НАНОАМОРФНАЯ ФОРМА (RS)-3-(4-АМИНО-1-ОКСО-1,3-ДИГИДРО-2Н-ИЗОИНДОЛ-2-ИЛ)ПИПЕРИДИН-2,6-ДИОН (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ЕЁ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ИЛИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
NANO-AMORPHOUS FORM (RS)-3-(4-AMINO-1-OXO-1,3-DIHYDRO-2H-ISOINDOL-2-YL)PIPERIDINE-2,6-DIONE (VERSIONS), A METHOD FOR PRODUCTION THEREOF AND USE FOR TREATING IMMUNOLOGICAL OR ONCOLOGICAL DISEASES

Область техники, к которой относится изобретение
Заявленная группа изобретений относится к наноаморфной форме (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона (международное непатентованное название - леналидомид), способу ее получения и применению в фармацевтических композициях, которые могут быть использованы для лечения иммунологических и/или онкологических заболеваний.
Уровень техники
Аморфное состояние вещества отличается от кристаллического отсутствием дальнего порядка взаимного расположения молекул, более высокой внутренней энергией и межмолекулярным расстоянием. Способность химических соединений существовать в нескольких аморфных формах называют полиаморфизмом. В термодинамически строгом смысле под этим следует понимать возможное существование двух аморфных фаз, между которыми имеется четкий фазовый переход. Однако зачастую аморфное вещество не подходит под это определение. Так, стекловидные материалы находятся в термодинамически неравновесном состоянии, но при этом могут оставаться стабильными в течение длительного времени при температурах ниже точки стеклования. Хэнкок и др. предложили для таких случаев термин «псевдополиаморфизм» [J. Pharm. Pharmacol. 2002, 54 (8), 1151-2], который не прижился глубоко в научной литературе. Чтобы избежать путаницы в терминологии, далее по тексту мы будем считать аморфные формы одного вещества разными, если эти формы отличаются своими признаками.
Аморфные вещества широко используются в фармацевтике. При этом истинный полиаморфизм описан лишь для немногих лекарственных веществ, таких как О-ацетилсалициловая кислота [CrystEngComm, 2015, 17, 9029-9036], и вспомогательных фармацевтических ингредиентов, таких как D-маннит [J. Chem. Pkys., 2017, 146, 244503]. Аморфные формы органических соединений обычно характеризуют такими физическими методами, как рентгеновская дифракция, дифференциальная сканирующая калориметрия, инфракрасная спектроскопия, Рамановская спектроскопия, терагерцовая спектроскопия, спектроскопия твердофазного ядерного магнитного резонанса и другими. Первые четыре метода используются наиболее часто ввиду широкой доступности соответствующего аналитического оборудования. Спектральные свойства кристаллических и аморфных форм органических соединений могут заметно отличаться. Например, в работе [Mol. Pharmaceutics, 2008, 56, 937-945] приведено сравнительное описание инфракрасных спектров кристаллических и аморфных форм фармацевтических субстанций целикоксиба, валдекоксиба, рофекоксиба и эторикоксиба. Эти данные демонстрируют значительные изменения отдельных сигналов в инфракрасном спектре аморфных субстанций. Эти изменения касаются как положения отдельных сигналов, так их интенсивности и, в первую очередь, характерны для атомов, участвующих в образовании водородных связей.
Хорошо известно, что свойства аморфного вещества могут зависеть от способа, которым оно было получено. Так, аморфный симвастатин, полученный методом криоизмельчения, обладает более низкой стабильностью, чем аморфный симвастатин, приготовленный путем переохлаждения расплава [K.A. Graeser, С.J. Strachan, J.Е. Patterson, K.С. Gordon and Т. Rades, Physicochemical properties and stability of two differently prepared amorphous forms of simvastatin, Cryst. Growth Des. 8, 2008, 128-135]. Аморфный цефамандола нафат, полученный методом распылительной сушки, отличается от полученного методом лиофилизации наличием узкого рефлекса на фоне обычного широкого «гало» в спектре рентгеновской дифракции. Это позволяет предположить большую степень молекулярной упорядоченности для аморфного цефамандола нафата, полученного методом распылительной сушки. [E.Y. Shalaev, G. Zogra. The concept of "structure" in amorphous solids from the perspectives of the pharmaceutical sciences. Progress in Amorphous Food and Pharmaceutical Systems, Publisher: The Royal Society of Chemistry, Editors: H Levine, 2002, pp. 11-30].
Таким образом, для описания разных аморфных форм химических соединений возможно использовать как признаки, относящиеся непосредственно к формам, так и признаки способа их получения, включающие последовательность технологических стадий и режимов их проведения.
Изучение полиаморфизма органических соединений является актуальной задачей современной науки, а создание новых аморфных форм для известных веществ, обладающих улучшенными технологическими, фармакологическими или иными свойствами, представляет собой важное техническое достижение.
Настоящая группа изобретений относится к наноаморфной форме известного соединения леналидомид, которое характеризуется следующей структурной формулой:
13
13
3
3
Брутто-формулой: CHNO;
Молекулярной массой: 259,25.
Леналидомид относится к классу противоопухолевых иммуномодуляторов, оказывает иммуномодулирующее и антиангиогенное действие. Леналидомид ингибирует пролиферацию клеток различных линий гемопоэтических опухолей, главным образом тех, которые имеют цитогенетические дефекты хромосомы 5, усиливает опосредованный Т-лимфоцитами и клетками - естественными киллерами (ЕК) иммунитет, увеличивает число ЕК Т-клеток, подавляет ангиогенез, блокируя миграцию и адгезию эндотелиальных клеток и образование микрососудов, повышает продукцию фетального гемоглобина CD 34+ стволовыми гемопоэтическими клетками, и ингибирует продукцию про-воспалительных цитокинов, включая ФНО-альфа и интерлейкин-6.
