СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ ДЛИНЫ ТЕЛОМЕР КЛЕТОК ЛЕЙКОКОНЦЕНТРАТА ПУПОВИННОЙ КРОВИ
METHOD OF MEASURING LENGTH OF TELOMERES OF UMBILICAL BLOOD LEUKOCONCENTRATE CELLS

Способ измерения длины теломер клеток лейкоконцентрата пуповинной крови относится к области биотехнологии и генной инженерии, может быть использован в медицине в качестве дополнительного информационного материала при диагностике и при медицинской оценке тяжелых заболеваний, при определении качества образца для трансплантации.
Теломеры являются некодирующими концевыми участками хромосом, которые состоят из повторяющейся последовательности ДНК и комплекса белков. Укорочение длины теломер с каждым делением клетки являются ограничителем пролиферативного клеточного потенциала в клетках, способных делиться практически неограниченно, - это эмбриональные стволовые клетки, клетки герминативной линии, а также большинство раковых клеток, в которых активно экспрессируется теломераза, способная достраивать теломеры или/и активно активируется альтернативный путь удлинения теломер. В клинической практике активно развивается использование показателя длины теломер. Стандартные методы характеристики качества образца пуповинной крови для трансплантации включают количество гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) на массу тела пациента, их жизнеспособность, качество колониеобразующих единиц (КОЕ), отсутствие контаминации. Дополнительная характеристика пролиферативной активности стволовых клеток, оцениваемая по длине теломер, также является информативным показателем качества трансплантата.
6
В статье M.Hultdin, E.Gronlund, K.-F.Norrback, E.Eriksson-Lindstrom, T.Justl and G.Roos "Telomere analysis by fluorescence in situ hybridization and flow cytometry" Nucleic Acids Research, 1998, Vol.26? No.16 3651-3656, указывается анализ теломер после гибридизации и окрашивании с помощью проточной цитометрии. Клеточную суспензию отмывают в фосфатно-солевом буфере (PBS) при центрифугировании 400g, 5 мин и ресуспендируют в 1 мл PBS. Клетки окрашивают Img/ml трипан синий и подсчитывают на клеточном счетчике Burker chamber. Клетки смешивают 1:1 с клетками 1301 и общим количеством в 2×10 помещают в 1,5 мл пробирках. После добавления PBS пробирки центрифугируют с ускорением 4900g 30 секунд. Осадок ресуспендируют в 400 мкл Fix & Perm Reagent A и инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре. Далее добавляют 1 мл PBS, центрифугируют, осадок ресуспендируют в 400 мкл Fix & Perm Reagent B и после 15-минутной инкубации клетки дважды отмывают в PBS. В гибридизационном растворе, содержащем 70% формамид, 4 нМ флуоресцеин-3-флуоресцеин PNA зонд в 10 мм Tris, pH 7.2. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре пробирки перемешивают на вортексе и помещают в водяную баню на 87 град на 10 мин с перемешиванием. Затем пробирки помещают в темноту при комнатной температуре на ночь (15-20 часов), затем клетки центрифугируют и инкубируют дважды при комнатной температуре по 10 минут в 70% формамиде, 0,1% BSA и 0,1% Tween в 10 mM Tris pH 7.2. Клетки ресуспендируют в 1 мл 0,15 М NaCl, 0,1% BSA, 0,1% Twin 20 в 50 mM Tris, pH 7.5 и переносят в 5 мл пробирки, добавляют 3-4 мл 0.15 М NaCl, 0,1% BSA, 0,1% Tween 20 в 50 mM Tris, ph 7.5 и после 10 минут при комнатной температуре пробирки центрифугируют с ускорением 400g в течение 5 минут. Клетки ресуспендируют в 0,5 мл PBS и добавляют пропидиум йодид до конечной концентрации 0,1 микрограмм/мл, вортексируют и держат в темноте в течение 30 минут до проведения анализа.
Недостатками такого анализа теломер являются: повышенная сложность технологии, невозможность стандартизации методики, недостаточная эффективность измерения длины теломер, способ неэффективен, не технологичен и занимает много времени, является исследовательским и не эффективным в промышленном применении.
