Лимфоцитарный контроль дифференцировки кроветворных стволовых клеток

Дискуссионные и общетеоретические работы

ДИСКУССИОННЫЕ И ОБЩЕТЕОРЕТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ

Лимфоцитарный контроль дифференцировки кроветворных стволовых клеток

В.М. Манько, Р.В. Петров

Государственный научный центр Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства, Москва

В наши дни сотни экспериментальных и клинических исследований посвящены проблемам стволовых клеток [СК], как эмбрионального, так и тканевого происхождения. Интерес к этому возник в связи с осмысливанием и возможностью воспроизведения двух основных качеств СК: способность к длительному самовоспроизведению и их мультипотентность, т.е. способность дифференцироваться в любую клетку организма. Первое качество дает возможность накопления СК в культуре. Второе - окрыляет своей заманчивостью лечения очень широкого круга заболеваний, травм, инфарктов, нервных и эндокринных нарушений, включая диабет. Тканевое клонирование снимает все проблемы несовместимости при трансплантациях.

Высокая значимость стволовой кроветворной клетки [СКК] для биологии и медицины определяется ее иерархическим положением в клеточной дифференцировке, дающей начало пулу жизненно важных популяций клеток периферической крови - эритроцитам, мононуклеарным фагоцитам [моноцитам и макрофагам], гранулоцитам [нейтрофилам, базофилам и эозинофилам], тучным клеткам, тромбоцитам и лимфоцитам [естественным киллерам, Т- и В-клеткам), формируемым через дочерние клетки-предшественники -миелоидную и лимфоидную стволовые клетки.

Активное изучение функций СКК индуцировали два открытия. Одно из них сделало возможным количественное определение СКК, содержащихся в различных тканях, включая костный мозг, периферическую кровь, селезенку. Это открытие было сделано канадскими исследователями Тиллом и Мак Куллохом в 1961 г. [1, 2]. Было показано, что внутривенная трансплантация клеток костного мозга сингенным летально облученным реципиентам сопровождается через 78 сут образованием в их селезенке видимых на глаз колоний дифференцированных клеток. С помощью серийных гистологических срезов селезенки облученных реципиентов установлено, что из общего числа колоний около 42-55% составляют колонии эритроидного типа, 14-24% - гранулоцитарные, 18-21% - мегакариоцитарные, 16-21% - смешанные [3, 4]. С помощью хромосомных маркеров было доказано, что каждая из колоний образуется отдельной пролиферирующей и дифференцирующейся стволовой клеткой, а численность селезеночных колоний характеризует количество СКК, содержащихся в данной взвеси клеток, осевших в селезенке после трансплантации и давших рост клеточных колоний.

*Адрес для корреспонденции:

ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России» 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24/2.

Другое открытие было сделано Р.В. Петровым и Л.С. Сес-лавиной, показавшими возможность регуляции функций СКК через лимфоцитарный контроль. Оказалось, что лимфоциты, трансплантированные совместно с клетками костного мозга, изменяют характер дифференцировки генетически идентичных СКК [5, 6] и инактивируют генетически чужеродные СКК [7, 8]. Обнаруженное Р.В. Петровым и Л.С. Сесла-виной явление взаимодействия лимфоцитов со стволовыми кроветворными клетками зарегистрировано в качестве открытия Государственным Комитетом СССР по делам изобретений и открытий в Государственном реестре открытий за №192 от 1 декабря 1977 г.

Эти факты явились той необходимой основой, на которой развернулись широкомасштабные экспериментальные исследования по изучению функций стволовой кроветворной клетки и их регуляции. Эти исследования проводились с 1965 года на протяжении более чем 20-летнего периода коллективом иммунологов под руководством академика Р.В. Петрова в Институте биофизики Минздрава СССР, а затем в Государственном научном центре Институте иммунологии Федерального медико-биологического агентства. При проведении исследований использовались разные линейные и гибридные мыши разных гаплотипов, а также конген-ные, рекомбинантные и мутантные линии, в т.ч. специально выводимые для решения поставленных задач, и различные модельные системы, созданные исследовательским коллективом, для изучения особенностей и механизмов регистрируемых реакций. Это позволило получить целый ряд пионерских данных, уникальность которых была высоко оценена на международном уровне.

Лимфоцитарный контроль дифференцировки стволовых кроветворных клеток, формирующих гемопоэтические колонии в селезенке облученных реципиентов

Уже на ранних этапах изучения факторов, регулирующих основные функции СКК, была установлена выраженная зависимость их дифференцировки от взаимодействия с син-генными лимфоцитами. Оказалось, что клетки костного мозга мышей линии СВА, трансплантированные летально облученным реципиентам [CBAxC57BL/6J]F1, образуют в их селезенках примерно такое же число колоний кроветворных

Дискуссионные и общетеоретические работы

клеток, как и в селезенках сингенных [СВА] летально облученных мышей. При одной и той же дозе костномозговых клеток принципиально одинаковым было и отношение числа колоний эритроидного и гранулоцитарного типов [Э/Г] -2,4 и 2,1. Иначе говоря, родительские СКК в селезенке обоих генотипов дифференцировались преимущественно в эрит-роидном направлении. Однако при трансплантации клеток костного мозга мышей линии СВА в смеси с сингенными лимфоцитами [клетки лимфатических узлов] летально облученным реципиентам (CBAxC57BL/6J)Fr но не мышам линии СВА, резко снижается [вплоть до полной отмены] способность СКК формировать в селезенке реципиентов колонии эритроидного типа при одновременном увеличении численности гранулоцитарных колоний [9, 10]. С увеличением в смеси числа лимфоцитов, отношение Э/Г снижалось [с 2,0 до 0,03] вплоть до полной отмены дифференцировки СКК в направлении эритропоэза. В этом случае на серийных срезах селезенки облученных реципиентов регистрировали колонии только гранулоцитарного типа [10]. Костномозговое происхождение селезеночных колоний было доказано с помощью хромосомного маркера Т6Т6 [11]. Поскольку в полностью сингенной системе донор-реципиент (СВА+СВАхСВА) лимфоциты не влияли на характер дифференцировки сингенных СКК, было заключено, что лимфоциты, стимулированные антигеном [со стороны облученного реципиента], тормозят образование эритроидных колоний сингенными клетками костного мозга и направляют диф-ференцировку СКК в сторону гранулопоэза [10, 12].

Полученные результаты опытов были впервые доложены Р.В. Петровым на XII Международном конгрессе по переливанию крови [Москва, 17-23 августа 1969 г.], а затем и опубликованы [5, 6, 13]. В иных экспериментальных системах факт сдвига дифференцировки СКК в направлении гранулопоэза под влиянием сингенных лимфоцитов был подтвержден японскими [14] и американскими [15] исследователями.

Эффект аллогенной ингибиции и его отмена

сингенными лимфоцитами

В отличие от СКК мышей линии СВА, трансплантация летально облученным мышам [CBAxC57BL/6J]Fn клеток костного мозга мышей другого родительского генотипа -C57BL/6J - сопровождается резким снижением числа селезеночных колоний [1,6±02], по сравнению с их количеством в селезенке летально облученных сингенных реципиентов -C57BL/6J [37,5±3,4]. При этом число колоний эритроидного типа увеличивалось, отношение Э/Г возрастало с 1,6 в селезенке сингенных мышей до 4,0 - в селезенке мышей F1 [9]. Этот эффект известен в литературе под разными наименованиями [Эффект аллогенной ингибиции, Эффект репрессии СКК, Эффект гибридной резистентности, Эффект сингенного предпочтения - для клеток, характеризующихся предпочтительным ростом в сингенном организме, по сравнению с реципиентом гибридной природы]. Он обычно проявляется в отношении СКК одного из двух родительских генотипов, детально охарактеризован в работах [9, 10, 12, 16]. Эффект аллогенной ингибиции не зависит от возраста доноров СКК, регистрируется при трансплантации облученным гибридным реципиентам, клеток эмбриональной печени [13-16-суточные зародыши] или костного мозга половозрелых или старых [3-месячные, 2-летние] мышей родительского генотипа [C57BL/6J] [17]. В количественном отношении эффект слабо выражен для клеток селезенки [9], содержащей как СКК, так и лимфоциты, отменяется при совместной трансплантации реципиентам-гибридам клеточных взвесей, содержащих СКК репрессируемого родительского генотипа в смеси с сингенными лимфоцитами [9, 18, 19, 20]

или клетками тимуса [17]. Однако и в этом случае, несмотря на заметное усиление колониеобразующей активности СКК, характер их дифференцировки изменяется под влиянием сингенных лимфоцитов стимулированных антигеном с преимущественно эритроидного на преимущественно грануло-цитарный путь развития. Отношение Э/Г падало с 4,4 до 0,6 [19, 20, 21].

Лимфоцитарный контроль дифференцировки

стволовых кроветворных клеток, формирующих

«ранние» и «поздние» гемопоэтические колонии

в селезенке облученных реципиентов

Было показано, что колонии гемопоэтических клеток в селезенке облученных реципиентов формируют, по меньшей мере, два типа предшественников [СКК]. «Ранние» колонии [7-8-суточные] образуют преимущественно коммитиро-ванные предшественники эритроидных клеток, «поздние» [10-12-суточные] - менее зрелые стволовые элементы, способные дифференцироваться в направлении различных ростков кроветворения. Показано также наличие «персисти-рующих» колоний, выявляемых на всех сроках наблюдения [22]. Как оказалось, 12-суточные колонии, образуются не примитивными стволовыми клетками [23], как это полагалось ранее [22], а формируются, по-видимому, все же иными, менее коммитированными СКК, по сравнению с СКК, формирующими 7-8-суточные колонии [24, 25].

Характеристику дифференцировки СКК на разных этапах образования колоний изучали в зависимости от генотипа доноров костного мозга, сочетания генотипов донор-реципиент, включения в костномозговой трансплантат Т-лимфоцитов или их элиминации в результате тимэктомии половозрелых доноров костного мозга.

Определение численности СКК в селезенке сингенных реципиентов на 7-8 сутки после летального облучения показало, что их содержание в клеточной популяции определяется используемой тканью и генотипом животных. В популяции спленоцитов содержание СКК в 10-20 раз меньше, по сравнению с их содержанием в костном мозге, в популяции клеток лимфатических узлов, тимуса или головного мозга СКК не выявляются [16, 26, 27, 28]. При внутривенной трансплантации 106 спленоцитов сингенным летально облученным животным число определяемых колоний в селезенке составляло в среднем: у мышей линии СВА - 12,8; C57BL/ 6J - 14,7; А - 16,8; [CBAxC57BL/6J]F1 - 18,5; С3Н - 27; CC57BR - 45,6; СС57'М - 59,5 [16].

Определение характера дифференцировки СКК в разные сроки [5, 7, 9, 12, 14 сут] после трансплантации сингенных клеток костного мозга летально облученным мышам разных генотипов не выявило отличий в величине отношения Э/Г, которое находилось в пределах одних и тех же величин

- 1,6-2,8 [29]. Принципиально сходные результаты получены при трансплантации летально облученным реципиентам [CBAxC57BL/6J]F1 клеток костного мозга родительских генотипов СВА и C57BL/6J, характеризующихся разной чувствительностью к проявлению эффекта аллогенной ингибиции - сильной по отношению к СКК генотипа C57BL/6J и незначительной - по отношению к СКК генотипа СВА. При гистологическом анализе 7- и 12-суточных колоний отношение Э/Г находилось в пределах одних и тех же показателей -1,8-2,6 [12].

Вне зависимости от сроков анализа после облучения [5-14 сут], на гистологических срезах селезенки облученных реципиентов [CBAxC57BL/6J]F1, получавших трансплантат родительских [СВА] клеток костного мозга в смеси с син-генными [СВА] клетками лимфатических узлов, наблюдали сдвиг дифференцировки СКК в сторону гранулопоэза -отношение Э/Г составляло 0,3-0,5 [29].

Дискуссионные и общетеоретические работы

В целом, данные, полученные в разной постановке опытов, не выявили принципиальных различий в характере дифференцировки СКК в «ранние» [5-7 сутки] и «поздние» [12-14 сутки] сроки после трансплантации только клеток костного мозга или клеток костного мозга в смеси с сингенны-ми лимфоцитами. Как на уровне «ранних», так и на уровне «поздних» колоний дифференцировка СКК находится под вышеописанным лимфоцитарным контролем [12].

