Способ получения упорядоченных пленок лизоцима на твердых подложках в ленгмюровской ванне
METHOD OF OBTAINING ORDERED LYSOZYME FILMS ON SOLID SUBSTRATES IN LANGMUIR BATH

Способ получения упорядоченных пленок лизоцима на твердых подложках в ленгмюровской ванне.
Изобретение относится к способам получения белковых пленок толщиной в одну молекулу, а более конкретно, к получению упорядоченных пленок лизоцима на твердых подложках в ленгмюровской ванне. Изобретение может быть использовано для получения упорядоченных белковых пленок с целью создания новых гибридных систем [1, 2] и определения структуры и свойств белковых молекул, имеющих промышленное и медицинское значение.
Детально способ формирования пленок толщиной в одну молекулу на поверхности воды был изучен И. Ленгмюром, а способ переноса монослоев на твердые подложки был разработан им в содружестве с К. Блождетт (способ Ленгмюра - Блоджет) и В. Шеффером (способ Ленгмюра-Шеффера).
Известен способ получения монослоев, который используют для создания белковых пленок на поверхности жидкости и их дальнейшего переноса на твердые подложки, содержащий операции растворения белка в буфере, нанесения белкового раствора на поверхность субфазы, формирования ленгмюровского монослоя и перенос монослоя методом Ленгмюра-Шеффера (ЛШ) [3].
Способ ЛШ заключается в формировании на водной поверхности мономолекулярного слоя белковых молекул путем нанесения белкового раствора на поверхность субфазы, дальнейшем поджатии вещества за счет уменьшения занимаемой им площади и последующем его переносе на твердую подложку, путем горизонтального соприкосновения подложки с монослоем.
Данный метод имеет следующие недостатки: пленки белка при переносе на твердую подложку имеют вид случайных неоднородных островковых участков и таким образом практически непригодны как для определения структуры самих белков, так и для создания гибридных систем.
С целью устранения указанных недостатков специальным образом подбирается состав раствора белка и вводится дополнительная процедура подготовки раствора белка.
В раствор белка вводится специальная добавка, при этом концентрация белка, добавки и температура раствора подбираются близкими к условиям кристаллизации данного белка. Раствор выдерживается в течение времени, которое подбирается для каждого белка: нижний предел определяется началом образования олигомеров, а верхний началом выпадения осадка, например, кристаллов.
Например, в [4, 5] было показано, что добавление осадителя (хлорида натрия) к раствору белка (лизоцима), при соблюдении условий кристаллизации (концентрации белка и осадителя, рН, состав буфера и температура), приводит к процессу образования олигомеров (октамеров). При этом в растворе свыше 40% молекул белка собирается в образования из 8 молекул - октамеры, которые предположительно принимают непосредственное участие в построении кристалла белка и представляют собой упорядоченные мотивы данного кристалла. Наличие образованных в кристаллизационном растворе олигомеров оказывает влияние на структуру полученной пленки.
Известен также способ формирования белковых пленок на твердых подложках путем нанесения на поверхность воды раствора белка с последующим формированием монослоя белка на поверхности воды и нанесением монослоя белка на твердую подложку (патент RU 2317100, «СПОСОБ ФОРМИРОВАНИЯ БЕЛКОВЫХ ПЛЕНОК НА ТВЕРДЫХ ПОДЛОЖКАХ», МПК A61K 30/00, C12N 11/12, C07K 17/18, опубл. 20.02.2008).
В соответствии с этим способом формирование упорядоченных белковых пленок осуществляют путем нанесения монослоя иммобилизующего агента на твердую подложку по методу Ленгмюра-Блоджетт с последующей адсорбцией на ней белковых молекул из водного раствора путем молекулярной самосборки и повторного нанесения монослоя иммобилизующего агента на поверхность образованного белкового слоя с использованием в качестве иммобилизующего агента смешанного сложного эфира целлюлозы - ацетопивалината целлюлозы.
