Применеине ПЦР для выявления вируса иммунодефицита КРС у животнъiх в крови и пробах мяса

мер борьбы с артритом-энцефалитом коз в РФ. Ает. дис. канд. вет. наук. -Покров, 2008, 25 с.

3. Angelopoulou К., Karanikolaou К., Papanastasopoulou М. First partial characterization of small ruminant lentiviruses from Greece. Vet Microbiol, 2005, 109, 1—2, 1—9.

4. Crawford T.B.. Adams S„ Cheevers W.P., Cork L.C. Chronic arthritis in goats caused by a retrovirus. Science, 1980, 207, 997—999.

5. Coackley W., Smith V.W., Houwers D.J. Preparation and evaluation of antigens used in serological tests for caprine syncytial retrovirus antibody in sheep and goat sera. Vet Microbiol, 1984. 9. 581—586.

6. Konishi M„ Tsuduku S., Haritani M. et. al. An epidemic of caprine arthritis encephalitis in Japan: isolation of the virus. J Vet Med Sci, 2004, 66, 8, 911—917.

7. NarayanO., Clements J.E. Biology and pathogenesis of Lentiviruses. J Gen Virol, 1989, 70, 1617—1639.

8. Ngatia Т.Д., Njenga M.J.. Mbuthia P.G. Occurrence and pathology of caprine arthritis — encephalitis in young goats in Kenya. Bull Anim Health Prod Africa, 2005, 53, 1, 77—83.

9. Oliver R.E., Adams D.S., GorhamJ.R. et al. Isolation of caprine arthritis encephalitis virus from a goat. N Z Vet J, 1982, 30, 10, 147 —149.

10. Shah C., Huder J.B., Buni J. et al. Direct Evidence for Natural Transmission of Small-Ruminant Lentiviruses of Subtype A4 from Goats to Sheep and Vice Versa. J Virol, 2004, 78, 14, 7518—7522.

11. Surman P.G., Daniels E., Dixon B.R. Caprine arthritis-encephalitis virus infection of goats in Sougth Australia. Aust Vet J, 1987, 64, 9, 266—271.

G.D. Sidelnikov, D.V. Kolbasov, S.G. Cybanov. Isolation CAEV and development serological method for diagnostic this infection.

УДК 619:616-092:612.017.1-008.64-076:636.22/28

Применение ПЦР для выявления вируса иммунодефицита КРС у животных в крови и пробах мяса

В.Г. Бурба1, Д.С. Меграбян1, В.В. Колотвин1, Н.Ф. Гриненко2, А.Д. Альтштейн2, А.Ф. Валихов1

1 Московский государственный университет прикладной биотехнологии

2 Институт биологии гена РАН

Ключевые слова: культура клеток, крупный рогатый скот, ретровирусы

Сокращения: ВИК — вирус иммунодефицита КРС; ВПК — вирус лейкоза КРС; КРС — крупный рогатый скот; ЛЭК — легкое эмбриона коровы; ПЦР — полимеразная цепная реакция: ЦПД — цитопатическое действие

Введение

Ретровирусы — уникальное семейство РНК-содержащих вирусов, обладающее способностью синтезировать ДНК с помощью специализированного фермента (обратной транскриптазы). Данное свойство позволяет им интегрировать собственную нуклеиновую кислоту в геном клеток хозяина, что фактически делает невозможным излечение последнего. Среди млекопитающих ретровирусы распространены особенно широко [2]. У КРС инфекцию могут вызывать 2 ретровируса — ВЛК и ВИК.

