Исследование механизмов действия аденозина, АДФ и АТФ в коронарном кровообращении трансгенных мышей с хроническим окислительным стрессом и сердечной недостаточностью

УДК 615.224:612.12-008.46

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ДЕЙСТВИЯ АДЕНОЗИНА, АДФ И АТФ В КОРОНАРНОМ КРОВООБРАЩЕНИИ ТРАНСГЕННЫХ МЫШЕЙ С ХРОНИЧЕСКИМ ОКИСЛИТЕЛЬНЫМ СТРЕССОМ И СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ

В.И. Козловский, к.м.н.

Кафедра фармакологии УО «Гродненский государственный медицинский университет»

Известно, что аденозин играет важную роль для защиты сердца при ряде патологических состояний. Предположено, что окислительный стресс, являющийся одним из важных факторов патогенеза сердечной недостаточности, способствует активации образования аденозина из адениновых нуклеотидов. С этой целью был сравнен вклад аденозиновых рецепторов в механизмы коронарорасширяющего действия аденозина, АДФ и АТФ в изолированных сердцах у трансгенных мышей с моделью хронического окислительного стресса и сердечной недостаточности. Эксперименты выполнены на изолированных сердцах, перфузируемых по методу Лангендорффа. У трансгенных мышей обнаружен более выраженный, в сравнении с контрольными мышами, вклад аденозиновыхрецеп-торов в механизм коронарной вазодилатации, вызванной АДФ, что может свидетельствовать о повышенной активность энзимов, ответственных за дефосфорилирование адениновых нуклеотидов коронарным эндотелием. Данные изменения предшествуют развитию сердечной недостаточности и могут рассматриваться как механизм компенсации окислительного стресса.

Ключевые слова: аденозин, коронарная вазодилатация, изолированное сердце мыши, окислительный стресс, сердечная недостаточность.

It is known that adenosine plays significant role in cardioprotection in various pathological states. It was suggested that oxidative stress, which is one of the most importantfactor of the pathogenesis of the heartfailure, contributes to activation ofadenosine generation from adenine nucleotides. For this purpose contribution of adenosine receptors to the mechanisms of the coronary vasodilative activity of adenosine, ADF and ATP was compared in isolated hearts of transgenic mice to a model of the chronic oxidative stress and heart failure. Experiments were carried out on isolated hearts perfused by the Langendorff method. More significant, in comparison with control mice, contribution of adenosine to the coronary vasodilation induced by ADP was found in transgenic mice. This indicates to the increased activity of enzymes responsible for dephosphorilation ofthe adenine nucleotides by the coronary endothelium. These changes precede the development of the heartfailure and can be considered as a mechanism of the oxidative stress compensation.

Key words: adenosine, coronary vasodilation, isolated mouse heart, oxidative stress, heart failure.

Введение ров и эндотелиновых рецепторов. Имеются данные Аденозин играет особо важную роль в механиз- о том, что активация рецепторов, ассоциированных мах защиты сердца от недостатка кислорода. Из- с Gaq протеинами, ведёт к усилению генерации сво-вестно, что образование аденозина в сердце значи- бодных радикалов кислорода и активации процес-тельно увеличивается в ситуациях, когда доставка сов перекисного окисления липидов [7, 8]. Таким кислорода к сердцу не обеспечивает полностью по- образом, модель мышей с повышенной экспресси-требность миокарда в кислороде [2]. С другой сто- ей белка Gaq можно считать моделью окислитель-роны, аденозин оказывает выраженное защитное ного стресса в сердце. Подтверждением этого яв-действие не только при ишемическом, но и при ляются данные о повышенном содержании супе-реперфузионном повреждении миокарда [12, 13]. роксид аниона в сердце мышей линии Tgaq*44 уже Защитный эффект аденозина при данных состоя- в возрасте 2 месяцев [5]. Характерной чертой мы-ниях может быть связан с его участием в регуля- шей линии Tgaq*44 является развитие дилатаци-ции прооксидантно-антиоксидантного баланса. онной кардиомиопатии в возрасте 14 - 16 месяцев Показано, что аденозин уменьшает продукцию сво- [10], очевидно, являющейся следствием хроничес-бодных радикалов кислорода нейтрофилами [4], а кого окислительного стресса. также повышает активность антиоксидантных фер- Принимая во внимание важную роль аденозина ментов [11]. в защите сердца как от гипоксии, так и от окисли-Одной из экспериментальных моделей наруше- тельного стресса, мы предполагаем, что увеличения регуляции прооксидантно-антиоксидантного ние продукции аденозина может служить одним из баланса являются трансгенные мыши линии важных компенсаторных механизмов, препятству-Tgaq*44 с повышенной экспрессией в кардиомио- ющих развитию сердечной недостаточности, в том цитах белка Ga . Данные белки участвуют в пост- числе и у вышеупомянутых мышей линии Tgaq*44. рецепторных сигнальных механизмах активации а- Основным источником аденозина является дефос-адренорецепторов, ангиотензиновых АТ. рецепто-п форилирование адениновых нуклеотидов (АТФ,

