ОТКРЫТОЕ ПОЛЕ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ

Предложение относится к экспериментальной физиологии и экспериментальной медицине. Предназначено для определения степени нарушения опорных функций задних конечностей у мелких лабораторных животных (мышей, крыс, морских свинок и др.).
Опорные реакции направлены на поддержку веса тела, на сохранение позы. В опорных реакциях участвует весь опорно-двигательный аппарат. Особая роль у задних конечностей у четвероногих животных и нижних конечностей - у двуногих. Традиционный способ оценки опорных реакций в эксперименте - визуальное наблюдение и описание. Для объективизации наблюдений используется латеральная видеосъемка, когда камеры располагают сбоку от животных, чтобы зафиксировать положение суставов во время движения. При этом животное (мышь, крыса, кошка) обычно фиксируют (подвешивают) над движущейся лентой тредбана так, чтобы задние конечности опирались на ленту тредбана [1, 2]. Это метод кинематического анализа движений. Он имеет ряд ограничений: он трудоемкий и дорогостоящий, так как экспериментальная установка включает в себя тредбан, устройство, фиксирующее животное, видеокамеру с высоким разрешением и нестандартно большой частотой кадров, чтобы записать все детали перемещения суставов; после записи видеофильма происходит покадровый анализ изображений. Кроме того туловище животного подвешено и это обстоятельство осложняет интерпретацию экспериментальных результатов из-за неестественного положения животного.
Для исследования поражения (восстановления) функции поддержки веса тела задними конечностями у крыс и мышей может быть использовании БББ-шкалирование (BBB-scale) [3]. Это поведенческий тест, предназначенный для исследования движений задних конечностей после травмы спинного мозга. Животное помещают в «открытое поле» [4] и двое исследователей в течение 4 мин наблюдают за движениями задних конечностей во время свободного перемещения животного по «открытому полю» - манежу диаметром около 1 м. Все возможные движения задних конечностей прошкалированы от 0 баллов (отсутствие движений) до 21 балла (подошвенная постановка стоп и координированные движения конечностей с полной поддержкой веса тела). По сравнению с кинематическим анализом движений, БББ-шкалирование гораздо менее трудоемкое, значительно дешевле, животные во время тестирования - в естественной для них позе. Однако процедура шкалирования может быть субъективной, этот метод плохо поддается документированию, количественная оценка затруднена.
Задача - определение восстановления движений задних конечностей после травмы, с оценкой функции поддержки веса тела с дополнительным результатом: шкалированием функции поддержки веса тела.
Предложен манеж, позволяющий определять (измерять) степень нарушений восстановления опорных реакций с помощью дополненного теста «открытого поля». Устройство предназначено для исследования у лабораторных животных (крыс, мышей, морских свинок и т.д.) способности задних конечностей поддерживать вес тела. Устройство (рисунок 1) состоит из прозрачного со всех бортов 1 манежа 2, с прозрачным дном, причем манеж служит «открытым полем», куда помещают животных. Борта 1 манежа препятствуют тому, чтобы животные покидали «открытое поле». Вверху манеж открыт.Под ним, в центре, размещена видеокамера 3 (пленочная или цифровая). Объектив видеокамеры снизу нацелен на «открытое поле», которое должно полностью попадать в объектив видеокамеры (см. рисунок 2, где представлен вид по стрелке А на рисунке 1). Видеоизображение может сохраняться на пленке, в памяти видеокамеры или может передаваться на компьютер 4 для сохранения на жестком диске компьютера и вывода изображения на экран монитора для анализа результатов в реальном времени.
Перед тестированием подошвенную поверхность стоп исследуемых конечностей окрашивают быстросохнущим красителем (тушь, фломастер на спиртовой основе, спиртовой раствор бриллиантового зеленого и т.д.). Цвет красителя контрастирует с окраской шерсти животного. После высыхания красителя животное помещают в «открытое поле», начинают запись на видеокамеру. Длительность наблюдения и записи - 4 мин, что соответствует длительности наблюдения при БББ-шкалировании. Прозрачные стенки и дно «открытого поля» позволяют наблюдать за животными во время передвижений и проводить БББ-шкалирование.
Нормальное проявление опорной функции у многих лабораторных животных - постановка задних конечностей на подошвенную поверхность стопы или на пальцы стоп так, чтобы подошвенная поверхность стопы была обращена к опоре. При нарушении опорной функции задние конечности волочатся по опоре или позиционируются на тыльную поверхность стопы. Изображение окрашенных стоп на видеозаписи - свидетельство нормальной постановки стоп задних конечностей на опору. В норме количество появления изображений окрашенных стоп будет совпадать с количеством шагов, и правильная постановка стоп - в 100% шагов. При частичном нарушении опорных функций задних конечностей количество случаев правильной постановки стоп меньше 100%. При отсутствии опорных функций - 0% изображений. Мерой отклонения от нормы является доля появления изображений окрашенных стоп от общего количества шагов в течение ограниченного периода тестирования, выраженная в процентах. При значительных нарушениях опорных функций, сочетающихся с нарушением локомоторных функций, для оценки степени поражения (или восстановления) опорных функций служит количество случаев, когда окрашенная поверхность стопы была направлена к опоре. При одностороннем поражении опорных функций, когда необходимо тестирование одной конечности, окрашивают подошвенную поверхность стопы только этой конечности.
