Гиперрекомбиногениость химерного белка recaх53 (Esherichia coli/Pseudomonas aeruginosa) определяется его повышенной динамичностью

© Д. Б. Червякова,

В. А. Ланцов

Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова РАН, г. Гатчина

' Белок RecAX53 оказался наиболее рекомбинационно активным среди химерных белков RecA, состоящих из фрагментов белков RecA из Esherichia coli (RecAEc) и Pseudomonas aeruginosa (RecAPa). Мы обнаружили, что белок RecAX53 быстрее белков RecAEc и RecAPa гидролизует АТФ и диссоциирует с однонитевой ДНК (онДНК), а также быстрее контрольных белков вытеснят белок SSB с онДНК и ассоциирует с двунитевой ДНК (днДНК). Полученные результаты свидетельствуют о том, что гиперрекомбиногенность белка RecAX53 определяется его высокой динамичностью — быстрой ассоциацией и диссоциацией с онДНК. Активное связывание белка RecAX53 с днДНК объясняет SOS-независимый механизм гиперрекомбинации, свойственный этому белку.

' Ключевые слова: белок RecA; гиперрекомбиногенность; гидролиз АТФ, катализируемый белком RecA; SOS-независимый механизм рекомбинации.

Поступила в редакцию 02.10.2008 Принята к публикации 11.12.2008

УДК 575.17

гиперрекомбиногенность химерного белка REcAX53 (ESHERICHIA COLI/PSEUDOMONAS aeruginosa) определяется его повышенной динамичностью

ВВЕДЕНИЕ

Гомологическая рекомбинация, представляющая собой один из фундаментальных биологических механизмов, необходима для репарации повреждений ДНК, репликации генома и правильной сегрегации хромосом в мейозе (Ланцов, 2007). Гомологическая рекомбинация является основным механизмом, за счет которого поддерживается генетическая изменчивость популяций. Центральным белком гомологической рекомбинации у бактерий (и наиболее полно изученным) является белок RecA.

Образуя активный филамент на ДНК, белок RecA выполняет несколько функций в бактериальной клетке (Ланцов, 2007; Gallettoa et al., 2007; Roca et al., 1997). Он осуществляет основной процесс гомологической рекомбинации — трансферазную реакцию, участвует в репарации ДНК, в SOS-мутагенезе, а также обладает копротеазной активностью, катализируя автока-талитическое расщепление белка LexA и индуцируя тем самым SOS-ответ (Cox, 2003). Реакцию гомологической рекомбинации, проводимую белком RecA, принято подразделять на три этапа: 1) формирование пресинаптичес-кого комплекса — активного филамента RecA на онДНК в присутствии АТФ и ионов магния; 2) образование синаптического комплекса белком RecA при нахождении участка гомологии в двунитевой ДНК (днДНК) и инициации трансферазной реакции (реакции переноса нити); 3) постсинаптическая фаза «миграции ветви ДНК», приводящая к образованию продуктов реакции — гетеродуплексной днДНК и вытесненной онДНК (Roca et al., 1997).

Реакция переноса нити и автопротеолиз репрессора LexA — два взаимоисключающих события, поскольку сайты связывания активного RecA филамента с днДНК (необходимого для инициации трансферазной реакции) и с белком LexA перекрываются (Rehrauer et al., 1996).

Одним из основных свойств белка RecA, которое широко используется для постановки экспериментов, направленных на выявление особенностей различных белков RecA, является его способность гидролизовать АТФ в присутствии он- и днДНК (Roca et al., 1997). Измерение скорости гидролиза АТФ белками RecA в различных условиях позволяет воссоздать достаточно полную картину функциональной и биохимической активности данных белков. С помощью этого метода можно установить, например, такие свойства RecA, как: параметр kcat, характеризующий максимальную скорость гидролиза АТФ, приходящуюся на единицу фермента; стехиометрию связывания белков RecA с ДНК — число нуклеотидов ДНК, связываемых мономером RecA; стабильность филаментов RecA; аффинность белков RecA к АТФ и ДНК; скорость сборки и разборки филаментов RecA на ДНК; характер вытеснения белка SSB с онДНК.

События RecA-зависимых рекомбинационных обменов, происходящих во время конъюгации у бактерий, случаются относительно редко: частота рекомбинационных обменов на единицу длины ДНК (ЧРО) (Бреслер с со-авт., 1978), измеренная для RecAEc, составляет 5 обменов на геном (Lanzov et al, 2003). Белок RecAEc принято использовать в качестве контроля при изучении свойств различных RecA белков. Два механизма могут приводить к повышению параметра ЧРО: SOS-зависимый и SOS-независимый (Lanzov, 2002). В первом случае ЧРО преимущественно увеличивается за счет накоп-