Известно лекарственное средство, содержащее леналидомид, «Ревлимид», выпускаемое в форме твердых желатиновых капсул с дозировкой 2,5 мг; 7,5 мг; 20 мг; 5 мг; 10 мг; 15 мг; 25 мг. Согласно инструкции по медицинскому применению, препарат Ревлимид 20 мг содержит следующие компоненты:
- Леналидомид - 20 мг;
- Лактоза - 244,5 мг;
- Целлюлоза микрокристаллическая - 120,5 мг;
- Кроскармеллоза натрия - 12,0 мг;
- Магния стеарат - 3,0 мг.
Состав оболочки капсул: титана диоксид, желатин, чернила черные TekPrint™SW-9008, краситель индигокармин FD&C синий №2. Состав чернил: шеллак; этанол; изопропанол; бутанол; пропиленгликоль; вода; аммиак водный; калия гидроксид; краситель железа оксид черный.
Согласно инструкции по медицинскому применению, Ревлимид применяется для лечения взрослых пациентов с ранее не леченной множественной миеломой, которым не показана трансплантация гемопоэтических стволовых клеток. В комбинации с дексаметазоном для лечения взрослых пациентов с множественной миеломой, которые получили, по крайней мере, одну линию терапии.
max
После приема внутрь здоровыми добровольцами леналидомид быстро всасывается; при этом максимальная концентрация достигается через 1,5-2 часа после однократного приема. Фармакокинетическое распределение имеет линейный характер. Максимальная концентрация (C) и площадь под кривой «концентрация-время» (AUC) возрастают пропорционально увеличению дозы. Леналидомид можно принимать вне зависимости от приема пищи.
Леналидомид практически не метаболизируется в организме, так как 82% его дозы выделяется почками в неизменном виде.
Известно, что леналидомид обладает низкой растворимостью при рН, близком к 7. Существует несколько вариантов для ее увеличения: образование твердых дисперсий, со-кристаллов или аморфных форм веществ. Применение твердых дисперсий и со-кристаллов в готовых лекарственных формах имеет ряд недостатков, среди которых можно, в первую очередь, упомянуть увеличение объема таблетки или капсулы. Получение твердых дисперсий и со-кристаллов усложняется выбором органических растворителей для синтеза. В работе [Journal of Molecular Structure, 2019, 1175, 852-857] приведен пример получения со-кристаллов леналидомида с ацесульфаном в присутствии хлороформа в качестве растворителя. Используемый хлороформ относится ко 2-му классу токсичности в соответствии с классификацией ICH Q3C. Требованиями ЮН и государственных (региональных) фармакопей устанавливаются определенные допустимые уровни остаточного содержания органических растворителей в фармацевтических продуктах. Правила ЮН нормируют содержание в лекарственных средствах исходя из допустимого ежедневного воздействия (PDE) или предельно допустимого остаточного содержания, выражаемого в миллионных долях (м.д.). Так, для хлороформа PDE=0,6 мг/сут, а предельно допустимое остаточное содержание - 60 м.д. (0,006%). Исходя из этого, получение аморфной формы леналидомида становится важной технической задачей, позволяющей увеличить его растворимость.
Актуальной задачей изобретения является разработка наноаморфной формы леналидомида, обладающей повышенной растворимостью, и, как следствие, улучшенными фармакокинетическими параметрами.
В патенте Канады СА2717326С раскрывается аморфная форма леналидомида и твердые дисперсии, содержащие аморфный леналидомид и фармацевтически приемлемый носитель. Аморфная форма леналидомида охарактеризована при помощи спектра порошковой рентгеновской дифракции и термоаналитических методов, таких как дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) и термогравиметрический анализ (ТГА). Раскрываются способы получения аморфного леналидомида, связанные с удалением растворителя из раствора леналидомида, включая распылительную сушку, отгонку растворителя с использованием ротационного испарителя, сублимационную сушку.
Также описывается способ получения твердой дисперсии, содержащей леналидомид. Он включает в себя удаление растворителя из раствора леналидомида в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Полученный таким образом, леналидомид имеет чистоту около 99% масс.
Способ получения чистого леналидомида включает взаимодействие метил-2-галогенметил-3-нитробензоата с гидрохлоридом α-аминоглутаримида в присутствии триэтиламина с образованием 3-(4-нитро-1-оксо-1,3-дигидроизоиндол-2-ил)-пиперидин-2,6-диона, который далее подвергают каталитическому гидрированию в растворителе в присутствии кислоты. В качестве катализатора гидрирования заявлен палладий на угле. Добавление кислоты уменьшает количество органического растворителя, а также сокращает длительность времени реакции и обеспечивает большие выход и чистоту леналидомида. Результатом реакции является кислотно-аддитивная соль леналидомида, которая может быть выделена и затем превращена в леналидомид при взаимодействии с основанием в присутствии растворителя.
В патенте США №10328028 (опубл. 25.06.2019, МПК: A61K 31/454; A61K 9/16; А61Р 35/00) раскрываются фармацевтические композиции, содержащие аморфный леналидомид или его фармацевтически приемлемую соль. Также раскрывается способ получения аморфного леналидомида, который включает следующие стадии:
- растворение леналидомида с полимером и синтетическим антиоксидантом;
- распыление или распылительная сушка раствора на носителе для получения гранул;
- смешивание гранул с дополнительными наполнителями.
Также описывается способ получения композиций аморфного леналидомида с синтетическими антиоксидантами. Предпочтительными являются монофенольные антиоксиданты. Также раскрывается способ получения фармацевтических композиций, содержащих аморфный леналидомид, синтетический антиоксидант, полимер и фармацевтически приемлемые наполнители.
