Мониторинг активности антител к структурным белкам ВИЧ-1 в отсутствие лечения антиретровирусными препаратами и на фоне терапии

Медицинская Иммунология 2007, Т. 9, № 4-5, стр. 531-534 © 2007, СПб РО РААКИ

Краткие сообщения

мониторингАктивности АНТИТЕЛ к структурным БЕЛКАМ вич-l в отсутствие лечения антиретровирусными препаратами и на фоне терапии

Рязанова Г.А, Фазулзянова И.М.

Серологическая лаборатория Республиканского центра по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ, г. Казань

Резюме. У больных ВИЧ-инфекцией процесс образования антител к отдельным структурным белкам вируса иммунодефицита человека первого типа носит дифференциальный характер, в зависимости от локализации антигена. По мере прогрессирования заболевания увеличивается доля антител к поверхностным гликопротеинам гена env и уменьшается процентное содержание к белкам гена gag.

Ключевые слова: антигены ВИЧ-1, антитела, Т-лимфоциты.

Ryasanova G.A., Fazulzyanova I.M.

ACTIVITY MONITORING OF ANTIBODIES TO HIV-1 STRUCTURAL PROTEINS IN ABSENCE

of antiretroviral treatment and in the course of therapy

Abstract. In HIV-infected patients, the process of antibody production to certain HIV-I structural proteins proceeds in differential manner, depending on the antigen localization. Upon progression of the disease, an increased ratio of antibodies to env surface glycoproteins is found, along with decreased percentage of antibodies to gag gene proteins.

При болезнях с длительным инкубационным периодом и разнообразной клинической симптоматикой, одной из которой является ВИЧ-инфекция, исключительно велика роль лабораторных методов диагностики. Для выявления антител к ВИЧ чаще всего используют метод иммуноферментного анализа. Антитела к вирусным белкам в иммуноферментном анализе можно выявить у 99% инфицированных ВИЧ людей. Сложности ранней диагностики связаны с тем, что специфические антитела отсутствуют в первый месяц после заражения, а в терминальной стадии заболевания их количество заметно уменьшается. В связи с этим исследование динамики образования антител к структурным белкам вируса в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных в период формирования гуморального иммунного ответа

Адрес для переписки:

420097, г. Казань, ул. Вишневского, 2а. Тел.: (843) 238-79-04.

Факс: (843) 238-70-70.

E-mail: ospz@yandex.ru

на внедрение ВИЧ-1 важно не только для изучения иммунопатогенеза ВИЧ-инфекции, но и для ранней диагностики заболевания.

Целью исследования было определение динамики образования «свободных» антител к вирусным белкам генов gag, env, ро1 у больных ВИЧ-инфекцией.

В работе были использованы образцы сывороток крови ВИЧ-инфицированных, проходивших плановые медицинские осмотры в Республиканском центре по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ.

Методами ИФА («ВИЧ-1, ВИЧ-2-ИФА-Ави-ценна» фирмы «Авиценна») и иммунного блот-тинга фирмы «Bio-Rad» (Франция) был проведен длительный мониторинг относительной серологической активности антител к структурным белкам вируса первого типа в сыворотках крови двух больных ВИЧ-инфекцией. Молекулярные массы вирусных белков ВИЧ-1 даны в соответствии с инструкцией прилагаемой к набору для проведения иммуноблоттинга «NEW LAV BLOT 1».

531

Рязанова Г.А, Фазулзянова И.М.

Медицинская Иммунология

Денситометрию результатов постановки иммунного блоттинга проводили в отраженном свете на сканере «SHARP JX-330». В анализе денситограмм (количественный анализ сероактивных фракций) была использована программа «Image Master 1D Prime» фирмы «Pharmacia Biotech».

Количество Т-лимфоцитов, несущих маркеры CD4+ и CD8+, определяли методом прямой иммунофлюоресценции на проточном лазерном цитофлюориметре фирмы «Becton Dickinson» в программе «Multi TEST».

