СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО ТУЛЯРЕМИЙНОГО
METHOD OF PREPARATION OF ERYTHROCYTE IMMUNOGLOBULIN TULAREMIA DIAGNOSTICUM

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологии, в частности к способу получения эритроцитарных диагностикумов, применяемых в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА). Способ позволяет получить эффективный диагностический препарат для выявления в РНГА Francisella (F.) tularensis - возбудителя туляремийной инфекции.
Стремительное развитие биотехнологии в последние годы привело к появлению новых методов исследования, однако хорошо известная реакция непрямой гемагглютинации до сих пор остается актуальной в диагностике инфекций. Такой метод выявления взаимодействия «антиген-антитело» обладает высокой чувствительностью и простотой постановки. Данный метод не требует применения дорогостоящего оборудования, инструментального учета результатов, прост в использовании и доступен любой лаборатории. Может использоваться и как скрининг-тест. При том, что его чувствительность не уступает иммуноферментному и иммунофлуоресцентному анализам.
6
Известен способ получения диагностикума эритроцитарного сапного иммуноглобулинового моноклонального [1]. Способ получения диагностикума по изобретению включает нагрузку эритроцитов барана сапными моноклональными антителами, выделяемыми методом двукратного переосаждения сульфатом аммония, на их основе получают диагностикум эритроцитарный сапной иммуноглобулиновый моноклональный. Для этого берут навески мышиных моноклональных сапных иммуноглобулинов в двойной оптимальной сенсибилизирующей дозе (ОСД) и проводят сенсибилизацию формалинизированных танизированных эритроцитов барана, с последующей лиофилизацией полученного диагностикума. Контроль препарата осуществляют постановкой РНГА с гомологичными и гетерологичными штаммами микроорганизмов, подтверждая аналитические характеристики препарата в титрах (2,5×10 м.к./мл) для возбудителя сапа. Специфичность диагностикума в РНГА показана отсутствием реакции с близкородственными и гетерологичными микроорганизмами. В качестве разводящей жидкости применяется 1% раствор нормальной кроличьей сыворотки. Недостатком способа получения диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового можно назвать многостадийность его приготовления, а также необходимость использования разводящей жидкости при постановке РНГА.
Известно получение диагностикума эритроцитарного сапного и мелиоидозного моноклонального, сконструированного в ФКУЗ Волгоградский противочумный институт Роспотребнадзора, на основе сапных моноклональных антител. Как отмечает в своей работе Саяпина Л.В. с соавт. [2], диагностикум («Набор реагентов. Диагностикум эритроцитарный сапной и мелиоидозный иммуноглобулиновый сухой» (№ ФСР 2011/11613), существенно отличаясь по трудоемкости и экономической целесообразности, не демонстрировал преимуществ перед препаратом на основе поликлональных антител козьих сывороток, в связи с чем не нашел практического применения.
6
6
Наиболее близким к предлагаемому способу можно считать следующий известный способ получения диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового сухого [3]. Способ получения диагностикума по изобретению включает нагрузку эритроцитов барана иммуноглобулинами из противотуляремийной гипериммунной сыворотки, выделяемыми методом двукратного переосаждения сульфатом аммония, на их основе получают диагностикум эритроцитарный туляремийный иммуноглобулиновый сухой. Для этого к 5%-ной взвеси танизированных эритроцитов при постоянном перемешивании добавляют равный объем, содержащий 1,5 оптимальные дозы иммуноглобулина в 0,9%-ном растворе натрия хлорида (рН 6,4), с последующей лиофилизацией полученного диагностикума. Контроль препарата осуществляют постановкой РНГА с гомологичными и гетерологичными штаммами микроорганизмов, подтверждая его аналитические характеристики. Препарат выявляет F. tularensis в концентрации 3,12×10 м.к./мл макрометодом и 6,25×10 м.к./мл микрометодом в РНГА. Специфичность диагностикума в РНГА показана отсутствием реакции с близкородственными и гетерологичными микроорганизмами. Недостатком способа получения диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового можно назвать многостадийность его приготовления (предварительное обработка эритроцитов танином), а также недостаточную чувствительность препарата при постановке РНГА.
Целью изобретения стало повышение чувствительности и стабильности диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового для обнаружения возбудителя туляремии.
