СПОСОБ ХРАНЕНИЯ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ КОНТАКТНО-СОРБЦИОННЫМ ВЫСУШИВАНИЕМ (ОБЕЗВОЖИВАНИЕМ) НА ИОНООБМЕННОЙ СМОЛЕ МАРКИ КБ-4П-2
METHOD OF STORING ANTHRAX BACTERIOPHAGES BY CONTACT-SORPTION DRYING (DEHYDRATION) ON AN ION-EXCHANGE RESIN OF KB-4P-2 GRADE

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, может быть использовано для хранения коллекционных культур сибиреязвенных бактериофагов.
Целью изобретения является упрощение способа поддержания сибиреязвенных бактериофагов при сохранении показателя специфической активности.
Сущность изобретения: способ предусматривает приготовление защитной среды (сахарозо-желатиновой, содержащей 10% сахарозы и 2% желатина); выращивание индикаторного штамма Bacillus anthracis СТИ-1 для размножения сибиреязвенного бактериофага; получение концентрированной суспензии сибиреязвенного бактериофага по методу двухслойного агара, экстрагируя негативные колонии из верхнего, полужидкого агара защитной, сахарозо-желатиновой средой; подготовку ионообменной смолы в пенициллиновых флаконах; щадящее высушивание (обезвоживание) путем нанесения концентрированной суспензии сибиреязвенного бактериофага в защитной среде при температуре 0°С на сорбент - ионообменную смолу марки КБ-4П-2 (высушенную до массовой доли влаги не более 1÷3% при оптимальном соотношении суспензии бактериофага и смолы - 1:7; хранение высушенных культур сибиреязвенного бактериофага в пенициллиновых флаконах при температуре 2÷6°С.
Способ позволяет хранить культуры сибиреязвенных бактериофагов после высушивания их в сахарозо-желатиновой защитной среде (конечная концентрация сахарозы и желатина в суспензии бактериофагов 10% и 2% соответственно). Высушивание (обезвоживание) суспензии сибиреязвенных бактериофагов достигается за счет использования защитной сахарозо-желатиновой среды и влагоемкого органического сорбента - ионообменной смолы КБ-4П-2 при охлаждении всех компонентов до температуры 0°С.
Культуры сибиреязвенных бактериофагов используют при производстве препаратов сибиреязвенных бактериофагов, предназначенных для обнаружения возбудителя сибирской язвы в объектах окружающей среды. Для поддержания коллекционных культур сибиреязвенных бактериофагов, а также при производстве диагностических препаратов сибиреязвенных бактериофагов необходимо обеспечить их хранение без потери биологических свойств.
Известен способ получения лиофилизированных культур в стеклянных закрытых ампулах с последующим хранением в течение длительного времени. В качестве прототипа выбран известный способ хранения лиофильно высушенных сибиреязвенных бактериофагов [1, 2]. Способ получения лиофилизированного препарата сибиреязвенного бактериофага включает получение вегетативной культуры индикаторного штамма и его специфическое лизирование бактериофагами в жидкой питательной среде. Полученный фаголизат центрифугируют, фильтруют с применением стерилизующих фильтров и высушивают в защитной среде методом лиофилизации в течение 18-24 ч. Защитная среда для лиофильного высушивания препарата содержит 1,5 г желатина и 20 г сахарозы на 100 мл дистиллированной воды [1]. Также к суспензии бактериофага в качестве защитных компонентов добавляют сахарозу, желатин и хинозол [2].
Основной недостаток способа лиофильного высушивания сибиреязвенных бактериофагов - высокая сложность специализированного оборудования и его обслуживания, а также существенные энергетические и временные затраты. Кроме того, полученный препарат обычно обладает высокой гигроскопичностью.
Одним из эффективных способов сохранения коллекционных микроорганизмов является контактно-сорбционное высушивание (обезвоживание) микроорганизмов [3, 4].
В производстве сухих микробиологических препаратов и ветеринарных вакцин широко используется способ контактно-сорбционного высушивания (обезвоживания), суть которого состоит в смешивании суспензии микроорганизмов с влагоемким сорбентом влаги [5-7]. Для контактно-сорбционного высушивания (обезвоживания) коллекционных штаммов микроорганизмов целесообразно применение гранулированной ионообменной смолы марки КБ-4П-2 в Na+-форме [8-13]. Продолжительность обезвоживания биомассы в процессе высушивания составляет 0,5 ч, что, примерно, в 40 раз быстрее, чем при лиофилизации (от 18 до 24 часов). Выживаемость физиологически разнородных видов микроорганизмов при контактно-сорбционном высушивании (обезвоживании) зависит от возраста клеток, их концентрации, защитной среды, времени экспозиции в защитной среде, температуры сорбента, условий и сроков хранения.
