Способ диагностики эндотелиальной дисфункции у беременных
DIAGNOSTIC TECHNIQUE FOR ENDOTHELIAL DYSFUNCTION IN PREGNANT WOMEN

Изобретение относится к медицине, а именно, к лабораторной диагностике в акушерстве, и может быть использовано для обнаружения эндотелиальной дисфункции у беременных.
Течение беременности определяется полноценностью кровотока в системе мать-плацента-плод, нарушение маточно-плацентарных отношений лежит в основе развития акушерской и перинатальной патологии. На современном этапе в исследованиях большое внимание уделяется интиме сосудов: эндотелий представляет собой аппарат, объединяющий основные компоненты гомеостаза в системе микроциркуляции фетоплацентарного комплекса. В научной литературе встречается большое количество работ, подтверждающих роль эндотелиальной дисфункции в развитии патологии беременности (преждевременное прерывание беременности, преэклапсия, фетоплацентарная недостаточность, СЗРП и т.д.) [Сидорова, И.С., Никитина, Н.А. Особенности патогенеза эндотелиоза при преэклампсии // Акушерство и гинекология. - 2015. - №1. - С. 72-78; Зиганшина, М.М. Аутоантитела к антигенам эндотелия при преэклампсии /  М.М. Зиганшина, Н.В. Шилова, Н.Р. Хасбиуллина и др. // Акушерство и гинекология, 2016. - №3. - С. 24-31; Моисеева, И.В., Мансур-Хассан, С.Х. Функциональные показатели эндотелия в динамике физиологической беременности у женщин (по данным реактивной пробы плечевой артерии) // Аспирантский вестник Поволжья. - 2015. - №3-4. - С. 78-82; George, Е.М., Granger, J.P. Endothelin: Key mediator of hypertension in preeclampsia // Am J Hypertens. - 2011. - 24(29). P. 964-969; Karthikeyan, V.J., Lip, G.Y. Endothelial damage/dysfunction and hypertension in pregnancy. Front. Biosci. (Elite Ed). - 2011. - №3. - P. 1100-1108 и др.]. Перинатальная медицина сегодня зачастую позволяет диагностировать осложнения беременности только при появлении клинической симптоматики, методы диагностики не всегда совершенны, а первичная профилактика отсутствует. Это диктует необходимость в разработке новых методов ранней диагностики акушерской и перинатальной патологии.
Многими авторами изучалась роль маркеров нарушения эндотелия при сердечно-сосудистых заболеваниях, сахарном диабете, нарушениях мозгового кровообращения, метаболическом синдроме, почечной патологии [Асташев, П.Е., Гудымович, В.Г. Маркеры эндотелиальной дисфункции как прогностический признак течения внутрисердечного инфекционного процесса // Вестник Национального медико-хирургического Центра им. Н.И. Пирогова. - 2011. - Т. 6. - №3. - С. 3-8; 115; Сушкина, И.Ф. Сравнительная оценка состояния микрогемодинамики и вазомоторной функции эндотелия у пациентов ИБС и практически здоровых лиц разного возраста / И. Ф.Сушкина, И.О. Халявкина, Я.А.Хананашвили и др. // Вестник ВолгГМУ. - 2014. - Выпуск 2 (50). - С. 63-65; 123; Феоктистова, B.C. Новый подход к оценке дисфункции эндотелия: определение количества циркулирующих эндотелиальных клеток методом проточной цитометрии / В.С. Феоктистова, Т.В. Вавилова, О.В. Сироткина и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2015. - Т.60, №4. - С. 23-27; Fadini, G.P. Reduced endothelial progenitor cells and brachial artery flow-mediated dilation as evidence of endothelial dysfunction in ocular hypertension and primary open-angle glaucoma / G.P. Fadini, C. Pagano, I. Baesso, O. Kotsafti, D. Doro et al. // Acta Ophthalmol. - 2010. - Vol.88. - P. 135-141; Lampka, M., Grabczewska, Z.,  E. Circulating endothelial cells in coronary artery disease. Kardiologia Polska. - 2010. - Vol.  68(10). - P.l100-1105; Jim, B. Hypertension in pregnancy / B.Jim, S.Sharma, T.Kebede et al. // Semin. Perinatol. 