СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРА ГИДРАТА КОЛЛАГЕНОВ ПРЕСНОВОДНЫХ ГИДРОБИОНТОВ
FRESHWATER HYDROBIONT COLLAGEN HYDRATE SOLUTION PREPARATION METHOD

Изобретение относится к биотехнологической промышленности, а именно к способу получения раствора гидрата коллагена из дермальных покровов пресноводных бесчешуйчатых гидробионтов и может быть использован для получения или обогащения медицинских и косметических препаратов, биологически активных добавок, а также функциональных и специализированных продуктов питания.
Из уровня техники известен способ получения коллагенового продукта (патент RU 2614273, заявка 2014146938, приоритет от 24.11.2014, патентообладатель Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Воронежский государственный университет инженерных технологий»), включающий приемку шкуры пресноводных рыб, очищение их от чешуи, прирезей мышечной ткани, плавников и механических загрязнений, первичную промывку, перекисно-щелочную обработку промытых шкур смесью пероксида водорода и гидроксида натрия с массовой концентрацией 3% и выдержку в течение 1,5-2 часов при температуре 20-25°С и гидромодуле 1:4, последующую промывку шкур в проточной воде при температуре 8-12°С в течение 10-15 мин, выдержку промытых шкур в растворе органической кислоты с последующей их гомогенизацией и фасовкой.
Недостатком способа является недостаточный выход количества полученного негидрализованного коллагена, а также большое количество примесей, солей, образованных в результате кислотно-шелочных реакций и микроэлементов в составе кожи рыбы.
Также, известен способ получения коллагена морских гидробионтов (Jency, G.; Dr. Manjusha, W.A. Extraction and Purification of Collagen from Marine Squid Uroteuthis Duvauceli. Int. J. Pharma Bio Sci. 2020, 10, doi:10.22376/ijpbs/lpr.2020.10.4.177-89.). Согласно этому способу, кожу гидробионтов рода Dosidicus отделяли от мантии и лиофилизировали при 20°С и давлении 0,03 мБар. Лиофилизованную кожу гомогенизировали на механическом диспергаторе IKA при скорости 2600 об/мин. Полученный порошок весом 50 граммов помещали в плоскодонную колбу для экстракции не коллагеновых белков и липидов. 250 мл PBS буферного раствора рН 8.4, содержащего трипсин (2000 ед. активности) и фосфолипазу А (2500 ед. активности) добавили к 50 грамм порошка и перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов с периодической обработкой ультразвуком (2.4 кГц) в течение 1 минуты каждый час. Коллагеновые белки отделили центрифугированием при 2500 об/мин и поместили в плоскодонную колбу объемом 500 мл, добавили 300 мл 0.2 М раствора NaOH и перемешивали в течение 6 часов. Коллагеновые белки осадили центрифугированием при 2500 об/мин и полученный осадок использовали для выделения кислотно-растворимого коллагена. К осадку добавили 300 мл 3% уксусной кислоты и перемешивали 3 часа при периодическом воздействии ультразвука. Нерастворимую фракцию отделили центрифугированием при 1500 об/мин. Полученный коллоидный раствор нейтрализовали 0.2 М NaOH до рН 7.4, осадок коллагена 1-го типа выделили центрифугированием при 3500 об/мин. Осадок промыли тремя порциями дистиллированной воды до исчезновения кислой реакции и лиофилизировали.
Недостатком способа является его высокая технологичность, трудно воспроизводимая при потоковом производстве, большая длительностью технологического процесса, а также возможность присутствия ионов тяжелых металлов в шкурах морских гидробионтов.
В качестве прототипа выбран способ получения высокомолекулярного коллагена (патент RU 2746215, заявка 2020117376, приоритет от 14.05.2020, патентообладатель Хитров Анатолий Анатольевич, Басарыгин Артем Сергеевич) включающий промывку раствором с пищевым растворителем жира на основе фруктовой кислоты, перекисно-щелочную обработку промытых шкур пероксидом водорода с массовой концентрацией 4,0÷10,0% и использованием органической кислоты для достижения рН раствора 1,0÷3,0. Во время выдержки осуществляют воздействие ультразвуком, после выдержки в растворе органических кислот шкуры измельчают до частиц размером 2,0÷5,0 мм, нейтрализуют щелочным раствором до рН 4,5÷7,0, после гомогенизации смесь фильтруют от остатков неразволокненной шкуры. В фильтрат добавляют дистилированную воду в соотношении 1:5÷1:10 и подвергают холодной стерилизации, дополнительной ультрафильтрации для удаления химических примесей и концентрирования. Далее повторно стерилизуют ультрафиолетом.
Недостатком прототипа является высокая трудоемкость, большая длительность технологического процесса, а также отсутствие его селективности и по подтверждения качественных характеристик готового продукта.
Задачей настоящего изобретения является создание нового способа получения раствора нативного гидрата нативного коллагена пресноводных бесчешуйчатых гидробионтов, для широкого использования в пищевой, косметической, медицинской и других отраслях промышленности.
