СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНОГО РАДИОФАРМПРЕПАРАТА
METHOD FOR PRODUCING A THERMOSENSITIVE RADIOPHARMACEUTICAL AGENT

Изобретение относится к области ядерной медицины, радиофармацевтики, радиофармакологии, более узко - к сфере локальной радиотерапии.
фр
В медицинской практике радиотерапии злокачественных опухолей активно используется брахитерапия, основанная на введении радиоактивных источников непосредственно в опухоль. Подвижность носителей радионуклидов в окрестности места инъекции препарата, способствующая перемещению радиоактивности по отделам организма, может быть эффективно ограничена за счет их связывания в полимерном геле. Предпочтение отдается (со)полимерам, в водном растворе которых происходит обратимый фазовый золь-гель переход, вызываемый изменением в достаточно узком интервале факторов среды. Термочувствительный водный полимерный раствор смешивается при комнатной температуре с эффективным количеством биоактивного агента с целью сформировать композицию, способную обратимо превращаться в теплокровном животном в гелеобразное депо лекарств, когда температура раствора поднимается до температуры животного выше температуры фазового золь-гель перехода Т. Это свойство позволяет использовать такую композицию при хирургических операциях на теплокровном животном, вводя ее в область вскрытия. Лекарствами могут служить противораковые агенты, гормоны, антибиотики, иммуноактиваторы, терапевтические пептиды и протеины. Поскольку термочувствительность позволяет формировать гель путем инъекции раствора, то не требуется хирургическая процедура для имплантирования лекарственного депо в нужный отдел организма. Физические свойства мягкого гидрогеля уменьшают нагрузку на соседние ткани.
Особенно привлекательны препараты, в которых в качестве терапевтического противоопухолевого средства используются радионуклиды, прикрепленные химически к термочувствительной цепи или иммобилизованные в физическом геле, образовавшемся в водных растворах в процессе термотропного золь-гель перехода при нагревании от комнатной до температур, близких к температуре человеческого тела. Водный раствор термочувствительного биосовместимого (со)полимера, гомогенный и маловязкий при комнатной температуре, после фазового перехода становится достаточно плотным гелем с содержащимися в нем атомами радионуклида и представляет собой локальный источник излучения для брахитерапии. Таким образом, максимальную дозу излучения удается доставить непосредственно в пораженный орган, практически не облучая прилегающие ткани, что является решением парадигмы идеального облучения в лучевой терапии.
90
90
Из конкретных технических решений, наиболее близких к рассматриваемой проблеме, обращают на себя внимание следующие разработки. Радиогелевая система, описанная в патентах [1-8], включает инжектируемый водный раствор биоразлагаемого полимера, в котором диспергированы микросферы солей Y коллоидных размеров. Раствор после инъекции в опухоль быстро нагревается до температуры тела и затем превращается в трехмерную сетку, в которой иммобилизованы микросферы солей Y. Высокоэнергетические электроны, излучаемые радионуклидом, эффективно облучают раковые клетки в объеме мишени с очень малыми потерями энергии на облучение соседних тканей. Инжектируемый радиогель выгодно использовать, когда опухоль не может быть удалена хирургически, как, например, в ряде случаев рака печени, мозга, головы и шеи, почек и поджелудочной железы.
w
фр
фр
3
В патентах [4-6] изучены сополимеры, состоящие из биосовместимого гидрофильного полиэтиленгликоля (PEG) и биоразлагаемого полиэфирного гидрофобного компонента с различной макромолекулярной архитектурой: триблок-сополимер PEG-b-PLGA-b-PEG или графт-сополимеры вида PEG-g-PLGA и PLGA-g-PEG, где PLGA - DL-молочная кислота-со-гликолевая кислота. Графт-сополимеры имеют в воде разную структуру мицелл. В PEG-g-PLGA сердцевину образуют гидрофобные боковые ветви PLGA, а оболочку - скелетные гидрофильные цепи PEG. Поверхностно-активные свойства привитых сополимеров служат дополнительным фактором, увеличивающим растворимость гидрофобного терапевтического средства. В биомедицинских приложениях важно, чтобы компоненты носителя были биосовместимы, а биоразлагаемая компонента не индуцировала орошение соседних тканей продуктами разложения. Последние оказывают негативное денатурирующее воздействие на протеин/полипептидные лекарства, которые с развитием генной инженерии становятся обычным терапевтическим средством. Поэтому возникает необходимость в создании носителей лекарств с различным сроком стабильности. Свойства короткоживущих (меньше недели) носителей проявляют гели графт-сополимера PEG-g-PLGA, а долговременных (один-два месяца) - гели PLGA-g-PEG. Примечательно, что изменение соотношения между PEG и PLGA в сополимерах влияет на следующие важные свойства растворенного сополимера: скорость выделения лекарства из геля, термочувствительность к гелеобразованию, вязкость раствора при комнатной температуре и плотность геля выше физиологических температур. Например, вязкость 22% водного раствора графт-сополимера PEG-g-PLGA (47 мол. % PEG, M = 11000) при 20°С составляет 22 мПа⋅с, и раствор легко набирается в шприц со стандартной иглой. Температура фазового разделения Т, ассоциируемая с резким возрастанием динамической вязкости, для этой системы была оценена в 30°С и мало зависела от концентрации в пределах 20-25 мас. %. Реальная часть комплексной динамической вязкости 22% водного раствора в результате термотропного перехода увеличивается в 10 раз с 0,05 до 50 Па⋅с, а модуль упругости достигает 10-100 Па. Согласно фазовой диаграмме критическая концентрация гелеобразования (ККГ), выше которой в растворе появляется гель-фаза, составляет 16 мас. %. Ниже ККГ наблюдается течение, даже когда вязкость растет с увеличением температуры. При увеличении температуры сверх Т гель проявляет синерезис - макрофазовое разделение, когда некоторое количество воды выделяется из гель-фазы. Присутствие гель-фазы вблизи температуры тела делает эту систему подходящей для доставки лекарств путем инъекции, в месте которой образующийся гель удерживает биоактивные агенты, способные медленно выделяться. Компактный гель сохраняется одну неделю, делая систему кандидатом на роль короткосрочного переносчика противораковых и других лекарств.
w
фр
фр
В графт-сополимере PLGA-g-PEG (40 мол. % PEG, M = 7800) Т ≈ 40°С, когда молекулярная масса PEG колеблется в пределах 600-1000. Если же содержание PEG снижается до 20%, Т падает до 20°С. Во время золь-гель перехода PEG становится более гидрофобным вследствие дегидратации и изменения степени водородного связывания между молекулами воды и полимера. Гель сохраняется в крысе в течение двух месяцев в отличие от предыдущего сополимера, который распадается за 1 неделю.
