Вакцина против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19
VACCINE AGAINST INFLUENZA TYPE A, INFLUENZA TYPE B AND COVID-19

Область техники
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, вирусологии, медицины. Оно касается векторной вакцины, которая может применяться в системе здравоохранения для одновременной профилактики респираторных инфекционных болезней у населения, вызываемых эпидемически актуальными оболочечными одноцепочечными РНК-вирусами, такими как вирусы гриппа типов А и В, новый коронавирус Sars-Cov-2.
Предшествующий уровень развития
Подъем сезонной заболеваемости гриппом наблюдается ежегодно, поэтому достижение более широкого охвата популяции профилактической вакцинацией является приоритетной задачей системы здравоохранения. Также не исключена возможность появления новых пандемических штаммов вируса гриппа, что заранее следует учитывать при разработке вакцин. Однако в настоящее время ситуация с вакцинацией осложнилась в связи с возникновением пандемии коронавирусной инфекции COVID-19, вызванной вирусом SARS-CoV-2. Так как ожидается циркуляция возбудителя COVID-19 в ближайшее время, возникает необходимость в проведении комплексной вакцинации от двух клинических схожих инфекционных респираторных болезней человека. Одним из подходов к решению данной проблемы является создание комплексных иммунобиологических средств на основе актуальных штаммов вируса гриппа и/или коронавируса, с возможностью быстрой замены состава с учетом текущей эпидемической обстановки.
Betacoronavirus,
Основными патогенами, вызывающими различной степени тяжести респираторные заболевания у человека являются оболочечные одноцепочечные РНК-вирусы, к которым относятся вирусы гриппа и коронавирусы. Важно учитывать, что данные инфекционные возбудители имеют значительный пандемический потенциал. С 1918 года человечество четыре раза сталкивалось с пандемиями вируса гриппа А (1918, 1957, 1968, 2009 гг.), которые в разные годы уносили от сотен тысяч до миллионов жизней. Ежегодные типичные сезонные вспышки вируса гриппа также вызывают высокую заболеваемость и смертность. С 2002 года в эпидемический процесс стали входить коронавирусы рода два из которых вызвали кратковременные эпидемии (SARS-CoV, MERS-CoV), а третий - SARS-CoV2, вызвал пандемию, которая на сегодняшний день продолжает оставаться чрезвычайной ситуацией для глобального здравоохранения. (Abdelrahman Z. et al. Comparative review of SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV, and Influenza A respiratory viruses // Front. Immunol., 11 September 2020). В последнее время стали появляться сообщения о возможности ко-инфекции вирусами гриппа и коронавируса у людей, что значительно осложняет процесс постановки диагноза и дальнейшего лечения (Cuadrado-PayánE. etal.SARS-CoV-2 and influenza virus co-infection // The Lancet. V. 395, ISSUE 10236, E84, MAY 16, 2020).
Influenzavirus
Оболочечные одноцепочечные РНК-вирусы способны быстро накапливать эволюционно выгодные мутации в своем геноме. Одними из наиболее проблемных вирусов с точки зрения создания вакцин являются вирусы гриппа (род ). Обладая геномом из восьми различных сегментов, они имеют возможность путем антигенного шифта и дрейфа уходить от иммунного ответа зараженного организма, что потенциально снижает эффективность вакцинации. Особенно изменчив геном вируса гриппа А, поэтому основные усилия по разработке сезонных вакцин против гриппа сфокусированы на подборе антигенных составляющих вирусов именно этого типа. Вирус гриппа типа В мутирует медленнее, однако, это также вносит коррективы при разработке вакцин (Nobusawa E., Sato K. Comparison of the Mutation Rates of Human Influenza A and B Viruses // Journal of virology, Vol. 80, No. 7. Apr. 2006, p. 3675–3678).
Эволюция коронавируса SARS-CoV2 также свидетельствуют о достаточно быстром накоплении мутаций в последовательности S-белка, дающих возможность ускользать от иммунного ответа, что в дальнейшем может повлиять на необходимость замены существующих антигенов в вакцинах. (Tegally H. et al. Emergence and rapid spread of a new severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lineage with multiple spike mutations in South Africa // December 2020).
В ежегодных рекомендациях ВОЗ по составу противогриппозных вакцин, указываются актуальные на предстоящий сезон штаммы вируса гриппа, которые на сегодняшний день предпочтительнее выпускать в четырехвалентном составе, содержащем вирусы гриппа А субтипов H1, Н3 и вирусы гриппа В линий Ямагата и Виктория. (https://www.who.int/influenza/vaccines/virus/en/). При этом каждый год возможна смена рекомендуемых штаммов, что влечет за собой необходимость быстрой замены штаммов в существующих вакцинах.
Последние рекомендации ВОЗ по вакцинации от сезонного гриппа во время пандемии COVID-19 подчеркивают необходимость изучения одновременного введения вакцин от сезонного гриппа и от COVID-19. (https://www.who.int/immunization/policy/position_papers/Interim_SAGE_influenza_vaccination_recommendations.pdf). Стали появляться сведения о положительном влиянии вакцинации от сезонного гриппа на протекание COVID-19 у ранее иммунизированных пациентов (Fink G, Orlova-Fink N, Schindler T, et al.Inactivated trivalent influenza vaccination is associated with lower mortality among patients with COVID-19 in Brazil // BMJ Evidence-Based Medicine Published Online First: 11 December 2020).
На сегодняшний день сложилась следующая ситуация: COVID-19, вызванный вирусом SARS-CoV-2 в настоящее время является глобальной пандемией, а вирусы гриппа распространяются ежегодно со значительной заболеваемостью и смертностью, прогнозируется циркуляция обоих вирусов в следующих сезонах. (Grech V., Borg M. Influenza vaccination in the COVID-19 era // Early Human Development, Volume 148, 2020). В таких условиях идеальным вариантом будет всеобщий охват вакцинацией против гриппа и коронавируса. В настоящее время в мире нет зарегистрированных вакцин против респираторных инфекций, вызываемых оболочечными одноцепочечными РНК-вирусами, вызывающих защиту от вирусов гриппа и коронавируса SARS-CoV-2 одновременно).
Таким образом, существует необходимость в разработке современных вакцин против респираторных инфекций, вызываемых оболочечными одноцепочечными РНК-вирусами, таких как вирусы гриппа типа А и B, и новый коронавирус SARS-CoV-2,способные вызывать иммунный ответ ко всем указанным возбудителям одновременно, с возможностью быстрой замены штаммов для реагирования на эпидемическую ситуацию.
Наибольшее распространение на сегодняшний день получили инактивированные и живые (аттенуированные) противогриппозные вакцины, как правило, применяемые для защиты от трех различных вирусов сезонного гриппа (трехвалентные вакцины). В некоторых странах сейчас стали доступны вакцины, защищающие от четырех различных вирусов, включая вирусы гриппа В обеих линий (четырехвалентные вакцины). (https://www.euro.who.int/ru/health-topics/communicable-diseases/influenza/vaccination/types-of-seasonal-influenza-vaccine).
В последние годы были лицензированы рекомбинантные противогриппозные вакцины, содержащие гемагглютинин вируса гриппа, полученный генно-инженерным способом в клетках насекомых или растений. (ВОЗ 20 марта 2018 года Версия 1 Информационный бюллетень). Такие вакцины требуют меньшего времени для разработки и масштабирования производства в случае возникновения новых вариантов вирусов.
Известно решение (CN107537032), в котором четырехвалентная субъединичная вакцина против вируса гриппа получена путем выращивания на аллантоисной жидкости куриных эмбрионов, дальнейшей инактивации вируса химическим лизисом (формальдегид или ноноксинол-9) и дальнейшей очисткой субъединиц гемагглютининов, при этом вакцина не содержит адъюванта, а также не содержит тиомерсала и других консервантов.
Известно решение (CN102068692) по получению расщепленной вакцины против гриппа. Каждая доза вакцины, содержит три гемагглютинина гриппа, а именно H1N1, H3N2 и тип B, адъювант CpG ODN и алюминиевый адъювант. Вакцину получают в несколько стадий: размножение вирусов гриппа в куриных эмбрионах; проведение ультрафильтрации и концентрирования, центрифугирование и очистка, расщепление Triton X-100, проведение вторичной очистки, инактивация формальдегидом, разбавление и упаковка.
Известно решение (US6245532) в котором противогриппозная мультивалентная вакцина приготавливается с использованием ДНК-технологии. Полученная вакцина представляет собой поливалентную, предпочтительно трехвалентную вакцину против гриппа, основанную на смеси рекомбинантных антигенов гемагглютинина, клонированных из вирусов гриппа, имеющих эпидемический потенциал. Рекомбинантные антигены гемагглютинина представляют собой полноразмерные нерасщепленные (НА0) гликопротеины, продуцируемые бакуловирусами в качестве векторов экспрессии в клетках насекомых и очищенные в неденатурирующих условиях.
Указанные решения, в общем, имеют существенные недостатки.
- производство классической вакцины занимает около 6 месяцев, поэтому ежегодно вакцина против гриппа производится в условиях большого дефицита времени, требуя своевременного предоставления вакцинных штаммов вирусов из ВОЗ производителям.
- живые вакцины содержат ослабленный вирус гриппа, что потенциально снижает их безопасность по сравнению с другими типами вакцин;
- гемагглютинины, представленные в виде рекомбинантного белка, обладают достаточно низкой иммуногенностью, что снижает их эффективность и влечет необходимость в добавке адъювантов, которые часто вызывают местную реактогенность;
- применение куриных эмбрионов при выращивании повышает нежелательный аллергогенный потенциал препаратов;
- формальдегид, применяемый для инактивации вируса, требует соблюдения мер безопасности и несколько повреждает белки, что сказывается на антигенных свойствах препаратов;
- в составе существующих противогриппозных вакцин не предусмотрено включение антигенов нового коронавируса SARS-CoV-2;
- традиционные подходы для производства вакцин подразумевают выращивание в куриных эмбрионах в случае гриппа, или культуре клеток в случае коронавируса, и совмещение данных методов в одном технологическим процессе для производства комплексной вакцины представляет большую сложность.
В настоящее время разработаны более современные подходы к производству вакцин против респираторных инфекций, основанные на биотехнологиях, одним из которых является платформа на основе аденовирусных векторов. Научно-технической проблемой является отсутствие вакцины против гриппа типа А, гриппа типа В и COVID-19, вызываемых эпидемически актуальными оболочечными одноцепочечными РНК-вирусами, такими как гриппа А субтипа H1, гриппа А субтипа Н3, гриппа В линии Ямагата, гриппа В линии Виктория, Sars-Cov-2, которая вызывает напряженный иммунитет одновременно ко всем перечисленным возбудителям.
Таким образом, в области техники существует необходимость в разработке новых вакцин для одновременной профилактики респираторных болезней, таких как грипп типа А и грипп типа В, а также COVID-19.
Раскрытие изобретения
Технической задачей изобретения является создание вакцины, индуцирующей напряженный иммунитет против респираторных инфекций, таких как грипп типа А, грипп типа В, а также COVID-19.
Технический результат заключается в создании эффективной и безопасной векторной вакцины против респираторных инфекций, созданной на основе аденовирусных векторов 5 серотипа, несущих гены антигенов 5 эпидемически актуальных оболочечных одноцепочечных РНК вирусов: гриппа А субтипа H1, гриппа А субтипа Н3, гриппа В линии Ямагата, гриппа В линии Виктория, Sars-Cov-2, способной создать напряженный иммунитет к каждому из этих вирусов одновременно.
Указанный результат достигается за счет создания вакцины против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19, содержащей смесь следующих аденовирусных векторов на основе аденовируса человека 5 серотипа с делециями в областях Е1 и Е3 генома, при этом аденовирусный вектор несет экспрессионную кассету со вставкой целевого гена, выбранного из списка: ген, имеющий последовательность с идентичностью более 92% с SEQ ID NO: 1, ген, имеющий последовательность с идентичностью более 89% с SEQ ID NO: 2, ген, имеющий последовательность с идентичностью более 84% с SEQ ID NO: 3, ген, имеющий последовательность с идентичностью более 84% с SEQ ID NO: 4, ген, имеющий последовательность с идентичностью более 99% SEQ ID NO: 5, а также содержит фармацевтически приемлемый буферный раствор.
Кроме того, авторами настоящего изобретения отмечено, что экспрессия некоторых трансгенов может влиять на состояние клеточной культуры и количественный выход векторных частиц. Для решения данной проблемы предлагается использование индуцибельного промотора, активность которого подавляется при выращивании урожая аденовирусных векторов.
Таким образом, в одном из вариантов решения экспрессионная кассета находится в месте делеции E1-области аденовирусного генома, имеет индуцибельный промотор, целевой ген, сигнал полиаденилирования, а в месте делеции E3-области аденовирусного генома имеет промотор, ген - продукт которого активирует индуцибельный промотор, сигнал полиаденилирования.
В другом предложенном варианте в аденовирусном векторе экспрессионная кассета в месте делеции E1-области аденовируса может иметь конститутивный промотор, целевой ген, сигнал полиаденилирования.
Также в частном варианте исполнения вакцины целевой ген в составе экспрессионной кассеты представлен SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.
