Дисферлинопатии: возможности диагностики, моделирования и генно-клеточной терапии

Обзоры

61

ОБЗОРЫ

Дисферлинопатии: возможности диагностики, моделирования и генно-клеточной терапии

И.Г. Старостина 1, В.В. Соловьева 1, К.С. Юрьева 2, К.Г. Шевченко 2, В.П. Федотов 3, А.А. Ризванов 1, Р.В. Деев 2, А.А. Исаев 2

1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань

2 Институт стволовых клеток человека, Москва

3 Воронежская областная клиническая больница № 1, Воронеж

Modeling and gene therapy of dysferlinopathy

I.G. Starostina 1, V.V. Solovyeva 1, K.S. Yuryeva2, K.G. Shevchenko 2, V.P. Fedotov 3, A.A. Rizvanov1,

R.V. Deev2, A.A. Isaev2

1 Kazan federal university, Kazan

2 Human Stem Cells Institute, Moscow

3 Voronezh Regional Clinical Hospital № 1, Voronezh

Дисферлинопатии — группа нервно-мышечных болезней аутосомно-рецессивного типа наследования, при которых происходит нарушение экспрессии мРНК и (или) функции белка дисферлина в скелетной мышечной ткани, что обусловлено мутациями в гене DYSF (англ. dystrophy-associated fer-1-like). Частота заболевания 1:200 000 новорожденных. К дисферлинопатиям относят такие типы заболеваний, как миопатия Миоши (ММ), с первичным поражением дистальных сегментов нижних конечностей, поясно-конечностная мышечная дистрофия типа 2В (ПКМД 2В), в основном с поражением проксимальных сегментов конечностей, дистальная миопатия с первичным поражением передней группы мышц голени, а также вторичные дисферлинопатии, возникающие при кавеолино- и кальпаинопатиях. В настоящем обзоре рассмотрены, структура белка дисферлина, его функции, а также клинические фенотипы, известные экспериментальные модели и стратегические подходы к терапии дисферлинопатий.

Ключевые слова: дисферлинопатии, дисферлин, миопатия Миоши, поясно-конечностная мышечная дистрофия, дистальная миопатия с первичным поражением передней группы мышц голени.

Введение

Поясно-конечностные мышечные дистрофии (ПКМД) — обширная группа наследственных мышечных заболеваний, характеризующихся выраженным клиническим полиморфизмом и значительной генетической гетерогенностью. К настоящему времени описано более 40 локусов ПКМД, для 37 из них идентифицированы гены, мутации в которых ответственны за развитие мышечных дистрофий. Клиническая картина ПКМД характеризуется прогрессирующей слабостью и атрофией мышц конечностей и туловища, приводящих к параличам и инвалидности.

Dysferlinopathies is a group of autosomal-recessive inherited neuromuscular diseases, which are characterized by defect in mRNA expression or in functionioning of dysferlin protein, appearing in about 1/200 000 births. Dysferlin is encoded by DYSF gene (Dystrophy-associated fer-1-like). It's disruption can cause various types of primary dysferlinopathies, which include Miyoshi myopathy (MM), Limb-girdle Muscular Dystrophy type 2B (LGMD2B) and distal myopathy with anterior tibial onset. Also, dysferlin deficiency can be associated with other diseases, such as caveolin- and calpainopathies. Here we discuss dysferlin protein structure and function, it's clinical phenotypes, known animal models and developing treatment strategies for dysferlinopathies.

Key words: dysferlinopathy, dysferlin, Miyoshi myopathy, limb girdle muscular dystrophy, distal myopathy with anterior tibial onset.

Дебют заболеваний приходится преимущественно на молодой и реже детский возраст, что обусловливает их высокую медико-социальную значимость.

История первых описаний ПКМД восходит к середине XIX столетия, когда усилиями клиницистов-неврологов и патоморфологов были приведены и выделены в отдельные нозологические формы семейные наблюдения больных с развитием мышечных атрофий и параличей, получивших имена авторов их описавших (детская псевдогипертрофическая форма Дюшена, юношеская форма Эрба, лице-

e-mail: rizvanov@gmail.com, romdey@gmail.com

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

62

Обзоры

плече-лопаточная форма Ландузи — Дежерина). В ХХ столетии было продолжено описание новых форм миопатий, что неизбежно привело к необходимости создания классификации, отражающей современные представления о данной группе заболеваний. Классификация основана как на особенностях клинической картины ПКМД (возраст дебюта, локализация мышечных атрофий, темп прогрессирования), так и генетических, а теперь и молекулярногенетических данных.

В 1995 г. по результатам встречи международного консорциума по изучению LGMD — Limb-Girdle Muscular Dystrophy (ПКМД) в Наардене (Голландия) была принята международная номенклатура наименования ПКМД на основе типа наследования, хронологического порядка описания заболевания и локуса каузативного гена (табл. 1). В случае ауто-сомно-доминантного типа наследования присваивается «1» (LGMD1), а при аутосомно-рецессивном наследовании — тип «2» (LGMD2). Последующие за цифрой латинские буквы кодируют локус гена, мутации которого приводят к ПКМД данного типа. Так заболевание, связанное с дефицитом кальпаина-3, картированного в локусе 15q15, обозначено ПКМД тип 2А, другой локус для гена дисферлина (2p13) получил обозначение ПКМД 2В.

Классические описания ПКМД представлены развитием мышечных атрофий и парезов в первую очередь и преимущественно проксимальных сегментов конечностей (плечевого и тазового поясов). Первое описание дистальной формы миопатии, развивающейся после 40-летнего возраста с поражением мышц кистей и предплечий в дебюте, с аутосом-но-доминантным типом наследования (локус 2р13) принадлежит Welander (1951).

Японским исследователем К. Миоши с соавторами в 1967 году впервые была описана дистальная миопатия с рецессивной формой наследования у четырех больных из двух кровнородственных семей, со значительно повышенным уровнем креатинкиназы в сыворотке крови, которая в последующем получила название «миопатия Миоши» [1, 2]. Клинические проявления миопатии Миоши имеют сходство с ПКМД 2В. Локус ПКМД 2В был впервые картирован в семьях больных с преимущественно проксимальной мышечной дистрофией, начинающейся в позднем подростковом возрасте (в 15—25 лет), которые в детстве имели нормальную подвижность. Дебют мышечной слабости и атрофии приходится на мышцы тазового пояса (ягодичные, бедренные), в то время как мышцы голени и плечевого пояса с медленным прогрессированием поражаются позднее и менее выражено. У небольшого количества больных на ранних стадиях заболевания зарегистрирована гипертрофия икроножной мышцы, как переходный синдром к атрофии. Также на ранних стадиях для этой формы редкими были контрактуры [3].

Молекулярно-генетические методы в конце ХХ столетия позволили подтвердить или отвергнуть нозологическую самостоятельность многих из описанных форм ПКМД. В 1994 г. группой I. Richard впервые был выявлен ген, мутации в котором связаны с развитием ПКМД. Им стал ген CAPN3, кодирующий белок кальпаин, недостаточность которого приводит к формированию ПКМД 2А[4]. Дальнейшие исследования показали во-

влечение и других генов в патогенез ПКМД различных типов.

