СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ДРЯХЛОСТИ
METHOD FOR SENILITY TREATMENT

Область изобретения
Изобретение относится к способу лечения дряхлости у пожилых пациентов. Изобретение также относится к фармацевтической композиции для применения в таком способе. Изобретение, в частности, относится к восстановительной вспомогательной терапии для дряхлых пожилых людей.
Предпосылки изобретения
Дряхлость представляет собой клинический синдром с такими симптомами как низкая масса тела, вызванная непреднамеренной потерей веса, истощение, слабость, медленная походка и низкая физическая активность. Дряхлость характеризуется пониженной устойчивостью к стресс-факторам, которая возникает, в свою очередь, из-за общего ухудшения работы многих физиологических систем и обуславливает уязвимость перед неблагоприятными факторами. Среди них выделяют резистентность к инсулину, метаболический синдром и остеопороз.
Широко применяемое определение этого комплексного старческого синдрома, предложенное в Fried et al. (2001) J Gerontol A Biol Sci Med Sci 56:M146-M156, основано на оценке пяти различных характеристик. Индивидуума следует считать дряхлым, если он обладает, по меньшей мере, тремя из следующих пяти характеристик: непреднамеренная потеря веса за последний год; слабость сжатия кисти; низкая выносливость/утомление; медлительность и низкий уровень физической активности.
Дряхлость связывают с изменениями в биомаркерах, таких как IL-6, CRP, 25-OH-витамин-D, IGF-I и D-димеры, особенно заметными у пожилых людей. В контексте изобретения возраст пожилых людей составлял 60 лет или старше, и более конкретно 65 лет или старше.
Дряхлость связывают с постепенным снижением эффективности белкового метаболизма. В свою очередь, это влияет на уровень общего метаболизма, приводя к появлению указанных выше синдромов.
Главное свойство дряхлости проявляется в воздействии на мышечную массу и силу, которое приводит к повышению вероятности падения пациента и таким сопутствующим повреждениям как переломы и ограниченная подвижность. Вместе с ослаблением мышц ослабевает иммунитет, снижается скорость заживления и возникают психические нарушения, что приводит к потере самостоятельности.
В настоящее время специальные способы лечения дряхлости не зарегистрированы. Проведен ряд клинических исследований воздействия различных способов лечения на отдельные симптомы дряхлости. Сюда относят, например, воздействие анаболических стероидов на мышечную массу, хорошо известное специалистам.
Ссылка на работу по влиянию анаболического стероида оксандролона на мышечную массу у пожилых людей представлена у Schroeder et al. 2005 J Gerontol A Biol Sci Med Sci 60:1586-1592.
Низкая концентрация маркера дефицита кальцитриола 25-OH-витамина-D в сыворотке часто наблюдается у пожилых людей и развивается совместно с симптомами дряхлости.
Ссылка на работу, рекомендующую лечение витамином D, представлена Campbell и Szoeke, Journal of Pharmacy Practice и Research, vol.39, no.2, June 2009, 147-151 и предоставляет обзор альтернативных способов лечения дряхлости у пожилых людей. Один из этих способов включает применение витамина D, который предлагают благодаря его воздействию на кости, мышцы и поддержание равновесия. Другой такой способ включает применение анаболических гормонов, но этот способ, как полагают, не имеет очевидных преимуществ при лечении старческой дряхлости.
Ссылка на работу по перспективным терапиям для лечения синдрома дряхлости у пожилых людей представляет собой Cherniack et al., Alternative Medicine Review Volume 12, Number 3 2007, pages 246-258. Работа описывает пищевые добавки, содержащие, например, витамины, каротиноиды, креатин, DHEA или бета-гидрокси-бета-метилбутират, и физические упражнения (тай чи и ходьба по булыжникам). Пищевую добавку, содержащую витамин D, рассматривают как перспективное средство для смягчения проявлений синдрома дряхлости. Кроме того, с учетом частого возникновения дефицита витамина D у пожилых людей, предполагают, что добавка с витамином D может предотвращать дряхлость.
