ХИМЕРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ РЕЦЕПТОРЫ, СПЕЦИФИЧНЫЕ В ОТНОШЕНИИ РЕЦЕПТОРА ТИМУСНОГО СТРОМАЛЬНОГО ЛИМФОПОЭТИНА, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS SPECIFIC FOR THYMIC STROMAL LYMPHOPOIETIN RECEPTOR, AND METHODS FOR USE THEREOF

Перекрестная ссылка на родственные заявки
[0001] Эта заявка на патент испрашивает преимущество предварительной патентной заявки США №61/912948, поданной 6 декабря 2013, и предварительной патентной заявки США №61/991697, поданной 12 мая 2014, каждая из которых включена в данное описание посредством ссылки в полном объеме.
Заявление о федеральной поддержке научных исследований
Настоящее изобретение было создано при поддержке Правительства с № проекта ZIA ВС 011295 Национальным институтом здоровья, Национальным институтом онкологии. Правительство имеет определенные права на изобретение.
Включение посредством ссылки материала, представленного в электронном виде
[0002] Включенный в данный документ в полном объеме посредством ссылки читаемый на компьютере список нуклеотидных/аминокислотных последовательностей, представленный одновременно с данной заявкой и определенный следующим образом: один файл размером 58011 байт ASCII (Text) с названием "718601ST25", созданный 11 сентября 2014 г.
Уровень техники
[0003] Рак является проблемой общественного здравоохранения. Несмотря на успехи в подходах к лечению, таких как химиотерапия, прогноз для многих видов рака продолжает быть плохим. Соответственно, существует неудовлетворенная потребность в дополнительных подходах к лечению рака.
Сущность изобретения
[0004] Данное изобретение относится к химерным антигенным рецепторам (от англ. chimeric antigen receptor, CAR), содержащим антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении рецептора тимусного стромального лимфопоэтина (thymic stromal lymphopoietin receptor, TSLPR), трансмембранный домен и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга. CAR также может содержать внутриклеточный домен 4-1ВВ, спейсер или и то, и другое.
[0005] Другие воплощения данного изобретения предлагают родственные нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессионные векторы, клетки-хозяева, популяции клеток, антитела или их антигенсвязывающие части и фармацевтические композиции, относящиеся к CAR согласно изобретению.
[0006] Дополнительные воплощения данного изобретения предлагают способы обнаружения пролиферативного нарушения, в частности, рака, а также способы лечения или профилактики пролиферативного нарушения, например, рака, у млекопитающих.
Краткое описание графических материалов
[0007] На фиг. 1 представлены графики проточной цитометрии, показывающие связывание анти-TSLPR-антитела 3G11 и коммерчески доступного анти-TSLPR-антитела к пре-В-клеткам острого лимфобластного лейкоза, которые сверхэкспрессируют TSLPR. На оси ординат представлено число событий, на оси х представлена средняя интенсивность флуоресценции. Связывание обнаруживали с помощью фикоэритрин-конъюгированного козлиного противомышиного антитела.
[0008] На фиг. 2 представлены графики проточной цитометрии, показывающие поверхностную экспрессию CD19, CD22 и TSLPR на стабильных лейкозных клеточных линиях и на клетках JH331, полученных из недифференцированных лейкозных клеток пациента, в естественных условиях сверхэкспрессирующих TSLPR, и не могут быть культивированы in vitro. На оси ординат представлено число событий, на оси х представлена средняя интенсивность флуоресценции.
[0009] На фиг. 3 показаны схематические представления коротких и длинных CAR в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
[0010] На фиг. 4 показано схематическое изображение конструкции вектора, кодирующего CAR в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
[0011] На фиг. 5А и 5В показаны графики проточной цитометрии, показывающие трансдукцию человеческих Т-клеток с использованием CAR в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения. На фиг. 5А показано обнаружение CAR с использованием белка L. На фиг. 5В показано обнаружение CAR с использованием конструкции "CD22-белок-Fc".
[0012] На фиг. 6 представлена столбчатая диаграмма, показывающая цитолитическое высвобождение цитокинов Т-клетками, трансдуцированными TSLPR CAR, в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
[0013] На фиг. 7А-7Н и 8А-8Е представлены столбчатые диаграммы, показывающие, что Т-клетки с TSLPR CAR продуцируют широкий спектр воспалительных цитокинов в присутствии как TSLPR-трансдуцированных, так и природно сверхэкспрессирующих ALL-клеток, в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
[0014] На фиг. 9A-D представлены линейные графики, показывающие TSLPR CAR-опосредованный лизис опухолевых клеток в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
[0015] На фиг. 10 показаны изображения уменьшения лейкоза in vivo короткими TSLPR CAR в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения. День 0: 5Е5 клеток REH-TSLPR, день 4: 15Е6 клеток CAR Т. Четвертое животное в столбце с коротким CAR на 23-й день и 30-й день не показано, так как животное умерло из-за синдрома истощения в связи с заболеванием "ксенотрансплантат против хозяина".
[0016] На фиг. 11 представлен точечный график, показывающий сравнение ALL в крови при введении Т-клеток, трансдуцированных различными типами конструкций в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения. Периферическая нагрузка ALL на 27-й день после ADT (адоптивного переноса).
[0017] На фиг. 12А представлен точечный график, показывающий процент и персистенцию CAR Т-клеток in vivo после адоптивного переноса в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения, р составляет 0,0008 для короткого CAR на 27-й день и длинного CAR на 16-й и 27-й день. Есть доказательство увеличения числа Т-клеток с коротким CAR на 16-й день, хотя оно не значимо.
[0018] На фиг. 12В представлен точечный график проточного анализа, показывающий типичное количество CAR-T-клеток в крови в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
[0019] На фиг. 13 представлены изображения, показывающие, что уменьшение лейкоза in vivo посредством TSLPR CAR является специфичным в отношении мишени в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения. День 0: 1Е6 опухолевых клеток; день 16: введение 10Е6 клеток с коротким CAR.
[0020] На фиг. 14 представлена столбчатая диаграмма, показывающая, что Т-клетки, трансдуцированные TSLPR CAR, смещены в сторону CD8 после ADT (на 50-й день) в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения. Перед введением клеток наблюдается немного повышенное относительное число CD4+ CAR Т-клеток после экспансии, опосредованной CD3/CD28-частицами, а на 50-й день после введения преобладают CD8+/TSLPR CAR+ (что измеряется с помощью TSLPR Fc).
[0021] На фиг. 15 представлен точечный график, показывающий физическое распределение TSLPR CAR в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения. CD45RA+CCR7+ являются наивными, CD45RA-CCR7+ являются центральными клетками памяти, a CD45RA+CCR7- являются фенотипом эффекторных Т-клеток памяти.
[0022] На фиг. 16А представлены биолюминесцентные изображения, отслеживающие прогрессию лейкоза при различном лечении in vivo в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
[0023] На фиг. 16B представлен линейный график, показывающий количественную оценку прогрессии лейкоза в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
[0024] На фиг. 16С представлен линейный график, показывающий график выживаемости при введении TSLPR CAR в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
[0025] На фиг. 17 представлены изображения, показывающие снижение высокой нагрузки у пациентов с ксенотрансплантатами TSLPRhi при использовании CAR с коротким TSLPR в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
[0026] На фиг. 18А представлен точечный график, показывающий анализ крови пациентов с ксенотрансплантатами TSLPRhi через 22 дня после введения опухолевых клеток в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения. 1Е6 клеток JH352 или NH362 вводили с 15Е6 Т-клеток с CAR с коротким TSLPR или Т-клеток Lenti-GFP мышам NSG.
[0027] На фиг. 18В представлен точечный график, показывающий анализ костного мозга пациентов с ксенотрансплантатами TSLPRhi через 22 дня после введения опухолевых клеток в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения. 1Е6 JH352 или NH362 вводили с 15Е6 Т-клеток с CAR с коротким TSLPR или Т-клеток Lenti-GFP мышам NSG.
[0028] На фиг. 19 представлены изображения, показывающие лечение пациента JH331-Luc путем введения 1.2Е6 клеток с CAR с коротким TSLPR, где клетки с CAR с коротким TSLPR могут уменьшить ALL у пациентов с ксенотрансплантатами при введении их в такой низкой дозе, как 1,2 миллиона CAR-Т-клеток, в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения,
[0029] На фиг. 20 представлен точечный график, показывающий процент CAR-T-клеток, находящихся в образце крови мышей, в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
[0030] На фиг. 21 представлена столбчатая диаграмма, показывающая смещение CAR-T-клеток от CD4 к CD8 после введения in vivo в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
[0031] На фиг. 22 представлен репрезентативный точечный график на 35-й день после введения лейкоза в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
6
[0032] На фиг. 23 представлен линейный график, показывающий выживаемость после введения клеток агрессивной ALL TSLPRhi мышам NSG с введением TSLPR CAT (2×10/мышь) и без введения на 18-й день (n равный 5/группа) в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
[0033] На фиг. 24 представлены изображения, показывающие результаты, основанные на CAR+ Т-клетках (3Е6) с TSLPR, CD19 и CD22, вводимых мышам NSG, которым привиты ксенотрансплантатная клеточная линия от пациента JH331-Luc, в течение 29 дней в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения. Т-клетки, трансдуцированные GFP (от англ. green fluorescent protein - зеленый флуоресцентный белок), были использованы в качестве отрицательного контроля.
[0034] На фиг. 25А-С представлены линейные графики, показывающие процент лизиса опухолевых клеток с использованием CAR в соответствии некоторыми воплощениями данного изобретения.
[0035] На фиг. 26 представлены изображения, показывающие терапевтическую функцию различных конструкций CAR in vivo в соответствии с некоторыми воплощениями данного изобретения.
Подробное описание изобретения
[0036] Острый лимфобластный лейкоз (acute lymphoblastic leukemia; ALL) представляет собой распространенный онкологический диагноз у детей. В современной химиотерапии ALL детей был достигнут значительный прогресс, так что большинство пациентов излечиваются. Тем не менее, ALL остается частой причиной смерти от рака у детей из-за рецидива заболевания, которое больше не реагирует на цитотоксическую химиотерапию, или в связи с устойчивостью к современному лечению. Кроме того, заболеваемость, вызванная длительной терапией, остается серьезной проблемой, особенно у тех пациентов, которые, как считается, имеют высокий риск рецидива и, таким образом, подвергаются лечению более интенсивными режимами в соответствии с текущими риск-адаптированными протоколами. У взрослых ALL возникает реже, чем у детей, но прогноз для ALL у взрослых хуже, чем у детей, которые проходят стандартную цитотоксическую химиотерапию. Лечение молодых взрослых в соответствии с режимами педиатрического типа улучшило результат, но не до того уровня, который достигается у детей.
[0037] Адоптивный клеточный перенос (adoptive cell transfer, ADT или ACT) T-клеток, генетически модифицированных для экспрессии химерных антигенных рецепторов (CAR), нацеленных на антигены, экспрессированные на лимфоидных клетках, показал высокую активность при В-клеточных злокачественных опухолях, включая ALL, приводя к ремиссии у пациентов, устойчивых к химиотерапии. Поверхностный белок, который является мишенью в большинстве этих испытаний, представляет собой CD19-антиген, который экспрессируется как на доброкачественных, так и на злокачественных В-клетках. Тем не менее, не все пациенты отвечают на лечение, и рецидивы имеют место, в некоторых случаях из-за потери экспрессии CD19. Потеря CD19 также наблюдается после лечения агентами на основе биспецифических антител, нацеленных на CD19 и CD3.
[0038] Значительный прогресс в области геномики привел к выявлению генов и путей, регуляция которых нарушается при ALL. Одной из таких категорий являются те, которые ассоциированы с сигналингом цитокинов, включая ИЛ-7 и, в частности, CD127 (ИЛ-7Р альфа). Тимусный стромальный лимфопоэтин (TSLP) представляет собой цитокин, который имеет CD127, но использует вторую рецепторную цепь, TSLPR (название гена CRLF2) в качестве части гетеродимерного сигнального комплекса. Сверхэкспрессия TSLPR была выявлена у от 5 до 10% детей и взрослых с ALL, в основном за счет транслокаций или делеций, приводящих к образованию альтернативных промоторов. Сверхэкспрессия TSLPR, по-видимому, связана с плохим прогнозом у детей и взрослых с ALL, и очевидно, что активация пути TSLPR является биологически важной для бластов ALL. Кроме того, примерно в 50% случаев повышенная экспрессия TSLPR связана с мутациями в гене IKZF, особенно в подгруппе пациентов с высоким риском. TSLPR, по-видимому, имеет ограниченную экспрессию в нормальной ткани.
[0039] Одно из воплощений данного изобретения предусматривает химерные антигенные рецепторы (CAR), содержащие антигенсвязывающий домен, специфичный в отношении TSLPR, трансмембранный домен и внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга. CAR также может содержать внутриклеточный домен 4-1ВВ, спейсер или и то, и другое.
[0040] Химерный антигенный рецептор (CAR) представляет собой искусственно сконструированный гибридный белок или полипептид, содержащий антигенсвязывающий домен антитела (например, одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv)), связанный с доменами Т-клеточного сигналинга. Характеристики CAR включают их способность перенаправлять Т-клеточную специфичность и реактивность на выбранную мишень МНС-неограниченным образом, используя антигенсвязывающие свойства моноклональных антител. МНС-неограниченное распознавание антигена дает Т-клеткам, экспрессирующим CAR, способность распознавать антиген независимо от процессинга антигена, таким образом, минуя главный механизм избегания опухоли. Более того, при экспрессии в Т-клетках CAR преимущественно не димеризуются с альфа- и бета-цепями эндогенного Т-клеточного рецептора (TCR).
