Лекарственный препарат для профилактики и лечения токсического гепатита
DRUGS FOR TOXIC HEPATITIS PREVENTION AND TREATMENT

Одной из важнейших задач современной медицины является поиск новых эффективных лекарственных препаратов для профилактики и лечения заболеваний печени различного генеза, таких как токсические и вирусные гепатиты, цирроз, лекарственные, радиационные и ишемические повреждения и др.
Изобретение относится к области фармакологии, а именно к гепатопротекторным препаратам, и может быть использовано при разработке новых лекарственных средств растительного происхождения, преимущественно для профилактики и лечения токсической гепатопатии, вызванной интоксикацией сулемой.
Номенклатура лекарственных средств для профилактики и лечения гепатита представлена, в основном, препаратами растительного происхождения, в качестве активных субстанций которых преобладают флавоноиды. Они обладают широким спектром фармакологического действия, основным из которых является антиоксидантное, позволяющее инактивировать как свободные радикалы, так и активные формы кислорода в клетке, что во многом обусловливает их высокую терапевтическую эффективность при лечении таких заболеваний печени, как токсические и вирусные гепатиты, цирроз, лекарственные, радиационные и ишемические повреждения и др. [Луценко С.В., Фельдман Н.Б., Луценко Е.В., Быков В.А. / Растительные флаволигнаны. Биологическая активность и терапевтический потенциал. М. 2006].
Известно, в частности, средство для лечения хронического гепатита неинфекционной этиологии [RU 2139071, C1, А61К 35/78, 10.10.1999], представляющее собой сбор лекарственных растений, включающий ромашку аптечную, траву череды и цветки календулы, соцветия бессмертника песчаного, листья мяты перечной, плоды фенхеля, кукурузные рыльца, донник лекарственный, листья брусники, корневища с корнями валерианы, корневища с корнями аира, цветки пижмы, цветки василька синего, золотарник канадский, цветки бузины черной, цветки липы, траву полыни горькой, листья крапивы двудомной и плоды рябины при следующем соотношении компонентов в мас. %: бессмертника песчаного соцветия - 4-6, мяты перечной листья - 9-11, фенхеля плоды - 7-9, каландулы цветки - 8-10, кукурузные рыльца - 9-11, череды травы 14-16, донник лекарственный - 10-12, ромашка аптечная - 4-6, брусники листья - 9-11, корневища с корнями валерианы - 4-6, корневища с корнями аира - 5-7, пижмы цветки - 2-4, василька синего цветки - 2-4, золотарник канадский - 4-6, бузины черной цветки - 7-9, липы цветки - 14-16, полыни горькой трава - 2-4, крапивы двудомной листья - 4-6, рябины плоды - 6-8.
Недостатком этого средства является его относительно высокая сложность приготовления.
Кроме того, известно средство для лечения больных лекарственным гепатитом [RU 2419449, C1, А61К 36/288, 27.05.2011], представляющее собой травяной сбор, включающий: траву земляники лесной, траву одуванчика лекарственного, соцветия ромашки безъязычковой, лист крапивы двудомной, соцветия пижмы обыкновенной, соцветия календулы лекарственной, плоды можжевельника обыкновенного, лист мяты перечной, траву зверобоя продырявленного, отличающееся тем, что дополнительно содержит цветки липы, траву фиалки трехцветной, траву золототысячника, семя льна, семя укропа, корень лопуха, траву цикория обыкновенного, траву горца птичьего, соплодия хмеля обыкновенного, траву василька синего, лист брусники, лист толокнянки, рыльца кукурузные, траву бессмертника, корни и корневища аира, траву вахты трехлистной, корень дягиля, траву донника лекарственного, корень девясила, траву хвоща полевого, при следующем массовом соотношении компонентов:
Земляника лесная, трава
5-7
Одуванчик лекарственный, трава
4-6
Ромашка безъязычковая, соцветия
10-12
Крапива двудомная, лист
6-8
Пижма обыкновенная, соцветия
2-4
Календула лекарственная, соцветия
1-3
Можжевельник обыкновенный, плоды
5-7
Мята перечная, лист
8-10
Зверобой продырявленный, трава
9-11
Липа, цветки
20-22
Фиалка трехцветная, трава
19-21
Золототысячник, трава
6-8
Семя льна
10-12
Семя укропа
9-11
Лопух, корень
4-6
Цикорий обыкновенный, трава
7-9
Горец птичий, трава
6-8
Хмель обыкновенный, соплодия
8-10
Василек синий, трава
3-5
Брусника, лист
6-8
Толокнянка, лист
3-5
Рыльца кукурузные
7-9
Бессмертник, трава
4-6
Аир, корни и корневища
5-7
Вахта трехлистная, трава
7-9
Дягиль, корень
7-9
Донник лекарственный, трава
8-10
Девясил, корень
7-9
Хвощ полевой, трава
6-8
Недостатком этого средства также является его относительно высокая сложность приготовления.
