Способ многофакторного прогноза рака молочной железы
METHOD FOR MULTIVARIATE PROGNOSIS OF BREAST CANCER

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и касается способов прогноза рака молочной железы на ранних стадиях заболевания (стадии Т1-Т2 N0).
В данном изобретении под прогнозом рака молочной железы понимается вероятностная оценка исхода заболевания у больных раком молочной железы, в том числе ожидаемая общая выживаемость.
Одним из актуальных вопросов современной онкологии является проблема прогнозирования течения и исхода злокачественных новообразований с целью предсказания развития разных форм прогрессии заболевания и проведения коррекции противоопухолевой терапии.
Важным направлением в исследованиях является поиск новых более точных и достоверных способов прогноза, основанных на оценке не единичного фактора прогноза, а на совокупности нескольких различных клинических, биологических, морфологических, иммунологических и других факторов и определении прогностической значимости каждого из них.
Известно, что биологическое поведение злокачественной опухоли, которое характеризует скорость ее роста, способность к инвазии и распространению зависит от многих причин, связанных как с ее особенностями, так и с эффективностью или неэффективностью системных защитных механизмов.
Так, например, известен способ определения прогноза рака молочной железы [US2020370122] с помощью панели из множества биомаркеров - связанных с иммунитетом генов, выбранных из группы генов, состоящей из APOBEC3G, CCL5, CCR2, CD2, CD27, CD3D, CD52, COROIA, CXCL9, GZMA, GZMK, HLA-DMA, IL2RG, LCK, PRKCB, PTPRC и SH2D1A.
Уровни экспрессии указанных генов, полученные при их определении в отобранной у пациента биологической ткани, преобразуются в оценку или индекс, который используют для определения прогноза рака молочной железы.
Указанный способ обеспечивает высокую точность прогноза, однако стоимость, техническая сложность и интерпретация технологии микрочипов ДНК по-прежнему затрудняют исследования с образцами рака и не подходят для рутинного использования в стандартных клинических условиях.
В настоящее время установлена потенциальная важность для прогнозирования рака молочной железы целого ряда белков, включая рецепторы гормонов (ER, PR), маркеры подкласса цитокератинов, супрессоры опухолей (р53), молекулы адгезии (кадгерины, катенины) и другие маркеры, следствием чего является появление различных способов прогноза рака молочной железы, основанных на использовании указанных белков в качестве прогностических факторов.
Известен способ многофакторного прогноза рака молочный железы, описанный в [US2005221398], основанный на обнаружении сверхэкспрессии или недостаточной экспрессии пула белков в тканях или клетках груди, включающий набор из 21 белков, в число которых могут, в частности, входить белки E-cadherin, EGFR, р53, CK14.
Формирование прогностического параметра в данном способе осуществляют на основании сравнения уровня экспрессии исследуемых белков в отобранных у пациента образцах биологической ткани с предварительно полученным профилем экспрессии пула соответствующих белков. На основании полученных результатов пациента относят к группе с благоприятным или не благоприятным прогнозом.
Рассматриваемый способ обеспечивает высокую точность и достоверность прогноза, однако требует проведения большого обьема трудоемких аналитических исследований с последующим сравнением полученных результатов с предварительно полученными молекулярными спектрами белков, что обуславливает сложность данного способа и ограничивает его применения в клинической практике. Кроме того, в данном способе формирование прогноза рака молочной железы осуществляется на основании комбинации прогностических факторов, не включающей факторы, отражающие ряд потенциально важных для процесса возникновения и развития злокачественного новообразования процессов, что снижает точность и достоверность прогноза.
Задачей заявляемого изобретения является упрощение и повышение удобства использования способа прогноза рака молочной железы при обеспечении высокой точности и достоверности прогноза.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе многофакторного прогноза рака молочной железы, в ходе которого определяют у пациента комплекс прогностических факторов, включающий уровень экспрессии белков СК14, Е-cadherin, р53, EGFR, осуществляют оценку каждого из прогностических факторов и используют полученные данные для формирования прогноза рака молочной железы, согласно изобретению у пациента дополнительно определяют стадию заболевания, степень дифференцировки опухоли, уровень экспрессии белка FOXP3, уровень экспрессии рецепторов HER-2, количество Т-лимфоцитов CD8+, количество Т-лимфоцитов CD4+, каждому фактору присваивают количество баллов в соответствии с предварительно полученной 100 балльной прогностической шкалой, при этом в случае обнаружения экспрессии белка СК14 фактор оценивают в 16 баллов, при значении уровня экспрессии белка FOXP3, равном 0, фактор оценивают в 15 баллов, для стадии заболевания T2N0M0 фактор оценивают в 10 баллов, в случае обнаружения экспрессии белка Е-cadherin фактор оценивают в 6 баллов, в случае обнаружения экспрессии белка р53 фактор оценивают в 19 баллов, при значении уровня экспрессии рецепторов HER-2 равном 3 фактор оценивают в 13 баллов, при количестве Т-лимфоцитов CD8+ больше 0 фактор оценивают в 9 баллов, в случае обнаружения экспрессии белка EGFR фактор оценивают в 4 балла, для степени дифференцировки опухоли G2 или G3 фактор оценивают в 5 баллов, при количестве Т-лимфоцитов CD4+ больше 0 фактор оценивают в 3 балла, суммируют полученные баллы и используют суммарное значение баллов в качестве прогностического параметра, при сумме баллов менее 40 прогноз расценивают как благоприятный, причем благоприятным считают прогноз со сроком выживаемости пациентов не менее 10 лет.
