СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ СТРЕССУСТОЙЧИВОСТИ ЖИВОТНЫХ
METHOD FOR IMPROVEMENT OF ANIMAL STRESS RESISTANCE

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии, и может быть использовано в животноводстве для введения парентерально и в рационы животных и птицы с целью предотвращения пагубного влияния на организм стресс-факторов любой этиологии.
Внедрение интенсивных промышленных технологий производства животноводческой продукции нередко связано с возникновением противоречий между биологическими и технологическими аспектами одной и той же проблемы. Облегчая себе условия работы, человек зачастую делает менее комфортными условия существования животных. Возникает ряд новых стресс-факторов, называемых технологическими. Безусловным следствием стрессов любой этиологии является избыточное образование свободных радикалов, что крайне неблагоприятно сказывается на обмене веществ, а следовательно, на здоровье животных, их продуктивности, качестве продукции и себестоимости ее производства.
Из уровня техники известно большое количество всевозможных нейротропных веществ и для людей, и для животных. Эти биологически активные вещества предназначены для предотвращения, а если это своевременно не удалось, то для смягчения и ликвидации последствий стрессовых воздействий на организм. Они призваны помочь животному нормализовать ответные реакции на неадекватные раздражители, инициирующие метаболические отклонения, выходящие за пределы колебаний естественных биологических параметров динамического гомеостаза. Все эти вещества самой различной природы представляют собой в основном продукты химического синтеза. Все они в большей или меньшей степени являются чужеродными для живого организма, все они далеко не безразличны для здоровья животных, практически все они не могут быть применены при производстве экологически чистых продуктов питания для человека (Фомичев Ю.П. Биотехнология производства говядины. М.: Россельхозиздат, 1984. - 238 с.; Байдевлятов А.Б., Николаенко В.П. Профилактика стрессов перемещения и ветеринарных обработок птицы. Научно-технический бюллетень. Харьков. (НО Украина. НИИ птицеводства). - 1983. - №15. - С.37-39. Афанасьева А.И., Огуй В.Г., Мякушко Н.В., Тараненко В.Н. Технологические приемы адаптивных методов выращивания телят. Барнаул, АГАУ, 2006, 319 с., прототип).
Настоящее изобретение направлено на решение технической задачи по разработке нового, более физиологичного и более эффективного, способа борьбы с любыми формами стресса путем предотвращения развития стрессовых реакций или для смягчения и ликвидации последствий, если реакции на стресс-фактор не удалось предотвратить, у сельскохозяйственных животных и птицы различных видов и разных половозрастных групп. Необходимость разработки новых, более совершенных способов повышения стрессустойчивости с.-х. животных и птицы обусловлена тесно связанными с этим критерием проблемами повышения продуктивности животных, улучшения качества производимой продукции, снижения затрат кормов, труда и финансовых средств на ее производство.
Суть авторской рабочей гипотезы заключается в следующем: гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) - один из основных естественных медиаторов процессов торможения в центральной нервной системе всех высших животных. Возбудимость, нервозность, чувствительность животных и человека к стрессу, в первую очередь, связаны с этой кислотой. Сложности возникают в связи с тем, что молекула ГАМК - это типичный цвиттерион, и в силу своей выраженной полярности и гидрофильности она в обычных условиях практически не проникает через гематоэнцефалический барьер и действует преимущественно либо периферически, либо непосредственно в местах синтеза (Сытинский И.А. Гамма-аминомасляная кислота - медиатор торможения. Л.: Наука, 1977. - 139 с.).
В поисках аналогов ГАМК, способных проникать через гематоэнцефалический барьер и оказывать преимущественно центральное действие, в медицине в конце шестидесятых годов прошлого столетия было обращено внимание на гамма-оксимасляную кислоту, которая в эксперименте и клинике проявила отчетливое гипнотическое, транквилизирующее и антигипоксическое действие. В виде натриевой соли препарат, получивший название натрия оксибутират, нашел широкое применение в хирургии, анестезиологии, офтальмологии, неврологии и психиатрии (Закусов В.В., ред. Оксибутират натрия. Нейрофармакологическое и клиническое исследование. М.: Медицина, 1968, с.134). Ценным свойством оксибутирата натрия оказалась его способность усиливать действие наркотических и анальгетических веществ, оказывать антигипоксическое и антитоксическое действие. В психиатрической практике находят использование транквилизирующий и снотворный эффекты препарата.
