СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО ПЛАСТА ИЗ КЛЕТОК ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ СЕТЧАТКИ
METHOD FOR CELL SHEET PRODUCTION FROM RETINAL PIGMENT EPITHELIAL CELLS

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способу получения клеточного пласта, включающему высевание клеток пигментного эпителия сетчатки на коллагеновом геле. Настоящее изобретение также относится к клеточному пласту для трансплантации, содержащему слой клеток, сформированный из клеток пигментного эпителия сетчатки, и базальную мембрану.
Уровень техники
В настоящее время, возрастная дегенерация желтого пятна (AMD) представляет собой одно из главных заболеваний, вызывающих практическую слепоту в развитых странах, и наблюдается в основном у пожилых граждан в возрасте больше 50. Возрастная дегенерация желтого пятна вызывается возрастными изменениями в макуле, и разделятся в основном на экссудативную форму и атрофическую форму. Экссудативная возрастная дегенерация желтого пятна представляет собой заболевание, связанное с развитием новообразовавшихся сосудов из сосудистой оболочки глаза, в макуле пожилых граждан, затем с кровотечением и экссудативным повреждением под пигментным эпителием сетчатки или под сетчаткой, и наконец, с формированием рубцовой ткани. Атрофическая возрастная дегенерация желтого пятна представляет собой заболевание, сопровождаемое атрофией макулярной области и накоплением друзов. Предшествующее повреждение, приводящее к экссудативной и атрофической возрастной дегенерации желтого пятна, иногда упоминается, в частности, как ранняя возрастная дегенерация желтого пятна, и это повреждение также рассматривается как одна из патологий возрастной дегенерации желтого пятна.
Для лечения возрастной дегенерации желтого пятна, когда она находится в легкой экссудативной форме, может выбираться хирургическое лечение, такое как фотодинамическая терапия, лазерная фотокоагуляция, отслоение новообразовавшихся сосудов, и тому подобное, или способ лечения, имеющий целью регрессию и удаление новообразовавшихся сосудов с помощью лекарственной терапии, такой как введение ингибитора фактора роста сосудов эндотелия (VEGF), вовлеченного в ангиогенез, и тому подобное. Однако рассмотренные выше средства не могут обеспечить терапевтическую эффективность для экссудативной или атрофической формы, которая прогрессирует до запущенной атрофии или до отсутствия пигментного эпителия сетчатки (RPE). В таком случае, эффективный способ лечения представляет собой трансплантацию клеток пигментного эпителия сетчатки или самого пигментного эпителия сетчатки на место, где он отсутствует, под сетчаткой.
Опробованы разнообразные способы лечения посредством трансплантации клеток пигментного эпителия сетчатки. Сообщается, что трансплантация клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных от эмбриона человека, в форме клеточной суспензии демонстрирует плохую приживаемость трансплантируемых клеток. В случаях, когда трансплантируется клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки, содержащий также оболочку Бруха и сосудистую оболочку глаза, отсоединенную в виде пласта из глаза трупа, происходит постоперационное отторжение и не получается достаточное воздействие лечения (непатентный документ 1). В дополнение к этому, способ, использующий глаз трупа, как отмечено, включает этическую проблему. С другой стороны, сообщается о случае улучшения зрения у пациента с возрастной дегенерацией желтого пятна, когда используют способ, включающий отбор собственных нормальных клеток пигментного эпителия сетчатки пациента и сосудистой оболочки глаза и трансплантацию их в то место, где их нет, под макулой. Однако этот способ доставляет исключительно большое неудобство для пациентов и имеет исключительно высокий риск при операции. Хотя была сделана попытка использования собственных клеток пигментного эпителия радужной оболочки глаза пациента, отобранных у пациента с возрастной дегенерацией желтого пятна, для трансплантации вместо клеток пигментного эпителия сетчатки, верхний предел конечного зрения является низким и достаточное воздействие не получается, и кроме того, неудобства и риск использования собственных клеток пациента являются большими (непатентный документ 2). Таким образом, обычные способы лечения с использованием клеток, отобранных из глаза трупа, или собственных клеток пациента являются непрактичными с точки зрения этики, безопасности, воздействия, и тому подобное, и клетки пигментного эпителия сетчатки, действительно пригодные для использования при трансплантационном лечении, являются желательными.
В качестве одного из способов получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, может быть рассмотрен способ, включающий нанесение на субстрат клеточной культуры внеклеточного матрикса, и тому подобное, и культивирование клеток пигментного эпителия сетчатки на нем с формированием пласта. Например, клеточный пласт может быть сформирован посредством культивирования клеток пигментного эпителия сетчатки на материале, покрытом фибронектином, но о формировании базальной мембраны не сообщалось, и способ отбора пласта из контейнера, в котором формируется пласт, вообще не описывался (непатентный документ 3). При рассмотрении таких проблем, способ формирования заранее клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки посредством использования искусственной мембраны вместо базальной мембраны разрабатывался многими лабораториями. Однако искусственная мембрана вызывает опасения относительно расстройства при приживлении во время трансплантации и функциональной поддержки организма. Хотя разработана также искусственная мембрана с меньшей биологической реакцией, она непригодна для трансплантации, поскольку она доставляет проблемы, вызывая воспаление и отторжение, связанные с ней, которые вызываются отличиями от базальной мембраны, производимой самими клетками, по композиции, свойствам, жесткости, и тому подобное. Однако повсеместно известен способ культивирования клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, имеющих полярность. Однако он предназначается только для использования на экспериментальных моделях, где клетки пигментного эпителия сетчатки и иммортализованная линия, полученная из живого организма, формируются в виде пласта в контейнере и используются непосредственно, и это еще не дает возможности реального извлечения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, снабженного базальной мембраной, как в живых организмах, из контейнера (непатентный документ 4). Имеется способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки посредством отслаивания клеток пигментного эпителия сетчатки, непосредственно культивируемых на чашке для культивирования, без использования внеклеточного матрикса, и тому подобное. Такой способ отсоединения клеток посредством отслаивания не может стабилизировать форму и размер пласта, базальной мембраны, и тому подобное, вызывает большие повреждения на клетках пигментного эпителия сетчатки при отслаивании и вызывает, в большинстве случаев, разрушение формы пласта и отдельных клеток из-за отслаивания, таким образом, он не может обеспечить клеточный пласт, пригодный для трансплантации, и тому подобное (непатентный документ 5). В дополнение к этому, хотя сообщалось о нанесении покрытия на субстрат культуры клеток покрытия из коллагена и культивирования клеток на коллагене, клетки пигментного эпителия сетчатки человека не использовали. Кроме того, для повышения прочности геля, должен отдельно добавляться агент для поперечной сшивки, что делает способ далеким от удобства и скорости (патентный документ 1). В соответствии с современной ситуацией, получение клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, который является терапевтически эффективным для заболеваний сетчатки, таких как возрастная дегенерация желтого пятна, и тому подобное, и удобным и стабильным с точки зрения приготовления, по-прежнему представляет собой проблему.
[Список документов]
[Патентный документ]
Патентный документ 1: JP-A-2005-261292
[Непатентные документы]
Непатентный документ 1: Ophthalmic Surg. 1991 Feb; 22(2): 102-8.
Непатентный документ 2: Tohoku J Exp Med. 1999 Dec; 189(4): 295-305.
Непатентный документ 3: Nat. Protoc., 4(5), 2009, 662-673.
Непатентный документ 4: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 47, 2006, 3612-3624.
Непатентный документ 5: Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36(2), 1995, 381-390.
Сущность изобретения
Проблемы, которые должны решаться изобретением
Задачей настоящего изобретения является разработка нового способа получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки удобным и стабильным образом без использования искусственной мембраны и обеспечение пациентов с заболеванием, связанным с отсутствием пигментного эпителия сетчатки, таким как возрастная дегенерация желтого пятна, и тому подобное, клеточным пластом из клеток пигментного эпителия сетчатки для трансплантации, который демонстрирует высокую скорость приживления и является превосходным при функционировании.
