ПЕПТИД, СТИМУЛИРУЮЩИЙ ОБРАЗОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ, ВЫЯВЛЯЮЩИХ СУРВИВИН В ОПУХОЛЕВЫХ ТКАНЯХ
PEPTIDE STIMULATING FORMATION OF SPECIFIC ANTIBODIES HAVING EFFECT ON SURVIVIN IN TUMOUR TISSUE

Изобретение относится к области биохимии, конкретно к получению пептида, при иммунизации которым можно получить антитела, выявляющие белок сурвивин, и может быть использовано в медицине для диагностики онкологических заболеваний.
Разработка новых методов уточняющей диагностики опухолевых заболеваний является актуальным направлением в современной онкологии. Одним из перспективных маркеров злокачественных опухолей является сурвивин. Это эндогенный белок из семейства белков-ингибиторов апоптоза, участвующий в митозе и препятствующий программированной клеточной смерти. Сурвивин практически отсутствует во взрослых здоровых тканях, однако его сверхэкспрессия показана в различных неоплазмах человека. Есть данные о том, что высокое содержание сурвивина в раковых клетках коррелирует со стадией болезни, плохим прогнозом развития заболевания и резистентностью опухоли к химиотерапии. Поэтому количественная оценка содержания сурвивина в опухолях и его локализации в клетке дает возможности для выбора оптимальной схемы лечения при онкологических заболеваниях.
Для исследования содержания сурвивина в тканях применяют иммуногистохимический метод, основанный на выявлении белка антителами к нему, причем достоверность метода напрямую зависит от специфичности применяемых антител. Различные антитела на одних и тех же образцах опухолей дают разные результаты содержания сурвивина в тканях и его локализации в клетке [Vischioni В., Oudejans J.J., Kruyt F.A.E. Immunmohistochemical detection of nuclear survivin in NSCLC: a comparison of commercial antibodies. // Histopathology. 2007. V.50. P.671-680]. Поэтому существует потребность в получении новых антител к сурвивину и ведется поиск новых иммуногенов, с помощью которых антитела могут быть получены.
Для объективной оценки содержания и локализации сурвивина необходимы антитела, направленные к различным участкам последовательности этого белка. Такие антитела могут быть получены только с помощью синтетических фрагментов сурвивина.
Известны синтетические пептиды, которые применяют в качестве иммуногенов для получения антител к сурвивину, а именно: пептид, соответствующий аминокислотной последовательности 1-12 сурвивина человека [http://www.abcam.com/Survivin-peptide-ab7866.html], а также пептиды, моделирующие С-концевые участки сурвивина человека 125-142 [http://www.abcam.com/Survivin-antibody-ab47038.html] и 131-142 [http://www.abcam.com/Survivin-antibody-ab27468.html]. Данные пептиды полезны в исследовательской практике для получения антител к различным районам белка, однако диагностического значения антитела к ним не имеют, так как связывают сурвивин только в культурах клеток методом иммуноблоттинга и иммуноцитохимическим методом, но не в тканях опухолей человека.
Известен наиболее близкий к заявленному по проявляемым свойствам синтетический пептид последовательности PTLPPAWQPFLKDHRI участка 4-19 сурвивина человека [К.Trieb, R.Lehner, Т.Stulnig, et al. Survivin expression in human osteosarcoma is a marker for survival. // EJSO. 2003. V.29. P.379-382]. Антитела, полученные иммунизацией кроликов данным пептидом, выявляют сурвивин методом иммуногистохимии на парафиновых срезах остеосаркомы, что делает их пригодными для использования в диагностических целях. Иммуноблоттинг с данными антителами подтвердил их специфичность к белку с молекулярной массой приблизительно 16.5 кДа, что соответствует массе сурвивина.
Изобретение решает задачу расширения ассортимента пептидов для получения антител, пригодных для диагностики раковых заболеваний путем выявления сурвивина в образцах опухолей человека иммуногистохимическим методом.
