Доклинические испытания противоопухолевого фермента L-лизин-а-оксидазы

е

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Доклинические испытания противоопухолевого фермента Ь-лизин-а-оксидазы

В. М. ПОДБОРОНОВ1, А. Е. КУЗОВНИКОВ2, А. К. ЗАЙЦЕВА2, И. П. СМИРНОВА2

1 Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, Москва

2 Российский университет дружбы народов, Москва

Preclinical Trials of L-Lysine-a-Oxidase, an Antitumor Enzyme

V. M. PODBORONOV, A. E. KUZOVNIKOV, A. K. ZAITSEVA, I. P. SMIRNOVA

N. F. Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow Russian Peoples' Friendship University, Moscow

Изучено влияние Ь-лизин-а-оксидазы из гриба Trichoderma на гуморальный иммунный ответ к белковым антигенам. Установлено, что введение Ь-лизин-а-оксидазы в дозе 35 ЕД/кг внутривенно, пятикратно не оказывало депрессивного действия на показатели гуморального иммунитета. Фермент не оказывает супрессивного действия на гиперчувствительность замедленного типа к ксеногенным эритроцитам. Использование Ь-лизин-а-оксидазы в терапевтической дозе и в два раза её превышающей достоверно не сказывалось на миграционной способности лейкоцитов по сравнению с контролем.

Ключевые слова: L-лизин-а-оксидаза, иммуногенные свойства, триходерма.

The effect of L-lysine-a-oxidase from a representative of the Trichoderma genus on the humoral immune response to protein antigens was studied. It was shown that repeated fife-fold intravenous administrations of L-lysine-a-oxidase in a dose of 35 U/kg had no depressive action on the humoral immunity. The enzyme had no suppressive effect on the delayed type hypersensitivity to xenogenous erythrocytes. The use of L-lysine-a-oxidase in a therapeutic dose or in a twice as higher dose had no reliable effect on the leukocyte migration capacity vs. the control.

Key words: L-lysine-a-oxidase, immunogenic properties, Trichoderma.

Ь-лизин-а-оксидаза — новый фермент, полученный из гриба рода ТпсНойвгта. Фермент осуществляет реакцию окислительного дезаминирования незаменимой аминокислоты Ь-лизина.

Ранее нами проводились исследования на животных по изучению биологического эффекта полученной субстанции. Как показали исследования, фермент полифункционален. Полученная субстанция обладает антивирусным, противоопухолевым, антимикробными свойствами, является иммуномодулятором и может быть использована для получения лекарственных форм разной терапевтической направленности [1—9].

Продолжены некоторые доклинические испытания новой субстанции Ь-лизин-а- оксидазы.

Целью настоящей работы стало изучение влияния Ь-лизин-а-оксидазы из ТпсНойвгта Наг11апыт ШГа1 на гуморальный иммунный ответ к белковым антигенам.

© Коллектив авторов, 2010

Адрес для корреспонденции: 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6. РУДН

Схема изучения влияния Ь-лизин-а-оксидазы на иммунный ответ к белку Ь-аспарагиназе из Е.соіі.

Примечание. 1-я группа ( контрольная) получала только 1_-лизин-а-оксидазу; 2-я группа (опытная) - предварительно иммунизирована 1_-лизин-а-оксидазой, затем иммунизировалась, как контрольная группа.

Материал и методы

Влияние Ь-лизин-а-оксидазы на гуморальный иммунный ответ к водорастворимым белковым антигенам: овальбу-мину и Ь-аспарагиназе из Е.соіі изучено методом непрямого гетерогенного иммуноферментного анализа (ИФА).

Выбор белкового антигена может быть достаточно произвольным. Стратегия опыта разрабатывалась так, чтобы на фоне реакции организма к контрольному белку была ощутима реакция к испытуемому препарату. Для выбора оптимальной модели нами проведён эксперимент в двух вариантах:

1) влияние Ь-лизин-а-оксидазы на гуморальный иммунный ответ при однократном её введении в терапевтической дозе совместно с достаточно слабым иммуногеном овальбу-мином;

-е-

Є

2) влияние препарата при многократном его введении в терапевтической дозе на иммунный ответ к белку Ь-аспараги-назе из Е.соїі.

Схема опыта показана на рисунке.