Средства решения проблем
Авторы настоящего изобретения получают клеточный пласт посредством формирования слоя коллагенового геля на субстрате культуры клеток и высевания и культивирования на нем клеток пигментного эпителия сетчатки. Клеточный пласт, полученный с помощью такого способа, поддерживает базальную мембрану между коллагеновым гелем и клеточным пластом из клеток пигментного эпителия сетчатки, имеет способность секреции цитокинов и адгезивность между клетками, сходные со свойствами клеток пигментного эпителия сетчатки in vivo, и делает возможным легкое отсоединение клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки от субстрата культуры клеток, в то же время, поддерживая базальную мембрану посредством разложения коллагенового геля с помощью коллагеназы. В дополнение к этому, клетки, составляющие клеточный пласт, поддерживают экспрессирование специфичного маркера клеток пигментного эпителия сетчатки. Авторы настоящего изобретения осуществили интенсивные исследования и завершили настоящее изобретение на основе этих данных. Соответственно, настоящее изобретение предлагает:
[1] способ получения клеточного пласта, включающий следующие стадии
(1) высевания и культивирования клеток пигментного эпителия сетчатки на коллагеновом геле с формированием клеточного пласта, состоящего из клеток пигментного эпителия сетчатки, и
(2) деградации коллагенового геля с помощью коллагеназы для отсоединения клеточного пласта, состоящего из клеток пигментного эпителия сетчатки;
[2] способ получения клеточного пласта из рассмотренного выше [1], где клетки пигментного эпителия сетчатки представляют собой клетки, полученные посредством индуцирования дифференциации стволовых клеток или клеток-предшественников;
[3] способ получения клеточного пласта из рассмотренного выше [2], где стволовые клетки представляют собой ES клетки или iPS клетки;
[4] способ получения клеточного пласта из рассмотренного выше [1], где концентрация коллагена в коллагеновом геле составляет 0,1%-0,5%;
[5] способ получения клеточного пласта по любому из рассмотренных выше [1]-[4], дополнительно включающий следующую далее стадию (3)
(3) подтверждение присутствия или отсутствия базальной мембраны на поверхности контакта между отсоединенным клеточным пластом и коллагеновым гелем;
[6] клеточный пласт, полученный с помощью способа по любому из рассмотренных выше [1]-[5];
[7] клеточный пласт для трансплантации, содержащий слой клеток, сформированный из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученный посредством индуцирования дифференциации стволовых клеток или клеток-предшественников ex vivo, и базальную мембрану, секретированную из указанных клеток; и
[8] клеточный пласт для скрининга, содержащий слой клеток, сформированный из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных посредством индуцирования дифференциации стволовых клеток или клеток-предшественников ex vivo, и базальную мембрану, секретированную из указанных клеток.
Воздействие изобретения
В соответствии с настоящим изобретением, клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки, имеющий конституцию, имеющую базальную мембрану, образующуюся на поверхности, может быть получен легким и стабильным образом. Поскольку клеточный пласт по настоящему изобретению является превосходным по скорости приживления и функциональности и исключительно пригодным для использования для трансплантации, пласт, состоящий из базальной мембраны и клеток пигментного эпителия сетчатки, может быть получен и применен на пациентах с офтальмологическими заболеваниями, такими как пациенты с возрастной дегенерацией желтого пятна, и тому подобное, посредством трансплантации. Конкретно, когда клетка, которая должна использоваться для культивирования, представляет собой клетку пигментного эпителия сетчатки, полученную из iPS клетки, отторжение при трансплантации может быть предотвращено посредством использования собственной клетки пациента в качестве источника.
Краткое описание чертежей
Фиг.1 показывает результаты исследования секреторной емкости цитокинов клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки.
Описание вариантов осуществления
Настоящее изобретение поясняется подробно далее.
Настоящее изобретение предлагает способ получения клеточного пласта, включающий следующие стадии:
(1) высевания и культивирования клеток пигментного эпителия сетчатки на коллагеновом геле с формированием клеточного пласта, состоящего из клеток пигментного эпителия сетчатки, и
(2) деградации коллагенового геля с помощью коллагеназы для отсоединения клеточного пласта, состоящего из клеток пигментного эпителия сетчатки.
Хотя клетка пигментного эпителия сетчатки, которая должна высеваться на стадии (1), может представлять собой клетку, полученную от любого млекопитающего, постольку, поскольку она получается от млекопитающих (например, человека, обезьяны, мыши, крысы, собаки, коровы, лошади, свиньи, овцы, козы, кошки, кролика, хомяка, морской свинки, и тому подобное), предпочтительно, она представляет собой клетку, полученную от человека.
Клетка пигментного эпителия сетчатки, которая должна высеваться может представлять собой первичную клетку, непосредственно отобранную из глазного яблока, или клетку, полученную после нескольких пассажей. Первичные клетки пигментного эпителия сетчатки могут изолироваться с помощью известного способа. Например, в случае клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных из глазного яблока, глазное яблоко трупа изолируют, быстро разделяют в экваториальной области, стекловидное тело и сетчатку удаляют и обрабатывают коллагеназой, гиалуронидазой, и тому подобное, по необходимости, клетки собирают посредством соскребывания с помощью лезвия для сбора клеток или обработки в растворе трипсина или EDTA для освобождения клеток от оболочки Бруха, выдерживают в культурной среде для индуцирования адгезии к чашке, для культивирования и роста, и клетки, выращенные в необходимом количестве, соответствующим образом пассажируют с помощью обработки трипсином, и тому подобное, для фиксации количества клеток.
Кроме того, эти клетки могут также представлять собой клетки, полученные посредством индуцирования дифференциации недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток, таких как эмбриональная стволовая клетка (ES клетка), индуцированная плюрипотентная стволовая клетка (iPS клетка), и тому подобное, стволовые клетки, включая соматические стволовые клетки, такие как нейронная стволовая клетка, и тому подобное, или клетки-предшественники, включая нейронную клетку-предшественник и клетку-предшественник сетчатки. ES Клетка может также представлять собой ES клетку, полученную посредством перепрограммирования ядра соматической клетки. В дополнение к этому, в качестве стволовой клетки, целевая клетка может быть получена посредством индуцирования дифференциации индуцированной плюрипотентной стволовой клетки (iPS клетки), о котором сообщалось в последние годы. iPS Клетка представляет собой индуцированную стволовую клетку, полученную из соматической клетки, имеющую свойства, эквивалентные свойствам ES клетки, которая может быть получена посредством введения конкретного вещества, перепрограммирующего ядро (нуклеиновых кислот, белка, низкомолекулярного соединения, и тому подобное) в соматическую клетку [Takahashi, K. and Yamanaka, S., Cell, 126: 663-676 (2006); Takahashi, K. et al., Cell, 131: 861-872 (2007)]. Условия и среда, используемые для дифференциации рассмотренной выше стволовой клетки в целевую дифференцированную клетку, могут воспроизводить повсеместно известные условия и среду, или могут соответствующим образом определяться специалистами в данной области. В настоящем изобретении, клетка, полученная посредством индуцирования дифференциации стволовой клетки или клетки-предшественника, предпочтительно, плюрипотентной стволовой клетки, используется предпочтительно в качестве клетки пигментного эпителия сетчатки, которая должна использоваться для клеточного пласта, поскольку клетка пигментного эпителия сетчатки может быть получена на соответствующей стадии созревания, и в частности, могут быть получены сравнительно незрелые клетки пигментного эпителия сетчатки, и может быть преимущественно сформирован клеточный пласт. В дополнение к этому, когда клеточный пласт, который должен быть получен в соответствии с настоящим изобретением, предназначен для трансплантации, использование iPS клетки является предпочтительным, поскольку клеточный пласт, полученный с использованием соматической клетки субъекта, который принимает трансплантацию, в качестве источника iPS клетки, не имеет антигенности против субъекта. Когда стволовая клетка индуцируется для дифференциации, например, ES клетка человека или плюрипотентная стволовая клетка, такая как iPS клетка, и тому подобное, культивируется в среде для ES дифференциации, в которую добавляют антагонист Wnt, такой как Dkk-1, CKI-7, и тому подобное, и антагонист Nodal, такой как Lefty A, SB-431542, и тому подобное. Когда их культивируют в течение заданного периода, экспрессируются Rx, Pax6 и Mitf, которые представляют собой маркеры клеток-предшественников сетчатки, и клетки пигментного эпителия сетчатки человека могут быть получены посредством морфологического наблюдения с помощью оптического микроскопа посредством подтверждения присутствия клеток, имеющих многоугольную форму и пигмент [Neuroscience Letters 2009 Jul 24 458(3) 126-31, Journal of Cell Science 2009 Sep 1 122(Pt 17) 3169-79].
Клетки пигментного эпителия сетчатки по настоящему изобретению культивируют посредством высевания на коллагеновом геле. Коллаген, используемый для коллагенового геля, может быть любым постольку, поскольку его получают от млекопитающего (например, человека, обезьяны, мыши, крысы, собаки, коровы, лошади, свиньи, овцы, козы, кошки, кролика, хомяка, морской свинки, и тому подобное) и, например, используют коллаген, полученный от человека или свиньи. Примеры ткани, полученной из коллагена, включают сухожилие, кожу, и тому подобное. Хотя вид коллагена может быть любым, предпочтительным является коллаген иной, чем коллаген, составляющий базальную мембрану человека, и коллаген иной, чем коллаген типа IV является особенно предпочтительным. Среди них предпочтительно используют коллаген типа I. Хотя коллагеновый гель может быть получен с помощью, например, повсеместно известного способа получения, в настоящем изобретении, гель, состоящий из сетки коллагеновых волокон, получают посредством индуцирования фиброгенеза коллагена, как описано в рассмотренном ниже примере. Поскольку фиброзный коллаген имеет прочность и гибкость в сочетании, он является простым при манипулировании, показывает хорошую поддержку пролиферации клеток и дифференциации клеток, и является предпочтительным в качестве коллагенового геля для использования в настоящем изобретении. В дополнение к этому, коллаген, который используют в настоящем изобретении, требуется для поддержания клеток, которые высевают на коллагеновом геле, на поверхности геля, не позволяя им погружаться в слой геля. Следовательно, в качестве коллагена предпочтительным является коллаген, где гель имеет прочность, необходимую для пролиферации клеток, предпочтительным является, например, и коллаген, имеющий большую величину межмолекулярной поперечной сшивки. В качестве такого коллагена может рассматриваться коллаген, полученный из сухожилий.
