Иммунорегуляция

Медицинская Иммунология 2003, Т.5, №3-4 ©2003, СПбРОРААКИ

ИММУНОРЕГУЛЯЦИЯ

УЧАСТИЕ ЦИТОКИНОВ И НЕЙРОПЕПТИДОВ В ПРОЦЕССЕ РАЗВИТИЯ ЭАЭ

Абдурасулова И.Н.. Тарасова Е.А., ЖитнухинЮ.Л., Соколов д.и., Ефанов A.B., Клименко В.М.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Современные представления о нейроиммунных взаимодействиях, осуществляемых в частности цитокинами и нейропептидами, позволяют рассматривать многие формы патологии нервной системы с точки зрения нарушения взаимодействий между этими системами. Наиболее ярко это проявляется при рассеянном склерозе (PC), где собственная нервная ткань становится мишенью для иммунных клеток. Экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) является общепризнанной моделью PC, поскольку имеет сходные патогенетические механизмы.

Цитокины - эндогенные медиаторы межклеточных взаимодействий, участвующие в регуляции иммунных функций, вовлечены в патогенез ЭАЭ и PC. Провоспалитель-ным цитокинам, особенно фактору некроза опухоли а (TNFa), интерлейкину-lß (IL-lß) принадлежит ключевая патогенетическая роль, напротив, противовоспалительные цитокины обладают защитными свойствами, подавляя экспрессию провоспалительных цитокинов (IL-10) или конкурируя с ними за рецепторы (IL-1 p.a.).

Нейропептиды (вазопрессин и окситоцин) также участвуют в регуляции иммунных функций, активируя ГГНС и регулируя активность иммунокомпетентных клеток. Однако роль нейропептидов в патогенезе ЭАЭ практически не изучена.

Целью данной работы явилось исследование динамики циркулирующих цитокинов (TNFa и IL-10) и экспрессии мРНК цитокинов (TNFa, IL-lß, IL-10 и IL-lp.a.) в спинном мозге, а также измерение уровня нейропептидов вазопрессина и окситоцина в гипоталамусе животных в процессе развития ЭАЭ.

ЭАЭ вызывали однократной инокуляцией гомогена-та гомологичного спинного мозга (ГГСМ) в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) у самок крыс Вистар весом 170-190 гр. Экспрессию мРНК цитокинов в спинном мозге животных определяли методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией на 6,13 и 30 день после индукции ЭАЭ (д.п.и.). Циркулирующий IL-10 определяли методом ELISA., TNFa - по цитотокси-ческому действию на культуру фибробластов. Уровень нейропептидов измеряли методом ВЭЖХ.

Введение ГГСМ вызывало у самок крыс Вистар развитие заболевания различной степени тяжести (КИ = 0-6). Изучение циркулирующих цитокинов показало, что их уровень коррелирует с тяжестью заболевания, причем, как повышенная активность TNFa, так и сниженная - IL-10 являются факторами риска для развития заболевания. Ран-

ний подъем (6-14 д.п.и.) уровня IL-10 предопределяет более легкое течение заболевания у животных, сопровождающееся снижением активности TNFa, тогда как при отсутствии повышения IL-10 в крови в этот период не наблюдается подавления активности TNFa и заболевание протекает в тяжелой форме, с летальными исходами в ряде случаев. Динамика про- и противовоспалительных цитокинов в ЦНС иная: в период проявления клинических симптомов в ЦНС выявляется мРНК провоспалительных цитокинов, в стадию выздоровления - противовоспалительных цитокинов, причем, чем тяжелее протекало заболевание, тем дольше сохранялась экспрессия мРНК провоспалительных цитокинов. При отсутствии неврологической симптоматики у животных не обнаруживалась экспрессия мРНК цитокинов в спинном мозге. Исследование концентрации вазопрессина и окситоцина в гипоталамусе крыс в процессе развития ЭАЭ показало вовлеченность нейропептидов в патогенез этого заболевания. Таким образом, цитокиновые и нейропептидные системы участвуют в регуляции иммунных и воспалительных реакций в ЦНС при ЭАЭ.

Работа поддержана грантом РФФИ №02-04-49595.

ВЛИЯНИЕ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЛИНИИ EA.HY926

Амчиславский Е.И.. Старикова Э. А.,

Соколов Д.И., ФрейдлинИ.С.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Патогенез многих хронических заболеваний связан с формированием порочного круга хронического воспаления, которое характеризуется выраженным пролиферативным компонентом. В ходе воспалительного ответа, в особенности на его поздних стадиях, in situ продуцируется большое количество медиаторов, которые, с одной стороны, участвуют в поддержании воспаления, а с другой, обладают ангиогенным потенциалом. Большинство провоспалительных медиаторов (цитокины, простогланди-ны, метаболиты арахидоновой кислоты), способствуют ангиогенезу, стимулируя продукцию ангиогенных факторов, таких как VEGF, PDGF, bFGF. Ранее было показано, что фактор некроза опухолей-a (TNFa) в опытах ш vivo стимулирует образование новых сосудов, в то время как, в системах in vitro этот цитокин обладает дозозависимым двойственным эффектом, в низких дозах - индуцирует, а в высоких - ингибирует пролиферацию, миграцию и образование трубок эндотелиальными клетками. Другой провоспалительный цитокин, интерлейкин-ip (IL-1P), так же как и TNFa в опытах in vivo обладает выраженным ангиогенным потенциалом. Гранулоцитар-но-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), регулируя миграцию нейтрофилов через эн-

дотелий, также способен индуцировать пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток. Значительной анти-ангиогенной активностью обладают интерфероны а и у (IFNa и IFNy).

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния провоспалительных цитокинов: TNFa, IL-ip, GM-CSF, IFNa и IFNy на пролиферацию эндотелиальных клеток перевиваемой линии ЕА.Ну 926. Оценка пролиферации осуществлялась при помощи стандартной тест-системы («Amersham Biosciences»), основанной на включении бромдезоксиуридина в ДНК делящихся клеток в S-фазу митоза, с последующим учетом результатов в ИФА. Изученные цитокины в использованных концентрациях не обладали цитоток-сическим эффектом на человеческие эндотелиальные клетки перевиваемой линии EA.hy 926, что проверяли с помощью МТТ-теста.

Результаты наших исследований показали, что TNFa в низкой концентрации 0,01 ЕД/мл вызывал достоверное усиление пролиферации, в то время как высокая его концентрация 500 ЕД/мл оказывала ингибирующее действие на пролиферацию человеческих эндотелиальных клеток перевиваемой линии EA.hy 926. IFNa вызывал ингибирующий эффект в концентрациях от 100 до 1000 ЕД/мл, наиболее выраженный при концентрации 1000 ЕД/мл. IL-ip в изученных концентрациях (от 1 до 10000 ЕД/мл) оказывал стимулирующее влияние на пролиферацию клеток перевиваемой линии EA.hy 926, однако наиболее выраженное действие было выявлено только при концентрации 100 ЕД/мл. GM-CSF и IFNy в широком диапазоне концентраций не оказывали достоверного влияния на пролиферацию человеческих эндотелиальных клеток перевиваемой линии EA.hy 926.

Анализ полученных результатов показал, что на перевиваемой линии эндотелиальных клеток EA.hy 926 можно воспроизвести как про-, так и антиангиогенные эффекты ряда провоспалительных цитокинов, которые согласуются с литературными данными, что позволяет использовать эту линию клеток в качестве модели для исследования in vitro различных этапов ангиогенеза.

Работа поддержана грантом РФФИ № 03-04-48118.

РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ ОСЛОЖНЕННОГО ТЕЧЕНИЯ РАНЕВОГО ПРОЦЕССА НА ФОНЕ ИММУНОСУПРЕССИИ У МЫШЕЙ

Анциферова М. А.. Варюшина Е. А., Александров Г. В., Конусова В. Г., Петров А. В., Пигарева Н. В., Исаева Е. Н., Казаков А. А., Демьянов А. В., Симбирцев А. С.

ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург, Россия

Заживление раны представляет собой сложный биологический процесс, включающий в себя воспаление, ре-эпителизацию, ангиогенез, формирование грануляционной ткани, образование внеклеточного матрикса и восстановление тканей. При хронических и длительно незаживающих ранах наблюдается значительное замедление заживления, которое особенно выражено при снижении показателей иммунитета. Кортикостероиды, обладая мощным противовоспалительным и антипролифератив-ным действием, могут вызывать значительное снижение числа и функциональной активности иммунокомпетент-

ных клеток, ингибицию ангиогенеза, пролиферации фиб-робластов и синтеза компонентов внеклеточного матрикса. Данные показатели являются чрезвычайно важными при заживлении ран, поэтому при применении кортикостероидов наблюдается осложнение течения раневого процесса, что приводит к замедлению заживления ран.

Целью настоящего исследования являлась разработка модели осложненного течения раневого процесса у мышей на фоне иммуносупрессии, вызванной введением кортикостероидного гормона, гидрокортизона. В наши задачи входило:

- отработать дозу гидрокортизона с тем, чтобы добиться замедленного заживления кожных ран у мышей (планиметрическое исследование);

- оценить влияние системного введения гидрокортизона на течение раневого процесса (планиметрическое и гистологическое исследование);

- охарактеризовать изменения параметров системы иммунитета в данной модели по следующим показателям: вес мышей, количество лейкоцитов и формула периферической крови, функциональная активность лейкоцитов крови, селезенки и перитонеального лаважа, вес, морфологический состав селезенки и функциональная активность спленоцитов в динамике.

В результате проведенных исследований была отработана воспроизводимая модель осложненного заживления полнокожных ран у мышей. В ходе экспериментов нами была подобрана оптимальная доза гидрокортизона (25 мг/кг веса), вызывающая значительное замедление заживления полнокожных ран у мышей. При использовании этой дозы по предложенной схеме введения (внутримышечно ежедневно в течение 14 дней) при сходной начальной площади раневого поражения на 3-й и последующие дни измерений площадь ран животных, получающих гидрокортизон, была значительно выше площадей раневого поражения контрольных животных. Планиметрические данные подтверждались гистологическими исследованиями, демонстрирующими значительное замедление течения раневого процесса у животных опытной группы.

Исследование показателей иммунной системы продемонстрировало, что при системном введении гидрокортизона наблюдалось ухудшение общего состояния животных и значительная общая иммуносупрессия. Снижался вес животных. В периферической крови наблюдались лейкоцитоз и лимфопения. Количество ней-трофилов в крови возрастало, но при этом происходило снижение их функциональной активности. Уменьшался вес селезенок, количество клеток в селезенках и функциональная активность спленоцитов. Таким образом, нами было показано, что под влиянием введения гидрокортизона происходило снижение основных показателей системного иммунитета, при этом изменения наблюдались уже на 3-й день после ранения и сохранялись до конца эксперимента.

На основании проведенных нами исследований можно заключить, что данная система моделирует условия осложненного течения раневого процесса на фоне иммуносупрессии. В настоящее время представляется перспективным местное применение рекомбинантных цитокинов для лечения хронических и длительно незаживающих ран. Разработанная модель может быть использована для изучения эффективности применения различных ранозаживляющих агентов, в том числе провоспалительных цитокинов.

АКТИВНОСТЬ ИНИЦИИРУЮЩИХ И ЭФФЕКТОРНЫХ КАСПАЗ В ЛИМФОЦИТАХ ПРИ ОСТРОЙ ХАНТАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

Ахматова Н.К.. Юсупова Р.Ш.*, Сибиряк С.В.*, Кулагин В.Ф., Ямалова Л.З.

НИИВС им И.И. Мечникова, ГУП “Иммунопрепарат”, г.У фа; * Отдел иммунологии Всероссийского центра глазной и пластической хирургии М3 РФ, Уфа, Россия

Программированная клеточная смерть как механизм иммунорегуляции играет ключевую роль в формировании иммунной защиты при вирусных инфекциях. Реализация программы апоптоза осуществляется каскадом цистеин-зависимых аспарагин-специфических протеаз

- каспаз. Инициирующие каспазы активируются при взаимодействии с адапторными белками, ассоциированными с рецепторами апоптогенного сигнала (Fas—>каспаза-8, TNFR—жаспаза-2) или при нарушении целостности мембраны митохондрий (каспаза-9). Инициирующие каспазы, в свою очередь, путем каталитического расщепления активируют эффекторные каспазы 3,7,10, вызывающие разрушение витальных субстратов (ламина ядра, кератина 18, PARP и др.). В настоящей работе изучена динамика активности инициирующих и эффекторных каспаз в лимфоцитах периферической крови при острой хантавирусной инфекции (геморрагическая лихорадка с почечным синдромом, ГЛПС), а также реактивность лимфоцитов при их стимуляции анти-СОЗ МКА (2.5 pg/ml, 72 часа). Активность каспаз в лизатах свежевыделенных лимфоцитов периферической крови у здоровых доноров и больных ГЛПС оценивали флюориметрическим методом, используя селективные флюорогенные субстраты. Пролиферативную активность оценивали, используя МТТ-тест.

В динамике заболевания активность каспазы-8 в остром периоде ГЛПС (5-9 день болезни) статистически значимо повышалась - в 1,7 раза по сравнению со здоровыми донорами, в фазе реконвалесценции статистически значимого снижения активности каспазы 8 не выявлено. Активность каспазы-2 в лимфоцитах в остром периоде возрастала более чем в 12 раз, значимо снижаясь у рекон-валесцентов, но оставалась существенно выше, чем у здоровых лиц. Активность каспазы-9 в остром периоде ГЛПС также была повышена, а в фазе реконвалесценции снижалась практически до уровня такового у здоровых доноров. Активность эффекторных каспаз-3,7,10, являющихся точкой конвергенции апоптотических сигналов, в лизатах свежевыделенных лимфоцитов у больных в олигу-рическом периоде, в 4,4 раза была выше, чем у доноров; у реконвалесцентов активность эффекторных каспаз значимо снижалась по сравнению с активностью в остром периоде, сохраняясь на повышенном уровне в сравнении со здоровыми донорами. В остром периоде ГЛПС отмечалась выраженная депрессия анти-СБЗ-индуцированного митогенеза, в то же время активационный апоптоз резко нарастал и соотношение между индексом активации апоптоза и индексом пролиферации возрастало более чем в 11 раз. В фазе реконвалесценции, несмотря на выраженное угнетение митогенеза, соотношение между индексом активации каспаз и индексом стимуляции было меньше, чем в остром периоде и лишь в 5,5 раза превышало таковое в контрольной группе.

Полученные данные свидетельствуют об активации всех сигнальных путей апоптоза в лимфоцитах при ост-

рой хантавирусной инфекции, что сопровождается изменением реактивности Т-клеток и преобладающей “негативной” их активацией при стимуляции и формированием характерного для многих вирусных инфекций иммунодефицита. Описанные изменения являются закономерной реакцией иммунной системы, направленной на поддержание гомеостаза и ограничение вирусной репликации в организме хозяина.

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССААПОПТОЗАЛИМФОИДНЫХ КЛЕТОК "IN VITRO" С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДОВ МАТЕМАТИЧЕСКОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ

Баев Д.В., Пономарев А. Д., Тарасенко Т.Н., Сапожников А.М.

Институт Биоорганической Химии

им. В.В. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Программированная гибель лимфоцитов является сложным и многостадийным процессом, играющим одну из основных ролей в процессе появления и регуляции иммунного ответа организма. Однако детальный механизм данного процесса, в особенности - кинетические характеристики начальных стадий апоптоза, остаются в настоящее время достаточно слабоизученными.

Целью нашего исследования было кинетическое описание процесса программированной гибели лимфоидных клеток "in vitro". В экспериментах использовались культуры клеток линии EL-4, характеризующиеся высоким уровнем спонтанного апоптоза, культивируемые в стандартных условиях в среде RPMI 1640 с добавлением 5% фетальной сыворотки. В качестве индуктора апоптоза использовался С6-церамид. Количество клеток в экспериментальных культурах, находящихся на разных стадиях программированной гибели оценивалось с помощью методов проточной цитофлуориметрии по различиям в морфологических параметрах и с использованием ДНК-спе-цифичного флуорофора пропидия иодида. Для моделирования процесса апоптоза была предложена следующая система дифференциальных уравнений:

dN

dî

dA

dt

= knL-kaN

~kaN -kdA

Uto) ~ Ц} N(t0) = N0

Mt0)= A)

A(i1) = A1

Ь, N. А - число живых клеток, клеток "перешейка" и апоптозных соответственно. кп, ка, к(1 - константы скоростей каждой из стадий процесса апоптоза (с1).

В рамках данной модели были определены скорости прохождения различных стадий апоптоза. Было показано, что время нахождения клеток в предапоптотической

фазе (в зоне "перешейка") одинаково как для процессов спонтанного, так и церамид-индуцированного апоптоза, что позволяет постулировать независимость времени прохождения начальных этапов программированной гибели клеток от природы апоптотического сигнала.

ОБЩНОСТЬ ПУТЕЙ ФРАГМЕНТАЦИИ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ РНК ПРИ АП0ПТ03Е ЖИВОТНЫХ КЛЕТОК И ПРИ АВТОЛИЗЕ ПРЕПАРАТОВ РНК

Бекман Э.М.. Баранова O.A.

НИИ физико-химической медицины М3 РФ, Москва

Введение. Биорегуляция, и в частности, иммунорегуляция, носит сложный, многоуровневый характер как внутри живых клеток, так и в цельном организме. Один из регуляторных путей связан со специфической фрагментацией высокомолекулярных белков, и продукты этого ограниченного протеолиза выступают в качестве регуляторов. В настоящее время накапливаются данные, что аналогичные представления справедливы для другого класса биополимеров - РНК, чьи «неканонические» (регуляторные) функции также могут проявляться в ходе ограниченного эндонуклеолиза высокополимерных образцов клеточных РНК. Эти процессы, по данным литературы, удается зафиксировать в «экстремальных» для клеток состояниях: апоптоз, инфицирование вирусами, аутоиммунные патологии и т.п. В наших предыдущих исследованиях мы наблюдали аналогичную специфическую фрагментацию при так называемом автолизе цРНК, выделенных из различных органов и тканей животных (органы иммунной системы, печень, опухоли).

Цель настоящей работы - сравнить пути фрагментации высокомолекулярных цитоплазматических РНК (цРНК) при апоптозе и при автолизе.

Материалы и методы. Суммарные цРНК из тимуса крыс и телят, клеток печени мышей и мышиной лимфо-мы EL4 выделяли модифицированным «холодным фенольным» или «детергентным» методами. В модельных экспериментах экстрагированную из клеток цРНК подвергали специальной процедуре автолиза в условиях, близких к физиологическим (рН=7,5, t=37°, различные концентрации одно- и двувалентных катионов). Размеры фрагментов определяли с помощью ЭФ в ПААГ-7М мочевина с последующей оценкой молекулярных масс (М) по калибровочной кривой (график зависимости ЭФ- подвижности от IgM). В экспериментах по апоптозу клетки EL4 культивировали в течение 20-24 ч в присутствии или в отсутствие индуктора апоптоза циклогексимида (ЦГИ). Затем оценивали наличие апоптотических признаков: межнуклеосомная фрагментация ДНК (электрофоретическая «лестница» и процент фрагментации по ДФА-ме-тоду), а также характерные морфологические изменения в ядрах клеток.

Основные результаты:

1. Показано, что после культивирования клеток EL4 без ЦГИ выявляется до 10% апоптотических клеток (спонтанный апоптоз), а культивирование с добавлением ЦГИ приводит к повышению уровня апоптоза (более 60%).

2. Продемонстрировано, что как при апоптозе, так и при автолизе экстрагированных из клеток цРНК, процесс фрагментирования начинается с эндонуклеолитического расщепления 28S рРНК и накопления фрагментов с молекулярными массами 1340 (1380), 1100, 970, 890, 600 и

400кД, а при дальнейшей инкубации происходит многоступенчатый эндонуклеолиз этих фрагментов с образованием более низкомолекулярных компонентов.

3.Установлено сходство картины фрагментации высокомолекулярных цРНК клеток EL4 с аналогичной фрагментацией при автолизе цРНК других животных клеток (тимус, селезенка, печень, АКЭ) по последовательности событий и спектрам образующихся фрагментов.

Заключение. Полученные результаты в совокупности с опубликованными другими авторами данными о регуляторном характере фрагментации цРНК при апоптозе позволяют предположить, что фрагментация «зрелых» молекул цитоплазмы связана с регуляцией различных процессов, как внутриклеточных, так и на организмен-ном уровне. Более того, по нашим представлениям, продукты фрагментации могут прямо или опосредованно влиять на эти процессы, причем не только в «экстремальных», но и в «нормальных» физиологических условиях. Хорошей иллюстрацией для таких предположений служат полученные нами ранее результаты по регуляторному влиянию на транскрипцию автолизатов цРНК печени и о способности автолизатов тимусных цРНК быть медиаторами T-зависимого антителообразования.

РАЗЛИЧНЫЕ ВИДЫ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ Са2+- ДЕПО В ЛИМФОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЛЮДЕЙ

Беликова Н. А.. ЮсиповаЮ.Х., Грачев С.В., Асташкин Е.И.

Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова, Москва, Россия

Известно, что Са2+ служит сигналом для активации лимфоцитов. При этом увеличение концентрации свободных ионов Са2+ в цитоплазме ([Ca2+]j) происходит за счет выхода Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо и последующего его поступления из внеклеточной среды. Физиологическим регулятором выхода Са2+ из внутриклеточных депо лимфоцитов является инозитол трисфосфат (1Р3). Однако в опухолевых линиях и бластных клетках, образующихся из лимфоцитов, также описаны внутриклеточные Са2+-депо, имеющее на своей мембране рецептор к рианодину, характерный, в основном, для электровозбу-димых клеток.

Целью настоящей работы было изучить соотношение различных видов внутриклеточных Са2+-депо лимфоцитов периферической крови.

Материалы и методы. Лимфоциты выделяли из периферической крови доноров на градиенте плотности фи-колл-гипак (1,077 г/мл). Изменение [Са2+]( оценивали по флуоресценции красителя FURA-2. Для того чтобы быть абсолютно убежденными, что изменение ([Ca2+]j) под действием агентов происходит только из депо, необходимо было предотвратить поступление Са2+ снаружи. Для этого опыты проводили в среде, не содержащей Са2+ (6 мМ ЭГТА, pH = 7.4).

Результаты. Специфического ингибитора Са2+-АТФ-азы сарко/эндоплазматического ретикулюма тапсигаргин (ТГ) действует на Са2+-депо, имеющее на своей мембране рецептор к 1Р3. ТГ-чувствительные депо обнаружены в лимфоцитах всех обследованных людей (15 доноров). Концентрационная зависимость действия ТГ на изменение [Са2+]( носила вид кривой с насыщением, которое наступало при 200-400 нМ. У некоторых людей (5 человек) при полном опустошении ТГ-чувствительных депо

кофеин (2,5 мкМ) вызывал дополнительный рост [Ca2+]¡. При этом кофеин (в концентрации до 10 мкМ), примененный первым, никогда полностью не опустошал ТГ-чув-ствительное Са2+-депо, хотя последующий ответ на ТГ был снижен. Полное опустошение разных внутриклеточных депо осуществлялось с помощью применения Са2+-ионофора иономицина (1 мкМ).

Заключение. Таким образом, в лимфоцитах периферической крови у некоторых людей имеются, по крайней мере, два вида внутриклеточных Са2+-депо. ТГ- и кофеин-чувствительные Са2+-депо частично “пересекаются”. Наличие разных депо, возможно, необходимо для более тонкой регуляции уровня [Ca2+]¡ при последующей активации лимфоцитов.

ПОВЫШЕНИЕ РОСТОСТИМУЛИРУЮЩИХ свойств КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ФИБРОБЛАСТОВ ПОСЛЕ ЕЕ ОБЛУЧЕНИЯ IN VIVO (ТРАНСКУТАННО) ВИДИМЫМ И ИНФРАКРАСНЫМ ПОЛЯРИЗОВАННЫМ СВЕТОМ

Богачева О.Н.. Жеваго H.A., Самойлова К.А.

Институт цитологии РАН,

Санкт-Петербург, Россия

Установлено, что видимое и ИК излучение низкоинтенсивных лазеров обладает выраженным ранозаживляющим действием. При этом вызванные светом регенераторные процессы развиваются как в облученной ране, так и в необлученных поврежденных тканях того же пациента. Кроме того, заживление ран достигается и при облучении здоровых участков поверхности тела. Один из механизмов, с помощью которого локальное воздействие света влечет за собой развитие изменений системного характера, может быть связан с освобождением в кровоток ростовых факторов и цитокинов.

Цель и задачи: (1) Изучить влияние однократных и многократных (курсовых) облучений поверхности тела добровольцев полихроматическим видимым + И К поляризованным (ВИП) на способность плазмы крови стимулировать пролиферацию фибробластов (ФБ) человека в условиях in vitro. (2) Выяснить, не появляются ли в периферической крови облученных добровольцев ростовые факторы для ФБ - PDGF-AB и TGF-bl.

Материалы и методы: Облучали крестцовую область 32 добровольцев ВИП светом швейцарского фототерапев-тического аппарата “Bioptron” (400-3400 нм, 12 Дж/см2) и в разные сроки проводили забор крови для исследований. Контрольную группу составили необлученные лица (п=30), у которых только проводились гемоэксфузии в те же сроки и в том же объеме - 40 мл за 10 дней. Выделенную плазму (2,5 %) вносили в среду культивирования клеток, вместо ее стандартного компонента - эмбриональной телячьей сыворотки. Тестирование ростовых свойств (PC) крови проводили на клетках первичной культуры эмбриональных легочных ФБ человека. При определении содержания в сыворотке PDGF-AB и TGF-bl использовали метод твердофазного ИФА (тест-системы “R&D Systems”, США).

Основные результаты. Плазма крови, полученная через 0,5 ч после облучения добровольцев в 50% случаев обладала повышенной PC активностью, стимулируя пролиферацию ФБ, в среднем, на 14% (р<0,01). Повышенная PC активность крови сохранялась через сутки и после 4-9 ежедневных сеансов фототерапии (в 68-74 %, в среднем, на 10-16%), р<0,01. В параллельных опытах кровь тех же добро-

вольцев облучали in vitro и, моделируя события в сосудистом русле, когда небольшое количество транскутанно фо-томодифицированной крови взаимодействует с ее основным циркулирующим объемом, смешивали облученную и необлученную аутологичную кровь (1:10). Выяснилось, что в этих случаях происходило возрастание PC активности крови в той же степени и с той же частотой, что и in vivo. Таким образом, повышение PC потенций крови облученных добровольцев связана с воздействием света. Его эффекты носят выраженный регулирующий характер: возрастает только исходно сниженная PC активность, а повышенная снижается или не меняется. Тестирование свойств плазмы добровольцев контрольной группы показало, что сопутствующие нашим исследованиям эксфузии небольших объемов крови также способствуют возрастанию ее PC активности, причем частота и степень этого эффекта превосходили таковые в основной группе (у 60-85% волонтеров, в среднем, на 16-22%, р<0,01). При сочетанном воздействии света и гемоэксфузий эффект последней снижается.

Через 0,5 ч после облучения добровольцев в их крови изменяется содержание ростовых факторов. При исходно нормальном уровне PDGF-АВ регистрируется его повышение, в среднем, на 28% (р<0,05), а в случае превышающих норму значений - снижение на 21% (р<0,05). Возрастание содержания TGF-bl отмечается только в случае исходно пониженного уровня: в среднем, на 46 и 37%, через 0,5 ч и 24

ч, соответственно (р<0,05). В контрольной группе достоверные изменения этих ростовых факторов не выявлены.

Заключение. Таким образом, облучение поверхности тела человека полихроматическим видимым + ИК светом способствует повышению PC активности крови для ФБ и возрастанию уровня PDGF-AB и TGF-bl. Эти эффекты связаны с транскутанной фотомодификацией крови и носят выраженный регулирующий характер. Выяснение вопроса, появление каких ростовых факторов способствует повышению PC потенций крови при гемоэксфузиях - задача ближайших исследований.

ПРОДУКЦИЯ СУПРЕССОРНЫХ ФАКТОРОВ ФРАКЦИЯМИ NS КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА В ОТВЕТ НА ВОЗДЕЙСТВИЕ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА

Богданов А.Ю.. Беляев Н.Н., Саввулиди Ф.Г., Тлеулиева Р.Т.

