СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЦИОННОГО МАТЕРИАЛА ИЗ СЛОЕВИЩ ЛИШАЙНИКОВ
METHOD FOR PREPARING SORPTION MATERIAL OF BLASTEMAS

Изобретение относится к биотехнологической (биофармацевтической) отрасли промышленности, а именно к получению сорбционного материала медицинского назначения (лечебного, профилактического) из растительного сырья.
Одно из основных направлений биотехнологии предусматривает разработку сорбционных материалов и дальнейшее их применение в медицине и медицинской промышленности в качестве незаменимых материалов для энтеросорбции. Метод энтеросорбции начал активно соперничать с гемосорбцией в связи с рядом преимуществ: отсутствие необходимости оперативного вмешательства и связанного с этим риска возможных осложнений, характерных для гемосорбции; отсутствие прямого повреждающего контакта с биологическими жидкостями (кровь, лимфа); возможность широкого использования сорбционной терапии при амбулаторном лечении в полевых и обычных домашних условиях.
Анализируя предъявляемые нормативными документами и клинической практикой требования к энтеросорбентам, можно выделить комплекс свойств, присущих «идеальному» энтеросорбенту:
- полная безвредность и нетоксичность;
- высокая биосовместимость с тканями, кровью и другими биосубстратами организма;
- неповреждающее действие на слизистые оболочки ротовой полости, пищевода, желудочно-кишечного тракта;
- избирательная сорбция среднемолекулярных токсичных метаболитов;
- высокая адсорбционная емкость.
Проблему создания эффективного и безопасного энтеросорбента, предназначенного для очищения организма от токсических веществ, которые продуцируются при различных заболеваниях, уже в течение многих лет решают ученые разных стран.
Известные энтеросорбенты можно объединить в следующие группы.
1. Углеродные адсорбенты на основе активированного угля и углеволокнистых материалов (уголь активированный, карболен, гастросорб, Энсорал, Карбодон, актилен и др.).
2. Ионообменные материалы (холестирамин).
3. Энтеросорбенты на основе лигнина (лигносорб, прлифепан).
4. Производные поливинилпирролидона (энтеросорб, энтеродез).
5. Сорбенты на основе природных минералов (белая глина, кремнеземсодержащее минеральное сырье, цеолиты).
6. Энтеросорбенты растительного происхождения (семена подорожника, камедь гуары, слизь алтея, корень цикория, семена тыквы, пищевые волокна, отруби злаковых, пектин).
Энтеросорбенты последней группы имеют ряд преимуществ: не обладают раздражающим эффектом на желудочно-кишечный тракт, не вызывают побочных и токсических явлений, безвредны при длительном их приеме (например, см. RU 2389498, кл. А61K 36/185, 2009).
Известен способ получения энтеросорбента растительного происхождения (см. RU 2391998, кл. А61K 36/902, 2008), представляющего собой гранулы, содержащие Sphagnum fuscum, полученные путем измельчения высушенной дерновины Sphagnum fuscum до размера частиц 0,1-0,3 мм, с последующим смешиванием с 10% водным медицинским низкомолекулярным поливинилпирролидином, гранулированием, сушкой и повторным гранулированием.
Общим признаком заявляемого изобретения и известных аналогов является использование местного растительного сырья. Недостатки аналогов можно сформулировать следующим образом: невысокая биологическая ценность получаемого сорбента, низкая технологичность процесса, выражающаяся в дорогостоящем и трудоемком процессе получения энтеросорбентов, который, в частности, может состоять из нескольких этапов, например растворение в щелочах, нейтрализация, промывка водой, многостадийная сушка, сгущение суспензии и др.
Задача, на решение которой направлено заявленное изобретение, выражается в расширении ассортимента сорбционных материалов растительного происхождения и способов их получения, повышении их сорбционной активности.
В качестве источника для создания сорбционных материалов используются слоевища лишайников родов Cladonia - ягель.
Использование лишайников в качестве продукта питания известно очень давно, есть предположение, что библейской манной был лишайник Аспицилия съедобная (Aspicilia esculenta), свободноживущий кочующий лишайник, распространенный в пустынных районах. Растертые талломы лишайников слегка напоминают муку, а испеченные из такой муки пресные лепешки вполне съедобны. В Японии лишайник как деликатес кладется в суп или салат, также и в Северной Америке многие виды используют в пищу. Из слоевищ лишайников рода Cladonia варили кисели, студни и использовали как добавку к муке. Лишайники Cladonia spp., Cetraria islandica сегодня используются для производства спирта.