2012. - 36(1). - P. 56-9 и др.]. Как правило, состояние сосудистого эндотелия оценивается по количеству циркулирующих десквамированных эндотелиоцитов, уровню метаболитов оксида азота, концентрации С-реактивного белка или фактора фон Виллебранда в плазме крови, уровня альбумина в моче и т.п., либо с помощью выявления нарушений вазомоторной функции эндотелия инструментальными методами исследования. Следует констатировать, что применение классических методов диагностики эндотелиальной дисфункции в акушерстве имеет некоторые недостатки: микроциркуляторное русло во время беременности претерпевает изменения, что необходимо учитывать при интерпретации результатов диагностики сосудодвигательной функции эндотелия, кроме того, введение вазоактивных препаратов функциональных проб не всегда допустимо у беременных, т.к. связано с возможностью негативного влияния на плод. Биохимическая диагностика эндотелиальной дисфункции также имеет ограничения. Состояние эндотелиоцитов теоретически может оцениваться по снижению синтеза оксида азота - прямого показателя функции эндотелия, что, однако, лимитировано нестабильностью и коротким периодом жизни молекулы NO. Остальные же биохимические маркеры дают косвенную оценку функции эндотелия, т.к. сопровождают течение множества других сосудистых заболеваний или коагулопатий, а при беременности изменяют свою концентрацию и в физиологических условиях: Диагностический метод, базирующийся на морфологической характеристике эндотелия, представляется перспективным вектором изучения сосудистых нарушений у беременных. Эндотелиоциты являются лабильными биоструктурами, что позволяет использовать регистрацию их морфологических изменений в качестве информативного критерия нарушений в микрососудистом русле. Десквамированные эндотелиоциты - это эндотелиальные клетки, которые отделяются от стенки сосуда, циркулируют в кровотоке и являются репрезентативным объектом цитологической диагностики системного поражения сосудистой системы. Количество циркулирующих эндотелиоцитов в периферической крови в норме очень мало, т.к. процесс самообновления интимы сосудов проходит медленно, а десквамированные клетки интенсивно разрушаются ретикулоэндотелиальной системой. Продолжительность нахождения десквамированных эндотелиоцитов в крови составляет около 24-42 часа, в течение которых происходит их захват и разрушение макрофагами печени, легких и селезенки [Козловский, В.И. Методы определения числа циркулирующих в крови эндотелиоцитов (методические рекомендации)/ В.И. Козловский, А.П. Солодков, О.Д. Мяделец и др. - Издание Витебского государственного медицинского университета, 2008. - 29 с,]. Тем не менее, отмечается повышение концентрации этих клеток в периферической кровотоке при заболеваниях, сопровождающихся сосудистыми нарушениями (сахарный диабет, сердечно-сосудистые заболевания, нарушение мозгового кровообращения, васкулиты и т.п.). Десквамированные эндотелиальные клетки имеют плоскую форму и обладают выраженной морфологической неоднородностью: толщина клетки составляет 1-2 мкм, диаметр варьирует от 10 до 50 мкм. Доказано, что основным механизмом поражения эндотелиоцитов при эндотелиальной дисфункции является апоптоз [Герилович, Л.А. Эндотелин-1 у пациенток с различными формами бесплодия в программах вспомогательных репродуктивных технологий / Л.А. Герилович, М.И. .Базина, А.Т. Егорова и др. // Медицина и образование в Сибири. - 2013. - №6. - С. 19], морфологическими критериями которого являются уменьшение объема цитоплазмы и ядра с последующей фрагментацией клетки и формированием апоптозных телец.
