Способ выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени
METHOD FOR DETECTION OF BOVINE LEUKOSIS VIRUS (BLV) PROVIRUS DNA IN FOOD BY REAL-TIME POLYMERASE CHAIN REACTION

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к лабораторной диагностике возбудителей инфекционных заболеваний, а также к практике ветеринарной службы.
Известен способ выявления вируса лейкоза КРС по нуклеотидным последовательностям консервативных областей вирусного генома с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (патент РФ №2521330, кл. C12Q 1/68, G01N 33/569, 2013 г.), включающий выделение ДНК вируса лейкоза из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку полимеразной цепной реакции - с добавлением внутреннего положительного контроля и проведением последовательно 40 циклов амплификации с флуоресцентной детекцией в реальном времени с использованием специфичных для участка генома возбудителя олигонуклеотидных праймеров, флуоресцентно-меченного зонда, положительного и отрицательного контрольных образцов, измерение накопления флуоресцентного сигнала по каналам соответствующих флуоресцентных красителей для специфического сигнала и сигнала внутреннего контроля и интерпретацию результатов на основании наличия/отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией.
Известно использование для диагностики эндогенного внутреннего контроля, для снижения доли ошибочных результатов ПЦР в тест-системе «ЛЕЙКОЗ» для выявления вируса лейкоза КРС методом ПЦР (http://www.interlabservice.ru/upload/iblock/195/Leykoz.MANUAL.150413.pdf, 2015 г.).
В качестве такого контроля используют фрагмент гена α-актина КРС с присутствием специфической полосы на электрофореграмме на уровне 582 п.н.
Недостатком применения фрагмента гена α-актина КРС в качестве эндогенного внутреннего контроля является то, что он не является видоспецифичным для КРС, так как встречается и у других видов животных и имеет высокий уровень структурного сходства (более 90% идентичности) у разных видов позвоночных животных. Это снижает надежность его использования в целях внутреннего контроля ПЦР при исследовании биологического материала для выявления вируса лейкоза КРС, поскольку не дает достаточных оснований утверждать, что в исследуемом образце амплифицируется именно фрагмент ДНК КРС.
3
Наиболее близким техническим решением является изобретение (патент РФ №2700245, кл. C12Q 1/68, 2019 г.) включающий выделение ДНК из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением циклов амплификации с детекцией с использованием специфичных для участка генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей, положительных и отрицательных контролей, внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, положительного контрольного образца, представляющего собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и фрагмент генома бактериофага Т4, со следующими нуклеотидными последовательностями:
измерение по каналу JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и по каналу FAM/Green - сигнала внутреннего контрольного образца, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, ДНК провируса лейкоза присутствует, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, ДНК провируса лейкоза отсутствует, то результат реакции - отрицательный.
Общим недостатком известных технических решений является отсутствие возможности получения достоверной диагностики выявления генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания животного происхождения.
Техническим результатом заявляемого технического решения является получение достоверной диагностики выявления генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания и в сырье для их приготовления животного происхождения.
3
Технический результат достигается тем, что в способе выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, включающем выделение ДНК из биологического материала от инфицированных животных сорбционным методом, постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением циклов амплификации с детекцией с использованием положительных и отрицательных контролей, внутреннего экзогенного контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл, положительного контрольного образца, представляющего собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома вируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и фрагмент генома бактериофага Т4, специфичных для участка генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и генома бактериофага Т4, а также олигонуклеотидных праймеров, зондов со следующими нуклеотидными последовательностями:
измерение по каналу JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и по каналу FAM/Green - сигнала внутреннего контрольного образца, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, ДНК провируса лейкоза присутствует, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, ДНК провируса лейкоза отсутствует, то результат реакции - отрицательный, согласно изобретению в качестве биологического материала используют пробы продуктов и сырья животного происхождения, а в смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и фрагмент генома бактериофага Т4 добавляют фрагмент гена бета-актина крупного рогатого скота, который используют в качестве эндогенного внутреннего контроля с праймерами, имеющими следующие нуклеотидные последовательности:
при этом все фрагменты геномов и ген бета-актина крупного рогатого скота, входящие в смесь положительного контрольного образца взяты в равных частях, а для эндогенного внутреннего контроля используют флуоресцентный краситель - ROX.
Новизна заявляемого технического решения заключается в том, что для повышения точности выявления генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания животного происхождения используют фрагмент гена бета-актина крупного рогатого скота в качестве эндогенного внутреннего контроля.
