МЕЧЕННЫЕ СОРТАЗОЙ НЕЙРОТОКСИНЫ КЛОСТРИДИЙ

1. Способ получения меченого полипептида, включающий:
a. получение полипептида, содержащего:
i. акцепторный участок для сортазы или донорный участок для сортазы;
ii. нецитотоксическую протеазу или ее протеолитически неактивный мутант;
iii. нацеливающую часть (TM), которая способна связываться с участком связывания на клетке-мишени; и
iv. домен транслокации;
b. инкубацию полипептида с:
сортазой; и
меченым субстратом, содержащим донорный участок для сортазы или акцепторный участок для сортазы, соответственно, и конъюгированную поддающуюся детекции метку;
где сортаза катализирует:
конъюгацию между аминокислотой акцепторного участка для сортазы в полипептиде и аминокислотой донорного участка для сортазы в меченном субстрате; или
конъюгацию между аминокислотой акцепторного участка для сортазы в меченом субстрате и аминокислотой донорного участка для сортазы в полипептиде;
с осуществлением тем самым мечения полипептида; и
c. получение меченого полипептида, где меченый полипептид не имеет сниженную эффективность по сравнению с эквивалентным немеченым полипептидом и/или где меченый полипептид демонстрирует сходное связывание клеток, транслокацию и расщепление белка SNARE с эквивалентным немеченым полипептидом.
2. Способ по п. 1, где
a. акцепторный или донорный участок для сортазы находится с C-концевой стороны от TM или где акцепторный или донорный участок для сортазы находится с N-концевой стороны от нецитотоксической протеазы или ее протеолитически неактивного мутанта; и/или
n
n
b. акцепторный участок для сортазы содержит (или состоит из) L(A/P/S)X(T/S/A/C)(G/A), NPQTN, YPRTG, IPQTG, VPDTG или LPXTGS, где X представляет собой любую аминокислоту, и/или где донорный участок для сортазы содержит (или состоит из) G или A, где n равен по меньшей мере 1; и/или
n
c. акцепторный участок для сортазы содержит (или состоит из) L(A/P/S)X(T/S/A/C)G, где X представляет собой любую аминокислоту, NPQTN, YPRTG, IPQTG, VPDTG или LPXTGS, где X представляет собой любую аминокислоту, и/или где донорный участок для сортазы содержит (или состоит из) G, где n равен по меньшей мере 1, и/или
d. сортаза представляет собой сортазу A (SrtA); и/или
e. полипептид содержит:
i. полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2 или 4;
ii. полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2 или 4;
iii. полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 2 или 4; или
iv. полипептидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 2 или 4.
3. Способ по п. 1 или 2, где полипептид содержит: по меньшей мере два акцепторных участка для сортазы; по меньшей мере два донорных участка для сортазы; или по меньшей мере один акцепторный участок для сортазы и по меньшей мере один донорный участок для сортазы.
4. Способ по п. 3, где по меньшей мере два участка различаются, предпочтительно где по меньшей мере два участка имеют различные аминокислотные последовательности,
где:
первый акцепторный или донорный участок для сортазы находится с C-концевой стороны от TM и второй акцепторный или донорный участок для сортазы находится с N-концевой стороны от нецитотоксической протеазы или ее протеолитически неактивного мутанта; или
первый акцепторный или донорный участок для сортазы находится с N-концевой стороны от нецитотоксической протеазы или ее протеолитически неактивного мутанта и второй акцепторный или донорный участок для сортазы находится с C-концевой стороны от TM.
