Применение мембранных везикул мультипотентных стромальных клеток, индуцированных цитохалазином В, для восстановления и повышения митохондриальной функции
APPLICATION OF MEMBRANE VESICLES OF MULTIPOTENT STROMAL CELLS INDUCED BY B CYTOCHALASIN, FOR RESTORATION AND INCREASE OF MITOCHONDRIAL FUNCTION

Изобретение в целом относится к медицине и ветеринарии, более детально к области разработки лекарств и медикаментов при их производстве в промышленном масштабе. Заявленное техническое решение обеспечивает возможность осуществлять доставку функционально активных митохондрий в составе мембранных везикул мультипотентных стромальных клеток человека, индуцированных цитохалазином В (МВ-ЦВ МСК), в клетки млекопитающих in vitro, с целью повышения / восстановления митохондриальной функции в клетках, что позволяет повысить / восстановить митохондриальную функцию в клетках с пониженной активностью или/и дисфункцией митохондрий.
Разрабатываемая на основе заявленного технического решения фармацевтическая композиция может быть использована для лечения заболеваний, вызванных мутациями в митохондриальной ДНК, например, дегенерация, мышечная атрофия и миопатия, а также для терапии заболеваний, связанных с нарушением функции митохондрий (диабет 2 типа, ишемическая болезнь сердца, инсульт, рак), нейродегенеративных заболеваний, в которых существует проблема использования митохондриальной заместительной терапии для взрослых людей, может быть использовано для замедления старения организма.
терминов
Далее в тексте заявителем приведено разъяснение ряда , которое необходимо для облегчения однозначного понимания сущности заявленных материалов и исключения противоречий и/или спорных трактовок при проведении экспертизы по существу.
Дисфункция митохондрий
– в контексте настоящего описания заявитель подразумевает под указанным термином нарушение функциональной активности митохондрий, в результате мутаций, каких-либо заболеваний или старения клеток, характеризующееся снижением потенциала митохондрий.
Дефектные клетки
– в контексте настоящего описания заявитель подразумевает под указанным термином клетки с низким митохондриальным потенциалом: с дисфункцией (не функционированием) митохондрий или пониженным функционированием митохондрий.
Фибробласты
– вид клеток, содержащихся в соединительных тканях тела. Фибробласты выполняют восстановительную функцию при ранении и любом другом повреждении ткани. Вытянутые или неправильного размера клетки являются составляющими волокнистого белка коллагена и других веществ, входящих в состав соединительных тканей [https://dic.academic.ru/contents.nsf/ntes].
А549
- аденокарциномические альвеолярные базальные эпителиальные клетки человека и составляют клеточную линию, которая была впервые разработана в 1972 году путем удаления и культивирования раковой ткани легких [https://en.wikipedia.org/wiki/].
Дебрис
- в контексте настоящего описания заявитель подразумевает под указанным термином обломки клеток, образовавшиеся после воздействия веществом цитохалазин В.
Литические ферменты
– ферменты, вызывающие лизис, то есть растворение клеток и их систем, в том числе микроорганизмов, под влиянием различных агентов [https://ru.wikipedia.org/wiki/].
Экспрессия (экспрессия генов)
— в контексте настоящего описания заявитель подразумевает под указанными терминами процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок. Некоторые этапы экспрессии генов могут регулироваться: это транскрипция, трансляция, сплайсинг РНК и стадия посттрансляционных модификаций белков. Процесс активации экспрессии генов короткими двуцепочечными РНК называется активацией РНК [https://ru.wikipedia.org/wiki/].
Неиммуногенность
— в контексте настоящего описания заявитель подразумевает под указанным термином отсутствие способности антигена вызывать иммунный ответ вне зависимости от его иммунной специфичности.
Мембранные везикулы мультипотентных стромальных клеток, индуцированных цитохалазином В
— в контексте настоящего описания заявитель  использует в качестве указанного термина аббревиатуру МВ-ЦВ МСТ.
На дату подачи заявленного технического решения заявителем проведены исследования уровня техники и тенденций развития техники в данной области по научной и патентной информации, выявлены существующие проблемы, связанные с отсутствием способа доставки функционально активных митохондрий в клетки человека с целью восполнения недостаточной функции митохондрий. Таким образом, существует неразрешенная до настоящего времени проблема по созданию новых лекарственных средств, характеризующихся способностью восстанавливать митохондриальную функцию в клетках человека, увеличивать функциональную активность митохондрий в местах с пониженной активностью или/и дисфункцией митохондрий.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту №WO2018140726 [1] (аналог №1) «Method for identifying mitochondrial dna in extracellular vesicles and treatment of mtDNA-related disorders and cancer» «Способ идентификации митохондриальной ДНК во внеклеточных везикулах и лечение заболеваний, связанных с митохондриальной ДНК и раком».
