КОМПЛЕКСНЫЙ ПРОБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
COMPOSITE PROBIOTIC PREPARATION AND METHOD FOR PREPARING IT

Изобретение относится к препаратам медицинского и ветеринарного назначения и способам их получения и может быть использовано в биотехнологии, медицине при создании лекарственных средств и биологически активных добавок (БАД), предназначенных для лечения и профилактики дисбактериозов и инфекционных заболеваний кишечника у детей и взрослых.
Дисбиотические нарушения в микрофлоре желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) в последние годы имеют все большее распространение среди населения во всем мире и в России в частности. Дисбактериоз провоцируется экологическими, психоэмоциональными, техногенными и др. факторами; возникает вследствие лекарственной терапии, в частности, антибиотикотерапии; а также поражает новорожденных и детей раннего возраста. Возникнув, это заболевание может явиться пусковым механизмом для расстройства обменных процессов, развития аллергических реакций и возникновения различных соматических нарушений здоровья [Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериозы кишечника у взрослых // Москва: КМК Scientific Press, 2003, 220 с.]. Одним из приемов коррекции микробной экологии человека и животных, нашедшим наибольшую практическую реализацию сегодня, является применение пробиотиков - живых микроорганизмов, которые при употреблении в адекватных количествах могут оказывать благотворное действие на здоровье пациентов [Бондаренко В.М., Грачева Н.М. Препараты пробиотики, пребиотики и синбиотики в терапии и профилактике кишечных дисбактериозов // Фарматека. 2003. №7. С.56-63]. Лечебно-профилактическая эффективность пробиотиков во многом зависит от полезных свойств входящих в их состав микроорганизмов, а также от их жизнеспособности в составе препаратов и после прохождения верхних отделов ЖКТ человека.
Для создания пробиотиков широко используются микроорганизмы естественной микрофлоры кишечника здорового человека: бифидобактерии (род Bifidobacterium) и лактобациллы (род Lactobacillus). При этом более предпочтительными являются многовидовые по составу пробиотики, поскольку в них суммированы полезные свойства, присущие отдельным штаммам. Кроме того, такие пробиотики способствуют избирательному заселению кишечника культурой того вида, который наиболее адекватен микробиоценозу конкретного индивидуума, следовательно, в них снижен риск несовместимости бактерий препарата с реципиентом.
Например, известны средства для коррекции микрофлоры человека, созданные на основе консорциумов бифидобактерий и лактобацилл (штаммы В.bifidum, В.longum, В.adolescentis, L.acidophilus, L.plantarum) [Алешкин В.А., Амерханова A.M. «Консорциум бифидобактерий и лактобацилл, используемый для приготовления бактериальных препаратов, заквасок для кисломолочных продуктов, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, биологически активных добавок, предназначенных для коррекции микрофлоры человека в возрасте от 12 лет и старше» // Патент РФ №2180914 (2001); МКП C12N 1/20, А61К 35/74, А23С 9/12]. Собственно пробиотическое средство представляет собой консорциум пробиотических микроорганизмов, лиофильно высушенный для получения бактерийного препарата или используемый в качестве закваски для приготовления кисломолочного продукта, жидкой биологически активной добавки к пище или ферментированного напитка (кваса). Недостатком указанного пробиотического средства является его невысокая биологическая активность, связанная с инактивацией микроорганизмов при пероральном приеме и прохождении их суспензий через верхние отделы ЖКТ (желудок, двенадцатиперстная кишка), а также невысокая стабильность его биологических свойств при получении соответствующих препаратов и при длительном хранении, что ведет к снижению эффективности лечебно-профилактических процедур.
