Структурные критерии хронизации воспаления

Оригинальные исследования

О СЕМИНСКИЙ И.Ж., МАЙБОРОДА А.А. -УДК 616-002-036.12

СТРУКТУРНЫЕ КРИТЕРИИ ХРОНИЗАЦИИ ВОСПАЛЕНИЯ

И.Ж. Семинский, А.А. Майборода.

Резюме. Применение унифицированной модели и количественных способов оценки процесса позволило провести объективный анализ различных по этиологии форм воспаления, выявить общие пространственно-временные закономерности и особенности патогенеза асептического, микробного, паразитарного и инфекционного воспаления. Определены факторы, механизмы и морфологические критерии перехода острого воспаления в хроническое.

Воспаление, как известно, является основным звеном патогенеза большинства заболеваний человека, от его исхода зависит выздоровление от болезни. В неблагоприятных эколого-социальных условиях воспалительные процессы у людей часто протекают атипично с тенденцией к хронизации и генерализации. Поэтому возникает необходимость изучения самых разных форм воспаления, условий, влияющих на его течение, причин перехода острого воспаления в хроническое.

Особую актуальность приобретают исследования по экспериментальному моделированию воспаления. К сожалению, в настоящее время в медицине нет общепринятых моделей воспалительного процесса. Это создает большие трудности при сравнении результатов, полученных разными авторами. Практически отсутствуют адекватные модели и критерии оценки хронического воспаления (А.И. Струков, 1981; В.В. Серов, А.Б. Шех-тер, 1981; А.И. Струков, О.Я. Кауфман, 1989; Д.Н. Маянский, 1991; B.C. Пауков, 1996 и др.,

S. Klebanoff, 1988; R. Smith, 1990; J. Gallin, R. Goldstein, R. Sniderman, 1992).

Исходя из вышеизложенного, в настоящей работе была поставлена цель - разработать унифицированный подход к изучению разных форм воспаления и выявить морфологические критерии хронизации воспаления.

Материалы и методы

Эксперимент проведен на 990 беспородных белых крысах-самцах, 320 мышах-самцах линии CBA/j, 90 беспородных морских свинках-самцах, 60 лягушках в осенне-зимний период. Животные содержались в условиях вивария и были в соответствии с поставленными задачами разделены на 8 основных групп. Первой группе животных (90 крыс) моделировали асептическое воспаление; второй (200 крыс) - создавали микробное воспаление, на третьей (320 крыс) - проводили исследование по определению влияния нарушения углеводного обмена на динамику и структуру воспаления; на четвертой экспериментальной группе животных (60 лягушек, 110 крыс, 90 мышей,

90 морских свинок) проводили опыты по определению степени патогенности гриба В. Bassiana, особенностей грибкового воспаления при ингаляционном заражении; у животных пятой серии экспериментов (120 мышей, 150 крыс) исследовали динамику клеточных реакций и структуру очага при паразитарном воспалении; шестая - (200 мышей) использовалась для изучения инфекционного воспалительного процесса при моделировании псевдотуберкулеза; седьмая - (110 крыс) подвергалась экспериментам по изучению влияния растительного биостимулятора “ам-рит-калаш” на динамику клеточных реакций в очаге воспаления; восьмая группа животных (150 крыс) использовалась для определения противовоспалительного эффекта иммобилизованного протеолитического фермента “профезим”.

Для оценки клеточных реакций в очагах экспериментального воспаления разного генеза применяли комплекс морфологических методов. Материал для исследования забирали через 12 часов,

1, 2, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40 и 60 суток после начала воспалительного процесса. В периферической крови определяли суммарную плотность лейкоцитов и на мазках, окрашенных по Романов-скому-Гимза - лейкоцитарную формулу. Хемо-таксическую способность лейкоцитов определяли методом “кожного окна” (J. Rebuck, J. Crowley, P. Wolf-Jurgensen, 1971). Поглотительную способность фагоцитов оценивали по фагоцитарному индексу (ФИ) и фагоцитарному числу (ФЧ). О бактерицидной активности фагоцитов (БА) судили по степени завершенности фагоцитоза, которую определяли методом посева на питательную среду (Г. Фримель, 1987; В.В. Меньшиков, 1987). В очаге воспаления для оценки интенсивности и скорости протекания клеточных реакций применяли метод А.А. Майбороды (1979) при окрашивании препаратов гематоксилин-эозином и азур Н-эозином. Зрелость фибробластической капсулы оценивали при окрашивании препаратов по Ван-Гизону. В экспериментальной серии с нарушением углеводного обмена для определения величины

воспалительного отека применяли фотокалори-метрический метод с использованием красителя Эванса и гистохимические реакции с ТНТС с последующей фотометрией для определения уровня гликогена, Г6ФДГ, ЛДГ, СДГ в клетках очага воспаления (3. Лойда, Р. Госсрау, Т. Шиблер, 1982).