В качестве основного метода цитологической диагностики эндотелиальной дисфункции до сих пор используется подсчет ДЭК в периферической крови, разработанный J.Hladovec с соавт. в 1978 г. [Hladovec, J. Circulating endothelial cells in acute myocardial infarction and angina pectoris / J.Hladovec, I.Prerovsky, V.Stanek et al. // Klin. Wochenschr. - 1978. - 56(20). - P. 1033-1036]. Метод основан на визуальной количественной оценке десквамированных клеток с помощью световой микроскопии и представлении результата, как количество ДЭК на единицу объема плазмы. Метод подсчета концентрации десквамированных эндотелиальных клеток (ДЭК) в плазме используется в России в интерпретации Н.Н.Петрищева с соавт. [Петрищев Н.Н., Беркович О.А., Власов Т.Д. и др. Диагностическая ценность определения десквамированных эндотелиальных клеток в крови. // Клиническая и лабораторная диагностика. - 2001, №1. - С. 50-58]. Венозная кровь отбирается в пробирки, стабилизируется 3,8% раствором цитрата натрия, центрифугируется (1000 оборотов/мин в течение 10 мин). Тромбоцитарная масса отделяется путем добавления раствора АДФ; супернатант перемешивается в течение 10 мин и центрифугируется (1000 оборотов/мин в течение 20 мин). Надосадочная жидкость сливается и к преципитату добавляется 0,1 мл 0,9% раствора NaCl. Подсчет количества ДЭК осуществляется в 2 сетках камеры Горяева с пересчетом на 1 л плазмы с учетом изменения концентрации в процессе проведения вышеописанной методики. Метод нашел широкое применение в качестве диагностики тяжести течения заболеваний, сопряженных с поражением сосудистой системы [Загородских, Е.Б., Черкасов, В.А., Щёкотова, А.П. Маркеры эндотелиальной дисфункции и их прогностическое значение при остром панкреатите тяжелого течения // Фундаментальные исследования. - 2013. - №9. - С. 355-361; Козловский, В.И. Методы определения числа циркулирующих в крови эндотелиоцитов (методические рекомендации)/ В.И. Козловский, А.П. Солодков, О.Д. Мяделец и др. - Издание Витебского государственного медицинского университета, 2008. - 29 с.; Савельев, B.C. Перитонит и эндотоксиновая агрессия / B.C. Савельев, В.А. Петухов. - М., 2012. - 326 с. и др.].
Данный метод является наиболее близким к предлагаемому нами способу диагностики дисфункции эндотелия. Преимуществом классического цитологического метода диагностики эндотелиальной дисфункции являются информативность, малоинвазивность, быстрота выполнения, а также техническая и экономическая доступность. Недостатком способа является представление результата как количество ДЭК на единицу объема плазмы, что снижает информативность теста в связи с вариабельностью содержания форменных элементов крови, различным разведением полученной концентрации ДЭК и, как следствие, несопоставимостью содержания ДЭК у больных и здоровых лиц при различном уровне гематокрита.
Е.Г. Мясоедовой предложен метод, заключающийся в определении ДЭК в одном литре цельной крови с учетом уровня гематокрита (Патент РФ №2338192, G01N 33/49, 10.11.2008), что дает возможность получить результат более универсальный и сопоставимый с концентрацией других клеточных элементов в крови. Недостаток этого способа - использование традиционного метода получения препаратов ДЭК по методике J.Hladovec с соавт.(1978 г.), который включает сложную технику сепарации циркулирующих эндотелиоцитов, выполняемую в ручную, что не исключает возможность погрешности создания стандартной концентрации рабочего раствора исследуемых клеток, и требует либо разработки автоматизации способа, либо учета дополнительных критериев поражения сосудистой системы.
Л.Г. Краснова и соавт. усовершенствовали классический метод за счет предварительной компрессии плеча на 40-50 мм рт.ст. за 4 минуты до забора крови (Патент РФ №2234094; G01N 33/49, 08.10.2004), что, согласно трактовке авторов, позволяет выявить скрытую эндотелиальную дисфункцию. Однако следует констатировать, что создание компрессии е области плеча (манжеточная проба) является дополнительным физическим провоцирующим фактором локальной десквамации эндотелия. Кроме того, условие проведения манжеточной пробы и фиксированная экспозиция компрессии до забора крови ограничивает применение данного метода в условиях клинической лаборатории.
А.И. Инжутовой и соавт.(2014) разработан метод микроскопической регистрации десквамированных эндотелиоцитов в пересчете на 100 лимфоцитов с определением коэффициента содержания мембран высвобожденных микрочастиц и суммарного титра антител к фосфолипидам и sPECAM-1 [Пат. РФ №2526154. МПК G01N 33/49]. Использование метода позволяет определить содержание гуморальных маркеров по регистрации десквамированных эндотелиоцитов периферической крови, однако требует использования дорогостоящих реактивов и сопряжена со сложной интерпретацией полученных результатов.
