Прогресс молекулярно-биологических технологий и клинические перспективы

аспекты преаналитического и постаналитического этапов, информационные системы.

О.С. Сергеева, А.Н. Насонов. Практические результаты оптимизации преаналитического этапа и внедрения систем автоматизации в централизованных лабораториях на примере лаборатории Клинико-диагностического центра № 1, Москва. Sarstedt AG&Co.

Основным этапом оптимизации и стандартизации преаналитического этапа лабораторных исследований является выявление и устранение ошибок и "узких" мест, так называемый аудит:

- в самой лаборатории;

- вне ее, т. е. в удаленных пунктах взятия биологического материала.

Вне лаборатории работа, проводимая методистами, направлена на снижение числа общих преаналитических ошибок, стандартизацию расходных материалов и создание СОП преаналитических процедур, включающих взятие, штрих-кодирование и транспортировку проб биологических материалов. В централизованной лаборатории совокупное проведение работ позволяет сократить число повторных заказов и ошибочных проб, в случае удаленного заказа тестов - снизить число "потерянных" проб или направлений. Внутри лаборатории система автоматизации преаналитического этапа позволяет оптимизировать логистику и маршрутизацию потоков проб.

Основной результат внедрения систем автоматизации -это сокращение времени получения результата исследования в 2-3 раза (на основе статистики лабораторий с установленными системами такого типа).

М.Г. Светашев. Вопросы взаимодействия информационных систем и систем автоматизации в лаборатории. Sarstedt AG&Co.

Внедрение систем автоматизации подразумевает их взаимодействие с лабораторными информационными системами.

Требования к лабораторной информационной системе, сформированные на опыте внедрения систем автоматизации преаналитического этапа:

- поддержка быстрой регистрации всего необходимого для системы автоматизации набора данных; уникальный номер штрих-кода и заказанные тесты. При этом должна быть возможность раздельной регистрации данных самого пациента и данных биологического материала;

- поддержка уникальной идентификации пробирок биологического материала и направлений (исключение ошибок и дубликатов в течение длительного промежутка времени);

- поддержка обмена данных в режиме "по запросу" (так называемый Querymode);

- наличие модуля архивирования проб биологического материала, т.е. адресного хранения проб в стеках и штативах.

ПРОГРЕСС МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ

и клинические перспективы

С.Н. Щербо, Д.С. Щербо. Микро-РНК - новый класс биомаркеров лабораторной и персонализированной медицины. ГБОУ ВПО "Российский научно-исследовательский медицинский университет" Минздрава России, Москва

Известно более двух тысяч коротких РНК: микро-РНК (miRNA) человека, информация о которых сосредоточена в базе данных - miRBase, каждая из которых может регулировать работу сотен генов-мишеней. Велика роль коротких РНК в регуляции трансляции, формировании неактивного "молчащего хроматина" (silent chromatin) и обеспечении защиты клетки от перемещающихся подвижных элементов (транспо-зонов). Функционирование "коротких" РНК осуществляется при их комплементарном взаимодействии с цитоплазмати-ческими и ядерными транскриптами по механизму РНК-интерференции (РНКи). Микро-РНК - класс малых РНК, которые имеют длину около 22 нуклеотидов, кодируются генами и играют важную роль в регуляции трансляции и деградации мРНК. Микро-РНК - полиморфизм (miR-polymorphisms), новый класс полиморфизмов в геноме человека, который ассоциируется с многими заболеваниями: онкологическими, неврологическими, сердечно-сосудистыми и эндокринными и оказывает влияние на ответ лекарственным средствам путем влияния на экспрессию генов-мишеней. Так, содержание микро-РНК более информативно для диагностики рака, чем длинные, кодирующие белок РНК. В 2006 г открыто явление РНК интерференции (РНКи) - специфической деградации молекул РНК с помощью образования двухцепочечных молекул РНК и их избирательной деградации. Открытие РНКи показало, что контроль над работой генов в организме человека вполне возможен, и начались клинические испытания первых лекарственных средств, основанных на РНКи. В биомедицине проведено большое количество исследований биологических эффектов РНКи, связанных с онкологическими, сердечно-сосудистыми, инфекционными заболеваниями, нейробиологией. Изучение нкРНК - одно из наиболее динамично развивающихся направлений современной биомедицины, в том числе малых ядрышковых РНК ^поРНК - smoll