8
9
Вакцина может содержать на дозу смесь аденовирусных векторов, в суммарном количестве от 10 до 10 БОЕ, а также фармацевтически приемлемый буферный раствор – до 0,5 мл. Кроме того, фармацевтически приемлемый буферный раствор может быть добавленным до 1,0 мл на дозу. В частности, в качестве фармацевтически приемлемого буферного раствора может использоваться буферная система, включающая 10 мМ-50 мМ TrisHCl, 50 мМ до - 80 мМ NaCl, 0,5-1,5 мМ MgCl2, 3%-5% сахарозы, 0,01% до 0,1% полисорбат- 80, 0,1-1% этанола, 30мкМ – 200 мкМ ЭДТА, вода – остальное, рН 7,0-8.0.
Наконец, в частном варианте исполнения вакцины аденовирусные векторы находятся в смеси, каждый в эффективном количестве для создания напряженного иммунитета к вирусам: гриппа А субтипа H1, гриппа А субтипа Н3, гриппа В линии Ямагата, гриппа В линии Виктория, Sars-Cov-2.
Также настоящее изобретение относится к применению созданной по изобретению вакцины для индукции иммунитета против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19, при этом в одном из вариантов решения вакцина может вводится интраназально, в другом предложенном авторами настоящего изобретения варианте вакцина может вводится одновременно интраназально и внутримышечно (комбинированным способом).
Предлагаемый авторами настоящего изобретения способ введения вакцины, заключающийся в одновременном введении субъекту вакцины интраназально и внутримышечно в эффективных количествах, позволяет быстро индуцировать напряженный иммунитет к гриппу типа А, гриппу типа B и COVID-19 одновременно в верхних и нижних дыхательных путях. Комбинированный способ введения (одновременно интраназально и внутримышечного), в рамках описанного изобретения обозначает введение вакцины за одну процедуру вакцинации в разные места – в носовую полость и область тела пригодную для внутримышечного введения, при этом для каждой области введения медицинские изделия применяются одноразово (например, шприц с иглой для внутримышечного введения и другой шприц с распылительной насадкой или глазная пипетка - для интраназального).
В связи со сложившейся пандемической ситуацией по COVID-19, очевидна необходимость в разработке новых многокомпонентных иммунобиологических средств для ежегодных вакцинаций против вирусных респираторных инфекций, упрощающих индивидуальный план вакцинации и не растягивающий его во времени. Такие вакцины экономически оправданы, так как снижают затраты медперсонала на сами препараты и на процедуру вакцинации, в том числе временные. Применение многокомпонентных вакцин уменьшает количество необходимых инъекций с точки зрения травматичности и безопасности для пациента, особенно перспективно при этом интраназальное введение. Однако создание эффективных и безопасных многокомпонентных вакцин является сложной научно-практической проблемой. Таким образом, в связи с отсутствием в данное время подобных вакцин для использования населению, предлагаемое авторами изобретение имеет актуальность.
Преимуществом созданной авторами вакцины является возможность создания напряженного иммунитета одновременно против респираторных инфекций, таких как грипп типа А и грипп типа В, а также COVID-19, Вакцина содержит 5 аденовирусных векторов, несущих ген антигена оболочечного одноцепочечного РНК-вируса, выбранного из списка эпидемически актуальных вирусов: гриппа А субтипа H1, гриппа А субтипа Н3, гриппа В линии Ямагата, гриппа В линии Виктория, Sars-Cov-2. Разработка аденовирусного вектора со вставкой нового гена антигена актуального штамма вируса занимает не более одного месяца. При этом не требуется живой вирус, а только нуклеотидная последовательность целевого антигена. Все созданные аденовирусные векторы могут выпускаться на одной производственной площадке, путем одного технологического процесса. Вакцина может вводиться малотравматичным и нетрудоемким интраназальным способом для предотвращения заражения, или, для одновременной быстрой индукции иммунитета к респираторным инфекциям в верхних и нижних дыхательных путях, осуществляется комбинированным интраназально-внутримышечным способом, что позволяет не только предотвратить репликацию вируса в воротах инфекции, но и дополнительно защитить субъекта от тяжелых форм заболевания.
Описание фигур
На фиг. 1 представлены схемы экспрессионных кассет созданных аденовирусных векторов.
1А. В геноме аденовирусного вектора Ad5-GeneReg, где:
Ψ
1 - Часть генома аденовируса,  – сигнал упаковки аденовируса;
2 - Индуцибельный промотор;
3 - Целевой ген;
4 - Сигнал полиаденилирования;
5 - Сайт после рекомбинации с плазмидойpAdeno-full;
6 - Промотор для гена;
7 - Инвертированные повторы аденовируса;
8 - Ген, продукт которого активирует индуцибельный промотор;
9 - Экспрессионная кассета на месте E1 области аденовируса;
10 - Экспрессионная кассета на месте E3 области аденовируса.
1Б. В геноме аденовирусного вектора Ad5-CMV, где:
Ψ
1 - Часть генома аденовируса,  - сигнал упаковки аденовируса;
2 - Конститутивный промотор, например CMV;
3 - Целевой ген;
4 - Сигнал полиаденилирования;
5 - Экспрессионная кассета на месте E1 области аденовируса.
На фиг. 2 представлены результаты оценки эффективности компонентавакцины, содержащего Ad5 - СМV - H1s20/21 или Ad5 - GeneReg - H1s20/21, выявленные с помощью ИФА по уровням антител к вирусу гриппа А/California/04/2009 (H1N1) в сыворотках крови мышей на 28 сутки после иммунизации.
Ось ординат - титр антител, log2;
Ось абсцисс - группы иммунизированных животных:
1 - Ad5 - СМV - H1s20/21;
2 - Ad5 - GeneReg - H1s20/21;
3 - буферный раствор.
●, , - значения по каждому животному;
▬ - среднее по группе;
* - уровень антител, достоверно отличный от контрольной группы (p<0,05).
На фиг. 3 представлены результаты оценки эффективности компонента вакцины, содержащегоAd5 – СМV - H3s20/21 или Ad5 – GeneReg - H3s20/21, выявленные с помощью ИФА по уровням антител к вирусу гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2) в сыворотках крови мышей на 28 сутки после иммунизации.
Ось ординат - титр антител, log2;
Ось абсцисс - группы иммунизированных животных:
1 - Ad5 – СМV - H3s20/21;
2 - Ad5 – GeneReg - H3s20/21;
3 - буферный раствор.
●, , - значения по каждому животному;
▬ - среднее по группе;
* - уровень антител, достоверно отличный от контрольной группы (p<0,05).
На фиг. 4 представлены результаты оценки эффективности компонента вакцины, содержащегоAd5 – CMV - B/Colorado, или Ad5 – GeneReg - B/Colorado, или Ad5 – CMV - B/Massachusetts, или Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts, выявленные с помощью ИФА по уровням антител к вирусу гриппа B/Phuket/37/13 в сыворотках крови мышей на 28 сутки после иммунизации.
Ось ординат – титр антител, log2;
Ось абсцисс – группы иммунизированных животных:
1 – Ad5 – CMV - B/Colorado;
2 - Ad5 – CMV - B/Massachusetts;
3 – Ad5 – GeneReg - B/Colorado;
4 - Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts;
5 – буферный раствор.
●, , - значения по каждому животному;
▬ - среднее по группе;
* - уровень антител, достоверно отличный от контрольной группы (p<0,05).
На фиг. 5 представлены результаты оценки эффективности компонента вакцины, содержащегоAd5 - CMV - B/Colorado, или Ad5 – GeneReg - B/Colorado, или Ad5 – CMV - B/Massachusetts, или Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts, выявленные с помощью ИФА по уровням антител к вирусу гриппа B/Victoria/2/87 в сыворотках крови мышей на 28 сутки после иммунизации.
Ось ординат – титр антител, log2;
Ось абсцисс – группы иммунизированных животных:
1 – Ad5 – CMV - B/Colorado;
2 - Ad5 – CMV - B/Massachusetts;
3 – Ad5 – GeneReg - B/Colorado;
4 - Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts;
5 – буферный раствор (контроль).
●, , - значения по каждому животному;
▬ - среднее по группе;
* - уровень антител, достоверно отличный от контрольной группы (p<0,05).
На фиг. 6 представлены результаты оценки эффективности иммунизации компонентомвакцины, содержащимAd5 – CMV – S или Ad5 – GeneReg – S, по уровню антител к рецептор-связывающему домену S-белка коронавируса SARS-CoV-2 в сыворотках крови иммунизированных мышей, выявленного с помощью метода ИФА.
Ось ординат – титр антител, log2;
Ось абсцисс – группы иммунизированных животных:
1 – Ad5 – CMV – S;
2 - Ad5 – GeneReg – S;
3 – буферный раствор (контроль).
●, , - значения по каждому животному;
▬ - среднее по группе;
* - уровень антител, достоверно отличный от контрольной группы (p<0,05).
На фиг.7 представлен результат изучения протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных компонентом вакциныAd5 - СМV - H1s20/21 и Ad5 - GeneReg - H1s20/21, с последующим заражением летальной дозой вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1).
На графиках средние значения по группам иммунизированных животных обозначены:
♦ - Ad5 - СМV - H1s20/21
 - Ad5 - GeneReg - H1s20/21
 - буферный раствор
50
7А. Выживаемость мышей, зараженных летальной дозой (15LD) вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1).
Ось ординат – % выживших животных.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
50
7Б. Изменение веса мышей, зараженных летальной дозой (15LD) вируса гриппа штамма A/California/07/2009(H1N1).
Ось ординат – изменение веса животных в %.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
На фиг.8 представлен результат изучения протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных компонентом вакциныAd5 – СМV - H3s20/21 и Ad5 – GeneReg - H3s20/21, с последующим заражением летальной дозой вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2).
На графиках средние значения по группам иммунизированных животных обозначены:
♦ - Ad5 – СМV - H3s20/21
 - Ad5 – GeneReg - H3s20/21
 - буферный раствор
50
8А. Выживаемость мышей, зараженных летальной дозой (15LD) вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2).
Ось ординат – % выживших животных.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
50
8Б. Изменение веса мышей, зараженных летальной дозой (15LD) вируса гриппа штамма А/Aichi/2/1968 (H3N2).
Ось ординат – изменение веса животных в %.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
На фиг.9 представлены результаты анализа протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных компонентом вакцины с содержанием Ad5 – СМV - B/Colorado, или Ad5 – GeneReg - B/Colorado, или Ad5 – СМV - B/Massachusetts, или Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts, с последующим заражением сублетальной дозой вируса гриппа B/Victoria/2/87.
50
На фигуре столбиками отображены средние значения титров вируса гриппа (в lgЭИД/мл) в легких иммунизированных мышей,через 3 и 6 дней после заражения вирусом гриппаB/Victoria/2/87.
50
Ось ординат - титр вируса гриппа, lgЭИД/мл;
Ось абсцисс – сутки.
Группы иммунизированных мышей:
1. Ad5 – СМV - B/Colorado;
2. Ad5 – GeneReg - B/Colorado;
3. Ad5 – СМV - B/Massachusetts;
4. Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts.
5. буферныйраствор
* -
статистически достоверное отличие от контрольной группы на 3 или 6 день после заражения (p<0,05).
На фиг. 10 представлены результаты анализа протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных компонентом вакцины с содержанием Ad5 – СМV - B/Colorado, или Ad5 – GeneReg - B/Colorado, или Ad5 – СМV - B/Massachusetts, или Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts, с последующим заражением сублетальной дозой вируса гриппа B/Phuket/37/13.
50
На фигуре столбиками отображены средние значения титров вируса гриппа (в lgЭИД/мл) в легких иммунизированных мышей,через 3 и 6 дней после заражения вирусом гриппаB/Phuket/37/13.
50
Ось ординат - титр вируса гриппа, lgЭИД/мл;
Ось абсцисс – сутки.
Группы иммунизированных мышей:
1. Ad5 – СМV - B/Colorado;
2. Ad5 – GeneReg - B/Colorado;
3. Ad5 – СМV - B/Massachusetts;
4. Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts.
5. буферный раствор (контроль)
* -
статистически достоверное отличие от контрольной группы на 3 или 6 день после заражения (p<0,05).
На фиг. 11 представлены результаты оценки эффективности иммунизации компонентом вакцины, содержащим Ad5–CMV–S или Ad5 – GeneReg – S, по уровню вирус-нейтрализующих антител к коронавирусу SARS-CoV-2 в сыворотках крови иммунизированных мышей, выявленный в реакции ИФА с рецептор-связывающим доменом (RBD) S-белка коронавируса SARS-CoV-2.
2
Ось ординат – титр антител, log;
Ось абсцисс – группы иммунизированных животных:
1 – Ad5 – CMV – S;
2 - Ad5 – GeneReg – S;
3 – буферный раствор (контроль).
●, , - значения по каждому животному;
▬ - среднее по группе;
* - уровень антител, достоверно отличный от контрольной группы (p<0,05).
7
8
На фиг. 12 представлены результаты анализа протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных вакциной, содержащей смесь 5 аденовирусных векторов, при интраназальном способе введения, в дозах 10 БОЕ/животное каждого вектора и 10 БОЕ/животное каждого вектора, с последующим заражением летальной дозой вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1).
На графиках средние значения по группам иммунизированных животных обозначены:
7
♦ - доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора
8
 - доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора
 - буферный раствор (контроль).
50
12А. Выживаемость мышей, зараженных летальной дозой (15LD) вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1).
Ось ординат – % выживших животных.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
50
12Б. Изменение веса мышей, зараженных летальной дозой (15LD) вируса гриппа штамма A/California/07/2009(H1N1).
Ось ординат – изменение веса животных в %.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
Различия между выживаемостью в группах иммунизированных мышей и контрольной группой являются статистически достоверными (p<0,05).