Наиболее близким по технической сущности и эффекту при применении является лечебное средство профилактики и лечения хронических заболеваний печени [RU 2526172, С2, А61К 36/21, 20.08.2014], представляющее собой амарантовое масло, полученное холодным прессованием зародышей и оболочек семян амаранта, которое применяется в дозе 62,5-250 мг/кг массы тела.
Недостатком наиболее близкого технического решения является относительно узкая область применения, что выражается в относительно низко выраженных гепатопротекторных свойствах применительно к токсической гепатопатии, вызванной интоксикацией сулемой.
Задачей, которая решается в предложенном изобретении, является расширение ассортимента лекарственных средств растительного происхождения и создание на этой основе лекарственного препарата для профилактики и лечения токсической гепатопатии, вызванной интоксикацией сулемой.
Требуемый технический результат заключается в расширении ассортимента лекарственных средств растительного происхождения и повышении гепатопротекторного действия относительно токсической гепатопатии, вызванной интоксикацией сулемой.
Поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается темлекарственным препаратом на растительной основе, согласно изобретению в качестве лекарственного препарата используют володушки экстракт сухой в дозе 10 мг на килограмм веса пациента.
Кроме того, требуемый технический результат достигается тем, что володушки экстракт сухой представляет собой фенольные соединения флавоноидов-агликонов: лютеолина 0,3±0,01 мг/г, кверцетина 13,3±0,50 мг/г, кемпферола 1,1±0,10 мг/г, изорамнетина 9,1±0,30 мг/г.; флавоноидов: рутина - 6,2±0,10 мг/г, гиперозида 5,7±0,10 мг/г, астрагалина 0,4±0,01 мг/г.; фенолкарбоновых кислот: феруловая кислота 657,4 мг/100, кофейная кислота 83,9 мг/100, 4-кофеоилхинная 592,2 мг/100, розмариновая 130,2 мг/100; дубильных веществ: на (+) - катехин 7,2%±0,5%; сапонинов в пересчете на олеаноловую кислоту 8,4%±0,3%; полисахаридов в пересчете на глюкозу 1,80±0,15%; аскорбиновой кислоты 0,4 мг/г; незаменимых аминокислот: валина - 0,12%, лизина - 0,15%, треонина - 0,07%, гистидина - 0,3%, аргинина - 0,14%; заменимых аминокислот: аланина - 0,15%, цистеина - 0,95%, глицина - 0,05%, тирозина - 0,45%.
На чертеже представлены:
на фиг. 1 - морфологическая картина печени крыс при интоксикации сулемой;
на фиг. 2 - морфологическая картина печени крыс, получавших володушки экстракт в дозе 10 мг/кг + сулема;
на фиг. 3 - морфологическая картина печени крыс, получавших володушки экстракт в дозе 100 мг/кг + сулема.
Приведем теоретические и экспериментальные данные, подтверждающие эффективность применения володушки экстракта сухого в качестве лекарственного препарата при профилактике и лечении токсического гепатита.
Перспективными источниками получения биологически активных веществ являются растения рода Володушка, которая имеет широкий ареал произрастания на территории России, что обеспечивает стабильную сырьевую базу. Кроме того, на территории республики Башкортостан проводились работы по введению володушки золотистой в культуру и установлено, что она более технологично вводится в культуру, чем многожильчатая, имеет большую (в четыре раза) наземную массу растений, что важно при создании промышленных запасов растения. Экспериментальные данные по биохимическому изучению извлечений из володушки золотистой свидетельствуют о положительном влиянии на печень и желчные пути в опытах на животных.
