ГЕНЕТИЧЕСКАЯ КОНСТРУКЦИЯ НА ОСНОВЕ СИСТЕМЫ РЕДАКТИРОВАНИЯ ГЕНОМА CRISPR/CAS9, КОДИРУЮЩАЯ НУКЛЕАЗУ CAS9, СПЕЦИФИЧЕСКИ ИМПОРТИРУЕМУЮ В МИТОХОНДРИИ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
GENETIC CONSTRUCT BASED ON CRISPR/Cas9 GENOME SYSTEM EDITING, CODING Cas9 NUCLEASE, SPECIFICALLY IMPORTED IN HUMAN CELLS MITOCHONDRIA

Изобретение относится к медицине, терапии наследственных заболеваний и молекулярной биологии и может, в комплексе с направляющей РНК, быть использовано для элиминирования патогенных мутаций митохондриальной ДНК (мтДНК), ассоциированных с различными наследственными митохондриальными патологиями.
Известен «Способ лечения атрофии зрительного нерва различной этиологии» (патент РФ №2375019 2003 г. A61F 9/007, A61K 35/28, A61P 27/02), обеспечивающий улучшение или стойкую стабилизацию зрительных функций на небольшом временном промежутке, поскольку не направлен на коррекцию наследственного материала митохондрий.
Известно изобретение «Митохондриальные таргетные антиоксиданты» (Mitochondrially targeted antioxidants) (патент US 6331532 1998 г., C07F 9/54, C07F 9/572, C07F 9/655, A61K 31/665, A61K 31/66), которое является технологией импорта функциональных молекул в митохондрии, с использованием липофильных агентов с иммобилизованными молекулами антиоксидантов, но не дает возможности осуществлять редактирование патогенных мутаций в митохондриальной ДНК.
Известно изобретение «Система доставки нуклеиновых кислот в митохондрии» (Mitochondrial nucleic acid delivery systems) (патент CA 2678572 2008 г., A61K 48/00D2, C12N15/864A, C12N15/90B4). Недостатками данной технологии является то, что она не подразумевает доставку в митохондрии белков, поэтому не может быть использована для импорта нуклеазы Cas9 в митохондрии, следовательно, не подходит для работы с системой CRISPR/Cas9.
Из данных отечественной и зарубежной литературы, патентов и патентных заявок авторам не известно использование генетических конструкций на базе системы редактирования генома CRISPR/Cas9 для элиминирования патогенных мутаций мтДНК путем доставки нуклеазы Cas9 в митохондрии; генетическая конструкция отличается модификацией последовательности кодирующей Cas9, обеспечивающей доставку данной нуклеазы в митохондрии.
Отличительным признаком изобретения является модификация нуклеазы Cas9, обеспечивающая ее доставку в митохондрии для обеспечения универсального механизма для специфической элиминации дефектной мтДНК, несущей ту или иную мутацию. Новизну представляют нуклеотидные последовательность вектора, который кодирует модифицированный белок Cas9.
Задачей заявляемого изобретения является элиминирование митохондриальной ДНК, содержащей патогенные мутации, ассоциированные с наследственными митохондриальными патологиями.
Поставленная задача решается тем, что генетическая конструкция заявляемого изобретения, после попадания в цитоплазму клеток, обеспечивает экспрессию кодируемой ею молекулы нуклеазы Cas9, которая, используя собственный аппарат клетки, транспортируется в митохондрии, где обеспечивает элиминирование мутантных молекул мтДНК путем распознавания специфического участка последовательности посредством взаимодействия со специфической направляющей РНК и последующей рестрикцией обеих цепей мтДНК. Поскольку в митохондриях отсутствуют системы репарации двухцепочечных разрывов, такие «разрезанные» мтДНК элиминируются экзонуклеазами. Общий пул мтДНК в митохондриях восстанавливается за счет мтДНК, не имеющих мутации.
Техническим результатом изобретения является обеспечение системы элиминации мутантной мтДНК и способа ее доставки в органеллы.
Принцип функционирования предлагаемых веществ базируется на особенностях работы системы CRISPR/Cas9. Нуклеазы Cas9 взаимодействуют с особыми направляющими молекулами РНК, образуя комплекс, который специфически взаимодействует с участком двухцепочечной ДНК комплементарным участку направляющей РНК. В результате такого взаимодействия функциональный домен Cas9 вносит разрывы в обе цепи ДНК.