В патенте Латвии №14985 (опубл. 20.06.2015; МПК: C07D 401/04) раскрывается способ получения кристаллического леналидомида из 3-(4-нитро-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона. Восстановление происходит в водном растворе аммония хлорида в присутствии порошка железа. Затем осадок промывают и кипятят в водно-спиртовом растворе в присутствии активированного угля, получая кристаллический продукт высокой чистоты.
Также раскрывается способ получения исходных соединений для леналидомида. Раскрыты способы получения метилового эфира 2-(бромметил)-3-нитробензойной кислоты из метилового эфира 2-метил-3-нитробензойной кислоты.
Одной из важных задач заявленной группы изобретений является расширение арсенала технических средств определенного назначения путем разработки новой, неизвестной ранее стабильной наноаморфной формы леналидомида, отличающейся повышенной биологической доступностью и терапевтической эффективностью, а также способов ее получения, свободных от использования оборудования с высоким энергопотреблением, а также органических растворителей 1-го и 2-го классов токсичности в соответствии с классификацией ICH Q3C.
Раскрытие изобретения
Заявленная группа изобретений относится к стабильной наноаморфной форме (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона (международное непатентованное название - леналидомид), способу ее получения и применения в фармацевтических композициях, которые могут быть использованы для лечения иммунологических и онкологических заболеваний.
-9
-7
Основной технический результат заявленной группы изобретений заключается в решении актуальной задачи расширения арсенала технических средств определенного назначения. Данная задача решается путем создания новой, не известной ранее, стабильной слабо гигроскопичной наноаморфной формы (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона, которая может применяться для получения фармацевтических композиций, которые могут быть использованы для лечения иммунологических и онкологических заболеваний. При этом под наноаморфной формой понимается аморфная форма вещества, состоящая из частиц с размером от 1×10 до 1×10 м (от 1 до 100 нм) в соответствии с определением понятия «наночастица» IUPAC [Pure Appl. Chem., 84 (2), 377-410, 2012].
Дополнительным техническим результатом заявленной группы изобретений является получение стабильной и слабо гигроскопичной наноаморфной формы (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона, обладающей улучшенной биодоступностью и терапевтической эффективностью.
Наноаморфная форма леналидомида по изобретению характеризуется широким гало в спектре порошковой рентгеновской дифракции, средним размером частиц 63,85±10,0 нм. В предпочтительном варианте наноаморфная форма характеризуется температурой стеклования 122,9°С±7°С, кристаллизацией при температуре 172,6±5°С с удельным тепловым эффектом 85,77±9 Дж/г и плавлением при температуре 267,5±5°С с удельным тепловым эффектом 149,8±15 Дж/г в условиях дифференциальной сканирующей калориметрии при скорости нагрева 10°С/мин.
В соответствии с другим аспектом группа изобретений относится к способу получения наноаморфной формы (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона, в соответствии с которым леналидомид растворяют в расплаве D-фруктозы, лактозы моногидрата и мочевины. Горячий сироп выливают в очищенную, охлажденную до +5°С воду и интенсивно перемешивают. Выделившийся осадок леналидомида фильтруют, повторно суспендируют в очищенной воде и перемешивают при температуре 20°С. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре водой очищенной и высушивают под вакуумом до постоянной массы. В одном из вариантов осуществления изобретения вместо готового сырьевого кристаллического леналидомида используют 3-(4-нитро-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион, который восстанавливают серым чугуном в форме колотой дроби в среде водного этанола, а затем продукт реакции без выделения в чистом виде растворяют в расплаве D-фруктозы, лактозы моногидрата и мочевины. Горячий сироп выливают в очищенную, охлажденную до +5°С воду и интенсивно перемешивают. Выделившийся осадок леналидомида фильтруют, повторно суспендируют в очищенной воде и перемешивают при температуре 30°С. Осадок отфильтровывают, промывают на фильтре водой очищенной и высушивают под вакуумом до постоянной массы. Указанный вариант способа синтеза наноаморфного леналидомида отличается от известных способов из уровня техники тем, что в нем не используются катализаторы драгоценных металлов, таких как палладий, а в качестве эффективного восстановителя применяется серый чугун в форме колотой дроби. Колотая дробь серого чугуна является дешевым и доступным сырьем. При использовании в качестве восстановителя существенно более дорогого порошка восстановленного железа, 97%, <0,044 мм (325 mesh) достигается меньший выход целевого продукта.
В предпочтительном варианте способ получения наноаморфной формы (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона включает следующие стадии:
загрузка (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона в расплав, состоящий из 40 г D-фруктозы, 15 г лактозы моногидрата и 40 г мочевины при температуре 55°С;
перемешивание при температуре 55°С;
внесение полученного расплава в воду, охлажденную до +7°С;
перемешивание;
фильтрование осадка;
приготовление суспензии осадка в воде;
перемешивание при температуре 20°С в течение около 1 часа;
фильтрование;
промывание осадка водой на фильтре;
высушивание до постоянной массы под вакуумом при температуре +40°С
Предложенные способы получения указанной аморфной формы леналидомида отличаются тем, что в них не используется оборудование с высоким энергопотреблением, такое как шариковые мельницы, лиофильные сушилки, или установки для распылительной сушки; а также тем, что в них либо совсем не используются органические растворители, либо используются растворители первого класса токсичности, причем обеспечивается их остаточное содержание ниже предельно допустимых уровней.
Одним из аспектов изобретения является также наноаморфная форма (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона, полученная вышеуказанным способом.
Заявленная группа изобретений относится также к применению наноаморфной формы (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона для приготовления фармацевтической композиции для лечения иммунологических или онкологических заболеваний.
