Влияние светодиодного облучения и мексикора на агрегационную активность тромбоцитов

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XV • N04 • 2008

РЕЗЮМЕ

Г. С. Авхутская, И. Ю. Сенчик, И. А. Кравцова, Т. С. Михайлова, О. Г. Кузнецова, О. С. Фролова

Исследование свойств протезов кровеносных сосудов из лавсана, обработанных антимикробной композицией с введением метронидазола

Цель работы - создание антимикробной композиции для обработки сосудистых протезов из лавсана. На кафедре общей и биоорганической химии СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова была разработана антимикробная композиция пролонгированного действия на основе поливинилового спирта с включением хлоргексидина и метронидазола. Микробиологические исследования подтвердили выраженные антимикробные свойства композиции, которые удавалось сохранить после стерилизации озонированием. Биохимические тесты не выявили существенной иммуногенности у исследуемых материалов. Данные гистологического исследования после проведения эксперимента на животных (нелинейные белые крысы) показали минимальную выраженность воспаления и ускорение регенерации при использовании антимикробной композиции. Полученные результаты свидетельствуют о возможности придания антимикробной активности сосудистым протезам из лавсана и открывают перспективу разработки и применения лекарственных композиций.

Ключевые слова: антимикробная композиция, пролонгированное действие, хлоргексидин, метронидазол, озонирование.

S UMMARY

G. S. Avkthutovskaya, I. YU. Senchick, I. A. Kravtzova, T. S. Mikthailova, O. G. Kuznetsova, O. S. Frolova Characteristics of lavsan vascular prostheses treated with antibacterial preparation and metronidazol

The investigation aim was to create a long-acting antibacterial composition for vascular graft treatment. A pharmaceutical composition based on polyvinile alcohol with chlorhexidine and metronidazol was developed at the Department of General and Bioorganic Chemistry of St. Petersburg Pavlov State Medical University. Microbiological studies evidenced good antibacterial properties of the composition before and after ozonization. Biochemical tests practically showed no immunological activity in the implants under study. Our histological studies after the experiments on the animals (non-linear white rats) revealed minimal inflammation and quick regeneration in case of the composition pretreatment. The data obtained demonstrate the possibility of imarting of antiseptic antibiotic activity to the implanted lavsan prostheses and open the way to further development and application of pharmaceutical compositions

Key words: antibacterial composition, prolonged activity, chlorhexidine, metronidazol, ozonization.

О И. Н. Дементьева, 2008 г. УДК 616.155.2:612.014.44

И. Н. Дементьева

ВЛИЯНИЕ СВЕТОДИОДНОГО ОБЛУЧЕНИЯ И МЕКСИКОРА НА АГРЕГАЦИОННУЮ АКТИВНОСТЬ ТРОМБОЦИТОВ

Центр лазерной медицины, Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова

В настоящее время в кардиологии широко используют миокардиальные цитопротекторы - препараты, улучшающие энергетический метаболизм в ишемизированном миокарде. Отечественный кардиопротектор мексикор, наряду с цитопротективной активностью, обладает антиокси-дантными и атиагрегантными свойствами [1, 6, 9]. В условиях окислительного стресса активные формы кислорода при недостаточности эндогенной антиокислительной системы организма оказывают прямое повреждающее действие на клетки, в том числе на кардиомиоциты и клетки крови. В связи с этим антиоксидантная коррекция окислительного стресса с использованием антиоксиданта мекси-кора (2-этил-6-метил-3-оксипирина сукцинат) рассматривается как перспективное направление терапии у больных кардиологического профиля [2, 10]. Для улучшения реологических свойств крови при заболеваниях сердечно-сосудистой системы широко используется метод внутривенной лазеротерапии как отдельно, так и в комплексе с лекар-

ственными средствами [7, 19, 24]. Однако необходимо учитывать, что на фоне облучения могут изменяться терапевтические эффекты различных фармакологических препаратов. Широта лечебного действия красного света обусловлена улучшением реологических свойств крови, снижением агрегационной активности тромбоцитов, улучшением микроциркуляции и стимуляцией иммунитета [5, 11]. В наших предыдущих работах [4] показано, что светодиодное узкополосное облучение (660 нм) ингибирует агрегацию тромбоцитов, а также выявлено сочетанное анти-агрегантное действие светодиодного облучения и RGDF-пептидов, которые являются эффективными ингибиторами агрегации тромбоцитов [13].

