СИНЕРГИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ КОМБИНАЦИИ ФИТАЗ В ОТНОШЕНИИ ГИДРОЛИЗА ФИТИНОВОЙ КИСЛОТЫ
SYNERGISTIC RESULT OF PHYTASE COMBINATION IN RELATION TO PHYTIC ACID HYDROLYSIS

Изобретение относится к синергическому эффекту комбинации фитаз в отношении гидролиза фитиновой кислоты.
3+
2+
2+
2+
Соли фитиновой кислоты (миоинозитола гексакисфосфат) или фитаты (миоинозитола гексакисдигидрофосфат) представляют собой основную форму хранения фосфора в злаках, бобовых растениях и маслянистых растениях. Таким образом, они составляют основной источник фосфора в растительных кормах для животных, основные компоненты в диетах моногастрических животных (домашняя птица и свиньи). Тем не менее, биодоступность такого фосфора в кормах ограничена для этих животных. Это является следствием того, что эти животные лишены кишечных ферментов, разрушающих фитаты в достаточной степени для того, чтобы обеспечить возможность гидролиза фитатов и таким образом обеспечить требующиеся животным количества неорганического фосфата. Дополнительно, фитиновая кислота представляет собой антипитательный фактор, который образует комплексы с белками и ионами (Fe, Са, Zn, Mg) и, таким образом, уменьшает биодоступность этих элементов.
Таким образом, потребление корма домашней птицей и свиньями должно быть дополнено неорганическим фосфатом, тогда как фосфор фитатов экскретируется и вносит вклад в эвтрофикацию поверхностной воды в областях, в которых осуществляют интенсивное разведение моногастирических животных.
6
5
1
Фитазы (миоинозитола гексакисфосфата 3- и 6-фосфогидролазы ЕС 3.1.3.8 и 3.1.3.2 6) составляют часть семейства фосфатаз гистидиновой кислоты. Фитазы представляют собой гексакисфосфогидролазы, которые гидролизуют фосфоэфирные связи в фитиновой кислоте или фитате. Таким образом, они катализируют гидролиз миоинозитола гексакисфосфата (фитиновая кислота, InsP) до неорганических монофосфатов и до миоинозитола фосфатов с небольшой степенью фосфорилирования (InsP до InsP) и в некоторых случаях до свободного миоинозитола.
Существует два класса фитаз, отличающихся только позицией первого гидролизуемого фосфата. 3-Фитазы (ЕС 3.1.3.8) гидролизуют фосфат в 3-позиции, а 6-фитазы (ЕС 3.1.3.26) гидролизуют фосфат в 6-позиции.
Эти ферменты, при использовании в качестве добавок при кормлении животных, позволяют, во-первых, увеличить доступность фосфора фитиновой кислоты и, во-вторых, улучшить перевариваемость кормов. Помимо этого, высвобождение фосфата фитиновой кислоты значительно уменьшает затраты, обусловленные обогащением фосфатами, а также загрязнение, вызванное избытком экскретируемых фосфатов.
Фитазы продуцируются большим количеством различных организмов: растениями, животными и в особенности микроорганизмами. Эти фитазы обладают различными биохимическими характеристиками, в частности их активность зависит от рН и их температурной стабильности. Помимо этого, эти ферменты демонстрируют различия с точки зрения: (а) их эффективности при гидролизе всех фосфатов, (б) их стереоспецифичности и (в) их аффинности в отношении инозитолфосфатов.
Среди микроорганизмов, продуцирующих фитазы, в частности, можно упомянуть: грибы родов Aspergillus, Penicillium, Mucor и Rhizopus, бактерии: Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Escherichia coli, Enterobacter sp., Bacillus subtilis и дрожжи: Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Torulopsis Candida, Debaryomyces castellii, Debaryomyces occidentalis (синоним Schwanniomyces castellii), Kluyveromyces fragilis.
Множество фитаз микроорганизмов уже изучено и используется в различных агропромышленных областях. Эффективность этих ферментов при кормлении и в процессе расщепления в организме животных зависит от их способности сохранять свою силу независимо от различных условий, которые могут иметь место на различных стадиях приготовления кормов и в пищеварительном тракте. Для приготовления этих кормов требуются терморезистентные ферменты, тогда как диапазон значений рН составляет, например, от 5,02, 2,75, 6,28, 6,63 до 5,98 во время прохождения через зоб, желудок, двенадцатеперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку домашней птицы.
Большинство описанных до настоящего времени фитаз лишь частично гидролизуют фитиновую кислоту, причем некоторые с очень медленной кинетикой. Таким образом, многие фитазы гидролизуют лишь 5-фосфатные связи фитиновой кислоты, т.е. 83% возможного фосфора.
До настоящего времени у дрожжей только фитаза дрожжей Schwanniomyces occidentalis описана как способная гидролизовать все фосфатные связи фитата (ЕР 0699762 и Segueilha L., Lambrechts C., Boze H., Moulin G., Galzy P. (1992) Purification and properties of a phytase from Schwanniomyces castellii, J. Perm. Bioeng., 74, 7-11).