Поставленная цель достигается следующим образом: кровь у барана берут из яремной вены в бутыли со стеклянными бусинками, перемешивают в течение (15±5) мин, извлекают фибрин и сливают в стеклянную бутыль. Дефибринированную кровь фильтруют и осаждают на центрифуге в течение (15±5) мин при 2000 g в 0,9% растворе хлорида натрия. Супернатант сливают, осадок эритроцитов промывают три-четыре раза 0,9% раствором хлорида натрия. К полученному объему эритроцитов добавляют равный объем 0,9% раствора хлорида натрия, подогретого до температуры (37±1)°C с рассчитанным количеством раствора формалина и помещают на шуттель-аппарат при умеренном встряхивании на 16-18 ч при температуре (22±4)°C. По окончании формалинизации эритроциты осаждают центрифугированием и четырежды отмывают 10-кратным объемом 0,9% раствора хлорида натрия (по 10 мин при 2000 g). После чего добавляют в отмытые эритроциты 0,9% раствор хлорида натрия до первоначального объема и консервант - формалин до 1% (добавляется капельно). Полученные эритроциты хранят при температуре (5±3)°C в течение 3-5 лет без изменения свойств в течение указанного срока наблюдения.
Для обеспечения максимальной чувствительности метода предусматривают выяснение не только способов наиболее эффективной стабилизации эритроцитов, но и оптимального режима взаимодействия эритроцитов с антителами.
Для отработки оптимальной концентрации взвеси эритроцитов при нагрузке их белками нами испытаны следующие концентрации: 5%, 10%, 15%, 20% формалинизированные эритроциты барана. Наилучшие результаты удалось получить при использовании 20% взвеси формалинизированных эритроцитов. Для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов барана мы использовали иммуноглобулины, выделенные из иммунных сывороток различными способами: сернокислым аммонием, ПЭГ-6000, каприловой кислотой. Стабильные результаты получены при связывании белков, фракционированных каприловой кислотой.
В качестве коньюгирующего агента нами испытаны первичный и вторичный алкилсульфат натрия в различных концентрациях: 2%, 1%, 0,5%, 0,25%. После взаимодействия эритроцитов с алкилсульфатами проводили контроль целостности клеток с использованием биологического микроскопа. При использовании 2% и 1% растворов первичного алкилсульфата натрия в контроле диагностикума наблюдалось разрушение эритроцитов, сопровождающееся спонтанной агглютинацией. Контроль целостности эритроцитов, после их контакта с раствором вторичного алкилсульфата натрия в 2% концентрации показал неизменность формы формалинизированных эритроцитов.
Далее были отработаны оптимальные режимы взаимодействия 20% взвеси формалинизированных эритроцитов с иммуноглобулинами. В процессе работы изучено влияние температуры (37°C, 45°C), рН среды при сенсибилизации эритроцитов (4,0; 5,0; 6,0; 7,2) и времени взаимодействия (1 ч, 3 ч, 6 ч, 12 ч, 18 ч), было показано, что удлинение экспозиции до 12 ч при температуре 45°C со снижением рН среды до 5,0 сопровождалось формированием стабильного диагностикума. Была определена необходимая концентрация иммуноглобулинов при сенсибилизации эритроцитов, которая составила 400 мкг/мл.
Таким образом, в результате оптимизации параметров определен способ приготовления эритроцитарного диагностикума иммуноглобулинового туляремийного, включающий получение 20% взвеси формалинизированных эритроцитов для сенсибилизации туляремийными иммуноглобулинами выделенными из иммунной сыворотки, фракционированные каприловой кислотой, добавление 25 мл цитратного буфера рН-5,0, инкубирование 1 ч при температуре 45°C; параллельно к 50 мл иммуноглобулинов с концентрацией белка 400 мкг/мл на 0,9% растворе хлорида натрия, внесение 1,5 мл конъюгирующего агента - вторичного алкилсульфат натрия в концентрации 2%, инкубирование 1 ч при температуре 45°C; смешивание эритроцитов на цитратном буфере с конъюгированными иммуноглобулинами, инкубирование 12 ч при температуре 45°C; двойную отмывку 0,1 М раствором фосфатно-солевого буфера от не связавшихся иммуноглобулинов центрифугированием; добавление 0,9% раствора хлорида натрия до объема 100 мл и консерванта формалина до 1,5%.
Стабильность полученного препарата определялась путем постановки РНГА в процессе хранения (через 1, 3, 6, 12, 18 месяцев). Активность препарата оставалась стабильной, что может говорить о прочности связывания биологических агентов.
5
5
5
6
В результате установлено, что препараты специфичны и не дают перекрестных реакций с пробами, содержащими гетерологичные микроорганизмы. Чувствительность полученных диагностикумов составила 1,95×10-3,9×10 м.к./мл при выполнении макроварианта РНГА и 7,8×10-1,56×10 м.к./мл при использовании микроварианта (таблица 1), что полностью удовлетворяет НД. Для длительного хранения диагностикумы эритроцитарные переводили в среду высушивания [4] и лиофилизировали.
