БИСПЕЦИФИЧЕСКИЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

1. Биспецифический рекомбинантный белок, где биспецифический рекомбинантный белок содержит высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо и слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα; где
высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо не связывается с CD47, и аффинность его связывания, характеризующая антитело, соответствующее высокоаффинному нацеливающемуся на опухоль плечу, с антигеном-мишенью на опухолевой клетке в по меньшей мере 6 раз превышает аффинность связывания гомодимера мономерного слитого белка, соответствующего слитому белку с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα, с CD47 на опухолевой клетке;
аффинность связывания слитого белка с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα с CD47 не превышает аффинность связывания гомодимера мономерного слитого белка, содержащего внеклеточный усеченный вариант SIRPα, с CD47; где внеклеточный усеченный вариант SIRPα включает внеклеточный усеченный вариант человеческого SIRPα дикого типа или внеклеточный усеченный вариант человеческого SIRPα с невысокой аффинностью в отношении CD47.
2. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 1, где слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит внеклеточный усеченный вариант SIRPα, и внеклеточный усеченный вариант SIRPα содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из a1), a2), a3) и a4): a1) SEQ ID No: 30; a2) SEQ ID No: 31; a3) SEQ ID No: 32; a4) аминокислотная последовательность, полученная путем осуществления вставки, делеции, модификации и/или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1-5 аминокислотных остатков, любой из аминокислотных последовательностей, описанных выше, где аффинность связывания ее мономера с CD47 не превышает аффинность связывания мономера a1), a2) или a3) с CD47.
3. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 1, где биспецифический рекомбинантный белок имеет конфигурацию, предусматривающую левое плечо и правое плечо, которые расположены симметрично, при этом высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо расположено в левом плече, слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα расположен в правом плече; предпочтительно левое плечо имеет форму Fab или Fab' иммуноглобулина, а правое плечо является внеклеточным усеченным вариантом SIRPα.
4. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 3, где длина правого плеча сконфигурирована так, чтобы соответствовать расстоянию от эпитопа, с которым связывается левое плечо, до поверхности мембраны клетки-мишени; предпочтительно, если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо сконфигурировано для связывания проксимального по отношению к мембране эпитопа клетки-мишени, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα выбран из более короткой аминокислотной последовательности среди a1), a2), a3) и a4).
5. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 1, где высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо является специфическим в отношении мишени, выбранной из группы, состоящей из 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, FN, FR-α, GCC, GD2, GPC-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, MSLN, MUC16, MUC1, NaPi2b, нектина-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1R, MSB0010718C, BCMA и CD138;
предпочтительно, если мишенью является CD20, EGFR или PD-L1, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой a1); если мишенью является HER2, то внеклеточный усеченный вариант SIRPα представляет собой a1) или a2).
6. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 1, где высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо и слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα объединены посредством одного, двух или трех из следующих видов связывания: силы межмолекулярного взаимодействия, ковалентной связи, такой как межцепочечная дисульфидная связь, и солевой связи.
7. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 6, где биспецифический рекомбинантный белок дополнительно содержит Fc-область; предпочтительно Fc-область содержит природную последовательность Fc-области или неприродную последовательность Fc-области; более предпочтительно Fc-область является человеческой Fc-областью; еще более предпочтительно высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо и слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα являются гетеродимеризированными посредством «выступов-во-впадины».
8. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 7, где высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо представляет собой полуантитело, специфическое по отношению к мишени, выбранной из группы, состоящей из 5T4, AGS-16, ALK1, ANG-2, B7-H3, B7-H4, c-fms, c-Met, CA6, CD123, CD19, CD20, CD22, EpCAM, CD30, CD32b, CD37, CD38, CD40, CD52, CD70, CD74, CD79b, CD98, CEA, CEACAM5, CLDN18.2, CLDN6, CS1, CXCR4, DLL-4, EGFR, EGP-1, ENPP3, EphA3, ETBR, FGFR2, FN, FR-α, GCC, GD2, GPC-3, GPNMB, HER2, HER3, HLA-DR, ICAM-1, IGF-1R, IL-3R, LIV-1, MSLN, MUC16, MUC1, NaPi2b, нектина-4, Notch 2, Notch 1, PD-L1, PD-L2, PDGFR-α, PS, PSMA, SLTRK6, STEAP1, TEM1, VEGFR, CD25, CD27L, DKK-1, CSF-1R, MSB0010718C, BCMA и CD138, предпочтительно полуантитело из антитела IgG1, необязательно химерное полуантитело с человеческими и мышиными последовательностями, гуманизированное полуантитело, полностью человеческое полуантитело; более предпочтительно гуманизированное или полностью человеческое полуантитело из антитела IgG1.
9. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 7, где слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из b1), b2), b3) и b4): b1) SEQ ID No: 26; b2) SEQ ID No: 27; b3) SEQ ID No: 28; b4) аминокислотная последовательность, полученная путем осуществления вставки, делеции, модификации и/или консервативной замены по меньшей мере одного аминокислотного остатка, например, 1-5 аминокислотных остатков, любой из аминокислотных последовательностей, описанных выше, где аффинность связывания ее гомодимера с CD47 не превышает аффинность связывания гомодимера b1), b2) или b3) с CD47.
10. Биспецифический рекомбинантный белок по п. 9, где:
если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на CD20, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID No: 16 и SEQ ID No: 17, при этом слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит SEQ ID No: 26;
если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на EGFR, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID No: 19 и SEQ ID No: 8, при этом слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит SEQ ID No: 26;
если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на Her2, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID No: 20 и SEQ ID No: 21 или SEQ ID No: 22 и SEQ ID No: 23, при этом слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит SEQ ID No: 26 или SEQ ID No: 27; или
если высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо нацеливается на PD-L1, то высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо содержит SEQ ID No: 24 и SEQ ID No: 13, при этом слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα содержит SEQ ID No: 26.
11. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая биспецифический рекомбинантный белок по п. 1; предпочтительно молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα, представлены вместе в одной и той же нити ДНК, или молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая высокоаффинное нацеливающееся на опухоль плечо, и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок с низкой аффинностью для блокирования взаимодействия между CD47 и SIRPα, представлены в разных нитях ДНК.
12. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 11.
13. Клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии по п. 12.
14. Способ получения биспецифического рекомбинантного белка, где способ предусматривает клетку по п. 13 для экспрессии рекомбинантного белка.
15. Применение биспецифического рекомбинантного белка по п. 1 в изготовлении лекарственного препарата для лечения опухоли; предпочтительно опухоль является гематологической опухолью или солидной опухолью, выбранной из группы, состоящей из рака молочной железы, колоректального рака, рака легкого, рака поджелудочной железы, рака пищевода, рака эндометрия, рака яичника, рака желудка, рака предстательной железы, рака почки, рака шейки матки, миеломы, лимфомы, лейкоза, рака щитовидной железы, рака матки, рака мочевого пузыря, нейроэндокринного рака, рака головы и шеи, рака печени, карциномы носоглотки, рака яичка, мелкоклеточного рака легкого, немелкоклеточного рака легкого, меланомы, базально-клеточного рака кожи, плоскоклеточного рака кожи, возвышающейся дерматофибросаркомы, карциномы из клеток Меркеля, глиобластомы, глиомы, саркомы, мезотелиомы, миелодиспластического синдрома и т.п.
16. Способ ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела, которые нацеливаются на CD47 и обладают ADCC-активностью, in vitro, где способ предусматривает следующие стадии:
a) обеспечение рекомбинантного белка/антитела (в том числе моновалентного или поливалентного), который нацеливается на CD47 и обладает ADCC-активностью;
b) выявление ADCC-активности рекомбинантного белка/антитела и
c) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела;
предпочтительно способ дополнительно предусматривает следующие стадии между стадией a) и стадией b):
a1) получение эффекторной клетки, такой как без ограничения человеческая эффекторная клетка NK92MI-CD16a;
a2) приведение в контакт эффекторной клетки и рекомбинантного белка/антитела, и при этом антитело включает в себя моновалентное антитело или поливалентное антитело;
5
6
более предпочтительно на стадии a1) осуществляют повторное суспендирование собранных эффекторных клеток до плотности клеток от 1×10 клеток/мл до 5×10 клеток/мл; на стадии a2) осуществляют инкубирование рекомбинантного белка/антитела при градиенте концентрации с эффекторными клетками, полученными на стадии a1), в течение 0,5-5 ч; на стадии b) осуществляют определение активности LDH и расчет степени лизиса клеток; и/или на стадии c) проводят раннюю оценку иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела на основании степени лизиса клеток, при этом рекомбинантный белок/антитело с более низкой степенью лизиса клеток характеризуется более высокой иммунологической безопасностью.
17. Способ ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела, нацеливающегося на CD47, in vivo, где способ предусматривает:
a) обеспечение белка/антитела, нацеливающегося на CD47, где антитело включает в себя моновалентное антитело или поливалентное антитело;
b) обеспечение мыши Hu-NSG;
c) приведение в контакт рекомбинантного белка/антитела и мыши Hu-NSG и
d) проведение ранней оценки иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела у мыши Hu-NSG;
предпочтительно на стадии c) через 24-96 ч после введения осуществляют отбор венозной крови у мыши, лизирование RBC, инкубирование оставшихся клеток и флуоресцентно меченого антитела к человеческому CD45, антитела к человеческому CD19 или антитела к человеческому CD3 в течение 15-60 мин и выявление с помощью проточной цитометрии; на стадии d) проводят раннюю оценку иммунологической безопасности рекомбинантного белка/антитела на основании уровня клиренса клеток, где рекомбинантные белки/антитело с более низким уровнем клиренса клеток характеризуются более высокой иммунологической безопасностью.