[0041] Фразы "обладает антигенной специфичностью" и "вызывает антигенспецифический ответ", используемые в данном документе, означают, что CAR может специфически связываться и иммунологически распознавать антиген таким образом, что связывание CAR с антигеном вызывает иммунный ответ.
[0042] CAR согласно изобретению обладают антигенной специфичностью к рецептору тимусного стромального лимфопоэтина (TSLPR). TSLPR свверхэкспрессируется на поверхности примерно у 10% взрослых и детей с пре-В-клеточным острым лимфобластным лейкозом (BCP-ALL). Экспрессия TSLPR нормальными, неопухолевыми или незлокачественными клетками является не столь мощной, как экспрессия опухолевыми или раковыми клетками. В связи с этим опухолевые или раковые клетки могут сверхэкспрессировать TSLPR или экспрессировать TSLPR на значительно более высоком уровне по сравнению с экспрессией TSLPR нормальными, неопухолевыми или незлокачественными клетками.
[0043] Не связываясь с конкретной теорией или механизмом, полагают, что, вызывая антигенспецифический ответ против TSLPR, CAR согласно изобретению вызывают одно или более чем одно из следующих явлений: нацеливание и разрушение TSLPR-экспрессирующих раковых клеток, уменьшение или устранение раковых клеток, облегчение инфильтрации мест(а) опухоли иммунными клетками и усиление/удлинение противораковых ответов.
[0044] Данное изобретение предусматривает CAR, содержащий антигенсвязывающий домен, специфический в отношении TSLPR, на основании антител, например, на основании 3G11, описанного в Lu et al., J. Exp. Med., 2009, 206: 2111-9, или на основании 2D10, описанного in Rochman et al., J. Immunol., 2007, 178: 6720-6724 (каждая из статей включена в данный документ посредством ссылки во всей ее полноте). ScFv этих антител содержат вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи. В воплощениях данного изобретения легкая цепь и тяжелая цепь могут содержать любую подходящую комбинацию последовательностей легкой цепи и тяжелой цепи, например, как указано в таблице 1 ниже.
[0045] В одном из воплощений антигенсвязывающий домен содержит линкер. Линкер связывает вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антигенсвязывающего домена. Любой линкер, пригодный для соединения вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, может быть использован в антигенсвязывающих доменах согласно изобретению. В одном из воплощений линкер содержит, состоит или по существу состоит из линкерного домена "глицин - серии". Предпочтительно антигенсвязывающий домен содержит scFv, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи и линкер. В воплощениях данного изобретения легкая цепь, тяжелая цепь и линкер могут содержать любую подходящую комбинацию последовательностей легкой цепи, тяжелой цепи и линкера, как указано в таблице 1 ниже.
[0046] В одном из воплощений данного изобретения антигенсвязывающий домен, который содержит scFv, содержит, состоит или по существу состоит из
или
.
[0047] Вектор, кодирующий аминокислотные последовательности, описанные в данном документе, может включать нуклеиновокислотную последовательность, которая кодирует AS, AT или обе, например ASAT (SEQ ID NO 3), непосредственно перед стартовым кодоном. Эти последовательности не транслируются как часть CAR.
[0048] В одном из воплощений антигенсвязывающий домен содержит лидерную/сигнальную последовательность. Лидерная последовательность может быть расположена на амино-конце вариабельной области тяжелой цепи. Лидерная последовательность может содержать любую подходящую лидерную последовательность. В воплощениях данного изобретения лидерная/сигнальная последовательность может включать последовательность, указанную в таблице 1 ниже. В зрелой форме Т-клетки лидерная последовательность может не присутствовать.
[0049] В одном из воплощений данного изобретения CAR содержит трансмембранный домен. В одном из воплощений данного изобретения трансмембранный домен содержит CD8. CD8 может содержать шарнирный и трансмембранный домен CD8α (CD8 альфа). В предпочтительном воплощении данного изобретения CD8 является человеческим. CD8 может включать меньшую часть, чем весь CD8. В воплощениях данного изобретения CD8 может включать последовательность, указанную в таблице 1 ниже.
[0050] В одном из воплощений данного изобретения CAR содержит внутриклеточный домен Т-клеточного сигналинга, включающий 4-1ВВ (CD137), CD3 дзета (ζ) или их обоих. В предпочтительном воплощении CD3ζ, 4-1ВВ или они оба являются человеческими. 4-1ВВ передает мощный костимуляторный сигнал Т-клеткам, стимулируя дифференцировку и повышая долгосрочную выживаемость Т-лимфоцитов. CD3ζ ассоциируется с TCR, чтобы образовать сигнал, и содержит иммунорецепторные тирозинактивируемые мотивы (immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM). В одном воплощении CAR теряет домен 4-1ВВ. В другом воплощении CAR содержит домен CD28. CD28 представляет собой Т-клеточный маркер, который играет важную роль в костимуляции Т-клеток. 4-1ВВ, CD28, CD3ζ или любой из них может включать меньшую часть, чем весь 4-1ВВ или CD3ζ, соответственно. В воплощениях данного изобретения 4-1ВВ может включать последовательность, указанную в таблице 1 ниже. В воплощениях данного изобретения CD3ζ может включать последовательность, указанную в таблице 1 ниже.
[0051] В одном из воплощений данного изобретения CAR содержит спейсер. Спейсер может находиться между любыми вышеупомянутыми доменами. В одном из воплощений CAR содержит спейсер из константного домена тяжелой цепи IgG (СН2СН3). В еще одном воплощении спейсер может находиться между scFv и трансмембранным доменом. В предпочтительном воплощении последовательность спейсера, например, СН2СН3, является человеческой. В воплощениях данного изобретения спейсер может содержать последовательность, указанную в таблице 1 ниже.
[0052] Воплощения данного изобретения содержат последовательности, указанные в таблице 1 ниже.
[0053] Воплощения данного изобретения включают следующие последовательности в таблице 2, которые содержат последовательности, представленные в таблице 1 выше.
[0054] Воплощения данного изобретения включают следующие последовательности в таблице 3, которые содержат последовательности, представленные в таблице 1 выше, где сигнальный пептид не представлен.
[0055] В объем данного изобретения включены функциональные части описанных CAR согласно изобретению. Термин "функциональная часть", используемый в отношении CAR, относится к любой части или фрагменту CAR согласно изобретению, где часть или фрагмент сохраняет биологическую активность того CAR, частью которого он является (родительского CAR). Функциональные части охватывают, например, те части CAR, которые сохраняют способность распознавать клетки-мишени или обнаруживать, излечивать или предотвращать заболевание в подобной степени, в той же степени или в большей степени, чем родительский CAR. В отношении родительского CAR функциональная часть может содержать, например, примерно 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% или более от родительского CAR.
[0056] Функциональная часть может содержать дополнительные аминокислоты на амино- или карбокси-конце или на обоих концах, где дополнительные аминокислоты не присутствуют в аминокислотной последовательности родительского CAR. Желательно, чтобы дополнительные аминокислоты не мешали биологической функции функциональной части, например, распознаванию клеток-мишеней, обнаружению рака, лечению или профилактике рака и т.д. Более предпочтительно, чтобы дополнительные аминокислоты повышали биологическую активность по сравнению с биологической активностью родительского CAR.
[0057] В объем данного изобретения включены функциональные варианты описанных CAR согласно изобретению. Термин "функциональный вариант", используемый в данном документе, относится к CAR, полипептиду или белку, имеющему существенную или значительную идентичность или сходство последовательности с родительским CAR, при этом функциональный вариант сохраняет биологическую активность того CAR, вариантом которого он является. Функциональные варианты охватывают, например, те варианты CAR, описанного в данном документе (родительского CAR), которые сохраняют способность распознавать клетки-мишени в подобной степени, в той же степени или в большей степени, чем родительский CAR. В отношении родительского CAR функциональный вариант может быть по меньшей мере примерно на 30%, 50%, 75%, 80%, 90%, 98% или более идентичен аминокислотной последовательности родительского CAR.
[0058] Функциональный вариант может, например, включать аминокислотную последовательность родительского CAR по меньшей мере с одной консервативной аминокислотной заменой. Альтернативно или дополнительно, функциональные варианты могут содержать аминокислотную последовательность родительского CAR по меньшей мере с одной неконсервативной аминокислотной заменой. В этом случае предпочтительно, чтобы неконсервативная аминокислотная замена не мешала или не ингибировала биологическую активность функционального варианта. Неконсервативная аминокислотная замена может повышать биологическую активность функционального варианта, так что биологическая активность функционального варианта увеличивается по сравнению с родительским CAR.
[0059] Аминокислотные замены в CAR согласно изобретению предпочтительно являются консервативными аминокислотными заменами. Консервативные аминокислотные замены известны в данной области и включают аминокислотные замены, в которых одна аминокислота с определенными физическими и/или химическими свойствами заменена на другую аминокислоту с такими же или подобными химическими или физическими свойствами. Например, консервативная аминокислотная замена может быть кислой/отрицательно заряженной полярной аминокислотой, замененной на другую кислую/отрицательно заряженную полярную аминокислоту (например, Asp или Glu), аминокислотой с неполярной боковой цепью, замененной на другую аминокислоту с неполярной боковой цепью (например, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val и т.д.), основной/положительно заряженной полярной аминокислотой, замененной на другую основную/положительно заряженную полярную аминокислоту (например, Lys, His, Arg и т.д.), незаряженной аминокислотой с полярной боковой цепью, замененной на другую незаряженную аминокислоту с полярной боковой цепью (например, Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr и т.п.), аминокислотой с бета-разветвленной боковой цепью, замененной на другую аминокислоту с бета-разветвленной боковой цепью (например, Ile, Thr и Val), аминокислотой с ароматической боковой цепью, замененной на другую аминокислоту с ароматической боковой цепью (например, His, Phe, Trp и Tyr) и т.д.
[0060] Кроме того, аминокислоты могут быть добавлены или удалены из последовательности на основе векторного дизайна. Например, SEQ ID NO 34, добавленные аминокислоты из-за векторного дизайна на сайте BspEI в векторе, могут быть удалены из CAR, описанных в данном документе, например, удалены из последовательностей в таблице 2, таблице 3 или обеих.
[0061] CAR может состоять по существу из конкретной аминокислотной последовательности или последовательностей, описанных в данном документе, так что другие компоненты, например, другие аминокислоты, существенно не изменяют биологическую активность функционального варианта.
[0062] CAR согласно воплощениям данного изобретения (в том числе их функциональные части и функциональные варианты) могут быть любой длины, т.е. могут содержать любое число аминокислот, при условии, что CAR (или их функциональные части или функциональные варианты) сохраняют их биологическую активность, например, способность специфически связываться с антигеном, обнаруживать больные клетки у млекопитающего или лечить или предотвращать заболевание у млекопитающего и т.д. Например, CAR может иметь длину от примерно 50 до примерно 5000 аминокислот, например 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 или более аминокислот.
[0063] CAR согласно воплощениям данного изобретения (в том числе их функциональные части и функциональные варианты) могут содержать синтетические аминокислоты вместо одной или более чем одной природной аминокислоты. Такие синтетические аминокислоты известны в данной области и включают, например, аминоциклогексановую карбоновую кислоту, норлейцин, α-амино-n-декановую кислоту, гомосерин, S-ацетиламинометилцистеин, транс-3- и транс-4-гидроксипролин, 4-аминофенилаланин, 4-нитрофенилаланин, 4-хлорофенилаланин, 4-карбоксифенилаланин, β-фенилсерин-β-гидроксифенилаланин, фенилглицин, α-нафтилаланин, циклогексилаланин, циклогексилглицин, индолин-2-карбоновую кислоту, 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновую кислоту, аминомалоновую кислоту, моноамид аминомалоновой кислоты, N'-бензил-N'-метиллизин, N',N'-дибензиллизин, 6-гидроксилизин, орнитин, α-аминоциклопентановую карбоновую кислоту, α-аминоциклогексановую карбоновую кислоту, α-аминоциклогептановую карбоновую кислоту, α-(2-амино-2-норборнан)карбоновую кислоту, α,γ-диаминомасляную кислоту, α,β-диаминопропионовую кислоту, гомофенилаланин и α-трет-бутилглицин.
[0064] CAR согласно воплощениям данного изобретения (в том числе функциональные части и функциональные варианты) могут быть гликозилированными, амидированными, карбоксилированными, фосфорилированными, этерифицированными, N-ацилированными, циклизованными, например, через дисульфидный мостик, или могут быть превращены в соль присоединения кислоты и/или, возможно, димеризованы, полимеризованы или конъюгированы.
rd
[0065] CAR согласно воплощениям данного изобретения (в том числе их функциональные части и функциональные варианты) могут быть получены способами, известными в данной области. CAR могут быть изготовлены с помощью любого подходящего способа изготовления полипептидов или белков. Подходящие способы синтеза полипептидов и белков de novo описаны в статьях, таких как Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2001; и в патенте США 5449752. Кроме того, полипептиды и белки могут быть рекомбинантно получены с использованием нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, с помощью стандартных рекомбинантных способов. См., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2001; и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994. Кроме того, некоторые из CAR согласно изобретению (в том числе функциональные части и функциональные варианты) могут быть выделены и/или очищены из источника, такого как растение, бактерия, насекомое, млекопитающее, например, крыса, человек и т.д. Способы выделения и очистки хорошо известны в данной области. Альтернативно, описанные в данном документе CAR (в том числе их функциональные части и функциональные варианты) могут быть коммерчески синтезированы рядом компаний. В этой связи CAR согласно изобретению могут быть синтетическими, рекомбинантными, выделенными и/или очищенными.
