Питательная среда для выделения Pseudomonas aeruginosa из водных объектов
NUTRIENT MEDIUM FOR EXTRACTING PSEUDOMONAS AERUGINOSA FROM WATER BODIES

Изобретение относится к санитарной микробиологии, в частности, к разработке селективной питательной среды для выделения Pseudomonas aeruginosa из воды и может быть использовано при осуществлении контроля за качеством воды поверхностных водоемов, зон рекреации, сточных и питьевых вод.
Pseudomonas aeruginosa (синегнойная палочка) - грамотрицательная свободноживущая бактерия, обитающая в воде и почве. Синегнойная палочка - условно-патогенный микроорганизм, возбудитель нозокомиальных инфекций, обладающий высокой устойчивостью к антибиотикам. Одним из характерных биологических признаков, отличающих синегнойную палочку от других микроорганизмов, является способность синтезировать водорастворимый пигмент - пиоцианин (производное феназинов), регистрация которого используется в рутинной практике при идентификации P. aeruginosa. Встречаются беспигментные штаммы P. aeruginosa, которые, по литературным данным, играют особую роль в синегнойно-кандидозных ассоциациях - распространенной этиологической причине полимикробных инфекций (А.В. Лазарева и соавт. Pseudomonas aeruginosa: патогенность, патогенез и патология. - Клин микробиол антимикроб химиотер. - 2015. - Том 17, №3.- С. 171, 180).
Выделение P. aeruginosa из воды исследуемых водных объектов осуществляют в 2 этапа. На 1 этапе проводят посев воды в среду накопления, в которой могут расти не только P.aeruginosa, но и другие грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы, обитающие в воде. На 2 этапе проводят высев из среды накопления на твердые дифференциально - диагностические среды, так как выделение штаммов P. aeruginosa на простых питательных средах (МПА, кровяной агар) затруднено в связи с обильным ростом сопутствующих бактерий, угнетающих рост синегнойной палочки.
В микробиологической практике для выделения P. aeruginosa из воды используют среду «Блеск», в состав которой входят питательный агар, обезжиренное молоко, L-аргинин, селективный агент - трифенилтетразолий хлорид (ТТХ). Данная среда обеспечивает подавление роста сопутствующих микроорганизмов, но не дает возможности визуального наблюдения выработки синегнойными бактериями пигмента пиоцианина. Использование в составе среды молока требует дополнительной термической обработки при ее изготовлении (Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга I / под ред. Лабинской А.С., Волиной Е.Г. - М.: БИНОМ, 2008. - С. 1017).
Известна среда Кинг А для обнаружения и дифференциации P. aeruginosa от других Pseudomonas на основе выделения пиоцианина. Среда содержит панкреатический гидролизат желатина в качестве источника азота, глицерин - источника углерода, другие питательные вещества. Сульфат калия и хлорид магния обеспечивают активацию выделения пиоцианина (Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Книга I / под ред. Лабинской А.С., Волиной Е.Г. - М.: БИНОМ, 2008. - С. 1016).
Для выделения P. aeruginosa из клинических образцов и дифференциации их от других псевдомонад на основании формирования пигмента пиоцианина используют BD Pseudomonas Isolation Agar. Агар содержит пептон Bacto (источник углерода и азота), противомикробный агент иргазан (Irgasan), избирательно ингибирующий сопутствующие грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы, глицерин в качестве источника энергии, а также сульфат калия и хлорид магния - для активации выделения пиоцианина (Инструкция по применению - готовая к использованию среда в чашках РА-257002.04 Ред.: April 2013 http//www.bd.com/resource.aspx?IDX=25359).
Ведущими зарубежными фирмами выпускаются твердые питательные среды на основе панкреатического гидролизата желатина, мясного пептона и лактозы, содержащие цетримид для подавления роста сопутствующих микроорганизмов, калий сернокислый и магний хлористый для активации выделения пиоцианина и глицерин. Среды предназначены для селективного выделения и идентификации бактерий P. aeruginosa из клинического материала: Cetrimide Agar - Pseudomonas Selective Agar Base, фирмы Fluka (Scientific research 2003/2004, стр. 361) и ООО «ГЕМ» (Среды бактериологические. Каталог 2012); Cetrimide Agar Base HiMedia (HiMedia Laboratories Pvt. Limited (Индия), http:www.himedialabs.com).
Недостатком вышеуказанных сред является то, что, наряду с угнетением сопутствующей грамположительной и грамотрицательной микрофлоры ингибиторами, входящими в их состав, происходит одновременное угнетение роста ряда штаммов синегнойной палочки. Кроме того, селективное действие данных сред основано на активации пигментообразования, что затрудняет выделение и диагностику атипичных, не образующих пигмент штаммов синегнойной палочки, особенно при проведении широкомасштабного эпидемиологического мониторинга. При этом указанные отечественные и зарубежные питательные среды многокомпонентны, имеют сложный состав, включающий дорогостоящие компоненты, не всегда доступны.
