Средство для профилактического и/или терапевтического лечения вызванных патогенными бактериями инфекций и/или воспалений (варианты)
AGENT FOR PREVENTIVE AND/OR THERAPEUTIC TREATMENT OF PATHOGENIC BACTERIAL INFECTIONS AND/OR INFLAMMATIONS (VERSIONS)

Настоящее изобретение относится к избранным штаммам молочнокислых бактерий для применения в лечении инфекций и/или воспалений, обусловленных патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes, в частности для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении дерматита в целом, себорейного дерматита, розацеа, экземы и акне. Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции, содержащей смесь, содержащую или, альтернативно, состоящую из избранных штаммов молочнокислых бактерий, для применения в лечении инфекций и/или воспалений, вызванных патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes, в частности для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении дерматита в целом, себорейного дерматита, розацеа, экземы и акне. Композицию, содержащую указанную смесь избранных штаммов молочнокислых бактерий, включают в лекарственную форму для перорального применения (новый продукт питания, пищевая добавка или медицинское устройство, или фармацевтическая композиция), в форме порошка, диспергируемого порошка, гранулята, пакетов или полоски, раствора, распыляемого раствора, сиропа, таблетки, капсулы, пилюли или пастилки; или для местного применения (композиция для медицинского устройства или фармацевтическая композиция) в форме крема, мази, помады, геля, гидрогеля, дисперсии, эмульсии или спрея для использования в неизменном виде для нанесения на кожу или для трансдермального применения также в форме пластыря.
Известно, что термин «дерматит» включает заболевание кожи и, в целом, состоит из воспалительной реакции кожи, проявляющейся как раздражение. Себорейный дерматит (также называемый себорейной экземой) представляет собой дерматит, поражающий прежде всего такие области тела, как волосистая часть головы, лицо, грудь и наружный слуховой проход. В частности, вероятность поражения выше в областях кожи с большим количеством сальных желез. Себорейный дерматит может иногда быть похожим на и/или сосуществовать с розацеа. Розацеа также известно как хронический дерматоз, а именно патологическое повреждение кожи, обычно включающее среднюю часть лица и проявляющееся как покраснение и воспалительная угреподобная сыпь, то есть папулы и пустулы, похожие на акне. Из-за этого признака раньше его также называли «acne rosacea» (розовые угри); этот термин более не используется, чтобы его не путали с акне.
Известно, что акне представляет собой заболевание кожи, характеризующееся воспалением волосяного фолликула и связанной с ним сальной железы (обычно определяемым как «прыщ» или «фурункул»). Волосяной фолликул является определенной структурой кожи (или дермы), образующей клетки, которые в последующем формируют волос. Волосяной фолликул представляет собой сумкообразное углубление эпидермиса с расширением у основания, называемым луковицей, которое продолжается шейкой, сужающейся по направлению к поверхности эпидермиса. Вместе с волосом и связанной с ним сальной железой фолликул образует пилосебацейный комплекс. Функция сальной железы, расположенной в коже, а точнее в дерме под эпидермисом, состоит в образовании и секреции маслянистого вещества, называемого кожным салом (биологическая жидкость), состоящего главным образом из холестерина и жирных кислот. Кожное сало придает коже мягкость и удерживает в ней воду, препятствуя посредством этого появлению сухости. Частями тела, в наибольшей степени подверженными появлению акне, являются лицо, шея, плечи, спина и грудь, особенно у субъектов европеоидной расы в возрасте от 12 до 20 лет. Наиболее распространенный вид акне называют «acne vulgaris».
Пока остается нерешенной задача лечения дерматита в целом, себорейного дерматита, розацеа, экземы и акне естественным образом без массированного местного применения мыла или обезжиривающих веществ, с или без местного или перорального системного применения антибиотиков. Например, с использованием кортикостероидов с противовоспалительной активностью для местного применения.
Действительно, применение мыла или обезжиривающих веществ иногда нежелательно и не лишено ограничений и недостатков. Несмотря на то, что при раздражении, вызванном, например, акне, себорейным дерматитом, экземой или розацеа, склонна к «жирности» из-за большого количества кожного сала, чрезмерное обезжиривание под действием мыла и детергентов фактически приводит к противоположному эффекту, когда защитная реакция кожи естественным образом приводит к усилению образования собственного кожного сала. Кроме того, чрезмерное удаление кожного сала может приводить к повреждению воднолипидного слоя, способствуя бактериальной колонизации и повышая чувствительность кожи к потенциальным раздражителям.