7
Более устойчивыми к агрессивному воздействию среды верхних отделов ЖКТ являются препараты пробиотиков, где культуры лактобацилл и бифидобактерий помещены в кислотоустойчивую кишечнорастворимую капсулу, например, пробиотический препарат «Линекс» [Toma M.M., Pokrotnieks J. Probiotics as functional food: microbiological and medical aspects // Acta Universitatis Latviensis. 2006, V.710. Biology. P.117-129]. Этот препарат содержит порядка 1.2×10 клеток на капсулу, но в реальности еще ниже, т.к. часть бактерий погибает при вакуумном блистеровании. К недостаткам данного препарата также относится невысокое содержание полезных микроорганизмов и низкое видовое разнообразие входящих в его состав пробиотических бактерий (три вида: Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium mfantis, Enterococcus faeciuni). Лактоза, также присутствующая в капсулах препарата, может спровоцировать проявление симптомов непереносимости лактозы у лиц с лактазной недостаточностью.
Чтобы повысить стабильность пробиотиков в процессе хранения и во время нахождения в организме реципиента, наряду с компонентами среды культивирования, в соответствующие препараты часто добавляют олиго- и полисахариды, в основном, в качестве наполнителя. Так, известен пробиотический препарат «Стрептобифид» [Панин А.Н., Малик Е.В., Малик Н.И., Вершинина И.Ю. «Пробиотический препарат «Стрептобифид» для животных» // Пат. РФ №2086248 (2006) А61К 35/74, C12N 1/20, C12N 1/20, C12R 1/46], содержащий сухую бакмассу штаммов Bifidobacterium globosum ВГНКИ N БФ-4-ДЕП и Streptococcus faecium ВГНКИ N 27-/ПВ-ДЕП, а также окись алюминия, гидроокись алюминия, наполнитель, взятый в определенном количественном соотношении, и углеводы (сахарозу или лактозу). В качестве наполнителей используют муку, крахмал, сухую сыворотку молока, сухое молоко и заменитель цельного молока. Основным недостатком этого известного технического решения является слабая защита пробиотических лакто- и бифи-добактерий от инактивирующего действия желудочного сока и пищеварительных ферментов, поскольку указанные выше добавки и наполнители не предотвращают прямой контакт пробиотических микроорганизмов с такими инактиваторами при пероральном введении препарата в организм. Опасность присутствия лактозы в составе подобного пробиотического препарата в отношении лиц с лактазной недостаточностью уже отмечалась выше.
Наиболее близким к заявляемому техническим решением по составу является пробиотический препарат [Mulhbacher J., Mateescu M.A., Calinescu С.«Composition comprising polymeric material and uses thereof» // WO 2005074976 (2005); A61K 38/46], выбранный нами в качестве прототипа, представляющий собой композицию на основе пробиотических микроорганизмов и модифицированного кислотными группировками несшитого высокоамилозного (70 и более % амилозы) крахмала, в которой модифицированный крахмал, выбранный из группы карбоксилированный крахмал, сульфированный крахмал, фосфорилированный крахмал, служит носителем для доставки пробиотиков до мест их функциональной активности в организме человека - тонкой и толстой кишки, а в качестве микроорганизмов используются бактериальные культуры, относящиеся к родам Escherichia и Lactobacillus, причем для перорального применения заявлено использование композиции либо в форме капсул, либо таблеток, либо шариков, либо микросфер. Метод получения препарата-прототипа включает смешивание лиофилизованных клеток микроорганизмов с остальными компонентами композиции в определенном соотношении с последующим дозированием в пероральные формы, но конкретные примеры описывают только таблетирование прессованием.
Недостатками прототипа являются:
1. Высокий риск несовместимости с реципиентом из-за скудного видового состава пробиотической составляющей композиции - она представлена двумя видами: Lactobacillus rhamnosus и Escherichia coli.
2. Использованные в препарате штаммы L.rhamnosus и Е.coli не идентифицированы, тогда как для создания пробиотиков следует использовать полностью охарактеризованные (прежде всего с точки зрения безопасности) штаммы микроорганизмов или их консорциумы. В частности известно, что среди Е.coli широко представлены вирулентные штаммы, вызывающие желудочно-кишечные инфекции, воспаления мочеполовой системы, а также менингит у новорожденных [Kaper J.B., Nataro J.P., Mobley H.L. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2004. V.2. N.2. P.123-140].