Технический результат - повышение выхода нативных молекул коллагена с сохранением фибриллярной структуры его молекул без денатурации и расщепления молекулы до аминокислот и/или пептидов в гидратированной форме, при значительном сокращении времени всего технологического процесса с 7 суток до 48 часов.
2
Поставленная задача и технический результат - повышение выхода нативных молекул коллагена в гидратированной форме и значительное сокращение времени технологического процесса, достигаются за счет использования низко концентрированных органических кислот для разволокнения дермальных покровов безчешуйчатых гидробионтов в сочетании с непрерывной мягкой ультразвуковой обработкой. Качество технического результата достигается за счет обработки специфическими ферментами полученного продукта, в том числе коллагеназой. Первичную промывку осуществляют проточной водой, содержащей 1 масс. % пищевых поверхностно-активных веществ и при механическом перемешивании в системе барабанного типа. Обесцвечивание дермальных покровов и удаление посторонних примесей осуществляют в перекисно-щелочном растворе, содержащем 750 мМ гидроксида натрия и 300 мМ перекиси водорода, до обесцвечивания кожных покровов. Обработанные дермальные покровы пресноводных гидробионтов дополнительно промывают проточной водой в массовом соотношении дермальные покровы : вода - 1:3 соответственно при постоянном перемешивании, после чего проводят разволокнение в растворе слабой органической кислоты (яблочной, молочной, лимонной, уксусной) при рН=4,0 и воздействии низкоинтенсивного ультразвука частотой 100 кГц в течении 48 часов. После удаления жидкой фазы к полученному полуфабрикату добавляют дистиллированную воду в массовом соотношении полуфабрикат : вода 1:3÷1:5 соответственно и проводят гомогенизацию до получения дисперсии использованием гомогенизатора лопаточного типа мощностью 400 Вт в течение 5 минут с частотой вращения ножа 600 об/мин. Полученную дисперсию фильтруют с использованием фильтра с диаметром пор 0.45 мкм после чего проводят холодную стерилизацию с использованием ультрафиолетового излучения с длиной волны бактерицидного потока 253,7 нм и интенсивностью облучения, не менее 14 Вт/м.
Дополнительная сортировка шкуры пресноводных гидробионтов перед первичной промывкой и их измельчение после разволокнения не требуется.
Технический результат достигается тем, что в способе получения раствора гидрата коллагенов пресноводных гидробионтов, включающем приемку шкуры пресноводных бесчешуйчатых рыб, очищение их от прирезей мышечной ткани, плавников и механических загрязнений, первичную промывку и выдерживание дермальных покровов в перекисно-щелочном растворе, последующую промывку обработанных дермальных покровов пресноводных гидробионтов проточной водой при температуре 8-12°С в течение 10-15 мин, последующую выдержку промытых шкур в растворе слабой органической кислоты, гомогенизацию, фильтрацию, холодную стерилизацию с использованием ультрафиолетового излучения, фасовку, согласно изобретению, первичную промывку осуществляют раствором, содержащим 1 масс. % пищевых поверхностно-активных веществ в воде и соотношении раствор пищевых поверхностно-активных веществ : сырье – 2 л раствора : 1 кг сырья, соответственно, при механическом перемешивании в системе барабанного типа с частотой вращения барабана не менее 400 об/мин при комнатной температуре, выдерживание дермальных покровов осуществляют в перекисно-щелочном растворе, содержащем 750 мМ гидроксида натрия и 300 мМ перекиси водорода, при комнатной температуре до обесцвечивания кожных покровов при соотношении раствор : сырье – 2,5 л раствора : 1 кг сырья, соответственно, дермальные покровы пресноводных гидробионтов дополнительно промывают проточной водой до полного удаления кислоты и щелочи при массовом соотношении дермальные покровы : вода – 1:3, соответственно, при постоянном перемешивании, операцию повторяют трижды, выдерживая при постоянном перемешивании 10-15 мин на каждом этапе, после чего дермальные покровы выдерживают в растворе слабой органической кислоты c концентрацией 117 мМ при рН 4 в течение 48 часов и постоянном воздействии ультразвука частотой 100 кГц, а затем проводят удаление жидкой фазы путем ее слива, к полученному полуфабрикату добавляют дистиллированную воду в диапазоне массовых соотношений полуфабрикат : вода – 1:3÷1:5, соответственно, и проводят гомогенизацию с использованием гомогенизатора лопаточного типа мощностью 400 Вт в течение 5 минут с частотой вращения ножа 600 об/мин до получения дисперсии, полученную дисперсию фильтруют с использованием фильтра с диаметром пор 0,45 мкм.