ления белка RecA в клетке при RecA-опосредованной дерепрессии SOS-оперона, а во втором случае к высоким значениям ЧРО приводит повышенная активность самого белка RecA, вызванная его структурными особенностями. Известные мутантные формы RecAЕс — белки RecA441 и RecA730 — повышают ЧРО по SOS-зависимому пути (Lavery et al., 1990; Lavery et al., 1992), а белок RecAPa и многие химерные белки RecAX, состоящие из комбинаций фрагментов белков RecAEc и RecAPa, вызывают увеличение ЧРО по SOS-независимому механизму (Namsaraev et al., 1998; Ogawa et al., 1992; Bakhlanova et al., 2001). Среди последних — химерный белок RecAX21, для которого было показано, что аминокислотная замена L29M (по сравнению с RecAEc) приводит к повышению ЧРО в З раза по сравнению с белком RecAEc (Chervyakova et al., 2001). Самым рекомбинационно активным среди исследованных химерных белков оказался белок RecAX53: по значениям ЧРО белки RecAX53, RecAPa и RecAE соотносятся следующим образом: 9 : 6 : 1 (Bakhlanova et al., 2001; Bianco et al., 1998).

RecAX53 представляет собой белок RecAEc, у которого участок центрального домена от 170 до 250 аминокислоты заменен соответствующим фрагментом белка RecAPa (Ogawa et al., 1992). По сравнению с белком RecAEc, химерный белок RecAX53 содержит 12 аминокислотных замен: M170L, M175L, L178I, A179T, L182I, Q184N, S185A, T187C, L189V, I228T, E236D, N237E. Сравнительный генетический анализ RecAX53 и контрольных белков RecAEc и RecAPa показал, что RecAX53 функционирует по иному механизму, чем белки RecAEc и RecAPa (Baitin et al., 2008). RecAX53 быстрее контрольных белков осуществляет трансферазную реакцию на уровне трехнитевого обмена, приводя к появлению гетеродуплексов, характерных для рекомбинации конверсионного типа. Однако, в отличие от белков RecAEc и RecAPa, белок RecAX53 не способен проводить перенос нити на четырехни-тевом уровне с образованием конечных продуктов реакции кроссинговерного типа, а формирует только интермедиаты. Отмеченная динамическая активность RecAX53 предположительно влияет на повышенную частоту инициации реакций переноса нити этим белком (Baitin et al., 2008).

В настоящей работе мы приводим доказательства повышенной динамичности белка RecAX53, выявленные с помощью сравнительного анализа биохимической активности белков RecAEc и RecAPa. Кроме этого, мы обнаружили, что RecAX53 образует более гибкий фила-мент на онДНК по сравнению с контрольными белками, что является отражением структурных особенностей этого белка. Aгрессивное связывание RecAX53 с днДНК является доказательством в пользу SOS-независимого механизма гиперрекомбинации, свойственного белку RecAX53 (Bakhlanova et al., 2001).

МЕТОДИКА

Белки, реактивы и ДНК. Белки RecAEc, RecAPa и RecAX53 были выделены по известной методике (Shan et al., 1996). Концентрации белков определяли по методу Брэдфорда (Read et al., 1981). Концентрацию приобретенного в фирме «Sigma» (USA) белка SSB определяли спектрофотометрически, используя коэффициент экстинции £280 = 30,000 М-1 см-1. Кольцевую M13mp 18 онДНК и M13mp 18 днДНК приобрели в компании «New England Biolabs», Великобритания. Линейную днДНК получили путем рестрикции супер-скрученной M13mp18 днДНК эндонуклеазой EcoRI с последующей депротеинизацией. Молярные концентрации ДНК, выраженные в нуклеотидах, определяли спектрофотометрически, используя коэффициент экстинции для онДНК S260 = 6,500 М-1 см-1, а для днДНК S260 = 8,780 M-1 см-1. Линейную онДНК — poly(dT)3600 — приобрели в «Sigma», USA. Дезокси-рибозилтимидиновые олигонуклеотиды (oligo(dT)) длиной 20, 25, 30 и 40 нуклеотидов были любезно предоставлены Быстровым Н. С., Институт биоорга-нической химии РАН, Москва, Россия. Нуклеотидные молярные концентрации poly(dT)3600 и oligo(dT) определяли спектрофотометрически с помощью коэффициента экстинции £260 = 8,540 M-1 см-1. АТФ, трис, MgCl2, NADH, фосфоенолпируват, дитиотрейтол (ДТТ), L-лактатдегидрогеназу, пируваткиназу также приобрели в «Sigma», USA. Другие реактивы, использованные в этой работе, имели квалификацию «ЧДА» и были приобретены в известных компаниях.

Гидролиз АТФ. Измерение гидролиза АТФ проводили с помощью спектофотометрического метода, связывающего появление АДФ с окислением NADH (Kowalczykowski et al., 1987). Коэффициент экстинции NADH £380 = 1,21 мМ-1 см-1. Реакции проводили при 37 °С в буфере ТМД, содержащем 25 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 10 мМ MgCl2 и 0,1 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ и АТФ-регенерируюшую систему, состоящую из 2 мМ фосфо-енолпирувата, 30 единиц/мл пируват киназы, 0,56 мМ NADH (или 2,7 мМ в реакциях с днДНК), 30 единиц/мл L-лактатдегидрогеназы. ДНК-независимый гидролиз АТФ в высокосолевых условиях проводили с 1 мкМ RecA в буфере ТАМД, содержащем 25 мМ Трис-ацета-та (pH 7,5), 17,5 мМ ацетата магния, 1 мМ ДТТ, 2 мМ АТФ, 1,8 М ацетата натрия и АТФ-регенерирующую систему, как указано выше.