Для оценки влияния Ь-лизин-а- оксидазы на уровень антител к овальбумину использовали мышей линии СВА, которым вводили однократно внутривенно овальбумин в дозе 2 мг/кг и фермент Ь-лизин-а- оксидазу в дозе 100 МЕ/кг внутривенно. Для изучения влияния Ь-лизин-а- оксидазы на анти-телообразование к Ь-аспарагиназе Е.соїі мышам линии С57В1 вводили внутрибрюшинно, трёхкратно Ь-лизин-а-оксидазу в дозе 35 ЕД/кг, а затем Ь-аспарагиназу Е.соїі в дозе 300 МЕ/кг также внутрибрюшинно в течении трёх дней. Отбор крови у мышей проводили на 7-, 14-, 21-, 28-е сутки от начала иммунизации Ь-аспарагиназой. Исследование мышиных антисывороток проводили в динамике (на 7-, 14-, 21-е сутки от начала иммунизации) с помощью метода ИФА.

Результаты и обсуждение

Результаты анализов представлены в табл. 1 и 2.

Как видно из табл. 1, под влиянием фермента Ь-лизин-а-оксидазы антителообразование к овальбумину происходит несколько слабее, чем в контрольных группах животных, не получавших Ь-лизин-а-оксидазу. Однако, при многократном введении препарата (см. табл. 2) не было обнаружено его влияния на иммунный ответ к более сильному иммуногену — Ь-аспарагиназе Е.соїі. На основании полученных данных можно сделать вывод, что изученный препарат практически не оказывает влияние на гуморальный иммунный ответ к белковым антигенам.

В дальнейшем мы продолжили наши исследования и изучили влияние препарата на

иммунный ответ к Т-зависимому антигену (эритроциты барана, ЭБ). Исследовано влияние Ь-лизин-а-оксидазы на синтез антител к Т-зависимому антигену по данным гемаглю-тинации и количеству антителообразующих клеток. Анализ сывороток мышей линии СВА., иммунизированных нативной Ь-лизин-а-оксидазой внутривенно, пятикратно в дозе 35 ЕД/кг показал,что препарат практически не влиял на иммунный ответ к Т-зависимому антигену. Титры антител у сильнореагирующей линии мышей СВА достоверно не отличались у контрольных и опытных животных на соответствующие сроки и в опыте на 7 и 14 сутки 7,0±0,2 ^2 и 7,2±0,3 1о§2, а в контроле 6,9±0,2 ^2 и 7,2±0,3 1о§2 при р>0, 05 (различие между опытом и контролем).

Влияние Ь-лизин-а-оксидазы на гуморальный иммунный ответ к Т-зависимому антигену также оценивали по количеству антителообразующих клеток в спленоцитах мышей СВА. Как видно из табл. 3, нативная и модифицированная Ь-лизин-а-оксидаза вызывает некоторое подавление синтеза антител класса ^М, однако достоверных различий между опытом и контролем выявить не удалось. Также не было различий между влиянием препарата на количество антител между нативным и модифицированным ферментом (см. табл. 3).

В последующих экспериментах изучалось влияние нативной Ь-лизин-а-оксидазы на кле-

Таблица 1. Влияние Ь-лизин-а-оксидазы на иммунный ответ к овальбумину

Срок Титр антисыворотки

контроль опыт

7 сут 1/64 1/4

14 сут 1/16 1/8

21 сут 1/8 1/4

Таблица 2. Влияние Ь-лизин-а-оксидазы на иммунный ответ к Ь-аспарагиназе Е.соіі

Срок Титр антисыворотки

контроль опыт

7 сутки 1/64 1/64

14 сутки 1/128 1/128

21 сутки 1/1024 1/512

28 сутки 1/128 1/128

Таблица 3. Влияние Ь-лизин-а-оксидазы на иммунный ответ к Т-зависимому антигену

Препараты Количество Количество Р*

животных антителообразующих

в группе клеток на 105 спленоцитов

Контроль-1 (физиологический раствор) 15 278,0+17,47

Ь-лизин-а-оксидаза (нативная-1) 12 218,8+13,52 >0,05

Ь-лизин-а-оксидаза (нативная-2) 12 220,8+12,86 >0,05

Контроль-2 (физиологический раствор) 14 335,8+14,11 —

Ь-лизин-а-оксидаза (модифицированная) 13 352,4+18,34 >0,05

Примечание. Контроль-1 - относится к группе животных, получавших нативный фермент. Контроль-2 - относится к группе животных, получавших модифицированный фермент. р* - дано в сравнении с соответствующими контролями. Опыты выполнены на мышах линии СВА, которым вводили препарат в дозе 35 ЕД/кг внутривенно, пятикратно.

