2
Способ получения СО экстракта кедрового стланика Pinus pumila
2
METHOD FOR PRODUCING A CO EXTRACT OF SIBERIAN DWARF PINE PINUS PUMILA

2
Изобретение относится к технологии экстракции натурального сырья, а именно к способам получения СО экстракта, который может быть использован в пищевой, парфюмерно-косметической и фармацевтической промышленности.
2
2
Известен способ получения СО экстракта, включающий подготовку растительного сырья с последующим проведением СО-экстракции при давлении 20-40 МПа в течение 120 мин [см. патент РФ № 2070053, МПК A61K 35/78, дата публикации 10.12.1996].
2
Недостатком аналога является тот факт, что чистый СО является неэффективным растворителем для химических соединений с более высокой полярностью.
2
2
В качестве ближайшего аналога принят способ получения СО экстракта женьшеня, включающий его подготовку с последующим проведением экстракции сверхкритическим флюидным СО с массовой долей этанола 1,7-3,4% в скорости потока жидкости 250 г/мин при температуре 31-70°С и давлении 20-40 МПа в течение 120 мин [см. патент РФ № 2679634, МПК A61K 36/258, A61P 37/00, дата публикации 12.02.2019].
Недостатками ближайшего аналога являются:
- извлечение в эффективных количествах только термолабильных шести общих гинзенозидов из дальневосточного женьшеня;
- длительное время, а также высокие значения температуры и давления экстракции;
- небольшой выход биологически активных веществ, связанный с расходованием малого количества сорастворителя;
- разрушение некоторых термолабильных биологически активных компонентов.
2
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка технологии получения СО экстракта кедрового стланика Pinus pumila, содержащего дигидрокверцетин в количестве 0,28-5,12 мг/г растительного сырья.
Технический результат, проявляющийся при решении поставленной задачи, выражается в следующем:
- обеспечение эффективной экстракции кедрового стланика Pinus pumila за счет увеличения массовой доли сорастворителя, в качестве которого используют этанол;
- возможность извлечения биологически активных веществ (БАВ), в частности дигидрокверцетина, с выходом 0,28-5,12 мг/г растительного сырья;
- использование доступного, безопасного и легко отделяемого сорастворителя этанола;
- сокращение времени, уменьшение температуры и давления экстракции;
- сохранение состава биологически активных веществ в получаемом продукте;
- отсутствие трудно утилизируемых отходов и побочных продуктов.
2
2
2
Поставленная задача решается тем, что в способе получения СО экстракта кедрового стланика Pinus pumila, включающем подготовку растительного сырья с последующим проведением экстракции сверхкритическим флюидным СО с этанолом при повышенных температуре и давлении, в качестве растительного сырья используют хвою кедрового стланика Pinus pumila, измельченную до размера частиц 5-6 мм, экстракцию осуществляют растворителем с расходом 5-20 кг/кг растительного сырья, в качестве которого используют сверхкритический флюидный СО с массовой долей этанола 5%, при температуре 31-60°С и давлении 50-200 бар в течение 60 мин.
Сопоставительный анализ совокупности существенных признаков предлагаемого технического решения и совокупности существенных признаков прототипа и аналогов свидетельствует о его соответствии критерию «новизна».
При этом отличительные признаки формулы изобретения решают следующие функциональные задачи.
Признак «в качестве растительного сырья используют хвою кедрового стланика» описывает тип используемого растительного сырья.
Кедровый стланик (Сосна стланиковая) Pinus pumila (Pall.) Regel, семейство Сосновые - лекарственное растение, широко известное в традиционной медицине. Скипидар из смолы кедрового стланика является ценным средством для внутреннего использования при лечении почек и мочевого пузыря. Кроме того, он очень полезен для дыхательной системы и применяется при лечении заболеваний, таких как: кашель, простуда, грипп и туберкулез [1-3].
