СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЛИМФОМЫ, ПРИМЕНЯЯ ТИЕНОТРИАЗОЛОДИАЗЕПИНОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ
METHOD OF TREATING LYMPHOMA USING THIENOTRIAZOLODIAZEPINE COMPOUNDS

Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к способам лечения B-клеточных злокачественных заболеваний и T-клеточных злокачественных заболеваний, применяя фармацевтически приемлемые количества композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение.
Уровень техники настоящего изобретения
Белки, содержащие бромодомен, играют важную роль в регуляции экспрессии генов, посредством ремоделирования структуры хроматина. О противоопухолевой активности сообщается при острых и хронических гематологических злокачественных опухолях, включая B-клеточные и T-клеточные злокачественные опухоли, применяя ингибиторы BRD2/3/4, членов семейства бромодомена и экстратерминальных доменов (BET). B-клеточные злокачественные опухоли, которые известны как B-клеточные неоплазмы или B-клеточные лимфомы, представляют собой рак, который возникает, когда B-клетки сверхпродуцируются или являются злокачественными. B-клеточные злокачественные опухоли включают, например, диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL), лимфому зоны мантии (MCL), лимфому маргинальной зоны селезенки (SMZL) и множественную миелому (MM). T-клеточные злокачественные опухоли, такие как анапластическая крупноклеточная T-клеточная лимфома, представляют собой гетерогенную группу лимфоидных неоплазм, представляющих собой злокачественную трансформацию T-лимфоцитов. Настоящее описание предоставляет способы лечения определенных B-клеточных злокачественных заболеваний и T-клеточных злокачественных заболеваний.
Сущность настоящего изобретения
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения B-клеточных злокачественных заболеваний или T-клеточных злокачественных заболеваний введением пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение, представленное формулой 1:
1
где R представляет собой алкил, содержащий количество атомов углерода 1-4,
2
3
5
2
6
5
6
7
2
8
7
8
4
2
a
9
9
2
b
10
10
R представляет собой атом водорода; атом галогена; или алкил, содержащий количество атомов углерода 1-4, необязательно замещенных атомом галогена или гидроксильной группой, Rпредставляет собой атом галогена; фенил, необязательно замещенный атомом галогена, алкилом, содержащим количество атомов углерода 1-4, алкокси, содержащим количество атомов углерода 1-4 или циано; -NR-(CH)m-R, где R представляет собой атом водорода или алкил, содержащий количество атомов углерода 1-4, m представляет собой целое 0-4, и R представляет собой фенил или пиридил, необязательно замещенный атомом галогена; или -NR-CO-(CH)n-R, где R представляет собой атом водорода или алкил, содержащий количество атомов углерода 1-4, n представляет собой целое 0-2, и R представляет собой фенил или пиридил, необязательно замещенный атомом галогена, и R представляет собой -(CH)-CO-NH-R, где a представляет собой целое 1-4, и Rпредставляет собой алкил, содержащий количество атомов углерода 1-4; гидроксиалкил, содержащий количество атомов углерода 1-4; алкокси, содержащий количество атомов углерода 1-4; или фенил или пиридил, необязательно замещенный алкилом, содержащим количество атомов углерода 1-4, алкокси, содержащим количество атомов углерода 1-4, амино или гидроксильную группу или -(CH)-COOR, где b представляет собой целое 1-4, и R представляет собой алкил, содержащий количество атомов углерода 1-4, или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата или сольвата.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения B-клеточных злокачественных заболеваний или T-клеточных злокачественных заболеваний введением пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение, независимо выбранное из группы (i) (S)-2-[4-(4-хлорфенил)-2,3,9-триметил-6H-тиено[3,2-f][1,2,4]триазоло-[4,3-a][1,4]диазепин-6-ил]-N-(4-гидроксифенил)ацетамида или его дигидрата, (ii) метил (S)-{4-(3'-цианобифенил-4-ил)-2,3,9-триметил-6H-тиено[3,2-f][1,2,4]триазоло[4,3-a][1,4]диазепин-6-ил}ацетата, (iii) метил (S)-{2,3,9-триметил-4-(4-фениламинофенил)-6H-тиено[3,2-f][1,2,4]триазоло[4,3-a][1,4]диазепин-6-ил}ацетата; и (iv) метил (S)-{2,3,9-триметил-4-[4-(3-фенилпропиониламино)фенил]-6H-тиено[3,2-f][1,2,4]триазоло[4,3-a][1,4]диазепин-6-ил}ацетата.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения B-клеточных злокачественных заболеваний или T-клеточных злокачественных заболеваний введением пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции, содержащей (S)-2-[4-(4-хлорфенил)-2,3,9-триметил-6H-тиено[3,2-f][1,2,4]триазоло-[4,3-a][1,4]диазепин-6-ил]-N-(4-гидроксифенил)ацетамид, имеющий структуру формулы 2:
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения B-клеточных злокачественных заболеваний или T-клеточных злокачественных заболеваний введением пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение, представленное формулой 1, где пациент представляет собой человека.