Контроль качества эритроцитарного диагностикума туляремийного иммуноглобулинового производили после лиофильного высушивания по следующим параметрам:
1. Растворимость - при добавлении 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия диагностикум растворяется в течение 1 мин, имеет вид гомогенной суспензии красно-коричневого цвета; при отстаивании образуются два слоя: прозрачная бесцветная или светло-желтого цвета надосадочная жидкость и плотный осадок красно-коричневого цвета;
2. Потеря в массе при высушивании - не более 2,5%;
3. Отсутствие спонтанной агглютинации - при добавлении к 2,5% взвеси диагностикума 0,9% раствора хлорида натрия (1:1) через 4 ч формируется осадок в виде "пуговки";
3
5
4. Количество эритроцитов - при подсчете в камере Горяева в 1 мм 2,5% диагностикума содержится (5,6±0,5)×10 эритроцитов;
5
5
5
6
5. Чувствительность - обеспечивает выявление в РНГА F.tularensis в концентрациях, эквивалентных по отраслевому стандарту мутности ОСО 42-28-85 ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России 1,95×10-3,9×10 м.к./мл макрометодом и 7,8×10-1,56×10 м.к./мл микрометодом;
8
6. Специфичность - не выявляет в РНГА гетерологичные микроорагнизмы в концентрациях, эквивалентных по отраслевому стандарту мутности ОСО 42-28-85 ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России 1×10 м.к./мл.
Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.
Пример 1. Получали 100 мл 5% диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового туляремийного (вариант 1).
Кровь у барана брали из яремной вены, перемешивали в течение 15 мин, извлекали фибрин и сливали в бутыль. Дефибринированную кровь фильтровали и осаждали на центрифуге в течение 15 мин при 2000 g в 0,9% растворе хлорида натрия. Супернатант сливали, а осадок эритроцитов промывали четыре раза 0,9% раствором хлорида натрия. К полученному объему эритроцитов добавляли равный объем 0,9% раствора хлорида натрия, подогретого до температуры 37°C с рассчитанным количеством раствора формалина и помещали на шуттель-аппарат при умеренном встряхивании на 18 ч при температуре (22±4)°C. По окончании формалинизации эритроциты осаждали центрифугированием и четырежды отмывали 10-кратным объемом 0,9% раствора натрия хлорида (по 10 мин при 2000 g). После чего в отмытые эритроциты добавляли 0,9% раствор хлорида натрия до первоначального объема и консервант - формалин до 1%.
Далее использовали 20% взвесь формалинизированных эритроцитов для сенсибилизации туляремийными иммуноглобулинами, выделенными из иммунной сыворотки, фракционированной каприловой кислотой. Первоначально к 25 мл 20% эритроцитов добавляли 25 мл цитратного буфера, рН-5,0, инкубировали 1 ч при температуре 37°C. Параллельно, к 50 мл иммуноглобулинов с концентрацией белка 400 мкг/мл, на 0,9% растворе хлорида натрия, вносили 1,5 мл коньюгирующего агента - вторичный алкилсульфат натрия в концентрации 2%, инкубировали 1 ч при температуре 37°C. Далее смешивали эритроциты на цитратном буфере с конъюгированными иммуноглобулинами. Инкубировали 12 ч при температуре 37°C. Следующий этап - двойная отмывка диагностикума 0,1 М раствором фосфатно-солевого буфера, рН 7,2±0,1 от не связавшихся иммуноглобулинов центрифугированием (по 10 мин при 2000 g). После чего в отмытый диагностикум добавляли 0,9% раствор хлорида натрия до объема 100 мл и консервант - формалин до 1,5%.
6
В единичных случаях (по 1 штамму при изучении 2 и 3 серий) чувствительность макроварианта полученного диагностикума с гомологичными штаммами составила 3,12×10 м.к./мл, при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами.
Стабильность препарата определялась путем постановки РНГА в процессе хранения (через 1, 3, 6, 12, 18 месяцев). Активность препарата оставалась стабильной в течение 18 месяцев (срок наблюдения).
Пример 2. Получали 100 мл 5% диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового туляремийного (вариант 2).
Формалинизированные эритроциты получали аналогично примеру 1.