Институт молекулярной биологии и биохимии им. МЛЛйтхожина, Алматы, Казахстан

В ряде работ показано, что онко-фетальный белок аль-фа-фетопротеин ( AFP) способен регулировать иммунный ответ. Так, AFP существенно подавляет цитотоксические Т-лимфоциты и натуральные киллеры (NK клетки) в реакциях против опухолевых клеток. Предполагают, что этот эффект частично связан с активацией естественных супрессорных (NS) клеток. Однако в настоящее время работы, напрямую показывающие эффект влияния AFP на NS клетки, отсутствуют. Целью нашего исследования явилось изучение влияния AFP на NS клетки костного мозга, а также природы секретируемых ими супрессорных факторов. Эксперименты проводили на трех изопик-нических фракциях NS клеток костного мозга с различными плавучими плотностями: р=1,080 (NS1 фракция), р=1,090 (NS2 фракция) и 1,10<р>1,09 г/мл (NS3 фракция), выделенных от мышей линии СВА. NS активность оценивали по влиянию секретируемых супрессорных факторов культуры клеток на пролиферацию клеток миело-

мы PAI в МТТ-тесте. Время инкубации AFP с фракциями составляло 3 ч. О влиянии опосредованного действия AFP на NK клетки судили по влиянию NS факторов на цитолитическую активность мононуклеарной фракции спленоцитов, лишенных макрофагов, в отношении клеток линии К-562, меченных 3Н-уридином. При этом анализировалась как спонтанная NK активность, так и модулированная супернатантами NS клеток, обработанных AFP. Время инкубации супернатантов с мононуклеарами составляло 12 ч. Оценивали также в супернатантах наличие TGF-ß по подавлению супрессорной активности с помощью поликлональных антител к TGF-ß. В ходе исследования мы установили, что все три фракции NS клеток отличаются друг от друга не только по плавучей плотности, но и по способности активироваться строго определенными индукторами. Так, NS1 клетки активировались только IL-2 или гистамином, и не реагировали на IL-3. NS2 клетки достоверно отвечали только на IL-3, a NS3 клетки - только на IL-2. При этом ни одна из полученных фракций не показывала спонтанной NS активности. Однако все три фракции NS клеток реагировали продукцией антипролиферативных факторов в ответ на AFP. Причем NS2 фракция оказалась достоверно более чувствительной к стимулирующему действию AFP, чем две другие. Супернатанты NS клеток всех фракций, индуцированных AFP и другими индукторами (интерлейкины и гистамин) оказывали ингибирующий эффект на NK активность моно-нуклеаров селезенки. Причем, корреляция между антипро-лиферативной активностью и NK-ингибирующей активностью достигала высокого уровня (г=0,89), что указывает на единую природу факторов, демонстрирующих эти эффекты. Наибольшую NK-ингибирующую активность показали супернатанты NS2 фракции естественных супрессоров. Анализ природы супрессорных факторов показал, что NS1 фракция под действием любых индукторов (AFP, IL-2, гистамин) секретировала исключительно TGF-ß. NS2 фракция под действием IL-3 также секретировала только TGF-ß, а под действием AFP как TGF-ß, так и иной супрессорный фактор отличный от TGF-ß. В продуктах NS3 фракции TGF-ß отсутствовал как в случае действия IL-2, так и при воздействии AFP. Таким образом, альфа-фетопротеин является сильным индуктором NS клеток, через посредство которых он может угнетать цитолитическую активность NK клеток, что позволяет рассматривать AFP не только как опухолевый маркер при некоторых видах рака, а также как существенное звено патогенеза опухолевого процесса.

ИНДУКЦИЯ ТЕЛОМЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ И ЭЛОНГАЦИЯ ТЕЛОМЕР ПЕПТИДОМ ЭПИТАЛОН В СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА

Бондарев И.Э.1. Бутюгов A.A.2, Смирнова Т.Д.4, Ряднова И.В. *, Слита A.B.4, Соколов Д.И.3, Сельков С. А.3, Анисимов В.Н.5, Назаров П.Г.2, Малинин В.В.*, Хавинсон В.Х.1

1 Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН;2ГУ Институт Экспериментальной медицины РАМН, отдел иммунологии,

3 НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта РАМН, СПб;4НИИ гриппа РАМН, СПб;5НИИ онкологии им H.H. Петрова РАМН, СПб

Введение. Пептид эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly) сконструирован и синтезирован на основе анализа амино-

кислотного состава комплексного пептидного препарата эпиталамина, выделенного из эпифиза мозга животных. Установлено, что эпиталон восстанавливает нарушенную нейроэндокринную регуляцию у старых обезьян, индуцирует активацию рибосомальных генов. Также обнаружено, что добавление этого тетрапептида в культуру лимфоцитов, выделенных от людей пожилого и старческого возраста, способствует деконденсации перицентрометрического гетерохроматина и активации генов, репрессированных вследствие зависимой от возраста конденсации эух-роматиновых регионов хромосом. Эпиталон способствует увеличению средней продолжительности жизни у мышей и крыс, снижает частоту хромосомных аберраций у ускоренно стареющих мышей SAM. Следует отметить, что эпиталон увеличивает среднюю и максимальную продолжительность жизни без развития злокачественных новообразований у этих животных.

Цель. Исследование влияния эпиталона на экспрессию каталитической субъединицы теломеразы, активность теломеразы и удлинение теломер в соматических клетках человека.

Материал и методы. Культура положительной по те-ломеразе клеточной линий HeLa и первичная культура человеческих фетальных легочных фибробластов 602/17 (24 недели) была получена из лаборатории клеточных культур НИИ гриппа РАМН. Клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота; 2 мМ L-глутамина; 100 мкг/мл гентамицина сульфата. Фетальные фибробласты, начиная с 27-го пассажа, обрабатывали эпиталоном в концентрации 0,05 мкг/мл в течение 4 суток и анализировали. Иммуногистохимическое окрашивание осуществляли пероксидазным ABC методом с мышиными моноклональными антителами к каталитической субъединице человеческой теломеразы NCL-hTERT (Novocastra Laboratories Ltd). Энзиматическую активность теломеразы определяли по протоколу амплификации теломерных повторов (TRAP). Среднюю длину теломер в индивидуальных клетках измеряли методом флюоресцентной гибридизации in situ с проточной цитофлюориметрией (flow-FISH) с использованием С3ТА2 пептидно-нуклеи-новой кислотной (ПНК) пробы, меченной ФИТЦ (PerSeptive Biosystems). Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программного обеспечения CellQuest и XnViewl.17. Достоверность различий между вариантами оценивали с помощью i-критерия Стъюдента.

Основные результаты и заключение. Иммуногистохимическое исследование показало интенсивное ядерное окрашивание клеток положительной по теломеразе линии HeLa, использованных в качестве положительного контроля, а также обработанных эпиталоном фетальных фибробластов. В интактных (контрольных) фетальных фибробластах подобного окрашивания не обнаружено. В интактных фетальных фибробластах также не обнаружено теломеразной активности, в то время как такая активность выявлена в клетках HeLa и фибробластах, обработанных эпиталоном. Флюоресцентная гибридизация in situ с проточной цитофлюориметрией продемонстрировала увеличение средней и максимальной длины теломер в фазе G1 клеточного цикла в фетальных фибробластах, обработанных эпиталоном, по сравнению с контрольными клетками. Средняя длина теломер в фазе G1 клеточного цикла в контроле составила 180 у.е. Добавление эпиталона привело к увеличению средней длины теломер до

240 у.е. (р<0,05). Результаты проведенного эксперимента показали, что эпиталон в соматических клетках человека может индуцировать экспрессию энзиматического компонента теломеразы, теломеразную активность и удлинение теломер, которое в среднем составило 33,3%. Таким образом, в нашем эксперименте впервые установлена индукция теломеразной активности пептидом. Эти данные в значительной мере способствуют пониманию геропро-текторных эффектов эпиталона в различных экспериментальных моделях. Известно, что критически короткие те-ломеры не способны предотвращать слияние хромосом, а это может приводить к активации протоонкогенов и ма-лигнизации клетки. Поэтому активация теломеразы и удлинение теломер под действием пептида может объяснять один из механизмов противоопухолевого действия эпиталона у старых животных.

ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ПАМЯТЬ НАТ-НЕЗАВИСИМЫЕ АНТИГЕНЫ 2-го ТИПА

Борисова Т.К.

Научно-исследовательский институт вирусных препаратов им.О.Г Анджапаридзе РАМН,

Москва, Россия

Механизмы генерации В клеток памяти (Вп) на белковые антигены (Т-зависимые антигены, ТЗ) достаточно хорошо изучены, чего нельзя сказать о Т-независимых антигенах 2-го типа (ТН-2). В последние годы признается, что при иммунизации ТН-2 антигенами возможно образование Bn-IgM типа, т.е. Вп, секретирующих IgM антитела. Некоторыми авторами отмечалось образование при вторичном иммунном ответе на ТН-2 антигены антител «переключенных» изотипов (IgGj, IgG2). Тем не менее, вопрос образования Вп, специфичных к ТН-2 антигенам, остается нерешенным. Неясно, способны ли ТН-2 антигены индуцировать образование Bn-IgG типа и какие клеточные популяции могут участвовать в этих процессах. Целью данной работы было изучение механизмов генерации Вп к ТН-2 антигенам и роли отдельных клеточных популяций в этом процессе. Для этого была разработана модельная система, основанная на сочетании индукции Вп на ТН-2 антиген (ДНФ-фиколл) in vitro (в культуре спленоцитов мыши) и «проявлении» памяти in vivo (у интактных мышей, получивших Вп из культур). О величине иммунного ответа судили, определяя число антителообразующих клеток (АОК) на 5-е сутки после иммунизации антигеном методом локального гемолиза в геле, изотип антител (АТ) определяли методом иммуно-ферментного анализа (ИФА). Для удаления из суспензии спленоцитов Т лимфоцитов клетки обрабатывали анти-Thy 1.2 антителами в присутствии комплемента морской свинки. Прилипающие клетки селезенки (ПКС) выделяли адгезией спленоцитов на пластике.

Через 1 месяц после переноса интактным мышам иммунных клеток наблюдалось увеличение иммунного ответа на ДНФ-фиколл примерно в 2 раза по сравнению с таковым у контрольных мышей. Аналогичные результаты были получены и при переносе мышам лишенных Т клеток спленоцитов (“В-спленоцитов”), иммунизированных in vitro. Усиление иммунного ответа на ДНФ-фиколл может быть обусловлено присутствием в организме мышей-реципиентов, индуцированных in vitro Вп. В пользу этого свидетельствует изотип анти-ДНФ АТ, выявляемых в сыворотке мышей-реципиентов. В сыво-

ротке мышей-реципиентов иммунных спленоцитов или «В-спленоцитов» при иммунном ответе на антиген выявлялись не только IgM-AT, но и IgG-AT всех изотипов, но с преобладанием IgG2 и IgGj-АТ. В контрольной группе мышей выявлялись только IgM-AT. Для выяснения роли отдельных клеточных популяций - В клеток и макрофагов в процессе формирования иммунного ответа на ДНФ-фиколл у мышей-реципиентов мышам переносили В-клетки и ПКС (макрофаги). У мышей-реципиентов иммунных В-клеток через 1 месяц после переноса клеток наблюдалось небольшое увеличение иммунного ответа (на 25%), а в сыворотке выявлялись не только IgM, но и IgG-AT, с преобладанием IgG2b и IgGj-АТ. Это может свидетельствовать о присутствии небольшого количества Bn-IgG типа, созревших из пула перенесенных примированных in vitro В клеток. У мышей-реципиентов ПКС через 1 месяц после переноса клеток наблюдалось увеличение иммунного ответа на антиген примерно на 70%, а в сыворотке мышей этой группы определялись помимо IgM-AT, IgG анти-ДНФ АТ, с преобладанием AT IgG, и IgG^-изотипов, что может свидетельствовать о формировании Bn-IgG. Таким образом, в нашей модельной системе клеточного переноса наблюдалось образование Вп, индуцированных в культуре спленоцитов, и Вп, индуцированных в популяции В клеток реципиента перенесенными ПКС. Полученные результаты позволяют заключить, что ТН-2 антигены способны индуцировать образование не только Bn-IgM типа, но и Bn-IgG типа. Показано, что индукция Вп на ТН-2 антигены не зависит от специфической помощи Т клеток, но требует присутствия макрофагов, тогда как при “созревании” Вп в Bn-IgG типа необходимо участие клеток микроокружения или их факторов.

ВЛИЯНИЕ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 НА ВЫЗВАННЫЙ IN VITRO ЦИТОСТАТИ KAM И АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ ЗДОРОВЫХ И ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

Вашкевич Е.П.. Савицкий В.П., Белевцев М.В., Исмаил-заде P.C., Потапнев М.П.

Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии, Минск, Беларусь

Интерлейкин-2 (IL-2) обладает множеством иммунобиологических эффектов, определяющих его противоопухолевую активность у онкологических больных. В настоящем сообщении нами оценено действие цитокина на апоптоз лимфоцитов (мононуклеарных клеток периферической крови, МПК) in vitro при воздействии концентраций лекарственных препаратов (цитостатиков), используемых для терапии онкологических заболеваний.

Объектом исследования являлись МПК, полученные от 8 детей, больных солидными опухолями (саркома Юинга, рабдомиосаркома и др.), а также 16 здоровых людей (доноров крови) и опухолевые клеточные линии Raji, К 562, HeLa. Клетки культивировали в течение 1-2 суток в питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки без или в присутствии цитостатиков (вепезид 16, карбоплатин, 5-фторурацил), а также IL-2 (Биотех).

Проведенные исследования показали, что в большинстве случаев IL-2 (в концентрациях 10-100 ЕД/мл) обладает достоверным протективным действием на апоптоз МПК здоровых людей, а также больных, вызванный in vitro вепезидом 16 (в концентрациях (50-250 мкг/мл).При

этом CD3" (не-Т) клетки были более чувствительны к лекарственно-индуцированному апоптозу по сравнению с CD3+ Т клетками. IL-2 в исследуемых концентрациях (10,100 ЕД/мл) практически не оказывал никакого влияния на уровень апоптоза исследованных опухолевых клеточных линий, которые были более чувствительны к токсическому действию цитостатиков по сравнению с МПК.

При совместном культивировании клетки HeLa оказывали проапоптотическое действие на МПК здоровых людей, которое достоверно снижалось в присутствии IL-

2 (10-100 ЕД/мл). В то же время при совместном воздействии цитостатиков (карбоплатин, фторурацила) и клеток HeLa антиапоптотическое действие IL-2 на МПК здоровых людей было менее выражено.

На основании проведенных исследований сделано предварительное заключение о том, что интерлейкин-2 оказывает выраженное антиапоптотическое действие in vitro на МПК здоровых людей и детей с онкологическими заболеваниями при действии на них цитостатических лекарственных препаратов или опухолевых клеток. Действие интерлейкина-2 на МПК при совместном действии цитостатиков и опухолевых клеток менее выражено и требует дальнейшего изучения.

СОВМЕСТНОЕ ДЕЙСТВИЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО ИЗЛУЧЕНИЯ И ИОНОВ РТУТИ НА РЕАКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА

Винокуров М.Г.. Беляева Т.В., Юринская М.М., Сусликов A.B.*, Печатников В. А.

Институт биофизики клетки РАН,

* Больница Пущинского научного центра,

Пущино Московской области, Россия

В последние десятилетия значительно возросло количество заболеваний, вызванных рядом экологически вредных факторов, связанных с деятельностью человека. Наблюдается стремительное ослабление врожденного иммунитета, отягощается протекание заболеваний. В связи с этим особое значение приобретает изучение действия различных патогенных факторов, в частности, соединений тяжелых металлов, на организм человека и его иммунную систему. Действие тяжелых металлов на нейтрофилы - фагоцитарные клетки, ответственные за врожденный иммунитет, - вызывает особый интерес.

УФ облучение крови (УФОК) является одним из методов лечения различных заболеваний: сердечно-сосуди-стых, гнойно-септических и др. В медицинских целях используют УФ диапазона С (УФС) с длиной волны 254 нм, однако молекулярные механизмы его действия практически не выяснены.

Ранее нами показано, что УФС является индуктором апоптоза нейтрофилов. HgCl2 в концентрации 10 мкМ полностью ингибирует УФС-зависимый апоптоз нейтрофилов, не оказывая существенного влияния на спонтанный апоптоз клеток. В настоящей работе проведено изучение совместного действия HgCl2 и УФС на основные функциональные свойства нейтрофилов: адгезию, поглощение (фагоцитоз) и генерацию активных форм кислорода (АФК).

Нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров на двухступенчатом градиенте фи-колла. Ультрафиолетовое облучение клеток проводили в фосфатном буфере (pH 7,4) при комнатной темпера-

туре на медицинском аппарате “Изольда” МД-73М. Доза УФС облучения нейтрофилов варьировала от 0 до 600 Дж/м2. Концентрация облучаемых нейтрофилов 1х107кл/мл. Фагоцитоз проводили в среде Hanks (“Sigma”)/RPMI 1640 (“Serva”), с содержанием 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (“Sigma”), 1% L-глутамина, 1% пенициллина и 1% стрептомицина (“Sigma”). Объект фагоцитоза- FITC-меченые пекарские дрожжи. Адгезионные свойства нейтрофилов регистрировали по их способности адгезироваться на культуральный пластик в течение 1 ч при 37°С. Оксидант-ную активность нейтрофилов измеряли методом лю-минол - зависимой FMLP-индуцированной хемилюми-несценции.

Показано, что при малых концентрациях HgCl2 (1-3 мкМ) фагоцитоз нейтрофилов остается практически неизменным. При концентрациях 5-10 мкМ HgCl2 процент фагоцитирующих клеток уменьшается на 20-30%. Нами показано, У ФС в диапазоне доз от 0 до 600 Дж/м2 активирует фагоцитоз нейтрофилов. Предварительная 7-минутная инкубация нейтрофилов с 10 мкМ HgCl2 полностью ингибирует этот эффект.

Спонтанная адгезия нейтрофилов на пластик в присутствии 10 мкМ HgCl2 снижается в среднем на 20%. Увеличение адгезии нейтрофилов при действии УФС практически полностью ингибируется ионами ртути.

УФС в диапазоне доз от 0 до 600 Дж/м2 не оказывает существенного влияния на респираторный взрыв нейтрофилов. Увеличение концентрации HgCl2 от 0,5 до 5 мкМ вызывало дозозависимое ингибирование респираторного взрыва нейтрофилов.

Таким образом, показано, что ионы ртути ингибируют УФС-зависимое увеличение адгезии и фагоцитоза нейтрофилов человека.

Работа выполнена при финансовой поддержке фонда “Университеты России. Фундаментальные исследования”, грант № УР.07.01.040.

ВЛИЯНИЕАНТИОВАРИАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ И БЛОКАТОРОВ NO-СИНТАЗ НА КУМУЛЮСНО-ООЦИТАРНЫЕ КЛЕТОЧНЫЕ КОМПЛЕКСЫ У МЫШЕЙ

Вознесенская Т.Ю.

Институт физиологии имЛЛ.Богомольца НАН Украины, г.Киев

Опережая овуляцию, в ответ на преовуляторное возрастание гонадотропинов, возобновляется мейоз ооцитов. Возобновление мейоза, определяемое по растворению зародышевого пузырька, и созревание ооцитов характеризуют прохождения диктиотенны хромосом через мейоти-ческий цикл, а формирование первого полярного тельца и достижение ооцитами метафазы II контролируются несколькими категориями молекул. Это такие внутриклеточные месенджеры как цАМФ, кальмодулин, кальций и диацетилглицерол, а также пептиды, стероиды, пурины. Регулирование развития ооцитов млекопитающих и процесс их мейотичного созревания активно изучают. Роль гормонов и ростовых факторов, которые руководят этими процессами, сложная, в особенности принимая во внимание влияние фолликулярного окружения ооцита в яичнике.

На сегодня уже есть весомые доказательства того, что N0 является одним из важных интраовариальных меди-

аторов. N0, как было показано, влияет на овуляцию, сте-роидогенез и апоптическую гибель фолликулярных клеток. Роль N0 в мейотическом созревании овариальных ооцитов изучен недостаточно. Широко распостраненная в человеческой популяции иммунологическая неполноценность людей и сложная экологическая обстановка, отмечаемая в настоящее время, в условиях которой человек нередко подвергается одновременному воздействию нескольких токсических факторов различной природы, включая эндогенные мутагенные метаболиты, создают потенциально провокационный фон для проявления токсических свойств лекарственных препаратов.

Целью этого исследования стало изучение влияние антиовариальных антител (АОАТ) и неспецифического фармакологического блокатора предшественника NO, NOS: ДГс-нитро-1-аргинина метиловый эфир (L-NAME), который угнетает все изоформы NOS, на способность ооцитов в составе кумулюсно-ооцитарных клеточных комплексов осуществлять мейотическое созревание in vitro.

24 ч после введения АОАТ осуществляли забор яичников у экспериментальных и контрольных животных. Трехкратное введение АОАТ в дозе 0,02 мг/кг вызывало уменьшение: количества ооцитов, которые выделяли из одного яичника (р<0,01 ); процентного соотношения ооцитов, возобновлявших мейоз in vitro (р<0,01) и таких, которые формировали первое полярное тельце (р<0,01), после 20 ч культивирования. Следовательно, имеет место угнетающее влияние АОАТ на гаметогенез.

Кумулюсно-ооцитарные клеточные комплексы (КОКК) экспериментальных животных культивировали 5 ч и 20 ч в среде с L-NAME. После периода культивирования кумулюсные клетки удалялись и ооциты подсчитывались как такие, что находились на стадии метафазы

II (МИ), метафазы I (MI) или же атипичные морфологически (дегенеративные). Присутствие в среде L-NAME в дозах 0,12 ммоль/л и 0,24 ммоль/л достоверно увеличивало количество ооцитов из КОКК, возобновивших мей-

оз 20,5±2,1 % (р<0,05) и 22,0±1,4 % (р<0,01), соответственно, от самок мышей СВА, которые поддавались влиянию АОАТ, в сравнении с 12,5± 1,4 % ооцитов из КОКК от самок СВА, которые поддавались влиянию АОАТ, но созревавших при отсутствии блокатора NOS в среде культивирования. L-NAME в дозе 0,24 ммоль/л увеличивал количество ооцитов на стадии МП - 40,5±2,0 % (р<0,05), в сравнении с 32,4± 1,8 % при отсутствии блокатора NOS в среде культивирования.

Оценивали также процент ооцитов из КОКК, в которых возобновлялся мейоз в среде с L-NAME (0,02, 0,12 и 0,24 ммоль/л). Созревание таких ооцитов (от ин-тактных самок СВА), которые поддавались влиянию L-NAME in vitro отображалось в меньшем проценте ооцитов на стадии MI (27,5±3,0 (р<0,05) и 25,0+1,4 (р<0,01), при L-NAME: 0,12 и 0,24 ммоль/л, соответственно) и в меньшем проценте ооцитов на стадии MII (52,5±1,4 % (р<0,01), 50,0±0,8 % (р<0,01) и 47,5±3,0 % (р<0,01 )) и атипичных, в сравнении с таким при контрольных условиях (отсутствие блокатора NOS в среде культивирования) 40,0±2,5 % (MI) и 90,0±2,5 % (МП), соответственно.

Результаты показывают, что N0 есть ключевым модулятором ооцитарного развития in vitro. Блокатор NOS уменьшает повреждающее действие на ооциты АОАТ, которые вводили экспериментальным животным.

УЧАСТИЕ Р-ЭНДОРФИНА И СЕЛЕКГИВНЫХЛИГАНДОВ 5-, ц-ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ INVFTRO

ГейнС.В.. Симоненко Т.А.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермский государственный университет, Пермь, Россия

В настоящее время доказана важная роль опиатных рецепторов, их естественных и синтетических лигандов в регуляции функций иммунной системы, однако литературные данные, касающиеся этого вопроса, весьма неоднозначны. В частности, недостаточно освещен вопрос об участии того или иного типа рецепторов в проведении сигнала Р-эндорфина, неселективного лиганда 5,ц,е-опиатных рецепторов, а также практически неисследованными остаются иммуномодулирующие свойства пептидных агонистов ц-рецепторов.

Цель работы - изучение влияния Р-эндорфина и селективных лигандов 5,ц-опиатных рецепторов DADLE и DAGO на пролиферативную активность лимфоцитов, индуцированную ФГА.

Материалы и методы. Лейкоциты периферической крови здоровых мужчин-добровольцев в возрасте от 22 до 30 лет культивировали с различными концентрациями ФГА (200,100, 50, 25, 12,5 мкг/мл) в 96-луночных планшетах на среде 199 с добавлением 10 mM HEPES, 2 тМ L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 10% аутоплазмы в течение 72 часов. За 18 часов до окончания культивирования в каждую лунку вносили по 2 мкКи 3Н-метил-тимидина. Радиоактивность проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике, p-эндорфин, DAGO и DADLE вносили в культуры сразу с момента их постановки в конечных концентрациях от 10'7 до 10‘12 М.

Основные результаты. Установлено, что эффекты исследуемых опиоидных пептидов зависели как от их собственной концентрации, так и от концентрации митогена в культуральной среде. Р-эндорфин в широком диапазоне концентраций усиливал пролиферативную активность лимфоцитов в культурах с субоптимальными и оптимальными концентрациями ФГА. Синтетический лиганд ц-опиатных рецепторов DAGO (10'7-10_12М) стимулировал пролиферативный ответ только в культурах с субоптимальной концентрацией митогена. Агонист 5-рецепторов DADLE оказывал разнонаправленный эффект на реакцию бласттранс-формации, стимулируя ее в высоких концентрациях в присутствии гипероптимальной, оптимальной и субоптимальной доз ФГА, и угнетая в низкой концентрации (10'ИМ) ответ на гипероптимальную концентрацию ФГА.

Заключение. Таким образом, опиоидные пептиды оказывают преимущественно стимулирующее влияние на пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови in vitro.

ВЛИЯНИЕ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА НА ФОРМИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНООПОСРЕДОВАННЫХ И ГУМОРАЛЬНЫХ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ В ПЕРИОД АНТИГЕННЕЗАВИСИМОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ИММУНОКОМПЕГЕНТНЫХ КЛЕТОК

Горбунова О.Л. Ширшев С.В., Бахметьев Б.А.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Хорионический гонадотропин (ХГ) - один из наиболее важных гормонов, который продуцируется плацен-

той и протектирует развитие беременности. ХГ способен наряду с регуляцией стероидогенеза плаценты и плода модулировать иммунные реакции. Установлено, что некоторые эффекты ХГ могут перекрываться действием половых стероидных гормонов. Учитывая, что на протяжении всего гестационного периода гормон присутствует в организме не только беременной женщины, но и плода, важно знать, какое влияние он оказывает на процессы созревания иммунокомпетентных клеток, происходящих, как правило, на антигеннезависимом этапе дифференци-ровки. Известно, что в период беременности происходит смещение типа иммунного ответа с клеточноопосредованного (ТЫ) в сторону гуморального (Th2), поскольку Thl ответ может привести к спонтанному аборту.

Целью работы явилось изучение влияния ХГ на формирование антителообразующих клеток (АОК) и реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в период антигеннезависимого этапа становления иммунного ответа.

Материалы и методы. Опыты проведены на половозрелых мышах-самках породы Swiss массой 20-22 г. Контрольной группе животных инъецировали растворитель гормона. Для изучения влияния ХГ на антигеннезависи-мый этап иммунного ответа двум экспериментальным группам гормон вводили подкожно через день в течение 5 суток до иммунизации. ХГ инъецировали в 2-х дозах, экстраполированных со средних концентраций гормона в сыворотке крови беременных женщин в I и II-III триместры, которые составили 200 и 20 МЕ/мышь соответственно в течение 5 суток до иммунизации. Эксперимент проводили в 3-х вариантах. В первом изучали только гуморальный иммунный ответ по количеству АОК в селезенке методом прямого локального гемолиза в геле агарозы по Ерне. Для этого на 5-е сутки от начала введения ХГ мышей иммунизировали внутрибрюшинно эритроцитами барана (ЭБ) 108 клеток. Во втором случае исследовали влияние ХГ на клеточноопосредованные иммунные реакции. Для этого мышей 2-кратно иммунизировали ЭБ 108и 5• 107 под апоневроз стопы на 5-е и 9-е дни эксперимента соответственно. Через сутки оценивали реакцию ГЗТ, измеряя величину отека стопы в сравнении с интак-тной стопой. Разница в толщине характеризовала выраженность реакции ГЗТ. В третьем варианте эксперимента гуморальные и клеточные реакции оценивались одномоментно. На фоне введения гормона проводили внутри-брюшинную иммунизацию (108 ЭБ), а через 4 дня инициировали ГЗТ (5* 107 ЭБ под апоневроз стопы). Спустя 24 часа регистрировали выраженность реакции ГЗТ и численность АОК в селезенке.

