Особенности окислительного стресса у гороха в условиях раздельного и комбинированного действия гипертермии и засоления

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2009 Биология Вып. 10

Физиология растений

УДК 581.1

ОСОБЕННОСТИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА У

ГОРОХА В УСЛОВИЯХ РАЗДЕЛЬНОГО И

КОМБИНИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ГИПЕРТЕРМИИ И

ЗАСОЛЕНИЯ

В.И. Суворов, Л.А. Чудинова, Е.В. Болгарова

Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15

Предварительная обработка закаливающей температурой (37°С) проростков гороха повышала активность антиоксидантных ферментов и нормализовала содержание АФК при последующем засолении, что, очевидно, способствовало развитию кросс-адаптации. Последовательное действие сильных стрессоров (повреждающей температуры - 42°С и монозасоления) приводило к снижению активности антиоксидантных ферментов и, как следствие этого, к значительному увеличению уровня АФК, что свидетельствует о нарастании в этих условиях окислительного стресса.

Введение

Окислительный стресс, который определяют как реакцию организма на присутствие в среде избытка оксидантов, в растениях возникает в результате действия практически всех неблагоприятных факторов внешней среды, включая засуху, почвенное засоление, низкие и высокие температуры, свет высокой интенсивности, ультрафиолетовое излучение, патогены различной природы и др. (Рогожин. 2002. Суворов, Чудинова. 2009). Можно предположить, что окислительный стресс входит как компонент в большинство других стрессов. Такая универсальность в индукции окислительного стресса при действии на растения самых разнообразных стрессоров указывает на принципиально важное значение антиоксидантных систем, снижающих внутриклеточные концентрации активных форм кислорода (АФК), а также систем, ликвидирующих токсические продукты взаимодействия АФК с биополимерами и повышающих устойчивость растений к неблагоприятным факторам среды вообще (Чевари, 1985, Рогожин, 2004). По этой причине представляется интересным изучение разных стресс-воздействий на генерацию АФК и активность антиоксидантных систем (АОС) для последующего выявления качественных связей между этими функциональными элементами.

Целью данной работы было исследование раздельного и комбинированного влияния гипертермии и хлоридного засоления на генерацию АФК в побегах гороха, а также на динамику активности ряда антиоксидантных ферментов (АОФ) - супер-оксиддисмутазы (СОД) и каталазы. Первый фермент катализирует реакцию дисмутации двух су-пероксиданионов, а второй участвует в разложении перекиси водорода.

Объекты и методы исследования

Исследования проводили на проростках гороха (Pisum sativum L) сорта Альфа. Для проращивания использовали семена, стерилизованные 4%-ным раствором перманганата калия в течение 30 мин. Трехдневные проростки неделю выращивали методом водной культуры на питательной смеси Прянишникова (0.5 нормы). Далее проростки подвергали тепловому воздействию и засолению по следующей схеме: 1) закаливающая температура (37°С) - Зч, 2) повреждающая температура (42оС) - Зч, 3) засоление 0,3% №С1 - 1ч, 4) закаливающая температура и последующее засоление в этот же день, 5) повреждающая температура и последующее засоление в этот же день. Контролем служили проростки, выращенные при комнатной температуре на питательной смеси без засоления. Окислительный стресс изучали через 1 ч и через неделю после воздействий. Определяли общее содержание перекиси водорода ферротиоционатным методом (Лукаткин, 2GG2, а). Генерацию суперок-сидного радикала (СОР) определяли методом, в основе которого лежит способность последнего окислять адреналин в адренохром (Лукаткин, 2GG2, б). Активность каталазы определяли по методу, основанному на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс (Королюк, 1981). Для определения активности супероксиддисмутазы использовали метод, основанный на способности этого фермента конкурировать с нитросиним тетрозоли-ем за супероксидные анионы, образующиеся в результате аэробного взаимодействия НАДН и фена-зинметасульфата (Полесская, 2GG7). Повторность эксперимента - трехкратная.

© В.И. Суворов, Л.А. Чудинова, Е.В. Болгарова, 2GG9

154

Особенности окислительного стресса.

