Исследование мембранных рецепторов Т-лимфоцитов в индуцированной мокроте больных бронхиальной астмой и хроническим обструктивным бронхитом

УДК 616.248+616.233-002-008.8:578.233.22

С.А.Пазыч, В.А.Невзорова, Е.Н.Кабанов

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕМБРАННЫХ РЕЦЕПТОРОВ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ИНДУЦИРОВАННОЙ МОКРОТЕ БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ И ХРОНИЧЕСКИМ ОБСТРУКТИВНЫМ БРОНХИТОМ

Владивостокский государственный медицинский университет

РЕЗЮМЕ

Цель исследования: изучить рецепторную активность Т-лимфоцитов в индуцированной мокроте больных бронхиальной астмой и хроническим бронхитом в динамике заболевания и при использовании различных методов лечения. Материал для исследования - клеточный осадок индуцированной мокроты. Рецепторы определяли иммунофлюоресцентным методом с помощью моноклональных антител. Исследование показало, что содержание клеток, имеющих CD4, CD8, CD25 и HLA-DR-рецепторы в индуцированной мокроте различно у больных астмой и хроническим об-структивным бронхитом и зависит в обеих группах от периода заболевания и используемой терапии. Данный анализ индуцированной мокроты может быть использован для мониторинга активности воспалительного процесса в дыхательных путях при этих заболеваниях и эффективности проводимой терапии.

SUMMARY

S.A.Pazych, V.A.Nevzorova, E.N.Kabanov

THE STUDY OF T-LYMPHOCYTE MEMBRANE RECEPTORS IN INDUCED SPUTUM OF PATIENTS WITH ASTHMA AND CHRONIC OBSTRUCTIVE BRONCHITIS

The purpose of the study was to analyze receptor activity of T-lymphocytes in induced sputum of patients with asthma and chronic obstructive bronchitis. We used cell precipitate of induced sputum. Receptors were determined by immune fluorescent method with monoclonal antibodies. Study showed that the content of cells containing CD4, CD8, CD25 и HLA-DR-receptors in induced sputum is different in patients with asthma and chronic obstructive bronchitis and is correlated in both groups with disease stage and the therapy used. This analysis can be used to monitor inflammation process activity in respiratory tract in patients with the above diseases and therapy used.

На сегодняшний день Т-лимфоциты рассматриваются в качестве главного звена в прогрессировании бронхиальной астмы (БА) и хронического обструктивного бронхита (ХОБ) у взрослых, как на местном, так и на системном уровнях. Причем патогенетиче-

ское значение имеют клетки, находящиеся в функционально активном состоянии и несущие на своей поверхности выявляемые фенотипические молекулы. Так у больных БА на мембранах эозинофилов и лимфоцитов повышается экспрессия СБ11Ъ, СБ54, СБ63, СБ25, СБ4 и НЬЛ-БЯ рецепторов [3]. При ХОБ увеличивается число СБ3, СБ8, СБ68, СБ25, НЬЛ-БЯ лимфоцитов. При этом повышение количества СБ8 лимфоцитов считают биологическим маркером ХОБ [5, 11]. Т-лимфоциты играют важнейшую роль в антиген-обусловленном воспалительном процессе, поскольку это единственные клетки, способные распознавать антигенный материал после обработки антиген-представляющими клетками [6]. Активированные таким образом СБ4+ и СБ8+ Т-лимфоциты вырабатывают большое количество белковых медиаторов, включая цитокины, обладающие способностью управлять дифференцировкой, привлечением, накоплением и активацией специфических гранулоцитов на поверхности слизистой оболочки [8].

Одним из наиболее ценных диагностических методов, используемых в клинике легочных заболеваний, является исследование мокроты. В последние годы большой распространенностью пользуется метод индуцированной мокроты, то есть получение мокроты после ингаляции 3-5%-ного гипертонического раствора №С1. Достоинством этого метода является простота выполнения процедуры, неинвазив-ность, безопасность и высокая доверительность, а также низкое число побочных эффектов [1].