В еще одном варианте осуществления заявленная группа изобретений относится к фармацевтической композиции для лечения иммунологических или онкологических заболеваний, которая содержит наноаморфную форму наноаморфную форму (RS)-3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона в сочетании с фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами.
Краткое описание чертежей
Для пояснения сущности заявляемого технического решения к описанию приложены Фигуры 1-8:
На Фиг. 1 приведен спектр порошковой рентгеновской дифракции сырьевого леналидомида кристаллической формы А.
На Фиг. 2 приведен спектр порошковой рентгеновской дифракции образцов наноаморфного леналидомида по примеру 1 до испытания на стабильность (график а) и после испытаний (график b).
На Фиг. 3 приведен спектр порошковой рентгеновской дифракции аморфного леналидомида по примеру 2b.
На Фиг. 4 приведена дериватограмма наноаморфного леналидомида по примеру 1 (кривая А) и известной кристаллической формы А (кривая В, адаптировано из описания к патенту США №7465800 В2).
На Фиг. 3 приведена дериватограмма наноаморфного леналидомида по примеру 2а.
На Фиг. 6 приведено распределение по размеру частиц наноаморфного леналидомида, полученного по примерам 1, 2а, b, и 3а, b.
1
6
На Фиг. 7 приведен спектр Н ЯМР раствора аморфного леналидомида по примеру 1 (ДМСО-D, 400, 13 МГц).
1
6
На Фиг. 8 приведен спектр Н ЯМР раствора аморфного леналидомида по примеру 2а (ДМСО-D, 400, 13 МГц).
На Фиг. 9 приведен график сравнительной оценки терапевтической эффективности наноаморфного, аморфного и кристаллического леналидомида в эксперименте при начале медикаментозного лечения на следующий день после прививания опухолевых клеток.
На Фиг. 10 приведен график сравнительной оценки терапевтической эффективности наноаморфного, аморфного и кристаллического леналидомида в эксперименте по влиянию леналидомида на уже имеющуюся опухоль.
Осуществление изобретения
Для образца наноаморфного леналидомида, полученного по примеру 1, в условиях дифференциальной сканирующей калориметрии при скорости нагрева 10°С/мин, наблюдаются следующие тепловые эффекты: температура стеклования (Tg) 127,5°С, кристаллизация 172,7°С (экзотермический, удельный тепловой эффект 91,03 Дж/г), плавление 266,4°С (эндотермический удельный тепловой эффект 147,6 Дж/г). Для образца наноаморфного леналидомида, полученного по примеру 2а, в условиях дифференциальной сканирующей калориметрии при скорости нагрева 10°С/мин, наблюдаются следующие тепловые эффекты: температура стеклования (Tg) 118,32°С, кристаллизация 172,6°С (экзотермический, удельный тепловой эффект 80,51 Дж/г), плавление 267,5°С (эндотермический, удельный тепловой эффект 147,6 Дж/г). Учитывая близкие значения температур и величин тепловых эффектов на графиках ДСК, зарегистрированных при одинаковых условиях, можно считать, что оба образца относятся к одной и той же наноаморфной форме леналидомида. На Фиг. 4 представлена дериватограмма наноаморфного леналидомида по примеру 1 (кривая А) и известной кристаллической формы А (кривая В, адаптировано из описания к патенту США №7465800, (опубл. 16.12.2008; МПК: A61K 31/445; A61K 31/454; C07D 401/04; A61K), которая характеризуется только одним эндотермическим эффектом, соответствующим плавлению при температуре 266,4°С. Сравнение двух дериватограмм позволяет предположить, что наноаморфный леналидомид по настоящему изобретению кристаллизуется именно в форму А при температуре 172,7°С, которая затем плавится при 266,4°С (для образца по примеру 1).
Поскольку координаты экстремума на кривой ДСК существенно зависят от конструкции прибора и условий проведения эксперимента, во всех случаях в качестве температуры фазового перехода принималась температура, соответствующая точке пересечения экстраполированной в область пика базовой линии графика с касательной к точке перегиба на левом плече кривой (Tonset). Температуру стеклования (расстекловывания) Tg определяли, как точку S-образного перегиба кривой ДСК в области, где теплоемкость системы резко изменялась. Высокая чистота полученных образцов наноаморфного леналидомида исключает возможность проявления примесями и остаточными органическими растворителями «пластифицирующего» эффекта на полученную наноаморфную форму леналидомида. Это обеспечивает достоверность определенного значения температуры стеклования для веществ по изобретению. Принято считать, что статистический разброс результатов для Tg может варьироваться в зависимости от природы материала в пределах 2-5% (внутрилабораторный тест) и 2-7% (межлабораторный тест).
Стабильность и низкая гигроскопичность наноаморфной формы леналидомида по изобретению по сравнению с известными аморфными формами леналидомида подтверждена соответствующими исследованиями (примеры №5 и 6).
Испытания на животных показывают, что наноаморфная форма леналидомида по изобретению, характеризующаяся указанными выше параметрами и полученная предложенными в настоящем изобретении способами, обладает улучшенной биологической доступностью и терапевтической эффективностью при лечении опухолевых заболеваний, чем известные аморфные формы, полученные по примерам 3а, b и кристаллическая форма леналидомида.
