Флуориметрический анализатор биологических микрочипов
BIOLOGICAL MICROCHIPS FLUORIMETRIC ANALYZER

Область техники, к которой относится изобретение
Предлагаемое изобретение относится к молекулярной биологии, биофизике, биохимии, биоорганической химии, биотехнологии и фармакологии, в частности, к количественной люминесцентной микроскопии, применяемой в приборах, предназначенных для регистрации взаимодействий между биологическими молекулами, помеченными красителем, флуоресцирующим в видимой или инфракрасной (ИК) области спектра, и молекулярными зондами, иммобилизованными в ячейках биологического микрочипа (биочипа). В результате взаимодействия флуоресцентно меченных молекул анализируемого вещества с зондами соответствующие ячейки начинают флуоресцировать при возбуждении светом в определенной длине волны. Разработанное устройство представляет собой анализатор изображений биочипов и предназначено для измерения интенсивности флуоресценции ячеек биочипа. Анализатор позволяет проводить измерения в трех длинах волн от 380 нм до 850 нм при возбуждении флуоресценции расфокусированным лазерным излучением и содержит устройство подавления спеклов, возникающих вследствие интерференции когерентного света на подложке биочипа. Применение предлагаемого анализатора позволяет определять относительные количества флуоресцирующих красителей в ячейках биочипа с точностью до 10%. Увеличение диапазона измеряемых величин интенсивности флуоресценции достигается путем регистрации серии изображений биочипа на ПЗС камеру с различными экспозициями.
Уровень техники
Биологическим микрочипом или биочипом называется матрица микроячеек, регулярно расположенных на плоской подложке (Venkatasubbarao S. 2004. Microarrays-status and prospects. Trends Biotechnol. 22: 630-637). Размер ячеек и расстояние между ними могут варьироваться от нескольких микрон до сотен микрон. В каждой ячейке биочипа иммобилизованы молекулы одного типа (молекулярные зонды), способные с высокой степенью специфичности связывать определенные биомолекулы исследуемого раствора, нанесенного на поверхность биочипа. Биочипы используются для выявления специфических последовательностей ДНК, включая экспрессию генов, нуклеотидные инверсии, замены и вставки, а также для иммунологических анализов (Roger Bumgarner. 2013. DNA microarrays: Types, Applications and their future. Curr Protoc Mol Biol. Jan; 0 22: Unit-22.1).
Биомолекулы исследуемого раствора, предварительно помеченные флуоресцирующим красителем, связываются с различными молекулярными зондами с большим или меньшим сродством, что приводит к разной степени свечения ячеек биочипа. По интенсивности свечения ячеек биочипа судят об эффективности образования соответствующих комплексов (Колчинский A.M., Грядунов Д.А., Лысов Ю.П., Михайлович В.М., Наседкина Т.В., Турыгин А.Ю., Рубина А.Ю., Барский В.Е. и Заседателев А.С. 2004. Микрочипы на основе трехмерных ячеек геля: история и перспективы. Молекулярная биология, 38: 5-16; Miller, М. В., & Tang, Y.-W. 2009. «Basic concepts of microarrays and potential applications in clinical microbiology.». Clinical Microbiology Reviews 22(4): 611-633). В зависимости от природы флуорохрома и типа ячеек биочипа используют различные способы возбуждения и регистрации флуоресценции (Simultaneous measurement of gene expression and genomic abnormalities using nucleic acid microarrays. US patent 6251601 B1, 1999; Method and system for detecting fluorescence from microarray disk US patent 7794661 B2, 2010; Fluorescence enhanced microarray biochip based on micro/nano periodic structures and method for preparing same. China patent CN 102901715 A).
Приборы для регистрации результатов анализов, проводящихся с помощью биологических микрочипов, выпускаются многими фирмами и различаются по способу получения и анализа изображений (George Cortese. Microarray readers. Pushing the envelope. The Scientist, 2001, Vol. 15, стр. 24).
Наиболее часто для получения изображений биологических микрочипов и анализа этих изображений используются приборы, основанные на сканировании биологических объектов лазерным лучом в сочетании с конфокальной оптикой (Optical systems for microarray scanning US patent 7706419 B26 2005; Method and apparatus for scanned beam microarray assay US 20070081163 A1, 2007; Biological microarray line scanning method and system US 7791013 B2). В значительной степени это связано с тем, что наиболее широко используются биологические микрочипы, в которых зонды нанесены в виде мономолекулярного слоя на поверхности подложки, образуя двумерные (2D) ячейки. Интенсивность флуоресценции 2D ячеек сравнительно слабая, и для регистрации сигналов таких микрочипов требуется высокочувствительный детектор света (Fodor (1997) "Genes, Chips and the Human Genome." FASEB Journal 11:A879). В некоторых работах описано сканирование объекта модулированным по яркости тонким лазерным лучом (US patent 6329661).
В приборах для анализа биочипов, содержащих 2D ячейки, тонкий луч лазерного излучения последовательно возбуждает флуоресценцию разных участков поверхности биочипа, которые регистрируются приемником света, и затем, в результате компьютерной обработки, воссоздается полное изображение флуоресцирующих ячеек. Применение системы конфокальности, при которой в плоскости изображения биочипа располагается диафрагма, соответствующая по размеру диаметру возбуждающего лазерного луча, позволяет добиться высокой чувствительности и обнаруживать по флуоресценции даже единичные флуоресцирующие молекулы (Dietrich Wilhelm Karl Lueerssen Apparatus for imaging single molecules/ Patent application WO 2008032096 A2). Конфокальное лазерное сканирование применяется не только для анализа биочипов, но и для высокочувствительного анализа многих других объектов, расположенных на плоской не флуоресцирующей подложке. Общим ограничением подобного подхода является необходимость поточечного сканирования объекта тонким лазерным лучом, что приводит к увеличению времени регистрации и уменьшению производительности прибора. Кроме того, сканирование и конфокальная регистрация осуществляются с помощью прецизионных механических устройств, что приводит к удорожанию приборов.
