Влияние видимого света на свойства растворов ДНК

БІОФІЗИКА

BIOPHYSICS

МОЛЕКУЛЯРНА БІОФІЗИКА

MOLECULAR BIOPHYSICS

Физика живого, Т. 17, No2, 2009. С.40-43.

© Пивоваренко Ю.В., Шевченко В.Б., Ляхов А.М., Макара В.А.

УДК 539.211: 573.3

ВЛИЯНИЕ ВИДИМОГО СВЕТА НА СВОЙСТВА РАСТВОРОВ ДНК

Пивоваренко Ю.В.1, Шевченко В.Б.2, Ляхов А.М.1*, Макара В.А.2

1 Институт биоорганической химии и нефтехимии НАНУ.

2Киевский национальный университет им. Тараса Шевченко

Поступила в редакцию 25.06.2009

Установлено, что состояние растворенной ДНК определяют освещенность раствора и содержание в нем воздуха. В частности, показано, что в дегазированных растворах не происходит термической денатурации ДНК. Использование пористого кремния - перспективного материала для создания сверхчувствительных биотестеров - позволило установить, что под действием видимого света и в присутствии растворённого воздуха ДНК проявляет окислительные свойства, не свойственные ей в темноте и в дегазированных растворах, т.е. в нативных условиях существования ДНК.

Ключевые слова: пористый кремний, фотолюминесценция, гипо- и гиперхромизм растворов ДНК, видимый свет.

ВВЕДЕНИЕ

Не вызывает сомнений, что компоненты внутренних органов человека и животных находятся преимущественно в темноте. Глубина проникновения света сквозь кожу зависит от длины его волны. Так, глубже всего, на 2 см, сквозь кожу человека проникает свет с длиной волны 600-700 нм (красный), а свет с длиной волны 400-500 нм (синий и зелёный) полностью поглощаются слоем кожи толщиной 1 - 2 мм [1]. Однако, при изучении компонентов внутренних органов in vitro действием на них света обычно пренебрегают.

Пионерскими исследованиями А.Э. Беккереля (1839 г.) было установлено, что от освещённости водных растворов зависит их электрический потенциал. Позже независимыми исследованиями Максвелла, Вагнера и Дебая было доказано [1], что под действием переменных электромагнитных полей удельная электро-проводность воды, водных растворов и интактных тканей человека и животных увеличивается. Поскольку

электрический потенциал и электропроводность водных растворов коррелируют с активностью и подвижностью их ионов [1-4], можно ожидать, что свойства растворов биополимеров, находящихся на свету и в темноте, будут различаться.

Полученные ранее результаты [5-7] и существующая теория [1,2] позволяли

предположить, что нам удастся обнаружить различия в свойствах растворов ДНК, находящихся под действием света и в темноте.

Лучше понять процессы, происходящие в растворах ДНК под действием света, позволило изучение спектров фотолюминесценции (ФЛ) пористого кремния (ПК), контактирующего с ДНК. Использование пористого кремния для создания высокочувствительных биотестеров стало возможным после открытия зависимости его ФЛ от окислительно-восстановительных свойств контактирующих с ПК веществ [8-10].

Целью работы было изучение влияния видимого света на свойства растворённой ДНК.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовалась натриевая соль тимусной ДНК (Шиска, Швейцария). Для приготовления растворов использовалась свежеперегнанная вода. Регистрацию оптической плотности водных растворов ДНК при длине волны 260 нм (А260) осуществляли на спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО, Россия).

Слой пористого кремния (ПК) формировали методом электрохимического травления поверхности монокристаллов кремния (с электропроводностью р-типа и ориентацией 100) в смеси, приготовленной из равных объёмов 48% раствора

ВЛИЯНИЕ ВИДИМОГО СВЕТА НА СОСТОЯНИЕ ДНК И СВОЙСТВА ЕЁ РАСТВОРОВ

ИБ и 96% этанола; травление осуществлялось в течение 5 мин. при плотности тока 10 или 20 мА/см2. Полученные таким способом образцы ПК имеют нанокрис-таллическую структуру и

фотолюминесцируют в видимой области [9].

Для возбуждения ФЛ ПК использовали азотный импульсный лазер ИЛГИ-503 (Россия);

возбуждение и регистрацию спектров ФЛ проводили при комнатной температуре.

Для дегазации растворы ДНК в течение суток выдерживали в вакуумном эксикаторе под давлением ~20 мм рт. ст. Аэрацию растворов ДНК осуществляли барботированием через оттянутый капилляр воздухом, поступавшим под давлением 1,05 атм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние рассеянного солнечного света на оптическую плотность водных растворов ДНК в УФ-диапазоне

Изучая влияние света на растворы ДНК, мы, в частности, обнаружили, что под действием света происходит увеличение оптической плотности А260 растворов ДНК (табл. 1).

Таблица 1.

Зависимость оптической плотности и гиперхромизма раствора натриевой соли ДНК от времени освещения рассеянным дневным светом.

