Молекулярно-генетическое типирование энтеробактерий с продукцией БЛРС, выделенных от больных гемобластозами

Молекулярно-генетическое типирование энтеробактерий с продукцией БЛРС, выделенных от больных гемобластозами

А. Г. КОРОБОВА*, С. А. ХРУЛЬНОВА, В. А. ОХМАТ, Г. А. КЛЯСОВА

Гематологический научный центр Минздрава России, Москва

Molecular-Genetic Typing of Enterobacteriaceae Producing an Extended Spectrum Beta-Lactamase in Patients with Hemoblastoses

A. G. KOROBOVA, S. A. KHRULNOVA, V. A. OKHMAT, G. A. KLYASOVA Hematology Research Center, Moscow

Цель исследования — определить основные механизмы инфицирования энтеробактериями с продукцией бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) у гематологических больных. Материал и методы. В проспективное исследование (2013—2015 гг.) были включены случаи бактериемии, вызванные энтеробактериями. Мазки со слизистой оболочки прямой кишки брали в течение первых трёх суток после получения гемокультуры. Для детекции БЛРС были использованы фенотипические методы. Гены резистентности групп blaTEM, blaSHV и blaCTX-M определяли методом ПЦР. Генотипирование проводили методом ERIC-ПЦР. Результаты. В 89 случаях бактериемии был выделен 91 изолят энтеробактерий (56% — E.coli, 26% — K.pneumoniae, 18% — другие) у 82 больных (медиана возраста 50 лет). Продукция БЛРС была у 19 (21%) изоля-тов (E.coli — n=11, K.pneumoniae — n=8). Бета-лактамазы CTX-M типа были определены у 95% изолятов. Колонизация слизистой оболочки прямой кишки, идентичными по виду энтеробактериями с продукцией БЛРС, была во всех 19 случаях бактериемии, вызванной БЛРС положительными энтеробактериями, и только в 8 (11%) из 72 при выделении из гемокультуры энтеробактерий без продукции БЛРС (p<0,0001). Генотипирование 19 продуцентов БЛРС из гемокультуры выявило генетическую идентичность только у двух изолятов E.coli, выделенных от одного пациента с интервалом в два месяца. При попарном генотипировании продуцентов БЛРС, выделенных из гемокультуры и со слизистой прямой кишки, генетически родственными были 26% пар изолятов. Заключение. У больных с опухолями системы крови и бактериемией, вызванной энтеробактериями с продукцией БЛРС, преобладает эндогенный путь инфицирования.

Ключевые слова: Enterobacteriaceae, БЛРС; CTX-M, бактериемия, колонизация, генотипирование.

The aim of this study was to determine the prevalent path of extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing Enterobacteriaceae transmission in hematological patients. Methods. Prospective study was performed from 2013 to 2015 and included cases of bacteremia caused by Enterobacteriaceae. Rectal swabs were taken within the first three days after positive blood culture. ESBL-pro-duction was confirmed by phenotypic tests. The genes of blaTEM, blaSHV and blaCTX-M were determined by PCR. Genotyping was performed by ERIC-PCR. Results. A total of 91 enterobacteria isolates (56% — E.coli, 26% — K.pneumoniae, 18% — other) derived from blood were obtained in 89 cases of bacteremia in 82 patients (median age — 50 years). Production of ESBL was found in 19 (21%) isolates (E.coli — n=11, K.pneumoniae n=8). Beta-lactamase CTX-M type was identified in 95% of isolates. Colonization of gut with the same species was detected in all 19 episodes of bacteremia caused by ESBL positive isolates and only in 8 (11%) of 72 episodes of bacteremia caused ESBL-negative isolates (P<0.0001). Genotyping of 19 ESBL producers from blood culture revealed a genetic identity of only two isolates of E.coli, taken from the same patient within two months. Genetically related isolates from blood and gut in the same patients were identified in 26% of the pairs. Conclusion. The endogenous path of infection caused by ESBL producing Enterobacteriaceae prevailed in patients with hematological malignancies.

Keywords: Enterobacteriaceae; ESBL; CTX-M; bacteremia; colonization; genotyping.

Введение

В последние годы в этиологии инфекционных осложнений у больных опухолями системы крови отмечается увеличение доли полирезистентных бактерий, среди которых ведущую позицию занимают энтеробактерии с продукцией бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) [1]. В России доля БЛРС-положительных энтеробактерий из гемо-

© Коллектив авторов, 2017

*Адрес для корреспонденции: E-mail: amalofeeva@yandex.ru

культуры у больных гемобластозами составляет 43% [2]. Распространение энтеробактерий с продукцией БЛРС представляет серьёзную проблему, так как в отношении их активность проявляют ограниченное число антимикробных препаратов.

Развитие тяжёлых инфекционных осложнений у иммунокомпрометированных больных происходит как при эндогенном, так и при экзогенном варианте инфицирования микроорганизмами. Эндогенная транслокация бактерий возникает, как правило, через слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта, повреждаемую

цитостатическими препаратами или опухолью. Экзогенная передача внутрибольничных возбудителей происходит из окружающей среды или от пациента к пациенту. Этому способствует длительное, иногда 6—10 мес, пребывание больного в стационаре, тяжёлое течение опухоли, для адекватной терапии которой необходимо проведение инвазивных исследований, наличие сосудистых доступов. Рассматривают и смешанный механизм инфицирования, когда под воздействием антимикробных препаратов ранее чувствительные к антибиотикам эндогенные штаммы бактерий приобретают детерминанты устойчивости, и, попадая в окружающую среду, они способны сохраняться в условиях стационара и распространяться от пациента к пациенту.

