VERSIONS OF DISINTEGRIN AND THEIR PHARMACEUTICAL APPLICATION
ВАРИАНТЫ ДИЗИНТЕГРИНА И ИХ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Эта заявка имеет приоритет в соответствии с U.S.C. 35 § 119(e) предварительной заявки на патент США №62/040,503, поданной 22 августа 2014 г., которая непосредственно включена в данный документ ссылкой в полном объеме.
ССЫЛКА НА СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕННЫХ В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ
[0002] Настоящая заявка содержит список последовательностей, представленный в формате ASCII через EFS-Web с именем файла "688947-1 РСТ Sequence Listing.txt", дата создания 20 августа 2015 г., и имеющий размер 157219 байт. Список последовательностей, представленный через EFS-Web, является частью описания и включен в данный документ ссылкой в полном виде.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0003] Изобретение относится к вариантам дизинтегрина, которые специфически связываются с одним или несколькими интегринами α5β1 и αv, такими как αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8, но с пониженной связывающей активностью к αIIbβ3, и способам применения вариантов дизинтегрина для лечения и предупреждения заболевания, связанного с интегрином αv или интегрином α5β1.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] Интегрины являются трансмембранными рецепторами, которые связываются с белками внеклеточного матрикса или другими рецепторами адгезии на соседних клетках. Гетеродимерное спаривание α и β субъединиц интегрина придает специфичность связывания с одним или несколькими субстратами (Weis et al., 2011, Cold Spring Harb Perspecl Afcc/I Med; 1:са006478). Это семейство молекул адгезии играет ключевую роль в широком контексте биологии, включающем воспаление, врожденный и антигенспецифический иммунитет, гомеостаз, заживление ран, морфогенез тканей и регуляцию роста и дифференцировки клеток. Дисрегуляция интегринов участвует в патогенезе многих болезненных состояний, от аутоиммунитета до тромботических сосудистых заболеваний, до метастазов рака. Обширные усилия были направлены на открытие и развитие антагонистов интегрина для клинических применений.
[0005] Интегрины αv, каждый из которых имеет αv субъединицу, спаренную с субъединицей β1, β3, β5, β6 или β8, по-видимому, являются особенно важными во время ремоделирования тканей, связанного с заживлением ран, агиогенезом и раком (Weis et al., 201 1, выше). Причем интегрины αv становятся мишенью для рака, офтальмологических и ортопедических показаний. Интегрины αvβ3 и αvβ5 также были связаны с опухолями, артритом, псориазом и возрастной макулярной дегенерацией (AMD). В частности, интегрин αvβ3 имеет большое значение в опосредовании ангиогенеза и в ингибировании миграции опухоли, и интегрин αvβ6 положительно регулируется в некоторых вида рака. Остальные αv интегрины, присутствующие в роговице, (αvβ5, αvβ6 и αvβ8) опосредуют активацию трансформирующего фактора роста β (TGFβ).
[0006] Сообщалось, что интегрины α5β1, αvβ3 и αvβ5 играют важную роль в процессе ангиогенеза и экспрессируются в различных злокачественных опухолях, в том числе, но не ограничиваются ими, меланоме, раке молочной железы, раке предстательной железы, раке толстой кишки и глиомах (Staunton et al., 2006, Adv Immunol., 91:111-57). Внутриопухолевая экспрессия этих интегринов была связана с прогрессированием и метастазированием в опухолях, таких как меланома, рак молочной железы и рак предстательной железы (Staunton et al., 2006, supra). Они, как было показано, передают сигнал посредством множественных каскадов реакций и вносят вклад в миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток. In vivo, они сверхэкспрессируются на новообразованных сосудах опухолей и на самих опухолевых клетках, что позволяет предположить, что их функционирование может стимулировать прогрессирование опухоли с помощью множественных механизмов. Было показано, что антагонистические антитела и малые молекулы, направленные против интегринов α5β1, αvβ3 и αvβ5, ингибируют ангиогенез in vitro и in vivo. Ингибиторы интегринов α5β1, αvβ3 и αvβ5 способны ингибировать передачу сигнала через ERK (пер., киназу, регулируемую внеклеточными сигналами), киназу Akt и FAK (пер., киназу фокальных адгезий), что приводит к снижению адгезии, миграции и пролиферации эндотелиальных и раковых клеток. Также было обнаружено, что эти антагонисты вызывают гибель клеток посредством каспазо-зависимых механизмов. Следовательно, критическая роль интегринов α5β1, αvβ3 и αvβ5 в ангиогенезе и связи с прогрессированием опухоли делает их привлекательными мишенями противораковой терапии, и многие антагонисты этих интегринов были протестированы в клинических испытаниях.
[0007] Интегрин αvβ3 делит ту же самую β3 субъединицу с интегрином αIIbβ3, а также несколькими макромолекулярными лигандами, включающими фибриноген, фибронектин, тромбоспондин, фактор фон Виллебранда и витронектин. Все эти лиганды содержат последовательность из трех аминокислот аргинин-глицин-аспарагиновая кислота (RGD). Фибронектин и витронектин являются также лигандами для α5β1 и других αv интегринов. Интегрин αIIbβ3 является основным мембранным белком на тромбоцитах и играет важную роль в агрегации тромбоцитов. Было разработано несколько антагонистов интегрина αIIbβ3 для лечения пациентов с острым коронарным синдромом (ACS). Однако, поскольку обширное ингибирование агрегации тромбоцитов связано с повышенным риском кровотечения, продолжающиеся исследования сосредоточены на уменьшении кровотечения и других побочных эффектах от антагонистов интегрина αIIbβ3 Крайне важно разработать лекарственные средства, блокируя или один интегрин или множество интегринов αv для различных показаний (Goodman, 2012. Trends Pharmacol Sci. 2012;33:405-412).
[0008] Дизинтегрины представляют собой семейство RGD-содержащих пептидов с низкой молекулярной массой, которые связываются с интегринами, такими как, αIIbβ3, α5β1 и αvβ3, экспрессируемых на тромбоцитах и других клетках, в том числе сосудистых эндотелиальных клетках и некоторых опухолевых клетках. В дополнение к их мощной антитромбоцитарной активности, исследования дизинтегринов выявили новые применения в диагностике сердечно-сосудистых заболеваний, а также при разработке терапевтических агентов при артериальном тромбозе, остеопорозе и связанном с ангиогенезом росте опухолей и метастазировании. Было обнаружено, что родостомин (Rho), дизинтегрин из яда Colloselasma rhodostoma (пер., гладкого щитомордника), ингибирует агрегацию тромбоцитов in vitro и in vivo посредством блокирования гликопротеина тромбоцитов αIIbβ3. Также установлено, что Rho может связываться с интегринами αIIbβ3, α5β1 и αvβ3 с высокой аффинностью и взаимодействовать с раковыми клетками. Сообщается, например, что Rho ингибирует адгезию клеток рака молочной железы и предстательной железы как к деминерализованным, так и к минерализованным внеклеточным костным матриксам в зависимости от дозы, не оказывая влияния на жизнеспособность опухолевых клеток. Rho также ингибирует миграцию и инвазию клеток карциномы молочной железы и предстательной железы.
[0009] Тем не менее, поскольку родостомин неспецифически связывается с интегринами αIIbβ3, α5β1 и αvβ3, фармацевтические применения родостомина могут вызвать серьезные побочные эффекты, такие как кровотечение в результате ингибирования агрегации тромбоцитов. Таким образом, в данной области техники существует необходимость в варианте дизинтегрина, который является селективным в отношении интегринов α5β1 и αvβ3, но с пониженной активностью связывания с αIIbβ3. Такая потребность удовлетворяется этим изобретением.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010] Изобретение относится к вариантам дизинтегринов, имеющим одну или несколько мутаций в одной или нескольких из линкерной области, петли RGD и C-конца дизинтегрина, таким как родостомин, которые имеют пониженную активность связывания с интегрином αIIbβ3, а значит и слабое ингибирование агрегации тромбоцитов, но специфически связываются с одним или несколькими из интегринов α5β1 и αv, такими как αvβl, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8.
[0011] Таким образом, в одном общем аспекте, изобретение относится к варианту дизинтегрина, содержащему по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из:
(а) мутантного линкера, содержащего по меньшей мере одну мутацию в положениях с 1 по 5 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 332 (SRAGKIC);
(b) мутантной петли RGD, содержащей аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 329 - 331; и
(c) мутантного С-конца, содержащего по меньшей мере одну мутацию в положениях 1 - 4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 334 (PRYH),
где вариант дизинтегрина имеет пониженную активность связывания с интегрином αIIbβ3 по сравнению с дизинтегрином, не имеющим по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из мутантного линкера, мутантной петли RGD, мутантного C-конца. Предпочтительно вариант дизинтегрина также имеет повышенную активность связывания по меньшей мере с одним из интегринов αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6, αvβ8 и α5β1 пo сравнению с дизинтегрином, не имеющим по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из мутантного линкера, мутантной петли RGD, мутантного С-конца.
[0012] В соответствии с воплощениями изобретения, вариант дизинтегрина может быть вариантом любого дизинтегрина, включающим, но не ограничиваются ими, дизинтегрин, выбранный из группы, состоящей из родостамина, алболабрина, апплагина, басилицина, батроксостатина, битистатина, цереберина, церастина, кротатроксина, дуриссина, элегантина, флаворидина, флавостатина, халисина, халистатина, ярарацина, ярастатина, кистрина, лачесина, лутосина, молоссина, салмосина, саксатилина, тергеминина, триместатина, тримукрина, тримутаса, уссуристатина и виридина. Предпочтительно, вариант дизинтегрина является вариантом дизинтегрина, имеющим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 1-6. Более предпочтительно, вариант дизинтегрина является вариантом родостамина, имеющим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
[0013] В предпочтительном воплощении, вариант дизинтегрина содержит мутантную петлю RGD, содержащую по меньшей мере одну мутацию в положениях 1-3, 5, 7 и 8 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 333 (RIPRGDMP) и по меньшей мере один из мутантных линкеров и мутантный С-конец, описанные здесь.
[0014] В другом предпочтительном воплощении изобретения, вариант дизинтегрина содержит мутантный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 306 по SEQ ID NO: 318.
[0015] В еще другом предпочтительном воплощении изобретения, вариант дизинтегрина содержит мутантный С-конец, имеющий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 319 по SEQ ID NO: 328.
[0016] В предпочтительном воплощении изобретения, вариант дизинтегрина содержит мутантную петлю RGD, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 329 по SEQ ID NO: 331, и по меньшей мере одно из мутантного линкера, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 306 по SEQ ID NO: 318, и мутантного С-конца, имеющего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 319 по SEQ ID NO: 328. Более предпочтительно, вариант дизинтегрина содержит мутантную петлю RGD, мутантный линкер и мутантный С-конец, описанные здесь.
[0017] В соответствии с воплощениями изобретения, вариант дизинтегрина содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7 по SEQ ID NO: 179. Предпочтительно, вариант дизинтегрина в соответствии с воплощением изобретения содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 123, 124, 147, 149 и 171.
[0018] Предпочтительно, вариант дизинтегрина в соответствии с воплощением изобретения является модифицированным, например, для улучшения доставки или стабильности. Например, вариант дизинтегрина является пегилированным или конъюгированным с партнером для слияния, таким как альбумин или Fc.