В 1995 г. при изучении 12 семей, пять из которых были кровнородственными, K. Bejaoui с соавторами картировал ген миопатии Миоши в сегменте 2p14—p12 [5]. В 1996 г. Т. Weiler с соавторами отметили в больших семьях канадских индейцев из племени Манитоба наличие у одних больных клинических признаков миопатии Миоши, а у других поясно-конечностной мышечной дистрофии [6]. Ранее I. Mahjneh с соавторами зарегистрировали подобные феномены в нескольких семьях Палестинских арабов [7]. Внутрисемейный клинический полиморфизм был отмечен в большой 6-поколен-ной аварской семье из Дагестана, исследованной группой С.Н. Иллариошкина в 1996 г., в которой из 12 пациентов у 3 были проявления миопатии Миоши, а у 7 ПКМД тип 2В. Ген аутосомно-рецес-сивной ПКМД, выявленной в данной семье был картирован в локусе хромосомы 2р13. В последующем ДНК анализе у всех больных в этой семье была обнаружена одна и та же мутация в гене DYSF, с заменой p.Val67Asp, что свидетельствует о единой молекулярно-генетической природе миопатии Миоши и ПКМД тип 2В [8].

В 1998 году при исследовании локуса MM/ПКМД 2В сегмента 2p13, две независимые лаборатории клонировали ген дисферлина и показали, что ММ и ПКМД 2В вызваны дефектом в одном и том же гене DYSF [9, 10].

K. Bushby с соавторами в 1998 г. предложила объединяющий термин «дисферлинопатии» для миопатии Миоши (ММ) и ПКМД 2В, которые определяются как аллельные состояния, обусловленные мутациями в гене дисферлина (DYSF) [11]. В настоящее время термин характеризует различные клинические фенотипы, связанные с нарушением экспрессии гена и функции белка дисферлина.

Клиническая характеристика

дисферлинопатии

Для дистальной миопатии Миоши характерен аутосомно-рецессивный тип наследования и медленная прогрессия мышечной слабости и атрофии, распространяющихся первоначально на икроножную мышцу, начиная с позднего подросткового, реже с детского возраста. На ранней стадии заболевания повышаются уровни «мышечных ферментов», таких как креатинкиназа, альдолаза и др. С течением времени мышечная слабость может распространяться на дистальные мышцы таза и верхних конечностей (избирательное поражение бицепса плеча) [12—14]. Характерной клинической картиной миопатии Мио-ши является уменьшение икроножных мышц в объеме и их атрофия.

Ферлин-1-подобные белки

Дисферлин относится к семейству ферлин-1 подобных белков, которое включает в себя также ото-ферлин (Fer1L2) [15], миоферлин (Fer1L3) [16, 17], ферлины Fer1L4, Fer1L5 и Fer1L6. Каждый белок содержит несколько кальций-связывающих C2 доменов и С-концевой трансмембранный домен, отвечающий за связывания белка с мембраной. Ферлин-1-подобные белки имеют гомологию с белком FER-1 Caenorhabditis elegans (нематода).

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

Обзоры

63

Таблица 1. Классификация поясно-конечностных мышечных дистрофий

Продукт гена (символ) Кол-во экзонов Тип мутации Локализация мутаций, встречаемость в популяции

Дисферлин (Dysferlin, DYSF) ~55 Миссенс-мутации, короткие делеции и дупликации Мутации распределены по гену и, по-видимому, впервые открыты у населения евреев Ливии

Кальпаин 3 (Calpain 3, CAPN3) 24 Преимущественно миссенс-мутации, небольшие делеции и мутации в сайтах сплайсинга Мутации распределены по гену. Впервые открыты мутации в Амиш, Реюньон, Баск и Турецких популяциях. Иногда с низкой частотой наблюдаются ревертанты

а-Саркогликан (Sarcoglycan, SGCA) 8 Нонсенс-мутации, мутации сайтов сплайсинга, дупликации миссенс-мутаций Обычно мутации происходят в экзоне 3 или во внеклеточном домене. Наиболее частые мутации - R77C (~40% всех мутаций). Описано несколько повторяющихся мутаций

p-Саркогликан

у-Саркогликан

5-Саркогликан (SGCD) 9 Одиночные нуклеотидные замены или делеции Не описаны

Экспрессия белка FER-1 у C. elegans происходит в первичных сперматоцитах, где он необходим для созревания подвижных сперматозоидов. FER-1 белок опосредует кальций-зависимое слияние мембран нескольких внутриклеточных органоидов с плазматической мембраной сперматид во время сперматогенеза [18]. У гомозиготных мутантов по FER-1, сперматидные мембранные органоиды не соединяются с плазматической мембраной во время сперматогенеза, что приводит к образованию неподвижных сперматозоидов и бесплодию [19]. Достаточно одной аминокислотной замены в любом из трех C2 доменов FER-1 для нарушения слияние мембранных органоидов, что изменяет чувствительность этого белка к ионам Ca2+.

Белок миоферлин обладает наивысшей гомологией к дисферлину, среди семейства ферлин-1 подобных белков. Миоферлин присутствует в сарколемме скелетных мышц, но, в отличие от дисфер-лина, в большом количестве находится в ядре [17]. Миоферлин необходим при слиянии миобластов с мышечными волокнами в процессах рабдомиоги-стогенеза (дифференцировки и роста поперечно-полосатой скелетной мышечной ткани). Нокаут гена миоферлина у мышей приводит к атрофии мышц

[20] . Миоферлин и дисферлин выполняют, по-видимому, разные функции, о чем свидетельствует отсутствие компенсационного повышения экспрессии миоферлина в мышцах при дисферлинопатии

[21] . До сих пор не обнаружена связь миоферлина с какими-либо заболеваниями человека.

Ген отоферлина в основном экспрессируется в клетках улитки и вестибулярного отдела внутреннего уха, головного мозга, хотя низкий уровень экспрессии гена показан и для других органов, включая легкие, почки, скелетные мышцы и сердце. Мутации в гене отоферлина приводят к несиндромной глухоте у людей, известной как DFNB9 (англ. OTOF-Related

Deafness, Nonsyndromic Hearing Loss) [15]. Недавние исследования показали, что отоферлин важен для последнего этапа синаптического экзоцитоза везикул и может выступать в качестве главного Caг+-воспринимающего элемента, инициируя синаптическое везикулярно-плазматическое мембранное слияние [22].

Белки Fer1L4, Fer1L5 и Fer1L6 были обнаружены у человека и мыши, но еще не достаточно исследованы.

Дисферлин и его функции

Дисферлин — трансмембранный белок (230 кДа), который локализуется как на цитоплазматической, так и на мембране эндоплазматического ретикулума. 2080 аминокислот формируют семь С2 доменов, два DysF домена и один мембран-связывающий С-концевой домен [23]. Функция DysF доменов на настоящий момент не известна. С2 домены обладают способностью связывать фосфолипиды и белки Са2+-зависимым способом, наиболее выраженной для С2А-домена. Для остальных С2 доменов показана роль в образовании функциональных димеров белка [24]. Белок экспрессируется в клетках различных тканей и органов, в том числе помимо скелетных и сердечной мышцах, в почках, плаценте и в головном мозге [10]. В центральной нервной системе, дисферлин может играть роль в изменении проницаемости гематоэнцефалического барьера [25] Повышение проницаемости капилляров почечных клубочков коррелирует с дефицитом дисферлина в подоцитах [26]. Снижение содержания этого белка в синцитиотрофобласте плаценты не препятствует ее функционированию. В то же время, исследователи из института Огайо выявили пониженный уровень дисферлина в ряде тяжелых случаев преэклампсии [27]. В мышечной ткани снижение содержания дисферлина до уровня 20% от физиологического