Большинство вспышек внутрибольничных инфекций характеризуются распространением ограниченного числа эпидемических клонов, что подтверждает экзогенную передачу эпидемических штаммов. Распространение генетически родственных изолятов характерно, прежде всего, для отделений реанимации и неонаталогии [3]. Так, по результатам O. Paniara и соавт. [4] при геноти-пировании семи неповторяющихся изолятов Klebsiella pneumoniae, выделенных от больных в отделении реанимации в течение одного месяца, была подтверждена циркуляция единственного эпидемического клона. В то же время при анализе генетического родства энтеробактерий с продукцией БЛРС, полученных в процессе более длительного наблюдения, чаще обнаруживали поликлональность изолятов [5, 6]. В университетском госпитале в Мадриде было проведено моле-кулярно-генетическое исследование клинически значимых изолятов Escherichia coli и Kpneumoniae с продукцией БЛРС, полученных в течение 12 лет [7]. Авторы отметили генетическое разнообразие энтеробактерий с продукцией БЛРС, что подтверждает наличие нескольких источников, формирующих пул резистентных микроорганизмов в стационаре. Такими источниками могут быть как эпидемические клоны, так и ранее чувствительные эндогенные штаммы бактерий с приобретенными детерминантами устойчивости, которые впоследствии могут передаваться от одного микроорганизма другому с помощью мобильных генетических элементов.

Можно полагать, что преобладание эндогенного или экзогенного варианта инфицирования определяется не только спецификой стационара, но и видом микроорганизмов. Задачей настоящей работы было проведение генотипирования энте-робактерий с продукцией БЛРС, выделенных от больных опухолями системы крови, с целью определения какой из механизмов инфицирования (эндогенный или экзогенный) этими микроорганизмами преобладает в гематологии.

Материал и методы

Проспективное исследование было проведено в ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России в 2013—2015 гг. За период исследования у всех пациентов с бактериемией, вызванной энтеробактериями, брали мазок со слизистой оболочки прямой кишки в течение 1—3 сут после получения положительной гемокультуры с целью определения колонизации слизистой продуцентами БЛРС.

Детекцию БЛРС у всех энтеробактерий, выделенных из гемокультуры и со слизистой оболочки прямой кишки, проводили на хромогенной селективной среде CHROMagar™ESBL и далее подтверждали методом «двойных дисков» согласно методическим рекомендациям МУК 4.21890-04 [8]. Для исследования использовали диски с цефа-лоспоринами III поколения — цефтазидимом (30 мкг), цефт-риаксоном (30 мкг) (Oxoid, Великобритания) и амоксицилли-ном с клавулановой кислотой (20/10 мкг) (Becton, Dickinson, США). Согласно рекомендациям, продукцию БЛРС выявляли по наличию расширенной зоны подавления роста вокруг диска с цефалоспорином III поколения напротив диска, содержащего клавулановую кислоту. Для внутреннего контроля качества использовали референтные штаммы E.coli ATCC25922 и K.pneumoniae ATCC700603.

Для выделения ДНК использовали суточную культуру исследуемого микроорганизма. Несколько колоний суспендировали в 0,5 мл воды Milli Q, далее суспензию клеток нагревали в течение 5 мин при 95°C, затем центрифугировали 1 мин при 13000 об/мин и отбирали супернатант.

Наличие генов резистентности групп bla^EM, blasHV и blaCTX-M, кодирующих наиболее распространённые бета-лак-тамазы, определяли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Для детекции групп blaTEM и blaCTX-M использовали наборы реагентов для выявления генов, кодирующих TEM и CTX-M бета-лактамазы («Ли-тех», Россия). Для выявления генов, кодирующих SHV бета-лактамазы, использовали ПЦР-РВ со специфичными праймерами (179-s-F 5'-CGATGAACGCTTTCCCATGA-3'; 280-s-R 5'-AGATCCTGCTGGCGATAGT-3').

Принадлежность CTX-M бета-лактамаз к одному из 5 известных генетических кластеров (CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9, CTX-M-25-родственные ферменты) определяли с помощью специфичных праймеров (табл. 1). Для детекции генов CTX-M бета-лактамаз у каждого изолята было проведено две мультиплексные ПЦР: в первой использовали специфичные праймеры для определения генов групп blaCTX-M-1, blaCTX-M-8 и blaCTX-M-9, во второй — blaCXX-M-2 и blaCTX-M-25. ПЦР проводили в конечном объёме 20 мкл, содержащем 6 мкл экстрагированной ДНК, 8 мкл ПЦР-смеси-2-blue (ИнтерЛабСервис, Россия), 0,2 мМ дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP), специфичные праймеры в концентрации 0,1 мкМ (каждый).

Программа амплификации с использованием термоцик-лера CFX96 Touch (BioRad, США) включала следующие этапы: предварительная денатурация (95°C в течение 3 мин), затем следовали 33 цикла денатурации (95°C в течение 20 с), отжига (58°C в течение 30 с), элонгации (72°C в течение 50 с), затем один цикл при 72°C в течение 4 мин. Полученные продукты ПЦР разделяли в 1% агарозном геле (Helicon, Россия) с добавлением этидия бромида (BioRad, США) при 200В в ^TAE буфере (Литех, Россия). Визуализацию полос проводили при облучении УФ-светом с X 260 нм при помощи трансиллюминатора (Vilber Lourmat, Франция). В качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК-маркер GeneRuler™, 100 п.н. (Thermo Fisher Sceientific, США).

