Выделение эпифитных штаммов Aureobasidium pullulans, продуцирующих высокомолекулярные внеклеточные полисахариды

БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ

УДК 579.6

ВЫДЕЛЕНИЕ ЭПИФИТНЫХ ШТАММОВ AUREOBASIDIUM PULLULANS, ПРОДУЦИРУЮЩИХ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ

О.И. Сазонова, А.А. Ветрова, А.Б. Гафаров, С.Л. Соколов

Исследованы три штамма микромицетов, А3, Т2.1 и F11, выделенные методом прямого высева на селективной среде с салицилатом в качестве единственного источника углерода. Все три штамма были идентифицированы как Aureobasidium pul-lulans. Установлено, что изолированные микроорганизмы способны продуцировать эк-зополисахариды массой около 500 кДа и выше. Впервые показана способность штаммов A. pullulans использовать салицилат в качестве единственного источника углерода и энергии.

Ключевые слова: экзополисахариды, Aureobasidium pullulans, салицилат, фил-лосфера.

Во многих странах с развитым биотехнологическим производством большое внимание уделяется процессам промышленного получения внеклеточных полисахаридов (экзополисахаридов, ЭПС), имеющих микробное происхождение. Они обладают такими важными для потребителей свойствами, как студнеобразование, загущение, влагоудержание, стабилизация, эмульгирование и др. [1]. Биоразлагаемость, нетоксичность, возобновляемость и другие вышеперечисленные свойства обеспечивают ЭПС применение при переработке сельхозпродукции, в медицине и во многих отраслях промышленности (нефтяной, пищевой, косметической, фармацевтической и др.). Кроме того, микробные полисахариды, в отличие от часто применяемых в России растительных ЭПС, обладают широким диапазоном свойств, на которые можно влиять, изменяя условия культивирования штаммов микроорганизмов [2].

Способность синтезировать ЭПС в количествах, представляющих интерес для их промышленной наработки, обнаружена у представителей различных родов бактерий (Xanthomonas, Acetobacter, Acinetobacter, Arthrobacter, Azotobacter, Paracoccus, Pseudomonas и др.), дрожжей (Cryptococcus, Hansenula, Saccharomyces и др.), микромицетов (Aureobasidium, Sclerotium и др.).

Среди вышеперечисленных микроорганизмов особое внимание следует уделить продуценту разнообразных экзополисхаридов -представителю аскомицетов Aureobasidium pullulans. Данный микроорганизм является эпифитным микроорганизмом, достаточно широко используется в биотехнологии, являясь потенциальным

источником промышленных ферментов (амилазы, ксиланазы, пектиназы), полисахаридной смолы, пуллулана [3, 4].

Целью данной работы являлся поиск, выделение и характеристика эпифитных аскомицетов, способных к синтезу внеклеточных полисахаридов.

Материалы и методы

В работе изучали три штамма аскомицетов, АЗ, Т2.1 и F11, выделенные методом прямого высева на минеральной среде Эванса с салицилатом в качестве единственного источника углерода и энергии как описано в работе [5].

Штаммы выращивали в среде 1/10 TSB (Tryptic Soy Broth) фирмы Sigma-Aldrich (США), а также в минеральной среде Эванса [6] при 28°С на качалке в течение 14-16 часов. Для приготовления агаризованной среды использовали Agar-Agar American type QP фирмы Panreac (Испания). В качестве единственного источника углерода и энергии в минеральную среду добавляли салицилат натрия в концентрации 1 г/л.

Геномную ДНК микроорганизмов выделяли с использованием AxyPrep Bacterial Genomic DNA MiniPrep Kit по протоколу фирмы-изготовителя («Axygen Biosciences», США).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) осуществляли в амплификаторе GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США). Реакцию проводили в стандартных условиях, при конечной концентрации дезоксирибонуклеозидтрифосфатов 200 мкМ и 1,5 мМ MgCl2. Для амплификации внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) и определения его первичной нуклеотидной последовательности использовали олигонуклеотидные праймеры ITS1-F (5'-CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A-З') и ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-З) [7, 8]. Размер амплифицированного фрагмента составлял около 620 п.н.

Электрофорез ДНК проводили в 0,8 % агарозном геле в 0,5 x трис-боратном буфере по стандартной методике [9]. Визуализацию ДНК проводили путем окрашивания геля в растворе бромистого этидия.