Сущностью известного технического решения является cпособ обнаружения состояния, связанного с митохондриальной ДНК (далее по тексту – мтДНК), у субъекта, включающий стадии: (а) выделения внеклеточных везикул (далее по тексту - ВВ) из плазмы или других биологических жидкостей, полученных от субъекта;
(b) обнаружение уровней одного или нескольких генов мтДНК и / или 70%, 80%, 90% или 95% полного генома мтДНК в выделенных ВВ;
определение вероятности наличия состояния, связанного с мтДНК, на основании результата этапа (b), где состояние, связанное с мтДНК, выбрано из группы, состоящей из рака, метаболических нарушений, сердечной недостаточности, повреждения головного мозга и неврологических синдромов.
Способ по п.1, дополнительно включающий стадию (с) идентификации конкретных генетических вариантов мтДНК; и определение вероятности наличия состояния, связанного с мтДНК, на основе результата этапа (b) и этапа (с), где состояние, связанное с мтДНК, выбрано из группы, состоящей из рака, метаболических нарушений, сердечной недостаточности, повреждения головного мозга и неврологические синдромы.
Таким образом, кратко сущностью известного технического решения является cпособ обнаружения (диагностики), а также мониторинга заболевания, связанного с митохондриальной ДНК (далее по тексту – мтДНК): рак, метаболические нарушения, сердечная недостаточность, повреждение головного мозга, легких / почек, неврологические синдромы, путем выделения внеклеточных везикул (ВВ) из плазмы или других биологических жидкостей, полученных от субъекта, с последующим анализом мтДНК в составе ВВ. Сущностью известного способа также является детекция конкретных генетических вариантов мтДНК пациента для оценки вероятности развития устойчивости к гормональной терапии у пациента с раком молочной железы. Сущностью известного способа также является генерирование ВВ, нагруженных мтДНК дикого типа, и введение эффективного количества функциональных ВВ, содержащих мтДНК, субъекту. Подробнее, известный способ относится к возможности терапии расстройства, связанного с мтДНК, путем введения ВВ, загруженных функциональными молекулами мтДНК дикого типа. Показаниями к применению известного способа являются расстройства, связанные с мтДНК, а именно дефицит мтДНК (уменьшенное количество копий мтДНК) или генетическая мутация мтДНК у человека. Способ состоит в выделении ВВ, нагруженных мтДНК дикого типа, и введение этих функциональных мтДНК в кровоток (плазма), и / или местно (внутри ткани) субъекта.
Недостатком известного изобретения по патенту №WO2018140726 является низкая эффективность действия по назначению, вследствие отсутствия функционально активных митохондрий в составе ВВ. мтДНК выполняет функцию хранения генетической информации, не обладая функцией клеточной органеллы, то есть митохондриальной функцией, а именно мтДНК не способна поддерживать реакции окислительного фосфорилирования, в то время как заявленное техническое решение обеспечивает реализацию доставки функционально активных митохондрий в клетки.
При этом заявленное техническое решение решает проблему низкой эффективности действия по назначению за счет того, что применение их по новому назначению (для восстановления и повышения митохондриальной функции)  обеспечивает возможность доставки в клетки млекопитающих целых и функционально активных органелл - митохондрий, в составе мембранных везикул мультипотентных стромальных клеток, индуцированных цитохалазином В, которые по сути и обеспечивают реализацию доставки функционально активных митохондрий в клетки.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту №US2018036344 [2] (аналог №2) «Targeted transplantation of mitochondria to hepatocytes» «Целевая трансплантация митохондрий в гепатоциты».
Сущностью известного технического решения является фармацевтическая композиция, содержащая: асиалогликопротеин (AsG), ковалентно связанный с поликатионом; и функциональные митохондрии млекопитающих, которые по меньшей мере частично очищены; где AsG, ковалентно связанный с поликатионом, электростатически образует комплекс с митохондриями. Композиция по п.1, в которой митохондрии получены из клетки от здорового донора или выделены из клетки или ткани млекопитающего. Композиция по п.11, где донорская клетка млекопитающего представляет собой гепатоцит, лейкоцит, стволовую клетку или ткань. Композиция по п.1, где митохондрии представляют собой митохондрии человека или крысы. Способ изготовления композиции, включающий: по крайней мере, частичное очищение функциональных митохондрий от клетки; обеспечение возможности AsG ковалентно присоединяться к сильно положительно заряженному поликатиону; а также, позволяя AsG, ковалентно присоединенному к сильно положительно заряженному поликатиону, электростатически связываться с митохондриями. Способ трансплантации митохондрий в гепатоцит, включающий обеспечение функциональных митохондрий млекопитающих, комплексно с AsG-PL, электростатически и эндосомолитического агента, который ковалентно присоединен к AsG посредством расщепляемой связи; а также доставку указанной композиции в гепатоцит.