Для определения генетического родства изолятов энтеро-бактерий с продукцией БЛРС был использован один из вариантов ПЦР с произвольными праймерами — ERIC-ПЦР. В работе использовали праймер ERIC1 [9]. В результате разделения в 1% агарозном геле получали набор ПЦР-фраг-ментов (профиль), характерный для каждого изолята. Сравне-

Таблица 1. Праймеры, используемые для проведения ПЦР

Ген Название праймера Последовательность олигонуклеотидов

blaCTX-M-1 CTX-M-1-For CTX-M-1-Rev TGCCGAATTAGAGCGGCAGTC GCTGTCACCCAATGCTTTACC 504

blaCTX-M-2 CTX-M-2-For CTX-M-2-Rev GAAGCACCTGCTAAATCAGCG GGTTGGTGGTGCCATAATCTC 470

blaCTX-M-8 CTX-M-8-For CTX-M-8-Rev TCGCGTTAAGCGGATGATGC CCGTCGGTGACGATTTTCGC 857

blaCTX-M-9 CTX-M-9-For CTX-M-9-Rev GGAAACGCAAAAGCAGCTGCTT AGTTTCGCCCAGCGCATGAC 352

WacTX-M-25 CTX-M-25-For GTGCCCAGGCGAACGATGTT 743

CTX-M-25-Rev TCTCTGCCTTCGGCTCCGA

Таблица 2. Колонизация слизистой оболочки прямой кишки при бактериемии, вызванной энтеробактерия-ми с продукцией БЛРС

Гемокультура Колонизация слизистой оболочки прямой кишки

Энтеробактерии п энтеробактериями с продукцией БЛРС

Всего 91 _27

Из них,

с продукцией БЛРС 19 19 (100%)*

без продукции БЛРС 72 8 (11%)*

Примечание. * - p<0,0001.

ние и интерпретацию результатов исследования проводили с использованием программы компьютерного анализа (GelJ v.1.3). Анализ ПЦР-профилей с построением дендрограмм был выполнен с использованием коэффициента Dice и алгоритма сравнения невзвешенных попарных средних (UPGMA). Изоляты считали генетически родственными, если коэффициент сходства (КС) был 80% и более.

Результаты исследования

Характеристика микроорганизмов, выделенных из гемокультуры. В исследование были включены 89 случаев бактериемии, вызванной энтеробактериями, у 82 больных в возрасте от 18 до 77 лет (медиана 50 лет). Основную долю составили больные острыми лейкозами (46%, n=38) и лимфомами (33%, n=7). У 5 пациентов были зарегистрированы неоднократные выделения энтеробактерий из крови с интервалом более одного месяца: три повторных эпизода бактериемии были у двоих больных и два — у троих.

В 89 случаях бактериемии был выделен 91 изолят энтеробактерий, поскольку в двух случаях было сочетание микроорганизмов. В структуре возбудителей доминировали E.coli (56%, n=51), далее следовали K.pneumoniae (26%, n=23) и Enterobacter spp. (9%, n=8). Доля других видов эн-теробактерий составила 9%, включая Klebsiella oxytoca (n=2), Citrobacter spp. (n=2), Serratia spp. (n=2), Morganella morganii (n=1), Raoultella spp. (n=1), Salmonella spp. (n=1).

Продукция БЛРС была выявлена у 19 (21%) из 91 энтеробактерий, в их число вошли 11 (22%) изолятов E.coli и 8 (35%) K.pneumoniae. У других видов энтеробактерий продукция БЛРС не была подтверждена. У каждого из 19 БЛРС-положи-тельных изолятов был определен хотя бы один ген из исследуемых групп генов бета-лактамаз

(Ь/аТЕМ или Ь/а&НУ или ¿/аСТХ_М). Одновременно наличие двух генов было у 11 (58%) продуцентов БЛРС и трех генов — у 8 (42%). Бета-лактамазы схх-м типа преобладали и были определены у

18 (95%) изолятов, ТЕМ — у 17 (89%) и 8НУ — у 11 (58%). Принадлежность СТХ-М бета-лактамаз к генетическому кластеру СТХ-М-1 была выявлена у 15 (83%) из 18 изолятов, один изолят (5,5%) принадлежал к кластеру СТХ-М-9. В нашем исследовании был получен высокий процент детекции групп генов Ь/аХЕМ и Ь/а8НУ, однако, метод ПЦР не позволяет дифференцировать бета-лак-тамазы ТЕМ и 8НУ типа на ферменты широкого и расширенного спектра.

У всех больных при выделении энтеробакте-рий из гемокультуры брали мазки со слизистой оболочки прямой кишки. Колонизация слизистой оболочки прямой кишки идентичными по виду энтеробактериями с продукцией БЛРС была во всех 19 случаях бактериемии, вызванной БЛРС положительными энтеробактериями, и только в 8 (11%) из 72 при выделении из гемокультуры энтеробактерий без продукции БЛРС (р<0,0001) (табл. 2). Не наблюдалось выделения продуцентов БЛРС из гемокультуры, если при исследовании мазков со слизистой оболочки прямой кишки не выявляли подобные бактерии.

Генотипирование энтеробактерий с продукцией БЛРС, выделенных из гемокультуры. Генотипирование методом ЕЫС-ПЦР было проведено у

19 энтеробактерий с продукцией БЛРС, в число которых вошли Е.соИ («=11) и К.рнеытотае («=8). По результатам генотипирования изоляты Е.соИ были объединены в 5 генетических групп (Е1—Е5) (рис. 1). Группа Е1 включала 6 изоля-тов, Е2 — 2 изолята, а Е3, Е4 и Е5 — по одному

Рис. 1. Дендрограмма генетических профилей E.coliс продукцией БЛРС, вы деленных из гемокультуры (л=11).

Коэффи циент сходства,

60

70

80

90

1» , 1 №

в К1

• 1

/ и

Рис. 2. Дендрограмма генетических профилей K.pneumoniae с продукцией БЛРС, выделенных из гемокультуры (п=8).