Таким образом, местная обработка кожи, пораженной дерматитом в целом, себорейным дерматитом, розацеа, экземой или акне, с использованием мыла или детергентов не является ни радикальным, ни эффективным лечением для всех пораженных субъектов.
С другой стороны, альтернатива местному лечению с использованием мыла или детергентов представлена типичным способом, применяемым многими дерматологами, когда для лечения заболеваний кожи (дерматита), таких как, например, акне, действие направлено против бактерий, вызывающих инфекцию, посредством использования антибиотиков для местного или перорального системного применения, таких как, например, антибиотики на основе тетрациклина или миноциклина или их производные.
В случае акне, например, к фактическому воспалению (ответу организма) и инфекции, развивающейся на коже, приводят пропиониформные типы бактерий.
Бактерии, принадлежащие к виду Propionibacterium acnes, обнаружены на поверхности кожи или дермы и являются возбудителями некоторых заболеваний кожи, таких как, например, среди прочего, акне. Акне, например, развиваются, когда бактерии, принадлежащие к виду Propionibacterium acnes, закупоривают поры кожи, приводя к инфекции, которой организм (иммунная система) противодействует посредством воспаления самой кожи.
Что касается патогенеза акне, считают, что патогенный микроорганизм P. acnes колонизирует протоки сальных желез, вызывая врожденный иммунный ответ, а также прогрессирование от невоспаленного черного угря до воспаленной папулы, пустулы и узелка. При исследовании воспаления, обусловленного P. acnes, и очагов акне на лице показано, что уровни интерлейкина-8 (IL-8) повышены приблизительно в 3015 раз (Р<0,001) по сравнению с прилежащими областями тканей лица без акне ("The role of inflammation in the pathology of acne", (Literature Review) Emil A. Tanghetti MD Center for Dermatology and Laser Surgery, Sacramento, California), Sept. 2013, volume 6, number 9; "Inflammation and Extracellular Matrix Degradation Mediated by Activated Transcription Factors Nuclear Factor-kB and Activator Protein-1 in inflammatory Acne Lesions in Vivo", Sewon Kang et al, American Journal of Pathology, Vol. 166, No. 6, June 2005).
Хемокин IL-8 часто связан с воспалением и повышен при оксидативном стрессе, в результате чего он является ключевым параметром локализованного воспаления; по этой причине его считают основным провоспалительным медиатором при акне.
Было обнаружено, что разные штаммы P. acnes демонстрируют разную способность индуцировать секрецию HBD2, IL-8 и IL-1-альфа из кератиноцитов ("Pathways to inflammation: acne pathophysiology" (Review article) Taylor M et al, EJD, vol. 21, n.° 3, May-June 2011).
На основании вышеизложенного, ввиду того, что патогенный микроорганизм P. acnes приводит к процессам, вызывающим инфекцию, а также обуславливающим развитие воспаления, что лежит в основе акне, желательно иметь эффективное средство лечения (профилактического и/или терапевтического) акне, способное противодействовать инфекции и, в то же время, воспалению.
Было обнаружено, что использование определенных антибиотиков для местного или системного применения, действующих против бактерий, принадлежащих к виду Propionibacterium acnes, может, но не всегда, быть средством лечения акне.
Тем не менее, использование антибиотиков для местного (таких как, например, кортикостероиды с противовоспалительной активностью для местного применения) или системного применения не позволяет устранить причину, лежащую в основе механизма, посредством которого пропиониформные бактерии обуславливают развитие акне или других заболеваний, поражающих кожу. Помимо этого, использование антибиотиков для местного или системного применения не лишено побочных эффектов и противопоказаний, что существенно ограничивает их использование, в первую очередь при их применении на протяжении длительных периодов времени. Кроме того, существует проблема, обусловленная тем фактом, что применение антибиотиков приводит к развитию подтвержденной антибиотикорезистентности и появлению резистентных штаммов P. acnes.
В этом отношении, бактериостатическая, бактерицидная и противовоспалительная активность некоторых антибиотиков для местного или системного применения является недостатком, приводя к росту штаммов P. acnes, резистентных к некоторым антимикробным средствам, используемым в местной терапии (клиндамицину, эритромицину, меклоциклину и гентамицину).
Таким образом, до настоящего времени сохраняется потребность в лечении против патогенов, вызывающих инфекции, приводящие к воспалениям кожи или аллергии.
Конкретно, существует потребность в эффективном и естественном лечении дерматита, себорейного дерматита, экземы, розацеа и акне, позволяющем избежать или обеспечить существенное уменьшение применения мыла и детергентов и использования антибиотиков для местного или системного применения.
