Микробная модель Halobacterium salinarum для поиска ингибиторов биосинтеза стеролов

Микробная модель Halobacterium salinarum для поиска ингибиторов биосинтеза стеролов

А. С. ТРЕНИН

ФГБУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков им. Г. Ф. Гаузе» РАМН, Москва

Microbial Model of Halobacterium salinarum for Screening Inhibitors of Sterol Biosynthesis

A. S. TRENIN

G. F. Gause Institute of New Antibiotics, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

Предлагается простая высокоэффективная микробная тест-система для поиска ингибиторов биосинтеза стеролов (ИБС). Она основана на использовании галофильной бактериальной культуры Halobacterium salinarum (по прежней классификации Halobacterium halobium), обладающей мевалонатным путём биосинтеза стеролов и значительным сходством их биосинтеза с образованием холестерина в организме человека. ИБС в модели H.salinarum выявляются как соединения, подавляющие рост тест-культуры. Внесение мевалоновой кислоты — одного из ключевых интермедиатов биосинтеза стеролов, снимает ингибирующее действие многих микробных метаболитов и, таким образом, служит доказательством их влияния на ранние этапы биосинтеза стеролов, включая этап работы ГМГ-КоА редуктазы. Тест с H.salinarum разработан в виде микрометода, легко поддается механизации благодаря миниатюризации микробиологических процессов, выращиванию культуры в стерильных 96-луночных планшетах и использованию автоматических микропипеток. Описываемая тест-ситема пригодна для работы с грубоочищенными экстрактами культуральной жидкости микроорганизмов-продуцентов и может быть с успехом применена на начальных этапах поиска. Показана возможность применения теста H.salinarum для поиска противоопухолевых антибиотиков.

Ключевые слова: ингибиторы биосинтеза стеролов, противоопухолевые антибиотики, archaea, микробные модели поиска, мевалоновая кислота, ГМГ-КоА редуктаза, ловастатин, миниатюризация, механизация микробиологических процессов.

A highly effective and simple microbial test system for screening inhibitors of sterol biosynthesis (ISB) is described. The system is based on cultivation of the bacterial strain Halobacterium salinarum (former Halobacterium halobium), that possesses mevalonate pathway of sterol biosynthesis and is much similar in the biosynthesis to cholesterol formation in humans. In the H.salinarum test system the ISB were found as compounds that inhibited the test culture growth. Mevalonate which is one of the crucial intermediates of sterol biosynthesis dismissed the inhibitory effect of many microbial metabolites thus being evident of their action at the early stages of the sterol biosynthesis, including the HMG-CoA reductase stage. The H.salinarum test system was developed as a micromethod and could be easily mechanized by miniaturization of the microbiological procedures, cultivation in sterile 96-well plates and using automatic micropipettes and dispensers. The H.salinarum test system was effective in testing crude extracts of the culture broths and advantageous at early stage of screening. The use of the H.salinarum test system was shown possible for screening antitumor antibiotics.

Key words: inhibitors of sterol biosynthesis, antitumor antibiotics, archaea, microbial models for screening, mevalonate, HMG-CoA reductase, lovastatin, miniaturization, mechanization of microbial processes.

Введение

Микробные вторичные метаболиты — ингибиторы биосинтеза стеролов (ИБС), в первую очередь статины — ингибиторы З-гидрокси-З-метилглутарил-КоА редуктазы (ГМГ-КоА редуктазы), хорошо зарекомендовали себя в лечении и профилактике атеросклероза [1—3]. Среди ингибиторов более поздних этапов биосинтеза стеролов, большой интерес представляют ингибиторы сквален-синтазы, сквален-эпоксидазы, ряда других ферментов, перспективные для лечения сер-

© А. С. Тренин, 2013

Адрес для корреспонденции: 119021 г. Москва, Большая Пироговская, 11. ФГБУ НИИНА

дечно-сосудистых заболеваний [4—6], а также ингибиторы Р-450 зависимой деметилазы ланос-терола, являющиеся действенным средством лечения грибковых инфекций [7, 8]. Многие ИБС, независимо от особенностей своего механизма действия, обладают также противоопухолевой активностью и высоко оцениваются в качестве лекарственных препаратов для лечения онкологических заболеваний [9]. В настоящее время развернут широкий поиск ИБС среди продуктов жизнедеятельности различных микроорганизмов, как грибов, так и актиномицетов [10, 11]. Успех поисковых работ во многом зависит от эффективности применяемых тест-систем, в особенности на начальном этапе отбора.

Возможность применения ферментных систем, требующих тщательной химической очистки тестируемых препаратов, на начальных этапах скрининговых исследований весьма затруднительна. По-видимому, более уместным здесь оказывается использование клеточных культур. Предложенный нами ранее метод отбора ИБС с помощью культуры клеток гепатобластомы G2 (Hep G2), основанный на проведении количественной оценки включения радиоизотопных предшественников в холестерин и отдельные фракции липидов [12], позволяет выявлять важные особенности механизма действия отбираемых микробных метаболитов, однако отличается весьма высокой трудоёмкостью. Микробная тест-система, основанная на использовании грибной культуры Acremonium fusidioides, образующей антибиотик стероидной структуры фузидин [13], обладает значительно меньшей трудоёмкостью, однако требует использования дополнительных процедур для биологического тестирования продукции фузиди-на, что, в целом, несколько усложняет процесс выявления ИБС. Кроме того, наличие у многих микробных метаболитов выраженной противогрибковой активности существенно затрудняет их оценку в указанном тесте.