Для электронномикроскопического исследования кусочки ткани очага воспаления фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на фосфатном буфере рН-7,4, контрастировали четы-рехокисью осмия, уранилацетатом и нитратом си-винца по Рейнольдсу, ультратонкие срезы получали на УМТП-6 и просматривали на электронном микроскопе ПЭМ-100 при ускоряющем напряжении 50 кВт и 75 кВт. На электронограммах качественно оценивали состояние клеток и межклеточного вещества соединительной ткани в очагах воспаления.

Полученные цифровые данные обработаны статистически, считались достоверными при Р<0,05 и представлены в виде таблиц и графиков. По общепринятым методам рассчитаны коэффициенты корреляции между основными показателями клеточных реакций в очагах воспаления (А.Н. Мерков, Л.Е. Поляков, 1974; Э. Ллойд, 1989).

Результаты и обсуждение

Создавая модель воспаления мы стремились, чтобы она отвечала следующим требованиям: хорошей воспроизводимостью, точной дозировкой воспалительного агента, локализованностью процесса, возможностью изучать разные виды и формы воспаления, проводить количественную оценку всех фаз воспаления, изучать влияние различных факторов на механизмы воспаления.

Базовой (контрольной) моделью воспалительного процесса в наших исследованиях являлась следующая. Изготавливают стандартную диффузионную камеру 3x1 мм, объемом 2,5 мм3, которая состоит из милипорового фильтра с диаметром пор 0,3-0,5 мкм. Камеру стерилизуют, заполняют физиологическим раствором и вводят под кожу лабораторным животным. Через определенные сроки, соответствующие основным стадиям воспалительного процесса, кусочки ткани вместе с камерами извлекают и после стандартной гистологической проводки и окраски гематоксилин-эозином микроскопируют. Часть материала осми-руют. Получают ультратонкие срезы, контрастируют по Рейнольдсу и исследуют в электронном микроскопе. На микропрепаратах количественно при помощи окуляра-микрометра и сетки Автандилова определяют интенсивность и продолжительность клеточных реакций воспаления. Лейкоцитарная фаза воспаления характеризуется толщиной лейкоцитарного вала вокруг камеры, концентрацией нейтрофилов и началом их массовой гибели. Эта точка служит временной границей лейкоцитарной и макрофагической фаз воспаления. Вторая стадия (макрофагическая) определяется толщиной клеточного вала вокруг камеры с преобладанием в нем макрофагов, концентрацией

макрофагов в вале. Третья фаза - фибробластиче-ская. Началом ее является момент образования вокруг камеры четырех слоев фибробластов. В формирующейся капсуле подсчитывают ее толщину, концентрацию фибробластов, число слоев фибробластов. Цифровые данные выносятся на график, по которому определяют продолжительность и интенсивность протекания клеточных реакций при воспалении (рис.1).

Ультраструктурные характеристики клеток, реализующих воспаление, позволяют качественно оценить их морфофункциональное состояние в динамике процесса.

— — - плотность лейкоцитов

— • — - плотность макрофагов

— / — - плотность фибробластов

------ - число слоев фибробластов

- лейкоцитарная фаза УУУ\Д - макрофагическая фаза

Ш i - фибробластическая фаза

Т - время удвоения числа слоев фибробластов

Рис.1. Метод оценки динамики и количественных показателей клеточных реакций в очаге воспаления.

Установлено, что у контрольных животных воспалительный процесс протекает по классической схеме асептического воспаления: в течение первых суток развивается лейкоцитарная фаза с образованием вала вокруг камеры толщиной 150±17 мкм с максимальной плотностью клеток 25-30 в 1000 мкм2. Соотношение нейтрофил: мо-нонуклеар на этот срок составляет 3:1. На вторые сутки процесса вокруг камеры формируется клеточный вал толщиной 100±12 мкм с преобладанием в нем макрофагов (макрофагическая фаза воспаления). Начиная с третьих суток вокруг камеры формируется фибробластическая капсула, толщина которой максимальна на десятые сутки -

100± 15 мкм. Затем капсула уплотняется, толщина ее уменьшается и к 20 суткам воспалительный процесс завершается образованием вокруг камеры плотной соединительнотканной капсулы толщиной 50±7 мкм (рис.2).