Модель золь-гель перехода в этой системе можно представить следующим образом. В растворе при комнатной температуре степень ассоциации мицелл недостаточна, чтобы сформировать трехмерную сетку. Процессом гелеобразования управляет энтропия, а молекулярным драйвером являются гидрофобные взаимодействия PLGA-сегментов. Энтропия молекул воды уменьшается в присутствии гидрофобной компоненты, площадь поверхности гидрофобных сегментов минимизируется в воде. Гидрофобные взаимодействия возрастают с увеличением температуры, и ассоциация полимера уменьшает движение PEG-компоненты, вызывая образование сетки на длинных масштабах, то есть геля. Степень ассоциации достаточна, чтобы удерживать избыток воды при физиологических температурах. Это скорее гель, чем сильно вязкая жидкость. При дальнейшем увеличении температуры и усилении длинномасштабных взаимодействий возрастает смешение компонентов внутри полимера, вызывая макрофазовое разделение между водой и полимером.
В качестве биоразлагаемого полимерного поставщика лекарств рассматриваются также полипептид/полиэтиленгликольные сополимеры. Подходящие полипептиды для этой цели должны включать две или более аминокислоты, которые отличаются по степени гидрофильности. Рассмотренная выше полимерная система PEG-g-PLGA выделяет в результате гидролиза молочную и гликолевую кислоты, что в свою очередь может вызвать деградацию чувствительных к кислоте лекарств и денатурацию протеинсодержащих агентов. Полиэфир PLGA чувствителен к гидролизу, поэтому препараты на его основе нужно хранить при пониженных температурах. Так как пептидная связь более устойчива к гидролизу чем эфирная, то сополимеры, содержащие пептидные блоки, более стабильны во времени, лучше хранятся при комнатной температуре и их разложение ускоряется после инъекции в организм за счет пролитических ферментов. Выделяющиеся в результате разложения полипептидов нейтральные аминокислоты не влияют на рН среды и функционирование поставщика биоактивных агентов. Полипептидные доставщики имеют более высокую температуру стеклования, чем полиэфирные PEG/PLGA системы, и их удобнее использовать в виде порошка, чем полиэфирсодержащие пасты. Полипептидные системы доставки могут быть особенно продуктивны in situ в качестве терможелирующих депо для доставки протеинов, клеток и других агентов, чувствительных к кислоте.
90
фр
фр
В патентах [1-3], [7-8] носители терапевтических агентов представляют собой статистический сополимер, линейные цепи которого состоят из чередующихся последовательностей звеньев термочувствительного N-изопропилакриламида (НИПА) и гидрофильного сомономера - акриловой кислоты (АК) или 2-диметиламинэтилакрилата (ДМАЭА). В качестве терапевтического агента используются соли радиоактивного иттрия Y. Коллоидные частицы солей субмикронного размера благодаря большой удельной поверхности и ионно-координационным связям со звеньями АК или ДМАЭА формируют узлы пространственной полимерной сетки. Было найдено, что 2% раствор сополимера НИПА/АК с содержанием АК около 2 мол. % способен сформировать обратимый гель без всяких признаков синерезиса воды. Недостаток этой разработки состоит в том, что заряженные гидрофильные звенья сомономеров АК или ДМАЭА, необходимые для создания узлов трехмерной сетки, смещают Т сополимера с 32,5°С, присущую гомополимеру поли-N-изопропилакриламиду (ПНИПА), в окрестность физиологических температур (36-37°С при содержании АК 2 мол. %). Как показали эксперименты на животных, при незначительном удалении системы от бинодали за счет не совсем благоприятного соотношения температуры тела и Т наблюдается распространение радионуклида по всему организму.
125
131
В цикле работ [9-13] ионно-координационные связи между полимерным носителем и радионуклидом заменяли более сильными ковалентными или хелатными связями за счет введения тирозинсодержащих звеньев в цепь термочувствительного полимера при радикальной полимеризации НИПА или винилкапролактама (ВКЛ) либо с использованием инициатора, содержащего тирозиновые группы, либо сомономера типа N-метилакрилоил-L-тирозинамида (МАТАМ). Модифицированные тем или иным способом цепи термочувствительного сополимера подвергали мечению в водном растворе NaI или NaI в присутствии окислителя хлорамина Т. Отделение высокомолекулярных фракций от низкомолекулярных реагентов смеси проводили с помощью элюирования фосфатным буфером в хроматографической колонке, заполненной сефадексом, с последующим измерением радиоактивности фракций. Выяснилось, что только половина активного йода во время мечения ковалентно связывается с тирозин-содержащим модификатором цепи, а другая часть в виде хлористого йода или йодидов с большой вероятностью образует физические комплексы с термочувствительным полимером, особенно с поли-N-винилкапролактамом (ПВКЛ). В результате вдвое снижается эффективность мечения по сравнению с ПНИПА-содержащими препаратами. Испытания на стабильность йодированных радиофармацевтических препаратов (РФП) на основе ПВКЛ-МАТАМ показали, что в первый день радиоактивность высокомолекулярных фракций падает почти на 80% от исходного значения, а затем не изменяется в течение недели, то есть препарат плохо очищается в результате однократного прохода через колонку. Предложено очищать препарат за счет одновременного введения в систему три(гидроксиметил)аминоэтана (ТГОМАЭ) и аскорбиновой кислоты и двукратного пропускания через колонку. Аскорбиновая кислота восстанавливает до йодида входящие в комплекс йодиновые специи, а ТГОМАЭ, будучи комплексообразующим агентом для йодиновых соединений, как и ПВКЛ, сдвигает равновесие в сторону очищения полимера.