Наиболее близким аналогом является Основа агара с цетримидом Cetrimide Agar Base (Pseudomonas Selective Agar Base), которая в настоящее время используется в практических лабораториях для выделения P. aeruginosa при исследовании как клинического материала, так и объектов внешней среды, пищевых продуктов и др. (Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIII издание - М.: ФЭМБ, 2015. - 1.1.2.4. Методы биологического анализа; ГОСТ 54755-2011 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Pseudomonas aeruginosa». М.: Стандартинформ, 2012 г.).
Данная среда имеет следующий состав, г/л:
Готовят среду с цетримидом по нижеследующей прописи: навеску питательной среды с цетримидом (согласно прописи на этикетке) тщательно размешивают в 1,0 л дистиллированной воды, содержащей 10 мл глицерина. Нагревают и кипятят 2 мин для полного расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют автоклавированием при 1,1 атм (120±2°С) в течение 15 мин. Среду охлаждают до температуры 45-50°С, разливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды чашки подсушивают. Готовая среда опалесцирующая, светло-янтарного цвета.
Недостатком данной среды является то, что, во-первых, все-таки происходит угнетение роста ряда штаммов синегнойной палочки, и, во-вторых, на данной среде не всегда возможно выделить и диагностировать атипичные беспигментные штаммы синегнойной палочки. Кроме того, среда многокомпонентная, производится зарубежными фирмами, дорогостоящая.
Целью предлагаемого изобретения является дифференциально-диагностическая питательная среда для выделения P. aeruginosa из воды, которая обеспечит преимущественный рост синегнойной палочки при максимальном подавлении роста сопутствующей микрофлоры, а также позволит выделить атипичные беспигментные штаммы синегнойной палочки.
4
2
4
2
Поставленная задача достигается введением в состав мясо-пептонного агара глюкозы, сульфата меди - CuSO×5HO и глицерина в определенных концентрациях. В предлагаемой питательной среде МПА и глюкоза являются источником углерода и азота, необходимых для роста бактерий. Сульфат меди - CuSO×5HO (медный купорос, выпускаемый отечественной промышленностью в виде сухого кристаллического порошка синего цвета и применяемый как асептическое и фунгицидное средство) ингибирует рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, отличных от Pseudomonas. Глицерин служит источником энергии и способствует выработке пигмента пиоцианина.
При высеве из среды накопления на предлагаемую дифференциально-диагностическую среду достигается максимальное подавление роста сопутствующей микрофлоры без угнетения роста P. aeruginosa, что обеспечивает также возможность выделения и диагностики беспигментных штаммов синегнойной палочки за счет преимущественного роста P. aeruginosa.
Предлагаемая питательная среда состоит (г/л):
Мясо-пептонный агар (МПА)
1 л
Сульфат меди (CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O)
0,14 г
Глюкоза
10,0 г
Глицерин
10,0 мл
рН - 7,0±0,2
Данная среда при температуре инкубации 42°С в термостате в течение 18-24 час позволяет изолировать из микробных ассоциаций синегнойные бактерии при максимальном подавлении роста других микроорганизмов.
4
2
Способ приготовления питательной среды: Предварительно готовят мясо-пептонный агар с 1% глюкозы. Для этого 20 г агара микробиологического и 10 г глюкозы растворяют в 1000 мл дистиллированной воды, нагревают и кипятят 2 мин до полного растворения агара, разливают в стерильные флаконы по 100 мл и стерилизуют автоклавированием при 1,1 атм (120±2°С) в течение 20 мин. К 100 мл стерильного, расплавленного мясо-пептонного агара с глюкозой, охлажденного до 60°С, добавляют 0,014 г сульфата меди (CuSO×5HO) и 1,0 мл глицерина. Содержимое энергично перемешивают до полного растворения и разливают в стерильные чашки Петри (не менее 20-25 мл). Перед посевом чашки с. питательной средой подсушивают. Среду готовят в лаборатории непосредственно перед использованием. Готовая среда слегка зеленоватого цвета.
На данной среде формируются крупные или средние полупрозрачные колонии P. aeruginosa (1,5-3 мм) серо-зеленого или сине-зеленого цвета, с выделением специфического сладковатого запаха жасмина.
Пример 1. Подбор концентраций ингредиентов в составе предлагаемой питательной среды
Питательную среду готовят по вышеуказанному способу, используя разные концентрации сульфата меди (Таблица 1).
При подборе концентраций ингредиентов использовали тест-штаммы: P. aeruginosa 10145; S. paratyphi В 506; E. coli 3912/41.
9
-4
-5
-6
-4
-5
-6
Приготовление микробных взвесей. Суточные агаровые культуры тест-штаммов смывают 0,9% стерильным изотоническим раствором хлорида натрия, доводят взвеси до 10 ед. по оптическому стандарту мутности, что соответствует 10 микробных клеток в 1 мл. Затем серийными десятикратными разведениями доводят до содержания 100 тыс. (10), 10 тыс. (10) и 1 тыс. (10) микробных клеток в 1 мл взвеси. Высев производят из разведений 10, 10, 10 по 0,1 мл на чашки со средой, содержащей разные концентрации сульфата меди и инкубируют при температуре 37 и 42°С в течение 18-24 час.
