ТРАНСПОЗОННАЯ СИСТЕМА И СПОСОБЫ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Способ ex-vivo генетической модификации иммунной клетки, включающий доставку в иммунную клетку:
(а) последовательности нуклеиновой кислоты или аминокислотной последовательности, содержащей последовательность, кодирующую фермент транспозазу, и
(b) рекомбинантной и неприродной последовательности ДНК, включающей последовательность ДНК, кодирующую транспозон.
2. Способ по п.1, где последовательностью, кодирующей фермент транспозазу, является последовательность мРНК.
3. Способ по п. 1, где последовательностью, кодирующей фермент транспозазу, является последовательность ДНК.
4. Способ по п. 1, где последовательностью, кодирующей фермент транспозазу, является аминокислотная последовательность.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где стадия доставки включает электропорацию или нуклеофекцию иммунной клетки.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где способ также включает стадию стимуляции иммунной клетки одним или более цитокинами.
7. Способ по п. 6, где стадию стимуляции иммунной клетки одним или более цитокинами осуществляют после стадии доставки.
8. Способ по п. 6, где стадию стимуляции иммунной клетки одним или более цитокинами осуществляют до стадии доставки.
9. Способ по любому из пп. 6-8, где один или более цитокинов включают IL-2, IL-21, IL-7 и/или IL-15.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, где иммунной клеткой является аутологичная иммунная клетка.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где иммунной клеткой является Т-лимфоцит.
12. Способ по любому из пп. 1-10, где иммунной клеткой является природная клетка-киллер (NK).
13. Способ по любому из пп. 1-10, где иммунной клеткой является клетка-киллер, индуцированная цитокином (CIK).
14. Способ по любому из пп. 1-10, где иммунной клеткой является природная Т-клетка-киллер (NКТ).
in vitro
15. Способ по любому из пп. 2 и 5-14, где последовательность мРНК, кодирующую фермент транспозазу, продуцируют .
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где фермент транспозаза представляет собой фермент транспозазу Super piggyBac™ (sPBo).
17. Способ по п. 16, где фермент транспозаза Super piggyBac™ (PB) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности:
MGSSLDDEHILSALLQSD DELVGEDSDSEVSDHVSE DDVQSDTEEAFIDEVHEV QPTSSGSEILDEQNVIEQ PGSSLASNRILTLPQRTI RGKNKHCWSTSKSTRRSR VSALNIVRSQRGPTRMCR NIYDPLLCFKLFFTDEII SEIVKWTNAEISLKRRES MTSATFRDTNEDEIYAFF GILVMTAVRKDNHMSTDD LFDRSLSMVYVSVMSRDR FDFLIRCLRMDDKSIRPT LRENDVFTPVRKIWDLFI HQCIQNYTPGAHLTIDEQ LLGFRGRCPFRVYIPNKP SKYGIKILMMCDSGTKYM INGMPYLGRGTQTNGVPL GEYYVKELSKPVHGSCRN ITCDNWFTSIPLAKNLLQ EPYKLTIVGTVRSNKREI PEVLKNSRSRPVGTSMFC FDGPLTLVSYKPKPAKMV YLLSSCDEDASINESTGK PQMVMYYNQTKGGVDTLD QMCSVMTCSRKTNRWPMA LLYGMINIACINSFIIYS HNVSSKGEKVQSRKKFMR NLYMSLTSSFMRKRLEAP TLKRYLRDNISNILPKEV PGTSDDSTEEPVMKKRTY CTYCPSKIRRKANASCKK CKKVICREHNIDMCQSCF (SEQ ID NO: 1).
18. Способ по любому из пп. 1-15, где фермент транспозаза представляет собой фермент транспозазу Sleeping Beauty.
19. Способ по п. 18, где транспозаза Sleeping Beauty представляет собой гиперактивную транспозазу Sleeping Beauty SB100X.
