Полиморфизм генов биотрансформации ксенобиотиков GSTT1, GSTM1, CYP2E1 и CYP2C19 у больных атопической бронхиальной астмой

УДК 575.2244.22: 616.248

Е.Ю. Брагина, М.Б. Фрейдин, И.А. Тен, Л.М. Огородова

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ БИОТРАНСФОРМАЦИИ КСЕНОБИОТИКОВ GSTT1> GSTM1, CYP2E1 И CYP2C19 У БОЛЬНЫХ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ

ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН, Томск Сибирский государственный медицинский университет, Томск

Представлены результаты исследования полиморфизмов по«нулевым» аллелям генов GSTT1 и GSTM1, а также генов CYP2E1, CYP2C19 у больных атопической бронхиальной астмой и здоровых жителей г. Томска. Не установлено связи изученных полиморфизмов генов CYP2C19 и CYP2E1 со степенью тяжести астмы. Частота генотипа GSTT1+/GSTM1+ была значимо выше в контрольной группе ^=0,0287).

Ключевые слова: глутатион S-трансферазы, цитохром P-450, гены ферментов биотрансформации, полиморфизм

Введение

В развитие большинства патологий наряду с генетическими факторами существенный вклад вносит влияние окружающей среды. Постоянное воздействие на организм ксенобиотиков в экологически неблагоприятных регионах вызывает сбой в работе ферментативной системы метаболизма (ФМК), что приводит к росту многих социально значимых заболеваний. Поскольку негативное воздействие окружающей среды выступает фактором риска при бронхиальной астме (БА), то представляется перспективным изучение вклада генов, кодирующих ФМК и определяющих индивидуальную чувствительность к агентам окружающей среды, в возникновение и развитие данной патологии.

ФМК активно задействованы в метаболизме различных субстратов, в том числе и интермедиатов процессов воспаления. Одной из характерных особенностей этой группы ферментов является широкая межиндивидуальная вариабельность изозимного спектра, обусловленная генетическим полиморфизмом. Это позволяет определить среди индивидуумов группы «быстрых», «средних» и «медленных» метаболизеров, различающихся в скорости деградации ксенобиотиков и эндогенных субстратов [1]. Возможно, эти различия играют определенную роль в формировании клинического фенотипа БА.

В представленной работе впервые изучены ассоциации полиморфизмов генов цитохромов Р450 2С19 и 2Е1 со степенью тяжести у больных БА г. Томска, а также проведено сравнительное исследование в группе больных и контроле для генов СБТТ1 и ОБТМ1.

Материал и методы

Объектом исследования стала семейная выборка (n=207), из них 139 человек — больные атопической БА, проходящие курс лечения в областном Центре клинической иммунологии и аллергологии (областная детская больница, г. Томск). Выборку больных БА составили 68 индивидов женского пола и 71 — мужского пола (средний возраст ±S.D. 28,7±19,5).В качестве контроля использовали материал банка ДНК НИИ медицинской генетики 95 практически здоровых индивидов, не имеющих в анамнезе БА (среди них 5 женщин и 90 мужчин, средний возраст ±S.D. составил 41,2±7,9).Все участники исследования славянской национальности, проживающие на территории г. Томска. Исследование выполнено в соответствии с Правилами клинической практики в Российской Федерации, принятыми в 2003 г.

Проведено комплексное клиническое обследование, включающее оценку семейного анамнеза, мониторирование клинических симптомов и функции легких. Подтверждение атопического статуса проведено с помощью кожных аллергопроб и исследования уровня IgE в сыворотке крови. Для диагноза БА и установления степени тяжести заболевания использованы критерии документа GINA 2002.

Для проведения молекулярно-генетического анализа были взяты образцы венозной крови в количестве 5-10 мл. Выделение ДНК проводили стандартным методом с фенол-хлороформной очисткой.

Генотипирование для генов GSTT1 и GSTM1 проводили с помощью мультиплексной ПЦР. Гомозиготность по «нулевым» аллелям генов

GSTT1 и GSTM1 определяли по отсутствию соответствующих фрагментов размером 131 и 114 п.н. Наличие этих фрагментов свидетельствовало о гомо- либо гетерозиготности по одной нормальной копии гена. Нормальные аллели генов GSTT1 и GSTM1 обозначали «+/+», наличие делеции по одному гену «+/-» , «-/+», соответственно, полная делеция по двум генам — «-/-». Для внутреннего контроля амплификации определяли фрагмент гена ER размером 181 п.н. [12].