1
1
Физико-химический анализ леналидомида был осуществлен методами ядерной магнитной спектроскопии Н ЯМР, масс-спектрометрии, ВЭЖХ, ГЖХ и порошковой рентгеновской дифракции. Спектры Н ЯМР были зарегистрированы в насыщенном растворе дейтерированного диметилсульфоксида (ДМСО-D6) на ЯМР-спектрометре высокого разрешения VXR-400 фирмы "VAPJAN" (США) на рабочей частоте 400,13 МГц для протонного спектра и 100,61 МГц для углеродного. Рентгенофазовый анализ (РФА) проводили на дифрактометре Rigaku D/MAX-2500 (Rigaku, Япония) на Си Ка излучении (λ=1,54056 ). Содержание воды анализировалось на автоматическом титраторе C20D, Mettler Toledo (Швейцария). Размер частиц определяли при помощи анализатора Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments). Условия проведения анализа методом ВЭЖХ см. в примере №9.
Возможность осуществления заявленной группы изобретений иллюстрируется следующими примерами, но не ограничивается только ими.
Пример №1. Получение наноаморфного леналидомида из кристаллического леналидомида.
+
1
В трехгорлую круглодонную колбу объемом 500 мл, оснащенную механической якорной мешалкой, загрузили 40,0 г D-фруктозы, 15,0 г лактозы моногидрата и 40,0 г мочевины. Смесь нагрели до температуры 55°С при медленном перемешивании, при этом происходило сплавление компонентов. В полученный полупрозрачный сироп вносили тремя равными порциями с интервалом 5 минут 10,0 г кристаллической формы леналидомида (производства Henrikang, Китай). Спектр порошковой рентгеновской дифракции сырьевого кристаллического леналидомида приведен на Фиг. 1. Перемешивание продолжали в течение 15 минут до получения вязкой однородной массы при температуре 55°С. Горячий сироп вылили в 500 мл очищенной, охлажденной до +7°С воды при интенсивном перемешивании в течение 20 мин. Выделившийся осадок леналидомида отфильтровали на стеклянном пористом фильтре Шотта (S3), повторно суспендировали в 500 мл очищенной воды и перемешивали в течение 1 часа при температуре 20°С. Осадок отфильтровали на стеклянном пористом фильтре Шотта (S3), промыли на фильтре 3×100 мл воды очищенной и высушили под вакуумом до постоянной массы при температуре +40°С. Получили 9,79 г леналидомида. Выход 98%. Содержание основного вещества - 99,89%) по данным ВЭЖХ. ESI-MS: m/z=260,33 (M+H). Образец полученного вещества полностью рентгеноаморфен (Фиг. 3). Средний размер частиц составил 58,6 нм (Фиг. 6А). Исследование полученного вещества методом дифференциальной сканирующей калориметрии показало следующие термические эффекты: эндотермический при 127,5°С (температура стеклования), экзотермический 172,7°С (кристаллизация) и эндотермический 266,4°С (плавление). Сохранность молекулярной структуры леналидомида, отсутствие продуктов деградации и других органических примесей, включая значимые уровни остаточных органических растворителей, подтверждается спектром Н ЯМР полученного продукта (Фиг. 7).
Пример №2а. Синтез наноаморфного леналидомида.
К кипящей, хорошо перемешиваемой взвеси серого чугуна в виде дроби колотой с размером частиц 0,3 мм (15,30 г) в 50%-м водном этаноле (300 мл) постепенно добавляли 3-(4-нитро-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион (10,00 г, 0,038 моль). В реакционную смесь прикапывали небольшое количество соляной кислоты (5 мл). Реакцию проводили в трехгорлой круглодонной колбе, снабженной механической мешалкой и обратным холодильником.
По окончании восстановления реакционную смесь нейтрализовали 7% раствором бикарбоната натрия до рН 7,0 и фильтровали на стеклянном пористом фильтре Шотта (S3). Из полученного осадка продукт экстрагировали диметилсульфоксидом, при этом оставалось небольшое количество нерастворимого шлама. Раствор пропускали через слой диатомита (Celite 545). Осветленный раствор нагревали до 40°С и постепенно добавляли к охлажденной до 5-10°С воде при перемешивании (700 об/мин). Полученный осадок отфильтровывали на фильтре Шотта (S3), промывали очищенной водой 3×100 мл.
1
Полученный осадок вносили при медленном перемешивании в трехгорлую кругло донную колбу объемом 250 мл, оснащенную механической якорной мешалкой, содержащий расплав 20,0 г D-фруктозы, 7,5 г лактозы моногидрата и 20,0 г мочевины, нагретый до температуры 55°С, Перемешивание продолжали в течение 15 минут до получения вязкой однородной массы при температуре 55°С. Горячий сироп выливали в 300 мл очищенной, охлажденной до +7°С воды и интенсивно перемешивали в течение 20 мин. Выделившийся осадок леналидомида фильтровали на стеклянном пористом фильтре Шотта (S3), повторно суспендировали в 300 мл очищенной воды и перемешивали в течение 1 часа при температуре 20°С. Осадок отфильтровывали на стеклянном пористом фильтре Шотта (S3), промывали на фильтре 3×70 мл воды очищенной и высушивали под вакуумом до постоянной массы при температуре +40°С. Получали 8,05 г рентгеноаморфного 3-(4-амино-1-оксо-1,3-дигидро-2H-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-диона. Содержание основного вещества - 99,80% по данным ВЭЖХ. Средний размер частиц составил 69,1 нм (Фиг. 6В). Выход 82%). Сохранность молекулярной структуры леналидомида, отсутствие продуктов деградации и других органических примесей, включая значимые уровни остаточных органических растворителей, подтверждается спектром Н ЯМР полученного продукта (Фиг. 8).
Пример №2b. Синтез наноаморфного леналидомида.