[0066] Воплощение данного изобретения также предусматривает антитело или его антигенсвязывающую часть, которая специфически связывается с эпитопом CAR согласно изобретению. Антитело может представлять собой любой тип иммуноглобулина, который известен в данной области. Например, антитело может быть любого изотипа, например, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM и т.д. Антитело может быть моноклональным или поликлональным. Антитело может быть природным антителом, например, антителом, выделенным и/или очищенным из млекопитающего, например, мыши, кролика, козы, лошади, курицы, хомяка, человека и т.д. Альтернативно, антитело может быть генно-инженерным антителом, например, гуманизированным антителом или химерным антителом. Антитело может находиться в мономерной или полимерной форме. Кроме того, антитело может иметь любой уровень аффинности или авидности к функциональной части CAR согласно изобретению.
[0067] Способы анализа антител на способность связываться с какой-либо функциональной частью CAR согласно данному изобретению известны в данной области и включают любой анализ связывания "антиген - антитело", такой как, например, радиоиммуноанализ (RIA), иммуно-ферментный анализ (ИФА или ELISA, от англ. enzyme-linked immunosorbent assay), вестерн-блот, иммунопреципитация и анализы конкурентного ингибирования (см., например, Janeway et al., см. ниже, публикацию патентной заявки США №2002/0197266 А1 и патент США №7338929).
th
[0068] Подходящие способы получения антител хорошо известны в данной области. Например, стандартные гибридомные способы описаны в Köhler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), и C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). Альтернативно, в данной области известны и другие способы, такие как EBV-гибридомные способы (Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984), и Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)), и экспрессионные системы на основе бактериофаговых векторов (см., например, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)). Кроме того, способы получения антител на животных описаны, например, в патентах США 5545806, 5569825 и 5714352, а также в заявке на патент США 2002/0197266 А1 и в патенте США №7338929.
[0069] Кроме того, для создания антитела можно использовать фаговый дисплей. В связи с этим фаговые библиотеки, кодирующие антигенсвязывающие вариабельные (V) домены антител, могут быть получены с использованием стандартной молекулярной биологии и методик рекомбинантной ДНК (см., например, Sambrook et al., см. выше, и Ausubel et al., см. выше). Фаг, кодирующий вариабельную область с нужной специфичностью, выбирают по специфическому связыванию с нужным антигеном и восстанавливают полное или частичное антитело, содержащее выбранный вариабельный домен. Нуклеиновокислотные последовательности, кодирующие восстановленное антитело, вводят в подходящую клеточную линию, такую как клетка миеломы, которая используется для получения гибридомы, так что клетка секретирует антитела с характеристиками моноклональных антител (см., например, Janeway et al., см. выше, Huse et al., см. выше, и патент США №6265150).
[0070] Антитела могут быть получены с помощью трансгенных мышей, которые являются трансгенными по специфическим генам тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина. Такие способы известны в данной области и описаны, например, в патентах США 5545806 и 5569825, а также в Janeway et al., см. выше.
[0071] Способы получения гуманизированных антител хорошо известны в данной области и описаны подробно, например, в Janeway et al., см. выше, патентах США 5225539, 5585089 и 5693761, европейском патенте №0239400 В1 и патенте Великобритании №2188638. Гуманизированные антитела также могут быть получены с использованием методики перекладки антитела, описанной в патенте США 5639641 и в Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959-973 (1994).
2
[0072] Одно из воплощений данного изобретения также предусматривает антигенсвязывающие части любого из антител, описанных в данном документе. Антигенсвязывающая часть может быть любой частью, которая имеет по меньшей мере один антигенсвязывающий сайт, например Fab, F(ab'), dsFv, sFv, димерные и тримерные антитела.
[0073] Одноцепочечный фрагмент вариабельной области (sFv) антитела может быть получен с использованием стандартных методик рекомбинантной ДНК (например, Janeway et al., см. выше). Аналогичным образом, стабилизированные дисульфидным мостиком вариабельные фрагменты (dsFv) могут быть получены с помощью методики рекомбинантной ДНК (см., например, Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). Тем не менее, фрагменты антител согласно изобретению не ограничиваются этими иллюстративными типами фрагментов антител.
[0074] Кроме того, антитело или его антигенсвязывающая часть могут быть изменены так, чтобы включать обнаруживаемую метку, такую как, например, радиоактивный изотоп, флуорофор (например, флуоресцеин изотиоцианат (FITC), фикоэритрин (РЕ)), фермент (например, щелочную фосфатазу, пероксидазу хрена) и элементарные частицы (например, частицы золота).
[0075] Другим воплощением данного изобретения также является нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую любой из описанных в данном документе CAR (включая их функциональные части и функциональные варианты). Нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую любую из лидерных последовательностей, антигенсвязывающих доменов, трансмембранных доменов и/или внутриклеточных доменов Т-клеточного сигналинга, описанных в данном документе.
[0076] В некоторых воплощениях нуклеотидная последовательность может быть оптимизированной по кодонам. Не привязываясь к определенной теории, полагают, что оптимизация нуклеотидной последовательности по кодонам увеличивает эффективность трансляции транскриптов мРНК. Оптимизация нуклеотидной последовательности по кодонам может включать замену нативного кодона на другой кодон, который кодирует ту же аминокислоту, но может быть транслирован с помощью т-РНК, которая является более доступной в клетке, тем самым увеличивая эффективность трансляции. Оптимизация нуклеотидной последовательности также может уменьшать вторичные структуры мРНК, которые могли бы помешать трансляции, таким образом, повышая эффективность трансляции.
[0077] В одном из воплощений данного изобретения нуклеиновая кислота может содержать оптимизированную по кодонам нуклеотидную последовательность, которая кодирует антигенсвязывающий домен CAR согласно изобретению. В другом воплощении данного изобретения нуклеиновая кислота может включать оптимизированную по кодонам нуклеотидную последовательность, которая кодирует любой из описанных в данном документе CAR (включая функциональные части и их функциональные варианты).
[0078] Понятие "нуклеиновой кислоты", используемое в данном документе, включает "полинуклеотид", "олигонуклеотид" и "нуклеиновокислотную молекулу" и обычно обозначает полимер ДНК или РНК, который может быть одноцепочечным или двухцепочечным, синтезированным или полученным (например, выделенным и/или очищенным) из природных источников, который может содержать природные, неприродные или измененные нуклеотиды, и который может содержать природную, неприродную или измененную межнуклеотидную связь, например, фосфорамидатную связь или фосфоротиоатную связь, вместо фосфодиэфирной, находящейся между нуклеотидами немодифицированного олигонуклеотида. В некоторых воплощениях нуклеиновая кислота не содержит никаких вставок, делеций, инверсий и/или замен. Тем не менее, в некоторых случаях может быть подходящим, как описано в данном документе, чтобы нуклеиновая кислота включала одну или более чем одну вставку, делецию, инверсию и/или замену.
[0079] Нуклеиновые кислоты согласно воплощению данного изобретения могут быть рекомбинантными. Используемый в данном документе термин "рекомбинантный" относится к (i) молекулам, которые создаются вне живых клеток путем присоединения природных или синтетических нуклеиновокислотных сегментов к нуклеиновокислотным молекулам, которые могут реплицироваться в живой клетке, или к (ii) молекулам, которые являются результатом репликации таких молекул, которые описаны в (i) выше. Для целей данного изобретения репликация может быть репликацией in vitro или репликацией in vivo.
6
6
6
[0080] Рекомбинантная нуклеиновая кислота может быть такой, которая имеет неприродную последовательность, или такой, которая имеет последовательность, полученную путем искусственного объединения двух сегментов последовательности, в противном случае разделенных. Это искусственное объединение часто осуществляется путем химического синтеза или, чаще, путем искусственной манипуляции с выделенными сегментами нуклеиновых кислот, например, с помощью методик генной инженерии, таких как те, которые описаны в Sam brook et al., см. выше. Нуклеиновые кислоты могут быть сконструированы на основе химического синтеза и/или ферментативных реакций лигирования с использованием процедур, известных в данной области. См., например, Sam brook et al., см. выше, и Ausubel et al., см. выше. Например, нуклеиновая кислота может быть химически синтезирована с использованием природных нуклеотидов или различным образом модифицированных нуклеотидов, разработанных для повышения биологической стабильности молекул или для повышения физической стабильности дуплекса, формирующегося при гибридизации (например, фосфоротиоатные производные и акридин-замещенные нуклеотиды). Примеры модифицированных нуклеотидов, которые могут быть использованы для создания нуклеиновых кислот, включают, но не ограничиваясь ими, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-хлорурацил, 5-йодурацил, гипоксантин, ксантин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксилметил)урацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тиоуридин, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, бета-D-галактозилквеозин, инозин, N-изопентениладенин, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N-замещенный аденин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тиоурацил, бета-D-маннозилквеозин, 5'-метоксикарбоксиметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-N-изопентениладенин, урацил-5-оксиуксусную кислоту (v), вибутоксозин, псевдоурацил, квеозин, 2-тиоцитозин, 5-метил-2-тиоурацил, 2-тиоурацил, 4-тиоурацил, 5-метилурацил, метиловый эфир урацил-5-оксиуксусной кислоты, 3-(3-амино-3-N-2-карбоксипропил)урацил и 2,6-диаминопурин. Альтернативно, одна или более чем одна нуклеиновая кислота согласно изобретению может быть приобретена у таких компаний как Integrated DNA Technologies (Коралвилл, Айова, США).
[0081] Нуклеиновая кислота может содержать любую из выделенных или очищенных нуклеотидных последовательностей, которые кодируют любой из CAR или их функциональных частей или функциональных вариантов. Альтернативно, нуклеотидная последовательность может содержать нуклеотидную последовательность, которая вырождена до любой из последовательностей, или комбинацию вырожденных последовательностей.
[0082] Одно из воплощений данного изобретения также предусматривает выделенную или очищенную нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, которая комплементарна нуклеотидной последовательности любой из нуклеиновых кислот, описанных в данном документе, или нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеотидной последовательностью любой из нуклеиновых кислот, описанных в данном документе.
[0083] Нуклеотидная последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях, может гибридизоваться в условиях высокой жесткости. Под "условиями высокой жесткости" понимают, что нуклеотидная последовательность специфически гибридизуется с целевой последовательностью (нуклеотидной последовательностью любой из нуклеиновых кислот, описанных в данном документе) в количестве, которое обнаруживается сильнее, чем неспецифическая гибридизация. Условия высокой жесткости включают условия, которые бы позволили отличить полинуклеотид с точной комплементарной последовательностью или полинуклеотид, содержащий только несколько разрозненных несоответствий, от случайной последовательности, в которой оказалось несколько небольших областей (например, от 3 до 10 оснований), совпадающих с данной нуклеотидной последовательностью. Такие небольшие области комплементарности легче плавятся, чем полноразмерный комплемент длиной от 14 до 17 или более оснований, и гибридизация в условиях высокой жесткости позволяет их легко отличить. Условия относительно высокой жесткости будут включать, например, низкое содержание солей и/или высокотемпературные условия, например, примерно от 0,02 до 0,1 М NaCl или эквивалентное этому, при температуре примерно от 50 до 70°С. Такие условия высокой жесткости переносят небольшие несоответствия, если таковые имеются, между нуклеотидной последовательностью и матричной или целевой цепью и особенно подходят для обнаружения экспрессии какого-либо из CAR согласно изобретению. Как правило, считается, что условия можно сделать более жесткими путем добавления возрастающих количеств формамида.
[0084] Данное изобретение также предусматривает нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 70% или более, например, примерно на 80%, примерно на 90%, примерно на 91%, примерно на 92%, примерно на 93%, примерно на 94%, примерно на 95%, примерно на 96%, примерно на 97%, примерно на 98% или примерно на 99% идентична любой из нуклеиновых кислот, описанных в данном документе.
[0085] В одном воплощении нуклеиновые кислоты согласно изобретению могут быть встроены в рекомбинантный экспрессионный вектор. В связи с этим воплощение данного изобретения предусматривает рекомбинантные экспрессионные векторы, содержащие любую из нуклеиновых кислот согласно изобретению. Для целей данного изобретения термин "рекомбинантный экспрессионный вектор" означает генетически модифицированную олигонуклеотидную или полинуклеотидную конструкцию, которая позволяет экспрессировать мРНК, белок, полипептид или пептид клеткой-хозяином, где указанная конструкция содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую мРНК, белок, полипептид или пептид, а вектор контактирует с клеткой в условиях, подходящих для того, чтобы мРНК, белок, полипептид или пептид экспрессировались в клетке. Векторы согласно данному изобретению не являются природными в виде целых молекул. Тем не менее, части векторов могут иметь природное происхождение. Рекомбинантные экспрессионные векторы согласно изобретению могут содержать любой тип нуклеотидов, в том числе, но не ограничиваясь ими, ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, синтезированными или полученными частично из природных источников, и которые могут содержать природные, неприродные или измененные нуклеотиды. Рекомбинантные экспрессионные векторы могут включать природные или неприродные межнуклеотидные связи или оба типа связей. Предпочтительно, неприродные или измененные нуклеотиды или межнуклеотидные связи не препятствуют транскрипции или репликации вектора.
