ШТАММ БАКТЕРИЙ Clostridium acetobutylicum - ПРОДУЦЕНТ БУТАНОЛА, АЦЕТОНА И ЭТАНОЛА
STRAIN OF BACTERIA Clostridium acetobutylicum-PRODUCER OF BUTANOL, ACETONE AND ETHANOL

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма Clostridium acetobutylicum, продуцирующего бутанол, ацетон и этанол.
Изобретение может быть использовано для получения бутанола, ацетона и этанола экологически чистым методом - методом сбраживания сырья.
Бутанол, ацетон и этанол - органические растворители, широко применяемые при изготовлении нитролаков и масляных лаков, в производстве сложных растворителей, синтетической резины и шелка, при экстрагировании фармацевтических препаратов, служат сырьем для производства практически всех пластмасс и их растворителей.
Известны химические методы получения бутанола, ацетона и этанола, но при этом в конечном продукте почти всегда обнаруживается присутствие примесей в виде остаточных количеств исходного сырья или промежуточных продуктов химического синтеза, а также вторичный бутиловый спирт, что значительно снижает качественные показатели и сферу применения растворителей.
Получение бутанола, ацетона и этанола методом ацетонобутилового брожения не имеет недостатков, присущих химическому синтезу, и находит широкое применение в различных отраслях хозяйственной деятельности человека, являясь не только целевым продуктом, но и сырьем, особенно в производствах, связанных с повышенными требованиями к качеству исходного сырья, - это, прежде всего, промышленность тонкого органического синтеза и фармацевтическая промышленность.
Обычное соотношение растворителей, получаемых при сбраживании бактериями Clostridium acetobutylicum, бутанол:ацетон:этанол 6:3:1, может изменяться в зависимости от свойств штамма-продуцента, от особенностей технологии, от видов сбраживаемого сырья. Наиболее ценным продуктом является бутанол.
С появлением нового направления в использовании бутанола в качестве биотоплива, альтернативного углеводородному топливу, возвратился интерес к ацетонобутиловому брожению. При этом направление исследований - получение максимального выхода бутанола, возможность переработки воспроизводимых источников сырья.
Основными направлениями исследований в Великобритании, США, Германии, Китае, Японии являются конструирование новых штаммов ацетонобутиловых бактерий методами генетической инженерии, разработка новых технологических приемов производства и выделения конечных целевых продуктов.
Совершенствования известных отечественных технологий в ацетонобутиловом производстве касались, как правило, создания приемов с целью повышения выхода целевых продуктов, главным образом бутанола, как наиболее ценного продукта.
При этом сбраживаемым сырьем традиционно была мука - пшеничная, кукурузная, реже ржано-пшеничная, т.е. пищевое крахмалистое сырье. Следует учесть также, что производственный штамм на отечественных предприятиях, вырабатывающих бутанол и ацетон методом брожения, был фактически один, предложенный при вводе первого ацетонобутилового завода страны, - Clostridium acetobutylicum ВКПМ В 4361.
Результаты исследований отечественных ученых (Логоткин И.С. Технология ацетонобутилового брожения, М., 1958 г. С.144-153) позволили перевести ацетонобутиловое производство на смешанное сырье - муку и мелассу, как новый способ, предусматривающий снижение расхода пищевого сырья - муки и замену на непищевое сырье - мелассу.
Отечественные работы по использованию иных видов сырья, в частности древесных гидролизатов (Яровенко В.Л. и др. «Непрерывное брожение в ацетонобутиловом производстве», Нальчик, 1962 г.), получаемых кислотным гидролизом, были частью основного направления исследований этого коллектива и касались разработки способа непрерывного ацетонобутилового брожения, с использованием уже упомянутого производственного штамма бактерий Clostridium acetobutylicum ВКПМ В 4361. Промышленного применения эти работы не нашли, но с появлением нового вида сырья появились разработки по созданию новых штаммов-продуцентов бутанола и ацетона (SU №1604852, 1988).
В настоящее время самыми многочисленными являются исследования по поиску микроорганизмов и конструированию штаммов, накапливающих максимальное количество бутанола при переработке воспроизводимых источников сырья.