7
8
На фиг. 13 представлены результаты анализа протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных вакциной, содержащей смесь 5 аденовирусных векторов, при интраназальном способе введения, в дозах 10 БОЕ/животное каждого вектора и 10 БОЕ/животное каждого вектора, с последующим заражением летальной дозой вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2).
На графиках средние значения по группам иммунизированных животных обозначены:
7
♦ - доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора
8
 - доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора
 - буферный раствор (контроль).
50
13А. Выживаемость мышей, зараженных летальной дозой (15LD) вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2).
Ось ординат – % выживших животных.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
50
13Б. Изменение веса мышей, зараженных летальной дозой (15LD) вируса гриппа штамма А/Aichi/2/1968 (H3N2).
Ось ординат – изменение веса животных в %.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
Различия между выживаемостью в группах иммунизированных мышей и контрольной группой являются статистически достоверными (p<0,05).
7
8
На фиг. 14 представлены результаты анализа протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных вакциной, содержащей смесь 5 аденовирусных векторов, при интраназальном способе введения, в дозах 10 БОЕ/животное каждого вектора и 10 БОЕ/животное каждого вектора, с последующим заражением сублетальной дозой вируса гриппа B/Victoria/2/87.
50
На фигуре столбиками отображены средние значения титров вируса гриппа (в lgЭИД/мл) в легких иммунизированных мышей, через 3 и 6 дней после заражения вирусом гриппаB/Victoria/2/87.
50
Ось ординат - титр вируса гриппа, lgЭИД/мл;
Ось абсцисс – сутки.
Группы иммунизированных мышей:
7
1. доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора;
8
2. доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора;
3. буферный раствор (контроль).
* -
статистически достоверное отличие от контрольной группы на 3 или 6 день после заражения (p<0,05).
7
8
На фиг. 15 представлены результаты анализа протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных вакциной, содержащей смесь 5 аденовирусных векторов, при интраназальном способе введения, в дозах 10 БОЕ/животное каждого вектора и 10 БОЕ/животное каждого вектора, с последующим заражением сублетальной дозой вируса гриппа B/Phuket/37/13.
50
На фигуре столбиками отображены средние значения титров вируса гриппа (в lgЭИД/мл) в легких иммунизированных мышей, через 3 и 6 дней после заражения вирусом гриппаB/Phuket/37/13.
50
Ось ординат - титр вируса гриппа, lgЭИД/мл;
Ось абсцисс – сутки.
Группы иммунизированных мышей:
7
1. доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора;
8
2. доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора;
3. буферный раствор (контроль).
* -
статистически достоверное отличие от контрольной группы на 3 или 6 день после заражения (p<0,05).
7
8
На фиг. 16 представлены результаты оценки эффективности иммунизации вакциной, содержащей смесь из 5 аденовирусных векторов, при интраназальном способе введения в дозах 10 БОЕ/животное каждого или 10 БОЕ/животное каждого, выявленные по уровню вирус-нейтрализующих антител к коронавирусу SARS-CoV-2 в сыворотках крови иммунизированных мышей с помощью реакции ИФА с рецептор-связывающим доменом S-белка коронавируса SARS-CoV-2.
На графике средние значения по группам иммунизированных животных обозначены:
7
● - доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора;
8
 - доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора;
 - буферный раствор (контроль).
* - уровень антител, достоверно отличный от контрольной группы (p<0,05).
7
8
На фиг. 17 представлены результаты анализа протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных вакциной, содержащей смесь 5 аденовирусных векторов, при комбинированном интраназально-внутримышечном способе введения, в дозах 10 БОЕ/животное каждого вектора и 10 БОЕ/животное каждого вектора, с последующим заражением летальной дозой вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1).
На графиках средние значения по группам иммунизированных животных обозначены:
7
♦ - доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора
8
 - доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора
 - буферный раствор (контроль).
50
17А. Выживаемость мышей, зараженных летальной дозой (15LD) вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1).
Ось ординат – % выживших животных.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
50
17Б. Изменение веса мышей, зараженных летальной дозой (15LD) вируса гриппа штамма A/California/07/2009(H1N1).
Ось ординат – изменение веса животных в %.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
Различия между выживаемостью в группах иммунизированных мышей и контрольной группой являются статистически достоверными (p<0,05).
7
8
На фиг. 18 представлены результаты анализа протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных вакциной, содержащей смесь 5 аденовирусных векторов, при комбинированном интраназально-внутримышечном способе введения, в дозах 10 БОЕ/животное каждого вектора и 10 БОЕ/животное каждого вектора, с последующим заражением летальной дозой вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2).
На графиках средние значения по группам иммунизированных животных обозначены:
7
♦ - доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора
8
 - доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора
 - буферный раствор (контроль).
50
18А. Выживаемость мышей, зараженных летальной дозой (15LD) вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2).
Ось ординат – % выживших животных.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
50
18Б. Изменение веса мышей, зараженных летальной дозой (15LD) вируса гриппа штамма А/Aichi/2/1968 (H3N2).
Ось ординат – изменение веса животных в %.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
Различия между выживаемостью в группах иммунизированных мышей и контрольной группой являются статистически достоверными (p<0,05).
7
8
На фиг. 19 представлены результаты анализа протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных вакциной, содержащей смесь 5 аденовирусных векторов, при комбинированном интраназально-внутримышечном способе введения, в дозах 10 БОЕ/животное каждого вектора и 10 БОЕ/животное каждого вектора, с последующим заражением сублетальной дозой вируса гриппа B/Victoria/2/87.
50
На фигуре столбиками отображены средние значения титров вируса гриппа (в lgЭИД/мл) в легких иммунизированных мышей, через 3 и 6 дней после заражения вирусом гриппа B/Victoria/2/87.
50
Ось ординат - титр вируса гриппа, lgЭИД/мл;
Ось абсцисс – сутки.
Группы иммунизированных мышей:
7
1. доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора;
8
2. доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора;
3. буферный раствор (контроль).
* -
статистически достоверное отличие от контрольной группы на 3 или 6 день после заражения (p<0,05).
7
8
На фиг. 20 представлены результаты анализа протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных вакциной, содержащей смесь 5 аденовирусных векторов, при комбинированном интраназально-внутримышечном способе введения, в дозах 10 БОЕ/животное каждого вектора или 10 БОЕ/животное каждого вектора, с последующим заражением сублетальной дозой вируса гриппа B/Phuket/37/13.
50
На фигуре столбиками отображены средние значения титров вируса гриппа (в lgЭИД/мл) в легких иммунизированных мышей, через 3 и 6 дней после заражения вирусом гриппаB/Phuket/37/13.
50
Ось ординат - титр вируса гриппа, lgЭИД/мл;
Ось абсцисс – сутки.
Группы иммунизированных мышей:
7
1. доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора;
8
2. доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора;
3. буферный раствор (контроль).
* -
статистически достоверное отличие от контрольной группы на 3 или 6 день после заражения (p<0,05).
7
8
На фиг. 21 представлены результаты оценки эффективности иммунизации вакциной, содержащей смесь из 5 аденовирусных векторов, при комбинированном интраназально-внутримышечном способе введения в дозах 10 БОЕ/животное каждого или 10 БОЕ/животное каждого, выявленные по уровню вирус-нейтрализующих антител к коронавирусу SARS-CoV-2 в сыворотках крови иммунизированных мышей с помощью реакции ИФА с рецептор-связывающим доменом S-белка коронавируса SARS-CoV-2.
На графике средние значения по группам иммунизированных животных обозначены:
7
● - доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора;
8
 - доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора;
 - буферный раствор (контроль).
* - уровень антител, достоверно отличный от контрольной группы (p<0,05).
7
8
На фиг. 22 представлены результаты анализа протективности иммунного ответа мышей, иммунизированных вакциной, содержащей смесь 5 аденовирусных векторов, один из которых содержит идентичный на 88% целевой ген (Ad5 – GeneReg - H3s14/15) при интраназальном способе введения, в дозах 10 БОЕ/животное каждого вектора и 10 БОЕ/животное каждого вектора, с последующим заражением летальной дозой вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2).
На графиках средние значения по группам иммунизированных животных обозначены:
7
♦ - доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора
8
 - доза вакцины 10БОЕ/животное каждого вектора
 - буферный раствор (контроль).
50
22А. Выживаемость мышей, зараженных летальной дозой (15LD) вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2).
Ось ординат – % выживших животных.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
50
22Б. Изменение веса мышей, зараженных летальной дозой (15LD) вируса гриппа штамма А/Aichi/2/1968 (H3N2).
Ось ординат – изменение веса животных в %.
Ось абсцисс - дни с момента заражения.
Различия между выживаемостью в группах иммунизированных мышей и контрольной группой являются статистически достоверными (p<0,05).
Реализация изобретение
Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами, но при этом не ограничивают его объем.
Пример 1.
Получение аденовирусных векторов на основе аденовируса человека 5 серотипа, несущих экспрессионные кассеты с целевыми генами.
Первым этапом конструирования аденовирусных векторов являлся подбор генетических последовательностей целевых трансгенов. В общедоступных базах данных были подобраны нуклеотидные последовательности гемагглютининов вирусов гриппа А субтипов H1, Н3 и вирусов гриппа В, линий Ямагата и Виктория, ген S-белка нового коронавируса Sars-Cov-2, которые применены в качестве примера реализации данного изобретения и не ограничивает его использование в отношении других эпидемически актуальных штаммов вируса гриппа и коронавируса при сезонной смене состава вакцины. Для таких вариантных штаммов вирусов авторами настоящего изобретения предусмотрена возможность внесения нуклеотидных замен в целевые гены аденовирусных конструкций, при соблюдении указанных процентов идентичности по отношению к исходному гомологичному гену.
Таким образом, под используемыми в патенте понятиями «список эпидемически актуальных штаммов», «эпидемически актуальные штаммы» следует понимать конкретные вирусы гриппа и коронавируса, необходимые для включения в состав вакцины в качестве антигенов в зависимости от изменений эпидемической ситуации и рекомендаций ВОЗ.
В ходе работ были подобраны гены гемагглютининов штаммов вируса гриппа, эпидемически актуальных для сезона 2020-2021:
- ген гемагглютинина вируса A/Hawaii/70/2019 (H1N1)pdm09, номер в NCBI GenBank - MN819680,
- ген гемагглютинина вируса гриппа A/HongKong/45/2019 (H3N2), номер в Gisaid - EPI1691930,
- ген гемагглютинина вируса гриппа B (B/Colorado/06/2017, линияVictoria), номер в NCBI GenBank: CY236607.1,
- ген гемагглютинина вируса гриппа B (B/Massachusetts/02/12, линияYamagata), номер в NCBI GenBank: KC892118.1.
- ген поверхностного гликопротеина S нового коронавируса SARS-CoV-2, (номер в базе данных GisAid EPI_ISL_601443).
Нуклеотидные последовательности указанных генов были оптимизированы для экспрессии в клетках млекопитающих и в таком виде синтезированы в ЗАО Евроген (Россия). Нуклеотидные последовательности представлены в Перечне последовательностей, как SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.
Идентичная последовательность гомологичных генов в составе созданных аденовирусных векторов при внесении нуклеотидных замен характеризуется процентом идентичности с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5.
На втором этапе конструирование аденовирусных векторов со вставкой трансгена проводили с использованием стандартных генно-инженерных методик. Для создания вариантов высокопродуктивного аденовирусного вектора было учтено, что экспрессия некоторых трансгенов может влиять на состояние клеточной культуры и количественный выход векторных частиц. Одним из способов решения данной проблемы является использование индуцибельного промотора, активность которого подавлена при выращивании урожая аденовирусных векторов. Предлагаемая авторами система позволила клонировать ген интереса под контроль индуцибельного промотора, чья активность зависит от наличия свободных молекул тетрациклина (доксициклина). Для этого плазмиду pAdenoT-shuttle, в которую был клонирован целевой транген, далее котрансфецировали в клетках линии HEK293с плазмидой pAdeno-full, содержащей геном аденовируса с делецией E1 и E3 областей.
Плазмида pAdenoT-shuttle содержит экспрессионную кассету с индуцибельным промотором, сайтом полиаденилирования и единичными сайтами узнавания рестриктаз для быстрой замены одного гена на другой, например, в случае смены рекомендованного ВОЗ вакцинного штамма гриппа.
В плазмиде pAdeno-full в делетированной E3 области вставлена экспрессионная кассета с геном, продукт которого запускает транскрипцию с индуцибельного промотора в отсутствии тетрациклина (доксициклина). Также в этой плазмиде имеется кассета с геном рекомбиназы, которая обеспечивает рекомбинацию между плазмидами pAdenoT-shuttle и pAdeno-full в клетках линии HEK293, в результате чего образовался геном аденовирусного вектора, способный к упаковке в аденовирусные белки и перезаражению клеток линии HEK293. Схема экспрессионной кассеты с индуцибельным промотором в составе сконструированного аденовирусного вектора Adeno-GeneReg представлена на фигуре 1А. Получены аденовирусные векторы:
1) Ad5 - GeneReg - H1s20/21;
2) Ad5 – GeneReg - H3s20/21;
3) Ad5 – GeneReg - B/Colorado;
4) Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts;
5) Ad5 – GeneReg – S.
