700 до около 5000 нМ, от около 800 до около 5000 нМ, от около 900 до около 5000 нМ, от около 1000 нМ до около 5000 нМ, от около 600 до около 1000 нМ, от около 700 до около 1000 нМ, от около 800 до около 1000 нМ, от около 600 до около 1200 нМ, от около 700 до около 1200 нМ, от около 800 до около 1200 нМ, от около 900 до около 1200 нМ, альтернативно около 500 нМ, альтернативно около 1000 мМ, и альтернативно около 10,000 нМ ингибитора ALK5.
Подходящие ингибиторы ALK5 включают, не ограничиваясь, SD208, ингибитор ALK5 II, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III и их сочетания.
В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ALK5-ингибитор II. В другом варианте осуществления использовано около 1000 нМ ингибитора ALK5. Соответственно, в одном из вариантов осуществления клетки стадии 5 могут быть дифференцированы в клетки стадии 6 путем обработки средой, обогащенной гепарином, ингибитора SMO или SHH антагонистом, сигнализирующим о траектории, ингибитором ВМР, Т3/Т4 и ингибитором ALK5, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении примерно шести дней. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории. В некоторых вариантах осуществления клетки могут быть обработаны клеткоотделяющим раствором, например, раствором, содержащим протеолитические и коллагенолитические ферменты, перед культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
4
4
В другом варианте осуществления клетки стадии 5 могут быть дифференцированы в клетки стадии 6 путем обработки средой, обогащенной гепарином, SMO ингибитором или SHH антагонистом, сигнализирующим о траектории, ингибитором ВМР, T3, и ингибитором ALK5 II, и культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении от около 5 дней до около 15 дней, от около 6 дней до около 14 дней, от около 7 дней до около 13 дней, от около 8 дней до около 12 дней, от около 9 дней до около 11 дней, от около 5 дней до около 10 дней, от около 10 дней до около 15 дней, альтернативно около 5 дней, альтернативно около 6 дней, альтернативно около 7 дней, альтернативно около 8 дней, альтернативно около 9 дней, альтернативно около 10 дней, альтернативно около 11 дней, альтернативно около 12 дней, альтернативно около 13 дней, альтернативно около 14 дней, альтернативно около 15 дней. В одном из вариантов осуществления клетки культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении 5 дней или более. 6 дней или более, 7 дней или более, 8 дней или более, 9 дней или более, 10 дней или более, 11 дней или более, 12 дней или более, 13 дней или более, 14 дней или более, 15 дней или более. В одном из вариантов осуществления клетки культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на протяжении 15 дней или менее, 14 дней или менее, 13 дней или менее, 12 дней или менее, 11 дней или менее, 10 дней или менее, 9 дней или менее, 8 дней или менее, 7 дней или менее, 6 дней или менее, 5 дней или менее. В одном варианте осуществления клетки культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в течение приблизительно 10 дней. В другом варианте осуществления клетки культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в течение приблизительно 11 дней. В альтернативном варианте осуществления клетки культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в течение приблизительно 12 дней. В еще одном варианте осуществления клетки культивируют в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в течение приблизительно 15 дней. В этих вариантах осуществления среда может быть обогащена примерно 10 мкг/мл гепарина, примерно 0,25 мкМ SANT-1, примерно 100 нМ LDN-193189, примерно 1000 нМ T3 и примерно 10000 нМ ингибитора ALK5 II. В некоторых вариантах осуществления среда может быть также обогащена сульфатом цинка (ZnSO). Например, среда может быть обогащена 10 мкМ ZnSO. В альтернативном варианте осуществления среда может быть обогащена ингибитором SMO и SHH антагонистом, сигнализирующем о траектории.
В соответствии с последующим способом, изобретение также представляет клеточную культуру для дифференцировки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, включающую: (а) культуральный сосуд; (b) объем ростовой среды внутри указанного сосуда, достаточный для заполнения только части объема указанного сосуда; (с) воздух внутри указанного сосуда, который заполняет часть указанного сосуда, дополняя указанную среду; (d) пористый субстрат, расположенный в зоне взаимодействия между указанной средой и указанным воздухом; и (е) клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатических энтодермальных/панкреатических эндокринных клеток-предшественников, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, расположенные на поверхности указанного субстрата таким образом, что указанная среда контактирует только с частью поверхности указанных клеток.
В одном из вариантов осуществления клетки стадии 5, полученные согласно вариантам осуществления изобретения используются и дифференцируются в клетки стадии 6, в то время как в других вариантах осуществления могут использоваться клетки 5, полученные в соответствии с другими протоколами.
В другом варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 6, который являются положительными для одного гормона. Таким образом, способы изобретения приводят к получению клеток стадии 6, которые со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А. В другом варианте осуществления способы изобретения приводят к получению клеток стадии 6, которые со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
В определенных вариантах осуществления изобретения способ использует среду BLAR (см. таблицу II) на стадиях 4-6. Среда предпочтительно должна заменяться каждый день или альтернативно через день. В некоторых вариантах осуществления способы включают обработку клеток стадий 4-6 указанными компонентами в количествах, указанных в таблицах VIII-XIII настоящего документа.
В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения клеток стадии 6, со-экспрессирующих NKX6.1 и хромогранин-А, включающему культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на стадиях 4-6, предпочтительно стадиях 5-6. В еще одном варианте осуществления изобретение относится к способу получения клеток, положительных для одного гормона инсулина, экспрессирующих NKX6.1, путем культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на стадиях 4-6, предпочтительно стадиях 5-6.
Культивирование клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия во время или после стадии 4 может существенно улучшить экспрессию панкреатических энтодермальных маркеров вместе с маркерами, относящимися к эндокринным. Соответственно, изобретение представляет способ увеличения экспрессии панкреатических энтодермальных и относящихся к эндокринным маркеров путем культивирования клеток во время или после стадии 4 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
В другом варианте осуществления изобретение также представляет способы увеличения урожая положительных для NKX6.1 клеток, со-экспрессирующих инсулин, хромогранин-А и инсулин, путем культивирования клеток стадии 4 и последующих в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в присутствии ингибитора ALK5. В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ALK5-ингибитор II. Другие подходящие ингибиторы ALK5 включают, не ограничиваясь, ингибитора рецептора TGF-β V, TGF-β ингибитора рецептора I, ингибитора рецептора TGF-β IV, ингибитора рецептора TGF-β VII, ингибитора рецептора TGF-β VIII, ингибитора рецептора TGF-β II, ингибитора рецептора TGF-β VI, ингибитора рецептора TGF-β III и их сочетания. В некоторых вариантах осуществления, в дополнение к ингибитору ALK5, клетки могут быть обработаны, как описано в таблицах VIII-XIII ниже.
В одном из вариантов осуществления изобретение представляет способы увеличения урожая положительных для NKX6.1 клеток, со-экспрессирующих инсулин, хромогранин-А и инсулин, путем культивирования клеток стадии 5 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в присутствии ингибитора ALK5 II. В одном из вариантов осуществления способ также включает культивирование клеток во время стадии 5 в присутствии ингибитора ALK5 II и Т3.
Созревание клеток стадии 6 в условиях in vivo
В некоторых вариантах осуществления клетки стадии 6, подготовленные в соответствии с способами изобретения, могут в дальнейшем созревать в условиях in vivo. В одном из вариантов осуществления эти клетки могут дозревать путем трансплантации in vivo млекопитающему. Например, клетки могут быть трансплантированы под почечную капсулу мыши. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 6, которые дозревают в условиях in vivo, являются клетками, со-экспрессирующими NKX6.1 и инсулин. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 6, которые дозревают в условиях in vivo, являются клетками, со-экспрессирующими NKX6.1 и хромагранин. В альтернативном варианте осуществления созревание in vivo (а) клеток, со-экспрессирующих NKX6.1 и инсулин, или (b) клеток, со-экспрессирующих NKX6.1 и хромагранин, приводит к раннему получению С-пептида. В определенных вариантах осуществления уровень выработки С-пептида от трансплантации приблизительно 3 миллионов клеток стадии 6 равен количеству С-пептида, полученного от трансплантации приблизительно 3000 человеческих островков.
Культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия согласно способам, описанным в настоящем документе, также хорошо подходит для применения в скрининговых составах из-за их эффекта на секрецию панкреатических гормонов и эндокринных маркеров. В частности, клетки стадий 4-6, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, могут использоваться в различных культурных форматах, включая от 384 до 6- WELL(&) форматы, для оценки эффекта включения различных мелких молекул или биоединиц, в различных дозах и временных интервалах, оказываемого на последующую экспрессию маркеров панкреатических энтодермальных, панкреатических эндокринных и панкреатических бета-клеток. Такая оценка может быть выполнена путем измерения генной экспрессии с помощью ПЦР, белковой экспрессии путем FACS, иммуноокрашивания, или с помощью ELISA секреции факторов клетками, на которые воздействовало добавление низкомолекулярных компонентов или высокомолекулярных биологических препаратов.
Клетки, получаемые с помощью способов изобретения
Настоящее изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, которые можно получить способами настоящего изобретения. Настоящее изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, полученную способами настоящего изобретения.
Изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, предпочтительно экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, для которых характерна значительная со-экспрессия NKX6.1 и хромогранин-А. Изобретение также представляет инсулин-положительную клетку или популяцию инсулин-положительных клеток, предпочтительно экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатических эндокринных клеток, для которых характерна экспрессия NKX6.1 (не в обязательном порядке >30%). Эти популяции ранее не описаны, как объяснено в Примере 10.
Способы обработки
Изобретение представляет способы обработки. В частности, настоящее изобретение представляет способ лечения пациента, страдающего диабетом или подвергающегося риску развития данного заболевания.
Настоящее изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, которые можно получить или полученные способом настоящего изобретения для применения в способе лечения. В частности, настоящее изобретение также представляет клетку или популяцию клеток, которые можно получить или полученные способом настоящего изобретения для применения в способе лечения пациента, страдающего диабетом или подвергающегося риску развития данного заболевания.
