ПРОИЗВОДНЫЕ СТЕРИНА И ИХ СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ
STERINE DERIVATIVES AND SYNTHESIS AND USE THEREOF

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к фармацевтическим соединениям в области химических и биологических наук, в частности, к противоопухолевым лекарственным средствам CL168 с общей структурной формулой I и II и их способу синтеза и применению.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Опухоль является одним из основных заболеваний, которые пагубны для человеческого здоровья, и становится вторым по летальности среди различных заболеваний. Большое количество клинических опытов доказывает, что при уничтожении опухолевых клеток химическая обработка и радиационная обработка одновременно характеризуются значительным повреждающим воздействием на нормальные клетки. Эти обработки приводят к серьезному повреждению гемопоэтической системы и нарушению иммунной функции человеческого организма и легко приводят к смерти пациентов. Все опухолевые клетки зависят от сосудов, и ангиогенез является важным этапом при росте и метастазировании опухоли. Как для первичных опухолей, так и вторичных опухолей ангиогенез возникает после того, как опухоль вырастает до диаметра более 2 мм, и затем опухоли растут быстрее и возникает метастазирование (Folkman J. what is the evidence that tumors are angiogenesis department? J Nati Cancer Inst. 1990, 82: 4-6).
В настоящее время лекарственные средства для лечения опухолей в основном могут быть разделены на три типа: цитотоксические лекарственные средства, вспомогательные лекарственные средства при радиотерапии и химиотерапии и ингибиторы ангиогенеза. В настоящее время ингибиторы ангиогенеза являются типом очень многообещающих противоопухолевых лекарственных средств.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Соединения данного изобретения под названием CL168 представляют собой тип соединений с новыми структурными скелетами, явными активностями и специфическими противоопухолевыми мишенями, выбранные из структурных модификаций сотен природных продуктов на основании принципа отбора по модели САМ (Ribatti D, Vacca A, et al. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for in vivo research on anti-angiogenesis. Curr Pharm Biotechnol. 2000 Jul;l(l):73-82.) и VEGF (Gretten TF. Korangy F, et al. Molecular therapy for the treatment of hepatocellular carcinoma.Br J Cancer. 2009 Jan 13; 100(1): 19-23.). Фармакологические эксперименты показывают, что эти соединения обладают значительными противоопухолевыми эффектами, где CL 168-6 имеет противоопухолевый терапевтический индекс 49,3, и могут применяться для получения лекарственных средств для предупреждения и лечения рака, такого как рак печени, рак легких и т.д., и иммунологических заболеваний.
Одной из целей данного изобретения является обеспечение пути синтеза для получения CL168, которое представлено общей формулой I, и его промежуточных химических соединений.
Второй целью данного изобретения является обеспечение пути синтеза для получения CL168, которое представлено общей формулой П, и его промежуточных химических соединений.
Третьей целью данного изобретения является обеспечение применений CL168 общих формул I и П и их промежуточных химических соединений в исследованиях противоопухолевой активности и улучшения иммунитета.
Цели данного изобретения могут быть осуществлены при помощи следующих процедур.
Соединение CL168, представленное общей структурной формулой I, может быть получено способом, включающим следующие этапы:
(1) растворение холестерина (холест-5-ен-3-ол), (соединение 2) в органическом растворителе для получения холестерилацетата (соединение 3) путем реакции холестерина с уксусным ангидридом при катализе катализатором при определенной температуре;
(2) растворение соединения 3 в органическом растворителе для получения 7-бромхолестен-3-олацетата (соединение 4) путем реакции соединения 3 с бромидным реагентом при катализе катализатором при определенной температуре;
(3) растворение соединения 4 в органическом растворителе для получения 7-дегидрохолестен-3-олацетата (соединение 5) путем реакции отщепления с основанием при определенной температуре;
(4) растворение соединения 5 в органическом растворителе для получения 7-дегидрохолестерина (соединение 6) путем гидролиза соединения 5 с основанием при определенной температуре;
(5) растворение соединения 6 в органическом растворителе для получения 5а,8а-эпидиокси-6-холестен-3-ола (соединение 7) путем окисления соединения 6 окислителем при определенной температуре;
(6) растворение соединения 7 в органическом растворителе для получения 5а,8а-эпидиокси-6-холестен-3-она (соединение 1, т.е. CL168-6) путем окисления соединения 7 окислителем при определенной температуре;
Уравнения реакций на вышеуказанных этапах (1)-(6) являются следующими:
Где на этапе (1) органический растворитель выбирают из группы, включающей следующие соединения, каждое из которых содержит 2-20 атомов углерода: эфир, спирт, алкан, ароматический углеводород, кетон, алкилгалогенид, амид, нитрил, сложный эфир или их смесь с различными отношениями концентраций компонентов смеси; температура составляет от -20°С до 250°°С; катализатором является протонная кислота, такая как серная кислота, или органическое основание, такое как пиридин; молярное соотношение соединения 2 к уксусному ангидриду равно 1:1 -20.
Где на этапе (2) органический растворитель выбирают из группы, включающей следующие соединения, каждое из которых содержит 2-20 атомов углерода: ароматический углеводород, алкан, эфир, кетон, алкилгалогенид, амид, нитрил, сложный эфир или их смесь с различными с различными отношениями концентраций компонентов смеси; температура составляет от -10°С до 150°С; бромидным реагентом является бромсукцинимид (NBS), бромоводород или ацетилбромид; катализатором является трифенилфосфин или источник света с длиной волны 290-800 нм; молярное соотношение соединения 3 к бромидному реагенту равно 1:1-10.
Где на этапе (3) органический растворитель выбирают из группы, включающей следующие соединения, каждое из которых содержит 2-20 атомов углерода: ароматический углеводород, алкан, эфир, кетон, алкилгалогенид, амид, нитрил, сложный эфир или их смесь с различными отношениями концентраций компонентов смеси; температура составляет от 0°С до 150°С; катализатором является органическое основание, такое как пиридин или триэтиламин; молярное соотношение соединения 4 к органическому основанию равно 1:1-10.
Где на этапе (4) органический растворитель выбирают из группы, включающей следующие соединения, каждое из которых содержит 2-20 атомов углерода: эфир, спирт, алкан, ароматический углеводород, кетон, алкилгалогенид, амид, нитрил, сложный эфир или их смесь с различными отношениями концентраций компонентов смеси; температура составляет от 0°С до 150°С; катализатором является протонная кислота, которая представлена серной кислотой, или протонное основание, которое представлено гидроксидом натрия.
Где на этапе (5) органический растворитель выбирают из группы, включающей следующие соединения, каждое из которых содержит 2-20 атомов углерода:
ароматический углеводород, алкан, эфир, кетон, алкилгалогенид, амид, нитрил, сложный эфир или их смесь с различными отношениями концентраций компонентов смеси; температура составляет от 0°С до 150°С; катализатором является эозин Y, трифенилфосфин или источник света с длиной волны 290-800 нм.
Где на этапе (6) органический растворитель выбирают из группы, включающей следующие соединения, каждое из которых содержит 2-20 атомов углерода:
ароматический углеводород, алкан, эфир, кетон, алкилгалогенид, амид, нитрил, сложный эфир или их смесь с различными отношениями концентраций компонентов смеси; температура составляет от -20°С до 100°С; серная кислота или раствор хромовой кислоты представляют собой иллюстративный окислитель.