Поставленная задача решается за счет пептида, стимулирующего образование специфических антител, выявляющих сурвивин в опухолевых тканях, формулы:
Ala-Tyr-Ala-Cys-Asn-Thr-Ser-Thr-Leu-Lys-Val-Arg-Arg-Ala-Ile-Glu-Gln-Leu-Ala.
Синтез целевого продукта осуществляют твердофазным методом с использованием алкоксибензильного полимера. Конденсации осуществляют одним из двух методов: 1) при помощи тетрафторбората O-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилмочевины (TBTU); 2) при помощи 1-гидроксибензотриазола (НОВТ) и N,N'-диизопропилкарбодиимида (DIPC). Присоединение очередных Fmoc-защищенных аминокислотных остатков проводят однократно за исключением случаев, когда на растущем пептидил-полимере после реакции конденсации обнаруживают непрореагировавшие аминогруппы. Контроль за содержанием непрореагировавших аминогрупп пептидил-полимера проводят с помощью нингидринового теста. Для отделения пептида от полимерного носителя и конечного деблокирования используют трифторуксусную кислоту с добавкой тиоанизола, фенола, этандитиола, триизопропилсилана и воды. Структуру и гомогенность целевого продукта подтверждают данными аминокислотного анализа, масс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Сущностью изобретения является новый пептид формулы Ala-Tyr-Ala-Cys-Asn-Thr-Ser-Thr-Leu-Lys-Val-Arg-Arg-Ala-Ile-Glu-Gln-Leu-Ala (SEQ ID NO 1), моделирующий участки (80-88) и (153-162) последовательности сурвивина 2В человека, получаемый с помощью стандартных методик пептидного синтеза. Антитела, получаемые иммунизацией кроликов заявляемым синтетическим пептидом, специфичны к сурвивину, что доказывается их связыванием с рекомбинантным сурвивином в твердофазном иммуноферментном анализе и иммуноблоттинге. Данные антитела выявляют сурвивин в образцах опухолей человека, что подтверждается специфической реакцией в иммуногистохимическом тесте с парафиновыми срезами тканей опухолей пациентов с диагнозом - рак мочевого пузыря.
Техническим результатом изобретения является способность заявляемого пептида стимулировать при иммунизации в свободном виде, без конъюгации с высокомолекулярным носителем, образование антител, специфичных к сурвивину и выявляющих данный белок в образцах опухолевых тканей человека иммуногистохимическим методом.
Изобретение иллюстрируют чертежи.
Фиг.1. Связывание антител к пептиду (SEQ ID NO 1) с рекомбинантным сурвивином в иммуноблоте. Молекулярная масса 17 кДа, выявляемая антителами к пептиду (I), соответствует молекулярной массе сурвивина.
Фиг.2. Иммуногистохимическое окрашивание антителами к пептиду (SEQ ID NO 1) срезов опухолей мочевого пузыря. Темным окрашены ядра клеток и цитоплазма, связавшие антитела.
Пример 1. Синтез пептида Ala-Tyr-Ala-Cys-Asn-Thr-Ser-Thr-Leu-Lys-Val-Arg-Arg-Ala-Ile-Glu-Gln-Leu-Ala (SEQ ID NO 1).
Операция 1.
0,3 г алкоксибензильного полимера с содержанием ОН-групп 0,5 ммоль/г полимера помещают в проточный реактор, промывают диметилформамидом (2×10 мл), снова добавляют 10 мл диметилформамида и оставляют набухать в течение 5-10 мин, затем диметилформамид удаляют. Синтез пептида ведут в проточном реакторе при комнатной температуре.
Операция 2. Получение Fmoc-Ala-полимера (I).
2
В 4 мл диметилформамида растворяют 0,494 г (1,5 ммоль) Fmoc-Ala-OH·HO, добавляют 116 мкл (0,75 ммоль) N,N'-диизопропилкарбодиимида и 1,8 мг (0,015 ммоль) 4-диметиламинопиридина. Раствор перемешивают при температуре 0°С. Через 10 мин раствор добавляют к алкоксибензильному полимеру, находящемуся в проточном реакторе. Полученную смесь выдерживают при периодическом перемешивании 12 часов. Полученный Fmoc-Ala-полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл) и снова диметилформамидом (2×10 мл). Непрореагировавшие аминогруппы ацилируют смесью 2 мл уксусного ангидрида, 2 мл пиридина и 6 мл диметилформамида в течение 2 ч. Промывки повторяют.