Несколькими годами позже получила клиническое применение в качестве психотропного средства литиевая соль гама-оксимасляной кислоты (Любимов Б.И., Толмачева Н.С., Островская Р.У., Митрофанов B.C. Экспериментальное изучение нейротропной активности лития оксибутирата. Фармакол. и токсикол., 1980, 43, 395-401, прототип). Фармакологическое и клиническое изучение препарата показало, что его действие не является простой суммой эффектов катиона лития и аниона оксибутирата, а характеризуется своим собственным спектром, сочетающим в себе антиманиакальное действие лития с транквилизирующим эффектом гамма-оксимасляной кислоты. Эффект лития при этом оказывается усиленным за счет большего накопления в мозговой ткани, что позволяет использовать его в меньших дозах. В клинике препарат проявляет отчетливое профилактическое действие при депрессивных состояниях, обладая при этом собственным седативным эффектом (Раевский К.С., Георгиев В.П. Медиаторные аминокислоты. М.: Медицина, 1986, с.239). Поскольку в организме жвачных сельскохозяйственных животных постоянно продуцируется громадное количество короткоцепных жирных кислот, включая масляную с ее многочисленными взаимопревращениями, в том числе и в оксибутират, то не имеет смысла испытывать существующую в медицине соль лития с оксимасляной кислотой на жвачных.
Это обстоятельство стало одним из побудительных мотивов для создания нового препарата - соли лития с ГАМК.
Из уровня техники известно, что минеральные соли лития также обладают ноотропными (психотропными) свойствами, при этом они свободно преодолевают гематоэнцефалический барьер и проникают в головной мозг (Schou M. Lithium studies. Acta Pharmacol. Toxicol, 1998, 45(2): 115-124). Следовательно, логично было допустить, что при введении гамма-аминомасляной кислоты в соединении с литием ГАМК будет медленнее метаболизироваться специфической аминотрансферазой (основной фермент деградации ГАМК), легче преодолевать гематоэнцефалический барьер и ее концентрация в мозге возрастет. В свою очередь, возрастание концентрации ГАМК, на основе знаний о ее физиологическом действии, повлечет за собой одновременное снижение возбудимости животных с повышением стрессустойчивости.
Основываясь на этих данных, можно сказать, что конкретная цель создания комплексного соединения лития с гамма-аминомасляной кислотой заключается в необходимости получения такого препарата, на основе которого будет возможно получить более физиологичный и более высокий положительный эффект, чем это имеет место при применении животным отдельно лития и гамма-аминомасляной кислоты. Такое соединение нами синтезировано, заявка №2009116486 от 29.04.2009. Способ синтеза органического соединения усиливающего стресс-резистентность животных.
Оба компонента, входящие в состав новой органической соли (минеральная соль лития и гамма-аминомасляная кислота), законодательно разрешены для применения в медицинской практике.
В патентной и научно-технической литературе отсутствует описание способа повышения стрессустойчивости животных с использованием литиевой соли гамма-аминомасляной кислоты. Данное обстоятельство позволяет считать заявленное изобретение патентоспособным как отвечающее условию патентоспособности «изобретательский уровень» (часть четвертая Гражданского кодекса РФ №230-ФЗ от 18.12.2007).
Способ синтеза соли лития с гамма-аминомасляной кислотой.
2
4
В работе использованы литий сернокислый (LiSO), натрия гидроокись (NaOH), калия гидроокись (КОН), гамма-аминомасляная кислота, этиловый спирт (98%). Все реактивы марки ХЧ.
Навеску соли сернокислого лития массой 90 г растворяли в 100 мл дистиллированной воды до получения прозрачного насыщенного при температуре 40°С раствора. После растворения контролировали, чтобы значение рН раствора было равно 7. К полученному раствору последовательно добавляли навески гидроокиси натрия массой 50 г и гидроокиси калия массой 50 г. В результате реакции замещения происходит выпадение белого осадка гидрата окиси лития.
Образовавшийся осадок отфильтровывали от супернатанта на стеклянном фильтре под вакуумом. Полученный порошок белого цвета гидроксида лития промывали этиловым спиртом (98%) и переносили в эксикатор до полного высыхания. Далее навеску высушенного гидроксида лития массой 60 г растворяли в 250 мл дистиллированной воды при температуре 25°С. Раствор при этом приобретает значение рН 10. Растворяли навеску гамма-аминомасляной кислоты 50 г в100 мл дистиллированной воды. Оба раствора сливали в круглодонную колбу, помещали в водяную баню с температурой 45°С и производили отгонку с помощью роторного испарителя под вакуумом (Р=97 Па). В течение 6,5 часов происходит формирование осадка. Полученную пастообразную массу белого цвета переносили на фильтровальную (98%) и помещали в эксикатор до полного высыхания. Получали 62,04 г сухого вещества, представляющего собой конечный искомый продукт - литиевую соль ГАМК.
Основные физико-химические параметры ГАМК - Li
Номенклатурное название - литиевая соль гамма-аминомасляной кислоты
2
2
2
2
Эмпирическая формула - NH-СН-СН-CH-COOLi;
4
8
2
Брутто-формула - CHONLi;
Элементный состав в процентах:
С - 42.8
Н - 7.1
О - 28.5
N - 12.4
Li - 6.2
Массовая доля основного вещества - 97%
Молекулярная масса - 108,9
Температура плавления - 209°С
Температура разложения - соль плавится с разложением.
Соль растворима в водно-спиртовых смесях и воде.
Безвредность для животных - ГАМК-Li выдерживает испытание, относится к третьему классу опасности по ГОСТ 12.1. 007-76.