Способ контактно-сорбционного высушивания имеет технологические преимущества, минимальное инструментальное обеспечение, а также щадящий режим обезвоживания, вследствие чего обеспечивается сохранение ультраструктуры микроорганизмов и их биологических свойств.
Предлагаемый нами способ длительного хранения сибиреязвенных бактериофагов контактно-сорбционным высушиванием на ионообменной смоле марки КБ-4П-2, по сравнению с известными, характеризуется экономичностью, простотой и доступностью осуществления. В связи с тем, что хранение микроорганизмов в коллекциях необходимо осуществлять не менее чем двумя методами, способ контактно-сорбционного высушивания (обезвоживания) может рассматриваться как один из альтернативных методов длительного хранения.
В общедоступной патентной и научно-технической литературе сведения о способе хранения сибиреязвенных бактериофагов с помощью контактно-сорбционного высушивания (обезвоживания) на ионообменной смоле отсутствуют. Таким образом, предлагаемое изобретение обладает новизной.
Основным отличительным признаком заявленного способа является обезвоживание концентрированной суспензии сибиреязвенных бактериофагов в защитной сахарозо-желатиновой среде с применением гранулированной ионообменной смолы марки КБ-4П-2 (Na+-форма), охлажденной до температуры 0°С при оптимальном соотношении суспензии бактериофага и смолы - 1:7 [8].
Целью изобретения является сохранение жизнеспособности и биологических свойств культур сибиреязвенных бактериофагов при высушивании и длительном хранении, снижение материальных и временных затрат при высушивании сибиреязвенных бактериофагов с помощью заявленного способа - контактно-сорбционного высушивания (обезвоживания).
Заявленный способ контактно-сорбционного высушивания (обезвоживания) сибиреязвенных бактериофагов осуществляют следующим образом:
1 Готовят питательные среды и защитную среду.
Готовят питательные среды для выращивания индикаторной культуры Bacillus anthracis СТИ-1 и сибиреязвенных бактериофагов: плотную питательную среду - 2,0% мясо-пептонный агар (МПА), полужидкую питательную среду - 0,7% МПА и жидкую питательную среду - мясо-пептонный бульон (МПБ).
3
3
3
3
Для приготовления сахарозо-желатиновой среды асептически вносят в стерильный флакон 50 см 20% раствора сахарозы и 50 см 4% раствора желатина. Для приготовления 20% раствора сахарозы к 20,0 г сахарозы добавляют 80,0 см дистиллированной воды. Для приготовления 4% раствора желатина к 4,0 г желатина добавляют 96,0 смдистиллированной воды, раствор выдерживают в течение 30-40 минут при комнатной температуре с последующим нагреванием на водяной бане при температуре 40÷50°С в течение 7 минут. Растворы сахарозы и желатина стерилизуют при 0,1 МПа и температуре 112°С в течение 20 минут.
2 Готовят сорбент в пенициллиновых флаконах.
Гранулированную ионообменную смолу марки КБ-4П-2 (Na+-форма) промывают в дистиллированной воде. Сорбент высушивают до постоянного веса при температуре 110°С, фасуют по 1,4 г в пенициллиновые флаконы, закрывают их ватно-марлевыми пробками и повторно стерилизуют при температуре 110°С в течение 5 часов до массовой доли влаги не более 1÷3%. После стерилизации флаконы с сорбентом закрывают резиновыми пробками и герметизируют парафиновой пленкой. Перед использованием флаконы с сорбентом влаги охлаждают до температуры 0°С в ледяной бане.
3 Готовят бульонную культуру индикаторного штамма В. anthracis СТИ-1.
3
3
3
6
-3
В ампулу с лиофилизированной культурой индикаторного штамма В. anthracis СТИ-1 добавляют 1,0 см МПБ; содержимое ампулы встряхивают до полного растворения. Во флакон с 20,0 см МПБ из ампулы добавляют 0,5 см суспензии индикаторного штамма и инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. Готовят суспензию клеток индикаторного штамма В. anthracis СТИ-1 с концентрацией 1,0⋅10 КОЕ⋅см.