Диабет может быть диабетом типа I или типа II.
В одном из вариантов осуществления способ лечения включает имплантацию клеток, которые получены или могут быть получены способом настоящего изобретения, пациенту.
В одном из вариантов осуществления способ лечения включает
дифференцировку плюрипотентных клеток in vitro в клетки стадии 1, стадии 2, стадии 3, стадии 4, стадии 5 или стадии 6, например, как описано в настоящем документе,
и имплантации дифференцированных клеток пациенту.
В одном из вариантов осуществления способ также содержит стадию культивирования плюрипотентных стволовых клеток, например как описано в настоящем документе, предшествующую стадии дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток.
В одном из вариантов осуществления способ также включает стадию дифференцировки клеток in vivo, после стадии имплантации.
В одном из вариантов осуществления пациент является млекопитающим, предпочтительно человеком.
В одном из вариантов осуществления клетки можно имплантировать в форме дисперсных клеток или клеток, образующих кластеры, которые можно вводить в воротную вену печени способом инфузии. Клетки можно альтернативно вводить в биосовместимые разлагающиеся полимерные опорные материалы, пористые неразлагающиеся устройства или в инкапсулированном виде для защиты от иммунного ответа организма-хозяина. Клетки можно имплантировать в подходящее место в организме реципиента. Места имплантации включают в себя, например, печень, естественную поджелудочную железу, пространство под почечной капсулой, сальник, брюшную полость, субсерозное пространство, кишечник, желудок или подкожный карман.
Для стимуляции дальнейшего дифференцирования, выживаемости или активности имплантированных клеток in vivo, до, одновременно с или после введения клеток можно вводить дополнительные факторы, такие как факторы роста, антиоксиданты или противовоспалительные вещества. Данные факторы могут секретироваться эндогенными клетками и воздействовать на внедренные клетки in situ. Дифференцирование имплантированных клеток можно индуцировать любой комбинацией эндогенных и введенных экзогенно факторов роста, известных в данной области.
Количество клеток, используемых при имплантации, зависит от ряда различных факторов, включая состояние пациента и его реакцию на лечение, и может быть определено специалистом в данной области.
В одном из вариантов осуществления способ лечения также включает встраивание клеток перед имплантацией в трехмерный опорный материал. Клетки можно поддерживать in vitro на данном опорном материале перед имплантацией пациенту. Опорный материал, содержащий клетки, альтернативно можно имплантировать непосредственно в организм пациента без дополнительного культивирования in vitro. В опорный материал может быть необязательно включено по меньшей мере одно фармацевтическое вещество, обеспечивающее выживаемость и функционирование трансплантированных клеток.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Культивирование панкреатических эндокринных клеток-предшественников в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример изучает и демонстрирует, что панкреатические эндокринные клетки-предшественники (клетки стадии 5) могут далее дозревать с помощью культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Для культивирования панкреатических эндокринных клеток-предшественников в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы в панкреатические эндокринные клетки-предшественники на основе протокола, описанного ниже.
5
2
Эмбриональные стволовые клетки человека линии H1 рассеивали как одиночные клетки при концентрации 1×10 клеток/см на чашки, покрытые MATRIGEL™ (разведение 1:30; BD Biosciences, штат Нью-Джерси), в среде MTESR1 (StemCell Technologies, г. Ванкувер, Канада) с добавлением 10 мкM Y27632 (Rock inhibitor, Catalog No. Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1: (3 дня): 60-70% конфлюэнтных прикрепленных к субстрату культур недифференцированных клеток Н1, размещенных на поверхностях, покрытых MATRIGEL, разведенным в соотношении 1:30, были помещены в среду GIBCO RPMI 1640 (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY), обогащенную 0,2% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (Hyclone, Utah), 100 нг/мл активина-A (AA; Pepro-tech; Rocky Hill, NJ), и 20 нг/мл Wnt3A (R&D Systems), только на один день. В течение последующих двух дней клетки культивировались в среде GIBCO RPMI с 0,5% FBS и 100 нг/мл АА.
b) Стадия 2: (3 дня): Клетки стадии 1 были затем помещены в среду Дюльбекко, модифицированную по способу Игла (DMEM-F12) (Life Technologies Corporation, NY), обогащенную 2% FBS и 50 нг/мл FGF7 (Pepro-tech) на три дня.
с) Стадия 3: (4 дня): Клетки стадии 2 затем культивировались на протяжении четырех дней в среде DMEM-HG (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY), обогащенной 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma-Aldrich; St. Louis, MO), 2 мкМ ретиноевой кислоты (Sigma-Aldrich), 100 нг/мл Noggin (R&D Systems), и 1% (об/об) добавки, которая продается под торговой маркой B27 (Life Technologies Corporation, Grand Island, NY (кат. №: 17504044).
d) Стадия 4: (3 дня): Клетки стадии 3 культивировались на протяжении трех дней в среде DMEM-HG, обогащенной 0,1 мкМ ингибитора ALK5 (ALK5i; Axxora, San Diego, CA), 100 нг/мл Noggin, 500 нМ ТРВ ((2S,5S)-(E,E)-8-(5-(4-(трифторометил)фенил)-2,4-пентадиенойламино)бензолактам; EMD Chemicals Inc., Gibbstown NJ) и 1% В27 в однослойном формате. Для последнего дня культивирования клетки были обработаны 5 мг/мл диспазы (Becton Dickinson, Bedford, MA, #354235) на протяжении 5 минут, после чего осторожно пипетированы для смешивания и разбивки на клеточные кластеры (<100 микрон). Клеточные кластеры были перенесены в одноразовые полистироловые центрифужные пробирки емкостью 125 мл (Corning) и вращались со скоростью 80-100 об/мин на протяжении ночи в суспензии со средой DMEM-HG, обогащенной 200 нМ ингибитора ALK5, 100 нМ LDN-193189 (Stemgent, CA) и 1% В27.
е) Стадия 5: (1 день): Клетки стадии 4 были обработаны 5 мг/мл диспазы на протяжении 5 минут, после чего осторожно пипетированы для смешивания и разбивки на клеточные кластеры (<100 микрон). Клеточные кластеры были перенесены в одноразовые полистироловые центрифужные пробирки емкостью 125 мл (Corning, NY) и вращались со скоростью 80-100 об/мин на протяжении ночи в суспензии со средой DMEM-HG, обогащенной 200 нМ ингибитора ALK5, 100 нМ LDN-193189 (Stemgent, CA), и 1% В27.
Кластеры стадии 5 день 1 были посеяны в пористые культуральные фильтровые вкладыши с диаметром пор 0,4 микрон (BD Biosciences, PET membranes, #353493) на 6-лунковые пластины (в 10 микролитров аликвот содержится ~1 миллион клеток) и культивировались на протяжении 3 недель в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия путем добавления 1,5 мл DMEM-HG + 1% B27 на дно вкладыша и без среды над ним. На Фиг. 1А-Н представлены фазовые контрастные образы кластеров на разных временных точках после посева в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. На Фиг. 2 А-К показаны результаты иммуноокрашивания для следующих белков через 1 неделю после посева клеточных кластеров на фильтры: DAPI (Фиг. 2A); инсулин (Фиг. 2B); HB9 (Фиг. 2С), DAPI (Фиг. 2D); глюкагон (Фиг. 2E); инсулин (Фиг. 2F); DAPI (Фиг. 2G); инсулин (Фиг. 2H); соматостатин (Фиг. 2I); NKX6.1 (Фиг. 2J); и инсулин (Фиг. 2K). В то время как на Фиг. 3А-Н показаны результаты иммуноокрашивания для следующих белков через 2 недели после посева на фильтры: инсулин (Фиг. 3А); глюкагон (Фиг. 3В); инсулин (Фиг. 3С); соматостатин (Фиг. 3D); инсулин (Фиг. 3Е), NKX6.1 (Фиг. 3F); HB9 (Фиг. 3G) и NKX6.1 (Фиг. 3Н). На Фиг. 2 панели A-C, D-F, G-I и J-K были взяты из того же поля. На Фиг. 3 панели А-В, С-D, E-F и G-H, соответственно, были взяты из того же поля. На Фиг. 4А-D показаны результаты иммуноокрашивания следующих протеинов через 3 недели после посева на фильтры: инсулин (Фиг. 4А; глюкагон (Фиг. 4В),; инсулин (Фиг. 4С) и соматостатин (Фиг. 4D). На Фиг. 4 панели А-В и С-D, соответственно, были взяты из того же поля.
образец
справочное
На стадии 4 и в последующих культурах мРНК была собрана для ПЦР анализа на релевантные панкреатические энтодермальные/ эндокринные гены. Общая РНК был экстрагирована с помощью RNeasy Mini Kit (Qiagen; Valencia, CA) и обратнотранскрибирована с помощью High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) в соответствии с инструкциями производителя. кДНК была усилена с помощью Taqman Universal Master Mix и Taqman Gene Expression Assays, которые были предварительно загружены в Taqman Arrays (Applied Biosystems). Данные были проанализированы с применением ПО Sequence Detection Software (Applied Biosystems) и нормализованы относительно недифференцированных эмбриональных стволовых клеток человека (hES) с помощью способа ΔΔCt (т.е. результаты ПЦР были откорректированы относительно внутренних контролей (ΔΔCt=ΔCt-ΔCt)). Все праймеры приобретали в Applied Biosystems. Цитометрия и иммунофлуоресцентный анализ были осуществлены в соответствии с предшествующим описанием (Diabetes, 61, 20126, 2012).
