Способ неинвазивной молекулярно-биологической диагностики болезней пульпы
METHOD FOR NON-INVASIVE MOLECULAR BIOLOGICAL DIAGNOSIS OF PULP DISEASES

Изобретение относится к медицине, а именно к стоматологии, и предназначено для дифференциальной диагностики болезней пульпы на молекулярно-биологическом уровне на основании данных протеомного профиля дентинной жидкости зубов, что позволит существенно повысить достоверность диагностики обратимости воспалительного процесса в пульпе зубов с целью назначения адекватного плана лечения.
Диагностика и лечение болезней пульпы остается одной из ведущих проблем в стоматологии, что определяется высокой распространенностью данной патологии среди населения (Янушевич О.О., Максимовская Л.Н. с соавт., 2016; Николаев А.И., Цепов с соавт 2018; Митронин А.В., 2020; Ricucci D., Siqueira J.F., Li Y., 2019; Cohen S., Hargreaves K.M., Berman L.H., 2020). В общей структуре оказания медицинской помощи больным в лечебно-профилактических учреждениях стоматологического профиля воспаление пульпы зуба встречается во всех возрастных группах пациентов и составляет 28-30% от общего числа обращений (Леонтьев В.К., 2004; Боровский Е.В., Вагнер В.Д., Кузьмина Э.М. с соавт., 2018). Согласно международной классификации болезней (МКБ-10), в структуре болезней пульпы выделяют нозологические формы «К04.00 Начальный пульпит», которой соответствует обратимая стадия воспалительного процесса в тканях пульпы, и нозологические формы «К04.01 Острый пульпит», «К04.02 Гнойный пульпит», «К04.03 Хронический пульпит», которым соответствует необратимая стадии воспаления пульпы зубов (Дмитриева Л.А., с соавт., 2015; Rucucci D., 2015; Kenneth М., Louis Н. Berman, Han Rotstein, Митронин A.B., 2020). Результатами многочисленных рандомизированных исследований была подтверждена эффективность методов сохранения жизнеспособности пульпы новыми биоактивными материалами, при условии, что воспалительный процесс в пульпе находится в стадии обратимости (Островская И.Г., 2018; Cohenca N., 2013; Matsuura Т., Yamada S., 2019; Wei X., Ling JQ., 2019). Тем не менее, высокий процент осложнений после лечения обратимых форм пульпита указывает на низкую диагностическую достоверность проводимого тестирования пульпы, которое не позволяет объективно оценить воспалительный статус пульпы и прогнозировать сохранение ее жизнеспособности в долгосрочной перспективе (Мамедова Л.А., 2002; Манак Т.Н., Чернышева Т.В., 2019; Hirsch, V., Wolgin, М., Mitronin, A.V., Kielbassa, A.M., 2017).
Очевидно, что диагностика состояния пульпы на ранней стадии воспаления является особенно важным этапом, который предопределяет дальнейший план лечения и, в частности, возможность сохранения жизнеспособности пульпы. Следовательно, ведущим критерием успешного лечения начального пульпита и снижения вероятности возникновения осложнений является повышение точности диагностики статуса пульпы с определением прогностических предикторов (Ширяк Т.Ю., Салеев Р.А., 2017; Ермольев С.Н., Волков Е.А., 2018; Rechenberg D.K., 2017; Mishra S., Ssharma D., Bhusari C., 2019).
Большинство существующих методов диагностики ограничены определением только субъективных признаков воспаления, что не позволяет истинно оценить воспалительный статус пульпы (Янушевич О.О., Островская И.Г., Вавилова Т.П., 2019; Ricucci D. и др., 2019). Например, наиболее распространенным методом диагностики витальности пульпы является холодовая проба, которая основана на стимуляции термочувствительных нервных волокон тканей пульпы. Другими методами являются электроодонтометрия и диагностическое препарирование зуба без анестезии. Однако, эффективность и достоверность таких тестов зачастую ограничена, в частности, при диагностике витальности зубов с имеющимися реставрациями, при облитерации системы корневых каналов зуба или после острой травмы. Все вышеописанные методы диагностики основаны на активации нервного ответа пульпы на раздражитель и реакции пациента на болевой приступ, и не могут быть использованы для прогнозирования состояния пульпы, поэтому их следует считать «тестами на чувствительность», а не «тестами на жизнеспособность». С целью повышения диагностической достоверности состояния пульпы наряду с данными клинического обследования также используют показатели аппаратных методов исследования. Функциональные методы диагностики микроциркуляции сосудов пульпы, такие как допплеровская флоуметрия (Olgart L., 1988), оксиметрия пульпы (Schmitt JM, Webber RL, 1991) и двухволновая спектрофотометрия (Nissan R, Trope М, Zhang CD, 1992), могут быть полезными при диагностике статуса интактного фронтального зуба в случае острой травмы (Levin LG, 2013), однако, их применение для диагностики боковой группы зубов и ранее леченных зубов неэффективно и трудоемко, что и определило их ограниченное применение в терапевтической стоматологии. Следует заключить, что основанный на результатах современных методов диагностики клинический диагноз зачастую не подтверждается данными гистологических исследований (Seltzer S, Bender I, Ziontz M., 1963; Ricucci D., 2014; Wolters W., Duncan H., 2017). Это свидетельствует о том, что основные и дополнительные методы обследования не располагают возможностями оценки изменений пульпы на клеточном и молекулярном уровнях и, как следствие, не позволяют правильно поставить диагноз (Mejare et al., 2012).