nucleolar RNAs) и малых ядерных РНК ^пРНК - smoll nuclear RNAs). Изменение экспрессии snoРНК и связанных с ними белков могут вносить вклад в развитие ряда заболеваний: наследственных, аутоиммунных, онкологических, и уровень их экспрессии изменяется при различных состояниях организма (вирусных инфекциях, хирургическом вмешательстве и др.). Длинные 1псРНК, вероятно, представляют собой первичный фактор многих мультифакторных заболеваний человека, включая сердечно-сосудистые и неврологические заболевания, псориаз, лейкоз, рак простаты, толстой кишки и др. В различных опухолях, таких как карцинома легкого и РМЖ, происходит сверэкспрессия 1псРНК, а 1псРНК HOTAIR является точным предиктором метастазов при опухолях молочной железы. Методом ПЦР с детекцией в режиме реального времени показано, что микро-РНК: MiR-21, -155, -222 и -10b являются кандидатами в качестве биомаркеров для РМЖ. Семейство микро-РНК-183 (miR-183) предлагается в качестве многообещающего биомаркера для ранней диагностики и точного прогноза онкологических заболеваний, а также для более эффективного лечения. Одним из механизмов регуляции генов микро-РНК является метилирование CpG-островков их промоторных участков. Показано отсутствие метилирования промоторных CpG-островков генов mir-107 и 130b при немелкоклеточном раке легкого и выявлены корреляции частоты метилирования генов mir-125 b-1 и mir-137 с показателями прогрессии заболевания. Анализ метилирования может проводиться с применением метилспецифич-ной ПЦР. С помощью оценки экспрессии микро-РНК можно улучшить гистологическую классификацию различных типов раков, прогноза течения заболевания.

Многие микро-РНК принимают активное участие в развитии нервной системы и могут быть связаны с развитием нейродегенеративных заболеваний, изменяя профиль своей экспрессии при болезнях Альцгеймера и Паркинсона. Изучается роль рассматриваемого типа биомаркеров в возникновении и развитии гематологических (лимфома, лейкозы), психиатрических (шизофрения) заболеваний, ишемической

болезни сердца, мышечной патологии, псориаза, регуляции уровня РНК вирусами (гепатит C, Эпштейна-Барр вирус, ВИЧ-1) и других патологических процессов.

А.Ю. Аникаев. Применение секвенирования нового поколения (NGS) в клинической практике. ООО "ИнтерЛаб-Сервис", Москва

Стремительное развитие молекулярно-биологических технологий предъявляет новые требования к качеству медицинской диагностики в современном мире. В настоящее время для идентификации клинически значимых мутаций в геноме пациента используется широкий спектр молекулярно-биологических методов. Однако наиболее комплексным подходом, обеспечивающим достоверный результат подобных исследований, является прямое определение нуклеотидной последовательности интересующих участков генома пациента, которое достигается секвенированием ДНК. В начале XXI века стало возможным применение методов массового параллельного секвенирования, т. е. определения нуклеотид-ного состава молекулы ДНК. Секвенирование нового поколения (англ. - Next-generation sequencing, NGS) явилось предпосылкой к возникновению нового научно-практического направления - молекулярной медицины, в которой проблемы диагностики, профилактики и лечения решаются на молекулярном уровне при помощи анализа нуклеиновых кислот (ДНК, РНК) и продуктов их экспрессии (белков). Сегодня можно выделить несколько основных компаний, реализующих технологии секвенирования NGS:454 Sequencing, Illumina, Life Technologies, Pacific Biosciences. На данный момент лидирующую позицию занимает компания Illumina: ~ 90% всех данных секвенирования в мире получены на сек-венаторах Illumina.

Высокая точность получаемых результатов и производительность позволила использовать технологию секвенирова-ния Illumina для проведения медицинских исследований и генетической диагностики. В частности, секвенатор MiSeq (модель MiSeqDx) стал первым в мире секвенатором нового поколения, получившим марку CE IVD и одобрение FDA. Это означает, что MiSeq может использоваться в целях клинической генетической диагностики в странах Европейского союза и США соответственно. Точность получаемых данных позволяет быть уверенным в полученном результате, избежать явления ложноположительных и ложноотрицательных результатов, часто встречающихся при проведении стандартных молекулярных методик.