Основные результаты. При исследовании действия гормона на формирование гуморального иммунного ответа в период антигеннезависимой дифференцировки иммунокомпетентных клеток установлено, что ХГ вне зависимости от дозы статистически значимо увеличивал число АОК в селезенке.

При индукции клеточноопосредованных иммунных реакций инъекции гормона дозозависимо усиливали реакцию ГЗТ, причем наибольшим эффектом обладала высокая доза гормона (20 МЕ/мышь).

Введение хориогонина при одновременной стимуляции гуморальных и клеточных реакций на антигеннезависимом этапе приводило к угнетающему дозозависимому эффекту гормона на образование АОК и параллельно дозозависимо стимулировало реакцию ГЗТ. Корреляционный анализ выявил отрицательную связь между чис-

ленностью АОК и выраженностью реакции ГЗТ (т=-0,7671,р<0,02). Учитывая, что в контрольной группе не обнаружена достоверная корреляция, можно говорить о реципрокном действии гормона на формирование гуморальных и клеточноопосредованных реакций.

Заключение. Таким образом, ХГ активирует прекурсоры эффекторных клеток ТЬО до этапа их поляризации в ТЫ или ТЬ2, что в равной степени усиливает как гуморальный, так и клеточноопосредованный иммунный ответ. В условиях одновременной индукции гуморального и клеточноопосредованного ответов тип иммунного реагирования смещается в сторону провоспа-лительных реакций, что, по-видимому, связано с пока еще не изученными эффектами гормона на механизмы, устанавливающие поляризацию ТЬО в ТЫ. Учитывая, что ХГ активирует стероидогенез, представленные выше данные отражают не только самостоятельное действие гормона, но и его совместное действие с половыми стероидами.

ОЦЕНКА НАТУРАЛЬНОГО КИЛЛИНГА В МОДЕЛИ УСИЛЕНИЯ ЭКСПРЕСИИ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ

Гресько Н.П., Власкин П.А., Коваленко Е.И.

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчиннникова РАН, Москва, Россия

Натуральные киллеры, или NK-клетки, выполняют важную регуляторную функцию в реакциях врожденного и приобретенного иммунитета. Они способны распознавать и уничтожать в организме аномальные клетки, в том числе вирус-инфицированные и опухолевые. Существует предположение, что роль маркеров поврежденных клеток, распознаваемых натуральными киллерами, могут выполнять белки теплового шока (БТШ), представленные на клеточной поверхности. Ранее нами было показано, что суточная инкубация клеток линии К562, стандартных мишеней натуральных киллеров в системах in vitro в присутствии низких доз ингибитора внутриклеточного транспорта моненсина приводила к общему увеличению уровня поверхностной экспрессии БТШ70. Данная модель усиления экспрессии белков теплового шока на клеточной поверхности с использованием моненсина была применена для оценки влияния БТШ70 на цитолитическую функцию NK-клеток человека. Клетки К562 предварительно инкубировали в присутствии 0,1 мкг/мл моненсина в течение 24 часов и затем использовали в цитотоксическом тесте в качестве мишеней. При этом, обработка клеток моненсином в использованной концентрации не приводила к изменению клеточной морфологии и жизнеспособности. Источником NK-клеток служили свежевыделенные мононуклеа-ры периферической крови здорового донора. Цитотоксичность оценивали с использованием нерадиоактивного метода, в ходе которого фотометрически регистрировали уровень лактатдегидрогеназы, вышедшей из разрушенных клеток-мишеней. В соответствии с полученными данными, обработка клеток К562 моненсином приводила к значительному увеличению опосредованной NK-клетками цитотоксичности. Таким образом, получены предварительные результаты, которые свидетельствуют в пользу того, что экспрессия БТШ70 на по-

верхности клеток-мишеней способствует распознаванию и лизису этих клеток натуральными киллерами.

Исследования проводятся при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 01-04-48693).

ВЛИЯНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА НА КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ СОСТАВ И ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ КРЫС

Груздева Е.А.. Шилов Ю.И.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Ранее при исследовании влияния тестостерона и других андрогенов в системе in vivo на показатели клиренса корпускулярных и коллоидных частиц не было выявлено значительных изменений суммарной поглотительной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов и прежде всего клеток Купфера печени и макрофагов селезенки [Bilbey, Nicol, 1958; Juhlin, Miquel, 1961; Nicol et al„ 1965; 1967]. Однако существует вероятность, что эти гормоны могут оказывать влияние на функции других фагоцитирующих клеток, таких как нейтрофилы, эози-нофилы и моноциты крови, и наряду с эстрогенами вносить существенный вклад в половые различия, наблюдаемые как у лабораторных животных, так и у человека. В частности, известно, что фагоцитарная активность лейкоцитов периферической крови у мужчин ниже, чем у женщин [Шилов и др., 1998]. Цель работы - исследование влияния тестостерона на количественный состав и фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови крыс.

Материалы и методы. Эксперимент выполнен на кры-сах-самцах популяции Wistar массой 235±11 г. Офици-нальный препарат тестостерона пропионата вводили однократно в дозе 2 мг/крысу подкожно. Образцы периферической крови получали из сосудов хвоста до начала эксперимента (исходный фон), через 6,24 и 48ч от момента введения тестостерона. Проводили оценку количественного состава лейкоцитов периферической крови, их поглотительной активности по отношению к формалини-зированным эритроцитам барана и суммарной кислородозависимой микробицидности в спектрофотометрическом варианте НСТ-теста.

Основные результаты. Введение тестостерона приводило к снижению общего количества лейкоцитов и абсолютного числа лимфоцитов через 6 и 24 ч после введения гормона (см. таблицу). Через 48ч оба показателя не отличались от исходного уровня. Наряду со снижением числа лимфоцитов в условиях однократного введения тестостерона выявлены изменения количества и других клеток периферической крови. Через 6 ч после инъекции гормона снижалось абсолютное число

моноцитов и эозинофилов. Уменьшение числа эозино-филов было кратковременным, через 24 ч абсолютное количество этих клеток восстанавливалось до исходного уровня, а через 48 ч достоверно превышало его. Снижение количества моноцитов было более продолжительным и регистрировалось в течение 24 ч от начала эксперимента. Абсолютное число нейтрофилов не изменялось на фоне гормонального воздействия. При оценке фагоцитарной активности нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов в условиях однократного введения тестостерона выявлено снижение абсолютных показателей фагоцитарной активности (абс. числа участвующих в фагоцитозе клеток и абс. количества захваченных данным типом фагоцитов объектов фагоцитоза) нейтрофилов (р<0,05 через 24 ч) и моноцитов (р<0,05 через 6 и 24 ч) при отсутствии каких-либо значительных изменений относительных показателей (процента фагоцитоза и фагоцитарного числа). Эозинофильный фагоцитоз угнетался не только по абсолютным (р<0,05 через 6 ч), но и по относительным показателям (р<0,05 через 48 ч). Соответственно абсолютные показатели общего лейкоцитарного фагоцитоза также достоверно снижались через 24 ч, а на 2-е сутки возвращались к исходному уровню. Абсолютные показатели спонтанного варианта НСТ-теста под действием тестостерона, напротив, повышались.

Заключение. Введение тестостерона приводит к выраженному угнетению фагоцитарной активности нейтрофилов, моноцитов и эозинофилов по абсолютным параметрам, что частично может быть обусловлено снижением их количества в периферической крови.

СРАВНЕНИЕ ФЕНОТИПА И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА, ПОЛУЧЕННЫХ ПРИ ОБЫЧНОМ И “УСКОРЕННОМ”

МЕТОДЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ГукасоваН.В. Москалева Е.Ю., Родина А.В., Луценко С.В., Беляев Д.Л., БабаянцА.А., Кузнецова С.Ю., Северин С.Е., Северин Е.С.

Всероссийский центр молекулярной диагностики и лечения, г. Москва; НИИ молекулярной медицины ММ А им.И.М. Сеченова; Центр медико-биологических и экологических проблем, г. Москва

Дендритные клетки (ДК) являются уникальными антигенпредставляющими клетками, играющими ключевую роль в иммунной защите организма, в том числе и в развитии противоопухолевого иммунитета. В настоящее время основным источником для создания противоопухолевых вакцин с использованием ДК являются ДК, полученные из моноцитов периферической крови по стандартной методике, которая включает стадию

Табл. ИЗМЕНЕНИЯ КОЛ ИЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА Л ЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ КРЫС ПРИ ВВЕДЕНИИ ТЕСТОСТЕРОНА

Срок наблюдения Абс. число лимфоцитов Абс. число нейтрофилов Абс. число моноцитов Абс. число эозинофилов

Исходный фон 6ч 24 ч 48 ч 14398,4+1463,0 9866,7±1657,8*# 11040,011123,2*# 15282,4±1544,8 4381,61967,6 3376,91614,2 3789,6+665,1 4565,71453,9 451,5187,2 276,4155,7*# 265,5166,3*# 407,51109,6 623.6176.6 332,8145,4*# 648.11106.6 1043,31203,3#

Примечание. Все показатели приведены на 1 мм3 крови. * - р<0,05 в сравнении с исходным фоном по парному ¿-критерию Стьюдента, # - то же по парному знаковому Т-критерию Вилкоксона.

дифференцировки моноцитов в незрелые ДК (5-7 дней) и стадию индукции созревания и активации ДК, необходимую для получения зрелых функционально активных ДК (1-2 дня). На втором этапе культивирования в среду вносят цитокиновые “коктейли”, включающие провоспалительные медиаторы (ТЫР-а, 1Ь-1(3), компоненты стенки микроорганизмов (липополисахариды -ЛПС), а также среду, кондиционированную моноцитами (СКМ), под действием которых происходит образование зрелых ДК (С014‘, СБ83+), экспрессирующих большое количество молекул МНС I и II классов, молекул адгезии (СБ54, С058) и костимуляции (СЭвО, СБ86). Кроме стандартного метода получения ДК из моноцитов, занимающего 8-9 суток, в ряде работ предлагаются более короткие методики приготовления зрелых ДК с использованием 1РЫа или стандартным набором лимфокинов. Целью данной работы явилась сравнительная характеристика ДК, приготовленных из фракции моноцитов периферической крови человека по стандартному (ДКстанд) и “ускоренному” (ДКускор) методам приготовления ДК.

Для получения ДКстанд моноциты культивировали до дня "1" в полной культуральной среде (ПКС), а затем в ПКС, содержащей ГМ-КСФ (800 ед/мл) и 1Ь-4 (1000 ед/мл). Цитокины добавляли повторно в день "3" и”5". В день "6" добавляли стимуляторы индукции созревания ДК (50 нг/мл ТОТ-ос, 100 ед/мл "Лейкин-ферона", 50 нг/мл ЛПС) и на день "8" ДК собирали, и исследовали их фенотип. Лейкинферон представляет собой комплекс цитокинов первой фазы иммунного ответа и включает ШЫа, 1Ь-1, 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ь-12, ТОТа, МИФ и ЛИФ. Поэтому этот препарат использовали для индукции созревания ДК вместо СКМ. Часть ДКстанд замораживали для последующего исследования их антигенпредставляющей способности. ДКускор получали путем замены среды на ПКС, содержащую ГМ-КСФ (800 ед/мл) и 1Ь-4 (1000 ед/мл) в первый день культивирования и внесения тех же факторов для индукции созревания ДК на второй день. На следующий день клетки собирали, исследовали их фенотип, а часть также замораживали. ДКстанд и ДКускор одновременно размораживали и исследовали их антигенпредставля-ющую способность, которую оценивали по уровню индукции пролиферации аллогенных Т-лимфоцитов в смешанной культуре.

При фазово-контрастной микроскопии ДКстанд и ДКускор имели округлую форму и многочисленные цитоплазматические выросты. Однако ДКстанд были более крупными. На 3 сутки культивирования ДКускор на поверхности клеток еще наблюдается экспрессия маркера моноцитов СБ14, отмечается повышенная экспрессия молекул НЬЛ-ЭЯ и невысокий уровень экспрессии СБ80, СБ86. ДКстанд, полученные на 8 сутки культивирования, характеризовались отсутствием экспрессии СБ14, сохранением высокого уровня экспрессии НЬА-БК, а также повышением в 6-7 раз по сравнению с ДК^скор экспрессии молекул костимуляции, СБ80 и СЕ>86 ДКстанд обладали более высокой стимулирующей активностью по сравнению с ДКускор при всех соотношениях ДК:аллогенные Т-лимфоци-ты. Таким образом, ДКуСКОр являются, по-видимому, промежуточной формой при созревании ДК. Так как хотя они характеризуются морфологией, соответствующей зрелым ДК, и имеют высокий уровень экспрессии моле-кул МНС II класса, но еще содержат С014

маркер моноцитов и характеризуются промежуточным уровнем экспрессии CD80/CD86, а также более низкой, чем зрелые ДК, способностью стимулировать ал-логенные Т-лимфоциты.

ФЕНОМЕН ИНТЕРНАЛИЗАЦИИ ЭКЗОГЕННЫХ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА70 КДАЛИМФОИДНЫМИ КЛЕТКАМИ

Гусарова Г.А.. Тарасенко Т.Н., Пономарёв А.Д., Мурашко Д. А., Сапожников А.М.

Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина и ЮЛ.Овчинникова РАН,

Москва, Россия

В настоящее время известно, что локализация белков теплового шока (БТШ) не ограничивается внутриклеточным пространством. Они могут также экспонироваться на клеточной поверхности и присутствовать в растворимом виде в межклеточной среде. В последние годы у БТШ, в частности у основных представителей этого семейства, обладающих молекулярной массой 70 кДа (БТШ70), были обнаружены уникальные иммуностимулирующие свойства. Один из механизмов такого влияния БТШ70 на иммунные реакции обусловлен их взаимодействием с рецепторами антигенпредставляющих клеток, сопровожда-имся последующим эндоцитозом этих протеинов и активацией данного звена иммунной системы. Учитывая важную роль БТШ70 в функционировании всех типов клеток, мы предположили, что указанный иммуностимулирующий эффект внеклеточных БТШ70 может быть также связан с их возможной интернализацией лимфоидными клетками, приводящей к модуляции процессов активации и программированной гибели в популяции этих клеток.

С целью проверки предположения о возможности поглощения БТШ70 лимфоидными клетками мы провели анализ взаимодействия рекомбинантных биотинилиро-ванных БТШ70 с клетками линий CTLL-2, EL-4, а также с тимоцитами и спленоцитами мыши. Экзогенные БТШ70, связавшиеся с клеточной поверхностью или проникшие во внутриклеточное пространство, регистрировали с помощью метода проточной цитофлуориметрии с использованием для выявления биотинилированных БТШ70 конъюгата стрептавидин-FITC.

В результате было установлено, что экзогенные БТШ70 прочно адсорбируются на поверхности плазматических мембран всех типов исследуемых клеток и быстро (в течение 15 - 30 минут) проникают в их внутриклеточное пространство, вероятно, вследствие процесса эндоцитоза. Активность связывания и поглощения клетками экзогенных БТШ70 убывала в ряду EL-4 > спленоциты > тимоциты > CTLL-2. Интернализация БТШ70 приводила к увеличению сопротивляемости клеток индукторам апоптоза. В частности, дексаметазон-индуцированная программированная гибель тимоцитов снижалась в результате их предин-кубации с разными дозами БТШ70 на 50-75%.

Таким образом, экзогенные БТШ70 взаимодействуют с поверхностью лимфоидных клеток, интернали-зуются этими клетками и модулируют протекание внутриклеточных процессов, в частности, процесса апоптоза. Это свидетельствует в пользу нашего предположения о существенной роли данного взаимодействия в механизмах иммуностимулирующих эффектов внеклеточных БТШ70.

ИЗУЧЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРНЫХ КЛЕТОК МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ДНК-ЦИТОМЕГРИИ

Дмитриева И.Б.. Бычкова Н. В., Калинина Н.М.

Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины МЧС РФ, Санкт-Петербург, Россия

Цитотоксическая активность естественных киллер-ных клеток является одним из важных показателей естественной резистентности организма. Известно, что естественные киллеры являются первой линией защиты организма от генетически измененных клеток, подвергшихся опухолевой трансформации либо пораженных вирусом.

Целью исследования являлась разработка методики изучения цитотоксической активности естественных кил-лерных клеток.

В качестве клеток-мишеней была использована линия К-562 с модальным числом хромосом 64. Для изучения цитотоксической активности клетки культуры и выделенные мононуклеары периферической крови доводили полной культуральной средой до концентрации 1 х 106 кл/мл и 10x10 кл/мл соответственно. Жизнеспособность используемых клеток составляла 97-98%. Клетки-эффекторы и клетки-мишени ресуспендировали в полной культуральной среде и инкубировали в течение

4 часов при 37°. Часть пробы, оставленную перед началом инкубации, использовали для получения исходной ДНК-гистограммы. Перед окрашиванием каждой пробы концентрацию клеток доводили до 1х10б кл/мл раствором Версена. Полученную взвесь окрашивали 1% раствором бромистого этидия с добавлением 1% раствора РНК-азы (Sigma). Распределение клеток культуры К-562 по фазам клеточного цикла на второй день после их пересева, оцененное методом проточной ДНК-цитомет-рии, было следующим: 48,9± 10,9,42,0±8,9 и 10,1 ±7,1 % в Gj/G0, S и G2 фазах цикла соответственно. Данные гистограммы позволяли определить уровень жизнеспособности клеток К-562, что и являлось контролем в каждом исследовании. Уровень детрита во всех случаях не превышал 5%. Анализ проб проводили на проточном цитометре EPICS XL (Beckman-Culter). ДНК-гистограммы анализировали в программе MultiCycle AV ver. 3

(Вескшап-Сикег). В каждой пробе оценивали 50 тысяч событий. В исходной пробе 95% событий приходились на клеточный цикл лимфоцитов, а 5% - на клетки культуры, что соответствует соотношению 20:1. В результате оценки ДНК-гистограммы исходной пробы клеточной суспензии были выявлены два отдельных клеточных цикла с модальными значениями различающимися в 1,47 раза. Первый пик соответствовал 65 лимфоцитов с модальным числом хромосом 46, а второй пик С1 соответствовал клеткам К-562 с модальным числом хромосом 64. Анализ ДНК-гистограммы клеточной суспензии после 4-часовой инкубации также позволял выявить два отдельных клеточных цикла, но по сравнению с исходной пробой было обнаружено снижение количества клеток-мишеней. Величиной цитотоксической активности являлось содержание клеток К-562 во второй пробе, соотнесенное с таковым до инкубации, выраженное в процентах.

Цитотоксическая активность естественных киллеров была определена у 10 доноров двумя методами: нерадиометрическим и вышеописанным. Средняя цитотоксическая активность доноров составила 31,5+7,0 и 34,2±7,7% соответственно. Использование проточной цитометрии дает возможность быстро и с высокой точностью охарактеризовать обе клеточные популяции (эффекторы и мишени) по нескольким параметрам. Объективность анализа данных, высокая воспроизводимость результатов и отсутствие дорогостоящих реагентов делают метод весьма перспективным для дальнейшей разработки и внедрения в клиническую практику.

ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ МАГНИТНОГО ПОЛЯ НА СВОЙСТВА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК

Златник Е.Ю.

Научно-исследовательский онкологический институт, Ростов-на-Дону, Россия

Многие физические факторы, в том числе и магнитное поле, обладают иммуномодулирующим эффектом, который обычно связывают с их центральным действием. Ранее были получены экспериментальные данные о про-

Показатель Контроль Опыт

CD2* (%) 46,3±2,1 56,0±3,36*

CD4* (%) 27,8±4,4 27,1±1,25

CD8+ (%) 23,4±1,32 22,7±1,4

CD11b+ (%) 18,6±1,1 26,0±2,3*

HLA-DR* (лимф.) (%) 13,4±1,7 24,9±1,1*

ИЦ 1,85+0,17 2,35±0,2*

IL-2 (ИС) 1,83±0,34 5,04±1,12*

НСТстим. (%) 42,9±2,13 53,4±2,9*

НСТспонт. (%) 24,0±2,13 31,1±2,8*

ФА (%) 58,0±3,32 68,1 ±3,2*

HLA-DR* (мон.) (%) 20,0±2,2 25,8±1,7*

TNF-a (ИС) 1,27±0,66 3,97+0,97*

тивоопухолевом действии переменного магнитного поля (ПеМП) низкочастотных и низкоинтенсивных характеристик.

Нашей задачей было оценить возможный вклад иммунной системы в реализацию этого эффекта путем исследования влияния ПеМП на иммунобиологическое состояние лимфоцитов и моноцитов периферической крови онкологических больных.

Методы исследования. Цельную кровь больных обрабатывали ПеМП на генераторе "Спектр-2" в режиме 50 Гц 10 мТл в течение 30 мин. Затем из нее выделяли моно-нуклеарные клетки (МНК) в градиенте фиколл-верогра-фина, проводили определение экспрессии дифференци-ровочных рецепторов лимфоцитов с помощью непрямого иммунофлюоресцентного метода, функциональной активности NK-клеток в цитотоксическом тесте с культурой К562. Функциональное состояние моноцитов оценивали по экспрессии ими HLA-DR, фагоцитарной активности (ФА), результатам НСТ-теста. Продукцию TNF-a и IL-ip изучали в супернатантах спонтанных и стимулированных ЛПС культур МНК; продукцию IL-2 - в комито-генном тесте, который ставили с супернатантами интак-тных и омагниченных клеток линии Jurkat после внесения их в культуры спленоцитов мышей СВА, престиму-лированных субоптимальными дозами КонА. Вычисляли индексы стимуляции (ИС) и индекс цитотоксичности (ИЦ).

Результаты представлены в таблице.

Как видно из представленных данных, ПеМП способно стимулировать экспрессию молекул адгезии и активации, а также цитотоксичность NK-клеток, продукцию моно-и лимфокинов, фагоцитоз и кислородозависимые реакции, то есть обладает стимулирующим действием на моноцитарно-макрофагальное, Т- и NK-клеточное звенья иммунитета.

ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫЕ АСПЕКТЫ АНТИАНГИОГЕННОЙ ТЕРАПИИ

Киселева Е.П.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Перербург, Россия

В настоящее время описано значительное количество фармакологических и генно-инженерных способов анти-ангиогенной терапии (Li et al., 1998). Одним из видов такого лечения является применение препаратов, блокирующих действие одного из основных ангиогенных факторов - VEGF (васкулярно-эндотелиального ростового фактора).

Моноклональные анти-VEGF антитела (bevacizumab) и агенты, блокирующие VEGF-рецептор (SU5416) включены в протоколы для лечения лейкозов и ряда солидных новообразований (Giles, 2002; Richard et al., 2002). Основная тактика применения подобной терапии направлена на отмену ангиогенного действия VEGF (Rosen, 2002) и на повышение чувствительности опухолевых клеток к действию лучевой или химиотерапии в случае комбинированного лечения, поскольку VEGF является антиапоп-тогенным фактором для клеток эндотелия (Harmey et al., 2002).

VEGF продуцируется многими опухолевыми клетками и играет важную роль в регуляции опухолевого неоангиогенеза. Уровень содержания VEGF в крови

может существенно увеличиваться при росте опухолей (Kondo et al., 1994; Dirix et al., 1997) и вызывать ряд нежелательных для организма системных эффектов, а именно способствовать развитию иммунодефицита.

Показано ингибирующее влияние VEGF на диффе-ренцировку дендритных клеток на уровне костно-мозговых предшественников (Gabrilovich et al., 1996), в результате чего в организме больных раком создается дефицит периферических дендритных клеток и их способности презентировать антигены (Gabrilovich et al., 1997, Almand et al., 2000). Применение анти-VEGF антител в эксперименте восстанавливало количество дендритных клеток и значительно усиливало их функциональную активность (Gabrilovich et al., 1999).

Недавно было показано, что длительное введение VEGF интактным животным вызывает у них развитие инволюции тимуса с такой же динамикой и изменением клеточного состава тимоцитов, что и при росте опухоли (Ohm et al., 2003). В наших экспериментах было показано, что VEGF способен повышать чувствительность тимоцитов к развитию апоптоза в условиях эксперимента in vivo и in vitro (Kisseleva, Gabrilovich, 2000). Известно, что нарушение созревания и дифференцировки лимфоцитов в тимусе может приводить к развитию Т-клеточного иммунодефицита, что характерно для роста многих опухолей. Применение анти-VEGF терапии задерживало развитие инволюции тимуса у животных-опухоленосителей (Ohm et al., 2003).

Макрофаги могут также подвергаться системному воздействию VEGF в организме. В частности, описано хемотаксическое действие этого фактора на моноциты крови человека (Clauss et al., 1996; Barleon et al., 1996). Привлечение макрофагов в область опухолевого узла может способствовать росту неопластической ткани, поскольку клетки мононуклеарно-фагоцитарной системы способны продуцировать более 20 различных ангиогенных молекул (Polverini, 1996).

В наших исследованиях было показано, что VEGF в условиях in vitro вызывает усиление продукции макрофагами нитроксид анионов (Крылов и др., 2002), которые способны оказывать ангиогенное действие и усиливать пролиферацию эндотелия (Ziehe, 1998). Кроме того, инкубация макрофагов интактных мышей в присутствии VEGF вызывала усиление экспрессии своей собственной мРНК. Следовательно, повышенный уровень содержания VEGF может не только привлекать макрофаги к месту опухолевого роста, но и влиять на их ангиогенные свойства по типу петли усиления, вызывая дополнительную продукцию VEGF макрофагами, что будет способствовать синергичному действию этого фактора и нитроксид анионов на эндотелий. Предполагаемый механизм может увеличивать новообразование опухолевых сосудов, чем способствовать прогрессии опухолей.

Факты, свидетельствующие о влиянии VEGF на тимус и макрофаги, с учетом данных о негативном воздействии этого фактора на созревание дендритных клеток, позволяют обосновать новый подход к проведению биотерапии опухолей: применение антиангиогенной терапии не только для подавления роста сосудов, но и для устранения нежелательных последствий влияния VEGF на иммунную систему с конечной целью усиления противоопухолевого иммунитета.

Работа поддержана грантом РФФИ № 03-04-49186.

КЛЕТКИ МЕЛАНОМЫ ЧЕЛОВЕКА ЭКСПРЕССИРУЮТ Fas В ЦИТОПЛАЗМЕ И НА КЛЕТОЧНОЙ МЕМБРАНЕ, A FasL - ВНУТРИ КЛЕТКИ И ИНДУЦИРУЮТ ГИБЕЛЬ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СИНГЕННЫХ ЦТЛ IN VITRO

Кондрашева И.Г., Москалева Е.Ю., Родина A.B., Кутняк O.A., Морозова Л.Ф., Гукасова Н.В, Северин С.Е., Северин Е.С.

Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии; Всероссийский центр молекулярной диагностики и лечения; Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина, г. Москва

Введение. В основе биотерапии рака с использованием дендритных клеток (ДК) лежит индукция специфических в отношении антигенов опухолевых клеток ЦТЛ. ЦТА таких лимфоцитов реализуется с помощью секреции комплекса перфорин-гранзим и взаимодействия молекул FasL поверхности активированных лимфоцитов и Fas-рецепторов поверхности опухолевой клетки-мишени. Поэтому чувствительность опухоли к действию ЦТЛ в значительной степени будет предопределяться способностью ее клеток к Fas-зависимому апоптозу. В то же время многие опухолевые клетки экспрессируют FasL, что может приводить к инактивации ЦТЛ в результате индукции апоптоза активированных лимфоцитов. Поэтому для прогноза эффективности биотерапии опухолей целесообразно исследовать уровень экспрессии белков Fas и FasL в опухолевых клетках и их чувствительность к Fas-зави-симому апоптозу. В связи с этим целью работы явилось изучение уровня экспрессии белков Fas и FasL в первичных культурах клеток меланомы человека, полученных из ткани опухоли при хирургическом удалении узла, их чувствительности к Fas-зависимому апоптозу и влияния инактивированных опухолевых клеток на жизнеспособность сингенных ЦТЛ, индуцированных in vitro, с помощью ДК, нагруженных лизатом клеток меланомы.

Материалы и методы. Первичные клетки меланомы человека культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 20% фетальной сыворотки. Уровень экспрессии и внутриклеточную локализацию белков Fas и FasL в опухолевых клетках исследовали с помощью иммуногисто-химического метода с использованием стрептавидин-био-тин-пероксидазной системы (Dako). Их чувствительность к Fas-зависимому апоптозу исследовали с помощью метода TUNEL с использованием набора APO-BRDU™ (PharminGen) после инкубации с антителами к Fas в течение 24 часов. Зрелые ДК получали из выделенных из периферической крови больных моноцитов, которые культивировали в среде, содержащей рГМ-КСФ и pIL-4, а с 6-го дня и индукторы созревания. Зрелые ДК инкубировали с лизатом опухолевых клеток и после отмывания использовали для индукции специфических ЦТЛ при стимуляции лимфоцитов ДК в соотношении ДК:лимфо-циты 1:5 и последующем культивировании в присутствии IL-2 (30 ед/мл). Спустя неделю к культуре были добавлены опухолевые клетки, инактивированные УФ-облуче-нием.

