КОНСОРЦИУМЫ МИКРООРГАНИЗМОВ
CONSORTIA OF MICROORGANISMS

Перекрестные ссылки на имеющие отношение заявки
Данная подача заявки претендует на все преимущества предварительной заявки на патент США серийный No. 62/289020, зарегистрированной 29 января 2016 года, которая включена в настоящий документ путем отсылки во всей своей полноте.
Область техники, к которой относится изобретение
Данное раскрытие относится к консорциумам микроорганизмов и способам применения микроорганизмов, включенных в консорциумы, в частности, для биодеградации и сельскохозяйственных способов и применений.
Уровень техники
Мировой спрос на продукты питания продолжает расти под давлением увеличения роста населения. Однако работники сельского хозяйства сталкиваются, среди прочих проблем, с сокращением количества земель, пригодных для ведения сельского хозяйства, истощением почвы и с изменением условий окружающей среды. Таким образом, существует необходимость в разработке композиций и технологий, которые могут увеличить производство продуктов питания. Необходимо также сделать это, уменьшая применение потенциально опасных гербицидов, инсектицидов и фунгицидов.
Раскрытие изобретения
В настоящем документе раскрыты консорциумы микроорганизмов и композиции, включающие микроорганизмы, для применения в сельскохозяйственных целях или для биодеградации. В некоторых воплощениях, композиция микроорганизмов настоящего раскрытия представляет собой консорциумы микроорганизмов, депонированные в Американской коллекции типовых культур (ATCC, Manassas, VA) 23 декабря 2015, и которому был присвоен номер депозита PTA-122728 (упоминаемый в настоящем документе как A1007) или композицию, включающую некоторые или все микроорганизмы в A1007. В других воплощениях, композиция настоящего раскрытия включает клетки пяти или более видов микроорганизмов, которые выбирают из Bacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp. и Candida spp. В дополнительных воплощениях, композиция настоящего раскрытия включает клетки пяти или более видов микроорганизмов, которые выбирают из Bacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Streptomyces spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp. и Candida spp.
В некоторых воплощениях, композиция дополнительно включает клетки одного или нескольких из следующего Pseudomonas spp., Desulfococcus spp., Desulfotomaculum spp., Marinobacter spp., Nitrosopumilus spp., Deinococcus spp., Azospirillum spp., Leptolyngbya spp., Ruminococcus spp., Acidisoma spp., Leptospirillum spp., Rhodoferax spp., Pseudomonas spp., Halorhabdus spp., Microbacterium spp., Sporosarcina spp., Nesterenkonia spp., Agrococcus spp., Xenococcus spp., Cytophaga spp., Actinomyces spp., Devosia spp., Candidatus spp., Aquabacterim spp., Bradyrhizobium spp., Microcoleus spp., Acetobacter spp., Brevibacterium spp., Methanosaeta spp. и Acremonium spp.
В дополнительных воплощениях, композиция включает клетки двух или более (например, 5, 10, 15, 20, 25 или более) микроорганизмов, перечисленных в таблице 1. Раскрытые композиции также могут включать дополнительные компоненты, включающие, без ограничений, хитин, хитозан, глюкозамин, аминокислоты, удобрения и/или связующие вещества.
Также раскрыты сельскохозяйственные применения раскрытых консорциумов или композиций микроорганизмов. В некоторых воплощениях, способы (применения) включают контактирование почвы, растений и/или частей растений (таких как семена, саженцы, побеги, листья, стебли или ветви) с раскрытыми консорциумами микроорганизмов (таким как A1007), с композицией, включающей некоторые или все микроорганизмы из A1007 или с композицией, включающей клетки двух или более видов микроорганизмов, перечисленных в таблице 1. Консорциумы микроорганизмов или содержащие микроорганизмы композиции могут быть применены к почве, растения и/или частям растения по отдельности или в сочетании с дополнительными компонентами (такими как хитин, хитозан, глюкозамин, аминокислоты и/или удобрение, такое как жидкое удобрение).
В дополнительных воплощениях, раскрытые консорциумы или композиции микроорганизмов, включающие микроорганизмы, применяют в способах деградации биологических материалов, таких как хитин-содержащие биологические материалы. В некоторых примерах, хитин-содержащие материалы смешивают с консорциумами микроорганизмов (таким как A1007) или композициями, включающими пять или более видов микроорганизмов, перечисленных в таблице 1, и ферментируют для получения ферментированной смеси. Ферментированная смесь необязательно может быть разделена на твердую и жидкую фракцию. Данные фракции могут быть впоследствии применены в сельскохозяйственных приложениях, например, в комбинации с раскрытыми консорциумами микроорганизмов или композициями или могут быть применены в дальнейших процессах деградации, например, для повышения уровня продуктов деградации в твердых и/или жидких фракциях.
Вышеуказанные и другие особенности раскрытия станут более очевидными из следующего подробного описания, которое приводится со ссылкой на прилагаемые чертежи.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение типичного способа ферментации, примененного для получения консорциума микроорганизмов A1007.
Фиг. 2 представляет собой схематическое изображение типичного способа биодеградации хитин-содержащего биологического материала (в качестве примера приводят отходы переработки креветок) с раскрытыми консорциумами или композицией микроорганизмов.
Фиг. 3 представляет собой схематическое изображение типичного способа биодеградации хитина с раскрытыми консорциумами микроорганизмов (таким как A1007) или композицией микроорганизмов.
Фиг. 4A-4C представляют собой графики, показывающие влияние обработки кукурузы композицией микроорганизмов (фиг. 4A), HYT B (фиг. 4B) или композицией микроорганизмов в условиях недостатка воды (фиг. 4C) на урожайность зерна (бушели на акр).
Фиг. 5 представляет собой график, показывающий урожай растений томата, обработанных A1007 плюс HYT B без активации (TRT1), A1007 плюс HYT B в половинном количестве без активации (TRT2), A1007 плюс HYT B с трехдневной активацией (TRT3) или контрольных. Для каждой обработки разные полосы указывают на урожай 1-10 (снизу вверх).
FIGS. 6A и 6B представляют собой графики, показывающие распространенность нематод (левая ось – пунктирная линия) и урожайность локализованных клубней (правая ось – столбики) после роста с обработками, включающими HYT A (A1007) или нематорин (фиг. 6A), и общий урожай картофеля после роста с указанными обработками (фиг. 6B).
Фиг. 7 представляет собой график анализа всхожести огурца, показывая индекс площади третьего листа (LAI) на день 27 в растениях, обработанных HYT A (A1007). Буквы (a, b, c) указывают на значительные различия в p<0,05 по анализу ANOVA.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Любые последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, приведенные в настоящем документе или в прилагаемом списке последовательностей, показаны с применением стандартных сокращений для нуклеотидных оснований и аминокислот, как определено в 37 C.F.R. § 1,822. По крайней мере, в некоторых случаях, показана только одна нить каждой последовательности нуклеиновой кислоты, но комплементарная цепь понимается как включенная любой отсылкой на отображенную нить.
SEQ ID NO: 1 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Lactobacillus sp. (paracasei/casei).
SEQ ID NO: 2 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Clostridium beijerinckii.
SEQ ID NO: 3 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Acetobacter pasteurianum.
SEQ ID NO: 4 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Lactobacillus buchneri.
SEQ ID NO: 5 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Bacillus subtilis.
SEQ ID NO: 6 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Paenibacillus cookii.
SEQ ID NO: 7 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Lactobacillus vini.
SEQ ID NO: 8 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Lactobacillus lautus.
SEQ ID NO: 9 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Oceanobacillus oncorhynchi subsp. incaldanensis.
SEQ ID NO: 10 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Bacillus amyloliquefaciens.
SEQ ID NO: 11 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как в высокой степени сходного с Bacillus pocheonensis.
SEQ ID NO: 12 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Paenibacillus chibensis.
SEQ ID NO: 13 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Bacillus flexus.
SEQ ID NO: 14 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Clostridium pasteurianum.
SEQ ID NO: 15 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Virgibacillus halophilus.
SEQ ID NO: 16 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Bacillus licheniformis.
SEQ ID NO: 17 представляет собой нуклеотидную последовательность 16S рДНК из микроорганизма, изолированного из A1007 и идентифицированного как Streptomyces griseus.
Осуществление изобретения
В природе, баланс видов микроорганизмов в почве зависит от многих факторов, включая тип почвы, плодородие почвы, влажность, конкурирующих микроорганизмов и растения (Lakshmanan et al., Plant Physiol. 166:689-700, 2014). На взаимодействие между видами микроорганизмов и растениями дополнительно влияет сельскохозяйственные приемы, которые могут улучшать или разрушать микробиому почвы (Adair et al., Environ Microbiol Rep. 5:404-413, 2013; Carbonetto et al., PLoS One 9:e99949, 2014; Ikeda et al., Microbes Environ. 29:50-59, 2014). Плодородные или высокопродуктивные почвы содержат различные композиции нативных микроорганизмов, по сравнению с почвой, которая истощена по питательным веществам, что связано с низкой урожайностью сельскохозяйственных культур. Различные виды микроорганизмов тесно связаны с растениями, на надземных поверхностях растений в филлосфере, на поверхности корней в почвенной ризосфере или неразрывно в качестве эндофитов. Крупномасштабный анализ ДНК этих ассоциаций микроорганизмов выявил неожиданную филогенетическую сложность (Rincon-Florez et al., Diversity 5:581-612, 2013; Lakshmanan et al., Plant Physiol. 166:689-700, 2014). Исследования показали, что сложные микробиомы могут коррелировать с продуктивностью растений, урожайностью, устойчивостью к стрессам, накоплению вторичных метаболитов и устойчивостью к болезням (Bhardwaj et al., Microbial Cell Factories 13:66-75, 2014; Vacheron et al., Frontiers Plant Science 4:1-19, 2014). Кроме того, растения может специфически выбирать смеси микроорганизмов из окружающей среды и потенциально тонко настраивать микробиому на уровне разнообразия сельскохозяйственных культур (Hartmann et al., Plant Soil 321:235-257, 2009; Doornbos et al., Agron. Sustain. Dev. 32:227-243, 2012; Marasco et al., PLoS One 7:e48479, 2012; Peiffer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110:6548-6553, 2013; Bulgarelli et al., Ann. Rev. Plant Biol. 64:807-838, 2014).
Связанные с корнем микроорганизмы могут способствовать росту растений и корней путем стимулирования циклирования и получения питательных веществ, путем прямой фитостимуляции, путем опосредования биоудобрения или предоставляя преимущества в росте через биоконтроль патогенов. Популяции, применяемы в сельском хозяйстве, включают ризобактерии, стимулирующие рост растений (PGPR), патоген-подавляющие бактерии, микоризы, азотфиксирующие цианобактерии, устойчивые к стрессу эндофиты плюс микроорганизмы с рядом биодеградирующих возможностей. Микроорганизмы, участвующие в азотном цикле, включают азотфиксирующие рода Azotobacter и Bradyrhizobium, азотфиксирующие цианобактерии, аммиак-окисляющие бактерии (например, рода Nitrosomonas и Nitrospira), нитрит-окисляющие рода, такие как Nitrospira и Nitrobacter и гетеротрофно-денитрифицирующие бактерии (например, рода Pseudomonas и Azospirillum; Isobe and Ohte, Microbes Environ. 29:4-16, 2014). Бактерии, которые, как сообщают, активны в солюбилизации и в увеличении доступа растений к фосфору, включают Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus и Flavobacterium, плюс ряд родов грибков (Pindi et al., J. Biofertil. Biopest. 3:4, 2012), в то время как виды Bacillus и Clostridium способствуют растворению и мобилизации калия (Mohammadi et al., J. Agric. Biol. Sci. 7:307-316, 2012). Фитостимуляция роста растений и ослабление биотического и абиотического стрессов доставляется многочисленными бактериальными и грибковыми ассоциациями непосредственно через производство стимулирующих вторичных метаболитов или косвенно путем запуска низкоуровневых защитных реакций растений (Gaiero et al., Amer. J. Bot. 100:1738-1750, 2013; Bhardwaj et al., Microbial Cell Factories 13:66-76, 2014).
