Влияние арбускулярных микоризных грибов на рост и развитие растений

Зинаида Алещенкова Галина Сафронова Екатерина Соловьева Анастасия Федоренчик

заведующая лабораторией взаимоотношений микроорганизмов почвы и высших растений Института микробиологии НАН Беларуси, доктор биологических наук

ведущий научный сотрудник Института микробиологии НАН Беларуси, кандидат биологических наук

младший научный сотрудник Института микробиологии НАН Беларуси

младший научный сотрудник Института микробиологии НАН Беларуси

Влияние арбускулярных микоризных грибов на рост и развитие растений

УДК 579.64+606:63

Арбускулярная микориза — широко распространенная форма симбиоза арбускулярных микоризных грибов (АМГ) с корнями высших растений. АМГ обеспечивают ассимиляцию питательных (в основном фосфор- и азотсодержащих) веществ из почвы, а также способствуют выживанию растений в неблагоприятных условиях окружающей среды. В свою очередь, растения снабжают арбускулярные микоризные грибы углеводами и ли-пидами [1—3].

АМГ являются облигатными симбионтами, не растущими в культуре in vitro, существующими вне растения лишь в форме покоящихся спор. Микосимбионт образует несептированный многоядерный мицелий, который присутствует в межклетниках корней растения-хозяина, а также внутриклеточные структуры — арбускулы и везикулы. Помимо меж- и внутриклеточных структур у АМГ имеются экстраматрикальные гифы, отходящие от корней растения-хозяина в почву на расстояние до 8 см, что превышает длину корневых волосков. Длина свободного мицелия может достигать 55 м на 1 г почвы, на гифах формируются бесполые хламидоспоры, выполняющие функции запасания питательных веществ и переживания неблагоприятных условий окружающей среды. Спора прорастает, внедряется в корень растения-хозяина через корневой

волосок, формирует аппрессории. Гифы проникают в клетки или между клеток коры, но не входят в меристему или эндодерму. Арбускулярная микориза может составлять 4—17% сухого веса корня и содержать до 1,4 м гиф на 1 см корня [4]. Показано положительное влияние АМГ на рост и развитие сельскохозяйственных культур [5—9]. Установление специфической роли АМГ в улучшении фосфорного питания растений и широкое распространение микоризных структур в корнях наземных растений явилось стимулом для расширения исследований в данном направлении. Начатые в Великобритании, они приобрели в настоящее время большой размах в разных странах, в том числе проводятся и в Институте микробиологии нАн Беларуси.

Цель данной работы — изучить влияние предпосевной обработки семян Pisum sativum L., Medicago sativa и Triticale арбу-скулярными микоризными грибами на эффективность развития микоризной инфекции в корнях растений и их продуктивность.

Объектами исследования являлись арбускулярные микоризные грибы, колонизовавшие корневую систему растений гороха посевного (Pisum sativum L.) сорта Миллениум, люцерны посевной (Medicago sativa) сорта Будучыня и яровой тритикале

Таблица 1. Высота и фитомасса растений гороха сорта Миллениум

Фаза стеблевания Фаза бутонизации-цветения

Вариант опыта высота растений,см сырая/сухая фитомасса, г/раст. высота растений, см сырая/сухая фитомасса, г/раст.

Без обработки (контроль) 13,8 1,73 / 0,29 49,0 13,64 / 1,56

Обработка АМГ 15,4 2,75 / 0,31 54,0 15,80 /2,20

Обработка АМГ + Я. ¡едит1пс-ва-гит bv. Vсеае 27П 16,5 2,71 / 0,34 57,6 18,48 / 3,08

НСР _ 0,05 0,65 0,169 / 0,097 1,72 1,078 / 0,336

сорта Лана; штаммы клубеньковых бактерий R. leguminosarum Ы. Vсеае 27П и Sinorhizobium теШсИ Б3, ассоциативного диа-зотрофа АдгсЬас1епит ер. 17; растение плектрантус — объект получения накопительных культур АМГ.

Полевые мелкоделяночные опыты по изучению влияния предпосевной обработки семян АМГ на рост, развитие и продуктивность гороха и тритикале были заложены на полях РУП «НПЦ НАН Беларуси по земледелию», люцерны — на опытном поле «Тушково» кафедры генетики и селекции УО «БГСХА».