На Фиг. 5А-R представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 1: PDX1 (Фиг. 5A); NKX6.1 (Фиг. 5B); Pax4 (Фиг. 5C); Pax6 (Фиг. 5D), NGN3 (Фиг. 5E); NKX2.2 (Фиг. 5F); ABCC8 (Фиг. 5G); хромогранин-А (Фиг. 5H); PCSK1 (Фиг. 5I); IAPP (Фиг. 5J); инсулин (Фиг. 5К); глюкагон (Фиг. 5L); соматостатин (Фиг. 5М); грелин (Фиг. 5N); Ptf1a (Фиг. 5О); Zic1 (Фиг. 5Р); CDX2 (Фиг. 5Q) и SOX9 (Фиг. 5R). По истечении 3-недельного культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия было отмечено значительное зависимое от времени увеличение экспрессии маркеров, ассоциированных с созреванием эндокринных клеток, таких как ABCC8, IAPP (амилин) и PCSK1. Наблюдался значительный спад в экспрессии PTF1а и SOX9 и очень низкая экспрессия CDX2 (кишечный маркер), ZIC1 (эктодермический маркер) и SOX2 (фронтальный эндодермический маркер), в то время как экспрессия NKX6.1 и PDX1 поддерживались на очень высоком уровне. Экспрессия все гормонов поджелудочной железы была значительно улучшена на протяжении 3-недельного культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Пример 2. Культивирование панкреатических эндокринных клеток-предшественников в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с применением различных фильтровых вкладышей
Этот пример изучает тип и пористость фильтровых вкладышей в дифференцировке панкреатических энтодермальных клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Для изучения воздействия типа и пористости фильтровых вкладышей эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением описанного ниже протокола.
5
2
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×10 клеток/см на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ) или покрытые MATRIGEL™ фильтровые вкладыши (Millipore PIHT 30R 48) , в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100) (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а. Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c. Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d. Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 10 нМ Т3 (Т6397 Sigma) и 100 нМ TPB в течение трех дней.
е. Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 10 нМ Т3, 50 нМ LDN-193189, 1000 нМ ингибитора ALK5 SD208 в течение трех дней. SD208 (2-(5-хлоро-2-фторофенил)птеридин-4-ил]пиридин-4-ил-амин) является 2,4-двузамещенным птеридином, АТР-конкурентным ингибитором TGF-βR I киназы, раскрытом в Molecular Pharmacology 2007, 72: 152-161, и обладающим структурой, показанной в формуле 1.
Формула 1
f. Стадия 6 (5 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 0,025 мМ аскорбиновой кислоты, 500 нМ ингибитора ALK5, 0,1 нМ T3 в течение трех дней.
6
2
В некоторых культурах клетки на стадиях 3-6, которые культивировались на планарных чашках, были обработаны 1X ACCUTASE™ (StemCell Tech, Vancouver) на протяжении 1-3 минут при комнатной температуре, после чего были удалены ферменты, а клетки сняты клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была посеяна с плотностью около 2-6×10 клеток на фильтровые вкладыши для клеточных культур с диаметром пор 0,4 микрон, обладающие поверхностной областью приблизительно 4,2 см на 6-лунковой платформе. Различные фильтровые вкладыши, использованные в этом процессе, идентифицированы в таблице I. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. В некоторых культурах фильтры покрывались MATRIGEL™ (раствор 1:30) на 1 час при комнатной температуре, и клетки были посеяны на верхнюю часть покрытых вкладышей в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия или же с культуральной средой на верхушке вкладыша. На протяжении исследования среда заменялась через день.
Фиг. 6 демонстрирует данные анализа ПЦР в реальном времени об экспрессии следующих генов в клетках линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1, дифференцированных как описано в примере 2: PDX1 (Фиг. 6A); NKX6.1 (Фиг. 6B); PAX4 (Фиг. 6C); PAX6 (Фиг. 6D), NGN3 (Фиг. 6E); NKX2.2 (Фиг. 6F); ABCC8 (Фиг. 6G); хромогранин-А (Фиг. 6Н); PCSK1 (Фиг. 6I); IAPP (Фиг. 6J); инсулин (Фиг. 6К) и глюкагон (Фиг. 5L). Культивирование клеток стадии 4 на фильтровых вкладышах ((Corning, 3412, BD 353493, и Millipore PIHT 30R 48) существенно увеличивает панкреатические энтодермальные маркеры, так же как и маркеры, относящиеся к эндокринным. Покрытие фильтров MATRIGEL™ существенно снижает преимущества культивирования на фильтре в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Более того, клетки, культивируемые на фильтровых вкладышах с низкой плотностью пор (BD 353090, Corning 3452) продемонстрировали более низкую выживаемость и дифференцировку.
Таблица IСписок фильтровых вкладышей, оцененных в примере 2.
Фильтровый вкладыш
Полимерная композиция
Размер пор (микрон)
Плотность пор (#/см<sup>2</sup>)
Покрытие
BD, #353493
PET
0,4
100+/- 10×10<sup>6</sup>
Нет
BD, #353090
PET
0,4
2+/- 0,2×10<sup>6</sup>
Нет
Corning, #3452
Полистирол
0,4
4×10<sup>6</sup>
+/- покрытие MATRIGEL™ (раствор 1:30)
Corning, #3412
Поликарбонат
0,4
100×10<sup>6</sup>
Нет
Millipore, #PIHT 30R 48
PET
0,4
100×10<sup>6</sup>
+/- покрытие MATRIGEL™ (раствор 1:30)
Пример 3 Панкреатические энтодермальные клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, показали увеличение экспрессии эндокринных маркеров по сравнению с планарными культурами или культурами, поддержанными на фильтрах в жидкостно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример направлен на различия в склонности к дифференцировке панкреатических энтодермальных клеток, культивированных на планарных субстратах по сравнению с культивированными в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В дополнение, эффект воздушно-жидкостной зоны взаимодействия был дополнительно подчеркнут дифференцировкой интересующих клеток на вкладышах, но со средой, добавленной как на верхнюю, так и на нижнюю части вкладышей.
5
2
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×10 клеток/см на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ) или покрытые MATRIGEL™ фильтровые вкладыши (Millipore PIHT 30R 48), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100) (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Для клеток, культивированных на фильтровых вкладышах, в начале стадии 1 в некоторых культурах среда была добавлена только на дно вкладыша, а верхняя часть вкладыша находилась в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, в то время как в других культурах среда также была добавлена как на верхнюю, так и на нижнюю часть фильтрового вкладыша. Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и композиции 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (производится компанией Invitrogen, см. таблицу II с компонентами среды BLAR), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 10 нМ Т3 (Т6397 Sigma) и 100 нМ TPB в течение трех дней.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты, 10 нМ Т3, 50 нМ LDN-193189, 1000 нМ ингибитора ALK5 (SD208) в течение трех дней.
f) Стадия 6 (5 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 0,025 мМ аскорбиновой кислоты, 500 нМ ингибитора ALK5, 0,1 нМ T3 в течение трех дней.
6
В некоторых культурах клетки в конце стадии 3, которые культивировались на планарных чашках, были обработаны 1X ACCUTASE™ (StemCell Tech, Vancouver) на протяжении 1-3 минут при комнатной температуре, после чего были удалены ферменты, а клетки сняты клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 2-6×10 клеток (в 50-100 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон (BD 353493) на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась через день.
Фиг. 7 демонстрирует данные анализа ПЦР в реальном времени об экспрессии следующих генов в клетках линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1, дифференцированных как описано в примере 3: PDX1 (Фиг. 7A); NKX6.1 (Фиг. 7B); PAX4 (Фиг. 7C); PAX6 (Фиг. 7D), NGN3 (Фиг. 7E); NKX2.2 (Фиг. 7F); ABCC8 (Фиг. 7G); хромогранин-А (Фиг. 7Н); PCSK1 (Фиг. 7I); IAPP (Фиг. 7J); инсулин (Фиг. 7К) и глюкагон (Фиг. 7L).
Культивирование клеток на фильтровых вкладышах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на стадиях 4-6 значительно повысило панкреатические маркеры, относящиеся к эндокринным. Далее, клетки, которые культивировались и дифференцировались на покрытых MATRIGEL™ фильтровых вкладышах с начала стадии 1 со средой на верхней и нижней частях фильтровых вкладышей, продемонстрировали более низкие уровни панкреатической энтодермальной и эндокринной экспрессией по сравнению с клетками, культивированными в планарных культурах и в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Более того, панкреатические энтодермальные клетки, культивированные на фильтровых вкладышах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, продемонстрировали самую высокую экспрессию панкреатических эндокринных клетках по сравнению со всеми протестированными конфигурациями.
Таблица IIСписок компонентов среды BLAR
Компонент
Концентрация (мМ)
Аминокислоты
Глицин
3.0E-02
Аланин
3.0E-02
Аргинин
3.0E-01
Аспарагин
1.0E-01
Аспарагиновая кислота
1.0E-01
Цистеин
2.0E-01
Глутаминовая кислота
3.0E-02
Гистидин
1.1E-01
Изолейцин
1.0E-02
Лейцин
9.0E-02
Лизина гидрохлорид
1.5E-01
Метиан
3.0E-02
Фенилаланин
3.0E-02
Пролин
1.0E-01
Серин
1.0E-01
Теронин
3.0E-02
Триптофан
2.0E-03
Тирозиндинатрий
1.0E-02
Воздушно-жидкостной зоны взаимодействия
3.0E-02
Витамины
Биотин
3.0E-05
Холина хлорид
5.0E-03
D-кальций пантотенат
1.5E-03
Соль кальция фолиевой кислоты
2.3E-03
Ниацинамид
4.9E-03
Пиридоксина гидрохлорид
9.7E-04
Рибофлавин
1.0E-05
Тинамина гидрохлорид
3.0E-03
Витамин В12
3.7E-06
I-инозитол
2.8E-03
Минералы/прочие
Кальция хлорид (CaCl<sub>2</sub>-2H<sub>2</sub>O)
3.0E-01
Меди сульфат (CuSO<sub>4</sub>-5H2O)
4.8E-06
Железа сульфат (FeSO<sub>4</sub>-7H<sub>2</sub>O)
1.0E-03
Магния сульфат (MgSO4-7H<sub>2</sub>O)
4.1E-01
Калия хлорид (KCl)
3.8E+00
Селеновая кислота H<sub>2</sub>SeO<sub>3</sub>
Натрия бикарбонат (NaHCO<sub>3</sub>)
1.4E+01
Натрия хлорид (NaCl)
1.1E+02
Натрия фосфат двухосновный (Na2HPO4-7H<sub>2</sub>O)
5.0E-01
Цинка сульфат (ZnSO<sub>4</sub>-H<sub>2</sub>O)
1.0E-04
Aденин
1.0E-03
D-глюкоза (декстроза)
5.0E+00
Липоевая кислота
1.2E+05
Фенол красный
1.0E-02
Натрия пируват
1.0E+00
Тимидин
9.8E-05
Пример 4. Панкреатические энтодермальные клетки, культивированные в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия и обработанные ингибитором ALK5 II, продемонстрировали существенно большее количество клеток, положительных для NKX6.1, со-экспрессирующих хромогранин-А и инсулин.
