Достижения в области лабораторной диагностики губкообразной энцефалопатии КРС

8. Capobianco R., Casalone C., Suardi S. et al. Conversion of the BASE prion strain into the BSE strain: the origin of BSE? PLoS Pathog, 2007, 3: 31.

9. Casalone C., Zanusso G., Acutis P. et al. Identification of a second bovine amyloidotic spongiform encephalopathy: molecular similarities with sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. PNAS USA, 2004, 101, 3065—3070.

10. Collinge J., Sidle K.C.L., Meads J. et al. Variant Creutzfeldt-Jakob disease. Nature (London), 1996, 383, 685—690.

11. Collinge J. Molecular analysis of prion strain variation and the aetiology of 'new variant' CJD. Lancet, 1999, 354, 317—323.

12. Cutlip R.C., Miller J.M., Race R.E. et al. Intracerebral transmission of scrapie to cattle. J Infect Dis, 1994, 169, 814—820.

13. Cutlip R.C., Miller J.M., Lehmkuhl H.D. Second passage of a US scrapie agent in cattle. J Comp Pathol, 1997, 17, 271—275.

14. Dupuis L., Mbebi C., Gonzalez de Aguilar J.L. et al. Loss of prion protein in a transgenic model of amyotrophic lateral sclerosis. Mol Cell Neurosci, 2002, 19, 216—224.

15. Jacobs J.G., Langeveld J.P., Biacabe A.G. et al. Molecular discrimination of atypical bovine spongiform encephalopathy strains from a geographical region spanning a wide area in Europe. J Clin Microbiol, 2007, 45, 1821—1829.

16. Juling K., Schwarzenbacher H., Williams J.L., Fries R. A major genetic component of BSE susceptibility. BMC Biol, 2006, 4, 33.

17. Kong Q., Zheng M., Casalone C. et al. Evaluation of the human transmission risk of an atypical bovine spongiform encephalopathy prion strain. J Virol, 2008, 82, 3697—3701.

18. Konold T., Bone G., Ryder S. et al. Clinical findings in 78 suspected cases

УДК 619:616.98:578

of bovine spongiform encephalopathy in Great Britain. Vet Rec, 2004, 155, 659—666.

19. Konold T., Lee Y.H., Stack M.J. et al. Different prion disease phenotypes result from inoculation of cattle with two temporally separated sources of sheep scrapie from Great Britain. BMC Vet Res, 2006, 2, 31.

20. Simmons M.M., Harris P., Jeffrey M. et al. BSE in Great Britain: consistency of the neurohistopathological findings in two random annual samples of clinically suspect cases. Vet Rec, 1996, 138, 175—177.

21. Watts J.C., Balachandran A., Westaway D. The expanding universe of prion diseases. PLOS Pathog, 2006, 2, 26.

22. Wells G.A., Hancock R.D., Cooley W.A. et al. Bovine spongiform encephalopathy: diagnostic significance of vacuolar changes in selected nuclei of the medulla oblongata. Vet Rec, 1989, 125, 521—524.

23. Wells G.A., Sayers A.R., Wilesmith J.W. and epidemiological correlates of the neurohistology of cases of histologically unconfirmed, clinically suspect bovine spongiform encephalopathy. Vet Rec, 1995, 136, 211—216.

24. Will R.G., Ironside J.W., Zeidler M. et al. A new variant of CreutzfeldtJakob disease in the UK. Lancet, 1996, 347, 921—925.

25. Williams E.S. Chronic wasting disease. Vet Pathol, 2005, 42, 530—549.

26. Zanusso G., Ferrari S., Cardone F. et al. Detection of pathologic prion protein in the olfactory epithelium in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. N Engl J Med, 2003, 348, 711—719.

G. Lombardi, C. Casalone, A. D'Angelo et al. Intraspecies transmission of BASE induces clinical dullness and amyotrophic changes. PLoS Pathog, 2008, 4, 5 : e1000075. doi:10.1371/journal.ppat.1000075. OA.

Достижения в области лабораторной диагностики губкообразной

энцефалопатии КРС

С.С. Рыбаков, А.А. Егоров,

Федеральный центр охраны здоровья животных

Ключевые слова: диагностика, прионные инфекции

Сокращения: ГМ — головной мозг; ПЦР — полимеразная цепная реакция_

Введение

В основе патогенеза прионных болезней лежат нейро-дегенеративные нарушения, имеющие генетические и инфекционные механизмы. Многие из них (скрепи овец и коз, трансмиссивная энцефалопатия норок, куру, болезнь Крейц-фельда — Якоба) известны давно. В 1986 г. в Великобритании появилась новая прионная болезнь, названная в средствах массовой информации «коровьим бешенством». Через несколько лет ее зарегистрировали в континентальной Европе, а после 2000 г. — в Японии, Канаде и США. Помимо той опасности, которую ее возбудитель представляет для КРС, он стал причиной появления у людей нового варианта болезни Крейц-фельда — Якоба. Прион представляет собой конформационно измененный клеточный белок PrPС, который отличается от остальных известных в настоящее время инфекционных агентов по структуре, способу репликации, механизмам индукции и развития инфекционного процесса [15]. Нормальная форма прионного белка образуется не только в нейронах, но и в других клетках. Его обнаружили у всех животных, начиная от нематод и заканчивая позвоночными. Структурная модификация PrPC становится причиной изменения его свойств и функций, что в конечном итоге приводит к развитию ГЭ.

