НОВЫЙ ПЕПТИД И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
NEW PEPTIDE AND ITS USE

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Данное изобретение относится к новому пептиду, который эффективен для лечения и/или предупреждения остеохондрозов, лечения фиброза органа тела, лечения рака, лечения гломерулосклероза или подобного.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Остеохондроз (DDD), причина хронического люмбаго, является патологическим состоянием, которое сопровождается люмбаго, происходящим в результате раскалывания и дробления диска вследствие дегенерации диска или дискового оседания в ответ на дегидратацию диска (в частности, в студенистом ядре) с возрастом. Дегенерированный диск характеризуется увеличенным атипичным нервом, и ангиогенезом, и изменениями в количестве и функций клеток (формирование сгустков, некроз, апоптоз и т.д.). Одной из молекулярных характеристик дегенерированного диска является уменьшение аггрекана. Потеря аггрекана, которая играет ключевую роль в весовой нагрузке диска, приводит к падению дискового осмотического давления, таким образом, становясь не способным более удерживать воду, которая вследствие этого ускоряет существующую дегенерацию диска, включая существующее фиброзное кольцо, и имеет значительное влияние на другие позвоночные структуры и функции, такие как дегенерация и гипертрофия фацетного сустава и желтой связки.
Хотя в настоящее время доступны методы лечения для патологического хронического люмбаго, включая эти остеохондрозы, существуют медицинские методы лечения, включая аналгезирующий, методы лечения реабилитационного комплекса упражнений и подобные. К сожалению, эти терапевтические подходы страдают от частого рецидива заболевания, необходимости в длинном периоде времени и больших усилий для лечения рассматриваемого заболевания, а также риска возможных осложнений вследствие продолжительного медикаментозного лечения.
Когда не существует благоприятного исхода заболевания даже после лечения таким долговременным консервативным методом лечения, пациент будет неизбежно получать хирургический метод лечения. Характерные хирургические лечения включают традиционную операцию люмбального срастания, включающую полное удаление поврежденных тканей диска, и вставку костного трансплантата для участка целевого повреждения, и недавно изобретенную вставку искусственного диска. Однако эти хирургические способы имеют различные недостатки такие как, являющиеся относительно дорогостоящими, а также потенциальный риск ранних и поздних хирургических осложнений, являющихся результатом операции. Например, операция люмбального срастания часто требует периодической повторной операции вследствие дегенерации примыкающих дисков. Искусственный диск, разработанный для сокращения этого недостатка, не обеспечивает удовлетворительные результаты долговременного последующего исследования. Поэтому операция с искусственным диском обычно не осуществляются в настоящее время. Как описано выше, существует огромная сложность в лечении хронического люмбаго вследствие остеохондрозов. Чтобы справиться с такими ситуациями, как альтернативный подход к консервативному методу лечения и хирургическому методу лечения, разнообразие экспериментальных методов лечения были неудавшимися для достижения регенерации диска, несмотря на минимизацию дегенерации диска самого по себе.
В последние годы были опробованы некоторые биологические методы лечения для лечения дегенерации диска, например, способ, который активирует выработку важных матричных белков (например, аггрекана), способ, который подавляет катаболизм, вызванный провоспалительными цитокинами (например, интерлейкином-1 (IL-1), фактором некроза опухоли-альфа (TNF-α)) (Ahn, SH et al., Spine 27:911-917, 2002; Burke JG et al., Spine 28:2685-2693, 2003; Kang JD et al., Spine 21:271-277, 1996; Weiler C et al., Spine 30:44-53, 2005; Igarashi T et al., Spine 25:2975-2980, 2000; Olmarker K et al., Spine 23:2538-2544, 1998; Le Maitre CL et al., Arthritis Res Ther 7:R732R745, 2005; и Seguin CA et al., Spine 30:1940-1948, 2005).
Эти биологические терапевтические способы были выполнены главным образом за границей. Популярный способ, привлекающий большой интерес, представляет собой прямую инъекцию костного фактора роста (костного морфогенетического белка, BMP) в диск или трансплантацию дисковых клеток с терапевтической инъекцией гена (Masuda K et al., Spine 31:742-745, 2006; Imai Y et al., Spine 32: 1197-1205, 2007; Zhang Y et al., Spine 33:831-838, 2008). Однако этот способ, только способ достижения физических изменений дисковой структуры через физическую регенерацию, который не обеспечивает ослабления или устранения боли у пациентов, а гипертрофия диска, если таковая присутствует, может приводить к ухудшению неврологических состояний вследствие сдавления нерва.
Между тем, известно, что TGF-бета1 сигналинг вовлечен в фиброз, апоптоз, ангиогенез, инвазию опухолевых клеток и метастаз, и ингибирование TGF-бета1 сигналинга можно допустимо измерить, чтобы осуществить лечение фиброза органа тела, рака и/или гломерулосклероза (Prud'homme GJ, Lab Invest 87:1077-1091, 2007).
