Ферментативное окисление октадекапентаеновой кислоты

Отмытые монослои макрофагов инкубировали с разными количествами ОДПК, растворенной в 3 мл раствора Хэнкса, содержащего 0,5 мг/л восстановленного глутатиона, в течение 1 ч при 37 °С и 5 % СО2.

Для определения влияния ОДПК на липоксигеназное окисление экзогенной АК клетки инкубировали в тех же условиях с 3 мл раствора Хэнкса, содержащего АК (3,3 мкМ) и ОДПК соответствующей концентрации. Часть экспериментов проводили с преинкубацией ОДПК. В этом случае вначале клетки инкубировали 30 мин с 1,5 мл раствора ОДПК в растворе Хэнкса и затем добавляли 1,5 мл 6,6 мкМ АК. Конечные концентрации ОДПК в этих экспериментах и в экспериментах с одновременной инкубацией были одинаковы. Контрольные образцы не содержали ОДПК. В тех случаях, когда количество этанола в опытных образцах превышало 1 мкл/мл, в контрольные образцы вносили соответствующее количество этанола. Аналогичные эксперименты проводили с 13-HOPE вместо ОДПК. По окончании опыта инкубационную среду переносили в центрифужные пробирки, содержащие 50 мкл 1 М лимонной кислоты (для снижения pH до 3). Затем в каждую пробирку в качестве внутреннего стандарта вносили 200 нг 5-HEPE, растворенного в 100 мкл раствора Хэнкса. После этого образцы подвергались твердофазной экстракции и ВЭЖХ-анализу.

После удаления инкубационной среды в чашки Петри вносили 2 мл 2 %-ного раствора додецилсульфата натрия для получения клеточных лизатов.

Спленоциты выделяли из селезенки мышей СВА любого пола весом 25-30 г по описаной ранее методике (Безуглов и др., 1994) и суспендировали в растворе Хэнкса, содержащем 0,5 мг/л восстановленного глутатиона. В 1 мл суспензии содержалось 4 . 107 клеток. Жизнеспособность клеток определяли с помощью трипанового синего, она составляла не менее 90 % до и после инкубации.

Липоксигеназное окисление ОДПК в спленоцитах достигалось следующим образом. Суспензию спленоцитов порциями по 1,5 мл инкубировали на водяной бане при 37 °С в течение 1 ч при легком перемешивании с ОДПК различных концентраций. В контрольные образцы вместо ОДПК добавляли равные количества раствора Хэнкса. Затем инкубационную среду быстро охлаждали до 4 оС и центрифугировали 15 мин при 8000 g. Супернатант декантировали в пробирки, содержащие 400 нг 5-HEPE в качестве внутреннего стандарта. Образцы подкисляли до рН 3 1 М лимонной кислотой и оставляли на ночь при минус 50 °С. Размороженную суспензию центрифугировали 15 мин при 10000 g. Су-пернатант подвергали твердофазной экстракции.

Для выделения окисленных продуктов жирных кислот методом твердофазной экстракции реакционные смеси и инкубационные среды, подкисленные до рН 3 и содержащие внутренний стандарт, подвергали твердофазной экстракции на колонках Amprep C2 ("Amprep", США). Колонки промывали MeCN, MeOH, MeOH/H2O (1/1, об/об) и H2O порциями по 3 мл, затем наносили образцы и элюировали их равными объемами (2-3 мл) воды, 15 % метанола, 80 % метанола и 100 % метанола. 80 %-ные элюаты собирали и упаривали на Speed Vac Concentrator ("Savant", USA). Затем образцы растворяли в 50 мкл метанола и анализировали методом ВЭЖХ.

При проведении высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) 5-, 12-, 15-HETEs, соединения 1 и 2 (рис. 1), полученные как

89

ров (см. рис. 1) (Veldink et al., 1977). В наших экспериментах концентрация кислорода в реакционной смеси была достаточной для предотвращения образования побочных продуктов при низкой концентрации фермента, при высокой концентрации 15-LO для предотвращения побочных реакций в случае направленного синтеза 13-HOPE (3) было необходимо проводить дополнительное насыщение реакционной смеси кислородом. Боргидрид натрия, добавленный к реакционной смеси вместе с субстратом, препятствует образованию альдегида (2) за счет восстановления гидроперекиси (1) в гидрокси-производное (3) (рис. 1, табл. 1).