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

64

Обзоры

выявлено при первичной дисферлинопатии. Кроме того, возможны вторичные дефицитные состояния, например при наследственном дефиците кальпаи-на-3 и кавеолина-3 [28]. Также дисферлин может участвовать в рабдомиогенезе [29]

Роль дисферлина в репарации сарколеммы

и во внутриклеточной везикулярной системе

Один из механизмов репарации мембраны требует присутствия внутриклеточных везикул [30], которые поставляют дополнительный мембранный материал для формирования «мембраного пэтча» («заплатки») через кальций-инициируемый везикулярный экзоцитоз [31, 32]. Такой способ репарации характерен для повреждений мембраны 30—50 нм [33] Исследование ультраструктурных изменений в скелетной мышце у пациентов с дисферлинопатией показало, что области под сарколеммой характеризуются множественным скоплением везикул. Также в самой сарколемме наблюдается множество обрывков и неровностей, в то время как в норме она должна быть непрерывной и гладкой [34, 35]. Была выдвинута гипотеза, что внутриклеточные везикулы изначально транспортируются в место повреждения путем последовательных действий моторных белков, в том числе кинезина и немышечного миозина IIA и IIB [36, 37], а процесс слияния везикул с мембраной опосредован другими белками. В ряде исследований показано, что внутриклеточные везикулы содержат кавеолин-3 [38] и DYSF, который связан с аннекси-нами A1 и A2 [39].

Некоторые исследования показали, что митсугу-мин 53 (mitsugumin 53, MG53) играет важную роль в облегчении транслокации везикул для мышечной репарации мембраны [40—45]. Взаимодействия между DYSF, MG53 и кавеолином-3 были показаны in vitro с помощью иммунопреципитации [40]. Таким образом, считается, что DYSF взаимодействует с MG53, аннексинами и другими белками в скоплении везикул в месте повреждения мембраны. В дополнение к MG53, аннексинам и кавеолину-3, DYSF может также взаимодействовать с AHNAK-белком (human neuroblast differentiation-associated protein) [46], аффиксином [47], S100A10 [48], кальпаином-3 [49], тубулином [50] и дигидропиридиновым рецептором (англ. dihydropyridine receptor, DHPR) [51].

На модели иммортализованнных «миобластов» пациентов с дисферлинопатией, S. Spuler определила пролонгированное время репарации мембраны после механического повреждения, по сравнению с аналогичной культурой миобластов здорового донора. При экспериментальном восстановлении функции дисферлина время репарации мембраны нормализовалось [52].

Роль дисферлина в развитии Т-трубочек

Недавние исследования показали, что DYSF играет активную роль в формировании Т-трубочек и взаимодействует с дигидропиридиновым рецептором (потенциал-зависимый кальциевый канал) в сарколемме [53, 54]. Предполагают, что дисфер-лин опосредует слияние микровезикул, содержащих кавеолин-3, с Т-трубочками. В связи с тем, что недостаток DYSF вызывает ультраструктурные нарушения в Т-трубочках скелетных мышц, была высказана гипотеза, что DYSF требуется для поддержания или развития Т-трубочек.

Роль дисферлина в высвобождении АТФ

и внутриклеточной сигнализации Ca2+

В ряде исследований показано, что DYSF может быть вовлечен в высвобождение АТФ и межклеточную Caг+-сигнализацию [55]. Было установлено, что DYSF опосредует Caг+-инициируемую межклеточную сигнализацию в ответ на повреждение мембраны у эмбрионов морских ежей: нокдаун экспрессии мРНК дисферлина с использованием морфолино-вых олигонуклеотидов у эмбрионов морского ежа эффективно блокирует высвобождение АТФ после повреждения мембраны и тем самым подавляет последующую межклеточную Caг+-сигнализацию [55]. В других исследованиях было показано, что недостаток DYSF в скелетных мышцах млекопитающих приводит к высвобождению АТФ или других эндогенных сигнальных молекул, таких как белки высокомобильной группы бокс-1 (high-mobility group box-1, HMGB1), S100 или белки теплового шока (heat-shock proteins, HSPs). Увеличение везикулярного трафика связывают с активацией компенсаторного пути синаптотагмин-подобного белка Slp2a и ГТФазы Rab27A. Была выдвинута гипотеза, что высвобождающиеся при этом эндогенные факторы, в том числе активируют воспалительный путь через Toll-подобные рецепторы и без участия экзогенной инфекции. Для рецептора Р2Х7 (АТФ-зависимый неселективный катионный канал млекопитающих) была показана активация воспалительного ответа при повышении уровня внеклеточного АТФ. [56]. В действительности, антагонист рецептора P2 снизил уровни креатинкиназы (КК) сыворотки крови и сократил повреждения мышц у дистрофин-дефицит-ных мышей mdx и у саркогликан-дефицитных хомяков BIO 14.6 [57]. Однако, данных о взаимосвязи между высвобождениями сигнальных молекул и недостатком DYSF на сегодняшний день недостаточно.

Роль дисферлина в фагоцитозе

Было показано, что моноциты, полученные от DYSF-дефицитных мышей и от человека с дисфер-линопатией, обладают повышенной фагоцитарной активностью [58]. Нокдаун экспрессии мРНК дисферлина путем РНК-интерференции в клеточной линии макрофагов J774 существенно усилил фагоцитоз. Однако, поскольку мышечно-специфичная трансгенная экспрессия DYSF на соответствующих уровнях (отделах) подавляет прогрессирование дистрофических изменений в модели дисферлино-патии у мышей [59, 60], усиленная фагоцитарная активность DYSF-дефицитных моноцитов не может считаться основным патогенетическим фактором повреждения мышц при дисферлинопатии.

Диагностика дисферлинопатии

Диагностика дисферлинопатии стала возможной с внедрением в повседневную практику иммунологических методов анализа и методов молекулярной генетики. Следует отметить, что для точной диагностики дисферлинопатии необходимо комбинированное применение различных методов.

Уровень креатинкиназы

Креатинкиназа (КК) — ключевой фермент клеточной энергетики, который стимулирует превращение креатинина в креатинфосфат и депонирует

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

Обзоры

65

энергию для мышечного сокращения. Повышенный уровень КК в сыворотке крови характерен для дистрофических и некротических процессов в мышечной ткани. Для дисферлинопатий установлен и сохраняется на протяжении всего заболевания высокий уровень КК в крови, как правило, превышающий норму в десятки раз (на ранних стадиях 50—100 раз). Наряду с симптомами слабости и атрофией дистальных мышц, значительное увеличение КК может указывать на миопатию Миоши и, следовательно, дисфер-линопатию. С течением времени, уровень КК и ее диагностическая информативность имеет тенденцию к снижению [61].

Электромиографические исследования

Электромиографические (ЭМГ) исследования при ПКМД в первую очередь позволяют установить топический уровень поражения нервно-мышечного аппарата. При игольчатой ЭМГ у больных ПКМД выявляется «миодистрофический» паттерн изменений в пораженных мышцах, что позволяет провести дифференциальную диагностику с наследственными моторно-сенсорными нейропатиями, для которых характерен нейрогенный тип нарушений электрогенеза. Это особенно актуально, когда у больного преобладает синдром вялого дистального пареза, «свисающих стоп» как при дистальной миопатии с первичным поражением передней группы мышц голени. В большинстве случаев дисферлинопатий отмечаются миогенные изменения, а скорость проводимости нерва остается в норме. Нейрогенные изменения могут быть выявлены на поздних стадиях мышечной дегенерации [61].