В ФГБНУ ВИЛАР разработана оптимальная технология экстракта сухого володушки золотистой (длиннолистной) - Bupleurum aureum Fisch. seu longifolium L., сем. Apiaceae - сельдерейные, и проведена его стандартизация.
Володушки экстракт сухой представляет собой фенольные соединения флавоноидов-агликонов: лютеолина 0,3±0,01 мг/г, кверцетина 13,3±0,50 мг/г, кемпферола 1,1±0,10 мг/г, изорамнетина 9,1±0,30 мг/г.; флавоноидов: рутина - 6,2±0,10 мг/г, гиперозида 5,7±0,10 мг/г, астрагалина 0,4±0,01 мг/г; фенолкарбоновых кислот: феруловая кислота 657,4 мг/100, кофейная кислота 83,9 мг/100, 4-кофеоилхинная 592,2 мг/100, розмариновая 130,2 мг/100; дубильных веществ пересчете на (+) - катехин 7,2%±0,5%; сапонинов в пересчете на олеаноловую кислоту 8,4%±0,3%; полисахаридов в пересчете на глюкозу 1,80±0,15%; аскорбиновой кислоты 0,4 мг/г; незаменимых аминокислот валина - 0,12%, лизина - 0,15%, треонина - 0,07%, гистидина - 0,3%, аргинина - 0,14%; заменимых аминокислот: аланина - 0,15%, цистеина - 0,95%, глицина - 0,05%, тирозина - 0,45%.
Широкий спектр фармакологической активности володушки золотистой обусловлен ее уникальным химическим составом.
В качестве модели патологии выбрана экспериментальная модель токсического гепатита, вызванного введением сулемы (хлорид ртути (II)). Ртуть является одним из наиболее мощных блокаторов SH-групп, ее однозначно квалифицируют как сульфгидрильный яд. Связь ртути с серой является практически необратимой. Считается, что именно это свойство ртути является основой механизма ее токсического действия. Вне зависимости от химической формулы, ртуть является мощным клеточным ядом, поскольку способна изменять третичную и четвертичную структуру белковых молекул, поэтому ртуть потенциально способна изменять функциональное состояние любой клетки, ткани, органа, приводя к клеточному апоптозу. Являясь мощным тиоловым ядом, сулема приводит к повреждению белковых структур и ингибированию тиолсодержащих антиоксидантов, снижению активности ферментов антиоксидантной защиты, печеночным повреждениям, обусловленным развитием окислительного стресса. В известных работах показано, что под воздействием сулемы формируются выраженные гистологические изменения в печени. Отмечается выраженная картина дегенерации и сплошной вакуолизации клеточных ядер, фокусной центродолевой и перипортальный некроз гепатоцитов, а также признаки желчного застоя. Гепатотоксическое действие сулемы приводит к развитию изменений биохимических показателей крови, а именно увеличению концентрации (более, чем в 6 раз) активности аланинаминотрансферазы, нарушению липидного, белкового и минерального обменов, приводящих в свою очередь к развитию системных патофизиологических состояний.
Целью исследований явилось изучение гепатопротекторного действия володушки золотистой экстракта сухого на экспериментальной модели острой сулемовой интоксикации крыс.
Исследования выполнены на 105 крысах Вистар (самцы) масса тела 180-200 г. Эксперименты проведены в соответствии с «Правилами лабораторной практики». Содержание, кормление и уход за животными регламентировались санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник - вивариев [Правила по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей. Европейская конвенция, Стасбург, 1986].
50
50
Модель острого токсического поражения печени крыс вызывали однократным подкожным введением сулемы в дозе 3 мг/кг (≈ ЛД при подкожном введении сулемы белым крысам). Животные были разделены на 4 группы по 15 животных в каждой. I группу - интактный контроль, используемый для оценки токсического действия сулемы. Животным II группы (модель) однократно вводили подкожно (п/к) сулему в дозе 3 мг/кг; животным III и IV групп за 1 час до введения сулемы и в последующие 5 дней вводили в желудок володушки экстракт сухой в дозах 10 и 100 мг/кг соответственно. Выбор экспериментальных доз володушки экстракта сухого был обусловлен тем, что максимальная доза составляла 1/100 от ЛД при внутрижелудочном введении крысам.