изоляту (табл. 3). Генетически идентичными (КС=100%) быши только два изолята (группа Е2), однако оба изолята Е.еоН были выделены из гемокультуры одного пациента (П4) с интервалом в два месяца. В группе Е1 КС варьировал от 51 до 67%, и период между выделением изолятов составлял от 2 мес до 1,5 лет. Представители групп Е3, Е4 и Е5 обладали уникальными генетическими профилями с интервалом выделения из гемокультуры больных от 44 дней до 11 мес.

Результаты генотипи-рования восьми К.рпеитотае представлены на рис. 2. При анализе дендрограм-мы было выявлено, что изоляты принадлежали к трём разным генетическим группам (К1—КЗ). Группа К1 включала 4 изолята, а К2 и К3 — по два. КС в группах варьировал от 57 до 68% (табл. 2). Наиболее высокий КС (68%) был у двух изолятов с интервалом выделения в 5 мес. Как и при анализе изолятов Е.еоН, у одного больного с интервалом в два месяца из гемо-культуры дважды выделяли идентичные по виду К.рпеитотае с продукцией БЛРС, но генетического родства между ними не было выявлено (КС=51%). Таким образом, при анализе генетических профилей К.рпеитотае с продукцией БЛРС из гемокульуты было выявлено генетическое разнообразие всех микроорганизмов, включая изо-ляты от одного больного.

Попарное генотипиро-вание энтеробактерий с продукцией БЛРС, выделенных из гемокультуры и со слизистой оболочки прямой кишки больных. Методом ЕЫС-ПЦР было проведено попарное генотипирование изолятов энтеробакте-рий с продукцией БЛРС, выделенных из гемокуль-туры и со слизистой прямой кишки, у одного и того же больного. Всего было проанализировано 22 генетических профиля Е.еоН (11 пар) и 16 генетических профилей К.рпеитотае (8 пар) (рис. 3).

Генетически идентичными были три пары изо-лятов Е.еоН (6 изолятов), среди них две пары Е.еоН

Таблица 3. Результаты генотипирования энтеробактерий с продукцией БЛРС, выделенных из гемокультуры

Энтеробактерии с продукцией БЛРС Генотипирование

Вид N Группа Количество изолятов, п КС между изолятами, %

Е.еоН 11 Е1 6 51—7

Е2 2 100

ЕЗ 1 —

Е4 1 —

Е5 1 —

К.рпеитотае 8 К1 4 57—68

К2 2 62

КЗ 2 59

Коэффициент сходства, %

50 60 ?о го 90

имели полное совпадение (КС=100%), и для одной пары КС составил 92% (рис. 3, а). Среди Крнеытотае было выявлено две пары генетически родственных изоля-тов с КС 83 и 92%, соответственно (рис. 3, б). Таким образом, в 5 (26%) из 19 случаев бактериемии изо-ляты из гемокультуры были генетически родственными изолятам, выделенным со слизистой оболочки кишечника, включая 3 (28%) пары Е.со/1 и 2 (25%) — Крнеытотае (табл. 4).

Как было представлено ранее, у одного больного дважды с интервалом в два месяца из гемокультуры были выделены генетически идентичные (КС=100%) изоляты Е.соЫ. Изоляты, полученные со слизистой прямой кишки (от 01.07.2014 и от 03.09.2014) у этого больного, также оказались генетически родственными (КС=87%) между собой, но не было выявлено генетического родства между изолятами, выделенными из гемокультуры и со слизистой оболочки прямой кишки.

Также хотелось бы отметить, что генетически родственными (КС=82%) оказались два изолята Крнеытотае с продукцией БЛРС, выделенные из гемо-культуры и со слизистой оболочки прямой кишки, от разных пациентов (П15, П12) (рис. 3, б). Из этих изо-лятов первым был выделен изолят со слизистой оболочки прямой кишки у одного больного, и лишь через год и два месяца был получен генетически родственный изолят из гемокульту-ры другого больного.

Обсуждение результатов

Одним из основных факторов развития инфекций, вызванных энтеробактериями с продук-

Козффициент с кодам, %

ЬО 60 70 «и 90

и

«

ГУ

с

б

1

11

вВ- И «в л

1 11

X:

А4ИГНТ |ПОГу< Дом выделения

ПА хрорь 0J.09.20H

ГМ КРОВЬ 0l.flf.WH

ПА КИ^ШНИК 01.07.J014

П4 ккимчник №.09.2014

пэ к-рорь ll.01.201f

пэ кпш*чнин 14.0J.J0JS

пг крОРь 22.04.2014

П2 мнывчнн* 22.0i.20li

П9 ИХиКЧп!« 01-12.2013

«рот. 0?-М.20]5

№ кровь tM.ll.201i

Пб мшечнич 04.11.2012

П1 крййь ОЗЛб.2М7

П5 нкшечикк 07.04.2011

П10 кровь 09.0fi.20is

Г 8 нро*ь 17,07,2014

П0 птИж 17.q7.2PW

11? НИДОЧИЙН 17.Cfc.20M

п? кровь 17.flS.W14

т кровь 01.12.2013

П1 НИцЦ^МН «.».да;

то кишечник (»«.3015

Пащ«н1 Лонус Д1та (ИуДС.ПГ-НЫЯ

пи •рои.

