СПОСОБ ЗАКРЫТИЯ ДЕФЕКТА ОПЛОДОТВОРЕННОГО ЯЙЦА ПРИ СОЗДАНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МОДЕЛИ
METHOD OF CLOSING DEFECT OF FERTILIZED EGG WHEN CREATING EXPERIMENTAL MODEL

Изобретение относится к способу обработки оплодотворенного яйца - закрытие искусственно созданного отверстия скорлупы оплодотворенного яйца в процессе эксперимента.
При изучении патогенетических механизмов различных заболеваний часто требуется создание экспериментальной модели с целью анализа морфологических, биохимических, гистологических показателей. При проведении экспериментов на курином эмбрионе возникает необходимость использования открытого доступа к эмбриону. Отверстие доступа может достигать диаметра 0,8×1,5 см. Для получения положительного результата завершения эмбриогенеза и вылупления птенца, необходимо сохранение гомеостаза яйца, как элемент - воссоздание целостности скорлупы.
Известен способ анализа и/или обработки оплодотворенного яйца (патент РФ на изобретение №2543263, МПК А01К 45/00, опубл. 27.02.2015), включающий в себя этап пункции и/или инъекции вещества в белковый мешок яйца, для чего в скорлупе яйца прокалывают отверстие вблизи острого конца яйца и вводят в указанное отверстие полую иглу. Дистальный конец полой иглы вводят в белковый мешок без прохода иглы через мешки с эмбриональными жидкостями или жизненно важные органы зародыша и выполняют пункцию вещества белкового мешка и/или впрыскивают в белковый мешок обрабатывающее вещество.
При данном способе выполняют маленькое отверстие, не задевая мешки с эмбриональными жидкостями или жизненно важные органы зародыша. Поэтому для сохранения гомеостаза яйца не возникает необходимости воссоздания целостности скорлупы. Для экспериментов, требующих больших размеров отверстия доступа данный способ неприменим.
Известен также способ проведения эксперимента на курином эмбрионе (https://studopedia.ru/2_122933_metodi-eksperimentalnogo-zarazheniya-kurinih-embrionov.html) путем заражения эмбриона.
Для заражения эмбриона этим методом его помещают в штатив горизонтально зародышем вверх.
В скорлупе делают два отверстия: одно небольшое над центром воздушной камеры, а другое диаметром 0,2-0,5 см сбоку, со стороны зародыша. Через боковое отверстие на поверхность хорионаллантоисной оболочки наносят инфекционную жидкость и отверстие закрывают кусочком лейкопластыря.
При таком способе возникает проблема вынужденного положения яйца - так как лейкопластырь промокает и возникает риск бактериальной обсемененности закрывающего материала, так как пропитывание происходит белком, который является благоприятным субстратом для роста бактериальной флоры. Так же «вынужденное» положение яйца - преимущественно в вертикальном положении - отрицательно влияет на развитие зародыша - формирование уродств. Потеря хориоаллантоисной жидкости вследствие пропитывания «укрывного» материала, оказывает отрицательное воздействие на сохранение гомеостаза яйца. Невозможность стерилизации «укрывного» материала значительно повышает риск присоединения бактериальной флоры через «окно» доступа. Вследствие наличия клейкого содержимого на поверхности лейкопластыря при контакте с белковой частью яйца, возникает риск отклеивания «укрывного» материала.