Операция 3. Получение Fmoc-Leu-Ala-полимера (II).
a) Полученный Fmoc-Ala-полимер (I) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,159 г (0,45 ммоль) Fmoc-Leu-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова иметилформамидом (2×10 мл).
Операция 4. Получение Fmoc-Gln-Leu-Ala-полимера (III).
a) Fmoc-Leu-Ala-полимер (II) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,166 г (0,45 ммоль) Fmoc-Gln-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
Операция 5. Получение Fmoc-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера (IV).
a) Fmoc-Gln-Leu-Ala-полимер (III) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
б) 0,192 г (0,45 ммоль) Fmoc-Glu(OBu)-ОН и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
Операция 6. Получение Fmoc-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера (V).
t
a) Fmoc-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимер (IV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,159 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ile-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) 0,159 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ile-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
г) Полученный полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
Операция 7. Получение Fmoc-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера (VI).
t
a) Fmoc-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимер (V) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
2
б) 0,148 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ala-OH·HO и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
Операция 8. Получение Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера (VII).
t
a) Fmoc-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимер (VI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,292 г (0,45 ммоль) Fmoc-Arg(Pbf)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
Операция 9. Получение Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера (VIII).
t
a) Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимер (VII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,292 г (0,45 ммоль) Fmoc-Arg(Pbf)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) 0,292 г (0,45 ммоль) Fmoc-Arg(Pbf)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
г) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
Операция 10. Получение Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера (IX).
t
a) Fmoc-Arg(Pbf)- Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Glu-Leu-Ala-полимер (VIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,153 г (0,45 ммоль) Fmoc-Val-OH и 0,069 г (0,45 ммоль) НОВТ растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 70 мкл (0,45 ммоль) DIPC и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
Операция 11. Получение Fmoc-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера (X).
t
a)Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимер(IX) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,211 г (0,45 ммоль) Fmoc-Lys(Boc)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
Операция 12. Получение Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера(Х1).
t
a) Fmoc-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимер (X) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,159 г (0,45 ммоль) Fmoc-Leu-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) 0,159 г (0,45 ммоль) Fmoc-Leu-OH и 0,069 г (0,45 ммоль) НОВТ растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 70 мкл (0,45 ммоль) DIPC и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
г) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
t
Операция 13. Получение Fmoc-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера(ХII).
t
a) Fmoc-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимер (XI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
б) 0,179 г (0,45 ммоль) Fmoc-Thr(Bu)-ОН и 0,069 г (0,45 ммоль) НОВТ растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 70 мкл (0,45 ммоль) DIPC и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
t
t
Операция 14. Получение Fmoc-Ser(Bu)-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера(XIII).
t
t
a) Fmoc-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимер (XII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
б) 0,173 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ser(Bu)-OH и 0,069 г (0,45 ммоль) НОВТ растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 70 мкл (0,45 ммоль) DIPC и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
t
в) 0,173 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ser(Bu)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
г) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
t
t
t
Операция 15. Получение Fmoc-Thr(Bu)-Ser(Bu)-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера (XIV).
t
t
t
a) Fmoc-Ser(Bu)-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимер (XIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
б) 0,173 г (0,45 ммоль) Fmoc-Thr(Bu)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
t
t
t
Операция 16. Получение Fmoc-Asn-Thr(Bu)-Ser(Bu)-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbl)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера (XV).
t
t
t
t
a) Fmoc-Thr(Bu)-Ser(Bu)-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbl)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Glu-Leu-Ala-полимер (XIV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,160 г (0,45 ммоль) Fmoc-Asn-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
t
t
t
Операция 17. Получение Fmoc-Cys(Trt)-Asn-Thr(Bu)-Ser(Bu)-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера (XVI).