5 9 _

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Журнал ГрГМУ 2009 № 1

АДФ) [3]. В связи с этим мы предположили, что у мышей линии Tgaq*44 будет повышена активность энзимов, ответственных за образование аденозина из АТФ и АДФ. Для проверки данной гипотезы был сравнён вклад пуриновых Р1 (аденозиновых) рецепторов в механизм коронарорасширяющего действия АТФ и АДФ в изолированном сердце мышей линии Tgaq*44 и контрольных мышей линии FVB.

Материал и методы исследования

Эксперименты проводились на изолированных сердцах мышей, которые перфузировались под постоянным давлением по методу Лангендорфа. В экспериментах использовались мыши линий Tgaq*44 и FVB обоих полов массой 20-25 г. Животные наркотизировались тиопенталом (100-120 мг/кг массы тела). После вскрытия грудной клетки сердца изолировались, промывались в холодном физиологическом растворе, затем коронарное русло изолированного сердца перфузировалось ретроградно через аорту под постоянным перфузион-ным давлением 100 мм рт. ст. с использованием аппарата Лангендорфа (Hugo Sachs Electronics) раствором Кребса - Ханзелайта следующего состава (mM): NaCl 118, CaCl2 2,52, MgSO4 1,64, NaHCO3 24,88, K2HPO4 1,18, глюкоза 5,55, натрия пируват 2,0. Перфузионный раствор оксигенировался смесью 95 % О2 + 5 % СО2 при 37°С. Сердца стимулировались двумя платиновыми электродами, введёнными в правое предсердие (частота составляла 400 импульсов в минуту). Объём жидкости, протекавший в единицу времени, соответствовал величине коронарного потока. Коронарный поток измерялся с помощью ультразвукового датчика (Hugo Sachs Electronics). Величина коронарного потока записывалась в течение всего эксперимента, а затем анализировалась с помощью специальной программы (PSCF - IGEL, Польша).

Для оценки вклада пуриновых Р1 рецепторов в механизм коронарорасширяющего действия адено-зина, АДФ и АТФ данные соединения вводились в виде болюсов в объёме 10 мкл. Каждое соединение вводилось дважды в ходе эксперимента - без ингибиторов и в присутствии антагониста пуриновых Р1 рецепторов 8-сульфофенилтеофиллина (8-СФТ, 5х 10-5 М). Были сопоставлены эффекты аде-нозина, АДФ и АТФ у животных трёх возрастов: 2 месяца, 8 месяцев и 14 месяцев.

Статистическая обработка данных проводилась непараметрическими методами с использованием критерия Манна - Уитни. Данные выражались как среднее значение (M) ± стандартная ошибка (m). Статистически достоверным различие между группами считалось при р<0,05.