Признаки, отличающие заявляемое техническое решение от прототипа, направлены на достижение технического результата и не выявлены при изучении данной и смежной областей науки и техники и, следовательно, соответствуют критерию «изобретательский уровень».
Заявляемый способ рекомендовано использовать в ветеринарной службе, для выявления генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания, что соответствует критерию «промышленная применимость».
Способ выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания осуществляют следующим образом
Предварительно сорбционным методом выделяют из биологического материала, в качестве которого использованы пробы продуктов питания или сырья для их приготовления животного происхождения геном провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV), взятый от животных.
3
Далее проводят постановку одноэтапной полимеразной цепной реакции - с одновременным проведением циклов амплификации с детекцией с использованием специфичных для участка генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) олигонуклеотидных праймеров, зондов, красителей, положительных и отрицательных контролей, внутреннего контрольного образца в виде суспензии бактериофага Т4 с концентрацией 5×10 копий нуклеотидных последовательностей на 1 мкл и положительного контрольного образца, представляющего собой смесь рекомбинантных плазмидных ДНК, содержащих фрагмент генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV), фрагмент генома бактериофага Т4 и фрагмент гена бета-актина крупного рогатого скота, который используют в качестве эндогенного внутреннего контроля, при этом все фрагменты геномов и гена, входящие в смесь положительного контрольного образца взяты в равных частях со следующими нуклеотидными последовательностями:
Затем измеряют по каналу JOE(HEX)/Yellow накопление флуоресцентного сигнала для специфического сигнала тестирования наличия генома провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) и по каналу FAM/Green - сигнала внутреннего контрольного образца, а для эндогенного внутреннего контроля используют канал - ROX/Orange, если кривые накопления флуоресцентного сигнала выходят до 35 цикла, то результат реакции считается положительным, ДНК провируса лейкоза присутствует, а если кривые не пересекают пороговую линию или пересекают ее после 35 цикла, ДНК провируса лейкоза отсутствует, то результат реакции - отрицательный.
Ген бета-актина является белком, синтезирующийся практически во всех клетках организма и отвечающий за их подвижность.
Использование для положительного контрольного образца гена бета-актина крупного рогатого скота в качестве эндогенного внутреннего контроля обусловлено тем, что обеспечивается возможность контролировать корректное прохождение реакции в каждой пробирки, а также контролируется этап выделения ДНК из образцов.
Выбор последовательности и расчет первичной структуры олигонуклеотидных праймеров и зондов.
Праймеры, специфичные для ДНК Bovine leukosis virus были отобраны на основе консервативного участка гена "pol" (Bovine leukemia virus complete genome, AF033818.1) и спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems). С помощью BLAST праймеры были проверены на отсутствие гомологии с последовательностями других вирусов и генома человека. Термодинамический анализ выбранных праймеров был выполнен с помощью Vector NTI. Расчетная длина специфического фрагмента составила 98 пар нуклеотидов.
Для детекции продуктов амплификации был подобран олигонуклеотидный флуоресцентно-меченный зонд TMBLV-P (комплементарный участку нук-леотидной последовательности, ограниченной позициями отжига праймеров TMBLV-F и TMBLV-R). Зонд был помечен красителем R6G. Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3"-конце олигонуклеотидного зонда прикреплен гаситель BHQ-1. Основные свойства рассчитанных олигонуклеотидов, определившие возможность их использования в ПНР были описаны с помощью программы "Oligo 6.0".
В качестве внутреннего контрольного образца использовался бактериофаг Т4, имеющий геномную ДНК порядка 169-170 тысяч пар нуклеотидов (Enterobacteria phage Т4Т, complete genome GenBank: HM137666.1). В результате анализа был выбран участок между 400 и 500 нуклеотидами, содержащий уникальные нуклеотидные последовательности, рассчитаны первичные структуры олигонуклеотидных праймеров, фланкирующих выбранный участок генома. Праймеры были спроектированы с использованием Primer Express Software v3.0 (Applied Biosystems) и исследованы с использованием BLAST, чтобы подтвердить их специфичность.
