СПОСОБ КОРРЕКЦИИ ВОЗРАСТНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ КОЖИ
METHOD FOR CORRECTION OF AGE-RELATED SKIN CHANGES

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к косметологии, и может быть использовано как метод терапевтического воздействия на пациентов с возрастными изменениями кожи.
Возрастные изменения кожи: ухудшение ее цвета, снижение тургора и эластичности, появление морщин и пигментации отмечаются в различной степени у всех людей обычно в возрасте старше 35-40 лет и постепенно прогрессируют.
Как показывают исследования последних лет, при старении организма, уменьшением в дерме количества клеточных элементов и снижением их активности, прежде всего фибробластов, являющихся в ней наиболее функционально значимыми клетками [6]. Фибробласты непосредственно обеспечивают и регулируют процесс обновление дермы, так как они не только сами участвуют в продукции волокон коллагена, гиалуроновой кислоты и фибронектина, но и за счет синтеза и выделения ими в околоклеточную среду целого спектра различных трофических регуляторных полипептидов, активизируются как анаболические процессы в дерме, так и одновременно обеспечивается катаболизм - деградация старых и поврежденных волокон и белков соединительной ткани под действием активированных металлопротеиназ [6]. В стареющей дерме не только уменьшается количество фибробластов, но и их синтетическая активность снижается значительно быстрее, чем катаболическое действие. Обновление дермы идет медленнее, в ней накапливаются фрагментированные волокна, поэтому количество высокомолекулярных протеогликанов снижается, растет гидрофобность дермального гелевого фильтра, что ведет к уменьшению толщины дермы, снижению в ней влаги, а поэтому потери кожей упругости и появлению морщин [6]
Вторым важным механизмом старения кожи является затруднение выведения из дермы продуктов деградации волокон коллагена и белков и плохая перфузия кожи - недостаточное поступление кислорода к клеткам кожи вследствие возрастного ухудшения микроциркуляции [1, 3, 7].
Коррекция возрастных изменений кожи предполагает комплексное терапевтическое воздействие на оба этих механизма.
В настоящее время для коррекции возрастных изменений кожи предложены различные способы [1, 3, 7], которые условно можно разделить на следующие группы:
1 группа - основана на механическом и химическом освобождении кожи от утолщенного с возрастом рогового слоя: пиллинг и дермабразия, которые уменьшают гипоксию кожи, стимулируют репаративные процессы за счет активации имеющихся в коже клеток, однако, эти способы практически не увеличивают количества функционирующих фибробластов в дерме, могут сопровождаться гиперпигментациями, аллергическими и воспалительными реакциями, а эффект носит временный характер.
2 группа - основана на введении различными способами (путем нанесение на кожу мазей, кремов, гелей, микроинъекций-мезотерапии или внутритканевого электрофареза) в дерму препаратов, содержащих продукты синтеза фибробластов или их отдельные компоненты, чаще всего коллаген или производные гиалуроновой кислоты, что приводит к насыщению внеклеточного вещества дермы влагой и, соответственно, повышает ее эластичность. Терапевтический эффект носит временный характер, т.к. при этом не меняется количество функционирующих в дерме фибробластов. К тому же одностороннее искусственное введение в дерму чужеродных продуктов синтеза фибробластов и белков не только нарушает естественные процессы синтеза и катаболизма в дерме, но и может сопровождаться различной степенью выраженности иммунологической и воспалительной реакции организма в ответ на чужеродный антиген.
3 группа - основана на введение различными способами (путем нанесение на кожу мазей, кремов, гелей, микроинъекций - мезотерапия или внутритканевого электрофареза) в дерму препаратов, активирующих клеточный метаболизм фибробластов и других клеток, тем самым усиливая их функциональную активность и, возможно, в какой-то мере пролиферативную активность. Сходным эффектом обладают различные способы, основанные на воздействии квантовой терапии (свет, лазер, ультрафиолет, инфракрасное излучение), электромагнитного излучения или термического действия (холод, тепло) на кожу. Они к тому же могут локально улучшать микроциркуляцию в зоне воздействия. Терапевтический эффект указанных способов временный, т.к. они, стимулируя активность сохранившихся постаревших клеток, лишь ускоряют и истощают их потенциал к делению, т.е. клетки быстрее достигают лимита Хейфлика и подвергаются апоптозу.
4 группа - основана на использование препаратов (ботокс), содержащих ботулотоксин, вызывающих временный паралич мимической мускулатуры и как следствие временное разглаживание морщин также не решает задачи обновления кожи. Терапевтический эффект временный, требуются повторные введения препарата и возрастания его дозы. К тому же нередки осложнения - парезы, аллергические и воспалительные реакции.
