Противоопухолевая активность фукоиданов бурьж водорослей

10. Mytar B., Gawliska M., Szatanek R. et al. Induction of intracellular cytokine production in human monocytes/macrophages with ligands of pattern recognition receptors // Inflamm. Res. 2004. Vol. 101, No. 3. P. 100-106.

11. Ponce N.M., Pujol C.A., Damonte E.B. et al. Fucoidans from the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods, antiviral activity and structural studies // Carbohydr. Res. 2003. Vol. 338, No. 2. P. 153-165.

12. Preeprame S., Hayashi K., Lee J.B. et al. A novel antivirally active fucan sulfate derived from an edible brown alga, Sar-gassum horneri // Chem. Pharm. Bull. 2001. Vol. 49, No. 4. P. 484-485.

13. Zhu W., Chiu L.C., Ooi V.E. et al. Antiviral property and mode of action of a sulphated polysaccharide from Sargassum patents against herpes simplex virus type 2// Int. J. Antimicrob. Agents.

2004. Vol. 24, No. 3. P. 279-283.

14. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Chizhov A.O. et al. Water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Distribution, structure, and their dependence on the developmental conditions // J. Exp. marine Biol. Ecol. 2003. Vol. 294, Is. 1. P. 1-13.

Поступила в редакцию 07.04.2009.

PROTECTIVE EFFECTS OF FUCOIDAN DERIVED FROM BROWN ALGAE LAMINARIA JAPONICA UNDER EXPERIMENTAL TICK-BORNE ENCEPHALITIS

I.D. Makarenkova1, N.V. Kryilova1, G.N. Leonova1,

N.N. Besednova1, T.N. Zvyagintseva2, N.M. Shevchenko2

1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the RAMS, Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087Russia),

2 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS

Summary — The paper provides experimental study into the protective effects of sulphated polysaccharide fucoidan derived from the sea brown algae Laminaria japonica after in vivo infecting mice with highly pathogenic strain of tick-borne encephalitis virus. As reported, the drug efficiency depends on dose and dosing regimen, and it allows obtaining adequate protection in infected animals. A wide range of biological effects produced by the sul-phated polysaccharides extracted from the sea brown algae, low toxicity and environmentally friendly production technologies offer great opportunities of applying fucoidans in an effort to prevent and treat viral infections.

Key words: virus, tick-borne encephalitis, fucoidan, protective effects, survival rate.

Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 83—86.

УДК 616-006-085.322:582.272:577.14

О.С. Вищук1, С.П. Ермакова2, Фам Дюк Тин3, Н.М. Шевченко2, Буи Минг Ли3, Т.Н. Звягинцева2

1 Дальневосточный государственный университет

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ ФУКОИДАНОВ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ

Ключевые слова: фукоиданы, бурые водоросли, противоопухолевая активность.

Противоопухолевое действие фукоиданов из 9 видов бурых водорослей исследовано на модели мягких агаров. Показано, что фукоиданы нетоксичны к клеткам DLD-1 и HT-29 в концентрациях до 200 мкг/мл. Установлено, что фукоидан из Laminaria cichorioides, состоящий из 1,3-связанных молекул a-L-фукозы, ингибирует рост колоний раковых клеток кишечника, а низкосульфатированные фукогалактаны из Sargassum swartzii, S. mcClurei, S. denticarpum практически не обладают противоопухолевой активностью. Полученные результаты демонстрируют, что использование фукоиданов бурых водорослей дальневосточных морей может оказаться перспективным для предотвращения и лечения онкологических заболеваний.

В настоящее время большое внимание уделяется изучению полисахаридов, выделенных из таких природных источников, как бактерии, грибы, водоросли и растения. Полисахариды бурых водорослей представлены альгиновыми кислотами, ламинара-нами и фукоиданами, проявляющими различную биологическую активность. Так, альгинат натрия является самым активным и безвредным природным сорбентом, а также повышает фагоцитарную активность клеток животных и человека [10]. Лами-нараны (1,3- и 1,6-р^-глюканы) известны как противораковые вещества, радио- и криопротекторы, активаторы иммунной системы [3, 15]. Фукоиданы

Ермакова Светлана Павловна — канд. хим. наук, старший научный сотрудник лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН, тел: 8 (4232) 31-07-05, добавочный.4; e-mail: swetlana_e@mail.ru.