t
t
t
t
a) Fmoc-Asn-Thr(Bu)-Ser(Bu)-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимер (XV) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,264 г (0,45 ммоль) Fmoc-Cys(Trt)-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
t
t
t
Операция 18. Получение Fmoc-Ala-Cys(Trt)-Asn-Thr(Bu)-Ser(Bu)-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)Gln-Leu-Ala-полимера (XVII).
t
t
t
t
a) Fmoc-Cys(Trt)-Asn-Thr(Bu)-Ser(Bu)-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Gln(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимер (XVI) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
б) 0,148 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ala-OH и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль). N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
t
t
t
t
Операция 19. Получение Fmoc-Tyr(Bu)-Ala-Cys(Trt)-Asn-Thr(Bu)-Ser(Bu)-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера (XVIII).
t
t
t
t
a) Fmoc-Ala-Cys(Trt)-Asn-Thr(Bu)-Ser(Bu)-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимер (XVII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
б) 0,207 г (0,45 ммоль) Fmoc-Tyr(Bu)-ОН и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
в) Полимер обрабатывают раствором 43 мкл (0,45 ммоль) уксусного ангидрида и 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина в 4 мл диметилформамида в течение 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), этанолом (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
t
t
t
t
t
Операция 20. Получение Fmoc-Ala-Tyr(Bu)-Ala-Cys(Trt)-Asn-Thr(Bu)-Ser(Bu)-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbl)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Glu(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимера (XIX).
t
t
t
t
t
a) Fmoc-Tyr(Bu)-Ala-Cys(Trt)-Asn-Thr(Bu)-Ser(Bu)-Thr(Bu)-Leu-Lys(Boc)-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ile-Gln(OBu)-Gln-Leu-Ala-полимер (XVIII) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл).
2
б) 0,148 г (0,45 ммоль) Fmoc-Ala-OH·HO и 0,145 г (0,45 ммоль) TBTU растворяют в 4 мл диметилформамида. В раствор добавляют 77 мкл (0,45 ммоль) N-этилдиизопропиламина и перемешивают при 0°С в течение 10 мин. Раствор добавляют к полимеру и при периодическом перемешивании оставляют на 2 ч. Полимер промывают диметилформамидом (2×10 мл).
Операция 23. Получение целевого пептида Ala-Tyr-Ala-Cys-Asn-Thr-Ser-Thr-Leu-Lys-Val-Arg-Arg-Ala-Ile-Glu-Gln-Leu-Ala (SEQ ID NO 1).
0,3 г пептидил-полимера (XIX) обрабатывают 10 мл 20%-ного раствора пиперидина в диметилформамиде 20 мин, промывают диметилформамидом (2×10 мл), раствором диоксана в воде (2:1) (2×10 мл), снова диметилформамидом (2×10 мл), затем этанолом (2×10 мл) и высушивают в токе воздуха. Высушенный пептидил-полимер обрабатывают 4 мл смеси трифторуксусная кислота-тиоанизол-фенол-вода-этандитиол-триизопропилсилан в объемном соотношении 81,5:5:5:5:2,5:1 в течение 2 ч. Полимер отфильтровывают, раствор упаривают, сухой остаток промывают сухим диэтиловым эфиром (2×50 мл). Растворяют в 10-% уксусной кислоте и очищают на препаративной ВЭЖХ при следующих условиях: колонка Phenomenex (США) Jupiter 10µ С 18 300А (250×10 мм), растворитель А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, растворитель Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиент растворителя А в Б - 20-80% за 2 ч, скорость потока элюента - 3 мл/мин, выход пептида регистрируют при оптической длине волны 226 нм. Собранную после ВЭЖХ фракцию, содержащую целевой продукт, лиофилизуют.
