3D-модели злокачественных опухолей – современный подход к оценке противоопухолевых свойств макрофагов

© Коллектив авторов, 2023

Муругина Н.Е.1, Есипова Д. Д.1' 2, Пащенков М.В.1' 2

ЭБ-модели злокачественных опухолей - современный подход к оценке противоопухолевых свойств макрофагов

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация

2 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация

Резюме

Опухолевая ткань формирует сложное микроокружение, которое состоит из клеток опухоли, клеток иммунной системы, клеток соединительной ткани и межклеточного матрикса. Исследование такой системы требует особого подхода, учитывающего кон -такты между всеми типами клеток и межклеточным матриксом. Переход от привычного двумерного (2D) сокультивирования клеток на поверхности культурального пластика к трехмерным (3D) моделям злокачественных опухолей позволяет точнее воспроизвести in vitro сложные взаимодействия между клетками, а также между клетками и внеклеточным матриксом, происходящие только in vivo. Ключевое влияние на развитие опухолевого процесса и на эффективность терапии злокачественных новообразований оказывают взаимодействия клеток опухоли и клеток иммунной системы. В данном обзоре мы рассматриваем основные виды 3D-моделей злокачественных опухолей, уделяя особое внимание тем из них, которые предназначены для исследования взаимодействий опухолевых клеток и макрофагов. Приведены примеры использования 3D-моделей злокачественных опухолей для доклинических исследований лекарственных препаратов, направленных на модуляцию функций макрофагов.

Ключевые слова: 3D-культуры клеток; макрофаги; злокачественные новообразования; сфероиды; иммунотерапия

Статья получена 26.07.2023. Принята в печать 25.10.2023.

Для цитирования: Муругина Н.Е., Есипова Д.Д., Пащенков М.В. 3D-модели злокачественных опухолей -современный подход к оценке противоопухолевых свойств макрофагов. Иммунология. 2023; 44 (6): 802-812. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-6-802-812

Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 21-15-00211. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Анализ литературы, написание статьи - Муругина Н.Е.; анализ литературы, написание статьи -Есипова Д.Д.; анализ литературы, редактирование и утверждение окончательного текста статьи - Пащенков М.В.

Для корреспонденции

Пащенков Михаил Владимирович -доктор медицинских наук, заведующий лабораторией клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: mvpashenkov@yandex.ru https://orcid.org/F=0000-0002-6995-1790

Murugina N.E.1, Esipova D.D.1' 2, Pashenkov M.V.1' 2

3D models of malignant tumors - a modern approach to assessing the antitumor properties of macrophages

1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency of Russia, 115522, Moscow, Russian Federation

2 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation

Abstract

Tumor tissue forms a complex microenvironment that consists of tumor cells, cells of the immune system, connective tissue cells, and extracellular matrix. The study of such a system requires a special approach that takes into account the contacts between all types of cells and the extracellular matrix. The transition from the usual two-dimensional (2D) cell co-culture on plastic surfaces to three-dimensional (3D) models of malignant tumors makes it possible to more accurately reproduce, under in vitro conditions, the complex interactions between cells as well as between cells and the extracellular matrix which occur only in vivo. Interactions

For correspondence

Pashenkov Mikhail Vladimirovich -MD, PhD, Head of the Clinical Immunology Laboratory, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mvpashenkov@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6995-1790

between tumor cells and cells of the immune system have a key influence on the development of the tumor process and on the effectiveness of malignant neoplasm therapy. In this review, we consider main types of 3D models of malignant tumors, paying special attention to those designed to study the interactions of tumor cells and macrophages. Examples of the use of 3D models of malignant tumors for preclinical studies of drugs aimed at modulating macrophage functions are presented.

Keywords: 3D cell cultures; macrophages; malignant neoplasms; spheroids; immunotherapy

Received 26.07.2023. Accepted 25.10.2023.

For citation: Murugina N.E., Esipova D.D., Pashenkov M.V. 3D models of malignant tumors - a modern approach to assessing the antitumor properties of macrophages. Immunologiya. 2023; 44

Funding. The work was supported by a grant of the Russian Science Foundation No. 21-15-00211. Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.

Authors' contribution. Literature analysis, article writing - Murugina N.E.; literature analysis, article writing -Esipova D.D.; literature analysis, editing and approval of the final text of the article - Pashenkov M.V.

Введение

Клетки в живом организме существуют в многокомпонентном и изменчивом микроокружении, которое крайне сложно в полной мере воспроизвести in vitro. В силу этого процессы, регистрируемые in vitro, далеко не всегда отражают реальную картину, происходящую в живом организме, что давно является камнем преткновения всей биологической науки. С этой точки зрения трехмерные культуры клеток (3Б-культуры или 3Б-модели) представляют собой наиболее приближенную к ситуации in vivo воспроизводимую модель. В отличие от привычных монослоев, или 2Б-культур, где клетки в равной степени подвергаются воздействию среды и пластика культурального флакона, в 3Б-культурах все клетки подвергаются воздействию либо других клеток, либо внеклеточного матрикса с разной интенсивностью [1]. Клетки, культивируемые в упрощенных монослоях, теряют свои первоначальные фенотипические и функциональные характеристики, в значительной степени отличаясь от тканей, из которых они были получены. Следовательно, биологические реакции этих клеток могут не быть физиологически значимыми, что может являться основным препятствием при разработке лекарственных средств [2]. Благодаря своему архитектурному сходству с тканями in vivo, 3Б-культуры клеток сохраняют фенотипические и функциональные характеристики своих прототипов в живом организме, обеспечивая более физиологически релевантную систему для оценки биологических реакций in vitro. В настоящее время растет интерес к 3Б-моделям как альтернативе к традиционному подходу к культивированию в формате 2D [3-5].

Стоит отметить, что наибольший интерес к моделированию 3D-структур существует в области онкологии, так как, во-первых, опухолевые ткани обладают значительной гетерогенностью, которую сложно или невозможно воспроизвести в привычных двумерных культурах, а во-вторых, опухолевым образованиям свой-

ственно формировать специфическое микроокружение, сильно влияющее как на сами опухолевые, так и на нормальные ткани [5-7]. Исследование взаимодействия злокачественного новообразования с иммунной системой организма-хозяина имеет важное значение для развития онкоиммунологии. Новые научные данные свидетельствуют о том, что, помимо стромальных клеток, фибро-бластов и эндотелиальных клеток, микроокружение опухоли также формируют клетки врожденного иммунитета [макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, лимфоидные клетки врожденного иммунитета (innate lymphoid cells, ILC), миелоидные супрессорные клетки (myeloid-derived suppressor cells, MDSC) и естественные киллеры], а также клетки адаптивного иммунитета (Т- и В-лимфоциты). Все эти клеточные элементы в совокупности могут способствовать прогрессиро-ванию или деградации опухоли [8, 9]. Таким образом, изучение механизмов взаимодействия опухолевых клеток и их иммунного микроокружения является перспективным направлением для создания иммунотера-певтических препаратов.

