СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГО ПРЕПАРАТА ПАПАИНА И КАРБОКСИМЕТИЛЦЕЛЛЮЛОЗЫ В ВИДЕ ГУСТОГО РАСТВОРА
METHOD FOR OBTAINING HYBRID PREPARATION OF PAPAIN AND CARBOXYMETHYLCELLULOSE IN THE FORM OF A DENSE SOLUTION

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой и химико-фармацевтической промышленности, медицинской практике, косметологии и исследовательских целях. Изобретение может применяться при создании лекарственных препаратов в виде густого раствора ранозаживляющего и противоожогового назначения, рекомендованного для предотвращения образования шрамов и рубцов.
Папаин (КФ 3.4.22.2) - протеолитический фермент, выделенный из папай (Carcia Papaya). Его структура представляет собой единую полипептидную цепь, свернутую в два домена примерно одинакового размера, но с конформационными различиями. Эта цепь состоит из 212 аминокислот с молекулярной массой 23 кДа, включает 7 остатков цистеина, один из которых входит в состав активного центра фермента вместе с гистидином [Holyavka М., Pankova S., Koroleva V. et al. Influence of uv radiation on molecular structure and catalytic activity of free and immobilized bromelain, ficin and papain // Journal of Photochemistry dnd Photobiology B: Biology. - 2019. V. 201. - P. 111681]. Папаин эффективнее работает в средах с значениями рН, близкими к 6,0-7,0, но ему удается сохранять свою активность в широком диапазоне значений рН и температуры, что увеличивает область его применения [V.G. Tacias-Pascacioa, R. Morellon-Sterling,  et al. Immobilization of papain: A review // International Journal of Biological Macromolecules. - 2021. V. 188. - P. 94-113]. Папаин используется в различных отраслях промышленности, таких как пивоваренная, кожевенная, рыбная и мясная, в процессах производства лекарств и биологически активных пептидов. В пищевой промышленности папаин используют в составе тонизирующих напитков, соков, сиропов, желе; в пивоваренном производстве и виноделии фермент применяется для осветления растворов и увеличения сроков хранения продуктов. Известно его применение для лечения аллергии, заживления язв, ожогов и травм, снижения токсичности или побочного действия лекарств, а также для удаления некротических и гнойных тканей из ложа раны [Н.A. Shouket, I. Ameen, О. Tursunov et al. Study on industrial applications of papain: A succinct review // IOP Conf. Series: Earth and Environmental Science. - 2020. V. 614. - Р. 7].
В настоящее время с высокими темпами развивается направление с использованием ферментов в качестве промышленных биокатализаторов. Энзимы являются почти идеальными катализаторами благодаря их высокой активности в «мягких» условиях, селективности (снижающей вероятность образования побочных продуктов) и специфичности (позволяющей избегать модификации молекул, сходных по структуре с субстратом) [Холявка М.Г., Артюхов В.Г. Иммобилизованные биологические системы: биофизические аспекты и практическое применение // учебное пособие, Воронеж: Издательский дом ВГУ. - 2017. - С. 261]. Однако ферменты относительно нестабильны, склонны к ингибированию различными соединениями. Данные проблемы можно преодолеть с помощью различных способов их иммобилизации и комплексообразования [V.G. Tacias-Pascacio, D.  R. Morellon-Sterling et al. Bioactive peptides from Hsheries residues: A review of use of papain in proteolysis reactions // International Journal of Biological Macromolecules. - 2021. V. 184. - P. 415-428].
Перспективными носителями для иммобилизации ферментов и образования с ними стабильных комплексов являются биополимеры. Карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ) - анионное водорастворимое производное целлюлозы. Благодаря легкому и дешевому процессу синтеза, обилию сырья, характерным поверхностным свойствам, механической прочности, настраиваемой гидрофильности, вязкости, КМЦ нашла широкое применение в биомедицинской, фармацевтической, текстильной, строительной, пищевой, косметической, бумажной и нефтяной промышленностях. Например, в биомедицине КМЦ широко используется в перевязочных материалах для ран, при изготовлении 3D-каркасов для биосовместимых имплантатов, искусственных органов, а также в антимикробных и антиоксидант гых препаратах. Благодаря их биосовместимости, биодеградируемости, связывающей способности по отношению к биологически активным соединениям, таким как белки, пептиды и ферменты, гидрогели, пленки и другие гибридные материалы на основе КМЦ вызвали высокий интерес в фармацевтике, особенно для доставки лекарств, их эмульгирования и стабилизации [M.S. Rahman, M.S. Hasan, A.S. Nitai et al. Recent Developments of Carboxymethyl Cellulose // Polymers. - 2021. V. 13. - P. 48]. В пищевой промышленности КМЦ выполняет функции суспендирующего агента, загустителя, защитного коллоида, увлажнителя и может быть использована для регулирования процессов кристаллизации некоторых других компонентов [Патент RU 2334762 С2, МПК С08В 11/12, С08В 15/00, С08В 1/08, С08В 1/10, опубл. 27.09.2008, Бюл. №27].