В журнале «Гематология» №3, 2002 г., с.265-269 указана статья «Анализ длины теломеры клеток пуповинной крови по методу проточной цитометрии» - Nora Regeczy, Sandor Valent, Luca Kormos, Melinda Hajdu, Laszio Gopcsa and Katalin Paloczi "Telomere length analysis on cord blood cells by the flow-FISH method", Hematologia? Vol.32, No.3, pp.265-269, 2002, содержащая способ измерения длины теломер пуповинной крови, включающий центрифугирование гепаринизированных образцов пуповинной крови в градиенте плотности на Ficoll-Hypaque, мононуклеарные клетки гибридизируют и окрашивают с использованием набора DAKO. В качестве клеточного контроля используют клеточную линию 1301. Клеточную суспензию, состоящую из клеток образца и контрольной культуры, денатурируют при 82°C в течение 10 минут в микроцентрифужных пробирках в гибридизационном растворе либо с зондом либо без него. При гибридизации пробирки с раствором оставляют при комнатной температуре в темноте в течение ночи. После гибридизации проводят две 10-минутные отмывки с помощью отмывочного раствора при 40°C. Далее образцы ресуспендируют в буфере для окрашивания с помощью пропидиум йодид. Сигнал флуоресценции теломер определяют как средний сигнал по каналу FL1 в области G0/G1 клеток после вычитания автофлуореценции (сигнал от пробирки без зонда). Относительная длина теломер высчитывалась как отношение теломерного сигнала образца к сигналу от контрольной клеточной линии 1301.
Недостатками такого способа измерения длины теломеры клеток пуповинной крови, являющегося самым близким решением, являются: форму анализируемых клеток технология такого способа недостаточно хорошо сохраняет, контрольные и анализируемые клетки смешивают в одной пробирке, что при анализе теломер усложняет выделение необходимой популяции клеток, способ не позволяет эффективно проводить выделение клеток на стации GO/G1 клеточного цикла, большая затрата времени.
Техническим результатом изобретения является повышение качества определения свойств трансплантата, образцов гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови для трансплантации, повышения эффективности получения дополнительных информационных данных о пролиферативном потенциале клеток трансплантата, а также для диагностики и оценки тяжести тяжелых заболеваний, за счет своевременного определения ускоренного укорочения длины теломер, являющейся наиболее общим маркером необратимых процессов при различных заболеваниях.
dim
6
Этот результат достигается тем, что в способе измерения длины теломер клеток лейкоконцентрата пуповинной крови, включающем выделение центрифугированием гепаринизированных мононуклеарных клеток пуповинной крови в градиенте плотности на Ficoll, денатурацию при 82°C клеточной суспензии, состоящей из клеток пуповинной крови и контрольной клеточной культуры 1301, гибридизацию раствора в темноте с зондом и без него при комнатной температуре в отмывочном буфере, отмывание при температуре 40°C, ресуспензирование анализируемых и контрольных клеток в буфере для окрашивания в растворе пропидиум йодида, подсчет клеток на проточном цитометре и определение длины теломер анализируемых клеток в сравнении с контрольной клеточной линии 1301, лейкоконцентрат пуповинной крови выделяют в градиенте плотности на Ficoll-Paque™PLUS, в мононуклеарной фракции пуповинной крови определяют количество гемопоэтических стволовых клеток CD34+CD45, лимфоцитов и лейкоцитов, клеточную культуру линии Т-лимфобластоидной лейкемии 1301 поддерживают в среде раствора RPMI с добавлением 10% бычьей сыворотки, глютамина и пенициллина со стрептомицином, отмывают анализируемые и контрольные клетки от дебриса в