Следовательно, необходим поиск альтернативных способов диагностики состояния пульпы, которые позволят достоверно оценить активность воспалительного процесса в тканях пульпы с целью дифференциальной диагностики обратимой и необратимой стадии пульпита, что позволит назначить адекватное лечение.
Ввиду того, что при начальном пульпите пульпа сохраняет свою витальность, более предпочтительными являются неинвазивный или малоинвазивный подходы к ее диагностике, которые позволят диагностировать заболевания на ранних стадиях его развития, осуществлять контроль эффективности лечения и мониторинг статуса витальности пульпы без дополнительного ятрогенного вмешательства.
На сегодняшний день новым направлением развития современной медицины является применение метаболомных исследований в диагностических целях (Гончаров Н.В., Уколов А.И., Орлова Т.И., 2015). Основная идея метаболомики заключается в обнаружении специфических маркеров в биологическом образце для ранней диагностики ряда заболеваний. Идеальный биомаркер должен обладать высокой чувствительностью, специфичностью и прогностической значимостью, надежно воспроизводится у людей разного пола и разных этнических групп, а процедура его определения должна быть безопасна для здоровья пациентов. Наиболее часто данные методы исследования в качестве диагностического инструмента применяются в общей медицине, например, для ранней диагностики онкологических заболеваний (Якупова К.И., Князева О.А., 2019). Однако, метаболомный анализ в стоматологии находится лишь на начальном этапе своего развития.
Предполагается, что преодолеть «субъективизм» диагностики статуса пульпы позволят более специфично-направленные и узкие критерии диагностики, согласно которым будет определен уровень вмешательства, необходимый для заживления пульпы и/или клинического выздоровления. Это особенно важно при лечении обратимого воспаления пульпы методом прямого или непрямого покрытия, а также при оценке общего статуса пульпы при замене прямых или непрямых реставраций. Большую диагностическую ценность для выполнения вышеперечисленных задач будет иметь молекулярный анализ некоторого субстрата витального зуба и поиск потенциальных прогностических показателей (биомаркеров) заболеваний, которые смогут точно описать континуум воспаления пульпы и определить связь между воспалительным статусом и потенциалом заживления пораженной ткани. Концепция континуума в медицине отражает накопление научных знаний о молекулярно-клеточных механизмах возникновения заболеваний, а также о патогенезе и саногенезе заболеваний и, несомненно, связана с новыми разработками лекарственных подходов (Минеев В.Н., 2016).
Согласно фундаментальным иммуно-биохимическим исследованиям, реакция пульпы на чужеродный агент имеет врожденный или неспецифический иммунный ответ (Вавилова Т.П., Островская И.Г., Митронин А.В., 2017). Данные гистологических исследований свидетельствуют о том, что пульпит характеризуется воспалением тканей пульпы, которое ассоциировано с активностью полиморфноядерных лейкоцитов (Fouad A.F., 2020). При изучении тканевых образцов пульпы было выявлено, что активность связанных с нейтрофилами ферментов, таких как эластаза, катепсин-G (Chu Р., 2019), ММР-9 (Zender М., 2016), и других соединений повышается в клинически воспаленной пульпе в сравнении со здоровой пульпой. Кроме того, активность провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в значительной степени различается между клинически здоровыми и воспаленными тканями пульпы (Rechenberg D.K., Galicia J.С, Peters О.А., 2016). Эти данные имеют фундаментальное значение для диагностики в стоматологии, однако, не могут быть применены для клинической диагностики статуса пульпы зуба на повседневном стоматологическом приеме вследствие неприемлемого для сохранения жизнеспособности пульпы метода забора материала для исследования, который приводит к сокращению витальности зуба.