Идентификацию выделенных микроорганизмов-деструкторов осуществляли, используя систему MALDI Biotyper (матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация) по протоколу фирмы-изготовителя («Bruker Daltonics», Германия). Пробы для анализа готовили согласно [10].

Нуклеотидную последовательность ДНК определяли c помощью генетического анализатора ABI З1З0 xl Analysis System («Applied Biosystem», США) по протоколу фирмы производителя. Анализ идентичности нуклеотидных последовательностей осуществляли при помощи программы BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

Эволюционные расстояния рассчитывали методом максимального правдоподобия на основе модели Tamura-Nei [11]. Исходные дендрограммы для эвристического поиска были получены автоматически путем применения алгоритмов Neighbor-Joining и BioNJ к матрице попарных расстояний, оцененных с использованием метода максимального правдоподобия (MCL). Эволюционный анализ и конструирование филогенетического дерева были проведены с использованием программного пакета MEGA v. 7.0 [12].

Способность штаммов продуцировать экзополисахариды проверяли в двух жидких питательных средах следующего состава:

- пептон 0,2 %, K2HPO4 0,2 %, NaCl 0,2 %, MgSÜ4 0,04 %, FeSÜ4 0,001 %, сахароза в конечной концентрации 10%;

- пептон 0,2 %, K2HPO4 0,2 %, NaCl 0,2 %, MgSÜ4 0,04 %, FeSÜ4 0,001 %, глюкоза в конечной концентрации 10 %.

Предварительно микроорганизмы выращивали в жидкой минеральной среде с салицилатом до OD62o = 0,6 - 0,8; затем инокулят (1 мл на 100 мл среды) переносили в ферментационные колбы с добавлением соответствующего углевода (см. выше). Ферментацию проводили 5-7 суток.

Экзополисахариды из культуральной жидкости осаждали тремя объемами метанола; полученный осадок промывали 96 %-ным этанолом и высушивали до постоянной массы. С полученными препаратами провели качественную реакцию на углеводы с a-нафтолом (реакция Подобедова -Молиша).

Молекулярно-массовое распределение и среднюю молекулярную массу полисахаридов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) при помощи системы Agilent 1100 («Agilent Technologies», США) с рефрактометрическим детектором по протоколу фирмы-изготовителя. В работе использовали колонку BioSil TSK 250 (7,5 х 300 мм) фирмы Bio-Rad (США); элюент - натрий-ацетатный буфер (0,1 М, рН 5,0) с добавлением 0,15 M NaCl, скорость потока - 1 мл/мин Калибровку хроматографической колонки осуществляли по декстранам («Pharmacia Fine Chemicals», Швеция) с молекулярными массами в диапазоне 500000-20000 Да и мальтоолигосахаридам с массами 2610, 1620 и 900 Да («Aldrich», США, «Merck», Германия). Калибровочный график близок к линейному в диапазоне молекулярных масс 110000-2600 Да (время выхода максимума пика 11,2 - 21,4 мин).

Навески растворяли в 0,1 М натрий-ацетатном буфере (рН 5,0) с добавлением 0,15 M хлорида натрия в течение 2 часов; концентрация составляла 5 мг/мл. Перед анализом все образцы центрифугировали при 14000 g в течение 5 минут.

Результаты и их обсуждение

Объектами нашего исследования были три штамма аскомицетов, А3, Т2.1 и F11, выделенные с поверхности листовых пластинок трех видов древесных растений (клена, липы и ясеня) методом прямого высева на минеральной среде Эванса с салицилатом в качестве единственного источника углерода и энергии. Видовую принадлежность исследуемых микроорганизмов определяли, используя масс-спектрометрическую систему MALDI Biotyper; полученные результаты подтверждали секвенированием ITS региона. Данные методы позволили установить, что все исследуемые штаммы относятся к виду Aureobasidium pullulans, представители которого широко распространены в природе и нередко встречаются в местах с изменчивой влажностью, таких как филлосфера

[13].