Проверенная технология секвенирования NGS позволяет секвенаторам Illumina быть эффективными инструментами для осуществления быстрого и эффективного генетического анализа для широкого круга областей применения на базе одного прибора: диагностика генетических заболеваний и предрасположенности, дифференциальная диагностика рака, фармакогенетические исследования, полногеномный анализ инфекционных возбудителей, метагеномов, HLA-типирование и др. Готовые диагностические наборы реагентов, разработанные совместно с ведущими мировыми научными и медицинскими центрами, обеспечат простой процесс подготовки образцов и выдачи результатов анализа участков генома, имеющих отношение к той или иной патологии. Кроме того, применение секвенирования NGS позволяет проводить ранее невозможные диагностические исследования, в частности неинвазивную пренатальную диагностику, при которой анализ генетических нарушений плода проводится по материалу, выделенному из крови матери, без операционной инвазии в околоплодное пространство.

Таким образом, возможность проведения нескольких раз-нотиповых анализов на базе одного прибора, способности проводить автоматический анализ с интерпретацией результатов, точности проведения генетического анализа, метод секвенирования NGS является эффективным решением для проведения лабораторной диагностики. Применение технологий секвенирования нового поколения способно дать мощнейший толчок для развития медицинской области в Россий-

ской Федерации и выйти на новый этап развития медицины, превентивной диагностики, тем самым способствуя повышению точности диагностики и эффективности лечения пациентов.

Р.Н. Котельников. Концепция автоматизации ПЦР-исследований от компании "ИнтерЛабСервис". Компания "ИнтерЛабСервис", Москва

Компания "ИнтерЛабСервис" осуществляет комплексное оснащение ПЦР-лабораторий, включая поставку реагентов, расходных материалов и оборудования. Оборудование для автоматизации выделения ДНК/РНК различается по производительности. При потоке 50-300 образцов в день оптимально использовать высокопроизводительную станцию Neon-100 (Xiril, Швейцария), которая позволяет проводить экстракцию нуклеиновых кислот (НК) из образцов плазмы крови, урогенитальных, респираторных мазков, мочи, мокроты или клещевой суспензии (1-96 образцов за запуск). Станция Neon-100 использует отечественный набор реагентов МАГНО-сорб (ЦНИИ эпидемиологии, Москва), что обеспечивает низкую себестоимость анализа.

При потоке до 72 образцов в день используются станции QIAcube (QIAGEN, Германия) и MagPurix 12s (Zinext, Тайвань), позволяющие обрабатывать до 12 образцов за запуск. Отличительной особенностью станции QIAcube является возможность выделять НК из широчайшего спектра образцов - от плазмы крови до образцов почвы. Станция MadPurix 12s отличается непревзойденной простотой использования.

Станция QIAsymphony, модуль SP (QIAGEN, Германия) позволяет выделять ДНК/РНК с использованием наборов реагентов производства компании QIAGEN, признанного мирового лидера в сфере реагентики для выделения НК. Пропускная способность станции QIAsymphony 24-144 образца в день. Станция обладает системой зашиты от случайных ошибок пользователя, что гарантирует высочайшее качество результата.

Для подготовки образцов к ПЦР компания "ИнтерЛаб-Сервис" предлагает станцию QIAgility (QIAGEN, Германия), которая отличается удобным, русифицированным программным обеспечением (ПО), и модуль AS станции QIAsymphony, который совместно с модулем SP автоматизирует весь процесс пробоподготовки.

Для проведения ПЦР используется амплификатор RotorGene Q (QIAGEN, Германия), который благодаря роторному дизайну позволяет проводить высокоточный ПЦР-анализ, и плашечный амплификатор LineGene (BIOBR, Китай), отличающийся низкой стоимостью прибора,

Для контроля этапов сортировки образцов, выделения ДНК/РНК, подготовки образцов к ПЦР, ПЦР и анализа результатов разработано специальное управляющее ПО, которое интегрируется с лабораторной информационной системой (ЛИС) и позволяет заметно упростить процесс тестирования. Управляющее ПО формирует рабочее задание для каждого прибора, сводя работу пользователя только к установке образцов, реагентов и расходных материалов.

Управляющее ПО комплекса КДЛ-макс (станция Xiril для выделения НК и станция Xiril для подготовки образцов к ПЦР) позволяет полностью автоматизировать работу со всеми наборами реагентов "АмплиСенс" (ЦНИИ эпидемиологии, Москва), включающими самый широкий спектр наборов для молекулярной диагностики на отечественном рынке. Комплекс КДЛ-прайм (станция Piro для подготовки образцов к ПЦР) специально создан для коммерческих лабораторий и позволяет использовать недорогие экспресс-методы выделения НК и автоматизировать сложную подготовку урогени-тальных образцов к ПЦР.

