Молекулярно-клеточные механизмы терапевтического действия / пробиотиков

гЕПАРАТЫ

МОЛЕКУЛЯРНО-КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ ПРОБИОТИКОВ

Бондаренко В. М.

НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, Москва

Рассмотрены данные о молекулярно-клеточных механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков. В основе действия указанных препаратов лежит способность поверхностных структур и ДНК интродуцентов взаимодействовать с Toll-подобными рецепторами (TLR), в значительной мере зависящей от штамма-пробиотика. Отсюда очевидна необходимость оценки иммунологического эффекта пробиотика, опосредованного его взаимодействием с TLR, что позволяет выбрать оптимальной препарат для применения в конкретном клиническом случае.

Ключевые слова: пробиотики, То11-подобные рецепторы, микрофлора.

\_,_/

Пробиотические препараты широко применяются в медицинской практике для нормализации микробио-ты человека, профилактики и лечения различных заболеваний желудочно-кишечного тракта, включая дисби-отические состояния, ожирение, диабет I типа, опухолевые процессы и др. [1, 2, 8, 13, 23]. Целью настоящего сообщения является анализ данных по молекулярно-биологическому механизму действия пробиотических бактерий, входящих в состав лечебно-профилактических препаратов.

Полагают, что эффект действия пробиотиков тесным образом связан с приживлением бактерий-симбионтов на слизистой кишечника, биологической активностью их метаболитов, а также иммуностимулирующей активностью, ассоциированной со способностью пробиотических штаммов и их антигенных комплексов взаимодействовать с ТоН-подобными рецепторами [3, 9, 24, 26]. В экспериментах на лабораторных животных и в испытаниях на людях показано, что после перорального введения живые бифидобактерии и лак-тобациллы в течение 1-2 нед. приживаются на слизистой кишечника и, таким образом, индуцируют процесс нормализации кишечной микрофлоры. Позитивное действие живых пробиотических бактерий на организм может быть связано с конкуренцией за питательные вещества и рецепторы адгезии на эпителии, подавлением роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов за счет синтеза различных антибиотикопо-добных веществ, органических кислот и других метаболитов, и предотвращения поступления бактериальных токсинов из просвета кишечника в системный кровоток [1, 2, 3, 25, 27].

Общепринятым является мнение о том, что пробиотики обладают иммуностимулирующим действием. Показано, что живые нейтрофилы при взаимодействии с жизнеспособными бактериями производственных

штаммов В. bifidum 1, L. plantarum 8Р-АЗ и Е. coli М-17 in vitro формируют во внеклеточном пространстве сете-подобные внеклеточные ловушки, максимально выраженные при взаимодействии с бифидобактериями [4].

Важным является контакт вводимых пробиотических бактерий с образраспознающими рецепторами эпителиальных и иммунокомпетентных клеток, в частности, с ТоИ-подобными рецепторами (TLR). Подробные сведения об образраспознающих рецепторах приведены в ряде обзоров [5,6,7, 11 ]. В настоящее время известны три семейства ОРР: NOD-рецепторы, маннозо-лек-тиновые рецепторы и TLR. Все эти рецепторы являются сигнальными, т. е., они распознают различные образы, так называемые лиганды, принадлежащие, главным образом, микроорганизмам и вирусам, оповещают об их приходе и запускают каскад реакций, обеспечивающих передачу сигнала к ядру иммунокомпетентной клетки. Передача сигнала от всех этих рецепторов проходит с использованием адапторной молекулы MyD88 и транскрипционного фактора NF-kB, и приводит к продукции целого спектра различных медиаторов: провос-палительных и противовоспалительных цитокинов, интерферонов, катионных противомикробных пептидов, стимуляции процессов регенерации, апоптозу и др. Транскрипционный фактор NF-kB представлен группой консервативных плазматических белков, присутствующих во всех клетках человека. При стимуляции эти белки перемещаются в ядро, где связываются с промоторными участками многих генов, обеспечивая их экспрессию. Мишенями служат гены, кодирующие синтез ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ФНО-а, ГМ-КСФ, ИФ-у, а также адгезивных молекул межклеточного взаимодействия, острофазных белков, NO-синтазы, циклооксигеназы-2, ß-дефенсины, молекул главного комплекса гистосовместимости и регуляторов апопто-за [6, 15, 16].

