Эпизоотия энцефаломиелита крс на юге Японии, вызванного вирусом Акабане

(от 12,3 ± 0,9 мН- м с1/2 — у лактирующих свиноматок до 13,8 ± 0,8 мН • м 1 • с"2 — у подсвинков на откорме).

Для уточнения характера влияния отдельных компонентов сыворотки крови свиноматок на ее ДИН провели корреляционный анализ между данными тензиометрии и биохимическими показателями. Установили, что значения биохимических параметров сыворотки крови зависят от возраста животных, периода репродуктивного цикла и состава рациона, однако все изменения не выходили за пределы физиологической нормы [4]. У супоросных свиноматок уровень общего белка был на 7,8% выше, чем у холостых, а у лактирующих — на 9 % выше, чем у супоросных. Уровень альбуминов оказался выше у подсвинков, находящихся на откорме (по сравнению с остальными группами), что связано с более высоким содержанием белка в комбикормах этой группы животных. У лактирующих свиноматок в сыворотке крови отметили наименьшее содержание глюкозы по сравнению с животными других исследуемых групп. Самое низкое содержание кальция выявили у супоросных свиноматок, а самое высокое — у подсвинков, находящихся на откорме. Наиболее важными результатами корреляционного анализа является обнаружение у свиноматок сильной положительной корреляционной связи: а,, А.(| с уровнем мочевины, глюкозы, ионов хлора и кальция; Х0 с уровнем триглицеридов; сильной отрицательной связи: А., с уровнем общего белка; А.0 с уровнем кальция, глюкозы, холестерина и мочевины.

Заключение

Рост, развитие и адаптация организма свиноматок в пост-натальный период сопровождаются закономерными измене-

ниями крови, связанными со степенью ее функциональной активности, которые в свою очередь определяют изменения значений ДПН сыворотки крови.

Результаты проведенных исследований позволяют сделать вывод о перспективности изучения ДПН сыворотки крови свиноматок. По нашему мнению, внедрение в лабораторную практику относительно недорогого, простого и удобного метода определения ДПН сыворотки крови позволит осуществлять экспресс-оцеику физиолого-биохимического состояния организма свиней.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Казаков В Н.. Синяченко О.В., Файнерман В.Б. и др. Динамическое поверхностное натяжение биологических жидкостей здоровых людей. Архив клинич. и экспер, мед, 1996, т. 5, 1, 3—6.

2. Казаков В.Н., Синяченко О.В., Постовая М.В. и др. Межфазная тензио-метрия биологических жидкостей: Вопросы теории, методы и перспективы использования в медицине. Архив клин, экспер. мед.. 1998, т. 7, 1. 5—12.

3. Казаков В.Н., Синяченко О.В., Игнатенко Г.А. и др. Межфазная тензиоре-ометрия биологических жидкостей в терапии. - Донецк: Донеччина, 2003.

4. Кондрахин И.П. Клиническая лабораторная диагностика в ветеринарии/ Кондрахин И.П., Курилов Н.В., Малахов А.Г. - М.: Агропромиздат, 1990, 116 с.

5. Максимов В.И., Зарудная E.H., Зайцев С.Ю.. Милаева И.В. Использование метода динамической межфазной тензиометрии для исследования сыворотки крови крупного рогатого скота//Уч. записки Казанской гос. академии ветеринарной медицины//Материалы Межд. н-практ. конф.. посвященная 135-летию академии «Современные подходы развития АПК», 29—31 мая 2008 г., т. 194. - Казань. 2008. 57—60.

6. Fainerman V.B., Miller R„ Joos P. The measurement of dynamic surface tension by the maximum bubble pressure method. Colloid Polymer Sei, 1994, 272, 731—739.

E.N. Zarudnaya, S.U. Zaitsev, V.l. Maximov. Dynamyc surface tension of sow's serum.

УДК 619:616.98:576-078:636

Эпизоотия энцефаломиелита КРС, вызванного вирусом Акабане, на юге Японии

Р. Коно1, М. Хирата2, М. Каджи', Ю. Гото2, С. Икеда2, Т. Янасе3, Т. Като3, С. Танака3, Т. Тсютсюи4, Т. Имада3 и М. Ямакава3

1 Центр зоогигиены провинции Кумамото

2 Центр зоогигиены провинции Кагошима

3 Национальный институт здоровья животных

11 Национальный институт здоровья животных

Ключевые слова: болезнь Акабане, вектор инфекции, вирусы, диагностика, крупный рогатый скот, патоморфоло-гия, симптоматика

Сокращения: БА — болезнь Акабане; ВА — вирус Акабане; ОТ-ПЦР — обратнотранскриптазная полимераз-ная цепная реакция

Введение

Возбудитель БА относится к роду О г! ЬоЬипуа\чги.ч семейства Випуа\апс1ае. Он распространен на обширной территории — от тропиков до решонов с умеренным климатом, т. е. там, где одновременно имеются его векторы (членистоногие — комары, мошки) и жвачные [7,16.18,28]. В Японии, Корее, Тайване, Австралии, Израиле и Турции [3, 4, 7| периодически возникают вспышки инфекции, которые сопровождаются абортами, рождением мертвых, недоношенных или имеющих врожденные уродства (артрогрппоз и водянку головного мозга) телят, ягнят и козлят [6, 8, 23]. В Японии во время одной из самых крупных эпизоотий БА (1972—1975 гг.) родилось около 42 000 телят с уродствами. Из изолированного в 1974 г. штаммаОВЕ-1

приготовили вакцину, которой пользуются для специфической профилактики болезни и в настоящее время [ 13, 14].