+
Аминокислотный анализ проводят на приборе Biotronik LC-3000 (ФРГ) после гидролиза пептидов смесью 6 н. HCl-TFA (2:1) в течение 45 мин при 170°С. Синтезированный пептид имеет корректный аминокислотный состав. Масс-спектрометрию осуществляли методом MALDI на приборе VISION 2000 (Bioanalysis, Великобритания). По данным масс-спектрометрии m/z 2109 для [M+H] (2107,46 - вычисленная). По данным аналитической ВЭЖХ время удерживания составляет 23,01 мин, условия: колонка Phenomenex (США) Jupiter 5µ С 18 300А (250×4,6 мм), растворитель А: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в воде, растворитель Б: 0,1%-ная трифторуксусная кислота в ацетонитриле, градиент растворителя А в Б - 10-70% за 1 ч, скорость потока элюента - 1 мл/мин, выход пептида регистрируют при оптической длине волны 226 нм. Данные аминокислотного анализа: Asp 1.08 (1), Thr 1.96 (2), Ser 0.83 (1), Glu 2.14 (2), Ala 3.96 (4), Val 0.91 (1), Ile 0.96 (1), Leu 1.8 (2)
Пример 2. Проведение биологических испытаний.
Полученным в результате синтеза пептидом (SEQ ID NO 1) иммунизируют кроликов, из сывороток крови путем аффинной хроматографии выделяют противопептидные антитела, которые проверяют в иммуноферментном анализе и иммуноблоте на специфичность к сурвивину и используют в исследовании образцов опухолевых тканей человека иммуногистохимическим методом.
Операция 1. Иммунизация животных.
Для иммунизации животных готовят раствор пептида (SEQ ID NO 1) в физиологическом растворе (0.9% NaCl) в концентрации 1 мг/мл, который затем смешивают с равным объемом полного адъюванта Фрейнда для первой иммунизации или неполного адъюванта Фрейнда для второй иммунизации до получения эмульсии. Кроликов иммунизируют двукратно в дозе 1 мг пептида на животное для каждой иммунизации с интервалом в 44 сут. Препарат вводят внутримышечно вдоль позвоночника в четыре точки.
Операция 2. Получение кроличьих сывороток и определение титра противопептидных антител.
1
2
4
2
4
2
4
492
Кровь отбирают из ушной вены кроликов через 14 сут. после второй иммунизации. Из отобранной крови после выдерживания в течение 1 ч при температуре 37°С путем отделения клеток центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин готовят сыворотку. Титр противопептидных антител определяют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В девяностошестилуночный планшет Nunc MaxiSorp вносят по 0.1 мл в каждую лунку раствора пептида в 0.05 М Na-карбонат-бикарбонатном буфере (рН 9.6) в концентрации 20 мкг/мл и инкубируют 16 ч при температуре 4°С. Затем раствор пептида удаляют и планшет четырехкратно промывают PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM NaHPO, 1.5 mM KHPO, рН 7.4), содержащим 0.05% Твин-20. Процедуры четырехкратной промывки следуют после каждой стадии инкубации. В лунки вносят по 0.1 мл образцов сывороток в двойных разведениях, начиная с 1:40 или 1:1000, и инкубируют в течение 1 ч при температуре 37°С. В качестве контроля используют преиммунные сыворотки кроликов. После отмывки добавляют в лунки по 0.1 мл раствора антител козы к иммуноглобулинам кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена (ИМТЕК, Россия) в разведении 1:3000, а после инкубации и отмывки вносят по 0.1 мл раствора субстрата (0.05% перекись водорода и 0.05% о-фенилендиамин в 0.05 М Na-цитратном буфере, рН 5.0). Реакцию останавливают добавлением 0.1 мл 10% HSO. За титр антител принимают отрицательный логарифм (-lg) значения наибольшего разведения сыворотки, дающего окрашивание более 0.1 OE и превышающего окрашивание контрольных сывороток более чем в два раза.
Титр антител к пептиду, описанному в изобретении, составляет 5.8.
Операция 3. Получение аффинного носителя.