Предварительный диагноз на ГЭ КРС ставят с учетом эпи-зоотологических данных путем выявления при обследовании животного прогрессирующих клинических нарушений: изменения поведения, проявления повышенной чувствительности к раздражителям (свету, звуку, прикосновению и т.д.), атаксии. Вариабельность симптоматики болезни и ее развитие после длительного инкубационного периода диктует необходимость применения специфических лабораторных методов диагностики.

Лабораторные методы диагностики

Как и у других видов животных, у КРС при ГЭ не образуется специфических антител, а возбудитель локализуется преимущественно в продолговатом мозге, не выделяясь в спинномозговую жидкость, кровь и мочу в количествах, достаточных для его обнаружения. Поэтому лабораторную диагностику этой болезни осуществляют постмортально по обнаружению типичных гистологических изменений и/или прионного белка PrPBSE в ГМ.

Свое название ГЭ получили в связи с тем, что их развитие сопровождается вакуолизацией и некрозом нейронов, которые придают мозгу сходство с губкой [5]. На рисунке 1 приведены снимки окрашенных гематоксилином и эозином срезов стволовой части ГМ здорового и больного КРС, позволяющие судить о динамике развития патологического процесса при ГЭ.

Характерные для ГЭ КРС изменения структуры ГМ развиваются постепенно на протяжении длительного периода времени. Кроме того, недавно стало известно об атипичных формах ГЭ КРС [4, 10], при которых интенсивность и локализация патоморфологических изменений в ГМ скота отличаются от наблюдаемых при типичном (классическом) течении болезни. Это в значительной степени снижает ценность показаний гистологического метода диагностики. Еще одним его существенным недостатком является относительно низкая производительность: даже при частичной автоматизации за день удается провести гистологическое исследование всего лишь нескольких десятков проб. Как следствие, его применяют преимущественно в случаях, когда у животных проявились неврологические симптомы. Это позволяет осуществлять лишь пассивный мониторинг эпизоотической ситуации по ГЭ КРС.

В 90-е годы ХХ века были разработаны иммунологические методы обнаружения в тканях PrPBSE, позволяющие исследовать за день до нескольких сотен проб патологического

Рис. 1. Развитие патологических изменений в стволовой части ГМ КРС при ГЭ (препараты на снимках В...Е приготовлены из блоков ткани ГМ, полученных из Центральной научной ветеринарной лаборатории (г. Дублин, Республика Ирландия). Увеличение: А, В, Д — х625, Б, Г, Е — х312. А — скопление нейронов в стволовой части мозга здорового животного (вакуолизация отсутствует); Б — тракт тройничного нерва здорового животного (вакуолизация отсутствует); В — вакуоль в перикарионе нейрона животного, больного ГЭ; Г — множественная вакуолизация тракта тройничного нерва при ГЭ; Д — множественная вакуолизация перикарионов при ГЭ; Е — некроз нейронов и спонгиозность мозга на терминальной стадии болезни

материала. Кроме того, их применение открыло возможность для ранней диагностики инфекции. Например, иммунофер-ментный метод, предложенный Дж. Грасси и соавт. [9], позволяет выявлять РгРБ5Е в пробах мозга КРС приблизительно за полгода до проявления клинических признаков.

Скрининг большого количества проб мозга с целью диагностики ГЭ КРС в настоящее время проводят преимущественно иммуноферментным или иммунолюминесцентным методами. Если эти тесты дали положительный или сомнительный результат, то для подтверждения диагноза применяют иммуноблотинг, иммуногистохимический или гистологический методы.

Для скрининга ГЭ КРС исследуют препараты стволовой части ГМ, поскольку в ней происходит максимальное накопление РгРБ5Е и в наибольшей степени нарушаются структура клеток и ткани. Вакуолизацию нейронов и их отростков чаще всего выявляют в области задвижки продолговатого мозга. Иммуногистохимический метод позволяет обнаружить РгРБЖ в ЦНС до появления в ней морфологических изменений.

На рисунке 2 представлены снимки препаратов ГМ КРС, полученные на разных стадиях накопления в нем РгРБ5Е.