4
4
Основным недостатком всех применяемых методов цитологической диагностики эндотелиальной дисфункции является отсутствие четких значений референтных показателей, характеризующих исследуемую патологию, что очевидно, связано с методикой сепарации циркулирующих ДЭК из цельной крови, не исключающей погрешности в создании стандартной концентрации раствора, используемого при подсчете клеток, что в конечном итоге отражается на вариабельности полученных результатов: по способу, предложенному авторами, эндотелиальную дисфункцию диагностируют при значении показателя от 2 до 6×10 в 100 мкл плазмы, что является достаточно большим диапазоном исследуемого критерия. Так, например, по данным B.C. Савельева (2010) количество циркулирующих эндотелиоцитов в плазме крови в норме составляет от 2 до 4 клеток/100 мкл [Савельев, B.C. Перитонит и эндотоксиновая агрессия / B.C. Савельев, В.А. Петухов. - М., 2012. - 326 с.], П.Е. Асташев (2011) оценивает эндотелиальную дисфункцию при значениях количества ДЭК от 6×10 клеток/100 мкл [Асташев, П.Е., Гудымович, В.Г. Маркеры эндотелиальной дисфункции как прогностический признак течения внутрисердечного инфекционного процесса // Вестник Национального медико-хирургического Центра им. Н.И. Пирогова. - 2011. - Т. 6. - №3. - С. 3-8], а в исследовании F.Dignat-George с соавт. (2004), количество циркулирующих эндотелиоцитов у здорового человека составляет менее 3 клеток на 100 мкл крови [Dignat-George, F. Circulating endothelial cells: realities and promises in vascular disorders. / F.Dignat-George, J.Sampol, G.Lip, A.D.Blann et al. // Pathophysiol Haemost Thromb. - 2004. - №33. - Р. 495-499]. В связи с этим, во многих работах учитывается не референтное значение, а сравнительная характеристика параметра с помощью метода «случай-контроль», что адаптирует диагностику в практике с учетом особенностей выполнения метода [Козловский, В.И. Методы определения числа циркулирующих в крови эндотелиоцитов (методические рекомендации) / В.И.Козловский, А.П. Солодков, О.Д. Мяделец и др. - Издание Витебского государственного медицинского университета, 2008. - 29 с.; Савельев, B.C. Перитонит и эндотоксиновая агрессия / B.C. Савельев, В.А. Петухов. - М., 2012. - 326 с. и др.]. Также с целью преодоления вышеуказанного недостатка метода используется определение количества ДЭК в пересчете на концентрацию лейкоцитов [Феоктистова, B.C. Новый подход к оценке дисфункции эндотелия: определение количества циркулирующих эндотелиальных клеток методом проточной цитометрии / В.С.Феоктистова, Т.В. Вавилова, О.В. Сироткина и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2015 - Т.60, №4. - С. 23-27.] или лимфоцитов [Пат. РФ №2526154. МПК G01N 33/49. Способ оценки степени выраженности реактивного ответа организма / А.И. Инжутова, А.Б. Салмина, М.Б. Петрова и др.; Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Красноярский государственный медицинский университет им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого министерства здравоохранения и социального развития российской федерации. - Заявл 07.09.2012; опубл. 20.08.2014.], что усложняет методику выполнения диагностического теста, а также затрудняет интерпретацию результата. Кроме того, классический метод подсчета циркулирующих ДЭК ограничен морфологической неоднородностью исследуемых клеток. Это отмечается во многим работах, использующих данный метод диагностики эндотелиальной дисфункции. В литературе встречаются термины: апотозные клетки и клетки-предшественники [Woywodt, A. Circulating endothelial cells: life, death, detachment and repair of the endothelial cell layer / A. Woywodt, F.H. Balhmann, K. Groot et al. // Nephrol Dial Transplant. - 2002. - 17. P. 1728-1730.], «зрелые» клетки [Mancuso, P. Validation of a standardized method for enumeratin circulating endothelial cells and progenitors: flow cytometry and molecular and ultrastructural analyses / P.Mancuso, P.Antoniotti, J.Quarna et al. // Clin. Cancer. Res. - 2009. - №5(1). - P. 267-73], «микрочастицы» [Бицадзе, В.О. Тромбофилия как важнейшее звено патогенеза осложнений беременности / В.О. Бицадзе, А.Д .Макацария, Д.Х. Хизроева и др. // Практическая медицина. - 2012. - 5(60). - С. 22-29] и т.п. Геометрические параметры циркулирующих ДЭК рознятся и выбор клеток, учитываемых при подсчете в цитометрической камере, может определяться субъективизмом исследователя, что также является ограничением достоверности диагностического теста.