[0086] В одном из воплощений рекомбинантный экспрессионный вектор согласно изобретению может быть любым подходящим рекомбинантным экспрессионным вектором и может быть использован для трансформации или трансфекции любой подходящей клетки-хозяина. Подходящие векторы включают те, которые предназначены для размножения и экспансии, для экспрессии или для того и другого, например, плазмиды и вирусы. Вектор может быть выбран из группы, включающей серию pUC (Fermentas Life Sciences, Глен-Берни, Мэриленд), серию pBluescript (Stratagene, Ла-Хойя, Калифорния), серию рЕТ (Novagen, Мэдисон, Висконсин), серию pGEX (Pharmacia Biotech, Уппсала, Швеция) и серию рЕХ (Clontech, Пало-Альто, Калифорния). Также могут быть использованы бактериофаговые векторы, такие как λGT10, λGT11, λZapll (Stratagene), λEMBL4 и λNM1149. Примеры векторов для экспрессии в растениях включают pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 и pBIN19 (Clontech). Примеры векторов для экспрессии в животных включают pEUK-Cl, рМАМ и pMAMneo (Clontech). Рекомбинантный экспрессионный вектор может быть вирусным вектором, например, ретровирусным вектором или лентивирусным вектором.
[0087] Многие методики трансфекции хорошо известны в данной области (см., например Graham et al., Virology, 52: 456-467 (1973); Sambrook et al., см. выше; Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier (1986); и Chu et al., Gene, 13: 97 (1981). Способы трансфекции включают, например, копреципитацию фосфатом кальция (например, Graham et al., см. выше); прямую микроинъекцию в культивируемые клетки (например, см. Capecchi, Cell, 22: 479-488 (1980)); электропорацию (например, см. Shigekawa et al., BioTechniques, 6: 742-751 (1988)); опосредованный липосомами перенос гена (например, см. Mannino et al., BioTechniques, 6: 682-690 (1988)), липид-опосредованную трансдукцию (например, см. Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987)) и доставку нуклеиновой кислоты с использованием микроснарядов высоких скоростей (см., например, Klein et al., Nature, 327: 70-73 (1987)).
[0088] В одном из воплощений рекомбинантные экспрессионные векторы согласно данному изобретению могут быть получены с использованием стандартных методик рекомбинантной ДНК, описанных, например, в Sambrook et al., см. выше, и Ausubel et al., см. выше. Конструкции экспрессионных векторов, которые являются кольцевыми или линейными, могут быть изготовлены так, чтобы они содержали систему репликации, функционирующую в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине. Системы репликации могут быть получены, например, из ColEI, плазмиды 2 μ, λ, SV40, вируса папилломы крупного рогатого скота и т.п.
[0089] Рекомбинантный экспрессионный вектор может содержать регуляторные последовательности, такие как кодоны инициации и терминации транскрипции и трансляции, которые специфичны для конкретного типа клетки-хозяина (например, бактерии, гриба, растения или животного), в которую вектор будет введен, при необходимости и с учетом того, основан ли вектор на ДНК или РНК. Рекомбинантный экспрессионный вектор может содержать сайты рестрикции для облегчения клонирования.
[0090] Рекомбинантный экспрессионный вектор может включать один или более чем один маркерный ген, который позволяет отбирать трансформированные или трансфицированные клетки-хозяева. Гены-маркеры включают устойчивость к биоцидным веществам, например, устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам и т.д., комплементацию в ауксотрофном хозяине для получения прототрофии и т.п. Подходящие гены-маркеры для экспрессионных векторов согласно изобретению включают, например, гены устойчивости к неомицину/G418, гены устойчивости к гигромицину, гены устойчивости к гистидинолу, гены устойчивости к тетрациклину и гены устойчивости к ампициллину.
[0091] Рекомбинантный экспрессионный вектор может включать нативный или ненативный промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, кодирующей CAR (включая его функциональные части или функциональные варианты), или с нуклеотидной последовательностью, которая комплементарна или которая гибридизуется с нуклеотидной последовательностью, кодирующей CAR. Выбор промоторов, например, сильного, слабого, индуцируемого, специфического к ткани или специфического к развитию, находится в пределах квалификации специалиста в данной области. Аналогичным образом, объединение нуклеотидной последовательности с промотором также находится в пределах квалификации специалиста в данной области. Промотор может быть невирусным промотором или вирусным промотором, например, цитомегаловирусным (CMV) промотором, промотором SV40, промотором RSV или промотором, найденным в длинном концевом повторе вируса мышиных стволовых клеток.
[0092] Рекомбинантные экспрессионные векторы согласно изобретению могут быть сконструированы либо для временной экспрессии, либо для стабильной экспрессии, либо для той и другой экспрессии. Кроме того, рекомбинантные экспрессионные векторы могут быть сконструированы для конститутивной экспрессии или для индуцибельной экспрессии.
[0093] Кроме того, рекомбинантные экспрессионные векторы могут быть сконструированы так, чтобы они включали ген самоубийства. Используемый в данном документе термин "ген самоубийства" относится к гену, который вызывает гибель клетки, экспрессирующей ген самоубийства. Ген самоубийства может быть геном, который придает чувствительность к агенту, например, лекарственному препарату, той клетке, в которой экспрессируется данный ген, и вызывает гибель клетки, когда клетка контактирует с этим агентом или подвергается его воздействию. Гены самоубийства известны в данной области (см., например, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004) и включают, например, ген тимидинкиназы (ТК) вируса простого герпеса (HSV), цитозиндеаминазы, фосфорилазы пуринового нуклеозида и нитроредуктазы.
[0094] В объем данного изобретения включены конъюгаты, например, биоконъюгаты, включающие любой из CAR согласно изобретению (в том числе любую из их функциональных частей или вариантов), нуклеиновых кислот, рекомбинантных экспрессионных векторов, клеток-хозяев, популяций клеток-хозяев, антител или их антигенсвязывающих частей. Конъюгаты, а также способы синтеза конъюгатов в целом, известны в данной области (см., например, Hudecz, F., Methods Mol. Biol. 298: 209-223 (2005) и Kirin et al., Inorg Chem. 44(15): 5405-5415 (2005)).
[0095] Воплощение согласно изобретению также предусматривает клетку-хозяина, содержащую любой из рекомбинантных экспрессионных векторов, описанных в данном документе. Используемый в данном документе термин "клетка-хозяин" относится к любому типу клеток, которые могут содержать рекомбинантный экспрессионный вектор согласно изобретению. Клетка-хозяин может быть эукариотической клеткой, например, клеткой растения, животного, гриба или водоросли, либо она может быть прокариотической клеткой, например, клеткой бактерии или простейшего. Клетка-хозяин может быть культивированной клеткой или первичной клеткой, т.е. выделенной непосредственно из организма, например, человека. Клетка-хозяин может быть прикрепленной клеткой или суспензионной клеткой, т.е. клеткой, которая растет в суспензии. Подходящие клетки-хозяева известны в данной области и включают, например, клетки Е. coli DH5α, клетки яичников китайского хомячка, клетки обезьяны VERO, клетки COS, клетки HEK293 и т.п. В целях амплификации или репликации рекомбинантного экспрессионного вектора клетка-хозяин может быть прокариотической клеткой, например, клеткой DH5α. В целях получения рекомбинантного CAR клетка-хозяин может быть клеткой млекопитающего. Клетка-хозяин может быть клеткой человека. Притом что клетка-хозяин может быть клеткой любого типа, может происходить из любого типа ткани и может находиться на любой стадии развития, клетка-хозяин может быть лимфоцитом периферической крови (PBL) или мононуклеарной клеткой периферической крови (РВМС). Клетка-хозяин может быть Т-клеткой.
+
+
+
+
+
+
1
2
[0096] В целях данного изобретения Т-клетка может быть любой Т-клеткой, такой как культивированная Т-клетка, например, первичная Т-клетка или Т-клетка из культивируемой Т-клеточной линии, например, Jurkat, SupT1 и т.д., или Т-клетка, полученная от млекопитающего. Если Т-клетка получена от млекопитающего, то она может быть получена из различных источников, включая, но не ограничиваясь ими, кровь, костный мозг, лимфатические узлы, тимус или другие ткани или жидкости. Т-клетки также могут быть обогащенными или очищенными. Т-клетка может быть человеческой Т-клеткой. Т-клетка может быть Т-клеткой, выделенной из организма человека. Т-клетка может быть Т-клеткой любого типа и может находиться на любой стадии развития, включая, но не ограничиваясь ими, CD4/CD8-двойные положительные Т-клетки, CD4 Т-хелперы, например, клетки Th и Th, CD8 Т-клетки (например, цитотоксические Т-клетки), инфильтрирующие опухоль клетки, Т-клетки памяти, наивные Т-клетки и т.п. Т-клетка может быть CD8 Т-клеткой или CD4 Т-клеткой.
[0097] В одном из воплощений CAR, описанные в данном документе, могут быть использованы в подходящих не-Т-клетках. Такие клетки представляют собой клетки с иммунно-эффекторной функцией, такие как, например, NK-клетки и Т-подобные клетки, образующиеся из плюрипотентных стволовых клеток.
[0098] Также одним из воплощений данного изобретения является популяция клеток, содержащая по меньшей мере одну клетку-хозяина, описанную в данном документе. Популяция клеток может быть гетерогенной популяцией, содержащей клетку-хозяина, которая содержит любой из описанных рекомбинантных экспрессионных векторов, в дополнение по меньшей мере к одной другой клетке, например, клетке-хозяину (например, Т-клетке), которая не содержит никаких рекомбинантных экспрессионных векторов, или в дополнение к клетке, отличающейся от Т-клетки, например, В-клетке, макрофагу, нейтрофилу, эритроциту, гепатоциту, эндотелиальной клетке, эпителиальной клетке, мышечной клетке, клетке головного мозга и т.д. Альтернативно, популяция клеток может быть по существу гомогенной популяцией, которая включает главным образом клетки-хозяева (например, состоит по существу из них), содержащие рекомбинантный экспрессионный вектор. Популяция также может быть клональной популяцией клетокв которой где все клетки популяции являются клонами одной клетки-хозяина, содержащей рекомбинантный экспрессионный вектор, так что все клетки популяции содержат рекомбинантный экспрессионный вектор. В одном из воплощений изобретения популяция клеток является клональной популяцией, содержащей клетки-хозяева с рекомбинантным экспрессионным вектором, описанным в данном документе.
[0100] CAR (в том числе их функциональные части и варианты), нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессионные векторы, клетки-хозяева (в том числе их популяции) и антитела (в том числе их антигенсвязывающие части), которые все в совокупности далее называются "CAR-материалами согласно изобретению", могут быть выделены и/или очищены. Термин "выделенный", используемый в данном документе, означает "удаленный из природной среды". Термин "очищенный" или "выделенный" не требует абсолютной чистоты или выделения; скорее, он понимается как относительный термин. Так, например, препарат очищенной (или выделенной) клетки-хозяина является таким, в котором клетка-хозяин является более чистой, чем клетка в ее природной среде в организме. Такие клетки-хозяева могут быть получены, например, с помощью стандартных методик очистки. В некоторых воплощениях препарат клетки-хозяина очищен таким образом, что клетка-хозяин составляет по меньшей мере примерно 50%, например, по меньшей мере примерно 70% от общего содержания клеток в препарате. Например, чистота может составлять по меньшей мере примерно 50%, может быть больше, чем примерно 60%, примерно 70% или примерно 80%, или может составлять примерно 100%.
[0101] CAR-материалы согласно изобретению могут быть собраны в композицию, такую как фармацевтическая композиция. В связи с этим воплощение данного изобретения предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую любой из CAR, функциональных частей, функциональных вариантов, нуклеиновых кислот, экспрессионных векторов, клеток-хозяев (в том числе их популяций) и антител (в том числе их антигенсвязывающих частей) согласно изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции согласно изобретению, содержащие любой из CAR-материалов согласно изобретению, могут содержать более чем один CAR-материал согласно изобретению, например, CAR и нуклеиновую кислоту или два или более двух различных CAR. Альтернативно, фармацевтическая композиция может содержать CAR-материал согласно изобретению в сочетании с другими фармацевтически активными агентами или лекарственными препаратами, такими как химиотерапевтические агенты, например, аспарагиназа, бусульфан, карбоплатин, цисплатин, даунорубицин, доксорубицин, фторурацил, гемцитабин, гидроксимочевина, метотрексат, паклитаксел, ритуксимаб, винбластин, винкристин и т.п. В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция содержит клетку-хозяина согласно изобретению или ее популяцию.
[0102] CAR-материалы согласно изобретению могут быть представлены в форме соли, например, фармацевтически приемлемой соли. Подходящие фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты включают соли, полученные из минеральных кислот, таких как соляная, бромистоводородная, фосфорная, метафосфорная, азотная и серная кислоты, а также из органических кислот, таких как винная, уксусная, лимонная, яблочная, молочная, фумаровая, бензойная, гликолевая, глюконовая, янтарная и арилсульфокислота, например, п-толуолсульфокислота.