ВА проявляет большое сходство с другими представителями рода Orthobunyavirus [25]. Его вирионы покрыты ли-пидной оболочкой, а геном состоит из трех сегментов одноце-почечной РНК: крупного (L. 6868 нуклеотидов), среднего (М, 4309 нуклеотидов) и маленького (S, 858 нуклеотидов) [2, 20, 31 ]. Сегмент L РНК кодирует L-протеин, обладающий активностью РНК-полимеразы и принимающий участие в репликации и транскрипции агента. М-сегмент РНК несет информацию о двух гликопротеинах оболочки ВА (Gn и Ge), а также о предшественнике неструктурного белка NSm. Гли-копротеины ВА индуцируют in vivo образование антител, выявляемых в реакциях нейтрализации и гемагглютинации, а также обеспечивают прикрепление к рецепторам клеток. Белок NSm служит регулятором сборки и созревания вирио-нов |27]. S-сегмент РНК кодирует нуклеокапсидный протеин (N) и маленький неструктурный белок (NSs). Протеин N несет общие с другими вирусами рода антигенные детерминанты. Белок NSs выполняет роль антагониста альфа/бета-интерферона, регулирует синтез белков клеток хозяина и индуцирует их апоптоз [5, 10, 30].

Прототипный штамм ВА (JaGAr39) впервые изолировали из комаров Aedes vexans и Culex tritaeniorhynchus в японской префектуре Ганма в 1959 г. [21], а в последующем вирус неоднократно удавалось обнаруживать у мошек Culicoides sp. [11, 19, 32|. Недавно было доказано, что полевые изоляты ВА проявляют вариабельные вирулентность, антигенные и генетические свойства [1, 2,9, 19,33,341. В частности типовой штамм Ирики 119] вызвал осенью 1984 г. на юге Японии вспышку БА, проявившуюся развитием негнойного энцефалита и соответствующей симптоматикой у телят в возрасте 3...16 мес. Возбудитель изолировали из мозжечка теленка с негнойным энцефалитом. В реакции нейтрализации его идентифицировали как ВА. Серологическо-эпизоотологическое исследование и воспроизведение болезни в экспериментальных условиях подтвердили этиологическую роль этого штамма во вспышке болезни [ 19|. Хотя ВА обычно вызывает у взрослого КРС только кратковременную бессимптомную виремию, однако в постна-тальный период высоковнрулентные штаммы этого агента нередко становятся причиной энцефалита, о чем сообщалось не только в Японии, но и в соседних Корее и Тайване [15, 161.

В 2006 г. крупная вспышка болезни произошла на юге Японии. В этой статье описаны клинические, эпизоотологп-ческие и патоморфологические особенности болезни, приведены антигенная и генетическая характеристики штаммов ВА, изолированных от больных и клинически здоровых телят, находившихся в очагах инфекции.

Результаты исследований

Клиническое и эпизоотологическое исследования. С конца августа до середины декабря 2006 г. в 5 префектурах Японии (Кумамото, Кагошима, Опта, Миязаки и Эхим) зарегистрировали 180 случаев неврологического заболевания КРС. Из них 124 (68,9%) и 41 (22,8%) случай болезни произошел в первых двух из упомянутых выше префектур соответственно. Возраст больных животных варьировал от 4 дн до 96 мес. Болезнь проявлялась частичной (дистазией) или полной (астазией) утратой способности стоять, не опираясь на окружающие предметы, атаксией, тремором, нистагмом, онистотонусом и повышенной возбудимостью. Астазия в большинстве случаев сочеталась с параличами тазовых и/или грудных конечностей. Лихорадку и анорексию регистрироватп значительно реже и преимущественно у животных в возрасте моложе 24 мес. Породной или половой предрасположенности скота к болезни не отметили.

Гистологическое исследование и иммуногистологичес-кий анализ ЦНС больного КРС на наличие ВА. У 72 больных животных из префектур Кумамото и Кагошима не обнаружили патологоаиатомических поражений в головном и спинном мозге, скелетной мускулатуре и внутренних органах. Однако при гистологическом исследовании у большинства этих животных диагностировали негнойный энцефаломиелит, сопровождавшийся вариабельной инфильтрацией тканей головного мозга мононуклеарными клетками, образованием клетками микроглии узелков (рис. 1), дегенерацией и/или некрозом нейронов среднего мозга, моста мозжечка и продолговатого мозга. В других отделах головного мозга перечисленные изменения носили легкий характер. Иногда в вентральных рогах спинного мозга обнаруживали воспаление средней тяжести.

Иммуиогистохимически установили скопление антигенов ВА в стволе головного мозга, где агент локализовался преимущественно в цитоплазме нейронов и нервных аксонах (рис. 2), а в отдельных случаях — в эндотелиальных клетках кровеносных сосудов и макрофагах, находившихся в пери-васкулярных инфильтратах (рис. 3). Между числом таких очагов и интенсивностью аккумуляции в них вирусного антигена, с одной стороны, и тяжестью воспаления головного мозга, с другой, выявили положительную корреляцию.

