Способ получения биомодифицированного белкового продукта из тритикале
METHOD FOR OBTAINING BIOMODIFICATED PROTEIN PRODUCT FROM TRICTICALE

Способ получения биомодифицированного белкового продукта из тритикале.
Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к получению белкового продукта из зернового сырья и может быть использовано при производстве обогащенных белком пищевых продуктов с повышенной пищевой ценностью, а также продуктов, обладающих определенными функционально-технологическими свойствами.
В настоящее время общепризнано, что использование растительных белковых продуктов, других компонентов растительного сырья, полученных с использованием биотехнологических методов в пищевой промышленности целесообразно для создания нового ассортимента продуктов, технологические и функциональные свойства которых могут быть заранее определены за счет применения направленного биокатализа. Это в полной мере касается зернового сырья, и такой зерновой культуры как тритикале, увеличение промышленного производства которой наблюдается в последнее время.
Технологические свойства зерна тритикале сравнительно мало изучены, что объясняет незначительный объем использования тритикале для продовольственных целей. Результаты работ, проводимых в последние годы в ФГБНУ «ВНИИЗ», показали, что мука и другие продукты переработки зерна тритикале могут с успехом быть использованы для производства различных продуктов питания: были сформированы 5 сортов (типов) муки на основе кумулятивных кривых зольности - Т-600, Т-700, Т-800, Т-1200 и Т-2000. Первые три сорта обладали наилучшими технологическими показателями качества, что подтвердила пробная лабораторная выпечка; последние два сорта Т-1200 и Т-2000 содержащие большое количество периферийных частей (зольность 1,2 и 2,0 соответственно) не могут быть использованы в хлебопечении, но содержат большое количество белка (18-25%), других компонентов и могут быть использованы для получения ценных ингредиентов, в т.ч. и модифицированных, полученных с использованием ферментных препаратов (1. Панкратов Г.Н., Мелешкина Е.П., Кандроков Р.Х., Витол И.С. Технологические свойства новых сортов тритикалевой муки / Хлебопродукты. - 2016. - №1 - С. 60-62. 2. Витол И.С, Мелешкина Е.П., Кандроков, Р.Х., Вережникова И.А., Карпиленко Г.П. Биохимическая характеристика новых сортов тритикалевой муки // Хлебопродукты. - 2016. - №2. - С. 42-44).
Ферментативная модификация биополимеров зерна и продуктов его переработки проводится с целью и получения компонентов заданными функционально-технологическими свойствами, которые могут быть использованы в различных отраслях пищевой промышленности (хлебопекарная, кондитерская, пищеконцентратная и др.). В настоящее время широко изучаются возможности использования ферментов целлюлолитического комплекса в композиции с амилолитическими и протеолитическим ферментами для комплексной глубокой переработки зернового сырья и вторичных продуктов переработки зерна.
Известен (RU, патент 2063144, опубл. 10.07.1996) способ получения белкового продукта из пшеничных отрубей. Согласно известному способу проводят щелочное экстрагирование сырья, отделение экстракта от шрота отрубей и последовательное выделение из экстракта крахмало-белковой фракции и целевого продукта, причем экстрагирование сырья проводят в присутствии тиосульфата натрия, взятого в количестве 0,05-1% от массы сырья, при рН 10-11 и температуре 50-60°С, а выделение целевого продукта при рН 4,0-4,5.
Недостатком данного способа является использование агрессивных химических реагентов (гидроксид натрия) и трудоемкость процесса.
Известен (В.В. Колпакова, А.П. Нечаев, А.В. Смирнова. Белок из пшеничных отрубей. Влияние технологических факторов на выход и биологическую ценность. Хранение и переработка сельхозсырья, 1994, №6. С. 34-42) также способ получения белковых продуктов из пшеничных отрубей и их гранулометрической фракции, включающий щелочное экстрагирование сырья при рН 10-11, отделение экстракта от шрота отрубей, выделение из него крахмало-белковой фракции сепарированием и выделение белкового продукта доведением рН оставшегося раствора до 4,0-4,5 и последующим центрифугированием.
Недостатком данного способа является получение белковых препаратов, содержащих повышенные количества тяжелых металлов (свинца, меди, цинка и, особенно, кадмия) при условии неудовлетворительного качества исходного зернового сырья.
Известен способ (Production and characterization of an extesive rapessed protein haydrolysate / Vioque Javier, Sanchez-Vioque Raul, Clemente Alfonso, Pedrockt Justto, Bautiste Juan, Milan Francisso // J. Amer. Oil Chem. Soc. - 1999. - 76, №7, - p. 819-823) получения белкового гидролизата из семян рапса с использованием эндопептидазы (алкалазы 2,4 L FG) - фермента, продуцируемого штаммом Bacillus licheniformis, и экзопептидазы (Flovourzyme-1000 MG), представляющих собой комплекс экзопротеаз из Aspergillus orysae.