В некоторых приборах для возбуждения флуоресценции ячеек биочипа при сканировании изображения используют мощные пульсирующие лампы. Так, в патенте US 6377346 описано устройство, включающее несколько источников света и вращающееся зеркало. В качестве источников света в этом патенте указаны пульс-лампы, а вращающееся зеркало служит для переключения источников света. В описанной оптической схеме происходят очень большие потери света: при мощности источников возбуждающего излучения около 50W приемником света должна быть охлаждаемая ПЗС камера. Данное устройство не предназначено для подавления спеклов и для увеличения диапазона измеряемых величин.
Для некоторых специальных типов микрочипов, в которых все ячейки расположены вдоль одной прямой, описан прибор, основанный на использовании для возбуждения флуоресценции модулированного по яркости лазерного луча, диаметр которого совпадает с диаметром ячеек микрочипа (A biochip scanner device WO 2001065241 A1, 2001). Этот подход непригоден для измерения флуоресценции стандартных микрочипов, в которых ячейки расположены на подложке в виде серии параллельных рядов.
Наряду с лазерными анализаторами, для визуального наблюдения и цифровой регистрации изображений флуоресцирующих биологических объектов используют люминесцентные микроскопы - приборы, в которых излучение от источника света возбуждает флуоресценцию большого участка объекта, при этом изображение анализируемого объекта в свете его люминесценции анализируется либо визуально, либо регистрируется с помощью приемника света (фотопленки, ПЗС или КМОП камеры). Достоинствами такого типа приборов является возможность одновременного получения изображения в свете флуоресценции всех участков поля зрения прибора, и высокая производительность, позволяющая анализировать сотни образцов за рабочую смену. Размер флуоресцирующего участка в этих приборах определяется увеличением микроскопа и может варьировать от десятков квадратных микрон до десятков квадратных миллиметров. При этом визуализируется и измеряется тотальная интенсивность флуоресценции участков объекта по всей его глубине, в отличие от послойной регистрации флуоресценции, осуществляемой с помощью конфокального сканирования. Благодаря отмеченным особенностям люминесцентных микроскопов, их использование оказывается предпочтительным при работе с трехмерными ячейками биочипов, в которых флуоресцентная метка распределена по всему объему ячейки.
В патенте US 20050110998 описано устройство получения изображений биочипов в свете их флуоресценции. Источником возбуждающего излучения в данном устройстве является широкополосная лампа, которая не дает когерентного излучения и, соответственно, не дает спеклов. Оптическая схема устройства предназначена для увеличения равномерности интенсивности освещенности поля зрения, в котором находится биочип. Недостатками такого устройства является бесполезный расход энергии, излучаемой широкополосной лампой, необходимость использования интерференционных фильтров в ходе мощного возбуждающего излучения, приводящее к их быстрому выгоранию, сложность оптической и электронной схем, что все вместе ограничивает применимость данного устройства только научными исследованиями.
Для флуоресцентного анализа объектов, расположенных на предметных стеклах, ведущие фирмы, выпускающие микроскопы (Nikon, Leitz, etc.), применяют для возбуждения флуоресценции объектов освещение лазерными лучами, введенными в торец предметного стекла, так называемая Total Internal Reflection Fluorescence или TIRF микроскопия (Axelrod, D. 1981. "Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence". The Journal of Cell Biology. 89 141-145). При таком способе освещения лазерные лучи распространяются по толще предметного стекла, подчиняясь закону полного внутреннего отражения, и возбуждают флуоресценцию объектов, находящихся на поверхности этого стекла. В местах неоднородностей подложки происходит возбуждение флуоресценции находящихся на ее поверхности ячеек микрочипа. Основным недостатком данного метода является то, что он пригоден только для определенного типа подложек, а именно, для прозрачных стеклянных или пластиковых предметных стекол. При использовании приборов, основанных на этом принципе, следует учитывать также наличие паразитного свечения вследствие нарушения полного внутреннего отражения возбуждающего света в местах неоднородностей прозрачной поверхности подложки (царапины, вкрапления примесей, соринки). Этот подход не нашел применения для количественного анализа биочипов ввиду высоких требований, предъявляемых к качеству и геометрии подложки биочипа.
Для количественного анализа флуоресценции ячеек микрочипов, расположенных на непрозрачных подложках, применяют также стандартную широкопольную люминесцентную микроскопию (Технология гидрогелевых биочипов и ее применение в медицинской лабораторной диагностике Д.А. Грядунов, Д.В. Зименков, В.М. Михайлович, Т.В. Наседкина, Е.И. Дементьева, А.Ю. Рубина, С.В. Паньков, В.Е. Барский, А.С. Заседателев. Медицинский алфавит. Лаборатория 3, 2009, стр. 10-14. Биофизические методы для анализа биологических микрочипов, применение широкопольной цифровой люминесцентной микроскопии. В.Е. Барский, Е.Е. Егоров, Э.Я. Крейндлин, Ю.П. Лысов, С.В. Паньков, Д.А. Юрасов, Р.А. Юрасов, А.С. Заседателев, Биофизика, 2012, том 57, вып. 3, с. 522-527). В таких приборах для возбуждения флуоресценции применяется либо освещение мощными светодиодами, либо расфокусированными лазерными лучами.