В научной литературе использование морфометрического метода в исследовании циркулирующих ДЭК имеет отражение лишь в единичных работах. Простым и доступным методом идентификации и исследования морфологии апоптозных клеток является световая микроскопия. В.И. Козловский и соавт. (2008) исследовали морфологию циркулирующих ДЭК с помощью световой микроскопии. В работе показано увеличение количества клеток с признаками апоптоза у больных с артериальной гипертензией [Козловский, В.И. Методы определения числа циркулирующих в крови эндотелиоцитов (методические рекомендации)/ В.И. Козловский, А.П. Солодков, О.Д. Мяделец и др. - Издание Витебского государственного медицинского университета, 2008. - 29 с.]. Недостаток способа - условие регистрации повреждения ДЭК на основе оценки ядерно-плазменных отношений. Апоптоз - стадийный процесс, и десквамация эндотелиоцитов уже означает инициацию деструктивных изменений в клетке, а значит, идентификация нарушений ядерно-плазменных отношений при световой микроскопии в циркулирующих эндотелиоцитах может определяться субъективизмом исследователя и влиять на конечный результат диагностического метода.
Также используется проточная цитометрия циркулирующих эндотелиоцитов для определения количества «зрелых» ДЭК и исключения клеток с измененной геометрией [Феоктистова, B.C. Новый подход к оценке дисфункции эндотелия: определение количества циркулирующих эндотелиальных клеток методом проточной цитометрии/ В.С. Феоктистова, Т.В. Вавилова, О.В. Сироткина и др. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2015 - Т.60, №4. - С. 23-27; Mancuso, P. Validation of а standardized method for enumeratin circulating endothelial cells and progenitors: flow cytometry and molecular and ultrastructural analyses/ P.Mancuso, P.Antoniotti, J.Quarna et al. // Clin. Cancer. Res.- 2009. - №5(1). - P. 267-73]. Метод проточной цитометрии основан на фиксации сигналов светорассеяния и флюоресценции луча лазера от исследуемого биологического объекта. В работе поврежденные клетки исключали из анализа, так как они дают слабое рассеивание. Увеличение же в крови содержания «зрелых» ДЭК связывали с патологией в ответ на повреждение стенки сосуда. Исключение из исследования поврежденных эндотелиоцитов является, на наш взгляд, недостатком метода, так как не позволяет зафиксировать особенности деструкции ДЭК, что немаловажно для полноценного морфологического исследования изучаемой патологии. Апоптоз во временном промежутке представлен несколькими стадиями, которые сопровождаются изменением геометрии клетки, и игнорирование этих изменений в исследовании не оправдано.
В зарубежной литературе описывается метод сортировки циркулирующих ДЭК, активированных флюоресценцией, и расчета соотношения между апоптозными клетками эндотелия (CD-146) и клетками-предшественниками (CD-34), как показатель степени поражения эндотелиальной системы [Woywodt, A. Circulating endothelial cells: life, death, detachment and repair of the endothelial cell layer / A. Woywodt, F.H. Balhmann, K. Groot et al. // Nephrol Dial Transplant. - 2002. - №17. - P. 1728-1730]. Информативность исследования достигается требованием наличия дорогостоящего оборудования и подготовленного персонала, что позволяет использовать метод только в специализированных лабораториях.
Задачей предлагаемого способа является повышение точности цитологической диагностики эндотелиальной дисфункции у беременных, оптимизация исследования данной патологии с позиции доступности, малоинвазивности и хронометража выполнения, что позволит рассматривать его как скрининговый метод ранней сосудистой патологии у беременных.
Технический результат предлагаемого способа заключается в определении среднего эквивалентного диаметра циркулирующих ДЭК - морфометрического параметра, являющегося количественной и качественной характеристикой деструктивных изменений эндотелия.
Предлагается способ диагностики эндотелиальной дисфункции у беременных, дополняющий имеющуюся методику получения ДЭК из периферической крови разработанной J. Hladovec с соавт. в 1978 г., и заключающийся в определении среднего эквивалентного диаметра десквамированных эндотелиоцитов (СДДЭК). Средний эквивалентный диаметр - это расстояние между максимально удаленными точками оптического объекта на плоскости. Цитологические препараты исследуют с помощью светового микроскопа (увеличение 600×) и микрометра для микроскопа с ценой деления 0,01 мм. Изобретение направлено на повышение точности диагностики эндотелиальной дисфункции у беременных.
Алгоритм исследования состоит из следующих функциональных частей:
1. Пробирку с кровью центрифугируют (1000 оборотов/мин) 10 мин.
