ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО С АКТИВНОСТЬЮ ПРОТИВ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ, МИКОБАКТЕРИЙ И ГРИБОВ
DRUG WITH ACTIVITY AGAINST GRAM-POSITIVE BACTERIA, MICROBACTERIA AND FUNGI

Область техники
Изобретение относится к химии и фармакологии, конкретно - к синтетическим биологически активным веществам, получаемым на основе пергидропиримидин-2,4,6-трионов (барбитуровых кислот) и производных салицилового альдегида, обладающим противомикробной активностью, и способу их синтеза. Заявляемые вещества представляют собой продукты конденсации производных салицилового альдегида с барбитуровой кислотой, N-замещенных барбитуровыми кислотами, или другие новые производные салицилового альдегида.
Изобретение распространяется на все пространственные изомеры заявляемых веществ, все их таутомерные и солевые формы, а также аддукты с органическими кислотами.
Вещества предназначены для использования в медицинской практике для лечения заболеваний, вызванных инфекционными заболеваниями, а также для аналогичных целей в ветеринарии. Вещества могут применяться как в индивидуальном виде, так и в виде их фармакологически приемлемых солей, комплексов, а также в комбинации с другими препаратами и комплексами.
Предшествующий уровень техники
В современной литературе отмечается внимание к производным барбитуровых кислот в связи с их воздействием на различные ферментные системы [2 - Novae L., Kovac В. Electronic structure and biological activity: barbiturates end thiobarbiturates // Chem. Phys. Lett. 2010, 493, 242-244]. Значительный интерес представляют 5-арилиденпроизводные барбитуровых кислот, обладающих антиконвульсантной, антимикробной, спазмолитической, жаропонижающей и противоопухолевой активностью [3 - Sans R.G., Chosas M.G. // Pharmazie, 1988, Bd 43, N 12, S. 827-829]. Появляются новые работы по изучению антибактериальных свойств 5-арилиденбарбитуровых кислот [4 - Yan Q., Cao R., Yi W., Chen Z., Wen H, Ma L, Song H. // Inhibitory effects of 5-arylidene barbiturate derivatives on mushroom tyrozinase and their antibacterial activity // Eur. J. Med. Chem., 2009, 44, 4235-4243].
Ранее у многих других 5-арилиденбарбитуровых кислот были выявлены ценные биологические свойства - пестицидные, противоопухолевые, антимикробные, иммуносупрессивные, ноотропные, антигипертензионные и антиаллергические [5 - Singh A., Mohan R.R., Misra V.S. // Indian Drugs.,1985, Vol. 22, N 8, P. 418-422 (Chemical Abstracts, Vol. 104, 129855 c).
6 - Singh S., Gupta G.P., Shanker K. // Indian J. Chem., 1985, Vol. 24B, N 10, P. 1094-1097.
7 - Singh A., Misra V.S. // Pharmacol. Res., 1989, Vol. 21, N 1, P. 59-64 (Chemical Abstracts, Vol. 111, 49906z).
8 - Kumar P., Nath C., Agarwal J.C., Bhargava K.P., Shanker K. // Indian J. Chem., 1983, Vol. 22B, N 9, P. 955-958.
9 - Патент Японии, M. кл. A61K 31/505, No 05213755, заявлен 07.02.1992 (92/56671), опубликован 24.08.1993 (Chemical Abstracts, 1993, Vol. 119, 262520 r).
10 - Kumar A., Singh S., Saxena A.K., Shanker K. // Indian J. Chem., Sect. 1988, Vol. 27, N 5, P. 443-447.
11 - Hirota K., Fukazawa Т., Isobe Y., Morita Н., 3аявка ЕПВ No. 546661, M кл. C07D 239/62, заявлен 09.10.1991 (91/290538), опубликован 16.06.1993 (Chemical Abstracts, Vol. 119. 180814a)].
Приведенные выше документы свидетельствуют о перспективности поиска новых антибактериальных агентов в ряду барбитуровых кислот и в частности, среди 5-арилиденпроизводных барбитуровой кислоты.