Тем не менее, в экспериментальных условиях не достигают полного гидролиза фитата или фитиновой кислоты.
Таким образом, для достижения более эффективного гидролиза фитиновой кислоты предложено комбинировать различные фитазы.
В WO 98/30681 описана комбинация фитаз, обладающих различными стереоспецифичностями, и в частности комбинация 3-фитазы и 6-фитазы. В этом документе описана, в частности, комбинация 6-фитазы Peniophora lycii и 3-фитазы Aspergillus niger (фитаза Novo™).
В US 6183740 также описана комбинация фитаз, обладающих различными специфичностями, и также комбинация с другими кислыми фосфатазами.
Тем не менее, полный гидролиз фитиновой кислоты до фосфата и инозитола не наблюдается.
Проблема, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в улучшении степени и эффективности гидролиза фитиновой кислоты для достижения полного гидролиза фитиновой кислоты при различных агропромышленных применениях.
Эту проблему решают при помощи композиций и способов по настоящему изобретению, в которых комбинируют по меньшей мере две специфические фитазы. Предпочтительно, композиции по настоящему изобретению обеспечивают полный гидролиз всех фосфатных групп фитиновой кислоты благодаря наблюдающемуся синергическому эффекту. Предпочтительно, композиции по настоящему изобретению активны в широком диапазоне рН, подходящем для агропромышленного применения фитаз, и в частности для применения в области кормления животных. Еще одно преимущество настоящего изобретения заключается в том, что используемые фитазы являются термостабильными.
Описание оследовательностей
SEQ ID No.1: фитаза Schwanniomyces castellii.
SEQ ID No.2: фитаза Debaryomyces castellii.
SEQ ID No.3: фитаза Aspergillus niger.
SEQ ID No.4: фитаза Penicillium funiculosum.
SEQ ID No.5: фитаза Peniophora lycii.
SEQ ID No.6: Последовательность, кодирующая фитазу пшеницы.
SEQ ID No.7: Фитаза пшеницы (Triticum aestivum).
Описание изобретения
Объектом изобретения является композиция, включающая по меньшей мере две фитазы, для гидролиза фитиновой кислоты (миоинозитол 1,2,3,4,5,6-гексакисфосфат), содержащая:
- первую фитазу, демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с фитазой согласно SEQ ID No.1 или демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с фитазой согласно SEQ ID No.2;
- вторую фитазу, демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с фитазой согласно SEQ ID No.3.
Предпочтительно, первая фитаза представляет собой 3-фитазу, которая катализирует гидролиз шести фосфатных связей фитиновой кислоты.
Предпочтительно, первая фитаза имеет температурный оптимум в пределах от 55°С до 80°С и оптимум рН в пределах от рН 3,5 до рН 5.
В предпочтительном воплощении первая фитаза представляет собой фитазу дрожжей Schwanniomyces castellii или фитазу дрожжей Debaryomyces castellii.
В еще одном предпочтительном воплощении первая фитаза представляет собой фитазу согласно SEQ ID No.1 или фитазу согласно SEQ ID No.2.
Предпочтительно вторая фитаза представляет собой 3-фитазу, которая катализирует гидролиз по меньшей мере пяти фосфатных связей фитиновой кислоты.
Предпочтительно вторая фитаза имеет температурный оптимум от 50°С до 60°С и оптимум рН от рН 2 до рН 6.
В предпочтительном воплощении вторая фитаза представляет собой фитазу Aspergillus niger.
В еще одном предпочтительном воплощении вторая фитаза представляет собой фитазу согласно SEQ ID No.3.
Предпочтительно композиции по изобретению состоят из кормовой добавки для животных или корма для животных.
Объектом изобретения также является применение композиции по изобретению для изготовления кормовой добавки для животных или корма для животных.
Объектом изобретения также является применение композиции по изобретению для увеличения доступности фосфора фитиновой кислоты и улучшения перевариваемости кормов животными.
Настоящее изобретение также относится к способу гидролиза фитиновой кислоты (миоинозитола 1,2,3,4,5,6-гексакисфосфат) до неорганических монофосфатов, до миоинозитолов, имеющих меньшую степень фосфорилирования, и до свободного миоинозитола, включающего следующие стадии:
- обеспечивают наличие первой фитазы, демонстрирующей по меньшей мере 80% идентичность с фитазой согласно SEQ ID No.1, или демонстрирующей по меньшей мере 80% идентичность с фитазой согласно SEQ ID No.2;
- обеспечивают наличие второй фитазы, демонстрирующей по меньшей мере 80% идентичность с фитазой согласно SEQ ID No.3;
- фитиновую кислоту одновременно приводят в контакт с первой фитазой и второй фитазой.
Предпочтительно первая фитаза представляет собой 3-фитазу, которая катализирует гидролиз шести фосфатных связей фитиновой кислоты.