TLR обнаружены у клеток эпителия, эндотелия, моноцитов и макрофагов, полиморфно-ядерных лейко-

е

цитов, дендритных клеток, то есть, у клеток, в первую очередь вступающих в контакт с чужеродными агентами. У человека идентифицировано наличие одиннадцати TLR, распознающих различные в основном экзогенные и некоторые эндогенные молекулярные структуры. Установлено, что TLR1 формирует гетеродимеры с TLR2 и распознает триациловые липопептиды. TLR2 во взаимодействии с TLR1 и TLR6 распознает пепти-догликан, липопептиды и липопротеины грамположи-тельных бактерий, липопротеины микоплазм и зимозан дрожжевых грибов. TLR3 распознает двунитевую РНК, a TLR4 вместе с внеклеточными белками MD2, CD14 и LBP (LPS binding protein) распознает бактериальные липополисахариды. TLR5 распознает бактериальные флагеллины. TLR6 в ассоциации с TLR2 узнает диаци-ловые липопептиды. TLR7 и TLR8 распознают однони-тевую РНК, a TLR9 — неметилированные дезоксцити-дил-фосфат-дезоксигуанозин (CpG) структуры. Лиганды TLR10 и TLR11 пока не идентифицированы [3, 5, 6].

Хотя различные TLR взаимодействуют с разными лигандами, дальнейший сигнальный путь, инициированный этим взаимодействием, является общим для большинства рецепторов. Этот путь включает взаимодействие с протеином MyD88. отвечающим за дифференциацию миелоидов. Рецепторы TLR мобилизуют MyD88, используя домен TIR (Toll-IH receptor), являющийся рецептором интерлейкина 1. Дальнейшая передача сигнала осуществляется через протеинкиназу IRAK, ассоциированную с IL-1R, и через фактор TRAF6, ассоциированный с рецептором TNF-a, вызывает активацию фактора NF-kB и МАР-киназы, что ведет к экспрессии различных биологически активных молекул, указанных выше. Совокупность TLR и других рецепторов обеспечивает распознавание целого ряда консервативных структур микроорганизмов и вирусов и развитие реакций врожденного и адаптивного иммунитета. Следует отметить, что реакция образования цитокинов на грамположительные и грамотрица-тельные бактерии-комменсалы может полностью меняться, когда моноциты дифференцируются в дедритные клетки [12].

Еще несколько лет тому назад, когда речь шла о функциях TLR, подразумевалась их способность распознавать структуры патогенных микроорганизмов. Однако многие лиганды, взаимодействующие с TLR, характерны не только для патогенов, но и для представителей нормальной микрофлоры. Было широко распространено мнение о том, что организм хозяина не отвечает воспалительной реакцией на нормальную микрофлору кишечника в связи с развитием у новорожденных местной толерантности. Полагали, что клетки кишечного эпителия отличают нормальную микрофлору от чужеродной патогенной в связи с тем, что TLR не реагируют на лиганды нормальной микрофлоры. Поэтому само собой полагали, 4toTLR не распознают лиганды проби-отических бактерий, которые в своем большинстве являются представителями нормальной микрофлоры человека. Однако сравнительно недавно было показано, что иммунная система кишечника в норме распознает и отвечает на антигены нормальной микрофлоры, и микрофлора влияет на экспрессию генов в клетках, презентирующих антигены [3, 17, 28]. Наиболее дока-

зательные данные о том, что лиганды нормальной микрофлоры кишечника взаимодействуют с TLR в физиологических условиях, были приведены в работе Rakoff-Nahoum S. с соавторами [20]. Было установлено, что распознавание комменсальной микрофлоры TLR осуществляется в физиологических условиях и это распознавание необходимо для поддержания кишечного гомеостаза. Авторы вызывали повреждения кишечного эпителия у мышей путем перорального введения декс-трансульфата натрия. У животных, дефектных по MyD88, тяжесть поражений кишечного эпителия, потеря веса и смертность были весьма высокими по сравнению с животными дикого типа. Несколько повышенная чувствительность к декстрансульфату натрия была обнаружена также у животных, дефектных по TLR4 или TLR2. У мышей с дефектным MyD88 гомеостаз кишечного эпителия, синтез протективных цитокинов, а также синтез цитопротективных белков теплового шока были нарушены и до и после обработки декстрансуль-фатом. Высокая чувствительность дефектных животных не была связана с избыточным ростом кишечной микрофлоры. Более того, подавление микрофлоры антибиотиками приводило к подавлению синтеза протективных цитокинов и к повышению чувствительности к повреждающему агенту. Введение животным ЛПС или липо-тейхоевой кислоты в относительно небольших дозах защищало животных от повреждающего действия декстрансульфата [20].