В частном случае реализации изобретения используют суммарное значение баллов в качестве прогностического параметра для определения риска неблагоприятного исхода болезни, причем при сумме баллов менее 40 риск расценивают как низкий, при сумме баллов от 40 до 60 риск расценивают как средний, при сумме баллов более 60 риск расценивают как высокий.
Принципиально важным в заявляемом способе является то, что для формирования прогностического параметра рака молочной железы предлагается использовать новую комбинацию из 10 вышеуказанных прогностических факторов, отражающих различные аспекты процесса возникновения и развития рака молочной железы, такие как клинико-морфологические факторы (стадия заболевания, степень Дифференцировки опухоли), факторы, отражающие гистологические особенности рака молочной железы - белки СК14, E-cadherin, р53, EGFR, факторы, отражающие статус иммунного ответа пациента против рака молочной железы (белок FOXP3, количество клеток CD8+и CD4+), фактор, отражающий вовлеченность клеток в передачу сигналов, управляющих ростом и дифференцированием клеток (уровень экспрессии рецепторов HER-2).
Указанный многоаспектный подход к формированию прогноза рака молочной железы способствует повышению точности и достоверности прогноза.
Значения баллов, присвоенных каждому прогностическому фактору, определены авторами заявляемого изобретения на основании результатов многочисленных экспериментальных исследований образцов биологических тканей, отобранных у пациентов с установленным диагнозом рак молочной железы, и на статистическом анализе полученных данных.
Для количественной оценки прогностических факторов была создана новая прогностическая шкала, основанная на результатах анализа большого массива данных.
В ходе создания прогностической шкалы был построен ряд прогнозных моделей для показателя ключевого события (в частности, исход смерть), включающих различные комбинации из 19 факторов, имеющих потенциальную прогнозную ценность. В результате сравнения указанных моделей с помощью пошаговой логистической регрессии и с учетом результатов оценки их эффективности и специфичности была выявлена наилучшая прогнозная логистическая модель, включающая десять вышеуказанных прогностических факторов, при этом для каждого фактора определен коэффициент, показывающий силу влияния фактора на ключевой показатель. Для обеспечения удобства пользования моделью с помощью известных программ [см., например, пакет программ Statistica 6] была осуществлена процедура перевода (масштабирования) полученных коэффициентов в оценочные (скоринговые) баллы с получением в итоге 100 балльной прогностической шкалы, в которой каждому прогностическому фактору соответствует определенное количество баллов, как описано выше.
Было установлено, что значение суммарного балла менее 40 с высокой степенью вероятности можно классифицировать как показатель благоприятного исхода, под которым подразумевается срок выживаемости пациента не менее 10 лет.
Высокая вероятность правильности прогноза по заявляемому способу (общая выживаемость 90%) была подтверждена с помощью исследования выживаемости пациентов по методу Каплана - Мейера [http.://ru.wikipedia.org/wiki]
Методы определения включенных в шкалу прогностических факторов являются хорошо известными и доступными для реализации в клинической практике, что повышает удобство использования заявляемого способа.
Кроме того, для получения прогностического параметра достаточно присвоить прогностическим факторам, установленным в ходе обследования пациентов, значения баллов, соответствующие приведенным в шкале величинам, и определить суммарное значение баллов, что обеспечивает простоту и удобство использования предлагаемого способа.
Как показали данные проведенных авторами исследований, заявляемый способ применим для пациентов, у которых подтвержден диагноз рак молочной железы независимо от его подтипа, что значительно расширяет сферу применения заявляемого способа.
Таким образом, техническим результатом заявляемого способа является повышение его простоты и удобства использования при обеспечении высокой объективности и достоверности прогноза.
Суммарное значение баллов дополнительно может быть использовано в качестве прогностического параметра для количественного определения границ групп риска неблагоприятного исхода (наступление смерти ранее 10 лет), а именно, при значениях суммарного балла менее 40, пациентов относят к группе низкого риска, при значениях суммарного балла от 40 до 60 - к группе среднего риска, а при значениях более 60 пациентов относят к группе высокого риска.