2
2
2
2
2
2
2
Синтез проводили аналогично Примеру 2а на загрузке исходного 3-(4-нитро-1-оксо-1,3-дигидро-2Н-изоиндол-2-ил)пиперидин-2,6-дион (1,00 г, 0,0038 моль), с отличием в том, что в качестве восстановителя вместо колотой дроби серого чугуна использовали восстановленное железо, 97%, порошок <0,044 мм (325 mesh) (209309, Sigma-Aldrich). Выход продукта составил 77%. Спектр 1H ЯМР (ДМСО-d6, δ, м.д.): 11,01 (с, 1H, NH); 7,20 (т, J=7,6 Гц, 1H, Н-6); 6,93 (д, J=7,4 Гц, 1H, Н-7); 6,81 (д, J=7,9 Гц, 1H, Н-5); 5,43 (с, 2Н, NH); 5,12 (дд, J=13,3, 5,1 Гц, 1H, NCH); 4,19 (д, J=16,9 Гц, 1H, NCH); 4,13 (д, J=16,9 Гц, 1H, NCH), 2.92 (ддд, J=18,1, 13,6, 5,4 Гц, 1H, СОСН); 2.64 (дт, J=17,2, 3,2 Гц, 1H, СОСН); 2,32 (кв д, J=13,2, 4,4 Гц, 1Н, СН); 2.06-2.01 (м, 1H, СН).
Пример №3а. Получение аморфного леналидомида (пример сравнения).
Аморфный леналидомид получали по способу, раскрытому в патенте Канады СА2717326С, примеру 8. Леналидомид (2,00 г) растворяли при перемешивании в смеси метанола (25 мл) и диметилформамида (25 мл) при 34°С. Прозрачный раствор нагревали до 60°С в течение 2 минут и упаривали на распылительной сушильной установке Buchi В290 в условиях, соответствующих примеру 8. Получали 1,02 г рентгеноаморфного леналидомида. Выход 51%. Средний размер частиц составил 482,6 нм (Фиг. 6С). Образец хранили при температуре не выше +5°С в полиэтиленовой банке с крышкой, заполненной азотом в течение не более 5 дней.
Пример №3b. Получение аморфного леналидомида (пример сравнения).
Аморфный леналидомид получали аналогично способу, раскрытому в патенте Канады СА2717326С, примеру 9. Леналидомид (1,00 г) измельчали на планетарной шаровой мельнице с мелющими шарами из карбида вольфрама в течение 2 часов на скорости 450 об/мин с реверсивным движением каждые 10 минут. Получали 0,91 г рентгеноаморфного леналидомида. Выход 91%. Содержание основного вещества 99,29% по данным ВЭЖХ. Средний размер частиц составил 523,3 нм (Фиг. 6D). Образец хранили при температуре не выше +5°С в полиэтиленовой банке с крышкой, заполненной азотом в течение не более 5 дней.
Пример №4. Определение остаточных органических растворителей.
Для образцов аморфного леналидомида по изобретению остаточные органические растворители определяли методом газовой хроматографии в соответствии с ГФ РФ (ОФС.1.1.0008.15 «Остаточные органические растворители», ОФС.1.2.1.2.0004.15 «Газовая хроматография», ОФС.1.2.1.2.0001.15 «Хроматография») на газовом хроматографе с программированием температуры, снабженном пламенно-ионизационным детектором GC-2010 Plus, Shimadzu (Япония) и автоматическим устройством для анализа равновесной паровой фазы типа «Headspace», АОС-5000 Plus, Shimadzu (Швейцария).
Хроматографические условия:
- капиллярная кварцевая колонка размером 30 м × 0,32 мм, заполненная сорбентом (6%-цианопропилфенил)-диметилполисилоксан, толщина неподвижной фазы 1,8 мкм (типа ZB-624, кат. №: 7HM-G005-31, «Phenomenex», США);
- температура колонки - градиент: 110°С (3 мин) → 15°С/мин 190°С (3 мин);
- температура инжектора 200°С;
- детектор - пламенно-ионизационный (ПИД);
- скорость подачи воздуха для ПИД - 450 мл/мин;
- скорость подачи водорода для ПИД - 45 мл/мин;
- температура детектора - 250°С;
- газ-носитель - азот;
- скорость газа-носителя - 1 мл/мин;
- расщепление потока - 20:1;
- время регистрации - 11,33 мин.
Пример №5. Исследование растворимости аморфного леналидомида.
Сравнение растворимости кристаллической и аморфных форм леналидомида проводится в 0,2 М фосфатном буфере при рН 6,8. Навеску образца леналидомида (300 мг) добавляют к 10,0 мл фосфатного буфера в колбу и оставляют на 48 часов на орбитальном шейкере KS 130 Basic IKA. Отбирают 5,0 мл содержимого колбы, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 минут, а затем пропускают надосадочную жидкость через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм типа Millex HN «Merck Millipore», отбрасывая первые порции фильтрата. Результат оценивают по данным ВЭЖХ. В качестве стандартного раствора леналидомида используют раствор с известной концентрацией 10 мг/мл. Исходя из этого, осуществляется пересчет для всех исследуемых растворов.
Наноаморфный леналидомид по примеру 1 - 0,625±0,005 мг/мл;
Наноаморфный леналидомид по примеру 2а 0,623±0,005 мг/мл;
Аморфный леналидомид по примеру 3а - 0,597±0,005 мг/мл;
Кристаллический леналидомид, форма А - 0,540±0,005 мг/мл.
Пример №6. Исследование стабильности аморфного леналидомида.
Стабильность образцов наноаморфного леналидомида, полученных по примерам 1 и 2 была подтверждена отсутствием пиков в спектре порошковой рентгеновской дифракции после двух месяцев хранения при температуре 25±2°С и относительной влажности 60±5%. На Фиг. 2 представлены дифрактограммы образцов наноаморфного леналидомида до испытания на стабильность (график а) и после испытаний (график b). Для образца аморфного леналидомида, полученного известным способом по примерам 3а, b (примеры сравнения) в спектрах порошковой рентгеновской дифракции наблюдались заметные рефлексы кристаллической формы на фоне широкого гало спустя 1 месяц хранения при вышеуказанных условиях.
