ТРЕХМЕРНАЯ МОДЕЛЬ АЛЬВЕОЛЯРНОГО ЛЕГКОГО IN VITRO, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УКАЗАННОЙ МОДЕЛИ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И/ИЛИ ПРЕДСКАЗАНИЯ СЕНСИБИЛИЗИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ВДЫХАЕМЫХ ПРОДУКТОВ

1. Трехмерная модель альвеолярного легкого in vitro, содержащая преимущественно следующие четыре типа клеток:
- a) альвеолоциты II типа, способные секретировать сурфактант,
- b) эндотелиальные клетки, которые образуют внутреннюю оболочку капилляров, обеспечивающие проницаемый барьер,
- с) дендритоподобные клетки,
- d) макрофагоподобные клетки, способные принимать участие в защитных реакциях посредством поглощения чужеродных веществ путем фагоцитоза, при этом:
указанная трехмерная модель легкого in vitro представлена в форме лунки для культивирования, оснащенной пористой мембраной, разделяющей указанную лунку на апикальный компартмент, контактирующий с поверхностью раздела воздушной и водной сред, и базолатеральный компартмент, погруженный в культуральную среду, причем указанные эпителиальные клетки и указанные макрофаги находятся в указанном апикальном компартменте, и указанные эндотелиальные клетки и указанные дендритоподобные клетки находятся в указанном базолатеральном компартменте и погружены в указанную культуральную среду,
указанная пористая мембрана имеет поры в диапазоне от 2 до 10 мкм, что обеспечивает возможность миграции указанных дендритоподобных клеток из указанного базолатерального компартмента в указанный апикальный компартмент.
2. Модель по п. 1, отличающаяся тем, что макрофагоподобные клетки представляют собой клетки ТНР-1, дифференцированные с применением РМА (Форбол-12-миристат-13-ацетат) или с применением 1,25-дигидроксивитамина D3, предпочтительно дифференцированные с применением РМА.
3. Модель по любому из пп. 1 и 2, отличающаяся тем, что все клетки представляют собой иммортализованные линии клеток человека.
4. Модель по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанные альвеолоциты II типа представляют собой клетки А549.
5. Модель по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанные эндотелиальные клетки представляют собой клетки EA.hy926.
6. Модель по любому из предшествующих пунктов, отличающаяся тем, что указанные дендритоподобные клетки представляют собой недифференцированные клетки ТНР-1.
7. Модель по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что указанная пористая мембрана имеет поры в диапазоне от 3 до 8 мкм.
8. Способ получения трехмерной модели альвеолярного легкого in vitro согласно любому из предшествующих пунктов, включающий совместное культивирование клеток a)-d) во вставке, имеющей пористую мембрану, в следующей последовательности стадий:
5
5
2
i) осуществление посева 0,24 10 - 0,6 10 эндотелиальных клеток/см на нижнюю сторону (которая станет базолатеральной стороной) указанной мембранной вставки, имеющей поры в диапазоне от 2 до 10 мкм,
5
5
5
5
2
ii) спустя по меньшей мере четыре часа, осуществление посева альвеолоцитов II типа, предпочтительно в количестве 0,12 10 - 1,2 10, предпочтительно в количестве 0,5 10 - 1,0 10 клеток/см, на другую сторону (апикальную сторону) указанной мембранной вставки;
iii) спустя приблизительно четверо суток, добавление клеточной суспензии, содержащей от 0,1 до одного миллиона дендритоподобных клеток/мл, к указанной базолатеральной стороне указанной мембранной вставки, и затем
5
5
2
iv) добавление макрофагоподобных клеток поверх посева указанных альвеолоцитов II типа, предпочтительно в количестве 0,12 10 - 1,2 10 макрофагоподобных клеток/см, и, наконец,
v) введение указанной мембранной вставки в среду таким образом, чтобы указанные эндотелиальные клетки и указанные дендритоподобные клетки были (находясь в указанном базолатеральном компартменте) погружены в среду для совместного культивирования, и указанные эпителиальные клетки и указанные макрофагоподобные клетки находились в апикальном компартменте, на поверхности раздела воздушной и жидкостной сред.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что указанные макрофагоподобные клетки представляют собой клетки ТНР-1, дифференцированные с применением РМА (Форбол-12-миристат-13-ацетат), и/или указанные альвеолоциты II типа представляют собой клетки А549, и/или указанные эндотелиальные клетки представляют собой клетки EA.hy926, и/или указанные дендритоподобные клетки представляют собой недифференцированные клетки ТНР-1.
10. Применение трехмерной модели альвеолярного легкого in vitro согласно любому из пп. 1-7, для оценки потенциальной способности вдыхаемых продуктов вызывать раздражение аэрогематического барьера легких или токсичности вдыхаемых продуктов на аэрогематический барьер легких.
11. Применение трехмерной модели альвеолярного легкого in vitro согласно любому из пп. 1-7 для определения и/или предсказания сенсибилизирующего действия вдыхаемых продуктов на аэрогематический барьер легких.
12. Способ определения и/или предсказания сенсибилизирующего действия и/или потенциальной способности вызывать раздражающее действие или токсического действия вдыхаемых продуктов на аэрогематический барьер легких, включающий следующие стадии:
A) стадия осуществления воздействия посредством пульверизации/распыления вдыхаемого продукта, подлежащего тестированию, над апикальным компартментом трехмерной модели альвеолярного легкого in vitro согласно любому из пп. 1-7, в форме лунки для культивирования, оснащенной пористой мембраной, имеющей поры в диапазоне от 2 до 10 мкм, причем указанные эпителиальные клетки и указанные макрофаги находятся на апикальной стороне указанной мембраны, и указанные эндотелиальные клетки и указанные дендритоподобные клетки находятся на базальной стороне указанной мембраны, причем указанные эндотелиальные клетки и указанные дендритоподобные клетки погружены в среду для совместного культивирования, причем указанное воздействие приводит к активации указанных дендритоподобных клеток,
B) стадия совместного культивирования указанных активированных дендритоподобных клеток с клеточной линией Т-лимфобластов.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что Т-клетки презентируют профиль Т-хелперов типа 2 (ТН2), если продукт, подлежащий тестированию, представляет собой предполагаемый респираторный сенсибилизатор.
14. Способ по любому из пп. 12-13, отличающийся тем, что маркеры для оценки потенциальной способности вызывать респираторную сенсибилизацию измеряют посредством FACS (сортировки клеток с активированной флуоресценцией) (CD40, CD54, CD86, TSLPr (рецептор тимического стромального лимфопоэтина), IL-1ra (антагонист рецептора интерлейкина), OX40L) и/или посредством ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа) (TSLP (тимический стромальный лимфопоэтин), IL-33, IL-25, RANTES, МСР-1 (моноцитарный хемотаксический фактор-1), MIP-3a, IL-6, IL-7, IL-10 и GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор)).
15. Способ по любому из пп. 12-14, отличающийся тем, измеряют дополнительные биологические конечные точки, включающие высвобождение интерлейкинов, генотоксичность, биомаркеры сенсибилизации, протеомику, транскриптомику и метаболическую активацию.