СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ГИПОКСИЧЕСКОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ В ПРЕНАТАЛЬНЫЙ ПЕРИОД У МЕЛКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
METHOD FOR SIMULATING PRENATAL HYPOXIC ENCEPHALOPATHY IN SMALL LABORATORY ANIMALS

Изобретение относится к области медицины, конкретно к экспериментальной медицине, и касается способа моделирования гипоксической энцефалопатии.
Известны способы моделирования токсической, постгеморрагической и гипоксической энцефалопатии путем гипоксического воздействия в условиях гипоксии гермообъема, кровопотери, путем воздействия паров металлической ртути или ацетата свинца [3,4,5]. Наиболее близким способом моделирования гипоксической энцефалопатии (прототип) является способ моделирования гипоксической энцефалопатии, заключающийся в ведении экспериментальным животным фенилгидразина в дозе 100-150 мг/кг [3].
Однако во всех перечисленных способах моделирования гипоксическая энцефалопатия воспроизводится у половозрелых крыс с функционально полноценной нервной системой, а не в пренатальный период, когда идет пролиферация и дифференцировка нервной ткани и развитие центральной нервной системы (ЦНС).
Многочисленные результаты исследований свидетельствуют о важной роли пренатальной гипоксии в генезе нарушений развития организма. Пренатальная гипоксия оказывает патологическое влияние на функциональную активность как отдельных систем, так и всего организма в целом, в основе которого могут лежать необратимые морфологические поражения на тканевом и органном уровнях. Последствием кислородной недостаточности для плода в период эмбриогенеза является поражение ЦНС плода и новорожденного, нарушение процессов адаптации ребенка после родов; в редких случаях она может стать причиной мертворождения. Учитывая высокую медико-социальную значимость для здоровья популяции проблем, связанных с пренатальной гипоксией, возникает необходимость изучения механизмов развития патологических процессов в головном мозге, возникающих в развивающемся и взрослом организме, а также вопросов медицинской реабилитации. Для такого рода исследований необходимо иметь высоковоспроизводимую экспериментальную модель, позволяющую воссоздать пренатальную гипоксию с последующим развитием энцефалопатии. При оценке перинатальных поражений ЦНС использование в качестве тест-объектов грызунов, в частности белых крыс, считается достаточно обоснованным, поскольку плацента белой крысы, так же как и плацента человека, является гемохориальной, и молекулярная, и клеточная биология их нервных клеток имеет высокую степень гомологии с высшими млекопитающими, в том числе и с человеком.
Задачей, решаемой данным изобретением, является получение модели гипоксической энцефалопатии у экспериментальных животных, в пренатальный период развития.
Поставленная задача достигается тем, что беременным самкам крыс ежедневно подкожно вводят раствор нитрита натрия, являющегося типичным метгемоглобинобразователем, в дозе 50 мг/кг с 10-го по 19 день беременности. В основе патологических процессов при действии нитрита натрия лежит гипоксия смешанного генеза, - гемическая гипоксия, обусловленная образованием метгемоглобина, которая сочетается с тканевой гипоксией вследствие разобщения процессов окисления и фосфорилирования. Нарушение кислородтранспортной функции крови у беременных самок крыс приводит к нарушению маточно-плацентарного кровообращения [2, 6] и, как следствие, кислородному голоданию плода или эмбриона. Введение нитрита натрия в дозе 50 мг/кг приводит к гипоксии средней тяжести у взрослых особей, согласно критериям, предложенным Н.Ф. Иваницкой [1]. Из данных работ не следует, что воздействие нитрита натрия в пренатальный период может приводить к поражению ЦНС у взрослых животных, так как в них получен иной технический результат, направленный на оценку функционального состояния системы мать-плод и физиологического развития новорожденного потомства.
Новым в предлагаемом изобретении является то, что моделирование гипоксической энцефалопатии производится в пренатальный период - с 10-х по 19-ые сутки эмбрионального развития, и для этого используется нитрит натрия в дозе 50 мг/кг.
В данном изобретении достигается новый неочевидный результат: создание гипоксического поражения головного мозга у животных в пренатальный период способствует развитию энцефалопатии у взрослых животных, проявления которой подтверждаются при оценке поведения, когнитивных способностей и морфологической структуры нервной ткани головного мозга.
