Способ получения каллусной культуры Hedysarum alpinum L.
METHOD FOR OBTAINING CALLUS CULTURE HEDYSARUM ALPINUM L.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению и выращиванию клеточных культур лекарственных растений, и может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения сырья, представляющего собой каллусную культуру Hedysarum alpinum L., с целью выделения комплекса биологически активных веществ.
Копеечник альпийский Hedysarum alpinum L. - многолетнее травянистое растение, встречается в Западной и Восточной Сибири, на Дальнем Востоке (Амурская область), на севере Монголии и Китая. Является ценным лекарственным сырьем и широко применяется в тибетской, китайской, дальневосточной медицине при лечении простудных заболеваний вирусной природы, сердечных и хронических легочных заболеваний, атеросклероза и в качестве болеутоляющего. Вышеперечисленные свойства обусловлены наличием следующих биологически активных веществ: сапонинов, флавоноидов, дубильных веществ, ксантонов, кумаринов, алкалоидов и полисахаридов. В связи с массовыми заготовками сырья в некоторых регионах копеечник получил статус уязвимого вида и для его сохранения существует необходимость выращивании в культуре in vitro [1].
Известен способ получения каллусной культуры клеток дикорастущего растения змееголовника дланевидного (Dracocephalum palmatum Steph.) в условиях in vitro, включающий стерилизацию семян змееголовника раствором 3% перекиси водорода в течение 5 минут, 80% этиловым спиртом в течение 1 мин, трехкратное ополаскивание в стерильной дистиллированной воде, помещение стерильных семян на твердую питательную среду без гормонов следующего состава, мг/л: NH4NO3 - 33000, KNO3 - 38000, СаС12×2H2O - 8800, MgSO4×7H2O - 7400, KH2PO4 - 3400, KI - 166, Н3ВО3 - 1240, MnSO4×4H2O - 4460, ZnSO4×7H2O - 1720, Na2MoO4×2H2O - 50, CuSO4×5H2O - 5, CoCl2×6H2O - 5, FeSO4×7H2O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 2500, вода - 1000 мл, агар - 7000. Далее, полученные из проростков листовые экспланты помещают в питательную среду следующего состава, мг/л: NH4NO3 - 33000, KNO3 - 38000, CaCl2×2H2O - 8800, MgSO4×7H2O - 7400, KH2PO4 - 3400, KI - 166, Н3ВО3 - 1240, MnSO4×4H2O - 4460, ZnSO4×7H2O - 1720, Na2MoO4×2H2O - 50, CuSO4×5H2O - 5, CoCl2×6H2O - 5, FeSO4×7H2O - 5560, Na-ЭДТА - 7460, мезоинозит - 100, никотиновая кислота - 100, пиридоксин - 100, тиамин - 100, сахароза - 3000, гидролизат казеина - 500, кинетин - 1, 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота - 1, вода - 1000 мл, агар - 12000. При этом культивирование растений проводят в темноте, при температуре 26±1°С, влажности помещения 70±5%, цикл субкультивирования составляет 4 недели. Изобретение позволяет получить каллусную культуру змееголовника дланевидного в условиях in vitro (Dracocephalum palmatum Steph.), которая может быть использована в качестве источника флавоноидов терапевтического действия [3].
Недостатком данного способа является добавление в питательные среды таких компонентов как мезоинозит и гидролизат казеина, что увеличивает ее стоимость. Также Dracocephalum palmatum Steph. относится к семейству яснотковые тогда как Hedysarum alpinum L. относится к семейству бобовые, соответственно состав флавоноидов полученных культур может значительно отличаться.
Известна культура корня Hed.th. (Hedysarum theinum Krasnob.) - продуцента изофлавонов, депонированная в Коллекции генетически трансформированных корней растений при Институте физиологии растений РАН - под обозначением Hed.th. Культуру получают их стерильных проростков надземную часть которых отделяют, разрезают на сегменты, которые после осторожного накалывания иглой инсулинового шприца помещают в жидкую питательную среду Мурасиге и Скуга (МС), содержащую суспензию 48-часовой почвенной бактерии. Далее сегменты промывают стерильной средой и переносят на агаризованную питательную среду МС, не содержащую гормонов с добавлением антибиотика (клафоран - 500 мг/мл) для элиминирования бактерии. Через 3-4 недели на семядолях в зонах поранения появляются плагиотропно растущие корни, которые отделяют и пересаживают на агаризованную питательную среду Гамборга (В5), содержащую уменьшенную дозу антибиотика (250 мг/мл). После 3-5 пассажей (период между пассажами составляет 5-7 недель) корневых эксплантов на агаризованной среде часть экспланта переносят в жидкую питательную среду того же состава, не содержащую антибиотик, и выращивают в условиях качания (90 об/мин) в темноте при температуре 26°С. Полученная культура корня Hed.th. сохраняет способность к синтезу вторичных метаболитов, характерных для корней целого растения, а именно изофлавонов группы формононетина: ононин, гликозид тексазина, малонилононин, формононетина [3].
Недостатком данного способа является то, что он направлен на получение корневой культуры Hedysarum theinum Krasnob., продуцирующей изофлавоны, тогда как нами описано получение каллусной культуры Hedysarum alpinum L., представляющей собой массу недифференцированных клеток, источника биологически активных веществ. Помимо этого у Н. theinum наибольшее количество БАВ содержит в корнях и соответственно в корневой культуре, тогда как у Н. alpinum биологически активные вещества и в частности флавоноиды содержаться в надземной части растения, в связи, с чем создание корневой культуры не гарантирует их присутствие.
