СПОСОБЫ И СИСТЕМЫ ДЛЯ ОТЛИЧИЯ СИНДРОМА РАЗДРАЖЕННОГО КИШЕЧНИКА ОТ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ЗАБОЛЕВАНИЯ КИШЕЧНИКА И ГЛЮТЕНОВОЙ БОЛЕЗНИ
METHODS AND SYSTEMS FOR DISTINGUISHING IRRITABLE BOWEL SYNDROME FROM INFLAMMATORY INTESTINAL DISEASE AND GLUTEN DISEASE

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[01]
Настоящая заявка заявляет приоритет согласно 35 U.S.C. 119(e) по предварительной заявки на патент Соединенных Штатов № 62/061877, поданной 9 октября 2014 г. и в настоящее время находящейся на рассмотрении, и по предварительной заявки на патент Соединенных Штатов № 62/085825, поданной 1 декабря 2014 г., и в настоящее время находящейся на рассмотрении, которые в полном объеме включены в данный документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[02]
Данное изобретение относится к синдрому раздраженного кишечника, его диагностике и лечению.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[03]
Все упоминаемые в данном документе публикации включены посредством ссылки в той же степени, как если бы было указано, что каждая индивидуальная публикация или заявка на патент прямым и индивидуальным образом включена посредством ссылки. Нижеприведенное описание включает информацию, которая может помощь понять настоящее изобретение. Это не является признанием того, что любая приведенная в данном документе информация составляет известный уровень техники или относится к заявляемому изобретению, или, что любая публикация, на которую приведена прямая или косвенная ссылка, составляет известный уровень техники.
[04]
Синдром раздраженного кишечника (СРК) является наиболее часто диагностируемым патологическим состоянием в гастроэнтерологии с показателем распространенности приблизительно 15% населения. В течение последних 30 лет диагностика СРК базируется на клинических критериях. Это связано с плохим пониманием патофизиологии данного патологического состояния.
[05]
В патогенезе СРК появилось две микробных концепции. Первая предполагает, что симптомы СРК связаны с изменениями микрофлоры тонкого кишечника. Доказательство этого основано на данных дыхательного теста, исследований культуры тонкого кишечника, глубокого секвенирования флоры тонкого кишечника и клинического ответа на кишечный антибиотик рифаксимин. Вторая микробная концепция состоит в том, что у подгруппы субъектов развивается СРК после приступа острого гастроэнтерита (ОГЭ). Мета-анализ классических вспышек заболевания дает основание считать, что уровень развития СРК после ОГЭ составляет приблизительно 10%.
[06]
СРК представляет собой патологическое состояние, которое приводит к хроническим изменениям функции кишечника, включая диарею, запор и изменяющиеся симптомы, а также абдоминальные симптомы, включая боль и вздутие. Так как симптомы СРК могут перекрываться с органическими заболеваниями, такими как ВЗК и глютеновая болезнь, диагноз СРК часто ставят после исключения органических заболеваний. В ходе недавней международной инициативы эксперты по СРК согласились, что эти субъекты страдают от значительных изменений ритма дефекации и вздутия в качестве основных симптомов. В отсутствие четкой патофизиологии СРК идентификация субъектов основана на подходе «диагноз методом исключения». Этот подход подразумевает большие затраты и уровень заболеваемости для пациентов с СРК, в частности, с Д-СРК, включая частое визуальное исследование организма, эндоскопию и исследование крови для исключения альтернативных органических объяснений их симптомов.
[07]
Хотя Римские критерии важны при стандартизации подбора субъектов с СРК для клинических исследований, эти критерии до сих пор основаны на подходе «диагноз методом исключения», так как являются неспецифическими. Например, большинство субъектов с болезнью Крона или язвенным колитом удовлетворяют Римским критериям. Римские критерии II дополнительно помогали определить СРК на основании преобладающего типа стула, например, форм с преобладающими диареей или запором. Этот подход привел к разработке линии лекарственных препаратов для лечения СРК, основанных на регулировании симптомов при СРК. Прокинетики и стимуляторы секреции были разработаны для З-СРК, а антикинетики - для Д-СРК. Однако эти варианты терапии не сфокусированы на причинном механизме СРК, а вместо этого сфокусированы на регулировании симптомов. В результате они могут привести к возникновению противоположных симптомов.
[08]
Хотя диагностика глютеновой болезни была значительно усилена измерением сывороточной тканевой трансглутаминазы, остается потребность в биомаркерах, которые позволят отличить СРК от ВЗК при развитии хронической диареи. В данной области техники остается потребность в способах, методах анализа и системах для диагностики СРК и отличия СРК от других заболеваний ЖКТ, таких как ВЗК и глютеновая болезнь.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[09]
Нижеприведенные варианты реализации изобретения и их аспекты описаны и проиллюстрированы в сочетании с композициями и способами, которые считаются типовыми и иллюстративными, не ограничивающими объем изобретения.
[010]
В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ отличия синдрома раздраженного кишечника (СРК) от воспалительного заболевания кишечника (ВЗК), глютеновой болезни или обоих заболеваний, включающий стадии, на которых: получают биологический образец от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК, глютеновой болезни или обоих заболеваний; определяют в биологическом образце уровни антител к винкулину и антител к CdtB; и диагностируют СРК, если уровень антител к винкулину превышает установленный контрольный уровень антител к винкулину, уровень антител к CdtB превышает установленный контрольный уровень антител к CdtB, или уровни как антител к винкулину, так и антител к CdtB превышают установленные контрольные уровни антител к винкулину и антител к CdtB, или диагностирование ВЗК, подозрения на ВЗК, глютеновой болезни или подозрения на глютеновую болезнь, если уровень антител к винкулину не превышает установленный контрольный уровень антител к винкулину и уровень антител к CdtB не превышает установленный контрольный уровень антител к CdtB.
[011]
В различных вариантах реализации изобретения биологический образец может быть цельной кровью, сывороткой или плазмой.
[012]
В различных вариантах реализации изобретения определение в биологическом образце может включать применение ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA). В различных вариантах реализации изобретения определение в биологическом образце может включать применение иммуногистохимии, проточной цитометрии, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), радиоиммуноанализа или аффинной очистки.
[013]
В различных вариантах реализации изобретения антитела к винкулину могут обладать способностью специфически связываться с эпитопом на винкулине или SEQ ID NO:7.
[014]
В различных вариантах реализации изобретения антитела к CdtB могут обладать способностью специфически связываться с эпитопом на CdtB Campylobacter jejuni или SEQ ID NO:5.
[015]
В определенных вариантах реализации изобретения диагноз СРК можно ставить, если уровень антител к винкулину превышает установленный контрольный уровень антител к винкулину. В определенных вариантах реализации изобретения диагноз СРК можно ставить, если уровень антител к CdtB превышает установленный контрольный уровень антител к CdtB. В различных вариантах реализации изобретения диагноз СРК можно ставить, если уровни как антител к винкулину, так и антител к CdtB превышают установленные контрольные уровни антител к винкулину и антител к CdtB.
[016]
В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень антител к винкулину, антител к CdtB или обоих антител может являться результатом измерения оптической плотности.
[017]
В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ выбора лечения синдрома раздраженного кишечника (СРК), воспалительного заболевания кишечника (ВЗК) или глютеновой болезни, включающий стадии, на которых: получают биологический образец от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК, глютеновой болезни или обоих заболеваний; определяют в биологическом образце уровни антител к винкулину и антител к CdtB; диагностируют СРК, если уровень антител к винкулину превышает установленный контрольный уровень антител к винкулину, уровень антител к CdtB превышает установленный контрольный уровень антител к CdtB, или уровни как антител к винкулину, так и антител к CdtB превышают установленные контрольные уровни антител к винкулину и антител к CdtB, или диагностирование ВЗК, подозрения на ВЗК, глютеновой болезни или подозрения на глютеновую болезнь, если уровень антител к винкулину не превышает установленный контрольный уровень антител к винкулину и уровень антител к CdtB не превышает установленный контрольный уровень антител к CdtB; и выбор лечения СРК при диагностировании СРК, выбор лечения ВЗК при диагностировании или подозрении ВЗК или выбор лечения глютеновой болезни при диагностировании или подозрении глютеновой болезни.
[018]
В различных вариантах реализации изобретения биологический образец может быть цельной кровью, сывороткой или плазмой.
[019]
В различных вариантах реализации изобретения определение в биологическом образце может включать применение ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA). В различных вариантах реализации изобретения определение в биологическом образце может включать применение иммуногистохимии, проточной цитометрии, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), радиоиммуноанализа или аффинной очистки.
[020]
В различных вариантах реализации изобретения антитела к винкулину могут обладать способностью специфически связываться с эпитопом на винкулине или SEQ ID NO:7.
[021]
В различных вариантах реализации изобретения антитела к CdtB могут обладать способностью специфически связываться с эпитопом на CdtB Campylobacter jejuni или SEQ ID NO:5.
[022]
В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень антител к винкулину, антител к CdtB или обоих антител может являться результатом измерения оптической плотности.
[023]
В определенных вариантах реализации изобретения диагноз СРК можно ставить, если уровень антител к винкулину превышает установленный контрольный уровень антител к винкулину. В определенных вариантах реализации изобретения диагноз СРК можно ставить, если уровень антител к CdtB превышает установленный контрольный уровень антител к CdtB. В различных вариантах реализации изобретения диагноз СРК можно ставить, если уровни как антител к винкулину, так и антител к CdtB превышают установленные контрольные уровни антител к винкулину и антител к CdtB.
[024]
Другие признаки и преимущества изобретения станут очевидны после прочтения подробного описания в сочетании с прилагающимися графическими материалами, которые иллюстрируют, в качестве примера, различные признаки и варианты реализации изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[025]
Типовые варианты реализации изобретения проиллюстрированы на прилагающихся фигурах. Подразумевается, что раскрытые в данном документе варианты реализации изобретения и фигуры являются иллюстративными, а не ограничительными.
[026]
На Фиг. 1A проиллюстрировано сравнение ОП антител к CdtB среди групп в соответствии с различными вариантами реализации настоящего изобретения.
[027]
На Фиг. 1B проиллюстрировано сравнение оптической плотности (ОП) антител к CdtB среди групп. Точками представлены субъекты с резко отличающимися результатами за пределами погрешности. Титры у субъектов с СРК были выше по сравнению с любой другой группой (p<0,001). Титры у субъектов с глютеновой болезнью были выше по сравнению со здоровыми контрольными субъектами и субъектами с ВЗК (p<0,001).
[028]
На Фиг. 2A проиллюстрировано сравнение ОП антител к винкулину среди групп в соответствии с различными вариантами реализации настоящего изобретения.
[029]
На Фиг. 2B проиллюстрировано сравнение оптической плотности (ОП) антител к винкулину среди групп. Точками представлены субъекты с резко отличающимися результатами за пределами погрешности. Титры у субъектов с СРК были выше по сравнению с любой другой группой (p<0,001).
[030]
На Фиг. 3A проиллюстрирована кривая зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (ROC), сравнивающая уровни антител к CdtB и антител к винкулину для субъектов с СРК и субъектов без СРК в исследовании в соответствии с различными вариантами реализации настоящего изобретения. (Анти-CdtB - верхняя линия; анти-винкулин - нижняя линия).
[031]
На Фиг. 3B проиллюстрирована кривая зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (ROC), сравнивающая уровни антител к CdtB и антител к винкулину для субъектов с СРК и субъектов с ВЗК в исследовании. ППК, площадь под кривой; ДИ, доверительный интервал. (Анти-CdtB - верхняя линия; анти-винкулин - нижняя линия).
[032]
На Фиг. 3C проиллюстрирована кривая зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (ROC), сравнивающая уровни антител к CdtB и антител к винкулину для субъектов с СРК и здоровых субъектов в исследовании. (Анти-CdtB - верхняя линия; анти-винкулин - нижняя линия).
[033]
На Фиг. 4 проиллюстрирована кривая зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (ROC), сравнивающая уровни антител к CdtB и антител к винкулину для субъектов с СРК и всех субъектов с ВЗК в исследовании в соответствии с различными вариантами реализации настоящего изобретения. (Анти-CdtB - верхняя линия; анти-винкулин - нижняя линия).
[034]
На Фиг. 5 проиллюстрирована кривая зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (ROC), сравнивающая уровни антител к CdtB и антител к винкулину для субъектов с СРК и глютеновой болезнью. (Анти-CdtB - верхняя линия в начале; анти-винкулин - нижняя линия в начале).
[035]
На Фиг. 6 проиллюстрирована кривая зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (ROC), сравнивающая уровни антител к CdtB и антител к винкулину для субъектов с СРК и субъектов без СРК с хронической диареей (т.е. с БК, ЯК и глютеновой болезнью). (Анти-CdtB - верхняя линия; анти-винкулин - нижняя линия).
[036]
На Фиг. 7 проиллюстрирована кривая зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (ROC), сравнивающая уровни антител к CdtB и антител к винкулину для субъектов с СРК и БК. (Анти-CdtB - верхняя линия; анти-винкулин - нижняя линия).