Таким образом, при использовании контрольной (базовой) модели мы наблюдали все признаки

классического асептического воспаления: последовательная смена клеточных фаз, завершение воспаления в короткие сроки, полная изоляция инородного тела от прилегающих тканей.

180 160 140-

; 100 j. 80 ; 60 40 20 0

ФК

A—i-.

А

'.......О. I Л.................I.................I ГТ I 1-1 I I I I I I I I I' I I I

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Время

Щ - лейкоцитарная фаза (—); ЛВ - лейкоцитарный вал;

[7] - макрофагическая фаза (- -); МВ - макрофагический вал; Д~| - фибробластическая фаза (---);

ФК - фибробластическая капсула.

Рис.2. Динамика и количественные показатели клеточных реакций в очаге асептического воспаления у контрольных животных (камеры заполнены физиологическим раствором).

Аналогичным способом исследовали динамику стафилококкового, паразитарного, инфекционного и грибкового воспаления. Внутрь камер помещали соответственно дозированную взвесь стафилококка, экзометаболитов паразитов, споры грибов, бактерии псевдотуберкулеза. Как видно на рис.З при асептическом воспалении лейкоцитарная фаза протекает в течение 1 суток, макрофагическая - в течение 2 суток, фибробластическая - 17 суток, процесс завершается на 20 сутки; при стафилококковом воспалении: 10, 13, 27 суток соответственно, процесс завершается на 30 сутки; при паразитарном: 5, 5, 5 суток (начало) соответственно; при инфекционном: 5-7, 5-10, 5 суток (начало) соответственно. Воспаление при паразитарном и инфекционном процессе не заканчивается к 30 суткам эксперимента.

асептическое

гнойное I Г1ТТ1      ЕЗ

1___ паразитарное

.........................11 П

%___ инфекционное

11

I I I I I I I I I I I I I I I » I I I I I I Г-т—I I | I | I I

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30

время

НИИ - лейкоцитарная фаза [//// - макрофагическая фаза Ш Ш Ш - фибробластическая фаза

Рис.З. Продолжительность клеточных фаз при разных формах воспаления.

Таким образом, с повышением повреждающей способности воспалительного агента прогрессивно увеличивается время течения лейкоцитарной, макрофагической и фибробластической фаз воспаления, происходит наложение фаз друг на друга, воспалительный процесс не завершается и наступает его хронизация.

В следующей серии опытов, создавая у животных гипо- и гипертиреоз, который сопровождался энергетическим дисбалансом в организме, мы получали хронизацию воспалительного процесса, его затягивание на 10-15 суток без нарушения последовательности клеточных фаз. Лечение животных противовоспалительными препаратами оптимизировали течение воспаления: сокращалось

время протекания процесса, уменьшался объем воспалительного очага, образовывалась более тонкая фиброзная капсула.

В целом можно считать, что структуру, динамику и исход воспаления определяет функционирование системы клеток очага воспаления, из которых основными “фигурами” являются нейтро-фил, макрофаг и фибробласт. Морфологическими критериями их деятельности служат следующие показатели: толщина лейкоцитарного вала, плотность нейтрофилов в лейкоцитарном вале, толщина макрофагического вала, плотность макрофагов в вале, толщина фибробластической капсулы, число слоев фибробластов в капсуле. Корреляционные связи между этими параметрами отражают уровень функционирования всей системы: « ней-трофил « макрофаг « фибробласт ». Степень дезинтеграции между клетками, реализующими воспаление, зависит от силы и специфичности повреждающего агента, состояния функциональных систем организма, энергообеспечения и других факторов, нарушающих ауторегуляторные механизмы воспаления. Противовоспалительный эффект лекарственных препаратов направлен на восстановление функциональных корреляций между нейтрофилом, макрофагом и фибробластом, повышение устойчивости и адаптации системы клеток при работе в экстремальных условиях. Причем наиболее “уязвимым” элементом системы является макрофаг, связи которого разрушаются сильнее, чем у других клеток и медленнее восстанавливаются (рис.4).

хроническое

воспаление

энергетическии дисбаланс

геское энергеп

ение^ £ Л * ди

/ асептическое^ воспаление^

противовоспалительная терапия

Рис.4. Функциональные связи клеток очага воспаления и степень их изменения под влиянием про- и противовоспалительных факторов.