Обнаружение и изоляция ВА. Специфический продукт ОТ-ПЦР, имевший размер в 389 нуклеотидов, обнаружили в

Ш&к  V- л V U

^^ * V . V; - .

Рис. 1. Очаг (показан стрелкой) периваскулярной инфильтрации мононуклеарными клетками и образование глиальных узелков ретикулярной формации моста мозжечка. Окраска гематоксилином и эозином. Риска = 0,5 мм

U v '

: да

#v

% 5 а

ь

А

* #

•

п

.ч • • . '

• J»

Iff

Рис. 2. Обнаружение иммуногистохимическим методом антигенов ВА (темно-коричневые гранулы) в цитоплазме нейрона (стрелка) и нервных аксонах (короткие стрелки) среднего мозга. Риска = 0,1 мм

Рис. 3. Обнаружение иммуногистохимическим методом антигенов ВА (темно-коричневые гранулы) в цитоплазме макрофагов (стрелка), находящихся в периваскулярных инфильтратах среднего мозга. Риска = 0,1 мм

пробах патологического материала, взятых у 39 (54,2 %) из 72 гол. КРС с негнойным энцефаломиелитом. Из ПЦР-пози-тивных проб изолировали 7 штаммов вируса в перевиваемой линии клеток НшЬи-1. Еще 4 штамма выделили из крови или ее плазмы клинически здоровых телят неблагополучных хозяйств. Кроме того, во время вспышки болезни удалось изолировать штамм КБВ-З/Р/Об от клинически здорового животного на исследовательской станции Киуши. Все 12 изолятов с помощью иммуноблотинга идентифицировали как ВА.

Характеристика антигенов изолятов ВА. Все изоляты положительно реагировали с моноклональными антителами к протеину N и у них выявили эпитопы А1, А2, В и С1 глико-протеина вс штамма ОВЕ-1 вируса Акабане [33]. По результатам иммуноблотинга изоляты признали родственными штамму Ирики и отнесли к антигенной группе 3 [33|. Один из изолятов (КМ-1/Вг/06) сравнили со штаммами ОВЕ-1 и Ирики в реакции перекрестной нейтрализации, которую проводили с кроличьими антисыворотками ко всем трем штаммам. Тест подтвердил идентичность выделенного изолята и штамма Ирики, а также их отдаленное родство со штаммом ОВЕ-1.

Серологические исследования. Нейтрализующие сывороточные антитела к ВА обнаружили у 117 (98,3 %) из 119 гол. КРС с неврологическими симптомами и 113 (74,3%) из 152 гол. скота, содержавшихся совместно с больными животными. Серологическое обследование, проведенное в сентябре—ноябре 2006 г. в обеих префектурах, выявило сероконвер-сию к ВА 60 (45,5 %) из 132 клинически здоровых сентинель-ных телят. Антител к другим вирусам, передающимся членистоногими, в т. ч. вирусам Айно, блутанга, Чузан, Ибараки и эфемерной лихорадки КРС, у этих животных не обнаружили.

Секвенс анализ 5- и М-сегментов РНК изолятов и их филогенетический анализ. Провели секвенс анализ 5- и М-сегмен-тов РНК изолятов и сравнили полученную информацию с результатами изучения ранее выделявшихся штаммов ВА [9]. Открытый для чтения участок Б-сегмента РНК (699 нуклеотидов) оставался высоко консервативным (99,6...100%-я идентичность) у всех 12 штаммов, выделенных в разные периоды вспышки энцефаломиелита. Идентичность этих участков генома у изолята КМ-1/Вг/06, выделенного в 2006 г., штаммов Ирики, ОВЕ-1 и ^САгЗЭ варьировала от 95,9 до 99,0 %, а идентичность аминокислотного состава кодируемых ими белков — от 99,1 до 100 %.

Изоляты КМ-1/Вг/06, КМ-2/Вг/06, К5-2/Мо/06 и КЗ В-З/Р/06 использовали для анализа открытого для чтения участка (4203 нуклеотидов) М-сегмента РНК. Нуклеотидная последовательность этого участка генома и аминокислотный состав кодируемого им нейтрализующего антигена также оказались высококонсервативными у сравниваемых изолятов. Изолят КМ-1/Вг/06 проявил большее родство к штамму Ирики, чем к штаммам ОВЕ-1 и ^САгЗЭ.

Для окончательной оценки родства референтных штаммов ВА и изолятов, выделенных в 2006 г., по результатам анализа М- и Б-сегментов РНК построили филогенетическое дерево1. Как сообщалось ранее [9], известные изоляты ВА по М-сегмен-ту РНК распадаются на 4 самостоятельные линии (геномогруп-пы 1....1У). Геномогруппа I включает 2 монофилогенетических кластера — 1а и 1Ь. Изолят КМ-1/Вг/06 отнесли к подгруппе 1а, в состав которой входит штамм Ирики. Филогенетическое дерево, построенное по результатам анализа М-сегмента РНК ВА, оказалось идентичным предыдущему [9, 34].