Целью настоящей работы является изучение сочетан-ного влияния мексикора («Экофарм Ивест», Россия) и светодиодного облучения красного спектра на агрега-ционную активность тромбоцитов в цельной крови.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для проведения исследований использовали крыс-самцов линии Wistar массой 220-240 г (питомник «Рап-полово» РАМН, Санкт-Петербург). Забор крови в объеме 5 мл у крыс осуществляли в течение 40^60 с из наружной яремной вены с помощью шприца (наркоз - 20 % уретан, 0,45 мл/100 г). В качестве стабилизатора использовали гепарин (Московский эндокринный завод) - 50 ед/мл. Соотношение крови и стабилизатора составляло 9:1. Кровь помещали в силиконизированные пробирки и осторожно перемешивали. Исследование агрегационной активности тромбоцитов производили в цельной крови через 30 мин от момента забора крови.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ

Облучение крови осуществляли с помощью светоди-ода («АФС-Соларис», Х=630 нм, плотность мощности -17 мВт/см2) в темноте в полистероловом лабораторном стакане, внутренний диаметр которого составлял 30 мм. В стакан помещали 0,6 мл крови, толщина слоя - около 1 мм. Использовали 3 режима облучения: 30 с, 3 мин и двойное облучение: 30 с и через 10 мин - 3 мин. Расстояние светодиода от поверхности пробы 15 мм обеспечивало равномерное облучение.

Агрегационную активность тромбоцитов в цельной крови исследовали сразу после завершения облучения крови на отечественном импедансном агрегометре АИ-300 при стандартной температуре (37 оС) и постоянной скорости перемешивания (1100 об/мин) [8]. В качестве индуктора использовали раствор динатриевой соли АДФ (Мм. 427,2, <^еапа1», Венгрия) в физиологическом растворе в конечной концентрации в пробе 2,55-10-4 М. Соотношение объемов индуктора агрегации и пробы цельной крови составляло 1:12. Результаты исследования обработаны статистически с использованием критерия Стьюден-та. Статистически значимым считали различие при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сразу после 30-секундного облучения агрегационная активность тромбоцитов практически не изменялась (рис. 1).

Как видно из рис. 1, 30-секундное облучение крови не сопровождалось достоверным изменением агрегации. После 3-хминутного облучения агрегационная активность тромбоцитов уменьшилась на 36 %. В следующей группе опытов облучение производили дважды - в течение 30 с и 3 мин с 10-минутным интервалом. Как видно из рис. 1, после двойного облучения агрегационная активность тромбоцитов уменьшилась на 55 %. В качестве дополнительного контроля мы определяли агрегационную активность после однократного 30-тисекундного облучения через 10 мин. Результаты получили несколько неожиданными -агрегационная активность была увеличена на 24 % от контроля. Таким образом, ингибирующий агрегационный эффект повторного 3-хминутного светодиодного облучения является еще более впечатляющим.

В следующей серии опытов мы исследовали эффект сочетанного воздействия мексикора и светодиодного облучения на агрегационную активность тромбоцитов в цельной крови. В литературе нет данных о влиянии мексикора на агрегацию тромбоцитов крыс, поэтому было проведено соответственное исследование. Мексикор («Экофарм Инвест», Россия) добавляли в цельную кровь (конечные концентрации 1,96^ 10-4 М/л и 1,96-10-5 М/л) и инкубировали в течение 10 и 23 минут. Дозы рассчитывали исходя из рекомендуемых для клинического применения. Агрегаци-онную активность тромбоцитов определяли через 10 и 23 мин после инкубирования крови с мексикором.

Как видно из рис. 2, мексикор в конечной концентрации 1,96-10-5 М/л оказывал слабое ингибирующее действие, а в дозе 1,96^ 10-4 М/л ингибирующий эффект на агрегацию тромбоцитов крыс был весьма значительным.

к» СПбГМУ Ж

Рис. 1. Изменение интенсивности агрегации тромбоцитов после светодиодного облучения.