Лишайники рода Cladonia - природное лекарственное и пищевое сырье, используемое в народной медицине для лечения многих заболеваний. В слоевищах лишайников содержатся негормональные физиологически активные вещества (НФАВ) различных групп: углеводы (70-80%) в виде лишайниковых β-полисахаридов лихенина и изолихенина (фиг.1); дубильные вещества (1-2%); лишайниковые кислоты (2-3%) - леканоровая, физодовая, усниновая (фиг.2); микроэлементы (в используемом сырье содержание тяжелых металлов намного меньше ПДК). Содержание в слоевище лишайников НФАВ обусловливает довольно широкое их использование в официальной и народной медицине для лечения болезней желудочно-кишечного тракта, дистрофий, общего истощения, заболеваний дыхательных путей и легких, инфекционных заболеваний кожи, ожогов и опрелостей, нарушений деятельности щитовидной железы и других эндокринных заболеваний, также применение их в качестве иммуномодулирующих, противоопухолевых, гепато-протекторных и детоксикационных препаратов. Установлено, что лихенин и изолихенин тормозят у животных рост некоторых опухолей (см. Филиппова Г.В., Павлов Н.Г., Шашурин М.М., Кершенгольц Б.М. Влияние биологически активных веществ из слоевищ северных лишайников, экстрагированных различными методами, на биологические свойства микобактерий туберкулеза // Сибирский медицинский журнал. 2008. №3. С.99-103).
Вместе с тем, являясь β-полисахаридами, β-гликозидные связи в которых практически не расщепляются в желудочно-кишечном тракте, сами лишайниковые углеводы почти не усваиваются организмом человека. Задача состоит в том, чтобы в процессе предварительной обработки слоевищ лишайников повысить биодоступность и этих компонентов. Эта задача решается в рамках предлагаемого способа путем механохимической активации.
Техническим эффектом предлагаемого изобретения является то, что при механохимической обработке слоевищ ягеля значительно повышается его сорбционная активность в отношении средне- и низкомолекулярных токсинов, катионов тяжелых металлов вследствие образования лишайниковых β-олигосахаридов из природного полисахарида лихенина, также при этом возрастает биологическая активность НФАВ, например, лишайниковых кислот (фиг.2) в механохимическом препарате «Ягель-сорбент».
Для решения поставленной задачи способ получения сорбционного материала из слоевищ лишайников путем механохимической переработки сухих слоевищ лишайников отличается тем, что включает протекание твердофазных механохимических реакций без участия растворителей в одну технологическую стадию, при этом механохимической активации подвергаются сухие слоевища лишайников, предварительно измельченные до 1-3 мм, при скорости 1200-1500 об/мин в течение 1-3 минут в воздушной среде в мельнице-активаторе планетарного типа. Получаемый порошок есть сорбционный материал «Ягель-сорбент». Образующиеся при механоактивации слоевищ лишайников β-олигосахариды обуславливают повышение сорбционной активности к низко и среднемолекулярным токсинам и катионам тяжелых металлов, также возрастанию сорбционной активности способствует рост удельной поверхности и уменьшение размеров частиц сорбента (фиг.3). Присутствие в твердофазном препарате «Ягель-сорбент» природных НФАВ (лишайниковые кислоты мягкого антибактериального действия, витамины, микроэлементы) нисколько не ухудшают его сорбционных качеств, а придают ему дополнительные лечебно-профилактические свойства. Предварительная механоактивация ягеля с получением твердофазного порошка «Ягель-сорбент» позволяет значительно уменьшить размер частиц до 10-1000 нм, упростить технологию обработки растительного сырья и расширить ассортимент сорбционных материалов из растительного сырья высокой адсорбционной активности с широким спектром действия.
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию «новизна».
Сущность изобретения состоит в том, что механоактивированный препарат «Ягель-сорбент» имеет высокую удельную поверхность, способен хорошо адсорбировать средне- и низкомолекулярные токсины, к которым, в частности, относятся токсины белкового происхождения и катионы тяжелых металлов. Полученный сорбционный материал обладает высокой сорбционной способностью, что связано не только с развитой поверхностью, но и с возрастанием числа функциональных групп (фиг.4), это позволяет связывать и выводить экзогенные и эндогенные токсины (холестерин, билирубин, продукты тучных клеток и др.). Также происходит мягкое бактерицидное действие лишайниковых кислот, что способствует формированию здоровой микрофлоры за счет лизиса патогенных и условно патогенных бактериальных клеток и сорбции продуктов их жизнедеятельности.