Соединение CL168, представленное общей структурной формулой II, может быть получено способом, включающим следующие этапы:
2-25
3-6
3-9
3-9
1-20
(1) растворение холестерина (соединение 2) в органическом растворителе для получения соединения 3 путем реакции холестерина с реактивом, служащим донором R (R представляет собой C алкильную группу, арильную группу, арильную группу, замещенную электронодонорной группой или электроноакцепторной группой, С алкинильную группу, алкенильную группу, С циклоалкильную группу, С замещенную гетероциклоалкильную группу, С жирнокислотную ацильную группу, ароматическую ацильную группу, сульфонил, циннамоил, каффеоил, галлоил, ферулоил, бензоил, L-алифатический аминоацил или L-ароматический аминоацил), при катализе катализатором при определенной температуре;
(2) растворение соединения 3 в органическом растворителе для получения соединения 4 путем реакции соединения 3 с бромидным реагентом при катализе катализатором при определенной температуре;
(3) растворение соединения 4 в органическом растворителе для получения соединения 5 путем реакции отщепления с основанием при определенной температуре;
(4) растворение соединения 5 в органическом растворителе для получения соединения 6 путем окисления соединения 5 окислителем при определенной температуре;
Уравнения реакции на вышеуказанных этапах (1)-(4) являются следующими:
Где на этапе (1) органический растворитель выбирают из группы, включающей следующие соединения, каждое из которых содержит 2-20 атомов углерода: эфир, спирт, алкан, ароматический углеводород, кетон, алкилгалогенид, амид, нитрил, сложный эфир или их смесь с различными отношениями концентраций компонентов смеси; температура составляет от -20°С до 250°С; катализатором является протонная кислота, такая как серная кислота, или органическое основание, такое как пиридин; молярное соотношение соединения 2 к уксусному ангидриду равно 1:1 -20;
Где на этапе (2) органический растворитель выбирают из группы, включающей следующие соединения, каждое из которых содержит 2-20 атомов углерода: ароматический углеводород, алкан, эфир, кетон, алкилгалогенид, амид, нитрил, сложный эфир или их смесь с различными отношениями концентраций компонентов смеси; температура составляет от -10°С до 150°С; бромидным реагентом является бромсукцинимид (NBS), бромоводород или ацетилбромид; катализатором является трифенилфосфин или источник света с длиной волны 290-800 нм; молярное соотношение соединения 3 к бромидному реагенту равно 1:1-10;
Где на этапе (3) органический растворитель выбирают из группы, включающей следующие соединения, каждое из которых содержит 2-20 атомов углерода: ароматический углеводород, алкан, эфир, кетон, алкилгалогенид, амид, нитрил, сложный эфир или их смесь с различными отношениями концентраций компонентов смеси; температура составляет от 0°С до 150°С; катализатором является органическое основание, которое представлено пиридином и триэтиламином; молярное соотношение соединения 4 к органическому основанию равно 1:1-10;
Где на этапе (4) органический растворитель выбирают из группы, включающей следующие соединения, каждое из которых содержит 2-20 атомов углерода: ароматический углеводород, алкан, эфир, кетон, алкилгалогенид, амид, нитрил, сложный эфир или их смесь с различными отношениями концентраций компонентов смеси; температура составляет от 0°С до 150°С; катализатором является эозин Y, трифенилфосфин или источник света с длиной волны 290-800 нм.
Полученное выше CL 168-6 (5α,8α-эпидиокси-6-холестен-3-он) обладает значительным ингибируюшим эффектом на пролиферацию клетки гепатомы человека HepG2 и клетки рака легких человека А549 in vitro;
Полученное выше CL168-6 (5α,8α-эпидиокси-6-холестен-3-он) обладает значительной ингибирующей активностью на опухолевый ангиогенез;
Полученное выше CL168-6 (5α,8α-эпидиокси-6-холестен-3-он) может эффективно ингибировать рост опухоли S180, продлевать время выживаемости мышей с опухолью и увеличивать селезеночный индекс мышей;
50
Полученное выше CL168-6 (5α,8α-эпидиокси-6-холестен-3-он) проявляет низкую токсичность in vivo, и LD мышей составляет 1479 мг/кг;
Полученное выше CL168-6 (5а,8а-эпидиокси-6-холестен-3-он) может быть изготовлено в лекарственных формах перорального, инъекционного и наружного введения и применяться для предупреждения и лечения опухоли.
Краткое описание Графических материалов
Фигура 1 иллюстрирует эффект CL168-6 на сосуды в САМ.
Фигура 2 иллюстрирует кривые выживаемости мышей.
Фигура 3 иллюстрирует опухоли мышей групп с различными дозами.
Фигура 4 иллюстрирует результаты определения VEGF крови глаза мыши.
Фигура 5 иллюстрирует результаты 24-часового определения каспазы-3, 8, 9.
Фигура 6 иллюстрирует результаты 48-часового определения каспазы-3, 8, 9.
Фигура 7 иллюстрирует стандартную кривую белка.
Фигура 8 иллюстрирует уровень экспрессии р53 (n=3).
Фигура 9 иллюстрирует уровень экспрессии bcl-2 (n=3).
Фигура 10 иллюстрирует уровень экспрессии VEGF (n=3).
Фигура 11 иллюстрирует уровень экспрессии Р21 (n=3).
Подробное описание предпочтительных вариантов осуществления
Без ограничения, некоторые примеры данного изобретения будут описаны посредством иллюстрации наже в данном документе.
Пример получения 1; синтез холестерилацетата (соединение 3)
Холестерин (11,58 г, 30,00 ммоль), толуол (60 мл), уксусный ангидрид (5,67 мл, 60,00 ммоль) и пиридин (1 мл, 12,41 ммоль) помещали в 100 мл реакционную колбу, перемешивали магнитной мешалкой, нагревали до 114°С, нагревали с обратным холодильником, и реакцию проводили до тех пор, пока не оставалось сырьевого материала. Реакционную жидкость охлаждали, дважды отмывали 2-кратным количеством раствора хлористоводородной кислоты (0,10%), дважды отмывали 2-кратным количеством насыщенного раствора хлорида натрия, дважды отмывали 2-кратным количеством дистиллированной воды, высушивали при помощи безводного сульфата натрия, затем подвергали вакуумной перегонке с выделением толуола, в конечном итоге получали белое твердое вещество (12,84 г). Выход равен 100,0%, и ЯМР спектры водорода и углерода соединения 3 являются следующими:
1
3
Н ЯМР (500 МГц, CDCl): 0,68 (s, 3H, Н-18), 0,86 (d, 3H, J=2 Гц, Н-26), 0,87 (d, 3H, J=2 Гц, Н-27), 0,91 (d, 3H, J=4,4 Гц, Н-21), 1,02 (s, 3H, Н-19), 2,03 (s, 3H, Н-2'), 2,32 (dd, 2Н, Н-4), 4,60 (m, 1Н, Н-3), 5,39 (t, 1H, H-6);
13
3
C ЯМР (500 МГц, CDCl): 36,6 (C-1), 31,9 (С-2), 74,0 (С-3), 39,7 (С-4), 140,0 (С-5), 122,7 (С-6), 28,2 (С-7), 31,8 (С-8), 50,0 (С-9), 38,1 (С-10), 21,0 (C-11), 37,0 (С-12), 42,3 (С-13), 56,1 (С-14), 24,3 (С-15), 27,8 (С-16), 56,7 (С-17), 11,9 (С-18), 19,3 (С-19), 35,8 (С-20), 18,7 (С-21), 36,2 (С-22), 23,8 (С-23), 39,5 (С-24), 28,0 (С-25), 22,6 (С-26), 22,8 (С-27), 170,6 (С-1'), 21,5 (С-2').
Пример получения 2: синтез 7-дегидрохолестен-3-олацетата (соединение
5)
Холестерилацетат (4,28 г, 10,00 ммоль), четыреххлористый углерод (30 мл) и NBS (1,78 г, 10,00 ммоль) помещали в 50 мл реакционную колбу, подвергали действию флуоресцентного света, нагревали с обратным холодильником при 74°С, и реакцию проводили до тех пор, пока не оставалось сырьевого материала. Реакционную жидкость охлаждали, подвергали фильтрации с воздушным насосом, отмывали небольшим количеством четыреххлористого углерода, подвергали вакуумной перегонке с выделением четыреххлористого углерода, в конечном итоге получали оранжево-желтую маслоподобную жидкость.
Оранжево-желтую маслоподобную жидкость добавляли к толуолу (50 мл) и 2,6-диметилпиридину (5 мл), помещали в 100 мл реакционную колбу, перемешивали магнитной мешалкой, нагревали до 114°С, нагревали с обратным холодильником, и реакцию проводили до тех пор, пока не оставалось сырьевого материала. Реакционную жидкость охлаждали, дважды отмывали 2-кратным количеством раствора хлористоводородной кислоты (0,10%), дважды отмывали 2-кратным количеством насыщенного раствора хлорида натрия, дважды отмывали 2-кратным количеством дистиллированной воды, сушили при помощи безводного сульфата натрия, затем подвергали вакуумной перегонке для выделения толуола, растворяли в абсолютном этиловом спирте, подвергали повторной кристаллизации с получением 3,54 г белого твердого вещества с выходом 85,5%. ЯМР спектры водорода и углерода соединения 5 являются следующими:
1
3
Н ЯМР (500 МГц, CDCl): 0,62 (s, 3H, Н-18), 0,87 (d, 3H, J=2 Гц, Н-26), 0,87 (d, 3H, J=2 Гц, Н-27), 0,94 (d, 3H, J=4,4 Гц, Н-21), 0,99 (s, 3H, Н-19), 2,04 (s, 3H, Н-2'), 2,38 (m, 1Н, Н-4а), 2,50 (m, 1H, H-4b), 4,70 (m, 1H, H-3), 5,39 (d, 1H, J=2 Гц, Н-7), 5,59 (d, 1H, J=2 Гц, Н-6)
13
3
С ЯМР (500 МГц, CDCl): 36,6 (C-1), 28,1 (С-2), 72,8 (С-3), 37,9 (С-4), 141,6 (С-5), 120,2 (С-6), 116,2 (С-7), 138,5 (С-8), 46,0 (С-9), 39,5 (С-10), 21,5 (C-11), 37,1 (С-12), 42,9 (С-13), 55,4 (С-14), 23,9 (С-15), 28,1 (С-16), 55,8 (С-17), 11,8 (C-18), 18,4 (C-19), 36,2 (C-20), 16,2 (C-21), 36,1 (C-22), 23,0 (C-23), 39,1 (C-24), 28,1 (C-25), 22,6 (C-26), 22,8 (C-27), 170,6 (С-1'), 21,0 (С-2').
