Физико-химические методы исследования полисахаридов красных водорослей

2001

Известия Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра

Том 129

С.В.Суховерхов

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ КРАСНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

Полисахариды являются одними из основных компонентов биомассы морских водорослей (Кизеветтер и др., 1967, 1981). Большинство полисахаридов красных водорослей представляют собой линейные полимеры, построенные из остатков галактозы с чередующимися а-1^3 и Р-1^4 связями. Известны две большие группы этих полисахаридов, в одной из которых 4-О-замещенный остаток галактозы принадлежит к L-ряду (группа агара), а в другой - к D-ряду (группа каррагинана); соседние 3-О-замещенные остатки всегда имеют D-конфигурацию (Усов, 1985). Дальнейшие различия между представителями каждой группы обусловлены тем, что большая или меньшая часть 4-О-замещенных остатков может быть представлена 3,6-ангидрогалактозой, различные гидроксильные группы могут быть метилированны или сульфатированны, а 3-О-замещенные остатки D-галактозы могут дополнительно образовывать по положениям 4, 6 циклические ацетали с пировиноградной кислотой. Поэтому основными показателями, характеризующими структуру и определяющими практически важные свойства полисахаридов красных водорослей, являются мономерный состав, т.е. качественный и количественный состав моносахаридных единиц и неуглеводных компонентов (метоксильных групп, сульфатов, пируватов, ацетатов), и молекулярная масса.

В настоящее время для исследования полисахаридов водорослей применяют ряд химических, биохимических, хроматографических и спектроскопических методов (Усов, 1985; Чижов, Шашков, 1985). Цель настоящей работы - краткий обзор физико-химических методов анализа, используемых для исследования полисахаридов красных водорослей.

Исторически первыми получили развитие и распространение различные химические методы, которые предполагают деструкцию полисахарида и исследование полученных продуктов. Полный кислотный гидролиз агара или каррагинана приводит не только к расщеплению всех гликозидных связей, но и к удалению сульфатных групп и практически полной деградации 3,6-ангидрогалактозы. Этот метод применяется только для обнаружения галактозы и её метиловых эфиров, а также других моносахаридов (Усов, Кочетков, 1968; Кочетков и др., 1970). На повышенной лабильности к кислотным воздействиям основан распространенный метод количественного спектрофотометрического определения

3,6-ангидрогалактозы в присутствии других моносахаридов - реакция с резорцином-HCl (Yaphe, Arsenault, 1965). Наиболее распространенным методом определения общего содержания сульфатных групп в полиса-

154

харидах является метод Доджсона (Dodgson, 1961). Существенным недостатком данного метода является продолжительность гидролиза: количественное отщепление сульфатных групп от агара достигается только после длительного кипячения в 4M HCl (Труус, 1994).

Введение в конце 40-х - начале 50-х гг. бумажной хроматографии для разделения и идентификации продуктов деструкции полисахаридов заметно увеличило эффективность химических методов. С начала 60-х гг. для определения моносахаридного состава полисахаридов широко используется газожидкостная хроматография (Оводов, 1970), а с середины 60-х - масс-спектрометрия (Чижов, Шашков, 1985). Для получения летучих производных продукты гидролиза углеводов переводят в метилированные метилгликозиды (Elkin, 1979), ацетилированные полиолы (Mollion et al., 1990; Stevenson, Furneaux, 1991; Falshaw et al., 1999) или альдононитрилы (Seymour et al., 1979), триметилсилильные производные (Jankowski, Gaudin, 1978; Iverson, Bueno, 1981) или трифторацетаты (Arakawa et al., 1976). Одним из значительных достижений в области ГЖХ углеводов является возможность определения L- или D-конфигурации сахаров. Для этого сахара переводят в триметилсилильные производные (-)-бутил-2-гликозидов (Gerwig et al., 1978) или ацетаты (+)-октил-2-гликозидов (Чармс, 1986) и проводят разделение соответственно на капиллярных колонках с фазами SE-30 и SP-1000. Для детектирования используют пламенно-ионизационный детектор (Elkin, 1979; Iverson, Bueno, 1981) или масс-спектрометр (Jankowski, G audin, 1978; S eymour et al., 1979; Чижов, Шашков, 1985), а для трифторацетатов - детектор электронного захвата (Arakawa et al., 1976).