Таким образом, кратко сущностью известного технического решения является фармацевтическая композиция, содержащая: асиалогликопротеин (AsG), ковалентно связанный с поликатионом (полилизин, полиаргинин и полиорнитин); которые электростатически образуют комплекс с функциональными митохондриями млекопитающих. Митохондрии получены из клеток здорового донора или выделены из клеток/тканей млекопитающих. Способ изготовления композиции включает: частичную очистку функциональных митохондрий от клетки; обеспечение возможности AsG ковалентно присоединяться к сильно положительно заряженному поликатиону и обеспечение электростатического связывания с митохондриями. Сущностью известного способа является способ лечения пациента с заболеванием печени, которое может выиграть от усиления клеточной митохондриальной функции. Способ лечения пациента с заболеванием печени включает введение терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции пациенту, нуждающемуся в этом. Клетки печени (гепатоциты) имеют уникальные рецепторы клеточной поверхности, которые распознают и связывают белки, известные как асиалогликопротеины (AsG), которые содержат остатки галактозы. Связывание AsG с его рецептором запускает инвагинацию мембраны клеточной поверхности и, в конечном итоге, изолирует комплекс рецептор-гликопротеин во внутриклеточной мембране с ограниченной мембраной, эндосоме. Эндосомы сливаются с лизосомами, содержащими разлагающие ферменты, что приводит к расщеплению гликопротеина. Система рецептора асиалогликопротеина представляет собой естественный механизм, посредством которого вещества вне клеток могут получить доступ к внутренней части клеток.
Недостатком известного изобретения по патенту №US2018036344 является отсутствие мембраны, что подвергает угрозе сохранение функциональной активности митохондрий. Также недостатком является то, что очищенные митохондрии (не окруженные цитоплазматической мембраной клетки) вызывают иммунный ответ в организме человека, а именно было показано стимулирование макрофагов и нейтрофилов (Zhu et al., 2018) [3] «Mitochondria Released by Apoptotic Cell Death Initiate Innate Immune Responses».
Таким образом, известное изобретение распознается иммунной системой и удаляется из организма человека, в силу чего известное техническое решение не может быть использовано для реализации заявленной цели (ей), а именно не является эффективным при использовании по назначению.
В то время как заявленное техническое решение решает проблему отсутствия мембраны, так как предусматривает перенос функционально активных митохондрий внутри мембранных везикул мультипотентных стромальных клеток, индуцированных цитохалазином В (МВ-ЦВ МСК), которые защищены клеточной мембраной, что позволяет сохранить митохондриальную функцию, то есть обеспечивает возможность их использования по новому назначению, а именно для восстановления и повышения митохондриальной функции живой клетки.
Кроме этого, МВ-ЦВ МСК по заявленному техническому решению мало экспрессируют, либо вовсе не экспрессируют молекулы главного комплекса гистосовместимости, следовательно, неиммуногенны, то есть не отторгаются организмом, в отличие от известного технического решения.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту №IL247447 [4] (аналог №3) «An oocyte comprising exogenous, autologous functional mitochondria obtained from an oogonial stem cell (osc) or the progeny of an osc» «Ооцит, содержащий экзогенные, аутологичные функциональные митохондрии, полученные из оогониальной стволовой клетки (ОСК) или потомство из ОСК».
Сущностью известного технического решения является способ приготовления яйцеклетки для экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) или искусственное осеменение, причем этот способ включает перенос композиции, содержащей i) митохондрии оогониальных стволовых клеток (ОСК) или ii) митохондрии, полученные из потомства ОСК, в аутологичный ооцит, тем самым готовя указанный ооцит к ЭКО или искусственному осеменению. Способ по п.1, в котором композиция, содержащая i) митохондрии ОСК или ii) митохондрии, полученные из потомства ОСК, представляет собой очищенный препарат митохондрий. Композиция, содержащая изолированные митохондрии или митохондрии ОСК, полученные из потомства ОСК.