П|1 ПЩДТЧННЕ

пи >В1о 09.06 2011

ПК ННШГ11М1 12.02.2014

П14 чрсвь 11.02-3014

П»} крМ» 0Ч»-»11

пи ИМВЧМНИ 07.« ми

011 «ро» п.о>.1*г*

ПИ НЦШС1 чч

пи КРСЧЧ 21 ю ген

пи К*и«ЧИНК 21.102013

пи крй*в 11 шоп

П!6 04 №2014

пи 1 чн| мяч

П15 р<мь

ПИ о*|» гон

Рис. 3. Дендрограммы генетических профилей Е.соИ(п=22, а) и К.рпеитоп1-ае (п=16, б) с продукцией БЛРС из гемокультуры и со слизистой прямой кишки.

цией БЛРС, является предшествующая колонизация слизистой оболочки кишечника этими бактериями. Риск возникновения инфекции, вызванной продуцентами БЛРС, возрастает в 5—18 раз, если определяется детекция БЛРС-положи-

Таблица 4. Результаты попарного генотипирования энтеробактерий с продукцией БЛРС, выделенных из ге-мокультуры и со слизистой прямой кишки

Энтеробактерии КС энтеробактерий с продукцией БЛРС,

Вид Число пар _выделенных со слизистой прямой кишки и из гемокультуры, п (%)_

>80% 60-79% <60%

E.coli_11_3

K.pneumoniae 8 2

Всего 19 5~(2бУ

тельных бактерий со слизистой оболочки прямой кишки [10]. По результатам исследования, проведенного в многопрофильном стационаре Тель-Авива (Израиль), колонизация кишечника энте-робактериями с продукцией БЛРС была выявлена у 26 (10,8%) из 241 больного при госпитализации в стационар [11]. Впоследствии бактериемия развилась у 4 (15,4%) из 26 больных, имевших колонизацию энтеробактериями с продукцией БЛРС, и была вызвана тем же видом бактерий, и лишь у 1 (0,5%) из 215 больных без колонизации продуцентами БЛРС. Колонизация слизистой оболочки энтеробактериями с продукцией БЛРС явилась предиктором бактериемии, вызванной этими микроорганизмами (ОШ 38,9; р<0,001). Аналогичные результаты были получены в исследованиях у гематологических больных. В работе B. J. Liss и соавт. [12], опубликованной в 2012 г, приведены данные о 513 больных гемобла-стозами и солидными опухолями. Микробиологическое исследование образцов кала проводили в течение 72 ч после госпитализации в стационар, и колонизация энтеробактериями с продукцией БЛРС была выявлена у 90 (17,5%) больных. В дальнейшем бактериемия, вызванная энтеробактериями с продукцией БЛРС, развилась у 6 (6,6%) из 90 больных с колонизацией слизистой оболочки кишечника БЛРС-продуцирующими бактериями и только у 2 (0,5%) из 423 больных без колонизации (ОШ 4,5). В нашем исследовании были получены аналогичные результаты. Частота бактериемии, вызванной энтеробактериями с продукцией БЛРС, у больных с колонизацией этими микроорганизмами составила 7,5% (5 из 68 случаев), и не было случаев бактериемии, вызванной продуцентами БЛРС, у больных без колонизации этими бактериями (0 из 105 случаев; р=0,009) [13]. Информация о наличии колонизации устойчивыми бактериями позволяет косвенно предположить вероятного возбудителя у больных с пер-систирующей фебрильной нейтропенией.

Повсеместное распространение резистентности к антимикробным препаратам среди возбудителей инфекционных осложнений у больных гемобластозами способствовало пересмотру «классической» стратегии назначения антимикробных препаратов в гематологии. В международных рекомендациях экспертов ECIL-4

4

3

7

[14], выпущенных в 2013 г., впервые помимо эс-калационного подхода была предложена стратегия деэскалации антимикробной терапии в период гранулоцитопении у больных гемобластозами, которая раньше использовалась лишь у тяжёлых больных в ОРИТ. При деэскалационном подходе в качестве препаратов для 1-го этапа рекомендовано применять антибиотики с более широким спектром, включая активность против энтеробактерий с продукцией БЛРС и/или полирезистентных штаммов Pseudomonas aeruginosa, такие как карбапенем с антипсевдомонадной активностью или сочетание бета-лактамных антибиотиков с колистином. В дальнейшем можно провести деэскалацию антимикробной терапии в соответствии с результатами микробиологических исследований. Причём, показанием к использованию деэскалационного подхода у больных с фебрильной нейтропенией являются не только септический шок или тяжёлая пневмония, но и колонизация или предшествующая инфекция полирезистентными микроорганизмами. Впервые в гематологии в качестве препаратов для 1-го этапа при деэскалационном подходе было рекомендовано применение карбапенемов в центрах с высокой долей инфекций, вызванных энтеробактериями с продукцией БЛРС (уровень доказательности BIII), или у больных, колонизированных такими микроорганизмами (уровень доказательности BII). Акцент в рекомендациях на колонизацию слизистой оболочки полирезистентными грамотрицательными бактериями в выборе антибиотика также является доказательством того, что у больных с персистирующей фе-брильной нейтропенией преобладает эндогенный вариант инфицирования.

Основными типами БЛРС до конца 1990 годов были TEM и SHV [15, 16]. В настоящее время во всех странах мира, включая Россию, получили широкое распространение энтеробактерии с продукцией CTX-M-типа БЛРС, наибольшее эпидемическое значение имеют гены группы CTX-M-1, и основным представителем этой группы является CTX-M-15 [15, 17]. По нашим данным, большинство энтеробактерий с продукцией БЛРС (83%), выделенных из гемокультуры, были продуцентами CTX-M-1-типа бета-лактамаз.

