АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ПОПУЛЯЦИЙ НАЗЕМНОГО МОЛЛЮСКА СHONDRULA TRIDENS MüLL. (GASTROPODA, PULMONATA) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ RAPD И ISSR МАРКЕРОВ

ГЕНЕТИКА ПОПУЛЯЦИИ И ЭВОЛЮЦИЯ 37

УДК 575.1

© Э. А. Снегин

Белгородский государственный национальный исследовательский университет

C На основе метода полимеразной цепной реакции, с использованием RAPD и ISSR маркеров ДНк, проанализирована генетическая структура популяций модельного вида наземных моллюсков Chondrula tridens Müll., обитающих в условиях Среднерусской возвышенности. Дается расшифровка полученных ДНк-паттернов. Выделены полиморфные и мономорфные ампликоны. определен уровень генетической изменчивости популяций. Выявлены факторы, влияющие на формирование популяционных генофондов данного вида в условиях урбанизированного ландшафта.

C ключевые слова: ПЦР; наземные моллюски; популяционный генофонд; Среднерусская возвышенность.

анализ генетическом изменчивости популяции наземного МОЛЛЮСКА CHONDRULA TRIDENS MÜLL. (GASTROPODA, PULMONATA) С ИСПоЛЬЗоВАнИЕМ RAPD И ISSR МАРКЕРоВ

ВВЕДЕНИЕ

Настоящая работа является продолжением изучения популяционной структуры модельного вида наземных моллюсков Chondrula tridens Müll. (трехзубая улитка) на территории Русской равнины. Исследования проводились в условиях лесостепного и степного ландшафтов юга Среднерусской возвышенности.

Данный вид широко распространен в пределах Европы от юго-западной Франции до Урала, обитает в Крыму и на Кавказе, где населяет степные и полупустынные участки (Шилейко, 1984). В районе исследования моллюск обитает на меловых склонах, в балках, оврагах, а также в поймах рек. Вид относится к Средиземноморской реликтовой группе (Николаев, 1981). Благодаря своей эврибионтности и изменчивости конхиологических признаков Ch. tridens давно привлекает исследователей, анализирующих эволюцион-но-генетические процессы в природе (Матекин, 1950; Николаев, 1981; Гребенников, 1999; Крамаренко, Сверлова, 2003, 2006; Снегин, Гребенников, 2011; Комарова, Стойко, 2012). Но все эти работы были основаны только на морфометрических параметрах раковины.

В наших предыдущих исследованиях популяционная структура этого вида на юге Среднерусской возвышенности была изучена с помощью анализа конхиологических признаков и аллозимов (Снегин, 2011 а). Но использование этих маркеров генетической структуры имеет ряд ограничений. Во-первых, морфометрические параметры раковины у этого моллюска не дискретны и подвержены модификационной изменчивости, что не позволяет проследить за генетическими процессами, протекающими в исследуемых группах. Во-вторых, известно, что белковые маркеры отражают изменчивость только в кодирующей части генома, которая по разным оценкам составляет около 10 % от общего количества ДНК, а остальная, так называемая «молчащая» ДНК, оставалась вне поля зрения. Поэтому, чтобы устранить этот недостаток, дальнейший анализ состояния популяционных генофондов Ch. tridens был проведен нами на основе RAPD-, /SSR-маркеров ДНК, применение которых основано на использовании одного праймера, имеющего множественные комплементарные участки, разбросанные по всему геному.

Поступила в редакцию 28.03.2013 Принята к публикации 04.07.2013

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Материалом для исследования послужили образцы тканей особей СН. Мйе^, хранящиеся в криобанке, созданном при лаборатории популяционной генетики и генотоксикологии НИУ «БелГУ». Выборки из популяций были сделаны во время экспедиции в период с 2006 по 2010 годы. Моллюсков собирали вручную с поверхности почвы, со стеблей и листьев растений, иногда в подстилке. Всего было исследовано 1146 особей из двадцати пяти популяций СН. Мйе^ (табл. 1). Из них на территории Среднерусской возвышенности была изучена 21 естественная популяция, а также две адвентивные группы из г. Белгород, особи которых отличались наиболее крупными размерами ',

1 Высота раковины данных улиток, завезенных предположительно с Северного Кавказа, доходит до 20 мм, при максимальной 12 мм у местных форм. Подробное описание этого явления приводится в нашей предыдущей публикации (Снегин, 2011б).

Таблица 1

Описание пунктов сбора

Пункт Описание биотопа Координаты

1. «Белгород» Остаток естественной меловой балки со степной растительностью на территории г. Белгород (возле авторынка) 50°36'34.71'' с.ш., 36°36'40.91''в.д.

2. «Бекарюковский бор» Памятник природы с «Бекарюковский бор»; пойменные участки в долине р. Нежеголь 50°26'15.38'' с.ш., 37°04'23.98''в.д.

3. «Ржевка» Меловой склон западной экспозиции в пойме р. Короча возле пос. Ржевка 50°26'32.63'' с.ш., 36°58'22.89'' в.д.

4. «Афанасово» Меловой склон восточной экспозиции в пойме р. Короча возле д. Афанасово 50°44'06.34''с.ш., 37°08'49.79''в.д.

5. «Зимовное» Долина р. Нежеголь. Опушка нагорной дубравы возле д. Зимовное 50°29'35.80''с.ш., 37°09'56.56''в.д.

6. «Котеневка» Участки поймы реки Чуфичка, расположенные вблизи отвалов Стойленского ГОК; Старооскольский район 51°11'09.62''с.ш., 37°31'58.93''в.д

7. «Сапрыкино» Смешанный лес на дне балки, выходящей в пойму р. Дубенка возле пос. Сапрыкино. Зона влияния Стойленского и Лебединского ГОК 50°36'34.71''с.ш., 36°36'40.91''в.д.