3. Входящие в состав препарата-прототипа бактериальные культуры L.rhamnosus и Е.coli уступают по своей пробиотической активности многим известным культурам лак-тобацилл, бифидобактерий и энтерококков [Tannock G.W. (ed.) Probiotics: a critical review. Wymondham, UK: Horizon Scientific Press. 1999. 161 р.].
4. Созданные на основе бактерий L.rhamnosus и Е.coli пробиотики отличает ограниченность спектра действия, так как они направлены против относительно узкой группы возбудителей заболеваний.
5. Входящие в состав препарата-прототипа бактериальная культура Е.coli не имеет фермента NO-синтазы, продуцирующего важнейший метаболит - монооксид азота (NO), оказывающий регулирующее влияние на клетки и органы живых организмов [Ванин А.Ф. Динитрозильные комплексы железа и S-нитрозотиолы - две возможные формы стабилизации и транспорта монооксида азота в биосистемах // Биохимия, 1998, Т.63, №7, С.782-793], поэтому в случае приема препарата-прототипа при дисбактериозах организм пациентов не дополучает это вещество в необходимых количествах.
6. Используемые в прототипе модифицированные кислотными группировками крах-малы, хотя и способны выполнять функцию частичной защиты пробиотических микроорганизмов от инактивации в верхних отделах ЖКТ, во-первых, сами по себе дороги, поскольку синтезируются их природного крахмала его обработкой соответствующими реагентами с последующими очисткой и выделением конечного продукта; во-вторых, эта очистка должна гарантировать отсутствие в модифицированном крахмале примесей токсичных веществ, например, таких как монохлоруксусная, 1-хлорпропионовая, 2-хлорпропионовая и хлормасляная кислоты, хлористый тионил, хлорокись фосфора и др., используемых для карбоксилирования, сульфирования или фосфорилирования крахмалов, т.е. при реализации прототипа не исключаются примеси ядовитых компонентов; в третьих, собственно модифицированные кислотными группировками крахмалы при их расщеплении под действием амилолитических ферментов в нижних отделах ЖКТ распадаются на кислотные фрагменты, способные (особенно сульфо- и фосфо-производные) сдвигать значение рН среды в кислую область, тем самым создавая опасность эрозии слизистой кишечника, что наиболее опасно для пациентов с патологиями пищеварительной системы.
2
7. Способ получения препарата-прототипа также имеет ряд недостатков, в частности, при таблетировании лиофильно сухих бактерий совместно с модифицированным кислотными группировками крахмалом используется высокое давление (до 3 тонн на см), что обычно приводит к существенной потере жизнеспособности микроорганизмов, вызываемой как разрушающим действием самого высокого давления на клеточные мембраны, так и локальным разогревом смеси под действием компрессионных и сдвиговых усилий в объеме под плунжером таблетирующего механизма.
8. Согласно примерам прототипа, получаемые таким методом таблетки набухают без разрушения (в противовес таблеткам на основе нативного крахмала) в условиях верхних отделов ЖКТ, а солюбилизируются уже в условиях кишечника, где и происходит высвобождение клеток. Однако такое набухание в кислых средах делает возможным диффузию кислоты в таблетки и ее инактивирующее воздействие на пробиотические микроорганизмы. Иными словами, известное техническое решение лишь частично защищает клетки от неблагоприятных факторов верхних отделов пищеварительной системы пациентов.
Задачей предлагаемого изобретения является создание более эффективного и стабильного по сравнению с аналогами и прототипом препарата-пробиотика для профилактики и лечения дисбактериозов кишечника и кишечных инфекций, а также повышение способности препарата к продуцированию монооксида азота по NO-синтазному механизму.