У больного в отсутствие лечения антиретровирусными препаратами на стадии персистиру-ющей генерализованной лимфоаденопатии (ПВ) и до возникновения вторичных клинических проявлений ВИЧ-инфекции на стадии IIIB — токсо-плазмоз, кандидоз языка и пневмоцистная пневмония (по классификации Покровского В.И., 1989 г.), наблюдалось выраженное снижение количества Т-лимфоцитов, несущих маркеры CD4+, CD8+. При этом отмечались изменения в процентном соотношении активности анти-ВИЧ антител к структурным белкам вируса в иммуно-блоттинге. Из данных таблицы 1 следует, что в начале мониторинга (стадия IIB) при концентрации Т-лимфоцитов с фенотипами CD4+, CD8+, равной 499 кл/мкл и 615 кл/мкл, преобладали антитела к белкам гена gag (53,9%), а относительная серологическая активность антител к белкам генов env, pol составляла 32,8% и 13,3%. По мере нарастания инфекционного процесса и перехода больного ВИЧ-инфекцией в стадию IIIA количество Т-лимфоцитов, несущих маркеры CD4+, CD8+, изменилось и составило 260 кл/мкл и 1137 кл/мкл соответственно. В это время мы наблюдали увеличение относительной доли присутствия антител к бекам гена env за счет повышения относительной серологической активности антител к вирусным гликопротеинам gp160 и gp41 в иммуноблот-тинге. Процентное содержание антител к белкам гена pol тоже несколько повысилось (до 15,5%), а интенсивность реакции антител к белкам гена gag незначительно снизилась и составила 44,3% в иммуноблоттинге. Далее на фоне снижения абсолютного количества Т-лимфоцитов, несущих маркеры CD4+, CD8+ до 73 кл/мкл и 346 кл/ мкл, мы наблюдали уменьшение относительной доли присутствия антител к белкам генов gag и pol и дальнейшее увеличение относительной серологической активности антител к белкам гена env. Из данных таблицы 1 следует, что активно протекающее снижение концентрации популяции Т-лимфоцитов, несущих маркеры CD4+ и CD8+, сопровождалось относительным увеличением интенсивности реакции анти-ВИЧ антител к поверхностным гликопротеинам и белкам-пред-шественникам гликопротеинов гена env до 73,7%

и уменьшением уровня реакции антител как с белками гена gag, так и с вирусными ферментами гена pol, так как продукция этих антител возможна после виролиза и/или цитолиза инфицированных ВИЧ-1 клеток [1, 3, 4].

Кроме того, у больного ВИЧ-инфекцией в отсутствие лечения антиретровирусными препаратами динамика заболевания сопровождалась снижением в иммуноферментном анализе суммарного титра анти-ВИЧ антител к вирусным белкам, кодируемым генами env, gag и pol от 1:32 000 до 1:16 000.

В таблице 2 представлены результаты исследования спектра антител к структурным белкам вируса иммунодефицита человека первого типа в иммунном блоттинге у больного ВИЧ-инфекцией, которому в 1995 году была назначена монотерапия тимазидом, а позднее, с 1998 года, — комбинированная антиретровирусная терапия нуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы и ингибиторами протеазы ВИЧ. Длительное диспансерное наблюдение велось на протяжении восьми лет, от момента постановки стадии IIIA, в период вторичных заболеваний, до стадии ШВ [2]. В это время на фоне выраженного иммунодефицита — снижение количества Т-лимфоцитов, несущих маркеры CD4+, до критического уровня — отмечались рецидивирующие вирусные инфекции, грибковые заболевания, активный хронический гепатит смешанной этиологии, а с 2001 у больного ВИЧ-инфекцией был выявлен инфильтративный туберкулез левого легкого.

По результатам наших исследований был выявлен следующий алгоритм динамики анти-ВИЧ антител. В течение всего периода исследования относительной серологической активности анти-ВИЧ антител в иммуном блоттинге мы наблюдали присутствие антител к gp160, gp120, gp41, р25 и р34, а активность к р55, р18, р40, р68, р52 была транзиторной. Динамика инфекционного процесса сопровождалась изменением титра анти-ВИЧ антител в ИФА, если в начале наблюдения титры антител в ИФА составляли 1:20 000, в 2001 году — 1:73 718, то к концу исследования, в 2003 году, суммарная активность антител в ИФА снизилась до 1:32 768.

В период проведения монотерапии тимазидом абсолютное количество Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+ изменялось в диапазоне от 105 кл/мкл до 218 кл/мкл, а абсолютные значения Т-лимфо-цитов CD8+ колебались в пределах от 745 кл/мкл до 1786 кл/мкл. В это время основной серодоминантной фракцией общего пула антител к белкам гена env являлись антитела к белку-пред-шественнику гликопротеинов — gp160 (от 36,2 до 42,6%), по сравнению с относительной серо-

532

ТАБЛИЦА 1. ОТНОСИТЕЛЬНАЯ СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИ-ВИЧ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ БОЛЬНОГО ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ, НЕ ПРИНИМАВШЕГО АНТИРЕТРОВИРУСНЫЕ ПРЕПАРАТЫ

Сроки исследования Стадии заболевания CD4+ в мкп CD8+ в мкп Активность анти-ВИЧ антител к белкам генов env, gag, pol ВИЧ-1 в иммуноблоттинге (%)*

env gag pol

gpi60 др120 gp41 Z p55 p18 p25 p40 I p68 p52 p34 Z

а)ноябрь 1993 ив 499 615 14,7 13,5 4,6 32,8 8,1 13,2 24,8 7,8 53,9 4,6 3,0 5,7 13,3