С целью изучения структурно-функциональных свойств биологических мембран и их компонентов при повреждении белковых молекул ионами тяжелых металлов проводят иммобилизацию белковых молекул на монослое ацетопивалината целлюлозы.
Иммобилизацию щелочной фосфатазы и каталазы осуществляют на монослое ацетопивалината целлюлозы, предварительно перенесенного методом Ленгмюра-Блоджетт на твердую кремниевую подложку. Адсорбцию белковых молекул из водного раствора реализуют путем самосборки. Поднимая твердую подложку через вновь сформированный монослой ацетопивалината целлюлозы, обеспечивают формирование покровного слоя полимера на поверхности белкового монослоя. При этом белковая пленка состоит из трех слоев:
I - монослой полимера, II - белковые молекулы, III - монослой полимера.
Данный способ принят за прототип предлагаемого технического решения, поскольку имеет наибольшее число совпадающих существенных признаков.
Однако недостатком известного способа является то, что распределение белка на твердой подложке неоднородно и имеет неконтролируемую величину толщины и латеральной упорядоченности. Неконтролируемая величина толщины получаемой белковой пленки связана с процессом адсорбции, которая зависит от многих параметров (состав раствора, взаимодействие конкретного белка с иммобилизирующим агентом и др.). Кроме того, использование иммобилизирующего агента затрудняет применение данного способа для создания активных элементов биосенсорных устройств, так как фактически белковые молекулы являются закрытыми от внешней среды.
Задачей, поставленной при разработке настоящего изобретения, являлось получение упорядоченных белковых пленок, что позволяет создать новые гибридные системы, а также обеспечить надежное определение структуры и свойств белковых молекул, имеющих промышленное и медицинское значение.
Техническим результатом является создание надежного способа получения высококачественных однородных белковых пленок на твердых подложках.
Поставленные техническая задача и результат достигаются тем, что в способе получения упорядоченных белковых пленок на твердых подложках в ленгмюровской ванне путем нанесения на поверхность воды раствора белка с последующим формированием монослоя белка на поверхности воды и нанесением монослоя белка на твердую подложку, для получения раствора белка готовят маточный раствор лизоцима в буфере с концентрацией, соответствующей началу кристаллизации лизоцима, раствор лизоцима фильтруют, а затем центрифугируют, параллельно готовят маточный раствор хлорида натрия - осадителя для лизоцима, раствор осадителя фильтруют, а затем маточные растворы лизоцима и осадителя смешивают в объемном соотношении 1:1, полученную смесь выдерживают в течение одного часа для образования олигомеров, затем названную смесь наносят на водную субфазу ленгмюровской ванны, формируют монослой и переносят сформированный монослой на твердую подложку.
Для фильтрования растворов белка и добавки используют мембранные фильтры диаметром 0,15-0,5 мкм. Центрифугирование раствора белка проводят в течение 5-15 минут в центрифуге при числе оборотов 8000-12000 об/мин. В качестве воды для ванны Ленгмюра применяют очищенную воду с сопротивлением не менее 18 МОм*см. В качестве подложки для нанесения монослоя белка возможно использование кремниевой пластины с гидрофильной поверхностью.
Перенос мономолекулярного слоя белка в ленгнмюровской ванне на подложку осуществляют методом Ленгмюра - Шеффера или методом Ленгмюра - Блоджетт.
В качестве маточного раствора белка в буфере возможно использование лизоцима из куриного яйца.