Наиболее близким, к предлагаемому, является способ закрытия дефекта при анализе и/или обработке оплодотворенного яйца (патент РФ на изобретение №2665136, МПК G01N 33/08, опубл. 28.08.2018). При данном способе экспериментальное отверстие скорлупы оплодотворенного яйца закрывается силиконовой крышечкой. Однако закрытие более чем 10% скорлупы в оплодотворенном яйце, приводит к развитию гипоксии эмбриона. (ОНТОГЕНЕЗ, 2009, том 40, №2, с. 136-147 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЭМБРИОЛОГИЯ УДК 591.3:616.152.21:611-013.84:591.4131.415 КАК ВЫЖИВАЕТ КУРИНЫЙ ЭМБРИОН ПОСЛЕ ЗАКРЫТИЯ ПОЛОВИНЫ СКОРЛУПЫ? © 2009 г. И.М. Коростышевская, В.Ф. Максимов ГУ НИИ физиологии СО РАМН 630117 Новосибирск, ул. Академика Тимакова, д. 4 E-mail: kor@physiol.ru). Гипоксия ускоряет развертывание программы эмбрионального развития и приводит к более ранней и быстрой дифференцировке газотранспортных систем. Однако эффективность антигипоксических реакций ограничивается невозможностью увеличения плотности капилляров в дыхательной сети хориона - суммарный объем сосудов хориоаллантоиса снижается, а в его открытой половине значительно утолщаются стенки артерий, что вызывает повышение периферического сопротивления. В левом желудочке развивается коронаросклероз и дистрофия кардиомиоцитов. Эти признаки нарушения общей гемодинамики сочетаются с заметной задержкой роста эмбрионов. Таким образом, структурная компенсация газотранспортных систем при данном способе оказывается исчерпанной и неспособной обеспечивать возрастающие метаболические запросы растущего эмбриона.
Задача (технический результат) предлагаемого изобретения заключается в разработке способа закрытия отверстия скорлупы оплодотворенного яйца при создании экспериментальной модели, свободного от вышеуказанных недостатков.
Поставленная задача решается тем, что способ закрытия отверстия оплодотворенного яйца при создании экспериментальной модели включает размещение яйца горизонтально зародышем вверх, выполнение отверстия в скорлупе сбоку со стороны зародыша, проведение анализа и/или обработки зародыша и закрытие отверстия в скорлупе. Согласно предлагаемому изобретению для закрытия отверстия скорлупы используется фрагмент скорлупы яйца-донора. Яйцо-донор, так же как и яйцо, участвующее в эксперименте, обрабатывается дезинфицирующими средствами. Из скорлупы яйца-донора вырезается фрагмент больше отверстия в экспериментальном яйце, причем фрагмент скорлупы вырезают, вместе с подскорлуповой оболочкой. После проведения эксперимента на курином эмбрионе, отверстие скорлупы экспериментального яйца закрывается донорским фрагментом и герметизируется, например, размягченным воском.
Для восстановления герметичности краев фрагмента яйца-донора со скорлупой экспериментального яйца возможно применение медицинских клеев:
• медицинские клеи на основе α-цианакриловой кислоты (Коршак В.В., Полякова A.M., Шапиро М.С. Цианакрилатный клей и его применение. Журн. ВХО им. Менделеева, 1969, 14, (1), с. 52-55; Шапиро М.С. Цианакрилатные клеи в травматологии и ортопедии. М. Медицина. 1976);
• клеевые композиции - МК-2, МК-7, МК-14 и др. (А.А. Вишневский 1964; Ц.А. Кулькова 1965; H.W. Coover, F.B. Joyner, K. Ota. 1968; Т. Matsymoto, М. Nembauser, Н. Soloway 1969; Т.Е. Липатова 1972; Е.А. Вагнер, В.А. Орлов 1973; Т.Н. Фоменко 1992);
• клей медицинский «Сульфакрилат» (Регистрационное удостоверение Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития № ФСР 2010/09805 от 31 декабря 2010);
• клей БФ-6 (Федеральное государственное унитарное предприятие "Муромский приборостроительный завод" (ФГУП "МПЗ"). Номер регистрационного удостоверения ЛС-000638 от 29.12.2011;
• клеевая композиция Биоклей-лаб, состоящий из двух компонентов желатино-резорциновой основы и отвердителя (растворы глутарового альдегида и формалина);
• гистоакрила (Histoacryl, фирма В. BRAUN, Германия) лежит N-бутилкрилат.