5 группа - основана на хирургической коррекции.
К ним относятся - использование подкожного введения собственного жира, удаленного методом липосакции из других областей организма, для улучшения контура лица этот способ носит временный характер из-за быстрого рассасывания трансплантанта;
введение под кожу различных имплантантов - для улучшения рельефа (золотое армирование и т.д.); оперативная дермабразия, различные пластические операции на коже и подкожной клетчатке. Все эти методы чреваты осложнениями: реакциями отторжения и воспаления.
6 группа - основана на трансплантации в дерму культивированных аллогенных фибробластов, аллогенных эмбриональных клеток. Терапевтический эффект опосредован метаболическим действием вводимых клеток и воспалительной и иммунологической реакции на них организма - реципиента, носит временный характер, не приводит к увеличению количества функционирующих фибробластов, т.к. пересаженные клетки разрушаются и элиминируются в результате иммунологического ответа [6]. Эмбриональные аллогенные клетки человека к тому же опасны онкогенным и тератогенным эффектом [6].
Указанные способы (1-6 группы) коррекции возрастных изменений кожи по своей сущности объединяет то, что все они не основаны на прямом количественном увеличении собственных жизнеспособных и функционирующих фибробластов в дерме в зоне лечения, а потому терапевтический эффект носит временный характер и не затрагивает основу старения кожи - снижения в ней количества активно функционирующих фибробластов [1, 3, 6, 7].
7 группа - наиболее обоснованным и эффективным является метод трансплантации в дерму культуры аутологичных фибробластов [8]. Метод позволяет резко увеличить в дерме количество функционирующих фибробластов. Кроме того, доказано, что в различных участках тела старение кожи протекает с разной скоростью. На защищенных от травматизации и прямого солнечного света участках кожа стареет медленнее, фибробласты там дальше отстоят от барьера Хейфлика, и поэтому именно они наиболее предпочтительны для трансплантации [6].
Вместе с тем, этот способ имеет недостаток - не включает коррекцию нарушений микроциркуляции в коже, и потому не обеспечивает необходимого трансплантированным фибробластам притока кислорода и адекватной возможности выведения продуктов деградации коллагена и белков, что снижает терапевтическую эффективность.
В качестве прототипа изобретения принят наиболее близкий из известных по сущности способов коррекции косметических дефекта кожи - трансплантация в дерму культивированных аутологичных фибробластов [8].
Способ заключается в том, что осуществляют инъекцию суспензии аутологичных фибробластов в дермис и подкожную ткань, прилегающую к косметическому дефекту.
Дермальные аутологичные фибробласты выделяют из культуры биопсийного препарата, взятого от пациента.
Задачей, на решение которой было направлено настоящее изобретение, является создание эффективного способа коррекции возрастных изменений кожи, позволяющего повысить степень воздействия за счет дополнения коррекции количественного дефицита фибробластов в дерме и коррекции нарушений микроциркуляции кожи.
Техническим результатом разработанного способа является повышение эффективности коррекции возрастных изменений кожи: улучшение ее кровоснабжения, увеличение клеточного состава ее дермы и как следствие улучшение ее эластичности и внешнего вида кожи, что фиксируется специальными методами обследования.
Способ коррекции возрастных изменений кожи осуществляется следующим образом: первоначально у пациента в амбулаторных условиях под местной анестезией (аппликация местно-анестезирующей мази EMLA в сочетании с последующим охлаждение кожи жидким азотом) с обеих ягодичных областей на 7-8 см ниже крыла подвздошной кости производится забор в 4 точках эксплантата кожи путем панчбиопсии (диаметром 2 мм каждый). Смыкание краев ран достигается наложением клеящего пластыря Curofix.
Из полученных образцов эксплантата кожи выращивают культуру аутологичных фибробластов в соответствии с нижеприведенной методикой.
Через 2 недели после биопсии кожи пациенту в амбулаторных условиях проводят курс внутрисосудистого лазерного облучения аутокрови (ВЛОК), для чего используют низкоэнергетический гелий-неоновый лазер с длиной волны 632,8 нм (аппараты типа АЛОК, ШАТЛ и подобные, Россия). Мощность на конце выхода световода 2 МВт. Световод вводят в периферическую (кубитальную) вену. Облучению за процедуру подвергают 20±5% объема циркулирующей крови. Курс состоит из 10 процедур, проводимых через сутки. Аналогичный повторный курс ВЛОК проводится через 3 месяца и в дальнейшем может проводиться 2 раза в год с интервалом в полгода для поддержания уровня микроциркуляции.