Комплексы, предназначенные для станций переливания крови, позволяют автоматизировать пулирование и ПЦР-тестирование донорской плазмы. Комплекс СПК-Лайт (станция Xiril и амплификатор Rotor-Gene Q) позволяет достичь производительности 500 образцов плазмы доноров в день, а комплекс СПК-Стандарт (2 станции Xiril (для пулирования

и для выделения НК) и амплификатор Rotor-Gene Q) - 700 образцов в день, сохраняя низкую стоимость тестирования каждого образца. Комплекс СПК-Премиум (станция Xiril, станция QIAsymphony SP/AS и 2 амплификатора Rotor-Gene Q) оптимален для СПК, желающих использовать для выделения НК реагенты европейского производства (QIAGEN) и обладает производительностью до 700 образцов в день.

Д.Ю. Дроботова. Эффективная диагностика инфекции Mycobacterium tuberculosis - IGRA тест Квантифе-рон ТБ-Голд (QuantiFERRON-TB Gold). ООО "Интер-ЛабСервис", Москва

Существующая ситуация заболеваемости населения туберкулезом, как в мире, так и в России, требует пристального внимания, объединения усилий и внедрения современных технологий.

Туберкулез - инфекция, вызываемая инфицированием сложными организмами M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum). Заражение, как правило, происходит воздушно-капельным путем от больного, страдающего туберкулезом дыхательных путей. Инфицированный может заболеть туберкулезом в период от нескольких недель до нескольких месяцев, также у некоторых инфицированных развивается латентная туберкулезная инфекция. Латентная туберкулезная инфекция (ЛТБИ) - это заболевание, которое не передается контактным путем и может протекать асимпто-матически в течение многих лет. У некоторых индивидуумов туберкулез может развиться позже и спонтанно. Основная цель диагностирования ЛТБИ - назначение медицинского лечения для предотвращения заболевания туберкулезом.

До недавнего времени кожный туберкулиновый тест (реакция Манту, Диаскин-тест) был единственным доступным методом диагностирования ЛТБИ. Чувствительность кожного покрова к туберкулину развивается в течение 2-10 нед после заражения. Тем не менее у некоторых инфицированных реакция на туберкулин не выявляется, к этой группе относятся, например, больные с нарушенной иммунной функцией. С другой стороны, у некоторых испытуемых, которые с высокой долей вероятности не являются инфицированными M. tuberculosis, выявляется чувствительность к туберкулину и положительная реакция на туберкулиновый кожный тест после вакцинации бациллой Calmette-Gurin (BCG), после инфицирования ми-кобактерией, отличной от комплекса M. tuberculosis, или же в силу других неопределенных факторов. Также кожный туберкулиновый тест для некоторых групп может быть даже опасен по причине развития аллергической реакции.

Одной из последних мировых разработок в области диагностики туберкулезной инфекции является тест Кван-тиферон QuantiFERON-TB Gold. QuantiFERON-TB Gold является непрямым тестом на присутствие инфекции M. tuberculosis (латентную туберкулезную инфекцию, включая саму болезнь).

Уникальной особенностью данного теста является то, что он определяет клеточный ответ Т-лимфоцитов на антигены возбудителя в пробирке, т. е. является in vitro-тестом. Отсутствие необходимости контакта пациента с туберкулиновым антигеном позволяет использовать данный тест у пациентов с риском развития аллергической реакции.

Для стимулирования клеточного ответа используются антигены возбудителя, не содержащиеся в BCG. Таким образом, использование данного теста может гарантировать отсутствие перекрестных реакций и как следствие ложнопо-ложительных случаев диагностики, как при использовании кожного туберкулинового теста.

QuantiFERON-TB Gold является значительно более чувствительным, чем классический кожный туберкулиновый тест (реакция Манту). Специфичность составляет 99,2%, что означает, что ложноположительные результаты получаются менее чем в 1% случаев (для реакции Манту процент ложно-положительных реакций составляет от 3 до 65 в зависимости от популяции).

QuantiFERON-TB Gold одобрен контролирующими ор-

ганами США (Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов - FDA), Евросоюза (CE-марка) и ряда стран Азии. Также QuantiFERON-TB Gold рекомендован как "золотой стандарт" определения латентной туберкулезной инфекции в США и Евросоюзе.

Только общее понимание необходимости четко скоординированного сотрудничества с применением новейших средств диагностики позволит взять под контроль эпидемическую ситуацию по туберкулезу.