Этот пример был осуществлен для демонстрации того, что ингибитор ALK5 II был уникален в получении значительной популяции клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, которые экспрессировали NKX6.1 и инсулин или хромогранин-А. Более того, это наблюдение было уникально для культур в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Погруженные культуры в однослойных планарных культурах не смогли продемонстрировать значительное количество клеток NKX6.1, экспрессирующих инсулин или хромогранин-А.
5
2
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×10 клеток/см на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ) или покрытые MATRIGEL™ фильтровые вкладыши (Millipore PIHT 30R 48), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% не содержащего жирных кислот BSA(Lampire, PA) и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го BSA без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 100 нМ TPB в течение трех дней.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 мкM ретиноевой кислоты, 50 нМ LDN; 500-1000 нМ различных ингибиторов ALK5 (см. таблицу III со списком использованных ингибиторов) в течение трех дней.
f) Стадия 6 (7 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 мкM ретиноевой кислоты; 500-1000 нМ ингибиторов ALK5 (см. таблицу III со списком протестированных ингибиторов).
6
В некоторых культурах клетки в конце дня 1 стадии 4, которые культивировались на планарных чашках, были обработаны 1X ACCUTASE™ (StemCell Tech, Vancouver) на протяжении 1-3 минут при комнатной температуре, после чего были удалены ферменты, а клетки сняты клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 2-4×10 клеток (в 25-50 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон (BD 353493) на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась через день.
На Фиг. 8 представлены данные ПЦР в реальном времени при анализе экспрессии следующих генов в эмбриональных стволовых клетках человека линии Н1, дифференцированных и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия как описано в примере 4 после дня 1 стадии 4, дня 3 стадии 5 и дня 6 стадии 6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: PDX1 (Фиг. 8A); NKX6.1 (Фиг. 8B); NGN3 (Фиг. 8C); ABCC8 (Фиг. 8D); PCSK1 (Фиг. 8E); грелин (Фиг. 8F); глюкагон (Фиг. 8G); и инсулин (Фиг. 8Н).
На Фиг. 9 представлены данные ПЦР анализа в реальном времени об экспресии следующих генов в клетках линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1, дифференцированных как описано в примере 4 и культивированных в планарных однослойных культурах на день 3 стадии 5 и день 4 стадии 6 для PDX1 (Фиг. 9A), NKX6.1 (Фиг. 9B), NGN3 (Фиг. 9C), ABCC8 (Фиг. 9D), PCSK1 (Фиг. 9E), грелин (Фиг. 9F), глюкагон (Фиг. 9G), и инсулин (Фиг. 9H). Сравнение Фиг. 8 и 9 обнаруживает, что обработка планарных культур на стадии 5 и стадии 6 ингибитором ALK5 II привела к падению экспрессии инсулина на стадии 6 по сравнению со стадией 5. Однако обработка культур в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия ингибитором ALK5 привела к росту экспрессии инсулина на стадии 6 по сравнению со стадией 5. Та же схема применима к экспрессии NGN3 и NKX6.1 в культурах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в сравнении с однослойными культурами.
На Фиг. 10 описаны результаты иммуноокрашивания клеток стадии 6, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде, обработанной либо 1 микромолярным SD208 ингибитором (панель 9А), либо 1 микромолярным ALK5 ингибитором II (панель 10В) и окрашенным для хромогранина-А (пан-эндокринный маркер) и NKX6.1 (панкреатический прекурсорный маркер и специфический маркер бета-клеток). Культуры, обработанные ингибитором ALK5 II, привели в результате к со-экспрессии NKX6.1 и хромогранина-А. Однако культуры, обработанные SD208, продемонстрировали очень низкую со-экспрессию NKX6.1 и хромогранина-А.
Культивирование панкреатических клеток-предшественников передней кишки на фильтровых вкладышах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в сочетании с ингибитором ALK5 II существенно повысили количество клеток, положительных для NKX6.1, со-экспрессирующих инсулин и хромогранин-А. Более того, тот же протокол, примененный к клеткам, культивированным в однослойным культурам, не показал значительного количество клеток, положительных для NKX6.1, со-экспрессирующих инсулин или хромогранин-А. Последнее, обработка клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия ингибиторами ALK5, отличных от ингибитора ALK5 II, не показала значительного количества клеток, положительных для NKX6.1, со-экспрессирующих инсулин или хромогранин-А. Эти результаты показывают, что уникальная комбинация культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия со средой, обогащенной ингибитором ALK5 II, приводит к со-экспрессии инсулина/хромогранина-А и NKX6.1.
Таблица IIIИнгибиторы FLK5, протестированные в примере 4
Соединение
Производитель
Номер по каталогу
Ингибитор TGF-B SB431542
Xcess Biosciences (San Diego, Ca)
M60015-25s
SD208
R & D systems (MN)
3269
ITD-1
Xcess Biosciences (San Diego, Ca)
M600060-2S
LY2109761
Xcess Biosciences (San Diego, Ca)
M60035-2S
A83-01
Xcess Biosciences (San Diego, Ca)
M60021-2S
LY2157299
Xcess Biosciences (San Diego, Ca)
M60064-2S
ALK5-ингибитор II
Enzo (Farmingdale, NY)
ALX-270-445
Пример 5. Сравнение различных ингибиторов ALK5 на стадиях 5 и 6 для клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример демонстрирует, что ингибитор ALK5 II был уникален в получении значительной популяции клеток в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, которые экспрессировали NKX6.1 и инсулин или хромогранин-А. Дополнительные ингибиторы TGF-β, протестированные в данном примере, перечислены в таблице IV.
5
2
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×10 клеток/см на чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а. Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали в течение еще одного дня в среде MSDB-131, обогащенной следующими компонентами: 2% BSA без жирных кислот; 0,0012 г/мл натрия бикарбоната; 1X GlutaMax™; 4,5 мМ D-глюкозы; 100 нг/мл GDF8; и 0,1 мкМ композиции МСХ. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c. Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
5
d. Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 100 нМ ТРВ на протяжении двух дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×10 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон (BD 353493) на 6-лунковых пластинах или на фильтровые вкладыши размером 10 см (Corning, #3419) в 10-сантиметровые чашки. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша на 6-лунковых пластинах, и 7,5 мл среды было добавлено на дно каждого 10-сантиметрового вкладыша. На верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась каждый день.
е. Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 затем культивировались в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 мкM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189; 1000 нМ различных ингибиторов ALK5 (см. таблицу IV со списком использованных ингибиторов) в течение трех дней.
f. Стадия 6 (6 дней): Клетки стадии 5 затем культивировались в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3; 1000 нМ ингибитора ALK5 (см. таблицу IV со списком использованных ингибиторов) в течение шести дней.
На Фиг. 23 представлены данные ПЦР в реальном времени при анализе экспрессии следующих генов в эмбриональных стволовых клетках человека линии Н1, дифференцированных и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия как описано в примере 5 после дня 4 стадии 5 и дня 6 стадии 6: PDX1 (Фиг. 23А); NKX6.1 (Фиг. 23B); NGN3 (Фиг. 23C); ABCC8 (Фиг. 23D); глюкагон (Фиг. 23E); и инсулин (Фиг. 23F). Аналогично результатам примера 4, культивирование панкреатических клеток-предшественников передней кишки на фильтровых вкладышах в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия и обработка ингибитором ALK5 II значительно повысило экспрессию инсулина и глюкагона. Обработка панкреатических клеток-предшественников передней кишки с другими ингибиторами ALK5 не привела к существенной экспрессии инсулина или глюкагона.
Таблица IVИнгибиторы ALK5 (также называемые рецепторами TGF-β), протестированные в примере 5
Соединение
Производитель
Номер по каталогу
Ингибитор TGF-β рецептор V
EMD
616456
Ингибитор TGF-β рецептор I
EMD
616451
Ингибитор TGF-β рецептор IV
EMD
616454
Ингибитор TGF-β рецептор VII
EMD
616458
Ингибитор TGF-β рецептор VIII
EMD
616459
Ингибитор TGF-β рецептор II
EMD
616452
Ингибитор TGF-β рецептор VI
EMD
616464
Ингибитор TGF-β рецептор III
EMD
616453
Пример 6 Воздействие плотности клеточного посева в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия на последующую дифференцировку в эндокринные клетки
Этот пример идентифицирует диапазон плотности посева в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия и результирующую экспрессию эндокринных маркеров. Для осуществления исследований в данном примере эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением протокола, изложенного ниже.
5
2
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×10 клеток/смна чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
6
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4,5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней. Затем, в конце стадии 3, клетки, культивированные на планарных чашках, были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты PBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), затем последовало удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,1, 0,5, 1 и 5×10 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон (BD 353493) на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась каждый день.
d) Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 100 нМ TPB в течение двух дней.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (14 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 10000 нM ингибитора ALK5, 100 нМ LDN-193189 и 1000 нМ T3 в течение четырнадцати дней.
6
6
Образцы РНК отбирались на стадиях 4, 5 и 6, и анализировались способом ПЦР в реальном времени. На Фиг. 11 представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 6 и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: ABCC8 (Фиг. 11A), глюкагон (Фиг. 11B), амилин (Фиг. 11C), инсулин (Фиг. 11D), NGN3 (Фиг. 11Е), NKX2.2 (Фиг. 11F), NKX6.1 (Фиг. 11G) и PDX1 (Фиг. 11H). Плотность посева в диапазоне 0,1-1×10 клеток/10 мкл привела к одинаковой экспрессии панкреатических энтодермальных и эндокринных маркеров на стадиях 5 и 6. При самой высокой протестированной плотности посева (5×10 клеток/10 мкл) в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия наблюдался спад экспрессии эндокринных маркеров.