Предпочтительно первая фитаза имеет температурный оптимум от 55°С до 80°С и оптимум рН от рН 3,5 до рН 5.
В предпочтительном воплощении первая фитаза представляет собой фитазу дрожжей Schwanniomyces castellii или фитазу дрожжей Debaryomyces castellii.
В особенно предпочтительном воплощении первая фитаза представляет собой фитазу согласно SEQ ID No.1 или фитазу согласно SEQ ID No.2.
Предпочтительно вторая фитаза представляет собой 3-фитазу, которая катализирует гидролиз по меньшей мере пяти фосфатных связей фитиновой кислоты.
Предпочтительно вторая фитаза имеет температурный оптимум от 50°С до 60°С и оптимум рН от рН 2 до рН 6.
В предпочтительном воплощении вторая фитаза представляет собой фитазу Aspergillus niger.
В особенно предпочтительном воплощении вторая фитаза представляет собой фитазу согласно SEQ ID No.3.
Объектом изобретения также является набор или комплект для кормления животных, включающий:
фитазу Schwanniomyces castellii согласно SEQ ID No.1 или фитазу Debaryomyces castellii согласно SEQ ID No.2;
фитазу Aspergillus niger согласно SEQ ID No.3.
Композиции по изобретению включают первую фитазу, демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с фитазой согласно SEQ ID No.1 или демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с фитазой согласно SEQ ID No.2, и вторую фитазу, демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с фитазой согласно SEQ ID No.3.
Неожиданно оказалось, что эта специфическая комбинация фитаз дает возможность достичь синергического эффекта в отношении гидролиза фитиновой кислоты. Таким образом, композиции по изобретению катализируют быстрый и полный гидролиз фитиновой кислоты в широком диапазоне рН.
6
5
1
Имеется в виду, что термин "фитаза" обозначает миоинозитол гексакисфосфата фосфогидролазы (ЕС 3.1.3.8 и 3.1.3.26). Эти ферменты катализируют гидролиз миоинозитола 1,2,3,4,5,6-гексакисфосфата (фитиновой кислоты, InsP) до неорганических монофосфатов и до миоинозитола фосфата с меньшей степенью фосфорилирования (InsP до InsP) и до свободного миоинозитола для некоторых фитаз.
Композиции по изобретению содержат первую фитазу, демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с фитазой согласно SEQ ID No.1 или демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с фитазой согласно SEQ ID No.2.
Фитаза согласно SEQ ID No.1 представляет собой фитазу дрожжей Schwanniomyces castellii, тогда как фитаза согласно SEQ ID No.2 представляет собой фитазу дрожжей Debaryomyces castellii.
Эти фитазы обладают очень близкими каталитическими свойствами и, таким образом, взаимозаменяемы в комбинациях фитаз по изобретению.
Предпочтительно первая фитаза демонстрирует по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 98% и предпочтительно по меньшей мере 99% аминокислот, идентичных с фитазой согласно SEQ ID No.1, или демонстрирует по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 98%, и предпочтительно по меньшей мере 99% аминокислот, идентичных с фитазой согласно SEQ ID No.2.
Предпочтительно первая фитаза обладает теми же самыми свойствами и, в частности, теми же самыми каталитическими свойствами, что и фитазы согласно SEQ ID No.1 и SEQ ID No.2. Предпочтительно первая фитаза выделена из других штаммов Schwanniomyces castellii или Debaryomyces castellii, или из других дрожжей. Альтернативно, первая фитаза может быть получена, например, при помощи способов сайт-направленного мутагенеза.
Имеется в виду, что выражение "аминокислоты, являющиеся идентичными" обозначает аминокислоты, которые не различаются у двух последовательностей. Первая фитаза может демонстрировать делецию, вставку или замену по меньшей мере одной аминокислоты по сравнению с фитазой согласно SEQ ID No.1 или согласно SEQ ID No.2.
Фитазы согласно SEQ ID No.1 и согласно SEQ ID No.2 обладают общими каталитическими свойствами. В соответствии с изобретением первая фитаза, используемая в композициях и способах по изобретению, демонстрирует некоторую степень идентичности с фитазой согласно SEQ ID No.1 или SEQ ID No.2 и сохраняет эти общие каталитические свойства.
Предпочтительно первая фитаза обладает 3-фитазной активностью. Предпочтительно первая фитаза катализирует гидролиз шести фосфатных связей фитиновой кислоты.
3-Фитазы (ЕС 3.1.3.8) гидролизуют фосфат сначала в 3-позиции.
6
Фитаза, способная гидролизовать все фосфатные связи фитиновой кислоты (1-, 2-, 3-, 4-, 5- и 6-позиции) катализирует гидролиз миоинозитола 1,2,3,4,5,6-гексакисфосфата (фитиновая кислота, InsP) до неорганических монофосфатов и до свободного миоинозитола.