Таким образом, все еще есть выраженная потребность в лечении акне, которое можно проводить на протяжении длительных периодов времени, не имеющем противопоказаний и побочных эффектов и представляющем собой радикальное и эффективное лечение, действующее как против инфекции, вызванной P. acnes, так и в качестве ответа на дисбаланс, вызванный реакцией иммунной системы на воспаление, обусловленное патогенным микроорганизмом P. acnes.
После интенсивных и обширных работ по исследованию и разработке заявитель удовлетворил указанные выше потребности, отобрав и выделив определенные штаммы молочнокислых бактерий из очень большой группы встречающихся в природе штаммов бактерий. Избранные штаммы молочнокислых бактерий эффективны против патогена P. acnes, вызывающего некоторые заболевания кожи, такие как, например, среди прочего, акне.
Задачей настоящего изобретения является по меньшей мере один штамм бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus salivarius, для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении инфекций и/или воспалений, вызванных патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes, как заявлено в приложенной формуле изобретения.
В предпочтительном воплощении указанный по меньшей мере один штамм бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus salivarius, выделен и идентифицирован как Lactobacillus salivarius LS03 (ID 1382) - DSM 22776, депонированный 23 июля 2009 г. в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Institute Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, далее - DSMZ) компанией Probiotical SpA (Италия).
В другом предпочтительном воплощении указанный по меньшей мере один штамм бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus salivarius, выделен и идентифицирован как Lactobacillus salivarius LS04 - DSM 24618, депонированный 02 марта 2011 г. в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Institute Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, далее - DSMZ) компанией Probiotical SpA (Италия).
В еще одном предпочтительном воплощении указанный штамм бактерий является живым или неживым; предпочтительно, он может находиться в форме тиндализованных, обработанных ультразвуком, лизированных клеток и/или их частей, или ферментов и/или метаболитов.
В другом предпочтительном воплощении указанные инфекции и/или воспаление, вызванные патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes, обуславливают начало некоторых заболеваний кожи или дермы, предпочтительно выбранных из группы, включающей или, альтернативно, состоящей из дерматита, себорейного дерматита, экземы, розацеа и акне. Еще более предпочтительно, указанное заболевание представляет собой акне в легкой степени, средней степени или хронические акне.
В другом предпочтительном воплощении указанная патогенная бактерия представляет собой Propionibacterium acnes АТСС 11827.
Другой задачей настоящего изобретения является композиция, содержащая эффективное количество смеси, содержащей или, альтернативно, состоящей из по меньшей мере одного штамма бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus salivarius, и физиологически приемлемого носителя; предназначенная для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении инфекций и/или воспалений, вызванных патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes.
В предпочтительном воплощении указанная композиция для применения содержит по меньшей мере один штамм бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus salivarius, выделенный и идентифицированный как Lactobacillus salivarius LS03 (ID 1382) - DSM 22776, депонированный 23 июля 2009 г. в DSMZ.
В другом предпочтительном воплощении указанная композиция для применения содержит по меньшей мере один штамм бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus salivarius, выделенный и идентифицированный как Lactobacillus salivarius LS04 - DSM 24618, депонированный 02 марта 2011 г. в DSMZ.
В другом воплощении указанная композиция для применения содержит по меньшей мере один штамм бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus salivarius (Lactobacillus salivarius LS03 (ID 1382) - DSM 22776 и/или Lactobacillus salivarius LS04 - DSM 24618), который может быть живым или неживым; предпочтительно, он может находиться в форме тиндализованных, обработанных ультразвуком, лизированных клеток и/или их частей, или ферментов и/или метаболитов.
В другом воплощении указанная композиция для применения активна как против инфекций, так и против воспалений, вызванных патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes, обуславливающих начало некоторых заболеваний кожи или дермы, предпочтительно выбранных из группы, включающей или, альтернативно, состоящей из дерматита, себорейного дерматита, экземы, розацеа и акне. Еще более предпочтительно, указанное заболевание представляет собой акне в легкой степени, средней степени или хронические акне.
В другом воплощении указанная композиция для применения активна как против инфекций, так и против воспалении, вызванных, например, патогенной бактерией Propionibacterium acnes АТСС 11827.