Методы получения ЭБ-культур клеток

Создателем трехмерной клеточной культуры считается Джозеф Лейтон (1921-1999 гг.). В 1950-х годах он разработал технологию культивирования гистокуль-туры на крупнопористом губчатом матриксе, создавая базовую архитектуру ткани, аналогичную наблюдаемой in vivo. Он первым показал, что опухолевые клетки склонны самоагрегироваться в сфероиды, в отличие от нормальных клеток [10]. С тех пор интерес к трехмерным клеточным культурам возрастал и на данный момент существует множество 3D-культур клеток (см. таблицу). Самая простая из них - сфероиды. Они образуются либо путем самосборки линейных опухолевых клеток в культуральной посуде (тогда полученная 3D-культура будет гомотипической, т. е. содержащий клетки только одного вида - опухолевые), либо путем сборки из клеточных суспензий, содержащих

804 Обзоры

Некоторые методы получения 3Б-культур

Название Получение Особенности

Бескаркасные методы

Получение сфероидов методом жидкого наложения

Клетки высевают на неадгезивную поверхность (специальный культуральный пластик или агарозный гель), что не дает клеткам прочно прикрепиться ко дну культуральной посуды и образовать монослой. Это способствует межклеточной адгезии и приводит к спонтанному образованию сфероидов [15, 24]

Возможно получение либо путем самосборки линейных опухолевых клеток (гомотипические модели), либо путем реассоциации клеточных суспензий, полученных из образцов опухолевой ткани пациента (гетеротипическая культура, в которой присутствуют несколько типов клеток) [15]

Получение сфероидов методом висячей капли

Клеточную суспензию небольшими каплями раскапывают по лункам культурального планшета, на который потом надевают крышку, а планшет переворачивают. Капли клеточной суспензии остаются на дне лунок за счет поверхностного натяжения. Благодаря гравитационной силе клетки оседают на дно капли и агрегируют [1, 24]

Изменяя объем капли или плотность клеточной суспензии, можно контролировать размер сфероида. Метод простой и удобный в использовании, так как не требует дорогостоящего оборудования. Но он применим только для небольших экспериментов, не требующих большого количества клеток [24]

Получение сфероидов методом магнитной левитации

Клетки инкубируют с магнитными наночастицами, чтобы обеспечить прикрепление частиц к клеткам. Затем к ним подводят внешнее магнитное поле, чтобы поднять клетки со дна лунки к границе фаз жидкость-воздух. Благодаря этому клетки не прикрепляются ко дну лунки и могут свободно агрегировать друг с другом [25]

Наиболее быстрый метод, применимый для различных клеточных культур. При этом магнитные наночастицы и магнитное поле не оказывают существенного влияния на пролиферацию и метаболизм клеток [25]

Получение сфероидов в спиннер-культурах

Используют вращающиеся колбы, постоянно перемешивающие клеточную суспензию высокой плотности, что сводит к минимуму прикрепление клеток к пластику и увеличивает число контактов между ними [1]

Движение жидкости, создаваемое при перемешивании, может создавать динамическую микросреду, способствовать пролиферации и дифференцировке клеток. Кроме того, важно точно контролировать скорость перемешивания суспензии, так как слишком маленькая скорость не будет препятствовать седиментации, а чрезмерная разрушит клетки [27]

Получение органоидов

• • •

(S)  (?) • • . •

. -V

Органоиды представляют собой самоорганизующиеся трехмерные структуры, происходящие из плюрипотентных стволовых клеток или изолированных предшественников органов. При сокультивировании эти клетки дифференцируются с образованием органоподобной ткани, состоящей из нескольких типов клеток, которые образуют структуру, отражающую состав, архитектуру и в определенной степени функциональность различных тканей [29, 30]

Получаемые этим методом структуры являются наиболее приближенными к картине in vivo моделями из ныне существующих. [30]

Окончание табл.

Название Получение Особенности

Каркасные методы

Пористые микросферы

V-'

ф

Клеточную суспензию инкубируют с пористыми микросферами при периодическом взбалтывании среды. Благодаря большой площади поверхности микросфер на них может быть агрегировано большое количество клеток, которые потом вступают во взаимодействия друг с другом и образуют сфероид [2]

Несмотря на простоту и удобство этого метода, большинство существующих микроносителей обеспечивают прикрепление и рост клеток только на внешней поверхности микросфер или на внешней поверхности их пор, с однонаправленными межклеточными взаимодействиями либо без них. Это очень похоже на обычную монослойную культуру, а следовательно, не может считаться трехмерной культурой в строгом смысле [26]

Скаффолд-методы

ш

Методы используют различные каркасы в качестве подложки для роста культур. Каркасы могут быть изготовлены из пептидов и белков, гидрогеля, наноцеллюлозы, коллагена, ламинина и других полимеров естественного и синтетического происхождения [6, 15, 16]

Каркасы поддерживают трехмерную организацию клеток (физически и механически способствуя приживлению и пролиферации клеток) и могут проявлять биологическую активность, способствуя взаимодействиям между клетками и клетками и матриксом и влияя на функции опухолевых клеток посредством внешней передачи сигналов [31]

3D-биопечать

I

Используется технология 3Б-печати, но вместо синтетических пластиков используются биочернила для клеточных культур. Биочернила могут быть изготовлены из натуральных (коллаген) или синтетических материалов. Чернила предварительно смешивают с клеточной суспензией и «печатают» ими определенные трехмерные рисунки - кольца или сферы [6, 15]

3Б-биопечать предполагает гибкость в дозировании клеток и биоматериалов, что облегчает формирование сложных архитектур и особенностей, которые могут влиять на функцию тканей [15, 28]. Существующие ЗБ-биопринтеры различаются по методам биопечати и могут быть разделены на 4 категории: 1) капельные, 2) лазерные, 3) экструзионные и 4) стереолитографические [15]

разные виды клеток и полученных путем диссоциации образцов опухолевой ткани (гетеротипическая первичная клеточная культура).

Сфероиды легко воспроизводить и обрабатывать, а также интегрировать в них компоненты межклеточного матрикса, поэтому сейчас они являются наиболее используемым видом 3Б-культур. Однако в их простоте кроется и основной недостаток - самособирающиеся сфероиды лишь частично отражают организацию и микроокружение опухолей in vivo и не могут дать всеобъемлющей информации об организации и работе опухолевого компартмента в живом организме.

Некоторые основные свойства сфероидов продемонстрированы в работе L. Arora и соавт.: сфероиды обладают значительной гетерогенностью как по форме и размеру (их плотность и размер увеличивались

с увеличением времени культивирования), так и по свойствам клеток в составе сфероидов. В частности, опухолевые клетки в центре сфероида находились в условиях гипоксии и экспрессировали факторы, индуцируемые ею, такие как HIF-1a, BNIP3, CA-IX [11-13]. Также фибробласты и макрофаги, входящие в состав сфероидов, меняли свой фенотип на опухоль-ассоци-ированные фибробласты (cancer-associated fibroblasts, CAF) и опухоль-ассоциированные макрофаги (tumor-associated macrophages, TAM) соответственно [14].

Самоорганизующиеся органоиды являются разновидностью сфероидов. Они состоят из множественных типов клеток, характерных для данного типа ткани и получаемых из стволовых клеток (см. таблицу) [15, 16].

Более сложны в техническом плане методы выращивания трехмерных структур с использованием спе-

циального оборудования или расходных материалов с целью создания препятствия прилипанию клеток к поверхности культуральной посуды и стимулирования агрегации клеток друг с другом различными способами [16]. Примером таких систем могут служить спиннер-культуры, или вращающиеся биореакторы, где клеточная суспензия высокой плотности постоянно перемешивается, что сводит к минимуму прикрепление клеток к пластику и способствует контактам клеток друг с другом [1, 15].

