Способ получения фармацевтических сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей
METHOD FOR OBTAINING PHARMACEUTICAL SULFATED GLYCOSAMINOGLYCANS FROM BIOLOGICAL TISSUES

Изобретение относится к области фармацевтической промышленности и может быть использовано для получения сульфатированных гликозаминогликанов, таких как хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматансульфат, кератансульфат.
Гликозаминогликаны являются главными компонентами многих тканей, включая хрящи, кожу, сухожилия, связки. Гликозаминогликаны были обнаружены в пупочном канатике, артериях, роговице глаза, в клапанах сердца и аорте, селезенке, мозге, слюне. Известно несколько типов сульфатированных гликозаминогликанов (сГАГ). Наиболее изучены четыре представителя: хондроитин-4-сульфат, хондроитин-6-сульфат, дерматансульфат, кератансульфат.
Функции сГАГ: замещение в структуре протеогликанов, подавление биосинтеза медиаторов воспаления, повышение биосинтеза компонентов матрикса, подавление синергического действия ферментов и кислородных радикалов, подавление апоптоза, маскирование вторичных антигенных детерминант, маскирование вторичных антигенных детерминант и подавление хемотаксиса, построение коллагеновых волокон, стимулируют синтез гиалуроната.
СГАГ используют в фармакологии и косметологии как основные вещества, а также в сочетании с гиалуронатом натрия.
Для получения сГАГ используют субпродукты: хрящи, связки, трахеи, кожу, жилы крупного рогатого скота, роговицу глаз, ткани морских гидробионтов. Состав конечного продукта зависит от используемых субпродуктов. Содержание тех или иных сГАГ варьирует в различных тканях, что приведено в таблице 1.
Таблица 1
Наименование сГАГ
Молекулярная масса, Да
Где содержится или был обнаружен
Кератан-сульфат
от 4×10<sup>3</sup>       до 20×10<sup>3</sup>
Впервые выделен из роговицы глаза, позднее найден и в других тканях, включая кости скелета. Обнаружено, что протеогликановые комплексы КС в скелете и роговице различаются структурно и имеют разный метаболизм. КС присутствует в центральной нервной системе, обнаружена его функция как регулятора регенерации нейронов. В роговице, по данным сравнительного исследования, содержится в 10 раз больше КС, чем в хряще, и в 2–4 раза больше, чем в какой-либо иной ткани.
Хондроитин-4-сульфат (Х4С)
от 5×10<sup>3</sup> до 100×10<sup>3</sup>
Содержится в хрящевых и костных тканях, в трахеях, сердечных перегородках, преобладает в тканях животных и человека (~70%).
Хондроитин-6-сульфат (Х6С)
от 5×10<sup>3</sup> до 100×10<sup>3</sup>
Содержится в хрящевых и костных тканях. Х6С преобладает в тканях гидробионтов (до 80%), ранее его получали из хрящей (плавников) акулы
Дерматан-сульфат (ДС)
от 15×10<sup>3</sup> до 40×10<sup>3</sup>
Преобладает в тканях кожи, также встречается в сердечных клапанах, сухожилиях и стенках артерий, легких, лошадиной аорте, пуповине, коже свиньи, слизистой оболочке кишечника свиней, селезенке, межпозвоночном диске, мениске и др.
Показано, что клиническая эффективность и безопасность зависит от природы и качества используемого для производства сырья, способов технологической переработки, степени очистки (Хондроитина сульфат натрия – примеси и проблемы стандартизации (обзор литературы) Е.Л. Комарова, С.В. Чернова, К.В. Касумова, М.С. Табачная, Л.В. Овсянникова, К.И. Эллер, «Российский биотерапевтический журнал», том 18, №1 (2019), с. 25-36).