В последнее время большой интерес исследователей привлекает к себе архебактерии — уникальная группа микроорганизмов, способных к росту в экстремальных условиях внешней среды, включающих в себя повышенную температуру, рН, солёность питательной среды. Для роста большинства представителей рода Halobacterium, например, требуется, чтобы содержание соли (NaCI) в среде превышало 15% [14].

Несмотря на то что клетки архебактерий структурно относятся к прокариотному типу, многие их биохимические процессы существенно отличаются от процессов, присущих бактериям, сближая указанную группу с высшими — эукари-отными организмами [15]. Несколько видов гало-фильных архебактерий являются отличными модельными организмами, используемыми для изучения многих биологических вопросов, включая поддержание структуры и репликацию хромосом, регуляцию транскрипции, экспорт и деградацию белков [14, 15]. Они могут быть применены также для разработки моделей поиска биологически активных соединений.

Уникальной и вместе с тем весьма удобной биологической моделью, позволяющей изучать действие препаратов, способных к подавлению ГМГ-КоА редуктазы, является галофильная архе-бактерия Halobacterium salinarum.

Синтез её липидов осуществляется по мевало-натному, а не по более обычному для бактерий — малонатному пути. По мевалонатному пути, таким образом, происходит образование основного

стероидного компонента мембраны И^аИпагит

— диэфира фитанилфосфатидилглицеролфосфа-та [16,17].

ГМГ-КоА редуктаза Н.тИпагит состоит из двух идентичных субъединиц и значительно уступает по молекулярной массе (М 62.500) соответствующим ферментам позвоночных, а также аналогичным ферментам бактерий, обладающих мевалонатным путём биосинтеза стеролов. Вместе с тем в отличие от бактериального фермента, требующего для своей работы НАДН, ГМГ-КоА редуктаза Н^аИпагит, подобно ферменту человека, требует НАДФН. При этом известный ингибитор ГМГ-КоА редуктазы человека монаколи-новый антибиотик ловастатин оказывается конкурентным ингибитором соответствующего фермента у Н^аИпагит (К = 20 нМ) [15—17].

Отличительные особенности в регуляции биосинтеза стеролов в клетках человека и Н.заИ-пагит таковы, что в человеческих клетках действие ингибиторов ГМГ-КоА редуктазы вызывает лишь некоторое снижение уровня ХС. В то же время у архебактерий действие подобных ингибиторов может привести к полному подавлению роста клеток, поскольку блокируется образование изопреноидных липидов — основного компонента клеточных мембран [17].

Приведённые сведения позволяют оценить возможность использования Н^аИпагит для проведения поиска ИБС.

В настоящем исследовании на основе Н.заИ-пагит разработана модель поиска ИБС, где соответствующие микробные метаболиты выявляются как соединения, подавляющие рост тест-культуры. Внесение мевалоновой кислоты

— одного из ключевых интермедиатов биосинтеза стеролов, снимает ингибирующее действие многих микробных метаболитов и, таким образом, служит доказательством их влияния на ранние этапы биосинтеза стеролов, включая этап работы ГМГ-КоА редуктазы. Тест с Н^аИпагит разработан в виде микрометода, выращивание культуры проводится в стерильных 96-луночных планшетах. Благодаря миниатюризации микробиологических процессов, и использованию автоматических микропипеток тест легко поддается механизации. Показана возможность применения теста Н^аИпагит для поиска противоопухолевых антибиотиков.

Материал и методы

Условия культивирования, среды, определение биологической активности. Культуры актиномицетов и грибов выделяли из образцов почвы и выращивали при температуре 28°С на агари-зованных средах: актиномицеты — на среде Гаузе 1 и Гаузе 2 [18], грибы — на сусло-агаре и кислом агаре Чапека [19].

Для изучения антибиотической активности культур в жидкой питательной среде их выращивали в колбах Эрлен-мейера ёмкостью 750 мл, содержащих 50—150 мл питательной

среды, на качалках при 28°С в течение 5—11 суток в различных питательных средах (в %): Гаузе 2 (глюкоза — 10,0, пептон — 5,0, триптон — 5,0, NaCl — 5,0, СаСОз — 2,5), соево-глицери-новой (соевая мука — 1,5, глицерин — 3,0, NaCl — 0,3, СаСОз

— 0,3), соево-глюкозной (соевая мука — 1,0, глюкоза — 1,0, NaCl — 0,5, СаСО3 — 0,25), соево-сахарозной (соевая мука — 1,0, сахароза — 2,0, СаСО3, — 0,3, Nad — 0,3, KNO3 — 0,2), кукурузно-крахмальной (кукурузный экстракт — 0,3, крахмал

— 2,0, CaCO3, — 0,5, NaQ — 0,5, KNO3 — 0,4). В качестве ино-кулята использовали выращенную на агаризованных средах 7—10-суточную культуру. Рост культур в жидкой среде контролировали спектрофотометрически по уровню поглощения при 560 нм.