Множество фитаз гидролизуют только 5 фосфатных связей фитиновой кислоты, т.е. 83% потенциального фосфора. Эти ферменты гидролизуют фитиновую кислоту до миоинозитола монофосфата, но не до свободного миоинозитола.
Имеется в виду, что выражение "активность фитазы" обозначает ферментативную активность фитазы. Эту активность выражают в Международных единицах (Е) на миллиграмм белка. Одна Е ферментативной активности представляет собой каталитическую способность превращать один микромоль субстрата в единицу времени при заданном рН и при заданной температуре.
Предпочтительно первая фитаза имеет температурный оптимум от 55°С до 80°С и оптимум рН от рН 3,5 до рН 5.
В предпочтительном воплощении первая фитаза представляет собой фитазу дрожжей Schwanniomyces castellii или фитазу дрожжей Debaryomyces castellii.
В еще одном особенно выгодном воплощении первая фитаза представляет собой фитазу согласно SEQ ID No.1 или фитазу согласно SEQ ID No.2.
Композиции по изобретению содержат по меньшей мере вторую фитазу, демонстрирующую по меньшей мере 80% идентичность с фитазой согласно SEQ ID No.3.
Фитаза согласно SEQ ID No.3 представляет собой фитазу нитчатого гриба Aspergillus niger.
Предпочтительно вторая фитаза демонстрирует по меньшей мере 80%, 90%, 95%, 98% и предпочтительно по меньшей мере 99% аминокислот, идентичных с фитазой согласно SEQ ID No.3.
Предпочтительно вторая фитаза сохраняет свойства и, в частности, каталитические свойства фитазы согласно SEQ ID No.3. Предпочтительно эту фитазу выделяют из других штаммов Aspergillus niger или из других нитчатых грибов. Альтернативно, эта фитаза может быть получена, например, при помощи способов сайт-направленного мутагенеза.
Имеется в виду, что выражение "идентичные аминокислоты" обозначают аминокислоты, которые не отличаются у двух последовательностей. Вторая фитаза может демонстрировать делецию, вставку или замену по меньшей мере одной аминокислоты относительно фитазы согласно SEQ ID No.3.
В соответствии с изобретением вторая фитаза, применяемая в композициях и способах по изобретению, таким образом, демонстрирует определенную степень идентичности с фитазой согласно SEQ ID No.3 и сохраняет каталитические свойства последней.
Предпочтительно вторая фитаза представляет собой 3-фитазу, которая катализирует гидролиз по меньшей мере пяти фосфатных связей фитиновой кислоты.
Предпочтительно вторая фитаза имеет температурный оптимум от 50°С до 60°С и оптимум рН от рН 2 до рН 6. Более предпочтительно вторая фитаза имеет первый оптимум рН от рН 2,5 до рН 3,5 и второй оптимум рН от рН 4,5 до рН 5,5.
В предпочтительном воплощении вторая фитаза представляет собой фитазу Aspergillus niger.
В выгодном воплощении вторая фитаза представляет собой фитазу согласно SEQ ID No.3.
Ферментативная активность фитазы изменяется, в частности, в зависимости от рН. Таким образом, фитазы имеют диапазоны рН (или области), в которых их ферментативная активность является более высокой или оптимальной. Имеется в виду, что термин "диапазон" обозначает заданную область или интервал рН. Две фитазы обладают ферментативными активностями в комплементарных диапазонах рН, когда эти фитазы активны при различных диапазонах рН. Предпочтительно эти диапазоны перекрываются или частично накладываются. Как правило, фитазы обладают более высокой ферментативной активностью при кислом значении рН. Две фитазы, обладающие комплементарными диапазонами рН, таким образом, имеют, например, максимальную ферментативную активность при рН от 2 до 4 для первой фитазы и максимальную ферментативную активность при рН от 4 до 6 для второй фитазы. В композициях и способах по настоящему изобретению первая и вторая фитаза предпочтительно имеют комплементарные диапазоны рН или комплементарные оптимумы рН. Таким образом, композиции и способы по изобретению обеспечивают возможность гидролиза фитиновой кислоты в широком диапазоне рН.
Способы измерения и определения степени идентичности между полипептидами известны специалистам в данной области техники. Например, можно применять Vector NTi 9.1.0, программу совмещения AlignX (Clustal W algorithm) (Invitrogen INFORMAX, http://www.invitrogen.com). Предпочтительно используют параметры по умолчанию.
Фитазы для композиций и способов по изобретению выделяют или очищают из их природной среды. Фитазы могут быть получены при помощи различных способов. Эти способы, в частности, представляют собой очистку из природных источников, таких как клетки, в которых в природе экспрессируются эти фитазы, продукцию рекомбинантных фитаз при помощи соответствующих клеток хозяев и последующую их очистку, получение путем химического синтеза или, наконец, комбинацию этих различных подходов. Эти различные способы получения хорошо известны специалистам в данной области техники. Таким образом, фитазы, используемые в композициях и способах по настоящему изобретению, могут быть выделены из Schwanniomyces castellii, из Debaryomyces castellii или из Aspergillus niger. В еще одном воплощении фитазы по настоящему изобретению выделены из рекомбинантных организмов хозяев.