Помимо активности в окружающей среде, микроорганизмы также могут обеспечивать уникальные биодеградирующие свойства in vitro, в условиях направленной ферментации. Применение конкретных смесей микроорганизмов для деградации хитина и общего белка могут давать новые биоактивные молекулы, такие как свободные L-аминокислоты, L-пептиды, хитин и хитозан, о которых известно, что они усиливают рост или повышают устойчивость к стрессу путем активации врожденного иммунитета растений (Hill et al., PLoS один 6:e19220, 2011; Tanaka et al., Plant Signal Behav. E22598-147, 2013). Специфические сообщества микроорганизмов могут выполнять несколько задач, путем доставки уникальных продуктов ферментативного распада, которые сами по себе биологически полезны для зерновых культур, плюс полученный в результате консорциумы микроорганизмов, который может быть доставлен как сельскохозяйственный продукта для повышения продуктивности сельскохозяйственных культур.
Как описано в настоящем документе, консорциумы аэробных и/или анаэробных микроорганизмов, полученные из плодородной почвы и морских источников, были успешно совместно ферментированы и стабилизированы, предоставляя возможность для прямого роста и принося пользу посевам. Ферментативная активность данных смесей микроорганизмов также дает ферментационные продукты с хитином, глюкозамином, белком и/или аминокислотами. В некоторых воплощениях, прямая доставка консорциумов микроорганизмов и/или композиций может позволить раннюю колонизацию корней и содействовать ассоциациям ризосферы или эндофитов. В некоторых воплощениях, преимущества доставки консорциумов микроорганизмов растениям включают одно или более из следующего: увеличение роста корней, увеличение продукции корневых волосков, увеличение площади поверхности корня, более сильные растения, способные выдерживать трансплантационный шок, более быструю приживаемость насаждения, устойчивость к абиотическому стрессу и повышенную продуктивность и урожайность растений. Сложные смеси микроорганизмов могут распространяться по разным видам и генотипам растений, взаимодействуя с сообществами микроорганизмов почвы, предоставляя преимущества для широкого спектра сельскохозяйственных культур, растущих в различных сельскохозяйственных условиях.
I. Термины
Если не указано иное, то технические термины применяют в соответствии с общепринятым применением. Определения обычных в молекулярной биологии терминов можно найти в работах Krebs et al., Lewin’s Genes XI, опубликованных Jones and Bartlett Learning, 2012 (ISBN 1449659853); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, опубликованных Blackwell Publishers, 1994 (ISBN 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, опубликованных Wiley, John & Sons, Inc., 2011 (ISBN 8126531789); и George P. Rédei, Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics, 2nd Edition, 2003 (ISBN: 0-471-26821-6).
Следующие объяснения терминов и способов обеспечивают для лучшего описания настоящего раскрытия и для руководства специалистам в данной области техники для осуществления настоящего раскрытия на практике. Формы единственного числа «a», «an» и «the» относятся к одному или более чем к одному, если контекст явно не диктует иное. Например, термин «включающий клетку» включает единственную клетку или множество клеток и считается эквивалентным фразе «включающий, по меньшей мере, одну клетку». Как применено в настоящем документе, «включает (comprises)» означает «включает (includes)». Таким образом, «включающий (comprising) A или B», означает « включающий (including) A, B или A и B», без исключения дополнительных элементов. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие отсылки, упомянутые в настоящем документе, включены в качестве отсылки во всей их полноте для всех целей. В случае конфликта, настоящая спецификация, включающая объяснения терминов, будет контролировать.
Хотя способы и материалы, похожие или эквивалентные описанным в настоящем документе, могут быть применены на практике или для тестирования раскрытой технологии, подходящие способы и материалы описаны ниже. Материалы, способы и примеры представлены как иллюстративные и не предназначены для ограничения.
Для облегчения обзора различных воплощений раскрытия, обеспечены следующие пояснения специфических терминов:
Водные животные: Животное, которое живет в соленой или пресной воде. В конкретных воплощениях, раскрытых в настоящем документе, водное животное включает водных членистоногих, таких как креветки, криль, копеподы, усоногие раки, крабы, омары и речной рак. В других воплощениях, водное животное включает рыб. Побочный продукт переработки водных животных включает любую часть водного животного, в частности, части, являющиеся результатом промышленной переработки водного животного. Таким образом, в некоторых примерах, побочные продукты переработки водных животных включают одно или более из следующего: головогрудь или экзоскелет креветки, экзоскелет краба или омара или рыбью кожу или чешую.
Контактирование: Размещение в прямой физической связи, включая как в твердой, так и в жидкой форме. Например, контактирование может произойти с одним или более микроорганизмами (такими как микроорганизмы в консорциумах микроорганизмов) и биологическим образцом в растворе. Контактирование также может происходить с одним или более микроорганизмами (таким как микроорганизмы в консорциумах микроорганизмов) и с почвой, растениями и/или частями растения (такими как листва, стебель, саженец, корни и/или семена).
Культивирование: Преднамеренное выращивание одного или более организмов или клеток в присутствии ассимилируемых источников углерода, азота и минеральных солей. В качестве примера, такой рост может иметь место на твердой или полутвердой питательной среде или в жидкой среде, в которой питательные вещества растворяют или суспендируют. В качестве дополнительного примера, культивирование может происходить на поверхности или путем глубинного культивирования. Питательная среда может состоять из сложных питательных веществ или может быть химически определенной.
Ферментация: Процесс, который приводит к разрушению сложных органических соединений до более простых соединений, например, под действием клеток микроорганизмов (таким как бактерии и/или грибки). Процесс ферментации может происходить в аэробных условиях, анаэробных условиях или и в тех, и в других (например, в большом объеме, где некоторые порции аэробны, а другие порции анаэробны). В некоторых нелимитирующих воплощениях, ферментация включает ферментативное и/или неферментативное разрушение соединений, присутствующих в водных животных или в побочных продуктах переработки водных животных, таких как хитин.
Жидкое удобрение: Водный раствор или суспензия, содержащая растворимый азот. В некоторых примерах, растворимый азот в жидком удобрении включает источник органического азота, такого как мочевина или мочевина, полученная из безводного аммиака (такая как раствор мочевины и нитрата аммония (UAN)). Водный аммиак (20-32% безводного аммиака) также может быть применен. В других примерах, растворимый азот в жидком удобрении включает азот-содержащие неорганические соли, такие как гидроксид аммония, нитрат аммония, сульфат аммония, пирофосфат аммония, тиосульфат аммония или комбинации двух или более из них. В некоторых воплощениях жидкое удобрение включает не встречающийся в природе источник азота (такой как пирофосфат аммония или тиосульфат аммония) и/или другие не встречающиеся в природе компоненты.
Обычные смеси жидких неприродных удобрений определяют по содержанию в них азота-фосфата-калия (процентное содержание N-P-K), и они включают добавку других компонентов, таких как сера или цинк. Примеры созданных человеком смесей включают 10-34-0, 10-30-0 с 2% серы и 0,25% цинка (хелатированный), 11-37-0, 12-30-0 с 3% серы, 2-4-12, 2-6-12, 4-10-10, 3-18-6, 7-22-5, 8-25-3, 15-15-3, 17-17-0 с 2% серы, 18-18-0, 18-18-0 с 2% серы, 28-0-0 UAN, 9-27-0 с 2% серы и калия тиосульфата.
Микроорганизм: микроорганизм, включающий без ограничений, бактерии, архебактерии, грибки и водоросли (такие как микроводоросли). В некоторых примерах, микроорганизмы представляют собой одноклеточные организмы (например, бактерии, цианобактерии, некоторые грибки или некоторые водоросли). В других примерах, термин микроорганизмы включает многоклеточные организмы, такие как определенные грибки или водоросли (например, многоклеточные нитчатые грибки или многоклеточные водоросли).
Композиция микроорганизмов: Композиция (которая может быть твердой, жидкой или, по меньшей мере, частично в обеих формах), которая включает, по меньшей мере, один микроорганизм (или популяцию, по меньшей мере, одного микроорганизма). В некоторых примерах, композиция микроорганизмов представляет собой один или несколько микроорганизмов (или одну или несколько популяций микроорганизмов) в жидкой среде (такой как среда для хранения, культивирования или ферментационная среда), например, в виде суспензии в жидкой среде. В других примерах, композиция микроорганизмов представляет собой один или несколько микроорганизмов (или одну или несколько популяций микроорганизмов) на поверхности или погруженных в твердую или гелеобразную среду (включая без ограничений, культуральный планшет) или суспензию или пасту.
Консорциум микроорганизмов: Смесь, ассоциация или объединение двух или более видов микроорганизмов, которые в некоторых случаях находятся в физическом контакте друг с другом. Микроорганизмы в консорциуме могут влиять друг на друга путем непосредственного физического контакта или посредством биохимических взаимодействий или обоими способами. Например, микроорганизмы в консорциуме могут обмениваться питательными веществами, метаболитами или газами друг с другом. Таким образом, в некоторых примерах, по меньшей мере, некоторые микроорганизмы в консорциуме могут быть метаболически взаимозависимыми. Такие взаимозависимые взаимодействия могут меняться по своему характеру и степени со временем и при изменении условий культивирования.
II. Консорциумы и композиции микроорганизмов
В настоящем документе раскрыты несколько консорциумов микроорганизмов. Типичный консорциум микроорганизмов настоящего раскрытия был депонирован в Американской коллекции типовых культур (ATCC, Manassas, VA) 23 декабря 2015, и ему был присвоен номер доступа PTA-122728, обозначенный в настоящем документе как A1007. Консорциум A1007 включает, по меньшей мере, Bacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Streptomyces spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp. и Candida spp. Кроме того, в настоящем документе раскрыты консорциумы или композиции микроорганизмов, включающие два или более (например, 2 или более, 5 или более, 10 или более, 20 или более или 50 или более) или все микроорганизмы в A1007. В некоторых воплощениях, композиция микроорганизмов, раскрытая в настоящем документе, представляет собой определенную композицию, например, композицию, включающую конкретные виды микроорганизмов и необязательно, дополнительные немикробные компоненты (включая, без ограничений, соли, микроэлементы, хитин, хитозан, глюкозамин и/или аминокислоты). В некоторых примерах, консорциумы или композиции микроорганизмов включают аэробные и анаэробные микроорганизмы.
Как обсуждается ниже, идентичность, по меньшей мере, некоторых микроорганизмов, присутствующих в A1007, определяли с помощью очистки колонии и анализа последовательности ДНК (например, секвенирования рДНК 16S, пример 4) и/или анализа микропанелей (пример 14). Дополнительные методики идентификации микроорганизмов, присутствующих в микробной смеси или консорциуме, известные обычному специалисту в данной области техники, включают 1) способы, основанные на нуклеиновых кислотах, которые основаны на анализе и различении ДНК микроорганизмов (такие как микропанели ДНК для анализа нуклеиновых кислот, метагеномика или in situ гибридизация в сочетании с флуоресцентно-активированной сортировкой клеток (FACS)); 2) биохимические способы, которые основаны на разделении и идентификации спектра биомолекул, включая анализ метиловых эфиров жирных кислот (FAME), масс-спектрометрический анализ на основе времяпролетной матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI-TOF) или анализ клеточной миколиновой кислоты с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (MYCO-LCS); и 3) микробиологические способы, которые опираются на традиционные инструменты (такие как избирательный рост и микроскопическое исследование) для обеспечения более общих характеристик сообщества в целом и/или узко и идентификации только небольшого подмножества членов этого сообщества.
В некоторых примерах, микроорганизмы в смеси или консорциуме разделяют (например, с помощью различия в физическом размере и/или технологий сортировки клеток) с последующим глубоким секвенированием ДНК или полного генома полученных микроорганизмов (или подгрупп или субпопуляций микроорганизмов). Применение различных микропанелей или применение других методик идентификации может идентифицировать наличие различных микроорганизмов (больше, меньше или различные микробные таксоны или виды) из-за различий в чувствительности и специфичности выбранной методики анализа. Кроме того, разнообразные методики (включая анализ микропанелей или ПЦР-анализ ДНК) могут не обнаружить определенные микроорганизмы (даже если они присутствуют в образце), например, если зонды и/или праймеры, способные обнаруживать определенные микроорганизмы, не включены в анализ консорциума. Кроме того, обычный специалист в данной области техники признает, что классификация и наименование микроорганизмов могут меняться со временем, что приводит к реклассификации и/или переименованию микроорганизмов.