Результаты и обсуждение. Получены две первичные культуры клеток меланомы от различных больных № 1 и №2. В клетках обеих линий обнаружена экспрессия белка Fas как на поверхности клеточной мембраны, так и в цитоплазме клеток. Экспрессия FasL обнаружена только внутри клеток в перинуклеарной области обеих линий.

Обе линии клеток были высоко чувствительны к Fas-зависимому апоптозу, т.к. инкубация клеток с антителами к Fas в течение 24 часов приводила к индукции апоптоза 40 (№1) - 80 (№2)% клеток. Более высокий уровень апоптоза коррелировал с более высоким уровнем экспрессии Fas в клетках меланомы №2. Через 48 часов после добавления инактивированных сингенных опухолевых клеток меланомы №1 и №2 к индуцированным ДК ЦТЛ наблюдали гибель 100% лимфоцитов, что может быть связано либо с индукцией гибели клеток, связанной с секрецией УФ-облученными клетками меланомы FasL и индукцией Fas-зависимого апоптоза активированных лимфоцитов. По-видимому, in vivo аналогичные процессы могут приводить к гибели специфических противоопухолевых ЦТЛ.

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОГО ТИРОКСИНА НА ФОРМИРОВАНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА И ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ

Красных М.С.. Бахметьев Б.А., Ширшев С.В.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Тиреоидные гормоны играют существенную роль в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток иммунной системы, могут изменять формирование иммунных реакций и фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови. Поскольку установлена дозо-зависимость эффектов тироксина (Т4) на гуморальный иммунный ответ и известна контролирующая роль фагоцитирующих клеток в презентации тимусзависимого антигена, целью данной работы явилось изучение влияния различных доз Т4 на одновременное формирование антителообразующих клеток (АОК) и фагоцитарную активность отдельных популяций циркулирующих лейкоцитов периферической крови и макрофагов перитонеальной полости у иммунизированных животных.

Материалы и методы. Эксперименты проведены на мышах-самцах породы Swiss. Животные были разделены на 3 группы. Одной из групп вводили Т4 подкожно в суточной дозе 0,04 мг/кг, другой - 40 мг/кг, а контрольной инъецировали растворитель гормона по аналогичной схеме. Гормон вводили в течение 10 дней. На 5-е сутки введения Т4 животных внутрибрюшинно иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 108 клеток. Влияние гормона на иммунный ответ оценивали по числу АОК в селезенке методом прямого локального гемолиза в геле агарозы по Ерне. Помимо этого у всех иммунизированных животных подсчитывали количество ядросодержащих клеток (ЯСК) в периферической крови, селезенке, перитонеальной полости, а также оценивали суммарную фагоцитарную активность всех лейкоцитов периферической крови, перитонеальной полости и поглотительную активность отдельных популяций нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов. В качестве объектов фагоцитоза использовали формалинизированные ЭБ.

Основные результаты. Инъекции Т4 сопровождались дозозависимым повышением формирования АОК в селезенке и параллельно с этим увеличением численности ЯСК в органе и перитонеальной полости. При этом введение гормона не изменяло уровень ЯСК периферической крови. При оценке парциального состава лейкоцитов крови в малой дозе наблюдалось снижение числа сегментоядерных нейтрофилов и повышение числа лимфоцитов. Инъ-

екции Т4 в дозе 40 мг/кг не изменяли лейкоцитарный состав крови. В перитонеальной полости вне зависимости от доз уменьшалось число макрофагов и наблюдалось повышение численности лимфоцитов. При оценке фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови было выявлено дозозависимое угнетение поглотительной способности сегментоядерных нейтрофилов, без изменения активности популяции моноцитов и эозинофилов. В перитонеальной полости низкая доза гормона не влияла на фагоцитарную активность макрофагов. С увеличением дозы наблюдалась активация поглотительной способности макрофагов.

Заключение. Таким образом, результаты проведенного исследования выявили разнонаправленные, дозозависимые эффекты Т4 на иммунный ответ и фагоцитарную активность лейкоцитов крови и перитонеальной полости. Стимулируя антителопродуценты и повышая уровень ЯСК во вторичных лимфоидных органах, гормон не изменял общую фагоцитарную активность всей популяции лейкоцитов, а затрагивал только сегментоядерные нейт-рофилы крови и макрофаги перитонеальной полости. Вероятно, модуляция фагоцитарной активности лейкоцитов крови у экспериментальных животных связана с воздействием гормона на экспрессию молекул клеточной адгезии фагоцитами, в частности ßt и ß2 — интегринов, которые, по-видимому, обусловливают изменение метаболизма клетки.

РЕГУЛЯЦИЯ АНГИОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ МАКРОФАГОВ

КрыловА.В.. Киселева Е.П., Людыно В.И., Зубарева O.E.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

К настоящему моменту показано, что активность макрофагов играет ключевую роль в ангиогенезе. Известно, что мононуклеарные фагоциты, секретируя целый спектр как про-, так и антиангиогенных медиаторов во многом определяют процесс неоваскуляризации. Такими медиаторами являются: фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), рассматривающийся сейчас как основной посредник ангиогенеза, и антиангиогенный фактор тромбоспондин-1 (TSP-1). Установлено, что про-, либо антиангиогенная активность макрофагов определяется балансом продукции этими клетками ингибиторов или активаторов ангиогенеза и формированием ангиогенного фенотипа, характеризующего клетку в определенный промежуток времени (Xiong et al.), однако механизмы регуляции данного процесса не вполне ясны.

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния разных групп медиаторов по их воздействию на экспрессию мононуклеарными фагоцитами мРНК про-ангиогенного фактора VEGF и антиангиогенного фактора TSP-1. Было исследовано влияние иммунорегулятор-ных цитокинов (IL-4 и TNF-a), медиаторов гипоксии (аде-нозина и лактата), ангиогенного фактора (VEGF), а также дексаметазона. Работу проводили на мышах линии СЗНА. Резидентные перитонеальные макрофаги получали промыванием брюшной полости животных средой RPMI 1640, содержащей 10% фетальную сыворотку. Инкубацию клеток с исследуемыми медиаторами прово-

дили в течение 4 и 24 часов при 37°С. Уровень экспрессии мРНК УЕСР и ТБР-1 оценивали методом ОТ-ПЦР со специфическими праймерами.

Полученные результаты выявили следующие эффекты: УЕСР дозозависимо усиливал экспрессию собственной мРНК и мРНК ТЗР-1 в концентрациях 50 и 100 нг/ мл на сроке 24 часа. Дексаметазон в концентрации 100 и 10 нМ достоверно снижал уровень экспрессии мРНК УЕСР на всех сроках инкубации и не оказывал влияния на экспрессию мРНК ТЗР-1.

Лактат (6,5 мМ) и аденозин (100 цМ) стимулировали экспрессию мРНК УЕСР на сроке 24 часа и не оказывали влияния на экспрессию мРНК ТБР-1 при тех же условиях.

Для 1Ь-4 и ТЫР-а были выявлены следующие эффекты: ТЫР-а в концентрации 100 ед/мл увеличивал экспрессию мРНК ТБР-1 на сроке 4 часа, но снижал этот показатель на сроке 24 часа и стимулировал экспрессию мРНК УЕСР на сроке 24 часа. 1Ь-4 в концентрации 10 нг/мл снижал экспрессию мРНК УЕСР на сроке 24 часа и стимулировал раннюю продукцию мРНК Т5Р-1 на сроке 4 часа.

В работе впервые был исследован эффект различных групп веществ на продукцию мононуклеарными фагоцитами мышей мРНК факторов, имеющих противоположный эффект на рост сосудов. Исследовались различные типы медиаторов, играющих ключевое значение в процессах ангиогенеза, воспаления и ранозаживления

- 1Ь-4, ТОТ-а, УЕСР, лактат, аденозин и дексаметазон. Из всех исследованных нами веществ проангиогенный эффект был показан для лактата и аденозина. Для дексаметазона и 1Ь-4 был выявлен антиангиогенный эффект. Влияние УЕСР и ТОТ-ос на ангиогенную активность макрофагов выявило смешанное действие (стимуляция экспрессии мРНК как про- так и антиангио-генной молекулы в случае УЕСР; ранний анти- и поздний проангиогенный эффект ТЫР-а). Способность УЕСР стимулировать экспрессию мРНК собственной молекулы и создавать, тем самым, дополнительную петлю синтеза ангиогенного медиатора была показана нами впервые. Также впервые был показан антиангиогенный эффект дексаметазона, что соответствует данным литературы об антивоспалительных свойствах глюкокорти-коидов. Двойственные эффекты УЕСР и ТИР-а свидетельствуют в пользу возможной дифференцированной роли макрофагов на разных стадиях процесса ранозаживления.

Работа поддержана грантом РФФИ №03-04-49186

ЗНАЧЕНИЕ ГИПЕРВАРИАБЕЛ ЬНОГО УЧАСТКА НУМ В ИНИЦИАЦИИ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ ВИРУСОМ ГЕПАТИТАС

Кузьмина Т.И., Оленина Л.В., Кураева Т.Е., Соболев Б.Н., Колесанова Е.Ф., Арчаков А.И.

ГУ Институт биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича

Несмотря на то, что в мире уже выявлено около 500 млн. инфицированных вирусом гепатита С (ВГС), механизмы, приводящие к возникновению заболевания, мало изучены. В частности, практически отсутствует информация о взаимодействии ВГС с клеткой-хозяином. Предполагают, что для инициации инфекции ВГС может присоединяться к гепаран сульфату, молекулы которого

с высокой плотностью обнаруживаются на клеточной поверхности. Известно, что взаимодействие ВГС с гепаран сульфатом может иметь электростатическую природу. Если это так, то участок облочки, обеспечивающий взаимодействие ВГС с отрицательно заряженным гепаран сульфатом, должен отличаться высокой концентрацией положительно заряженных аминокислотных остатков. Этим требованиям отвечает участок оболочечного гликопротеина Е2 ВГС, называемый HVR1.

И хотя этот участок отличается гипервариабельностью, 97,5% последовательностей HVR1 из различных ВГС-изолятов имеет суммарный положительный заряд. Анализ выборки из 1457 последовательностей HVR1 из ВГС-изолятов, представленных в общедоступных базах данных, позволил построить так называемую консенсусную аминокислотную последовательность этого участка, в которой каждый аминокислотный остаток в данной позиции обнаруживается по крайней мере в 22% случаев. В настоящем исследовании предпринята попытка выявления внутри HVR1 участков, активно взаимодействующих с гепарином, растворимым аналогом гепаран сульфата. Для этого была создана пептидная библиотека, состоящая из 135 биотинилированных октапептидов. Синтезированные нами пептиды были представлены в виде четырех групп. Из них пептиды группы А перекрывали консенсусную последовательность HVR1 с шагом перекрывания в шесть аминокислотных остатков. Вторая группа (группа В) представляла собой аминокислотные последовательности, наиболее часто выявляемые в HVR1 изо-лятов ВГС. В третью группу (группу С) вошли пептиды, встречающиеся в последовательностях HVR 1 с низкой частотой, но отличающиеся высокой плотностью положительно заряженных аминокислотных остатков. Проведенные с помощью твердофазного анализа исследования показали, что только пептиды из группы С активно взаимодействуют с гепарином, тогда как пептиды из всех прочих групп обнаруживали это взаимодействие в значительно меньшей степени или не обнаруживали его вовсе. Полученные результаты подтверждают электростатическую природу взаимодействия ВГС с гепаран сульфатом. Очевидно, также, что незначительная частота выявления участков с высокой плотностью положительно заряженных аминокислотных остатков, которые встречаются внутри HVR1, не препятствует возникновению инфекции, вызываемой ВГС. Следовательно, либо взаимодействие ВГС с гепаран сульфатом не имеет решающего значения при интернализации вируса в клетку-хозяина, либо основной участок, ответственный за это взаимодействие находится за пределами HVR1.

Работа поддержана межведомственной программой Российского министерства промышленности, науки и техники «Вакцины нового поколения. Тема № 01.03. Синтетические и субъединичные вакцины».

ИЗМЕНЕНИЕ АФФИНИТЕГАТ-ХЕЛПЕРОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ ЭНДОТОКСИКОЗА

Кузьмичева Л.В.. Киселева P.E.

Мордовский государственный университет имени П.П. Огарева, Саранск, Россия

Т-хелперы синтезируют большое число растворимых факторов (цитокинов), регулирующих иммунные реакции и помогающие В-лимфоцитам. Одним из цитокинов является интерлейкин-2 (IL-2), мишенями которого служат

различные субпопуляции Т-лимфоцитов, В-лимфоциты, натуральные киллеры, макрофаги. Эти клетки имеют соответствующий рецептор для восприятия сигнала от интерлейкина-2. Рецепторный комплекс состоит из трех субъединиц, представляющих собой полипептиды разного размера и обозначаемых как а-, (3-, у-цепи, которые обладают различным аффинитетом. Более высокая аффинность связывания с 1Ь-2 свойственна Р-цепи рецептора, которая конститутивно экспрессируется на некоторых типах лимфоидных клеток, отличаясь по структуре от антигена СБ25.

Материал и методы исследования. Обследована кровь 40 доноров, в возрасте от 18 до 40 лет, и 60 больных бронхолегочными заболеваниями (пневмония, бронхит, бронхиальная астма) в стадии обострения и ремиссии. Аффинитет различных популяций определяли по интенсивности флуоресценции комплекса лимфоцит-монокло-нальное антитело, меченное ФИТЦ. Количественное определение интенсивности флуоресценции (ИФ) регистрировали на автоматическом спектрофлуориметре Signe-4. При оценке ИФ всей популяции лимфоцитов использовали показатель средней интенсивности флуоресценции (СИФ). В сыворотке крови определяли интегральные показатели, адекватно отражающие тяжесть эндогенной интоксикации: перекисное окисление липидов (ПОЛ), антиоксидантную активность (АОА), молекулы средней массы (МСМ), циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК), индекс токсичности по альбумину (ИТ).

Результаты и их обсуждение. Все бронхолегочные заболевания в стадию обострения сопровождались синдромом эндогенной интоксикации. В патогенезе бронхолегочных заболеваний существенная роль отводится дисбалансу оксидантно-антиоксидантной системы как фактору нарушения структурно-регуляторной системы клеток, повышению реактивности бронхов, формированию иммунологической недостаточности.

При биохимических исследованиях плазмы крови больных пневмонией в острую фазу происходит увеличение ПОЛ в 2,4 раза, МСМ - в 2,2 раза, ЦИК - в 1,75 раза, ИТ - в 2,1 раза по отношению к контролю. Эндотоксикоз при хроническом бронхите характеризуется ростом ПОЛ в 2,3 раза, МСМ - в 1,9 раза, ЦИК - в 1,6 раза, ИТ - в 1,8 раза. Наиболее высокие показатели были при обострении инфекционно-аллергической бронхиальной астмы: ПОЛ был увеличен более чем в 3 раза, МСМ - в 2,4 раза, ЦИК - в 2 раза, ИТ вырос в 2,5 раза. В стадию ремиссии показатели эндотоксикоза остаются выше контрольных. Это не позволяет развиваться компенсаторно-адаптационным механизмам защиты клеточных мембран, изменяя их микровязкость, создавая условия для элиминации рецепторных белков. Как показали наши исследования, уровень аффинитета Т- и В-клеточного звена при обострении БЛЗ снижается: при пневмонии от 3,5 до 4,6 раза, хроническом бронхите от 2,8 до 3,8 раза, бронхиальной астме от 2,7 до 3 раз. Особенно значительно снижается уровень флуоресценции при пневмонии у клеток экспрессирующих СБ25. При острых и хронических заболеваниях происходит резкое подавление функций клеточного иммунитета, о чем свидетельствует резкое снижение СИФ. При инфицировании организма возбудителями, размножающимися вне клетки, в иммунном ответе выступают хелперные клетки (ТЬ2), имеющие тот же маркер С 04, что и воспалительные ТЫ-клетки. Функция клеток этой популяции - активация В-лифоцитов к продукции специфических иммуноглобулинов, которые нейтрализу-

ют бактерии или их токсины. Продукты перекисного окисления, действуя на SH-группы, гистидиновые и другие аминокислотные остатки белков, в частности ОН*, вызывают денатурацию последних и инактивируют мембраносвязанные ферменты, кроме того, происходит пере-кисное окисление тиоловых групп мембранных белков. Известно, что интерлейкин-2 имеет внутримолекулярную дисульфидную связь в положении 58-105, которая играет ключевую роль в создании биологически активной конформации молекулы. Разрушение этой связи приводит к полной потере биологической активности IL-2 и снижению аффинитета. Таким образом, эндогенные токсины отрицательно влияют на хелперные клетки, которые уже не могут выступать в качестве организаторов адекватного иммунного ответа.

ЭКСПРЕССИЯ АПОПТОТИЧЕСКИХ БИОМАРКЕРОВ НАЭТАПАХДИФФЕРЕНЦИРОВКИ В-ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА

ЛысюкЕ.Ю.. Полосухина Е.Р., Ковригина А.М., Шишкин Ю. В., Барышников А.Ю.

Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва, Россия

Целью нашей работы было исследовать экспрессию Вс1-2, Вах и CD95 на стадиях дифференцировки В-лим-фоцитов человека, используя в качестве моделей различные лимфопролиферативные заболевания.

В работе мы исследовали 84 образца периферической крови больных хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), 10 образцов костного мозга детей и 10 взрослых, больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) и 18 образцов КМ больных множественной миеломой (ММ). Также исследовались отпечатки лимфатических узлов 14 больных центрофолликулярной лимфомой (ЦФЛ) различных цитологических стадий и 11 больных диффузно-круп-ноклеточной лимфомой (ДКЛ). Кровь и костный мозг анализировались методом проточной цитофлюориметрии с использованием проточного цитофлюориметра FACScan (Becton Dickinson), отпечатки лимфоузлов исследовались иммуноцитохимическим методом. Для обоих методов использовались моноклональные антитела к маркерам Bcl-2 (DAKO, Clone 124), Вах (Immunotech), CD95 (МедБиоСпектр, клон ICO-160).

Результаты исследования. Нами обнаружена высокая экспрессия ингибитора апоптоза Вс1-2 при заболеваниях, соответствующих нормальным зрелым лимфоцитам. Так, высокая его экспрессия выявлялась у 75% больных ХЛЛ и у 86% больных ЦФЛ. При ЦФЛ мы также наблюдали корреляцию между экспрессией Вс1-2 и наличием в исследуемом материале крупных (бластных) клеток: чем меньше таких клеток в материале, тем выше экспрессия белка. В подтверждение этому экспрессия Вс1-2 при ДКЛ, при которой в лимфоузлах обнаруживается большое количество бластных клеток, выявлялась только у 12,5% больных. В бластных клетках взрослых больных ОЛЛ экспрессии Вс1-2 не выявлялось, у детей положительная его экспрессия обнаруживалась у 20% больных. В клетках костного мозга при ММ этот белок экспрессировался у 17% больных. По литературным данным, наиболее информативным считается определение соотношения про- и анти-апоптотических маркеров, в частности Bcl-2/Bax. При ХЛЛ соотношение Bcl-2/Bax было повышено у 90% больных, при этом наблюдалась корре-

ляция между повышенным соотношением Вс1-2/Вах и отсутствием ответа на лечение. При ОЛЛ положительная экспрессия Вах выявлялась у 43% детей.

С095 экспрессировался при ХЛЛ у 50,6% больных, при ЦФЛ - у 54,5% больных, при ДКЛ - у 42,9%, при ММ - у 51,7% больных, так что существенных различий в экспрессии С095 в зависимости от стадии дифференцировки лимфоцитов нами выявлено не было.

Таким образом, нами было обнаружено, что Вс1-2 экспрессируется главным образом на зрелых лимфоцитах, в то время как на ранних лимфоидных, а также на плазматических клетках он не выявляется. СВ95, по нашим данным, экспрессируется на всех стадиях дифференцировки В-клеток в равной степени.

ДИСБАЛАНС В РЕГУЛЯЦИИ РЕСПИРАТОРНОГО ВЗРЫВА НЕЙТРОФИЛОВ ИЗ ОЧАГА ОСТРОГО ВОСПАЛЕНИЯ УЖИВОТНЫХ-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ

Мальцева В.НА Авхачева Н.В.1, Сафронова В.Г.2

1Пущинский Государственный Университет, 2Институт биофизики клетки Российской Академии Наук, Пущино, Россия

Введение. ПолиморТЫРядерные лейкоциты относятся к популяции клеток, обладающих цитотоксической активностью, направленной на инфекцию и собственные дефектные клетки. Нейтрофилы мигрируют по градиенту хемотаксических факторов в область острого воспаления, где проявляют свою функциональную активность, в том числе генерируя активные формы кислорода (АФК). Онкологические заболевания вызывают ряд физиологических и метаболических изменений в организме, которые могут служить причиной возникновения нарушений в системе регуляции интенсивности респираторного взрыва нейтрофилов. Такие возможные нарушения и особенности протекания воспаления на фоне развития опухолевого процесса в организме практически не изучены.

Задача работы. Оценить изменения в регуляции генерации АФК нейтрофилами мышей с экспериментальной опухолью.

Материалы и методы. Работа проведена на перитонеальных вызванных нейтрофилах мышей линии ЫМШ с солидной опухолью. Формирование солидной опухоли проводили путем внутримышечной трансплантации клеток асцитной карциномы Эрлиха. Нейтрофилы инкубировали с ингибиторами протеинкиназ и протеинфосфа-таз в течение 20 мин при 37°С и активировали хемотакси-ческим пептидом Ы-формил-Мет-Лей-Фен (ФМЛФ) в диапазоне концентраций от 0,5 до 50 мкМ. Интенсивность генерации АФК была оценена методом люминол-зави-симой хемилюминесценции (ХЛ).

Основные результаты. На фоне опухолевого процесса обнаружены изменения морфологии нейтрофилов, мигрировавших в перитонеальную полость, и увеличение их количества. Выявлено повышение уровня спонтанной ХЛ и понижение уровня индуцированной хемотаксическим пептидом ХЛ в нейтрофилах мышей-опухоленосителей, что позволяет говорить об их предрасположенности к патологически повышенной цитотоксичности. Показаны различия в эффектах ингибитора тирозиновых протеинкиназ тирфостина 51 (5 мкМ) на вызванный ФМЛФ ответ нейтрофилов контрольных мышей и животных-опухоленосителей: 1) наблюдалось более слабое ингибирование спонтанной ХЛ на нейтрофилах мышей-опухоленосителей; 2) при низких концент-

рациях ФМЛФ (1 мкМ) обнаружено ослабление ингибирования, тогда как при высоких концентрациях ФМЛФ (50 мкМ) наблюдался обратный эффект; 3) действие ингибитора на оксидазную активность нейтрофилов мышей с экспериментальной опухолью не зависело от концентрации ФМЛФ (в области концентраций ФМЛФ от 0,5 до 10 мкМ). Выявлены также различия в эффекте ортованадата (10 мкМ), ингибитора тирозиновых протеинфосфатаз. БВ 203580, ингибитор митоген активируемой р38 протеинкиназы, сильнее подавлял ответ нейтрофилов мышей с опухолью по сравнению с клетками контрольных животных.

Заключение. На фоне опухолевого процесса наблюдается модификация систем регуляции оксидазной активности нейтрофилов с участием р38 МАРК, тирозиновых протеинкиназ и протеинфосфатаз.

ВЛИЯНИЕ БЛ0КАТ0Р0В ГЮ-СИНТАЗ НА ИММУННЫЙ ОТВЕТ, МОНООКСИГЕНАЗНУЮ АКТИВНОСТЬ И ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В СЕЛЕЗЁНКЕ МЫШЕЙ

Мартынова Т.В.. Алексеева И.Н., Брызгана Т.М., Алексюк Л.И., Сухина В.С.

Институт физиологии им. АЛ. Богомольца НАН Украины, Киев, Украина

В литературе есть данные об участии окиси азота - N0, синтезируемого макрофагами и полиморфнонуклеарными лейкоцитами, в неспецифической резистентности организма, обеспечивающей защиту от инфекций. В последние годы накапливаются факты и об участии N0 в иммунных реакциях, в основном клеточного типа. Значительно меньше данных о роли N0 в гуморальном иммунном ответе (ИО). Известно, что активация иммунокомпетентных клеток связана с изменением структуры и состава липидного бислоя их мембран. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) модифицирует состав мембран, трансформацию сигналов внешней среды и обеспечивает оптимальное функционирование лимфоцитов. Есть данные о взаимосвязи ПОЛ и синтезом N0. Кроме того, известно о сложных взаимоотношениях между иммунной реакцией организма и активностью моно-оксигеназной системы (МОС) иммунокомпетентных клеток. Функционирование как МОС, так и иммунной системы находится в тесной связи с процессами ПОЛ.

Цель наших исследований состояла в изучении влияния блокатора всех изоформ ИО-синтаз - 1>^-омега-нит-ро-Ь-аргинина (ЫМЬА) и блокатора индуцибельной N0-синтазы - (¡ЫОБ) -дексаметазона (ДМ) на высоту иммунного ответа (ИО) при индукции иммуногенной и то-лерогенной дозой ЭБ, активность МОС и процессы ПОЛ в селезёнке мышей.

ЫЫЬА вводили мышам одноразово в дозе 75мг/кг массы тела внутривенно через 20 часов после введения ЭБ. ДМ вводили в дозе 1мг/кг массы тела ввнутривенно двухкратно через 2 и 20 часов после ЭБ. Исследования проводили на 5-е сутки после введения ЭБ в иммуногенной (250x106) или толерогенной (1,5x109) дозе. ИО оценивали по числу антителообразующих клеток (АО К) в селезенке. Активность МОС определяли в гомогенатах селезёнки (по показателям скорости И-деметилирования амино-пирина), активность ПОЛ изучали в спленоцитах методом индуцированной хемилюминесценции.

Установлено, что применение блокатора суммарных >Ю-синтаз NN1^ и блокатора ¡МОБ-ДМ приводило к стимуляции ИО, индуцированного как иммуногенной, так и

толерогенной дозой ЭБ. При использовании иммуногенной дозы в исследованиях с применением NNLA число АОК в селезёнке мышей достоверно увеличивалось на 57% относительно контроля. При применении ДМ- эта величина была несколько ниже, однако также достоверно выше контроля на 27%. Результаты влияния этих блокаторов в условиях ИО на активность ПОЛ и МОС в селезёнке животных были различными, а именно: применение NNLA- вызывало снижение активности ПОЛ и стимулировало МОС, а при ДМ

- достоверно повышало уровень активности ПОЛ и МОС. В исследованиях с введением толерогенной дозы ЭБ мышам использование NNLA приводило к достоверной стимуляции ИО - число АОК в селезёнке увеличивалось на 130%, а применение ДМ -лишь на 16% относительно контроля. В этих случаях возрастала активность МОС и незначительно снижалась активность ПОЛ в селезёнке. Следует отметить, что во всех случаях при применении ДМ наблюдалось достоверное снижение массы селезёнки.

Представленные данные свидетельствуют о том, что введение блокаторов синтеза N0 влияет на активность процессов ПОЛ и МОС в селезёнке мышей и приводит к стимуляции ИО независимо от применяемой дозы антигена. Эффект блокатора суммарных NO-синтаз выше, чем эффект блокатора iNOS.

УПРОЩЕННЫЙ МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК МЫШЕЙ

Масленникова H.A.. Мушенкова Н.В., Свирщевская Е.В.

Биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.В. Овчинникова РАН, Москва

Дендритные клетки (ДК) являются основными антиген представляющими клетками иммунной системы млекопитающих. На настоящий момент считается, что только ДК способны активировать первичный специфический иммунный ответ. Долгое время роль ДК оставалась не ясной, так как выделение большого количества этих клеток было проблематичным. В последние годы был предложен метод получения Д К in vitro из периферической крови человека или костного мозга мыши. В костном мозге находятся предшественники ДК, которые в определенных условиях in vitro дифференцируются в зрелые Д К. Показано, что дифферен-цировка может происходить под действием различных факторов таких, как сочетание IL-4 и GM-CSF, М-CSF и TGF-ß, TNF-oc и LPS и другие. Целью данной исследования была разработка метода получения ДК из костного мозга мышей, дифференцирующихся под действием коктейля цитокинов, продуцируемого спленоцитами, активированными конканавалином А (КонА).