е

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

Таблица 4. Влияние нативной Ь-лизин-а-оксидазы на гиперчувствительность замедленного типа к ЭБ

Пpeпapaт Дoзa, Бeлoк, Koличecтвo Индете p* p** ЕД/кг мг/кг жив(>тмых |)еакции, в ipynne %

Контроль (физиологический раствор) L-лизин-а-оксидаза (нативная) L-лизин-а-оксидаза (нативная) — — 15 18,0+1,2 — — 35 0,35 17 16,5 + 1,4 >0,05 — 125 1,25 14 17,б+1,3 >0,05 >0,05

Примечание, р* - дано в сравнении с контролем; р** - дано в сравнении с разными дозами. Опыты выполнены на мышах линии СВА; препарат вводили в дозе 35 ЕД/кг и 125 ЕД/кг, внутривенно.

Таблица 5. Влияние Ь-лизин-а-оксидазы на развитие гиперчувствительности замедленного типа

Пpeпapaт Bpeмя тecтиpoвaния p* б ч 24 ч Величина oтёкa, мм

Контроль (р-р Хенкса) L-лизин-а-оксидаза 1,2+0,13 (n=15) 1,3+0,21, (n=15) >0,05 1,3+0,15 1,2+0,13 >0,05

Примечание, р*— уровень значимости различий приведён в сравнении с соответствующим контролем; п - количест-

во животных в группе. Опыты выполнены на мышах линии HP.

Таблица 6. Действие L-лизин-а-окшдазы на Фонтанную миграцию лейкоцитов перефериче^ой крови мышей линии СВА

Пpeпapaт

Дoзa фepмeнтa

Длина пpoбeгa в делениях микpoмeтpичecкoй линейки

Контроль 1, n=8 Физиологический раствор 8,1+1,1 —

L-лизин-а-оксидаза, n=10 7EД/кг, 1/5ХД 7,0+0,8 > 0,5

L-лизин-а-оксидаза, n=10 14EД/кг, 1/2ГД 9,5+0,7 > 0,5

Контроль 2, n=9 Физиологический раствор 14,1+3,5 —

L-лизин-а-оксидаза, n=10 35EД/кг, ХД 11,9+1,2 > 0,5

L-лизин-а-оксидаза, n=10 70EД/кг, 2ХД 9,2+2,2 > 0,5

Примечание. Здесь и в табл. 7: р* - дано в сравнении с соответствующим контролем. Контроль 1 - животные не получавшие препарат, относится к группам, получавшим препарат в дозе 7 и 14 ЕД/кг. Контроль 2 - животные не получавшие препарат, относятся к группам, получавшим препарат в дозе 35 и 70 ЕД/кг. п - количество животных; ТД - терапевтическая доза.

точно-опосредованные реакции. Исследовалась гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ), отражающая состояние Т-клеточного иммунитета, на модели иммунного воспаления, вызванного сенсибилизацией эритроцитами барана. Нативный фермент в дозе 35 ЕД/кг вводили трёхкратно, затем на четвёртые сутки вводили антиген (ЭБ), затем дважды вводили препарат.

Как видно из табл. 4, фермент Ь-лизин-а-ок-сидаза не изменял ГЗТ, достоверных различий между опытной и контрольной группами по показанию индекса реакции (ИР) выявлено не было.

В следующей серии опытов изучено сенсибилизирующее действие Ь-лизин-а-оксидазы на модели гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), но в данном случае в отличие от предыдущего опыта использовался сам препарат. Результаты изучения модуляции ГЗТ под действием фермента показали, что Ь-лизин-а-оксидаза в дозе 35 ЕД/кг, введённая два раза внутрикожно, не оказывает влияния на ГЗТ (табл. 5).

В последующих экспериментах изучено действие препарата Ь-лизин-а-оксидазы на функциональную активность Т-лимфоцитов, на способ-

ность T-лимфоцитов вырабатывать фактор, угнетающий миграцию лейкоцитов, а также действие препарата на митогениндуцированную пролиферацию лимфоцитов в опытах in vivo и in vitro. Результаты изучения действия L-лизин-а-оксидазы на миграционную способность лейкоцитов показали, что многократное парентеральное введение нативного фермента в дозах 35 EД/кг и 70 EД/кг несколько замедляло спонтанную миграцию лейкоцитов. Миграция лейкоцитов в контроле и в опыте с дозой 70 EД/кг составила 14,1+3,5 и 9,2+2,2 соответственно. Однако достоверных различий выявить не удалось (табл. б).