Для измерения величины S05 к реакционным смесям, содержащим буфер ТМД (за исключением АТФ), 10 мкМ poly(dT)3600 и 0,5 мкМ RecAX53, добавляли АТФ в диапазоне концентраций от 0 до 1000 мкМ и регистрировали максимальные скорости гидролиза. Затем строили график зависимости АТФазной активности данного белка RecA от концентрации АТФ и определяли S05 — ту концентрацию АТФ, которая соответствует

половине максимальной скорости гидролиза ATФ данным белком RecA.

Коэффициент Хилла nH, представляющий собой тангенс угла наклона прямой на графике Хилла — зависимости log(V/ (Vmax - V)) от log[ATO], рассчитывали по данным, полученным для определения SQ5 (Mikawa et al., 1998).

Для определения значения STMP реакции проводили в буфере ТМД с 10 м^ poly(dT)36QQ и 1 мкM RecA. Каждый раз, когда скорость гидролиза ATФ становилась постоянной, очередные 50 мМ NaCl титровали в реакцию.

Для определения параметра т реакции проводили в буфере ТМД, содержащем 3 мкМ poly(dT)36Q0 и 0,75 мкМ RecA. Когда скорость гидролиза ATФ комплексов RecA : : poly(dT)36Q0:: ATP достигала своего максимума,

0.6 мкМ белка SSB добавляли к реакции и регистрировали падение скорости гидролиза ATФ. Время полураспада комплексов RecA : : poly(dT)36Q0:: ATP рассчитывали из аппроксимации методом наименьших квадратов полученных данных к экспоненциальному распаду.

Точность результатов. Все приведенные результаты являются усредненными, по меньшей мере из трех независимых экспериментов. Среднеквадратичное отклонение от среднего арифметического рассчитывали с учетом коэффициентов Стьюдента для заданной надежности P = 0,9. Относительная погрешность результатов не превышала 9 %.

результаты

1. RecAX53 быстрее контрольных белков гидролизует АТФ

Одной из основных характеристик белков RecA является их способность образовывать активные филаменты на онДНК в присутствии ATФ. Поскольку рекомбинационно активный RecAPa быстрее образует пресинаптичес-кие комплексы на онДНК, чем белок RecAEc (Namsaraev et al., 1998), и ЧРО RecAX53 превышает ЧРО RecAPa

1.5 раза, мы ожидали, что RecAX53 будет еще активнее связываться с онДНК, чем RecAPa.

Для достижения максимальной для данного фермента скорости гидролиза ATФ реакцию ДНК-зависимого гидролиза ATФ проводили в условиях избытка линейной онДНК (10мкМ) по сравнению с RecA белками. Концентрацию ферментов выбрали такой, чтобы значение kcat (максимальная скорость гидролиза ATФ, приходящаяся на единицу фермента) не зависело от концентрации белка, а именно 1 мкM (Mikawa et al., 1998). Значение параметра kcat, полученное для RecAX53, превышает соответствующие значения RecAEc и RecAPa почти в

1.5 раза (табл. 1). Реакцию гидролиза ATФ филаментом RecA продублировали в высоких солевых условиях, когда RecA мультимеризуется и образует такой же активный филамент без ДНК в присутствии ATФ, как и на онДНК (Pugh et al., 1988) (табл. 1).

Таблица 1

Структурные и кинетические параметры белков RecA

Параметры RecAX53 RecAEc RecAPa

kcat *(мин-1) с poly(dT) 45,2 ± 2,2 29,2 ± 0,2 31,5 ± 2,9

kcat *(мин-1) в ацетате натрия 43,0 ± 2,1 30,0 ± 1,2 31,1 ± 2,0

стехиометрия* (в нуклеотидах) 3,3 ± 0,4 3,0 ± 0,2 3,1 ± 0,3

S05* (iurM) 79,0 ± 5,8 76,0 ± 9,5 71,5 ± 6,9

nH 3,8 ± 0,6 13,0 ± 1,2 12,9 ± 1,4

STMP* (мМ NaCl) 300 ± 30 375 ± 30 600 ± 40

т(мин) 3 ± 0,4 4,5 ± 0,5 > 30

* данные опубликованы в (Baitin et al., 2008).

2. RecAX53 характеризуется пониженным сродством к онДНК, меньшей стабильностью пресинаптических комплексов и сниженной кооперативностью

Свидетельствует ли высокое значение kcat о каких-либо ярких функциональных отличиях RecAX53 от бел-ков-«предшественников» или просто характеризует его повышенную гидролитическую активность? Мы проверили стехиометрию связывания RecAX53 с онДНК, т. к. в зависимости от того, связана одна или две молекулы онДНК филаментом RecA, значение kcat может различаться вдвое (Zlotnic et al., 1993).