В одном варианте осуществления для лечения B-клеточных злокачественных заболеваний, применяя фармацевтически приемлемое количество соединения формулы (1), B-клеточные злокачественные заболевания включают диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому и лимфому маргинальной зоны селезенки. В другом варианте осуществления для лечения T-клеточных злокачественных заболеваний, применяя фармацевтически приемлемое количество соединения формулы (1), T-клеточные злокачественные заболевания включают анапластическую крупноклеточную T-клеточную лимфому.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения B-клеточных злокачественных заболеваний или T-клеточных злокачественных заболеваний введением пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции, содержащей (S)-2-[4-(4-хлорфенил)-2,3,9-триметил-6H-тиено[3,2-f][1,2,4]триазоло-[4,3-a][1,4]диазепин-6-ил]-N-(4-гидроксифенил)ацетамид, имеющий структуру формулы 2:
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения B-клеточных злокачественных заболеваний или T-клеточных злокачественных заболеваний у пациента введением пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение, представленное формулой 2, где пациент представляет собой человека.
В одном варианте осуществления для лечения B-клеточных злокачественных заболеваний, применяя фармацевтически приемлемое количество соединения формулы (2), B-клеточные злокачественные заболевания включают диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому и лимфому маргинальной зоны селезенки. В другом варианте осуществления для лечения T-клеточных злокачественных заболеваний, применяя фармацевтически приемлемое количество соединения формулы (2), T-клеточные злокачественные заболевания включают анапластическую крупноклеточную T-клеточную лимфому.
Краткое описание чертежей
Предшествующая сущность настоящего изобретения, а также последующее подробное описание настоящего изобретения, будут лучше понятны при прочтении в сочетании с прилагаемыми чертежами.
2
Фиг. 1(А-Е) показывает изменения клеточного цикла, вызванные различными концентрациями соединения формулы 2 в линиях клеток DLBLC, DoHH, U-2932, Karpas 422, SU-DHL-6 и Val. Ось X, линии клеток. Ось Y, процент клеток в каждой фазе клеточного цикла.
2
Фиг. 2A-2C показывают индукцию клеточного старения в линии клеток DoHHDLBLC и линии клеток L-82 ALCL после 48-часового воздействия соединения формулы 2. Ось Y представляет собой процент клеток, положительных - галактозидазе.
2
Фиг. 3A и 3B показывают степень экспрессии BRD2, BRD3 и BRD4 в DLBCL линиях клеток, SU-DHL-2, SU-DHL-4, SU-DHL-5, SU-DHL-6, SU-DHL-7, Val, OCI-Ly7, U-2932, DoHH и Karpas 422. Ось X, линии клеток. Ось Y, количества мРНК, относительно GAPDH.
Фиг. 4A и 4B показывают степень экспрессии BRD2, BRD3 и BRD4 в ALCL линиях клеток, MACl, FE-PD, Karpas 299, SU-DHL-1, SUPM-2, L82, JB6 и TS. Ось X, линии клеток. Ось Y, количества мРНК, относительно GAPDH.