Цель исследования: изучить состояние рецепторов СБ4, СБ8, СБ25 и НЬЛ-БЯ на лимфоцитах индуцированной мокроты (ИМ) больных БА и ХОБ в различные периоды заболевания и при использовании различных способов терапии.

Материалы и методы

В исследование были включены 45 больных БА. В стадию обострения было обследовано 24 пациента, из которых 13 имели среднюю степень тяжести, 11 -тяжелую. Все больные в этот период получали терапию глюкокортикостероидами (ГКС) - будесонид в дозе 800-1800 мкг/сут, или преднизолон 20 мг/сут. Обследовано 21 больных БА, находящихся в ремиссию заболевания. Из них 12 человек со средней степенью тяжести, 9 человек с тяжелым течением болезни. Все больные получали базисную терапию ГКС - будесонид в дозе 400-800 мкг/сут, или сочетанную терапию будесонид 600-1000 мкг/сут и преднизолон

10 мг/сут.

Также обследовано 40 больных ХОБ. В период обострения ХОБ было обследовано 26 человек, 15 из которых имели среднетяжелое течение заболевания,

11 - тяжелое. Все пациенты в фазу обострения получали теопек 300 мг - 1-2 раза в сутки.

В стадию ремиссии ХОБ обследовано 14 человек, при одинаковом количестве больных со средней и тяжелой степенями тяжести течения заболевания. В период ремиссии 9 человек получали терапию теопе-ком в дозе 300-600 мг/сут.

Контрольную группу составили 8 здоровых некурящих добровольцев без клинических, лабораторных, функциональных и морфологических признаков воспаления и обструкции бронхов.

Материалом для исследования служил клеточный осадок индуцированной мокроты, которую получали после ингаляции 3-5%-ного гипертонического раствора, используя ультразвуковой небулайзер. Для диспергирования и гомогенизации мокроты использовали раствор дитиотриетол - вещество с низким окислительновостановительным потенциалом, разрушающее дисульфидные связи гликопротеинов слизистого секрета и не оказывающее влияния на клеточные и растворимые факторы мокроты.

Определение рецепторов СБ4, СБ8, СБ25 и НЬЛ-БЯ проводили методом непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции с помощью набора моноклональных антител “Клоноспектр”. Просмотр клеток производили в люминисцентном микроскопе при увеличении в 90 раз. Положительными считали светящиеся в форме кольца клетки. Содержание рецепторов выражали в процентах из расчета на 100 клеток образца ИМ.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием критерия Стьюден-та 1.

Результаты и обсуждение

У здоровых уровень СБ-антигенов составляет СБ4 4,6±2,1%, СБ8 7,2±1,5%, СБ25 3,0±1,2% и НЬЛ-БЯ 11,0±1,3%. При обострении астмы повышается активность всех изучаемых рецепторов. В этот период болезни значительно возрастает количество СБ4-положительных клеток, уровень которых составляет 26,4±2,1% (р<0,05 по отношению к контролю). Наименьшие изменения коснулись СБ8-клеток, их активность повысилась до 16,5±1,3% (р<0,05) (табл.1). С присутствием СБ4+ субпопуляции Т-лимфоцитов связывают развитие аллергического компонента астмы [2, 4]. У больных страдающих аллергией циркулирующие в крови СБ-4+ Т-лимфоциты продуцируют высокий уровень цитокинов 2 типа, включая интерлейкин-5, интерлейкин-3 и вМ-С8Б, и поэтому могут способствовать эозинофильному воспалению [6]. Применение ГКС-терапии способствует снижению в ИМ числа СБ4 клеток до 12,1±1,1% (р<0,05), а СБ8 до 8,6±2,1. Не так давно О.М. Коп й а1. оценили роль единственной внутривенной инъекции моноклональных антител, которые связываются специфично с СБ-4 человеческим антигеном, в лечении тяжелой стероид-зависимой астмы. Это исследование

показало значительное повышение утренней и вечерней пиковой скорости выдоха у группы с наибольшей дозой. Дополнительные эксперименты показали, что инфузия келиксимаба индуцирует быструю и эффективную связь со всеми CD-4+ Т-клетками с транзитным снижением количества циркулирующих клеток этого типа, что позволяет предположить, что терапия, направленная на CD-4 Т-клетки может оказаться полезной при лечении астмы [9].