Иное соотношение наблюдали при изучении торможения миграции лейкоцитов. При использовании оптимальной дозы туберкулина 40 мкг/мл было отмечено угнетение миграции в контроле, составившее 24,39+3,73%, а в культурах клеток, выделенных от животных, получавших L-лизин-а-оксидазу в дозах 7 и 14 EД/кг многократно внутривенно, показатели составили 14,2 5+1,79 и 10,11+2,73% соответственно, при p<0,05.

Использование препарата в предполагаемой терапевтической дозе и в два раза её превышаю-

*

Є

Таблица 7. Влияние Ь-лизин-а-оксидазы на миграционную способность лейкоцитов периферической крови мышей линии СВА

Пpeпapaт Доза фермента Длина пробега в делениях микрометрической линейки p*

Контроль 1, n=9 Физиологический раствор, 5 раз 24,39+3,73 —

L-лизин-а-оксидаза, n=10 7 ЕД/кг, внутривенно, 1/5ТД 14,25+1,79 <0,25

L-лизин-а-оксидаза, n=8 14 ЕД/кг, внутрибрюшинно, 1/2ТД 10,11+2,73 <0,05

Контроль 2, n=9 Физиологический раствор, 5 раз 30,92+9,34 —

L-лизин-а-оксидаза, n=10 35 ЕД/кг, внутривенно, ТД 22,17+5,97 >0,05

L-лизин-а-оксидаза, n=9 70 ЕД/кг, внутрибрюшинно, 2ТД 18,71+2,21 >0,05

щей достоверно не сказывалось на миграционном способности лейкоцитов по сравнению с контролем (табл. 7).

Заключение

Таким образом, представленные результаты исследования влияния Ь-лизин-а-оксидазы на гуморальный иммунный ответ показали, что препарат практически не оказывает влияние на гуморальный иммунный ответ к белковым антигенам. Установлено, что многократное введение Ь-ли-зин-а-оксидаза в дозе 35 ЕД/кг внутривенно, пятикратно не оказывало депрессивного действия на показатели гуморального иммунитета. Фермент не

ЛИТЕРАТУРА

1. Смирнова И. П., Алексеев С. Б., Подборонов В. М. Изучение влияния гелевой формы Ь-лизин-а-оксидазы на развитие офтальмогерпеса и герпетических поражений кожи кролика. Антибиотики и химиотер 2003; 48: 11: 11—13.

2. Смирнова И. П., ДиджяпетренеЯ., Алексеев С. Б. и др. Воздействие Ь-лизин-а-оксидазы на карциному кожи мышей, индуцированную метилхолантреном. Там же; 2001; 46: 4: 13—15.

3. Селищева А. А.,Алексеев С. Б., Смирнова И. П., Подборонов В. М. Эффективность антигерпетического действия различных лекарственных форм Ь-лизин-а-оксидазы. Там же 2003; 48: 1: 9—12.

4. Жукова О. С, Хадуев С. Х., Берёзов Т. Т. Влияние Ь-лизин-а-окси-дазы из ТгісНосіегта 8р. на кинетику цикла культивируемых клеток лимфомы Беркитта. Экспер онкол 1985; 6: 42—44.

оказывает супрессивного действия на гиперчувствительность замедленного типа к ксеногенным эритроцитам. Использование Ь-лизин-а-оксида-зы в терапевтической дозе и в два раза её превышающей достоверно не сказывалось на миграционной способности лейкоцитов по сравнению с контролем.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 годы.

Хадуев С. X., Жукова О. С., Добрынин Я. В. и др. Цитостатический эффект Ь-лизин-а-оксидазы из ТпсНойегта 8р. и из ТпсНойегта утйе. Бюлл экспер биол и мед1987; 4: 458—460.

Хадуев С. Х., Глазкова Т. Ю., Веса В. С. и др. Оценка противолей-козной активности Ь-лизин-а-оксидазы из ТпсНойегта 8р. в химиотерапевтических опытах. Там же; 1980: 10: 476.

Уманский В. Ю., Хадуев С. Х., Залеток С. П. и др. Антиметастати-ческий эффект Ь-лизин-а-оксидазы. Там же; 1990; 5: 458а459. Смирнова И. П., Алексеев С. Б., Подборонов В. М., Гришин В. М. Влияние Ь-лизин-а-оксидазы как ингибитора репродукции ВИЧ на специфичность синтеза клеточных белков. Аллергол иммунол 2005; 6: 3: 36—30. Смирнова И. П., Гусъкова Т. А., Пушкина Т. В., Подборонов В. М. Антибактериальная и антигрибковая активность Ь-лизин-а-ок-сидазы ТпсНойегта. «Сибирь-Восток» специал научно-производ мед профиля журн 2003; 1: 61: 10—12.