Известен новый штамм термофильных бактерий Cl. Thermosaccharolyticum, сбраживающий глюкозу, целлюлозу, мальтозу, целлобиозу при 55-62°С с повышенным выходом бутанола; брожение идет в течение 1-4 дней. Питательная среда содержит источник азотного и органического питания, неорганические соединения. С целью повышения выхода бутанола в среду при выращивании штамма вносят 0.1-1.0 часть (вес.) бутанола (JP 61209594).
Известен мутантный штамм Clostridium beijerinckii BA101 (WO 9851813), обеспечивающий высокий выход бутанола, который составляет от 18 до 21 г/л при батарейном или непрерывном брожении.
Известен мутантный штамм Clostridium pasteurianum CA 101, полученный выращиванием в анаэробных условиях в среде азота при 37°С в течение 12 часов, при центрифугировании и с обработкой мутагеном N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидином с последующим культивированием в среде, содержащей кротониловый спирт; мутант имеет высокую резистентность к кротониловому спирту и высокую продуктивность по бутанолу (JP 3058782).
Во всех цитированных источниках упоминается о сбраживании «углеводного сырья» и повышенных выходах бутанола, но не указываются виды сырья, что очень важно при сравнительной оценке эффективности штамма и возможного производственного использования его.
Технической задачей настоящего изобретения является расширение арсенала высокопродуктивных штаммов и получение нового штамма, который был бы устойчив к повышенному содержанию бутанола и обладал способностью сбраживать широкий спектр недорогих и легкодоступных источников углерода, содержащихся в возобновляемых источниках сырья и полученных, в основном, из отходов.
Бактерии могут быть легко выращены и использованы в коммерческих целях, поскольку они являются генетически стабильными вследствие их выделения их природных изолятов. Они обладают высокой скоростью роста и получения растворителей.
Наиболее близким к предложенному является штамм бактерий Clostridium acetobutylicum ВКПМ В 5359 (S-3716), полученный путем индуцированного мутагенеза и отбора мутантных клонов на селективных средах (Патент RU №2080382).
Штамм отличает высокий выход растворителей, главное - бутанола, а кроме того, высокая степень сбраживания углеводов.
К недостаткам известного штамма следует отнести необходимость использования в качестве сырья для сбраживания - свеклосахарной мелассы, которая в настоящее время является основным сырьем в пищевой промышленности при получении хлебопекарских дрожжей и в производстве кормового белка для животноводства. Эти обстоятельства значительно сокращают возможность применения штамма. Следует отметить, что штамм получен с помощью химических мутагенов, поэтому возникает значительная степень риска при использовании его в производстве из-за вероятности расщепления мутанта и потери ценных свойств. Данные об устойчивости штамма авторами не приводятся.
Заявляемый штамм получен методом ступенчатой аналитической селекции изолятов, выделенных из отрубей риса (ручного обмолота) и полученных при последующих многократных высевах и выращивании на селективных средах, содержащих различные углеводы. Ступенчатый отбор проводился по признаку сбраживания нескольких видов углеводов, с возможностью расширения видов перерабатываемого сырья, в частности растительного. Для повышения резистентности к бутанолу в среду после стерилизации вносили от 0.5 до 10.0 г/л бутанола. Сброженную среду рассевали на агаризованную среду с внесением бутанола, выращивали в анаэробных условиях, проводили отбор и пересев на жидкие селективные питательные среды, отличающиеся по углеводному компоненту, источнику азота, количеству вносимого бутанола.
Анализировали сброженные среды и оценивали по количеству накопившегося бутанола, остаточного (несброженного) сахара, газов брожения. Были отобраны изоляты, наиболее активным из которых оказался изолят №8 (вариант 31), подтвердивший высокие показатели при повторных пересевах, который и был отобран, как штамм Clostrydium acetobutylicum №3108. Указанный штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института Биохимии и Физиологии Микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН и имеет регистрационный номер ВКМ B-2531D.
Продуктивность заявляемого штамма по сравнению с прототипом представлена в таблице.
Штамм имеет следующие культурально-морфологические и физиологические признаки.