Методы. Клетки костного мозга инкубировали в течение 5 суток в 6-луночных планшетах в присутствии спле-ноцитов, предварительно активированных в течение 3 часов конканавалином А, а затем обработанных митомици-ном С. На 6-е сутки лимфоциты и гранулоциты удаляли аспирацией и добавляли свежую среду и новую порцию спле-ноцитов, приготовленную аналогично. На 10-е сутки ДК суспендировали, переносили в новые планшеты и добавляли LPS. Клетки собирали через 2-е суток и определяли фенотип методом проточной цитофлюорометрии с использованием антител к маркерам зрелых ДК.

Результаты. Интактные клетки КМ были представлены популяцией MHCIICD1 lb'CDl lc'CD220+CD8a\ После 6 дней инкубирования от 20 до 40% клеток несли маркер

CDllb. На 10-й день инкубирования от 40 до 80% клеток несли маркеры MHCIIloCDl lbloCDl lc+CD220+CD8oc+. Дополнительная активация LPS приводила к повышению экспрессии MHCII.

Вывод. Предложен относительно простой метод получения мышиных дендритных клеток.

ИССЛЕДОВАНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАГОЦИТОВ ЦЕЛЬНОЙ КРОВИ СЕНСИБИЛИЗИРОВАННЫХ МОРСКИХ СВИНОК С ПОМОЩЬЮ МОДИФИЦИРОВАННОГО МЕТОДА ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА

Митерева Д.Е.. Агафонов В.Е.

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва

Метод хемилюминесцентного (ХЛ) анализа, позволяет адекватно оценивать изменения клеточного метаболизма при различных патологических состояниях, в том числе и при аллергии. Суть метода заключается в том, что под действием стимулирующего агента, в частности специфического аллергена, фагоцитирующая клетка -полиморфноядерный лейкоцит (ПМЛ), переходит в состояние активации, в результате чего генерируются активные формы кислорода (АФК), что сопровождается хемилюминесценцией. При этом интенсивность ХЛ коррелирует со способностью клетки вырабатывать АФК.

В литературе имеются данные об использовании ХЛ метода в иммунологической и аллергологической практике. Однако разные авторы значительно расходятся в методологии проведения ХЛ анализа, в частности используют различные концентрации специфического аллергена.

В связи с этим целью нашего исследования явился подбор оптимальной дозы аллергена для изучения изменения функциональной активности фагоцитов цельной крови в ответ на воздействие специфического аллергена при экспериментальном аллергическом процессе.

Материалом для исследования служила цельная кровь сенсибилизированных альбумином из свиной сыворотки ("Sigma", США) и интактных морских свинок альбиносов с массой 400-500 г. ХЛ анализ проводили на хемилюминометре ХЛ-003 У ГАТУ г. Уфа. В качестве среды для инкубации клеток крови использовали среду Хен-кса без красителя. При приготовлении реакционной смеси использовали 10-4М люминол ("Merck", ФРГ), 0,25 М/мл сульфата бария, 0,5М аэросил (марки АМ-300, Калужского химкомбината, Украина).

Результаты ХЛ анализа учитывали в показателях светосуммы (значения световой суммы за время проведения анализа) и максимальной светимости (значение максимальной интенсивности свечения за то же время), выраженные в у.е. - условных единицах интенсивности свечения; при 1у.е.=1,00Е + 9 квант/с.

ХЛ анализ проводили по отработанной нами схеме, которая выглядела следующим образом: в лунку иммунологического планшета вносили 0,1 мл цельной крови, 0,1 мл бесцветного раствора Хенкса и 0,1 предварительно приготовленной взвеси аэросила с аллергеном в исследуемой концентрации. Полученную смесь инкубировали в течение 25 мин при 37°С. Затем в кювету, для учета ХЛ, вносили 0,3 мл проинкубированной смеси, 2мл раствора 10'4М люминола и 1мл 0,25М суспензии BaS04. Рабочую смесь помещали в камеру хемилюминометра и регистрировали интенсивность ХЛ в течение 25мин. В

качестве контроля использовали рабочую смесь без аллергена.

В связи с этим целью нашего исследования явился подбор оптимальной дозы аллергена для изучения изменения функциональной активности фагоцитов цельной крови в ответ на воздействие специфического аллергена при экспериментальном аллергическом процессе.

Для исследования влияния специфического аллергена на изменение показателей ХЛ крови сенсибилизированных животных необходимо было отработать оптимальную концентрацию специфического аллергена в реакционной смеси. При этом исследовали кровь одного и того же животного, используя концентрации аллергена в диапазоне от 0,001 до 15 мг/мл. Полученные результаты выражали в виде "Индекса перевеса" (ИП):

ИП = В/А , где Л - значения ХЛ показателей без добавления специфического аллергена - контрольная проба; В - значения показателей ХЛ при добавлении специфического аллергена;

Полученные нами результаты продемонстрировали, что взаимодействие крови со специфическим аллергеном носит зависимый от концентрации аллергена характер. Так, при дозах аллергена от 0,025 до 15 мг/мл ”ИП" был меньше единицы (ИП<1), то есть значения показателей ХЛ в пробах с аллергеном находились ниже таковых в контрольной пробе. При этом уменьшение концентрации аллергена вызывало увеличение показателей ХЛ по сравнению с контрольной пробой. При концентрации специфического аллергена 0,001 мг/мл средние значения светосуммы и максимальной светимости превышали контрольные значения в 2,1 и 2,2 раза соответственно.

Контрольное исследование крови несенсибилизиро-ванных морских свинок с теми же дозами аллергена не выявило существенного влияния на функциональную активность фагоцитов.

Таким образом, оптимальная доза аллергена (альбумина из свиной сыворотки) составила - 0,001 мг/мл.

Достоверность полученных результатов осуществляли с помощью параметрического метода Стьюдента. При оценке воспроизводимости получаемой нами разницы значений светосуммы при исследовании контрольной пробы и пробы с добавлением специфического аллергена, значение величины I составило 3,1 при табличном значении 2,13, исследуемая разница значений является достоверной (р<0,05).

Таким образом, представленная схема проведения ХЛ анализа позволяет получать достоверные и воспроизводимые результаты и может быть использована для оценки функциональной активности фагоцитов при аллергическом процессе.

ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ Ф0СФАТАЗН0Й АКТИВНОСТИ ОЧИЩЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ХОЛЕРНОГО ТОКСИНА В РЕАЛИЗАЦИИ ЕГО БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ НА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫЕ КЛЕТКИ

Мишанькин М.Б.

Научно-исследовательский противочумный институт, Ростов-на-Дону, Россия

Холерный токсин (ХТ) является мощным иммуномодулятором с выраженной адьювантной способностью. Кроме того, нами (Васильева Г.И. и др., 2002) установлено, что ХТ относится к группе суперантигенов. Представляет интерес вопрос участия энзиматических свойств этой белковой молекулы в реализации биологических эффектов ХТ на иммунокомпетентные клетки.

Замещение в структуре XT серина в положении 61 на фенилаланин (S61F) приводит к потере АДФ-рибозилт-рансферазной активности, а с ней и холерогенного эффекта (Yamamoto S. et al.,1997). Однако XT-S61F, несмотря на отсутствие энзиматической активности, все же вызывает активацию Т-хелперов 2 типа, сохраняя интерлейкин-индуцирующую активность (IL-4, -5, -6, -10) и обычный профиль антительного ответа (IgGl, IgG2bnsIgA) на уровнях, сравнимых с аналогичными эффектами нативного XT (Yamamoto S. et al.,1997). Таким образом, по мнению тех же авторов, XT индуцирует CD4+ ТЬ2-тип Т-клеточного ответа посредством транссигналинговых механизмов, отличных от аденилатциклазной системы и однозначно связанных с А-субъединицей XT. В связи с этим мы провели анализ первичной структуры альфа-цепи XT с помощью программы MotifFinder в электронной коллекции аминокислотных мотивов BLOCKS (http://www.expasy.ch/ tools) и обнаружили 11 консервативных последовательностей. Наиболее значительным, с нашей точки зрения, является мотив аденозин -и АМФ-деаминирующих белков (BL00485C), ответственный за АДФ-рибозилирующую активность А-субъединицы XT (67-108 остатки). Обращает на себя внимание и факт обнаружения консервативного участка RgtQMNIn-LYDHARG (BL00383A) между 51 и 65 АК остатками, характерного для 77 тирозин-специфи-ческих протеинфосфатаз.

Предположение о наличии у XT фосфатазной активности нашло экспериментальное подтверждение.

Хроматографическое исследование кислотных гидролизатов очищенных препаратов XT показало, что токсин наделен способностью к дефосфорилированию экзогенной меченой АТФ и переносу фосфатных групп на остатки тирозина и треонина собственной молекулы.

Взятый в дозе 5 мкг белка на пробу высокоочищен-ный препарат XT при щелочном значении pH проявлял фосфатазную активность в отношении практически всех предложенных субстратов. Наиболее активно дефосфо-рилировались 4-метилумбеллиферилфосфат, р-нитрофе-нилфосфат, аденозин-5’-дифосфат и аденозин-5’-моно-фосфат (удельная активность составила 0,9 - 1,19 катала). Далее шли глицерофосфат и глюкоза-6-фосфат (0,41

- 0,6 катала), а также циклический 3’,5’ -АМФ и бис-р-нитрофенилфосфат кальция (0,17 катала).

Таким образом, возможность участия XT в процессах обратимого фосфорилирования, особенно фосфотирози-на, позволит по-новому оценить роль токсина в регуляции клеточного цикла, запуске каскадных механизмов передачи сигналов внутрь клетки-мишени, ее возбуждении, пролиферации, модуляции биологической активности ферментов на посттрансляционном уровне.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований

МЕХАНИЗМЫ ИММУНОСУПРЕССИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ ГАНГЛИОЗИДАМИ - МАРКЕРАМИ ОПУХОЛЕВОГО ПРОЦЕССА

Молотковская И.М.. Холоденко Р.В., Якухина Н.А., Холоденко И.В.

Институт биоорганическойхимии им. М.М.Шемякина и ЮЛ.Овчинникова РАН, Москва

Ганглиозиды, сиалированные гликосфинголипиды плазматических мембран клеток эукариотов, являются активными участниками функционирования клеток раз-

ных тканей. Известно, что ганглиозиды способны суп-рессировать пролиферацию Т-лимфоцитов на этапе, зависимом от интерлейкина-2 (IL-2). Синтез ганглиозидов GM2 и GD3, использованных в данной работе, усиливается при малигнизации клеток; более того, эти ганглиозиды активно сбрасываются с поверхности в кровоток, так что их концентрация в крови у опухолевых больных возрастает в сто и более раз.

Было изучено влияние ганглиозидов GM2 и GD3 на пролиферацию клеток IL-2- и IL-4-зависимых клеточных линий (CTLL-2 и CT.4R соответственно). С помощью анализа Лайнуивера-Берка определены типы ингибирования данных ганглиозидов, ассоциированных с опухолями, на пролиферацию клеток. Показано, что сложный ганглиозид GD3 ингибирует пролиферацию цитокин-за-висимых клеток по конкурентному типу, причем тип ингибирования не зависит от количества добавленных сывороточных факторов. В то же время моносиалирован-ный GM2 проявляет и конкурентный, и неконкурентный типы ингибирования одновременно. Для GM2, как и для ганглиозидов, присущих организму в норме (GM1, GM3, GTlb), увеличение количества внешних белков и липидов приводит к увеличению вклада конкурентного типа ингибирования.

Специфичность взаимодействия rIL-2 и rIL-4 с ган-глиозидами была исследована также при помощи флуоресцентномеченых производных ганглиозидов (BODIPY-GM2 и BODIPY-GD3), встроенных в липо-сомы. Результаты, полученные при помощи функциональных тестов и ингибиторного анализа, а также при использовании флуоресцентных зондов, хорошо согласуются.

Работа выполнена при поддержке ISTC, проект №2185.

ДНК-АБЗИМЫ КАК МОЛЕКУЛЯРНЫЙ ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ СОЗДАНИЯ НА ИХ ОСНОВЕ СЕРОДИАГНОСТИЧЕСКИХ СИСТЕМ НОВЫХ ПОКОЛЕНИЙ.

Наумова Т.Е.1, Дурова О.М.1, Габибов А.Г.2, Хитров А.Н.3, Грачева Т.С.3,Палеев Ф.Н.1, Котова А. А.1,Сучков С.В.1'3

МОНИКИ,2Институт биоорганической химии РАН, 3ММА им. И.М. Сеченова, Москва, Россия

Предлагается высокочувствительный метод определения ДНК-абзимов, который можно использовать в комплексной диагностике системных аутоиммунных заболеваний, отличающийся от известных тем, что диагностику проводят путем комбинации двух технологий - методом электрофореза в агарозном геле и методом линейного дихроизма с оценкой количества релаксированной плаз-мидной ДНК. Метод значительно повышает чувствительность серологического исследования, а также сокращает сроки проведения анализа.

С использованием разработанного метода обследованы около 200 больных с различными формами аутоиммунной патологии и 38 здоровых доноров. Отмечена выраженная корреляция между активностью и стадией заболевания с одной стороны и каталитическими и цитотоксическими свойствами ДНК-абзимов, с другой.

Показаниями к применению метода абзимодиагнос-тики являются поиски дополнительных иммунологических критериев наличия у больного аутоиммунного про-

цесса и оценки степени активности заболевания аутоиммунной природы.

Исследование ДНК-абзимов можно использовать, в частности, как дополнительный лабораторный тест для верификации диагноза и мониторинга течения системной красной волчанки, ревматоидного артрита и аутоиммунного миокардита.

ВЛИЯНИЕ ПРОЛАКТИНА

НА СТРЕСС-ИНДУЦИРОВАННОЕ ИЗМЕНЕНИЕ

ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ

Немирович-Данченко Е.А., Фомичева Е.Е.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

В последнее десятилетие в проблеме взаимодействия нейроэндокринной и иммунной систем рассматривается важная роль некоторых гормонов, обладающих иммуномодулирующими эффектами, среди которых про-лактин выступает как один из непосредственных участников в развертывании защитных реакций в ответ на действие повреждающих агентов различной природы. Иммуномодулирующие эффекты пролактина обеспечиваются как наличием мембранносвязанного рецептора, относящегося к суперсемейству цитокиновых рецепторов, на клетках иммунной системы (Kelly РА et al., 1995, Matera L., 1997), так и функциональным взаимодействием пролактина с другими иммуномодуляторами, такими как глюкокортикоидные (ГК) гормоны и интерлейкин-1 (IL-1), которые индуцируют развитие защитных реакций при стрессе (Корнева ЕА и соавт., 2000, Besedovsky Н. et al., 1986), однако конкретные механизмы этого взаимодействия в условиях целостного организма практически не изучены.

Исследовали влияние пролактина на пролиферацию лимфоцитов периферической крови крыс, подвергнутых холодовому стрессу в течение 20 мин. Как известно (Dinarello СА., 1991), лимфоциты периферической крови животных отвечают реакцией бласттрансформации (РБТЛ) на действие IL-ip в присутствии субоптималь-ной дозы лектинов - в этом проявляется комитоген-ный эффект IL-ip, который позволяет оценить пролиферативную активность лимфоцитов. Пролиферацию лимфоцитов оценивали по включению [3Н] - тимиди-на в ДНК делящихся клеток. Для определения комито-генного действия IL-1 в РБТЛ использовали нативный препарат IL-1P кролика (hIL-1P со специфической активностью 2,5х104 ед.активности/мг белка) в дозе 0,06 мкг/мл в присутствии СопА в дозе 0,625 мкг/мл. Установлено, что внутрибрюшинное введение пролактина в дозах 5, 25 и 40 нг/100 г веса животных не изменяет интенсивность РБТЛ на действие hIL- 1 р по сравнению с этим показателем у интактных животных. Лимфоциты периферической крови крыс, подвергнутых холодовому стрессу, взятые через 10 мин после окончания стрессорного воздействия, не отвечают реакцией бласттрансформации на действие hIL-IP, что проявилось значительным угнетением включения меченого тими-дина в ДНК делящихся лимфоцитов. По-видимому, при аппликации стресса происходит повышение концентрации ГК гормонов в крови крыс, что вызывает выраженное угнетение чувствительности лимфоцитов к действию IL-1, в результате чего наблюдается торможение

пролиферации лимфоцитов, которая восстанавливается спустя 24 часа после окончания стрессорного воздействия. Введение пролактина только в дозе 40 нг/100г веса за 20 мин до аппликации стресса предотвращает угнетение пролиферативной активности лимфоцитов, взятых у животных как через 10 мин, так и через 24 часа после стресса. Таким образом, пролактин, не изменяя интенсивность пролиферации в РБТЛ у интактных животных, в условиях стрессорного воздействия повышает чувствительность лимфоцитов к комитогенному действию IL-1, тем самым предотвращает стрессиндуци-рованное угнетение пролиферативной активности лимфоцитов периферической крови крыс, свидетельствуя о проявлении пролактином иммунопротективного действия. Можно предположить, что пролактин, предотвращая дестабилизирующее действие ГК гормонов при стрессе на пролиферацию лимфоцитов, оказывает пер-миссивное действие, обеспечивая проявление регуляторных влияний IL-1, запускающего каскад реакций, приводящих к пролиферации и дифференцировке клеток иммунной системы. Возможно, интеграция пролактина с ГК гормонами и IL-1 происходит на уровне ли-ганд-рецепторного взаимодействия и направлена на предотвращение развития дисфункций иммунной системы.

МОДУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИИ АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК ПРИ ОСТРОМ СТРЕССЕ И ВВЕДЕНИИ ГИДРОКОРТИЗОНА

Орлова Е.Г.. Ланин Д.В., Шилов Ю.И.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь

Ранее в наших исследованиях было показано, что острый иммобилизационный стресс и введение гидрокортизона повышают фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови. Известно, что глю-кокортикоиды оказывают пермиссивное действие по отношению к катехоламинам, повышая экспрессию ад-ренорецепторов на клетках-мишенях различных органов. Однако возможность реализации действия глю-кокортикоидных гормонов через этот механизм на уровне фагоцитирующих клеток исследована недостаточно.

Цель работы - изучение влияния адренергических соединений in vitro на функции фагоцитирующих клеток периферической крови крыс при остром стрессе и введении гидрокортизона.

Материалы и методы. Эксперимент выполнен на крысах-самцах популяции Wistar. Животные 1-й группы были подвергнуты острому 6-часовому иммобили-зационному стрессу в сочетании с дозированной кро-вопотерей. Крысы 2-й группы подвергались аналогичному воздействию в условиях блокады Р-адренорецеп-торов (2 подкожные инъекции по 5 мг/кг массы тела пропранолола гидрохлорида с интервалом Зч, первая инъекция - за ЗОмин до начала иммобилизации). Животные 3-й группы получали однократно внутрибрю-шинно гидрокортизона ацетат в дозе 50 мг/кг массы тела. Животным 4-й группы вводили гидрокортизон в той же дозе на фоне блокады Р-адренорецепторов (4 инъекции пропранолола по 5 мг/кг массы тела под-

кожно с интервалом Зч, 1-я инъекция - за 30 мин до введения гидрокортизона), крысы 5-й группы подвергались только блокаде Р-адренорецепторов (по схеме, аналогичной 4-й группе). Влияние адреналина гидрохлорида (0,1 мкг/мл) и агониста Р-адренорецепторов тербуталина сульфата (10‘6 М) на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови по отношению к формалинизированным эритроцитам барана, а также адреналина гидрохлорида (0,1 мкг/мл) на суммарную кислородозависимую микробицидность в спектрофотометрическом варианте НСТ-теста оценивали in vitro в условиях 60-минутной преинкубации клеток крови с указанными соединениями у интакт-ных животных, а также через 6 и 24ч от начала иммобилизации или введения гидрокортизона. Контролем служили пробы с преинкубацией без препаратов.

Результаты исследования. В системе in vitro у ин-тактных животных адреналин не оказывал влияния, а Р-адреномиметик тербуталин снижал фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови. При стрессе через 6ч от начала иммобилизации адреналин in vitro повышал показатели фагоцитоза, т.е. оказывал а-адре-нергический (стимулирующий) эффект, а через 24ч выявлено угнетение суммарного лейкоцитарного фагоцитоза, опосредованное, по-видимому, пермиссивным влиянием глюкокортикоидов, повышающих экспрессию Р-адренорецепторов при стрессе, поскольку адреналин in vitro на фоне введения гидрокортизона in vivo также угнетал фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови. При введении гидрокортизона in vivo усиливалось ингибирующее влияние тербуталина in vitro на фагоцитоз.

На фоне блокады p-адренорецепторов при стрессе через 6ч от начала иммобилизации стимулирующий (а-адренергический) эффект адреналина in vitro на показатели фагоцитоза в сравнении с 1-й группой усиливался, а через 24ч - отсутствовал. При введении гидрокортизона на фоне блокады Р-адренорецепторов адреналин in vitro через 6ч от начала эксперимента повышал фагоцитарную активность лейкоцитов, а через 24ч не влиял на показатели фагоцитоза. Можно полагать, что поздние эффекты действия адреналина связаны с изменением экспрессии p-адренорецепторов после отмены их блокады. При введении гидрокортизона на фоне блокады Р-адренорецепторов Р-адреномиметик тербуталин депрессивного эффекта не оказывал. Адреналин и тербуталин in vitro не влияли на фагоцитарную активность лейкоцитов на фоне изолированного введения пропранолола in vivo.

Адреналин in vitro активировал кислородозависимую микробицидность в спонтанном варианте НСТ-теста с клетками периферической крови. При введении гидрокортизона активирующий эффект адреналина полностью отменялся, что, по-видимому, было опосредовано повышением экспрессии Р-адренорецепторов под действием гормона, поскольку на фоне блокады Р-адренорецепторов в этих условиях стимулирующее влияние адреналина вновь появлялось.

Заключение. В условиях стресса и введения глюкокортикоидов выявлены фазные изменения чувствительности фагоцитирующих клеток к адренергической регуляции и направленности действия на них адреналина in vitro, что может быть связано с регуляцией глюкокорти-коидами функциональной экспрессии разных типов ад-ренорецепторов.

РОЛЬ ЭКЗОГЕННЫХ И ЭНДОГЕННЫХ Л ЕЙКОТРИЕНОВ В ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕМ ВЛИЯНИИ ПЕЧЕНИ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ

Павлович С.И.

Институт физиологии им. АЛ. Богомольца НАНУ, Киев, Украина

Работы последних лет подчеркивают потенциальную роль липидных биоэффекторов, в частности лей-котриенов (ЛТ) , в регуляции функций печени, а также в инициировании и развитии патологических процессов в ней. Однако влияние ЛТ на процессы физиологической регенерации печени и процессы репаратив-ной регенерации после её токсического повреждения почти не исследованы. Вместе с тем известно, что печень имеет существенное значение в регуляции иммунных процессов в организме человека и животных как в норме, так и при гепатитах различной этиологии. В то же время вопрос о гуморальном влиянии печени на иммунокомпетентные клетки в условиях воздействия ЛТ изучен недостаточно. Целью данного исследования было изучение влияния экзогенных ЛТВ4 и ЛТС4 и эндогенных ЛТ при ингибировании липоксигеназ нордигидрогуаяретовой кислотой (НДГК) на гистоструктуру эксплантатов интактной и токсически поражённой печени мышей, а также влияние супернатантов от этих эксплантатов на пролиферацию и дифференциацию клеток интактных лимфоузлов. Токсическое поражение печени моделировали 3-кратным введением 50% масляного раствора тетрахлорметана (СС14) в дозе 0,5 мл на 100 г массы тела. Для культивирования эксплантатов и клеток лимфоузлов применяли комбинацию метода диффузионных камер и метода «плотика». ЛТВ4 и ЛТС4 использовали в конечных концентрациях 10'8и 1010 моль, НДГК - в дозах 0,6-10'

5, 0,6-10"6, 0,6-10'7 моль. Гистологическое исследование эксплантатов проводили в динамике культивирования через 10 и 30 мин, 4 и 24 часа. Подсчитывали также количество двуядерных, мйогоядерных гепато-цитов (в %) и митотический индекс (в %о). После воздействия супернатантов на клетки интактных лимфоузлов подсчитывали количество делящихся клеток, а также количество лимфоцитов различной степени зрелости (в %). Показано, что экзогенные ЛТВ4 и ЛТС4 вызывали морфологические изменения в эксплантатах интактной и поражённой СС14 печени, что выражалось в морфологических изменениях сосудистого русла и паренхимы печени, а также регенераторных процессах в ней. При действии ЛТС4 они были более выраженными. Нарушение гистоструктуры эксплантатов печени носило дозозависимый характер и было меньшим при использовании ЛТ в дозе Ю'10 моль, в случае как эксплантатов от интактной, так и поражённой СС14 печени. Наиболее выраженные морфологические изменения и достоверная интенсификация регенераторных процессов регистрировалась через 24 часа после введения ЛТ. В эксплантатах поражённой СС14 печени ЛТ в обеих дозах вызывали усиление токсического повреждения печени, что больше проявлялось в случае ЛТС4. Использование НДГК дозозависимо снижало токсический эффект СС14, что свидетельствовало об участии эндогенных ЛТ в патологическом процессе. Существенное уменьшение некроби-отических зон в паренхиме печени и усиление регене-

раторных процессов отмечалось в присутствии в культуральной жидкости НДГК в дозе 0,6-10‘7моля. Супернатанты выше указанных эксплантатов достоверно стимулировали пролиферацию и дифференциацию лимфоцитов со сменой соотношений типов иммуно-компетентных клеток в сторону более зрелых высокодифференцированных лимфоцитов в случае малых доз блокатора. Наиболее выраженный стимулирующий эффект отмечался при действии супернатантов от ин-тактной печени через 24 часа после применения ЛТВ4 в дозе Ю'10 моль. Супернатанты от эксплантатов поражённой СС14, обработанной обоими ЛТ, вызывали дозозависимое угнетение процесса дифференциации клеток лимфоузлов, что было более выражено при действии ЛТС4. Полученные данные об опосредованном через печень влиянии ЛТ на иммунокомпетен-тные клетки важно учитывать при лечении больных с токсическими поражениями печени.

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ ЭФФЕКТЫ ГИПЕРВЕНТИЛЯЦИОННОГО СИНДРОМА

Панина М.И.

Самарский государственный медицинский университет, Самара, Россия

Гипервентиляционный синдром (ГВС), относящийся к одной из форм нарушений в системе регуляции дыхания и развивающийся при различных функциональных и органических расстройствах, является общеклинической проблемой. Разнообразная симптоматика ГВС определяется неоднозначными перестройками деятельности не только аппарата внешнего дыхания, но и сердечно-сосудистой, нервной, эндокринной и других систем. В последнее время широко обсуждаются вопросы взаимоотношений гипервентиляции, ГВС и бронхиальной астмы. В то же время в литературе отсутствуют сведения о характере иммунологических изменений при ГВС.

Целью настоящей работы послужило определение иммуномодулирующих эффектов ГВС и выявление регуляторных взаимосвязей между содержанием в крови гормонов, биогенных аминов, нейромедиаторов, считающихся своеобразными биомаркерами обострения бронхиальной астмы и различными субпопуляциями иммунных клеток при моделировании острого ГВС у здоровых добровольцев.

Воспроизведение ГВС достигалось благодаря волевому управлению дыханием (VE поддерживалась на уровне 40 л/мин в течение 20 минут). До и после гипервентиляции в крови методом ИФА определялось содержание клеток, экспрессирующих основные CD- (CD3, CD4, CD8, CD16, CD22) и HLA-DR- маркеры, с помощью гистохимических методик - количество больших гранулярных лимфоцитов (БГЛ), выполняющих функцию естественных киллеров и способных депонировать и высвобождать из своих гранул биогенные амины (адреналин, серотонин, гистамин). Параллельно в крови биохимическими методами (с использованием спектрофотометра) исследовались уровни 11-оксикортикостероидов (11-ОКС), адреналина, норадреналина, ацетилхолиноподобных веществ, гистамина и серотонина.

Было обнаружено, что моделирование ГВС сопровождалось достоверным уменьшением содержания моноцитов в 1 мкл крови - на 37% (р<0,05) на фоне тен-

денции к увеличению числа лимфоцитов в 1 мкл крови и доли лимфоцитов среди мононуклеарных клеток (МНК). Гипервентиляция приводила к увеличению процентного содержания среди МНК иммунных клеток, экспрессирующих все определяемые дифференци-ровочные и активационные маркеры - в диапазоне от 6 до 14% от исходного уровня (р<0,05). Достоверно увеличивалось процентное содержание БГЛ среди МНК (р<0,05) и возрастало абсолютное количество в 1 мкл крови БГЛ, депонирующих серотонин и гистамин (р<0,05). Выполнение гипервентиляционной пробы сопровождалось увеличением содержания в крови 11-ОКС в 1,8 раза (р<0,05), адреналина в 2,1 раза (р<0,05) на фоне тенденции к снижению норадреналина на 16%, серотонина на 17,4%, увеличению концентрации ацетилхолиноподобных веществ на 25,3%, гистамина на 8,6% (р>0,05).

