ШТАММ Shewanella vesiculosa ARC 37 ВКПМ В-13083 - ДЕСТРУКТОР НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ
SHEWANELLA VESICULOSA ARC 37 VKPM B-13083 STRAIN - AN OIL AND OIL PRODUCTS DESTRUCTOR

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области биотехнологии, микробиологии, экологии, охране окружающей среды и представляет собой новый бактериальный штамм Shewanella vesiculosa ARC 37 ВКПМ В-13083, обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов. Штамм может быть использован для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре от +20 до -2,5°С и солености 30±10 г/л.
Уровень техники
Известен штамм Rhodococcus sp. - деструктор нефтяных углеводородов (патент РФ №2518349, приоритет 11.04.2013, опубл. 10.06.2014.), который утилизирует нефть, мазут, керосин, нафталин, пентадекан, тетрадекан, гексадецен, фенилдекан, пристан уже на 5 день при 20-30°С. Данный штамм показал высокую степень деструкции углеводородов при температуре +30°С. Однако данный штамм не способен производить утилизацию углеводородов при низких температурах.
Известен штамм Bacillus subtilis «Колыма-7/2к» (патент РФ 2446900, приоритет 13.07.2010, опубл. 10.04.2012), который может быть использован в условиях Крайнего Севера. Применение такого микробного препарата позволяет за 3 месяца летнего периода снизить концентрацию нефти до 0,48%. Недостатком данного штамма является то, что он утилизирует углеводороды в условиях почвы.
Известен штамм Exiguobacterium mexicanum ВКПМ В-11011 (патент РФ №2523584, приоритет 27.03.2013, опубл. 20.07.2014). Штамм может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +37°С. Также известен штамм Serratia plymuthica VKM B-2819D (патент РФ №2560272, приоритет 22.09.2014, опубл. 20.08.2015), обладающий способностью быстро утилизировать нефть и нефтепродукты (дизельное топливо, масло моторное, масло гидравлическое, газовый конденсат), может быть использован для очистки почв и водоемов, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, в широком диапазоне температур от +4 до +30°С. Недостатком штаммов является то, что они не способны утилизировать нефтезагрязнения при высокой солености воды до 30 г/л.
Штамм Rhodococcus erythropolis депонирован под регистрационным номером ВКМ AC-2613D (патент РФ 2553336 приоритет 20.08.2013 опубл. 10.06.2015). Штамм используется для очистки пресноводных, солоноватоводных и морских объектов и донных отложений. Микроорганизм обеспечивает деструкцию нефти в водных объектах при температуре от +2 до +25°С и солености до 2,7%. Недостатком изобретения является то, что штамм утилизирует углеводороды в условиях богатых по питательным веществам (в состав среды входит пептон 5 г/л и сахароза 15 г/л). В реальных условиях утилизации углеводородных загрязнений количество питательных веществ значительно снижены.
Наиболее близким аналогом является штамм Nocardia coeliaca ARC 12 ВКПМ Ас-1990 (патент РФ 0002624067, приоритет 30.06.2017, опубл. 30.06.2017), обладающий способностью к деструкции нефти и нефтепродуктов. Штамм может быть использован для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре от +20 до +4°С и солености 30 г/л, в условиях бедных по питательным веществам. К недостаткам препарата можно отнести тот факт, что заявленный температурный диапазон активности штамма находится в области положительных температур. Также для препарата не указаны пределы солености, в которых он сохраняет активность.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является получение бактериального штамма, способного осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов при температуре от +20 до -2,5°С и солености 30±10 г/л в условиях, бедных по питательным веществам.
Поставленная задача решается тем, что получен штамм Shewanella vesiculosa ARC 37 ВКПМ В-13083, способный осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов, который может быть использован для очистки акваторий водоемов, береговой линии, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, при температуре от +20 до -2,5°С и солености 30±10 г/л в условиях, бедных по питательным веществам.
Штамм выделен из портовой зоны города Мурманска в августе 2013 года. Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИгенетика (ВКПМ, Москва, 1-й Дорожный пр., д. 1) под регистрационным номером ВКПМ В-13083.
Идентификация штамма была осуществлена на основании изучения его культурально-морфологических и физиолого-биохимических характеристик, а также на основании изучения последовательности гена 16S рРНК.
Полученный штамм характеризуется следующими признаками.
Культурально-морфологические признаки.
Колонии оранжево-коричневые, округлые, блестящие, гладкие, выпуклые, с ровным краем, однородной структуры, мягкой консистенции. Размеры до 9 мм. Клетки палочковидные, размером 0,5-0,8×1,5-3,0 мкм, подвижные. Окраска по Граму отрицательная.
Физиолого-биохимические признаки
Штамм растет при температуре от +20 до -2,5°С, в аэробных условиях. Растет при рН 4,0-8,0. Растет на плотных и жидких питательных средах с содержанием NaCl 30±10 г/л. Способен расти в жидкой среде с углеводородами в качестве единственного источника углерода и энергии.
