СПОСОБ УПРОЩЕННОЙ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ЯДРЫШКООБРАЗУЮЩИХ РАЙОНОВ ХРОМОСОМ
METHOD OF SIMPLIFIED ACTIVITY RATING OF NUCLEOLAR-FORMING CHROMOSOME REGIONS

Изобретение относится к медицине и биологии, в области генетики человека, и может быть использовано для точного определения активности ядрышкообразующих районов (ЯОР) хромосом.
В качестве ближайшего аналога заявленного способа можно считать (Амелина И.В. Активность ядрышкообразующих районов хромосом в популяции жителей города Курска. Автореф. дисс. канд. биол. наук, г.Саранск, 2006).
Отличием заявленного изобретения от известного заключается в том, что дополнительно определяют соотношение показателей ЯОР - D ЯОР/G ЯОР и вычисляют индекс активности ЯОР хромосом (ИА ЯОРХ).
Техническим результатом является повышение точности и доступности определения уровня активности ядрышкообразующих районов хромосом.
Целью изобретения является повышение точности и доступности определения ранних изменений уровня активности ЯОР хромосом в клетках.
Сущность заявляемого способа заключается в том, что для исследования активности ЯОР хромосом в клетках из локтевой вены обследуемого берется кровь для культивирования лимфоцитов и приготовления препаратов метафазных хромосом с последующим анализом хромосомных препаратов для изучения активности ЯОР хромосом в клетках с последующим вычислением ИА ЯОРХ. Полученное значение является общим показателем активности ЯОР хромосом в клетках обследуемого.
Способ отличается тем, что с применением нескольких технически простых и не требующих дорогостоящих реактивов, оборудования, затрат сил и времени методов, возможно более тонкое определение уровня активности ЯОР хромосом у обследуемых с последующим вычислением индекса активности ЯОР хромосом, по значению которого можно точно и своевременно судить об изменениях уровня активности белоксинтезирующего аппарата у того или иного индивида.
Постановка культуры лимфоцитов и приготовление препаратов метафазных хромосом
Используется гепарин фирмы "Ricter" (Венгрия), фитогемагглютинин фирмы "Difko-P" (США), среда 199, сыворотка крупного рогатого скота, колхицин, хлорид калия, метанол, ледяная уксусная кислота, серная кислота концентрированная, дихромат калия, нитрат серебра, раствор желатина, цитрат натрия, хлорид натрия, гидроортофосфат натрия, дигидроортофосфат калия, краситель Гимза фирмы "Merck" (США). Реактивы отечественного производства должны быть марки "ХЧ" и "ОСЧ".
Культивирование крови и приготовление препаратов метафазных хромосом проводят по общепринятой методике [Методические рекомендации. / ЦИУВ. - М.: Медицина, 1989. - 113 с. Бочков, Н.П. Культура лимфоцитов как тест-объект для изучения генетических последствий у лиц, контактирующих с мутагенами. / Н.П.Бочков B.C.Журков, Н.П.Кулешов. // Докл. АН СССР. - 1974. - Т. 218. - №2. - С.463-465]. Кровь забирали из локтевой вены и заполняли ею стерильные пенициллиновые флаконы, в которых находился раствор гепарина (0,1 мл на 1 мл крови). Гепарин используют в разведении бидистилированной водой 1:20. Кровь культивируют в стерильных пенициллиновых флаконах с питательной средой при 37°С в течение 72 часов. Питательная среда состоит из среды 199 (6,0 мл) и сыворотки крупного рогатого скота (1,5 мл). В качестве стимулятора пролиферативной активности используется фитогемагглютинин. За 2 часа до начала фиксации в культуру лимфоцитов добавляли колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл.
Фиксацию проводят на 72 часу культивирования. После центрифугирования и отсасывания надосадочной жидкости клетки инкубируют с предварительно подогретым до 37°С 0,75 М раствором хлорида калия в течение 20 минут при 37°С. После гипотонизации проводят центрифугирование и отбор надосадочной жидкости. Клетки фиксируют в фиксаторе Карнуа (метанол + уксусная кислота) в соотношении 3:1 в течение трех и более часов. За это время производят три смены фиксатора. После полного обесцвечивания суспензии клеток ее раскапывают на обезжиренные предметные стекла, смоченные дистиллированной холодной водой. Препараты высушивали на воздухе и шифровали.
