Способ получения бактериального концентрата на основе симбиоза пробиотических микроорганизмов
METHOD FOR OBTAINING BACTERIAL CONCENTRATE BASED ON THE SYMBIOSIS OF PROBIOTIC MICROORGANISMS

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности и может быть использовано при производстве бактериальных концентратов, биологически активных добавок к пище, и ферментированных молочных продуктов.
Для производства пробиотических кисломолочных продуктов в основном используются комбинированные закваски бифидобактерий и лактобактерий. В настоящее время разработан широкий ассортимент бифидосодержащих молочных продуктов Бифилайф, бифидокефиры, йогурты, при производстве которых используются комбинированные закваски молочнокислых и бифидобактерий.
Что касается пропионовокислых бактерий, они недостаточно изучены и применяются, в основном, в сыроделии. В отличие от других микроорганизмов, большим преимуществом пропионовокислых бактерий является высокая технологичность, выживаемость в кислой среде, а также синтез метабиотиков с различным механизмом действия, антимутагенных веществ, супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, бактериоцинов, которые в совокупности будут оказывать положительное действие на организм человека.
Известен способ получения консорциума бактерий для производства кисломолочных продуктов, состоящий из пропионовокислых, молочнокислых и уксуснокислых бактерий (см. RU №2185436, МПК C12N 1/20, А23С 9/12, опубл. 20.07.2002 Бюл. №20).
Недостатком известного способа является слабая биохимическая активность пропионовокислых бактерий и многократные пересадки для получения производственной закваски, что снижает синтез внеклеточных метаболитов, обладающих пробиотическими свойствами.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ получения бактериального концентрата пропионовокислых бактерий, предусматривающий приготовление питательной среды, внесение активизированной β-галактозидазой культуры пропионовокислых бактерий Propionibacterium shermanii штамм МГУ в количестве 3-5 мас %. Осуществляют наращивание клеток, отделение бактериальной массы от культуральной среды, смешивание ее с защитной средой, розлив, замораживание и сушку (см. RU №2309982, МПК C12N 1/20, А23С 9/12, C12R 1/15, опубл. 10.11.2007 Бюл. №31).
Недостатком данного способа является недостаточно высокие биохимическая активность и пробиотические свойства бактериального концентрата.
Техническим результатом изобретения является повышение биохимической активности и пробиотических свойств бактериального концентрата.
Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем, что в способе получения бактериального концентрата на основе симбиоза пробиотических микроорганизмов, предусматривающем приготовление питательной среды, стерилизацию, охлаждение, внесение инокулята на основе пропионовокислых бактерий, активизированных β-галактозидазой, наращивание клеток, отделение бактериальной массы от культуральной среды, смешивание ее с защитной средой, розлив, замораживание, сушку, согласно изобретению в качестве инокулята используют Propionibakterium Freudenreichii Ш-85 и Lactobacillus acidophilus вязкой расы, взятых в соотношении 2:1.
Отличительным признаком заявляемого изобретения является использование в качестве инокулята консорциума пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii Ш-85 с высокой пробиотической активностью и ацидофильной палочки.
Сочетание биотехнологического потенциала пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки позволяет разработать концентрат с высокой биохимической активностью и пробиотическими свойствами.
Для осуществления заявленного способа получения бактериального концентрата были проведены экспериментальные исследования по изучению биотехнологических свойств симбиоза пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii Ш-85 и ацидофильной палочки, выбору их соотношения и изучению внеклеточных метаболитов в процессе культивирования.
12
С учетом органолептических показателей, сбалансированного роста микроорганизмов и содержания витамина В было выбрано оптимальное соотношение пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки 2:1. Температура культивирования консорциума 30°C является оптимальной для активного развития пропионовокислых бактерий и снижает кислотообразующую способность ацидофильной палочки.
В консорциуме с соотношением культур 1:2, в котором преобладает ацидофильная палочка, наблюдается повышение кислотообразующей способности, интенсифицируется процесс сквашивания, при этом снижается витаминсинтезирующая активность и количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки.
12
Экспериментальные данные позволяют сделать вывод о том, что наиболее оптимальным сочетанием культур пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки является соотношение 2:1. Данный консорциум отличается высоким содержанием витамина В, умеренной кислотностью, хорошими органолептическими показателями.