Для использования в качестве эндогенного внутреннего контроля разработаны праймеры на участок гена бета-астина, на основе референсной последовательности NCBI [ВТ030480 1776 bp mRNA linear МАМ 04-MAY-2007 DEFINITION Bos taurus actin, beta (ACTB), mRNA, complete cds.]. Зонд на 3'-конце помечен флуоресцентным красителем РОХ. Для гашения самопроизвольной флуоресценции на 3'-конце олигонуклеотидного зонда (АС-Р) поставлен гаситель BHQ-2.
Пример конкретного осуществления способа выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания
Список сокращений, используемых в примере:
ВКО - внутренний контрольный образец
К- - отрицательный контроль
ВК- - отрицательный контроль этапа экстракции
К+ - положительный контроль
ОКО - отрицательный контрольный образец
ПКО - положительный контрольный образец
ПЦР РВ - полимеразная цепная реакция с флуоресценной детекцией в режиме реального времени
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
НК - нуклеиновая кислота
BLV - Bovine leukosis virus
Для исследования пробы продуктов или сырье для их приготовления животного происхождения, гомогенизируют с использованием стерильных фарфоровых ступок и пестиков, затем готовят 10% суспензию на стерильном физиологическом растворе или фосфатном буфере. Суспензию переносят в пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируют при 10-12 тыс. об./мин в течение 2 минут. Надосадочную жидкость используют для экстракции НК. В некоторых случаях образовавшуюся суспензию не центрифугируют, а отстаивают при комнатной температуре в течение 5 мин, затем верхнюю фазу по 0,4-0,5 мл переносят пастеровской пипеткой (или наконечником с аэрозольным барьером) в пробирки на 1,5 мл, и в количестве 0,1 мл используют для выделения НК.
Молоко в объеме до 10 мл центрифугируют при 3 тыс. об/мин в течение 10-15 мин. Надосадочную жидкость осторожно отбирают, оставив над осадком примерно 0,2 мл жидкости. Осадок ресуспендируют в оставшейся надосадочной жидкости и 0,1 мл суспензии используют для выделения ДНК.
Затем проводят исследование с помощью наборов реагентов «ПЦР-ЛЕЙКОЗ-FOOD-ФАКТОР», состоящие из комплекта реагентов для проведения мультиплексной ПЦР РВ (комплект №1) и комплекта контрольных образцов (комплект №2).
Набор выпускается в двух вариантах:
• Для анализа 55 образцов (включая контрольные образцы).
• Для анализа 110 образцов (включая контрольные образцы).
Наборы используются в соответствии инструкции ТУ 21.10.60-250-51062356-2021 Для диагностики in vitr (http://www.vetfaktor.ru/.)
Состав набора приведен в таблицах 1 и 2.
В набор не входят реактивы для экстракции нуклеиновых кислот.
Выделение ДНК может проводиться, например, с помощью наборов на основе сорбционного метода, в состав которых входит силика или микроцентрифужные колонки, и также наборов на основе фенол-хлороформной экстракции и т.п. Исследования состоят из 3-х этапов:
- экстракция НК;
- проведение ПНР РВ;
- учет результатов анализа.
Для экстракции ДНК из продуктов питания рекомендуется использовать комплект реагентов «ДНК-ПЛАНТ-ФАКТОР» по инструкции (или аналогичный) https://www.vetfaktor.ru/products/nabory-dlya-vydeleniya-nk/gmo-s-factor-kat-edp001-vet-55-prob.html.
2
Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок объемом 1,5 мл, включая отрицательный контроль выделения. Внести во все пробирки с исследуемыми образцами, включая пробирку для ОКО, по 10 мкл ВКО BLV-F (суспензия бактериофага Т4). Внести исследуемые пробы в объеме согласно инструкции к набору для выделения НК, в пробирку отрицательного контроля выделения (ВК-) вместо исследуемой пробы внести ОКО (Вместо ОКО допускается использование физиологического раствора, ТЕ-буфера, дистиллированной воды. Реагенты должны быть чистыми и стерильными. Запрещается использовать забуференный физиологический раствор!) (пробирку обозначить как ВК-).
Выделять НК из анализируемых и контрольных образцов согласно протоколу инструкции производителя набора для выделения НК.
Выделенную ДНК можно хранить в течение одной недели при температуре от 2°С до 8°С или в течение года при температуре не выше минус 16°С.
Для проведения ПЦР осуществляют подготовку образцов, при этом общий объем реакционной смеси - 25 мкл, объем ДНК-пробы - 10 мкл.
Успешное прохождение реакции контролируют использованием ПКО BLV-F, ВКО BLV-F и ДНК буфера.