Получение аденовирусного вектора Ad5-CMV с нерегулируемым промотором, например, Ad5-CMV-H1s20/21 происходит по следующей схеме. В плазмиде pAdeno-CMV, содержащей полный геном аденовируса человека 5-го серотипа с делециями E1 и E3 областей, по сайтам уникальных рестриктаз происходит замена целевого гена (№3 на схеме на фигуре 1Б), на ген гемагглютинина гриппа А H1s20/21. Плазмида наращивается в бактериальных клетках, после чего по сайтам уникальных рестриктаз удаляется бактериальная часть плазмиды с образованием генома аденовирусного вектора Ad5-CMV-H1s20/21. Cхема экспрессионной кассеты аденовирусного вектора Ad5-CMV представлена на фигуре 1Б.Далее ДНК аденовирусного вектора трансфецируют клетки линии HEK293 c получением инфекционных частиц аденовирусного вектора.
В результате работ были получены:
1) Ad5 - СМV - H1s20/21;
2) Ad5 – СМV - H3s20/21;
3) Ad5 – СМV -B/Colorado;
4) Ad5 – СМV - B/Massachusetts;
5) Ad5 – СМV – S.
Таким образом, в клетках линии HEK293 путем рекомбинации между двумя плазмидами, был получен аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, с делецией E1 и E3 областей генома, с целевым геном, выбранным из списка SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, находящимся под контролем индуцибельного или конститутивного промотора.
Пример 2.
Получение монокомпонентов вакцины и вакцины, содержащей смесь 5 аденовирусных векторов на основе аденовируса человека 5 серотипа, с делецией E1 и E3 областей аденовирусного генома, экспрессирующих целевой антиген оболочечного одноцепочечного РНК-вируса, вфармацевтически приемлемом буферном растворе.
Содержание аденовирусных векторов измеряется в единицах активности (БОЕ, бляшкобразующие единицы), которые при необходимости могут быть выражены в количестве вирусных частиц, соотносящихся к единицам активности в диапазоне от 1:100 до 1:500 вирусных частиц.
Для производства вакцины, содержащей аденовирусные векторы, полученные в примере 1, использовали культуру клеток почки эмбриона человека НЕК 293, адаптированную для роста в суспензии.
8
9
Клеточную суспензию линии НЕК293, полученную в примере 1, трансфецированную аденовирусным вектором на основе аденовируса человека 5 серотипа, с делецией E1 и E3 областей генома, с целевым геном, в титре от 10 до 10 БОЕ/мл, использовали для наращивания с целью приготовления вакцины с эффективным количеством аденовирусных векторов.
7
8
8
Для наработки вакцины с содержанием аденовирусных векторов по изобретению, волновой биореактор с 4500,0 мл суспензии пермиссивной клеточной культуры 293HEKзасевали клеточной суспензией объемом 500,0 мл, содержащей аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, с делецией E1 и E3 областей генома, с целевым геном, имеющей титр 5×10-10БОЕ/мл. Для наращивания аденовирусного вектора Ad5 –GeneReg и достижения титра 2×10БОЕ/мл, проводили культивирование в течение 48 часов в присутствие доксициклина. Выращивание аденовирусного вектора Ad5-CMV проводили без доксициклина. Затем клеточную массу очищали с помощью общеизвестных методов ультрафильтрации и высокоэффективной жидкостной хроматографии в несколько этапов.
Для стерилизации полученный монополупродукт фильтровали через систему фильтров с размером пор 0,22 мкМ и разбавляли стерильным фармацевтически приемлемым буферным раствором, сохраняющим стабильность аденовирусных векторов, например, буферная система, включающая 10 мМ-50 мМ TrisHCl, 50 мМ до - 80 мМ NaCl, 0,5-1,5 мМ MgCl2, 3%-5% сахарозы, 0,01% до 0,1% полисорбат- 80, 0,1-1% этанола, 30 мкМ – 200 мкМ ЭДТА, вода – остальное, рН 7,0-8.0, с получением монокомпонента вакцины, содержащего на дозу:
8
9
- аденовирусный вектор – от 10 до 10БОЕ;
- фармацевтически приемлемый буферный раствор–до 0,5-1,0 мл.
На данном этапе работы, в качестве примера по изобретению, но не ограничивающие его, были произведены нижеследующие компоненты вакцины, которые содержат один тип аденовирусного вектора, несущего экспрессионную кассету с целевым геном, в фармацевтически приемлемом буферном растворе:
8
9
1). Компонент вакцины, содержащий аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующий гемагглютинин вируса гриппа А субтипа H1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, в количестве от 10 до 10 БОЕ (Ad5 - GeneReg - H1s20/21);
8
9
2). Компонент вакцины, содержащий аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующий гемагглютинином вируса гриппа А субтипа H3, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, в количестве от 10 до 10 БОЕ (Ad5 – GeneReg - H3s20/21);
8
9
3). Компонент вакцины, содержащий аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующий гемагглютинином вируса гриппа В линии Ямагата, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3, в количестве от 10 до 10 БОЕ (Ad5 – GeneReg - B/Colorado);
8
9
4). Компонент вакцины, содержащий аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующий гемагглютинином вируса гриппа В викторианской линии, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4, в количестве от 10 до 10 БОЕ (Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts);
8
9
5). Компонент вакцины, содержащий аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующий ген S-белка вируса SARS-CoV-2 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5, в количестве от 10 до 10 БОЕ (Ad5 – GeneReg – S).
8
9
6). Компонент вакцины, содержащий аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующий гемагглютинин вируса гриппа А субтипа H1, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1, в количестве от 10 до 10 БОЕ (Ad5 - CMV - H1s20/21);
8
9
7). Компонент вакцины, содержащий аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующий гемагглютинином вируса гриппа А субтипа H3, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 2, в количестве от 10 до 10 БОЕ (Ad5 – CMV - H3s20/21);
8
9
8). Компонент вакцины, содержащий аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующий гемагглютинином вируса гриппа В линии Ямагата, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3, в количестве от 10 до 10 БОЕ (Ad5 – CMV - B/Colorado);
8
9
9). Компонент вакцины, содержащий аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующий гемагглютинином вируса гриппа В викторианской линии, с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 4, в количестве от 10 до 10 БОЕ (Ad5 – CMV - B/Massachusetts);
8
9
10). Компонент вакцины, содержащий аденовирусный вектор на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующий ген S-белка вируса SARS-CoV-2 с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5, в количестве от 10 до 10 БОЕ (Ad5 – CMV – S).
Для получения вакцины, содержащей смесь 5аденовирусных векторов, несущих экспрессионные кассеты с различными целевыми трансгенами, монокомпоненты, полученные на конечной стадии производства, описанного в данном примере выше, смешивают в условиях стерильности и доводят стерильным фармацевтически приемлемым буферным раствором до требуемой эффективной концентрации, в фармацевтически приемлемом буферном растворе. Авторами в качестве примера, были получены следующие варианты вакцины, содержащие смесь 5аденовирусных векторов:
11). Вакцина, содержащая в фармацевтически приемлемом буферном растворе смесь 5 типов аденовирусных векторов на основе аденовируса человека 5 серотипа, с генами находящимися под контролем индуцибельного промотора:
1) Ad5 - GeneReg - H1s20/21;
2) Ad5 – GeneReg - H3s20/21;
3) Ad5 – GeneReg - B/Colorado;
4) Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts;
5) Ad5 – GeneReg – S;
8
9
в суммарном количестве от 10 до 10 БОЕ.
12). Вакцина, содержащая в фармацевтически приемлемом буферном растворе смесь 5 типов аденовирусных векторов на основе аденовируса человека 5 серотипа, с генами находящимися под контролем конститутивного промотора:
1) Ad5 - CMV - H1s20/21;
2) Ad5 – CMV - H3s20/21;
3) Ad5 – CMV - B/Colorado;
4) Ad5 – CMV - B/Massachusetts;
5) Ad5 – CMV – S;
8
9
в суммарном количестве от 10 до 10 БОЕ.
Таким образом, в ходе работ были получены варианты компонентов вакцины, содержащих один тип аденовирусного вектора или вариантывакцины, содержащей смесь 5 аденовирусных векторов на основе аденовируса человека 5 серотипа, с делецией E1 и E3 областей генома, со вставкой целевого гена выбранного из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, в фармацевтически приемлемом буферном растворе. При этом целевой ген в экспрессионной кассете аденовирусного вектора может находится под контролем индуцибельного промотора или конститутивного промотора.
Пример 3.
Определение эффективности компонента вакцины, содержащей в своем составе один аденовирусный вектор, путем оценки гуморального иммунного ответа.
С помощью иммуноферментного анализа (ИФА) была оценена иммуногенность компонентов вакцины, полученных в примере 2, содержащих один аденовирусный вектор, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа А, или гемагглютинина вируса гриппа В, или коронавируса SARS-CoV-2. Таким образом, лабораторные мыши линии Balb/c были иммунизированы компонентами вакцины, содержащими:
1) Ad5 - GeneReg - H1s20/21;
2) Ad5 – GeneReg - H3s20/21;
3) Ad5 – GeneReg - B/Colorado;
4) Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts;
5) Ad5 – GeneReg – S.
6) Ad5 - СМV - H1s20/21;
7) Ad5 – СМV - H3s20/21;
8) Ad5 – СМV -B/Colorado;
9) Ad5 – СМV - B/Massachusetts;
10) Ad5 – СМV – S.
8
Вводимая доза содержала аденовирусного вектора 10БОЕ/мышь. Введение осуществлялось однократно интраназально. В качестве контрольной группы была использована группа мышей, получавшая буферный раствор. На 28 день после иммунизации у животных отбирались сыворотки крови и в них определялись титры антител к антигенам вируса гриппа с помощью ИФА. В качестве антигенов были использованы:
- вируса гриппа А/California/04/2009 (H1N1), нарощенный в куриных эмбрионах и очищенный в градиенте сахарозы;
- вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2), нарощенный в куриных эмбрионах и очищенный в градиенте сахарозы;
- вирус гриппа B/Phuket/37/13, нарощенный в куриных эмбрионах и очищенный в градиенте сахарозы;
- вирус гриппа B/Victoria/2/87, нарощенный в куриных эмбрионах и очищенный в градиенте сахарозы.
- рекомбинантный рецептор-связывающий домен S-белка коронавируса SARS-CoV-2, полученный в культуре клеток яичника сирийского хомячка CHO и очищенный с помощью хроматографии.
Концентрацию антигена для определения уровня IgG в исследуемых образцах определяли способом «шахматного титрования».
2
4
Для этого 96-луночный высокосвязывающий, плоскодонный планшет сенсибилизировали антигеном (концентрация антигена для вирусов гриппа А и В составли 5-100 мкг/мл, концентрация рекомбинантного рецептор-связывающего домена S-белка коронавируса составила 100 нг/лунка) в 20 мМ калиево-фосфатном буфере, рН 8,0. Сенсибилизацию проводили на +4 °С в течение 12 часов. По окончании сенсибилизации планшет отмывали от несвязавшегося антигена рабочим буфером (20 мМ калиево-фосфатном буфере, рН 8,0 с 0,05% Твин 20). Далее в лунки планшета вносили двукратные разведения исследуемых образцов в рабочем буфере. По окончании инкубации (1 час при +37 °С на шейкере) планшет отмывали и вносили антитела к мышиным IgG, конъюгированные с пероксидазой, в разведении 1:10000 в рабочем буфере. После окончания инкубации планшет отмывали и для проявления реакции использовали TMB-индикаторную смесь. Далее реакцию останавливали 4М HSO и оптическую плотность окрашенного продукта определяли при длине волны 450 нм.
Статистическую обработку полученных данных проводили в программе GraphPad Prism с помощью двухстороннего t-критерия Стьюдента.
Полученные результаты представлены на фигурах 2, 3, 4 и 5, 6.
По результатам оценки эффективности компонента вакцины содержащего Ad5 - СМV - H1s20/21 или Ad5 - GeneReg - H1s20/21, выявленные с помощью ИФА по уровням антител к вирусу гриппа А/California/04/2009 (H1N1) в сыворотках крови мышей на 28 сутки после иммунизации, было показано, уровни антител в опытных группах были достоверно выше титров антител контрольной группы (p<0,05). Результаты оценки эффективности компонента вакцины, содержащего Ad5 – СМV - H3s20/21 или Ad5 – GeneReg - H3s20/21, выявленные с помощью ИФА по уровням антител к вирусу гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2), также показали достоверное повышение титров антител в опытных группах мышей по сравнению с контрольными(p<0,05).
Результаты оценки эффективности компонента вакцины, содержащего Ad5 – CMV - B/Colorado, или Ad5 – GeneReg - B/Colorado, или Ad5 – CMV - B/Massachusetts, или Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts, выявленные с помощью ИФА по уровням антител к вирусу гриппа B/Phuket/37/13 в сыворотках крови мышей на 28 сутки после иммунизации, были достоверно выше титров антител контрольной группы(p<0,05).Также наблюдались достоверное повышение уровней антител к вирусу гриппа B/Victoria/2/87 у опытных групп мышей от контрольных(p<0,05).
Уровень антител к рецептор-связывающему домену S-белка коронавируса SARS-CoV-2 в сыворотках крови иммунизированных Ad5 – СМV – Sи Ad5 – GeneReg – Sмышей, так же достоверно повышался по сравнениюс контрольной группой (p<0,05).
Из представленных данных следует, что все разработанные варианты компонентов вакцины, содержащей в своем составе один аденовирусный вектор, несущий ген антигена оболочечного одноцепочечного РНК-вируса, выбранный из SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, находящийся под контролем индуцибельного промотора или конститутивного промотора, показали свою эффективность, так как вызывали гуморальный иммунный ответ.
Пример 4.
