Способ стимуляции пострезекционной пролиферации гепатоцитов путем внутрипеченочного введения цианокобаламина
METHOD OF STIMULATING POSTRESECTION PROLIFERATION OF HEPATOCYTES BY INTRAHEPATIC INTRODUCTION OF CYANOCOBALAMIN

Изобретение относится к хирургии и может быть использовано для стимуляции пролиферации гепатоцитов после обширной резекции печени.
Хирургическое лечение объемных образований печени в большинстве случаев остается единственным способом, позволяющим добиться увеличения продолжительности жизни и излечения пациентов [В.А. Вишневский, М.Г. Ефанов, И.З. Икрамов, А.В. Чжао. Опухоли печени: диагностика и хирургическое лечение // Доказательная гастроэнтерология. – 2013. – Т.2 – С. 38-47.]. Часто при опухолевых и паразитарных заболеваниях печени применяются операции с удалением трех и более сегментов, что может приводить к осложнениям в послеоперационном периоде и развитию пострезекционной печеночной недостаточности [В.А. Вишневский, Ю.А. Коваленко, О.И. Андрейцева, Р.З. Икрамов, М.Г. Ефанов, Н.А. Назаренко, К.А. Тупикин Пострезекционная печеночная недостаточность: современные проблемы определения, эпидемиологии, патогенеза, оценки факторов риска, профилактики и лечения // Украинский журнал хирургии. – 2013. – №3. – С. 172-183]. Ведущую роль в этиологии пострезекционной печеночной недостаточности занимает недостаточность регенераторных процессов в паренхиме печени [Michalopoulos G.K., De Frances M.C. Liver regeneration // Science. – 1997. – Vol. 276. – P.6060-6066].
12
Таким образом, проблема стимуляции пострезекционной регенерации печени и на сегодняшний день остается актуальной. В клинической практике, с целью улучшения метаболических процессов печени часто используют гепатопротекторы, в состав большинства из которых входит цианокобаламин. Коферментная форма цианокобаламина — метилкобаламин необходим для репликации и роста клеток, т.е. для регенерации поврежденных тканей. Основная роль метилкобаламина заключается в участии в процессах метилирования ДНК [Медведев Д.В., Звягина В.И. Молекулярные механизмы токсического действия гомоцистеина// Кардиологический вестник. – 2017. - Т.12. - №1. – С. 52-57]. Начальным этапом данного процесса является реакция реметилирования гомоцистеина в метионин, которая происходит в присутствии цианокобаламина, являющегося кофактором в метионинсинтазной реакции. Получающийся из гомоцистеина метионин преобразуется в S-аденозилметионин (SAM), представляющий собой молекулу-источник метильной группы для реакций метилирования ДНК. Несмотря на то, что в большинстве случаев метилирование ДНК приводит к повышению содержания в клетке гетерохроматина, экспериментально доказано что увеличение содержания 5-метилцитозина в ДНК приводит к уменьшению площади плотного примембранного хроматина в регенерирующей печени, следовательно, происходит декомпактизация, разрыхление хроматина, он становится более активным. Активация хроматина в ядрах клеток-мишеней в ДНК несомненно может приводить к повышению пролиферативной активности гепатоцитов [Кляшева Р.И. Модуляция метилирования ДНК и реорганизация структуры хроматина под влиянием витамина В и адреналина у эукариот. Автореферат дис. доктора биологических наук / Рязанский гос. мед. ун-т., Рязань, 1996].
Таким образом, использование цианокобаламина является перспективным методом, позволяющим быстро достигнуть восстановления резецированной печени, снизить возможность развития пострезекционной печеночной недостаточности.
Технический результат – простота исполнения и восстановление 94,27%±2,96% от исходной массы печени к 14-м суткам после типичной резекции печени.
Технический результат достигнут тем, что при анатомической резекции 70% от массы печени лабораторному животному интраоперационно в паренхиму печени производили 8-10 инъекций на глубину 2-3 мм на расстоянии 5-7 мм друг от друга по 0,1 мл цианокобаламина в концентрации 200 мкг/мл.