Пример получения З: синтез 7-дегидрохолестерина (соединение 6)
7-дегидрохолестен-3-олацетат (соединение 5) (2,07 г, 5 ммоль), этанол (50 мл) и раствор гидроксида натрия (10%, 50 мл) помещали в реакционную колбу 250 мл, реакцию проводили при 80°С до тех пор, пока не оставалось сырьевого материала. Реакционную жидкость подвергали вакуумной перегонке с выделением оставшегося этанола, экстрагировали один раз однократным количеством этилацетата, промывали дистиллированной водой до нейтральности и сушили при помощи безводного сульфата натрия. После выделения этилацетата полученное в результате твердое вещество подвергали повторной кристаллизации этанолом с получением 1,85 г 5,7-диен-холестерина с выходом 96,4%. ЯМР спектр водорода соединения 6 является следующим:
1
3
Н ЯМР (500 МГц, CDCl): 0,62 (s, 3H, Н-18), 0,86 (d, 3H, J-2 Гц, Н-26), 0,88 (d, 3H, J=2 Гц, Н-27), 0,94 (s, 3H, Н-19), 1,22 (d, 3H, J=12 Гц, Н-21), 2,33 (dd, 1Н, H-4a), 2,49 (dd, 1H, H-4b), 3,66 (m, 1H, H-3), 4,03 (m, 1H, 3-OH), 5,39 (m, 1H, H-7), 5,68 (dd, 1H, H-6).
Пример получения 4: синтез 5α,8α-эпидиокси-6-холестен-3-ола (соединение 7)
5,7-диен-холестерин (1,15 г, приблизительно 3 ммоль), эозин Y (200 мг, приблизительно 0,31 ммоль, растворенный в спирте) и абсолютный этанол (100 мл, 10,00 ммоль) помещали в 250 мл реакционную колбу. После вдувания воздуха в реакционную жидкость последнюю подвергали действию флуоресцентного света, реакцию проводили до тех пор, пока не оставалось сырьевого материала, дистиллировали для выделения абсолютного этанола, пока не достигали определенного объема, выдерживали для кристаллизации с получением 0,94 г 5α,8α-эпидиокси-6-холестен-3-ола с выходом 75,3%.
1
3
Н ЯМР (500 МГц, CDCl): 0,80 (s, 3H, Н-18), 0,85 (d, 3H, J-2 Гц, Н-26), 0,88 (d, 3H, 3=2 Гц, Н-27), 0,88 (s, 3H, Н-19), 0,91 (d, 3H, J-12 Гц, Н-21), 3,97 (m, 1H, H-3), 6,23 (d, 1H, J-7 Гц, Н-7), 6,51 (d, 1H, J=7 Гц, Н-6);
13
3
С ЯМР (500 МГц, CDCl): 36,0 (C-1), 28,3 (С-2), 66,5 (С-3), 39,4 (С-4), 82,2 (С-5), 135,4 (С-6), 130,8 (С-7), 79,5 (С-8), 51,1 (С-9), 35,2 (С-10), 20,6 (C-11), 34,7 (С-12), 44,8 (С-13), 52,0 (С-14), 23,4 (С-15), 30,1 (С-16), 56,4 (С-17), 12,7 (С-18), 18,2 (С-19), 36,9 (С-20), 19,0 (С-21), 36,9 (С-22), 23,8 (С-23), 37,0 (С-24), 28,0 (С-25), 22,6 (С-26), 22,8 (С-27).
Пример получения 5: синтез 5а,8а-эпидиокси-6-холестен-3-она (соединение 1, CL168-6)
5α,8α-эпидиокси-6-холестен-3-ол (соединение 7) (0,62 г, приблизительно 1,5 ммоль) растворяли в ацетоне (50 мл) в 100 мл реакционной колбе, медленно добавляли по каплям раствор хромовой кислоты (1,6 ммоль) на бане со смесью воды и льда, реакцию проводили до тех пор, пока не оставалось сырьевого материала. Реакционную жидкость выливали в смесь воды и льда (600 мл), перемешивали, выдерживали в течение целой ночи и затем подвергали фильтрации с воздушным насосом. Осадок на фильтре подвергали повторной кристаллизации с этанолом с получением 0,62 г 5α,8α-эпидиокси-6-холестен-3-она с выходом 96,1%.
1
3
Н ЯМР (500 МГц, CDCl): 0,85 (s, 3H, Н-19), 0,88 (d, 3H, J=2 Гц, Н-26), 0,89 (d, 3H, J-2 Гц, Н-27), 0,92 (d, 3H, J-6,5 Гц, Н-21), 1,07 (s, 3H, Н-18), 3,97 (m, 1Н, H-3), 6,29 (d, 1H, J-8,5 Гц, Н-7), 6,59 (d, 1H, J-8,5 Гц, Н-6);
13
3
С ЯМР (500 МГц, CDCl): 36,7 (C-1), 35,3 (С-2), 207,0 (С-3), 43,6 (С-4), 83,4 (С-5), 134,2 (С-6), 131,6 (С-7), 80,0 (С-8), 51,1 (С-9), 39,4 (С-10), 20,5 (C-11), 37,3 (С-12), 44,9 (С-13), 51,4 (С-14), 23,8 (С-15), 28,2 (С-16), 56,4 (С-17), 12,8 (С-18), 18,5 (С-19), 35,2 (С-20), 17,5 (С-21), 35,9 (С-22), 23,5 (С-23), 39,3 (С-24), 28,0 (С-25), 22,5 (С-26), 22,8 (С-27).
Итоговый пример 1: оценка воздействия CL168-6 на пролиферацию клеток гепатомы человека HepG2, клеток рака легких человека А549 и клеток иммортализованных фибробластов человека NIH3T3 посредством МТТ анализа
1. Материалы
1.1 Опухолевые линии
Клетки гепатомы человека HepG2 и клетки рака легких человека А549 культивировались Институтом инфекционных заболеваний Народно-освободительной армии Китая для оценки жизнеспособности, тогда как клетки иммортализованных фибробластов человека NIH3T3 были куплены у Академии военно-медицинских наук.
1.2 Экспериментальные лекарственные средства CL168-6, полученные самостоятельно, которые имели чистоту равную или более чем 98%, оцененную при помощи жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC), и, следовательно, соответствовали требованиям эксперимента. Порошок указанного CL168-6, который заранее герметично закупорили и хранили при 4°С, растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO) с получением исходного раствора с концентрацией 1 мл/мг для последующего применения.
2. Способ
2.1 Культивирование клеток
Клетки гепатомы человека HepG2, клетки рака легких человека А549 и клетки NIH3T3 восстанавливали и субкультивировали в колбах для культивирования. Как только клетки достигали логарифмической фазы роста, эксперимент можно начинать. Клетки обрабатывали трипсином, отфильтрованным под высоким давлением с получением суспензии, содержащей клетки, окрашивали 3 минуты 0,4% трипановым синим и затем подсчитывались при помощи счетчика форменных элементов крови (живые клетки не были окрашены, тогда как мертвые клетки были окрашены синим). Проценты живых клеток, определенные по исключению трипанового синего все составляли до более 98%.