131
фр
s
фр
s
В йодсодержащих РФП на основе ПНИПА комплексообразование йодидов с цепью также снижает радиохимическую чистоту (РХЧ) препарата. Об этом свидетельствует наша разработка [14], преследующая цель создания термочувствительного йодсодержащего РФП с РХЧ ~ 95-98%. Матрицей РФП служит полимерно-белковый коньюгат - продукт привитой сополимеризации НИПА и глобулярного белка - бычьего сывороточного альбумина. К белковым молекулам ковалентно присоединены атомы радиоактивного йода. Водный раствор РФП обладает способностью совершать фазовый переход вблизи температуры человеческого тела, благодаря чему препарат превращается в компактный источник локального облучения. Основная масса анионов йода во время мечения окисляется до катионов и присоединяется к реакционным группам, инкорпорированным в термочувствительные макромолекулы. Наряду с этим позитивным процессом в реакционной среде благодаря значительной концентрации амидных групп имеет место негативный процесс, в котором анион йода включается в систему водородных связей между мостиковыми молекулами воды и карбонильными группами мономерных звеньев. Без принятия специальных мер образующиеся в процессе мечения паразитные тройные ПНИПА-Г-гидратные комплексы консервируются в препарате, не разрушаются на стадии колоночного фракционирования и после введения РФП в организм, распадаясь, становятся источником радиоактивного загрязнения. Удаление радиоактивных йодидных комплексов достигается в хроматографической колонке за счет введения в элюент стимулирующих добавок, преимущественно неорганических солей, служащих агентами деградации тройных комплексов и обладающих коэффициентом дестабилизации γ = - dТ/dС из интервала γ = 30-60 град⋅л/моль, где Т - температура фазового перехода в растворе, содержащем стимулирующую добавку; C - концентрация добавки.
Недостатком разработки мы считаем системное противоречие, корнем которого является соединение в одну макромолекулу двух функционально различных последовательностей, отдельных звеньев или групп, одни из которых ответственны за проявление термотропного перехода, а другие - за включение с помощью тех или иных химических связей терапевтических агентов, например, радионуклидов. С одной стороны, чем меньше молекулярная масса ПНИПА, тем легче он выводится из организма. С другой стороны, повышенная молекулярная масса способствует превращению исходного водного раствора в более плотный гель в результате термотропного перехода. Желание уплотнить полимерную фазу за счет увеличения концентрации исходного раствора сталкивается с ограничениями по вязкости исходного раствора.
6
Указанных недостатков лишен двухкомпонентный полимерный носитель радионуклида - прототип [15]. В качестве полимерного носителя радионуклидов используются интерполимерные комплексы, составленные из макромолекул термочувствительного ПВКЛ и белковых молекул казеина или йодказеина, несущих ковалентно связанные изотопы, в том числе радиоактивные. Водный раствор ПВКЛ обладает способностью претерпевать фазовый переход вблизи физиологических температур, а белковые молекулы, обвиваемые цепями ПВКЛ с образованием прочных интерполимерных комплексов, удерживаются в геле, благодаря чему меченый радионуклидами белок осуществляет радиационное разрушение опухоли. Недостатком разработки является тот факт, что наиболее удачные реализации основаны на использовании в качестве сокомпонента интерполимерных комплексов макромолекул ПВКЛ с высокой молекулярной массой ~ 10, которые не поддаются выводу из организма.
Техническая задача, решаемая в предлагаемом изобретении, заключается в создании термочувствительной системы, включающей полимерный носитель радионуклида, удовлетворяющей главному требованию брахитерапии: содержащийся в препарате радионуклид должен одновременно оказывать необходимое терапевтическое действие на опухоль и не обладать подвижностью, которая бы позволила ему сразу после введения или со временем выйти за пределы компактной полимерной фазы.
153
3+
153
3+
сп
Поставленная техническая задача в настоящем изобретении решается с помощью покомпонентного разделения основных функций РФП. С этой целью сначала изготовляется термочувствительный сополимер НИПА и аллиламина (ААм), который затем подвергается этерифицированию по аминным группам хелатирующим агентом диангидридом диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ДАДТПА) и последующей реакции мечения радионуклидом Sm за счет образования хелатных [ДТПА*Sm] комплексов. Отделение в реакционной смеси меченой сополимерной компоненты от низкомолекулярных активных и неактивных соединений осуществляется путем элюирования ацетатным буфером на хроматографической колонке, заполненной набухшим сефадексом. Колоночный элюат, содержащий активные сополимерные фракции, оказывается слишком разбавленным (С < 1 мас. %), чтобы напрямую быть использованным в качестве РФП, однако он может служить растворителем для приготовления более концентрированного раствора полимера-загустителя. Роль загустителя состоит в создании флуктуационной «квазисетки», которую формируют контакты остатков мономерных групп, принадлежащих разным цепям. Раствор с концентрацией, при которой начинается перекрывание клубков, называется полуразбавленным. В полуразбавленном концентрационном режиме независимой динамической единицей становится не отдельная цепь, а блоб. Полуразбавленный раствор при комнатной температуре представляет собой плотноупакованную систему блобов - фрагментов макромолекулы между контактами с другими макромолекулами, среднеквадратичный размер которых равен корреляционной длине ячейки флуктуационной «квазисетки». После фазового перехода флуктуационная сетка полуразбавленного раствора полимера-загустителя трансформируется в компактный конгломерат полимерных цепей. Относительно короткие цепи сополимера-носителя, иммобилизованные в пространственной сетке зацеплений полимерной фазы, теряют способность выпутываться из нее. Функцию загустителя может выполнять ПНИПА с оптимальными молекулярно-массовым распределением (ММР) и концентрацией в растворе для инъекции. Ограничения сверху по молекулярной массе вызваны желанием облегчить процесс выхода полимерных клубков из организма через почечные каналы.
Синтез и свойства сополимера-носителя радионуклида и полимера-загустителя. Синтез (со)полимеров на основе НИПА и ААм проводили методом радикальной (со)полимеризации в диоксане с использованием 2,2'-Азобисизобутиронитрила (АИБН) в качестве инициатора. Марки и качество реактивов приведены в таблице 1.