Полученные данные показали, что при ГВС выявляется несколько типов регуляторных взаимосвязей между содержанием в крови различных клеток иммунной системы и уровнем биогенных аминов и гормонов. Определены ведущие критерии, влияющие на характер корреляционных зависимостей между субпопуляцион-ным составом лимфоцитов/моноцитов и тестируемыми гормонами и нейромедиаторами: степень отклонения от исходного уровня при ГВС адреналина крови и функциональной активности БГЛ, выраженной величиной суммарного коэффициента аминосодержания. Результаты исследований показали также перспективность использования модели ГВС для изучения роли гипервентиляции в иммунопатогенезе бронхиальной астмы, а также индивидуальных особенностей неспецифической иммунорегуляции в ответ на стрессовые воздействия и выявления дизрегуляционной патологии интегративных систем.

ВЛИЯНИЕ СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ ОЖОГОВОЙ БОЛЕЗНЬЮ НА АДГЕЗИВНУЮ И БИОЦИДНУЮ СПОСОБНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ ДОНОРОВ

Петракова О.В.. Гурманчук И.Е.

Белорусский государственный медицинский университет, Минск, Беларусь

Известно, что полиморфноядерные лейкоциты принимают активное участие в развитии воспалительного процесса, вовлекаясь в него уже на самых первых этапах. Мигрируя в очаг воспаления, они реализуют свои основные функции: фагоцитоз и киллинг бактерий, посредством выброса активных форм кислорода и ферментов, содержащихся в гранулах. Обширные ожоговые повреждения сопровождаются выбросом в системный кровоток огромного количества биологически активных соединений, оказывающих непосредственное влияние на состояние и функции клеток иммунной системы, в том числе и нейтрофильных гранулоцитов

Цель исследования. Изучить влияние растворимых факторов сыворотки крови больных ожоговой болезнью на адгезивную и биоцидную способность нейтрофилов крови доноров.

Материалы и методы. Образцы сывороток крови брались у больных ожоговой болезнью в различные сроки после получения травмы: на 4 - 8 сутки со дня получения травмы (гр.1) и 17 - 20 сутки со дня получения травмы

(rp.II). Площадь ожога у всех больных составляла не менее 25%. В гр.1 было обследовано 11 больных, в гр.И -12. Нейтрофилы доноров получали из гепаринизирован-ной крови путем седиментации цельной крови с последующим центрифугированием образовавшейся лейковзве-си на градиенте плотности фиколл-верографин (1,077 г/мл). Седиментировавшие на дно пробирки вместе с ней-трофилами эритроциты удалялись гипотоническим лизисом с последующим восстановлением изотоничности. Нейтрофилы отмывали и ресуспендировали до концентрации 4х106 клеток/мл в среде RPMI 1640. Клетки помещали в лунки плоскодонного 96-луночного планшета и добавляли равный объем исследуемой сыворотки. В качестве контроля использовали пулированную сыворотку 12 доноров. Исследование адгезивной и биоцидной активности нейтрофилов проводили с использованием микрометодов (P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, Х.И. Истамов, 1995). Полученные результаты обрабатывали с использованием непараметрических критериев Вилкоксона-Манна-Уитни и Вальда-Вольфовица.

Результаты и обсуждение. Были выявлены разнонаправленные изменения активности нейтрофилов доноров в зависимости от исследуемой сыворотки. Так, инкубация клеток с сывороткой больных rp.II, приводила к уменьшению как биоцидной, так и адгезивной их способности по сравнению с контролем (р<0,01). Исследование воздействия сыворотки больных гр.1 на клетки доноров позволило разделить исследуемую группу на две - результатом инкубации было либо увеличение, либо уменьшение биоцидной активности клеток по сравнению с контролем (р<0,05). В случае адгезивной активности клеток достоверных различий между гр. I и контролем выявлено не было. Однако как адгезивная, так и биоцидная активность клеток после воздействия сывороток rp.II была ниже, чем после воздействия сывороток гр.1 (р<0,05).

Согласно современной теории патогенеза сепсиса, выделяют три составляющих системной воспалительной реакции (Roger С. Bone, Charles J. Grodzin, Robert A. Balk, 1997): синдром системного воспалительного ответа (SIRS), синдром компенсаторного противовоспалительного ответа (CARS) и синдром полиорганной недостаточности (MODS). Совместное действие про- и противовоспалительных медиаторов реализуется на уровне клинических проявлений патологического процесса. Анализируя полученные данные, можно предположить, что снижение активирующей способности сыворотки больных гр. II по сравнению с гр. I и донорской сывороткой связано с преобладанием на этом этапе компенсаторного противовоспалительного ответа и с увеличением концентрации противовоспалительных цитокинов в системном кровотоке. При этом снижение активности клеток относительно донорской сыворотки было весьма значительным. Распределение же пациентов гр. I на две, совершенно различных по своему влиянию на донорские клетки (с ги-пер- и гипоактивной сывороткой), позволяет говорить о возможном развитии иммунодепрессии у некоторых из них уже на начальном этапе болезни. На наш взгляд, именно больные с исходной гипореактивностью наиболее подвержены развитию системной иммунодепрессии и полиорганной недостаточности с неблагоприятным исходом.

Заключение. Таким образом, полученные нами результаты позволяют говорить о наличии исходно гипо- и гиперреактивных групп пациентов. Это говорит о необходимости применения диаметрально противоположных подходов при лечении таких больных и коррекции пато-

логического процесса, что в свою очередь требует дальнейшего более глубокого изучения.

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ КОНСЕРВАТИВНЫХ И НЕКОНСЕРВАТИВНЫХ ЭПИТОПОВ ТИРЕОГЛОБУЛИНА ПРИ ПОМОЩИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Пиневич A.A.. Руденко И.Я., Львова O.A., Климович В.Б.

Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт М3 РФ, Санкт-Петербург, Россия

Основной эндокринной функцией щитовидной железы (ЩЖ) является секреция тиреоидных гормонов, которые изначально синтезируются в виде высокомолекулярного белка-предшественника тиреоглобулина (ТГ). На молекуле ТГ человека идентифицировано более 40 антигенных детерминант. При изучении структуры и антигенных свойств молекулы ТГ человека и животных широкое применение получило использование моноклональных антител (МКАТ).

ТГ является высоко консервативным белком. Сравнение первичной структуры ТГ высших позвоночных выявило высокую степень гомологии этих белков. Несмотря на то, что белок, способный связывать йод и иммунологически идентичный ТГ, был идентифицирован уже у асцидий, антигенная структура молекулы ТГ различных видов животных изучена недостаточно. При различных заболеваниях ЩЖ свойства ТГ изменяются. ТГ является тканево-специфическим маркером не только нормальной ткани ЩЖ, но и происходящих из нее дифференцированных опухолей. Злокачественные опухоли ЩЖ являются рано метастазирующими. Выявление ТГ в метастатических опухолях может иметь существенное значение для определения их тиреоидно-го происхождения.

Задачами данной работы были: (а) изучение свойств панели МКАТ против ТГ; (б) отбор МКАТ, пригодных для иммуногистохимического исследования ТГ в ткани ЩЖ; (в) исследование экспрессии консервативных и неконсервативных эпитопов ТГ в ЩЖ животных и человека (в норме и при патологии). В работе была использована панель МКАТ против ТГ человека, полученная в лаборатории Гибридомной Технологии ЦНИРРИ. Свойства МКАТ изучали путем непрямого ИФА. Все МКАТ были помечены изотиоцианатом флуоресцеина (ФИТЦ). В работе были использованы образцы ткани ЩЖ больных аденоматозным зобом (A3, п=12), аутоиммунным тиреоидитом (АИТ, n=l 1), диффузно-токсическим зобом (ДТЗ, п=13), людей без патологии ЩЖ (п=10) и препараты метастазов дифференцированного рака ЩЖ в лимфатические узлы (п=13). Образцы ткани ЩЖ животных включали в себя ЩЖ собаки (п=8), кошки (п=9), крысы (п=10) и мыши (п=14). Ткань фиксировали в формалине, заливали в парафин и готовили срезы толщиной 5 мкм. Полученные препараты исследовали методом прямой иммунофлуоресценции.

Установлено, что 14 исследованных МКАТ распознают 12 антигенных детерминант на молекуле ТГ человека. Путем непрямого ИФА показано, что эпитопы, распознаваемые шестью МКАТ, присутствуют только на ТГ человека, а остальные МКАТ направлены к эпитопам, которые, помимо ТГ человека, представлены на ТГ других исследованных видов животных.

Для иммуногистохимических исследований были отобраны 11 МКАТ, меченых ФИТЦ, распознающие 9 эпитопов на молекуле ТГ. Установлено, что четыре эпитопа, распознаваемых панелью МКАТ являются видоспецифическими для ТГ человека (МКАТ 1G11 или ЗВ7, 1F10, 5Е6 и 5G8). Эпитопы, распознаваемые другими МКАТ (МКАТ 1А8,4В12,5G5,5F5 или 5F9) также экспрессированы наТГ других животных. Эпитоп, распознаваемый МКАТ 12G9, представлен на ТГ всех исследованных видов животных.

Все эпитопы, распознаваемые данной панелью МКАТ, присутствуют на ТГ людей без патологии ЩЖ и больных A3 и ДТЗ. При АИТ выявлено нарушение экспрессии эпитопа, распознаваемого МКАТ 5G8. Иммуногистохимичес-кое изучение препаратов дифференцированных метастатических опухолей ЩЖ в лимфатические узлы показало, что пять МКАТ (1А8,1G11, 4В12,5Е6 и 5G8) взаимодействуют с ТГ, синтезируемым дифференцированными злокачественными клетками, что подтверждает тиреоидное происхождение данных опухолей. МКАТ lF10,5G5n 12G9 не позволили выявить ТГ на тех же препаратах. Эпитоп, распознаваемый МКАТ 5F9, присутствовал на ТГ в случае метастатических опухолей фолликулярного рака ЩЖ, но отсутствовал в случае метастатических опухолей папиллярного рака ЩЖ. Следовательно, в ходе последнего заболевания данный эпитоп слабо экспрессирован на молекуле ТГ или отсутствует.

Таким образом, на молекуле ТГ человека идентифицировано и охарактеризовано 8 эволюционно консервативных эпитопов и 4 видоспецифичных эпитопа.

Исследование выполнено при поддержке РФФИ (грант№ 01-04-49781).

ИЗУЧЕНИЕТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ПЕПТИДОВ НА ЭПИТЕЛИАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ В ПРОЦЕССЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ И СТАРЕНИЯ IN VITRO

Полякова В.О.. Ярилин A.A., Коновалов С.С.

Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия.

Работа посвящена изучению тканеспецифических эффектов цитогенов на эпителиальные клетки в процессе дифференцировки и старения in vitro. Задачи исследования состояли в изучении влияния пептидов вилона (Lys-Glu) и эпиталона (Ala-Glu-Asp-Gly) на процессы пролиферации и некоторых проявлений функции эпителиальных клеток тимуса с акцентом на выявление тканеспецифических эффектов и различий в действии пептидов на клетки, отличающиеся по “возрасту in vitro”.

Материал и методы. Исследования проводились в культуре клеток тимуса человека. Тимоциты выделяли из фрагментов тимуса эмбрионов человека около 20-недельного срока развития. В качестве тимусных эпителиальных клеток (ТЭК) использовали клетки суспензионной линии VTEC2.H/S. Клетки культивировали 1 сутки. Тимоциты и ТЭК культивировали не только порознь (в монокультурах), но и совместно (в ко-культурах с соотношением ТЭК:тимоциты, равном 1:10). Пептиды вводили в культуры на весь срок культивирования в концентрациях 2, 20 и 200 нг/мл. Пролиферацию оценивали радиометрически по включению 3Н-тимидина. Все пробы ставились в триплетах.

Результаты исследований. Оценивали пролиферацию ТЭК, прошедших 1,4 и 7 пассажей в присутствии вилона

и эпиталона и без них. Существенного влияния на включение метки в 1-суточные культуры ТЭК 1-го и 4-го пассажей не наблюдалось. При действии эпиталона на пролиферацию ТЭК 7-го пассажа также не наблюдалось значимых эффектов (тенденция к усилению пролиферации зарегистрирована при дозах 20 и 200 нг/мл). Напротив, все три испытанные дозы вилона существенно усиливали пролиферацию ТЭК, причем наиболее выраженным был эффект дозы 400 нг/мл.

Выводы. Эти данные свидетельствуют:

- о способности вилона усиливать пролиферацию ТЭК в “старых” культурах;

- о тканеспецифичности эффекта пептидов (если учесть, что вилон первоначально выделен из тимуса, а эпиталон - из эпифиза).

Вилон, но не эпиталон, является фактором, в определенной степени “омолаживающим” состарившиеся ТЭК: он повышает пролиферативный потенциал ТЭК, длительно пассированных в культуре. Вилон повышает активность иммунной системы стареющих организмов.

РОЛЬ РАЗЛИЧНЫХ БЕЛКОВ КРОВИ В ВЫСВОБОЖДЕНИИ ЭНДОТОКСИНОВ ИЗ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ БАКТЕРИЙ

Прохоренко И.Р., Белков Д.А., Зубова С.В., Дряглева И.Д, Грачёв С.В., Косякова Н.И.

Институт фундаментальных проблем биологии РАН, Пущино, Россия; Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, Москва, Россия

Эндотоксины, или липополисахариды (ЛПС) - главная структурная составляющая клеточной стенки грам-отрицательных бактерий (Nikaido et al., 1987). При делении или гибели этих бактерий ЛПС высвобождаются в свободном виде или в связанном с белками комплексов. Установлено, что в патогенезе грамотрицательной бактериальной инфекции важную роль играют различные белки крови человека. В целом можно выделить три этапа, предшествующих активации различных клеток-мишеней организма хозяина при действии ЛПС, в которых принимают участие различные белки крови: высвобождение эндотоксинов из клеточной стенки бактерий; нейтрализация, циркуляция эндотоксинов и доставка их к клеткам-мишеням; активация внутриклеточных и межклеточных сигнальных путей. Располагаясь на внешней стороне клеточной стенки бактерий, ЛПС легко доступны для взаимодействия с компонентами сыворотки, которые могут способствовать их высвобождению из бактерии. Tesh и коллеги (1987) нашли, что сывороточные белки крови высвобождают до 30% молекул ЛПС из внешней мембраны Escherichia coli. В настоящей работе исследовалась роль некоторых белков крови в высвобождении эндотоксинов. Эксперименты проводились на грамотрицательной непатогенной бактерии Rhodobacter capsulatus, которая относится к Proteobacteria. На основании теста агглютинации по Линдберг и по данным электрофореза состава Л ПС эта бактерия отнесена нами к RS-хемотипу. ЛПС из Rhodobacter capsulatus использовали в качестве эталона для построения графика зависимости поглощения от концентрации. Нами исследовалось влияние альбумина, лизоцима, фибриногена, лактоферрина и ферритина. В каждом из этих белков предварительно определялась возможность присутствия эндотоксинов. Тщательно отмытые от культуральной среды клетки бактерий помещали

в ПБС-буфер, содержащий в физиологических концентрациях различные белки крови, и инкубировали при 37°С в течение тридцати минут. Супернатант отделяли от клеток центрифугированием и определяли в нём содержание ЛПС спектрофотометрически с помощью карбоцианино-вой краски по модифицированной нами методике. В качестве контроля служило содержание Л ПС в супернатанте клеток, проведённых через условия эксперимента в отсутствие белков в буфере. Наиболее выраженный эффект высвобождения наблюдался у альбумина - (почти в 3 раза выше чем в контроле), затем у ферритина (в 1,5 раза), фибриногена (в 1,3 раза). Эффекты лактоферрина и ли-зоцима были незначительны. По-видимому, среди белков крови ведущая роль в высвобождении ЛПС из клеточной стенки бактерий принадлежит альбумину.

Работа выполнена при поддержке Гранта РФФИ № 01-04-48597.

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО а-ИНТЕРФЕРОНА НА ЭКСПРЕССИЮ CD3 КОМПЛЕКСА Т-ЛИМФОЦИТАМИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

ПутинцеваО.В.. Колтаков И.А., Артюхов В.Г.

Воронежский государственный университет, кафедра биофизики и биотехнологии,

Воронеж, Россия

Введение. Запуск и регуляция эффективного иммунного ответа во многом определяется специфическим распознаванием антигена Т-лимфоцитами. Ответственными за эту функцию являются специальные антигенрас-познающие рецепторы - TCR, которые на мембранах Т-клеток ассоциированы с полипептидным комплексом из

5 белков под общим названием CD3. Этот комплекс необходим для экспрессии TCR на мембране Т-лимфоци-тов, а также для проведения внутрь Т-клетки сигнала о взаимодействии TCR с комплексом пептид - молекула МНС.

Целью данного исследования было изучение влияния человеческого лейкоцитарного а-интерферона в различных концентрациях на экспрессию CD3 комплекса на поверхности мембран Т-лимфоцитов крови доноров.

Материалы и методы. Эксперименты были проведены на Т- лимфоцитах 17 здоровых доноров. Уровень экспрессии CD3 комплексов на поверхности мембран нативных и модифицированных а-интерфероном Т -лимфоцитов определяли методом непрямого иммуно-ферментного анализа с использованием антиСБЗ антител мыши и конъюгата “бараньи антитела против Ig мыши - пероксидаза хрена” (ООО ’’Сорбент” г. Москва). В ходе работы нами был использован человеческий лейкоцитарный а-интерферон производства ГУП “Иммунопрепарат” г. Уфа.

Лимфоциты выделяли из дефибринированной крови доноров методом седиментации (300g, 15 мин ) на градиенте плотности фиколл-урографина (р= 1,076 г/ см3). Полученную суспензию лимфоцитов, содержащую 2-4-106 клеток в 1 мл, разделяли на Т - и В - популяции по методу Terasaki на колонках с синтетической нейлоновой ватой. При оценке влияния различных доз препарата на уровень экспрессии CD3 комплексов на поверхности мембран Т - лимфоцитов крови в условиях in vitro тестируемые клетки инкубировали в присутствии а-интерферона в концентрациях 0,01; 0,1; 1; 10 и 100 МЕ/мл в течение 24 часов при 37°С. Контрольные

образцы клеток инкубировали при тех же условиях в культуральной среде. Результаты экспериментов учитывали спектрофотометрически на ИФА - анализаторе “Униплан” производства ЗАО “Пикон”, г. Москва, измеряя оптическую плотность образцов при длине волны, равной 450 нм, и выражали в единицах оптической плотности.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с помощью прикладных программ “Stadia”. Достоверность отличий контрольных и опытных значений сравниваемых показателей определяли по £-критерию Стьюдента. При этом рассчитывали варьирование показателя при повторных определениях внутри опыта, а также достоверность различий показателя внутри отдельных групп.

Результаты. Экспрессия CD3 комплексов на поверхности Т-лимфоцитов крови доноров варьировала от 0,135 ± 0,012 до 0,223 ± 0,008 и в среднем составила 0,183 ± 0,032. Т-клетки проявили высокую чувствительность к действию модификатора. Все используемые нами концентрации сс-интерферона приводили к увеличению экспрессии CD3 комплекса на поверхности Т-лимфоцитов. Добавление а-интерферона в концентрациях 0,01 и 100 МЕ/мл вызывало увеличение исследуемой величины на 7 - 33%. При инкубации клеток с иммуномодулятором в концентрациях 0,1; 1 и 10 МЕ/мл наблюдалось повышение регистрируемого показателя на 16-36; 32-66 и 52-78 % соответственно. Индивидуальный анализ показал, что ответная реакция лимфоцитов на ту или иную концентрацию модификатора зависела от величины исходного уровня экспрессии исследуемого комплекса. Так, максимальное нарастание регистрируемого параметра отмечалось у лимфоцитов 6 доноров с исходно низкими показателями экспрессии CD3 (от 0,135 ± 0,012 до 0,149 ± 0,007) при концентрации а-интерферона, равной 0,01 МЕ/мл, а у лимфоцитов 11 доноров с высокими контрольными значениями уровня CD3 (от 0,197 ± 0,008 до 0,223 ± 0,008) - при 10 МЕ/мл.

Заключение. Человеческий а-интерферон может использоваться как стимулятор экспрессии для CD 3 комплекса Т-лимфоцитов. Применяя определенные концентрации этого цитокина и зная исходные показатели экспрессии данного комплекса, можно добиваться требуемого уровня экспрессии CD3 на мембранах Т-клеток и тем самым оказывать влияние на его трансмиссивную функцию, на транспорт TCR к клеточной мембране и степень поверхностной экспрессии данного антигена, что, в конечном итоге, приведет к более эффективному распознаванию чужеродных антигенов Т-лимфоцитами и выполнению ими своих функций.

ЛЕЙКИНФЕРОН ИНДУЦИРУЕТ СОЗРЕВАНИЕ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА IN VITRO

Родина A.B.. Москалева Е.Ю., Гукасова Н.В, Луценко С.В., Беляев Д.Л., Бабаянц A.A., Кузнецова С.Ю., Северин С.Е., Северин Е.С.

Всероссийский центр молекулярной диагностики и лечения, г. Москва; НИИ молекулярной медицины ММА им.И.М. Сеченова;Центрмедико-биологичес-ких и экологических проблем, г. Москва

В последние годы большие надежды в разработке противоопухолевых вакцин связывают с созданием клеточных вакцин на основе дендритных клеток (Д К). Уникаль-

ность функции ДК определяется их способностью активировать первичный иммунный ответ наивных Т-клеток. К настоящему времени уже хорошо известны требования, предъявляемые к ДК, используемым для индукции противоопухолевого иммунного ответа. ДК должны быть зрелыми, активированными и способными продуцировать высокий уровень IL-12 и низкий IL-10 и характеризоваться фенотипом CD 14-, МНС II+, CD83++, CD80/86++. Такое состояние ДК достигается с помощью индукции их созревания в процессе инкубации в присутствии коктейля лимфокинов и действия активирующих стимулов (CD40L или ЛПС). В качестве источника лимфокинов используют среду, кондиционированную моноцитами (СКМ), или набор рекомбинантных лимфокинов человека. Первое не очень удобно из-за отсутствия стандартизации получаемых препаратов, второе достаточно дорого. В то же время известно, что иммунокорригирующий препарат лейкинферон представляет собой комплекс цитоки-нов первой фазы иммунного ответа и включает TNFa, IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF a, МИФ и ЛИФ, что позволило предположить возможность использования этого препарата вместо СКМ для индукции созревания ДК. В связи с этим целью настоящего исследования явилось изучение способности лейкинферона и его сочетания с некоторыми другими факторами индуцировать созревание ДК человека in vitro.

ДК получали из выделенных из периферической крови человека моноцитов, культивировали до дня 1, а затем заменяли культуральную среду на среду, содержащую рекомбинантные факторы - ГМ-КСФ (800 ед/мл) и IL-4 (1000 ед/мл) человека. Цитокины добавляли повторно в день 3. В день 5 все неприлипающие клетки собирали, подсчитывали и переносили в свежую полную среду, содержащую ГМ-КСФ и IL-4 в той же дозе, в 6-луночные чашки и добавляли различные стимуляторы для индукции созревания ДК. На день 8-9 ДК собирали и исследовали их фенотип с помощью проточной цитофлуори-метрии. Помимо изменения морфологии и размера ДК в качестве маркеров созревания анализировали на поверхности ДК уровень экспрессии ко-стимулирующих молекул CD80 и CD86.

Показано, что лейкинферон индуцировал созревание ДК уже через 24 часа инкубации (таблица) и оптимальной при этом была его концентрация 100 мкг/мл. При инкубации ДК в присутствии 100 мкг/мл лейкинферона в сочетании с TNFa (50 нг/мл) или с TNFa и ЛПС (50 нг/мл) уровень CD80 и CD86 возрастал до 83 и 89 и 75 и 89% соответственно. Таким образом, использование лейкинферона и особенно его сочетания с TNFa, позволяет получить зрелые ДК, характеризующиеся типичной морфологией и высоким уровнем экспрессии молекул CD80 и CD86. Следующим этапом характеристики зрелых ДК, полученных с помощью лейкинферона и TNFa, будет изучение секреции IL-12 этими клетками.

TIGHT REGULATION OF PRIMARY CYTOTOXIC RESPONSE BY “INNATE HELPER” CELLS AND ITS IMPAIRMENT BY PERSISTING VIRUSES*

Rouzine I., Murali-Krishna K., Ahmed R.

Tufts University, Boston, Massachusetts University of Washington, Seattle, Washington; Emory University, Atlanta, Georgia

Purpose. Knowing how different CTL types interact with each other when responding to a viral threat, and why they fail to clear some viruses, would be useful for developing vaccines and antiviral drugs. In addition to experimental studies of particular cases, this requires finding a mathematical model approximating the complex mechanism of CTL response. Such model can be selected by fitting the existing data on CTL kinetics for viruses causing impaired CTL response.

Methods. HIV/SIV in humans and primates and lymphocytic choreomeningitis virus in mice (LCMV) show similarities at the systemic level of host-virus interaction, such as premature depletion of antigenspecific CD8 T cells, and tropism to same three types of lymphoid cells: CD4 T cells, macrophages and follicular dendritic cells (FDC). We make the hypothesis that the general mechanism of the CTL response impairment is the same for HIV/SIV and LCMV, and that the differences between the two viruses and between LCMV strains are due to quantitative variation of system parameters, rather than to the qualitative differences in the impairment mechanism. We tested a large pool of models against published data on primary CTL response

(4 weeks) obtained in experiments on infection with SIV and 4 strains of LCMV with widely different immunological behavior (Armstrong, WE, Docile, and Clone 13) in 3 different mouse strains. For each experiment, two time dependent immunological quantities were available to fit the model parameters. The virus load as a function of time was considered as external input. Therefore, the results are independent on dynamics of infectable cells and the mechanisms of virus control by CTL.

Results. The simplest fitting model we found includes 8 different subtypes of immune cells and has 15 fitting parameters. It postulates that naive CD8 T cells differentiate into effector and dividing cells that become “transient effector” cells that either die or differentiate into anergic or memory cells. The model specifies which of these processes depend on the antigen and postulates that most of points of CTL differentiation are controlled, in a threshold fashion, by “innate helper” cells. These cells, that are activated all at once at the onset of infection, are not CD4 T helper cells, but either FDC or macrophages. The model assumes that HIV/ SIV and LCMV can infect “innate helper” cells and get them killed by CTL. The model predicts premature depletion of CTL and persistence (delayed clearance) of the virus ob-

* - русская версия тезисов на стр. 225

Мембранный маркер Уровень экспрессии,%

СКМ Лейкинферон, мкг/мл

Время инкубации - 24 часа 1:20 50 100 200

С 080 10 52 56 47

СР86 28 80 80 80

Время инкубации - 48 часов

СЭ80 10 64 65 51

С 086 28 74 75 46

served for SIV and large dozes of LCMV, as well high levels of CTL anergy (LCMV). Small modifications of the model impair fitting dramatically. We propose further tests of the model, including a predicted interference between CTL responses against similar but antigenically distinct virus strains.

Conclusions. We developed a mathematical model of antiviral CTL dynamics that fits CTL response against SIV and four strains of LCMV in three mice types, the fitting parameters varying within one decimal log between virsues, species, and indiviual animals. The difference between persistence and clearance of a virus is mostly due to a variable replication rate, rather than to immunological differences.

The model predicts a new class of “innate helper“ cells that tightly control an early CTL response and precede the expansion of antigen-specific CD4 T helper cells.

МОДУЛЯЦИЯ АКТИВАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОГО АП0ПТ03А КАК МЕХАНИЗМ ЭНДОГЕННОЙ И ЭКЗОГЕННОЙ ИММУНОРЕГУЛЯЦИИ

Сибиряк С.В.