В проанализированной патентной и научно-медицинской литературе адекватного прототипа не обнаружено.
Задачей настоящего изобретения является разработка способа получения каллусной культуры Hedysarum alpinum L., перспективной в качестве сырья для выделения биологически активных веществ и создания на их основе лекарственных средств.
Поставленная задача достигается техническим решением, представляющим собой способ, включающий в себя разделение 3-х недельных проростков на экспланты представляющие собой кусочек стебля длиной 1,5-2 см, посадку их на агаризованную питательную среду МС с добавлением гормонов 1 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2-4 D) и 0,1 мг/л 6-бензиламинопурина (6- БАП) на 6 недель для каллусообразования, пересадку полученного каллуса на агаризованную питательную среду МС с добавлением гормонов 2 мг/л а-нафтилуксусной кислоты (α-НУК) и 0,5 6-БАП для дальнейшего культивирования в темноте при 26±1°С, влажности 70%.
Новым в предлагаемом изобретении является то, что для получения культуры стерильные экспланты Hedysarum alpinum L., представляющие собой кусочек стебля длиной 1,5-2 см, высаживают на агаризованную питательную среду МС с добавлением 1 мг/л 2-4 D и 0,1 мг/л 6-БАП и далее полученный каллус культивируют на агаризованной питательной среде МС с добавлением 2 мг/л α-НУК и 0,5 мг/л 6-БАП в темноте при 26±1°С, влажности 70%.
Новые признаки проявили в заявляемой совокупности новые свойства явным образом не вытекающие из уровня техники в данной области и неочевидные для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено в патентной и научно -медицинской литературе.
Предлагаемый в качестве изобретения способ может быть использован для получения биомассы с целью выделения комплекса биологически активных веществ.
Исходя из вышеизложенного, следует считать предлагаемое изобретение соответствующим условиям патентоспособности «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».
Изобретение будет понятно из следующего описания и приложенной к нему фигуры.
На фиг. 1 изображена динамика накопления сырой и сухой биомассы.
Полученные ранее стерильные 3-х недельные проростки Hedysarum alpinum L. в условиях ламинарного бокса рассекают на экспланты, представляющие кусочек стебля длиной 1,5 - 2 см и затем помещают на агаризованную питательную среду, приготовленную по прописи МС, содержащую гормоны 1 мг/л 2-4 D и 0,1 мг/л 6-БАП и оставляют на 6 недель в условиях темноты для каллусообразования. Далее полученный каллус в стерильных условиях отделяют и переносят на агаризованную питательную среду МС с добавлением 2 мг/л α-НУК и 0,5 мг/л 6-БАП для дальнейшего культивирования и помещают на стеллажи в условия темноты при 26±1°С и влажности 70%.
Каждые 5 суток в течение 35 дней измеряли вес сырой и высушенной биомассы каллуса. По полученным данным рассчитывали ростовой индекс по сухой и сырой биомассе. На фигуре изображена динамика накопления сырой и сухой биомассы каллусной культуры Hedysarum alpinum L..
Достигаемый технический результат заключается в получении каллусной культуры Hedysarum alpinum L., характеризующейся значимым приростом биомассы и высокой удельной скоростью роста.
Пример
В условиях ламинарного бокса 3-х недельные стерильные проростки Hedysarum alpinum L. рассекают на экспланты, представляющие собой кусочек стебля длиной 1,5-2 см, и помещают в культуральные сосуды на агаризованную питательную среду, приготовленную по прописи МС, содержащую гормоны 1 мг/л 2-4 D и 0,1 мг/л 6-БАП, закрывают фольгой и затягивают парафилмом и помещают на стеллажи в темноту на 6 недель для каллусообразования. Далее в стерильных условиях отделяют полученный каллус от растительной ткани и переносят в культуральные сосуды на свежую агаризованную питательную среду того же состава но с добавлением 2 мг/л α-НУК и 0,5 мг/л 6-БАП для дальнейшего культивирования, закрывают и помещают на стеллажи в условия темноты при температуре 26±1°С и влажности 70%. Полученный каллус представляет собой белую массу средней плотности с рыжим окрашиванием на контакте с питательной средой. Субкультивирование осуществляют каждые 30 суток.
Полученная культура обладает следующими характеристиками роста, отмеченными в таблице 1.
Кривая роста культуры представлена на рис 1, для построения кривой роста по сухой и сырой биомассе использовали натуральный логарифм (фиг. 1).
Наибольшая удельная скорость роста и прирост по сырой биомассе отмечен на 35 сутки, максимальный пророст по сухой биомассе наблюдается на 25 сутки.
Вышеописанный способ позволяет получить стабильно растущую каллусную культуру Hedysarum alpinum L., отличающуюся значимым приростом биомассы и высокой удельной скоростью роста.
Питательная среда Мурасиге-Скуга содержит компоненты в количественном соотношении, представленном в таблице 1.
Предлагаемый в качестве изобретения способ позволяет получать каллусную культуру Hedysarum alpinum L., перспективную в качестве сырья для выделения биологически активных веществ и создания на их основе лекарственных средств со значимым приростом биомассы и высокой удельной скоростью роста.
Список литературы
1. Зиннер, Н.С., Высочина, Г.И., Кукушкина, Т.А., Свиридова, Т.П. (2010). Биологически активные вещества Hedysarum alpinum L. и Н. theinum Krasnob. (fabaceae), интродуцируемых в Томскую область // Вестник Томского государственного университета. Биология, (4 (12)), 116-122.
2. Патент РФ №RU 2718253 опубликован 31.03.2020.
3. Патент РФ №2360964 опубликован: 10.07.2009.