Заявитель проанализировал 70 штаммов бактерий для оценки их способности модулировать активность Th1- и Th2-лимфоцитов. При первом скрининге было обнаружено, что 22 из 70 проанализированных штаммов обладали существенной противовоспалительной активностью (про-Th2 штаммы). Эти 22 штамма бактерий были изучены дополнительно для оценки их способности ингибировать высвобождение хемокина IL-8. Хемокин IL-8 часто связан с воспалением и повышен при оксидативном стрессе, в результате чего он является ключевым параметром локализованного воспаления; по этой причине его считают основным провоспалительным медиатором при акне.
Исследование показало, что все 22 штамма пробиотических бактерий (Таблица 1) способны значительно ингибировать высвобождение IL-8, образованного РНА(фитогемагглютинин)-активированными мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) на 10-25%, например, BPS01 (DSM 26456) и LS04 (DSM 24618). В частности, 3 штамма пробиотических бактерий, LDD01 (DSM 22106), LRE04 (DSM 23880) и LS03 (DSM 22776), способны снижать продукцию IL-8, приводя к снижению на 36%, 44% и 30%, соответственно. Таким образом, использование этих пробиотических штаммов, оказывающих столь выраженное действие, ингибируя IL-8, очевидно, имеет первостепенное значение для ограничения провоспалительной активности этого хемокина в месте воспаления и инфекции, вызванных Propionibacterium acnes.
Задачей настоящего изобретения является штамм бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus salivarius, для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении инфекций и/или воспалений, вызванных патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes; где указанный штамм бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus salivarius выделен и идентифицирован как Lactobacillus salivarius LS04 - DSM 24618, депонированный 02 марта 2011 г. в DSMZ компанией Probiotical SpA (Италия).
Задачей настоящего изобретения является штамм бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii, для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении инфекций и/или воспалений, вызванных патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes; где указанный штамм бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii выделен и идентифицирован как Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii LDD01 (DSMZ 20074) - DSM 22106, депонированный 10 декабря 2008 г. в DSMZ компанией Probiotical SpA (Италия).
Задачей настоящего изобретения является штамм бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus reuteri, для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении инфекций и/или воспалений, вызванных патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes; где указанный штамм бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus reuteri выделен и идентифицирован как Lactobacillus reuteri LRE04 - DSM 23880, депонированный 05 августа 2010 г. в DSMZ компанией Probiotical SpA (Италия).
Задачей настоящего изобретения является штамм бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium pseudolongum ssp. globosum, для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении инфекций и/или воспалений, вызванных патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes; где указанный штамм бактерий, принадлежащих к виду Bifidobacterium pseudolongum ssp. globosum выделен и идентифицирован как Bifidobacterium pseudolongum ssp. globosum BPS01 - DSM 26456, депонированный 02 октября 2012 г. в DSMZ компанией Probiotical SpA (Италия).
Задачей настоящего изобретения является композиция, содержащая эффективное количество смеси, содержащей или, альтернативно, состоящей из:
(1) по меньшей мере одного штамма бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus salivarius, выбранного из группы, включающей или, альтернативно, состоящей из штамма Lactobacillus salivarius LS03 - DSM 22776, штамма Lactobacillus salivarius LS04 - DSM 24618 и/или их смесей; и/или
(2) по меньшей мере одного штамма бактерий, выбранного из группы, включающей или, альтернативно, состоящей из штамма Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii LDD01 (DSMZ 20074) - DSM 22106, штамма Lactobacillus reuteri LRE04 - DSM 23880 и/или штамма Bifidobacterium pseudolongum ssp. globosum BPS01 - DSM 26456; и физиологически приемлемого носителя;
предназначенная для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении инфекций и/или воспалений, вызванных патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes. В одном воплощении указанные композиции для применения по настоящему изобретению дополнительно содержат лактат аммония, предпочтительно ферментативного происхождения из молочнокислых бактерий.
Задачей настоящего изобретения является композиция, содержащая эффективное количество смеси, содержащей или, альтернативно, состоящей из:
(1) по меньшей мере одного штамма бактерий, принадлежащих к виду Lactobacillus salivarius, выбранного из группы, включающей или, альтернативно, состоящей из штамма Lactobacillus salivarius LS03 - DSM 22776; и/или
(2) по меньшей мере одного штамма бактерий, выбранного из группы, включающей или, альтернативно, состоящей из штамма Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii LDD01 (DSMZ 20074) - DSM 22106 и штамма Lactobacillus reuteri LRE04 - DSM 23880; и физиологически приемлемого носителя;
предназначенная для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении инфекций и/или воспалений, вызванных патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes. В одном воплощении указанные композиции для применения по настоящему изобретению дополнительно содержат лактат аммония, предпочтительно ферментативного происхождения из молочнокислых бактерий.