[037]
На Фиг. 8 проиллюстрирована кривая зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (ROC), сравнивающая уровни антител к CdtB и антител к винкулину для субъектов с СРК и ЯК. (Анти-CdtB - верхняя линия; анти-винкулин - нижняя линия).
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[038]
et al
Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3
ed.
Revised
Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4
ed.
Antibodies: A Laboratory Manual 2
ed.
et al.
et al.
rd
th
nd
Все приведенные в данном документе ссылки в полном объеме включены посредством ссылки, как если бы были приведены полностью. Если не указано иное, все употребляемые в данном документе технические и научные термины имеют значения, обычно подразумеваемые специалистом в области техники, к которой относится данное изобретение. Singleton ., , , J. Wiley & Sons (New York, NY 2006); и Sambrook and Russel, , Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012) представляют для специалиста в данной области техники общее руководство в отношении многих терминов, употребляемых в настоящей заявке. Ссылки в отношении приготовления антител смотрите в D. Lane, (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, 2013); Kohler and Milstein, (1976) Eur. J. Immunol. 6: 511; Queen et al. патенте США № 5585089; и Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988); патенте США № 4946778; Bird, Science 242:423-42 (1988); Huston , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); Ward , Nature 334:544-54 (1989); Tomlinson I. and Holliger P. (2000) Methods Enzymol, 326, 461-479; Holliger P. (2005) Nat. Biotechnol. Sep;23(9):1126-36).
[039]
Для специалиста в данной области техники очевидно существование многих способов и материалов, сходных или эквивалентных описанным в данном документе, которые можно применять для практической реализации настоящего изобретения. Более того, настоящее изобретение никоим образом не ограничено описанными способами и материалами. В целях настоящего изобретения ниже приведены определения некоторых терминов.
[040]
В контексте данного документа «млекопитающее» относится к любому представителю класса Млекопитающих, включая, не ограничиваясь ими, людей и отличных от людей приматов, таких как шимпанзе и другие виды обезьян и макак; сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, козы и лошади; домашних животных, таких как собаки и кошки; лабораторных животных, включая грызунов, таких как мыши, крысы и морские свинки, и т.д. Данный термин не обозначает конкретный возраст или пол. Следовательно, подразумевается, что в объем данного термина входят взрослые и новорожденные субъекты, а так же эмбрионы, как мужского, так и женского пола.
[041]
В контексте данного документа «лечение» относится как к терапевтическому лечению, так и к профилактическим или предупредительным мерам (например, направленным на снижение вероятности появления патологического состояния или болезненного состояния), при этом у субъекта необходимо предотвратить или замедлить (ослабить) целевое патологическое состояние или нарушение, даже если лечение в конечном итоге не является успешным. Нуждающиеся в лечении включают тех, у кого уже имеется патологическое состояние или нарушение, а также тех, кто предрасположен к патологическому состоянию или нарушению, или тех, у кого необходимо предотвратить патологическое состояние или нарушение (например, снизить вероятность появления патологического состояния или нарушения).
[042]
В контексте данного документа «антитело» или «антитела» включают поликлональные антитела, моноклональные антитела, варианты антител, такие как одноцепочечные (рекомбинантные) Fv, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела и иммунологически активные фрагменты антител.
[043]
В контексте данного документа «специфически связывается» относится к акту связывания антитела со своим антигеном и не включает низкоуровневое неспецифическое связывание, которое может происходить между случайными белками. В контексте данного документа не подразумевается, что «специфически связывается» означает, что антитело не будет связываться с любым белком, отличным от раскрытых в данном документе белков или полипептидов, так как антитела могут перекрестно реагировать с любым белком, который содержит соответствующий эпитоп.
[044]
В контексте данного документа выражение «значительно выше», применяемое по отношению к стандартным или контрольным количествам, относится к количеству, статистически значимо превышающему стандартное или контрольное количество.
[045]
Недавно утвержденная животная модель постинфекционного СРК (ПИ-СРК) с применением инфицирования Campylobacter jejuni дает основание предположить, что ОГЭ провоцирует ПИ-СРК, приводя к значительным изменениям в микробной колонизации тонкого кишечника. С помощью этой модели было определено, что развитие СРК-подобных фенотипов у этих животных зависело от специфического токсина - цитолетального растягивающего токсина В (CdtB). Важным является то, что развитие СРК-подобных фенотипов в этой животной модели уменьшалось в отсутствие CdtB. В последующей серии экспериментов мы обнаружили, что посредством молекулярной мимикрии хозяйские антитела к CdtB вступают в реакцию с хозяйским белком винкулином в нервно-мышечном аппарате кишечника. Наличие в кровотоке антител к CdtB и винкулину в животной модели связано с развитием измененных микробных популяций кишечника и изменениями в нервно-мышечном аппарате кишечника, включая значительное снижение числа интерстициальных клеток Кахаля (ИКК) в глубоких мышечных сплетениях.
[046]
На основании этих новых патофизиологических механизмов, лежащих в основе СРК, мы оценили долю антител к CdtB и винкулину, а также CdtB в большой группе пациентов с СРКи контрольных пациентов без СРК, чтобы определить биомаркеры СРКна основании определения в кровотоке людей антител к винкулину и CdtB.
[047]
В данном документе описан биомаркер для Д-СРКна основании, не ограничиваясь ими, какой-либо конкретной теорией, патофизиологического механизма постинфекционного СРКи последующего развития аутоантител к винкулину в организме-хозяине. Оказалось, что такой тест является специфическим не только в отношении диагностирования Д-СРК, но также при диагнозе хронической диареи может позволить отличить субъектов с Д-СРК от субъектов с ВЗК.
[048]
Campylobacter jejuni
Salmonella
E. coli
Shigella
Хотя уровень развития СРК после приступа острого гастроэнтерита составляет приблизительно 10%, данные по размещению войск и математическое моделирование дают основание предположить, что в США ПИ-СРК может приходиться на большую долю случаев СРК. ПИ-СРК возникает главным образом, но не исключительно, после бактериальных инфекций, таких как , ,  и . Одним из токсинов, обычно вырабатываемых всеми четырьмя этими организмами, является цитолетальный растягивающий токсин - гетеротримерный комплекс из трех субъединиц, CdtA, CdtB и CdtC, из которых активной субъединицей является CdtB.
[049]
C. jejuni
C. Jejuni
C. jejuni
Было показано, что утвержденная животная модель, разработанная с использованием  81-176, демонстрирует СРК-подобный фенотип. Важно, что эти крысы демонстрируют изменения стула, избыточный бактериальный рост в тонком кишечнике (ИБРТК) и повышенное содержание внутриэпителиальных лимфоцитов в прямой кишке, что характерно для людей с СРК. В этой модели указанные эффекты проявились вследствие изменений нейроанатомии кишечника с заметным снижением числа интерстициальных клеток Кахаля. Кроме того, крысы, инфицированные мутантным штаммом , в котором отсутствует CdtB, демонстрировали значительно ослабленный СРК-подобный фенотип по сравнению с крысами, инфицированными  дикого типа, что дает основание предположить, что CdtB был важен для развития СРК в данной модели. В серии иммунологических экспериментов с этой моделью было определено, что CdtB действует не просто посредством прямой токсичности, но скорее посредством перекрестной реакции антител к CdtB с хозяйским белком винкулином. Уровни антител к CdtB и винкулину в кровотоке коррелировали с развитием и уровнями ИБРТК у этих животных.
[050]
Helicobacter pullorum
Shigella
Винкулин представляет собой 117 кДа цитоплазматический актинсвязывающий белок, который является ключевым компонентом как в фокальных контактах, так и в адгезионных контактах, образуя промежуточное звено между интегринами и кадгеринами соответственно и актиновым цитоскелетом. Кроме того, винкулин важен для подвижности и сокращения нервных клеток, а также сердечной деятельности, о чем свидетельствуют дефекты нервной трубки, миокарда и эндокарда у мышей с нокаутом винкулина, а также стресс-индуцированная кардиомиопатия у гетерозиготных мутантов. В недавно опубликованном исследовании было показано, что Cdt из  нацеливается на винкулин в клетках кишечного эпителия, инициируя атипичное перемещение винкулина из фокальных контактов в сочетании со снижением клеточной адгезии. Другое исследование продемонстрировало, что винкулин используется токсином IpA  для попадания в клетку.
[051]
На основании патофизиологических наблюдений в этой животной модели мы предположили, что воздействие CdtB приводило к выявляемой иммунности к CdtB и аутоиммунности к винкулину, в основе которых лежит молекулярная мимикрия. В данном исследовании мы впервые оцениваем, могут ли уровни этих антител служить биомаркером Д-СРК у людей, с привлечением большого числа пациентов с СРК и без СРК. Согласно нашим наблюдениям число плазменных антител к винкулину и CdtB было повышено у субъектов с Д-СРК по сравнению со здоровыми контрольными субъектами, субъектами с глютеновой болезнью и субъектами с ВЗК, так что оказалось, что биомаркеры могут позволить отличить Д-СРК от всех случаев, не связанных с СРК. За счет идеальных пороговых титров данный тест характеризуется высокой специфичностью для определения Д-СРК по сравнению с ВЗК. Так как tTG является устойчивым критерием глютеновой болезни, в исследовании хронической диареи действительной неудовлетворенной потребностью является биомаркер, который мог бы надежным образом позволить отличить СРК от ВЗК. Интересно, что при глютеновой болезни также были повышены антитела к CdtB, но не антитела к винкулину. Другой существенной неудовлетворенной потребностью в отношении глютеновой болезни является исследование, которое позволяло бы легко отличать функциональные симптомы от текущего воздействия глютена. Исследования дают основание предположить, что после воздействия глютена СРК является второй наиболее частой причиной устойчивой к лечению глютеновой болезни и, следовательно, тест, который может позволить отличить эти причины симптомов, был бы полезен в клинических условиях.
[052]
Учитывая эти результаты, антитела к CdtB и винкулину являются биомаркерами Д-СРК и составляют уникальную перспективу для патофизиологии ПИ-СРК. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, можно сказать, что, во-первых, это биомаркеры на основании механизма развития СРК, который может включать изменения энтеральной нервной системы и перистальтики кишечника. Во-вторых, они представляют первую возможность поставить диагноз СРК методом включения, а не «методом исключения». Так как не все субъекты с Д-СРК дают положительные результаты в отношении этих биомаркеров, возможно, что эти антитела позволяют определить подгруппу СРК, для которой можно разработать механизм и вариант терапии. И наконец, это дает основание предположить, что СРК имеет органическое основание. В качестве биомаркера измерения уровней антител в винкулину и антител к CdtB могут помочь определить Д-СРК без проведения излишних исследований и могут помочь направить исследования в случае тех, у кого тест дал отрицательный результат.
[053]
Хотя данный тест обладает более низкой специфичностью в отношении определения Д-СРК по сравнению с глютеновой болезнью, сопутствующее тестирование с использованием анти-tTG может это компенсировать.
[054]
В заключение можно сказать, что данное исследование подтверждает наличие антител к винкулину и антител к CdtB в качестве биомаркеров крови, которые позволяют отличать Д-СРК от ВЗК и случаев здорового контроля с помощью крупномасштабного проспективного многоцентрового исследования. Антитела к винкулину и CdtB также являются частью патофизиологии постинфекционного СРК и могут позволить определить подгруппу Д-СРК для направленной терапии. Наиболее важно то, что это является важным этапом в определении органических оснований СРК.
Определение отличия СРК от ВЗК и глютеновой болезни
[055]
В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы, методы анализа и системы для определения отличия СРК от ВЗК и глютеновой болезни.
[056]
Способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК и глютеновой болезни, определение в биологическом образце наличия антител к винкулину и диагностирование СРК в случае определения наличия антител к винкулину или диагностирование ВЗК, подозрения на ВЗК, глютеновой болезни или подозрения на глютеновую болезнь в случае отсутствия антител к винкулину. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении наличия или отсутствия антител к винкулину. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК, выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК или выбор лечения глютеновой болезни в случае диагностирования или подозрения глютеновой болезни.
[057]
В различных вариантах реализации изобретения способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК и глютеновой болезни, определение в биологическом образце уровня антител к винкулину и диагностирование СРК, если уровень антител к винкулину превышает установленный контрольный уровень, или диагностирование ВЗК, подозрения на ВЗК, глютеновой болезни или подозрения на глютеновую болезнь, если уровень антител к винкулину соответствует или ниже установленного контрольного уровня. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к винкулину в пределах двух стандартных отклонений уровней антител к винкулину у здоровых субъектов без СРК, ВЗК, глютеновой болезни или их комбинаций. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к винкулину.
[058]
В различных вариантах реализации изобретения способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК и глютеновой болезни, определение в биологическом образце уровня антител к винкулину и диагностирование СРК, если уровень антител к винкулину значительно превышает установленный контрольный уровень, или диагностирование ВЗК, подозрения на ВЗК, глютеновой болезни или подозрения на глютеновую болезнь, если уровень антител к винкулину значительно не превышает установленный контрольный уровень. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к винкулину у субъектов без СРК, ВЗК, глютеновой болезни или их комбинаций. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к винкулину. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК, выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК или выбор лечения глютеновой болезни в случае диагностирования или подозрения глютеновой болезни.