В начале 90-х гг. были разработаны методы, позволяющие избежать разрушения 3,6-ангидрогалактозы и её 2-О-метилового эфира в процессе гидролиза за счет перевода их в 3,6-ангидроальдитолы. Это методы двойного гидролиза и восстановления (Furneaux et al., 1990) и восстановительного гидролиза в присутствии 4-метилморфолинборана (Усов, Элаш-вили, 1991; S tevenson, F urneaux, 1991; U sov, 1993). В настоящее время эти методы наиболее широко используются для определения моносахарид-ного состава полисахаридов красных водорослей.

Метод двойного гидролиза и восстановления включает начальный гидролиз полисахарида 0,1 М раствором трифторуксусной кислоты в течение 3 ч при 80 оС, затем восстановление 0,26 М раствором боргид-рида натрия в 1 М растворе аммиака в течение 1 ч. Второй гидролиз проводится раствором 2 М трифторуксусной кислоты 1 ч при 120 оС, продукты гидролиза снова восстанавливают боргидридом натрия, ацети-лируют и анализируют ГЖХ на капиллярной колонке Supelco SP-2330. Этим методом можно определять галактозу и её метиловые эфиры, 3,6-ангидрогалактозу и её 2-О-метиловый эфир, а также часто присутствующие в гидролизатах биомассы красных водорослей ксилозу, маннозу и глюкозу (Furneaux et al., 1990).

В методе полного восстановительного гидролиза процессы гидролиза и восстановления не разделяют, а проводят одновременно. Гидролиз осуществляют в 2 М растворе трифторуксусной кислоты в присутствии 4-метилморфолинборана в течение 8 ч при 100 оС (Усов, Элашви-ли, 1991). Восстановление 3,6-ангидрогалактозы до 3,6-ангидродульцита происходит в момент гидролиза, что позволяет избежать кислотной деградации (Garegg et al., 1988). Остальные моносахариды после гидролиза

155

переводят в альдононитрилы обработкой 6 %-ным раствором хлоргид-рата гидроксиламина в пиридине в течение 30 мин при 100 °С. Полученные продукты ацетилируют уксусным ангидридом и анализируют ГЖХ на капиллярных колонках типа ОУ-101, SE-54 или НР иНга-1. Таким образом, 3,6-ангидрогалактозу и 2-0-метил-3,6-ангидрогалактозу определяют в виде ацетата полиола, а галактозу и её 0-метиловые эфиры - в виде ацетатов альдононитрилов (Усов, Элашвили, 1991). Данный метод также пригоден для определения содержания агара в биомассе водорослей на разных стадиях онтогенеза красных водорослей (Сухо-верхов, Левченко, 1999). Типичная хроматограмма продуктов полного восстановительного гидролиза биомассы красных водорослей показана на рис. 1.

Время, мин

Рис. 1. Хроматограмма продуктов полного восстановительного гидролиза биомассы красной водоросли Gracilaria verrucosa: 1 - 3,6-ангидрогалактоза, 2 -галактоза, 3 - инозит (внутренний стандарт). Капиллярная колонка CBP1 (Shimadzu, Я пония), газ-носитель - гелий, градиент температуры от 180 до 280 оС, 5 оС/мин

Fig. 1. Chromatogram of products of complete reductive hydrolysis of red alga Gracilaria verrucosa biomass: 1 - 3,6-anhydrogalactose, 2 - galactose, 3 -inositol (internal standard). Capillary column CBP1 (Shimadzu, Japan), carrier gas

- helium, temperature gradient from 180 to 280 оС, 5 °C/min

Применяя более мягкие условия восстановительного гидролиза (частичный восстановительный гидролиз) полисахаридов, можно получать восстановленные дисахариды (галактозиды 3,6-ангидрогалактитолов). После ацетилирования получаются ацетаты агаробиита или каррабиита, которые легко разделяются ГЖХ. Поэтому метод частичного восстановительного гидролиза используют для отнесения полисахарида к группе агара или группе каррагинана (Усов, Элашвили, 1991; U sov, 1993).