Одним из потенциальных неинвазивных методов диагностики состояния пульпы выступает исследование дентинной жидкости зубов (ДЖЗ), поскольку это позволяет без специальной подготовки пациента к исследованию и с минимальным риском для здоровья оценить активность воспалительного процесса непосредственно в тканях пульпы. Пульпа зуба находится в тесном контакте с дентином и формирует единый дентинно-пульпарный комплекс. Дентинная жидкость - это ультрафильтрат крови пульпы, который содержится в дентинных канальцах (Быков И.М., 1999; Островская И.Г., 2018; Coffey СТ, 1970; Longridge NN, 2019). В процессе развития воспалительного процесса как в пульпе, так и в дентинной жидкости появляются сигнальные молекулы, концентрация которых меняется в зависимости от стадии воспаления, что подтверждает факт пребывания дентинной жидкости в физиологически активном и динамичном состоянии. Идея собирать дентинную жидкость с поверхности обнаженного дентина с целью оценки состояния пульпы принадлежит исследовательской группе профессора Pashley DH (Maita Е, Simpson MD, Tao L, Pashley DH. Fluid and protein nux across the pulpodentine complex of the dog in vivo. Arch Oral Biol. - 1991. - №36. - P. 103-110). Первые исследования были выполнены на молярах собак и направлены на изучение проницаемости дентина, объема получаемой жидкости, концентрации белка в дентинной жидкости и внутрипульпарного давления зуба. Основными недостатками проводимого способа оказались низкий уровень выхода биологического материала и невозможность его неинвазивного получения, а так же очень низкая концентрация белка, что ограничивало его применение в клинической практике. Это послужило в дальнейшем совершенствованию методов сбора и анализа дентинной жидкости, которые становились более разнообразными в соответствии с развитием медицинских технологий, а так же использованию других субстратов зуба, таких как кровь пульпы при вскрытии полости зуба и десневая жидкость зуба, в диагностических целях.
Известен способ диагностики воспаления пульпы временных зубов путем определения активности ферментов аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (ACT) в десневой жидкости зубов - [Пат. 2558985 Российская Федерация, МПК А61В 6/00. Способ диагностики воспаления пульпы временного зуба / И.Г. Островская, Т.П. Вавилова, Л.П. Кисельникова, Е.В. Холодкова; заявитель и патентообладатель ГБОУ ВПО МГМСУ им. А.И. Евдокимова. - №2014126448; заявл. 30.06.2014; опубл. 09.07.2015, Бюл. №22. - 8 с.]. Забор образцов десневой жидкости для исследования осуществляется по стандартной методике с использованием бумажных пинов, которые вводят в десневую борозду на определенное время. По результатам исследования десневой жидкости диагностируют воспаление пульпы временного зуба при соотношении ферментов АСТ/АЛТ>1,5. Данный способ является неинвазивным и обеспечивает оценку состояния пульпы на разных стадиях воспаления, однако, его применение возможно только для дифференциальной диагностики состояния пульпы временных зубов у детей. К тому же, регенеративная способность клеток пульпы временных зубов у детей в значительной степени выше, чем у взрослых, что ограничивает его применение на взрослом стоматологическом приеме. Однако, одним из основных недостатков диагностики состояния пульпы по данным десневой жидкости является отсутствие возможности дифференцировки пульпарного и пародонтального воспаления. Выполняя анализ десневой жидкости с целью определения статуса воспаления непосредственно в тканях пульпы, всегда будет иметь место предвзятое отношение к воспалению десен или тканей пародонта, имеющих высокую распространенность в России и мире. В частности, к 30 годам более 50% населения имеют различные клинические проявления заболеваний пародонта, а в возрасте 40 лет - более 90% населения (Артюшкевич А.С., 2006; Максимовский Ю.М., Митронин А.В., 2014; ShariH S. и соавт., 2020). Таким образом, у пациентов с гингивитом и/или пародонтитом будет наблюдаться искажение достоверности результатов исследования. Следовательно, десневая жидкость, вероятно, является спорным субстратом зуба для достоверной диагностики состояния пульпы.