Хотя концентрация коллагена у рассмотренного выше коллагенового геля может находиться в любом диапазоне постольку, поскольку она может давать гель, имеющий прочность, дающую возможность для приживления и роста клеток пигментного эпителия сетчатки, и удовлетворяющий требованиям к растворимости, облегчающим деградацию с помощью коллагеназы, к вязкости, делающей возможными простые манипуляции, и тому подобное, она предпочтительно составляет 0,1% (масс/объем) - 0,5% (масс/объем), более предпочтительно, 0,2% (масс/объем) - 0,3% (масс/объем). Когда концентрация коллагена коллагенового геля меньше чем 0,1% (масс/объем), прочность коллагенового геля становится недостаточной, и по этой причине, скорость образования колоний и скорость пролиферации клеток для клеток пигментного эпителия сетчатки уменьшаются. Когда концентрация коллагена коллагенового геля превышает 0,5% (масс/объем), время обработки коллагеназой для деградации коллагенового геля становится продолжительным, что вызывает опасения относительно оказания отрицательного воздействия на клетки.
2
Хотя объем смешанного раствора коллагенового геля, используемого для получения рассмотренного выше коллагенового геля, изменяется в зависимости от площади культивирования и формы субстрата культуры, который должен использоваться для клеточной культуры, предпочтительно, он составляет примерно 100 мкл - примерно 250 мкл, более предпочтительно, примерно 150 мкл - примерно 200 мкл, на единицу площади (см). Когда количество смешанного раствора коллагенового геля является слишком малым, формируется слой коллагенового геля, имеющий тонкую центральную часть, из-за влияния поверхностного натяжения, прикладываемого к поверхности геля, и имеется тенденция к повреждению пласта во время вырезания клеточного пласта, поскольку клетки непосредственно вступают в контакт с субстратом культуры, когда культивируются клетки пигментного эпителия сетчатки. Когда количество смешанного раствора коллагенового геля является избыточным, формируется толстый слой коллагенового геля на субстрате культуры, что значительно сокращает количество среды для культивирования, и по этой причине, осуществление поддержания культуры не является легким, обработка коллагеназой занимает время, и имеются опасения относительно появления повреждений на клеточном пласте.
На стадии (1), клеточный пласт может быть получен посредством высевания и культивирования рассмотренных выше клеток пигментного эпителия сетчатки на коллагеновом геле субстрата клеточной культуры. Субстрат клеточной культуры по настоящему изобретению не является как-либо ограниченным постольку, поскольку он предназначен для культивирования клеток. Его примеры включают контейнеры для культур, имеющие пористую мембрану, такие как трансвел, и тому подобное, колба, колба для культур тканей, чашка, чашка Петри, чашка для культур тканей, многоцелевая чашка, микропланшет, рамка для микролунок, многоцелевой планшет, многолуночный планшет, предметное стекло с лункой и покровным стеклом, чашка Петри, пробирка, поддон, культуральный мешок и вращающийся флакон. Контейнеры для культур, имеющие пористую мембрану, являются предпочтительными, поскольку удобно осуществлять обработку коллагеназой и операцию отрезания клеточного пласта. Например, предпочтительно используют коммерчески доступный трансвел. Примеры материала субстрата клеточной культуры в настоящем описании включают, но, не ограничиваясь этим, неорганические материалы, такие как металл, стекло, керамика, силикон, и тому подобное, органические материалы, представленные эластомером, пластиком (например, полиэфирной смолой, полиэтиленовой смолой, полипропиленовой смолой, ABS смолой, нейлоном, акриловой смолой, фторкаучуком, поликарбонатной смолой, полиуретановой смолой, метилпентеновой смолой, фенольной смолой, меламиновой смолой, эпоксидной смолой, винилхлоридной смолой).
4
2
5
2
4
2
5
2
5
2
Количество клеток пигментного эпителия сетчатки, которые должны высеваться, может находиться в любом диапазоне постольку, поскольку оно соответствует плотности клеток, которые могут образовывать клеточный пласт. Однако когда плотность клеток является слишком низкой, форма клеток является плохой, время культивирования до достижения конфлюэнтности является продолжительным, и кроме того, время, необходимое для созревания и окрашивания клеток, является продолжительным. Когда плотность клеток является слишком высокой, подобным же образом, подавляется пролиферация клеток, время культивирования до достижения конфлюэнтности имеет тенденцию к увеличению и клетки могут погибать от перенаселенности. По этой причине, плотность клеток, которые должны высеваться, предпочтительно составляет примерно 4,5×10 клеток/см - примерно 8,5×10 клеток/см, более предпочтительно, примерно 8,5×10 клеток/см - примерно 8,5×10 клеток/см, наиболее предпочтительно, примерно 4,5×10 клеток/см.
Однослойная популяция клеток (клеточный пласт), состоящий из клеток пигментного эпителия сетчатки, может формироваться посредством культивирования клеток пигментного эпителия сетчатки, высеваемых на коллагеновом геле, в среде для культивирования. Среда для культивирования может использоваться без какого-либо ограничения постольку, поскольку это среда для культивирования клеток, используемая, как правило, в данной области. Например, можно использовать базальные среды, описанные в “Japan tissue culture conference ed., Technique of Tissue Culture 3rd edition” page 581, опубликованной Asakura Shoten, такая как среда F-10, среда F12, MEM, среда BME, DMEM, αMEM, среда IMD, среда ES, среда DM-160, среда Фишера, среда WE, среда RPMI1640, и тому подобное. Кроме того, к базальной среде может добавляться сыворотка (фетальная сыворотка теленка и тому подобное), различные факторы роста (EGF, FGF, HGF, PDGF и тому подобное), антибиотик, аминокислота, и тому подобное. pH среды предпочтительно составляет примерно 6 - примерно 8. Относительно культуры, например, первичное культивирование осуществляют, как правило, примерно при 30 - примерно 40°C в течение примерно 15 - примерно 60 час, пока клетки пигментного эпителия сетчатки не станут конфлюэнтными. После этого осуществляют вторичное культивирование в течение примерно 1 недели - примерно 2 месяцев, заменяя при этом среду, после чего культивирование осуществляют, в то же время, аэрируя и перемешивая по необходимости, до образования клеточного пласта. Клетки, составляющие клеточный пласт, полученные с помощью такого культивирования, поддерживаются как клетки пигментного эпителия сетчатки. Поддерживание клеток в качестве клеток пигментного эпителия сетчатки может подтверждаться посредством детектирования BEST1, RPE65, MERTK, CRALBP или чего-либо подобного в качестве специфичного маркера дифференциации.
Поскольку клеточный пласт, сформированный на стадии (1), прилипает к коллагеновому гелю, например, когда его непосредственно используют для трансплантации, и тому подобное, имеется опасение, что коллагеновый гель будет мешать приживлению трансплантата у реципиента. Если коллагеновый гель может удаляться заранее, это является благоприятным для решения такой проблемы. На стадии (2) настоящего изобретения, коллагеновый гель, прилипший к клеточному пласту, сформированному на стадии (1), деградирует под действием коллагеназы. Специалисты в данной области могут выбрать соответствующую коллагеназу в соответствии с видом коллагена, используемого для получения коллагенового геля. Хотя коллагеназа, которая должна использоваться для деградации коллагенового геля, не является конкретно ограниченной постольку, поскольку она имеет активность переваривания коллагенового геля, предпочтительной является коллагеназа, которая не деградирует легко коллаген, составляющий базальную мембрану человека (например, коллаген Типа IV, и тому подобное). Например, можно использовать коллагеназу, полученную от микроорганизма, происходящего из Clostridium (Clostridium histolyticum) или Streptomyces (Streptomyces parvulus), которые являются доступными на коммерческом уровне, безопасны и имеют высокую ферментативную активность.