В современных стандартных люминесцентных микроскопах, часто используется комбинация мощных светодиодов и соответствующих интерференционных фильтров для выделения спектральных областей возбуждения и флуоресценции - так называемые возбуждающие и запирающие фильтры (см. каталоги люминесцентных микроскопов фирм Leitz, Nikon, Olimpus, Zeiss, и каталоги фильтров фирм Semrock, Omega Opticals и др.). Поскольку светодиоды не являются точечными источниками света, и пучок света от них является сильно неравномерным в поперечном сечении, в микроскопии применяют различные устройства для достижения равномерности освещения анализируемого поля зрения. Так, в микроскопах фирмы Olimpus для равномерного освещения поля зрения микроскопа используют золь-гелевый жгут (Laurie J., Bagnall С.М. et al. 1992, Colloidal suspensions for the preparation of ceramics by a freeze casting route // Journal of Non-Crystalline Solids - vol. 147-148, pp. 320-325). При освещении одного торца жгута мощным светом, даже при большой неравномерности яркости в поперечном сечении, на выходе наблюдается равномерно светящийся торец, который проецируется на объект с помощью светоделительного кубика и интерференционных возбуждающих фильтров. К сожалению, такое устройство недолговечно, раствор геля портится со временем и требует периодической замены.
Вместе с тем, для анализа изображений флуоресцирующих объектов, в частности, трехмерных биологических микрочипов, применяют широкопольную люминесцентную микроскопию в сочетании с точечными источниками света - лазерными светодиодами. Поскольку биочипы, как правило, занимают относительно большую площадь подложки, для измерения интенсивности флуоресценции отдельных ячеек, расположенных на значительном расстоянии друг от друга, не подходят стандартные объективы для микроскопии, в этих приборах применяют пару высокоапертурных фотографических объективов. (Биофизические методы для анализа биологических микрочипов, применение широкопольной цифровой люминесцентной микроскопии. В.Е. Барский, Е.Е. Егоров, Э.Я. Крейндлин, Ю.П. Лысов, С.В. Паньков, Д.А. Юрасов, Р.А. Юрасов, А.С. Заседателев, Биофизика, 2012, том 57, вып. 3, с. 522-527). В этом случае возбуждение флуоресценции объектов, расположенных в поле зрения микроскопа, производится лазерными лучами, освещающими все анализируемое поле зрения микрокопа, а детектором изображения служит ПЗС камера. Анализаторы биочипов, основанные на таком принципе, обладают достаточной чувствительностью для регистрации флуоресценции трехмерных гелевых ячеек, содержащих флуорохром, и высокой производительностью, что существенно в клинической диагностике при проведении серийных однотипных анализов. (D. Gryadunov, V. Mikhailovich, S. Lapa, N. Roudinskii, M. Donnikov, S. Pan'kov, O. Markova, A. Kuz'min, L. Chemousova, O. Skotnikova, A. Moroz, A. Zasedatelev and A. Mirzabekov. 2005 Evaluation of hybridization on oligonucleotide microarrays for analysis of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis). В отличие от лазерных сканаторов такие анализаторы биочипов одновременно регистрируют интенсивность флуоресценции всех ячеек биочипа, находящихся в поле зрения прибора, что позволяет в случае необходимости следить за кинетикой процессов, проходящих в разных ячейках (UV fluorescence of tryptophan residues effectively measures protein binding to nucleic acid fragments immobilized in gel elements of microarrays. O. Zasedateleva, V. Vasiliskov, S. Surzhikov, A. Sazykin, L. Putlyaeva, A. Schwarz, D. Kuprash, A. Rubina, V. Barsky and A. Zasedatelev Biotechnol. J. 2014, 9). Высокая скорость получения изображения позволяет регистрировать за рабочую смену результаты сотен анализов (Clinical microbiology and infection. Vol 11: p. 531-539. И.М. Сон, A.M. Мороз, CA. Стерликов, Е.И. Скачкова, Е.Ю. Носова, К.Ю. Галкина, М.А. Краснова, А.А. Букатина. Руководство по выявлению микобактерий туберкулеза и определению лекарственной чувствительности с использованием биологических микрочипов». Москва, РИО ЦНИИОИЗ, 2009, 56 с.). Подобные приборы нашли применение для регистрации результатов некоторых типов анализов, проводимых с помощью биочипов, в ячейках которых иммобилизованы фрагменты ДНК.
Особенностью освещения лазерными лучами является когерентность излучения. Когерентное излучение лазера приводит к эффекту интерференции на освещаемом объекте, выражающемуся в появлении так называемых спеклов - участков с большей и меньшей интенсивностью освещения (М. Франсон, Оптика спеклов, пер. с франц. М., 1980; Laser speckle and related phenomena, Ed. by J.C. Dainty, 2 ed. 1984). Наличие спеклов не влияет на результаты измерений, проводящихся путем сканирования объекта узким лазерным лучом, в то же время, при использовании анализатора биочипов, в котором для возбуждения флуоресценции применяют расфокусированное лазерное излучение, спеклы, неизбежно возникающие на подложке, понижают точность получаемых результатов. Именно этим объясняется недостаточно широкое применение анализаторов, в которых используется возбуждение флуоресценции всего поля зрения расфокусированным лазерным лучом, поскольку разница в освещенности светлых и темных участков поля зрения, вызванная наличием спеклов, может составлять 50% и более (Laser speckle and related phenomena, ed. By J.C. Dainty, 2 ed., 1984).
Одним из способов уменьшения выраженности спеклов является применение волоконно-оптических осветителей с различающейся длиной индивидуальных волокон (D.S. Mehta, D.N. Naik, R.K. Singh, and M. Takeda, Applied Optics 51, 1894, 2012). Благодаря различию в длине пути лазерных лучей в разных волокнах, свет на выходе из волоконно-оптического жгута имеет разную фазу. Изменение соотношения длин оптических волокон формирует на объекте разную степень выраженности спеклов (Т. Tsuji, Т. Asakura, and Н. Fujii, Opt. Quant. Electron. 16, 197, 1984). Чем длиннее волоконно-оптический жгут, чем больше в нем волокон, и, чем больше разница длин индивидуальных волокон, тем менее выражены будут спеклы. Хорошее подавление спеклов достигается при длинах волоконно-оптического жгута существенно больше 20 м. Однако жгут такого размера имеет довольно большие размеры и не может быть применен в портативных устройствах. Другим способом подавления спеклов является применение жидкокристаллических фильтров с постоянно изменяющейся структурой кристалла (http://www.optotune.com/products/laser-speckle-reducers). Свет, проходя через такую структуру, частично теряет когерентность, что приводит к уменьшению выраженности спеклов. Однако коэффициент подавления спеклов в таких устройствах обычно невелик и позволяет понизить флуктуации освещенности только до 50% по полю зрения.