Пример 7. Сравнение фильтровых вкладышей с размером пор 0,4, 1 и 3 микрон
Этот пример сравнивает воздействие размера пор фильтра на последующую дифференцировку в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Для осуществления исследований в данном примере эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением протокола, изложенного ниже.
5
2
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×10 клеток/смна чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. № Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
6
d) Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты и 100 нМ TPB в течение трех дней. Затем, в конце стадии 4, клетки, культивированные на планарных чашках, были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты PBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), затем последовало удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×10 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4, 1 или 3 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. На протяжении исследования среда заменялась каждый день.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (15 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение пятнадцати дней.
Образцы РНК отбирались на стадии 6 и анализировались способом ПЦР в реальном времени. На Фиг. 12 представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в этом примере и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: ABCC8 (Фиг. 12A), глюкагон (Фиг. 12B), амилин (Фиг. 12C), инсулин (Фиг. 12D), NGN3 (Фиг. 12Е), NKX2.2 (Фиг. 12F), NKX6.1 (Фиг. 12G) и PDX1 (Фиг. 12H). Фильтровые вкладыши с размером пор от 0,4 до 3 микрон не оказали значительного влияния на экспрессию панкреатических энтодермальных или эндокринных маркеров в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Пример 8. Сравнение дифференцировки панкреатических клеток-предшественников передней кишки в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с жидкостно-жидкостной (L/L) зоной взаимодействия на фильтровых вкладышах
Этот пример сравнивает воздействие культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия с культивированием в жидкостно-жидкостной зоне взаимодействия на дифференцировку панкреатических клеток-предшественников передней кишки на фильтровых вкладышах. Для осуществления исследований в данном примере эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением протокола, изложенного ниже.
5
2
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×10 клеток/смна чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma-Aldrich). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
6
d) Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 100 нМ ТРВ на протяжении двух дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×10 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась. Для условий L/L среда также добавлялась на верхнюю часть фильтровых вкладышей, что приводит к получению жидкостно-жидкостной зоне взаимодействия. На протяжении исследования среда заменялась каждый день.
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
f) Стадия 6 (10 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение десяти дней.
Образцы РНК отбирались на стадиях 5 и 6, и анализировались способом ПЦР в реальном времени. На Фиг. 13 представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 8 и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: ABCC8 (Фиг. 13A), глюкагон (Фиг. 13B), амилин (Фиг. 13C), инсулин (Фиг. 13D), NGN3 (Фиг. 13Е), NKX2.2 (Фиг. 13F), NKX6.1 (Фиг. 13G) и PDX1 (Фиг. 13H). Наиболее значительная разница была отмечена в значительном повышении регуляции (7Х) глюкагона в условиях L/L в сравнении с воздушно-жидкостной зоной взаимодействия.
Пример 9. Панкреатические энтодермальные/эндокринные клетки-предшественники, культивированные в воздушно-жидкостной среде, могут применяться для скрининга библиотеки композиций
Этот пример изучает применение культур в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия для скрининга библиотек композиций. Для осуществления этого эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы с применением протокола, изложенного ниже.
5
2
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×10 клеток/смна чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1:100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
6
d) Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ ТРВ на протяжении двух дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×10 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
4
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкМ ZnSO (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
4
f) Стадия 6 (12 дней): Клетки стадии 5 были затем культивированы в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкM ZnSO (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение двенадцати дней. На этой стадии композиции, перечисленные в таблице V, были скринированы для идентификации потенциальных композиций которые воздействуют на энтодермальные и эндокринные маркеры.
Таблица VСписок композиций, протестированных на стадии 6
Кат. №/ Производитель
Ингибитор
Целевая киназа
Тестовая концентрация
328007-EMD
ERK-ингибитор II
ERK1, ERK2
2 мкM
420119-EMD
JNK-ингибитор II
JNK
2 мкM
420136-EMD
JNK-ингибитор IX
JNK2, JNK3
2 мкM
444939-EMD
Ингибитор MEK1/2
MEK1/2
2 мкM
454861-EMD
Ингибитор MNK1
MNK1
2 мкM
475863-EMD
Ингибитор MK2a
MK2a
2 мкM
506156-EMD
Ингибитор V MAP-киназы p38
p38, CK1
2 мкM
513000-EMD
PD 98059
MEK
2 мкM
553014-EMD
Ингибитор IV Raf-киназы
B-Raf
2 мкM
559389-EMD
SB 203580
p38 MAPK
2 мкM
616373-EMD
Ингибитор Tpl2-киназы
Tpl2-киназа
2 мкM
692000-EMD
ZM 336372
c-Raf 1
2 мкM
M60043-25/XcessBio
IDH1
Изоцитрата дегидрогеназа
2 мкM
M60668-25/XcessBio
AGI5198
Изоцитрата дегидрогеназа
2 мкM
Образцы РНК отбирались на стадии 6 и анализировались способом ПЦР в реальном времени. На Фиг. 14 представлены данные анализов ПЦР в реальном времени по экспрессии следующих генов в клетках линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, дифференцированных как описано в примере 9 и культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия: ABCC8 (Фиг. 14A), глюкагон (Фиг. 14B), амилин (Фиг. 14C), инсулин (Фиг. 14D), ISL-1 (Фиг. 14Е), MNX1 (Фиг. 14F), NKX6.1 (Фиг. 14G) и SLC30A8 (Фиг. 14H). Этот пример демонстрирует потенциал клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в качестве инструмента скрининга.
Пример 10. FACS-профиль клеток стадии 5-6, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример изучает композицию культур стадии 5 и стадии 6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Для осуществления исследований в данном примере эмбриональные стволовые клетки были дифференцированы на стадии 5 и стадии 6 с применением протокола, изложенного ниже.
5
2
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×10 клеток/смна чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
6
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ ТРВ на протяжении трех дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×10 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
4
е) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкМ ZnSO (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
4
f) Стадия 6 (15 дней): Клетки стадии 5 были затем культивированы в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкМ ZnSO (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение 5-15 дней.
Урожай клеток был собран на стадии 5 и различных временных точках стадии 6, и проанализирован способом FACS. FACS окрашивание было осуществлено, как ранее описывалось (Diabetes, 61, 2016, 2012), с применением антител, перечисленных в таблице VI. На Фиг. 15 представлены FACS профили клеток, собранных на стадии 5. На Фиг. 16 представлены FACS профили клеток стадии 6 день 5, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. И наконец, на Фиг. 17 представлены профили клеток стадии 6 день 15, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Как показано на Фиг. 15, на стадии 5 было мало клеток, со-экспрессирующих инсулин и NKX6.1 (~1%) и значительное количество PDX1-положительных клеток находились в активном клеточном цикле, как измерено со-экспрессией PDX1 и KI-67 (~23%; KI-67 является индикатором клеток, находящихся в клеточном цикле.) Однако на стадии 6 день 5 (Фиг. 16) произошел значительный спад в пролиферации PDX1 + клеток (8%), в то время как наблюдался значительный рост количества NKX6.1 + клеток, со-экспрессирующих хромогранин-А (51%; хромогранин-А является пан эндокринным маркером) или инсулин (14%). Более того, отмечен значительный рост клеток, экспрессирующих эндокринные прекурсорные маркеры ISL-1, NeuroD и NKX2.2. Это означает, что уникальные культуры стадии 6 позволяют быстрое созревание клеток вне судьбы пролиферирующего прогенитора к раннему созреванию эндокринных клеток. Дополнительно, рост процентной доли клеток, со-экспрессирующих инсулин и NKX6.1 (33%) наблюдался при продлении стадии 6 до 15 дней (Фигура 17), Более того, наблюдался дальнейший спад процентной доли клеток, положительных для PDX1, которые находились в клеточном цикле (1%) и дальнейший рост процентной доли ISL-1 и NeuroD. И наконец, большинство гормон-положительных клеток являлись одногормонными инсулин-положительными клетками (34% одногормонных инсулин-положительных клеток, 7% одногормонных глюкагон-положительных клеток и 8% полигормонных клеток). Значительная со-экспрессия NKX6.1 и хромогранина-А и одногормонный инсулин-положительные клетки, экспрессирующие NKX6.1 (>30%) отличают ранее неописанную популяцию клеток.
Таблица VIСписок антител, использованных в FACS анализах клеток, полученных в примере 10
Антиген
Вид
Источник/кат. №
Разведение
Глюкагон
Мышь
Sigma-Aldrich, G2654
1:250
Инсулин
Кролик
Cell Signaling, 3014B
1:10
NKX6.1
Мышь
Developmental Studies Hybridoma Bank; F55A12
1:50
NKX2.2
Мышь
Developmental Studies Hybridoma Bank;
1:100
PDX1
Мышь
BD BioSciences, 562161
1:50
Ki67
Мышь
BD Biosciences, 558595
1:20
Pax6
Мышь
BD Biosciences, 561552
1:20
Хромогранин-А
Кролик
Dako, A0430
1:40
ISL-1
Мышь
BD Biosciences, 562547
1:20
NEUROD
Мышь
BD Biosciences, 563001
1:40
FOXA2
Мышь
BD Biosciences, 561589
1:80
Пример 11. Созревание в условиях in vivo NKX6.1+ Хромогранин-А+ инсулин+ клеток NKX6.1 + Хромогранин-А-инсулин- и панкреатических прогениторных клеток, со-экспрессирующих PDX1 и NKX6.1 в сравнении с человеческими островками в SCID мыши
Этот пример описывает in vitro композицию дифференцированных клеток и влияние на поведение клеток в условиях in vivo. В частности, 5 миллионов панкреатических клеток-предшественников передней кишки (PDX1+ NKX6.1+), взятых на стадии 4 в день 4 и подготовленных в соответствии с примером 1 в планарных культурах, 5 миллионов NKX6.1+ хромогранин-А-отрицательных клеток, культивированных в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия, и 3 миллиона NKX6.1+ хромогранин-А-положительных клеток, подготовленных в соответствии с примером 10 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия были трансплантированы в почечную капсулу не больных диабетом SCID мышей, как описано в (Diabetes 2012, 61(8):2016-29). У мышей отслеживали циркуляцию человеческого С-пептида как способа измерения состояния зрелости клеток во времени. Дополнительно, в отдельную партию мышей был трансплантирован эквивалент1500-4000 трупных человеческих островков (PRODO labs, Irvine, CA) в качестве положительного контроля.