В качестве активности рассмотренной выше коллагеназы, важна удельная активность по отношению к массе коллагена в коллагеновом геле, а не активность на единицу массы коллагеназы и активность на единицу объема водного раствора коллагеназы. Удельная активность коллагеназы, которая должна использоваться для растворения коллагенового геля (активность коллагеназы/масса коллагена), предпочтительно не меньше чем 0,1 Ед./мг. Когда удельная активность коллагеназы меньше чем 0,1 Ед./мг, растворение коллагенового геля может быть нежелательно продолжительным или же гель может растворяться нежелательно недостаточно. Более предпочтительно, она находится в пределах 0,1-10000 Ед./мг, более предпочтительно, 1-3000 Ед./мг.
В способе получения клеточного пласта по настоящему изобретению, способ действия коллагеназы на коллагеновый гель не является конкретно ограниченным. Раствор коллагеназы, полученный с использованием, в качестве растворителя, среды или изотонического раствора, имеющего буферную емкость, может добавляться в среду, или же соединенный с клетками коллагеновый гель, отсоединенный от чашки для культивирования клеток, может быть погружен в рассмотренный выше раствор коллагеназы. Поскольку в настоящем изобретении используют трансвел в качестве субстрата культуры клеток, слой коллагенового геля может экспонироваться посредством извлечения вставки и удаления мембраны на дне вставки, и экспонируемый коллагеновый гель предпочтительно погружают непосредственно в рассмотренный выше раствор коллагеназы.
В способе получения клеточного пласта по настоящему изобретению, время растворения коллагенового геля с помощью коллагеназы не является конкретно ограниченным. Когда время действия коллагеназы является слишком большим, функции клеток, такие как способность к адгезии, способность к пролиферации, и тому подобное, могут деградироваться нежелательным образом. Хотя время растворения посредством коллагеназы может изменяться под действием изменения удельной активности коллагеназы, температуры, формы коллагенового геля, способа обработки коллагеназой, и тому подобное, как правило, оно составляет 15 мин - 60 мин. Обработка коллагеназой может представлять собой одну обработку или осуществляться множество раз.
Температура во время обработки коллагенового геля с помощью коллагеназы в способе получения клеточного пласта по настоящему изобретению предпочтительно устанавливается в пределах 10-42°C, более предпочтительно, 30-40°C, еще более предпочтительно, 36-38°C, поскольку текучесть цитоплазмы клетки, как правило, уменьшается и способность к метаболизму уменьшается, когда температура внутри живых организмов становится не выше чем 10°C (примерно 30°C у людей), белок денатурирует и функционирование клеток ухудшается, когда температура превышает 42°C, и оптимальная температура коллагеназы составляет в основном 37°C, а температура ниже этого уровня продлевает время растворения.
В способе получения клеточного пласта по настоящему изобретению, когда происходит растворение коллагенового геля, клеточный пласт постепенно отсоединяется от геля и, наконец, освобождается в растворе коллагеназы. Для извлечения клеточного пласта, клеточный пласт может механически отсоединяться от остального геля или может извлекаться после полного растворения геля. Хотя механическое отсоединение сокращает время до извлечения клеточного пласта, поскольку клеточный пласт может быть поврежден, его предпочтительно извлекают после полного растворения геля.
Хотя клеточный пласт, извлеченный, как рассмотрено выше, может непосредственно использоваться для различных применений, поскольку оставшаяся коллагеназа может ингибировать адгезивность между клеточными пластами или адгезивность по отношению к тканям, его предпочтительно промывают средой или изотоническим раствором, имеющим буферную емкость. Температура во время промывки может определяться в соответствии с видом обработки для растворения коллагенового геля с помощью коллагеназы. Для достаточного удаления оставшейся коллагеназы, пласт предпочтительно промывают один или несколько раз средой или изотоническим раствором, имеющим буферную емкость.
В клеточном пласте, полученном с помощью способа по настоящему изобретению, секретируется цитокин, специфичный для клеток пигментного эпителия сетчатки, с полярностью сходной с полярностью в живых организмах, и трансэпителиальное электрическое сопротивление (TER), которое должно быть показателем прочной адгезионной связи между клетками, повышается, как в живых организмах. По этой причине, он имеет барьерную функцию клеточного слоя, сходную с функцией в живых организмах. В соответствии со способом по настоящему изобретению, может быть получен клеточный пласт, имеющий функции, сходные с функциями в живых организмах.
В клеточном пласте, полученном с помощью способа по настоящему изобретению, образуется плотное соединение между клетками пигментного эпителия сетчатки и формируется базальная мембрана на стороне контакта с коллагеновым гелем. В настоящем описании, “базальная мембрана” представляет собой мембрану, сформированную из компонентов, продуцируемых клетками пигментного эпителия сетчатки, и означает мембрану, содержащую, по меньшей мере, часть компонентов базальной мембраны (ниже должна упоминаться как “базальная мембрана клеток пигментного эпителия сетчатки”). Базальная мембрана клеток пигментного эпителия сетчатки в живых организмах присутствует как тонкая пленка между слоем клеток пигментного эпителия сетчатки и внутренним слоем коллагена, составляющим оболочку Бруха, и представляет собой внеклеточный матрикс, имеющий коллаген Типа IV, ламинин, гепаран сульфат протеогликан (перлекан), нидоген, и тому подобное, в качестве репрезентативных компонентов. Оболочка Бруха представляет собой тонкую пленку между слоем клеток пигментного эпителия сетчатки и сосудистой оболочкой глаза и имеет 5-слойную структуру базальной мембраны клеток пигментного эпителия сетчатки, внутренний слой коллагена, слой эластина, наружный слой коллагена и базальную мембрану капиллярного слоя сосудистой оболочки глаза. Клеточный пласт по настоящему изобретению содержит часть (базальную мембрану клеток пигментного эпителия сетчатки) структуры оболочки Бруха. Образование плотного соединения может быть подтверждено посредством наблюдения формы плотно слипшихся клеток гексагональной формы и экспрессирования окклюдина, ZO-1, и тому подобное, между клетками с помощью иммунного окрашивания. Образование базальной мембраны может быть подтверждено посредством наблюдения экспрессирования маркеров базальной мембраны, таких как ламинин, гепаран сульфат протеогликан (перлекан), нидоген или коллаген Типа IV, и тому подобное, на поверхности клеток с помощью иммунного окрашивания или наблюдения с помощью сканирующего электронного микроскопа.
Как правило, клетки пигментного эпителия сетчатки, культивируемые в чашке для культивирования, продуцируют компоненты базальной мембраны, но является исключительно сложным отсоединение клеток в форме пригодного для использования клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, отсоединенного от чашки для культивирования (Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 36(2), 1995, 381-390). В соответствии со способом по настоящему изобретению, клетки пигментного эпителия сетчатки вместе с базальной мембраной, полученной из клеток пигментного эпителия сетчатки, могут извлекаться как пласт без использования искусственной мембраны. Поскольку клетки пигментного эпителия сетчатки образуют однослойную структуру, когда ими манипулируют по отдельности, структура пласта разрушается, и клетки распадаются на единичные клетки. Таким образом, трансплантация их в виде пласта является исключительно сложной. С другой стороны, поскольку клеточный пласт по настоящему изобретению сопровождается базальной мембраной и имеет достаточную жесткость, он не сморщивается легко во время извлечения, что делает манипуляции с ним исключительно простыми. Как следствие, поскольку установка в устройстве для трансплантации клеток и операция трансплантации могут осуществляться плавно, трансплантация клеток может осуществляться с минимальным вмешательством, и как воздействие, так и прогноз, как ожидается, должны улучшиться. В дополнение к этому, поскольку клеточный пласт сопровождается базальной мембраной, это является исключительно преимущественным для трансплантации при заболевании, когда базальная мембрана при этом разрушается. Например, возрастная дегенерация желтого пятна иногда сопровождается разрушениями оболочки Бруха. Базальная мембрана в клеточном пласте по настоящему изобретению компенсирует разрушенную часть, при этом скорость приживления клеточного пласта может быть улучшена, а также можно ожидать его терапевтического воздействия. Следовательно, клеточный пласт по настоящему изобретению является предпочтительным в качестве пласта для трансплантации, нацеленного на заболевание с нарушенной базальной мембраной, и может предпочтительно использоваться в качестве пласта для трансплантации, конкретно нацеленного на возрастную дегенерацию желтого пятна.
Способ получения клеточного пласта по настоящему изобретению может дополнительно включать следующую стадию (3):
(3) подтверждения присутствия или отсутствия базальной мембраны на поверхности контакта между отсоединенным клеточным пластом и коллагеновым гелем.
На стадии (3), образование клеточного пласта, имеющего клеточный слой, состоящий из клеток пигментного эпителия сетчатки и базальную мембрану, может определяться посредством подтверждения присутствия или отсутствия базальной мембраны в клеточном пласте. Присутствие или отсутствие базальной мембраны может подтверждаться с помощью способа, сходного с рассмотренным выше, подтверждением образования базальной мембраны, например, экспрессии маркера базальной мембраны, наблюдения с помощью сканирующего электронного микроскопа, и тому подобное. Для детектирования базальной мембраны, экспрессирование маркера базальной мембраны может подтверждаться в любой области клетки (например, в цитоплазме, на клеточной мембране, на ядерной мембране, и тому подобное). Предпочтительно, целевым является маркер, экспрессируемый на стороне контакта с коллагеновым гелем.