В приступный период астмы нами также отмечено повышение содержания CD25 и HLA-DR-позитивных клеток до 17,6±2,7% и 23,5±2,5%, соответственно (p<0,05 по отношению к контролю). Как известно CD25-антигенная детерминанта является рецептором для интерлейкина-2 (ИЛ-2), участвующего в стимуляции пролиферации Т- и В-лимфоцитов, и увеличение ее экспрессии при обострении БА связана с индукцией иммунного ответа. Использование в лечении ГКС в фазу обострения БА приводит к снижению экспрессии CD25. Однако его содержание остается выше, чем в контрольной группе и составляет 13,5±1,5% (p<0,05). Очевидно, уменьшение представленности CD25 в ИМ под влиянием ГКС связано со снижением концентрации ИЛ-2 [10]. Увеличение содержания HLA-DR-позитивных клеток является следствием активации эффекторных клеток и их миграции в дыхательные пути [3]. Применение ГКС-терапии способствует снижению в ИМ HLA-DR-рецепторов, уровень которых практически достигает значений контрольной группы и составляет

Таблица 1

Количество CD4, CD8, CD25 и HLA-DR лимфоцитов в ИМ при БА

Группы пациентов Наличие рецепторов, %

CD4 CD25 CD8 HLA-DR

БА, ремиссия 5,1±1,3 2,5±1,1 6,7±1,2 4,7±1,8*

БА, обострение 26,4±2,1* 17,6±2,7* 16,5±1,3* 23,5±2,5*

БА+ГКС 12,1±1,1* 13,5±1,5* 8,6±2,1 11,3±3,0*

Контроль 4,6±2,1 3,0±1,2 7,2±1,5 11,0±1,3

Примечание: здесь и далее* - различия достоверны при p<0,05 по сравнению с контролем.

Таблица 2

Количество CD8, CD4, CD25 и HLA-DR лимфоцитов в ИМ при ХОБ

Группы Наличие рецепторов, %

пациентов CD8 CD25 CD4 HLA-DR

ХОБ,

ремиссия 8,1±1,9 - - 4,7±1,8*

ХОБ,

обострение 37,6±2,8* 0,9±1,5* 4,9±2,2 6,1±1,4*

ХОБ+Теопек 13,4±2,1* 8,5±3,3* 5,1±2,9 10,4±2,3

Контроль 7,2±1,5 3,0±1,2 4,6±2,1 11,0±1,3

11,3±3,0% ф>0,05). Снижение экспрессии HLA-DR-клеток может быть следствием непосредственного ингибирующего влияния ГКС на их синтез.

В период ремиссии БА отмечено снижение экспрессии представленных рецепторов. Количество CD25-позитивных клеток снизилось почти в 8 раз по сравнению с приступным периодом астмы и составило 2,5±1,1%, достоверно не отличаясь от показателей здоровых. Достигли контрольных значений и показатели CD4 и CD8-антигена. Их уровень составил 5,1±1,3% и 6,7±1,2% соответственно. Количество клеток, имеющих HLA-DR-рецептор уменьшилось более чем в 5 раз и стало 4,7±1,8%, что достоверно меньше, чем у здоровых (табл. 1).

При обострении ХОБ выраженная экспрессия происходит с CD8 Т-лимфоцитами. Количество клеток с данным фенотипом составляет 37,6±2,8%. Представленность клеток, несущих СD4-рецепторы практически не отличается от показателей здоровых и составляет 4,9±2,2%. Интересные данные получены относительно СD25 и HLA-DR рецепторов. Отмечается снижение содержания СD25 и HLA-DR-позитивных клеток до 0,9±1,5% и 6,1±1,4%, соответственно, что достоверно отличается от показателей контрольной группы ф<0,05) (табл. 2). Одной из причин ослабления экспрессии рассмотренных антигенных детерминант следует считать инфекционный процесс, часто запускающий обострение ХОБ и являющийся ответственным за нарушение иммунного ответа на этапе распознавания антигена, тесно связанного с комплексом гистосовместимости [7].