Известен способ диагностики статуса пульпы по показателям крови при вскрытии полости зуба - [Elsalhy М., Azizieh F., Raghupathy R. Cytokines as diagnostic markers of pulpal inflammation // International Endodontic Journal. - 2013. - №46. - P. 573-580]. Забор образцов крови пульпы проводят наложением ватного шарика на область вскрытия полости зуба в течение 1 минуты. Затем с помощью иммуноферментного анализа оценивают активность цитокинов интерлейкина -2, -6, -8, -10 (ИЛ-2, -6, -8, -10), фактора некроза опухоли-а (ФНО-а) и Интерферона-С (ИФН-с) в полученных образцах биологического материала. Было показано, что активность цитокинов ИЛ-8 и ИЛ-10 была значительно выше при необратимом пульпите, чем при обратимой стадии воспаления (р<0,001), а соотношение цитокинов IL-6/IL-10 и IL-8/IL-10 может свидетельствовать о развитии необратимого воспаления пульпы. Недостатком данного метода диагностики является его инвазивность и отсутствие возможности проведения анализа без вскрытия полости зуба, что противоречит малоинвазивному подходу лечения начального пульпита. Кроме того, отсутствие количественных данных активности цитокинов на разных стадиях воспаления ограничивает применение данного метода для диагностики статуса пульпы на сегодняшний день. Требуется проведение дальнейших исследований в данной области для получения более конкретных качественных и количественных данных.
Наиболее близким по методике сбора биологического материала для исследования и достигаемому результату является способ диагностики состояния пульпы зуба путем определения активности ферментов матриксной металлопротеиназы - 2 (ММП-2) и матриксной металлопротеиназы - 9 (ММП-9) в дентинной жидкости зубов - [Ballal V., Rao S., Bagheri A., [et al.] MMP-9 in dentinal fluid correlates with caries lesion depth // Caries Research. - 2017. - №51 (5). - P. 460-465]. При проведении диагностики проводится забор образцов дентинной жидкости зубов и определяется активность ферментов ММП-2 и ММП-9 с помощью иммуноферментного анализа. По результатам исследования уровень активности ММП-9 повышается в зубах с глубоким кариозным поражением, поэтому данный фермент можно косвенно считать маркером начального воспаления пульпы. Уровень ММП-2 оставался неизменным во всех группах сравнения. Данный способ выбран за прототип. Основным достоинством данного метода диагностики является изучение дентинной жидкости зуба, который позволяет провести неинвазивную диагностику без дополнительных вмешательств. Однако, недостатками способа является то, что полученные результаты активности ферментов коррелируют только с данными глубины кариозного поражения, что имеет косвенное отношение к процессам воспаления в пульпе, и не предназначены для диагностики непосредственно воспалительного статуса пульпы.
Исходя из этого следует заключить, что требуется более глубокий и детальный анализ компонентов дентинной жидкости зубов на молекулярном уровне в норме и при патологии с целью разработки и усовершенствования уже имеющихся неинвазивных методов диагностики обратимых форм пульпита на основе полученных данных. Диагностика пульпы по показателям дентинной жидкости зубов оказалась наиболее адаптированной ко всем стоматологическим вмешательствам, которые направлены на поддержание жизнеспособности пульпы. Молекулярный анализ дентинной жидкости может внести ясность в оставшиеся на сегодняшний день клинически нерешенные вопросы - можно ли неинвазивно дифференцировать обратимое и необратимое воспаление пульпы и прогнозировать жизнеспособность пульпы при ее лечении.
Задачей изобретения является повышение объективности диагностики болезней пульпы на молекулярно-биологическом уровне и возможность прогнозирования течения воспалительного процесса в пульпе зубов.
Технический результат заявленного изобретения заключается в обеспечении возможности дифференциальной диагностики различных нозологических форм болезней пульпы за счет создания надежной системы критериев протеомного диагностирования, который включает определение воспалительного статуса пульпы путем изучения уровня экспрессии белковых идентификаций дентинной жидкости исследуемого зуба, по результатам которого определяют резервные возможности пульпы к сохранению ее жизнеспособности.
Технический результат достигается тем, что в дентинной жидкости зуба методом иммуноферментного анализа определяют уровень экспрессии белковой фракции альфа-1-антихимотрипсин и при значениях более 5.35 нг/мл диагностируют начальный пульпит с развитием обратимого воспаления в тканях пульпы, при значениях 2.06-5.34 нг/мл - острый пульпит с необратимым воспалением в тканях пульпы, а при значениях альфа-1-антихимотрипсин менее 1.54 нг/мл у пациентов диагностируют хронические формы пульпита с низкими репаративными возможностями пульпы.