2. В пластиковую пробирку переносят 1 мл полученной плазмы и добавляют 0,1 мл 0,1% раствора АДФ.
3. Пробирку встряхивают в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем центрифугируют (2000 оборотов/мин) в течение 10 минут.
4. Из полученной надосадочной жидкости переносят 0,2 мл на предметное стекло и проводят микроскопию полученного материала (600×) для выявления циркулирующих ДЭК. Микроскопируют в 10 полях зрения.
5. Проводят определение эквивалентного диаметра обнаруженных ДЭК в 10 полях зрения с помощью микрометра для микроскопа.
6. Осуществляют статистический анализ и представляют искомый результат по формуле:
где СДДЭК - средний эквивалентный диаметр ДЭК; ∑ЭДДЭК _ сумма показателей эквивалентного диаметра исследованных ДЭК; ∑ДЭК -количество исследованных ДЭК.
Количество исследованных клеток ∑ДЭК не должно быть меньше 10, так как объем выборки определяет точность искомого среднего значения. Значение СДДЭК более 30 мкм следует расценивать, как показатель нормального функционального состояния эндотелия, значение СДДЭК 30 мкм и менее является показателем развития эндотелиальной дисфункции у беременных.
Предлагаемый способ был успешно апробирован в условиях кафедры акушерства и гинеоклогии стоматологического факультета ФГБОУ ВО МГМСУ имени А.И. Евдокимова Минздрава России в отделениях гинекологии ГБУЗ ГКБ №13 ДЗ города Москвы на 180 женщинах в I триместре: основную группу составили 90 пациенток, у которых диагностирована неразвивающаяся беременность, в контрольную группу вошли 90 здоровых женщин с физиологическим течением беременности. Неразвивающаяся беременность является необратимым и конечным проявлением нарушений в маточно-плодовых отношениях, и участие в этом процессе эндотелия неоспоримо. Выбор для нашего исследования данной нозологии позволил использовать критические изменения в сосудистой системе при несостоявшемся выкидыше в качестве информативной модели развития эндотелиальной дисфункции у беременных.
У всех пациенток проведена диагностика эндотелиальной дисфункции. Исследованы традиционные биохимические маркеры поражения эндотелия (высокочувствительный С-реактивный белок сыворотки крови (hsCRP), фактор фон Виллебранда сыворотки крови (vWf), микроальбуминурия (МАУ)), а также осуществлено определение количества ДЭК в периферической крови по методу, разработанному J. Hladovec с соавт. в 1978 г., и проведена морфометричекая диагностика ДЭК по предлагаемому методу: у каждой пациентки выполнена морфометрия 100 оптических объектов циркулирующих ДЭК и определен СДДЭК.
Ниже приводятся результаты апробации.
4
4
Средний возраст беременных основной группы составил 30,9±2,62 лет, в контрольной группе 31,4±2,12 лет. Статистически значимых отличий при исследовании соматической патологии в исследуемых группах обнаружено не было. При цитологическом исследовании циркулирующих ДЭК у беременных в группах получены следующие результаты. Сравнение величин проводилось на основе критерия Манна-Уитни. Среднее количество ДЭК в контрольной группе составило 5,5±2,12×10 клеток/100 мл. В группе с несостоявшимся выкидышем этот показатель был в 2 раза выше и составил 12,6±5,89×10 клеток/100 мл (р<0,0001). При морфометрии ДЭК также получены достоверные отличия в исследуемых группах. Средний эквивалентный диаметр ДЭК в группе с физиологическим течением беременности составил 43,9±3,99 мкм, что в 1,5 раза выше данного показателя в группе с несостоявшимся выкидышем 29,5±9,40 мкм (р<0,0001). Полученные результаты продемонстрировали достоверность отличий СДДЭК в исследуемых группах, что актуализирует морфометрическое исследование циркулирующих ДЭК для определения состояния эндотелия у беременных (фиг. 1-2).