3
3
2
4
7
2
1 г CNBr-активированной сефарозы 4 В (GE Healthcare bio-science AB, Швеция) суспендируют в 6 мл 1 мМ HCl в течение 15 мин до образования прозрачного геля и промывают 1 мМ HCl (5×10 мл). 2.8 мг пептида растворяют в 4 мл конденсирующего буфера (0.1 М NаНСО, 0.1 М NaCl, рН 8.0), добавляют к сефарозе и при периодическом перемешивании оставляют на 1 ч при 20°С. После промывки конденсирующим буфером (5×3 мл) к сефарозе добавляют блокирующий буфер (0.2 М Gly, 0.1 М NaCl, рН 8.0) и выдерживают в течение 2 ч. Затем сефарозу промывают поочередно ацетатным (0.1 М NaOCOCH, 0.1 М NaCl, рН 4.0) и боратным буфером (0.1 М NaBO·10HO, 0.1 M NaCl, рН 8.1) (5×10 мл).
Операция 4. Проведение аффинной хроматографии.
2
2
4
2
280
2 мл сыворотки наносят на колонку с 3.5 мл аффинного носителя, промытую PBS (0.15 М NaCl, 0.01 М NaHPO, pH 7.4), и инкубируют при комнатной температуре в течение 40-60 мин. Затем колонку промывают 35 мл PBS и 35 мл элюирующего буфера (0.2 М раствора глицина в 0.1 М NaCl, рН 2.5). В отобранных фракциях элюата значения рН доводят до 6.5-8.0 с помощью 1М TRIS, рН 10. Содержание белка определяют спектрофотометрически, измеряя ОЕ. В данном случае оно составляло 0.23 мг/мл. Титр аффинно-очищенных противопептидных антител (5.4) определяют с помощью твердофазного иммуноферментного анализа по описанной в операции 2 методике.
Операция 5. Связывание противопептидных антител с рекомбинантным сурвивином в ИФА.
Специфичность противопептидных антител к сурвивину определяют с помощью иммуноферментного анализа по описанной в операции 2 методике. Для сорбирования на планшете в лунки вносят вместо раствора пептида по 0.1 мл раствора рекомбинантного сурвивина, содержащего 142 а. о., полученного экспрессией в Е. coli, в концентрации 10 мг/мл. Титр антител составляет 5.4.
Операция 6. Связывание противопептидных антител с рекомбинантным сурвивином в иммуноблоттинге.
Специфичность противопептидных антител к сурвивину определяют с помощью иммуноблоттинга с рекомбинантным сурвивином.
1
Подготовка образцов: к 5 мкл раствора рекомбинантного сурвивина в диметилсульфоксиде с концентрацией 30 мг/мл добавляют 45 мкл PBS, затем солюбилизирующий буфер, содержащий 62 мМ Tris-HCl, 2% SDS, 5% 2-меркаптоэтанола, 1 мМ ЭДТА, рН 6.8. Смесь термостатируют при 100°С в течение 1.5 мин, затем добавляют раствор 10% глицерина и 0,01% бромфенолового синего.
Электрофорез проводят на пластинках полиакриламидного геля (15% акриламида -в разделяющем геле и 5% - в концентрирующем) в денатурирующих условиях. Белки концентрируют при силе тока 10 мА/пластину, а разделяют - при 20 мА/пластину.
3
Электроперенос осуществляют на мембраны иммобилона NC с диаметром пор 0.45 мкм ("Millipore", США) в условиях: 0,025 М Na-бикарбонатный буфер (20% CHOH, 0.1% SDS, рН 9.0) при постоянной силе тока 400 мА в течение 1.5 ч, затем мембраны промывают буфером А (50 мМ Tris-HCl, 200 мМ NaCl, 0.1% Triton Х-100, рН 7.5) (6×5 мин) на качалке. После этого мембраны обрабатывают буфером А, содержащим 5% обезжиренного сухого молока (AppliChem, Германия), в течение 1 ч, а затем инкубируют в течение 16 ч с аффинно-очищенными антителами к пептиду (SEQ ID NO 1) в том же буфере при 4°С в разведении 1/200. Далее мембраны промывают буфером А (6×5 мин) и повторно обрабатывают буфером А, содержащим 5% молока, в течение 40 мин. Затем инкубируют с вторичными антителами (козьи антитела против суммарных иммуноглобулинов кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена, ИМТЕК, Россия) в буфере А, содержащем 5% молока, в течение 1.5 ч. Мембраны промывают буфером А (6×5 мин) и дистиллированной водой (3×3 мин). Для окрашивания полос к мембранам добавляют 25 мл раствора 50 мМ Tris-HCl (pH 7.6), содержащего 12.5 мг диаминобензидина и 10 мкл 50% раствора перекиси водорода. Проявляют в течение 5-10 мин в темноте. Молекулярная масса 17 кДа, выявляемая антителами к пептиду (SEQ ID NO 1), соответствует молекулярной массе сурвивина (фиг.1).