[0019] Другой общий аспект изобретения относится к полинуклеотиду, кодирующему вариант дизинтегрина по изобретению, который может быть экспрессирующим вектором, содержащим регуляторную последовательность, такую как промотор, функционально связанный с последовательностью ДНК, кодирующей вариант дизинтегрина.
[0020] Изобретение также относится к рекомбинантной клетке-хозяину, содержащей полинуклеотид, кодирующий вариант дизинтегрина по изобретению. Клетка-хозяин может быть прокариотической клеткой, дрожжевой клеткой, клеткой насекомого или клеткой млекопитающего.
[0021] Изобретение дополнительно относится к способу изготовления варианта дизинтегрина по изобретению, содержащему получение варианта дизинтегрина в рекомбинантной клетке-хозяине в соответствии с воплощением изобретения.
[0022] Изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую вариант дизинтегрина по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
[0023] Еще другой общий аспект изобретения относится к способу лечения заболевания, связанного по меньшей мере с одним из интегринов αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6, αvβ8, α5β1, предпочтительно заболевания, связанного по меньшей мере с одним из интегринов α5β1 и αvβ3, у субъекта, нуждающемуся в этом. Способ содержит введение субъекту фармацевтической композиции по изобретению.
[0024] В одном воплощении изобретения, интегрин-ассоциированное заболевание является глазным заболеванием, связанным с ангиогенезом кровеносных сосудов, выбранным из группы, состоящей из возрастной макулярной дегенерации, диабетической ретинопатии, заболевания неоваскуляризации роговицы, индуцированной ишемией неоваскуляризированной ретинопатии, миопии высокой степени и ретинопатии недоношенных.
[0025] В другом воплощении изобретения, интегрин-ассоциированное заболевание является раковым заболеванием, выбранным из группы, состоящей из метастатической меланомы, метастатического рака простаты, метастатического рака молочной железы, колоректальной карциномы, рака печени, рака яичников, рака шейки матки, рака поджелудочной железы, немелкоклеточного рака легкого и мультиформной глиобластомы.
[0026] Другой общий аспект изобретения относится к применению варианта дизинтегрина по изобретению в производстве лекарственного средства для лечения заболевания, связанного по меньшей мере с одним из интегринов αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6, αvβ8 и α5β1 у субъекта, нуждающемуся в этом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
[0027] Предшествующее краткое описание, а также последующее подробное описание настоящего изобретения, будут лучше поняты при прочтении вместе с прилагаемым графическим материалом. Следует понимать, что изобретение не ограничено показанными точными вариантами осуществления, представленными на графических материалах.
[0028] На графических материалах:
[0029] Фиг. 1 демонстрирует карту взаимодействия родостомина: (А) иллюстрация взаимодействий между линкерной областью, петлей RGD и С-концевой областью родостомина; и (В) аминокислотные последовательности областей, вовлеченных во взаимодействия между родостомином и интегринами, где остатки, которые могут быть мутированы в варианте дизинтегрина в соответствии с воплощением по изобретению, помечены в виде "X";
[0030] Фиг. 2 демонстрирует ингибирующую активность различных протестированных агентов на миграцию клеток меланомы человека А375: (A) Rho, дикий тип, (В) AR-NP, вариант дизинтегрина в соответствии с вариантом осуществления изобретения, и (С) забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS);
™
[0031] Фиг. 3А представляет собой фотографии, демонстрирующие пониженную плотность кровеносных сосудов в пробках MATRIGEL мышей C57BL/6, леченных белком AR-NP или ARLDDL в сравнении с нелеченными контрольными мышами;
™
[0032] Фиг. 3В представляет собой график, демонстрирующий пониженное содержание гемоглобина в пробках MATRIGEL от мышей C57BL/6, леченных белком AR-NP или белком ARLDDL два раза в день, через 5 дней в сравнении с нелеченными контрольными мышами;
™
[0033] Фиг. 3С представляет собой график, демонстрирующий пониженное содержание гемоглобина в пробках MATRIGEL от мышей C57BL/6, леченных белком AR-NP или белком ARLDDL, который вводили один раз в день в течение 5 дней в сравнении с нелеченными контрольными мышами;
[0034] Фиг. 4А представляет собой фотографии, демонстрирующие ангиогенез на мышиной модели ретинопатии недоношенных (ROP), и снижение ангиогенеза у мышей с ROP, леченных белком AR-NP, стрелками показаны профили кровеносных сосудов (BVPs) новых сосудов;
[0035] Фиг. 4В представляет собой график, демонстрирующий пониженные BVPs новых сосудов на мышиной модели ретинопатии недоношенных (ROP), леченных белком AR-NP;
[0036] Фиг. 4С представляет собой график, демонстрирующий пониженные BVPs эндотелиальных клеток на мышиной модели ретинопатии недоношенных (ROP), леченных белком AR-NP;
[0037] Фиг. 5 демонстрирует ингибирование аортального кольца мыши белком AR-NP (0,1 мкМ) в течение 7 дней в сравнении с нелеченным контролем: верхняя панель: изображения, полученные при увеличении ×20; нижняя панель: изображения, полученные при увеличении ×100;
[0038] Фиг. 6(А, В) демонстрирует, что как ARLDDL (0,1 мкМ и 1 мкМ) 6(A), так и AR-NP(6B) (0,1 мкМ и 1 мкМ), ингибировали образование колоний клеток 4-Т1 рака молочной железы;
[0039] Фиг. 7 демонстрирует, что белок AR-NP или белок ARLDDL ингибировал RANKL-индуцированный остеокластогенез по сравнению с нелеченным контролем: белок AR-NP (В и С); белок ARLDDL (D); контроль (А);
[0040] Фиг. 8 демонстрирует, что как ARLDDL (0,1 мкМ), так и AR-NP (0,1 мкМ) заметно ингибировал инвазию глиомы;
[0041] Фиг. 9(А, В) демонстрирует, что AR-NP из расчета 5 мг/кг не оказывал существенного влияния на кровяное давление (фиг. 9А) и частоту сердечных сокращений(фиг. 9В) у крыс Wistar;
[0042] Фиг. 10 демонстрирует ингибирование роста меланомы А375 белком AR-NP у мышей SC1D, масштабная линейка: 1 см;
[0043] Фиг. 11 демонстрирует ингибирование роста опухоли белком AR-NP (KG) у трансгенных мышей K-rasG12D; и
[0044] Фиг. 12 (А-С) демонстрирует ингибирование роста опухоли мозга у мышей, несущих U87, белком AR-NP (KG).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0045] Различные публикации, статьи и патенты приведены или описаны в предпосылках изобретения и на всем протяжении описания изобретения; каждая из этих ссылок непосредственно включена в данный документ ссылкой в полном объеме. Обсуждение документов, актов, материалов, устройств, статей и тому подобное, которое было включено в настоящее описание, является целью предоставления контекста данного изобретения. Такое обсуждение не является признанием того, что любой или все из этих предметов являются частью предшествующего уровня техники в отношении любых изобретений раскрытых или заявленных.
[0046] Если иное не определено, все применяемые здесь технические и научные термины имеют то же самое значение, которое обычно понятно специалисту с обычной квалификацией в данной области техники, к которой относится данное изобретение. В противном случае, определенные термины, используемые в настоящем описании, имеют значения, как указано в описании. Все патенты, опубликованные заявки на патенты и публикации, цитируемые здесь, непосредственно включены в данный документ ссылкой, как если бы полностью изложены в настоящем документе. Следует отметить, что при использовании в данном документе и в прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа "a", "an" и " the" включают ссылки на множественное число, если контекст ясно не диктует иначе.
[0047] В применении здесь, "дизинтегрин" относится к классу богатых цистеином белков, которые являются сильнодействующими растворимыми лигандами интегринов и участвуют в регуляции многих процессов, таких как межклеточная адгезия и адгезия клеток к внеклеточному матриксу, миграция и инвазия, последовательность этапов клеточного цикла, дифференцировка и видообразование клеточного типа в процессе развития многих многоклеточных организмов, гибель клеток и апоптоз. Аминокислотный мотив RGD (Arg-Gly-Asp) является консервативным у большинства мономерных дизинтегринов и расположен на конце гибкой петли, интегрин-связывающей петли, которая стабилизирована дисульфидными связями и выпячивается из основного остова полипептидной цепи. Все дизинтегрины, очищенные из змеиного яда, селективно связываются с рецепторами фибриногена или нацелены на рецепторы фибриногена, такие как αv-интегрины, интегрин α5β1 и интегрин αIIbβ3, связывание которого приводит к ингибированию фибриноген-зависимой агрегации тромбоцитов, а также других биологических активностей, опосредованных этими рецепторами фибриногена. Примеры дизинтегринов, применимых в изобретении, включают, но не ограничиваются ими, родостомин, трифлавин (triflavin), регистатин (rehistatin) тримукрин (trimucrin), элегантин (elegantin), триграмин и апплаггин (applaggin). Приводимые в качестве примеров пептидные последовательности дизинтегринов, применимые в изобретении, представлены в SEQ ID NOs: с 1 по 6.
[0048] В применении здесь, "вариант дизинтегрина" относится к сконструированному, функционально активному белку, или полипептиду, или любым их производным, который содержит аминокислотную последовательность, полученную или модифицированную или мутантную из дизинтегрина дикого типа. Вариант дизинтегрина содержит одну или несколько мутаций по сравнению с природно-встречающимся дизинтегрином. Одна или несколько мутаций могут быть заменой, делецией или инсерцией (вставкой) одной или нескольких аминокислот в природно-встречающийся дизинтегрин. В одном варианте осуществления, вариант дизинтегрина обладает пониженной активностью связывания с интегрином αIIbβ3 по сравнению с природно-встречающимся дизинтегрином, не имеющим одну или несколько мутаций. Более предпочтительно вариант дизинтегрина специфически связывается с одним или несколькими дизинтегринами αvβ1,αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8, и интегрином α5β1. Более предпочтительно вариант дизинтегрина имеет повышенную активность связывания с одним или обоими интегрином αvβ3 и интегрином α5 β1 по сравнению с природно-встречающимся дизинтегрином, не имеющим одну или несколько мутаций.
[0049] В определенных воплощениях, вариант дизинтегрина содержит модифицированный Rho белок из яда, который содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену, инсерцию или делецию по сравнению с природно-встречающимся Rho. Модифицированные варианты Rho и/или различные дизинтегрины могут дополнительно содержать посттрансляционные модификации.
[0050] В одном воплощении, вариант дизинтегрина по изобретению содержит мутантную петлю RGD. В применении здесь, "мутантная петля RGD " или "мутантная область RGD" относится к пептиду, содержащему одну или несколько мутаций в аминокислотной последовательности, которые охватывают петлю RGD дизинтегрина. Петля RGD дизинтегрина дикого типа содержит остатки RGD, которые связываются с интегринами. Например, петля RGD Rho содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 333 (RIPRGDMP). В предпочтительных воплощениях изобретения, мутантная петля RGD содержит по меньшей мере одну мутацию в положениях 1-3, 5, 7 и 8 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 333. Более предпочтительно, мутантная петля RGD содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 329 - 331.