8
12
Указанная задача решается тем, что в заявляемом техническом решении комплексный противобиотический препарат представляет собой клетки пробиотических лакто- или бифидобактерий, или их смеси, и полимерную добавку, помещенные в кишечнорастворимую капсулу; при этом клетки пробиотических лакто- и бифидобактерий принадлежат к видам Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus acidophilus, Lactoba-cillus casei, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum, а полимерная добавка, выполняющая функцию связующего и являющаяся полисахаридом, выбрана из группы: амило-пектин, крахмал восковидной кукурузы, нативный картофельный крахмал, растворимый картофельный крахмал, пшеничный крахмал, мальтодекстрин, их смеси, причем указанные компоненты входят в состав комплексного препарата в соотношении, равном 10-10 клеток пробиотических лакто- и бифидобактерий на 0,01-1 г полимерной добавки. Способ получения заявляемого комплексного пробиотического препарата заключается в том, что клетки пробиотических лакто- или бифидобактерий, или их смеси суспендируют в водном растворе полимерной добавки, затем приготовленную суспензию замораживают при температуре от -10 до -196°С в течение 0,1-6 ч и высушивают лиофильно, после чего полученную сухую субстанцию помещают в кишечнорастворимую капсулу.
Выбор параметров предлагаемого технического решения обусловлен следующими моментами:
1. Клетки пробиотических лакто- или бифидобактерий, или их смеси, входящие в состав препарата, помещены в полимерное связующее полисахаридной природы, что достигается лиофилизацией суспензии микроорганизмов в водного растворе этого связующего, в результате чего каждая клетка оказывается окруженной сухой полимерной оболочкой (Фиг.1), которая, с одной стороны, защищает микроорганизмы от ферментов ЖКТ, а с другой стороны, служит для клеток питательным субстратом после солюбилизации кишечнорастворимой капсулы, являющейся, в свою очередь, защитой пробиотических бактерий от инактивации желудочным соком.
8
12
8
12
12
8
2. Заявляемое в предлагаемом техническом решении соотношение пробиотических лакто- и бифидобактерий к полимерному связующему полисахаридной природы, равное 10-10 клеток на 0,01-1 г связующего, выбрано на основании экспериментов. В частности, при меньшем, чем 10 количестве микроорганизмов биологическая активность препарата находится на уровне, не обеспечивающем необходимый физиологический эффект, а большее, чем 10 количество клеток, приводит к существенному удорожанию технологии изготовления препарата, не влияя при этом на его лечебную эффективность. В свою очередь, содержание полимерного связующего в заявляемом препарате обусловлено как природой используемого полисахарида, так и необходимостью формирования защитного слоя вокруг клеток. Опыт показал, что меньше, чем 0,01 г связующего (т.е. минимум заявляемого диапазона) на 10 клеток (максимум заявляемого диапазона) является недостаточным для формирования эффективно работающего защитного слоя. Если же в состав препарата вводится более 1 г полимерного связующего (максимум заявляемого диапазона) на 10 клеток (минимум заявляемого диапазона), то эффективность препарата снижается из-за недостаточной удельной концентрации в нем пробиотических микроорганизмов.
3. Использование в предлагаемом техническом решении пробиотических лакто- и бифидобактерий видов Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus aci-dophilus, Lactobacillus casei, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium longum обусловлено тем, что данные микроорганизмы, являясь представителями резидентной нормофлоры, обладают доказанным противоинфекционным действием, а также стимулируют иммуно-логическую реактивность и толерантность организма. Кроме того, бактерии L.plantarum и L.fermentum, благодаря их способности продуцировать монооксид азота [Яруллина Д.Р., Ильинская О.Н., Аганов А.В., Силкин Н.И., Зверев Д.Г. Альтернативные пути образования оксида азота у лактобацилл: обнаружение возможной NO-синтазной активности методом ЭПР // Микробиология. 2006. Т.75. №6. С.731-736; Morita H., Yoshikawa H., Sacata R., Nagata Y., Tanaka H. Synthesis of nitric oxide from the two equivalent guanidine nitrogens of L-arginine by Lactobacillus fermentum II J. Bacteriol. 1997. V.179. N.24. P.7812-7815], могут оказывать положительное влияние на процессы пищеварительной системы, регулируемые NO, а именно: регуляцию сосудистого тонуса, передачу нервных импульсов и моторную функцию ЖКТ.