1 - контроль; 2-30 с облучения; 3-3 мин облучения; 4-30 с облуче-

ния+10 мин инкубации+3мин облучения; 5-30 с облучения+10мин инкубации; * - р<0,05; ** - р<0,002 - достоверность различий по отношению к контролю

Сочетанное воздействие мексикора и светодиодного облучения производили по следующей схеме: после 10-минутной инкубации с мексикором кровь облучали в течение 30 с и затем через 10 мин - второе облучение в течение 3 мин. Как видно из данных, представленных на рис. 3, эффект облучения зависел от концентрации мек-сикора. Как уже отмечалось ранее, мексикор в конечной концентрации 1,96^ 10-5 М/л оказывал слабое ингибирую-щее действие на агрегацию тромбоцитов крысы. Светодиодное облучение крови в режиме, вызывающем выраженное ингибирование агрегации, на фоне воздействия мексикора 1,96-10-5 М/л приводило к меньшему эффекту (55 и 36 % соответственно), а при концентрации препарата 1,96^ 10-4 М/л облучение практически отменяло инги-бирующий эффект мексикора.

В наших исследованиях облучение цельной крови крыс в течение 30 с красным светом (Х=630 нм, 17 мВт/см2, доза 0,5 Дж/см2) не привело к значительному изменению

Рис. 2. Изменение интенсивности агрегации тромбоцитов в присутствии мексикора.

1 - контроль; 2 - мексикор (1,96-10-5 М/л) +10 мин инкубации; 3 - мексикор (1,9610-5 М/л) + 23 мин инкубации; 4 - мексикор (1,96-10~4М/л) + 10 мин инкубации; 5 - мексикор (1,96-10-4М/л) + 23 мин инкубации; * - р<0,002; ** - р<0,05 - достоверность различий по отношению к контролю

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XV • №4 • 2008

Рис. 3. Комплексное влияние светодиодного облучения и мекси-кора на агрегацию тромбоцитов.

1 - контроль; 2 - мексикор (1,96-10-5 М/л); 3 - мексикор (1,96-10-5 М/л) + облучение; 4 - мексикор (1,9610-4 М/л); 5 - мексикор (1,9610-4 М/л) + облучение; 6 - облучение; * - р<0,002; ** - р<0,05 - достоверность различий по отношению к контролю

агрегации тромбоцитов. В проведенных ранее исследованиях [4] выявлено, что после фотомодификации цельной крови крыс красным светом в течение 90 с (Х=660 нм, 7,05 мВт/см2, доза 0,5 Дж/см2) наблюдалось выраженное уменьшение интенсивности агрегации. Следовательно, выраженность антиагрегантного эффекта светодиодного облучения (630 нм) при однократной дозе зависит от времени воздействия. Через 10 мин после 30-секундного облучения (Х=630 нм) наблюдается увеличение интенсивности агрегации тромбоцитов. По-видимому, это связано с тем, что в период последействия увеличивается концентрация внутриклеточного кальция в тромбоцитах, что ведет к усилению АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов [14, 20]. Кальций, связываясь с кальмодули-ном, активирует фосфодиэстеразу цГМФ, гуанилатцик-лаза инактивируется, в результате чего снижается уровень цГМФ и увеличивается интенсивность агрегации. Наблюдаемое нами в 10-минутный пострадиационный период усиление активности тромбоцитов согласуется с данными [16] о росте амплитуды фазно-тонических сокращений ГМК воротной вены крыс на 10 минуте пострадиационного периода. Увеличение содержания внутриклеточного кальция запускает Са2+-зависимые процессы, приводящие к предстимуляции (праймингу) клеток [12]. Активация тромбоцитов выражается в повышении уровня функциональной активности клетки и при последующем облучении в течение 3 мин в повышенной продукции активных форм кислорода, прежде всего супе-роксиданиона, которые активируют гуанилатциклазу. Стимуляция гуанилатциклазы и увеличение цГМФ под действием активных форм кислорода приводят к значительному ингибированию АДФ-индуцированной агрегации.

Полученные данные свидетельствуют о высоком анти-агрегантном эффекте мексикора. Антиагрегационные свойства мексикора объясняются его способностью подавлять активность цГМФ - фосфодиэстеразы [6]. Путем подавления активности фосфодистеразы цГМФ повыша-

ется уровень цГМФ, происходит активация гуанилатцик-лазы тромбоцитов крысы, что приводит к ингибирова-нию тромбоцитарной агрегации. А. С. Соболев (1987), Р. Savi et а1. (1996) убедительно показали, что цАМФ не участвует в передаче сигнала от АДФ при индукции агрегации тромбоцитов крыс, при этом определяющую роль играет цГМФ [15, 23]. Антиоксидантный эффект мекси-кора связывают также с повышением активности эндогенной антиоксидантной системы [2, 3, 6]. Воздействие высокими, но не токсичными концентрациями экзогенного супероксиданиона и продукта его дисмутации перекиси водорода ингибируют агрегацию тромбоцитов через стимуляцию гуанилатциклазы [18, 21].