В некоторых воплощениях, композиция настоящего раскрытия включает клетки пяти или более видов микроорганизмов, которые выбирают из Bacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp. и Candida spp. В некоторых примерах, композиция включает клетки, которые выбирают из 5 или более, 6 или более, 7 или более, 8 или более, 9 или более, 10 или более или из всех из следующего Bacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp. и Candida spp. В дополнительных воплощениях, композиция настоящего раскрытия включает клетки пяти или более видов микроорганизмов, которые выбирают из Bacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Streptomyces spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp. и Candida spp. В некоторых примерах, композиция включает клетки, которые выбирают из 5 или более, 6 или более, 7 или более, 8 или более, 9 или более, 10 или более, 11 или более или из всех из Bacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Streptomyces spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp. и Candida spp.
В других воплощениях раскрытые консорциумы или композиции микроорганизмов включают, состоят в основном из или состоят из двух или более (например, 5 или более, 6 или более, 7 или более, 8 или более, 9 или более, 10 или более, 11 или более, 12 или более, 13 или более, 14 или более, 15 или более, 20 или более или всех) микроорганизмов, перечисленных в таблице 1. В дополнительных воплощениях, раскрытые консорциумы или композиции микроорганизмов включают, состоят в основном из или состоят из двух или более (например, 5 или более, 10 или более, 15 или более или всех) микроорганизмов, имеющих последовательность 16S рДНК с, по меньшей мере, 95% идентичности (например, по меньшей мере, 96%, 97%, 98%, 99% или более) с SEQ ID NOs: 1-17.
Таблица 1. Микроорганизмы
Микроорганизм
Типичные виды
Acetobacter spp.
Acetobacter pasteurianum
Bacillus spp.
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pocheonensis, Bacillus clausii, Bacillus subtilis, Bacillus circulans, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus flexus, Bacillus subterraneus, Bacillus oceanisediminis, Bacillus firmus
Brevibacillus spp.
Brevibacillus brevis
Candida spp.
Candida ethanolica
Clostridium spp.
Clostridium nitrophenolicum, Clostridium pasteurianum, Clostridium beijerinckii, Clostridium sphenoides, C. tyrobutyricum
Lactobacillus spp.
Lactobacillus casei, Lactobacillus vini, Lactobacillus buchneri, Lactobacillus casei
Lysinibacillus spp.
Lysinibacillus xylanilyticus, Lysinibacillus fusiformis
Oceanobacillus spp.
Oceanobacillus oncorhynchi subsp. incaldanensis
Paenibacillus spp.
Paenibacillus chibensis, Paenibacillus lautus, Paenibacillus validus, Paenibacillus cookii, Paenibacillus anaericanus, Paenibacillus agaridevorans, Paenibacillus timonensis, Paenibacillus cineris, Paenibacillus rhizoospherae, Paenibacillus brevis, Paenibacillus favisporus
Rummeliibacillus spp.
Rummeliibacillus pycnus, Rummeliibacillus stabekisii
Streptomyces spp.
Streptomyces griseus
Virgibacillus spp.
Virgibacillus halophilus
В некоторых воплощениях, композиция микроорганизмов включает возрастающее количество определенных микроорганизмов, по сравнению с A1007. Например, культура A1007 с жидким удобрением (например, как описано в примере 5) приводит к увеличению в количестве одного или более из следующего Bacillus spp. (например, одно или более из следующего Bacillus circulans, Bacillus pocheonensis, Bacillus flexus, Bacillus subterraneus, Bacillus firmus или Bacillus oceanisediminis), Brevibacillus spp. (например, Brevibacillus brevis), Lysinibacillus spp. (например, Lysinibacillus fusiformis), Paenibacillus spp. (например Paenibacillus validus, Paenibacillus anaericanus, Paenibacillus agaridevorans, Paenibacillus cineris, Paenibacillus rhizoospherae, Paenibacillus favisporus или Paenibacillus timonensis), Clostridium spp. (например, Clostridium nitrophenolicum, Clostridium tyrobutyricum или Clostridium sphenoides), Oceanobacillus spp. (например, Oceanobacillus oncorhynchi subsp. incaldanensis), Rummeliibacillus spp. (например, Rummeliibacillus stabekisii) и/или Virgibacillus spp. (например, Virgibacillus halophilus) в композиции микроорганизмов.
В некоторых примерах, композиция микроорганизмов включает, по меньшей мере, примерно на 10% больше одного или более из следующего Bacillus spp. (например, одно или более из следующего Bacillus circulans, Bacillus pocheonensis, Bacillus flexus, Bacillus subterraneus, Bacillus firmus или Bacillus oceanisediminis), Brevibacillus spp. (например, Brevibacillus brevis), Lysinibacillus spp. (например, Lysinibacillus fusiformis), Paenibacillus spp. (например Paenibacillus validus, Paenibacillus anaericanus, Paenibacillus agaridevorans, Paenibacillus cineris, Paenibacillus rhizoospherae, Paenibacillus favisporus или Paenibacillus timonensis), Clostridium spp. (например, Clostridium nitrophenolicum, Clostridium tyrobutyricum или Clostridium sphenoides), Oceanobacillus spp. (например, Oceanobacillus oncorhynchi subsp. incaldanensis), Rummeliibacillus spp. (например, Rummeliibacillus stabekisii) и/или Virgibacillus spp. (например, Virgibacillus halophilus) по сравнению с A1007.
Консорциумы или композиции необязательно могут включать клетки одного или более дополнительных видов микроорганизмов, помимо тех, которые перечислены в таблице 1. В некоторых воплощениях дополнительные микроорганизмы включают Azotobacter spp. (например, Azotobacter vinelandii и/или Azotobacter chroococcum) или Rhizobium spp. (например, Rhizobium japonicus и/или Rhizobium leguminosarum). Дополнительные микроорганизмы включают, без ограничения, один или более из следующего Desulfococcus spp., Desulfotomaculum spp., Marinobacter spp. (например, Marinobacter bryozoorum), Nitrosopumilus spp., Ruminococcus spp. (например, Ruminococcus flavefaciens), Pseudomonas spp. (например, Pseudomonas fluorescens или Pseudomonas putida), Deinococcus spp., Azospirillum spp., Aquabacterium spp., Clostridium spp. (например, Clostridium butyricum), Cytophaga spp., Microbacterium spp. (например, Microbacterium testaceum), Lysinibacillus (например, Lysinibacillus sphaericus), Sporosarcina spp., Nesterenkonia spp., Agrococcus spp. (например, Agrococcus terreus), Acremonium spp. (например, Acremonium bacillisporum), Bacillus sp. (например, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus), Lactobacillus spp. (например, Lactobacillus acidophilus), Acetobacter spp. (например, Acetobacter aceti), Acidisoma spp., Azotobacter spp. (например, Azotobacter vinelandii или Azotobacter chroococcum), Treponema spp. (например, Treponema primitia), Bradyrhizobium spp. (например, Bradyrhizobium elkanii), Lactococcus spp., Leptolyngbya spp., Leptospirillum spp. (например Leptospirillum ferrodiazotrophum), Halorhabdus spp., Xenococcus spp., Paenibacillus spp. (например, Paenibacillus amyloticus), Pediococcus (например, Pediococcus pentosceus), Proteus spp. (например, Proteus vulgaris), Rhizobium (например, Rhizobium japonicus или Rhizobium leguminosarum), Rhodoferax spp., Streptomyces spp. (например, Streptomyces griseus), Streptococcus spp., Trichoderma spp. (например, Trichoderma harzianum), Microcoleus spp., Micrococcus spp. (например, Micrococcus luteus), Nitrobacter spp., Nitrosomonas spp., Nitrospira spp., Actinomyces spp., Devosia spp., Brevibacterium spp., Methanosaeta spp., Saccharomyces spp. (например, Saccharomyces cerevisiae), Penicillium spp. (например, Penicillium roqueforti), Monascus (например, Monascus ruber), Aspergillus spp. (например, Aspergillus oryzae), Arthrospira spp. (например, Arthrospira platensis) и Ascophyllum spp. (например, Ascophyllum nodosum). Подходящие дополнительные микроорганизмы могут быть идентифицированы специалистом в данной области техники, например, на основании характеристик, которые желательно включить в консорциумы или композиции.
2
4
2
4
2
4
3
4
2
4
Раскрытые композиции могут, помимо микроорганизмов, включать один или несколько дополнительных компонентов, включая без ограничений, соли, ионы металлов и/или буферы (например, одно или более из следующего KHPO, KHPO, CaCl, MgSO, FeCl, NaMoO и/или NaMoO), микроэлементы (такие как сера, сульфат, сульфит, медь или селен), микроэлементы (такие как бор (B), цинк (Zn), марганец (Mn), железо (Fe), медь (Cu), молибден (Mo), хлор (Cl)), витамины (такие как витамины группы B или витамин K), сахара (такие как сахароза, глюкоза или фруктоза), хитин, хитозан, глюкозамин, белок и/или аминокислоты. Дополнительные компоненты, которые также могут быть включены в композиции, включают HYT B, HYT C и/или HYT D, одно или несколько удобрений (например, жидкое удобрение), один или несколько пестицидов, один или несколько фунгицидов, один или несколько гербицидов, один или несколько инсектицидов, один или несколько гормонов растений, один или несколько элиситоров растений или комбинации двух или более из данных компонентов.
В некоторых воплощениях, раскрытые консорциумы или композиции микроорганизмов (такие как включающие пять или более видов микроорганизмов в консорциумы микроорганизмов, описанных в настоящем документе) находятся в жидкой среде (такой как среда для культивирования или ферментационная среда) или инокулят. В других воплощениях, консорциумы или композиции микроорганизмов (например, композиции, включающие пять или более видов микроорганизмов, перечисленных в таблице 1) присутствуют на твердой или гелеобразной среде (такой как культуральный планшет), содержащей или поддерживающей микроорганизмы.
Еще в одном воплощении, консорциумы или композиции микроорганизмов (такие как композиция, включающая пять или более видов микроорганизмов, перечисленных в таблице 1) присутствуют в сухих композициях, таких как сухой порошок, крупинки или гранулы. Сухие композиции могут быть получены путем добавления осмопротектора (такого как сахар, например, трегалоза и/или мальтодекстрин) к композиции микроорганизмов в растворе в желаемом соотношении. Этот раствор объединяют с сухим носителем или абсорбирующим средством, таким как древесная мука или глина, в желаемой концентрации композиции микроорганизмов (такой как 2-30%, например, 2,5-10%, 5-15%, 7,5-20% или 15-30%). Гранулы могут быть созданы путем включения глины или полимерных связующих, которые служат для удерживания гранул вместе или придают специфические физические свойства или свойства, обеспечивающие деградацию. Гранулы могут быть сформированы с применением ротационного гранулирования, гранулятора-смесителя или экструзии, в качестве несколько возможных способов. В других примерах, сухие композиции могут быть получены путем распыления или замачивания жидкой композиции микроорганизмов на/в твердом носителе, таком как бентонит, или нанесения жидкой композиции микроорганизмов в виде покрытия непосредственно на гранулы удобрения. Дополнительные способы получения сухих композиций, включающих один или более видов микроорганизмов, известны обычному специалисту в данной области техники, например, как описано в работах Formulation of Microbial Biopesticides: Beneficial Microorganisms, Nematodes and Seed Treatments, Burges, ed., Springer Science, 1998; Bashan, Biotechnol. Adv. 16:729-770, 1998; Ratul et al., Int. Res. J. Pharm. 4:90-95, 2013.