Антибиотическую активность определяли методом штриха на агаровой среде при выращивании продуцентов на плотных питательных средах и методом диффузии в агаре при выращивании в жидких средах — в отношении различных бактериальных тест-микроорганизмов и грибов: Bacillus sub-tilis ATCC 6633, Micrococcus luteus ATCC 9341, Staphylococcus aureus ATCC 21027, Escherichia coli ATCC 25922, Candida albicans ATCC 14053, Candida tropicalis ATCC 750, Cryptococcus humicolus ATCC 9949, Aspergillus niger ATCC 16404 и Fusarium oxysporum VKM F-140 (= CMI, IMI 90473).

Для культуры H.salinarum использованы следующие питательные среды (в %): среда 1 (NaCl — 15,6; MgCl2X6H2O — 1,3; MgSO4x7H2O — 2,0; CaCl2x2H2O — 0,1; KCl — 0,4; NaHCO3 — 0,02; NaBr — 0,05; дрожжевой экстракт — 0,5; глюкоза — 0,1; вода — до 100; рН — 7,0); среда 2 (NaCl — 25,0; MgCl2x6H2O — 2,0; CaCl2x2H2O — 0,02; KCl — 0,2; гидроли-зат казеина — 0,5; дрожжевой экстракт — 0,5; вода — до 100; рН — 7,4); среда 3 (NaCl — 25,0; MgSO4x7H2O — 0,1; K2HPO4

— 0,1; дрожжевой экстракт — 1,0; вода — до 100; рН — 7,0— 7,2); среда 4 (NaCl —18,0; MgSO4x7H2O — 0,1; K2HPO4 — 0,1; дрожжевой экстракт — 1,0; вода — до 100; рН — 7,0—7,2). Плотные питательные среды содержали 2% агара.

Препараты антибиотиков, реактивы и материалы. В работе использовали следующие препараты антибиотиков: Нога-ламицин, «Upjohn», США; Стрептонигрин, «Pfizer», США; Актиномицин D предоставлен Институтом антибиотиков, Йена, Германия; Олеандомицин и Виомицин, Pfizer, США; Спектиномицин и Новобиоцин, «Upjohn Co», США; Пуро-мицин, «Nutritional Biochem. Co», Cleveland, США; Ловаста-тин, «Merck Sharp & Dohme», США; Полимиксин М, Поли-миксин B, Хлорамфеникол, Олигомицин, Этамицин, Неомицин, Канамицин, Амикацин и Амфомицин «Sigma», США; Ванкомицин, «Eli Lilly», США; D-циклосерин, «Manu. Res. Lab.», N.Y., США; Бацитрацин и Бензилпенициллин, «Serva», Германия; Мономицин и Оливомицин, Россия; Ампициллин, Тетрациклин и Гелиомицин (резистомицин), «Биосинтез», Пенза; Грамицидин S, «Красфарм», РФ; Ампи-цилин тригидрат, Усолье, Россия; Лизоцим, Доксициклин, Тетрациклин, Гентамицин, Оксациллин, Клоксациллин и Диклоксациллин, Россия, Москва; Амфотерицин В, ВНИИ-ТИАФ, Москва; Стрептотрицин предоставлен ИБХ РАН, Москва, и антибиотики, полученные непосредственно в НИ-ИНА им. Г. Ф. Гаузе, РАМН: Брунеомицин, Даунорубицин, Доксорубицин, Карминомицин, Блеомицетин, Этамицин, Рифамицин SV, Рифампицин, Ристомицин, Эремомицин, а также препараты ряда новых антибиотиков неустановленной химической структуры.

Используемый в тест-системе препарат лактона D^-мева-лоновой кислоты («Sigma», США) подвергали сапонификации

— выдерживали в слабощелочной среде для получения кислотной формы: 1 М раствор лактона в 0,1 н NaOH инкубировали при 50°С в течение 2 часов, либо при 37°С в течение 4 часов.

Контрольным препаратом при выявлении ИБС служил ловастатин («MSD», США).

Для стерилизации проб культуральной жидкости применяли одноразовые стерильные фильтры Sterivex (диаметр пор 0,22 мкм) фирмы «Millipore», США. В целях концентрирова-

ния препаратов культуральнои жидкости проводили их лио-филизацию на лиофилизационноИ установке SUE 300 Q («Heto», Швеция).

Выделение и очистка антибиотиков. Проведено, как описано ранее [12, 13] Культуральную жидкость и мицелиИ продуцентов разделяли фильтрацией или центрифугированием. Выделение антибиотиков из фильтрата культуральноИ жидкости проводили сорбциеИ на смоле Амберлит XAD-2, или экстракцией этилацетатом при кислом (4,0) и нейтральном значениях рН. ПолученныИ после упаривания в вакууме осадок растворяли в небольшом объёме 60% EtOH. Экстракцию антибиотиков из мицелия проводили 80% EtOH.

Хроматографическую очистку и разделение компонентов перспективных препаратов проводили методом колоночноИ хроматографии. Определяли физико-химические характеристики полученных соединениИ. Для идентификации выделенных антибиотических веществ использовали компьютерную базу данных природных биологически активных веществ (BNPD), разработанную Я. Берди (Венгрия).