Под действием свободных радикалов, являющихся эндогенными регуляторами гуанилатциклазной активности тромбоцитов, происходит активация фермента гуа-нилатциклазы и ингибирование агрегации [17, 22].

Исходя из того, что мексикор подавляет активность фосфодиэстеразы цГМФ и активирует гуанилатциклазу, можно предположить, что при сочетанном действии облучения и мексикора антиагрегационный эффект усилится. Однако, как следует из полученных нами данных, этого не произошло. Более того, ингибирующий эффект двойного облучения на фоне мексикора был уменьшен. В настоящее время мы находим следующее объяснение этому феномену: под влиянием мексикора повышается активность антиоксидантной системы клетки и инактиви-руется АФК, которые играют ключевую роль в активации гуанилатциклазы тромбоцитов после облучения (600 нм) [3, 4, 6], и, как следствие, уменьшается образование цГМФ и ингибирование эффекта двойного облучения на агрегацию тромбоцитов.

Таким образом, мексикор препятствует праймингу тромбоцитов. Полученные данные указывают на необходимость учитывать влияние прайминга тромбоцитов при фотомодификации крови.

ЛИТЕРАТУРА

1. Воронина, Т. А. Создание психотропных препаратов : от эксперимента к клинике / Т. А. Воронина // Клиническое исслед. лекарств. средств в России. - 2003. - № 3/4. - С. 56-59.

2. Голиков, А. П. Эффективность цитопротектора мексикора в неотложной кардиологии / А. П. Голиков [и др.] // Терапевтический арх. - 2004. - № 4. - С. 60-65.

3. Голиков, А. П. Влияние мексикора на окислительный стресс при остром инфаркте миокарда / А. П. Голиков [и др.] // Кардиология. -2005. - Т. 45. - № 7. - С. 21-26.

4. Дементьева, И. Н. Влияние светодиодного облучения на агрегационную активность тромбоцитов / И. Н. Дементьева, А. С. Тюкавин, Л. В. Галебская // Актуальные проблемы лазерной медицины : сборник / под ред. Н. Н. Петрищева. - СПб., 2006. -С. 313-335.

5. Дерябин, Е. И. Влияние некогерентного инфракрасного излучения на репарацию костной ткани нижней челюсти в эксперименте / Е. И. Дерябин // Стоматология. - 1997. - № 2. - С. 24-25.

6. Дюмаев, К. М. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий ЦНС / К. М. Дюмаев, Т. А. Воронина, Л. Д. Смирнов. -М. : Ин-т биомед. химии РАМН, 1995. - 272 с.

7. Есауленко, И. Э. Клинико-патофизиологическое обоснование применения различных видов низкоинтенсивного лазерного

ОРИГИНАЛЬНЫЕ

РАБОТЫ

излучения в клинике внутренних болезней / И. Э. Есауленко [и др.] // Журнал теорет. и практ. мед. - 2003. - Т. 1. - № 1. - С. 17-20.

8. Иванов, В. И. Исследование функциональной активности тромбоцитов в цельной крови / В. И. Иванов // Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний / под ред. Н. Н. Петрищева, Л. П. Папа-ян ; СПбГМУ, Рос. НИИ гематологии и трансфузиологии. - СПб., 1999. - С. 53-58.

9. Инчина, В. И. Ангиопротекторная активность комбинации этилметилгидроксипиридин сукцината (мексикора) с актовегином при облитерирующем атеросклерозе артерий нижних конечностей / В. И. Инчина [и др.] // Регионарное кровообращение. -2007. - Т. 5. - № 2 (22). - С. 58-62.

10. Казанцев, Д. Н. Влияние мексикора на агрегацию тромбоцитов, вязкость крови, гемодинамические течение ишемической болезни сердца / Д. Н. Казанцев [и др.] // Клин. мед. - 2006. - Т. 84. -№ 10 (2). - С. 59-62.

11. Карандашов, В. И. Изменение агрегационной активности тромбоцитов при облучении крови гелий-неоновым лазером и красными светодиодами / В. И. Карандашов, Е. В. Петухов, В. С. Зродников // Бюллетень эксперимент. биол. и мед. - 1998. -Т. 126. - № 12. - P. 645-648.