Данные по ростовым свойствам среды представлены в таблицах 2 и 3.
Рост P. aeruginosa в количестве, соответствующем посевной дозе микроорганизма, отмечен на среде с минимальным и оптимальным содержанием сульфата меди. При этом преимущественный рост псевдомонад регистрировали при температуре 42°С. На питательной среде с максимальным содержанием сульфата меди наблюдали угнетение роста синегнойных бактерий (единичные колонии, отсутствие роста).
Рост других микроорганизмов (E. coli и S. paratyphi В) зависит от посевной дозы микроорганизма и на среде с оптимальным содержанием сульфата меди наблюдали значительное угнетение роста. При максимальном содержании сульфата меди рост сопутствующих бактерий отсутствует. При температуре 42°С на данной среде растут только синегнойные палочки.
При необходимости, принадлежность колоний к P. aeruginosa подтверждают дополнительными видоспецифическими тестами (образование цитохромоксидазы, флуоресцирующих пигментов и др.).
Пример 2. Определение ростовых и морфологических характеристик референс-штаммов на предлагаемой питательной среде (в зависимости от температурных условий культивирования)
-6
Для оценки предлагаемой питательной среды использовали культуры музейных штаммов: P. aeruginosa 10145; S. aureus 209-Р 6538; E. coli 3912/41; Sh. sonnei (S-форм); S. paratyphi В 506; K. pneumoniae 79. Референс-штаммы готовят вышеуказанным способом. Высев производят из разведения 10. Посевы инкубируют аэробно при температуре 37±1°С и 42±1°С в течение 18-24 час. Учитывают форму и характер роста колоний. Ростовые и морфологические характеристики референс-штаммов на предлагаемой питательной среде в зависимости от температурных условий культивирования представлены в таблице 4.
Предлагаемая питательная среда для выделения псевдомонад, содержащая мясо-пептонный агар, глюкозу, сульфат меди и глицерин в соответствующих концентрациях, обеспечивает рост P. aeruginosa в виде колоний серо-зеленого или сине-зеленого цвета (1,5-3 мм в диаметре). Рост сопутствующих грамположительных и грамотрицательных бактерий при 37±1°С в значительной степени ингибируется, при 42±1°С - рост сопутствующих бактерий отсутствовал.
Пример 3. Сравнение эффективности предлагаемой питательной среды и прототипа при выделении P. aeruginosa из объектов водной среды
Изучена сравнительная эффективность предлагаемой питательной среды и прототипа для выделения P. aeruginosa из воды поверхностных водоемов и сточных вод.
Исследование объектов окружающей среды на P. aeruginosa состояло из двух этапов: накопления P. aeruginosa в жидкой питательной среде для обогащения, выделения P. aeruginosa на плотной питательной дифференциально-диагностической среде с последующей идентификацией Р. aeruginosa с использованием ограниченного набора наиболее надежных тестов.
Посев проб воды реки Дон и сточной воды производили в одну из общепринятых сред накопления: Магниевую среду или Жидкую питательную среду накопления (MP 01-19/98-17 от 06.11.1995 г.) и культивировали при температуре 42°С в течение 18-24 час. Высев из среды накопления на предлагаемую питательную среду производили бактериологической петлей штрихами для получения изолированных колоний. Изучено 45 проб воды реки Дон и 45 проб сточной воды (таблица 4).
При использовании предлагаемой питательной среды с сульфатом меди P.aeruginosa изолирована из воды реки Дон в 86,7±5,1% проб, из сточной воды - в 93,3±3,7% проб. Полученные результаты значительно превысили выявляемость данного микроорганизма при использовании агара с цетримидом: из воды реки Дон - 71,1±6,8%, из сточных вод - 77,8±6,2%. Рост других микроорганизмов не наблюдали.
Принадлежность колоний к P. aeruginosa, а также выявление атипичных беспигментных штаммов данного микроорганизма на предлагаемой питательной среде подтверждали дополнительными видоспецифическими тестами (образование цитохромоксидазы, флуоресцирующих пигментов и др.).
При использовании предлагаемой питательной среды с сульфатом меди P. aeruginosa изолирована из воды реки Дон в 86,7±5,1% проб, из сточной воды - в 93,3±3,7% проб, что значительно превысило выявляемость данного микроорганизма при использовании агара с цетримидом: из воды реки Дон - 71,1±6,8%, из сточных вод - 77,8±6,2%. Роста других микроорганизмов не наблюдали. Принадлежность колоний к P. aeruginosa, а также выявление атипичных беспигментных штаммов микроорганизма на предлагаемой питательной среде, подтверждали дополнительными видоспецифическими тестами (образование цитохромоксидазы, флуоресцирующих пигментов и др.).
Результаты проведенных исследований показали преимущества предлагаемой питательной среды с сульфатом меди при выделении P. aeruginosa из воды различной степени биологического загрязнения. Использование данной среды в практике санитарно-бактериологических исследований позволит адекватно оценить степень эпидемической опасности водных объектов.