Влияние производных дифенилмочевины на введение в культуру in vitro ягодных растений

References

1. Atlas sovremennyh i prognoznyh aspektov posledstvij avarii na Chernobyl'skoj AJeS na postradavshih territorijah Rossii i Belarusi (ASPA Rossija-Belarus') /Pod red. Ju.A. Izrajelja i I.M. Bogdevicha. - Moskva-Minsk: Fond «Ionosfera» -NIA-Priroda, 2009. - 139 s.

2. Shubina O.A. Kratkij obzor rezul'tatov pasportizacii sel'skohozjajstvennyh predprijatij na territorijah brjanskoj oblasti, postradavshih posle avarii na ChAJeS / O.A. Shubina, I.E. Titov, V.V. Krechetnikov, E.I. Karpenko//Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. - 2015. - № 11-3 (42). - S. 99-103.

3. Rekomendacii po vedeniju sel'skohozjajstvennogo proizvodstva v uslovijah radioaktivnogo zagrjaznenija zemel' Respubliki Belarus' na 2012-2016 gody /Pod redakciej V. V. Rzheuckoj. - Minsk, 2012. -124 s.

4. Chernobyl': 25 let spustja/Pod obshhej redakciej S.K. Shojgu. - M., 2011 - 354 s.

5. Prudnikov P.V. Ispol'zovanie agronomicheskih rud i novyh kompleksnyh mineral'nyh udobrenij na radi-oaktivno zagrjaznennyhpochvah. - Brjansk: Izd-vo GUP «Klincovskaja gorodskaja tipografija», 2012. - 296 c.

6. Sanzharova N.I. Rol' himii v reabilitacii sel'skohozjajstvennyh ugodij, podvergshihsja radioaktivnomu zagrjazneniju / N.I. Sanzharova, A.A. Sysoev, N.N. Isamov, R.M. Aleksahin, V.K. Kuznecov, T.L. Zhigareva // Rossijskij himicheskij zhurnal. — 2005. - T. XLIX. - S. 26-29.

УДК 634.7:581.192.7

ВЛИЯНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ДИФЕНИЛМОЧЕВИНЫ НА ВВЕДЕНИЕ В КУЛЬТУРУ

IN VITRO ЯГОДНЫХ РАСТЕНИЙ

Influence of Diphenyl-urea Derivatives on Small Fruit Introduction in Culture in vitro

Милехина H.B., кандидат с.-х. наук, доцент, milekhina_74@mail.ru, Сковородников Д.Н. кандидат с.-х. наук, доцент skovorodnikov_d@mail.ru Milekhina N.V., Skovorodnikov D.N.

ФГБОУ ВО «Брянский государственный аграрный университет» 243345 Брянская область, Выгоничский район, с. Кокино, ул. Советская, 2а Bryansk State Agrarian University

Реферат. Работа проводилась в научно-образовательном центре биотехнологии Брянского ГАУ в 2015-2016 г.г. Объектом исследования являлись 2 сорта смородины чёрной (Исток и Дебрянск) [1, с. 154], 2 сорта крыжовника (Северный Капитан и Русский) и один сорт жимолости (Берель). В статье представлены результаты исследования по оптимизации условий введения в культуру in vitro перспективных сортов смородины чёрной, крыжовника и жимолости. Цель исследований оценить долю контаминированных эксплантов ягодных культур при их изолировании в весенний период, подобрать оптимальные источники цитокининов для стимуляции регенерации побегов из первичных эксплантов. Исследования показали, что на этапе введения в культуру in vitro ягодных культур для индукции образования побегов следует использовать регуляторы роста ряда дифенилмочевины тиди-азурон (TDZ) в концентрации 0,1 мг/л и CPPU в концентрации 0,2 мг/л, производные дифенилмочевины можно применять на почках дифференцированных по цветочному типу; реакция испытанных сортов ягодных растений в значительной степени зависит от генотипа.

Summary. The research was carried out in the scientific-educational centre of biotechnology of the Bryansk GAU. The research objects were 2 cultivars of the black currant (Istok and Debrjansk), 2 cultivars of the gooseberry (Northern Captain and Russian) and one cultivar of the honeysuckle (Berel). The research results on optimisation of the introduction conditions of the perspective cultivars of black currant, gooseberry and a honeysuckle in culture in vitro are presented in the article. The objective of the researches was to estimate a share contaminated explants of berry plants at their isolation during the spring period, and to select optimum sources of cytokinins for stimulation of shoot regeneration of the primary explants. The researches have shown that it is necessary to use plant growth regulators of the diphenylurea tidiazuron group (TDZ) with the concentration of 0.1 mg/l and CPPU with the concentration of 0.2 mg/l at the stage of berry plant introduction in culture in vitro for an induction of shoot formation. The derivatives of diphenyl-urea can be applied to the buds differentiated on the flower type. The reaction of the tested cultivars of berry plants substantially depended on a genotype.