Была определена важная функция флавоноидов в сердечно-сосудистой системе, а именно их способность снижать кровяное давление и улучшать функцию эндотелия. Таксифолин - это флавоноид с заметным антигипертензивным действием и множеством полезных свойств для нормального функционирования сердечно-сосудистой системы, также он обладает противовирусным действием, что может иметь особое значение в текущей ситуации пандемии. В ходе многочисленных научных исследований было доказано, что дигидрокверцетин (таксифолин) благотворно влияет на состояние сосудистой стенки капилляров, уменьшает вязкость крови и препятствует тромбообразованию. У людей с бронхолегочными заболеваниями при пневмонии, хроническом бронхите, астме, ХОБЛ (хронической обструктивной болезни легких) он способствует уменьшению частоты приступов, более быстрому исчезновению кашля, одышки, отечности бронхов, улучшению проходимости бронхов, восстановлению легочной ткани и нормального дыхания.
В статье Bernatova & Liskova [4] показано воздействие молекулярных механизмов при влиянии таксифолина, определенных в доклинических исследованиях, которые актуальны не только для лечения гипертонии как таковой, но и могут обеспечить дополнительные противовирусные преимущества, которые могут иметь отношение к лечению пациентов с гипертонией и инфекцией SARS-CoV-2.
После недавнего появления SARS-CoV-2 или коронавирусной болезни (COVID-19) решающее значение имеют открытие лекарств и разработка вакцины для борьбы с этой смертельной инфекцией. В исследовании [5] основной фермент в аппарате репликации SARS-CoV-2, РНК-зависимая РНК-полимераза (RDRP), подвергается виртуальному скрининговому анализу с использованием набора из 1664 одобренных FDA препаратов, включая наборы растительных и синтетических производных. Набор из 22 препаратов показал высокий балл стыковки > -7. Примечательно, что примерно одна треть хитов приходилась либо на натуральные продукты, либо на биологические молекулы. Фитохимические вещества, одобренные FDA, включали сеннозиды, дигоксин, азиатикозид, глицирризин, неогесперидин, таксифолин, кверцетин и алоин. Эти одобренные натуральные продукты и фитохимические вещества используются в качестве общих тонизирующих средств, антиоксидантов, клеточных защитных средств и иммуностимуляторов и в других различных системных или местных применениях.
Признак «в качестве растительного сырья используют хвою кедрового стланика, измельченную до размера частиц 5-6 мм» описывает оптимальные размеры частиц растительного сырья, обеспечивающие более эффективное извлечение биологически активных веществ.
Признаки «экстракцию осуществляют растворителем с расходом 5-20 кг/кг растительного сырья, в качестве которого используют сверхкритический флюидный СО2 с массовой долей этанола 5%, при температуре 31-60°С и давлении 50-200 бар в течение 60 мин» описывают оптимальные режимные характеристики.
Изменение режимных характеристик как в сторону уменьшения, так и увеличения, приводит к снижению эффективности извлечения биологически активных веществ.
На фиг. показан выход дигидрокверцетина в зависимости от температуры и давления при экстракции растворителем с расходом 20 кг/кг растительного сырья в течение 60 мин.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом.
Предварительно подготавливают растительное сырье.
2
Хвою кедрового стланика (Pinus pumila) измельчают до размера частиц 5-6 мм и загружают в емкость экстракционного аппарата сверхкритического давления Thar SFC, S.N. 3526551, США, уже нагретую с помощью горячего кожуха, температуру контролируют термостатом (±1°С). Углекислый газ (СО) был сжат при помощи компрессора, давление контролируют дозирующим клапаном.
2
Далее осуществляют экстракцию растворителем с расходом 5-20 кг/кг растительного сырья, в качестве которого используют сверхкритический флюидный СО с массовой долей этанола 5%, при температуре 31-60°С и давлении 50-200 бар в течение 60 мин.
2
Раствор биологически активных веществ в CO подвергают декомпрессии в сепараторе.
Выход биологически активных веществ при различных режимных характеристиках приведен в таблице 1.