Выбор белковой фракции альфа-1-антихимотрипсин (a1 ACT) в дентинной жидкости зубов в качестве диагностического показателя обусловлен его специфической активностью при воспалении в тканях пульпы, что было выявлено при проведении протеомного анализа. Следует отметить, что протеомное исследование дентинной жидкости зубов проводится впервые и ранее в источниках мировой и отечественной литературы не упоминается. Забор биологического материала для исследования производили неинвазивным методом из полости витального зуба с помощью нитроцеллюлозной мембраны Sartorius 1288 (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Gottingen, Germany) плотностью 84 г/м2, толщиной 0,21 мм и задерживающей способностью 12-15 мкм у трех групп пациентов согласно диагнозам по МКБ-10: G01 группа (контроль) - интактные зубы (n=10); G02 группа - К04.00 «Начальный пульпит» (n=10); G03 группа - К04.01 «Острый пульпит», К04.02 «Гнойный пульпит» (n=10). Затем эти зубы удалялись по медицинским показаниям и направлялись на патоморфологическое исследование с целью подтверждения клинического диагноза. В случае несовпадения патоморфологического и клинического диагнозов, соответствующие образцы ДЖЗ исключались из протеомного исследования.
Протеомные профили дентинной жидкости зубов были получены методом хромато-масс-спектрометрии с дальнейшим проведением полуколичественного анализа с использованием алгоритма dNSAF (Distributed Normalized Spectral Abundance Factor). Согласно данным исследования, между тремя группами качественное совпадение протеомов составило 19%, или 39 индивидуальных белковых идентификаций (Фиг. 1). Протеом дентинной жидкости интактных зубов представлен 71 индивидуальной белковой идентификацией, при начальном пульпите наблюдается повышение разнообразия белкового спектра до 75 идентифицированных белков. Наиболее обогащенный протеом представлен в группе G03, в которой было идентифицировано 173 индивидуальные белковые идентификации.
Полуколичественный анализ с использованием алгоритма dNSAF проводили на выборке конститутивного протеома из 39 белков. В качестве контрольной группы сравнения использовали группу G01. Для определения гетерогенности исследуемых групп по ранжированному распределению белков конститутивного протеома строили тепловую карту распределения белков с кластеризацией белков и групп методом ранговой корреляции Кендалла (Фиг. 2). В данном случае, при ранговой корреляции определяется дистанция между белковыми идентификациями путем попарного комбинаторного сравнения внутри каждой группы исследования по отношению к контрольной группе сравнения. Далее была рассчитана дистанция между всеми тремя исследуемыми группами для определения возможности дифференциации групп норма/патология. Дистанция между группами показывает, на сколько идентичные белки с идентичным рангом имеют различную представленность между группами. Насыщенность цвета на тепловой карте отражает степень представленности белка, а цвет -непосредственно представленность белка в количественной шкале (зеленый цвет - больше, красный - меньше).
Согласно полученным данным, которые представлены на Фиг. 2, группы G02 и G03 объединены в один кластер, тогда как группа G01 наиболее дистальная от исследуемых групп (горизонтальная дендрограмма), что позволяет дифференцировать контрольную группу от экспериментальных путем сравнительного рангового анализа протеомов. Другими словами, между группами G02 и G03 распределение белков более схожее, чем между любой из этих групп и группой G01. Согласно результатам исследования, группы G01, G02 и G03 достоверно отличаются друг от друга на уровне значимости 0.0042<0.005.