2
Фиг. 5A-5F показывают концентрацию мРНК MYC после повышающихся доз соединения формулы 2 в DLBCL линиях клеток, SU-DHL-2, OCI-Ly3, U-2932, DoHH, Karpas 422 и SU-DHL-6. Ось X, линии клеток. Ось Y, количества мРНК, относительно необработанного образца.
Фиг. 6A-6D показывают концентрацию мРНК MYC после повышающихся доз соединения формулы 2 в ALCL линиях клеток, L82, Karpas 299, FE-PD и SU-DHL-1. Ось X, линии клеток. Ось Y, количества мРНК, относительно необработанного образца.
2
Фиг. 7A-7C показывают концентрацию мРНК MYC для DLBCL линий клеток, DoHH, Karpas 422 и SU-DHL-2, после 2-часового воздействия 1 мкМ соединения формулы 2, с последующей отмывкой.
2
Фиг. 8A-8C показывают влияние соединения формулы 2 на пролиферацию DLBCL линий клеток, DoHH, U-2932 и SU-DHL-6, с течением времени после 24-часовой обработки IC50 дозой соединения формулы 2, с последующей отмывкой.
Фиг. 9A-9B показывают концентрации мРНК NF·B мишеней (IRF4, A20, BIRC3) в ABC-DLBCL линиях клеток, SU-DHL-2 и U-2932, после повышающихся доз соединения формулы 2. Ось X, линии клеток. Ось Y, кратное изменение, относительно необработанного образца.
Подробное описание настоящего изобретения
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения B-клеточных злокачественных заболеваний или T-клеточных злокачественных заболеваний фармацевтически приемлемым количеством композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение. В одном данном варианте осуществления тиенотриазолодиазепиновое соединение представлено следующей формулой (1):
1
2
3
5
2
6
5
6
7
2
8
7
8
4
2
a
9
9
2
b
10
10
где R представляет собой алкил, содержащий количество атомов углерода 1-4, R представляет собой атом водорода; атом галогена; или алкил, содержащий количество атомов углерода 1-4, необязательно замещенный атомом галогена или гидроксильной группой, R представляет собой атом галогена; фенил, необязательно замещенный атомом галогена, алкилом, содержащим количество атомов углерода 1-4, алкокси, содержащим количество атомов углерода 1-4 или циано; -NR-(CH)m-R, где R представляет собой атом водорода или алкил, содержащий количество атомов углерода 1-4, m представляет собой целое 0-4, и R представляет собой фенил или пиридил, необязательно замещенный атомом галогена; или -NR-CO-(CH)n-R, где R представляет собой атом водорода или алкил, содержащий количество атомов углерода 1-4, n представляет собой целое 0-2, и R представляет собой фенил или пиридил, необязательно замещенный атомом галогена, и R представляет собой -(CH)-CO-NH-R, где a представляет собой целое 1-4, и R представляет собой алкил, содержащий количество атомов углерода 1-4; гидроксиалкил, содержащий количество атомов углерода 1-4; алкокси, содержащий количество атомов углерода 1-4; или фенил или пиридил, необязательно замещенный алкилом, содержащим количество атомов углерода 1-4, алкокси, содержащим количество атомов углерода 1-4, амино или гидроксильной группой или -(CH)-COOR, где b представляет собой целое 1-4, и R представляет собой алкил, содержащий количество атомов углерода 1-4, или его фармацевтически приемлемой соли или его гидрата или сольвата. В одном данном варианте осуществления пациент представляет собой человека.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения B-клеточных злокачественных заболеваний или T-клеточных злокачественных заболеваний фармацевтически приемлемым количеством композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение, представленное формулой (1), где B-клеточные злокачественные заболевания или Т-клеточные злокачественные заболевания независимо выбраны из ходжкинской лимфомы или неходжкинской лимфомы. В одном данном варианте осуществления пациент представляет собой человека.
В одном данном варианте осуществления ходжкинская лимфома независимо выбрана из классической ходжкинской лимфомы (нодулярный склероз) (КХЛ), КХЛ смешанно-клеточного типа, КХЛ с лимфопенией, КХЛ с большим количеством лимфоцитов и нодулярного типа лимфомы Ходжкина с преобладанием лимфоцитов.