Таким образом, нормальная микрофлора кишечника постоянно взаимодействует с TLR и обеспечивает осуществление важных физиологических функций в организме животного. В связи с этим авторы рассмотренной выше работы полагают, что TLR имеют, по крайней мере, две функции: (1) защиту от инфекции и (2) поддержание тканевого гомеостаза. В осуществлении обеих функций очень важная роль принадлежит лигандам нормальной микрофлоры кишечника.

Установлено, что лактобациллы в норме активируют иммунную систему кишечника, взаимодействуя с TLR2, однако в эффектах действия различных пробиотичес-ких штаммов лактобацилл могут наблюдаться отличия. Так, бактерии L. acidophilus, L. casei и L. delbrueckii вызывали повышение содержания фактора некроза опухоли (TNFa) и интерферона (IFNg), а заметное повышение интерлейкинов IL-4 и IL-10 обнаруживали главным образом у животных, получавших L. delbrueckii и L. casei, тогда как существенное повышение продукции интерлейкинов IL-2 и IL-12 отмечено только при введении L.acidophilus [14]. В другой работе было показано, что при пероральном введении L. casei в основном активизировались клетки врожденной иммунной системы с увеличением содержания рецептора TLR2 и В-лимфоцитов, синтезирующих IgA, специфичных против L. casei, без повышения популяции Т-клеток, т. е. определяется клональное распределение популяции В-клеток [9]. Интересные данные были получены при изучении первичных культур эпителиальных клеток, изолированных от лабораторных животных, получавших с кормом пробиотические лактобациллы. Полученные первичные эпителиальные культуры, обрабатывали живыми или убитыми бактериями L. casei или Е. coli и сыворотками против TLR2 или TLR4. Исследования

ПРЕПАРАТЫ

выявили различия в концентрации интерлейкина IL-6, необходимого для дифференциации В-клеток, что позволило авторам сделать заключение о том, что эпителиальные клетки кишечника распознают и отличают пробиотические лактобациллы от патогенов, отвечая различными уровнями продукции цитокинов [18]. В другой работе при использовании таких же культур первичных эпителиальных клеток ободочной кишки показано также, что пробиотик L. rhamnosus (LGG) и бактерии Bacteroides ovatus и Е. coli взаимодействовали с TLR2 и с TLR4 соответственно и индуцировали синтез разных цитокинов, причем при совместном культивировании пробиотик LGG подавлял синтез цитокинов, индуцированный В. ovatus или Е. coli [19]. По-видимому, противовоспалительное действие LGG in vivo опосредовано его взаимодействием с TLR4. Это предположение подтверждается данными о том, что терапевтическое противовоспалительное действие пробиотиков при экспериментальном колите опосредовано ТоП-подобным рецептором, в частности, TLR9 [19]. В другой работе авторы изучали действие препарата VSL-#-3, содержащего 8 пробиотических штаммов: 3 бифидобактерий (В. longum, В. breve, В. infan-tis), 4 лактобацилл (L. casei, L. plantarum, L. Acidophilus, L. delbrieckii subsp. bulgaricus) и 1 симбиотических стрептококков (S. salivarius), при экспериментальном колите, вызванном введением декстрансульфата натрия мышам дикого типа и дефектным по адаптеру MyD88 или одному из рецепторов TLR2, TLR4 и TLR9. Мышам вводили в желудок или под кожу живые, облученные (g-лучами) или обработанные ДНК-азой бактериальные клетки пробиотика VSL#3, их ДНК (нативную или метилированную), а также ДНК E.coli и тимуса теленка. Введение ДНК пробиотика и E.coli смягчало выраженность течения колитов, в то время как метилированная ДНК пробиотика, ДНК тимуса теленка и клетки пробиотика, обработанные ДНК-азой, такого эффекта не давали. Тяжесть течения колитов снижалась в одинаковой степени при введении живых или убитых облучением пробиотиков. Мыши, дефицитные по MyD88, не реагировали на введение пробиотиков. У мышей, дефицитных noTLR2 или TLR4, выраженность течения колита существенно снижалась, тогда как при дефиците TLR9 терапевтический эффект полностью отсутствовал. Эти данные показывают, что терапевтическое действие пробиотиков обусловлено взаимодействием клеток пробиотика (живых или убитых облучением) или их ДНК с ТоИ-подобными рецепторами, особенно с TLR9 [19].