Количественный учет развития АМГ в корнях растений проводили модифицированным методом Травло в соответствии с рекомендациями Лабутовой Н.М. [10]. Препараты мацерированных и окрашенных корней просматривали с помощью микроскопа МБИ-15 в проходящем свете.

В качестве инокулюма АМГ использовали субстратно-корневую смесь, полученную при культивировании арбускулярных микоризных грибов в двойной культуре с растениями плектрантуса в течение 6 месяцев. По истечении срока культивирования в корнях растений определяли частоту встречаемости микоризной инфекции (^ %). Субстратно-корневую смесь высушивали до воздушно-сухого состояния и хранили в темноте при комнатной температуре. Инокуляцию семян гороха и люцерны проводили при посеве из расчета 50 г измельченной субстратно-корневой смеси АМГ/погонный метр, а семян тритикале из расчета 0,2 г/1 г семян.

Математическая обработка данных — общепринятая для биологических исследований [11]. Статистическую обработку осуществляли при помощи статистического пакета Microsoft Excel.

Исследование влияния эндомикоризных грибов на формирование бобово-ризобиального и арбускулярно-микоризного симбиозов гороха в природных экосистемах выявило позитивное их действие на симбиотические свойства культуры. Обработка семян инокулюмом АМГ и микобактериальной ассоциацией (АМГ+ R. leguminosarum bv. viceae 27П) стимулировала образование клубеньков на корнях культуры. В опытном варианте при моноинокуляции сформировалось в среднем на 3,1 клубенька/раст. больше, чем в контроле, при бинарной инокуляции — на 17,6. Возрастание числа клубеньков способствовало увеличению азотфиксирующей активности в стадии стеблевания в среднем в 2,2 раза. В корнях присутствовали все структуры АМГ: мицелий (внешний и внутренний), арбуску-лы и везикулы (рис. 1).

Важной характеристикой эффективности инокуляции являются биометрические показатели развития растений. Высота и фитомасса гороха свидетельствуют об его отзывчивости на обработку симбиотическими инокулянтами. Однако степень их положительного влияния на зернобобовую культуру различна (табл. 1).

Максимальные значения высоты растений на обеих стадиях развития культуры определены в варианте с использованием

Таблица 2. Структура урожая и продуктивность гороха сорта Миллениум

Вариант опыта Количество бобов, шт./раст. Количество семян в бобе, шт./раст. Масса 1000 семян, г Продуктивность, г/м2

Без обработки (контроль) 3,55 3,80 223,2 448,0

Обработка АМГ 3,70 3,81 271,8 555,0

Обработка АМГ + Я. ¡едит'тс-ва-гит bv. Vсеае 27П 3,85 4,17 272,7 595,0

нср _ 0,05 26,3

микобактериальной ассоциации. В этом варианте отмечено и повышение накопления фитомассы растениями. В стадии стеблевания сырой вес растений при обработке инокулюмом АМГ и бинарным инокулянтом увеличивался в среднем на 58%, сухой — на 8%. В фазе бутонизации-цветения прибавка сырой/ сухой массы в опытных вариантах в сравнении с контролем составила 2,16/0,64 и 4,84/1,52 г/раст. соответственно.

Обработка семян арбускулярными микоризными грибами позитивно повлияла на формирование урожая гороха, что положительно сказалось на его структуре и продуктивности культуры (табл. 2).

В период ручной уборки урожая максимальная зерновая продуктивность гороха (595 г/м2) получена при совместной обработке АМГ + И. leguminosarum Ы. víceae 27П (в контроле — 448, при моноинокуляции инокулюмом АМГ — 555 г/м2).