Аам
Из реакционной смеси в стеклянных ампулах удаляли кислород продувкой аргоном в течение 30-45 мин либо вакуумированием в сочетании с трехкратным циклом замораживание-размораживание, отпаивали и помещали в термостат при заданной температуре. Через определенные промежутки времени ампулы вынимали, охлаждали, вскрывали и содержимое высаживали в диэтиловый эфир (ДЭЭ). Осадок отфильтровывали, высушивали, затем повторно растворяли в свежеперегнанном тетрагидрофуране (ТГФ), осаждали ДЭЭ, отфильтровывали, высушивали под вакуумом при температуре 50-60°С и рассчитывали степень конверсии Ψ. Содержание ААм в сополимере Х определяли из спектров оптического поглощения комплексов TNBS с аминной группой сополимера в водном растворе буры [18].
3
w
-4
0,61
Характеристическую вязкость [η] водных растворов (со)полимерных образцов измеряли с помощью вискозиметра Уббелоде при 20°С в присутствии 0,5 М LiNO (таблица 2). При расчете средневязкостной молекулярной массы сополимеров ПНИПА с небольшим содержанием ААм (≤1,5 мол. %) применяли уравнения Марка-Куна-Хаувинка [η] = 4,7⋅10 M [19].
3
7
-1
1
2
0
0
ПС
ПС
ПС
ПС
w
wПС
n
nПС
ПНИПА
ПНИПА
ПВП
ПВП
Молекулярно-массовое распределение (ММР) и гидродинамический объем макромолекул. Для оценки параметров ММР в работе использовали прибор WATERS, снабженный тремя хроматографическими колонками высокого разрешения HR4, HR5 и HR6. Колонки заполнены полистирольным гелем. Набор позволяет определять ММР образцов полистирола (ПС) в интервале молекулярной массы (ММ) = 5⋅10-1⋅10 без проведения дополнительной коррекции на приборное уширение. Растворителем служил тетрагидрофуран (ТГФ), элюирование проводили при 30°С со скоростью 0,8 мл/мин. Концентрация растворов 0,05-0,2 мас. %. Метод гельпроникающей хроматографии (ГПХ) осуществляет эксклюзионное фракционирование макромолекул по их гидродинамическим объемам f = M[η] согласно универсальной калибровочной зависимости lgf = C-CV, связывающей гидродинамический объем макромолекул и объем удерживания V. Постулируется, что при одинаковых процедурных условиях ГПХ для макромолекул исследуемого полимера и полистирольных ПС-стандартов, выходящих с одним и тем же удерживаемым объемом, равны их гидродинамические объемы. Переводной множитель, или Q-фактор представляет собой коэффициент пропорциональности между ММ полимерной цепи и ее контурной длиной [20]. В рамках модели свободно-сочлененной гауссовой цепи справедливо соотношение Q = sM/A (M - молекулярная масса мономерного звена, s - число звеньев в сегменте, А - размер сегмента), так что при оценке Q нет необходимости рассматривать конкретное строение полимерной цепи. Классические значения s ≈ 7,9, А ≈ 2 нм [21] позволяют определить Q ≈ 410 нм, а именно по ПС-стандартам чаще всего калибруют колонки для ГПХ. Собственно отношение Q* = Q/Q и является переводным множителем при вычислении средних ММ исследуемого полимера: M = Q*M, M = Q*M. Подставляя литературные значения S = 62, А = 14 нм, S = 14,5, А = 3,65 нм, рассчитанные по данным [16, 22], получаем оценочные значения Q* ≈ 1,2 и 1,1 для ПНИПА и поливинилпирролидона (ПВП) соответственно. Отсюда следует, что гидродинамические объемы макромолекулярных клубков ПВП и ПНИПА с равными ММ в пределах погрешности одинаковы. Медико-биологическими исследованиями установлено, что введенные в организм макромолекулы ПВП с ММ меньше 30000 выходят через почки в течение нескольких дней. Макромолекулы с ММ из интервала 30000-100000 выделяются гораздо медленнее - в течение нескольких месяцев [23]. Поскольку оба полимера не способны к биоразложению, можно считать, что схожим образом протекает биологическое фракционирование цепей ПНИПА, для которого количественные сведения об этом процессе в литературе отсутствуют. Таким образом, с точки зрения вывода из организма ПНИПА и ПВП «биоэквивалентны». Значение этого вывода трудно переоценить, т.к. он позволяет осуществить последний шаг на пути принятия решения о практическом применении термочувствительного терапевтического препарата на основе ПНИПА и заменяет трудоемкие и дорогостоящие эксперименты.
кооп
Пространственная сетка зацеплений в растворах ПНИПА. Калориметрическое изучение фазового перехода показало [16], что размер независимой кинетической единицы гидратированной макромолекулы ПНИПА при переходе из разбавленной фазы в фазу, обогащенную полимером, составляет 63 звена, что соответствует молекулярной массе М ≈ 7000. По данным поступательной диффузии и светорассеяния статистический сегмент Куна ПНИПА включает в себя 62 звена. Таким образом, размеры кинетического и статистического сегментов макромолекулы ПНИПА практически совпадают [16]. Фазовое расслоение водных растворов ПНИПА при нагревании сопровождается дегидратацией макромолекул и фиксируется в виде резко возрастающей оптической мутности раствора в узком интервале температур с хорошо выраженной начальной точкой. Можно предположить, что такое поведение обусловлено сильным взаимодействием совокупности молекул воды, образующих кооперативную единицу гидратной структуры макромолекулы. По-видимому, гибкость полимерной цепи нарушает непрерывность гидратной оболочки в областях изгибов полимерной цепи. Этим и объясняется довольно редкое явление совпадения кинетического сегмента и статистического сегмента Куна в водных растворах ПНИПА.