С этой целью существует необходимость для развития нового биологического материала, который эффективен для остеохондроза путем промотирования дисковой регенерации, несмотря на минимизацию дегенерации диска самого по себе, и способен к лечению фиброза органа тела, рака, гломерулосклероза или подобного ингибированием TGF-бета1 сигналинга.
РАСКРЫТИЕ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Техническая проблема
Данное изобретение предназначено обеспечить новый пептид, который способен промотировать регенерацию диска несмотря на минимизацию дистрофии диска самого по себе.
Кроме того, данное изобретение предназначено обеспечить эффективную композицию для лечения фиброза органа тела, рака или гломерулосклероза.
Техническое решение
Данное изобретение обеспечивает пептид, содержащий аминокислотную последовательность (LQVVYLH) SEQ ID NO: 1, или вариант, или ее фармацевтически приемлемую соль.
В аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, L, Q, V, Y и H представляют собой лейцин (Leu), глутамин (Gln), валин (Val), тирозин (Tyr) и гистидин (His) соответственно.
Каждая из составляющих пептид аминокислот может быть в L-форме, D-форме и/или DL-форме, все из которых охвачены в составляющие пептид аминокислоты данного изобретения.
Вариант представляет собой форму, в которой структура пептида данного изобретения частично изменена самопроизвольной изменчивостью или искусственной изменчивостью, несмотря на отсутствие причин любых изменений главной активности. Например, она может представлять собой таковую, где одна или несколько аминокислот в положении глутамина, тирозина и гистидина в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 замещены другими аминокислотами. Предпочтительным является таковая, где замены глутамина аспарагином, тирозина фенилаланином или триптофаном и/или гистидина лизином или аргинином вставлены в аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Глутамин и аспарагин принадлежат к группе аминокислот, содержащих терминальную амидную группу. Тирозин, фенилаланин и триптофан принадлежат к группе ароматических аминокислот, содержащих ароматические боковые цепи. Гистидин, лизин и аргинин принадлежат к группе основных аминокислот, содержащих очень полярную боковую цепь, которая придает им высокую гидрофильность. Считается, что аминокислоты в одной и той же группе имеют одни и те же или подобные биохимические характеристики (размер, форму, заряд, водородсвязывающую способность или химическую реактивность).
Пептид или его вариант может иметь общую формулу (I)
1
2
3
L-X-VV-X-L-X (I),
1
2
3
где X представляет собой Q или N; X представляет собой Y, F или W; X представляет собой H, K или R; L представляет собой лейцин; Q представляет собой глутамин; N представляет собой аспарагин; V представляет собой валин; Y представляет собой тирозин; F представляет собой фенилаланин; W представляет собой триптофан; H представляет собой гистидин; K представляет собой лизин; и R представляет собой аргинин.
Примеры фармацевтически приемлемой соли могут включать хлоргидрат, сульфат, фосфат, лактат, малеат, фумарат, оксалат, метансульфонат, p-толуолсульфонат и подобные.
Кроме того, данное изобретение обеспечивает медицинское применение пептида, или варианта, или его фармацевтически приемлемой соли по данному изобретению. Медицинское применение включает терапевтическое и/или профилактическое применение для остеохондрозов, терапевтическое применение при фиброзе органа тела, терапевтическое применение при раке и терапевтическое применение при гломерулосклерозе. Лечение фиброза органа тела, рака или гломерулосклероза осуществляют ингибированием сигналинга трансформирующего фактора роста - бета1 (TGF-β1).
TGF-β известен как высоко плейотропный цитокин, который играет важную роль в контроле апоптоза, ангиогенеза, заживления ран, иммунной регуляции и природе опухоли. TGF-β существует в трех изоформах: TGF-β1, TGF-β2 и TGF-β3. Все три TGF-β используют один и тот же рецептор. TGF-β рецептор имеет три компонента: тип I (RI или ALK5), тип II (RII) и тип III (RIII или бетагликан). TGF-β (все изоформы) связывает RIII и пополняет RII, который затем фосфорилирует RI с образованием гетеротетрамерного серин/треонин киназного комплекса. В свою очередь, RI фосфорилирует Smad2 и Smad3 (рецептор-ассоциированные Smads (R-Smads)), и последний образует гетеромерный комплекс со Smad4, который перемещается к ядрам, связывается с ДНК и регулирует транскрипцию (Prud'homme GJ, Lab Invest 87:1077-1091, 2007).