Известны способы получения хондроитинсульфата из морских иглокожих, например, голотурий (заявка Японии 63-10601, 1988 г.) или хрящей животных ("Scand. Arch. Physrol." 1989. V.I, p.210-215), однако при этом получают неочищенные препараты, содержащие значительное количество примесей других полисахаридов и белков.
o
o
Известен способ, описанный в заявке FR 2491475 (1982 г.), при получении хондроитинсульфата А измельченные бычьи трахеи гидролизуют 1,25%-ным водным раствором пепсина при рH 4,5 и температуре 50C в течение 12 ч, фермент инактивируют при 80-90C, осадок отделяют центрифугированием, промывают горячей водой, промывные воды и надосадочную жидкость объединяют и последовательно обрабатывают сначала при рH 9-10, а затем при рH 6,5, нагревают до кипения, охлаждают, осадок отделяют, надосачную жидкость обрабатывают 5%-ным раствором цетилпиридинийхлорида, осадок отделяют, промывают метанолом, растворяют в воде, центрифугируют и осадок высушивают.
Известен способ получения хондроитинсульфата А, включающем ферментативный гидролиз бычьих трахей пепсином, инактивацию фермента при 80-90% отделение гидролизата центрифугированием, осаждение цетилпиридинийхлоридом, растворение осадка в воде и его сушку, гидролиз проводят 2-3 объемами 0,5-1%-ного раствора пепсина при 38-40°С и рH 1,5-2,0 в течение 4-6 ч, цетилпиридинийхлорид используют в количестве 2-4 г/л раствора, при этом перед осаждением гидролизат хроматографируют на колонке с диэтиламиноэтилцеллюлозой при использовании 1-2%-ной HCl в качестве элюента, а после растворения осадка в воде продукт высаливают хлоридом натрия из расчета 20-30 г/л при 2-4°С и целевой продукт получают обессоливанием диализом против воды при течение 12-16 ч (RU 2089557 С1,  опубл. 10.09.1997).
Известен способ получения хондроитинсульфата из носового хряща лосося, предусматривающий измельчение сырья, растворение хондроитинсульфата в щелочной среде, ферментативный гидролиз белков, отделение высокомолекулярной углеводной фракции осаждением от низкомолекулярных продуктов гидролиза белка, остающихся в растворе, промывку полученного осадка и сушку готового продукта (EP 1270599 A1, опубл. 02.01.2003).
Известен также способ выделения сульфатированных гликозаминогликанов (RU 2304441 С1, опуб. 20.08.2007), который заключается в механической очистке биологической ткани, отмывке, гидролизе отмытой ткани активированным папаином, осаждением этанолом, при этом после механической очистки измельченную ткань промывают два раза нагретым фосфатным буфером в соотношении на 1 часть ткани 1,5–2 объема буфера и затем выдерживают в новой порции нагретого буфера в течение 15–30 минут, затем переваривают в растворе активированного папаина при нагревании в течение 6–24 часов, перевар охлаждают до 4°С и выдерживают при этой температуре в течение 2–24 часов, удаляют фильтрованием жиры и непереваренные остатки ткани, затем в течение времени от 10 до 24 часов селективно выделяют сульфатированные гликозаимногликаны на твердом носителе, полученном из коллагена костной ткани, носитель отмывают 0,05-0,1 н раствором соляной кислоты, обезжиривают, элюируют с носителя раствором 0,6-1,5 н минеральной соли в 0,8 н уксусной кислоте или 0,01-0,025 н раствором щелочи, осаждают сульфатированные гликозаминогликаны в этаноле, центрифугируют 15 минут при 1500 об/мин при 4°С, осадок отмывают этанолом или ацетоном, высушивают  и стерилизуют.
В данном способе используется метод селективной адсорбции сГАГ на твердом коллагеновом носителе с последующим элюированием. Данный метод является достаточно медленным, используются нерегенерируемые растворители (соляная кислота, уксусная кислота, щелочь). Также в данном способе используется без исключений этанол для получения конечного продукта. В данном способе невозможно получение конечного продукта с заданным процентным содержанием конкретных сульфатсодержащих гликозаминогликанов.
