Биокаталитические свойства клеток methyl obacterium extorquens дикого и рекомбинантного штаммов

ХИМИЧЕСКИЕ НАУКИ

УДК 541.138

БИОКАТАЛИТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА КЛЕТОК МЕТИУЬОБЛСТЕШиМ Ехтоядшт ДИКОГО И РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММОВ

Т. А. Кузнецова

Изучены процессы, протекающие в биоэлектрохимических системах на основе генетически модифицированных клеток метилобактерий и медиатора электронного транспорта - ферроцена. Определены параметры биосенсоров на основе клеток ре-комбинантного и дикого штаммов метилобактерий Methylobacterium extorquens. Показана возможность применения таких устройств для определения концентрации метанола в реальных образцах.

Ключевые слова: биокатализ, метилобактерии, медиаторный биосенсор, медиаторы электронного транспорта, ферроцен, метанол, метанолдегидрогеназа.

Интенсивное использование метанола, формальдегида, метиламинов и галометанов обусловливает необходимость мониторинга и контроля концентрации этих токсичных Отсоединений в окружающей среде, питьевой воде, продуктах питания, медицинских препаратах и биологических жидкостях [1]. Метанол, являясь доступным и относительно дешевым непищевым сырьем, служит источником углерода при ведении многих биосинтетических процессов на основе метилобактерий: получение кормового белка, биополимеров (полибутират, полисахариды), ферментов (оксидоредуктазы), биопротекторов (эктоин) [1 - 3]. Для эффективного ведения таких процессов требуется постоянный мониторинг потребления исходного субстрата. Анализ содержания метанола проводят в основном методами газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии, которые характеризуются сложностью применяемого оборудования, пробоподготовки, длительностью анализа. Применение биосенсоров для анализа метанола во многом может упростить задачу, поскольку данные устройства характеризуются простотой, низкой стоимостью, экспрессностью, высокой чувствительностью [4].

Уникальный метаболизм метилотрофов позволяет использовать их клетки и ферменты в биоаналитике, что является доступной альтернативой дорогостоящим и сложным физико-химическим методам обнаружения [1]. Клетки этих бактерий характеризуются высокой концентрацией периплазматических дегидрогеназ, основной из которых является метанолдегидрогеназа (МДГ), что облегчает их взаимодействие с медиаторами электронного транспорта. В связи с этим эффективными биокатализаторами для разработки медиаторного биосенсора могут

служить клетки аэробных метилобактерий. Таким образом, применение метилобактерий и разработка на их основе амперометрического медиаторного биосенсора является актуальной задачей современной биоаналитики. Целью данной работы является сравнение биокаталитических свойств клеток аэробных метилобактерий Methylobacterium extorquens дикого и рекомбинантного штаммов в условиях функционирования амперометрического медиаторного биосенсора.

Материалы и методы

Микроорганизмы. В работе использовали дикий и рекомбинантный штаммы метилобактерий Methylobacterium extorquens [5].

Условия культивирования. Микроорганизмы выращивали на качалке (180 об/мин) при 29 °С в колбах Эрленмейера с 200 мл среды Канеда, содержащей (г/л): KH2PO4 - 2, (NH4)2SO4 - 2, NaCl - 0,5, MgSO4 х 7H2O - 0,025, FeSO4 х 7H2O - 0,002, рН 7,2. Метанол и канамицин (только для рекомбинантного штамма) вносили в стерильные среды до концентрации 0,5 % (по объему) и 50 мкг/мл соответственно. Клетки микроорганизмов отделяли центрифугированием при 10000 g в течение 20 минут и промывали 50 мМ калий фосфатным буфером, pH 7,2.

Формирование рабочего электрода и электрохимические измерения проводили по ранее описанной методике [6]. На поверхность электрода наносили 5 мкл суспензии клеток (400 мг/мл) в 50 мМ калий-фосфатном буфере pH 7,5, и подсушивали при комнатной температуре в течение 30 мин.

Газовая хроматография. Содержание метанола на разных стадиях роста метилобактерий определяли методом газо-жидкостной хроматографии в соответствии с ГОСТ 30536-97 [7] на хроматографе «Кристалл-5000» (Россия). На разных стадиях роста бактерий отбирали культуральную жидкость и центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут, супернатант использовали для определения концентрации метанола. Условия проведения хроматографии: капиллярная газохроматографическая колонка DB-FFAP (США) 50 мх0,32 ммх0,50 мкм; (неподвижная фаза - полиэтиленгликоль, модифицированный нитротерефталатом), газ-носитель - гелий, сжатый в баллоне по ГОСТ 9293-74 (марки А).