Микробная модель H.salinarum. Культуру Halobacterium salinarum (Halobacterium halobium ATCC 29341) поддерживали пересевами в агаризованноИ среде №4 при температуре 37°С в течение 7 суток. При постановке эксперимента культуру переносили в одну из жидких питательных сред приведённого выше состава с повышенным содержанием NaCl. Работу с микробным тестом H.salinarum проводили в виде двух вариантов — макро- и микрометода. При использовании макрометода культивирование H.salinarum производили в колбах Эрлен-меИера объёмом 250 мл, содержащих 50 мл питательноИ среды, или пробирках объёмом 25 мл, содержащих 5 мл питательноИ среды, на качалке при 120 об/мин в темноте при температуре 37°С. Рост H.salinarum контролировали спектро-фотометрически в микрокалориметре МКМФ-1 (Россия) в 1 см кюветах при 540 нм. В качестве посевного материала использовали культуру, выращенную на агаризованных питательных средах в течение 1 недели. Снятые с агаризованных питательных сред клетки суспендировали в жидкоИ питательноИ среде с использованием вибратора «Вортекс ELMI» (Латвия). Начальная оптическая плотность культуры при засеве жидкоИ питательноИ среды составляла 0,005—0,015. Исследуемые препараты вносили в среду культивирования H.salinarum из расчёта 10 мкл на 1 мл среды. Выращивание производили до оптическоИ плотности 0,20—0,30.

При использовании микрометода выращивание микроб-ноИ культуры проводили в стерильных 96-луночных полистироловых планшетах с круглым дном, предназначенных для проведения иммунологических реакциИ («Медполимер», С-Пб.). Объём питательноИ среды в каждоИ лунке (пробе) составлял 150 мкл. Инкубирование проводили в термостате при 37°С в течение 5—22 суток. Для предотвращения высыхания проб в термостате создавали условия повышенноИ влажности. В качестве посевного материала использовали культуру H.sali-narum, выращенную на агаризованных питательных средах в течение 1 недели. Клетки суспендировали в жидкоИ питатель-ноИ среде с использованием вибратора «Вортекс ELMI» (Латвия) и разводили питательноИ средоИ до нужного объёма. Начальная оптическая плотность посевного материала, контролируемая в микрокалориметре МКМФ-1 (Россия), составляла 0,005—0,015 (в 1 см кюветах при 570 нм).

Препарат мевалоновоИ кислоты вносили в конечноИ концентрации 1-10 мМ непосредственно в питательную среду в начале культивирования.

Исследуемые препараты, полученные из культуральноИ жидкости и мицелия продуцентов, вносили в среду культивирования H.salinarum в виде спиртовых растворов. Тестированию подвергали также препараты, прошедшие различные стадии химическоИ очистки. Испытуемые соединения добавляли в виде сконцентрированных в 50—100 раз спиртовых растворов, а также серии полученных из исходного концентрата последовательных трёхкратных разведениИ в том же растворите-

ле (спирт). Препарат в каждой концентрации вносили в 2—3 повторах. При внесении в каждую ячейку препарата из расчёта 3 мкл на 150 мкл среды конечное содержание этанола в эксперименте не превышало 2%. Анализу подвергали также непосредственно культуральную жидкость продуцентов, прошедшую стерилизационную обработку микрофильтрацией. В этом случае серию последовательных разведений проводили в стерильной дистиллированной воде.

Концентрацию препаратов рассчитывали в единицах активности культуральной жидкости (ед. кж/мл) (для первичных экстрактов антибиотиков), а также в мкг/мл (для очищенных препаратов-сырцов и препаратов антибиотиков). Препаратом сравнения служил ловастатин.

Оценку роста при использовании микрометода проводили фотометрически с помощью микроплейтфотометра вертикального сканирования (ИФКО-2, Россия) после перемешивания содержимого лунок, а также визуально, оценивая рост клеток H.salinarum в виде плотного осадка красного цвета на дне лунки.

О наличии у испытуемых препаратов способности к ин-гибированию биосинтеза стеролов судили по подавлению роста культуры.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием компьютерных программ Statgraf и Microsoft Ехсе1, рассчитывая средние арифметические значения, доверительные интервалы и стандартное отклонение. Достоверность различий между средними величинами оценивали с использованием /-критерия Стьюдента (p<0,05).

Результаты и обсуждение

Выбор H.salinarum в качестве модели для отбора ИБС основан на том, что у этой культуры биосинтез стеролов протекает по мевалонатному пути, аналогичному пути биосинтеза в организме млекопитающих, для роста культуры требуются высокое содержание NaCl и для поддержания целостности клеток в таких условиях им необходима полноценная липидная мембрана. Подавление биосинтеза стеролов и связанное с этим нарушение целостности клеточных мембран приводит к лизису клеток.

При наличии несомненного сходства с эука-риотными организмами в целом, у галобактерий имеется ряд существенных отличий. Они касаются в первую очередь свойств основного фермента биосинтеза стеролов — ГМГ-КоА редуктазы, а также некоторых аспектов регулирования биосинтеза стеролов.

