СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ПОЛИМЕРНЫХ ГИДРОГЕЛЕЙ
METHOD OF PREPARING GLUCOSE-SENSITIVE POLYMER HYDROGELS

Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей, которые могут применяться в качестве носителей для контролируемого выделения инсулина при появлении в окружающей среде глюкозы в определенной концентрации.
Как известно, жизненно важные вещества полипептидной природы (ферменты, ингибиторы, гормоны и т.п.) синтезируются внутри организма, а не попадают в него с пищей. Последнее невозможно, так как протеолитические ферменты, участвующие в процессе пищеварения, гидролизуют белки до аминокислот. Поэтому для устранения дефицита такого белка его вводят в организм инъекционно, минуя пищеварительный тракт.
Одним из таких препаратов является гормон поджелудочной железы инсулин - полипептид, вырабатываемый β-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы. Инсулин является универсальным гормоном, влияющим на большое число процессов, протекающих в организме, таких как: транспорт глюкозы через мембрану; утилизация глюкозы; ингибирование глюконеогенеза (образования глюкозы из предшественников неуглеводной природы); метаболизм глюкозы; метаболизм липидов; метаболизм белков; размножение клеток и т.д. Частичная или полная недостаточность инсулина приводит к сахарному диабету. Уже сейчас по некоторым оценкам в мире страдают от диабета более 60 миллионов человек, причем выявлена четкая тенденция к увеличению роста числа больных.
В физиологических условиях инсулин вырабатывается поджелудочной железой в ответ на повышение концентрации глюкозы. Пороговой для секреции инсулина является концентрация глюкозы 80-100 мг/100 мл крови, а максимальная скорость достигается при концентрации глюкозы 300-500 мг/100 мл.
Обычно (в норме) инсулин попадает в печень через кровеносные сосуды, соединенные с портальной печеночной веной. Через ту же вену в печень транспортируются продукты пищеварения. Поскольку основной функцией инсулина является регулирование последующих трансформаций продуктов пищеварения, то в естественных условиях оба эти компонента попадают в печень одновременно. Печень, в свою очередь, контролирует количество инсулина, достигающего другие органы и ткани. При инъекционном же введении инсулина (а это наиболее распространенный способ лечения сахарного диабета) такой контроль отсутствует, физиологическое соотношение между концентрациями инсулина и глюкозы нарушается, что и является причиной таких осложнений при сахарном диабете, как сердечно-сосудистые заболевания, расстройство функций головного мозга и т.д. [М.Saffran, in: Targeting of Drugs: The Challenge of Peptides and Proteins, G. Gregoriadis (ed.), Plenum Press, New York (1992), pp.89-95].
Поскольку повышение концентрации глюкозы в крови - главный стимул секреции инсулина поджелудочной железой в живом организме, то крайне перспективным представляется создание систем, которые, будучи имплантированы в организм больного, контролируемо выделяли бы инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы в определенных пределах.
Известен способ получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей путем взаимодействия углеводных производных инсулина с конканавалином A [Sato S., Yeong S.Y., McRea Y.C., Kim S.W. Self-regulating insulin-delivery systems. II. In vitro studies. // J.Control. Release. 1984. V.1. P.67-77]. В качестве углеводных производных инсулина используют N-сукцинилглюкозамин-инсулин, N-глутарилглюкозамин-инсулин, n-(глутарилоамидо)фенил-α-(D-глюкопиранозид)-инсулин, n-(глутарило-амидо)фенил-α-(D-маннопиранозид)-инсулин, n-(сукциниламидо)фенил-α-(D-глюкопиранозид)-инсулин, n-(сукциниламидо)фенил-α-(D-маннопиранозид)-инсулин. Конканавалин А - белок с молекулярной массой 102000, имеющий четыре места связывания углеводов. При реакции с углеводным производным инсулина конканавалин А выполняет роль сшивающего агента, образуя комплексные соединения с остатками углеводов. При появлении глюкозы в окружающей среде она вытесняет углеводное производное инсулина из его комплекса с конканавалином А, в результате чего гидрогель распадается и в окружающую среду выделяется углеводное производное инсулина.
Недостатком этого способа является выделение в окружающую среду всех компонентов полимерного гидрогеля, а также невозможность применения этой системы для контролируемого выделения инсулина, а не его углеводного производного.