растворе фосфатно-солевого буфера с раствором 0,1% бычьего сывороточного альбумина, сохраняя форму клеток, выравнив и подсчитав количество анализируемых и контрольных клеток, помещают по 2×10 анализируемых и контрольных клеток по двум парам пробирок, добавляя к ним во все пробирки по 0,5 мл фосфатно-солевого буфера с 0,1% бычьим сывороточным альбумином, центрифугируют полученные растворы с клетками с ускорением 500g в течение 5 минут, сливая после него супернатант, в первую пару пробирок с анализируемыми и контрольными клетками вливают по 300 мкл гибридизационного буфера, содержащего 70% формамида, во вторую пару пробирок с клетками вливают по 300 мкл раствора гибридизационного буфера с пептидо-нуклеиновым зондом, меченным флурохромом FITC комплементарной теломерной последовательности ДНК, после перемешивания всех растворов в пробирках на вортексе проводят денатурацию ДНК клеток из двухцепочечной в одноцепочечную форму, посредством инкубирования растворов всех пробирок в твердотельном термостате при температуре 82°C в течение 10 минут, перемешав растворы на вортексе, инкубируют их в темноте в диапазоне от 2-х до 20 часов при комнатной температуре, осуществляя процесс гибридизации пептидо-нуклеинового зонда к теломерной последовательности в ДНК клеток, потом дважды отмывают клетки, добавив в пробирки с клетками по 1 мл отмывочного буфера из набора Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometry, разведенного в 10-кратном объеме дистиллированной воды, перемешав их на вортексе и инкубировав в темноте при температуре 40°C в течение 10 минут, после очередного перемешивания на вортексе центрифугируют растворы с ускорением 500g в течение 5 минут, сливая супернатант, к клетками в пробирках добавляют по 500 мкл буфера для окрашивания ДНК, разведенного в 10-кратном объеме дистиллированной воды и содержащего пропидиум йодидида и рибонуклеазу A, перемешав содержимое на вортексе, инкубируют в темноте образцы с клетками при температуре 37°C в течение 30 минут, для определения анализируемых клеток, имеющих диплоидный набор хромосом и тетраплоидный для контрольной клеточной культуры 1301, после анализа клеточных образцов считают относительную длину теломер (ОДТ) образца анализируемых клеток пуповинной крови по формуле в зависимости от средней длины теломер контрольной клеточной линии 1301 с учетом индекса ДНК тетраплоидных контрольных клеток, при этом
образцы
1301
ОДТ=(П-А)×2×100/(П-А), где
образцы
(П-А) - разница между интенсивностями флюоресценции в анализируемых клетках без зонда, измеренными в относительных единицах по первому каналу проточного цитофлюориметраметра,
1301
(П-А) - разница между интенсивностями флюоресценции контрольных клеток 1301 с размещенным в них зондом.
Сущность изобретения как технического решения выражается в совокупности существенных признаков, достаточной для достижения обеспечиваемого решением технического результата.
Существенными признаками изобретения, совпадающими с признаками прототипа, являются: А - выделение центрифугированием гепаринизированных мононуклеарных клеток пуповинной крови в градиенте плотности Ficoll; Б - проведение денатурации при 82°C клеточнй суспензии, состоящей из клеток пуповинной крови и контрольной клеточной культуры 1301; В - осуществление гибридизации раствора в темноте с зондом и без него при комнатной температуре; Г - отмывание при температуре 40°C, ресуспензирование анализируемых и контрольных клеток в буфере для окрашивания в растворе пропидиум йодида, подсчет клеток на проточном цитометре и определение относительной длины теломер анализируемых клеток в сравнении с контрольной клеточной линии 1301.