Лимфоцитарный контроль дифференцировки стволовых кроветворных клеток, формирующих гемопоэтические колонии в костномозговой полости облученных реципиентов

Как оказалось, аналогичные процессы развиваются в костном мозге облученных реципиентов. Было показано, что в костном мозге, в отличие от селезенки, гемопоэз идет преимущественно в сторону образования колоний гранулоци-тарного типа. Так, при трансплантации клеток костного мозга мышей линии СВА в костном мозге летально облученных реципиентов [CBAxC57BL/6J]F1 донорские СКК формируют колонии преимущественно гранулоцитарного типа, отношение Э/Г составляет на 8-9 сутки после облучения 0,55-

0,57. При включении в костномозговую смесь сингенных [СВА] лимфоцитов лимфатических узлов отношение Э/Г падает до 0,14 [10]. Иначе говоря, лимфоциты, взаимодействуя с сингенными СКК, изменяют направление их дифференцировки в селезенке с преимущественно эритроидного пути на преимущественно гранулоцитарный, в костном мозге

- усиливают дифференцировку СКК по пути гранулопоэза [10, 30, 31]. Поскольку в полностью сингенной системе донор-реципиент [СВА+СВАаСВА], как и в выше приведенных результатах опытов [32], характер дифференцировки СКК под влиянием лимфоцитов не изменяется, сделано заключение о том, что СКК в костномозговой полости изменяют типичное для них направление дифференцировки под влиянием сингенных антигенностимулированных [со стороны облученного гибридного реципиента] лимфоцитов [9].

Исследование характера дифференцировки СКК в костном мозге мышей показало также возможность изменения их развития и в сторону эритропоэза [31]. Так, при различных воздействиях, сопровождающихся перераспределением Т-лимфоцитов и миграцией их в костный мозг без их предварительной антигенной активации [инъекции гидрокортизона, стрессовые нагрузки, трансплантация летально облученным реципиентам сингенных сублетально облученных клеток костного мозга в смеси с сингенными тимоцитами и пр.] в костномозговой полости животных регистрируется изменение дифференцировки СКК с преимущественно гра-нулоцитарного на преимущественно эритроидный путь кроветворения - отношение Э/Г возрастает с 0,6 до 1,2-2,0. В этих же условиях, например при гормональных нагрузках, спленоциты формируют в костномозговой полости колонии преимущественно гранулоцитарного типа. Иначе говоря, при инъекциях гормона СКК костного мозга дифференцируются в костномозговой полости реципиентов как клетки селезенки, а клетки селезенки - как клетки костного мозга. Результаты этих экспериментов обобщены в работе [12].

Т-лимфоцитарный контроль дифференцировки стволовых кроветворных клеток

Для характеристики лимфоцитов, контролирующих процесс дифференцировки сингенных СКК, использовали лимфоидные клетки из разных источников [мыши линии СВА], трансплантируемые в смеси с клетками костного мозга [мыши линии СВА] летально облученным реципиентам (CBAxC57BL/6J)Fr На 8-9 сутки после трансплантации на серийных срезах селезенки реципиентов считали число коло-

ний различных гистологических типов [32, 33]. Наибольшую активность проявляли нефракционированные клетки лимфатических узлов, под их влиянием отношение Э/Г падало с 2,4 до 0,17. Сходной активностью характеризовались клетки лимфатических узлов тимэктомированных доноров [Э/Г 0,19]. По сравнению с кортизонрезистентными клетками лимфатических узлов [Э/Г 0,25] или нефракционированными клетками лимфатических узлов существенно меньшую активность проявляли кортизонрезистентные тимоциты, которые были примерно в 5 раз более активными, по сравнению с нефракционированными клетками тимуса [Э/Г 0,1 и 0,5, соответственно в дозах в 10 раз превышающих количество трансплантируемых нефракционированных клеток лимфатических узлов]. Т-лимфоциты из лимфатических узлов Т-мышей характеризовались такой же активностью, как и клетки лимфатических узлов интактных животных, однако Т-лимфоциты из селезенки Т-мышей не влияли на процесс дифференцировки СКК в направлении гранулопоэза. Неактивными были также В-лимфоциты из лимфатических узлов В-мышей [12, 21, 32, 33, 34].

В целом, полученные факты демонстрируют, что диф-ференцировка СКК находится под контролем лимфоцитов Т-системы иммунитета. Проведенный детальный анализ результатов экспериментов по Т-лимфоцитарной зависимости дифференцировки СКК позволил заключить, что взаимодействие Т-лимфоцитов с СКК не опосредуется через реакцию «трансплантат против хозяина» [РТПХ], регистрируемые эффекты являются следствием прямого взаимодействия лимфоцит-стволовая клетка в присутствии тканевых антигенов [4, 9, 11, 12, 35, 36]. Лимфоциты, контролирующие процесс дифференцировки СКК, были названы Т-диффе-ренцирующими ^] [12, 21, 32, 37].

Тимический контроль дифференцировки

стволовых кроветворных клеток

Для исследования роли тимуса в процессе диффе-ренцировки СКК выполняли тимэктомию доноров костного мозга, реципиентов или как доноров костного мозга, так и реципиентов. Колонии различных гистологических типов считали на серийных срезах селезенки реципиентов, на 8-9 сутки после их летального облучения. Выключение функции тимуса сопровождалось сдвигом дифференцировки СКК в сторону эритропоэза, отношение Э/Г увеличивалось с 2,2-2,4 до 5,2-14,5. Этот эффект наблюдали как при трансплантации клеток костного мозга тимэктомированных мышей [мыши линии СВА] сингенным летально облученным реципиентам [мыши линии СВА], так и летально облученным реципиентам гибридной природы - (CBAxC57BL/6J)Fr Включение в костномозговой трансплантат сингенных Т-лимфоцитов [мыши линии СВА] увеличивало выход колоний миелоидного типа, нормализовало дифференцировку СКК в организме сингенного реципиента [СВА] и приводило к ее резкому сдвигу в сторону гранулопоэза в организме реципиента гибридной природы. Отношение Э/Г падало с 5,2-14,5 до 2,9-6,0 [реципиенты СВА] и с 4,7-5,4 до 0,1 -0,2 [реципиенты гибриды ^] [33, 38, 134].

В соответствии с приведенными фактами по анализу тимического контроля функций СКК находятся результаты экспериментов по исследованию дифференцировки СКК новорожденных мышей, характеризующихся минимальным количеством функционально активных Т-лимфоцитов, или старых мышей [24-28-месячных] с тимической инволюцией. В этих опытах летально облученным половозрелым мышам [СВАхC57BL/6J]F1 трансплантировали СКК-содержащие клетки печени [новорожденные мыши] костного мозга и периферической крови сингенных животных разного возраста - новорожденных, 2-недельных, 2,5- и 26-месяч-

Дискуссионные и общетеоретические работы

ных. Как и во всех других экспериментах, на 8-9 сутки после облучения в селезенке считали число макроскопически видимых колоний, а на ее серийных срезах - число колоний разных гистологических типов. Было показано, что диффе-ренцировка СКК донорского костного мозга [новорожденные животные или 26-месячные] шла с превалированием эрит-ропоэза, т.е. так же, как и дифференцировка СКК тимэкто-мированных мышей. Величина Э/Г составляла 4,5-10,1. Добавление к костномозговому трансплантату старых [26-месячных] мышей сингенных клеток тимуса или лимфатических узлов животных в возрасте 2,5 мес обеспечивало нормализацию дифференцировки СКК - отношение Э/Г падало с 5,0 до 2,0-2,2 [32, 39].

Результаты экспериментов по изучению контроля Т-си-стемой иммунитета функций СКК подробно проанализированы в работе [12]. Сделаны следующие заключения.

1. Процессы дифференцировки СКК находятся под совместным Т-лимфоцитарным и тимическим контролем.

2. Под контролем Т-системы иммунитета находятся не только процессы дифференцировки СКК, но и другие их функции: пролиферации и самообновления. Как будет показано ниже, Т-система иммунитета контролирует также процессы миграции СКК.

3. Нормализация процесса дифференцировки СКК, нарушенной при Т-иммунодефиците [выключение функции тимуса], происходит в полностью сингенной системе, не требуя антигенной стимуляции Т-лимфоцитов, тогда как сдвиг дифференцировки СКК в сторону гранулопоэза осуществляется антигенностимулированными Т-лимфо-цитами.

4. Изменение характера дифференцировки СКК в полностью сингенной системе донор-реципиент и его нормализация в результате трансплантации сингенных Т-лимфоцитов подтверждает прямое взаимодействие лимфоцитов и СКК, и что оно не опосредуется через РТПХ.

Важным следствием проведенных исследований явилось создание экспериментальной системы, позволяющей моделировать направление дифференцировки СКК через лимфоцитарный контроль - изменять ее с нормальной на эритроидную и с эритроидной на гранулоцитарную.

Т-лимфоцитарный контроль пролиферации

и самообновления стволовых

кроветворных клеток

Заключение о Т-лимфоцитарном и тимическом контроле дифференцировки СКК неоднократно подтверждалось многочисленными экспериментальными исследованиями многих научных коллективов. Значимость открытой и описанной проблемы Т-лимфоцитарного контроля функций СКК обусловила независимое проведение двух специальных форумов по иммунологии, посвященных Т-клеточной регуляции гемопоэза [40, 41].

Было установлено, что под контролем Т-лимфоцитов находятся и другие функции СКК - процессы их пролиферации и самообновления. Как уже отмечалось, первые данные о зависимости пролиферации СКК от взаимодействия с лимфоцитами были получены Р.В. Петровым и сотрудниками и доложены в 1969 г. на XII Международном конгрессе по переливанию крови. Эти работы получили дальнейшее экспериментальное развитие. На этом же Конгрессе был представлен доклад D. Barnes и соавторов [42], в котором авторы подтвердили заключения Р.В. Петрова о лимфоцитарном контроле процессов пролиферации СКК. Здесь же мы отметим наиболее значимые исследования, развившие эти выводы в иных экспериментальных системах и подтвердившие заключения Р.В. Петрова и сотрудников о Т-лимфоцитарной зависимости таких функ-

ций СКК, как их пролиферация и самообновление.

В опытах с различными воздействиями на клетки костного мозга - введение донорам костного мозга митогенов КонА или ФГА [43, 44], облучение в дозе 1,8 Гр [45], обработка клеток кроличьей антисывороткой к антигенам головного мозга мышей [46, 47, 48], антисывороткой к антигену Thy-1 [49, 50] или в результате трансплантации клеток костного мозга мышей с аллелем Thy-1.2 летально облученным мышам с аллелем Thy-1.1, иммунизированным тимоцитами животных с аллелем Thy-1.2 [51], регистрировали резкое снижение колониеобразующей способности СКК.

Добавление к облученным или обработанным митогена-ми или антисыворотками клеткам костного мозга интактных сингенных тимоцитов нормализовало колониеобразующую способность СКК. Однако добавление тимоцитов к интактным клеткам костного мозга сингенных половозрелых животных не влияло на функции СКК. Эффект усиления колониеобра-зования наблюдался лишь при добавлении тимоцитов половозрелых мышей к клеткам костного мозга или селезенки новорожденных животных [52].

В случае трансплантации клеток костного мозга мышей с аллелем Thy-1.1 летально облученным мышам с аллелем Thy-1.1, иммунизированным тимоцитами животных с аллелем Thy-1.2, колониеобразующая способность СКК так же, как их характер дифференцировки, не изменялись.