Известен способ получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей путем взаимодействия декстранов с конканавалином A [Tang М., Zhang R., Bowyer A., Eisenthal R., Hubble J. A reversible hydrogel membrane for controlling the delivery of macromolecules. // Biotechnol. Bioeng. 2003. V.82. №1. P.47-53].
Недостатком этого способа является выделение в окружающую среду при взаимодействии с глюкозой всех компонентов полимерного гидрогеля.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам является способ получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей путем взаимодействия производного глюкозы с конканавалином А. [И.Л.Валуев, В.В.Чупов, Г.А.Сытов, Л.И.Валуев, Н.А.Платэ. Фазообратимые гидрогели на основе акриламида и М-(2-0-глюкоз)акриламида. // Высокомолек. соед., 1997, Т.39Б, №4, С.751-754].
В качестве производного глюкоза используют сополимер 3,9-14,5 мол.% N-(2-D-глюкоз)акриламида и 85,5-96,1 мол.% акриламида, а взаимодействие осуществляют путем смешивания водного раствора, содержащего 10-25 мас.% сополимера N-(2-D-глюкоз)акриламида и акриламида, с водным 1-10%-ным раствором конканавалина А.
При реакции с глюкозосодержащим полимером конканавалин А выполняет роль сшивающего агента, образуя комплексные соединения с остатками глюкозы, принадлежащими различным полимерным цепям. В результате реакции образуется гидрогель, степень набухания которого в воде определяется содержанием звеньев
N-(2-D-глюкоз)акриламида в сополимере и соотношением N-(2-D-глюкоз)акриламид/конканавалин А. При растворении в воде определенного количества глюкозы она вытесняет конканавалин А из комплекса, в результате чего происходит разрушение гидрогеля с образованием растворимого сополимера N-(2-D-глюкоз)акриламида и акриламида и растворимого комплекса конканавалин А-глюкоза. Если в гидрогель предварительно был введен инсулин, то при разрушении гидрогеля происходит выделение инсулина в раствор. Таким образом, синтезированная система представляет собой модель поджелудочной железы, способной выделять определенное количество инсулина в ответ на появление в растворе определенного количества глюкозы.
Недостатком этого способа является образование растворимого синтетического сополимера N-(2-D-глюкоз)акриламида с акриламидом при выделении инсулина. При использовании в живых организмах этот сополимер накапливается в организме, сорбируясь на мембранах клеток и приводя к токсическому эффекту.
Задачей изобретения является предотвращение образования растворимого синтетического сополимера при выделении инсулина.
Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является предотвращение образования растворимого синтетического сополимера при выделении инсулина.
Технический результат достигается тем, что в способе получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей путем взаимодействия производного глюкозы с конканавалином А в качестве производного глюкозы используют N-(2-D-глюкоз)акриламид, а взаимодействие проводят сополимеризацией в водном растворе под действием окислительно-восстановительного инициатора 0,1-2,0 мас.% N-(2-D-глюкоз)акриламида, 1-5 мас.% акриламида и 0,01-0,075 мас.% N,N-метиленбисакриламида в присутствии 5-20 мас.% конканавалина А.
Пример 1.
При комнатной температуре и постоянном перемешивании в 85,95 мл дистиллированной воды растворяют 3 г акриламида, 1 г N-(2-D-глюкоз)акриламида, 0,05 г N,N-метиленбисакриламида и 10 г конканавалина А. После полного растворения в раствор добавляют 0,04 г персульфата аммония и 40 мкл N,N,N'N'-тетраметилэтилендиамина. Образовавшийся раствор дегазируют в круглодонном сосуде на водоструйном насосе (давление 50 мм рт.ст.) и оставляют при комнатной температуре до окончания реакции (1,0-1,5 час). Об окончании реакции свидетельствует образование бесцветного геля. Полученный гель извлекают из сосуда, измельчают и промывают 10-кратным избытком дистиллированной воды. Степень набухания полученного гидрогеля в воде равна 8,7 г воды/г сухого гидрогеля.
Примеры 2-5. Процесс проводят по примеру 1, используя различные количества
N-(2-D-глюкоз)акриламида, акриламида, N,N-метиленбисакриламида и конканавалина А (таблица 1).