Способ получения раствора нативного гидрата коллагена пресноводных гидробионтов осуществляется следующим образом. Способ включает приемку шкуры пресноводных рыб, таких как сом, веслонос, осетр, очищение их от прирезей мышечной ткани, плавников и механических загрязнений, первичную промывку осуществляют раствором, содержащим 1 масс. % пищевых поверхностно-активных веществ в воде и массовом соотношении раствор пищевых поверхностно-активных веществ : сырье - 2:1, с механическим перемешиванием в устройстве барабанного типа с частотой вращения барабана не менее 400 об/мин. при комнатной температуре, перекисно-щелочную обработку промытых шкур раствором, содержащим 750 мМ гидроксида натрия и 300 мМ перекиси водорода до обесцвечивания кожных покровов при комнатной температуре, последующую троекратную промывку шкур проточной водой при температуре 8÷12°С в течение 10÷15 мин, при массовом соотношении дермальные покровы : вода - 1:3, соответственно, при постоянном перемешивании, выдержку промытых шкур в растворе слабой органической кислоты при рН раствора, равном 4,0, во время выдержки осуществляют воздействие ультразвука частотой 100 кГц, затем путем слива отделяют жидкую фазу, после шкуры гомогенизируют и фильтруют, в фильтрат добавляют воду в соотношении 1:3÷1:5, осуществляют холодную стерилизацию и фасовку.
Пример 1 реализации способа.
Способ включает приемку шкуры пресноводных бесчешуйчатой рыбы - Сом Европейский (Siluris glanis), очищение их от прирезей мышечной ткани, плавников и механических загрязнений. Первичную промывку 3 кг дермальных покровов сома осуществляют водным раствором, содержащим пищевых поверхностно-активных веществ 1 масс. %, взятом в объеме 6 л, при механическом перемешивании в устройстве барабанного типа с частотой вращения барабана не менее 400 об/мин. при комнатной температуре.
2
Перекисно-щелочную обработку промытых шкур проводят раствором, взятом в объеме, равном 7,5 л, содержащим 750 мМ гидроксида натрия и 300 мМ перекиси водорода в течение 40 минут при комнатной температуре, то есть до полного обесцвечивания шур, последующую промывку сырья проводят с использованием проточной воды в массовом соотношении дермальные покровы : вода 1:3, соответственно при постоянном перемешивании, операцию повторяют троекратно при температуре 8÷12°С в течение 10÷15 мин каждая на горизонтальной платформе с частотой вращения не менее 100 об/мин., выдержку промытых шкур в растворе, содержащим 1 масс. % уксусной кислоты при рН раствора 4,0 в течении 48 часов, соответственно, во время выдержки осуществляют непрерывное воздействие ультразвука с частотой 100 кГц, проводят удаление жидкой фазы путем слива, после сырье гомогенизируют с использованием гомогенизатора лопаточного типа мощностью 400 Вт в течение 5 минут с частотой вращения ножа 600 об/мин до получения гомогенной дисперсии и фильтруют с использованием фильтра с размером пор 0.45 мкм, в фильтрат добавляют воду в соотношении 1:3, осуществляют холодную стерилизацию с использованием ультрафиолетового излучения с длиной волны бактерицидного потока 253,7 нм и интенсивностью облучения, не менее 14 Вт/м, после чего осуществляют фасовку.
Пример 2 реализации способа.
Способ аналогичен примеру 1. За исключением следующего. Для получения раствора нативного гидрата коллагена использовали шкуру Веслоноса (Polyodon spathula). После троекратной промывки сырья с использованием проточной воды в массовом соотношении дермальные покровы : вода 1:3, соответственно при постоянном перемешивании на горизонтальной платформе с частотой вращения не менее 100 об/мин., при температуре 8÷12°С в течение 10÷15 мин каждая, шкуры заливают 1 масс % раствором лимонной кислоты, а после стадии фильтрации в фильтрат добавляют воду в соотношении 1:5. Полученный в обоих примерах продукт имеет янтарный цвет и содержит свыше 90% коллагеновых белков от общей доли белков в растворе.
Заявленное изобретение на практике показало свою эффективность в достижении технического результата (фиг 1).
На фиг. 1 приведена электрофореграмма раствора коллагенов, выделенных из разных организмов до и после расщепления различными ферментами. А) Продукты расщепления после обработки коллагеназой в течение 10, 30 и 60 мин.; В) Продукты трипсинолиза: 1. - коллаген Сома Европейского (Silurus glanis); 2. - коллагена крупного рогатого скота (КРС); С) Продукты расщепления после воздействия смесью слабокислых протеаз: коллаген Сома Европейского (Silurus glanis); 2. - коллагена крупного рогатого скота (КРС);
Предложенный способ может быть реализован в условиях промышленного производства с использованием стандартного оборудования, общеизвестных технологий и материалов. Специалисту в данной области техники очевидно множество других вариантов осуществления изобретения, представленного в приведенном выше описании. Поэтому, следует понимать, что изобретение не ограничивается конкретным раскрытием воплощения и другие варианты выполнения могут быть включенными в объем предлагаемой формулы.