Указанная градация групп пациентов по степени риска получена с привлечением процедуры логрангового тестирования [О. Реброва. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. МедиаСфера: Москва, 2002.]
На фиг. 1 представлена прогностическая шкала, используемая в заявляемом способе; на фиг. 2 представлена таблица данных, касающихся проведения иммуногистохимических исследований.
Способ осуществляют следующим образом.
У пациента с установленным диагнозом рак молочной железы определяют требуемые прогностические факторы и в зависимости от полученного результата присваивают каждому из них количество баллов в соответствии с данными прогностической шкалы (см. фиг. 1).
Стадию заболевания определяют согласно системе TNM [Brierley J.D., Gospodarowicz М.K., Wittekind С. TNM Classification of Malignant Tumours, 8th Edition (UIJCC).] на основании результатов проведенного клинического обследования пациента.
Стадия T2N0M0 соответствует следующим признакам:
Т2 - опухоль от 2 см до 5 см в наибольшем измерении;
N0 - нет признаков поражения метастазами регионарных лимфатических узлов;
М0 - нет признаков отдаленных метастазов.
Если у пациента установлено соответствие рака молочной железы данной стадии, прогностический фактор оценивается в 10 баллов, в ином случае прогностический фактор получает 0 баллов.
Показатель степени дифференцировки (злокачественности) G рака молочной железы отражает гистологические особенности опухоли. Этот признак указывает на степень активности и агрессивности опухоли.
Степень дифференцировки G2 соответствует умеренно дифференцированной опухоли (умеренно-агрессивная), G3 соответствует низкодифференцированной опухоли (высокоагрессивная).
Для определения указанного прогностического фактора могут быть использованы известные методы, например [SBR - шкала Scarff-Bloom-Richardson, Ноттингемская модификация].
Если у пациента установлена степень дифференцировки опухоли G2 или G3, данный прогностический фактор оценивают в 5 баллов, в ином случае прогностический фактор оценивают в 0 баллов.
Определяют уровень экспрессии белка СК14 (далее СК 14), уровень экспрессии белка FOXP3 (далее FOXP3), уровень экспрессии белка E-cadherin (далее E-cadherin), уровень экспрессии белка р53 (далее р53), уровень экспрессии рецепторов HER-2 (далее HER-2), количество Т-лимфоцитов CD8+ (далее CD8+), экспрессию белка EGFR (далее EGFR), количество Т-лимфоцитов CD4+ (далее CD4+), которые являются специфическими маркерами ткани молочной железы.
FOXP3 является белком, вовлеченным в иммунные реакции. FOXP3 функционирует как регулятор (транскрипционный фактор) регуляторных Т-клеток. Прогностическая значимость указанного белка при раке молочной железы отмечается рядом исследований [см., например, Целуйко А.И., Семиглазов В.Ф., Кудайбергенова А.Г. и др. Некоторые аспекты противоопухолевого иммунитета при раке молочной железы. Ж. Эффективная фармакотерапия, 2021, т. 17, № 2, с. 6-14].
СК14 относится к группе цитокератинов - тканеспецифических белков промежуточных филаментов (ПФ).
E-cadherin (Е-кадхерин) является маркером межклеточной адгезии эпителиальных клеток, и утрата его экспрессии в раковых клетках является признаком частичной потери эпителиального фенотипа.
р53 является транскрипционным фактором, регулирующим клеточный цикл. р53 выполняет функцию супрессора образования злокачественных опухолей.
EGFR является трансмембранным рецептором, связывающим внеклеточные лиганды из группы эпидермальных факторов роста.
Прогностическая значимость указанных белков при раке молочной железы отмечается рядом исследований [см., например, Клименко В.В. Молекулярные маркеры эффективности предоперационной химиотерапии местно-распространенного рака молочной железы. Диссертация на соискание ученой степени к.м.н., Санкт-Петербург, 2015 г.].
HER-2 - рецепторы факторов роста 2 типа составляют семейство поверхностных рецепторов клеток, вовлеченных в передачу сигналов, управляющих нормальным ростом и дифференцированием клеток. HER-2 является биомаркером, традиционно используемым для диагностики и прогноза рака молочной железы [см., например, Асель Кудайбергенова. Перевод рекомендаций САР. Протокол исследования инвазивного рака молочной железы. Общероссийская общественная организация «Российское общество онкомаммологов», 2016].
Т-лимфоциты CD8+ (цитотоксические) и CD4+ (регуляторные) являются одними из ключевых участников клеточного звена иммунитета у больных раком молочной железы. Прогностическая значимость указанных клеток установлена целым рядом исследований (см., например, Л.В. Скотаренко, И.К и др. Особенности Т-клеточного иммунитета при раке молочной железы, ж. Опухоли женской репродуктивной системы. 2011, № 4, с. 24-27).