Предпочтительно, указанная смесь и, таким образом, указанная композиция содержат или, альтернативно, состоят из:
- штамма Lactobacillus salivarius LS03 - DSM 22776; и/или
- штамма Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii LDD01 (DSMZ 20074) - DSM 22106; и физиологически приемлемого носителя;
где указанная композиция предназначена для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении инфекций и/или воспалений, вызванных патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes. Массовое отношение указанных штаммов бактерий предпочтительно составляет приблизительно 1:1, или 2:1, или 3:1, или 4:1, или 5:1, 1:2. В одном воплощении указанные композиции для применения по настоящему изобретению дополнительно содержат лактат аммония, предпочтительно ферментативного происхождения из молочнокислых бактерий.
Предпочтительно, указанная смесь и, таким образом, указанная композиция содержат или, альтернативно, состоят из:
- штамма Lactobacillus salivarius LS03 - DSM 22776; и/или
- штамма Lactobacillus reuteri LRE04 - DSM 23880; и физиологически приемлемого носителя;
где указанная композиция предназначена для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении инфекций и/или воспалений, вызванных патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes. Массовое отношение указанных штаммов бактерий предпочтительно составляет приблизительно 1:1, или 2:1, или 3:1, или 4:1, или 5:1, 1:2. В одном воплощении указанные композиции для применения по настоящему изобретению дополнительно содержат лактат аммония, предпочтительно ферментативного происхождения из молочнокислых бактерий.
Предпочтительно, указанная смесь и, таким образом, указанная композиция содержат или, альтернативно, состоят из:
- штамма Lactobacillus salivarius LS03 - DSM 22776; и
- штамма Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii LDD01 (DSMZ 20074) - DSM 22106; и
- штамма Lactobacillus reuteri LRE04 - DSM 23880; и физиологически приемлемого носителя;
где указанная композиция предназначена для применения в профилактическом и/или терапевтическом лечении инфекций и/или воспалений, вызванных патогенными бактериями, принадлежащими к виду Propionibacterium acnes. Массовое указанных штаммов бактерий предпочтительно составляет приблизительно 1:1:1, или 2:1:1, или 3:1:1, или 4:1:1, или 5:1:1, 1:2:1, или 1:1:2. В одном воплощении указанные композиции для применения по настоящему изобретению дополнительно содержат лактат аммония, предпочтительно ферментативного происхождения из молочнокислых бактерий.
Композиции по настоящему изобретению эффективны для применения в лечении прыщей или фурункулов, предпочтительно расположенных на лице, плечах, спине и верхней части груди.
6
12
7
11
8
10
Общее количество указанного по меньшей мере одного штамма бактерий или комбинации указанных штаммов лактобацилл/бифидобактерий по настоящему изобретению в указанных смесях составляет от 1×10 до 1×10 колониеобразующих единиц (КОЕ) на грамм смеси; предпочтительно от 1×10 до 1×10 КОЕ/г смеси; более предпочтительно от 1×10 до 1×10 КОЕ/г смеси. В одном воплощении указанные композиции для применения по настоящему изобретению дополнительно содержат лактат аммония, предпочтительно ферментативного происхождения из молочнокислых бактерий, в количестве от 1 до 30% по массе относительно массы композиции, предпочтительно в количестве от 5 до 15% по массе относительно массы композиции.
6
11
7
10
8
9
Общее количество указанного по меньшей мере одного штамма бактерий или комбинации указанных штаммов лактобацилл/бифидобактерий по настоящему изобретению в указанных композициях для применения составляет от 1×10 до 1×10 КОЕ/г композиции; предпочтительно от 1×10 до 1×10 КОЕ/г композиции; более предпочтительно от 1×10 до 1×10 КОЕ/г композиции.
По необходимости, указанные композиции для применения могут также дополнительно содержать необходимые/подходящие количества других компонентов, эксципиентов, носителей, поверхностно-активных веществ, адъювантов, консервантов, красителей. Указанные вещества выбирают надлежащим количественным и качественным образом из известных веществ, обычно используемых фармацевтами, которые являются специалистами в области изготовления композиций.
Композицию по настоящему изобретению, содержащую указанную смесь избранных штаммов молочнокислых бактерий, включают в лекарственную форму для перорального применения (новый продукт питания, пищевая добавка или медицинское устройство, или фармацевтическая композиция), в форме порошка, диспергируемого порошка, гранулята, пакетов или полоски, раствора, распыляемого раствора, сиропа, таблетки, капсулы, пилюли или пастилки; или для местного применения (композиция для медицинского устройства или фармацевтическая композиция) в форме крема, мази, помады, геля, гидрогеля, дисперсии, эмульсии или спрея для использования в неизменном виде для нанесения на кожу или для трансдермального применения также в форме пластыря.