В работе Squire и Basyiaens (Journal of Microscopy, 1999, V. 193, pp. 36-49) описан способ подавления спеклов, основанный на вращении матового стекла. Когерентный свет рассеивается на матовом стекле, причем постоянное вращение стекла обеспечивает эффективное «размазывание» спеклов, практические полное подавление их. Недостатком этого метода являются сильные потери света на матовом стекле, что заставляет авторов применять довольно мощный газовый лазер (мощностью до 1 Вт) и высокочувствительную охлаждаемую ПЗС камеру.
В американском патенте US patent 6329661 описано устройство в котором анализ биочипов производится путем возбуждения флуоресценции тонким, модулированным по интенсивности лазерным источником и воссоздания изображения по результатам сканирования. Приемником возбуждающего излучения служит фотодиод или фотоумножитель. Действительно, при сканировании объекта малым зондом спеклы меньше влияют на точность измерения, однако при этом возникают другие трудности: необходимость использования высокоточных механических деталей, сложная электрическая схема, увеличение времени получения изображения, невозможность одновременного наблюдения за процессами, происходящими в разных ячейках биочипа.
В нашей недавней работе, посвященной сравнению способов подавления спеклов в анализаторах биочипов, основанных на принципе широкопольной люминесцентной микроскопии (Биофизика, 2015, том 60, вып. 6, с. 1198-1202), для подавления спеклов использовали комбинацию кольцевого волоконно-оптического осветителя и устройства для механического перемещения торцов оптических волокон, идущих к лазеру. Кольцевой осветитель обеспечивал равномерное освещение поля зрения прибора, а торцы волокон волоконно-оптического осветителя, направленные к лазерному диоду, подвергали возвратно-поступательному перемещению с помощью вибратора. В результате такого перемещения, на конце пучка волокон, идущих к лазеру, возникает постоянно меняющаяся картина спеклов. По мере увеличения амплитуды перемещения волокон, спеклы становятся менее выраженными. Аналогичный способ подавления спеклов был предложен в работе Kwakwa et. al. (J. Biophotonics, 2016, No. 9, 948-957). Недостатком устройства, основанного на таком принципе, способа является необходимость механического перемещения оптических волокон, что уменьшает их срок службы и меняет светопропускание.
Еще одним ограничением анализаторов биочипов, основанных на принципе широкопольной люминесцентной микроскопии, является невысокий диапазон измеряемых яркостей объекта, что связано с размером индивидуальных пикселей и/или разрядностью АЦП, применяемых в детекторах изображения (ПЗС или КМОП камера). Это ограничение существенно в тех случаях, когда необходимо анализировать с высокой точностью объекты, различающиеся по яркости на несколько порядков. При анализе двумерных чипов с помощью метода сканирования детектором света является фотоумножитель с диапазоном измерения яркостей, достигающим нескольких порядков (см., например, продукцию фирмы Hamamatsu).
В цифровой фотографии, используют светочувствительные матрицы с высоким разрешением и малым размером пикселя и, соответственно, с малым диапазоном регистрируемых яркостей. В связи с этим, в фотографии способ получения изображения объектов, резко различающихся по своей яркости, реализуется с помощью метода, называемого HDR (High Dynamic Range), позволяющего автоматически или вручную получать изображение объекта при разных заранее выбранных экспозициях, и затем «склеивать» полученные кадры (http://www.stuckincustoms.com/hdr-photography). Этот метод широко применяется при фотографировании контрастных объектов и позволяет уменьшить общий контраст получаемых снимков, либо наоборот увеличить контраст некоторых участков снимка. В его стандартном применении в широкопольной микроскопии метод не используется для получения точных количественных данных о яркости участков поля зрения, различающихся по интенсивности флуоресценции содержащихся в них красителей в сотни раз, что необходимо при анализе биочипов.
При решении ряда задач часто возникает необходимость параллельного анализа взаимодействий различных соединений с молекулярными зондами, иммобилизованными в ячейках биочипов. В этом случае каждое анализируемое соединение связывают с красителем, спектральные характеристики которого отличаются от таковых, применяемых для других соединений, а измерения проводят в условиях, специфичных для каждого применяемого красителя. При этом возникает возможность количественного анализа связывания какого-либо соединения, помеченного красителем, с зондами, иммобилизованными в ячейках биочипа, исключая влияние других соединений, помеченных другими красителями.
В широкопольной флуоресцентной микроскопии такой подход реализуется с помощью специальных устройств (сменных опак-иллюминаторов), позволяющих перестраивать спектральные диапазоны возбуждения и регистрации флуоресценции. Имеющиеся в настоящее время цифровые люминесцентные анализаторы биочипов, основанные на принципе широкопольной цифровой люминесцентной микроскопии, пригодны для визуального или полуколичественного анализа различных флуоресцирующих биологических объектов, в том числе для предварительного просмотра отдельных ячеек биологических микрочипов. Однако сочетание апертуры и поля зрения стандартных объективов не позволяет использовать стандартные микроскопы для анализа флуоресцирующих красителей, содержащихся в ячейках биологических микрочипов, занимающих площадь в десятки квадратных миллиметров (см. каталоги микроскопов фирм Nikon, Zeiss, Olympus и др.).
Описаны примеры использования двухволновых анализаторов биочипов, позволяющих параллельно количественно определять содержание в ячейках биочипа двух соединений, содержащих два разных красителя, например, с красителями типа Су3 и Су5 (Биофизика, 2015, том 60, вып. 6, с. 1198-1202). Вместе с тем, представляется целесообразным одновременное использование нескольких красителей для анализа связывания большего количества соединений с ячейками биочипа, однако многоволновые высокопроизводительные анализаторы биочипов в литературе не описаны.