В структурном анализе полисахаридов также широко применяются ИК-спектроскопия (Rochas et al., 1986; Murano et al., 1990; Fostier et al., 1992; Труус, 1994) и ЯМР-спектроскопия (Usov et al., 1983; U sov, 1984; Усов, 1985; Чижов, Шашков, 1985; Lahaye et al., 1985, 1986; Иванова, 1986;

156

Chiles et al., 1989; Rochas, Lahaye, 1989a; Go rdon-Mills et al., 1990; Tpyyc, 1994). ИК-спектры привлекательны благодаря простоте их получения и высокой чувствительности, однако полная интерпретация их затруднительна. Они используются только для обнаружения сульфатных групп (интенсивная полоса поглощения групп S=O при 1240-1260 см-1) и определения их положения (первичный сульфат поглощает при 820 см-1, вторичный экваториальный - при 830 см-1, вторичный аксиальный - при 850 см-1) (Lloyd et al., 1961). Из перечисленных правил возможны исключения: формально аксиальный сульфат во 2-м положении 3,6-ангид-рогалактозы имеет полосу поглощения 805-810 см-1 (Anderson et al., 1968). На положение полос поглощения могут влиять даже условия съемки спектра; спектры порошковых препаратов агара в виде таблеток с KBr малоинформативные, лучше использовать пленки агара толщиной менее 4.10 -2 мм (Труус, 1994). ИК-спектры используют для контроля щелочной модификации агаров (Труус, 1994) или определения содержания сульфатных групп по соотношению интенсивности поглощения при 1250 см-1 (S=O группа) и 2920 см-1 (-CH группа) (Rochas et al., 1986; Murano et al., 1990).

Спектры ПМР дают более полную информацию о составе и строении агара. По сигналам протонов О- и С-метильных групп легко обнаружить и количественно определить содержание метилированных сахаров и остатков пировиноградной кислоты (Усов, 1985). Концентрацию 2-О-метил-3,6-ангидро^-галактозы и 6-О-метил^-галактозы определяют соответственно по интегральной интенсивности сигналов протонов метильных групп в области 3,50 и 3,40 м.д. (Lahaye et al., 1986). ПМР-спектроскопию также можно использовать для определения соотношения 3,6-ангидрогалактозы и галактозы и степени сульфатирования (Usov, 1984).

С середины 70-х гг. наиболее эффективным методом структурного анализа галактанов красных водорослей является 13С ЯМР-спектроско-пия (Usov, 1984; Усов, 1985). 13С ЯМР-спектр агара содержит 12 основных сигналов, соответствующих 12 углеродным атомам повторяющегося звена агарозы (Яроцкий и др., 1977; Усов, 1985; Иванова, 1986; Rochas, Lahaye, 1989а; Gordon-Mills et al., 1990). Появление заместителей в молекуле агарозы (О-метильных или сульфатных групп) вызывает специфические изменения в 13С ЯМР-спектре. Поэтому при сравнении 13С ЯМР-спектра образца полисахарида со спектрами наиболее часто встречающихся “предельных” структур можно легко расшифровать его строение и отнести к группе агара или каррагинана (Шашков и др., 1978; Яроцкий и др, 1978; Usov et al., 1980; Иванова, 1986; Falshaw, Furneaux, 1994; Miller et al., 1995; Miller, 1998, 1999; Falshaw et al., 1999).

Для облегчения идентификации моносахаридных единиц в 13С ЯМР-спектрах полисахаридов в конце 90-х гг. предложена следующая номенклатура: 3-связанные остатки ß-D-галактопиранозы обозначают буквой G, буквой L - 4-связанные остатки a-L-галактопиранозы и LA - 4-свя-занные остатки 3,6-ангидро-а^-галактопиранозы (Miller, 1998, 1999; Falshaw et al., 1999). Согласно этой номенклатуре GP обозначают 4,6-О-(1 ’-карбоксиэтилиден)^-галактозу, L6S - 6-сульфат^-галактозы, LA2M

- 2-О-метил-3,6-ангидро^-галактозу и т.д. Для обозначения сигналов в 13С ЯМР-спектре указывают обозначение моносахарида и номер соответствующего атома углерода. Например, сигнал 3-го атома углерода в 2-О-

157

метил-3,6-ангидро-Ь-галактопиранозе обозначают LA2MC—3 или сокращенно LA2M-3 (рис. 2).

G LA

LA2M

105 100 95 90 85 ВО 75 70 65 60 55 М.Д.