Е.Е. Баранова1,2, А.Е. Донников12, Т.Е. Кошкина3, Г.Ж. Мсхалая4, Е.Е. Захарова4, В.В. Залетова4, Д.Ю. Трофимов12. Частоты делений STS-маркеров локуса AZF в группе мужчин, проходящих лечение бесплодия в программе ЭКО/ ИКСИ. 'ФГБУ "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова" Минздрава Российской Федерации, Москва; 2ЗАО "НПФ ДНК-Технология"; 3ООО "ДНК-Технология"; 4Медицинская клиника репродукции МАМА, Москва

По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) от бесплодия страдает до 15% всех пар репродуктивного возраста в мире. От 30 до 50% случаев азооспермии, криптозооспермии и олигозооспермии тяжелой степени (менее 5 млн/мл) обусловлены генетическими нарушениями, из них не менее 12-15% случаев объясняются носительством микроделеций локуса AZF (Azoospermia Factor - фактор азооспермии). В локусе AZF длинного плеча Y-хромосомы, выделены три региона: AZFa, AZFb и AZFc, для каждого из этих регионов описаны STS-маркеры (Sequence-Tagged Sites), позволяющие выявлять микроделеции этих регионов. Также, для каждого из регионов описаны наиболее значимые гены, участвующие в контроле сперматогенеза. По рекомендациям Европейской ассоциации урологов (ЕАУ), в диагностическую панель рекомендуется включать не менее 6 STS-маркеров, наиболее сильно ассоциированных с нарушением сперматогенеза: sY84, sY86 для региона AZFa, sY127, sY134 для региона AZFb и sY254, sY255 для региона AZFc. Однако в научных публикациях придается значение и определению ряда других STS-маркеров, частоты которых и их клиническая значимость все еще изучаются. Цель нашего исследования - оценить частоту наиболее перспективных в клиническом плане делеций STS-маркеров локуса AZF хромосомы Y, выбранных при анализе литературы, - sY84, sY86, sY615, sY127, sY134, sY254, sY255, sY1192, sY1291, sY242, sY1125, sY1197, sY1206 и sY142 в группе мужчин, обратившихся в специализированную клинику для прохождения программы ЭКО/ИКСИ.

По результатам спермиологического анализа эякулята, который проводился не менее двух раз в соответствии с рекомендациями ВОЗ от 2010 г., в исследование включены образцы от 108 мужчин с разной степенью снижения количества сперматозоидов в эякуляте, которым проводилось лечение бесплодия в программе ЭКО/ИКСИ (основная группа) и 31 фертильный мужчина с нормозооспермией (контрольная группа). Всем мужчинам проводилось ДНК-типирование 14 STS-маркеров - sY84, sY86, sY615, sY127, sY134, sY254, sY255, sY1192, sY1291, sY242, sY1125, sY1197, sY1206 и sY142 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с помощью коммерческой тест-системы

000 "НПО ДНК-Технология", Россия.

Микроделеции локуса AZF были выявлены у 28 (26%) в

основной группе и у 3 (10%) мужчин в контроле. Делеции STS-маркера sY1192 выявлялись как в основной группе у 16 (15%), так и в контрольной группе у 2 (7%). В группе контроля делеция маркера sY1291 (gr/gr делеция) встретилась у

1 (3%) пациента , в основной группе она составила 8 (8%). Частота прочих микроделеций в основной группе составила: sY1197 - 8 (8%), sY254, sY255, sY242, sY1206 и sY142 - по 5 (5%), sY127, sY134 - 2 (2%). В группе контроля не встречено данных микроделеций. Не встречено делеций - sY84, sY86, sY615 и sY1125 ни в одной группе.

Полные делеции регионов AZFb + AZFc и делеции AZFc:

b2/b3 наблюдались только у мужчин с тяжелыми нарушениями сперматогенеза. Частичные делеции локуса AZFc: деле-ции маркеров sY1192 и sY1291 встречались как у мужчин с нарушением сперматогенеза, так и в группе контроля, делеции sY1197 выявлены только в основной группе.

М.К. Иванов13, В.В. Дзюбенко', Н.А. Гасилова3, В.Е. Кан-друшин', Е.В. Кандрушин'. Распространенность генотипов вируса папилломы человека высокого онкогенного риска среди пациентов крупной клинико-диагностической лаборатории. 'ЗАО "Вектор-Бест", Кольцово; 2ООО "Независимая лаборатория ИНВИТРО", Москва; 'Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

Инфицирование вирусом папилломы человека (ВПЧ) является причиной развития новообразований аногенитальных областей и дыхательных путей у мужчин и женщин, среди которых наибольшую угрозу представляет рак шейки матки (РШМ). Основным путем инфицирования является половой. Различные генотипы ВПЧ отличаются по патогенности. РШМ в подавляющем большинстве случаев ассоциирован с группой ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВПЧ ВКР). Возможна коинфекция несколькими типами ВПЧ. Относительная встречаемость различных типов при раке не соответствует встречаемости у клинически здоровых пациентов.