Обсуждение

Осенью 2006 г. на юге Японии произошла вспышка неврологического заболевания КРС. Время года, в которое это случилось, и характер патоморфологических поражений головного мозга животных наталкивали на предположение о том, что болезнь вызвал передающийся членистоногими нейротроп-

1 Представлено на сайте журнала

ный вирус. Этиологическая роль ВА в данной патологии подтвердили теми же способами, как и при вспышке БА, которая произошла в 1984 г. 119], т. е. посредством обнаружения в патологическом материале антигена и генома этого агента, его изоляции в очагах болезни, обнаружения у больного и контактировавшего с ним скота специфических антител.

Болезни, вызываемые различными вирусами, которые передаются членистоногими, в т. ч. вирусами Айно, Чузан, Ибараки и эфемерной лихорадки КРС и ВА, представляют серьезную проблему для скотоводства Японии. Среди них наиболее опасным в экономическом отношении считают ВА, поскольку эту инфекцию регистрируют с 1959 г. практически ежегодно.

Энтомологические исследования, проводившиеся на юге Японии в течение 20 лет, показали, что в этом регионе основным вектором ВА служит СиПсокк'х оху^ота. Чаще всего от мокрецов этого вида изолируют вирусы в период максимального повышения плотности популяции — с августа по ноябрь [32|. Сравнение генома полевых изолятов ВА, выделенных в Японии за последние 50 лет, а также штаммов вируса, обнаруженных в Израиле, Тайване, Австрашн и Кении, показало, что циркулирующие в Азии штаммы агента имеют общее происхождение и значительно отличаются от штаммов ВА, выделяемых в Океании и Африке [9, 34]. Поскольку маловероятно, что ВА способен «перезимовывать» в Японии, можно предположить, что его регулярно заносят с более низких широт (из тропических и субтропических районов Азии), где климатические условия более подходят для этого и откуда инфицированные вирусом мошки могут в определенные сезоны переноситься ветром на большие расстояния [26, 32]. Если бы существовал штамм ВА, адаптировавшийся к условиям Японии, то он бы распространялся не се-зонно, а постоянно [32,34]. Чтобы внести ясность в данный вопрос, необходимо провести вирусологические исследования перезимовывающих в Японии личинок мошек. Однако следует иметь в виду, что с помощью сентинельных животных было доказано отсутствие циркуляции В А в Японии в 2005 г. Поэтому можно утверждать, что в префектуру Кумамото, в которой первый случай описанной в настоящей статье вспышки БА зарегистрировали 30 августа 2006 г., возбудитель болезни занесли мокрецы извне, и он распространялся по южным районам страны на протяжегаш всей осени. Вирус вызвал вспышку энцефалита преимущественно у чувствительного к нему молодняка. Благополучие по этой инфекции в предшествующий год могло стать фактором, обеспечившим наличие большого количества серонегативного к ВА скота, что могло послужить одной из причин вспышки БА.

Известны 4 геномогруппы ВА, из которых в Японии регистрируют только две — I и II [4, 24]. Полевые изоляты вируса можно разделить в реакции нейтрализации по меньшей мере на 5 антигенных групп [33]. Хотя имеется некоторое несоответствие между генетической и антигенной классификациями ВА, изоляты агента, относящиеся к антигенной группе 3, всегда принадлежат к субгеномогруппе 1а [4]. 12 изолятов ВА, выделенные в Японии в 2006 г., относились к этой же субгеномогруппе, что и штамм Ирики, вызвавший энцефалит у телят в 1984 г. Штамм Ирики после интрацеребрально-го введения вызывает у телят те же неврологические нарушения, которые регистрируют при естественном течении инфекции [19]. Гистологические изменения головного мозга телят, описанные в этой статье, полностью идентичны тем, которые индуцирует этот штамм ВА [16, 19]. Напротив, штаммы ^вАг 39 и ОВЕ-1, относящиеся к геномогруппе И, вызывают у телят после интрацеребрального заражения легкую неврологическую симптоматику [12]. Хотя для окончательных выводов необходимы дополнительные исследования, но можно предположить, что нейровирулентность геномогруппы 1а выше, чем геномогруппы II.

Нами установлены антигенные различия штамма ОВЕ-1, использованного для получения вакцинного штамма ТБ-С2,

и изолята КМ-1/Вг/06. Поэтому целесообразна разработка новой вакцины против БА из этого или подобных ему изоля-тов ВА. Также необходима кооперация эндемичных по БА стран в плане обмена эпизоотологической, вирусологической и энтомологической информацией.

БИБЛИОГРАФИЯ

1.AkashiH., Inaba Y. Antigenic diversity of Akabane virus detected by monoclonal antibodies. Virus Res. 1997, 47, 187—196.

2. Akashi H., Kaku Y., Kong X.-G., Pang H. Sequence determination and phylogenetic analysis of the Akabane bunyavirus S RNA genome segment. J Gen Virol, 1997, 78. 2847—2851.

3. Bak U.B., Lim C.H., Cheong C.K. et al. Outbreaks of Akabane disease of cattle in Korea. Korean J Vet Res, 1980, 20, 65—78.

4. Brenner J., Tsuda Т., Yadin H., Kato T. Serological evidence of Akabane virus infection in northern Israel in 2001. J Vet Med Sci, 2004, 66, 441—443.

5. Bridgen A., Weber F., Fazakerley J.K., Elliott R.M. Bunyamwera bunyavirus nonstructural protein NSs is a nonessential gene product that contributes to viral pathogenesis. PNAS USA, 2001, 98, 664—669.