dim
6
образцы
1301
образцы
1301
Существенными отличительными признаками решения являются: Д - лейкоконцентрат пуповинной крови выделяют в градиенте плотности на Ficoll-Paque™PLUS; E - в мононуклеарной фракции пуповинной крови определяют количество гемопоэтических стволовых клеток CD34+CD45, лимфоцитов и лейкоцитов; Ж - клеточную культуру линии Т-лимфобластоидной лейкемии 1301 поддерживают в среде раствора RPMI с добавлением 10% бычьей сыворотки, глютамина и пенициллина со стрептомицином; И - отмывают анализируемые и контрольные клетки от дебриса в растворе фосфатно-солевого буфера с раствором 0,1% бычьего сывороточного альбумина, сохраняя форму клеток, выравнив и подсчитав количество анализируемых и контрольных клеток; К - помещают по 2×10 анализируемых и контрольных клеток по двум парам пробирок, добавляя к ним во все пробирки по 0,5 мл фосфатно-солевого буфера с 0,1% бычьим сывороточным альбумином, центрифугируют полученные растворы с клетками с ускорением 500g в течение 5 минут, сливая после него супернатант; Л - в первую пару пробирок с анализируемыми и контрольными клетками вливают по 300 мкл гибридизационного буфера, содержащего 70% формамида; М - во вторую пару пробирок с клетками вливают по 300 мкл раствора гибридизационного буфера с пептидо-нуклеиновым зондом, меченым флуорохромом FITC комплементарной теломерной последовательности ДНК; Н - после перемешивания всех растворов в пробирках на вортексе проводят денатурацию ДНК клеток, при сниженной температуре плавления ДНК с осуществлением перехода ДНК из двухцепочечной в одноцепочечную форму, посредством инкубирования растворов всех пробирок в твердотельном термостате при температуре 82°C в течение 10 минут; О - перемешав растворы на вортексе, инкубируют их в темноте в диапазоне от 2-х до 20 часов при комнатной температуре, осуществляя процесс гибридизации пептидо-нуклеинового зонда к теломерной последовательности в ДНК клеток; П - дважды отмывают клетки, добавив по 1 мл отмывочного буфера из набора Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometry, разведенного в 10-кратном объеме дистиллированной воды, перемешав их на вортексе и инкубировав в темноте при температуре 40°C в течение 10 минут, после очередного перемешивания на вортексе центрифугируют растворы с ускорением 500g в течение 5 минут, сливая супернатант; Р - к клеткам в пробирках добавляют по 500 мкл буфера для окрашивания ДНК, разведенного в 10-кратном объеме дистиллированной воды и содержащего пропидиум йодида и рибонуклеазу A, перемешав содержимое на вортексе, инкубируют в темноте образцы с клетками при температуре 37°C в течение 30 минут, для определения анализируемых клеток, имеющих диплоидный набор хромосом и тетраплоидный для контрольной клеточной культуры 1301; С - после анализа клеточных образцов считают относительную длину теломер (ОДТ) образца анализируемых клеток пуповинной крови по формуле в зависимости от средней длины теломер контрольной клеточной линии 1301 с учетом индекса ДНК тетраплоидных контрольных клеток, при этом ОДТ=(П-А)×2×100/(П-А), где (П-А) - разница между интенсивностями флюоресценции в анализируемых клетках без зонда, измеренными в относительных единицах по первому каналу проточного цитофлюориметра, (П-А) - разница между интенсивностями флюоресценции контрольных клеток 1301, с размещенными в них зондом.