В более чем 80% случаях ВПЧ-инфекция носит временный характер (6-15 мес) и вирус элиминируется без лечения. Лишь у ~0,5% инфицированных развиваются клинические проявления различной тяжести. Длительность персистен-ции вируса является одним из основных факторов риска. От заражения до развития РШМ обычно проходит 15-20 лет, хотя известны случаи гораздо более быстрого развития рака. Как правило, инфекция протекает латентно, не вызывает жалоб, часто не выявляется при осмотре вплоть до стадии инвазивного рака. Специфической терапии против ВПЧ не существует.

ДНК ВПЧ может быть выявлена даже при отсутствии клинических проявлений у пациента. Следует учитывать, что инфицирование в большинстве случаев не указывает на на-личиё патологии и заканчивается спонтанной элиминацией вируса. Поэтому выявление ДНК ВПЧ не должно являться основанием для лечения без привлечения дополнительных данных. В ряде работ показано, что содержание ДНК ВПЧ ниже определенного значения (~103 геномов/100 тыс. клеток эпителия) практически не встречается при CIN2+ и может трактоваться как «клинически незначимое», а превышение порога ~105 геномов/100 тыс. клеток ассоциировано с существенно большей вероятностью наличия или прогрессии в CIN2+. В то же время указанные закономерности относительно надежно установлены только для ВПЧ 16 типа. В ряде случаев, особенно в молодом возрасте, высокое содержание ВПЧ ВКР не сопровождается ни наличием, ни последующим развитием патологии и в отсутствие клинических проявлений не требует медицинского вмешательства.

Целью настоящей работы являлся анализ вирусных нагрузок и относительной представленности различных генотипов ВПЧ ВКР (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59) в случайной выборке анонимных проб от пациентов ООО «Независимая лаборатория ИНВИТРО» (Москва), собранной в период с весны 2011 г. до весны 2013 г., а также выявление закономерностей, связанных с полом и возрастом пациентов.

Образцы урогенитальных соскобов были собраны в различных офисах ООО «Независимая лаборатория ИНВИТРО» и проанализированы в головных лабораториях. Суммарная выборка индивидуальных результатов тестирования после отбраковки невалидных результатов, связанных с ингибиро-ванием и недостаточным количеством материала, включала 160 888 женщин (преимущественно эндоцервикальные со-скобы) и 33 057 мужчин (преимущественно соскобы из уретры). Независимо от пола в выборке преобладали молодые люди (медиана 25 лет). Анонимные данные для каждого пациента включали пол, возраст и дату забора пробы. Выделе-

ние ДНК, определение вирусной нагрузки и генотипирова-ние ВПЧ ВКР методом ПЦР в реальном времени проводили с помощью наборов реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). Вирусную нагрузку оценивали на 1 мл пробы по каждому генотипу ВПЧ отдельно. Статистический анализ данных осуществляли при помощи разработанного нами программного обеспечения.

Вирусные нагрузки >104 копий на 1 мл пробы хотя бы по одному типу ВПЧ ВКР обнаружены у 35 248 (21,9%) женщин и 2 942 (8,9%) мужчин. Распределение ВПЧ ВКР-положительных проб по возрастным категориям в анализируемой выборке заметно зависело от пола: был выявлен относительно более высокий вклад в инфицированность по сравнению с ровесниками противоположного пола для женщин моложе 24 лет и мужчин старше 30. Молодые женщины достигают максимального уровня инфицированности в 2223 года, мужчины - в 25-26 лет, что может быть связано как с более ранним началом активной половой жизни, характерным для женщин из рассматриваемой выборки по сравнению с мужчинами, так и более активной колонизацией вирусом женского урогенитального тракта, приводящей к достижению более высоких вирусных нагрузок.

Для пациенток женского пола ожидаемо оказались более высокие нагрузки ВПЧ ВКР, в особенности для группы < 26 лет. С возрастом доля инфицированных женщин с нагрузкой >105 копий/мл относительно общего числа ВПЧ-инфицированных снижается, что может быть связано как с сопротивлением иммунной системы, так и со снижением риска перезаражения другими генотипами ВПЧ ВКР, против которых организм не иммунизирован, при контактах с новым половым партнером. Более низкие нагрузки, характерные для мужчин, указывают на то, что при использовании тестов, использующих отсечку по порогу «клинической значимости», существенная часть случаев инфицирования мужчин может оставаться невыявленной. При снятии такой отсечки инфицированность пациентов мужского пола оказывается достаточно высокой. Учитывая, что основным путем передачи ВПЧ является половой, это указывает на актуальность вопроса об участии мужчин в программах вакцинации против ВПЧ.