Недостатком данного способа является необходимость использования серии ферментных препаратов в довольно больших концентрациях для достижения высокой производительности, что приводит к удорожанию продукта.
Известен (RU, патент 2250026, опубл. 29.11.2010) способ получения белкового продукта из отрубей, включающий щелочное экстрагирование сырья, отделение экстракта от шрота отрубей и последовательное выделение из экстракта крахмало-белковой фракции и целевого продукта, причем отруби перед щелочным экстрагированием подвергают ферментной обработке, ферменты вносят последовательно: вначале пектолитического действия 2,0…5,0 ед. пектолитической активности на 1 г отрубей, затем ксиланазного действия 30…60 ед. ксиланазной активности на 1 г отрубей, и целлюлолитического действия 4,0…9,0 ед. целлюлолитической активности на 1 г отрубей, при этом время обработки каждым ферментным препаратом составляет 40…60 мин при температуре 50±2°С, гидромодуле 10-1…12-1 и нейтральных значениях рН.
Недостатком данного способа является длительность процесса экстрагирования, использование щелочной экстракции и соляной кислоты для осаждения белков, использования серии ферментных препаратов в довольно больших концентрациях для достижения высокой производительности, трудоемкость процесса, что приводит к удорожанию продукта.
Наиболее близким к заявляемому способу можно признать (RU, патент 2604194 С1, опубл. 10.12.2016) способ получения структурно модифицированного продукта из тритикале - гидролизованной тритикалевой муки, предусматривающий модификацию белкового комплекса сырья путем ферментативного гидролиза протеолитическими ферментными препаратами с последующей его остановкой, перед проведением ферментативного гидролиза проводят измельчение зерна тритикале до размера, характеризующегося 100%-ным проходом через сито диаметром 1 мм, смешивание измельченного сырья с водой при гидромодуле 1:4, проведение процесса гидролиза в течение 2 часов при температуре 50-60°С и рН 5,0-6,0, остановку гидролиза нагреванием суспензии при температуре 80-85°С в течение 10-15 мин, разделение полученной суспензии на твердый остаток и жидкую фракцию структурно модифицированного продукта, при этом в качестве протеолитических ферментных препаратов используют Нейтразу 0,8 L или Протеазу GC-106 в количестве 0,5-1,0 ед. ПС/г измельченного сырья.
Недостатком известного способа следует признать использование в качестве сырья муки хлебопекарного качества.
Техническая задача, решаемая посредством разработанного технического решения, состоит в разработке способа ферментативной трансформации тритикалевой муки с высоким содержанием периферийных частей.
Техническим результатом заявленного способа является получение пищевого биомодифицированного белкового продукта из муки с высоким содержанием периферийных частей с повышенным выходом белка, а также, глубины и степени его гидролиза, высокой биологической ценностью, с определенными функционально-технологическими свойствами (водопоглотительной, пенообразующей способностью, жиросвязывающей и жироэмульгирующей способностью, а также стабильностью эмульсии и стойкостью пены).
Для достижения указанного технического результата предложено использовать разработанный способ ферментативной трансформации тритикалевой муки с высоким содержанием периферийных частей. Согласно разработанному способу проводят модификацию некрахмальных полисахаридов и белкового комплекса тритикалевой муки путем ферментативного гидролиза целлюлолитическими и протеолитическими ферментными препаратами с последующей его остановкой, перед проведением ферментативного гидролиза проводят смешивание измельченного сырья с водой, гидролиз проводят при насыщающих концентрациях субстрата, остановку гидролиза осуществляют нагреванием суспензии с последующим разделением полученной суспензии на твердый остаток и жидкую фракцию биомодифицированного продукта, при этом гидролиз проводят в два этапа, причем на первом этапе вносят целлюлолитический ферментный препарат, а на втором этапе вносят протеолитический ферментный препарат, а время проведения каждого этапа составляет 1,5 часа.
Обычно смешивание измельченного сырья с водой проводят при гидромодуле 1:4.
Предпочтительно нагревание суспензии осуществляют до температуры 80±5°С с выдерживанием в течение 10-15 мин.