2.2 Эксперименты по ингибированию размножения клеток
4
2
2
Три типа клеток в логарифмической фазе высеяли в 96-луночные планшеты с плотностью 1×10/мл (200 мкл/лунка) и затем культивировали в течение 24 часов при 37°С в пригодном для выращивания боксе с 5% СО. Питательную среду аспирировали и удаляли. Добавляли 200 мкл CL168-6 различной концентрации (с конечной концентрацией соответственно 10 мкг/мл, 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл и 0 мкг/мл, полученных с культуральной средой из 4% телячьей сыворотки в DMEM), где для каждой концентрации было 6 параллельных лунок. После культивирования в течение 24 часов и 48 часов, 100 мкл супернатанта осторожно аспирировали и удаляли, соответственно. Добавляли MTS (20 мкл/лунка) и равномерно смешивали. Смесь культивировали в течение 1 часа при 37°С в пригодном для выращивания боксе с 5% СО. Поглощение при 492 нм определяли путем количественного иммуноферментного твердофазного анализа (ИФА). Эксперимент повторяли три раза. Степень ингибирования роста рассчитывали следующим образом. Степень ингибирования роста (%)=[(среднее значение ОП контрольной группы - среднее значение ОП группы обработки)/среднее значение ОП контрольной группы]×100%
3. Результаты
CL168-6 обладает значительным ингибирующим эффектом на пролиферацию клеток гепатомы человека HepG2 и клеток рака легких человека А549, культивируемых in vitro, и показывает зависимость от дозы; соответствующие результаты изложены в Таблице 1-1. При обработке лекарственным средством с концентрацией 2,5 мкг/мл в течение 24 часов, степень ингибирования равна 52,85% и 48,69% для клеток HepG2 и клеток А549, соответственно. Степень ингибирования будет возрастать с возрастанием концентрации лекарственного средства; если концентрация лекарственного средства равна 10 мкг/мл, степень ингибирования по отношению к вышеуказанным двум типам клеток равна до 64,39% и 62,40%, соответственно; если через 48 часов и при дозировке 2,5 мкг/мл, скорость ингибирования клеток HepG2 и А549 равна до 59,83% и 51,91%, соответственно; если концентрация равна 10 мкг/мл, степень по отношению к HepG2 и А549 равна 73,67% и 69,67%, соответственно. По сравнению с ситуацией с клетками NIH3T3 ингибирование CL168-6 по отношению к HepG2 и А549 показывает существенное различие в группах с различной концентрацией и временем обработки (p<0,05). Результаты эксперимента показали, что ингибирующий эффект CL168-6 в отношении клеток имеет хорошую селективность, и эффект положительно коррелирует с концентрацией лекарственного средства и временем лечения.
Таблица 1-1
Ингибирующий эффект CL 168-6 на размножение 3 типов клеточных линий
Концентрация
Степень ингибирования 24 ч, (%)
: Степень ингибирования 48 ч. (%)
(мкг/мл)
HepG2
A549
NIH3T3
HepG2
A549
NIH3T3
02,5
52,85*
48,69*
3,87
59,83*
51,91*
0,75
5,0
58,51*
55,78*
5,69
69,08*
59,75*
1,97
10,0
64,39*
62,40*
8,45
73,67*
69,37*
5,37
Примечание: *Р<0,05 по сравнению с 0,0 мкг/мл
4. Заключение
CL168-6 может существенно ингибировать размножение клеток гепатомы человека HepG2 и клеток рака легких человека A549.
Итоговый пример 2: оценка воздействия CL168-6 на ангиогенез опухоли посредством анализа САМ
1. Материалы
1.1 Животные
Яйца породы German Roman с зародышем (каждое весит 50-60 г, полученное из Экспериментального центра по изучению эмбрионов Китайского сельскохозяйственного университета).
1.2 Экспериментальные лекарственные средства
CL168-6, полученные самостоятельно, которые имели чистоту равную или более чем 98%, оцененную при помощи жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC), и, следовательно, соответствовали требованиям эксперимента. Порошок указанного CL168-6 герметично закупорили и хранили при 4°С.
Сурамин предоставлен компанией SIGMA.
2. Способ
2.1 Способ получения оцениваемых образцов
Стерильную желатиновую губку, ранее изготовленную в виде диска с диаметром 5 мм при помощи дырокола, использовали как носитель образца. CL168-6 растворяли в 70% этаноле с получением раствора с концентрацией 2 мг/5 мл. Было 3 группы доз, где 5 мкл (группа с низкой дозой с объемом дозы 2 мкг/эмбрион), 10 мкл (группа со средней дозой с объемом дозы 4 мкг/эмбрион) и 20 мкл (группа с высокой дозой с объемом дозы 8 мкг/эмбрион) раствора добавляли соответственно в срезы желатиновой губки при помощи количественного переноса жидкости. Части губки сушили в стерильной окружающей среде.
2.2 Инкубирование эмбриона и процесс удаления воздушной камеры в яйце с эмбрионом
Стерилизованное яйцо помещали в инкубатор при 37°С с его воздушной камерой, направленной вверх. На 7-й день эмбрион помещали в сверхчистый ламинарный шкаф, и стерилизовали этанолом, и затем просверливали бормашиной с образованием небольшого отверстия вверху эмбриона. Яичную скорлупу и мембрану скорлупы вокруг отверстия осторожно удаляли с образованием щели приблизительно 1,2 см × 1,2 см; после определения участка добавления образца мембрану воздушной камеры осторожно прокалывали в месте разделения между камерой и желтком иголкой шприца; через отверстие прокола вводили 1-2 капли стерилизованной воды, что сделало мембрану камеры и мембрану САМ разделенными; после осторожного удаления верхнего слоя мембраны камеры пинцетом мембрана САМ в нижнем слое была открыта.
2.3 Процесс добавления образца
Носитель, содержащий лекарственное средство, помещали на область перехода мембраны САМ и мембраны желточного мешка на участок, где было меньше всего сосудов, и затем герметизировали при помощи стерилизованной прозрачной клейкой ленты с продолжением инкубирования в течение 72 часов.
2.4 Измерение сосудов
После инкубирования прозрачную клейкую ленту, запечатывающую верх воздушной камеры, осторожно удаляли при помощи пинцета; осторожно добавляли смесь метанола/ацетона (1:1, 1-2 мл); комнатная температура оставалась постоянной в течение 10 минут. Затем, мембрану САМ осторожно отслаивали и помещали на предметное стекло для наблюдения и получения фотографий. Воздействие соединения на ангиогенез оценивали путем подсчетом количества больших, средних, небольших кровеносных сосудов, иррадиированных возле носителя.
2.5 Статистическая обработка
2
Все данные анализировали статистически при помощи пакета программного обеспечения SPSS 11,0; сравнение данных подсчета подтверждали с помощью теста х. Поскольку P<0,05, все данные имели статистическую значимость.
3. Результаты
Фигура 1 иллюстрирует воздействие CL 168-6 на сосуды САМ и холостой контроль.
Количества мелких сосудов трех групп доз CL168-6 сравнивали с таковым холостой группы, соответственно; для всех трех групп были обнаружены существенные различия и показана зависимость от дозы. Результаты изложены в таблице 2-1, в которой показано, что соединение обладает существенным ингибирующим эффектом на рост при ангиогенезе.
Таблица 2-1
Статистическая таблица приблизительного воздействия CL168-6 на сосуды САМ с анализом сосудов [<maths num="1"><math display="block"><mrow><mover accent="true"><mi>X</mi><mo stretchy="true">¯</mo></mover></mrow></math><img file="00000004.tif" he="5" wi="4" img-content="undefined" img-format="tif" /></maths>
(число сосудов) ±s]
Группы
Число эмбрионов
Большие сосуды
Средние сосуды
Небольшие сосуды
CL168-6
20
3,5±1,8
13,2±3,7
8,8±2,3**
(2 мкг/эмбрион)
CL 168-6(4 мкг/эмбрион)
20
3,6±1,9
11,2±3,2
6,5±2,5**
CL168-6 (8 мкг/эмбрион)
20
2,5±2,0
12,6±5,6
4,0±2,8**
Сурамин (4 мкг/эмбрион)
20
3,6±2,0
12,4±3,8
6,1±3,0**
Группа пустого контроля
20
4,7±3,1
18,1±5,5
11,6±2,2
Примечания: по сравнению с группой холостого контроля, *Р<0,05, **Р<0,01.
4. Заключение
CL168-6 обладает существенным ингибирующим эффектом на опухолевый ангиогенез, и указанный эффект зависит от количества лекарственного средства.
Итоговый пример 3: противоопухолевый эффект CL168-6 в отношении асцитных мышей, несущих опухоль S180, Н22
1. Материалы
1.1 Экспериментальные животные и опухолевые линии Здоровых самок мышей Balb/C, каждую весом 18-22 г, приобрели у Центра экспериментальных животных Академии военно-медицинских наук (сертификат № SCXK-(Military)2007-004). Клетки гепатоаденомы мыши Н22 культивировали в лаборатории для оценки жизнеспособности; клетки саркомы мыши S180 были предоставлены Институтом китайской медицины из 302 больницы; асциты мышей, несущих опухоль S180, Н22, субкультивировали раз в каждые 7 дней.
