Способ получения биоимплантата для замещения сегментарных дефектов трахеи
METHOD FOR OBTAINING BIOIMPLANT FOR REPLACEMENT OF SEGMENTAL DEFECTS OF TRACHEA

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к трансплантологии, травматологии, хирургии, онкологии, и касается биоимплантатов, предназначенных для замещения сегментарных дефектов трахеи человека и животных.
Известно, что при развитии стеноза трахеи, вызванного злокачественными новообразованиями, инфекционными заболеваниями, послеоперационными осложнениями или травмой, возникает необходимость в резекции значительных участков органа. В ряде случаев невозможно формирование первичного анастомоза и возникает необходимость в замещении значительных дефектов трахеи с использованием биоимплантатов.
Известен способ получения биоимплантата трахеи на основе скаффолда композитной структуры из биосовместимого материала, насыщенного клетками, предназначенного для репарации стенки трахеи (CN 1386478).
Недостатки: способ не обеспечивает возможность создания сегментарного биоимплантата, соответствующего механическим и конфигуративным характеристикам трахеи.
Известен способ получения биоимплантата трахеи на основе биосовместимого полимерного матрикса из волокон политетрафторэтилена, между которыми имеются единичные пустоты, армированного жесткоупругим каркасом, покрытого снаружи лекарственным веществом (патент Франции N 9402475).
Недостатки: способ не обеспечивает достаточную барьерную функцию биоимплантата, поскольку его стенка проницаема для крови и воды; риск инфицирования, отсутствие плотной фиксации биоимплантата к культе трахеи для формирования состоятельного анастомоза.
Известен способ получения биоимплантата трахеи на основе матрикса из полиэтилен терефталата и полиуретана, заселенного мезенхимальными стромальными клетками (МСК) третьего-седьмого пассажа, культированными в DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки в биореакторе оригинальной конструкции (Ajalloueian F. et al. Biomechanical and biocompatibility characteristics of electrospun polymeric tracheal scaffolds. Biomaterials. 2014 Jul; 35 (20): 5307-15).
Недостатки: использование чужеродного белка - эмбриональной телячьей сыворотки для культивирования МСК с возможным развитием острой иммунологической реакции; не предусмотрено нанесение на синтетический матрикс биоактивного компонента для обеспечения адгезии клеток, что ведет к большой потере культуры МСК за счет их расселения на дне биореактора; требуется использование биореактора оригинальной конструкции для культивирования МСК на поверхности скаффолда.
Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению (прототипом) является способ получения биоимплантата для замещения сегментарных дефектов трахеи, имеющего в основе пористый матрикс, полученный из резорбируемого полимера POSS-PCL (polyhedral oligomeric silsesquioxane poly(ε-caprolactone) urea urethane): уретана на основе 80% поликапролактона и 20% поликарбоната. Скаффолд получают путем погружения U-образных колец из эластомера POSS-PGU в жидкую смесь POSS-PCL и натрия бикарбоната с образованием внутреннего и наружного пенистых слоев матрикса. Наружный слой матрикса заселяют МСК, выделенными из костного мозга пациента с использованием клеточного процессора, культивированными в среде RPMI с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 мг/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина. Внутренний слой заселяют эпителиальными клетками трахеи пациента после их экспозиции в среде с пенициллином и стрептомицином, 10% эмбриональной телячьей сывороткой и последующим культивированием в ростовой среде для эпителиальных клеток. Для колонизации клетками биоимплантат культивируют в течение 14 суток (G.Z. Teoh et al. Development of resorbable nanocomposite tracheal and bronchial scaffolds for paediatric applications. British Journal of Surgery 102 (2) P e140-e150, 2015).
Недостатки прототипа: риск резорбции матрикса биоимплантата, что может привести к потере каркасных и функциональных свойств; высокий риск развития медиастенита, системных гнойно-септических осложнений, вследствие потенциальной проницаемости стенки для микроорганизмов через поры матрикса (диаметр пор 40-105 мкм); возможность развития острой иммунологической реакции вследствие использования чужеродного белка - эмбриональной телячьей сыворотки для культивирования клеток; не предусмотрено нанесение биоактивного компонента на синтетический матрикс для обеспечения адгезии клеток, что ведет к большой потере культуры МСК, предназначенных для колонизации матрикса.
Задачей изобретения является создание нового способа получения биоимплантата для замещения сегментарных дефектов трахеи, устраняющего недостатки прототипа.