Предпочтительно композиции по изобретению состоят из кормовой добавки для животных или корма для животных.
Объектом изобретения также является применение композиции по изобретению для приготовления кормовой добавки для животных или корма для животных.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к кормовым добавкам, которые обеспечивают фитазную активность. Обеспечение этого типа ферментативной активности дает возможность улучшить перевариваемость корма и его кормовую ценность.
Имеется в виду, что термин "кормовая добавка" обозначает вещество, специально добавляемое к корму, как правило в небольших количествах, таким образом, чтобы улучшить его питательные характеристики или его перевариваемость. Кормовые добавки для животных могут, например, содержать витамины, минеральные соли, аминокислоты и ферменты.
Настоящее изобретение также относится к кормам для животных. Эти корма обычно представлены в форме муки или гранул, в которые включены добавки по изобретению. Имеется в виду, что термин "корм" обозначает все, что можно использовать для кормления животных. При интенсивном разведении животных корма для животных обычно содержат кормовое основание и кормовые добавки. Имеется в виду, что термин "кормовое основание" обозначает то, что составляет большую часть корма, потребляемого животными, и состоит, например, из смеси злаков, белков и жиров, имеющих животное и/или растительное происхождение.
Кормовые основания для животных подходят для питания этих животных и хорошо известны специалистам в данной области техники. Обычно эти кормовые основания содержат, например, кукурузу, пшеницу, горох и сою. Эти кормовые основания подходят для потребностей различных видов животных, для которых они предназначены. Эти кормовые основания уже могут содержать кормовые добавки, такие как витамины, минеральные соли и аминокислоты.
В предпочтительном воплощении изобретение относится к кормам моногастрических животных и, в частности, домашней птицы и свиней. Домашняя птица включает, в частности, кур-несушек, цыплят для мяса, индюшек и уток. Свиньи включают, в частности, растущих свиней и свиней в заключительной стадии откорма, а также поросят.
Задача изобретения также представляет собой применение композиции по изобретению для увеличения доступности фосфора фитиновой кислоты и улучшения перевариваемости кормов для животных.
В композициях и способах по изобретению комбинируют первую фитазу, способную гидролизовать все фосфатные связи фитиновой кислоты, выбранной из фитазы Schwanniomyces castellii и фитазы Debaryomyces castellii, и вторую фитазу, способную гидролизовать по меньшей мере пять фосфатных связей фитиновой кислоты, и обладающую ферментативной активностью в диапазоне рН, комплементарном диапазону рН первой фитазы.
Графические материалы
Фиг.1: Сравнение кинетики гидролиза фитиновой кислоты при различных рН для 6 фитаз по одной или комбинированных в пары. Результаты выражены в виде % от теоретического количества высвобождаемых фосфатов.
Фиг.2: Процент гидролиза фитиновой кислоты различными фитазами после реакции в течение 120 минут. (А) фитазы по одной, (Б) комбинированные фитазы. Пунктирные линии соответствуют гидролизу 5 фосфатных связей.
-1
-1
Фиг.3: Сравнение исходных скоростей гидролиза фитиновой кислоты (мкмоль. мл. мин) для 6 фитаз при различных рН. (А) фитазы по одной, (Б) комбинированные фитазы. Скорости рассчитывают в течение первых 10 минут реакции.
Примеры
Материалы и методы
1. Источники фитазы
- Aspergillus niger Natuphos (AN): партия R2503 или партия 057NPHO2
Wim van Hartingsveldt, Cora M. J. van ZeijI, G. Marian Harteveld, Robin J. Gouka, Marjon E.G. Suykerbuyk, Ruud G. M. Luiten, Peter A. van Paridon, Gerard C. M. Selten, Annemarie E. Veenstra, Robert F. M. van Gorcom and Cees A. M. J. van den Hondel; Cloning, characterization and overexpression of the phytase-encoding gene (phyA) of Aspergillus niger. Gene, 127, (1) 87-94 (1993).
- Peniophora lycii (PL): партия 172NHSO2
Lassens, S.F., Breinholt, J., Ostergaard, P.R., Brugger, R., Bischoff, A., Wyss, M. and Fuglsang, C.C.; Expression, gene cloning, and characterization of five novel phytases from four basidiomycete fungi: Peniophora lycii, Agrocybe pediades, a Ceriporia sp., and Trametes pubescens. Appl. Environ. Microbiol. 67 (10), 4701-4707 (2001).
- Penicillium funiculosum (PF): Godo A1346 партия 1301 WO 03054199.
- Пшеница (В): ссылочный номер Sigma P1259.
WO 0183763
- Schwanniomyces castellii (SC): продуцированный в Candida boidinii партия 10059 CN 25.
EP 0931837
- Debaryomyces castellii штамм CBS 2923 (DC).