Показано, что комбинированное лечение женщин, восстанавливающихся после перелома шейки бедра, нандролон деканоатом, холекальциферолом (витамин D3) перорально и содержащей кальций пищевой добавкой повышает плотность костей, мышечную массу и баллы по шкале походки (Hedstrom et al. J Bone Joint Surg Br 2002; 84: 497-503). Эта работа не рассматривает дряхлость. Кроме того, пациенты жили независимо и имели средний индекс массы тела, равный 23, что указывает на то, что участники данного исследования не являлись дряхлыми. Хотя исследование предоставляет витамин D в сочетании с анаболическими стероидами, данные, отличные от, например, приведенных в упомянутой выше работе Campbell et al., отражают общепринятую точку зрения, подчеркивая роль витамина D для костей и влияние анаболических стероидов на кости и мышцы.
В настоящее время, с учетом увеличения стоимости патофизиологических разработок и медицинского ухода, эффективное лечение симптомов дряхлости представляет собой актуальную медицинскую проблему.
Для облегчения и предотвращения симптомов дряхлости желательно проводить лечение или предотвращение нескольких симптомов одновременно. При лечении дряхлости желательно предоставлять единую терапию для лечения самого состояния дряхлости и, в частности, для повышения функциональных способностей и независимости индивидуума, что является предпочтительным клиническим результатом для пожилых пациентов. Типичным следствием дряхлости является то, что состояние пациента неуклонно ухудшается, и пациент почти неизбежно нуждается в длительном лечении. Желательно предотвращать и лечить такое состояние, иначе неизбежно дальнейшее ухудшение, и позволять пациентам жить независимо в течение большего периода времени. Это, в частности, важно для пациентов, восстанавливающихся после госпитализации, так как она часто является критической точкой в развитии дряхлости у пожилых людей, приводящей к необходимости длительного пребывания в доме престарелых (и дальнейшему ухудшению), а не к сохранению независимости (и восстановлению физической и умственной активности, приводящей к улучшению здоровья). Таким образом, медицинское вмешательство необходимо.
Сущность изобретения
Для более эффективного решения одной или нескольких приведенных выше задач изобретение в одном из аспектов представляет собой способ лечения или предотвращения дряхлости у пожилых пациентов, более конкретно, в возрасте 60 лет или старше, включающий одновременное парентеральное введение эффективной дозы комбинации анаболического стероида и соединения витамина D.
В другом аспекте изобретение предоставляет композицию, содержащую анаболический стероид и витамин D, для применения при лечении дряхлости у пожилых пациентов, в частности, в возрасте 60 лет или старше, которое включает одновременное парентеральное введение эффективной дозы анаболического стероида и витамина D.
В другом аспекте изобретение представляет собой фармацевтическую композицию, включающую анаболический стероид и витамин D в жидком носителе, подходящем для парентерального введения.
Еще в одном дополнительном аспекте изобретение включает устройство для внутримышечного введения жидкости, где жидкость содержит анаболический стероид и витамин D в жидком носителе, подходящем для парентерального введения.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 представлена гистограмма, иллюстрирующая воздействие нандролона и 1α,25-дигидроксивитамина D3 (DHVD3) на изменение доли клеток скелетной мускулатуры человека (миосателлитов) линии hSkMC2 с положительным уровнем экспрессии рецептора андрогена (AR) через 5 суток после обработки нандролоном и/или DHVD3. Тестостерон использовали в качестве точки отсчета.
Фиг.2 аналогична фиг.1 и иллюстрирует воздействие на положительный уровень экспрессии рецептора витамина D (VD3R).
На фиг.3 представлены гистограммы (a) и (b), иллюстрирующие воздействие двух концентраций нандролона и 1α,25-дигидроксивитамина D3 (DHVD3), добавленных отдельно или в виде смеси, на пролиферацию клеток скелетной мускулатуры человека (линии hSkMC1 и 2), которые применяют в качестве меры мышечной массы.
Подробное описание вариантов осуществления
Изобретение относится к лечению дряхлости. Термин "дряхлость" в настоящем документе определен, в частности, со ссылкой на указанное выше определение (Fried et al. 2001). Пациенты, подлежащие лечению, являются, как правило, пожилыми людьми как мужского, так и женского пола, как правило в возрасте 60 лет или старше. Более конкретно, пациентами являются пожилые люди в возрасте 65 лет или старше.