Вирусную природу лейкоза КРС установили в 1970-х годах. К настоящему моменту изучены свойства возбудителя, широта его распространения в разных странах, разработаны методы диагностики и рекомендации по оздоровлению неблагополучных хозяйств. ВИК изучен хуже. До сих пор остается неизвестным его патогенетический потенциал, способы передачи и степень распространения в стадах КРС. Его обнаружили в скотоводческих хозяйствах США, Аргентины, Японии, Канады, Германии, Турции, Южной Кореи, Замбии и др. На территории России эту инфекцию диагностировали недавно [ 11. Установили, что в ряде хозяйств Московской области широта распространения ВИК в среднем составляет 40 %, в то время как благополучие по этой инфекции других субъектов Российской Федерации остается неизвестным. Чтобы решить эту задачу, требовался чувствительный и специфичный метод диагностики, позволяющий выявлять ВИК непосредственно в крови животных. В настоящее время наиболее универсальным методом обнаружения вирусов в биологических объектах является ПЦР. Для подтверждения специфичности показаний ПЦР, разработкой которой мы занялись, был необходим положительный контроль. С этой целью трансфицировали плаз-миду с полным геномом ВИК в культуру клеток ЛЭК. В статье описано ЦПД, которое вызывал агент в данной клеточной системе. Приведены результаты исследования в ПЦР крови КРС из нескольких хозяйств Ставропольского края и Вологодской области, а также проб импортированного мяса.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 12262-офи.

Материалы и методы

Вирус. Культуру Е. coli, трансформированную плазмидой pBIV127 с полным геномом ВИК R-29, получили из коллекции Национального института здоровья США. Плазмидой пользовались дня трансфицирования культуры клеток ЛЭК.

Культура клеток. Диплоидную линию клеток ЛЭК получили из иервично-трипсинизированиой (рисунок). После 30 пассажей расплодку этой культуры перенесли на хранение в жидкий азот.

ПЦР. ДНК из культуры клеток и цельной крови КРС выделяли с помощью набора для универсальной подготовки проб ДНК Diatom DNA Prep 100 (Лаборатория Изоген, Россия). ПЦР ставили с применением наборов лиофилизиро-ванных смесей PCR core и оригинальных праймеров gagl/ gag2 и blv2/blvl0, предназначенных для обнаружения прови-русов ВИК и ВЛК соответственно. Продукты реакции фер-ментативно секвенировали с применением дидезоксирибо-нуклеотидов. При анализе продуктов секвенирования пользовались программой LaserGene MegAlign_v6.

Тестированный материал. Образцы ДНК выделили из цельной крови КРС шести скотоводческих хозяйств Ставропольского края (120 проб) и одного экспериментального хозяйства Вологодской области (30 проб), а также из 64 партий говядины, импортированной из стран Европейского Союза, Восточной Европы и Южпой Америки.

ЦПД в культуре клеток ЛЭК после траксфекции плазмид с полным геномом ВИК

РВЖ СХЖ №2-2009

29

Результаты исследований

Размножение ВИК в трансфидиро ванной плазмидой рВ1У127 диплоидной культуре ЛЭК сопровождалось образованием синцития и очагов морфологически измененных или поврежденных клеток (рисунок). Вирус-специфические изменения появлялись примерно через 3 дня после заражения клеток и рач-вивались с увеличением срока инкубации инфицированных культур. В ПЦР при исследовании ДНК, выделенной из транс-фицированной плазмидой культуры клеток, выявили ВПК.

Зараженная культура клеток обычно выдерживала не более трех пассажей, поскольку клетки разрушались по мере развития ЦОД. Впоследствии инфицированную ВПК культуру клеток использовали при постановке ПЦР в качестве положительного контроля.

Результаты исследования проб ДНК, выделенных из крови и мышечной ткани КРС, представлены в таблицах 1 и 2. ВИК обнаружили в 15,83% проб крови КРС из хозяйств Ставропольского края. В пробах крови животных из Вологодской области его не нашли. Средняя частота обнаружения ВЛК в обследованных хозяйствах обоих регионов составила 32 %.

1. Результаты выявления ВИК и ВЛК у КРС Ставропольского края и Вологодской области методом ПЦР

Регион Обследовано Признано Признано

животных. инфициро- инфициро-

гол. ванными ванными

ВИК, гол/% ВЛК, гол/%

Ставропольс- 120 19/15,83 32/26,6

кий край

Вологодская 30 0/0 16/53,3

область

Итого 150 19/12,6 48/32

2. Результаты исследования в ПЦР импортной говядины на наличие провирусной ДНК ВИК

Страна Количество тестированных партий мяса Частота обнаружения ВИК, партии /%

Аргентина 12 0/0

Бразилия 34 3/8,8

Парагвай 4 2/50

Украина 5 3/60

Франция 4 2/50

Италия 5 2/40

Итого 64 12/18,75

В результате секвенирования продуктов ПЦР обнаружили большее количество нуклеотидных замен в области гена ро1 штаммов ВИК, циркулирующих в скотоводческих хозяйствах России, по сравнению с нуклеотидной последовательностью референтного штамма ВИК К-29.