У мышей с макроцитарной анемией W/Wv известен генетический дефект, обусловливающий неполноценность кроветворения. Считалось, что генетический дефект реализуется на уровне стволовой клетки. S. Sharkis и соавт. [50] установили возможность нормализации пролиферации и дифференцировки СКК с нормализацией кроветворения у этих мышей с помощью Т-лимфоцитов нормальных доноров. Авторы назвали эти клетки «Чувствительными к антитэтасы-воротке регуляторными клетками» - TSRC [antitheta-sensitive regulatory cells]. Регуляторные клетки, чувствительные к ан-титэтасыворотке, содержатся также в костном мозге. Так, было показано, что клетки костного мозга, обработанные антисывороткой к антигену Thy-1.2, фактически полностью утрачивали пролиферативную активность, они не формировали колонии в селезенке и не нормализовали анемию у мышей W/Wv [68]

Пролиферацию СКК и их дифференцировку в направлении гранулопоэза усиливали и сингенные тимоциты, трансплантированные вместе с клетками костного мозга сингенным сублетально [600 rd или 6 Gy] или летально [750 rd или 7,5 Gy] облученным мышам линии C57BL/6 с мутацией bg/bg [53].

В процессах Т-лимфоцитарной регуляции пролиферативной активности СКК участвуют не только хелперные, но и супрессорные Т-клетки, в частности, активируемые при обработке клеток костного мозга митогенами [43, 44]. Как уже отмечалось, в этих случаях колониеобразующая активность СКК падает, но она нормализуется при трансплантации реципиентам тимических клеток интактных животных.

Помимо процессов пролиферации и дифференцировки СКК, под контролем Т-системы иммунитета находятся также процессы их самообновления, усиливающиеся в 2-3 раза в результате взаимодействия с тимическими клетками. Процессы самообновления характеризуются линейной специфичностью [хорошо выражены у мышей линий C57BL/6 и BALB/c, но не у мышей B6D2F1], зависят от соотношения тимоцитов и стволовых колониеобразующих единиц [КОЕ] -оптимальное 50:1 и от возраста доноров тимоцитов [эффективны 4-5-недельные, а12-26-недельные - мало- или неэффективны]. Предварительное облучение тимоцитов in vitro в дозе 1500 Р усиливает их способность влиять на само-

Дискуссионные и общетеоретические работы

поддержание С« [114]. Обработка клеток костного мозга антисывороткой к антигену Thy-1 практически полностью лишает их способность к самоподдержанию [50].

Рєгуляция функций cтвoлoвыx кpoвєтвopныx

клєток пpєдшєcтвєнниками T-лимфоцитов

Bыяснeниe природы T-лимфоцитов, регулирующих процессы пролиферации и дифференцировки С«, выявило необходимость взаимодействия двух типов клеток, определяемых в костном мозге нормальных мышей. Одна из таких фракций костномозговых клеток не экспрессировала на мембране антиген SC-1, а другая характеризовалась фенотипом SC-1 +. Считалось, что антиген SC-1 экспрессируют С«, поскольку элиминация из костного мозга SC-V-i^e^n с помощью антисыворотки к головному мозгу мышей сопровождалась отменой селезеночного колониеобразования. Этот антиген был вначале определен как антиген стволовых клеток [SC-1 - Stem cell antigen 1) [46]. Оказалось, однако, что антиген SC-1 экспрессируют не С«, а костномозговые предшественники T-лимфоцитов [П^). С«, наоборот, не несут на поверхности эту молекулярную структуру и имеют фенотип SC-1-. Обе фракции клеток [CS-1 + и SC-1-), выделенные из костного мозга и порознь трансплантируемые летально облученным сингенным реципиенетам, не формируют колоний кроветворных клеток в селезенке облученных животных [55]. Однако при их совместной трансплантации клетки фенотипа SC-1- образуют колонии в селезенке летально облученных мышей. Хелперами селезеночного колониеобразования являются П^ [43, 55, 56, 57] фенотипа CS-1 + [55, 58].

Экспрессию антигенов Sca-1 и Sca-2 на T-лимфоцитах, ранее считавшихся антигенами С«, определили и другие исследователи [5B].

Bспoмoгатeльная активность П^ в селезеночном ко-лониеобразовании впоследствии была подтверждена многими исследованиями. Более того, оказалось, что хелперная активность П^ опосредуется через растворимые продукты, секретируемые этими клетками в надосадочную жидкость [60, 57,]. Определение мембранных структур, экспрессируемых взаимодействующми клетками, показало, что П^ характеризуются фенотипом Ig-, Thy-1+, Sc-1+, CD3-, L3T4+, Lyt-2+, IL-2R+, фенотип С« - Ig-, Thy-1-, SC-1-, L3T4-, Lyt-2-[61, 62, 63, 64, 133]. Aнализ механизмов регуляции колониеобразования в селезенке С«, привел к заключению, что в кооперации, по-видимому, участвуют три типа клеток: С« фенотипа SC-1-, зрелые T-клетки костного мозга, проти-моциты фенотипа SC-1 + [57]. Содержание среди тимоцитов хелперных клеток, по-видимому, небольшое. Оптимальный стимулирующий эффект, по данным разных авторов, колеблется при соотношении костномозговых и тимических клеток от 1:200 до 1:250.

С« различаются чувствительностью ответов на активирующее действие лимфоцитов T-ряда. Tак, было показано, что на стимуляцию тимоцитами отвечает лишь часть колониеобразующих клеток с плотностью >1,075 г/см-3 [65]. Более того, определили, что на действие тимоцитов отвечает лишь ~50% С«, выживших после обработки антимозговой сывороткой, составляющее ~10% от числа С«, содержащихся в костном мозге мышей.

Помимо незрелых клеток T-ряда с хелперной активностью, в селезенке и тимусе [66], а также в костном мозге мышей [66, 67] обнаружены клетки с супрессорной активностью, подавляющие образование колоний С« костного мозга и имеющие фенотип Lyt-1-, Lyt-2+, L3T4+ [67]. Супрессорные клетки экспрессировали также на мембране антиген I-J [66].

В-лимфоцитарная зависимость процессов пролиферации и дифференцировки стволовых кроветворных клеток. Хелперное действие В-лимфоцитов

Как отмечалось выше, В-лимфоциты не обладали способностью изменять характер дифференцировки СКК, однако они проявляли выраженную вспомогательную активность в процессах взаимодействия СКК-Т-лимфоцит. Регуляторное действие В-лимфоцитов и способность этих клеток оказывать хелперную активность были впервые обнаружены нами и опубликованы в 1978 г. [68]. В исследованиях одного из направлений, развивавших обнаруженный факт, было показано, что удаление В-лимфоцитов из взвеси клеток лимфатических узлов с помощью анти-В-сыворотки [АВС] и комплемента резко снижало дифференцирующую активность Т-лимфоцитов. При трансплантации летально облученным реципиентам [CBAxC57BL/6J]F1 клеток костного мозга мышей линии СВА и анализе селезеночных колоний на 7-8-е сутки после облучения отношение Э/Г характеризовалось стандартными параметрами и составляло 1,8. В присутствии сингенных Т-лимфоцитов лимфатических узлов характер дифференцировки СКК изменялся, как и в выше описанных экспериментах, с преимущественно эрит-роидного на преимущественно гранулоцитарный путь развития, отношение Э/Г падало с 1,8 до 0,1. Однако обработка клеток лимфатических узлов АВС и комплементом приводила к заметному снижению дифференцирующей активности Т-лимфоцитов, отношение Э/Г с 0,1 повышалось до 1,0. Аналогичный результат получили при обработке клеток лимфатических узлов анти-Т-сывороткой [АТС] и комплементом, отношение Э/Г увеличилось с 0,1 до 1,0. Однако в случае трансплантации облученным реципиентам клеток костного мозга в смеси с сингенными лимфоцитами, обработанными АВС и комплементом и лимфоцитами, обработанными АТС и комплементом, отношение Э/Г восстановилось и составляло 0,1. Следует отметить, что во всех группах опытов изменяется, в основном, число эритроидных колоний. Рост колоний гранулоцитарного и мегакариоцитарного типов является стабильным. Поэтому сдвиг дифференцировки СКК носит относительный характер. Поскольку ни АВС, ни АТС полностью не отменяли дифференцирующую функцию Т-лимфо-цитов, предположили, что среди Т-лимфоцитов имеются, по меньшей мере, две фракции клеток, одна из которых не нуждается во вспомогательном действии В-лимфоцитов. С В-лимфоцитами, по-видимому, взаимодействует фракция предшественников Т-лимфоцитов, не элиминируемых АТС и комплементом [69].

В последующих экспериментах эти предположения полностью подтвердились. С помощью препаративного электрофореза были выделены 2 фракции Т-лимфоцитов. Одна из них, Т-лимфоциты со средней и высокой электрофоретической подвижностью, непосредственно взаимодействовала с СКК и направляла их дифференцировку по пути гранулопоэза [Э/Г 0,3-0,5]. В-лимфоциты на дифференцирующую активность этих фракций Т-лимфоцитов не влияли. Другая группа Т-клеток [с низкой электрофоретической подвижностью] фактически не влияла на дифференцировку СКК [Э/Г 1,1], но в присутствии В-лимфоцитов проявляла такую же активность, как и Т-лимфоциты со средней или высокой электрофоретической подвижностью, Э/Г составляло 0,2-0,3 [70]. Как и в ранее проведенных экспериментах, В-лимфо-циты, сингенные или аллогенные, в отсутствие Т-лимфоцитов не проявляли дифференцирующую активность. В отличие от Т-лимфоцитов, тропных к лимфатическим узлам и к селезенке [см. выше] и проявлявших различное дифференцирующее действие на СКК [33], В-лимфоциты из лимфатических узлов и селезенки характеризовались одинаковой

Дискуссионные и общетеоретические работы

вспомогательной активностью [70]. Как оказалось, хелпер-ное действие В-клеток не подвержено генетическому ограничению [с Тd гаплотипа Н-2к с равной степенью эффективности взаимодействовали В-хелперы гаплотипов Н-2к, Н-2Ь и H-2d], проявляется не только в процессах селезеночного колониеобразования, но и в процессах формирования колоний в костномозговой полости облученных мышей. В костномозговой полости Т-лимфоциты снижали соотношение Э/Г с 0,5 до 0,3, в присутствии В-лимфоцитов - до 0,1.

Обнаруженная нами В-лимфоцитарная зависимость Т-лимфоцитарного контроля функций СКК неоднократно обобщалась в литературе [12, 61, 64, 68], включая проблему хелперного действия В-лимфоцитов на процессы пролиферации и дифференцировки СКК, не ограниченного генетическим комплексом Н-2 [70]. Не ограниченное комплексом Н-2 стимулирующее действие В-лимфоцитов на пролиферативную активность СКК впоследствии было подтверждено и другими авторами [71].

В-лимфоцитарная зависимость процессов

пролиферации и дифференцировки стволовых

кроветворных клеток.

Супрессорное и контрсупрессорное действие

В-лимфоцитов

В процессе разработки В-лимфоцитарной регуляции функций СКК было установлено, что при фракционировании костного мозга и удалении фракций зрелых Т- и В-лим-фоцитов, предшественников Т-лимфоцитов [ПТЛ], а также прилипающих к пластику клеток, выделенная фракция СКК не образует колоний кроветворных клеток в селезенке облученных реципиентов. Для индукции колониеобразования, помимо очищенной фракции СКК, необходимо включение в трансплантат сингенных В-лимфоцитов или ПТЛ. Однако при добавлении В-лимфоцитов к сингенному трансплантату, содержащему помимо СКК фракцию ПТЛ, также обладающих по отношению к СКК хелперной активностью, отсутствовал как хелперный, так и аддитивный эффект. Более того, регистрировалась супрессия образования колоний [61].

Проведенный анализ хелперной и супрессорной активности В-лимфоцитов из разных тканей показал, что наибольшей хелперной и наименьшей супрессорной активностью обладают В-клетки костного мозга. В-лимфоциты селезенки хелперную активность не проявляют, но обладают резко выраженной супрессорной активностью, обеспечивающей практически полное подавление колониеобразующей способности сингенных СКК. В-лимфоциты лимфатических узлов по этим показателям занимают промежуточное положение между В-клетками костного мозга и селезенки [72].