Стехиометрию связывания RecA с онДНК определяли из зависимостей максимальных скоростей гидролиза ATФ (мкМ мин-1) от концентрации белков при неизменной концентрации poly(dT)36QQ (3 мкМ) (Baitin et al., 2003). Оказалось, что стехиометрия связывания RecAX53 с онДНК (табл. 1) практически не отличается от соответствующих значений RecAEc и RecAPa (Baitin et al., 2003).

Мы проверили, есть ли связь между необычно высокой скоростью гидролиза ATФ белком RecAX53 и его сродством к ATФ. Известно, что в присутствии ATФ RecA связывает ДНК в так называемой расширенной конформации, характеризующейся высокоаффинным к ДНК состоянием и большим размером витка спирали фила-мента. Наличие молекулы A^^, связанной RecA, характеризуется низкоаффинным к ДНК состоянием белка, так называемой компактной конформацией, в которой невозможны поиск гомологии или протеолиз белка LexA. Гидролиз ATO связан с переходом в субъединице RecA от расширенной к компактной конформации (Roca et al.,

1997).

Поскольку RecA относится к аллостерическим ферментам, его активность не может быть описана классическими уравнениями Михаэлиса-Мэнтен для ферментативных систем. Сродство к ATO RecA на онДНК

принято описывать величиной S05, соответствующей той концентрации АТФ, при которой скорость гидролиза АТФ равна половине ее максимальной скорости (Lee et al., 1990). Еще одним параметром, демонстрирующим активность таких ферментов, является коэффициент Хилла nH, который характеризует меру кооперативности сайта связывания к субстрату и показывает число смежных субъединиц белка, в которых происходят структурные изменения, индуцированные связыванием молекулы субстрата одной субъединицей белка (Mikawa et al., 1998).

Из таблицы 1 видно, что значение S05, полученное для RecAX53, не отличается от соответствующих величин у белков RecAEc и RecAPa (Baitin et al., 2003), а коэффициент Хилла, характеризующий RecAX53, почти в 3,5 раза ниже соответствующих значений, полученных для RecAEc и RecAPa. Сниженная кооперативность RecAX53 означает, что для создания активного филамен-та этому белку необходимо связать больше мономеров на ДНК, чем RecAEc и RecAPa, указывая тем самым на сниженную стабильность филаментов RecAX53 на онДНК.

Аффинность белка к онДНК наиболее точно характеризует параметр STMP (Salt Titration Mid Point) — та концентрация NaCl, которая необходима для диссоциации половины пресинаптических комплексов, образованных RecA, чему соответствует падение первоначальной скорости гидролиза АТФ в два раза (Menetski et al., 1988). Как видно из таблицы 1, комплекс RecAX53 : : ATP : : pol y(dT) немного менее устойчив к действию ионов хлора, чем комплекс с RecAEc: значение STMP, соответствующее RecAX53 в два раза ниже, чем STMP у RecAPa, и несколько ниже соответствующей величины, полученной для RecAEc. Это означает, что RecAX53 обладает сходным с RecAEc сродством к онДНК. Как было показано ранее (Namsaraev et al., 1998; Chervyakova et al., 2001), RecAPa имеет повышенную аффинность к онДНК.

Еще один эксперимент, позволяющий оценить прочность мономер-мономерных контактов и аффинность RecA к онДНК, а также оценить кооперативность, — это способность белков RecA формировать активные филаменты на коротких олигонуклеотидах (Bianco et al.,

1998). Было показано, что мономер RecAEc становится полностью активной АТФазой только в том случае, когда он является частью кластера мономеров, связанных последовательно вдоль остова ДНК и превышающего по длине определенный размер — 10 мономеров (Bianco et al., 1998). Максимальные скорости гидролиза АТФ для RecAEc, RecAPa и RecAX53 измеряли, используя в качестве основы для образования филамента дезоксирибо-зилтимидиновые олигонуклеотиды (oligo(dT)) длиной 20, 25, 30 и 40 нуклеотидов. На рисунке 1 показана диаграмма максимальных скоростей гидролиза АТФ исследуемых белков для данных oligo(dT), отнесенных к соответствующим максимальным скоростям гидролиза этих же белков на poly(dT) длиной 3600 нуклеотидов. Как видно, на

Рис. 1. Связывание белков RecAEc, RecAPa и RecAX53 с короткими олигонуклеотидами.

Реакции проводили в буфере ТМД, содержащем 1мкМ анализируемого RecA и 100 мкМ олиго^Т^, где n = 20, 25, 30, 40. Каждый столбец диаграммы показывает отношение средней максимальной скорости гидролиза АТФ данного белка RecA в комплексе с нуклеотидами указанной длины к максимальной скорости гидролиза АТФ с поли(ёТ)3600

всех использованных субстратах RecAX53 значительно уступает RecAPa и ведет себя подобно RecAEc. Таким образом, RecAX53 в меньшей степени, чем RecAPa, способен создавать активные филаменты на коротких онДНК. Этот результат подтверждает пониженную кооперативность RecAX53 и его ослабленное взаимодействие с онДНК.