Как используется в данном документе, выражение “ингибирование TGF-бета1 сигналинга” означает, что TGF-β1 не удается связываться с рецептором, к тому же Smad2 и Smad3 не удается подвергнуться фосфорилированию, таким образом, не удается образовать комплекс со Smad4, и в результате, комплексу не удается переместиться к ядрам и регулировать транскрицию.
Соответственно, данное изобретение обеспечивает композицию для лечения и/или предупреждения остеохондроза, содержащую пептид, или его вариант, или его фармацевтически приемлемую соль по данному изобретению.
Кроме того, данное изобретение обеспечивает композицию для лечения фиброза органа тела, содержащую пептид, или его вариант, или его фармацевтически приемлемую соль по данному изобретению.
Кроме того, данное изобретение обеспечивает композицию для лечения рака, содержащую пептид, или его вариант, или его фармацевтически приемлемую соль по данному изобретению.
Кроме того, данное изобретение обеспечивает композицию для лечения гломерулосклероза, содержащую пептид, или его вариант, или его фармацевтически приемлемую соль по данному изобретению.
Пептид данного изобретения можно получить способами, обычно применяемыми в пептидном синтезе. Например, пептид можно получить способами, описанными в Schroder и Lubke, The Peptides, Vol.1, Academic Press, New York, 1965, и подобных, и можно получить, или жидкофазным синтезом, или твердофазным синтезом.
Примеры способов для образования пептидных связей включают азидный способ, хлорангидридный способ, симметрически ангидридный способ, смешанный ангидридный способ, карбодиимидный способ, способ карбодиимид-добавки, способ с активированным сложным эфиром, карбодиимидазольный способ, окислительно-восстановительный способ и способ, применяющий K-реагент Вудворда. В синтезе пептида цистиновую часть можно получить при помощи применения цистинового производного или превращением цистеиновой части пептидной цепи в цистиновую часть после образования пептидной цепи, при помощи традиционного способа.
Перед проведением реакции связывания карбоксильную группу, аминогруппу, гуанидиновую группу, гидроксильную группу и подобные, которые не участвуют в реакции, можно защитить, и карбоксильную группу, и аминогруппу, которые участвуют в реакции связывания, можно активировать способами, известными в данном уровне техники.
Примеры защитных групп для карбоксильной группы могут включать группы, образующие сложный эфир, такие как метил, этил, бензил, p-нитробензил, t-бутил и циклогексил.
Примеры защитных групп для аминогруппы могут включать бензилоксикарбонил, t-бутоксикарбонил, изоборнилоксикарбонил и/или 9-флуоренилметилоксикарбонил.
Примеры защитных групп для гуанидиновой группы могут включать нитро, бензилоксикарбонил, тозил, p-метоксибензолсульфонил и/или 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил.
Примеры защитных групп для гидроксильной группы могут включать t-бутил, бензил, тетрагидропиранил и/или ацетил.
Примеры активированных форм карбоксильной группы могут включать симметричный ангидрид, азид и активный сложный эфир (сложный эфир со спиртом, например, пентахлорфенолом, 2,4-динитрофенолом, цианометиловым спиртом, p-нитрофенолом, N-гидрокси-5-норборнен-2,3-дикарбоксимидом, N-гидроксисукцинимидом, N-гидроксифталимидом и 1-гидроксибензотриазолом).
Примером активированной аминогруппы является амид-фосфат.
Реакцию проводят в растворителе, таком как хлороформ, дихлорметан, этилацетат, N,N-диметилформамид, диметилсульфоксид, пиридин, диоксан, тетрагидрофуран, вода, метанол или их смеси.
Температура реакции может быть в диапазоне приблизительно от -30 до +50°С, которую обычно применяют для реакции.
Реакция для удаления защитной группы пептида данного изобретения может отличаться в зависимости от вида защитной группы, но она должна быть таковой, которая способна освободить защитную группу, не оказывая никакого влияния на пептидное связывание.
Защитную группу можно удалить кислотной обработкой, например, обработкой хлорводородом, бромводородом, фторводородом, метансульфоновой кислотой, трифторометансульфоновой кислотой, трифтороуксусной кислотой или смесью этих кислот. Кроме того, можно применить восстановление металлическим натрием в жидком аммиаке или каталитическое восстановление посредством палладированного угля.
В проведении реакции для удаления защитной группы вышеуказанной кислотной обработкой, можно выбрать добавку, такую как анизол, фенол или тиоанизол.
После того, как реакция завершилась, полученный пептид данного изобретения можно восстановить традиционным способом для очистки пептидов, например, экстракцией, разделением, повторным осаждением, повторной кристаллизацией или колоночной хроматографией.
Кроме того, пептид данного изобретения можно превратить в его вариант или его фармацевтически приемлемую соль, традиционным способом как описано выше.