Авторами не найдено в проанализированной литературе способа моделирования гипоксической энцефалопатии в пренатальный период у мелких лабораторных животных с использованием нитрита натрия.
Таким образом, заявленное изобретение соответствует критериям изобретения «Новизна» и «Изобретательский уровень», так как оно явным образом не следует для специалиста из уровня техники. Предлагаемое изобретение соответствует критерию «Промышленная применимость», так как оно с успехом может использоваться в экспериментальной медицине (физиологии, патологической физиологии, фармакологии) для моделирования патологических состояний человека и животных.
Способ осуществляют следующим образом:
Моделирование гипоксической энцефалопатии осуществляется в период пренатального развития - с 10-ых по 19-ые сутки эмбрионального развития, путем ежедневного подкожного введения беременным самкам крыс раствора нитрита натрия в дозе 50 мг/кг. Результаты воздействия на центральную нервную систему оцениваются у самцов полученного потомства в возрасте 3-х месяцев при тестировании в «крестообразном лабиринте», «радиальном лабиринте» и «водном лабиринте Морриса», а также при проведении морфологических исследований. Краткое описание чертежей.
На фиг.1 приведены фотографии ткани сенсомоторной зоны коры головного мозга белых крыс из контрольной и опытной групп.
Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на 20-ти беспородных белых крысах-самках массой и 80-ти крысах-самцах их половозрелого потомства массой 180-240 г. Белые крысы получены из собственного питомника АФ-НИИ МТ и ЭЧ ГУ НЦ МЭ ВСНЦ СО РАМН (сертификат имеется). Моделирование гипоксической энцефалопатии осуществляли в пренатальном периоде развития путем введения беременным самкам крыс раствора нитрита натрия с 10-го по 19-ый день беременности. Беременным самкам контрольной группы вводили физиологический раствор в том же режиме. Оценку состояния центральной нервной системы осуществляли у самцов из полученного потомства в возрасте 3-х месяцев с использованием следующих тестов: для оценки исследовательской и двигательной активности применялось тестирование животных в «крестообразном лабиринте», для оценки рабочей, референтной и пространственной памяти, а также способности к обучению использовали «радиальный лабиринт» и «водный лабиринт Морриса». Морфометрический анализ ткани головного мозга включал в себя стереологические и морфометрические методы гистометрии: обзорную оценку состояния ткани мозга, подсчет общей численной плотности нейронов, число дистрофически измененных нейронов в различных слоях коры головного мозга. Обработку результатов проводили с использованием непараметрического U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.
Результаты исследования.
Исследование поведения животных в «крестообразном лабиринте» показало, что животные, испытавшие гипоксическое воздействие в пренатальный период, демонстрировали сниженный уровень ориентировочно-исследовательской активности.
Так, количество вертикальных стоек за все время пребывания в лабиринте у животных опытной группы значительно ниже, и составляло 13,5 (9;21,5), в то время как в группе контроля данный показатель составил 21 (18;24) (р=0,003). К тому же в первые четыре минуты тестирования, когда поведение животных связано с такими эмоциогенными факторами, как внезапность, необычность и новизна, у животных опытной группы наблюдалось большое количество диаметральных переходов, что является показателем нарушения навигационного научения и пространственной памяти (табл.1).
Таблица 1
Показатели поведения крыс в «крестообразном лабиринте», Me (LQ;UQ)
Группа
Количество вертикальных стоек
Число диаметральных переходов
Латентный период первого посещения, с
Контроль
21,0 (18,0; 24,0) 15,0 (10,0; 18,0)
1 (1; 2) 0,5 (0; 1)
5,0 (3,0; 8,6)
Перинатальная гипоксия
13,5 (9,0; 21,5)* 8,0 (6,0; 13,5)*
2 (1; 3) 1 (1; 2)*
6,2 (3,7; 9,7)
Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем при р<0,05; над чертой - весь период тестирования, под чертой - первые 4 минуты тестирования, количество животных в каждой группе равно 40.
При тестировании животных в «водном лабиринте Морриса» также выявлены нарушения навигационного научения и пространственной памяти у особей, подвергавшихся пренатальному воздействию нитрита натрия, что выражалось в увеличении латентного периода поиска скрытой под водой платформы (табл.2).
