ПРИМЕНЕНИЕ СТАБИЛИЗАТОРОВ HIF-АЛЬФА ДЛЯ УСИЛЕНИЯ ЭРИТРОПОЭЗА
APPLICATION OF STABILISERS OF HIF- ALPHA FOR INTENSIFICATION OF ERYTHROPOIESIS

Для данной заявки испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США регистрационный №60/476704, поданной 6 июня 2003; по предварительной патентной заявке США регистрационный №60/566488, поданной 29 апреля 2004; по предварительной патентной заявке США регистрационный №60/566237, поданной 29 апреля 2004; а также по предварительной патентной заявке США регистрационный №60/569797, поданной 10 мая 2004, причем каждая из этих заявок включена во всей полноте в данный документ посредством ссылки.
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способам и соединениям, предназначенным для регулирования или усиления эритропоэза и метаболизма железа, а также для лечения или профилактики дефицита железа и анемии, вызванной хроническими заболеваниями.
Уровень техники
Термин анемия, как правило, относится к любой аномалии гемоглобина или эритроцитов, которая ведет к снижению уровня кислорода в крови. Кроме этого, анемия развивается в связи с хроническими заболеваниями, например хроническими инфекциями, неопластическими расстройствами, хроническими воспалительными расстройствами, включая расстройства с последующим воспалительным угнетением деятельности костного мозга и т.д. Анемия, вызванная хроническими заболеваниями (ACD), представляет собой один из наиболее обычных синдромов в медицине.
Анемия, вызванная хроническими заболеваниями (ACD), часто связана с дефицитом железа. ACD может развиваться из-за наличия недостаточного количества железа (например, анемия из-за дефицита железа) или, в том случае, когда общее содержание железа в организме находится на достаточном уровне, но не удовлетворяется потребность в образовании гемоглобина (например, функциональный дефицит железа). Железо необходимо для образования гемоглобина красных кровяных телец в эритропоэтических клетках-предшественниках костного мозга.
В организме пациентов с анемией, вызванной хроническими заболеваниями, наблюдаются многочисленные дефициты, включая сниженную выработку эритропоэтина (EPO), пониженную реактивность костного мозга по отношению к EPO и пониженный метаболизм железа, включая пониженную абсорбцию железа из кишечника, пониженный транспорт железа через энтероциты, пониженное окисление железа в трехвалентное состояние гефестином или церулоплазмином, пониженное связывание железа и поглощение трансферрином и рецептором трансферрина, а также пониженный транспорт железа к костному мозгу, при использовании железа, включая синтез гема. По отдельности и совместно, эти физиологические дефициты вносят вклад в неэффективный или ослабленный эритропоэз, который может приводить к микроцитарной анемии и гипохромным красным кровяным тельцам, связанным с пониженной выработкой гемоглобина и уменьшенным транспортом кислорода.
in vitro
in vivo
Анемия, вызванная хроническими заболеваниями, связана с увеличенной выработкой воспалительных цитокинов (Means (1995) Stem cells 13:32-37 и Means (1999) Int J Hematol 70:7-12), включая, например, фактор некроза опухолей α (TNF-α), интерлейкин-1β (IL-1β), IL-6 и интерферон-γ (IFN-γ). В нескольких  и  модельных животных системах, воспалительные цитокины негативно воздействуют на способность опосредовать выработку EPO, реактивность EPO и согласованное регулирование метаболизма железа (Roodman et al. (1989) Adv Exp Med Biol 271:185-196; Fuchs et al. (1991) Eur J Hematol 46:65-70; Jelkmann et al. (1994) Ann NY Acad Sci 718:300-311; Vannucchi et al. (1994) Br J Hematol 87:18-23; and Oldenburg et al. (2001) Aliment Pharmacol Ther 15:429-438). Введение эритропоэтина не способно обратить вспять развитие анемии у мышей, непрерывно подвергаемых воздействию TNF-α (Clibon et al. (1990) Exp Hematol 18:438-441). Повышенные уровни воспалительных цитокинов, таких как TNF-α, IL-1β и IFN-γ, вносят вклад в нарушение выработки EPO и устойчивости EPO, наблюдаемой у пациентов с анемией, вызванной хроническим заболеванием (Jelkmann et al.(1991) Ann NY Acad Sci 718:300-311 и Macdougall и Cooper (2002) Neprol Dial Transplant 17(11):39-43). Следовательно, различные цитокины, например воспалительные цитокины, связанные с воспалением, вовлечены в многочисленные аспекты патогенеза анемии, вызванной хроническим заболеванием, включая ингибирование эритроидных предшественников, ингибирование выработки EPO, а также ухудшение высвобождения железа и доступности железа для эритропоэза.
Следовательно, в данной области существует потребность в способах лечения или профилактики анемии, вызванной хроническими заболеваниями. В данной области существует потребность в способах преодоления дефицита рекомбинантного EPO при его текущем применении для лечения анемии, вызванной хроническим заболеванием. В частности, сохраняется необходимость разработки способов и соединений, эффективных с точки зрения преодоления пониженной выработки EPO и уменьшенной реактивности EPO, которые связаны с анемией, вызванной хроническим заболеванием, способов и соединений, эффективных с точки зрения улучшения регулирования метаболизма железа и преодоления недостатков измененного или аномального метаболизма и использования железа, а также способов и соединений, эффективных с точки зрения улучшения общего или полного эритропоэза за счет улучшения путей метаболизма, относящихся к выработке EPO, реактивности EPO и передачи сигналов, а также доступности, использования, поглощения, транспорта, процессинга железа и т.д. В технике существует потребность в способах преодоления или улучшения последствий эффектов, вызванных цитокинами, у субъектов, у которых наблюдается анемия, вызванная хроническим заболеванием.
Дефицит железа представляет собой одну из наиболее обычных разновидностей дефицита питания во всем мире, и этот дефицит является главной причиной анемии на глобальном уровне. Баланс железа, по существу, регулируется скоростью эритропоэза и размером запасов железа. Дефицит железа может наблюдаться при анемии или в ее отсутствие, причем он связан с ухудшенным развитием познавательных способностей.
Дефицит железа определяется как недостаточное снабжение железом (уровни или резервы) или как недостаточная доступность, или недостаточное использование железа в организме. Причиной этого может быть недостаточность питания, например недостаток железа в рационе питания; недостаточное поглощение железа, из-за, например, хирургического вмешательства (последствия гастроэктомии) или заболевания (болезнь Крона); истощение запасов железа или возрастание потерь железа из-за хронической или острой потери крови вследствие травмы, менструации, донорства крови, флеботомии (как и вследствие различных процедур и хирургических вмешательств); выросшая потребность в железе, например, из-за быстрого роста в раннем детстве или юности, беременности, эритропоэтиновой терапии и т.д.
Помимо этого дефицит железа может представлять собой функциональный дефицит железа, например дефицит железа, характеризующийся ослабленной способностью субъекта получать доступ к запасам железа и использовать их. Железо не поступает со скоростью, достаточной для обеспечения нормальной насыщенности эритроцитов гемоглобином, что ведет к пониженному клеточному содержанию гемоглобина в ретикулоцитах и эритроцитах. Функциональный дефицит железа часто наблюдается у здоровых индивидуумов с явно нормальными или даже повышенными запасами железа, но с ухудшенной доступностью железа, что определяют, например, по низким процентным уровням насыщения трансферрина. Данный тип дефицита железа часто связан с острым или хроническим воспалением.
Дефицит железа любого вида может приводить к железодефицитному эритропоэзу или эритропоэзу при ограниченном количестве железа, при котором уменьшается число красных кровяных телец, причем циркулирующие красные кровяные тельца меньше нормальных (микроцитарные) и отличаются недостатком нормального гемоглобина, вследствие чего они имеют бледный цвет (гипохромные).
У субъектов с дефицитом железа, включая функциональный дефицит железа, может развиться ухудшенный синтез гемоглобина, уменьшенное процентное насыщение трансферрина и сниженные уровни гемоглобина и гематокрита, ведущие к железодефицитной анемии. Железодефицитная анемия представляет собой наиболее обычную разновидность анемии в мире. Железо является основным компонентом гемоглобина; в отсутствие железа костный мозг не способен эффективно вырабатывать гемоглобин. Железодефицитная анемия может наблюдаться у субъектов с истощенными или уменьшенными запасами железа, или же она может иметь место у субъектов, имеющих функциональный дефицит железа, когда имеется запас железа, но оно не доступно, например, при выработке гемоглобина.
В силу изложенного выше, в данной области имеется потребность в способах лечения или профилактики расстройств, связанных с метаболизмом железа, кроме этого, в данной области имеется потребность в способах улучшения метаболизма железа. Существует необходимость в разработке способов лечения или профилактики дефицита железа, включая функциональный дефицит железа, а также лечения или профилактики сопутствующих состояний, таких как микроцитоз и железодефицитная анемия.
Настоящее изобретение предоставляет способы и соединения, предназначенные для улучшения метаболических и физиологических путей, которые вносят вклад в полный и эффективный эритропоэз и, в частности, для лечения анемии, вызванной хроническим заболеванием. Помимо этого предоставлены способы и соединения для преодоления подавляющего/ингибирующего воздействия воспалительных цитокинов на выработку и реактивность EPO. Дополнительно настоящее изобретение предоставляет способы и соединения для улучшения метаболизма железа, а также для лечения или профилактики состояний, связанных с пониженным метаболизмом железа, таких как дефицит железа, включая функциональный дефицит железа, железодефицитную анемию, микроцитоз, железодефицитный эритропоэз и т.д.
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение относится к способам и соединениям, предназначенным для индукции усиленного или полного эритропоэза у субъекта. В частности, способы включают индукцию усиленного или полного эритропоэза путем стабилизации HIFα у субъекта. Конкретно рассматриваются способы индукции усиленного эритропоэза за счет ингибирования HIF-пролилгидроксилазы. В конкретных вариантах осуществления способы включают введение субъекту соединения по настоящему изобретению. В различных вариантах осуществления субъект может представлять собой клетку, ткань, орган, систему органов или весь организм.
В различных вариантах осуществления субъект представляет собой клетку, ткань, орган, систему органов или весь организм. В отдельных вариантах осуществления организм представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека.
В одном из аспектов способ увеличивает выработку факторов, требуемых для дифференцировки эритроцитов от гемопоэтических клеток-предшественников, включающих, например, линии гемопоэтических клеток (HSCs), клетки CFU-GEMM (колониеобразующие единицы гранулоцит/эритроид/моноцит/мегакариоцит) и т.д. Факторы, которые стимулируют эритропоэз, включают, не ограничиваясь этим, эритропоэтин. В другом аспекте способы увеличивают выработку факторов, необходимых для поглощения, транспорта и использования железа. Такие факторы включают, не ограничиваясь перечисленным, эритроид аминолевулинатсинтазу, трансферрин, рецептор трансферрина, церулоплазмин и т.д. В еще одном аспекте способ увеличивает выработку факторов, необходимых для дифференцировки эритроцитов и дополнительных факторов, необходимых для поглощения, транспорта и использования железа.
В другом воплощении способы по настоящему изобретению улучшают реактивность гемопоэтических клеток-предшественников в отношении эритропоэтина. Как упоминалось выше, эти клетки-предшественники включают HSCs, CFU-GEMMs и т.д. Реактивность клеток-предшественников может быть увеличена, например, за счет изменения экспрессии рецепторов эритропоэтина, внутриклеточных факторов, вовлеченных в передачу сигналов эритропоэтина, и секретируемых факторов, которые облегчают взаимодействие эритропоэтина с рецепторами.
В другом аспекте способы могут применяться для преодоления ингибирования эритропоэза, вызванного воспалительными цитокинами, такими как фактор-α некроза опухолей (TNF-α), интерлейкин-1β (IL-1β) и т.п. В отдельных аспектах способы могут применяться для лечения анемии, которая с трудом поддается лечению экзогенно вводимым эритропоэтином. Подобная анемия может быть вызвана, например, хроническими воспалительными или аутоиммунными расстройствами, которые включают, не ограничиваясь перечисленным, хронический бактериальный эндокардит, остеомиелит, ревматоидный артрит, ревматизм, болезнь Крона и язвенный колит.
В определенных воплощениях способы по настоящему изобретению могут быть применены для лечения анемии, вызванной хроническим заболеванием. В частности, разработаны способы индукции усиленного или полного эритропоэза у пациентов с анемией, вызванной хроническим заболеванием. В отдельных вариантах осуществления способы увеличивают количество железа, доступного для образования новых красных кровяных телец.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способы усиления реактивности EPO костного мозга.
В частности, разработаны способы ингибирования супрессии EPO TNF-α, а также разработаны способы ингибирования супрессии EPO IL-1β.
Настоящее изобретение относится к способам лечения/профилактики анемии, вызванной хроническими заболеваниями, а также к способам регулирования процессинга железа и лечения/профилактики состояний, связанных с дефицитом железа и/или процессинга железа.
В одном из аспектов изобретение предоставляет способ лечения у субъекта анемии, вызванной хроническим заболеванием, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу индуцируемого при гипоксии фактора (HIF), осуществляя тем самым лечение анемии, вызванной хроническим заболеванием. Кроме этого разработаны способы достижения конкретных физиологических результатов у субъекта с анемией, вызванной хроническим заболеванием; в частности, предоставлены способы повышения ретикулоцитов, увеличения среднего корпускулярного объема клетки, повышения среднего корпускулярного гемоглобина, увеличения гематокрита, повышения гемоглобина, увеличения количества красных кровяных телец и т.д. у субъекта с анемией, вызванной хроническим заболеванием, причем каждый из способов включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу индуцируемого при гипоксии фактора (HIF), достигая тем самым желаемого физиологического результата. В различных аспектах анемия, вызванная хроническим заболеванием, связана, например, с воспалением, аутоиммунным заболеванием, недостатком железа, микроцитозом, злокачественными опухолевыми заболеваниями и т.д.
В различных вариантах осуществления субъект представляет собой клетку, ткань или орган. В других вариантах осуществления субъект представляет собой животное, предпочтительно млекопитающее, наиболее предпочтительно - человека. Если субъект является клеткой, настоящее изобретение, в частности, предполагает, что клетка может быть обособленной клеткой, как прокариотической, так и эукариотической. В случае если субъект представляет собой ткань, изобретение, в частности, рассматривает как эндогенные ткани, так и ткани in vitro, например ткани, выращенные в культуре. В предпочтительных вариантах осуществления субъект является животным, в частности одним из видов млекопитающих, включая крысу, кролика, корову, овцу, свинью, мышь, лошадь и различные виды приматов. В наиболее предпочтительном варианте осуществления субъект представляет собой человека.
Стабилизация HIFα может выполняться любым из способов, которые доступны и известны специалисту в данной области техники, и может включать применение любого средства, которое взаимодействует с HIFα, связывается с HIFα или модифицирует HIFα, или факторов, которые взаимодействуют с HIFα, включая, например, ферменты, для которых HIFα является субстратом. В определенных аспектах настоящее изобретение предполагает получение конститутивно стабильного варианта HIFα, например стабильных мутеинов HIF и т.д. или полинуклеотида, кодирующего такой вариант. В других аспектах настоящее изобретение предполагает, что стабилизация HIFα включает введение средства, которое стабилизирует HIFα. Такое средство может состоять из полинуклеотидов, например антисмысловых последовательностей; антител; других белков; углеводов; жиров; липидов; а также органических и неорганических веществ, например небольших молекул и т.д. В предпочтительном воплощении настоящее изобретение предполагает стабилизацию HIFα в субъекте, например, за счет введения субъекту средства, которое стабилизирует HIFα, причем средство представляет собой соединение, например соединение с небольшими молекулами и т.д., которое стабилизирует HIFα.
В различных аспектах HIFα представляет собой HIF1α, HIF2α или HIF3α. В предпочтительном аспекте стабилизация HIFα включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое ингибирует активность HIF-гидроксилазы. В определенных аспектах HIF-гидроксилаза выбрана из группы, состоящей из EGLN1, EGLN2 и EGLN3.
В одном из вариантов осуществления изобретение предоставляет способ увеличения среднего корпускулярного объема у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF). В дополнительном варианте осуществления изобретение предоставляет способ повышения средних уровней корпускулярного гемоглобина у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF). В другом варианте осуществления настоящее изобретение охватывает способ уменьшения микроцитоза у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF).
Изобретение дополнительно предоставляет способ лечения или профилактики микроцитарной анемии, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF).
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения или профилактики состояний, связанных с дефицитом железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF). В отдельном аспекте изобретение предоставляет способ улучшения процессинга железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого при гипоксии (HIF). Кроме этого разработан способ лечения или профилактики состояний, связанных с нарушением доступности железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF).
В других вариантах осуществления изобретение относится к способу преодоления эффектов, индуцированных цитокинами у субъекта. В частности, в одном аспекте изобретение предоставляет способ преодоления вызванного цитокинами ингибирования выработки EPO у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF). Кроме этого изобретение предоставляет способ преодоления вызванного цитокинами ингибирования доступности железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF). В другом аспекте настоящее изобретение охватывает способ лечения или профилактики связанной с цитокинами анемии у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF). Кроме этого разработаны способы увеличения выработки EPO в присутствии цитокинов у субъекта, причем способы включают введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF). В конкретных вариантах осуществления цитокин выбран из группы, состоящей из TNF-α и IL-1β.
В одном из аспектов изобретение предоставляет способ снижения индуцированной цитокинами экспрессии VCAM (Vascular Cell Adhesion Molecule) у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF). В конкретном аспекте цитокин представляет собой TNF-α или IL-1β. В одном из аспектов способ применяют для снижения индуцированной цитокинами экспрессии VCAM в эндотелиальных клетках субъекта. В другом аспекте субъект находится в состоянии, выбранном из группы, состоящей из воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания и анемии, вызванной хроническим заболеванием.
В другом аспекте изобретение предоставляет способ снижения индуцированной цитокинами экспрессии E-селектина у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией. В конкретном аспекте цитокин представляет собой TNF-α или IL-1β. В одном из аспектов способ применяют для снижения индуцированной цитокинами экспрессии Е-селектина в эндотелиальных клетках субъекта. В другом аспекте субъект находится в состоянии, выбранном из группы, состоящей из воспалительного заболевания, аутоиммунного заболевания и анемии, вызванной хроническим заболеванием.
Изобретение предоставляет различные способы регулирования/улучшения процессинга и метаболизма железа. В одном аспекте изобретение предоставляет способы улучшения транспорта, поглощения, использования и абсорбции железа у субъекта, причем каждый из способов включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF). В отдельных вариантах осуществления изобретение предоставляет способы увеличения экспрессии трансферрина, экспрессии рецептора трансферрина, экспрессии IRP-2, экспрессии ферритина, экспрессии церулоплазмина, экспрессии NRAMP2, экспрессии спроутина и экспрессии ALAS-2 у субъекта, причем каждый из способов включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF). В других вариантах осуществления изобретение предоставляет способы уменьшения экспрессии гепсидина, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF). Кроме этого, разработаны способы увеличения синтеза гема у субъекта за счет введения субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF).
В определенных аспектах изобретение рассматривает способы повышения содержания железа в сыворотке субъекта, включая насыщение трансферрином, повышение уровней растворимого рецептора трансферрина и увеличение уровней содержания ферритина, причем каждый из способов включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF). В дополнительном аспекте изобретение предоставляет способ для увеличения транспорта железа в костный мозг субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует альфа-субъединицу фактора, индуцируемого гипоксией (HIF).
В одном из аспектов представленные способы применяют к лечению или производству лекарственного средства для субъекта, предпочтительно человека, у которого имеется любое из расстройств или состояний, обсуждаемых в настоящем описании. Следует понимать, что различные параметры, связанные с клиническими состояниями, изменяются в соответствии с возрастом, полом и т.д. В одном аспекте уровень ферритина в сыворотке субъекта ниже нормальных пределов, например ниже 50-200 мкг/л; следовательно, субъект, имеющий уровень ферритина в сыворотке ниже 200 нг/мл, ниже 150 нг/мл, ниже 100 нг/мл, ниже 75 нг/мл и ниже 50 нг/мл мог бы являться подходящим субъектом для лечения способами по настоящему изобретению или для применения медикаментов, разработанных в настоящем изобретении. С другой стороны, подходящий субъект мог бы быть идентифицирован благодаря тому, что его общая способность к связыванию железа (TIBS) ниже нормальных пределов, например TIBS менее 300-360 мкг/дл.
В другом варианте осуществления уровень железа в сыворотке субъекта ниже нормальных пределов, например уровни железа менее 50-150 мкг/дл. Другие подходящие параметры для идентификации подходящих субъектов включают следующие результаты измерений: насыщение трансферрина ниже 30-50%, сидеробласты костного мозга ниже 40-60% и уровни гемоглобина ниже приблизительно 10-11 г/дл. Любой из приведенных выше параметров измеряют, например, в стандартных гематологических тестах, при химическом анализе крови и полном клиническом анализе крови (CBC), результаты которых, как правило, представляют в виде измерений нескольких параметров крови и получают, например, путем анализа крови с помощью автоматического устройства, которое измеряет, например, количество красных кровяных телец, количество белых кровяных телец, количество тромбоцитов и показатели красных кровяных телец. Измерения могут проводиться любыми стандартными средствами измерений, которые применяются в гематологическом и/или биохимическом анализе крови, включая, например, автоматизированные системы, такие как анализатор CELL DYN 4000 (Abbott Laboratories, Abbott Park IL), анализатор Coulter GenS (Beckman Coulter, Inc., Fullerton CA), анализатор Bayer ADVIA (Bayer Healthcare AG, Leverkuzen, Germany) и т.д.
В одном из аспектов изобретение охватывает способ лечения или профилактики дефицита железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, осуществляя тем самым лечение или профилактику дефицита железа у субъекта. В дополнительных аспектах дефицит железа представляет собой функциональный дефицит железа; дефицит железа, связанный с анемией; дефицит железа, связанный с расстройством, выбранным из группы, которая состоит из воспаления, инфекционного заболевания, расстройства, связанного с иммунодефицитом, неопластического расстройства; или же дефицит железа, связанный с расстройством, выбранным из группы, состоящей из анемии, вызванной хроническим заболеванием, железодефицитной анемии (IDA) или микроцитарной анемии.
Субъект по настоящему изобретению может являться субъектом, у которого любой стандартный, приемлемый с клинической точки зрения способ измерения свидетельствует о дефиците железа или о повышенном риске развития дефицита железа. Например, в определенных вариантах осуществления у субъекта имеются низкие уровни ферритина в сыворотке (<20 нг/мл) или сниженный процент насыщения трансферрина, например менее 16% (у взрослых). Конкретно рассматриваются уровни ферритина в сыворотке ниже 50 нг/мл, ниже 40 нг/мл, ниже 30 нг/мл и ниже 20 нг/мл. Отмечено, что если у субъекта имеется повышенный риск возникновения дефицита железа или дефицит железа, который представляет собой функциональный дефицит железа, уровни ферритина в сыворотке могут повышаться выше нормальных пределов, например 200 нг/мл и выше. Дефицит железа может наблюдаться благодаря началу протекания эритропоэза при ограниченном количестве/дефиците железа (ухудшение синтеза гемоглобина, которое, как правило, наблюдается, когда процент насыщения трансферрина падает ниже 15-20%). Указанные параметры, имеющие отношение к железу, могут быть измерены с применением любого описанного выше стандартного анализа CBC или биохимического анализа и/или с применением автоматических приборов, более конкретно предназначенных для анализа железа, например Unimate 5 Iron и комплекта Unimate 7 UBIC (Roshe, Switzerland).
Субъект, который мог бы получить пользу от представленных способов лечения и профилактики, мог бы представлять собой субъекта, у которого имеется железодефицитная анемия или повышенный риск ее возникновения; например, субъект, имеющий процент насыщения трансферрина 10-15% или ниже 10%.
В одном аспекте субъект, имеющий дефицит железа или повышенный риск его возникновения, имеет функциональный дефицит железа или риск его возникновения. Содержание гемоглобина ретикулоцитов менее 28 пикограмм/клетка могло бы служить индикатором подобного состояния. В другом аспекте субъект, имеющий функциональный дефицит железа или повышенный риск его возникновения, показывает более чем 5%-ное содержание гипохромных красных телец.
В определенных вариантах осуществления у субъекта имеется анемия, вызванная хроническим заболеванием, или повышенный риск ее возникновения. У подобного субъекта могла бы проявляться анемия легкой или умеренной степени, например уровни гемоглобина около 10-13 г/дл или, более конкретно, 10-11 г/дл. В других вариантах осуществления проявляется более острая анемия, например уровни гемоглобина составляют менее 10 г/дл, включая уровни менее 5 г/дл и уровни менее 3 г/дл. В некоторых вариантах осуществления субъект, у которого имеется анемия, вызванная хроническим заболеванием, или повышенный риск ее возникновения, демонстрирует аномалии в распределении железа. Такими аномалиями могут являться, например, уровни железа в сыворотке, например ниже приблизительно 60 мг/дл, или уровни ферритина выше нормальных пределов, например выше 200 нг/мл, выше 300 нг/мл или выше 400 нг/мл.
В определенных аспектах у субъекта может иметься микроцитарная анемия или повышенный риск ее возникновения. Подобный субъект может, например, демонстрировать измеренный средний корпускулярный объем менее 80 фемтолитров, например, в качестве одной из частей полного клинического анализа крови. В других аспектах субъект имеет средний корпускулярный объем меньше нормального значения 90±8 фемтолитров. В различных аспектах субъект может иметь пониженное среднее количество гемоглобина в клетках, например среднее количество гемоглобина в клетке менее чем 30±3 пикограмма гемоглобина/клетка; или пониженную среднюю концентрацию гемоглобина в клетке, например среднюю концентрацию гемоглобина менее чем 33±2%.
Кроме этого предоставлен способ лечения или профилактики функционального дефицита железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, осуществляя тем самым лечение или профилактику функционального дефицита железа.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предоставляет способ регулирования или улучшения метаболизма железа или процессов метаболизма железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, тем самым регулируя или улучшая метаболизм железа или процессы метаболизма железа у субъекта. В другом варианте осуществления изобретение предоставляет способ регулирования и улучшения процессов метаболизма железа, выбранных из группы, состоящей из поглощения железа, абсорбции железа, транспорта железа, накопления железа, процессинга железа, мобилизации железа и использования железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, тем самым регулируя или улучшая процессы метаболизма железа у субъекта.
Кроме этого в настоящей заявке предоставлен способ увеличения абсорбции железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, тем самым увеличивая абсорбцию железа у субъекта. В определенных аспектах абсорбция железа представляет собой абсорбцию, происходящую в кишечнике; абсорбцию железа, поступающего с пищей; или абсорбцию в дуоденальных энтероцитах.
Помимо перечисленного в настоящей заявке также рассматриваются следующие способы: способ увеличения транспорта железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым транспорт железа у субъекта; способ увеличения накопления железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым накопление железа у субъекта; способ увеличения поглощения железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым поглощение железа у субъекта; способ увеличения процессинга железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым процессинг железа у субъекта; способ увеличения мобилизации железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым мобилизацию железа у субъекта; способ увеличения использования железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым использование железа у субъекта.
В одном варианте осуществления изобретение рассматривает способ увеличения доступности железа для эритропоэза у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым доступность железа для эритропоэза у субъекта. В различных вариантах осуществления возрастающая доступность железа для эритропоэза увеличивает доступность железа для синтеза гема; увеличивает доступность железа для выработки гемоглобина; или увеличивает доступность железа для выработки красных кровяных телец.
Дополнительно изобретение предоставляет способы регулирования экспрессии регуляторных факторов железа у субъекта, причем способы включают введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, регулируя тем самым экспрессию факторов метаболизма железа у субъекта.
Настоящей заявкой охвачены способы регулирования экспрессии определенных регуляторных факторов железа, включая: способ увеличения экспрессии рецептора трансферрина у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым экспрессию рецептора трансферрина у субъекта; способ увеличения экспрессии трансферрина у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым экспрессию трансферрина у субъекта; способ увеличения экспрессии церулоплазмина у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым экспрессию церулоплазмина у субъекта; способ увеличения экспрессии NRAMP2 (slc11a2) у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым экспрессию NRAMP2 у субъекта; способ увеличения экспрессии дуоденальной цитохром b редуктазы 1 у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым экспрессию дуоденальной цитохром b редуктазы 1 у субъекта; а также способ увеличения экспрессии 5-аминолевулинатсинтазы у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым экспрессию 5-аминолевулинатсинтазы у субъекта.