9
2
2
9
9
9
В зависимости от площади кожи, которую необходимо подвергнуть коррекции, и характера её изменения (локальные глубокие морщины или распространенные мелкие морщины), что устанавливается при первичном осмотре врачом-косметологом, проводится от одной до трех процедур трансплантации аутологичных культивированных фибробластов, которые выполняются с интервалом в две недели из расчета 5×10клеток на 1-2 см крупных морщин или на 5 см мелких морщин методом интрадермальных микроинъекций (мезотерапия). При этом в зоне мелких морщин расстояние между интрадермальными инъекциями составляет 2-2,5 мм, а в зону крупных морщин клетки вводятся методом «папулы». К моменту первой трансплпнтации количество культивированных фибробластов составляет в среднем 35±5×10 клеток, ко второй процедуре еще 20±10×10 клеток, к третьей - еще 20±10×10. При необходимости (недостаточный терапевтический эффект) количество процедур может быть увеличено или курс может быть повторен через год. Контроль за результатом может быть осуществлен на основании динамики данных цифровой фотосъемки зоны коррекции, данных ультразвуковой допплерографии внутрикожного кровотока и при необходимости гистологического исследования кожи.
Таким образом, предлагаемый способ существенно отличается от прототипа, поскольку при этом вследствие воздействия ВЛОК на микроциркуляцию значительно улучшается кровоснабжение кожи, что обеспечивает более оптимальные условия для приживления и функционирования трансплантированных культивированных аутологичных фибробластов в дерме.
Использование панчбиопсии обеспечивает минимальную травматичность манипуляций, высокий косметический эффект и достаточный объем клеточного материала для культивирования.
Методика культивирования аутологичных фибробластов
2
2
2
3
2
6
Эксплантаты помещаются в фосфатно-солевой буферный раствор PBS (MP Biomedicals, США), содержащий пенициллин, стрептомицин (Sigma, США) и амфотерицин-В (MP Biomedicals, США), концентрации которых в два раза превышают те, которые необходимы при культивировании, и сохраняются при температуре 4°С не более 24 часов (время транспортировки в цитологическую лабораторию). Затем эксплантаты трёхкратно промываются в буферном растворе PBS, после чего с помощью специального режущего инструмента их подвергают механической диссоциации на фрагменты размером 0,1 мм и помещают в чашки Петри с культуральной средой под покровное стекло. Культуральную среду готовят на стерильной воде с высокой степенью очистки класса MQ. Среда для культивирования фибробластов состоит из среды D-MEM (Sigma) - 60%, Ham′s F-12 (MP Biomedicals) - 30%, фетальной бычьей сыворотки степени очистки defined (HyClone, США) - 10%. Полученную смесь титруют до рН 7,3 при 5% CO и фильтруют через стерилизующий ацетат-целлюлозный фильтр (диаметр пор 0,2 мкм; Sarstedt, Германия). На начальном этапе культивирования в среду добавляют антибиотики в концентрациях; пенициллин - 100 ЕД/мл, стрептомицин - 100 мкг/мл, амфотерицин-В - 2,5 мкг/мл (Sigma, MP Biomedicals, все антибиотики имеют градацию «для клеточных культур»). Культивирование фибробластов проводят в инкубаторе (типа Sanyo (Япония) при 37°С, 5% GO и 95% влажности. Культуральную среду меняют 1 раз в 3 дня. Ежедневно производят микроскопический контроль за состоянием культуры с использованием фазово-контрастной микроскопии. Клетки, достигшие субконфлюэнтного состояния, снимают при помощи раствора трипсина и ЭДТА (Gibco, США), считают в камере Горяева и пересевают в вентилируемые культуральные матрасы (Sarstedt, Германия) из расчета 3×10/см и помещают в СО - инкубатор. Дальнейшее культивирование проводят при тех же условиях (смена среды, визуальный контроль). Культуру фибробластов выращивают до получения требуемой клеточной массы. По завершении культивирования клетки трипсинизируют, отмывают и используют для исследования и трансплантации. Жизнеспособность клеток определяют по проценту окрашенных в 0,4% растворе трипанового синего. На получение первой порции трансплантата (в среднем 30±10×10 клеток) уходит в среднем 40±5 суток.
Апробация способа.