Особо следует выделить каркасные методы создания 3Б-культур, основанные на предварительном создании волокнистого каркаса, или матрицы, на которые впоследствии будут адгезированы клетки. Каркасы могут быть изготовлены из пептидов и белков, гидрогеля, наноцеллюлозы, коллагена, ламинина и других полимеров, причем важно учитывать следующее: так как такой каркас является своеобразной имитацией внеклеточного матрикса, то химический состав и форма каркаса будут влиять на свойства как опухолевых, так и иммунных клеток, а также на передачу молекулярных сигналов между ними [17]. Применяя методы биоприн-тинга, при помощи клеток и каркасного материала можно создавать 3Б-системы сложной архитектуры [6, 15, 18].

Подробнее методы получения 3Б-культур описаны в таблице.

Анализ фенотипических и функциональных характеристик клеток в составе 3Б-культур, как правило, проводится теми же привычными методами, что и для 2Б-культур, включая микроскопию, проточную цитометрию, методы оценки экспрессии генов и т. д. [14, 18].

Отличие 3Б- от 2Б-культур состоит в том, что может проводиться оценка как клеточных агрегатов в целом, так и отдельных клеток в их составе. Витальная микроскопия позволяет измерять размеры, оценивать рост и гетерогенность клеточных агрегатов [19]. Клеточные агрегаты можно зафиксировать и использовать для приготовления срезов, в которых с помощью световой и иммунофлуоресцентной микроскопии может быть исследовано количество и расположение клеток, а также отдельных белков, входящих в состав культуры [20]. Для изучения функционального состояния отдельных клеток 3Б-культуры преобразуют в клеточную суспензию с помощью методов вымывания клеток с использованием специальных буферных растворов [21], механического разрушения 3Б-моделей клеточных культур, путем пропускания через нейлоновый фильтр [22], расщепления коллагенового каркаса коллагеназой [20], дезинтеграции желатиновых гидрогелей при помощи 1-адамантанамина гидрохлорида [23] и других методов. Таким образом, использование 3Б-моделей злокачественных опухолей позволяет изучать как рост и развитие опухоли в целом, так и функциональное состояние отдельных компонентов ее микроокружения.

С помощью 3Б-культур были получены многообещающие результаты в биологических исследованиях

опухолей. Например, гетерогенная трехмерная опухолевая культура на основе клеток холангиокарциномы и стромальных клеток, созданная с помощью биоприн-тинга, зарекомендовала себя как эффективный способ изучения клеточных взаимодействий in vitro. С ее помощью было установлено, что клетки в 3D-культуре проявляют большую пролиферативную способность, жизнеспособность, устойчивость к лекарствам и более высокий уровень экспрессии проопухолевых генов по сравнению с аналогичными клетками в 2D-куль-турах [18]. Также с помощью 3D-культур установлен факт эпителиально-мезенхимального перехода клеток холангиокарциномы и рака простаты, вероятно, связанный с увеличением экспрессии генов пути Wnt/p-катенина (Р-катенин, циклин D1 и c-Myc), что является весомым аспектом в стратегиях лечения этого заболевания [18, 32].

Макрофаги - гетерогенная и пластичная популяция

Макрофаги являются неотъемлемой частью опухолевого окружения. Их влияние на развитие опухоли неоднозначно. С одной стороны, макрофаги обладают способностью уничтожать клетки опухоли, с другой -они могут приобретать проопухолевые свойства, благоприятствуя поддержанию роста ткани опухоли и ее метастатической диссеминации [33, 34].

В ответ на различные стимулы микроокружения, макрофаги поляризуются в классически активированные М1-макрофаги либо в альтернативно активированные М2-макрофаги [35]. Активация по М1-типу запускается интерфероном(ИФН)-у и липополиса-харидами (ЛПС). М1-макрофаги продуцируют про-воспалительные цитокины, такие как ИЛ-1Р, ИЛ-6, ИЛ-12 и фактор некроза опухоли (ФНО), которые участвуют в провоспалительном и противоопухолевом ответе.

Активация макрофагов по М2-типу индуцируется ИЛ-4. М2-макрофаги продуцируют противовоспалительные цитокины, такие как ИЛ-10 и ТФРр, которые помогают восстанавливать поврежденные ткани и контролировать воспаление, а также ингиби-руют М1-активацию макрофагов [36, 37]. Накопление М2-макрофагов в опухолях коррелирует с плохим клиническим исходом, тогда как активация по М1-типу способствует регрессу опухоли [38].

Важно отметить, что получаемые in vitro М1-и М2-макрофаги представляют собой лишь крайние точки континуума функций и фенотипов. В зависимости от сигналов, которые макрофаги получают от микроокружения, их свойства in vivo в большей или меньшей степени могут быть схожи с M1 или M2 [37, 39]. Поэтому изучение транскрипционного и метаболического перепрограммирования макрофагов в 3D-клеточных культурах (т. е. наиболее приближенных к ситуации in vivo) представляет большой интерес.

Особенности трехмерных клеточных моделей для оценки противоопухолевых свойств макрофагов

Для оценки противоопухолевых свойств макрофагов, как правило, используют 3Б-модели злокачественных опухолей, которые состоят из следующих компонентов: макрофаги, клетки опухоли, клетки окружения (фибро-бласты, лимфоциты) и компоненты межклеточного мат-рикса (коллаген, фибрин и др.).

Макрофаги сами по себе не способны к агрегации в 3Б-структуры, но добавление к ним других клеток, например клеток опухоли, приводит к формированию трехмерных сфероидов. Такие сфероиды представляют собой кластеры опухолевых клеток с вкраплениями макрофагов. Клеточная 3Б-модель, состоящая из моноцитов в комплексе с аутологичными Т-клетками и В-лимфоцитами мантийно-клеточной лимфомы проявляет схожие профили экспрессии генов и ответы на действие противоопухолевых препаратов с клетками В-клеточной неходжкинской лимфомы, полученной из лимфоузла [42]. Клетки соединительной ткани потенцируют образование структур, напоминающих ткани опухоли [20, 40]. Так, введение фибробластов в систему «макрофаг - клетки меланомы» приводит к образованию сфероидов, напоминающих компактную структуру меланомы in vivo [41]. Таким образом, введение дополнительных клеточных элементов позволяет создавать 3Б-модели злокачественных опухолей, более приближенные к ситуации in vivo, чем 2Б-модели.

Присутствие либо фибробластов, либо опухолевых клеток в культуре значительно увеличивает выживаемость макрофагов, при этом фибробласты более эффективно, чем опухолевые клетки, способствуют поддержанию жизнеспособности макрофагов. Фибробласты являются основным клеточным компонентом, отвечающим за миграцию и активацию макрофагов [20, 45]. Кроме того, активированные фибробласты продуцируют компоненты внеклеточного матрикса (коллаген, фибронектин и др.), который имитирует естественное микроокружение [14].

В работе C. Nascimento и соавт. с использованием трехмерной клеточной модели показано, что в присутствии фибробластов культура макрофагов с клетками рака молочной железы человека имеет более рыхлую пространственную организацию по сравнению с культурой, в состав которой входили только макрофаги и клетки опухоли, что способствует лучшему проникновению лекарственных препаратов [40].