s
Для подтверждения правильности используемой гипотезы о достоверности выбранного показателя в диагностике дисфункции эндотелия были изучены корреляционные отношения между новым морфометрическим параметром СДДЭК и классическими маркерами поражения эндотелия. Определены вероятностные связи между традиционным цитологическим маркером эндотелиальной дисфункции - количеством ДЭК и разработанным нами параметром среднего эквивалентного диаметра ДЭК. Анализ осуществлялся с помощью метода ранговой корреляции Спирмена и проводился для основной группы, так как разброс значений переменной в ней был существенно выше, чем в контрольной группе. Расчет показал высокий уровень корреляции между исследуемыми показателями. Корреляционный анализ продемонстрировал обратную зависимость количества ДЭК и их среднего диаметра: с количеством ДЭК эквивалентный диаметр ДЭК коррелировал сильно и отрицательно r=-0,95, то есть увеличение количества десквамированных эндотелиоцитов в периферической крови сопровождалось уменьшением их среднего диаметра (фиг. 3-6).
s
s
s
Изучены вероятностные связи между биохимическими маркерами эндотелиальной дисфункции и СДДЭК. Показатель высокочувствительного С-реактвиного белка в сыворотке крови продемонстрировал сильную отрицательную корреляционную связь с СДДЭК и составил r=-0,91. Коэффициент корреляции микроальбуминурии и СДДЭК составил r=-0,72; коэффициент корреляции фактора фон Виллебранда и СДДЭК r=-0,69.
Перечень и описание рисунков:
Фиг. 1 - График распределения количества ДЭК в исследуемых группах.
Фиг. 2 - График распределения среднего эквивалентного диаметра ДЭК в исследуемых группах.
Фиг. 3 - График линейной корреляции среднего эквивалентного диаметра ДЭК (СДДЭК) и количества ДЭК (КДЭК).
Фиг. 4 - График линейной корреляции среднего эквивалентного диаметра ДЭК (СДДЭК) и параметра микроальбуминурии (МАУ).
Фиг. 5 - График линейной корреляции среднего эквивалентного диаметра ДЭК (СДДЭК) и параметра фактора фон Виллебранда (vWf);
Фиг. 6 - График линейной корреляции среднего эквивалентного диаметра ДЭК (СДДЭК) и параметра высокочувствительного С-реактивного белка (hsCRP).
Ниже приведены клинические примеры использования разработанного метода диагностики эндотелиальной дисфункции у беременных.
Клинический пример №1 (основная группа).
4
Пациентка В., 27 лет, № истории болезни 7804/14. Поступила в гинекологическое отделение 15.03.2014 г. с диагнозом: Беременность 8 недель неразвивающаяся. Беременность 3-ая: в анамнезе 2 родов, без осложнений. Соматический анамнез: детские инфекции, ОРВИ, мочекаменная болезнь. Гинекологический анамнез: не отягощен. Обследована. По УЗИ: Беременность 6-7 недель. Анэмбриония. С-реактивный белок 3,9 мг/мл. Фактор фон Виллебранда 112,4%. Микроальбуминурия 0,015 мкг/мл. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции: количество ДЭК 22×10 клеток/100 мл; СДДЭК 20 мкм. Заключение: у пациентки морфометрические признаки эндотелиальной дисфункции.
Клинический пример №2 (основная группа).
4
Пациентка Б., 27 лет, № истории болезни 8536/14. Поступила 22 марта 2014 г с диагнозом: Беременность 8-9 недель. Начавшийся выкидыш. Беременность 1-ая. Соматический анамнез: корь, грипп, ангина, ОРВИ, хронический гастрит. Гинекологический анамнез: эктопия шейки матки; Обследована в стационаре. По УЗИ: Беременность 7-8 недель неразвивающаяся. Ретрохориальная гематома. С-реактивный белок 3,4 мг/мл. Фактор фон Виллебранда 112,6%. Микроальбуминурия 0,0327 мкг/мл. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции: количество ДЭК 6×10 клеток/100 мл; СДДЭК 30 мкм. Заключение: у пациентки морфометрические признаки эндотелиальной дисфункции.
Клинический пример №3 (основная группа).
4
Пациентка К., 31 год, № истории болезни 13586/14. Поступила в гинекологическое отделение 10 мая 2014 г с диагнозом: Беременность 10 недель неразвивающаяся. Беременность 6-ая, роды - 1, аборты - 4. Соматический анамнез: детские инфекции, ОРВИ. Гинекологический анамнез: хронический сальпингоофорит, хронический эндометрит. Обследована в стационаре. УЗИ малого таза: Беременность 9 недель неразвивающаяся. С-реактивный белок 5,1 мг/мл. Фактор фон Виллебранда 105,9%. Микроальбуминурия 0,03 мкг/мл. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции: количество ДЭК 8×10 клеток/100 мл; СДДЭК 18 мкм. Заключение: у пациентки морфометрические признаки эндотелиальной дисфункции.