3
6
I. В соответствии с разработанным способом выполнена серия доклинических хронических экспериментальных исследований на кроликах. 10-двухлетним кроликам-самцам массой 2.8±0,2 кг под комбинированной анестезией (внутривенно ксилазин + местная инфильтрационная анестезия новокаином) выполнялась панчбиопсия кожи (диаметром 2 мм) из 4 точек (по два биоптата с каждого бедра). Одновременно с этим определяли состояние микроциркуляции в коже на спине (определяли фоновую объемную скорость тканевого кровотока Qas (мл/с/см) с помощью ультразвукового высокочастотного доплерографического исследования на приборе «Минимакс-Допплер-К» (ООО «Минимакс», Россия) с использованием датчика с частотой излучения 25 МГц. Проводилось выделение и культивирование фибробластов указанным выше способом в течение 30 суток. Через неделю после биопсии 5 кроликам (основная группа) выполнено внутрисосудистое лазерное облучение аутокрови (ВЛОК) с помощью аппарата «АЛОК» (Россия). Источник излучения - гелий-неоновый лазер с длиной волны 632,8 нм. Мощность на конце выхода световода 2 МВт. Световод вводился в периферическую вену края уха кролика. Облучению за процедуру подвергнуто 15-20% объема циркулирующей крови, время экспозиции составило 5±1 минута. Выполнено 10 процедур ВЛОК с интервалом через день. Остальным 5 кроликам (контрольная группа) лечения не проводилось. Через 45 суток после культивирования всем 10 животным выполнено внутридермальное введение в толщу дермы культуры фибробластов общим количеством 20×10 клеток на спине на площади 16 см методом мезотерапии. Непосредственно перед трансплантацией в зоне инъекции клеток выполнено исследование микроциркуляции в коже. Через 3 месяца после первого курса ВЛОК животным основной группы повторно выполнен курс ВЛОК и контрольное исследование микроциркуляции кожи животным основной и контрольной групп в зоне трансплантации фибробластов. Через 6 месяцев вновь выполнено исследование микроциркуляции в коже спины в зоне трасплантации и взяты участки кожи на гистологическое исследование, где на микроперепаратах исследовалась толщина дермы.
3
Изменение исследованных показателей (М±m) в основной и контрольной группе животных в процессе лечения в зоне трансплантации аутологичных культивированных фибробластов приведены на фиг.1А и фиг.1Б, где: А - динамика скорости внутрикожного кровотока Qas (мл/с/см); Б - динамика толщины дермы (мм).
На фиг.1А приведена динамика объемной скорости внутрикожного кровотока у обследованных групп животных. На фиг. 1Б показана динамика толщины дермы кожи у обследуемых животных.
Результаты исследования показали, что в основной группе показатели микроциркуляции были лучше (Фигура 1А), а толщина дермы в зоне трансплантации фибробластов была больше, чем в контрольной группе (Фигура 1Б). В обеих группах толщина дермы в процессе терапевтического воздействия достоверно увеличивалась по сравнению с исходным состоянием в основном за счет увеличения сетчатого слоя.
6
2
3
II. В соответствии с разработанным способом 6 пациенткам в возрасте 58-68 (63±5) лет под местной анестезией (аппликация мази EMLA в сочетании с последующим охлаждение кожи жидким азотом) с обеих ягодичных областей на 7-8 см ниже крыла подвздошной кости производился забор в 6 точках эксплантата кожи (по два биоптата с каждого бедра) путем панчбиопсии (диаметром 2 мм каждый). Одновременно с этим определяли состояние микроциркуляции в коже левого предплечья с помощью ультразвукового высокочастотного доплерографического исследования на приборе «Минимакс-Допплер-К» (ООО «Минимакс», Россия) с использованием датчика с частотой излучения 25 МГц. Выделение, культивирование аутологичных фибробластов выполнено по методике, описанной выше. 3 Пациенткам (основная группа) через неделю после биопсии выполнено внутрисосудистое лазерное облучение аутокрови (ВЛОК) с помощью аппарата «АЛОК» (Россия). Источник излучения - гелий-неоновый лазер с длиной волны 632,8 нм. Мощность на конце выхода световода 2 МВт. Световод вводился в кубитальную вену. Облучению за процедуру подвергнуто 15-20% объема циркулирующей крови, время экспозиции составило 30±3 минуты. Выполнено 10 процедур ВЛОК с интервалом через день. В контрольной группе лечение ВЛОК не проводилось. Через 45 суток после культивирования всем пациентам выполнена трансплантация 20×10 культивированных аутологичных фибробластов в дерму левого предплечья на площади 16 см методом мезотерапии, непосредственно перед этим выполнено контрольное исследование микроциркуляции в коже левого предплечья. Через 3 месяца после первого курса ВЛОК пациентам основной группы повторно выполнен курс ВЛОК и контрольное исследование микроциркуляции кожи предплечья в зоне трансплантации фибробластов у пациентов основной и контрольной групп. Через 6 месяцев после трансплантации фибробластов вновь выполнено исследование микроциркуляции в коже предплечья в зоне трасплантации и под местной анестезией взяты участки кожи методом панчбиопсии на гистологическое исследование, для исследования толщина дермы и состояния кожи в зоне трансплантации. Изменение исследованных показателей (М±m) в основной и контрольной группе пациентов в процессе лечения в зоне трансплантации аутологичных культивированных фибробластов приведены на фиг.2А - динамика скорости внутрикожного кровотока Qas (мл/с/см) и на фиг.2Б - динамика толщины дермы (мм).