В некоторых примерах, консорциумы микроорганизмов или композиции, включающие микроорганизмы, могут поддерживаться при температуре, способствующей росту микроорганизма(микроорганизмов), например, при примерно 25-45°C (например, примерно 30-35°C, примерно 30-40°C или примерно 35-40°C). В других примерах, композиции хранят при температурах, при которых микроорганизм(микроорганизмы) не растут или неактивны, таких как меньше, чем 25°C (например, 4°C, -20°C, -40°C, -70°C или ниже). Специалист в данной области техники может составить композиции для холодного хранения, например, путем включения стабилизаторов (таких как глицерин). Еще в дополнительных примерах, композиции хранят при температуре окружающей среды, такой как примерно 0-35°C (например, примерно 10-30°C или примерно 15-25°C).
III. Способы биодеградация
Раскрытые консорциумы микроорганизмов и композиции могут быть применены для деградации биологических материалов, таких как обогащенные хитином материалы, например, водные животные или побочные продукты переработки водных животных, насекомые или грибки. Таким образом, в настоящем документе раскрыты способы, включающие смешивание одного или более из следующего: раскрытые консорциумы или композиции микроорганизмов с хитин-содержащим биологическим материалом с образованием смеси и ферментацию смеси. В некоторых воплощениях, способы также включают разделение смеси на твердую, водную и необязательно, липидную фракции (фиг. 2) после ферментации.
В некоторых воплощениях, способ биодеградации, раскрытый в настоящем документе, включает смешивание консорциума микроорганизмов (такого как A1007, композиции, включающей некоторые или все микроорганизмы в A1007, или композиции, включающей пять или более видов микроорганизмов в таблице 1) с одним или более хитин-содержащим биологическим материалом. Хитин-содержащие биологические материалы включают, без ограничения, водных животных или побочные продукты переработки водных животных, насекомых или грибки. В некоторых примерах, хитин-содержащий биологический материал представляет собой водное животное, такое как водное членистоногое (например, члена класса Malacostraca). Водные членистоногие для применения в раскрытых способах включают креветку, краба, омара, речного рака или криля; смеси из двух или более водных членистоногих рассматриваются. В некоторых примерах, все водное животное целиком (такое как водное членистоногое) или побочные продукты переработки водных животных применяют в способах биодеградации, раскрытых в настоящем документе. Побочные продукты переработки водных животных включают любую часть водного животного, такую как любую часть, полученную путем переработки водных животных. В некоторых примерах, побочный продукт переработки водного животного представляет собой весь экзоскелет такого водного животного, как креветка, краб, речной рак или омар или его часть. В других примерах, побочный продукт переработки водного животного представляет собой часть водного животного, например, головогрудь креветки.
В других примерах, хитин-содержащий биологический материал включает грибки, такие как грибки из отделов зигомицеты, базидомицеты, аскомицеты или дейтеромицеты. Определенные типичные грибки включают Aspergillus spp., Penicillium spp., Trichoderma spp., Saccharomyces spp. и Schizosaccharomyces spp. Таким образом, потоки отходов хлебопекарного, пивоваренного и дистилляционного производства могут обеспечивать источники для хитин-содержащих биологических материалов. Еще в дополнительных примерах, хитин-содержащий биологический материал включает насекомых, которые содержат хитин в своих экзоскелетах, такие как кузнечики, сверчки, жуки и другие насекомые. Побочные продукты переработки таких насекомых также рассматривают как источники хитина.
Хитин-содержащий биологический материал смешивают с композицией, включающей микроорганизмы, описанные выше в разделе II (такие как консорциум микроорганизмов A1007 или другой консорциум или композиция, описанные в разделе II) с образованием по существу гомогенной смеси. В некоторых примерах, хитин-содержащий биологический материал перемалывают, крошат, измельчают, толкут или иначе диспергируют до смешивания с микроорганизмами или консорциумами микроорганизмов, описанных в настоящем документе. В определенных примерах, смесь содержит примерно 10-50% (например, примерно 10-20%, примерно 20-30%, примерно 30-40%, примерно 25-40%, например, примерно 25%, примерно 30%, примерно 35%, примерно 40%, примерно 45% или примерно 50%) хитин-содержащего материала (такого как головогрудь и/или панцирь креветки) (масс./объем) в инокуляте, содержащем примерно 0,1-5% (например, примерно 0,1-1%, примерно 0,5-2%, примерно 1-2%, примерно 2-3%, примерно 0,1%, примерно 0,2%, примерно 0,3%, примерно 0,5%, примерно 0,8%, примерно 1%, примерно 1,25%, примерно 1,5%, примерно 1,75%, примерно 2%, примерно 2,5%, примерно 3%, примерно 4% или примерно 5%) микроорганизмов (объем/объем).
В некоторых примерах, инокулят, хитин-содержащий биологический материал и сахар (или другой источник углерода) смешивают, например, путем перемешивания или перебалтывания. В других примерах, один или более микроорганизм в композиции микроорганизмов или консорциуме необязательно активируют перед смешиванием с хитин-содержащим биологическим материалом и ферментацией. Активация не требуется для способов, раскрытых в настоящем документе. Установка времени и/или температуры ферментации может быть выполнена специалистом в данной области техники, в зависимости от того, активируют ли микроорганизмы перед ферментацией. Активация композиции микроорганизмов может быть осуществлена путем инкубации инокулята микроорганизмов с источником углерода (таким как сахар, например, глюкоза, сахароза, фруктоза или другой сахар) при температуре и в течение достаточного для роста микроорганизмов периода времени. В некоторых примерах, инокулят микроорганизмов (такой как консорциум микроорганизмов или композиция, описанные в настоящем документе) имеет концентрацию, равную примерно 0,05-5% объем/объем (например, примерно 0,5-5%, примерно 0,5-2%, примерно 1-2% или примерно 2-3%) в жидкой среде. Инокулят разбавляют в растворе, содержащем примерно 0,1-1% сахара (например, примерно 0,1-0,5%, примерно 0,1-0,3%, примерно 0,2-0,6% или примерно 0,5-1%, например, примерно 0,1%, примерно 0,2%, примерно 0,3%, примерно 0,4%, примерно 0,5%, примерно 0,6%, примерно 0,7%, примерно 0,8%, примерно 0,9% или примерно 1%) и инкубируют при температуре окружающей среды, например, примерно при 20-40°C (например, при примерно 20°C, примерно 25°C, примерно 30°C, примерно 35°C или примерно 40°C) в течение примерно 1-5 дней (например, в течение примерно 24-х часов, примерно 48-ми часов, примерно 72-х часов, примерно 96-ти часов или примерно 120-ти часов). В других примерах, активация композиции микроорганизмов может быть достигнута путем инкубации инокулята микроорганизмов при температуре и в течение достаточного для роста микроорганизмов периода времени, например, инкубация при примерно 20-40°C (например, примерно 25-35°C) в течение от 12 часов до 5 дней (таким как 1-4 дней или 2-3 дней). В некоторых неограничивающих примерах, микроорганизмы считаются активированными, когда культура достигает оптической плотности >0,005 при 600 нм.
После смешивания хитин-содержащего биологического материала и микроорганизмов или консорциума микроорганизмов (которые необязательно активированы), смесь ферментируют. В некоторых примерах, перед ферментацией измеряют pH смеси. При необходимости, перед ферментацией pH регулируют до выбранного диапазона (например, pH от примерно 3 до примерно 4 или от примерно 3,5 до 4). Смесь инкубируют при температуре, равной примерно 20-40°C (например, примерно 30°-36°C, например, примерно 30°C, примерно 31°C, примерно 32°C, примерно 33°C, примерно 34°C, примерно 35°C, примерно 36°C, примерно 37°C, примерно 38°C, примерно 39°C или примерно 40°C) в течение примерно 1-30 дней (например, примерно 3-28 дней, примерно 7-21 день, примерно 3, 5, 7, 10, 14, 16, 20, 24, 28 или 30 дней). Смесь периодически перемешивают (например, не перемешивают непрерывно). В некоторых примерах, смесь перемешивают в течение определенного периода времени каждые 1-7 дней, например, каждые 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней. В некоторых неограничивающих примерах, ферментация продолжается до тех пор, пока общая титруемая кислотность (TTA) не станет равна примерно 3-5%, и pH не станет примерно 4-5.
После ферментации, полученные ферментированные смеси разделяют, по меньшей мере, на твердую и жидкую фракции. В некоторых примерах, ферментацию перемещают из резервуара в отстойное оборудование. Жидкость впоследствии декантируют и центрифугируют. В одном из неограничивающих примеров, ферментированные смеси центрифугируют при 1250 rpm (930 x g) в течение 15 минут при примерно 5°C для получения жидкой и липидной (например, пигментной) фракции. Жидкую (или водную) фракцию, полученную способом биодеградации, можно хранить при температуре окружающей среды. В некоторых неограничивающих примерах, к жидкой фракции добавляют сахар, например, в количестве 1-10% объем/объем.
Жидкая фракция может включать такие компоненты, как белок, аминокислоты, глюкозамин, микроэлементы (такие как кальций, магний, цинк, медь, железо и/или марганец) и/или ферменты (такие как молочнокислые ферменты, протеазы, липазы и/или хитинaзы). В некоторых неограничивающих примерах, жидкая фракция содержит (масс./объем) примерно 1-5% общих аминокислот, примерно 3-7% белка, примерно 0,1-2% азота, меньше, чем примерно 0,2% фосфора, примерно 0,5-1% калия, примерно 4-8% углерода, примерно 0,2-1% кальция, меньше, чем примерно 0,2% магния, меньше, чем примерно 0,2% натрия и/или примерно 0,1-0,4% серы. В дополнительных неограничивающих примерах, жидкая фракция включает примерно 0,01-0,2% глюкозамина (например, примерно 0,1% или менее). Жидкая фракция также может содержать один или более микроорганизм (например, из инокулята, примененного для запуска процесса ферментации) и/или следовые количества хитозана или хитина. Жидкая фракция в некоторых примерах обозначена в настоящем документе как «HYT B».
Твердая фракция, полученная способом биодеградации, содержит хитин (например, примерно 50-70% или примерно 50-60% хитина). Твердая фракция также может содержать один или более из следующих микроэлементов (таких как кальций, магний, цинк, медь, железо и/или марганец), белок или аминокислоты и/или один или более микроорганизм из инокулята, примененного для запуска процесса ферментации. Твердая фракция в некоторых примерах обозначена в настоящем документе как «HYT C». HYT C необязательно тонко измельчают для получения микронизированного хитина и остаточного хитина. В некоторых неограничивающих примерах, твердая фракция содержит (масс./объем) примерно 9-35% общих аминокислот, примерно 30-50% неочищенного белка, примерно 5-10% азота, примерно 0,3-1% фосфора, меньше, чем примерно 0,3% калия, примерно 35-55% углерода, примерно 0,5-2% кальция, меньше, чем примерно 0,1% магния, примерно 0,1-0,4% натрия и/или примерно 0,2-0,5% серы.
В некоторых примерах, липидную фракцию также отделяют от твердой и жидкой фракций. Липидная фракция представляет собой верхнюю фазу жидкой фракции. Липидная фракция содержит такие соединения, как стеролы, витамин A и/или витамин E, жирные кислоты (таким как DHA и/или EHA) и в некоторых примерах, каротиноидные пигменты (например, астаксантин). Липидная фракция может быть применена для различных целей, включая, без ограничений, производство косметики или продуктов питания.
В дополнительных воплощениях, хитин ферментируют с консорциумом микроорганизмов (таким как A1007 или с некоторыми или со всеми микроорганизмами в A1007) или с композицией, содержащими пять или более виды микроорганизмов в таблице 1. В некоторых примерах хитин (такой как HYT C или микронизированный и/или остаточный хитин полученный как описано выше) смешивают с консорциумом микроорганизмов или композицией, которые содержат микроорганизмы, описанные в настоящем документе и гидролизат белков (например, HYT B), и ферментируют с образованием ферментированной смеси. По меньшей мере, часть хитина в исходной смеси переваривается в результате ферментации. В некоторых примерах, смесь инкубируют при температуре, равной примерно 20-40°C (например, примерно 30°-35°C, например, примерно 30°C, примерно 31°C, примерно 32°C, примерно 33°C, примерно 34°C, примерно 35°C, примерно 36°C, примерно 37°C, примерно 38°C, примерно 39°C или примерно 40°C) в течение примерно от 1 дня до 30 дней (например, примерно 2-28 дней, примерно 4-24 дня, примерно 16-30 дней, примерно 10-20 дней или примерно 12-24 дня). В некоторых примерах, смесь перемешивают периодически (например, не перемешивают непрерывно). В других примерах, смесь непрерывно перемешивают. В одном из неограничивающих примеров, смесь перемешивают в течение примерно 1-12 часов ежедневно (например, примерно 2-8 часов или примерно 4-10 часов). pH ферментационной смеси можно периодически контролировать. В некоторых примерах, pH необязательно поддерживают на уровне примерно 4-5. В некоторых примерах, ферментация продолжается до тех пор, пока общая титруемая кислотность (TTA) не станет равной, по меньшей мере, примерно 1-10% (например, примерно 2-8%, примерно 4-8% или примерно 5-10%).