1.2 Экспериментальные лекарственные средства
CL168-6, полученные самостоятельно, имели чистоту равную или более 98%, оцененную при помощи жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) и, следовательно, соответствовали требованиям эксперимента.
Порошок указанного CL168-6 герметично закупорили и хранили при 4°С.
Циклофосфамид для инъекции: изготовлен Shanxi Pude Pharmaceutical Co., Ltd.
2. Процесс
2.1 Разработка животных моделей
7
Асцитных мышей S180 и Н22, которых вакцинировали за 7 дней, умерщвляли сворачиванием шеи, из них получали асциты в стерильных условиях, соответственно; полученные асциты дважды промывали культуральной средой RPMI1640, и получали в виде суспензии 2×10/мл в стерильном физиологическом солевом растворе. Суспензию клеток S180 инокулировали подкожно в правую подмышечную ямку 40 мышей (0,1 мл/мышь) для получения моделей солидной опухоли; тогда как суспензию клеток Н22 инокулировали в брюшные полости 40 мышей (0,2 мл/мышь) обычными способами при стерильных условиях для получения моделей асцитных опухолей.
2.2 Экспериментальные группы
90 мышей случайно разделяли на 9 групп из 3 типов, где группой первого типа была группа нормального контроля, группами второго типа были группы солидной опухоли S180, включая группу положительного (циклофосфамид) контроля, группу отрицательного контроля, группу с низкой дозой и группу с высокой дозой, и группами третьего типа были группы Н22 асцитов, включая группу положительного (циклофосфамид) контроля, группу отрицательного контроля, группу с низкой дозой и группу с высокой дозой. В каждой группе было 10 мышей. Эксперимент повторяли три раза.
2.3 Введение лекарственного средства
CL168-6 получали в виде эмульсий в кукурузном масле. Группе с низкой дозой вводили парентерально дозу 16 мг/кг, группе с высокой дозой вводили парентерально дозу 32 мг/кг, группе отрицательного контроля вводили парентерально такой же объем кукурузного масла, и группе положительного контроля вводили парентерально циклофосфамидный инъекционный раствор с дозой 0,02 г/(кг в сутки). Применяемый объем инъекции составлял 0,1 мл/мышь, и инъекцию давали в виде внутрибрюшинной инъекции через день в течение 15 дней. В течение 15 дней ежедневно вели наблюдение за общей активностью, шерстью, экскрементами и т.д. мышей. Через 24 часа после последнего введения мышей, которых инокулировали подкожно S180, умерщвляли сворачиванием шеи, после чего извлекали опухоли, тимус и селезенку. После последнего введения мышей, инокулированных в брюшную полость Н22, непрерывно выкармливали общепринятым способом, взвешивали и наблюдали время выживаемости каждый день до тех пор, пока все мыши отрицательной группы не были мертвы.
2.4 Расчет степени продления выживаемости мышей
Через 24 часа после инокуляции асцитов измеряли вес и величину окружности живота мышей в группах асцитных моделей. Введение лекарственного средства и выкармливание продолжали соответственно для различных групп, вес и окружность живота измеряли ежедневно до одного дня до умерщвления. Рассчитывали увеличение веса (г) и увеличение окружности живота (см). Эксперимент начали в день инокуляции опухолью и закончили в день, когда все мыши в группе отрицательного контроля были мертвы; время смерти было записано и рассчитывали степень продления выживаемости.
Степень продления выживаемости (%)=[(среднее значение дней выживаемости группы обработки - среднее значение дней выживаемости группы отрицательного контроля)/среднее значение дней выживаемости контрольной группы]×100%
2.5 Расчет селезеночного индекса и печеночного индекса
После окончания введения всем мышам в группе солидной опухоли мышей умерщвляли и их селезенки и печени взвешивали на электронных весах. Селезеночный индекс был эквивалентен весу селезенки (мг) мышей в каждой группе, разделенной на вес мышей, тогда как печеночный индекс был эквивалентен весу печени (100 г), разделенному на вес (г) мышей.
2.6 Расчет степени ингибирования опухоли
На следующий день после отмены лекарственного средства мышей в группе отрицательного контроля с солидной опухолью взвешивали и умерщвляли сворачиванием шеи, где сыворотку собирали путем кровопускания из глаза для дальнейшего применения в последующих экспериментах. Ткани опухоли иссекали и взвешивали на электронных весах. Степень ингибирования опухоли рассчитывали следующим образом.
Степень ингибирования опухоли (%)=[(средняя масса опухоли группы отрицательного контроля - средняя масса опухоли группы обработки)/средняя масса опухоли контрольной группы]×100%
2.7 Статистическая обработка
2
Все данные были статистически проанализированы при помощи пакета программного обеспечения SPSS 11,0; сравнение данных подсчета подтверждали при помощи теста х. Поскольку Р<0,05, все данные имели статистическую значимость.
3. Результаты эксперимента
3.1 Изменение массы, окружности живота и времени выживаемости мышей в группах
Как показано в Таблице 3-1, мыши в группах CL 168-6 с низкой и высокой дозой имели более длительное время выживаемости, чем в группе отрицательного контроля, и соответствующие показатели степени продления выживаемости составляли 37,11% и 51,55%, соответственно. Мыши в группе обработки имели меньшее увеличение окружности живота, чем в отрицательной группе, и нормальный рост таких обработанных мышей не был затронут указанным увеличением. Вес мышей в группе с вводимым парентерально циклофосфамидом возрастал медленно, с увеличением только на 3,42 г, тогда как мыши в нормальной группе имели увеличение веса на 6,72 г. Фигура 2 иллюстрирует статистический график времени выживаемости Н22 асцитных мышей.
Таблица 3-1
Воздействие CL168-6 на вес, окружность живота и время выживаемости мышей в различных группах (x±s)
Таблица 3-1
Воздействие CL168-6 на вес, окружность живота и время выживаемости мышей в различных группах (x±s)
Группы
Увеличение веса (г)
Увеличение окружности живота (см)
Время выживаемости (дни)
Степень продления выживаемо ста (%)
Группа нормального контроля
6,76±1,56
0,58±0,09
-
-
Группа отрицательного контроля
4,85±1,21<sup>①</sup>
3,17±0,33<sup>②</sup>
9,7±2,7
-
Группа циклофосфамида
3,42±1,67<sup>②④</sup>
2,30±0,66<sup>②④</sup>
15,3±1,06<sup>④</sup>
57,73
Группа CL168-6 с низкой дозой
7,16±1,39<sup>④</sup>
2,84±0,34<sup>②③</sup>
13,3±1,77<sup>④</sup>
37,11
Группа CL168-6 с высокой дозой
5,05±1,88<sup>④</sup>
2,32±0,71<sup>②④</sup>
14,7±1,41<sup>④</sup>
51,55
Примечания: 1. По сравнению с группой нормального контроля: <sup>①</sup>Р<0,05, <sup>②</sup>Р<0,01;2. По сравнению с группой отрицательного контроля: <sup>③</sup>Р<0,05, <sup>④</sup>Р<0,01.
3.2 Изменение печеночного индекса и селезеночного индекса мышей в различных группах
Как показано в Таблице 3-2, как печеночный индекс, так и селезеночный индекс асцитных мышей в группе циклофосфамида были соответственно ниже, чем у мышей в группе отрицательного контроля, таким образом, они имели статистическую значимость. При этом все индексы групп CL168-6 с низкой и высокой дозами были больше, чем в группе отрицательного контроля.
Таблица 3-2
Влияние CL168-6 на печеночный индекс и селезеночный индекс асцитных мышей (x±s)
Группы
Печеночный индекс (100 г/г)
Селезеночный индекс (мг/г)
Группа холостого контроля
4,04±0,47
3,45±0,58
Группа отрицательного контроля
4,32±0,14
3,84±0,56
Группа циклофосфамида
3,26±0,27<sup>①④</sup>
2,45±0,34<sup>①④</sup>
Группа CL 168-6 группа с низкой дозой
4,9±0,24<sup>①④</sup>
6,53±1,29<sup>②④</sup>
Группа CL 168-6 с высокой дозой
5,19±0,64<sup>②④</sup>
5,76±0,96<sup>②④</sup>
Примечания: 1. По сравнению с группой нормального контроля: <sup>①</sup>р<0,05, <sup>②</sup>Р<0,01;2. По сравнению с группой отрицательного контроля: <sup>③</sup>Р<0,05, <sup>④</sup>Р<0,01.