Определение эффективности компонента вакцины, содержащего один аденовирусный вектор, путем оценки защитных (протективных) свойств.
Были оценены протективные свойства компонентов вакцины, полученных в примере 2, содержащих один аденовирусный вектор, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа А (по выживаемости и динамике веса), или гемагглютинина вируса гриппа В (по вирусовыделению из легких), или коронавируса SARS-CoV-2 (по уровню вирус-нейтрализующих антител).
Таким образом, лабораторные мыши линии Balb/c были иммунизированы компонентами вакцинами, содержащими:
1) Ad5 - GeneReg - H1s20/21;
2) Ad5 – GeneReg - H3s20/21;
3) Ad5 – GeneReg - B/Colorado;
4) Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts;
5) Ad5 – GeneReg – S.
6) Ad5 - СМV - H1s20/21;
7) Ad5 – СМV - H3s20/21;
8) Ad5 – СМV -B/Colorado;
9) Ad5 – СМV - B/Massachusetts;
10) Ad5 – СМV – S.
8
50
Лабораторные мыши линии Balb/c были иммунизированы компонентом вакцины, содержащим аденовирусный вектор, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа в дозе 10 БОЕ/мышь. В качестве контрольной группы была использована группа мышей, получавшая буферный раствор. На 28 день после иммунизации животные были заражены 15ЛД следующих вирусов гриппа:
- вируса гриппа А/California/04/2009 (H1N1);
- вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2);
- вирус гриппа B/Phuket/37/13;
- вирус гриппа B/Victoria/2/87.
У животных, иммунизированных компонентом вакцины, содержащим аденовирусные векторы, несущие ген S-белка коронавируса SARS-CoV-2, были отобраны сыворотки и оценен уровень антител к рецептор-связывающему домену (RBD) S-белка коронавируса SARS-CoV-2.
Из научных источников известно, что выявление методом ИФА антител, направленных на RBD, убедительно коррелирует с нейтрализацией SARS-CoV-2(Peterhoff D. et al. A highly specific and sensitive serological assay detects SARS-CoV-2 antibody levels in COVID-19 patients that correlate with neutralization // Infection.- volume 49 - pages75–82(2021; doi:10.1007/s15010-020-01503-7). Поэтому в тексте патента, обнаруженные антитела к рецептор-связывающему домену (RBD) S-белка коронавируса SARS-CoV-2 именуются вирус-нейтрализующими и несут соответствующий смысл по осуществлению защиты от вируса SARS-CoV-2.
Статистическую обработку полученных данных проводили в программе Graph Pad Prism. Оценку титров вирус-нейтрализующих антител проводили с помощью двухстороннего t-критерия Стьюдента. Для оценки статистической разницы в кривых выживаемости опытной и контрольной группы был использован критерий Гехана-Берслоу-Вилкоксона.
Результаты проведенного исследования представлены на фиг. 7, 8, 9, 10, 11.
По результатам проведенного эксперимента показано, что различия между выживаемостью мышей после заражения вирусами гриппа А во всех опытных группах, которым вводили компонент вакцины, содержащий аденовирусный вектор со вставкой гена гемагглютинина вируса А и контрольной группой, которой вводили буферный раствор, являются статистически достоверными (p<0,05), выживаемость составляла 100% и при этом животные из опытных групп не теряли в весе (что свидетельствует об отсутствии заболевания). После заражения сублетальными дозами вируса гриппа В уровень вируса гриппа В в легких мышей из опытных групп к 6-му дню снижался, что указывает на наличие протективных свойств у разработанных составов вакцины, содержащих аденовирусный вектор со вставкой гена гемагглютинина вируса В. Уровень вирус-нейтрализующих антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных вакциной, содержащая аденовирусный вектор со вставкой гена S-белка коронавируса SARS-CoV-2, в опытных группах был достоверно отличный от контрольной группы (p<0,05).
Таким образом, все разработанные составы компонентов векторной вакцины, содержащее один аденовирусный вектор, несущий ген антигена оболочечного одноцепочечного РНК вируса, показали наличие защитных (протективных) свойств в отношении соответствующих специфических возбудителей.
Пример 5.
Определение эффективности векторной вакцины, содержащей смесь из 5 аденовирусных векторов, путем оценки ее протективных свойств против респираторных инфекций, вызываемых эпидемически актуальными оболочечными одноцепочечными РНК вирусами (вирусами гриппа типа А и гриппа типа B, а также Sars-СоV-2).
Была оценена протективность при интраназальном введении вакцины, содержащей смесь 5 аденовирусных векторов, созданной в примере 2, в состав которой входили следующие аденовирусные векторы:
1) Ad5 - GeneReg - H1s20/21;
2) Ad5 – GeneReg - H3s20/21;
3) Ad5 – GeneReg - B/Colorado;
4) Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts;
5) Ad5-GeneReg-S.
8
9
Аденовирусные векторы входили в состав вакцины либо в концентрации 2×10 БОЕ/мл препарата, либо в концентрации 2×10 БОЕ/мл препарата.
7
8
50
Для оценки защитных свойств вакцины, лабораторные мыши линии Balb/c были иммунизированы вакциной, включающей смесь 5 аденовирусных векторов в дозах 10 БОЕ каждого вектора на животное или 10 БОЕ каждого вектора на животное. В качестве контрольной группы была использована группа мышей, получавшая буферный раствор. Введение осуществлялось интраназально. На 28 день после иммунизации животные были заражены 15ЛД следующих вирусов гриппа:
- вируса гриппа А/California/04/2009 (H1N1);
- вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2);
- вирус гриппа B/Phuket/37/13;
- вирус гриппа B/Victoria/2/87.
После заражения вирусом гриппа у животных в течение 14 дней оценивались выживаемость и проявления клинических симптомов заболевания (падение веса). У животных, зараженные вирусами гриппа B/Phuket/37/13 и B/Victoria/2/87, оценку протективного действия иммунизации проводили по уровню вируса гриппа В в легких на 3 и 6 дни после заражения вирусом гриппа. Титры вируса гриппа определяли путем проведения высевов в куриных эмбрионах.
У животных, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами, несущими ген S-белка коронавируса SARS-CoV-2, были отобраны сыворотки и был оценен уровень антител к коронавирусу SARS-CoV-2 в реакции ИФА с рецептор-связывающим доменом (RBD) S-белка коронавируса SARS-CoV-2.
Статистическую обработку полученных данных проводили в программе Graph Pad Prism с помощью критерия Гехана-Берслоу-Вилкоксона и с помощью двухстороннего t-критерия Стьюдента. Данные представлены на фиг. 12- 16.
7
8
7
8
8
По результатам проведенного эксперимента показано, что вакцина, содержащая смесь 5 аденовирусных векторов, несущих вставки гена гемагглютинина вирусов гриппа А и В, а также гена S-белка коронавируса SARS-CoV-2, при введении интраназальным способом, обладает защитными свойствами в отношении специфических возбудителей респираторных болезней, при введении мышам как в дозе 10 БОЕ/животное каждого вектора, так и 10 БОЕ/животное каждого вектора. Различия между выживаемостью после заражения вирусами гриппа А в группах иммунизированных мышей и контрольной группой являлись статистически достоверными (p<0,05). При этом меньшая доза 10 БОЕ/животное каждого вектора показала выживаемость против вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) - 80%, против вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2) – 70%, животные из опытных групп сначала немного теряли в весе, к концу опыта восстанавливали. При иммунизации дозой 10 БОЕ/животное каждого вектора показала выживаемость против вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) - 100%, против вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2) – 100%, животные из опытных групп не теряли в весе. После заражения сублетальными дозами вируса гриппа В уровень вирусов гриппа В B/Phuket/37/13 и B/Victoria/2/87 в легких мышей из опытных групп к 6-му дню снижался, при этом наблюдался дозозависимый эффект, большее снижение вирусной нагрузки в легких вызывала доза вакцины, содержащая 10 БОЕ/животное каждого вектора. Уровень вирус-нейтрализующих антител в сыворотках крови мышей, к рецептор-связывающему домену S-белка коронавируса SARS-CoV-2, в опытных группах был достоверно выше, чем в контрольной группе (p<0,05).
Таким образом, у созданной по изобретению вакцины, содержащей смесь из 5 аденовирусных векторов, введенной интраназальным способом, было показано наличие защитных (протективных) свойств против заболевания респираторными инфекциями, вызываемыми вызываемых эпидемически актуальными оболочечными одноцепочечными РНК вирусами (вирусами гриппа типа А и типа В, а также Sars-СоV-2).
Пример 6.
Определение эффективности векторной вакцины, содержащей смесь из 5 аденовирусных векторов, путем оценки ее протективных свойств против респираторных инфекций, вызываемых эпидемически актуальными оболочечными одноцепочечными РНК вирусами (вирусами гриппа и Sars-СоV-2), при комбинированном способе введения (одновременно интраназально и внутримышечно).
Целью исследования была оценка протективных (защитных) свойств вакцины содержащей смесь из 5 аденовирусных векторов, введенной комбинированным интраназально-внутримышечным способом, в состав которой входили следующие аденовирусные векторы:
1) Ad5 - GeneReg - H1s20/21;
2) Ad5 – GeneReg - H3s20/21;
3) Ad5 – GeneReg - B/Colorado;
4) Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts;
5) Ad5-GeneReg-S.
8
9
Вирусы входили в состав вакцины либо в концентрации 2×10 БОЕ/мл препарата, либо в концентрации 2×10 БОЕ/мл препарата.
7
8
50
Для оценки защитных свойств вакцины, лабораторные мыши линии Balb/c были иммунизированы вакциной, включающей смесь нескольких аденовирусных векторов в дозах 10 БОЕ каждого вектора на животное или 10 БОЕ каждого вектора на животное. В качестве контрольной группы была использована группа мышей, получавшая буферный раствор. Комбинированный способ введения заключался в том, что вакцина вводилась одновременно внутримышечно (1/2 дозы) и интраназально (1/2 дозы). На 28 день после иммунизации животные были заражены 15ЛД следующих вирусов гриппа:
- вируса гриппа А/California/04/2009 (H1N1);
- вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2);
- вирус гриппа B/Phuket/37/13;
- вирус гриппа B/Victoria/2/87.
После заражения вирусом гриппа у животных в течение 14 дней оценивались выживаемость и проявления клинических симптомов заболевания (падение веса). У животных, зараженные вирусами гриппа B/Phuket/37/13 и B/Victoria/2/87, оценку протективного действия иммунизации проводили по уровню вируса гриппа Вв легких на 3 и 6 дни после заражения вирусом гриппа. Титры вируса гриппа определяли путем проведения высевов в куриных эмбрионах.
У животных, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами, несущими ген S-белка коронавируса SARS-CoV-2, были отобраны сыворотки и был оценен уровень антител к коронавирусу SARS-CoV-2 в реакции ИФА с рецептор-связывающим доменом (RBD) S-белка коронавируса SARS-CoV-2.
Статистическую обработку полученных данных проводили в программе GraphPad Prism с помощью критерия Гехана-Берслоу-Вилкоксона. Данные представлены на фиг. 17-21.
7
8
7
8
По результатам проведенного эксперимента показано, что вакцина, содержащая смесь 5 аденовирусных векторов, несущих вставки гена гемагглютинина вирусов гриппа Аи В, а также гена S-белка коронавируса SARS-CoV-2, при введении комбинированным назально-внутримышечным способом, обладает защитными свойствами в отношении специфических возбудителей респираторных болезней, при введении мышам как в дозе 10БОЕ/животное каждого вектора, так и 10 БОЕ/животное каждого вектора. Различия между выживаемостью после заражения вирусами гриппа А в группах иммунизированных мышей и контрольной группой являлись статистически достоверными (p<0,05). При этом меньшая доза 10 БОЕ/животное каждого вектора показала выживаемость против вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) - 100%, против вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2) – 100%, животные из опытных групп не теряли в весе. При иммунизации дозой 10 БОЕ/животное каждого вектора показала выживаемость против вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) - 100%, против вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2) – 100%, животные из опытных групп не теряли в весе. После заражения сублетальными дозами вируса гриппа В уровень вирусов гриппа В B/Phuket/37/13 и B/Victoria/2/87 в легких мышей из опытных групп к 6-му дню значительно снижался для обеих доз. Уровень вирус-нейтрализующих антител в сыворотках крови мышей, к рецептор-связывающему домену S-белка коронавируса SARS-CoV-2, в обеих опытных группах был достоверно выше, чем в контрольной группе (p<0,05).
Таким образом, у созданной по изобретению вакцины, включающей смесь из 5 аденовирусных векторов, введенной комбинированным способом (одновременно интраназально и внутримышечно), было показано наличие защитных (протективных) свойств против заболевания респираторными инфекциями, вызываемыми вызываемых эпидемически актуальными оболочечными одноцепочечными РНК вирусами (вирусами гриппа типа А и типа В, а также Sars-СоV-2).
Пример 7.
Обоснование комбинированного способа введения (одновременно интраназально и внутримышечно).
Комбинированный способ введения (одновременно интраназально и внутримышечно), в рамках описанного изобретения обозначает введение вакцины за одну процедуру вакцинации в разные места – в носовую полость и область тела пригодную для внутримышечного введения, при этом для каждой области введения медицинские изделия применяются одноразово (например, шприц с иглой для внутримышечного введения и другой шприц с распылительной насадкой или глазная пипетка - для интраназального). При этом введение в разные области тела, осуществляемое за одну процедуру вакцинации означает, по сути, последовательное введение иммунологически эффективного количества одной дозы двумя частями, проводимое с небольшим интервалом времени, необходимым для подготовки второй части инъекции. При этом предпочтительным вариантом выбора последовательности введения является сначала внутримышечное, затем интраназальное, однако это не отменяет возможности сначала интраназального введения и сразу после этого внутримышечного.