Наиболее близким к предложенному способу является способ получения хондроитина сульфата с применением ультрафильтрации (RU 2458134 С1, опубл. 10.08.2012), согласно которому хондроитина сульфат получают из тканей морских гидробионтов, предусматривающий подготовку сырья к ферментативному гидролизу, гидролиз протеолитическими ферментными препаратами с осаждением примеси белка и отделением осадка от раствора гидролизата, выделение целевого продукта посредством ультрафильтрации, при этом предварительно проводят щелочной гидролиз с нейтрализацией полученного раствора до рН 7 и отделением твердого осадка, в ферментативный гидролизат добавляют соль до значения не менее 0,1 моль/л, проводят ультрафильтрацию ферментативного гидролизата на мембране с пределом задержания 50 кДа и отделение высокомолекулярной примеси, полученный раствор при концентрации соли в нем не менее 0,1 моль/л подвергают ультрафильтрации на мембране с пределом задержания 5 кДа и отделяют низкомолекулярные вещества, удержанный на мембране хондроитина сульфат промывают на той же мембране дистиллированной водой до полного удаления солей, затем проводят промывку дистиллированной водой и концентрирование раствора хондроитина сульфата путем ультрафильтрации на мембране с пределом задержания 50 кДа.
Недостатками данного способа является невозможность получения различных сульфатированных гликозаминогликанов, таких как кератансульфата, дерматансульфата, т.к. используется мембрана при ультрафильтрации с достаточно большим размером пор, что приводит к потере кератансульфата и дерматансульфата. Также недостатками является сравнительно небольшой выход и невозможность использования широкого спектра субпродуктов, также невозможность контролировать состав конечного продукта.
Сульфатированные гликозаминогликаны (сГАГ) в тканях всегда присутствуют вместе, отличается лишь количественный состав. Промышленное разделение на отдельные сГАГ – сложный, длительный и затратный процесс, снижающий выход и возможность применения разнообразных малоценных субпродуктов. Целесообразно получение именно комплексов сГАГ, которые имеют большее сродство к тканям тела человека. Перспективно использование данных комплексов в косметологической практике для создания биологически совместимых гетерогенных матриксов, а также в офтальмологии.
Данное изобретение решает техническую проблему получения фармацевтических композиций фармацевтического качества определенного состава с заданным процентным содержанием конкретных сульфатированных гликозаминогликанов, использования более широкого ассортимента малоценных субпродуктов, из которых можно выделить хондроитинсульфаты (4 и 6), повышения выхода целевого продукта, более полного выделения сопутствующих сГАГ (дерматансульфата, кератансульфата), а также повышение чистоты конечного продукта.
Технический результат достигается способом получения сульфатированных гликозаминогликанов из биологических тканей, заключающимся в том, что сырье очищают, измельчают, проводят его щелочной гидролиз, полученную смесь нейтрализуют и проводят ферментативный гидролиз, проводят ультрафильтрацию ферментативного гидролизата, удержанный на мембране продукт промывают раствором хлорида натрия и концентрируют с получением раствора сульфатированных гликозаминогликанов, при этом, согласно изобретению, после очистки перед измельчением сырье обеззараживают гипохлоритом натрия, и промывают водой, щелочной гидролиз проводят до полного растворения осадка, нейтрализацию смеси проводят с последующим закислением до рН 5,5-6,5, ферментативный гидролиз проводят с использованием комплекса ферментов папаина, трипсина и химотрипсина при температуре 30-40°С, после чего дезактивируют ферменты нагреванием до температуры 65-70°С (указать интервал) и фильтруют горячий раствор последовательно на мембранах с размером пор на конечной мембране не более 0,2 мкм, ультрафильтрацию полученного ферментативного гидролизата проводят мембране с пределом задерживания 2,5 кДа, а полученный после промывания и концентрирования раствор сульфатированных гликозаминогликанов фильтруют через мембрану с размером пор 0,2 мкм и используют как готовый продукт или направляют на получение сухого готового продукта.
Кроме того, предпочтительно использовать комплекс ферментов в виде раствора со следующими значениями концентрации: папаин 0,25-0,5 мас.%, трипсин 0,5-1 мас.%, химтрипсин 0,5-1 мас.%.
Также предпочтительно проводить концентрирование до достижения концентрации 0,5-1% сульфатированных гликозаминогликанов.
При получении сухого готового продукта осуществляют осаждение этанолом из полученного после фильтрации раствора сульфатированных гликозаминогликанов и сушку полученного осадка.