[0051] В другом варианте осуществления, вариант дизинтегрина по изобретению содержит мутантный линкер. В применении здесь, "мутантный линкер" или "мутантная линкерная область" относится к пептиду, содержащему одну или несколько мутаций в аминокислотной последовательности, которые охватывают линкерную область дизинтегрина. Линкерная область дизинтегрина расположена непосредственно на N-конце петли RGD. Например, линкерная область Rho содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:332 (SRAGKIC). В предпочтительных воплощениях изобретения, мутантный линкер содержит по меньшей мере одну мутацию в положениях с 1 по 5 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 332. Более предпочтительно мутантный линкер содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 306 по SEQ ID NO: 318.
[0052] Еще в другом варианте осуществления, вариант дизинтегрина по изобретению содержит мутантный С-конец. В применении здесь, "мутантный С-конец" или "мутантная С-концевая область" относится к пептиду, содержащему одну или несколько мутаций в аминокислотной последовательности С-концевой области дизинтегрина. С-концевая область дизинтегрина расположена на карбоксильном конце дизинтегрина. Например, С-конец Rho содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 334 (PRYH). В предпочтительных воплощениях изобретения, мутантный С-конец содержит по меньшей мере одну мутацию в положениях 1-4 аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 334. Более предпочтительно мутантный С-конец содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:319 по SEQ ID NO: 328.
[0053] В предпочтительных вариантах осуществления, вариант дизинтегрина по изобретению содержит мутантную петлю RGD и по меньшей мере одно из мутантного линкера и мутантного С-конца дизинтегрина.
[0054] В более предпочтительных вариантах осуществления, вариант дизинтегрина по изобретению содержит мутантную петлю RGD, мутантный линкер и мутантный С-конец дизинтегрина, описанные здесь.
[0055] Вариант дизинтегрина по изобретению может включать в себя природно-встречающиеся и не встречающиеся в природе аминокислоты. Примеры природно-встречающихся аминокислот включают, без ограничения перечисленным, любую из двадцати основных, природно-встречающихся аминокислот, которые обычно образуют пептиды, полипептиды и белки. Приведенная ниже таблица 1 представляет собой табулирование 20 природно-встречающихся аминокислот.
[0057] Не встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой непротеиногенные аминокислоты, которые как встречаются в природе, так и являются химически синтезированными. Примеры не встречающихся в природе аминокислот включают в себя, но без ограничения перечисленным, β-аминокислоты (β3 и β2), гомо-аминокислоты, производные пролина и пировиноградной кислоты, 3-замещенные производные аланина, производные глицина, замещенные в кольце производные фенилаланина и тирозина, линейные  аминокислоты, N-метил аминокислоты, и т.п.
[0058] В применении здесь, "консервативная замена" является заменой аминокислоты другой аминокислотой, которая имеет тот же самый суммарный заряд электронов и приблизительно тот же самый размер и форму. Аминокислоты с алифатическими или замещенными алифатическими боковыми цепями аминокислот имеют приблизительно тот же самый размер, когда общее число атомов углерода и гетероатомов в их боковых цепях отличается не более чем приблизительно на четыре. Они имеют приблизительно ту же самую форму, когда количество ветвей в их боковых цепях отличается не более чем на одну. Считается, что аминокислоты с фенильными или замещенными фенильными группами в их боковых цепях имеют примерно тот же самый размер и форму. Ниже перечислено пять групп аминокислот. Замена аминокислоты в полипептиде на другую аминокислоту из той же самой группы приводит к консервативной замене: группа I: глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серии, треонин, цистеин и не встречающиеся в природе аминокислоты с С1-С4 алифатическими или с замещенными гидроксилом С1-С4 алифатическими боковыми цепями (прямоцепочечные или одноразветвленные); группа II: глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота и не встречающиеся в природе аминокислоты с замещенными карбоновой кислотой С1-С4 алифатическими боковыми цепями (неразветвленные или имеющие одну точку разветвления); группа III: лизин, орнитин, аргинин и не встречающиеся в природе аминокислоты с замещенными амином или гуанидиногруппой С1-С4 алифатическими боковыми цепями (неразветвленные или имеющие одну точку разветвления); группа IV: глутамин, аспарагин и не встречающиеся в природе аминокислоты с замещенными амидом С1-С4 алифатическими боковыми цепями (неразветвленные или имеющие одну точку разветвления); и группа V: фенилаланин, фенилглицин, тирозин и триптофан.
[0059] В применении здесь, "высококонсервативная замена" представляет собой замену аминокислоты другой аминокислотой, которая имеет ту же самую функциональную группу в боковой цепи и приблизительно тот же самый размер и форму. Аминокислоты с алифатическими или аминокислоты с замещенными алифатическими боковыми цепями имеют приблизительно тот же самый размер, когда общее число атомов углерода и гетероатомов в их боковых цепях отличается не более чем на два. Они имеют приблизительно ту же самую форму, когда они имеют то же самое количество ветвей в их боковых цепях. Примеры высококонсервативных замен включают замены валина на лейцин, треонина на серии, аспарагиновой кислоты на глутаминовую кислоту и фенилглицина на фенилаланин.
[0060] В применении здесь, термин "выделенный белок" или "выделенный полипептид" относится к белку, кодируемому нуклеиновой кислотой, включающей, inter alia (среди прочих), геномную ДНК, к ДНК, рекомбинантную ДНК, рекомбинантную РНК или нуклеиновую кислоту синтетического происхождения или некоторую их комбинацию, который (1) не содержит по меньшей мере некоторые белки, с которыми он обычно был бы обнаружен, (2) по существу не содержит другие белки из того же самого источника, например, из той же самой клетки или вида, (3) экспрессируется клеткой других видов, (4) был отделен по меньшей мере приблизительно от 50 процентов полинуклеотидов, липидов, углеводов или других материалов, с которыми он природно обнаруживается при выделении из источника клеток, (5) не является связанным (ковалентным или нековалентным взаимодействием) со всем полипептидом или частью полипептида, с которым "выделенный белок" связан по своей природе, (6) функционально связан (ковалентным или нековалентным взаимодействием) с полипептидом, с которым он не связан по своей природе, или (7) не встречается в природе. Предпочтительно выделенный белок по существу не содержит другие контаминирующие белки или полипептиды или другие загрязняющие вещества, которые обнаруживаются в его естественной окружающей среде, которые мешали бы его терапевтическому, диагностическому, профилактическому или научно-исследовательскому применению.
[0061] В применении здесь, термины "полинуклеотид", "нуклеотид", "олигонуклеотид" и "нуклеиновая кислота" могут быть использованы взаимозаменяемо для обозначения нуклеиновой кислоты, содержащей ДНК, РНК, их производное или их комбинацию.
[0062] В применении здесь, термины "полипептид" и "белок" могут быть использованы взаимозаменяемо для обозначения белков, продуцируемых природно-встречающимися и не встречающимися в природе клетками, генно-инженерными или рекомбинантными клетками, или химическим синтезом, и содержат молекулы, имеющие аминокислотную последовательность нативного белка, или последовательности, которые имеют делеции, присоединения и/или замены одной или нескольких аминокислот нативной последовательности. В соответствии с рассматриваемым изобретением, дизинтегрины представляют собой полипептид или белок, конкретно включают модифицированный белок Rho или его фрагмент или его варианты. В определенных конкретных воплощениях, дизинтегрины охватывают Rho белок, его фрагменты или варианты, которые ингибируют активность интегрина. В определенных конкретных воплощениях, дизинтегрин нацелен на изоформу интегрина αv, такую как любая группа, выбранная из αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8, и интегрина α5β1. В других определенных конкретных воплощениях, интегрин не является αIIbβ3.
[0063] В применении здесь, "клетка-хозяин" является индивидуальной клеткой или культурой клеток, которая может быть или стала реципиентом любого рекомбинантного вектора (векторов) или полинуклеотида. Клетки-хозяева включают в себя потомство единственной клетки-хозяина, и потомство не обязательно может быть полностью идентичным (по морфологии или комплементарности геномной ДНК) исходной родительской клетке вследствие природной, случайной или преднамеренной мутации и/или изменения. Клетка-хозяин включают в себя клетки трансфицированные или инфицированные in vitro или in vivo рекомбинантным вектором или полинуклеотидом настоящего изобретения. Клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантный вектор настоящего изобретения может быть названа "рекомбинантной клеткой-хозяином". Подходящие клетки-хозяева включают в себя прокариотические или эукариотические клетки, в том числе, например, бактериальные, дрожжевые, грибковые, растительные клетки и клетки млекопитающих.
[0064] В применении здесь, термин "связывающая активность" относится к связыванию дизинтегрина или варианта дизинтегрина с интегрином, что приводит к одному или нескольким: ингибированию, блокированию, нейтрализации, понижению, подавлению или препятствию активности интегрина. В определенных воплощениях, дизинтегрин или вариант дизинтегрина ингибирует активность интегрина путем связывания с интегрином и изолирования интегрина от связывания с другими молекулами, например, другими белками внеклеточного матрикса (ЕСМ). В других определенных воплощениях, дизинтегрин или вариант дизинтегрина ингибирует активность интегрина путем связывания с интегрином и предупреждения интегрина от запуска событий путей передачи сигналов внутрь клеток.
[0065] В применении здесь, термин "ингибирование" или "ингибировать" в контексте активности интегрина, в применении здесь относится к свойству дизинтегрина или варианта дизинтегрина, которое снижает активность интегрина, как проанализировано различными функциональными анализами, включающими, без ограничения, анализы связывания, анализы миграции, анализы апоптоза и анализы адгезии клеток. В определенных воплощениях изобретения, интегрин является изоформой αv интегрина, включающей αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8. В других определенных конкретных воплощениях, интегрин является α5β1. В определенных дополнительных воплощениях дизинтегрин или вариант дизинтегрина ингибирует активность интегрина от около 0% до около 100% по сравнению с контролем в отсутствие дизинтегрина или варианта дизинтегрина.
[0066] В применении здесь, термин "селективно связывает", "селективно ингибирует", "селективное связывание", "селективное ингибирование", "дифференциально связывает", "дифференциально ингибирует", "дифференциальное связывание" или "дифференциальное ингибирование" относится к свойству дизинтегрина или варианта дизинтегрина, который показывает дифференциальную специфичность к конкретной молекуле-мишени интегрина по сравнению с одним или несколькими другими интегринами. Например, вариант дизинтегрина настоящего изобретения селективно связывается с одним или несколькими интегринами αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6, α5β1, следовательно, имеет более высокую аффинность (сродство) к одному или нескольким интегринам αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6, α5β1, чем к другому интегрину, такому как интегрин αIIbβ3. В определенных воплощениях, вариант дизинтегрина, содержащий модифицированный фрагмент Rho, селективно ингибирует активность одного или нескольких интегринов, выбранных из группы, состоящей из интегринов αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и интегрина α5β1. В предпочтительных воплощениях, вариант дизинтегрина, содержащий модифицированный фрагмент Rho, специфически ингибирует активность как интегрина αvβ3, так и интегрина α5β1, ингибирует (активность) как интегрина αvβ5, так и интегрина α5β1, или как интегрина αvβ6, так и α5β1. В определенных альтернативных воплощениях, вариант дизинтегрина, содержащий модифицированный фрагмент Rho, специфически ингибирует активность всех интегринов αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и интегрина α5β1.