Результаты и их обсуждение

Обнаружено, что аденозин, АТФ и АДФ увеличивали коронарный поток изолированного сердца как у контрольных мышей линии FVB, так и у трансгенных мышей линии Tgaq*44, что свидетельствует о коронарорасширяющих свойствах этих соединений. Не было обнаружено существенного различия между величиной коронарорасши-ряющих эффектов аденозина, АДФ и АТФ в серд-

цах мышей линий Тgaq*44 и FVB 2 и 8 месяцев, в то же время у трансгенных мышей 14 месяцев прирост коронарного потока, вызванный аденозином, статистически достоверно превышал аналогичный показатель у контрольных мышей (таблицы 1, 2, 3). Коронарная вазодилатация, вызванная данными соединениями в присутствии 8-СФТ, а также процент её ингибирования 8-СФТ не отличались у контрольных и трансгенных мышей 2 месяцев. В то же время процент ингибирования коронарорас-ширяющего эффекта АДФ под влиянием 8-СФТ был статистически достоверно выше, а величина прироста коронарного потока, вызванного АДФ в присутствии 8-СФТ, была статистически достоверно ниже в сердцах мышей линии Тgaq*44 8 и 14 месяцев в сравнении с аналогичными показателями у контрольных мышей линии FVB. Коронаро-расширяющая реакция на АТФ в присутствии 8-СФТ, а также процент ингибирования её данным антагонистом не отличались существенно в сердцах мышей 8 и 14 месяцев, однако отмечалась тенденция к более выраженному ингибированию коронарорасширяющего действия АТФ 8-СФТ в сердцах трансгенных мышей данных возрастов.

Результаты проведённых экспериментов позволяют предположить, что в сердце мышей линии Тgaq*44, в сравнении с сердцами контрольных мышей линии FVB, более выражены процессы де-фосфорилирования адениновых нуклеотидов (прежде всего, АДФ) до аденозина. Интересно, что появление данных изменений у трансгенных мышей предшествует развитию сердечной недостаточности. Очевидно, активация продукции аденозина из адениновых нуклеотидов в коронарных сосудах представляет собой важный компенсаторный механизм, направленный на уменьшение последствий окислительного стресса. Основными энзимами, ответственными за дефосфорилирование аденино-вых нуклеотидов эндотелиальными клетками, являются АТФ-дифосфорилаза (CD39), ответственная за превращение АТФ и АДФ до АМФ, и экто-5'-нуклеотидаза, осуществляющая дефосфорили-рование АМФ до аденозина [6].

Роль дефосфорилирования адениновых нукле-отидов для защиты сердца от окислительного стресса подтверждается данными, полученными на мышах с нокаутированным геном, ответственным за CD39. У данных мышей, в сравнении с контрольными животными, было более выражено повреждающее действие ишемии-реперфузии миокарда, ключевое значение в патогенезе которой имеет окислительный стресс [9].

Увеличение вклада аденозина в механизм коро-нарорасширяющего действия АДФ у трансгенных мышей линии Тgaq*44 может также объясняться торможением активности аденозиндеаминазы, ответственной за метаболизм аденозина до инозина. Asаkurа с соавт. обнаружили сниженную активность данного энзима в сердце больных с деком-пенсированной сердечной недостаточностью [1].

Нельзя также полностью исключить возможность увеличения чувствительности аденозиновых

Таблица 1 - Влияние 8-СФТ на прирост коронарного потока, вызванный аденозином, АДФ и АТФ

Соединение Контрольные мыши FVB

прирост коронарного потока (мл/мин) % ингибирования 8-СФТ прирост коронарного потока (мл/мин) % ингибирования 8-СФТ