Таким образом, кратко сущностью известного технического решения являются композиции, полученные из оогониальных стволовых клеток (ОСК), такие как безъядерная цитоплазма или изолированные митохондрии, и описаны применения композиций, полученных из ОСК, в процедурах, направленных на повышение рождаемости. В одном аспекте изобретение относится к способу подготовки ооцита для экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) или искусственного оплодотворения. Способ включает перенос композиции, содержащей митохондрии ОСК или митохондрии, полученные из потомства ОСК, в аутологичный ооцит, тем самым готовя ооцит для оплодотворения in vitro. ОСК представляет собой изолированную неэмбриональную стволовую клетку, которая является компетентной клеткой и экспрессирует специфичные для эмбриональной стадии антигены: Vasa, Oct-4, Dazl, Stella, SSEA (например, SSEA-1, -2, -3 и -4). ОСК может быть получен из ткани яичника или не яичниковой ткани, а также, костного мозга, периферической и пуповинной крови.
Недостатком известного изобретения по патенту №IL247447 является сложность получения биоматериала. Материал может быть взят исключительно у женщин детородного возраста.
Кроме того, использование чистых митохондрий несет риск их гибели из-за отсутствия защитной мембраны и, как следствие, известное техническое решение обладает низкой эффективностью действия по назначению.
При этом заявленное техническое решение решает проблему возрастных и гендерных ограничений вследствие того, что биоматериал по заявленному техническому решению может быть получен из МСК любого здорового человека. Заявленное техническое решение решает проблему низкой эффективности действия по назначению аналогов путем доставки в клетки животных целых и функционально активных митохондрий, заключенных в мембранные везикулы мультипотентных стромальных клеток, индуцированных цитохалазином В.
В заявленном техническом решении устранена проблема потери функциональной активности митохондрий путем заключения митохондрий в мембранные везикулы мультипотентных стромальных клеток, индуцированных цитохалазином В, которые окружены цитоплазматической мембраной, что обеспечивает возможность их применения по новому назначению, а именно для восстановления и повышения митохондриальной функции.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту №KR20190026045 [5] (аналог №4) «Compositions and methods for improving mitochondrial function and treating neurodegenerative diseases and cognitive disorders» «Композиции и способы для улучшения митохондриальной функции и лечения нейродегенеративных заболеваний и когнитивных расстройств».
Сущностью известного технического решения является:
Для лечения и профилактики состояний, выбранных из группы, состоящей из ожирения, пониженной скорости метаболизма, метаболического синдрома, диабета, сердечно-сосудистых заболеваний, гиперлипидемии, нейродегенеративных расстройств, когнитивных расстройств, расстройств настроения, стресса и тревожных расстройств; Для контроля веса; Или для повышения работоспособности мышц или умственных способностей: пищевой продукт или пищевая добавка, содержащая эффективное количество экстракта граната.
Контактирование клеток с эффективным количеством уроритина или его предшественника для повышения функции митохондрий, при этом способ включает этапы: увеличение или поддержание митохондриальной функции.
Введение терапевтически эффективного количества эворитина или его предшественника индивидууму, нуждающемуся в этом, для лечения заболевания или состояния, связанного с измененной функцией митохондрий или пониженной плотностью митохондрий, включающим стадии: связанные с измененной функцией митохондрий или пониженной плотностью митохондрий. Способ лечение, профилактика или лечение митохондриального заболевания или состояния.
Таким образом, кратко сущностью известного технического решения являются композиции, которые могут быть использованы в различных терапевтических целях, включая лечение и / или предотвращение заболеваний или расстройств, связанных с пониженной или неадекватной митохондриальной активностью, включая старение или стресс, диабет, ожирение и нейродегенеративные заболевания. Известное изобретение предоставляет экстракт плодов, его активную фракцию или один, или несколько активных ингредиентов, которые можно отделить от них, для использования в качестве фактора митохондриальной функции. Используемый здесь термин «фракция» относится к очищенным или частично очищенным экстрактам. Известное изобретение также относится к природным соединениям, обладающим биологической активностью, обнаруживаемым в гранате и других фруктах, а также к природным экстрактам с биологической активностью, содержащим эти соединения, также относится к полифенольным соединениям и их производным, связанным с элагитанином. Эти соединения включают в себя элагитанин, пунациразин и элагиновую кислоту, которые содержатся в гранате, но также могут быть выделены из других фруктов и ягод, а также из метаболитов этих соединений. Как описано в известном изобретении, было обнаружено, что эти соединения оказывают благотворное влияние на функцию митохондрий, клеточный метаболизм и образование нейронов. Исследования проводились на модели культуры нейрональных клеток in vitro. В одном аспекте известное изобретение относится к композиции, содержащей соединение по известному изобретению, такое как фармацевтическая, медицинская пища, функциональная пища, растительная добавка или пищевая добавка, и их смеси. Композиции могут необязательно содержать дополнительные терапевтические агенты и могут вводиться в комбинации с другим терапевтическим соединением. Также предоставляются упакованные продукты, содержащие вышеупомянутые композиции и этикетки и / или инструкции по применению для улучшения памяти и когнитивных функций или для лечения заболеваний или состояний, связанных с типичными повреждениями головного мозга, в случае состояний, встречающихся у пожилых людей.