Для гена CYP2C19 определяли полиморфизм 681G>A в пятом экзоне, а также исследовали полиморфный вариант 7632T>A в шестом интроне гена CYP2E1, генотипирование осуществляли по опубликованным источникам [7, 11].

Для работы были использованы праймеры и рестриктазы, произведенные НПО «Сибэнзим» (г. Новосибирск). Продукты амплификации визуализировали в 3% агарозном геле в проходящем УФ-свете.

Для поиска ассоциаций изучаемой патологии с исследуемыми генетическими маркерами был применен тест на неравновесие по сцеплению Transmission/DiseqiHbrium Test (TDT) [5], а также определены величины отношения шансов (OR) с оценкой их значимости по точному тесту Фишера.

Результаты и обсуждение

Изучение полиморфизмов генов ФБК в последнее время привлекает особое внимание исследователей. Показано, что аллель CYP1A1-Val, мутация S2 гена NAT2, отсутствие мутации S1 в этом же гене и «нулевые аллели» генов GSTT1 и GSTM1 ассоциированы с предрасположенностью к БА у детей (Новосибирск) [2]. Найдены ассоциации полиморфизмов по «нулевым» аллелям генов GSTT1 и GSTM1 с БА (Санкт-Петербург) [3]. Многолетние исследования показали ассоциации между полиморфными вариантами GSTT1 и GSTM1 и процессами канцерогенеза, а также эн-дометриозом [11]. Пациенты, несущие делецию

генов обоих ферментов имеют более высокий риск развития раковых заболеваний [10].

Значение генов СУР2С19 и СУР2Е1 в отношении атопической бронхиальной астмы у русских изучено впервые. Основной генетический дефект, найденный у «медленных» метаболизеров ^)-мефенетоина — точечная замена G на А в пятом экзоне гена СУР2С19 (СУР2С19*2) приводит к аберрантному сайту сплайсинга. Частота фенотипа «медленного» метаболизера у европейцев встречается в 4-5 раз реже, чем у азиатов (2-5% и 13-20% соответственно) [13, 14].

Полиморфизм СУР2Е1 связан с наличием в шестом интроне гена аллелей С и D. В европеоидной популяции аллель С встречается с частотой до 90%, у монголоидов - до 50%. С аллелем D ассоциированы редкие мутации, влияющие на экспрессию гена и каталитическую активность соответствующего белка [9].

Распределение генотипов изучаемых полиморфизмов генов СУР2С19 и СУР2Е1 соответствовало ожидаемому при распределении Харди-Вайнберга (Таблица 1), однако частота аллеля М гена СУР2С19 в популяции русских жителей г. Томска составила 18,8%, что, по данным литературы, выше частоты, характерной для европеоидов [13, 14]. Этот факт позволяет предположить наличие специфики генофонда русских Томского региона, где присутствует в высокой степени примесь монголоидной компоненты.

Анализ семейного материала с помощью теста TDT показал отсутствие ассоциации изучаемых полиморфизмов генов СУР2С19 (TDT=2,083, р=0,139±0,003) и СУР2Е1 (ГОТ=1,125, р=0,324±0,004) с атопической БА. Возможно, они не вовлечены в формирование данной патологии в исследованной выборке в г. Томске либо их роль очень мала, а также можно предположить, что данная система обладает в определенной степени универсальностью за счет широкой субстратной специфичности и индуцибельности, позволяю-

Таблица 1

Распределение генотипов CYP2C19 и CYP2E1 у больных бронхиальной астмой г. Томска

Ген Генотип Абс. % Частота аллеля, О/ % сч II d.

ww 85 63,9

CYP2C19 wm 46 34,6 MW УУ оо 82 * S So cnA

mm 2 1,5

cc 65 79,3

CYP2E1 cd 17 20,7 DC У 1 со 46 - 1 S-л &

dd 0 0,0

Примечание: * критерий х2 использован для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга.

Таблица 2

Распределение генотипов CYP2C19 у больных бронхиальной астмой разной степени тяжести

Генотип Группы сравпепия

I, n=28 II, n=57 III, n=48 I—»II** I—III** II—III**

ww,

wm,

mm, (%)* 0 (0,0) 1 (1,8) 1 (2,1) 0,807 0,636 0,313

p** 0,535

Примечание: * из-за малочисленности гомозигот «тш» объединили с гетерозиготами «тт». ** достигнутый уровень значимости по точному тесту Фишера.