12
12
Важным биохимическим показателем пропионовокислых бактерий является способность синтезировать витамины группы В, в большей степени витамин В. В связи с этим, на следующем этапе работы был изучен процесс накопления витамина В в консорциуме культур Propionibacterium freudenreichii Ш-85 и L. acidophilus. Результаты представлены на фиг. 1.
12
12
Экспериментальные данные, представленные на фиг. 1, свидетельствуют о том, что в консорциуме содержание витамина В несколько меньше по сравнению с закваской на основе чистых культур пропионовокислых бактерий. Это вероятно связано с тем, что витамин В в консорциуме является ростовым фактором ацидофильной палочки.
Антагонистическая активность микроорганизмов по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре также является важной характеристикой пробиотической микрофлоры, используемой в производстве бактериальных концентратов и БАД.
В связи с этим, на следующем этапе работы была изучена антимутагенная и антибиотическая активность разработанного консорциума на основе культур Propionibacterium freudenreichii Ш-85 и L. acidophilus, который в дальнейшем будет использован для производства БАД и бактериальной концентрированной закваски. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Антагонистическая активность консорциума была изучена по отношению к таким наиболее часто встречающимся патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, как Е. coli, S. aureus и Pr. Vulgaris. Контролем служили чистые культуры Propionibacterium freudenreichii Ш-85 и L. acidophilus.
Данные таблицы 2 показывают, что консорциум обладает широким спектром антибактериальной активности, но отличается по своему действию на тест-культуры патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Наибольшую антагонистическую активность консорциум проявил по отношению к тест-культурам S. aureus и Pr. Vulgaris, наименьшую - к тест-культуре Е. coli.
Высокая антагонистическая активность консорциума, вероятно, обусловлена, способностью микрофлоры выделять антимикробные субстанции, например пропионовую кислоту (Propionibacterium freudenreichii Ш-85), бактериоцины, ацидолин и лактоцидин, продуцируемые L. acidophilus, синтез которых усиливается при симбиотических взаимоотношениях.
Отмечены высокие антимутагенные свойства ацидофильной палочки и пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii Ш-85. Количество синтезируемых антимутагенных веществ составляет у пропионовокислых бактерий 65,6%, а у ацидофильной палочки 50,9%.
Установлено, что консорциум имеет более высокую антимутагенную активность по сравнению с монокультурами. Антимутагенная активность консорциума составляет 70,5%.
12
Таким образом, результаты исследований показали, что консорциум на основе культур Propionibacterium freudenreichii Ш-85 и L. acidophilus обладает высокими антимутагенными, антибиотическими свойствами и синтезирует большое количество витамина В, что позволяет использовать его для создания биологически активной добавки и бактериального концентрата с высокими пробиотическими свойствами.
Важную роль при культивировании микроорганизмов играет активность посевного материала. Данные, представленные в таблице 3, свидетельствуют, что консорциум на основе пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки, обладает высокой биохимической активностью (таблица 3).
12
3
Для наращивания биомассы пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки была использована среда на основе молочной сыворотки и ростовых факторов. Нами установлено, что необходимая плотность популяции пробиотических микроорганизмов обеспечивается при внесении 5% инокулята. При выбранной дозе инокулята наблюдается активное накопление клеточной биомассы, о чем свидетельствует повышение оптической плотности. Установлено, что количество клеток пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки в конце культивирования достигает 10 к.о.е./см. Рост биомассы сопровождается образованием экзополисахаридов (см. фиг. 2).
Данные, представленные на фиг. 2, показывают, что синтез экзополисахаридов начинается с первых часов развития заквасочных культур и продолжается на всех стадиях. Максимальное количество экзополисахаридов отмечено в стационарной фазе роста и составляет 47,5 мкг/мл.
Оценку качества бактериального концентрата в процессе хранения проводили по количеству жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки и изменению ферментационной активности. Показатели качества концентрата определяли в течение четырех месяцев хранения. Температура хранения концентрата (6±2)°C. Результаты представлены в таблице 4.
В результате проведенных исследований установлено, что в течение трех месяцев хранения бактериальный концентрат сохраняет высокую биохимическую активность.