В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение предоставляет способ увеличения содержания железа в сыворотке субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым содержание железа в сыворотке субъекта. В определенных вариантах осуществления субъект является человеком, и уровни железа в сыворотке повышаются до величины от 50 до 150 мг/дл.
В другом аспекте настоящее изобретение предоставляет способы увеличения общей емкости связывания железа (TIBC) у субъекта. Способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым TIBC у субъекта. В предпочтительном аспекте субъект представляет собой человека, и общая емкость связывания железа повышается до величины от 300 до 360 мкг/дл.
Предоставлены способы и соединения, предназначенные для корректировки уровней ферритина в сыворотке субъекта. В определенном варианте осуществления субъект представляет собой человека, и уровни ферритина в сыворотке поднимаются выше 15 мкг/л. В дополнительном варианте осуществления субъект представляет собой взрослого человека мужского пола, и уровень ферритина в сыворотке повышается до величины около 100 мкг/л. В другом варианте осуществления субъект представляет собой взрослую женщину, и уровень ферритина в сыворотке повышается до величины около 30 мкг/л.
В одном из аспектов изобретение включает способ увеличения насыщения трансферрина у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым насыщение трансферрина у субъекта. В одном из аспектов насыщение трансферрина возрастает выше уровня, выбранного из группы, состоящей из 10%, 15%, 20%, 30%, 40% и 50%. Настоящее изобретение охватывает способы увеличения процентного насыщения трансферрина у субъекта. В одном из вариантов осуществления субъект представляет собой человека, и процентное насыщение трансферрина возрастает выше величины приблизительно 18%. В другом варианте осуществления процентное насыщение трансферрина увеличивается до величины от 25 до 50%. Процентное насыщение трансферрина, как правило, вычисляют, применяя формулу: (железо в сыворотке)(100)/(TIBC).
Помимо перечисленного предоставлены способы увеличения у субъекта уровней растворимого рецептора трансферрина, причем способы включают введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым уровни содержания растворимого рецептора трансферрина у субъекта. Настоящее изобретение дополнительно предоставляет способы увеличения общей массы эритроидов костного мозга, которая измерена, например, по уровням рецептора трансферрина в сыворотке. В одном из аспектов субъект представляет собой человека, и уровень рецептора трансферрина в сыворотке возрастает до 4-9 мг/л, что определяют с помощью иммунного анализа.
Разработан способ уменьшения экспрессии гепсидина у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, уменьшая тем самым экспрессию гепсидина у субъекта.
В одном из вариантов осуществления изобретение предоставляет способ лечения или профилактики расстройств, связанных с дефицитом железа у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, тем самым осуществляя лечение или профилактику расстройств, связанных с дефицитом железа у субъекта. В одном из вариантов осуществления дефицит железа представляет собой функциональный дефицит железа. В различных вариантах осуществления расстройство выбрано из группы, состоящей из воспаления, инфекционного заболевания, расстройств, связанных с иммунодефицитом, и неопластических расстройств; или же расстройство выбрано из группы, состоящей из анемии, вызванной хроническим заболеванием, железодефицитной анемии и микроцитарной анемии.
Изобретение предоставляет способ улучшения эритропоэза у субъекта, у которого имеется дефицит железа или повышенный риск его возникновения, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, улучшая тем самым эритропоэз у субъекта. В определенном аспекте предполагается, что дефицит железа представляет собой функциональный дефицит железа.
Далее настоящее изобретение предоставляет способ улучшения эритропоэза у субъекта, согласно которому у субъекта имеется функциональный дефицит железа или повышенный риск его возникновения, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, улучшая тем самым эритропоэз у субъекта. В различных аспектах хроническое заболевание выбрано из группы, состоящей из воспаления, инфекционного заболевания, расстройств, связанных с иммунодефицитом, и неопластических расстройств.
Дополнительно предоставлен способ улучшения эритропоэза у субъекта, согласно которому у субъекта имеется анемия, вызванная хроническим заболеванием или повышенный риск ее возникновения, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, улучшая тем самым эритропоэз у субъекта.
В одном из вариантов осуществления изобретение охватывает способ улучшения эритропоэза у субъекта, в котором субъект не поддается лечению EPO-терапией, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, улучшая тем самым эритропоэз у субъекта.
Кроме этого предоставлен способ лечения или профилактики анемии, вызванной хроническим заболеванием у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, осуществляя тем самым лечение или профилактику анемии, вызванной хроническим заболеванием, у субъекта. В определенных аспектах предполагается, что анемия, вызванная хроническим заболеванием, связана с состоянием, выбранным из группы, состоящей из воспаления, инфекционного заболевания, расстройства, связанного с иммунодефицитом, или неопластического расстройства.
В изобретении конкретно рассматриваются следующие способы: способ увеличения числа ретикулоцитов у субъекта, у которого имеется хроническое заболевание, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым число ретикулоцитов у субъекта; способ повышения гематокрита у субъекта, у которого имеется хроническое заболевание, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, повышая тем самым гематокрит у субъекта; способ повышения содержания гемоглобина у субъекта, у которого наблюдается хроническое заболевание, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, повышая тем самым содержание гемоглобина у субъекта; способ увеличения количества красных кровяных телец у субъекта, у которого наблюдается хроническое заболевание, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым количество красных кровяных телец у субъекта; способ увеличения среднего корпускулярного объема у субъекта, у которого наблюдается хроническое заболевание, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым средний корпускулярный объем у субъекта; способ увеличения среднего корпускулярного гемоглобина у субъекта, у которого имеется хроническое заболевание, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым средний корпускулярный гемоглобин у субъекта; способ повышения содержания железа в сыворотке субъекта, у которого наблюдается хроническое заболевание, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым содержание железа в сыворотке субъекта; а также способ увеличения насыщения трансферрина у субъекта, у которого имеется хроническое заболевание, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым насыщение трансферрина у субъекта. В любом из перечисленных способов в конкретных вариантах осуществления хроническое заболевание выбрано из группы, состоящей из воспаления, инфекционного заболевания, расстройства, связанного с иммунодефицитом, и неопластического расстройства; или хроническое заболевание выбрано из группы, состоящей из анемии, вызванной хроническим заболеванием, анемии, вызванной дефицитом железа, дефицита железа, функционального дефицита железа и микроцитарной анемии.
Кроме этого разработаны следующие способы: способ увеличения числа ретикулоцитов у субъекта, у которого имеется дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым число ретикулоцитов у субъекта; способ повышения гематокрита у субъекта, у которого имеется дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, повышая тем самым гематокрит у субъекта; способ повышения содержания гемоглобина у субъекта, у которого имеется дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, повышая тем самым содержание гемоглобина у субъекта; способ увеличения количества красных кровяных телец у субъекта, у которого имеется дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым количество красных кровяных телец у субъекта; способ увеличения среднего корпускулярного объема у субъекта, у которого имеется дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым средний корпускулярный объем у субъекта; способ увеличения среднего корпускулярного гемоглобина у субъекта, у которого имеется дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым средний корпускулярный гемоглобин у субъекта; способ повышения содержания железа в сыворотке у субъекта, у которого имеется дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым содержание железа в сыворотке у субъекта; а также способ увеличения насыщения трансферрина у субъекта, у которого имеется дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым насыщение трансферрина у субъекта. В любом из перечисленных способов в определенных вариантах осуществления дефицит железа представляет собой функциональный дефицит железа.
Помимо перечисленного рассмотрены следующие способы: способ увеличения числа ретикулоцитов у субъекта, у которого имеется функциональный дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым число ретикулоцитов у субъекта; способ повышения гематокрита у субъекта, у которого имеется функциональный дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, повышая тем самым гематокрит у субъекта; способ повышения содержания гемоглобина у субъекта, у которого имеется функциональный дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, повышая тем самым содержание гемоглобина у субъекта; способ увеличения количества красных кровяных телец у субъекта, у которого имеется функциональный дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым количество красных кровяных телец у субъекта; способ увеличения среднего корпускулярного объема у субъекта, у которого имеется функциональный дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым средний корпускулярный объем у субъекта; способ увеличения среднего корпускулярного гемоглобина у субъекта, у которого имеется функциональный дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым средний корпускулярный гемоглобин у субъекта; способ повышения содержания железа в сыворотке у субъекта, у которого имеется функциональный дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым содержание железа в сыворотке у субъекта; а также способ увеличения насыщения трансферрина у субъекта, у которого имеется функциональный дефицит железа, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым насыщение трансферрина у субъекта.
В одном из аспектов изобретение включает способ преодоления или облегчения последствий индуцированного цитокинами ухудшения эритропоэза у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, тем самым преодолевая или облегчая последствия индуцированного цитокинами ухудшения эритропоэза у субъекта. В различных аспектах индуцированное цитокинами ухудшение эритропоэза представляет собой ингибирование выработки EPO; или ухудшение метаболизма железа. В любом из описанных выше способов цитокин представляет собой воспалительный цитокин. В дополнительных вариантах осуществления цитокин выбран из группы, состоящей из TNF-α, IL-1β и IFN-γ.
Также предоставлены способы уменьшения индукции цитокином экспрессии VCAM-1 и/или E-селектина, причем способы включают введение субъекту в случае необходимости эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, понижая таким образом индукцию цитокином экспрессии VCAM-1 и/или E-селектина.
В любом из описанных выше способов цитокин представляет собой воспалительный цитокин. В дополнительных вариантах осуществления цитокин выбран из группы, состоящей из TNF-α, IL-1β и IFN-γ.
В настоящем изобретении предоставлены способы лечения или профилактики расстройств, связанных с активностью цитокина у субъекта, согласно которым расстройство выбрано из группы, состоящей из дефицита железа, функционального дефицита железа, железодефицитной анемии, анемии, вызванной хроническим заболеванием, и микроцитарной анемии, причем способы включают введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, осуществляя тем самым лечение или профилактику расстройств, связанных с активностью цитокина. В любом из описанных выше способов цитокин представляет собой воспалительный цитокин. В дополнительных вариантах осуществления цитокин выбран из группы, состоящей из TNF-α, IL-1β и IFN-γ.
Также предоставлены способы лечения или профилактики расстройств, связанных с активностью цитокина у субъекта, в которых расстройство связано с состоянием, выбранным из группы, состоящей из воспаления, инфекционного заболевания, иммунодефицита и неопластического расстройства, причем способы включают введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, осуществляя тем самым лечение или профилактику расстройств, связанных с активностью цитокина. В любом из описанных выше способов цитокин представляет собой воспалительный цитокин. В дополнительных вариантах осуществления цитокин выбран из группы, состоящей из TNF-α, IL-1β и IFN-γ.
В одном из аспектов изобретение охватывает способ увеличения выработки EPO в присутствии цитокинов у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, увеличивая тем самым выработку EPO у субъекта. Кроме этого в настоящем изобретении разработан способ лечения или профилактики микроцитоза у субъекта, причем способ включает введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα, тем самым осуществляя лечение или профилактику микроцитоза у субъекта. В дополнительных аспектах микроцитоз связан с расстройством, выбранным из группы, состоящей из хронического заболевания, анемии, вызванной хроническим заболеванием, дефицита железа, функционального дефицита железа и анемии, вызванной дефицитом железа. В любом из описанных выше способов цитокин представляет собой воспалительный цитокин. В дополнительных вариантах осуществления цитокин выбран из группы, состоящей из TNF-α, IL-1β и IFN-γ.
В любом из представленных способов лечения или профилактики предполагается, что соединение по настоящему изобретению может вводиться как часть комбинированной терапии, которая дополнительно включает введение другого терапевтического средства, например EPO, железа и витаминов, например витаминов группы B и т.д.
В настоящем изобретении предложен комплект, включающий соединение, которое стабилизирует HIFα, и, по крайней мере, еще одну добавку. В одном из аспектов настоящим изобретением предоставлена добавка, выбранная из группы, состоящей из эритропоэтина, железа и витаминов группы B, а также фармацевтическая композиция, содержащая соединение, которое стабилизирует HIFα, и, по крайней мере, одну добавку, выбранную из группы, состоящей из эритропоэтина, железа и витаминов группы B.
Настоящее изобретение предоставляет соединения и способы, предназначенные для лечения или профилактики анемии, вызванной хроническими заболеваниями, причем анемия, вызванная хроническими заболеваниями, связана с повышенными уровнями содержания цитокинов. В частности, изобретение относится к способам и соединениям, предназначенным для преодоления или ослабления последствий индуцированных цитокинами эффектов у субъекта, у которого имеются повышенные уровни цитокинов, например, для преодоления или ослабления ингибирования выработки EPO, связанного с цитокинами, индуцированной цитокинами экспрессии различных факторов неспецифической адгезии клеток и т.п.
В одном из вариантов осуществления изобретение предоставляет способы и соединения, предназначенные для преодоления ингибирования выработки EPO, связанного с цитокинами. Эти способы и соединения применимы для преодоления ингибирования выработки EPO, связанного с TNF-α и/или IL-1β, которое измерено, например, с помощью способности преодолевать ингибирование выработки EPO под действием TNF-α и/или IL-1β в культивированных клетках Hep3B.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способам и соединениям, предназначенным для уменьшения индуцированного цитокинами увеличения экспрессии различных факторов неспецифической адгезии клеток. Эти способы и соединения могут применяться для преодоления индуцированного TNF-α, IL-1β и IFN-γ роста экспрессии эндотелиальных факторов адгезии клеток, например, VCAM-1 и E-селектина, что установлено, например, при измерении уменьшения уровней экспрессии VCAM-1 и E-селектина в эндотелиальных клетках (HUVEC и т.д.)
Изобретение предоставляет способы и соединения, предназначенные для лечения или профилактики дефицита железа у субъекта. В частности, представленные способы и соединения могут применяться для улучшения метаболизма железа или для лечения и профилактики заболеваний и расстройств, связанных с ухудшенным метаболизмом железа, например ухудшенным поглощением, накоплением, процессингом, транспортом, мобилизацией и использованием железа и т.д.
В одном из аспектов предложенные способы и соединения корректируют экспрессию факторов, вовлеченных в метаболизм железа, например в процессы транспорта, использования, накопления и т.д. Например, данные способы и соединения увеличивают экспрессию рецептора трансферрина, что определено, например, с помощью измерения повышенной экспрессии рецептора трансферрина в клетках печени (например, Hep3B, HepG2), клетках почек (например, HK-2) или лимфоцитах (например, THP-1), или с помощью измерения повышенных уровней растворимого рецептора трансферрина у людей. Представленные способы и соединения увеличивают экспрессию гена церулоплазмина, что установлено, например, при измерении увеличенной экспрессии гена в мышиных почках и в клетках Hep3B. В одном из аспектов изобретение относится к способам и соединениям, которые снижают экспрессию гена гепсидина в печени мышей. В дополнительном аспекте способы и соединения по настоящему изобретению применяются для увеличения экспрессии факторов, включающих NRAMP2, дуоденальную цитохром b редуктазу 1 и т.д., что установлено, например, с помощью измерения увеличенной экспрессии гена в кишечнике мыши. Представленные способы и соединения увеличивают экспрессию 5-аминолевулинатсинтазы, т.е. первого фермента в пути синтеза гема, а также фермента, определяющего скорость синтеза гема, что установлено, например, путем измерения возросшей экспрессии гена в кишечнике мыши.
Представленные способы и соединения могут применяться для улучшения метаболизма железа. В частности, представленные способы и соединения улучшают метаболизм железа, что установлено, например, путем измерения увеличенных уровней содержания железа в сыворотке, увеличенного процентного насыщения трансферрина и уменьшенного микроцитоза у крысиной модели ухудшенного метаболизма железа.
Настоящее изобретение предоставляет способы и соединения, предназначенные для индукции усиленного эритропоэза. В частности, представленные способы и соединения усиливают эритропоэз, что установлено, например, при измерении роста количества ретикулоцитов, гематокрита и количества красных кровяных телец у модельной крысы с ухудшенным эритропоэзом, а также у людей, или же, что установлено, например, путем измерения повышенных уровней гемоглобина у крысиной модели ухудшенного эритропоэза.
Представленные способы и соединения снижают микроцитоз, что установлено, например, при измерении увеличенных средних корпускулярных уровней гемоглобина и увеличенного среднего корпускулярного объема у крысиной модели ухудшенного эритропоэза.
Представленные способы включают введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα. Подобная стабилизация может происходить за счет, например, ингибирования активности HIF-гидроксилазы. Предпочтительное соединение по настоящему изобретению представляет собой соединение, которое ингибирует активность HIF-пролилгидроксилазы. Ингибирование может быть прямым или косвенным, конкурентным или неконкурентным и т.д. В различных вариантах осуществления соединение по настоящему изобретению выбрано из группы, состоящей из веществ, имитирующих 2-оксоглутарат, соединений, образующих хелатные комплексы с железом (хелаторов железа) и аналогов пролина. В одном из аспектов соединение, имитирующее 2-оксоглутарат, представляет собой гетероциклический карбонилсодержащий глицин формул I, Ia или Ib. В другом аспекте хелатор железа представляет собой гидроксамовую кислоту формулы III. В отдельных воплощениях, как показано на примерах в настоящей заявке, соединение представляет собой соединение D.
Типовые соединения по настоящему изобретению включают [(1-хлор-4-гидрокси-изохинолин-3-карбонил)-амино]уксусную кислоту (соединение A), [(4-гидрокси-7-фенокси-изохинолин-3-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение B), [(4-гидрокси-7-фенилсульфанил-изохинолин-3-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение C) и 3-{[4-(3,3-дибензил-уреидо)-бензолсульфонил]-[2-(4-метокси-фенил)-этил]-амино}-N-гидроксипропионамид (соединение D). Ниже раскрыты дополнительные соединения по настоящему изобретению, а также способы идентификации дополнительных соединений настоящего изобретения.
Краткое описание чертежей
Фиг.1A и 1B представляют данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению преодолевают ингибирующее воздействие TNF-α на выработку EPO.
Фиг.2A и 2B представляют данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению преодолевают ингибирующее воздействие TNF-α на выработку EPO в клетках, предварительно обработанных TNF-α.
Фиг.3A и 3B представляют данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению преодолевают ингибирующее воздействие IL-1β на выработку EPO.
Фиг.4A и 4B представляют данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению преодолевают ингибирующее воздействие IL-1β на выработку EPO в клетках, предварительно обработанных IL-1β.
Фиг.5 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению снижают экспрессию VCAM-1, связанную с TNF-α.
Фиг.6A, 6B и 6C представляют данные, показывающие увеличенную экспрессию рецептора трансферрина и переносчика железа (Фиг.6A), кишечного белка, переносящего железо (Фиг.6B) и 5-аминолевулинатсинтазы (Фиг.6C), причем отмеченные изменения возникают после воздействия на мышь соединений по настоящему изобретению.
Фиг.7 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению увеличивают количество ретикулоцитов в животной модели с анемией, вызванной хроническим заболеванием.
Фиг.8 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению увеличивают гематокрит в животной модели с анемией, вызванной хроническим заболеванием.
Фиг.9 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению увеличивают уровни гемоглобина в животной модели с анемией, вызванной хроническим заболеванием.
Фиг.10 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению увеличивают количество красных кровяных телец в животной модели с анемией, вызванной хроническим заболеванием.
Фиг.11 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению уменьшают микроцитоз в животной модели с анемией, вызванной хроническим заболеванием.
Фиг.12 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению увеличивают средний корпускулярный гемоглобин и исправляют гипохромию в животной модели с анемией, вызванной хроническим заболеванием.
Фиг.13 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению увеличивают гематокрит у нормальных животных и в животной модели с анемией, вызванной хроническим заболеванием.
Фиг.14 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению увеличивают уровни гемоглобина у нормальных животных и в животной модели с анемией, вызванной хроническим заболеванием.
Фиг.15 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению увеличивают количества красных кровяных телец у нормальных животных и в животной модели с анемией, вызванной хроническим заболеванием.
Фиг.16 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению улучшают средний корпускулярный объем у нормальных животных и в животной модели с анемией, вызванной хроническим заболеванием.
Фиг.17 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению улучшают средние уровни корпускулярного гемоглобина у нормальных животных и в животной модели с анемией, вызванной хроническим заболеванием.
Фиг.18A и 18B представляют данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению увеличивают уровни содержания железа в сыворотке (Фиг.18A) и уровни насыщения трансферрина (Фиг.18B) у нормальных животных и в животной модели с анемией, вызванной хроническим заболеванием.
Фиг.19 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению увеличивают экспрессию гена NRAMP2 (slc11a2) и спроутина (CYBRD1, дуоденальной цитохром b редуктазы 1) у нормальных животных и в животной модели с анемией, вызванной хроническим заболеванием.
Фиг.20 представляет данные, показывающие увеличение числа ретикулоцитов после введения здоровым людям соединения по настоящему изобретению.
Фиг.21 представляет данные, показывающие увеличенное число красных кровяных телец у здоровых людей, которым введены соединения по настоящему изобретению.
Фиг.22 представляет данные, показывающие увеличение уровней растворимого рецептора трансферрина, следующее за введением соединения по настоящему изобретению здоровым людям.
Фиг.23 представляет данные, показывающие уменьшение уровней содержания ферритина в сыворотке здоровых людей, которым введены соединения по настоящему изобретению.
Фиг.24A и 24B представляют данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению уменьшают экспрессию VCAM-1 и E-селектина, связанную с TNF-α.
Фиг.25 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению уменьшают экспрессию VCAM-1, связанную с TNF-α и IL-1β.
Фиг.26 представляет данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению уменьшают экспрессию E-селектина, связанную с TNF-α, IL-1β и IFN-γ.
Фиг.27A и 27B представляют данные, показывающие, что способы и соединения по настоящему изобретению и IL-6 совместно увеличивают уровни EPO в гепатоцитах.
Осуществление изобретения
Перед тем, как будут описаны композиции и способы по настоящему изобретению, следует понять, что изобретение не ограничено описанными отдельными методиками, описаниями экспериментов, линиями клеток и реагентами, поскольку все это может изменяться. Кроме этого следует понять, что терминология, используемая в данной заявке, направлена на описание отдельных вариантов осуществления настоящего изобретения и никоим образом не преследует цели ограничить область действия настоящего изобретения, которая определена в приложенной формуле изобретения.
Следует заметить, что в рамках настоящей заявки и в приложенной формуле изобретения формы единственного числа относятся также и к множественному числу, если контекст явно не указывает на противоположное. Таким образом, например, упоминание о “фрагменте” (“a fragment”) включает большое число таких фрагментов; упоминание о “соединении” (“a compound”) представляет собой упоминание об одном или нескольких соединениях, а также об их эквивалентах, в соответствии с тем, что описано в настоящей заявке, и мнением специалистов в данной области техники, и т.д.
Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в настоящем описании, имеют те значения, в которых они, как правило, понимаются обычным специалистом в той области техники, к которой принадлежит изобретение. Хотя при практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения могут применяться любые способы и вещества, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящей заявке, предпочтительные способы, приборы и вещества описаны в тексте. Все публикации, цитируемые в настоящей заявке, включены в заявку во всей полноте посредством ссылок, для целей описания и раскрытия методик, реагентов и инструментальных средств, описанных в публикациях, которые могли бы быть применены в связи с настоящим изобретением. Ничто в настоящей заявке не должно быть истолковано как признание того, что изобретение не дает права датировать такие раскрытия задним числом на основании предшествующего изобретения.
,
nd
Практическое воплощение настоящего изобретения подразумевает, если не указано иное, применение обычных методик химии, биохимии, молекулярной биологии, клеточной биологии, генетики, иммунологии и фармакологии, при участии специалиста в данной области техники. Указанные методики полностью разъяснены в литературе. См., напримерGennaro, A.R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.; Hardman, J.G., Limbird, L.E., and Gilman, A.G., eds. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Weir, DM., and Blackwell, C.C., eds. (1986) Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV, Blackwell Scientific Publications; Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press; Newton, C.R., and Graham, A., eds. (1997) PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2 ed., Springer Verlag.
Определения
Термин “анемия, вызванная хроническим заболеванием”, относится к любой анемии, которая развивается в результате, например, продолжительного инфекционного заболевания, воспаления, неопластического расстройства и т.д. Анемия, развивающаяся в таких ситуациях, часто характеризуется уменьшенной продолжительностью жизни красных кровяных телец и секвестрацией железа в макрофагах, что приводит к понижению количества железа, доступного для создания новых красных кровяных телец. Состояния, связанные с анемией, вызванной хроническим заболеванием, включают, не ограничиваясь перечисленным, хронический бактериальный эндокардит, остеомиелит, ревматизм, язвенный колит и неопластические расстройства. Дополнительные состояния включают другие заболевания и расстройства, связанные с инфекционным заболеванием, воспалением и новообразованиями, включая, например, воспалительные инфекции (например, легочный абсцесс, туберкулез, остеомиелит и т.д.), неинфекционные воспалительные расстройства (например, ревматоидный артрит, общий волчаночный эритрематоз, болезнь Крона, гепатит, воспалительные заболевания кишечника и т.д.), различные виды рака, опухолей и злокачественных новообразований (например, карциному, саркому, лимфому и т.д.)
Термины “расстройства”, “заболевания” и “состояния” включены друг в друга и относятся к любому состоянию, которое отклоняется от нормального.
Термин “эритропоэтин” относится к любому рекомбинантному или существующему в природе эритропоэтину, включая, например, человеческий эритропоэтин (GenBank Accession No. AAA52400; Lin et al. (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:7580-7584), EPOETIN - рекомбинантный человеческий эритропоэтин (Amgen Inc., Thousand Oaks CA), ARANESP - рекомбинантный человеческий эритропоэтин (Amgen), PROCRIT - рекомбинантный человеческий эритропоэтин (Ortho Biotech Products, L.P., Raritan NJ), и т.д.
Термин “HIFα” относится к альфа-субъединице белка фактора, индуцируемого гипоксией. HIFα может быть любым белком человека или другого млекопитающего, или фрагментом этого белка, включая человеческие HIF-1α (GenBank Accession No. Q16665), HIF-2α (GenBank Accession No. AAB41495) и HIF-3α (GenBank Accession No. AAD22668), мышиные HIF-1α (GenBank Accession No. Q61221), HIF-2α (GenBank Accession No. BAA20130 и AAB41496) и HIF-3α (GenBank Accession No. AAC72734); крысиные HIF-1α (GenBank Accession No. CAA70701), HIF-2α (GenBank Accession No. CAB96612) и HIF-3α (GenBank Accession No. CAB96611); и бычий HIF-1α (GenBank Accession No. BAA78675). HIFα также может быть белком животных, которые не относятся к млекопитающим, или фрагментом такого белка, включая HIF-1α Xenopus laevis (африканских шпорцевых лягушек) (GenBank Accession No. CAB96628), HIF-1α Drosophila melanogaster (GenBank Accession No. JC4851) и HIF-1α цыплят (GenBank Accession No. BAA34234). Последовательность гена HIFα также может быть получена путем обычных методик клонирования, например, при использовании полной последовательности гена HIFα или ее части, описанной выше, в качестве образца для восстановления и определения последовательности гена HIFα у других видов.
397
559
Фрагменты HIFα включают области, определенные человеческим HIF-1α от аминокислоты 401 до 603 (Huang et al, выше), от 531 до 575 (Jiang et al. (1997) J Biol Chem 272:19253-19260), аминокислоты от 556 до 575 (Tanimoto et al., выше), аминокислоты от 557 до 571 (Srinivas et al. (1999) Biochem Biophys Res Commun 260:557-561) и аминокислоты с 556 по 575 (Ivan и Kaelin (2001) Science 292:464-468). Далее, фрагмент HIFα включает любой из фрагментов, в котором по меньшей мере один раз встречается последовательность LXXLAP, что имеет место, например, в нативной последовательности HIFα при LTLLAP и LEMLAP. Кроме этого, фрагмент HIFα включает любой фрагмент, сохраняющий, по крайней мере, одну из функциональных или структурных особенностей HIFα.