кр
кр
з
з
кр
з
кооп
з
кр
фр
Макроскопическое динамическое поведение макромолекул описывается с помощью модели межцепных топологических узлов - зацеплений с большим, но ограниченным временем жизни [17]. Эта модель применима локально в полуразбавленных и гомогенно в концентрированных растворах. Эффекты зацеплений наблюдаются лишь для цепей, ММ которых превышают критическое значение М. Эмпирическим путем найдена связь между М и М, где М равно молекулярной массе участков цепи между узлами сетки зацеплений: М ≈ 2М. Логично допустить, что в случае гидратной структуры ПНИПА в воде М ≈ М. Тогда М ≈ 14000. В этой связи показателен эксперимент, описанный в [1], согласно которому удаление из ПНИПА фракций с ММ < 12000-14000 за счет диализа через мембраны с соответствующим максимальным размером пор способствует формированию компактного геля по достижении Т, в противном случае образуется молочная дисперсия.
152
8/5
е
е
е
е
е
Полуразбавленные водные растворы, аналогичные тем, что предполагается использовать в качестве РФП, "меченые" неактивными атомами Sm, тестировали на способность при комнатной температуре всасываться шприцем со стандартными иглами с диаметром 0,4-0,8 мм. Параметры растворов и характеристики растворенных макромолекул в сочетании с концентрационной и молекулярно-массовой зависимостями динамической вязкости полимерных растворов в различных режимах предопределяют результаты тестирования [24]. Разбавленные растворы, в которых одиночная цепь движется независимо от других цепей, для наших целей не годятся, так как не способны превратиться в единый конгломерат перепутанных цепей. В полуразбавленных растворах взаимодействие цепей приводит к появлению нового класса движений - коллективных движений сегментов разных цепей, за счет чего происходит выравнивание флуктуаций концентраций. Коллективные моды являются драйвером переходных процессов при распаде и характеризуются коэффициентом кооперативной диффузии, пропорциональным концентрации раствора. Здесь мы ограничимся поведением нейтральных (незаряженных) макромолекул в полуразбавленных растворов, область которых ограничена критическими значениями концентраций перекрывания клубков (с* - пороговая концентрация разбавленного режима) и перепутывания (с - граница концентрированного режима) цепей. До опубликования работы [25] было принято считать, что с* и с совпадают. Теперь установлено, что полимерные растворы нейтральных макромолекул в области 5≤с/с*≤10 ведут себя как полуразбавленные (система блобов [24]), но цепи в них не перепутаны. Все определяется степенью топологических ограничений взаимного движения цепей. Феноменологически найдено, что начало перепутывания происходит, когда каждый полимерный клубок перекрывается с (n) другими, где значение 5≤n≤10 зависит от вида полимера. При концентрации перепутывания с вязкость раствора оценивается как  ( - вязкость растворителя) и для нейтральных, и для заряженных полимеров. В режиме неперепутанных полуразбавленных нейтральных макромолекул в хорошем растворителе имеют место закономерности: с ≈ nс* ≈ 10с*,  Перепутывание увеличивает показатель степенной зависимости втрое:  [24] и приводит к неприемлемо высокой абсолютной вязкости раствора термочувствительных полимеров при комнатной температуре, не позволяющей осуществлять мембранную фильтрацию и использовать стандартные иглы для инъекции. Фазовый переход в организме вызывает коллапсирование полимерной фазы, за счет чего вероятность контактов между цепями значительно увеличивается, и узлы зацеплений становятся фактором, благоприятствующим удерживанию цепей-носителей радионуклидов в трехмерной сетке.
фр
фр
Температуры нижней критической температуры растворения (НКТР) ПНИПА и его сополимеров Т оценивали из зависимостей оптической плотности водных растворов от температуры интервальным методом на спектрофотометре Agilent 8453 UV-vision. Диапазон Т (со)полимерных образцов в настоящей работе составлял 32,5-34°С.
Введение хелаторов в цепь достигалось посредством реакции этерификации аминных групп сополимера в фосфатном буфере (рН ≈ 8) в присутствии ДАДТПА при комнатной температуре с перемешиванием в течение 6-7 часов. Реакционный продукт разделяли на предварительно проградуированной колонке, заполненной набухшим сефадексом, с использованием воды в качестве подвижной фазы. Остатки не вошедшего в цепь ДАДТПА удаляли из водного раствора путем диализа. Полимерные фракции после диализа подвергались лиофильной сушке. Содержание аминных групп в сополимере определяли до и после этерификации.
153
3
Радиоактивное мечение этерифицированного сополимера проводили в ацетатном буфере (рН = 5,4), смешанного с радиоактивным солянокислым раствором SmCl, в течение 1 час. Реакционную смесь разделяли с помощью элюирования ацетатным буфером на колонке, отделяли радиоактивные сополимерные фракции, измеряли их объемную радиоактивность на гамма-спектрометре. Эффективность мечения определяли как отношение суммарной радиоактивности в сополимерных фракциях к радиоактивности в реакционной смеси. Для определения РХЧ использовали метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), включающий хроматографирование радиоактивных фракций на пластинах «Silufol» в водных растворах сульфата аммония и последующее измерение радиоактивности фрагментов пластины с помощью гамма-спектрометра или всей пластины на гамма-сканере.
пз
спн
ф
н
p
р
Испытания на термостабильность. В отдельном флаконе готовили 1-2 мл раствора полимера-загустителя ПНИПА с концентрацией С ≈ 10-20 мас. %, причем в качестве растворителя использовали колоночную сополимерную фракцию с радиоактивностью ~ 50-100 МБк/мл и концентрацией сополимера-носителя С ~ 0,7 мас. %. Флакон с испытуемым раствором и стеклянный цилиндр с притертой пробкой, содержащий отмеренный объем физраствора, выдерживали в термостате при 37°С в течение 15 мин. Далее открытый флакон с гелем погружали в сосуд с нагретым физраствором, затыкали пробкой и устанавливали в термостате. Через фиксированные промежутки времени (t) отбирали контрольные пробы физраствора и измеряли их радиоактивность. В дальнейшем регистрировали следующие данные: a(t) - радиоактивность отобранной пробы объемом 1 мл через время t (час) и доля выделившейся из геля в объем физраствора радиоактивности с учетом естественного распада q(t) = а(t)⋅V⋅100/Аехр (-t/T) (%), где Т = 67 час - характеристическое время распада. Испытания на термостабильность длились 3-4 суток.