Лучевая визуализация

Независимо от типа дисферлинопатии, мышечная визуализация представляет интерес, особенно на ранних стадиях заболевания. Исследования путем магнитно-резонансной томографии (МРТ) или компьютерной томографии (КТ) нижних конечностей целесообразно применять для первичного обследования. Атрофия мышц обеих голеней указывает на миопатию Миоши, в то время как преобладание дистрофии в мышцах тазового пояса свидетельствует о ПКМД 2В. Атрофия мышц голеней с течением времени часто распространяется и на мышцы задней стороны бедра, задолго до того, как этот процесс достигнет клинического проявления. Нарушение структуры икроножных мышц часто предшествует появлению клинических симптомов. В некоторых немногочисленных случаях дистальная миопатия с первичным поражением передней группы мышц голени атрофия изначально визуализируется в передней большеберцовой мышце, однако с течением времени распространяется и на икроножную мышцу (как правило, в течение нескольких лет) [61].

Патогистологический и иммуногистохимический

анализ

Одним из патогистологических признаков дис-ферлинопатий является наличие некротического процесса в мышцах. На ранней стадии заболевания тканевые изменения могут быть минимальны, характерны признаки регенерации — волокна с центрально расположенными ядрами. Экспрессию дисферлина исследуют в основном с применением двух коммер-

чески доступных моноклональных антител (Hamlet-1 и Hamlet-2), обеспечивающих визуализацию снижения уровня или полное отсутствие дисферлина в мышце [62—64]. Исследование мышечной ткани у пациентов с дисферлинопатией на ультраструктурном уровне показали наличие в мембранах повреждений и накопление субсарколеммных везикул и вакуолей [61]. Также показано, что у пациентов с дисферлинопатией наблюдаются амилоидоподобные отложения [65], воспалительные инфильтраты [66], которые иммунологически и цитологически отличаются от классического полимиозита (аутоиммунное заболевание, характеризующееся диффузным воспалением мышц).

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг — полуколичественный метод, направленный на оценку количества и молекулярной массы исследуемого белка. При диагностике дисферлинопатий, уровень белка оценивают как в мышечных образцах, так и в CD14+ моноцитах [61, 67, 68]. Было показано, что ген дисферлин экспрессируется в моноцитах CD14+ периферической крови человека [67]. Для ряда важных функций моноцитов/макрофагов, включающих рецептор-опосредованный фагоцитоз, секрецию цитокинов и рецепторов сигнальной регуляции посредством Rho семейства небольших GTPаз, таких как Rac1, RhoA, и Cdc42, необходима эффективная мембранная регуляция [69—72]. Учитывая роль дисферлина в мембранной регуляции в мышечных клетках и наличие дисферлина в моноцитах, можно предположить, что дефицит дисферлина может изменить способность моноцитов выполнять такие функции, опосредованные Rho семейством небольших GTPаз. Так как моноциты являются предшественниками тканевых макрофагов, можно предположить, что нарушение функций макрофагов может играть определенную роль в воспалительных реакциях, происходящих у многих пациентов с дисферлинопатией.

Генетические исследования

Причины дисферлинопатий — нарушение экспрессии гена DYSF и (или) функции дисферлина [10]. В теории, анализ ДНК — основной способ для подтверждения диагноза первичной дисферлинопатии. Однако на практике возникают сложности в определении мутаций гена DYSF, который включает 55 экзонов и имеет размер 150 тысяч пар нуклеотидов (т. п. н.), что затрудняет полное секвенирование гена. Выявлено более 450 различных мутаций, большинство из которых являются однонуклеотидными заменами [62, 63, 73]. Доступные в настоящее время методы не могут определять большие делеции, по сравнению с микроделециями/дупликациями или точечными мутациями, которые обнаружить легче. Вторая проблема заключается в сложности определения компаунд-гетерозигот на молекулярном уровне. Нахождение только одной из двух ожидаемых мутаций гена DYSF нередкое явление. Кроме того, существует множество полиморфных аллелей гена DYSF.

Наконец, имеется выраженный фенотипический полиморфизм среди больных, несущих одинаковые мутации. Так, описаны семьи, у одних членов которых болезнь протекает по типу миопатии Миоши, тогда как у других ПКМД 2В [61].

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

66

Обзоры

Трансгенные животные в моделировании

дисферлинопатий

Для изучения механизмов развития и подходов к терапии дисферлинопатии человека были разработаны экспериментальные модели заболевания у мышей (табл. 2).

Первой была описана линия мышей SJL — естественная модель поясно-конечностной миодистро-фии [74]. Помимо мышечной дистрофии, мыши этой линии обладают повышенной восприимчивостью к индуцируемым аутоиммунным болезням, таким как экспериментальные аутоиммунные энцефалиты и воспалительные заболевания мышечной ткани. У животных часто развиваются спонтанные воспалительные миопатии, но при этом мышцы не теряют способность к регенерации. На линиях SJL на протяжении многих лет проводился большой объем экспериментальных исследований, касающихся различных аутоиммунных заболеваний человека, изучались процессы регенерации и трансплантации мышц [75].

Позже была предложена вторая модель — ин-бредная линия A/J (родственные генотипы: a/a Tyrp1b/Tyrp1b Tyrc/Tyrc). Это гибрид белой линии Cold Spring Harbor и белой линии Baga. Инбредные линии A/J широко используются в исследованиях в области онкологии и иммунологии. Они очень восприимчивы к вызванной кортизоном врожденной волчьей пасти и подвержены к спонтанным аденомам легких (опухоли легких быстро развиваются в ответ на канцерогены). У мышей линии A/J подтвержден высокий процент развития аденокарцином молочных желез среди многорожавших самок. Также наблюдаются редкие спонтанные миоэпителиомы, образующиеся

из клеток различных экзокринных желез [76].

У линии мышей A/J мышечная дистрофия проявляется достаточно поздно (на 4—5 мес.). Спонтанная мутация представляет собой вставку ретротранспо-зона в ген dysf около 5' конца (интрон 4). Мышцы проксимальных сегментов повреждаются сильнее, чем дистальных [77].

В 2004 г. опубликовано описание трансгенной линии мышей Dysf-/- [77]. Эти животные выведены в результате вставки ретротранспозона на 3' и 5' концах гена dysf . У мышей линий Dysf-/- и A/J развивается прогрессирующая мышечная дистрофия. В начале болезни у обеих линий наблюдается проксимальная мышечная дегенерация. У этих линий проявляются клинические, биохимические и патогистологические характеристики дисферлино-патии человека, в том числе повышенные уровни сывороточной креатинфосфокиназы, миофибриль-ная дегенерация и регенерация, изменение размера фибрилл, эндомизиальный фиброз, замещение мышечной ткани на жировую и воспаление мышечной ткани [77]. Клиническое проявление заболевания на ранних этапах у обеих линий мышей идентично и не имеет очевидной корреляции между сайтами мутаций в гене dysf. На поздних этапах болезни у линии мышей A/J наблюдается более медленная прогрессия мышечного заболевания в сравнении с линией Dysf-/-. Фенотипическое проявление болезни на поздних этапах у разных линий в основном зависит от их генетического происхождения. Таким образом, линия мышей A/J больше подходит для идентификации генов, которые могут задержать начало или прогрессию мышечного заболевания.