Р ис. 2. 13С ЯМР-спектр агарозы из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis. Спектрометр Bruker WM-250

Fig. 2. 13C-NMR spectra of agarose from red alga Ahnfeltia tobuchiensis. Spectrometer Bruker WM-250 (Germany) at a carbon freq uency of 62,9 MHz, referenced to internal methanol at 50,16 ppm

Для определения молекулярной массы полисахаридов типа агара и каррагинана широко используют высокоэффективную эксклюзионную хроматографию (Ekstrom, Kuiviner, 1983; Ekstrom, 1985; Lecacheux et al., 1985; Rochas, Lahaye, 1989b; Murano et al., 1990, 1992, 1996; Singh, J acobsson, 1994; Singh et al., 1994; С уховерхов и др., 1999, 2000). Разделение проводят на колонках с гидрофильными полимерными сорбентами типа S hodex Asahi pak GS или TSK-Gel PW (Rochas , Lahaye , 1989b; Суховерхов и др., 1999). Для увеличения диапазона разделения по молекулярным массам используют принцип бимодального распределения размеров пор в сорбентах (Barth, 1980; С тыскин и др., 1986). В соответствии с этим принципом для составления набора колонок с широким диапазоном разделения по молекулярной массе и линейной калибровочной зависимостью используют два сорбента с размерами пор, различающимися на один-полто-ра порядка. Получаемые бимодальные наборы имеют линейный участок калибровочной кривой, перекрывающий около четырех порядков изменения молекулярной массы, и умеренную разрешающую способность (Стыскин и др., 1986).

При определении молекулярной массы образцы агаров растворяют в диметилсульфоксиде (ДМСО) с добавлением небольшого количества воды или солей аммония (Rochas, Lahaye, 1989b; M urano et al., 1990; Суховерхов и др., 1999), а образцы каррагинанов - в дистиллированной воде или в 0,1 —0,2 М растворах LiCl (Ekstrom, Kuiviner, 1983; Lecacheux et al., 1985). В качестве элюентов используют дистиллированную воду или 0,1 —0,2 М растворы NaNO3 и LiCl (Ekstrom, Kuiviner, 1983; Lecacheux et al., 1985; Rochas, Lahaye, 1989b; Суховерхов и др., 1999). Для снижения вязкости элюента и повышения точности определения молекулярной массы колонки термостатируют при 45 или 60 оС (Lecacheux et al., 1985; Rochas, Lahaye, 1989b; С уховерхов и др., 1999).

158

Для определения молекулярной массы полисахаридов типа агара или каррагинана колонки калибруют по стандартам декстранов или пуллуланов с известной молекулярной массой (Barth, 1980; Суховерхов и др., 1999). С появлением в конце 70-х гг. проточного лазерного нефелометра (малоугольного лазерного светорассеивающего детектора) отпала необходимость в калибровке разделительной системы по стандартам с известной молекулярной массой. В комбинации с рефрактометрическим детектором он позволяет непрерывно определять молекулярную массу полисахарида в элюенте (Barth, 1980; Lecacheux et al., 1985; Rochas, Lahaye, 1989b; Singh, Jacobsson, 1994). Типичное молекулярномассовое распределение агаров приведено на рис. 3.

1

2

3

Время, мин

Образец M , кДа w’ % M , кДа w’ % Mw, кДа %

1 1510 100 - - - -

2 1495 100 - - - -

3 1618 47,7 1017 10,5 41 41,8

Рис. 3. Молекулярно-массовое распределение агаров из красной водоросли Gelidium amansii: 1 - агар получен экстракцией водой; 2 - агар получен экстракцией водой после предварительной обработки водоросли раствором Na2CO3; 3 - агар получен экстракцией раствором 0,01 N H2SO4. Колонки Shodex Asahi pak GS-520 и GS-620 (Showa Denko , Япония) , соединенные последовательно, элюент - дистиллированная вода, детектор - дифференциальный рефрактометр

Fig. 3. Molecular weight distribution of agars from red alga Gelidium amansii: 1 - agar was extracted by water; 2 - agar was extracted by water after pretreatment by solution of Na2CO3; 3 - agar was extracted by solution of 0,01 N H2SO4. Columns Shodex Asahi pak GS-520 and GS-620 (Showa Denko , Japan) connected in line, eluent - distilled water, detector - differential refractometer

Таким образом, основными физико-химическими методами исследования полисахаридов красных водорослей являются ИК-, ПМР- и 13С ЯМР-спектроскопия, а также газожидкостная и высокоэффективная экс-клюзионная хроматография.

Литература

Иванова Е.Г. Новые полисахариды группы агара из красных водорослей Японского моря: Автореф. дис.... канд. хим. наук. - М., 1986. - 23 с.