8. «Проточное» Меловой склон напротив пос. Прточное, зона влияния Стойленского и Лебединского ГОК 50°00'18.75''с.ш., 37°31'58.93''в.д.

9. «Кочегуры» Меловой склон балки выходящей в пойму р. Ольшанка напротив пос. Кочегуры. Зона влияния Стойленского и Лебединского ГОК 50°59'36.59''с.ш., 37°35'29.66''в.д.

10. «Губкин» Меловой склон западной экспозиции в долине р. Осколец на территории г. Губкина 51°17'41.29''с.ш., 37°32'21.99''в.д.

11. «Скородное» Склон балки выходящей в пойму реки Короча возле с. Скородное 51°04'22.77''с.ш. 37°15'03.39''в.д.

12. «Стенки Изгорья» Заповедный участок «Стенки Изгорья». Меловой склон южной экспозиции с реликтовой степной растительностью, расположенный на территории одноименного заповедного участка 50°40'44.80''с.ш., 37°48'29.48''в.д.

13. «Борки» Памятник природы «Борки». Меловой склон в пойме р. Козинка. Северозападной экспозиции 50°08'12.03''с.ш., 37°53'09.01''в.д.

14. «Валуйки» Долина р. Валуй, подножие юго-восточного мелового склона, окрестности г. Валуйки, рядом с автомобильной трассой 50°13'24.38''с.ш., 38°00'34.61''в.д.

15. «Лисья гора» Памятник природы «Лисья гора» возле пос. Яблоново. Пойма р. Оскол. Опушка дубового леса 50°13'24.38''с.ш. 38°00'34.61''в.д.

16. «Купянск» Меловой склон западной экспозиции в долине р. Оскол возле г. Купянск (Украина) 49°42'19.24''с.ш., 37°37'24.98''в.д.

17. «Калюжный яр» Меловая балка восточной экспозиции, выходящая в пойму р. Айдар, территория природного парка «Айдарский» 49°57'02.88''с.ш., 38°53'49.32''в.д.

18. «Клименково» Меловой склон южной экспозиции в долине р. Сарма. Территория природного парка «Айдарский» 49°59'25.30''с.ш., 39°02'35.08''в.д.

19. «Нагольное» Меловой склон южной экспозиции в долине р. Сарма. Территория природного парка «Айдарский» 49°58'43.61''с.ш., 38°57'33.69''в.д.

20. «ГОК» Рекультивированные отвалы Стойленского ГОК 51°17'18.18"с.ш. 37°40'56.29" в.д.

21/1 «Водстрой» 21/2 г. Белгород, насыпь автомагистрали, спускающейся в пойму р. Гостянка, смешанный лес из ивы и клена с примесью ели 50°35' 23.32'' с.ш., 36°33' 58.20'' в.д.

Тот же биотоп, в котором совместно с аборигенными улитками обитают интродуцированные особи крупной формы

22. «БелГУ» г. Белгород, газон возле старого здания БелГУ, посадки каштанов и елей. Местообитание интродуцированных улиток крупной формы 50°37' 16.58'' с.ш., 36°34' 36.25'' в.д.

23. «Аракаево» Правый берег Михайловского пруда (р. Серга), Свердловская область, Нижнесергинский район, село Аракаево — подножье склона и крутой склон, заросший травой. На склоне несколько скальных выходов известняка, у подножья которых есть скальных осыпи 56°26' 45.00'' с.ш. 59°12' 56.00'' в.д.

24. «Николаев» Пустырь около насосной станции водоканала (НСВ-3) г. Николаева (Украина). Травянистый газон вдоль бетонного забора. Улитки были собраны среди листового опада 46°57' 55.82'' с.ш. 32°02' 17.09'' в.д.

Таблица 2

характеристика используемых праймеров

Метод Обозначение праймера Нуклеотидная последовательность Количество локусов

RAPD OPC 8 5'-GGGATATCGG-3' 13

ISSR UBC 827 5'-(AC)8G-3' 18

SAS 1 5'-(GTG)4GC-3' 18

и сформировали в указанных пунктах репродуктив-но обособленные от местных форм колонии. Особенно в пункте 21, где крупные особи живут в том же биотопе, что и аборигенные мелкие особи. Поэтому данный пункт мы условно разделили на две группы (21/1 и 21/2). Кроме того, для сопоставления нами были взяты выборки из популяций, обитающих на территории Урала и Причерноморья (пункты 23 и 24 соответственно).

Анализ изменчивости проводили с использованием полимеразной цепной реакции — методы RAPD (Random amplified polymorphic DNA) (Welsh, McClelland, 1990) и ISSR (ínter simple sequence repeats) (Zietkiewicz et. al., 1994). Для анализа использовали три праймера (табл. 2). Амплификацию проводили в термоциклерах MJ Mini и MyCycler (Bio-Rad).

Метод RAPD. Реакцию проводили в 20 мкл смеси, содержащей 20 нг геномной ДНК, ПЦР-буфер (10 мМ трис-HCl (рН 8,3), 50 мМ KCL, 2 мМ MgCl), 0,25 мМ dNTP, 0,5 мкМ праймера, 1 единица Taq ДНК-поли-меразы (ингибированной для горячего старта). Реакция проходила в следующих условиях: «горячий старт»

— 2 мин/94 °С, 35 циклов (денатурация--45 с/94 °С,

отжиг праймера — 15 с/36 °С, 15 с/45 °С, синтез — 1 мин/72 °С), дополнительный синтез — 10 мин/72 °С, охлаждение до 4 °С.