Для выявления степени выраженности гепатопротекторного действия володушки экстракта сухого были проведены исследования в сравнении с известным гепатопротектором карсилом. Препараты вводили в желудок животным в одинаковой дозе 10 мг/кг по той же схеме, что и приведенной выше. В этом эксперименте животные были разделены на 3 группы по 15 крыс в каждой: I группа - п/к сулема в дозе 3 мг/кг; II группа - володушки экстракт 10 мг/кг + сулема; III группа - карсил 10 мг/кг + сулема.
2
На протяжении эксперимента регистрировали основные интегральные показатели экспериментальных животных: общее состояние, поведение, динамику массы тела, потребление сухого корма и воды, гибель. Дважды, на 5-е и 10-е сутки опыта, исследовали гематологические показатели (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина, гематокрит, среднее содержание и концентрацию гемоглобина в эритроците, средний объем эритроцитов, распределение эритроцитов по объему) на полуавтоматическом гематологическом анализаторе «ВС-2300», MINDRAY (Китай). В эти же сроки определяли показатели клинической биохимии: общий белок (ОБ), общий холестерин (ОХ), триглицериды (TP), глюкоза (Гл), активность щелочной фосфатазы (ЩФ), аланин- и аспартатаминотрансфераз (АлТА, АсТА), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) на автоматическом биохимическом анализаторе крови URIT-8030 фирмы Urit Medical Electronic (Китай), при помощи наборов фирмы «Human», Германия. В конце эксперимента животные были подвергнуты эвтаназии в СО-камере, у них определены коэффициенты внутренних органов (печень, селезенка, тимус) с их патогистологической оценкой при окрашивании гематоксилином и эозином и исследовании световой микроскопией при увеличении ×100 и ×200.
После завершения экспериментальных исследований проведена статистическая обработка полученных результатов методом вариационной статистики с применением t-критерия Стьюдента. Достоверность различий с контролем считали при Р<0,05. Статистические данные обрабатывали с помощью программы Office Excel.
Под влиянием сулемы у животных развивалось токсическое повреждение печени, характерное для острого отравления крыс этим гепатотропным ядом, резкое нарушение ее функционального состояния, снижение основных видов межуточного обмена, повреждение мембран гепатоцитов и их гибель. Указанные эффекты гепатотоксического действия сулемы сопровождались нарушением общего состояния животных (снижение потребления корма и воды, динамики массы тела на 39-51%, вялость, гиподинамия, размягчение кала), гибелью 4 животных, что составляло 26,6%, а также лейкоцитозом. Интоксикация сулемой приводила к статистически достоверному увеличению в сыворотке крови крыс уровня общего белка, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов, активности «печеночных» ферментов: АсТА и АлТА, ЛДГ, ЩФ.
У животных этой группы отмечено снижение коэффициента массы печени и иммунокомпетентных органов - селезенки и тимуса. Гистологическая картина печени показала (фиг. 1) наличие дистрофии гепатоцитов, характеризующейся гиалиново-капельной и вакуольной дистрофией.
Введение володушки экстракта сухого в дозах 10 и 100 мг/кг улучшало общее состояние животных, предотвращало резкое снижение массы тела и двигательной активности. На 5-й день опыта снижение массы тела крыс, получавших экстракт в обеих испытанных дозах, не превышало 12-15% по сравнению с моделью патологии, а на 10-й день масса тела животных этих групп соответствовала интактному контролю (таблица 1).
В группе животных, получавших володушки экстракт сухой в дозе 10 мг/кг, была зарегистрировано гибель 2 животных, что составляло 13%, а группе животных, получавших володушки экстракт сухой в дозе 100 мг/кг гибели животных не отмечено. Крысы в этих группах имели опрятный внешний вид, оформленный кал, охотно поедали корм.