Время экспозиции, мин Оптическая плотность A260, °.е. Гиперхром-ный эффект, %

0 0.088 0

15 0.095 8

65 0.110 25

90 0.115 30

115 0.122 39

170 0.125 42

270 0.132 50

Примечание: измерения проводились в середине апреля в ясную солнечную погоду в дневное время с 12.30 до 17 часов при температуре воздуха 20-22 °С.

А260 находившихся в темноте растворов Ка-ДНК (контрольных) за то же время оставалась неизменной.

Дальнейшее изучение этого явления показало, что скорость увеличения А260 освещаемых растворов Ка-ДНК зависит от содержания в них воздуха. В частности, было установлено, что А260 дегазированных растворов Ка-ДНК к действию света не чувствительна.

Более того, оказалось, что А260 дегазированных растворов ДНК не увеличивается при их нагревании до 95°С (рис. 1), т. е. в условиях теплового плавления ДНК [11-13]. В то же время при нагревании аэрированных растворов их А260 увеличивалась более чем на 100% (рис. 1), что соответствует результатам Фозия Хан и сотр. [14].

Таким образом, мы обнаружили, что свет и повышенная температура увеличивают А260 содержащих воздух растворов ДНК, но не влияют на А260 дегазированных растворов ДНК.

Известно [3,15,16], что активация растворённого кислорода может происходить как при освещении растворов видимым светом, так и при их нагревании. Полученные результаты позволяют предположить, что разрушение водородных связей между комплементарными основаниями ДНК вызывается АФК. Нам представляется, что образующиеся под действием света или при повышении температуры АФК окисляют основания ДНК, т. е. вызывают их дегидрирование [17], а обеднённые водородом основания не могут образовывать водородные связи. Понятно, что образование АФК в дегазированных растворах не возможно. Поэтому окисление оснований и плавление ДНК в таких растворах не происходят.

Влияние света на растворы ДНК с различным содержанием воздуха хорошо коррелирует с изменениями ФЛ ПК модифицированного раствором ДНК.

Зависимость фотолюминесценции пористого кремния от условий его модификации растворами ДНК.

Изучая ФЛ ПК, модифицированного раствором ДНК, мы установили, что интенсивность ФЛ тех образцов ПК, которые до полного высыхания раствора освещались дневным рассеянным светом (рис. 2, спектр 3), намного превосходила

интенсивность ФЛ тех образцов ПК, которые до полного высыхания раствора находились в темноте (рис. 2, спектр 2); в последнем случае ФЛ ПК, модифицированного раствором ДНК, практически не отличалась от ФЛ немодифицированного ПК (рис. 2, спектр 1).

Также было установлено, что ФЛ образцов ПК, модифицированных дегазированным раствором Ка-ДНК и высушенных в вакуумном эксикаторе не отличается от ФЛ немодифицированного ПК.

Пивоваренко Ю.В., Шевченко В.Б., Ляхов А.М., Макара В.А.

Рис. 1. УФ-спектры поглощения водных растворов ДНК: 1 - дегазированный раствор, 20 °С; 2 дегазированный раствор, 95 °С; 3 - насыщенный воздухом раствор, 95 °С. Увеличение температуры дегазированных растворов не приводит к изменению вида спектра, что свидетельствует о повышении термической резистентности ДНК в отсутствие растворенного кислорода. Увеличение

температуры растворов насыщенных воздухом

сопровождается большим гиперхромным эффектом, что свидетельствует о снижении термической резистентности ДНК.

Увеличение ФЛ ПК свидетельствует о том, что под действием света содержащие воздух растворы ДНК проявляют окислительные свойства [8-10]; вероятной причиной появления окислительных свойств у таких растворов является образование в них активных форм кислорода (АФК) [14-16].

ВЫВОДЫ

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что свойства, проявляемые ДНК в освещённых растворах, могут существенно отличаться от свойств, проявляемых ДНК в темноте, т.е. - в условиях, более соответствующих нативным. В частности, наблюдаемое увеличение А260 под действием света позволяет предположить, что в содержащих воздух растворах разрушаются водородные связи между комплементарными основаниями ДНК, т.е. происходят такие же изменения как и при тепловом плавлении ДНК.

Увеличение фотолюминесценции пористого кремния после его модификации раствором №-ДНК доказывает, что под действием света в содержащих воздух растворах ДНК образуются

Рис. 2. Спектры фотолюминесценции пористого

кремния, немодифицированного и модифицированного высохшими в темноте и на свету растворами ДНК: 1 -немодифицированного ПК; 2 - ПК, модифици-рованного раствором №-ДНК, высохшим в темноте; 3 - ПК, модифицировенного тем же раствором ДНК, высохшим на свету. Интенсивность ФЛ образца ПК, который освещался дневным рассеянным светом до полного высыхания нанесённого на его поверхность раствора ДНК (спектр 3), намного превосходит интенсивность ФЛ образца ПК, находившегося в темноте до полного высыхания нанесённого на его поверхность раствора ДНК (спектр 2). Видно, что видимый свет не влияет на люминесцентные свойства ПК, поверхность которого свободна от ДНК (спектр 1).