Исследователи отмечают значительное генетическое разнообразие энтеробактерий, проду-

цирующих бета-лактамазы СТХ-М-типа [15, 18]. Так, исследователями из Франции быши проанализированы 74 штамма энтеробактерий с продукцией БЛРС, из которыгх у 71,5% быши вымвлены1 гены бета-лактамаз СТХ-М-типа [6]. В это исследование были включены изоляты клинически значимые и со слизистой оболочки прямой кишки. Генотипирование методом БЫС-ПЦР показало, что 40 (54%) изолятов энтеробактерий с продукцией БЛРС обладало уникальными профилями, а 34 (46%) быши объединены в шесть генетически родственный кластеров. Бышо выявлено, что в течение трёх лет в этом стационаре наблюдалось как экзогенное распространение эпидемических клонов энтеробактерий, так и эндогенное инфицирование у больных с колонизацией слизистой оболочки кишечника.

Поликлональность изолятов, выделенных из гемокультуры больных с гематологическими заболеваниями, быша подтверждена в исследовании, проведённом в нашем центре в более ранний период (2003—2006 гг.) [19]. Среди изученных грамо-трицательных бактерий («=152) доминирующий клон отсутствовал, идентичные бактерии в одном клоне были представлены ограниченным числом изолятов, и бышо сделано заключение о наличии двух вариантов инфицирования в стационаре — эндогенном и экзогенном, с преобладанием эндогенного. Однако для штаммов Е.еоН наиболее характерным было эндогенное инфицирование, а экзогенный путь передачи инфекции чаще определялся у Р.аеги^пож, поскольку генетически родственные изоляты определяли достоверно чаще среди изолятов Р.аеги&пож, чем среди изолятов Е.еоН (35% против 3%, р<0,001).

В представленной работе мы проводили гено-типирование только энтеробактерий с продукцией БЛРС, и выявили разнообразие генетических профилей изолятов. Подобные результаты были получены другими исследователями при генотипирова-нии энтеробактерий. Так, в исследовании, проведённом в университетском онкологическом центре в Барселоне, при генотипировании Е.еоН с продукцией БЛРС («=17) из гемокультуры также была определена поликлональность, все изучаемые изоляты не быши генетически родственными [20].

Число публикаций, в которыгх оценивается генетическое родство идентичных по виду энтеробактерий с продукцией БЛРС, выщеленных у одного и того же пациента из гемокультуры и со слизистой оболочки прямой кишки, ограничено. По данным С. Сиайего и соавт. [21], у одного из 12 пациентов с колонизацией Е.еоН, продуцирующими БЛРС, развилась бактериемия, вызванная идентичными по виду бактериями. Исследователями было подтверждено генетическое родство изолятов, полученных из гемокультуры и со слизистой прямой кишки у этого пациента. Анало-

гичное исследование проводили в университетском медицинском центре в Мериленде [22], в процессе которого были изучены изоляты Aеinetobaеter Ьаитаппп, полученные у шести больных из гемокультуры и со слизистой оболочки прямой кишки. По результатам пульс-электрофореза у всех пациентов было подтверждено генетическое родство исследуемых изолятов, полу-ченныгх из разных локусов.

В наше исследование было включено двое больных с двукратным выделением идентичных по виду продуцентов БЛРС из гемокультуры. У одного больного изоляты Е.еоН, выщеленные из гемокультуры с интервалом в два месяца, были генетически родственными, в то время как у другого больного изоляты К.рпеитотае имели разные ПЦР-профили (КС=51%). Аналогичные результаты были получены в исследовании А. 8аше1 и соавт. [23]. Неоднократное выделение Е.еоН из гемокультуры было у шести больных гематологическими заболеваниями и только у троих повторные эпизоды бактериемии были вызваны генетически родственными изолятами Е.еоН. В этой работе также было проведено генотипирование изолятов Е.еоН, выщеленныгх в повторных исследованиях из образцов кала, которое показало, что у больныгх с гемобластозами в течение нескольких недель происходит смена одного генотипа Е.еоН на другой. Авторы исследования объясняют полученные результаты изменчивостью кишечной микрофлоры у больных гемобластозами, возникающей под воздействием ряда факторов, наиболее значимыми из которых являются антибиотики и цитостатические препараты, приводящие к селекции наиболее резистентных изолятов. Следовательно, в кишечнике может находиться одновременно несколько разныгх штаммов энтеро-бактерий одного вида. Так, в исследование, проведённое В. Кга,те2ук и соавт. [24], было включено 115 больных гемобластозами, у каждого пациента был выделен один изолят Е.еоН из ге-мокультуры и от трёх до десяти фенотипически разных изолятов Е.еоН со слизистой оболочки кишечника. Молекулярно-генетическое исследование доказало, что 77% (89 из 115) изолятов Е.еоН из гемокультуры были генетически родственными изолятам Е.еоН, полученными со слизистой оболочки прямой кишки. Также у всех Е.еоН, включённых в исследование изучали гены вирулентности, кодирующие такие факторы, как Бг-адгезин, Б1С-фимбрии и другие. Генетически родственные изоляты из крови и со слизистой оболочки кишечника имели идентичные наборы генов вирулентности. Интересно отметить, что изоляты из гемокультуры достоверно чаще имели гены вирулентности, кодирующие Бг-адгезин, в отличие от штаммов Е.еоН, выщеленныгх со слизистой оболочки кишечника у того же больного, но

не являющихся генетически родственными (16% против 5%, p=0,009). И наоборот, гены, кодирующие ПС-фимбрии, значимо чаще определяли у изолятов E.coli, которые были получены со слизистой оболочки кишечника, и не являлись генетически родственными изоляту из гемокультуры (36% против 17%, p=0,001). Это исследование продемонстрировало, что в кишечнике у больного может постоянно находиться несколько разных штаммов энтеробактерий одного вида, а наличие генов вирулентности у штаммов E.coli, колонизирующих слизистую кишечника, может быть дополнительным фактором, предрасполагающим к транслокации энтеробактерий со слизистой оболочки кишечника в кровоток.