[0067] В применении здесь, термин "гомология" или "гомологичный" относится к уровню общего сходства последовательностей и/или идентичности между соответствующими фрагментами дизинтегрина, такими как фрагмент Rho. Высокая гомология последовательности предполагает сохранение активности белка. Ряд общедоступных алгоритмов или компьютерных программ может быть использовано для определения гомологии последовательностей. Специалист в данной области техники в состоянии определить пригодность дополнительных консервативных или неконсервативных аминокислотных замен и уровень гомологии последовательностей.
[0068] В применении здесь, термин "субъект" относится к любому животному, в том числе, но не ограничивается ими, человеку и другим приматам, грызунам (например, мышам, крысам и морским свинкам), зайцеобразным (например, кроликам), быкам (например, крупному рогатому скоту), овечьим (например, овцам), козьим (например, козам), свинообразным (например, свинье), лошадиным (например, лошадям), псовым (например, собакам), кошачьим (например, кошкам), домашним птицам (например, курам, индейкам, уткам, гусям, другим куриным и т.п.), а также одичавшим или диким животным, в том числе, но не ограничиваются ими, таким животным, как копытные (например, оленям), медведям, зайцеобразным, грызунам, птицам и т.п.. Не предполагается, что этот термин ограничивается конкретным возрастом или полом. Таким образом, взрослые и новорожденные субъекты, а также эмбрионы, мужского или женского пола, охвачены этим термином. Субъекты "нуждающиеся в лечении" являются субъектами с заболеваниями и/или состояниями, которые могут получить лечение путем ингибирования одной или нескольких активностей интегрина для достижения благоприятного терапевтического и/или профилактического результата. Благоприятный результат включает в себя уменьшение тяжести симптомов или задержку появления симптомов, увеличение продолжительности жизни и/или более быстрое или более полное разрешение заболевания или состояния.
[0069] Термин "Фармацевтически приемлемый носитель" относится к нетоксичному твердому, полутвердому или жидкому наполнителю, разбавителю, инкапсулирующему материалу, вспомогательному веществу композиции или наполнителю любого традиционного типа. Фармацевтически приемлемый носитель нетоксичен для реципиентов при используемых дозировках и концентрациях и совместим с другими ингредиентами композиции.
[0070] В применении здесь, термин "фармацевтически приемлемые соли" относится к производным соединений, в которых исходное соединение модифицируют путем получения его кислотных или щелочных солей.
[0071] В применении здесь, термн "заболевание, связанное с интегрином" относится к любому связанному с интегрином состоянию, нарушению или синдрому, которое требует медицинского вмешательства, или для которого желательно медицинское вмешательство. Такое медицинское вмешательство может включать в себя лечение, диагностику и/или предупреждение.
[0072] В применении здесь, "эффективное количество" или "достаточное количество" относится к количеству варианта дизинтегрина, как описано здесь, которое может быть терапевтически эффективным для ингибирования, предупреждения или лечения симптома конкретного заболевания, нарушения, состояния или побочного эффекта.
[0073] Термин "лечить", "лечение" или "проведение лечения" означает снижение частоты, степени, тяжести и/или продолжительности симптома конкретного заболевания, нарушения, состояния или побочного эффекта.
[0074] Термин "предупреждать", "предупреждение" или "проведение предупреждения" означает подавление или предотвращение симптомов конкретного заболевания, нарушения, состояния или побочного эффекта.
Варианты дизинтегрина
[0075] В настоящем изобретении обнаружено, что варианты дизинтегринов из змеиного яда, такие как родостомин (Rho) из родостомы, демонстрируют различные способности селективно связываться с одним или несколькими интегринами αv, такими как один или несколько из αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8 и другими интегринами, такими как α5β1, с пониженной связывающей активностью к αIIbβ3. Способность селективно связываться с определенным интегрином (интегринами) была обеспечена путем мутирования аминокислотных последовательностей в одной или нескольких линкерной области, петле RGD и С-конце представляющего интерес дизинтегрина.
[0076] Таким образом, один общий аспект изобретения относится к вариантам дезинтегрина. В соответствии с одним из вариантов осуществления настоящего изобретения вариант дизинтегрина обладает пониженной связывающей активностью к αIIbβ3, и специфически связывается по меньшей мере с одним из α5β1, αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8.
[0077] Предпочтительно вариант дизинтегрина обладает пониженной связывающей активностью к αIIbβ3, но повышенной связывающей активностью по меньшей мере к одному из α5β1 и αvβ3 по сравнению с дизинтегрином дикого типа, из которого получен вариант дизинтегрина.
[0078] Например, было обнаружено, что мутация Rho в петле RGD (например,
46
53
65
68
39
45
XXXRXDXX) может повысить специфичность к интегрину αVβ3 и/или интегрину α5 β1, мутация в С-концевой области (например, ХХХХ) может вызывать меньшее связывание с αIIbβ3 (следовательно, более слабое ингибирование агрегации тромбоцитов и меньший побочный эффект кровотечения), и мутация в линкерной области (например, XXXXXIC) также может снижать связывание с αIIbβ3, где каждую из трех областей идентифицируют номерами аминокислотных остатков в Rho, дикого типа, и аминокислотные остатки, которые могут быть модифицированы, например, инсерцией (вставкой), делецией или заменой в соответствии с вариантами осуществления изобретения, каждый независимо обозначен как "X".
46
53
[0079] В соответствии с вариантами осуществления изобретения, вариант дизинтегрина содержит мутацию в петле RGD (например, XXXRXDXX), то есть мутантную петлю RGD.
49
51
[0080] В одном варианте осуществления, вариант дизинтегрина содержит мутантную петлю RGD, имеющую консенсусную последовательность RXD. Примеры таких вариантов включают в себя, но не ограничиваются ими, варианты, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 7-24.
48
51
[0081] В другом варианте осуществления, вариант дизинтегрина содержит мутантную петлю RGD, имеющую консенсусную последовательность XRGD. Примеры таких вариантов включают в себя, но не ограничиваются ими, варианты, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 25-42.
48
53
[0082] В другом варианте осуществления, вариант дизинтегрина содержит мутантную петлю RGD, имеющую консенсусную последовательность XRGDXP. Примеры таких вариантов включают в себя, но не ограничиваются ими, варианты, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 43-61.
48
53
[0083] В другом варианте осуществления, вариант дизинтегрина содержит мутантную петлю RGD, имеющую консенсусную последовательность XRGDMX. Примеры таких вариантов включают в себя, но не ограничиваются ими, варианты, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 62-78.
46
51
[0084] В другом варианте осуществления, вариант дизинтегрина содержит мутантную петлю RGD, имеющую консенсусную последовательность XXPRGD. Примеры таких вариантов включают в себя, но не ограничиваются ими, варианты, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 79-94.
48
53
[0085] В другом варианте осуществления, вариант дизинтегрина содержит мутантную петлю RGD, имеющую консенсусную последовательность XRXDXP. Примеры таких вариантов включают в себя, но не ограничиваются ими, варианты, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 95-101.
65
68
[0086] В соответствии с другими вариантами осуществления изобретения, вариант дизинтегрина содержит мутацию в С-концевой области (например, ХХХХ), то есть мутантный С-конец.
65
71
[0087] В одном варианте осуществления, вариант дизинтегрина содержит мутантный С-конец, имеющий консенсусную последовательность PRXXXXX. Примеры таких вариантов включают в себя, но не ограничиваются ими, варианты, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 102-107.
65
71
48
53
[0088] В другом варианте осуществления, вариант дизинтегрина содержит мутантный С-конец, имеющий консенсусную последовательность PRXXXXX, и дополнительно содержит мутантную петлю RGD, такие как те, что описаны здесь. Например, мутантная петля RGD может иметь консенсусную последовательность ARGDMP (SEQ ID NO: 335). Примеры таких вариантов включают в себя, но не ограничиваются ими, варианты, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 115-119.
39
45
[0089] В соответствии еще с другими вариантами осуществления изобретения, вариант дизинтегрина содержит мутацию в линкерной области (например, ХХХХХIC), то есть мутантный линкер.
39
47
48
53
[0090] В одном варианте осуществления, вариант дизинтегрина содержит мутантный линкер, имеющий консенсусную последовательность KKKRTIC (SEQ ID NO: 306). Предпочтительно вариант дизинтегрина дополнительно содержит мутантную петлю RGD, такую как те, что описаны здесь. Например, мутантная петля RGD может иметь консенсусную последовательность XRXDXP. Примеры таких вариантов включают в себя, но не ограничиваются ими, варианты, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 108-114.
39
45
46
53
65
68
[0091] В соответствии с дополнительными вариантами осуществления изобретения, вариант дизинтегрина содержит мутацию в линкерной области (например, XXXXXIC), мутацию в петле RGD (например, XXXRXDXX) и мутацию в С-концевой области (например, ХХХХ). Примеры таких вариантов включают в себя, но не ограничиваются ими, варианты, имеющие аминокислотные последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NOs:120-179.
[0092] Вариант дизинтегрина по изобретению может быть сделан любым способом, подходящим для целей изобретения, принимая во внимание настоящее описание. Например, вариант дизинтегрина может быть сконструирован методом сайт-направленного мутагенеза. Вариант дизинтегрина по изобретению может быть экспрессирован с использованием методов, известных в данной области, принимая во внимание настоящее описание. Клеточные методы и бесклеточные системы являются особенно подходящими для изготовления пептидов по изобретению. Клеточные методы обычно включают введение конструкции нуклеиновой кислоты в клетку-хозяин in vitro и культивирование клетки-хозяина в условиях, подходящих для экспрессии, затем сбор пептида, либо из культуральной среды, либо из клетки-хозяина, (например, путем разрушения клетки-хозяина), или обоих. Изобретение также обеспечивает способы изготовления варианта дизинтегрина с использованием бесклеточных систем транскрипции/трансляции in vitro, которые хорошо известны в данной области.
[0093] Вариант дизинтегрина по изобретению может быть кодируемым модифицированной дизинтегриновой нуклеотидной последовательностью, которая кодирует модифицированную аминокислотную последовательность, приводящую к тому, что указанный полипептид, имеющий по существу сниженную блокирующую активность рецептора интегрина αIIbβ3, и/или повышенную специфичность к одному или нескольким αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8 и другим интегринам, таким как α5β1. Кодирующая последовательность варианта дизинтегрина может быть получена путем модификации кодирующей последовательности для дизинтегрина, произведенного из змеиного яда. Дизинтегрин может быть выбран из одного из родостомина, алболабрина, апплагина, басилицина, батроксостатина, битистатина, цереберина, церастина, кротатроксина, дуриссина, элегантина, флаворидина, флавостатина, халисина, халистатина, ярарацина, ярастатина, кистрина, лачесина, лутосина, молоссина, салмосина, саксатилина, тергеминина, триместатина, тримукрина, тримутаса, уссуристатина и виридина.
[0094] Таким образом, другой общий аспект изобретения относится к полинуклеотиду, кодирующему вариант дизинтегрина по изобретению. Еще другой общий аспект изобретения относится к клетке-хозяину, содержащей полинуклеотид, кодирующий вариант дизинтегрина по изобретению.