Существует способ получения гетерогенного препарата на основе папаина, обладающего регенерационными свойствами [Патент RU 2677873 С2, МПК А61К 38/48, А61К 47/30, А61Р 17/02, опубл. 22.01.2019, Бюл. №3], включающий обработку матрицы ионообменных волокон ВИОН АН-1 или ВИОН КН-1 раствором папаина, инкубирование, отличающийся тем, что для иммобилизации на ВИОН КН-1 используют 0,2 М ацетатный буфер (рН 4,5-5,5) или 0,05 М боратный буфер с добавлением KCl (рН 9,0-9,5), а для иммобилизации на ВИОН АН-1 - 0,05 М трис-глициновый (рН 9,0) или 0,05 М глициновый (рН 10,0) буфер в расчете 20 мл раствора фермента в концентрации 5 мг/мл на 1 г волокон, инкубирование проводится в течение 24 ч при комнатной температуре, образовавшийся осадок промывают использованным при иммобилизации буфером до отсутствия в промывных водах белка.
Известен способ получения гетерогенного биокатализатора на основе папаина, иммобилизованного на ионообменных смолах [Патент RU 2768742 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 24.03.2022, Бюл. №9], включающий адсорбционн)ю иммобилизацию папаина в буферном растворе на матрицу ионообменной смолы в соотношении 20 мл раствора папаина в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя, инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием, промывку образовавшегося осадка буфером до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу воздушно-сухой ионообменной смолы АВ-16-ГС, а в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М фосфатный буфер, рН 11,0, инкубацию осуществляют в течение 2 часов, промывку образовавшегося осадка проводят 0,05 М трис-HCl буфером, рН 7,5.
В обоих способах иммобилизация папаина проводится путем адсорбции на нерастворимых носителях в соотношении 20 мл раствора папаина в концентрации 5 мг/мл на 1 г носителя при периодическом перемешивании, что не позволяет полностью автоматизировать процесс. Кроме того, получается нерастворимая форма фермента, которая, безусловно, имеет свои преимущества, но не дает возможность проводить реакции на твердых субстратах.
Известен способ получения иммобилизованного ферментного препарата на основе папаина, гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами [Патент RU 2750378 С1, МПК A61K 8/66, A61K 31/702, A61K 31/728, A61K 31/717, А61К 31/722, А61Р 31/00, А61Р 17/00, C12N 11/04 опубл. 28.06.2021, Бюл. №19], включающий растворение папаина в водном растворе низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (300 кДа) или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты (500 кДа) или высокомолекулярной гиалу юновой кислоты (800 кДа) в соотношении 10 мг папаина на 2 мл водного раствора низкомолекулярной гиалуроновой кислоты (300 кДа) или среднемолекулярной гиалуроновой кислоты (500 кДа) или высокомолекулярной гиалуроновой кислоты (800 кДа) в концентрации 1,5%, при этом осуществляют перемешивание до полного растворения при комнатной температуре; затем ведут иммобилизацию папаина путем добавления к полученной смеси графт-сополимера карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ) или хитозана (ХТЗ) с N-винилимидазолом (ВИ) или N,N-диметиламиноэтилметакрилатом (ДМАЭМА) при молекулярной массе полисахарида 50-100 кДа в количестве от 100 до 290 мг для получения жидкого препарата или от 300 до 500 мг для получения геля.
Недостатком способа является высокая стоимость гиалуроновой кислоты и полисахаридов, модифицированных виниловыми мономерами. Использование КМЦ позволит сократить расходы.
Известен способ стабилизации протеаз для применения в косметологических целях [US 2011/0177052]. Недостатком способа является использование 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, который вызывает серьезные ожоги кожи и повреждение глаз, может приводить к аллергическим кожным реакциям, при вдыхании может вызывать аллергию, симптомы астмы или затруднение дыхания, что ограничивает применение препарата в косметологии.