Клинический пример №4 (контрольная группа).
4
Пациентка Т., 35 лет, №истории болезни 10757/16. Поступила в гинекологическое отделение 28 марта 2016 г. с диагнозом: Беременность 8 недель (для проведения медицинского аборта). Беременность 6-ая: роды - 3, аборты - 3. Соматический анамнез: детские инфекции, ОРВИ. Гинекологический анамнез: эктопия шейки матки. Обследована. УЗИ малого таза: Беременность 8 недель прогрессирующая. С-реактивный белок 1,8 мг/мл. Фактор фон Виллебранда 106,7%. Микроальбуминурия 0,015 мкг/мл. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции: количество ДЭК 5×10 клеток/100 мл; СДДЭК 40 мкм. Заключение: у пациентки морфометрические признаки нормального функционального состояния эндотелия.
Клинический пример №5 (контрольная группа).
4
Пациентка К., 30 лет, № истории болезни 8503/16. Поступила в гинекологическое отделение 10 марта 2016 г. с диагнозом: Беременность 7-8 недель (для проведения медицинского аборта). Беременность 3-ая: роды - 1, выкидыш - 1 (на сроке до 12 недель). Соматический и гинекологический анамнез не отягощен. Обследована. УЗИ малого таза: Беременность 8 недель прогрессирующая. С-реактивный белок 0,2 мг/мл. Фактор фон Виллебранда 98,5%. Микроальбуминурия 0,01 мкг/мл. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции: количество ДЭК 8×10 клеток/100 мл; СДДЭК 50 мкм. Заключение: у пациентки морфометрические признаки нормального функционального состояния эндотелия.
Клинический пример №6 (контрольная группа).
4
Пациентка Г., 36 лет, № истории болезни 13215/16. Поступила в гинекологическое отделение 15 апреля 2016 г. с диагнозом: Беременность 9-10 недель (для проведения медицинского аборта). Беременность 5-ая: роды -2, аборты - 2. Соматический анамнез: хроничекий гастрит. Гинекологический анамнез: эктопия шейки матки (лечение в 2013 г.). Обследована. УЗИ малого таза: Беременность 9 недель прогрессирующая. С-реактивный белок 2,1 мг/мл. Фактор фон Виллебранда 105,7%. Микроальбуминурия 0,015 мкг/мл. Цитологическая диагностика эндотелиальной дисфункции: количество ДЭК 13×10 клеток/100 мл; СДДЭК 40 мкм. Заключение: у пациентки морфометрические признаки нормального функционального состояния эндотелия.
4
4
Таким образом, вариабельность результатов параметра количества ДЭК (от 6 до 22×10 клеток/100 мл в основной группе, и от 5 до 13×10клеток/100 мл в контрольной группе) не позволяет получить четкий ответ о функциональном состоянии эндотелия у обследованных больных. Разработанный показатель СДДЭК в представленных примерах четко отражает наличие дисфункции эндотелия у пациенток основной группы (СДДЭК<30 мкм) и нормальное функциональное состояние эндотелия у беременных контрольной группы (СДДЭК>30 мкм). Различие показателей достаточно информативно выявляется уже при единичных исследованиях, что может существенно изменить средний показатель при выборке в целом.
Исследование традиционных биохимических маркеров поражения эндотелия у пациентов основной группы подтвердило наличие эндотелиальной дисфункции, что также актуализирует диагностическую значимость предложенного метода.
Предлагаемым способом достигается повышение точности диагностики эндотелиальной дисфункции. Используемый метод основан на изучении морфогенеза сосудистой системы, а точнее на активности апоптоза эндотелиоцитов, что определяет новый вектор диагностического поиска биомаркеров эндотелиальной дисфункции. Предлагаемый метод диагностики эндотелиальной дисфункции у беременных позволяет на клеточном уровне определять нарушения в сосудистом русле, что следует рассматривать как новый метод ранней пренатальной диагностики, который может рассматриваться в формате скринингового исследования. Разработанная диагностика является доступным, малоинвазивным и быстровыполнимым методом, способствующим своевременному принятию диагностического решения и выбору тактики лечебных мероприятий, определяя дифференцированный подход в прогнозировании, профилактике и лечении сосудистой патологии у беременных.