4. Выбор в качестве полимерной добавки, выполняющей функцию связующего, таких веществ полисахаридной природы, как амилопектин, крахмал восковидной кукурузы, картофельный крахмал, растворимый картофельный крахмал, пшеничный крахмал, маль-тодекстрин, и их смеси, обусловлен, во-первых, их биосовместимостью и нетоксичностью, во-вторых, невысокой стоимостью и доступностью, в-третьих, простотой приготовления растворов для диспергирования микроорганизмов при получении целевого продукта изобретения - нового пробиотического препарата. Кроме того, что уже отмечалось выше, перечисленные полисахариды служат питательным субстратом для включаемых в матрицу полимерного связующего клеток, что обеспечивает их высокую жизнеспособность и, как следствие, хорошую NO-синтазную активность.
5. Параметры способа получения заявляемого пробиотического препарата также найдены экспериментально. В частности, при температуре выше -10°С суспензии клеток в водном растворе заявляемого полимерного связующего часто из-за эффектов переохлаждения просто не замерзают, что не дает возможности высушить затем систему лиофильно, а использование температур замораживания ниже -196°С нецелесообразно по экономическим соображениям из-за высокой стоимости сверхглубокого холода. Время замораживания определяется сочетанием объема замораживаемой системы и температурным режимом процесса. Использование кишечнорастворимой капсулы, устойчивой в кислой среде желудка, связано с необходимостью дополнительной защиты пробиотических бактерий от инактивации в этом отделе ЖКТ организмов пациентов.
Заявляемый комплексный пробиотический препарат, его качественный и количественный состав, а также совокупность операций при его получении, не известны из уровня техники, поэтому заявляемое техническое решение отвечает критерию новизны, поскольку оказалось, что именно сочетание заявляемых признаков, а именно, высокое содержание обладающих доказанной пробиотической активностью бифидобактерий и NO-продуцирующих лактобацилл и их включение в матрицу полимерного связующего полисахаридной природы, позволяет не только повысить стабильность биологического действующего начала (т.е. пробиотических микроорганизмов), но и существенно усилить способность пробиотического препарата к продуцированию монооксида азота по NO-синтазному механизму, что не свойственно ни для аналогов, ни для прототипа.
Сущность предлагаемого технического решения иллюстрируется типичным примером, поясняющим изобретение, но не ограничивающего его объем; остальные примеры, отвечающие диапазонам заявляемых параметров, суммированы в таблице, а достигаемый в этих случаях положительный эффект (уровень сохранения жизнеспособности свободных клеток пробиотических микроорганизмов и тех же культур в составе заявляемого препарата in vitro и in vivo) суммирован в виде диаграмм на Фиг.5.
Приводимые ниже графики, диаграммы и микрофотографии содержат следующую информацию:
Фиг.1. Микрофотографии (сканирующая электронная микроскопия) клеток Lacto-bacillus plantarum 8P-A3, смешанных с водным раствором мальтодекстрина и лиофильно высушенных в нем (а) и помещенных в изотонический раствор NaCl (б). Изображения получены с помощью сканирующего электронного микроскопа Carl Zeiss Evo-40 при увеличении 20000-25000 раз.
Фиг.2. Содержание микроорганизмов (а), в том числе лактобацилл (б) и бактерий семейства Enterobacteriaceae (в), в фекалиях кроликов во время (1-5 день) и после (9-18 день) приема пробиотического препарата по примеру №1 в таблице примеров. Микрофлора фекалий контрольных кроликов, не получавших препарат, показана светлыми столбцами на рис.а, б и на рис.г. На рис.в, г: темные столбцы - кислотообразующие бактерии, заштрихованные - бактерии, не ферментирующие лактозу и (или) сахарозу.