Пример №7. Исследование гигроскопичности аморфного леналидомида по примерам la, 2а, b и 3а, b и кристаллической формы леналидомида.
Оценка гигроскопичности образцов аморфного леналидомида, полученных по примерам 1a, 2a, b, 3а, b и кристаллической формы леналидомида производилась в соответствии с Европейской Фармакопеей [Characters section in monographs. European Pharmacopoeia 6, version 6.8, Section 5.11 ed.2010] в условиях относительной влажности 80±2% при 25°С в течение 24 ч.
В соответствии с критериями Европейской Фармакопеи - прибавка в массе образца < 2% и > 0,2%, все исследованные образцы леналидомида следует классифицировать как слабо гигроскопичные.
Пример №8. Получение готового лекарственного средства в форме твердых желатиновых капсул, содержащих наноаморфный и аморфный леналидомид, 10 мг.
Отвешивают на весах и просеивают в индивидуальные маркированные контейнеры следующие компоненты:
- Леналидомид наноаморфный, полученный по примерам №1, 2а, b или аморфный по примерам 3а, b - 1000,0±1,0 г;
- Лактоза микрокристаллическая (DFE pharma, Германия) - 29400±1,0 г;
- Целлюлоза микрокристаллическая (VIVAPUR 102, производства JRS PHARMA, Германия) - 8000±1,0 г;
- Кроскармеллоза натрия (Blanver, Бразилия) 1200±1,0 г;
- Магния стеарат (NutriMag STv, Galmags GmbH, Германия) - 400±1,0 г Просев сырья осуществляется на автоматической просеивающей
машине через сито с размером отверстий 0,200±0,0083 мм для стеарата магния, 0,400±0,015 мм для остальных компонентов.
В смеситель-гранулятор загружают аморфный леналидомид и кроскармеллозу натрия и перемешивают массу в течение 7-9 мин со скоростью 1000 об/мин. Затем добавляют целлюлозу микрокристаллическую и перемешивают массу в течение 10-12 мин со скоростью 20 об/мин. По прошествии указанного времени в смеситель загружают лактозы моногидрат и перемешивают еще 10-12 мин на скорости 20 об/мин. Далее загружают магния стеарат и перемешивают 2-5 мин на скорости 20 об/мин. Полученную капсульную смесь вручную выгружают из бункера смесителя в промаркированный тарированный контейнер. Капсульную массу фасуют в твердые желатиновые капсулы №0 производства Capsulgel на автоматической капсулонаполняющей машине. Содержимое капсул - порошок белого или белого с желтоватым оттенком цвета массой 400,0 мг ± 7,5% (от 370 мг до 430 мг).
Пример №9. Ускоренные испытания стабильности капсул, содержащих леналидомид, 10 мг.
Ускоренные испытания стабильности препарата проводились в течение 12 месяцев при температуре 40±2°С и относительной влажности 75±5%. На основании результатов изучения стабильности подтвержден срок годности лекарственного препарата в течение 24 месяцев.
Данные по стабильности препарата на основе наноаморфного леналидомида по примеру 1.
Данные по стабильности препарата на основе наноаморфного леналидомида по примеру 2а.
Данные по стабильности препарата на основе аморфного леналидомида по примеру 3а.
Данные по стабильности препарата на основе аморфного леналидомида по примеру 3b.
Количественное определение проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе, снабженном ультрафиолетовым детектором, системой построения градиента и системой обработки данных.
В мерную колбу вместимостью 20 мл помещали 1,0 мл стандартного раствора леналидомида с концентрацией 1 мг/мл, доводили объем раствора до метки 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты и перемешивали. Отбирали 1 мл полученного раствора и переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл. Затем доводили объем раствора до метки 0,1 М раствором хлористоводородной кислоты и перемешивали. Конечная концентрация в растворе леналидомида составила 0,005 мг/мл.
Приготовление испытуемого раствора.
10 капсул с дозировкой 10 мг помещали в мерную колбу вместимостью 200 мл, прибавляли 100 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты, затем обрабатывали ультразвуком в течение 20 мин. После интенсивно перемешивали на вихревой лабораторной мешалке в течение 1-2 мин, добавляли 50 мл 0,1 М раствора хлористоводородной кислоты и обрабатывали ультразвуком в течение 20 мин до полного разрушения оболочки капсул. Охлаждали полученный раствор до комнатной температуры, доводили объем раствора до метки растворителем и перемешивали. Полученный раствор фильтровали через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм (типа Millex HN «Merck Millipore» или аналогичный), отбрасывая первые порции фильтрата. 1 мл полученного раствора (фильтрата) переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора до метки растворителем и перемешивали (раствор леналидомида с концентрацией 0,005 мг/мл).
Хроматографические условия:
- колонка из нержавеющей стали размером 250×4,6 мм, заполненная сорбентом CN с размером частиц 5 мкм (типа Zorbax SB-CN кат. №880975905 Agilent, США или аналогичная);
- подвижная фаза состоит из раствора Э1 и метанола в соотношении 3:1 соответственно;
- элюирование осуществляли в изократическом режиме;
- скорость потока подвижной фазы - 1,0 мл/мин;
- объем инжекции - 10 мкл;
- промывка внешней стороны иглы растворителем перед каждой инжекцией;
- температура термостата автосемплера - 5°С;
- температура термостата колонки - 30°С;
- детектирование (УФ) - 210 нм ± 4 нм;
- длина волны сравнения - 360 нм ± 100 нм;
- время хроматографирования - 12 мин.