Посадку, культивирование лимфоцитов крови и приготовление препаратов проводят строго стандартно во всех случаях. После приготовления препараты выдерживают при комнатной температуре для окраски нитратом серебра 7-14 дней, а для рутинного окрашивания для изучения уровня хромосомных аберраций - 2-3 дня.
Окраска хромосомных препаратов раствором нитрата серебра -Ag-окрашивание
3
6
5
7
2
С целью выявления транскрипционно активных ЯОР хромосом используется метод, предложенный Howell W.M. [Howell W.M. Chromosome core structure revealed by silver staining. // Chromosome. - 1979. - Vol.73. - P.61-66]. На препараты метафазных хромосом наносят по 50 мкл бидистиллированной воды, 150 мкл 50% раствора нитрата серебра и 100 мкл 2% раствора желатина. Тщательно перемешивают и помещают в термостат на 8-10 мин при температуре 56,7 С°. После завершения окраски смывают раствор серебра под проточной водой и высушивают на воздухе. Препараты помещают в нагретый до 56,7 С° раствор 2 × SSC (0,03 М раствор NaCHO·5,5HO и 0,3 М раствор NaCl в соотношении 1:1) и выдерживают при 56,7 С° в течение 10 мин. Обезвоживают в 70% и 96% этиловом спитре. Препараты высушивают на воздухе и окрашивают раствором красителя Романовского-Гимзы (250 мкл красителя растворяют в 5 мл буферного раствора (хлорид натрия + цитрат натрия)).
Оценка хромосомных препаратов на количество активных ЯОР проводится следующим образом.
Количество активных ЯОР хромосом определяют с помощью светового микроскопа "Биолам" (увеличение окуляра 10, увеличение объектива 90). Сумма размеров 10 AgЯOP (ЯОР 10 акроцентрических хромосом) характеризует количество транскрипционно активных ЯОР в клетке и служит основой для сравнения индивидуальных геномов по этому признаку (Ag-полиморфизм).
Число окрашенных ЯОР подсчитывают в каждой анализируемой метафазной пластинке. Если данная акроцентрическая хромосома содержала в коротком плече зерна серебра, то такой ЯОР оценивается как транскрипционно активный, если он был неокрашен, то расценивался как неактивный.
Для исключения возможности недоокраски ЯОР серебром для анализа отбирают метафазные пластинки с полной (завершенной) окраской. На хромосомах, окрашенных серебром не полностью, в ЯОР появляется гомогенное, слабо окрашенное пятно вместо хорошо контурированных спутничных нитей, в то время как проксимальная часть короткого плеча и длинные плечи хромосом остаются неизменными. В полностью окрашенных серебром ЯОР таких слабо окрашенных пятен нет.
Для оценки окрашенных серебром хромосом всех просматриваемых метафазных пластинок используются следующие показатели: D ЯОР (ЯОР D-акроцентрических хромосом), G ЯОР (ЯОР G-акроцентрических хромосом), 10AgЯОР и D ЯОР/G ЯОР.
Оценка транскрипционной активности ЯОР акроцентрических хромосом проводится у каждого индивида три дня подряд по приведенным выше показателям в 100 метафазных пластинках с расчетом среднего арифметического каждого показателя. Нормативные показатели получали на группе здоровых лиц численностью не менее 20 человек с расчетом по каждому показателю среднего арифметического значения.
Для определения активности в целом ядрышкообразующих районов хромосом обследованных вычислялся индекс активности ЯОР хромосом по формуле
Вычисление на основе полученных результатов ИА ЯОРХ позволяет адекватно оценивать уровень образования белковой основы для рибосом у обследуемых. Так, при значении ИА ЯОРХ от 0,064 до 0,070 уровень активности ЯОР хромосом можно оценить как нормальный и не требующий никаких корректирующих вмешательств, при значении ИА ЯОРХ от 0,058 до 0,063 активность ЯОР хромосом повышена, а при ИА ЯОРХ от 0,071 до 0,075 - понижена и требует динамического наблюдения и коррекции образа жизни; при уровне ИА ЯОРХ от 0,057 и ниже активность ЯОР резко повышена, а при ИА ЯОРХ 0,076 и выше резко понижена, что угрожает по развитию различных заболеваний и требует безотлагательного назначения корректирующего лечения.