Маркер базальной мембраны в настоящем описании включает продукт транскрипции, продукт трансляции или продукт деградации гена, специфично экспрессируемого в базальной мембране. Примеры такого гена включают ламинин, гепаран сульфат протеогликан (перлекан), нидоген, коллаген Типа IV, и тому подобное. Среди них, ламинин, коллаген Типа IV, и тому подобное, которые представляют собой главные компоненты базальной мембраны, используются предпочтительно.
Образец, который должен использоваться для “подтверждения присутствия или отсутствия базальной мембраны на поверхности контакта между отсоединенным клеточным пластом и коллагеновым гелем”, не является конкретно ограниченным постольку, поскольку он содержит маркер базальной мембраны (например, РНК, белок, продукт его деградации, и тому подобное), полученный из клеточного пласта (или клетки), отсоединенного на стадии (2).
Экспрессирование гена маркера базальной мембраны, когда рассмотренный выше образец представляет собой РНК, может быть исследовано посредством получения фракции РНК (например, РНК, мРНК в целом) из клеток клеточного пласта, отсоединенного на стадии (2), и детектирования продукта транскрипции гена маркера, содержащегося во фракции, или прямого детектирования продукта гена маркера в клетке без извлечения РНК из клетки.
Когда фракцию РНК (например, РНК, мРНК, в целом) приготавливают из клеток, она может быть приготовлена с использованием известного способа, такого как способ ультрацентрифугирования в гуанидине–CsCl, способ AGPC (водной гель-проникающей хроматографии), и тому подобное. Используя коммерчески доступный набор для извлечения РНК (например, RNeasy Mini Kit; производимый QIAGEN, и тому подобное), РНК в целом с высокой чистотой может быть получена быстрым и удобным образом из микроскопического количества образца. Примеры способа детектирования продукта транскрипции гена маркера базальной мембраны во фракции РНК включают способ с использованием гибридизации (Нозерн блот, дот блот, анализ с помощью ДНК чипов и тому подобное), способ с использованием PCR (RT-PCR, конкурентной PCR, PCR в реальном времени, и тому подобное) и тому подобное. Количественные способы PCR, такие как конкурентная PCR, PCR в реальном времени, и тому подобное, являются предпочтительными, поскольку изменение экспрессии гена маркера базальной мембраны может детектироваться быстрым и удобным способом из микроскопического количества образца, и анализ с помощью ДНК чипов является предпочтительным, поскольку изменение экспрессии множества генов маркеров может детектироваться коллективно и рабочие характеристики количественного определения могут также быть улучшены с помощью выбора способа детектирования, и тому подобное.
Когда используют гибридизацию Нозерн блот или дот блот, ген маркера базальной мембраны может детектироваться с использованием нуклеиновой кислоты (зонда), которая может гибридизироваться с продуктом транскрипции гена. Примеры такой нуклеиновой кислоты включают нуклеиновую кислоту, которая может гибридизироваться с продуктом транскрипции гена маркера базальной мембраны при очень жестких условиях. Примеры “очень жестких условий” включают реакцию гибридизации при 45°C в 6×SSC (хлорид натрия/цитрат натрия), с последующей промывкой один или несколько раз при 65°C в 0,2×SSC/0,1% SDS, и тому подобное. Специалисты в данной области могут легко установить желательные жесткие условия посредством соответствующего изменения концентрации соли раствора для гибридизации, температуры реакции гибридизации, концентрации зонда, длины зонда, количества несовпадений, времени реакции гибридизации, концентрации соли при промывке, температуры промывки, и тому подобное. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК, РНК или химеру ДНК/РНК, при этом предпочтение отдается ДНК.
32
3
14
Нуклеиновая кислота, которая должна использоваться в качестве зонда, может быть двухнитевой или однонитевой. Когда она двухнитевая, она может представлять собой двухнитевую ДНК, двухнитевую РНК или гибрид ДНК:РНК. Когда она однонитевая, можно использовать антисмысловую нить. Хотя длина нуклеиновой кислоты не является как-либо ограниченной постольку, поскольку она может специфично гибридизироваться с целевой нуклеиновой кислотой, она составляет, например, не меньше примерно, чем 15 оснований, предпочтительно, не меньше примерно, чем 30 оснований. Чтобы сделать возможным детектирование и количественное определение целевой нуклеиновой кислоты, нуклеиновую кислоту предпочтительно метят. Примеры метки включают радиоактивный изотоп, фермент, флуоресцентное вещество, люминесцентное вещество, и тому подобное. Примеры радиоактивного изотопа включают [P], [H], [C], и тому подобное. В качестве фермента является предпочтительным стабильный фермент, имеющий высокую удельную активность, например, β-галактозидаза, β-глюкозидаза, щелочная фосфатаза, пероксидаза, дегидрогеназа яблочной кислоты, и тому подобное. Примеры флуоресцентного вещества включают флуорескамин, флуоресцеин изотиоцианат, и тому подобное. Примеры люминесцентного вещества включают люминол, производное люминола, люциферин, люцигенин, и тому подобное. Кроме того, биотин-(стрепт)авидин также можно использовать для связывания зонда и метки.
Когда используют Нозерн гибридизацию, фракцию РНК, полученную, как рассмотрено выше, разделяют с помощью гель-электрофореза, переносят на мембрану из нитроцеллюлозы, нейлона, поливинилидена дифторида, и тому подобное, гибридизируют при рассмотренных выше “очень жестких условиях” в буфере для гибридизации, содержащем метящий зонд, полученный, как рассмотрено выше, и измеряют количество метки, связанной с мембраной, для каждой полосы с помощью соответствующего способа, при этом можно измерить уровень экспрессирования каждого гена маркера базальной мембраны. Также и в случае дот блота, мембрану, на которую нанесена фракция РНК, подвергают сходному воздействию реакции гибридизации (осуществляемой для каждого гена маркера), и измеряют количество метки в пятне, при этом можно измерить уровень экспрессирования каждого гена маркера.
Когда используют анализ с помощью ДНК чипов, например, кДНК, вводимую вместе с соответствующим промотором, таким как T7 промотор, и тому подобное, посредством реакции обратной транскрипции, синтезируют из фракции РНК, полученной, как рассмотрено выше, кРНК синтезируют с использованием РНК полимеразы (в этом случае, меченую кРНК получают с использованием мононуклеотида, меченного биотиномом, и тому подобное, в качестве субстрата). Меченую кРНК приводят в контакт с чипом, имеющим рассмотренный выше зонд, иммобилизованный на нем, для осуществления реакции гибридизации, и измеряют количество метки, связанной с каждым зондом на твердой фазе, при этом может быть измерен уровень экспрессирования каждого гена маркера базальной мембраны. Этот способ является преимущественным с точки зрения быстроты и удобства, поскольку увеличивается количество детектируемых дифференцированных генов маркеров (для этого зонды должны находиться на твердой фазе).
С другой стороны, когда ген маркера детектируется без извлечения РНК из клетки, в качестве среды детектирования можно использовать гибридизацию in situ. В этом способе, клетку иммобилизуют посредством обработки клеток фиксирующим агентом, предпочтительно, преципитационным фиксирующим агентом, например, ацетоном, или инкубирования клеток в течение короткого времени в буферном растворе формальдегида, вместо извлечения РНК из клеток. После иммобилизации, клетку погружают в парафин с получением блока, и срез, срезанный с него, можно использовать в качестве образца. Хорошо приготовленный образец, погруженный в парафин, может сохраняться при комнатной температуре в течение многих лет. В качестве нуклеиновой кислоты, которая должна использоваться в качестве зонда, можно использовать соединения сходные с рассмотренными выше примерами. Гибридизацию in situ предпочтительно используют в настоящем изобретении, поскольку экспрессирование маркера базальной мембраны на поверхности контакта между клеткой и коллагеновым гелем может подтверждаться непосредственно.
Альтернативно, экспрессию маркера базальной мембраны в отсоединенном клеточном пласте на стадии (2) можно подтвердить посредством приготовления фракции белков из клеточного пласта (или клеток) и детектирования продукта трансляции (то есть, маркерного белка) гена маркера, содержащегося во фракции, или непосредственного детектирования продукта трансляции гена маркера в клеточном пласте (или клетке), без извлечения белка из клеточного пласта (или клетки). Маркерный белок может детектироваться посредством иммунологического способа измерений (например, ELISA, FIA, RIA, Вестерн блот, и тому подобное) с использованием антитела к каждому белку, и в случае белка, показывающего заметную физиологическую активность, такого как фермент, и тому подобное, его можно детектировать посредством измерения физиологической активности каждого маркерного белка с помощью известного способа. Альтернативно, маркерный белок может также детектироваться с помощью способа масс-спектрометрии, такого как MALDI-TOFMS, и тому подобное.