Недостатком известного изобретения по патенту № KR20190026045 является отсутствие целенаправленного действия на митохондриальную активность клеток человека, поскольку растительные митохондрии не способны заменить и взять на себя функцию митохондрий человека. Сходство растительных и животных митохондрий является предположением, поскольку прямые химические анализы с целью определения гомологии состава и функции растительных и животных митохондрий заявителем не выявлены. Таким образом, известное изобретение является биологически активной пищевой добавкой, применение которой не приводит к замене дефектных митохондрий на донорские. Недостатком известного изобретения по патенту № KR20190026045 является низкая эффективность действия по назначению, так как лекарственное средство вводится пациенту перорально. Пероральное применение аналога № KR20190026045 приводит к разрушению растительных митохондрий, не достигая кровотока человека. Более детально: растительные митохондрии, входящие в состав изобретения по патенту № KR20190026045, не попадают в кровеносное русло, так как разрушаются при прохождении через желудочно-кишечный тракт, таким образом, по мнению заявителя, растительные митохондрии не могут достигнуть  очага заболевания и, как следствие, не могут быть использованы по назначению, а именно - для восстановления и повышения митохондриальной функции клеток человека.
При этом заявленное техническое решение решает проблему повышения эффективности действия путем внутривенного введения мембранных везикул мультипотентных стромальных клеток человека, индуцированных цитохалазином В, которые содержат в своем составе функционально активные митохондрии, способные повысить функциональную активность митохондрий.
Метод внутривенного введения наиболее эффективен в применении по назначению ввиду быстрого действия и возможности точного дозирования МВ-ЦВ МСК.
Кроме того, заявленное техническое решение содержит митохондрии человека, защищенные цитоплазматической мембраной от разрушающих факторов внешней среды, что обеспечивает возможность их применения по новому назначению, а именно для восстановления и повышения митохондриальной функции.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту № SG11201901689Y [6] (аналог №5) «Compounds for treating diseases associated with a mitochondrial dysfonction» «Cоединения для лечения заболеваний, связанных с митохондриальной дисфункцией»
Сущностью известного технического решения является:
Соединение или его фармацевтически приемлемая соль или гидрат по любому из пп.1-9 в сочетании по меньшей мере с одним дополнительным соединением, полезным для профилактики или лечения заболевания, связанного с дисфункцией митохондрий. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного вещества соединение формулы (А) или его фармацевтически приемлемую соль или гидрат, как определено в любом из пп.1-5, необязательно в сочетании по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым наполнителем или носителем, для применения в профилактика или лечение заболевания, связанного с дисфункцией митохондрий по п.1, 6 или 7 у индивидуума.  Продукты, содержащие: соединение формулы (А) по любому из пп.1-5, по меньшей мере, одно дополнительное соединение, полезное для профилактики или лечения заболевания, связанного с дисфункцией митохондрий, в качестве комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения в профилактике или лечение заболевания, связанного с дисфункцией митохондрий, по п.1, 6 или 7 у индивидуума.
WO 2018/041919 33 PCT / EP2017 / 071812.
Пищевая добавка, содержащая соединение формулы (А) по любому из пп.1-5 для применения для снижения риска заболевания, связанного с дисфункцией митохондрий, по п.1, 6 или 7 у индивидуума.