Ь) июнь 1995 IIIA 260 1 137 24,0 11,3 4,9 40,2 4,4 1,9 30,5 7,5 44,3 3,7 3,7 8,1 15,5

с) март 1996 IIIA 160 656 30,1 16,3 6,2 52,6 4,4 1,7 17,2 2,3 25,6 6,2 6,5 9,1 21,8

d) октябрь 1996 IIIB 100 579 20,4 21,1 8,6 50,1 9,2 2,7 14,3 5,8 32,0 5,4 4,9 7,6 17,9

е) июнь 1997 IIIB 73 346 40,5 26,6 6,6 73,7 6,4 0,0 11,8 2,5 20,7 2,1 0,0 3,5 5,6

Примечание: * - в % к общему числу сероактивных фракций антител в иммуноблоттинге.

ТАБЛИЦА 2. МОНИТОРИНГ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ АНТИ-ВИЧ АНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ КРОВИ БОЛЬНОГО ВИЧ-ИНФЕКЦИЕЙ, ПРИНИМАВШЕГО АНТИРЕТРОВИРУСНЫЕ ПРЕПАРАТЫ

Сроки исследования Стадии заболевания CD4+ в МКЛ CD8+ В МКЛ Активность анти-ВИЧ антител к белкам генов env, gag, pol ВИЧ-1 в иммуноблоттинге (%)*

env gag pol

gpi60 др120 gp41 Z p55 p18 p25 p40 z p68 p52 p34 Z

а) апрель 1996 IIIA 109 1 738 41,7 18,4 5,2 65,3 1,6 0,0 20,4 0,0 22,0 1,9 1,5 9,4 12,7

b) сентябрь 1997 IIIA 218 1 786 36,2 32,8 5,7 74,7 2,1 0,0 11,3 1,8 15,2 0,0 0,0 10,1 10,1

с)ноябрь 1997 IIIB 105 745 42,6 25,9 12,7 81,2 2,9 0,0 8,8 0,0 11,7 3,3 0,0 3,8 7,1

d) июль 1998 IIIB 128 1 246 26,0 13,9 24,6 64,5 4,9 0,0 13,9 0,0 18,8 6,2 0,0 10,5 16,7

е)ноябрь 1998 IIIB 43 791 48,9 13,7 16,6 79,2 0,0 0,0 16,3 0,0 16,3 0,0 0,0 4,5 4,5

f) март 1999 IIIB 110 1 197 31,2 15,1 12,1 58,4 0,0 0,0 18,3 0,0 18,3 7,2 7,9 8,2 23,3

д) июнь 1999 IIIB 60 396 28,0 8,8 10,7 47,5 8,6 0,0 17,7 3,5 29,8 6,0 6,4 10,3 22,7

h) март 2000 IIIB 127 853 17,5 8,3 8,0 33,8 10,5 1,9 17,8 5,8 36,0 10,3 6,4 13,5 30,2

i) октябрь 2001 IIIB 87 590 29,9 30,2 6,6 66,7 2,8 0,2 11,8 0,5 15,3 6,7 3,6 7,8 18,1

j) июнь 2002 IIIB 112 970 40,4 30,9 3,4 74,7 2,2 0,0 6,5 0,1 8,8 7,2 2,2 7,1 16,5

к) ноябрь 2002 IIIB 158 1 093 48,5 28,3 0,7 77,5 0,6 0,0 9,5 0,0 10,1 6,7 1,4 4,3 12,4

I) июль 2003 IIIB 228 1 687 27,9 11,8 21,3 61,0 5,6 8,6 9,4 0,0 23,6 5,8 2,6 7,0 15,4

т)декабрь 2003 IIIB 106 815 41,3 8,6 18,7 68,6 2,1 5,9 11,2 0,0 19,2 5,9 1,7 4,6 12,2

Примечание: * - в % к общему числу сероактивных фракций антител в иммуноблоттинге.

2007, Т. 9, № 4-5 Динамика образования антител к структурным белкам ВИЧ-1

Рязанова Г.А, Фазулзянова И.М.