3.3 Противораковая активность CL168-6 invivo
CL168-6 не оказывал эффекта на увеличение массы саркомы мыши S180, тогда как увеличение массы мышей в группе положительного контроля было незначительным. Степени ингибирования опухоли мышей, несущих опухоль саркомы S180, в группе с низкой и высокой дозой составляли 44,33% и 54,58% соответственно; и по сравнению с группой отрицательного контроля группа с высокой дозой имела статистическую значимость. Результаты показаны в таблице 3-3. Основные части опухолей мышей во всех группах показаны на фигуре 3.
Таблица 3-3
Ингибирующий эффект CL 168-6 на S 180 саркому мышей (x±s)
Группы
Увеличение массы (г)
Вес опухоли (г)
Степень ингибирования
опухоли (%)
Группа пустого контроля
6,76±1,56
Группа отрицательного контроля
6,92±1,23
1,385±0,440
Группа циклофосфамида
4,76±1,01<sup>①③</sup>
0,518±0,231<sup>④</sup>
62,63%
Группа CL 168-6 с низкой дозой
6,71±1,22
0,771±0,407
44,33%
Группа CL 168-6 с высокой дозой
6,00±1,11
0,629±0,133<sup>③</sup>
54,58%
Примечания: 1. По сравнению с группой нормального контроля: <sup>①</sup>Р<0,05, <sup>②</sup>Р<0,01;2. По сравнению с группой отрицательного контроля: <sup>③</sup>Р<0,05, <sup>④</sup>Р<0,01.
3.4 Изменение печеночных и селезеночных индексов S180 мышей в группах
Как показано в Таблице 3-4, печеночные и селезеночные индексы S180 мышей в группе циклофосфамида ниже, чем в отрицательной группе, и, таким образом, имеют статистическую значимость. Хотя селезеночные индексы мышей в группах CL 168-6 низкой и высокой доз выше, чем у мышей в отрицательной группе, и между ними существует значимое различие; однако между соответствующими печеночными индексами значимого различия нет.
Таблица 3-4
Влияние CL168-6 селезеночный индекс и печеночный индекс S 180-мышей (x±s)
Группы
Печеночный индекс (100 г/г)
Селезеночный индекс (мг/г)
Группа пустого контроля
4,04±0,47
3,45±0,58
Группа отрицательного контроля
4,21±0,45
3,83±0,63
Группа циклофосфамида
3,09±0,31<sup>①④</sup>
2,76±0,64<sup>①④</sup>
Группа CL 168-6 с низкой дозой
4,45±0,19
5,32±0,68<sup>②④</sup>
Группа CL 168-6 с высокой дозой
4,38±0,13
5,34±0,73<sup>②④</sup>
Примечания: 1. По сравнению с группой нормального контроля: <sup>①</sup>Р<0,05; <sup>②</sup>Р<0,01;2. По сравнению с группой отрицательного контроля: <sup>③</sup>Р<0,05, <sup>④</sup>Р<0,01.
4. Заключение
4.1 CL168-6 может существенно ингибировать рост саркомы мыши S180.
4.2 CL168-6 может улучшать селезеночный индекс мыши, несущей опухоль.
4.3 CL168-6 может продлить время выживаемости мыши, несущей опухоль.
4.4 CL168-6 может рассеивать асциты или задерживать асциты, образующиеся у мыши Н22.
Итоговый пример 4: исследование противоопухолевого механизма CL168-6
Было актуальной темой при исследовании лечения опухолей с целью изучения механизмов апоптоза опухолевой клетки и сигнальной трансдукции, селективно блокировать пути передачи сигнала опухолевых клеток и уничтожить собственные, контролирующие рост регуляторные механизмы. Р53, Bcl-2, P21, VEGF являются ключевыми молекулами при росте или апоптозе опухолевых клеток. В данном эксперименте изучали противоопухолевый механизм CL168-6 на молекулярном уровне.
I. Экспериментальные материалы (для подробностей см. итоговые примеры 1 и 3)
II. Процесс эксперимента
1. Определение VEGF в сыворотке из глаза мыши (для подробностей см. итоговые примеры 1 и 3)
Перед забором опухоли кровь собирали при помощи кровопускания из глаза у мышей в четырех группах, т.е. группе отрицательного контроля, группе положительного СТХ (циклофосфамид) контроля, группе с высокой дозой (32 мг/кг) и группе с низкой дозой (16 мг/кг).
1.1 Получение реактивов, образцов и стандартов;
1.2 Добавление полученных образцов и стандартов и взаимодействие в течение 90 минут при 37°С;
1.3 Промывание планшета дважды, добавление рабочего раствора биотинилированного антитела и взаимодействие в течение 60 минут при 37°С;
1.4 Промывание планшета трижды, добавление рабочего раствора АВС (комплекс авидин-биотин-пероксидаза хрена) и взаимодействие в течение 30 минут при 37°С;
1.5 Промывание планшета пять раз, добавление окрашивающей жидкости ТМВ (тетраметилбензидин) и взаимодействие в темноте в течение 15 минут при 37°С;
1.6 Добавление ТМВ стоп-раствора и измерение значения ОП при 450 нм.
2. Определение активности каспазы 3, 8, 9
2.0 мкг/мл CL 168-6 воздействовали на клетки HepG2 в течение 24 часов и 48 часов.
2.1 Сбор образцов
6
2.1.1 Клетки HepG2 обрабатывали трипсином в среде культивирования клеток. Полученную в результате смесь (600 г) центрифугировали в течение 5 минут при 4°С для сбора клеток. Супернатант осторожно аспирировали и отливали. Остатки промывали один раз PBS, добавляли к лизату (100 мкл/2×10 клеток); и затем после ресуспендирования осадка лед кололи в течение 15 минут.
2.1.2 Полученную в результате смесь (16000 г) центрифугировали при 4°С в течение 15 минут.
2.1.3 Супернатант переносили в центрифужную пробирку, которую предварительно охладили в ледяной бане. 2.2 Определение активности каспазы 3
2.2.1 Брали pNA (паранитроанилид) и подходящее количество Ac-DEVD-PNA (2 мМ), помещали их на ледяную баню для последующего применения;
2.2.2 Реакционная система была следующей:
Холостой контроль
Образцы
Определяемый буферный раствор
90 мкл
80 мкл
Образцы, которые необходимо определить
0 мкл
10 мкл
Ac-DEVD-PNA(2 мМ)
10 мкл
10 мкл
Общий объем
100 мкл
100 мкл
2.2.3 Инкубировали при 37°С в течение 120 минут, определяли каспазу 3 с А405;
2.2.4 Добавляли Ac-IETD-PNA (2 мМ) и Ac-LEHD-PNA (2 мМ), соответственно, для определения каспазы 8, 9
3. Определение активности опухолевых клеток VEGF, P53, Р21, Вс1-2 (брали β-актин в качестве внутреннего стандарта)
С помощью электрофореза белков (вестерн блоттинг)
3.1 Экстракция общего клеточного белка
Предварительно иссеченную опухолевую ткань размером с боб измельчали и помещали в предварительно охлажденный гомогенизатор ткани. Добавляли 400 мкл раствора для лизиса ткани. После 10 минут осторожной гомогенизации, смесь переносили в 1,5 мл центрифужную пробирку и затем после интенсивного перемешивания на вортекс-мешалке пробирки в течение 15 секунд смесь помещали на лед на 10 минут и повторно подвергали покачиванию. После 20 минут центрифугирования (12000 об/мин.) супернатант собрали, перенесли в предварительно охлажденную пробирку Эппендорфа и затем отдельно загрузили и хранили замороженным при -80°С для определения уровня активности различных антител.
3.2 Определение белка: с помощью ВСА (бицинхониновая кислота) анализа белка
3.2.1 Приготовление серий стандартов (Таблица 4-1): Стандарт в наборе разводили по порядку в соответствии с его описанием с получением стандартных растворов с концентрациями 2000 мкг/мл, 1500 мкг/мл, 1000 мкг/мл, 750 мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл и 25 мкг/мл.
Таблица 4-1
Приготовление стандартов
№ пробирки
Количество деионизированной воды
Количество стандарта BSA
Конечная концентрация BSA
А
0
300 мкл маточного
2000 мкг/мл
раствора BSA
В
125 мкл
375 мкл маточного
1500 мкг/мл
раствора BSA
С
325 мкл
325 мкл маточного
1000 мкг/мл
раствора BSA
D
175 мкл
175 мкл разбавителя В
750 мкг/мл
Е
325 мкл
325 мкл разбавителя С
500 мкг/мл
F
325 мкл
325 мкл разбавителя Е
250 мкг/мл
G
325 мкл
325 мкл разбавителя F
125 мкг/мл
Н
400 мкл
100 мкл разбавителя
25 мкг/мл
G
I
400 мкл
0
0 мкг/мл
3.2.2 Приготовление рабочего раствора: раствор А и раствор В (50:1) смешивали для последующего применения.