При обработке В-лимфоцитов специфической антисывороткой к антигену В-клеток MBLA и комплементом наблюдали отмену хелперной активности клеток костного мозга и лимфатических узлов, но проявление такой активности в популяции В-лимфоцитов селезенки. Сравнительная оценка супрессорной и хелперной активности обработанных анти-В-сывороткой В-лимфоцитов зарегистрировала изменение супрессорной активности В-лимфоцитов селезенки на хелперную и резко усилила супрессорную активность В-клеток костного мозга и лимфатических узлов, обнаружив наличие контрсупрессорной активности в необработанных популяциях В-лимфоцитов лимфатических узлов и костного мозга. Иначе говоря, популяции В-лимфоцитов всех использованных тканей содержали в своем составе как хелперные, так и супрессорные клетки. При этом хелперная активность превалировала над супрессорной, что проявлялось при обработке взвесей В-лимфоцитов специфической антисывороткой, направленной против В-клеток [64].

Активация костномозговых В-лимфоцитов Т-зависимым [эритроциты барана], но не В-зависимым антигеном [ЛПС] усиливала их супрессорную активность [63]. В отличие от костномозговых В-лимфоцитов, активация В-лимфоцитов селезенки указанными антигенами не влияла на проявление их супрессорной активности, но в присутствии зрелых Т-лимфоцитов в виде примеси к СКК индуцировала проявление хелперного действия селезеночных В-лимфоцитов, особенно выраженное при активации клеток ЛПС [62].

Макрофагальная зависимость дифференцировки стволовых кроветворных клеток

Трансплантация летально облученным реципиентам [CBAxC57BL]F1 клеток костного мозга мышей линии СВА в смеси с клетками системы мононуклеарных фагоцитов сопровождалась сдвигом дифференцировки СКК с преимущественно эритроидного на преимущественно гранулоцитарное направление кроветворения. Эффект не зависел от локализации и происхождения фагоцитов [моноциты периферической крови, макрофаги лимфатических узлов, перитонеальные макрофаги, клетки макрофагоподобной линии J-774) и от их генетической идентичности с клетками костного мозга -сингенные, аллогенные и ксеногенные [73]. При блокаде клеток системы мононуклеарных фагоцитов кремнеземом дифференцировка СКК развивается в преимущественно эритроидном направлении [74].

Миграция и рециркуляция стволовых кроветворных клеток

Для изучения процессов миграции и рециркуляции СКК был разработан [Р.В. Петров, Р.М. Хаитов], апробирован и внедрен в экспериментальные исследования ряд модельных систем. Они представляют собой комбинацию методов с экранированием свинцовым экраном участка костного мозга [источник СКК] при облучении мышей в летальной дозе, адреналэктомией, тимэктомией или спленэктомией и визуальным подсчетом числа колоний кроветворных клеток, формируемых СКК, в селезенке, микроскопическим подсчетом численности СКК на гистологических препаратах [серийные срезы тканей разных органов - селезенки, костного мозга и др.] или путем определения в различных тканях реципиентов размножающихся донорских клеток, выселяющихся из экранированного участка костного мозга или экзогенно введенных и идентифицируемых по хромосомному маркеру Т6Т6.

Миграция и рециркуляция стволовых кроветворных клеток, идентификация выселяющихся из костного мозга кроветворных клеток-предшественников

Для определения параметров миграции и рециркуляции СКК использовали парабиотически соединенных сингенных мышей линии СВА, одна из которых несла хромосомный маркер Т6Т6. До операции одного из партнеров [мыши СВА-Н] облучали тотально у-лучами в летальной дозе [850 Р], второму партнеру [мыши СВА-Т6Т6] при летальном облучении экранировали участок костного мозга. Через 12-14 сут после облучения в селезенке тотально облученного парабионта [мыши СВА-Н] определяли численность [по числу селезеночных колоний] и происхождение СКК [по хромосомной метке]. В более поздние сроки [30-60 сут] с помощью хромосомного маркера Т6Т6 у мышей СВА-Н определяли репопуляцию стволовыми клетками тканей тимуса, лимфатических узлов, селезенки и костного мозга. Проведенный анализ показал, что у летально облученных мышей СКК быстро репопули-руют гемопоэтические ткани вследствие их миграции из защищенного участка костного мозга в периферическую

Дискуссионные и общетеоретические работы

кровь, циркуляции в организме и заселения облученных тканей [75]. Показано, что все селезеночные колонии у мышей СВА-Н несли хромосомный маркер Т6Т6 и были образованы СКК, мигрировавшими из экранированного участка костного мозга. Таким же происхождением характеризовались СКК, репопулировавшие кроветворные и лимфоидные органы тотально облученного парабионта. Темп выселения СКК из экранированного участка костного мозга не снижался, по меньшей мере, в течение 24 час. Установлена прямая зависимость между количеством защищенных свинцовым экраном клеток, числом выселяющихся в кровоток СКК и выживаемостью облученных мышей [4, 75]. Доказано, что восстановление животных после облучения происходит благодаря миграции и рециркуляции СКК, но не гуморальной стимуляции со стороны необлученных участков костного мозга [36, 75].

Использование этой системы с облучением ранее экранированного участка костного мозга и защитой ранее облучавшейся остальной поверхности тела в различные периоды времени после первого сеанса облучения дало возможность количественно установить численность СКК, выселяющихся из костного мозга за различные временные интервалы. Показано, что число колоний в селезенке зависит от времени между облучением и подсчетом их числа и определяется количеством мигрировавших за это время СКК в селезенку [36]. Доказан контроль миграции СКК со стороны генов главного комплекса гистосовместимости [11, 36].

Т-лимфоцитарный и тимический контроль

миграции и дифференцировки стволовых

кроветворных клеток

У половозрелых мышей [СВАxC57BL/6J]F1 удаляли тимус и в разные сроки [14-56 сут]. После этого животных облучали в летальной дозе с экранированием участка костного мозга [1/2 голени]. Через 8-9 дней после облучения в селезенке мышей считали число макроколоний, а на ее серийных срезах - число колоний разных гистологических типов. У тимэктомированных мышей, по сравнению с ложнооперированными, наблюдали резкое угнетение миграции СКК из экранированного участка костного мозга и практически полное торможение их гранулопоэтической, но не эритропоэтической дифференцировки, число колоний эритроидного типа не изменилось. Результатом этого явилось существенное увеличение соотношения колоний эритроидного и гранулоцитарного типов [Э/Г] - с 1,8 до тимэк-томии до 5,5 - на 14 сутки и до 17,2 - на 30 сутки после удаления тимуса. Инъекция таким мышам тимозина или трансплантация сингенных клеток тимуса или лимфатических узлов полностью нормализовала процессы миграции СКК и характер их дифференцировки, сопоставимый с таковой контрольных мышей - отношение Э/Г снижалось с 17,2 до 1,7 [76].

Сходные данные зарегистрированы у стареющих мышей [СВАxC57BL/6J]F1 с возрастной инволюцией тимуса - снижается число СКК, мигрирующих из экранированного при летальном облучении участка костного мозга [1/2 голени] в селезенку и увеличивается соотношение Э/Г - с 1,9 у 2-месячных мышей до 5,7 - у 7-месячных и до 15,8 -у 26-месячных [39].

На основании полученных данных было заключено, что процессы миграции СКК находятся под совместным контролем - тимическим и Т-лимфоцитарным [36]. Более того, как отмечалось выше, под контролем Т-системы иммунитета находятся и другие важные функции СКК - процессы их пролиферации, дифференцировки и самообновления [12].

Гормональный контроль миграции стволовых

кроветворных клеток

Изучали влияние гипофиз-адреналовой системы на процессы миграции и рециркуляции СКК. Использовали мышей [CBAxC57BL/6J]F1 с экранированным участком костного мозга [стопа, * голени или задняя конечность до коленного сустава] во время летального облучения. Двусторонняя ад-реналэктомия за 2-7 сут до лучевого воздействия сопровождалась резким снижением уровня 11 -оксикортикостероидов в плазме крови и существенным усилением миграции СКК [77]. При этом состояние гипокортицизма не влияло на характер дифференцировки СКК [78], а регистрируемый эффект не зависел от объема экранированного костного мозга [79]. Аналогичный эффект наблюдали при сублетальном облучении мышей за 1-2 дня до удаления надпочечников или через 7 сут после операции [78, 79]. Вместе с тем, удаление надпочечников не влияло на репопуляцию селезенки летально облученных мышей F1 экзогенными стволовыми клетками и не стимулировало их размножение. Таким образом, было установлено, что кортикостероидные гормоны оказывают выраженное угнетающее действие на процессы эмиграции из костного мозга и рециркуляции эндогенных СКК. При снижении гормонального уровня эти процессы заметно интенсифицируются [36].

Справедливость такого заключения была подтверждена результатами экспериментов, проведенных на мышах с ги-перкортицизмом, индуцированным подкожными повторными инъекциями адренокортикотропного гормона [АКТГ] пролонгированного действия. Повышение уровня гормона в крови вызывало резко выраженное угнетение миграции СКК из экранированного участка костного мозга в селезенку [80]. Сходные данные были получены в опытах с введением АКТГ сублетально облученным мышам [81 ]. Более того, у оппозит-ных по уровню кортикостерона в крови линий мышей СВА и C57BL/6J выявили обратную зависимость между содержанием гормона в крови и интенсивностью миграции СКК [78]. Оказалось, что повышение уровня гормона в крови приводит также к сдвигу дифференцировки СКК в направлении грану-лопоэза. Таким образом, состояние гипокортицизма, индуцированное адреналэктомией, стимулирует процессы миграции СКК, тогда как состояние гиперкортицизма, вызванное введением АКТГ пролонгированного действия, угнетает миграцию СКК из костного мозга. Иначе говоря, процессы миграции СКК в организме находятся под гормональным контролем и зависят от уровня глюкокортикоидов в крови, определяемого гипо-физ-адреналовой системой. Подробный анализ этих данных проведен в работах [21, 36].

В целом, результаты проведенных исследований показывают, что процессы миграции СКК контролируются не только Т-системой иммунитета, но и гипофиз-адреналовой.

Роль гуморальных факторов в функциональной

активности стволовых кроветворных клеток

Наряду с известными факторами, влияющими на функции СКК, такими как эритропоэтин, интерлейкин-3, колониестимулирующие факторы и др., осуществлялись попытки идентификации растворимых продуктов регуляторных клеток, контролирующих рассмотренные выше функции СКК. Так, А.М. Поверенный [43] и Т.Н. Семенец [82] зарегистрировали действие на СКК, наряду с отмеченным эффектом тимозина и интерлейкина-3, интерлейкина-2, а также супрессорных факторов, вырабатываемых Т-лимфоцитами стимулированными митогенами КонА и ФГА [43, 44] Роль тимозина в Т-лимфоцитарном контроле дифференцировки СКК регистрировалась и в наших исследованиях [32]. А.А. Ярилиным, помимо уже упоминавшегося интерлейкина-2, впервые были выявлены и описаны гуморальные факторы

Дискуссионные и общетеоретические работы

стимулирующего и ингибирующего действия - продукты предшественников Т-лимфоцитов [ПТЛ], оказывающие влияние на функции СКК [57, 60]. В работе [83] описаны активированные Т-лимфоциты в качестве источника факторов, регулирующих СКК.

Изучение цитокиновой регуляции функций гемопоэти-ческих клеток-предшественников показало также стимулирующее действие интерлейкина-1 на колониеобразующую функцию СКК [84]. Однако в этом случае не исключается опосредованное действие интерлейкина-1 через активность ряда факторов, секретируемых под его влиянием. Показана, например, секреция Т-лимфоцитами колониестимулирующих факторов под влиянием интерлейкина-1, действующих на гемопоэтические клетки [85]. Сходным действием на колониеобразующую способность СКК характеризуется Т^-а - фактор некроза опухоли-альфа [86].

При разработке проблемы В-клеточной регуляции функций СКК было установлено, что хелперное и супрессорное действие В-лимфоцитов на СКК опосредуется, как и в случае Т-лимфоцитарного контроля, через секретируемые ими продукты неиммуноглобулиновой природы. Это было доказано при использовании надосадочной жидкости В-лимфоцитов разной органной локализации, надосадочной жидкости полученных В-клеточных гибридом на основе В-лимфоцитов селезенки или лимфатических узлов, надосадочной жидкости не вырабатывающей иммуноглобулины клеток миеломы, а также выделенных из надосадочной жидкости и очищенных иммуноглобулинов [61, 64].