Операция 7. Иммуногистохимический анализ.
Специфическую активность антител тестируют методом иммуногистохимии на серийных парафиновых срезах. Исследование проводят методом непрямого иммунопероксидазного анализа.
В качестве материала для тестирования используют серийные депарафинизированные срезы тканей инфильтративно-протокового рака молочной железы и рака мочевого пузыря человека. Операционный материал фиксирован в 10% забуференном формалине. Срезы депарафинизируют в стандартной гистологической проводке в толуоле и спиртах понижающейся концентрации. Трижды отмывают в забуференном физиологическом растворе (0.01 М натрий-фосфатный буфер, содержащий 0.9% натрия хлорид, pH 7.4) (ЗФР). Эндогенную пероксидазу инактивируют в 3% растворе перекиси водорода в ЗФР в течение 20 мин при комнатной температуре. После трехкратной отмывки в ЗФР проводят процедуру демаскировки антигена в 0,01 М натрий-цитратном буфере, pH 6.0, на водяной бане при 95°С в течение 20 мин. После завершения инкубации срезы охлаждают в течение 20 мин при комнатной температуре и трижды отмывают в ЗФР. Неспецифические взаимодействия блокируют в 3% растворе БСА в ЗФР в течение 30 мин при 37°С. Растворы антител готовят в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) в ЗФР и наносят на срезы на 1 час в разведении 1:20. Для контроля неспецифических взаимодействий на срезы наносят раствор очищенных IgG кролика в концентрации 10 мкг/мл. Связавшиеся антитела выявляют с использованием козьих антител, меченных пероксидазой, к иммуноглобулинам кролика ("DakoCytomation", P0448) в разведении 1:100, раствор которых наносят на срезы на 30 мин. В качестве хромогена используют Liquid DAB ("DakoCytomation", K3465). Иммунохимическую реакцию ведут при комнатной температуре, последовательные этапы нанесения реагентов чередуют с трехкратной отмывкой в ЗФР. По окончании окрашивания срезы отмывают в дистиллированной воде, дегидратируют и заключают в смолу (Bio Mount, "Bio-Optica" Италия, ВО-05 ВМ500). Окрашивание анализируют на световом микроскопе, оценивая наличие специфического окрашивания в опухолевых клетках.
Исследовано 20 образцов опухолей пациентов с диагнозом - рак мочевого пузыря. Во всех образцах выявлено окрашивание клеток. Наблюдалось окрашивание различной степени интенсивности цитоплазмы и/или ядер клеток во всех образцах опухолевых тканей (табл., фиг.2). Отсутствие подобной реакции с контрольными IgG кролика (Jackson ImmunoResearch) позволяет утверждать, что взаимодействие является специфическим. Для контроля также исследовали связывание антител к пептиду (SEQ ID NO 1) с образцами нормальных тканей. В этих случаях окрашивания не наблюдалось.
Таблица
Обнаружение сурвивина в образцах опухолей мочевого пузыря антителами к пептиду (SEQ ID NO 1)
Количество образцов
Всего
Локализация в ядре
Локализация в цитоплазме
20
19
12
Таким образом, антитела к заявляемому пептиду выявляют сурвивин во всех исследованных образцах опухолевых тканей пациентов с диагнозом - рак мочевого пузыря.
В описании использован пептид последовательности SEQ ID NO 1 Ala-Tyr-Ala-Cys-Asn-Thr-Ser-Thr-Leu-Lys-Val-Arg-Arg-Ala-Ile-Glu-Gln-Leu-Ala