3.2.3 Образец, которые нужно определить, разбавляли до 20-кратным разведения. По 10 мкл образца и 10 мкл стандарта добавляли в три лунки 96-луночного планшета для ИФА. 200 мкл рабочего раствора добавляли и смешивали. Смесь реагировала при 37°С в течение 30 минут.
3.2.4 Планшет для ИФА удалили, охладили до комнатной температуры и измеряли значение поглощения при 562 нм. Стандартную кривую построили согласно стандартам и содержание белка измеряемых образцов рассчитывали с помощью стандартной кривой. 3.3 Электрофорез белка
3.3.1 Приготовление образцов белка: подходящее количество каждого образца добавляли к буферу 4 для белкового образца и буферу 1 для белкового образца, смешивали с получением объема каждого 300 мкл и концентрации 3,7 мкг/мкл, нагревали 3-5 минут в горячей воде для денатурации, центрифугировали в течение короткого периода времени с высокой скоростью и затем хранили при -20°С для последующего применения.
3.3.2 Приготовление 12% разделяющего геля и 4% концентрирующего геля и разливание геля: см. таблицу 4-2.
Таблица 4-2
Приготовление разделяющего геля и концентрирующего геля
Разделяющий гель (мл)
Концентрирующий гель (мл)
30% раствор акриламида
4
0,5
1,5 ммоль/л Tris (pH 8,8)
2,5
-
1,0 ммоль/л Tris (pH 6,8)
-
0,38
10% SDS (додецилсульфат натрия)
0,1
0,03
Деионизированная вода
3,3
2,1
10% персульфат аммония (АР)
0,1
0,03
5% TEMED
0,004
0,003
(тетраметилэтилендиамин)
При получении разделяющего геля и концентрирующего геля для предотвращения слишком раннего затвердевания геля TEMED должен быть добавлен перед выливанием геля. Во-первых, разделяющий гель выливали в слой между стекол; затем верхнюю поверхность геля залили дистиллированной водой для поддержания ровной поверхности геля. Во-вторых, когда разделяющий гель затвердевал, и дистиллированную воду поглощали, смесь промывали дистиллированной водой несколько раз для удаления акриламида, который не полимеризовался. Наконец, когда дистиллированную воду снова поглощали, вставляли гребенку для внесения образца, причем ее передняя часть находился за 0,5 см от разделяющего геля.
3.3.3 Добавление образца: Когда гель затвердевал при комнатной температуре, электрофоретический буфер выливали в емкость для электрофореза; после извлечения гребенки для загрузки образца, подходящие объемы образцов, которые нужно исследовать, соответственно добавляли в лунки, сделанные гребенкой, с помощью микропипетки в соответствии с концентрациями цитоплазматического белка.
3.3.4 Электрофорез: После добавления образца подключали источник питания, устанавливали напряжение на 120 В, и в течение этого периода образец выстраивался в виде линии в концентрирующем геле, и передний край образца входил в разделяющий гель; затем устанавливали напряжение на 100 В и в течение этого периода проводили электрофорез при постоянном напряжении в течение 120 минут; в конце, выключали источник питания, когда индикатор бромфеноловый синий достигал нижнего края геля.
3.4 Анализ с использованием вестерн блоттинга
3.4.1 Электроблоттинг: Пленку из PVDF (поливинилиденфторид) сначала вымачивали в абсолютном метаноле в течение 30 секунд, чтобы сделать ее прозрачной, и затем вымачивали в дистиллированной воде в течение 10 минут, в конце вымачивали с ватманской бумагой в буфере для блоттинга. Гель удаляли. Фильтровальную бумагу, гель, пленку из PVDF и фильтровальную бумагу располагали по порядку во избежание короткого замыкания путем обеспечения размеров обеих сторон листов бумаги, фиксировали и вставляли в емкость для электроблоттинга, обеспечивая гель в направлении катода и пленки из PVDF в направлении анода. Электроблоттинг проводили в течение 3 часов при 80 В, 4°С.
3.4.2 Блокирование: После электроблоттинга пленку из PVDF снимали, блокировали 5% блокирующим буфером BSA (бычий сывороточный альбумин) (растворен в растворе 1 TBST) при комнатной температуре в течение 3 часов и затем промывали TBST при покачивании 3 раза, каждый в течение 10 минут.
3.4.3 Реакция с первым антителом: Первое антитело разводили раствором TBST при соотношении 1:200 и затем приводили во взаимодействие с пленкой из PVDF при 4°С в течение ночи. На следующий день после уравновешивания при комнатной температуре в течение одного часа реакционную смесь промывали TBST 3 раза.
3.4.4 Реакция со вторым антителом: Соответствующее НКР(пероксидаза хрена)-конъюгированное второе антитело разводили раствором TBST при соотношении 1:2000, приводили во взаимодействие с пленкой из PVDF при комнатной температуре в течение 2 часов и затем промывали TBST 3 раза.
3.4.5 Проявка и фиксация: Растворы субстратов А и В смешивали в соотношении 1:1. Смесь наносили на пленку из PVDF, инкубировали 5 минут при комнатной температуре, и после удаления избытка жидкости на пленке, оставшиеся вещества закрывали пищевой пленкой для предотвращения появления пузырьков между пленкой из PVDF и полимерной пленкой. Следующие процедуры включали наслоение, выдерживание, проявку, 1 минутное промывание бидистиллированной водой и 1 минуту фиксирования.
3.4.6 Отсканированные проявленные фотографии подвергали анализу оптической плотности с помощью программного обеспечения Alpha Ease FC4.0, которое брало среднюю интенсивность света полос β-актина в качестве внутреннего стандартного значения, и показали результаты в виде соотношения уровней соответствующего белка к β-актину.
4. Статистическая обработка
Все данные статистически проанализировали при помощи пакета программного обеспечения SPSS 11.0; данные с нормальным распределением и однородностью дисперсии определяли при помощи t-критерия. Если данные не соответствовали нормальному распределению или однородности дисперсии, использовали непараметрический критерий.
III. Результаты эксперимента
1. Определение VEGF в сыворотке из глаза мыши
Как показано в таблице 4-3 и на Фигуре 4, значение оптической плотности (значение ОП) сывороточного VEGF мышей в группе с высокой дозой составляло 0,1937 при сравнении со значением ОП 0,2200 группы отрицательного контроля, Р=0,0037; для группы с низкой дозой при сравнении с группой отрицательного контроля, Р=0,0259, оба имеют статистическую значимость.
Таблица 4-3
Результаты определения активности VEGF (x±s)
Группы
Отрицательный контроль
Положительный контроль
16 мг/кг
32 мг/кг
Значение ОП
0,2200±0,0174
0,2205±0,0238
0,2064±0,0114<sup>①</sup>
0,1937±0,0170<sup>②</sup>
Примечания: по сравнению с отрицательным контролем, <sup>①</sup>Р<0,05, <sup>②</sup>Р<0,01.
2. Определение активности каспазы 3, 8, 9
После действия CL168-6 на клетки HepG2 в течение 24 часов и 48 часов определяли активность каспазы 3, 8, 9, и соответствующие результаты показаны в таблице 4-4 и на Фигуре 6.
Таблица 4-4
значения ОП каспазы 3, 8, 9
24 ч
48 ч
0 мкг
2,0 мкг
0 мкг
2,0 мкг
Каспаза 3
0,163
0,190
0,165
0,185
Каспаза 8
0,362
0,413
0,368
0,408
Каспаза 9
0,130
0,156
0,132
0,146
Активности трех каспаз значительно не увеличились и следовательно не имели статистической значимости.
3. Электрофорез белка
3.1 Определение концентраций белка в клеточном экстракте (Фигура 7) Стандартную кривую белка построили согласно концентрациям (x) и значениям поглощения (у) стандартов BSA. Линейное уравнение Y=2,22x-0,02 было получено с применением стандартной кривой, где Y представляет собой концентрации разведенных образцов, и x представляет значения поглощения. Как показано в Фигуре 3.3, что соответствующий коэффициент r=1,00 означает хорошую корреляцию в линейном уравнении. Соответствующую концентрацию белка (x) рассчитывали на основе определенного значения поглощения (y).