В широком смысле изобретение основано на понимании того, что проводимые в настоящее время разрозненные исследования, направленные на отдельные симптомы дряхлости, не достаточны для получения эффективного способа лечения. Изобретение предоставляет подобный способ лечения, основанный на введении подходящей комбинации активных веществ. Не связываясь с какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения полагают, что эффективность комбинированного парентерального введения анаболического стероида, предпочтительно нандролон деканоата, и витамина D, предпочтительно витамина D3 (холекальциферол) основана на синергическом воздействии двух компонентов, в частности, на мышечную массу и мышечную функциональность. Это предположение основано на молекулярном действии рецепторов этих двух компонентов и на каскадах реакций, которые эти компоненты могут активировать в миобластах/миосателлитах. Рецептор андрогена и рецептор витамина D принадлежат к семейству ядерных факторов транскрипции, но соответствующие им механизмы действия сильно различаются. Рецептор витамина D, как известно, учувствует в клеточной пролиферации и дифференцировке. Рецептор андрогена участвует в клеточном росте. Таким образом, в сочетании они предположительно приводят к более эффективной стимуляции роста мышечных клеток. Более того, введение анаболического стероида одновременно с витамином D, как полагают, положительно влияет на активность рецепторов витамина D. А витамин D положительно влияет на нервно-мышечную систему.
Изобретение подразумевает одновременное парентеральное введение эффективной дозы анаболического стероида и витамина D.
Термин "одновременное введение" хорошо известен в данной области и, как правило, относится к введению двух активных веществ в одно и то же время или почти в одно и то же время. В контексте настоящего изобретения это означает, что оба компонента вводят в один и тот же промежуток времени. Таким образом, если один из компонентов применяют ежедневно, то другой компонент также применяют ежедневно, в тот же день. Если один из компонентов применяют раз в неделю, то другой компонент также применяют раз в неделю, на той же неделе. Если один из компонентов применяют раз в месяц, то другой компонент также применяют раз в месяц, в том же месяце. Следует понимать, что термины "сутки", "неделя" и "месяц" необязательно относятся к календарным суткам, неделе или месяцу, а к временным интервалам, имеющим сравнимую с ними длительность. Предпочтительно введение обоих компонентов непосредственно друг за другом и более предпочтительно их одновременное введение. Наиболее предпочтительно их одновременное введение в виде одной композиции, содержащей оба компонента.
Термин "парентеральное введение" хорошо известен в данной области и, как правило, относится ко всем способам введения, отличным от введения через желудочно-кишечный тракт, включая в качестве неограничивающих примеров внутримышечное, внутривенное, подкожное, трансдермальное, трансмукозальное или ингаляционное введение. В настоящем изобретении предпочтительный способ парентерального введения представляет собой внутримышечное или подкожное введение.
С учетом того, что пациенты, нуждающиеся в лечении, являются пожилыми людьми, наиболее предпочтительный способ введения представляет собой подкожную инъекцию. Пожилые люди часто характеризуются низкой мышечной массой (особенно если страдают от дряхлости). С другой стороны, их кожа, как правило, имеет большую поверхность и множество складок. Таким образом, подкожная инъекция имеет преимущества по сравнению с внутримышечной инъекцией, являясь более простой в осуществлении и менее болезненной для пациента, особенно при лечении дряхлости.
Пациентам вводят эффективные дозы компонентов. Термин "эффективная доза" хорошо известен в данной области. В фармакологии эффективная доза представляет собой среднюю дозу лекарственного средства, приводящую к желаемому эффекту. Эффективную дозу часто определяют на основе анализа зависимости доза-реакция, специфической для лекарственного средства. Доза, приводящая к желаемому эффекту у половины тестируемой группы, которую обозначают как ED-50, представляет собой общепризнанную эффективную дозу. В контексте настоящего изобретения дозу считают эффективной, если она смягчает несколько (т.е. два или более) симптомов дряхлости. Предпочтительная эффективная доза облегчает состояние дряхлости, что оценивают с применением подходящих биомаркеров и/или подходящих клинических результатов. В контексте настоящего изобретения термин "эффективная доза" относится к общей дозе двух активных веществ. Эффективная доза и интервал между введением доз иногда могут различаться для пациентов мужского и женского пола. Например, доза анаболического андрогенного стероида может быть выше для мужчин. Кроме того, женщины, как правило, заболевают дряхлостью в более молодом возрасте, чем мужчины, и могут нуждаться в длительном регулярном лечении, тогда как мужчины становятся дряхлыми в более старшем возрасте и могут нуждаться в кратковременной интенсивной восстановительной вспомогательной терапии.