159

Kизeвeттep И-B., Гpюнep B.C., Eвтyшeнкo B.A. Переработка морских водорослей и других промысловых водных растений. - М.: Пищ. пром-сть, 1967. - 416 с.

Kизeвeттep И-B., Cyxoвeeвa M.B., Шмeлькoвa Л.П. Промысловые водоросли и травы дальневосточных морей. - М.: Лег. и пищ. пром-сть, 1981.

- 112 с.

Koчeткoв H.K., У^в A.^, Mиpoшникoвa Л.И. Полисахариды водорослей. V. Дальнейшее изучение состава и строения сульфатированного полисахарида из Laingia pacifica Yamada // Журн. общ. химии. - 1970. - T. 40, № 11. - С. 2473-2478.

Oвoдoв ЮХ. Газожидкостная хроматография углеводов: Обзор. - Владивосток, 1970. - 120 с.

Огь^кин E^., Ицикздн Л.Б., Бpayдe E.B. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. - М.: Химия, 1986. - 288 с.

Cyxoвepxoв C.B., Лeвчeнкo E.B. Определение содержания и структуры агара у красной водоросли Gracilaria verrucosa в онтогенезе // Tез. докл. конф. молодых ученых «Биомониторинг и рациональное использование морских и пресноводных гидробионтов». - Владивосток: TИHPO-Центp, 1999. - С.

98-99.

Cyxoвepxoв C.B., Kaдникoвa И^., Пoдкopытoвa A.B. Получение агара и агарозы из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis // Прикладная биохимия и микробиология. - 2000. - T. 36, № 2. - С. 238-240.

Cyxoвepxoв C.B., У^в A.^, Пoдкopытoвa A.^, Kaдникoвa ИА.

Хроматографическое исследование агаровых экстрактов из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis // Биоорган. химия. - 1999. - T. 25, № 3. - С. 211-215.

Tpyyc K. Исследование строения и модификации агарозы из красной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis: Автореф. дис.... канд. хим. наук. - М., 1994.

- 26 с.

У^в A.^ Полисахариды красных морских водорослей // Прогресс химии углеводов. - М.: Наука, 1985. - C. 77-96.

У^в A.^, Koчeткoв H.K. Полисахариды водорослей. II. Полисахариды красной водоросли Odonthalia corymbifera (Gmel.) J. Ag. Выделение 6-O-метил^-галактозы // Журн. общ. химии. - 1968. - T. 38, № 2. - С. 234-238.

У^в A.^, Элaшвили MÆ. Количественное определение производных

3,6-ангидрогалактозы и специфическое расщепление галактанов красных водорослей в условиях восстановительного гидролиза // Биоорган. химия. -1991. - T. 17, № 6. - С. 839-848.

4apMc Ш. Углеводы // Хроматография: Практическое приложение метода / Под ред. Э.Хефтмана. - М.: Мир, 1986. - Ч. 2. - С. 5-87.

Чижoв O.C., Шaшкoв A.C. Масс-спектрометрия и ЯМP-cпектpocкoпия в установлении структуры полисахаридов // Прогресс химии углеводов. -М.: Наука, 1985. - C. 30-54.

Шaшкoв A.C., У^в AÆ., Яpoцкиñ C.B. Полисахариды водорослей.

XXIV. Применение спектроскопии 13С-ЯМP для анализа структуры полисахаридов группы агара // Биоорган. химия. - 1978. - T. 4, № 1. - С. 74-81.

Яpoцкиñ C.B., Шaшкoв A.C., У^в AÆ. Анализ спектров 13С-ЯМP некоторых галактанов красных водорослей // Tам же. - 1977. - T. 3, № 8. -С. 1135-1137.

Яpoцкиñ C.B., Шaшкoв A.C., У^в AÆ. Полисахариды водорослей.

XXV. Применение спектроскопии 13С-ЯМP для анализа структуры полисахаридов типа %-каррагинана // Tам же. - 1978. - T. 4, № 5. - С. 745-751.

Anderson N.S., Dolan T.C.S., Penman A. et al. Carrageenans. Part IV. Variations in the structure and gel properties of c-carrageenan, and the characterisation of sulphate esters by infrared spectroscopy // J. Chem. Soc. - 1968. - № 5. - P. 602-606.

Arakawa Y., Imanari T., Tamura Z. Determination of neutral and amino sugars in glycoproteins by gas chromatography // Chem. Pharm. Bull. - 1976. -Vol. 24, № 9. - P. 2032-2037.