Пептид по данному изобретению можно синтезировать автоматизированным синтезатором пептидов или можно получить способами генной инженерии. Например, желаемый пептид можно изготовить посредством подготовки слитого гена, кодирующего слитый белок, состоящий из сливающейся клетки и пептида данного изобретения через генное воздействие, преобразуя микроорганизм хозяина со слитым геном, экспрессируя желаемый пептид в форме слитого белка в микроорганизме хозяина, и расщепляя, и отделяя пептид данного изобретения от слитого белка с помощью протеазы или смеси.
Аминокислоты, применяемые в данном изобретении, сокращены в соответствии с номенклатурой IUPAC_IUB, как указано ниже.
<u>Аминокислота</u>
<u>Сокращение</u>
Аланин
A
Аргинин
R
Аспарагин
N
Аспарагиновая кислота
E
Цистеин
C
Глутаминовая кислота
D
Глутамин
Q
Глицин
G
Гистидин
H
Изолейцин
I
Лейцин
L
Лизин
K
Метионин
M
Фенилаланин
F
Пролин
P
Серин
S
Треонин
T
Триптофан
W
Тирозин
Y
Валин
V
Доза пептида, или его варианта, или фармацевтически приемлемой соли находится в диапазоне от 50 мкг/день до 1 мг/день, предпочтительно от 0,5 мг/день до 1 мг/день для парентерального введения. Для перорального введения доза составляет от 1,2 до 1,5 раз больше, чем парентеральная доза. Для ректального введения доза составляет от 2 до 5 раз больше, чем парентеральная доза. Пептид данного изобретения вводят главным образом парентеральными путями, например, локальной инъекцией (внутридисковая инъекция для остеохондроза и локальная вводимая внутрь пораженных тканей инъекция для другого фиброза органа тела и рака), внутривенной/внутримышечной или подкожной инъекцией, интрацеребровентрикулярным или интраспинальным введением или трансназальным введением и внутриректальным введением. Кроме того, можно выбрать пероральное введение при необходимости.
Пептид или композицию данного изобретения в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, можно сформулировать в желаемые лекарственные формы, такие как инъекции, суппозитории, порошки, назальные капли, гранулы, таблетки и т.д.
Фармацевтически приемлемый носитель можно получить согласно ряду факторов, хорошо известных специалистам данной области техники, например, принимая во внимание следующие не ограничивающие факторы: отдельный физиологически активный материал для применения и его концентрация, стабильность и предполагаемая биологическая доступность; заболевание, нарушение или состояние, подвергаемое лечению; субъект, подвергаемый лечению и его возраст, размер и общее состояние; и предполагаемый путь введения композиции, например, назальный, пероральный, глазной, локальный, трансдермальный и внутримышечный. Вообще, примеры фармацевтически приемлемого носителя, используемого для введения физиологически активного материала, в отличие от перорального пути введения, могут включать D5W (5% глюкозы в воде), водный раствор, содержащий 5% по объему или менее декстрозы и физиологический солевой раствор. В случае локальной инъекции, вводимой внутрь поражения, разнообразие инъецируемых гидрогелей можно применять для усиления терапевтических действий и увеличения продолжительности действия лекарственного средства. К тому же фармацевтически доступный носитель может содержать дополнительные ингредиенты, которые могут усиливать стабильность активных ингредиентов, такие как консерванты и антиоксиданты. Пептид или композицию данного изобретения можно предпочтительно сформулировать в желаемую лекарственную форму, в зависимости от болезней, требуемых лечения и ингредиентов, с помощью любого подходящего способа, известного в данном уровне техники, например, как раскрыто в “Remington's Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA (последнее издание).
Пептид данного изобретения можно хранить в физиологическом солевом растворе и можно лиофилизировать в ампуле после добавления маннита или сорбита. Лиофилизированный пептид можно растворить в физиологическом солевом растворе или подобном для восстановления перед применением.
Кроме того, данное изобретение предусматривает пептид, или его вариант, или его фармацевтически приемлемую соль по данному изобретению для использования в качестве лекарственного препарата.
Кроме того, данное изобретение обеспечивает использование пептида, или его варианта, или его фармацевтически приемлемой соли по данному изобретению для изготовления лекарственного препарата для лечения и/или предупреждения остеохондроза, фиброза органа тела, рака и/или гломерулосклероза.
Кроме того, данное изобретение обеспечивает способ для лечения и/или предупреждения остеохондроза, фиброза органа тела, рака и/или гломерулосклероза, при котором вводят пептид, или его вариант, или его фармацевтически приемлемую соль по данному изобретению субъекту (млекопитающему, включая человека).
Лечение фиброза органа тела, рака и/или гломерулосклероза можно осуществлять ингибированием TGF-бета1 сигналинга.