Таблица 1

Образование продуктов окисления октадекапентаеновой кислоты под действием 15-липоксигеназы в различных условиях

Table 1

Formation of the octadecapentaenoic acid lipoxygenase oxidation products

at the various conditions

Конц. Насыще-15-LO, ние кис-мкг/мл лородом

~30 ~

30 30 30 5 5

Условия реакции

Добавление фермента до 30 мкг/мл 4 неактивного активного

Добавление NaBH

Выход продуктов, мкМ 13-HOPE

43.3 20,8 41,0

22.4 26,4 23,2

Альдегид 0

22,9 0

20,5 0

24,8

Таблица 2 Кинетические параметры окисления полиненасыщенных жирных кислот, катализируемого 15-липоксигеназой

Table 2

The kinetic parameters of the lipoxygenase oxidation of the polyunsaturated fatty acids

Субстрат K , мкМ m' V , ммоль/час max

ОДПК 19,8 ± 3,1 1,14 ±0,076

АК 15,5 ± 1,6 2,14 ± 0,11

ЭПК 21,0± 1,7 2,54 ±0,11

ДГК 11,6 ± 0,86 2,16±0,072

нем в 2 раза меньше, чем для др выходит за рамки обычных разбр

Изучение кинетики окисления ОДПК 15-Ш показало, что Кт этого субстрата близка по значению к Кт других полиненасыщенных жирных кислот как ю-3 семейства, так и ю-6 семейства (табл. 2). Для сравнения мы определили кинетические параметры окисления АА, ЭПК и ДГК в тех же условиях, так как использование литературных данных затруднено из-за большого разброса значений в различных источниках. Значение Утах для ОДПК оказалось в сред-изученных кислот, что, однако, не значений V для С,„-С„„ ПНЖК.

шяу ^ IX 77

Липоксигеназное окисление ОДПК в спленоцитах и макрофагах мышей

Инкубация как макрофагов (рис. 3, а), так и спленоцитов (рис. 3, б) с различными концентрациями ОДПК приводит к дозозависимому образованию единственного продукта с максимумом поглощения при 234 нм и таким же временем удерживания, как и у 13-НОРЕ. Масс-спектроско-пия ВЭЖХ-фракций, содержащих этот продукт, подтвердила идентичность

92

lipoxygenase formation

10.0 15.0 20.0

ОДПК, мкМ

oxida-tion products: 1 - 12-HETE formation ,

Рис. 4. Влияние ОДПК на синтез продуктов липокси-геназного окисления эндогенной АК в спленоцитах: 1 - образование 12-HETE; 2 - образование 12,20-diHETE

Fig. 4. I n fl u -ence of octadeca-pentaenoic acid on the synthesis in sple-nocytes of endogenous arachidonic acid 2 - 12,20-diHETE

Р ис. 5. Влияние ОДПК на синтез 12-HETE из экзогенной АК в макрофагах: 1 - при одновременной инкубации ОДПК и АК; 2 - при преинкубации ОДПК в течение 30 мин

Fig. 5. Influence of octadecapentaenoic acid on the 12-HETE synthesis in macrophages from exogenous arachidonic acid: 1 - simultaneously

incubation of octadecapentaenoic acid with arachidonic acid; 2 - preincubation of octadecapentaenoic acid for 30 min

Рис. 6. Влияние 13-HOPE на синтез

12-HETE из экзогенной АК в макрофагах: 1 - при одновременной инкубации

13-HOPE и АК; 2 -при преинкубации 13-HOPE в течение 30 мин

Fig. 6. Influence

of 13-HOPE on the 12-HETE synthesis in macrophages from exogenous arachidonic acid: 1 - simultaneously incubation of 13-HOPE with arachidonic acid, 2 - preincubation of 13-HOPE for 30 min