Предпосевная обработка семян люцерны посевной сорта «Бу-дучыня» инокулюмом АМГ как отдельно, так и совместно со штаммом клубеньковых бактерий 5. те1М S3 стимулирует развитие структур АМГ в корнях люцерны. Наблюдение за их динамикой в разные фазы развития растений показало, что в фазе первого тройчатого листа идет интенсивное формирование арбускул, улучшающих фосфорное питание растений люцерны, и интенсивное инфицирование корневой системы такими структурами АМГ, как мицелий. В вариантах с обработкой семян инокулюмом АМГ и АМГ + 5. теЮ S3 интенсивность развития микоризной инфекции составила 83 и 71%, а арбускул — 70 и 50% соответственно. Корни контрольных растений были инфицированы спонтанной микоризой, степень инфицирования составила всего 11%. В варианте с монообработкой АМГ отмечается появление в корнях везикул—толстостенных, вздутых запасающих структур, часто наполненных липидами.

В фазе стеблевания в корнях люцерны отмечено увеличение интенсивности развития микоризной инфекции. В вариантах с обработкой семян АМГ и АМГ + 5. те1М S3 ее уровень достигает 95 и 76,5% соответственно, при интенсивности развития арбускул — 23,6 и 25,4%, а везикул — 0,4 и 0,77% соответственно. Обилие арбускул в корнях люцерны, инокулированной АМГ и АМГ+ 5. теШ S3, превышает контроль более чем в 20

раз. В контроле без обработки АМГ в корнях везикул не было обнаружено, что свидетельствует о неэффективном симбиозе спонтанных АМГ с растениями люцерны.

Анализ микроскопической структуры корневой системы люцерны в фазе ветвления показал увеличение интенсивности развития арбускулярных структур во всех вариантах по сравнению с фазой стеблевания, что свидетельствует о формировании эффективного симбиоза АМГ с растением. Интенсивность развития спонтанной микоризной инфекции в контрольном варианте достигла 46,7%, арбускулярных структур — 12,4%. Интенсивность развития микоризной инфекции была максимальной в вариантах с обработкой АМГ — как моно-, так и совместно с 5. те1С S3 — и превышала контрольные показатели на 32,3 и 36,8% соответственно. Совместная обработка семян люцерны АМГ и ризобиями стимулировала образование арбускул на 3,9% по сравнению с моноинокуляцией и на 23,4% — по сравнению с контролем. Обработка семян инокулюмом АМГ способствовала повышению интенсивности развития везикул до 12,3%, что на 5% выше, чем в контроле.

Предпосевная обработка семян арбускулярными микоризными грибами и клубеньковыми бактериями — как моно-, так и совместно — повышала накопление сырой и сухой фитомассы люцерны. В фазе первого тройчатого листа максимальный эффект стимуляции выявлен в варианте с совместной обработкой АМГ и клубеньковыми бактериями, вес сырой фитомассы люцерны превышал контроль на 35%. При моноинокуляции эффект стимуляции составил в среднем 5% (рис. 2).

В фазе стеблевания совместная обработка АМГ и 5. теШсИ S3 способствовала прибавке веса сырой зеленой массы на 0,33 г/раст. по сравнению с контролем и на 0,19 г/раст. и 0,12 г/ раст. по сравнению с моноинокуляцией АМГ и клубеньковыми бактериями, соответственно. Максимальная прибавка сырого веса получена в фазе ветвления, когда дополнительно сформировалось 4,9 г/раст. зеленой массы люцерны по сравнению с контролем, а также 2,9 г/раст. и 2,4 г/ раст. — по сравнению с моноинокуляцией АМГ и ризобиями соответственно. Вес сырой фитомассы при моноинокуляции микоризой и клубеньковыми бактериями превысил контроль на 103,7 и 131,6% соответственно.

Таблица 3. Влияние инокуляции на развитие яровой тритикале сорта Лана

Вариант опыта Фаза всходов ( Фаза колошения Фаза созревания

сырой вес зеленой массы, г сухой вес зеленой массы, г высота растений,см сырой вес зеленой массы, г сухой вес зеленой массы,г высота растений, см вес соломы, г

Без обработки (контроль) 0,41 0,068 15,14 7,46 2,67 84,72 1,42

Обработка АМГ +АдпсЬа^епит эр. 17 0,43 0,075 16,48 8,61 3,3 86,03 2,31

В вариантах с бинарной инокуляцией АМГ + S. meliloti S3 был получен максимальный вес сухих растений люцерны в фазе ветвления — 3,2 г/раст., что превысило контроль в 3,5 раза.