2. Ферментативный способ
Фитазную активность измеряют, отслеживая высвобождение неорганического фосфата с течением времени.
Активность измеряют в присутствии 8 мМ фитата натрия (Sigma), растворенного в 200 мМ буфере ацетате натрия, рН 5,5, при 37°С (5 объемов). Реакцию запускают, добавляя ферментативный экстракт (1 объем). Реакцию останавливают, подкисляя среду 20% трихлоруксусной кислотой (1 объем реакционной среды +1 объем кислоты). Количество высвобождающегося фосфата определяют спустя разное время инкубации.
Одну ферментативную единицу (Е) определяют как количество фермента, которое приводит к высвобождению одного мкмоля неорганического фосфата за одну минуту.
3. Условия гидролиза фитатов при различных рН
Гидролиз осуществляют при 40°С в 10 мл 250 мМ ацетатного буфера для рН 4-6,5 или 200 мМ глицинового буфера при рН 3, содержащего: 0,340 мМ фитата натрия, 0,04 или 0,08 Е/мл фитазы. Образцы отбирают в различные моменты времени в течение 120 минут. Реакцию останавливают путем добавления трихлоруксусной кислоты.
Анализ фосфатов проводят непосредственно без разбавления.
4. Анализ фосфата
Количество высвободившегося фосфата визуализируют колориметрией. Визуализирующий раствор, приготовленный для немедленного применения, содержит сульфат железа (380 мМ, 1 объем) и гептамолибдат аммония (12 мМ, 4 объема). Абсорбцию измеряют при 700 нм после визуализации в течение 30 минут при температуре окружающей среды (1 объем реакционной среды +1 объем визуализирующего раствора) с использованием спектрофотометра, работающего в ультрафиолетовом (УФ)/видимом диапазоне (Beckman DU 530).
Калибровочный график предварительно строят с использованием дигидрофосфата калия.
Результаты
1. Тестируемые фитазы
Тестируемые фитазы отличаются друг от друга по различным критериям: (1) биохимические характеристики (оптимальное значение рН, стереоспецифичность: 3, 4 или 6 фитазы), (2) количество гидролизуемых фосфатных связей.
Все эти фитазы имеют оптимум рН для гидролиза, близкий к 5; тем не менее, AN и PL фитазы имеют второй оптимум рН 2,5. Три фитазы полностью гидролизуют фосфаты (SC, DC, пшеницы). Позиция, гидролизуемая первой, представляет собой 3-ю позицию (AN, PL, DC), или 6-ю позицию (PL), или 4-ю позицию (пшеница) (Таблица 1).
(1) Ullah, A.H.J. and Sethumadhavan, К., (2003) PhyA gene product of Aspergillus ficuum and Peniophora lycii produces dissimilar phytases. Biochemical and Biophysical Research Communications 303: 463-468.
(2) WO 03054199, поданная 13 июня 2003 Bohlmann, R., Moussu, F., Nore, O., Pierrard, J., Saunier, D., Testeniere, 0., New polynucleotide encoding fungal phytase, useful as feed additive to improve phosphate assimilation, also new strain of Penicillium.
(3) Nakano, Т., Joh, T., Narita, K., Hayakawa, T.(2000) The pathway of dephosphorylation of myo-lnositol Hexakisphosphate by Phytases from Wheat Bran of Tricicum aestivum L. cv Nourin#61. Biosci. Biotechnol. Biochem., 64:995-1003.
(4) Segueilha, L., Lambrechts, C, Boze, H., Moulin, G. and Galzy, P. (1992) Purification and Properties of the Phytase from Schwanniomyces castellii. J. Ferment. Bioeng. 74 (1): 7-11.
2. Сравнение эффективности гидролиза фитиновой кислоты 6 фитазами при различных рН
Исследование осуществляют в присутствии 0,340 мМ фитата. Количество вводимого фермента соответствует 0,08 Е/мл фитазы, измеренному в стандартных условиях при рН 5,5. Тестируемые значения рН составляют 3, 4, 5,5, 6, 6,5. Реакцию контролируют в течение 120 минут. Образцы отбирают в течение времени, реакцию останавливают путем подкисления и фосфаты измеряют с помощью колориметрии.
Сравнение различных фитаз осуществляют в зависимости от эффективности гидролиза, т.е. процента фосфата, высвобождаемого относительно теоретически ожидаемого процента. Результаты представлены на Фиг.1А.
В соответствии с литературой четыре фитазы (PF, SC, DC, В) способны полностью гидролизовать фитиновую кислоту до инозитола и фосфата; две фитазы (AN и PL) гидролизуют только пять связей, т.е. 83% потенциального фосфора.