ПОЛЕЗНЫЕ ДЕЙСТВИЯ
Новый пептид данного изобретения, или его вариант, или его фармацевтически приемлемая соль эффективен(а) для лечения и/или предупреждения остеохондрозов, фиброза органа тела, рака и/или гломерулосклероза и эффективен для ингибирования TGF-бета1 сигналинга.
ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
ФИГ. 1 иллюстрирует снимок, взятый после окрашивания нормальной ткани диска, дегенерированной ткани диска с введенным DMSO и дегенерированной ткани диска с введенным пептидом примера 1.
ФИГ. 2 иллюстрирует диаграмму, показывающую уровни экспрессии гена аггрекана дисковой группы с введенным DMSO и дисковой группы с введенным пептидом примера 1 в модели дегенерации диска, по сравнению с нормальной дисковой группы как эталона.
ФИГ. 3 иллюстрирует результаты Вестерн-блоттинга для подтверждения фосфорилированных Smad2 экспрессированных в не подвергающихся обработке HepG2 клетках, TGF-бета1-обработанных клетках, TGF-бета1/SB431542-обработанных клетках, TGF-бета1/клетках обработанных пептидом примера 1 и TGF-бета1/клетках обработанных DMSO.
СПОСОБ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее данное изобретение будет описано детальнее со ссылкой на следующие примеры. Эти примеры представлены только для иллюстрации данного изобретения и не должны быть истолкованы, как ограничивающие объем и понимание данного изобретения.
Пример 1: Получение пептида
Пептид (LQVVYLH: SEQ ID NO: 1), имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 был получен Peptron Inc. (Республика Корея) на запрос нынешних изобретателей. В частности, аминокислотные единицы были соединены одна за одной с C-конца, посредством Fmoc SPPS (9-флуоренилметилоксикарбонилового твердофазного пептидного синтеза), используя автоматизированный синтезатор пептидов (ASP48S, Peptron Inc.).
2
2
Применяли NH-His(Trt)-2-хлор-тритиловую смолу, в которой первая аминокислота C-конца пептида была прикреплена к смоле. Все аминокислоты, используемые в пептидном синтезе, были защищаемые тритилом (Trt), t-бутилоксикарбонилом (Boc), t-бутилом (t-Bu), и подобными, тем самым N-конец защищен Fmoc, и остатки полностью удалены в кислоте. В качестве связующего реактива был использован 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний гексафторфосфат (HBTU)/гидроксибензотриазол (HOBt)/N-метилморфолин (NMM). (1) Защищенная аминокислота (8 эквивалентов) и связующий регент HBTU (8 эквивалентов)/HOBt (8 эквивалентов)/NMM (16 эквивалентов) были растворены в диметилформамиде (DMF) и добавлены с последующей реакцией при комнатной температура в течение 2 часов. (2) Удаление Fmoc осуществляли посредством добавления 20% пиперидина в DMF, с последующей реакцией при комнатной температуре в течение 5 минут дважды. Реакции (1) и (2) были повторены для получения основного пептидного скелета, и пептид отделяли от смолы с помощью трифтороуксусной кислоты (TFA)/1,2-этандитиол (EDT)/тиоанизол/триизопропилсилан (TIS)/HO=90/2,5/2,5/2,5/2,5. Пептид был очищен обращенно-фазовой ВЭЖХ с помощью Vydac Everest C18 колонки (250 мм, 22 мм, 10 мкм) и затем отеделен линейным градиентом вода-ацетонитрил (10-75% (объем/объем) ацетонитрила), содержащим 0,1% (объем/объем) трифтороуксусной кислоты. Молекулярный вес очищенного пептида был подтвержден с помощью LC/MS (Agilent HP1100 серий), с последующей лиофилизацией.
Пример 2: Подтверждение действий регенерации диска
2-1. Получение модели дегенерации диска животного и сбор экспериментального диска
30 кроликов (New Zealand white rabbits; Orient Bio Inc.) весом 3-3,5 кг были подготовлены независимо от пола.
Кролики были анестезированы внутримышечной инъекцией 5 мг/кг ксилазина (Rompun, Bayer) и 35 мг/кг кетамина хлоргидрата (Ketalar, Pfizer). Перед процедурой была получена рентгенограмма отчетливого ответвления с помощью рентгеноскопического аппарата (Model VPX-200; Toshiba Co.) для установления высоты исходного уровня предварительной инъекции межпозвоночного диска. Контроль исходного уровня относится к стандарту для измерения дискового пространства. После того, как кролики были размещены в лабораторной таблице, L23, L34, L45 и L56 дисковые уровни были подтверждены вычислительной машиной, и фиброзное кольцо было проколото в заднебоковой стороне диска при L23, L45 и L56 уровнях с помощью 18G иглы. После восстановления после анестезии животных поместили в клетку при следующих производственных условиях: температура 20-25ºС, влажность 10-50% и цикл света/темноты (L/D): (свет с 08:00 до 20:00). Всех животных кормили один раз в день. Снимки рентгенограммы были сняты на 2 и 4 неделях после начального кольцевидного укола. Рентгенограммы были сняты после анестезии. На основе результатов рентгенограммы была измерена высота межпозвоночного диска (IVD высота). Из результатов измерения количественно определяли степень дегенерации диска модификацией способа, раскрытого в Lu et al., Spine. 22:1828-34, 1997.