Изобретение иллюстрируется графиками, поясняющими частные случаи выполнения:
на фиг. 1 - ММР образцов (со)полимеров серий ТНХ и ТПЗ: 1 - ТНХ-2, 2 - ТНХ-1, 3 - ТПЗ-1 (таблица 2);
на фиг. 2 - хроматограмма РФП-образца из примера 2, полученная на гамма-сканере «Радиометр Scan-Ram». Подвижная фаза - 1М водный раствор сернокислого аммония;
на фиг. 3 - хроматограмма РФП-образца из примера 5, полученная на гамма-сканере «Радиометр Scan-Ram». Подвижная фаза - 1М водный раствор сернокислого аммония.
Примеры. Нижеследующие примеры демонстрируют предмет изобретения.
w
n
w
n
w
кр
Пример 1 - положительный. Оптимальные термочувствительные носители хелаторов (ТНХ) и термочувствительные полимер-загустители (ТПЗ), концентрация полимера-загустителя С* = 15 мас. %. В данном примере для приготовления РФП использовали сополимер ТНХ-1 (таблица 2). Параметры его ММР рассчитывали по унимодальной диаграмме ГПХ в ТГФ с использованием калибровки по ПС-стандартам (фиг. 1, кривая 2) и переводного множителя Q* = 1,2: M = 30000, M = 20000, M/M = 1,5. Отметим, что M сополимера-носителя более чем вдвое превышает М ≈ 14000, то есть его цепи способны участвовать в образовании пространственной сетки вместе с полимером-загустителем.
w
n
w
n
ТПЗ-1 (таблица 2) представлял собой гомополимер ПНИПА и был синтезирован, как и образцы серии ТНХ, методом радикальной полимеризации НИПА в отсутствие ААм. Параметры ММР полимера-загустителя (фиг. 1, кривая 3): M = 102000, M = 75000, M/M = 1,36.
п
2+
Связывание хелаторов с цепью сополимера ТНХ-1 (80 мг) достигалось посредством реакции этерификации аминных групп в 4 мл фосфатного буфера (рН = 8,22) в присутствии 15 мг ДАДТПА при комнатной температуре с перемешиванием в течение 7 часов. Реакционный продукт разделяли на предварительно проградуированной колонке длиной 230 мм и диаметром 18 мм, заполненной набухшим сефадексом 50f, с использованием воды в качестве подвижной фазы. Полимерные фракции выходили в интервале удерживаемого объема V* = 12-30 мл, в то время как ДТПА - в районе V* ≈ 45 мл. Концентрация вводимого в колонку раствора С ≈ 2 мас. % была ниже значения, соответствующего точке кроссовера С* = 1/[η] ≈ 4% (таблица 2). Полимерные фракции подвергались лиофильной сушке. Эффективность этерификации была близка к полной. Остатки не вошедшего в цепь ДТПА удаляли из раствора в воде с помощью мембранного диализа, полноту которого контролировали методом комплексонометрического титрования в аммиачном буфере (рН = 9,25) раствором Zn и эриохромом черным Т.
153
3
Радиомечение этерифицированного лиофилизованного сополимера (88 мг) проводили в течение 1 час в 2 мл ацетатного буфере (рН = 5,4), смешанного с 1 мл солянокислого раствора SmCl, обладающего активностью 2,5 ГБк. Далее реакционную смесь разделяли на колонке путем элюирования ацетатным буфером, измеряли на гамма-спектрометре методом точечных источников объемную радиоактивность полимерных фракций: 610 МБк первой в интервале V* = 15-21 мл и 385 МБк второй в интервале V* = 21-27 мл. Эти данные позволяют оценить эффективность радиомечения ~ 40%. Микрообъемы полимерных фракций на пластинах «Silufol» хроматографировали в водных растворах сульфата аммония (1М) и после сушки определяли как «дискретное» значение РХЧ (95%) - путем разрезания полоски на 10 одинаковых фрагментов и измерения их активности на полупроводниковом спектрометре гамма-излучения «Гамма-1П», так и «непрерывное» значение РХЧ - экспресс-методом на гамма-сканере «Радиометр Scan-Ram» (97%).
пз
пз
пз
пз
е
2
4
н
+
2+
2+
Чтобы оценить термостабильность РФП, в отдельном флаконе растворяли 0,15 г лиофилизованного гомополимера ТПЗ-1 в 0,85 мл первой колоночной фракции (С ≈ 15 мас. %, при [η] = 0,52 дл/г произведение [η]С ≈ 8, что ниже порога перепутывания с/с* ≈ 10) с объемной радиоактивностью 40 МБк/мл. Флакон с раствором и стеклянный сосуд с притертой пробкой, содержащий 80 мл физраствора (содержание ионов: Na- 150 mM, Са - 1 mM, Mg - 10 mM, HPO - 1 mM), одновременно помещали в термостат при 37°С и выдерживали 15 мин. Далее открытый флакон со сколлапсировавшим терморадиогелем погружали в сосуд с нагретым физраствором, затыкали пробкой и устанавливали в термостате. Через 1 час в отобранной пробе физраствора объемом 1 мл была обнаружена радиоактивность а = 1,5 кБк/мл, что соответствует q = 0,3% в расчете на начальную объемную радиоактивность в цилиндре (А = 0,5 МБк/мл). В последующие трое суток дополнительного выделения радиоактивности из геля в физраствор не зафиксировали. Образец следует признать оптимальным как с точки зрения РХЧ, так и термостабильности в организме и пригодным для доклинических испытаний.