Морфология клеток:
Вегетативные клетки бактерий с хорошей подвижностью, крупные палочковидные, одиночные или попарно, короткими цепочками, в зависимости от стадии развития культуры. Окраска по Граму положительная. Образуют эндоспоры. Тип образования спор бацилярный, споры овальные, диаметр 2-2.5 мкм.
Размер клеток: на 5-8 часу роста d=1.3-1.5 мкм, цепочки, длинные палочки, l=12-20 мкм; на 20-32 часу роста d=1.3-1.5 мкм, подвижные палочки (иногда попарно) l=5-8 мкм.
Культурально-морфологические признаки на разных питательных средах:
Агаризованная картофельная среда с глюкозой.
Через 48 часов роста в анаэробных условиях образует круглые гладкие с ровными краями колонии размером от 1.0 до 2.0-2.2 мм.
Структура колоний однородная, цвет - от светло-серого до белого, непрозрачные, поверхность гладкая, блестящая.
Среда мелассно-мучная.
Через 48 часов роста в анаэробных условиях образует круглые гладкие колонии размером от 1.0 до 2.0 мм, края ровные, структура однородная, цвет серо-белый, прозрачные, блестящие, выпуклые.
Среда с ферментолизатом древесных опилок и добавками.
Через 48 часов роста в анаэробных условиях при 37°С образует колонии размером до 1.0 мм, белые, непрозрачные, круглые, края ровные, поверхность блестящая.
Физиолого-биохимические признаки:
Облигатный гетеротрофный анаэроб.
Желатину разжижает.
На мясо-пептонном агаре (посев уколом) - слабый рост, разрывает газами брожения.
Отношение к источникам углерода:
Сбраживает: крахмал, мальтозу, глюкозу, сахарозу, фруктозу, ксилозу, галактозу, маннит, маннозу, арабинозу, лактозу, декстрин, целлобиозу.
Не сбраживает: раффинозу, дульцит.
Отношение к источникам азота:
Усваивает соединения азота в восстановленной форме.
Отношение к источникам фосфора:
Усваивает соединения фосфора.
Потребность в факторах роста:
Необходимы: биотин и парааминобензойная кислота.
Отношение к температуре:
Растет при температуре 30-38°С, оптимум 36-37°С.
Растет при значениях рН 4.5-7.0, оптимальные значения рН 5.5-6.5.
Хранение штамма - в виде спор на жидкой питательной среде картофельно-глюкозной, на мелассно-мучной, на среде с ферментолизатом древесных опилок в лиофилизированном состоянии.
Хранение в запаянных стеклянных пробирках при температуре от плюс 4°С до плюс 25°С.
Пример 1.
Получение бутанола, ацетона и этанола с использованием заявляемого штамма-продуцента бутанола, ацетона и этанола.
3
4
2
4
Штамм Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D, хранившийся в виде спор в запаянной пробирке, пастеризуют на кипящей водяной бане в течение 1 минуты. Суспензией спор инокулируют 150 мл стерильной жидкой картофельно-глюкозной среды, имеющей следующий состав: картофель - 37 г/л, глюкоза - 0,75 г/л, СаСО - 0,3 г/л, (NH) SO - 0,225 г/л, рН - 6.2, стерилизуют 40 мин при 120°С. Выращивание ведут в термостате при 37°С.
Через 12 часов роста при 36,5°С (экспоненциальная фаза роста бактерий) полученным посевным материалом (5% объема сбраживаемой среды) инокулируют стерильную питательную среду в лабораторном ферментере вместимостью 4 литра (полезная емкость 3 литра).
Состав среды: ферментолизат хвойно-лиственных опилок
- 2,85 л
(соотношение глюкоза:ксилоза
- 8:2,
концентрация сбраживаемых углеводов
- 5,4%)
автолизат кормовых дрожжей
- 3 г/л
биотин
- 3 мг/л
парааминобензойная кислота
- 3 мг/л
Стерилизацию ферментолизата (2,85 л) проводят через подготовленный мембранный фильтр с размером пор не более 0,22 мкм. В стерильный ферментер вносят, соблюдая правила асептики, предварительно простерилизованный при 115°С раствор, в количестве 200 мл, состоящий из автолизата кормовых дрожжей, биотина и пара-аминобензойной кислоты. Ферментацию ведут при 36,5°С. Брожение заканчивается через 40 часов.