После этого эксперименты были проведены для двух отдельных групп, контрольной группе с введенным DMSO и экспериментальной группе с введенным пептидом примера 1, и кролики были умерщвлены инъекцией кетамина (25 мг/кг) и пентобарбитал натрия (1,2 г/кг, Nembutal, Ovation) согласно запланированному расписанию, с последующим извлечением диска для гистологического и биохимического анализа, соответственно.
2-2. Измерение действий регенерации диска посредством окрашивания ткани диска
Кролики с дегенерированным диском из раздела 2-1 были поделены на две группы. Каждой группе давали диметилсульфоксид (DMSO) и пептид примера 1 (0,5 ммоль/животное) посредством локальной внутридисковой инъекции дважды. Точка введения для каждой группы составила 4 недели после вызывания дегенерации диска и 2 недели после этого. После второго введения животные выращивались в течение 2, 4 и 8 недель соответственно. На неделях 4, 6 и 10 после первого введения каждого из пептида примера 1 и DMSO, аналогичные соответствующие ткани диска были извлечены и закреплены в формалине. Закрепленные ткани диска были погружены в парафин, и были получены серийные срезы, имеющие толщину 4 мм вдоль сагиттальной плоскости. Из этих срезов два среднесагиттальных среза были окрашены гематоксилином и эозином (H&E). Для сравнения с нормальной тканью диска, диск был извлечен из кроликов, обработан и окрашен без вызывания дегенерации диска согласно такому же способу, описанному выше.
ФИГ. 1 иллюстрирует микрографические результаты отдельных тканей диска, которые были извлечены и окрашены на 10 неделе. A и B: нормальная ткань диска, C и D: дегенерированная ткань диска с введенным DMSO, и E, и F: дегенерированная ткань диска с введенным пептидом примера 1. A, C и E: x40, и B, D и F: x400. На x400 картинках, стрелка показывает ядра клетки диска.
В результате, было отмечено, что студенистое ядро и фиброзное кольцо определенно различимы между собой и внеклеточные матричные компоненты распространены в нормальной ткани диска (панели A и B ФИГ. 1). К тому же характерное окрашивание ядра клетки наблюдалось в студенистом ядре нормальной ткани диска (панель B ФИГ. 1).
С другой стороны, ткань диска с введенным DMSO показала дробление диска, неопределенность между фиброзным кольцом и студенистым ядром, и недостаток внеклеточных матричных компонентов (панели C и D ФИГ. 1). Кроме того, было сложно обнаружить окрашенное ядро клетки в области студенистого ядра (панель D ФИГ. 1). То есть эти результаты свидетельствуют о смерти клеток, которые присутствовали в студенистом ядре. Смерть клетки вследствие дегенерации диска уже известна, и отсутствие клеток привело к отсутствию выработки внеклеточных матричных компонентов, таким образом дополнительно усугубляя дегенерацию диска.
Ткань диска с введенным пептидом примера 1 показала увеличенный размер диска, как по сравнению с тканью диска с введенным DMSO, являющейся видимой между студенистым ядром и фиброзным кольцом, и избыток внеклеточных матричных компонентов (панели E и F ФИГ. 1). К тому же яркое окрашивание ядер клеток наблюдалось в области студенистого ядра (панель F ФИГ. 1).
Из этих результатов было показано, что пептид примера 1 имеет терапевтические действия диска посредством предупреждения уменьшения внеклеточных матричных компонентов и смерть клеток вследствие дегенерации диска.
Пример 3: Подтверждение увеличенной экспрессии гена аггрекана в ткани диска
ПЦР в режиме реального времени был проведен для исследования уровня экспрессии гена аггрекана, который представляет собой характерный внеклеточный матричный компонент в ткани диска.
Таким же образом, как в примере 2-1, животные были подготовлены и поделены на две группы, каждой из которых были введены DMSO и пептид примера 1 (0,5 ммоль/животное) посредством локальной внутридисковой инъекции. Точка введения для каждой группы составила 4 недели после вызывания дегенерации диска и 2 недели после этого. После второго введения животные выращивались в течение 2, 4 и 8 недель, соответственно. На неделях 4, 6 и 10 после первого введения каждого из пептида примера 1 и DMSO, аналогичные соответствующие ткани диска были извлечены, и студенистое ядро, и фиброзное кольцо были отделены и помещены в пробирки, с последующим быстрым замораживанием в жидком азоте и хранением в сверхнизкотемпературной морозильной камере при -70°С.