w
n
w
n
3
н
н
пз
пз
е
кр
153
Пример 2 - отрицательный. Влияние низкомолекулярности полимера-носителя. Сополимер ТНХ-2, используемый в качестве носителя радионуклида, был получен методом растворной сополимеризации в диоксане (таблица 2). Параметры ММР ТНХ-2 (рис. 1, кривая 1) присущи низкомолекулярному образцу: M = 12100, M = 9400, M/M = 1,3. Последующие стадии модифицирования сополимера-носителя радионуклида - этерифицирование по аминным группам с помощью ДАДТПА, колоночное фракционирование реакционной смеси, лиофильная сушка, радиомечение в солянокислом растворе SmCl с активностью 1,5 ГБк/мл, колоночное разделение высокомолекулярных и низкомолекулярных компонентов принципиально не отличались от аналогичной цепочки реакций в примере 1. В результате радиомечения и колоночного элюирования ацетатным буфером были выделены две полимерные фракции объемом по 6 мл в интервале V* = 15-27 мл с радиоактивностями 330 и 220 МБк соответственно, что дает эффективность радиомечения 36%. Методом ТСХ на силуфоловых пластинах с использованием в качестве подвижной фазы 1М водного раствора сернокислого аммония определены «дискретные» значения РХЧ полимерных фракций: 89 и 85%. Для контроля термостабильности использовали 1 мл 15% раствора лиофилизованного полимера-загустителя ТПЗ-1 в первой полимерной фракции элюата с начальной радиоактивностью А = 30 МБк. Приготовленный раствор после пятнадцатиминутной выдержки при 37°С помещали в 80 мл нагретого до 37°С физраствора. Через 1 час в отобранной пробе физраствора объемом 1 мл была зафиксирована радиоактивность а = 47 кБк/мл, что дает q ≈ 12% от А. Через сутки выделение активности в физраствор продолжилось и составило уже q = 29%. Образец неприемлем в качестве препарата для введения в живой организм по причине низкой РХЧ и недостаточной степени удерживания радионуклидов в месте инъекции, хотя произведение [η]С ≈ 8 и в этом примере ниже порога перепутывания с/с* ≈ 10. К негативным последствиям привело использование сополимера-носителя, в ММР которого содержится значительная фракция коротких цепей с ММ меньше М ≈ 14000, не способных участвовать в формировании пространственной сетки высокомолекулярного полимера-загустителя. Короткие цепочки получают возможность за счет рептационных движений выпутываться из геля.
пз
пз
пз
пз
е
w
n
w
n
3
пз
н
ф
153
Пример 3 - положительный. Уменьшение концентрации загустителя до C = 12 мас. % (при [η] = 0,54 дл/г произведение [η]С ≈ 6,5, что ниже порога перепутывания с/с* ≈ 10). В качестве (со)полимера-носителя использовали сополимер ТНХ-3 (таблица 2). Параметры ММР ТНХ-3 были также близки к аналогичным параметрам ТНХ-1: M = 33000, M = 21000, M/M = 1,57. Радиомечение этерифицированного лиофилизованного сополимера ТНХ-3 (80 мг) проводили в течение 1 час в смеси 2 мл ацетатного буфера (рН = 5,45) и 1 мл солянокислого раствора SmCl, обладающего радиоактивностью 1,85 ГБк. Реакционную смесь разделяли на колонке путем элюирования ацетатным буфером, измеряли на гамма-спектрометре объемную радиоактивность полимерных фракций. Далее часть первой полимерной фракции (V* = 15-21 мл, активность 540 МБк), РХЧ которой равнялась 97%, использовали в качестве растворителя для приготовления 1 мл раствора полимера-загустителя ТПЗ-2 с концентрацией С ≈ 12 мас. % и радиоактивностью А = 62 МБк/мл. Испытания на термостабильность проводили как и в предыдущих примерах. Через t = 1 час в пробе 1 мл, взятой из объема физраствора (V = 80 мл), была обнаружена радиоактивность а = 8 кБк/мл, что соответствует выделению из геля q ≈ 1% его начальной объемной радиоактивности. В дальнейшем регистрировали следующую кинетику: t = 24 час, а = 30 кБк/мл и q = 5,5%; t = 48 час, а = 17 кБк/мл, q = 4,6%; t = 72 час, а = 13 кБк/мл, q = 5%. Как видно, выделившаяся в физраствор в первые сутки радиоактивность в дальнейшем не пополнялась свежими порциями нуклидов. Образец приемлем в качестве препарата для введения в живой организм.
153
3+
пз
пз
пз
Пример 4 - отрицательный. Уменьшение концентрации загустителя до 10%. Процесс приготовления активного сополимера-носителя ТНХ-1 с хелатными комплексами [ДТПА*Sm] и РХЧ меченого элюата в целом не отличались от примеров 1 и 3. Различие заключается в том, что концентрация полимера-загустителя ТПЗ-1 была снижена до С ≈ 10 мас. %, что соответствует границе области полуразбавленного неперепутанного раствора С[η] ≈ 5. Термостабильность препарата при этом значительно ухудшилась по сравнению с примерами 1 и 3. В самом деле, в испытуемом образце начальная радиоактивность составляла 100 МБк в 2 мл раствора полимера-загустителя, помещенном после нагревания до 37°С в 80 мл нагретого физраствора. Пробы объемом 1 мл отбирали через 4, 24, 48 и 72 час и измеряли соответствующие радиоактивности a(t), которые составляли 135, 116, 86 и 65 кБк/мл. Расчет показывает постепенное возрастание q(t) со временем 11,5, 14,5, 16 и 19%. Испытуемый образец не пригоден в качестве РФП.
153
3+
пз
пз
пз
пз
Пример 5 - отрицательный. Увеличение концентрации загустителя до 20%. Процесс приготовления радиоактивного сополимера-носителя ТНХ-1 с хелатными комплексами [ДТПА*Sm] и РХЧ меченого элюата, близкие к 100% (фиг. 3), в целом не отличались от примеров 1 и 3. Различие заключается в том, что концентрация полимера-загустителя ТПЗ-1 была повышена до С ≈ 20 мас. %, что соответствует граничному значению области перепутывания С[η] ≈ 10. Термостабильность препарата при этом была на уровне препаратов в примерах 1 и 3. В испытуемом образце начальная радиоактивность составляла 45 МБк в 1 мл раствора полимера-загустителя, помещенном после нагревания до 37°С в 80 мл нагретого физраствора. Проба объемом 1 мл, отобранная из физраствора через 1 час, имела радиоактивность а = 1,2 кБк/мл, что соответствует ничтожно малой доле q = 0,2%. В последующие трое суток физраствор не пополнялся свежими порциями радиоактивности. Тем не менее, испытуемый образец не пригоден в качестве РФП, так как его вязкость столь велика, что даже шприцем с иглой G21 (диаметр 0,8 мм) не удавалось набрать заметное количество раствора С ≈ 20 мас. %.