Все виды перечисленных медицинских клеев и клеевых композиций обладают хорошей фиксирующей способностью, упакованы в асептических условиях на заводах-производителях. Указанные клеевые композиции используются в хирургии для склеивания и фиксации тканей, герметизации швов и анастамозов, ускорения заживления ран. Таким образом, они обеспечивают сохранение физиологических параметров в месте соединения скорлупы экспериментального яйца и фрагмента донорского яйца.
15
31
31
63
Так же возможно применение пчелиного воска. Пчелиный воск является продуктом жизнедеятельности пчел, потому воск - это сложное органическое соединение - состоит из сложного эфира пальмитиновой кислоты и мирицилового спирта СНСООСН. Поскольку пчелиный воск является органическим соединением, поэтому при его использовании практически полностью исключается развитие токсических и воспалительных реакций со стороны экспериментального яйца. Помимо хорошего фиксирующего качества, пчелиный воск содержит большое количество примесей - остатков меда, механические примеси пыльцы растений, что придает ему высокие бактерицидные свойства - используется для производства лекарственных препаратов (мазей и пластырей), при лечении ран, ожогов, язв, воспалительных процессов кожи и слизистых оболочек.
Применение воска полностью исключает риск развития гипоксии у развивающегося куриного эмбриона, так как воск проницаем для воздуха.
Заявляемый способ препятствует развитию гипоксии развивающегося куриного эмбриона - практически все участки поверхности скорлупы экспериментального яйца участвуют в дыхании, что позволяет достичь физиологического завершения эмбриогенеза птенца. Применяемый способ позволяет завершить формирование птенца без нарушения физиологических параметров. Данный способ исключает риск развития анаэробной бактериальной инфекции. Сохраняется возможность ротирования яйца, исключается потеря хориоаллантоисной жидкости. Подскорлуповая оболочка выполняет функцию фильтрации поступающего воздуха и влаги с поверхности яйца, не пропускает коллоиды и удерживает белок яйца. Сохранение подскорлуповой оболочки на всей поверхности экспериментального яйца обеспечивает достижение параметры естественных условий инкубации.
Изобретение поясняется фотографией, где на фигуре показано экспериментальное яйцо на подставке.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
Яйцо 1, участвующее в эксперименте, и яйцо-донор обрабатывают дезинфицирующими средствами. Размещают экспериментальное яйцо 1 горизонтально зародышем вверх. Из скорлупы яйца-донора вырезают фрагмент 2, например, на 5-8% больше экспериментального отверстия, причем фрагмент 2 скорлупы вырезают, вместе с подскорлуповой оболочкой. Выполняют отверстие в скорлупе яйца 1 с горизонтальной поверхности со стороны зародыша, проводят анализ и/или обработку зародыша и закрывают отверстие в скорлупе путем наложения на отверстие фрагмента 2 из скорлупы яйца-донора. Герметизируют место соединения скорлупы экспериментального яйца 1 и фрагмента 2 из яйца-донора посредством, например, пчелиного воска 3.
Пример конкретного выполнения
Для реализации поставленной задачи, при выполнении эксперимента, скорлупу фертильного куриного яйца и яйца-донора обрабатывали 70% спиртом. Далее экспериментальное яйцо укладывали на подложку горизонтально, сделали прокол стерильной иглой с вертикальной стороны, далее стерильными хирургическими ножницами сделали отверстие в размере 0,8×1,5 см, отрезанную скорлупу убирали. Также удаляли подскорлуповую оболочку. Выполняли манипуляции на курином эмбрионе. Из скорлупы яйца-донора стерильными ножницами вырезали фрагмент для закрытия отверстия на скорлупе экспериментального яйца. После выполнения манипуляций накладывали фрагмент из скорлупы яйца-донора вместе с подскорлуповой оболочкой. Герметизировали края дефекта стерильным воском. Оставили на сутки дефектом вверх, после чего ротировали яйцо в соответствии с физиологией развития куриного эмбриона.
Аналогично выполняются операции при использовании для герметизации краев дефекта посредством медицинского клея.