Экспрессный электрохимический метод анализа антиоксидантной активности пищевых продуктов

Экспрессный электрохимическим метод анализа антиоксидантной активности пищевых продуктов

A.Я. Яшин, Я.И. Яшин, Н.И. Черноусова

НПО «Химавтоматика»

B.П. Пахомов

Институт клинической фармакологии НЦ ЭСМП МЗ РФ

В последние годы установлена связь между ростом свободных радикалов (супероксидный анион-радикал, гидро-пероксидный радикал, пероксид водорода, гидроксил радикал и др.) в биологических жидкостях человека с возникновением опасных заболеваний, в частности сердечно-сосудистых, онкологических, диабета и др. Преждевременное старение также связывают с ростом количества свободных радикалов.

Увеличение содержания в организме свободных радикалов обусловлено снижением активности ферментов антиоксидантной защиты организма: оксид-дисмутазы, каталазы, пероксидазы, а также влиянием неблагоприятных внешних факторов (загрязнения внешней среды, радиация, курение, постоянные стрессы, алкоголизм, УФ-облучение, некачественное питание).

Для снижения уровня свободных радикалов в биологических жидкостях человека рекомендуется ежедневно употреблять пищевые продукты, лекарственные препараты, биологически активные добавки и напитки, содержащие природные антиоксиданты, в частности фрукты, ягоды, овощи, растительные масла, чай, мед, вино, пиво и др. Регулярное профилактическое потребление соответствующего уровня антиокси-дантов позволит восстановить до нормы антиоксидантный статус организма

и сохранить здоровье и продолжительность полноценной жизни.

Однако для эффективной профилактики и лечения свободнорадикальной патологии прежде всего необходимо иметь достоверные сведения, во-первых, о содержании антиоксидантов в разных продуктах и напитках, во-вторых, — о состоянии антиоксидантной системы организма.

Многие существующие, особенно химические, методы недостоверно определяют антиоксидантную активность продуктов. Нами предложен оригинальный амперометрический метод определения антиоксидантной активности продуктов питания, биологически активных веществ и напитков. На основе этого метода разработан прибор. Антиоксидантная активность связана с присутствием в указанных продуктах природных соединений, в частности флавоноидов, витаминов С, Е, ароматических оксидантов и других полифенолов.

Амперометрический способ [1, 2] основан на измерении электрического тока, возникающего при окислении исследуемого вещества (или смеси веществ) на поверхности рабочего электрода, находящегося под определенным потенциалом.

Чувствительность амперометричес-кого способа определяется как приро-

дой рабочего электрода, так и потенциалом, приложенным к нему. В качестве материала рабочего электрода используют стеклоуглерод, золото, платину, серебро, медь, никель, палладий и др. Потенциал может устанавливаться в пределах от 0 до 2,5 В.

Известно, что амперометрический способ анализа обладает рядом преимуществ: низким пределом обнаружения, высокой селективностью (определяются только соединения, молекулы которых могут окисляться; другие соединения, присутствующие даже в больших концентрациях, не определяются), малым объемом ячейки (0,1-5 мкл), простотой обслуживания.

В условиях амперометрического детектирования хорошо окисляются соединения, содержащие гидроксильные группы, предел их обнаружения на уровне 10-9-10-12 г, в благоприятных условиях некоторые соединения определяются на уровне 10-15 г (фемтог-раммы).

Основные и наиболее активные природные антиоксиданты имеют феноль-ную природу. Это природные полифенолы, разные типы флавоноидов, феноль-ные оксикислоты, витамины и др.

Таким образом, амперометрический способ — наиболее подходящий метод для оценки антиоксидантной активности.

Принципиальная схема прибора [3, 4], который включает емкость для растворителя; насос; дозатор, выполненный в виде многоходового крана; ам-перометрический детектор, состоящий из термостатируемой электрохимической ячейки со сменными рабочими электродами; усилитель тока; аналого-цифровой преобразователь и устройство регистрации выходного сигнала, показана на рис. 1. Прибор позволяет проводить прямые количественные измерения антиоксидантной активности исследуемых проб, содержащих биологически активные соединения. Амперо-метрический детектор может работать в трех режимах: постоянном потенциале, импульсных потенциалах и при сканировании потенциалов во всем диапазоне. Причем, варьируя полярность и величины приложенных потенциалов, можно определять не только суммарную антиоксидантную активность, но и активность отдельных классов биологических соединений.