Далее использовали 20% взвесь формалинизированных эритроцитов для сенсибилизации туляремийными иммуноглобулинами, выделенными из иммунной сыворотки, фракционированной каприловой кислотой. Первоначально к 25 мл 20% эритроцитов добавляли 25 мл цитратного буфера, рН-5,0, инкубировали 1 ч при температуре 45°C. Параллельно, к 50 мл иммуноглобулинов с концентрацией белка 400 мкг/мл, на 0,9% растворе хлорида натрия, вносили 1,5 мл коньюгирующего агента - вторичный алкилсульфат натрия в концентрации 2%, инкубировали 1 ч при температуре 45°C. Далее смешивали эритроциты на цитратном буфере с конъюгированными иммуноглобулинами. Инкубировали 12 ч при температуре 45°C. Следующий этап - двойная отмывка диагностикума 0,1 М раствором фосфатно-солевого буфера от не связавшихся иммуноглобулинов центрифугированием (по 10 мин при 2000 g). После чего в отмытый диагностикум добавляли 0,9% раствор хлорида натрия до объема 100 мл и консервант - формалин до 1,5%.
Отличием от примера 1 является температурный режим реакционной смеси.
5
5
5
6
Чувствительность полученных серий диагностикума составила 1,95×10-3,9×10 м.к./мл при выполнении макроварианта РНГА и 7,8×10-1,56×10 м.к./мл при использовании микроварианта, при отсутствии перекрестных реакций с гетерологичными штаммами.
Стабильность препарата определялась путем постановки РНГА в процессе хранения (через 1, 3, 6, 12, 18 месяцев). Активность препарата оставалась стабильной в течение 18 месяцев (срок наблюдения).
Пример 3. Получали 100 мл 5% диагностикума эритроцитарного иммуноглобулинового туляремийного (вариант 3).
Формалинизированные эритроциты получали аналогично примеру 1.
Далее использовали 20% взвесь формалинизированных эритроцитов для сенсибилизации туляремийными иммуноглобулинами, выделенными из иммунной сыворотки, фракционированной каприловой кислотой. Первоначально к 25 мл 20% эритроцитов добавляли 25 мл цитратного буфера, рН-5,0, инкубировали 1 ч при температуре 45°C. Параллельно, к 50 мл иммуноглобулинов с концентрацией белка 400 мкг/мл, на 0,9% растворе хлорида натрия, вносили 1,5 мл коньюгирующего агента - первичный алкилсульфат натрия в концентрации 2%, инкубировали 1 ч при температуре 45°C. Далее смешивали эритроциты на цитратном буфере с конъюгированными иммуноглобулинами. Инкубировали 12 ч при температуре 45°C. Следующий этап - двойная отмывка диагностикума 0,1 М раствором фосфатно-солевого буфера от не связавшихся иммуноглобулинов центрифугированием (по 10 мин при 2000 g). После чего в отмытый диагностикум добавляли 0,9% раствор хлорида натрия до объема 100 мл и консервант - формалин до 1,5%.
Отличием от примера 2 является замена конъюгирующего агента на первичный алкилсульфат натрия 2%.
При постановке РНГА установлено, что в контрольных лунках диагностикума, не содержащих гомологичных или гетерологичных микроорганизмов, наблюдалось явление спонтанной агглютинации клеток, что не позволило учесть результаты реакции как положительные.
Таким образом, предлагаемый способ приготовления эритроцитарного диагностикума иммуноглобулинового туляремийного по примеру 2 является эффективным решением в производстве диагностических препаратов предназначенных для индикации возбудителя туляремии.
Используемая литература
1. Савина Е.В., Новицкая И.В., Храпова Н.П., Кулаков М.Я., Топорков А.В., Викторов Д.В. Способ получения диагностикума эритроцитарного сапного иммуноглобулинового моноклонального. Патент №2658434 от 21.06.2018. Бюл. №18.
2. Саяпина Л.В., Касина И.В., Малахаева и др. Оценка эффективности нового эритроцитарного сапного моноклонального диагностикума // Сб. научных трудов, поев. 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 2003. - С. 53-54.
3. Левчук Б.А., Пятков В.А., Пекшев А.В., Кузнецов С.Л. Способ получения противотуляремийной гипериммунной сыворотки и способ получения диагностикума эритроцитарного туляремийного иммуноглобулинового сухого. Патент №2240822 от 27.11.2004. Бюл. №33.
4. Жарникова И.В., Курчева С.А., Жданова Е.В., Тюменцева И.С, Афанасьев Е.Н., Жарникова Т.В., Старцева О.Л, Кошкидько А.Г., Геогджаян А.С, Гаркуша Ю.Ю. Универсальная среда высушивания для стабилизации эритроцитарных диагностикумов туляремийных. Патент №2708636 от 10.12.2019. Бюл. №34.