без 8-СФТ в присутствии 8-СФТ без 8-СФТ в присутствии 8-СФТ

Аденозин 2,24±0,21 0,36±0,09 82,3±6,6 2,76±0,23 0,29±0,07 89,1±2,6

АДФ 2,14±0,13 0,88±0,08 58,7±4,1 2,19±0,12 0,88±0,10 59,4±5,3

АТФ 2,38±0,14 1,43±0,15 40,7±3,1 1,99±0,34 1,33±0,09 48,0±6,7

Таблица 2 - Влияние 8-СФТ на прирост коронарного потока, вызванный аденозином, АДФ и АТФ (все в дозе 10-9 М) в изолированных сердцах трансгенных мышей Тgaq*44 и контрольных мышей FVB в возрасте 8 месяцев

Соединение Контрольные мыши FVB

прирост коронарного потока (мл/мин) % ингибирования 8-СФТ прирост коронарного потока (мл/мин) % ингибирования 8-СФТ

без 8-СФТ в присутствии 8-СФТ без 8-СФТ в присутствии 8-СФТ

Аденозин 2,33±0,13 0,43±0,04 81,0±2,5 2,24±0,15 0,46±0,05 79,6±2,3

АДФ 1,81±0,09 0,85±0,04 51,8±3,4 1,88±0,12 0,63±0,06* 66,6±2,7*

АТФ 2,19±0,10 1,34±0,10 37,9±4,7 2,01±0,12 1,15±0,08 41,6±3,4

Примечание: * - здесь и ниже: статистически достоверно различие аналогичных показателей у мышей Тgaq*44 и FVB.

Таблица 3 - Влияние 8-СФТ на прирост коронарного потока, вызванный аденозином, АДФ и АТФ (все в дозе 10-9 М) в изолированных сердцах трансгенных мышей Тgaq*44 и контрольных мышей FVB в возрасте 14 месяцев

Соединение Контрольные мыши FVB

прирост коронарного потока (мл/мин) % ингибирования 8-СФТ прирост коронарного потока (мл/мин) % ингибирования 8-СФТ

без 8-СФТ в присутствии 8-СФТ без 8-СФТ в присутствии 8-СФТ

Аденозин 1,88±0,11 0,35±0,05 81,6±2,3 2,25±0,10* 0,36±0,05 83,1±2,7

АДФ 1,74±0,14 0,89±0,09 48,5±3,5 1,75±0,11 0,64±0,05* 61,3±3,1*

АТФ 1,85±0,11 1,24±0,14 34,3±4,9 2,09±0,09 1,20±0,09 43,6±3,1

рецепторов в качестве компенсаторного механизма у данных мышей. О возможности этого, в частности, свидетельствует повышение коронарорас-ширяющей реакции на аденозин у мышей линии Тgaq*44 14 месяцев. С другой стороны, у трансгенных мышей 8 месяцев данная реакция существенно не отличалась от таковой у контрольных животных соответствующего возраста.

Таким образом, в сердце трасгенных мышей линии Тgaq*44 с хроническим окислительным стрессом и сердечной недостаточностью отмечается более выраженный вклад аденозина в механизм коронарорасширяющего действия АДФ, причём, данный феномен предшествует появлению явных признаков декомпенсированной сердечной недостаточности. Наиболее вероятными причинами обнаруженного феномена могут быть повышенное дефосфорилирование АДФ до аденозина, торможение метаболизма аденозина аденозиндеамина-зой, а также увеличение чувствительности адено-зиновых рецепторов.

Выводы

1. Аденозин, АДФ и АТФ обладают коронаро-расширяющим действием в изолированных сердцах трансгенных мышей линии Тgaq*44 и контрольных мышей линии БУВ.

2. Коронарная вазодилатация, вызванная данными веществами, не отличается существенно в сердцах животных обеих групп в возрасте 2 и 8 месяцев, в то же время, в возрасте 14 месяцев корона-рорасширяющая реакция на аденозин выше у трансгенных мышей.

3. Ингибирование коронарной вазодилатации, вызванной АДФ, антагонистом аденозиновых рецепторов 8-сульфофенил-теофиллином более выражено у трансгенных мышей 8- и 14-месячных возрастов в сравнении с контрольными мышами аналогичного возраста.