6. Inaba Y., Kurogi H„ Omori T. Akabane disease: epizootic abortion, premature birth, stillbirth and congenital arthroglyposis-hydranencephaly in cattle, sheep and goats caused by Akabane virus. Aust Vet J, 1975, 51, 584—585.

7. Inaba Y., Matumoto M. Akabane virus. In: Dinter Z., Morein B. Virus infections of ruminants. (Eds). -Amsterdam, Netherlands: Elsevier Sci Publ, 1990, 467—480.

8. Kirkland P.D.. Barry R.D., Harper P.A.., Zelski R.Z. The development of Akabane virus-induced congenital abnormalities in cattle. Vet Rec. 1988, 122, 582—586.

9. Kobayashi Т., Yanase Т., Yamakawa M. et al. Genetic diversity and reas-sortments among Akabane virus field isolates. Virus Res, 2007, 130, 162—171.

10. Kohl A., Clayton R.F., Weber F. et al. Bunyamwera virus nonstructural protein NSs counteracts interferon regulatory factor 3-mediated induction of early cell death. J Virol, 2003, 77, 7999—8008.

11. Kurogi H.. Inaba Y., Takahashi E. et al. Epizootic congenital arthrogryposis-hydranencephaly syndrome in cattle: isolation of Akabane virus from affected fetuses. Arch Virol, 1976, 51, 67—74.

12. Kurogi H., Inaba Y., Takahashi E. et al. Experimental infection of calves with Akabane virus. Bull Natl Inst Anim Health, 1977, 75, 1—8.

13. Kurogi H., Inaba Y., Takahashi E. et al. Development of inactivated vaccine for Akabane disease. Natl Inst Anim Health Q, 1978, 18, 97—108.

14. Kurogi H., Inaba Y., Takahashi E. et al. An attenuated strain of Akabane virus: a candidate for live virus vaccine. Natl Inst Anim Health Q, 1979, 19, 12-22.

15. Lee J.K.. ParkJ.S., ChoiJ.H. et al. Encephalomyelitis associated with Akabane virus infection in adult cows. Vet Pathol, 2002, 39, 269—273.

16. LiaoY.K., Lu Y.S., GotoY., Inaba Y. The isolation of Akabane virus (Iriki strain) from calves in Taiwan. J Basic Microbiol, 1996, 36, 331—39.

17. Matsumori Y., Inai K„ Yanase T. et al. Serological and genetic characterization of newly isolated Peaton virus in Japan. Arch Virol, 2002, 147, 4011—410.

18. Metselaar D„ Robin Y. Akabane virus isolated in Kenya. Vet Rec, 1976, 99, 86.

19. Miyazato S., Miura Y., Hase M. et al. Encephalitis of cattle caused by Iriki isolate, a new strain belonging to Akabane vims. Jpn J Vet Sci, 1989, 51, 1281—136.

20. Ogawa Y„ Kato K., Tohya Y., Akashi H. Sequence determination and functional analysis of the Akabane virus L RNA segment. Arch Virol, 2007, 152, 9711—979. 21.0yaA., OkunoT., Ogata T. et al. Akabane, a new arbovirus isolated in Japan. Jpn J Med Sci Biol, 1961, 14, 1011—108.

22. Page R.D.M. TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Comput Appl Biosci, 1996, 12, 3571—358.

23. Parsonson I.M., McPhee D.A. Bunyavirus pathogenesis. In: Maramorosch K. et al. (Eds). Advances in virus research, v. 30. -Orlando, Fla: Acad Press, 1985, 2791—316.

24. Saitou N.. Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Bio Evol, 1987, 4. 406-425.

25. Schmaljohn C.S., Nichol S.T. Bunyaviridae. In: Knipe D.M., Howley P.M. (Eds).. Fields Virology, 5th Ed. - Philadelphia, PA: Lippincott Williams & Wilkins, 2007, 17411—1789.

26. Sellers R.F., Mellor P.S. Temperature and the persistence of viruses in Culicoides spp. during adverse conditions. Rev Sci Tech OIE, 1993, 12, 7331—755.

27. Shi X., Kohl A., Leonard V.H.J, et al. Requirement of the N-terminal region of orthobunyavirus nonstructural protein NSm for virus assembly and morphogenesis. J Virol, 2006, 80, 80891—8099.

28. Taylor W.P., Mellor P.S. The distribution of Akabane virus in the Middle East. Epidemiol Infect, 1994, 113, 1751—185.

29. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 1994, 22. 46731^1680.

30. WeberF., BridgenA., Fazakerley J.K. et al. Bunyamwera bunyavirus nonstructural protein NSs counteracts the induction of alpha/beta interferon. J Virol, 2002, 76, 79491—7955.

31. Yanase Т., Yoshida K„ Ohashi S. et al. Sequence analysis of the medium RNA segment of three Simbu serogroup viruses, Akabane, Aino and Peaton viruses. Virus Res, 2003, 93, 631—69.

32. Yanase T„ Kato Т., KuboT. et al. Isolation of bovine arboviruses from Culicoides biting midges (Diptera: Ceratopogonidae) in southern Japan: 19851— 2002. J Med Entomol, 2005, 42, 631—67.

33. Yoshida K., Tsuda T. Rapid detection of antigenic diversity of Akabane virus isolates by dot immunobinding assay using neutralizing monoclonal antibodies. Clin Diagn Lab Immunol. 1998. 5, 1921—198.