NKX6.1+ хромогранин-А отрицательная популяция была подготовлена следующим образом:
5
2
Клетки линии человеческих эмбриональных стволовых клеток Н1 (пассаж 40) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×10 клеток/смна чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1:100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
а. Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b. Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
6
c. Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней. Затем клетки стадии 3 были обработаны 1X ACCUTASE™ (StemCell Tech, Vancouver) на протяжении 1-3 минут при комнатной температуре, после чего были удалены ферменты, а клетки сняты клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью ~2×10 клеток/10 мкл на фильтровый вкладыш для культивации клеток с размером пор 0,4 микрон. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
d. Стадия 4 (2 дня): Клетки стадии 3 затем культивировались в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 4,5 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0017 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 100 мкM ретиноевой кислоты, 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 100 нМ Т3 (Т6397 Sigma) и 100 нМ TPB в течение двух дней.
e. Стадия 5 (2 дня): Клетки стадии 4 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 50 нМ LDN-193189 и 500 нМ ингибитора ALK5 (SD208) в течение двух дней.
f. Стадия 6 (6 дней): Клетки стадии 5 обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 0,25 нМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 500 нМ ингибитора ALK5 в течение шести дней.
Таблица VII ниже описывает уровень экспрессии различных панкреатических энтодермальных и эндокринных маркеров для трех популяций, полученных из человеческих эмбриональный стволовых клеток. Более детально, таблица VII сравнивает следующие результаты: (1) популяция стадии 4 день 4, полученная в соответствии с примером 1 (стадия 4 день 4); (2) популяция панкреатических энтодермальных/эндокринных клеток-предшественников, полученная в соответствии с примером 11 (панкреатические энтодермальные/эндокринные); и (3) NKX6.1+ хромогранин-А+ инсулин+ популяция, полученная в соответствии с примером 10 (NKX6.1+ хромогранин-А+ инсулин+). Информация по каждому FACS профилю представлена на Фиг. 17-19. В частности, Фиг.17 демонстрирует FACS профиль NKX6.1+ хромогранин-А+ популяции; Фиг.18 демонстрирует FACS профиль клеток стадии 4 день 4; и Фиг. 19 демонстрирует FACS профиль панкреатических эндокринных клеток стадии 6 день 6, полученных в соответствии с примером 11.
Таблица VIIСравнение профиля экспрессии трех трансплантированных популяций, измеренной способом FACS
Популяция
Маркер
Стадия 4 день 4<sup>a</sup>
Панкреатическая энтодермальная/ эндокринная<sup>b</sup>
NKX6.1+ хромогранин-A+ инсулин+<sup>c</sup>
% PDX1+ Ki-67+
25
17
1
% NKX6.1+ хромогранин-A+
10
10
57
% NKX6.1-хромогранин-А+
19
53
31
% Инсулин+ NKX6.1+
1
1
33
<sup>a</sup> Популяция стадии 4 день 4 была получена в соответствии с примером 1 (см. Фиг. 18)
<sup>b</sup> Панкреатическая энтодермальная/эндокринная популяция была получена в соответствии с примером 11. (см. Фиг. 19)
<sup>c</sup> Популяция NKX6.1+ хромогранин-А+ инсулин+ была получена в соответствии с примером 10 (см. Фиг. 17)
После внедрения мышей периодически тестировали на концентрацию циркулирующего человеческого С-пептида. Циркуляция человеческого С-пептида тестировалась путем взятия крови из подкожной вены ноги. Плазма хранилась при -20°C и позднее анализировалась с применением человеческого С-пептида с помощью набора для анализа ELISA (Alpco Diagnostics, Salem, NH). Результаты представлены графически на Фиг. 20.
Фигура 20 показывает кинетику производства С-пептида в трех популяциях, полученных из эмбриональных стволовых клеток, в сравнении с различными дозами человеческих островков. Популяция клеток, экспрессирующая значимую со-экспрессию NKX6.1 и хромогранина-А, и NKX6.1 и инсулина привела к существенно раннему производству С-пептида. Уровень производства С-пептида был аналогичен трансплантации приблизительно 4000 человеческих островков на 12 недель. Однако через 16 недель после трансплантации, уровни человеческого С-пептида почти вдвое превзошла магнитуду С-пептида, которая наблюдалась при трансплантации 4000 человеческих островков.
Однако трансплантация прогениторных клеток, экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, или смешанной популяции панкреатических клеток-предшественников и полигормонных клеток (хромогранин-А+ NKX6.1-) потребовала существенно более длительных периодов времени для выделения уровней С-пептида, эквивалентных 4000 человеческих островков.
Пример 12. Добавление ингибитора гамма секретазы ХХ ускоряет созревание маркеров клеток стадии 6, культивируемых в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
5
2
Этот пример демонстрирует, что ингибиторы NOTCH, такие как ингибиторы гамма секретазы, дополнительно увеличивают количество маркеров зрелости бета-клеток, одновременно поддерживая уровень экспрессии NKX6.1. Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 42) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×10клеток/смна чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду, содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1-100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10 мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
a) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
6
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ ТРВ на протяжении трех дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×10 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
e) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2 % BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
4
f) Стадия 6 (14 дней): Клетки стадии 5 были затем культивированы в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2 % BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкM ZnSO (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение 14 дней.
На стадии 6 были протестированы различные дозы (от 100 нМ до 5000 нМ) ингибитора гамма секретазы ХХ (EMD, #565789). мРНК была собрана на стадии 6 день 4 и стадии 6 день 8. Фиг. 21 описывает данные анализа ПЦР для ключевых маркеров зрелости бета-клеток и панкреатических прогениторных маркеров. Как показано на Фиг. 21, маркеры зрелости, такие как амилин (панель 21А), инсулин (панель 21В) и MAFA (панель 21С) были значительно повышены, в то время как экспрессия NKX6.1 (панель 21D) не испытала значительного влияния. Однако панкреатические прекурсорные маркеры, такие как PTFF1 (панель 21Е) и SOX9 (панель 21F), были значительно понижены.
Пример 13. Присутствие ингибитора ALK5 важно для повышения MAFA и добавление Т3 также повышает экспрессию MAFA
Этот пример описывает способность добавки ингибитора ALK5 II к повышению экспрессии MAFA и что добавка Т3 с ингибитором ALK5 и LDN-193189 еще больше увеличивает экспрессию MAFA.
5
2
Клетки линии человеческих эмбриональный стволовых клеток Н1 (пассаж 42) были посеяны как одиночные клетки с плотностью 1×10 клеток/смна чашки, покрытые MATRIGEL™ (раствор 1:30; BD Biosciences, NJ), в среду содержащую DMEM-F12 (Invitrogen, Ca), GlutaMax™ (раствор 1:100, Invitrogen), 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO), 100 нг/мл FGF2 (R & D systems, MN), 1 нг/мл TGF-β (R & D systems), ITS-X (раствор 1:100), 2% BSA без жирных кислот (Lampire, PA), и 20 нг/мл IGF-1 (R & D systems), обогащенную 10мкМ Y27632 (Rock inhibitor, кат. №Y0503, Sigma). Спустя сорок восемь часов после посева культуры промыли в неполном ФСБ (фосфатно-солевом буферном растворе без Mg или Ca). Клетки затем были дифференцированы в соответствии со следующим протоколом:
a) Стадия 1 (3 дня): Клетки культивировались на протяжении одного дня в среде MCDB-131 (Invitrogen, № по каталогу 10372-019) с добавкой 2%-го БСА без жирных кислот (Proliant, № по каталогу 68700), 0,0012 г/мл бикарбоната натрия (SigmaAldrich, № по каталогу S3187), 1 X GlutaMax™ (Invitrogen, № по каталогу 35050-079), 4,5 мM D-глюкозы (SigmaAldrich, № по каталогу G8769), 100 нг/мл GDF8 (R&D Systems) и 1 мкМ композиции MCX. Затем клетки культивировали на протяжении дополнительного дня в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот БСА, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы, 100 нг/мл GDF8 и 0,1 мкМ композиции MCX. Затем клетки дополнительно культивировали один день в среде MCDB-131 с добавлением 2% не содержащего жирных кислот BSA, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мM D-глюкозы и 100 нг/мл GDF8.
b) Стадия 2 (2 дня): Клетки стадии 1 на протяжении двух дней обрабатывались средой MCDB-131, обогащенной 2% BSA без жирных кислот, 0,0012 г/мл бикарбоната натрия, 1X GlutaMax™, 4,5 мМ D-глюкозы, 0,25 мМ аскорбиновой кислоты (Sigma, MO) и 25 нг/мл FGF7 (R & D Systems, MN).
c) Стадия 3 (2 дня): Клетки стадии 2 были затем обработаны средой BLAR (Invitrogen), обогащенной 1:200 раствором ITS-X (Invitrogen, Ca); 4.5 мМ глюкозой; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл бикарбоната натрия; 2% не содержащего жирных кислот BSA; 0,25 мкМ SANT-1 (Sigma, MO); 1 мкМ RA (Sigma, MO); 25 нг/мл FGF7; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; 200 нМ TPB (PKC активатор; № по каталогу 565740; EMD Chemicals, Gibbstown, NJ); и 100 нМ LDN-193189 (ингибитор рецептора BMP; № по каталогу 04-0019; Stemgent), на протяжении двух дней.