Таким образом, имеющиеся в настоящее время анализаторы биочипов, основанные на принципе широкопольной люминесцентной микроскопии, пригодны для визуального или полуколичественного анализа биочипов. Однако их точность, диапазон измеряемых интенсивностей свечения, а также возможность применения не более двух оптически независимых красителей оказываются недостаточными для решения ряда задач анализа флуоресценции ячеек биочипа.
Раскрытие сущности изобретения
Целью настоящего изобретения является создание анализатора биологических микрочипов (биочипов), основанного на принципе широкопольной цифровой люминисцентной микроскопии, позволяющего измерять интенсивности флуоресценции ячеек биочипа в трех длинах волн от 380 нм до 850 нм с точностью до 10% за счет эффективного подавления спеклов, содержащего волоконно-оптический жгут и вращающееся зеркало, установленные между источником излучения и матрицей ячеек биочипа, причем, зеркало установлено таким образом, чтобы при его вращении в пределах одного оборота расстояние от торца волоконно-оптического жгута до поверхности зеркала постоянно менялось, и обладающих возможностью не менее десятикратного увеличения линейного диапазона измеряемых величин по сравнению с линейным диапазоном матрицы детектора изображения.
Краткое описание Фигур и Таблиц
Фиг. 1. Принципиальная схема конструкции анализатора биочипов. На схеме показаны три осветителя для разных спектральных диапазонов, лазерный диод одного из осветителей, держатель микрочипа, верхний объектив для сбора изображения, устройство перефокусировки при смене спектрального диапазона, ПЗС камера.
Фиг. 2. Схема устройства для подавления спеклов при освещении биочипов лазерным лучом, расфокусированным с помощью волоконно-оптического жгута в сочетании с вращающимся зеркалом.
Фиг. 3. Эффективность подавления спеклов, регистрируемых в спектральном диапазоне 710±20 нм при облучении желатиновой поверхности фотопленки, окрашенной красителем Cy5, расфокусированным лазерным светом с длиной волны 655 нм.
А - изображение при прямом освещении расфокусированным лазерным лучом (спеклы приводят к локальным вариациям освещенности, существенно понижающим точность измерений);
Б - изображение, полученное при использовании устройства для подавления спеклов, представленного на Фиг. 1 и 2;
Область, заключенная внутри пунктирных линий на Фиг. А и Б, показывает полосу, ширина которой соответствует диаметру одной ячейки биочипа.
В и Г - распределение интенсивности флуоресценции участка поверхности фотопленки, вдоль полосы, заключенной между пунктирными линиями на Фиг. А и Б.
exc
em
exc
em
exc
em
Фиг. 4. А - схема биочипа, содержащего ряды ячеек с уменьшающимися концентрациями красителей Су3, Су5, Су7 и номера рядов ячеек; Б, В, Г -изображения флуоресцирующего биочипа при регистрации в условиях, специфичных для каждого красителя, а именно, для: Су3 λ=532 нм, λ=607±35 нм; для Су5 λ=655 нм, λ=710±20 нм; и для Су7 λ=760 нм, λ=807±35 нм. В таблице представлены концентрации красителей Су3, Су5, Су7 (в молях) в соответствующих ячейках биочипа.
Фиг. 5. Кривая 1. - Зависимость величины сигналов ПЗС камеры при регистрации изображения участка флуоресцирующего красного стекла (КС-10) от времени экспозиции при разной интенсивности возбуждающего света. Кривые 2 и 3 получены в результате уменьшения интенсивности флуоресценции стекла соответственно в 2 и 4 раза с помощью нейтральных фильтров, вводимых между источником возбуждающего излучения и объектом и пропускающих, соответственно, 50% и 25% возбуждающего излучения.
Фиг. 6. Интенсивности флуоресценции ячеек биочипа, содержащих краситель Су5, при разных временах экспозиции. Изображение биочипа представлено на Фиг. 4Г, цифровые данные об интенсивности флуоресценции ячеек даны в Табл. 1.
По оси абсцисс номер ячейки и концентрация красителя в ней. По оси ординат - средние интенсивности флуоресценции соответствующих ячеек. Значения концентраций по оси абсцисс и интенсивностей флуоресценции по оси ординат отложены в логарифмическом масштабе. Пунктирными линиями показаны границы линейного диапазона ПЗС камеры (D1) и линейного диапазона значений интенсивности флуоресценции, регистрируемых при разных экспозициях (D2). Среднюю интенсивность флуоресценции (ИФ) данной ячейки выражали в виде суммы сигналов от всех пикселей, покрывающих данную ячейку, деленную на число этих пикселей. Светлые столбики представляют результат регистрации интенсивности флуоресценции для ячеек №1-5 при экспозиции 250 мсек; для ячеек №6 и 7 при экспозиции 1000 мсек; и для ячеек №8 и 9 при экспозиции 4000 мсек. Темные столбики представляют результат пересчета измерений согласно предложенному алгоритму: значения для ячеек №1-5 умножены на 16; ячеек №6,7 умножены на 4; а ячеек №8,9 умножены на 1.
Фиг. 7. Изображения биочипа в условиях возбуждения и регистрации флуоресценции, в диапазонах длин волн, специфичных для Су5 (А) и Су7 (Б). В - Схема биочипа. Биочип содержит индивидуальные красители Су5 (левый угол), Су7 (правый угол) и их смеси в разных концентрациях. Концентрации красителей даны в Таблице на Фиг. 7; верхние значения показывают концентрацию Су5, нижние - концентрацию Су7.
Таблица 1. Значения концентраций красителя в ячейках биочипа, показанного на Рис. 4 В и графически представленного на Фиг. 6. Представлены значения интенсивности флуоресценции (ИФ) для ячеек №1-5 при экспозиции 250 мсек; для ячеек №6 и 7 при экспозиции 1000 мсек; и ячеек №8 и 9 при экспозиции 4000 мсек. Жирным шрифтом показаны пересчитанные значения согласно разработанному алгоритму (объяснение в тексте). Для сравнения представлены значения ИФ, вычисленной из разведений красителя.