4 Готовят концентрированную суспензию сибиреязвенного бактериофага в сахарозо-желатиновой защитной среде по методу двухслойного агара (метод Грациа).
7
-3
3
3
3
4
-3
Готовят разведения культуры сибиреязвенного бактериофага. В ампулу с лиофилизированной культурой бактериофага со специфической литической активностью не менее 1,0⋅10 БОЕ⋅см вносят 1,0 см МПБ и встряхивают до полного растворения содержимого ампулы. Переносят в пробирку 0,5 см полученной культуры бактериофага, добавляют 4,5 см МПБ, встряхивают и готовят десятикратные разведения культуры до 1,0⋅10 БОЕ⋅см.
3
4
-3
3
6
-3
3
Для получения негативных колоний в пробирку вносят 0,1 см разведенной культуры бактериофага (1,0⋅10 БОЕ см), добавляют 0,2 см бульонной суточной культуры индикаторного штамма (1,0⋅10 КОЕ⋅см). После экспозиции смеси культуры индикаторного штамма и бактериофага при комнатной температуре в течение 15÷20 минут (для адсорбции бактериофага на поверхности бактериальных клеток) в пробирку добавляют 5,0 см предварительно расплавленной на водяной бане и охлажденной до температуры 38÷40°С полужидкой среды МПА. Содержимое пробирки наслаивают на поверхность плотной питательной среды МПА в чашках Петри, инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 18 часов.
3
-1
В чашку Петри с негативными колониями добавляют 5,0 см защитной среды, разрыхляют верхний слой шпателем и оставляют на 20 минут для экстракции негативных колоний. Полученный экстракт центрифугируют при 7000 об.⋅мин в течение 25 минут. Надосадочную жидкость стерилизуют фильтрацией через мембранный фильтр с размерами пор 0,22 мкм в стерильную колбу. Содержание частиц бактериофага (титр) в концентрированной суспензии сибиреязвенного бактериофага определяют методом Грациа. Флакон с концентрированной суспензией сибиреязвенного бактериофага в защитной среде охлаждают на ледяной бане в течение 30 минут.
5 Получают культуры сибиреязвенных бактериофагов способом контактно-сорбционного высушивания (обезвоживания).
3
Охлажденную до температуры 0°С концентрированную суспензию сибиреязвенного бактериофага в сахарозо-желатиновой защитной среде объемом 0,2 см вносят в охлажденные до температуры 0°С пенициллиновые флаконы с 1,4 г ионообменной смолы КБ-4П-2.
Флаконы выдерживают на ледяной бане в течение 30 минут, предварительно закрыв их резиновыми пробками. Резиновые пробки фиксируют алюминиевыми колпачками с помощью устройства для обжима. Культуры сибиреязвенных бактериофагов, высушенные способом контактно-сорбционного обезвоживания, хранят при температуре 2÷6°С.
3
Восстановление культур сибиреязвенных бактериофагов, высушенных способом контактно-сорбционного обезвоживания, осуществляют путем регидратации культуры в жидкой среде при охлаждении в ледяной бане до температуры 0°С. В пенициллиновые флаконы с высушенной на сорбенте культурой (твердым конгломератом) вносят 9,8 см МПБ, охлажденного до температуры 0°С. Содержимое флаконов встряхивают и выдерживают их в течение 30 минут, затем отбирают пипеткой суспензию культуры сибиреязвенного бактериофага и переносят в стерильную пробирку для определения концентрации бактериофага по методу Грациа.
Возможность осуществления заявленного изобретения и его эффективность подтверждены экспериментально в лабораторных условиях. Эффективность предложенного способа оценивали по следующим показателям:
- жизнеспособность культур сибиреязвенных бактериофагов, высушенных способом контактно-сорбционного обезвоживания;
- специфическая литическая активность культур сибиреязвенных бактериофагов, высушенных способом контактно-сорбционного обезвоживания.
Возможность практического использования изобретения подтверждается примерами его конкретного выполнения.
Примеры осуществления способа
Пример 1
Высушиванию подвергали суспензии сибиреязвенных бактериофагов Ф112PRE, ФС-3 и ФВМ, содержащие 10% сахарозы и 2% желатина. В качестве сорбента влаги использовали ионообменную смолу КБ-4П-2, высушенную до массовой доли влаги не более 1÷3%.
Подготовленные пенициллиновые флаконы с ионообменной смолой и флаконы с концентрированной суспензией сибиреязвенных бактериофагов в защитной сахарозо-желатиновой среде помещали в ледяную баню (эксикатор с кусочками льда) на 30 минут.