Общая РНК была выделена из быстрозамароженной и хранящейся ткани диска с помощью реагента-триазола (Invitrogen). кДНК была синтезирована с помощью выделенной общей РНК (2 мкг), олиго dT и MMLV-обратной транскриптазы (Invitrogen).
(-△△CT)
Количество мРНК GAPDH и аггрекана было исследовано с помощью Prism 7900HT (ABI) с помощью PowerSYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems Inc.). 25 нг кДНК, 3 мкл 10 мкM праймеров и 2X PowerSYBR Green PCR Master Mix были смешаны для получения общего объема 10 мкл. ПЦР в режиме реального времени осуществлялась при следующих условиях реакции: вызывание энзиматической активности при 50°С в течение 2 минут и при 95°С в течение 10 минут, а затем 45 циклов, каждый состоящий из реакции при 95°С в течение 15 секунд и реакции при 60°С в течение 1 минуты, с последующим измерением каждого значения порогового цикла (CT). GAPDH был выбран в качестве эталонного гена, и была подсчитана CT разница значений (△CT) между эталонным геном и геном аггрекана. К тому же была подсчитана CT разница значений (△△CT) между нормальным диском и диском с введенным пептидом примера 1 (или диском с введенным DMSO). Затем, 2 было подсчитано и выражено в процентном выражении по отношению к значению нормального диска.
Результаты ПЦР в режиме реального времени приведены на ФИГ. 2. ФИГ. 2 представляет собой диаграмму, показывающую период действия уровней экспрессии гена аггрекана дисковой группы с введенным DMSO и дисковой группы с введенным пептидом примера 1 в модели дегенерации диска, по сравнению с нормальной дисковой группой как эталона. Как показано в вышеуказанной диаграмме, видно, что на неделе 4, ткань диска с введенным пептидом примера 1 показала увеличение в экспрессии гена аггрекана по сравнению с тканью диска с введенным DMSO. На неделях 6 и 10, ткань диска с введенным пептидом примера 1 показала уровень экспрессии аггрекана сходный с таковым ткани диска с введенным DMSO. Так как пептид примера 1 был введен только на 0 и 2 неделях, а затем животные остались без дополнительного введения, можно отметить, что увеличение в экспрессии гена аггрекана на 4 неделе было достигнуто действием пептида примера 1, который однако не сохранял экспрессию гена аггрекана на 6 и 10 неделях. Из этих результатов видно, что пептид данного изобретения показывает действия регенерации диска посредством увеличения экспрессии гена аггрекана, характерного внеклеточного матричного компонента, необходимого для регенерации диска в ткани диска, и продолжительности действия усиливающего экспрессию гена аггрекана пептида, не слишком длинной, чтобы таким образом исключить возможные побочные эффекты вследствие избыточного увеличения экспрессии гена аггрекана.
Пример 4: Подтверждение ингибирования TGF-бета1 сигналинга
Ингибирование TGF-бета1 сигналинга пептидом примера 1 было подтверждено в соответствии со следующим экспериментальным способом.
6
3
4
Известно, что лечение HepG2 клеток TGF-бета1 приводит к апоптозу, во время которого Smad2 первым фосфорилируется (Park TJ. et al., Mol Carcinog. 47:784-796, 2008; и Gressner AM. et al., J Hepatol. 26:1079-1092, 1997). С помощью этих свойств эксперимент проводили, как указано далее. 1x10HepG2 клеток (ATCC; Американская коллекция типовых культур) были высеяны в 60 мм планшет, стабилизированы в течение всей ночи, и затем обеднены питательными веществами посредством бессывороточной среды (SFM) в течение 24 часов. Перед обработкой клеток пептидом примера 1, 5 нг/мл TGF-бета1 (PromoKine, Германия) и вышеуказанным пептидом (1, 5 и 25 мкмоль) были подвергнуты предварительной инкубации при 37°С в течение 1 часа. Кроме того, DMSO (2 мкл/мл) был также предварительно инкубирован с TGF-бета1 (5 нг/мл) при 37°С в течение 1 часа. Затем клетки были обработаны предварительно инкубированными растворами в течение 30 минут с последующим извлечением белков. К тому же клетки были предварительно обработаны только 10 мкмоль SB431542 (TOCRIS, США), ингибитором TGF-бета рецептора с последующей инкубацией в течение 1 часа, и затем обработаны TGF-бета1 (5 нг/мл) в течение 30 минут. Затем клетки были гомогенизированы на льду в радиоиммунопреципитационном (RIPA) лизисном буфере (Millipore) {50 ммоль Трис-HCl (pH 7,4), 150 ммоль NaCl, 0,25% дезоксихолевая кислота, 1% NP-40, 1 ммоль этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), 1 ммоль фенилметилсульфонил фторид (PMSF), 40 ммоль NaF, 1 ммоль NaVO, 1 ммоль дитиотреитол (DTT)}. Гомогенат был разрушен ультразвуком пять раз с помощью BRANSON SONIFIER 450 с выходным контролем 2,56, цикл нагрузки (%) 20 и датчиком времени 6. Клеточный лизат был центрифугирован при 4°С и 12000 об/мин в течение 10 минут, и супернатант использовался для Вестерн-блоттинга. Концентрация белка была оценена с помощью способа Брэдфорда. 