Высокая изменчивость бактерий, приводящая к появлению и быстрому распространению устойчивости к антибиотикам, не позволяет достичь достаточного клинического эффекта в лечении большого количества вызываемых ими заболеваний различной локализации. Медицина нуждается в появлении новых лекарственных средств, не имеющих аналогов и, как следствие, циркуляции устойчивых клонов. Выявленные особенности жизни микробов в биопленках также показали необходимость отбора антимикробных препаратов с новыми свойствами.
Staphylococcus aureus является одним из наиболее опасных микроорганизмов, с которыми сталкивается сегодняшняя медицина, представляя собой значительную часть всех антибиотикоустойчивых штаммов. Это становится очевидным благодаря возросшей роли метициллин-устойчивых форм во внебольничных инфекциях. Более того, многие из этих штаммов могут вызывать инфекции, угрожающие жизни даже здоровых людей. Это объясняет в значительной степени на том наблюдении, что в США более 100000 пациентов страдают от инфекций, вызванных метициллин-устойчивыми формами Staphylococcus aureus (MRSA), приводящими к фатальному результату приблизительно в 20000 случаев [http://www.ndhealth.gov/ disease/Documents/Resources/MRSA%20Book/MRSAVRE.pdf]. Пoявление антибиотикоустойчивых штаммов создало срочную потребность в новых антибактериальных агентах.
Прототипом изобретения, т.е. веществом, наиболее близким по биологическому действию к заявляемому средству, был выбран антибиотик ампициллин. Пенициллины ингибируют один из ферментов, вовлеченных в синтез бактериальной клеточной стенки. Возникшая в результате этого нестабильность клеточной стенки ведет к лизису микроорганизмов.
Ампициллин представляет собой соединение:
6-[[(2R)-aminophenylacetyl]amino]-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2carboxylic acid,
см.: [http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?cid=6249].
Ампициллин - антибиотик широкого спектра действия, но он не действует на метициллин-устойчивые штаммы Staphylococcus aureus (MRSA), микобактерии и грибы, плохо проникает в бактериальные биопленки [Davies D. Understanding biofilm resistance to antibacterial agents. Nat Rev Drug Discov 2003; 2:114-122; Anderl, J. N., Franklin M. J., Stewart, P. S. Role of antibiotic penetration limitation in Klebsiella pneumoniae biofilm resistance to ampicillin and ciprofloxacin. Antimicrob. Agents Chemother. 2000. 44:1818-1824].
Раскрытие изобретения
Задачей изобретения является получение новых химических соединений, обладающих более высокой антибактериальной активностью и большей широтой действия.
Согласно изобретению поставленная задача решается путем синтеза новых противомикробных веществ общей формулы (1)
1
3
2
где X, Х выбраны из группы: H, галоген; NO;
2
4
Х, Х представляют собой H;
2
Z выбран из группы: О, NNH, NOH, пергидропиримидин-5-илиден-2,4,6-трион, замещенный по атому азота метильной, аллильной, метоксибензильной, фенильной группой;
Y выбран из группы: H, Na, Li, K.
Изобретение распространяется на все пространственные изомеры заявляемых веществ, все их таутомерные и солевые формы, а также аддукты с органическими кислотами, такими как муравьиная, уксусная, пропионовая, молочная, бензойная, салициловая.
Заявителю не известны какие-либо источники информации, в которых бы содержались сведения об идентичных технических решениях, что позволяет сделать вывод о соответствии заявленного изобретения критерию "Новизна" (N).
Заявителем не выявлены какие-либо источники информации, содержащие сведения о влиянии заявленных отличительных признаков на достигаемый вследствие их реализации технический результат. Это, по мнению заявителя, свидетельствует о соответствии данного технического решения критерию «Изобретательский уровень» (IS).
Краткое описание чертежей
В дальнейшем изобретение поясняется подробным описанием примеров его осуществления без ссылок на чертежи.
Лучший вариант осуществления изобретения
Для решения поставленной задачи предпочтительны вещества, указанные в таблице 1.
Заявляемые вещества 1-16 синтезируют в соответствии со схемой 1, вещества 17-19 - в соответствии со схемой 2, а вещества 20-21 - со схемой 3. Расшифровка радикалов в структуре заявляемых веществ приведена в Таблице 1.