При анализе клеточных факторов, определяющих функционирование СКК, является очевидной их множественность. Помимо описанных выше клеточных субпопуляций трех основных систем [Т-системы, В-системы, системы клеток мононуклеарных фагоцитов], регуляторное действие на функции СКК оказывают естественные киллеры [30, 87, 88, 89, 90], описано стимулирующее действие эритробластов на колониеобразующую активность СКК [91].

Один из механизмов взаимодействия СКК с регуляторными клетками может включать их прямое взаимодействие по типу рецептор-лиганд, как в случае Т-В-взаимодействий при индукции иммунного ответа, определяемое, например, особенностями молекул главного комплекса гистосовместимости взаимодействующих клеток. Такое взаимодействие может быть индуцирующим, определяющим последующие функции взаимодействующих клеток, включая и продукцию цитокинов регуляторными клетками. Экспрессия СКК различных рецепторных структур, лигандами для которых являются множественные продукты гистологически разных клеточных типов, может определяться степенью их коммитированности, тогда как разная продукция цитокинов различными клеточными типами может определять необходимость их существенного пополнения за счет СКК при тех или иных возникающих потребностях организма.

Однако не может быть исключена и зависимость проявления различных функций СКК от конститутивно продуцируемых регуляторными клетками растворимых продуктов. Множественность цитокинов, продуцируемых гистологически разными клеточными элементами, описана [92, 93] и продолжает изучаться.

Лимфоцитарный контроль пролиферации и дифференцировки стволовых кроветворных клеток, взаимодействующих с аллогенными лимфоцитамим.

Роль тимуса, Т- и В-лимфоцитов

Взаимодействие СКК и несингенных лимфоцитов, не только аллогенных, но и ксеногенных, является важнейшей составной частью открытия Р.В. Петровым и Л.С. Сеславиной

явления взаимодействия СКК и лимфоцитов. Этой проблеме посвящено большое количество публикаций в отечественной и зарубежной литературе, вскрытые механизмы явления и сформулированные на их основе заключения неоднократно публиковались и обобщались в обзорных работах [8, 16, 21, 94, 95]. Ограничимся лишь теми публикациями, как и в случае взаимодействия СКК с сингенными лимфоцитами, которые имеют наибольшее значение для фундаментальной и прикладной иммунологии и клеточной трансплантологии.

Феноменология явления заключается в том, что лимфоциты, взаимодействуя с несингенными СКК в культуре клеток in vivo [в организме летально облученного реципиента], блокируют процессы их пролиферации и дифференцировки. Инактивированные лимфоцитами СКК не образуют колонии в селезенках реципиентов, обычно определяемых на 7-9 сутки после летального облучения реципиентов и трансплантации им клеток. Процессы инактивации СКК лимфоцитами, выделенными из разных тканей, развиваются при сочетании различных несингенных друг другу генотипов, так же как и при использовании облученных реципиентов разных генотипов [7, 8, 94, 96]. Колонии не образуются также в костномозговой полости облученных реципиентов [18]. Анализируемые с помощью хромосомного маркера [Т6Т6] клетки генотипа донорского костного мозга в тканях реципиента не выявляются [11, 35, 97]. Инактивации лимфоцитами подвергаются также аллогенные СКК эндогенного происхождения, определяемые в селезенке на 7-9 сутки после сублетального облучения мышей [34]. В большинстве опытов, за исключением тех, в которых решались проблемы изучения специальных механизмов клеточных взаимодействий, донорами костного мозга [источник СКК] были мыши линии С57BL/6J, донорами клеток тимуса или лимфатических узлов [источник лимфоцитов] были мыши линии CBA, летально облученными реципиентами служили мыши [CBAxC57BL/6J]Fr в селезенках которых определяли колониеобразующую способность костномозговых СКК.

Как и в случае Т-лимфоцитарного контроля функций сингенных СКК, было показано, что процессы миграции, пролиферации и дифференцировки несингенных СКК контролируются зрелыми, резистентными к действию кортизона и к тимэктомии во взрослом состоянии Т-лимфо-цитами, выявляемыми в костном мозге, периферической крови, тимусе, селезенке, лимфатических узлах и в перитонеальном экссудате нормальных мышей [21, 95, 98, 99 100, 101], В-лимфоциты инактивирующей способностью не обладают, но проявляют хелперную активность [68]. Оказалось при этом, что среди Т-лимфоцитов, как и в экспериментах, описанных выше, обнаруживаются по меньшей мере, две субпопуляции эффекторных Т-лим-фоцитов. Одни из них инактивируют несингенные СКК без помощи В-клеток, другие инактивируют несингенные СКК только в результате взаимодействия с сингенными В-лимфоцитами. Проведенные исследования обобщены в работе [21 ].

При изучении механизмов взаимодействия СКК с несин-генными Т-лимфоцитами было доказано, что процессы инактивации несингенных СКК не опосредуются через реакцию «трансплантат против хозяина» [102] и осуществляются живыми несенсибилизированными Т-лимфоцитами при первичном контакте с генетически чужеродными клетка-ми-предшественниками [97]. Активация Т-эффекторов изоантигенами генотипа доноров костного мозга [103], но не посторонними гетерологичными корпускулярными или растворимыми антигенами [эритроциты барана, яичный альбумин, бычий сывороточный альбумин, нормальная лошадиная или кроличья сыворотки [97, 103], усиливает процессы взаимодействия несингенных клеток и сопровождается

Дискуссионные и общетеоретические работы

процессами инактивации несингенных СКК существенно меньшим количеством лимфоидных клеток.

В 1968 г. Р.В. Петров высказал предположение о том, что инактивирующее или тормозящее действие лимфоцитов на несингенные СКК может распространяться и на другие клетки-предшественники, обладающие признаками стволовых элементов в смысле их способности размножаться и дифференцироваться в зрелые формы. Детальный анализ клеток-предшественников, мишеней инактивирующего действия несингенных Т-лимфоцитов, представил доказательства, полностью подтверждающие это предположение. Оказалось, что СКК костного мозга в результате взаимодействия с аллогенными лимфоцитами утрачивают способность формировать колонии кроветворных клеток в селезенке и в костномозговой полости облученных реципиентов, а оставшиеся неинактивированными СКК изменяют характер их дифференцировки в сторону преимущественного образования колоний миелоидного типа [9]. Как отмечалось выше, с помощью хромосомного маркера Т6Т6 доказано, что размножающиеся клетки инактивируемого генотипа не обнаруживаются в селезенке, в костном мозге, тимусе и в лимфатических узлах реципиента. С помощью различных методических приемов установлено, что в результате межклеточных взаимодействий инактивируются предшественники продуцентов антител, определяемые методом Кеннеди в селезенке на серийных срезах [104] и их потомки, определяемые методом Ерне в клеточной популяции спленоцитов [105]. Инактивации подвергаются остеобласты и клетки, формирующие очаги кроветворения в костномозговой полости облученных животных [106]; фетальные СКК печени [107] и опухолевые клетки [108]; клетки селезенки, индуцирующие реакцию «трансплантат против хозяина» [109]; гемоглобин-образующие клетки [110] и др.

На основании анализа имеющихся данных сделано заключение, что феномен взаимодействия несингенных клеток, сопровождающийся инактивацией лимфоцитами несингенных СКК имеет общее значение, развивается против разнообразных активно пролиферирующих клеток-предшественников не только в любом участке кроветворной системы, но и в других участках организма. При этом учет эффекта инактивации несингенных клеток осуществляется различными методами -по блокированию той или иной функциональной активности клеточных элементов или по элиминации того или иного гистологического типа клеток [16].

Характеристика эффекта взаимодействия лимфоцитов с несингенными СКК показала, что основные процессы, обеспечивающие инактивацию функций СКК лимфоцитами, осуществляется в пределах одного часа после трансплантации реципиентам клеточной смеси [111, 112]. По-видимому, в этот период времени развиваются первичные процессы взаимодействия трансплантированных клеток. Последующие этапы этого сложного, развивающегося во времени процесса включают колонизацию тканей облученного реципиента, перераспределение клеток, активацию лимфоцитов со стороны изоантигенов облученного генетически чужеродного реципиента и клеток-мишеней, инактивацию СКК. Колонизация тканей лимфоцитами происходит быстро и завершается за 3-4 часа. Процессы колонизации сменяются процессами перераспределения лимфоидных клеток, которые завершаются за 3-4 суток и приводят к накоплению лимфоцитов в селезенке. В эти сроки и развивается собственно процесс инактивации СКК Т-лимфо-цитами, завершающийся очень быстро - в течение 1-3 дней, как в селезенке, так и в костном мозге реципиентов [113].

Трансплантация облученным реципиентам генетически несовместимых клеточных взвесей, содержащих как СКК, так и лимфоциты обоих генотипов, сопровождается, как правило,

преимущественной инактивацией СКК одного из генотипов смеси клеток [11, 21, 96, 97]. Изучение генетического контроля процессов взаимодействия несингенных СКК и лимфоцитов, показало уникальность феномена, отличающего его от известных проявлений клеточного иммунитета, контролируемых главным комплексом гистосовместимости Н-2 у мышей[114, 115, 116]. Использование огромного спектра различных линий и гибридных мышей разных гаплоти-пов, а также мутантных, рекомбинантных и конгенных линий привело Р.В. Петрова и коллектив, руководимых им иммунологов и иммуногенетиков к заключению о том, что проявление эффекта инактивации СКК лимфоцитами контролируется генетическими структурами как комплекса Н-2, так и не Н-2-комплекса. При этом различия по не Н-2 комплексу даже более значимы для проявления эффекта, по сравнению с различиями только по комплексу Н-2. Иначе говоря, проявление эффекта не определяется преимущественным контролем со стороны главного комплекса гистосовместимости и зависит от еще некартированных генов, не сцепленных с комплексом Н-2 мышей [114, 115, 116].

Заключение

В заключение следует отметить, что полученный массив данных представляет собой не только фундаментальное обоснование принципиальной возможности целенаправленной регуляции функций стволовых клеток [СК], но и выполненные на их основе практически значимые разработки прикладного характера.

Одной из них является формулирование вывода о нецелесообразности лечения лучевых поражений и других состояний, требующих пересадки СКК, смесью клеток от нескольких генетически различающихся доноров, как это предлагалось делать в клинике, из-за взаимной инактивации СКК. Эта проблема изложена в работе Р.М. Хаито-ва [117].

Другой аспект связан с использованием явления инактивации СКК лимфоцитами для поиска веществ направленного лимфотропного действия. Неоднократно демонстрировалось, что эффект инактивации СКК лимфоцитами имеет место не только в системе экзогенного, но и эндогенного колониеобразования [34, 117], т.е. возможен количественный учет реакции «трансплантат против хозяина» [РТПХ] по числу инактивируемых лимфоцитами СКК эндогенного происхождения. Совершенно очевидно, что такая система характеризуется двумя одновременно протекающими процессами -размножением эндогенных СКК и инактивацией их Т-лим-фоцитами. Оба процесса могут быть количественно учтены путем подсчета численности колоний в селезенках животных соответствующих групп. Это дает возможность в одном эксперименте количественно сравнить два наиболее важных критерия иммуномодуляторов различной природы, включая иммунодепрессанты и цитостатики: действие, направленное на подавление пролиферации стволовых клеток [митостатический эффект] и истинно иммунодепрессивное действие [лимфотоксический эффект], направленное на Т-инактивирующие лимфоциты и обеспечивающее отмену их инактивирующей способности. Эти принципы были использованы для разработки экспериментальных систем с целью оценки митостатических и лимфотоксических свойств препаратов различной природы, а также оценки активности препаратов, обеспечивающих отмену действия инициирующих РТПХ лимфоцитов [38, 119, 120, 121]. В разработанных системах испытанные препараты характеризовались активностью, определяемой по теоретически ожидаемым результатам [12].