Интраназальный и внутримышечный способы введения вакцин, осуществляемые по отдельности, в случае респираторных инфекций обладают рядом недостатков, так как не позволяют достичь достаточного по напряженности иммунитета одновременно в верхних и нижних дыхательных путях. Вводимые парентерально респираторные вакцины обеспечивают системный иммунитет, предотвращая виремию и развитие клинической симптоматики, однако только ограниченно защищают от вирусной репликации и выделения в дыхательных путях (BleierB.S, RamanathanM.Jr., LaneA.P.COVID-19 vaccines may not prevent nasal SARS-CoV-2 infection and asymptomatic transmission //Otolaryngol Head Neck Surg. 2021 Feb;164(2):305-307. doi: 10.1177/0194599820982633.). Интраназальная вакцинация защищает от репликации вируса в верхних дыхательных путях, что снижает вероятность распространения возбудителя инфекции в нижние дыхательные пути, а также прерывает передачу от человека к человеку.(Hou Y.J. et al. SARS-CoV-2 reverse genetics reveals a variable infection gradient in the respiratory tract // Cell. 2020 Jul 23;182(2):429-446.e14. doi: 10.1016/j.cell.2020.05.042.; Richard, M., van den Brand, J.M.A., Bestebroer, T.M. et al. Influenza A viruses are transmitted via the air from the nasal respiratory epithelium of ferrets. NatCommun 11, 766 (2020).https://doi.org/10.1038/s41467-020-14626-0). Однако интраназальная иммунизация вызывает слабый системный иммунный ответ, который в случае возникновения заболевания в нижнем отделе респираторного тракта, вероятно, не позволит защитить от переболевания. Кроме того, известны случаи сниженного иммунного ответа на интраназальные вакцины у людей с удаленными аденоидами и миндалинами, так как они являются первичным местом индукции секреторной иммунной системы (Ogra PL. Effect of tonsil ectomy and adenoid ectomy on nasopharyngeal antibody response to poliovirus. N Engl J Med. 1971 Jan 14;284(2):59-64. doi: 10.1056/NEJM197101142840201. PMID: 4321186.;Shikina T, et al. IgA class switch occurs in the organized nasopharynx- and gut-associated lymphoid tissue, but not in the diffuse lamina propria of airways and gut. J Immunol. 2004 May 15;172(10):6259-64. doi: 10.4049/j immunol.172.10.6259.).
7
Таким образом, предлагаемый авторами изобретения способ введения вакцины, заключающийся в одновременном введении субъекту вакцины интраназально и внутримышечно в эффективных количествах, позволяет быстро индуцировать иммунитет к респираторным инфекциям в верхних и нижних дыхательных путях, вызываемым оболочечными одноцепочечными РНК-вирусами, что подтверждалось результатами проведенных экспериментов. Влияние комбинированного интраназально - внутримышечного способа введения на усиление протективных свойств вакцины было выявлено при иммунизации вакциной, содержащей смесь 5 аденовирусных векторов в наименьшей дозе, составляющей 10 БОЕ/животное. При интраназальном способе введения не наблюдался полный защитный эффект после заражения мышей специфическими возбудителями (фиг. 12-16), однако при введении аналогичной дозы комбинированным интраназально-внутримышечным способом, протективный эффект увеличивался (фиг. 17-21). Сравнение полученных эффектов отражено в таблице 1.
Таблица 1. Сравнение протективных свойств вакцины, содержащей смесь 5 аденовирусных векторов, при введении мышам интраназальным или комбинированным (интраназально-внутримышечным) способами
Сравниваемый показатель
Способ введения
Интраназальный
Комбинированный интраназально-внутримышечный
Выживаемость и динамика изменения веса мышей при заражении летальной дозой вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1)
80%теряли в весе
100%прибавляли в весе
Выживаемость и динамика изменения веса мышей при заражении летальной дозой вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2)
70%теряли в весе
100%прибавляли в весе
Вирусовыделение из легких при заражении сублетальной дозой вируса гриппа B/Victoria/2/87,на 6 сутки,средние значения lgЭИД50/мл
1,616
0,233
Вирусовыделение из легких при заражении вирусом гриппа B/Phuket/37/13, на 6 сутки,средние значения lgЭИД50/мл
1,699
0,549
Титр антител в сыворотке крови к коронавирусу SARS-CoV-2, средние значения,log<sub>2</sub>
2,454
3,104
Таким образом, данные таблицы 1 свидетельствуют об усилении иммунного ответа в верхних и нижних отделах респираторного тракта после применения комбинированного интраназально-внутримышечного способа введения, что выражалось в отсутствии летальности и прибавке в весе мышей после заражения летальными дозами вирусов гриппа А, значительном снижении вирусовыделения из легких после заражения сублетальными дозами вирусов гриппа В, и повышению титров антител к рецептор-связывающему домену S-белка коронавируса SARS-CoV-2.
Комбинированный интраназально-внутримышечный способ введения позволяет добиться одновременной быстрой индукции иммунитета к респираторным инфекциям, вызываемым оболочечными одноцепочечными РНК-вирусами (вирусами гриппа типа A, гриппа типа В, и Sars-СоV-2), в верхних и нижних дыхательных путях.
Пример 8.
Показана возможность внесения идентичных замен целевых генов аденовирусных векторов с определением вариаций процента идентичности, выявленные по сохранению протективной активности вакцины.
Известно, что при циркуляции вирусов в популяции человека систематически появляются мутации в генах гемагглютининов вирусов гриппа и генах S-белка коронавирусов, что может повлечь за собой снижение эффективности существующей вакцины. Поэтому авторами настоящего изобретения экспериментально проверена возможность внесения определенного количества нуклеотидных замен в нуклеотидные последовательности целевых генов в составе аденовирусных векторов для сохранения протективных свойств вакцины к новым вирусным вариантам.
При проведении опытов по изучению протективной активности (защитных свойств) вакцины было замечено, что нуклеотидные последовательности антигенов использованных вирусов-пробойников не на 100% совпадают с гомологичными им последовательностями входящими в состав аденовирусных векторов в качестве целевых генов, однако это не влияло на эффективность вакцины. Данные анализа представлены в таблице 2.
Таблица 2. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов, входящих в состав экспрессирующей кассеты аденовирусных векторов и гомологичных им генам в составе геномов вирусов, использованных для определения протективных свойств вакцины
Номер нуклеотидной последовательности гена в составе экспрессирующей кассеты аденовирусного вектора
Номер нуклеотидной последовательности гена антигена вируса, использованного для определения протективных свойств вакцины
% гомологии (сходства) нуклеотидных последовательностей
SEQ ID NO: 1
Гемагглютинин вируса гриппа A/California/04/2009 (H1N1)№ EPI_ISL_29618
74,60
SEQ ID NO: 2
Гемагглютинин вируса гриппа A/Aichi/2/1968 (H3N2)№ EPI_ISL_236
77,09
SEQ ID NO: 3
Гемагглютинин вирус гриппаB/Victoria/2/87№ EPI_ISL_95
75,16
SEQ ID NO: 4
Гемагглютинин вируса гриппаB/Phuket/3073/2013№ EPI_ISL_166958
80,74
SEQ ID NO: 5
S-белок коронавируса SARS-CoV-2№ EPI_ISL_402124
72,34
Таким образом, авторы предположили возможность внесения нуклеотидных замен в целевые гены аденовирусных векторов для получения гомологов с определенным процентом идентичности при сохранении эффективности вакцины. Для подтверждения этого в аденовирусном векторе Ad5 – GeneReg - H3s20/21 нуклеотидная последовательность SEQ ID NO: 2 была заменена на идентичную ей на 89 % нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 6, являющуюся кодоноптимизированной нуклеотидной последовательностью гемагглютинина штамма гриппа А субтипа Н3 (A/Norway/466/2014, GISAID ID: EPI543729), с получением аденовирусного вектора Ad5 – GeneReg - H3s15/16.
Для демонстрации наличия протективных свойств вакцины к вирусу гриппа типа А субтипа Н3 после замены целевого гена (гемагглютинина вируса гриппа типа А субтипа Н3) в составе аденовирусного гена на идентичный гомолог, иммунизированных животных заражали вирусом гриппа A/Aichi/2/1968 (H3N2) № EPI_ISL_236, использовавшимся в предыдущих примерах.
Таким образом, исследуемая вакцина, в целом созданная как описано в примере 2, содержала смесь 5 аденовирусных векторов (вектор, несущий SEQ ID NO: 1; вектор, несущий последовательность на 89% идентичную SEQ ID NO: 2; вектор, несущий SEQ ID NO: 3; вектор, несущий SEQ ID NO: 4; вектор, несущий SEQ ID NO: 5):
1) Ad5 - GeneReg - H1s20/21 (с SEQ ID NO: 1);
2) Ad5 – GeneReg - H3s15/16 (с 89% идентичностью с SEQ ID NO: 2);
3) Ad5 – GeneReg - B/Colorado (с SEQ ID NO: 3);
4) Ad5 – GeneReg - B/Massachusetts (с SEQ ID NO: 4);
5) Ad5-GeneReg-S (SEQ ID NO: 5).
8
9
Аденовирусные векторы входили в состав вакцины либо в концентрации 2×10 БОЕ/мл препарата, либо в концентрации 2×10 БОЕ/мл препарата.
7
8
50
Для оценки защитных свойств вакцины, лабораторные мыши линии Balb/c были иммунизированы вакциной, включающей смесь 5 аденовирусных векторов в дозах 10 БОЕ каждого вектора на животное или 10 БОЕ каждого вектора на животное. В качестве контрольной группы была использована группа мышей, получавшая буферный раствор. Введение осуществлялось интраназально. На 28 день после иммунизации животные были заражены 15ЛД вируса гриппа вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2).
После заражения вирусом гриппа у животных в течение 14 дней оценивались выживаемость и проявления клинических симптомов заболевания (падение веса).
Статистическую обработку полученных данных проводили в программе GraphPad Prism с помощью критерия Гехана-Берслоу-Вилкоксона и с помощью двухстороннего t-критерия Стьюдента. Данные представлены на фигуре 22.
7
8
7
8
По результатам проведенного эксперимента показано, что вакцина, содержащая смесь 5 аденовирусных векторов, один из которых несет идентичную первоначальному варианту на 89% нуклеотидную последовательность целевого гена (Ad5 – GeneReg - H3s14/15) при введении интраназальным способом мышам, как в дозе 10 БОЕ/животное каждого вектора, так и 10 БОЕ/животное каждого вектора, сохраняет защитные свойства в отношении вируса гриппа А субтипа Н3. Различия между выживаемостью после заражения вирусом гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2) в группах иммунизированных мышей и контрольной группой являлись статистически достоверными (p<0,05). При этом меньшая доза 10 БОЕ/животное каждого вектора показала выживаемость против вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2) – 80%, животные из опытных групп сначала немного теряли в весе, к концу опыта восстанавливали его. При иммунизации дозой 10 БОЕ/животное каждого вектора показала выживаемость против вируса гриппа А/Aichi/2/1968 (H3N2) – 100%, животные из опытных групп не теряли в весе.
Очевидно, что варианты замен в нуклеотидной последовательности целевого гена с еще большим процентом идентичности нуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 от показанного в примере, также не будут влиять на эффективность вакцины.
Также в рамках настоящего изобретения определены проценты идентичности гомологов следующих целевых генов аденовирусных векторов: ген, имеющий последовательность с идентичностью более 92% с SEQ ID NO: 1, ген, имеющий последовательность с идентичностью более 84% с SEQ ID NO: 3, ген, имеющий последовательность с идентичностью более 84% с SEQ ID NO: 4, ген, имеющий последовательность с идентичностью более 99% SEQ ID NO: 5, при этом защитные свойства вакцины сохранены.
Таким образом, у созданной по настоящему изобретению вакцины показана возможность внесения идентичных замен целевых генов в аденовирусных векторах, в рамках определенных вариаций процентов идентичности, с сохранением протективной активности (защитных свойств) вакцины в отношении гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19.
Пример 9.
Обоснование безопасности вакцины.
7
8
После введения созданной по изобретению вакцины против гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19, интраназальным или интраназально-внутримышечным способами в дозах как 10 БОЕ/животное каждого вектора, так и 10 БОЕ/животное каждого вектора, у лабораторных животных не наблюдалось общих и специфических токсических явлений. Вакцина хорошо переносилась животными.
Таким образом, вакцина, содержащая смесь 5 аденовирусных векторов на основе аденовируса человека 5 серотипа, с делецией E1 и E3 областей аденовирусного генома, экспрессирующих целевой антиген, была безопасной и признана кандидатной вакциной для клинического применения в целях профилактики гриппа типа А, гриппа типа B и COVID-19.
SEQ ID NO: 1
Ген гемагглютинина вируса A/Hawaii/70/2019 (H1N1)pdm09, штамм рекомендован ВОЗ для рекомбинантной вакцины сезона 2020-2021. Нуклеотидная последовательность, оптимизирована для клеток млекопитающих.
