Способ определения функциональных показателей регионарного кровообращения в эксперименте
METHOD FOR DETERMINING THE FUNCTIONAL INDICATORS OF REGIONAL BLOOD CIRCULATION IN AN EXPERIMENT

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано для исследования функциональных показателей регионарного кровообращения, в частности для оценки резерва капиллярного кровотока, сосудистой реактивности и ряда других. Способ осуществляют путем определения показателей реактивной гиперемии в коже хвоста крысы с помощью неинвазивной окклюзионной пробы в сочетании с лазерной допплеровской флоуметрией (ЛДФ).
Использование в экспериментальных исследованиях на животных малоинвазивных функциональных проб позволяет, с одной стороны, более полно охарактеризовать работу сердечнососудистой системы при той или иной функциональной нагрузке, а с другой стороны, придерживаться биоэтического принципа минимизации болезненных процедур у животных и повысить клиническую релевантность исследования [Директива 2010/63/EU; Roustit M, Cracowski JL., 2012; Крупаткин А.И., Сидоров В.В., 2013].
Уровень техники
Известны примеры использования в научных исследованиях окклюзионной функциональной пробы в сочетании с ЛДФ и другими методами регистрации периферического кровотока (УЗИ, фотоплетизмография и др.) для оценки структурно-функциональных характеристик микроциркуляторного русла.
В частности известен ряд способов, предусматривающих проведение окклюзионной пробы с целью определения параметров регионарного кровообращения.
Известен способ проведения окклюзионной пробы с помощью раздувания пневматической манжеты на бедре крысы. При этом кровоток в мышце дистально от места окклюзии регистрируют с помощью ЛДФ (Souza-Silva E, Ascenso R, Tonussi CR, da Silva-Santos JE. Detection of blood flow perfusion and post occlusive reactive hyperemia in the skeletal muscle of rats. Life Sci. 2021 May 4:119571. doi: 10.1016/j.lfs.2021.119571. Epub ahead of print. PMID: 33961851). Недостатками и ограничительными характеристиками данной методики являются ее инвазивность, а также то, что методика применима только на наркотизированных крысах.
Известен также способ проведения окклюзионной пробы на задней конечности крысы с помощью раздувания пневматической манжеты, которую накладывают на бедро животного [Yuan X, Wu Q, Shang F, Li B, Liu M, Wang B, Sheng Y, Zhang H, Xiu R. A comparison of the cutaneous microvascular properties of the Spontaneously Hypertensive and the Wistar-Kyoto rats by Spectral analysis of Laser Doppler. Clin Exp Hypertens. 2019;41(4):342-352. doi: 10.1080/10641963.2018.1481424. Epub 2018 Jun 25. PMID: 29939761]. Кровоток регистрируют на подошвенной поверхности задней лапы животного с помощью ЛДФ. При этом оптический зонд для ЛДФ устанавливают на расстоянии около 1 мм от кожных покровов. Недостатками и ограничительными характеристиками данной методики является то, что методика применима только на наркотизированных крысах, а также то, что между анализируемыми покровами и используемом датчиком имеется расстояние 1 мм, которое влияет на стабильность и повторяемость получаемых результатов.
Перечисленные выше известные способы проведения окклюзионной пробы с одной стороны реализуются на наркотизированных крысах, с другой стороны, являются инвазивными методиками, что существенно ограничивает их применение в экспериментальной медицине.
Способов проведения окклюзионной пробы на крысах (экспериментальных животных), предусматривающих возможность наблюдения за крысой в активном состоянии в динамике, а также неинвазивность самой методики при плотном соприкосновении с исследуемыми поверхностями, в доступной авторам информационной базе данных не обнаружено.
Раскрытие сущности изобретения
Заявляемое изобретение направлено на решения задачи определения функциональных показателей регионарного кровообращения крысы (экспериментального животного), в условиях сохраненного сознания, отсутствия инвазивности, а также максимально плотного контакта с исследуемыми слоями и безболезненности для животного. Необходимым этапом решения указанной задачи является проведение окклюзионной функциональной пробы на крысах (экспериментальных животных).
Использование в экспериментальной практике заявляемого способа позволяет достичь нескольких технических (лечебных) и экономических результатов:
- возможность использовать как применительно к наркотизированному животному, так и к бодрствующему животному, а также возможность установить плотный контакт с анализируемыми поверхностями за счет использования фиксатора для иммобилизации лабораторного животного;
- возможность повторного использования экспериментальных животных.
Окклюзионную функциональную пробу в сочетании с ЛДФ используют в клинической функциональной диагностике и научных исследованиях для оценки резерва капиллярного кровотока, сосудистой реактивности и ряда других функциональных показателей регионарного кровообращения [Крупаткин А.И., 2013; Сагайдачный А.А., 2018]. В основе этого теста лежит анализ выраженности и длительности реактивной гиперемии в коже конечности после снятия временной (в течение 1-3 минут) окклюзии кровотока в ней.