Таким образом, кратко сущностью известного технического решения является фармацевтическая композиция, представляющая собой органическое соединение формулы (<br/> WO 2018/041919 4 PCT / EP2017 / 071812 NH 0 NH NN NH 2 R 1) (I) или его фармацевтически приемлемая соль/гидрат, которая оказывает нейропротективное действие на модели болезни Паркинсона in vitro, включающей дисфункцию митохондрий. В варианте осуществления изобретения указанная выше фармацевтическая композиция дополнительно содержит, по меньшей мере, одно дополнительное соединение, полезное для предотвращения или лечения заболевания, связанного с дисфункцией митохондрий, в качестве комбинированного препарата для единовременного, раздельного или последовательного применения при профилактике или лечении заболевания. Сущностью известного способа является получение фармацевтической композиции с помощью химического синтеза, или же с помощью экстрагирования, с последующим очищением из природных источников, таких как микроорганизмы, в частности бактерии, или из растений, в частности, из растений, не содержащих альфа-протеобактерии, таких как бактерии Rhizobium, Mesorhizobium и Sinorhizobium genii.
Недостатком известного изобретения по патенту является ограниченное применение в связи с использованием химического вещества, которое может отрицательно повлиять на состояние пациента. Также существует опасность иммунного отторжения организмом синтезированного вещества. Экстрагирование фармацевтической композиции из природных источников несет опасность загрязнения токсинами (фитотоксины, эндотоксины). Токсины оказывают специфичное действие на организм, а именно нейтрализуются только соответствующей антитоксической сывороткой, что предполагает внесение дополнительной трудности при реализации изобретения по патенту № SG11201901689Y.
При этом заявленное техническое решение является безопасным, технологичными по применению, так как мембранные везикулы мультипотентных стромальных клеток, индуцированных цитохалазином В, мало экспрессируют либо вовсе не экспрессируют молекулы главного комплекса гистосовместимости, следовательно, неиммуногенны, а также не несут в своем составе каких-либо синтетических материалов. Таким образом, применение мембранных везикул МСК для доставки функционально активных митохондрий в клетки млекопитающих является биосовместимым, неиммуногенным и не токсичным,  а также служит для восстановления и повышения митохондриальной функции.
Из исследованного уровня техники выявлен способ переноса митохондрий из стромальных клеток, полученных из костного мозга в альвеолы легких, что защищает от острого повреждения легких (Islam et al., 2012) [7] (аналог №6) «Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury».
Сущность заключается в том, что культура стромальных клеток (bone marrow-derived stromal cells (далее по тексту - BMSCs) выделяется из костного мозга и культивируется. Далее на модели индуцированного липополисахаридом острого повреждения легких была осуществлена доставка в альвеолы мышей человеческих BMSCs, которые выделяют во внеклеточную среду естественные микровезикулы, несущие в своем составе митохондрии. Микроскопические исследования в режиме реального времени показали, что мышиные BMSCs образовали соединительные каналы с альвеолярным эпителием, высвобождая везикулы с митохондриями, которые захватывали эпителиальные клетки альвеол. Присутствие митохондрий, перенесенных от BMSCs в эпителиальных клетках наблюдалось визуально, благодаря флуоресцентной метке, а также по наличию человеческой митохондриальной ДНК в легких мыши. В результате митохондриального переноса увеличилось количество АТФ в альвеолах легких. Известный способ отчасти совпадает с заявленным техническим решением в области выбора метода доставки митохондрий – с помощью везикул.
Недостатком известного технического решения является низкая эффективность применения по назначению вследствие ограниченного выхода продукта. Введение клеток (BMSCs) несет риски неограниченного деления и опухолевой трансформации. Естественный выход везикул осуществляется in vitro и in vivo постоянно, однако в очень малых количествах, что требует большого количества времени и клеточного материала. В этой связи достижение терапевтического эффекта займет много времени, что неблагоприятно скажется на состоянии пациента. Вследствие вышеизложенного указанный известный способ является малоэффективным и дискомфортным в применении по назначению для пациента, так как требует регулярного и частого введения данного фармацевтической композиции пациенту. Недостатком является также ограниченная применимость, так как известное техническое решение направлено на лечение острого повреждения легких, тогда как заявленное техническое решение предусматривает лечебное действие на весь организм, так как мембранные везикулы мультипотентных стромальных клеток, полученные с помощью цитохалазина В, распространяются по всему кровотоку и достигают всех органов и тканей. В результате, известное техническое решение обладает меньшей эффективностью действия по назначению и ограниченной применимостью по назначению по сравнению с заявленным техническим решением.
При этом заявленное техническое решение решает проблему ограниченного выхода продукта, так как предусматривает получение мембранных везикул из мультипотентных стромальных клеток с помощью цитохалазина В, что повышает выход мембранных везикул, не требует значительного временного интервала и не требует использования специального дорогостоящего оборудования. Также заявленное техническое решение направлено на перенос митохондрий во все органы и ткани, что обеспечивает возможность его применения по новому назначению, а именно для восстановления и повышения митохондриальной функции.
Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту № RU2605853C1 [8] (аналог №7) «Способ получения лекарственного препарата на основе везикул клеток человека».
Сущностью известного технического решения является способ получения лекарственного средства на основе везикул человека для стимуляции ангиогенеза у пациентов с ишемическим повреждением тканей, отличающийся тем, что выращивают клетки человека линии SH-SY5Y на культуральном флаконе, промывают изотоническим буферным раствором, добавляют к клеткам стерильный раствор цитохалазина В, клетки промывают изотоническим буферным раствором, переводят в суспензию, подвергают активному перемешиванию и осуществляют серию центрифугирований с получением заявленного лекарственного средства. Способ по п. 1, отличающийся тем, что проводят фильтрацию полученного лекарственного средства.
Недостатком известного технического решения является отсутствие у заявителя информации  о свойстве мембранных везикул содержать в своем составе функционально активные митохондрии и не изученность свойств мембранных везикул, связанных с передачей функционально активных митохондрий в другие клетки. Недостатком является также ограниченная применимость, так как известное техническое решение направлено на стимуляцию ангиогенеза у пациентов с ишемическим повреждением тканей. В результате известное техническое решение обладает меньшей эффективностью действия по назначению и ограниченной применимостью по назначению по сравнению с заявленным техническим решением.
При этом заявленное техническое решение предусматривает применение по назначению на весь организм, так как мембранные везикулы мультипотентных стромальных клеток, полученные с помощью цитохалазина В, достигают всех органов и тканей и содержат в своем составе функционально активные митохондрии, что обеспечивает возможность их применения по новому назначению, а именно для восстановления и повышения митохондриальной функции.
Таким образом, из исследованного уровня техники по всем аналогам заявленного технического решения в целом можно сделать выводы общего характера о том, что:
- мтДНК (см. аналог представленного технического решения – 1), входящая в состав внеклеточных везикул не обладает митохондриальной функцией, а именно мтДНК не способна поддерживать реакции окислительного фосфорилирования;
-   трансплантация митохондрий (см. аналоги представленного технического решения – 2,3), не защищенных мембраной, подвергает угрозе сохранение их функциональной активности вследствие воздействия разрушающих факторов внеклеточной среды;
- пероральный путь введения фармацевтической композиции (см. аналог представленного технического решения - 4) неэффективен при  применении по назначению, так как часть фармацевтической композиции неизбежно теряется, растворяясь в содержимом желудочно-кишечного тракта или же всасываясь, попадает с кровотоком в печень, где частично разрушается, не достигая очага заболевания;
- химические соединения или химически синтезированные фармацевтические композиции (см. аналог представленного технического решения – 5) являются небезопасными для применения в качестве лекарственного средства для человека, так как могут оказывать вредное воздействие на здоровые органы;
- введение клеток (BMSCs) несет риски неограниченного деления, что может привести в дальнейшем к опухолевой трансформации (см. аналог представленного технического решения – 5);
- естественные везикулы клеток человека (см. аналог представленного технического решения – 5) не применимы в широких промышленных масштабах, так как количество естественно выделяемых клетками везикул очень маленькое, а метод выделения естественных везикул сложен и времязатратен, поэтому нет возможности их широкого клинического применения;
- отсутствие у заявителя информации  о свойстве мембранных везикул содержать в своем составе функционально активные митохондрии и не изученность свойств мембранных везикул, связанных с передачей функционально активных митохондрий в другие клетки (см. аналог представленного технического решения – 6).
Целью и техническим результатом заявленного технического решения
является устранение недостатков аналогов, а именно:
1 - применение  безопасных, эффективных при использовании, неиммуногенных мембранных везикул мультипотентных стромальных клеток, индуцированных цитохалазином В, которые несут в своем составе функционально активные митохондрии и мало экспрессируют либо вовсе не экспрессируют молекулы главного комплекса гистосовместимости;
2 - доставка функционально активных митохондрий, находящихся внутри МВ-ЦВ МСТ, и защищенных цитоплазматической мембраной от внешних факторов внеклеточной среды, что увеличивает срок жизни митохондрий и, как следствие, повышает эффективность действия заявленного технического решения по назначению;
3 - повышение эффективности действия по назначению, увеличение скорости действия и точности дозирования МВ-ЦВ МСТ благодаря внутривенному введению;
4 - получение мембранных везикул из мультипотентных стромальных клеток млекопитающих, не содержащей каких-либо токсинов и не характерных для животной клетки компонентов;
5 - замена клеточной терапии на везикулярную терапию, что позволит избежать угрозы неограниченного деления и опухолевой трансформации;
6 - применение высокоэффективного, конкурентоспособного, импортозамещающего средства нового поколения, которое не требует значительного временного интервала, не требует использования специального дорогостоящего оборудования;
7 - получение мембранных везикул мультипотентных стромальных клеток, содержащих функционально активные митохондрии и подтверждение их наличия в составе мембранных везикул.