В качестве прототипа служил способ получения гетерогенного препарата папаина в геле на основе пищевого хитозана или сукцината хитозана [Патент RU 2712690 С1, МПК C12N 11/04, C12N 11/10, опубл. 30.01.2020, Бюл. №4], включающий иммобилизацию папаина в буферном растворе на матрицу хитозана в соотношении 20 мл раствора фермента в концентрации 1 мг/мл на 1 г носителя; инкубацию при комнатной температуре с периодическим перемешиванием; промывку образовавшегося осадка 50 мМ трис-HCl буфером (рН 7,5) до отсутствия в промывных водах белка, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят на матрицу пищевого хитозана с молекулярной массой менее 100 кДа или сукцината хитозана; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М глициновый буфер с рН 10,0 или 0,05 М ацетатный буфер с рН 5,8; инкубация проводится в течение 2 часов.
В отличие прототипа наш способ позволяет получить иммобилизованный папаин в другой форме, т.е. не в виде геля, а в форме густого раствора, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) папаин и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы. Заявляемое изобретение предназначено для расширения числа полисахаридов, используемых для стабилизации препаратов папаина. Кроме того, карбоксиметилцеллюлоза является водорастворимым носителем, что позволяет работать с ней в широком диапазоне значений рН среды.
Технический результат заявленного изобретения заключается в разработке способа получения гибридного препарата на основе иммобилизованного папаина и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора с абсолютной вязкостью 200-220 МПа×с, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) папаин и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, при этом в ходе иммобилизации активный центр папаина защищен от окисления путем добавления цистеина в концентрации 0,04М.
Технический результат достигается тем, что в способе получения гибридного препарата папаина и карбоксиметилцеллюлозы в виде густого раствора, включающем иммобилизацию ферментного препарата папаина в буферном растворе с носителем, инкубирование при комнатной температуре в течение 2 часов и промывку, согласно изобретению, иммобилизацию папаина проводят путем комплексообразования в густой раствор натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы в соотношении 10 мл раствора папаина в концентрации 20 мг/мл, полученного растворением в буфере, на 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, предварительно растворенной в 10 мл буфера, при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации используют 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl буфер с рН 8,0 или 0,05 М фосфатный буфер с рН 5,8-7,5, содержащие цистеин в концентрации 0,04 М, образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывают с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины с диаметром пор 25 кДа против 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, из расчета, что для промывки 21 мл полученного препарата используют 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5, диализ ведут в течение 8 часов, после чего буфер меняют на порцию свежего в объеме 400 мл и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного папаина.
Фиг. 1. Диаграмма значений содержания белка (в мг на 1 г носителя) в гибридных препаратах в виде густого раствора папаина и карбоксиметилцеллюлозы с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Фиг. 2. Диаграмма значений общей активности (в ед на 1 мл раствора) гибридных препаратов в виде густого раствора папаина и карбоксиметилцеллюлозы с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Фиг. 3. Диаграмма значений удельной активности (в ед на 1 мг белка в пробе) гибридных препаратов в виде густого раствора с использованием следующих буферов: 1 - 0,05 М ацетатный, 2 - 0,05 М фосфатный, 3 - 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl, 4 - 0,05 М трис-глициновый, 5 - 0,05 М глициновый.
Пример реализации способа.
В качестве объекта исследования был выбран папаин фирмы «Sigma-Aldrich», субстратом для гидролиза служил азоказеин фирмы «Sigma-Aldrich». В качестве носителя для комплексообразования применяли натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы фирмы «Sigma-Aldrich» с молекулярной массой 90 кДа и степенью замещения 0,7.
Комплексообразование папаина и карбоксиметилцеллюлозы осуществляли следующим образом. К 1 г натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, предварительно растворенной в 10 мл буфера, добавляли 10 мл раствора фермента в концентрации 20 мг/мл, полученного растворением в буфере, содержащем цистеин в концентрации 0,04 М для предотвращения процессов окисления активного центра папаина; инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре при постоянном перемешивании со скоростью 250 об/мин; в качестве буферного раствора для иммобилизации использовали 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl буфер с рН 8,0 или 0,05 М фосфатный буфер с рН 5,8-7,5; образовавшийся в процессе инкубирования препарат в виде густого раствора промывали с помощью диализа с использованием целлофанового мешочка Spectra/Por 6 Standard RC, шириной 34 мм, вместимостью 3,7 мл на 10 мм длины, изготовленного из регенерированной целлюлозы, с диаметром пор 25 кДа против 400 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 в течение 8 часов, после чего буфер меняли на 400 мл свежего и продолжают диализ еще в течение 16 часов до отсутствия в промывном растворе свободного папаина. Для промывки 21 мл полученного препарата использовали 800 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5. По истечении этого времени осуществляли контроль наличия белка в промывных водах с помощью спектрофотометра СФ-2000 при λ=280 нм.