Добавление внеклеточного матрикса (коллагена) в 3Б-культуры, содержащие клетки меланомы, макрофаги и фибробласты, приводит к дополнительным изменениям морфологии клеток [20]. В частности, появляется отчетливая зависимость морфологии макрофагов от их расположения в коллагеновом геле. Макрофаги, находящиеся вблизи от клеток меланомы или фибро-бластов, образуют выросты по направлению к соседним клеткам, формируя с ними прямые контакты. Макро-

фаги, расположенные вдали от опухолевых клеток и фибробластов, в основном округлые и мелкие, с морфологией, сходной с автономно культивируемыми макрофагами. Макрофаги также способны взаимодействовать с коллагеном, изменяя ландшафт коллагеновых структур [21]. Очень удобно использовать в качестве матрикса гидрогели, так как с помощью их протеоли-тической деградации можно разделять различные типы клеток с высокой степенью чистоты для их последующего исследования и терапии опухолей [23, 43]. Желатиновый гидрогель способствует лучшему перепрограммированию мышиных макрофагов в М1 при действии ИФН-у в модели аденокарциномы матки с клетками THP-1, а клеточная культура на основе желатинового гидрогеля может служить для репрограммиро-вания опухоль-ассоциированных макрофагов в М1 для ингибирования прогрессии опухолевых клеток [23].

В модели культивирования макрофагов человека на подложке из фибринового гидрогеля было показано, что на функциональную активность макрофагов оказывает влияние жесткость субстрата. Это явление объясняется тем, что при адгезии макрофагов к внеклеточному мат-риксу происходит образование фокальных контактов, число которых тем выше, чем больше жесткость субстрата; внутриклеточный сигналинг из областей контактов приводит к активации факторов транскрипции семейства YAP (Yes-associated protein), которые способствуют, в частности, увеличению продукции ФНО в макрофагах [6, 44]

В настоящее время построены и оптимизированы системы совместного 3Б-культивирования макрофагов in vitro, состоящие из каркасов коллагена, макрофагов, фибробластов и клеток меланомы [20]; на основе сфероидов из моноцитов, аутологичных Т-клеток и В-лимфоцитов мантийно-клеточной лимфомы (В-клеточная неходжкинская лимфома) [42]; на основе желатинового гидрогеля с клетками THP-1 и аденокарциномы матки [23] и другие модели. Особый интерес представляют клеточные модели, полученные методом биоприн-тинга, которые позволяют наиболее точно моделировать пространственную структуру опухолевой ткани.

M. Tang с соавт. с помощью биопринтинга создали трехмерную культуру, воспроизводящую глио-бластому [52]. Для этого формировали ядро опухоли из клеток глиобластомы и макрофагов, тогда как периферия формировали из астроцитов и клеток-предшественников нервной ткани. В качестве мат-рикса использовали гидрогель. Эта модель позволила проводить контролируемые, воспроизводимые и масштабируемые исследования взаимодействий между клетками опухоли и нервной ткани [52].

Общей чертой трехмерных клеточных культур является то, что они более близко воспроизводят структуру ткани опухоли, по сравнению с 2Б-культурами [20, 23, 42], что способствует широкому применению 3Б-моделей для оценки противоопухолевых свойств макрофагов.

ЭБ-модели злокачественных опухолей в оценке противоопухолевых свойств макрофагов

Использование ЭБ-моделей для изучения микроокружения опухолей. С помощью 3Б-культивирования удалось подтвердить традиционное представление о преимущественной дифференцировке опухоль-ассо-циированных макрофагов в иммуносупрессивные: макрофаги человека при сокультивировании с опухолевыми клетками приобретают преимущественно М2-фенотип [14, 20, 42, 43]. Однако по сравнению с 2Б-моделями при 3Б-культивировании макрофаги в течение длительного времени сохраняли выраженную гетерогенность популяции, где наряду с М2-подоб-ными макрофагами присутствовали макрофаги с М1- и М0-подобными параметрами, подтверждая высокую пластичность этой клеточной популяции [14, 20]. В исследовании M. Stadler и соавт. на примере 3Б-модели опухоли толстой кишки показано, что ключевую роль в фенотипической конверсии моноцитов в М2-макрофаги играют фибробласты микроокружения опухоли [45].

Использование ЭБ-моделей для изучения влияния клеток стромы на функции макрофагов. Перекрестные взаимодействия между опухолевыми клетками, фибробластами и моноцитами изменяют профили экспрессии генов в фибробластах и моноцитах на профили, соответствующие их активированному состоянию [14]. В макрофагах при 3Б-сокультиви-ровании с фибробластами происходит индукция экспрессии проопухолевых генов [43]. Присутствие фибробластов в культуре потенциирует увеличение экспрессии фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в макрофагах [14, 23]. На 3Б-модели аденокарциномы матки человека показано, что VEGF способствует накоплению М2-макрофагов в опухоли и ее микроокружении, способствует миграции опухолевых клеток и прогрессированию опухоли [23, 46]. Более того, макрофаги в трехмерных опухолевых сфероидах на 14-й день демонстрируют повышенную экспрессию генов эндо-телиальных маркеров, таких как VE-кадгерин, VEGF, фактор фон Виллебранда, CD31 и эндоглин, наряду с усилением экспрессии генов различных проангио-генных транскрипционных факторов, таких как Etv2, FLI1, GATA2, ZEB1, Tie2 и ETS. Эти результаты показывают, что макрофаги в опухолевом микроокружении являются пластичной популяцией и могут приобретать свойства клеток эндотелия, а также стимулировать рост эндотелиальных клеток [14].

Применение ЭБ-моделей для раскрытия механизмов проопухолевого действия макрофагов. Использование 3D-модели, состоящей из клеток опухоли предстательной железы мыши (Pr111) и клеток макрофагальной линии Raw264.7, позволило визуализировать инфильтрацию макрофагами ткани опухоли, а благодаря исследованию продукции хемокинов и использованию блокирующих антител была показана ведущая роль ICAM-1 и CCR2 в инфильтрации макрофа-

гами ткани опухоли. С помощью 3D-моделей опухолей также было показано, что секретируемые макрофагами хемоаттрактанты, включая C5a, CXCL1 и CCL2, активируют пролиферацию клеток опухоли предстательной железы, главным образом посредством активации киназы ERK [47]. CCL2 способствует также рекрутированию моноцитов и инфильтрации клеточной культуры опухолевыми клетками [45]. В совместной 3D-кyльтyре макрофагов, Т-лимфоцитов и клеток опухоли яичников макрофаги M2 способствовали супрессии Т-клеток, которая была ассоциирована с повышением экспрессии PD-L1 на макрофагах. Применение ингибиторов PD-1/ PD-L1 восстанавливало активацию и цитотоксичность Т-клеток [22].

Применение 3D-моделей злокачественных опухолей для доклинических исследований лекарственных препаратов. С практической точки зрения интересны 3D-модели на основе макрофагов и опухолевых клеток, которые можно использовать для проведения доклинического скрининга лекарств и тестирования методов противоопухолевой иммунотерапии, нацеленной на макрофаги. Существующие в настоящее время методы лечения, нацеленные на макрофаги, направлены на перепрограммирование макрофагов в направлении противоопухолевого фенотипа, истощение подтипов макрофагов, способствующих развитию опухоли. Эти методы могут сочетаться с традиционными подходами, направленными на прямое уничтожение клеток опухоли.

В работе C. Nascimento и соавт. на 3D-модели опухоли молочной железы показаны возможности использования наночастиц Fe2O3, покрытых полианилином, в качестве иммуномодулирующей терапии для перепрограммирования макрофагов в сторону противоопухолевого фенотипа M1 [40]. В сфероидной модели, включающей клетки опухоли поджелудочной железы, фибробласты и макрофаги, показана роль в противоопухолевой защите перепрограммирования макрофагов в М1 с применением ОТ40-лиганда и поли-LC [48]. С помощью 3D-модели было показано, что вещество EPZ643 - ингибитор гистоновой N-метилтрансферазы EZH2 (Enhancer of Zeste Homolog 2) - подавляет пролиферацию клеток колоректального рака in vitro путем стимулирования М1-поляризации опухоль-ассоцииро-ванных макрофагов, что было подтверждено и в экспериментах in vivo [49].