3. RecAX53 быстрее контрольных белков диссоциирует с 5’-конца онДНК

RecAX53 быстрее контрольных белков ассоциирует с онДНК. Но для того чтобы инициировать большее число трансферазных реакций по сравнению с контрольными белками, гиперрекомбиногенному белку необходимо быстро покидать ДНК. Поэтому нас заинтересовало, насколько быстро он диссоциирует с онДНК.

Наиболее ярко, на наш взгляд, это свойство характеризует эксперимент, в котором белок RecA вытесняется белком SSB с poly(dT) (Lavery et al., 1990). Этот опыт основан на том факте, что белок SSB характеризуется большим сродством к poly(dT), чем RecA (Kowalczykowski et al., 1987). В присутствии АТФ RecA создает активный филамент на онДНК. Добавление к уже сформированному комплексу RecA : : ATP : : poly(dT) SSB приводит к вытеснению мономеров RecA со своего субстрата, т.е. к разборке филамента RecA, что можно видеть, например, по падению скорости гидролиза АТФ. Как видно из таблицы 1 (параметр тау, характеризующий время полу-расапда комплексов RecA : : poly(dT)3600 : : ATP), комплексы RecAX53 : : ATP : : poly(dT) при добавлении к ним

О 10 20 30 40 50 60

Время, мин

Рис. 2. Кинетика вытеснения белка SSB с онДНК белками RecAEc, RecAPa и RecAX53

Реакции проводили в буфере ТМД при 37 °С, содержащем 3 мкM онM13ДHК, 0,6 мкM SSB и 2 мкM соответствующего белка RecA. Кольцевую онДHК преинкубировали с SSB в течение 2 минут и затем инициировали реакцию гидролиза ATФ добавлением анализируемого белка RecA

белка SSB распадаются даже быстрее, чем комплексы с RecAEc, в то время как пресинаптические комплексы, образованные RecAPa, вообще не диссоциируют под влиянием SSB (Chervyakova et al., 2001).

4. RecAX53 быстрее контрольных белков вытесняет белок SSB с онДНК

Образующиеся в бактериальной клетке однонитевые участки ДHК, как правило, быстро оккупируются белком SSB. Поэтому для формирования пресинаптическо-го комплекса белку RecA необходимо сначала вытеснить SSB с онДHК.

Mbi сравнили скорость вытеснения SSB с кольцевой онДHК исследуемыми белками (рис. 2). Как видно из этого рисунка, RecAX53 быстрее контрольных белков достигает максимальной скорости гидролиза A№ — уже примерно через 25 минут от начала регистрации, тогда как RecAPa — через 45 минут, а RecAEc — после 55 минут. Tаким образом, RecAX53 вытесняет SSB даже быстрее, чем RecAPa. Более активная ассоциация RecAX53 с онДHК по сравнению с RecAEc и RecAPa (Baitin et al., 2008) позволяет объяснить лучшее вытеснение SSB белком RecAX53 высокой скоростью ассоциации последнего с онДHК.

5. RecAX53 быстрее контрольных белков ассоциирует с днДНК

Поскольку RecAX53 быстрее контрольных белков ассоциирует с онДHК, мы предположили, что RecAX53 быстрее связывается и с днДHК. Для проверки этой гипотезы мы изучили характер связывания RecAX53 с линейной днДHК. Как видно из графика зависимости

О 10 20 30 40 50 60

Время, МИН

Рис. 3. Кинетика связывания белков reca с линейной днДНК

Реакции проводили в буфере ТМД, содержащем 3мкМ соответствующего белка RecA и 8,4 мкМ днM13ДНК/EcoRI . На графике представлены зависимости скорости гидролиза АТФ белками RecA от времени

скорости гидролиза АТФ белками RecA при создании активных филаментов на днДНК от времени (рис. 3), RecAX53 быстрее связывается с днДНК, чем RecAPa и RecAEc. Этот результат свидетельствует о том, что фи-ламент RecAX53 способен так же быстро собираться на днДНК, как и на онДНК. Полученные результаты для RecAEc и RecAPa находятся в соответствии с опубликованными данными (Chervyakova et al., 2001).

ОБСУЖДЕНИЕ

Химерный RecAX53 представляет собой белок RecAEc, белок содержащий в центральном домене 12 аминокислот из RecAPa (Ogawa et al., 1992; Baitin et al., 2008). Согласно имеющимся данным, среди этих 12 аминокислотных позиций нет ни одной, задействованной в RecA-АТФ взаимодействиях, включающих связывание АТФ, у-фосфата АТФ, гидролиз АТФ, связывание иона Mg и аллостерический конформационный переход (Kowalczykowski, 1986; Voloshin et al., 2000). RecAX53 также не содержит аминокислотных замен, участвующих в RecA-LexA взаимодействиях (Nastri et al, 1997) и в RecA-RecA взаимодействиях (Story et al., 1992). Участок RecAX53, соответствующий петле L2 (аминокислоты с 194-й по 210-ю), которая предположительно участвует в связывании с онДНК (Hortnagel et al., 1999), также не содержит аминокислотных замен. Однако область RecA со 178-й по 183-ю аминокислоты, связывающаяся с онДНК при воздействии ультрафиолетового излучения (Morimatsu et al., 1995), содержит 3 аминокислотные замены в белке RecAX53: L178I, A179T, L182I, которые могут влиять на взаимодействие RecAX53 с онДНК.