20. Способ по п. 18 или 19, где фермент транспозаза Sleeping Beauty содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности: MGKSKEISQDLRKKIV DLHKSGSSLGAISKRL KVPRSSVQTIVRKYKH HGTTQPSYRSGRRRYL SPRDERTLVRKVQINP RTTAKDLVKMLEETGT KVSISTVKRVLYRHNL KGRSARKKPLLQNRHK KARLRFATAHGDKDRT FWRNVLWSDETKIELF GHNDHRYVWRKKGEAC KPKNTIPTVKHGGGSI MLWGCFAAGGTGALHK IDGIMRKENYVDILKQ HLKTSVRKLKLGRKWV FQMDNDPKHTSKVVAK WLKDNKVKVLEWPSQS PDLNPIENLWAELKKR VRARRPTNLTQLHQLC QEEWAKIHPTYCGKL VEGYPKRLTQVKQFKGNATKY (SEQ ID NO: 2).
21. Способ по п. 18 или 19, где фермент транспозаза Sleeping Beauty содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75% идентична последовательности:
MGKSKEISQDLRKRIVD LHKSGSSLGAISKRLAV PRSSVQTIVRKYKHHG TTQPSYRSGRRRYLSP RDERTLVRKVQINPRT TAKDLVKMLEETGTKV SISTVKRVLYRHNLKG HSARKKPLLQNRHKKA RLRFATAHGDKDRTFW RNVLWSDETKIELFGH NDHRYVWRKKGEACKP KNTIPTVKHGGGSIML WGCFAAGGTGALHKID GIMDAVQYVDILKQHL KTSVRKLKLGRKWVFQ HDNDPKHTSKVVAKWL KDNKVKVLEWPSQSPD LNPIENLWAELKKRVR ARRPTNLTQLHQLCQE EWAKIHPNYCGKLVE GYPKRLTQVKQFKGNATKY (SEQ ID NO: 3).
22. Способ по любому из предшествующих пунктов, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, содержащие последовательность ДНК, кодирующую транспозон, являются кольцевыми.
23. Способ по п. 22, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, кодирующая транспозон, содержится в плазмидном векторе.
24. Способ по п. 22, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, кодирующая транспозон, содержится в миникольцевом ДНК-векторе.
25. Способ по любому из пп. 1-21, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, кодирующая транспозон, является линейной.
26. Способ по любому из предшествующих пунктов, где рекомбинантную и неприродную последовательность ДНК, кодирующую транспозон, продуцируют in vitro.
27. Способ по п. 25 или 26, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, кодирующая транспозон, представляет собой продукт расщепления кольцевой ДНК рестриктирующими ферментами.
28. Способ по п. 27, где кольцевой ДНК является плазмидный вектор или миникольцевой ДНК-вектор.
29. Способ по п. 25 или 26, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, кодирующая транспозон, представляет собой продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР).
30. Способ по п. 25 или 26, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, кодирующая транспозон, представляет собой двухцепочечную последовательность ДНК doggybone™.
31. Способ по п. 30, где последовательность ДНК doggybone™ получают ферментативным способом так, чтобы они по отдельности кодировали антигенный экспрессионный кластер, содержащий антиген, промотор, поли-A хвост и теломерные концы.
32. Способ по любому из предшествующих пунктов, где иммунную клетку выделяют или получают от человека.
33. Способ по любому из пп. 1-31, где иммунную клетку выделяют или получают от млекопитающего, не являющегося человеком.
34. Способ по п. 33, где млекопитающим, не являющимся человеком, являются грызуны, кролики, кошки, собаки, свиньи, лошади, коровы, верблюды или приматы.
35. Способ по любому из предшествующих пунктов, где рекомбинантная и неприродная последовательность ДНК, кодирующая транспозон, также содержит последовательность, кодирующую химерный антигенный рецептор или его часть.
36. Способ по п. 35, где часть последовательности, кодирующей химерный антигенный рецептор, кодирует антиген-распознающую область.
37. Способ по п. 35 или 36, где антиген-распознающая область содержит одну или более гипервариабельных областей.
38. Способ по п. 35 или 36, где антиген-распознающая область содержит антитело, антитело-миметик, каркасный белок или их фрагмент.
39. Способ по п. 38, где антителом является химерное антитело, рекомбинантное антитело, гуманизованное антитело или человеческое антитело.
40. Способ по п. 39, где антителом является антитело со скорректированной аффинностью.