В другом данном варианте осуществления неходжкинская лимфома независимо выбрана из лимфом, связанных со СПИДом, анапластической крупноклеточной лимфомы, ангиоиммунобластомной лимфомы, бластической NK-клеточной лимфомы, хронической лимфоцитарной лимфомы/мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, кожной Т-клеточной лимфомы, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, Т-клеточной лимфомы энтеропатического типа, фолликулярной лимфомы, гамма-дельта Т-клеточной лимфомы печени и селезенки, лимфобластной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, назальной Т-клеточной лимфомы, детской лимфомы, периферийной Т-клеточной лимфомы, первичной лимфомы центральной нервной системы, Т-клеточного лейкоза, трансформированных лимфом, Т-клеточной лимфомы, связанной с лечением и макроглобулинемии Вальденстрема.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы введением пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение, представленное формулой 1. В одном данном варианте осуществления пациент представляет собой человека.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения лимфомы маргинальной зоны селезенки у пациента введением пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение, представленное формулой 1. В одном данном варианте осуществления пациент представляет собой человека.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения анапластической крупноклеточной T-клеточной лимфомы введением пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение, представленное формулой 1. В одном данном варианте осуществления пациент представляет собой человека.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает способ лечения B-клеточных злокачественных заболеваний или T-клеточных злокачественных заболеваний введением пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение, представленное формулой 1, которое выбрано из группы, состоящей из: (i) (S)-2-[4-(4-хлорфенил)-2,3,9-триметил-6H-тиено[3,2-f][1,2,4]триазоло[4,3-a][1,4]диазепин-6-ил]-N-(4-гидроксифенил)ацетамида или его дигидрата, (ii) метил (S)-{4-(3'-цианобифенил-4-ил)-2,3,9-триметил-6H-тиено[3,2-f][1,2,4]триазоло[4,3-a][1,4]диазепин-6-ил}ацетата, (iii) метил (S)-{2,3,9-триметил-4-(4-фениламинофенил)-6H-тиено[3,2-f][1,2,4]триазоло[4,3-a][1,4]диазепин-6-ил}ацетата; и (iv) метил (S)-{2,3,9-триметил-4-[4-(3-фенилпропиониламино)фенил]-6H-тиено[3,2-f-][1,2,4]триазоло[4,3-a][1,4]диазепин-6-ил}ацетата. В одном данном варианте осуществления пациент представляет собой человека.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает способ лечения B-клеточных злокачественных заболеваний или T-клеточных злокачественных заболеваний введением пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции, содержащей (S)-2-[4-(4-хлорфенил)-2,3,9-триметил-6H-тиено[3,2-f][1,2,4]триазоло[4,3-a][1,4]диазепин-6-ил]-N-(4-гидроксифенил)ацетамид (формула 2), также известный как Y-803 и OTX-015:
В одном данном варианте осуществления пациент представляет собой человека.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения B-клеточных злокачественных заболеваний или T-клеточных злокачественных заболеваний фармацевтически приемлемым количеством композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение, представленное формулой (2), где B-клеточные злокачественные заболевания или T-клеточные злокачественные заболевания независимо выбраны из ходжкинской лимфомы или неходжкинской лимфомы. В одном данном варианте осуществления пациент представляет собой человека.
В одном данном варианте осуществления ходжкинская лимфома независимо выбрана из классической ходжкинской лимфомы (нодулярный склероз) (КХЛ), КХЛ смешанно-клеточного типа, КХЛ с лимфопенией, КХЛ с большим количеством лимфоцитов и лимфомы Ходжкина нодулярного типа с преобладанием лимфоцитов.