11
11
Фиг.3. Жизнеспособность бактерий Lactobacillus plantarum 8P-A3, включенных в полисахаридное связующее на основе растворимого картофельного крахмала в соотношении 10 клеток на 2,5 г связующего - №1 в таблице примеров (а); на основе мальтодекстрина при соотношении 10 клеток на 5 г связующего - №2 в таблице примеров (б) и свободных клеток (в). Жизнеспособность бактерий определяли с помощью окрашивания LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit.
Фиг.4. Биосинтез монооксида азота в клетках Lactobacillus plantarum 8P-A3 в составе пробиотических препаратов по примерам №1 и №2 (таблица примеров), а также в свободных клетках (Контроль). NO определяли флуоресцентным методом с помощью DAF-FM DA (а, б) и DAA (в, г).
Фиг.5. Содержание жизнеспособных клеток в одной капсуле пробиотического препарата после in vitro воздействия физиологической концентрации желчных солей 0,5% (а) и значений рН 3,0 в желудке (б) для №№1-24 таблицы примеров (серые столбцы) и для свободных клеток (черные столбцы). Жизнеспособность бактерий определяли с помощью окрашивания LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit.
Пример 1. Пробиотический препарат на основе бактерий Lactobacillus plantarum 8Р-А3 и растворимого картофельного крахмала
а) Бактериальный компонент препарата.
10
Бактерии Lactobacillus plantarum 8P-A3 выращивают 24 ч при 37°С на среде DeMan-Rogosa-Sharpe (MRS) производства Merck (Германия) с добавлением 100 мкМ L-аргинина, трижды отмывают от среды центрифугированием с изотоническим раствором NaCl и ресуспендируют в нем до плотности 10 кл./мл.
б) Полисахаридный компонент препарата.
Растворимый картофельный крахмал производства НИИ Крахмалопродуктов (Москва) в количестве 2,5 г суспендируют в 90 мл воды и нагревают на водяной бане при перемешивании до получения однородного раствора, который затем охлаждают до комнатной температуры.
в) Получение сухой субстанции.
Суспензию клеток лактобактерий L.plantarum смешивают с раствором полисахаридного компонента при объемном соотношении 1:9, полученную смесь разливают в плоские поддоны, замораживают при -18°С в течение 6 ч и высушивают лиофильно.
г) Приготовление конечного пробиотического препарата.
9
Сухую субстанцию, содержащую клетки и полимерное связующее в соотношении 10 клеток на 0,25 г полисахарида, порциями по 0,04 г фасуют в кишечнорастворимые капсулы, которые укупоривают и хранят при 4-6°С.
д) Биологическое тестирование.
9
В ходе биологического тестирования проводят оценку влияния полученного пробиотического препарата на микрофлору ЖКТ кроликов путем анализа эффектов приема препарата в отношении количественного и качественного состава микрофлоры фекалий подопытных животных во время (5 дней) и по окончании приема препарата (через 9, 12, 15 и 18 дней после начала приема). В экспериментах используют кроликов возрастом 1 месяц. Животных содержат в идентичных условиях. Животным опытной группы препарат вводят один раз в день в течение 5 дней перорально в дозах, эквивалентных при пересчете по поверхности тела терапевтической дозе для человека, а именно 2×10 клеток L.plantarum на животное. Кролики контрольной группы получают плацебо. Болюсы кроликов собирают и хранят при -18°С не более 24 ч. Для анализа взвешенные образцы болюсов (0.5 г) гомогенизируют в стерильной водопроводной воде и готовят серию последовательных разведении в ней же. Из соответствующего разведения делают высевы на чашках Петри с агаризованными питательными средами: MRS (для лактобацилл), средой Левина (для выделения, подсчета и дифференциации микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae) и средой для определения общего микробного числа следующего состава: питательный бульон - 15 г/л; глюкоза - 5 г/л; пептон - 10 г/л; дрожжевой экстракт - 5 г/л; агар - 20 г/л. Чашки Петри инкубируют при 37°С в течение 48 ч, после чего их анализируют присутствие колоний, их число и внешний вид.