[059]
Способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК и глютеновой болезни, определение в биологическом образце наличия антител к CdtB и диагностирование СРК в случае определения наличия антител к CdtB или диагностирование ВЗК, подозрения на ВЗК, глютеновой болезни или подозрения на глютеновую болезнь в случае отсутствия антител к CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении наличия или отсутствия антител к CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК, выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК или выбор лечения глютеновой болезни в случае диагностирования или подозрения глютеновой болезни.
[060]
В различных вариантах реализации изобретения способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК и глютеновой болезни, определение в биологическом образце уровня антител к CdtB и диагностирование СРК, если уровень антител к CdtB превышает установленный контрольный уровень, или диагностирование ВЗК, подозрения на ВЗК, глютеновой болезни или подозрения на глютеновую болезнь, если уровень антител к CdtB соответствует или ниже установленного контрольного уровня. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к CdtB в пределах двух стандартных отклонений уровней антител к CdtB у здоровых субъектов без СРК, ВЗК, глютеновой болезни или их комбинаций. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК, выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК или выбор лечения глютеновой болезни в случае диагностирования или подозрения глютеновой болезни.
[061]
В различных вариантах реализации изобретения способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК и глютеновой болезни, определение в биологическом образце уровня антител к CdtB и диагностирование СРК, если уровень антител к CdtB значительно превышает установленный контрольный уровень, или диагностирование ВЗК, подозрения на ВЗК, глютеновой болезни или подозрения на глютеновую болезнь, если уровень антител к CdtB значительно не превышает установленный контрольный уровень. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к CdtB у субъектов без СРК, ВЗК, глютеновой болезни или их комбинаций. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК или выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК.
[062]
В различных вариантах реализации изобретения способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК и глютеновой болезни, определение в биологическом образце наличия антител к винкулину и антител к CdtB и диагностирование СРК в случае определения наличия антител к винкулину и антител к CdtB или диагностирование ВЗК, подозрения на ВЗК, глютеновой болезни или подозрения на глютеновую болезнь в случае отсутствия антител к винкулину и антител к CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении наличия или отсутствия антител к винкулину и антител к CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК, выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК или выбор лечения глютеновой болезни в случае диагностирования или подозрения глютеновой болезни.
[063]
В различных вариантах реализации изобретения способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК и глютеновой болезни, определение в биологическом образце уровня антител к винкулину и антител к CdtB и диагностирование СРК, если уровни антител к винкулину и антител к CdtB превышают установленный контрольный уровень, или диагностирование ВЗК, подозрения на ВЗК, глютеновой болезни или подозрения на глютеновую болезнь, если уровни антител к винкулину и антител к CdtB соответствуют или ниже установленных контрольных уровней. В различных вариантах реализации изобретения установленные контрольные уровни представляют собой уровни антител к винкулину и антител к CdtB в пределах двух стандартных отклонений уровней антител к винкулину и антител к CdtB у здоровых субъектов без СРК, ВЗК, глютеновой болезни или их комбинаций. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровней антител к винкулину и антител к CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК, выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК или выбор лечения глютеновой болезни в случае диагностирования или подозрения глютеновой болезни.
[064]
В различных вариантах реализации изобретения способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК и глютеновой болезни, определение в биологическом образце уровня антител к винкулину и антител к CdtB и диагностирование СРК, если уровень антител к винкулину и антител к CdtB значительно превышает установленный контрольный уровень, или диагностирование ВЗК, подозрения на ВЗК, глютеновой болезни или подозрения на глютеновую болезнь, если уровень антител к винкулину и антител к CdtB значительно не превышает установленные контрольные уровни. В различных вариантах реализации изобретения установленные контрольные уровни представляют собой уровни антител к винкулину и антител к CdtB у субъектов без СРК, ВЗК, глютеновой болезни или их комбинаций. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровней антител к винкулину и антител к CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК, выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК или выбор лечения глютеновой болезни в случае диагностирования или подозрения глютеновой болезни.
[065]
В различных вариантах реализации изобретения система может включать выделенный биологический образец от субъекта, у которого необходимо отличить СРК от ВЗК и глютеновой болезни, и аналитическую систему для определения в биологическом образце наличия антител к винкулину или уровня антител к винкулину, чтобы отличить СРК от ВЗК и глютеновой болезни.
[066]
В различных вариантах реализации изобретения СРК может представлять собой З-СРК, Д-СРК, A-СРК (также известный как С-СРК) или постинфекционный синдром раздраженного кишечника (ПИ-СРК). В конкретных вариантах реализации изобретения СРК представляет собой Д-СРК.
[067]
В различных вариантах реализации изобретения, если диагностируют или подозревают ВЗК, это заключение можно дополнительно скоррелировать с симптомами ВЗК, чтобы дополнительно подтвердить ВЗК. В других вариантах реализации изобретения чтобы дополнительно подтвердить ВЗК, можно провести дополнительное исследование ВЗК.
[068]
В различных вариантах реализации изобретения, если диагностируют или подозревают глютеновую болезнь, это заключение можно дополнительно скоррелировать с симптомами глютеновой болезни, чтобы дополнительно подтвердить глютеновую болезнь. В других вариантах реализации изобретения чтобы дополнительно подтвердить глютеновую болезнь, можно провести дополнительное исследование глютеновой болезни; например, измерение сывороточной тканевой трансглутаминазы.
[069]
В различных вариантах реализации изобретения анализ представляет собой ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), включая, но не ограничиваясь этим, непрямой анализ ELISA, сендвич-анализ ELISA, конкурентный анализ ELISA, множественный и портативный анализ ELISA.
[070]
В различных вариантах реализации изобретения аналитическая система содержит первый реагент для реакции с биологическим образцом, если биологический образец содержит антитело к винкулину (если антитела к винкулину отсутствуют, первый реагент не будет вступать в реакцию с биологическим образцом, при этом первый реагент все еще присутствует в аналитической системе), второй реагент (например, вторичное антитело) для реакции с антителом к винкулину или второй реагент для реакции с первым реагентом, и субстрат. В различных вариантах реализации изобретения первый реагент представляет собой винкулин или его фрагмент. В различных вариантах реализации изобретения второй реагент содержит метку, чтобы обеспечить сигнал, указывающий на наличие антитела к винкулину. В различных вариантах реализации изобретения метка представляет собой радиоактивную метку, хромофор, флуорофор, квантовую точку, фермент, пероксидазу хрена (ПХ), щелочную фосфатазу (ЩФ), биотин или их комбинацию. В различных вариантах реализации изобретения метка представляет собой фермент, который вступает в реакцию с субстратом. В различных вариантах реализации изобретения первый реагент находится на твердой подложке (например, планшете, многолуночном планшете).
[071]
В различных вариантах реализации изобретения аналитическая система содержит первый реагент для реакции с антителом к винкулину. В различных вариантах реализации изобретения первый реагент содержит метку, чтобы обеспечить сигнал, указывающий на наличие антитела к винкулину. В различных вариантах реализации изобретения метка представляет собой радиоактивную метку, хромофор, флуорофор, квантовую точку, фермент, пероксидазу хрена (ПХ), щелочную фосфатазу (ЩФ), биотин или их комбинацию. В различных вариантах реализации изобретения реагент находится на твердой подложке (например, планшете, многолуночном планшете).
[072]
В различных вариантах реализации изобретения система дополнительно включает устройство для определения наличия или вероятного наличия СРК в случае выявления наличия антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител, или определения наличия или вероятного наличия ВЗК или глютеновой болезни в случае отсутствия антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител. В различных вариантах реализации изобретения устройство представляет собой компьютер. В различных вариантах реализации изобретения компьютер включает дисплей для отображения вероятности наличия у пациента СРК, ВЗК или глютеновой болезни.
[073]
В различных вариантах реализации изобретения система дополнительно включает устройство для определения наличия или вероятного наличия СРК, если уровень антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител превышает установленный(ые) контрольный(ые) уровень(ни), или определения наличия или вероятного наличия ВЗК, если уровень антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител соответствует или ниже установленного(ых) контрольного(ых) уровня(ей). В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител в пределах двух стандартных отклонений уровня антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител у здоровых субъектов без СРК, ВЗК, глютеновой болезни или их комбинаций. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к винкулину.
[074]
В различных вариантах реализации изобретения система дополнительно включает устройство для определения наличия или вероятного наличия СРК, если уровень антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител значительно превышает установленный контрольный уровень, или определения наличия или вероятного наличия ВЗК, если уровень антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител значительно не превышает установленный контрольный уровень. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител у здоровых субъектов без СРК, ВЗК, глютеновой болезни или их комбинаций. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител.
[075]
В различных вариантах реализации изобретения устройство представляет собой компьютер. В различных вариантах реализации изобретения компьютер включает дисплей для отображения вероятности наличия у пациента СРК, ВЗК или глютеновой болезни.
[076]
В различных вариантах реализации изобретения предложено лечение СРК у субъекта, у которого может быть СРК, ВЗК или глютеновая болезнь. Способ включает обеспечение терапии СРК и применение терапии СРК в отношении субъекта с диагнозом СРК с применением способов согласно настоящему изобретению. Это означает, что субъекту был поставлен диагноз СРК вследствие выявления наличия антител к винкулину и CdtB в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, обсуждаемыми в данном документе.
[077]
В различных вариантах реализации изобретения терапия СРК представляет собой описанную в данном документе терапию. В различных вариантах реализации изобретения терапия СРК включает применение курса терапии антибиотиками для лечения СРК. В различных вариантах реализации изобретения терапия СРК является доступной терапией согласно известному уровню техники. В различных вариантах реализации изобретения терапия СРК представляет собой описанный в данном документе курс терапии антибиотиками.
[078]
В различных вариантах реализации изобретения СРК, лечение которого проводят, может представлять собой З-СРК, Д-СРК, A-СРК (также известный как С-СРК) или постинфекционный синдром раздраженного кишечника (ПИ-СРК). В конкретных вариантах реализации изобретения СРК представляет собой Д-СРК.
Определение отличия между СРК и ВЗК
[079]
В различных вариантах реализации настоящего изобретения предложены способы, методы анализа и системы для определения отличий между СРК и ВЗК.
[080]
Способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК, определение в биологическом образце наличия антител к винкулину и диагностирование СРК в случае определения наличия антител к винкулину или диагностирование ВЗК или подозрения на ВЗК в случае отсутствия антител к винкулину. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении наличия или отсутствия антител к винкулину. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК или выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК.
[081]
В различных вариантах реализации изобретения способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК, определение в биологическом образце уровня антител к винкулину и диагностирование СРК, если уровень антител к винкулину превышает установленный контрольный уровень, или диагностирование ВЗК или подозрения на ВЗК, если уровень антител к винкулину соответствует или ниже установленного контрольного уровня. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к винкулину в пределах двух стандартных отклонений уровней антител к винкулину у здоровых субъектов без СРК, ВЗК или обоих заболеваний. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к винкулину.
[082]
В различных вариантах реализации изобретения способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК, определение в биологическом образце уровня антител к винкулину и диагностирование СРК, если уровень антител к винкулину значительно превышает установленный контрольный уровень, или диагностирование ВЗК или подозрения на ВЗК, если уровень антител к винкулину значительно не превышает установленный контрольный уровень. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к винкулину у субъектов без СРК, ВЗК или обоих заболеваний. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к винкулину. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК или выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК.
[083]
Способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК, определение в биологическом образце наличия антител к CdtB и диагностирование СРК в случае определения наличия антител к CdtB или диагностирование ВЗК или подозрения на ВЗК в случае отсутствия антител к CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении наличия или отсутствия антител к CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК или выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК.
[084]
В различных вариантах реализации изобретения способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК, определение в биологическом образце уровня антител к CdtB и диагностирование СРК, если уровень антител к CdtB превышает установленный контрольный уровень, или диагностирование ВЗК или подозрения на ВЗК, если уровень антител к CdtB соответствует или ниже установленного контрольного уровня. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к CdtB в пределах двух стандартных отклонений уровней антител к CdtB у здоровых субъектов без СРК, ВЗК или обоих заболеваний. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК или выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК.
[085]
В различных вариантах реализации изобретения способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК, определение в биологическом образце уровня антител к CdtB и диагностирование СРК, если уровень антител к CdtB значительно превышает установленный контрольный уровень, или диагностирование ВЗК или подозрения на ВЗК, если уровень антител к CdtB значительно не превышает установленный контрольный уровень. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к CdtB у субъектов без СРК, ВЗК или обоих заболеваний. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК или выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК.
[086]
В различных вариантах реализации изобретения способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК, определение в биологическом образце наличия антител к винкулину и CdtB и диагностирование СРК в случае определения наличия антител к винкулину и CdtB или диагностирование ВЗК или подозрения на ВЗК в случае отсутствия антител к винкулину и CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении наличия или отсутствия антител к винкулину и CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК или выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК.
