Способ создания удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (Brassica oleracea L.) в культуре изолированных микроспор
METHOD FOR CREATING DOUBLED HAPLOIDS OF WHITE CABBAGE (BRASSICA OLERACEA L.) IN A CULTURE OF ISOLATED MICROSPORES

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии и может быть использовано для снижения трудозатрат и себестоимости при производстве удвоенных гаплоидов капусты белокочанной (B. oleracea L.) в культуре изолированных микроспор.
Известные способы получения удвоенных гаплоидов в культуре изолированных микроспор у капусты белокочанной (Plant Cell Tiss Organ Cult, 2012, 110, pp. 69-76, DOI: 10.1007/s11240-012-0131-z, Romanian Biotechnological Letters, 2013, 18, pp. 8677-8684, DOI - нет). Использование питательной среды на этапе выделения, очистки и индукции эмбриогенеза делает технологию более дорогой.
4
Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому решению является технология производства эмбриоидов Plant Cell Tiss Organ Cult, 2012, 110, pp. 69-76, DOI: 10.1007/s11240-012-0131-z. Выделение микроспор из пыльников проводят в охлажденной до 4°С питательной среде В5 (Gamborg et al., 1968) с добавлением 130 г/л сахарозы, рН 5,8. После этого микроспоры очищают фильтрованием через двухслойный нейлоновый фильтр с диаметром пор 45 мкм, и троекратным центрифугированием суспензии микроспор при 4°С, 1000 оборотов/мин. в течение трех минут, заменяя питательную среду на свежую после каждого цикла. После последнего цикла центрифугирования микроспоры ресуспендируют в 2 мл охлажденной до 4°С среды NLN-13 (Lichter, 1982) с добавлением 130 г/л сахарозы, рН 5,8. Плотность микроспор определяют в камере Фукса-Розенталя и средой NLN-13 с добавлением 130 г/л сахарозы и рН 5,8 доводят плотность микроспор в суспензии до 4×10 микроспор/мл. Суспензию микроспор разливают в чашки Петри диаметром 60 мм по 3 мл. Чашки Петри с суспензией микроспор инкубируют в темноте в течение 72 ч. при 32±0,1°С, или 24 ч. при 32±0,1°С, затем температуру снижают до 25±1°С и продолжают инкубировать в темноте до появления эмбриоидов.
Использование питательной среды NLN-13 для выделения и очистки микроспор делает технологию производства удвоенных гаплоидов более трудоемкой и дорогостоящей, так как используется холодная фильтр-стерилизация питательной среды. Выделение и очистка микроспор с использованием питательной среды В5 с добавлением маннитола менее трудоемко и менее затратно, чем использование среды NLN-13, так как для ее стерилизации используется автоклавирование и не требуется использование дорогостоящих одноразовых стерильных фильтров и шприцов. В среднем выделение и очистка микроспор одного образца с использованием питательной среды В5 (Gamborg et al., 1968) обходится в 33-35 рублей, с использованием питательной среды NLN-13 - 37-40 руб., с использованием 13%-ного раствора сахарозы - 13-15 руб., таким образом снижение себестоимости выделения, очистки микроспор и индукции эмбриогенеза может составить 60-65%.
Технический результат предлагаемого изобретения - снижение трудоемкости получения удвоенных гаплоидов капусты при снижении себестоимости процесса с сохранением частоты эмбриогенеза микроспор на уровне стандартного протокола.
4
Для решения указанной проблемы и достижения заявленного результата в способе создания удвоенных гаплоидов капусты белокочанной выделение и очистку микроспор осуществляют в 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8, индукцию эмбриогенеза осуществляют в условиях инициирующего стресса в темноте при температуре 32,5±0,1°С, инкубируя микроспоры в течение 48 часов в 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8, после воздействия инициирующего стресса питательную среду заменяют на питательную среду NLN-13, рН 5,8, затем определяют плотность микроспор, доводят ее до 4×10 микроспор/мл и инкубируют в темноте до образования эмбриоидов при 25±1°С в климатической комнате.
В предложенном способе выделение, очистка микроспор и индукция эмбриогенеза микроспор капусты белокочанной проводится в 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8, что снижает себестоимость данных этапов технологии на 70-75% и не оказывает негативного влияния на частоту эмбриогенеза микроспор капусты белокочанной.
Существенными признаками, характеризующими изобретение, являются выделение и очистка микроспор с использованием 13% раствора сахарозы, индукция эмбриогенеза в 13% растворе сахарозы в условиях стандартного инициирующего стресса в течение 48 часов при 32,5±0,5°С.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления способа.
Пример 1
4
Микроспоры 7 генотипов капусты белокочанной выделяли в охлажденном до 4°С 13%-ном растворе сахарозы, рН 5,8. После этого микроспоры фильтровали через двухслойный нейлоновый фильтр с диаметром пор 45 мкм, и троекратно центрифугировали суспензию микроспор при 4°С, 800 об/мин в течение четырех минут, заменяя раствор сахарозы на свежий после каждого цикла центрифугирования. После последнего цикла центрифугирования микроспоры ресуспендировали в пробирках объемом 15 мл в 10 мл 13% раствора сахарозы (рН 5,8) после чего инкубировали микроспоры в 13%) растворе сахарозы в темноте при температуре 32,5±0,5°С в течение 48 часов. После этого микроспоры в пробирках осаждали центрифугированием в течение 4 минут при 800 оборотов/мин., сливали надосадочную жидкость и добавляли 2 мл свежей питательной среды NLN-13 с добавлением 130 г сахарозы (рН 5,8), в которой ресуспендировали микроспоры. С помощью камеры Фукса-Розенталя определяли плотность микроспор в суспензии и доводили плотность до 4×10 микроспор/мл, питательной средой NLN-13 с добавлением 130 г сахарозы, рН 5,8. Далее суспензию микроспор разливали по чашкам Петри диаметром 60 мм по 3 мл в каждую, и инкубировали микроспоры в климатической комнате в темноте при 25±1°С до образования эмбриоидов.
Описанным выше способом были произведены эмбриоиды у следующих генотипов/образцов капусты белокочанной № 1 с, № 2 с, № 3 с, № 4 с и № 5 с.
В таблице 1 представлена частота эмбриогенеза микроспор (число эмбриоидов в 1 мл питательной среды) образцов капусты белокочанной (B. oleracea L.): 1) при использовании питательной среды В5 (рН 5,8) для выделения и очистки микроспор, и при индукции эмбриогенеза микроспор в питательной среде NLN-13 (рН 5,8) при 32,5±0,1°С в течение 48 час (контроль); 2) при использовании 13%-ного раствора сахарозы (рН 5,8) для выделения и очистки микроспор, и при индукции эмбриогенеза в 13%-ном растворе сахарозы (рН 5,8) при 32,5±0,1°С в течение 48 час.
По сравнению с прототипом предложенный способ позволяет снизить затраты этапов выделения, очистки микроспор и индукции эмбриогенеза микроспор на 63% за счет замены дорогостоящих питательных сред 13%-ном раствором сахарозы.