[0103] Что касается фармацевтических композиций, то фармацевтически приемлемый носитель может быть любым из обычно используемых и ограничивается только физико-химическими соображениями, такими как растворимость и отсутствие реактивности с активным агентом (агентами), а также ограничивается путем введения. Описанные в данном документе фармацевтически приемлемые носители, например, носители, адъюванты, эксципиенты и разбавители, хорошо известны специалистам в данной области и легко доступны. Предпочтительно, чтобы фармацевтически приемлемый носитель был таким, который химически инертен по отношению к активному агенту (агентам), и таким, который не имеет вредных побочных эффектов или токсичности в условиях применения.
[0104] Выбор носителя будет определяться отчасти конкретным CAR-материалом согласно изобретению, а также конкретным способом, используемым для введения CAR-материала согласно изобретению. Соответственно, существует множество подходящих составов фармацевтической композиции согласно изобретению. Могут быть использованы консерванты. Подходящие консерванты могут включать, например, метилпарабен, пропилпарабен, бензоат натрия и хлорид бензалкония. Возможно, может быть использована смесь двух или более двух консервантов. Консерванты или их смеси, как правило, присутствуют в количестве от примерно 0,0001% до примерно 2% от общей массы композиции.
[0105] Подходящие буферные агенты могут включать, например, лимонную кислоту, цитрат натрия, фосфорную кислоту, фосфат калия и различные другие кислоты и соли. Возможно, может быть использована смесь двух или более двух буферных агентов. Буферные агенты или их смеси, как правило, присутствуют в количестве от примерно 0,001% до примерно 4% от общей массы композиции.
[0106] Концентрация CAR-материала согласно изобретению в фармацевтических составах может варьировать, например, от менее чем примерно 1%, как правило, на уровне или по меньшей мере примерно 10%, до примерно 20-50% или более по массе, и может быть выбрана, прежде всего, по объемам жидкости и вязкости в соответствии с конкретным выбранным способом введения.
[0107] Способы подготовки вводимых (например, вводимых парентеральным путем) композиций известны или очевидны специалистам в данной области и описаны более подробно, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005).
[0108] Следующие составы для перорального, аэрозольного, парентерального (например, подкожного, внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, внутрикожного, внутрибрюшинного и интратекального) и местного введения являются только иллюстративными и никоим образом не являются ограничивающими. Для введения CAR-материалов согласно изобретению может быть использован более чем один путь, а в некоторых случаях конкретный путь может обеспечить более непосредственный и более эффективный ответ, чем другой путь.
[0109] Составы, пригодные для перорального введения, могут содержать или состоять из (а) жидких растворов, таких как эффективное количество CAR-материала согласно изобретению, растворенное в разбавителях, таких как вода, физиологический раствор или апельсиновый сок; (b) капсул, саше, таблеток, пастилок и леденцов, каждый из которых содержит заранее определенное количество активного ингредиента, в виде твердых веществ или гранул; (с) порошков; (d) суспензий в соответствующей жидкости; и (е) подходящих эмульсий. Жидкие составы могут включать разбавители, такие как воду и спирты, например, этанол, бензиловый спирт и полиэтиленовые спирты, с добавлением или без добавления фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества. Капсульные формы могут быть в обычной жесткой или мягкой желатиновой оболочке, содержащей, например, поверхностно-активные вещества, смазывающие вещества и инертные наполнители, такие как лактозу, сахарозу, фосфат кальция и кукурузный крахмал. Таблетированные формы могут включать один или более чем один агент, выбранный среди лактозы, сахарозы, маннита, кукурузного крахмала, картофельного крахмала, альгиновой кислоты, микрокристаллической целлюлозы, гуммиарабика, желатина, гуаровой камеди, коллоидного диоксида кремния, кроскармеллозы натрия, талька, стеарата магния, стеарата кальция, стеарата цинка, стеариновой кислоты и других эксципиентов, красителей, разбавителей, буферных агентов, разрыхлителей, увлажняющих агентов, консервантов, ароматизаторов и других фармакологически совместимых эксципиентов. Леденцы могут содержать CAR-материал согласно изобретению в ароматизированной форме, обычно с сахарозой и гуммиарабиком или трагакантом, также как и пастилки, содержащие CAR-материал согласно изобретению в инертной основе, такой как желатин и глицерин, или сахароза и гуммиарабик, эмульсии, гели и подобные композиции, содержащие, помимо прочего, такие эксципиенты, которые известны в данной области.
[0110] Составы, пригодные для парентерального введения, включают водные и неводные изотонические стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические и растворенные вещества, которые делают состав изотоничным крови предполагаемого реципиента, и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. CAR-материал согласно изобретению может быть введен в физиологически приемлемом разбавителе в фармацевтическом носителе, например в виде стерильной жидкости или смеси жидкостей, включая воду, физиологический раствор, водный раствор декстрозы и растворы родственных Сахаров, спирт, такой как этанол или гексадециловый спирт, гликоль, такой как пропиленгликоль или полиэтиленгликоль, диметилсульфоксид, глицерин, кетали, такие как 2,2-диметил-1,3-диоксолан-4-метанол, простые эфиры, полиэтиленгликоль 400, масла, жирные кислоты, сложные эфиры или глицериды жирных кислот, или ацетилированные глицериды жирных кислот с добавлением или без добавления фармацевтически приемлемого поверхностно-активного вещества, такого как мыло или детергент, суспендирующего агента, такого как пектин, карбомеры, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или карбоксиметилцеллюлоза, или эмульгирующих агентов и других фармацевтических адъювантов.
[0111] Масла, которые могут быть использованы в парентеральных составах, включают масла минерального, животного, растительного или синтетического происхождения. Конкретные примеры масел включают арахисовое, соевое, кунжутное, хлопковое, кукурузное, оливковое, вазелиновое и минеральное. Подходящие жирные кислоты для применения в составах для парентерального введения включают олеиновую кислоту, стеариновую кислоту и изостеариновую кислоту. Этилолеат и изопропилмиристат являются примерами подходящих сложных эфиров жирных кислот.
[0112] Подходящие мыла для применения в составах для парентерального введения включают соли жирных кислот и щелочных металлов, аммония и триэтаноламина, а подходящие детергенты включают (а) катионные детергенты, такие как, например, диметилдиалкиламмония галогениды и алкилпиридиния галогениды, (b) анионные детергенты, такие как, например, алкила, арила и олефина сульфонаты, алкила, олефина, эфира и моноглицерида сульфаты и сульфосукцинаты, (с) неионные детергенты, такие как, например, оксиды жирных аминов, алканоламиды жирных кислот и сополимеры полиоксиэтилена и полипропилена, (d) амфотерные детергенты, такие как, например, алкил-β-аминопропионаты и 2-алкил-имидазолина четвертичные аммониевые соли, и (е) их смеси.
[0113] Парентеральные составы, как правило, будут содержать в растворе, например, от примерно 0,5% до примерно 25% по массе CAR-материала согласно изобретению. Могут быть использованы консерванты и буферы. Для того чтобы свести к минимуму или устранить раздражение в месте инъекции, такие композиции могут содержать одно или более чем одно неионное поверхностно-активное вещество, имеющее, например, гидрофильно-липофильный баланс (hydrophile-lipophile balance, HLB) от примерно 12 до примерно 17. Количество поверхностно-активного вещества в таких составах, как правило, будет находиться в диапазоне, например, от примерно 5% до примерно 15% по массе. Подходящие поверхностно-активные вещества включают сложные эфиры полиэтиленгликоль сорбитана и жирных кислот, такие как сорбитан моноолеат и высокомолекулярные продукты присоединения оксида этилена к гидрофобному основанию, образованные путем конденсации пропиленоксида с пропиленгликолем. Парентеральные составы могут быть представлены в виде единичной дозы или в герметичных контейнерах с несколькими дозами, таких как ампулы и флаконы, и могут храниться в высушенном замораживанием (лиофилизированном) состоянии, требующем только добавления стерильного жидкого эксципиента, например, воды для инъекций, непосредственно перед применением. Инъекционные растворы и суспензии, приготовленные непосредственно перед применением, могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток типа таких, которые описаны выше.
[0114] Инъекционные составы представлены в соответствии с воплощением данного изобретения. Требования к эффективным фармацевтическим носителям для инъекционных композиций хорошо известны специалистам в данной области (см., например, Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982), и ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)).
[0115] Составы для местного применения, в том числе те, которые могут быть использованы для трансдермального высвобождения лекарства, хорошо известны специалистам в данной области и пригодны в контексте воплощений данного изобретения для нанесения на кожу. CAR-материал согласно изобретению, используемый отдельно или в комбинации с другими подходящими компонентами, может быть приготовлен в виде аэрозольных составов для введения посредством ингаляции. Эти аэрозольные составы могут находиться под давлением подходящих пропеллентов, таких как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п. Также они могут быть приготовлены в виде фармацевтических препаратов, находящихся не под давлением, таких как небулайзер или атомайзер (распылитель). Такие аэрозольные составы также могут быть использованы для распыления на слизистую оболочку.
4
8
[0116] Термин "эффективное количество" или "количество, эффективное для лечения" относится к дозе, которая является достаточной для предотвращения или лечения рака у индивидуума. Количества, эффективные для терапевтического или профилактического применения, будут зависеть, например, от стадии и тяжести заболевания или нарушения, подлежащего лечению, от возраста, массы и общего состояния здоровья пациента и от решения лечащего врача. Размер дозы также будет определяться выбранным активным агентом, способом введения, временем и частотой введения, наличием, природой и степенью проявления любых побочных эффектов, которые могут сопровождать введение конкретного активного агента, и желаемым физиологическим эффектом. Специалистам в данной области должно быть понятно, что различные заболевания или нарушения могут потребовать длительного лечения, включающего множественные введения, возможно, с использованием CAR-материалов согласно изобретению на каждом этапе или на различных этапах введения. В качестве примера и не ограничивая изобретение, доза CAR-материала согласно изобретению может составлять от примерно 0,001 до примерно 1000 мг/кг массы тела субъекта, подлежащего лечению, в день, от примерно 0,01 до примерно 10 мг/кг массы тела/день, от примерно 0,01 мг до примерно 1 мг/кг массы тела/день. В одном из воплощений доза может составлять от примерно 1×10 до примерно 1×10 клеток, экспрессирующих CAR-материал согласно изобретению, на кг массы тела. Когда CAR-материал согласно изобретению представляет собой клетку-хозяина, иллюстративной дозой клеток-хозяев может быть минимум один миллион клеток (1 мг клеток/доза). Когда CAR-материал согласно изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, упакованную в вирус, иллюстративная доза вируса может составлять 1 нг/доза.
[0117] В целях данного изобретения количество или доза вводимого CAR-материала согласно изобретению должна быть достаточной, чтобы вызвать терапевтический или профилактический ответ у субъекта или животного в течение разумного периода времени. Например, доза CAR-материала согласно изобретению должна быть достаточной для связывания с антигеном, либо для обнаружения, лечения или предотвращения заболевания в течение периода времени от примерно 2 ч или дольше, например, от примерно 12 до примерно 24 часов и более с момента введения. В некоторых воплощениях период времени может быть еще более долгим. Доза будет зависеть от эффективности конкретного CAR-материала согласно изобретению и от состояния животного (или человека), а также от массы тела животного (или человека), подлежащего лечению.
[0118] В целях данного изобретения для определения начальной дозы, которую следует вводить млекопитающему, может быть использован анализ, который включает, например, сравнение степени, в которой клетки-мишени подвергаются лизису, и/или в которой ИФНγ секретируется Т-клетками, экспрессирующими CAR согласно изобретению, при введении данной дозы таких Т-клеток млекопитающему, среди множества млекопитающих, каждому из которых даны разные дозы Т-клеток. Степень, в которой клетки-мишени подвергаются лизису и/или ИФНγ секретируется при введении определенной дозы, может быть проанализирована с помощью способов, известных в данной области.
[0119] В дополнение к описанным выше фармацевтическим композициям CAR-материалы согласно изобретению могут быть приготовлены в виде комплексов включения, таких как комплексы включения циклодекстринов, или в виде липосом. Липосомы могут служить для нацеливания CAR-материалов согласно изобретению на конкретную ткань. Липосомы также могут быть использованы для увеличения периода полужизни CAR-материалов согласно изобретению. Многие способы доступны для получения липосом и описаны, например, в Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9, 467 (1980) и патентах США 4235871, 4501728, 4837028 и 5019369.
[0120] Системы доставки, используемые в контексте воплощений данного изобретения, могут включать систему с отсроченным высвобождением, замедленным высвобождением и пролонгированным высвобождением, так что доставка композиции согласно изобретению происходит заранее и в течение достаточно времени, чтобы вызвать сенсибилизацию места лечения. Композиция согласно изобретению может быть использована в сочетании с другими терапевтическими агентами или терапевтическими подходами. С помощью таких систем можно избежать повторных введений композиции согласно изобретению, тем самым увеличивая удобство для субъекта и врача, и они могут быть особенно подходящими для определенных воплощений композиции данного изобретения.