Таблица 2
Показатели обучения крыс в «радиальном лабиринте» и «водном лабиринте Морриса», Me (LO;UO)
Группа
Контроль
Перинатальная гипоксия
Латентный период поиска скрытой платформы, с
42,7 (31,8; 61,5)
59,5 (46,2; 72,8) *
Число животных, достигших критерия обученности, %
69
30*
Количество ошибок рабочей памяти
0 (0,0)
0 (0,1)*
Количество ошибок референтной памяти
0 (0,1)
0 (0,1)
Число последовательно посещенных подкрепляемых рукавов
4 (3,4)
3 (2,4)*
Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с контролем при р<0,05, количество животных в каждой группе равно 20
При обучении крыс в «радиальном лабиринте» выявлено ухудшение памяти у животных, подвергавшихся воздействию нитрита натрия в период эмбриогенеза. У данных животных наблюдалось большее количество ошибок рабочей памяти и снижение количества последовательно посещенных подкрепляемых рукавов, по сравнению с контролем, что свидетельствовало о снижении у данных животных способности к обучению и нарушениях в процессах кратковременной памяти. Количество обученных животных в данной опытной группе составило лишь 30% (табл.2).
При проведении патоморфологического исследования у особей, подвергавшихся воздействию нитрита натрия в пренатальный период, выявлено повышение количества дистрофически-измененных нейронов и глиальных клеток на фоне снижения числа нормальных нейронов и клеток глии (табл.3), а также отмечался периваскулярный отек крупных сосудов коры головного мозга и резко выраженное нарушение цитоархитектоники, вследствие чего отсутствовало послойное морфологическое деление коры головного мозга (рис.1, А, Б).
Таблица 3
Количество морфологически измененных нейронов и клеток астроглии (абсолютная величина в 0,2 мм<sup>2</sup>) (ME(LQ;UQ)
Группа
Количество нормальных нейронов
Количество дистрофически измененных нейронов
Количество нормальных клеток астроглии
Количество дистрофически измененных клеток астроглии
Контроль m=100
210 (210; 226)
11 (8; 11)
186 (175; 192)
11 (9; 12)
Пренатальная гипоксия m=100
180 (143; 217)*
13 (12; 14)*
103 (80; 126)*
14 (9; 19)*
Примечание: * различия статистически значимы по сравнению с контролем при р<0,05; m - число срезов ткани.
Оценивая полученные результаты в целом, можно заключить, что пренатальное воздействие нитрита натрия приводило к развитию у белых крыс в половозрелом возрасте признаков патологии центральной нервной системы, характерных для гипоксической энцефалопатии, выражающихся в угнетении исследовательского поведения, снижении двигательной активности, нарушениях в процессах рабочей и пространственной памяти, а также снижении способности животных к обучению. В ткани сенсомоторной коры головного мозга наблюдалось нарушение цитоархитектоники, повышение количества дистрофически измененных клеток, периваскулярный отек крупных сосудов.
Литература
1. Иваницкая Н. Ф. Методика получения разных стадий гемической гипоксии у крыс введением нитрита натрия / Н.Ф. Иваницкая // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1976. - №3. - С.69-71.
2. Пятышкина Н.А. Изменение макрометрических показателей плацент крыс при гипобарической гипоксии и постгеморрагической анемии в различные эмбриональные периоды / Н.А. Пятышкина, Б.Г. Юшков, И.А. Брыкина, А.В. Шешенина, А.В. Володарская // Бюллетень сибирской медицины.- Т4, приложение 1. - 2005. - С.142
3. Способ моделирования гипоксической энцефалопатии: Пат. №2253152. РФ. Опубл. 27.05.2005. Бюл. №15.
4. Способ моделирования постгеморрагической энцефалопатии: Пат. №2257620. РФ. Опубл. 27.06.2005. Бюл. №21.
5. Способ моделирования постгипоксической энцефалопатии и связанных с ней нарушений в системе крови: Пат.№2240604. РФ. Опубл. 20.11.2004. Бюл. №32.
6. Черкесова Д.У. Функциональные изменения в системе мать-плод при экспериментальной хронической нитритной гипоксии / Д.У. Черкесова, Д.Н. Магомедгаджиева, А.И. Рабаданова // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2009. - Т. 11.  - №1 - 5. - С.934-937.