Комбинация активных веществ по изобретению содержит анаболический стероид. Термин "анаболический стероид" хорошо известен в данной области и обозначает класс стероидных гормонов, связанных с гормоном тестостероном. Ссылка на обзор анаболических стероидов представляет собой A.T. Kicman, British Journal of Pharmacology (2008) 154, 502-521. Анаболические стероиды, как правило, характеризуются накладывающимися анаболическим и андрогенным эффектами, и, таким образом, их иногда обозначают как анаболически-андрогенные стероиды (AAS). Андрогенно-анаболическое соотношение AAS представляет собой важный фактор при определении клинических применений этих веществ. Следует понимать, что в настоящем изобретении желательно преобладание анаболического (миотрофического) эффекта, вызывающего рост мышечных клеток, над андрогенным эффектом. Соответственно, анаболический стероид предпочтительно выбирать из группы, состоящей из норболетона, оксиметолона, оксандролона, нандролона и их сложных эфиров. Предпочтительный анаболический стероид для применения по настоящему изобретению представляет собой нандролон или его сложный эфир, наиболее предпочтительно нандролон деканоат.
Согласно изобретению предпочтительно введение нандролон деканоата (предпочтительно внутримышечной инъекцией и более предпочтительно подкожной инъекцией) раз в месяц, более предпочтительно раз в три недели и наиболее предпочтительно раз в неделю. Суммарная доза, введенная за период времени, может, как правило, варьировать от 15 мг, предпочтительно 25 мг в месяц, до 600 мг, предпочтительно 400 мг в месяц. При лечении дряхлости по изобретению предпочтительно, чтобы доза не была слишком низкой. С учетом неизбежных андрогенных эффектов также предпочтительно, чтобы доза не была слишком высокой. Предпочтительная доза должна быть настолько низкой, насколько возможно, и настолько высокой, насколько необходимо, находясь в диапазоне от 5 мг, предпочтительно от 10 мг до 150 мг, предпочтительно 50 мг в неделю, или от 20 мг, предпочтительно от 40 мг до 600 мг, предпочтительно 200 мг в месяц.
При применении другого анаболического стероида диапазон предпочтительных доз эквивалентен указанному для нандролона деканоата. Специалисты в данной области могут рассчитать эквивалентные дозы для различных анаболических стероидов.
Комбинация активных веществ по изобретению включает витамин D. В контексте настоящего изобретения термин "витамин D" относится к витамину D и различным его формам, а также к предшественникам и аналогам витамина D. Этот класс веществ хорошо известен в данной области. Витамин D предпочтительно представляет собой одну из распространенных форм витамина D, выбранных из группы, состоящей из эргокальциферола, холекальциферола, кальцидиола, кальцитриола, доксеркальциферола, и кальципотриена. Наиболее предпочтительная форма витамина D для применения согласно изобретению представляет собой холекальциферол (витамин D3).
Согласно изобретению предпочтительно введение витамина D в дозе, приводящей к повышению концентрации витамина в плазме крови до уровня, превышающего концентрацию, ассоциированную с дефицитом витамина D. Как правило, дефицит витамина D диагностируют, если концентрация 25-гидроксивитамина D в плазме крови составляет менее 20 нг/мл(50 нмоль/л). Концентрацию в плазме крови, составляющую >140 нмоль/л, связывают с нежелательными явлениями. Таким образом, предпочтительную дозу витамина D выбирают так, чтобы установить концентрацию витамина в плазме крови в диапазоне от 50 до 70 нмоль/л и 140 нмоль/л.