Для филогенетического сравнения исследуемых в данной работе штаммов A. pullulans были выбраны последовательности ITS регионов различных штаммов грибов рода Aureobasidium. Как видно из рис. 1 ITS последовательности штаммов A. pullulans А3, Т2.1 и F11 полностью идентичны таковым у штаммов A. pullulans Sib5-3-1, ICMP:21612 и KUC3002, что подтверждает таксономическую принадлежность выделенных нами штаммов к виду Aureobasidium pullulans.

Aureobasidium pullulans, черный дрожжеподобный гриб, является продуцентом различных экзополисахаридов используемых в пищевой, легкой, фармацевтической, нефтяной и других отраслях промышленности. Представители данного вида обладают широкой субстратной специфичностью и могут утилизировать такие соединения, как целлобиозу, галактозу, сахарозу, глюкозу, глицерин, ксилозу, фруктозу, ксилитол, раффинозу, но не целлюлозу, хитин, сукцинат и салицилат [14]. В настоящей работе впервые показана способность штаммов A. pullulans использовать салицилат в качестве единственного источника углерода и энергии.

Для изучения способности изолированных в ходе данной работы штаммов A. pullulans продуцировать экзополисахариды, грибы выращивали в течение 7 суток в жидкой питательной среде (см. раздел «Материалы и методы») с двумя разными источниками углерода -глюкозой или сахарозой. Образование внеклеточных полисахаридов замечено во всех исследуемых образцах как на среде с глюкозой, так и с сахарозой. Независимо от использованного источника углерода выход экзополисаридов практически не менялся ни у одного из исследованных в работе штаммов A. pullulans и составлял в среднем 0,74, 0,93 и 1,62 г для грибов, выделенных с поверхности листовых пластинок клена, ясеня и липы соответственно.

Aureobasidium pullulans Т2.1 Aureobasidium pullulans A3 Aureobasidium pullulans F11

— A. pullulans Sib5-3-1

- A, pullulans KUC3002

A. proteae

-A. namibiae

A. melanogenum

-A. luecospermi

-A. subglaciale

A.caulivorum

-A. thailandense

0.0050

Рис. 1. Филогенетическое древо, построенное на основе сравнения последовательностей ITS региона различных представителей рода Aureobasidium. Полужирным шрифтом выделены изученные в данной работе эпифитные штаммы Aureobasidium pullulans. В скобках приведены номера нуклеотидных последовательностей в GenBank

Гель-проникающая хроматография высокого разрешения позволила установить молекулярно-массовое распределение и среднюю молекулярную массу полученных препаратов внеклеточных полисахаридов. Все образцы имели основной пик высокомолекулярных продуктов массой около 500 кДа, а также некоторое количество более низкомолекулярных компонентов (от 1 кДа до 9 кДа). Без дополнительной очистки содержание высокомолекулярных продуктов в препаратах экзополисахаридов составляло от 85 до 98 %. Хроматографический профиль одного из образцов представлен на рис. 2.

Известно, что грибы рода Aureobasidium могут накапливать темный пигмент меланин в клеточной стенке. Интенсивность образования культурами A. pullulans этого пигмента различна и зависит от состава питательной среды, в частности от источника углерода [15]. Так, было показано, что в среде с ксилозой или глюкозой образцы внеклеточных полисахаридов имеют окраску от зеленой до черной (загрязнены пигментом), а в среде с сахарозой или лактозой - белую. У штаммов A. pullulans, изученных в настоящей работе, на среде с глюкозой не наблюдается меланиногенез, что делает их перспективными для использования в различных отраслях промышленности.

500 кДа

g 1400

1 1200

U

S3 1000

<L>

Ы

О 800

1=1

G

о С 600

400

200

0

-200

)

1

1_

1

0 5 10 15 20 25 3

Время, мин

Рис. 2. Хроматограмма образца экзополисахарида штамма A. pullulans A3. Хроматограмма получена на колонке BioSil TSK 250

Список литературы

1. Елинов Н.П. Химия микробных полисахаридов / под ред. Н.П. Елинова. М.: Высшая школа, 1984. 156с.

2. Кочетков Н.К. Синтез полисахаридов / под ред. Н.К. Кочеткова. М.: Наука, 1994. 219с.

3. Deshpande M.S., Rale V.B., Lynch J.M. Aureobasidium pullulans in applied microbiology: A status report // Enzym. Microb. Tech. 1992. Vol. 14. P. 514 - 527.