Таблица 3

Распределение генотипов СYP2E1 у больных бронхиальной астмой разной степени тяжести

Генотип Группы сравпепия

I, n=25 II, n=37 III, n=20 I—II I—III II—III

ec, (%) 21 (84,0) 26 (70,3) 18 (90,0) 0,245* 0,678* 0,111*

cd,

dd,

p* 0,191

Примечание: * — достигнутый уровень значимости по точному тесту Фишера.

Таблица 4

Частоты комбинаций генотипов генов GSTT1 и GSTM1 у европеоидов, проживающих на территории России

Генотип GSTT1/GSTM1 +/+ +/- -/+ -/- Источник

Холмогоры 65,31 22,45 10,2 2,04 [4]

Ошевенск 64,06 23,44 7,81 4,69

Москва 66,0 22,0 10,0 2,0 [6]

Санкт-Петербург 51,2 32,6 11,6 4,7 [3]

Новосибирск 50,96 37,50 6,73 4,81 [2]

щей компенсировать недостаток одного фермента другим.

Был проведен анализ связи генотипов со степенью тяжести БА. Все больные индивиды были разделены на три группы в зависимости от клинических характеристик: I - легкая, II - среднетяжелая, III - тяжелая БА. Связи между степенью тяжести и исследуемыми полиморфизмами генов CYP2C19 (р=0,535) и CYP2E1 (р=0,191) не выявлено. При попарном сравнении групп различных степеней тяжести БА статистически значимых различий также не обнаружено (Таблица 2,3).

Семейство ферментов глутатионовых S-транс-фераз (GST) играет большую роль в биотрансформации и детоксикации многочисленных различных по составу ксенобиотиков и ряда эндогенных субстратов [1, 3]. Для генов GSTT1 и GSTM1 показан полиморфизм по «нулевым» аллелям, представляющий собой протяженные делеции, результатом которых являются укороченные бел-

ковые продукты без выраженной ферментативной активности. Частота «нулевого» аллеля гена GSTM1 варьирует от 40 до 60% в различных популяциях и этнических группах [8]. Обширная де-леция в структурной части гена GSTT1 (нуль-аллель) встречается у европейцев с частотой до 30% [1, 12]. Из сравнительного анализа распределения частот комбинаций генотипов GSTT1 и GSTM1 среди европеоидов, проживающих на территории России (Таблица 4, 5), в контрольной выборке отмечена несколько повышенная частота (6,3%) именно по «нулевым» аллелям изучаемых генов. Результаты исследования (Таблица 6) в целом согласуются с опубликованными данными, однако в группе больных частота генотипа GSTM1 «+» значительно ниже, чем в контроле (р=0,0108). При сравнении распределения генотипов с полной делецией по двум генам GST и остальных генотипов в группе больных и контроле (Таблица 7) наблюдалась некоторая тенденция к увеличению

Таблица 5

Частоты комбинаций генотипов GSTM1 и GSTT1 у больных атопической бронхиальной астмой и в контроле

Гепотип GSTT1/GSTM1 +/-,

Больные,

Здоровые,

OR* 1,87

p** 0,0607 0,5864 0,0287 0,3985

Примечание: * отношение шансов (95%-ый доверительный интервал); ** достигнутый уровень значимости по точному тесту Фишера.

Таблица 6

Распределение «нулевых» и «ненулевых» генотипов у больных атопической бронхиальной астмой и здоровых жителей г. Томска

Группы сравнения GSTT1 GSTM1

«+»,

Больные 59

Здоровые 79

p* 0,8397 0,0108

Примечание: * достигнутый уровень значимости по точному тесту Фишера.

Таблица 7

Распределение генотипов генов GSTT1 и GSTM1 у больных атопической бронхиальной астмой и здоровых

Группы сравнения GSTT1, GSTM1 «+»*,

Больные 64

Здоровые 89

p*** 0,3985

Примечание: * наличие хотя бы одного «ненулевого» аллеля генов; ** полная делеция; *** достигнутый уровень значимости по точному тесту Фишера.

в группе здоровых, имеющих хотя бы одну нормальную копию гена, однако эти различия статистически незначимы (р=0,3985).