Исходя из вышеизложенного, мы можем выделить основные причины и морфологические критерии хронизации воспалительного процесса. Причинами затягивания процесса воспаления могут быть эндогенные и экзогенные факторы. Эндогенные факторы включают состояние самого организма (стресс, нарушение энергетического обмена, гормональный дисбаланс, голодание, авитаминозы, иммунодефициты и другие явления, приводящие к снижению защитных механизмов), а экзогенные связаны со свойствами воспалительного агента (размеры, физико-химические параметры, антигенность, токсичность, способность к персистированию, структурные особенности и другие факторы, препятствующие фагоцитозу). Морфологическими критериями хронизации воспаления являются: 1) длительное течение лейкоцитарной и, особенно, макрофагической фаз вос-

паления; 2) наложение фаз процесса друг на друга; 3) снижение фагоцитарных функций клеток (ФИ, ФЧ, БА, хемотаксис); 4) медленное фибро-зирование очага воспаления; 5) образование “неполноценной” соединительнотканной капсулы (мало коллагена, присутствие макрофагов, низкая плотность фибробластов, слабая их ориентация).

Ультраструктурными критериями хронического воспаления можно считать: большое количество в очаге незрелых и неактивных форм нейтрофилов, макрофагов и фибробластов, “фигуры” незавершенного фагоцитоза, слабое развитие в клетках вакуо-лярно-лизосомального и секреторного аппарата, измененную поверхность плазмолеммы, присутствие большого количества эозинофилов, тучных клеток, лимфоцитов, плазматических клеток, несовершенный фибриллогенез коллагена.

THE MORPHOLOGICAL CRITERIES OF CHRONIC INFLAMMATION

J. Seminsky, A.A. Maiboroda

Experimental models of the inflammation were created. We studied factors, mechanisms, criterions of the acute and chronic inflammations. Staphylococcus inflammation is character by chronic in the course of time, decreasing of functions cells in the inflammatory focus, disorder cells cooperation. The dynamics of parasitic inflammation has different from aseptic. Leukocyte, macrophage and fibroblast phases are prolonged. Metabolites of the parasites decrease phagocyte reaction, synthesis of collagen and others repair processes. Destruction of the correlate communications between cells in the inflammatory focus take place. Granulomatosic inflammation characterize prolongation, decrease of the fibroblast functions, spreading infection. Granulomes are consist of bacteria, detrit, leukocytes, macrophages and fibroblasts.

Литература

1. Лойда 3., Госсрау P., Шиблер Т. Гистохимия ферментов: лабораторные методы. - М.: Мир. - 1982. -272с.

2. Майборода А.А. Динамическая структура очага воспаления // Сб. “Морфофизиологические критерии адаптивных состояний”. - Иркутск. - 1979. -С.38-49.

3*Маянский Д.Н. Хроническое воспаление. - М.: Медицина. - 1991. - 272с.

4. Меньшиков В.В., Делекторская JI.H., Золотниц-кая Р.П. и др. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. - М.: Медицина. - 1987. -368с.

5. Мерков А.Н., Поляков Л.Е. Статистика: пособие для врачей. - Л.: Медицина. - 1974. - 384с.

6. Пауков B.C., Гостищев В.К., Ермакова Н.Г. и др. Иммунопатология и морфология хронического воспаления // Архив патологии. - 1996. - Т.58. -№1. - С.28-33.

7. Серов В.В., Шехтер А.Б. Соединительная ткань. -М.: Медицина. - 1981. - 321 с.

8. Струков А.И. Новые аспекты учения о воспалении // Архив патологии. - 1981. - №1. - С.3-12.

9. Струков А.И., Кауфман О.Я. Гранулематозное воспаление и гранулематозные болезни. - М.: Медицина. - 1989. - 184с.

10. Фримель Г. Иммунологические методы. - М.: Медицина. - 1987. - 472с.

11. Gallin J. Human neutrophil heterogeneity exits, but meaningful // Blood. - 1992. - Vol.63. - P.977-983.

12. Klebanoff S.J., Clark R.A. The neutrophil: function and disordes. - Amsterdam. - 1988. - 81 lp.

13. Klebanoff S.J. Phagocyte cells // Inflammation. -1989.-N-Y.-P.391-444.

14. Rebuck J. W., Crowlly J.H. A method of studying leukocyte function in vivo // Ann. 4 Acad. Sci. -1971.- 59. -P.757-805.