Keywords: clonal micropropagation, culture in vitro, explant, plant growth regulators, diphenylurea derivatives, small fruit, black current, gooseberry, honeysuckle.

Введение. Новые возможности для решения проблемы получения экологически чистой сельскохозяйственной продукции открывают современные методы биотехнологии растений. Их применение, наряду с традиционными методами селекции, позволяет значительно ускорить процесс получения ценных форм растений с хорошими вкусовыми и товарными качествами плодов, высоким адаптивным потенциалом, пригодных для интенсивных технологий возделывания [2, с. 69]. Одним из критических этапов клонального микроразмножения является введение растений в культуру in vitro. В связи с трудностью стерилизации первичных эксплантов, а также отсутствием надежных приемов культивирования, становится невозможным дальнейшее ускоренное размножение растений с использованием культуры тканей. Вопрос об управлении морфогенетическим потенциалом in vitro остается актуальным в связи с все более активным применением методов культуры тканей растений для решения как задач практической селекции и питомниководства, так и фундаментальных проблем биологии растений. Клональное микроразмножение и оздоровление растений в культуре изолированных тканей является наиболее хорошо разработанным и широко применяемым как в нашей стране, так и за рубежом методом прикладной биотехнологии.

Материалы и методы. Эффективность введения в культуру зависит от многих факторов, наиболее важные из которых: тип стерилизующего вещества и время обработки; видовые и сортовые особенности растения; тип используемого экспланта; возраст и качество растительного материала; сезон проведения работ [3, с. 137-149].

Выбор типа экспланта и определение оптимальных календарных сроков введения определяются спецификой развития растений, включенных в исследования. В качестве начальных эксплантов при клональном микроразмножении ягодных и плодовых культур обычно используют одноглазковые черенки и меристематические участки апикальных и латеральных почек. Наиболее удобны для работы экспланты размером от 0,2 до 2 см.

Как показывает опыт, для древесных плодовых культур оптимальным сроком эксплантирова-ния является период выхода растений из состояния покоя (февраль, апрель). Плодовые растения лучше вводить в культуру проросшими латеральными и апикальными почками, очищенными от покровных чешуй. Ягодные лучше приживаются, когда в качестве эксплантов используют узлы побегов текущего года в фазе активного роста (май-август).

Нарезку черенков осуществляли осенью. Заготовленный материал хранили в полиэтиленовых пакетах для предотвращения его подсыхания в бытовом холодильнике при температуре 4°С.

В настоящее время разработаны и активно используется множество схем стерилизации растительной ткани, применяют более или менее жесткую схему стерилизации.

Нарезанные черенки стерилизовали в 0,1% растворе мертиолята (орто-этилртутьтиосалицилат натрия и 0,3% SDS (додецилсульфат натрия) в качестве поверхностно-активного вещества в течение 3 минут на шейкере, с последующей пятикратной промывкой в стерильной дистиллированной воде.

После стерилизации черенки обсушивали на стерильных кружках фильтровальной бумаги в ламинарном шкафу.

Изолирование проводили в условиях ламинарного шкафа ЛШ-2. В качестве источников эксплантов испытывали целые почки (5-8 мм) и цветочные зачатки (3-5 мм) без нескольких кроющих чешуй, которые отсекались от черенка с помощью глазного скальпеля.

Культивирование эксплантов осуществляли на питательной среде Мурасиге-Скуга в пробирках Флоринского с добавлением в качестве источников цитокинина 0,5 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП), 0,2 мг/л CPPU и 0,1 мг/л тидиазурона (TDZ).

Культивировали стерильные экспланты в люминостатной комнате при 16-часовом световом дне с освещенностью 2000-2500 люкс при температуре 25-270С и влажности воздуха 50-60%.

Пробирки, для сохранения стерильности и уменьшения испарения воды из питательной среды, закрывали пищевой пленкой в два слоя.

Через 1-2 месяца культивирования учитывали следующие показатели: частота контаминации -доля культуральных сосудов с микробиологическим зарастанием, %; частота приживаемости эксплантов - доля погибших эксплантов без учета инфицированных, %; высота регенерантов - высота почек или стеблей образовавшихся в течение учетного периода, мм; количество образовавшихся регенерантов на эксплант, шт.; число почек и стеблей, образовавшихся в течение учетного периода.

Начальным этапом клонального микроразмножения растений является введение в культуру in vitro. Главным условием его осуществления является получение новообразовавшихся вегетативных структур способных к дальнейшему размножению и свободных от заражения сапрофитной микрофлорой.