Метод ISSR. Реакцию проводили в 25 мкл смеси, содержащей 20 нг геномной ДНК, ПЦР-буфер (67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16 мМ (NH4)2SO4, 5 мМ 0-меркаптоэтанол, 7 мМ ЭДТА, 3 мМ MgCl), 0,25 мМ dNTP, 0,5 мкМ праймера, 1 единица Taq ДНК полимеразы (ингибированной для горячего старта). Реакция проходила в следующих условиях: «горячий старт» — 2 мин/94 °С, 40 циклов (денатурация — 30 с/94 °С, отжиг праймера — 30 с/55 °С, синтез — 2 мин/72 °С), дополнительный синтез — 10 мин/72 °С, охлаждение до 4 °С. Продукты ПЦР разделяли с помощью электрофореза в 2%-м агарозном геле с использованием ТАЕ буфера, 100 В — 45 мин. Блоки окрашивали бромистым этидием.

По картинам амплифицированных фрагментов, полученных в ходе электрофореза составляли бинарные матрицы, где присутствие полосы обозначалось как «1» (аллель p), отсутствие «0» (аллель q). Ввиду того, что при использовании метода RAPD могут появляться неспецифические продукты амплификации, для анализа мы использовали четко просматриваемые и воспроизводимые ампликоны. Критерием воспроизводимости было повторное проявление амп-ликонов после ПЦР у одних и тех же исследуемых особей.

У данного вида нами обнаружено 49 локусов: 13 с использованием праймера ОРС 8 (метод RAPD), и по 18 локусов с использованием праймеров SAS 1 и UBC 827 (метод ISSR). Полученные ДНК-паттерны и их расшифровка приведены на рисунке 1.

Обработка полученных данных проводилась с использованием программы GenAlEx (Peakall, Smouse, 2001), POPGENE 32 (Yeh et al., 2000), MEGA5 (Tamura et al., 2011). Полигоны Дебеца были построены при помощи программы Statistica 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В таблице 3 представлены уровни гетерозиготности сорока девяти локусов, вычисленные на основе анализа двадцати пяти популяций. Согласно представленным данным наиболее полиморфными среди RAPD-маркеров

Таблица 3

уровни гетерозиготности обнаруженных локусов

№ локуса He

OPC8 SAS1 UBC 827

1 0,212 ± 0,013 0,083 ± 0,009 0,035 ± 0,007

2 0,238 ± 0,012 0,03 ± 0,004 0,061 ± 0,010

3 0,406 ± 0,007 0,102 ± 0,010 0,095 ± 0,010

4 0,390 ± 0,010 0,118 ± 0,009 0,254 ± 0,015

5 0,301 ± 0,010 0,179 ± 0,011 0,137 ± 0,011

6 0,415 ± 0,012 0,167 ± 0,011 0,378 ± 0,011

7 0,385 ± 0,009 0,357 ± 0,012 0,254 ± 0,012

8 0,405 ± 0,007 0,176 ± 0,011 0,296 ± 0,011

9 0,374 ± 0,010 0,398 ± 0,012 0,261 ± 0,015

10 0,411 ± 0,008 0,316 ± 0,013 0,222 ± 0,013

11 0,212 ± 0,013 0,318 ± 0,011 0,355 ± 0,012

12 0,156 ± 0,014 0,355 ± 0,009 0,307 ± 0,012

13 0,068 ± 0,010 0,368 ± 0,010 0,358 ± 0,012

14 - 0,342 ± 0,010 0,343 ± 0,014

15 - 0,243 ± 0,011 0,269 ± 0,014

16 - 0,384 ± 0,011 0,202 ± 0,014

17 - 0,264 ± 0,014 0,147 ± 0,012

18 - 0,041 ± 0,008 0,073 ± 0,010

являются локусы 3, 4, 6, 8 и 10, а среди /55^-маркеров более изменчивыми оказались локусы 7, 9 и 16 по прай-меру 5Л5 /, и локусы 6, 11, 13, 14 по праймеру иВС 827. В группу более мономорфных локусов вошли: по праймеру ОРС 8 — локусы 12 и 13, по праймеру

А

S4S 1 — локусы 1, 12 и 18, по праймеру UBC 827— локусы 1, 2, 3 и 18. Причем стоит отметить, что средняя гетерозиготность по R4PD локусам (H = 0,306 ± 0,010) выше, чем по ISSR локусам (по S4S 1 He = 0,235 ± 0,010; по UBC 827 H = 0,225 ± 0,011).

e ' — ' '

& * »-Sfe

ОРС 8

isoot» оьр

400 bp

Obp

ьр

1500 top

. M

4

200 Ьр SObp

SAS1

— - ~ ^ S | i = ^ — "~Si0bp

UBC 827 50 "

Б

В

Рис. 1. А, Б, В — ДНК-паттерны С^ tridens. Г — расшифровка ДНК-паттернов Ch. tridens

Таблица 4

Усредненные по совокупности ДНК-локусов меры генетической гетерогенности в популяциях Ch. tridens.