30 мкг белка добавили к SDS буферу для образа, содержащему 2-меркаптоэтанол. После выдерживания при 95°С в течение 5 минут фракционирование провели посредством 10% SDS-PAGE, с последующим Вестерн-блоттингом. Для Вестерн-блоттинга франкционированный белок перенесли в нитроцеллюлозную мембрану (Bio-Rad Lab) и заблокировали 5% снятым латексом в PBS-T с последующей реакцией с 1:3000 разведением начального антитела в 5% снятом латексе в PBS-T при 4°С в течение всей ночи. Далее, мембрану промыли три раза PBS-T в течение 5 минут, обработали 1:5000 разведением пероксидазы хрена (HRP)-сопряженным анти-кроличьим вторичным антителом (Bio-Rad Lab, 1706515) в 5% снятом латексе в PBS-T при комнатной температуре в течение 1 часа, и подвергли цветному проявлению с помощью ECL (Amersham Pharmacia). Поскольку Smad2 первый фосфорилируется одновременно со связыванием TGF-бета1 с TGF-бета рецептором, фосфо-Smad2 (серия 465/467) антитело (Cell Signaling, 3101, 8), способное к обнаружению фосфорилированного Smad2, применялося как первичное антитело.
Результаты показаны на ФИГ. 3. ФИГ. 3 иллюстрирует результаты Вестерн-блоттинга (линия 1: необработанные HepG2 клетки, линия 2: TGF-бета1-обработанные клетки, линия 3: TGF-бета1/SB431542-обработанные клетки, линии 4, 5 и 6: клетки, обработанные 1, 5, и 25 мкмоль пептид/TGF-бета1, соответственно и линия 7: TGF-бета1/DMSO-обработанные клетки). На ФИГ. 3, символ '+' показывает, что она была обработана материалом субъекта, и '-' показывает, что она не была обработана материалом субъекта. Нижняя часть ФИГ. 3 иллюстрирует результаты окрашивания мембраны кумасси голубым, применяемым в Вестерн-блоттинге, показывающие, что количество белка одинаковое во всех линиях.
Ссылаясь на ФИГ. 3, было отмечено, что линия 1 проявляет очень незначительное фосфорилирование белка, извлеченного из необработанных HepG2 клеток, где линия 2 показывает значительное фосфорилирование белка посредством TGF-бета1. К тому же было отмечено, что линия 3 показывет полное ингибирование фосфорилирования посредством SB431542. Было подтверждено, что степень фосфорилирования белка была уменьшена дозозависимым способом, когда пептид примера 1 был обработан при концентрации 1 мкмоль, 5 мкмоль и 25 мкмоль, соответственно. DMSO-обработанная линия 7 показала такие же графики как обработка TGF-бета1.
Из этих результатов можно заметить, что поскольку пептид данного изобретения проявляет дозозависимое ингибирование TGF-бета1 сигналинга, болезни, излечимые вышеупомянутым ингибированием TGF-бета1 сигналинга, т.е. фиброз органа тела, рак и/или гломерулосклероз могут быть вылечены (Prud'homme GJ, Lab Invest 87:1077-1091, 2007). Кроме того, можно отметить, что пептид примера 1 полностью не ингибирует TGF-бета1 сигналинг, непохожий на SB431542. Как TGF-бета1 сигналинг является важным регуляторным механизмом в человеческом теле, полное ингибирование TGF-бета1 сигналинга, такое как посредстовм SB431542, может приводить к побочным эффектам. Однако пептид данного изобретения ослабляет TGF-бета1 сигналинг дозозависимым способом, так что концентрация пептида может быть преимущественно доведена до, таким образом, пониженных возможных побочных эффектов при его применении для лечения рассматриваемых болезней.
Промышленная применимость
Новый пептид данного изобретения, или его вариант, или фармацевтически приемлемая соль эффективен(а) для лечения и/или предупреждения остеохондрозов, фиброза органа тела, рака и/или гломерулосклероза, и эффективен(а) для ингибирования TGF-бета1 сигналинга, и является, следовательно, промышленно применимым(ой).