Таблица 2. Значения интенсивностей флуоресценции красителей Су5 и Су7 в ячейках биочипа, показанного на Рис. 7 А и Б, при возбуждении и измерении флуоресценции в соответствующих длинах волн, а также значения коэффициентов, используемых для вычисления концентраций этих красителей в ячейках R1, R2, №1, 2, 3, показанных на схеме Фиг. 7 В
Таблица 3. Концентрации красителей Су5 и Су7 в ячейках биочипа, изображения которого показаны на Фиг. 7
Осуществление изобретения
Принципиальная схема прибора
Предлагаемый флуориметрический анализатор содержит лазерные источники возбуждающего излучения, фильтры для выделения флуоресценции ячеек биочипов, оптическую систему для проецирования изображения биочипов на светочувствительную матрицу детектора, волоконно-оптический жгут с перепутанными волокнами, вращающееся зеркало для распределения возбуждающего излучения в анализируемом поле зрения прибора. Принципиальная схема анализатора показана на Фиг. 1.
Флуоресценция биочипа возбуждается с помощью одного из трех осветителей - лазерных диодов, излучающих когерентный монохроматический свет. В качестве примера применены лазерные диоды с длинами волн 532 нм, 655 нм и 760 нм. Эти длины волн используются для возбуждения флуоресценции часто применяемых цианиновых красителей Су3, Су5, Су7, их аналогов, а также красителей со сходными спектральными характеристиками, которые выпускаются разными фирмами.
Изображение биочипа в свете его флуоресценции собирается оптической системой, состоящей из двух фотографических объективов, расположенных навстречу друг другу, и направляется на матрицу приемника изображения. В качестве детектора изображения использовали ПЗС камеру фирмы Видеоскан (www.Videoscan.ru) с матрицей SONY ICX285, 2/3".
Перед матрицей находится сочлененный с устройством перефокусировки блок переключения запирающих фильтров, выделяющих флуоресцентное излучение и отсекающих возбуждающий свет. Объективы для получения фотографического изображения, использованные в приборе (Nikon 50×1,4), рассчитаны на сохранение фокусировки в диапазоне длин волн, которые воспринимаются глазом, однако при переходе в ИК область требуется перефокусировка оптической системы. В качестве запирающих фильтров перед ПЗС камерой были выбраны фильтры фирмы Semrock со следующими спектральными характеристиками: 607±35 нм для красителя Су3, 710±20 нм для красителя Су5 и 807±35 нм для красителя Су7. Принципиальная схема описанной оптической системы при использовании соответствующих лазерных источников излучения и фильтров пригодна для работы в любых трех длинах волн от 380 нм до 850 нм.
Измерения интенсивностей флуоресценции ячеек биочипа при использовании предлагаемого устройства осуществляется следующим способом. Включается источник возбуждающего излучения (лазер соответствующей длины волны), который освещает поле зрения прибора, в котором находится исследуемый биочип. В соответствии с выбранным лазерным излучением устанавливается фильтр для выделения флуоресценции ячеек биочипа. Выбирается экспозиция, при которой производится регистрация изображения биочипа в свете его флуоресценции, и при этой экспозиции производится регистрация изображения. С помощью стандартных компьютерных программ осуществляется измерение интенсивностей флуоресценции ячеек биочипа на зарегистрированном изображении.
Устройство для подавления спеклов
Подавление спеклов лазерного излучения достигается с помощью устройства, схема которого представлена на Фиг. 2.
Свет от лазерного диода попадает на торец волоконно-оптического жгута с перепутанными волокнами, при этом на другом торце жгута распределение яркости в плоскости, перпендикулярной направлению луча, становится более однородным по сравнению с таковым на входе жгута. Более высокая однородность достигается благодаря тому, что волокна внутри жгута перепутаны, и неравномерности яркости лазерного луча в поперечном сечении, имеющиеся на входе жгута, распределяются в виде случайной мозаики на его выходе. Кроме того, равномерность освещенности повышается благодаря частичной потере когерентности лучей, идущих внутри жгута по волокнам, имеющим разную длину оптического пути. Далее, луч направляется на вращающееся зеркало, установленное таким образом, чтобы при его вращении расстояние от выходного торца волоконно-оптического жгута до поверхности зеркала постоянно менялось. При вращении зеркала отраженный луч описывает эллипс в плоскости биочипа. При этом происходит «размазывание» спеклов в плоскости объекта, и интенсивность освещения, усредненная по времени регистрации, становится еще более равномерной.
На Фиг. 3 представлены изображения желатиновой поверхности мелкозернистой фотопленки, окрашенной красителем Су5, в свете флуоресценции, полученные при прямом освещении расфокусированным лазерным лучом с длиной волны 655 нм, а также при использовании устройства подавления спеклов, показанного на Фиг. 1 и Фиг. 2.
Эффективность подавления спеклов при использовании прибора для анализа биочипов можно оценить следующим образом. Обозначим интенсивность флуоресценции площадки, размеры которой соответствуют размеру ячейки биочипа, как F. Характеристикой неоднородности освещенности из-за наличия спеклов может служить разброс интенсивности флуоресценции по полю зрения. Тогда относительный разброс освещенности по полю зрения (σ) можно определить следующим образом.
max
min
max
min
σ=(F-F)/(F+F)
max
min
где F и F - соответственно максимальное и минимальное значения интенсивности флуоресценции выбранной площадки при всех ее расположениях в поле зрения.