3
2
2
5: R=H (a), CH (b), CHCH=CH (с), 4-метоксибензил (d), Ph (е)
2
4
6: Х=Х=H;
1
3
1
3
1
3
Х=Х=Br (a); Х=Х=Cl (b); Х=Х=H (с);
1
3
1
3
1
3
2
Х=Н, X=Br (d); Х=Н, X=С1 (е); Х=H, X=NO (f);
1
3
2
1
3
2
1
3
Х=Br, X=NO (g); Х=Cl, X=NO (h); X=X=I (j);
1
3
2
1
3
1
3
X=I, X=NO (k); X=Br, X=I (1); X=I, X=Br (m).
Синтез заявляемых веществ 1-16 по схеме 1 в общем виде включает в себя три основных этапа:
1) Получают N-алкилмочевину (3) из соли соответствующего алкиламина (2) и цианата калия в водном растворе.
2) Получают соответствующее производное барбитуровой кислоты 5 путем циклоконденсации N-алкилмочевины 3 с диэтилмалонатом (4) в присутствии алкоголята натрия.
3) Получают заявляемое вещество 1-16 конденсацией производного барбитуровой кислоты 5 с соответствующим 2-гидроксибензальдегидом (6).
В случае получения веществ 1-12 в качестве промежуточного соединения (5) используется барбитуровая кислота (5а, R=H), которая является доступным реагентом и поэтому первых двух этапов синтеза не требуется, то есть синтез веществ 1-12 осуществляется в одну стадию.
Заявляемые вещества 17-19 получают по схеме 2 путем обработки соответствующего производного 2-гидроксибензальдегида (6) водно-спиртовым раствором щелочи YOH, где Y - Li, Na или K.
Заявляемые вещества 20, 21 получают по схеме 3 путем обработки соответствующего производного 2-гидроксибензальдегида (6) гидразин гидратом или гидроксиламином в спиртовом растворе с последующей обработкой спиртовым раствором щелочи YOH, где Y - Li, Na или K.
Способ является общим для всех членов группы.
Сущность изобретения поясняется приведенными ниже примерами синтеза промежуточных веществ, примерами синтеза заявленного вещества, таблицами выходов и характеристик целевых веществ, экспериментами по изучению биологических свойств и таблицами результатов экспериментов по определению биологических свойств заявляемых веществ, где:
пример 1 - конкретный вариант выполнения синтеза заявляемого вещества (получение целевых веществ 1-12);
пример 2 - конкретный вариант выполнения синтеза заявляемого вещества (получение целевых веществ 13-16);
пример 3 - конкретный вариант выполнения синтеза заявляемого вещества (получение целевых веществ 17-19);
пример 4 - конкретный вариант выполнения синтеза заявляемого вещества (получение целевых веществ 20-21);
эксперимент 1 - определение антибактериальной активности;
эксперимент 2 - определение активности заявляемых веществ против резистентных бактериальных штаммов;
эксперимент 3 - определение острой токсичности;
таблица 1 - структура заявляемых производных (1-21);
1
таблица 2 - данные спектров H ЯМР целевых веществ (1-21);
таблица 3 - данные элементного анализа целевых веществ (1-21).
Пример 1. Вариант выполнения синтеза заявляемого вещества - получение 5-(3,5-дибром-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2.4,6-триона (1а).
0.01 моль (1.28 г) барбитуровой кислоты (5а) растворяли при нагревании в 25 мл ледяной уксусной кислоты. К этому раствору прибавляли при перемешивании 0.011 моль (3.08 г) 3,5-дибром-2-гидроксибензальдегида (6а) и полученную реакционную смесь оставляли при комнатной температуре на 36 ч. Образовавшийся кристаллический продукт отфильтровывали, промывали холодной уксусной кислотой, затем эфиром и сушили на воздухе. Получили 3.3 г продукта 1а виде желтых игольчатых кристаллов с Тпл 255-260°C (с разл.). Выход 77% от теоретического.