проявляют чрезвычайно широкий спектр биологической активности, что является причиной повышенного интереса к ним. Так, в литературе имеются сообщения о противоопухолевых и противовоспалительных свойствах фукоиданов [11, 12]. Особый интерес вызывает антикоагулянтное действие фу-коиданов [2, 6]. Кроме того, эти соединения, как правило, являются иммуностимуляторами [13]. По этой причине их можно отнести к так называемым «поливалентным биомодуляторам». Однако интенсивность изучения биологической активности фу-коиданов значительно опережает исследования их химической структуры.

Имеется небольшое количество данных о связи структуры и биологической активности этих полисахаридов. Считается, что биологическая активность фукоиданов обусловлена в первую очередь степенью сульфатирования, наличием фрагментов определенной структуры. Кроме того, она может быть связана с моносахаридным составом, степенью разветвлен-ности, типом связи, молекулярно-массовым распределением [1, 9, 14]. С определенной уверенностью установить структурный мотив, который отвечает за проявление той или иной биологической активности фукоиданов, пока так и не удалось.

Целью настоящей работы явился анализ противоопухолевой и антиметастатической активности фукоиданов, выделенных из различных бурых

водорослей и имеющих разную структуру, на модели мягких агаров.

Материалы и методы. Реагенты и материалы: DEAE — целлюлоза и мембраны 3 кДа — коммерческие препараты фирмы Sigma и Millipore (США) соответственно; органические растворители, неорганические кислоты и соли — коммерческие препараты фирмы «Диаэм» (Россия); клеточные линии HT-29, DLD-1 были предоставлены Hormel Institute University of Minnesota (Austin, MN США). Среда RPMI-1640 — 10% фосфатный буфер с добавлением пенициллина (100 Ед/л) и стрептомицина (100 мкг/л). Фосфатный буфер, пенициллин, стрептомицин, L-глутамин, трипсин, этилендиаминтетрауксусная кислота, эмбриональный бычий альбумин, гидрокарбонат натрия, агар — коммерческие препараты фирмы «Биолот» (Россия). Водоросли: бурая водоросль Fucus evanescens была собрана в экспедиции НИС «Академик Опарин» в июле 2003 г. на побережье острова Большой Шантар Охотского моря; Laminaria japónica, Undaria pinatifida, L. cichorioides были собраны в июле 2005 г. в бухте Троица Японского моря на Морской экспериментальной станции ТИБОХ ДВО РАН; Sargassum sp. были собраны в Южно-Китайском море у побережья Вьетнама в мае-июне 2007 г. Полисахариды: фукоиданы были выделены по модифицированному методу [4].

Определение содержания общих углеводов в выделенных образцах полисахаридов проводили колориметрически с помощью феноло-сернокислотно-го метода [8]. Определение содержания сульфатных групп в полисахаридах проводили с помощью тит-риметрического метода [7]. Кислотный гидролиз полисахаридов: образец фукоидана (5 мг) растворяли в

0,5 мл 2M трифторуксусной кислоты; реакционную смесь нагревали при 100°C в течение 6 часов. Мо-носахаридный состав определяли на углеводном анализаторе Biotronik IC-5000 (Германия), используя колонку Shim-pack ISA-07/S2504 (0,4x25 см); элюировали калиево-боратным буфером, скорость элюции — 0,6 мл/мин; обнаружение проводили би-цинхонинатным методом; интегрирующая система Shimadzu C-R2 AX.

I3C-ЯМР-спектроскопия: спектры 13С-ЯМР для растворов веществ в D2O были получены на ядерномагнитно-резонансном спектрометре Bruker Avance DPX-300 NMR с рабочей частотой 75,5 МГц при температуре 60°C.

Культивирование клеток: клетки рака кишечника человека HT-29 и DLD-1 культивировали в питательной среде RPMI-1640, 10% FBS с добавлением пенициллина (100 Ед/л) и стрептомицина (100 мкг/л) в инкубаторе MCO-18AIC, SANYO (Япония) при температуре 37°С, содержание СО2 — 5%.

Определение цитотоксичности фукоиданов. Клетки рака кишечника человека HT-29 и DLD-1 (5х104/мл) рассевали в 96-луночные планшеты и культивировали в 200 мкл 10% RPMI-1640 в С02-инкубаторе при

температуре 37°С в течение 24 часов. Затем клетки обрабатывали фукоиданами различной концентрации (10, 50, 100 и 200 мкг/мл) и инкубировали в течение 24 часов. После инкубации добавляли по 15 мкл 3-(4,5 -диметилтиазол-2 -ил)-2,5 -дифенилтетразолин бромида (MTS-реагент) и инкубировали 4 часа (37°С, 5% CO2). Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре Bio-Tek Instruments (США), при длине волны 490/630 нм (А490/630).