Прибор работает следующим образом: насос постоянно прокачивает растворитель, забирая его из емкости, через всю систему. В кран-дозатор в положении «отбор проб» вводится стандартным шприцем на 1 мл исследуемый раствор в дозируемую петлю. Поворотом ручки крана в положение «анализ» поток растворителя направляет опре-

Рис. 1. Принципиальная схема электрохимического прибора для определения антиоксидантной активности

ПИ]

НАЛИТСИу 6 •

2004

1160,84 519,44 нА

1 2 3 4 - 5 6 7 8

-- "Г"

\

-121,96

! ! ! !

340,61 774,89 1209,17 с Рис. 2. Воспроизводимость последовательных восьми дозирований разбавленных растворов бальзама «Тайга»

деленную дозу исследуемого вещества в ячейку детектора. В последней на поверхности рабочего электрода происходит окисление молекул исследуемого вещества, при этом возрастает электрический ток между двумя электродами. Величина электрического тока зависит от природы анализируемого вещества, природы рабочего электрода и

потенциала, приложенного к электроду.

Возникающие электрические токи очень малы (в пределах 10-6-10-9 А), эти аналоговые сигналы усиливаются, а затем с помощью АЦП преобразуются в цифровой сигнал, который регистрируется на дисплее компьютера. В случае необходимости выходные результаты можно распечатать на принтере.

Рабочий электрод выполнен из стек-лоуглерода, который наиболее универсален при определении полифенольных соединений. Потенциал может изменяться от 0 до 2 В, потенциалы ионизации фенольных соединений варьируются в пределах 100-1000 мВ.

Электрохимическое окисление может быть использовано как модельное при измерении активности поглощения свободных радикалов в соответствии со следующими уравнениями:

Флавоноид-О-Нфлавоноид-О' + + - + Н+ (окисление

при максимальном потенциале);

Флавоноид-О-Нфлавоноид-О' + Н' (улавливание свободным радикалом).

Обе реакции включают разрыв одной и той же связи О-Н, Н. состоит из - + Н+. Таким образом, способность к захвату свободных радикалов флавоноидами или другими полифенолами (т.е. их ан-

тиоксидантная активность) может измеряться величиной окисляемости этих соединений на рабочем электроде ампе-рометрического детектора.

Сигнал регистрируется в виде дифференциальных выходных кривых. С помощью специального программного обеспечения производится расчет площадей или высот пиков (дифференциальных кривых) анализируемого и стандартного веществ. Для анализа используется среднее значение из трех-пяти последовательных измерений. В качестве стандартных веществ можно использовать следующие общеизвестные антиоксиданты: рутин, кверцетин, ди-гидрокверцетин, мексидол, тролокс, аскорбиновую кислоту, галловую кислоту и др. Амперометрический прибор имеет ряд преимуществ при определении антиоксидантной активности. Без учета пробоподготовки время отдельного определения занимает несколько минут. Анализ (регистрация и обработка результатов) проходит в реальном времени. Правильность и воспроизводимость анализа обеспечиваются за счет точного дозирования шестиходовым

Таблица 1

Сок Отношение (сигнал исследуемого

вещества/сигнал стандарта)

Лимона 7,86

Чеснока 7,82

Белой редьки 6,86

Свеклы 6,61

Граната 5,98

Грейпфрута 5,84

Красного 5,29

винограда

Апельсина 4,5

Мандарина 4,2

Красного перца 4,14

Лука 3,95

Хурмы 2,85

краном; объем дозируемой петли может меняться от 20 до 500 мкл; СКО дозирования краном менее 0,5 %; СКО последовательных измерений анализируемых проб < 3 % (рис. 2).

Предел обнаружения амперометри-ческого детектора полифенолов, фла-воноидов на уровне нанопикограммов (10-9-10-12 г). При таких малых концентрациях меньшая вероятность взаимного влияния разных антиоксидантов при их совместном присутствии, в частности проявление явления синергизма. Меняя величину приложенного потенциала, можно дифференцировать анти-оксиданты по классам. Дифференциация возрастает при применении импульсного режима работы амперомет-рического детектора, имеющегося в приборе. Кроме того, в автоматическом режиме можно определять вольтампе-рограммы для идентификации антиок-сидантов. Амперометрическое детектирование в импульсном режиме выполняется автоматически с помощью серии из нескольких кратковременных потенциалов. Детектирующий потенциал выбирается соответствующим для определения конкретных соединений. Он налагается в течение короткого времени. Типичное значение детектирующего времени — 100-400 мс. После детектирования поверхность электрода очищается при высоком положительном потенциале в течение 50-200 мс и затем восстановления при отрицательном потенциале в течение 100-400 мс, прежде чем наступит новый цикл.