6
По данным анализа микробной обсемененности фекалий кроликов, прием препарата оказывает положительный эффект на микрофлору ЖКТ (Фиг.2). Во время приема препарата и в течение двух недель после окончания курса лечения в фекалиях кроликов содержание лактобацилл составляет 3-6×10 кл./г (Фиг.2б). Поскольку обнаружение перорально принятых пробиотических бактерий в образцах фекалий рассматривают как показатель их выживания [Ahrne S., Johansson M.L., Molin G. Intestinal passage of Lactobacillus rhamnosus DSM6594 after oral administration in fermented milk // Netherlands Milkland Dairy Journal. 1995. V.49. P.201-206], регистрируемое высокое содержание лактобацилл свидетельствует о том, что ацидорезистентная капсула и полисахаридное связующее обеспечивают надежную защиту клеток во время хранения и при прохождении верхних отделов ЖКТ, а также способствуют высокой жизнеспособности бактерий препарата в нижних отделах ЖКТ. Тестируемый пробиотический препарат не оказывает существенного влияния на общую обсемененность фекалий (Фиг.2а), однако доказано возрастание в ней доли лактобацилл (Фиг.2б) и сахаролитических энтеробактерий (Фиг.2в, г), что свидетельствует о благотворном эффекте препарата на микрофлору кишечника. При наблюдении за животными в течение и после курса введения препарата не обнаруживается отклонений в их внешнем виде, состоянии шерстного покрова, характере выделений, поведенческих реакциях и в динамике прибавки массы тела у самок и самцов. Также не наблюдаются побочные эффекты и осложнения.
е) Сохранение жизнеспособности микробной составляющей пробиотического препарата при длительном хранении.
Полученный согласно пункту «г» пробиотический препарат хранят в сухом темном месте при 4-6°С. На протяжении 6 месяцев ежемесячно проводят оценку жизнеспособности бактерий препарата методом чашечного подсчета и дифференциального флуоресцентного окрашивания реактивом LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Molecular Probes, Invitrogen).
Проведенный анализ показывает, что жизнеспособность лактобацилл в составе пробиотического препарата не изменяется в течение всего времени хранения, причем доля мертвых клеток, проницаемых для йодида пропидия, сохраняется на низком уровне - менее 1% от общего числа бактерий (Фиг.3).
ж) Продукция монооксида азота (NO) бактериями пробиотического препарата
Для полученного согласно пункту «г» пробиотического препарата продукцию NO определяют с помощью NO-чувствительных флуоресцентных индикаторов: сульфата 1,2-диаминоантрахипона (DAA) (Molecular Probes, Invitrogen) и диацетильного производного 4-амино-5-метиламино-2',7'-дифторфлуоресцеина (DAF-FM DA) (Molecular Probes, Invitrogen) в концентрациях 10 мкМ и 50 мкг/мл соответственно. Образцы микроскопируют под флуоресцентным микроскопом Leica DM 6000B (Германия); полученные изображения флуоресцентного сигнала анализируют с помощью компьютерной программы Leica FW4000.
Уровень внутриклеточного NO, измеренный с помощью DAF-FM DA (Фиг.4а, б), и общее содержание монооксида азота в пробах, регистрируемое с помощью DAA (Фиг.4в, г), в клетках пробиотического препарата не отличаются, как показывают измерения, от таковых в контрольных интактных лактобациллах (Фиг.4а, в). Следовательно, бактерии заявляемого пробиотического препарата способны продуцировать NO, что может успешно использоваться как дополнительный фактор активности лактобацилл в пробиотикотерапии.