41. Способ по п. 38, где антитело содержит или состоит из них, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), VHH, однодоменное антитело (sdAB), небольшую модульную иммунофармацевтическую (SMIP) молекулу или наноантитело.
42. Способ по п. 41, где VHH является верблюжьим.
43. Способ по п. 41 или 42, где VHH является гуманизованным.
44. Способ по п. 38, где фрагмент антитела включает или состоит из них, гипервариабельную область, вариабельную область, тяжелую цепь, легкую цепь или любые их комбинации.
45. Способ по п. 38, где антитело-миметик включает или состоит из них, аффинное антитело, аффилин, аффимер, аффитин, альфа-антитело, антикалин, авимер, DARPin, финомер, пептидный домен Кунитца или моноантитело.
46. Способ по п. 38, где каркасный белок включает Центирин или состоит из него.
47. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 10 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
48. Способ по п. 47, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 100 мкг/мл или менее.
49. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 7,5 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
50. Способ по п. 49, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 75 мкг/мл или менее.
51. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 6,0 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
52. Способ по п. 51, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 60 мкг/мл или менее.
53. Способ по п. 50 или 51, где транспозазой является транспозаза Sleeping Beauty.
54. Способ по п. 53, где транспозазой Sleeping Beauty является транспозаза Sleeping Beauty 100X (SB100X).
55. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 5,0 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
56. Способ по п. 55, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 50 мкг/мл или менее.
57. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 2,5 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
58. Способ по п. 57, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 25 мкг/мл или менее.
59. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 1,67 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
60. Способ по п. 59, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 16,7 мкг/мл или менее.
61. Способ по п. 59 или 60, где транспозазой является транспозаза Super piggyBac (PB).
62. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 0,55 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
63. Способ по п. 62, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 5,5 мкг/мл или менее.
64. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 0,19 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
65. Способ по п. 64, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 1,9 мкг/мл или менее.
66. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность ДНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляют 0,1 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
67. Способ по п. 66, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей фермент транспозазу, и количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляют 1,0 мкг/мл или менее.
68. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 10 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
69. Способ по п. 68, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 100 мкг/мл или менее.
70. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 7,5 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
71. Способ по п. 70, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 75 мкг/мл или менее.
72. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 6,0 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
73. Способ по п. 72, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 60 мкг/мл или менее.
74. Способ по п. 72 или 73, где транспозазой является транспозаза Sleeping Beauty.
75. Способ по п. 74, где транспозазой Sleeping Beauty является транспозаза Sleeping Beauty 100X (SB100X).
76. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 5,0 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
77. Способ по п. 76, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 50 мкг/мл или менее.
78. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 2,5 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
79. Способ по п. 78, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 25 мкг/мл или менее.
80. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 1,67 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
81. Способ по п. 80, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 16,7 мкг/мл или менее.
82. Способ по п. 80 или 81, где транспозазой является транспозаза Super piggyBac (PB).
83. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 0,55 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
84. Способ по п. 83, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 5,5 мкг/мл или менее.
85. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 0,19 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
86. Способ по п. 85, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 1,9 мкг/мл или менее.
87. Способ по любому из пп. 5-46, где:
(а) последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая фермент транспозазу, представляет собой последовательность РНК, и
(b) количество последовательности ДНК, кодирующей транспозон, составляет 0,1 мкг или менее на 100 мкл реагента для электропорации или нуклеофекции.
88. Способ по п. 87, где концентрация последовательности ДНК, кодирующей транспозон в реакции электропорации или нуклеофекции, составляет 1,0 мкг/мл или менее.
89. Иммунная клетка, модифицированная способом по любому из пп. 1-88.
90. Иммунная клетка по п. 89, где иммунной клеткой являются T-лимфоцит, природная клетка-киллер (NK), клетка-киллер, индуцированная цитокином (CIK) или природная Т-клетка-киллер (NКТ).
91. Иммунная клетка по п. 89 или 90, дополнительно модифицированная посредством второго инструмента для редактирования генов.
92. Иммунная клетка по п. 91, где второй инструмент для редактирования генов включает эндонуклеазу, функционально присоединенную к последовательности Cas9 или TALE.
