СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИКОАГУЛЯНТНО-ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ГЕПАРИНА
METHOD FOR MAKING ANTICOAGULANT-FIBRINOLYTIC HEPARIN PREPARATION

Изобретение относится к способу получения антикоагулянтно-фибринолитических средств на основе гепарина, которые могут быть использованы в области медицины, физиологии, биохимии, фармакологии.
Известен способ получения фибринолитического и протеолитического комплекса гепарина с ферментом трипсином, полученным в соотношении 1:6, с последующим осаждением комплекса в кислой среде (pH 2,0) и лиофильным высушиванием продукта.
Однако использование трипсина придает полученному продукту токсичные протеолитические свойства.
[Mansfeld V, Hladovec J. Studien über Reactionen des Kristallisierten Trypsins.II.Beziehung zwischen der Aktivität des Heporins und Trypsins - "Collection of Czechoslovak chemical communication", 1957, т.21, №5, c.1209].
Известен способ получения средства на основе гепарина и аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), проявляющего антикоагулянтно-фибринолитические свойства.
Согласно способу указанный комплекс получают путем соединения водных растворов гепарина и АТФ в соотношении 1:1-20 (мол.), инкубирования при 35-37,5°С в течение 50-60 мин, а после доведения смеси фосфатным буфером до pH 3,9-4,2 добавляют 6-кратный объем охлажденного ацетона. Смесь выдерживают на холоде и после охлаждения комплекса проводят центрифугирование при 3000 g в течение 30 мин. Полученный осадок, представляющий комплекс гепарин-АТФ, лиофильно высушивают.
Известный способ имеет следующие недостатки:
- получаемый препарат можно применять только внутримышечно,
- он обладает дополнительным побочным действием за счет использования коммерческого препарата АТФ, при передозировке которого возникают брадикардия, гипотензия, бронхоспазм.
[Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Николаева Л.С., Изв. РАН. сер. биол. 2005. №2. С.221, "Гемостазиологическая характеристика комплекса гепарина с АТФ"].
Способ получения комплексов гепарина с аминокислотами, взятый за прототип, характеризуется следующим. Водный раствор гепарината натрия последовательно наносят на колонку с катионообменной смолой (на 15-20 мин), а затем полученный раствор выдерживают с анионно-обменной смолой (10-15 мин), после чего к полученному фильтрату при перемешивании добавляют водный раствор аминокислоты в соотношении 1:1,1, осаждают полученный комплекс органическим растворителем - спиртом или ацетоном, отделяют осадок центрифугированием, после чего его лиофильно высушивают.
Выход в расчете на исходную антикоагулянтную активность составляет от 100 до 120%. Полученное таким образом средство проявляет антикоагулянтные, антилипидемические свойства.
Однако способ получения препарата достаточно сложен, требует дорогостоящих материалов и оборудования. Кроме того, получаемые препараты нестабильны и через 17-20 дней хранения наступает потеря активности при хранении при комнатной температуре, а получаемые комплексы обладают только антикоагулянтным и незначительным антилипемическим действием. Фибринолитические и фибриндеполимеризационные свойства целевого продукта отсутствуют.
[Патент США №3577534, опубл. 1970].
Задачей изобретения является создание простого способа получения комплексного средства на основе гепарина, обладающего антикоагулянтно-фибринолитическим действием.
Поставленная задача решается способом получения антикоагулянтно-фибринолитического средства на основе высокомолекулярного гепарина, заключающимся во взаимодействии водных растворов гепарина и лейцина при перемешивании в молярном соотношении 1:3-4, образовавшийся продукт замораживают при температуре не выше -10°С и лиофильно высушивают.
Обычно перемешивание ведут в течение 25-30 мин.
Преимущественно используют 0,8-1,0% водный раствор гепарина и 0,3-1,0% раствор лейцина.
Гепарин относится к естественным антикоагулянтам прямого действия, т.е. непосредственно влияет на факторы свертывания крови (XII, XI, X, IX, VII и II). Противосвертывающее действие гепарина проявляется in vitro и in vivo. Противосвертывающее действие гепарина осуществляется при его внутривенном, внутримышечном, подкожном введении. Однако он действует относительно кратковременно.
Лейцин - алифатическая незаменимая аминокислота, которая входит в состав всех природных белков и применяется для лечения болезней печени, анемий и других заболеваний. Лейцин является специфическим источником энергии на клеточном уровне.
Комплексный препарат гепарин-лейцин имеет иную структуру, чем составляющие его компоненты. Методом пересекающегося электрофореза было доказано участие кислых - карбоксильных и сульфогрупп гепарина в комплексообразовании с лейцином. Установлено, что при использовании химически чистых препаратов высокомолекулярного гепарина и L-лейцина полная реакция их взаимодействия протекает при добавлении избытка аминокислоты (соотношение 1:3-1:4), в связи с чем все кислые (сульфатные и карбоксильные) группы гепарина были связаны с аминогруппами лейцина.
Молярное соотношение 1:3-4 является оптимальным для проявления максимальной антикоагулянтной активности комплекса гепарина с L-лейцином, что доказано методом компьютерного моделирования по универсальной компьютерной программе расчета химических равновесий AUTOEQUIL, данных pH-метрии физиологических растворов: гепарин-L-лейцин и кальций-гепарин-L-лейцин. При получении продукта проводят периодическое перемешивания образовавшейся смеси при комнатной температуре в течение 25-35 мин.