Таким образом, экспериментальные возможности предлагаемой методики удовлетворяют требованиям регламентирующих документов о гуманном отношении к животным, а также позволяют использовать заявляемый способ в различных экспериментах (с и без использования наркоза, в динамике и одномоментно и т.д.), что обеспечивает сопоставимость получаемых результатов и возможность сравнения различных экспериментальных групп с общими анализируемыми параметрами.
Краткое описание иллюстраций.
На Фиг. 1 представлен общий вид эксперимента, проводимого с участием наркотизированной крысы.
Обозначения:
1 - монитор отражения измеряемых показателей;
2 - оптический зонд ЛДФ (ООО НПП «ЛАЗМА», Россия);
3 - манометр;
4 - манжета хвостового сфигмоманометра;
5 - подогреваемая платформа;
6 - термодатчик.
На Фиг. 2 представлен общий вид эксперимента, проводимого с участием крысы в условиях сохраненного сознания.
Обозначения:
7 - фиксатор для иммобилизации лабораторного животного (рестрейнер);
2 - оптический зонд ЛДФ (ООО НПП «ЛАЗМА», Россия);
3 - манометр;
4 - манжета хвостового сфигмоманометра.
На Фиг. 3 представлен пример ЛДФ-граммы с окклюзионной пробой.
Обозначения:
8 - значение кровотока в исходном состоянии
9 - резкое снижение перфузии во время раздувания манжеты до 200-220 мм рт.ст. в течение 3 минут
10 - динамика кровотока после снятия окклюзии (реактивная гиперемия).
Описание процедуры эксперимента.
При выполнении эксперимента с участием наркотизированного лабораторного животного его фиксируют в положении на спине на подогреваемой платформе.
При выполнении эксперимента с участием лабораторного животного в условиях сохраненного сознания для его иммобилизации используют фиксатор (рестрейнер).
На проксимальный отдел хвоста экспериментального животного накладывают манжету хвостового сфигмоманометра - комплектующая деталь прибора для неинвазивного измерения артериального давления у грызунов «Систола» (ООО «Нейроботикс», Россия). Датчик прибора ЛАЗМА МЦ-3 (ООО НПП «ЛАЗМА», Россия) устанавливают на поверхности хвоста животного дистально от уровня расположения манжеты (граница проксимальной и средней трети хвоста). После регистрации базовой ЛДФ, манжету надувают до давления 200-220 мм рт.ст. и удерживают раздутой в течение 3 минут. После сдувания манжеты проводят регистрацию ЛДФ в течение еще 6 минут.
max
max
На Фиг. 3 приведен пример записи ЛДФ-граммы во время выполнения окклюзионной пробы. Отражены значения кровотока в исходном состоянии, резкое снижение перфузии во время раздувания манжеты до 200-220 мм рт.ст. в течение 3 минут и динамика кровотока после снятия окклюзии (реактивная гиперемия). Установлены: резерв капиллярного кровотока (M/М %), продолжительность достижения максимального кровотока после снятия окклюзии (T, с).
В ходе проведенных авторами исследований были получены и проанализированы следующие показатели: средняя величина перфузии (М, пф. ед.); среднее квадратичное отклонение амплитуды колебаний кровотока (σ, пф. ед.); коэффициент вариации перфузии (Kv, %). Методом лазерной флуоресцентной диагностики были исследованы уровень флуоресценции коферментов НАД-Н и ФАД в том же участке кожи.
Авторами были проведены эксперименты с различными наркотизирующими средствами. В группе I (n=13) проводили комбинированную анестезию тилетамин/золазепамом («Золетил 100», Virbac, Франция) из расчета 20 мг/кг + ксилазин («Ксиланит», ООО «НИТА-ФАРМ», Россия) 5 мг/кг внутримышечно. В группе II (n=10) осуществляли анестезию хлоралгидратом (Panreac, Испания) из расчета 300 мг/кг внутрибрюшинно. Группе III (n=4) измерение параметров проводили у бодрствующих крыс с использованием иммобилизирующего фиксатора.
В обеих группах животных введение анестетиков вызывало анестезию, достаточную для осуществления небольшого хирургического вмешательства с отсутствием произвольных движений и угнетением болевых рефлексов (отрицательный «пинч-тест»). При этом показатели, определяемые у животных группы III в ходе эксперимента были повторяемы в серии измерений и имели ряд достоверных отличий от групп I и II. Основные результаты исследования приведены в Таблице 1.
Таким образом, в результате проведения эксперимента была обоснованно доказана сопоставимость внутри группы анализируемых параметров, а также была получена разница по ряду показателей между группами, различающимися по средству для наркоза, что убедительно доказало повторяемость и стабильность заявляемого способа, включающего проведение окклюзионной пробы на хвосте крысы в соответствии с предлагаемой методикой.