[0095] Обычно, гетерологичный пептид, модифицирован ли или немодифицирован, может быть экспрессирован сам по себе, как описано выше, или в виде слитого белка, и может включать в себя не только сигналы секреции, но также и секреторную лидерную последовательность. Секреторная лидерная последовательность по изобретению может направлять определенные белки к эндоплазматическому ретикулуму (ER) или в периплазму. ER отделяет мембраносвязанные белки от других белков. После локализации в ER белки далее могут направляться в аппарат Гольджи для распределения в везикулы, в том числе секреторные везикулы, плазматические мембраны, лизосомы и другие органеллы. В случае периплазмы, белок секретируется в периплазматическое пространство грамотрицательной бактерии, такой как Escherichia coli.
[0096] Дополнительно, пептидные фрагменты и/или метки очистки могут быть добавлены к вариантам дизинтегрина. Такие области могут быть удалены перед конечной стадией получения полипептида. Добавление пептидных фрагментов к полипептидам для обеспечения секреции или экскреции, улучшения стабильности и облегчения очистки, или с другой целью, является известной и рутинной в данной области технологией. Подходящие маркеры очистки включают, например, V5, полигистидины, авидин и биотин. Конъюгирование пептидов с такими соединениями, как биотин, можно проводить с помощью хорошо известных в данной области технологий. (Hermanson ed. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press). Пептиды также можно конъюгировать с радиоактивными изотопами, токсинами, ферментами, флуоресцентными метками, коллоидным золотом, нуклеиновыми кислотами, винорелбином и доксорубицином с использованием известных в данной области технологий. (Hermanson ed. (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press; Stefano et al. (2006).
[0097] Партнеры для слияния, подходящие для применения по изобретению, включают в себя, например, фетуин, человеческий сывороточный альбумин, СН2/СН3 домены Fc-фрагмента иммуноглобулина, и/или один или несколько их фрагментов. Настоящее изобретение также обеспечивает конъюгированные белки, такие как конъюгаты с полиэтиленгликолем.
[0098] Пептиды по изобретению также можно синтезировать химически с помощью известных в данной области технологий (например, см., Hunkapiller et al., Nature, 310:105 111 (1984); Grant ed. (1992) Synthetic Peptides, A Users Guide, W.H. Freeman and патент США №6974884)). Например, полипептид, соответствующий фрагменту полипептида, может быть синтезирован с помощью пептидного синтезатора или с помощью известных в данной области способов твердофазного синтеза.
[0100] Кроме того, при желании можно вводить неклассические аминокислоты или химические аналоги аминокислот путем замены или добавления к полипептидной последовательности. Неклассические аминокислоты включают в себя, но не ограничиваются ими, D-изомеры обычных аминокислот, 2,4-диаминомасляную кислоту, а-аминоизомасляную кислоту, 4-аминомасляную кислоту, Abu, 2-аминомасляную кислоту, g-Abu, e-Ahx, 6-аминогексановую кислоту, Aib, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминопропионовую кислоту, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитруллин, гомоцитруллин, цистеиновую кислоту, t-бутилглицин, t-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, b-аланин, фтор-аминокислоты, сконструированные аминокислоты, такие как b-метил аминокислоты, Са-метил аминокислоты, Na-метил аминокислоты и аналоги аминокислот в целом. Кроме того, аминокислота может быть D (правовращающей) или L (левовращающей).
[0101] Вариант дизинтегрина по изобретению может быть извлечен и очищен из химического синтеза и рекомбинантных клеточных культур стандартными способами, которые включают, но не ограничиваются ими, осаждение сульфатом аммония или этанолом, кислотную экстракцию, анионо- или катионообменную хроматографию, фосфоцеллюлозную хроматографию, хроматографию на основе гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, гидроксиапатитную хроматографию и лектин-хроматографию. В одном варианте осуществления для очистки используют высокоэффективную жидкостную хроматографию («ВЭЖХ») ("HPLC"). Хорошо известные технологии рефолдинга белка могут использоваться для регенерации активной конформации, когда полипептид денатурируется во время выделения и/или очистки.
[0102] Вариант дизинтегрина по изобретению может быть модифицирован или ковалентно связан с одним или несколькими из различных гидрофильных полимеров для увеличения растворимости и периода полувыведения из циркуляции пептида. Подходящие небелковые гидрофильные полимеры для соединения с пептидом включают без ограничения перечисленным, полиалкилэфиры, например, полиэтиленгликоль и полипропиленгликоль, полимолочную кислоту, полигликолевую кислоту, полиоксиалкены, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, целлюлозу и производные целлюлозы, декстран и производные декстрана. В целом, такие гидрофильные полимеры имеют среднюю молекулярную массу в диапазоне от около 500 до около 100000 дальтон, от около 2000 до около 40000 дальтон, от около 5000 до около 20000 дальтон. Пептид может быть дериватизирован или соединен с такими полимерами с использованием любого из способов, изложенных в Zallipsky, S. (1995) Bioconjugate Chem., 6:150-165; Monfardini, С, et al. (1995) Bioconjugate Chem. 6:62-69; патентах США №№4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192; 4179337 или WO 95/34326.
[0103] Фармацевтические композиции
[0104] Другой общий аспект изобретения относится к фармацевтической композиции, содержащей вариант дизинтегрина по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В зависимости от необходимости, фармацевтические композиции могут быть приготовлены в виде препаратов в твердой, полутвердой, жидкой или газообразной формах, таких как таблетки, капсулы, порошки, гранулы, мази, растворы, суппозитории, инъекции, ингаляторы и аэрозоли. Следующие способы и наполнители являются лишь примерными и никоим образом не являются ограничивающими.
[0105] В некоторых вариантах осуществления, вариант дизинтегрина по изобретению обеспечивают в композиции с фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами и разбавителями, широкое разнообразие которых известно в данной области. Эти фармацевтические носители, эксципиенты и разбавители включают в себя те, которые перечислены в перечне фармацевтических эксципиентов Фармакопеи USP (США). Национальный формуляр (NF) Фармакопеи США «Эксципиенты», перечисленные по категориям, на стр. 2404-2406, 24 Фармакопея США, 19 Национальный формуляр, United States Pharmacopeial Convention Inc., Rockville, Md. (ISBN 1-889788-03-1). фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как наполнители, адъюванты, носители или разбавители, являются вполне общедоступными. Кроме того, фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как регуляторы рН и буферные агенты, агенты, регулирующие тоничность, смачивающие агенты и т.п., являются вполне общедоступными.
[0106] Подходящие носители включают, без ограничения перечисленным, воду, декстрозу, трегалозу, гистидин, глицерин, солевой раствор, этанол и их комбинации. Носитель может содержать дополнительные агенты, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, забуферивающие рН агенты или адъюванты, которые повышают эффективность композиции. Топические носители (для местного применения) включают в себя жидкие углеводороды, вазелиновое масло, изопропилпальмитат, полиэтиленгликоль, этанол (95%), полиоксизтиленмонолаурат (5%) в воде или лаурилсульфат натрия (5%) в воде. При необходимости могут добавляться другие материалы, такие как антиоксиданты, увлажнители, стабилизаторы вязкости и аналогичные агенты. Могут быть также включены усилители проникновения через кожу, такие как Азон (Azone).
[0107] Фактические способы получения таких лекарственных форм известны или будут очевидны специалистам в данной области техники. Композиция, или композиция подлежащая введению, в любом случае будет содержать количество агента, адекватное для достижения необходимого состояния у субъекта, подлежащего лечению.
[0108] В определенных воплощениях, вариант дизинтегрина по изобретению может быть приготовлен в препаратах для инъекции путем растворения, суспендирования или эмульгирования его в водном или неводном растворителе, таком как растительные или другие подобные масла, синтетические глицериды алифатических кислот, сложные эфиры высших алифатических кислот или пропиленгликоля; и, при желании, с обычными добавками, такими как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты, стабилизаторы и консерванты. Также могут быть использованы другие композиции для пероральной или парентеральной доставки, в виде общепринятых в данной области техники.
[0109] В фармацевтических лекарственных формах, фармацевтические композиции по изобретению могут быть введены в форме их фармацевтически приемлемых солей, или они могут также применяться отдельно или в подходящей ассоциации, а также в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями. Обсуждаемые композиции составляются в соответствии со способом потенциального введения. В предпочтительном варианте осуществления фармацевтическая композиция приготовлена для парентерального введения, например, в жидкой форме для инъекций.
[0110] Способы лечения
[0111] Изобретение также относится к способам применения вариантов дизинтегрина в лечении и/или предупреждении заболевания, связанного с одним или несколькими интегринами, выбранными из группы, состоящей из α5β1, αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 и αvβ8, у субъекта, нуждающегося в этом. Такие заболевания включают в себя, но не ограничиваются ими, остеопороз, накостную опухоль или рост рака и связанные с ним симптомы, связанные с ангиогенезом рост опухоли и метастаз, метастазирование опухоли в костях, индуцированная злокачественными опухолями гиперкальциемия, связанные с ангиогенезом заболевания глаз, болезнь Педжета, ревматический артрит и остеоартрит.Способ содержит введение субъекту, нуждающемуся в этом лечении, фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективное количество варианта дизинтегрина по изобретению и фармацевтически приемлемого носителя.
[0112] В одном варианте осуществления изобретения, вариант дизинтегрина по изобретению применяют для лечения и/или предупреждения связанного с ангиогенезом заболевания глаз, которое включает, но не ограничивается этим, возрастную макулярную дегенерацию, диабетическую ретинопатию, неоваскуляризующие заболевания роговицы, индуцированную ишемией неоваскуляризующую ретинопатию, высокую миопию и ретинопатию недоношенных.
[0113] В другом варианте осуществления изобретения, вариант дизинтегрина по изобретению применяют для лечения и/или предупреждения связанного с ангиогенезом заболевания, в том числе, но не ограничивается этим, рака, заболевания глаз, такого как дегенерация желтого пятна, отек.
[0114] В другом варианте осуществления изобретения, вариант дизинтегрина по изобретению связывается с интегринами αv, присутствующими в роговице (αvβ5, αvβ6, и αvβ8), опосредует активацию трансформирующего фактора роста β (TGFβ), что приводит к лечению связанных заболеваний. Эти заболевания включают в себя глазные болезни, артрит и рак. В дополнительном аспекте, полипептид по изобретению является анти-ангиогенными лекарственным средством для облегчения боли при артрите и предупреждения разрушения костного сустава, вызванного этими патологическими и деструктивными кровеносными сосудами. Полипептиды по изобретению также могут оказаться пригодными при комбинировании с традиционной химиотерапией или лучевой терапией, в рамках подхода "многозарядной боеголовки" для одновременного воздействия на рак с помощью различных стратегий.
[0115] Еще в другом варианте осуществления изобретения, вариант дизинтегрина по изобретению применяют для лечения и/или предупреждения остеопороза. Остеопороз может быть связан с патологическим состоянием, выбранным из эстрогенной недостаточности в период постменопаузы, вторичного остеопороза, ревматоидного артрита, овариэктомии, болезни Педжета, злокачественного поражения костей, костной опухоли, остеоартрита, повышенного образования остеокластов и повышенной активности остеокластов. Кроме того, остеопороз включает, но без ограничения перечисленным, вызванный овариэктомией остеопороз или потерю костной массы и остеопороз в период постменопаузы или потерю костной массы.