Согласно изобретению предпочтительную форму витамина D холекальциферол предпочтительно вводят (наиболее предпочтительно внутримышечной инъекцией) раз в месяц, более предпочтительно раз в три недели и наиболее предпочтительно раз в неделю. Доза холекальциферола находится в диапазоне доз, эквивалентных пероральному приему витамина в дозе 100-4000 МЕ/сутки или в соответствующих дозах на неделю или месяц. Однако допустима парентеральная доза холекальциферола, составляющая до 600000 МЕ (15 мг) внутримышечно.
Приведенные выше компоненты предпочтительно объединять в одной фармацевтической композиции, подходящей для парентерального введения. Более предпочтительна фармацевтическая композиция, включающая анаболический стероид и витамин D, предпочтительно комбинацию нандролона деканоата и холекальциферола, в жидком носителе, подходящем для парентерального введения. Предпочтительный жидкий носитель представляет собой масло, более предпочтительно выбранное из группы, состоящей из арахисового масла, хлопкового масла и кунжутного масла.
Не связываясь с какой-либо конкретной теорией, авторы изобретения предполагают, что растворимость в масле анаболического стероида и витамина D (и, в частности, нандролон деканоата и холекальциферола) может способствовать взаимному положительному воздействию на стабильность инъекционных препаратов, основанных на масле. Кроме того, комбинирование в одном инъекционном препарате двух компонентов облегчает их одновременное введение, делает введение менее инвазивным для пациента и способствует облегчению соблюдения режима приема обоих лекарственных средств.
Следует понимать, что фармацевтические композиции по изобретению могут содержать также вспомогательные вещества, часто применяемые в подобных препаратах. Наполнители, добавки, вспомогательные средства и т.п. для парентерального введения и их дозы хорошо известны специалистам и не требуют пояснений в настоящем документе.
При лечении дряхлости композицию по изобретению применяют, как правило, в течение, по меньшей мере, от 3 месяцев до 12 месяцев, предпочтительно от 4 до 8 месяцев и наиболее предпочтительно 6 месяцев. Изобретение относится к новому медицинскому подходу в лечении дряхлости у пожилых пациентов.
Хотя этот способ лечения дряхлости не имеет преимущественного значения, авторы изобретения предполагают (не связываясь с какой-либо конкретной теорией), что медицинский подход согласно изобретению обладает дополнительными преимуществами.
Это, в частности, относится к упомянутой выше критической точке, после которой пожилые пациенты, страдающие от дряхлости, при госпитализации могут оказаться неспособными более сохранять свою независимость. Длительное пребывание в домах престарелых, а также соответствующие физические и психические терапии, в сущности, лишают пациентов средств для предотвращения неуклонного ухудшения их состояния, а именно, независимости и способности жить своей жизнью с регулярной ежедневной физической и умственной активностью.
В этом отношении изобретение основано на понимании того, что адекватное медицинское вмешательство может не только лечить состояние дряхлости как таковое у пациента, находящегося в такой критической точке, но и помогать пациенту сохранять независимость и восстанавливать физическую и умственную активность. Чтобы помочь пациентам улучшить свое здоровье таким образом, изобретение также предоставляет восстановительную вспомогательную терапию для пожилых людей, страдающих дряхлостью, в частности, после госпитализации или хирургической операции. В этом аспекте изобретения вводят относительно высокую дозу двух активных веществ, предпочтительно нандролон деканоата и холекальциферола, с относительно высокой частотой, предпочтительно раз в неделю, в течение периода времени, достаточного для достижения желаемого фармакологического эффекта, но достаточно короткого, чтобы его можно было рассматривать как кратковременную восстановительную терапию (для восстановления независимости), а не как длительную терапию (которая соответствовала бы хроническому заболеванию). Предпочтительная продолжительность восстановительной терапии находится в диапазоне 4-8 месяцев, составляя предпочтительно 6 месяцев.
Изобретение также относится к предотвращению дряхлости у пациентов, склонных к дряхлости после госпитализации. Как правило, у этих пациентов не наблюдается состояние саркопении, но они страдают от снижения иммунитета.
При проведении указанной выше восстановительной терапии предпочтительно применение одной фармацевтической композиции, включающей оба активных вещества, при каждом введении.