Таблица 1
№ примера
Концентрация в воде,  мас.%
Степень набухания, г воды/ г сухого полимера
N-(2-D-глюкоз)-акриламид
Акриламид
N,N-метилен-бисакриламид
Конканавалин А
2
0,1
5,0
0,01
5,0
14,2
3
0,5
3,0
0,025
8,0
11,6
4
1,0
1,0
0,075
12,0
6,5
5
2,0
2,0
0,075
20,0
4,8
6
0,5
3,0
0,025
20,0
9,7
7
1,5
5,0
0,075
10,0
5,6
1,0 г высушенного полимерного гидрогеля насыщают раствором, содержащем 10 мг инсулина. Затем равновесно набухшие гидрогели помещают в 100 мл воды, в воде растворяют различные количества глюкозы и измеряют объем полимерного гидрогеля и количество выделившегося в раствор инсулина. Результаты приведены в таблице 2.
Таблица 2
Гидрогель по примеру
Степень набухания гидрогеля после добавления глюкозы (в скобках концентрация инсулина в растворе, мг/100 мл)
Исход
150*
300
450
600
750
1
8,7 (0)
8,9 (0,2)
8,7 (0,4)
8,8 (0,5)
11,5 (8,1)
11,7 (8,8)
2
14,2 (0)
17,9 (5,9)
18,0 (6,4)
17,7 (7,0)
18,1 (7,1)
17,8 (7,1)
3
11,6 (0)
11,7 (0,1)
13,9 (6,2)
13,8 (7,2)
13,8 (7,4)
13,8 (7,5)
4
6,5 (0)
6,5 (0,1)
6,6 (0,2)
6,6 (0,2)
6,8 (0,4)
9,7 (8,1)
5
4,8 (0)
4,6 (0,1)
4,9 (0,1)
4,8 (0,2)
4,7 (0,4)
9,3 (8,3)
6
9,7 (0)
9,8 (0,1)
14,8 (7,3)
14,8 (7,7)
15,0 (7,9)
15,1 (8,2)
7
5,6 (0)
5,5 (,2)
5,6 (0,2)
7,8 (7,8)
7,7 (8,1)
7,7 (8,3)
*количество добавленной глюкозы, мг/100 мл раствора
Видно, что для каждого гидрогеля увеличение его степени набухания и выделение инсулина происходит при определенной концентрации глюкозы в растворе, лежащей в области концентраций глюкозы, характерных для больных сахарным диабетом (выше 150 мг/100 мл). При этом не происходит выделения в окружающий раствор синтетического сополимера и конканавалина А. Синтетический сополимер N-(2-D-глюкоз)акриламида и акриламида остается в гелевом состоянии вследствие сшивания N,N-метиленбисакриламидом, а конканавалин А не выделяется вследствие стерических препятствий для диффузии высокомолекулярного белка (молекулярная масса Кон А равна 102000) из полимерного гидрогеля.
Полимерные гидрогели, полученные по способу прототипу и предварительно насыщенные инсулином, в аналогичных условиях разрушаются с образованием растворимых продуктов и выделением инсулина при концентрации глюкозы в растворе 180, 380 и 565 мг/100 мл при содержании звеньев N-(2-D-глюкоз)акриламида в сополимере 3,92, 10,14 и 14,45 мол.% соответственно.
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет получать полимерные гидрогели, способные быть носителем инсулина и выделять в раствор определенное количество инсулина в ответ на появление в окружающей среде определенной концентрации глюкозы. При этом никакие другие компоненты полимерного гидрогеля в окружающую среду не выделяются.
Предельные количества исходных веществ, используемых при получении полимерного гидрогеля определяются следующим. При концентрации N-(2-D-глюкоз)акриламида ниже 0,1 мас.% и концентрации конканавалина А ниже 5 мас.% полимерные гидрогели практически не изменяют степень набухания при увеличении концентрации глюкозы, а при концентрации N-(2-D-глюкоз)акриламида выше 2,0 мас.% и концентрации конканавалина А выше 5 мас.% увеличение степени набухания гидрогелей происходит при чрезвычайно высокой концентрации глюкозы порядка 1000 мг/100 мл. При концентрации N,N-метиленбисакриламида ниже 0,01 мас.% образуются гидрогели с чрезвычайно низкой механической прочностью, а при концентрации N,N-метиленбисакриламида выше 0,075 мас.% образуются жесткие гидрогели, диффузия инсулина из которых чрезвычайно затруднена.