Результаты и их обсуждение

Клетки аэробных метилобактерий благодаря специфике метаболизма могут использоваться при разработке биосенсоров для определения содержания С1-соединений, поскольку имеют периплазматическую локализацию PQQ - дегидрогеназ, ключевой из

которых является метанолдегидрогеназа (МДГ). В работе использовали штаммы аэробных метилотрофных бактерий из коллекции лаборатории метилотрофии ИБФМ РАН: Methylobacterium extorquens AM1 (дикий), и полученный на его основе рекомбинантный штамм, содержащий ген большой субъединицы МДГ - mxaF, клонированный в векторе pCM160 [6]. Для создания векторной конструкции использовалась плазмида pCM160, реплицирующуюся в метилобактериях, что обеспечивает получение функционально-активного фермента МДГ.

В клетках метилобактерий под действием МДГ метанол окисляется до формальдегида. Известно, что in vitro МДГ проявляет активность с искусственными акцепторами электронов, такими, как феназинметосульфат [8]. Поэтому эффективный перенос электронов от фермента in vivo на электрод возможен при использовании природных или синтетических соединений, способных диффундировать через клеточную мембрану и взаимодействовать с восстановленными сайтами бактерий. Для сравнения биокаталитических свойств метилобактерий в качестве медиатора электронного транспорта использовали ферроцен [9, 10].

Регистрацию окислительной активности биологического материала - метилобактерий проводили электрохимическим методом с помощью амперометрического медиаторного биосенсора. Медиаторный биосенсор представлял собой двухэлектродную систему, в которой электродом сравнения служил хлорсеребряный электрод, а рабочим электродом -графито-пастовый электрод, содержащий пасту с медиатором -ферроценом и на поверхности биокатализатор - клетки метилобактерий M. extorquens дикого и рекомбинантного штаммов. Отклики медиаторных электродов получали в виде зависимости силы тока I от времени.

Процесс, протекающий при электрокаталитическом окислении метанола мембранной МДГ в присутствии ферроцена, может быть представлен следующим образом:

Анод (подается потенциал 250 мВ относительно электрода сравнения):

СН3ОН + PQQ-МДГ -НСОН + PQQ^-МДГ

PQQ^-МДГ + 2^е(С5Н5^]+- PQQ-МДГ + 2 Fe(C5H5)2 + 2Н+

Fe(C5H5)2 - 1e--^5^)2]+

Катод:

AgCl + e- - Ag + Cl-

Активные центры ферментов взаимодействуют с ферроцений-ионом, восстанавливая его до ферроцена. При наложенном на рабочий электрод потенциале ФЦ окисляется до ферроцений-иона и вступает в новый цикл взаимодействий.

Протекающий в системе ток пропорционален скорости реакции: АI = п^ (1), где п - количество электронов, Б - число Фарадея, V -скорость реакции. За ответ сенсора принимали амплитуду силы тока Д1 -разность между базовой и стационарной величинами тока.

Селективность биосенсорного анализа определяется специфичностью биорецептора, которая напрямую зависит от свойств биоматериала. Для изучения специфичности биокатализаторов оценивали величину откликов сенсора на одну и ту же концентрацию субстрата. Результаты биоэлектрохимического окисления субстратов клетками M. extorquens представлены в табл. 1.