10
3
Количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки к концу четвертого месяца хранения составило 10 к.о.е./см, что на два порядка ниже, чем в начале хранения. Незначительное уменьшение количества жизнеспособных клеток в течение трех месяцев не повлияло значительно на показатели качества бактериального концентрата и продолжительность ферментации составляет не более 7-8 часов. Следовательно, три месяца является оптимальным сроком хранения жидкого бактериального концентрата.
Длительное хранение биопрепаратов с сохранением ценных свойств и жизнеспособности может быть обеспечено только методами консервирования, способными тормозить процессы метаболизма, не нарушая целостность биоматериала.
Жидкий бактериальный концентрат на основе пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки можно рекомендовать для использования в качестве биологически активной добавки. Для применения на предприятиях молочной промышленности целесообразно разработать замороженную и сухую формы бактериального концентрата, имеющего длительный срок хранения. Поэтому в дальнейших исследованиях необходимо изучить выживаемость клеток пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки при различных условиях консервации.
На первом этапе исследований, было изучено влияние криоанабиоза на выживаемость клеток микроорганизмов в консорциуме.
Выживаемость микроорганизмов при хранении зависит от состава резервных веществ в клетках, а также количества микроорганизмов в полученной биомассе, и характера взаимоотношений между бактериями и криопротектором.
Защитная среда также обеспечивает сохранение жизнеспособности клеток пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки при длительном хранении замороженной концентрированной закваски.
Контроль качества замороженного бактериального концентрата в процессе хранения проводили по количеству жизнеспособных клеток и изменению биохимической активности. Хранение замороженной концентрированной закваски осуществляли в течение семи месяцев при температуре минус (18±2)°C. Результаты представлены в таблице 5.
9
3
9
3
Анализ данных, представленных в таблице 5, показывает, что в течение шести месяцев хранения замороженный бактериальный концентрат сохраняет высокую биохимическую активность, а на седьмой месяц хранения активность закваски незначительно уменьшается. Количество жизнеспособных клеток к концу седьмого месяца хранения снизилось на один порядок и составляет 8×10 к.о.е./см пропионовокислых бактерий и 9×10 к.о.е./см ацидофильной палочки.
При температуре хранения бактериального концентрата минус (18±2)°C на клетку в меньшей степени оказывают влияние внешние факторы, и обеспечивается анабиотическое состояние, при котором происходит предельное торможение метаболизма и сохранение структуры в течение продолжительного времени хранения. Незначительное уменьшение количества жизнеспособных клеток к концу шести месяцев хранения не повлияло значительно на показатели качества концентрата. Таким образом, шесть месяцев является оптимальным сроком хранения замороженного бактериального концентрата.
Важной задачей при производстве бактериальных препаратов, в том числе заквасок для пищевой и биотехнологической промышленности, медицины, является сохранение жизнеспособности микроорганизмов довольно длительное время.
На следующем этапе работы проводили лиофилизацию замороженного бактериального концентрата на основе созданного микробного консорциума культур Propionibacterium freudenreichii Ш-85 и L. acidophilus.
Начальная температура сушки замороженной биомассы составила (-18°C), досушивание проводили при температуре (37-38)°C. В процессе сушки остаточное давление в системе поддерживали в пределах 0,13-1,3 Па. Продолжительность процесса контролировали по показателю остаточной влажности бактериального концентрата. После проведения процесса лиофилизации оценивали качество сухой бактериальной концентрированной закваски по количеству жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки (фиг. 3).
10
3
10
3
Из данных фиг. 3 видно, что процесс лиофилизации привел к незначительной гибели клеток пробиотических микроорганизмов бактериального концентрата. Количество пропионовокислых бактерий оставалось на достаточно высоком уровне и составило 7×10 к.о.е./см, количество ацидофильной палочки - 5×10 к.о.е./см.
В дальнейшем, проводили активизацию сухого бактериального концентрата на молоке методом прямого внесения при температуре молока 30°C (фиг. 4).
9
3
Данные, представленные на фиг. 4, показывают, что при активизации сухого бактериального концентрата продолжительность ферментации составляет 10 часов. Кислотность достигает в конце ферментации (76±5)°T, количество жизнеспособных клеток пробиотических микроорганизмов в биопродукте остается на высоком уровне и составляет 10 к.о.е./см, что свидетельствует о высокой биохимической активности сухого бактериального концентрата.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что сухой бактериальный концентрат пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки обладает высокой биохимической активностью и способен ферментировать молоко путем прямого внесения. Применение сухого бактериального концентрата для получения кисломолочных биопродуктов позволит исключить пересадки, что повлияет на снижение себестоимости готовой продукции, и улучшить санитарно-гигиенические показатели биопродукта.