2
4
2
4
4
4
2
4
2
4
2
4
4
4
2
4
Штамм поддерживается пересевами 1 раз в 14 дней на плотной питательной среде modPCA следующего состава (г/л): KHPO - 1,5; KHPO - 0,75; MgSO - 1,0; (NH)SO - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; D-глюкоза - 1,0; агар - 14; рН 7,0 или жидкой питательной среде №1 следующего состава: KHPO - 1,5; KHPO - 0,75; MgSO - 1,0; (NH)SO - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 0,5; дрожжевой экстракт - 0,1; рН 7,0. В жидкой питательной среде в качестве углеводородного субстрата использовали смесь товарной нефти Возейского месторождения (плотность 37,9°API, сернистость 0,66%, характеризуется как тяжелая, вязкая, с высоким содержанием смол и асфальтенов) и дизельного топлива в соотношении 1:1 по объему.
Также штамм может храниться при +6±2°С в лиофилизированном состоянии с использованием сухого обезжиренного молока в качестве защитной среды.
Для приготовления препарата к культуре микроорганизмов можно добавить питательный премикс на основе различных органических компонентов в различных соотношениях (таких как сухое обезжиренное молоко, мука различных растительных культур, молочная сыворотка, меласса и т.п.), неорганические вещества, стимулирующие микробный рост - в первую очередь содержащие такие макроэлементы как азот и фосфор, железо и пр. (различные копмлексные минеральные удобрения). Кроме того, в сухой форме препарат содержит защитные среды, использующиеся для увеличения выживаемости микроорганизмов при сушке, например растворы сахаров, сложные среды, такие как раствор сухого обезжиренного молока, сухие протеины и другие.
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение поясняется конкретными примерами выполнения, которые не являются единственно возможным, но наглядно демонстрирует возможность достижения требуемого технического результата.
Пример 1. Выделение и культивирование штамма Shewanella vesiculosa ARC 37 ВКПМ В-13083.
Штамм выделен из образцов грунта и морской воды береговой линии порта города Мурманска в августе 2013 года. Образец массой 5±2 г вносили в 100 мл питательной среды №1. Культивирование проводили при температуре +4°С, на орбитальном шейкере (130 об/мин). Время культивирования 7 суток. Полученную накопительную культуру вносили в количестве 10 мл в 100 мл питательной среды №1. Было проведено не менее 30 пассажей накопительной культуры. Выделение штамма из накопительной культуры проводили на среде modPCA, полученную чистую культуру далее культивировали на среде №1.
Пример 2. Исследование нефтеокисляющей активности штамма Shewanella vesiculosa ARC 37 ВКПМ В-13083.
Штамм, выращенный на жидкой питательной среде №1, вносили в качестве инокулята в 100 мл питательной среды №1. В качестве контроля была использована питательная среда без добавления культуры. После проведения культивирования при температуре -2,5°С, 130 об./мин в течение 30 суток проводилась экстракция углеводородов гексаном согласно ГОСТ 31953-2012, хроматографическая оценка убыли углеводородов проводилась на на хроматографе Кристалл 2000 м (Хроматэк) с капиллярной колонкой DB-1 (Agilent) [длина - 30 м, диаметр - 0,25 мм, толщина слоя - 0,25 мкм] с пламенно-ионизационным детектором (ПИД). Температура детектора - 350°С; температура испарителя - 300°С; газ-носитель - гелий; поток газа - 1,0 мл/мин; расход газа - 20,0 мл/мин; расход водорода - 20 мл/мин; расход воздуха - 200 мл/мин. Измерения проводят в условиях температурного градиента от 100 до 300°С со скоростью градиента 15,0°С/мин.
Суммарная убыль для среднекипящей и высококипящей фракции составляла не менее 30% за 30 суток культивирования при -2,5°С и солености среды 30 г/л.
Суммарная убыль для среднекипящей и высококипящей фракции составляла не менее 30% за 30 суток культивирования при -2,5°С и солености среды 40 г/л.
Пример 3. Способ производства препарата на основе штамма Shewanella vesiculosa ARC 37 ВКПМ В-13083.
2
4
2
4
4
4
2
4
9
Штамм Shewanella vesiculosa ARC 37 ВКПМ В-13083, выращенный на среде modPCA при температуре +4°С в течение 7 суток, вносят в жидкую питательную среду следующего состава (г/л): KHPO - 1,5; KHPO - 0,75; MgSO - 1,0; (NH)SO - 4,0; NaCl - 30; гидролизат казеина - 5,0; дрожжевой экстракт - 2,5; D-глюкоза - 1,0; рН 7,0. Далее культивируют при температуре +10°С на орбитальном шейкере в течение 3 суток до конечного титра 10 КОЕ/мл. В полученную суспензию клеток в питательной среде вносят защитную среду (сухое обезжиренное молоко в количестве 10%). Далее полученную суспензиию замораживают и обезвоживают методом лиофилизации. Полученную сухую биомассу штамма Shewanella vesiculosa ARC 37 ВКПМ В-13083 смешивают с питательным премиксом (сухое обезжиренное молоко) в соотношении 1:10.
Таким образом, получен штамм, способный осуществлять деструкцию нефти и нефтепродуктов при температуре -2,5°С и солености 30±10 г/л в условиях, бедных по питательным веществам.