[087]
В различных вариантах реализации изобретения способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК, определение в биологическом образце уровня антител к винкулину и CdtB и диагностирование СРК, если уровни антител к винкулину и CdtB превышают установленный контрольный уровень, или диагностирование ВЗК или подозрения на ВЗК, если уровни антител к винкулину и CdtB соответствуют или ниже установленного контрольного уровня. В различных вариантах реализации изобретения установленные контрольные уровни представляют собой уровни антител к винкулину и CdtB в пределах двух стандартных отклонений уровней антител к винкулину и CdtB у здоровых субъектов без СРК, ВЗК или обоих заболеваний. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровней антител к винкулину и CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК или выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК.
[088]
В различных вариантах реализации изобретения способ может включать получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК, определение в биологическом образце уровня антител к винкулину и CdtB и диагностирование СРК, если уровень антител к винкулину и CdtB значительно превышает установленный контрольный уровень, или диагностирование ВЗК или подозрения на ВЗК, если уровень антител к винкулину и CdtB значительно не превышает установленный контрольный уровень. В различных вариантах реализации изобретения установленные контрольные уровни представляют собой уровни антител к винкулину и CdtB у субъектов без СРК, ВЗК или обоих заболеваний. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровней антител к винкулину и CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает выбор лечения СРК в случае диагностирования СРК или выбор лечения ВЗК в случае диагностирования или подозрения ВЗК.
[089]
В различных вариантах реализации изобретения система может включать выделенный биологический образец от субъекта, у которого необходимо отличить СРК от ВЗК, и аналитическую систему для определения в биологическом образце наличия антител к винкулину или уровня антител к винкулину, чтобы отличить СРК от ВЗК.
[090]
В различных вариантах реализации изобретения СРК может представлять собой З-СРК, Д-СРК, A-СРК (также известный как С-СРК) или постинфекционный синдром раздраженного кишечника (ПИ-СРК). В конкретных вариантах реализации изобретения СРК представляет собой Д-СРК.
[091]
В различных вариантах реализации изобретения, если диагностируют или подозревают ВЗК, это заключение можно дополнительно скоррелировать с симптомами ВЗК, чтобы дополнительно подтвердить ВЗК. В других вариантах реализации изобретения чтобы дополнительно подтвердить ВЗК, можно провести дополнительное исследование ВЗК.
[092]
В различных вариантах реализации изобретения анализ представляет собой ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), включая, но не ограничиваясь этим, непрямой анализ ELISA, сендвич-анализ ELISA, конкурентный анализ ELISA, множественный и портативный анализ ELISA.
[093]
В различных вариантах реализации изобретения аналитическая система содержит первый реагент для реакции с биологическим образцом, если биологический образец содержит антитело к винкулину (если антитела к винкулину отсутствуют, первый реагент не будет вступать в реакцию с биологическим образцом, при этом первый реагент все еще присутствует в аналитической системе), второй реагент (например, вторичное антитело) для реакции с антителом к винкулину или второй реагент для реакции с первым реагентом, и субстрат. В различных вариантах реализации изобретения первый реагент представляет собой винкулин или его фрагмент. В различных вариантах реализации изобретения второй реагент содержит метку, чтобы обеспечить сигнал, указывающий на наличие антитела к винкулину. В различных вариантах реализации изобретения метка представляет собой радиоактивную метку, хромофор, флуорофор, квантовую точку, фермент, пероксидазу хрена (ПХ), щелочную фосфатазу (ЩФ), биотин или их комбинацию. В различных вариантах реализации изобретения метка представляет собой фермент, который вступает в реакцию с субстратом. В различных вариантах реализации изобретения первый реагент находится на твердой подложке (например, планшете, многолуночном планшете).
[094]
В различных вариантах реализации изобретения аналитическая система содержит первый реагент для реакции с антителом к винкулину. В различных вариантах реализации изобретения первый реагент содержит метку, чтобы обеспечить сигнал, указывающий на наличие антитела к винкулину. В различных вариантах реализации изобретения метка представляет собой радиоактивную метку, хромофор, флуорофор, квантовую точку, фермент, пероксидазу хрена (ПХ), щелочную фосфатазу (ЩФ), биотин или их комбинацию. В различных вариантах реализации изобретения реагент находится на твердой подложке (например, планшете, многолуночном планшете).
[095]
В различных вариантах реализации изобретения система дополнительно включает устройство для определения наличия или вероятного наличия СРК в случае выявления наличия антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител, или определения наличия или вероятного наличия ВЗК в случае отсутствия антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител. В различных вариантах реализации изобретения устройство представляет собой компьютер. В различных вариантах реализации изобретения компьютер включает дисплей для отображения вероятности наличия у пациента СРК или ВЗК.
[096]
В различных вариантах реализации изобретения система дополнительно включает устройство для определения наличия или вероятного наличия СРК, если уровень антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител превышает установленный(ые) контрольный(ые) уровень(ни), или определения наличия или вероятного наличия ВЗК, если уровень антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител соответствует или ниже установленного(ых) контрольного(ых) уровня(ей). В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител в пределах двух стандартных отклонений уровня антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител у здоровых субъектов без СРК, ВЗК или обоих заболеваний. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к винкулину.
[097]
В различных вариантах реализации изобретения система дополнительно включает устройство для определения наличия или вероятного наличия СРК, если уровень антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител значительно превышает установленный контрольный уровень, или определения наличия или вероятного наличия ВЗК, если уровень антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител значительно не превышает установленный контрольный уровень. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител у здоровых субъектов без СРК, ВЗК или обоих заболеваний. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител.
[098]
В различных вариантах реализации изобретения устройство представляет собой компьютер. В различных вариантах реализации изобретения компьютер включает дисплей для отображения вероятности наличия у пациента СРК или ВЗК.
Диагностика СРК
[099]
В различных вариантах реализации изобретения предложены способы, методы анализа и системы для диагностики или выявления СРК у субъекта.
[0100]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз СРК, определение в биологическом образце наличия антител к винкулину и CdtB и определение наличия или вероятного наличия СРК в случае выявления наличия антител к винкулину и CdtB или определение отсутствия или вероятного отсутствия СРК в случае выявления отсутствия антител к винкулину и CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении наличия или отсутствия антител к винкулину и CdtB.
[0101]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз СРК, определение в биологическом образце уровня антител к винкулину и CdtB и определение наличия или вероятного наличия СРК, если уровень антител к винкулину и CdtB превышает установленный контрольный уровень, или определение отсутствия или вероятного отсутствия СРК, если уровень антител к винкулину и CdtB соответствует или ниже установленного контрольного уровня. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к винкулину и CdtB в пределах двух стандартных отклонений уровней антител к винкулину и CdtB у субъектов без СРК.В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к винкулину и CdtB.
[0102]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз СРК, определение в биологическом образце уровня антител к винкулину и CdtB и определение наличия или вероятного наличия СРК, если уровень антител к винкулину и CdtB значительно превышает установленный контрольный уровень, или определение отсутствия или вероятного отсутствия СРК, если уровень антител к винкулину и CdtB значительно не превышает установленный контрольный уровень. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к винкулину и CdtB у субъектов без СРК. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к винкулину и CdtB.
[0103]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз СРК, определение в биологическом образце наличия антител к винкулину и определение наличия или вероятного наличия СРК в случае выявления наличия антител к винкулину или определение отсутствия или вероятного отсутствия СРК в случае отсутствия антител к винкулину. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении наличия или отсутствия антител к винкулину.
[0104]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз СРК, определение в биологическом образце уровня антител к винкулину и определение наличия или вероятного наличия СРК, если уровень антител к винкулину превышает установленный контрольный уровень, или определение отсутствия или вероятного отсутствия СРК, если уровень антител к винкулину соответствует или ниже установленного контрольного уровня. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к винкулину в пределах двух стандартных отклонений уровней антител к винкулину у субъектов без СРК.В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к винкулину.
[0105]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз СРК, определение в биологическом образце уровня антител к винкулину и определение наличия или вероятного наличия СРК, если уровень антител к винкулину значительно превышает установленный контрольный уровень, или определение отсутствия или вероятного отсутствия СРК, если уровень антител к винкулину значительно не превышает установленный контрольный уровень. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к винкулину у субъектов без СРК. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к винкулину.
[0106]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз СРК, определение в биологическом образце наличия антител к CdtB и определение наличия или вероятного наличия СРК в случае выявления наличия антител к CdtB или определение отсутствия или вероятного отсутствия СРК в случае выявления отсутствия антител к CdtB. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении наличия или отсутствия антител к CdtB.
[0107]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз СРК, определение в биологическом образце уровня антител к CdtB и определение наличия или вероятного наличия СРК, если уровень антител к CdtB превышает установленный контрольный уровень, или определение отсутствия или вероятного отсутствия СРК, если уровень антител к CdtB соответствует или ниже установленного контрольного уровня. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к CdtB в пределах двух стандартных отклонений уровней антител к CdtB у субъектов без СРК.В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к CdtB.
[0108]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: получение биологического образца от субъекта, которому необходимо поставить диагноз СРК, определение в биологическом образце уровня антител к CdtB и определение наличия или вероятного наличия СРК, если уровень антител к CdtB значительно превышает установленный контрольный уровень, или определение отсутствия или вероятного отсутствия СРК, если уровень антител к CdtB значительно не превышает установленный контрольный уровень. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к CdtB у субъектов без СРК. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к CdtB.
[0109]
Не у всех субъектов с наличием антител к винкулину и/или антител к CdtB будет наблюдаться или развиваться СРК; однако эти способы дают представление о вероятности того, что у субъекта есть СРК или разовьется СРК. Определение вероятного наличия СРК можно дополнительно скоррелировать и/или подтвердить другими методами диагностики СРК или симптомами СРК, известными в данной области техники. Кроме того, определение вероятного отсутствия СРК также можно дополнительно скоррелировать и/или подтвердить другими методами диагностики СРК или симптомами СРК, известными в данной области техники, чтобы исключить СРК.
[0110]
В различных вариантах реализации изобретения СРК может представлять собой З-СРК, Д-СРК, A-СРК (также известный как С-СРК) или постинфекционный синдром раздраженного кишечника (ПИ-СРК). В конкретных вариантах реализации изобретения СРК представляет собой Д-СРК.
[0111]
В различных вариантах реализации изобретения система включает: выделенный биологический образец от субъекта, которому необходимо поставить диагноз СРК, и аналитическую систему для определения в биологическом образце наличия или уровня антител к винкулину и CdtB.
[0112]
В различных вариантах реализации изобретения система включает: выделенный биологический образец от субъекта, которому необходимо поставить диагноз СРК, и аналитическую систему для определения в биологическом образце наличия или уровня антител к винкулину.
[0113]
В различных вариантах реализации изобретения система включает: выделенный биологический образец от субъекта, которому необходимо поставить диагноз СРК, и аналитическую систему для определения в биологическом образце наличия или уровня антител к CdtB.
[0114]
В различных вариантах реализации изобретения анализ представляет собой ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), включая, но не ограничиваясь этим, непрямой анализ ELISA, сендвич-анализ ELISA, конкурентный анализ ELISA, множественный и портативный анализ ELISA.
[0115]
В различных вариантах реализации изобретения аналитическая система содержит первый реагент для реакции с биологическим образцом, второй реагент (например, вторичное антитело) для реакции с антителом к винкулину и субстрат. В различных вариантах реализации изобретения первый реагент представляет собой винкулин или его фрагмент, который вступает в реакцию с антителом к винкулину в случае его наличия в биологическом образце. В различных вариантах реализации изобретения второй реагент содержит метку, чтобы обеспечить сигнал, указывающий на наличие антитела к винкулину. В различных вариантах реализации изобретения метка представляет собой радиоактивную метку, хромофор, флуорофор, квантовую точку, фермент, пероксидазу хрена (ПХ), щелочную фосфатазу (ЩФ), биотин или их комбинацию. В различных вариантах реализации изобретения метка представляет собой фермент, который вступает в реакцию с субстратом. В различных вариантах реализации изобретения первый реагент находится на твердой подложке (например, планшете, многолуночном планшете).
[0116]
В различных вариантах реализации изобретения аналитическая система содержит первый реагент для реакции с антителом к винкулину. В различных вариантах реализации изобретения первый реагент содержит метку, чтобы обеспечить сигнал, указывающий на наличие антитела к винкулину. В различных вариантах реализации изобретения метка представляет собой радиоактивную метку, хромофор, флуорофор, квантовую точку, фермент, пероксидазу хрена (ПХ), щелочную фосфатазу (ЩФ), биотин или их комбинацию. В различных вариантах реализации изобретения реагент находится на твердой подложке (например, планшете, многолуночном планшете).
[0117]
В различных вариантах реализации изобретения система дополнительно включает устройство для определения наличия или вероятного наличия СРК в случае выявления наличия антител к винкулину или определения отсутствия или вероятного отсутствия СРК в случае отсутствия антител к винкулину. В различных вариантах реализации изобретения устройство представляет собой компьютер. В различных вариантах реализации изобретения компьютер включает дисплей для отображения вероятности наличия или отсутствия СРК.