Инокуляция семян клубеньковыми бактериями способствовала стимуляции роста растений Medicago sativa в высоту на протяжении всего периода вегетации. Так, в фазе первого тройчатого листа в вариантах с инокуляцией S. meliloti S3 (моно) и S. meliloti S3 + АМГ отмечено увеличение высоты растений на 32,1 и 25% соответственно, в фазе стеблевания — на 31,4 и 33,9% по сравнению с контролем соответственно. Максимального роста растения люцерны достигают в фазе ветвления. При совместной инокуляции АМГ с ризобиями высота растений составляет 37,9 см, при моноинокуляции ризобиями — 32,2 см, что на 73,3 и 47,5% соответственно превышает контрольные показатели (рис. 3).

Интенсивная микоризация корневой системы Medicago sativa в варианте с обработкой АМГ и АМГ + S. meliloti S3 коррелирует с весом сухих корней люцерны в фазе ветвления. Максимальный сухой вес корней/раст. был получен в варианте с обработкой АМГ + S. meliloti S3 и составил 1,6 г/раст., что выше контроля на 131,9%. При моноинокуляции АМГ сухой вес корней равен 1,3 г/раст., что превышает контроль на 88,4% и свидетельствует о стимулирующем влиянии микоризы на развитие корневой системы Medicago sativa (рис. 4).

На всех изученных стадиях развития тритикале насыщенность корневой системы структурами АМГ была выше в вариантах с обработкой монокультурой Agrobacterium sp. 17 и АМГ + Agrobacterium sp. 17 в сравнении с контролем .

На стадии колошения обилие арбускул в варианте с обработкой диазотрофными бактериями было выше в 1,8 раза по сравнению с контролем. К концу вегетации насыщенность корневой системы везикулами в варианте с обработкой семян тритикале монокультурой Agrobacterium sp. 17 превышала контроль на 28,6% (рис. 5).

Полученные данные свидетельствуют о позитивном влиянии предпосевной инокуляции семян яровой тритикале сорта Лана на развитие структур АМГ в корнях растений, а также воздействии предпосевной инокуляции семян ризобактериями и АМГ в целом на рост и развитие данной культуры (табл. 3).

Сырой и сухой вес зеленой массы яровой тритикале на стадии всходов, семена которой инокулировали АМГ + Agrobacterium sp. 17, превышал контрольные образцы на 4,9 и 10,3% соответственно. В фазе колошения эти показатели были выше контрольных на 15,4 и 23,6%. Высота растений, семена которых инокулированы АМГ + Agrobacterium sp. 17, в фазе всходов и колошения отличалась от контрольных вариантов на 8,9 и 1,5%, в фазе созревания — на 62,7% по весу соломы.

Рис. 2. Влияние инокуляции семян АМГ и ризобиями на высоту растений Medicago sativa

.ВЫСОТА. РАСТЕНИЙ.

фаза первого тройчатого листа

фаза стеблевания фаза ветвления

ризобии амг амг+ризобии

Рис. 3. Влияние инокуляции семян АМГ и ризобиями на высоту растений Medicago sativa

Полученные в полевых условиях данные по урожайности и структуре урожая тритикале свидетельствуют об эффективности предпосевной инокуляции семян АМГ + Agrсbacterium sр. 17, обеспечивающей получение статистически достоверной прибавки урожая в сравнении с контролем. По числу зерен в

40

35

30

25

20

15

10

¡онтроль

Литература

Рис. 4. Влияние предпосевной инокуляции семян штаммом клубеньковых бактерий S.meШoti S3 и АМГ на вес сухих корней люцерны

колосе вариант с инокуляцией превышает контроль на 48,5%, по массе зерна в одном колосе — на 94,8%. Зерновая продуктивность яровой тритикале, инокулированной АМГ + АдгоЬас-terium sp. 17, выше контроля на 17%. Полученные результаты подтверждают результаты модельных экспериментов и свидетельствуют об эффективности бинарной инокуляции семян яровой тритикале АМГ + АдгоЬеСепит sp. 17. Это доказывает перспективность применения в практике растениеводства предпосевной инокуляции семян ризобактериями и АМГ.