93. Иммунная клетка по п. 92, где эндонуклеаза функционально присоединена к последовательности Cas9 или TALE посредством ковалентной связи.
94. Иммунная клетка по п. 92, где эндонуклеаза функционально присоединена к последовательности Cas9 или TALE посредством нековалентной связи.
95. Иммунная клетка по любому из пп. 89-94, где Cas9 представляет собой инактивированную Cas9 (dCas9).
96. Иммунная клетка по п. 95, где инактивированная Cas9 включает D10A и N580A в каталитическом сайте.
97. Иммунная клетка по п. 95 или 96, где Cas9 представляет собой небольшую и инактивированную Cas9 (dSaCas9).
98. Иммунная клетка по п. 97, где dSaCas9 содержит аминокислотную последовательность:
mkrnyilglaigitsvg ygiidyetrdvidagvr lfkeanvennegrrsk rgarrlkrrrrhriqrv kkllfdynlltdhsels ginpyearvkglsqkls eeefsaallhlakrrgv hnvneveedtgnelstk eqisrnskaleekyvae lqlerlkkdgevrgsin rfktsdyvkeakqllkv qkayhqldqsfidtyid lletrrtyyegpgegsp fgwkdikewyemlmghc tyfpeelrsvkyaynad lynalndlnnlvitrde nekleyyekfqiienvf kqkkkptlkqiakeilv needikgyrvtstgkpe ftnlkvyhdikditark eiienaelldqiakilt iyqssediqeeltnlns eltqeeieqisnlkgyt gthnlslkainlildel whtndnqiaifnrlklv pkkvdlsqqkeipttlv ddfilspvvkrsfiqsi kvinaiikkyglpndii ielareknskdaqkmin emqkrnrqtnerieeii rttgkenakyliekikl hdmqegkclysleaipl edllnnpfnyevdhiip rsvsfdnsfnnkvlvkq eeaskkgnrtpfqylss sdskisyetfkkhilnl akgkgrisktkkeylle erdinrfsvqkdfinrn lvdtryatrglmnllrs yfrvnnldvkvksingg ftsflrrkwkfkkernk gykhhaedaliianadf ifkewkkldkakkvmen qmfeekqaesmpeiete qeykeifitphqikhik dfkdykyshrvdkkpnr elindtlystrkddkgn tlivnnlnglydkdndk lkklinkspekllmyhh dpqtyqklklimeqygd eknplykyyeetgnylt kyskkdngpvikkikyy gnklnahlditddypns rnkvvklslkpyrfdvy ldngvykfvtvknldvi kkenyyevnskcyeeak klkkisnqaefiasfyn ndlikingelyrvigvn ndllnrievnmidityr eylenmndkrppriikt iasktqsikkystdilg nlyevkskkhpqiikkg (SEQ ID NO: 4).
99. Композиция, содержащая иммунную клетку по любому из пп. 89-98.
100. Применение композиции по п. 99 для лечения заболевания или расстройства у индивидуума, нуждающегося в этом.
101. Применение по п. 100, где заболеванием или расстройством является рак.
102. Применение по п. 100, где заболеванием или расстройством является инфекционное заболевание.
103. Применение по любому из пп. 99-102, где иммунная клетка является аутологичной.
104. Применение по любому из пп. 99-102, где иммунная клетка является аллогенной.
105. Культуральная среда для повышения жизнеспособности модифицированной иммунной клетки, содержащей IL-2, IL-21, IL-7, IL-15 или любые их комбинации.
106. Культуральная среда по п. 105, где модифицированной иммунной клеткой являются T-лимфоцит, природная клетка-киллер (NK), клетка-киллер, индуцированная цитокином (CIK) или природная Т-клетка-киллер (NКТ).
107. Культуральная среда по п. 105 или 106, где модифицированная иммунная клетка содержит одну или более экзогенных последовательностей ДНК.
108. Культуральная среда по п. 105 или 106, где модифицированная иммунная клетка содержит одну или более экзогенных последовательностей РНК.
109. Культуральная среда по любому из пп. 105-108, где модифицированная иммунная клетка была подвергнута электропорации или нуклеофекции.