Barth H.G. A practical approach to steric exclusion chromatography of water-soluble polymers // J. Chromatogr. Sci. - 1980. - Vol. 18, № 9. - P. 409429.

Chiles T.C., Bird K.T., Koehn F.E. Influence of nitrogen availability on agar-polysaccharides from Gracilaria verrucosa strain G-16: structural analysis by NMR spectroscopy // J. Appl. Phycol. - 1989. - Vol. 1. - P. 53-58.

Dodgson K.S. Determination of inorganic sulphate in studies on the enzymic and non-enzymic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate esters // Biochem. Jourm. - 1961. - Vol. 78. - P. 312-319.

Ekstrom L. Molecular weight distribution and the behavior of kappa-carra-geenans // Carbohydr. Res. - 1985. - Vol. 135. - P. 283-285.

Ekstrom L., Kuiviner J. Molecular weight distribution and hydrolysis behavior of carrageenans // Ibid. - 1983. - Vol. 116. - P. 89-94.

Elkin Yu.N. Gas chromatographic separation of the methyl ether methylg-lycopyranoside series hexose, 6-deoxyhexose and pentose acetates // J. Chro-matogr. - 1979. - Vol. 180. - P. 163-169.

Falshaw R., Furneaux R.H. Carrageenan from the tetrasporic stage of Gigartina decipiens (Gigartinaceae, Rhodophyta) // Carbohydr. Res. - 1994. -Vol. 252. - P. 171-182.

Falshaw R., Furneaux R.H., Pickering T.D., Stevenson D.E. Agars from three Fijian Gracilaria species // Bot. Mar. - 1999. - Vol. 42. - P. 51-59.

Fostier A.H., Kornprobst J.M., Combaut G. Chemical composition and rheological properties of carrageenans from two Senegalese Soleriaceae Anatheca montagnei Schmitz and Meristotheca senegalensis Feldmann // Ibid. - 1992. -Vol. 35. - P. 351-355.

Furneaux R.H., Miller I.J., Stevenson T.T. Agaroid from New Zealand of the Gracilariaceae (Gracilariales, Rhodophyta) - a novel dimethylated agar // Hydrobiologia. - 1990. - Vol. 204/205. - P. 645-654.

Garegg P.J., Lindberg B., Konradsson P., Kvanstru,m I. Hydrolysis of glycosides under reducing conditions // Carbohydr. Res. - 1988. - Vol. 176. - P. 145-148.

Gerwig G.J., Kamerling J.P., Vliegenthart J.F.G. Determination of the D and L configuration of neutral monosaccharides by high-resolution capillary GLC // Ibid. - 1978. - Vol. 62. - P. 349-357.

Gordon-Mills E., Tate M., Hounslow A. Use of solid and gel state 13C

NMR spectroscopy for differentiation between agarophytes and carrageenophytes // Hydrobiologia. - 1990. - Vol. 204/205. - P. 629-636.

Iverson J.L., Bueno M.P. Evaluation of high pressure liq uid chromatography and gas-liq uid chromatography for q uantitative determination of sugars in foods // J. Assoc. Anal. Chem. - 1981. - Vol. 64, № 1. - P. 139-143.

Jankowski K., Gaudin D. Critical examination of the use of gas chromatography-mass spectrometry in the identification of persillyated saccharides // Biomedical Mass Spectrometry. - 1978. - Vol. 5, № 5. - P. 371-372.

Lahaye M., Rochas C., Yaphe W. A new procedure for determining the heterogeneity of agar polymers in cell walls of Gracilaria spp. (Gracilariaceae, Rhodophyta) // Can. J. Bot. - 1986. - Vol. 64. - P. 579-585.

Lahaye M., Yaphe W., Rochas C. 13C NMR spectral analysis of sulfated and desulfated polysaccharides of the agar type // Carbohydr. Res. - 1985. -Vol. 143. - P. 240-245.

Lecacheux D., Panaras R., Brigand G., Martin G. Molecular weight distribution of carrageenans by size exclusion chromatography and low angle laser light scattering // Carbohydr. Polym. - 1985. - Vol. 5. - P. 423-440.

Lloyd A.G., Dodgson K.S., Price R.G., Rose F.A. Infrared studies on sulphate esters. I. Polysaccharide sulphates // Biochim. Biophys. Acta. - 1961. -Vol. 46, № 1. - P. 108-115.