Антитело к каждому маркерному белку может быть получено в соответствии с повсеместно используемой методикой получения поликлональных антител или моноклональных антител и использования маркерного белка или белка или его частичного пептида в качестве антигена для иммунизации.
Когда соответствующие иммунологические способы измерений применяются к способу исследования по настоящему изобретению, установление специальных условий, операций, и тому подобное, не является необходимым. Система измерения маркерного белка базальной мембраны может быть построена посредством добавления общего технического рассмотрения специалистами в данной области общих условий и методов работы в каждом способе. Относительно подробностей этих общих технических средств можно сослаться на руководства, книги, и тому подобное. Например, можно сослаться на “Radioimmunoassay” edited by Hiroshi Irie (Kodansha, published in 1974), “cont. Radioimmunoassay” edited by Hiroshi Irie (Kodansha, published in 1979), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. (Igaku-Shoin, published в 1978), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. (2nd edition) (Igaku-Shoin, published в 1982), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. (3rd edition) (Igaku-Shoin, published в 1987), “Methods in ENZYMOLOGY”, Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)), ibidem, Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B)), ibidem, Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part C)), ibidem, Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays)), ibidem, Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), ibidem, Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (все опубликованы Academic Press), и тому подобное.
Настоящее изобретение также относится к клеточному пласту, полученному в соответствии с рассмотренным выше способом получения клеточных пластов, предпочтительно, к клеточному пласту для трансплантации, содержащему слой клеток, сформированных из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных посредством индуцирования дифференциации ex vivo, и базальной мембраны. Клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой материал для трансплантации с целью лечения сетчатки у пациентов с офтальмологическими заболеваниями. Примеры офтальмологического заболевания включают дегенеративные заболевания сетчатки, такие как возрастная дегенерация желтого пятна, пигментная дистрофия сетчатки, диабетическая ретинопатия, отслоение сетчатки, и тому подобное. Поскольку клеточный пласт по настоящему изобретению содержит базальную мембрану, он может трансплантироваться с высокой долей приживления для заболевания, одновременно включающего повреждение оболочки Бруха. В дополнение к этому, поскольку клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки по настоящему изобретению имеет базальную мембрану, полученную из компонентов сходных с компонентами в живых организмах, его можно также использовать для различных целей скрининга, таких как скрининг эффективности, оценка токсичности, и тому подобное, при рассмотренных выше офтальмологических заболеваниях. Для скрининга эффективности относительно рассмотренных выше офтальмологических заболеваний, например, клеточный пласт по настоящему изобретению может применяться для скрининга вещества, имеющего эффективность при рассмотренных выше офтальмологических заболеваниях, в соответствии со способом, описанным в JP-A-2007-500509. Чтобы быть конкретным, клеточный пласт по настоящему изобретению культивируют в присутствии или в отсутствие вещества кандидата, имеющего эффективность при стрессовых условиях, возможно, вызывающих рассмотренные выше офтальмологические заболевания (например, света (например, белого света, голубого света; свет вызывает гибель клеток сетчатки, в частности, фоторецепторных клеток, и может представлять собой фактор, вызывающий дегенерацию желтого пятна), A2E [ретиноида N-ретинилиден-N-ретинил-этаноламина] (накопление A2E, как считается, вносит вклад в возрастную нейродегенерацию клеток сетчатки, в частности, экспрессирование дегенерации желтого пятна), агрегатов сигаретного дыма (курение, как считается, представляет собой фактор риска при дегенерации желтого пятна), внешнего давления (например, гидростатического давления; повышение внутриглазного давления, как ожидается, причастно к возникновению глаукомы)), и оценку можно осуществить на основе количества фоторецепторов, которые экспрессируют родопсин, и с помощью иммунного окрашивания с использованием антитела анти-каспеаза 3. Для оценки токсичности, клеточный пласт по настоящему изобретению может применяться для скрининга токсичного вещества в соответствии со способом, описанным в JP-A-2007-517210. Чтобы быть конкретным, клеточный пласт по настоящему изобретению культивируют в присутствии или в отсутствие кандидата в токсичные вещества и с использованием маркерного пептида интегрина, описанного в JP-A-2007-517210, возбуждаемого с помощью лазера на длине волны 488 нм, и для оценки детектируется флуоресценция на 520 нм. Кроме того, клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки по настоящему изобретению может также использоваться как модель in vitro для оценки различных функций in vivo клеток пигментного эпителия сетчатки, таких как функция, относящаяся к поддержанию зрительных клеток, таких как фагоцитарная способность наружного сегмента фоторецептора, нейропротекторное действие, и тому подобное, барьерная функция кровеносных сосудов сетчатки, такая как функция насоса, плотное соединение, и тому подобное.
Клеточный пласт для трансплантации по настоящему изобретению может использоваться для лечения рассмотренных выше заболеваний у людей и млекопитающих иных, чем люди (например, обезьяна, мышь, крыс, собака, корова, лошадь, свинья, овца, коза, кошка, кролик, хомяк, морская свинка, и тому подобное).
Диапазон областей заболеваний, при которых может применяться клеточный пласт для трансплантации по настоящему изобретению, определяют соответствующим образом в зависимости от целевого заболевания, вида, возраста, пола, массы тела животного и симптомов субъекта введения, и тому подобное.
Клеточный пласт для трансплантации по настоящему изобретению может трансплантироваться за один раз или несколькими частями. Количество применений трансплантации определяется профессионалами здравоохранения в соответствии с заболеванием и инструкциями. Например, когда заболевание представляет собой заболевание возрастной дегенерации желтого пятна, клеточный пласт для трансплантации по настоящему изобретению может трансплантироваться два или более раз в зависимости от его тяжести. Когда трансплантацию осуществляют множество раз, интервал не является конкретно ограниченным, и может быть положен период от нескольких дней до нескольких недель.
Клеточный пласт для трансплантации по настоящему изобретению трансплантируется профессионалами здравоохранения в соответствии с соответствующим способом трансплантации в соответствии с инструкциями. Когда клеточный пласт для трансплантации по настоящему изобретению трансплантируют под сетчатку, можно использовать способ трансплантации, включающий доставку пласта на потоке воды из полой иглы для инъекций до места трансплантации под сетчаткой глазного яблока, или можно также использовать терапевтическое устройство, предназначенное только для трансплантации.
Примеры
Настоящее изобретение объясняется более подробно в дальнейшем посредством ссылок на примеры, которые представляют собой иллюстрации и не ограничивают рамок настоящего изобретения каким-либо образом.
Пример получения 1. Приготовление клеток пигментного эпителия сетчатки
В качестве клеток пигментного эпителия сетчатки, которые должны использоваться для получения клеточных пластов, в следующем далее примере 1, используют зрелые клетки пигментного эпителия сетчатки (253G1, K11PD2, 59M8, 59SV2, 59SV3, 59SV9, 46a, K21EV15, 101EV3, K11EV9, 454E2), полученные посредством индуцирования дифференциации iPS клеток, и клетки пигментного эпителия сетчатки (hES, CMK6), полученные посредством индуцирования дифференциации ES клеток, в соответствии со способом, описанным в Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131.
<Клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные из iPS человека>
253G1 представляет собой клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные посредством индуцирования дифференциации iPS клеток человека, полученных у здоровых людей, и K11PD2 и 59M8 представляют собой клетки пигментного эпителия сетчатки, у которых индуцируют дифференциацию из iPS клеток человека, полученных от пациентов с пигментной дистрофией сетчатки, отличных друг от друга. iPS клетки устанавливают с помощью способа, включающего введение генов Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc в фибробласты, полученные из кожи человека с использованием ретровируса, в соответствии со способом, описанным в Cell 131, 861-872, 2007.
59SV2, 59SV3 и 59SV9 представляют собой клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные посредством индуцирования дифференциации iPS клеток человека, полученных от одного и того же пациента с пигментной дистрофией сетчатки. iPS клетки устанавливают с помощью способа, включающего введение Oct3/4, Sox2, Klf4 и c-Myc в фибробласты, полученные из кожи человека, с использованием вируса Sendai, в соответствии со способом, описанным в Proc. Jpn. Acad., Ser. B 85 (2009) 348-362.
K21EV15, 101EV3, K11EV9 и 454E2 представляют собой клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные посредством индуцирования дифференциации iPS клеток человека, полученных от пациентов с пигментной дистрофией сетчатки, отличных друг от друга. iPS клетки устанавливают с помощью способа, включающего введение Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc и LIN28 человека в фибробласты, полученные из кожи человека, с использованием эписомного вектора, в соответствии со способом, описанным в Nat Methods. 2011 May; 8(5): 409-12.
<Клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные из iPS обезьяны>
46a представляет собой клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные посредством индуцирования дифференциации iPS клеток обезьяны (макака циномолгус) в соответствии со способом, описанным в Jpn. J. Transplant. 44, 231-235.
<Клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные из ES клеток человека>
hES представляет собой клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные посредством индуцирования дифференциации линии ES клеток человека khES-1. CMK6 представляет собой клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные посредством индуцирования дифференциации ES клеток обезьяны в соответствии со способом, описанным в Neuroscience Letters 458 (2009) 126-131.
Пример 1. Способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки
<Приготовление смешанного раствора коллагенового геля>
3
Приготавливают A: Полученный из сухожилий свиньи растворимый в кислоте коллаген Типа I Cellmatrix I-A (Nitta Gelatin, 3,0 мг/мл), B: концентрированную среду для культивирования при 5-кратной концентрации [DMEM/F12 (Invitrogen, 12500-062, 3 г) растворяют в воде MilliQ, и общий объем (50 мл) обрабатывают на фильтре], и C: буфер для разбавления [1 н NaOH (50 мМ, 5 мл), NaHCO (260 мМ, 2,2 г) и HEPES (200 мМ, 4,77 г) растворяют в воде MilliQ, и общий объем (100 мл) обрабатывают на фильтре]. При охлаждении (бледно-желтый) B (2 объема) смешивают с A (7 объемов) без образования пузырьков. Затем, добавляют C (1 объем), и (бледно-розовую) смесь перемешивают с получением 0,21% смешанного раствора коллагенового геля.
<Приготовление клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки>
5
0,21% смешанного раствора коллагенового геля (200 мкл) добавляют во вставку 12 мм вставки трансвел (0,4 мкм мембрана Pore Polyester; Cornig, 3460), и смесь инкубируют при 37°C в течение 30 мин. Затем F10-10% FBS [F-10 (Sigma, N6908, 445 мл), FBS (50 мл), пенициллин-стрептомицин (Invitrogen, 15140-122, 5 мл)] добавляют по 1500 мкл снаружи вставки и 500 мкл внутрь вставки, и трансвел инкубируют при 37°C в течение 24 час. После этого, вставки промывают внутри и снаружи один раз F10-10% FBS, соответствующие клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные в примере получения 1, высевают при 5×10 клеток (F10-10% FBS, 500 мкл) внутри вставки и F10-10% FBS (1500 мкл) добавляют снаружи вставки. Клетки пигментного эпителия сетчатки культивируют в F10-10% FBS до конфлюэнтности. После достижения конфлюэнтности, среду заменяют на SFRM-B27 [DMEM (Sigma, D6046, 350 мл), F12 HAM (Sigma, N6658, 150 мл), B27 (Invitrogen, 17504-044, 10 мл), 200 мМ L-глютамин (Sigma, G7513, 5 мл), пенициллин-стрептомицин (Invitrogen, 15140-122, 5 мл), bFGF (Wako, 060-04543, 10 нг/мл)] (1500 мкл снаружи вставки, 500 мкл внутрь вставки, замену среды осуществляют 3 раза/неделю), и клетки пигментного эпителия сетчатки культивируют, пока они не будут показывать соответствующий цвет и форму.
<Вырезание>
По прохождении 6 недель от начала культивирования, мембрану вставки удаляют, добавляют коллагеназу L (Nitta Gelatin, PBS(+): Sigma, 2600 Ед./мл, 100 мкл) под вставку, и инкубируют вставку при 37°C в течение 60 мин и промывают 3 раза PBS(+). Добавляют SFRM-B27 по каплям, так, чтобы клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки не высыхал, и вырезают с желаемыми размерами с помощью PALM MicroBeam (ZEISS).
Пример 2. Способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки (вид коллагена)
Таким же способом, как и в примере 1, за исключением того, что на стадии получения клеточного пласта с использованием 253G1 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) в примере 1, (A) полученный из кожи свиньи коллаген TE Типа I (специально заказанный продукт: в основном содержит коллаген Типа I, малое количество коллагена Типа III, Nitta Gelatin, 5 мг/мл) используют в качестве 0,35% смешанного раствора коллагена/лунка, (B) полученный из сухожилий свиньи коллаген Типа I T-1002 (специально заказанный продукт: коллаген Типа I, Nitta Gelatin, 5,1 мг/мл) используют в качестве 0,35% смешанного раствора коллагена/лунка, (C) меченый FITC коллаген I (Chondrex, 1 мг/мл) используют в качестве 0,07% смешанного раствора коллагена/лунка, (D) меченый FITC коллаген I (специальный заказ, Chondrex, 3 мг/мл) используют в качестве 0,21% смешанного раствора коллагена/лунка, (E) ателоколлаген (KOKEN, 3 мг/мл) используют в качестве 0,21% смешанного раствора коллагена/лунка и (F) проницаемую коллагеновую мембрану для клеточной культуры (KOKEN) используют, соответственно, вместо полученного из сухожилий свиньи растворимого в кислоте коллагена Типа I Cellmatrix I-A (Nitta Gelatin, 3 мг/мл), в качестве 0,21% смешанного раствора коллагена/лунка, клеточные пласты получают и вырезают с получением клеточных пластов из клеток пигментного эпителия сетчатки.
Результаты исследований примера 1 и случаев с использованием каждого из рассмотренных выше коллагенов сравнивают и оценивают в терминах 4 пунктов [1. прочности геля; 2. адгезии клеток; 3. роста клеток; 4. безопасности]. В результате, (A) {1. хуже; 2. эквивалентно; 3. хуже; 4. хорошо}, (B) {1. хорошо (5,1 мг/мл); 2. эквивалентно; 3. хуже; 4. хорошо}, (C) {1. хуже (1 мг/мл); 2. хуже; 3. неизвестно; 4. неизвестно}, (D) {1. эквивалентно (3 мг/мл); 2. эквивалентно; 3. хуже; 4, неизвестно}, (E) {1. эквивалентно (3 мг/мл); 2. хуже; 3. неизвестно; 4, хорошо} и (F) {не лизируется с помощью коллагеназы, то есть непригоден}. Относительно прочности геля, определенный уровень прочности необходим, чтобы сделать возможным рост клеток пигментного эпителия сетчатки. В этом аспекте особенно предпочтительный вид и концентрация коллагена представляют собой полученный из сухожилий свиньи растворимый в кислоте коллаген Типа I Cellmatrix I-A примера 1 и (B) полученный из сухожилий свиньи коллаген Типа I T-1002, используемые при рассмотренной выше концентрации. Когда субстрат не имеет определенного уровня прочности, пигментный эпителий сетчатки не растет и не может использоваться для настоящего изобретения.
Пример 3. Способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки (количество коллагена)
Таким же способом, как в примере 1, за исключением того, что на стадии получения клеточного пласта с использованием 253G1 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) из примера 1, количество смешанного раствора коллагенового геля, которое должно использоваться, изменяют до 100 мкл или 300 мкл от 200 мкл, получают и вырезают клеточные пласты, при этом извлекают клеточные пласты из клеток пигментного эпителия сетчатки.
По сравнению с примером 1, когда количество используемого смешанного раствора коллагенового геля составляет 100 мкл, в центральной части образуется тонкий слой коллагенового геля из-за влияния поверхностного натяжения, связанного с малым количеством смешанного раствора коллагенового геля, и когда осуществляют культивирование, высеваемые клетки пигментного эпителия сетчатки с легкостью вступают в непосредственный контакт с мембраной в нижней части, это вызывает разрыв клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки во время операции вырезания пласта. Когда количество используемого смешанного раствора коллагенового геля составляет 300 мкл, поскольку количество смешанного раствора коллагенового геля является большим, образуется толстый слой коллагенового геля, что относительно уменьшает количество среды, которое могло бы удерживаться во вставке, и по этой причине, осуществлять поддержание культуры нелегко, обработка коллагеназой занимает время, и появляется опасение относительно появления более значительных повреждений клеточного пласта. Когда количество используемого смешанного раствора коллагенового геля составляет 100 мкл, клетки непосредственно вступают в контакт с мембраной и клеточный пласт отрывается от этой части при удалении мембраны.
Пример 4. Способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки (количество коллагеназы и время обработки)
Таким же способом, как в примере 1, за исключением того, что на стадии получения клеточного пласта с использованием 253G1 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) из примера 1, 1% коллагеназа L (Nitta Gelatin) или коллагеназа Типа I (Roche) вступает в контакт с клеточным пластом из клеток пигментного эпителия сетчатки в течение 10 мин в количестве 10 мкл, 20 мин в количестве 10 мкл, 30 мин в количестве 10 мкл, 20 мин в количестве 20 мкл, 60 мин в количестве 20 мкл, и 50 мин в количестве 30 мкл, вместо 30 мин в количестве 30 мкл, клеточные пласты получают и вырезают, при этом извлекают клеточные пласты из клеток пигментного эпителия сетчатки.