397
559
Термины “HIF-пролилгидроксилаза” и “HIF PH” относятся к любому ферменту, способному гидроксилировать остаток пролина в белке HIF. Предпочтительно остаток пролина, гидроксилированный с помощью HIF PH, включает пролин, входящий в состав фрагмента LXXLAP, что имеет место, например, в нативной последовательности человеческого HIF-1α при LTLLAP и LEMLAP. HIF PH включает членов семейства генов Egl-девять (EGLN), которые описаны Тейлором (Taylor) (2001, Gene 275:125-132) и охарактеризованы Aravind и Koonin (2001, Genome Biol 2:RESEARCH0007), Epstein et al. (2001, Cell 107:43-54), а также Bruick и McKnight (2001, Science 294:1337-1340). Примеры ферментов, которые проявляют активность HIF пролилгидроксилазы, включают человеческие SM-20 (EGLN1) (GenBank Accession No. AAG33965; Dupuy et al. (2000) Genomics 69:348-54), EGLN2 изоформу 1 (GenBank Accession No. CAC42510; Taylor см. выше), EGLN2 изоформу 2 (GenBank Accession No. NP_060025) и EGLN3 (GenBank Accession No. CAC42511; Taylor см. выше); мышиные EGLN1 (GenBank Accession No. CAC42515), EGLN2 (GenBank Accession No. CAC42511) и EGLN3 (SM-20)(GenBank Accession No. CAC42517); и крысиный SM-20 (GenBank Accession No. AAA19321). Дополнительно HIF PH могут включать EGL-9 Caenorhabditis elegans (GenBank Accession No. AAD56365) и продукт гена CG1114 Drosophila melanogaster (GenBank Accession No. AAF52050). Кроме этого HIF-пролилгидроксилаза включает любой из фрагментов упомянутых выше полноразмерных белков, который сохраняет, по меньшей мере, одну структурную или функциональную особенность.
Термин “ингибитор пролилгидроксилазы” или “PHI” в рамках настоящего изобретения относится к любому соединению, которое понижает или другим образом корректирует активность фермента, гидроксилирующего аминокислотные остатки. Хотя ферментативная активность, обеспечивающая гидроксилирование остатков пролина, является предпочтительной, также рассматривается гидроксилирование и других аминокислотных остатков, включая, но не ограничиваясь этим, гидроксилирование аргинина. Соединения, которые могут быть применены в способах по настоящему изобретению, включают, например, хелаторы железа, соединения, имитирующие 2-оксоглутарат, и модифицированные аминокислоты, например аналоги пролина.
В отдельных вариантах осуществления настоящее изобретение предусматривает применение соединений, имитирующих структуру 2-оксоглутарата. Такие соединения могут конкурентно ингибировать активность членов семейства ферментов 2-оксоглутаратдиоксигеназы в отношении 2-оксоглутарата и не конкурентно в отношении железа. (Majamaa et al. (1984) Eur J Biochem 138:239-245; и Majamaa et al. (1985) Biochem J 229:127-133). PHIs, конкретно рассматриваемые для применения в способах по настоящему изобретению, описаны, например, в Majamaa et al., см. выше; Kivirikko и Myllyharju (1998) Matrix Biol 16:357-368; Bickel et al. (1998) Hepatology 28:404-411; Friedman et al.(2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:4736-4741; Franklin (1991) Biochem Soc Trans 190:812-815; Franklin et al. (2001) Biochem J 353:333-338; а также Международные публикации № WO 03/053977 и WO 03/049686, причем каждый из источников полностью включен в настоящую заявку. Типовые PHIs, включающие [(1-хлор-4-гидрокси-изохинолин-3-карбонил)-амино]уксусную кислоту (соединение A), [(4-гидрокси-7-фенокси-изохинолин-3-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение B), [(4-гидрокси-7-фенилсульфанил-изохинолин-3-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение C) и 3-{[4-(3,3-дибензил-уреидо)-бензолсульфонил]-[2-(4-метокси-фенил)-этил]-амино}-N-гидроксипропионамид (соединение D), используются в примерах данного описания для демонстрации способов по описанному здесь изобретению.
Изобретение
Настоящее изобретение относится к способам и соединениям, предназначенным для стимулирования усиленного или полного эритропоэза у субъекта. В частности, способы включают стимулирование улучшенного или полного эритропоэза путем стабилизации HIFα у субъекта. В частности, рассмотрены способы индукции усиленного эритропоэза за счет ингибирования HIF-пролилгидроксилазы. В конкретных вариантах осуществления способы включают введение субъекту соединения по настоящему изобретению. В различных вариантах осуществления субъект может представлять собой клетку, ткань, орган, систему органов или организм в целом.
Анемия, вызванная хроническим заболеванием, представляет собой наиболее обычную форму анемии у пациентов, помещенных в больницу. Анемия, вызванная хроническим заболеванием, встречается у пациентов с воспалительными расстройствами или злокачественными заболеваниями, включая воспалительные инфекционные заболевания (например, легочный абсцесс, туберкулез, остеомиелит и т.д.), неинфекционные воспалительные расстройства (например, ревматоидный артрит, общий волчаночный эритрематоз, болезнь Крона, гепатит, воспалительные заболевания кишечника и т.д.), различные виды рака, опухолей и злокачественных новообразований (например, карциному, саркому, лимфому и т.д.), хронический бактериальный эндокардит, остеомиелит, ревматизм, язвенный колит и неопластические расстройства.
В одном из аспектов изобретение предоставляет способы, предназначенные для индукции усиленного или полного эритропоэза с целью лечения анемии, вызванной хроническим заболеванием. Анемия, вызванная хроническим заболеванием, связана с многочисленными расстройствами хронического характера, включая, например, ревматоидный артрит, ревматизм, воспалительные заболевания кишечника, язвенный колит, общий волчаночный эритрематоз, васкулит, неопластические расстройства и т.д., а также хронические инфекционные заболевания и хронические воспаления. Причиной снижения эритропоэза или неэффективного эритропоэза могут являться различные метаболические аномалии в путях эритропоэза, включающие, например, ингибирование выработки EPO, уменьшенную реактивность EPO в костном мозге, а также аномальный процессинг железа, включающий, например, аномальное или неэффективное поглощение, мобилизацию, накопление и абсорбцию железа.
Физиологической особенностью расстройств, которые связаны с анемией, вызванной хроническим заболеванием, является повышенная выработка воспалительных цитокинов (Means (1995) Stem Cells 13:32-37 и Means (1999) Int J Hematol 70:7-12), включая, например, фактор некроза опухолей α (TNF-α), интерлейкин-1β (IL-1β) и интерферон γ (IFN-γ), которые оказывают отрицательное влияние на способность опосредовать выработку EPO, на реактивность EPO и на согласованное регулирование метаболизма железа (См., например, Roodman et al. (1989) Adv Exp Med Biol 271:185-196; Fuchs et al. (1991) Eur J Hematol 46:65-70; Jelkmann et al. (1991) Ann NY Acad Sci 718:300-311; Vannucchi et al. (1994) Br J Hematol 87:18-23; и Oldenburg et al. (2001) Aliment Pharmacol Ther 15:429-438). Настоящее изобретение предоставляет способы улучшения метаболических и физиологических путей, связанных с выработкой EPO, передачей сигналов EPO и использованием железа, причем упомянутое улучшение приводит к полному или улучшенному эритропоэзу, а также к ослаблению или улучшению течения анемии, вызванной хроническим заболеванием.
Настоящее изобретение обеспечивает различные преимущества перед существующими способами лечения анемии, вызванной хроническим заболеванием, например, такими как введение рекомбинантного EPO. Снижение выработки EPO является только одним из аспектов ослабленного эритропоэза и очевидно, что введение рекомбинантного EPO не направлено против остальных недостатков, связанных с ослабленным эритропоэзом, которые имеются у пациентов с анемией, вызванной хроническим заболеванием (См., например, Clibon et al. (1990) Exp Hematol 18:438-441, а также Macdougall и Cooper (2002) Neprol Dial Transplant 17(11):39-43). Указанные недостатки включают, например, пониженную реактивность EPO костного мозга, а также многочисленные аспекты метаболизма железа, которые вносят вклад в полный или совершенный эритропоэз, включая абсорбцию железа из кишечника, транспорт через кишечник, окисление железа в трехвалентное состояние гефестином или церулоплазмином, связывание и поглощение железа трансферрином или рецептором трансферрина, а также транспорт железа в костный мозг, где происходит использование железа, включая синтез гема. Многие пациенты, у которых снижена или отсутствует реакция на введение рекомбинантного EPO, даже при применении высоких доз последнего, не поддаются лечению введением рекомбинантного EPO по описанным выше причинам.
Преобладание воспалительных цитокинов при анемии, вызванной хроническим заболеванием, ведет, например, к пониженным уровням железа в сыворотке и увеличенному накоплению железа, преимущественно в макрофагах, т.е. в клеточных компартментах, с трудом доступных для появляющихся эритроидных предшественников, которым требуется железо для нормального синтеза гема. Изобретение предоставляет способы для улучшения метаболических путей, которые вносят вклад в полный и совершенный эритропоэз. В одном из вариантов осуществления терапевтическое средство вводят в сочетании с добавками, которые дополнительно усиливают его эффективность, например железом и витаминами группы B.
Анемия, вызванная хроническим заболеванием, связана с повышенными уровнями ферритина. Несмотря на высокие уровни ферритина, субъекты с анемией, вызванной хроническим заболеванием, не способны эффективно использовать железо. Высокие уровни ферритина указывают на пониженное повторное возвращение железа в костный мозг и улучшенное накопление железа, т.е. на функциональный дефицит железа, который часто связан с анемией, вызванной хроническим заболеванием, и псевдовоспалительным состоянием, которое часто встречается у пациентов с уремическим заболеванием почек хронического характера. Снижая уровни ферритина, способы и соединения по настоящему изобретению уменьшают количество накопленного железа и увеличивают повторное использование железа с помощью трансферрина и рецептора трансферрина. Пониженные уровни ферритина в сыворотке могли бы служить показателем улучшенного использования железа и улучшенного повторного поступления железа в костный мозг, и, следовательно, увеличенной доступности железа для выработки гема и эритропоэза.
Геномный отклик на гипоксию включает изменения в экспрессии генов и клеточной физиологии с целью ослабления острого и хронического воздействия отсутствия кислорода. Индуцируемый при гипоксии фактор (HIF) представляет собой транскрипционный фактор, состоящий из регулируемой кислородом альфа-субъединицы (HIFα) и конститутивно экспрессируемой бета-субъединицы (HIFβ). HIFα дестабилизируется в среде с нормальным содержанием кислорода из-за гидроксилирования определенных остатков пролина HIF-специфичными пролингидроксилазами (HIF-PHs). Однако когда количество кислорода становится ограничивающим, например, в гипоксической окружающей среде, HIF-PH не может гидроксилировать HIFα, альфа-субъединица не распадается, и активные HIF-комплексы образуются, переносятся на ядро и активируют транскрипцию гена.
В определенных аспектах настоящее изобретение предоставляет способы лечения анемии, вызванной хроническим заболеванием, благодаря гипоксии, которая имитируется фармацевтическим путем. В определенных аспектах способы по настоящему изобретению улучшают выработку EPO способом, который устойчив к ингибирующему воздействию воспалительных цитокинов. Выработка EPO, как правило, индуцируется гипоксией или низким уровнем кислорода, но экспрессия и секреция остаются пониженными в присутствии воспалительных цитокинов, таких как TNF-α, IL-1β и IFN-γ, которые преобладают у пациентов с хроническими заболеваниями (См., например, Means (1995) Stem Cells 13:32-37; Means (1999) Int J Hematol 70:7-12; Roodman et al. (1989) Adv Exp Med Biol 271:185-196; Fuchs et al. (1991) Eur J Hematol 46:65-70; Jelkmann et al. (1991) Ann NY Acad Sci 718:300-311; и Vannucchi et al. (1994) Br J Hematol 87:18-23). Ингибиторы пролилгидроксилазы, по крайней мере отчасти, преодолевают ингибирующее воздействие воспалительных цитокинов на выработку EPO, что доказано способностью клеток Hep3B секретировать EPO вплоть до уровней, превосходящих те, которые наблюдались в присутствии воспалительных цитокинов (См., например, Фиг.1A, 1B, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A и 4B). Такие средства, как хелаторы железа и десферриоксамин, также продемонстрировали определенную эффективность в исследованиях эритропоэтин-устойчивой анемии, например анемии, вызванной хроническим заболеванием (См., например, Salvarani et al.(1996) Rheumatol Int 16:45-48 и Goch et al. (1995) Eur J Hematol 55:73-77).
В других аспектах настоящее изобретение относится к способам улучшения передачи сигналов рецептора EPO в присутствии воспалительных цитокинов. Преобладание воспалительных цитокинов у пациентов с хроническими заболеваниями приводит к уменьшению эффективности передачи сигналов EPO, что очевидно из неспособности многих пациентов реагировать улучшением эритропоэза на введение рекомбинантного EPO. Как полагают, такой результат является следствием уменьшенной чувствительности к биологической активности EPO, а также недостатков в строении костного мозга и/или микросреды (См., например, Clibon et al. (1990) Exp Hematol 18:438-441, а также Macdougall и Cooper (2002) Neprol Dial Transplant 17(11):39-43). В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение предоставляет способы стимулирования совершенного и полного эритропоэза за счет восстановления чувствительности соответствующих клеток к сигнальной трансдукции через рецептор EPO.
Дефицит железа представляет собой один из наиболее обычных дефицитов питания по всему миру и является ведущей причиной анемии в мировом масштабе. С фундаментальной точки зрения баланс железа регулируется скоростью эритропоэза и количеством накопленного железа. Дефицит железа может наблюдаться в сочетании с анемией или без нее, причем он связан с ухудшенным развитием познавательных способностей.
Под дефицитом железа понимают неадекватное снабжение железом (уровни или накопления) или же неадекватную доступность, или использование железа в организме. Это может происходить из-за недостаточности питания, например, вследствие недостатка железа в рационе; из-за недостаточной абсорбции железа вследствие, например, хирургического вмешательства (после гастроэктомии) или заболевания (болезнь Крона); или же из-за истощения поступления железа или увеличенных потерь железа вследствие хронической или острой потери крови от повреждения или травмы, менструации, донорства крови, флеботомии (а также из-за различных процедур или хирургического вмешательства); из-за увеличенной потребности в железе, например, вследствие быстрого роста в детстве или подростковом возрасте, беременности, эритропоэтиновой терапии и т.д.
Кроме этого дефицит железа может представлять собой функциональный дефицит железа, например дефицит железа, отличающийся, тем, что субъект имеет пониженный доступ к запасам железа и пониженную способность их использования. Железо не доступно со скоростью, достаточной для нормального насыщения эритроцитов гемоглобином, что ведет к уменьшенному клеточному содержанию гемоглобина в ретикулоцитах и эритроцитах. Функциональный дефицит железа часто наблюдается у здоровых людей с явно нормальными или даже повышенным запасами железа, но с ухудшенной доступностью железа, что определено, например, измерением низких уровней процентного насыщения трансферрина. Данный тип дефицита железа часто связан с острым или хроническим воспалением.
Дефицит железа любого вида может вести к железодефицитному эритропоэзу или эритропоэзу при ограниченном содержании железа, при которых уменьшается число красных кровяных телец, циркулирующие красные кровяные тельца меньше нормальных (микроцитарные) и содержат недостаточное количество нормального гемоглобина, в результате чего имеют бледный цвет (гипохромные).
У субъектов с дефицитом железа, включая функциональный дефицит железа, может развиваться ухудшенный синтез гемоглобина, пониженный процент насыщения трансферрина, пониженные уровни гемоглобина и гематокрита, ведущие к железодефицитной анемии. Железодефицитная анемия является наиболее обычной разновидностью анемии в мире. Железо представляет собой важнейший компонент гемоглобина; в отсутствие железа костный мозг не способен эффективно вырабатывать гемоглобин. Железодефицитная анемия может наблюдаться у субъектов с истощенным или ухудшенным поступлением железа или же у субъектов, имеющих функциональный дефицит железа, когда присутствуют запасы железа, но они недоступны, например, для выработки гемоглобина.
Метаболизм железа в основном охватывает процессы, с помощью которых клетка, ткань, орган, система органов или весь организм поддерживают гомеостаз железа путем изменения, например увеличения или сокращения специфических процессов метаболизма железа. Метаболизм железа или процессы метаболизма железа охватывают процессы, включающие процессинг, транспорт, поглощение, использование, накопление, мобилизацию, абсорбцию железа и т.д. Конкретные аспекты метаболизма и процессинга железа включают экспрессию транспортеров железа и ферментов, которые облегчают перемещение железа через клеточные мембраны и удерживание или выделение железа клеткой; изменение в экспрессии белков, вовлеченных в транспорт железа в кровь; изменение в экспрессии трансферрина и рецепторов трансферрина; изменение в экспрессии и/или активности белков, вовлеченных в абсорбцию железа; изменение в экспрессии и/или активности транскрипционных или трансляционных регуляторных белков, связанных с железом; а также изменение распределения железа в жидкостях организма или культуральных жидкостях, включая, например, интерстициальные (т.е. внеклеточные), внутриклеточные, кровь, костный мозг и т.п.
В определенных аспектах настоящее изобретение относится к способам улучшения поглощения, транспорта, процессинга и использования железа. Анемия, вызванная хроническим заболеванием, связана с недостатками в использовании железа, которые отрицательно влияют на синтез гема и образование гемоглобина, приводя к пониженному эритропоэзу (См., например, Oldenburg et al. (2001) Aliment Pharmacol Ther 15:429-438). Пониженные уровни железа в сыворотке, мобилизация железа, а также любое связанное с этим увеличение накопления железа у пациентов с хроническими заболеваниями могут относиться к механизмам микробной защиты макрофага в условиях продолжительного воспаления. (См. Fuchs et al. (1991) Eur J Hematol 46:65-70). В некоторых аспектах настоящее изобретение предоставляет способы увеличения эффективного метаболизма железа путем стабилизации HIFα.
Многие белки опосредуют метаболизм железа, включая такие белки, как синтаза 5-аминолевулиновой кислоты эритроида (ALAS) (первая и скорость-определяющая стадия в синтезе гема) (Bottomley и Muller-Eberhard (1988) Semin Hematol 25:282-302, а также Yin et al. (1998) Blood, Cells, Molecules, and Diseases 24(3):41-533), трансферрин, рецептор трансферрина, транспортеры железа (вовлеченные в транспорт железа), церулоплазмин и т.д. Увеличение экспрессии трансферрина и рецептора трансферрина стимулирует поглощение железа эритроидными предшественниками, а также содействует поглощению железа макрофагами и транспорту к костному мозгу (Goswami et al. (2002) Biochem Cell Biol 80:679-689). Церулоплазмин увеличивает окисление двухвалентного железа в трехвалентное, вследствие чего осуществляется связывание с трансферрином. (Goswami et al. (2002) Biochem Cell Biol 80:679-689). В определенных аспектах способы по настоящему изобретению увеличивают метаболизм железа путем увеличения экспрессии или активности белков, вовлеченных в метаболизм железа, включая 5-аминолевулинатсинтазу эритроида, трансферрин, рецептор трансферрина, NRAMP2, спроутин (дуоденальную цитохром b редуктазу 1) и церулоплазмин. В других аспектах способы по настоящему изобретению увеличивают метаболизм железа за счет уменьшения экспрессии или активности гепсидина или за счет корректировки экспрессии ферритина.
В одном из вариантов осуществления изобретение относится к способам и соединениям, предназначенным для увеличения экспрессии генов, продукты которых вовлечены в метаболизм и процессинг железа, включая поглощение, накопление, транспорт, абсорбцию железа и т.д. Такие гены включают, не ограничиваясь перечисленным, гены рецептора трансферрина, церулоплазмина, NRAMP-2, 5-аминолевулинатсинтазы, спроутина (CYBRD1) и т.д. Терапевтическая регуляция, направленная на повышение экспрессии генов, включенных в метаболизм и процессинг железа, эффективно увеличивает доступность железа и за счет этого осуществляет благотворное воздействие на пациентов с анемией, вызванной хроническими заболеваниями, анемией, связанной с дефицитом железа, функциональным дефицитом железа и т.д. В другом варианте осуществления изобретение предоставляет способы и соединения, предназначенные для снижения экспрессии гепсидина, т.е. белка, связанного с регуляцией железа.
Надлежащий метаболизм железа частично регулируется железорегуляторными белками (IRPs), которые связываются с элементами, чувствительными к железу (IREs), обнаруженными в 5' и/или 3' UTRs (нетранслируемых областей) мРНК, которые кодируют, например, ферритин (накопление железа), митохондриальную аконитазу (энергетический обмен), эритроид-аминолевулинатсинтазу и рецептор трансферрина. Связывание IRP с 5'IRE, которое имеет место, например, в транскрипте ферритина, ингибирует трансляцию мРНК, в то время как связывание с 3'IRE, которое имеет место, например, в транскрипте трансферрина, защищает мРНК от разрушения. IRP-2 конститутивно вырабатывается в клетках, но в условиях избытка железа распадается, и, следовательно инактивируется. Тем не менее IRP-2 сохраняет стабильность в условиях недостатка железа и/или в условиях гипоксии. (Hanson et al.(1999) J Biol Chem 274:5047-5052). Поскольку IRP-2 уменьшает экспрессию ферритина, который отвечает за долговременное накопление железа, и увеличивает экспрессию трансферрина и рецептора трансферрина, то IRP-2 облегчает поглощение, транспорт и использование железа, улучшая, таким образом, эритропоэз (Klausner et al. (1993) Cell 72:19-28). В последнее время были описаны IREs в других генах, которые также необходимы для эритропоэза, включая 5-аминолевулинатсинтазу, транспортер железа NRAMP2 (помимо этого известный как Slc11a2, DCT1, DMT1, mk (локус гена микроцитарной анемии у мышей)), а также транспортер железа, который опосредует абсорбцию железа из пищевых источников в двенадцатиперстной кишке (Haile (1999) Am J Med Sci 318:230-240 и GunShin et al. (2001) FEBS Lett 509:309-316).
Способы по настоящему изобретению с помощью имитации условий гипоксии потенциально стабилизируют IRP-2 в дополнение к HIFα, обеспечивая, таким образом, синергический эффект, охватывающий как эндогенную выработку EPO, так и улучшение поглощения, транспорта и использования железа при выработке функциональных эритроцитов.
Среди взрослого населения поглощение железа, поступающего с пищей, составляет в среднем приблизительно 6% для мужчин и 13% для небеременных женщин. NRAMP2 (также известный как DMT1, DCT1, Slc11a2) представляет собой повсеместно экспрессируемый транспортер двухвалентных металлов, вовлеченный в трансмембранный транспорт железа, которое не связано с трансферрином. NRAMP2 представляет собой транспортирующий железо белок, связанный с транспортом железа из желудочно-кишечной полости в энтероциты двенадцатиперстной кишки и из эндосом эритробластов в цитоплазму. У животных, перенесших пищевое железодефицитное голодание, резко возросла экспрессия NRAMP2 (Slc11a2) в верхушечной части энтероцитов ворсиночного всасывающего эпителия проксимальной части двенадцатиперстной кишки (См., например, Cannone-Hergaux et al. (1999) Blood 93:4406-4417). Генетические модели грызунов связывали эти гены с различными видами анемии, которые вызваны дефицитом железа, включая гипохромную и микроцитарную анемию мышей (мышей mk), у которых имелся мутированный ген NRAMP2. Мыши MK демонстрировали серьезные нарушения в абсорбции железа и использовании эритроидного железа.
В определенных аспектах способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения абсорбции железа из пищевых источников. Настоящее изобретение относится к способам и соединениям, предназначенным для увеличения экспрессии генов, связанных с транспортом и абсорбцией железа. В частности, соединения по настоящему изобретению являются эффективными при увеличении экспрессии NRAMP2 в кишечнике. Увеличенная экспрессия NRAMP2 (Slc11a2) была бы желательна для увеличения абсорбции железа, например пищевого железа, из кишечника.
Настоящее изобретение дополнительно предоставляет данные, которые показывают увеличение экспрессии гена спроутина в кишечнике животных, подвергшихся воздействию соединения по настоящему изобретению. Спроутин, т.е. кишечная редуктаза железа, известная также как Dcytb и Cybrd1 (CYBRD1, дуоденальная цитохром b редуктаза 1), представляет собой редуктазу трехвалентного железа, причем она катализирует восстановление внеклеточных ионов трехвалентного железа в ионы двухвалентного железа, которые связаны с абсорбцией железа. Спроутин экспрессируется совместно с NRAMP2 у животных, испытывающих острый недостаток железа, в верхней области ворсинок двенадцатиперстной кишки (См., например, McKie et al. (2001) Science 291:1755-1759).
Способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения экспрессии гена церулоплазмина. Церулоплазмин, известный также как ферроксидаза-1, превращает восстановленное железо, выделенное из мест накопления (таких как ферритин), в окисленную форму. Окисленное железо способно связываться с его транспортным белком плазмы, т.е. трансферрином. Недостаток церулоплазмина связан с аккумулированием железа в печени и других тканях. Существуют данные, показывающие, что церулоплазмин содействует оттоку железа из печени и притоку железа в железодефицитные клетки (См., например, Tran et al. (2002) J Nutr 132:351-356).
Соединения по настоящему изобретению уменьшают экспрессию мРНК гепсидина в печени мышей. Воспаление приводит к выработке IL-1β, который действует на гепатоциты, чтобы вызвать выделение гепсидина. Гепсидин ингибирует выделение железа макрофагами и абсорбцию железа в кишечнике, уменьшая доступность железа и вызывая, например, гипоферремию (понижение содержания железа в крови). Уменьшенная экспрессия гепсидина связана с увеличенным выделением железа из ретикулоэндотелиальных клеток и увеличенной абсорбцией железа в кишечнике. Следовательно, способы и соединения по настоящему изобретению пригодны для уменьшения экспрессии гепсидина, увеличения абсорбции железа в кишечнике и снижения гипоферремии.
Особо рассмотрены способы лечения анемии, связанной с инфекцией вируса гепатита C (HCV). Имеющиеся в настоящее время способы лечения HCV-инфекций включают сочетание интерферона-α и рибавирона. Эта комбинированная терапия связана с уменьшением концентрации гемоглобина и анемией. В одном из аспектов способы и соединения по настоящему изобретению разработаны для лечения анемии, связанной с HCV-инфекций. В другом аспекте предоставлены способы и соединения, предназначенные для лечения анемии, связанной с интерферон-α терапией при HCV-инфекции. В другом аспекте настоящее изобретение относится к соединениям и способам, пригодным для лечения анемии, связанной с рибавириновой терапией при HCV-инфекции.
Помимо этого рассмотрены способы увеличения выработки факторов, требуемых для дифференцировки эритроцитов, от гематопоэтических клеток-предшественников, включая, например, гематопоэтические стволовые клетки (HSCs), клетки CFU-GEMM (колониеобразующие гранулоцит/эритроид/моноцит/мегакариоцит), и т.д. Факторы, которые стимулируют эритропоэз, включают, не ограничиваясь им, эритропоэтин. В другом аспекте способы увеличивают выработку факторов, необходимых для поглощения, транспорта и использования железа. Такие факторы включают, не ограничиваясь перечисленным, эритроид аминолевулинатсинтазу, трансферрин, рецептор трансферрина, церулоплазмин, ферритин и т.д. В еще одном аспекте способ увеличивает выработку факторов, необходимых для дифференцировки эритроцитов и, кроме этого, факторов, необходимых для поглощения, транспорта и использования железа.
Также рассмотрены способы улучшения реактивности гематопоэтических предшественников эритропоэтина. Как было указано выше, эти предшественники включают HSCs, CFU-GEMMs и т.д. Реактивность клеток-предшественников может быть увеличена за счет, например, изменения экспрессии рецепторов эритропоэтина, внутриклеточных факторов, вовлеченных в передачу сигналов эритропоэтина и секретируемых факторов, которые облегчают взаимодействие эритропоэтина с рецепторами. Настоящее изобретение относится к способам улучшения реактивности EPO костного мозга, например, за счет увеличения экспрессии рецептора EPO.
Способы
В настоящем изобретении разработаны различные способы. В одном из аспектов способы включают введение субъекту средства, которое стабилизирует HIFα.
Стабилизация HIFα может осуществляться любым из спосоов, доступных и известных специалисту в данной области техники, и может включать применение любого средства, которое взаимодействует с HIFα, связывается с HIFα или изменяет HIFα, или факторов, которые взаимодействуют с HIFα, включая, например, ферменты, для которых HIFα является субстратом. В определенных аспектах настоящее изобретение рассматривает применение конститутивно стабильного варианта HIFα, например стабильных мутеинов HIF и т.д., или полинуклеотида, кодирующего такой вариант (см., например, Патенты США № 6 562 799 и 6 124 131 и патент США №6 432 927). В других аспектах настоящее изобретение предполагает, что стабилизация HIFα включает введение средства, которое стабилизирует HIFα. Это средство может состоять из полинуклеотидов, например антисмысловых последовательностей (см., например, международную публикацию № WO 03/045440); полипептидов; антител; других белков; углеводов; жиров; липидов; а также органических и неорганических веществ, например небольших молекул, и т.д. В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение предполагает стабилизацию HIFα, например, у субъекта введением субъекту средства, которое стабилизирует HIFα, причем средство представляет собой соединение, например соединение с небольшой молекулой и т.д., которое стабилизирует HIFα.
