СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ФОЛДИНГА ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА

1. Способ проведения фолдинга трансформирующего фактора роста Бета или его функционального аналога с получением биологически активной димерной формы, заключающийся в добавлении растворимой несвернутой формы фактора роста к раствору, содержащему следующие компоненты:
(i) 2-(циклогексиламино)этансульфоновая кислота (ЦГЭС) или ее функциональный аналог;
(ii) низкомолекулярная сульфгидрильная/дисульфидная окислительно-восстановительная система; и
инкубации фактора роста в растворе до образования биологически активной димерной формы.
2. Способ по п.1, в котором ЦГЭС применяется в концентрации от 100 мМ до 1,0 М.
3. Способ по п.1, в котором ЦГЭС применяется в концентрации около 0,7 М.
4. Способ по п.1, в котором функциональный аналог ЦГЭС имеет формулу:
1
2
1-4
3-8
1
2
где R и R - это одинаковые или разные заместители из следующей группы: водород, замещенные или незамещенные Салкильные группы, замещенные или незамещенные Сциклоалкильные группы, или замещенное или незамещенное ароматическое кольцо, либо R и R вместе участвуют в образовании кольцевой системы, содержащей до 10 атомов;
1
2
2
3
4
5
4
5
6
1-4
3-8
3
4
5
1
2
4
5
X и Х независимо друг от друга выбираются из следующего перечня: -О-, -S, -S(O), -S(O)-, -NR-, -CHR и CHR, где R, R и R - это одинаковые или разные заместители из следующей группы: водород, замещенные или незамещенные Салкильные группы, замещенные или незамещенные Сциклоалкильные группы, или замещенное или незамещенное ароматическое кольцо, причем два заместителя (из R, R, R) могут образовывать кольцевую систему с числом атомов углерода до 6, при этом должно выполняться условие, что по меньшей мере один из заместителей X, X - это -CHR- или -CHR-; а также
3
Х - это С, S, S=O или Р-ОН.
5. Способ по п.4, в котором функциональный аналог ЦГЭС описывается формулой:
6. Способ по п.4, в котором функциональный аналог ЦГЭС описывается формулой:
7. Способ по п.4, в котором функциональный аналог ЦГЭС описывается формулой:
8. Способ по п.1, в котором низкомолекулярная сульфгидрильная/дисульфидная окислительно-восстановительная система представлена глютатионом в окисленной и восстановленной формах.
9. Способ по п.8, в котором сульфгидрильная/дисульфидная окислительно-восстановительная система содержит около 200 мкМ-20 мМ восстановленного глютатиона и 40 мкМ-4 мМ окисленного глютатиона.
10. Способ по п.1, в котором трансформирующий фактор роста Бета инкубируется при рН от 8 до 10.
11. Способ по п.10, в котором трансформирующий фактор роста Бета инкубируется при рН около 8,5-9,5.
12. Способ по п.1, в котором трансформирующий фактор роста Бета инкубируется при температуре от 0 до 37°С.
13. Способ по п.1, в котором концентрация трансформирующего фактора роста Бета в растворе составляет 0,1-0,5 мг/мл.
14. Способ по п.1, в котором трансформирующий фактор роста Бета представляет собой трансформирующий фактор роста Бета 3.
15. Способ по п.14, в котором концентрация трансформирующего фактора роста Бета 3 в растворе составляет 0,12-0,25 мг/мл.
16. Способ по п.1, в котором фолдинг проводится при следующих условиях: 0,7 М 2-(циклогексиламино)этансульфоновой кислоты (ЦГЭС), 2 мМ восстановленного глютатиона (GSH), 0,4 мМ окисленного глютатиона (GSSH), 0,12 мг/мл ТФР-Бета 3, рН 9,5 при 2-8°С.
17. Способ по п.1, в котором фолдинг проводится при следующих условиях: 0,7 М ЦГЭС, 2 мМ GSH, 0,4 мМ GSSH, 0,12 мг/мл ТФР-Бета 3, рН 9,5 при комнатной температуре.
18. Способ по п.1, в котором в раствор дополнительно вводится тауродезоксихолат.
19. Способ по п.18, в котором трансформирующий фактор роста Бета инкубируется в растворе с концентрацией тауродезоксихолата 10 мМ-100 мМ.
20. Способ по п.18, в котором трансформирующий фактор роста Бета инкубируется в растворе с концентрацией тауродезоксихолата около 30 мМ.
21. Способ по п.1, в котором фолдинг проводится при следующих условиях: 30 мМ тауродезоксихолата, 0,7 М ЦГЭС, 2 мМ GSH, 0,4 мМ GSSH, 0,12 мг/мл ТФР-Бета 3, рН 9,5 при 2-8°С.
22. Способ по п.1, в котором фолдинг проводится при следующих условиях: 30 мМ тауродезоксихолата, 0,7 М ЦГЭС, 2 мМ GSH, 2 мМ GSSH, 0,25 мг/мл ТФР-Бета 3, рН 9,5 при 2-8°С.
23. Способ по п.1, в котором трансформирующий фактор роста составляет более 50% всех белков в растворе.
24. Способ по п.1, в котором низкомолекулярная сульфгидрильная/дисульфидная окислительно-восстановительная система приготовлена и «состарена» в течение 7 ч до введения трансформирующего фактора роста в раствор с системой.
25. Способ получения активного трансформирующего фактора роста Бета из прокариотических клеток-хозяев, включающий:
(A) ферментацию прокариотических микроорганизмов, трансформированных для экспрессии представителя надсемейства трансформирующих факторов роста Бета;
(B) выделение телец включения и восстановление экспрессированного белка из телец включения;
(C) проведение ренатурации представителя надсемейства трансформирующих факторов роста Бета способом по п.1; и
(D) очистку ренатурированного представителя надсемейства трансформирующих факторов роста Бета.
26. Способ по п.25, в котором на этапе (А) прокариотическая клетка-хозяин представляет собой бактерию, трансформированную вектором экспрессии, содержащим код трансформирующего фактора роста.
27. Способ по п.25, в котором на этапе (С) фактор роста ренатурируется способом в соответствии с пп.1-24.
28. Способ по пп.25-27, в котором этап (D) проводят путем ультрафильтрации и ионно-обменной хроматографии.
29. Способ по п.28, в котором ионная хроматография представляет собой хроматографию гидрофобного взаимодействия с последующей катионно-обменной хроматографией, при этом трансформирующий фактор роста доводится до желаемой концентрации и помещается во флаконы.
30. Способ по пп.25-27, дополнительно содержащий этап (Е), на котором фактор роста доводится до желаемой концентрации и помещается во флаконы.