[0121] Многие типы систем доставки доступны и известны специалистам в данной области. Они включают системы на основе полимера, такого как поли(лактид-гликолид), сополиоксалаты, поликапролактоны, полиэфирамиды, полиортоэфиры, полигидроксимасляная кислота и полиангидриды. Микрокапсулы вышеуказанных полимеров, содержащие лекарственные препараты, описаны, например, в патенте США 5075109. Системы доставки также включают неполимерные системы, которые представляют собой липиды, включая стерины, такие как холестерин, сложные эфиры холестерина и жирные кислоты, или нейтральные жиры, такие как моно-, ди- и триглицериды; системы высвобождения из гидрогеля; силастические системы; системы на основе пептидов; покрытия из воска; спрессованные таблетки, полученные с использованием стандартных связывающих агентов и эксципиентов; частично расплавленные имплантаты; и т.п. Конкретные примеры включают, но не ограничиваясь ими: (а) эрозивные системы, в которых активная композиция содержится в некоторой форме внутри матрицы, такой как описана в патентах США №№4452775, 4667014, 4748034 и 5239660, и (b) диффузные системы, в которых активный компонент высвобождается с регулируемой скоростью из полимера, такого как описан в патентах США №№3832253 и 3854480. Кроме того, могут быть использованы системы доставки с оборудованием на основе насоса, некоторые из которых адаптированы для имплантации.
[0122] Специалист в данной области легко поймет, что CAR-материалы согласно изобретению могут быть модифицированы с помощью любого числа способов, например, так, чтобы терапевтическая или профилактическая эффективность CAR-материалов согласно изобретению увеличивалась за счет этой модификации. Например, CAR-материалы согласно изобретению могут быть конъюгированы прямо или косвенно через связывающую группировку с нацеливающей группировкой. Практика конъюгации соединений, например, CAR-материалов согласно изобретению, с нацеливающими группировками известна в данной области. См., например, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995) и патент США 5087616.
[0123] Альтернативно, CAR-материалы согласно изобретению могут быть модифицированы в депо-форму, например, так, чтобы характер высвобождения CAR-материалов согласно изобретению в организм, в который их вводят, контролировался по времени и месту внутри организма (см., например, патент США 4450150). Депо-формы CAR-материалов согласно изобретению могут представлять собой, например, имплантируемую композицию, содержащую CAR-материалы согласно изобретению и пористый или непористый материал, такой как полимер, где CAR-материалы согласно изобретению инкапсулированы или диффундированы по всему материалу, и/или могут представлять собой деградацию непористого материала. Затем депо имплантируют в нужное место в организме, и CAR-материалы согласно изобретению высвобождаются из имплантата с заданной скоростью.
[0124] Когда CAR-материалы согласно изобретению вводят с одним или более чем одним дополнительным терапевтическим агентом, этот один или более чем один дополнительный терапевтический агент может быть совместно введен млекопитающему. Под "совместным введением" понимают введение одного или более чем одного дополнительного терапевтического агента и CAR-материалов согласно изобретению достаточно близко по времени, так что CAR-материалы согласно изобретению могут усиливать эффект одного или более чем одного дополнительного терапевтического агента, или наоборот. В связи с этим CAR-материалы согласно изобретению могут быть введены вначале, а один или более чем один дополнительный терапевтический агент может быть введен во вторую очередь, или наоборот. Альтернативно, CAR-материалы согласно изобретению и один или более чем один дополнительный терапевтический агент могут быть введены одновременно.
[0125] Иллюстративным терапевтическим агентом, который может быть введен совместно с CAR-материалами, является цитокин активных Т-клеток, такой как ИЛ-2. Не связываясь с какой-либо конкретной теорией или механизмом, считают, что ИЛ-2 усиливает терапевтический эффект за счет увеличения in vivo числа клеток или усиления эффекторной функции клеток, экспрессирующих CAR согласно изобретению. Другие иллюстративные цитокины включают ИЛ-7 и ИЛ-15. В способах данного изобретения, в которых клетки-хозяева или популяции клеток вводятся млекопитающему, клетки могут быть такими клетками, которые аллогенны или аутологичны данному млекопитающему.
[0126] Следует понимать, что CAR-материалы согласно изобретению могут быть использованы в способах лечения или профилактики заболевания у млекопитающего. Без связи с конкретной теорией или механизмом CAR согласно изобретению обладают биологической активностью, например, способностью распознавать антиген, например, TSLPR, таким образом, что CAR, когда он экспрессируется клеткой, способен опосредовать иммунный ответ против клетки, экспрессирующей антиген, например, TSLPR, в отношении которого CAR является специфическим. В связи с этим воплощение данного изобретения относится к способу лечения или профилактики рака у млекопитающего, включающему введение указанному млекопитающему CAR, нуклеиновых кислот, рекомбинантных экспрессионных векторов, клеток-хозяев, популяции клеток, антител и/или их антигенсвязывающих частей и/или фармацевтических композиций согласно изобретению в количестве, эффективном для лечения или профилактики рака у млекопитающего.
[0127] Воплощение данного изобретения также включает лимфоидное истощение млекопитающего перед введением CAR-материалов согласно изобретению. Примеры лимфоидного истощения включают, но не ограничиваясь ими, лимфоидное истощение путем немиелоаблативной химиотерапии, лимфоидное истощение путем миелоаблативной химиотерапии, облучение всего тела и т.д.
[0128] В способах данного изобретения, в которых вводят клетки-хозяева или популяции клеток, клетки могут быть такими клетками, которые аллогенны или аутологичны данному млекопитающему. Предпочтительно, клетки аутологичны данному млекопитающему.
[0129] Млекопитающее, упоминаемое в данном документе, может быть любым млекопитающим. Используемый в данном документе термин "млекопитающее" относится к любому млекопитающему, включая, но не ограничиваясь ими, млекопитающих отряда Rodentia, таких как мыши и хомяки, и млекопитающих отряда Logomorpha, таких как кролики. Млекопитающие могут относиться к отряду Carnivora, включая Felines (кошки) и Canines (собаки). Млекопитающие могут относиться к отряду Artiodactyla, включая Bovines (коровы) и Swines (свиньи) или к отряду Perssodactyla, включая Equines (лошади). Млекопитающие могут относиться к отрядам Primates, Ceboids или Simoids (обезьяны) или к отряду Anthropoids (люди и человекообразные обезьяны). Предпочтительно млекопитающее является человеком.
[0130] В отношении способов согласно изобретению рак может быть любым раком, включая любой из острого лимфоцитарного рака, острого миелоидного лейкоза, альвеолярной рабдомиосаркомы, рака мочевого пузыря (например, карциномы мочевого пузыря), рака кости, рака мозга (например, медуллобластомы), рака молочной железы, рака анального отверстия, анального канала или прямой кишки, рака глаза, рака внутрипеченочного желчного протока, рака суставов, рака шеи, желчного пузыря или плевры, рака носа, полости носа или среднего уха, рака ротовой полости, рака вульвы, хронического лимфоцитарного лейкоза, хронического миелоидного рака, рака толстой кишки, рака пищевода, рака шейки матки, фибросаркомы, желудочно-кишечной карциноидной опухоли, рака головы и шеи (например, плоскоклеточной карциномы головы и шеи), лимфомы Ходжкина, рака гортаноглотки, рака почки, рака гортани, лейкоза, несолидных опухолей, рака печени, рака легких (например, немелкоклеточной карциномы легких и аденокарциномы легких), лимфомы, мезотелиомы, мастоцитомы, меланомы, множественной миеломы, рака носоглотки, неходжкинской лимфомы, В-хронического лимфоцитарного лейкоза, волосатоклеточного лейкоза, острого лимфоцитарного лейкоза (ALL) и лимфомы Беркитта, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака брюшины, сальника и брыжейки, рака глотки, рака предстательной железы, рака прямой кишки, рака почки, рака кожи, рака тонкого кишечника, рака мягких тканей, солидных опухолей, синовиальной саркомы, рака желудка, рака яичка, рака щитовидной железы и рака уретры. Предпочтительно, рак характеризуется экспрессией TSLPR.
[0131] Термины "лечить" и "предотвращать", используемые в данном документе, а также слова, образующиеся из них, не обязательно означают 100% или полное излечение или профилактику. Скорее, есть различные степени лечения или предотвращения, которые любому специалисту в данной области очевидны как имеющие потенциальное преимущество или терапевтический эффект. В этом отношении способы согласно изобретению могут предложить любой уровень лечения или профилактики рака у млекопитающего. Кроме того, лечение или профилактика, предложенные в способе согласно изобретению, могут включать лечение или профилактику одного или более чем одного состояния или симптома заболевания, например, рака, которые нужно лечить или предотвращать. Кроме того, в данном изобретении "профилактика" может включать задержку начала заболевания или его симптома или состояния.
[0132] Другое воплощение данного изобретения предусматривает способ обнаружения рака у млекопитающего, включающий: (а) контактирование образца, содержащего одну или более чем одну клетку млекопитающего, с CAR, нуклеиновыми кислотами, рекомбинантными экспрессионными векторами, клетками-хозяевами, популяцией клеток, антителами и/или их антигенсвязывающими частями согласно изобретению или с фармацевтической композицией согласно изобретению и, таким образом, формирование комплекса, (b) и обнаружение комплекса, где его выявление свидетельствует о наличии рака у млекопитающего.
[0133] Другое воплощение данного изобретения включает способ определения того, является ли субъект с пролиферативным нарушением кандидатом на лечение химерным антигенным рецептором, содержащим антигенсвязывающий домен, специфический в отношении TSLPR, причем указанный способ включает измерение уровней экспрессии TSLPR в биологическом образце от субъекта; и определения того, повышены ли уровни экспрессии TSLPR в биологическом образце по сравнению с образцом от контрольного субъекта без пролиферативного нарушения.
[0134] Образец может быть получен любым подходящим способом, например, путем биопсии или аутопсии. Биопсия представляет собой извлечение ткани и/или клеток из индивидуума. Такое извлечение может быть сделано для сбора ткани и/или клеток от индивидуума с целью выполнения экспериментов на удаленной ткани и/или клетках. Это экспериментирование может включать эксперименты по определению того, имеет и/или страдает ли человек от определенного состояния или заболевания. Состояние или заболевание может быть, например, раком.
[0135] Что касается воплощения способа обнаружения рака у млекопитающего согласно изобретению, образец, содержащий клетки млекопитающего, может быть образцом, содержащим целые клетки, их лизаты или фракцию цельноклеточных лизатов, например, ядерную или цитоплазматическую фракцию, суммарную белковую фракцию или нуклеиновокислотную фракцию. Если образец содержит целые клетки, то эти клетки могут быть любыми клетками млекопитающего, например, клетками любого органа или ткани, в том числе клетками крови или эндотелиальными клетками.
[0136] Контактирование может иметь место in vitro или in vivo по отношению к млекопитающему. Предпочтительно, контактирование происходит in vitro.
[0137] Кроме того, обнаружение комплекса может осуществляться с помощью любого числа способов, известных в данной области. Например, CAR согласно изобретению, полипептиды, белки, нуклеиновые кислоты, рекомбинантные экспрессионные векторы, клетки-хозяева, популяции клеток, антитела или их антигенсвязывающие части, описанные в данном документе, могут быть помечены обнаруживаемыми метками, такими как, например, радиоактивный изотоп, флуорофор (например, флуоресцеина изотиоцианат (FITC), фикоэритрин (РЕ)), фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена) и элементарные частицы (например, частицы золота).
[0138] Способы анализа CAR на способность распознавать клетки-мишени и на антигенную специфичность известны в данной области. Например, в Clay et al., J. Immunol., 163: 507-513 (1999), даны способы измерения высвобождения цитокинов (например, интерферона-γ, гранулоцитарно-моноцитарного колониестимулирующего фактора (GM-CSF), фактора некроза опухоли альфа (ФНОα) или интерлейкина 2 (ИЛ-2)). Кроме того, функция CAR может быть оценена путем измерения клеточной цитотоксичности, как описано в Zhao et al., J. Immunol., 174: 4415-4423 (2005).
[0139] Другое воплощение данного изобретения предусматривает применение CAR, нуклеиновых кислот, рекомбинантных экспрессионных векторов, клеток-хозяев, популяций клеток, антител или их антигенсвязывающих частей и/или фармацевтических композиций согласно изобретению для лечения или профилактики пролиферативного нарушения, например, рака, у млекопитающего. Рак может представлять собой любой из видов рака, описанных в данном документе. Предпочтительно рак представляет собой BCP-ALL.
[0140] Следующие примеры дополнительно иллюстрируют изобретение, но, разумеется, не должны быть истолкованы как каким-либо образом ограничивающие его объем.
Пример 1
[0141] Этот пример демонстрирует создание и тестирование 3G11 TSLPR CAR - короткий 3G11 (SEQ ID NO 39 и 43) и длинный 3G11 (SEQ ID NO 40 и 44). Лидерная последовательность является исходно закодированной и усиливает перенос к поверхности клетки. По-видимому, она должна быть отщеплена в зрелой форме.