Сигнальный путь M-CSF1/CSF1R играет решающую роль в дифференцировке и выживании макрофагов. Ингибирование этого пути совместно с активацией CD40 в клеточной модели, состоящей из M2-подобных первичных макрофагов человека и клеток BT-474, полученных из ER+PR+HER2+-рака молочной железы человека, приводит к истощению субпопуляции М2-макро-фагов и подавлению роста рака молочной железы [53].

Заключение

Лечение злокачественных новообразований - одна из наиболее актуальных задач современной науки

и медицины. Понимание механизмов сложного взаимодействия опухолевых клеток с микроокружением позволяет находить новые точки приложения химиотерапев-тических и иммунотропных препаратов [50]. Клетки опухоли не существуют разобщенно, а вступают во взаимодействия как друг с другом, так и с другими клетками организма, в том числе с клетками иммунной системы, образуя сложные 3Б-структуры. Каждая клетка, входящая в такую структуру, получает мультифакторный сигналинг от близлежащих и отдаленных клеток, который, к сожалению, в полной мере смоделировать in vitro пока не представляется возможным [51]. При сравнении макрофагов, полученных в 2D- и 3Б-моделях злокачественных опухолей, выявились существенные различия не только в их морфологии, но и в таких клю-

чевых биологических характеристиках, как экспрессия генов, продукция белков и др. SD-модели позволяют воспроизводить структуру опухолей, более приближенную к ситуации in vivo, чем 2D-модели. Несмотря на очевидные перспективы применения SD-моделей опухолей, необходимо тщательно изучать новообразования, которые предполагается воспроизводить in vitro, иначе существует риск создания искусственных SD-моделей, не отражающих реальное микроокружение опухоли [52]. Поскольку SD-модели наиболее точно воспроизводят взаимодействие опухоли и клеток иммунной системы in vivo, они могут стать инструментом для изучения индивидуальных особенностей ответа пациента на действие противоопухолевой терапии [42], приближая нас к персонализированной терапии опухолей.

Литература

1. Cesarz Z., Tamama K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. 2016; 2016: 9176357. DOI: https://doi. org/10.1155/2016/9176357

2. Huang L., Abdalla A.M.E., Xiao L. et al. Biopolymer-Based Microcarriers for Three-Dimensional Cell Culture and Engineered Tissue Formation. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21 (5): 1895. DOI: https://doi.org/10.3390/ IJMS21051895

3. Padmalayam I., Suto M.J. 3D Cell Cultures: Mimicking In Vivo Tissues for Improved Predictability in Drug Discovery. Annu. Rep. Med. Chem. 2012; 47: 367-78. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-396492-2.00024-2

4. Kapalczynska M., Kolenda T., Przybyla W., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch. Med. Sci. 2018; 14 (4): 910-9. DOI: https://doi.org/10.5114/A0MS.2016.63743

5. Poornima K., Francis A.P., Hoda M., et al. Implications of Three-Dimensional Cell Culture in Cancer Therapeutic Research. Front. Oncol. 2022; 12: 891673. DOI: https://doi.org/10.3389/FONC.2022.891673

6. Cutter S., Wright M.D., Reynolds N.P., et al. Towards using 3D cellular cultures to model the activation and diverse functions of macrophages. Biochem. Soc. Trans. 2023; 51 (1): 387-401. DOI: https://doi. org/10.1042/BST20221008

7. Атауллаханов Р.И., Ушакова Е.И., Аль Худур С.А., Пичу-гин А.В., Лебедева Е.С. Перепрограммирование миелоидных клеток опухолевого микроокружения - новый подход в иммунотерапии злокачественных новообразований. Иммунология. 2022; 43 (4): 375-88. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-375-388

8. Hinshaw D.C., Shevde L.A. The Tumor Microenvironment Innately Modulates Cancer Progression. Cancer Res. 2019; 79 (18): 4557-66. DOI: https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-18-3962

9. Ren B., Cui M., Yang G., et al. Tumor microenvironment participates in metastasis of pancreatic cancer. Mol. Cancer. 2018; 17 (1): 108. DOI: https://doi.org/10.1186/S12943-018-0858-1

10. Hoffman R.M. In Memoriam: Joseph Leighton, 1921-1999 -Father of 3-Dimensional Tissue Culture. Methods Mol. Biol. 2018; 1760: 1-9. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7745-1_1

11. Ziello J.E., Jovin I.S., Huang Y. Hypoxia-Inducible Factor (HIF)-1 regulatory pathway and its potential for therapeutic intervention in malignancy and ischemia. Yale J. Biol. Med. 2007; 80 (2): 51-60. PMID: 18160990

12. Koop E.A., Laar T. van, Wichen D.F. van, et al. Expression of BNIP3 in invasive breast cancer: Correlations with the hypoxic response and clinicopathological features. BMC Cancer. 2009; 9: 175. DOI: https:// doi.org/10.1186/1471-2407-9-175

13. Ambrosio M.R., Serio C. Di, Danza G., et al. Carbonic anhydrase IX is a marker of hypoxia and correlates with higher Gleason scores and ISUP grading in prostate cancer. Diagn. Pathol. 2016; 11 (1): 45. DOI: https://doi.org/10.1186/s13000-016-0495-1

14. Arora L., Kalia M., Dasgupta S., et al. Development of a Multicellular 3D Tumor Model to Study Cellular Heterogeneity and Plasticity in

NSCLC Tumor Microenvironment. Front. Oncol. 2022; 12: 881207. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2022.881207

15. Jubelin C., Muñoz-Garcia J., Griscom L., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 2022; 12 (1): 155. DOI: https://doi.org/10.1186/s13578-022-00887-3

16. Shyam R., Reddy L.V.K., Palaniappan A. Fabrication and Characterization Techniques of In Vitro 3D Tissue Models. Int. J. Mol. Sci. 2023; 24 (3): 1912. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms24031912

17. Heredia-Mendez A.J., Sánchez-Sánchez G., López-Camarillo C. Reprogramming of the Genome-Wide DNA Methylation Landscape in Three-Dimensional Cancer Cell Cultures. Cancers (Basel). 2023; 15 (7): 1991. DOI: https://doi.org/10.3390/CANCERS15071991

18. Li C., Jin B., Sun H., et al. Exploring the function of stromal cells in cholangiocarcinoma by three-dimensional bioprinting immune microenvironment model. Front. Immunol. 2022; 13: 941289. DOI: https://doi. org/10.3389/FIMMU.2022.941289

19. Nii T., Kuwahara T., Makino K., et al. A co-culture system ofthree-dimensional tumor-associated macrophages and three-dimensional cancer-associated fibroblasts combined with biomolecule release for cancer cell migration. Tissue Eng. 2020; 26 (23-24): 1272-82. DOI: https://doi. org/10.1089/ten.tea.2020.0095

20. Pizzurro G.A., Liu C., Bridges K., et al. 3D Model of the Early Melanoma Microenvironment Captures Macrophage Transition into a Tumor-Promoting Phenotype. Cancers (Basel). 2021; 13 (18): 4579. DOI: https://doi.org/10.3390/CANCERS13184579

21. McWhorter F.Y., Wang T., Nguyen P., et al. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013; 110 (43): 17253-8. DOI: https://doi.org/10.1073/PNAS.1308887110