Техническим результатом предлагаемого способа по сравнению с прототипом является повышение выхода продукта вследствие использования комплекса ферментов и субпродукты гидролизуются практически полностью, что повышает эффективность отделения целевого продукта из смеси гидролизата, а также использование при ультрафильтрации мембраны с меньшим размером пор.  Также техническим результатом предлагаемого способа по сравнению с прототипом является повышение чистоты конечного продукта в результате того, что раствор гидролизата последовательно фильтруют, прежде чем залить его в систему тангенцальной фильтрации на мембранах с размером пор на конечной мембране не более 0,2 мкм, ультрафильтрацию полученного ферментативного гидролизата проводят на мембране с пределом задерживания 2,5 кДа, а  также полученный после промывания и концентрирования раствор сульфатированных гликозаминогликанов фильтруют через мембрану с размером пор 0,2 мкм.
Можно заранее установить, каким является %-ное содержание компонентов при использовании различного сырья в определенных рамках и получать композицию с содержанием компонентов, которое получается из определенного вида сырья. Кроме того, при использовании одновременно различных видов сырья процентное содержание в конечном продукте конкретного сГАГ будет зависеть от процентного содержания конкретного субпродукта на входе, так как в разных субпродуктах содержится разное количество определенного сГАГ. Так, например, в роговице содержится максимальное количество кератансульфата, и чем больше этого субпродукта в исходном сырье, тем больше кератансульфата в конечном продукте.
Предложенный способ осуществляется следующим образом.
Подготовка материала. Особенностью данного способа является то, что в качестве субпродуктов для получения различных по составу фармацевтических композиций используют сырье, которое может иметь различный процентный состав субпродуктов, как это показано в таблице 2.
Таблица 2
Субпродукт
Содержание в сырье, %
Трахеи крупного рогатого скота (КРС)
0 – 100
Хрящи и синовиальные сумки
0 – 100
Хрящи носовой перегородки КРС
0 – 100
Клапаны сердца
0 – 100
Сухожилия и связки
0 – 100
Кожа свиная, прошедшая мездрение
0 – 100
Роговица глаз КРС
0 – 100
Вначале материал промывают в проточной воде для удаления крови, мусора. Материал тщательно обрезают от имеющихся на нем кусков жира и мяса. Особенностью данного способа является то, что материал обеззараживают веществами, содержащими активный хлор, предпочтительно раствором гипохлорита натрия с концентрацией 0,5–0,55% , вымачивая его в течение 24–36 часов в соотношении по массе 1 часть материала на 3–4 части раствора. После этого материал вынимают из раствора гипохлорита натрия и промывают дистиллированной водой 2–3 раза из расчета 1:1 по массе.
Измельчение. Материал пропускают через мясорубку и гомогенизируют в дисковом истирателе до размеров частиц 0,005-0,01 мм. Тщательность гомогенизации в значительной мере сказывается на выходе конечного продукта.
Щелочной гидролиз. Особенностью данного способа является то, что щелочной гидролиз ведут при перемешивании при температуре 20–30°С в растворе гидроксида натрия с концентрацией 6,0–6,5% в течение 24–36 часов до полного растворения осадка. Для щелочного гидролиза берут 1 часть сырого материала на 1–2 части раствора гидроксида натрия по массе. Затем раствор нейтрализуют и закисляют до рН = 5,5 – 6,5 раствором соляной кислоты с концентрацией 0,5–1 моль/л.
Ферментативный гидролиз. Особенностью данного способа является то, что после щелочного гидролиза на смесь действуют ферментативным папаин-трипсин-химотрипсиновым комплексом при соотношении ферментов по массе: папаина от 0,25% до 0,5%; трипсина от 0,5% до 1%; химотрипсина от 0,5% до 1%. На 1 л смеси после нейтрализации и закисления берут 100 мл раствора ферментного комплекса с общей концентрацией ферментов 2–3%. Ферментативный гидролиз ведут при температуре 30–40°С при перемешивании в течение 12–24 часов при поддержании рН = 5,5 – 6,5. По истечении заданного отрезка времени смесь нагревают до 70°С для дезактивации ферментов.
Фильтрация. Особенностью данного способа является то, что смесь после ферментативного гидролиза нагрева не охлаждают, а сразу фильтруют на мембранах 1,2 мкм, затем 0,65 мкм, далее 0,45 ммк и далее 0,2 мкм. Стерильный фильтрат поступает в систему фильтрации по принципу обратного осмоса.