155

Результаты и их обсуждение

Полученные результаты (табл. 1) показали угнетающее действие стрессоров на проростки гороха на 6-е сутки эксперимента. Наиболее сильно рост проростков подавлялся при температуре 42°С и при засолении. Предварительная обработка умеренной температурой (37°С) снижала ростингиби-рующий эффект последующего засоления. Это наводит на мысль о закаливающей роли умеренного термического воздействия и формировании кроссадаптации. Предварительная обработка повреждающей температурой (42оС), наоборот, усугубляла негативное влияние засоления.

Таблица 1

Ростовые параметры проростков гороха, см

Варианты Время отбора проб

воздействия 1 час 6 суток

Контроль 14.9+0.9 15.0+1.3

37оС 14.9+0.5 14.4+0.8

42оС 15.1+0.9 10.4+1.1

№С1 13.3+0.6 11.9+0.6

37оС+№С1 12.8+0.7 13.7+1.0

42оС+№С1 14.5+0.8 9.2+0.8

Содержание СОР через 1 ч после воздействия повышенных температур увеличивалось (табл. 2). Засоление без температурной обработки и при предварительном прогреве до 37оС не вызывало заметного изменения СОР. При действии сильных стрессоров (гипертермии 42оС и последующего засоления), приводящих к серьезным нарушениям метаболизма, интенсивность генерации СОР увеличивалась.

Результаты, представленные в таблице 3, показывают заметный рост количества перекиси водорода в вариантах с сильным воздействием стрессоров (42оС и 42оС +№С1). В остальных случаях ее содержание было относительно стабильным.

Таблица 2

Содержание супероксидного анион радикала в __________проростках гороха, усл. ед._______

Варианты воздействия Время отбора проб

1 час 6 суток

Контроль 0.26+0.04 0.23+0.04

37оС 0.40+0.06 0.17+0.02

42оС 0.36+0.06 0.48+0.08

NaCl 0.27+0.02 0.18+0.05

37оС+NaQ 0.26+0.05 0.17+0.02

42оС+NaQ 0.52+0.08 0.44+0.07

В целом показатели исследуемых АФК находились в обратном соотношении с интенсивностью роста проростков. В связи с этим можно предположить, что уровень СОР и перекиси водорода может служить индикатором стресса у растений.

Таблица 3

Содержание перекиси водорода в проростках _______________гороха, мМоль________________

Варианты Время отбора проб

1 час 6 суток

Контроль 0.007+0.0004 0.008+0.0009

37оС 0.010+0.0012 0.009+0.0014

42оС 0.006+0.0090 0.015+0.0025

NaCl 0.006+0.0006 0.009+0.0013

37оС+NaQ 0.006+0.0005 0.006+0.0009

42°С+№С! 0.006+0.0007 0.017+0.0025

Через 1 ч после температурного воздействия наблюдалось заметное снижение активности СОД, тогда как через неделю активность этого фермента была существенно выше, чем в контрольном варианте (табл. 4). Засоление вызывало рост активности СОД, особенно через 6 суток. Часовое воздействие высоких температур и последующее засоления приводило к подавлению СОД, однако через неделю активность этого фермента заметно возрастала. Возможно, эти изменения активности СОД связаны с действием неспецифических факторов защиты - белков теплового шока (БТШ), синтез которых носит транзитный характер. При синтезе БТШ происходит изменение синтеза других белков, которые образуются в норме. Обращает на себя внимание резкий рост активности СОД при засолении, а также при комплексном воздействии повреждающих температур и засоления. Возможно, в этом случае действие неспецифических защитных систем заканчивается. Дальнейший процесс адаптации связан уже с работой специализированной системы защиты, к которую входят и ферменты окислительного стресса. СОД - единственный фермент, участвующий в ликвидации токсического действия супероксидного радикала.

Таблица 4

Активность супероксиддисмутазы в пророст_____________ках гороха, усл. ед._________

Варианты воздействия Время отбора пробыта

1 час 6 суток

Контроль 8.6+0.3 7.60+0.8

37оС 7.8+0.4 13.9+2.1

42оС 3.0+0.2 12.9+1.5

NaCl 12.7+0.9 22.6+1.8

37оС+NaQ 5.7+1.1 17.3+2.6

42оС+NaQ 4.2+0.9 8.9+1.1

Активность каталазы сохранялась повышенной во всех опытных вариантах, особенно при засолении в сочетании с предварительным прогревом закаливающей температурой (табл. 5). Возможно,

156

В.И. Суворов, Л.А. Чудинова, Е.В. Болгарова

такая динамика нарастания активности каталазы связана с постепенным увеличением концентрации перекиси водорода вследствие реакции дисмута-ции, направленной на ликвидацию супероксидного аниона. Кроме того, каталаза имеет низкое сродство к субстрату и начинает «работать» только при достаточно высоком содержании перекиси.