[0118]
В различных вариантах реализации изобретения система дополнительно включает устройство для определения наличия или вероятного наличия СРК, если уровень антител к винкулину превышает установленный контрольный уровень, или определения отсутствия или вероятного отсутствия СРК, если уровень антител к винкулину соответствует или ниже установленного контрольного уровня. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к винкулину в пределах двух стандартных отклонений уровней антител к винкулину у субъектов без СРК. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к винкулину.
[0119]
В различных вариантах реализации изобретения система дополнительно включает устройство для определения наличия или вероятного наличия СРК, если уровень антител к винкулину значительно превышает установленный контрольный уровень, или определения отсутствия или вероятного отсутствия СРК, если уровень антител к винкулину значительно не превышает установленный контрольный уровень. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к винкулину у субъектов без СРК.В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к винкулину.
[0120]
В различных вариантах реализации изобретения аналитическая система содержит первый реагент для реакции с биологическим образцом, второй реагент (например, вторичное антитело) для реакции с антителом к CdtB и субстрат. В различных вариантах реализации изобретения первый реагент представляет собой CdtB или его фрагмент, который вступает в реакцию с антителом к CdtB в случае его наличия в биологическом образце. В различных вариантах реализации изобретения второй реагент содержит метку, чтобы обеспечить сигнал, указывающий на наличие антитела к CdtB. В различных вариантах реализации изобретения метка представляет собой радиоактивную метку, хромофор, флуорофор, квантовую точку, фермент, пероксидазу хрена (ПХ), щелочную фосфатазу (ЩФ), биотин или их комбинацию. В различных вариантах реализации изобретения метка представляет собой фермент, который вступает в реакцию с субстратом. В различных вариантах реализации изобретения первый реагент находится на твердой подложке (например, планшете, многолуночном планшете).
[0121]
В различных вариантах реализации изобретения аналитическая система содержит первый реагент для реакции с антителом к CdtB. В различных вариантах реализации изобретения первый реагент содержит метку, чтобы обеспечить сигнал, указывающий на наличие антитела к CdtB. В различных вариантах реализации изобретения метка представляет собой радиоактивную метку, хромофор, флуорофор, квантовую точку, фермент, пероксидазу хрена (ПХ), щелочную фосфатазу (ЩФ), биотин или их комбинацию. В различных вариантах реализации изобретения реагент находится на твердой подложке (например, планшете, многолуночном планшете).
[0122]
В различных вариантах реализации изобретения система дополнительно включает устройство для определения наличия или вероятного наличия СРК в случае выявления наличия антител к CdtB или определения отсутствия или вероятного отсутствия СРК в случае отсутствия антител к CdtB. В различных вариантах реализации изобретения устройство представляет собой компьютер. В различных вариантах реализации изобретения компьютер включает дисплей для отображения вероятности наличия или отсутствия СРК.
[0123]
В различных вариантах реализации изобретения система дополнительно включает устройство для определения наличия или вероятного наличия СРК, если уровень антител к CdtB превышает установленный контрольный уровень, или определения отсутствия или вероятного отсутствия СРК, если уровень антител к CdtB соответствует или ниже установленного контрольного уровня. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к CdtB в пределах двух стандартных отклонений уровней антител к CdtB у субъектов без СРК. В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к CdtB.
[0124]
В различных вариантах реализации изобретения система дополнительно включает устройство для определения наличия или вероятного наличия СРК, если уровень антител к CdtB значительно превышает установленный контрольный уровень, или определения отсутствия или вероятного отсутствия СРК, если уровень антител к CdtB значительно не превышает установленный контрольный уровень. В различных вариантах реализации изобретения установленный контрольный уровень представляет собой уровень антител к CdtB у субъектов без СРК.В определенных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает анализ биологического образца в отношении уровня антител к CdtB.
[0125]
В различных вариантах реализации изобретения анализ включает методы анализа (например, как описано выше) для определения уровней антител к винкулину и антител к CdtB.
[0126]
В различных вариантах реализации изобретения определение наличия или уровня антител к винкулину и/или антител к CdtB включает добавление обсуждаемого в данном документе винкулина или его фрагмента и/или обсуждаемого в данном документе CdtB или его фрагмента в биологический образец от субъекта, которому необходимо определение в отношении СРК, при этом антитела к винкулину и/или CdtB (в случае наличия в биологическом образце) специфически связываются с винкулином или его фрагментом и/или CdtB или его фрагментом в биологическом образце; измерение уровней антител к винкулину и антител к CdtB в биологическом образце; и установление того, что субъект имеет СРК, если уровни антител к винкулину превышают уровни антител к CdtB.
[0127]
В различных вариантах реализации изобретения анализ включает добавление обсуждаемого в данном документе винкулина или его фрагмента, и/или обсуждаемого в данном документе CdtB или его фрагмента в биологический образец от субъекта, которому необходимо определение в отношении СРК, при этом антитела к винкулину и/или CdtB (в случае наличия в биологическом образце) специфически связываются с винкулином или его фрагментом и/или CdtB или его фрагментом в биологическом образце; измерение уровней антител к винкулину и антител к CdtB в биологическом образце; и установление того, что субъект имеет СРК, если уровни антител к винкулину превышают уровни антител к CdtB.
Выбор лечения и лечение
[0128]
В различных вариантах реализации изобретения предложен способ выбора терапии СРК для нуждающегося в этом субъекта.
[0129]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: определение наличия антител к винкулину и антител к CdtB у субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК, глютеновой болезни или обоих заболеваний; и выбор терапии для лечения СРК.
[0130]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: определение наличия антител к винкулину у субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК, глютеновой болезни или обоих заболеваний; и выбор терапии для лечения СРК.
[0131]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: определение наличия антител к CdtB у субъекта, которому необходимо поставить диагноз, чтобы отличить СРК от ВЗК, глютеновой болезни или обоих заболеваний; и выбор терапии для лечения СРК.
[0132]
В контексте данного документе выбор терапии включает, но не ограничивается этим, выбор, подбор, предписание, совет, рекомендацию, инструктирование или консультирование субъекта в отношении лечения.
[0133]
В различных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает применение терапии для лечения СРК. В различных вариантах реализации изобретения терапия представляет собой описанную в данном документе терапию. В различных вариантах реализации изобретения доступная терапия включает проведение курса терапии антибиотиками для лечения СРК. В различных вариантах реализации изобретения терапия представляет собой доступную терапию согласно известному уровню техники.
[0134]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: определение наличия антител к винкулину и антител к CdtB; и выбор курса терапии антибиотиками для лечения СРК. В различных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает проведение курса терапии антибиотиками для лечения СРК.
[0135]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: определение наличия антител к винкулину; и выбор курса терапии антибиотиками для лечения СРК. В различных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает проведение курса терапии антибиотиками для лечения СРК.
[0136]
В различных вариантах реализации изобретения способ включает: определение наличия антител к CdtB; и выбор курса терапии антибиотиками для лечения СРК. В различных вариантах реализации изобретения способ дополнительно включает проведение курса терапии антибиотиками для лечения СРК.
[0137]
В различных вариантах реализации изобретения определение наличия антител к винкулину, антител к CdtB или обоих видов антител можно осуществлять с помощью описанных способов и систем согласно настоящему изобретению.
[0138]
В различных вариантах реализации изобретения субъект может представлять собой субъекта, проявляющего один или более симптомов СРК; например, как описано в данном документе.
[0139]
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
например
Примеры антибиотиков включают, но не ограничиваются ими, аминогликозиды (, амикацин, гентамицин, канамицин, неомицин, нетилмицин, стрептомицин, тобрамицин, паромомицин), ансамицины (, гелданамицин, гербимицин), карбацефемы (, лоракарбеф), карбапенемы (, эртапенем, дорипенем, имипенем, циластатин, меропенем), цефалоспорины (, первого поколения: цефадроксил, цефазолин, цефалотин, цефалексин; второго поколения: цефаклор, цефамандол, цефокситин, цефпрозил, цефуроксим; третьего поколения: цефиксим, цефдинир, цефдиторен, цефоперазон, цефотаксим, цефподоксим, цефтазидим, цефтибутен, цефтизоксим, цефтриаксон; четвертого поколения: цефепим; пятого поколения: цефтобипрол), гликопептиды (, тейкопланин, ванкомицин), макролиды (, азитромицин, кларитромицин, диритромицин, эритромицин, рокситромицин, тролеандомицин, телитромицин, спектиномицин), монобактамы (, азтреонам), пенициллины (, амоксициллин, ампициллин, азлоциллин, карбенициллин, клоксациллин, диклоксациллин, флуклоксациллин, мезлоциллин, метициллин, нафциллин, оксациллин, пенициллин, пиперациллин, тикарциллин), антибиотические полипептиды (, бацитрацин, колистин, полимиксин В), хинолоны (, ципрофлоксацин, эноксацин, гатифлоксацин, левофлоксацин, ломефлоксацин, моксифлоксацин, норфлоксацин, офлоксацин, тровафлоксацин), рифамицины (, рифампицин или рифампин, рифабутин, рифапентин, рифаксимин), сульфонамиды (, мафенид, протонзил, сульфацетамид, сульфаметизол, сульфаниламид, сульфасалазин, сульфизоксазол, триметоприм, триметоприм-сульфаметоксазол (ко-тримоксазол, «tmp-smx») и тетрациклины (, демеклоциклин, доксициклин, миноциклин, окситетрациклин, тетрациклин), а также арсфенамин, хлорамфеникол, клиндамицин, линкомицин, этамбутол, фосфомицин, фусидовую кислоту, фуразолидон, изониазид, линезолид, метронидазол, мупироцин, нитрофурантоин, платенсимицин, пиразинамид, комбинацию квинупристин/дальфопристин и тинидазол или их комбинацию. В различных вариантах реализации изобретения антибиотики представляют собой комбинацию рифаксимина и неомицина. В различных вариантах реализации изобретения антибиотики представляют собой комбинацию рифаксимина и доксициклина. В различных вариантах реализации изобретения антибиотики представляют собой комбинацию рифаксимина и метронидазола.
[0140]
В различных вариантах реализации изобретения антибиотики представляют собой невсасывающиеся антибиотики. Примеры невсасывающихся антибиотиков включают, но не ограничиваются ими, рифаксимин, неомицин, бацитрацин, ванкомицин, тейкопланин, рамопланин и парамомицин.
[0141]
В различных вариантах реализации изобретения СРК, лечение которого проводят, может представлять собой З-СРК, Д-СРК, A-СРК (также известный как С-СРК) или постинфекционный синдром раздраженного кишечника (ПИ-СРК). В конкретных вариантах реализации изобретения СРК представляет собой Д-СРК.
[0142]
В различных вариантах реализации изобретения предложено лечение СРК у субъекта. Способ включает обеспечение терапии СРК и применение терапии СРК в отношении субъекта, которому был поставлен диагноз СРК с помощью способов согласно настоящему изобретению. Это означает, что субъекту был поставлен диагноз СРК путем определения наличия антител к винкулину и CdtB в соответствии со способами настоящего изобретения, обсуждаемыми в данном документе.
[0143]
В различных вариантах реализации изобретения терапия СРК представляет собой описанную в данном документе терапию. В различных вариантах реализации изобретения терапия СРК включает проведение курса терапии антибиотиками для лечения СРК. В различных вариантах реализации изобретения терапия СРК представляет собой доступную терапию согласно известному уровню техники. В различных вариантах реализации изобретения терапия СРК представляет собой курс терапии антибиотиками, описанный в данном документе.
[0144]
В различных вариантах реализации изобретения СРК, лечение которого проводят, может представлять собой З-СРК, Д-СРК, A-СРК (также известный как С-СРК) или постинфекционный синдром раздраженного кишечника (ПИ-СРК). В конкретных вариантах реализации изобретения СРК представляет собой Д-СРК.
Оптическая плотность как измерение уровней антител
[0145]
В
В
В определенных вариантах реализации изобретения для измерения уровня антител к винкулину и/или антител к CDT используют оптическую плотность (ОП). Например, оптическая плотность служит в качестве установленного контрольного уровня в различных вариантах реализации изобретения. В определенных вариантах реализации изобретения, если ОП антител к винкулину (OП) превышает 1,62, 1,86 или 2,23, у субъекта определяют наличие СРК. В различных вариантах реализации изобретения, если ОП антител к винкулину (OП) превышает 1,00, 1,25, 1,50, 1,75, 2,00, 2,25, 2,50, 2,75 у субъекта определяют наличие СРК. В определенных вариантах реализации изобретения эти значения ОП получены при разведении биологического образца до 1:32 и концентрации антигена 1,2 мкг/мл.
[0146]
CDT
CDT
В определенных вариантах реализации изобретения, если ОП антител к CDT (ОП) превышает 2,48 или 2,79, у субъекта определяют наличие СРК. В различных вариантах реализации изобретения, если ОП антител к CDT (ОП) превышает 2,00, 2,25, 2,50, 2,75, 3,00, у субъекта определяют наличие СРК. В определенных вариантах реализации изобретения эти значения ОП получены при разведении биологического образца до 1:512 и концентрации антигена 1,2 мкг/мл.
[0147]
В
CDT
В других вариантах реализации изобретения пороговые значения OПи ОПмогут быть определены при разных значениях разведения биологического образца и антигенов и включены в варианты реализации настоящего изобретения.