В других вариантах осуществления способы по настоящему изобретению включают стабилизацию HIFα за счет ингибирования активности, по меньшей мере, одного из ферментов, выбранного из семейства 2-оксоглутаратдиоксигеназ. В предпочтительном воплощении фермент представляет собой фермент из числа HIF-гидроксилаз, например EGLN-1, EGLN-2, EGLN-3 и т.д. (См., например, Taylor (2001) Gene 275:125-132; Epstein et al. (2001) Cell 107:43-54; а также Bruick и McKnight (2001) Science 294:1337-1340). Однако конкретно предполагается, что фермент является любым ферментом, выбранным из семейства ферментов 2-оксоглутаратдиоксигеназы, включая, например, проколлагенлизилгидроксилазу, проколлагенпролил 3-гидроксилазу, проколлагенпролил 4-гидроксилазу α(I) и α(II), тимин 7-гидроксилазу, аспартил(аспарагинил) β-гидроксилазу, ε-N-триметиллизин гидроксилазу и γ-бутиробетаингидроксилазу и т.д. (См., например, Majamaa et al (1985) Biochem J 229:127-133; Mullyharju и Kivirikko (1997) EMBO J 16:1173-1180; Thornburg et al. (1993) 32:14023-14033; а также Jia et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:7227-7231).
564
402
803
В определенных вариантах осуществления способы включают лечение анемии, вызванной хроническим заболеванием, или регулирование метаболизма железа введением субъекту эффективного количества средства, которое стабилизирует HIFα. В предпочтительных вариантах осуществления средство представляет собой соединение по настоящему изобретению. В одном из аспектов соединение стабилизирует HIFα за счет ингибирования гидроксилирования определенных остатков HIFα, например остатков пролина, остатков аспарагина, и т.д. В предпочтительном варианте осуществления остатки представляют собой остатки пролина. В конкретных вариантах осуществления остатки могут представлять собой: остаток P в HIF-1α или гомологичный пролин в другой изоформе HIFα, или остаток P в HIF-1α или гомологичный пролин в другой изоформе HIFα и т.д. В других вариантах осуществления представленные способы могут охватывать ингибирование гидроксилирования аспарагиновых остатков HIFα, например остатка N в HIF-1α или гомологичного аспарагинового остатка в другой изоформе HIFα.
Соединения
В предпочтительных вариантах осуществления представленные способы включают введение субъекту эффективного количества соединения, которое стабилизирует HIFα. Типовые соединения раскрыты, например, в Международной публикации № WO 03/049686 и Международной публикации № WO 03/053997, которые во всей полноте включены в настоящую заявку. Конкретно, соединения по настоящему изобретению, включают следующие соединения.
В определенных вариантах осуществления соединение по настоящему изобретению является соединением, которое ингибирует активность HIF-гидроксилаз. В различных вариантах осуществления эта активность возникает благодаря HIF-пролилгидроксилазам, таким как, например, EGLN1, EGLN2 или EGLN3 и т.д. В других вариантах осуществления активность возникает благодаря HIF-аспарагинилгидроксилазе, например, такой как FIH, не ограничиваясь лишь данным примером. Предпочтительное соединение по настоящему изобретению представляет собой соединение, которое ингибирует активность HIF-пролилгидроксилазы. Ингибирование может быть прямым или опосредованным, конкурентным или неконкурентным и т.д.
В одном из аспектов соединение по настоящему изобретению представляет собой любое соединение, которое ингибирует или другим образом корректирует активность ферментов семейства 2-оксоглутаратдиоксигеназы. Ферменты семейства 2-оксоглутаратдиоксигеназы включают, не ограничиваясь указанным примером, ферменты семейства гидроксилаз. Ферменты семейства гидроксилаз гидроксилируют остатки, входящие в состав целевого субстрата, и в их число входят, например, пролил-, лизил-, аспарагинил- (аспарагил, аспартил) гидроксилазы и т.д. Гидроксилазы часто характеризуют по целевому субстрату, например HIF-гидроксилазы, проколлагенгидроксилазы и т.д., и/или по целевому остатку в субстрате, например пролилгидроксилазы, лизилгидроксилазы и т.д., или же по обоим указанным признакам, например HIF-пролилгидроксилазы, проколлагенпролилгидроксилазы и т.д. Представители семейства ферментов 2-оксоглутаратдиоксигеназы включают, не ограничиваясь перечисленным, HIF-гидроксилазы, включая HIF-пролилгидроксилазы, например EGLN1, EGLN2 и EGLN3, HIF-аспарагинилгидроксилазы, например фактор, ингибирующий HIF(FIH) и т.д.; проколлагенгидроксилазы, например проколлагенлизилгидроксилазы, проколлаген пролилгидроксилазы, например проколлаген пролил 3-гидроксилазу, проколлагенпролил 4-гидроксилазу α(I) и α(II) и т.д.; тимин 7-гидроксилазу; аспартил(аспарагинил) β-гидроксилазу; ε-N-триметиллизингидроксилазу; γ-бутиробетаингидроксилазу и т.д. Хотя ферментативная активность может включать любую активность, связанную с любой 2-оксоглутаратдиоксигеназой, конкретно рассматривается гидроксилирование аминокислотных остатков в субстрате. Хотя конкретно включено гидроксилирование остатков пролина и/или аспарагина в субстрате, кроме этого предполагается гидроксилирование других аминокислот.
В одном из аспектов соединение по настоящему изобретению, которое проявляет ингибиторную активность в отношении одного или нескольких ферментов из семейства 2-оксоглутарат диоксигеназ, может также демонстрировать ингибиторную активность в отношении еще одного или нескольких ферментов из того же семейства, например соединение, которое ингибирует активность HIF-гидроксилазы, может дополнительно ингибировать активность коллагенпролилгидроксилазы, а соединение, которое ингибирует активность HIF-пролилгидроксилазы, может дополнительно ингибировать активность HIF-аспарагинилгидроксилазы и т.д.
2+
2+
Поскольку HIFα модифицируется за счет гидроксилирования пролина, т.е. реакции, требующей наличия кислорода и Fe, настоящее изобретение в одном из аспектов предполагает, что фермент, ответственный за гидроксилирование HIFα, входит в семейство 2-оксоглутаратдиоксигеназы. Такие ферменты включают, не ограничиваясь перечисленным, проколлагенлизилгидроксилазу, проколлагенпролил 3-гидроксилазу, проколлагенпролил 4-гидроксилазу α(I) и α(II), тимин 7-гидроксилазу, аспартил(аспарагинил) β-гидроксилазу, ε-N-триметиллизингидроксилазу и γ-бутиробетаингидроксилазу и т.д. Для проявления гидроксилазной активности перечисленных ферментов им требуется кислород, Fe, 2-оксоглутарат и аскорбиновая кислота. (См., например Majamaa et al (1985) Biochem J 229:127-133; Mullyharju и Kivirikko (1997) EMBO J 16:1173-1180; Thornburg et al. (1993) 32:14023-14033; а также Jia et al.(1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:7227-7231).
В одном из аспектов соединение по настоящему изобретению представляет собой соединение, которое стабилизирует HIFα. Предпочтительно соединение стабилизирует HIFα за счет ингибирования активности HIF-гидроксилазы. Конкретно предполагается, что соединение по настоящему изобретению выбрано из ранее идентифицированных регуляторов активности гидроксилазы. Например, были идентифицированы низкомолекулярные ингибиторы пролил 4-гидроксилазы. (См., например, Majamaa et al. (1984) Eur J Biochem 138:239-245; Majamaa et al. (1985) Biochem J 229:127-133; Kivirikko and Myllyharju (1998) Matrix Biol 16:357-368; Bickel et al. (1998) Hepatology 28:404-411; Friedman et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:4736-4741; and Franklin et al. (2001) Biochem J 353:333-338; все источники включены в настоящую заявку во всей полноте с помощью ссылки). Настоящее изобретение предполагает применение указанных соединений в разработанных здесь способах.
В отдельных аспектах соединения по настоящему изобретению включают, например, соединения, имитирующие структуру 2-оксоглутарата. Такие соединения могут конкурентно ингибировать мишень ферментов, входящих в семейство 2-оксоглутаратдиоксигеназы, по отношению к 2-оксоглутарату, и не конкурентно по отношению к железу (Majamaa et al (1984) Eur J Biochem 138:239-245; и Majamaa et al. Biochem J 229:127-133).
В определенных вариантах осуществления соединения, применяемые в способах по настоящему изобретению, выбраны из соединений формулы (I)
1
4
1
6
1
6
1
6
2
x
f
2f+1-g)
g
1
6
1
8
1
8
2
2
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
4
1
4
1
6
3
8
1
4
1
4
6
12
7
11
6
12
7
11
1
6
1
6
2
x
f
2f+1-g)
g
2
2
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
4
1
4
1
6
3
8
1
4
1
4
1
6
3
7
5
6
5
6
где A представляет собой 1,2-арилиден, 1,3-арилиден, 1,4-арилиден; или (C-C)-алкилен, необязательно замещенный одним или двумя галогенами, циано, нитро, трифторметилом, (C-C)-алкилом, (C-C)-гидроксиалкилом, (C-C)-алкокси, -O-[CH]-CH(Hal, (C-C)-фторалкокси, (C-C)-фторалкенилокси, (C-C)-фторалкинилокси, OCFCl, -O-CF-CHFCl; (C-C)-алкилмеркапто, (C-C)-алкилсульфинил, (C-C)-алкилсульфонил, (C-C)-алкилкарбонил, (C-C)-алкоксикарбонил, карбамоил, N-(C-C)-алкилкарбамоил, N,N-ди-(C-C)-алкилкарбамоил, (C-C)-алкилкарбонилокси, (C-C)-циклоалкил, фенил, бензил, фенокси, бензилокси, анилино, N-метиланилино, фенилмеркапто, фенилсульфонил, фенилсульфинил, сульфамоил, N-(C-C)-алкилсульфамоил, N,N-ди-(C-C)-алкилсульфамоил; или замещенными группами (C-C)-арилокси, (C-C)-аралкилокси, (C-C)-арилом, (C-C)-аралкилом, которые несут на арильном фрагменте от одного до пяти одинаковых или различных заместителей, выбранных из галогена, циано, нитро, трифторметила, (C-C)-алкила, (C-C)-алкокси, -O-[CH]-CH(Hal, OCFCl, -O-CF-CHFCl; (C-C)-алкилмеркапто, (C-C)-алкилсульфинил, (C-C)-алкилсульфонил, (C-C)-алкилкарбонил, (C-C)-алкоксикарбонил, карбамоил, N-(C-C)-алкилкарбамоил, N,N-ди-(C-C)-алкилкарбамоил, (C-C)-алкилкарбонилокси, (C-C)-циклоалкил, сульфамоил, N-(C-C)-алкилсульфамоил, N,N-ди-(C-C)-алкилсульфамоил; или где A представляет собой -CRR и каждый из R и R независимо выбран из водорода, (C-C)-алкила, (C-C)-циклоалкила, арила или заместителя у α-углеродного атома α-аминокислоты, где аминокислота представляет собой природную L-аминокислоту или ее D-изомер.
2
2
2
3
2
3
7
1
4
6
12
1
4
1
4
1
4
1
4
1
4
3
2
2
5
2
1
4
1
4
1
4
2
1
20
3
8
2
20
3
8
2
20
4
20
6
16
7
16
1
12
3
8
5
8
6
12
7
16
2
12
2
12
1
12
1
12
1
12
1
12
1
12
6
12
7
16
1
8
2
x
f
2f+1-g)
g
2
2
1
12
3
8
6
12
7
16
2
12
2
12
1
12
1
12
1
12
6
12
7
16
3
8
2
12
2
12
1
12
1
12
1
12
6
12
7
16
3
8
2
12
2
12
1
12
1
12
3
8
6
16
7
16
1
10
6
16
1
10
7
16
1
10
1
10
6
12
1
10
7
16
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
6
16
1
10
1
10
7
16
1
10
1
12
1
12
3
8
6
12
7
16
1
10
6
12
1
10
7
16
1
10
6
12
1
10
7
16
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
6
12
1
10
1
10
7
16
1
10
1
12
1
12
3
8
2
12
2
12
6
12
7
11
1
12
1
12
1
10
1
12
3
8
6
12
7
16
1
12
1
10
3
8
1
10
6
12
1
10
7
11
1
10
1
12
1
8
3
8
1
8
6
12
1
8
7
12
1
8
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
3
8
1
10
1
12
1
12
1
12
6
16
6
16
6
12
7
16
7
16
7
16
1
10
1
10
3
8
6
12
7
16
1
10
6
12
1
10
7
16
1
10
1
10
1
10
7
16
1
10
7
16
1
12
3
8
6
12
7
16
1
12
1
12
1
12
1
12
1
12
6
12
7
16
1
8
1
12
3
8
6
12
7
16
1
12
1
12
1
12
6
12
7
16
3
8
2
12
2
12
1
12
3
8
6
12
7
16
2
12
2
12
1
12
1
12
1
12
6
12
7
16
3
8
2
12
2
12
1
12
1
12
3
8
6
12
7
16
1
10
6
12
1
10
7
16
1
10
1
10
6
12
1
10
7
16
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
6
12
1
10
1
10
7
16
1
10
1
12
1
12
3
8
6
12
7
16
1
10
6
12
1
10
7
16
1
10
6
12
1
10
7
16
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
6
12
1
10
1
10
7
16
1
10
1
12
1
12
3
8
3
12
3
12
6
12
7
11
1
12
1
12
1
10
1
12
3
8
6
12
7
16
1
12
1
10
3
8
1
10
6
12
1
10
7
11
1
10
1
12
1
8
3
8
1
8
6
12
1
8
7
16
1
8
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
3
8
1
10
1
12
1
12
1
12
6
12
6
12
6
12
7
16
7
16
7
16
B представляет собой -COH, -NH, -NHSOCF, тетразолил, имидазолил, 3-гидроксиизоксазолил, -CONHCOR”', -CONHSOR”', CONHSOR”', где R”' представляет собой арил, гетероарил, (C-C)-циклоалкил или (C-C)-алкил, необязательно монозамещенный (C-C)-арилом, гетероарилом, OH, SH, (C-C)-алкилом, (C-C)-алкокси, (C-C)-тиоалкилом, (C-C)-сульфинилом, (C-C)-сульфонилом, CF, Cl, Br, F, I, NO, -COOH, (C-C)-алкоксикарбонилом, NH, моно-(C-C-алкил)-амино, ди-(C-C-алкил)-амино или (C-C)-перфторалкилом; или где B представляет собой карбоксильный остаток CO-G, где G представляет собой остаток спирта G-OH, в котором G выбран из алкильного остатка (C-C), циклоалкильного остатка (C-C), алкенильного остатка (C-C), циклоалкенильного остатка (C-C), ретинильного остатка, алкинильного остатка (C-C), алкенинильного остатка (C-C), где алкенильный, циклоалкенильный, алкинильный и алкенинильный остатки содержат одну или несколько кратных связей; карбоциклического арильного остатка (C-C), карбоциклического аралкильного остатка (C-C), гетероарильного остатка или гетероаралкильного остатка, причем гетероарильный остаток или гетероарильный фрагмент гетероаралкильного остатка содержит 5 или 6 кольцевых атомов; и где остатки, обозначенные буквой G, замещены одним или несколькими группами из числа следующих: гидроксил, галоген, циано, трифторметил, нитро, карбоксил, (C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкил, (C-C)-циклоалкенил, (C-C)-арил, (C-C)-аралкил, (C-C)-алкенил, (C-C)-алкинил, (C-C)-алкокси, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкокси, (C-C)-арилокси, (C-C)-аралкилокси, (C-C)-гидроксиалкил, -O-[CH]-CH(F, OCFCl, -O-CF-CHFCl, (C-C)-алкилкарбонил, (C-C)-циклоалкилкарбонил, (C-C)-арилкарбонил, (C-C)-аралкилкарбонил, циннамоил, (C-C)-алкенилкарбонил, (C-C)-алкинилкарбонил, (C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-арилоксикарбонил, (C-C)-аралкоксикарбонил, (C-C)-циклоалкоксикарбонил, (C-C)-алкенилоксикарбонил, (C-C)-алкинилоксикарбонил, ацилокси, (C-C)-алкоксикарбонилокси, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкоксикарбонилокси, (C-C)-арилоксикарбонилокси, (C-C)-аралкилоксикарбонилокси, (C-C)-циклоалкоксикарбонилокси, (C-C)-алкенилоксикарбонилокси, (C-C)-алкинилоксикарбонилокси, карбамоил, N-(C-C)-алкилкарбамоил, N,N-ди-(C-C)-алкилкарбамоил, N-(C-C)-циклоалкилкарбамоил, N-(C-C)-арилкарбамоил, N-(C-C)-аралкилкарбамоил, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-арилкарбамоил, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-аралкилкарбамоил, N-((C-C)-алкокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-алкокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, карбамоилокси, N-(C-C)-алкилкарбамоилокси, N,N-ди-(C-C)-алкилкарбамоилокси, N-(C-C)-циклоалкилкарбамоилокси, N-(C-C)-арилкарбамоилокси, N-(C-C)-аралкилкарбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-арилкарбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-аралкилкарбамоилокси, N-((C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-алкокси-(C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)-карбамоилокси, амино, (C-C)-алкиламино, ди-(C-C)-алкиламино, (C-C)-циклоалкиламино, (C-C)-алкениламино, (C-C)-алкиниламино, N-(C-C)-ариламино, N-(C-C)-аралкиламино, N-алкиларалкиламино, N-алкилариламино, (C-C)-алкоксиамино, (C-C)-алкокси-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-алкилкарбониламино, (C-C)-циклоалкилкарбониламино, (C-C)-арилкарбониламино, (C-C)-аралкилкарбониламино, (C-C)-алкилкарбонил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-циклоалкилкарбонил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-арилкарбонил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-аралкилкарбонил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-алкилкарбониламино-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкилкарбониламино-(C-C)-алкил, (C-C)-арилкарбониламино-(C-C)-алкил, (C-C)-аралкилкарбониламино-(C-C)-алкил, амино-(C-C)-алкил, N-(C-C)-алкиламино-(C-C)-алкил, N,N-ди-(C-C)-алкиламино-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкиламино-(C-C)-алкил, (C-C)-алкилмеркапто, (C-C)-алкилсульфинил, (C-C)-алкилсульфонил, (C-C)-арилмеркапто, (C-C)-арилсульфинил, (C-C)-арилсульфонил, (C-C)-аралкилмеркапто, (C-C)-аралкилсульфинил, (C-C)-аралкилсульфонил, сульфамоил, N-(C-C)-алкилсульфамоил, N,N-ди-(C-C)-алкилсульфамоил, (C-C)-циклоалкилсульфамоил, N-(C-C)-арилсульфамоил, N-(C-C)-аралкилсульфамоил, N-(C-C)-алкил- N-(C-C)-арилсульфамоил, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-аралкилсульфамоил, (C-C)-алкилсульфонамидо, N-((C-C)-алкил)-(C-C)-алкилсульфонамидо, (C-C)-аралкилсульфонамидо или N-((C-C)-алкил)-(C-C)-аралкилсульфонамидо; где органические остатки, которые являются арилами или содержат арильный фрагмент, могут быть замещены по арильному фрагменту одинаковыми или различными заместителями, в количестве от одного до пяти из числа следующих: гидроксил, галоген, циано, трифторметил, нитро, карбоксил, (C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкил, (C-C)-арил, (C-C)-аралкил, (C-C)-алкокси, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкокси, (C-C)-арилокси, (C-C)-аралкилокси, (C-C)-гидроксиалкил, (C-C)-алкилкарбонил, (C-C)-циклоалкилкарбонил, (C-C)-арилкарбонил, (C-C)-аралкилкарбонил, (C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-арилоксикарбонил, (C-C)-аралкоксикарбонил, (C-C)-циклоалкоксикарбонил, (C-C)-алкенилоксикарбонил, (C-C)-алкинилоксикарбонил, (C-C)-алкилкарбонилокси, (C-C)-циклоалкилкарбонилокси, (C-C)-арилкарбонилокси, (C-C)-аралкилкарбонилокси, циннамоилокси, (C-C)-алкенилкарбонилокси, (C-C)-алкинилкарбонилокси, (C-C)-алкоксикарбонилокси, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкоксикарбонилокси, (C-C)-арилоксикарбонилокси, (C-C)-аралкилоксикарбонилокси, (C-C)-циклоалкоксикарбонилокси, (C-C)-алкенилоксикарбонилокси, (C-C)-алкинилоксикарбонилокси, карбамоил, N-(C-C)-алкилкарбамоил, N,N-ди-(C-C)-алкилкарбамоил, N-(C-C)-циклоалкилкарбамоил, N-(C-C)-арилкарбамоил, N-(C-C)-аралкилкарбамоил, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-арилкарбамоил, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-аралкилкарбамоил, N-((C-C)-алкокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-алкокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, карбамоилокси, N-(C-C)-алкилкарбамоилокси, N,N-ди-(C-C)-алкилкарбамоилокси, N-(C-C)-циклоалкилкарбамоилокси, N-(C-C)-арилкарбамоилокси, N-(C-C)-аралкилкарбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-арилкарбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-аралкилкарбамоилокси, N-((C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-алкокси-(C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)-карбамоилокси, амино, (C-C)-алкиламино, ди-(C-C)-алкиламино, (C-C)-циклоалкиламино, (C-C)-алкениламино, (C-C)-алкиниламино, N-(C-C)-ариламино, N-(C-C)-аралкиламино, N-алкиларалкиламино, N-алкилариламино, (C-C)-алкоксиамино, (C-C)-алкокси-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-алкилкарбониламино, (C-C)-циклоалкилкарбониламино, (C-C)-арилкарбониламино, (C-C)-аралкилкарбониламино, (C-C)-алкилкарбонил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-циклоалкилкарбонил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-арилкарбонил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-аралкилкарбонил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-алкилкарбониламино-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкилкарбониламино-(C-C)-алкил, (C-C)-арилкарбониламино-(C-C)-алкил, (C-C)-аралкилкарбониламино-(C-C)-алкил, амино-(C-C)-алкил, N-(C-C)-алкиламино-(C-C)-алкил, N,N-ди-(C-C)-алкиламино-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкиламино-(C-C)-алкил, (C-C)-алкилмеркапто, (C-C)-алкилсульфинил, (C-C)-алкилсульфонил, (C-C)-арилмеркапто, (C-C)-арилсульфинил, (C-C)-арилсульфонил, (C-C)-аралкилмеркапто, (C-C)-аралкилсульфинил или (C-C)-аралкилсульфонил;
X представляет собой O или S;
Q представляет собой O, S, NR' или связь;
4
причем, если Q представляет собой связь, R представляет собой галоген, нитрил или трифторметил;
4
1
10
2
10
2
10
2
x
f
2f+1-g)
g
1
8
1
6
1
6
1
4
1
4
7
11
или если Q представляет собой O, S или NR', R представляет собой водород, (C-C)-алкильный остаток, (C-C)-алкенильный остаток, (C-C)-алкинильный остаток, причем алкенильный или алкинильный остатки содержат одну или две кратные связи C-C; незамещенный трифторалкильный остаток формулы -O-[CH]-CH(F, остаток (C-C)-алкокси-(C-C)алкил, остаток (C-C)-алкокси-(C-C)-алкокси-(C-C)алкил, арильный остаток, гетероарильный остаток, (C-C)-аралкильный остаток или остаток формулы Z
2
v
w
2
t
-[CH]-[O]-[CH]-E (Z),
в которой:
3
8
E представляет собой гетероарильный остаток, циклоалкильный остаток (C-C)- или фенильный остаток формулы F
v представляет собой 0-6;
w представляет собой 0 или 1;
t представляет собой 0-3 и
7
8
9
10
11
Y
Z
Y
Z
Y
Z
7
8
8
9
9
10
10
11
Y
7
11
7
11
4
1
6
3
8
1
6
2
x
f
2f+1-g)
g
2
2
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
8
1
8
1
8
7
11
1
6
3
8
3
8
1
4
1
6
1
12
1
8
1
8
7
12
1
8
6
12
1
8
3
10
3
12
3
12
6
12
7
11
1
12
7
12
1
12
3
8
6
12
7
16
2
h
2
1
4
1
4
1
8
1
8
2
n
2
2
6
12
7
11
1
8
1
8
1
8
7
12
1
8
6
12
1
8
1
10
7
16
6
12
2
h
2
1
10
R, R, R, R и R представляют собой одинаковые или различающиеся заместители из числа следующих: водород, галоген, циано, нитро, трифторметил, (C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкил, (C-C)-алкокси, -O-[CH]-CH(F, OCF-Cl, -O-CF-CHFCl, (C-C)-алкилмеркапто, (C-C)-гидроксиалкил, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкокси, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-алкилсульфинил, (C-C)-алкилсульфонил, (C-C)-алкилкарбонил, (C-C)-алкоксикарбонил, карбамоил, N-(C-C)-алкилкарбамоил, N,N-ди-(C-C)-алкилкарбамоил или (C-C)-аралкилкарбамоил, необязательно замещенные фтором, хлором, бромом, трифторметилом, (C-C)-алкокси, N-(C-C)-циклоалкилкарбамоилом, N-(C-C)-циклоалкил- (C-C)-алкилкарбамоилом, (C-C)-алкилкарбонилокси, фенилом, бензилом, фенокси, бензилокси, NRR, где R и R независимо выбраны из водорода, (C-C)-алкила, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкила, (C-C)-аралкокси-(C-C)-алкила, (C-C)-арилокси-(C-C)-алкила, (C-C)-циклоалкила, (C-C)-алкенила, (C-C)-алкинила, (C-C)-арила, (C-C)-аралкила, (C-C)-алкокси, (C-C)-аралкокси, (C-C)-алкилкарбонила, (C-C)-циклоалкилкарбонила, (C-C)-арилкарбонила, (C-C)-аралкилкарбонила; или где, дополнительно, R и R совместно представляют собой -[CH], в котором группа CH может быть замещена O, S, N-(C-C)-алкилкарбонилимино или N-(C-C)-алкоксикарбонилимино; фенилмеркапто, фенилсульфонил, фенилсульфинил, сульфамоил, N-(C-C)-алкилсульфамоил или N,N-ди-(C-C)-алкилсульфамоил; или, с другой стороны, R и R, R и R, R и R или R и R совместно представляют собой цепь, выбранную из -[CH]- или -CH=CH-CH=CH-, где группа CH в цепи необязательно замещена O, S, SO, SO или NR; и n представляет собой 3, 4 или 5; и если E является гетероарильным остатком, этот остаток может нести 1-3 заместителей, выбранных из заместителей, перечисленных для R-R, или, если E представляет собой циклоалкильный остаток, то этот остаток может нести один заместитель, выбранный из заместителей, перечисленных для R-R; или где, если Q представляет собой NR', R, напротив, представляет собой R”, где R' или R” являются одинаковыми или различающимися заместителями и представляют собой водород, (C-C)-арил, (C-C)-аралкил, (C-C)-алкил, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-аралкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-арилокси-(C-C)-алкил, (C-C)-алкилкарбонил, необязательно замещенный (C-C)-аралкилкарбонил или необязательно замещенный (C-C)-арилкарбонил; или R' и R” совместно представляют собой -[CH], в котором группа CH может быть замещена O, S, N-ацилимино, или N-(C-C)-алкоксикарбонилимино и h равняется 3-7.