Указанные выше штаммы бактерий присутствуют в смеси по настоящему изобретению в количестве от 1% до 50% по массе, предпочтительно от 5% до 40% по массе, еще более предпочтительно от 10% до 30%, относительно общей массы смеси. Тем не менее, указанный процент зависит от типа лекарственной формы, которую предполагается использовать. Например, в случае капсул количество указанных бактерий составляет более 25%, например, более 35%.
6
11
8
10
В одном воплощении композиция содержит штаммы бактерий в концентрации от 1×10 до 1×10 КОЕ на дозу, предпочтительно от 1×10 КОЕ на дозу до 1×10 КОЕ на дозу. Доза может составлять от 0,2 до 10 г, например, может составлять 0,25 г, 1 г, 3 г, 5 г или 7 г. Штаммы бактерий могут присутствовать в композиции в твердой форме, например, в форме порошка, сухого порошка или лиофилизированного порошка.
Все штаммы, описанные и/или заявленные в настоящей заявке на патент, были депонированы в соответствии с Будапештским соглашением.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Тесты ингибирования бактерии Propionibacterium acnes АТСС 11827
Проводили тесты ингибирования общедоступной бактерии Propionibacterium acnes АТСС 11827.
Интенсивная исследовательская активность заявителя была сосредоточена на выявлении, отборе и выделении одного или более чем одного штамма молочнокислых бактерий, способного ингибировать патогенную бактерию, принадлежащую к виду Propionibacterium acnes.
По этой причине было проведено большое количество скрининговых тестов с использованием ряда штаммов бактерий, принадлежащих к видам Lactobacillus salivarius и Lactobacillus rhamnosus. Применяли метод ингибирования в чашках (plate inhibition technique).
Патоген Propionibacterium acnes (АТСС 11827) использовали, получая его жидкую культуру. Патогенную бактерию выращивали в среде BHI (Brain Hearth Infusion, сердечно-мозговой экстракт), дополненной 1%-й глюкозой, до плотности приблизительно 2 по шкале Мак-Фарланда и затем разводили 1:10 в физиологическом растворе. Такую суспензию высевали на среду Раймонда.
Заявитель начал эксперименты на первой большой группе штаммов бактерий, принадлежащих к видам Lactobacillus salivarius и Lactobacillus rhamnosus с целью получения второй отобранной группы потенциальных штаммов-кандидатов. Затем заявитель провел дополнительный отбор и, в итоге, проанализировал следующие штаммы бактерий, демонстрирующие существенную активность против целевого патогенного штамма:
Lactobacillus salivarius LS01 (ID 1797) - DSM 22775, депонированный 23 июля 2009 г. в DSMZ (*);
Lactobacillus salivarius DLV8 (ID 1813) - DSM 25545 депонированный 12 января 2012 г. в DSMZ (*);
Lactobacillus salivarius LS03 (ID 1382) - DSM 22776, депонированный 23 июля 2009 г. в DSMZ (*);
Lactobacillus rhamnosus LR06 (ID 1697) - DSM 21981, депонированный 14 ноября 2008 г. в DSMZ (*);
Lactobacillus rhamnosus LR04 (ID 1132) - DSM 16605, депонированный 20 июля 2004 г. в DSMZ компанией Anidral Sri (Италия), в настоящее время Probiotical SpA (Италия);
Lactobacillus rhamnosus LR05 (ID 1602) - DSM 19739, депонированный 27 сентября 2007 г. в DSMZ компанией Anidral Sri (Италия), в настоящее время Probiotical SpA (Италия).
Все штаммы, обозначенные выше символом (*), были депонированы компанией Probiotical SpA (Италия).
Эти бактерии оживляли двумя последовательными засевами в жидкую среду MRS, центрифугировали и ресуспендировали в свежей среде (об./об.); обозначено «С». Супернатант нейтрализовали и фильтровали, обозначено «S».
Затем проводили тест ингибирования по методике погружаемых дисков (soaked-disk technique), как показано на Фиг. 1.
Указанный тест сразу продемонстрировал неожиданную и более высокую ингибирующую активность штамма Lactobacillus salivarius LS03 (ID 1382) - DSM 22776, депонированного 23 июля 2009 г. в DSMZ, против целевого патогенного штамма.