Состав конкретного зернового субстрата может оказывать влияние на характер протекания процесса протеолиза и изменять используемые значения температуры и рН. Кроме того, при действии ферментного препарата, а не высокоочищенного фермента на сложный гетерогенный субстрат (тритикалевая мука с высоким содержанием периферийных частей), возможны отклонения от классической зависимости начальной скорости реакции гидролиза от концентрации фермента (дозировки ферментного препарата). Указанные отклонения, в свою очередь, связаны с различного рода факторами, например, ингибирующим действием отдельных компонентов зернового субстрата.
В связи с этим, были разработаны оптимальные условия для действия целлюлолитических и протеолитических ферментных препаратов, позволяющие получить продукт с высоким выходом, провести гидролиз некрахмальных полисахаридов и протеолиз белковых веществ конкретного зернового субстрата (тритикалевая мука с высоким содержанием периферийных частей), получить продукты с разным соотношением высоко-, средне- и низкомолекулярных фракций пептидов и количеством аминокислот и, как следствие, с различными функционально-технологическими свойствами.
В состав мультиэнзимных композиций (МЭК-1 и МЭК-2) входили: МЭК-1 ферментные препараты Шеарзим 500 L + Нейтраза 0,8 L; МЭК-2 соответственно Вискоферм L + Дистицим Протацид Экстра. Выбор ферментных препаратов обусловлен различной специфичностью действия и примерно одинаковыми оптимумами действия: оптимум температуры - 50°С; рН 5,5-6,0 для МЭК-1 и 40°С; рН 3,5 для МЭК-2. Оптимальной дозировкой ферментного препарата «Шеарзим 500 L» является 0,30 ед. КС/г муки, а ферментного препарата «Вискоферм L» - 0,40 ед. ЦС/г муки; оптимальные условия проведения ферментативной реакции при действии препаратов микробных протеаз «Нейтраза 0,8 L» и «Дистицим Протацид Экстра» на белки муки тритикале - оптимальная дозировка 0,5 и 0,75 ед. ПС/г муки тритикале соответственно, концентрация субстрата 100 мг/мл. Способ осуществляют следующим образом.
Перед проведением ферментативного гидролиза муку тритикале с высоким содержанием периферийных частей (Т-2000 проход сита 450 мкм и Т-1200 проход сита 250 мкм) смешивали с водой при гидромодуле 1:4, вносили ферментные препараты целлюлолитического и протеолитического действия в 2 этапа. На первом этапе вносили целлюлолитический ферментный препарат. На втором этапе - ферментный препарат суспензии при температуре 80±5°С в течение 10-15 минут, разделяли полученную суспензию на твердый остаток и жидкую фракцию структурно модифицированного продукта. Полученный продукт дополнительно может быть высушен.
Заявляемый способ поясняется следующими примерами.
Пример 1. Мука с высоким содержанием периферийных частей, характеризующаяся проходом через сито 450 мкм и зольностью 2,0% (образец Т-2000) и проходом через сито 250 мкм, с зольностью 1,1-1,2% (образец Т-1200) с смешивали с водой при гидромодуле 1:4, вносили ферментный препарат Шеарзим 500 L в количестве 0,3 ед. КС/г муки. Далее проводили гидролиз при температуре 50°С и рН 5,5-6,0 в течение 1,5 часа. Остановку гидролиза проводили при 80±5°С в течение 15 минут. Далее суспензию центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 минут. Выход РВ и растворимого белка увеличивается в 2 раза по сравнению с исходными значениями. На следующем этапе вносили ферментный препарат Нейтраза 0,8 L в количестве 0,5 ед. ПС/г муки и проводили гидролиз в течение 1,5 ч при тех же условиях. Остановку гидролиза проводили при 80±5°С в течение 15 минут. Далее суспензию центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 минут. Выход белка 85% от его исходного содержания в сырье.
Пример 2. Мука с высоким содержанием периферийных частей, характеризующаяся проходом через сито 450 мкм и зольностью 2,0% (образец Т-2000) и проходом через сито 250 мкм, с зольностью 1,1-1,2% (образец Т-1200), смешивали с водой при гидромодуле 1:4, вносили ферментный препарат Вискоферм L в количестве 0,4 ед. ЦС/г муки. Далее проводили гидролиз при температуре 40°С и рН 3,5 в течение 1,5 часа. Остановку гидролиза проводили при 80±5°С в течение 10 минут. Далее суспензию центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 минут. Выход РВ и растворимого белка увеличивается в 1,5 и 2,5 раза соответственно по сравнению с исходными значениями. На следующем этапе вносили ферментный препарат Дистицим Протацид Экстра в количестве 0,75 ед. ПС/г муки и проводили гидролиз в течение 1,5 ч при тех же условиях. Остановку гидролиза проводили при 80±5°С в течение 10 минут. Далее суспензию центрифугировали при 5000 об/мин в течение 15 минут. Выход белка 87% от его исходного содержания в сырье.