Внедрение данного способа упрощенной, но ранней оценки потенциала активности ЯОР хромосом у людей в практику лечебных учреждений, центров планирования семьи и медикогенетических консультаций, позволит решить ряд насущных социально-экономических проблем современности. Своевременное и адекватное назначение корректирующего подхода для нормализации отклонений ИА ЯОРХ в каждом конкретном случае способно оптимизировать генетические процессы и обеспечить получение более здорового потомства от женщин, собирающихся забеременеть.
Пример 1. Жительница г.Курска, 34 года, практически здорова, ведущая здоровый образ жизни, обследована во время профилактического осмотра по месту жительства. У больной была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой уровня D ЯОР=10,2 у.е., G ЯОР=8,3 у.е., 10AgЯОР=18,5 у.e., D ЯОР/G ЯОР=1,23 и расчетом общего потенциала активности ЯОР хромосом.
У больной было найдено нормативное значение ИА ЯОРХ=0,066 и даны рекомендации и дальше вести здоровый образ жизни.
Пример 2. Житель Курской области, 50 лет, страдающий артериальной гипертонией в течение 10 лет, обследован во время посещения участкового терапевта по месту жительства при обращении по поводу дестабилизации артериального давления. У больного была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой уровня D ЯОР=10,9 у.е., G ЯОР=9,1 у.е., 10АgЯОР=20,0 у.е., D ЯОР/G ЯОР=1,20 и расчетом ИА ЯОРХ=0,060, что говорило о повышенной активности ЯОР у обследуемого.
Больному была рекомендована диета с ограничением поваренной соли, нормализация периодов сна и бодрствования, избегание психоэмоциональных нагрузок и препарат амлодипин 10 мг 1 раз утром, что позволило нормализовать ИА ЯОРХ=0,067 через 3 месяца.
Пример 3. Жительница Курской области, 38 лет, страдающая хроническим гастритом в течение 7 лет, обследована во время профилактического осмотра в поликлинике по месту жительства. У больной была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой уровня D ЯОР=10,7 у.е., G ЯОР=7,9 у.е., 10АgЯОР=18,6 у.е., D ЯОР/G ЯОР=1,35 и расчетом ИА ЯОРХ=0,073, что говорило о понижении активности ЯОР у обследуемой.
Больной была рекомендована рациональная диета с ограничением острого, горячего и не прошедшего тщательную термическую обработку с дробным приемом пищи в течение суток не менее 5 раз, что позволило нормализовать ИА ЯОРХ=0,065 через 2 месяца.
Пример 4. Житель Курской области, 42 года, страдающий язвенной болезнью желудка в течение 6 лет, обследован во время профилактического осмотра по месту жительства. У больного была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой уровня D ЯОР=9,9 у.е., G ЯОР=7,4у.е., 10AgЯОР=17,3 у.e., D ЯОР/G ЯОР=1,34 и расчетом ИА ЯОРХ=0,077, что говорило о резком понижении активности ЯОР у обследуемого.
5
Больному была рекомендована диета, богатая витамином В, морепродуктами и прием антиоксиданта - токоферола ацетата 0,2 г по 1 капсуле 3 раз в день на 2 месяца, что позволило нормализовать ИА ЯОРХ=0,068 через 4 месяца.
Пример 5. Жительница г.Курска, 72 года, прооперирована 2 года назад по поводу рака прямой кишки III ст, обследована во время профилактического осмотра по месту жительства. У больной была взята кровь и исследована по изложенной выше схеме с оценкой уровня D ЯОР=8,8 у.е., G ЯОР=9,1 у.е., 10AgЯОР=17,9 у.e., D ЯОР/G ЯОР=0,97 и расчетом ИА ЯОРХ=0,054, указывающим на резкое повышение активности ЯОР.
Больной была рекомендована диета, богатая молочными продуктами. Через 2 месяца у больной нормализовался ИА ЯОРХ=0,065. Больной было предложено соблюдать в дальнейшем данные ей рекомендации.