Проведенный количественный учет спор арбускулярных микоризных грибов, встречающихся в различных почвенно-климатических условиях Беларуси, показал, что их численность колеблется от 80 до 386 шт./100 г почвы. Число спор варьирует в зависимости от типа почвы, степени ее окультуривания, вида растительного покрова, сроков взятия образцов, а также от содержания в ней фосфора. Сравнение полученных результатов с данными по содержанию спор АМГ в различных почвах мира свидетельствует о незначительном количестве их в почвах Беларуси и подтверждает необходимость проведения искусственной предпосевной микоризации семян сельскохозяйственных культур.

Рис. 5. Структуры АМГ в корне (I) и спора в ризосфере (II) тритикале: 1 — везикулы, 2 — гифы, 3 — спора

1. Молекулярные и клеточные аспекты развития арбускулярных микоризных симбиозов и их значение в жизнедеятельности растений / А.В. Крипка [и др.] // Цитол. и генетика. Т. 36, №4, 2002. С. 72-81.

2. Carbon export from arbuscular mycorrhizal roots involves the translocation of carbohydrate as well as lipid / B. Bago [et al.] // Plant Physiol. 2003. Vol. 131. P. 1496-1507.

3. Сравнительная генетика и эволюционная морфология симбиозов растений с микробами-азотфиксаторами и эндомикоризными грибами / Н.А. Проворов [и др.] // Журнал общей биологии. Т. 63, №6, 2002. С. 451-472.

4. Воронина Е.Ю. Микоризы в наземных экосистемах: экологические, физиологические и молекулярно-генетические аспекты микоризных симбиозов / Микология сегодня. Под ред. Ю.Т. Дьякова, Ю.В. Сергеева. Т. 1. — М., 2007. С. 142—235.

5. Роль почвенных микроорганизмов в фосфорном питании растений / Г.С. Муромцев [и др.] // Успехи микробиологии. №20. — М., 1985. С. 174—198.

6. Борисов А.Ю. Эффективность использования совместной инокуляции гороха посевного (Pisum sativum L.) грибами арбускулярной микоризы и клубеньковыми бактериями для повышения продуктивности растений в устойчивом экологически ориентированном земледелии / А.Ю. Борисов [и др.] // Доклады Россельхозакадемии. №2, 2004. C. 12—14.

7. Влияние инокуляции растений клубеньковыми бактериями и эндомикориз-ным грибом Glomus intraradices на урожай различных сортов сои и содержание белка и масла в семенах / Н.М. Лабутова [и др.] // Докл. Рос. акад. сельхоз. наук. №2, 2004. С. 10—12.

8. Aleschenkova Z.M. Formation of efficient symbiotic microbial-plant systems to raise productivity of legume cultivars / Biotechnology: State of the Art and Prospects for Development. — New York: Nova Science Publishers, Inc., 2008. Р. 5—10.

9. Aleschenkova Z.M. Efficiency evaluation of pre-sowing inoculation of barley seeds with diazotrophic rhizobacteria and arbuscular mycorrhizal fungi / Z.M. Aleschenkova, L.A. Sukhovitskaya, N.V. Melnicova // Весц НАН Беларуа Сер. бiял. навук. №2, 2010. С. 66—69.

10. Н.М. Лабутова. Методы исследования арбускулярных микоризных грибов. — СПб., 2000.

11. П.Ф. Рокицкий. Основы вариационной статистики для биологов. — Мн., 1973.

Summary

Effect of pre-sowing cultivar seed treatment with arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) on spread efficiency of mycorrhizal infection in plant roots and their productivity was studied in field small plot trials. It was shown that seed treatment with AMF and AMF + Rhizobacteria increased saturation of Pisum sativum L, Medicago sativa and Triticale root system with AMF structures (hy-phae, arbuscles, vesicles). Presowing seed treatment with AMF was found to stimulate plant growth and development.

Seed treatment with AMF + Rhizobium leguminosarum bv viceae 2711 resulted in maximum peas grain productivity — 595 g/m2 (which is 32,8% over control value). Grain harvest of spring triticale inoculated with AMF + Agrobacterium sp. 17 is increased by 17%. The obtained results evidence good application prospects in crop cultivation practice for pre-sowing seed inoculation with AMF.