Пункт N P % А Ае ^sh Не

1. Белгород 54 100,00 2,0 ± 0,0 1,55 ± 0,04 0,514 ± 0,019 0,339 ± 0,016

2. Бекарюковский бор 189 95,92 1,96 ± 0,03 1,43 ± 0,05 0,402 ± 0,033 0,260 ± 0,024

3. Ржевка 18 87,76 1,88 ± 0,05 1,45 ± 0,05 0,421 ± 0,032 0,275 ± 0,024

4. Афанасово 16 67,35 1,67 ± 0,07 1,40 ± 0,05 0,348 ± 0,04 0,232 ± 0,029

5. Зимовное 31 85,71 1,86 ± 0,05 1,50 ± 0,05 0,442 ± 0,034 0,295 ± 0,025

6. Котеневка 32 73,47 1,73 ± 0,06 1,39 ± 0,05 0,35 ± 0,038 0,230 ± 0,027

7. Сапрыкино 18 93,88 1,94 ± 0,03 1,50 ± 0,05 0,452 ± 0,03 0,297 ± 0,023

8. Проточное 12 28,57 1,29 ± 0,06 1,19 ± 0,05 0,160 ± 0,038 0,109 ± 0,026

9. Кочегуры 38 89,80 1,90 ± 0,04 1,44 ± 0,05 0,403 ± 0,035 0,264 ± 0,026

10. Губкин 31 85,71 1,86 ± 0,05 1,47 ± 0,05 0,419 ± 0,035 0,276 ± 0,025

11. Скородное 60 89,80 1,90 ± 0,04 1,40 ± 0,05 0,363 ± 0,038 0,238 ± 0,028

12. Стенки Изгорья 37 83,67 1,84 ± 0,05 1,42 ± 0,05 0,386 ± 0,036 0,253 ± 0,026

13. Борки 58 87,76 1,88 ± 0,05 1,43 ± 0,05 0,405 ± 0,033 0,263 ± 0,024

14. Валуйки 94 89,80 1,90 ± 0,04 1,32 ± 0,05 0,325 ± 0,034 0,205 ± 0,024

15. Лисья гора 35 93,88 1,94 ± 0,03 1,50 ± 0,04 0,459 ± 0,028 0,301 ± 0,022

16. Купянск 86 93,88 1,94 ± 0,03 1,50 ± 0,05 0,455 ± 0,031 0,300 ± 0,023

17. Калюжный яр 43 83,67 1,84 ± 0,05 1,34 ± 0,05 0,329 ± 0,036 0,211 ± 0,026

18. Клименково 50 79,59 1,80 ± 0,06 1,36 ± 0,05 0,348 ± 0,036 0,224 ± 0,026

19. Нагольное 31 85,71 1,86 ± 0,05 1,43 ± 0,05 0,395 ± 0,035 0,258 ± 0,026

20. ГОК 53 79,59 1,80 ± 0,06 1,37 ± 0,05 0,341 ± 0,038 0,222 ± 0,027

21/1. Водстрой 20 100,00 2,0 ± 0,0 1,66 ± 0,03 0,574 ± 0,013 0,389 ± 0,011

Среднее для Среднерусской возвышенности 84,5 ± 3,3 1,85 ± 0,04 1,43 ± 0,05 0,395 ± 0,033 0,259 ± 0,024

21/2. Водстрой, КФ 42 55,10 1,55 ± 0,07 1,29 ± 0,05 0,250 ± 0,040 0,166 ± 0,028

22. БелГУ, КФ 50 75,51 1,75 ± 0,06 1,38 ± 0,05 0,349 ± 0,038 0,228 ± 0,027

23. Аракаево 22 67,35 1,67 ± 0,07 1,32 ± 0,05 0,300 ± 0,039 0,195 ± 0,027

24. Николаев 25 67,35 1,67 ± 0,07 1,39 ± 0,05 0,339 ± 0,041 0,226 ± 0,029

Общее среднее 81,6 ± 3,2 1,82 ± 0,05 1,42 ± 0,05 0,381 ± 0,034 0,250 ± 0,025

N — количество проанализированных особей, Р % — процент полиморфных локусов, А — среднее число аллелей на локус, Ае — эффективное число аллелей, — индекс Шеннона, Не — ожидаемая гетерозиготность

Уровни гетерозиготности, а также графические полигоны исследуемых популяций по различным праймерам приведены на рисунках 2, 3 и в таблице 4.

Согласно полученным данным, уровни изменчивости в популяциях Ск. tridens неодинаковы по различным локусам ДНК (рис. 2). Например, по локусам иВС 827 наименьшие значения гетерозиготности отмечены в пунктах «Клименково» (№ 18) и «Проточное» (№ 8). В последнем пункте зафиксирован также самый низкий для естественных популяций лесостепи показатель гетерозиготности по локусам ОРС 8 и 5Л5 1. В адвентивной колонии 21/2 отмечен низкий уровень гетерозиготности по локусам 5Л5 1. Причем в популяции местных улиток, обитающей в том же биотопе (21/1), показатели гетерозиготности по всем локусам значительно превосходят таковую в адвентивной группе. По соотношению частот аллелей эти две колонии также попали в различные кластеры (рис. 4). Это косвенно подтверж-

дает выдвинутое нами ранее предположение об отсутствии скрещивания между улитками двух форм (Снегин, 2011 б).