При регулировании биосинтеза стеролов у эу-кариотных организмов избыток или недостаток конечного продукта — ХС и его основного интер-медиата — мевалоновой кислоты — приводит к изменению активности ГМГ-КоА редуктазы, меняется также концентрация фермента. Поэтому в клетках эукариотов, у которых известный ингибитор этого фермента — ловастатин конкурентно ингибирует ГМГ-КоА редуктазу, внесение антибиотика сопровождается одновременным увеличением измеряемой активности фермента, происходящим, по-видимому, за счёт стимуляции его синтеза de novo [16].

Регуляция биосинтеза стеролов у галобакте-рий идет несколько иным способом — возможно

Рис. 1. Рост H.salinarum в присутствии ловастатина и мевалоната.

Концентрация ловастатина (мкг/мл): 0 (а), 0,3 (Ь), 0,6 (с), 1,25 (d, f), 2,5 (e). Концентрация мевалоната (мМ): 0 (а, Ь, с, d, e), 3 (f)). Ось абсцисс - время (сутки); ось ординат - рост, й570нм (в % от контроля).

в некоторой степени за счёт изменения внутриклеточной концентрации субстрата реакции — ГМГ-КоА. При этом никакого изменения активности фермента ГМГ-КоА редуктазы, а также изменения его содержания в клетках не происходит [17]. Следовательно, в человеческих клетках ингибиторы ГМГ-КоА редуктазы способны лишь несколько снизить уровень ХС, а у архебактерий они могут полностью подавить рост клеток, блокируя образование изопреноидных липидов — основного компонента клеточных мембран.

Приведённые сведения позволяют использовать H.salinarum для изучения мевалонатного синтеза на молекулярном уровне и, что, особенно важно, взять за основу для разработки моделей поиска ИБС.

Активный рост тест-культуры H.salinarum начинался на 2—3 сутки культивирования. Внесение ловастатина в тест-систему приводило к подавлению или задержке роста тест-культуры. Наблюдаемый эффект зависел от концентрации антибиотика и возрастал с увеличением дозы препарата (рис. 1, кривые a—e). Использование ловастатина в концентрации 2,5—10 мкг/мл приводило к полному подавлению роста (рис. 1, кривая e) и лизису клеток. Известно, что ингибиторы отдельных этапов биосинтеза стеролов могут вызвать нарушение целостности мембран [20]. В гипертонических условиях питательной среды, необходимой для выращивания H.salinarum, подобное нарушение целостности мембран должно приводить к лизису клеток, что и наблюдалось в условиях эксперимента. Поэтому препараты, способные вызывать лизис клеток H.salinarum, рассматривались нами в качестве потенциальных ИБС.

Внесение в тест-систему экзогенной мевало-новой кислоты (1-10 мМ) приводило к тому, что

Рис. 2. Рост Н.5аИпагит в ячейках планшета в присутствии ловастатина и мевалоната (микрометод).

Концентрация ловастатина в ячейках каждого ряда (слева - направо, в мкг/мл): 5 (1-я ячейка), 2,5 (2-я), 1,25 (3-я), 0,6 (4-я), 0,3 (5-я), 0 (6-я); концентрация мевалоната: верхний ряд А - 0; нижний ряд В - 3 мМ; Продолжительность культивирования - 16 сут.

Рис. 3. Влияние мевалоновой кислоты на рост Н.ваНпагит в присутствии экстрактов, полученных из культу-ральной жидкости штаммов 13/88 (а), 1709 (б), 55/90 (в) и 199/88 (г).

Продолжительность культивирования - 16 сут. Ось абсцисс - содержание мевалоновой кислоты; ось ординат -рост, Р570 нм (в % от контроля). Обозначение столбиков - концентрация препаратов (ед. кж/мл).

рост культуры ИлаНпагит происходил в присутствии ловастатина (рис. 1, сопоставление кривых / и с[). Мевалонат (3 мМ) снимал подавляющее действие ловастатина вплоть до концентрации последнего 2,5—5 мкг/мл (6—12 мкМ).

Влияние ловастатина и мевалоновой кислоты на рост ИлаИпагит показано на фотографии, демонстрирующей результаты культивирования ИлаИпагит в ячейках 96-луночного полистиролового планшета (рис. 2). В лунках верхнего ряда заметно подавление роста ИлаНпагит ловастатином, полное или частичное в зависимости от концентрации препарата (лунки 1А—4А). В нижнем ряду, содержащем мевалоновую кислоту, такого подавления не происходит. В лунках 1В—4В, содержа-

щих ловастатин в концентрации 5—0,6 мкг/мл, имеет место активный рост тест-культуры, демонстрирующий снятие мевалонатом подавляющего действия ловастатина.

Подавление роста ИлаНпагит наблюдалось при анализе грубых экстрактов и очищенных препаратов, получаемых из культуральной жидкости и мицелия различных продуцентов. Внесение в тест-систему экзогенной мевалоновой кислоты в ряде случаев приводило к возобновлению роста ИлаНпагит, что свидетельствовало о подавлении этими метаболитами начальных (т. е. до образования мевалоната) этапов биосинтеза сте-ролов (рис. 3, а—в). Действие других препаратов, напротив, в присутствии мевалоната не снима-

Рис. 4. Способность микробных штаммов-продуцентов к подавлению биосинтеза стеролов в модели Н.ваГтагит.