В качестве первичных эксплантов чаще всего используют апикальные и пазушные почки, которые имеют ряд преимуществ перед другими органами растений - легко поддаются стерилизации,

имеют активно пролиферирующие образовательные ткани (меристемы).

Результаты и их обсуждение. Введение в культуру трех видов ягодных культур осуществлялось в конце апреля. В зависимости от биологии исследуемых растений пазушные почки находились на разных этапах развития. Так к этому периоду большая часть черенков смородины и крыжовника имела распустившиеся почки, тогда как у жимолости ростовых процессов еще не было отмечено. Данные биологические особенности в первую очередь повлияли на показатель контаминации первичных эксплантов при введении в культуру in vitro.

Так наибольшая частота контаминации наблюдалась у эксплантов черной смородины сорта Исток (81,8%), а наименьшая у эксплантов жимолости сорта Берель (22,0%). У крыжовника отмечалась средняя частота контаминации (сорт Северный капитан (58,0%) и сорт Русский (56,3%)) (табл. 1).

Таблица 1 - Показатели контаминации при введении в культуру in vitro смородины чёрной, крыжовника и жимолости

Сорт *Количество изолиро- Количество инфициро- Частота контаминации, %

ванных эксплантов, шт. ванных эксплантов, шт.

Смородина черная

Дебрянск 50 14 28,0 ± 14,8

Исток 33 27 81,8 ± 9,1

Крыжовник

Северный капитан 100 58 58,0 ± 14,7

Русский 80 45 56,3 ± 16,0

Жимолость

Берель 50 11 22,0 ± 17,8

*Примечание - количество изолированных эксплантов без учета контаминированных

Таким образом, введение в культуру in vitro сортов смородины чёрной и крыжовника следует осуществлять в более ранние периоды, когда почки еще не распустились (в марте). Изолирование эксплантов в этот период должно существенно снизить показатели контаминации исходной культуры.

Мы считаем, что показатель контаминации зависит, не только от особенностей исходного материла, но и, в определенной степени, от мастерства исследователя, который осуществляет удаление кроющих чешуй и вычленение меристематических верхушек почек исследуемых растений. Кроме того, следует учитывать, что на чистоту получаемой культуры оказывает влияние загрязненность почек, особенно тех, которые находятся у основания побегов, а также их механическое повреждение.

При изолировании эксплантов растений также следует учитывать их размер. Установлено, что предпочтение должно отдаваться крупным инициальным структурам, которые имеют лучшие показатели приживаемости и быстрее регенерируют дополнительные почки и побеги, в сравнении с мелкими эксплантами.

Свободные от контаминации экспланты смородины черной (рис. 1) обладали высокой приживаемостью (100%), что говорит о правильном выборе питательной среды на первом этапе.

По таким показателям как высота растений и количество образовавшихся почек на эксплант два испытанных сорта смородины существенно не отличались (табл. 2).

Рисунок 1 - Образование побегов из первичных эксплантов смородины

Сорт Количество изолированных эксплантов, шт. Приживаемость эксплантов, % Высота растений, мм Количество почек на эксплантах, шт

Дебрянск 36 100 8,8 ± 1,7 2,0 ± 0,7

Исток 6 100 6,3 ± 0,8 2,9 ± 1,8

При использовании в качестве первичных эксплантов цветочных зачатков наблюдалось их распускание, увеличение в размере и даже образование адвентивных почек.

При оценке влияния трех цитокининов на введение крыжовника в культуру in vitro (рис. 2) было установлено, что более высокой приживаемостью отличались экспланты, культивируемые на питательной среде в присутствии производных дифенилмочевины (CPPU и TDZ) (табл. 3).

Рисунок 2 - Образование побегов из первичных эксплантов крыжовника

По высоте полученных растений была отмечена следующая закономерность: более мелкие побеги формировались в присутствии TDZ и CPPU. Тогда как эти же препараты вызывали более интенсивную закладку дополнительных почек.

При анализе имеющейся литературы, мы пришли к выводу, что при культивировании всех изучаемых культур в данной работе в качестве источника цитокинина использовался 6-БАП в низких концентрациях [4, с. 3-8; 5, с. 163-168]. Тогда как сведений об использовании производных дифенилмочевины отсутствуют. Эффективное влияние этих веществ продемонстрировано в нашей лаборатории на ремонтантных формах малины [6, с. 131].

Анализируя полученные результаты по введению в культуру in vitro жимолости можно отметить, что по таким показателям как приживаемость и высота растений, сохраняется такая же закономерность, как и на сортах крыжовника (табл. 3).