Изменение количества жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки в процессе хранения показано в таблице 6.
10
3
Установлено, что в сухом бактериальном концентрате пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки при хранении в течение 12 месяцев количество жизнеспособных клеток остается на высоком уровне 10 к.о.е./см. Высокая выживаемость клеток пробиотических микроорганизмов в стрессовых процессах замораживания и сушки, и в процессе хранения обусловлена составом питательной и защитной сред.
В таблице 7 представлены показатели качества сухого бактериального концентрата.
10
3
Проведенные исследования показали возможность получения сухой концентрированной бактериальной закваски прямого внесения на основе замороженного бактериального концентрата, содержащей высокий титр жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий и ацидофильной палочки 10 к.о.е./см и обладающей выраженной биохимической активностью.
Таким образом, заявляемый способ обеспечивает повышение биохимической активности и пробиотических свойств бактериального концентрата.
Заявляемый способ осуществляют следующим образом.
При получении бактериального концентрата средой для наращивания пробиотических микроорганизмов служит осветленная сыворотка. Для осветления сыворотки ее нагревают до температуры (92-95)°C и выдерживают для полного выделения белков в течение 30 минут, фильтруют. В подготовленную сыворотку вносят хлористый магний, натрий лимоннокислый трехзамещенный, калий лимоннокислый однозамещенный, аскорбиновую кислоту, агар-агар, рН среды устанавливают в пределах 6,8-7,0. Готовую среду стерилизуют при температуре (121±1)°C в течение 30 минут, охлаждают до температуры 30°C и вносят консорциум (инокулят) в количестве 3-5%, перемешивают.
Консорциум состоит из активизированных β-галактозидазой культур пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii Ш-85 и ацидофильной палочки Lactobacillus acidophilus штамм вязкой расы ВНИМИ, взятых в соотношении 2:1.
3
Наращивание клеток проводят в течение 16-20 часов при температуре (30±1)°C. В процессе культивирования осуществляют контроль за показателем рН в пределах 6,6-7,0. По окончании процесса культивирования производят отделение бактериальной массы от культуральной жидкости центрифугированием при n=3000 об/мин, продолжительность 15 минут. Выход бактериальной массы составляет (1,5-2)%. Полученную суспензию клеток смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, разливают во флаконы по (2±0,1) см (1 доза), и замораживают при температуре минус 25°C. Хранение концентрата осуществляют в морозильной камере при температуре минус 18°C. Замороженный концентрат сохраняет активность сквашивания молока до 6 месяцев.
Пример 1. Получение жидкого бактериального концентрата на основе симбиоза пробиотических микроорганизмов.
Сыворотку нагревают до температуры 92°C и выдерживают для полного выделения белков в течение 30 минут, фильтруют. В подготовленную сыворотку вносят хлористый магний, натрий лимоннокислый трехзамещенный, калий лимоннокислый однозамещенный, аскорбиновую кислоту, агар-агар, рН среды устанавливают в пределах 6,8. Готовую среду стерилизуют при температуре 120°C в течение 30 минут, охлаждают до температуры 30°C и вносят инокулят в количестве 3%, перемешивают. Инокулят состоит из активизированных Р-галактозидазой культур пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii Ш-85 и ацидофильной палочки Lactobacillus acidophilus штамм вязкой расы ВНИМИ, взятых в соотношении 2:1.
Наращивание клеток проводят в течение 24 часов. По окончании процесса бактериальную массу охлаждают до 4°C. Затем проводят декантацию верхнего слоя сыворотки и разливают по флаконам. Жидкий бактериальный концентрат хранят в течение трех месяцев при температуре (6±2)°C.
Пример 2. Получение замороженного бактериального концентрата на основе симбиоза пробиотических микроорганизмов.