Далее проводили статистический анализ для определения максимально дистальных и проксимальных белков в исследуемых группах при попарном сравнении их протеомов с протеомом контрольной группы на основании данных о ранговом распределении, полученном при построении тепловой карты (при р<0.005, точный тест Фишера) (Фиг. 3, Фиг. 4). Дистанция обозначена в безразмерных величинах; чем выше значение, тем дальше отстоит белок, то есть данный белок образует наименее сильные с другими белками функциональные связи. В частности, на Фиг. 3 представлена матрица, графически отражающая дистанцию между исследуемыми белками. Дистанция в матрице рассчитана по коэффициенту ранговой корреляции Кендала, где значение коэффициента t=0 означает полную корреляцию и образует диагональную ось симметрии матрицы (то есть попарная дистанция между идентичными белками по вертикальной и горизонтальной осям), а значения, отличные от нуля, отражают наличие отличий в корреляции между белками в паре сравнения. В свою очередь, на Фиг. 4 продемонстрировано, что белок Collagen alpha-1 (COL1A1) является максимально отстоящим от всех белков. В то же время, белки Lipocalin-1 (LCN1) и Cystatin-S (CST4) объединяются в одну пару, которая на третьем уровне (дистанция 1.07) объединяется с Collagen alpha-1 (COL1A1). COL1A1 и CST4 характеризуются максимальным значением и располагаются дальше от остальных белков. Это объясняется тем, что коллаген (COL1A1) - это белок архитектуры внеклеточного матрикса, а цистатин (CST4) - неспецифичная протеаза. Тем не менее, COL1A1 и CST4 объединены между собой одной скобкой, поскольку цистатин С, будучи неспецифичной протеазой, также участвует в процессах ремоделлинга внеклеточного матрикса, отвечает за свойства эластичности и ригидности межклеточного пространства и предопределяет процесс миграции клеток. Кроме того, он принимает частичное участие в процессах фибринолиза. Обращаясь к общей картине идентифицированных в наших пробах белков, очевидно, что в группах G02 и G03 протекают воспалительные процессы, поскольку выявлены белки острой иммунной реакции, а также белки-посредники, участвующие в ответной реакции локального стресса в условиях гипоксии (например, альфа-2-макроглобулин, серотрансферрин, альфа-2-кислый гликопротеин). Это все свидетельствует о том, что близлежащие белки, выявленные на дендрограммах, участвуют во взаимосвязанных биологических процессах, которые отражают физиологические процессы в пульпы на момент исследования.
В соответствии с проанализированными результатами, в таблице 1 отражены белки конститутивного (обобщенного) протеома групп исследования со значениями полуколичественных динамических изменений с использованием линейной шкалы. Значимыми изменениями считаются те, для которых FC>2 или FC<0.5 при р<0.005 (с поправкой Бонферрони).
Согласно результатам сравнения обобщенного протеома экспериментальных групп с группой контроля (таблица 1), белок альфа-1-антихимотрипсин (α1ACT) в группе G02 в 42 раза больше, чем в контрольной группе, в то время как в группе G03 в 27 раз больше и 21 раз меньше, чем в группах G01 и G02 соответственно (р<0.005). Рассматривая функциональную активность данного белка, α1ACT является членом семейства белков острой фазы ингибитора сериновых протеаз, таких как катепсин G, который продуцируется в нейтрофилах, защищая тем самым ткани от повреждений, вызванных протеолитическими ферментами. Этот белок, вероятно, одним из первых индуцируется при воспалении. Таким образом, по данным протеомного профиля дентинной жидкости зуба белковую фракцию α1ACT целесообразно рассматривать в качестве специфического маркера воспаления при болезнях пульпы.
Альфа-1-антихимотрипсин (SERPINA3) - альфа-глобулин, гликопротеин семейства ингибиторов сериновых протеиназ (серпинов), из которых к настоящему времени идентифицировано более 700 как у эукариот, так и у прокариот (Morgan, K., F. Licastro, L. Tilley et al., 2001). Филогенетический анализ с использованием белковых последовательностей классифицировал человеческие серпины на девять групп (А-I) (Irving J.A., Pike R.N., Lesk A.M., Whisstock J.C., 2000). Белок α1ACT является одним из 13 внеклеточных белков в группе А и состоит из 423 аминокислот, включая сигнальный пептид из 25 остатков на аминоконце, который отщепляется от зрелого белка. Общая молекулярная масса α1ACT составляет приблизительно 55-66 кДа из-за тяжелого гликозилирования в нескольких сайтах (Hwang S.R., Steineckert В., Kohn A., et al., 1999).
α1ACT имеет типичную серпиновую структуру, состоящую из трех бета-листов, 8 альфа-спиралей и активного сайта, расположенного в гипервариабельной реактивной центральной петле (РЦП). В человеческом белке α1ACT РЦП-домен имеет длину 23 аминокислоты и расположен вблизи карбоксильного конца белка. Серпины находятся в расслабленной (нативной) конформации, пока целевая протеаза не свяжется с РЦП, что вызывает конформационное изменение. Этот процесс необратим, и серпины больше не способны связываться с дополнительными протеазами (Baker С., Belbin О., Kalsheker N., Morgan K., 2007).