Для того чтобы понять структурно-функциональные особенности RecAX53, лежащие в основе его необычно высокой ЧРО, мы провели сравнительный анализ биохимической активности RecAX53 и контрольных белков RecAEc и RecAPa.

Первым обнаруженным ярким отличием RecAX53 от контрольных белков оказалась увеличенная почти в 1,5 раза скорость гидролиза ATФ. Мы убедились, что структурные параметры, которые потенциально могут влиять на скорость гидролиза ATФ, такие как размер сайта связывания RecA с онДHК и его сродство к ATФ, оказались у RecAX53 практически таким же, как и у RecAEc и RecAPa. Однако кооперативность по ATФ nH, характерная для RecAX53 (табл. 1), оказалась почти в 3 раза сниженной по сравнению с контрольными белками. Этот означает, что связывание молекулы ATФ одним мономером RecAX53 вызывает конформационные изменения только в 3-4 соседних субъединицах, находящихся в составе нуклеопротеинового филамента, а не в 11-12, как в случае c RecAEc и RecAPa (Mikawa et al., 1998). Иными словами, пониженная коопреативность по ATФ, свойственная RecAX53, косвенно свидетельствует об ослабленных межмономерных взаимодействиях внутри активного филамента этого белка.

Поскольку RecAX53 активнее контрольных белков связывается с онДHК, а RecAPa обладает еще и повышенной аффинностью к онДHК (Namsaraev et al., 1998), мы проверили, не обладает ли RecAX53 таким же свойством. Как показал эксперимент по устойчивости RecA филаментов к воздействию ионов NaCl (STMP, табл. 1), по стабильности филаментов на онДHК исследуемые белки можно расположить так: RecAX53 < RecAEc < RecAPa. Этот эксперимент свидетельствует также о несколько пониженном сродстве филамента RecAX53 к онДHК и менее прочных межмономерных контактах по сравнению с RecAEc.

Пониженная кооперативность RecAX53, его ослабленное взаимодействие с онДHК и менее прочные меж-мономерные контакты, в особенности по сравнению с RecAPa, наиболее ярко проявляются в эксперименте по способности RecA белков создавать активные филаменты на коротких одигонуклеотидах. По относительным скоростям гидролиза ATФ на всех исследованных олигонуклеотидах рассматриваемые белки можно расположить следующим образом: RecAX53 < RecAEc < RecAPa. Тот факт, что для RecAX53 требуется большее число мономеров на онДHК для образования активного филамента, чем RecAPa, скорее всего, связан с ослабленными мономер-мономерными контактами, что, в свою очередь, может обуславливать повышенную гибкость RecAX53 и объяснять его повышенную кинетическую активность.

Поскольку RecAX53 быстрее ассоциирует с онДHК и создает менее прочные филаменты, способность к диссоциации RecAX53 с он^К мы оценили в эксперименте по

конкурентному вытеснению RecA с poly(dT) белком SSB. RecAX53 вытеснялся с этого субстрата даже быстрее, чем RecAEc, в то время как филамент RecAPa вообще не подвергся разборке (таблица 1, параметр тау). Как известно, для диссоциации мономеров RecA необходим гидролиз ATФ (Shan et al., 1997), поэтому способность филамен-та RecAX53 к быстрой разборке коррелирует с присущей этому белку высокой скоростью гидролиза ATФ.

Aгрессивность RecAX53 на начальном этапе переноса нити (Baitin et al., 2003) подтверждается также его способностью быстрее контрольных белков вытеснять SSB с он^К, необходимой для формирования пресина-птического комплекса.

Ускоренная ассоциация RecAX53 с днДHК объясняет SOS-независимый механизм гиперрекомбинации этого белка: активный филамент RecAX53 более вероятно свяжется с дн^К и инициирует процесс рекомбинации, нежели послужит катализатором автопротеолиза белка LexA с последующей индукцией SOS-ответа.

заключение

Мы показали, что RecAX53 опережает белки RecAEc и RecAPa в гидролизе ATФ и в скорости диссоциации с онДHК, но филаменты RecAX53 на онДHК оказались менее стабильными по сравнению с контрольными белками. Полученные результаты в совокупности с опубликованными данными о быстрой ассоциации белка RecAX53 с онДHК (Baitin et al., 2008) позволили заключить, что гиперрекомбиногенность химерного белка RecAX53 определяется его повышенной динамичностью — способностью к быстрой ассоциации и диссоциации с о^ЛЦ^ Мы предполагаем, что это качество RecAX53 определяется его повышенной гибкостью, на которую указывает сниженная стабильность филамен-тов RecAX53.