Указанная ингибирующая активность обусловлена способностью штамма Lactobacillus salivarius LS03 (ID 1382) - DSM 22776, депонированного 23 июля 2009 г. в DSMZ, продуцировать бактериоцины, очень активные против патогена P. acnes. Есть достаточные основания исключить возможность связи этого эффекта с кислотностью и/или возможным образованием перекиси водорода. Первая причина не рассматривается, поскольку другие бактерии, обладающие сходной кислотообразующей активностью, не оказывали эффекта на рост целевого патогена; вторая причина не рассматривается, поскольку чашки инкубировали в анаэробных условиях, препятствующих образованию перекиси водорода лактобациллами.
На основании этого результата исследование было расширено с включением других возможных кандидатов, и результат, полученный при использовании штамма Lactobacillus salivarius LS03 (ID 1382) - DSM 22776, депонированного 23 июля 2009 г. в DSMZ, был дополнительно подтвержден.
Затем, следующие штаммы бактерий были проанализированы во втором тесте:
Lactobacillus reuteri LRE 01 (ID 1775) - DSM 23877, депонированный 05 августа 2010 г. в DSMZ;
Lactobacillus reuteri LRE 02 (ID 1774) - DSM 23878, депонированный 05 августа 2010 г. в DSMZ;
Lactobacillus reuteri LRE 03 (ID 1777) - DSM 23879, депонированный 05 августа 2010 г. в DSMZ;
Lactobacillus reuteri LRE 04 (ID 1779) - DSM 23880, депонированный 05 августа 2010 г. в DSMZ;
Lactobacillus reuteri LRE 05 (ID 1807) - DSM 25139, депонированный 02 сентября 2011 г. в DSMZ;
Все указанные выше штаммы были депонированы компанией Probiotical SpA (Италия).
Поскольку, согласно литературным данным, некоторые Streptococci thermophilus способны продуцировать бактериоцины широкого спектра действия, авторы изобретения также включили в тест некоторые штаммы бактерий, принадлежащих к виду S. thermophilus:
Streptococcus thermophilus Y0 2 (1427) - DSM 16590, депонированный 20 июля 2004 г. в DSMZ;
Streptococcus thermophilus YO 3 (1286) - DSM 16591, депонированный 20 июля 2004 г. в DSMZ;
Streptococcus thermophilus YO 4 (1288) - DSM 16592, депонированный 20 июля 2004 г. в DSMZ;
Streptococcus thermophilus YO 5 (1405) - DSM 16593, депонированный 20 июля 2004 г. в DSMZ.
Все указанные выше штаммы были депонированы компанией Anidral Sri (Италия), в настоящее время Probiotical SpA (Италия).
Авторы изобретения провели скрининг ресуспендированных бактерий, как описано в первом эксперименте, получив таким образом следующие результаты, как показано на Фиг. 2.
В этом втором скрининге не было получено полезных результатов, что дополнительно подтвердило исключительную природу бактериоциновой активности штамма LS03 по настоящему изобретению.
Затем для подтверждения такой ингибирующей активности против целевого патогенного штамма был проведен новый тест со штаммом LS03.
Этот второй тест был сравнением со штаммом Lactobacillus rhamnosus Т12 (ID 1738) LMGP-25211 (WO 2011/029784), использованным в качестве положительного контроля и являющегося частью имеющейся в продаже композиции против акне, называемой Lichtena Norma-Acn.
После выращивания штаммов бактерий, как описано в первом тесте, жидкие культуры разделяли на две аликвоты: первую аликвоту жидкой культуры нейтрализовали перед удалением супернатанта посредством центрифугирования; в то время как вторую аликвоту сначала центрифугировали и только после этого нейтрализовали супернатант.
Согласно литературным данным, адгезия некоторых бактериоцинов на клеточной мембране патогена фактически зависит от кислого рН.
Таким образом, анализировали по 4 образца для каждого из двух анализируемых штаммов (Lactobacillus rhamnosus Т12 (ID 1738) LMGP-25211 и Lactobacillus salivarius LS03 (ID 1382) - DSM 22776). Результаты показаны на Фиг. 3.
Штамм Lactobacillus salivarius LS03 (ID 1382) - DSM 22776, депонированный 23 июля 2009 г. в DSMZ, снова превосходит по своей ингибирующей способности штамм Lactobacillus rhamnosus Т12 LMGP-25211 (Lichtena Norma-Acn), используемый в качестве контроля.