Фермент alACT является одним из первых белков острой фазы, активность которого резко повышается в ответ на воспаление (Baker, С., Н.М. Nielsen, L. Minthon, Н., 2005). Главная физиологическая функция заключается в ингибировании нейтрофильной эластазы, протеазы, гидролизующей структурные протеины. α1ACT ингибирует активность некоторых протеиназ, таких как катепсин G, который находится в нейтрофилах, и химаз тучных клеток с их трансформацией в другую форму или конформацию. Основной мишенью α1ACT считается катепсин G, который содержится в нейтрофильных гранулах и секретируется в область воспаления для уничтожения патогенов, ремоделирования поврежденной ткани и активации рецепторов и провоспалительных цитокинов (Blanco I., 2017). Фермент α1ACT защищает ткани от повреждений, вызванных протеолитическими ферментами. Ранее было выявлено, что данная белковая фракция может быть использована для диагностики болезни Альцгеймера, эмфиземы легких или цирроза печени. Для изучения активности белковой фракции SERPINA3 в различных биологических образцах используется метод высокочувствительного иммуноферментного анализа (ИФА).
Дентинная жидкость зуба в качестве диагностического материала была выбрана благодаря своей относительной доступности для прижизненного анализа пульпы зуба по показателям активности различных химических соединений дентинно-пульпарного комплекса. Забор дентинной жидкости осуществляется неинвазивным, простым в исполнении и безболезненным для пациента методом, что имеет особенно важное значение для пациентов и соответствует актуальным рекомендациям высших стоматологических организаций по малоинвазивному подходу к лечению болезней пульпы.
Разработанный метод молекулярно-биологического тестирования состояния пульпы по данным белкового спектра дентинной жидкости зуба является одним из достоверных методов витальной диагностики с целью определения стадии воспалительного процесса, который выполняется неинвазивным путем, что важно для профилактики осложнений и сохранения жизнеспособности пульпы.
Указанный способ осуществляется следующим образом. После проведения местной анестезии и изоляции рабочего поля, препарируют кариозную полость зуба с целью удаления некротизированных тканей или старой реставрации, затем осуществляют стимуляцию скорости тока дентинной жидкости (методом дегидратации) и в полость зуба вносят целлюлозную мембрану на 5 минут с целью забора биологического материала. В полученном образце дентинной жидкости определяют уровень экспрессии белка альфа-1-антихимотрипсин методом иммуноферментного анализа, и при значениях более 5.35 нг/мл диагностируют начальный пульпит с развитием обратимого воспаления в тканях пульпы, при значениях 2.06-5.34 нг/мл - острый пульпит с необратимым воспалением в тканях пульпы, а при значениях альфа-1-антихимотрипсин менее 1.54 нг/мл у пациентов диагностируют хронические формы пульпита с низкими репаративными возможностями пульпы.
Для подтверждения подлинности наших рассуждений и предложенного способа диагностики было проведено исследование дентинной жидкости зубов у 42 пациентов обоего пола в возрасте от 18 до 35 лет, обратившихся в терапевтическое отделение стоматологической клиники (таблица 2).
Исследование проводилось на основании письменного добровольного информированного согласия. Для определения референсных значений экспрессии белка α1ACT в дентинной жидкости зубов при различных болезнях пульпы был проведен иммуноферментный анализ. Были выявлены существенные различия экспрессии белка альфа-1-антихимотрипсин в норме и при различных болезнях пульпы зубов (таблица 3).
Согласно данным, представленным в таблице 3, в дентинной жидкости зубов при начальном воспалении пульпы наблюдалась тенденция к повышению экспрессии α1ACT по отношению к данным контрольной группы. Так, результаты расчетов непараметрического аналога дисперсионного анализа - теста Крускалла-Уоллиса для несвязанных выборок свидетельствуют о достоверном различии уровней экспрессии белка α1ACT между группой контроля и группами начального и острого пульпита на уровне р<0.001 (Фиг. 5, а). Корреляционный анализ с использованием графика квантилей показал высокодостоверную (р<0.05) прямую корреляционную зависимость данных состояния пульпы зубов и уровня экспрессии α1ACT в пробах дентинной жидкости (Фиг. 5, б). На графике показана хорошая связь между наблюдаемыми значениями переменных.