dim
6
6
При способе измерения длины теломер клеток лейкоконцентрата пуповинной крови лейконцентрат из пуповинной крови получают сепарацией с использованием клеточного сепаратора Sepax S100 (Швейцария), из которого получают фракцию мононуклеарных клеток с помощью градиентного центрифугирования на Ficoll-Paque™PLUS (Ge Healthtare). В мононуклеарной фракции пуповинной крови определяют количество гемопоэтических стволовых клеток CD34+CD45, лейкоцитов - лимфоцитов и монооцитов. Для сравнения и контроля отбирают 1,5 мл клеточной суспензии контрольной линии 1301. Клетки культуры клеточной линии T-лимфобластоидной лейкемии 1301 поддерживают в среде RPMI с добавлением 10% бычьей сыворотки, глютамина и пенициллина - со стрептомицином. Анализируемые и контрольные клетки отмывают от дебриса в растворе смеси фосфатно солевого буфера (PBS) и бычьего сывороточного альбумина (BSA), сохраняя форму клеток и выравнивая количество анализируемых и контрольных клеток. Подсчитывают количество клеток на проточном цитометре FC500 (Beckman Coulter, США). В две пробирки (эппендорфа), маркированных номером пробы-контроль и номером пробы-зонд, помещают по 2×10 анализируемых клеток. В две другие пробирки, маркированных 1301 контроль и 1301 зонд, помещают по 2×10контрольных клеток. Во все пробирки с содержимым добавляют до 0,5 мл общего объема фосфатно-солевого буфера с 0,1% бычьим сывороточным альбумином и центрифугируют полученные растворы с клетками с ускорением 500g в течение 5 минут, после чего сливают супернатант. В пробирки с маркировкой контроль, т.е. содержащие анализируемые и контрольные клетки, вносят по 300 мкл раствора гибридизационного буфера, содержащего 70% формамида без зонда. В пробирки с маркировкой зонд вносят по 300 мкл раствора гибридизационного буфера, содержащего 70% формамида, с пептидио-нуклеиновым зондом, меченым флуорохромом FITC комплементарным теломерным последовательностью ДНК. После перемешивания всех четырех пробирок с растворами на вортексе проводят денатурацию ДНК клеток при сниженной температурой плавления ДНК с осуществлением перехода ДНК из двухцепочечной в одноцепочечную форму посредством инкубирования растворов во всех пробирках в твердотельном термостате (Bio TDB-120, Biosan) при температуре 82°C в течение 10 минут, позволяя сохранить форму клетки. Осуществляя гибридизацию, перемешивают растворы на вортексе и инкубируют их в темноте в течение от 2-х до 20 часов при комнатной температуре, осуществляя процесс гибридизации пептидо-нуклеинового зонда к теломерной последовательности ДНК клеток. После этапа денатурации ДНК находится в одноцепочечном состоянии, что позволяет зонду гибридизироваться (соединиться) с комплементарной последовательностью на ДНК клетки. Постепенно ДНК возвращается в двухцепочечную форму, прикрепившиеся зонды остаются на комплементарных им участках. Раствор с клетками отмывают в 1 мл отмывочного буфера (типа Wash Solution) из набора Telomere PNA Kit/FITC for Flow Cytometry, предварительно разбавив его дистиллированной водой в 10-кратном объеме, и перемешивают на вортексе. После инкубирования отмытых клеток в течение 10 минут при 40°C в термостате перемешивают их на вортексе и центрифугируют растворы с ускорением 500g в течение 5 минут. После слива супернатанта повторяют дважды процесс отмывки, перемешивания, инкубации и центрифугирования. На данном этапе происходит отмывка неприкрепившихся зондов.
Tween 20 в составе отмывочного раствора способствует созданию перфузий (дырок) в клеточной мембране, что способствует выводу неприкрепившихся зондов из клетки. Для окрашивания ДНК используют 500 мкл буфера, разведенного в 10-кратном объеме дистиллированной воды и содержащего пропидиум йодида и рибонуклеазу А. Окрашенные клетки переносят в стандартные 12×75 мм полистироловые пробирки. Перемешав содержимое на вортексе, инкубируют образцы с клетками в темноте при температуре 37°C в течение 30 минут для определения анализируемых клеток, имеющих диплоидный набор хромосом и тетраплоидный для контрольной клеточной культуры 1301. На данном этапе происходит окрашивание всей ДНК клетки. Это позволяет оценить количество ДНК в клетках при анализе и выделить именно те клетки для анализа, которые находятся на стадии G0/G1 клеточного цикла. Это проводится для осуществления нормализации количества теломер на клетку.
Анализ образцов осуществляют на проточном цитометре и считают относительную длину теломер (ОДТ) образца анализируемых клеток пуповинной крови по формуле в зависимости от средней длины теломер контрольной клеточной линии 1301 с учетом индекса ДНК тетраплоидных контрольных клеток.
образцы
1301
ОДТ=(П-А)×2×100/(П-А), где
образцы
(П-А) - разница между интенсивностями флюоресценции в анализируемых клетках без зонда в относительных единицах, определенных по первому каналу проточного цитофлюориметра.