[0142] Использовали следующие клеточные линии В-клеточного острого лимфобластного лейкоза (ALL): MUTZ-5 (DSMZ АСС 490), REH-TSLPR (трансдуцированные человеческим TSLPR) и REH в качестве TSLPR-отрицательного контроля. Клеточные линии культивировали в средах, дополненных 10% инактивированной нагреванием FBS (Gemini Byproducts, Уэст-Сакраменто, Калифорния, США), 10 мМ HEPES, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США). Клетки линии 293Т с упаковывающим ретровирусным вектором (Clonetech, Маунтин-Вью, Калифорния, США) культивировали в среде DMEM (Invitrogen). Кроме того, пре-В-клеточные ALL-ксенотрансплантаты JH331, JH352, NH362, которые в природе сверхэкспрессируют TSLPR, были использованы в качестве моделей in vivo. Они являются ALL-ксенотрансплантатами, полученными от пациента, установленными после согласия пациента по IRB-утвержденнму протоколу. Человеческие РВМС от здоровых доноров были получены из Департамента трансфузионной медицины в Клиническом Центре NIH по протоколу, утвержденному NIH IRB, после информированного согласия в соответствии с Хельсинской декларацией. Человеческие РВМС культивировали в AIMV с 5% FBS.
H
L
H
[0143] Конструирование TSLPR-химерных антигенных рецепторов. Последовательности TSLPR-связывающих одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv) определяли из анти-TSLPR-продуцирующей гибридомы 3G11 (Lu et al., J. Exp.Med., 2009, 206: 2111-2119, включен в данный документ посредством ссылки). 3G11 культивировали в среде RPMI 1640 с пируватом натрия (1 мМ), пенициллином и стрептомицином (pen/strep) и 10% фетальной бычьей сывороткой. Когда клетки были готовы к разделению, среду заменяли на среду RPMI с добавкой пирувата натрия, pen/strep и 5% FBS со сверхнизким содержанием IgG от GIBCO (Grand Island, Нью-Йорк, США; кат. №16250) для продукции антител или сбора клеток для выделения тотальной РНК. Тотальную РНК из 3G11 экстрагировали с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США), а затем проводили обратную транскрипцию, получая кДНК с помощью Superscript III (Invitrogen). Затем кДНК использовали для ПЦР-амплификации, используя комбинацию вырожденных праймеров для вариабельной области тяжелой цепи и константной гамма-цепи, чтобы получить вариабельную область тяжелой цепи (V), и, аналогично, используя вырожденный праймер для вариабельной области каппа-цепи и специфический праймер для константной области каппа-цепи, чтобы получить легкую каппа-цепь (V) (Kettleborough et al., Eur. J. Immunol., 1993, 23: 206-211, включен в данный документ посредством ссылки во всей его полноте). Реагенты для ПЦР были либо приобретены у Roche Diagnostics (PCR Buffer Set, Индианаполис, Индиана, США) или у New England Biolabs (One Taq DNA Polymerase, Ипсвич, Массачусетс, США). Для амплификации применяли следующие условия ПЦР: 95°С в течение 1 мин, 35 циклов по (95°С в течение 15 сек, 50°С в течение 30 сек, 68°С в течение 45 сек), финальная элонгация при 68°С в течение 5 мин. Полученные ПЦР-продукты очищали в геле и клонировали в ТОРО-вектор (ТОРО ТА Cloning Kit for Sequencing, Invitrogen), а затем трансформировали им химически компетентные клетки Е.coli One Shot ТОРЮ (Invitrogen). Одиночные клоны собирали для выделения в формате мини-препа, и полученные плазмиды направляли на анализ последовательности. Чтобы преодолеть вторичную структуру в начале вариабельной области тяжелой цепи, был разработан новый обратный праймер, специфичный к субтипу антитела, который находится ближе к началу 5', для комбинации с вырожденным праймером на 5'-конце, чтобы амплифицировать 5'-область V. Для облегчения реакции ПЦР использовали усилитель ПЦР бетаин в концентрации 1 М. При построении длинных CAR-конструкций включали домены СН2СН3 из IGHG1 (gb|AAC82527.1 аа 98-329). Лидерная последовательность для scFv, кодирующего альфа-цепь гликопротеина CD8 Т-клеточной поверхности, была включена для облегчения переноса к мембране. CAR-кодирующие аминокислотные последовательности подвергали обратной трансляции, оптимизировали по кодонам и синтезировали в виде отдельных конструкций (DNA 2.0, Менло-Парк, Калифорния, США). Затем эти конструкции субклонировали в лентивирусную плазмиду третьего поколения (pELNS-19BBzeta), содержащую трансмембранный домен CD8, домен сигналинга 41ВВ (CD137) и домен CD3ζ (ранее описан в Hudecek et al., "The non-signaling extracellular spacer domain of chimeric antigen receptors is decisive for in vivo antitumor activity," Cancer Immunol. Res., 2014 and Milone et al., Molecular Therapy, 2009, 17(8): 1453-1464, все включены в данный документ посредством ссылки).
[0144] Продукция лентивирусного вектора и Т-клеточная трансдукция. TSLPR CAR-кодирующие лентивирусные векторы получали путем временной трансфекции клеточной линии 293Т, как описано ранее в Hudecek et al., см. выше, и Milone et al., см. выше. Вкратце, клетки 293Т высевали в 15 см планшеты, покрытые поли-D-лизином (BD Bioscience, Сан-Хосе, Калифорния, США). На следующий день клетки 293Т трансфицировали с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) плазмидами, кодирующими CAR TSLPR, вместе с упаковывающими и оболочечными векторами pMDLg/pRRE, pMD-G и pRSV-Rev, которые были любезно предоставлены доктором Р. Морганом (Отделение хирургии, Центр по исследованию рака, NCI, NIH). Лентивирусные супернатанты собирали через 48-72 часа после трансфекции, центрифугировали со скоростью 3000 оборотов в минуту в течение 10 минут для удаления клеточного дебриса, а затем хранили при -80°С. Человеческие РВМС от нормальных доноров активировали с помощью CD3/CD28-микрочастиц в соотношении 1:1 (Invitrogen) в среде AIM-V, содержащей 40 МЕ/мл рекомбинантного ИЛ-2 (тецелейкин, чрИЛ-2; Roche, Индианаполис, Индиана, США), в течение 24 часов. Активированные Т-клетки ресуспендировали в количестве 2 миллиона клеток на 3 мл лентивирусных супернатантов плюс 1 мл свежей среды AIM-V с 10 мкг/мл протамина сульфата и 40 МЕ/мл ИЛ-2 и культивировали в 6-луночных планшетах. Планшеты центрифугировали со скоростью 1000 g в течение 2 часов при 32°С, а затем инкубировали при 37°С в течение ночи. На следующий день проводили вторую трансдукцию. На третий день после трансдукции CD28/CD3-частицы удаляли и клетки культивировали в количестве 300000 клеток/мл в среде AIM-V, содержащей 100 МЕ/мл ИЛ-2, с добавлением свежей среды, содержащей ИЛ-2, каждые 2-3 дня до сбора на 8-й или 9-й день.
2
2
[0145] Анализ путем проточной цитометрии. Поверхностную экспрессию CAR-трансдуцированных Т-клеток определяли с помощью проточной цитометрии с использованием TSLPR-Fc (R&D Systems, Миннеаполис, Миннесота, США) с последующей инкубацией с PE-F(ab) или APC-F(ab), специфичным для человеческого IgG-Fc (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Вест Грув, Пенсильвания, США). Альтернативно, биотин-конъюгированный белок L (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) использовали для выявления экспрессии CAR после инкубации со стрептавидин-конъюгированной РЕ (BD Bioscience). Экспрессию CD19, CD22 и TSLPR на лейкозных линиях обнаруживали с помощью следующих противочеловеческих антител: CD45-PerCP-Cy5.5 (eBioscience, Сан-Диего, Калифорния, США), CD19-Pac-Blue, CD19-APC-Cy7, CD10_PE-Cy7 и CD22-PE, TSLPR- АРС (BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США), а Т-клетки характеризовали с помощью следующих антител: CD3-APC-Cy7, CCR7-FITC (CD197), CD45RA-APC, CD4-PacBlue, (BioLegend), CD45-PerCP-Cy5.5 (eBioscience), CD8-V500 (BD, Франклин Лейке, Нью-Джерси, США). Связывание супернатанта гибридомы 3G11 с TSLPR-экспрессирующми ALL-линиями обнаруживали с помощью козлиной противомышиной РЕ (BD Bioscience). Мертвые клетки исключали путем окрашивания меткой Fixable Viability Dye eFluor 506 (eBioscience).
51
51
[0146] Анализы клеточной цитотоксичности и цитокинов. Обе клеточные линии - REH-TSLPR и MUTZ5 - экспрессируют TSLPR на высоком уровне. REH использовали в качестве отрицательного контроля для экспрессии TSLPR. Клетки-мишени метили с помощью 100 мкКи Cr (Perkin Elmer, Уолтем, Массачусетс, США) в течение 1 часа. После промывки 5000 мишеней на лунку инкубировали в течение 4-6 часов с трансдуцированными Т-клетками, очищенными с помощью частиц из набора Pan Т Cell II isolation kit (Miltenyi Biotec, Сан-Диего, Калифорния, США), при различных соотношениях эффектора и мишени (Е : Т). В анализируемых супернатантах подсчитывали высвобождение Cr с использованием планшетов LumaPlates (Perkin Elmer) и ридера Top Count Reader (Packard, Мериден, Коннектикут). Специфический лизис рассчитывали следующим образом: % лизиса = (экспериментальный лизис - спонтанный лизис)/(максимальный лизис - спонтанный лизис) × 100. Уровни цитокинов в супернатантах определяли через 24 часа с помощью мультиплексного анализа (Meso Scale Discovery, Роквилл, Мэриленд, США). В исследования включали клетки K562. Клетки K562 являются иммортализованными клетками человеческого миелогенного эритролейкоза. Они не экспрессируют TSLPR на клеточной поверхности и, как правило, используются для обнаружения NK-активности. K562 и REH использовали в качестве отрицательных контролей, REH-TSLPR и MUTZ5 использовали в качестве положительных контролей. CAR-трансдуцированные Т-клетки подвергали NK-истощению с помощью набора Pan-T isolation kit, а затем инкубировали с различными клетками-мишенями. Для продукции цитокинов использовали следующий протокол: подсчитывали клетки-мишени, промывали их 3 раза и ресуспендировали с плотностью 1Е6/мл в среде RPMI, помещали в 96-луночный планшет по 100 мкл в каждую лунку (конечная плотность 1Е5/лунка); подсчитывали трансдуцированные Т-клетки, промывали их 3 раза и ресуспендировали с плотностью 1Е6/мл в среде RPMI, помещали в 96-луночный планшет по 100 мкл в каждую лунку (конечная плотность 1Е5/лунка); устанавливали настройки "только Т-клетки" и "только опухолевые клетки"; инкубировали в течение 24 часов при 37°С и собирали по 100 мкл супернатанта для анализа продукции цитокинов. Все образцы анализировали в трех повторах.
2
[0147] Исследования in vivo. Исследования на животных проводили в соответствии с протоколами, утвержденными комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных (NCI Bethesda Animal Care and Use Committee). Клеточные линии и ксенотрансплантаты пре-В-клеточной ALL внутривенно вводили мышам NSG (NOD scid gamma, NOD.Cg-Prkdcscid ll2rgtm1Wjl/SzJ JAX, Jackson ImmunoResearch Laboratories). На линиях, экспрессирующих люциферазу, лейкоз обнаруживали с помощью Xenogen MS Lumina (Caliper Life Sciences). Мышам NSG внутрибрюшинно вводили 3 мг D-люциферина (Caliper Life Sciences) и визуализировали через 6 минут с временем экспозиции 3 мин. Программное обеспечение Living Image версии 4.1 (Caliper Life Sciences, Хопкинтон, Массачусетс, США) использовали для анализа биолюминесцентных сигналов для каждой мыши в виде фотон/с/см/стер. Не экспрессирующие люциферазу ксенотрансплантаты отслеживали с помощью проточной цитометрии периферической крови или костного мозга.
[0148] Связывание анти-TSLPR-антитела, продуцируемого гибридомой 3G11, с TSLPR-сверхэкспрессирующими пре-В-клетками острого лимфобластного лейкоза ("TSLPRhi ALL") было подтверждено (фиг. 1). На фиг. 2 показана экспрессия, определенная с помощью коммерческого TSLPR-антитела. Затем были определены последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей (Fv). Одноцепочечные последовательности Fv (scFv) были сконструированы с использованием глицинового линкера и встроены в цепь лентивирусного вектора с химерным антигенным рецептором, кодирующую шарнир CD8a и трансмембранные области CD8 с внутриклеточными доменами CD3ζ и 41ВВ (CD137) (фиг. 3 и 4). Поскольку расстояние scFv от Т-клеточной поверхности может влиять на функцию CAR, конструкцию, содержащую иммуноглобулиновый СН2СН3-спейсерный домен между scFv и трансмембранной последовательностью, также создавали для "длинного" CAR. Лентивирусные векторы, кодирующие TSLPR CAR, затем использовали для трансдукции человеческих Т-клеток, активированных CD3/CD28-частицами, что привело к высокой эффективности переноса генов, что было обнаружено с помощью белка L и гибридного белка TSLPR-Fc (фиг. 5А и 5В). Хотя трансдукция происходила на 2 и 3 дни культивирования, доля CAR-экспрессирующих Т-клеток повышалась в ходе последующего культивирования, подтверждая преимущественное выживание или повышенную экспансию Т-клеток, экспрессирующих конструкцию CAR. TSLPR имеет ограниченную экспрессию в нормальных тканях вне иммунной системы. Он был обнаружен на дендритных клетках и подгруппах активированных Т-клеток. При иммуногистохимии микроматрицы нормальной педиатрической ткани в лимфоидной ткани найдены разбросанные редкие клетки с сильной мембранной экспрессией, возможно, представляющие дендритные клетки. Также наблюдалось некоторое окрашивание в поджелудочной железе, клетках почечных канальцев и слизистой оболочке толстой кишки, при этом окрашивание этих тканей не согласовывалось с экспрессией на клеточной поверхности. В сердце никакого окрашивания не наблюдалось. Как было показано на некоторых первичных пре-B-ALL, клеточная линия TSLPRhi ALL (MUTZ5) и человеческий ксенотрансплантат TSLPRhi (JHH331) экспрессируют TSLPR на уровнях, сопоставимых с CD19 и CD22 (фиг. 2).