Как для мужчин, так и для женщин инфицированность возрастала с возрастом вплоть до 24-26 лет и затем постепенно снижалась до ~40 лет. Вслед за этим наблюдался рост инфицированности вплоть до >60 лет. Вторичный рост ин-фицированности ВПЧ, согласно отчетам ВОЗ, наблюдается в развивающихся странах, для населения которых более характерно приобретение новых половых партнеров в старшем возрасте (Центральная и Южная Африка, Южная Америка). Для России в целом подобные данные отсутствуют.

В анализируемой выборке ВПЧ 16 типа ожидаемо являлся преобладающим, на 2-3-м месте, независимо от пола и возраста, оказались ВПЧ 31 и ВПЧ 51. Относительная встречаемость ВПЧ 51 (у женщин ~4%, из них ~3% > 104 копий/мл) значительно превышает опубликованные данные, полученные с помощью других тестов и на других выборках. Относительная выявляемость разных генотипов ВПЧ ВКР у женщин слабо зависела от месяца забора пробы, колебания ее в течение двух лет оказались незначительными. Наблюдаемые вариации встречаемости генотипов у мужчин оказались значительно выше, что может являться следствием меньшего размера выборки, более низкой общей инфици-рованности мужчин, а также более низкими характерными нагрузками, приближающимися к пределу чувствительности тестов. У женщин для более агрессивного ВПЧ 16 оказались характерны более высокие вирусные нагрузки, чем для других типов. Вариации в распределении генотипов, связанные с возрастом, не выявлены.

В 2013 г. 907 образцов ДНК, выделенной из цервикаль-ных соскобов, проанализировано дополнительно на «более редкие» генотипы ВПЧ (68, 73 и 82). В сумме выявлен 61 (6,6%) образец , содержавший ДНК ВПЧ одного из этих

типов, при этом в 15 (1,6%) образцах не выявлена ДНК ни одного из типов ВПЧ ВКР, кроме ВПЧ 68, 73 или 82 (из них 8 с нагрузкой >104 копий в 1 мл пробы). Такая встречаемость этих генотипов оказалась выше ожидаемой и указывает на актуальность их выявления.

Впервые в России проанализирован массив единообразных данных, касающихся инфицированности крупной (~200 тыс. человек) выборки пациентов вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска.

Н.В. Фоменко', М.К. Иванов12. Выявление ДНК микроскопических грибов методом ПЦР в реальном времени: возможности и актуальность. 'ЗАО «Вектор-Бест»; 2Инсти-тут цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

Микроскопические грибы являются этиологическими агентами многих заболеваний, объединяемых общим названием «микозы». Среди микозов наиболее распространены кандидозы, вызываемые грибами рода Candida. Согласно данным литературы, наиболее распространенными возбудителями кандидозов считаются Candida albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei, однако относительная выявляемость разных видов варьирует в зависимости от патологии, выборки и метода исследования. Помимо кандид, значительную роль в этиологии микозов могут играть другие виды микроскопических грибов, такие как аспергиллы и пенициллы.

Цель нашей работы - анализ видовой принадлежности и количественного содержания микроскопических грибов, колонизирующих урогенитальный тракт женщин из случайной выборки пациенток диагностических лабораторий.

В работе проанализированы 1593 женских урогенитальных соскоба, предоставленных отделениями лаборатории «ИНВИ-ТРО» Москвы и Новосибирска и АНО ЦНМТ Новосибирска. Выявление ДНК грибов проводили с использованием наборов реагентов на основе ПЦР с детекцией в реальном времени «РеалБест Candida albicans/Fungi», «РеалБест ДНК Candida

krusei/Candida glabrata», «РеалБест ДНК Candida parapsilosis/ Candida tropicalis» и «РеалБест ДНК Candida famata/Candida guilliermondii» (ЗАО «Вектор-Бест», Новосибирск). Видовую принадлежность грибов устанавливали при помощи секвенирования вариабельных фрагментов генов 18S рРНК, 28 S рРНК и 5S рРНК-ITS2. Количественные оценки проводили с использованием калибровки по разведениям стандартных образцов, содержащих ДНК грибов в известной концентрации.