3
Y представляет собой N или CR;
1
2
3
1
20
3
8
3
8
1
12
3
8
3
8
1
12
3
8
1
12
3
8
1
12
3
8
1
8
1
6
3
8
1
8
1
6
3
8
1
8
1
6
3
8
1
8
1
8
6
12
7
16
7
16
7
16
2
20
2
20
1
20
2
20
2
20
1
20
1
12
1
12
1
12
1
12
1
8
1
8
6
12
7
16
6
12
1
6
7
16
1
6
1
16
6
16
1
8
7
16
1
8
6
12
1
8
1
6
7
12
1
8
1
6
2
20
1
6
2
20
1
6
1
6
2
x
f
2f+1-g)
g
2
2
1
20
3
8
6
12
7
16
2
20
2
20
1
20
1
12
1
12
6
12
7
16
3
8
2
20
2
20
6
12
1
6
7
16
1
6
3
8
1
6
3
8
1
6
1
12
3
8
6
12
7
16
2
12
2
12
1
12
1
12
1
12
6
12
7
16
3
8
2
12
2
12
1
12
1
12
3
8
3
8
1
10
3
8
3
8
1
6
1
6
3
8
1
6
1
6
6
12
7
16
1
10
6
16
1
10
7
16
1
18
1
10
6
16
1
10
7
16
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
6
12
1
10
1
10
7
16
1
10
2
h
2
1
8
3
8
3
8
1
4
6
12
7
16
1
4
1
6
R, R и R являются одинаковыми или различающимися заместителями и представляют собой водород, гидроксил, галоген, циано, трифторметил, нитро, карбоксил, (C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкил, (C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкокси, (C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкокси, (C-C)-циклоалкилокси-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкилокси-(C-C)-алкокси, (C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкил-(C-C)-алкокси, (C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкилокси-(C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкокси-(C-C)-алкокси-(C-C)-алкокси, (C-C)-арил, (C-C)-аралкил, (C-C)-аралкенил, (C-C)-аралкинил, (C-C)-алкенил, (C-C)-алкинил, (C-C)-алкокси, (C-C)-алкенилокси, (C-C)-алкинилокси, ретинилокси, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкокси, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-арилокси, (C-C)-аралкилокси, (C-C)-арилокси-(C-C)-алкокси, (C-C)-аралкокси-(C-C)-алкокси, (C-C)-гидроксиалкил, (C-C)-арилокси-(C-C)-алкил, (C-C)-аралкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-арилокси-(C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-алкенилокси-(C-C)-алкил, (C-C)-алкинилокси-(C-C)-алкил, ретинилокси-(C-C)-алкил, -O-[CH]-CH(F, OCFCl, -O-CF-CHFCl, (C-C)-алкилкарбонил, (C-C)-циклоалкилкарбонил, (C-C)-арилкарбонил, (C-C)-аралкилкарбонил, циннамоил, (C-C)-алкенилкарбонил, (C-C)-алкинилкарбонил, (C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-арилоксикарбонил, (C-C)-аралкоксикарбонил, (C-C)-циклоалкоксикарбонил, (C-C)-алкенилоксикарбонил, ретинилоксикарбонил, (C-C)-алкинилоксикарбонил, (C-C)-арилокси-(C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-аралкокси-(C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-циклоалкокси-(C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-алкилкарбонилокси, (C-C)-циклоалкилкарбонилокси, (C-C)-арилкарбонилокси, (C-C)-аралкилкарбонилокси, циннамоилокси, (C-C)-алкенилкарбонилокси, (C-C)-алкинилкарбонилокси, (C-C)-алкоксикарбонилокси, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкоксикарбонилокси, (C-C)-арилоксикарбонилокси, (C-C)-аралкилоксикарбонилокси, (C-C)-циклоалкоксикарбонилокси, (C-C)-алкенилоксикарбонилокси, (C-C)-алкинилоксикарбонилокси, карбамоил, N-(C-C)-алкилкарбамоил, N,N-ди-(C-C)-алкилкарбамоил, N-(C-C)-циклоалкилкарбамоил, N,N-дицикло-(C-C)-алкилкарбамоил, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-циклоалкилкарбамоил, N-((C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-(+)-дегидроабиетилкарбамоил, N-(C-C)-алкил-N-(+)-дегидроабиетилкарбамоил, N-(C-C)-арилкарбамоил, N-(C-C)-аралкилкарбамоил, N-(C-C)-алкил- N-(C-C)-арилкарбамоил, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-аралкилкарбамоил, N-((C-C)-алкокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-алкокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)-карбамоил, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)-карбамоил; CON(CH), в котором группа CH может быть замещена на O, S, N-(C-C)-алкилимино, N-(C-C)-циклоалкилимино, N-(C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкилимино, N-(C-C)-арилимино, N-(C-C)-аралкилимино, N-(C-C)-алкокси-(C-C)-алкилимино и значение h составляет 3-7; карбамоильный остаток формулы R
в которой:
X
Y
1
6
3
7
каждый из R и R независимо выбран из водорода, (C-C)-алкила, (C-C)-циклоалкила, арила или заместителя у α-углерода α-аминокислоты, к которой принадлежат L- и D-аминокислоты,
s представляет собой 1-5,
6
12
7
11
1
8
3
8
1
8
1
8
7
12
1
8
6
12
1
8
1
10
7
16
6
12
2
h
2
2
1
10
1
8
3
8
3
8
1
4
6
12
7
16
1
4
1
6
T представляет собой OH, или NR*R**, и R*, R** и R*** представляют собой одинаковые или различающиеся заместители, причем они выбраны из водорода, (C-C)-арила, (C-C)-аралкила, (C-C)-алкила, (C-C)-циклоалкила, (+)-дегидроабиетила, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкила, (C-C)-аралкокси-(C-C)-алкила, (C-C)-арилокси-(C-C)-алкила, (C-C)-алканоила, необязательно замещенного (C-C)-аралканоила, необязательно замещенного (C-C)-ароила; или R* и R** совместно представляют собой -[CH], в котором группа CH может быть замещена O, S, SO, SO, N-ациламино, N-(C-C)-алкоксикарбонилимино, N-(C-C)-алкилимино, N-(C-C)-циклоалкилимино, N-(C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкилимино, N-(C-C)-арилимино, N-(C-C)-аралкилимино, N-(C-C)-алкокси-(C-C)-алкилимино и значение h составляет от 3 до 7;
1
12
1
12
3
8
6
12
7
16
1
10
6
12
1
10
7
16
1
10
6
12
1
10
7
16
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
6
12
1
10
1
10
7
16
1
10
1
12
1
12
3
8
3
12
3
12
6
12
7
11
1
12
1
12
1
10
1
12
3
8
6
12
7
16
1
12
1
10
3
8
1
10
6
12
1
10
7
11
1
10
1
12
1
8
3
8
1
8
6
12
1
8
7
16
1
8
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
3
8
1
10
1
20
1
20
1
20
6
12
6
12
6
12
7
16
7
16
7
16
1
12
1
6
1
12
1
6
1
12
1
6
6
12
1
6
6
12
1
6
6
12
1
6
7
16
1
6
7
16
1
6
7
16
1
6
1
10
1
10
3
8
6
12
7
16
1
10
6
12
1
10
7
16
1
10
1
10
1
10
7
16
1
10
7
16
2
16
3
8
3
8
1
12
3
8
3
8
1
12
3
8
1
12
3
8
1
12
3
8
1
8
1
6
3
8
1
8
1
6
3
8
1
8
1
6
3
8
1
8
1
8
6
12
7
16
2
16
2
12
1
16
2
16
1
12
1
12
1
12
1
12
1
12
1
8
1
8
6
12
7
16
6
12
1
6
7
16
1
6
1
8
6
16
1
8
7
16
1
8
6
12
1
8
1
6
7
12
1
8
1
6
2
x
f
2f+1-g)
g
2
2
1
12
3
8
6
12
7
16
1
12
1
12
1
12
6
12
7
16
3
8
2
12
2
12
6
12
1
6
7
16
1
6
3
8
1
6
3
8
1
6
1
12
3
8
6
12
7
16
2
12
2
12
1
12
1
12
1
12
6
12
7
16
3
8
2
12
2
12
1
12
1
12
3
8
3
8
1
10
3
8
3
8
1
6
1
6
3
8
1
6
1
6
6
12
7
16
1
10
6
16
1
10
7
16
1
16
1
10
6
16
1
10
7
16
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
6
12
1
10
1
10
7
16
1
10
2
h
2
1
8
3
8
3
8
1
4
6
12
7
16
1
4
1
6
1
12
1
12
3
8
6
16
7
16
1
10
6
12
1
10
7
16
1
10
6
12
1
10
7
16
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
6
12
1
10
1
10
7
16
1
10
1
12
1
12
3
8
3
12
3
12
6
12
7
11
1
12
1
12
1
10
1
12
3
8
6
12
7
16
1
12
1
10
3
8
1
10
6
12
1
10
7
11
1
10
1
12
1
8
3
8
1
8
6
12
1
8
7
16
1
8
1
10
1
10
1
10
1
10
1
10
3
8
1
10
1
12
1
12
1
12
6
16
6
16
6
16
7
16
7
16
7
16
2
o
2
2
6
12
1
8
1
8
1
8
7
12
1
8
6
12
1
8
1
10
7
16
6
12
1
2
2
3
карбамоилокси, N-(C-C)-алкилкарбамоилокси, N,N-ди-(C-C)-алкилкарбамоилокси, N-(C-C)-циклоалкилкарбамоилокси, N-(C-C)-арилкарбамоилокси, N-(C-C)-аралкилкарбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-арилкарбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-аралкилкарбамоилокси, N-((C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-алкокси-(C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)-карбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)-карбамоилоксиамино, (C-C)-алкиламино, ди-(C-C)-алкиламино, (C-C)-циклоалкиламино, (C-C)-алкениламино, (C-C)-алкиниламино, N-(C-C)-ариламино, N-(C-C)-аралкиламино, N-алкиларалкиламино, N-алкилариламино, (C-C)-алкоксиамино, (C-C)-алкокси-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-алканоиламино, (C-C)-циклоалканоиламино, (C-C)-ароиламино, (C-C)-аралканоиламино, (C-C)-алканоил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-циклоалканоил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-ароил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-аралканоил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-алканоиламино-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалканоиламино-(C-C)-алкил, (C-C)-ароиламино-(C-C)-алкил, (C-C)-аралканоиламино-(C-C)-алкил, амино-(C-C)-алкил, N-(C-C)-алкиламино-(C-C)-алкил, N,N-ди-(C-C)-алкиламино-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкиламино-(C-C)-алкил, (C-C)-алкилмеркапто, (C-C)-алкилсульфинил, (C-C)-алкилсульфонил, (C-C)-арилмеркапто, (C-C)-арилсульфинил, (C-C)-арилсульфонил, (C-C)-аралкилмеркапто, (C-C)-аралкилсульфинил, (C-C)-аралкилсульфонил, (C-C)-алкилмеркапто-(C-C)-алкил, (C-C)-алкилсульфинил-(C-C)-алкил, (C-C)-алкилсульфонил-(C-C)-алкил, (C-C)-арилмеркапто-(C-C)-алкил, (C-C)-арилсульфинил-(C-C)-алкил, (C-C)-арилсульфонил-(C-C)-алкил, (C-C)-аралкилмеркапто-(C-C)-алкил, (C-C)-аралкилсульфинил-(C-C)-алкил, (C-C)-аралкилсульфонил-(C-C)-алкил, сульфамоил, N-(C-C)-алкилсульфамоил, N,N-ди-(C-C)-алкилсульфамоил, (C-C)-циклоалкилсульфамоил, N-(C-C)-арилсульфамоил, N-(C-C)-аралкилсульфамоил, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-арилсульфамоил, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-аралкилсульфамоил, (C-C)-алкилсульфонамидо, N-((C-C)-алкил)-(C-C)-алкилсульфонамидо, (C-C)-аралкилсульфонамидо и N-((C-C)-алкил)-(C-C)-аралкилсульфонамидо; где арильный остаток может быть замещен 1-5 заместителями, выбранными из числа следующих: гидроксил, галоген, циано, трифторметил, нитро, карбоксил, (C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкил, (C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкокси, (C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкокси, (C-C)-циклоалкилокси-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкилокси-(C-C)-алкокси, (C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкил-(C-C)-алкокси, (C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкилокси-(C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкокси-(C-C)-алкокси-(C-C)-алкокси, (C-C)-арил, (C-C)-аралкил, (C-C)-алкенил, (C-C)-алкинил, (C-C)-алкокси, (C-C)-алкенилокси, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкокси, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-арилокси, (C-C)-аралкилокси, (C-C)-арилокси-(C-C)-алкокси, (C-C)-аралкокси-(C-C)-алкокси, (C-C)-гидроксиалкил, (C-C)-арилокси-(C-C)-алкил, (C-C)-аралкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-арилокси-(C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, -O-[CH]-CH(F, OCFCl, -O-CF-CHFCl, (C-C)-алкилкарбонил, (C-C)-циклоалкилкарбонил, (C-C)-арилкарбонил, (C-C)-аралкилкарбонил, (C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-арилоксикарбонил, (C-C)-аралкоксикарбонил, (C-C)-циклоалкоксикарбонил, (C-C)-алкенилоксикарбонил, (C-C)-алкинилоксикарбонил, (C-C)-арилокси-(C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-аралкокси-(C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-циклоалкокси-(C-C)-алкоксикарбонил, (C-C)-алкилкарбонилокси, (C-C)-циклоалкилкарбонилокси, (C-C)-арилкарбонилокси, (C-C)-аралкилкарбонилокси, циннамоилокси, (C-C)-алкенилкарбонилокси, (C-C)-алкинилкарбонилокси, (C-C)-алкоксикарбонилокси, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкоксикарбонилокси, (C-C)-арилоксикарбонилокси, (C-C)-аралкилоксикарбонилокси, (C-C)-циклоалкоксикарбонилокси, (C-C)-алкенилоксикарбонилокси, (C-C)-алкинилоксикарбонилокси, карбамоил, N-(C-C)-алкилкарбамоил, N,N-ди-(C-C)-алкилкарбамоил, N-(C-C)-циклоалкилкарбамоил, N,N-дицикло-(C-C)-алкилкарбамоил, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-циклоалкилкарбамоил, N-((C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкил)карбамоил, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкил)карбамоил, N-(+)дегидроабиетилкарбамоил, N-(C-C)-алкил-N-(+)дегидроабиетилкарбамоил, N-(C-C)-арилкарбамоил, N-(C-C)-аралкилкарбамоил, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-арилкарбамоил, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-аралкилкарбамоил, N-((C-C)-алкокси-(C-C)-алкил)карбамоил, N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)карбамоил, N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)карбамоил, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-алкокси-(C-C)-алкил)карбамоил, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)карбамоил, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)карбамоил, CON(CH), в котором группа CH может быть замещена на O, S, N-(C-C)-алкилимино, N-(C-C)-циклоалкилимино, N-(C-C)-циклоалкил-(C-C)-алкилимино, N-(C-C)-арилимино, N-(C-C)-аралкилимино, N-(C-C)-алкокси-N-(C-C)-алкилимино, и значение h составляет от 3 до 7; карбамоилокси, N-(C-C)-алкилкарбамоилокси, N,N-ди-(C-C)-алкилкарбамоилокси, N-(C-C)-циклоалкилкарбамоилокси, N-(C-C)-арилкарбамоилокси, N-(C-C)-аралкилкарбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-арилкарбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-(C-C)-аралкилкарбамоилокси, N-((C-C)-алкил)карбамоилокси, N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)карбамоилокси, N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)карбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-алкокси-(C-C)-алкил)карбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-арилокси-(C-C)-алкил)карбамоилокси, N-(C-C)-алкил-N-((C-C)-аралкилокси-(C-C)-алкил)карбамоилокси, амино, (C-C)-алкиламино, ди-(C-C)-алкиламино, (C-C)-циклоалкиламино, (C-C)-алкениламино, (C-C)-алкиниламино, N-(C-C)-ариламино, N-(C-C)-аралкиламино, N-алкил-аралкиламино, N-алкил-ариламино, (C-C)-алкоксиамино, (C-C)-алкокси-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-алканоиламино, (C-C)-циклоалканоиламино, (C-C)-ароиламино, (C-C)-аралканоиламино, (C-C)-алканоил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-циклоалканоил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-ароил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-аралканоил-N-(C-C)-алкиламино, (C-C)-алканоиламино-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалканоиламино-(C-C)-алкил, (C-C)-ароиламино-(C-C)-алкил, (C-C)-аралканоиламино-(C-C)-алкил, амино-(C-C)-алкил, N-(C-C)-алкиламино-(C-C)-алкил, N,N-ди-(C-C)-алкиламино-(C-C)-алкил, (C-C)-циклоалкиламино-(C-C)-алкил, (C-C)-алкилмеркапто, (C-C)-алкилсульфинил, (C-C)-алкилсульфонил, (C-C)-арилмеркапто, (C-C)-арилсульфинил, (C-C)-арилсульфонил, (C-C)-аралкилмеркапто, (C-C)-аралкилсульфинил или (C-C)-аралкилсульфонил; или где R и R или R и R образуют цепь [CH], которая является насыщенной или ненасыщенной за счет двойной связи C=C, и в которой 1 или 2 группы CH необязательно замещены на O, S, SO, SO или NR', и R' представляет собой водород, (C-C)-арил, (C-C)-алкил, (C-C)-алкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-аралкокси-(C-C)-алкил, (C-C)-арилокси-(C-C)-алкил, (C-C)-алканоил, необязательно замещенный (C-C)-аралканоил или необязательно замещенный (C-C)-ароил; и o представляет собой 3, 4 или 5;
1
2
2
3
или где заместители R и R или R и R совместно с пиридином или пиридазином, к которому они прикреплены, образуют 5,6,7,8-тетрагидроизохинолиновый цикл, 5,6,7,8-тетрагидрохинолиновый цикл, 5,6,7,8-тетрагидроциннолиновый цикл;
1
2
2
3
или где R и R или R и R образуют карбоциклический или гетероциклический 5- или 6-членный ароматический цикл;
1
2
2
3
или где R и R или R и R совместно с пиридином или пиридазином, к которому они прикреплены, образуют необязательно замещенные гетероциклические системы, выбранные из тиенопиридинов, фуранопиридинов, пиридопиридинов, пиримидинопиридинов, имидазопиридинов, тиазолпиридинов, оксазолпиридинов, хинолина, изохинолина и циннолина; причем хинолин, изохинолин или циннолин предпочтительно соответствуют формулам Ia, Ib, Ic:
12
23
1
2
3
и заместители от R до R в каждом из случаев, независимо один от другого, являются теми же заместителями, которые понимаются под R, R и R;
1
2
или где заместители R и R, совместно с пиридином, к которому они присоединены, образуют соединение формулы Id:
k
k
1
6
где V представляет собой S, O или NR, и R выбран из водорода, (C-C)-алкила, арила или бензила; причем арильный остаток может быть необязательно замещен заместителями, определенными выше, в количестве от 1 до 5; и
24
25
26
27
1
2
3
R, R, R, R в каждом из случаев независимо один от другого являются теми же заместителями, которые понимаются под R, R и R;
значение f составляет от 1 до 8;
g представляет собой 0 или от 1 до (2f +1);
значение x составляет от 0 до 3; и
значение h составляет от 3 до 7,
включая физиологически активные соли и пролекарства, являющиеся производными указанных соединений.
Типовые соединения формулы (I) описаны в Европейских патентах № EP0650960 и EP0650961. Все соединения, перечисленные в EP0650960 и EP0650961, в частности, те из них, которые перечислены в списке соединений формулы изобретения, и конечные продукты действующих образцов настоящим включены в данную заявку с помощью ссылки. Типовые соединения формулы (I) включают, не ограничиваясь перечисленным, [(3-гидроксипиридин-2-карбонил)-амино]-уксусную кислоту и [(3-метоксипиридин-2-карбонил)-амино]-уксусную кислоту.
Кроме этого, типовые соединения формулы (I) описаны в патенте США № 5 658 933. Все соединения, перечисленные в патенте США № 5 658 933, в частности те из них, которые перечислены в списке соединений формулы изобретения, и конечные продукты действующих образцов настоящим включены в данную заявку с помощью ссылки. Типовые соединения формулы (I) включают, не ограничиваясь перечисленными, гидрохлорид N-(((гексадецилокси)-карбонил)-метил)-амида 3-метоксипиридин-2-карбоновой кислоты, N-(((октилокси)-карбонил)-метил)-амид 3-метоксипиридин-2-карбоновой кислоты, N-(((гексилокси)-карбонил)-метил)-амид 3-метоксипиридин-2-карбоновой кислоты, N-(((бутилокси)-карбонил)-метил)-амид 3-метоксипиридин-2-карбоновой кислоты, рацемат N-(((2-нонилокси)-карбонил)-метил)-амида 3-метоксипиридин-2-карбоновой кислоты, N-(((гептилокси)-карбонил)-метил)-амид 3-метоксипиридин-2-карбоновой кислоты, N-(((октилокси)-карбонил)-метил)-амид 3-бензилоксипиридин-2-карбоновой кислоты, N-((бутилоксикарбонил)-метил)-амид 3-бензилоксипиридин-2-карбоновой кислоты, N-((бензилоксикарбонил)-метил)-амид 5-(((3-(1-бутилокси)-пропил)-амино)-карбонил)-3-метоксипиридин-2-карбоновой кислоты, N-(((1-бутилокси)-карбонил)-метил)-амид 5-(((3-(1-бутилокси)-пропил)-амино)-карбонил)-3-метоксипиридин-2-карбоновой кислоты и N-(((бензилокси)-карбонил)-метил)-амид 5-(((3-лаурилокси)-пропил)-амино)-карбонил)-3-метоксипиридин-2-карбоновой кислоты.
Дополнительные соединения формулы (I) представляют собой замещенные гетероциклические карбоксиамиды, описанные в патенте США № 5 620 995; 3-гидроксипиридин-2-карбоксамидоэфиры, описанные в патенте США № 6 020 350; сульфонамидокарбонилпиридин-2-карбоксамиды, описанные в патенте США № 5 607 954; а также сульфонамидокарбонил-пиридин-2-карбоксамиды и сложные эфиры сульфонамидокарбонил-пиридин-2-карбоксамидов, описанные в патентах США № 5 610 172 и 5 620 996. Все соединения, перечисленные в указанных патентах, в частности те из них, которые приведены в списке соединений формулы изобретения, и конечные продукты действующих образцов настоящим включены в данную заявку с помощью ссылки.
Типовые соединения формулы (Ia) описаны в патентах США № 5 719 164 и 5 726 305. Все соединения, перечисленные в предшествующих патентах, в частности те из них, которые перечислены в списках соединений формулы изобретения, и конечные продукты действующих образцов настоящим включены в данную заявку с помощью ссылки. Типовые соединения формулы (Ia) включают, не ограничиваясь перечисленным, N-((3-гидрокси-6-изопропокси-хинолин-2-карбонил)-амино)-уксусную кислоту, N-((6-(1-бутилокси)-3-гидроксихинолин-2-ил)-карбонил)-глицин, [(3-гидрокси-6-трифторметокси-хинолин-2-карбонил)-амино]-уксусную кислоту, N-((6-хлор-3-гидроксихинолин-2-ил)-карбонил)-глицин, N-((7-хлор-3-гидроксихинолин-2-ил)-карбонил)-глицин и [(6-хлор-3-гидроксихинолин-2-карбонил)-амино]-уксусную кислоту.
Типовые соединения формулы (Ib) описаны в патенте США №6 093 730. Все соединения, перечисленные в патенте США № 6 093 730, в частности те из них, которые приведены в списке соединений формулы изобретения, и конечные продукты действующих образцов настоящим включены в данную заявку посредством ссылки. Типовые соединения формулы (Ib) включают, не ограничиваясь перечисленными, N-((1-хлор-4-гидрокси-7-(2-пропилокси)изохинолин-3-ил)-карбонил)-глицин, N-((1-хлор-4-гидрокси-6-(2-пропилокси)изохинолин-3-ил)-карбонил)-глицин, N-((1-хлор-4-гидрокси-изохинолин-3-карбонил)-амино)-уксусную кислоту (соединение A), N-((1-хлор-4-гидрокси-7-метоксиизохинолин-3-ил)-карбонил)-глицин, N-((1-хлор-4-гидрокси-6-метоксиизохинолин-3-ил)-карбонил)-глицин, N-((7-бутилокси)-1-хлор-4-гидроксиизохинолин-3-ил)-карбонил)-глицин, N-((6-бензилокси-1-хлор-4-гидрокси-изохинолин-3-карбонил)-амино)-уксусную кислоту, метиловый эфир ((7-бензилокси-1-хлор-4-гидрокси-изохинолин-3-карбонил)-амино)-уксусную кислоту, N-((7-бензилокси-1-хлор-4-гидрокси-изохинолин-3-карбонил)-амино)-уксусную кислоту, N-((8-хлор-4-гидроксиизохинолин-3-ил)-карбонил)-глицин, N-((7-бутокси-4-гидрокси-изохинолин-3-карбонил)-амино)-уксусную кислоту.
Помимо этого соединения, относящиеся к формуле (I), которые могут быть применены в способах по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь перечисленным, 6-циклогексил-1-гидрокси-4-метил-1H-пиридин-2-он, 7-(4-метил-пиперазин-1-илметил)-5-фенилсульфанилметил-хинолин-8-ол, 4-нитро-хинолин-8-ол, 5-бутоксиметил-хинолин-8-ол, [(4-гидрокси-7-фенокси-изохинолин-3-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение B) и [(4-гидрокси-7-фенилсульфанил-изохинолин-3-карбонил)-амино]-уксусную кислоту (соединение C). Кроме этого, настоящее изобретение предоставляет дополнительные типовые соединения, в которых, например, A и B совместно могут представлять собой, например, гексановую кислоту, цианометил, 2-аминоэтил, бензойную кислоту, 1H-бензоимидазол-2-илметил и т.д.
В других вариантах осуществления соединения, применяемые в способах по настоящему изобретению, выбраны из соединений формулы (III)
или их фармацевтически приемлемых солей, где:
a представляет собой целое число от 1 до 4;
b представляет собой целое число от 0 до 4;
c представляет собой целое число от 0 до 4;
3
10
3
10
5
20
5
20
1
1
1
1
Z выбран из группы, состоящей из (C-C)-циклоалкила, (C-C)-циклоалкила, независимо замещенного одним или несколькими Y, 3-10-членного гетероциклоалкила и 3-10-членного гетероциклоалкила, независимо замещенного одним или несколькими Y; (C-C)-арила, (C-C)-арила, независимо замещенного одним или несколькими Y; 5-20-членного гетероарила и 5-20-членного гетероарила, независимо замещенного одним или несколькими Y;
1
2
2
5
20
5
20
Ar выбран из группы, состоящей из (C-C)-арила, (C-C)-арила, независимо замещенного одним или несколькими Y; 5-20-членного гетероарила и 5-20-членного гетероарила, независимо замещенного одним или несколькими Y;
1
5
20
6
26
каждый из Y независимо выбран из группы, состоящей из липофильной функциональной группы, (C-C)-арила, (C-C)-алкил-арила, 5-20-членного гетероарила и 6-26-членного алкил-гетероарила;
2
2
каждый из Y независимо выбран из группы, состоящей из -R', -OR', -OR”, -SR', -SR”, -NR'R', -NO, -CN, -галогена, тригалогенметила, тригалогенметокси, -C(O)R', -C(O)OR',
2
-C(O)NR'R', -C(O)NR'OR', -C(NR'R')=NOR', -NR'-C(O)R', -SOR'
2
2
-SOR”, -NR'-SO-R', -NR'-C(O)-NR'R', теразол-5-ила, -NR'-C(O)-OR', -C(NR'R')=NR', -S(O)-R', -S(O)-R” и NR'-C(S)-NR'R'; и
1
8
2
8
2
8
каждый из R' независимо выбран из группы, состоящей из -H, (C-C)-алкила, (C-C)-алкенила и (C-C)-алкинила; и
5
20
5
20
2
каждый из R” независимо выбран из группы, состоящей из (C-C)-арила и (C-C)-арила, независимо замещенного одной или несколькими группами -OR', -SR', -NR'R', -NO, -CN, галогенами или тригалогенметильными группами,
1
или где c представляет собой 0, Ar представляет собой N'-замещенный остаток арилмочевины, соединение имеет структурную формулу (IIIa):
или его фармацевтически приемлемую соль, где:
a, b и Z определены выше; и
35
36
1
8
2
8
2
8
3
10
5
20
5
20
6
26
6
26
каждый из R и R независимо выбран из группы, состоящей из водорода, (C-C)-алкила, (C-C)-алкенила, (C-C)-алкинила, (C-C)-циклоалкила, (C-C)-арила, (C-C)-замещенного арила, (C-C)-алкарила, (C-C)-замещенного алкарила, 5-20-членного гетероарила, 5-20-членного замещенного гетероарила, 6-26- членного алкил-гетероарила и 6-26-членного замещенного алкил-гетероарила; и
37
1
8
2
8
2
8
R независимо выбран из группы, состоящей из водорода, (C-C)-алкила, (C-C)-алкенила и (C-C)-алкинила.
Типовые соединения формулы (III) описаны в международной публикации № WO 00/50390. Все соединения, перечисленные в WO 00/50390, в частности те из них, которые приведены в списке соединений формулы изобретения, и конечные продукты действующих образцов настоящим включены в данную заявку посредством ссылки. Типовые соединения формулы (III) включают 3-{[4-(3,3-дибензилуреидо)-бензолсульфонил]-[2-(4-метокси-фенил)-этил]-амино}-N-гидрокси-пропионамид (соединение D), 3-{{4-[3-(4-хлор-фенил)-уреидо]-бензолсульфонил}-[2-(4-метокси-фенил)-этил]-амино}-N-гидрокси-пропионамид и 3-{{4-[3-(1,2-дифенил-этил)-уреидо]-бензолсульфонил}-[2-(4-метокси-фенил)-этил]-амино}-N-гидрокси-пропионамид.