Еще один аспект разрабатываемой проблемы регуляции функций СКК был использован для оценки эффекторных

Дискуссионные и общетеоретические работы

функций Т-лимфоцитов разных животных, в том числе крупных, при различных иммунозависимых патологических состояниях или при разного рода воздействиях. Заключение о том, что взаимодействие СКК с лимфоцитами генетически не ограничено и инактивация СКК развивается не только при использовании аллогенных, но и ксеногенных лимфоцитов [122, 123], индуцировало разработку новой экспериментальной системы. В этом случае летально облученным реципиентам [CBAxC57BL/6J]F1 трансплантировали только клетки костного мозга мышей линии C57BL/6J или клетки костного мозга мышей C57BL/6J в смеси с лимфоцитами тех или иных животных. По числу колоний, определяемых в селезенке реципиентов через 7-9 суток после трансплантации клеток, судили об инактивирующей активности эффек-торных Т-лимфоцитов. Оказалось, что функции пролиферации и дифференцировки СКК мышей подвергаются инактивирующему действию лимфоцитов собак, овец, кур, морских свинок, крыс [124, 125] и даже человека [126].

Сходная система использовалась в экспериментах с трансплантацией лимфоцитов взрослых кур в смеси с ал-логенными гемопоэтическими клетками на хориоалланто-исную мембрану 10-11-дневных куриных эмбрионов, син-генных донорам лимфоидных клеток. Взаимодействуя с несингенными гемопоэтическими клетками, лимфоциты блокируют их функциональную активность [127]. Это дает возможность характеризовать активность лимфоцитов при разных иммунозависимых патологических состояниях или при различных воздействиях.

Одной из тенденций современного научного сообщества в области медицины и биологии, наблюдаемой в течение ряда последних лет, является возврат существенного интереса к стволовым клеткам [СК] и, в частности, к СКК. Этот возврат определяется открывшимися возможностями клонирования растений и животных, перспективой управления процессами размножения и дифференцировки СК с целью их использования для получения массива клонированных популяций, необходимых для применения в качестве терапевтического средства для лечения гематологических и негематологических заболеваний. Имеется в виду не только терапия лейкозов, но и таких заболеваний, как инсулин-зави-симый сахарный диабет [I типа], ишемическая болезнь сердца, болезнь Альцгеймера и др. Клинические перспективы клеточной терапии с использованием СК и определяемые биологические основы проблемы являются предметом многих дискуссий и обобщений [128, 129, 135].

Не менее интригующей проблемой, практическое решение которой видится в весьма далекой перспективе, является управление функциями СК с целью получения масси-

вов ткани и даже отдельных органов в целях практической медицины. Заключительные этапы этих проблем, по-видимому, являются скорее биотехнологическими проблемами, чем фундаментальными, однако доведение их до практического приложения требует огромных усилий экспериментального характера. Понимание этих задач обусловило проведение множественных исследований, направленных на разработку проблем разного уровня - от обозначения СК разной степени коммитированности [129, 130, 131] и теории специальных ниш, обеспечивающих поддержание СК во взрослом организме в течение неопределенно долгого периода времени и определяющего их функции с помощью определенных сигналов [130, 132], до определения маркерных структур СК на их поверхности, условий поддержания СК в функциональном состоянии, характеристики функций, попыток использования СК в клинической практике [128, 132, 135]. Многие из этих проблем обозначены в монографии Р.М. Хаитова [36], многие дискутируются [133, 131].

Наиболее обсуждаемой проблемой является пластичность СК, определяемая как способность генетически маркированных СК одного органа, например, половозрелой мыши, обеспечивать после трансплантации рост клеток других органов, противореча тем самым установившейся закономерности о линейной ограниченности СК половозрелых млекопитающих [131]. Это обнажает проблему непредсказуемости потенциала пластичности и возможности диффе-ренцировки СК в совершенно ином, непредвиденном, направлении, например, в сторону формирования опухолевых клеток, определяемом, в частности, отсутствием репрессор-ных или контролирующих факторов сингенного организма. Степень контролируемости «вредной» для организма диф-ференцировки СК и последующего размножения данного клона клеток при функционировании СК в генетически несовместимом организме совершенно не ясна. Является очевидным, что на современном уровне знаний не только не снимаются, но и продолжают быть актуальными такие проблемы, как проблемы взаимодействия СК с клетками организма [син-генными - при трансплантации СК сингенным реципиентам и с несингенными - при трансплантации СК генетически чужеродным реципиентам], контролирующими, как это было показано выше, основные функции СКК.

Обозначенные проблемы, как уже отмечалось, подлежат дальнейшей разработке. Однако вне зависимости от результатов этих исследований является очевидной значимость накопленных данных по регуляции основных функций СКК клетками системы иммунитета для решения проблем терапевтического применения СК, стоящих на повестке сегодняшнего дня.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Till J.E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radiat. Res., 1961, v.14, №2, 213-222.

2. Till J.E., McCulloch E.A. Repair processes in irradiated mouse hematopoietic tissue. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1964, v.114, №1, 115-125.

3. Фриденштейн А.Я., Чертков И.Л. Клеточные основы иммунитета. М., Медицина, 1969, 256 с.

4. Хаитов Р.М. Рециркуляция стволовых и лимфоидных клеток в организме: значение для иммуногенеза. В кн.: Общие вопросы патологии. Том 3. Развивающиеся аспекты иммунологии - Иммуногенетика и взаимодействие клеток в иммунном ответе [Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР]. М., 1972, 217-254.

5. Головистиков И.Н., Петров Р.В., Хаитов Р.М. Роль лимфоцитов в передифференцировке стволовых кроветворных клеток. ДАН СССР, 1970, т.194, №5, 1208-1210.

6. Петров Р.В. Эффекты взаимодействия иммунологически несовместимых клеток кроветворных тканей. В кн.: Материалы пленарных заседаний XII Международного конгресса по переливанию крови. М., 1969, 192-208.

7. Петров Р.В., Сеславина Л.С. Инактивация стволовых клеток при контакте генетически несовместимых клеточных взвесей из лимфоидных тканей. ДАН

СССР, 1967, т.176, №5, 1170-1173.

52. Петров Р.В., Сеславина Л.С. Взаимодействие лимфоцитов с кроветворными стволовыми клетками. В кн.: Актуальные проблемы пересадки органов. М., Медицина, 1978, 14-36.

8. Петров Р.В., Швец В.Н. Взаимодействие стволовых кроветворных клеток с лимфоцитами. Проблемы гематологии и переливания крови, 1973, т.18, №10, 48-55.

9. Петров Р.В., Швец В.Н., Манько В.М. Изменение эритроидного типа дифференцировки стволовых клеток на миелоидный под влиянием лимфоцитов. ДАН СССР, 1972, т.204, №2, 489-492.

10. Хаитов Р.М. Экспериментальный анализ практически значимых проблем трансплантации кроветворных тканей облученным реципиентам. Автореферат дис... доктора мед. наук, Ташкент, 1972, 52 с.

11. Петров Р.В., Манько В.М. Взаимодействие Т-лимфоцитов со стволовыми кроветворными клетками: влияние на процессы пролиферации и дифференцировки гемопоэтических клеток-предшественников. В кн.: Иммунология. Том 15. Актуальные проблемы прикладной иммунологии [Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР]. М., 1986, 109-154.

1 2. Петров Р.В. Эффекты взаимодействия иммунологически несовместимых клеток кроветворных тканей. Труды XII Международного конгресса по переливанию крови [М., 17-23.08.1969 г.]. М., Медицина,

Дискуссионные и общетеоретические работы

1972, 437-441.

13. KitamuraY., Kawata T., Kanamaru A. Parental lymph node cell dose necessary to change differentiation pattern of parental colony-forming cells in F, hybrid mice. Transplantation, 1972, v.14, №5, 568-573.

14. Basford N.L., Goodman J.W. Effects of lymphocytes from the thymus and lymph nodes on differentiation of hemopoietic spleen colonies in irradiated mice. J. Cell Physiol., 1974, v.84, №1, 37-48.

15. Манько В.М., Михайлова А.А., Сеславина Л.С. Эффекты и механизмы взаимодействия аллогенных клеток. В кн.: Общие вопросы патологии. Том 3. Развивающиеся аспекты иммунологии - Иммуногенетика и взаимодействие клеток в иммунном ответе [Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР]. М.,

1972, 154-216.

16. Козлов В.А., Колесникова С.М. Влияние возраста мышей на способность стволовых кроветворных клеток взаимодействовать с клетками тимуса. Онтогенез, 1978, т.9, №4, 376-381.

17. Манько В.М. В-лимфоциты регулируют процессы пролиферации и дифференцировки кроветворных стволовых клеток. Гематология и трансфузиология, 1997, т.42, №2, 15-19.

18. Петров Р.В., Швец В.Н., Манько В.М. Влияние лимфоцитов на дифференцировку стволовых кроветворных клеток и проявление эффекта аллогенного ингибирования. Онтогенез, 1973, т.4, №5, 488-496.

19. Петров Р.В., Швец В.Н., Манько В.М. Отмена аллогенного ингибирования и изменение дифференцировки колониеобразующих клеток костного мозга мышей под влиянием сингенных лимфоцитов. Бюл. экспер. биол. и мед., 1975, т.80, №12, 53-56.

20. Манько В.М. Дифференцировка стволовых клеток под влиянием лимфоцитов. В кн.: Иммунология. Том 7. Регуляторные клетки иммунной системы [Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР]. М., 1978, 140-191.

21. Magli M.C., Iscove N.N., Odartchenko N. Transient nature of early haematopoietic spleen colonies. Nature, 1982, v.295, №5849, 527-529.

22. Lord B.I., Dexter T.M. Purification of haemopoietic stem cells - the end of the road? Immunology Today, 1988, v.9, №12, 376-377.

23. Visser J.W.M., Bauman J.G.J., Mulder A.H., Eliason J.F., de Leeuw A.M. Isolation of murine pluripotent hemopoietic stem cells. J. Exp. Med., 1984, v.59, 1576-1590.

24. Visser J.W.M., de Vries P. Isolation of spleen-colony forming cells [CFU-s] using wheat germ agglutinin and rhodamin 123 labeling. Blood cells, 1988, v.14, 369-384.

25. Петров Р.В., Манько В.М. Попытки обнаружения стволовых клеток в головном мозгу мышей. В кн.: Стволовые клетки и опухолевый рост. Киев, Наукова думка, 1985, 77-80.

26. Bartlett P.F. Pluripotential hemopoietic stem cells in adult mouse brain. Proc. Nat. Acad Sci. USA, 1982, v.79, №5, 2722-2725.

27. Benca R.M., Wemhoff G., Quintans J. Functional studies of pluripotential hemopoietic stem cells in mouse brain. J. Neuroimmunology, 1986, v.10, 341-352.

28. Манько В.М., Осипова Е.Ю., Руднева Т.Б., Компаниец Н.А. Влияние сингенных лимфоцитов, Т-иммунодефицита и генотипа доноров костного мозга на дифференцировку «ранних» и «поздних» селезеночных колоний. Цитология, 1985, т.27, №12, 1388-1393.

29. Degliantoni G., Perussia B., Mangoni L., Trinchieri G. Inhibition of bone marrow colony formation by human natural killer cells and by natural killer cell-derived colony-inhibiting activity. J. Exp. Med., 1985, v.161, 1152-1168.

30. Швец В.Н. Регуляторное влияние лимфоидной ткани на кроветворение в экстремальных условиях. Автореф. дис... докт. биол. наук, М., 1979, 37 с.

31. Петров Р.В., Манько В.М., Хаитов Р.М. Влияние Т-лимфоцитов на дифференцировку стволовых кроветворных клеток [Т-лимфоцитов]. В кн.:Стволовые и иммунокомпетентные клетки в норме и при опухолевом росте. Киев, Наукова Думка, 1981, 17-37.

32. Петров Р.В., Манько В.М., Хаитов Р.М., Рябова Л.В., Руднева Т.Б. Факторы, контролирующие дифференцировку стволовых клеток. I. Изменение направления дифференцировки стволовых кроветворных клеток под влиянием дифференцирующих Т-лимфоцитов. Цитология, 1979, т.21, №5, 602-609.

33. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Сеславина Л.С. Подавление эндоколонизации селезенки у сублетально облученных мышей при трансплантации аллогенных лимфоидных клеток. Радиобиология, 1970, т.10, №4, 532-535.