Медицинская Иммунология

логической активностью антител к белкам gp120 (от 18,4 до 32,8%) и gp41 (от 5,2 до 12,7%). Среди антител к белкам гена gag преобладали антитела к основному ядерному белку — р25 (от 8,8 до 20,4%), а в общем пуле анти-ВИЧ антител к белкам гена ро1 доминировали антитела к вирусной эндонуклеазе — р34 (от 3,8 до 10,1%). Отмеченная тенденция перераспределения относительной серологической активности анти-ВИЧ в иммуноблоттинге сохранялась на всем протяжении монотерапии тимазидом. С 1998 года по 2000 год больному была назначена комбинированная антиретровирусная терапия нуклеозидными ингибиторами обратной транскриптазы и ингибиторами протеазы ВИЧ. Абсолютное количество Т-лимфоцитов, несущих рецепторы CD4+, CD8+, не превышало значений 128 кл/мкл и 1246 кл/мкл соответственно. В этот период процентное соотношение антител к gp160, gp120, gp41 в иммуноблоттинге изменилось. Антитела к белку-предшественнику гликопротеинов продолжали оставаться доминирующими в общем пуле антител гена env, но серологическая активность антител к gp41 увеличилась и в большинстве случаев превысила относительный уровень содержания антител к gp120. В период с 1998 года по 2000 год антитела к основному ядерному белку продолжали оставаться доминирующими в общем пуле антител к белкам гена gag, а среди антител к белкам гена ро1 преобладали антитела к р34. С 2001 по 2002 год схема антиретовирусной терапии изменилась, были назначены комбивир, состоящий из нуклеозидных аналогов ингибиторов обратной транскриптазы, и ингибиторы вирусной протеазы. В этот период при достаточно низком уровне Т-лимфоцитов с фенотипом CD4+ (менее 200 кл/мкл) относительная серологическая активность антител к трансмембранному гликопротеину — gp41 вновь снизилась и к концу наблюдения составила 0,7%, в то время как активность антител к gp120 увеличилась до 28,3%. Относительная серологическая активность антител к р25 оставалась доминирующей среди антител к белкам гена gag и изменялась в диапазоне от 6,5 до 11,2%, тогда как среди антител к белкам гена ро1 преобладали антитела к р68, р34. В 2003 году, когда помимо комбивира больному был назначен зиаген (ингибитор обратной транскриптазы, нуклеозидный аналог тимидина), уровень Т-лимфоцитов CD4+ несколько повысился и в июле 2003 года составил 228 кл/мкл. В общем пуле анти-ВИЧ антител к белкам гена env доминировали антитела к gp160, а активность антител к трансмембранному гликопротеину вновь увеличилась с 0,7 до 21,3% и к концу исследования составила 18,7%. Среди

антител к белкам гена gag продолжали доминировать антитела к ядерному белку — р25 (от 9,4 до 11,2%). В общем пуле анти-ВИЧ антител к белкам гена ро1 преобладали антитела к вирусной эндонуклеазе и обратной транскриптазе.

Таким образом, на основании результатов, полученных во время длительного исследования относительной серологической активности «свободных» антител к белкам генов env, gag и pol у больных ВИЧ-инфекцией, мы сделали заключение о дифференциальной регуляции гуморального иммунного ответа к отдельным структурным антигенам вируса иммунодефицита человека первого типа. Поскольку, согласно литературным данным, поверхностные гликопротеины вируса могут активировать В-лимфоциты без участия Т-лимфоцитов, так называемые Т-независимые антигены, и, следовательно, вирус самостоятельно способен поддерживать продукцию антител к белкам гена env. Тогда как для вирусных белков, которые имеют внутреннюю локализацию, необходим полноценный процессинг и презентация антигена в составе молекул МНС I и II класса ан-тигенпрезентирующими клетками Т-хелперам, а те в свою очередь активируют В-лимфоциты, которые делятся и дифференцируются в антителообразующие клетки, продуцирующие высо-коафинные антитела класса IgG. Следовательно, снижение активности антител к белкам генов gag и pol ВИЧ-1 на поздних стадиях заболевания может являться индикатором прогрессирования заболевания от бессимптомного вирусоноси-тельства в СПИД-ассоциированный комплекс и СПИД.

Список литературы

1. Орлова В.М. Иммунологическая и серологическая характеристика динамики ВИЧ-инфекции у детей: Автореф. дис. ... канд. биол. наук. — Краснодар., 1996. — 24 с.

2. Покровский В.В., Ермак Т.Н., Беляева В.В., Юрин О.Г. ВИЧ-инфекция: клиника, диагностика, лечение / Под общ. ред. В.В. Покровского. — М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 2000. - 496 с.

3. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология: Пер. с англ. — М.: Мир, 2000. — 592 с.

4. Binley J.M., Klasse PJ., Cao Y, Jones I., Markowitz M., Ho D.D., Moore J.P.. Differential regulation of antibody responses to gag and env proteins of human immunodeficiency virus type // J. Virol. — 1997. — Vol. 71, N 4. — P. 2799-2809.

поступила в редакцию 23.03.2007 принята к печати 27.04.2007

534