Изобретение может быть реализовано следующим образом.
Сухие слоевища лишайников, предварительно измельченные до 1-3 мм, подвергаются механохимической активации без участия растворителей в одну технологическую стадию при скорости 1200-1500 об/мин в течение 1-3 минут в воздушной среде в мельнице-активаторе планетарного типа, ударно-истирающий режим работы которой обеспечивает максимальное воздействие мелющих тел на объект исследования. Полученный порошок - сорбционный материал «Ягель-сорбент».
Механохимическая активация лишайникового сырья увеличивает биодоступность компонентов в результате разрыва части химических связей (даже таких прочных как β-гликозидных) и получения олигосахаридов из природных полисахаридов. Результатом успешной механохимической обработки биосырья является увеличение в продукте более полного спектра НФАВ в биологически доступных (водорастворимых) формах (фиг.4), высокая адсорбционная активность, особенно в первые 20 минут (таблицы 2, 3).
Для исследования изменения состава слоевищ лишайников при твердофазной механохимической обработке использовали метод ИК-спектроскопии, изменение рельефа поверхности изучали методом атомно-силовой микроскопии. Для определения бактерицидных свойств полученного сорбционного материала «Ягель-сорбент» использовали микробиологическое тестирование. Эффективность адсорбционных свойств изучали прямой спектрофотометрией.
-1
Исследование порошка ягеля, полученного твердофазной механохимической технологией в одну стадию без применения растворителей, методом ИК-спектроскопии показало, что характер ИК-спектров в случае всех образцов ягеля идентичен по наличию характерных функциональных групп (см. фиг.4). Набор пиков поглощения не меняется от условий обработки. Вместе с тем, интенсивность всех наблюдаемых полос поглощения зависит от способа получения образца биопрепарата. Увеличение интенсивности поглощения в области валентных колебаний ОН-группы (3450-3350 см) механохимического ягеля свидетельствует о разрыве части прочных β-гликозидных связей в исходных нерастворимых полисахаридах, входящих в состав лишайникового сырья, и как следствие, об образовании более биодоступных β-олигосахаридов.
-1
-1
-1
-1
Наличие в ИК-спектре ряда полос (1670 1630 см - ОС связи сопряженных систем; 1200-1270 см -С-О-С- группы атомов; 1100-1000 см - как пиранозные циклы, так и -С-ОС- группы атомов; 900 см - деформационные колебания С-Н) выше для механоактивированного образца, что свидетельствует о большей насыщенности его функциональными группами и об увеличении содержания НФАВ в исследуемом механохимическом ягеле.
Антибактериальные свойства препарата «Ягель-сорбент» определяли in vitro на культурах бактериальных штаммов четырех условно-патогенных и патогенных микроорганизмов по стандартным и модифицированным методикам.
Проведены сравнительные исследования антибактериального действия слоевищ лишайников грубого помола без механохимической обработки (порошок №1 - контроль) и исследуемого препарата «Ягель-сорбент» на следующих культурах по стандартам мутности культур на 5 и 10 единиц:
1. Staphylococcus aureus - 6538-р
2. Escherichia coli - H-257
3. Pseudomonas aeruginosa - 33105
4. Klebsiella pneumoniae
Использовались стандартные питательные среды: среда Эндо, молочно-желточно солевой агар, среда Плоскирева, мясопептонный агар (МПА), которые были приготовлены по стандартной прописи (МУК 4.2.1890-04. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания, утвержденные главным государственным санитарным врачом РФ 04.03.2004 г.) с добавлением в питательную среду контрольного и исследуемого образца количеством 5,0 mg/ml. Газонным методом был произведен посев культур микроорганизмов и после культивации в термостате при 37,0°С оценивалась интенсивность их роста. Результаты оценки приведены в таблице 2.
Порошок №1 показал либо едва заметную попытку к лизису, либо микроорганизмы лизировались частично. Таким образом продемонстрирована более высокая эффективность препарата «Ягель-сорбент» в отношении условно-патогенных и патогенных бактериальных штаммов, включая Staphylococus aureus, Klebsiella pneumonia и др.
Образование новых структур и большей удельной поверхности было зафиксировано методом атомно-силовой микроскопии (фиг.3б), в то время как неструктурированная поверхность порошка ягеля грубого помола отличалась отсутствием таковых и наличием более гладкого рельефа (фиг.3а).
