Способ прогнозирования риска развития гиперпластических процессов эндометрия на основе генетических данных
METHOD FOR PREDICTING RISK OF ENDOMETRIAL HYPERPLASTIC PROCESSES BASED ON GENETIC DATA

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития гиперпластических процессов эндометрия.
Гиперпластические процессы эндометрия – это хроническое прогрессирующее заболевание, широко распространенное среди женщин любого возраста и характеризующееся чрезмерным разрастанием слизистой оболочки матки. Распространенность данной патологии в общей популяции достигает 30%, причем процент трансформации в рак эндометрия составляет от 5 до 10%.
К факторам риска при развитии гиперплазии эндометрия с возможностью к малигнизации у женщин с аномальными маточными кровотечениями в возрасте до 40 лет и индексом массы тела более 30 относятся такие факторы, как отсутствие родов в анамнезе, бесплодие, ановуляция, синдром поликистозных яичников, раннее менархе, позднее наступление менопаузы, диабет, гипертензия, эстроген-заместительная терапия [Zhang H., Yan L., Bai Y., Li C. et al. Dual-specifity phosphatase 6 predicts the sensitivity of progestin therapy for atypical endometrial hyperplasia // Gynecol. Oncol. 2015. Vol. 136. P. 549-553].
У пациенток репродуктивного возраста патогенетическую основу гиперпластических процессов эндометрия составляет гиперэстрогенемия и ановуляция, поэтому одним из симптомов является бесплодие. У 10% менструирующих больных и у 40% в постменопаузе может наблюдаться бессимптомное течение гиперпластических процессов эндометрия.
Вероятность малигнизации гиперпластических процессов эндометрия является предметом дискуссий на протяжении более половины столетия и до сих пор до конца не установлена. Невозможность получить четкие статистические данные обусловлена тем, что гиперпластические процессы эндометрия в основном определяется у женщин, которые имеют жалобы и обращаются к гинекологу, в то время как большое число женщин, не проходящих лечение, остаются необследованными. Кроме того, сложность представляет и дифференциальная диагностика между атипической гиперплазией и высокодифференцированным раком эндометрия. В среднем риск малигнизации при атипических гиперпластических процессах эндометрия потенциальный составляет 29% [El Behery M.M., Saleh H.S., Ibrahiem M.A., Kamal E.M. et al. Levonorgesterl-relasing intrauterine device versus dydrogesterone for management of endometrial hyperplasia without atypia // Reprod. Sci. 2014. Vol. 22, №3. P. 329-334].
С практической точки зрения представляется крайне необходимым выделение критериев индивидуального прогнозирования у женщин риска развития гиперпластических процессов эндометрия на основании исследования генов-кандидатов с целью выявления женщин, предрасположенных к гиперпластическим процессам эндометрия.
В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе не было обнаружено способа прогнозирования риска развития гиперпластических процессов эндометрия на основе данных о сочетании генетических полиморфизмов  rs1398217, rs1073768 и rs4986938.
Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2016 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития гиперпластических процессов эндометрия на основе молекулярно-генетических данных в зависимости от полиморфных маркеров генов rs7538038, rs1782507 и rs7589318.
В патенте РФ № 2267993 (дата публикации 20.01.2006), где предложен «Способ ультразвуковой диагностики гиперпластических процессов эндометрия», заключающийся в регистрации срединного маточного эха - М-эхо, объема эндометрия (ОЭ), дополнительно определяют объем тела матки (ОМ) и вычисляют показатель отношения объема эндометрия к объему тела матки (ОЭ/ОМ). У женщин репродуктивного возраста в ранней стадии пролиферации показатель ОЭ/ОМ в пределах значений от 5 до 10% считают нормой, при показателях от 10 до 19% женщины составляют группу риска и им рекомендуют уз-контроль в течение 1 года, от 19 до 40% - гиперплазия эндометрия - данной группе пациенток показано диагностическое выскабливание полости матки с гистологическим исследованием, свыше 40% - женщин направляют для лечения в онкоцентр. В постменопаузальном периоде до 5 лет показатель ОЭ/ОМ в пределах значений от 3 до 7% считают нормой, при показателях от 7 до 13% - женщины составляют группу риска, и им рекомендуют уз-контроль в течение полугодия, при показателях от 13 до 35% - гиперплазия эндометрия - данной группе пациенток показано диагностическое выскабливание полости матки с гистологическим исследованием, свыше 35% - рекомендуют лечение в онкоцентре.