Приспособления для парентерального введения компонентов, применяемых в изобретении, хорошо известны специалистам. Основываясь на известном оборудовании, изобретение также относится к приспособлениям для внутримышечного введения жидкости, где жидкость представляет собой описанную выше композицию согласно настоящему изобретению.
Далее изобретение проиллюстрировано в настоящем документе приведенными ниже неограничивающими примерами и соответствующими рисунками.
in vitro,
Примеры представляют собой исследования  в которых показано, что нандролон и 1α,25-дигидроксивитамин D3 оказывают синергическое воздействие на пролиферацию мышечных клеток-сателлитов и, таким образом, влияют на мышечную массу. Изобретение, таким образом, направлено на применение для людей более низких доз нандролон деканоата в составе комбинации для получения такого же воздействия на мышечную массу и/или функцию, как при применении только нандролон деканоата. Это направлено на улучшение показателей безопасности.
Пример 1
Материалы и методы
2
2
Две разные линии клеток скелетных мышц человека или клеток-сателлитов (hSkMC1 – полученные от 33-летней здоровой женщины - и hSkMC2 – полученные от 64-летней здоровой женщины) получали от PromoCell (Heidelberg, Germany) и культивировали на матрасах согласно инструкции производителя. Клетки собирали и хранили в жидком азоте до применения в эксперименте. Клетки не применяли, если количество пассажей превышало 15. Для экспериментов клетки культивировали при 37°C и в 5% CO при плотности 3,500-7,000 клеток/см на минимальной среде (PromoCell) с добавлением 5% активированного угля (Sigma-Aldrich), обработанного эмбриональной телячьей сывороткой (FBS) (PAA, Germany), с применением 24-луночных планшетов (Costar) до приблизительно 80% заселенности. Нандролон, тестостерон и 1α,25-дигидроксивитамин D3 получали от Sigma-Aldrich.
Для изучения рецепторов клетки культивировали в течение 5 суток с добавлением 1 мкМ и 10 мкМ нандролона (активного метаболита нандролон деканоата) или 1, 10 и 100 нМ 1α,25-дигидроксивитамина D3. Рецепторы андрогена и витамина D окрашивали согласно протоколу с последующей визуализацией способами проточной цитометрии, полученными из работ Krishan et al. (2000) и Folgueira et al. (2000). Способ, дающий наилучшее окрашивание, включает фиксацию в формалине с последующей пермеабилизацией Tween 20 и двойным окрашиванием немечеными первичными антителами (антитела против рецепторов андрогена (Epitomics) и антитела против рецепторов витамина D (GeneTex)) и меченными флоурофором вторичными антителами (козьи антитела против крысиного IgG, меченные фикоэритрином, для окрашивания рецепторов витамина D, и козьи антитела против кроличьего IgG, меченные флуорецеином, для окрашивания рецепторов андрогена; все антитела получали от Rockland). Окрашивание обоими вторичными антителами применяли в качестве фона. Fc-рецепторы блокировали инкубацией в содержащем сыворотку буфере. Все растворы далее содержали Tween 20 (Sigma Aldrich) в качестве детергента для поддержания пермеабилизованного состояния у клеток на всем протяжении окрашивания. Сравнивали окрашивание нестимулированных и стимулированных клеток, определяя его интенсивность и долю окрасившихся клеток. Измерения проводили на двулучевом проточном цитометре (Beckman Coulter модель FC500 Cytomics). Для обработанных и необработанных гормоном клеток определяли повышение доли окрашенных клеток по сравнению с установленным значением маркера (при 1% для фонового окрашивания).
Для изучения пролиферации клетки культивировали в течение 8 суток с 100 и 1000 нМ нандролона или 10 и 100 нМ 1α,25-дигидроксивитамина D3 и с комбинацией нандролона и 1α,25-дигидроксивитамина D3. Среду и гормоны заменяли на 1, 4 и 7 сутки. Уровень пролиферации измеряли с применением индикатора резазурина (Stern-Straeter et al., 2008). Статистический анализ данных уровня пролиферации проводили с применением t-критерия Стьюдента.