лось (рис. 3, г), что расценивалось как их неспособность подавлять ранние этапы биосинтеза стеролов.

Предложенная тест-система была применена для исследования свыше 2000 штаммов актино-мицетов и плесневых грибов, проявивших на предварительных этапах противогрибковую активность. У большинства метаболитов (1500 штаммов или 75%) выявлена способность к подавлению роста ИлаНпагит. При этом у 600 штаммов подавление было значительным, т. е. наблюдалось при испытании сильно разведённых (в 100—1000 раз) препаратов культуральной жидкости и мицелия продуцентов.

Подавление роста ИлаНпагит снималось в присутствии экзогенной мевалоновой кислоты у 200 штаммов (13% от числа активных штаммов), что было доказательством воздействия образуемых ими метаболитов на ранние этапы биосинтеза стеролов. Среди оставшихся 1300 культур большинство, по-видимому, образуют метаболиты, действующие на поздние этапы биосинтеза стеролов (рис. 4).

Таким образом, ИБС при использовании модели И.БаНпагит выявляются как соединения, подавляющие рост продуцента. Рассматриваемая модель пригодна для работы с грубоочищенными экстрактами, полученными из культуральной жидкости и мицелия микроорганизмов-продуцентов, фильтратами культуральной жидкости и может быть с успехом использована на начальных этапах поиска. Возможность применения в микробной модели И.БаИпагит мевалоновой кислоты позволяет уже на начальных этапах поиска успешно выявлять метаболиты, способные к подавлению ранних этапов биосинтеза стеролов.

Применение модели для поиска противоопухолевых антибиотиков. Для широкого и полноцен-

ного использования И.БаИпагит в поисковой работе необходимо было определить чувствительность этой культуры к различным антибиотикам и, таким образом, выяснить возможность применения указанной модели для поиска соответствующих биологически активных веществ, в том числе, возможно, не относящихся непосредственно к группе ИБС.

С этой целью было изучено действие на указанную модель 52 антибиотиков, относящихся к различным классам биологически активных соединений (таблица). В подавляющем большинстве антибиотики не проявляли высокой активности в отношении микробной модели И.БаИпагит. Практически неактивны ингибиторы синтеза белка и ингибиторы биосинтеза клеточной стенки (МПК свыше 130, 250 и 600 мкМ). Из ингибиторов синтеза клеточной стенки некоторую активность удалось обнаружить у бацитрацина, гликопептидных антибиотиков ванкомицина, ристомицина и эре-момицина, однако только при использовании, так называемой, «мягкой» оценки минимальной подавляющей концентрации (МПК), допускающей частичный рост тест-культуры (МПК-2). Слабой активностью (МПК 20—60 мкМ) обладали ингибиторы ДНК-зависимой РНК-полимеразы рифа-мицин БУ и рифампицин.

Умеренной активностью обладали такие дезорганизаторы мембран, как полимиксины В и М, амфотерицин В. Вместе с тем заметная активность обнаружена у грамицидина Б, гелиомици-на, амфомицина и новобиоцина (МПК 3—6 мкМ). Эти препараты, как известно, обладают способностью к образованию комплексов с ионами Mg2+ и, таким образом, могут подавлять активность многих ферментов [21]. Умеренную активность проявляет ингибитор АТФ-азы — олигомицин (МПК 6 мкМ).

Высокой активностью в отношении И.БаИ-пагит обладает ловастатин (МПК 3 мкМ), а также противоопухолевые антибиотики митомицин С, стрептонигрин (брунеомицин), актиномицин Б, антрациклиновые антибиотики карминомицин и ногаламицин (МПК от 1,4 до 4,0 мкМ). В отличие от ловастатина, действие указанных препаратов не снимается в присутствии мевалоновой кислоты. Способность противоопухолевых антибиотиков доксорубицина, даунорубицина и винкристи-на к подавлению роста ИлаНпагит была отмечена также зарубежными исследователями [22].

Таким образом, изучение различных препаратов позволяет считать бактериальную модель И.БаИпагит полезной для поиска не только ИБС, но также ряда других биологически активных соединений, в первую очередь противоопухолевых антибиотиков.