Задача решается тем, что разработан новый способ получения биоимплантата для замещения сегментарных дефектов трахеи на основе синтетического матрикса, наружный слой которого заселяют МСК костного мозга пациента, культивированными в питательной среде RPMI-1640. Стенка матрикса состоит из пяти разнонаправленно ориентированных слоев. Матрикс получен с использованием 3D принтинга, а именно электроформования, в соответствии с размерами и формой дефектного участка трахеи пациента. Готовый матрикс стерилизуют перегретым паром в течение 40 мин под давлением 1 атм, покрывают фибрином крови пациента, заселяют культурой МСК пациента, культивированных в питательной среде, содержащей 20% сыворотки крови пациента. Для формирования in situ соединительной ткани и сети кровеносных сосудов биоимплантат предварительно сроком на 1 месяц имплантируют подкожно. Затем трансплантируют в область дефекта трахеи пациента.
Заявляемый способ осуществляется следующим образом.
Основой биоимплантата трахеи служит синтетический матрикс из ультраволокнистого материала - фторопласта, полученного с применением 3D принтинга, а именно электроформования. Размеры и форму матрикса определяют на основе данных компьютерной томографии. Матрикс формируют из пяти разнонаправлено ориентированных слоев нетканого ультраволокнистого материала: технологический слой, двойные внутренний и наружные слои. Плотность упаковки волокон в материале - не менее 8%. Между внутренним и наружным слоем располагают полукольца из полиуретана.
2
2
2
Предшественники МСК выделяют из костного мозга пациента, генерируют культуру МСК с фенотипом CD34-CD45-CD90+CD105+ в питательной среде RPMI-1640, содержащей 20% сыворотки крови пациента, 2 мМ L-глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина G, 100 мкг/мл стрептомицина. Готовый матрикс стерилизуют перегретым паром в течение 40 мин под давлением 1 атм, затем покрывают фибрином крови пациента (не менее 0,01 мг/см), заселяют культурой МСК пациента (второго пассажа, не менее 6 тыс кл./см) и инкубируют в питательной среде RPMI-1640 при t=37°С и 5% СО в течение 7 суток.
Для формирования соединительной ткани и сети кровеносных сосудов биоимплантат предварительно сроком на 1 месяц имплантируют подкожно. Затем трансплантируют в область дефекта трахеи пациента.
Изобретение иллюстрируется чертежами.
На фиг. 1 представлен покрытый соединительной тканью и васкуляризированный биоимплантат.
На фиг. 2 представлено замещение сегментарного дефекта трахеи биоимплантатом у собаки (трахеоскопия).
На фиг. 3 представлена стенка биоимплантата через 1,5 месяца после имплантации (гистологическое исследование биоптата, ув. 100).
Пример
По заявляемому способу был изготовлен матрикс биоимплантата для замещения сегментарного дефекта трахеи, полученный в соответствии с данными компьютерной томографии, из фторопласта Ф-42В и полиуретана марки Элластолан 1195 А с использованием метода 3D принтинга, а именно электроформования: толщина стенки - 4 мм, длина - 5,5 см, внутренний диаметр устройства - 2,4 см. Плотность упаковки пяти разнонаправлено ориентированных слоев нетканого ультраволокнистого материала - 8,9±0,6%. Матрикс простерилизован перегретым паром под давлением 1 атм в течение 40 мин.
2
2
2
Из костного мозга собаки выделяли предшественники МСК, генерировали культуру МСК с фенотипом CD34-CD45-CD90+CD105+ в питательной среде RPMI-1640, содержащей 20% сыворотки крови собаки, 2 мМ L-глутамина, 100 МЕ/мл пенициллина G, 100 мкг/мл стрептомицина. Наносили на внутреннюю и наружную поверхности стерильного матрикса фибрин сыворотки крови - 0,08±0,002 мг/см, пассировали 1,4 мл суспензии МСК второго пассажа в концентрации 498000 кл/мл - 6000 кл/см. Затем культивировали в питательной среде на основе RPMI-1640 в течение 7 суток при 37°С и 5% СО.
Полученный биоимплантат имплантировали в область паховой складки собаки подкожно сроком на 1 месяц. Затем трансплантировали васкуляризированный биоимплантат в область дефекта трахеи собаки.
Через 1,5 месяца после трансплантации биоимплантата гнойно-септических осложнений, реакции отторжения тканей и признаков дыхательной недостаточности не наблюдали. Констатировали восстановление функции воздухопроводящих путей, что подтверждено данными трахеоскопии: в области замещения дефекта биоимплантатом имелись сформировавшиеся состоятельные анастомозы, сохранение широкого просвета воздухоносных путей, отсутствие признаков инфицирования тканей (Фиг. 2). При гистологическом исследовании биоптата отмечена репарация тканей в зоне имплантации (Фиг. 3).
Технический результат
Заявляемый способ обеспечивает получение биоимплантата трахеи на основе синтетического матрикса из биосовместимого нерезорбируемого материала, соответствующего по размерам и форме замещаемому сегменту трахеи пациента, обладающего воздухопроводящей и барьерной функциями, снижает риск инфицирования, обеспечивает быструю фиксацию и репарацию в зоне имплантации.