[0116] Еще другим вариантом осуществления изобретения является способ с применением варианта дизинтегрина для лечения и/или предупреждения, индуцированных овариэктомией или остеопорозом в период постменопаузы физиологических изменений у млекопитающего, включающего человека. Способ включает в себя введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества выделенного полипептида или его фармацевтически приемлемой соли, который обладает антагонистической активностью по отношению к рецептору интегрина αvβ1, αvβ3, αvβ5, αvβ6 или α5β1, и существенно более низкой блокирующей активностью по отношению к рецептору интегрина αIIbβ3 по сравнению с дизинтегрином дикого типа, и посредством чего приводит к лечению и/или предупреждению индуцированного овариэктомией физиологического изменения у млекопитающего.
[0117] В другом аспекте, изобретение обеспечивает способ ингибирования агрегации тромбоцитов, содержащий введение эффективного количества варианта дизинтегрина по изобретению или фармацевтической композиции по изобретению субъекту, нуждающемуся в таком лечении.
[0118] Вариант дизинтегрина по изобретению может быть введен субъекту, нуждающемуся в лечении, путем системной инъекции, такой как внутривенная инъекция; или путем введения в соответствующий участок, или нанесения на такой участок, например, путем прямой инъекции, или прямого нанесения на участок, если участок подвергается хирургической операции; или путем местного нанесения, например, если нарушение присутствует на коже.
[0119] Вариант дизинтегрина по изобретению может быть применен в качестве монотерапии. Альтернативно вариант дизинтегрина по изобретению может быть применен в комбинации со стандартными способами лечения связанных с интегрином заболеваний. Например, пептиды по изобретению могут быть использованы в комбинационной терапии с терапевтически эффективным количеством одного или нескольких других фармацевтических агентов. Предпочтительно другой фармацевтический агент выбран из группы, состоящей из противоракового агента, противовоспалительного агента, иммуномодулирующего агента и противоостеопорозного агента. Предпочтительно противораковый агент выбран из группы, состоящей из антиангиогенного агента, цитотоксического агента и антинеопластического агента. Другой фармацевтический агент(ы) может быть введен перед, вместе с введением или после введения пептидов по изобретению.
[0120] В некоторых вариантах осуществления, вариант дизинтегрина по изобретению является особенно эффективным против злокачественных опухолей, которые связаны с высокоэкспрессированным остеопонтином. В предпочтительных вариантах осуществления, полипептиды по изобретению могут ингибировать индуцированную остеопонтином инвазию опухоли.
[0121] Введение вариантов дизинтегрина можно осуществлять разными способами, включающими пероральное, трансбуккальное, назальное, ректальное, парентеральное, внутрибрюшинное, внутрикожное, чрескожное, подкожное, внутривенное, внутриартериальное, внутрисердечное, внутрижелудочковое, внутричерепное, внутритрахеальное и внутриоболочечное введение и др., или путем имплантации или ингаляции.
[0122] Следующие примеры изобретения приводят для дополнительной иллюстрации природы изобретения. Следует понимать, что следующие примеры не ограничивают изобретение и что объем изобретения должен определяться прилагаемой формулой изобретения.
Примеры
Пример 1. Конструирование экспрессирующих векторов, экспрессирующих Rho дикого типа и мутанты Rho (варианты дизинтегрина)
[0123] ДНК, кодирующую Rho, составляли из кодонов, предпочтительно используемых у Pichia pastoris. ДНК Rho амплифицировали полимеразной цепной реакцией (ПЦР) с использованием смыслового праймера 5'-GAATTCGAATTCCATCATCATCATCATCATCATGGTAAGGAATGTGACTGTTCT-3' (SEQ ID NO: 183), который содержит участок распознавания Eco RI и кодирует шесть остатков гистидина для облегчения очистки. Антисмысловой праймер имеет последовательность 5'-CCGCGGCCGCGGTCAGTGGTATCTTGGACAGTCAGC-3' (SEQ ID NO: 180), подлежащей добавлению в список последовательностей) или 5'-CCGCGGCCGCGGTTAGTGGTATCTTGGACAGTCAGC-3' (SEQ ID NO: 184), содержащий участок распознавания Sac II и стоп-кодон ТСА (или ТТА). Продукт ПЦР очищали и затем лигировали в участки EcoR1 и SacII дрожжевого рекомбинантного вектора, pPICZαA. Рекомбинантную плазмиду использовали для трансформации штамма DH5α, и колонии подвергали селекции на чашках с агаром, содержащих LB с низким содержанием солей LB (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,5% NaCI, 1,5% агар при рН 7,0) и 25 мкг/мл антибиотика зеоцина.
[0124] Различные конструкции ДНК, кодирующие мутанты Rho, синтезировали и амплифицировали методом ПЦР с использованием стратегии перекрывающихся олигонуклеотидов с праймерами, содержащими сайты рестрикции Eco RI и Sac II. С целью иллюстрации, в таблице 2 перечислены консенсусные последовательности некоторых вариантов дизинтегрина и праймеры, используемые для конструирования этих вариантов в соответствии с вариантами осуществления изобретения, где праймерные последовательности представлены от 5' к 3' (слева направо).
[0125] Экспрессирующие векторы, кодирующие другие варианты, охваченные настоящим изобретением, были или могут быть сконструированы аналогичным образом, принимая во внимание настоящее описание. Различные праймеры, используемые для синтезирования или подтверждения вариантов дизинтегрина, перечислены в SEQ ID NOs: 180-305.
Пример 2. Экспрессия и очистка мутантов Rho
™
™

[0126] Экспрессию белка мутантов и вариантов родостомина в Pichia pastoris выполняли в соответствии с инструкциями к набору Pichia EasyComp Kit с незначительными изменениями. Вкратце, всего 10 мкг плазмид, содержащих ДНК, кодирующих родостомин или варианты дизинтегрина, очищали и расщепляли Sac I, чтобы линеаризовать плазмиды. Штамм Pichia Х33 трансформировали линеаризованными конструкциями методом теплового шока с использованием набора, Pichia EasyComp от Invitrogen. Трансформант интегрировали в локус 5'АОХ1 путем единичного кроссинговера. Чтобы определить, интегрировался ли ген Rho в геном Pichia, проводили анализ интегрированных элементов Pichia методом ПЦР, и клетки лизировали литиказой (Sigma). Колонии подвергали селекции на чашках с агаром, содержащих YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона, 2% глюкозы и 2% агара) и 100 мкг/мл зеоцина. Некоторое количество клонов с множественными копиями вставок дизинтегрина выбирали для отбора клона с самой высокой экспрессией белка вариантов дизинтегрина.
-5
[0127] Рекомбинантные мутанты Rho получали следующим способом: отобранные колонии выращивали в среде YPD (1% дрожжевого экстракта, 2% пептона и 2% декстрозы), содержащей 100 мкг/мл зеоцина, при 30°С. Через 48 часов клетки собирали центрифугированием и выращивали в 1 литре минимальной метанольной среды (которая содержит 1,34% дрожжевого азотистого основания, сульфат аммония при отсутствии аминокислот и 4×10% биотина). Чтобы индуцировать экспрессию Rho или его варианта, в течение 2 дней один раз каждые 24 часа добавляют метанол в общем количестве 1%. Супернатант собирали центрифугированием и диализовали дважды против 5 литров буфера А (5 мМ EDTA, 8М мочевина и 10 мМ Na-фосфатный буфер, рН 7,7). Конечный раствор наносили на никель-хелатирующую смолу и элюировали градиентом, содержащим 200 мМ имидазола. Затем рекомбинантный родостомин и варианты дизинтегрина очищали методом ВЭЖХ (ВЭЖХ на обращенной фазе С18). Очищенные рекомбинантные варианты дизинтегрина имели чистоту более 95%, которую определяли с использованием трицин-SDS-PAGE.
Пример 3. Мутанты Rho селективно ингибировали прикрепление клеток, опосредованное различными αv интегринами и интегрином α5β1
[0129] Ингибирующие активности мутантов и вариантов Rho оценивали анализом ингибирования клеточной адгезии как описано ранее (Zhang, et al., 1998 J Biol Chem 73:7345-7350). Адгезию клеток CHO-αIIbβ3 к фибриногену, клеток CHO-αvβ3 к фибриногену, клеток К562 к фибронектину, клеток НТ-29 к витронектину и клеток НТ-29 к фибронектину использовали для определения ингибирующей активности протестированных белков на интегрины αIIbβ3, αvβ3, α5β1, αvβ5 и αvβ6. Вкратце, лунки 96-луночных микротитровальных планшетов Immulon-2 (Costar, Corning, NY) покрывали 100 мкл забуференного фосфатом солевого раствора (PBS: 10 мМ фосфатный буфер, 0.15М NaCI, рН 7,4), содержащего субстраты в концентрации 50-500 нМ, и инкубировали в течение ночи при 4°С.Субстратами и их концентрациями в покрытии были: фибриноген (Fg) 200 мкг/мл, витронектин (Vn) 50 мкг/мл и фибронектин (Fn) 25 мкг/мл. Сайты неспецифического связывания белка блокировали инкубацией каждой лунки с 200 мкл денатурированного нагреванием 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Calbiochem) при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Денатурированный нагреванием BSA удаляли, и каждую лунку промывали дважды 200 мкл PBS.
4
2
2
2
2
5
[0130] Клетки яичников китайских хомячков (СНО), экспрессирующие интегрины αvβ3 (CHO-αvβ3) и αIIbβ3 (СНО-αIIbβ3), были любезно предоставлены доктором Y. Takada (Scripps Research Institute) и поддерживали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM). Клетки эритролейкоза человека К562 и клетки колоректальной аденокарциномы НТ-29 приобретали в АТСС (Американской Коллекции Типовых Культур) и культивировали в среде RPMI-1640 (Roswell Park Memorial institute Medium), содержащей 5% фетальной телячьей сыворотки (FCS). Собранные клетки К562 и НТ-29 отмывали в буфере PBS, содержащем 1 мМ EDTA и ресуспедировали в буфере Tyrode (150 мМ NaCI, 5 мМ КС1 и 10 мМ Hepes) [рН 7,35], содержащем 1 мМ MgS0, 2 мМ CaCl и 500 мкМ MnCl. Клетки (СНО, К562 и НТ-29) разбавляли до 3×10 клеток/мл, и 100 мкл клеток использовали для анализа. Rho и его мутанты добавляли к культивируемым клеткам и инкубировали при 37°С, 5% СO в течение 15 минут. Rho и его варианты использовали в качестве ингибиторов в концентрациях 0,001-500 мкМ. Затем обработанные клетки добавляли в покрытый планшет и подвергали взаимодействию при 37°С в атмосфере 5% СO в течение 1 часа. Затем раствор для инкубации удаляли и неприкрепленные к субстрату клетки удаляли промыванием дважды 200 мкл PBS.
600
600
[0131] Связанные клетки количественно анализировали окрашиванием кристаллическим фиолетовым. Вкратце, лунки фиксировали 100 мкл 10% формалина в течение 10 минут и подсушивали. Затем 50 мкл 0,05% кристаллического фиолетового добавляли в лунку при комнатной температуре на 20 минут. Каждую лунку промывали 200 мкл дистиллированной воды четыре раза и подсушивали. Окрашивание проводили добавлением 150 мкл окрашивающего раствора (50% спирта и 0,1% уксусной кислоты). Полученную спектральную поглощательную способность считывали при 600 нм, и считывания коррелировали с числом прикрепленных клеток. Ингибирование определяли как % ингибирования=100 - [OD(проба, обработанная Rho дикого типа или дизинтегрином)/ОD (необработанная проба)]×100.