После ферментации, полученные ферментированные смеси разделяют, по меньшей мере, на твердую и жидкую фракции, например, декантированием, фильтрацией и/или центрифугированием. Жидкую фракцию, полученную в результате ферментации HYT B и хитина с композицией микроорганизмов, в некоторых примерах обозначают в настоящем документе как «HYT D». В некоторых неограничивающих примерах, жидкая фракция содержит (масс./объем) примерно 0,5-2% общих аминокислот, примерно 3-7% белка, примерно 0,5-1% азота, меньше, чем примерно 0,1% фосфора, примерно 0,4-1% калия, примерно 3-7% углерода, меньше, чем примерно 0,5% кальция, меньше, чем примерно 0,1% магния, меньше, чем примерно 0,3% натрия и/или примерно меньше, чем примерно 0,3% серы. Кроме того, HYT D содержит меньше, чем примерно 50% хитина (например, меньше, чем примерно 45%, меньше, чем примерно 40%, меньше, чем примерно 35% или меньше, чем примерно 30% хитина) и меньше, чем 2% глюкозамина (например, меньше, чем примерно 1,5% или меньше, чем примерно 1% глюкозамина). В других примерах, HYT D содержит примерно 25-50% хитина и примерно 0,5-2% глюкозамина.
IV. Способы обработки почвы, растений и/или семян
Раскрытые консорциумы микроорганизмов, композиции, содержащие микроорганизмы и/или продукты, раскрытые в настоящем документе (такие как HYT B, HYT C и/или HYT D) могут быть применены для обработки почвы, растений или частей растения (таких как корни, стебли, листья, семена или саженцы). В некоторых примерах, обработка консорциумами микроорганизмов, композициями, содержащими микроорганизмы и/или продуктами, улучшает рост растений, улучшает устойчивость к стрессу и/или повышает урожайность. Способы получения HYT B, HYT C и HYT D описаны выше, а также в патенте США № 8,748,124 и в международной публикации патентной заявки № WO 2012/175738, обе из которых включены в настоящий документ путем отсылки во всей полноте.
В некоторых воплощениях способы включают контактирование почвы, растений (например, листья, стебли, корни, саженцы растений или других частей растений) или семян с консорциумом (таким как A1007) или композицией, включающей микроорганизмы, присутствующие в одном или более из следующего: раскрытых консорциумах или композициях микроорганизмов. Способы также могут включать выращивание обработанных растений, частей растений или семян и/или культивирование растений, частей растений или семян в обработанной почве.
Микроорганизмы необязательно активируют перед применением. В некоторых примерах, активацию микроорганизмов осуществляют, как описано выше в разделе III. В других примерах, микроорганизмы активируют смешиванием 100 частей воды и 1 части консорциума микроорганизмов или композиции и инкубированием при примерно 15-40°C (например, примерно 20-40°C, примерно 15-30°C или примерно 25-35°C) в течение примерно 12 часов-14 дней (например, примерно 1-14 дней, 3-10 дней, 3-5 дней или 5-7 дней). Смесь активации необязательно также может включать 1 часть HYT B, если консорциумы микроорганизмов или композиция должны быть применены в комбинации с HYT B.
В других воплощениях, способы включают контактирование почвы, растений (или частей растений) или семян с продуктом раскрытых консорциумов или композиций микроорганизмов, таким как HYT B, HYT C, HYT D или их комбинациями. Еще в дополнительных воплощениях, способы включают контактирование почвы, растений или семян с раскрытым консорциумом микроорганизмов или композицией, включающей раскрытые микроорганизмы, и с одним или более из следующего HYT B, HYT C и HYT D (таким как один, два или все из HYT B, HYT C и HYT D). HYT B, HYT C и/или HYT D могут быть отдельно применены к почве, растениям (или частям растений) и/или семенам, например, последовательно, одновременно или по существу одновременно с раскрытыми консорциумами микроорганизмов или композициями, содержащими микроорганизмы.
В некоторых примерах, способы дополнительно включают контактирование почвы, растений (или части растения) или семян с одним или более дополнительным компонентом, включающим без ограничений, хитин, хитозан, глюкозамин, белок, аминокислоты, жидкое удобрение, один или несколько пестицидов, один или несколько фунгицидов, один или несколько гербицидов, один или несколько инсектицидов, один или несколько гормонов растений, один или несколько элиситоров растений или комбинации из двух или более из них. Дополнительные компоненты могут быть включены в композицию, включающую микроорганизмы, или в консорциумы микроорганизмов, раскрытые в настоящем документе, или могут быть отдельно применены к почве, растениям (или частям растений) и/или семенам, например, последовательно, одновременно или по существу одновременно с раскрытыми консорциумами или композициями, содержащими микроорганизмы.
В конкретных воплощениях, консорциум микроорганизмов или композицию комбинируют с жидким удобрением (например, раствор или суспензия, содержащие растворимый азот). В некоторых примерах, жидкое удобрение включает органический источник азота, такой как мочевина, или азотсодержащую неорганическую соль, такую как аммония гидроксид, аммония нитрат, аммония сульфат, аммония пирофосфат, аммония тиосульфат, или их комбинации. Водный аммиак (20-24,6% безводного аммиака) также может быть применен в качестве растворимого азота. В некоторых примерах, консорциум микроорганизмов или композицию комбинируют с жидким удобрением (например, смешивают с жидким удобрением) непосредственно перед применением или за короткое время перед применением (таким как в рамках от 10 минут до 24 часов перед применением, например, примерно за 30 минут, 1 час, 2 часа, 3 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 12 часов, 16 часов, 18 часов или 24 часов перед применением). В других примерах, консорциум микроорганизмов или композицию комбинируют с жидким удобрением (например, смешивают с жидким удобрением), по меньшей мере, за 24 часа перед применением (например, от 24 часов до 6 месяцев, например, по меньшей мере, за 36 часов, по меньшей мере, 48 часов, по меньшей мере, 72 часов, по меньшей мере, 96 часов, по меньшей мере, за одну неделю, по меньшей мере, две недели, по меньшей мере, четыре недели, по меньшей мере, восемь недель или, по меньшей мере, за 12 недель перед применением).
В некоторых примерах, рассчитывают количество композиции(композиций), которое нужно применить (например, на акр или гектар), и композицию разводят в воде (или в некоторых примерах, в жидком удобрении) до количества, достаточного для распрыскивания или достаточного для орошения области, подлежащей обработке (если композиция жидкая, такая как консорциумы или композиции микроорганизмов, HYT B или HYT D). В других примерах, композиция может быть смешана с разбавленными гербицидами, инсектицидами, пестицидами или химические вещества, регулирующими рост растений. Если композиция, предназначенная для нанесения, представляет собой твердую композицию (такую как сухая композиция микроорганизмов, HYT C, хитин, глюкозамин, хитозан или аминокислоты), то твердая композиция может быть нанесена непосредственно на почву, растения или части растений, или может быть суспендирована или растворена в воде (или в другой жидкости) перед применением. В некоторых примерах, HYT C высушивают и микронизируют перед применением.
Раскрытые композиции микроорганизмов (по отдельности или в сочетании с другими компонентами, раскрытыми в настоящем документе, такими как HYT B, HYT C и/или HYT D) могут быть доставлены различными способами на различных стадиях развития растения, в зависимости от ситуации при выращивании культуры и сельскохозяйственных практик. В некоторых примерах, раскрытую композицию микроорганизмов и HYT B смешивают и разводят жидким удобрением и применяют во время посадки семян в количестве от 0,5 до 1-2 литров каждый на акр или альтернативно применяют индивидуально. В других примерах, раскрытую композицию микроорганизмов и HYT B смешивают и разводят и применяют при посеве семян и также наносят несколько раз на почву около корней во время роста растений, в количестве от 0,5 до 1-2 литров каждый на акр или альтернативно применяют индивидуально. Еще в дополнительных примерах, раскрытую композицию микроорганизмов и HYT B разводят и доставляют вместе путем капельного орошения при низкой концентрации, когда саженцы или рассада приживаются, доставляют орошением затоплением или разливают в виде разведенной смеси с питательными веществами в верхнем орошении или при капельном орошении в теплицах на саженцы или высаженные растения или альтернативно применяют индивидуально. В дополнительных примерах, раскрытую композицию микроорганизмов добавляют к другим обработкам почв в поле, таким как добавка к обработкам инсектицидам, для облегчения применения. В других примерах, таких как теплицы, раскрытую композицию микроорганизмов и HYT B применяют индивидуально или вместе, комбинируя с жидким удобрением (таким как рыбное удобрение) и другими питательными веществами и впрыскивают в верхние системы орошения водой или в линии капельного орошения по мере роста растения. В одном примере с теплицей, раскрытую композицию микроорганизмов и HYT B применяли вместе, например, разводили и применяли при орошении дождеванием или при удобрительном орошение в количестве от 0,25 до 1 литра при прорастании семян, с последующим от 0,25 до 1 литра в ходе цикла среднего роста с удобрительным орошением и, наконец, от 0,25 до 1 литра с удобрительным орошением 5-10 дней в конце цикла роста.
В некоторых воплощениях, раскрытую композицию микроорганизмов или консорциумы (такой как A1007) и HYT B применяют вместе или индивидуально (например, последовательно) для стимуляции урожайности, активности роста, типичности, качества, развития корней или стрессоустойчивости в посевах. В одном конкретном примере, где культура представляет собой кукурузу, 1-2 л/акр композиции микроорганизмов добавляют в борозды с жидким удобрением при посеве семян или применяют как междурядную подкормку во время оплодотворения после стадии V3, а затем от 0,5 до 2 л/акр HYT B в виде спрея для листьев после стадии V5, добавляют и разводят с гербицидами, лиственными пестицидами, микроэлементами или удобрениями.
В другом специфическом примере, где культура представляет собой картофель, 1-3 л/акр композиции микроорганизмов разбавляют и применяют или в одиночку, или с 1-3 л/акр HYT B при посадке клубня; за этим может следовать последующее нанесение на почву композиции микроорганизмов и HYT B до клубнеобразования, либо поодиночке (например, последовательно) или вместе. После прорастания растений, HYT B можно применять нанесением на листья картофеля в количестве 1-2 л/акр, или разведенным в одиночку или смешанным с гербицидом, лиственным пестицидом, питательным микроэлементом и/или с обработками, представляющими собой удобрения, и наносить в ходе сезона выращивания один раз, два раза, три раза, четыре раза или более.
В еще одном конкретном примере, где культура представляет собой хлопок, 1-2 л/акр композиции микроорганизмов применяют в борозды при посадке, в виде междурядной подкормки или 2x2 (2 дюйма в сторону и 2 дюйма ниже семени), с удобрением или без него. При первом белом цветении хлопка, может быть применена обработка листьев в количестве от 0,5 до 2 л/акр HYT B, разведенная в одиночку или в сочетании с другими питательными веществами, гербицидной или пестицидной обработками.
В другом конкретном примере, где культура представляет собой пшеницу, композицию микроорганизмов (1-2 л/акр) применяют после зимнего покоя (стадия S4) и HYT B применяют через листья (от 0,5 до 2 л/акр; стадия от S4 до S10).