Таблица 2. Особенности трех линий мышей с недостатком дисферлина. По [77] с изм.

Линия животных Генетип Эффект мутации 6 Ф t | S | 2 Р Первичная локализация Отличительные особенности

Dysf-/- Делеция экзона 45 Потеря белка дисферлина ~ 2 мес. Проксимальные мышцы Прогрессирующая мышечная дистрофия с повышенным уровнем креатинфосфокиназы; не агрессивны

A/J Вставка ETn в интрон 4 Потеря белка дисферлина ~ 5 мес. Проксимальные мышцы Болезнь становится явной в более позднем периоде и наблюдается менее выраженные патогистологические проявления, чем у мышей Dysf-/-; не агрессивны; высока вероятность развития спонтанных опухолей легких

Широко используются для построения рекомбинантных инбредных линий, конгенетических рекомбинантов и линий с хромосомным замещением

SJL Мутация в сайте сплайсинга на 3’ конце, приводящая кделеции Заметное сокращение (~ 85%) уровня дисферлина ~ 2 мес. Проксимальные мышцы Патогистологическая выраженность подобна мышам Dysf-/-; животные чрезвычайно агрессивны; крайне склонны к аутоиммунным заболеваниям,вирусным инфекциям и B-клеточным-лимфомам

экзона 45 в мРНК Также несут мутацию дегенерации сетчатки глаза в одном дефектном гене

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

Обзоры

67

Таким образом, у моделей мышей SJL/J (SJL) и A/J мутации в гене DYSF связаны с фенотипическими особенностями прогрессивной мышечной дистрофии. У мышей SJL мутации затрагивают сайты сплайсинга, в результате чего происходит делеция экзона 45, кодирующего высоко консервативный домен C2E белка DYSF.

Генная терапия дисферлинопатий

Ген дисферлина имеет большой размер (6243 п.н.) и состоит из 55 экзонов, которые охватывают 233140 п.н. геномной ДНК. Возможность восстановления дефектного белка мышц путем введения в клетку функционального гена дикого типа является перспективным методом генной терапии мышечных дистрофий. Вследствие большого размера кодон-оп-тимизированного гена DYSF (6243 п.н.) для создания генетических конструкций подходят аденовирусные векторы, которые способны доставлять большой объем рекомбинантной генетической информации как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, обеспечивают достаточный уровень экспрессии трансгенов, а также обладают высокой биобезопасностью [78]. Однако, эффективность аденовирусных конструкций для лечения нервно-мышечных заболеваний требует дополнительного изучения в связи с известными недостатками данной технологической платформы. В частности, аденовирусы плохо трансфицируют мышечную ткань, а их введение связано с возникновением иммунного ответа и формированием пула специфических антител.

Другой подход связан с использованием в каче-сте носителя кодирующей ДНК дисферлина аденоассоциированных вирусов (англ. adeno-associated vector, AAV). Данный тип вирусов встраивается в геном клетки-хозяина. Благодаря этому свойству может быть достигнута постоянная, а не транзиторная экспрессия белкового продукта. Размер гена превышает размер трансгенной вставки, которую способен нести геном данного вируса. Интересным приемом для обхода этого ограничения является применение метода двойного транс-сплайсинга, при котором кДНК гена DYSF клонируют в виде двух отдельных частей в два AAV вектора: один рекомбинантный AAV вектор несет 5' конец кДНК вместе с донорным сайтом сплайсинга интрона; другой рекомбинантный AAV вектор несёт акцепторный сайт сплайсинга и следующую за ним 3' концевую последовательность кДНК. В результате естественной способности AAV векторов к конкатемеризации [79, 80] происходит объединение двух частей кДНК и экспрессия полноразмерного белка дисферлина [81]. Внутримышечная инъекция двух рекомбинантных AAV в мышцу модельным мышам линии A/J привела к экспрессии полноразмерного дисферлина, продолжающейся, по крайней мере, в течение одного года. Важно, что системная инъекция в хвостовую вену мышей этих двух векторов привела к системной, хотя и слабой, экспрессии белка. Генная терапия в этом случае привела к улучшению состояния мышечной ткани, что было установлено по данным гистологического исследования. В целом, эти данные свидетельствуют о перспективности использования данной стратегии для лечения дисферлинопатии [81].

В 2010 г. была опубликована статья по созданию белка минидисферлина человека, восстанавливающего поражения сарколеммы у модельных мышей

с дисферлинопатией [82]. Как упоминалось ранее, ввиду большого размера гена DYSF прямой перенос всей кДНК в клетки затруднителен в связи с ограниченным размером упаковки адено-ассоциированного вируса, поэтому использование мРНК минидисфер-лина, укороченной формы белка, обнаруженной у пациента с мягкой формой дисферлинопатии, рассматривается как альтернативная стратегия. Была идентифицирована гомозиготная геномная муль-тиэкзонная внутренняя делеция гена дисферлина у пациентки с поздним проявлением и умеренным развитием заболевания дисферлинопатии. Таким образом, работа продемонстрировала возможность идентификации естественных «минигенов» дисфер-лина при системном скрининге пациентов со слабым фенотипическим проявлением заболевания. К сожалению, геннотерапевтическая экспрессия минигена дисферлина в мышцах в условиях in vivo, не привела к улучшению на гистологическом уровне, несмотря на восстановление скорости репарации мембраны в условиях in vitro [83].

Метод пропуска экзонов с помощью

антисмысловых олигонуклеотидов

Метод пропуска экзонов с помощью антисмысловых олигонуклеотидов — один из передовых методов терапии мышечной дистрофии Дюшена. Примером такой терапии являются препарат-кандидат Drisapersen, разрабатываемый компанией GlaxoSmithKline, который в настоящее время находится на III фазе клинических исследований и Eteplirsen компании AVI BioPharma (II фаза клинических исследований). Оба препарата обеспечивают пропуск 51-го экзона гена дистрофина.

Метод пропуска экзонов с помощью антисмысловых олигонуклеотидов имеет некоторые недостатки [84]. Так, для коррекции различных мутаций гена требуются специфичные антисмысловые олигонуклеотиды, разрабатываемые и создаваемые для каждой мутации отдельно. Кроме того, терапевтический подход на основе метода пропуска экзона предполагает, что укороченный белок будет функционально активным, что показано для мышечной дистрофии Дюшена. В двух независимых исследованиях была показана техническая возможность осуществления пропуска экзона в гене дисферлина, однако функциональность такого подхода так и не была изучена [85, 86].

Трансплантация стволовых

или прогениторных клеток

Возможность восстановления мышц в результате клеточной трансплантации все еще считается перспективным методом лечения поясно-конечностных мышечных дистрофий или других форм прогрессирующей мышечной дистрофии. Описаны различные источники стволовых и прогениторных клеток (СК), которые показывают способность к пролиферации in vitro, а также имеют способность участвовать в формировании нормальных мышечных волокон in vitro и in vivo [87-88]. Описаны и опробованы два подхода клеточной терапии: трансплантация аллогенных клеток здорового донора и трансплантация аутогенных генетически модифицированных (с коррекцией генетического дефекта) клеток.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

68

Обзоры

На предмет возможного применения в клеточной терапии были исследованы миосателлитоциты (т.н. «миобласты»), гемопоэтические стволовые клетки, мезенхимные стволовые клетки, побочная популяция костномозговых клеток, побочная популяция мышечных клеток, стволовые клетки мышечной ткани, стволовые клетки жировой ткани, эндотелиальные клетки-предшественницы и стволовые клетки, связанные с кровеносными сосудами (мезоангиобласты) [89, 90]. Начались или планируются к проведению несколько клинических исследований по трансплантации миобластов или мезоангиобластов от HLA-совместимых доноров [89].