На фиг.2А показана динамика объемной скорости внутрикожного кровотока у обследованных групп пациентов
На фиг.2Б показана динамика толщины дермы кожи у обследуемых пациентов. Результаты исследования показали, что в основной группе показатели микроциркуляции были лучше (фигура 2А), а толщина дермы в зоне трансплантации фибробластов была больше, чем в контрольной группе (фигура 2Б). В обеих группах толщина дермы в процессе лечения достоверно увеличивалась по сравнению с исходным состоянием в основном за счет увеличения сетчатого слоя.
С помощью предложенного способа выполнена коррекция возрастных изменений кожи лица у 5 пациентов в возрасте 48-56 лет (2 мужчин и 3 женщин).
9
Пример 1. Пациент Д., 48 лет предъявлял жалобы на выраженные морщины в околоорбитальной области. Под местной анестезией выполнена панчбиопсия кожи из 4 точек с обеих ягодиц, (диаметр 2 мм).Через неделю после биопсии кожи проведен курс ВЛОК по описанной методике. По описанному способу выполнено приготовление культуры аутологичных фибробластов, которые через 45 суток от начала культивирования в количестве 15×10 были трансплантированы методом мезотерапии в дерму околоорбитальной области с обеих сторон. Через 3 месяц курс ВЛОК повторен. Осмотрен через 12 месяцев после трансплантации - отмечено заметное сглаживание морщин в зоне трансплантации. Субъективная оценка пациентом эффекта коррекции - «хорошо».
9
9
9
Пример 2 Пациентка П., 53 лет предъявляла жалобы на наличие распространенных возникновение морщин на лице, снижение эластичности кожи, её сухость. Под местной анестезией выполнена панчбиопсия кожи из 4 точек с обеих ягодиц (диаметр 2 мм).Через неделю после биопсии кожи проведен курс ВЛОК по описанной методике. По описанному способу выполнено приготовление культуры аутологичных фибробластов, которые через 45 суток от начала культивирования в количестве 40×10 были трансплантированы методом мезотерапии в дерму измененных морщинами участков лица, через 2 недели повторная трансплантация 20 х10 фибробластов и еще через 2 недели трансплантация 10×10 фибробластов. Через 3 месяц курс ВЛОК повторен. Осмотрена через 12 месяцев - тургор и цвет кожи улучшился, кожа стала более эластична, морщины менее выражены. Субъективная оценка пациентом эффекта коррекции - «хорошо».
Список литературы
1. Ахтямов С.Н., Бутов Ю.С. Практическая дерматокосметология (учебное пособие). - М.: Медицина, 2003. - 400 с.
2. Давыденко Т.Е. Внутрисосудистое лазерное облучение крови в комплексной терапии распространенного атеросклероза у больных пожилого и старческого возраста: Диссерт. канд. мед. наук 14.00.27; 14.00.37 / С.-Петербург, гос. мед. университет им. акад. И.П.Павлова. - СПб., 2006. - С.138.
3. Дрибноход Ю.Ю. Косметология (учебное пособие). - М.: Феникс, 2008. - 538 с.
4. Карандашов В.И., Петухов Е.Б., Зродников B.C. Квантовая терапия / Под ред. Н.Р.Палеева: Учебное пособие. - М.: Медицина, 2004. - 336 с.
5. Леонтьева Н.В. Механизм влияния низкоинтенсивного лазерного излучения на систему гемостаза и микроциркуляцию: Диссерт. докт. мед. наук 14.00.16 / С.-Петербург, мед. академия последипломного образования СПб., 2000. - С.458.
6. Макеев О.Г., Зубанов П.С., Улыбин А.И., Измайлов И.Х. и др. Коррекция возрастных изменений кожи лица культивируемыми аутогенными клетками // Госпитальный вестник. - 2006. - №2 (11). - С.2-11.
7. Папий Н.А., Папий Т.Н. Медицинская косметология (руководство для врачей). - М.: МИА, 2008. - 512 с.
8. US патент №5665372, опубл. 09.09.1997.