По совокупности всех ДНК-локусов наиболее гетерогенными оказались естественные популяции, обитающие в черте г. Белгород (пункты № 1 и 21/1) (табл. 4). Немного им уступают группы «Купянск» (№ 16), «Лисья гора» (№ 15), «Сапрыкино» (№ 7) и «Бекарюковский бор» (№ 2). Самой мономорфной является уже упомянутая популяция «Проточное» (№ 8), которая относится к группе популяций, обитающих в зоне влияния Стойлен-ского и Лебединского горно-обогатительных комбинатов, где отмечается чрезвычайная раздробленность популяций ввиду активного освоения территории (создание карьеров, строительство дорог и путепроводов). Тем не менее стоит отметить, что в других популяциях этого района (пункты № 6, 7, 9, 10, 20) достоверного снижения уровня изменчивости нами не выявлено. Особенно это касается

П\икты

Q0PC8 QSAS1 0 UBC827

TN (Ч

Рис. 2. Уровни гетерозиготности по различным локусам ДНК в популяциях СН. tridens

Рис. 3. Полигоны Дебеца, построенные по совокупности частот ^-аллеля 49 локусов ДНК в популяциях СН. tridens

пункта 20 («ГОК»), где улитки обитают в изолированном биотопе, сформировавшемся сравнительно недавно (30 лет назад) на отвалах горно-обогатительных комбинатов, но соотношение частот аллелей и уровень изменчивости здесь (особенно по RAPD локусам) сопоставим с аналогичным показателем из других популяций, включая исконные группы из реликтовых особо охраняемых природных территорий (12, 13, 17, 18, 19).

Такое генетическое сходство групп обеспечивается, вероятнее всего, не миграцией особей между популяциями, а тем, что в условиях изоляции в популяциях Ch. tridens увеличивается частота гомозиготных комбинаций по одним и тем же аллелям, что было показано нами ранее на примере изоферментных маркеров (Сне-гин, 2011 а). Последнее, вероятно, обеспечивается сходными векторами естественного отбора в условиях лесостепи, а также дрейфом генов и процессами генетической революции в изолированных группах (Майр, 1968).

Кроме того, стоит подчеркнуть, что на юге лесостепи Среднерусской возвышенности площадь пригодных биотопов для Ch. tridens значительно больше, чем, например, для другого индикаторного моллюска Bradybaena fruticum (до 20 % от общей территории, против 9 %), т. к. трехзубая улитка, являясь ксеромезофилом, может обитать в разнообразном спектре условий: на меловых притеррасных склонах, в лесных массивах, в поймах рек, в балках и оврагах. Такая эвритопность способствует меньшей разобщенности популяций у этого вида по сравнению с кустарниковой улиткой. Но, обладая относительно слабой подвижностью, Ch. tridens в своем расселении по району исследования, вероятно, больше опирается на внешние для популяции факторы, такие как водные потоки, ветер, животные, а в последние столетия и человек. Тем не менее усиленная распашка территории и уничтожение естественных меловых сообществ нарушают миграционные процессы и ведут к повышению степени изоляции между группами, что находит свое отражение в рассчитываемых индексах подразделенности и среднего потока генов.

Так, оценка степени дифференциации популяций Ch. tridens на основе модели, предложенной М. Неем (Nei, 1975), показала умеренную разобщенность изучаемых групп в условиях лесостепи (Gst = 0,177, табл. 5). При этом средний поток генов оказался больше единицы (Nm = 2,33) 2.

Известно, что средние величины Gst соответствуют уровню генетической дифференциации при селективно-нейтральном процессе. В таком случае локусы с большими значениями Gst, вероятнее всего, испытывают действие дизруптивного отбора, а локусы с низкими показателями индекса подразделенности подвержены влиянию стабилизирующего отбора (Динамика..., 2004).

2 Согласно «теории эволюции со смещающимся равновесием» (Wright, 1970), для поддержания панмиксии в метапопуляции требуется поток генов 1—2 особи за поколение

Таблица 5

Показатели генетической дифференциации популяции Ch. tridens (по Nei, 1975).

Локус № локуса Ht Hs Gst Nm

1 0,260 0,233 0,104 4,30

2 0,264 0,233 0,120 3,65

3 0,436 0,403 0,077 6,04

4 0,500 0,377 0,245 1,54

5 0,330 0,283 0,141 3,04

6 0,499 0,431 0,136 3,18

OPC 8 7 0,495 0,380 0,233 1,65

8 0,453 0,410 0,095 4,75

9 0,476 0,395 0,171 2,43

10 0,496 0,408 0,176 2,34

11 0,320 0,223 0,304 1,14

12 0,174 0,146 0,160 2,62

13 0,095 0,079 0,175 2,37

1 0,111 0,097 0,125 3,51

2 0,037 0,036 0,039 12,28

3 0,141 0,122 0,138 3,13

4 0,149 0,141 0,056 8,40

5 0,230 0,207 0,097 4,64

6 0,207 0,187 0,098 4,59

7 0,480 0,385 0,198 2,03

8 0,217 0,204 0,061 7,71

SAS 1 9 0,491 0,404 0,177 2,32

10 0,370 0,321 0,133 3,26

11 0,404 0,345 0,146 2,92

12 0,394 0,354 0,100 4,48

13 0,458 0,398 0,132 3,28

14 0,419 0,360 0,140 3,08

15 0,298 0,249 0,164 2,56

16 0,489 0,394 0,193 2,09

17 0,362 0,289 0,203 1,96

18 0,059 0,049 0,182 2,25

1 0,049 0,040 0,183 2,23

2 0,089 0,071 0,197 2,04

3 0,092 0,080 0,128 3,40

4 0,442 0,270 0,390 0,78

5 0,146 0,131 0,109 4,10

6 0,434 0,377 0,131 3,32

7 0,309 0,284 0,081 5,64

8 0,400 0,302 0,244 1,55

UBC 9 0,380 0,261 0,315 1,09

827 10 0,247 0,215 0,131 3,31

11 0,494 0,359 0,272 1,34

12 0,359 0,308 0,143 3,00

13 0,470 0,383 0,184 2,22

14 0,455 0,364 0,201 1,99

15 0,428 0,297 0,306 1,13

16 0,229 0,183 0,201 1,99

17 0,209 0,171 0,182 2,24

18 0,073 0,060 0,181 2,26

Среднее 0,315 ± 0,023 0,259 ± 0,015 0,177 2,33

Gst — доля межпопуляционного генного разнообразия в общем разнообразии, Н — ожидаемая доля гетерозиготных генотипов во всей популяции № — среднее для всех субпопуляций значение внутрипопуляционного разнообразия, Nm — средний поток генов за поколение