Неопластическая трансформация клеток (метод мягких агаров). Действие фукоиданов бурых водорослей на формирование и рост колоний клеток рака кишечника человека определяли с помощью метода мягкого агара [5]. Клетки рака кишечника (8х103 клеток) обрабатывали фукоиданами из бурых водорослей L. cichorioides, F. evanescens, U. pinnatifida, L. ja-ponica, Sargassum swartzii, S. oligocystum, S. denticarpum, S. mcClurei, S. polycystum. (50, 100 мкг/мл). Клетки культивировали при 37°С (5% СО2) в течение 30 дней. Колонии клеток были оценены с использованием обратимого микроскопа Motic AE 20 (Китай) и программы Motic Image Plus.

Статистическая обработка данных проведена с использованием t-критерия Стьюдента в условиях заданной доверительной вероятности, равной 95% (программа SigmaPlot 2000, вер. 6, SPSS Inc., США).

Результаты исследования. Фукоиданы бурых водорослей были очищены при помощи описанной выше комбинации методов. Фукоиданы, выделенные из бурых водорослей дальневосточных морей, являются высокосульфатированными полисахаридами, тогда как фукоиданы из бурых водорослей Южно-Китайского моря — низкосульфатированные, за исключением фукоидана из S. polycystum. Содержание сульфатов в фукоиданах из L. cichorioides и U. pinnatifida составляет 38 и 36% соответственно. Фукоиданы из F. evanescens, L. japonica и S. polycystum содержат около 30% сульфатов. В остальных полисахаридах из сар-гассовых водорослей содержание сульфатных групп составляет менее 12%.

Анализ моносахаридного состава исследуемых соединений позволяет разделить их на фуканы, фу-когалактаны и галактофуканы. Фуканами являются сульфатированные полисахариды из F. evanescens, L. cichorioides. Фукогалактан выделен из L. japonica, галактофукан — из U. pinnatifida. Все полисахариды из саргассовых водорослей являются фукогалактана-ми (табл.).

По структуре главной цепи фукоиданы разделялись на три группы:

1. Полисахариды, молекулы которых содержат в главной цепи 1,3-связанные a-L-фукопиранозные остатки (L. cichorioides);

2. Полисахариды, молекулы которых построены из чередующихся 1,3- и 1,4-связанных остатков a-L-фу-копиранозы (F. evanescens);

3. Полисахариды, в главной цепи которых чередуются 1,3-; 1,4-связанные остатки a-L-фукопиранозы

Таблица

Структурные характеристики фукоиданов бурых водорослей

Водоросль Молекулярная масса, кДа1 Сульфаты, % Моносахаридный состав, мольные %

а СО О £ •е манноза галактоза ксилоза глюкоза

F. evanescens 2 о 4 О 31,0 94,9 0,2 1,93 2,8 0,0

L. japonica 20-30 26,0 59,4 5,2 43,4 2,2 9,6

L. cichorioides 6 О 8 О 38,0 91,8 3,5 4,6 0,0 0,0

U. pinnatifida 3 О 5 О 36,0 33,8 2,0 61,1 0,9 2,2

S. swartzii н/о 5,9 35,8 19,2 32,3 9,9 2,8

S. oligocystum н/о 9,1 41,3 8,9 38,3 7,1 3,4

S. denticarpum н/о 11,2 40,1 15,9 38,7 5,3 0,0

S. mcClurei н/о 2,8 38,5 4,2 33,1 3,6 20,6

S. polycystum н/о 32,1 32,4 12,6 35,3 8,5 11,2

1 н/о — не определяли.

и галактозы (U. pinnatifida, S. swartzii, S. oligocystum, S. denticarpum, S. mcClurei, S. polycystum).

Обработка клеток DLD-1 и HT-29 фукоиданом из L. cichorioides в концентрации до 200 мкг/мл не приводила к торможению их роста и не сопровождалась массовой гибелью (рис. 1). Аналогичные результаты получены при использовании и других фукоиданов. В дальнейших экспериментах все препараты фукоиданов использовали в дозе 50 мкг/мл.

Торможение роста колоний в клетках DLD-1, обработанных фукоиданом в дозе 50 мкг/мл, составило более 50% для фукоиданов, выделенных из L. cichorioides, L. japónica. Фукоиданы из F. evanescens, U. pinnatifida, S. polycystum и S. oligocystum ингибировали рост колоний от 50 до 70%. Слабое ингибирование до 20% показали фукоиданы из S. swartzii, S. mcClurei, S. denticarpum (рис. 2, а).