Полученный согласно предложенному способу комплекс гепарина и лейцина обладает высокой антикоагулянтной и фибриндеполимеризационной активностью, а также стабильностью при хранении. Полученный комплекс не обладает протеолитическими свойствами, что придает ему безопасность при применении. Полученный комплекс стабилен, сохраняет свои свойства при +4-6°С в течение не менее 2-х лет.
Пример 1
1%-ный раствор высокомолекулярного гепарина (10 мг в 1 мл дистиллированной воды) и 0,8%-ный раствор лейцина (0,8 мг в 0,1 мл дистиллированной воды) перемешивают, при этом достигается молярное соотношение гепарина и лейцина, равное 1:4, (или эквивалентное этому соотношение 1 мг лейцина на 170 ME активности высокомолекулярного гепарина), при котором происходит образование наиболее активного комплекса. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 30-35 мин, далее замораживают при -10°С и лиофильно высушивают. Получают белый негигроскопичный порошок - комплексный препарат гепарина с лейцином. Выход комплексного препарата - 17 мг, 79-82% (по весу) или 250-290% антикоагулянтной активности от исходной.
2
2
Полученный продукт при нанесении на нестабилизированные фактором XIIIa пластины фибрина обнаруживает высокую суммарную фибринолитическую активность, равную 100 мм, фибриндеполимеризационную активность, равную 92 мм.
При добавлении к нормальной плазме крови крыс целевого продукта установлены высокая антикоагулянтная активность, составляющая 286% по сравнению с контролем (0,85%-ный раствор NaCl), высокая суммарная и фибриндеполимеризационная, фибринолитическая активность, составляющая соответственно 144 и 90 мм. Протеолитического действия препарата не обнаружено.
Полученный целевой продукт (комплексный препарат гепарина с лейцином) обладает максимальным фибриндеполимеризационным, суммарным фибринолитическим и антикоагулянтным действием при его добавлении к плазме крови крыс.
Пример 2
Аналогично примеру 1 получают продукт с молярным соотношением гепарина и лейцина, равным 1:2, используя 0,8% раствор высокомолекулярного гепарина (0,8 мг в 1 мл дистиллированной воды - 105 ME активности гепарина) и 0,3% раствор лейцина (0,3 мг в 0, 1 мл дистиллированной воды) (или эквивалентное этому соотношение гепарина в единицах активности к количеству лейцина как - 346 ME активности высокомолекулярного гепарина:1,0 мг лейцина.)
2
2
2
Комплексный препарат обнаруживает умеренную суммарную фибринолитическую активность, равную 36 мм, фибриндеполимеризационную активность, равную 30 мм. При добавлении к нормальной плазме крови крыс установлены низкая антикоагулянтная активность, составляющая 115% по сравнению с контролем (0,85%-ный раствор NaCl), принятым за 100%, суммарная и фибриндеполимеризационная, фибринолитическая активность, составляющая соответственно 56 и 42 мм. Протеолитического действия препарата не обнаружено.
Пример 3
Аналогично примеру 1 получают продукт с молярным соотношением высокомолекулярного гепарина и лейцина, равным 2:1, для чего готовят 0,5%-ный раствор высокомолекулярного гепарина (10 мг в 2 мл дистиллированной воды) и 0,2%-ный раствор лейцина (0,97 мг в 0,5 мл дистиллированной воды) или вводят соотношение единиц активности гепарина на количество лейцина как - 44760 ME активности высокомолекулярного гепарина:1,0 мг лейцина, перемешивают при комнатной температуре в течение 30-35 мин, далее замораживают при -10°С и лиофильно высушивают.
Комплексообразование - слабое, получают немного порошка - примерно 1,0 мг. Комплексный препарат, полученный при таком соотношении компонентов, не обладает фибриндеполимеризационным действием, но проявляет антикоагулянтную активность при добавлении к плазме крови крыс.
Установлено, что при концентрациях гепарина ниже 0,8% и лейцина ниже 0,3% и выше 1,0% выход целевого продукта малый и не обнаруживаются искомые активности.
Таким образом, в отличие от прототипа целевой продукт, содержащий соединение гепарин-лейцин в молярном соотношении 1:3-4, получаемый предлагаемым способом, проявляет одновременно суммарное фибринолитическое, фибриндеполимеризационное и антикоагулянтное действие как в отсутствие плазмы, так и при добавлении к плазме крови. Комплексы, имея аналогичные составы с прототипом, значительно различаются по свойствам, полученным за счет щадящего (безопасного для структуры молекул) режима получения комплексного препарата и нового соотношения компонентов. В процессе не использовалась обработка исходного гепарина с ионообменными смолами, не использовались органические растворители для осаждения комплекса.
Предлагаемый способ позволяет получать комплексы с улучшенными свойствами, в полученном препарате антикоагулянтная активность на 150-190% превышает ту же активность исходного высокомолекулярного гепарина. Полученный препарат дополнительно обладает фибринолитической, фибриндеполимеризационной и антитромбоцитарной активностью, не проявляет побочного отрицательного протеолитического действия, продукт безопасен при возможной передозировке, так как в его состав входят природные компоненты, не проявляющие протеолитического действия. Его можно применять перорально, что также является его преимуществом. Препарат стабилен, срок хранения не менее 2-х лет. Благодаря своим свойствам целевой продукт в организме будет способен как предупреждать и снижать уровень тромбообразования, так и вызывать лизис свежих венозных тромбов при пероральном применении.