22. Li Y.R., Yu Y., Kramer A., et al. An Ex Vivo 3D Tumor Micro-environment-Mimicry Culture to Study TAM Modulation of Cancer Immunotherapy. Cells. 2022; 11 (9): 1583. DOI: https://doi.org/10.3390/ CELLS11091583

23. Huang Y., Feng Q., Jiang H., et al. Mimicking the Endometrial Cancer Tumor Microenvironment to Reprogram Tumor-Associated Macrophages in Disintegrable Supramolecular Gelatin Hydrogel. Int. J. Nano-medicine. 2020; 15: 4625-37. DOI: https://doi.org/10.2147/IJN.S252074

24. Ryu N.E., Lee S.H., Park H. Spheroid Culture System Methods and Applications for Mesenchymal Stem Cells. Cells. 2019; 8 (12): 1620. DOI: https://doi.org/10.3390/CELLS8121620

25. Haisler W.L., Timm D.M., Gage J.A., et al. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat. Protoc. 2013; 8 (10): 1940-9. DOI: https://doi.org/10.1038/nprot.2013.125

26. Huang L., Xiao L., Jung Poudel A., et al. Porous chitosan micro-spheres as microcarriers for 3D cell culture. Carbohydr. Polym. 2018; 202: 611-20. DOI: https://doi.org/10.1016J.CARBPOL.2018.09.021

27. Shen H., Cai S., Wu C., et al. Recent Advances in Three-Dimensional Multicellular Spheroid Culture and Future Development. Micromachines. 2021; 12 (1): 96. DOI: https://doi.org/10.3390/MI12010096

28. Zhang Y., Liao K., Li C., et al. Progress in Integrative Biomaterial Systems to Approach Three-Dimensional Cell Mechanotransduc-

tion. Bioeng. 2017; 4 (3): 72. DOI: https://doi.org/10.3390/BIOENGI-NEERING4030072

29. Artegiani B., Clevers H. Use and application of 3D-organoid technology. Hum. Mol. Genet. 2018; 27 (R2): R99-R107. DOI: https://doi. org/10.1093/HMG/DDY187

30. Lancaster M.A., Knoblich J.A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014; 345 (6194): 283-94. DOI: https://doi.org/10.1126/SCIENCE.1247125

31. Maura R., Francesco A., Simona R., et al. Three-dimensional models: a novel approach for lymphoma research. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2022; 148 (4): 753-65. DOI: https://doi.org/10.1007/S00432-021-03897-9/METRICS

32. Fontana F., Raimondi M., Marzagalli M., et al. Epithelial-To-Mesenchymal Transition Markers and CD44 Isoforms Are Differently Expressed in 2D and 3D Cell Cultures of Prostate Cancer Cells. Cells. 2019; 8 (2): 143. DOI: https://doi.org/10.3390/CELLS8020143

33. Sica A., Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo Veritas. J. Clin. Invest. 2012; 122 (3): 787-95. DOI: https://doi. org/10.1172/JCI59643

34. Gordon S., Martinez F.O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 2010; 32 (5): 593-604. DOI: https:// doi.org/10.1016/J.IMMUNI.2010.05.007

35. Wang S., Liu R., Yu Q., et al. Metabolic reprogramming of macrophages during infections and cancer. Cancer Lett. 2019; 452: 14-22. DOI: https://doi.org/10.1016/J.CANLET.2019.03.015

36. Keskinov A.A., Shurin M.R. Myeloid regulatory cells in tumor spreading and metastasis. Immunobiology. 2015; 220 (2): 236-42. DOI: https://doi.org/10.1016/J.IMBro.2014.07.017

37. Murray P.J., Wynn T.A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat. Rev. Immunol. 2011; 11 (11): 723-37. DOI: https://doi.org/10.1038/nri3073

38. Choi J., Gyamfi J., Jang H., et al. The role of tumor-associated macrophage in breast cancer biology. Histol. Histopathol. 2018; 33 (2): 133-45. DOI: https://doi.org/10.14670/HH-11-916

39. Муругина Н.Е., Муругин В.В., Пащенков М.В. Противоопухолевая активность макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4 in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 548-57. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-548-557

40. Nascimento C., Castro F., Domingues M., et al. Reprogramming of tumor-associated macrophages by polyaniline-coated iron oxide nanoparticles applied to treatment of breast cancer. Int. J. Pharm. 2023; 636: 122866. DOI: https://doi.org/10.1016/J.IJPHARM.2023.122866

41. Blenman K.R.M., Wang J., Cowper S., et al. Pathology of spontaneous and immunotherapy-induced tumor regression in a murine model of melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 2019; 32 (3): 448-57. DOI: https://doi.org/10.1111/PCMR.12769

42. Araujo-Ayala F., Dobano-Lopez C., Valero J.G., et al. A novel patient-derived 3D model recapitulates mantle cell lymphoma lymph

node signaling, immune profile and in vivo ibrutinib responses. Leukemia. 2023; 37 (6): 1311-23. DOI: https://doi.org/10.1038/S41375-023-01885-1

43. Lee S., Ki C.S. Proteolytically degradable PEG hydrogel matrix mimicking tumor immune microenvironment for 3D co-culture of lung adenocarcinoma cells and macrophages. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2023; 1-19. DOI: https://doi.org/10.1080/09205063.2023.2204778

44. Meli VS., Atcha H., Veerasubramanian P.K., et al. YAP-mediated mechanotransduction tunes the macrophage inflammatory response. Sci. Adv. 2020; 6 (49): eabb8471. DOI: https://doi.org/10.1126/SCIADV. ABB8471

45. Stadler M., Pudelko K., Biermeier A., et al. Stromal fibroblasts shape the myeloid phenotype in normal colon and colorectal cancer and induce CD163 and CCL2 expression in macrophages. Cancer Lett. 2021; 520: 184-200. DOI: https://doi.org/10.1016/J.CANLET.2021. 07.006

46. Nii T., Kuwahara T., Makino K., et al. A Co-Culture System of Three-Dimensional Tumor-Associated Macrophages and Three-Dimensional Cancer-Associated Fibroblasts Combined with Biomolecule Release for Cancer Cell Migration. Tissue Eng. 2020; 26 (23-24): 1272-82. DOI: https://doi.org/10.1089/TEN.TEA.2020.0095

47. Thomas M.U., Messex J.K., Dang T., et al. Macrophages expedite cell proliferation of prostate intraepithelial neoplasia through their downstream target ERK. FEBS J. 2021; 288 (6): 1871-86. DOI: https://doi. org/10.1111/FEBS.15541

48. Helleberg Madsen N., Schnack Nielsen B., Larsen J., et al. In vitro 2D and 3D cancer models to evaluate compounds that modulate macrophage polarization. Cell. Immunol. 2022; 378: 104574. DOI: https://doi. org/10.1016/J.CELLIMM.2022.104574

49. Li C., Song J., Guo Z., et al. EZH2 Inhibitors Suppress Colorectal Cancer by Regulating Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Front. Immunol. 2022; 13: 857808. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2022.857808

50. Xiao Y., Yu D. Tumor microenvironment as a therapeutic target in cancer. Pharmacol. Ther. 2021; 221: 107753. DOI: https://doi. org/10.1016/J.PHARMTHERA.2020.107753

51. Pampaloni F., Reynaud E.G., Stelzer E.H.K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007; 8 (10): 839-45. DOI: https://doi.org/10.1038/nrm2236

52. Tang M., Xie Q., Gimple R.C., et al. Three-dimensional bioprinted glioblastoma microenvironments model cellular dependencies and immune interactions. Cell Res. 2020; 30 (10): 833-53. DOI: https://doi.org/10.1038/ S41422-020-0338-1