Таблица 1

Субстратная специфичность метилобактерий М. ех1ощиет

в п присутствии ферроцена

Субстрат Относительный ответ биосенсора, %

Дикий Рекомбинантный

Метанол 77 100*

Этанол 62 96

Пропанол - 1 70 95

Пропанол - 2 10 18

Бутанол - 1 74 96

Изоамиловый спирт 61 74

Формальдегид 18 64

Муравьиная кислота 73 26

*за 100 % принят ответ сенсора на основе рекомбинантного штамма на метанол

Следует отметить, что оба штамма M. extorquens наиболее высокий ответ дают на метанол. Однако ответ сенсора на основе рекомбинантного штамма клеток оказался выше (8,5±0,7 мкА), чем для дикого штамма клеток (6,3±0,5). Примечательно, что ответы сенсора на другие спирты для рекомбинантного штамма выше на 25-30 %, чем для дикого, из чего можно сделать вывод, что рекомбинантный штамм метилобактерий M. extorquens обладает более высокой окислительной активностью, чем дикий штамм. Высокие ответы на метанол и другие первичные спирты связаны с активностью метанолдегидрогеназы и согласуются с литературными данными [11]. Активность фермента снижается по отношению к спиртам с увеличением длины их углеродной цепи. Известно [12], что формальдегида также является субстратом МДГ, что объясняет высокий ответ биосенсора на основе дикого штамма M. extorquens на этот субстрат. В целом ответы сенсора на основе рекомбинантного штамма выше, чем для бесплазмидного по отношению практически ко всем субстратам, что

может объясняться более высоким содержанием фермента МДГ в его клетках.

Следует также отметить, что биосенсор на основе клеток безплазмидного штамма M. extorquens обладает более высокой селективностью к метанолу в присутствии формальдегида, чем биосенсор на основе M. extorquens_pCM160: относительный ответ на формальдегид составляет 25 и 60 % соответственно. Таким образом, биосенсор на основе клеток дикого штамма может более эффективно применяться для определения концентрации метанола в культуральной жидкости метилотрофов при ведении биотехнологических процессов на их основе, когда мешающим компонентом является формальдегид, выделяющийся в среду.

Характеристики амперометрического медиаторных биосенсоров на основе метилобактерий были рассчитаны на основе градуировочных зависимостей откликов сенсора от концентрации метанола в кювете (табл. 2).

Таблица 2

Характеристики амперометрического медиаторного биосенсора

на основе метилобактерий М. ех1ощиет _и медиатора ферроцена, субстрат метанол _

Характеристика биосенсора Дикий Рекомби-нантный Данные работы [10]

Коэффициент чувствительности, (мкА х дм3)/ моль 5,9±0,3 13,0±0,6 0,98±0,09

Верхняя граница определяемых концентраций метанола, мМ 0,18 ±0,02 0,10±0,01 0,33 ± 0,02

Предел обнаружения, мМ 0,0057 0,0023 0,03

Относительное стандартное отклонение (п=10), % 11,3 2,8 15

Потеря стабильности за 10 сут, % 81 70 90

Воспроизводимость, % 14,9 6,8 -

Время отклика, концентрация метанола 12,5 мМ, с 25-50 -

Время измерения, с 250-300 < 600

По своим параметрам изучаемые биосенсоры не уступает аналогичному [10]. Биосенсор на основе рекомбинантного штамма обладает наилучшими показателями коэффициента чувствительности, операционной и долговременной стабильностью и может применяться для определения содержания метанола в стоках. Изучение селективности бесплазмидного штамма выявило, что сенсор на его основе позволит определять концентрацию метанола в культуральной жидкости метилотрофов.

Биосенсор на основе рекомбинантного штамма M. extorquens применили для определения концентрации метанола в культуральной среде метилобактерий на разных стадиях роста (лаг-фаза, фаза линейного роста, фаза замедления, стационарная фаза). В качестве референтного метода использовали газовую хроматографию.

Таблица 3

Концентрация метанола в реальных образцах, _определенная двумя методами_

Стадии роста Концентрация метанола, мМ

Газовая хроматография Биосенсор

Лаг-фаза 0,14±0,02 0,14±0,08

Фаза линейного роста 0,16± 0,03 0,16±0,06

Фаза замедления 1,5 ± 0,3 1,5±0,5

Стационарная фаза 91,9 ± 0,3 92,0±0,4

Значения концентраций, полученных биосенсорным методом и методом газовой хроматографии хорошо коррелируют между собой (Я =0,9975). Итак,

клетки дикого и рекомбинантного штаммов метилобактерий M. extorquens могут служить эффективными биокатализаторами амперометрических медиаторных биосенсоров. При этом каждый тип биокатализатора, обладая некоторыми преимуществами и недостатками, может применяться в биосенсорном анализе при решении определенной задачи.