Все эти материалы показывают, что с ТоП-подобными рецепторами могут взаимодействовать и цельные клетки пробиотика, живые или убитые, и их компоненты. Так, пептидогликан лактобацилл активизирует Toll-подобные рецепторы, индуцирует заметный антиопухолевый эффект в толстой кишке и обусловливает развитие иммунной реакции типа Th 1, опосредованной активацией макрофагов пептидогликаном клеточной стенки бактерий [21].

Супернатанты Bifidobacterium breve индуцируют созревание, активацию и выживаемость дендритных клеток путем воздействия на TLR2, но не взаимодействуют с TLR4, TLR7 и TLR9 [ 10]. И в этом случае действу-

ющим началом супернатанта являлся пептидогликан клеточной стенки бактерий. Интересно отметить, что супернатант пролонгировал выживаемость дендритных клеток при высокой степени синтеза IL-10 и низкого уровня продукции IL-12 в отличие оттого, что наблюдалось при обработке дендритных клеток ЛПС. Более того, супернатант подавлял влияние ЛПС на дендритные клетки. По мнению авторов, супернатант оказывал регуляторное воздействие на профили дендритных клеток, ограничивая чрезмерный ответ по типу Th 1 и чрезмерную поляризацию Th2, которая наблюдается у новорожденных детей с атопией.

В другой работе было показано, что различные бактерии-комменсалы могут по разному участвовать в регуляции мукозного и системного иммунитета [13]. Авторы изучали реакцию двух типов антигенпрезенти-рующих клеток, моноцитов и дендритных клеток, на различные штаммы типичных бактерий кишечной микрофлоры. Очищенные человеческие моноциты и дендритные клетки, производные моноцитов, стимулировали УФ-инактивированными грамположительными бактериями L. plantarum и В. adolescentis и грамотри-цательными бактериями Е. coli и V. parvula. При этом было установлено, что моноциты продуцировали более высокие уровни IL-12 и TNF при стимуляции бактериями L. plantarum, чем при стимуляции бактериями Е. coli и V. parvula. В противоположность этому дендритные клетки, производные моноцитов, продуцировали большие количества IL-6, IL-10, IL-12 и TNF при стимуляции Е. coli и V. parvula, но не реагировали на L. plantarum и В.adolescentis. Слабый ответ на грамположительные бактерии коррелировал с низкой экспрессией на поверхности клеток TLR2. Таким образом, моноциты становятся неспособными реагировать на грамположительные пробиотические бактерии в связи с низкой экспрессией рецептора TLR2.

Известно, что пробиотическое действие некоторых штаммов обусловлено наличием в структуре их ДНК иммуностимулирующих олигонуклеотидов. Так, в результате изучения 9 штаммов Lactobacillus и 6 штаммов Streptococcus thermophilus было установлено, что иммуностимулирующей активностью обладала только ДНК из штамма L. bulgaricus NIAI В6, которая содержала CpG-подобный олигонуклеотид [14]. Сильная иммуностимулирующая активность была выявлена у одного из фрагментов ДНК штамма L. gasseri 2716, который содержал АТ-олигодезоксинуклеотиды с шес-ти-основной самостабилизирующейся петлей. Последовательность оснований ДНК с иммуностимулирующей активностью была обнаружена также у штамма Bifidobacterium longum ВВ536. ДНК этого штамма инги-бировала образование IgE В-клетками, что может объяснить механизм антиаллергического действия бактерий В. longum ВВ536 [14]. Липотейхоевые кислоты из штаммов Lactobacillus johsonii La1 и Lactobacillus acidophilus La10 подавляли ответ клеток кишечника человека НТ29 на эндотоксин грамотрицательных бактерий [27].