Под влиянием володушки экстракта сухого в указанных дозах в оба срока наблюдения отмечалась нормализация гематологических и биохимических показателей: не наблюдалось лейкоцитоза, происходило снижение уровня общего белка, общего холестерина, триглицеридов и глюкозы (таблицы 3, 4). Введение володушки экстракта сухого в указанных дозах предотвращало также резкое повышение активности ряда ферментов сыворотки крови, характеризующих функциональное состояние печени, и способствовало их более быстрой нормализации, причем несколько более выраженными эти изменения были у животных, получавших максимальную дозу экстракта - 100 мг/кг (таблицы 2 и 3).
Однако прямой корреляционной зависимости уровня гепатозащитного действия володушки экстракта по биохимическим показателям и активности ферментов сыворотки крови и скорости их нормализации от испытанных доз экстракта не установлено. Препарат проявляет выраженные гепатопротекторные свойства уже в дозе 10 мг/кг и в дальнейшем наблюдается лишь незначительное нарастание этого эффекта даже при увеличении дозы экстракта в 10 раз. Это подтверждается и результатами патогистологического исследования печени экспериментальных животных. Введение володушки экстракта сухого в дозе 10 мг/кг на фоне интоксикации сулемой показало отсутствие дистрофических изменений в гепатоцитах, а в группе животных, получавших препарат в дозе 100 мг/кг, кроме того, наблюдались процессы регенерации гепатоцитов и отсутствие признаков разрастания внутридольковой соединительной ткани (фиг. 2, 3).
Введение володушки экстракта сухого в обеих дозах способствовало сохранению относительной массы печени, селезенки и тимуса на уровне показателей интактного контроля (таблица 4).
Таким образом, установлено выраженное гепатопротекторное действие володушки экстракта сухого на модели острой интоксикации сулемой, причем эффект препарата проявлялся уже в дозе 10 мг/кг.
Исследование по сравнительной оценке гепатозащитного действия двух препаратов при острой интоксикации сулемой показали несколько превосходящее действие володушки экстракта сухого в сравнении с карсилом. Это выражалось тем, что данный эффект у экстракта наступал уже в начальный период проведения эксперимента (5 день) и сохранялся до его окончания, в то время как карсил предотвращал токсическое действие сулемы только к 10 суткам проведения опыта.
Введение исследуемых препаратов в желудок крысам с острым токсическим гепатитом полностью предотвращало гибель животных, в то время как в контрольной группе крыс, только с интоксикацией сулемой, гибель составляла 26,9%. Исследуемые препараты замедляли резкое снижение массы тела животных, предупреждали нарушение белкового, липидного и углеводного обмена в печени. При этом уровень общего белка в сыворотке крови крыс, получавших на фоне интоксикации сулемой володушки экстракт сухой и карсил, был не выше 78,2 г/л по сравнению с животными, получавшими сулему - 86,4 г/л. Концентрация общего холестерина в сыворотке крови животных (сулема) повышалась до 4,20-4,80 ммоль/л (соответственно на 5 и 10 дни эксперимента) у крыс, леченных володушки экстрактом и карсилом, соответствующий показатель находился на уровне 3,38-2,53 ммоль/л. Аналогичные результаты были получены при анализе уровня триглицеридов. Введение володушки экстракта и карсила в дозе 10 мг/кг снижало гипертриглицеридемию, которая наблюдалась у животных, получавших сулему. Под действием исследуемых препаратов снижался уровень активности ферментов сыворотки крови, таких как АсТА, АлТА, ЩФ. Активность ЛДГ существенно не изменялась (таблица 5).
Введение володушки экстракта сухого и карсила способствовало сохранению относительной массы печени на уровне интактного контроля - 3,82±0,32; модель патологии (сулема 3 мг/кг) - 2,96±0,18; володушки экстракт сухой + сулема - 3,61±0,10; карсил + сулема - 3,45±0,10 (Р<0,05).
Таким образом, результаты проведенных исследований подтвердили ранее установленные выраженные гепатопротекторные свойства володушки золотистой экстракта сухого на модели токсической гепатопатии, вызванной интоксикацией сулемой, и свидетельствуют о том, что по эффективности гепатозащитного действия на указанной модели патологии печени володушки экстракт сухой в дозе 10 мг/кг несколько превосходил карсил (в дозе 10 мг/кг) - наиболее широко применяющийся в настоящее время в медицинской практике гепатопротектор.
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности дальнейшего более углубленного исследования володушки золотистой экстракта сухого в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний печени различной этиологии.