44

ГЕНЕТИКА ПОПУЛЯЦИЙ И ЭВОЛЮЦИЯ

Таблица 6

Значения молекулярной дисперсии (AMOVA) по ДНК-локусам в популяциях Ch. tridens (по 21 популяции) 3

Источник изменчивости Число степеней свободы (df) Сумма квадратов (SS) Средний квадрат (MS) Дисперсия (V) % Ф, st P Nm

Между популяциями 20 1688,784 84,439 1,662 19% 0,185 0,010 0,954

Внутри популяций 985 7207,496 7,317 7,317 81%

Итого 1005 8896,280 91,756 8,979

Согласно полученным данным (табл. 5), наибольшая дифференциация между популяциями зафиксирована по ло-кусам OPC 8 — 11, S4S 1 — 17 и UBC 827 — 4, а наименьшая — OPC 8 — 3, S4S 1 — 8 и UBC 827 — 7.

Анализ молекулярной дисперсии (AMOVA, Excoffier et al., 1992) (табл. 6) выявил также большее сходство между популяциями Ch. tridens. Только 19 % изменчивости пришлось на межпопуляционные различия, при этом Ф t = 0,185, а Nm = 0,954.

st ' ' '

Данные свидетельствуют о сходных генетических процессах, протекающих в географически удаленных популяциях, но связанных единой ландшафтной структурой.

Между тем кластерный анализ по ДНК-локусам, результаты которого показаны на рисунке 4, продемонстрировал отсутствие какой-либо географической привязки выделяемых кластеров, за исключением двух городских популяций из пунктов 1 и 21/1. То есть относительно большая генетическая дистанция наблюдалась, как между географически близко расположенными группами, так и удаленными. Это связано, как уже говорилось, с нарушением естественно сложившихся каналов миграции генов между популяциями в урбанизированном ландшафте. Данный вывод подтверждается тем, что попарные оценки индекса Фst не коррелируют со значениями географических расстояний между популяциями (рис. 5; R=0,082±0,069).

Из групп улиток, взятых для сравнения, уральская популяция (№ 23) оказалась генетически более близкой к лесостепным популяциям, чем причерноморская группа (№ 24). Последняя сильно дистанцировалась от большинства изученных популяций лесостепного региона.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты дают представление о структуре расселения и о состоянии популяционных генофондов Ch. tridens в условиях урбанизированного лесостепного ландшафта Среднерусской возвышенности. Согласно полученным данным, в популяциях этого моллюска, несмотря на давление со стороны человека,

3 В анализе не учитывались адвентивные колонии (21/2 и 22),

популяции из Причерноморья

присутствует высокий уровень генетического полиморфизма, вероятно из-за обитания в широком диапазоне условий, включая весьма экстремальные для моллюсков открытые меловые склоны с резкими суточными колебаниями температуры и влажности. Тем не менее процессы инсуляризации, наблюдаемые на исследуемой территории, приводят к нарушению исторически сложившихся каналов миграции, что ведет к сильной изолированности популяций и к постепенной потере их аллельного раз-

I-13

I—П-16

-2

-15

__9

— -II

-23

Г J-4

Ч-17

- -6

-14

- 1-8

-11

-18

19 10

20 22 24 1 21/1 3

-21/2

-1-1-1-1-1-1-1

0.12 0.10 0.0S 0.06 0.04 0.02 0.00

Генетическое расстояние D

Рис. 4. Дендрограмма генетических расстояний по Неи (Nei, 1972) (UPGMA) между популяциями Ch. tridens

генетика популяции и эволюция 45

0.450 0.400 0,350 0,300' 0.250 0.200 0.150 0,100 0.050 0.000

у=0.0001л+ 0.1956

0 R" = 0.0067

* ft 0 0 0 О

Л Л

v

- -<i5-

<*>

•VW v 0

20

40

60

30

100

120

140

160

ISO

200

Дистанция

Рис. 5. Значение показателя дифференциации Фз1 между парами популяций Ch. tridens в зависимости от географического расстояния между ними

нообразия. Представленные результаты можно считать отправной точкой для дальнейшего мониторинга этого модельного вида с целью выяснения особенностей эволюционных процессов, происходящих в его популяциях.

Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ, гос. задание № 4.8480.2013.

ЛИТЕРАТУРА

1. Гребенников М.Е, 1999. Реликтовые популяции Chondrula tridens (Müll, 1974) на Среднем Урале // Актуальные проблемы биологии и экологии. Сыктывкар. С. 49.

2. Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях / Под ред. Ю. П. Алтухова. — М.: Наука, 2004. С. 619.

3. Комарова Е.В., Стойко Т.Г., 2012. Изменчивость раковины наземного моллюска Chondrula tridens в Среднем Поволжье // Известия Пензенского гос. пед. ун-та им. В. Г. Белинского. № 29. С. 220—226.

4. Крамаренко С. С., Сверлова Н.В., 2003. До вивчен-ня внутршньовидово! мшливосл Chondrula tridens (Gastropoda, Pulmonata, Buliminidae) на заходi Ук-ра'ши та з'ясування таксономiчного статусу окремих форм // Наук. зап. Держ. природозн. музею. Львiв. Т. 18. С. 93-110.