В отдельной пробирке смешать компоненты набора из расчета на каждую реакцию ПЦР:
5 мкл ПЦР СМЕСЬ BLV-F;
10 мкл смеси ПЦР БУФЕР BLV-F;
0,5 мкл TAQ POLYMERASE
Перемешать смесь на вортексе и сбросить капли кратковременным центрифугированием.
Отобрать необходимое количество пробирок для амплификации ДНК исследуемых и контрольных проб. Внести по 15 мкл приготовленной реакционной смеси.
Используя наконечники с фильтром в подготовленные пробирки внести:
а) в пробирку отрицательного контроля ПЦР (К-) 10 мкл ДНК буфера;
б) в ряд пробирок для исследуемых проб - в каждую внести по 10 мкл ДНК соответствующей пробы, полученной по п. 7.1 (включая пробу ВК-);
в) в пробирку с положительным контролем ПЦР (К+) 10 мкл ПКО BLV-F.
Далее проводят реакцию ПЦР РВ с флуоресцентной детекцией на приборе «Rotor-Gene Q».
Параметры температурно-временного режима амплификации на этом приборе представлены в таблице 3.
Поместить подготовленные для проведения ПЦР пробирки в ячейки амплификатора. Запрограммировать прибор согласно инструкции производителя этого прибора.
Интерпретация результатов анализа
Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала анализируются с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией производителя к прибору.
Учет результатов ПЦР-анализа проводится по наличию или отсутствию пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию или отсутствию значения порогового цикла «Ct» для исследуемого образца).
Результат считается достоверным в случае корректного прохождения положительных и отрицательных контролей амплификации и экстракции ДНК в соответствии с таблицей 4.
Появление любого значения Ct в таблице результатов для отрицательного контроля этапа экстракции ВК- на канале JOE(HEX)/Yellow и для отрицательного контроля этапа ПЦР К- на любом из каналов свидетельствует о наличии контаминации реактивов или образцов. В этом случае результаты анализа по всем пробам считаются недействительными. Требуется повторить анализ всех проб, а также предпринять меры по выявлению и ликвидации источника контаминации (рекомендуется поставить смывы).
Образцы, для которых по каналу FAM/Green значение Ct отсутствует или превышает 32 цикл (и при этом по каналу JOE(HEX)/Yellow отсутствует значение Ct) требуют повторного проведения исследования с этапа ПЦР. Задержка в значениях пороговых циклов для исследуемых образцов на канале FAM/Green указывает на присутствие ингибиторов в пробе(ах) или на ошибки при экстракции ДНК или при постановке реакции. Требуется провести исследование, начиная с этапа экстракции ДНК.
Если для выделенных образцов по каналу ROX/Orange значение Ct отсутствует или превышает 32 цикл, повторно проводят исследования с этапа выделения ДНК. Задержка в значениях пороговых циклов может указывать на не корректный забор материала и отсутствие ДНК КРС.
Образец считается положительным (ДНК провируса лейкоза КРС присутствует) если наблюдается экспоненциальный рост сигнала на канале JOE(HEX)/Yellow, при этом значения Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (табл. 4). Если для исследуемого образца по каналу JOE(HEX)/Yellow значение Ct определяется позднее 32 цикла при корректном прохождении положительных и отрицательных контролей - он считается спорным и исследуется повторно с этапа выделения НК. Если при повторной постановке наблюдается схожий результат (Ct на канале JOE(HEX)/Yellow более 32), требуется повторное взятие материала от того же животного для проведения ПЦР-исследования и (или) использование альтернативных методов диагностики.
В случае получения значения Ct на канале JOE(HEX)/Yellow менее 32 при исследовании повторно взятого от животного материала - образец считать положительным.
Образец считается отрицательным (ДНК провируса лейкоза КРС отсутствует), если не наблюдается рост сигнала флуоресценции на канале JOE(HEX)/Yellow, при этом значения Ct по каналам ROX/Orange и FAM/Green и Ct контрольных образцов находятся в пределах нормы (Табл. 4).
Для доказательства эффективности выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (Bovine leukosis virus, BLV) в продуктах питания методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени проводился сравнительный анализ чувствительности заявляемого с прототипом. Оказалось, что чувствительность ПЦР с флуоресцентной детекцией при обнаружении ДНК провируса лейкоза КРС в продуктах питания на 2,8-3,4% выше, чем в прототипе.