ATG
TAA
AAAGCCATCCTGGTGGTGTTGCTGTACACCTTCACCACAGCCAATGCCGACACCTTGTGCATTGGCTACCATGCCAACAACAGCACAGACACCGTGGACACCGTGCTGGAGAAGAACGTCACTGTGACCCACAGCGTGAACCTGCTGGAGGACAAGCACAATGGCAAGCTGTGCAAGCTGAGAGGAGTGGCACCTCTGCACCTTGGCAAGTGCAACATCGCTGGCTGGATCCTGGGCAATCCCGAGTGCGAGAGTCTGAGCACAGCCAGAAGCTGGTCCTACATCGTGGAAACCAGCAACAGTGACAATGGCACCTGCTATCCTGGAGACTTCATCAACTACGAAGAGTTGAGAGAGCAGCTGAGCTCAGTCAGCTCCTTCGAGAGGTTTGAGATCTTCCCCAAGACCTCTAGCTGGCCCAACCATGATAGCGACAAGGGAGTGACAGCTGCCTGTCCCCATGCAGGAGCCAAGAGCTTCTACAAGAACCTGATCTGGCTGGTGAAGAAAGGCAACAGCTATCCCAAGCTGAACCAGACCTACATCAATGACAAAGGCAAGGAGGTGCTTGTCCTGTGGGGCATCCACCATCCACCCACCATTGCAGCCCAGGAGAGCCTGTACCAGAACGCCGATGCCTACGTGTTCGTTGGCACCAGCAGATACTCCAAGAAGTTCAAACCCGAGATTGCCACCAGACCCAAGGTGAGAGATCAAGAGGGCAGGATGAACTACTACTGGACACTTGTGGAACCTGGAGACAAGATCACCTTCGAAGCCACTGGCAACCTCGTGGTTCCCAGATATGCCTTCACCATGGAGAGAGATGCAGGCTCAGGCATCATCATCAGCGACACACCTGTGCACGACTGCAACACTACCTGTCAGACTCCAGAAGGTGCCATCAACACCAGTCTTCCCTTTCAGAACGTGCATCCCATCACCATTGGCAAGTGTCCCAAGTACGTCAAGAGCACCAAGCTCAGACTTGCCACAGGCTTGAGAAACGTTCCCAGCATCCAGTCCAGAGGCTTGTTTGGAGCAATCGCTGGCTTCATCGAAGGTGGCTGGACAGGCATGGTGGACGGCTGGTATGGCTACCACCATCAGAACGAGCAAGGCAGTGGCTATGCTGCAGACCTGAAGAGCACCCAGAATGCCATCGACAAGATCACCAACAAAGTCAACTCCGTGATCGAGAAGATGAACACTCAGTTCACCGCCGTTGGCAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGAGAATCGAGAACCTGAACAAGAAGGTGGACGATGGCTTCCTGGACATCTGGACCTACAATGCCGAGCTGCTGGTGCTTCTGGAGAACGAGAGAACCCTCGACTACCACGACAGCAACGTGAAGAACCTGTACGAGAAGGTGAGGAACCAGCTGAAGAACAATGCCAAGGAGATTGGCAATGGCTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGACAACACCTGCATGGAGAGCGTGAAGAATGGCACCTACGACTATCCCAAGTACTCAGAGGAAGCCAAGCTGAACAGAGAGAAGATTGATGGAGTGAAACTGGAGAGCACCAGGATCTACCAGATCCTTGCCATCTACAGCACAGTTGCCTCTAGCTTGGTTCTCGTGGTCAGTCTGGGAGCCATCAGCTTCTGGATGTGCAGCAATGGCTCCTTGCAGTGCAGAATCTGCATC
SEQ ID NO: 2
Ген гемагглютинина вируса гриппа A/Hong Kong/45/2019 (H3N2), штамм рекомендован ВОЗ для рекомбинантной вакцины сезона 2020-2021. Нуклеотидная последовательность, оптимизирована для клеток млекопитающих.
ATG
TAA
AAGACCATCATTGCCTTGAGCTACATCCTGTGTCTTGGCTTCACCCAGAAGATTCCTGGCAACGACAACAGCACAGCCACCTTGTGCCTTGGCCACCATGCAGTTCCCAATGGCACCATCGTGAAGACCATCACCAACGACAGGATCGAGGTGACCAATGCCACAGAGCTGGTGCAGAACTCCAGCATCGGAGAGATCTGCGACAGTCCCCACCAGATCCTGGACGGAGGCAACTGCACACTGATTGATGCCTTGCTTGGCGATCCACAGTGTGACGGGTTCCAGAACAAGAAGTGGGACCTGTTCGTGGAGAGAAGCAGAGCCTACAGCAACTGCTATCCCTACGACGTTCCTGACTATGCCAGTCTGAGAAGCCTGGTTGCCAGCTCAGGCACCCTGGAGTTCAAGAACGAGAGCTTCAACTGGGCTGGCGTCACTCAGAATGGCAAGAGCTTCAGCTGCATCAGAGGCAGCTCCAGTAGCTTCTTCAGCAGACTCAACTGGTTGACCCACCTGAACTACACCTATCCCGCATTGAACGTGACCATGCCCAACAAGGAGCAGTTCGACAAGCTGTACATCTGGGGCGTGCACCATCCAGGCACAGACAAGGATCAGATCAGTCTGTACGCACAGAGCTCAGGCAGAATCACCGTCAGCACCAAACGGAGTCAACAGGCAGTGATCCCCAACATCGGCAGCAGACCCAGGATCAGAGACATTCCCAGCAGGATCAGCATCTACTGGACCATCGTGAAACCTGGAGACATCCTTCTGATCAACAGCACCGGCAACCTGATTGCTCCCAGAGGCTACTTCAAGATCAGAAGTGGCAAGTCTAGCATCATGAGAAGCGATGCTCCCATTGGCAAGTGCAAGAGCGAGTGCATCACACCCAACGGCAGCATTCCCAACGACAAACCCTTCCAGAACGTGAACAGGATCACCTATGGAGCCTGCCCCAGATACGTGAAGCAGAACACCCTCAAGCTTGCCACTGGCATGAGAAACGTTCCCGAGAAGCAGACCAGAGGGATCTTTGGAGCCATTGCTGGCTTCATCGAGAACGGCTGGGAGGGCATGGTGGATGGATGGTATGGCTTCAGACACCAGAACTCAGAAGGCAGAGGACAGGCTGCAGATCTCAAGAGCACCCAAGCAGCCATCGACCAGATCAATGGCAAGTTGAACAGACTGATTGGCAAGACCAACGAGAAGTTCCACCAGATCGAGAAGGAGTTCAGCGAGGTGGAAGGGAGAGTCCAGGACCTGGAGAAGTACGTGGAAGACACCAAGATCGACCTGTGGTCCTACAATGCCGAGCTGCTGGTGGCTCTGGAGAACCAGCACACCATCGACTTGACCGACAGCGAGATGAACAAGCTCTTCGAGAAGACCAAGAAGCAACTGAGAGAGAATGCAGAGGACATGGGGAACGGCTGCTTCAAGATCTACCACAAGTGTGACAATGCCTGCATTGGCAGCATCAGGAACGAAACCTACGACCACAACGTGTACAGAGATGAAGCCCTGAACAACAGGTTCCAGATCAAAGGAGTGGAGCTGAAGAGTGGCTACAAGGACTGGATCCTGTGGATCAGCTTTGCCATCTCCTGCTTTCTCCTGTGCGTTGCACTGCTTGGCTTCATCATGTGGGCCTGTCAGAAAGGCAACATCAGATGCAACATCTGCATC
SEQ ID NO: 3
Ген гемагглютинина вируса гриппа B (B/Colorado/06/2017, линия Victoria). Нуклеотидная последовательность, оптимизирована для клеток млекопитающих.
ATG
TGA
AAAGCCATCATTGTGTTGCTGATGGTTGTGACCTCTAGTGCTGACAGGATCTGCACAGGCATCACCAGCTCCAACAGTCCTCACGTGGTGAAGACTGCCACACAAGGAGAGGTGAACGTGACAGGAGTGATTCCACTGACCACTACACCCACCAAGAGCCACTTTGCCAACCTGAAAGGCACAGAGACCAGAGGCAAGCTGTGTCCCAAGTGCTTGAACTGCACCGATCTGGACGTTGCACTTGGCAGACCCAAGTGCACCGGCAAGATTCCCAGTGCCAGGGTGAGCATCCTGCACGAGGTGAGACCTGTGACCTCAGGCTGCTTTCCCATCATGCACGACAGGACCAAGATCAGACAGCTTCCCAACCTTCTGAGAGGCTATGAGCATGTGAGACTGAGCACCCACAACGTGATCAATGCTGAAGGTGCACCTGGAGGTCCCTACAAGATTGGCACCTCTGGCAGCTGTCCTAACATCACCAATGGCAATGGGTTCTTTGCTACCATGGCCTGGGCCGTGCCAGACAAGAACAAGACAGCCACCAATCCCTTGACCATCGAGGTTCCCTACGTGTGCACTGAAGGAGAAGATCAGATCACTGTGTGGGGCTTCCACAGCGACAACGAGACCCAGATGGCCAAGCTGTACGGTGACAGCAAGCCTCAGAAGTTCACCAGCTCAGCCAATGGAGTGACCACACACTACGTGAGCCAGATTGGAGGGTTTCCGAACCAGACAGAGGATGGAGGACTTCCACAGAGTGGCAGGATCGTGGTTGACTACATGGTGCAGAAGTCTGGCAAGACTGGCACCATCACCTACCAGAGAGGGATCCTCCTTCCTCAGAAGGTGTGGTGTGCCAGCGGCAGGAGCAAGGTGATCAAAGGCTCCCTTCCTCTGATTGGTGAGGCTGACTGTCTGCACGAGAAGTATGGAGGCTTGAACAAGAGCAAACCCTACTACACAGGAGAGCATGCCAAAGCCATTGGCAACTGTCCCATCTGGGTGAAGACACCACTGAAGCTTGCCAATGGCACCAAGTACAGACCTCCTGCCAAGCTTCTCAAGGAGAGAGGCTTCTTTGGAGCCATTGCAGGGTTCCTGGAAGGTGGCTGGGAAGGGATGATTGCAGGCTGGCATGGCTACACCTCCCATGGTGCTCATGGAGTTGCTGTTGCAGCTGATCTGAAGAGCACCCAGGAAGCCATCAACAAGATCACCAAGAACCTGAACTCTCTGTCTGAACTCGAGGTGAAGAACCTGCAGAGACTGTCAGGAGCCATGGACGAGCTGCACAACGAGATCCTGGAACTGGACGAGAAAGTGGACGATCTGAGAGCCGACACCATCAGTAGCCAGATCGAGCTTGCAGTTCTGCTGAGCAACGAAGGGATCATCAACAGCGAGGATGAGCACTTGCTTGCTCTGGAGAGGAAGCTGAAGAAGATGCTTGGACCCTCAGCCGTGGAGATTGGCAATGGCTGCTTCGAGACCAAGCACAAGTGCAACCAGACCTGTCTGGACAAGATTGCAGCTGGCACCTTTGATGCAGGCGAGTTCTCACTTCCCACCTTCGACTCCCTGAACATCACTGCTGCCTCACTGAACGACGATGGCTTGGACAACCACACCATCCTCCTGTACTACAGCACAGCAGCCAGCAGTCTGGCTGTGACACTGATGATTGCCATCTTCGTTGTGTACATGGTGAGCAGAGACAACGTGAGCTGCTCCATCTGTCTG
SEQ ID NO: 4
Ген гемагглютинина вируса гриппа B (B/Massachusetts/02/12, линия Yamagata). Нуклеотидная последовательность, оптимизирована для клеток млекопитающих.