34. Yamakawa M., Yanase T„ KatoT., Tsuda T. Chronological and geographical variations in the small RNA segment of the teratogenic Akabane virus. Virus Res, 2006, 121, 84—92.

35. UchidaK., Murakami T., Sueyoshi M. et al. Detection of Akabane viral antigens in spontaneous lymphohistiocytic encephalomyelitis in cattle. J Vet Diagn Invest, 2000, 12, 518—524.

R. Kono, M. Hirata, M. Kaji, Y. Goto, S. Ikeda, T. Yanase, T. Kato, S. Tanaka, T. Tsutsui, T. Imada, M. Yamakawa. Bovine epizootic encephalomyelitis caused by Akabane virus in southern Japan.

УДК 619:616.72-022-022.6:636.39

Выделение вируса артрита-энцефалита коз и разработка серологического метода диагностики

инфекции

Г.Д. Сидельников, Д.В. Колбасов,

С.Ж. Цыбанов, ВНИИВпМ

Ключевые слова: артрит-энцефалит коз, лентивирус, серологическая диагностика, симптоматика

Сокращения: АЭК — артрит-энцефалит коз; ВАЭК — вирус артрита-энцефалита коз; РДП — реакция диффузионной преципитации; СМК — синовиальная мембрана козлят

Введение

АЭК представляет собой симптомокомплекс, вызываемый лентивирусом (сем. Яе1хоут<1ае). Эта инфекция характеризуется длительным инкубационным периодом, хроническим течением, признаками поражения нервной системы, легких, молочной железы и суставов с прилегающими тканями либо пожизненным вирусоносительством без проявления клинических признаков [4, 7, 11).

К вирусу АЭК восприимчивы домашние козы и овцы 110]. Экономический ущерб от болезни обусловлен снижением молочной продуктивности, а также выбраковкой клинически больных животных и вирусоносителей. Персистенция ВАЭК сопровождается появлением антител у инфицированных коз [5, 7|. Выявление и выбраковка серопозитивных животных, являющихся основным источником вируса, позволяет предотвращать распространение инфекции и оздорав-ливать неблагополучные по ней стада.

АЭК диагностировали во многих странах мира, в т. ч. и России [2,3, 6, 8,9, 11]. Однако для нашей страны эта болезнь все еще является экзотической и малоизученной.

Нами предпринята попытка выделения ВАЭК и использования РДП для выявления антител к нему. Работа включала изоляцию вируса от больных животных, получение адекватной лабораторной модели для его накопления, изготовление антигена, а также апробацию РДП для серологического обследования коз.

Материалы и методы

Культура клеток. Культуру клеток СМК получали выращиванием эксплантатов синовиальной оболочки [4] на среде БМЕМ с 10 % фетальной сыворотки крови КРС. На 3... 12-м пассажах субкультивирования ее использовали для изоляции и репродукции ВАЭК.

Вирусы. Штамм 75С-63 ВАЭК любезно предоставила д-р Л. Херманн (США). Изолят «Тверской» выделили сокуль-тивированием культуры клеток СМК с лимфоцитами и моноцитами крови козы, естественно инфицированной ВАЭК.

Антиген для РДП. Вирусный антиген для РДП получали концентрированием осветленной культуральной жидкости культуры клеток СМК, зараженной штаммом 75С-63 и изо-лятом «Тверской» ВАЭК.

Постановка РДП. Раствор агарозы (0,7 %) готовили в 0,05 М трис-НС1 буферном растворе с 8 % хлорида натрия (рН 7,2...7,4). Расплавленный гель разливали по 15 мл в чашки Петри диаметром 10 см. После застывания в геле с помощью штампа вырезали розетки лунок (в каждой — 6 периферических и 1 центральную). Диаметр лунок составлял 8 мм, периферические были удалены от центральной на 3 мм. После заполнения лунок чашки закрывали крышками и помещали во влажную камеру при температуре 17...25 "С. Реакцию учитывали в крестах (от + до ++++) через 48 и 72 ч [1 ].

Животные. Для апробации РДП и изучения распространения инфекции исследовали сыворотку крови и молозива коз, содержавшихся на ферме Ленинградской области (поголовье импортировано из Германии), — 305 проб, на ферме Тверской области — 58 проб, в Московском зоопарке (привезены из Чехии и Австрии) — 6 проб, в частном хозяйстве (г. Покров) — 9 проб, в виварии института — 7 проб (в т. ч. от двух козлят, экспериментально зараженных штаммом 75С-63 вируса АЭК).

Результаты и обсуждение

После убоя животных собирали фрагменты синовиальной мембраны запястных суставов, которые в последующем измельчали на кусочки, не превышающие 2 мм в диаметре. Их трижды промывали питательной средой ОМЕМ с антибиотиками и переносили в культуральные матрасы с добавлением смеси той же среды и 10 % фетальной сыворотки крови КРС. Матрасы инкубировали в атмосфере с повышенным до 5 % содержанием С02 при 37 °С в течение 5 дн.

На 4...5 сутки культивирования эксплантатов отмечали интенсивный рост клеток по периметру прикрепившихся тканевых фрагментов. В течение последующих 5...7 дн выросшие колонии клеток фибробластиого типа образовывали монослой.