Наиболее значительные показатели торможения роста колоний для клеточной линии НТ-29 были получены при обработке их фукоиданами из L. cichorioides и S. polycystum: в 2 раза по сравнению с контролем. Слабое ингибирование роста колоний фу-коиданами из S. swartzii, S. mcClurei, S. denticarpum было аналогично их действию на клетки DLD-1. Обработка фукоиданами из S. oligocystum, F. evanescens, U. pinnatifida и L. japonica клеточной линии НТ-29 приводила к снижению количества колоний от 60 до 70% (рис. 2, б). Сопоставление противоопухолевой активности 9 исследованных фукоиданов, собранных в разных регионах, позволило выявить среди них как высокоактивные ингибиторы роста колоний клеток рака кишечника, так и фукоиданы, практически не проявляющие противоопухолевого действия.

Обсуждение полученных данных. Различия в противоопухолевой активности между фукоиданами из различных источников обусловлены, по-видимо-

му, особенностями их структуры. Исследуемые соединения отличаются друг от друга по типу гликозидных связей, моносахаридному составу, степени сульфатирования, молекулярной массе. Ранее на клеточной линии JB6 C141 нами было показано, что фукоиданы из L. cichorioides и L. gurianovae обладают более сильным ингибированием процесса трансформации клеток мыши JB6 C141 под действием эпидермального фактора роста по сравнению с фукоиданом из F. evanescens. Возможно, для проявления превентивного действия фукоиданов необходимо присутствие 1,3-связанной a-L-фукозы. В настоящем исследовании фукоиданы из L. ci-chorioides и L. japonica проявили наиболее выраженное противоопухолевое действие. Другие соединения, такие как фукоиданы из S. swartzii, S. denticarpum и S. mcClurei, практически не обладали противоопухолевой активностью.

Вероятно, противоопухолевая активность фукоиданов зависела от строения главной цепи молекулы. Об этом говорит тот факт, что фукоидан из L. cichorioides, проявивший наибольшую активность, содержал главную цепь, построенную только из а-1,3-связанной фукозы. Фукоиданы из F. evanescens и U. pinnatifida, активность которых была меньше, построены из 1,3- и 1,4-связанных остатков a-L-фукопиранозы и чередующихся 1,3- и 1,4-связан-ных остатков a-L-фукопиранозы и галактозы соответственно.

Таким образом, все исследованные полисахариды были нетоксичны в концентрации до 200 мкг/мл. В наших экспериментах на модели мягких агаров впервые показано, что фукоиданы из F. evanescens, L. japonica, L. cichorioides, U. pinnatifida, S. oligocystum и S. polycystum обладают противоопухолевой активностью по отношению к клеткам рака кишечника человека DLD-1 и HT-29.

Полученные данные могут представлять несомненный интерес, поскольку соединения, обладающие низкой токсичностью и проявляющие биологическую активность, находят применение в медицине [13]. Использование фукоиданов как ингибиторов роста колоний в нетоксических дозах может оказаться

* 100-О

I

50-

50 100 150 200

Концентрация фукоидана, мкг/мл Рис. 1. Жизнеспособность клеток DLD-1 и HT-29, обработанных фукоиданом.

2000-

1000 —

Колонии/8х 10 3 клеток

6000 —I

4000-

2000-

II

Контроль F. evanescens L. japónica L. chichorioides U. pinnatiflda S. swartzii S. oligocystum S. denticaipum S. mcClurei S. polycystum Колонии/8*. 10 3 клеток

|~б~| Контроль F. evanescens L. japónica L. chichorioides U. pinnatiflda S. swartzii S. oligocystum S. denticarpum S. mcClurei S. polycystum Рис. 2. Ингибирующее действие фукоиданов на рост колоний клеток рака кишечника человека DLD-1 (а) и HT-29 (б).

перспективным для предотвращения и лечения раковых заболеваний. Задачами нашей дальнейшей работы является исследование взаимосвязи между структурными особенностями фукоиданов и их противоопухолевым действием.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ № 09-04-00761-а, № 09-04-90312-Вьет_а и программы «Молекулярная клеточная биология».

Литература

1. Кузнецова Т.А., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. и др. Биологическая активность фукоиданов из бурых водорослей и перспективы их применения //Антибиотики и химиотерапия. 2004. Т. 49, № 5. С. 24—27.