Таблица 3 жимолости

Влияние различных цитокининов на введение в культуру in vitro крыжовника и

Вариант * Количество изоированных, шт. Приживаемость, % Высота растений, мм Количество почек на эксплантах, шт

Северный капитан

BAP (0.5) 10 90 11,3 ± 1,5 6,3 ± 2,2

CPPU (0.2) 18 94,5 10,2 ± 2,0 10,2 ± 4,4

TDZ (0.1) 14 100 9,4 ± 3,5 4,75 ± 3,8

Русский

BAP (0.5) 10 85 8,4±2,4 3,5±1,8

CPPU (0.2) 11 95 7,1± 2,3 4,0± 2,2

TDZ (0.1) 13 100 6,0± 3,1 2,4± 1,5

Берель

BAP (0.5) 8 22 30,0±5,4 6,3±2,4

CPPU (0.2) 16 100 9,5 ± 3,5 1,9 ± 1,0

TDZ (0.1) 15 96 6,7±2,8 2,1±0,8

"Примечание - количество изолированных эксплантов без учета контаминированных

Более крупные побеги образовывались на питательной среде в присутствии 6-БАП (рис. 3). Тогда как по приживаемости изолированных почек этот вариант уступал CPPU и TDZ.

Рисунок 3 - Побеги жимолости в культуре in vitro

При сравнительной оценке полученных результатов по влиянию трех цитокининов на введение в культуру in vitro жимолости было четко выявлено положительное воздействие цитокинина (BAP) на высоту полученного растения и на количество заложенных дополнительных почек. Хотя по такому важному показателю как приживаемость эксплантов этот вариант уступал производным дифе-нилмочевины.

Заключение. Производные дифенилмочевины можно применять на почках дифференцированных по цветочному типу; реакция испытанных сортов ягодных растений в значительной степени зависит от генотипа. На этапе введения в культуру in vitro ягодных культур для индукции образования побегов следует использовать регуляторы роста ряда дифенилмочевины тидиазурон в концентрации 0,1 мг/л и CPPU в концентрации 0,2 мг/л.

Библиографический список

1. Ягодные культуры в Центральном регионе России /Казаков И.В. [и др.]. Брянск, 2009. 154 с.

2. Муратова С.А., Шорников Д.Г., Янковская М.Б. Размножение садовых культур in vitro: методические рекомендации. Мичуринск-наукоград, 2008. 69с.

3. Катаева Н.В., Аветисова В.А. Клональное размножение растений в культуре ткани // Культура клеток растений. M., 1981.С. 137-149.

4. Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение плодовых растений и декоративных кустарников //Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводства: Сб. науч. тр. ВНИИС им. И.В Мичурина. Мичуринск. 1989. С. 3-8.

5. Колбанова Е.В., Кухарчик Н.В. Методика микроразмножения смородины чёрной in vitro //Плодоводство: Сб. науч. ст. инт-т плодоводства нац-й акад-ии наук Беларуси. Самохваловичи, 2006. Т.2. 4.2. С. 163-168.

6. Вовк В. В. Оптимизация селекционного процесса и ускоренное размножение межвидовых ремонтантных форм малины методом in vitro: дис. на соиск. учен. степ. канд. с.-х. наук. Брянск. 2000. 131 с.

References

1. Yagodnye kul'tury v Tsentral'nom regione Rossii/Kazakov I.V. [i dr.]. Bryansk, 2009. 154 s.

2. Muratova S.A., Shornikov D.G., Yankovskaya M.B. Razmnozhenie sadovykh kul'tur in vitro: metodicheskie rekomendatsii. Michurinsk-naukograd, 2008. 69s.

3. Kataeva N.V., Avetisova V.A. Klonal'noe razmnozhenie rasteniy v kul'ture tkani // Kul'tura kletok rasteniy. M., 1981.S. 137-149.

4. Vysotskiy V.A. Klonal'noe mikrorazmnozhenie plodovykh rasteniy i dekorativnykh kustarnikov //Mikrorazmnozhenie i ozdorovlenie rasteniy v promyshlennom plodovodstve i tsvetovodstva: Sb. nauch. tr. VNIIS im. I.V Michurina. Michurinsk. 1989. S. 3-8.

5. Kolbanova E.V., Kukharchik N.V. Metodika mikrorazmnozheniya smorodiny chernoy in vitro //Plodovodstvo: Sb. nauch. st. int-t plodovodstva nats-y akad-ii nauk Belarusi. Samokhvalovichi, 2006. T.2. ch.2. S. 163-168.

6. Vovk V. V. Optimizatsiya selektsionnogo protsessa i uskorennoe razmnozhenie mezh-vidovykh remon-tantnykh form maliny metodom in vitro: dis. na soisk. uchen. step. kand. s.-kh. nauk. Bryansk. 2000. 131 s.