В урогенитальных соскобах женщин ДНК микроскопических грибов выявлена в 42,1% образцов. В 72% грибы представлены родом Candida. Помимо этого, выявлены плесневые грибы родов Aspergillus spp, Cryptococcus spp., Trichosporon spp., а также не классифицированные грибы. В 40 случаях видовая принадлежность не установлена из-за присутствия двух видов и более в одной пробе. Помимо C. albicans, выявленной в 15,4% случаев, обнаружена ДНК еще 12 видов рода Candida. Следующими после C. albicans по частоте встречаемости оказались C. Palmio leophita (19,6%) и C. Guillier mondii (6,6%). Суммарная встречаемость C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei составила 5,4%. Полученные результаты практически совпали для проб, полученных из Москвы и Новосибирска. Содержание ДНК грибов варьировало в диапазоне от 104 до 107 копий на соскоб, при этом для C. albicans оказались характерны более высокие нагрузки, что согласуется с данными литературы о более высокой па-тогенности этого вида. Однако, грибы других видов, в том числе не относящихся к выявляемым использованными тестами, также содержались в некоторых образцах в значительной концентрации, которая может являться клинически значимой (более 105 копий/образец и даже более 108).

Таким образом, показана возможность применения ПЦР с детекцией в реальном времени для выявления ДНК микроскопических грибов и актуальность расширения перечня выявляемых видов грибов.

публикации по проблеме

А.М. Бондарев, О.В. Островский, Т.А. Веровская, Е.П. Богатырева. Диагностические риски молекулярно-гене-тического исследования с использованием набора Prenatal BoBs™. ГБОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет

Мультиплексная диагностика анеуплоидий хромосом 21, 13, 18, X, Y и 9 микроделеционных синдромов осуществлялась с использованием набора Prenatal BoBs™ (PerkinElmer, США), включающего 81 зонд, на анализаторе Luminex 200 (Luminex Corporation, США). В качестве материала использовались ворсины хориона, клетки амниотической жидкости, кровь и архивные культивированные лимфоциты. Всего было исследовано 230 образцов. Для анализа данных применялась программа BoBsoft 2.0. Значимым считалось отклонение не менее 3 зондов к одному локусу за пределы 2 стандартных отклонений. Дополнительно проводился поиск подпорого-вых отклонений и мутаций затрагивающих менее 3 зондов.

Анализ архивного материала показал совпадение молекулярно-генетического и цито-генетического заключений при наличии в наборе зондов к целевым участкам генома. В одном случае молекулярное кариотипирование позволило уточнить механизм несбалансированной транслокации. Всего было выявлено 52 образца с отклонениями от нормы. Наиболее часто присутствовала трисомия 21 (21 случай). Также были выявлены трисомии 13, 18, анеуплоидии по половым хромосомам, два случая синдрома Вильямса, один случай синдрома кошачьего крика. Мутации, затрагивающие несколько фрагментов хромосом, выявлены в 7 образцах. Зонды к локусам микроделеционных синдромов позволили диаг-

ностировать не только сами эти синдромы, но и дупликации этих участков, а также несбалансированные транслокации (3 образца). В трех случаях, не выявляемых по стандартному критерию, мутация затрагивала только одно плечо либо для двух плеч изменения были разнонаправленными (образование изохромосомы). С одной стороны, это расширяет спектр патологии, выявляемой набором, с другой - усложняет медико-генетическое консультирование и требует привлечения дополнительных исследований. Чувствительность метода определяется коэффициентом вариации, который по рекомендациям производителя не должен превышать 9% для аутосомных зондов. Единичные случаи превышения этого показателя были связаны с низкой концентрацией ДНК после выделения из архивных образцов. При постановке проб в дублях во всех случаях результаты совпадали.

Для трех образцов отмечалось несоответствие молеку-лярно-генетического и цитогенетического заключений. В образце с триплоидией 69, XXY, подтвержденной цитогенети-чески, Prenatal BoBs™, хотя и выявил патологию, не позволил дифференцировать это состояние от мозаицизма по половым хромосомам или контаминации материнскими клетками. Не выявлена трисомия 16 вследствие отсутствия зондов к ней. В одном случае несовпадение вызвано наличием мозаицизма по половым хромосомам. При варьировании процентного содержания геномной ДНК с анеуплоидией минимальный детектируемый уровень мозаицизма составил 25%, что согласуется с данными литературы. Результаты при более низком уровне (12,5 и 6,25%) позволяли заподозрить патологию, однако сигнал не выходил за пороговый уровень.