5. Крамаренко С. С., Сверлова Н. В., 2006. Мiжпопу-ляцшна мшливють конхолопчних ознак наземного молюска Chondrula tridens (Buliminidae) ^вшчно-захщного Причорномор'я // Наук. зап. Держ. приро-дознавч. музею. Львiв: Т. 22. С. 105-118.

6. Майр Э., 1968. Зоологический вид и эволюция. М.: Мир. С. 398.

7. Матёкин П. В., 1950. Фауна наземных моллюсков Нижнего Поволжья и ее значение для представления об истории современных лесов района // Зоологический журнал. Т. 29. Вып. 3. С. 193-205.

8. Николаев В. А., 1981. Изменчивость и экология энид Среднерусской возвышенности // Фауна и экология беспозвоночных лесостепной зоны. Научные труды Курского гос. пед. ин-та. Курск: Т. 210. С. 54-57.

9. Снегин Э. А., 2011 а. Генетическая структура популяций модельных видов наземных моллюсков в условиях урбанизированного ландшафта на примере ^ondrula tridens Müll. (Gastropoda, Pulmonata) // Экологическая генетика. Т. IX, № 2. С. 54-64.

10. Снегин Э. А., 2011 б. К вопросу о роли принципа основателя в формировании генофондов адвентивных колоний на примере Chondrula tridens (Gastropoda, Pulmonata) // Зоологический журнал. Т. 90, № 6. С. 643-648.

11. Снегин Э. А., Гребенников М. Е, 2011. Анализ изменчивости модельных видов наземных моллюсков в популяциях Урала и юга Среднерусской возвышенности // Научные ведомости БелГУ. Сер. Естественные науки. Вып. 15. № 9 (104). С. 67-75.

12. Шилейко А. А., 1984. Наземные моллюски подотряда Pupillina фауны СССР (Gastropoda, Pulmonata, Geophila) // Фауна СССР. Моллюски. Нов. сер. Л.: Наука. Т. 3. Вып. 3. 339 с.

13. ExcoffierL., Smouse P.E, Quattro J.M., 1992. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochondrial DNA restriction data // Genetics. N 131. Р 479-491.

14. Nei M., 1972. Genetic distance between populations // The American Naturalist. Vol. 106, N 949. P. 283-292.

15. Nei M., 1975. Molecular population genetics and evolution. Amsterdam. 278 p.

16. PeakallR., Smouse P.E, 2001. GenAlEx V5: Genetic Analisis in Excel. Population genetic software for teaching and reseach. Australion National University, Canberra, Australia. http://www.anu.edu.au/BoZo/GenAlEx/.

17. Snegin E. A. 2011. The genetic structure of model species populations of terrestrial mollusks in conditions of urbanized landscape using the example of Chondrula tridens Müll (Gastropoda, Pulmonata) // Russian Journal of Genetics: Applied Research. Vol. 2, N. 2. P. 160-170.

18. Welsh J., McClelland M, 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Research. Vol. 18, N 22. P. 7213-7219.

19. Wright S, 1970. Random drift and shifting balance theory of evolution//Mathematical Topics in Population Genetics. Berlin: Springer Verlag. P. 1-31.

20. Tamura K, Peterson D, Peterson N. at al., 2011. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution. http://www.kumarlab.net/publications.

21. Yeh F. C. YangR, Boyle T. J., Ye Z, Xiyan J. M, 2000. POPGENE 32, Microsoft Window-based Freeware for Population Genetic Analysis, Version 1.32; Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta: Edmonton, Canada. http://www.ualberta.ca/~fyeh/ popgene_download.html.

22. Zietkiewicz E, Rafalski A., Labuda D., 1994. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) — anchored polymerase chain reaction amplification // Ge-nomics. Vol. 20, N 2. P. 176-181.

ANALYSIS OF THE GENETIC VARIABILITY OF POPULATIONS OF LAND SNAIL СHONDRULA TRIDENS MÜLL. (GASTROPODA, PULMONATA) RAPD AND ISSR MARKERS

Snegin E. A.

C SUMMARY: Background. This article is about evolutionary processes in populations of small mobile species in the urbanized landscape. Materials and methods. Based of the polymerase chain reaction, using RAPD and ISSR DNA markers the genetic structure of populations of model species of terrestrial mollusks Chondrula tridens Müll., living in Mid-Russian Upland, has been analyzed. Results. Interpretation of the obtained DNA-patterns is presented. Polymorphic and monomorphic amplicons are identified. The level of genetic variability of population is defined. The factors influencing formation population of gen pool of the given species in the conditions of the urbanized landscape are revealed. Conclusion. The structure of population's distribution and the state population gene pools of Ch. tridens in the urbanized landscape were determined.

C KEY WORDS: PCR; terrestrial mollusks; population gene pool; Central Russian Upland.

C REFERENCES

1. Grebennikov M.E. Reliktovie populacii Chondrula tridens (Müll, 1974) na Srednem Urale [Relict popula-

tions of Chondrula tridens (Müll, 1974) in the Middle Urals]. Actual problems of biology and ecology. Syktyvkar, 1999. P. 49.

2. Dinamika populacionnich genofondov pri antropo-gennich vozdeistviach [Population dynamics of gene pools in anthropogenic impacts]. Ed. Y. P. Altukhova. Moscow: Nauka, 2004. 619 p.

3. Komarova E.V., Stoiko T.G. Izmenchivosti rakovin nazemnogo molluska Chondrula tridens v Srednem Povolzhie [The variability of the land snail shells Chondrula tridens in the Middle Volga region]. News of Penza State Pedagogical University V.G. Belinsky. 2012. N 29. P. 220-226.