53. Rodriguez-Perdigon M, Haeni L, Rothen-Rutishauser B, Rüegg C. Dual CSF1R inhibition and CD40 activation demonstrates anti-tumor activity in a 3D macrophage- HER2+ breast cancer spheroid model. Front Bioeng Biotechnol. 2023; 11: 1159819. DOI: https://doi.org/10.3389/ fbioe.2023.1159819

References

1. Cesarz Z., Tamama K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. 2016; 2016: 9176357. DOI: https://doi.org/10.1155/ 2016/9176357

2. Huang L., Abdalla A.M.E., Xiao L., et al. Biopolymer-Based Microcarriers for Three-Dimensional Cell Culture and Engineered Tissue Formation. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21 (5): 1895. DOI: https://doi.org/10.3390/ IJMS21051895

3. Padmalayam I., Suto M.J. 3D Cell Cultures: Mimicking In Vivo Tissues for Improved Predictability in Drug Discovery. Annu. Rep. Med. Chem. 2012; 47: 367-78. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-396492-2.00024-2

4. Kapalczynska M., Kolenda T., Przybyla W., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch. Med. Sci. 2018; 14 (4): 910-19. DOI: https://doi.org/10.5114/AOMS.2016.63743

5. Poornima K., Francis A.P., Hoda M., et al. Implications of Three-Dimensional Cell Culture in Cancer Therapeutic Research. Front. Oncol. 2022; 12: 891673. DOI: https://doi.org/10.3389/FONC.2022.891673

6. Cutter S., Wright M.D., Reynolds N.P., et al. Towards using 3D cellular cultures to model the activation and diverse functions of macrophages. Biochem. Soc. Trans. 2023; 51 (1): 387-401. DOI: https://doi. org/10.1042/BST20221008

7. Ataullakhanov R.I., Ushakova E.I., Khudhur S. Al, et al. Reprogramming of myeloid cells of the tumor microenvironment - a new approach in the immunotherapy of malignant neoplasms. Immunologiya. 2022; 43

8. Hinshaw D.C., Shevde L.A. The Tumor Microenvironment Innately Modulates Cancer Progression. Cancer Res. 2019; 79 (18): 4557-66. DOI: https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-18-3962

9. Ren B., Cui M., Yang G., et al. Tumor microenvironment participates in metastasis of pancreatic cancer. Mol. Cancer. 2018; 17 (1): 108. DOI: https://doi.org/10.1186/S12943-018-0858-1

10. Hoffman R.M. In Memoriam: Joseph Leighton, 1921-1999 - Father of 3-Dimensional Tissue Culture. Methods Mol. Biol. 2018; 1760: 1-9. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7745-1_1

11. Ziello J.E., Jovin I.S., Huang Y. Hypoxia-Inducible Factor (HIF)-1 regulatory pathway and its potential for therapeutic intervention in malignancy and ischemia. Yale J. Biol. Med. 2007; 80 (2): 51-60. PMID: 18160990

12. Koop E.A., Laar T. van, Wichen D.F. van, et al. Expression of BNIP3 in invasive breast cancer: Correlations with the hypoxic response and clinicopathological features. BMC Cancer. 2009; 9: 175. DOI: https://doi. org/10.1186/1471-2407-9-175

13. Ambrosio M.R., Serio C. Di, Danza G., et al. Carbonic anhydrase IX is a marker of hypoxia and correlates with higher Gleason scores and ISUP grading in prostate cancer. Diagn. Pathol. 2016; 11 (1): 45. DOI: https://doi. org/10.1186/s13000-016-0495-1

14. Arora L., Kalia M., Dasgupta S., et al. Development of a Multicellular 3D Tumor Model to Study Cellular Heterogeneity and Plasticity in NSCLC Tumor Microenvironment. Front. Oncol. 2022; 12: 881207. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2022.881207

15. Jubelin C., Muñoz-Garcia J., Griscom L., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 2022; 12 (1): 155. DOI: https://doi.org/10.1186/s13578-022-00887-3

16. Shyam R., Reddy L.V.K., Palaniappan A. Fabrication and Characterization Techniques of In Vitro 3D Tissue Models. Int. J. Mol. Sci. 2023; 24 (3): 1912. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms24031912

17. Heredia-Mendez A.J., Sánchez-Sánchez G., López-Camarillo C. Reprogramming of the Genome-Wide DNA Methylation Landscape in Three-Dimensional Cancer Cell Cultures. Cancers (Basel). 2023; 15 (7): 1991. DOI: https://doi.org/10.3390/CANCERS15071991

18. Li C., Jin B., Sun H., et al. Exploring the function of stromal cells in cholangiocarcinoma by three-dimensional bioprinting immune microenvironment model. Front. Immunol. 2022; 13: 941289. DOI: https://doi. org/10.3389/FIMMU.2022.941289

19. Nii T., Kuwahara T., Makino K., et al. A co-culture system of three-dimensional tumor-associated macrophages and three-dimensional cancer-associated fibroblasts combined with biomolecule release for cancer cell migration. Tissue Eng. 2020; 26 (23-24): 1272-82. DOI: https://doi. org/10.1089/ten.tea.2020.0095

20. Pizzurro G.A., Liu C., Bridges K., et al. 3D Model ofthe Early Melanoma Microenvironment Captures Macrophage Transition into a Tumor-Promoting Phenotype. Cancers (Basel). 2021; 13 (18): 4579. DOI: https:// doi.org/10.3390/CANCERS13184579

21. McWhorter F.Y., Wang T., Nguyen P., et al. Modulation of macrophage phenotype by cell shape. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2013; 110 (43): 17253-8. DOI: https://doi.org/10.1073/PNAS.1308887110

22. Li Y.R., Yu Y., Kramer A., et al. An Ex Vivo 3D Tumor Microenviron-ment-Mimicry Culture to Study TAM Modulation of Cancer Immunotherapy. Cells. 2022; 11 (9): 1583. DOI: https://doi.org/10.3390/CELLS11091583

23. Huang Y., Feng Q., Jiang H., et al. Mimicking the Endometrial Cancer Tumor Microenvironment to Reprogram Tumor-Associated Macrophages in Disintegrable Supramolecular Gelatin Hydrogel. Int. J. Nanomedi-cine. 2020; 15: 4625-37. DOI: https://doi.org/10.2147/IJN.S252074

24. Ryu N.E., Lee S.H., Park H. Spheroid Culture System Methods and Applications for Mesenchymal Stem Cells. Cells. 2019; 8 (12): 1620. DOI: https://doi.org/10.3390/CELLS8121620

25. Haisler W.L., Timm D.M., Gage J.A., et al. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nat. Protoc. 2013; 8 (10): 1940-9. DOI: https://doi.org/10.1038/nprot.2013.125

26. Huang L., Xiao L., Jung Poudel A., et al. Porous chitosan microspheres as microcarriers for 3D cell culture. Carbohydr. Polym. 2018; 202: 611-20. DOI: https://doi.org/10.1016/J.CARBPOL.2018.09.021

27. Shen H., Cai S., Wu C., et al. Recent Advances in Three-Dimensional Multicellular Spheroid Culture and Future Development. Micromachines. 2021; 12 (1): 96. DOI: https://doi.org/10.3390/MI12010096

28. Zhang Y., Liao K., Li C., et al. Progress in Integrative Biomaterial Systems to Approach Three-Dimensional Cell Mechanotransduction. Bioeng. 2017; 4 (3): 72. DOI: https://doi.org/10.3390/BIOENGINEERING4030072