Таблица 1Выход БАВ при различных режимных характеристиках
№ примера
Температура, °С
Давление, бар
Расход растворителя, кг/кг растительного сырья
Выход дигидрокверцетина, мг/г растительного сырья
Пример 1
31
50
5
0,28
Пример 2
31
100
10
1,2
Пример 3
40
100
12
1,9
Пример 4
50
150
20
4,3
Пример 5
60
200
5
5,12
На основе табл.1 можно сделать вывод, что повышение температуры и давления экстракции способствует более эффективному извлечению биологически активных веществ из растительного сырья.
Разделение многокомпонентных смесей проводили методом ВЭЖХ с использованием жидкостного хроматографа высокого давления Shimadzu LC-20 Prominence HPLC (Shimadzu, Япония), оборудованного спектрофотометрическим детектором SPD-20A и колонкой с обратной фазой Shodex ODP-40 4E.
2
3
2
3
2
3
2
3
Программа градиента элюции (вода - ацетонитрил) следующая: 0-4 мин, 100% НО, 0% ацетонитрила (CHCN); 4-60 мин, 100-25% НО, 0-75% CHCN; 60-75 мин, 25-0% НО, 75-100% CHCN; контрольная промывка 75-120 мин 0% НО, 100% CHCN. Весь ВЭЖХ-анализ сделан с ESI-детектором при длинах волн 230 нм и 330 нм; температура 17°С. Объем впрыска составлял 1 мл.
Идентификацию БАВ проводили методом тандемной масс-спектрометрии с помощью масс-спектрометра amaZon SL (производство фирмы «BRUKER DALTONIKS», Германия), оснащенного источником ионизации электрораспылением ESI в режимах отрицательных и положительных ионов.
Оптимизированные параметры получены следующим образом: температура источника ионизации 70°С; поток газа 4 л/мин; газ-небилайзер (распылитель) 7,3 psi; капиллярное напряжение 4500 V; напряжение на изгибе торцевой пластины 1500 V; напряжение фрагментатора 280 V; энергия столкновения 60 eV. Масс-спектрометр использовался в диапазоне сканирования m/z 100-1.700 для MС и МС/МС. Скорость захвата составляла 1 спектр/с для MС и 2 спектра/с для МС/МС. Сбор данных контролировался программным обеспечением Windows для BRUKER DALTONIKS.
На фиг. видно, что при температуре 31°С и давлении 50 бар выход дигидрокверцетина минимальный и составляет 0,28 мг/г растительного сырья, а при температуре 60°С и давлении 200 бар - максимальный и составляет 5,12 мг/г растительного сырья.
2
Таким образом, заявляемый способ в сравнении с ближайшим аналогом позволяет получить СО экстракт кедрового стланика Pinus pumila с содержанием дигидрокверцетина 0,28-5,12 мг/г растительного сырья при более низких давлении и температуре за более короткий срок.
Источники информации
1. Стародубов, А.В.; Домрачев, Д.В.; Ткачев, А.В. Состав эфирного масла кедрового стланика (Pinus pumila) из Хабаровского края. // Химия растительного сырья. - 2010. - №1. - С. 81-86.
2. Хан, В.А.; Дубовенко, Ж.В.; Пентегова, В.А. Сесквитерпеноиды живиц некоторых видов хвойных семейства Pinaceae Сибири и Дальнего Востока. // Химия древесины. - 1983. - №4. - С. 34-42.
3. Kurose, K., Okamura, D. and Yatagai, M. Composition of the essential oils from the leaves of nine Pinus species and the cones of three of Pinus species. Flavour Fragr. J. - 2007. - Vol. 22. - Issue 1. - Рp. 10-20.
4. Bernatova, I.; Liskova, S. Mechanisms Modified by (-)-Epicatechin and Taxifolin Relevant for the Treatment of Hypertension and Viral Infection: Knowledge from Preclinical Studies. Antioxidants. 2021, 10, 467.
5. Kandeel, M.; Kitade, Y.; Almubarak, A. Repurposing FDA-approved phytomedicines, natural products, antivirals and cell protectives against SARS-CoV-2 (COVID-19) RNA-dependent RNA polymerase. PeerJ. 2020. 8:e10480. DOI 10.7717/peerj.10480.