Сыворотку нагревают до температуры 92°C и выдерживают для полного выделения белков в течение 30 минут, фильтруют. В подготовленную сыворотку вносят хлористый магний, натрий лимоннокислый трехзамещенный, калий лимоннокислый однозамещенный, аскорбиновую кислоту, агар-агар, рН среды устанавливают в пределах 6,8. Готовую среду стерилизуют при температуре 120°C в течение 30 минут, охлаждают до температуры 30°C и вносят инокулят в количестве 3%, перемешивают. Инокулят состоит из активизированных β-галактозидазой культур пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii Ш-85 и ацидофильной палочки Lactobacillus acidophilus штамм вязкой расы ВНИМИ, взятых в соотношении 2:1.
3
Наращивание клеток проводят в течение 20 часов при температуре 30°C. В процессе культивирования осуществляют контроль за показателем рН в пределах 6,6. По окончании процесса культивирования производят отделение бактериальной массы от культуральной жидкости центрифугированием при n=3000 об/мин, продолжительность 15 минут. Выход бактериальной массы составляет (1,5-2)%. Полученную суспензию клеток смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, разливают во флаконы по (2±0,1) см (1 доза), и замораживают при температуре минус 25°C. Хранение концентрата осуществляют в морозильной камере при температуре минус 18°C. Замороженный концентрат сохраняет активность сквашивания молока до 6 месяцев.
Пример 3. Получение замороженного бактериального концентрата на основе симбиоза пробиотических микроорганизмов.
Сыворотку нагревают до температуры 93°C и выдерживают для полного выделения белков в течение 30 минут, фильтруют. В подготовленную сыворотку вносят хлористый магний, натрий лимоннокислый трехзамещенный, калий лимоннокислый однозамещенный, аскорбиновую кислоту, агар-агар, рН среды устанавливают в пределах 6,9. Готовую среду стерилизуют при температуре 121°C в течение 30 минут, охлаждают до температуры 30°C и вносят инокулят в количестве 5%, перемешивают. Инокулят состоит из активизированных β-галактозидазой культур пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii Ш-85 и ацидофильной палочки Lactobacillus acidophilus штамм вязкой расы ВНИМИ, взятых в соотношении 2:1.
3
Наращивание клеток проводят в течение 20 часов при температуре 29°C. В процессе культивирования осуществляют контроль за показателем рН в пределах 6,8. По окончании процесса культивирования производят отделение бактериальной массы от культуральной жидкости центрифугированием при n=3000 об/мин, продолжительность 15 минут. Выход бактериальной массы составляет (1,5-2)%. Полученную суспензию клеток смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, разливают во флаконы по (2±0,1) см (1 доза), и замораживают при температуре минус 25°C. Хранение концентрата осуществляют в морозильной камере при температуре минус 18°C. Замороженный концентрат сохраняет активность сквашивания молока до 6 месяцев.
Пример 4. Получение сухого бактериального концентрата на основе симбиоза пробиотических микроорганизмов.
Сыворотку нагревают до температуры 92°C и выдерживают для полного выделения белков в течение 30 минут, фильтруют. В подготовленную сыворотку вносят хлористый магний, натрий лимоннокислый трехзамещенный, калий лимоннокислый однозамещенный, аскорбиновую кислоту, агар-агар, рН среды устанавливают в пределах 6,8. Готовую среду стерилизуют при температуре 120°C в течение 30 минут, охлаждают до температуры 30°C и вносят инокулят в количестве 3%, перемешивают. Инокулят состоит из активизированных β-галактозидазой культур пропионовокислых бактерий Propionibacterium freudenreichii Ш-85 и ацидофильной палочки Lactobacillus acidophilus штамм вязкой расы ВНИМИ, взятых в соотношении 2:1.
3
Наращивание клеток проводят в течение 20 часов при температуре 30°C. В процессе культивирования осуществляют контроль за показателем рН в пределах 6,6. По окончании процесса культивирования производят отделение бактериальной массы от культуральной жидкости центрифугированием при n=3000 об/мин, продолжительность 15 минут. Выход бактериальной массы составляет (1,5-2)%. Полученную суспензию клеток смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, разливают во флаконы по (2±0,1) см (1 доза), замораживают при температуре минус 18°C и высушивают в лиофильной сушке. Флаконы с бактериальным концентратом закрывают стерильными пробками и закатывают металлическими колпачками. Сухой бактериальный концентрат хранят в течение 12 месяцев при температуре минус (18±2)°C.