3
К 1,4 г подготовленной смолы в охлажденных пенициллиновых флаконах вносили 0,2 см охлажденной концентрированной суспензии сибиреязвенного бактериофага в сахарозо-желатиновой защитной среде. Флаконы со смолой и суспензией сибиреязвенного бактериофага в защитной среде выдерживали на ледяной бане в течение 30 минут, предварительно закрыв их резиновыми пробками. Затем резиновые пробки фиксировали алюминиевыми колпачками с помощью устройства для обжима.
Культуры сибиреязвенных бактериофагов, высушенные способом контактно-сорбционного обезвоживания, хранили при температуре 2±6°С.
3
Для оценки жизнеспособности и сохранения специфической литической активности высушенных культур бактериофагов их восстанавливали путем регидратации в жидкой среде. Мясо-пептонный бульон объемом 9,8 см, охлажденный при температуре 0°С, добавляли в пенициллиновые флаконы к высушенной на сорбенте культуре (твердому конгломерату). Содержимое флаконов встряхивали и выдерживали в течение 30 минут в ледяной бане.
Для оценки жизнеспособности культур сибиреязвенных бактериофагов после контактно-сорбционного высушивания (обезвоживания) и длительного хранения из восстановленной (регидратированной) суспензии культур сибиреязвенных бактериофагов готовили ряд последовательных разведений и определяли титр сибиреязвенных бактериофагов методом Грациа.
9
-3
9
-3
9
-3
7
-3
7
-3
8
-3
Результаты исследования жизнеспособности культур сибиреязвенных бактериофагов, высушенных способом контактно-сорбционного обезвоживания с использованием защитной сахарозо-желатиновой среды, через 3,5; 6,5; десять; двенадцать месяцев хранения при температуре 2÷6°С представлены в таблице 1. Концентрация бактериофага Ф112PRE через 3,5 месяца хранения - (3,0±0,3)⋅10 БОЕ⋅см, что составило 71,4% от исходной концентрации после высушивания, концентрация бактериофагов ФС-3 и ФВМ - (1,3±0,1)⋅10 БОЕ⋅см, что составило 73,6% от исходной концентрации и (2,2±0,2)⋅10БОЕ⋅см - 70,9% соответственно (таблица 1). Концентрация бактериофага Ф112PRE через 12 месяцев хранения (срок наблюдения) составила (6,8±0,2)⋅10 БОЕ⋅см, бактериофагов ФС-3 и ФВМ - (4,1±0,2)⋅10 БОЕ⋅см и (1,2±0,2)⋅10 БОЕ⋅см соответственно.
7
-3
7
-3
8
-3
Эффективность предложенного способа оценивали также по спектру специфической литической активности культур сибиреязвенных бактериофагов, приготовленных способом контактно-сорбционного высушивания (обезвоживания). Оценку спектра специфической литической активности культур сибиреязвенных бактериофагов производили методом спот-теста (таблица 2). В исследованиях использовали восстановленные ресуспендированием в МПБ культуры бактериофагов с количеством фаговых частиц: Ф112РRE - (6,8±0,3)⋅10 БОЕ⋅см, ФС-3 - (4,1±0,2)⋅10 БОЕ⋅см, ФВМ - (1,2±0,2)⋅10 БОЕ⋅см, а также культуры сибиреязвенных вакцинных штаммов и близкородственных бацилл. Для этого в чашки Петри на поверхность роста соответствующих микробных культур наносили каплю исследуемых культур бактериофагов, инкубировали при температуре 37°С в течение 18 часов и оценивали результат. Чувствительные к бактериофагу микробные культуры образовывали прозрачное пятно (зону лизиса). Из данных таблицы 2 следует, что все бактериофаги лизировали культуры сибиреязвенных штаммов и не лизировали культуры близкородственных бацилл.
Оценка жизнеспособности и спектра специфической литической активности культур сибиреязвенных бактериофагов, восстановленных после высушивания в защитной среде и хранения в течение 12 месяцев, подтверждает эффективность предложенного способа хранения сибиреязвенных бактериофагов, высушенных контактно-сорбционным обезвоживанием.
Пример 2
Высушиванию подвергали суспензии сибиреязвенных бактериофагов Ф112PRE, ФС-3, ФВМ, приготовленные на мясо-пептонном бульоне. В качестве сорбента использовали ионообменную смолу КБ-4П-2, высушенную до массовой доли влаги не более 1÷3%.