0
0
Для оценки влияния спеклов на точность измерения интенсивности флуоресценции ячеек биочипа на изображении фотопленки, равномерно окрашенной красителем Су5, была выделена область, ширина которой соответствует диаметру ячейки биочипа (100 μ), а длина - нескольким миллиметрам, и по длине этой области определен разброс величины суммарного сигнала от пикселей, покрывающих площадь, занимаемую ячейкой биочипа. Анализ полученных результатов до и после подавления спеклов показывает, что разброс относительных величин интенсивностей флуоресценции при освещении фотопленки расфокусированным лазерным лучом без подавления спеклов (σ) (Фиг. 3 А, В) равен σ=0.06, а после подавления спеклов σ=0.007 (Фиг. 3 В, Г). Отсюда можно сделать вывод о том, что при измерениях интенсивности флуоресценции ячеек биочипа диаметром 100 μ разброс в освещенности поля зрения площади, занимаемой одной ячейкой и вызванный влиянием спеклов, не превышает 1%.
Работа в трех длинах волн
exc
em
exc
em
exc
em
На Фиг. 4 показана схема биочипа, содержащего ячейки с уменьшающимися концентрациями красителей Су3, Су5, Су7 (А) и таблица с концентрациями этих красителей в соответствующих ячейках биочипа в молях. На этом же рисунке представлены флуоресцентные изображения этого биочипа (Б, В, Г) при регистрации в условиях, специфичных для каждого красителя, а именно: для Су3 λ=532 нм, λ=607±35 нм; для Су5 λ=655 нм, λ=710±20 нм; для Су7 λ=760 нм, λ=807±35 нм.
По изображениям биочипа, видно, что при выбранных нами условиях возбуждения и регистрации флуоресценции красители Су3 и Су5 могут анализироваться в смеси независимо друг от друга. В то же время, краситель Су7 обладает заметной флуоресценцией при возбуждении и регистрации в диапазонах длин волн, специфичных для красителя Су5. Количественный анализ смеси красителей с перекрывающимися спектральными характеристиками обсуждается далее в разделе «Анализ смесей красителей в одной ячейке».
Увеличение диапазона измеряемых интенсивностей флуоресценции
На Фиг. 5 на кривой 1 показаны результаты регистрации интенсивности флуоресценции (в условных единицах) участка красного стекла (КС-10), соответствующего по размеру одной ячейке биочипа при разных временах экспозиции (приведено среднее значение, получаемое от одного пикселя ПЗС камеры). Возбуждение флуоресценции и измерения интенсивности флуоресценции осуществляли при условиях, специфичных для красителя Су5. Кривая 2 была получена при ослаблении интенсивности возбуждающего света в 2 раза (введение в ход лучей от лазера нейтрального фильтра с пропусканием 50%), а кривая 3 - при ослаблении в 4 раза (введение в ход лучей от лазера нейтрального фильтра с пропусканием 25%).
Данные, представленные на Фиг. 5, подтверждают линейную зависимость сигналов пикселей ПЗС камеры от длительности экспозиции при регистрации интенсивности флуоресценции до 2700 у.е. Заявленный паспортный диапазон использованной в приборе ПЗС камеры составляет 12 бит, однако при значениях сигналов более 2700 у.е. наблюдается систематическое отклонение от линейности, связанное с приближением к максимальной емкости пикселей ПЗС камеры. Шумы ПЗС камеры составляют примерно ±20 у.е., следовательно, можно полагать, что реальный линейный диапазон камеры находятся в пределах от 60 у.е. (три значения шума) до 2700 у.е.
В линейном диапазоне одинаковые значения регистрируемых сигналов наблюдаются при времени экспозиции в 2 раза большем для второй кривой по сравнению с первой и в 4 раза большем для третьей кривой. Представленные результаты подтверждают, что получаемые значения сигналов в диапазоне до 2700 у.е. являются количественной характеристикой суммарной интенсивности флуоресценции, которая линейно зависит как от длительности экспозиции, так и концентрации красителя в ячейке.
Концентрации различных флуоресцентно-меченных соединений, входящих в состав смесей, анализируемых с помощью биочипов, могут различаться на порядки величин. Вследствие этого, во многих случаях при использовании одной экспозиции в изображении биочипа могут оказаться как слишком слабо светящиеся, так и слишком ярко светящиеся ячейки. При этом значения сигналов от пикселей, покрывающих данные ячейки, могут выйти за пределы линейного диапазона детектора изображения (в данном случае, пикселей ПЗС камеры). Локализация сигналов в зоне линейного диапазона детектора изображения может быть достигнута уменьшением времени экспозиции для сильно светящихся ячеек, и, наоборот, увеличением - для слабо светящихся. Это реализуется с помощью разработанного алгоритма нормализации всех сигналов к тем, которые были получены при максимальной выдержке. Согласно разработанному алгоритму нормализация проводится умножением сигналов на коэффициент, равный частному от деления максимальной экспозиции на ту, которая использовалась для регистрации соответствующих ячеек.
На Фиг. 6 и в Табл. 1 в графическом и табличном виде представлены результаты регистрации интенсивностей флуоресценции ячеек биочипа, показанного на Фиг. 4Г. При малых временах экспозициях сигналы от ярко светящихся ячеек оказываются в линейном диапазоне ПЗС камеры, а сигналы от слабо светящихся ячеек превышают шумы камеры примерно в 2,5 раза. При увеличении времени экспозиции сигналы от слабо светящихся ячеек заметно отличаются от шумов камеры, однако сигналы от сильно светящихся ячеек выходят за линейную область детектора изображения.