В исследованиях K. Leriche-Guerin (2002) были протестированы 2 модели: иммунодефицитной SCID мыши трансплантировали нормальные миобласты человека, либо мышам линии SJL, в условиях иммуносупрессии, трансплантировали аллогенные мышиные мышечные клетки-предшественницы. Через месяц белок специфический дисферлин (человека или мыши) был обнаружен в тканях у каждой из моделей [91]. Количество дисферлин-положительных волокон составило 40—50% и 20—30% в мышцах мышей SCID и SJL соответственно.

В другом исследовании иммуногистохимическим методом было продемонстрировано, что небольшое количество клеток, взятых из пуповинной крови человека, могут мигрировать в мышцы SJL мышей, и экспрессировать как дисферлин, так и дистрофин, специфичный для человека, на 12 нед. после трансплантации [92].

Литература:

1. Zager E.L., Shaver E.G., Hurst R.W., Flamm E.S. Distal anterior inferior cerebellar artery aneurysms. Report of four cases. Neurosurg. 2002; 97(3): 692-6.

2. Miyoshi K., Kawai H, Iwasa M., et al. Autosomal recessive distal muscular dystrophy as a new type of progressive muscular dystrophy. Seventeen cases in eight families including an autopsied case. Brain 1986; 109 (1): 31-54.

3. Mahjneh I., Marconi G., Bushby K. et al. Dysferlinopathy (LGMD2B): a 23-year follow-up study of 10 patients homozygous for the same frameshifting dysferlin mutations. Neuromuscul Disord. 2001. 11(1): 20-6.

4. Richard I., Broux O., Allamand V. et al., Mutations in the proteolytic enzyme calpain 3 cause limb-girdle muscular dystrophy type 2A. Cell 1995; 81(1): 27-40.

5. Bejaoui K., Hirabayashi K., Hentati F. et al. Linkage of Miyoshi myopathy (distal autosomal recessive muscular dystrophy) locus to chromosome 2p12-14. Neurology 1995; 45(4): 768-72.

6. Weiler T., Greenberg C.R., Nylen E. et al. Limb-girdle muscular dystrophy and Miyoshi myopathy in an aboriginal Canadian kindred map to LGMD2B and segregate with the same haplotype. Am J Hum Genet. 1996; 59(4): 872-8.

7. Mahjneh I., Vannelli G., Bushby K., Marconi G.P. A large inbred Palestinian family with two forms of muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 1992; 2(4): 277-83.

8. Illarioshkin S.N., Ivanova-Smolenskaya I.A., Greenberg C.R. et al. Identical dysferlin mutation in limb-girdle muscular dystrophy type 2b and distal myopathy. Neurology 2000; 55(12): 1931-3

9. Liu J., Aoki M., Illa I. et. al. Dysferlin, a novel skeletal muscle gene, is mutated in Miyoshi myopathy and limb girdle muscular dystrophy. Nat Genet. 1998; 20(1): 31-6.

10. Bashir R., Britton S., Strachan T. et al. A gene related to Caenorhabditis elegans spermatogenesis factor fer-1 is mutated in limb-girdle muscular dystrophy type 2B. Nat Genet. 1998; 20(1): 37-42.

11. Bushby K.M. Making sense of the limb-girdle muscular dystrophies. Brain 1999; 122 (8): 1403-20.

12. Eymard B., Laforet P., Tome F.M, et al. Miyoshi distal myopathy: specific signs and incidence. Rev Neurol. 2000; 156(2): 161-8.

13. Pradhan S. Calf-head sign in Miyoshi myopathy. Arch Neurol. 2006; 63(10): 1414-7.

14. Pradhan S. Diamond on quadriceps: a frequent sign in dysferlinopathy. Neurology 2008; 70(4): 322.

В 2008 г. N.M. Vieira с соавторами описали введение без иммуносупрессии стромальных жировых клеток человека (human adipose stromal cells) мышам SJL [93]. В статье впервые было показано, что клетки hASC не отторгаются после системного введения и могут участвовать в образовании химерных мышечных волокон, экспрессирующих значительное количество мышечных белков человека. Это приводило к улучшению двигательной способности подопытных животных.

Не теряет своей актуальности возможность генетической коррекции мутантных клеток in vitro при помощи технологий искусственных хромосом человека, Zn-фингерных эндонуклеаз, TALENs с последующей трансплантацией.

Несмотря на определенные научные сдвиги, произошедшие за первое десятилетие XXI века, проблема создания эффективного и безопасного метода лечения дисферлинопатий и других ПКМД пока далека от разрешения. Развитие генно-клеточных технологий открывает возможности для разработки новых методов терапии этого заболевания.

Благодарности

Работа финансировалась Институтом стволовых клеток человека (Москва) и грантом для молодых ученых ОПТЭК. Работа также поддержана федеральным центром коллективного пользования физикохимических исследований веществ и материалов (ФЦКП ФХИ) и научно образовательным центром фармацевтики Казанского (Приволжского) федерального университета.

15. Yasunaga S., Grati M., Cohen-Salmon M. et al. A mutation in OTOF, encoding otoferlin, a FER-1-like protein, causes DFNB9, a nonsyndromic form of deafness. Nat Genet. 1999. 21(4): 363-9.

16. Britton S., Freeman T., Vafiadaki E. et al. The third human FER-1-like protein is highly similar to dysferlin. Genomics 2000; 68(3): 313-21.

17. Davis D.B., Delmonte A.J., Ly C.T., McNally E.M. et al. Myoferlin, a candidate gene and potential modifier of muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 2000; 9(2): 217-26.

18. Glover L. and Brown R.H. Jr. Dysferlin in membrane trafficking and patch repair. Traffic 2007; 8(7): 785-94.

19. Achanzar W.E. and Ward S. A nematode gene required for sperm vesicle fusion. J Cell Sci. 1997; 110 (9): 1073-81.

20. Doherty K.R., Cave A., Davis D.B., Delmonte A.J. et al. Normal myoblast fusion requires myoferlin. Development 2005; 132(24): 5565-75.

21. Inoue M., Wakayama Y., Kojima H., Shibuya S. et al. Expression of myoferlin in skeletal muscles of patients with dysferlinopathy. Tohoku J Exp Med. 2006; 209(2): 109-16.

22. Roux I., Safieddine S., Nouvian R., Grati M., et al., Otoferlin, defective in a human deafness form, is essential for exocytosis at the auditory ribbon synapse. Cell 2006; 127(2): 277-89.

23. de Morree A., Hensbergen P.J., van Haagen H.H. et al. Proteomic Analysis of the Dysferlin Protein Complex Unveils Its Importance for Sarcolemmal Maintenance and Integrity. PLoS ONE 2010; 5(11): e13854.

24. Xu L., Pallikkuth S., Hou Z. et al. Dysferlin Forms a Dimer Mediated by the C2 Domains and the Transmembrane Domain In Vitro and in Living Cells. PLoS ONE 2011; 6(11): e27884.