Кроме этого разработаны способы идентификации соединений по настоящему изобретению. В определенных аспектах соединение по настоящему изобретению представляет собой такое соединение, которое стабилизирует HIFα. Способность соединения стабилизировать или активировать HIFα может быть установлена, например, прямым измерением HIFα в образце, непрямым измерением HIFα, например уменьшением HIFα, связанного с белком фон Гиппеля-Линдау (см., например, международную публикацию № WO 00/69908), или же активацией HIF-чувствительных целевых генов или репортерных конструкций (см., например, патент США № 5 942 434). Измерение и сравнение уровней HIF и/или HIF-чувствительного целевого белка в отсутствие и в присутствии соединения даст возможность распознать соединения, которые стабилизируют HIFα и/или активируют HIF.
et al
et al
В других аспектах соединение по настоящему изобретению представляет собой такое соединение, которое ингибирует активность HIF-гидроксилазы. Анализы активности гидроксилазы являются стандартными в технике. Подобные анализы могут прямо или косвенно измерять активность гидроксилазы. Например, анализ может измерить содержание гидроксилированных остатков, например пролина, аспарагина и т.д., которые имеются в субстрате фермента, например в целевом белке, в синтетическом имитационном пептиде или их фрагментах (См., например, Palmerini . (1985) J Chromatogr 339:285-292). Уменьшение количества гидроксилированных остатков, например пролина или аспарагина, в присутствии соединения указывает на соединение, которое ингибирует активность гидроксилазы. С другой стороны, анализы могут измерять другие продукты реакции гидроксилирования, например образование сукцината из 2-оксоглутарата (См., например, Cunliffe . (1986) Biochem J 240:617-619). Kaule и Gunzler (1990; Anal Biochem 184:291-297) описывают типовую процедуру для измерений образования сукцината из 2-оксоглутарата.
et al
et al
Методики, подобные описанным выше, могут быть применены для идентификации соединений, которые регулируют активность HIF-гидроксилазы. Целевой белок может включать HIFα или его фрагмент, например HIF (556-575). В число ферментов могут входить, например, HIF-пролилгидроксилаза (см., например, GenBank Accession № AAG33965 и т.д.) или HIF-аспарагинилгидроксилаза (см., например, GenBank Accession № AAL27308 и т.д.), полученные из любого источника. Фермент также может присутствовать в форме неочищенного клеточного лизата или в частично очищенной форме. Методики, предназначенные для измерения активности HIF-гидроксилазы, описаны, например, у Ivan . (2001, Science 292:464-468; и 2002, Proc Natl Acad Sci USA 99:13459-13464) и Hirsila . (2003, J Biol Chem 278:30772-30780); дополнительные способы описаны в международной публикации № WO 03/049686. Измерение и сравнение активности ферментов в отсутствие и в присутствии соединения позволит выявить соединения, которые ингибируют гидроксилирование HIFα.
in vitro
in vivo
Соединением по настоящему изобретению является такое соединение, которое, кроме того, дает измеримый результат, при измерениях  или , доказательством чего служит усиленный эритропоэз, улучшенный метаболизм железа или терапевтическое улучшение состояний, в число которых входят, например, дефицит железа, включая функциональный дефицит железа; анемия, вызванная хроническим заболеванием, дефицит железа и микроцитоз или микроцитарная анемия; или же состояний, связанных с воспалением, инфекционным заболеванием, иммунодефицитом или неопластическим расстройством.
Измеримый результат может представлять собой любой из следующих параметров: повышение гемоглобина, гематокрита, ретикулоцитов, количества красных кровяных телец, EPO плазмы и т.д.; улучшение метаболизма железа, которое выявлено по уменьшению наблюдаемых симптомов, включая, например, уменьшение хронической усталости, бледности, головокружения и т.д., или по увеличению уровней содержания железа в сыворотке, изменившимся уровням ферритина в сыворотке, % насыщения трансферрина, общей способности к связыванию железа, увеличению числа ретикулоцитов, гемоглобина, гематокрита, например всех параметров, измеряемых при стандартном анализе крови.
Фармацевтические препараты и пути введения
Композиции по настоящему изобретению могут доставляться непосредственно или в составе фармацевтических композиций, содержащих наполнители, что хорошо известно в технике. Представленные способы лечения могут включать введение эффективного количества соединения по настоящему изобретению субъекту, у которого имеется расстройство метаболизма или повышенный риск его возникновения; в частности, расстройство, связанное с регуляцией глюкозы, например диабет, гипергликемия и т.д. В предпочтительном варианте осуществления субъект представляет собой млекопитающее, причем в наиболее предпочтительном варианте осуществления субъект представляет собой человека.
Эффективное количество, например доза соединения или лекарства, легко может быть определена с помощью обычных экспериментальных исследований также, как и эффективный и удобный путь введения, и подходящая рецептура. В технике доступны различные виды препаратов и системы доставки лекарств. (См., например, Gennaro, ed.(2000) Remington's Pharmaceutical Sciences, выше; и Hardman, Limbird и Gilman, eds. (2001) The Pharmacological Basis of Therapeutics, выше).
Подходящие пути введения могут включать, например, пероральный, ректальный, местный, назальный, легочный, глазной, кишечный и парентеральный пути введения. Основные пути парентерального введения включают внутривенное, внутримышечное и подкожное введение. Вспомогательные пути введения включают интраперитонеальный, внутриартериальный, внутрисуставной, внутрисердечный, интрацистернальный, внутрикожный, внутрь очага поражения, внутриглазной, внутриплевральный, интратекальный, внутриматочный и внутрижелудочковый. Подлежащие излечению симптомы, а также физические, химические и биологические свойства лекарственного препарата диктуют, какой тип препарата и способ введения надлежит применить, а также какой вид доставки следует предпочесть - местную или системную.
Фармацевтические лекарственные формы соединений по настоящему изобретению могут предусматривать мгновенное выделение действующего начала, управляемое выделение, продолжительное выделение или являться целевой системой доставки лекарственного средства. Обычно применяемые лекарственные формы включают, например, растворы и суспензии, (микро-)эмульсии, мази, гели и пластыри, липосомы, таблетки, драже, капсулы с твердой и мягкой оболочкой, суппозитории, шарики, имплантаты, аморфные или кристаллические порошки, аэрозоли или лиофилизованные составы. Для применения или введения лекарственного средства в зависимости от выбранного способа введения могут потребоваться специальные устройства, как, например, шприцы и иглы, ингаляторы, насосы, карандаши для инъекций, аппликаторы или специальные колбы. Фармацевтические лекарственные формы часто состоят из лекарственного средства, наполнителя (наполнителей) и контейнера/системы изоляции от внешних воздействий. Для улучшения или облегчения производства, стабильности, введения и безопасности лекарственного средства к соединению по настоящему изобретению могут быть добавлены один или несколько наполнителей, которые также называются инертными компонентами, причем они могут предоставить возможности для достижения желаемых параметров выделения лекарственного средства. Следовательно, тип наполнителя (наполнителей), добавляемых к лекарственному средству, может зависеть от различных факторов, таких как, например, физические и химические свойства лекарственного средства, путь введения и методика производства. Фармацевтически приемлемые наполнители доступны в технике и включают наполнители, внесенные в списки различных фармакопей (См., например, веб-страницы USP, JP, EP и BP, FDA (www.fda.gov), Inactive Ingredient Guide 1996, и Handbook of Pharmaceutical Additives, ed. Ash; Synapse Information Resources, Ink.2002).
Фармацевтические лекарственные формы соединений по настоящему изобретению могут производиться одним из общеизвестных в технике способов, таких как, например, обычное смешивание, просеивание, растворение, плавление, грануляция, изготовление драже, таблетирование, суспендирование, экструдирование, распылительная сушка, растирание в порошок, эмульгирование, (нано/микро)инкапсуляция, захватывание или лиофилизация. Как было отмечено выше, композиции по настоящему изобретению могут включать один или несколько физиологически приемлемых инертных компонентов, которые облегчают превращение действующего соединения в препарат для фармацевтического применения.
Подходящий вид препарата зависит от желаемого пути введения. Например, для внутривенной инъекции композиция может быть приготовлена в виде водного раствора, с применением в случае необходимости физиологически совместимых буферов, включающих, например, фосфат, гистидин или цитрат для регулирования pH состава и тонический реагент, как, например, хлористый натрий или декстрозу. В случае введения через слизистую оболочку или назального введения могут быть предпочтительны полужидкие и жидкие составы или пластыри, возможно, содержащие средства для улучшения проникания. Подобные средства для улучшения проникания широко известны в технике. Для перорального введения соединения могут быть включены в состав жидких или твердых дозированных форм, а также в состав препаратов с мгновенным или управляемым/длительным выделением действующего начала. Удобные дозированные формы для перорального приема пациентом включают таблетки, пилюли, драже, капсулы с твердой и мягкой оболочкой, жидкости, гели, сиропы, пастообразные смеси, суспензии и эмульсии. Кроме этого соединения по настоящему изобретению могут включаться в составы композиций для ректального введения, таких как суппозитории или удерживающие клизмы, например, содержащие обычную основу для изготовления суппозиториев, такую как масло какао или другие глицериды.
Твердые дозированные формы для перорального приема могут быть получены с применением наполнителей, которые могут включать заполнители, дезинтегрирующие средства, связующие средства (сухие и мокрые), средства, замедляющие растворение, смазывающие средства, средства для скольжения, средства против прилипания, катионообменные смолы, увлажняющие средства, антиоксиданты, консерванты, красители и вкусовые добавки. Перечисленные наполнители могут быть синтетического или природного происхождения. Примеры подобных наполнителей включают производные целлюлозы, лимонную кислоту, дикальцийфосфат, желатин, карбонат магния, лаурилсульфат магния/натрия, маннит, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон, силикаты, диоксид кремния, бензоат натрия, сорбит, крахмалы, стеариновую кислоту или ее соли, сахара (например, декстрозу, сахарозу, лактозу и т.д.), тальк, растительный клей трагаканта, растительные масла (гидрогенированные) и воски. Этанол и вода могут служить в качестве средств для грануляции. В определенных примерах желательно покрытие таблеток, например, пленкой для сокрытия вкуса содержимого, пленкой, устойчивой к желудочному соку, или пленкой, замедляющей выделение. Для покрытия таблеток, приводящего к образованию драже, часто применяют природные и синтетические полимеры в сочетании с красителями, сахарами и органическими растворителями или водой. Если капсула является более предпочтительной по сравнению с таблеткой, порошок, суспензия или раствор лекарственного средства может доставляться в капсуле с совместимой твердой или мягкой оболочкой.
В одном из вариантов осуществления может производиться местное введение соединений по настоящему изобретению, как например, с помощью кожного пластыря, полужидкого или жидкого состава, например геля, (микро-)эмульсии, мази, раствора (нано/микро)суспензии или пены. Проникновение лекарственного средства в кожу и подкожные ткани можно регулировать, например, применяя средства, улучшающие проникновение; за счет подходящего выбора и сочетания липофильных, гидрофильных и амфифильных наполнителей, включая воду, органические растворители, воски, масла, синтетические и природные полимеры, поверхностно-активные вещества, эмульгаторы; с помощью регулирования pH; и за счет применения комплексообразующих средств. Для того, чтобы регулировать проникновение через кожу лекарственных средств по настоящему изобретению, можно применять другие методики, как, например, ионтофорез. Трансдермальное или местное введение было бы предпочтительно, например, в ситуациях, когда желательна местная доставка лекарственного средства с минимальным общим воздействием.
Для введения путем ингаляции или введения в нос соединение, предназначенное для применения по настоящему изобретению, как правило, доставляют в форме раствора, суспензии, эмульсии или полутвердого аэрозоля из упаковки под повышенным давлением или распылителя, обычно с применением пропеллента, например галогенированных углеводородов, производных метана и этана, диоксида углерода или любого другого подходящего газа. Для аэрозолей местного действия применяют углеводороды, такие как бутан, изобутен и пентан. В случае применения аэрозолей под давлением надлежащая величина дозировки может быть установлена за счет введения клапана, допускающего выделение определенного количества содержимого. Для применения в ингаляторах и инсуффляторах (вдувателях порошка) вещества по настоящему изобретению можно вводить в капсулы и картриджи, например, из желатина. Упомянутые капсулы и картриджи, как правило, содержат смесь порошка соединения по настоящему изобретению и подходящей порошкообразной основы, как, например, лактозы или крахмала.
Композиции, предназначенные для парентерального введения с помощью инъекции, как правило, являются стерильными и могут быть представлены в виде форм для разовой дозировки, например, в ампулах, шприцах, карандашах для инъекций или в упаковках, содержащих несколько доз, в состав последних, как правило, входит консервант. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в маслянистых или водных носителях и могут содержать такие средства, как буферы, тонические средства, средства для улучшения вязкости, поверхностно-активные вещества, средства для суспендирования и диспергирования, антиоксиданты, биосовместимые полимеры, хелатообразователи и консерванты. В зависимости от места инъекции носитель может содержать воду, синтетическое или растительное масло и/или дополнительные органические растворители. В определенных примерах, таких как лиофилизованный продукт или концентрат, парентеральный состав может быть восстановлен или разбавлен перед введением. Составы пролонгированного действия, которые обеспечивают регулируемое или длительное выделение соединения по настоящему изобретению, могут включать предназначенные для инъекции суспензии нано/микрочастиц или нано/микрокристаллы или кристаллы размером более 1 мкм. Полимеры, как, например, поли(молочная) кислота, поли(гликолевая) кислота или их сополимеры, могут служить матрицами для обеспечения регулируемого/длительного выделения, в дополнение к другим полимерам, хорошо известным в технике. Другие системы доставки пролонгированного действия могут быть представлены в форме имплантатов и насосов, требующих надрезов.
Подходящие носители для внутривенной инъекции молекул по настоящему изобретению общеизвестны в технике и включают растворы на основе воды, содержащие основание, такое как, например, гидроксид натрия, для образования ионизированного соединения, сахар или хлорид натрия, в качестве тонического средства, например буфер содержит фосфат или гистидин. Могут быть добавлены дополнительные растворители, такие как, например, полиэтиленгликоль. Системы на основе воды эффективны при растворении соединений по настоящему изобретению, и они дают низкую токсичность при системном введении. Соотношение компонентов системы раствора может значительно изменяться без нарушения растворимости и токсических характеристик. Более того, может изменяться индивидуальность компонентов. Например, могут применяться поверхностно-активные вещества с низкой токсичностью, такие как полисорбаты и полоксамеры, также может применяться полиэтиленгликоль и другие дополнительные растворители, можно добавлять биосовместимые полимеры, такие как поливинилпирролидон, декстрозу можно заменять другими сахарами и полиолами.
Для композиций, применимых в рамках способов лечения по настоящему изобретению, терапевтически эффективная дозировка может быть первоначально определена с помощью разнообразных методик, хорошо известных в технике. Первоначальные дозировки, используемые в исследованиях на животных, могут основываться на эффективных концентрациях, установленных в ходе испытаний на клеточных культурах. Диапазоны дозировок, приемлемых для человека, могут быть определены, например, при использовании данных, полученных в процессе экспериментов над животными и испытаний на клеточных культурах.
Под терапевтически эффективной дозой или количеством соединения, средства или лекарства по настоящему изобретению понимается количество или доза соединения, средства или лекарства по настоящему изобретению, которое приводит к облегчению симптомов или продлению сроков существования субъекта. Токсичность и терапевтическая эффективность таких молекул может быть определена в соответствии со стандартными фармацевтическими методиками с помощью клеточных культур или экспериментальных животных, например, определением LD50 (т.е. дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (т.е. дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение токсической дозы и дозы, вызывающей терапевтический эффект, представляет собой терапевтический коэффициент, который может быть выражен, как LD50/ED50. Средства, демонстрирующие высокое значение терапевтических коэффициентов, являются предпочтительными.
Эффективное количество или терапевтически эффективное количество представляет собой количество соединения или фармацевтической композиции, которое способно вызвать биологическую или медицинскую реакцию ткани, системы, животного или человека, к которой стремится исследователь, ветеринар, врач или другой клиницист, например регуляцию метаболизма глюкозы, уменьшение повышенных или увеличенных уровней глюкозы в крови, лечение или профилактика расстройства, связанного с измененным метаболизмом глюкозы, например диабета и т.д.
Дозировки предпочтительно находятся в диапазоне циркулирующих концентраций, который включает ED50 с малой или отсутствующей токсичностью. Дозировки могут изменяться в пределах этого диапазона в зависимости от примененной лекарственной формы и/или примененного пути введения. Точная рецептура, путь введения, дозировка и интервал между введениями должны выбираться в соответствии со способами, известными из уровня техники, принимая во внимание индивидуальное состояние пациента.
in vitro
Величина дозы и интервал между приемами могут регулироваться индивидуально, чтобы обеспечить уровни действующих веществ в плазме, достаточные для достижения желаемых результатов, например регуляции метаболизма глюкозы, уменьшения уровней глюкозы в крови и т.д., т.е. минимальных эффективных концентраций (MEC). MEC могут изменяться для каждого соединения, но их можно измерить на основании, например, данных  и экспериментов на животных. Дозировки, необходимые для достижения MEC, будут зависеть от индивидуальных особенностей и пути введения. В случае местного введения или селективного поглощения эффективные локальные концентрации лекарственного средства могут быть не связаны с концентрациями в плазме.
Количество введенного средства или композиции может зависеть от разнообразных факторов, включая пол, возраст и вес субъекта, подвергаемого лечению, тяжесть заболевания, способ введения и мнение лечащего врача.
Композиции, представленные в настоящем изобретении, могут, если это желательно, выпускаться в упаковке или дозирующем устройстве, содержащем одну или большее количество единиц дозировки лекарственного средства, включающего действующий ингредиент. Такие упаковки или устройства могут, например, включать металлическую или пластиковую фольгу, как, например, блистерная упаковка, или стеклянный сосуд с резиновой пробкой, как во флаконах. Упаковка или дозирующее устройство может комплектоваться инструкцией по применению. Композиции, содержащие соединения по настоящему изобретению, можно также получать в форме состава, включающего совместимый фармацевтический носитель, помещать в подходящие емкости и прикреплять этикетку с указанием условий лечения.
Приведенные выше и другие варианты осуществления настоящего изобретения легко придут на ум обычному специалисту в данной области техники, принимая во внимание сведения, раскрытые в данной заявке.
Примеры
Настоящее изобретение будет дополнительно объяснено с помощью ссылки на следующие ниже примеры, которые, как подразумевается, являются только иллюстрациями изобретения. Эти примеры приведены только для иллюстрации формулы настоящего изобретения. Область настоящего изобретения не ограничена типовыми вариантами осуществления, которые служат только для иллюстрации отдельных аспектов изобретения. Любые функционально эквивалентные способы находятся в рамках настоящего изобретения. Различные модификации изобретения, осуществленные в дополнение к тому, что описано в настоящей заявке, будут очевидны специалистам в данной области техники из предшествующего описания и сопроводительных чертежей. Подразумевается, что такие модификации попадают в рамки приложенной формулы изобретения.
Пример 1
: Преодоление ингибирующего воздействия TNF-α на выработку EPO
Клетки Hep3B обрабатывают TNF-α в различных концентрациях (0, 0,4, 2, 10 нг/мл) в отсутствие или в присутствии соединения A или соединения B в течение 3 дней. Уровни секретированного EPO определяют, применяя коммерческий доступный комплект ELISA kit (R&D Systems, catalog no. DEP00). В отсутствие соединений обработка клеток Hep3B TNF-α понижает выработку EPO, причем снижение зависит от дозы. Клетки Hep3B, обработанные либо соединением A (Фиг.1), либо соединением B (Фиг.2) в различных концентрациях в отсутствие TNF-α показывают зависящее от дозы увеличение выработки EPO. Добавление любого из соединений в присутствии TNF-α существенно снижает ингибиторное воздействие TNF-α на выработку EPO. Преодоление ингибиторного воздействия TNF-α на выработку EPO с помощью ингибирования пролилгидроксилазы наблюдают в присутствии низких (например, 0,4 нг/мл) и высоких (например, 10 нг/мл) концентраций TNF-α. Следовательно, ингибиторное воздействие воспалительного цитокина TNF-α на выработку EPO преодолевается за счет ингибирования активности пролилгидроксилазы, с применением соединений и способов по настоящему изобретению. Полученные результаты предполагают, что соединения и способы по настоящему изобретению применимы для увеличения выработки EPO в присутствии воспалительного цитокина TNF-α. Далее, способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения выработки EPO и, следовательно, для лечения анемии у субъекта, например, в случае, когда у субъекта имеется расстройство, связанное с TNF-α, такое как острое или хроническое воспаление или другая разновидность анемии, вызванной хроническим заболеванием.
Для изучения влияния соединений по настоящему изобретению на выработку EPO после того, как клетки подверглись воздействию воспалительного цитокина TNF-α (т.е. в клетках, уже подвергшихся воздействию TNF-α), выполняют серию экспериментов. Следовательно, в этих экспериментах передача сигнала TNF-α инициирована до добавления ингибитора пролилгидроксилазы. Клетки Hep3B обрабатывают TNF-α в различных концентрациях (0, 0,4, 2, 10 нг/мл) в течение 2 часов, после чего к клеточной культуре добавляют соединение A и соединение B в различных концентрациях. Уровни секретировнного EPO определяют, как описано выше, через три дня после добавления соединений.
Как показано на фиг.2A и 2B, соединение A и соединение B позволяют преодолеть ингибирующее воздействие TNF-α на выработку EPO, которое проявляется после 2-часовой предварительной обработки клеток Hep3B TNF-α. Эти данные показывают, что соединения и способы по настоящему изобретению применимы для увеличения выработки EPO в клетках, подвергшихся воздействию TNF-α. Эти результаты также означают, что обработка соединениями по настоящему изобретению предоставляет полезный способ увеличения выработки EPO и лечения анемии у субъекта, у которого выработка EPO подавлена TNF-α.
Добавление соединений по настоящему изобретению существенно уменьшает ингибиторное воздействие TNF-α на выработку EPO. Следовательно, соединения и способы по настоящему изобретению применимы для лечения или профилактики анемии, вызванной заболеваниями, которые связаны с повышенными уровнями TNF-α, например воспалительными расстройствами.
Пример 2:
Преодоление ингибирующего воздействия IL-1β на выработку EPO.
Клетки Hep3B в течение 3 дней обрабатывают IL-1β в различных концентрациях (0, 0,4, 2, 10 нг/мл) в отсутствие или в присутствии соединения A или соединения B. Уровни секретированного EPO определяют, применяя коммерческий доступный комплект ELISA kit (R&D Systems, catalog no. DEP00). В отсутствие соединений обработка клеток Hep3B IL-1β понижает выработку EPO, причем снижение зависит от дозы. Клетки Hep3B, обработанные либо соединением A (фиг.3A), либо соединением B (фиг.3B) в различных концентрациях в отсутствие IL-1β показывают зависящее от дозы увеличение выработки EPO. Добавление любого из соединений при наличии IL-1β существенно уменьшает ингибиторное воздействие IL-1β на выработку EPO. Преодоление ингибиторного воздействия IL-1β на выработку EPO за счет ингибирования пролилгидроксилазы наблюдается в присутствии низкой (например, 0,4 нг/мл) и высокой (например, 10 нг/мл) концентрации IL-1β. Следовательно, ингибиторное воздействие воспалительного цитокина IL-1β на выработку EPO преодолевается за счет ингибирования активности пролилгидроксилазы с применением соединений и способов по настоящему изобретению. Полученные результаты предполагают, что соединения и способы по настоящему изобретению применимы для увеличения выработки EPO в присутствии воспалительного цитокина IL-1β. Далее, способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения выработки EPO и, следовательно, для лечения анемии у субъекта, например, когда у субъекта имеется расстройство, связанное с IL-1β, такое как острое или хроническое воспаление или другая разновидность анемии, вызванной хроническим заболеванием.
Для изучения влияния соединений по настоящему изобретению на выработку EPO после того, как клетки подверглись воздействию воспалительного цитокина IL-1β (т.е. в клетках, уже подвергшихся воздействию IL-1β), выполняют серию экспериментов. Следовательно, в этих экспериментах передача сигнала IL-1β инициирована до добавления ингибитора пролилгидроксилазы. Клетки Hep3B в течение 2 часов обрабатывают IL-1β в различных концентрациях (0, 0,4, 2, 10 нг/мл), после чего к клеточной культуре добавляют соединение A и соединение B в различных концентрациях. Уровни секретированного EPO определяют, как описано выше через три дня после добавления соединений.
Как показано на фиг.4A и 4B, соединение A и соединение B позволяют преодолеть ингибирующее воздействие IL-1β на выработку EPO, которое проявляется после 2-часовой предварительной обработки клеток Hep3B IL-1β. Эти данные показывают, что соединения и способы по настоящему изобретению применимы для увеличения выработки EPO в клетках, подвергшихся воздействию IL-1β. Эти результаты также означают, что обработка соединениями по настоящему изобретению предоставляет полезный способ увеличения выработки EPO и лечения анемии у субъекта, у которого выработка EPO подавлена IL-1β.
Добавление соединений по настоящему изобретению существенно уменьшает ингибиторное воздействие IL-1β на выработку EPO. Следовательно, соединения и способы по настоящему изобретению применимы для лечения или профилактики анемии, связанной с IL-1β, например, при воспалительных расстройствах.
Пример 3:
Ингибирование экспрессии VCAM-1, индуцированной TNF-α.
Адгезионная способность эндотелиальных клеток в отношении лимфоцитов возникает, в частности, за счет экспрессии эндотелиальными клетками молекул адгезии васкулярных клеток (VCAM-1). Экспрессия VCAM-1 в эндотелиальных клетках вызвана различными воспалительными цитокинами, как, например, TNF-α. Для исследования воздействия ингибирования HIF-пролилгидроксилазы на экспрессию VCAM-1, индуцированную TNF-α, клетки HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) в течение 1 дня стимулируют TNF-α в отсутствие или в присутствии соединения B или соединения C в различных концентрациях. Затем измеряют экспрессию VCAM.
Как показано на фиг.5, TNF-α (1 нг/мл) индуцирует экспрессию VCAM-1 в клетках HUVEC. Однако добавление соединения B или соединения C к клеткам, стимулированным TNF-α, приводит к зависимому от дозы ингибированию экспрессии VCAM-1, индуцированной TNF-α. Эти данные показывают, что способы и соединения по настоящему изобретению эффективны при снижении экспрессии VCAM-1, связанной с воспалительным цитокином TNF-α. Далее этот результат означает, что соединения и способы по настоящему изобретению применимы для ингибирования экспрессии VCAM-1, связанной с различными воспалительными и аутоиммунными заболеваниями, например такими, как анемия, вызванная хроническим заболеванием.
Пример 4:
Ингибирование экспрессии VCAM-1, индуцированной IL-1β.
Экспрессия VCAM-1 в эндотелиальных клетках также вызвана воспалительным цитокином IL-1β. Для исследования воздействия ингибирования HIF-пролилгидроксилазы на экспрессию VCAM-1, индуцированную IL-1β, клетки HUVEC (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) в течение 1 дня стимулируют IL-1β в отсутствие или в присутствии соединения B или соединения C в различных концентрациях. Затем измеряют экспрессию VCAM.
IL-1β (1 нг/мл) индуцирует экспрессию VCAM-1 в клетках HUVEC. Однако добавление соединения B или соединения C к клеткам, стимулированным IL-1β, приводит к зависимому от дозы ингибированию экспрессии VCAM-1, индуцированной IL-1β. (Данные не показаны). Эти результаты показывают, что способы и соединения по настоящему изобретению эффективны при снижении экспрессии VCAM-1, связанной с воспалительным цитокином IL-1β. Далее этот результат означает, что соединения и способы по настоящему изобретению применимы для ингибирования экспрессии VCAM-1, связанной с различными воспалительными и аутоиммунными заболеваниями, например такими, как анемия, вызванная хроническим заболеванием.
Пример 5:
Ингибирование экспрессии VCAM-1 на эндотелиальных клетках, индуцированной TNF-α и IL-1β.
Клетки HUVEC обрабатывают контрольным раствором носителя или соединением B, или соединением C в различных концентрациях (0, 20, 40, 80 мкм) в течение 24 часов. Затем клетки промывают и после этого стимулируют либо 1 нг/мл TNF-α, либо 1 нг/мл IL-1β в течение 4 часов. После этого измеряют экспрессию VCAM-1 на поверхности клеток с помощью способа ELISA на основе клеток.