В другом данном варианте осуществления неходжкинская лимфома независимо выбрана из лимфом, связанных со СПИДом, анапластической крупноклеточной лимфомы, ангиоиммунобластомной лимфомы, бластической NK-клеточной лимфомы, хронической лимфоцитарной лимфомы/мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы, кожной Т-клеточной лимфомы, диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы, Т-клеточной лимфомы энтеропатического типа, фолликулярной лимфомы, гамма-дельта Т-клеточной лимфомы печени и селезенки, лимфобластной лимфомы, лимфомы маргинальной зоны, назальной Т-клеточной лимфомы, детской лимфомы, периферийной Т-клеточной лимфомы, первичной лимфомы центральной нервной системы, Т-клеточного лейкоза, трансформированных лимфом, Т-клеточной лимфомы, связанной с лечением и макроглобулинемии Вальденстрема.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает способ лечения диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомы введением пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение, представленное формулой 2. В одном данном варианте осуществления пациент представляет собой человека.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения лимфомы маргинальной зоны селезенки введением пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение, представленное формулой 2. В одном данном варианте осуществления пациент представляет собой человека.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения анапластической крупноклеточной T-клеточной лимфомы введением пациенту фармацевтически приемлемого количества композиции, содержащей тиенотриазолодиазепиновое соединение, представленное формулой 2. В одном данном варианте осуществления пациент представляет собой человека.
Специалист в данной области техники может осуществлять получение соединений, представленных формулой 1 и формулой 2, химическим способом согласно способам, описанным ранее в данной области техники, включая способы, описанные в патенте США №5712274, который включен в настоящее изобретение с помощью ссылки во всей своей полноте.
Соединения, представленные формулой 1 или формулой 2, можно смешивать с фармацевтически приемлемыми носителями для пероральной доставки. Носители могут включать связующие, смазывающие вещества, разрыхлители и другие, функциональные и нефункциональные вспомогательные вещества.
Специалист в данной области техники может определить дозу соединений, представленных формулой 1 или формулой 2, принимая во внимание массу тела, возраст, состояние здоровья, рацион и другие соответствующие факторы, представленные пациентом, а также биодоступность соединений формулы 1 или формулы 2 и композиции с соединениями формулы 1 или формулы 2. В одном варианте осуществления пероральная доза соединения формулы 1 или соединения формулы 2 может быть в диапазоне от 40 до 100 мг.
Настоящее изобретение дополнительно описано последующими не ограничивающими примерами, которые иллюстрируют неожиданные результаты способов лечения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Эффект соединения формулы 2 на пролиферацию лимфоидных клеток
Антипролиферативную активность соединения формулы 2 оценивали в двадцати двух (22) сформированных человеческих клеточных линиях с диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфомой (DLBCL), восьми (8) сформированных человеческих клеточных линиях с анапластической крупноклеточной T-клеточной лимфомой (ALCL), четырех (4) сформированных человеческих клеточных линиях с лимфомой зоны мантии (MCL) и трех (3) сформированных человеческих клеточных линиях с лимфомой маргинальной зоны селезенки (SMZL). Линии клеток выращивали в RPMI-1640 (GIBCO Invitrogen, Basel, Switzerland) или DMEM (GIBCO Invitrogen, Basel, Switzerland) среде, дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой, 1% L-глютамином и смесью пенициллин-стрептомицин-неомицин (~5,000 единиц пенициллина, 5 мг/мл стрептомицина, 10 мг/мл неомицина).
4
50
Для анализов на пролиферацию, клетки высевали в 96-луночные планшеты при плотности 10 клеток на лунку. Соединение формулы 2 (OncoEthix SA, Lausanne, Switzerland) растворяли в DMSO в виде исходного раствора 10 мМ, затем разделяли на аликвоты и хранили при -80°C. Для каждого эксперимента аликвоты исходного раствора размораживали, разбавляли последовательно в культуральной среде и применяли в течение 2-3 дней. Клетки обрабатывали DMSO (контроль) или повышающимися дозами соединения формулы 2 (в пяти экземплярах) в течение 72 часов при 37°C. Для обнаружения клеточной пролиферации, бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (MTT) (Sigma, Buchs, Switzerland) получали в виде исходного раствора 5 мг/мл в фосфатно-буферном соляном растворе (PBS) и стерилизовали фильтрованием. Затем, к каждой лунке добавляли количество раствора MTT, равное 0,5 мг/мл, и выдерживали в темноте при 37°C в течение 4 часов. Затем, клетки лизировали лизирующим буфером с 25% додецилсульфатом натрия (SDS), и регистрировали поглощение при 570 нм на Beckman-Coulter AD340 приборе. Дозы, соответствующие концентрации, которая дает 50% ингибирование роста (GI), оценивали подгонкой сигмоидальной модели посредством кривой зависимости эффекта от дозы, применяя R статистический пакет (R: A Language and Environment for Statistical Computing, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria).