Существо изобретения поясняется диаграммой и графиками, представленными на фигурах:
Фиг. 1 – Блок-схема реализации способа;
Фиг. 2 - Графики угловой зависимости зеркальной компоненты рентгеновского отражения (точки - эксперимент, сплошная линия - расчет) от подложки Si без белковой пленки; пленки лизоцим, сформированной из чистого раствора белка без осадителя; пленки лизоцима, сформированной из предварительно приготовленного белкового раствора с осадителем. Кривые смещены по вертикали для лучшей визуализации;
Фиг. 3 - Рассчитанный профиль электронной плотности (нормированный к значению электронной плотности подложки) от подложки Si без белковой пленки (а); пленки лизоцима, сформированной из чистого раствора белка без осадителя (б); пленки лизоцима, сформированная из предварительно приготовленного белкового раствора с осадителем (в);
Фиг. 4 - профиль изменения высоты (а) пленки лизоцима, полученной из чистого раствора белка, и (б) пленки лизоцима, сформированной из предварительно приготовленного белкового раствора с хлоридом натрия, перенесенных на Si подложки методом ЛШ.
Реализация способа осуществляется в следующей последовательности (фиг. 1).
1. Готовят маточные растворы белка в буфере с концентрацией, при которой, например, реализуются условия кристаллизации для данного белка.
2. Растворы белка фильтруют, а затем проводят центрифугирование раствора.
3. Готовят маточный раствор добавки из стандартного набора (например, из набора для кристаллизации фирмы HamptonResearchhttps://www.hamptonresearch.com/menus.aspx?id=2&cid=1), и любых других наборов для кристаллизации, растворимые соли, полиэтиленгликоль, глицерин, которые могут быть осадителями для данного белка (исходя из анализа последовательности аминокислот), а также вещества, которые могут оказать влияние на конформацию молекул - например спирты) с показателем рН, соответствующем показателю исходного белкового раствора, и концентрацией, при которой реализуются условия кристаллизации для данного белка.
4. Раствор добавки фильтруют через фильтры (диаметр 0,15-0,5 мкм).
5. Белковые растворы, полученные в соответствии с пунктом 2 смешивают с раствором добавки (из п. 4) в равных объемах.
6. Раствор выдерживается в течение времени, которое подбирается для каждого белка: нижний предел определяется началом образования олигомеров, а верхний началом выпадения осадка, например, кристаллов.
7. На поверхность ленгмюровской ванны на водную субфазу наносят приготовленный раствор белка с добавкой. Далее формируют ленгмюровский монослой посредством плавучего барьера с последующим переносом сформированного монослоя на подложку методом Ленгмюра-Шеффера (касание монослоя горизонтально расположенной подложкой) или методом Ленгмюра - Блоджетт (вертикальное опускание подложки в ванну).
Пример реализации способа.
Материалы. Для приготовления растворов использовались: белок лизоцим из куриного яйца (CAS# 12650-88-3, Sigma-Aldrich), хлорид натрия (CAS# 7647-14-5, Helicon) и ацетат натрия (CAS# 6131-90-4, Helicon). В качестве буфера использовали 0.2 М натрий-ацетатный буфер (буфер), рН=4.5. Для приготовления растворов использовали сверхчистую воду (чистая вода) (сопротивление воды 18 МОм*см), полученную с помощью системы Simplicity 185 (Millipore).
Белок растворяли в буфере с концентрацией 80 мг/мл. Полученный маточный раствор фильтровали с помощью 0.22 мкм мембранных фильтров (Millex), затем центрифугировали в течение 10 минут с частотой 10000 об/мин.
Хлорид натрия растворяли в том же буфере с концентрацией 50 мг/мл.
2
Подложки. Подложки были вырезаны из кремниевой пластины толщиной 380±15 мкм, ориентацией [110] и с гидрофильной поверхностью («Протон Альфа»). Размер подложек составлял 20×15 мм Поверхность подложек промывали чистой водой и высушивали; далее подложки использовали для переноса монослоя белка с осадителем.
2
Перенос монослоев. Монослой лизоцима с осадителем формировали с помощью ленгмюровской ванны KSV 5000 LB (KSV Instruments) с рабочей площадью поверхности 750 см. Поверхностное давление (π) измерялись помощью весов Вильгельми с платиновой пластиной (±0.1 мН/м). Эксперименты проводили при температуре 18.5±0.5°C. Перед экспериментом поверхность ванны очищали этанолом и промывали чистой водой.