Согласно предложенному алгоритму, для увеличения линейного диапазона регистрации были получены изображения ячеек биочипа при экспозициях 250 мсек (ячейки №1-5), 1000 мсек (ячейки №6, 7) и 4000 мсек (ячейки №8, 9). В дальнейших расчетах использовали значения средней интенсивности флуоресценции индивидуальных ячеек, получаемые путем деления значений сигналов всех пикселей, покрывающих данную ячейку, на число этих пикселей. В случае если ячейка содержит только один краситель и измерения были проведены в линейном диапазоне ПЗС камеры, получаемая величина пропорциональна концентрации этого красителя в ячейке. Полученные значения представлены на Фиг. 6. белыми столбцами. Затем, согласно алгоритму нормализации, интенсивности флуоресценции, полученные при экспозиции 250 мсек, были умножены на шестнадцать, при экспозиции 1000 мсек - на четыре, а при экспозиции 4000 мсек - на единицу. Эти значения представлены темными столбцами. Как можно видеть, применение данного алгоритма позволяет расширить область линейного диапазона регистрируемых интенсивностей флуоресценции. Так, для случая, представленного на Фиг. 4Г линейный диапазон регистрации интенсивностей флуоресценции был расширен в 16 раз.
При изготовлении биочипов количество красителя в ячейке зависит не только от его концентрации в наносимом растворе, но также и от размеров ячеек, точность нанесения которых составляет 10%. Поэтому даже соседние ячейки с одной и той же концентрацией красителя могут различаться по количеству красителя на 10%, а, следовательно, отклонения от линейности рассчитанных значений интенсивности флуоресценции в Табл. 1 (см. две нижних строки) отражают суммарную точность прибора и точность изготовления биочипов.
Описанная схема увеличения линейного диапазона с помощью регистрации сигналов с разным временем экспозиции применима при работе с любыми детекторами изображения типа ПЗС или КМОП, независимо от того, каков исходный линейный диапазон выбранного устройства.
Анализ смесей красителей в ячейках биочипа
При проведении количественных измерений с биологическими молекулами, меченными двумя красителями, спектры возбуждения и флуоресценции которых находятся в разных оптических диапазонах (например, с красителями типа Су3 и Су5), интенсивность флуоресценции ячейки при специфическом возбуждении одного красителя не зависит от концентрации второго красителя, и количество каждого из красителей в ячейке, содержащей их смесь, определяется независимо. Для этого в матрицу ячеек биочипа вводят дополнительно вспомогательные реперные ячейки, каждая из которых содержит только один из красителей в известной концентрации. При этом объем ячеек биочипа задается одинаковым, а небольшие случайные вариации этих объемов будут приводить к определенной погрешности в определении концентраций красителей.
При проведении количественных измерений с двумя красителями с пересекающимися спектрами возбуждения и/или флуоресценции (например, Су5 и Су7), может возникнуть необходимость в определении концентраций каждого из этих красителей в ячейках, содержащих их смесь. В этом случае биочип должен иметь две вспомогательные реперные ячейки R1 и R2, в каждой из которых содержится только по одному красителю, соответственно Су5 и Су7, в известных концентрациях  и . Для определения концентраций красителей в матрице из N ячеек биочипа измеряют интенсивности флуоресценции всех ячеек биочипа, включая реперные R1 и R2, в условиях, специфичных для анализа флуоресценции Су5 , а также - в условиях, специфичных для анализа флуоресценции Су7 . Затем рассчитывают коэффициенты
с помощью которых интенсивности флуоресценции любой j-ой ячейки в условиях, специфичных для анализа флуоресценции Су5  и в условиях, специфичных для анализа флуоресценции Су7 , могут быть представлены следующими выражениями:
где  и  являются, соответственно, искомыми концентрациями красителей Cy5 и Cy7 в j-ой ячейке биочипа.
Решение этой системы уравнений относительно  и , позволяет рассчитать значения концентраций красителей Cy5 и Cy7 в j-ой ячейке:
Аналогичным образом можно рассчитывать концентрации смесей трех меченных красителями биологических молекул в ячейках биочипа.
На Фиг. 7А и 7Б представлены изображения биочипа, с ячейками, содержащими красители Cy5 и Cy7, соответственно, при возбуждении и регистрации флуоресценции в условиях, специфичных для этих красителей. Левая ячейка биочипа (реперная ячейка, обозначенная на Фиг. 7В, как R1) содержит только краситель Cy5, правая ячейка биочипа (реперная ячейка, обозначенная, как R2) - только краситель Cy7. В трех остальных ячейках (обозначены, как 1, 2 и 3) содержатся смеси этих красителей в разных соотношениях. Концентрации красителей в ячейках показаны в таблице на Фиг. 7, верхние значения показывают концентрацию Cy5, нижние - концентрацию Cy7.
При расчетах концентраций красителей в ячейках, содержащих их смеси, использовали значения интенсивности флуоресценции двух реперных ячеек, содержащих индивидуальные красители Cy5 и Cy7 соответственно, а также трех ячеек среднего столбца, содержащих разные соотношения этих красителей. При этом были получены результаты, представленные в Табл. 2. На основании вычисленных коэффициентов пересчета (нижняя строка таблицы 2) были рассчитаны величины концентраций красителей Cy5 и Cy7 в ячейках со смесями красителей. Полученные данные приведены в Табл. 4. Видно, что эти значения достаточно хорошо согласуются с концентрациями красителя при нанесении. Наблюдаемые различия (завышение на 3-5% вычисленной концентрации по сравнению с заданной при нанесении) объясняются ошибками в объеме ячеек при изготовлении биочипа.
Аналогично можно решить задачу определения концентраций 3-х красителей с пересекающимися спектральными характеристиками в любой ячейке биочипа. Для этого чип должен содержать 3 реперные ячейки, в каждой из которых содержится только по одному красителю в известной концентрации. Далее следует измерить интенсивность флуоресценции во всех ячейках в условиях длин волн, специфичных для измерения флуоресценции каждого из красителей, а затем произвести расчеты с использованием трех линейных уравнений с тремя неизвестными.
Таким образом, разработанный анализатор позволяет а) эффективно подавлять спеклы, возникающие при возбуждении флуоресценции биочипов расфокусированным когерентным лазерным излучением, б) увеличить линейный диапазон регистрируемых сигналов при использовании детектора изображения на базе ПЗС или КМОП матрицы, в) получать изображения флуоресцирующих ячеек биочипов в трех длинах волн от 380 до 850 нм.