50
Результаты, обобщенные в таблице 1, показывали, что 68% (15/22) DLBCL линий, 100% (3/3) SMZL линий, 62% (5/8) ALCL линий, но не (0/3) MCL линии, были чувствительными к ингибированию роста соединения формулы 2, где чувствительность определяли GI<500 нМ. Интересно, что отсутствовало явное различие чувствительности линий клеток, полученных из DLBCL типа герминативного центра (GBC-DLBCL), линий клеток, полученных из DLBCL подобного активированным B-клеткам типа (ABC-DLBCL).
50
50
Для исследования возможного цитотоксического эффекта соединения формулы 2 на DLBCL линии клеток, степень некроза клеток оценивали после воздействия соединением в течение 72 часов при дозах в диапазоне от 100 до 1500 нМ (включая диапазон величин GI). Для оценки некроза клеток, клетки обрабатывали DMSO или различными дозами соединения формулы 2 в течение 72 часов, собирали, промывали один раз PBS, и затем окрашивали йодидом пропидия (1 мкг/мл, Sigma) в PBS. Поглощение регистрировали при 535 нМ на Beckman-Coulter AD340 приборе. Анализ процента некроза клеток осуществляли, применяя CellQuest Pro программное обеспечение (Becton Dickinson). Результаты (таблица 1) показывали, что соединение формулы 2 вызывает некроз клеток только у небольшого процента DLBCL линий с низкими величинами GI (SU-DHL-2, TMD8, OCI-Ly3).
Кроме того, эффект соединения формулы 2 на индуцирование апоптоза оценивали в четырех DLBCL линиях клеток (Karpas 422, SU-DHL-2, SU-DHL-6, U2932) и четырех ALCL линиях клеток (FE-PD, K299, L82, SU-DHL-1). Клетки обрабатывали DMSO (контроль) или различными дозами соединения формулы 2 в течение 72 часов, затем окрашивали набором реактивов для проточной цитометрии Click-iT EdU (Invitrogen) и 7-ADD (BD Pharmingen) и анализировали на содержание ДНК, применяя FACScan проточный цитометр. Анализ апоптоза в процентах проводили, применяя FlowJo 7.6.3 программное обеспечение (Cytek Development, Fremont, California, USA). Результаты не показали индукции апоптоза ни в DLBCL ни в ALCL линиях клеток.
2
Поскольку соединение формулы 2 не вызывало существенного некроза или апоптоза, несмотря на заметное снижение жизнеспособности клеток, эффект соединения формулы 2 на клеточный цикл оценивали на 5 линиях клеток DLBCL (DohH, Karpas 422, SU-DHL-6, VAL, U-2932). Клетки обрабатывали DMSO (контроль) или различными дозами соединения формулы 2 в течение 24 часов, затем собирали, промывали один раз PBS и фиксировали в 80% этаноле при 4°C в течение, по меньшей мере, одного часа. Фиксированные клетки окрашивали йодидом пропидия (50 мкг/мл, Sigma) в PBS, содержащем РНКазу-A (75 kU/мл, Sigma) и анализировали на содержание ДНК, применяя FACScan проточный цитометр (Becton Dickinson). Анализ клеточного цикла проводили, применяя пакет программного обеспечения ModFit LT (Verity Software House, Inc., Topsham, Maine, USA). Как показано на фигуре 1, результаты показывали, что соединение формулы 2 вызывало G1-блокировку зависящим от дозы способом.
Поскольку соединение формулы 2 вызывало значительное снижение жизнеспособности клеток и G1-блокировку без вызывания апоптоза, индукцию старения клеток оценивали в репрезентативных DLBCL и ALCL линиях клеток. Клетки обрабатывали соединением формулы 2 в течение 48 часов, и затем окрашивали галактозидазой. Как показано на фигуре 2, результаты показывали существенное усиление старения клеток и в DLBLC и в ALCL линиях клеток, указывая на то, что соединение формулы 2 обладает главным образом цитотоксическим эффектом на лимфомные клетки.