В результате данной работы мы показали, что экзогенная ОДПК метаболизируется макрофагами и спленоцитами с образованием 13-НОРЕ. Эта гидроксикислота, как нами было продемонстрировано ранее (Кук-лев и др., 1995), является продуктом окисления ОДПК 15-липоксигена-зой. Однако существование литературных данных о том, что 12^0 превращает С18 ПНЖК в 13-моногидроксипроизводные (Takahashi е! а1., 1993),

а также доминирующая активность 12^0 в изучаемых клетках позво-

94

и др., 1995), в то же время имеются сведения о том, что 13-гидрокси-октадекадиеновая кислота, образующаяся при циклооксигеназном окислении линолевой кислоты (Claeys et al., 1982), легко деградирует с образованием 13-оксо-тридекадиеновой кислоты (Funk, Powell, 1983). Таким образом, имеются предпосылки для предположения об оксодиеновой структуре полученного циклооксигеназного метаболита ОДПК.

Время, мин Длина волны, нм

Рис. 7. ВЭЖХ-анализ экстракта из инкубационной смеси октадекапента-еновой кислоты и циклооксигеназы

Fig. 7. HPLC of extract from reactionary mixture of octadecapentaenoic acid with cyclooxygenase

Литература

Безуглов В.В., Фомина-Агеева Е.В., Текиева Е.А., Дятловицкая

Э.В. Липоксигеназное окисление арахидоновой кислоты в спленоцитах мышей и его модулирование лактоном ганглиозида GM3 // Биохимия. - 1994. -Т. 59, № 9. - С. 1360-1368.

Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. - Т. 1. - М.: Мир, 1982. - 389 с.

Куклев Д.В., Когтева Г.С., Латышев Н.А., Безуглов В.В. Окисление октадекапентаеновой кислоты (18:5n-3) соевой 15-липоксигеназой // Биоорган. химия. - 1995. - Т. 21, № 8. - С. 651-653.

Куклев Д.В., Латышев Н.А., Безуглов В.В. Синтез (3Z,6Z,9Z,12Z,15Z)-октадекапентаеновой кислоты // Там же. - 1991а. - Т. 17, № 10. - С. 14331436.

Куклев Д.В., Шевченко В.П., Нагаев И.Ю. и др. Синтез 4,5-дегидро-докозагексаеновой, 5,6-дегидроэйкозапентаеновой кислот и их селективно меченных тритием производных // Там же. - 19916. - Т. 17, № 11. - С. 1574-

Шевченко В.П., Фетисова И.В., Лазуркина Т.Ю. и др. Получение меченого тритием простагландина Е3 // Химия природных соединений. - 1985.

- Т. 3. - С. 319-322.

Ackman R.G., Manzer A., Joseph J. Tentative identification of an unusual naturally-occurring poeyenoic fatty acid by calculation from precision open tubular GLC and structural element retention data // Chromatographia. - 1974. - Vol. 7.

- P. 107-112.

Bednar M.M., Ibraham N.G., Mcgiff J.C. et al. Conversion of arachi-donic acid to 2 novel products by a cytochrome-P450-dependent mixed function oxidase in polymorphonuclear leukocytes // Biochem. Biophys. Res. Comm. -1984. - Vol. 123, № 2. - P. 581-588.

Claeys M., Coene M.C., Herman A.G. et al. Characterization of mono-hydroxylated lipoxygenase metabolites of arachidonic and linoleic acid in rabbit peritoneal tissue // Biochim. Biophys. Acta. - 1982. - Vol. 713, № 1. - P. 160169.

Cunningham F.M., Woolard P.M. 12(R)-hydroxy-5,8,10,14-eicosa-tetraenoic acid is a chemoattractant for human polymorphonuclear leukocytes in-vitro // Prostaglandins. - 1987. - Vol. 34, № 1. - P. 71-78.