По окончании брожения методом газовой хроматографии определяют содержание бутанола, ацетона и этанола, содержание несброженных сахаров.
Сумма растворителей составляла 22,41 г/л, в том числе
Бутанол - 15,90 г/л (70,95%), ацетон - 6,01 г/л (26,82%), этанол - 0,50 г/л (2,23%)
Несброженный сахар - 0,28 г/л
Пример 2.
Получение бутанола, ацетона и этанола с использованием заявляемого штамма - продуцента бутанола, ацетона и этанола.
Штамм Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D, хранившийся в виде спор в запаянной пробирке, пастеризуют на кипящей водяной бане в течение 1 минуты. Суспензией спор инокулируют стерильную питательную среду, состоящую из мелассы и муки в соотношении 1:1 (в пересчете на сбраживаемые углеводы). Через 12 часов в термостате при 36,5°С полученным посевным материалом (5% объема сбраживаемой среды) инокулируют стерильную питательную среду в лабораторном ферментере вместимостью 4 л (рабочий объем 3 л).
Состав среды: ферментолизат хвойных опилок
- 2,85 л
соотношение глюкоза: ксилоза
= 8.6:1.4
концентрация углеводов
- 5,5%
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
- 4,5 г/л
жмых зародышей пшеничного зерна
- 3,0 г/л
Ферментацию ведут при 36,5°С. По окончании брожения определяют содержание растворителей, несброженных углеводов, объем выделившегося газа.
Сумма растворителей составила 22,38 г/л, в том числе
Бутанол - 15,78 г/л (70,50%), ацетон - 6.6 г/л (29,49%), этанол - следы (0,01%)
Содержание несброженного сахара - 0,25 г/л
Пример 3.
Получение бутанола, ацетона и этанола с использованием заявляемого штамма.
Заявляемый штамм Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D, хранившийся в запаянной пробирке, пастеризовали в кипящей водяной бане в течение 1 мин. Суспензией спор инокулировали стерильную питательную среду, состоящую из мелассы и муки в соотношении 1:1 (в пересчете на сбраживаемые углеводы). Через 12 часов роста в термостате при 36,5°С полученным посевным материалом (5% объема сбраживаемой среды) инокулировали подготовленную стерильную питательную среду в лабораторном ферментере вместимостью 4 л (рабочий объем 3 л).
Состав среды: - упаренная подсырная молочная сыворотка
- 2,85 л
(содержание лактозы 20 г/л, т.е. 57,0 г)
сахароза
- 100 г
жмых зародышей пшеницы
- 3,0 г/л
Концентрация углеводов в среде составляла 5,4%.
Сахарозу вносили в молочную сыворотку и стерилизовали при 110°С в течение 30 минут. Измельченный в тонкий порошок жмых вносили в 25 мл дистиллированной воды и стерилизовали при 110°С в течение 20 минут, и вносили в стерильную питательную среду при соблюдении правил асептики.
Инокулировали 150 мл. Ферментация проходила при 36,5°С. По окончании брожения определяли содержание растворителей, несброженные углеводы, объем выделившегося газа.
Сумма растворителей составила 22,38 г/л, в том числе
Бутанол 15,78 г/л (70,50%), ацетон 6,3 г/л (28,15%), этанол 0,3 г/л (1,35%).
Содержание несброженного сахара 0,25 г/л.
Таким образом, получен новый штамм, Clostridium acetobutylicum BKM B-2531D, продуцирующий бутанол, ацетон и этанол. Новый штамм, обеспечивая высокий выход целевых продуктов, обладает способностью утилизировать широкий спектр недорогих и легкодоступных источников углерода (которые в большинстве своем получены из отходов).
Таблица
Штамм
продуктивность
Конверсия углеводов
бутанол
ацетон
этанол
сумма
S-3716
15,50
6,50
нет
22,00
40%
B-2531D
15,9
6,01
0,50
22,41
41,5%