Недостаток метода заключается в том, что не рассматриваются генетические полиморфизмы и их сочетания с риском развития гиперпластических процессов эндометрия.
За прототип выбран патент РФ № 2557977 (дата публикации 27.07.2015) «Способ прогнозирования риска формирования гиперпластических процессов эндометрия», который заключается в выделении ДНК из периферической венозной крови у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья России, типировании и анализе сочетаний генетических полиморфизмов фактора некроза опухоли α (-308 G/А TNFα), рецептора фактора некроза опухоли 1 (+36 A/G TNFR1), интерферона индуцебельного хемоаттрактанта Т-клеток (А/G I-TAC), интерлейкина 1А (-889 С/Т IL-1A), лимфотаксина α (+250 А/G Ltα). Повышенный риск развития гиперпластических процессов эндометрия прогнозируют при выявлении сочетания аллелей -308 G TNFα, +36 A TNFR1, A I-TAC, -889 T IL-1A, и/или сочетания аллелей+36 A TNFR1, A I-TAC, -889 T IL-1A, и/или сочетания аллелей -308 G TNFα,+250 G Ltα, -889 T IL-1A.
Недостаток метода заключается в ограниченности применения,  т.к. необходимо исследовать значительное количество генетических полиморфизмов фактора некроза опухоли α (-308 G/А TNFα), рецептора фактора некроза опухоли 1 (+36 A/G TNFR1), интерферона индуцебельного хемоаттрактанта Т-клеток (А/G I-TAC), интерлейкина 1А (-889 С/Т IL-1A), лимфотаксина α (+250 А/G Ltα).
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов диагностики, а именно создание способа прогнозирования развития гиперпластических процессов эндометрия на основе данных о сочетании однонуклеотидных полиморфизмов – rs1398217, rs1073768 и rs4986938.
Технический результат использования изобретения – получение критериев оценки риска развития гиперпластических процессов эндометрия у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья на основе данных о сочетаниях генетических вариантов локусов rs1398217, rs1073768 и rs4986938.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования риска развития гиперпластических процессов эндометрия на основе генетических данных, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов генов rs1398217, rs1073768 и rs4986938;
- прогнозирование повышенного риска развития гиперпластических процессов эндометрия у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья в случае выявления сочетания аллеля G rs1398217 с аллелем A rs1073768 с генотипом АА rs4986938.
Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогноза риска развития гиперпластических процессов эндометрия по данным о сочетании генетических вариантов локусов rs1398217, rs1073768 и rs4986938.
Способ осуществляют следующим образом.
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови индивидуумов в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4ºС, 4000 об/мин в течение 20 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37ºС в течение 16 ч.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -200°С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ всех локусов (rs1398217, rs1073768 и rs4986938) осуществляют методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводилась на аппарате IQ5 (Bio-Rad) в режиме real time с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс-М» и стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол» с последующим анализом полиморфизмов методом дискриминации аллелей. Для дискриминации аллелей использовалась программа Bio-Rad «IQ5-Standart Edition».
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития гиперпластических процессов эндометрия подтверждает анализ результатов наблюдений 520 женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья РФ больных гиперпластическими процессами эндометрия и 981 человек контрольной группы. Обследование пациенток проводилось врачами гинекологического отделения и отделения вспомогательных репродуктивных технологий перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа. В контрольную группу включались женщины, не имеющие пролиферативных заболеваний органов малого таза и доброкачественных заболеваний молочных желез. Формирование контрольной выборки осуществлялось при профилактических осмотрах (диспансеризации). Обследование  женщин проводилось врачами консультативно-диагностического отделения перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.