6
d) Стадия 4 (3 дня): Клетки стадии 3 были затем обработаны средой BLAR, обогащенной раствором 1:200 ITS-X; 4,5 мМ глюкозы; 1X GlutaMax™; 0,0017 г/мл натрия бикарбоната, 2% BSA без жирных кислот; 0,25 мкМ SANT-1; 100 нМ ретиноевой кислоты; 2 нг/мл FGF7; 100 нМ LDN-193189; 0,25 мМ аскорбиновой кислоты; и 200 нМ ТРВ на протяжении трех дней, затем в конце стадии 4 клетки на планарных пластинах были обработаны на протяжении 4 часов 10 мкМ Y27632, промыты РBS и обработаны на протяжении 5 минут при комнатной температуре 1X TrypLE™ (Invitrogen), после чего было осуществлено удаление ферментов, ополаскивание базальной средой и удаление клеток клеточным скребком. Полученная клеточная суспензия была засеяна с плотностью 0,5-0,75×10 клеток (в 10 мкл аликвот) на фильтровый вкладыш для культивации клеток, покрытый MATRIGEL™ с размером пор 0,4 микрон на 6-лунковых пластинах. 1,5 мл среды было добавлено на дно каждого вкладыша, а на верхнюю часть фильтра среда не добавлялась.
4
e) Стадия 5 (3 дня): Клетки стадии 4 были затем культивированы в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкМ ZnSO (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 50 нM ретиноевой кислоты, 100 нМ LDN-193189, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение трех дней.
4
f) Стадия 6 (8 дней): Клетки стадии 5 были затем культивированы в среде BLAR, обогащенной 1:200 раствором ITS-X, 20 мМ глюкозы, 1X GlutaMax™, 0,0015 г/мл бикарбоната натрия, 2% BSA без жирных кислот, 10 мкг/мл гепарина (Sigma, #H3149), 10 мкM ZnSO (Sigma, Z0251), 0,25 мкМ SANT-1, 100 нM LDN-193189, 1000 нМ T3, 10000 нМ ингибитора ALK5 II в течение 8 дней.
На стадии 6 ингибитор ALK5, T3 или LDN были удалены в различных сочетаниях для проверки влияния каждого фактора на экспрессию NKX6.1, инсулина и MAFA. РНК была собрана на стадии 6 день 5 и стадии 6 день 8. Фиг. 22 описывает данные анализа ПЦР для ключевых маркеров зрелости бета-клеток и панкреатических прогениторных маркеров. Как показано на Фиг. 22, удаление ингибитора ALK5 на стадии 6 привело к резкому спаду экспрессии MAFA. В то же время сочетание ингибитора ALK5, LDN-183189 (ингибитор рецептора ВМР) и Т3 существенно улучшило экспрессию MAFA (Фиг. 22А), инсулина (Фиг. 22В), амилина (Фиг. 22С) и умеренно улучшило экспрессию NKX6.1 (Фиг. 22D).
Пример 14. Дополнительный протокол культивирования клеток стадии 6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Этот пример раскрывает дополнительные материалы и способы культивирования клеток стадии 6 в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия.
Применялись следующие материалы: 10-сантиметровые фильтры от компании Corning (кат. №3419, 0,4 микрон поликарбонатная мембрана), среда MCDB-131 (Invitrogen, кат. №10372-019) или среда BLAR (производства компании Invitrogen); ITS-X (Invitrogen, Ca); гормон щитовидной железы (Т3); Sigma ингибитор ALK5 II- ENZO (кат. №ALX-27-445); LDN-193189- StemGent (#04-0074); гепарин (Sigma, H3149); и BSA без жирных кислот (Proliant/Lampire, 7500804).
Подготовка базальной среды стадии 6: Добавить 1,5 г/л натрия бикарбоната в среду MCDB 131, плюс 2% BSA, плюс 1:200 ITS-X, плюс дополнительные 15 мМ глюкозы.
Подготовка дифференцировочной среды стадии 6: К базальной среде стадии 6 добавить 10 мМ ингибитора ALK5 II, 100 нМ LDN-193189 и 1 мМ Т3.
Способы
Добавить 7,5 мл дифференцировочной среды стадии 6 на дно фильтрового вкладыша размером 10 см. Добавить кластеры клеток в небольших объемах (20-30 мкл) на верхнюю часть фильтровых вкладышей. Как правило, примерно 50 клеточных кластеров размещаются на 10 см вкладыша. При посеве каждый клеточный кластер содержит приблизительно 0,5 М клеток.
Предпочтительно заменять среду ежедневно. Клетки могут быть удалены с фильтрового вкладыша путем удаления клеточных агрегаций индивидуально, например, при помощи пипетки с широким просветом, или же все агрегации могут быть удалены одновременно путем промывания верхних частей фильтра базальной средой. Клеточные агрегации слабо закреплены на вкладышах.
4
В дополнение к специфическим условиям культивирования, описанным в вышеизложенных примерах, другие подходящие условия для дифференцировки плюрипотентных клеток или их прогениторов в панкреатические эндокринные клетки перечислены далее в таблицах VIII-XIII. В этих таблицах «инг. ALK5» значит «ингибитор ALK5», «RA» - ретиноевая кислота, «Вит. С» - аскорбиновая кислота, «инг.» - ингибитор, «акт.» - активатор, ZnSO - цинка сульфат, «МСХ» - композиция МСХ, и «АА» - активин А. В определенных вариантах осуществления любая из обработок на одной стадии (например, стадии 4) может быть скомбинирована с любой обработкой на другой стадии (например, стадии 5).
Таблица VIIIПротокол дифференцировки клеток, включающий культивирование в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия
Стадия 1
Стадия 2
Стадия 3
Стадия 4
Фильтр стадии 5
Фильтр стадии 6
Базовая среда
MCDB131 Промежуточный Бикарбонат (Общее количество: 2,35 г/л)
MCDB131 Промежуточный Бикарбонат (Общее количество: 2,35 г/л)
BLAR Высокий Бикарбонат (Общее количество: 2,93 г/л)
BLAR Высокий Бикарбонат (Общее количество: 2,93 г/л)
BLAR Промежуточный Бикарбонат (Общее количество: 2,35 г/л)
BLAR Промежуточный Бикарбонат (Общее количество: 2,35 г/л)
Обогащение
0,5% FAF-BSA, 10 мМ глюкозы
0,5% FAF-BSA, 10 мМ глюкозы
2% FAF-BSA, 1:200 ITS-X,10 мМ глюкозы
2% FAF-BSA, 1:200 ITS-X, 10 мМ глюкозы
2% FAF-BSA, 1:200 ITS-X, 20 мМ глюкозы
2% FAF-BSA, 1:200 ITS-X, 20 мМ глюкозы
Факторы роста
100 нг/мл GDF8
25 нг/мл FGF7
25 нг/мл FGF7
2 нг/мл FGF7
10 мкг/мл гепарина
10 мкг/мл гепарина
Низкомолекулярный антагонист/ антагонист
1.0 мкM MCX День 1100 нM MCX на День 2
0,25 мM Вит. C
1 мкM ретиноевой кислоты 0,25 мкM SANT200 нM TPB100 нM LDN-1931890,25 мM Вит. C
100 нM LDN0,25 мкM SANT100 нM TPB 100 нMретиноевой кислоты0,25 мM Вит. C
0,25 мкM SANT50 нM ретиноевой кислоты10000 нM инг.ALK5100 нM LDN-19318910 мM ZnSO<sub>4</sub>
10000 нM инг. ALK51 мкМ T3100 нM LDN-19318910 мM ZnSO<sub>4</sub>
Продолжительность (дней)
Приблизительно 2-5 дней; предпочтительно около 3 дней
Приблизительно 2-3 дня, предпочтительно около 2 дней
Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 2 дней
Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней
Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней
Приблизительно 3-15 дней
Тип культуры
Планарная
Планарная
Планарная
Планарная
Воздушно-жидкостная зона взаимодействия
Воздушно-жидкостная зона взаимодействия
Таблица IXРеагенты, использованные в протоколе дифференцирования, описанном в таблице VII
Реактив
Концентрация
Производитель
№ по каталогу
MCDB131BLAR (изготовленная на заказ среда)
(Добавить 1:100 X Glutamax)Промежуточный бикарбонат: Добавить 1,5 г натрия бикарбоната/1000 мл среды.Высокий бикарбонат: Добавить 2,5 г бикарбоната/1000 мл среды
Invitrogen
10372019
FAF-BSA
0,5% на стадиях 1-22% на стадиях 3-6
Proliant
68700
ITS-X
раствор 1:200
Invitrogen
51500056
Глюкоза
10 мM на стадиях 1-420 мM на стадиях 5-6
Sigma
G8769
GDF8
100 нг/мл
Peprotech
120-00
MCX
1,0 мкМ в день 1 и 100 нМ на день 2
FGF7
25 нг/мл на стадии 2, 25 нг/мл на стадии 3, 2 нг/мл на стадии 4
R & D Systems
251-KG
RA
1 мкМ на стадии 3100 нM на стадии 450 нM на стадии 5
Sigma
R2625
SANT-1 (SHH ингибитор)
0,25 мкM
Sigma
S4572
LDN-193189(антагонист ВМР r)
100 нM на стадиях 3-6
Stemgent
04-0019
ТРВ (активатор РКС)
200 нМ на стадии 3, 100 нМ на стадии 4
ChemPartner
Дополнительно
Аскорбиновая кислота (Вит. С)
0,25 мM на стадиях 2-4
Sigma
A4544
Ингибитор ALK5 II
10000 нM на стадиях 5-6
ENZO
ALX-270-445
T3
1 мкМ на стадии 6
Sigma
T6397
Гепарин
10 мкг/мл на стадиях 5-6
Sigma
H3149
Цинка сульфат
10 мкМ на стадиях 5-6
Sigma
Z0251
Фильтровые вкладыши на 6-лунковых пластинах
0,4 микрон фильтры от BD или Millipore
BDMillipore
353493PIHT15R48
Таблица XПримеры культуральных условий, пригодных для применения в способах Изобретения
Стадия 4
Стадия 5
Стадия 6
Обработка
клетки стадии 3
клетки стадии 4
Стадия 5
с по меньшей мере
Инг. ALK5; Noggin
RA; FGF7; Вит. С.