34. Хаитов Р.М. Хромосомный анализ инактивации стволовых клеток при трансплантации смеси костного мозга от генетически различающихся доноров. Бюл. эксперим. биол. и мед., 1970, №6, 88-91.

35. Хаитов Р.М. Физиология иммунной системы. М., ВИНИТИ РАН, 2005, 428 с.

36. Петров Р.В. Регуляторные клетки иммунной системы. В кн.: Иммунология. Том 7. Регуляторные клетки иммунной системы [Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР]. М., 1978, 5-11.

37. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Манько В.М., Михайлова А.А. Контроль и регуляция иммунного ответа. Ленинград, Медицина, 1981, 311 с.

38. Хаитов Р.М., Рябова Л.В. Зависимость дифференцировки стволовых кроветворных клеток от функционального состояния тимуса. Онтогенез, 1978, т.9, №4, 406-410.

39. Стромальная и Т-клеточная регуляция кроветворных стволовых клеток. Международный симпозиум. М., 12-16 марта 1984 г.

40. 1er Forum d'immunologie. T cells as regulators of haematopoiesis. Ann. Immunol. [Inst. Pasteur], 1981, v.135 C, 261-302.

41. Barnes D.W.H., Evans E.P., Ford C.E., West B.J. Stem-cell inactivation in mixed spleen cell cultures investigated with chromosome markers. In: Proc. XII Internat. Congress of Blood Transfusion. Moscow, 1969, 19.

42. Поверенный А.М. Радиочувствительность плюрипотентных стволовых кроветвоных клеток: проблемы определения, перспективы модификации. В кн.: Радиобиология стволовых и клоногенных клеток. Обнинск, НИИ мед. радиологии АМН СССР, 1986, 5-10.

43. Семина О.В. Возможный механизм супрессии Т-клеточными митогенами селезеночного колониеобразования. В кн.: Радиобиология стволовых и клоногенных клеток. Обнинск, НИИ мед. радиологии АМН СССР, 1986, 31-37.

44. Lord B.I., Schofield R. The influence of thymus cells in hemopoiesis: stimulation of hemopoietic stem cells in a syngeneic, in vivo, situation. Blood, 1973, v.42, №3, 395-404.

45. Golub E.S. Brain-associated stem cell antigen: an antigen shared by brain and hemopoietic stem cells. J. Exp. Med., 1972, v.136, №2, 369-374.

46. Poverenny A.M., Semina O.V., Semenets T.N. Regulation of proliferation of stem blood cells and their radiosensitivity. Studia biophysica, 1981, v.80, №1, 75-76.

47. Testa N.G., Schofield R. Rescue of [CFU-S] treated with rabbit anti-mouse-brain serum [RAMB]. Annual report of Patersen Laboratories and Med. Oncology, 1978, 170-171.

48. Поверенный А.М., Семина О.В., Ярилин А.А., Семенец Т.Н. Роль тимусных клеток в селезеночном колониеобразовании. Сообщение 1. Влияние антисыворотки к И-антигену на изменения в селезеночном колониеобразовании. Радиобиология, 1978, т.18, №4, 545-547.

49. Sharkis S.J., Wiktor-Jedrzejczak W., Ahmed A., Santos G.W., McKee A., Sell K.W. Antitheta-sensitive regulatory cell [TSRC] and hematopoiesis: regulation of differentiation of transplanted stem cells in W/Wv anemic and normal mice. Blood, 1978, v.52, №4, 802-817.

50. Wiktor-Jedrzejczak W., Szczylik C., Gornas P., Ahmed A., Scharkis S.J., Siekierzynski M. Antitheta immunization affects hemopoietic colony growth in a theta-incompatible mouse system. Exp. Hematol., 1981, v.9, №1, 22-31.

51. Поверенный А.М., Семина О.В., Семенец Т.Н., Ярилин А.А. Роль тимусзависимых клеток в селезеночном колониеобразовании. Бюл. эксперим. биол. и мед., 1978, т.83, №6, 708-709.

52. Kruszewski J.A., Szczylic C., Wiktor-Jedrzejczak W. The effect of thymus cells on bone marrow transplants into sublethally irradiated mice. Lack of correlation between spleen colony formation and competitive repopulation of granulocytic system. Strahlentherapie, 1984, v.160, №1, 45-51.

53. Monette F. С. The modulation of stem cell-renewal by murine thymocytes. Report jn Internat. Symposium "Stromal and T cell regulation of haemopoietic stem cells”. Moscow, 12-16 march, 1984.

54. Шарова Н.И. Взаимодействие предшественников Т-лимфоцитов с гемопоэтическими стволовыми клетками. Автореф. дис...канд. биол. наук, М., 1987, 23 с.

55. Семина О.В., Семенец Т.Н., Ярилин А.А., Поверенный А.М. Вероятная природа клеточной популяции, способствующей селезеночному колониеобразованию. Бюл. эксперим. биол. и мед., 1981, №4, 485-487.

56. Ярилин А.А. Роль лимфокинов в нормальной регуляции и пострадиационном восстановлении кроветворной и иммунной систем. В кн. Радиобиология стволовых и клоногенных клеток. Обнинск, НИИ мед. радиологии АМН СССР, 1986, 16-26.

57. Ярилин А.А., Мирошниченко И.В., Шарова Н.И. Взаимодействие клеток костного мозга, несущих антиген стволовых клеток и лишенных его, в процессе селезеночного колониеобразования. Иммунология, 1 985, №6, 49-52.

58. Spangrude G.J., Aihara Y., Weissman I.L., Klein J. The stem cell antigens Sca-1 and Sca-2 subdivide thymic and peripheral T lymphocytes into unique subsets. J. Immunol., 1988, v.141, №11, 3697-3707.

59. Манько В.М. Анализ субпопуляций лимфоцитов и механизмов их влияния на дифференцировку кроветворных клеток. Успехи соврем. биол., 1981, т.92, №1[4],81-99.

60. Манько В.М. Т-лимфоцитарная зависимость процессов пролиферации и дифференцировки стволовых кроветворных клеток. Дис. докт. биол. наук. М., 1982, 509 с.

61. Манько В.М., Чоладзе Н.В., Гусева О.А., Сепиашвили Р.И., Ярилин А.А. В-лимфоцитарная регуляция функциональной активности кроветворных стволовых клеток. 1, Влияние активированных В-лимфоцитов селезенки мышей на пролиферацию сингенных кроветворных стволовых клеток костного мозга. Цитология, 1996, т.38, №1, 48-56.

62. Манько В.М., Чоладзе Н.В., Гусева О.А., Ярилин А.А. Регуляторное влияние активированных В-лимфоцитов костного мозга на колониеобразующую способность сингенных кроветворных стволовых клеток. Иммунология, 1997, №2, 21-25.

63. Man'ko V.M. B lymphocyte regulation of proliferation and differentiation of hematopoietic stem cells. Russian J. Immunology, 1996, v.1, №1, 9-16.

64. Monette F.C., Wassef W.Y. Thymocyte involvement in spleen colony formation by subpopulations of hemopoietic stem cells. Exp. Hematol., 1981, v.9, №10, 1011-1019.

65. Санин А.В., Пронин А.В., Бартенева Н.С. Роль !^+-кпеток в регуляции гемопоэза. В кн.: Стволовая кроветворная клетка в норме и при патологии. Томск, 1988, 23-24.

66. Буланова Т.А. К характеристике субпопуляций Т-лимфоцитов-регуляторов костномозгового миелопоэза. В кн.: Стволовая кроветворная клетка в норме и при патологии. Томск, 1988, 13-14.

67. Манько В.М., Халатян Н.А., Руднева Т.Б. Роль В-лимфоцитов в инактивации аллогенных стволовых клеток. ЖМЭИ, 1978, №11, 81-85.

68. Wiktor-Jedrzejczak W., Szczylik C., Gornas P., Ahmed A., Scharkis S.J.,

Дискуссионные и общетеоретические работы

Siekierzynski M. Treatment with antitheta serum affects hemopoietic stem cell HSC proliferation in an in vivo culture system. Biomedicine, 1982, v.36, 236-239.

69. Манько В.М. Роль В-лимфоцитов во взаимодействии Т-лимфоцитов с кроветворными стволовыми клетками. В кн.: Радиобиология стволовых и клоногенных клеток. Обнинск, НИИ мед. радиологии АМН СССР, 1986, 10-16.

70. Манько В.М., Руднева Т.Б., Осипова Е.Ю. Необходимость В-хелперов для регуляции Т-лимфоцитами процесса дифференцировки стволовых кроветворных клеток. Онтогенез, 1991, т.22, №2. 146-152.

71. Гольдина И.А., Гайдуль К.В. Регуляция функциональной активности стволовой кроветворной стволовой клетки костного мозга В-лимфоцитами у мышей. В кн.: Стволовая кроветворная клетка в норме и при патологии. Томск, 1988, 19-21.

72. Манько В.М., Гусева О.А., Мирошниченко И.А., Ярилин А.А. Влияние В-лимфоцитов разного органного происхождения на формирование кроветворных колоний в селезенке. Бюл. эксперим. биол. и мед., 1992, т.108, №2, 170-172.

73. Кравцов В.Д., Ласунская Е.Б., Фрейдлин И.С. Влияние мононуклеарных фагоцитов на дифференцировку сингенных, аллогенных и ксеногенных стволовых кроветворных клеток. Цитология, 1987, т.29, №10, 1156-1160.

74. Козлов В.А., Громыхина Н.Ю. Влияние макрофагов на гемопоэз и иммуногенез. В кн.: Иммунология. Том 13. Актуальные проблемы молекулярной, клеточной и клинической иммунологии [Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР]. М., 1984, 195-216.

75. Петров Р.В., Хаитов Р.М. Миграция стволовых клеток из экранированного костного мозга при неравномерном облучении. Радиобиология, 1972, т.12, №1, 69-76.

76. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Алейеникова Н.В., Гулак Л.В. Факторы, контролирующие рециркуляцию стволовых клеток. Сообщение 3. Влияние тимуса на миграцию и дифференцировку кроветворных стволовых клеток, расселяющихся из экранированного при облучении костного мозга. Радиобиология, 1976, т.16, №4, 560-566.

77. Khaitov R.M., Petrov R.V., Moroz B.B., Bezin G.I. The factors controlling stem cells recirculation. 1. Migration of hemopoietic stem cells in adrenalectomized mice. Blood, 1975, v.46, №1, 73-77.

78. Мороз Б.Б., Безин Г.И., Петров Р.В., Ромашко О.О., Гаврилов В.А. Миграция, пролиферация и дифференцировка стволовых кроветворных клеток в зависимости от уровня эндогенных глюкокортикоидов. В кн.: Стволовые и иммунокомпетентные клетки в норме и при опухолевом росте. Киев, Наукова думка, 1981, 86-99.

79. Хаитов Р.М., Петров Р.В., Мороз Б.Б., Безин Г.И. Факторы, контролирующие рециркуляцию стволовых клеток. Сообщение 1. Влияние адреналэктомии на миграцию кроветворных стволовых клеток из экранированного при облучении костного мозга. Радиобиология, 1974, т.14, №4, 516-521.

80. Bezin G.I., Khaitov R.M., Moroz B.B., Petrov R.V. The factors controlling stem cells recirculation. 2. ACTH-induced inhibition of migration of hemopoietic stem cells. Blood, 1975, v.46, №1, 79-84.

81. Безин Г.И., Хаитов Р.М., Мороз Б.Б., Петров Р.В., Ромашко О.О. Факторы, контролирующие рециркуляцию стволовых клеток. Сообщение 2. Влияние АКТГ на миграцию стволовых кроветворных клеток из экранированного участка костного мозга у облученных мышей. Радиобиология, 1975, т.15, №2, 193-196.

82. Семенец Т.Н. Стимуляция селезеночного колониеобразования рекомбинантным интерлейкином-2. В кн.: Радиобиология стволовых и клоногенных клеток. Обнинск, НИИ мед. радиологии АМН СССР, 1986, 38-42.