Пример 2
Изучение рецепторов
Действие как нандролона, так и 1α,25-дигидроксивитамина D3 на клетку зависит от наличия соответствующих рецепторов. Таким образом, авторы исследовали наличие как рецепторов андрогена, так и рецепторов витамина на применяемых клетках скелетной мускулатуры человека. На фиг.1 и 2 показано влияние нандролона и 1α,25-дигидроксивитамина D3 на долю клеток, у которых экспрессия рецепторов андрогена и витамина D изменилась по сравнению с клетками, окрашенными только вторичными антителами. В линии клеток hSkMC2 после воздействия нандролона и 1α,25-дигидроксивитамина D3 наблюдали увеличение числа клеток с рецепторами андрогена и витамина D. На гистограммах также показано увеличение интенсивности окрашивания клеток, что указывает на увеличение числа рецепторов на клетку у клеток, уже содержавших рецепторы до обработки гормоном. Эти результаты указывают на то, что рецепторы андрогена регистрируются у большего числа клеток, а у клеток, содержавших рецепторы до обработки, количество рецепторов на клетку повышается. Воздействие на линии клеток hSkMC1 менее выражено (данные не показаны).
Приведенные исследования рецепторов показали, что клетки скелетной мускулатуры человека содержат как рецепторы андрогена, так и рецепторы витамина D, и что нандролон и 1α,25-дигидроксивитамин D3 стимулируют экспрессию новых рецепторов.
Пример 3
Исследования пролиферации
Увеличение доли клеток с рецепторами андрогена и рецепторами витамина D под воздействием двух компонентов, как показано в примере 1, указывает на то, что на обработку потенциально может реагировать большее число клеток.
Пролиферацию клеток скелетной мускулатуры человека применяли в качестве контрольного параметра для выяснения того, обладает ли комбинация нандролона и 1α,25-дигидроксивитамина D3 синергическим воздействием на мышечную массу.
На фиг.3 показано (a), что в линии клеток hSkMC1 отдельные компоненты не влияли на пролиферацию, но при совмещении 1α,25-дигидроксивитамина D3 с нандролоном наблюдается достоверный эффект для всех 4 исследованных комбинаций (P<0,001, кроме комбинации, содержащей 100 нМ нандролона и 100 нМ 1α,25-дигидроксивитамина D3, для которой P<0,05). В линии клеток hSkMC2 (b) высокие концентрации 1α,25-дигидроксивитамина D3 усиливали пролиферацию, а 4 исследованных комбинации также показали достоверный эффект по сравнению с контролем (P<0,05, кроме комбинации, содержащей 100 нМ нандролона и 10 нМ 1α,25-дигидроксивитамина D3, для которой P<0,001). Доля клеток превышала контроль для разнообразных лекарственных средств, представленных в таблице 1. В линии клеток hSkMC1 увеличение при применении любой из комбинаций превышало суммарное увеличение при применении отдельных компонент, входящих в комбинацию. Это доказывает синергическое действие комбинации нандролона и 1α,25-дигидроксивитамина D3 на клетки скелетной мускулатуры человека. В линии клеток hSkMC2 синергическое действие наблюдали у трех из четырех исследуемых комбинаций.
<b>Таблица 1</b>Процентное увеличение (% Δ) пролиферации клеток скелетной мускулатуры человека (hSkMC1 и hSkMC2) за счет воздействия нандролона и 1α, 25-дигидроксивитамина D3 (dhvit D3) по отдельности и в комбинации по сравнению с контролем. Σ означает: сумму %Δ от нандролона плюс %Δ от dhvit D3, применяемых в различных комбинациях.
hSkMC1
hSkMC2
%Δ
Σ
%Δ
Σ
100 нМ нандролона
3
4
1000 нМ нандролона
1
1
10 нМ dhvit D3
1
1
100 нМ dhvit D3
-5
8
100 нМ нандролона + 10 нМ dhvit D3
12
4
11
5
100 нМ нандролона + 100 нМ dhvit D3
11
-2
13
12
1000 нМ нандролона + 10 нМ dhvit D3
13
2
13
2
1000 нМ нандролона + 100 нМ dhvit D3
10
-4
15
9