2. Лапикова Е.С., Дрозд Н.Н., Толстенков А.С. и др. Ингибирование тромбина и фактора Ха фукоиданом из Fucus evanescens и его модифицированными аналогами // Бюл. эксп. биол. и мед. 2008. Т. 146, № 9. С. 304—309.

3. Чертков К.С., Давыдова С.А., Нестерова Т.А. и др. Эффективность полисахарида транслама как средства раннего лечения острой лучевой болезни // Радиационная биология. Радиоэкология. 1999. Т. 39. С. 572—577.

4. Шевченко Н.М., Кусайкин М.И., Урванцева и др. Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением препаратов для медицины и косметологии//Патент RU 2240816. 2004. БИ33. С. 444-445.

5. Colburn N.H., WendelE.J., Abruzzo G. Dissociation of mitogen-esis and late-stage promotion of tumor cell phenotype by phorbol esters: mitogen-resistant variants are sensitive to promotion // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 78. P. 6912-6916.

6. Cumashi A., Ushakova N.A., Preobrazhenskaya M.Eet al. A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, antiangio-genic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from brown seaweeds//Glycobiology. 2007. Vol. 17. P. 541-552.

7. Dodgson K.S., Price, R.G. A note on the determination of the ester sulphate content of sulphatedpolysaccharides // Biochem. J. 1962. Vol. 84. P. 106-110.

8. Dubois M., Gilles K., Hamilton J.K., Rebers P.A. et al. A colorimetric methodfor the determination of sugars//Nature. 1951. Vol. 168. P. 167.

9. Haroun-Bouhedja F., Ellouali M., Sinquin C. et al. Relationship between sulfate groups and biological activities of fucans// Braz. J. Med. Biol. 2000. Vol. 100. P. 453.

10. Kikunaga S., Miyata Y., Ishibashi G. et al. The bioavailability of magnesium from Wakame (Undaria pinnatifida) and Hijiki

(Hijikia fusiforme) and the effect of alginic acid on magnesium utilization of rats // Plant Foods Hum. Nutr. 1999. Vol. 53. P. 265-274.

11. Lee N.Y., Ermakov, S.P., Zvyagintsev, T.N. et al. Inhibitory effects of fucoidan on activation of epidermal growth factor receptor and cell transformation in JB6 Cl41 cells // Food Chem. Toxicol. 2008. Vol. 46. P. 1793-1800.

12. Lee N.Y., Ermakova S.P., Choi H.K. et al. Fucoidan from Laminaria cichorioides inhibits AP-1 transactivation and cell transformation in the mouse epidermal JB6 cells // Mol. Carcinog. 2008. Vol. 47. P. 629-637.

13. Li B., Lu F., Wei X., Zhao R. Fucoidan: structure and bioactivity //Molecules. 2008. Vol. 13. P. 1671-1695.

14. Nishino T., Aizu Y., Nagumo, T. The influence of sulfate content and molecular weight of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome on its antithrombin activity // Thromb. Res. 1991. Vol. 64. P. 723-731.

15. Zhongcun P., Kodo O., Tarnshi M. Structure of b-glucan oligomer from laminarin ang its effect on human Monocytes to inhibit the proliferation of U937 cells // Biosci. Biotechnol. Biochem.

2005. Vol. 69. P. 553-558.

Поступила в редакцию 06.04.2009.

ANTICANCER ACTIVITY OF BROWN ALGAE-DERIVED FUCOIDANS

O.S. Vischuk1, S.P. Ermakova2, Fam Dyuk Tin3,

N.M. Shevchenko2, Bui Ming Li3, T.N. Zvyagintseva2 1 Far Eastern National University (27Oktyabrskaya St.

Vladivostok 690950 Russia), 2 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS (159100-Anniversary Av. Vladivostok 690022 Russia), 3 Nha Trang Institute of Technological Studies and VANTApplication (2 Hungvuong St. Nha Trang Vietnam) Summary — The authors have studied anticancer activities of fucoidans derived from nine brown algae species using the soft agaragar model. As shown, the fucoidans are non-toxic to DLD-1 and HT-29 cells in concentrations of up to 200 ^g/mL. The fucoidan extracted from Laminaria cichorioides and composed of 1.3-tie molecules a-L-fucose tends to inhibit growth of cancer cell colonies in bowels. The low sulphated fucogalactans derived from Sargassum swartzii, S. mcClurei and S. denticarpum do not really exhibit anticancer properties. The findings allowed considering application of the brown algae-derived fucoidans (Far Eastern seas) as very promising in effort to prevent and treat oncological diseases.

Key words: fucoidans, brown algae, anticancer activity.

Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 86—89.

а