Пример 2
Эффекты соединения формулы 2 на снижение экспрессии c-myc онкогена
Ранее было показано, что соединение формулы 2 представляет собой конкурентный ингибитор BET бромодоменовых белков 2, 3 и 4 (BRD2, BRD3, BRD4), как описано в опубликованной патентной заявке США №20100286127, которая включена в настоящее изобретение с помощью ссылки во всей своей полноте. Было показано, что ингибирование BRD4 приводит в результате к снижению экспрессии c-MYC онкогена [Delmore J.E, Issa G.C, Lemieux M.E, et al: BET bromodomain inhibition as a therapeutic strategy to target c-Myc. Cell 2011; 146:1-14]. Соответственно, базовые концентрации мРНК и белка BRD2, BRD3 и BRD4 и эффекты соединения формулы 2 на концентрации мРНК и белка c-MYC оценивали в отобранных DLBCL и ALCL линиях клеток.
Для оценки концентрации белка, анализ вестерн-блоттингом проводили следующим способом. Клетки растворяли в горячем SDS лизирующем буфере (2,5% SDS в pH 7,4 Tris-HCl) и обрабатывали ультразвуком в течение 15 секунд. Содержание белка в различных образцах определяли, применяя анализ белка с применением бицинхониновой кислоты (BCA) (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA). Лизаты (40 мкг) фракционировали SDS-PAGE, применяя 8% полиакриламидные гели, на основе ожидаемой молекулярной массы. Разделенные белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану электропереносом. Мембраны блокировали в TBS-T буфере (20 мМ Tris-HCl, pH 7,6, содержащем 137 мМ NaCl, 0,1% Tween 20 и 5% бычий сывороточный альбумин) в течение одного часа. Затем мембраны выдерживали в течение ночи с первичными антителами, разбавленными в TBS-T. Применяли следующие антитела: анти-BRD2 (ab37633, AbCam, Cambridge, UK), анти-BRD3 (ab56342, AbCam), анти-BRD4 (ab75898, AbCam) и анти-GAPDH (MAB374, Millipore, Billerica, Massachusetts, USA). Мембраны промывали TBS-T три раза в течение десяти минут каждая промывка, и затем выдерживали в течение одного часа в TBS-T, содержащем подходящие конъюгированные с пероксидазой хрена анти-мышиные или анти-кроличьи вторичные антитела (Amersham Life Sciences, Arlington Heights, Massachusetts, USA). Мембраны промывали три раза TBS-T в течение десяти минут для каждой промывки, и затем проявляли усиленным хемилюминесцентным детекторным анализом согласно инструкциям производителя (Amersham Life Science). Равную загрузку образцов подтверждали зондированием для GAPDH.
Анализ мРНК проводили следующим образом. РНК экстрагировали из клеток, применяя набор для выделения РНК (Qiagen AG, Hombrechtikon, Switzerland). Концентрацию суммарной РНК определяли спектрофотометрически при 260 нМ, применяя NanoDrop спектрофотометр (NanoDrop Technologies, Wilmington, Deleware, USA). Один микрограмм суммарной РНК подвергали обратной транскрипции, применяя Superscript First-Strand Synthesis System для набора ПЦР в реальном времени (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) согласно инструкциям производителя. Амплификацию ПЦР проводили, применяя Fast SYBR Green Master Mix на StepOnePlus системе для ПЦР в реальном времени (Applied City, California, USA). Набор праймеров для BRD2, BRD3 и BRD4 (таблица 2) конструировали, применяя пакет программного обеспечения Primer3 (Rozen S, Skaletsky H: Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. в: Misener S, Krawetz S.A (Eds) Methods in Molecular Biology, Vol.132: Bioinformatics Methods and Protocols. Towota, New Jersey, USA; Humana Press, Inc., 2000, pp.365-386), и набор праймеров для c-MYC был из опубликованных исследований. Все образцы анализировали в трех экземплярах. Относительное количество специфической мРНК для каждого образца рассчитывали, исходя из средних величин порогового цикла (Ct), применяя дельта-дельта Ct с корректировкой экспериментальных переменных нормализацией к конститутивному гену GAPDH.