Подготовленные пенициллиновые флаконы с ионообменной смолой и флаконы с концентрированной суспензией сибиреязвенного бактериофага в МПБ помещали в ледяную баню (эксикатор с кусочками льда) на 30 минут.
3
К 1,4 г подготовленной смолы в охлажденных пенициллиновых флаконах вносили 0,2 см охлажденной концентрированной суспензии сибиреязвенного бактериофага в мясо-пептонном бульоне. Флаконы со смолой и суспензией сибиреязвенных бактериофагов в МПБ выдерживали на ледяной бане в течение 30 минут, предварительно закрыв их резиновыми пробками. Затем резиновые пробки фиксировали алюминиевыми колпачками.
Культуры сибиреязвенных бактериофагов, высушенные способом контактно-сорбционного обезвоживания, хранили при температуре 2÷6°С.
3
Для оценки жизнеспособности и спектра специфической литической активности высушенных культур бактериофагов их восстанавливали путем регидратации в жидкой среде. Мясо-пептонный бульон объемом 9,8 см, охлажденный при температуре 0°С, добавляли в пенициллиновые флаконы к высушенной на сорбенте культуре (твердому конгломерату). Содержимое флаконов встряхивали и выдерживали в течение 30 минут. Восстановленную культуру сибиреязвенных бактериофагов переносили пипеткой в стерильную пробирку.
Для оценки жизнеспособности культуры после высушивания и длительного хранения готовили ряд последовательных разведений из регидратированной суспензии культур бактериофагов и определяли концентрацию бактериофагов методом Грациа.
3
-3
3
-3
3
-3
Результаты исследования жизнеспособности и спектра специфической литической активности культур сибиреязвенных бактериофагов в МПБ, высушенных способом контактно-сорбционного обезвоживания, через 3,5; 6,5; десять; двенадцать месяцев хранения при температуре 2÷6°С, представлены в таблице 1. Концентрация бактериофага Ф112РRЕ через 12 месяцев хранения (срок наблюдения) составила (1,1±0,1)⋅10 БОЕ⋅см, бактериофагов ФС-3 и ФВМ - (2,3±0,2)⋅10 БОЕ⋅см и (2,7±0,2)⋅10 БОЕ⋅смсоответственно (таблица 1).
Из данных таблицы 1 видно, что культуры сибиреязвенных бактериофагов, высушенные контактно-сорбционным способом с использованием защитной сахарозо-желатиновой среды, сохраняли после высушивания и хранения высокую выживаемость частиц бактериофагов по сравнению с соответствующими культурами в МПБ.
Оценку спектра специфической литической активности культур сибиреязвенных бактериофагов производили методом спот-теста. В исследованиях использовали восстановленные ресуспендированием в МПБ культуры бактериофагов, а также культуры сибиреязвенных вакцинных штаммов и близкородственных бацилл (таблица 2). Восстановленные после высушивания и хранения в защитной среде культуры сибиреязвенных бактериофагов сохраняют спектр специфической литической активности - лизируют культуры сибиреязвенных штаммов и не лизируют культуры близкородственных бацилл.
Таким образом, показано, что с помощью заявленного способа возможно сохранять жизнеспособность культур бактериофагов и основные биологические свойства (используя защитную сахарозо-желатиновой среду) при хранении их при температуре 2±6°С в течение двенадцати месяцев (срок наблюдения), а также использовать высушенные и хранившиеся культуры бактериофагов после восстановления в МПБ в практике коллекционного хранения и других областях микробиологии.
Изобретение практически осуществимо, его использование позволит с наименьшими материальными и временными затратами получить высушенные культуры сибиреязвенных бактериофагов с сохранением их биологических свойств в течение длительного срока хранения.
Предлагаемое техническое решение имеет изобретательский уровень, поскольку предлагаемый способ получения высушенных культур сибиреязвенных бактериофагов позволяет при высокой скорости обезвоживания биомассы микроорганизмов (в 40 раз выше, чем у прототипа) обеспечивать стабильность сибиреязвенных бактериофагов как при их приготовлении, так и при хранении и использовании по назначению.
МАТЕРИАЛЫ, ПОЯСНЯЮЩИЕ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1 Способ получения сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26: патент 2171842 (RU), МПК C12N 7/00, C12N 1/20 / Солодовников Б.В. (RU), Тюменцева И.С. (RU), Афанасьев Е.Н. (RU); заявители и патентообладатели РФ (RU) Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт (RU); заявл. 11.05.99; опубл. 10.08.01.