ATG
TAA
AAGGCCATCATTGTGCTGCTCATGGTTGTGACAAGCAATGCTGACCGGATCTGCACTGGGATCACCTCTTCCAACTCACCTCACGTGGTCAAGACAGCTACTCAAGGAGAGGTGAATGTCACTGGTGTGATTCCACTGACCACAACTCCCACCAAGAGCTACTTCGCCAACCTCAAAGGCACCAAGACTAGAGGGAAACTGTGCCCAGACTGTCTCAACTGCACCGATCTGGACGTGGCCCTTGGCAGGCCTATGTGCGTCGGAACTACACCCAGTGCTAAGGCATCCATCCTGCACGAAGTTAGACCAGTGACCTCTGGGTGCTTCCCTATCATGCATGACAGGACCAAGATTAGGCAGCTTGCCAATCTGTTGAGAGGATATGAGAACATCAGGCTGAGCACTCAGAACGTGATTGACGCAGAAAAGGCTCCAGGTGGACCCTACAGACTTGGAACCTCTGGCTCCTGTCCTAACGCCACTAGCAAGAGTGGCTTCTTTGCCACCATGGCTTGGGCAGTCCCAAAGGACAACAATAAGAATGCTACTAACCCACTGACAGTGGAGGTTCCCTACATCTGTGCTGAAGGAGAGGACCAGATCACCGTCTGGGGATTCCACTCTGATGACAAGACCCAAATGAAGAACCTCTATGGAGACTCCAATCCTCAGAAGTTCACTAGCTCTGCCAATGGAGTGACAACTCACTATGTCTCCCAGATTGGTGGCTTTCCAGATCAAACCGAAGACGGAGGCCTGCCTCAGAGTGGCAGAATCGTCGTGGATTACATGATGCAGAAACCAGGGAAGACCGGAACTATCGTGTACCAAAGAGGTGTCTTGCTGCCTCAGAAGGTGTGGTGTGCCTCTGGCAGGAGCAAGGTGATCAAAGGATCCCTGCCCTTGATTGGTGAGGCAGACTGCCTCCATGAGAAGTACGGTGGATTGAACAAGAGCAAACCTTACTATACAGGTGAACATGCAAAAGCCATTGGCAACTGTCCTATCTGGGTGAAGACTCCACTGAAACTCGCCAATGGGACCAAGTACAGACCACCTGCTAAACTGTTGAAGGAGAGAGGCTTCTTTGGAGCCATTGCTGGGTTCCTCGAGGGAGGCTGGGAAGGAATGATCGCTGGTTGGCACGGCTACACTAGCCACGGAGCTCATGGTGTGGCAGTTGCTGCCGACCTGAAGTCCACCCAAGAAGCCATCAACAAGATTACTAAGAATCTCAACAGCTTGAGTGAGCTGGAAGTCAAGAATCTTCAGAGGCTGTCTGGAGCCATGGATGAGCTCCACAACGAAATCCTGGAGCTTGATGAGAAAGTGGATGACCTCAGAGCTGACACTATATCCTCTCAGATCGAGCTTGCTGTCTTGCTGAGCAACGAAGGAATCATTAACAGTGAGGACGAGCACCTCTTGGCACTGGAGCGGAAACTCAAGAAAATGCTGGGTCCCTCCGCCGTGGACATCGGAAATGGATGCTTTGAAACTAAACACAAGTGCAACCAGACCTGCTTGGACAGGATTGCTGCAGGCACATTCAATGCTGGCGAGTTCTCACTTCCCACTTTTGATTCCTTGAACATCACAGCTGCCAGCTTGAATGACGATGGCCTGGACAACCACACCATTCTGCTCTATTACTCCACTGCTGCCTCTAGCTTGGCTGTGACCCTGATGCTTGCCATCTTCATCGTCTACATGGTGAGCAGAGACAACGTTTCCTGCAGCATCTGTCTG
SEQ ID NO: 5
Ген поверхностного гликопротеина S нового коронавируса SARS-CoV-2. Имеет некоторые мутации по сравнению с исходным штаммом, так называемый «британский» вариант коронавируса: H69del V70del Y144del N501Y A570D P681H T716I S982A D1118H. Номер в базе данных GisAid (EPI_ISL_601443). Нуклеотидная последовательность, оптимизирована для клеток млекопитающих.
ATG
TAA
TTTGTGTTCCTTGTGTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTGAACCTGACCACAAGAACCCAGCTGCCTCCAGCCTACACCAACAGCTTTACCAGAGGCGTGTACTACCCCGACAAGGTGTTCAGATCCAGCGTGCTGCACTCTACCCAGGACCTGTTCCTGCCTTTCTTCAGCAACGTGACCTGGTTCCACGCCATCTCCGGCACCAATGGCACCAAGAGATTCGACAACCCCGTGCTGCCCTTCAACGACGGGGTGTACTTTGCCAGCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGCTGGATCTTCGGCACCACACTGGACAGCAAGACCCAGAGCCTGCTGATCGTGAACAACGCCACCAACGTGGTCATCAAAGTGTGCGAGTTCCAGTTCTGCAACGACCCCTTCCTGGGCGTCTATCACAAGAACAACAAGAGCTGGATGGAAAGCGAGTTCCGGGTGTACAGCAGCGCCAACAACTGCACCTTCGAGTACGTGTCCCAGCCTTTCCTGATGGACCTGGAAGGCAAGCAGGGCAACTTCAAGAACCTGCGCGAGTTCGTGTTCAAGAACATCGACGGCTACTTCAAGATCTACAGCAAGCACACCCCTATCAACCTCGTGCGGGATCTGCCTCAGGGCTTCTCTGCTCTGGAACCCCTGGTGGATCTGCCCATCGGCATCAACATCACCCGGTTTCAGACACTGCTGGCCCTGCACAGAAGCTACCTGACACCTGGCGATAGCAGCAGCGGATGGACAGCTGGTGCCGCCGCTTACTATGTGGGCTACCTGCAGCCTAGAACCTTCCTGCTGAAGTACAACGAGAACGGCACCATCACCGACGCCGTGGATTGTGCTCTGGATCCTCTGAGCGAGACAAAGTGCACCCTGAAGTCCTTCACCGTGGAAAAGGGCATCTACCAGACCAGCAACTTCCGGGTGCAGCCCACCGAATCCATCGTGCGGTTCCCCAATATCACCAATCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAATGCCACCAGATTCGCCTCTGTGTACGCCTGGAACCGGAAGCGGATCAGCAATTGCGTGGCCGACTACTCCGTGCTGTACAACTCCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGTCCCCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACAAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCCGGGGAGATGAAGTGCGGCAGATTGCCCCTGGACAGACAGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGTGTGATTGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACTCCAAAGTCGGCGGCAACTACAATTACCTGTACCGGCTGTTCCGGAAGTCCAATCTGAAGCCCTTCGAGCGGGACATCTCCACCGAGATCTATCAGGCCGGCAGCACCCCTTGTAACGGCGTGGAAGGCTTCAACTGCTACTTCCCACTGCAGTCCTACGGCTTTCAGCCCACATATGGCGTGGGCTATCAGCCCTACAGAGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAACTGCTGCATGCCCCTGCCACAGTGTGCGGCCCTAAGAAAAGCACCAATCTCGTGAAGAACAAATGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCCTGACCGGCACCGGCGTGCTGACAGAGAGCAACAAGAAGTTCCTGCCATTCCAGCAGTTTGGCCGGGATATTGATGATACCACAGACGCCGTACGAGATCCCCAGACACTGGAAATCCTGGACATCACCCCTTGCAGCTTCGGCGGAGTGTCTGTGATCACCCCTGGCACCAACACCAGCAATCAGGTGGCAGTGCTGTACCAGGGTGTGAACTGTACCGAAGTGCCCGTGGCCATTCACGCCGATCAGCTGACACCTACATGGCGGGTGTACTCCACCGGCAGCAATGTGTTTCAGACCAGAGCCGGCTGTCTGATCGGAGCCGAGCACGTGAACAATAGCTACGAGTGCGACATCCCCATCGGCGCTGGCATCTGTGCCAGCTACCAGACACAGACAAACAGCCATAGACGGGCCAGATCTGTGGCCAGCCAGAGCATCATTGCCTACACAATGTCTCTGGGCGCCGAGAACAGCGTGGCCTACTCCAACAACTCTATCGCTATCCCCATAAACTTCACCATCAGCGTGACCACAGAGATCCTGCCTGTGTCCATGACCAAGACCAGCGTGGACTGCACCATGTACATCTGCGGCGATTCCACCGAGTGCTCCAACCTGCTGCTGCAGTACGGCAGCTTCTGCACCCAGCTGAATAGAGCCCTGACAGGGATCGCCGTGGAACAGGACAAGAACACCCAAGAGGTGTTCGCCCAAGTGAAGCAGATCTACAAGACCCCTCCTATCAAGGACTTCGGCGGCTTCAATTTCAGCCAGATTCTGCCCGATCCTAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCTTCATCGAGGACCTGCTGTTCAACAAAGTGACACTGGCCGACGCCGGCTTCATCAAGCAGTATGGCGATTGTCTGGGCGACATTGCCGCCAGGGATCTGATTTGCGCCCAGAAGTTTAACGGACTGACAGTGCTGCCACCACTGCTGACCGATGAGATGATCGCCCAGTACACATCTGCCCTGCTGGCCGGCACAATCACAAGCGGCTGGACATTTGGAGCTGGCGCCGCTCTGCAGATCCCCTTTGCTATGCAGATGGCCTACCGGTTCAACGGCATCGGAGTGACCCAGAATGTGCTGTACGAGAACCAGAAGCTGATCGCCAACCAGTTCAACAGCGCCATCGGCAAGATCCAGGACAGCCTGAGCAGCACAGCAAGCGCCCTGGGAAAGCTGCAGGACGTGGTCAACCAGAATGCCCAGGCACTGAACACCCTGGTCAAGCAGCTGTCCTCCAACTTCGGCGCCATCAGCTCTGTGCTGAACGACATCCTGGCAAGACTGGACAAGGTGGAAGCCGAGGTGCAGATCGACAGACTGATCACCGGAAGGCTGCAGTCCCTGCAGACCTACGTTACCCAGCAGCTGATCAGAGCCGCCGAGATTAGAGCCTCTGCCAATCTGGCCGCCACCAAGATGTCTGAGTGTGTGCTGGGCCAGAGCAAGAGAGTGGACTTTTGCGGCAAGGGCTACCACCTGATGAGCTTCCCTCAGTCTGCCCCTCACGGCGTGGTGTTTCTGCACGTGACATACGTGCCCGCTCAAGAGAAGAATTTCACCACCGCTCCAGCCATCTGCCACGACGGCAAAGCCCACTTTCCTAGAGAAGGCGTGTTCGTGTCCAACGGCACCCATTGGTTCGTGACCCAGCGGAACTTCTACGAGCCCCAGATCATCACCACCCACAACACCTTCGTGTCTGGCAACTGCGACGTCGTGATCGGCATTGTGAACAATACCGTGTACGACCCTCTGCAGCCCGAGCTGGACAGCTTCAAAGAGGAACTGGATAAGTACTTTAAGAACCACACAAGCCCCGACGTGGACCTGGGCGACATCAGCGGAATCAATGCCAGCGTCGTGAACATCCAGAAAGAGATCGACCGGCTGAACGAGGTGGCCAAGAATCTGAACGAGAGCCTGATCGACCTGCAAGAACTGGGGAAGTACGAGCAGTACATCAAGTGGCCCTGGTACATCTGGCTGGGCTTTATCGCCGGACTGATTGCCATCGTGATGGTCACAATCATGCTGTGTTGCATGACCAGCTGCTGTAGCTGCCTGAAGGGCTGTTGTAGCTGTGGCAGCTGCTGCAAGTTCGACGAGGACGATTCTGAGCCCGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACA
SEQ ID NO: 6
Нуклеотидная последовательность A/Norway/466/2014_opt
ATGAAGACTATCATTGCTTTGAGCTACATTCTATGTCTGGTTTTCGCTCAAAAACTTCCTGGAAATGACAACAGCACAGCAACGCTGTGCCTTGGGCACCATGCAGTACCAAACGGAACGATAGTGAAAACAATCACGAATGACCGAATCGAAGTTACCAATGCCACTGAGCTGGTTCAGAACTCCAGCATAGGTGAAATATGCGACAGTCCCCACCAGATCCTGGACGGAGGCAACTGCACACTGATTGATGCTCTATTGGGAGACCCTCAGTGTGACGGGTTCCAGAACAAGAAGTGGGACCTGTTCGTGGAGAGAAGCAAAGCCTACAGCAACTGCTATCCCTACGATGTTCCTGACTATGCCTCCCTTAGGAGCCTGGTTGCCAGCTCAGGCACACTGGAGTTTAACAATGAAAGCTTCAATTGGGCTGGAGTCACTCAGAATGGCACAAGCTCTAGCTGCATAAGGGGAAGCAATAGTAGCTTCTTCAGCAGACTCAATTGGTTGACCCACTTAAACTCCAAATATCCCGCATTGAACGTGACTATGCCAAACAATGAACAATTTGACAAGCTGTACATCTGGGGCGTGCACCATCCAGGCACAGACAAGGATCAGATCTTCCTGTATGCACAGAGCTCAGGCAGAATCACCGTCAGCACCAAACGGAGTCAACAAGCTGTAATCCCCAATATCGGCAGCAGACCCAGGATCAGAGACATTCCCAGCAGGATCAGCATCTACTGGACCATAGTAAAACCTGGAGACATCCTTCTGATCAACAGCACCGGCAACCTGATTGCTCCCAGAGGCTACTTCAAGATCAGAAGTGGGAAGTCTAGCATCATGAGAAGCGATGCTCCCATTGGCAAATGCAAGTCTGAATGCATCACACCCAACGGCAGCATTCCCAACGACAAACCCTTCCAAAATGTAAACAGGATCACCTATGGGGCCTGCCCCAGATACGTTAAGCAGAGCACCCTGAAGCTTGCAACAGGAATGCGAAATGTACCAGAGAGACAAACTAGAGGCATATTTGGAGCCATTGCTGGCTTCATAGAAAATGGTTGGGAGGGAATGGTGGATGGATGGTATGGCTTCAGACACCAGAATTCTGAGGGCAGAGGACAGGCTGCAGATCTCAAGAGCACCCAAGCAGCAATCGATCAAATCAATGGGAAGTTGAACAGACTGATTGGCAAGACCAACGAGAAGTTCCACCAGATCGAGAAGGAATTCAGCGAGGTGGAAGGGAGAATTCAGGACCTGGAGAAGTATGTTGAGGACACCAAGATCGACCTGTGGTCCTACAACGCGGAGCTTCTTGTTGCCCTGGAGAACCAGCACACCATCGACTTGACCGACAGCGAGATGAACAAACTCTTCGAGAAGACCAAGAAGCAACTGAGGGAAAATGCTGAGGATATGGGCAATGGTTGTTTCAAAATATACCACAAATGTGACAATGCCTGCATAGGATCAATCAGAAATGGAACTTATGACCACGATGTATACAGGGATGAAGCATTAAACAACCGGTTCCAGATCAAAGGAGTTGAGCTGAAGAGCGGGTACAAGGATTGGATCCTATGGATTAGCTTTGCCATATCCTGCTTTCTGCTTTGTGTTGCACTGCTGGGGTTCATCATGTGGGCCTGTCAGAAGGGCAACATCAGGTGCAACATTTGCATTTGA