В условиях испытания при рН 3 и рН 4 четыре фитазы (SC, PF, DC и PL) гидролизуют по меньшей мере 80% фитиновой кислоты. Фитаза пшеницы не имеет высокой активности при рН 3 и рН 4. При значениях рН выше 5,5 ни одна из фитаз не гидролизует больше, чем 70% фитиновой кислоты. Фитазы PF и DC не имеют высокой активности при рН 6,5. Фитаза AN наименее чувствительна к изменениям в рН; однако она высвобождает только от 60 до 70% фосфатов, т.е. значения меньше ожидаемых на 10-20% (Фиг.2А).
Сравнение исходных уровней высвобождения фосфата демонстрирует значительную гетерогенность между фитазами (Фиг.ЗА). Наиболее эффективной фитазой при кислом рН является фитаза Schwanniomyces castellii, тогда как фитаза A. niger является наиболее эффективной при значениях рН выше 5,5. Фитаза пшеницы является наименее эффективной независимо от условий испытания.
3. Влияние рН на уровень высвобождения фосфата в присутствии комбинации фитаз
Для улучшения эффективности гидролиза фитиновой кислоты тестировали несколько комбинаций двух фитаз. Каждую фитазу вводят в количестве 0.04 Е/мл, т.е. общее количество в реакционной пробирке - 0,08 Е/мл. Фитазу DC, которая гидролизует шесть фосфатных связей, систематически тестировали в комбинации с другими фитазами, которые гидролизуют пять или шесть фосфатных связей. Две другие комбинации также использовали для сравнения, во-первых, другой комбинации фитаз, способной высвобождать шесть и пять фосфатов (SC/AN), и, во-вторых, двух фитаз, PL/AN, имеющих очень близкие биохимические характеристики (Фиг.1Б).
Общий анализ дает возможность продемонстрировать, что комбинация двух фитаз в основном способствует эффективности гидролиза фитиновой кислоты. Хотя в тех же самых условиях ни одна из фитаз полностью не гидролизует фитиновую кислоту, для двух смесей (DC/AN и SC/AN) гидролизуются от 100% до 85% фосфатных связей независимо от рН. Для комбинации DC/PL также обнаружено увеличение приблизительно на 20% при кислых значениях рН. Комбинации PL/AN, DC/PF и DC/SC обеспечивают небольшое улучшение (Фиг.2Б).
Сравнение исходных уровней гидролиза показывает наличие сильного синергического действия для комбинации SC/AN и для комбинации DC/AN по сравнению с одной фитазой и по сравнению с другими комбинациями фитаз. Связанные с рН различия в уровне гидролиза минимизируются при использовании комбинации. Другие комбинации являются менее эффективными, синергическое действие обнаруживаемо только при некоторых рН, например для DC/PL при рН 3 и рН 4 (Фиг.3).
Синергическое действие, по-видимому, возникает в значительной степени вследствие способности фитаз гидролизовать все фосфаты. Помимо этого, наилучшие комбинации относятся к фитазам, имеющим комплементарные оптимумы рН в отношении активности (2,5-4,5). Тем не менее, следует заметить, что имеет место незначительное синергическое действие фитаз, которые наименее эффективны с точки зрения эффективности гидролиза, таких как фитаза пшеницы и Penicillium funiculosum.
4. Влияние концентраций и пропорции фитаз на эффективность гидролиза фитиновой кислоты
Авторы изобретения сравнивали влияние количества фитазы (эффекты дозы) и пропорции смеси фитаз на гидролиз фитиновой кислоты. Использовали три комбинации DC/AN, DC/PL и AN/PL и тестировали две концентрации фитаз (0,04 и 0,08 Е/мл) (Таблицы 2 и 3).
Таблица 2
Сравнение процента гидролиза фитиновой кислоты для различных комбинаций, тестируемых при двух конечных концентрациях 0,04 и 0,08 Е/мл. В первых трех столбцах приведены значения для трех фитаз по одной в концентрации 0,08 Е/мл.
AN
DC
PL
AN/DC
AN/DC
(0,08 Е)
(0,08 Е)
(0,08 Е)
(0,08 Е)
(0,04 Е)
рН 3
66
82
80
92
67 (73%)
рН 4
69
85
83
95
96(101%)
рН 5,5
55
63
67
92
81 (87%)
рН 6
72
42
64
94
78 (83%)
рН 6,5
63
6
34
75
42 (56%)
PL/DC
PL/DC
AN/PL
AN/PL
(0,08 Е)
(0,04 Е)
(0,08 Е)
(0,04 Е)
рН 3
94
70 (74%)
79
56 (72%).
рН 4
100
93 (94%)
86
76 (89%)
рН 5,5
85
71 (84%)
70
66 (94%)
рН 6
85
47 (56%)
74
67 (90%)
рН 6,5
35
10 (30%)
61
52 (86%)
Значения в скобках представляют собой отношение значений, полученных с 0,04 Е/мл, к значениям в присутствии 0,08 Е/мл.