Применение описываемой микробной модели в скрининге новых антибиотиков в НИИНА

Активность различных антибиотиков в отношении бактериальной культуры H.salinarum

№ п/п Соединение МПК, мкМ

МПК-11 МПК-22

Ингибиторы синтеза клеточной стенки

1 Бензилпенициллин >800 >800

2 Оксациллин >800 >800

3 Клоксациллин 800 300

4 Диклоксациллин 400 200

5 Ампициллин >800 800

6 Эремомицин 130 32

7 Ванкомицин 130 32

8 Ристомицин 200 64

9 Цефалоридин >800 >800

10 Бацитрацин 120 32

11 D-циклосерин >800 >800

12 Лизоцим >50 >50

Ингибиторы синтеза белка

13 Неомицин >800 >800

14 Канамицин >800 >800

15 Амикацин >800 >800

16 Гентамицин >800 >800

17 Тобрамицин >800 >800

18 Стрептотрицин >800 >800

19 Пуромицин >400 130

20 Хлорамфеникол 600 300

21 Тетрациклин 250 80

22 Доксициклин 160 80

23 Олеандомицин >600 >600

24 Виомицин >800 800

25 Спектиномицин 200 100

26 Мономицин >800 600

27 Эритромицин >500 130

Антибиотики, действующие как дезорганизаторы мембран

28 Амфотерицин В 40 4

29 Нистатин 60 8

30 Полимиксин М 20 2,5

31 Полимиксин B 12 2,5

32 Этамицин >600 300

33 Грамицидин S 6 0,7

Противоопухолевые антибиотики — ингибиторы синтеза НК

34 Стрептонигрин 2 0,3

35 Триметоприм 80 40

36 Блеомицетин 80 16

37 Актиномицин D 2 0,7

38 Доксорубицин 20 5

39 Карминомицин 2 0,3

40 Даунорубицин 16 4

41 Ногаламицин 4 1

42 Митомицин С 1,4 0,2

43 Оливомицин 5 1

44 Винкристин 6 0,8

45 Винбластин 30 6

Ингибиторы ДНК-зависимой РНК-полимеразы

46 Рифамицин SV 40 5

47 Рифампицин 50 6

Ингибитор АТФ-азы

48 Олигомицин 6 1,5

Антибиотики с неясным механизмом действия

49 Гелиомицин 0,4 0,2

50 Новобиоцин 3 0,3

51 Амфомицин 3 1,5

Примечание. 1 МПК-1 - определена как минимальная концентрация препарата, полностью предотвращающая рост тест-культуры; 2 МПК-2 - определена как минимальная концентрация препарата, при которой происходит подавление роста на 50%.

им. Г. Ф. Гаузе РАМН позволило выделить продуценты различных ИБС, как среди несовершенных и высших грибов [23, 24], так и среди актиномицетов, в том числе такие антибиотики, как антибиотик 1132 (хлоротрицин) [25], антибиотик 1278 из группы ирумамици-на, обладающиИ высокоИ противогрибковоИ активностью [26], антибиотиков стероидноИ (55/90) и монаколиновоИ структуры (13/88-2) [27, 28], а также ряда других соединениИ, находящихся в настоящее время в стадии углублённого изучения.

В сравнении с ранее предложенноИ моделью поиска ИБС с использованием клеток Hep G2 новая микробная модель H.salinarum обладает несравненно более высокоИ пропускноИ способностью. По этому показателю она значительно превосходит также микробную модель A.fusidioides. Предлагаемая тест-система малочувствительна к микробному заражению, а вследствие выращивания культуры в стерильных 96-луночных планшетах и использования автоматических микропипеток, легко поддается механизации. Результаты микробного теста хорошо сочетаются с оценкоИ ингибирующего деИствия метаболитов в тестах с клетками человека: все метаболиты, активные в тесте Hep G2, оказались активными в микробноИ модели, а среди метаболитов, неактивных в микробноИ модели, не было ни одного, которыИ бы проявил свою активность в тесте Hep G2. Следовательно, бактериальная модель H.salinarum, подобно ранее предложенноИ микробноИ модели A.fusidioides, не дает ложно отрицательных результатов, и её применение практически не вызывает неправомерного отсева потенциально перспективных культур.

Заключение

Таким образом, ИБС при использовании модели H.salinarum выявляются как соединения, подавляющие рост тест-культуры. Рассматриваемая модель пригодна для работы с грубо-очищенными экстрактами, полученными из культуральноИ жидкости и мицелия микроорганизмов-продуцентов, а также самоИ культу-ральноИ жидкости микроорганизмов продуцентов, и может быть с успехом использована на начальных этапах поиска. Возможность применения в микробноИ модели H.salinarum мевало-новоИ кислоты позволяет уже на начальных этапах поиска успешно выявлять метаболиты, способные к подавлению ранних этапов биосинтеза стеролов. Чувствительность модели к большинству противоопухолевых антибиотиков позволяет высоко оценивать перспективность её использования для проведения поиска противоопухолевых антибиотиков.

ЛИТЕРАТУРА

1. Тренин А. С, Катруха Г. С. Антибиотики — ингибиторы биосинтеза холестерина. Химфарм ж-л 1997; 31: 9: 5—16.

2. Тренин А. С. Вторичные метаболиты грибов — ингибиторы биосинтеза стеролов. Прикладная биохимия и микробиология 1998; 34: 2: 131—138.

3. Trapani L, Segatto M, Pallottini V. Regulation and deregulation of cholesterol homeostasis: The liver as a metabolic «power station». World J Hepatol 2012; 4: 6: 184—190.

4. Seiki S, Frishman W. H. Pharmacologic inhibition of squalene synthase and other downstream enzymes of the cholesterol synthesis pathway: a new therapeutic approach to treatment of hypercholesterolemia. Cardiol Rev 2009; 17: 2: 70—76.

5. Chugh A., Ray A., Gupta J. B. Squalene epoxidase as hypocholes-terolemic drug target revisited. Prog Lipid Res 2003; 42: 1: 37—50.