[0148]
В дополнительных вариантах реализации изобретения вышеприведенные определения можно применять непосредственно для лечения субъекта. В одном варианте реализации изобретения субъекта с вероятным наличием СРК или вероятностью наличия СРК можно лечить с помощью одного или более вариантов терапии СРК.
[0149]
Специалист в данной области техники сможет выбрать доступный вариант лечения СРК на основании диагноза СРК. Например, для лечения СРК можно применять антибиотики, такие как рифаксимин и неомицин. В частности, рифаксимин можно применять для лечения СРК с преобладающей диареей, а комбинацию рифаксимин/неомицин можно применять для лечения СРК с преобладающим запором.
Антитела к винкулину
[0150]
В различных вариантах реализации изобретения антитело к винкулину, определяемое с помощью указанных способов или систем, представляет собой антитело, которое специфически связывается с винкулином.
[0151]
В различных вариантах реализации изобретения антитело к винкулину представляет собой антитело, которое специфически связывается с пептидом из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 остатков, который имеет по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии с 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 смежными остатками винкулина.
[0152]
В другом варианте реализации изобретения антитело к винкулину специфически связывается с полипептидом, содержащим 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 остатков, который имеет по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии с 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 смежными остатками винкулина.
[0153]
В другом варианте реализации изобретения антитело к винкулину специфически связывается с полипептидом, содержащим или состоящим из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 смежных остатков винкулина.
[0154]
В различных вариантах реализации изобретения антитело к винкулину представляет собой антитело, которое специфически связывается с SEQ ID NO:7.
[0155]
В различных вариантах реализации изобретения антитело к винкулину представляет собой антитело, которое специфически связывается с пептидом из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 остатков, который имеет по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии с 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 смежными остатками SEQ ID NO:7.
[0156]
В другом варианте реализации изобретения антитело к винкулину специфически связывается с полипептидом, содержащим 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 остатков, который имеет по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии с 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 смежными остатками SEQ ID NO:7.
[0157]
В другом варианте реализации изобретения антитело к винкулину специфически связывается с полипептидом, содержащим или состоящим из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 смежных остатков SEQ ID NO:7.
[0158]
Смежные остатки винкулина или SEQ ID NO:7 включают остатки, начиная с любой аминокислоты и заканчивая любой аминокислотой винкулина или SEQ ID NO:7.
[0159]
Белковая последовательность винкулина (SEQ ID NO:7):
MPVFHTRTIESILEPVAQQISHLVIMHEEGEVDGKAIPDLTAPVAAVQAAVSNLVRVGKETVQTTEDQILKRDMPPAFIKVENACTKLVQAAQMLQSDPYSVPARDYLIDGSRGILSGTSDLLLTFDEAEVRKIIRVCKGILEYLTVAEVVETMEDLVTYTKNLGPGMTKMAKMIDERQQELTHQEHRVMLVNSMNTVKELLPVLISAMKIFVTTKNSKNQGIEEALKNRNFTVEKMSAEINEIIRVLQLTSWDEDAWASKDTEAMKRALASIDSKLNQAKGWLRDPSASPGDAGEQAIRQILDEAGKVGELCAGKERREILGTCKMLGQMTDQVADLRARGQGSSPVAMQKAQQVSQGLDVLTAKVENAARKLEAMTNSKQSIAKKIDAAQNWLADPNGGPEGEEQIRGALAEARKIAELCDDPKERDDILRSLGEISALTSKLADLRRQGKGDSPEARALAKQVATALQNLQTKTNRAVANSRPAKAAVHLEGKIEQAQRWIDNPTVDDRGVGQAAIRGLVAEGHRLANVMMGPYRQDLLAKCDRVDQLTAQLADLAARGEGESPQARALASQLQDSLKDLKARMQEAMTQEVSDVFSDTTTPIKLLAVAATAPPDAPNREEVFDERAANFENHSGKLGATAEKAAAVGTANKSTVEGIQASVKTARELTPQVVSAARILLRNPGNQAAYEHFETMKNQWIDNVEKMTGLVDEAIDTKSLLDASEEAIKKDLDKCKVAMANIQPQMLVAGATSIARRANRILLVAKREVENSEDPKFREAVKAASDELSKTISPMVMDAKAVAGNISDPGLQKSFLDSGYRILGAVAKVREAFQPQEPDFPPPPPDLEQLRLTDELAPPKPPLPEGEVPPPRPPPPEEKDEEFPEQKAGEVINQPMMMAARQLHDEARKWSSKGNDIIAAAKRMALLMAEMSRLVRGGSGTKRALIQCAKDIAKASDEVTRLAKEVAKQCTDKRIRTNLLQVCERIPTISTQLKILSTVKATMLGRTNISDEESEQATEMLVHNAQNLMQSVKETVREAEAASIKIRTDAGFTLRWVRKTPWYQ
[0160]
В различных вариантах реализации изобретения определение наличия или отсутствия антитела проводят в биологическом образце, полученном от субъекта. В другом варианте реализации изобретения определение наличия или отсутствия антитела проводят в образце крови, сыворотки или стула, полученном от субъекта. Для специалиста в данной области техники очевидны способы и системы, которые можно использовать, чтобы определить наличие или отсутствие антитела, которое специфически связывается с винкулином, SEQ ID NO: 7 или их фрагментом. Эти способы и системы включают, но не ограничиваются ими, ELISA, иммуногистохимию, проточную цитометрию, флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), радиоиммуноанализ и аффинную очистку.
[0161]
В различных вариантах реализации изобретения винкулин, SEQ ID NO: 7 или их фрагмент (как описано выше) применяют в качестве субстрата или реагента (например, коллектора, ловушки) для связывания антител к винкулину (в случае наличия).
[0162]
В определенных вариантах реализации изобретения определение наличия или отсутствия антитела, которое специфически связывается с винкулином, SEQ ID NO: 7 или их фрагментом, можно проводить путем приведения винкулина, SEQ ID NO: 7 или их фрагмента в контакт с биологическим образцом, полученным от субъекта, чтобы выделить антитело, которое специфически связывается с винкулином, SEQ ID NO: 7 или их фрагментом, при этом выделение антитела, которое специфически связывается с винкулином, SEQ ID NO: 7 или их фрагментом, указывает на наличие антитела, а отсутствие выделения антитела, которое специфически связывается с винкулином, SEQ ID NO: 7 или их фрагментом, указывает на отсутствие антитела. В различных вариантах реализации изобретения фрагмент винкулина или SEQ ID NO: 7 может представлять собой описанные в данном документе фрагменты. В качестве примера аффинную матрицу, содержащую винкулин, SEQ ID NO: 7 или их фрагмент, можно связать с твердой подложкой; биологический образец можно привести в контакт с аффинной матрицей для образования комплекса аффинная матрица-антитело (в случае наличия антитела); комплекс аффинная матрица-антитело можно отделить от остатков биологического образца; а антитело можно высвободить из аффинной матрицы. В другом примере к винкулину, SEQ ID NO: 7 или их фрагменту можно присоединить метку (например, флуоресцентную метку); меченый винкулин, SEQ ID NO: 7 или их фрагмент можно привести в контакт с биологическим образцом, чтобы дать возможность антителу (в случае наличия) специфически связаться с меченым винкулином, SEQ ID NO: 7 или их фрагментом. В различных вариантах реализации изобретения меченый винкулин, SEQ ID NO: 7 или их фрагмент можно отделить и проанализировать в отношении связывания с антителом.
Антитела к CdtB
[0163]
Campylobacter jejuni
Campylobacter coli
В различных вариантах реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с субъединицей CdtB CDT. Примером аминокислотной последовательности CdtB является цитолетальный растягивающий токсин В , который имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 5). Другим примером аминокислотной последовательности CdtB является цитолетальный растягивающий токсин В , который имеет аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 1) и нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO:2).
[0164]
SEQ ID NO:5:
MKKIICLFLSFNLAFANLENFNVGTWNLQGSSAATESKWSVSVRQLVSGANPLDILMIQEAGTLPRTATPTGRHVQQGGTPIDEYEWNLGTLSRPDRVFIYYSRVDVGANRVNLAIVSRMQAEEVIVLPPPTTVSRPIIGIRNGNDAFFNIHALANGGTDVGAIITAVDAHFANMPQVNWMIAGDFNRDPSTITSTVDRELANRIRVVFPTSATQASGGTLDYAITGNSNRQQTYTPPLLAAILMLASLRSHIVSDHFPVNFRKF
[0165]
SEQ ID NO:1:
MKKIVFLILSFNVLFAALENYNTGTWNLQGSSAATESKWNVSIRQLITGANPMDVLAVQEAGVLPSTAMMTPRQVQPVGVGIPIHEYIWNLGSVSRPSSVYIYYSRVDVGANRVNLAIVSRVQADEVFVLPPPTVASRPIIGIRIGNDAFFNIHALASGGNDAGAIVAAVDMFFRNRPDINWMILGDFNRESGALVTLLDPDLRARTRVVVPPSSTQTSGRTIDYAITGNSNTAALYNPPPIVAILALEGLRTFLASDHFPVNFRRP
[0166]
SEQ ID NO:2:
atgaaaaaaa tagtattttt gattttaagt tttaatgtat tatttgccgc tttagaaaat 60
tacaacaccg gaacttggaa tttgcaaggc tcatcagctg caactgaaag caaatggaat 120
gttagtataa gacaactcat aaccggtgca aatcctatgg atgttttagc tgttcaagaa 180
gcgggggttt tacctagtac agctatgatg actcctagac aggtacaacc cgtgggcgtg 240
ggtattccta tacatgaata catatggaat ttaggctctg tatcaagacc tagctctgtt 300
tatatatatt attctagagt ggatgtagga gcaaatcgtg tgaatttagc tatcgttagc 360
agagtgcaag cggatgaagt ttttgtttta ccccctccaa cagttgcttc aagacctatt 420
ataggcatac gcataggcaa tgatgctttt ttcaatatac acgctctagc aagtggggga 480
aatgacgcag gagccattgt cgctgctgtg gatatgtttt ttagaaatag acctgatatt 540
aattggatga ttttaggcga ttttaataga gaatcaggcg ccttagtaac cttgctagat 600
cctgacttaa gagcacgcac tcgcgtagtt gttccgcctt cttctacgca aacaagtgga 660
agaacgattg attatgctat cactggaaat tccaacactg cagctttata caacccacca 720
ccgatagttg cgattttagc tttagaagga ttaagaacct ttttggcttc agatcatttt 780
cctgtaaatt ttagaagacc ttag 804
[0167]
C. jejuni
Соответственно, в различных вариантах реализации изобретения антитело специфически связывается с SEQ ID NO:5 (CdtB из ). В различных вариантах реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной SEQ ID NO: 5.
[0168]
C. coli
В другом варианте реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с SEQ ID NO:1 (CdtB из ). В различных вариантах реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной SEQ ID NO: 1.
[0169]
В другом варианте реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с содержащим 17 остатков пептидом CdtB (например, 17 остатков SEQ. ID NO: 1 или 5). В одном варианте реализации изобретения содержащий 17 остатков пептид имеет следующую последовательность: LDYAITGNSNRQQTYTP (SEQ ID NO:3).
[0170]
В других вариантах реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с содержащим 17 остатков пептидом, который имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии с 17 смежными остатками CdtB (например, 17 смежными остатками SEQ. ID NO: 1 или 5). В одном варианте реализации изобретения 17 остатков CdtB имеют следующую последовательность: LDYAITGNSNRQQTYTP (SEQ ID NO:3).
[0171]
В других вариантах реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с содержащим 17 остатков полипептидом, который имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии с 17 смежными остатками CdtB (например, 17 остатками SEQ. ID NO: 1 или 5). В одном варианте реализации изобретения 17 смежных остатков CdtB имеют следующую последовательность: LDYAITGNSNRQQTYTP (SEQ ID NO:3).
[0172]
В другом варианте реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с содержащим 18 остатков пептидом, имеющим следующую последовательность: CLDYAITGNSNRQQTYTP (SEQ ID NO:4). Цистеин в N-конце был добавлен в SEQ ID NO:3 в целях конъюгации.
[0173]
В других вариантах реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с содержащим 18 остатков полипептидом, который имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии с CLDYAITGNSNRQQTYTP (SEQ ID NO:4).
[0174]
В другом варианте реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с пептидом из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 остатков, который имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии с 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 смежными остатками CdtB (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 смежными остатками SEQ ID NO:1 или 5). В другом варианте реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с полипептидом, содержащим 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 остатков, который имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии с 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 смежными остатками CdtB (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 смежными остатками SEQ ID NO:1 или 5). Смежные остатки SEQ ID NO:1 включают остатки, начиная с любой аминокислоты и заканчивая любой аминокислотой SEQ ID NO:1. Смежные остатки SEQ ID NO:5 включают остатки, начиная с любой аминокислоты и заканчивая любой аминокислотой SEQ ID NO:5.
