СПОСОБ ОЦЕНКИ ЗРЕЛОСТИ КОЛЛАГЕНОВЫХ ВОЛОКОН
METHOD FOR COLLAGEN FIBRE MATURITY EVALUATION

Изобретение, относится к биологии и медицине, в частности к биологии соединительных тканей, и касается способа оценки зрелости коллагеновых волокон.
Известен способ изучения зрелости коллагеновых волокон, включающий исследование биологического материала с помощью просвечивающей электронной микроскопии, основанный на различии диаметра (свыше 6 раз) коллагеновых волокон человеческого плода на различных сроках развития [1]. Недостатком данного метода является невозможность оценить структурно-функциональную зрелость коллагеновых волокон в одном образце вследствие совпадения диаметров коллагеновых волокон вне зависимости от уровня созревания и вследствие этого имеющих различные механические свойства.
Известен способ изучения коллагеновых волокон [2], в основе которого авторами положен принцип изучения поперечной исчерченности коллагенового волокна при воздействии различных температур, изменении среды и рН раствора, в которой находился коллаген. Показана лонгитудинальная повторяемость зон между щелью и зоной перекрытия отдельных фибрилл, именуемой в дальнейшем разрешенностью поперечной исчерченностью (D-периодичностью) [3, 4], исследуется изменение трехмерной организации фибрилл, а также свойств коллагенового волокна при его обводнении. Однако, по нашему мнению, данное исследование затрагивает только определение структуры коллагенового волокна, не показывает степень жесткости данного волокна и его зрелости, что очень важно для понимания процесса фибриллогенеза и не отражает рапарационные свойства той или иной тканевой структуры.
Наиболее близким к заявляемому по физической сущности и достигаемому эффекту является также способ (принятый за прототип) определения структурной зрелости коллагеновых волокон с помощью просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения [5], основанный на изучении тинкториальных свойств (в частности, плотности) коллагеновых волокон при различной степени зрелости. К недостаткам этого метода можно отнести его высокую трудоемкость, связанную со сложной предварительной подготовкой исследуемых биологических образцов (включающей например: дегидратацию (сушку), травление, пропитку, замораживание, нанесение проводящего слоя), при которой возникают значительные артифициальные изменения. В силу особенностей метода он не позволяет судить о степени организации поперечной D-периодичности коллагенового волокна.
Задачей данного изобретения является создание способа, позволяющего на основе изучения показателя механической жесткости коллагеновых волокон и степени организации поперечной D-периодичности, в литературе обычно именуемых степенью разрешенности поперечной исчерченности, судить о степени и времени созревания этих волокон, что, в свою очередь, позволяет судить о биомеханических свойствах изучаемой соединительной ткани.
Поставленная задача решается тем, что биологические материалы (коллагеновые волокна с различной степенью зрелости) изучаются с помощью сканирующего зондового микроскопа в прерывисто-контактном режиме [6] в воздушной среде с определением механической жесткости коллагенового волокна и степени разрешенности поперечной D-исчерченности.
В соответствии с заявленным способом предварительно полученный биологический материал (биоптат, полученный при различных оперативных (в том числе и эндоскопических) вмешательствах или аутопсийный материал, взятый в ходе экспериментальных исследований) фиксируют в 10% растворе нейтрального формалина, заливают в парафин. Срезы изготавливают на микротоме, после чего они помещаются на поверхности предметного стекла с последующей химической очисткой от парафина с помощью ксилола.
При изучении биологического материала по предложенному способу участки соединительной ткани исследуются с помощью сканирующего зондового микроскопа (СЗМ) в методе измерения рельефа, при котором изображение формируется на основе изменения положения кантилевера (гибкой консоли с зондом) при взаимодействии с поверхностью и отражает топографические особенности образца. Кроме этого, исследование производится и в методе фазового контраста, при котором изображение формируется на основе регистрации сдвига фазы колебаний кантилевера при взаимодействии с поверхностью в процессе сканирования и отражает как топографичекие особенности, так и изменение упругих характеристик поверхности исследуемого образца, что позволяет выявить характерную структуру коллагеновых фибрилл (поперечная исчерченность) и отличия в жесткости отдельных коллагеновых волокон. С целью установки степени поперечной разрешенности оценивалась высота шага между щелью и зоной перекрытия отдельных фибрилл с помощью Фурье-анализа (Image Analysis 3, NT-MDT) из анализа профилей поперек и вдоль оси фибрилл на топографических изображениях, предварительно обработанных нелинейным фильтром высоких частот с помощью программы Image Analysis 3 (NT-MDT). Аналогично оценивались диаметр коллагеновых структур и период их исчерченности (D-размер). При этом учитывалось, что количество ковалентных сшивок между молекулами тропоколлагена для новообразованной ткани меньше, чем в зрелой [4], что сопровождается низкой жесткостью новообразованных фибрилл и малой высотой шага между щелью и зоной перекрытия, по сравнению со зрелыми. В свою очередь, жесткость коллагеновых волокон оценивалась изменением сдвига фазы опорных колебаний кантилевера (изменение фазового контраста).