Процент гидролиза при испытании со смесью ферментов (общая концентрация 0,08 Е/мл) выше по сравнению с таковым, определенным только с одним ферментом (0,08 Е/мл), и близок к 100% для смесей AN/DC и PL/DC, в диапазоне рН, составляющем от рН 3 до рН 6. Смесь AN/PL не показывает значительного увеличения наблюдаемого процента гидролиза по сравнению с каждой фитазой, взятой по отдельности. Двукратное уменьшение общего количества (0,04 Е/мл) не вызывало двукратного уменьшения высвобождения фосфата. В некоторых случаях - AN/DC и PL/DC при рН 4 и рН 5,5 и AN/PL при рН от 4 до 6 - процент гидролиза эквивалентен обнаруженному в присутствии 0,08 Е/мл (Таблица 3).
В первых трех столбцах приведены значения для трех фитаз по одной в концентрации 0,08 Е/мл.
Таблица 3
Сравнение исходных уровней гидролиза (мкмоль/мл/мин) фитиновой кислоты для различных комбинаций, тестируемых при двух конечных концентрациях 0,04 и 0,08 Е/мл.
AN
DC
PL
AN/DC
AN/DC
(0,08 Е)
(0,08 Е)
(0,08 Е)
(0,08 Е)
(0,04 Е)
рН 3
2,04
1,78
2,52
4,00
1,70 (42%)
рН 4
4,98
3,96
5,36
6,49
2,85 (44%)
рН 5,5
7,76
1,56
4,00
7,26
1,86 (26%)
рН 6
7,91
0,39
2,87
7,53
1,04 (14%)
рН 6,5
5,09
0,00
0,85
3,71
0,26 (7%)
PL/DC
PL/DC
AN/PL
AN/PL
(0,08 Е)
(0,04 Е)
(0,08 Е)
(0,04 Е)
рН 3
3,88
1,45 (37%)
2,18
1,60 (73%)
рН 4
8,61
3,33 (39%)
4,29
2,73 (63%)
рН 5,5
3,79
0,85 (22%)
4,56
2,82 (62%)
рН 6
2,10
0,04 (2%)
3,96
2,60 (66%)
рН 6,5
0,22
0,00 (0%)
1,89
0,74 (39%)
Значения в скобках представляют собой отношение значений, полученных с 0,04 Е/мл, к значениям в присутствии 0,08 Е/мл.
Таким образом, комбинация фитаз дает возможность уменьшить количество фитаз в реакционной среде в два раза, в то же время поддерживая идентичную эффективность гидролиза в широком диапазоне рН. Имеется очевидное влияние дозы на высвобождение фосфата.
С другой стороны, исходные уровни гидролиза фитиновой кислоты по меньшей мере в два раза меньше в присутствии 0,04 Е/мл фитазы, чем в присутствии 0,08 Е/мл (Таблица 3). Эти результаты поддерживают гипотезу о том, что синергизм между фитазами по существу дает возможность полного гидролиза имеющихся фосфатов.
Доля каждой из фитаз в реакционной среде, по-видимому, не имеет значительного влияния на эффективность гидролиза (Таблица 4). Во всех случаях наблюдалось увеличение количества высвобождаемого фосфата, с небольшим преимуществом комбинации, содержащей 50% каждой фитазы, в основном для рН выше 5,5.
Таблица 4
Сравнение процента гидролиза фитиновой кислоты в зависимости от доли каждой фитазы в смеси. Во всех случаях общее количество остается равным 0,08 Е/мл.
Доля фитаз
AN
DC
AN/DC (1/1)
AN/DC (1/2)
AN/DC (2/1)
рН 3
66
82
92
90
88
рН 4
69
85
95
93
93
рН 5,5
55
63
92
79
79
рН 6
72
42
94
87
86
рН 6,5
63
6
75
52
64
В используемых авторами изобретения экспериментальных условиях ни одна из фитаз полностью не гидролизовала фитиновую кислоту на инозитол и фосфаты, хотя четыре из них способны высвобождать все фосфаты в соответствии с литературой. Четыре фитазы SC, PF, DC и PL гидролизуют 80% фосфатных связей при значениях рН 3 и 4. Две смеси DC/AN и SC/AN гидролизуют от 80% до 100% фосфатных связей при всех тестируемых значениях рН.
Комбинация фитаз, представляющих собой фитазы типа 3-фитаз (AN, DC, PF), типа 4-фитаз (В) или типа 6-фитаз (PL), друг с другом не обеспечивает какого-либо заметного улучшения.
Комплементарность и синергизм между фитазами, по-видимому, зависит от двух критериев, специфических для каждой фитазы: (1) их профиля активности в зависимости от рН, (2) их способности гидролизовать или не гидролизовать все фосфаты.
Применение таких комбинаций в питании животных дает возможность уменьшить количество используемых фитаз по меньшей мере на 20% и таким образом уменьшить стоимость. Содержание фосфата, происходящего из фитиновой кислоты, в корме также может быть увеличено, что увеличивает ценность корма и таким образом дает возможность уменьшить потребление неорганического фосфата. Таким образом может быть уменьшено загрязнение, вызванное неусвояемыми фосфатными отходами.