Пассирование культуры клеток проводили бесцентрп-фужным способом. Монослой диспергировали смесью 0,25 %-го раствора трипсина и 0,02 %-го раствора версена (1:1), подогретой до 37°+ 0,1 °С.

На первых 2...3 пассажах коэффициент пересева составлял 1 :2, но на уровне 3...8 пассажей его можно было увеличить до 1 : 3...1 : 4.

В доступной нам литературе отсутствует информация об изоляции ВАЭК в нашей стране. Необходимо отметить, что выделить этот вирус из патологического материала по схемам, принятым для возбудителей остро протекающих болезней, сложно. Ввиду крайне низкого содержания агента в пораженных органах и тканях приходится прибегать к различным приемам, сводящимся к его концентрированию или сокультиви-рованию инфицированных им клеток с чувствительными культурами клеток. ВАЭК, «избавившись» от сдерживающего влияния иммунной системы организма хозяина, активизируется по мере созревания и дифференцировки клеток-вирусо-носителей (происходит переход из интегрированной с геномом клетки провирусной ДНК в полноценные вирионы с РНК) и вызывает продуктивную инфекцию, индикатором ко-

торой можно считать феномен симпластообразования в чувствительной к нему культуре клеток.

ВАЭК изолировали пз лимфоцитов и моноцитов крови естественно инфицированного животного посредством их сокульти-вирования с культурой клеток СМК. Лимфоциты и моноциты получали центрифугированием крови в градиенте плотности фикола (1,077 г/см3). Суспензию среды БМЕМ с лимфоцитами и моноцитами добавляли к суспензии клеток СМК.

В ходе инкубирования зараженной культуры клеток в первых двух пассажах цитопатические изменения отсутствовали. На третьем пассаже па 5...6-е сутки в монослое появились многоядерные симпласты. В последующем их число и размеры увеличивались, а количество ядер в них доходило до 20...30. Выделенный изолят вируса АЭК назвали «Тверским».

Инфекционный титр изолята «Тверской» и штамма 75С-63 ВАЭК в культуре клеток СМК достигал 1050ТЦД50/см3 и 1060 ТЦД-0/см3 соответственно.

Вируссодержащую культуральную жидкость подвергали трем циклам замораживания (при -20 °С) и оттаивания (при 4 °С). Осветленную низкоскоростным центрифугированием (2 тыс. об/мин в течение 20 мин.) культуральную жидкость концентрировали в 50...100 раз диализом против сухого по-лиэтиленгликоля 6000. Полученный концентрат использовали в РДП в качестве антигена.

В РДП исследовали сыворотку крови и молозиво коз из источников, перечисленных в разделе «Материалы и методы». Полученные результаты представлены в таблице

Результаты исследования сывороток крови и молозива коз в РДП на наличие антител к ВАЭК

Хозяйство Порода Всего Показания РДП

проб + -

Ленинградская область Зааненская 305 0 305

Тверская область Зааненская и англо-нубийская 58 41 17

Московский Зааненская 6 5 1

зоопарк

Частное хозяйство (г. Покров) Аборигенные козы (беспородные) 9 9 0

Виварий Зааненская 7 5 2

института

Всего 385 59 325

Группа коз, завезенных из Германии (305 гол.), в период проведения обследований была клинически здоровой. В остальных обследованных поголовьях коз присутствовали животные с артритами, симптомами поражения дыхательной системы (кашлем, слизистыми истечениями из носа), нервной системы (парезами), а также истощением, которое развивалось, несмотря на обильное кормление. Указанные признаки отмечали у животных старше года. Одновременного поражения всех вышеперечисленных систем органов мы не наблюдали (за исключением 6-летней козы, у которой диагностировали артритную форму болезни, сочетавшуюся с неврологической симптоматикой).

Заключение

Впервые в нашей стране изолировали ВАЭК. Полевой изолят «Тверской» ВАЭК адаптировали к культуре клеток СМК. Испытания тест-системы РДП, созданной на основе культу-рального антигена этого изолята, показали, что ею можно пользоваться для выявления антител к ВАЭК в пробах сывороток крови и молозива инфицированных животных.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Валихов А.Ф. Сывороточные преципитируюицие антитела к онкорнавиру-су типа С крупного рогатого скота. Ветеринария, 1976, 1, 44—46.

2. Волкова И.Ю. Эпизоотологический мониторинг и совершенствование

мер борьбы с артритом-энцефалитом коз в РФ. Ает. дис. канд. вет. наук. -Покров, 2008, 25 с.

3. Angelopoulou К., Karanikolaou К., Papanastasopoulou М. First partial characterization of small ruminant lentiviruses from Greece. Vet Microbiol, 2005, 109, 1—2. 1—9.

4. Crawford T.B.. Adams S„ Cheevers W.P., Cork L.C. Chronic arthritis in goats caused by a retrovirus. Science, 1980, 207, 997—999.

5. Coackley W., Smith V.W., Houwers D.J. Preparation and evaluation of antigens used in serological tests for caprine syncytial retrovirus antibody in sheep and goat sera. Vet Microbiol, 1984. 9. 581—586.

6. Konishi M„ Tsuduku S., Haritani M. et. al. An epidemic of caprine arthritis encephalitis in Japan: isolation of the virus. J Vet Med Sci, 2004, 66, 8, 911—917.