АФК [8-10], которые и обуславливают окислительные свойства изучаемых растворов.

Поскольку освещённость растворов ДНК и содержание в них воздуха обычно не контролируются, а, следовательно, не учитывается и влияние этих факторов на ДНК, приходится признать, что состояние ДНК в таких растворах существенно отличается от нативного. Из этого следует, что свойства ДНК, растворы которых при проведении исследований находились на свету, нельзя экстраполировать на свойства ДНК внутренних органов.

Литература

1. Пресман А. С. Электромагнитные поля и живая природа. - М.: Наука, 1968, - 268 с.

2. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии. - Л.: Химия, 1974, - 352 с.

3. Некрасов Б.В. Основы общей химии. - Т.1. - М.: Химия, 1974, - 656 с.

4. Гамеева О.С. Физическая и коллоидная химия. - М.: Высшая школа, 1977, - 328 с.

5. Весельський С., Пивоваренко Ю., Ляхов О. Властивості нуклеінових кислот у водних розчинах з різним електричним потенціалом // Вісник Киівського університету. Сер.: біол. науки - 2006, -вип. № 11. - С.14-15.

ВЛИЯНИЕ ВИДИМОГО СВЕТА НА СОСТОЯНИЕ ДНК И СВОЙСТВА ЕЁ РАСТВОРОВ

6. Ляхов А.М., Пивоваренко Ю.В. Потенциалзависимые свойства воды и водных растворов // Спортивна медицина. - 2006. - № 1. - С.149-152.

7. Киркилевская Л.Н., Пивоваренко Ю.В., Ляхов А.М. Влияние геофизических факторов на форму кристаллов, образующихся после высыхания солевых растворов, в аспекте диагностики методом чувствительной кристаллизации // Фітотерапія. -2007. - № 4. - С.42-47.

S. Cullis A.G., Canham L.T. and Calcott P.D.J. The structural and luminescence properties of porous silicon // J. Appl. Phys. - 1997.- № S2. - P. 909-965.

9. Gaburro Z., Pavesi L., Baratto C. et al. A porous silicon microcavity as an optical and electrical multiparametric chemical sensor // Frontiers of Multifunctional Nanosystems. - 2002. - P.399-412.

10. Lopez H.A., Chen X.L., Jenekhe S.A. and Fauchet Ph.M. Tunability of the photoluminescence іп porous silicon due to different polymer dielectric environments // J. Lumin. - 199S. - № S0. - P.115-11S.

ВПЛИВ ВИДИМОГО СВІТЛА НА ВЛАСТИВОСТІ РОЗЧИНІВ ДНК Пивоваренко Ю.В., Шевченко В.Б., Ляхов О.М., Макара В.А.

Знайдено, що стан розчиненої ДНК визначають освітленість розчину та вміст в ньому повітря. Зокрема, показано, что в дегазованих розчинах не відбувається термічна денатурація ДНК. Застосування пористого кремнію -перспективного матеріалу для створення надчутливих біотестерів - дозволило виявити, що під дією видимого світла та за присутності розчиненого повітря ДНК виявляє окислювальні властивості не притаманні їй в темряві та в дегазованих розчинах, тобто за нативних умов існування ДНК більшості клітин внутрішніх органів.

Ключові слова: пористий кремній, фотолюмінесценція, гіпо- та гіперхромізм розчинів ДНК, видиме світло.

INFLUENCE OF VISIBLE LIGHT ON PROPERTIES OF DNA SOLUTIONS Pivovarenko Yu.V. , Shevchenko V. B., Lyakhov A. M., Makara V. A.

It has been established that the DNA state in solution is determined by the action of visible light and dissolved air. In particular, it is shown that the DNA termal denaturation does not occur in degasified solution. The use of porous silicon, which is a promising one to make ultrasensitive biosensor, let determine that under action of visible light and dissolved air DNA shows the oxidative properties, which is not proper for it in the dark and in degasified solution, i.e. in native living conditions of DNA for most of the internal organ cells.

Key words: porous silicon, photoluminescence, hypo- and hypercromic effect of DNA solutions, visible light.

11. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. - М.: Мир, 1987, - 584с.

12. Шабарова З.Ф., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. - М.: Химия, 1978, - 584 с.

13. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. - М.: Мир, 1985. - Т.3. - 536 с.

14. Фозия Хан, Фарина Хан, Сиддику А.А., Али Р. Повышение иммуногенности плазмидной ДНК под действием синглетного кислорода // Биохимия. -2006, - т. 71, № 8. - С. 1074-1082.

15. Владимиров Ю.А. Активные формы кислорода и азота: значение для диагностики, профилактики и терапии // Биохимия. - 2004, - т. 69, № 1. - С.5-7.

16. Владимиров Ю.А. Осипов А.Н., Клебанов Г.И. Фотобиологические основы терапевтического применения лазерного облучения // Биохимия. -2004, - т. 69, № 1. - С. 103-113.

17. Рэккер Э. Биоэнергетические механизмы: новые взгляды. - М.: Мир, 1979. - 216 с.