2 Штамм бактериофага Bacillus anthracis R/D, используемый для получения препарата для диагностики сибиреязвенной инфекции, жидкий препарат для диагностики сибиреязвенной инфекции и препарат для диагностики сибиреязвенной инфекции: патент 2351650 (RU), МПК C12N 7/00, A61K 35/76 / Дятлов И.А. (RU), Попова В.М. (RU), Баранов A.M. (RU); заявители и патентообладатели РФ (RU) и ФГУН ГНЦ ПМБ (RU); заявл. 07.08.07; опубл. 10.04.09.
3 Медицинские лабораторные технологии: руководство по клинической лабораторной диагностике в 2 т. / В.В. Алексеев [и др.]; под ред. А.И. Карпищенко // Способы сохранения музейных штаммов микроорганизмов. - 2012. - Т. 2. - С. 494-495.
4 Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития / В.Д. Похиленко, A.M. Баранов, К.В. Детушев // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. - 2009. - №4 (12). - С. 99-121.
5 Давыдкин, В.Ю. Технология и конструирование сухих биопрепаратов на основе микрокапельных порошков: автореф. дис… док. биол. наук: 03.01.06 / Давыдкин Валерий Юрьевич. - Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского. - М., 2010. - 28 с.
6 Набор для определения антител к вирусу энцефаломиелита птиц: патент 2199126 (RU), МПК G01N 33/545, G01N 33/569, C12N 7/08, A61K 39/196 / Борисов А.В. (RU), Кузнецов В.Н. (RU), Гусев А.А. (RU), Ирза В.Н. (RU), Беляева Н.В. (RU), Крестьянинова С.К. (RU), Меньщикова А.Э. (RU); заявители и патентообладатели РФ (RU) и ФГУ ВНИИ защиты животных (RU); заявл. 02.03.01; опубл. 20.02.03.
7 Вирусвакцина против инфекционного ларинготрахеита птиц для перорального применения: патент 2178308 (RU), МПК A61K 39/12, A61K 39/265 / Евсеева С.Д. (RU), Изотова Н.А. (RU), Хрипунов Е.М. (RU), Исакова Н.Б. (RU), Окрошидзе М.Г. (RU), Малоголовкина Н.В. (RU); заявители и патентообладатели РФ (RU) и ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии (RU); заявл. 24.05.00; опубл. 20.01.02.
8 Способ консервации микроорганизмов: патент 1730138 (SU), МПК C12N 1/04 / Мищенко В.В. (RU), Ильин А.А. (RU), Тарумов B.C. (RU); заявители и патентообладатели РФ (RU) и Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной биологии (RU); заявл. 06.04.90; опубл. 30.04.92.
9 Способ контактной сушки микроорганизмов: патент 1831498 (SU), МПК C12N 1/04 / Вирясов С.Н. (RU), Перелыгин В.В. (RU), Биркина Ю.С. (RU), Беккер М.Н. (RU); заявители и патентообладатели РФ (RU) и С.Н. Вирясов (RU), В.В. Перелыгин (RU), Ю.С. Биркина (RU), М.Н. Беккер (RU); заявл. 15.08.91; опубл. 30.07.93.
10 Методические рекомендации по консервации вегетативных форм микроорганизмов с использованием метода контактно-сорбционного обезвоживания / В.В. Мищенко, А.А. Ильин, B.C. Тарумов - Серпухов: ВНИИ ПМ, 1990. - 8 с.
11 Козуб, С.Н. Использование метода контактно-сорбционного обезвоживания для получения сухих музейных культур возбудителя дифтерии: автореф. дис… канд. мед. наук: 03.00.07 / Козуб Сергей Николаевич. - Омская государственная медицинская академия. - Челябинск, 1997. - 24 с.
12 Славогородский, B.C. Оптимизация методов контактно-сорбционного обезвоживания и Виньяля для сохранения культур неспорообразующих анаэробных бактерий: автореф. дис… канд. мед. наук: 03.00.07 / Славогородский Василий Семенович. - Самарский государственный медицинский университет.- Самара, 1999. - 22 с.
13 Юскевич, В.В. Формирование коллекции природных микромицетов и выявление штаммов с антибактериальными и москитоцидными свойствами: автореферат дис… канд. биол. наук: 03.02.03, 03.01.06 / Юскевич Виктория Викторовна. - Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. - Оболенск, 2012. - 26 с.