Aгрессивность белка RecAX53 в связывании с дн^К объясняет SOS-независимый механизм гиперрекомбинации этого белка.

Полученные данные согласуются с предположением о преимуществе белка RecAX53 в инициации рекомбинационных обменов по сравнению с белками RecAEc и RecAPa (Baitin et al., 2008).

Благодарность

Aвторы выражают благодарность д. б. н. В. Г. Королеву за критическое прочтение работы и за помощь в подготовке статьи к публикации.

Работа поддержана грантом РФФИ 08-04-00235.

литература

1. Ланцов В. А., 2007. Гомологическая ДHК-трансфе-раза RecA: функциональные активности и поиск гомологии рекомбинирующими ДHК // Молекулярная биология. T. 41. № 3. С. 1-12.

2. Бреслер С. Е, Ланцов В. А., 1978. Индуцибельная рекомбинация в Esherichia coli K-12: рекомбино-генный эффект мутации tifl // ДАН. 1978. Т. 238.

C. 715-717.

3. Baitin D. M., Zaitsev E. N, Lanzov V. A. 2003. Hy-per-recombinogenic RecA protein from Pseudomonas aeruginosa with enhanced activity of its primary DNA binding site // J. Mol. Biol. Vol. 328. P. 1-7.

4. Baitin D. M., Bakhlanova I. V., Chervyakova D. V. et al., 2008. Two RecA protein types that mediate different modes of hyperrecombination // Journal of bacteriology. Vol. 190. N. 8. P. 3036-3045.

5. Bakhlanova I. V., Ogawa T., Lanzov V. A., 2001. Re-combinogenic activity of chimeric RecA genes (Pseudomonas aeruginosa/Escherichia coli): a search for RecA protein regions responsible for this activity // Ge-netics.Vol. 159. P. 7-15.

6. Bianco P., Weinstock G, 1998. Characterization of RecA1332 in vivo and in vitro. A role for alpha-helix E as a liaison between the subunit-subunit interface and the DNA and ATP binding domains of RecA protein // Genes to Cells. Vol. 3. P. 79-97.

7. Chervyakova D., Kagansky A., Petukhov M., Lanzov V., 2001. [L29M] substitution in the interface of subunit-subunit interactions enhances Escherichia coli RecA protein properties important for its recombi-nogenic activity // J. Mol. Biol. Vol. 314. P. 923-935.

8. CoxM. M., 2003. The bacterial RecA protein as a motor protein //Annu. ReVol. Microbiol. Vol. 57. P. 551 -577.

9. Gallettoa R., Kowalczykowski S. C., 2007. RecA // Curr. Biol. Vol. 17. Issue 11. P. R395-R397.

10. Hortnagel K., Voloshin O. N, Kinal H. H. et al., 1999. Saturation mutagenesis of the E. coli RecA loop L2 homologous DNA pairing region reveals residues essential for recombination and recombinational repair // J. Mol. Biol. Vol. 286. P. 1097-1106.

11. Kowalczykowski S. C., 1986. Interaction of RecA protein with a photoaffinity analogue of ATP, 8-azi-do-ATP: Determination of nucleotide cofactor binding parameters and of the relationship between ATP binding and ATP hydrolysis // Biochemistry. Vol. 25. P. 5872-5881.

12. Kowalczykowski, S. C., Krupp R. A., 1987. Effects of the Escherichia coli SSB protein on the single-stranded DNA-dependent ATPase activity of Escherichia coli RecA protein: Evidence that SSB protein facilitates the binding of RecA protein to regions of secondary structure within single-stranded DNA // J. Mol. Biol. Vol. 193. P 97-113.

13. Lanzov V. A., 2002. Hyper-recombination in Escherichia coli with and without SOS response // Recent Research Development in DNA repair and Mutagenesis. (M. Ruiz-Rubio, E. Alejandre-Duran, and T. Roldan-Arjona, Eds). India: Kerala, Research Signpost. P 21-38.

14.Lanzov V. A., Bakhlanova I. V., Clark A. J., 2003. Conjugational hyperrecombination achieved by derepressing the LexA regulon, altering the properties of RecA protein and inactivating mismatch repair in Escherichia coli K-1 // Genetics. Vol. 163. P. 1243-1254.

15. Lavery P. E., Kowalczykowski S. C., 1990. Properties of RecA441 protein-catalyzed DNA strand exchange can be attributed to an enhanced ability to compete with SSB protein // J. Biol. Chem. Vol. 265. P 4004-4010.

16. Lavery P. E, Kowalczykowski S. C., 1992. Biochemical basis of the constitutive repressor cleavage activity of RecA730 protein. A comparison to recA441 and recA803 proteins // J. Biol. Chem. Vol. 267. P 20648-20658.

17. Lee J. W., Cox M. M., 1990. Inhibition of recA protein promoted ATP hydrolysis. 1. ATP gamma S and ADP are antagonistic inhibitors // Biochemistry. Vol. 29. P. 7666-7676.