1301
(П-А) - разница между интенсивностями флюоресценции контрольных клеток 1301 с размещенным в них зондом.
dim
При измерении длины теломер клеток лейкоцитарной фракции 14 образцов пуповинной крови параллельно было определено количество гемопоэтических стволовых клеток CD34+CD45, лимфоцитов и моноцитов, данных гематологического анализатора, проведен иммуноферментный анализ на наличие антител к стандартным возбудителям. По полученным данным относительной длины теломеры (ОДТ, % от 1301) были определены и абсолютные длины теломер (АДТ), пользуясь известными коэффициентами, по следующей эмпирической формуле. АДТ=ОДТ×0,77+2,02 (т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов).
Из 14 образцов пуповинной крови относительная средняя длина теломер в клетках лейконцентрата пуповинной крови составила 20,4±4,9% относительно контрольной клеточной линии T-лимфобластоидной лейкемии 1301. А абсолютная средняя длина теломер в клетках лейкоконцентрата пуповинной крови составляет 17,7±5,9 т.п.н. В результате проведенных исследований показано, что определение длины теломер указывает на то, что наличие хронических инфекционных заболеваний отрицательно влияют на длину теломер клеток крови.
В приложении описания предложенного решения способа указан пример теломерного теста, который проводился по предложенному методу флюоресцентной in Situ гибридизации и проточной цитофлюориметрии. В анализе была определена длина теломер в клетках лейкоцитарной фракции пуповинной крови. В качестве внутреннего контроля была использована стандартная клеточная линия T-лимфобластидной лейкемии 1301, характеризующейся стабильной длиной теломер вне зависимости от пассажа. Несоответствие длины теломер клеток лейкоцитарной фракции образца пуповинной крови норме может свидетельствовать о наличии патологии. Основными причинами ускоренного укорочения теломер является окислительные повреждения, хронические инфекции, гиподинамия, хронический психологический стресс и генетические факторы.
Использование технического решения «Способ измерения длины теломер клеток лейкоконцентрата пуповинной крови» по сравнению с прототипом позволяет повысить качество определения свойств трансплантата, т.к. коррелирует с процентным содержанием моноцитов, а также наличием или отсутствием антител к различным возбудителям, определение которых необходимо в стандартах при осуществлении заготовок пуповинной крови. Предложенный способ позволяет лучше сохранить форму анализируемых клеток, т.к. на первом этапе пробоподготовки клетки отмываются в растворе PBS с 0,1% BSA, контрольные и анализируемые клетки не смешиваются в одной пробирке, что при анализе позволяет более четко выделить необходимые популяции клеток. В протокол проведения анализа внесены также изменения, неосуществленные в способе прототипа. На диаграмме FS (прямое рассеяние) - SS (боковое рассеяние) выделяют интересуемую популяцию (лимфоциты и/или моноциты), для них, т.е. гейтировано по данной области, строят диаграмму распределения клеточных событий по FL3 в логарифмической шкале, что позволяет более эффективно провести выделение клеток на стации G0/G1 клеточного цикла, для которых затем, т.е. гейтировано по данной области выделения, строят диаграмму распределения клеточных событий по FL1 в линейной шкале, среднее значение по которой и будет флуоресценцией зондов или автофлуресценцией в данной области спектра. Кроме того, изменены условия инкубации на этапе окрашивания ДНК, вместо 2-3 часов при 2-8°C инкубацию проводят в течение 30 минут при 37°C, гибридизацию в темноте можно провести и в течение 2-х часов, что существенно сокращает время работы. Измерение длины теломер клеток образца пуповиной крови позволяет оценить пролиферативную активность стволовых клеток, что является важным показателем, так как успех трансплантации зачастую зависит от скорости восстановления гемопоэза. Более длинные теломеры донора ассоциированы с более быстрым восстановлением гранулоцитов реципиента. Предложенный способ измерения длины теломер клеток лейкоконцентрата пуповинной крови промышленно применим и отработан на предприятии ООО «Покровский банк стволовых клеток» (ООО «Покровский БСК») в г.Санкт-Петербург.