Таблица 5

Активность каталазы в проростках гороха, ___________________усл. ед.________________

Варианты воздействия Время отбора проб

1 час 6 суток

Контроль 62.G+93 67.1+7.2

З7оС 6З.З+Ю.9 66.1+6.5

42оС 66.5+17.5 74.8+1G.6

NaCl 62.2+11.7 8G.4+4.9

З7оС+№С1 67.4+4.З 97.6+1З.8

42оС+№С1 79.З+8.6 6G.G+6.7

В целом характер изменения активности ката-лазы в эксперименте в значительной степени совпадал с характером изменения активности СОД, что позволяет выдвинуть предположение о принадлежности этих ферментов к одному магистральному пути утилизации АФК.

Полученные результаты показали, что гипертермия и засоление как раздельно, так и в комплексе индуцируют окислительный стресс разной силы, который выражается в генерации АФК и в активации АОС. Последовательное действие сильных стрессоров (повреждающей температуры 42оС и монозасоления) приводило к снижению активности антиоксидантных ферментов и, как следствие этого, к значительному увеличению уровня АФК, что свидетельствует о нарастании окислительного стресса в этих условиях. Последнее может привести к необратимым повреждениям и даже гибели растений.

Предварительная обработка закаливающей температурой (37оС) повышала активность анти-оксидантных ферментов и нормализовала содержание АФК при засолении, что, очевидно, способствовало развитию кросс-адаптации, которая обеспечивается функционированием неспецифи-

ческих механизмов устойчивости. В целом полученные результаты указывают на существование хорошо скоординированной системы защиты от окислительного стресса в условиях действия умеренных стрессовых факторов.

Библиографический список

Королюк М.А. Метод определения активности каталазы / М.А.Королюк, Л.И.Иванова, И.Г.Майорова, В.Е.Токарев // Лабораторное дело. 1981. № 1. С. 16-19.

Лукаткин А. С. Вклад окислительного стресса в развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений. 1. Образование активированных форм кислорода при охлаждении растений // Физиология растений. 2002, а. Т. 49, № 5. С. 697702

Лукаткин А. С. Вклад окислительного стресса в развитие холодового повреждения в листьях теплолюбивых растений. 2. Активность антиокси-дантных ферментов в динамике охлаждения // Физиология растений. 2002, б. Т. 49, № 6. С. 878-885.

Полесская, О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода: учебное пособие /

О.Г.Полесская; под ред. И.П.Ермакова; КДУ. М. 2007. 140 с.

Рогожин В.В. Пероксидаза как компонент ан-тиоксидантной системы / В.В.Рогожин. СПб.: ГИОРД. 2004. 240 с.

Суворов В.И. Влияние раздельного и комбинированного действия гипертермии и засоления на активность некоторых антиоксидантных ферментов в проростках гороха /Суворов В.И., Чудинова Л.А. // Экология в высшей школе: синтез науки и образования: материалы Всерос.науч.-практ. конф. Челяб. гос. пед. ун-т. Челябинск, 2009. Ч.1. С. 115118.

Чевари С. Роль супероксиддисмутазы в окислительных процессах клетки и метод определения ее в биологических материалах / С.Чевари, И.Чаба, Й.Секей // Лабораторное дело. 1985. № 11. С.678-681.

Поступила в редакцию 16.05.2009

Some features in preserving actinobacteria of the genus Rhodococcus

VI. Suvorov, L.A. Chudinova, E.V. Bolgarova

Viability level necessary to recover cell populations upon long-term storage was measured. It is recommended to preserve alkanotrophic rhodococci pre-cultivated on nutrient hydrocarbon-containing media. The duration of rhodococci storage could be increased using protectants. The most effective lyoprotectants are shown to be a sucrose-gelatine agar or gelatine agar supplemented with Rhodococcus-biosurfactants.