5. Меченый полипептид, содержащий:
i. поддающуюся детекции метку, конъюгированную с полипептидом;
n
n
ii. аминокислотную последовательность, которая содержит L(A/P/S)X(T/S/A/C)G, где X представляет собой любую аминокислоту и n равен по меньшей мере 1, L(A/P/S)X(T/S/A/C)A, где X представляет собой любую аминокислоту и n равен по меньшей мере 1, NPQTN, YPRTG, IPQTG, VPDTG, LPXTGS, где X представляет собой любую аминокислоту;
iii. нецитотоксическую протеазу или ее протеолитически неактивный мутант;
iv. нацеливающую часть (TM), которая способна связываться с участком связывания на клетке-мишени; и
v. домен транслокации,
где меченый полипептид не имеет сниженную эффективность по сравнению с эквивалентным немеченым полипептидом и/или где меченый полипептид демонстрирует сходное связывание клеток, транслокацию и расщепление белка SNARE с эквивалентным немеченым полипептидом.
n
n
n
n
6. Меченый полипептид по п. 5, где аминокислотная последовательность, которая содержит L(A/P/S)X(T/S/A/C)G, L(A/P/S)X(T/S/A/C)A, NPQTN, YPRTG, IPQTG, VPDTG или LPXTGS, , находится с C-концевой стороны от TM, или где аминокислотная последовательность, которая содержит L(A/P/S)X(T/S/A/C)G, L(A/P/S)X(T/S/A/C)A, NPQTN, YPRTG, IPQTG, VPDTG или LPXTGS, находится с N-концевой стороны от нецитотоксической протеазы или ее протеолитически неактивного мутанта.
n
n
7. Меченый полипептид по п. 5 или 6, содержащий дополнительную поддающуюся детекции метку, конъюгированную с полипептидом, и дополнительную аминокислотную последовательность, которая содержит L(A/P/S)X(T/S/A/C)G, где X представляет собой любую аминокислоту и n равен по меньшей мере 1, L(A/P/S)X(T/S/A/C)A, где X представляет собой любую аминокислоту и n равен по меньшей мере 1, NPQTN, YPRTG, IPQTG, VPDTG или LPXTGS, где X представляет собой любую аминокислоту.
8. Меченый полипептид по п. 7, где
a. (первая) аминокислотная последовательность отличается от дополнительной (второй) аминокислотной последовательности; и/или
b. (первая) аминокислотная последовательность находится с C-концевой стороны от TM и дополнительная (вторая) аминокислотная последовательность находится с N-концевой стороны от нецитотоксической протеазы или ее протеолитически неактивного мутанта; или
(первая) аминокислотная последовательность находится с N-концевой стороны от нецитотоксической протеазы или ее протеолитически неактивного мутанта и дополнительная (вторая) аминокислотная последовательность находится с C-концевой стороны от TM; и/или
полипептид содержит
i.полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 70% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 26;
ii. полипептид содержит полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 26;
iii. полипептид содержит полипептидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 26, или
iv. полипептидную последовательность, представленную как SEQ ID NO: 26.
9. Способили меченый полипептид по любому из пп. 1-8, где нецитотоксическая протеаза содержит L-цепь клостридиального нейротоксина; и/или
где домен транслокации включает домен транслокации клостридиального нейротоксина; и/или
C
где TM представляет собой H-пептид клостридиального нейротоксина.
10. Способили меченый полипептид по любому из пп. 1-9, где полипептид представляет собой клостридиальный нейротоксин; и/илигде полипептид представляет собой ботулинический нейротоксин (BoNT); и/или
где полипептид выбран из: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X или TeNT.
С
11. Способ или меченый полипептид по любому из пп. 1-8, где полипептид лишен функционального домена Hклостридиальногонейротоксина.
12. Меченый полипептид, который может быть получен способом по любому из пп. 1-4 или 9-11.
13. Способ анализа полипептида, включающий:
a. приведение клетки-мишени в контакт с меченым полипептидом по любому из пп. 5-12; и
b. детекцию поддающейся детекции метки.
14. Способ или меченый полипептид по любому из пп. 1-12, где поддающаяся детекции метка представляет собой флуоресцентный краситель, предпочтительно где флуоресцентный краситель выбран из: HiLyte, AlexaFluor, Atto, Quantum Dots и Janelia Fluor.
15. Способ или меченый полипептид по любому из пп. 1-12 или 14, где меченый полипептид содержит две или более поддающихся детекции меток, предпочтительно где две или более поддающихся детекции меток представляют собой флуорофоры разного цвета.