В качестве примера, где культура представляет собой сахарный тростник, в одном из способов применяют раскрытую композицию микроорганизмов и HYT B в количестве 2-4 л/акр каждого, нанося на почву во время посадки тростника или в виде междурядной подкормки, с HYT B, который наносят на листья в количестве 1-2 л/акр, смешивая с водой или удобрениями или микроэлементами.
HYT B может быть применен в одиночку в виде обработки листьев на всех культурах для улучшения таких качеств, как устойчивость к стрессам растений, активность роста, качество урожая и урожайность. В качестве примера, где культура представляет собой кукурузу, HYT B может быть применен в количестве от ½ до 1 л/акр, один или несколько раз, будучи смешан с водой или пестицидами или гербицидами. В другом примере, HYT B может быть применен для обработки пшеницы в виде лиственного спрея, смешанного с водой или пестицидами или гербицидами, в количестве от ½ до 1 л/акр, с нанесением один или несколько раз.
Во всех культурах, HYT C может быть добавлен к почве в количестве примерно 0,5-2 кг/акр (например, примерно 0,5 кг/акр, примерно 1 кг/акр, примерно 1,5 кг/акр или примерно 2 кг/акр) во время приживания или посадки культур. В других примерах, HYT C добавляют в раствор для капельного орошения раскрытой композиции микроорганизмов и HYT B или добавляют при внесении удобрений, содержащих раскрытую композицию микроорганизмов и HYT B в теплицах, так как приведено в качестве примеров выше.
В дополнительных воплощениях, HYT D (по отдельности или в сочетании с микроорганизмами или другими компонентами, раскрытыми в настоящем документе) применяют в количестве примерно 1-20 л/гектар (например, примерно 1-15 л/гектар, примерно 3-10 л/гектар или примерно 3-5 л/гектар). В других примерах, HYT D (по отдельности или в сочетании с микроорганизмами или с другими компонентами, раскрытыми в настоящем документе) применяют как обработку семян для увеличения урожайности и производительности культур (например, примерно 1-10 л/кг семян, например, примерно 1-3 л/кг, примерно 3-5 л/кг или примерно 5-10 л/кг). Альтернативно, HYT D может быть применен в почве (по отдельности или в сочетании с микроорганизмами или с другими компонентами, раскрытыми в настоящем документе) в количестве примерно 1-3 л/гектар для увеличения роста растений, например, для помощи растениям в сохранении продуктивности в условиях стресса.
В некоторых примерах, обработка почвы, семян, растений или частей растения композицией, включающей микроорганизмы в раскрытом консорциуме микроорганизмов, увеличивает рост растений (например, общий размер растений, количество листьев, число корней, диаметр корней, длину корней, продукцию побегов, продукцию плодов, продукцию пыльцы или продукцию семян), по меньшей мере, на примерно 5% (например, по меньшей мере, на примерно 10%, по меньшей мере, примерно 30%, по меньшей мере, примерно 50%, по меньшей мере, примерно 75%, по меньшей мере, примерно 100%, по меньшей мере, примерно в 2 раза, по меньшей мере, примерно в 3 раза, по меньшей мере, примерно в 5 раз, по меньшей мере, примерно в 10 раз или более). В других примерах, раскрытые способы приводят к увеличению производства сельскохозяйственных культур примерно на 10-75% (например, примерно на 20-60% или примерно на 30-50%) по сравнению с необработанными культурами. Другие измерения производительности сельскохозяйственных культур включают качество плодов, урожайность, содержание крахмала или твердых веществ, содержание сахара, или брикс, срок годности плода или заготавливаемого продукта, продукцию товарной урожайности или заданного размера, качество плода или продукта, кущение травы и устойчивость к вытаптыванию в дерне, опыление и завязывание плода, цветение, число цветков, продолжительность жизни цветка, качество цветения, корнеобразование и массу корней, устойчивость культур к полеганию, к абиотическому стрессу, устойчивость к жаре, засухе, холоду и восстановление после стресса, приспособляемость к бедным почвам, уровень фотосинтеза и озеленения и здоровье растений. Чтобы определить эффективность продуктов, контроли включают такие же, выполняемые параллельно, агрономические практики, но без добавки микроорганизмов.
Раскрытые способы и композиции могут быть применены в связи с любой сельскохозяйственной культурой (например, для прямой обработки культуры или для обработки почвы перед посадкой или после посадки). Типичные культуры включают, без ограничения, люцерну, миндаль, банан, ячмень, брокколи, рапс, морковь, цитрусовые и фруктовые деревья, кукурузу, хлопок, огурец, цветы и декоративные растения, чеснок, виноград, хмель, садовые растения, лук-порей, дыню, масличную пальму, лук, арахис и бобовые, ананас, тополь, сосну и деревья, дающие древесину, картофель, малину, рис, кунжут, сорго, сою, тыкву, клубнику, сахарный тростник, подсолнечник, помидор, дерновые и кормовые травы, арбуз, пшеницу и эвкалипт.
Следующие примеры обеспечивают для иллюстрации некоторых определенных признаков и/или воплощений. Данные примеры не должны рассматриваться как ограничивающие раскрытие определенных описанных признаков или воплощений.
Пример 1
Консорциум микроорганизмов A1007
Данный пример описывает получение консорциума микроорганизмов A1007.
A1007 получают из посевной партии микроорганизмов, которые исходно были получены из плодородных почв и дополнительных микроорганизмов (таких как Bacillus spp.) (смотри, например, патент США № 8,748,124, включенный в настоящий документ путем отсылки). «Посевную» культуру смешивали с суспензией, содержавшей 5,5% масс./масс. белка сыворотки и 1,2% масс./масс. йогурта в воде («C vat»), и с суспензией, содержавшей 0,1% масс./масс. спирулины и 0,1% масс./масс. экстракт водорослей в воде («A vat»). Суспензии A vat и C vat были каждая индивидуально приготовлены за 3 дня до смешивания с посевной культурой и их инкубировали при температуре окружающей среды. Посевную культуру, C vat и A vat смешивали в пропорции, равной примерно 81:9:9. После смешивания, суспензию дополнительных компонентов, содержавшую примерно 70% объем/объем мелассы, 0,5% объем/объем HYT B, 0,003% масс./объем аравийской камеди и 0,02% масс./объем пивных дрожжей (S. cerevisiae) смешивали с смесью посевной культуры, C vat и A vat и дополнительной воды в соотношении, равном примерно 16:34:50. Смесь ферментировали в течение примерно 7-ми дней при температуре окружающей среды (примерно 19-35°C). Через 7 дней, резервуары аэрировали в течение 30 минут каждый второй день. Добавляли дополнительную воду (примерно на 10% больше, объем/объем) и ферментацию продолжали при тех же условиях в течение примерно 10-ти дополнительных дней. Добавляли дополнительную воду (примерно на 4% больше, объем/объем) и ферментацию продолжали в течение примерно 7-ми дополнительных дней, в это время собирали образцы для анализа и депонирования в ATCC. Полученный консорциум (обозначенный как A1007) впоследствии хранили в контейнерах при температуре окружающей среды. Схематическая диаграмма, показывающая типичный способ получения A1007, приведена на фиг. 1.
Пример 2
Анализ количества микроорганизмов в A1007 посевом на чашках
Данный пример описывает анализ нагрузки жизнеспособных микроорганизмов, присутствующих в A1007, путем распределения на чашке в аэробных и анаэробных условиях.
-2
9
Образцы (от 1 л до 5 л) собирали из хорошо перемешанного контейнера с A1007, с помощью дезинфицированного портативного сифонного барабанного насоса. Анализ количества микроорганизмов проводили, применяя методику распределения по чашке для определения колониеобразующих единиц (КОЕ) в образце(образцах). Все образцы хранили при комнатной температуре в свето- и воздухонепроницаемых контейнерах. После энергичного перемешивания образца, для обеспечения равномерного распределения содержимого, 1 мл сохраняли. Из этой аликвоты, 0,1 мл асептически отбирали и смешивали с 9,9 мл стерильной воды в культуральной пробирке (10 разведение). Пробирку затем перемешивали на вортексе (например, 60 секунд при 2000 rpm) и готовили 10-кратные серийные разведения в воде (вплоть до разведения 1:10). Сто микролитров каждого разведения затем распределяли на полутвердых средах в 100 мм чашках Петри с помощью стерильного L-образного распределителя. Применяли чашки, содержавшие агар, приготовленный стандартным способом (Standard Method Agar (SMA; BD #247940)), питательный агар (Nutrient Agar (NA; BD #213000)) или другую селективную среду роста (таблица 2). Инокулированные чашки затем инкубировали в камерах с контролируемой температурой при от 22°C до 35°C. Для оценки количества анаэробных микроорганизмов, чашки исходно помещали в анаэробные боксы (например, контейнерные системы BD GasPak™ EZ, BD Diagnostics) перед инкубацией при желаемой температуре (желаемых температурах). В некоторых случаях, тестируемую аликвоту сначала инкубировали в стерильной пептонной воде на протяжении вплоть до 3-х дней при температурах вплоть до 35°C перед выполнением серийных разведений и посева на чашки, как описано выше.
Таблица 2. Полутвердые среды, примененные для выделения микроорганизмов из A1007
Род
Полутвердая среда*
Bacillus spp.
NA, YPD, SMA, AMA, AMAG
Lactobacillus spp.
YPD, MRS, NA, SMA
Virgibacillus spp.
YPD
Brevibacillus spp.
RMA
Paenibacillus spp.
AMA, NA, RMA, MRS
Clostridium spp.
SMA, RCM
Oceanobacillus spp.
RMA
Lysinibacillus spp.
NA, MRS, YPD
Acetobacter spp.
YPD, PA
Rummeliibacillus spp.
NA
Candida spp.
YPD
*NA: питательный агар (BD #213000); SMA: агар, приготовленный стандартным способом (BD #247940); YPD: дрожжевая пептонная декстроза (BD#242720); AMA: агар, приготовленный на среде для азотобактера (HIMEDIA #M372); AMAG: агар, приготовленный на среде для азотобактера, дополненной 10 г/л глюкозой (HIMEDIA #M371); RCM: усиленная среда для клостридий (BD #218081); RMA: агар, приготовленный на среде для клубеньковых бактерий (HIMEDIA #M408); PA: среда Пиковской (HIMEDIA #M520); MRS: MRS для лактобактерий (BD# 288210).
9
9
5
5
После инкубации, все колонии на выбранных чашках подсчитывали, применяя счетчик колоний, такой как Quebec Dark-Field Colony Counter (Reichert) и рассчитывали КОЕ/мл. Для обработанных пептоном A1007, посев на чашки показал 8,73 x 10 КОЕ/мл в аэробных условиях и 1,4 x 10 КОЕ/мл в анаэробных условиях. Для A1007, которые не инкубировали с пептоном, посев на чашки показал 3,28 x 10 КОЕ/мл в аэробных условиях и 3,55 x 10 КОЕ/мл в анаэробных условиях.
Пример 3
Анализ микроорганизмов в A1007 путем очистки колоний
Данный пример описывает очистку колоний и анализ подмножества микроорганизмов, присутствовавших в A1007.
После энергичного перемешивания образа A1007 для обеспечения равномерного распределения содержимого, получили аликвоту, объемом в 1 мл. Из этой аликвоты, 0,1 мл непосредственно распределили на полутвердые среды с помощью описанного выше способа распределения посевного материала на чашки. Среды различных композиций отбирали как для селективных, так и для неселективных условий роста. В таблице 2 суммированы среды, примененные для выделения микроорганизмов из A1007. Чашки инкубировали или аэробно, или анаэробно, как описано в примере 2, при температурах, варьировавших от 22°C до 35°C.
Отбор штаммов микроорганизмов для дополнительного исследования был основан на классических макроскопических и микроскопических характеристиках колоний, выращенных на полутвердых средах (Bergey’s Manual of Systematics of Archaea and Bacteria; Editor(s): William B. Whitman, 2012). Применяли такие критерии, как цвет, плотность или морфология колоний. Кроме того, анализ морфологии клеток и дифференциальное окрашивание, такое как окрашивание по Граму, применяли для исследования индивидуальных клеток, полученных из колонии, применяя цифровой светопольный микроскоп.
Пример 4
Анализ микроорганизмов в A1007 секвенированием
Данный пример описывает анализ микроорганизмов в A1007 секвенированием 16S рДНК.