Danilowicz R.M., Reed G., Germolee D.R. et al. 12S, 19-dihydroxyei-cosanoids and 12S,20-dihydroxyeicosanoids - novel 12S-hydroxy-5,8-cis-10-trans-14-cis-eicosatetraenoic acid metabolites formed by hydroxylation and reduction in murine lymphocytes // Arch. Biochem. Biophys. - 1989. - Vol. 271, № 1. - P. 72-83.

Funk C.D., Powell W.S. Metabolism of linoleic acid by prostaglandin endoperoxide synthase from adult and fetal blood vessels // Biochim. Biophys. Acta. - 1983. - Vol. 754, № 1. - P. 57-71.

Gaiday N.V., Imbs A.B., Kuklev D.V., Latyshev N.A. Separation of natural polyunsaturated fatty acids by means of iodolactonization // J. Amer. Oil Chem. Soc. - 1991. - Vol. 68, № 4. - P. 230-233.

Ghioni G., Porter A.E.A., Sadler I.H. et al. Cultured cells metabolize octadecapentaenoic acid to octadecatetraenoic acid via its 2-trans intermediate // Lipids. - 2001. - Vol. 36 , № 2. - P. 145-152.

Honn K.V., Tang D.G., Crissman J.D. Platelets and cancer metastasis: a causal relationship // Cancer and Metastasis Review. - 1992. - Vol. 11 , № 34. - P. 325-351.

Hubbard N.E., Chapkin R.S., Erickson K.L. Effect of dietary linseed oil on tumoricidal activity and eicosanoid production in murine macrophages // Lipids.

- 1994. - Vol. 29, № 9. - P. 651-655.

Jones C.M., Hall E.R., Hester J.P., Wu K.K. Arachidonic acid metabolites produced by plateled depleted human blood monocytes: a possible role in throm-bogenesis // Am. J. Hematol. - 1989. - Vol. 31, № 3. - P. 145-152.

Joseph J. Identification of 3,6,9,12,15- octadecapentaenoic acid in laboratory-cultured photosynthetic dinoflagellates // Lipids. - 1975. - Vol.10 , № 3. - P. 395-403.

Kuklev D.V., Christie W.W., Durand T. et al. Synthesis of keto- and hydroxydienoic compounds from linoleic acid // Chem. Phys. Lipids. - 1997. -Vol. 85. - P. 125-134.

Lui B., Timar J., Howlett J. et al. Lipoxygenase metabolites of arachidonic and linoleic acids modulate the adhesion of tumor cells to endothelium via regulation of protein kinase C. // Cell. Regulation. - 1991. -Vol. 2, № 12. - P. 1045-1055.

Scott W.A., Pawlowski N.A., Andreach M., Cohn Z.A. Resting macrophages produce distinct metabolites from exogenous arachidonic acid // J. Exp. Med. - 1982. - Vol. 155, № 2. - P. 535-547.

Scott W.A., Zrike J.M., Hamill A.l. et al. Regulation of arachidonic acid metamolites in macrophages // Ibid. - 1980. - Vol. 152, № 2. - P. 324-329.

Somers S.D., Erickson K.L. Alteration of tumor-necrosis-factor-alpha production by macrophages from mice fed diets high in eicosapentaenoic and doco-sahexaenoic fatty acids // Cell. Immunol. - 1994. - Vol. 153, № 2. - P. 287-297.

97

Spector A.A., Gordon J.A., Moore S.A. Hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs) // Prog. Lipid Res. - 1988. - Vol. 27 , № 4. - P. 271-323.

Takahashi Y., Glasgov W.C., Suzuki H. et al. Investigation of the oxygenation of phospholipids by the porcine leukocyte and human platelet arachidonate 12-lipoxygenases // Eur. J. Biochem. - 1993. - Vol. 218 , № 1. - P. 165-171.

Veldink G.A., Vliegenthart J.F.G., Boldingh J. // Prog. Chem. Fats Other Lipids. - 1977. - Vol. 15. - P. 131-166.

Weber P.C., Sellmayer A. Modification of the eicosanoid system and cell signaling by precursors fatty acids // Adv. Prost. Tromb. Leuk. Res. - 1990. -Vol. 21. - P. 217-224.

Поступила в редакцию 18.05.2001 г.