4. Вероятными причинами обнаруженного феномена могут быть повышение активности энзимов, ответственных за де-фосфорилирование АДФ до аденозина, торможение метаболизма аденозина аденозиндеаминазой, а также увеличение чувствительности аденозино-вых рецепторов

Литература

1. Asakura, M. Impact of adenosine receptor signaling and metabolism on pathophysiology in patients with chronic heart failure / M. Asakura, H. Asanuma, J. Kim et al. // Hypertens. Res. - 2007. - Vol. 30, №9. - P. 781 - 787.

2. Bardenheuer, H. Supply-to-demand ratio for oxygen determines

formation of adenosine by the heart / H. Bardenheuer, J. Schrader// Am J Physiol. - 1986. - Vol. 250. - P. 173 - 180.

3. Borowiec, A. Adenosine as a metabolic regulator of tissue function: production of adenosine by cytoplasmic 5'-nucleotidases / A. Borowiec, K. Tkacz-Stachowska, A.C. Skladanowski // Acta Biochimica Polonica -2006. - Vol. 53, №2. - P. 269 - 278.

4. Cronstein, B.N. Adenosine: a physiological modulator of superoxide anion generation by human neutrophils / B.N. Cronstein, S.B. Kramer, G. Weissmann R. Hirschhorn // J. Exp. Med. - 1983. - Vol. 158. - P. 1160 -1177.

5. Drelicharz, L. NO and PGI2 in coronary endothelial dysfunction in transgenic mice with dilated cardiomyopathy / L. Drelicharz, V. Kozlovski, T. Skorka et al. // Basic Res. Cardiol.- 2008. - Vol. 103, №5. - P. 417-430.

6. Eltzschig, H.K. Coordinated adenine nucleotide phosphohydrolysis and nucleoside signaling in posthypoxic endothelium: role of ectonucleotidases and adenosine A2B receptors / H.K. Eltzschig, J.C. Ibla, G.T. Furuta // J. Exp. Med. - 2003. - Vol. 198, №5. - P. 783 - 796.

7. Griendling, K.K.. Angiotensin II stimulates NADH and NADPH oxidase activity in cultured vascular smooth muscle cells / K.K. Griendling,

C.A. Minieri, J.D., R.W. Alexander R.W.// Circ. Res. - 1994. - Vol. 74. -P. 1141 - 1148.

8. Ishida, K. Endothelin-1 enhances superoxide generation of human neutrophils stimulated by the chemotactic peptide N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine / K. Ishida, K. Takeshige, S. Minakami // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1990. - Vol. 173, №2. - P. 496 - 500.

9. K^ler, D. CD39/ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 provides myocardial protection during cardiac ischemia/reperfusion injury / D. Kflhler, T. Eckle, M. Faigle // Circulation. - 2007. - Vol. 116, №16. -P. 1784 - 1794.

10. Mende, U. Dilated cardiomyopathy in two transgenic mouse lines expressing activated G protein alpha(q): lack of correlation between phospholipase C activation and the phenotype / U. Mende, C. Semsarian,

D.C. Martins et al. // J. Mol. Cell. Cardiol. - 2001. - Vol. 33. P. 1477 -1491.

11. Ramkumar, V. Adenosine, antioxidant enzymes and cytoprotection / Z. Nie, L.P. Rybak, S.B. Maggiewar // Trends Pharmacol Sci. - 1995. -Vol. 16. - P. 283 - 285.

12. Sekili, S. Effect of adenosine on myocardial "stunning" in the dog / S. Sekili, M.O. Jeroudi, X.L. Tang et al. // Circ. Res. - 1995. - Vol. 76. -P. 82 - 94.

13. Zhao, Z.Q., Adenosine attenuates reperfusion-induced apoptotic cell death by modulating expression of Bcl-2 and Bax proteins / Z.Q. Zhao, J.M. Budde, C. Morris et al.// J. Mol. Cell. Cardiol. - 2001. - Vol. 33. - P. 57 - 68.

Поступила 24.12.08