25. Hochmeister S., Grundtner R., Bauer J., et al., Dysferlin Is a New Marker for Leaky Brain Blood Vessels in Multiple Sclerosis. J Neuropathol Exp Neurol. 2006; 65(9): 855-86

26. Izzedine H., Brocheriou I., Eymard B. et al. Loss of podocyte dysferlin expression is associated with minimal change nephropathy. Am J Kidney Dis. 2006. 48(1):143-50.

27. Lang C.T., Markham K.B., Behrendt N.J., et al. Placental Dysferlin Expression is Reduced in Severe Preeclampsia. Placenta 2009; 30(8): 711-8.

28. Cacciottolo M., Numitone G., Aurino S. et al. Muscular dystrophy with marked Dysferlin deficiency is consistently caused by primary dysferlin gene mutations. Eur J Hum Genet. 2011; 19(9): 974-80.

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

Обзоры

69

29. de Luna N., Gallardo E., Soriano M. et al. Absence of dysferlin alters myogenin expression and delays human muscle differentiation «in vitro». J Biol Chem. 2006; 281(25): 17092—8.

30. McNeil P.L., Miyake K., Vogel S.S. The endomembrane requirement for cell surface repair. Proc Natl Acad Sci. 2003; 100t8): 4592-7.

31. Bi, G.Q., Alderton J.M., Steinhardt R.A. Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing. J Cell Biol. 1995; 131(6 Pt 2): 1747-58.

32. Miyake K., McNeil P.L. Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption. J Cell Biol. 1995; 131(6 Pt 2): 1737-45.

33. Bischofberger M., Gonzalez M.R., van der Goot F.G. Membrane injury by pore-forming proteins. Curr Opin Cell Biol. 2009; 21(4): 589-95

34. Selcen, D., Stilling G., Engel A.G. The earliest pathologic alterations in dysferlinopathy. Neurology 2001; 56(11): 1472-81.

35. Cenacchi G., Fanin M., De Giorgi L.B., Angelini C. Ultrastructural changes in dysferlinopathy support defective membrane repair mechanism. J Clin Pathol. 2005; 58(2): 190-5.

36. Bi G.Q., Morris R.L., Liao G., Alderton J.M. et al. Kinesin-and myosin-driven steps of vesicle recruitment for Ca2+-regulated exocytosis. J Cell Bio. 1997; 138(5): 999-1008.

37. Togo, T., Steinhardt R.A. Nonmuscle myosin IIA and IIB have distinct functions in the exocytosis-dependent process of cell membrane repair. Mol Biol Cell. 2004; 15(2): 688-95.

38. Cacciottolo M., Belcastro V., Laval S. et al. Reverse engineering gene network identifies new dysferlin-interacting proteins. J Biol Chem. 2011; 286(7): 5404-13.

39. Lennon N.J., Kho A., Bacskai B.J. et al. Dysferlin interacts with annexins A1 and A2 and mediates sarcolemmal wound-healing. J Biol Chem. 2003; 278(50): 50466-73.

40. Weisleder N., Takeshima H., Ma J. Mitsugumin 53 (MG53) facilitates vesicle trafficking in striated muscle to contribute to cell membrane repair. Commun Integr Biol. 2009; 2(3): 225-6.

41. Cai C., Weisleder N., Ko J.K. Membrane repair defects in muscular dystrophy are linked to altered interaction between MG53, caveolin-3, and dysferlin. J Biol Chem. 2009; 284(23): 15894-902.

42. Cai C., Masumiya H., Weisleder N. et al. MG53 regulates membrane budding and exocytosis in muscle cells. J Biol Chem. 2009; 284(5): 3314-22.

43. Cai C., Masumiya H., Weisleder N. et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 2009; 11(1): 56-64.

44. Wang X., Xie W., Zhang Y. et al. Cardioprotection of ischemia/ reperfusion injury by cholesterol-dependent MG53-mediated membrane repair. Circ Res. 2010; 107(1): 76-83.

45. Cao C.M., Zhang Y., Weisleder N. et al., MG53 constitutes a primary determinant of cardiac ischemic preconditioning. Circulation 2010; 121(23): 2565-74.

46. Huang Y., Laval S.H., van Remoortere A. et al. AHNAK, a novel component of the dysferlin protein complex, redistributes to the cytoplasm with dysferlin during skeletal muscle regeneration. FASEB J. 2007; 21(3): 732-42.

47. Matsuda C., Kameyama K., Tagawa K. et al. Dysferlin interacts with affixin (beta-parvin) at the sarcolemma. J Neuropathol Exp Neurol. 2005; 64(4): 334-40.

48. Rezvanpour, A., Shaw G.S. Unique S100 target protein interactions. Gen Physiol Biophys. 2009; 28 Spec No Focus: F39-46.

49. Huang Y., de Morree A., van Remoortere A. et al. Calpain 3 is a modulator of the dysferlin protein complex in skeletal muscle. Hum Mol Genet. 2008; 17(12): 1855-66.

50. Azakir B.A., Di Fulvio S., Therrien C., Sinnreich M. et al. Dysferlin interacts with tubulin and microtubules in mouse skeletal muscle. PLoS One 2010; 5(4): e10122.

51. Ampong B.N., Imamura M., Matsumiya T. et al. Intracellular localization of dysferlin and its association with the dihydropyridine receptor. Acta Myol. 2005; 24(2): 134-44.

52. Schoewel V., Marg A., Kunz S. et al. Dysferlin-Peptides Reallocate Mutated Dysferlin Thereby Restoring Function. PLoS ONE 2012; 7(11): e49603.

53. Klinge L., Laval S., Keers S. et al. From T-tubule to sarcolemma: damage-induced dysferlin translocation in early myogenesis. FASEB J. 2007; 21(8): 1768-76.

54. Klinge L., Harris J., Sewry C. et al. Dysferlin associates with the developing T-tubule system in rodent and human skeletal muscle. Muscle Nerve. 2010; 41(2): 166-73.

55. Covian-Nares J.F., Koushik S.V., Puhl H.L. 3Rd, Vogel S.S. Membrane wounding triggers ATP release and dysferlin-mediated intercellular calcium signaling. J Cell Sci. 2010; 123(Pt 11): 1884-93.

56. Rawat R., Cohen T.V., Ampong B. et al. Inflammasome up-regulation and activation in dysferlin-deficient skeletal muscle. Am J Pathol. 2010; 176(6): 2891-900.

57. Iwata Y., Katanosaka Y., Hisamitsu T., Wakabayashi S. et al. Enhanced Na+/H+ exchange activity contributes to the pathogenesis

of muscular dystrophy via involvement of P2 receptors. Am J Pathol. 2007; 171(5): 1576-87.

58. Nagaraju K., Rawat R., Veszelovszky E. et al. Dysferlin deficiency enhances monocyte phagocytosis: a model for the inflammatory onset of limb-girdle muscular dystrophy 2B. Am J Pathol. 2008; 172(3): 774-85.

59. Han R., Frett E.M., Levy J.R. et al. Genetic ablation of complement C3 attenuates muscle pathology in dysferlin-deficient mice. J Clin Invest. 2010; 120(12): 4366-74.

60. Millay D.P., Maillet M., Roche J.A. et al. Genetic manipulation of dysferlin expression in skeletal muscle: novel insights into muscular dystrophy. Am J Pathol. 2009; 175(5): 1817-23.