Для определения латерализацин опорной функции подошвенную поверхность стоп правой и левой конечности окрашивают разными цветами для дифференцирования вклада каждой конечности в поддержку веса тела.
Подсчет ведут в реальном времени, наблюдая за изображением на экране монитора, либо - в отсроченном режиме, просматривая записанные видеофайлы. Подготовлены компьютерные программы для автоматизированного анализа результатов.
Пример
Эксперимент проведен на взрослых самках крыс линии Sprague-Dawley (200-250 г). Все манипуляции с животными осуществляли в соответствии с законом «О защите животных от жестокого обращениям гл.IV, ст.10, 4679/11 ГК от 01.12.1999. Перерезку спинного мозга на нижнегрудном уровне Th9 проводили по стандартной методике, в соответствии с международными стандартами, под глубоким наркозом [5]. Исследовали влияние локомоторных тренировок на восстановление опорных реакций. Тренировки начинали через сутки после операции, проводили 5 раз в неделю, в течение 6 недель, по 15 мин. Крыс подвешивали в фиксирующем устройстве [6]. Передние и задние конечности животных опирались на движущуюся ленту тредбана подошвенной поверхностью стоп. В процессе тренировки экспериментатор брал в руки задние конечности крыс и воспроизводил движения, повторяющие нормальный цикл шага, т.е. с подошвенной постановкой задних лап на опору. Животных контрольной группы не тренировали. Степень восстановления опорных реакций определяли каждые 7 дней, проведя первое тестирование на 8-ой день после операции.
Для тестирование был изготовлен манеж - «открытое поле». Борта манежа высотой 30 см и его дно диаметром 85 см - из прозрачного поливинилхлорида. Под манежем разместили вэб-камеру (Logitech-QuickCam Pro 1000) так, чтобы он полностью попадал в вэб-камеру. Вэб-камера соединена с ноутбуком (HP Compaq nx7400), для записи использован стандартный драйвер вэб-камеры. Перед тестированием стопы лап крыс окрашивали синим цветом, контрастным к белому цвету шерсти крыс, с помощью фломастера на спиртовой основе. Анализ результатов проводили в отсроченном времени. Одновременно с регистрацией опорных реакций проводили БББ-шкалирование двигательной активности крыс.
В результате проведенных исследований определено, что через 6 недель после локомоторных тренировок опорные реакции восстанавливаются, оценки по БББ-шкале достигали 11 баллов, что соответствует частым или постоянным шагам с поддержкой веса тела без координации с передними конечностями [3]. На рисунке 2 представлен кадр видеозаписи крысы с частичным восстановлением функции поддержки веса тела. Стрелка указывает на левую заднюю конечность, повернутую подошвенной поверхностью стопы к опоре. Правая задняя конечность повернута тыльной поверхностью стопы к опоре. У крыс, которых не тренировали, опорные реакции не восстанавливались.
Предложенное «открытое поле» для лабораторных животных используется в экспериментальной физиологии и медицине для исследования степени поражения пли восстановления опорных функций задних конечностей и функции поддержки веса тела. Манеж позволяет исследовать латерализацию функции поддержки веса тела.
Литература
1. Leon R.D. de, Hodgson J.A., Roy R.R., Edgerton V.R. Locomotor capacity attributable to step training versus spontaneous recovery after spinalization in adult cats. J Neurophysiol 79:1329-1340, 1998.
2. Ichiyama RM, Gerasimenko Y, Jindrich DL, Zhong H, Roy RR, Edgerton VR. Dose dependence of the 5-HT agonist quipazine in facilitating spinal stepping in the rat with epidural stimulation Neurosci Lett. 2008 Jun 27; 438(3):281-5
3. Basso DM, Beattie MS, Bresnahan JC A sensitive and reliable loco-motor rating scale for open field testing in rats. J Neurotrauma. 1995 Feb; 12(1):1-21
4. Walsh RN, Cummins R.A. The Open-Field Test: a critical review. Psychol. Bull. 1976 May; 83(3): 482-504.
5. Мошонкина Т.Р., и др. Морфо-функциональные основы восстановления локомоторных движений у крыс с полной перерезкой спинного мозга. БЭБМ 2004. №8. С.225-229.
6. Новиков Г.И., Мошонкина Т.Р. Устройство для фиксации мелких лабораторных животных. Заявка RU 2009106527/22 с решением о выдаче от 23.03.2009.