4. Kramarenko S. S., Sverlova N. B. Do vivchennia vnutrishniovidovoi minlivosti Chondrula tridens (Gastropoda, Pulmonata, Buliminidae) na zachodi Ukraini ta zasuvannia taksonomichnogo statusu okremich form [The study of intraspecific variation Chondrula tridens (Gastropoda, Pulmonata, Buliminidae) in western Ukraine and clarify the taxonomic status of certain forms]. Scientific Notes of the L'viv State Museum of Nature. 2003. Vol. 18. P. 93-110.

5. Kramarenko S.S., Sverlova N. B. Meshpopulaciona minlivisti konchiologichnih oznak nazemnogo moluska Chondrula tridens (Buliminidae) Severo-zapadnogo Prichernomoria [Inter-population variability conchological signs of terrestrial snail Chondrula tridens (Buliminidae) in North-western Black Sea] Scientific Notes of the L'viv State Museum of Nature. 2006. Vol. 22. P. 105-118.

6. Mayr E. Zoologicheskiy vid i evolucia [Animal species and evolution] / Moscow: Mir, 1968. P. 398.

7. Matekin P V. Fauna nazemnich molluskov Nignego Povolzhia i eio znachenie dlia predstavlenia ob isto-rii sovremennich lesov raiona [The fauna of terrestrial mollusks of the lower Volga region and its importance for the understanding of the history of modern forest area] Zoologicheskiy zhurnal. 1950. Vol. 29 (3). P. 193-205.

8. Nikolaev V. A. Izmenchivosti I ekologia enid Sred-nerusskoi vozvishennosti / [Variability and ecology Enida in Mid-Russian Upland] / in Fauna i ekologi-ya bespozvonochnykh lesostepnoi zony [Fauna and Ecology of Invertebrates of the Forest Steppe Zone]. Scientific papers of the Kursk State Pedagogical Institute. Kursk. 1981. Vol. 210. P. 54-57.

9. Snegin E. A. Assessment of the State of Population Gene Pools of Terrestrial Mollusks under the Influence of Ore Processing Plants: A Case Study of Bra-dybaena fruticum Mull. (Gastropoda, Pulmonata) // Russian Journal of Genetics: Applied Research. 2011a. Vol. 2 (2). P. 160-170.

10. Snegin E. A. K voprosu o roli principa osnovatelia v formirovanii genofondov adventivnich kolonii na primere Chondrula tridens (Gastropoda, Pulmonata) [On the role of the founder principle in the formation

of gene pools of adventive colonies from the example of Chondrula tridens (Gastropoda, Pulmonata)]. Zoolo-gicheskiy zhurnal. 2011b. Vol. 90 (6). P. 643-648.

11. Snegn E.A., Grebennikov M.E. Analiz izmenchivosti modelinich vidov nazemnich molluskov v populaciach Urala i iuga Srednerusskoi vozvishennosti [Analysis of variability of the model species of terrestrial mollusks in the populations of the Ural and Southern Mid-Russia Upland]. Scientific Statement Belgorod State University. Science Series. 2011. Issue 15. N 9 (104). P 67-75.

12. Shileiko A. A. Nazemnie molluski podotriada Pupillina fauni SSSR (Gastropoda, Pulmonata, Geophila) [Terrestrial Mollusks of the Suborder Pupillina of the Fauna of the USSR (Gastropoda, Pulmonata, Geophi-la)] / in Fauna SSSR. Mollyuski. Nov. Ser. [Fauna of the USSR. Molluska. New series]. Leningrad: Nauka. 1984. Vol. 3 (3). 339 p.

13. ExcoffierL., SmouseP. E., QuattroJ. M. Analysis of molecular variance inferred from metric distances among DNA haplotypes: application to human mitochon-drial DNA restriction data // Genetics. 1992. N 131. P. 479-491.

14. Nei M. Genetic distance between populations // The American Naturalist. 1972. Vol. 106 (949). P. 283-292.

15. Nei M. Molecular population genetics and evolution. Amsterdam. 1975. 278 p.

16. PeakallR., SmouseP.E. GenAlEx V5: Genetic Analisis in Excel. Population genetic software for teaching and reseach.AustralionNationalUniversity, Canberra, Australia. 2001. http://www.anu.edu.au./BoZo/ GenAlEx/.

17. Welsh J., McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Research. 1990. Vol. 18 (22). P. 7213-7219.

18. Wright S. Random drift and shifting balance theory of evolution // Mathematical Topics in Population Genetics. Berlin: Springer Verlag. 1970. P. 1-31.

19. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution. 2011. http: // www.kumarlab.net/publications.

20. Yeh F.C.; Yang R., Boyle T.J., Ye Z., Xiyan J.M., POPGENE 32, Microsoft Window-basedFreeware for Population Genetic Analysis, Version 1.32; Molecular Biology and BiotechnologyCentre, University of Alberta: Edmonton, Canada. 2000. http://www. ualberta.ca/~fyeh/popgene_download.html.

21. Zietkiewicz E., Rafalski A., Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) — anchored polymerase chain reaction amplification // Genomics. 1994. Vol. 20 (2). P. 176—181.

C Информация об авторе

Снегин Эдуард Анатольевич — д. б. н., заведующий кафедрой. Кафедра биоценологии и экологической генетики. Белгородский государственный национальный исследовательский университет. 308015, Белгород, ул. Победы, д. 85. E-mail: snegin@bsu.edu.ru.

Snegin Eduard Anatolyevich — Doctor of Biological Sciences, Head of Department. Department of biocenology and ecological genetics. Belgorod national research university. 308015, Belgorod, Pobedy St., 85. Russia. E-mail: snegin@bsu.edu.ru.