В качестве субфазы использовали воду, очищенную с помощью системы Millipore, сопротивление воды составляло не менее 18 МОм*см. Раствор наносили на предварительно очищенную поверхность субфазы с помощью автоматической пипетки Eppendorf. Монослои формировали сразу же после нанесения раствора за счет движения симметричных барьеров со скоростью 20 мм/мин. Перенос монослоев осуществляли при фиксированном значении поверхностного давления (14 мН/м) методом Ленгмюра-Шеффера [6], однократным касанием поверхности подложки к поверхности субфазы с монослоем.
Для формирования монослоя лизоцима с осадителем на поверхность субфазы наносили 1000 мкл раствора лизоцима с хлоридом натрия. Для приготовления такого раствора за час до эксперимента маточный белковый раствор смешали с раствором хлорида натрия в равных объемах. Таким образом, концентрации лизоцима и хлорида натрия в буферном растворе составили 40 мг/мл и 25 мг/мл соответственно. Такие концентрации белка и осадителя соответствуют условиям, при которых в растворе образуются октамеры лизоцима и реализуются условия кристаллизации лизоцима тетрагональной сингонии [4, 5].
С целью оценки качества нанесенных пленок проводилось исследование их структуры и сопоставление данных о толщине и качестве поверхности пленок лизоцима, полученных из растворов как чистого белка, так и белка с хлоридом натрия методами рентгеновской рефлектометрии (РР) и атомно-силовой микроскопии (АСМ).
В основе метода РР лежит регистрация угловой зависимости зеркальной компоненты рентгеновского отражения с последующим восстановлением из экспериментальной кривой профиля распределения электронной плотности по нормали к поверхности образца. Полученный профиль электронной плотности в явном виде несет в себе информацию о толщинах, плотностях, неидеальности границ раздела слоев исследуемой системы.
Для анализа данных РР исследуемые образцы представлялись в виде слоистых моделей пленка/подложка, характеризуемых профилем электронной плотности. Каждый слой задавался тремя параметрами: толщиной, электронной плотностью, шириной переходного слоя. Методом рекуррентных соотношений Парратта [7] проводился расчет теоретической кривой РР для данной слоистой модели. Путем минимизации методом Левенберга-Марквардта [8] расхождения между экспериментальной и теоретической кривыми были получены профили электронной плотности, наиболее соответствующие экспериментальным данным.
Экспериментальные зависимости РР были получены на дифрактометре SmartLab (Rigaku), оснащенном источником излучения с вращающимся молибденовым анодом мощностью 9 кВт. Использовалась спектральная линия MoKα1 , интенсивность пучка регистрировалась NaI детектором. В плоскости рассеяния приемные щели обеспечивали угловое разрешение 0. 012°, в поперечном направлении падающий пучок засвечивал весь образец. Измерения проводились с использованием специальной ячейки, которая представляла собой герметичную камеру, позволяющую сформировать и поддерживать химически изолированную атмосферу для исследуемого объекта [9].
На фигуре 2 представлены графики угловой зависимости зеркальной компоненты рентгеновского отражения от подложки Si без белковой пленки; пленки лизоцима, сформированной из чистого раствора белка без хлорида натрия; пленки лизоцима, сформированной из предварительно приготовленного белкового раствора с хлоридом натрия. Относительная интенсивность отражения на кривой 2 (фиг. 2) в области дальних углов (2-3°) несколько выше в сравнении с кривыми 1,3. Это может быть связано как с наличием диффузного рассеяния вследствие менее упорядоченной (менее гомогенной) структуры пленки (в сравнении с пленкой из белкового раствора с хлоридом натрия), так и с большей величиной переходного слоя подложка-пленка в данном образце.