Содержание белка в гибридных препаратах папаина определяли методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Faar A.L., Randall R.J. Protein measurement with folin-phenol reagent // J. Biol. Chem. - 1951. - V.193. - P. 265-275].
Определение протеазной активности папаина проводили m субстрате азоказеине (Sigma, США) [Sabirova A.R., Rudakova N.L., Balaban N.P., Ilyinskaya O.N Demidyuk I.V., Kostrov S.V., Rudenskaya G.N., Sharipova M.R. A novel secreted metzincin metalloproteinase from Bacillus itermeius // FEBS Lett. - 2010 - V. 584 (21), P. 4419-4425]. К 50 мг образца добавляли 200 мкл 0,05 М трис-HCl буфера с рН 7,5, 800 мкл азоказеина (0,5% масс. 0,05 М трис-HCl буфере, рН 7,5) и инкубировали 2 часа при 37°С. Далее добавляли 800 мкл трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (5% масс.), инкубировали 10 минут при 4°С, затем центрифугировали в течение 3 мин при 11700 g для удаления негидролизованного азоказеина. К 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл раствора NaOH (3% масс.) для нейтрализации кислоты, после чего измеряли оптическую плотность опытной пробы при 410 нм в 10 мм кювете. Контрольная проба содержала 800 мкл азоказеина, 800 мкл ТХУ, 50 мг образца и 200 мкл буфера (комплексообразованный фермент в контрольную пробу вносили последним, остальные операции для нее делали аналогично опытным пробам).
Единицей протеазной активности служило количество папаина, которое в условиях эксперимента гидролизует 1 мкМ азоказеина за 1 мин. Удельную протеазную активность рассчитывали по формуле:
А=D*1000/120/200/С,
где А - протеазная активность препарата, мкМ/мин на 1 мг белка,
D - оптическая плотность раствора при 410 нм,
С - концентрация белка в пробе, мг/мл, измеренная по методу Лоури,
120 - время инкубации в минутах,
200 - объем пробы, мкл,
1000 - коэффициент для пересчета в мкМ.
Все экспериментальные исследования осуществляли минимум в 8-кратной повторности. Статистическая обработка полученных результатов проводилась при уровне значимости 5% с использованием t-критерия Стьюдента.
Для получения гибридных препаратов папаина и карбоксиметилцеллюлозы, в качестве среды для комплексообразования мы использовали следующие буферы: 0,05 М боратный с добавлением 0,1 М KCl с рН 8,0-10,0, 0,05 М ацетатный с рН 4,0-5,8, 0,05 М глициновый с рН 8,6-10,5, 0,05 М трис-глициновый с рН 8,5-9,0, 0,05 М фосфатный с рН 5,8-7,5. Результаты отражены на фиг. 1-3.
Анализ содержания белка в гибридных препаратах показал, что наибольшее количество папаина (в мг на г носителя) наблюдается при использовании 0,05 М ацетатного буфера с рН 4,0 и 0,05 М боратного буфера с добавлением 0,1 М KCl с рН 10,0 (фиг. 1.)
Общая активность (в ед на мл раствора) папаина оказалась выше при применении 0,05 М боратного буфера с добавлением 0,1 М KCl с рН 8,0 (фиг. 2).
Наибольшую удельную активность показали препараты папаина, полученные при использовании 0,05 М фосфатного буфера с рН 5,8-7,5 и 0,05 М боратного буфера с добавлением 0,1 М KCl с рН 8,0 (фиг. 3).
Мы сравнили полученные результаты по определению каталитической активности и содержания белка для препаратов папаина в густом растворе карбоксиметилцеллюлозы. Оптимальное соотношение содержания белка (мг на г носителя), общей активности (в ед на мл раствора) и удельной активности (в ед на мг белка) получено при стабилизации папаина путем включения в густой раствор карбоксиметилцеллюлозы при использовании 0,05 М боратного буфера с добавлением 0,1 М KCl с рН 8,0 или 0,05 М фосфатного буфера с рН 5,8-7,5.
Таким образом, была разработана методика получения гибридного препарата папаина и карбоксиметилцеллолозы в виде густого раствора с абсолютной вязкостью 200-220 МПа×с, включающего только иммобилизованный (стабилизированный) папаин и полностью отмытого от его нестабилизированной (неиммобилизованной) формы, т.к. после диализа 21 мл препарата против 800 мл 50 мМ трис-HCl буфера с рН 7,5 исключается переход фермента из фазы носителя в раствор, что позволяет проводить реакции, получая продукт, не "загрязненный" ферментом. Кроме того, в ходе иммобилизации активный центр папаина защищен от окисления путем добавления цистеина в концентрации 0,04 М.