61. Urtizberea J.A., Bassez G., Leturcq F. et al. Dysferlinopathies. Neurol India. 2008; 56(3): 289-97.

62. Guglieri M., Magri F., D'Angelo M.G. et al. Clinical, molecular, and protein correlations in a large sample of genetically diagnosed Italian limb girdle muscular dystrophy patients. Hum Mutat. 2008; 29(2): 258-66.

63. Nguyen K., Bassez G,, Krahn M. et al. Phenotypic study in 40 patients with dysferlin gene mutations: high frequency of atypical phenotypes. Arch Neurol. 2007; 64(8): 1176-82.

64. Fanin, M., Angelini C. Muscle pathology in dysferlin deficiency. Neuropathol Appl Neurobiol. 2002; 28(6): 461-70.

65. Spuler S., Carl M., Zabojszcza J. et al. Dysferlin-deficient muscular dystrophy features amyloidosis. Ann Neurol. 2008; 63(3): 323-8.

66. Gallardo E., Rojas-Garcia R., de Luna N. et al. Inflammation in dysferlin myopathy: immunohistochemical characterization of 13 patients. Neurology 2001; 57(11): 2136-8.

67. Ho M., Gallardo E., McKenna-Yasek D. et al. A novel, blood-based diagnostic assay for limb girdle muscular dystrophy 2B and Miyoshi myopathy. Ann Neurol. 2002; 51(1): 129-33.

68. De Luna N., Freixas A., Gallano P. et al. Dysferlin expression in monocytes: a source of mRNA for mutation analysis. Neuromuscul Disord. 2007; 17(1): 69-76.

69. Kwiatkowska, K., Sobota A. Signaling pathways in phagocytosis. Bioessays. 1999; 21(5): 422-31.

70. Caron, E., Hall A., Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases. Science 1998; 282(5394): 1717-21.

71. Bokoch, G.M., Knaus U.G. The role of small GTP-binding proteins in leukocyte function. Curr Opin Immunol. 1994; 6(1): 98-105.

72. Cox D., Chang P, Zhang Q. et al. Requirements for both Rac1 and Cdc42 in membrane ruffling and phagocytosis in leukocytes. J Exp Med. 1997; 186(9): 1487-94.

73. Aoki M., Liu J., Richard I. et al. Genomic organization of the dysferlin gene and novel mutations in Miyoshi myopathy. Neurology 2001; 57(2): 271-8.

74. Bittner R.E., Anderson L.V., Burkhardt E. et al. Dysferlin deletion in SJL mice (SJL-Dysf) defines a natural model for limb girdle muscular dystrophy 2B. Nat Genet. 1999; 23(2): 141-2.

75. Vainzof M., Ayub-Guerrieri D., Onofre P.C. et al. Animal models for genetic neuromuscular diseases. J Mol Neurosci. 2008; 34(3): 241-8.

76. Kobayashi K., Izawa T., Kuwamura M., Yamate J. Dysferlin and animal models for dysferlinopathy. J Toxicol Pathol. 2012; 25(2): 135-47.

77. Ho M., Post C.M., Donahue L.R. et al. Disruption of muscle membrane and phenotype divergence in two novel mouse models of dysferlin deficiency. Hum Mol Genet. 2004; 13(18): 1999-2010.

78. Старостина И.Г., Соловьева В.В., Шевченко К.Г. et al. Создание рекомбинантного аденовируса, кодирующего кодон-оптими-зированный ген дисферлина, и анализ экспрессии рекомбинантного белка в культуре клеток in vitro. КТТИ. 2012; VII(4): 25-28.

79. Yan Z., Zhang Y., Duan D. et al. Trans-splicing vectors expand the utility of adeno-associated virus for gene therapy. Proc Natl Acad Sci. 2000; 97(12): 6716-21.

80. Xu Z., Yue Y., Lai Y. et al. Trans-splicing adeno-associated viral vector-mediated gene therapy is limited by the accumulation of spliced mRNA but not by dual vector coinfection efficiency. Hum Gene Ther. 2004; 15(9): 896-905.

81. Lostal W., Bartoli M., Bourg N. et al. Efficient recovery of dysferlin deficiency by dual adeno-associated vector-mediated gene transfer. Hum Mol Genet. 2010; 19(10): 1897-907.

82. Krahn M., Wein N., Bartoli M. et al. A naturally occurring human minidysferlin protein repairs sarcolemmal lesions in a mouse model of dysferlinopathy. Sci Transl Med. 2010, 2(50): 50ra69.

83. Lostal W., Bartoli M., Roudaut C. et al. Lack of Correlation between Outcomes of Membrane Repair Assay and Correction of Dystrophic Changes in Experimental Therapeutic Strategy in Dysferlinopathy. PLoS ONE 2012; 7(5): e38036.

84. Park, K.S., Oh D. Gene therapy for muscular dystrophies: progress and challenges. J Clin Neurol. 2010; 6(3): p. 111-6.

85. Aartsma-Rus A., Singh K.H., Fokkema I.F. et al. Therapeutic exon skipping for dysferlinopathies? Eur J Hum Genet. 2010; 18(8): 889-94 .

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013

70

Обзоры

86. Wein N., Avril A., Bartoli M. et al. Efficient bypass of mutations in dysferlin deficient patient cells by antisense-induced exon skipping. Hum Mutat. 2010; 31: 136-42.

87. Secco M., Zucconi E., Vieira N.M. et al. Multipotent stem cells from umbilical cord: cord is richer than blood! Stem Cells 2008; 26(1): 146-50.

88. Chan J., Waddington S.N., O'Donoghue K. et al. Widespread distribution and muscle differentiation of human fetal mesenchymal stem cells after intrauterine transplantation in dystrophic mdx mouse. Stem Cells 2007; 25(4): 875-84.

89. Quattrocelli M.,Cassano M., Crippa S. et al. Cell therapy strategies and improvements for muscular dystrophy. Cell Death Differ. 2010; 17(8): 1222-9.

90. Sancricca C., Mirabella M., Gliubizzi C. et al. Vessel-associated stem cells from skeletal muscle: From biology to future uses in cell therapy. World J Stem Cells. 2010; 2(3): 39-49.

91. Leriche-Guerin K., Anderson L.V., Wrogemann K. et al. Dysferlin expression after normal myoblast transplantation in SCID and in SJL mice. Neuromuscul Disord. 2002; 12(2): 167-73.

92. Kong K.Y., Ren J., Kraus M. et al. Human umbilical cord blood cells differentiate into muscle in sjl muscular dystrophy mice. Stem Cells 2004; 22(6): 981-93.

93. Vieira N.M., Bueno C.R. Jr., Brandalise V. et al. SJL dystrophic mice express a significant amount of human muscle proteins following systemic delivery of human adipose-derived stromal cells without immunosuppression. Stem Cells 2008; 26(9): 2391-8.

Поступила 2007.2013

CM

_ Hellion! tell (dialysis

www.optecgroup.CDm 3-BOO-2000-567

Cell-IQ

Научные исследования в области генетики, иммунологии, протеомики, физиологии и эмбриологии

Cell-IQ - это полностью интегрированная платформа для непрерывного наблюдения за живыми клетками а культуре, формирования я анализа изображений. Данную систему можно использовать для наблюдения за клеточными линиями, первичными культурами, совместными культурами и монослойными моделями тканей.

Это особый инструмент для исследований: его можно «научить» видеть то же, что и вы, и автоматически рассчитывать результаты.

Объединяя решения

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 3, 2013