кр
пз
пз
3
Анализ приведенных примеров позволяет сделать вывод, согласно которому эффективность удерживания радионуклидов при 37°С в сколлапсированном геле, погруженном в физраствор, определяется наличием в ММР термочувствительного сополимера-носителя фракции коротких цепей с М<М ≈ 14⋅10, при условии что концентрация термочувствительного гелеобразующего полимера-загустителя соответствует области полуразбавленного раствора неперепутанных цепей, определяемой неравенством 5<С[η]<10.
153
пз
пз
пз*
пз
Таким образом, совокупность признаков, содержащихся в представленной формуле заявленного способа получения термочувствительного радиофармпрепарата, представляющего собой раствор интерполимерного носителя радионуклида, и состоящего из стадий: синтеза сополимера-носителя на основе N-изопропилакриламида и аллиламина; этерификации аминных групп сополимера-носителя с помощью хелатирующего агента диангидрида диэтилентриаминпентауксусной кислоты; мечения радионуклидом Sm с образованием радиоактивных хелатных комплексов; выделения радиоактивной сополимерной фракции из реакционного объема смеси меченной полимерной путем элюирования ацетатным буфером в хроматографической колонке с целью отделения от низкомолекулярных соединений; смешивание выделенной фракции с сополимером-носителем водного раствора термочувствительного полимера-загустителя поли-N-изопропилакриламида, причем произведение характеристической вязкости [η] в дл/г и концентрации С поли-N-изопропилакриламида в воде в г/дл отвечает безразмерному соотношению 5<C[η]<10; позволяет решить техническую задачу изобретения, заключающуюся в создании термочувствительной системы, которая не позволяет радионуклиду, содержащемуся в препарате и оказывающему терапевтическое действие на опухоль, выйти за пределы компактной полимерной фазы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. R.Е. Weller, М.Е. Lind, D.R. Fisher, A. Gutovska, A.A. Campbell. Stimulus Sensitive Gel with Radioisotope and Methods of Making. U.S. 6,296,831
2. R.E. Weller, M.E. Lind, D.R. Fisher, A. Gutovska, A.A. Campbell. Stimulus Sensitive Gel with Radioisotope and Methods of Making. U.S. 6,869,588
3. A. Gutovska, A.A. Campbell, M.E. Lind, D.R. Fisher, R.E. Weller. Stimulus Sensitive Gel with Radioisotope and Methods of Making. CA 2,327,325
4. B. Jeong, A. Gutovska. Thermogelling Biodegradable Aqueous Polymer Solution. US. 6,841,617
5. B. Jeong, A. Gutovska, Thermogelling Oligopeptide Polymers. U.S. 7,087,244
6. B. Jeong, A. Gutovska. Thermogelling Biodegradable Aqueous Polymer Solution CA 2,423,488
7. A. Gutovska, K.K. Krzyminski. Multiple Stimulus Reversible Hydrogels. U.S. 6,660,247
8. A. Gutovska, K.K. Krzyminski. Multiple Stimulus Reversible Hydrogels. U.S. 7,033,571.
9. Hruby M., Subr V., Kucka J., Kozempel J., Lebeda O., Skoda A. Applied Radiation and Isotopes. 2005. V. 63. P. 423-431.
10. M. Hrubi, J. Kucka, H. Mackova, C. Konak, M. Vetnik, J. Kozempel, O. Lebeda. J. Applied Polymer Sci., 2009, V. 111, P. 2220-2228.
11. M. Hrubi, C. Konak, J. Kucka, M. Vetnik, S. K. Filippov, D. Vetvicka, H. Mackova, G. Karlson, K. Edwards, B. Rihova, K. Ulbrich. Macromol. Bioscience. 2009. V. 9. P. 1016-1027.
12. M. Hrubi, P. Pauckova, M. Zadinova, J. Kucka,, O. Lebeda. Europ. J. Pharm. Sci. 2011, V. 42, P. 464-488.
13. P. Cermoch, Z. Cernochova, J. Kucka, M. Hrubi, S. Petrova, P. Stepanek. Appl. Radiation and Isjtjpes. 2015. V. 98. P. 7-12.
14. H.M. Больбит, E.А. Дубова, В.P. Дуфлот, Гайворонский А.И. Патент РФ №2554472 (приоритет от 20.06. 2013). Термочувствительный полимер-протеиновый йодсодержащий радиофармпрепарат.
15. Н.М. Больбит, Е.А. Дубова, В.Р. Дуфлот, В.М. Петриев. Патент РФ №2478401 (приоритет от 11.03.2011). Термочувствительный интерполимерный носитель радионуклидов.
16. Дубовик А.С., Гринберг Н.В., Гринберг В.Я. // Высокомолек соед. А. 2010. Т. 52. №6. С. 899.
17. Готлиб Ю.Я., Даринский А.А., Светлов Ю.Е. Физическая кинетика макромолекул. Л.: Химия, 1986.
18. S.L. Snyder, R.Z. Sobocinsci. Analytic. Biochemistry. 1975. V. 64. P. 284.
19. G. Bocias, D. Houdret, J. Hiopolis. Macromolecules. 2000. V. 33. №8. P. 2929.
20. Hedrickson J.G., Moore J.C. // J. Polymer. Sci. 1966. A1. V. 4, №1. P. 167.
21. Цветков B.H., Эскин B.E., Френкель С.Я. Структура макромолекул в растворе. М.: Наука, 1964.
22. Solovski М.V., Nikolskaya N.V., Korneeva Е.V., Mikhailova N.A., Pavlov G.М. Russian Journal of Applied Chemistry. 2001. V. 74. №4. P. 663.
23. Кирш Ю.Э. Поли-N-винилпирролидон и другие поли-N-виниламиды: Синтез и физико-химические свойства. М.: Наука. 1998.
24. Dobrynin A.V., Colby R.Н., Rubinstein М. Macromolecules. 1995. V. 28. Р. 1859.
25. de Gennes P.-G., Pincus P., Velasco R.M., Brochard F. / J. Phys. (Paris). 1976. v. 37. p. 1461.