Для генов семейства GST анализ семейного материала методом TDT невозможен по причине трудности в определении наследования гетерозиготного (+/-) и гомозиготного (+/+) генотипа по нормальному аллелю. Поэтому для данных генов были определены величины отношения шансов (OR), характеризующие степень риска развития БА (Таблица 5). В группе контроля комбинация генотипов «+/+» встречается значимо чаще, чем среди больных (0R=0,45, 95% CI=0,21-0,94, p=0,0287). Возможно, в данном случае такое сочетание генотипов GSTT1/GSTM1 «+/+» может выступать как фактор устойчивости для развития БА. Для остальных сочетаний генотипов генов GST значимых отличий не показано.

Таким образом, можно предположить, что изучаемые полиморфизмы генов CYP2C19 и CYP2E1 не вовлечены в развитие атопической БА в выбор-

ке г. Томска. Однако нормальная работа ферментов фазы детоксикации ксенобиотиков (глутати-он S-трансфераз), обеспечивающая утилизацию и выведение токсических продуктов метаболизма из организма, уменьшает риск возникновения заболевания. Учитывая то, что БА — мультифак-ториальная патология, для изучения вклада генов системы биотрансформации необходим дальнейший поиск ассоциаций их полиморфизмов с количественными и качественными признаками, играющими существенную роль в патогенезе заболевания.

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ (01-04-48213) и гранта поддержки ведущих научных школ (ВНШ-840.2003.4) и молодых ученых-кандидатов наук РФ (МК-742.2003.04).

Polymorphism of xenobiotic metabolism genes of the glutatione S-transferase (GSTT1, GSTM1) and cytochrome P450 (CYP2E1 AND CYP2C19) in patients with atopic bronchial asthma

E.Yu. Bragina, M.B. Freidin, I.A. Ten,

L.M. Ogorodova

Polymorphic variants of the GSTT1, GSTM1 null alleles CYP2E1, CYP2C19 were analyzed in patients with atopic bronchial asthma (BA) and healthy individuals from Tomsk. No association was observed for CYP2C19, CYP2E1 and BA severity. The frequencies GSTT1+/GSTM1+ genotypes was significantly higher in control group (p=0,0287).

Литература

1. Вавилин В.А., Макарова С.И., Ляхович В.В., Га-валов С.М. // Генетика. — 2002. — Т. 38. — № 4. — С. 539-545.

2. Геном человека и гены «предрасположенности» / В.С. Баранов, В.Е. Баранова, Т.Э. Иващенко, М.В. Асеев // Введение в предиктивную медицину.

— С-Пб., 2000. — 272 с.

3. Иващенко Т.Э., Седелева О.Г., Петрова М.А. и др. // Генетика. — 2001. — Т. 37. — № 1. — С. 107111.

4. Попова С.Н., Сломинский П.А., Галушкин С.Н. и др. // Генетика. — 2002. — Т. 38. — № 2. — С. 281-284.

5. Фрейдин М.Б., Кобякова О.С., Огородова Л.М. и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. Приложение 1. — 2000. — Т. 129. — С. 5052.

6. Шадрина М.И., Кондратьева Е.А., Сломинский П.А. и др. // Генетика. — 2002. — Т. 38. — № 11. — С. 1566-1568.

7. De Morais Sonia M. F, Wilkinson Grant R, Blais-dellJoyce et al. // The Journal of Biological Chemistry.

— 1994. — Vol. 269. — № 22. — P. 15419-15422.

8. Hatagima A., Klautau-Guimaraes M.A., da Silva

F.P., Cabello P.H. // Genetics and Molecular Biology.

— 2000. — Vol. 23. — № 4. — P. 709-713.

9. Hu Yin, Oscarson Mikael, Johansson Inger et al. // Mol. Pharm. — 1997. — Vol. 51. — P. 370-376.

10. Kim W.-J, Lee H.-L, Lee S.-C. еt al. // The Journal of Urology. — 2000. — Vol. 164. — P. 209-213.

11. Lin D.-X, Tang Y.-M, Peng Q, et al. // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. — 1998. — Vol. 7. — P.1013-1018.

12. Spurdle A.B., Webb P.M., Purdie D.M. et al. // Carcinogenesis. — 2001. — Vol. 22. — P. 67-72.

13. Wilson J.F., Weale M.E., Smith A.C. et al. // Nature Genet. — 2001. — Vol. 29. — P. 265-269.

14. Xie H.G., Kim R.B., Stein C.M. et al. // British Journal of Clinical Pharmacology. — 1999 — Vol. 48.

— Is. 3. — P. 402-408.