18. Menetski J. P., Varghese A., Kowalczykowski S. C., 1988. Properties of the high-affinity single-stranded DNA binding state of the Escherichia coli RecA protein // Biochemistry. Vol. 27. P 1205-1212.

19. Mikawa T., Masui R, Kuramitsu S., 1998. RecA protein has extremely high cooperativity for substrate in its ATPase activity // J. Biochem. Vol. 123. P 450-457.

20. Morimatsu K, Horii T., 1995 DNA-binding surface of RecA protein photochemical cross-linking of the first DNA binding site on RecA filament // Eur. J. Biochem. Vol. 234. P. 695-705.

21. Namsaraev E. A., Baitin D., Bakhlanova I. V. et al., 1998. Biochemical basis of hyper-recombinogenic activity of Pseudomonas aeruginosa RecA protein in Escherichia coli cells // Mol. Microbiol. Vol. 27. P. 727-738.

22. Nastri H. G., Guzzo A, Lange C. S. et al., 1997. Mutational analysis of the RecA protein L1 region identifies this area as a probable part of the co-protease substrate binding site // Mol. Microbiol. Vol. 25. P. 967-978.

23. Ogawa T., Shinohara A., OgawaH., Tomizawa J.,

1992. Functional structures of the RecA protein found by chimera analysis // J. Mol. Biol. Vol. 226. P. 651-660.

24. Pugh B. F., CoxM. M., 1988. High salt activation of RecA protein ATPase in the absence of DNA // J. Biol. Chem. Vol. 263. P 76-83.

25. Read S. M., Northcote D. H., 1981. Minimization of variation in the response to different proteins of the Coomassie blue G dye-binding assay for protein // Anal. Biochem. Vol. 116. P 53-64.

26. Rehrauer W. M., Lavery P., PalmerE. et al., 1996. Interaction of Escherichia coli RecA protein with LexA repressor. I.LexA repressor cleavage is competitive with binding of a secondary DNA molecule // J. Biol. Chem. Vol. 271. P 23865-23873.

27. Roca A. I., Cox M. M., 1997. RecA protein: structure, function, and role in recombination DNA repair // Prog. Nucleic Acis Res. Mol. Biol. Vol. 56. P. 129-223. 15.

28. Shan Q., Cox M. M., 1996. RecA protein dynamics in the interior of RecA nucleoprotein filaments // J. Mol. Biol. Vol. 257. P. 756-774.

29. Shan, Q., Bork, J. M., Webb, B. L. et. al., 1997. RecA protein filaments: end-dependent dissociation from ss-DNA and stabilization by RecO and RecR proteins // J. Mol. Biol. Vol. 265. P. 519-540.

30. Story R. M., Weber I. T., Steitz T. A., 1992. The structure of the E. coli recA protein monomer and polymer // Nature. Vol. 355. P. 318-325.

31. Zlotnic A., Mitchell R. S., Steed R. K., Brenner S. L.,

1993. Analysis of two distinct single-stranded DNA binding sites on the RecA nucleoprotein filament // J. Biol. Chem. Vol. 268. P. 22525-22530.

32. Voloshin O. N., WangL., Camerini-OteroR. D., 2000. The homologous pairing domain of RecA also mediates the allosteric regulation of DNA binding and ATP hydrolysis: a remarkable concentration of functional residues // J. Mol. Biol. Vol. 303. P. 709-720.

Hyper-recombinogenity of the chimeric protein RecAX53 (Esherichia coli/Pseudomonas aeruginosa) is caused by its increased dynamics

D. B. Chervyakova, V. A. Lanzov

' SuMMARY: RecAX53 is the most recombinogenic protein among the chimeric RecA proteins composed of Esherichia coli RecA (Re-cAEc) and Pseudomonas aeruginosa RecA (RecAPa) protein fragments. We found out that RecAX53 protein is more rapid in ATP hydrolysis, dissociation from single-stranded DNA (ssDNA), SSB protein displacement from ssDNA and in association with doublestranded DNA (dsDNA), as compared with RecAEc and RecAPa proteins. These results indicate that the RecAX53 hyper-recombinogenity is caused by high dynamics of this protein — by its rapid association with and dissociation from ssDNA. The ability of RecAX53 to bind actively with dsDNA accounts for the SoS-independent mechanism of hyper-recombination used by this protein.

' KEY woRDS: RecA protein; hyper-recombinogenity; RecA protein-catalyzed ATP hydrolysis; SOS-independent recombination mechanism.

Информация об авторах:

червякова Дарья Борисовна, м. н. с., отделение молекулярной и радиационной биофизики, Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова РАН, 188300, Ленинградская область, г. Гатчина, Орлова роща, ОМРБ ПИЯФ РАН.

E-mail: dashach066@mail.ru.

Ланцов Владислав Александрович, д. б. н., профессор, заведующий, лаборатория молекулярной генетики, отделение молекулярной и радиационной биофизики, Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова РАН,

188300, Ленинградская область, г. Гатчина, Орлова роща, ОМРБ ПИЯФ РАН. E-mail: dashach066@mail.ru.