Соответствующие расчетные профили распределения электронной плотности по глубине, нормированные на значение электронной плотности подложки, показаны на фигуре 3. Полученные параметры слоистой модели представлены в числовом виде в таблицах 1-3.
2
Исходя из сравнения профилей плотностей и параметров слоистой модели пленок лизоцима с добавлением хлорида натрия и без, можно видеть, что толщина пленки лизоцима с хлоридом натрия почти в 2 раза больше толщины пленки без хлорида натрия ( и  соответственно), значение которой соответствует усредненному диаметру мономера лизоцима; а монослой лизоцима с хлоридом натрия, перенесенный на подложку, является более однородным и плотноупакованным: его плотность почти в 5 раз превышает плотность монослоя лизоцима без хлорида натрия, а шероховатость в 2,5 раза меньше. Возможно присутствие слоя НO между подложкой и пленкой белка.
2
После исследования методом РР высушенные пленки были исследованы методом АСМ в полуконтактном режиме. Размеры изображений варьировались в пределах от 1×1 мкм 2 до
Профили высоты поверхности пленок лизоцима с хлоридом натрия и без хлорида натрия показаны на фигуре 4. Толщина пленки лизоцима без хлорида натрия составляет 3,4 нм, сама пленка имеет островковую структуру. Пленка лизоцима с хлоридом натрия имеет однородную структуру, а ее толщина составляет 7,5 нм. Такая толщина пленки соответствует размеру октамеров, образующихся в растворе в условиях
3
кристаллизации, диаметр которых (в приближении сферической формы), согласно данным малоуглового рассеяния рентгеновских лучей, составляет 6,02 нм (V=117 нм) [5] плюс толщина тонких слоев буфера между пленкой и подложкой и на поверхности пленки. Эти данные согласуются с результатами, полученными методом PP. Таким образом, формирование плотноупакованной пленки лизоцима с хлоридом натрия с двойной толщиной можно объяснить участием октамеров в формировании ленгмюровского монослоя.
Таким образом, проведенные исследования подтвердили высокое качество полученных пленок, что свидетельствует об эффективности и промышленной применимости разработанного способа.
Источники информации:
1. Marchenkova М.А. et al. Cytochrome с Complexes with Cardiolipin Monolayer Formed under Different Surface Pressure // Langmuir. 2015. Vol. 31, №45. P. 12426-12436.
2. Дьякова Ю.А., Марченкова М.А. Создание частично упорядоченных органических планарных систем на основе in situ контроля их структурной организации // Кристаллография. 2016. Vol. 61, №5. Р. 718-735.
3. Langmuir I., Schaefer V.J. Properties and Structure of Protein Monolayers. // Chem. Rev. 1939. Vol. 24, №2. P. 181-202.
4. Marchenkova M.A. et al. In situ study of the state of lysozyme molecules at the very early stage of the crystallization process by small-angle X-ray scattering // Crystallogr. Reports. 2016. Vol. 61, №1. P. 5-10.
5. Kovalchuk M.V. et al. Investigation of the Initial Crystallization Stage in Lysozyme Solutions by Small-Angle X-ray Scattering // Cryst. Growth Des. 2016. Vol. 16, №4. P. 1792-1797.
6. Roberts G. Langmuir-Blodgett films / ed. Roberts G. New York: Plenum Press, 1990. 425 p.
7. Parratt L. Surface Studies of Solids by Total Reflection of X-Rays // Phys. Rev. 1954. Vol. 95, №2. P. 359-369.
8. Pedersen J.S., Hamley I.W. Analysis of neutron and X-ray reflectivity data. II. Constrained least-squares methods // J. Appl. Crystallogr. 1994. Vol. 27, № pt 1. P. 36-49.
9. Kovalchuk M.V. et al. In situ study of the growth and degradation processes in tetragonal lysozyme crystals on a silicon substrate by high-resolution X-ray diffractometry // Crystallogr. Reports. 2014. Vol. 59, №5. P. 679-684.