Современные способы обнаружения инфекционной формы прионного белка заметно превосходят по своим возможностям лабораторные методы десятилетней давности. За последние годы более 50 компаний сообщили о разработке наборов для диагностики прионных болезней разными методами [2].

Рис. 2. Срезы ГМ КРС, окрашенные иммуногистохимическим методом. Увеличение: А, Б, Д, Е — х312, В, Г — х625. А — скопление нейронов, не содержащих РгРВ8Е; Б — отростки нейронов, не содержащие РгРВ8Е; В — начальная стадия накопления РгРВ8Е в нейроне; Г — начальная фаза накопления РгРВЭЕ в области расположения отростков нейронов

В Федеральном центре охраны здоровья животных (г. Владимир) получили антитела к 14 синтетическим пептидам, представляющим собой антигенные детерминанты нескольких областей РгРБЖ [16]. Лучшие результаты по выявлению РгРБ5Е в ГМ КРС дали антитела к пептидам РгР (17...36), (106...126) и (214.233) [1].

Применение новых тестов позволило получить реальное представление о масштабах распространения ГЭ и показало, что помимо известных классических форм этих патологий существуют атипичные [11]. Впервые атипичные случаи ГЭ КРС, возбудители которых отличались по молекулярно-био-логическим характеристикам от РгРБ5Е, диагностировали в Италии, Франции и Японии. Вероятно, о них длительное время ничего не было известно из-за низкой чувствительности ранее применявшихся методов диагностики ГЭ.

Большинство методов лабораторной диагностики ГЭ КРС являются статическими, т.к. позволяют обнаруживать только то количество аномальной формы прионного белка, которое присутствует в анализируемой пробе.

В настоящее время применяют 3 способа активной диагностики ГЭ КРС. Это прежде всего биопроба. Обычно ее проводят посредством интрацеребральной инокуляции исследуемого материала мышам, у которых инкубационный период при таком способе заражения в среднем равен 150 дн. Его продолжительность зависит от линии мышей и исследуемого штамма возбудителя. Биопроба имеет ряд недостатков: тре-

РВЖ СХЖ №1-2009

21

бует больших затрат времени, труда и средств, а тестируемые штаммы приона должны быть адаптированы к соответствующей линии мышей. В противном случае можно получить лож-ноотрицательные результаты или столкнуться с удлинением инкубационного периода, что можно устранить применением трансгенных мышей, экспрессирующих PrPС с аминокислотной последовательностью, соответствующей структуре при-она, который присутствует в анализируемой пробе [3, 6, 7].

Второй способ активной диагностики основан на выявлении инфекционной формы прионного белка с помощью культур клеток [12]. Данный метод не только значительно дешевле биопробы на мышах, но и позволяет получить результат в десятки раз быстрее. Обычно с этой целью используют линию клеток нейробластомы мышей Ша, проявляющую высокую чувствительность к PrPBSE. Перед заражением культуру клеток необходимо проверять на отсутствие посторонних прионов.

Третий способ активной диагностики прионных болезней — циклическая амплификация PrPBSE, содержащегося в анализируемой пробе [17]. Небольшое количество инфекционного материала вносят в гомогенат мозга, полученного от неинфицированного животного, и трансформируют in vitro PrPC, а его — в PrPBSE. Образующиеся агрегаты PrPBSE разделяют на отдельные молекулы ультразвуком. Освобожденные молекулы служат затравкой для следующей стадии реакции [13, 14]. Вначале этот тест проводили, добавляя к исследуемой пробе гомогенаты ГМ неинфицированных животных с низким содержанием PrPC [18], а затем с целью повышения чувствительности и специфичности их стали заменять очищенными препаратами PrPC [8]. Метод принципиально похож на ПЦР. PrPBSE выполняет роль матричной цепи нуклеиновой кислоты, на которой проводится синтез, а PrPС

— олигонуклеотидных праймеров и мононуклеотидов, обеспечивающих амплификацию PrPBSE. Тест позволяет in vitro многократно увеличивать количество PrPBSE, благодаря чему удается выявлять животных, находящихся в инкубационном периоде инфекции, когда клинические признаки болезни еще отсутствуют, а другие методы диагностики дают отрицательные результаты [19].

Заключение

За последние 15 лет достигнуты значительные успехи в лабораторной диагностике прионных болезней, в т.ч. ГЭ КРС. В дальнейшем, по всей видимости, будет уделено большее внимание совершенствованию существующих и разработке новых методов выявления инфекционной формы прионного белка, позволяющих обнаруживать его в биоптатах легкодоступных тканей, крови, спинномозговой жидкости, моче и др. Решение этих задач станет основой прижизненной диагностики ГЭ КРС. Выявление и уничтожение животных, находящихся в инкубационном периоде болезни, обеспечат ее надежный контроль и предотвратят распространение среди животных и людей.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Рыбаков С.С., Рябоконь А.А, Егоров А.А. и др. Методы диагностики и мониторинг губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота в России. Ветеринария, 2001, 2, 17—21.