Дополнительно был проведен хроматографический анализ образцов по примерам 1 и 2 с целью выявления степени гидролиза. Для этого на колонку, заполненную гелем с Toyopearl gel HW-55F наносили 5 мл супернатанта. Элюцию проводили дистиллированной водой. Объем собираемых фракций - 4 мл. Регистрацию оптической плотности элюата во фракциях осуществляли при длине волны 280 нм. В качестве контроля использовали водный экстракт тритикалевой муки, полученный при соотношении мука:вода=1:20. Полученные данные приведены в таблицы 1.
Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют, что значительную часть анализируемых белков составляют агломераты белков с молекулярной массой 700000÷350000. При ферментативной модификации их количество снижается примерно в 1,5 и 2,0 раза соответственно для МЭК-1 и МЭК-2. Фракция с молекулярной массой 100000÷50000 Да (IV пик) в образцах с модифицированными по разработанному способу белками тритикалевой муки полностью отсутствует, хотя в контрольном варианте на ее долю приходится 13,46%. Также в варианте с использованием МЭК-2 отсутствует фракция пептидов с массой 25000÷1500 Да (VI пик). Обращает на себя внимание и резкое снижение количества низкомолекулярных белков и высокомолекулярных пептидов с массой 50000÷25000 Да примерно в 3-5 раз, а также средне- и низкомолекулярных пептидов с массой 25000÷1500 Да. Полученные данные свидетельствуют о высокой степени и глубине гидролиза белков тритикалиевой муки по разработанному. Так, доля низкомолекулярных азотистых соединений (≤1000) увеличилась в результате ферментативной модификации в 4-5 раз.
Таким образом методом гель-хроматографии показано, что при использовании МЭК-1 во всех гидролизатах преобладают высоко- и среднемолекулярные продукты протеолиза; а при использовании МЭК-2 низкомолекулярные пептиды и аминокислоты. Модифицированную муку, представляющую собой пасту, подсушивали при 30-45°С, с конечной влажностью 10-12%.
Кроме того, дополнительно была проведена оценка образцов, полученных по примерам 1-2 по функционально-технологическим свойствам. В таблице 2 представлены значения водосвязывающей способности (ВВС); жиросвязывающей способности (ЖСС); жироэмульгирующей способности (ЖЭС); стабильности эмульсии (СЭ); пенообразующей способности (ПОС); стойкости пены (СП).
Исследования были проведены с образцами муки с высоким содержанием периферийных частей (табл. 2).
В образцах муки, прошедшей модификацию с использованием МЭК-1 прослеживается тенденция увеличения ВСС на 21,3…26,0%; ЖСС на ЖЭС 13,8…16,0%; на 7,4…9,0%. В образцах муки, модифицированных с помощью МЭК-2, наоборот, наблюдается снижения этих функциональных характеристик: ВСС на 11,8…18,3%; ЖСС на 6,7…22,3%; ЖЭС на 3,8…4,0%. Стабильность эмульсии и пены модифицированной муки из зерна тритикале снижается: СЭ на 8,7%; СП на 13,4% (опыт 3) и СЭ на 20,7%; СП на 26,7% (опыт 4); СЭ на 9,1%; СП на 27,3% (опыт 5) и СЭ на 8,0%; СП на 30,2% (опыт 6).
Таблица 2 - Функциональные свойства модифицированной муки из тритикале с высоким содержанием периферийных частей
*) Контроль К2 - Мука Т-1200; Опыт 3 - Т-1200 + МЭК-1; Опыт 4 - Т-1200 + МЭК-2
Контроль К3 - Мука Т-2000; Опыт 5 - Т-2000 + МЭК-1; Опыт 6 - Т-2000 + МЭК-2
Полученные результаты свидетельствуют о том, что использование МЭК на основе целлюлолитических и протеолитических ферментных препаратов позволяет проводить глубокую деструкцию белков продуктов переработки зерна тритикале; получать продукты с различной степенью гидролиза и соотношением компонентов по молекулярной массе, что приводит к изменению функциональных свойств исходной муки и позволит найти новые области ее применения в продуктах питания
По результатам, представленным в таблицах 2 можно сделать вывод, что целенаправленный гидролиз ферментными препаратами целлюлолитического и протеолитического действия позволяет получить целевой продукт, обладающий характерными функционально-технологическими свойствами, улучшенными относительно исходных продуктов, обладающий повышенной биологической ценностью, без использования кислотных и щелочных реагентов.