Известен способ стимуляции регенерации печеночной ткани путем введения экспериментальным животным подкожно экстракта вытяжки коры свиных или фетальных надпочечников человека, в котором при коррекции смоделированного состояния токсического гепатита к экстракту вытяжки коры надпочечников добавляют витаминный комплекс, приготовленный на основе витаминов – пиридоксина гидрохлорида, цианокобаламина и витамина РР, и вводят его ежедневно по 0,8 мл курсом 10 инъекций [Патент №2185835]. Недостатками данного способа являются: необходимость длительного введения препаратов, отсутствие контроля концентрации действующих веществ в печеночной ткани, многокомпонентность предлагаемой терапии, сложность получения некоторых компонентов.
Известен способ стимуляции регенерации печени L-норвалином после резекции [Патент RU 2556609]. Недостатками данного способа являются: необходимость проведения дополнительных манипуляций (внутрижелудочное введение препаратов каждые 46 часов первые 7 суток эксперимента), строгое соблюдение дозирования и кратности введения препарата, возможность нарушения всасывания препарата при внутрижелудочном введении и достижение только 50% исходной массы на 14-е сутки после операции.
Известен способ внутрибрюшинного введения суспензии фетальных клеток печени и/или селезенки, и/или тимуса с целью стимуляции регенераторных процессов в печени [Патент РФ № 2203675]. Основным недостатком данного способа введения препарата является то, что инородные по своим антигенам клетки в брюшной полости активируют резидентные макрофаги, провоцируя развитие воспаления (перитонита), что и было подтверждено заявителями. Также недостатком внутрибрюшинного введения является невозможность контроля концентрации препарата, попадающего в паренхиму печени.
Эксперимент проводили на белых крысах линии Wistar массой 210-220 г., половозрелых самцах без признаков заболевания в полном соответствии с «Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» принятой Советом Европы (Страсбург, Франция, 1986) и согласно приказу лабораторной практики Российской Федерации МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г.
Лабораторным животным проводили типичную резекцию печени в объёме 70% от ее исходной массы, согласно модели предложенной G. Higgins и R. Anderson (1931). Животных вводили в эфирный наркоз. В качестве хирургического доступа использовали косой подреберный разрез от верхушки мечевидного отростка до свободного края XI ребра. Мобилизацию удаляемой  левой и медиальной долей осуществляли пересечением венозной связки. Предварительно выделенную сосудистую ножку перевязывали прошивной лигатурой. Мобилизованные доли отсекали выше уровня наложенной лигатуры.
В 1-й контрольной группе животных (n=30) проводилась только типичная резекция печени.
3
Во 2-й группе животных (n=30) – типичная резекция печени в сочетании с  интраоперационными инъекциями в паренхиму сохранённых долей печени на глубину 2-3 мм на расстоянии 5-7 мм друг от друга по 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия из расчета 0,1 мл препарата на 1 смпеченочной ткани.
3
В 3-й группе животных  (n=30) – типичная резекция печени в сочетании с интраоперационными инъекциями в паренхиму сохранённых долей печени на глубину 2-3 мм на расстоянии 5-7 мм друг от друга раствора цианокобаламина в концентрации 200 мкг/мл из расчета 0,1 мл препарата на 1 смпеченочной ткани. Ушивание раны животным осуществляли послойно: мышцы простым обвивным швом, кожи – узловыми швами. В качестве шовного материала на всех этапах использовалась полигидроксиацетиловая нить 4/0.
рез
max
max
рез.
Резецированные доли взвешивали (М). Рассчитывали долженствующую исходную массу (M) по формуле: M = М*3/2.
Животных выводили из эксперимента на 1-е, 7-е и 14-е сутки после операции. Взвешивали массу регенерировавших сохранённых долей печени.
max
Оценка регенерации проводилась посредством расчёта отношения наблюдаемой массы печени к исходной массе M.