По результатам нашей работы, 26% бактерие-мий были обусловлены изолятами генетически родственными изолятам энтеробактерий с продукцией БЛРС, выделенным со слизистой прямой кишки. Такое родство является подтверждением эндогенного инфицирования при бактериемии у больных с гемобластозами. В остальных случаях (74%) колонизация и бактериемия у одного и того же пациента были вызваны разными штаммами одного вида. Невысокий процент совпадений (26%) можно объяснить ограничениями нашего исследования, поскольку при генотипировании мы анализировали только один изолят, выделенный со слизистой оболочки кишечника, в то время как на слизистой оболочке кишечника могут находиться одновременно несколько БЛРС-положительных штаммов энте-робактерий одного вида.

При анализе результатов парного генотипи-рования оказалось, что генетически родствен-

ЛИТЕРАТУРА

1. Mikulska M., Viscoli С., Orasch С., Livermore D.M., Averbuch D., Cordonnier С. et al. Aetiology and resistance in bacteraemias among adult and paediatric haematology and cancer patients. J Infect 2014; 68 (4): 321-331.

2. Клясова Г.А. Инфекции при гемобластозах и депрессиях кроветворения: клиника, диагностика и лечение: Автореф. дисс. ... д-ра мед. наук. М.: 2009. / Kljasova G.A. Infekcii pri gemoblastozah i depressijah krovetvorenija: klinika, diagnostika i lechenie: Avtoref. diss. ... d-ra med. nauk. M.: 2009. [in Russsian]

3. Guyot K, Biran V., Doit C, Moissenet D, Guillard T, Brasme L. et al. Raman spectroscopic analysis of the clonal and horizontal spread of CTX-M-15-producing Klebsiella pneumoniae in a neonatal intensive care unit. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2012; 31: 2827—2834.

4. Paniara O, Platsouka E, Dimopoulou H, Tzelepi E, Miriagou V., Tzouvelekis L.S. Diversity of beta-lactam resistance levels among related Klebsiella pneumoniae strains isolated in an intensive care unit. J Chemother 2000; 12 (3): 204—207.

5. Giraud-Morin C, Fosse T. A seven-year survey of Klebsiella pneumoniae producing TEM-24 extended-spectrum beta-lactamase in Nice University Hospital (1994—2000). J Hosp Infect 2003; 54 (1): 25—31.

6. Marcade G, Brisse S, Bialek S, Marcon E, Leflon-Guibout V., Passet V. et al. The emergence of multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae of international clones ST13, ST16, ST35, ST48 and ST101 in a teaching hospital in the Paris region. Epidemiol Infect 2013; 141 (8): 1705—1712.

7. Baquero F, Coque T.M., Canton R. Allodemics. Lancet Infect Dis 2002; 2 (10): 591—592.

8. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания МУК 4.21890-04). Клин микробиол антимикроб химиотер 2004; 6: 306—359.

ными были два изолята K.pneumoniae с продукцией БЛРС, выделенные из гемокультуры и со слизистой оболочки прямой кишки, но от разных больных. Интервал между выделениями изолятов составил один год и два месяца. Можно предположить, что была длительная циркуляция изолята K.pneumoniae с продукцией БЛРС в окружающей среде стационара с последующей экзогенной передачей пациенту. Такое генетическое родство изолятов возможно при смешанном варианте инфицирования, когда ранее чувствительные к антимикробным препаратам эндогенные микроорганизмы приобретают детерминанты устойчивости под воздействием антибиотиков, и, попадая в окружающую среду стационара, вызывают экзогенное инфицирование других больных.

Заключение

На основании полученных результатов можно сделать заключение, что у больных опухолями системы крови при бактериемии, вызванной энтеробактериями с продукцией БЛРС, преобладает эндогенный путь инфицирования. Не было выявлено генетического родства между энтеробактериями с продукцией БЛРС, выделенными от разных больных. Доказано, что бактериемия, вызванная БЛРС-положительными бактериями, была только у пациентов с колонизацией слизистой оболочки кишечника идентичными по виду продуцентами БЛРС, а в 26% случаев было подтверждение генетического родства идентичных по виду изолятов, выделенными из гемокультуры и со слизистой оболочки прямой кишки.

9. Versalovic J., Koeuth T, Lupski J R. Distribution of repetitive DNA sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial genomes. Nucleic Acids Res 1991; 19 (24): 6823—6831.

10. Biehl L.M., Schmidt-Hieber M, Liss B, Cornely O.A., Vehreschild M.J. Colonization and infection with extended spectrum beta-lactamase producing Enterobacteriaceae in high-risk patients - Review of the literature from a clinical perspective. Crit Rev Microbiol 2016; 42 (1): 1—16.

11. Ben-Ami R, Schwaber M.J., Navon-Venezia S., Schwartz D, Giladi M, Chmelnitsky I. et al. Influx of extended-spectrum beta-lactamase-pro-ducing enterobacteriaceae into the hospital. Clin Infect Dis. 2006; 42 (7): 925—934.

12. Liss B.J., Vehreschild J.J., Cornely O.A., Hallek M, Fatkenheuer G, Wisplinghoff H. et al. Intestinal colonisation and blood stream infections due to vancomycin-resistant enterococci (VRE) and extended-spectrum beta-lactamase-producing Enterobacteriaceae (ESBLE) in patients with haemato logical and oncological malignancies. Infection 2012; 40 (6): 613—619.