[0175]
В другом варианте реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с пептидом из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 остатков, который имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии с 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 смежными остатками LDYAITGNSNRQQTYTP (SEQ ID NO:3) (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 смежными остатками SEQ ID NO:3). В другом варианте реализации изобретения очищенное антитело специфически связывается с полипептидом, содержащим 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 остатков, который имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии с 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 смежными остатками SEQ ID NO:3 (например, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 смежными остатками SEQ ID NO:3). Смежные остатки SEQ ID NO:3 включают остатки, начиная с любой аминокислоты и заканчивая любой аминокислотой SEQ ID NO:3.
[0176]
В другом варианте реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с пептидом из 17 остатков, кодируемым генной последовательностью CdtB. В конкретных вариантах реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с пептидом из 17 остатков, кодируемым SEQ ID NO: 2. В различных вариантах реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с пептидом из 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 остатков, кодируемым SEQ ID NO: 2. В различных вариантах реализации изобретения очищенное антитело специфически связывается с пептидом из 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 остатков, который имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии с 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 смежными остатками, кодируемыми SEQ ID NO: 2. В различных вариантах реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с полипептидом, содержащим 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 остатков, который имеет по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% гомологии с 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 или 22 смежными остатками, кодируемыми SEQ ID NO: 2.
[0177]
В другом варианте реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с пептидом, кодируемым нуклеотидной последовательностью, имеющей следующую последовательность: CTTGATTATGCAATTACAGGAAATTCAAATAGACAACAAACCTATACTCCA (SEQ ID NO:6), которая кодирует пептид из 17 аминокислот SEQ ID NO. 3. В другом варианте реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с полипептидом, содержащим пептид, кодируемый SEQ ID NO:6.
[0178]
E. coli
См.,
В другом варианте реализации изобретения антитело к CdtB представляет собой антитело, которое специфически связывается с CdtB, выделенным из  со сверхэкспрессией практически полноразмерной ОРС CdtB. ( Infection and Immunity, December 2000, p. 6535-6541, Vol. 68, No. 12, которая включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме, как если бы она была полностью приведена).
[0179]
В различных вариантах реализации изобретения при определении наличия или уровня антител к винкулину описанный в данном документе белок винкулина или его фрагмент используют в качестве антигена в концентрации около 1,2 мкг/мл. В других вариантах реализации изобретения концентрация может составлять около 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2,0 мкг/мл. В различных вариантах реализации изобретения при определении наличия или уровня антител к винкулину используют разведение биологического образца (например, плазмы) около 1:32. В других вариантах реализации изобретения при определении наличия или уровня антител к винкулину используют разведение биологического образца (например, плазмы) около 1:8, 1:10, 1:12; 1:16, 1:20, 1:24, 1:30, 1:36, 1:48 или 1:64. В других вариантах реализации изобретения при определении наличия или уровня антител к винкулину используют разведение биологического образца (например, плазмы) от около 1:8 до 1:64.
[0180]
В различных вариантах реализации изобретения при определении наличия или уровня антител к CdtB описанный в данном документе белок CdtB или его фрагмент используют в качестве антигена в концентрации около 1,2 мкг/мл. В других вариантах реализации изобретения концентрация может составлять около 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2,0 мкг/мл. В различных вариантах реализации изобретения при определении наличия или уровня антител к CdtB используют разведение биологического образца (например, плазмы) 1:512. В других вариантах реализации изобретения при определении наличия или уровня антител к CdtB используют разведение биологического образца (например, плазмы) около 1:128, 1:256, 1:768 или 1:1024. В других вариантах реализации изобретения при определении наличия или уровня антител к CdtB используют разведение биологического образца (например, плазмы) около 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400, 1:500, 1:550; 1:600, 1:650, 1:700, 1:750, 1:800, 1:850, 1:900, 1:950 или 1:1000. В других вариантах реализации изобретения при определении наличия или уровня антител к CdtB используют разведение биологического образца (например, плазмы) около 1:100-1:1000.
[0181]
Антигены иммобилизуют в течение около 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 часов (например, в течение ночи, >16 часов) при около 4°C на планшетах с высокой степенью связывания (например, 96-луночных планшетах) в боратно-солевом буфере (БСБ) при рН 8,2. Лунки покрывают антигеном или оставляют непокрытыми в БСБ, чтобы сделать возможным определение неспецифического связывания плазмы. Лунки блокируют около 3% бычьим сывороточным альбумином в 1xФСБ в течение около 1 часа приблизительно при комнатной температуре. Затем покрытые и непокрытые лунки инкубируют с 1:512 разведенной плазмой в случае CdtB и 1:32 разведенной плазмой в случае винкулина в течение около 1 часа при комнатной температуре. Антитела к CdtB и винкулину используют в качестве положительного контроля. За этим следует инкубация с конъюгированными с ПХ вторичными антителами в течение около 1 часа. За каждым этапом следует серия промывок с применением 0,05% ФСБ-Твин 20. В конце применяют раствор субстрата 3,3ʹ,5,5ʹ-тетраметилбензидина (ТМБ) для визуализации и незамедлительно проводят считывание на планшет-ридере (например, BioTek Synergy HT; Winooski, VT). Значения оптической плотности (ОП) считывают в течение около 90 минут на 370 нм и используют для сравнения уровней антител к CdtB или антител к винкулину. Для анализа данных используют исходные значения ОП.
Типы СРК
[0182]
В различных вариантах реализации изобретения СРК, определяемый с помощью способов, методов анализа или систем, представляет собой СРК с преобладающим запором (З-СРК), СРК с преобладающей диареей (Д-СРК), альтернирующий СРК (А-СРК) (недавно переименованный на смешанный (С-СРК)) или постинфекционный синдром раздраженного кишечника (ПИ-СРК). В различных вариантах реализации изобретения СРК представляет собой Д-СРК.
[0183]
В определенных вариантах реализации изобретения субъект, которому необходимо поставить диагноз СРК в соответствии со способами, методами анализа и системами настоящего изобретения, может иметь один или более симптомов, указывающих на СРК. Примеры симптомов СРК включают, но не ограничиваются ими, диарею, запор, боль в животе и вздутие.
Биологические образцы
[0184]
Примеры биологических образцов включают, но не ограничиваются ими, жидкости организма, цельную кровь, плазму, стул, кишечные жидкости или аспират и желудочные жидкости или аспират, сыворотку, цереброспинальную жидкость (ЦСЖ), мочу, пот, слюну, слезы, легочные выделения, аспират грудной железы, секрет простаты, семенную жидкость, цервикальный соскоб, околоплодную жидкость, внутриглазную жидкость, слизь и мокроту. В конкретных вариантах реализации способа биологический образец может представлять собой цельную кровь, плазму крови, сыворотку крови, стул, кишечную жидкость или аспират или желудочную жидкость или аспират. В различных вариантах реализации изобретения биологический образец может представлять собой цельную кровь. В различных вариантах реализации изобретения биологический образец может представлять собой сыворотку. В различных вариантах реализации изобретения биологический образец может представлять собой цельную плазму.
ПРИМЕРЫ
[0185]
Следующие примеры приведены для того, чтобы лучше проиллюстрировать заявляемое изобретение, и их не следует воспринимать, как ограничивающие объем изобретения. В той степени, в которой указаны конкретные материалы, это сделано в целях иллюстрации и не ограничивает объем изобретения. Специалист в данной области техники может разработать эквивалентные средства или реагенты, не выходя за рамки патентоспособности изобретения и не отступая от объема изобретения.
Пример 1 - Материалы и методы
Группы субъектов
[0186]
Для валидации этого сывороточного маркера были набраны субъекты для проведения 180-центрового рандомизированного контролируемого терапевтического исследования СРК с преобладанием диареи (Д-СРК) (ЦЕЛЬ 3). Субъекты с Д-СРК были отобраны на основании соответствия Римским критериям III. 6 здоровых контрольных субъектов были набраны из медицинского цента Cedars-Sinai и медицинского цента Beth Israel Deaconess. Всех здоровых контрольных субъектов проверяли в отношении анамнеза желудочно-кишечных заболеваний и в отношении активных желудочно-кишечных симптомов на основании анамнеза и заполнения опросника по кишечным симптомам. Субъектов с воспалительным заболеванием кишечника (ВЗК) и глютеновой болезнью набирали на основании наличия жалоб на состояние кишечника и гистологического подтверждения хронических воспалительных изменений в толстом и тонком кишечнике, согласующихся с болезнью Крона, язвенным колитом (ЯК) или глютеновой болезнью.
[0187]
Субъектов исключали из исследований, если у них в анамнезе присутствовал диабет, ВИЧ, неустойчивой заболевание щитовидной железы и хроническая наркозависимость. Для субъектов с СРК и здоровых контрольных субъектов критерием исключения также была хирургическая операция на кишечнике (за исключением удаления желчного пузыря или удаления аппендикса).
Данные пациентов
[0188]
Для всех субъектов были получены демографические данные пациентов, включая возраст и пол. В случае ВЗК - тип заболевания (ЯК или болезнь Крона).
Сбор плазмы
[0189]
Сбор плазмы проводили для всех субъектов. Ее набирали путем венепункции в пробирку с сиреневой крышкой, центрифугировали при 3500 об/мин в течение 15 мин, а затем хранили замороженными при -80°C до начала исследования. В этом исследовании в случае субъектов с Д-СРК из ЦЕЛИ 3 плазму собирали перед лечением.
Исследование методом ELISA
[0190]
Campylobacter
ELISA проводили, используя полноразмерный рекомбинантный белок CdtB (Creative Biomart, Shirley, NY) или полноразмерный белок винкулина (Novoprotein, Short Hills, NJ) в качестве антигенов при концентрации 1,2 мкг/мл. Антигены иммобилизовали в течение ночи при 4°C на 96-луночных планшетах с высокой степенью связывания (Grenier Bio-One, Monroe, NC) в боратно-солевом буфере (БСБ) (Medicago, Uppsala, Sweden) при pH 8,2. Лунки покрывали антигеном или оставляли непокрытыми в БСБ, чтобы сделать возможным определение неспецифического связывания плазмы. Лунки блокировали около 3% бычьим сывороточным альбумином в 1xФСБ в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем покрытые и непокрытые лунки инкубировали с 1:512 разведенной плазмой в случае CdtB и 1:32 разведенной плазмой в случае винкулина в течение 1 часа при комнатной температуре. Антитела к CdtB и винкулину использовали в качестве положительного контроля. За этим следовала инкубация с конъюгированными с ПХ вторичными антителами (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) в течение 1 часа. За каждым этапом следовала серия промывок с применением 0,05% ФСБ-Твин 20. В конце применяли раствор субстрата 3,3ʹ,5,5ʹ-тетраметилбензидина (ТМБ) (Pierce, Rockford, IL) для визуализации и незамедлительно проводили считывание на планшет-ридере BioTek Synergy HT (Winooski, VT). Значения оптической плотности (ОП) считывали в течение около 90 минут на 370 нм и использовали для сравнения уровней антител к CdtB или антител к винкулину. Для анализа данных использовали исходные значения ОП.
Статистический анализ (данные без учета пациентов с глютеновой болезнью)
[0191]
Данные выражали как среднее ± стандартная погрешность (СП) и использовали доверительный интервал (ДИ) точно 95%. Множественное сравнение проводили, применяя однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) после подтверждения эквивалентности дисперсии по критерию Бартлетта. Нормальность распределения данных оценивали с помощью гистограмм с перекрытием ядерной плотности и кривых нормального распределения. Распределение для антител к винкулину и антител к CdtB нормировали после преобразования величин в квадратные корни и квадраты соответственно. t-критерий Стьюдента использовали для сравнения нормально распределенных переменных между двумя группами. Критерий согласия хи-квадрат Пирсона использовали для сравнения категориальных данных. Строили кривые зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (ROC), используя непараметрическую методику. Доверительные интервалы для площади под кривой (ППК) рассчитывали, используя метод DeLong. Соотношения чувствительности, специфичности и правдоподобия каждого независимого значения для антител к винкулину и антител к CdtB с точностью до 0,01 ОП рассчитывали и оценивали для получения оптимальных отсечений. Значимым считали P-значение <0,05. Анализ проводили с помощью STATA, версия 11.2 (STATA Corp., Texas, USA).
Статистический анализ (данные с учетом пациентов с глютеновой болезнью)
[0192]
Числовые переменные обобщали как среднее ± стандартное отклонение. Нормальность распределения данных оценивали с помощью гистограмм с перекрытием ядерной плотности и кривых нормального распределения. Распределение для антител к винкулину нормировали путем преобразования в квадратный корень. Гомогенность дисперсии оценивали по критерию Бартлетта.
[0193]
t-критерий Стьюдента использовали для сравнения нормально распределенных переменных между двумя группами. Нормально распределенные переменные сравнивали для более чем двух групп с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA и апостериорного критерия Даннетта с СРК в качестве эталонной группы. Категориальные переменные обобщали по частоте и процентному содержанию. Критерий согласия хи-квадрат Пирсона использовали для сравнения категориальных данных. Кривые зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (ROC) строили стандартным образом. Доверительные интервалы для площади под кривой (ППК) рассчитывали, используя метод DeLong et al 21. Соотношения чувствительности, специфичности и правдоподобия для антител к винкулину и антител к CdtB с точностью до 0,01 ОП рассчитывали и оценивали для получения благоприятных отсечений. Везде использовали уровень значимости 0,05. Статистический анализ проводили с помощью STATA, версия 11.2 (STATA Corp., Texas, USA) и SAS, версия 9.3 (SAS Institute, Cary, North Carolina, USA).