Отдел иммунологии Всероссийского центра глазной и пластической хирургии М3 РФ, Уфа, Россия

Активационно-индуцированная программированная смерть (activation - induced programmed cell death, AICD) зрелых Т-лимфоцитов является ключевым механизмом регуляции силы и продолжительности иммунного ответа, а также одним из способов защиты от формирования аутоагрессивных клонов среди зрелых клеток. Реализация AICD осуществляется, в подавляющем большинстве случаев, по пути Fas-зависимого апоптоза. Экспрессия Fas и FasL тесно сопряжена с TCR-зависимыми сигнальными системами и механизмами, регулирующими клеточный цикл. Выбор клеткой программы реагирования (“позитивная” активация - пролиферация, клональная экспансия, или “негативная” активация - AICD) зависит от множества факторов, среди которых основное значение имеют характер и интенсивность “цитокиновой поддержки”, наличие костимулирующих сигналов и, что не менее важно, состояние внутриклеточного “оксидатив-ного статуса”. Последнее связано с тем, что многие регуляторные белки и транскрипционные факторы имеют редокс-чувствительные группы. Thl клетки значительно более чувствительны к AICD, нежели Th2 лимфоциты, что имеет глубокий биологический смысл. Одной из причин этого является большая устойчивость Th2 к оксида-тивному стрессу, связанная с высоким уровнем внутриклеточного глютатиона и активностью глютатион-S-трансфераз. Среди факторов, определяющих внутриклеточный оксидативный статус, одним из центральных является активность цитохром Р450-зависимых моноок-сигеназ, участвующих в биотрансформации эндогенных и экзогенных липофильных химических соединений.

Среди многочисленных работ феноменологического характера одной из пионерских попыток концептуального осмысления роли апоптоза (по-сути AICD) в регуляции иммунореактивности является концепция “апоптотичес-кого иммунодефицита” (А.Н. Чередеев, Л.В. Ковальчук, 1998 - 2000). В рамках этой концепции развитие вторичных иммунодефицитных состояний рассматривается как преимущественно “апоптотический характер реагирования” (негативная активация). Накапливаются убедительные факты, свидетельствующие о правомерности такого

подхода. Усиление AICD описано при некоторых вирусных инфекциях у человека и животных, при туберкулезе, септических состояниях, хирургической травме. Существенно, что белки некоторых вирусов (HIV) и полисахариды клеточной стенки некоторых бактерий (М. tuberculosis) способны усиливать AICD Т лимфоцитов, что обеспечивает снижение интенсивности иммунного ответа. Имеются работы, свидетельствующие, что развитие т.н. ТЬ2-за-висимой патологии, в частности, бронхиальной астмы и некоторых атопических заболеваний, связано с избыточным активационным апоптозом Thl лимфоцитов. Гиперэкспрессия Fas и усиление Fas-зависимой AICD обнаружены при воздействии стрессовых факторов, причем имеются сведения об участии опиатэргических механизмов в регуляции AICD. Многие ксенобиотики, включая экотоксиканты (2, 3, 7, 8-тетрахлордибензо-р-диоксин, полиаро-матические углеводороды), наркотоксиканты (героин, морфин), лекарственные препараты способны усиливать AICD и Fas-зависимый апоптоз, что лежит в основе развития иммунологической недостаточности. Механизмы, приводящие к гиперэкспрессии Fas, FasL и преобладанию активационного апоптоза при воздействии некоторых химических соединений связаны с развитием внутриклеточного оксидативного стресса и индукцией монооксигениро-вания в клетке. С другой стороны, ряд химических соединений, лекарственных препаратов и эндогенных факторов могут снижать интенсивность Fas-зависимого апоптоза и AICD. Такой способностью обладают биофлавоноиды, L-карнитин, антиоксиданты, эритроциты, некоторые белки сыворотки.

Таким образом, AICD, которая является одним из основных механизмов поддержания иммунного гомеостаза, является весьма чувствительной точкой воздействия различных экзогенных и эндогенных факторов. Важным является и разработка методологии оценки AICD в клинической практике. Исследования в этом направлении представляются весьма перспективными и позволят, на наш взгляд, расширить представления о патогенезе иммунодефицитных состояний и разработать новые подходы к их терапии.

МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК

Соколов Д.И.. Селютин A.B., Сельков С.А.

ГУ Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии РАМНим.Д.О.Отта, Санкт-Петербург, Россия.

Ангиогенез - это рост новых сосудов из ранее существовавших, который тормозится во взрослом организме и в физиологических условиях ограничивается репродуктивной сферой у женщин (формирование желтого тела и плаценты), ростом и развитием плода, заживлением ран. Процессы ангиогенеза также имеют место при патофизиологических процессах, таких как опухолевый рост, диабетическая ретинопатия, артриты, псориаз и атеросклероз. При формировании новых сосудов имеет значение взаимодействие между клетками, ростовыми факторами и компонентами внеклеточного матрикса. При этом эндотелиальные клетки (ЭК) разрушают базальную мембрану, мигрируют, пролиферируют и формируют капиллярные трубки.

Для изучения ангиогенеза используется множество методов, оценивающих пролиферацию эндотелиальных

клеток: включение витальных красителей, МТТ-тест, включение в ДНК бромдезоксиуридина или тимидина, меченого тритием. Для оценки кинетики пролиферации лимфоцитов и гемопоэтических клеток крови используется метод, основанный на включении витального красителя carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE), который при делении клетки равномерно кратно распределяется между дочерними клетками. Учет интенсивности флуоресценции популяции клеток в динамике проводится на проточном цитофлюориметре. Кроме того, дополнительную информацию об интенсивности пролиферации может дать изучение клеточного цикла при помощи окраски ДНК красителем propidium iodide (PI) с последующей оценкой на проточном цитофлюориметре.

Целью настоящего исследования была адапттация метода, основанного на включении CFSE, для оценки интенсивности пролиферации ЭК, а также оценка изменения в клеточном цикле при различных условиях культивирования.

Для этого использовали человеческие эндотелиальные клетки линии ЕА.Ну926, синхронизированные на G1\S стадии клеточного цикла при помощи предварительного культивирования в присутствии афидиколина. Затем клетки окрашивали CFSE и культивировали в среде DMEM с добавлением различной концентрации эмбриональной телячьей сыворотки, эпирубицина или акти-номицина D в течение 3 дней при 37°С и 5% С02. Для оценки клеточного цикла синхронизированные на G1\S стадии клеточного цикла клетки культивировали в среде DMEM с добавлением различной концентрации эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), эпирубицина или актиномицина D в течение суток при 37°С и 5% С02. По окончании культивирования клетки окрашивали PI.

Пролиферация ЭК в присутствии 1% или 5% ЭТС увеличивалась дозозависимо. Пролиферация в присутствии 10% ЭТС не отличалась от таковой в присутствии 5% ЭТС. Культивирование ЭК в присутствии 1% или 5% ЭТС с добавлением эпирубицина или актиномицина D приводила к снижению или остановке пролиферации.

Таким образом, метод основанный на включении CFSE, а также метод оценки клеточного цикла могут использоваться для оценки интенсивности пролиферации ЭК и экспрессии поверхностных молекул в случае применения моноклональных антител, меченых фикоэрит-рином. Указанные методы могут быть использованы для изучения ангиогенеза в норме и при диагностике таких патологий, как опухолевый рост.

ВЛИЯНИЕ L-ИЗОМЕРОВ АМИНОКИСЛОТ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ МОНОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

Суховей Ю.Г.. Костоломова Е.Г., Петров С.А., Береснева JI. А., Унгер И.Г.

Филиал НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Тюмень, Россия

Ангиогенез - это рост новых сосудов из ранее существовавших, который тормозится во взрослом организме и в физиологических условиях ограничивается репродуктивной сферой у женщин (формирование желтого тела и плаценты), ростом и развитием плода, заживлением ран. Процессы ангиогенеза также имеют место при патофизиологических процессах, таких как опухолевый рост, диабетическая ретинопатия, артриты, псориаз и атероск-

лероз. При формировании новых сосудов имеет значение взаимодействие между клетками, ростовыми факторами и компонентами внеклеточного матрикса. При этом эндотелиальные клетки (ЭК) разрушают базальную мембрану, мигрируют, пролиферируют и формируют капиллярные трубки.

Для изучения ангиогенеза используется множество методов, оценивающих пролиферацию эндотелиальных клеток: включение витальных красителей, МТТ-тест, включение в ДНК бромдезоксиуридина или тимидина, меченого тритием. Для оценки кинетики пролиферации лимфоцитов и гемопоэтических клеток крови используется метод, основанный на включении витального красителя carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE), который при делении клетки равномерно кратно распределяется между дочерними клетками. Учет интенсивности флуоресценции популяции клеток в динамике проводится на проточном цитофлюориметре. Кроме того, дополнительную информацию об интенсивности пролиферации может дать изучение клеточного цикла при помощи окраски ДНК красителем propidium iodide (PI) с последующей оценкой на проточном цитофлюориметре.

Цель данной работы - исследование влияния L-изо-меров аминокислот (лизин, серин, изолейцин) на функциональную активность МНК (моноцитов).

Объектом изучения служили мононуклеары, выделенные из периферической крови здоровых доноров. Монослой МНК нагружали раствором аминокислот (лизин, серин, изолейцин) в различных концентрациях. Моноциты получали методом адгезии прилипающих клеток к стеклу. Функциональная активность моноцитов изучалась по методу восстановления нитротетрозолиевого синего (НСТ), ЕА-розеткообразования, ЕА-фагоцитоз. Им-муногистохимическим методом оценивалась экспрессия на моноцитах маркеров Ki-67+ и CD'95+ (“DAKO LSAB” USА) в условиях инкубации с аминокислотами в течение 60 минут.

Установлено: лизин (15,44±0,56%), серин

(1163±0,65%), изолейцин (10,44±0,65%) по сравнению с контролем (9,33±0,33%), каждый в отдельности, достоверно повышают уровень спонтанного кислородзависи-мого метаболизма моноцитов. Кроме того, лизин по сравнению с контролем достоверно увеличивает уровень кис-лородзависимого метаболизма моноцитов в НСТ-стиму-лированном тесте(16,67±0,7 и 12,33+0,53% соответственно), розеткообразование (24,56± 1,59 и 11,0±0,47% соответственно), активность фагоцитоза (18,44± 1,13 и 8,0±0,58% соответственно). После нагрузки серином достоверно возрастает розеткообразование (15,5±1,11%) по сравнению с контролем (11,0±0,47%), уровень фагоцитоза (13,13±1,19 и 8,0±0,58% соответственно) моноцитов. При параллельной оценке апоптотических и пролиферативных маркеров моноцитов человека и их ответе на действие аминокислот in vitro, получены следующие результаты: лизин (5,8±0,5%) и изолейцин (3,4±0,52%) достоверно повышают количество маркера Ki-67+ моноцитов по сравнению с контролем (1,9±0,23%). При этом понижают уровень CD-95+ моноцитов лизин (1,6±0,4%), изолейцин (1,4±0,48%) по сравнению с контролем (2,9±0,23%). Серии достоверно увеличивает количество клеток экспрессирующих маркер CD95+mohouhtob (5,0±1,17% и 2,9+0,23% соответственно), подавляя при этом пролиферацию (1,0±0,45 и 1,9±0,23% соответственно). Установлено что, пороговой концентрацией раствора аминокислот, влияющих на функцию моноцитов, яв-

ляется концентрация, идентичная процентному содержанию аминокислот в первичной структуре альфа-интер-лейкина-1. Обращает на себя внимание, что меньшие концентрации не приводят к значимому изменению функции, при этом большие концентрации оказывают влияние, идентичное пороговой. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что аминокислоты могут являться самостоятельным звеном в регуляции функциональной активности моноцитов.

ИЗМЕНЕНИЕ ОТВЕТОВ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ЭНДОТОКСИНА

ТумкинаМ.Е.. Асташкин Е.И., Грачев С.В.

Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова, Москва, Россия

Врожденный иммунитет играет важнейшую роль в защите организма от патогенов эндогенного и экзогенного происхождения, осуществляя быстрый и неспецифический ответ, направленный на их элиминацию. В некоторых случаях может происходить предактивация (прай-мирование) фагоцитов, когда изменяются их метаболические процессы, подготавливая клетки к потенцированию последующих эффектов чужеродного агента. Неадекватная клеточная активация сопровождается выраженным воспалительным ответом, который может повреждать собственные клетки и ткани и тем самым представлять опасность для организма. Форма и степень клеточного ответа зависят от ряда причин, в том числе, от типа патогенов и особенностей их влияния на клетки.

Целью настоящей работы было изучить воздействие разных эндотоксинов на функциональную активность моноцитов. Объектами исследования являлись свежевыделенные мононуклеарные клетки и изолированные моноциты периферической крови доноров. Клетки выделяли на градиенте плотности Фиколл-Гипак. Для очистки моноцитов от других клеток использовали их адгезию к пластику. В целях предактивации моноциты инкубировали с 10 нг/мл эндотоксина (LPS) S. thyphimurium или E.coli 026:В6 в присутствии 10% аутологической плазмы в течение 1,2,4 и 24 ч. Функциональную активность клеток определяли по люцигенин-зависимой хемилюминес-ценции. Для активации моноцитов использовали LPS (500 нг/мл) и форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA, 1 мкМ), добавленные в разной последовательности.

Базальная хемилюминесценция клеток сложным образом зависела от возраста. Предактивация моноцитов эндотоксином в течение 1-2 ч вызывала усиление клеточного ответа на воздействие РМА. Выявлено, что оба вида эндотоксина снижали ответ на РМА в мононуклеарных клетках и моноцитах, не инкубированных с LPS. Предактивация моноцитов LPS оказывала противоположное действие: последующее добавление того или иного эндотоксина усиливало клеточную хемилюминесценцию в ответ на РМА. Характер клеточного ответа также зависел от возраста. Описанный активирующий эффект на моноцитах людей в возрасте до 55 лет достигался уже после 1 часа инкубации с LPS и сохранялся до 4 часов инкубации. В случае моноцитов людей старше 55 лет прай-мирование клеток наблюдалось только через 2 ч инкубации с LPS, а клеточные ответы были значительно более выраженными. РМА в некоторых случаях стимулировал ответ клеток на LPS, в то время как сам LPS не вызывал никакого эффекта.

Таким образом, воздействие эндогенных и экзогенных эндотоксинов оказывает сложное модулирующее влияние на функциональную активность клеток неспецифического иммунитета. Эти эндотоксины способны праймиро-вать моноциты к воздействию других агентов. Влияние LPS на эффект РМА при праймировании может осуществляться через усиление экспрессии индуцибельной формы протеин киназы С, которая является основной мишенью действия форболового эфира. Увеличение времени праймирования моноцитов и их неадекватная активация у лиц старше 55 лет может обусловливать ослабление иммунной защиты с возрастом.

ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ШАПЕРОНАН8Р70 ПРИ ДИЛАТАЦИОННОЙ КАРДИОМИОПАТИИ

Федоркова О.М., Бобык В.И., Капустин Л.Н., Яковенко Л.Ф., Рябенко Д.В.*, Сидорик Л.Л.

Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, г. Киев, Украина;

* Институт кардиологии им. НД. СтражескоАМН Украины, г. Киев, Украина

Различные виды физиологического стресса (тепловой шок, радиация, гемодинамические нарушения, ишемия, оксидативный стресс и др.) обусловливают множественные изменения в клетках, в том числе структуры и функции белков. Неправильная укладка вновь синтезированных полипептидных цепей белков может служить молекулярным базисом многих патологий - от аутоиммунных до раковых. Корректность укладки, определяющая точность реализации генетической информации, зависит от функционирования молекулярных шаперонов (HSPs), которые являются основным фактором в клеточном механизме контроля качества белков. HSPs определяют корректность процессов белкового синтеза на транскрипционном и посттрансляционном уровнях, опосредуют импорт предшественников белков органелл в соответствующие им клеточные компартменты, участвуют в редукции окислительного стресса, репарации ионных каналов, апоптозе, формировании стероидных рецепторов, модуляции иммуноопосредованного поражения клеток, в процессах синтеза коллагена при репаративном фиброзе. Выявлена активная роль шаперонов в физиологии клетки, цитопротекции, формировании стресс-индуцируемых регуляторных цепей.

Активное участие в важнейших процессах клетки свидетельствует, что эти белки играют ведущую регуляторную роль в обеспечении репарации и деградации, а “поломки” в функционировании этой “белковой машины” -одна из причин дисфункции и повреждения органов и тканей. Цель исследования: изучить изменения экспрессии шаперона Hsp70 - одного из основных кардиопротек-торных стрессовых белков, при дилатационной кардио-миопатии (ДКМП) у человека и в динамике на разработанной авторами на мышах модели миозининдуцирован-ного аутоиммунного поражения миокарда, подобного ДКМП человека [2].

Показано, что существенное снижение уровня экспрессии HSP 70 в цитоплазме и митохондриях пораженного ДКМП миокарда коррелировало как с повышением уровня антимиозиновых и антитропониновых аутоантител, так и с падением АТФазной активности кардиального миозина. На конечном этапе болезни у человека резко падает количество цитоплазматической и митохонд-

риальной фракции HSP 70. Анализ полученных нами результатов и литературных данных о различных физиологических функциях цитозольных и митохондриальных HSP70 позволили выдвинуть гипотезу развития ДКМП, согласно которой изменение экспрессии шаперо-нов может быть одной из основных причин развития митохондриальной дисфункции и появлению неправильно уложенных белков, что в конечном итоге может приводить к развитию аутоиммунного процесса.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКАДИНАМИКИ СЫВОРОТОЧНОГО УРОВНЯ TGF-ß1 И УДЕЛЬНОГО СОДЕРЖАНИЯ КОЛЛАГЕНА В ХОДЕ ФИБР03ИР0ВАНИЯ

Федулов A.B.. Сесь Т.П., Гавришева H.A.

Санкт -Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия

Введение. Согласно современным представлениям, трансформирующий ростовой фактор - бета 1 (TGF-ßl) является ключевым сигналом для клеток-эффекторов фиброза - фибробластов. В исследованиях in vitro показано, что уровень TGF-ßl линейно связан с удельным содержанием коллагена, в том числе в ходе фиброзирова-ния в органах дыхания, в печени и при развитии фиброза миокарда (ФМ). Предположительно, сывороточный TGF-ßl может являться прямым маркером ФМ. Однако в некоторых исследованиях in vivo было продемонстрировано отсутствие прямой связи между уровнем TGF-ßl и выраженностью фиброза. ФМ развивается, в частности, при хронической почечной недостаточности (ХПН), этот процесс опосредует развитие ряда ранних сердечно-сосудистых осложнений, для которых отсутствуют надежные предикторы.

Целью нашего исследования явилось сравнительное изучение содержания TGF-ßl и удельной площади коллагена в миокарде на ранних стадиях фиброзирования на модели хронической почечной недостаточности (ХПН).

Материалы и методы. Исследование проводили на 45 беспородных белых крысах-самцах (питомник “Рап-полово” РАМН, Санкт-Петербург). Моделирование ХПН осуществлялось путем левосторонней нефрэктомии с одновременной электрокоагуляцией 25 % коркового вещества правой почки. Уровень TGF-ßl в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом. Количественная оценка степени выраженности ФМ проводилась стереометрическим методом. Животных выводили из эксперимента через 2,4 и 6 месяцев после операции. Наступление ХПН подтверждено повышением содержания мочевины плазмы крови и увеличением артериального давления, а также при морфологическом исследовании ткани почки. В качестве контроля использовались интактные животные. При проведении статистического анализа использовали корреляционный анализ и метод множественной регрессии. Оценка достоверности разности средних проводилась с помощью U-критерия Манна-Уитни.

Результаты. Содержание TGF-ßl в сыворотке крови достоверно повышалось со второго месяца после операции (122,4±4,8 нг/мл; в контроле: 106,3±3,6 нг/мл; р<0,05). На 4 месяце этот показатель достигал максимального значения (137,6+1,8 нг/мл; р<0,05), оставаясь высоким и на сроке 6 мес. (135,2±4,0 нг/мл; р>0,05 по сравнению с 4 мес.). Удельная площадь коллагена в миокарде на сроках 2 и 4 мес. не отличалась от контроля

(8,8±0,9%), наблюдалась незначительная тенденция к снижению показателя. На сроке 6 мес. ХПН содержание коллагена значительно увеличилось и составило

11,7±0,7% (р<0,05). Таким образом, максимальный уровень ТСР-Р1 достигается на предыдущем, по сравнению с увеличением площади коллагена, сроке; после этого рост концентрации ТСР-Р1 прекращается. Линейная связь между удельной площадью коллагена в миокарде и уровнем ТСгР-р1 при сквозном анализе отсутствовала (р>0,05), что объясняется дискордантностью динамики показателей на сроках 2 и 4 месяца. Для исключения фактора времени была определена корреляция между данными показателями в контроле и в группе 6 мес. ХПН. Коэффициент корреляции Пирсона составил 0,582 (р<0,05). Для оценки связи между этими показателями с учетом фактора времени была построена модель множественной регрессии. Коэффициент множественной корреляции составил 11=0,439, коэффициент детерминации составил 112=0,193; Р-критерий оказался равен Р=3,7, уровень значимости р=0,036. Прогнозируемые значения для удельного содержания коллагена при неизменном уровне ТСР-Р1 составили: 12,6% для 10 мес., 13,8% для

12 мес. Было выполнено определение чувствительности и специфичности ТСР-Р1 как маркера ФМ без учета фактора времени для п=15 при пороговых значениях, надежно превышавших контрольные показатели. Чувствительность составила 86% (достаточно высокий результат для небольшой выборки нелинейных животных), специфичность - 75%.

Заключение. Повышение уровня ТСР-Р1 предшествует увеличению удельной площади коллагена в миокарде, поэтому на некоторых исследуемых сроках эти показатели могут не коррелировать, что необходимо учитывать в лабораторной диагностике фиброзирующих процессов. Связь ТСР-Р1 с прогрессированием ФМ и временем развития процесса может быть охарактеризована в модели множественной регрессии. Сывороточный ТСР-Р1 обладает достаточно высокой чувствительностью и умеренной специфичностью, и, с учетом его участия в механизме фиброзирования, может быть рекомендован к клиническому изучению как неинвазивный прогностический маркер ФМ.

МОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ АМИНОКИСЛОТ В КУЛЬТУРЕ ЛИМФОИДНЫХТКАНЕЙ С РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНЬЮ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ЗРЕЛОСТИ

Хаазе Г.. Чалисова Н.И.. Барыкина О.П., Пеннияйнен В.А.

Клиника иммунотерапии, Прюм, Германия, Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербургский Институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия

В тканях существует разнонаправленная регуляция репаративных процессов как в сторону стимуляции клеточной пролиферации, так и ее ингибирования за счет процессов апоптоза. Исследовалось действие заменимых и незаменимых аминокислот - лизина, аргинина, аспарагина, глутамата на развитие органотипической культуры фрагментов селезенки от 1-дневных и от иммунологически зрелых 21-дневных крыс.

Эффективной концентрацией для всех исследованных в культуре лимфоидной ткани аминокислот была

концентрация 0,05 нг/мл. Оценивались индекс площади (ИП) и индекс апоптоза (ИА), как показатели интенсивности развития эксплантатов. В культуре ткани селезенки 1-дневных крыс при действии 0,05 нг/мл лизина ИП уменьшался на 40+3% (п=22, р<0,05) по сравнению с контролем (п=23). При введении в культуральную среду 0,05 нг/мл аргинина зона роста уменьшалась , что выражалось в снижении ИП на 22+5% (п=23, р<0,05) по сравнению с контролем (п=22). Под влиянием 0,05 нг/мл аспарагина ИП снижался на 25+1% (п=25, р<0,05), по сравнению с контролем (п=20), а при действии 0,05 нг/ мл глютамата ИП уменьшался на 21+3% (п=20, р<0,05), по сравнению с контролем (п=18). В то же время ИА увеличивался при действии соответствующих аминокислот на 40-120%, что отражает участие процессов апоптоза в ингибировании развития незрелой лимфоидной ткани 1 -дневных крыс. В культуре селезенки 21 -дневных крыс при действии 0,05 нг/мл лизина ИП увеличивался на 49+5% (п=20, р<0,05) по сравнению с контролем (п=21). При введении в культуральную среду 0,05 нг/мл аспарагина или аргинина зона роста стимулировалась на 32-35% по сравнению с контрольными эксплантатами. При действии 0,05 нг/мл глютамата ИП увеличивался на 27+3% (п=22, р<0,05), по сравнению с контролем (п=19). В то же время отмечалось враженное снижение процессов апоптоза, и ИА уменьшался при действии соответствующих аминокислот на 27-58%.

На основании проведенных экспериментов можно полагать что аминокислоты, являющиеся структурными элементами молекул белков и пептидов, сами могут обладать модулирующими свойствами в отношении основных физиологических процессов в клетках лимфоидной ткани, причем эти процессы имеют различную степень выраженности в зависимости от ее иммунологической зрелости. 21-й день является критическим периодом в онтогенезе крыс, к этому времени происходят процессы формирования иммунологической толерантности за счет селекции лимфоцитов и измененяется иммунологический статус. В этот период, в отличие от раннего неонатального периода, при действии аминокислот в культуре ткани наблюдается стимуляция процессов клеточной пролиферации.

ИЗМЕНЕНИЕ СИСТЕМ ПОДДЕРЖАНИЯ ГОМЕОСТАЗА ИОНОВ СА2+ В ПРОЦЕССЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ Т-КЛЕТОК ПАМЯТИ ПКЧ ИЗ НАИВНЫХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ В ХОДЕ ПЕРВИЧНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА

Хайдуков С.В.. Литвинов И.С.

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, Москва, Россия

Две популяции CD4+ Т-лимфоцитов периферической крови человека (ПКЧ) качественно различаются по системам гомеостаза Са2+. Покоящиеся наивные Т-клетки ПКЧ с фенотипом: CD3+ CDllalow CD25‘ CD26' CD29-CD45RA+ CD45R0- CD62Lh«h CD69' CD95- H LA-DR’ -представлены чувствительными к действию иономици-на клетками. Значительная часть покоящихся CD4+ Т-лимфоцитов памяти ПКЧ с фенотипом CD3+ CDllahish CD26+ CD28+ CD29+ CD44hi«h CD45RA' CD45 R0+

CD62Llow CD95low - состоит из резистентных к действию иономицина (ИР) клеток. Возникает вполне закономерный вопрос: на какой стадии дифференцировки наивных CD4+ Т-клеток происходит перестройка гомеостаза Са2+ в цитоплазме клеток?

Важнейшим качественным маркером перехода клеток из популяции покоящихся наивных Т-лимфоцитов ПКЧ в покоящиеся Т-клетки памяти является появление на их поверхности молекул CD45R0. Неполное исчезновение CD4+ CD45RA+ CD45R0' Т-клеток из состава Т-клеток ПКЧ после действия иономицина свидетельствует о резистентности к Са2+-иоофору определенной части активированных CD4+ CD45R0+ CD45RA+ Т-клеток. Сопоставимые результаты были получены для более чем 100 доноров. Следовательно, среди активированных in vivo CD4+ CD45RA+ CD45R0+ Т-лимфоцитов ПКЧ присутствуют и ИР-популяция, и чувствительные к действию иономицина клетки.

Молекулы CD69 принято считать маркером наиболее ранней стадии активации наивных CD4+ Т-лимфоцитов. Согласно проведенному фенотипическому анализу, в составе ПКЧ доля CD3+ CD69+ Т-клеток составляла, как правило, менее 2 % от общего числа CD3+ Т-лимфоцитов. Среди ИР-фракции ПКЧ Т-клетки с данным фенотипом практически никогда не встречались. Сопоставимые результаты были получены для двадцати доноров. Скорее всего, большинство CD4+ Т-лимфоцитов ПКЧ на ранней стадии активации являются чувствительными к действию иономицина. Молекулы CD25 появляются на более поздней стадии активировации CD4+ Т-лимфоци-тов ПКЧ. Согласно современным представлениям, появление молекул CD25 на поверхности Т-клеток принято считать специфическим маркером стадии пролиферации активированных клеток. В ИР-фракции доля активиро-ваных CD3+ CD25+ Т-лимфоцитов незначительно отличалась от значений для клеток с данным фенотипом в составе ПКЧ. Скорее всего, на этой стадии активации CD4+ Т-лимфоцитов in vivo в составе популяции присутствуют приблизительно равные доли чувствительных к действию иономицина и ИР-клеток. Появление молекул HLA-DR на CD4+ Т-лимфоцитах ПКЧ является общепринятым маркером наиболее поздней стадии активации Т-клеток. В ИР-фракции доля CD3+ HLA-DR+ Т-клеток всегда была выше, чем в ПКЧ того же донора. Скорее всего, на поздних стадиях активации в ходе первичного иммунного ответа in vivo значительная часть активированных Т-лимфоцитов приобретает резистентность к действию иономицина.

Работа осуществлена при поддержке РФФИ грант № 03-04-48190.

ВЛИЯНИЕ МИКРОСТИМА НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ КРОВИ

Чистохина Л.П.