На основании рассмотренных материалов можно сделать заключение о том, что биологическое действие пробиотиков может быть обусловлено бактериальными клетками, живыми или убитыми, и их структурными

(Е

компонентами, в основе действия которых лежит их способность взаимодействовать с ТоП-подобными рецепторами, причем это взаимодействие может при-

Литература

1. Бондаренко В. М. // Фарматека. — 2005. — том. 20. №115. — С. 46-54.

2. Бондаренко В. М., Чупринина Р. П., Воробьева М. А.// Биопрепараты. — 2003. — №3. — С. 2-5.

3. Бондаренко В. М., Лиходед В. Г. // Иммунология. — 2009. — №5. — С. 317-320.

4. Долгушин И.И., Андреева Ю.С. // Журн. микро-биол. - 2009. - №2. - С. 70-73.

5. Ковальчук Л. В., Хорева Р. В., Варивода А. С.// Журн. микробиол. — 2005. — №4. — С. 96-104.

6. Хаитов Р. М., Пащенков М. В., Пинегин Б. В. // Иммунология. 2009. №1. С. 66-6.

7. Armant MA., Matthew Е. J.// Genom. Biol. — 2002. — V. 3. — №1. - P. 3011 -020.

8. Blandino G., Fazio D., Marco R.// Expert Rev.Anti Infect.Ther. — 2008. — V.6. — №4. — P. 497-508.

9. Galdeano С. M., Perdigon G.// Clin. Vaccine Immunol. — 2006. —V. 13. — №2. — P. 219-226.

10. Hoarau C., Lagaraine C., Martin L. et al.//J. Allergy Clin. Immunol. — 2006. — V. 117. — №3. — P. 696-702.

11. Janeway C. A.// Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biology. - 1989. -V. 54. - P. 1-13.

12. Karlsson H., Larsson P., Wold A. E., Rudin A.// Infect. Immun. — 2004. —V. 72. — №5. — P. 2671-2678.

13. Kaur I. P., Kuhad A., Garg A., Chopra K. J. Med. Food. - 2009. - V.12. - №2. — P. 219-235.

14. Kitazawa H., Watanabe H., Shimosato T. et al. // Int. J. Food Microbiol. — 2003. — V. 85. — №1 -2. — P. 11 -21.

15. Lan J. G., Cruickshank S. M., Singh J. C. et al.// World J.Gastroenterol. — 2005. — V. 11. — №22. — P. 3375-3384.

водить к неоднородным последствиям, что в значительной мере зависит от штамма пробиотика.

16. Medzhitov R. // Nature Rev. Immunol. — 2001. — V. 1. — №2. — P. 143-145.

17. Perdigon G., Galdeano C. M., Valdez J. C. et al. // Eur. J. Clin. Nutr. — 2002. — V. 56. — Suppl.4. - P. 21-26.

18. Pickard K. M., Bremner A. N., Gordon J. N. et al.// Best Pract. Res. Clin. Gastroenterol. — 2004. — V. 18. — №2. — P. 271-285.

19. Rachmilevitz D., Katakura K., Karmeli F. etal. //Gastroenterol. - 2004. - V. 126. - №2. - P. 520-528.

20. Rakoff-Nahoum S., Paglino J., Esmali-Varzaeh F. et al. // Cell. — 2004. — V. 118. — №2. — P. 229-241.

21. Sun J., Shi J. H., Le G. W., Ma X. Y //World J. Gastroenterol. — 2005. — V. 11. — №40. — P. 6330-6337.

22. Takahashi N., Kitazawa H., Shimosato T. et al. // FEMS Immunol.Med. Microbiol. — 2006. — V. 46. — №3. — P. 461-469.

23. Tennyson C. A., Friedman G. // Curr.Opin.Endocrinol. Diabetes Obes. — 2008. — V. 15. — №5. — P. 422-427.

24. Vinderola G., Matar C., Perdigon G. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. — 2005. —V. 12. — №9. — P. 1075-1084.

25. Ulevitch R. J. // Nature Rev. Immunol. — 2004. — V. 4.— P. 512-520.

26. Ventura M., O'Flaherty S., Claesson M. et al. // Nature Rev.Microbiol. — 2008. V. 7. — P. 61 V - 71.

27. Vidal K., Donnet-Hughes A., Granato D. // Infect. Immun. — 2002. — V.70. - №4. — P. 2057-2064.

28. Walter J. //AppI.Envir.Microbiol. — 2008. —V.74. — №16. — P. 4985-4996.

2