Оценка пролиферативной активности гепатоцитов осуществлялась с помощью иммуногистохимического исследования – определения индекса пролиферации гепатоцитов Ki-67.
Статистическая обработка выполнялась с помощью пакета «Описательная статистика» программы Excel, для оценки достоверности различий рассчитывали критерий сравнения Стьюдента. Достоверными считались различия при p <0,05.
Таблица 1.
Доля массы печени на момент выведения из эксперимента от долженствующей массы, %
Суткинаблюдения
Группы исследования
1-я
2-я
3-я
1
36,38±3,06
41,91±5,02
46,33±2,35**
7
70,31±2,12
77,4±3,3*
83,61±3,26**
14
80,98±4,6
83,71±4,46
94,27±2,96**
Примечание: * – p<0,05 при сравнении 1-й и 2-й групп животных;
** – p<0,05 при сравнении 1-й и 3-й групп животных.
Наличие статистически значимых различий между 1-й и 3-й группами животных подтверждает эффективность использования цианокобаламина для стимуляции регенерации резецированной печени.
Отсутствие статистически значимых различий между 1-й и 2-й группами животных подтверждает отсутствие вклада фактора использования именно внутрипаренхимальных инъекций в конечный результат.
Для оценки пролиферативной активности гепатоцитов проводили иммуногистохимическое исследование участков печени, взятых после выведения животных из эксперимента. Обработку материала проводили с фиксацией в формалине, заливкой в парафин, окрашиванием Ki-67. Далее подсчитывали индекс пролиферации путем определения Ki-67-положительных ядер в одноядерных и двуядерных гепатоцитах.
Таблица 2.
Индекс пролиферации одноядерных клеток в биоптате печени экспериментальных групп животных на 1, 7 и 14 сутки исследования, %
Сутки исследования
1 группа
2 группа
3 группа
1
2.19±0,52
2,22±0,43
5,97±0,34<sup>*</sup>
7
2,78±0,21
2,64±058
6,54±0,71<sup>*</sup>
14
2,54±0,29
2,56±0,45
6,22±0,54<sup>*</sup>
Примечание: * – p<0,05 при сравнении 1-й и 3-й групп животных.
Таблица 3.
Индекс пролиферации двуядерных клеток в биоптате печени экспериментальных групп животных на 1, 7 и 14 сутки исследования, %
Сутки исследования
1 группа
2 группа
3 группа
1 сутки
0,038±0,019
0,011±0,006<sup>*</sup>
0,063±0,026<sup>**</sup>
7 сутки
0,043±0,017
0,019±0,011<sup>*</sup>
0,089±0,031<sup>**</sup>
14 сутки
0,039±0,014
0,024±0,017
0,069±0,024<sup>**</sup>
Примечание: * - p<0,05 при сравнении 1-й и 2-й  групп животных; ** - p<0,05 при сравнении 1-й и 3-й групп животных.
При иммуногистохимическом исследовании наибольшее значение индекса пролиферации наблюдалось при введении цианокобаламина (одноядерные гепатоциты – 6,22%±0,54%, двуядерные гепатоциты – 0,069%±0,024% на 14 сутки эксперимента), что подтверждает влияние интраоперационного введения цианокобаламина в паренхиму печени на скорость пролиферации гепатоцитов.
Незначительные различия в результатах полученных в 1-й и 2-й группах животных: индекс пролиферации одноядерных гепатоцитов в 1-й группе на 14 сутки исследования 2,54%±0,29% и во 2-й группе – 2,56%±0,45%, позволяют исключить влияние фактора использования именно внутрипаренхимальных инъекций на повышение пролиферативной активности гепатоцитов после резекции печени.
Полученные результаты позволяют констатировать возможность стимуляции пострезекционной пролиферации гепатоцитов путем интраоперационного внутрипеченочного введения цианокобаламина.