Бактериоцин, продуцируемый штаммом бактерий LS03, демонстрирует адгезионные способности в зависимости от рН и, таким образом, способен оказывать свое ингибирующее действие в разных условиях. Активность только в кислой среде была бы не полностью полезной.
2. Оценка способности пробиотических штаммов ингибировать высвобождение IL-8 из РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови)
2.1 Цель
В этом исследовании были проанализированы 70 штаммов пробиотических бактерий для оценки их способности модулировать активность Th1- и Th2-лимфоцитов. При первом скрининге было обнаружено, что из 70 проанализированных штаммов 22 (Таблица 1) обладали существенной противовоспалительной активностью (про-Th2 штаммы).
Эти 22 штамма пробиотических бактерий (Таблица 1) были изучены дополнительно для оценки их способности ингибировать высвобождение хемокина IL-8 (Фиг. 4). Хемокин IL-8 часто связан с воспалением и повышен при оксидативном стрессе, в результате чего он является ключевым параметром локализованного воспаления; по этой причине его считают основным провоспалительным медиатором при акне.
В этом исследовании анализировали способность отобранных штаммов пробиотических бактерий (Таблица 1) ингибировать высвобождение IL-8 из РВМС. IL-8 является типичным провоспалительным цитокином, продуцируемым при акне в большом количестве.
2.2 Метод: стимуляция РВМС
Выделение РВМС из периферической крови здоровых субъектов согласно протоколу FICOLL.
Предварительная инкубация РВМС с РНА (фитогемагглютинин), 1 мкг/мл в течение 1 часа.
Стимуляция РВМС пробиотическими штаммами в течение 24 часов.
Сбор супернатантов после центрифугирования при 10000 об/мин в течение 5 минут и хранение при -80°С до использования.
Оценка высвобождения IL-8 с использованием набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (eBioscience, Human IL-8 ELISA Ready-Set-Go 2-го поколения).
Анализ данных и статистическая оценка, проводимая с применением парного критерия Стьюдента, данные считают значимыми при значениях р менее 0,05.
2.3 Метод: протокол ELISA для оценки IL-8
Сорбция планшетов с использованием 1X сорбирующего буфера, инкубация при 4°С в течение ночи.
Промывка промывочным буфером (3 раза).
Внесение 1X блокирующего буфера в каждую лунку и инкубация в течение 1 часа при комнатной температуре.
Промывка промывочным буфером (1 раз).
Внесение образцов и стандартов и инкубация в течение 2 часов при комнатной температуре.
Промывка промывочным буфером (5 раз).
Внесение буфера для детекторного антитела в каждую лунку и инкубация в течение 1 часа при комнатной температуре.
Промывка промывочным буфером (5 раз).
Внесение буфера с авидином-HRP (пероксидаза хрена) в каждую лунку и инкубация в течение 30 минут при комнатной температуре.
Промывка промывочным буфером (7 раз).
Инкубация в течение 15 минут с 1X раствором ТМВ (тетраметилбензидин) и остановка реакции останавливающим раствором.
Спектрофометрическое считывание при 450 нм.
2.4 Результаты
Результаты анализа хемокина IL-8 после 1 часа предварительной стимуляции с использованием РНА с последующей 24-часовой инкубацией с отобранными Th2-штаммами пробиотических бактерий (Таблица 1) и последующая оценка по методике ELISA показаны на Фиг. 4.
На Фиг. 4 значение «0» (ноль) относится к эталонному значению состояния воспаления. По существу, оно отражает РНА-активированные клетки. Это выбранный стимул для высвобождения IL-8 (он отражает максимальную продукцию IL-8 - положительный контроль) В то же время, значение «-0,25%» отражает уменьшение высвобождения IL-8 на 25%.
2.5 Выводы
По результатам исследования было обнаружено, что все 22 штамма пробиотических бактерий (Таблица 1) способны значительно ингибировать высвобождение IL-8, образованного РНА-активированными РВМС на 10-25%, например, BPS01 (DSM 26456) и LS04 (DSM 24618). В частности, 3 штамма пробиотических бактерий, LDD01 (DSM 22106), LRE04 (DSM 23880) и LS03 (DSM 22776), способны снижать продукцию IL-8, приводя к снижению, равному 36%, 44% и 30%, соответственно.
Очевидно, что использование этих пробиотических штаммов, оказывающих столь выраженное действие, ингибируя IL-8, имеет фундаментальное значение для ограничения провоспалительного действия этого хемокина в месте воспаления и инфекции, вызванных Propionibacterium acnes.