[0149] Был проведен анализ для определения того, демонстрируют ли Т-клетки, трансдуцированные конструкциями TSLPR CAR, активность в отношении пре-B-ALL-клеточной линии REH, трансдуцированной для экспрессии TSLPR (REH-TSLPR), а также в отношении природно TSLPR-сверхэкспресирующей ALL-линии (MUTZ5). Как показано на фиг. 6, Т-клетки с короткими и длинными CAR продуцируют высокие уровни интерферона-гамма (ИФНγ) и фактора некроза опухоли альфа (ФНОα) при инкубации с REH-TSLPR. Кроме того, Т-клетки с TSLPR CAR продуцируют широкий спектр воспалительных цитокинов в присутствии как TSLPR-трансдуцированных, так и природно сверхэкспрессирующих ALL-клеток (фиг. 7А-7Н и 8А-8Е). При измерении литической способности TSLPR CAR Т-клеток короткие и длинные конструкции продемонстрировали эквивалентную активность в отношении REH-TSLPR. Тем не менее, лизис MUTZ5, опосредованный коротким TSLPR CAR, был сильнее, чем опосредованный длинным CAR, несмотря на сопоставимые уровни TSLPR на REH-TSLPR и MUTZ5 (фиг. 2 и 9A-D).
6
[0150] Способность TSLPR CAR Т-клеток уменьшать ALL при введении мышам, несущим TSLPR-сверхэкспрессирующую ALL, анализировали следующим образом. Через четыре дня после внутривенного введения экспрессирующих люциферазу REH-TSLPR лейкоз обнаруживался на низких уровнях. Введение 15×10 Т-клеток с коротким CAR, по-видимому, полностью убирало ALL, что оценивалось путем визуализации (фиг. 10) и проточной цитометрии периферической крови на наличие клеток CD45+/GFP+ на 12-й день после введения лейкозных клеток. (Фиг. 11). Интересно, что, несмотря на эквивалентную активность in vitro в отношении REH-TSLPR, Т-клетки с длинным CAR оказывали минимальное влияние на прогрессирование лейкоза у мышей, что оценивали путем визуализации, получая некоторые доказательства пониженной лейкемической нагрузки в периферической крови по сравнению с мышами, получавшими GFP-трансдуцированные Т-клетки (хотя без статистической значимости). Для того чтобы определить причину отличающейся активности конструкций с длинным и коротким CAR, персистенцию CAR Т-клеток оценивали путем проточной цитометрии, и было установлено, что Т-клетки с коротким CAR присутствовали в большем количестве в периферической крови по сравнению с Т-клетками с длинным CAR (фиг. 12А-В). На фиг. 12В показаны TSLPR Fc против CD8.. CAR Т против CD45 показал следующие результаты: на 16-й день Т-клетки с коротким CAR составляли 3,02% (CD45-подгруппа: 5,36%), а Т-клетки с длинным CAR составляли 0,038% (CD45-подгруппа: 0,213%); на 27-й день Т-клетки с коротким CAR составляли 44,1% (CD45-подгруппа: 89,4%), а Т-клетки с длинным CAR составляли 2,14% (CD45-подгруппа: 7,54%). Интересно отметить, что присутствие в больших количествах в периферической крови Т-клеток с коротким CAR было наиболее заметным в более поздние моменты времени, несмотря на прогрессирование ALL, которое поддерживало экспрессию TSLPR у мышей, получавших Т-клетки с длинным TSLPR CAR. Таким образом, заметное увеличение активности, которое наблюдалось с короткой конструкцией TSLPR CAR по сравнению с длинной конструкцией, было связано с большей персистенцией Т-клеток, экспрессирующих короткий CAR.
6
[0151] Для анализа Т-клеток с коротким TSLPR CAR при более доказанном лейкозе инфузия была отложена до 16-го дня после введения REH-TSLPR (фиг. 13). Примечательно, что доза 10×10 Т-клеток с коротким TSLPR CAR все еще была способна вызывать быстрый клиренс TSLPRhi ALL, который сохранялся у большинства мышей в течение 40 дней (фиг. 13). Важно отметить, что не было доказательств каких-либо изменений в прогрессии TSLPR, когда TSLPR CAR Т-клетки не демонстрировали сверхэкспрессию ("TSLPRlo ALL"), что говорит о том, что активность зависит от экспрессии мишени CAR. Анализ рецидивов у мышей, получавших Т-клетки с коротким TSLPR CAR, показал сохраненную экспрессию CD19, CD10 и TSLPR, что указывает на то, что рецидив не связан с потерей антигена. CD8+ Т-клетки, как правило, проявляют большую литическую способность in vitro и, по-видимому, являются важными медиаторами прямой противоопухолевой активности in vivo по сравнению с CD4+ Т-клетками. Интересно отметить, что хотя протокол экспансии in vitro, используемый в этих экспериментах, привел к преобладанию CD4+ Т-клеток перед инфузией, на 50-й день число CD8+ Т-клеток заметно увеличилось, и они представляли наибольшую подгруппу Т-клеток в живом организме (фиг. 14). Эта экспансия CD8+CAR-экспрессирующих Т-клеток была связана с экспрессией поверхностных маркеров, ассоциированных с эффекторными фенотипами на 50 день (фиг. 15, показывающая физическое распределение TSLPR CAR). Также наблюдался значительный процент CAR Т-клеток с CCR7+/CD45RA-фенотипом, соответствующих центральной подгруппе памяти, которая, по-видимому, важна для персистенции и устойчивой противоопухолевой активности.
6
6
6
[0152] Титрование дозы Т-клеток с коротком CAR in vivo проводили для того, чтобы определить диапазон, в котором наблюдается активность, и чтобы определить, не может ли короткий TSLPR уменьшить доказанный лейкоз. Как показано на фиг. 16А-С, клетки с коротким TSLPR CAR в количестве 15×10 клеток на мышь значительно уменьшали ALL с явной активностью в дозе 5-10×10 на мышь и с некоторой активностью в такой низкой дозе как 1×10 на мышь; в частности, отмечено улучшение выживаемости (фиг. 16С). Опять же, после введения Т-клеток с длинным CAR наблюдалась минимальная активность лишь с незначительным снижением лейкемической нагрузки в периферической крови (фиг. 11) и активности люциферазы на 6 день (фиг. 16В) по сравнению с GFP-T-клетками, но не было никакой разницы между двумя группами в любой из более поздних моментов времени, что согласуется с рецидивом из-за персистенции Т-клеток с длинным CAR.
[0153] Короткую TSLPR-конструкцию анализировали на трех моделях с ксенотрансплантатами пре-В-клеточной ALL, которые в природе сверхэкспрессируют TSLPR. Как показано на фиг. 17, короткий TSLPR CAR значительно уменьшал ксенотрансплантат человеческой ALL TSLPRhi, экспрессирующий люциферазу. Короткий TSLPR CAR также значительно уменьшал дополнительные ксенотрансплантаты TSLPRhi как в крови, так и в костном мозге мышей (фиг. 18А и 18В).
[0154] На фиг. 19 показано, что короткий TSLPR CAR может уменьшать ALL у пациентов с ксенотрансплантатом в такой низкой дозе как 1,2 миллиона CAR-T-клеток. Фиг. 20 представляет собой точечный график, показывающий процент CAR-T-клеток, находящихся в образце крови мыши. На фиг. 21 показан сдвиг от CD4 к CD8 среди CAR-T-клеток после введения in vivo.
[0155] Короткий TSLPR CAR анализировали в отношении агрессивной TSLPR ALL, которая приводит к летальности в течение 60 дней после внутривенного введения у мышей NSG. Один миллион агрессивных TSLPRhi ALL-клеток внутривенно вводили мышам NSG в 1-й день, а затем вводили 1,2 миллиона TSLPR CAR+Т-клеток в 14-й день Короткий TSLPR CAR продемонстрировал высокую активность (фиг. 22-25), приводя к уменьшению спленомегалии и уменьшению числа бластов в селезенке и крови уже на 14-й день после введения CAR. Интересно, что, по-видимому, будучи активным также в костном мозге, клиренс лейкоза был менее быстрым и не был статистически значимым в это более раннее время оценки. Тем не менее, лечение CAR было связано с итоговым выведением агрессивной TSLPRhi ALL и с длительной выживаемостью.
[0156] Активность короткого CAR TSLPR сравнивали с конструкцией CD19 CAR, содержащей ту же scFv (FM68 scFv - CD8 - CD137 - CD3Q, и с конструкцией CD22 CAR (m971 scFv - CD8 - CD137 - CD3ζ). Все они имели один и тот же костимуляторный домен 41ВВ и приводили к сопоставимой эффективности трансдукции. Короткий TSLPR CAR был сопоставим как с CD19 CAR, так и с CD22 CAR в уменьшении трансплантата JHH331 Luc TSLPRhi (фиг. 24).
Пример 2
[0157] Этот пример демонстрирует анализ двух дополнительных TSLPR CAR (короткий 2D10 (SEQ ID NO 41 и 45) и длинный 2D10 (SEQ ID NO 42 и 46)) и сравнение с CAR из примера 1. Лидерная последовательность является исходно закодированной и усиливает перенос к поверхности клетки. По-видимому, она должна быть отщеплена в зрелой форме.
[0158] В целом, следовали способам из примера 1.
[0159] На фиг. 25А-С и 26 представлены результаты. Фиг. 25А-С показывают цитолитические функции трансдуцированных Т-клеток с различными конструкциями TSLPR CAR при инкубации с TSLPR-экспрессирующими лейкозными клеточными линиями, где REH служила в качестве отрицательного контроля. На фиг. 26 показана терапевтическая функция различных CAR-конструкций in vivo.
[0160] Все ссылки, включая публикации, патентные заявки и патенты, цитируемые в данном документе, включены посредством ссылки в той же степени, как если бы про каждый объект ссылки было отдельно и конкретно указано, что он включен посредством ссылки и изложен в данном документе во всей его полноте.
[0161] Применение терминов в единственном числе и с указанием "по меньшей мере один" и аналогичных объектов ссылки в контексте описания изобретения (особенно в контексте следующей ниже формулы изобретения) должно толковаться как охватывающее единственное число и множественное число, если иное не указано в данном документе или это явно не противоречит контексту. Применение термина "по меньшей мере один" с последующим списком из одного или более чем одного элемента (например, "по меньшей мере один из А и В") означает один элемент, выбранный среди перечисленных элементов (А и В), или любое сочетание двух или более из перечисленных элементов (А и В), если иное не указано в данном документе, или если это явно не противоречит контексту. Термины "содержащий", "имеющий" и "включающий" должны быть истолкованы как неограничивающие термины (т.е. означающие "включающий, но не ограниченный этим"), если не указано иное. Кроме того, считается, что везде, где используется термин "содержащий" (или его эквивалент), он включает значения "состоящий в основном из" и "состоящий из". Таким образом, воплощение, "содержащее" элемент(ы), поддерживает воплощения, "состоящие по существу из" и "состоящие из" перечисленных элементов. Считается, что везде термин "состоящий по существу из" включает значение "состоящий из". Таким образом, воплощение, "состоящее по существу из" элемента(ов), поддерживает воплощения, "состоящие из" перечисленных элементов. Указание диапазонов значений в данном документе является только способом быстрой записи с индивидуальной ссылкой на каждое отдельное значение, попадающее в диапазон, если в данном документе не указано иное, и каждое отдельное значение включено в описание, как если бы оно было отдельно приведено в данном документе. Все описанные здесь способы могут быть выполнены в любом подходящем порядке, если это явно не противоречит контексту, или если не указано иное. Использование в данном документе любых и всех примеров или иллюстративных выражений (например, "такой как") предназначено только для лучшего освещения изобретения и не накладывает ограничения на объем изобретения, если не заявлено иное. Никакое выражение в описании не следует толковать как указывающее на какой-либо незаявленный элемент как существенный для осуществления изобретения на практике.
[0162] В данном документе описаны предпочтительные воплощения данного изобретения, включая наилучший способ, известный авторам изобретения, для осуществления данного изобретения. Вариации этих предпочтительных воплощений могут стать очевидными специалистам в данной области после прочтения приведенного выше описания. Изобретатели ожидают, что специалисты используют такие вариации в зависимости от обстоятельств, и изобретатели подразумевают, что изобретение будет осуществлено иначе, чем конкретно описано в данном документе. Соответственно, данное изобретение включает все модификации и эквиваленты предмета, изложенного в формуле изобретения, прилагаемой к данному документу, как предусмотрено действующим законодательством. Кроме того, любая комбинация описанных выше элементов во всех возможных вариантах охватывается данным изобретением, если в данном описании не указано иное, или если это явно не противоречит контексту.