По аналогичной методике из барбитуровой кислоты (5а) и соответствующего альдегида (6) получали:
5-(3,5-дихлор-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2,4,6-трион (2), Тпл 260-263°C (с разл.), выход 71% от теоретического;
5-(5-бром-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2,4,6-трион (3), Тпл 256-258°C (с разл.), выход 74% от теоретического;
5-(5-хлор-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2,4,6-трион (4), Тпл 260-263°C (с разл.), выход 75% от теоретического;
5-(5-нитро-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2,4,6-трион (5), Тпл 240-245°C (с разл.), выход 70% от теоретического;
5 -(3-бром-5-нитро-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2,4,6-трион (7), Тпл 241-243°C (с разл.), выход 66% от теоретического;
5-(3-хлор-5-нитро-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2,4,6-трион (8), Тпл 241-245°C (с разл.), выход 69% от теоретического;
5-(3,5-дииод-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2,4,6-трион (9), Тпл 251-265°C (с разл.), выход 79% от теоретического;
5-(3-иод-5-нитро-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2,4,6-трион (1к) (10), Тпл 233-236°C (с разл.), выход 61% от теоретического;
5-(3-бром-5-иод-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2,4,6-трион (11), Тпл 255-259°C (с разл.), выход 68% от теоретического;
5-(3-иод-5-бром-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2,4,6-трион Тпл 260-264°C (с разл.), выход 70% от теоретического.
Пример 2. Вариант выполнения синтеза заявляемого вещества - получение 1-метил-5-(3,5-дибром-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2,4,6-триона (13) (Схема 1).
2.1. 1-Метилмочевина (3а). 0.1 Моль (6.7 г) метиламина хлоргидрата (2) растворяли при нагревании до 50°С в 30 мл воды. К раствору приливали при перемешивании раствор 0.11 моль (8.1 г) цианата калия в 35 мл воды, полученную смесь нагревали 15 мин и упаривали досуха на водяной бане. Остаток экстрагировали изопропанолом и экстракт упаривали досуха в вакууме до постоянного веса. Получили 6.2 г продукта 3а с Тпл 89°C. Выход 88% от теоретического.
3
2.2. 1-Метилбарбитуровая кислота (5b). В 60 мл безводного метанола растворяли 0.2 моль (4.6 г) металлического натрия. К полученному раствору прибавляли 0.1 моль (16 г) диэтилмалонового эфира (4) и перемешивали 5 мин. Затем прибавляли 0.1 моль (7.2 г) N-метилмочевины (3b R=CH) и кипятили смесь 3 ч с обратным холодильником при перемешивании. Затем отгоняли 2/3 метанола, охлаждали смесь до 25°C и прибавляли 25 мл воды. Раствор подкисляли HCl до pH 1 и выдерживали при 10°C, выпавший осадок фильтровали, промывали холодной водой и сушили. Получили 11.5 г 1-метилбарбитуровой кислоты 5b с Тпл 142-143°C. Выход 83% от теоретического.
2.3. 1-Метил-5-(3,5-дибром-2-гидроксибензилиден)пергидро-пиримидин-2,4,6-трион (13)
Из 1-метилбарбитуровой кислоты 5b и 3,5-дибром-2-гидроксибензальдегида (6а) по методике, аналогичной описанной в Примере 1, получали заявляемое вещество 9 с Тпл 202-205°C, выход 74% от теоретического.
По методике, аналогичной описанной в Примере 2, в соответствии со Схемой 1 получали замещенные барбитуровые кислоты 5b-d, которые конденсировали с 3,5-дибром-2-гидроксибензальдегидом (6а) и получали:
1-аллил-5-(3,5-дибром-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2,4,6-трион (14) с Тпл 206-210°C, выход 69% от теоретического.
1-(4-метоксибензил)-5-(3,5-бром-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2,4,6-трион (15) с Тпл 205-207°C, выход 66% от теоретического.
1-фенил-5-(3,5-бром-2-гидроксибензилиден)пергидропиримидин-2,4,6-трион (16) с Тпл 226-229°C, выход 70% от теоретического.
Пример 3. Вариант выполнения синтеза заявляемого вещества - получение 2-формил-4,6-дибромфенолята натрия (17), (Схема 2).
К раствору 0.01 моль (2.80 г) 3,5-дибром-2-гидрокси-бензальдегида (5а) в метаноле прибавляли водно-метанольный раствор 0.01 моль (0.4 г) едкого натра и полученную реакционную смесь оставляли при комнатной температуре. Образовавшийся кристаллический продукт отфильтровывали, промывали метанолом, затем эфиром и сушили на воздухе. Получили 2.9 г продукта 17 в виде желтого мелкокристаллического порошка с Тпл 260-262°C (с разл.). Выход 90% от теоретического.