3.2 Уровень экспрессии белка Р53
Во время электрофореза белка количества общего белка образцов в каждой лунке соответствовали друг другу. Три группы представляли собой группу отрицательного контроля, группу положительного контроля (СТХ) и экспериментальную группу CL168-6. β-актин представлял собой образец внутреннего стандарта. Для экспериментальной группы относительный уровень экспрессии Р53 был равен 0,74±0,03; тогда как для группы отрицательного контроля он был равен 0,32±0,05; было существенное различие между двумя группами, Р=0,002. (Фигура 8)
3.3 Уровень экспрессии bcl-2
Для экспериментальной группы относительный уровень экспрессии bcl-2 был равен 0,75±0,04; тогда как для группы отрицательного контроля он был равен 0,31±0,01; Р=0,000; значения обоих двух групп имели статистическую значимость. (Фигура 9)
3.4 Уровень экспрессии VEGF
Для экспериментальной группы относительный уровень экспрессии VEGF был равен 0,46=1=0,08; тогда как для группы отрицательного контроля он был равен 0,71±0,05; не было существенного различия между двумя группами, Р-0,04. (Фигура 10)
3.5 Уровень экспрессии Р21
Для экспериментальной группы относительный уровень экспрессии Р21 был равен 0,79±0,07; тогда как для группы отрицательного контроля он был равен 0,76±0,06; не было существенного различия между двумя группами, Р=0,73. (Фигура 11)
IV. Заключение
Настоящее экспериментальное исследование показывает, что CL 168-6 может понижать уровень VEGF в крови глаза несущей опухоль мыши; в это же время уровень экспрессии белка VEGF в опухоли имел тенденцию к снижению. CL 168-6 может ингибировать пролиферацию опухоли путем снижения активности VEFG.
Эксперимент показал, что CL 168-6 не имел значительного эффекта на активности каспазы 3, 8, 9. Предполагается, что индуцированный CL168-6 апоптоз в клетках HepG2 может не зависеть от активации этих трех ферментов.
В настоящем эксперименте, поскольку уровни экспрессии белка Р21 контрольной группы и группы обработки не имели статистической значимости, можно прийти к предварительному заключению, что эффект ингибирования опухоли CL168-6 не достигается через путь сигнальной трансдукции Р53→Р21.
В эксперименте было обнаружено, что уровень экспрессии белка Bcl-2 группы обработки был существенно ниже, чем в группе отрицательного контроля. Можно сделать вывод, что CL168-6 может достигать эффекта ингибирования опухоли путем снижения уровня экспрессии белка Bcl-2. Конкретный механизм должен быть дополнительно исследован.
Ген Р53 имеет два типа. Один представляет собой р53 дикого типа, т.е. wtp53, другой представляет собой р53 мутантного типа, т.е. mtp53. Wtp53, который представляет собой ген-супрессор опухолевого роста, может быть включен в регуляцию клеточного цикла и играть важную роль в процессах поддержания нормального роста клеток и ингибирования пролиферации опухоли. Результаты этого эксперимента показали, что уровень экспрессии белка Р53 группы обработки существенно выше, чем в группе отрицательного контроля. Следовательно, можно прийти к предварительному заключению, что CL168-6 может повышать уровень экспрессии wtp53 у несущей опухоль мыши и ингибировать экспрессию белка Вс1-2 и VEGF с тем, чтобы достичь противоопухолевого эффекта и т.д.
Пример исследования токсичности 1
I. Предмет эксперимента: внутрибрюшинная инъекция ЬОзо для мыши (способ по Керберу)
II. Экспериментальные материалы
Мыши ICR [самец/самка=1/1, 18-22 г, Номер лицензии на использование животных: SCXK (Beijing)2007-0001]; CL168, белый порошок (полученный самостоятельно), разведенный растительным маслом, приготовлен перед использованием.
III. Способ эксперимента
50
Использовали мышей ICR (категория SPF) с диапазоном веса 18-22 г, которыми обеспечила Vital River Laboratories (VRL) в Пекине, Китай. Всего было 5 групп обработки, где 2000 мг/кг была самой высокой дозой, а другие уменьшались до 0,8 кратной, т.е. 1600 мг/кг, 1280 мг/кг, 1024 мг/кг и 819,2 мг/кг. Мышей произвольно разделили на группы. В каждой группе было по 10 мышей - половина самцов и половина самок. Каждой мыши вводили внутрибрюшинно (0,2 мл/10 г). Наблюдали 3-7 дней, записывали разнообразные реакции животных и количество мертвых мышей в каждой группе. LD и доверительные пределы рассчитывали при помощи модифицированного способа по Керберу (Керберу) согласно показателю смертности животных в каждой группе.
IV. Результат эксперимента
Через 12 часов после введения смерть не наступала. Ситуация со смертью мышей в каждой группе через 7 дней изложена в следующей таблице.
50
Таблица в примере: Внутрибрюшинная инъекция LD для CL168-мышей
№ группы
Количество животных
Доза введения (мг/кг)
Логарифмическая доза (X)
Смерти животных
Показатель смертности
Р<sup>2</sup>
1
10
819,2
2,91
0
0
0
2
10
1024
3,01
1
0,1
0,01
3
10
1280
3,11
3
0,3
0,09
4
10
1600
3,20
6
0,6
0,36
5
10
2000
3,30
8
0,8
0,64
V. Краткое заключение
50
LD, рассчитанная по модифицированному способу Кербера (Кербера), для CL 168-6 составила 1479,11 мг/кг; 95% доверительный интервал составляет 13 04,19-1677,49 мг/кг.
Пример исследования токсичности 2
I. Предмет эксперимента: противоопухолевый терапевтический индекс CL168
II. Экспериментальные материалы: см. итоговый пример 2 и пример исследования токсичности 1.
III. Способ эксперимента: см. итоговый пример 2 и пример исследования токсичности 1.
IV. Результат эксперимента: см. итоговый пример 2 и пример исследования токсичности 1.
50
V. Из итогового примера 2 можно обнаружить, что при использовании высокой дозы (30 мг/кг) CL168, степень ингибирования солидной опухоли S180 составляла 54,58%, коэффициент выживаемости асцитных мышей с раком Н22 составлял 51,55%; при использовании низкой дозы (15 мг/кг) CL168 степень ингибирования солидной опухоли S180 составляла 44,33%, коэффициент выживаемости асцитных мышей с раком Н22 составлял 37,11%; в комбинации с примером исследования токсичности 1 можно увидеть, что LD CL168 равна 1479,11 мг/кг, и его терапевтических индекс (TI) равен приблизительно 49,3.
VI. Краткое заключение
Факт, что терапевтический индекс (TI) CL168 составлял приблизительно 49,3, указывает, что CL168 обладает высокой безопасностью и значительным противоопухолевым эффектом.
Пример состава 1
10 г CL168-6 и подходящие наполнители для инъекции (включая лиофилизированный порошок и сухой порошок в стерильной упаковке) смешивали и готовили в виде противоопухолевых инъекций с помощью процесса получения инъекций (включая лиофилизированный порошок и сухой порошок в стерильной упаковке).
Пример состава 2
10 г CL168-6 и подходящие наполнители для таблетки (включая таблетку медленного высвобождения, матричную таблетку, покрытую таблетку, диспергируемую таблетку и т.д.) смешивали и готовили в виде противоопухолевых таблеток с помощью процесса получения таблеток (включая таблетку медленного высвобождения, матричную таблетку, покрытую таблетку, диспергируемую таблетку и т.д.).
Пример состава 3
10 г CL168-6 и подходящие наполнители для капсулы смешивали и готовили в виде противоопухолевых капсул с помощью процесса получения капсул.
Пример состава 4
10 г CL168-6 и подходящие наполнители для эмульсии (включая микроэмульсию, наноэмульсию и т.д.) смешивали и готовили в виде противоопухолевых эмульсий с помощью процесса получения эмульсий (включая микроэмульсию, наноэмульсию и т.д.).
Пример состава 5
10 г CL168-6 и подходящие наполнители для гранулы смешивали и готовили в виде противоопухолевых гранул с помощью процесса грануляции.
Пример состава 6
10 г CL168-6 и подходящие наполнители для препарата с контролируемым высвобождением смешивали и готовили в виде противоопухолевых препаратов с контролируемым высвобождением с помощью процесса получения препарата с контролируемым высвобождением.
Пример состава 7
10 г CL168-6 и подходящие наполнители для пероральной жидкости смешивали и готовили в виде противоопухолевых пероральных жидкостей с помощью процесса получения пероральной жидкости.
Пример состава 8
10 г CL168-6 и подходящие наполнители для липосом смешивали и готовили в виде противоопухолевых липосом с помощью процесса получения липосом.