50
50
50
[0132] IC определяли как концентрацию (нМ) варианта дизинтегрина, требуемую для 50% ингибирования клеточной адгезии, опосредованной конкретным интегрином. Таким образом, более низкое IC означает более высокую специфичность или активность варианта дизинтегрина в ингибировании активности клеточной адгезии соответствующего интегрина, следовательно, более высокую активность связывания (или селективность) варианта дизинтегрина с соответствующим интегрином. Результаты ICсуммированы в таблицах 3-14 ниже.
50
48
52
53
46
47
51
52
39
40
41
42
43
66
67
68
69
70
66
67
[0133] Ряд мутантов Rho, вовлеченных в область петли RGD (RXD, XRGD, ARGDXP, ARGDMX, XXPRGD и ARGD, XX), линкерной области (XXXXX) и С-концевой области (ХХХХХ, XLYG, DXY), были экспрессированы рекомбинантно и очищены до гомогенного состояния. Анализы клеточной адгезии и агрегации тромбоцитов использовали для определения их интегрин-связывающей аффинности. Было обнаружено, что варианты родостомина или дизинтегринов с одной или несколькими модификациями в этих областях имеют различную селективную аффинность связывания с αvβ3, αvβ5, αvβ6, α5β1 и αIIbβ3 (таблицы 3-14).
48
52
53
[0134] Например, было обнаружено, что варианты Rho с определенными мутациями в мотиве RXD, в котором остаток "Gly50 (G)" замещали на Leu (L), Val (V), Ile (I), Glu (E), Asp (D), Gin (Q), Phe (F), Trp (W), His (H), Lys (К) или Arg (R), оказали свое наибольшее влияние на интегрины в следующем порядке: αIIbβ3 (приблизительно в 1686 раз)>α5β1 (приблизительно в 586 раз)>αvβ5 (приблизительно в 348 раз)>αvβ6 (приблизительно в 179 раз)>αvβ3 (приблизительно в 26 раз), демонстрируя свою связывающую селективность по отношению αvβ3 (таблица 3). Варианты Rho с мутацией в мотиве XRGD, в котором остаток Р замещали на другие аминокислоты, оказали свое наибольшее влияние на интегрины в следующем порядке: α5β1 (приблизительно в 71 раз)>αIIbβ3 (приблизительно в 41 раз)>αvβ3 (приблизительно в 5 раз) (таблица 4). Варианты Rho с мутацией в мотиве ARGDXP, в котором остаток М замещали на другие аминокислоты, оказали свое наибольшее влияние на интегрины в следующем порядке: αIIbβ3 (приблизительно в 209 раз)>α5β1 (приблизительно в 122 раза)>αvβ3 (приблизительно в 14 раз) (таблица 5). Варианты Rho с мутацией в мотиве ARGDMX, в котором остаток Р замещали на другие аминокислоты, оказывали свое наибольшее влияние на интегрины в следующем порядке: αIIbβ3 (приблизительно в 258 раз)>α5β1 (приблизительно в 45 раз)>αVβ3 (приблизительно в 40 раз) (таблица 6). Варианты Rho с мутацией в мотиве XXPRGD, в котором остатки R46 и I47 замещали на другие аминокислоты, оказали свое наибольшее влияние на интегрины в следующем порядке: αIIbβ3 (приблизительно в 73 раз)>α5β1 (приблизительно в 19 раз)>αvβ3 (приблизительно в 10 раз) (таблица 7). Эти результаты показали, что мутации в петле RGD проявляли существенный эффект на ингибирующую активность в отношении интегринов αIIbβ3 и α5β1, но не интегрина αvβ3.
39
40
41
42
43
[0135] Мутанты родостомина или дизинтегринов с одной или несколькими модификациями в дополнение к мотиву RGD, например, в линкерной области или С-конце, проявили способность избирательно связываться с αvβ3,αvβ5, αvβ6, α5β1 или αIIbβ3 (таблицы 8-14). Например, варианты Rho с мутацией в линкерной области (XХХХХ) в которой SRAGK замещали на аминокислоты KKKRT, KKART, MKKGT, IEEGT, MKEGT AKKRT, KAKRT, KKART, КККАТ, KKKRA, KAKRA и SKAGT, оказали свое наибольшее влияние на интегрины в следующем порядке: αIIbβ3 (приблизительно в 2 раза)>α5β1 (приблизительно в 5 раз)>αVβ3 (приблизительно в 14 раз) (таблица 8). Эти результаты показали, что мутации в линкерной области Rho проявляли существенный эффект на ингибирующую активность в отношении интегрина αVβ3.
66
67
68
69
70
[0136] Варианты Rho с мутацией в С-концевой области (ХХХХХ, в которой RYH замещали на аминокислоты RYH, RNGL, RGLYG, RGLY, RDLYG, RDLY, RNGLYG и RNPWNG, оказали свое наибольшее влияние на интегрины в следующем порядке: αIIbβ3 (приблизительно в 13 раз)>αVβ5 (приблизительно в 8 раз)=αVβ6 (приблизительно в 8 раз)>αvβ3 (приблизительно в 4 раза)>α5β1 (приблизительно в 2 раза) (таблица 9). Эти результаты показали, что мутации в С-концевой области Rho проявляли значимый эффект на ингибирующую активность в отношении интегринов αIIbβ3, αVβ5 и αVβ6.
66
[0137] Варианты Rho с мутацией в С-концевой области XLYG, в которой остаток в положении 66 замещали на аминокислоты G, Р, R, К, Y, D и Е, оказали свое наибольшее влияние на интегрины в следующем порядке: αIIbβ3 (приблизительно в 6493 раз)>α5β1 (приблизительно в 40 раз)>αvβ5 (приблизительно в 8 раз)>αvβ6 (приблизительно в 6 раз)>αvβ3 (приблизительно в I раз), демонстрируя его значительное влияние на интегрины αIIbβ3 и α5β1 (таблица 10).
39
46
66
[0138] Варианты (Rho) дизинтегрина, специфические к интегринам αvβ3 и α5β1 были успешно получены модификацией области петли RGD, линкерной области и С-концевой области Rho. Например, мутант KKART-ARGRGDNP-DLYG проявил превосходную ингибирующую активность в отношении интегринов αvβ3 и α5β1, но не αIIbβ3, αvβ5 и αvβ6 (Table 11). Мутации в петле RGD и линкерной области повысили его активность в отношении ингибирования интегринов αvβ3 и α5β1 и значимо понизили его активность в ингибировании интегрина αIIbβ3. Мутации в С-концевой области понизили его активность в ингибировании интегринов αvβ5 и αvβ6.
39
46
66
66
66
[0139] Варианты дизинтегрина (Rho), специфические для интегринов αvβ3, αvβ5 α5β1, были успешно получены модификацией области петли RGD, линкерной области и С-концевой области Rho. Например, мутант KKART-ARARGDDL-GLYG проявил превосходную ингибирующую активность в отношении интегринов αvβ3, αvβ5 и α5β1, но не αIIbβ3 и αvβ6 (таблица 12). Мутации SRAGK в линкерной области KART повысили его активность в ингибировании RGD-связывающих интегриногв. Мутации R46A, I47R, Р48А, M52D и P53L в петле RGD понизили его активность в ингибировании интегринов αIIbβ3 и αvβ6. Мутации RYH в GLYG в С-концевой области понизили его активность в ингибировании интегрина αIIbβ3.
39
46
66
[0140] Варианты дизинтегрина (Rho) специфические к интегринам αvβX и α5β1 были успешно получены модификацией области петли RGD, линкерной области и С-концевой области Rho. Например, мутант KKART-ARGRGDNP-DLYG проявил прекрасную ингибирующую активность в отношении интегринов αvβ3 и α5β1, но не к αIIbβ3, αvβ5 и αvβ6 (Table 11). Мутации в петле RGD и линкерной области повысили его активность в ингибировании интегринов αvβ3 и α5β1 значимо понизили его активность в отношении интегрина αIIbβ3. Мутации в С-концевой области понизили его активность в ингибировании интегринов αvβ5, и αvβ6.
Пример 4. Ингибирование агрегации тромбоцитов мутантами Rho
[0141] Варианты (Rho) дизинтегрина также были протестированы на их способность ингибировать агрегацию тромбоцитов, которая опосредуется αIIbβ3. Образцы венозной крови (9 частей) от здоровых доноров, которые не получали никаких лекарственных средств в течение, по меньшей мере, двух недель, собирали в 3,8% раствор цитрата натрия (1 часть). Образцы крови центрифугировали при 150×g в течение 10 мин для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP), которую оставляли стоять в течение 5 мин, после чего собирали PRP. Плазму с низким содержанием тромбоцитов (РРР) получали из оставшейся крови центрифугированием при 2000×g в течение 25 мин. Количество тромбоцитов в РРР измеряли с помощью гематологического анализатора и разбавляли РРР до 250000 тромбоцитов/мкл. Раствор 190 мкл PRP и 10 мкл либо Rho, либо буфера PBS, инкубировали в течение 5 мин в агрегометре Hema Tracer 601 при 37°С. Затем добавляли десять микролитров 200 мкМ раствора аденозиндифосфата (ADP) для регистрирации ответа агрегации тромбоцитов по пропусканию света. Результаты ингибирования агрегации тромбоцитов также суммированы в таблицах 3-14 ниже.
Пример 5. Ингибирование миграции клеток вариантом дизинтегрина и родостомином дикого типа
4
2
[0153] Перед использованием фильтры Transwell (трансвеллы) уравновешивали в сыворотке, содержащей DMEM в течение 2 часов. DMEM, содержащую 10% FBS (эмбриональную бычью сыворотку), добавляли в нижние отсеки миграционных фильтров. В объеме 100 мл бессывороточной среды DMEM, 2 × 10 клеток меланомы человека А375 высевали на трансвелл-фильтр. Клеткам позволяли мигрировать в течение 6 часов при 37°С в 5% СO и затем фиксировали путем погружения фильтров в метанол в течение 15 мин при комнатной температуре. Родостомин, AR-NP (см., таблицу 13 для консенсусной последовательности), или буфер PBS добавляли в верхнюю камеру, Фильтры промывали один раз водой и окрашивали в 0,2% кристаллическом фиолетовом (кристаллвиолете) в растворе 20% метанол/вода в течение 10 минут. Клетки извлекали из верхней поверхности мембраны ватной палочкой, Клетки, которые мигрировали к нижней стороне мембраны, подсчитывали при 200× увеличении из пяти случайных полей на мембрану.
[0154] Ингибирующая активность Rho, AR-NP или буфера PBS в этом исследовании показана на фиг.2. Вкратце, AR-NP заметно ингибировал миграцию клеток меланомы человека А375.
Пример 6, Ингибирование ангиогенеза вариантами дизинтегрина в анализе ангиогенеза в Matrigel
[0155] Matrigel (матригель), содержащий VEGF (100 нг/мл) и гепарин (24-26 ЕД/мл) инъецируют подкожно мышам В6. Через 5 дней гели извлекают, взвешивают и обрабатывают для количественного определения гемоглобина или для гистологии, как описано ранее. Содержание гемоглобина измеряют с использованием набора реагентов Драбкина (Drabkin reagent kit 525) (Sigma). Для гистологических анализов пробки matrigel фиксируют в 4% параформальдегиде и заливают в парафин; срезы толщиной четыре микрона окрашивают гематоксилин-эозином стандартными процедурами.