По методике, аналогичной Примеру 2.3, из 3,5-дибром-2-гидроксибензальдегида (5а) и гидроксида лития получали:
2-формил-4,6-дибромфенолят лития (18) с Тпл 259-260°C, выход 85% от теоретического.
По методике, аналогичной Примеру 2.3, из 3-бром-5-нитро-2-гидроксибензальдегида (5ж) и едкого кали получали:
2-формил-4-бром-6-нитрофенолят калия (19) с Тпл 272-273°C, выход 88% от теоретического.
Пример 4. Вариант выполнения синтеза заявляемого вещества (получение гидразона 2-формил-4,6-дибромфенолята натрия (20).
К раствору 0.01 моль (2.80 г) 3,5-дибром-2-гидрокси-бензальдегида (5а) в метаноле прибавляли 0.01 моль (0.5 г) гидразин гидрата, перемешивали 20 мин и затем приливали раствор 0.01 моль (0.4 г) метанольного раствора едкого натра. Полученную реакционную смесь оставляли при комнатной температуре. Образовавшийся кристаллический продукт отфильтровывали, промывали метанолом, затем эфиром и сушили на воздухе. Получили 2.56 г продукта 20 в виде желтых кристаллов с Тпл 260-262°C (с разл.). Выход 81% от теоретического.
По аналогичной методике из 3,5-дибром-2-гидрокси-бензальдегида (5а), гидроксиламина и едкого кали получали:
оксим 2-формил-4,6-дибромфенолята натрия (21) с Тпл 250°C (разл.), выход 72% от теоретического.
Эксперимент 1
Бактерии: Определение антимикробного действия веществ проводили при помощи оценки чувствительности к препаратам на плотных и жидких питательных средах. Для оценки минимальной ингибирующей концентрации использовали метод серийных разведений согласно рекомендациям CLSI (Clinical Laboratories and Standards Institute, ранее National Committee for Clinical Laboratory Standards) (Clinical Laboratories and Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard-Seventh Edition. Document M7-A7. CLSI, Wayne, Pa., 2006; Clinical Laboratories and Standards Institute).
Эксперимент 2
Использованы штаммы грамположительных микроорганизмов Staphylococcus aureus АТСС 29213, метициллин-устойчивый штамм S.aureus (MRSA) 24/31, S.aureus MRSA 201/010, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Streptococcus pyogenes ATCC 51339. Штаммы грамположительных микроорганизмов включали Haemophilus influenza ATCC 49247. Mycobacteria - Mycobacteria tuberculosis H37Rv. Грибы: Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus fumigatus ATCC 204305.
Минимальные ингибирующие концентрации для веществ f # 1, 2, 14, и 15 составили от: 1.5-3.1 мг/л для S. aureus ATCC 29213, S.aureus MRSA 24/31, S.aureus MRSA 201/010; 0.7-1.5 мг/л для E. faecalis ATCC 29212, S.pyogenes ATCC 51339; 1.5-3.0 мг/л для H. influenza ATCC 49247; 6.5-12.5 для M. tuberculosis H37Rv; 3.1-6.2 для С.albicans ATCC 10231 и A. fumigatus ATCC 204305.
В тех же условиях препарат сравнения – ампициллин - не действовал на все использованные штаммы грибов и MRSA.
Эксперимент 3
Контрольные высевы культур на плотные питательные среды не показал роста, что свидетельствует о бактерицидном действии препаратов.
Наибольшей активностью обладает вещество №1.
Заявляемые соединения проникают и убивают бактерии и грибы, находящиеся в биопленках. Для тестирования использовали биопленки, полученные в течение 24 часов в 96-луночных плато. После 24-часового воздействия compound #1 на биопленки S. aureus ATCC 29213, S.aureus MRSA 24/31, S.aureus MRSA 201/010 число КОЕ снижалось в 10000 раз, в то время как при действии 10 mg/l ампициллина на S. aureus ATCC 29213 число КОЕ снижалось только в 10 раз, а на штаммы MRSA препарат вообще не действовал.
Промышленная применимость
Для реализации изобретения используются известные материалы и оборудование, что обусловливает, по мнению заявителя, соответствие изобретения критерию «Промышленная применимость» (IA).
Структура наиболее активных заявляемых производных (1а-х) общей формулы 1.