Пермское Научно-производственное объединение «Биомед», Пермь, Россия

Многочисленные исследования функциональной активности микрофлоры человека и изучение механизма действия пробиотических препаратов подтверждают способность лактобактерий оказывать положительное влияние на различные звенья иммунной системы (Воробьев и др., 1999). Помимо иммуномодулирующего действия

пробиотики на основе лактобактерий обладают противоопухолевой активностью, а также способствуют повышению антибактериальной и противовирусной резистентности (Бондаренко и др., 1998; Шендеров, 2001). В Пермском НПО «Биомед» по оригинальной технологии из культуральной жидкости бактерий штамма Lactobacillus plantarum 8Р-АЗ, используемого в производстве лактобак -терина сухого, получен препарат микростим. Действующим началом микростима являются низкомолекулярные метаболиты лактобактерий, которые, как показали ранее проведенные исследования, проявляют пробиотическую и иммуномодулирующую активность, в частности, достоверно стимулируют гуморальный иммунный ответ.

Целью настоящей работы явилось исследование влияния микростима на фагоцитарную активность нейтро-филов крови.

Материалы и методы. Эксперимент проведен на белых беспородных мышах-самцах массой 18-20 г. Животным опытной группы вводили микростим per os с помощью зонда ежедневно 1 раз в сутки в течение 5 дней в дозе 0,14 мл/кг. Контрольным животным вводили эквиобъем-ное количество воды очищенной. Фагоцитарную активность нейтрофилов крови оценивали по модифицированному методу В.Н. Каплина (1996). В качестве объекта фагоцитоза использовали формалинизированные эритроциты барана. Рассчитывали абсолютные и относительные показатели фагоцитоза по Ю.И. Шилову и др. (1998). Полученные данные обработаны статистически и представлены в виде средней арифметической и ее средней ошибки (М±т). Достоверность различий между группами оценивали с помощью i-критерия Стьюдента.

Основные результаты. Представленные в таблице материалы свидетельствуют, что пероральное введение микростима оказывает стимулирующее действие на фагоцитарную активность нейтрофилов крови экспериментальных животных. Эффект проявляется в достоверном повышении относительных и абсолютных показателей фагоцитоза. При этом практически в 2 раза возрастает процентное содержание и абсолютное число активных фагоцитов (поглотивших два и более объектов), с одновременным увеличением (также практически в 2 раза) абсолютного числа захваченных объектов фагоцитоза. Таким образом, исследование влияния нового лекарственного препарата на поглотительную способность нейтрофилов крови явилось высоко информативным показателем в плане оценки его иммунотропных свойств.

Заключение. Введение микростима per os приводит к стимуляции фагоцитарной активности нейтрофилов крови. Данный эффект является еще одним проявлением иммуномодулирующего действия препарата, содержащего метаболиты лактобактерий. Результаты исследований

являются предпосылкой для использования микростима в комплексной терапии различных иммунодефицитных состояний.

ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОКИНОВ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПОСЛЕ СТИМУЛЯЦИИ НАГРУЖЕННЫМИ ДЕНДРИТНЫМИ КЛЕТКАМИ

Чкадуа Г.З.. Заботина Т.Н., Буркова А.А., Огородникова Е.В., Кадагидзе З.Г.,

Барышников А.Ю. Юрин B.JL, Вейко В.П.

ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, ФГУП "ГосНИИгенетика ", Москва, Россия

Одной из важных задач иммунотерапии онкологических заболеваний, а в частности вакцинотерапии, является индукция специфического клеточного иммунного ответа. На сегодняшний день в онкологических центрах мира интенсивно проводят исследования по использованию вакцин на основе дендритных клеток ( ДК). Условно принято разделение CD4 Т-лимфоцитов на Т-хелперы 1 типа (Тх1) и Т-хелперы 2 типа (Тх2), которые способствуют развитию клеточного или гуморального иммунного ответа, соответственно. Отличительной особенностью Тх1 от Тх2 является спектр секретируемых цитокинов. Так, для Тх1 характерна секреция интерферона-у (IFN-y), тогда какдляТх2 - интерлейкина-4 (IL-4). Преимущество в развитии клеточного или гуморального иммунного ответа, помимо всего прочего, зависит от взаимодействия Т-хел-пера с дендритной клеткой. Как показывают данные литературы, в зависимости от условий культивирования может меняться спектр секретируемых цитокинов дендритными клетками, что в конечном счете приводит к активации Тх1 или Тх2.

Целью работы явилось внутриклеточное определение цитокинов Т-лимфоцитов после взаимодействия с аутологичными нагруженными дендритными клетками.

Материалы и методы. Клетки культивировали при 37°С и 5% С02 в RPMI-1640, содержащей 2% (для дендритных клеток) или 5% (для совместного культивирования ДК с лимфоцитами) человеческой сыворотки (ЧС) группы АВ, L-глутамин, HEPES, антибиотики, витамины, Р-меркаптоэтанол (далее полная среда (ПС)). Мононуклеары периферической крови (МПК) выделяли из лейкомассы здоровых доноров или онкологических больных, центрифугировали в градиенте плотности Ficol-Hepaque (Pharmacia, Швеция) ( =1,077). МПК ре-суспендировали в ПС и наносили на чашки Петри d=90 мм (Costar, США) в количестве 50-106 клеток в 10 мл среды и инкубировали в течение 1,5 ч при 37°С и 5% С02. Затем отбирали неприлипшие клетки и подвергали кри-

Табл. ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ МЫШЕЙ ПРИ ВВЕДЕНИИ МИКРОСТИМА

Показатели фагоцитоза Контроль Микростим

Процент фагоцитоза 39,70±2,93 62,80±2,67 ***

Фагоцитарное число 0,71 ±0,06 1,27±0,09 ***

Фагоцитарный индекс 1,76±0,05 2,00±0,06 **

Процент активных фагоцитов 18,30±2,20 33,60±2,68 ***

Абсолютное число фагоцитирующих клеток, х 109/л 1,48±0,14 2,20±0,31 *

Абсолютное число захваченных объектов фагоцитоза, х 109/л 2,63±0,28 4,41±0,60 *

Абсолютное число активных фагоцитов, х 109/л 0,67±0,08 1,18±0,17 *

Примечание: * р< 0,05; ** р< 0,01 ; *** р< 0,001 в сравнении с контрольной группой.

Табл. 1. ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ ОКРАШИВАНИЕ CD3 Т-ЛИМФОЦИТОВ НА 7-е СУТКИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ.

Ненагруженные ДК ДК нагруженные ОЛ ДК нагруженные Df3/Muc1

IL-4 1,2% 2,0 % 2,1 %

IFN-y 11,5% 40,0 % 32,5 %

оконсервации для последующего использования, а к ад-гезированным на пластике моноцитам добавляли 10 мл ПС, содержащей 80 нг/мл ГМ-КСФ (Leucomax, Shering-Plough) и 10 нг/мл IL-4 (R&D Systems, США). На 2е, 4е и 6е сутки культивирования к ДК добавляли по 2 мл ПС, содержащей 800 нг ГМ-КСФ и 100 нг IL-4. ДК нагружали на 7е сутки культивирования, для этого производили полную замену культуральной среды в чашке Петри, после чего к клеткам добавляли, либо опухолевый лизат (ОЛ) меланомы, исходя из соотношения 1 ДК: 1,5-2 ли-зированные опухолевые клетки, либо гибридные Ту-ча-стицы, содержащие Df3/Mucl онкопептид (конечная концентрация 10 мкг/мл). Для терминальной дифферен-цировки ДК спустя 2 часа к культуре клеток добавляли фактор некроза опухоли- (конечная концентрация 40 нг/мл) (ICN, США) и простагландин Е2 (конечная концентрация 500 нг/мл) (ICN, США) и культивировали в течение 2х суток. Далее размораживали аутологичные лимфоциты и вносили по 1х10б клеток в лунку 24х луночного планшета. После этого к лимфоци-там добавляли по 1х105 зрелых нагруженных или ненагруженных ДК и совместно культивировали в течение 7 суток. На 2е, 4е и 6е сутки в лунки вносили интерлейкин-2 (Chiron, Нидерланды) (конечная концентрация 100 Ед/мл). За 4 часа до окончания культивирования в лунки вносили брефелдин A (ICN, США) для предотвращения секреции цитокинов. Затем собрали лимфоциты и провели реакцию иммунофлуоресценции для определения поверхностного антигена CD3 и внутриклеточного определения цитокинов: IFN-у и IL-4. Иммунофенотип определяли на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (Becton-Dickinson, США).

Результаты. Во всех экспериментах ДК имели зрелый иммунофенотип ( 70% CD83+ клеток). В случае совместного культивирования ДК больного меланомой, нагруженных аутологичным опухолевым лизатом, с аутологичными лимфоцитами, через 7 суток среди CD3+ Т-лимфоцитов выявляли 4,6% клеток, окрашенных по IL-4 и 38,0% клеток, окрашенных по IFN-у. При культивировании нагруженных или ненагруженных ДК здорового донора с аутологичными лимфоцитами были получены следующие результаты (табл. 1).

Полученные данные свидетельствуют, что условия культивирования ДК и антигены (OJI и гибридные Ту-частицы, содержащие Df3/Mucl онкопептид), которые использовали для нагрузки ДК способствуют, развитию клеточного иммунного ответа.

ИММУНОМОДУЛ ИРУЮЩИЕ ЭФФЕКТЫ ТЕСТОСТЕРОНА ПРИ РАЗВИТИИ ЛОКАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТАУ КРЫС

Шилов Ю.И.. Зимина Ю.В.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермский государственный университет, Пермь, Россия

Ранее при исследовании влияния тестостерона на системный гуморальный иммунный ответ, индуцированный у мышей или крыс внутривенным или внутрибрю-

шинным введением эритроцитов барана, выявлен как стимулирующий, так и депрессивный эффект на число антителообразующих клеток (АОК) в селезенке [Цырлова, 1977; Кеворков, Швецов, 1979; Цырлова, Козлов, 1981]. Поскольку тестостерон усиливал эритропоэз, постулировалась возможность опосредованности его действия через конкуренцию между дифференцировкой стволовых кроветворных клеток в эритроидном и лимфоидном направлениях [Козлов и др., 1982], а также через эритроид-ные клетки-супрессоры [Лорд и др., 1987]. В то же время влияние тестостерона на иммунный ответ, развивающийся преимущественно на территории регионарных лимфатических узлов, в которых отсутствуют эритроидные клетки-предшественники, ранее не изучалось. Удобной экспериментальной системой для подобных исследований может служить модель локального иммунного ответа при подкожной иммунизации.

Цель работы - исследование иммуномодулирующих эффектов тестостерона при развитии локального иммунного ответа на эритроциты барана у крыс.

Материалы и методы. Эксперимент выполнен на кры-сах-самцах популяции \\%1аг массой 246±7 г. Животным опытной группы в течение 14 дней ежедневно подкожно вводили официнальный препарат тестостерона пропионата в суточной дозе 2 мг/животное. Инъекции гормона заканчивали за 24 ч до забоя. Контрольным крысам по той же схеме вводили растворитель гормона. Дополнительным контролем служили животные, не получавшие препаратов. На 10-й день от начала введения препаратов крыс сенсибилизировали эритроцитами барана (108 клеток подкожно в подошвенную поверхность правой стопы). На 4-е сут после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена (109 эритроцитов подкожно в правую стопу, в левую контрольную стопу вводили 0,1 мл изотонического раствора ЫаС1). Через 24 ч (15-е сут эксперимента) оценивали гуморальный ответ по числу АОК в регионарном (правом подколенном), отдаленном (левом подколенном) лимфатических узлах (ЛУ) и селезенке методом локального гемолиза в геле агарозы, а также выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Индекс реакции ГЗТ рассчитывали по формуле: (Ро-Рк)/Ркх100%, где Ро - показатели толщины стопы опытной конечности; Рк - то же контрольной конечности. Помимо этого проанализированы изменения клеточности центральных и периферических органов иммунной системы.

Основные результаты. Установлено, что в условиях использованной схемы иммунизации развивался локальный иммунный ответ с преимущественным увеличением числа АОК только в регионарных ЛУ, в то время как в селезенке и отдаленных ЛУ количество АОК приближалось к показателям неиммунизированных животных (см. таблицу). Введение тестостерона приводило к угнетению гуморального иммунного ответа. Этот эффект проявлялся уменьшением количества АОК в регионарном лимфатическом узле в сравнении с показателями обеих контрольных групп (р<0,01). Количество АОК в селезенке и отдаленном лимфатическом узле статистически значимо снижалось только в сравнении с животными, не получавшими препаратов. Помимо этого отмечено выраженное угнете-

Табл. ВЛИЯНИЕТЕСТОСТЕРОНА ПРОПИОНАТА НА ЧИСЛО АОК И ВЫРАЖЕННОСТЬ ГЗТПРИ ЛОКАЛЬНОЙ ФОРМЕ ИММУННОГО ОТВЕТА НА ЭРИТРОЦИТЫ БАРАНАУ КРЫС

Экспериментальное

воздействие

Число АОКа

регионарный ЛУ

отдаленный ЛУ

селезенка

Индекс

реакции

ГЗТ

Тестостерона Пропионат Растворитель гормона

3439,8*#

18820.4

27439.4

4,04

12,40

11,05

167,5

310.8

294.8

4,3±2,0*#

14,8±1,3

4,8±2,2

Примечания:а - средние геометрические числа АОК на орган (антилогарифм из средней арифметической logl0 числа АОК);

* - р<0,05 в сравнении с контролем 1; * - то же с контролем 2.

ние ГЗТ. Исследование изменений клеточности органов лимфомиелоидного комплекса выявило значительное снижение числа ядросодержащих клеток в тимусе и менее выраженное уменьшение клеточности селезенки.

Заключение. Введение тестостерона приводит к выраженному угнетению антителообразования и реакции гиперчувствительности замедленного типа при развитии локальной формы иммунного ответа на эритроциты барана у крыс.

МОДИФИКАЦИЯ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ ЭФФЕКТОВ ГИДРОКОРТИЗОНА В УСЛОВИЯХ БЛОКАДЫ Р-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ

Шилов С.Ю. Шилов Ю.И., Черешнев В. А.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Изменения экспрессии адренорецепторов и трансдук-ции с них сигнала под действием глюкокортикоидов в клетках-мишенях различных органов могут лежать в основе взаимодействия эффектов этих гормонов и катехоламинов при стрессе [Elenkov etal., 1999; 2000]. Показано, что в условиях блокады p-адренорецепторов отменяется депрессивное действие стресса на реакцию гиперчувствительности замедленного типа и пролиферативный ответ лимфоцитов, наблюдается выраженная активация функций фагоцитирующих клеток [Шилов, Гейн, 1998; Шилов, Орлова, 2000; Shilov, Orlova, 1997; Nelson, Lysle, 1998]. Однако вклад изменения экспрессии р-адре-норецепторов глюкокортикоидами в их иммуномодулирующее действие изучен недостаточно.

Цель работы - исследование иммуномодулирующих эффектов гидрокортизона в условиях фармакологической

блокады Р-адренорецепторов при развитии иммунного ответа на эритроциты барана у крыс.

Материалы и методы. Эксперимент выполнен на крысах-самцах популяции \\^51аг. Животным 1-й группы вводили однократно внутрибрюшинно гидрокортизон в дозе 50 мг/кг. Крысам 2-й группы вводили гидрокортизон в той же дозе на фоне блокады Р-адренорецеп-торов (4 инъекции пропранолола гидрохлорида по 5 мг/ кг массы тела подкожно с интервалом 3 часа, 1-я инъекция за 30 минут до введения гидрокортизона). Животные 3-й группы служили контролем. Через 3 ч после введения гидрокортизона крыс сенсибилизировали эритроцитами барана (2х109 клеток подкожно в подошвенную поверхность правой стопы). На 4-е сут после сенсибилизации вводили разрешающую дозу антигена (2х109 эритроцитов подкожно в правую стопу, в левую контрольную стопу вводили 0,1 мл изотонического раствора №С1). Через 24 ч (5-е сут эксперимента) оценивали гуморальный ответ по числу антителообразующих клеток (АОК) в регионарном (правом подколенном), отдаленном (левом подколенном) лимфатических узлах (ЛУ) и селезенке методом локального гемолиза в геле агарозы, а также выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ). Индекс реакции ГЗТ рассчитывали по формуле: (Ро-Рк)/Ркх100%, где Ро - показатели толщины стопы опытной конечности; Рк - то же контрольной конечности. Помимо этого оценивали изменения клеточности центральных и периферических органов иммунной системы.

Основные результаты. Как видно из таблицы, изолированное введение гидрокортизона приводило к значительному уменьшению уровня АОК на высоте иммунного ответа в регионарных ЛУ (р<0,001), в условиях блокады Р-адренорецепторов этот эффект отменялся, и число

Табл. ВЛИЯНИЕ ГИДРОКОРТИЗОНА В УСЛОВИЯХ БЛОК/ЩЫ р-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ НА ЧИСЛО АОК И ВЫРАЖЕННОСТЬ ГЗТ ПРИ ИММУННОМ ОТВЕТЕ НА ЭРИТРОЦИТЫ БАРАНАУКРЫС

Экспериментальное воздействие Число АОКа Индекс реакции ГЗТ

регионарный ЛУ отдаленный ЛУ

Гидрокортизон (п=10) 1174,3* 16,97 5,70±2,09*

Гидрокортизон+пропранолол (п=7) 9284,1* 14,46 10,03±1,26

Контроль (п=11) 15171,5 23,56 14,39±2,16

Примечания:а - средние геометрические числа АОК на орган (антилогарифм из средней арифметической logl0 числа АОК); п - число животных; * - /КО,05 в сравнении с контролем; ’ - то же с гидрокортизоном.

АОК во 2-й группе было существенно выше, чем в 1-й {р<0,02). Введение пропранолола отменяло депрессивный эффект гидрокортизона и на развитие иммунного воспаления при ГЗТ. Существенных изменений количества АОК в отдаленных ЛУ на фоне экспериментальных воздействий не выявлено (см. таблицу). При исследовании изменений клеточности органов лимфомиелоидного комплекса отмечены значительное снижение числа ядросодержащих клеток в тимусе и селезенке у животных, получавших гидрокортизон, и частичная отмена этого эффекта при блокаде ß-адренорецепторов.

Заключение. В условиях фармакологической блокады ß-адренорецепторов существенно нивелируется имму-нодепрессивное действие гидрокортизона на развитие реакций клеточноопосредованного и гуморального иммунного ответа на эритроциты барана у крыс, что может указывать на роль пермиссивного действия глюкокортикои-дов по отношению к эндогенным катехоламинам в развитии иммуномодулирующих эффектов гидрокортизона.

ДЕЙСТВИЕ ПЛАЗМЕННЫХ ПОТОКОВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ

Шебникова Н.Е.. Кирюшенкова С.В.,

Гришанов Д.Ю., Соловьев A.C., Федосов Е.А.

Смоленская медицинская академия, Смоленск, Россия

В последние годы широко исследуется влияние плазменных потоков на биологические процессы. Настоящая работа посвящена изучению бактерицидного действия низкотемпературной гелиевой плазмы, а также исследовано воздействие плазменного потока на функциональную активность лимфоцитов. В опытах использовали плазменную установку СУПР-М и физиотерапевтический плазмотрон. Гелиевую плазму получали при силе тока 30 А, напряжении 20 В и расходе газа 2л/мин. Воздействие на бактерии и лимфоциты осуществляли в течение 15,30 и 90 секунд. Исходная концентрация бактерий составляла 1х103 микробных тел. Перед воздействием плазменного потока производили посев исходной взвеси бактерий в объеме 0,1 мл на чашки Петри. Для S. aureus использовали желточно-солевой агар, для S. pyogenes -кровяной агар, для K. pneumoniae - среду Эндо. Для каждого микроба 5 чашек с агаром были опытные, 1 - контрольная. После воздействия плазменным потоком каплю бактерий рассевали по питательной среде шпателем. Затем чашки Петри с посевами помещали в термостат при температуре 37°С на сутки. После инкубации производили подсчет выросших колоний. Сравнивали количество колоний в опытных чашках с количеством колоний в контрольном посеве. Функциональную активность клеток селезенки (КС) мышей-гибридов (CBAxC47B16)Fj после воздействия гелиевой плазмы оценивали по уровню их спонтанной и индуцированной пролиферации в ответ на стимуляцию митогенами ФГА, Кон-А, ЛПС E.coli и аллоантигенами. Контролем явились КС, находившиеся в тех же условиях, но без воздействия гелиевой плазмы. Результаты экспериментов показали, что гелиевая плазма при экспозиции 15,30 и 90 секунд оказывала выраженное бактерицидное действие на исследуемую культуру S. aureus, что проявлялось в угнетении роста на питательных средах. На S. pyogenes бактерицидное действие плазменного потока отмечалось лишь при обработке культуры в течение 90 секунд. K. pneumoniae оказались

не чувствительными к действию гелиевой плазмы данного режима. Облучение культуры лимфоцитов гелиевой плазмой в течение 15 секунд не влияло на их спонтанную и митоген-индуцированную пролиферацию, тогда как пролиферативный ответ при стимуляции аллоантигенами усиливался по сравнению с контролем. Экспозиция 30 секунд повышала спонтанную и индуцированную пролиферацию лимфоцитов в ответ на стимуляцию ФГА, Кон-А и аллоантигенами. Пролиферативный ответ лимфоцитов при стимуляции ЛПС E.coli не изменялся. Облучение лимфоцитов гелиевой плазмой в течение 90 секунд подавляло спонтанную пролиферацию КС, но не влияло на их пролиферативный ответ при стимуляции аллоантигенами и митогенами.

Таким образом, гелиевая плазма в зависимости от времени воздействия на биологические объекты оказывает бактерицидное действие на S. aureus и S.pyogenes, а также влияет на функциональную активность лимфоцитов.

РОЛЬ МОНОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО ЗВЕНА ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В РЕГУЛЯЦИИ РЕГЕНЕРАЦИИ КРОВИ

Юшков Б.Г., Храмцова Ю.С.

Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург, Россия

В настоящее время признается важная роль лимфоцитов и моноцитов-макрофагов в регуляции кроветворения. Вместе с тем практически не исследован вопрос о влиянии функционального состояния макрофагов на эритропоэз регулирующую функцию лимфоидных клеток.

Целью настоящей работы исследовать влияние та-мерита, иммуномодулятора функционально-метаболической активности макрофагов (10 мкг/г), на морфогенетическую функцию иммунной системы при острой крово-потере.

В качестве экспериментальных животных использовали белых беспородных крыс-самцов. 60-80* 106 лимфоидных клеток доноров через 4 часа после острой кровопо-тери из хвостовой вены в объеме 2% от массы тела вводили внутривенно интактным реципиентам. Гематологические исследования у последних проводились через 48 часов после трансплантации лимфоидных клеток.

После кровопотери у доноров наблюдается типичная реакция на данное экстремальное воздействие, состоящая в падении гематокритного показателя, снижении концентрации гемоглобина и эритроцитов. Однако под влиянием тамерита уменьшение количества эритроцитов было менее выражено (4,45+0,5 Г/л, р<0,05), чем у животных, препарат не получавших (2,16±0,49 Г/л; при 6,85±0,16Г/ л у интактных крыс). Особенностью реакции на кровопо-терю животных, получавших тамерит, является отсутствие достоверного снижения содержания моноцитов в периферической крови. В костном мозге у животных, получавших препарат, уменьшение клеточности костного мозга (68,41±6,04-106 ; при 98,44+11,89 у интактных крыс) не отличается от животных, не получавших препарат (57,27±7,32).

При сравнении гемопоэзстимулирующей функции спленоцитов и тимоцитов в модели адоптивного переноса оказалось, что через 48 часов после трансплантации клеток доноров, не получавших тамерит, спленоциты вызывают уменьшение количества эритроцитов (4,63±0,44 Г/л; при 6,85±0,16 у интактных крыс) и некоторое увели-

чение концентрации гемоглобина в крови (143±3,5 г/л; при 129,75±3,3 у интактных крыс), что указывает на их гемолитический эффект. У животных же, леченных таме-ритом указанный эффект отсутствует, более того у них развивается ретикулоцитоз. В отличие от спленоцитов тимоциты, полученные от животных как получавших, так и не получавших препарат на, гематологические показатели реципиентов влияние не оказывают. Клеточность костного мозга реципиентов, получавших спленоциты, от животных, леченных тамеритом (59,928±3,47Ю6), была выше, чем реципиентов клеток животных, препарат не получавших (36,69±10,36 106). Различия в эффекте спленоцитов и тимоцитов, вероятно, обусловлены значительным содержанием макрофагов в селезенке.

На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что в регуляции регенерации кроветворной ткани важное место занимают макрофаги, которые могут стимулировать регенерационные процессы.

ПРЯМАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ПЕРВИЧНОГО ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ОТВЕТА КЛЕТКАМИ -"ВРОЖДЕННЫМИ ХЕЛЛЕРАМИ" И ЕЕ НАРУШЕНИЕ ПЕРСИСГИРУЮЩИМИ ВИРУСАМ*

Рузин И., Мурали-Кришна К., Ахмед Р.

Тафтский университет, Бостон; Массачусетский университет, Вашингтон; Университет Эмори, Атланта, США

Цель. Выяснение того, как различные типы клеток, вовлеченные в СТЬ ответ, взаимодействуют друг с другом при ответе на вирусную инфекцию и почему они оказываются не в состоянии завершить очистку от некоторых вирусов, может оказаться полезным при создании новых вакцин и антивирусных препаратов. В дополнение к экспериментальному изучению конкретных случаев потребовалась разработка математической модели, аппроксимирующей комплекс механизмов СТЬ ответа. Такая модель может быть основана на сопоставлении с существующими данными, характеризующими СТЬ кинетику при использовании вирусов, вызывающих нарушение СТЬ ответа.

Методы. Н1У/81У у людей и приматов и вирус лимфоцитарного хореоменингита (ЬСМУ) у мышей имеют черты сходства на системном уровне взаимодействия вирус-организм хозяина: раннее исчезновение антиген-спе-цифических СБ8+Т клеток, тропизм к одним и тем же трем типам лимфоидных клеток: СБ4+ Т-клетки, макрофаги и фолликулярные дендритные клетки (РБС). Мы выдвинули гипотезу, что при всех этих вирусных инфекциях действует одинаковый основной механизм нарушения СТЬ

ответа, а различия между штаммами вирусов связаны с количественными вариациями системных параметров, а не с качественными различиями повреждающих механизмов. Были испробованы многие из ранее опубликованных моделей для описания первичного СТЬ ответа (4 недели), полученного в экспериментах с инфицированием мышей трех разных линий вирусами SIV и четырьмя штаммами вирусов LCMV, различающимися между собой по иммунологическим свойствам. В каждом из экспериментов два зависимых от времени иммунологических параметра были пригодны для сопоставления с параметрами модели. Количество вирусов как функция времени рассматривалась как вклад извне. В связи с этим, результаты были независимы от динамики инфицированных клеток и механизмов противовирусного контроля со стороны СТЬ.

Результаты. Простейшая из подходящих моделей включала 8 разных субтипов иммунных клеток и имела 15 сопоставимых параметров. Считается, что наивные CD8+ Т-клетки дифференцируются в эффекторы и в делящиеся клетки, которые превращаются в "транзиторные эффекторы", которые либо погибают, либо дифференцируются в энергичные клетки или клетки памяти. Модель специфицирует, который из этих процессов зависит от антигена и постулирует, что дифференцировка СТЬ, в основном, контролируется изначально "врожденными хелперами". Эти клетки, которые активируются все сразу при запуске инфекции, не являются CD4+ Т-клетками, а скорее являются FDC или макрофагами. Модель показала, что HIV/SIV и LCMV могут инфицировать эти "врожденные хелперы" и превращают их в мишени СТЬ. Модель предсказывает раннюю гибель СТЬ и персистенцию (отсроченное очищение) использованных вирусов, а также высокую степень CTL-анергии. Малейшие модификации модели нарушают совпадения. Мы предполагаем дальнейшее изучение модели, включая предикцию интерференции между СТЬ ответом против сходных штаммов вирусов, различающихся по антигенной структуре.

Заключение. Создана математическая модель динамики противовирусного СТЬ ответа, которая соответствует СТЬ ответу против SIV и четырех штаммов LCMV у трех линий мышей. Соответствующие параметры варьируют в пределах одного decimal log между вирусами, видами и индивидуальными животными. Различия между персистенцией и очищением от вируса связана с вариабельностью уровней репликации в большей степени, чем с иммунологическими различиями. Модель предсказывает существование нового класса "врожденных хелпе-ров", которые прямо контролируют ранний СТЬответ и предшествуют экспансии антиген-специфических CD4+ Т-хелперов.

* - английская версия тезисов на стр. 215