T3
Инг. ALK5
Т3 и инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II)
Т3 и инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II); RA; LDN-193189
инг ALK5 (например, инг. ALK5 II); RA; LDN-193189
Т3 и инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II)
Т3; инг. ALK5 (например, инг. ALK5 II) & LDN-193189
Т3; инг. ALK5
(например, инг. ALK5 II); LDN-193189 и гепарин
Другие необязательные компоненты<sup>а</sup>(по меньшей мере один из перечисленных)
PKC aкт. (например, TPB); SANT-1; ROCK инг. (например, Y27632)
RA; Вит. C.; SANT-1; ZnSO<sub>4; </sub>BMP инг. (например, LDN-193189); гепарин
RA; Вит. C.; SANT-1; ZnSO<sub>4; </sub>BMP инг. (например, LDN-193189); гепарин
Культивирование:
Планарное (воздушно-жидкостная зона взаимодействия не в обязательном порядке в конце стадии 4)
Воздушно-жидкостная зона взаимодействия
Воздушно-жидкостная зона взаимодействия
Продолжительность обработки
Приблизительно 2-4 дня; предпочтительно 2-3 дня
Приблизительно 2-4 дня; предпочтительно 2-3 дня
Приблизительно 3-15 дней
<sup>а</sup> исключены из списка, если упомянуты в категории «с по меньшей мере»
Примерные диапазоны компонентов, упомянутых в таблице Х, примененные в способах настоящего изобретения, показаны ниже:
Таблица XIПримеры объемов культуральных компонентов, пригодных для применения в способах настоящего изобретения
Компонент
Примерный пригодный объем
Альтернативно
T3
около 0-1500 нМ
около 10 нМоколо 1000 нМ
Ингибитор ALK5
от около 75 нМ до около 15000 нМ
около 100 нМоколо 200 нМоколо 1000 нМоколо 2000 нМоколо 10000 нМ
SANT-1
приблизительно от 0,1 мкМ до 0,3 мкМ
около 0,25 мкМ
Ретиноевая кислота
приблизительно от 25 нМ до 150 нМ
около 50 нМоколо 100 нМ
Аскорбиновая кислота
от около 0,1 до около 0,4 мМ
около 0,25 мМ
FGF7
от около 2 до около 35 нг/мл
около 2 нг/млоколо 25 нг/мл
ингибитор рецептора ВМР (например, LDN-193189)
от около 50 до около 150 мМ
около 100 мМ
PKC активатор (например, TPB)
от около 50 до около 150 мМ
около 200 мМ
Noggin
от около 50 нг/мл до около 150 нг/мл
около 100 нг/мл
Гепарин
от около 5 мкг/мл до около 15 мкг/мл
около 10 мкг/мл
ROCK ингибитор (например, Y27632)
приблизительно от 5 мкМ до 15 мкМ
около 10 мкМ
Цинка сульфат
приблизительно от 5 мкМ до 15 мкМ
около 10 мкМ
Таблица XI ниже иллюстрирует альтернативные примеры культуральных условий, пригодных для применения в вариантах осуществления способов настоящего изобретения.
Таблица XIIПримеры культуральных условий, пригодных для применения в вариантах осуществления способов настоящего изобретения
Стадия 1
Стадия 2
Стадия 3
Стадия 4
Стадия 5
Стадия 6
Обработка
Плюрипотентные стволовые клетки
клетки стадии 1
клетки стадии 2
клетки стадии 3
клетки стадии 4
Стадия 5
С по меньшей мере
GDF8 и MCX
AA и Wnt3A
FGF7 и Вит. С
FGF7; RA; SANT; TPB; LDN и Вит. C
Инг. ALK5, Noggin
RA; FGF7; Вит. С.
T3
FGF7; LDN-193189; SANT; TPB; RA и Вит. C
Инг. ALK5
Т3 и инг.
ALK5
Т3 и инг. ALK5, RA
Инг. ALK5, RA, LDN
гепарин; SANT; RA; инг. ALK5; LDN; ZnSO<sub>4</sub>
Т3 и инг. ALK5
Т3; инг. ALK5 и LDN
T3, инг. ALK5, LDN и гепарин
гепарин; инг. ALK5; T3; LDN; ZnSO<sub>4</sub>
Прочие необязательные компоненты а (по меньшей мере один из перечисленных)
PKC aкт. (например, TPB); SANT-1;ROCK инг. (например Y27632)
RA; Вит. C.; SANT-1; ZnSO<sub>4</sub>; BMP инг. (например, LDN); гепарин
RA; Вит. C.; SANT-1; ZnSO<sub>4; </sub>BMP инг. (например, LDN); гепарин
Продолжительность (дней)
Приблизительно 2-5 дней; предпочтительно около 3 дней
Приблизительно 2-3 дня, предпочтительно около 2 дней
Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 2 дней
Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней
Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней
Приблизительно 3-15 дней; предпочтительно около 7-15 дней
Тип культуры
Планарная
Планарная
Планарная
Планарная (воздушно-жидкостная зона взаимодействия не в обязательном порядке в конце стадии 4)
Воздушно-жидкостная зона взаимодействия (Фильтр)
Воздушно-жидкостная зона взаимодействия (Фильтр)
<sup>а</sup> исключены из списка, если упомянуты в категории «с по меньшей мере»
Таблица XII ниже иллюстрирует альтернативные примеры культуральных условий, пригодных для применения в вариантах осуществления способов настоящего изобретения.
Таблица XIIIПримеры культуральных условий, пригодных для применения в вариантах осуществления способов настоящего изобретения.
Стадия 1
Стадия 2
Стадия 3
Стадия 4
Стадия 5
Стадия 6
Обработка
Плюрипотентные стволовые клетки
клетки стадии 1
клетки стадии 2
клетки стадии 3
клетки стадии 4
Стадия 5
С по меньшей мере
GDF8 иMCX
FGF7 иВит. С
FGF7; RA; SANT; TPB; LDN и Вит. C
FGF7; LDN; SANT; TPB; RA и Вит. C
гепарин; SANT; RA; инг. ALK5; LDN; ZnSO<sub>4</sub>
гепарин; инг. ALK5; T3; LDN; ZnSO<sub>4</sub>
Примерные объемы
~100 нг/мл GDF8 и~1.0 мкM MCX день 1~100 нM MCX на день 2
~25 нг/мл FGF7; ~0,25 мМ Вит. C
~25 нг/мл FGF7; ~1 мкM RA~0,25 мкM SANT~200 нM TPB~100 нM LDN~0,25 мM Вит. C
~2 нг/мл FGF7; ~100 нM LDN~0,25 мкM SANT~100 нM TPB~100 нM RA~0,25 мM Вит. C
~0,25 мкM SANT~50 нM RA~10000 нM инг. ALK5~100 нM LDN~10 мM ZnSO<sub>4</sub>
~10 мкг/мл гепарина; ~10000 нM инг. ALK5~1 мкM T3~100 нM LDN~10 мM ZnSO<sub>4</sub>
Продолжительность (дней)
Приблизительно 2-5 дней; предпочтительно около 3 дней
Приблизительно 2-3 дня, предпочтительно около 2 дней
Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 2 дней
Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней
Приблизительно 2-4 дня, предпочтительно около 3 дней
Приблизительно 3-15 дней; предпочтительно около 7-15 дней
Тип культуры
Планарная
Планарная
Планарная
Планарная
Воздушно-жидкостная зона взаимодействия (Фильтр)
Воздушно-жидкостная зона взаимодействия (Фильтр)
Как детально описано выше, настоящее изобретение представляет, inter alia, способ формирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для бета-клеток, включая дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для бета-клеток, путем обработки средой, обогащенной Т3/Т4 или ингибитором ALK5, или и Т3/Т4 и ингибитором ALK5, и культивирования в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. В одном из вариантов осуществления только клетки стадии 4-6 путем культивируются в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Клетки стадии 6 могут быть положительными для NKX6.1, PDX1 и НВ9. Соответственно, изобретение также представляет способ включения экспрессии PDX1, NKX6.1 и НВ9 в клетки, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, включающий: (а) культивирование плюрипотентных стволовых клеток; (b) дифференцировку плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки; и (с) дифференцировку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для клеток энтодермы передней кишки, в клетки, экспрессирующие PDX1, NKX6.1 и НВ9, путем обработки средой, обогащенной Т3/Т4, ингибитором ALK5 или и Т3/Т4 и ингибитором ALK5, и культивированием в воздушно-жидкостной зоне взаимодействия. Далее, полученные клетки стадии 6 могут быть клетками, положительными для одного гормона. В одном из вариантов осуществления клетки стадии 6 со-экспрессируют NKX6.1 и хромогранин-А. В другом варианте осуществления клетки стадии 6 со-экспрессируют NKX6.1 и инсулин.
В определенных вариантах осуществления способ включает обработку клеток стадии 5 средой, обогащенной Т3/Т4 и ингибитором ALK5, например ингибитором ALK5 II. В этих вариантах осуществления среда может быть обогащена одним или несколькими из следующих компонентов: ретиноевая кислота, аскорбиновая кислота, SANT-1 или LDN-139189.
Хотя изобретение было описано и проиллюстрировано ссылками на различные конкретные материалы, процедуры и примеры, следует понимать, что изобретение не ограничивается конкретными комбинациями материалов и процедур, выбранными для этой цели. Многочисленные изменения, касающиеся таких деталей изобретения, будут очевидными для специалистов в данной области техники. Подразумевается, что все описания и примеры представлены только в качестве иллюстрации и находятся в пределах сущности и объема настоящего изобретения, что отражено в нижеприведенной формуле изобретения. Все ссылки, патенты и заявки на патенты, приведенные в этой заявке, полностью включены в этот документ путем отсылки.