Генетическая конструкция на основе системы редактирования генома CRISPR/Cas9, кодирующая нуклеазу Cas9, специфически импортируемую в митохондрии клеток человека, представляет собой плазмидный вектор, разработанный на базе векторов pUC19 и pTurboGFP-mito. Конструкция обеспечивает возможность трансформации компетентных клеток E. coli с последующей наработкой большого количества копий. Позволяют отбирать трансформированные колонии на селективной среде содержащей антибиотик. Обеспечивают экспрессию нуклеазы Cas9 в клетках млекопитающих и человека, а также доставку продуктов трансляции в митохондрии. Проникая в митохондрии, нуклеаза Cas9 может быть использована для специфической элиминации мтДНК, содержащей любую из описанных мутаций, благодаря взаимодействию с определенной направляющей РНК.
Белок Cas9 обладает нуклеазной активностью и имеет два активных центра, каждый их которых участвует в расщеплении одной из цепей двухцепочечной ДНК. Нуклеаза Cas9 связывается с направляющей РНК, образуя комплекс. Данный комплекс сканирует молекулу ДНК и в случае обнаружения гомологичной последовательности формирует дуплекс с участком направляющей РНК. После образования дуплекса нуклеаза Cas9 вносит разрывы в обе цепи ДНК в определенной структуре дуплекса, названной РАМ (protospacer adjacent motif).
Конструкция pMitoCas9 содержит ориджин репликации, ген устойчивости к ампициллину, промотор цитомегаловируса, митохондриальную лидерную последовательность гена СОХ8А, 3xFLAG, последовательность, кодирующую модифицированную нуклеазу Cas9, Т2А, ген TurboGFP, 3' UTR гена SOD2.
Описание способа получения генетической конструкции заявляемого изобретения.
Карта генетической конструкции pMitoCas9 была построена при помощи программного обеспечения SnapGene. Для сборки использовали фрагменты плазмид pTurboGFP-mito (# FP517, Evrogen), pUC19 и hCas9, а также синтезированные по заказу двухцепочечные фрагменты ДНК - gBloks (IDT, США). Амплификацию фрагментов ДНК проводили при помощи полимеразы Pfu Turbo Сх (Agilent Technologies, США) на амплификаторе С1000 Touch (Bio-Rad, США). Олигонуклеотидные праймеры синтезировали с помощью фосфорамидитного метода на AMS-2000 («Биоссет», Россия), очищали методом обращено-фазовой хроматографии на OPS-1000 («Биоссет») с применением реагентов компании «Glen Research» (США). Сборку плазмид осуществляли с использованием ферментативной системы USER (NEB, США), а также классических методов молекулярного клонирования. «Бесшовное» соединение фрагментов ДНК проводили путем сборки по Гибсону (NEB, США) согласно инструкции фирмы производителя.
На фиг. 1 представлена карта плазмидного вектора pMitoCas9, кодирующего нуклеазу CAS9, импортируемую в митохондрию.
На фиг. 2 представлен снимок конфокального микроскопа препарата клеток Phoenix, трансфецированных плазмидами pMitoCas9 и другими контрольными
плазмидами, включая pMitoCas9-SV40, pEGFP-N1 и pTurboGFP-mito, экспрессирующих GFP с цитоплазматической и митохондриальной локализацией.
Оценка эффективности заявляемой генетической конструкции для реализации указанного назначения проводилась на культуре клеток.
Культуру клеток линии Phoenix трансфецировали конструкцией pMitoCas9. Через 48 часов после трансфекции синтез нуклеазы Cas9 оценивали на живых клетках посредством конфокальной микроскопии по экспрессии GFP. Поскольку Cas9 и GFP разделены последовательностью Т2А, то в случае эффективной экспрессии GFP должен локализоваться в цитоплазме клетки. В качестве контроля внутриклеточной локализации GFP были использованы плазмидные векторы pTurboGFP-mito и pEGFP-N1 с митохондриальной и цитоплазматической локализацией GFP соответственно. Для прижизненного окрашивания митохондрий применяли краситель MitoTracker Red CMXRos. Результаты прижизненной конфокальной микроскопии представлены на Фиг. 2.
Использование заявляемой генетической конструкции позволяет осуществлять терапию наследственных митохондриальных патологий.