4. Leathers T.D. Biotechnological production and applications of pullulan // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. Vol. 62. P. 468 - 473.

5. Evans C.G.T., Herbert D., Tempest D.W. The continuous cultivation of microorganisms. 2. Construction of a chemostat: Methods in Microbiology. Vol. 2. / Eds.: J.R. Norris, D.W. Ribbons. London: Acad. Press, 1970. P. 277 -327.

6. Gardes, M. and Bruns, T.D. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes - application to identification of mycorhizae and rusts // Molecular Ecology. 1993. Vol. 2. P. 113 - 118.

7. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics / T.J. White [et al.]. New York: Academic Press, 1990. P. 315322.

8. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. / Eds. F.M. Ausubel, R. Brent, R.E. Kingston, D.D. Moore, J.G.

Seidman, J.A. Smith, K. Struhl. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 1626 p.

9. Bacterial species identification from MALDI-TOF mass spectra through data analysis and machine learning / K. De Bruyne, B. Slabbinck, W. Waegeman [et al.] // Systematic and Applied Microbiology. 2011. Vol. 34. P. 20 - 29.

10. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees // Molecular biology and evolution. 1993. Vol. 10. №3. P. 512526.

11. Kumar S., Stecher G., Tamura K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger data sets // Molecular biology and evolution. 2016. Vol. 33. №7. P. 1870-1874.

12. Эпифитные микроорганизмы-деструкторы ароматических углеводородов филлосферы городских древесных растений / О.И. Сазонова [и др.] // Микробиология. 2017. Т. 86. № 1. С. 72 - 79.

13. Morphogenesis and adhesion of Aureobasidium pullulans / J.H. Andrews, R.F. Harris, R.N. Speaer [et al.] // Canadian Journal of Microbiology. 1994. Vol. 40. P. 6-17.

14. Thailand habitats as sources of pullulan-producing strains of Aureobasidium pullulans / S. Prasongsuk, R.F. Sullivan, M. Kuhirun // World J. Microbiol. Biotechnol. 2005. Vol. 21. P. 393-398.

15. Шубаков А.А., Елькина Е.А., Ларина В.Е. Продуцирование пуллулана дрожжеподобным грибом Aureobasidium pullulans ВКПМ F-571 // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. 2007. Т. 3. № 2. С. 26 - 30.

Сазонова Олеся Ивановна, канд. биол. наук, науч. сотр., sazonova_oi@rambler.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук,

Ветрова Анна Андрияновна, канд. биол. наук, науч. сотр., phdvetrova@gmail.com, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук, Пущинский государственный естественно-научный институт,

Гафаров Арслан Булатович, науч. сотр., gafarov@,ibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук,

Соколов Сергей Львович, канд. биол. наук, науч. сотр., sls@ibpm.pushchino.ru, Россия, Пущино, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук, Пущинский государственный естественнонаучный институт

ISOLATION OF EPIPHITIC AUREOBASIDIUM STRAINS PRODUCING HIGH-MOLECULAR WEIGHT EXOPOLYSACCHARIDES

O.I. Sazonova, A.A. Vetrova, A.B. Gafarov, S.L. Sokolov

Three Aureobasidium strains, A3, T2.1 and F11, isolated by direct plating on a selective medium with salicylate as a sole carbon source have been studied. All strains above have been taxonomically identified as Aureobasidium pullulans, and they are able to produce exopolysaccharides with a molecular mass of about 500 kDa and higher. The ability of A. pullulans strains to use salicylate as a sole source of carbon and energy has been demonstrated for the first time.

Key words: exopolysaccharides, Aureobasidium pullulans, salicylate, phyllosphere

Sazonova Olesya Ivanovna, Candidate of Biological Sciences, Researcher, sazonova_oi@rambler.ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,

Vetrova Anna Andriyanovna, Candidate of Biological Sciences, Researcher, phdvetrova@gmail.com, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences; Pushchino State Institute of Natural Sciences,

Gafarov Arslan Bulatovich, Researcher, gafarov@,ibpm.pushchino. ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences,

Sokolov Sergey Lvovich, Candidate of Biological Sciences, Researcher, sls@,ibpm.pushchino.ru, Russia, Pushchino, G.K. Skryabin Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms, Russian Academy of Sciences; Pushchino State Institute of Natural Sciences