Геномную ДНК экстрагировали из изолированных колоний, полученных как описано в примере 3. 16S рДНК амплифицировали с помощью ПЦР и секвенировали, например, применяя систему идентификации микроорганизмов MICROSEQ ID (Applied Biosystems/Life Technologies, Grand Island, NY). Данные по секвенированию анализировали, например, применяя программное обеспечение SHERLOCK DNA (MIDI Labs, Newark, DE). Последовательности сопоставлялись публичными базами данных для идентификации микроорганизмов. Полученные последовательности 16S рДНК, обеспечивают в настоящем документе как SEQ ID NOs: 1-17.
Пример 5
Рост микроорганизмов на азотном удобрении
Данный пример описывает отбор субпопуляций консорциума микроорганизмов с применением различных условий роста, таких как воздействие жидкого удобрения. Данный пример также демонстрирует устойчивость микроорганизмов к высоким концентрациям азотных удобрений и полезность объединения консорциума микроорганизмов с удобрениями, применяемыми в сельском хозяйстве.
A1007 объединяли с жидким удобрением мочевина-аммоний-азот (UAN 32) в соотношении 80:1 (удобрение:микроорганизмы) в 50 мл культуральных пробирках, которые содержали при комнатной температуре и в темноте. Небольшие аликвоты (0,1 мл) собирали вплоть до 3-ей недели от начала инкубации и обрабатывали для изоляции колоний, применяя способ посева распределением на чашках/серийные разведения, описанные в примере 3. Посев на чашки и выделение колоний выполняли, как описано выше, применяя как селективные, так и неселективные среды. Колонии микроорганизмов отбирали на основе морфологии, цвета, размера колоний и условий роста, включавших окрашивание по Граму. Чисто отделенные колонии посылали в MIDI Labs Inc. (Newark, DE) для секвенирования вариабельной области 16S рибосомальной ДНК для идентификации вида (как описано в примере 4).
Очищенные идентифицированные изоляты перечислены в таблице 3, что указывает на восстановление этих штаммов как в условиях роста как без UAN, так и с UAN. Соответствие уровня вида назначали, если %GD (родовое различие) между неизвестным и ближайшим совпадением была меньше, чем приблизительное среднее значение %GD между видами в пределах определенного генетического семейства, которое обычно было равно 1%. Уровень соответствия роду назначали, если последовательность не соответствовала требованиям для соответствия уровню вида, но все еще кластеризовалась внутри ветвления хорошо определенного рода (1%< %GD<3%).
Таблица 3. Микроорганизмы, идентифицированные секвенированием колоний из A1007, культивированного в присутствии или отсутствии UAN
Микроорганизм
без UAN
плюс UAN
<i>Bacillus circulans</i><i>Bacillus pocheonensis</i>
XX
XX
<i>Bacillus flexus</i><i>Bacillus subterraneus</i><i>Bacillus oceanisediminis</i><i>Bacillus firmus</i>
X
XXXX
<i>Brevibacillus brevis</i>
X
X
<i>Clostridium nitrophenolicum</i>
X
X
<i>Clostridium tyrobutyricum</i><i>Clostridium sphenoides</i>
XX
<i>Lysinibacillus fusiformis</i>
X
<i>Oceanobacillus oncorhynchi subsp. incaldanensis</i>
X
X
<i>Paenibacillus validus</i><i>Paenibacillus anaericanus</i><i>Paenibacillus agaridevorans</i><i>Paenibacillus timonensis</i><i>Paenibacillus cineris</i><i>Paenibacillus rhizoospherae</i><i>Paenibacillus favisporus </i>
XX
XXXXXXX
<i>Rummeliibacillus stabekisii</i>
X
<i>Virgibacillus halophilus</i>
X
Пример 6
Биодеградация хитин-содержащих материалов
Данный пример описывает типичные способы биодеградации хитин-содержащих биологических материалов с применением консорциума микроорганизмов A1007. Однако специалист в данной области техники понимает, что способы, которые отклоняются от этих конкретных способов, также могут быть применены для успешной биодеградации хитин-содержащих биологических материалов.
Побочные продукты переработки креветок получали от производств переработки креветок и транспортировали в закрытых, охлажденных контейнерах. После инспекции качества сырья, побочные продукты переработки креветок обрабатывали для уменьшения размера частиц до примерно 3-5 мм. Предварительно активированные (например, с сахаром (примерно 2,5 г/л)) культуры микроорганизмов A1007 (примерно 0,2-100 мл/л) и сахарозу (примерно 5 г/л) смешивали с гомогенизированным побочным продуктом переработки креветок (примерно 50 г/л) и перемешивали до тех пор, пока смесь не становилась гомогенной. Температуру, при непрерывном перемешивании, поддерживали при температуре окружающей среды (примерно 19-35°C) и pH регулировали до 3,5-4,0 лимонной кислотой. Смешанные ингредиенты переносили в дезинфицированный резервуар для ферментации (25000 л) и ферментировали при 30-36°C в течение 120 часов. Перемешивание применяли в течение 30 минут, по меньшей мере, два раза в день. В ходе ферментации, контролировали pH и общую титруемую кислотность (TTA, %) определяли титрованием с 0,1 н NaOH. Ферментацию останавливали, когда TTA была равна примерно 3,5% и/или pH был равен примерно 4-5.
Ферментируемые культуры загружали в непрерывный декантер. Отделенный твердый слой со стадии декантации подвергался центрифугированию для удаления липидного слоя. Очищенную жидкость (HYT B) смешивали с сахаром (таким как меласса, 10% объем/объем), затем хранили в сборных резервуарах или разливали в контейнеры. Твердые материалы со стадии декантации сушили перегретым воздухом при 120°C до тех пор, пока содержание влаги в них не становилось ниже 8%, затем измельчали до 200 меш. Высушенный продукт (HYT C) упаковывали в пакеты или мешки.
Пример 7
Биодеградация хитина
Данный пример описывает типичные способы биодеградации хитина с применением консорциума микроорганизмов A1007. Однако специалист в данной области техники понимает, что способы, которые отклоняются от этих конкретных способов, также могут быть применены для успешной биодеградации хитина.
Культуру микроорганизмов A1007 предварительно активировали с сахаром (примерно 2,5 г/л) в 10000 л резервуаре в течение трех дней. Активированный инокулят смешивали с белковым гидролизатом, таким как HYT B (примерно 500 мл/л) и хитином (например, с HYT C, полученным как описано в примере 6). Смесь осторожно перемешивали в течение 1-го часа для достижения полной гомогенизации. Смесь ферментировали в течение 20-ти дней при температуре окружающей среды (например, примерно при 19-35°C) с перемешиванием в течение примерно 8-ми часов ежедневно и контролированием pH (pH 4,0-5,0). Образцы могут быть собраны периодически, например, каждые два дня, для количественной оценки глюкозамина и, необязательно, хитозана. После окончания ферментации, смесь фильтровали через фильтр, который удерживал частицы размером 300 меш, прежде всего удерживая хитин. Фильтрат сохраняли и разливали по бутылям после характеристики продукта.
Пример 8
Обработка кукурузы в поле композицией микроорганизмов
Данный пример описывает типичный способ получения повышенной урожайности культуры кукурузы, с применением консорциума микроорганизмов. Специалист в данной области техники понимает, что способы, которые отклоняются от этих конкретных способов, также могут быть применены для увеличения урожайности культур.
Обработка кукурузы в поле композицией микроорганизмов, похожей на A1007 или с HYT B, показала значительное увеличение окончательной заготавливаемой урожайности. Все агрономические практики оплодотворения, культивирования, контроля сорняков и контроля насекомых-вредителей, были идентичными и расположены рядом для участков, обработанных композициями микроорганизмов – или HYT B – (опыт) и контрольных (контроль) участков.
Испытание A показало, что при оценке в испытании с повторными участками, единственная инокуляция в почву кукурузы с композицией микроорганизмов в количестве 1 л/акр в борозде на стадии V6, с доставкой 28% азотного удобрения путем капельного орошения, обеспечивало 14%-ное увеличение урожайности по сравнению с необработанным контролем на пяти повторяющихся участках (фиг. 4A).
Испытание B показало, что HYT B, при применении в одиночку в виде обработки листьев на кукурузе, также обеспечивал 9,5%-ное увеличение урожайности, по сравнению с необработанным контролем, при тестировании в рандомизированном испытании с повторяющимися участками. HYT B был распылен на листья в ходе двух применениях, 1 л/акр каждое применение, на стадии V8 и на стадиях VT (фиг. 4B).
Испытание C также представляло собой рандомизированное испытание с повторяющимися участками на кукурузе, проведенное в условиях недостатка воды. В данном исследовании, количество орошение было ограничено до 11 дюймов воды по сравнению с надлежащим образом политыми участками, которые получили 17 дюймов орошения. Единственную обработку композицией микроорганизмов в 1 л/акр, доставляли на стадии V6 с 28% азотного удобрения путем капельного орошения (обработанные), что давало 38%-ное увеличения урожайности по сравнению с участками, обработанными только удобрением (необработанный контроль). Увеличение выхода, наблюдаемое с обработкой композицией микроорганизмов, представляло собой потенциал повышенной урожайности в 31 бушелей/акр (фиг. 4C).
Пример 9
Обработка томатов A1007
Данный пример описывает эффект композиции микроорганизмов A1007 на урожайность культуры томатов. Обработка томатов композицией микроорганизмов показала сильное увеличение в окончательной заготавливаемой урожайности. Все агрономические практики оплодотворения, культивирования, контроль сорняков и контроль насекомых-вредителей, были идентичными и расположены рядом для участков, обработанных композицией микроорганизмов (опыт), и контрольных (контроль) участков.
Консорциум микроорганизмов A1007 (обозначенный в данном примере как «HYT A») тестировали на неопределенном сорте томатов в испытании на полностью рандомизированном, реплицированном участке теплицы, сравнивая частоту и дозировку применения микроорганизмов и влияние на урожайность. Во всех случаях, применяли одинаковые стандартные практики фермеров, включающие подачу питания, опыление и контроль насекомых-вредителей. Почва была предварительно обработана HYT A (2 л/га) плюс HYT B (6 л/га), с дополнительной дозой при посадке (HYT A 1 л/га, HYT B 3 л/га). Во время роста растений, обработка представляла собой три повтора, каждый участок в 30 кв. метров, с HYT A и HYT B, примененными в виде капельного орошение с трехнедельными интервалами, с удвоенной первой дозой (HYT A 2 л/га, HYT B 4 л/га) и с последующими дозами, сниженными вдвое (HYT A 1 л/га и HYT B 2 л/га). Выход измеряли при каждом сборе плодов в течение шестимесячного цикла сбора урожая.
Обработка 1 не включала активировацию или предварительную инкубацию до воздействия на растения, тогда как обработка 3 представляла собой HYT A/HYT B, которые были преинкубированы вместе и активированы в течение трех дней до применения. В данном случае, выход томатов как для неактивированных, так и для активированных вариантов был почти одинаков, 370 кг/участок и 369 кг/участок. По сравнению с контролем (обработка 4), данный увеличенный выход был равен примерно 50 кг/30 кв. метр участка (15%-ное увеличение урожайности), что представляет собой потенциально повышенную урожайность, равную 16600 кг/га. Даже половинное количество HYT A и HYT B (обработка 2) повышало общую производительность на 25 кг/участок или примерно 8%-ное увеличение урожайности (фиг. 5).
Пример 10
Повышенная устойчивость к стрессу в картофеле
Данный пример описывает типичный способ получения повышения качества для клубней картофеля путем обработки композицией микроорганизмов, сходной с A1007, и HYT B в ходе роста в стрессовых полевых условиях.