В результате, когда обработку коллагеназой осуществляют в течение 60 мин в количестве 10 мкл или 60 мин в количестве 20 мкл, наблюдают деградацию коллагена на таком же уровне, как для 30 мкл в течение 30 мин.
Пример 5. Способ получения клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки (количество высеваемых клеток)
4
5
6
5
Таким же способом как в примере 1, за исключением того, что на стадии получения клеточного пласта с использованием 253G1 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) из примера 1, количество клеток, которые должны высеваться внутри вставки, изменяют до (A) 5×10 клеток/500 мкл, (B) 1×10/500 мкл или (C) 1×10/500 мкл от 5×10 клеток/500 мкл, получают и вырезают клеточные пласты, при этом извлекают клеточные пласты из клеток пигментного эпителия сетчатки.
По сравнению с примером 1, (A) и (B) требуют большего времени для достижения конфлюэнтности клеток из-за малого количества клеток и (C) показывает медленный рост, а также тенденцию к возникновению необходимости в большем времени для достижения конфлюэнтности клеток.
Пример 6. Базальная мембрана, формируемая на клеточном пласте из клеток пигментного эпителия сетчатки
Криогенный срез (замороженный срез) получают из клеточного пласта, полученного из 253G1 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) в примере 1, и подвергают воздействию иммуногистохимического окрашивания. Образование плотного соединения подтверждается экспрессированием ZO-1, и образование базальной мембраны подтверждается экспрессированием ламинина и коллагена Тип IV. Для детектирования каждого белка используют соответствующие антитела кролика анти-ZO-1, производимые Zymed (разбавления 1:100), ламинин кролика, производимый Abcam (разбавления 1:200) и антитела мыши против коллагена человека Тип IV, производимые Calbiochem (1:40). Кроме того, подтверждается, что клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки имеет однослойную эпителиальную форму по состоянию окрашивания ядер с использованием 4’,6-диамидино-2-фенилиндола, производимого Molecular Probes (DAPI; 1 мкг/мл).
Оценка 1. Профиль экспрессии гена, специфичного к пигментному эпителию сетчатки для клеточного пласта
На стадии получения клеточного пласта из 59SV3, 59SV9 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) в примере 1, экспрессирование BEST1, RPE65, MERTK, CRALBP в клетках, составляющих пласты, по прохождении 1 недели, 4 недель, 2 месяцев, где день, когда среду заменяют на SFRM-B27 после достижения конфлюэнтности клеток, представляет собой день 0, подтверждают с помощью RT-PCR. В результате, наблюдают экспрессирование на таком же уровне, как для положительного контроля (РНК клеток пигментного эпителия сетчатки человека в целом (производится ScienCell, Cat NO. 6545)). Здесь, BEST1, RPE65, MERTK представляют собой гены, специфично экспрессируемые в клетках пигментного эпителия сетчатки. CRALBP представляет собой ген, экспрессируемый в клетках пигментного эпителия сетчатки и в клетках Muller.
Оценка 2. Измерение остаточного коллагена в пласте клеток пигментного эпителия сетчатки
Криогенные срезы (замороженные срезы) получают посредством вырезания, до и после обработки коллагеназой, из соответствующих клеточных пластов, полученных из 253G1 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) в примере 1, и подвергают воздействию иммуногистохимического окрашивания. Ядро окрашивают с помощью 4’,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI; 1 мкг/мл), производимого Molecular Probes, и Коллаген Типа I окрашивают антителом кролика против коллагена человека Типа I (разбавления 1:40), производимым Calbiochem. В результате, коллаген не детектируется в пластах после обработки коллагеназой, и подтверждается, что коллагеназа удаляет коллаген, нанесенный в виде покрытия на чашку для культивирования. С другой стороны, коллаген детектируют на пластах, вырезанных до обработки коллагеназой.
Оценка 3. Способность к секретированию цитокинов клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки
Культурные среды на апикальной стороне и на базальной стороне трансвела извлекают до стадии вырезания клеточных пластов из клеток пигментного эпителия сетчатки из клеточных пластов, полученных из 253G1 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) и 454E2 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) в примере 1, и продуцируемые количества VEGF и PEDF детектируют с помощью ELISA в соответствии со способом, описанным в Arvydas M, IOVS. 2006; 47: 3612-3624. В результате подтверждается, что подобно пигментному эпителию сетчатки, полученному от эмбриона человека, как сообщает Arvydas M, IOVS. 2006; 47: 3612-3624, VEGF в основном секретируется на базальной стороне, а PEDF в основном секретируется на апикальной стороне (Фиг.1). Показано, что клеточный пласт по настоящему изобретению имеет способность секретирования цитокинов, сходную с параметрами живых организмов, и является превосходным по функциональности.
Оценка 4. Трансэпителиальное электрическое сопротивление клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки
2
Наблюдается сильная корреляция между барьерной функцией клеточного слоя и электрическим импедансом, а именно, удельным поверхностным трансэпителиальным/трансэндотелиальным электрическим сопротивлением (TER). Зонд помещают в среды внутри и снаружи вставки в соответствии со способом, описанным MILLIPORE (с использованием Millicell ERS-2), перед стадией вырезания клеточного пласта клеток пигментного эпителия сетчатки, полученного из 454E2 (iPS-клеток пигментного эпителия сетчатки) в примере 1, и электрически измеряют TER. В результате, TER составляет 640 Ом·см и показывает высокое значение TER, подобно пигментному эпителию сетчатки, полученному от эмбриона человека, как сообщается в Nature Protocols vol 4, No 5 662-673 (2009), Fig 10. Показано, что клеточный пласт по настоящему изобретению имеет высокую барьерную функцию, сходную с параметрами живых организмов.
Оценка 5. Трансплантация клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученного от ES клеток обезьяны
Клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки обезьяны, полученный из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных из ES клеток обезьяны, CMK6 в примере 1, трансплантируют в один глаз обезьяны в соответствии со способом, описанным в Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995 Feb; 36(2): 381-90. Перед трансплантацией, осуществляют фотокоагуляцию сетчатки для нарушения сетчатки глаза, который должен подвергаться воздействию трансплантации. В день 28 от трансплантации в один глаз обезьяны, имеющей макулу с фотокоагуляцией сетчатки, сформированную в нем, фотографируют глазное дно, и изображения срезов глазного дна получают как гистологические срезы с использованием OCT (оптического когерентного томографа), на основании которых подтверждается состояние сетчатки. В результате, утечки флуоресценции при флуоресцеиновой ангиографии не обнаружено, трансплантат приживается, и расстройства, такие как утончение чувствительной сетчатки, и тому подобное, не наблюдаются.
Оценка 6. Трансплантация клеточного пласта из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученной из iPS клеток обезьяны
Клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки обезьяны, полученный из клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных из iPS клеток обезьяны, 46a в примере 1, трансплантируют под сетчатку одного глаза для аутологичной трансплантации и трех глаз для перекрестной трансплантации в соответствии со способом, описанным в Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995 Feb; 36(2): 381-90. В течение одного года после трансплантации, фотографировали глазное дно, и срезы изображений глазного дна получали как гистологические срезы с использованием OCT (оптического когерентного томографа), на их основании наблюдали состояние сетчатки с ходом времени. При перекрестной трансплантации обнаруживали четкие реакции отторжения, такие как фиброзные изменения на периферии трансплантата, утечки флуоресценции при флуоресцеиновой ангиографии и повреждения с высокой яркостью под сетчаткой, с помощью OCT. С другой стороны, при аутологичной трансплантации не наблюдается такого явного отторжения, не обнаруживается утечек при флуоресцеиновой ангиографии, трансплантат приживается и не обнаружено таких расстройств как утончение чувствительной сетчатки, и тому подобное.
Промышленное применение
При использовании способа по настоящему изобретению, клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки, который должен применяться посредством трансплантации пациентам с возрастной дегенерацией желтого пятна, может быть получен сравнительно удобным образом. В частности, когда клетки, которые должны использоваться для культивирования, представляют собой клетки пигментного эпителия сетчатки, полученные из iPS клеток, можно использовать собственные клетки пациента, что может предотвратить отторжение при трансплантации. Кроме того, поскольку клеточный пласт, полученный с помощью способа по настоящему изобретению, имеет базальную мембрану, состоящую из таких же компонентов, как в живых организмах, может быть воспроизведен клеточный пласт из клеток пигментного эпителия сетчатки, более близкий к состоянию в живом организме, что является полезным для различных целей скрининга.
Настоящая заявка основывается на заявке на патент № 2011-040130, поданной в Японии (дата подачи: 25 февраля 2011 года), содержание которой включается в настоящий документ во всей ее полноте.