Обсуждение

Посредством трансфекции плазмиды рВ1У127, содержа-шей полный геном ВИК, получили культуру клеток, продуцирующую этот ретровирус. Инфекция ВИК проявлялась в культуре клеток специфическим для этого агента ЦПД. Применение зараженной ВИК культуры клеток в качестве положительного контроля при постановке ПЦР позволило подтвердить специфичность показаний теста.

Установленная нами частота обнаружения ВИК в крови КРС из хозяйств Ставропольского края соответствует данным литературы о широте распространения этой инфекции в других странах.

По результатам исследований проб говядины нельзя судить о широте распространении ВИК в скотоводческих хозяйствах стран, из которых ее импортировали. Однако дан-

ный опыт подтверждает возможность применения ПЦР для тестирования мяса КРС на наличие ВИК.

Выявлено большое количество нуклеотидных замен в гене pol референтного штамма ВПК и штаммов этого агента, циркулирующих в обследованных хозяйствах. Анализ информации о нуклеотидных заменах позволит создать более точную диагностическую тест-систему и избежать ложноот-рицательных результатов при проведении ПЦР.

Создание диагностической тест-системы ПЦР в реальном времени для одновременной детекции нровнру-сов ВИК и ВЛК станет предметом наших дальнейших исследований.

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Колотвин В.В., Капитонов А.В., Гриненко Н.Ф. и соавт. Выявление вируса иммунодефицита крупного рогатого скота в Московской области. РВЖ сельскохозяйственные животные, 2006, 2, 18—20.

2. van Regentmortel М.Н., Fauquet С.М., Bishop D.H.L. et al. Virus Taxonomy Classification and Nomenclature of Virus. Acad Press, San-Diego, 2000.

V.G. Burba, D.S. Megrabyan, V.V. Kolotvin. V.F. Grinenko, A.D. Altstein, A.F. Valikhov. The application of PCR to reveal BIV in blood and meat samples of cattle.

УДК 635.21:581.143.6

О культуре клеток хороидного

сплетения овец

Б.Ф. Шуляк, РВЖ СХЖ

Культивирование тканей и клеток на протяжении длительного времени считали искусством. Такое представление не стало анахронизмом и в наши дни, когда накоплен огромный опыт, доступны разнообразные питательные среды, культуральные матрасы и другие необходимые приспособления. Статья Г.Д. Сидельникова и соавт. напомнила мне о способе выращивания культуры клеток хороидного сплетения овец, которая по чувствительности к другому лентивирусу жвачных (вирусу висны-мэди) превосходит все остальные. Ею сейчас пользуются нечасто, что обусловлено сложностью выращивания и отсутствием достаточного количества сырья — масса хороидного сплетения, извлеченного из обоих боковых желудочков головного мозга взрослой овцы не превышает 0,3 г.

До настоящего времени культуру этой тканн выращивают методом, предложенным исландскими исследователями в 1930-х годах мшгувшего столетия. Схематично его технология сводится к следующему. Стерильно извлеченные из боковых желудочков головного мозга сплетения промывают в растворе Хенкса, измельчают и помещают полученные фрагменты в пробирки, куда предварительно внесено по капле смеси сгустка плазмы крови кур и экстракта куриных эмбрионов. Эта смесь быстро образует желеобразный сгусток, который удерживает эксплантаты на поверхности стекла. Со временем вокруг таких островков «переживающей» ткани разрастаются клетки, которые субкультивпруют обычным способом.

Пишу эту заметку с надеждой, что она будет полезна, а отнюдь не из-за того, что причисляю себя к мастерам «культу-рального дела». Напротив, в начале 1980-х годов мне на протяжении полутора лет не удавалось вырастить культуру исландским методом. Плазму крови кур и экстракт куриных эмбрионов приходилось готовить самостоятельно, что, безусловно,