Miller I.J. Further evaluation of the structure of the polysaccharide from Plocamium costatum with the use of set theory // Hydrobiologia. - 1999. - Vol. 398/399. - P. 385-389.

Miller I.J. The structure of a pyruvylated carrageenan extracted from Stenogramme interrupta as determined by 13C NMR spectroscopy // Bot. Mar. - 1998.

- Vol. 41. - P. 305-315.

Miller I. J., Falshaw R., Furneaux R.H. Structural analysis of the polysaccharide from Pachymenia lusoria (Cryptonemiaceae, Rhodophyta) // Carbohydr. Res. - 1995. - Vol. 268. - P. 219-232.

Mollion J., Andriantsiferana M., Sekkal M. A study of the phycocol-loids from Gelidium madagascariense and Eucheuma denticulatum (Rhodophyta) collected on south coasts of Madagascar // Hydrobiologia. - 1990. - Vol. 204/205. - P. 655-659.

Murano E., Brandolin C., Zanetti F. et al. Characterization of an agar fraction extracted from Gracilaria dura (Gracilariales, Rhodophyta) // Ibid. -1990. - Vol. 204/205. - P. 567-571.

Murano E., Toffanin R., Pedersini C. et al. Structure and properties of agar from two unexploited agarophytes from Venezuela // Ibid. - 1996. - Vol. 326/327. - P. 497-500.

Murano E., Toffanin R., Zanetti F. et al. Chemical and macromolecular characterisation of agars polymers from Gracilaria dura (C. Agardh) J. Agardh (Gracilariaceae, Rhodophyta) // Carbohydr. Polymers. - 1992. - Vol. 18. - P. 171-178.

Rochas C., Lahaye M. Solid state 13C NMR spectroscopy of red seaweeds, agars and carrageenans // Ibid. - 1989a. - Vol. 10. - P. 189-204.

Rochas C., Lahaye M. Average molecular weight and molecular weight distribution of agarose and agarose-type polysaccharides // Ibid. - 1989b. - Vol. 10. - P. 289-298.

Rochas C., Lahaye M., Yaphe W. Sulfate content of carrageenan and agar determined by infrared spectroscopy // Bot. Mar. - 1986. - Vol. 24. - P.

99-108.

Seymour F.R., Chen E.C.M., Bishop S.H. Identification of aldoses by use of their peracetylated aldononitrile derivatives: A GLC-MS approach // Carbohydr. Res. - 1979. - Vol. 73. - P. 19-45.

Singh S., Jacobsson S. Kinetics of acid hydrolysis of k-carrageenan as determined by molecular weight (SEC-LALLS-RI), gel breaking strength, and viscosity measurements // Carbohydr. Polym. - 1994. - Vol. 23. - P. 89-103.

Singh S.K., Shen B.C., Chon S.T., Fan L.T. Acid hydrolysis of k-carrageenan in a batch reactor: stochastic simulation of change of molecular weight distribution with time // Biotech. Prog. - 1994. - Vol. 10. - P. 389-397.

Stevenson T.T., Furneaux R.H. Chemical method for the analysis of sulphated galactans from red algae // Carbohydr. Res. - 1991. - Vol. 210. - P. 277-298.

Usov A.I. A new chemical tool for characterization and partial depolymerization of red algal galactans // Hydrobiologia. - 1993. - Vol. 260/261. - P. 641-645.

Usov A.I. NMR spectroscopy of red seaweed polysaccharides: agars, carra-geenans and xylans // Bot. Mar. - 1984. - Vol. 27. - P. 189-202.

Usov A.I., Yarotsky S.V., Shashkov A.S. 13C NMR spectroscopy of red algal galactans // Biopolymers. - 1980. - Vol. 19, № 5. - P. 977-990.

Usov A.I., Ivanova E.G., Sashkov A.S. Polysaccharides of algae. XXXIII. Isolation and 13C-NMR spectral stady of some new gel-forming polysaccharides from Japan sea red seaweeds // Bot. Mar. - 1983. - Vol. 26. - P. 285-294.

Yaphe W., Arsenault G.P. Improved resorcinol reagent for the determination of fructose and 3,6-angydrogalactose in polysaccharides // Anal. Biochem. -1965. - Vol. 13, № 1. - P. 143-148.

Поступила в редакцию 18.05.2001 г.