В указанных условиях ожидаемое время удерживания пика леналидомида составляло около 6-7 мин.
Количество леналидомида, в миллиграммах на капсулу (X), рассчитывали по формуле:
1
где: S - площадь пика леналидомида на хроматограмме испытуемого раствора;
0
S - площадь пика леналидомида на хроматограмме стандартного раствора;
0
а - навеска вторичного стандартного образца наноаморфного леналидомида, в миллиграммах;
i
i
al - аликвота, используемая для приготовления испытуемого раствора, мл (al для дозировки 10 мг = 1,0);
Р - содержание леналидомида в вторичном стандартном образце, в процентах;
i1
i1
V - объем мерной колбы, используемой для приготовления испытуемого раствора, мл (V для дозировки 10 мг = 200);
i2
i2
V - объем мерной колбы, используемой для приготовления испытуемого раствора, мл (V для дозировки 10 мг = 100).
Пример №10. Исследование фармако кинетики аморфного леналидомида.
Крысы - самцы Спрег-Доули (n=4) весом 180-200 г содержались в стандартных лабораторных условиях при температуре 22±2°С и относительной влажности 40±5%. Вода и пища находились в свободном доступе. Животных не кормили накануне приема препарата и 3 часа после полученной дозы. Забор крови проводился через катетер, установленный в яремной вене.
Субстанция на основе аморфного леналидомида в дозировке 10 мг/кг вводилась через желудочный зонд в виде водной суспензии, содержащей 0,5% карбоксиметилцеллюлозы и 0,25%) Tween80. Объем вводимой дозы 5 мл/кг. Препарат на основе кристаллического леналидомида в дозировке 10 мг/кг вводился внутривенно через хвостовую вену. Образцы крови (0,2 мл) отбирались через 0,5; 1; 2; 5; 10 и 24 ч и помещались в капилляры с гепарином. Плазма центрифугировалась при комнатной температуре в течение 1,5 мин при 4200 об/мин и хранилась при температуре -80°С.
в/в
max
1/2
При внутривенном введении были получены следующие фармакокинетические данные: AUC=226 мин×нг/мл, C=17,8 нг/мл, T=0,03 ч.
Фармакокинетические параметры наноаморфных и аморфных форм леналидомида и кристаллической после перорального и внутривенного введения крысам.
Биодоступность рассчитывали по следующей формуле:
*Различия можно считать статистически достоверными (p≤0.05).
Пример №11. Сравнительная оценка терапевтической эффективности аморфного леналидомида.
Для эксперимента использовались мыши-самки в возрасте 8 недель. Животные содержались в стандартных лабораторных условиях при температуре 22±2°С и относительной влажности 40±5%. Вода и пища находились в свободном доступе.
Субстанция на основе леналидомида в дозировке 50 мг/кг вводилась через желудочный зонд в виде водной суспензии, содержащей 0,5% карбоксиметилцеллюлозы. Объем вводимой дозы 0,1 мл ежедневно 1 раз в день. Контрольная группа получала 0,1 мл раствора 0,5% карбоксиметилцеллюлозы.
7
2
к
д
к
д
Для определения противоопухолевой активности препаратов на основе леналидомида мышам прививались 3×10 клеток HS Sultan Burkitt в 100 мкл RPMI-1640 среды совместно с 100 мкл Матригель. В первом эксперименте лечение начиналось на следующий день после прививки опухолевых клеток, во втором эксперименте медикаментозная терапия начиналась на следующий день после развития видимой опухоли. Препарат вводился перорально ежедневно. Для определения объема опухоли использовалась следующая формула (D)×(D)×0,5, где D - наименьший диаметр, D - наибольший диаметр опухоли. Измерения диаметров проводились штангенциркулем.
Мыши были разделены на 4 группы по 6 особей в каждой. Первая группа (контрольная) получала только раствор карбоксиметилцеллюлозы, вторая группа получала лечение препаратом на основе кристаллического леналидомида формы А, третья группа получала лечение препаратом на основе аморфного леналидомида по примеру 3а, четвертая группа получала лечение препаратом на основе наноаморфного леналидомида по примеру 1.
3
В эксперименте начиналось медикаментозное лечение на следующий день после прививания опухолевых клеток. У животных в контрольной группе разрастание опухоли происходило в среднем на 15 день (диапазон 7-18). Животных умерщвляли в среднем на 26 день (диапазон 21-32) из-за большого объема опухоли (более 2000 мм). После 18 дня лечения в третьей и в четвертой группе наблюдалось значительное подавление опухолевого роста, по сравнению со второй группой, получавшей лечение препаратом на основе кристаллического леналидомида (см. Фиг. 9).
3
В другом эксперименте изучалось влияние леналидомида на уже имеющуюся опухоль. Медикаментозное лечение начиналось, когда опухоль определялась при пальпации (объем больше 177 мм), в среднем на 6-ой день (диапазон 4-15) после прививки опухолевых клеток. Все животные, получавшие лечение, показывали увеличение выживаемости. Все животные из четвертой группы были живы на 45-й день эксперимента. Кроме того, рост опухоли замедлялся у всех животных, получавших лечение. Важно, что лечение препаратом на основе наноаморфного леналидомида по примеру 1 привело к полной регрессии опухоли у 4 мышей из 12. Эти 4 животных с полной ремиссией опухоли дополнительно получали ежедневные инъекции препарата в течение 10 дней: у двух из этих животных опухоль рецидивировала через 16 и 27 дней после прекращения лечения; у остальных мышей наблюдалась стойкая полная ремиссия опухоли до 102 дней (см. Фиг. 10).
Во всех экспериментах у животных не наблюдалось признаков токсичности или потери веса.