Заключение

Изучено электрокаталитическое окисление субстратов метилобактериями двух штаммов в присутствии ферроцена. В ходе работы обнаружено, что ответы сенсора на основе рекомбинантного штамма выше, чем для бесплазмидного, по отношению практически ко всем субстратам, что может объясняться более высоким содержанием фермента МДГ в его клетках. Проведен сравнительный анализ параметров биосенсоров на основе дикого и рекомбинантного штаммов M. extorquens при использовании метанола в качестве субстрата. Определено, что биосенсор на основе рекомбинантного штамма обладает наилучшими

показателями коэффициента чувствительности, операционной и долговременной стабильностью и может применяться для определения содержания метанола в стоках. С помощью аперометрического биосенсора на основе рекомбинантного штамма M. extorquens провели определение концентрации метанола в культуральной среде метилобактерий на разных стадиях роста. Полученные результаты хорошо коррелируют с результатами метода газовой хроматографии.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 16-34-00409 мол_а.

Список литературы

1. Aerobic methylobacteria as promising objects of modern biotechnology (Review) / N.V. Doronina [et al] // Applied Biochemistry and Microbiology. 2015. Vol. 51. № 2. P. 125-134.

2. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Торгонская М.Л. Аэробные метилобактерии / Ред. В.Ф. Гальченко. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2010. 325с.

3. Биосинтез биопротектора эктоина аэробными метилотрофными бактериями / Н.В. Доронина [и др.] // Прикл. биохимия и микробиология. 2010. Т. 46. № 2. С. 187-190/

4. Catalytic fuel cell used as an analytical tool for methanol and ethanol determination. Application to ethanol determination in alcoholic beverages / M. Tomassetti [et al.] // Electrochimica Acta. 2016. Vol. 191. № 10. P.1001-1009.

5. Кузнецова Т. А., Троценко Ю.А. Конструирование рекомбинантной плазмиды для экспрессии гена метанолдегидрогеназы // Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов: Всероссийский симпозиум с международным участием. Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова. Биологический факультет. 24-27 декабря 2014 г. М.: Макс Пресс, 2014. С. 137.

6. Кузнецова Т.А., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Эффективность биоэлектрокаталитического окисления метанола клетками метилотрофных бактерий в присутствии медиаторов электронного транспорта // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки. 2013. Вып. 1. C. 222-232.

7. ГОСТ 30536-97. Водка и спирт этиловый. Газохроматографический метод определения содержания токсичных микропримесей. М.: ИПК Изд-во стандартов, 1998.

8. Ghosh R., Quayle J.R. Phenazineethosulfate as a preferred electron acceptor to phenazinemethosulfate in dye-linked enzyme assays // Anal Biochem. 1979. Vol. 99. № 1. P. 112-117.

9. Liu Q., Kirchhoff J.R. Amperometric detection of methanol with a methanol dehydrogenase modified electrode sensor // Journal of Electroanalytical Chemistry. 2007. Vol. 601. № 1-2. P. 125-131

10. Свойства модифицированных амперометрических биосенсоров на основе метанолдегидрогеназы и клеток Methylobacterium nodulans / Кузнецова Т.А. [и др.] // Прикл. биохим. микробиол. 2013. Т. 49. № 6. С. 613-618.

11. Mountfort D. O. Oxidation of Aromatic Alcohols by Purified Methanol Dehydrogenase from Methylosinus trichosporium // Bacteriology J. 1990. Vol. 172. № 7. P. 3690-3694.

12. Гвоздев А.Р., Тухватуллин И.А., Гвоздев Р.И. Хиноновые алкогольдегидрогеназы и FAD-алкогольоксидазы // Биохимия. 2012. № 8. С. 1017-1032.

Кузнецова Татьяна Александровна, канд. хим. наук, доц., кафедра химии tatulyakuz@mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет

BIOCATALYTIC PROPERTIES OF METHYLOBACTERIUM EXTORQUENS METHYLOBACTERIUM OF WILD AND RECOMBINANT STRAINS

T.A. Kuznetsova

The processes occurring in bioelectrochemical systems based on genetically modified methylbacteria cells and the electronic transport mediator ferrocene were studied for the first time. The parameters of biosensors based on cells of a recombinant and wild strain of methylbacteria Methylobacterium extorquens were determined. The possibility of using such devices to determine the concentration of methanol in real samples is shown.

Key words: biocatalysis, methylobacteria, mediator biosensor, mediators of electronic transport, ferrocene, methanol, methanol dehydrogenase.

Kuznetsova Tatiana Alexandrovna, сandidate of chemical sciences, associate professort, department of chemistry, tatulyakuz@,mail.ru, Russia, Tula, Tula State University