13. Охмат В.А., Клясова Г.А., Коробова А.Г., Паровичникова Е.Н., Федорова А.В., Троицкая В В. и соавт. Следует ли назначать карбапене-мы всем больным с фебрильной нейтропенией и колонизацией эн-теробактериями с продукцией /3-лактамаз расширенного спектра? Онкогематология 2016;11(3): 49—57. / Okhmat V.A., Kljasova G.A., Korobova A.G., Parovichnikova E.N., Fedorova A.V., Troickaja V.V. i soavt. Sleduet li naznachat' karbapenemy vsem bol'nym s febril'noj nejtropeniej i kolonizaciej jenterobakterijami s produkciej /?-laktamaz rasshirennogo spektra? Onkogematologija 2016; 11(3): 49—57. [in Russian]

14. Averbuch D., Orasch C., Cordonnier C., Livermore D.M., Mikulska M., Viscoli C. et al. European guidelines for empirical antibacterial therapy for febrile neutropenic patients in the era of growing resistance: summary of the 2011 4th European Conference on Infections in Leukemia. Haematologica 2013; 98 (12): 1826—1835.

15. Calbo E, Garau J. The changing epidemiology of hospital outbreaks due to ESBL-producing Klebsiella pneumoniae: the CTX-M-15 type consolidation. Future Microbiol 2015; 10 (6): 1063-1075.

16. Сидоренко СВ., Тишков В.И. Молекулярные основы резистентности к антибиотикам. Успехи биол хим 2004; 44: 263—306. / Sidorenko SV, Tishkov V.I. Molekuljarnye osnovy rezistentnosti k antibiotikam. Uspekhi biol khim 2004; 44: 263—306. [in Russian]

17. Эйдельштейн М.В., Страчунский Л.С. Динамика распространенности и чувствительности БЛРС-продуцирующих штаммов энтеро-бактерий к различным антимикробным препаратам в ОРИТ Ро-сии. Клин микробиол антимикроб химиотер 2005; 7 (4): 323—336. / Jejdel'shtejn M.V., StrachunskijL.S. Dinamika rasprostranennosti i chu-vstvitel'nosti BLRS-producirujushhikh shtammov jenterobakterij k razlichnym antimikrobnym preparatam v ORIT Rosii. Klin mikrobiol antimikrob khimioter 2005; 7 (4): 323—336. [in Russian]

18. Livermore D.M., Canton R, Gniadkowski M, Nordmann P., Rossolini G.M., Arlet G. et al. CTX-M: changing the face of ESBLs in Europe. J Antimicrob Chemother 2007; 59 (2): 165—174.

19. Клясова Г.А., Бриллиантова A.H., Миронова А.В. Генотипирование грамотрицательных бактерий, выделенных из крови при сепсисе у больных с гематологическими заболеваниями. Тер архив 2007; 79 (7): 74—80. / Kljasova G.A., Brilliantova A.N., Mironova A.V. Genotipirovanie gramotricatel'nykh bakterij, vydelennykh iz krovi pri sepsise u bol'nykh s gematologicheskimi zabolevanijami. Ter arkhiv 2007; 79 (7): 74—80. [in Russian]

20. Gudiol C, Calatayud L, Garcia-Vidal C, Lora-Tamayo J., Cisnal M, Duarte R. et al. Bacteraemia due to extended-spectrum beta-lactamase-

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

producing Escherichia coli (ESBL-EC) in cancer patients: clinical features, risk factors, molecular epidemiology and outcome. J Antimicrob Chemother 2010; 65 (2): 333-341.

21. Cuartero C, Sánchez Díaz A.M., Ruiz-Garbajosa P., Valverde A., Alonso J.M., Rodríguez J.D. et al. Dynamics of intestinal colonization with extended-spectrum beta-lactamases (ESBL)-producing Enterobacteriaceae in neutropenic oncohaematological patients. P2132 In: Bacterial infections in cancer patients. Proceeding of 23th European Congress of Clinical Microbriology and Infectious Diseases, 2013 Apr 27-30; Berlin, Germany. Available from: https://www.escmid.org/escmid_publications/escmid_eli-brary/?q=Cuartero+C.&id=2173&L=0&x=27&y=18

22. Thom K.A., Hsiao W.W., Harris A.D., Stine O.C., Rasko D.A,. Johnson J.K. Patients with Acinetobacter baumannii bloodstream infections are colonized in the gastrointestinal tract with identical strains. Am J Infect Control 2010; 38 (9): 751-753.

23. Samet A., Sledzinska A., Krawczyk B., Hellmann A., Nowicki S., Kur J. et al. Leukemia and risk of recurrent Escherichia coli bacteremia: genotyp-ing implicates E.coli translocation from the colon to the bloodstream. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2013; 32 (11): 1393-1400.

24. Krawczyk B., Sledzinska A., Szemiako K., Samet A., Nowicki B., Kur J. Characterisation of Escherichia coli isolates from the blood of haemato-logical adult patients with bacteraemia: translocation from gut to blood requires the cooperation of multiple virulence factors. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2015; 34 (6): 1135-1143.

Коробова Анна Геннадьевна — научный сотрудник научно-клинической лаборатории клинической бактериологии, микологии и антибиотической терапии ГНЦ МЗ РФ, Москва

Хрульнова Светлана Алексеевна — к. б. н., старший научный сотрудник научно-клинической лаборатории клинической бактериологии, микологии и антибиотической терапии ФГБУ ГНЦ МЗ РФ, Москва

Охмат Владимир Александрович — к. м. н., научный сотрудник научно-клинической лаборатории клинической бактериологии, микологии и антибиотической терапии ФГБУ ГНЦ МЗ РФ

Клясова Галина Александровна — д. м. н., профессор, заведующая научно-клинической лабораторией клинической бактериологии, микологии и антибиотической терапии ФГБУ ГНЦ МЗ РФ, Москва