Ультрафильтрация. Особенностью данного способа, является то, что раствор подвергают ультрафильтрационному разделению на мембране с молекулярно-массовым пределом задерживания 2,5 кДа для наиболее полного выхода сГАГ различной молекулярной массы и более полного удаления аминокислотно-белковой фракции и других примесей. Раствор после предыдущей нормальной фильтрации разбавляют в 2-3 раза стерильным раствором 0,9% хлорида натрия и вливают в тангенциальную установку. Раствор отмывают 2-3-кратным раствором 0,9% хлорида натрия от объема разбавленного раствора.
Концентрирование. По окончании процесса отмывки начинают процесс концентрирования, для чего прекращают долив отмывочного раствора в систему ультрафильтрации, в результате чего происходит уменьшение объема не прошедшего через мембрану раствора, содержащего сГАГ, и концентрация его возрастает. Процесс ведут по достижении концентрации 0,5–2% целевого продукта в растворе.
Нормальная фильтрация на мембране 0,2 мкм. После концентрирования раствор фильтруют через мембрану 0,2 мкм. Полученный стерильный раствор комплекса целевых продуктов в физиологическом растворе хлорида натрия используют непосредственно, либо осаждают 96%-ным этанолом при объемном соотношении раствор:этанол = 1:3, затем осадок сушат, либо лиофильно сушат.
Целевой продукт. Выход сГАГ составляет от 1 до 10% по массе сухого вещества к сырым субпродуктам. Содержание основных веществ 98,3–98,5 мас.%. Содержание белка 0,02–0,025 мас.%. Содержание гиалуроната натрия 0,5–1 мас.%. Процентное содержание хондроитин-4-сульфата, хондроитин-6-сульфата, дерматансульфата и кератансульфата колеблется от 10% до 98% в зависимости от соотношения различных субпродуктов в начальной субстанции. Все проценты указаны по массе.
3
3
Содержание компонентов в целевом продукте определяли с помощью ВЭЖХ и ИК–спектрометрии. Содержание основных веществ может составлять 98,3–98,5 мас.%. Содержание белка – 0,02–0,025 мас.%. Содержание гиалуроната натрия – 0,5–1 мас.%. Было показано, что содержание хондроитинсульфатов (4 и 6) может колебаться от 30% до 98,5%; дерматансульфатов от 0,5% до 20,5%; кератансульфатов 0,15% до 80,5%, что зависит от соотношения субпродуктов в сырье. Молекулярная масса компонентов в целевом продукте составляет от 2,5⋅10Да до 100⋅10 Да. Вязкость 1% раствора составляет от 50 мПа⋅с до 230 мПа⋅с.
Пример 1
Получение сГАГ из трахей КРС (100%)
Взяли 1 кг очищенных и промытых бычьих трахей. Залили раствором гипохлорита натрия в количестве 3,5 л, содержащего 0,5% гипохлорита натрия, и оставили для отбеливания и дезинфекции материала на 24 часа. Затем жидкость слили, трахеи промыли три раза по 1 л дистиллированной водой.
Промытый материал пропустили через мясорубку. Измельченный материал поместили в дисковый истиратель. Измельчали в течение 20 минут.
Кашеобразную массу залили 1 л раствора гидроксида натрия, содержащего 65 г основания (6,5%), поставили на мешалку. Суспензию гидролизовали в течение 36 часов при температуре 23°С при перемешивании.
Смесь нейтрализовали и закислили 1 молярным раствором соляной кислоты в объеме 1630 мл.
В смесь влили раствор папаин-трипсин-химотрипсинового комплекса в объеме 363 мл, содержащего 1,452 г папаина (0,4%), 2,904 г трипсина (0,8%) и 2,904 г химотрипсина (0,8%). Ферментолиз проводили в течение 24 часов при температуре 35°С при рН = 5,5. По истечении заданного отрезка времени смесь нагрели до 70°С для дезактивации ферментов.
Смесь после ферментативного гидролиза и нагрева не охлаждали, а сразу фильтровали на мембранах 1,2 мкм, затем 0,65 мкм, далее 0,45 мкм и далее 0,2 мкм.
Стерильный фильтрат разбавили 12 литрами 0,9% раствора хлорида натрия и влили в систему тангенциальной фильтрации с мембраной 2,5 кДа.