6. Belter A., Skupinska M, Giel-Pietraszuk M. et al. Squalene monooxyge-nase — a target for hypercholesterolemic therapy. Biol Chem 2011; 392: 12: 1053—1075.

7. Espinel-Ingroff A. Novel antifungal agents, targets or therapeutic strategies for the treatment of invasive fungal diseases: a review of the literature (2005—2009). Rev Iberoam Micol 2009; 26: 1: 15—22.

8. Kathiravan M. K, Salake A. B, Chothe A. S. et al. The biology and chemistry of antifungal agents: a review. Bioorg Med Chem 2012; 20: 19: 5678—5698.

9. Garcia-Ruiz C, Morales A., Fernandez-Checa J. C. Statins and protein prenylation in cancer cell biology and therapy. Anticancer Agents Med Chem 2012; 12: 4: 303—315.

10. Hatori H, Sato B, Sato I. et al. FR901512, a novel HMG-CoA reductase inhibitor produced by an agonomycetous fungus No. 14919. II. Taxonomy of the producing organism, fermentation, isolation and physico-chemical properties. J Antibiot (Tokyo) 2004; 57: 4: 264—270.

11. Donadio S, Maffioli S, Monciardini P. et al. Sources of novel antibiotics — aside the common roads. Appl Microbiol Biotechnol 2010; 88: 6: 1261—1267.

12. Тренин А. С., Терехова Л. П., Толстых И. В. и др. Отбор микробных вторичных метаболитов — ингибиторов биосинтеза холестерина с помощью культуры клеток гепатобластомы G2. Антибиотики и химиотер 2003; 48: 1: 3—8.

13. Тренин А. С. Микробная тест-система для поиска ингибиторов биосинтеза стеролов. Антибиотики и химиотер 2013; 58: ?: .?—?.

14. Ventosa A., Nieto J. J., Oren A. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria. Microbiol Mol Biol Rev 1998; 62: 2: 504—544.

15. Soppa J. From genomes to function: Haloarchaea as model organisms. Microbiology 2006; 152: 3: 585—590.

16. Berg J. M, Tymoczko J. L, Stryer L. Biochemistry, 5th Edition: International Version. W. H. Freeman and Company, New York. 2002; 1100 pp.

17. Cabrera J. A., Bolds J., Shields P. E. et al. Isoprenoid synthesis in Halobacterium halobium. Modulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme concentration in response to mevalonate availability. J Biol Chem 1986; 261: 8: 3578—3583.

18. Гаузе Г. Ф., Преображенская Т. П., Свешникова М. А. и др. Определитель актиномицетов. М.: 1983; 245.

19. Waksman S. A. The Actinomycetes. Classification, Identification and Descriptions of Genera and Species. Vol. 2. The Williams and Wilkins Co, Baltimore. 1961; 363 pp.

20. Fitch M. E., Mangels A. R., Altmann W. A. et al. Microbiological screening of mevalonate-suppressive minor plant constituents. J Agric Food Chem 1989; 37: 687—691.

21. Lancini G., Parenti F., Gallo G. G. Antibiotics — a multidisciplinary approach. Plenum Press, New York. 1995; 278.

22. Sioud M., Baldacci G., Forterre P., de Recondo A. M. Antitumor drugs inhibit the growth of halophilic archaebacteria. Eur J Biochem 1987; 169: 2: 231—236.

23. Терехова Л. П., Тренин А. С., Озерская С. М. и др. Образование ас-кофуранона культурой гриба Paecilomyces variotii Bainier 199. Микробиология 1997; 66: 5: 611—615.

24. Тренин А. С, Цвигун Е. А., Соболева Н. Ю. и др. Антимикробная и гиполипидемическая активность штаммов Lentinus edodes и Ganoderma lucidum. Иммунопатология, аллергология, инфектоло-гия. Труды междисципл микол форума: Грибные биотехнологии в медицине и промышленности. 2010; 1: 270.

25. Терехова Л. П., Галатенко О. А., Тренин А. С. и др. Выделение и изучение антибиотика ИНА-1132 (хлоротрицина), образуемого штаммом Streptomyces baarnensis. Антибиотики и химиотер 2008; 53: 5—6: 3—7.

26. Shashkov A. S., Tsvetkov D. E., Lapchinskaya O. A. et al. Structure, 1H and 13C NMR spectra, and biological activity of the antibiotic INA-1278 related to irumamycin and produced by the experimental Streptomyces sp. strain No. 1278. Russ Chem Bull, Int Ed 2011; 60: 11: 2412-2417.

27. Тренин А. С, Цвигун Е. А., Терехова Л. П. и др. Микробные модели в поиске ингибиторов биосинтеза атеросклероза. Тез. докл. 1 Все-росс. конференции по проблемам атеросклероза. М.: 1999; 167.

28. Trenin A. S., Lapchinskaya O. A., Pogozheva V. V. et al. Antifungal activity of natural compounds produced by mutant strains of Amycolatopsis orientalis subsp. eremomycini and Streptoallefeichus cremeus subsp. tobramycini. Abstr 7th Int. Congress «Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development». М.: 2013; 1: 74.