Для определения вышеуказанных восьми биомаркеров используют известные методы определения, в частности, методы иммуногистохимии (ИГХ).
При осуществлении иммуногистохимических исследований проводят микроскопическое исследование гистологических препаратов, приготовленных из образцов опухоли, отобранных у пациентов с диагнозом рак молочной железы.
В способе предпочтительно используют гистологические препараты, приготовленные в виде тонких срезов (3-4 мкм) из фиксированных в парафине образцов опухолевой ткани (парафиновый блок) и окрашенных гематоксилином и эозином, но могут быть использованы и другие виды препаратов, приготовленные по известным в области гистологии методикам.
Для осуществления ИГХ определения целесообразно использовать выпускаемые различными производителями системы визуализации (детекции) антигена, которые включают наборы реактивов для проведения реакций антиген-антитело и протоколы проведения исследования (например, системы EnVision Flex, UltraView и др.)
В частности, определение вышеуказанных белков может быть проведено по процедурам, информация о которых приведена на фиг. 2.
Целесообразно также использовать аппаратур, способную обеспечить получение цифрового (виртуального) микроскопического изображения гистологического препарата, обработку и анализ изображения, снабженную пакетом программ, обеспечивающих подсчет количества окрашенных клеток или их фрагментов, и оценку интенсивности их окраски.
Полученные результаты определения вышеописанных прогностических факторов оценивают в баллах в соответствии со 100-балльной шкалой (см. фиг. 1).
HER-2.
При значении уровня экспрессии HER-2 равном 3, фактор оценивают в 13 баллов.
В том случае, если значение данного прогностического фактора не соответствует предусмотренному шкалой значению, фактор оценивается в 0 баллов.
FOXP3.
В том случае, если уровень экспрессии FOXP1 равен нулю, то есть не обнаруживается в исследуемом образце биологического материала пациента, данному фактору присваивается значение 15 баллов.
В ином случае данному прогностическому фактору присваивается 0 баллов.
СК14, E-cadherin, р53, EGFR.
В случае обнаружения указанных белков в исследуемых образцах биологического материала пациента, данным прогностическим факторам присваиваются соответствующие значения баллов: для СК14 16 баллов, для Е-cadherin 6 баллов, для р53 19 баллов, для EGFR 4 балла.
В том случае, если какой-то из данных белков не обнаруживается в исследуемых образцах биологической ткани пациента, соответствующий фактор получает значение 0 баллов.
CD8+ и CD4+.
В случае, если количество клеток CD8+ и CD4+ больше 0, то есть присутствуют в исследуемом образце ткани опухоли, указанным факторам присваиваются значения, соответственно, 9 и 3 балла.
В ином случае соответствующий прогностический фактор оцениваются в 0 баллов.
Далее значения полученных баллов суммируется. Суммарное значение используется как прогностический параметр.
Если значение прогностического параметра составляет менее 40, прогноз расценивается как благоприятный с вероятностью выживаемости в течение не менее 10 лет.
Исходя из значения суммарного показателя, пациента относят к соответствующей группе риска неблагоприятного исхода, причем если сумма баллов менее 40 прогнозируют низкий риск летального исхода (выживаемость 5 и более лет), если сумма баллов составляет величину от 40 до 60, прогнозируют средний риск летального исхода (выживаемость не менее 5 лет), сумма баллов более 60 говорит о высоком риске неблагоприятного исхода, при котором летальный исход может наступить до истечения 5 лет.
В том случае, если пациент, у которого прогностический параметр составляет более 40, проходит курс химиотерапии, неблагоприятный исход с вероятностью летального исхода менее 5 лет можно ожидать у пациентов с изначально установленным прогностическим параметром более 70%.
Возможность формирования прогноза рака молочной железы с использованием заявляемого способа подтверждена следующими исследованиями.
Осуществляли наблюдение за группой больных из 1260 человек с диагнозом рак молочной железы, у которых после постановки диагноза определяли комплекс вышеуказанных прогностических факторов.
Была выявлена первая группа больных (540 человек), у которых величина прогностического параметра составляла менее 40 баллов, вторая группа больных (420 человек), у которых величина прогностического параметра лежала в диапазоне от 40 до 60 баллов, и третья группа больных (300 человек) составляла более 60 баллов.
В первой группе больных за 10 лет наблюдения был зафиксирован только 1 случай летального исхода. Общая выживаемость для этой группы составила 90%
Во второй группе больных за 5 лет наблюдения был зафиксировано 10 случаев летального исхода. Общая выживаемость для этой группы составила 82%
В третьей группе больных за 5 лет наблюдения было зафиксировано 140 случаев летального исхода. Общая выживаемость для этой группы составила 75%
Полученные данные свидетельствует о высокой точности и достоверности прогноза для указанных групп больных, определенного с использованием заявляемого способа.