Как показано на фиг.25, предварительная обработка ингибиторами пролилгидроксилазы уменьшает стимулирование экспрессии VCAM-1 на поверхности клеток, связанной с воспалительными цитокинами TNF-α и IL-1β. Эти результаты показывают, что соединения и способы по настоящему изобретению ингибируют воспалительное действие TNF-α и IL-1β, а также ингибируют экспрессию на клеточной поверхности молекул адгезии, которые важны для опосредования гетероклеточной адгезии лейкоцитов. Ингибирование адгезии лейкоцитов обработкой соединениями по настоящему изобретению предоставляет эффективные способы уменьшения воспалительных каскадных реакций, снижая тем самым воспаление и уменьшая результат воспаления, связанный с ограничением выработки EPO и ингибированием эритропоэза.
Пример 6
: Ингибирование экспрессии E-селектина, индуцированной TNF-α.
Эндотелиальный E-селектин принадлежит к семейству селектинов, т.е. молекул клеточной адгезии, которые опосредуют первоначальное прикрепление лейкоцитов к эндотелиальным клеткам сосудов в случае воспаления. IL-1, TNF-α и липополисахариды могут индуцировать экспрессию E-селектина. (См., например, Bevilacqua et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:9238-9242 и Bevilacqua и van Furth (1993) J Leukoc Biol 54:363-378). Для исследования влияния ингибирования HIF-пролилгидроксилазы на индуцированную TNF-α экспрессию E-селектина, клетки HUVEC в течение 1 дня стимулируют TNF-α в концентрации 1 нг/мл в отсутствие или в присутствии соединения B или соединения C в различных концентрациях. Затем измеряют экспрессию E-селектина и VCAM.
Как показано на фиг.24A и 24B, соединение B или соединение C демонстрируют зависимое от дозировки ингибирование индуцированной TNF-α экспрессии VCAM и E-селектина в клетках HUVEC. На фиг.24A и 24B данные представлены как проценты ингибирования экспрессии VCAM и E-селектина, наблюдаемые в ответ на различные концентрации соединения B (фиг.24A) или соединения C (фиг.24 B). Более чем 60% ингибирование экспрессии VCAM и E-селектина наблюдается в клетках HUVEC, обработанных 50 мкМ раствором соединения B или соединения C. Эти данные показывают, что способы и соединения по настоящему изобретению эффективны при снижении экспрессии VCAM и E-селектина в эндотелиальных клетках, которая связана с воспалительным цитокином TNF-α. Полученные результаты далее означают, что соединения и способы по настоящему изобретению применимы для ингибирования экспрессии VCAM и E-селектина, связанной с различными воспалительными и аутоиммунными расстройствами, например, такими как анемия, вызванная хроническим заболеванием. Кроме этого, ингибирование экспрессии эндотелиальными клетками молекул адгезии, включая VCAM и E-селектин, с помощью способов и соединений по настоящему изобретению предоставляет способы уменьшения первичных явлений при воспалении сосудов.
Пример 7:
Ингибирование экспрессии E-селектина, индуцированной IL-1β.
Для исследования влияния ингибирования HIF-пролилгидроксилазы на индуцированную IL-1β экспрессию E-селектина клетки HUVEC в течение 1 дня стимулируют IL-1β в концентрации 1 нг/мл в отсутствие или в присутствии соединения B или соединения C в различных концентрациях. Затем измеряют экспрессию E-селектина.
Соединение B или соединение C демонстрирует зависимое от дозировки ингибирование индуцированной IL-1β экспрессии E-селектина в клетках HUVEC. (Данные не показаны). Эти результаты показывают, что способы и соединения по настоящему изобретению эффективны при снижении экспрессии E-селектина в эндотелиальных клетках, которая связана с воспалительным цитокином IL-1β. Полученные результаты далее означают, что соединения и способы по настоящему изобретению применимы для ингибирования экспрессии E-селектина, связанной с различными воспалительными и аутоиммунными расстройствами, например, такими как анемия, вызванная хроническим заболеванием. Кроме этого, ингибирование экспрессии эндотелиальными клетками молекул адгезии, включая VCAM и E-селектин, с помощью способов и соединений по настоящему изобретению предоставляет способы уменьшения первичных явлений при сосудистом воспалении.
Пример 8:
Ингибирование экспрессии E-селектина, индуцированной TNF-α, IL-1β и IFN-γ.
Клетки HUVEC обрабатывают контрольным раствором носителя или соединением B или соединением C в различных концентрациях в течение 24 часов. Клетки промывают и после этого стимулируют либо 1 нг/мл TNF-α либо 1 нг/мл IL-1β, либо сочетанием TNF-α, IL-1β и IFN-γ, 1 нг/мл каждого, в течение 4 часов. Затем измеряют экспрессию E-селектина на поверхности клеток с помощью способа ELISA на основе клеток.
Как показано на фиг.26, предварительная обработка клеток HUVEC соединением B или соединением C ингибирует экспрессию E-селектина на поверхности клеток, индуцированную воспалительными цитокинами TNF-α или IL-1β. Кроме этого, предварительная обработка любым из соединений уменьшает экспрессию E-селектина в присутствии трех воспалительных цитокинов, которые, как известно, усиливают экспрессию E-селектина (TNF-α, IL-1β и IFN-γ). Эти результаты показывают, что представленные соединения блокируют воспалительное действие TNF-α, IL-1β и IFN-γ на эндотелиальные клетки, что показано на примере ингибирования экспрессии на поверхностях клеток молекул адгезии, которые опосредуют свертывание лейкоцитов на активированном эндотелии. Поскольку адгезия лейкоцитов к активированному эндотелию с помощью E-селектина представляет собой первоначальную стадию сохранения каскадного воспалительного процесса, ингибирование свертывания лейкоцитов путем ингибирования экспрессии E-селектина, предоставляет способ уменьшения каскадной воспалительной реакции, которая дополнительно ограничивает выработку EPO и подавляет эритропоэз.
Пример 9
: Синергическое увеличение выработки EPO.
Клетки Hep3B обрабатывают IL-6 в различных концентрациях (0, 0,1, 1, 10 нг/мл) в отсутствие или в присутствии соединения A или соединения B в различных концентрациях (3 мкМ, 10 мкМ, 30 мкМ) в течение 1 или 3 дней. Уровни секретированного EPO определяют, применяя коммерческий доступный комплект ELISA kit (R&D Systems, catalog no. DEP00). В отсутствие соединений по настоящему изобретению обработка клеток Hep3B IL-6 оказывает минимальное воздействие на выработку EPO. Как показано на фиг.27A и 27B, клетки Hep3B, обработанные IL-6, демонстрируют слегка увеличенную экспрессию EPO по сравнению с необработанными клетками. Конкретно, уровни содержания EPO в контрольных клетках составляют приблизительно 20 мМЕ/мл, тогда как в клетках, обработанных IL-6 с концентрацией 10 нг/л, уровни составляют 50 мМЕ/мл.
Клетки Hep3B, обработанные соединением A или соединением B в отсутствие IL-6, демонстрировали увеличение уровней EPO в зависимости от дозировки. Тем не менее, клетки Hep3B, обработанные соединением A или соединением B в присутствии IL-6, демонстрировали значительное увеличение уровней содержания EPO (См. фиг.27A и 27B). Воздействие на выработку EPO обработки соединениями по настоящему изобретению в присутствии IL-6 является синергическим. Например, клетки Hep3B, обработанные IL-6 с концентрацией 10 нг/л, показывают уровни EPO приблизительно 50 мМЕ/мл. Обработка клеток Hep3B 10 мМ соединения A или соединения B в отсутствие IL-6 приводит к уровням 60 мМЕ/мл и 220 мМЕ/мл соответственно. В присутствии 10 нг/моль IL-6 добавление соединения A и соединения B увеличивает уровни EPO до приблизительно 270 мМЕ/мл и до более чем 400 мМЕ/мл соответственно. Следовательно, соединения по настоящему изобретению совместно с IL-6 действуют синергически при индуцировании экспрессии EPO в гепатоцитах.
Пример 10
: Преодоление индуцированного цитокинами ингибирования передачи сигнала рецептора EPO.
3
3
Линия клеток TF-1 (эритролейкемия человека; ATCC cat #CRL-2003) стимулируется к размножению в ответ на добавление EPO. В присутствии различных про-воспалительных цитокинов, EPO-опосредованное увеличение пролиферации клеток TF-1 ослабляется. Для определения воздействия ингибирования пролилгидроксилазы на пролиферацию клеток TF-1 клетки TF-1 обрабатывают про-воспалительными цитокинами IL-1β, TNF-α или IFN-γ в различных концентрациях в отсутствие или в присутствии ингибиторов пролилгидроксилазы и измеряют EPO-опосредованную пролиферацию клеток следующим образом. Три лунки, заполненные клетками, культивированными в 96-луночном микротитровальном планшете, инкубируют в бессывороточной среде в отсутствие или в присутствии EPO в течение 24 часов. В течение последних 4 часов культивирования в каждую лунку добавляют 1 мкКюри тимидина, меченного тритием (H-TdR; Amersham). Реактивность клеток в отношении передачи сигнала рецептора EPO определяют путем измерения пролиферации клеток. Пролиферацию клеток измеряют, определяя количество H-TdR, вошедшего в состав клеток, вначале разрушая клетки водой и затем собирая ДНК на нейлоновые фильтры в коллекторе клеток (харвестере).
ex vivo
С другой стороны, в качестве EPO-чувствительных клеток применяют суспензию отдельных клеток селезенки, полученную из животных, подвергшихся воздействию фенилгидразина, что ведет к преобладанию в селезенке EPO-чувствительных клеток-предшественников. После этого определяют EPO-опосредованную пролиферацию , как описано выше.
Обработка клеток TF-1 EPO приводит к возрастанию клеточной пролиферации, что определено по увеличению количества тритийсодержащего тимидина в составе клеток. Добавление про-воспалительных цитокинов IL-1β, TNF-α или IFN-γ к клеткам TF-1, обработанным EPO, приводит к снижению реактивности в отношении EPO, ведущему к уменьшению пролиферации клеток. Определено влияние добавления соединений по настоящему изобретению на ингибиторное воздействие про-воспалительных цитокинов на EPO-опосредованную пролиферацию клеток TF-1. Измеренный по увеличившемуся содержанию тритийсодержащего тимидина рост пролиферации клеток TF-1, обработанных EPO и про-воспалительными цитокинами, показывает, что соединения и способы по настоящему изобретению позволяют преодолеть ингибирующее воздействие про-воспалительных цитокинов на EPO-опосредованное увеличение пролиферации клеток.
Пример 11
: Увеличение экспрессии рецептора трансферрина
Воздействие соединений по настоящему изобретению на экспрессию рецептора трансферрина исследуют следующим образом. Различные клетки (Hep3B, HepG2, HK-2) инкубируют с соединением A или соединением B в течение 1 дня. Затем клетки исследуют с целью определения экспрессии рецептора трансферрина с помощью анализа FACS (fluorescent-activated cell sorter - клеточный сортер с возбуждением флуоресценции), применяя антитела CD71-PE (Ancell, catalog no. 223-050). Результаты показаны ниже в таблице 1.
Таблица 1
Тип клеток
Обработка
Среднее FL
Hep3B
DMSO
40,21
Соединение A
40,89
Соединение B
42,43
HepG2
DMSO
49,59
Соединение A
56,52
Соединение B
53,53
HK-2
DMSO
10,80
Соединение A
12,20
Соединение B
18,92
Как показано в таблице 1, добавление к клеткам различных соединений по настоящему изобретению увеличивает экспрессию рецептора трансферрина. Ингибирование процесса HIF-пролил гидроксилирования с применением ингибиторов пролилгидроксилазы по настоящему изобретению увеличивает экспрессию рецептора трансферрина в клетках. Увеличение экспрессии рецептора трансферрина при применении ингибиторов пролилгидроксилазы по настоящему изобретению наблюдается в клетках печени (например, Hep3B, HepG2), клетках почек (например, HK-2) и лимфоцитах (например, THP-1). Следовательно, способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения экспрессии рецептора трансферрина в различных типах клеток. Кроме этого, увеличенная экспрессия рецептора трансферрина могла бы привести к увеличению эндоцитоза трансферрина, связанного с трехвалентным железом, который опосредован рецептором трансферрина, увеличивая тем самым транспорт, использование, накопление и метаболизм железа. Следовательно, способы и соединения по настоящему изобретению применимы для улучшения эритропоэза за счет увеличения транспорта, использования, накопления и метаболизма железа.
Пример 12
in vitro
: Увеличение экспрессии рецептора трансферрина и поглощения железа .
59
59
59
Воздействие соединений по настоящему изобретению на поглощение железа в клетках определяют следующим образом. Первичные моноциты и макрофаги, а также клеточные линии моноцитов и макрофагов (например, THP-1) в течение одного, двух и трех дней обрабатывают ингибиторами пролилгидроксилазы в различных концентрациях. Затем клетки исследуют на наличие рецептора трансферрина на их поверхности, применяя флуоресцентное иммунное окрашивание и цитометрию в потоке. Результаты, показывающие, что добавление ингибиторов пролилгидроксилазы увеличивает экспрессию рецепторов трансферрина на поверхности клеток, указывают на эффективность ингибирования пролилгидроксилазы с целью увеличения связывания трансферрина с клетками и, следовательно, с целью связывания железа. Изменение поглощения железа клетками, которые обработаны ингибиторами пролилгидроксилазы, определяют следующим образом. Клетки обрабатывают соединением в присутствии изотопа Fe. Увеличение поглощения железа клетками, которые обработаны ингибиторами пролилгидроксилазы, определяют путем измерения количества Fe, связанного клетками. Увеличение количества Fe, связанного клетками, указывает на возросшее поглощение железа клетками.
Пример 13
: Увеличение уровней содержания и активности железо-регуляторного белка-2.
Регуляция поглощения, накопления и использования железа происходит, отчасти, за счет экспрессии и активности ключевых белков, вовлеченных в метаболизм железа, включая действующие в транс-положении белки, известные как железо-регуляторные белки (IRPs). IRP-1 и IRP-2 управляют стабильностью и трансляцией мРНК путем связывания с особыми железо-чувствительными фрагментами в различных мРНк или белках, вовлеченных в метаболизм железа, по-существу, влияя тем самым на все аспекты метаболизма железа. Дефицит железа увеличивает активность IRP, приводя к увеличению экспрессии рецептора трансферрина и уменьшению экспрессии ферритина. Подобным же образом, в присутствии железа, уменьшается активность IRP, что приводит к уменьшению экспрессии рецептора трансферрина и увеличению экспрессии ферритина.
Для исследования влияния соединений по настоящему изобретению на различные аспекты метаболизма железа выполняется следующий эксперимент. Клетки мыши Hepa-1 обрабатывают ингибиторами пролилгидроксилазы в течение 48 часов. Затем клетки собирают и анализируют клеточные лизаты для определения экспрессии IRP-2 с помощью иммуноблоттинга, применяя специфичные для IRP-2 антитела (Alpha Diagnostic International Inc., San Antonio TX). Результаты, показывающие повышение уровней IRP-2 в цитоплазме, которое следует за добавлением соединений по настоящему изобретению, демонстрируют, что способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения уровней IRP и, следовательно, метаболизма железа.
Воздействие соединений по настоящему изобретению на активность IRP-2, измеренную по изменению экспрессии ферритина и трансферрина, определяют следующим образом. Макрофаги мышей линии клеток RAW 264.1 обрабатывают ингибиторами пролилгидроксилазы в течение периода до 48 часов. Затем клетки собирают и анализируют для определения экспрессии белков трансферрина и ферритина с помощью иммуноблоттинга (ADI, catalogue #IRP21-S). Уменьшение уровней экспрессии ферритина и увеличение уровней экспрессии трансферрина, следующее за ингибированием пролилгидроксилазы, показывает, что способы и соединения по настоящему изобретению применимы для стабилизации и увеличения активности IRP-2. Увеличенная экспрессия IRP-2 снижает экспрессию ферритина, который ответственен за длительное хранение железа, и увеличивает экспрессию трансферрина и рецептора трансферрина, что способствует поглощению, транспорту и использованию железа и, таким образом, улучшает эритропоэз. За счет увеличения экспрессии и активности IRP-2 способы и соединения по настоящему изобретению применимы для уменьшения экспрессии ферритина и связанного с ним долговременного накопления железа, а также для увеличения экспрессии трансферрина и рецептора трансферрина. Таким образом, способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения поглощения, транспорта и использования железа и, следовательно, применимы для улучшения эритропоэза.
Пример 14
: Улучшение использования железа.
59
59
Перед внутривенной инъекцией цитрата железа, меченного радиоактивным изотопом Fe (Amersham), крысам вводят либо наполнитель для контроля, либо ингибиторы HIF-пролилгидроксилазы. Серийные образцы крови отбирают из хвостовой вены и в сцинтилляционном счетчике измеряют общую свободную радиоактивность плазмы и радиоактивность, связанную с эритроцитами, для обнаружения транспорта железа и включения железа в гем эритроцитов и синтез гемоглобина. Увеличение связанного эритроцитами Fe показывает, что соединения по настоящему изобретению применимы для улучшения использования железа, необходимого для синтеза гема, выработки гемоглобина и эритропоэза.
Пример 15
in vivo
: Улучшение экспрессии эритропоэтических генов .
Клетки Hep3B (ATCC No. HB-8064) выращивают в DMEM, содержащей 8% сыворотку зародышей телят. Клетки Hep3B высевают в 6-луночный планшет для культивирования в количестве приблизительно 500000 клеток на лунку. Через 8 часов среду заменяют на DMEM, содержащую 0,5% сыворотки зародышей телят, клетки инкубируют в течение еще 16 часов. К клеткам добавляют соединение B и соединение D (конечная концентрация 25 мкМ) и клетки инкубируют в течение различных периодов времени. Контрольные клетки (не обработанные соединениями, добавлен только ДМСО) собирают через 0, 6 и 48 часов. У собранных клеток оценивают жизнеспособность (GUAVA) или добавляют их к буферу для экстракции РНК (Rneasy, Qiagen) и хранят при -20°C для последующей очистки РНК. Генерируют реплики микроматриц, используя РНК, выделенную из экспериментов по репликации, которые проводят в другие дни. Общую РНК выделяют из клеток, применяя Rneasy kit (Qiagen).
Осаждают РНК в 0,3 М ацетате натрия (pH 5,2), 50 нг/мл гликогене и 2,5 объемах этанола в течение одного часа при -20°C. Образцы центрифугируют, осадок промывают холодным 80% этанолом, высушивают и повторно суспендируют в воде. Двухцепочечную кДНК синтезируют, используя праймер первой цепи T7-(dT)24 (Affymetrix, Inc., Santa Clara CA) и систему SUPERSCRIPT CHOICE (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Полученную кДНК экстрагируют эквивалентным объемом смеси 25:24:1 фенол:хлороформ:изоамиловый спирт, применяя вставку PHASE LOCK GEL (Brinkman, Ink., Westbury NY). Водные фазы собирают и осаждают кДНК, используя 0,5 объема 7,5 М ацетата аммония и 2,5 объема этанола. С другой стороны кДНК очищают, применяя модуль очистки образцов GENECHIP (Affymetrix) в соответствии с инструкциями производителя.
Меченную биотином кДНК синтезируют из кДНК в in vitro реакции трансляции (IVT), применяя комплект для внесения меток в транскрипты РНК BIOARRAY High Yield RNA transcript labelling kit (Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale NY) в соответствии с инструкциями производителя. Полученный меченый продукт очищают и фрагментируют, применяя модуль очистки образцов GENECHIP (Affymetrix) в соответствии с инструкциями производителя.
+
Смесь для гибридизации получают внесением 5 мкг пробы в смесь 100 мкл 1х буфера для гибридизации (100 мМ MES, 1 М [Na], 20 мМ EDTA, 0,01% Tween 20), 100 мкг/мл ДНК спермы сельди, 500 мкг/мл ацетилированного BSA, 0,03 нМ контрольного oligo B2 (Affymetrix) и 1x GENECHIP эукариотического контроля гибридизации (Affymetrix). Смесь последовательно инкубируют при 99°C в течение 5 минут и при 45°C в течение 5 минут и затем центрифугируют в течение 5 минут. Матрицу The Human Genome U133 array (Affymetrix) доводят до комнатной температуры и затем предварительно гибридизуют с 1х буфером для гибридизации при 45°C в течение 10 минут при вращении. Затем буфер заменяют 80 мкл смеси для гибридизации и матрицу гибридизуют в течение 16 часов при 45°C и 60 об/мин с противовесом. После гибридизации матрицы один раз промывают 6х SSPE, 0,1% Tween 20 и затем промывают и окрашивают, применяя R-фикоэритрин-сопряженный стрептавидин (Molecular Probes, Eugene OR), козье антитело против стрептавидина (Vector Laboratories, Burlingame CA) и GENECHIP Fluidics Station 400 instrument (Affymetrix) в соответствии с протоколом производителя micro_1v1 (Affymetrix). Матрицы анализируют, применяя сканнер GENEARRAY (Affymetrix) и программное обеспечение Microarray Suite (Affymetrix).
Матрица The Human Genome U133 array (Affymetrix) представляет все последовательности в базе данных Human Unigene database Build 133 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD), включающие приблизительно 14 500 хорошо охарактеризованных генов человека.
За качеством РНК следят с помощью капиллярного электрофореза (Agilent Bioanalyzer). Смеси для гибридизации получают, как описано (Affymetrix), и гибридизуют на матрицы Affymetrix Human U133A array, содержащие 22 283 набора зондов. Результаты обработки матрицы анализируют с помощью программного обеспечения Affymetrix MicroArray Suite (MAS), и индивидуальным наборам зондов приписывают статусы “присутствует”, “имеется в небольшом количестве” и “отсутствует”, в соответствии с установками программного обеспечения по умолчанию. Статистический анализ и отфильтрованные списки наборов зондов получают, применяя программное обеспечение GeneSpring (Silicon Genetics). Критерий отсечки “экспрессируется”, для наборов зондов использует сочетание статуса “P” и абсолютной величины экспрессии, полученной из встроенной модели ошибок данных программы GeneSpring. Данные нормализуют по усредненным контрольным образцам.
Как показано ниже в таблице 2, в клетках Hep3B, обработанных соединениями по настоящему изобретению, возрастает экспрессия генов, кодирующих эритропоэтические белки (числа в таблице показывают, во сколько раз выросли уровни мРНК по сравнению с контролем). (Два значения, отмеченных в случае церулоплазмина для каждых условий, приведены ниже в таблице 2). Конкретно, экспрессия генов церулоплазмина и рецептора трансферрина 2 возрастает в клетках Hep3B, обработанных различными соединениями по настоящему изобретению.
Таблица 2
Соединение
Время
Церулоплазмин(CP)
Рецептор трансферрина(TFR2)
D
6 ч
2,06/2,387
Не определен
B
1 ч
1,142/0,946
0,575
B
3 ч
1,123/0,955
0,558
B
6 ч
1,555/1,103
0,822
B
12 ч
2,366/2,507
1,253
B
24 ч
5,136/4,909
2,522
B
48 ч
5,82/4,678
4,169
Пример 16
: Дозировка животным.
Животные, использованные в следующих примерах, включают мужские особи мышей Swiss Webster (30-32 г), мужские особи крыс Sprague Dawley (200-350 г) и женские особи крыс Lewis Simonsen, полученных у Inc. (Gilroy CA), Charles River (Hollister, CA) или Harlan. Животных содержат с применением стандартных методик, причем вода и пища доступны животным свободно. Во время введения препаратов следят за изменением массы тела животных и признаками явной токсичности и смертности.
Соединения в основном вводят перорально с помощью принудительного питания или IV введения. Животные, которых подвергают принудительному кормлению, получают карбоксиметилцеллюлозу (CMC; Sigma-Aldrich, St. Louis MO) в объеме 4-10 мл/кг или 0,5% с или без 0,1% полисорбата 80 (0 мг/кг/день) или же изменяющиеся дозы соединений по настоящему изобретению (например, ингибиторов HIF-пролилгидроксилазы) в 0,5% CMC с или без 0,1% полисорбата 80, причем применяются различные режимы дозировки. По ходу введения препаратов через соответствующие промежутки времени отбирают образцы крови из, например, хвостовой вены (крысы) или брюшной вены, или с помощью пункции сердца (мыши или крысы). В основном животных подвергают анестезии с помощью изофлурана, и образцы крови собирают в пробирки сепаратора сыворотки MICROTAINER (Becton-Dickinson, Franklin Lakes NJ). Для измерения содержания компонентов сыворотки пробирки инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут и затем центрифугируют при 8 000 об/мин при 4°C в течение 10 минут. Затем фракции сыворотки подвергают обработке и анализируют на наличие определенных компонентов, например железа (анализ выполнен Quality Clinical Labs, Mountain View, CA). Для определения гематокрита образцы крови собирают в пробирки MICROTAINER EDTA-2K (Becton-Dickinson); затем EDTA-кровь втягивают в капиллярные трубки 75 мм × 1,1-1,2 мм I.D. (Chase Scientific Glass, Inc., Rockwood TN) приблизительно до 3/4 длины, один конец трубки закупоривают уплотнителем CRITOSEAL (Sherwood Medical Company) и трубки подвергают центрифугированию в центрифуге J-503M MICROHEMATOCRIT (Jorgensen Laboratories, Inc., Loveland CO) при 12 000 об/мин в течение 5 минут. Величину гематокрита считывают против карты считывания. После этого осуществляют полный клинический анализ крови, включая уровни гемоглобина в крови, число ретикулоцитов и гематокрит, анализ выполнен Quality Clinical Labs (Mountain View, CA).
2
В конце каждого исследования животных безболезненно умерщвляют, например обескровливают под общей анестезией, или животные умирают от удушья в атмосфере CO, и отбирают образцы органов и тканей. Ткани либо фиксируют в формалине с нейтральным буфером, либо сохраняют замороженными при -70°C. Ткани для геномного анализа помещают в RNAlater (специальный реагент).
Пример 17
in vivo
: Увеличение экспрессии генов, кодирующих белки, которые относятся к процессингу железа .
Мужских особей мыши Swiss Webster подвергают, как описано выше, воздействию одной дозы 0,5% CMC (Sigma-Aldrich) (0 мг/кг) или 100 мг/кг соединения A. Через 4, 8, 16, 24, 48 или 72 часа после введения животных подвергают анестезии, умерщвляют, отделяют образцы тканей почек, печени, мозга, легких и сердца и сохраняют в растворе RNALATER (Ambion) при -80°C. В другом эксперименте в течение 4 последовательных дней животных подвергают воздействию доз 0,5% CMC (0 мг/кг/день), 7 мг/мл соединения A в 0,5% CMC (30 мг/кг/день) или 25 мг/мл соединения A в 0,5% CMC (100 мг/кг/день). Через четыре часа после введения последней дозы животных подвергают анестезии, умерщвляют, отбирают приблизительно по 150 мг тканей печени и каждой из почек и сохраняют в растворе RNALATER (Ambion) при -20°C.
Выделение РНК выполняют, осуществляя следующую методику. Часть каждого органа разрезают на кусочки, добавляют 875 мкл буфера RLT (комплект RNEASY kit; Qiagen Inc., Valencia CA) и полученные кусочки гомогенизируют в течение примерно 20 секунд, применяя роторно-статорный гомогенизатор POLYTRON (Kinematica, Inc., Cincinnati OH). Гомогенат подвергают микроцентрифугированию в течение 3 минут для осаждения нерастворимых веществ, надосадочную жидкость переносят в новую пробирку и выделяют РНК, применяя комплект RNEASY kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. РНК элюируют 80 мкл воды и определяют количество с помощью реагента RIBOGREEN (Molecular Probes, Eugene OR). Измеряют поглощение на длинах волн 260 и 280 нм для определения чистоты и концентрации РНК.
С другой стороны, образцы тканей режут на кусочки и гомогенизируют в реагенте TRIZOL (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA), применяя роторно-статорный гомогенизатор POLYTRON (Kinematica). Гомогенаты доводят до комнатной температуры, добавляют 0,2 объема хлороформа и образцы энергично перемешивают. Смеси инкубируют при комнатной температуре в течение нескольких минут и затем центрифугируют при 12 000g в течение 15 мин при 4°C. Водные фазы собирают и добавляют 0,5 объема изопропанола. Образцы перемешивают, инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут и центрифугируют в течение 10 минут при 12 000g при 4°C. Жидкость над осадком удаляют, осадок промывают 75% EtOH и центрифугируют при 7 500g в течение 5 минут при 4°C. Измеряют поглощение на длинах волн 260 и 280 нм для определения чистоты и концентрации РНК.