Критерии включения в исследуемые выборки.
1. Женщины русской национальности, родившиеся в Центральном Черноземье России и не имеющие между собой родства.
2. Добровольное согласие пациенток на проведение исследования.
3. В группу больных включались индивидуумы только после установления диагноза гиперпластических процессов эндометрия, подтвержденного с помощью клинических, клинико-инструментальных и клинико-лабораторных методов исследования.
Критерии исключения из исследуемых выборок.
1. Пациентки со злокачественными заболеваниями  органов малого таза и молочных желез.
2. Женщины с нерусской национальностью, родившиеся вне Центрального Черноземья.
3. Индивидуумы, отказавшиеся от участия в исследования.
Типирование молекулярно-генетических маркеров осуществляли в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета.
Изучение роли комбинаций генетических вариантов rs1398217, rs1073768 и rs4986938 в формировании гиперпластических процессов эндометрия проводилось с помощью программного обеспечения АРSampler [http://sources.redhat.com/cygwin/], использующего метод Монте-Карло марковскими цепями и байесовскую непараметрическую статистику [A Gibbs sampler for identiﬁcation of symmetrically structured, spaced DNA motifs with improved estimation of the signal length [Text] / A.V. Favorov, M.S. Gelfand, A.V. Gerasimova [et al.] // Bioinformatics. – 2005. – Vol. 21, № 10. – P. 2240-2245].
Выявлено, что сочетание аллеля G rs1398217 с аллелем A rs1073768 с генотипом АА rs4986938 имеют 8,45% больных гиперпластическими процессами эндометрия, а в контрольной группе оно выявлено у 4,75%. Эта комбинация полиморфных вариантов генов является фактором риска развития гиперпластических процессов эндометрия, о чем свидетельствует величина ОR, равная 1,85 при 95% доверительном интервале 1,20-2,84, р=0,004.
Таким образом, результаты, полученные с помощью биоинформатического анализа, свидетельствуют о вовлеченности комбинации полиморфных вариантов генов rs1398217, rs1073768 и rs4986938 в формирование гиперпластических процессов эндометрия. Фактором риска развития гиперпластических процессов эндометрия у женщин является сочетание аллеля G rs1398217 с аллелем A rs1073768 с генотипом АА rs4986938.
В качестве примеров конкретного выполнения разработанного способа приведено генетическое обследование по локусам rs1398217, rs1073768 и rs4986938 двух женщин-добровольцев русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья, не имеющих среди родственников 1-й степени родства больных гиперпластическими процессами эндометрия.
Пример 1. У женщины А. было выявлено сочетание аллеля G rs1398217 с аллелем A rs1073768 с генотипом АА rs4986938.  На основании этого женщина включена в группу риска по развитию гиперпластических процессов эндометрия. Повторное обследование через 1 год подтвердило обоснованность прогноза. Назначен комплекс лечебных мероприятий, регулярный профилактический осмотр (посещение гинеколога раз в 6 мес).
Пример 2. У женщины В. было выявлено сочетание аллеля G rs1398217 с аллелем A rs1073768 с генотипом АА rs4986938. На основании этого женщина включена в группу риска по развитию гиперпластических процессов эндометрия и ей назначен комплекс профилактических мероприятий по предупреждению развития данного заболевания (лечение хронических гинекологических заболеваний, нормализация веса, физическая активность, контроль показателей артериального давления и уровня глюкозы в крови, нормализация психоэмоционального состояния, регулярный профилактический осмотр (посещение гинеколога раз в 6 мес) и др.). Повторные осмотры подтвердили эффективность проведенного комплекса профилактических мероприятий.
Пример 3.
Применение данного способа позволит формировать среди женщин на доклиническом этапе группы риска по развитию гиперпластических процессов эндометрия и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития гиперпластических процессов эндометрия.