Исследование показало, что содержание поверхностных рецепторов в ИМ у больных ХОБ зависит от терапии. Применение в лечении ингибиторов фосфо-диэстеразы приводит к снижению экспрессии CD8 Т-лимфоцитов до 13,4±2,1%. Способность теофиллинов уменьшать воспаление осуществляется посредством подавления хемотаксиса и пролиферации Т-лимфоцитов [5]. Напротив количество клеток, несущих CD25 увеличивается в 8,6 раза и превышает показатели здоровых (табл. 2). Содержание HLA-DR также увеличивается и практически достигает контрольных значений, составив 10,4±2,3%. Использование теопека в терапии обострения ХОБ изменяет состояние активационного сигнала и смещает его вектор в сторону усиления межклеточных взаимодействий, направленных на разрешение воспаления.

В период ремиссии ХОБ резко снижается содержание HLA-DR и СD8 антигенов до 4,7±1,8 и 8,1±1,9%, соответственно, а клетки, несущие СD4 и СD25 рецепторы в ИМ не определяются (табл. 2). Очевидно, это обусловлено депрессией иммунного

ответа у больных ХОБ и нарушениями дифференци-ровки и пролиферации Т-клеток [12].

Таким образом, и астма и ХОБ характеризуются воспалительным процессом, но мембранные маркеры активации клеток отличаются друг от друга. Так при астме ведущими клетками являются СD4 лимфоциты, в то время как при ХОБ биологическим маркером является повышение количества CD8 лимфоцитов.

ЛИТЕРАТУРА

1. Авдеев С.Н., Анаев Э.Х., Чучалин А.Г. Применение метода индуцированной мокроты для оценки эффективности воспаления дыхательных пу-тей//Пульмонология.-1998.-№7.-С.81-87.

2. Бронхиальная астма. Глобальная стратегия. Современный доклад НИЗ (США) и ВОЗ (1993)//Пульмонология.-1996.-Приложение.-С.4-9.

3. Потапнев М.П., Печковский Д.В. Молекулярные и клеточные механизмы иммунопатологии при бронхиальной астме//Пульмонология.-1997.-№3. -С.75-79.

4. Чучалин А.Г. Бронхиальная астма.-Т.1.-М.: Агар, 1997.-432 с.

5. Чучалин А.Г. Хронические обструктивные болезни легких.-М.: ЗАО Изд-во БИНОМ; СПб.: Невский диалект,1998.-512 с.

6. Corrigan C.J., Kay A.B. T-cells and eosinophils in the pathogenesis of asthma//Immunol Today.-1992.-№13.-Р.501-507.

7. Hogg J. Latent adenoviral infections in the pathogenesis of COPD//Eur. Respir. Rev.-1997.-Vol.7.-P.216-220.

8. Kay A.B. Allergy and allergic diseases//N. Engl. J. Med.-200L-Vol.344.-F.109-113.

9. Kon O.M., Sihra B.S., Loh L.C. et al. The effects of anti-CD-4 monoclonal antibody, keliximab, on peripheral blood CD+4 T-cells in asthma//Eur. Respir. J.-200L-Vol.18.-F.45-52.

10. Melis M., Siena L., Pace E. et al. Fluticasone induces apoptosis in peripheral T-lymphocytes: a comparison between asthmatic and normal subjects//Eur. Respir. J.-2002.-Vol.19.-P.257-266.

11. Saetta M., Di Stefano A., Turato G. et al. CD8+ T-lymphocytes in peripheral airways of smokers with chronic obstructive pulmonary disease//Am. J. Respir. Crit. Care Med.-1998.-Vol.157.-F.822-826.

12. Saetta M., Turato G., Maestrelli P. et al. Cellular and structural bases of chronic obstructive pulmonary disease//Am. J. Respir. Crit. Care Med.-2001.-Vol.163.-Р.1304-1309.