83. Schrader J.W., Clark-Lewis I., Bartlett P.F. Lympoid stem cells. In: Biol. Bone Marrow Transplant. Proc. ICN-UCLA Simposia on Mokecular and cellular biology. Keystone, Colorado, 1980, v.17. Ed. R.P. Gale, C.F. Fox. Acad. Press, New York e.a., 1980, 443-459.

84. Громыхина Н.Ю., Гайдуль К.В., Коваль Н.Б., Козлов В.А. Участие интерлейкина-1 в регуляции пролиферативной активности кроветворной клетки. В кн.: Стволовая кроветворная клетка в норме и при патологии. Томск, 1988, 16-18.

85. Nakai S., Aibara K., Hirai Y. Interleukin-1 potentiates granulopoiesis and thrombopoiesis by producing hematopoietic factors in vivo. Life Sciences, 1989, v.45, №7, 585-591.

86. Sloirdal L., Warden D.J., Moore M.A.S. Effect of recombinant murine tumor necrosis factor on hemopoietic reconstitution in sublethally irradiated mice. J. Immunol., 1989, v.142, №3, 833-835].

87. Hansson M., Kiessling R. NK surveillance of primitive normal cells in the thymus and bone marrow. In: Natural killer cells. Ed. B. Serrou e.a. Amsterdam e.a.: Elsevier Biomed. Press, 1982, 7-16.

88. Kannourakis G., Begley C.G., Johnson G.R., Werkmeister J.A., Burns G.F. Evidence for interactions between monocytes and natural killer cells in the regulation of in vitro hemopoiesis. J. Immunol., 1988, v.140, №8, 2489-2494.

89. Kiessling R., Wigzell H. Surveillance of primitive cells by natural killer cells. Curr. Microbiol. Immunol., 1981, v.92, 107-113.

90. O'Brien T.K., Kendra J.A., Stephens H.A.F., Knight R.A., Barrett A.J. Recognition of marrow elements by natural killer cells. Are NK cells involved in haemopoietic regulation? Brit. J. Haematol., 1983, v.53, 161-164.

91. Сенников С.В., Козлов В.А. Эритробласты - клетки-регуляторы в системе гемопоэза. В кн.: Стволовая кроветворная клетка в норме и при патологии. Томск, 1988, 21-23.

92. Hermann F., Mertelsmann R. Polypeptides controlling hematopoietic cell

development and activation. I. In vitro results. Blut, 1989, v.58, 117-128.

93. Hermann F., Mertelsmann R. Polypeptides controlling hematopoietic blood cell development and activation. II. Clinical results. Blut, 1989, v.58, 173-179.

94. Петров Р.В., Сеславина Л.С. Взаимодействие лимфоцитов с кроветворными стволовыми клетками. ЖМЭИ, 1977, №11, 28-42.

95. Man'ko V.M. Lymphocytic regulation of hemopoiesis. In: Immunology reviews. Cell Interaction, Myelopeptides, Artificial immunogenes. Ed. R. Petrov. London e.a., Harwood Academic Publishers GmbH, 1987, v.1, 3-147.

96. Петров Р.В., Манько В.М., Пантелеев Э.И., Сеславина Л.С. Взаимодействие генетически различающихся соматических [лимфоидных] клеток, трансплантированных летально облученным реципиентам. Цитология, 1969, т.11, №9, 1149-1161.

97. Petrov R.V., Man'ko V.M., Panteleyev E.I., Seslavina L.S. Inactivation of stem cells after transplantation of mixtures of haemopoietic or lymphoid cells of different genotypes. Transplantation, 1969, v.7, №3, 165-175.

98. Игнатьева Г.А., Манько В.М., Руднева Т.Б. Инактивация стволовых клеток аллогенными лимфоцитами: конкуренция между Т1- и Т2-субпопуляциями. Бюл. эксперим. биол. и мед., 1977, т.83, №6, 709-711.

99. Компаниец Н.А., Манько В.М., Руднева Т.Б. Влияние аллогенных лимфоцитов на процесс колониеобразования при культивировании клеток-предшественников в перитонеальной полости. ЖМЭИ, 1983, №6, 103-105.

100. Манько В.М., Руднева Т.Б. Инактивация стволовых клеток Т- и В-лимфоцитами. ДАН СССР, 1975, т.220, №1, 213-215.

101. Манько В.М., Руднева Т.Б., Халатян Н.А., Игнатьева Г.А. Угнетение функциональной активности стволовых клеток Т- и В-лимфоцитами. В кн.: Роль стволовых клеток в лейкозо- и канцерогенезе. Киев, 1977, 56-58.

102. Петров Р.В., Хаитов Р.М., Егорова В.С. Цитогенетический анализ феномена инактивации несингенных стволовых клеток. ДАН СССР, 1969, т.189, №6, 1371-1373.

103. Манько В.М. Значение антигенного стимула для инактивации стволовых клеток аллогенными лимфоцитами. Цитология, 1977, т.19, №10, 1176-1181.

104. Манько В.М., Петров Р.В., Кудряшов В.М., Руднева Т.Б. Взаимодействие аллогенных лимфоцитов и клеток-предшественников при первичном и вторичном иммунном ответе. Онтогенез, 1 976, т.7, №2, 123-130.

105. Petrov R.V., Seslavina L.S., Panteleyev E.I. Stem-cell inactivation in mixed spleen cell cultures. Nature, 1968, v.217, №5128, 558-560.

106. Швец В.Н., Манько В.М. Угнетение кроветворения и формирования остеобластов в костномозговой полости летально облученных мышей после трансплантации аллогенных лимфоцитов. Бюл. эксперим. биол. и мед., 1971, №12, 84-87.

107. Василейский С.С., Петров Р.В. Инактивация колониеобразующей активности эмбриональных кроветворных клеток при трансплантации от двух генетически несовместимых доноров. Бюл. эксперим. биол. и мед., 1969, №7, 86-87.

108. Wigzell H. Immunological depression of tumor growth in F1 hybrid/ parental strain systems. Cancer Res., 1961, v.21, №3, 365-370.

109. Пантелеев Э.И., Хаитов Р.М. Феномен инактивации несингенных клеток-предшественников, вызывающих реакцию трансплантат против хозяина у мышей. Бюл. эксперим. биол. и мед., 1972, №4, 86-89.

110. Popp R.A., Cosgrove F.E., Popp D.M. Relative ability of parental marrows to repopulate lethally irradiated F1 hybrids.

111. Манько В.М., Петров Р.В., Сидорович И.Г., Краскина Н.А. Использование антилимфоцитарной сыворотки с целью определения времени, необходимого для инактивации лимфоцитами аллогенных стволовых клеток. Бюл. эксперим. биол. и мед., 1973, №9, 81-83.

112. Man'ko V.M., Petrov R.V., Sidorovich I.G., Kraskina N.I. Effect of ALS on transplanted lymph node cells: determination of time required for inactivation of CFU by allogeneic lymphocytes. Folia Biologica, 1973, v.19, №5, 305-314.

113. Манько В.М., Петров Р.В., Руднева Т.Б. Временная характеристика процесса инактивации стволовых клеток аллогеными лимфоцитами. Цитология, 1977, т.19, №5, 559-564.

114. Пантелеев Э.И., Сеславина Л.С., Дишкант И.П. Г енетический контроль функциональной активности лимфоцитов. В кн.: Иммунология. Том 7. Регуляторные клетки иммунной системы [Итоги науки и техники, ВИНИТИ АН СССР]. М., 1978, 192-222.

115. Сеславина Л.С. Взаимодействие лимфоцитов с кроветворными стволовыми клетками и его иммуногенетический анализ. Дис. докт. мед. наук. в форме научного доклада. М., 1986, 41 с.

116. Petrov R.V., Seslavina L.S., Pantelejev E.I., Yegorova O.S. Inactivation of stem cells lymphocytes nonlinked to the H-2 histocompatibility system. Transplant. Proc., 1977 v.9 №1, 555-557.

117. Хаитов Р.М. Репопуляция костномозговых клеток в реципиентах различных линий мышей при совместной трансплантации от трех генетически различающихся доноров.Радиобиология, 1971, т.11, №5, 767-771.

118. Kitamura Y., Kawata T., Suda O., Ezumi K. Changed differentiation pattern of parental colony-forming cells in F1 hybrid mice suffering from graft-versus-host disease. Nransplantation, 1970, v.10, №6, 455-462.

119. Петров Р.В., Манько В.М., Хаитов Р.М., Сеславина Л.С. Экспериментальная модель для одновременного определения митостатического и лимфотоксического действия цитостатиков и иммунодепрессантов. Цитология, 1972, т.14, №1, 121-127.

120. Petrov R.V., Man'ko V.M., Khaitov R.M., Seslavina L.S. An experimental system for simultaneous estimation of mitostatic and lymphotoxic effects of immunosuppressants and cytostatics. J. Exp. Med., 1971, v.133, №3, 640-648.

Дискуссионные и общетеоретические работы

121. Petrov R.V., Man'ko V.M., Khaitov R.M., Seslavina L.S. A new quantitative GVH assay: simultaneous estimation of mitostatic and lymphotoxic effects of immunosuppressants. Transplant. Proc., 1971, v.3, №1, 427-429.

122. Ковальчук Л.В., Хаитов Р.М. Способность крысиных стволовых клеток образовывать гемопоэтические колонии в селезенке летально облученных мышей. Радиобиология, 1971, т.11, №5, 765-766.

123. Ковальчук Л.В., Хаитов Р.М., Швец В.Н. Особенности клонирования стволовых клеток крысиного генотипа в селезенке летально облученных мышей. Цитология, 1973, т.15, №1, 90-96.

124. Манько В.М., Боровкова Н.В., Андрущенко В.Н. Исследование функциональной активности лейкоцитов периферической крови интактных и облученных собак in vivo в тесте инактивации эндогенных кроветворных клеток сублетально облученных мышей. Радиобиология, 1995, т.35, №3, 412-417.

125. Манько В.М., Губарев М.И., Руднева Т.Б., Благонравова О.Л., Безин Г.И., Андрианова И.Е., Гаджиев Р.И. Инактивация кроветворных стволовых клеток мышей лейкоцитами разных видов животных. Иммунология, 1991, №5, 22-24.

126. Дозморов И.М., Задорожный С.И., Орлов Э.В., Петров Р.В. Взаимодействие лимфоцитов человека с кроветворными стволовыми клетками мыши. ДАН сСсР, 1987, т.296, №1, 246-248.

127. Lafferty K.J. An alternate mechanism for immune recognition. In: Biochem. gene expression higher organisms. Proc. Symp., Sydney, 1972. Sydney,

1973, 593-605.

128. Владимирская Е.Б., Майорова О.А., Румянцев С.А., Румянцев А.Г.

Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками. М., Медпрактика-М, 2005, 391 с.

129. Kondo M., Wagers A.J., Manz M.G., Prohaska S.S., Scherer D.C., BeilhackG.F., Shizuru J.A., Weissman I.L. Biology of hematopoietic stem cells and progenitors: implications for clinical application. Annu. Rev. Immunol., 2003, v.21, 759-806.

130. Li L., Xie T. Stem cell niche: structure and function. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 2005, v.21, 605-631.

131. Raff M. Adult stem cell plasticity: fact or artifact? Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., 2003, v.19, 1-22.

132. Schofield R. The relationship between spleen colony-forming cell and the haemopoietic stem cell. A hypothesis. Blood cells, 1978, v4, №1-2, 7-25.

133. Манько В.М., Швец В.Н. Учет колониеобразующей способности стволовых клеток и их инактивации аллогенными лимфоцитами методом гистологических срезов селезенки облученных реципиентов. Радиобиология, 1972, т.12, №2, 199-204.

134. Шарова Н.И., Ярилин А.А., Мирошниченко И.В., Сорокина Н.И., Филиппович И.В. Хелперный эффект предшественников Т-лимфоцитов на гемопоэз. Роль гуморальных факторов в этом процессе. В кн.: Радиобиология стволовых и клоногенных клеток. Обнинск, НИИ мед. радиологии АМН СССР, 1986, 42-44.

135. Владимирская Е.Б., Румянцев А.Г. Дифференцировочные потенции стволовых гемопоэтических клеток. Вопросы гематол./онкол. и иммунопатол. в педиатрии, 2002, т.1, №1, 7-11.

А