Таким образом, предлагаемое техническое решение, т.е. новый комплексный пробиотический препарат и способ его получения, имеют следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:
1. Заявляемый пробиотический препарат превосходит аналоги и прототип по спектру входящих в его состав лакто- и бифидобактерий с доказанной пробиотической активностью, т.е. он содержит пробиотические штаммы лакто- и бифидобактерий, обладающие благотворным действием на организм человека.
8
12
2. Заявляемый препарат имеет более высокий, чем в аналогах и прототипе, титр пробиотических бактерий - 10-10 клеток в одной дозе (таблица).
3. Заявляемый пробиотический препарат является эндогенным донором физиологических концентраций монооксида азота (NO) - универсального регулятора клеточного и тканевого метаболизма. Кроме того, состав питательной среды, на которой выращиваются бактерии, положительно влияет на их пробиотические свойства, а именно, способствует продукции монооксида азота [Яруллина Д.Р., Ильинская О.Н. Детекция NO-синтазной активности лактобацилл методом флуоресцентного окрашивания // Микробиология. 2007. Т.76, №4. С.570-572]. Следовательно, новый пробиотический препарат, наряду с традиционными полезными качествами, демонстрирует свойства высокоэффективного эндогенного донора физиологических концентраций NO.
4. Микробная биомасса включена в пространственную структуру полимерного связующего полисахаридной природы, что обеспечивает клеткам дополнительную защиту от инактивирующих факторов внешней среды (что видно из диаграмм Фиг.5) и, вместе с тем, само связующее в кишечнике служит питательным субстратом для пробиотических бактерий заявляемого препарата.
5. Предлагаемый пробиотический препарат обладает пролонгированным действием на всем протяжении кишечника за счет постепенного высвобождения бактерий из полимерного связующего полисахаридной природы по мере деградации последнего.
6. Поскольку в качестве полимерного связующего используются различные крахмалы (в частности, крахмал восковидной кукурузы, нативный картофельный крахмал, растворимый картофельный крахмал, пшеничный крахмал, их смеси) или составляющие крахмал полисахариды (например, амилопектин, мальтодекстрин, их смеси), то, в противовес препарату-прототипу, содержащему клетки в смеси с модифицированными кислотными группировками крахмалами, которые при расщеплении под действием амилолитических ферментов распадаются на кислотные фрагменты, способные (особенно сульфо- и фосфопроизводные) сдвигать значение рН среды в кислую область, тем самым создавая опасность эрозии слизистой кишечника, что наиболее опасно для пациентов с патологиями пищеварения, полимерные связующее заявляемого препарата исключает такую опасность полностью, поскольку под действием амилаз крахмалы и его полисахариды распадаются до простых нейтральных сахаров, потребляемых кишечной микрофлорой.
7. Кроме того, в полимерном связующем заявляемого технического решения вообще отсутствуют возможные примеси токсичных реагентов, используемых в прототипе для химической модификации крахмалов.
8. Способ получения заявляемого пробиотического препарата по сравнению со способом-прототипом является более щадящим по отношению к пробиотическим микроорганизмам, входящим в состав препарата, поскольку, во-первых, предусматривает лиофилизацию суспензии клеток в присутствии защищающего гидроколлойда, роль которого выполняет водный раствор полимерного связующего полисахаридной природы, и, во-вторых, исключает воздействие на клетки высоких давлений.
9. Использование устойчивой к действию желудочного сока кишечнорастворимой капсулы обеспечивает бактериям заявляемого пробиотического препарата сохранение жизнеспособности при прохождении через верхние отделы ЖКТ, тогда как в случае прототипа, несмотря на присутствие в препарате вместе с клетками еще полимерных компонентов, желудочный сок может оказывать инактивирующее воздействие на клетки по мере частичного набухания модифицированного кислотными группировками крахмала.