2. Рыбаков С.С. Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота.

- Владимир: Реклайн, 2007 г.

3. Asante E.A., Linehan J.M., Desbruslais M. et al. BSE prions propagate as either variant CJD-like or sporadic CJD-like prion strains in transgenic mice expressing human prion protein. EMBO J, 2002, 21, 6358—6366.

4. Baron T., Biacabe A.-G., Arsac J.-N. Et al. Atypical transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) in ruminants. Vaccine, 2007, 25, 5625—5630.

5. Besnoit C., Morel C. Note sur les tesions nerveuses de la tremblante du mouton. Rev Vet, 1898, 23, 397—400.

6. Browning S.R., Mason G.L., Sewald T. et al. Transmission of prions from mule deer and elk with chronic wasting disease to transgenic mice expressing cervid PrP. J Virol, 2004, 78, 13345—13350.

7. Crozet C., Flamant F., Bencsik A. et al. Efficient transmission of two different sheep scrapie isolates in transgenic mice expressing the ovine PrP gene. J. Virol, 2001, 75, 5328—5334.

8. Deleault N.R., Lucassen R.W., Supattapone S. RNA molecules stimulate prion protein conversion. Nature, 2003, 425, 717—720.

9. Grassi J., Comoy E., Simon S. et al. Rapid Test for the preclinical diagnosis of BSE in central nervous system tissue. Vet Rec, 2001, 149, 577—582.

10. Griffiths P.C., Spiropoulos J., Lockey R. et al. Bioassay of Atypical Scrap-ie Cases from Great Britain in TG338 Mice Provides Evidence That They Are Indistinguishable from NOR98. Prion 2007, Edinburgh, UK.Book of Abstracts, 2007, 38.

11. Jacobs J.G., Langeveld J.P.M., Biacabe A-G. et al. Molecular Discrimination of Atypical Bovine Spongiform Encephalopathy Strains from a Geographical Region Spanning a Wide Area in Europe. J of Clin. Microbiol, 2007, 45, 6, 1821—1829.

12. Klohn P.C., Stoltze L., Flechsig E. et al. A quantitative, highly sensitive cell-based infectivity assay for mouse scrapie prions. PNAS USA, 2003, 100, 11666—11671.

13. Lucassen R., Nishina K., Supattapone S. In vitro amplification of protease-resistant prion protein requires free sulfhydryl groups. Biochemistry, 2003, 42, 4127—4135.

14. Piening N., Weber P., Giese A., Kretzschmar H. Breakage of PrP aggregates is essential for efficient autocatalytic propagation of misfolded prion protein. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 326, 339—343.

15. Prusiner S.B. Prions. PNAS USA, 1998, 95, 13363—13383.

16. Rybakov S., Egorov A., Monks E. et al. Immunohistochemical detection of the bovine spongiform encephalopathy prion protein using antisera to synthetic peptide. XI-th Intern Congr Virology. Intern Union of Microbiol Soc, Australia, Sydney, 1999, 272.

17. Saborio G.P., Permanne B., Soto C. Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding, Nature, 2001, 411, 810— 813.

18. Soto C., Saborio G.P., Anderes L. Cyclic amplification of protein misfolding: application to prion-related disorders and beyond. Trends in Neurosciences 2002, 25, 8, 390—394.

19. Soto C., Anderes L., Suardi S. et al. Pre-symptomatic detection of prions by cyclic amplification of protein misfolding FEBS Letters, 2005, 579, 3, 638—642.

Rybakov S.S., Egorov A.A. Achievements in the area of laboratory diagnosis of bovine spongiform encephalopathy.

СЕКРЕТЫ МАСТЕРСТВА

Отбор

УДК 619:616.98:578

патологического материала для

диагностики ГЭ КРС

С.С. Рыбаков, А.А. Егоров,

Федеральный центр охраны здоровья животных

Ключевые слова: диагностика, прион Сокращения: ПО — пробоотборник

Для постмортальной лабораторной диагностики ГЭ КРС берут пробы из стволовой части головного мозга (рис. 1А), поскольку в ней при данной патологии лее сильно нарушается структура и в максимальной степени накапливается прион ^^^^ [1, 4]. Особенно интенсивную вакуолизацию отмечают в скоплениях нейронов и их отростках в области задвижки продолговатого мозга (рис. 1 Б).

Ранее для отбора проб мозга КРС, проводившегося с целью диагностики ГЭ, распиливали череп животного (рис. 2). Этот способ имеет низкую производительность; его применяли в большинстве стран в 1990-е годы для пассивного мониоринга ГЭ КРС.