[0156] Аликвоту (300 мкл) MATRIGEL™ (Becton Dickinson Lab.), содержащую VEGF (150 нг) и гепарин (30 ME) инъецировали подкожно в области спины мышам C57BL/6 возраста 6-8 недель. MATRIGEL™ быстро образовал пробку, AR-NP (I мг/кг) или ARLDDL (I мг/кг) (см., таблицу 13 для консенсусной последовательности) вводили один раз внутривенно через 24 часа. Через 5 дней, пробки извлекали и фотографировали (верхняя панель), Количество новых сосудов определяли путем измерения гемоглобина в пробках, который является показателем образования кровеносных сосудов, с использованием способа Драбкина и набора реагентов Драбкина (Drabkin reagent kit 525) (Sigma) (B&C). Анализ показал, что AR-NP был более эффективен, чем ARLDDL при введении лекарственного средства только один раз в течение 5 дней периода ангиогенеза (см. фиг. 3).
Пример 7. Ингибирование ангиогенеза на модели ретинопатии недоношенных (ROP), на основе управляемой гипероксии/нормоксии
[0157] Мышей C57BL/6j в возрасте одной недели или мышей ICR и их матерей подвергают воздействию 75%±2% кислорода в течение 5 дней (гипероксия), а затем возвращают в нормоксические условия в течение еще 5 дней (период гипероксии от Р7 до Р12) для индуцирования относительных гипоксических состояний, а затем помещают в комнатную атмосферу в течение дополнительных 7 дней (гипоксия-индуцированный ангиогенный период, от 12 дней после родов до 19 дней после родов, или от Р12 до Р19). AR-NP (1 пг) вводили с использованием интравитреального способа на 12-й день и мышей умерщвляли на 19-й день. Контрольных животных, которых не подвергали воздействию, хранили в комнатной атмосфере. Животных поддерживали при постоянной температуре 21±1° С и при 12-часовом цикле дня и ночи. Концентрацию кислорода измеряют оксиметром. В конце воздействия кислорода (12 день) и через 5 дней после возвращения в нормоксические условия (17 день), детенышей умервщляют и оценивают ретинальный ангиогенез по количеству новых сосудов и эндотелиальных клеток.
[0158] Результаты этого исследования показаны на фиг. 4. Анализ показал, что AR-NP значимо снижал ангиогенез в мышиной модели ретинопатии.
Пример 8. Ингибирование ангиогенеза вариантами дизинтегрина в анализе аортального кольца мыши
2
[0159] Грудную аорту мышей в возрасте 8-12 недель отделяют и разрезают на кольца шириной приблизительно 0,5 мм. Аортальные кольца заключают в 200 мл матригеля, покрытого средой DMEM, снабженной 2,5% FCS и 30 нг/мл VEGF (пер., фактора роста эндотелия сосудов) с добавлением или без добавления подходящих ингибиторов или контрольных агентов. Эксперимент проводили в СO инкубаторе при 37°С. После 7 дней культивирования аортальные кольца фиксировали 4% формальдегидом и окрашивали их кристаллическим фиолетовым. Число ростков, выросшее из каждого кольца, подсчитывали с использованием инвертированного микроскопа.
[0160] Аортальные кольца мыши инкубировали с VEGF и 0,1 мкМ AR-NP в матригеле, содержащем 100 мг/мл фибронектина. Культуральную среду меняли каждые 3 дня. На графиках показано прорастание микрососудов (спрутинг) после 7 дней культивирования. Следует отметить, что AR-NP значимо снижал прорастание сосудов (см. фиг. 5).
Пример 9. Ингибирование образования колоний вариантами дизинтегрина на клетках рака молочной железы
[0161] На репрезентативных изображениях фиг. 6 показаны результаты анализа образования колоний. Клетки 4-Т1 рака молочной железы высевали в 6-луночные чашки с верхним слоем 0,35% агара и нижним слоем 0,7% агара в среде. 0,3 мл среды добавляли каждые 3 дня. Через 18 дней число клеточных кластеров на чашку идентифицируют окрашиванием кристаллическим фиолетовым и подсчитывают. Анализ показал, что как ARLDDL (0,1 мкМ и 1 мкМ) (фиг. 6А), так и AR-NP (0,1 мкМ и 1 мкМ) (фиг. 6В), ингибируют образование колоний клеток 4-Т1 рака молочной железы.
Пример 10. Ингибирование остеокластогенеза вариантами дизинтегрина
6
[0162] 6-8 недельных крыс SD получали из Центра животных Национальной лаборатории (Animal Center of National Laboratory) и содержали в контролируемых условиях, включающих комнатную температуру 22±1°С и 12-часовой цикл дня и ночи. Животных кормили вволю с помощью лабораторной диеты для грызунов (Purina Laboratory Rodent Diet) и дистиллированной воды. Клетки костного мозга получали удалением бедренных костей и промыванием полости костного мозга средой DMEM (Invitrogen, Carlsbad, California), в которую добавляли 20 мМ HEPES и 10% инактивированной нагреванием FBS (фетальной телячьей сыворотки), 2 мМ глутамина, пенициллина (100 ЕД/мл) и стрептомицина (100 г/мл). Не прикрепленные к субстрату клетки (гематопоэтические клетки) собирали и использовали в качестве предшественников остеокластов через 24 ч. Клетки высевали в количестве 1×10клеток/лунку в 24-луночные планшеты в присутствии человеческого рекомбинантного растворимого RANKL (50 нг/мл) и M-CSF (20 нг/мл). Культуральную среду заменяли через каждые 3 дня. Образование остеокластов измеряли на 8-й день путем TRAP окрашивания. Вкратце, адгерентные (прикрепленные к субстрату) клетки фиксировали 10% формальдегидом в PBS в течение 3 мин и затем окрашивали нафтол-AS-MX-фосфатом и раствором тартрата в течение 1 часа при 37°С. Подобные остеокластам клетки в каждой лунке определяли подсчетом числа TRAP-положительных и многоядерных клеток, содержащих более чем три ядра.
50
[0163] Белковые лекарственные средства добавляли в течение 7 дней (D1~D7). IC остеокластогенеза для α5β1 и αvβ3 двойного интегрина AR-NP составляло 3,61 нМ. Как показано на фиг. 7, белок AR-NP или белок ARLDDL ингибировал RANKL-индуцированный остеокластогенез по сравнению с нелеченным контролем.
Пример 11. Ингибирование инвазии глиомы дизинтегрином
[0164] Клетки глиомы человека (U251) культивировали в верхней камере с матригелем, содержащим 100 г/мл гиалуронана. Вариант дизинтегрина добавляли как в верхнюю, так и в нижнюю камеры. Через 24 часа клетки в нижней камере окрашивали с использованием кристаллическим фиолетовым и подсчитывали. Как показано на фиг. 8, как ARLDDL (0,1 мкМ), так и AR-NP (0,1 мкМ) заметно ингибировали инвазию глиомы.
Пример 12. Эффект AR-NP на кровяное давление и частоту сердечных сокращений
[0165] Кровяное давление и частоту сердечных сокращений регистрировали на хвосте с использованием неинвазивного метода под анестезией изофлураном у крыс Wistar. AR-NP вводили через хвостовую вену после получения устойчивого измерения. Необходимо отметить, что AR-NP из расчета 5 мг/кг значимо не влиял на кровяное давление (фиг. 9А) и частоту сердечных сокращений (фиг. 9В). Обычная доза AR-NP для фармакологического эффекта составляет 1 мг/кг.
Пример 13. Ингибирование роста меланомы А375 AR-NP
6
[0166] Опухолевые клетки А375 (из расчета 5×I0) инъецировали подкожно в бок самцам мышей SCID 4-5 недельного возраста. Через неделю после имплантации клеток, мышам инъецировали AR-NP (KKART-ARGRGDNP) (2 мг/кг, 5 дней в неделю, внутрибрюшинно, i.p.). Объем опухоли измеряли каждые два дня. Опухоли вырезали и взвешивали после 18 дней лечения лекарственным средством. Масштабная линейка: 1 см. Необходимо отметить, что лечение AR-NP заметно ингибировало рост опухоли (см., фиг. 10).
Пример 14. Ингибирование роста опухоли KG (AR-NP) у трансгенных мышей K-rasG12D
G12D
[0167] Трансгенных мышей K-Ras кормили доксициклином 400 мг/л для индуцирования рака легких. Через 3,5 месяца TG мышам инъецировали интраперитонеально (IP) 2 мг/кг AR-NP с двухдневным интервалом в течение одного месяца. Через две недели после пятнадцатого лечения мышей умерщвляли. В легкие вводили индийские чернила и фиксировали раствором Фекете. Подсчитывали число опухолевых узлов на легких. **, Р-значение < 0,001. Как показано на фиг. 11, вариант дизинтегрина (AR-NP) ингибировал рост опухоли у трансгенных мышей K-rasG12D.
Пример 15. Ингибирование роста опухоли мозга у мышей, несущих U87, с использованием KG
5
[0168] Мышей NOD-SCID изначально приобретали и разводили/содержали виварии без специфических патогенов в хорошо контролируемых окружающих условиях с 12 часовым/12 часовым циклом день/ночь и контролируемой влажностью и температурой. Использовали мышей 8-10 недельного возраста массой приблизительно 22-25 г.Мышей интраперитонеально анестезировали смесью дексдомитор/золетил (20 мкг/кг/2 мг/кг), затем помещали в стереотаксическую скобу, и череп обнажали разрезом. Клетки U87-MG собирали и доводили до плотности 2,5×10 клеток/мкл в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) до внутричерепной инъекции. 2 мкл клеток U87-MG инъецировали в стриатум в указанных координатах от брегмы с использованием микроинфузионного насоса и 10 мл шприца Гамильтона с калибром иглы 30S. Затем череп очищали, отверстие закрывали костным воском и на разрез накладывали шов.
3
[0169] МРТ проводили в горизонтальном спектрометре 7.0-Т с активным экранированием градиента 300 мТ/м за 80 мксек. Очертания опухолей определяли на основе контраста, обеспечиваемого T2Wis между опухолью и тканями мозга. Общий объем опухоли (мм) рассчитывали путем суммирования области опухоли по срезам, покрытым опухолью, с использованием программного обеспечения MR Vision. Кривые роста были построены как изменение объема опухоли в каждый момент времени. Начиная с 23-го дня после имплантации опухоли, мышей лечили внутривенно через хвостовую вену только вариантом дизинтегрина (AR-NP) или смесью из расчета 5 мг/кг один раз в день, пять дней в неделю. Как видно из результатов на фиг. 12 (фиг. 12А-лечение; фиг. 12В-кривая роста опухоли; фиг. 12С-кривая выживания), вариант дизинтегрина (AR-NP) также ингибировал рост опухоли у мышей, несущих U87.
[0170] Хотя изобретение было подробно описано и со ссылкой на его конкретные варианты осуществления, для специалиста в данной области техники очевидно, что в него могут быть внесены различные изменения и модификации, не выходящие за его сущность и объем.