В импульсном режиме амперометри-ческий детектор работает стабильно длительное время. Отношение сигналов к одному и тому же антиоксиданту при разных потенциалах может быть также использовано для идентификации: высокая селективность определения характерна только для антиоксидантов, т.е. соединений, способных к окислению; другие соединения, присутствующие в сложных смесях, не мешают их определению. Для анализа не требуется никаких химических реактивов (кроме стандартов), поэтому стоимость анализа очень низкая.

Наиболее актуальная задача в области определения антиоксидантной активности — создание универсального и сравнительно дешевого метода. По нашему мнению, из всех существующих методов амперометрический способ в наибольшей степени удовлетворяет этим требованиям. Особенно удобен амперометрический способ при сопоставлении антиоксидантной активности (АОА) пищевых продуктов, разных лекарственных форм, напитков, БАД и др. Некоторые из подобных сопоставлений приведены в табл. 1-4. В табл. 1 приведена АОА свежевыжатых соков фрук-

6•2004

ПИВО " "ЛПИТКИ

Таблица 2

Мед | АОА, мг/г

Донника 2,68

Гречишный 2,31

Липовый 2,11

Луговой 1,96

Эспарцетовый 1,80

Цветочный 1,64

Белой акации 1,42

Расторопши 1,27

Таблица 3

Сорт хмеля АОА, мг/г

Крылатский 15,2

Михайловский 14,5

Подвязный 14,1

Челенджер 13,2

Истринский 12,2

Ранний 11,7

Дикий 11,7

Сумерь 11,6

Таблица 4

Бальзам АОА, S б / S ' образца ' стандарта

«Тайга» 14,1

«Виватон» 9,8

«Ишимский» 5,6

«Демидовский» 4,8

«Алтайский» 1,2

Jägermeister 1,2

тов и овощей (2 г сока разбавляли 10 мл воды); в табл. 2 — АОА разных типов пчелиного меда (мед был взят у пчеловодов на ярмарке меда в Москве); в табл. 3 — АОА разных видов хмеля, собранных в соответствии с ГОСТом; в табл. 4 — АОА некоторых типов бальзамов и эликсиров, взятых в упаковках производителя.

Отдельно исследована антиоксидан-тная активность концентрата стевии «Стевиол», которая может быть использована как пищевая добавка.

Антиоксидантная активность экстракта стевии оказалась равной 116,5 мг/мл (стандарт — кверцетин). Это очень вы-

сокая антиоксидантная активность: для сравнения можно указать, что антиок-сидантная активность красного вина «Каберне» равна 12,5 мг/мл.

ЛИТЕРАТУРА

1. Пахомов В.П, Яшин Я.И., Яшин А.Я., Багиро-ва В.Л., Арзамасцев А.П, Кукес В.Г., Ших Е.В. Способ определения суммарной антиокси-дантной активности биологически активных соединений. Патент № 2238554. Приоритет от 25.07.2003 г.

2. Яшин А.Я., Яшин Я.И., Пахомов В.П, Чер-ноусова Н.И. Новый экспрессный амперомет-рический способ определения антиоксидант-ной активности растительных лекарственных препаратов, биологически активных добавок

и напитков/Материалы VII Международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения», Фитофарм. — Миккели, Финляндия, 2004. С. 617-620.

33. Яшин Я.И., Яшин А.Я., Пахомов В.П. Установка для определения суммарной антиокси-дантной активности биологически активных соединений. Патент № 2238555. Приоритет от 25.07.2003 г.

4. Яшин А.Я., Яшин Я.И. Прибор для определения антиоксидантной активности растительных лекарственных экстрактов и напитков/ Материалы VII Международного съезда «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения». Фитофарм 2004. — Миккели, Финляндия. С. 613-617. (^ш

УПРАВЛЕНИЕ ПРОИЗВОДСТВОМ !*: В СИСТЕМЕ TRACE MODE

КРУПНЕЙШИЙ

СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫЙ ФОРУМ ПО УПРАМЕНИЮ ПРОИ360ДС1В0М

УПРАВЛЕНИЕ ПРОИЗВОДСТВОМ

В СИСТЕМЕ TRACE MODE

Одиннадцатая Международная конференция и выставка

SOFTLOGiC SCADA H М I ЕАМ HRM MES

I Мировые тенденции;

ВЫСТАВКА ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБОРУДОВАНИЯ

для управления современным expo производством

TRACE MODE COMPATIBLE 2005

I Промышленное оборудование с цифровым управлением:

Средство измерений, датчики, исполнительные устройства;

ПИВО "НАПИТКИ

6•2004