50
50
2
50
50
50
50
Результаты показывали, что исходные концентрации мРНК и белка BRD2 изменялись в широких пределах между DLBCL линиями клеток и ALCL линиями клеток, как показано на фигурах 3 и 4, соответственно, тогда как все испытуемые линии клеток имели низкие концентрации мРНК и белка BRD4 и только следовые концентрации мРНК и белка BRD3. Интересно, что исходные концентрации мРНК и белка BRD2 не коррелировали с чувствительностью к ингибированию роста соединения формулы 2. Среди испытуемых линий DLBCL, получали аналогичные GI величины для линии с наибольшей концентрацией мРНК BRD2 (SU-DHL-6 GI=110 нМ) и наименьшей концентрацией мРНК BRD2 (DoHH GI=90 нМ). Аналогично, среди испытуемых линий ALCL аналогичные величины GI получали для линии с наибольшей концентрацией мРНК BRD2 (L82 GI=36 нМ) и наименьшей концентрацией мРНК BRD2 (FE-PD GI=158 нМ).
50
Результаты анализа мРНК показали, что 24-часовое воздействие соединения формулы 2 приводило в результате к заметному снижению экспрессии мРНК c-MYC в пяти из шести (5 из 6) испытуемых линиях клеток DLBCL и в четырех из четырех (4 из 4) испытуемых линиях клеток ALCL, как показано на фиг. 5 и 6, соответственно. Интересно, что линия DLBCL, которая показала минимальное подавление экспрессии c-MYC, была очень чувствительной к ингибированию роста соединения формулы 2 (SU-DHL-6 GI=110 нМ).
2
50
Для оценки являлось ли обратимым снижение экспрессии c-MYC, вызванное соединением формулы 2-индуцированной, три DLBCL линии (DoHH, Karpas 422, SU-DHL-2) обрабатывали соединением формулы 2 в течение двух часов, и затем среду, содержащую соединение формулы 2, заменяли на среду, не содержащую соединения формулы 2 ("отмывка"). После отмывки, зависящее от времени восстановление экспрессии мРНК c-MYC наблюдали во всех линиях клеток, с различной кинетикой, как показано на фигуре 7. В похожем эксперименте, DLBCL клетки, обработанные соединением формулы 2 при концентрации GI в течение 24 часов, начинали расти после "отмывки", как показано на фигуре 8.
Пример 3
Эффект соединения формулы 2 на снижение экспрессии NFkB
2
Ранее было показано, что соединение формулы 2 является конкурентным ингибитором BET бромодоменовых белков 2, 3 и 4 (BRD2, BRD3, BRD4), как описано в опубликованной патентной заявке №20100286127, и сообщалось, что BRD4 участвует в регуляции фактора транскрипции NFkB, который может действовать как супрессор опухоли в определенных обстоятельствах [Huang B, Yang X.D, Zhou M.M, Ozato K, Chen L.F: Brd4 coactivates transcriptional activation ofNF-kB via specific binding to acetylated RelA. Mol. Cell Biol. 2009; 29:1375-1387]. Соответственно, эффект соединения формулы 2 на экспрессию мРНК NFkB мишеней (IRF4, A20, BIRC3) оценивали на пяти DLBCL (DoHH, Karpas 422, SU-DHL-2, SU-DHL-6, U2932) линиях клеток. Результаты показывали, что соединение формулы 2 вызывало снижение экспрессии NFkB мишеней; репрезентативные результаты показаны на фиг. 9.
Настоящее изобретение можно осуществлять в других конкретных формах без отступления от сущности или важных признаков настоящего изобретения. Соответственно, следует ссылаться на прилагаемую формулу изобретения, указывающую на объем настоящего изобретения, а не на приведенное выше описание. Хотя приведенное выше описание относится к предпочтительным вариантам осуществления настоящего изобретения, следует отметить, что другие варианты и модификации будут очевидны специалисту в данной области техники, и их можно осуществлять без отступления от существа и объема настоящего изобретения.