В ходе процесса ультрафильтрации в систему влили еще 30 л 0,9% раствора хлорида натрия для промывки.
Раствор сконцентрировали до объема 8,2 л.
Затем раствор профильтровали через мембрану 0,2 мкм. Получили прозрачный стерильный раствор с содержанием 1% сГАГ в растворе в 0,9%-ном растворе хлориде натрия. Выход целевого продукта составил 7,7% по массе. Содержание основных веществ 98,7 мас.%. Содержание хондроитинсульфатов 4, 6 составило 97,71 мас.%; дерматансульфатов – 0,43 мас.%; кератансульфатов – 0,015 мас.%; гиалуроната натрия – 0,55 мас.%. Содержание белка в сухом веществе составил 0,023 мас.%. Вязкость 1% раствора составила 230 мПа⋅с.
Пример 2.
Получение сГАГ из хрящей носовых перегородок КРС (50 %) и свиной кожи, прошедшей мездрение (50%).
Взяли 500 г очищенных и промытых хрящей носовых перегородок КРС и 500 г очищенной, промытой и прошедшей мездрение свиной кожи.
Проводили процесс как описано в примере 1.
Раствор сконцентрировали до объема 3 л.
Затем раствор профильтровали через мембрану 0,2 мкм. Получили прозрачный стерильный раствор.
Затем раствор осадили 9 литрами 96%-ного этанола, охлажденного до температуры 4°С.
Материал высушили и получили 14,3 г сухого целевого продукта.
Выход целевого продукта составил 1,43%. Содержание основных веществ –  98,3 мас.%. Содержание белка в сухом веществе составило 0,025 мас.%. Вязкость 1% раствора составило 152 мПа⋅с. Содержание компонентов в целевом продукте определяли с помощью ВЭЖХ и ИК – спектрометрии. Содержание хондроитина сульфатов 4, 6 составило 89,4 мас.%; дерматансульфатов – 9,3 мас.%; кератансульфатов – 0,17 мас.%; гиалуроната натрия – 0,95 мас.%.
Пример 3.
Получение сГАГ из роговицы глаз (100%).
Взяли 1000 г очищенных и промытых роговиц КРС.
Проводили процесс как описано в примере 1.
Раствор сконцентрировали до объема 2,6 л.
Затем раствор профильтровали через мембрану 0,2 мкм. Получили прозрачный стерильный раствор.
Затем раствор осадили 7,8 литрами 96%-ного этанола, охлажденного до температуры 4°С.
Материал высушили и получили 10,9 г сухого целевого продукта.
Выход целевого продукта составил 1,09%. Содержание основных веществ – 98,45 мас.%. Содержание белка в сухом веществе составило 0,02 мас.%. Вязкость 1%-ного раствора составило 50 мПа⋅с. Содержание компонентов в целевом продукте определяли с помощью ВЭЖХ и ИК – спектрометрии. Содержание кератансульфата составило 77,8 мас.%; хондроитинсульфатов (4 и 6) – 18,2 мас.%;  дерматансульфатов – 2,6 мас.%;  гиалуроната натрия – 1,05 мас.%.
Пример 4.
Получение сГАГ из суставных хрящей (50%), синовиальных сумок (25%) и роговицы глаз (25%).
Взяли 500 г суставных хрящей КРС, 250 г синовиальных сумок КРС и 250 г роговицы глаз КРС.
Проводили процесс как описано в примере 1.
Раствор сконцентрировали до объема 4,5 л.
Затем раствор профильтровали через мембрану 0,2 мкм. Получили прозрачный стерильный раствор.
Затем раствор осадили 13,5 литрами 96%-ного этанола, охлажденного до температуры 4°С.
Материал высушили и получили 55,7 г сухого целевого продукта.
Выход целевого продукта составил 5,57%. Содержание основных веществ – 98,35 мас.%. Содержание белка в сухом веществе составило 0,022 мас.%. Вязкость 1% раствора составило 97 мПа⋅с. Содержание компонентов в целевом продукте определяли с помощью ВЭЖХ и ИК – спектрометрии. Содержание кератансульфата составило 19,7 мас.%; хондроитинсульфатов (4 и 6) – 78,1 мас.%; дерматансульфата – 1,8 мас.%; гиалуроната натрия – 0,22 мас.%.