2+
Действие механохимического сорбционного материала «Ягель-сорбент» доказано в экспериментах с маркером средне- и низкомолекулярных токсинов - метиленовым синим (таблица 2) и с катионом Со (таблица 3). Адсорбционную активность порошков ягеля по метиленовому синему определяли по методике, рекомендуемой в ГОСТ 4453-74, но в ней были внесены изменения для моделирования условий, приближенных к гастральным. Гастральная среда создавалась подкислением НСl из расчета 30 мМ при t=37°С. Для исследования используется спектрометр с программным обеспечением «LAMBDA 20» при длине волны (λ) 400 нм в кюветах толщиной поглощающего свет слоя 10 мм относительно дистиллированной воды. Кроме того, были введены изменения на этапе центрифугирования. В данном случае центрифугирование не дает полного разделения фаз, поэтому разделение фаз дополнительно проводили фильтрованием. Для этого применили воронки Бюхнера и фильтровальную бумагу (ГОСТ 12026-76) одинакового размера. Статистическую обработку результатов исследования выполняли с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel 2010. Полученные данные обработаны статистически стандартными параметрическими методами с вычислением средней величины, стандартного отклонения, доверительного интервала по Стьюденту (n=9<20) при уровне значимости р=0,05. Результаты представлены в виде М±m, где М - среднее арифметическое значение, m - доверительный интервал. Сорбционная суточная емкость у механоактивированного образца составила 48±3 мг/г. Следует отметить, что это очень высокие показатели по сравнению с известными адсорбентами, такими как полифепан и глина белая, адсорбционная емкость которых по метиленовому синему составляет 10,0 и 11,4 мг/г соответственно (Маркелов Д.А., Ницак О.В., Геращенко И.И. Сравнительное изучение адсорбционной активности медицинских сорбентов // Химико-фармацевтический журнал. 2008. Т.42. №7. С.30-33., Решетников В.И. Оценка адсорбционной способности энтеросорбентов и их лекарственных форм // Химико-фармацевтический журнал. 2003. Т.37. №5. С.28-32). Скорость адсорбции также выше у механоактивированного препарата, в первые 20 минут адсорбировалось 92% его суточной адсорбционной емкости, в отличие от ягеля грубого помола, где за этот же промежуток времени адсорбционная емкость была в 2 раза ниже, чем у механоактивированного образца, и составила лишь 69% суточной активности.
2+
Ранее было показано, что природные лишайниковые β-олигосахариды проявляют себя как комплексообразователи с катионами металлов (Аньшакова В.В. Механохимические технологии получения биологически активных веществ из лишайников / В.В.Аньшакова, Б.М.Кершенгольц, Е.С.Хлебный, А.А.Шеин // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. 2011. Т.13, №1. С.236-240). Адсорбционную емкость для солей тяжелых металлов определяли на примере ионов Со из стандартных растворов хлорида кобальта (II). Из таблицы 3 видно, что сорбционная активность материала «Ягель-сорбент» в 2,5 раза превосходит сорбционные свойства порошка ягеля грубого помола.
Представленный сорбционный материал на основе механоактивированных слоевищ лишайников расширяет сырьевую базу для получения сорбентов из растительного сырья и может быть использован для создания энтеросорбентов с целью формирования здоровой микрофлоры, лечения экзогенных и эндогенных интоксикаций различной этиологии.
Таблица 1
Антибактериальное действие порошка №1 и сорбционного материала «Ягель-сорбент» на культуры условно-патогенных и патогенных бактериальных штаммов
Название видов бактериальных штаммов
Антибактериальное действие порошка №1(контроль)
Антибактериальное действие препарата «Ягель-сорбент»
Staphylococcus aureus - 6538-р
+<sup>*)</sup>
++++
Escherichia coli - H-257
+
+++
Pseudomonas aeruginosa - 33105
+
++++
Klebsiella pneumoniae
+
++++
Прим.: <sup>*)</sup> + - слабый лизис; ++ - частичное лизирование; +++ - почти полный лизис; ++++ - полный лизис
Таблица 2
Адсорбционная активность порошка ягеля по индикатору метиленовому синему, мг/г
Сорбционный материал
Время адсорбции
20 мин
24 часа
Порошок ягеля грубого помола
27±3
39±2
Порошок ягеля механоактивированный «Ягель-сорбент»
44±4
48±3
Таблица 3
Удельная адсорбция ионов кобальта (II), ммоль/кг
Сорбционный материал
Концентрация Со<sup>2+</sup> моль/л
0,2
0,4
0,6
0,8
Порошок ягеля грубого помола
10
15
35
60
Порошок ягеля механоактивированный «Ягель-сорбент»
25
70
80
150