Пример 1. Проведен опыт по изучению влияния литиевой соли гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК-лития) на стрессустойчивость крыс. Исследование проводили на общепринятой экспериментальной модели адаптогенности и стрессустойчивости крыс, т.к. эта модель весьма чувствительна к действию фармакологических агентов, являющихся ГАМК-агонистами и ГАМК-антагонистами.
В эксперименте использованы самцы крыс линии Вистар 2-месячного возраста. Животные содержались в стандартных условиях вивария и находились на типовом коммерческом полнорационном гранулированном комбикорме для линейных крыс. Было сформировано три аналогичные группы (по 10 голов в группе).
1. Группа - контроль, внутрибрюшинная инъекция плацебо.
2. Группа - опытная, внутрибрюшинная инъекция ГАМК-лития в дозе 15 мг/кг живой массы.
3. Группа-опытная, внутрибрюшинная инъекция ГАМК-лития в дозе 30 мг/кг живой массы.
В процессе эксперимента животных подвергали различным видам стресс-воздействия: социальный стресс (менялись соседи по клеткам); кормовой стресс (у животных изымался корм на 48 часов). Взвешивание животных проводили через каждые три дня. Через две недели после начала эксперимента животных усыпили эфиром, осуществили эвтаназию и определили массу внутренних органов: почки; печень; селезенка; легкие; сердце; надпочечники; тимус. Достоверной разницы в величине внутренних органов отмечено не было. Это говорит об отсутствии неблагоприятного воздействия данного препарата на организм опытных животных. Данные по живой массе представлены в таблице 1.
Таблица 1
Живая масса подопытных животных через 2 недели после начала эксперимента
Группы
Средняя живая масса на начало опыта
Средняя живая масса на конец опыта
% к контролю
Контроль
192.1±16.2
216,8±14,6
100%
2-я группа
174.8±12.1
240,4±18,7
111%
3-я группа
184.6±10.7
236,5±11,3
109%
Как следует из материалов таблицы 1, у опытных групп животных относительно контрольной группы живая масса была на 9-11% выше. Из приведенных данных также можно установить, что для литиевой соли гамма-аминомасляной кислоты более эффективной является доза 15 мг/кг живой массы животного. Таким образом, однократное введение ГАМК-лития приводит к уменьшению воздействия на организм стрессора и улучшению роста опытных животных. Препарат влиял дозозависимо.
Пример 2. Изучения адаптогенных свойств ГАМК-лития (общая физическая выносливость, тест на плавание).
Изучение адаптогенных свойств проводили с использованием самцов лабораторных крыс линии Вистар. С этой целью было сформировано три группы крыс-аналогов по 10 голов в группе. Животным контрольной группы вводили плацебо. Крысы опытной группы получили внутрибрюшинно одну инъекцию ГАМК-лития в дозе 15 мг/кг веса за 30 минут до опыта. Третья группа была интактной - не подвергалась никаким обработкам.
Всех животных подвергли стандартному тесту на общую физическую выносливость путем длительного плавания в воде при температуре 20°С до полного утомления (для чего требовалось в среднем по животным около 1 часа). После завершения теста всех животных усыпили эфиром и подвергли декапитации. После вскрытия у контрольных животных в желудке обнаружено 15±4.1 язвы. У опытных групп при вскрытии наблюдалось в пять раз меньшее количество язв (3±1.0).
Пример 3. Общая физическая выносливость. Тест на подвешивание.
Использовали так же, как и в предыдущем эксперименте, 3 аналогичные группы крыс по 10 голов в каждой. Доза ГАМК-лития в опытной группе также была 15 мг/кг живой массы и вводилась внутрибрюшинно за 30 минут до начала теста. По истечении 30 минут крысы подвешивались за передние конечности и в таком положении оставались на протяжении 24 часов. После завершения теста животных снимали, усыпляли эфиром, декапитировали, затем вскрывали и подсчитывали количество язв в желудке. Количество язв в контрольной группе было 19±4,6, что почти в четыре раза больше, чем в опытной (5±1.9). У интактной группы изъязвления желудка отсутствовали.
3
3
3
Из уровня техники известно, что эозинофилы представляют собой довольно информативный показатель, связанный с изменением в крови концентрации кортикостероидов, которые, в свою очередь, являются надежным критерием величины воздействия стрессора. Повышение в крови «кортикостероидов - гормонов стресса» вызывает понижение концентрации эозинофилов в крови. Эозинопения (снижение концентрации эозинофилов в крови) уже длительное время квалифицируется как значимый критерий величины стресс-реакции в организме. Это и было подтверждено в нашем эксперименте. В нативной группе животных концентрация эозинофилов составила 974±47/1 мм крови). В контрольной группе животных концентрация этих форменных элементов крови снизилась более чем вдвое и стала 435±26/1 мм, в то время как в опытной группе количество эозинофилов снизилось менее чем на 20% и осталось в пределах физиологической нормы: 793±38/1 мм.
Полученные данные подтверждают вывод о том, что испытанная соль ГАМК-литий обладает ярко выраженным стресс-протективными и адаптогенными свойствами.