Картофель сорта Russet Burbank растили в обычных условиях в испытании с повторяющимися участками (четыре повтора) или обработанным (композиция микроорганизмов плюс HYT B в количестве 1 л каждого на акр при посадке, в борозду, с последующими двумя нанесениями на листья HYT B в количестве 1 л/акр в течение 55 дней и снова через 85 дней после посадки), или необработанным (контроль). Сорт Russet Burbank склонен к снижению качества в условиях водного, теплового или питательного стресса. В данном испытании, обработка композицией микроорганизмов и HYT B усиливала устойчивость к индуцированному стрессом дефекту качества, называемому дуплистость. Участки, обработанные композицией микроорганизмов, имел частоту собираемых клубней с дуплистостью, равную 1,68%, по сравнению с дефектами дуплистости в контроле, равными 8,35% (таблица 4).
Таблиц 4. Качество дефектов дуплистости в картофеле
Обработка
Урожайность (кг/акр)
Процент дуплистости
Необработанные (контроль)
32,181
8,35%
Композиция микроорганизмов плюс HYT B
32,636
1,68%*
* p<0,01 по сравнению с необработанными
Пример 11
Повышенная устойчивость к нематодам в картофеле
Большеполосные испытания (0,12 га/обработка) картофеля сорта Nectar были высажены в землю с высокой распространенностью заражения цистами картофельных нематод (PCN). В начале испытания, подсчитывали яйца и цисты PCN в почве в 8 множественных GPS местах на участок, из которых отбирали 20 независимых образцов и объединяли в объединенный образец в каждом месте, что представляло собой исходные уровни заражения PCN. Данные подсчеты яиц и цист повторяли в конце испытания в тех же местоположениях GPS во время сбора урожая для оценки воздействия обработки на сезонную репликацию PCN. От десяти до 24 растений, в зависимости от места, на участок в каждом местоположении GPS собрали для измерения урожайности, ближайшей к специфическим измерениям PCN. Кроме того, клубни со всей испытательной полосы в 0,12 га для каждой обработки собирали для определения общей урожайности участка. Сравнивали пять различных обработок, включая A1007 («HYT A») плюс HYT B (один раз при посадке и один раз при всходе) в количестве 4 л/га для HYT A и 2,5 л/га для HYT B, с или без дополнительных 4 л HYT D (дважды, применяют при посадке и при всходе) или 1,5 кг/га HYT C (дважды, применяют при посадке и при всходе). На контрольных участках в данном исследовании применяли традиционную сельскохозяйственную практику обработки нематоцидом фостиазатом (нематорин 10 г, содержавший 10% масс./масс. фостиазата, 30 кг/га), или необработанный контрольный участок.
Оценка, проведенная в специфическом местоположении GPS, показала, что обработка нематорином значительно уменьшила отношение количества яиц/кист нематод по сравнению с другими обработками (фиг. 6A). При сравнении общего урожая от каждой обработки, обработка комбинацией HYT A-HYT B-HYT D давала на 15% больше урожайности, чем необработанный контроль и примерно на 25% выше урожайности, чем обработка нематорином (фиг. 6B). Эти результаты показывают, что комбинированная обработка HYT A-HYT B-HYT D не представляет собой нематицидную обработку, но может помочь растениям оставаться продуктивными в присутствии нематод, например, потенциально поддерживая поглощение питательных веществ, тем самым поддерживая здоровье растений.
Пример 12
Увеличенная мощность растений в модельных растительных системах
Быстрые функциональные анализы на основе растений могут быть применены для быстрой оценки реакции растений на новые композиции микроорганизмов. Применяя анализ мощности и роста растений огурца, данный пример демонстрирует, что A1007 усиливает скорость роста и расширения листьев растений.
Композицию микроорганизмов A1007 разводили 1:2000 в питательной среде с удобрениями. После предварительного проращивания саженцев огурцов в рулонной бумаге для проращивания, пропитанной питательными веществами, в течение четырех дней, синхронизированные растения на определенной стадии обрабатывали разведенной смесью жидкого удобрения и A1007. Проростки пересаживали в подготовленную беспочвенную среду роста, предварительно обработанную удобрением и A1007. В качестве контрольных обработок, сравнивали добавление или эквивалентного количества воды к питательной среде, или 1:2000 разведения стерилизованного через 0,2 мкм фильтры A1007. По меньшей мере, 18 растений из каждой обработки, росших на участках, включавших контроль растений, были рандомизированы на делянках и росли в определенных условиях роста, с контролируемой температурой и светом. Через 17 дней, измеряли показатель площади листьев (LAI) первого истинного листа для каждого растения. Второе измерение LAI третьего истинного листа проводили примерно на 28 день. Общий вес влажного растения также регистрировали. Данные анализировали с помощью одностороннего анализа ANOVA (дисперсионный анализ) и ретроспективного анализа Тьюки для сравнения образцов в рамках эксперимента.
На день 17, рейтинги LAI первого листа трех обработок показали незначительные отличия. Ко дню 27, усиленный рост третьего листа (LAI), стимулированный действием A1007, был значительно больше, чем у контроля с водой или у контроля со стерилизованным через фильтры A1007 (фиг. 7).
Пример 13
Анализ микроорганизмов в A1007 с помощью микропанелей
Данный пример описывает анализ микроорганизмов, присутствующих в A1007, с помощью микропанелей.
Образец хорошо перемешанного раствора A1007, объемом 1 мл, применяли для получения геномной ДНК с помощью набора для выделения ДНК PowerSoil (Mo Bio Laboratories, Carlsbad, CA). Сообщество микроорганизмов A1007 анализировали с помощью анализа pHyloChip (Second Genome, South San Francisco, CA), применяя изолированную геномную ДНК. Всего с помощью этого анализа из A1007 идентифицировали 578 операционных таксономических единиц (OTUs). Данные анализа микропанелей применяли для отбора микроорганизмов для включения в композиции, описанные в настоящем документе, в комбинации с данными, описанными в примерах 2-4. В особенности, анализ микропанелей идентифицировал присутствие Streptomyces spp. из A1007, который отобрали для включения в некоторые композиции микроорганизмов, описанные в настоящем документе.
Список различных воплощений
Кроме того, следующие воплощения описаны в дополнение к альтернативе или в качестве альтернативы вышеуказанному:
Воплощение 1 направлено на композицию, включающую микроорганизмы, депонированные в ATCC под номером PTA-122728 (A1007).
Воплощение 2 направлено на композицию, включающую пять или более видов микроорганизмов, которые выбирают из Bacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp. и Candida spp.
Воплощение 3 направлено на композицию, включающую десять или более видов микроорганизмов, которые выбирают из Bacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp. и Candida spp.
Воплощение 4 направлено на композицию микроорганизмов, включающую виды микроорганизмов, которые выбирают из каждого из Bacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp. и Candida spp.
Воплощение 5 направлено на композицию микроорганизмов, включающую виды микроорганизмов по любому из воплощений 2-4, дополнительно включающую виды микроорганизмов из Streptomyces spp.
Воплощение 6 направлено на композицию микроорганизмов, включающую пять или более видов микроорганизмов, которые выбирают из Bacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Streptomyces spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp. и Candida spp.
Воплощение 7 направлено на композицию микроорганизмов, включающую десять или более видов микроорганизмов, которые выбирают из Bacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Streptomyces spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp. и Candida spp.
Воплощение 8 направлено на композицию микроорганизмов, включающую виды микроорганизмов, которые выбирают из каждого из Bacillus spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Streptomyces spp., Virgibacillus spp., Brevibacillus spp., Paenibacillus spp., Oceanobacillus spp., Lysinibacillus spp., Acetobacter spp., Rummeliibacillus spp. и Candida spp.
Воплощение 9 направлено на композицию по любому из воплощений 2-8, в которой Bacillus spp. включает одно или более из следующего Bacillus flexus, Bacillus circulans, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus pocheonensis и Bacillus clausii.
Воплощение 10 направлено на композицию по любому из воплощений 2-9, в которой Lactobacillus spp. включает Lactobacillus vini и/или Lactobacillus buchneri.
Воплощение 11 направлено на композицию по любому из воплощений 2-10, в которой Clostridium spp. включает одно или более из следующего Clostridium nitrophenolcium, Clostridium beijerinckii и Clostridium pasteurianum.
Воплощение 12 направлено на композицию по любому из воплощений 2-11, в которой Paenibacillus spp. включает одно или более из следующего Paenibacillus brevis, Paenibacillus cookii, Paenibacillus lautus, Paenibacillus, chibensis, Paenibacillus anaericanus и Paenibacillus agaridevorans.
Воплощение 13 направлено на композицию по любому из воплощений 2-12, в которой Oceanobacillus spp. включает Oceanobacillus oncorhynchi subsp. incaldanensis.
Воплощение 14 направлено на композицию по любому из воплощений 2-13, в которой Lysinibacillus spp. включает Lysinibacillus xylanilyticus.
Воплощение 15 направлено на композицию по любому из воплощений 2-14, в которой Acetobacter spp. включает Acetobacter pasteurianum.
Воплощение 16 направлено на композицию по любому из воплощений 2-15, в которой Rummeliibacillus spp. включает Rummeliibacillus pycnus.
Воплощение 17 направлено на композицию по любому из воплощений 2-16, в которой Candida spp. включает Candida ethanolica.
Воплощение 18 направлено на композицию по любому из воплощений 2-17, дополнительно включающую одно или более из следующего Bacillus subterraneus, Bacillus oceanisediminis, Bacillus firmus, Virgibacillus halophilus, Brevibacillus brevis, Paenibacillus validus, Paenibacillus timonensis, Paenibacillus cineris, Paenibacillus rhizoospherae, Paenibacillus favisporus, Clostridium tyrobutyricum, Clostridium sphenoides, Lysinibacillus fusiformis и Rummeliibacillus stabekisii.
Воплощение 19 направлено на композицию по любому из воплощений 2-18, дополнительно включающую одно или более из следующего Azotobacter spp. и Rhizobium spp.
Воплощение 20 направлено на композицию воплощения 19, в которой Azotobacter spp. включает Azotobacter vinelandii и/или Azotobacter chroococcum или Rhizobium spp. включает Rhizobium japonicus и/или Rhizobium leguminosarum.
Воплощение 21 направлено на композицию по любому из воплощений 2-20, дополнительно включающую одно или более из хитина, хитозана, глюкозамина и аминокислот.
Воплощение 22 направлено на способ, включающий смешивание хитин-содержащего биологического источника с композицией по любому из воплощений 1-21 с образованием смеси; ферментацию смеси; и разделение ферментированной смеси на твердую, водную и липидную фракции.
Воплощение 23 направлено на способ воплощения 22, в котором хитин-содержащий биологический источник включает морское животное или побочный продукт переработки морского животного, насекомое или грибок.
Воплощение 24 направлено на способ воплощения 23, в котором морское животное представляет собой морское членистоногое.
Воплощение 25 направлено на способ воплощения 24, в котором морское членистоногое представляет собой креветку, краба или криля.
Воплощение 26 направлено на водную фракцию, полученную способом по любому из воплощений 22-25.
Воплощение 27 направлено на твердую фракцию, полученную способом по любому из воплощений 22-24.
Воплощение 28 направлено на способ, включающий контактирование почвы, растения или части растения с композицией по любому из воплощений 1-21.
Воплощение 29 направлено на способ воплощения 28, дополнительно включающий контактирование почвы, растений или частей растения с одним или более из хитина, хитозана, глюкозамина и аминокислот.
Воплощение 30 направлено на способ воплощений 28 или 29, дополнительно включающий контактирование почвы, растений или частей растения с водной фракцией воплощения 26 и/или твердой фракцией воплощения 27.
Воплощение 31 направлено на способ по любому из воплощений 28-30, дополнительно включающий контактирование почвы, растений или частей растения с жидким удобрением.
Воплощение 32 направлено на способ по любому из воплощений 28-31, дополнительно включающий контактирование почвы, растений или частей растения с одним или несколькими пестицидом, одним или несколькими фунгицидами, одним или несколькими гербицидами, одним или несколькими инсектицидами, одним или несколькими гормонами растений, одним или несколькими элиситорами растений или с комбинациями двух или более из них.
Ввиду многих возможных воплощений, к которым принципы раскрытия могут быть применены, следует признать, что проиллюстрированные воплощения представляют собой только примеры и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения. Скорее, объем изобретения определен следующей формулой изобретения. Поэтому, настоящее изобретение включает все, что входит пределы объема и сущности данной формулы изобретения.