Тем не менее, согласно статистическим расчетам с использованием Tukey post-hoc теста, уровень экспрессии α1ACT в группе контроля не отличается от данных группы хронического пульпита на достоверном уровне (0.082>0.05). В группе образцов ДЖЗ с начальным пульпитом был выявлен наибольший уровень экспрессии α1ACT (р<0.001), который снижался в процессе развития воспаления. Однако, при хроническом пульпите в семи образцах ДЖЗ из десяти исследуемых не было выявлено α1ACT, что, вероятно, свидетельствует о концентрации белка в образцах ДЖЗ ниже аналитической чувствительности теста.
Значения экспрессии белка альфа-1-антихимотрипсин в дентинной жидкости зубов при болезнях пульпы представлены в таблице 4.
Краткое описание фигур и таблиц.
На Фиг. 1 представлена диаграмма, отражающая результаты симметричного качественного анализа протеомов между исследуемыми группами.
На Фиг. 2 представлена тепловая карта ранжированного распределения белков внутри каждой группы и между группами исследования по отношению к контрольной группе сравнения.
На Фиг. 3 представлена диаграмма, отражающая дистанцию между белками во всех трех группах при попарном сравнении с контрольной группой.
На Фиг. 4 представлена диаграмма определения максимально дистальных и проксимальных белков в исследуемых группах при попарном сравнении их протеомов с протеомом контрольной группы.
На Фиг. 5 представлены диаграммы: а - диаграмма, отражающая динамику средних значений с доверительными интервалами экспрессии α1ACT в группах сравнения; 6 - диаграмма рассеяния уровней экспрессии α1ACT в образцах дентинной жидкости зубов.
В таблице 1 представлен список белков конститутивного протеома исследуемых групп, значимо изменяющихся по отношению к контрольной группе пациентов.
В таблице 2 представлено распределение пациентов в контрольную и экспериментальные группы в соответствии с предварительным диагнозом.
В таблице 3 представлены описательные статистические данные уровня экспрессии белка альфа-1-антихимотрипсин в норме и при болезнях пульпы зубов по данным иммуноферментного анализа.
В таблице 4 представлены референсные значения экспрессии белковой фракции альфа-1-антихимотрипсин в дентинной жидкости зубов в норме и при болезнях пульпы.
Клинический пример №1.
Пациентка З., 1990 года рождения, обратилась с жалобами на боль в области зуба 26 при употреблении холодной и горячей пищи. По данным осмотра была выявлена несостоятельная реставрация в 26 зубе, нарушение краевого прилегания и рецидив кариеса. При проведении холодовой пробы болевая реакция продолжалась в течение 20 секунд после устранения раздражителя. Показатели ЭОД были снижены до 19 мкА. На прицельной внутриротовой рентгенограмме 26 зуба был выявлен глубокий очаг кариозного поражения дентина непосредственно под пломбой, периапикальные изменения отсутствовали. Пациентом было подписано информированное добровольное согласие на участие в данном исследовании и проведение дополнительных терапевтических вмешательств для забора диагностического материала. В процессе лечения после выполнения местной анестезии и препарирования кариозных тканей зуба, производили забор дентинной жидкости по вышеописанной методике. Определяли уровень экспрессии белковой фракции альфа-1-антихимотрипсин в элюате дентинной жидкости, которая достигала 7,24 нг/мл. По данным молекулярно-биологической диагностики пульпы зуба 26 была выявлена повышенная экспрессия α1ACT, что свидетельствовало о развитии начальной стадии воспаления в тканях пульпы и возможности его купирования. Был поставлен диагноз К04.00 Начальный пульпит зуба 26, что послужило основанием к проведению пульпосохраняющей терапии.
Клинический пример №2.
Пациент Д., 1988 года рождения, обратился в стоматологическую клинику с жалобами на боль в зубе 27 при приеме пищи. По данным осмотра была выявлена глубокая кариозная полость в зубе 27, заполненная размягченным дентином. Показатели ЭОД были снижены до 20 мкА. На прицельной внутриротовой рентгенограмме 27 зуба была выявлена глубокая кариозная полость, периапикальные изменения отсутствовали. Пациентом было подписано информированное добровольное согласие на участие в данном исследовании и проведение дополнительных терапевтических вмешательств для забора диагностического материала. Было выполнено молекулярно-биологическое тестирование пульпы зуба 27, при этом определяли уровень экспрессии белковой фракции альфа-1-антихимотрипсин в элюате дентинной жидкости, которая достигала 4,54 нг/мл. Был поставлен диагноз К04.01 Острый пульпит зуба 27. Пациент был назначен на эндодонтическое лечение зуба 27.