РНК осаждают в 0,3М ацетате натрия (pH 5,2), 50 нг/мл гликогена и 2,5 объемах этанола в течение 1 часа при -20°C. Образцы центрифугируют и осадок промывают холодным 80% этанолом, затем высушивают и повторно суспендируют в воде. Двухцепочечную кДНК синтезируют, применяя праймер первой цепи T7-(dT)24 (Affymetrix, Inc., Santa Clara CA) и систему SUPERSCRIPT CHOICE (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Полученную кДНК экстрагируют эквивалентным объемом смеси 25:24:1 фенол:хлороформ:изоамиловый спирт, применяя вставку PHASE LOCK GEL (Brinkman, Ink., Westbury NY). Водные фазы собирают и осаждают кДНК, используя 0,5 объема 7,5 М ацетата аммония и 2,5 объема этанола. С другой стороны кДНК очищают, применяя модуль очистки образцов GENECHIP (Affymetrix) в соответствии с инструкциями производителя.
Меченную биотином кДНК синтезируют из кДНК в in vitro реакции трансляции (IVT), применяя комплект для внесения меток в транскрипты РНК BIOARRAY High Yield RNA transcript labelling kit (Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale NY) в соответствии с инструкциями производителя. Полученный меченый продукт очищают и фрагментируют, применяя модуль очистки образцов GENECHIP (Affymetrix) в соответствии с инструкциями производителя.
+
Смесь для гибридизации получают внесением 5 мкг пробы в смесь 100 мкл 1х буфера для гибридизации (100 мМ MES, 1 М [Na], 20 мМ EDTA, 0,01% Tween 20), 100 мкг/мл ДНК спермы сельди, 500 мкг/мл ацетилированного BSA, 0,03 нМ контрольного oligo B2 (Affymetrix) и 1x GENECHIP эукариотического контроля гибридизации (Affymetrix). Смесь последовательно инкубируют при 99°C в течение 5 минут и при 45°C в течение 5 минут, и затем центрифугируют в течение 5 минут. Матрицу мышиного генома Murine genome MOE430Aplus2 array (Affymetrix) доводят до комнатной температуры и затем предварительно гибридизуют с 1х буфером для гибридизации при 45°C в течение 10 минут при вращении. Затем буфер заменяют 80 мкл смеси для гибридизации и матрицу гибридизуют в течение 16 часов при 45°C и 60 об/мин с противовесом. После гибридизации матрицы один раз промывают 6х SSPE, 0,1% Tween 20 и затем промывают и окрашивают, применяя R-фикоэритрин-сопряженный стрептавидин (Molecular Probes, Eugene OR), козье антитело против стрептавидина (Vector Laboratories, Burlingame CA) и GENECHIP Fluidics Station 400 instrument (Affymetrix) в соответствии с протоколом производителя EukGE-WS2v4 (Affymetrix). Матрицы анализируют, применяя сканнер GENEARRAY (Affymetrix) и программное обеспечение Microarray Suite (Affymetrix).
Матрица мышиного генома Murine genome MOE430Aplus2 array (Affymetrix) представляет все последовательности в базе данных Murine UniGene database Build 107 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD), включающие приблизительно 14 000 хорошо охарактеризованных мышиных генов.
Приведенная ниже таблица 3 показывает экспрессию мРНК церулоплазмина в почках мыши после введения соединения A. Данные нормированы по среднему значению, которое наблюдалось у контрольных животных, не получавших указанного соединения.
Таблица 3
Условия эксперимента
Церулоплазмин (Относительные уровни мРНК)
Соединения не вводились
0,81
CMC контроль
1,26
Соединение A - 4 часа
1,16
Соединение A - 8 часов
1,39
Соединение A - 16 часов
1,22
Соединение A - 24 часа
2,45
Соединение A - 48 часов
1,44
Соединение A - 72 часа
2,10
Приведенные выше в таблице 3 данные демонстрируют, что способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения экспрессии гена церулоплазмина. Церулоплазмин, известный также как ферроксидаза-1, превращает восстановленную форму железа, выделяющуюся из мест его накопления (таких как ферритин) в окисленную форму. Окисленная форма железа способна связываться с белком плазмы, который осуществляет транспорт железа, т.е. с трансферрином. Дефицит церулоплазмина связан с накоплением железа в печени и других тканях. Существуют доказательства того, что церулоплазмин способствует оттоку железа из печени и притоку железа в железодефицитные клетки (См., например, Tran et al. (2002) J Nutr 132:351-356).
Приведенная ниже таблица 4 показывает экспрессию мРНК гепсидина в печени мышей после введения соединения A. Данные нормированы по величинам, которые наблюдались у контрольных животных, не получавших указанного соединения.
Таблица 4
Условия/Исследование животного
Время
Гепсидин (относительные уровни мРНК)
Контрольное
-
1,0
I-мультивысокая доза
-
0,275
II-мультивысокая доза
-
0,703
II-мультинизкая доза
-
0,129
III
4 часа
0,672
III
8 часов
0,305
III
16 часов
0,119
Как показано выше в таблице 4, введение соединения A приводит к уменьшению экспрессии мРНК гепсидина в печени мыши. Уменьшение экспрессии гепсидина связано с увеличением выделения железа из ретикулоэндотелиальных клеток и увеличением поглощения железа в кишечнике.
Фиг.6A показывает относительные уровни экспрессии рецептора трансферрина (серые столбики) в почках, а также транспортера железа двенадцатиперстной кишки NRAMP2 (природный резистентно-связанный белок макрофагов 2) (известный также как Slc11a2 (семейство переносчиков растворимых веществ 11, связанный с протоном транспортер ионов двухвалентных металлов член 2) по-другому именуемый DCT1 (транспортер двухвалентных катионов 1), DMT1 (транспортер двухвалентных металлов 1)) (черные столбики).
В другом эксперименте мРНК выделяют из малой кишки, отбирая образец через 4 часа после IV введения мыши 60 мг/кг соединения A, соединения B и соединения C. Получают пробы от каждого из двух животных из 5 групп, подвергшихся обработке, и гибридизуют с мышиными микроматрицами Affymetrix MOE430Aplus2 (одно животное на матрицу). Проводят статистическое сравнение данных, полученных из матриц обработанных и необработанных животных. Фиг.6B показывает относительные уровни экспрессии мРНК NRAMP2 в тонком кишечнике, у животных, подвергшихся воздействию соединения A, соединения B и соединения C. Уровни экспрессии для каждого экспрессируемого гена показаны в виде кратности по отношению к контролю, т.е. необработанным животным. Результаты этих экспериментов показывают, что способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения экспрессии NRAMP2 в кишечнике. Кроме того, эти результаты означают, что способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения абсорбции железа и за счет этого для увеличения доступности железа, для синтеза гема, синтеза гемоглобина, выработки красных кровяных телец и эритропоэза.
Фиг.6C показывает кратности превышения экспрессии 5-аминолевулинатсинтазы (ALAS-2) в животных, подвергшихся действию соединений, по сравнению с контрольными животными, которым вводят носитель. Данные показывают, что введение ингибиторов пролилгидроксилазы нормальным животным приводит к увеличению экспрессии генов, принимающих участие в метаболизме железа, включая гены, вовлеченные в абсорбцию железа из кишечника и транспорт железа на периферии через рецепторы трансферрина. Экспрессия этих генов приведена относительно исходных уровней (контроля) через 16 часов после введения дозы. Данные также демонстрируют согласованную экспрессию ALAS-2, т.е. первого фермента на пути синтеза гема, а также скорость-определяющего фермента в этом синтезе, в характерных тканях, после воздействия ингибитора пролилгидроксилазы. Совокупность этих результатов показывает, что соединения по настоящему изобретению согласованно увеличивают экспрессию генов, кодирующих белки, которые вовлечены в активацию эритропоэза, включая абсорбцию железа, транспорт железа и синтез гема.
С другой стороны применяют цитометрический анализ в потоке для измерения поверхностных маркеров клеток макрофагов CD11c и уровней рецептора трансферрина в двойных периферических моноядерных клетках крови, окрашенных с использованием иммунной метки. Активность примененных для обработки соединений показана благодаря тому, что обнаружено увеличение экспрессии рецептора трансферрина макрофагами. Кроме этого плазма может быть собрана и исследована в отношении уровней трансферрина с применением коммерчески доступного набора для ELISA (См., например, KomaBiotech, Korea)
Пример 18
in vivo
: Усиление эритропоэза
Влияние введения соединений по настоящему изобретению на эритропоэз определяют следующим образом. Нормальных мышей превращают в анемичных и поддерживают их в анемичном состоянии путем постоянного введения TNF-α, причем подобный режим, как известно, ингибирует эритропоэз из-за недостаточной выработки и передачи сигналов EPO, в ответ на присутствие TNF-α. После того, как у мышей вызвана анемия, в течение периода от одной до четырех недель животным вводят ингибиторы пролилгидроксилазы. Ткани исследуют на выработку BFU-E и CFU-E и анализируют образцы крови, определяя ее состав. Результаты, показывающие увеличение числа BFU-E и CFU-E в костном мозге, селезенке и на периферии и/или увеличение содержания в сыворотке гемоглобина, ретикулоцитов, а также увеличение гематокрита у животных, подвергшихся воздействию PHIs (ингибиторов пролилгидроксилазы), демонстрируют эффективность данного способа.
Другая экспериментальная животная модель применима для изучения воздействия введения ингибиторов пролилгидроксилазы на эритропоэз. В этой модели у трансгенных мышей в результате конститутивно избыточной экспрессии TNF-α развивается анемия, вызванная хроническим заболеванием. После начала анемии у данных мышей им вводят ингибиторы пролилгидроксилазы в течение различных периодов времени и используя различные стратегии дозирования. Затем отбирают и анализируют образцы тканей и крови. Как указано выше, результаты, показывающие увеличение числа BFU-E и CFU-E в костном мозге, селезенке и на периферии и/или увеличение содержания в сыворотке гемоглобина, ретикулоцитов, а также увеличение гематокрита, эффективно доказывают, что анемия, связанная с избыточной выработкой TNF-α у трансгенных животных, лечится введением ингибиторов пролилгидроксилазы, с применением способов и соединений по настоящему изобретению.
Пример 19
: Увеличение уровней железа в сыворотке.
Мужских и женских особей крыс дважды в неделю (понедельник и четверг) подвергают воздействию соединения A в различных концентрациях (0, 20, 60 или 150 мг/кг) в течение 93 дней. Определяют общие уровни железа в сыворотке.
Таблица 5
Доза
Железо в сыворотке(мкг/дл)Самцы крыс (среднее±ст.откл)
Железо в сыворотке(мкг/дл)Самки крыс (среднее±ст.откл)
0 мг/кг
158±37
342±91
20 мг/кг
198±64
505±41*
60 мг/кг
357±111*
445+46*
150 мг/кг
307±142*
399±117
Как показано в таблице 5, введение соединения A увеличивает уровни железа в сыворотке как у мужских, так и у женских особей (Данные в таблице 5 представлены в виде уровней железа в сыворотке ± стандартное отклонение, * обозначает значительную разницу уровней железа в сыворотке по сравнению с животными, которые не подвергались действию соединения A). Эти результаты показывают, что способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения уровней железа в сыворотке и тем самым применимы для лечения расстройств, связанных с дефицитом железа.
Пример 20
: Эффективность в животных моделях с анемией, вызванной хроническим заболеванием/ослабленным эритропоэзом/ослабленным метаболизмом железа.
Анемия, вызванная хроническим заболеванием (ACD), связана с различными воспалительными состояниями, включая артрит, неопластические заболевания и другие расстройства, связанные с хроническим воспалением. Для исследования результатов стабилизации HIF в качестве модели ACD используют заболевание у крыс, применяя способы и соединения по настоящему изобретению при лечении анемии, связанной с хроническим заболеванием. В этой модели у крыс провоцируют возникновение ACD с помощью пептидогликан-полисахаридных полимеров (См., например, Sartor et al. (1989) Infection and Immunity 57:1177-1185). При этом у животных на начальных стадиях развивается сильная острая анемия, за которой на более поздних стадиях следует умеренно сильная хроническая микроцитарная анемия.
Животная модель ACD - серия экспериментов 1
:
Женским особям крыс Lewis массой около 160 г вводят PG-PS 10S (Lee Laboratories, 15 мкг/г веса тела, интраперитонеально). PG-PS 10S содержит очищенные пептидогликан-полисахаридные полимеры, выделенные из клеточной стенки Streptococcus pyogenes, Group A, штамм D58. Артриту и анемии позволяют развиваться в течение 35 дней. На 35-й день из хвостовой вены под общей анестезией (изофлуран) отбирают образцы крови (приблизительно 400 мкл) для проведения CBC и определения количества ретикулоцитов (выполнено Quality Clinical Labs). Животных, у которых сформировался уровень гематокрита 45% или выше, считают не анемичными и снимают с исследования.
На 35 день после введения PG-PS анемичные животные получают только носитель или им вводят соединение A (60 мг/кг, PO) в течение двух последовательных дней в неделю на протяжении двух недель. Автоматизированный полный анализ крови (CBC) выполняют на 35 день (см.выше), 39, 42 и 49 дни, уровни железа в сыворотке измеряют на 49 день.
Количество ретикулоцитов
Как показано на фиг.7, введение соединения A анемичным животным увеличивает количество ретикулоцитов на 39 день (т.е. через 5 дней после начала введения соединения A). Уровни ретикулоцитов составляют приблизительно 2% и 4% от красных кровяных телец у контрольных животных (не анемичных) и анемичных (обработанных PG-PS) животных соответственно. Однако уровень ретикулоцитов у животных, подвергшихся воздействию соединения A, составляет приблизительно 10% от количества красных кровяных телец. Воздействие соединения A увеличивает количество ретикулоцитов у животных с анемией. Следовательно, соединение A стимулирует эритропоэз в животной модели ACD.
Гематокрит
У анемичных животных, подвергшихся воздействию соединения A, возрастают значения гематокрита. Уровни гематокрита (измерены с помощью Baker 9000 в Quality Clinical Labs) у анемичных животных (обработанных PG-PS) составляют менее 35% по сравнению с 41% у контрольных не анемичных животных. (См. фиг.8). Введение анемичным животным соединения A увеличивает значение гематокрита до 37% только за первые 5 дней после начала воздействия соединения. После введения второй дозы соединения A уровни гематокрита возрастают до приблизительно 40%, т.е. становятся сопоставимыми с уровнями гематокрита, которые наблюдаются у контрольных не анемичных животных. При использовании крыс в качестве модели ACD соединение A увеличивает гематокрит у модельных животных. Следовательно, способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения гематокрита и лечения анемии, вызванной хроническим заболеванием.
Гемоглобин
Кроме этого, введение соединения A увеличивало уровни гемоглобина у анемичных животных. Как показано на фиг.9, на 35 день контрольные не анемичные животные имеют уровень гемоглобина приблизительно 15 г/дл, в то время как уровни гемоглобина у животных, подвергшихся воздействию PG-PS (т.е. анемичных животных) составляют приблизительно 13 г/дл. Как показано на фиг.9, соединение A увеличивает уровни гемоглобина у анемичных животных уже в первые 5 дней (39 день) после введения соединения. Уровни гемоглобина остаются повышенными на 49 день, достигая уровней, сравнимых с контрольными не анемичными животными, и показывая, что соединения по настоящему изобретению восстанавливают нормальные уровни гемоглобина у анемичных животных. Эти результаты показывают, что соединение A повышает гемоглобин у анемичных животных, при использовании крыс в качестве модели ACD. Следовательно, способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения гемоглобина и лечения анемии, вызванной хроническим заболеванием.
Количество красных кровяных телец
Кроме этого, введение соединения A увеличивает количество красных кровяных телец у анемичных животных. Как показано на фиг.10, количество красных кровяных телец возрастает у анемичных животных, подвергшихся воздействию соединения A, по сравнению с животными, которые не подверглись такому воздействию, уже в первые 5 дней после начала введения соединения (т.е. 39 день на фиг.10). Соединение A увеличивает количество красных кровяных телец у анемичных животных, при использовании крысы в качестве модели ACD. Следовательно, способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения количества красных кровяных телец и лечения анемии, вызванной хроническим заболеванием.
Средний корпускулярный объем
По сравнению с не анемичными животными анемичные животные показывают уменьшение среднего корпускулярного объема (См. фиг.11). Анемичные животные, подвергшиеся воздействию соединения A, показывают увеличение среднего корпускулярного объема по сравнению с животными, которым соединение не вводилось, уже в первые 5 дней после введения соединения (день 39 на фиг.11). Средний корпускулярный объем у обработанных животных оставался повышенным по сравнению с необработанными анемичными животными на протяжении всего эксперимента. Эти результаты показывают, что соединение A улучшает (т.е. уменьшает) уровень микроцитоза (микроцитемию, т.е. наличие большого числа микроцитов - аномально малых красных кровяных телец, связанных с различными формами анемии). Следовательно, способы и соединения по настоящему изобретению улучшают/снижают микроцитоз при анемии, вызванной хроническим заболеванием.
Средний корпускулярный гемоглобин
У анемичных животных также наблюдаются сниженные уровни среднего корпускулярного гемоглобина. Как показано на фиг.12, воздействие на анемичных животных соединения A увеличивает уровни среднего корпускулярного гемоглобина выше уровней, наблюдающихся у анемичных животных, которым соединение не вводят. Эти результаты показывают, что способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения уровней среднего корпускулярного гемоглобина.
Животная модель ACD - серия экспериментов 2
Женским особям крыс Lewis с помощью инъекции вводят PG-PS (интраперитонеально). Дают развиваться артриту и анемии в течение 28 дней. Животным вводят соединение A путем принудительного питания через рот дважды в неделю (понедельник и четверг) в течение шести недель, соответственно на 28, 31, 35, 38, 42, 45, 49, 52, 56, 59, 63, 66 и 70 дни после инъекции PG-PS.
Цельную кровь отбирают через хвостовую вену для CBC анализа на 28, 42, 56 и 70 дни. Кроме этого отбирают сыворотку на 70 день для анализа связывания железа. CBC и анализ связывания железа осуществлен Quality Clinical Labs (Mountain View, CA).
Гематокрит
Через 28 дней после введения PG-PS уровни гематокрита у животных понижены. Фиг.13 показывает, что животные, которым инъецирован PG-PS, являются анемичными, уровень гематокрита составляет 85% от уровня гематокрита у животных, которым PG-PS не вводили (т.е. не анемичных животных). (Неделя 0 на фиг.13 соответствует 28 дню в данной методике эксперимента). При воздействии соединения A (40 мг/кг) животные, которым не вводили PG-PS (т.е. не анемичные животные), со временем демонстрируют увеличение уровней гематокрита, до значений более 110%, по отношению к животным, которым не вводили ни PG-PS, ни соединение A. Как показано на фиг.13, введение соединения A анемичным животным приводит к увеличению уровней гематокрита.
Гемоглобин
Введение соединения A повышает уровни гемоглобина как у анемичных, так и у не анемичных животных. Как показано на фиг.14, уровни гемоглобина у не анемичных животных, подвергшихся воздействию соединения A (40 мг/кг), увеличиваются приблизительно до 110% от уровней у не подвергшихся воздействию контрольных животных. (Неделя 0 на фиг.14 соответствует 28 дню в данной методике эксперимента). У анемичных животных уровни гемоглобина возрастают при введении соединения A дважды в неделю в количестве 10 мг/кг, 20 мг/кг или 40 мг/кг. Уровни гемоглобина продолжают расти в течение, как минимум, 4 недель.
Количество красных кровяных телец
Количество красных кровяных телец у анемичных животных меньше, чем у не анемичных животных. Конкретно, количество красных кровяных телец у анемичных животных составляет менее 90% по отношению к аналогичному показателю, наблюдаемому у не анемичных животных на 28 день после инъекции PG-PS. Как показано на фиг.15, количество красных кровяных телец увеличивается у анемичных животных, подвергшихся воздействию соединения A, по сравнению с животными, которые не подвергались действию этого соединения (Неделя 0 на фиг.15 соответствует 28 дню в данной методике эксперимента). Увеличение количества красных кровяных телец наблюдается на протяжении 2 недель после введения соединения, и это количество продолжает увеличиваться на протяжении 6-недельного периода эксперимента.
Средний корпускулярный объем
Анемичные животные демонстрируют снижение среднего корпускулярного объема по сравнению с не анемичными (которым не вводили PG-PS) животными. Как показано на фиг.16, средний корпускулярный объем у животных, которым вводили PG-PS, продолжает уменьшаться с течением времени, демонстрируя, что последствия анемии, вызванной хроническим заболеванием, приводят к микроцитарной анемии (отличающейся, в частности, более низким количеством красных кровяных телец и их меньшим размером) и к неспособности вырабатывать гемоглобин из-за того, что запасы железа недоступны для использования (Неделя 0 на фиг.16 соответствует 28 дню в данной методике эксперимента). Введение соединения A животным с анемией приводит к замедлению уменьшения среднего корпускулярного объема. Следовательно, ингибирование пролилгидроксилазы с применением соединений и способов по настоящему изобретению является эффективным при ослаблении уменьшения среднего корпускулярного объема, связанного с анемией, вызванной хроническим заболеванием, а также с анемией, вызванной дефицитом железа, восстановлении среднего корпускулярного объема, сохранении среднего корпускулярного объема и т.д. Кроме этого, данные показывают, что способы и соединения по настоящему изобретению применимы с целью увеличения доступности накопленного железа для его использования при выработке гемоглобина.
Средний корпускулярный гемоглобин
Животные с анемией имеют пониженные уровни среднего корпускулярного гемоглобина по сравнению с контрольными животными, показывая, что анемия, вызванная хроническим заболеванием, влияет на выработку гемоглобина. Как показано на фиг.17, анемичные животные, которым введено соединение A, с течением времени демонстрируют замедление уменьшения уровней среднего корпускулярного гемоглобина (Неделя 0 на фиг.17 соответствует 28 дню в данной методике эксперимента).
Состояние железа - железо в сыворотке и насыщение трансферрина
Пациенты с анемией, вызванной хроническим заболеванием, с клинической точки зрения отличаются пониженной концентрацией железа в плазме и пониженным насыщением трансферрина. Определяют воздействие соединений по настоящему изобретению на уровни железа в сыворотке и насыщение трансферрина у нормальных и анемичных животных. При использовании животной модели анемии, вызванной хроническим заболеванием, провоцируют развитие анемии у крыс с помощью IP инъекции пептидогликан-полисахаридных полимеров, как описано выше. Артриту и анемии дают развиться в течение 28 дней. Затем животных подвергают воздействию соединения A в различных концентрациях дважды в неделю в течение 6 недель. Определение уровней железа в сыворотке и насыщения трансферрина осуществлено Quality Clinical Labs.
Как показано на фиг.18A, животные с анемией (PG-PS) имеют более низкие уровни содержания железа в сыворотке по сравнению с не анемичными животными (имитация). Введение соединения A приводит к увеличению уровней железа в сыворотке как у анемичных (PG-PS), так и у не анемичных контрольных (имитация) животных. Животные, подвергшиеся воздействию соединения A, имеют увеличенное насыщение трансферрина, по сравнению с не анемичными, не получавшими соединения A животными, и по сравнению с анемичными животными, не получавшими соединения A (См. фиг.18 B). Эти результаты показывают, что способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения уровней железа в сыворотке и процентного насыщения трансферрина.
Абсорбция железа
На 6 неделе введения соединения A животным с анемией (40 мг/кг, дважды в неделю) выполняют микроматричный анализ для определения экспрессии генов, которые кодируют белки, включенные в транспорт и абсорбцию железа в кишечнике. Микроматричный анализ выполняют с применением описанных выше методик, используя матрицу The Rat Genome 230A array (Affymetrix), которая представляет все последовательности в базе данных Rat Unigene database build 99 (National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD), включающие приблизительно 4 699 хорошо охарактеризованных генов крысы, а также приблизительно 10 467 EST (Expression sequence tag) последовательностей и приблизительно 700 не-EST последовательностей.
Как показано на фиг.19, введение соединения A контрольным животным увеличивает экспрессию мРНК для NRAMP2 (неокрашенные столбики) и спроутина (черные столбики). Не подвергшиеся воздействию соединения A анемичные животные (PG-PS) имеют пониженные уровни экспрессии мРНК как для NRAMP2, так и для спроутина. Эти результаты показывают, что анемия, вызванная хроническим заболеванием, связана со сниженной экспрессией белков, включенных в процесс абсорбции железа. Тем не менее анемичные животные, подвергшиеся воздействию соединения A, демонстрируют увеличенную экспрессию NRAMP2 и спроутина в кишечнике (фиг.19). Эти результаты показывают, что способы и соединения по настоящему изобретению применимы для увеличения экспрессии генов, связанных с транспортом и абсорбцией железа. Кроме этого, полученные результаты означают, что соединения по настоящему изобретению увеличивают абсорбцию и транспорт железа у здоровых субъектов, а также у субъектов с анемией, вызванной хроническим заболеванием.
Пример 21
: Улучшение эритропоэза у людей.
Воздействие ингибирования пролилгидроксилазы на эритропоэз у людей изучают следующим образом. Осуществляют пероральное введение соединения A в количестве 20 мг/кг два или три раза в неделю здоровым добровольцам. В различное время после введения соединения у добровольцев отбирают кровь для определения EPO, гемоглобина, гематокрита, количества красных кровяных телец, растворимого рецептора трансферрина и уровней ферритина в сыворотке.
Количество ретикулоцитов
Как показано на фиг.20, введение людям соединения A увеличивает количество ретикулоцитов выше контрольного уровня плацебо. Увеличение числа ретикулоцитов наблюдается у пациентов, которым вводят соединение два или три раза в неделю. У людей, подвергшихся воздействию соединения A, уровни ретикулоцитов увеличиваются более чем до 1,7% от количества красных кровяных телец по сравнению с уровнями приблизительно 1,4% у людей, которым не вводят соединение A. Введение соединения A увеличивает количество ретикулоцитов у людей. Следовательно, способы и соединения по настоящему изобретению применимы для улучшения эритропоэза и тем самым для увеличения уровней ретикулоцитов.
Гематокрит
У людей, подвергшихся воздействию соединения A, возрастают уровни гематокрита. У людей, которым соединение A вводят дважды в неделю в течение 3 недель, уровни гематокрита превышают 46% по сравнению с приблизительно 44% у контрольных плацебо пациентов. Соединение A увеличивает гематокрит у людей. Следовательно, соединения и способы по настоящему изобретению применимы для улучшения эритропоэза и тем самым для увеличения гематокрита.
Количество красных кровяных телец
Введение соединения A увеличивает количество красных кровяных телец у людей. Как показано на фиг.21, у людей, подвергшихся воздействию 20 мг/кг соединения A дважды или трижды в неделю, количество красных кровяных телец увеличивается по сравнению с плацебо контрольными пациентами. Эти данные показывают, что способы и соединения по настоящему изобретению применимы для улучшения эритропоэза и тем самым для увеличения количества красных кровяных телец.
Состояние железа - Растворимый рецептор трансферрина и ферритин в сыворотке.
Представленные выше результаты показывают, что способы и соединения по настоящему изобретению эффективны при увеличении количества ретикулоцитов, красных кровяных телец, повышении гемоглобина и гематокрита у людей. Как показано на фиг.22, введение соединения A людям увеличивает уровни растворимого рецептора трансферрина по сравнению с уровнями, которые наблюдаются у контрольных пациентов, не подвергшихся действию соединений. Увеличение уровней растворимого рецептора трансферрина наблюдается у людей, получавших соединения дважды или три раза в неделю. Максимальная реакция 35% и 31% наблюдается на 21 день у пациентов, получавших лекарство дважды и трижды в неделю соответственно. Средние концентрации sTfR в плазме у плацебо пациентов остаются неизменными. Кроме этого, у людей, подвергшихся воздействию соединения A, уровни ферритина в сыворотке понижаются примерно на 46%, что служит признаком выросшего потребления железа у этих пациентов (См. фиг.23).
Совокупность приведенных данных показывает, что стабилизация HIF с применением соединений и способов по настоящему изобретению приводит к увеличению мобилизации запасов железа, увеличению транспорта железа в костный мозг и увеличению потребления железа для синтеза гемоглобина, эритропоэза и выработки красных кровяных телец.
Различные модификации настоящего изобретения дополнительно к тем, которые представлены и описаны в настоящей заявке, будут очевидны специалисту в данной области техники из предшествующего описания. Имеется в виду, что такие модификации попадают в рамки приложенной формулы изобретения.
Все источники, цитируемые в данной заявке, настоящим включены в заявку во всей полноте посредством ссылки.