29. Artegiani B., Clevers H. Use and application of 3D-organoid technology. Hum. Mol. Genet. 2018; 27 (R2): R99-R107. DOI: https://doi. org/10.1093/HMG/DDY187

30. Lancaster M.A., Knoblich J.A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 2014; 345 (6194): 283-94. DOI: https://doi.org/10.1126/SCIENCE.1247125

31. Maura R., Francesco A., Simona R., et al. Three-dimensional models: a novel approach for lymphoma research. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2022; 148 (4): 753-65. DOI: https://doi.org/10.1007/S00432-021-03897-9/METRICS

32. Fontana F., Raimondi M., Marzagalli M., et al. Epithelial-To-Mesen-chymal Transition Markers and CD44 Isoforms Are Differently Expressed in 2D and 3D Cell Cultures of Prostate Cancer Cells. Cells. 2019; 8 (2): 143. DOI: https://doi.org/10.3390/CELLS8020143

33. Sica A., Mantovani A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. J. Clin. Invest. 2012; 122 (3): 787-95. DOI: https://doi. org/10.1172/JCI59643

34. Gordon S., Martinez F.O. Alternative activation of macrophages: mechanism and functions. Immunity. 2010; 32 (5): 593-604. DOI: https:// doi.org/10.1016/J.IMMUNI.2010.05.007

35. Wang S., Liu R., Yu Q., et al. Metabolic reprogramming of macrophages during infections and cancer. Cancer Lett. 2019; 452: 14-22. DOI: https://doi.org/10.1016/J.CANLET.2019.03.015

36. Keskinov A.A., Shurin M.R. Myeloid regulatory cells in tumor spreading and metastasis. Immunobiology. 2015; 220 (2): 236-42. DOI: https://doi.org/10.1016ZJ.IMBI0.2014.07.017

37. Murray P.J., Wynn T.A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat. Rev. Immunol. 2011; 11 (11): 723-37. DOI: https://doi.org/10.1038/nri3073

38. Choi J., Gyamfi J., Jang H., et al. The role of tumor-associated macrophage in breast cancer biology. Histol. Histopathol. 2018; 33 (2): 133-45. DOI: https://doi.org/10.14670/HH-11-916

39. Murugina N.E., Murugin V. V., Pashenkov M. V. Antitumor activity of human macrophages activated by NOD1 and TLR4 receptor agonists in vitro. Immunologiya. 2022; 43

40. Nascimento C., Castro F., Domingues M., et al. Reprogramming of tumor-associated macrophages by polyaniline-coated iron oxide nanopar-ticles applied to treatment of breast cancer. Int. J. Pharm. 2023; 636: 122866. DOI: https://doi.org/10.1016/J.IJPHARM.2023.122866

41. Blenman K.R.M., Wang J., Cowper S., et al. Pathology of spontaneous and immunotherapy-induced tumor regression in a murine model of melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 2019; 32 (3): 448-57. DOI: https:// doi.org/10.1111/PCMR.12769

42. Araujo-Ayala F., Dobano-Löpez C., Valero J.G., et al. A novel patient-derived 3D model recapitulates mantle cell lymphoma lymph node signaling, immune profile and in vivo ibrutinib responses. Leukemia. 2023; 37 (6): 1311-23. DOI: https://doi.org/10.1038/S41375-023-01885-1

43. Lee S., Ki C.S. Proteolytically degradable PEG hydrogel matrix mimicking tumor immune microenvironment for 3D co-culture of lung adenocarcinoma cells and macrophages. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 2023; 1-19. DOI: https://doi.org/10.1080/09205063.2023.2204778

44. Meli V.S., Atcha H., Veerasubramanian P.K., et al. YAP-mediated mechanotransduction tunes the macrophage inflammatory response. Sci. Adv. 2020; 6 (49): eabb8471. DOI: https://doi.org/10.1126/SCIADV.ABB8471

45. Stadler M., Pudelko K., Biermeier A., et al. Stromal fibroblasts shape the myeloid phenotype in normal colon and colorectal cancer and induce CD163 and CCL2 expression in macrophages. Cancer Lett. 2021; 520: 184-200. DOI: https://doi.org/10.1016/J.CANLET.2021.07.006

46. Nii T., Kuwahara T., Makino K., et al. A Co-Culture System of Three-Dimensional Tumor-Associated Macrophages and Three-Dimensional Cancer-Associated Fibroblasts Combined with Biomolecule Release for Cancer Cell Migration. Tissue Eng. 2020; 26 (23-24): 1272-82. DOI: https://doi.org/10.1089/TEN.TEA.2020.0095

47. Thomas M.U., Messex J.K., Dang T., et al. Macrophages expedite cell proliferation of prostate intraepithelial neoplasia through their downstream target ERK. FEBS J. 2021; 288 (6): 1871-86. DOI: https://doi. org/10.1111/FEBS.15541

48. Helleberg Madsen N., Schnack Nielsen B., Larsen J., et al. In vitro 2D and 3D cancer models to evaluate compounds that modulate macrophage polarization. Cell. Immunol. 2022; 378: 104574. DOI: https://doi. org/10.1016/J.CELLIMM.2022.104574

49. Li C., Song J., Guo Z., et al. EZH2 Inhibitors Suppress Colorectal Cancer by Regulating Macrophage Polarization in the Tumor Microenvironment. Front. Immunol. 2022; 13: 857808. DOI: https://doi.org/10.3389/ fimmu.2022.857808

50. Xiao Y., Yu D. Tumor microenvironment as a therapeutic target in cancer. Pharmacol. Ther. 2021; 221: 107753. DOI: https://doi.org/10.1016/J. PHARMTHERA.2020.107753

51. Pampaloni F., Reynaud E.G., Stelzer E.H.K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007; 8 (10): 839-45. DOI: https://doi.org/10.1038/nrm2236

52. Tang M., Xie Q., Gimple R.C., et al. Three-dimensional bioprinted glioblastoma microenvironments model cellular dependencies and immune interactions. Cell Res. 2020; 30 (10): 833-53. DOI: https://doi.org/10.1038/ S41422-020-0338-1

53. Rodriguez-Perdigon M., Haeni L., Rothen-Rutishauser B., Rüegg C. Dual CSF1R inhibition and CD40 activation demonstrates anti-tumor activity in a 3D macrophage- HER2+ breast cancer spheroid model. Front Bioeng Biotechnol. 2023; 11: 1159819. DOI: https://doi.org/10.3389/ fbioe.2023.1159819

Сведения об авторах

Муругина Нина Евгеньевна - мл. науч. сотр. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: nekalashnikova@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-7000-5729

Есипова Дарья Дмитриевна - лаборант лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; студент V курса ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: esipova.dariya@yandex.ru https://orcid.org/0009-0006-0807-2529

Пащенков Михаил Владимирович - д-р мед. наук, зав. лаб. клинической иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; профессор кафедры иммунологии медико-биологического факультета ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: mvpashenkov@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6995-1790

Authors' information

Nina E. Murugina - PhD, Junior Researcher of Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation. E-mail: nekalashnikova@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-7000-5729

Daria D. Esipova - Lab. Technician of Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Student of the 5th year, N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: esipova.dariya@yandex.ru https://orcid.org/0009-0006-0807-2529

Mikhail V. Pashenkov - MD, PhD, Head of Clinical Immunology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of the Immunology Chair, MBF, N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mvpashenkov@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6995-1790