Пример 1 - Результаты
Демография пациентов (без анализа для пациентов с глютеновой болезнью)
[0194]
Всего было набрано 2767 субъектов (Таблица 1A). Они включали 2564 субъекта с Д-СРК, 43 здоровых субъекта, 10 субъектов с глютеновой болезнью и 150 субъектов с ВЗК (n=78 болезнь Крона, 72 язвенный колит (ЯК)). Среди здоровых волонтеров, групп с СРК и глютеновой болезнью было значительно больше женщин по сравнению с группой с ВЗК (P=0,01). Субъекты с СРК были в среднем на 6,7 лет старше, чем субъекты без СРК (P<0,01). Среди других групп возраст значительно не отличался.
Таблица 1A: Демография пациентов.
<b>Число субъектов</b>
<b>Возраст</b>
<b>% женщин</b>
Здоровые контрольные субъекты
43
36,0±9,9
67,4
СРК
2564
46,4±13,6
68,2
БК
78
41,8±13,1
56,4
ЯК
72
40,2±12,9
55,5
ВЗК (ЯК+БК)
150
41,0±13,0
56,0
Глютеновая болезнь
10
35,6±10,3
70
Величины поданы в виде среднего ± СО; ОП - оптическая плотность; БК - болезнь Крона, ЯК - язвенный колит
Демография пациентов (с анализом для пациентов с глютеновой болезнью)
[0195]
Всего было набрано 2681 субъектов (Таблица 1B). Они включали 2375 субъектов с Д-СРК, 43 здоровых субъекта, 121 субъектов с глютеновой болезнью и 142 субъекта с ВЗК (n=73 болезнь Крона, n=69 язвенный колит). Субъекты с СРК были в среднем на 3,9 лет старше, чем группы без СРК (p<0,001). Не было разницы в распределении по полу среди субъектов с СРК и без СРК; при этом процент женщин в группах здоровых контрольных субъектов, субъектов с СРК и глютеновой болезнью был выше по сравнению с группой с ВЗК (P<0,001).
Таблица 1B: Демография пациентов.
<b>Число субъектов</b>
<b>Возраст (диапазон)</b>
<b>% женщин</b>
Здоровые контрольные субъекты
43
36,0±9,9(22-62)
67,4
Д-СРК
2375
44,4±12,2(18-65)
67,6
БК
73
40,6±11,3(18-65)
56,2
ЯК
69
41,2±12,2(19-63)
55,1
ВЗК (ЯК+БК)
142
40,9±11,7(18-65)
55,6
Глютеновая болезнь
121
41,6±12,3(19-65)
76
Величины поданы в виде среднего ± СО; БК - болезнь Крона, ЯК - язвенный колит.
Сравнение данных ELISA между группами (без учета пациентов с глютеновой болезнью)
[0196]
Уровни антител к CdtB у субъектов с СРК были значительно выше, чем у всех субъектов без СРК (2,54±0,01 (95% ДИ 2,52-2,57) по сравнению с 1,68±0,05 (95% ДИ 1,58-1,79)) (P<0,001) (Фиг. 1A). Среди субъектов без СРК не было значительной разницы в уровнях антител к CdtB (F-критерий P=0,25).
[0197]
Уровни антител к винкулину у субъектов с СРК были значительно выше по сравнению со всеми субъектами без СРК (1,3334±0,02 (95% ДИ 1,30-1,37) по сравнению с 1,01±0,06 (95% ДИ 0,89-1,12)) (P<0,001) (Фиг. 2A). Разница в уровнях антител к винкулину среди субъектов без СРК не была статистически значимой (F-критерий P=0,08).
Сравнение данных ELISA между группами (с учетом пациентов с глютеновой болезнью)
[0198]
С учетом данных по оптической плотности уровни антител к CdtB у субъектов с Д-СРК (2,53±0,69) были значительно выше, чем у здоровых субъектов (1,81±0,73), субъектов с болезнью Крона (1,72±0,81), язвенным колитом (1,54±0,68) и глютеновой болезнью (2,23±0,70) (P<0,001) (Фиг. 1B). Между здоровыми субъектами и субъектами с ВЗК не было разницы в уровнях антител к CdtB (p=0,23); при этом субъекты с глютеновой болезнью имели более высокие уровни антител к CdtB, чем все другие группы без СРК (p<0,001).
[0199]
Уровни антител к винкулину также были выше у субъектов с Д-СРК (1,34±0,85) по сравнению со здоровыми субъектами (0,81±0,59), субъектами с болезнью Крона (1,05±0,91), язвенным колитом (0,96±0,77) и глютеновой болезнью (1,07±0,98) (P<0,0001) (Фиг. 1B). Разница в уровнях антител к винкулину среди субъектов без СРК не была статистически значимой.
Анализ чувствительности и специфичности (без учета пациентов с глютеновой болезнью)
[0200]
Характеристики зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (ROC) использовали, чтобы оценить практическую ценность уровней антител к винкулину и антител к CdtB для отличия субъектов с СРК от субъектов без СРК, субъектов с ВЗК и здоровых индивидов. На Фиг. 3A и 4 продемонстрированы кривые ROC для этих двух тестов, полученные при сравнении субъектов с СРК со всеми субъектами без СРК и субъектами с ВЗК соответственно. Тест для антител к CdtB дал лучшие результаты, чем тест для антител к винкулину, и одинаково отличал субъектов с СРК от всех субъектов без СРК и от группы только с ВЗК. При анализе подгрупп не оказалось никакой разницы в зависимости от типа ВЗК (данные не приведены). Кривая ROC для антител к CdtB и для антител к винкулину показывает, что субъектов с Д-СРК можно отличить от здоровых субъектов на основании этого теста.
[0201]
Уровни оптической плотности (ОП) для каждого теста использовали затем, чтобы определить идеальное пороговое значение для выявления Д-СРК. В Таблицах 2A и 3A приведены некоторые эффективные пороговые значения оптической плотности для выявления СРК на основании соотношения чувствительности, специфичности и правдоподобности. В случае Д-СРК более желательной является более высокая специфичность, даже в сочетании с более низкой чувствительностью. В случае Д-СРК идеальный тест однозначно бы диагностировал СРК, снижая, таким образом, необходимость в инвазивном исследовании. Поэтому соотношение специфичности и правдоподобности признали более важным. На основании данных кривых ROC идеальный уровень антител к CdtB соответствует уровню ≥2,48, а для антител к винкулину идеальный уровень составил ≥1,62 для оптимизации специфичности с относительно ограниченный действием на чувствительность.
Таблица 2A: Благоприятные отсечения для антител к CdtB для диагностики СРК, а не других причин
<b>ОП</b>
<b>Специфичность %</b>
<b>Чувствительность %</b>
<b>+LR</b>
<b>-LR</b>
≥2,48
84,7
60,7
4,0
0,5
≥2,79
91,1
44,4
5,0
0,6
ОП - оптическая плотность, +LR - положительное соотношение правдоподобности, -LR - отрицательное соотношение правдоподобности
Таблица 3A: Благоприятные отсечения для антител к винкулину для диагностики СРК, а не других причин
<b>ОП</b>
<b>Специфичность %</b>
<b>Чувствительность %</b>
<b>+LR</b>
<b>-LR</b>
≥1,62
82,3
35,0
2,0
0,78
≥1,86
86,7
26,5
2,0
0,8
≥2,23
92,1
15,7
2,0
0,9
ОП - оптическая плотность, +LR - положительное соотношение правдоподобности, -LR - отрицательное соотношение правдоподобности
Анализ чувствительности и специфичности (с учетом пациентов с глютеновой болезнью)
[0202]
Характеристики зависимости чувствительности от частоты ложноположительных заключений (ROC) использовали, чтобы оценить практическую ценность уровней антител к винкулину и антител к CdtB для отличия субъектов с Д-СРК от субъектов с ВЗК. На Фиг. 3B продемонстрированы кривые ROC для этих двух тестов, полученные при сравнении субъектов с Д-СРК с субъектами с ВЗК. Хотя оба теста были эффективны в отношении отличия субъектов с Д-СРК от группы с ВЗК, площадь под кривой (ППК) в случае диагноза Д-СРК против ВЗК была большей для антител к CdtB, чем для антител к CdtB (0,81 и 0,62 соответственно). При анализе подгрупп не оказалось никакой разницы в зависимости от типа ВЗК (данные не приведены). Кривые ROC для субъектов с Д-СРК по сравнению с субъектами без СРК, субъектами с глютеновой болезнью и здоровыми контрольными субъектами также были отличительными.
[0203]
Уровни оптической плотности (ОП) для каждого теста использовали затем, чтобы определить идеальное пороговое значение для выявления Д-СРК по сравнению с ВЗК. В Таблицах 2B и 3B приведены некоторые эффективные пороговые значения оптической плотности для выявления Д-СРК на основании соотношения чувствительности, специфичности и правдоподобности. Идеальный тест однозначно бы диагностировал СРК, снижая, таким образом, необходимость в инвазивном исследовании. Следовательно, мы сфокусировались на соотношении специфичности и положительной правдоподобности. На основании этого идеальное пороговое значение для антител к CdtB для выявления Д-СРК составляет ≥2,80, в то время как для антител к винкулину оптимальное пороговое значение составляет ≥1,68.
Таблица 2В: Благоприятные отсечения для антител к CdtB для диагностики Д-СРК, а не ВЗК
<b>ОП</b>
<b>Специфичность %</b>
<b>Чувствительность %</b>
<b>+LR</b>
<b>-LR</b>
≥2,49
85,9
60,0
4,3
0,5
≥2,80
91,6
43,7
5,2
0,6
≥3,04
95,8
28,3
6,7
0,7
OП - оптическая плотность, +LR - положительное соотношение правдоподобности, -LR - отрицательное соотношение правдоподобности.
Таблица 3В: Благоприятные отсечения для антител к винкулину для диагностики Д-СРК, а не ВЗК
<b>ОП</b>
<b>Специфичность %</b>
<b>Чувствительность %</b>
<b>+LR</b>
<b>-LR</b>
≥1,53
80,3
37,8
1,9
0,8
≥1,68
83,8
32,6
2,0
0,8
≥1,80
84,5
28,9
1,8
0,8
OП - оптическая плотность, +LR - положительное соотношение правдоподобности, -LR - отрицательное соотношение правдоподобности
Влияние пола на биомаркер (без учета пациентов с глютеновой болезнью)
[0204]
Уровни антител к CdtB и антител к винкулину также сравнивали только для женщин и только для мужчин. Несмотря на различия в поле между субъектами с Д-СРК и контрольными группами, оба биомаркера можно успешно использовать для выявления Д-СРК как у мужчин, так и у женщин.
[0205]
Используемые в данном документе заголовки имеют исключительно организационные цели и никоим образом не ограничивают изобретение. Содержание каждого отдельного раздела одинаково применимо ко всем разделам.
[0206]
Различные варианты реализации изобретения описаны выше в Подробном описании изобретения. Хотя эти описания непосредственно описывают вышеуказанные варианты реализации изобретения, для специалистов в данной области техники понятно существование модификаций и/или вариаций конкретных вариантов реализации изобретения, показанных и описанных в данном документе. Любые такие модификации или вариации, которые попадают в сферу действия этого описания, также включены в данный документ. Если четко не указано иное, авторами изобретения подразумевается, что слова и выражения в описании и формуле изобретения имеют традиционные и привычные значения для специалистов в данной области техники.
[0207]
Вышеприведенное описание различных вариантов реализации изобретения, известное заявителю на момент подачи заявки, было представлено и предназначено для иллюстрации и описания. Настоящее описание не является исчерпывающим и не ограничивает изобретение точной раскрытой формой, при этом в свете вышеприведенных материалов возможно существование многих модификаций и вариаций. Описанные варианты реализации изобретения служат для объяснения принципов изобретения и его практического применения и для того, чтобы другие специалисты в данной области техники могли применять изобретение в различных вариантах реализации и с различными модификациями, подходящими для конкретного предполагаемого применения. Следовательно, подразумевается, что изобретение не ограничено конкретными раскрытыми вариантами реализации в отношении осуществления изобретения.
[0208]
например
Хотя были продемонстрированы и описаны конкретные варианты реализации настоящего изобретения, для специалистов в данной области техники очевидно, что на основании приведенных в данном документе материалов возможно внесение изменений и модификаций без отступления от данного изобретения и его аспектов в широком смысле и, следовательно, в объем прилагаемой формулы изобретения включены все такие изменения и модификации, соответствующие сущности и объему данного изобретения. Специалистам в данной области понятно, что применяемые в данном документе термины в общем случае являются «открытыми» терминами (, термин «включая» следует интерпретировать как «включая, но не ограничиваясь ими», термин «имеющий» следует интерпретировать как «имеющий по меньшей мере», термин «включает» следует интерпретировать как «включает, но не ограничивается ими» и т.д.).