7. NarayanO., Clements J.E. Biology and pathogenesis of Lentiviruses. J Gen Virol, 1989, 70, 1617—1639.

8. Ngatia T.A., Njenga M.J.. Mbuthia P.G. Occurrence and pathology of caprine arthritis — encephalitis in young goats in Kenya. Bull Anim Health Prod Africa, 2005, 53, 1, 77—83.

9. Oliver R.E., Adams D.S., GorhamJ.R. et al. Isolation of caprine arthritis encephalitis virus from a goat. N Z Vet J, 1982, 30, 10, 147 —149.

10. Shah C., Huder J.B., Buni J. et al. Direct Evidence for Natural Transmission of Small-Ruminant Lentiviruses of Subtype A4 from Goats to Sheep and Vice Versa. J Virol, 2004, 78, 14, 7518—7522.

11. Surman P.G., Daniels E., Dixon B.R. Caprine arthritis-encephalitis virus infection of goats in Sougth Australia. Aust Vet J, 1987, 64, 9, 266—271.

G.D. Sidelnikov, D.V. Kolbasov, S.G. Cybanov. Isolation CAEV and development serological method for diagnostic this infection.

УДК 619:616-092:612.017.1-008.64-076:636.22/28

Применение ПЦР для выявления вируса иммунодефицита КРС у животных в крови и пробах мяса

В.Г. Бурба1, Д.С. Меграбян1, В.В. Колотвин1, Н.Ф. Гриненко2, А.Д. Альтштейн2, А.Ф. Валихов1

1 Московский государственный университет прикладной биотехнологии

2 Институт биологии гена РАН

Ключевые слова: культура клеток, крупный рогатый скот, ретровирусы

Сокращения: ВИК — вирус иммунодефицита КРС; ВПК — вирус лейкоза КРС; КРС — крупный рогатый скот; ЛЭК — легкое эмбриона коровы; ПЦР — полимеразная цепная реакция: ЦПД — цитопатическое действие

Введение

Ретровирусы — уникальное семейство РНК-содержащих вирусов, обладающее способностью синтезировать ДНК с помощью специализированного фермента (обратной транскриптазы). Данное свойство позволяет им интегрировать собственную нуклеиновую кислоту в геном клеток хозяина, что фактически делает невозможным излечение последнего. Среди млекопитающих ретровирусы распространены особенно широко [2]. У КРС инфекцию могут вызывать 2 ретровируса — ВЛК и ВИК.

Вирусную природу лейкоза КРС установили в 1970-х годах. К настоящему моменту изучены свойства возбудителя, широта его распространения в разных странах, разработаны методы диагностики и рекомендации но оздоровлению неблагополучных хозяйств. ВИК изучен хуже. До сих пор остается неизвестным его патогенетический потенциал, способы передачи и степень распространения в стадах КРС. Его обнаружили в скотоводческих хозяйствах США, Аргентины, Японии, Канады, Германии, Турции, Южной Кореи, Замбии и др. На территории России эту инфекцию диагностировали недавно [ 11. Установили, что в ряде хозяйств Московской области широта распространения ВИК в среднем составляет 40 %, в то время как благополучие по этой инфекции других субъектов Российской Федерации остается неизвестным. Чтобы решить эту задачу, требовался чувствительный и специфичный метод диагностики, позволяющий выявлять ВИК непосредственно в крови животных. В настоящее время наиболее универсальным методом обнаружения вирусов в биологических объектах является ПЦР. Для подтверждения специфичности показаний ПЦР, разработкой которой мы занялись, был необходим положительный контроль. С этой целью трансфицировали плаз-миду с полным геномом ВИК в культуру клеток ЛЭК. В статье описано ЦПД, которое вызывал агент в данной клеточной системе. Приведены результаты исследования в ПЦР крови КРС из нескольких хозяйств Ставропольского края и Вологодской области, а также проб импортированного мяса.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 12262-офи.

Материалы и методы

Вирус. Культуру Е. coli, трансформированную плазмидой pBIV127 с полным геномом ВИК R-29, получили из коллекции Национального института здоровья США. Плазмидой пользовались для трансфицирования культуры клеток ЛЭК.

Культура клеток. Диплоидную линию клеток ЛЭК получили из первично-трипсинизированиой (рисунок). После 30 пассажей расплодку этой культуры перенесли на хранение в жидкий азот.

ПЦР. ДНК из культуры клеток и цельной крови КРС выделяли с помощью набора для универсальной подготовки проб ДНК Diatom DNA Prep 100 (Лаборатория Изоген, Россия). ПЦР ставили с применением наборов лиофилизиро-ванных смесей PCR core и оригинальных праймеров gagl/ gag2 и blv2/blvl0, предназначенных для обнаружения прови-русов ВИК и ВЛК соответственно. Продукты реакции фер-ментативно секвенировали с применением дидезоксирибо-нуклеотидов. При анализе продуктов секвенирования пользовались программой LaserGene MegAlign_v6.

Тестированный материал. Образцы ДНК выделили из цельной крови КРС шести скотоводческих хозяйств Ставропольского края (120 проб) и одного экспериментального хозяйства Вологодской области (30 проб), а также из 64 партий говядины, импортированной из стран Европейского Союза, Восточной Европы и Южной Америки.

ЦПД в культуре клеток ЛЭК после траксфекции плазмид с полным геномом ВИК