Гистологические срезы зоны оперативного вмешательства при склеропластических операциях были приготовлены по методике, описанной выше. Оперативное вмешательство производилось на половозрелых кроликах породы Шиншилла в возрасте от 1 года до 2 лет с массой тела от 3 кг до 3,5 кг. При этом животным в теноново пространство глаза под местной анестезией имплантировали биологический контейнер размерами 10,0±1,0×2,0±0,5 мм. Биоконтейнер представлял из себя отрезок вены пуповины человека и был наполнен нанодисперсной плацентой, полученной методом механоактивации [7]. Морфологические исследования тканей глаз животных, забитых согласно «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных», производили через 2 месяца после пересадки.
Исследование поверхности гистологических срезов зоны оперативного вмешательства при склеропластических операциях проводилось на сканирующей зондовой лаборатории Ntegra (NT-MDT) и сканирующем зондовом микроскопе Solver Pro (NT-MDT) в прерывисто-контактной методике на воздухе. Использовались поликремневые кантилеверы HA_NC c резонансной частотой 200 кГц, радиусом закругления 10 нм и высоким аспектным соотношением.
В зоне оперативного вмешательства на поверхности склеры отмечалось формирование новообразованной соединительной ткани, которая по жесткости приближалась к интактной склере, отдаленной от зоны имплантации. Темные области на СЗМ-изображении в режиме фазового контраста (соответствующим меньшим значениям сдвига фазы кантилевера) (фиг.1б, участок 2) соответствуют более жестким зрелым коллагеновым волокнам и обладают хорошо разрешенной поперечной исчерченностью на СЗМ-изображении в методе измерения рельефа (фиг.1а, участок 2). В то же время участки с новообразованными волокнами, обладающими меньшей жесткостью на СЗМ-изображении в режиме фазового контраста (фиг.1б, участок 1), имеют и слабо разрешенную поперечную исчерченность (фиг.1а, участок 1).
При этом периоды поперечной исчерченности для зрелых и новообразованных коллагеновых волокон, определенные из изображений, полученных методом атомно-силовой микроскопии (АСМ), с помощью Фурье-анализа (Image Analysis 3, NT-MDT) спектральных частот, практически не отличаются, 69.4 нм для зрелых коллагеновых волокон и 69.7 нм для новообразованных коллагеновых волокон соответственно. Полученные значения D-размера согласуются с данными АСМ и просвечивающей электронной микроскопии [1, 8-11] для дегидратированных коллагеновых фибрилл. Высота шага между щелью и зоной перекрытия для зрелых фибрилл составляет 28-29 нм (фиг.1г), в то время как для новообразованных коллагеновых фибрилл эта величина не постоянна и изменяется в широком диапазоне значений от 14 до 24 нм (фиг.1в) соответственно.
Анализ проведенных исследований биологического материала методом (описанным выше) показывает, что упрощение заявленного способа по сравнению с прототипом достигается благодаря исключению многих операций подготовки образца, часть из которых является весьма дорогостоящими. Само исследование по заявленному способу проводится на воздухе, при минимальных дополнительных воздействиях на образец, что исключает артифициальные изменения материала, обусловленные его обработкой, и приводит к упрощению метода. И, наконец, в заявленном способе степень зрелости коллагеновых волокон оценивается по двум параметрам: жесткости отдельных коллагеновых волокон и разрешенности поперечной исчерченности, что делает оценку степени зрелости коллагеновых волокон более достоверной.
Отметим также, что в способе-прототипе разрешенность поперечной исчерченности вообще не оценивается. Это связано с физическими особенностями получения изображений в электронной просвечивающей микроскопии, где изображения формируются на основе электронного контраста и являются двухмерными. В заявленном способе изображение формируется на основе регистрации перемещения кантилевера при взаимодействии с поверхностью и является псевдо-трехмерным.
Таким образом, создан способ оценки степени зрелости коллагеновых волокон, позволяющий разделять коллагеновые волокна, имеющие различную степень зрелости, в одном образце.
Предлагаемый способ наряду с упрощением способа обеспечивает повышение достоверности результатов.