12. Клебанов, Г. И. Молекулярно-клеточные механизмы лазеротерапии / Г. И. Клебанов // Лазер и здоровье - 99 : сборник. -1999. - С. 451-452.

13. Москаленко, Ю. Е. Влияние аналогов RGD-пептидов и низкоинтенсивного светодиодного облучения на АДФ-инду-цированную агрегацию тромбоцитов человека / Ю. Е. Москаленко [и др.] // Клинико-лабораторный консилиум. - 2007. -№ 18. - С. 37-41.

14. Неменов, М. И. Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на агрегационную активность тромбоцитов / М. И. Неме-нов, Т. Н. Черняева // Патофизиология микроциркуляции и гемостаза : сб. науч. тр. - СПб. : СПбГМУ 1998. - С. 217-220.

15. Соболев, А. С. Радиационная биохимия циклических нук-леотидов / А. С. Соболев. - М. : Энергоатомиздат, 1987. - 104 с.

16. Чефу, С. Г. Действие гелий-неонового лазера на сократительную активность сосудистой стенки : автореф. дис.. .. канд. биол. наук / С. Г. Чефу. - СПб., 2005. - С. 17.

17. Шитикова, А. С. Тромбоцитарный гемостаз / А. С. Шити-кова. -СПб. : СПбГМУ 2000. - С. 227.

18. Ambrosio, G. Modulation of platelet function by oxygen metabolites / G. Ambrosio [et al] // Am. J. Physiol. - 1994. - Vol. 267. -Pt. 2. - P. 308-318.

19. IaitskiD, N. A. Intravascular laser irradiation of blood in complex treatment of obliterating atherosclerosis of the lower extremily versels in elderly and senile patients / N. A. IaitskiD [et al]// Vestn Khir Im I I Grek. - 2006. - Vol. 165. - № 4. - P. 34-41.

20. Lavi, R. Low power visible light and hydrogen peroxide change intracellular calcium concentration in cardiac cells / R. Lavi [et al] // Part of EUROTO Conference on Effects of Low-Power Light on Biological System. - 1998. - № 3569. - P. 36-43.

21. Mittal, C. K. Activation of guanilate cyclase by syperoxide dismutase and hydroxyle radical : a physiological regulator of guanosine 3',5'-monophosphate formation / C. K. Mittal, F. Murad // Proc Natl Sci. -1977. - Vol. 74. - № 10. - P. 4360-4364.

22. Ohyashiki, T. Oxygen-radical-mediated lipid peroxidation and inhibition of ADP-niduced platelet aggregation / T. Ohyashiki, M. Konayashi, K. Matsui // Arch. Biochem. Biophys. - 1991. -Vol. 288. - № 1. - P. 282-286.

23. Savi, P. сAMP is not an important messenger for ADP-induced platelet aggregation / P. Savi, A. M. Pflieger, J. M. Herbert // Blood Coagul Fibrinolysis. - 1996. - Vol. 7. - № 2. - P. 249-252.

24. Votolovskia, A. V. Antioxidant activation and therapeutic efficacy of laser irradiation of blood in patients with ische-mic heart disease / A. V. Votolovskia, V. S. Ulashchik, V. H. Filipo-vich // Vopr Кшти! Fizioter Lech Fiz Kult. - 2003. - Vol. 3. -P. 22-27.

РЕЗЮМЕ

И. Н. Дементьева

Влияние светодиодного облучения и мексикора на агре-гационную активность тромбоцитов

Изучено влияние светодиодного облучения (Х=630 nm) и мек-сикора на агрегационную активность тромбоцитов крыс в цельной крови ex vivo. При повторном облучении крови после световой предстимуляции тромбоцитов ингибирующий эффект значительно усиливался. Мексикор препятствует праймингу тромбоцитов.

Ключевые слова: тромбоциты, светодиодное облучение, мексикор, прайминг тромбоцитов.

S UMMARY

I. N. Dementieva

The effect of light-emitting diode irradiation and of mexicor on platelet aggregation

We studied the effect of light-emitting diode irradiation (X=630 nm) and of mexicor on the rat platelet aggregation in the whole blood ex vivo. Repeated irradiation of the blood after prestimulation of the platelets with light resulted in significant augmentation of the inhibiting effect. Mexicor prevented platelet priming.

Key words: platelets, light-emitting diode irradiation, mexicor, platelet priming.