Заявленное техническое решение, по мнению заявителя, обеспечивает в целом повышение качества жизни человека в силу обеспечения возможности (полной или частичной) замены известных на дату представления заявочных материалов средств и способов терапии для таких трудноизлечимых заболеваний, как дегенерация организма в целом (ухудшение биологических признаков организма), мышечная атрофия, миопатия, диабет 2 типа, ишемическая болезнь сердца, инсульт, рак, нейродегенеративные заболевания (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона) на возможность на первых стадиях использования заявленного технического решения существенного улучшения здоровья пациентов, с последующим выходом на стадию полного излечения выше представленных заболеваний в процессе совершенствования методов лечения этих заболеваний, в том числе и за счет использования заявленного технического решения.
Сущность заявленного технического решения
заключается в применении мембранных везикул мультипотентных стромальных клеток, индуцированных цитохалазином В, содержащих функционально активные митохондрии, для восстановления и повышения митохондриальной функции и доставки функционально активных митохондрий в клетки млекопитающих.
Таким образом, по  мнению заявителя, впервые в мире выявлено неизвестное ранее из исследованного заявителем уровня техники свойство мембранных везикул МСК, полученных с помощью цитохалазина В, заключать в свой состав функционально активные митохондрии, которые обеспечивают возможность применения заявленного технического решения для лечения неизлечимых ранее заболеваний, таких как дегенерация, мышечная атрофия и миопатия, вызванных мутациями в митохондриальной ДНК, а также для терапии заболеваний, связанных с нарушением функции митохондрий (диабет 2 типа, ишемическая болезнь сердца, инсульт, рак), нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и т.д.), в которых существует проблема использования митохондриальной заместительной терапии для взрослых людей, а также может быть использовано для замедления старения организма.
Таким образом, более детально целью заявленного технического решения является применение мембранных везикул мультипотентных стромальных клеток, индуцированных цитохалазином В, полученных из клеток человека с повышенным митохондриальным потенциалом - мультипотентных стромальных клеток (МСК).
Заявленное техническое решение поясняется Фиг.1 - Фиг. 8.
На Фиг.1
– представлены данные конфокальной микроскопии МСК человека, где:
1 А -  зеленым цветом окрашены функционально-активные митохондрии в клетке (указаны стрелками);
1 Б – синим цветом окрашены ядра клеток;
1 В – наложение MitoTracker Green+Hoechst 33342. Масштабный отрезок 20 микрометров.
На Фиг.2
– представлена сканирующая электронная микроскопия везикул клеток человека, выделенных из клеток МСК. На микрофотографии представлены отдельные везикулы клеток человека - окруженные мембраной округлые микроструктуры (указаны стрелками на фигуре), размер которых в диапазоне 100-820 нм. Увеличение 20 кратное, масштабный отрезок 20 микрометров.
На Фиг.3
– представлен анализ популяции МВ-ЦВ МСК на наличие митохондрий, где:
3 А – красным цветом окрашена цитоплазматическая мембрана мембранных везикул (краситель DiD, указаны стрелками);
3 Б – зеленым цветом окрашены функционально активные митохондрии в МВ-ЦВ М СК (краситель MitoTracker Green, указаны стелками);
3 В – наложение фотографий MitoTracker Green+DiD.
Масштабный отрезок 2 микрометра.
На Фиг.4
- представлен анализ популяции МВ-ЦВ МСК с помощью проточной цитофлуориметрии с усиленным детектором (BD FACS Aria III), где:
4 А – положение МВ-ЦВ МСК, содержащих митохондрии на дот-плот графике (ось Х – (SSC – side scatter – боковое светорассеяние) – пропорционально гранулярности мембранных везикул, ось Y (FSC – forward scatter – прямое светорассеяние)– пропорционально размеру микровезикул) (стрелками показаны мембранные везикулы МСК).
4 Б – дот-плот график микровезикул, содержащих митохондрии (DiD+ TMRE+).
На Фиг.5
- представлен анализ клеток-реципиентов (МСК), проинкубированных с МВ-ЦВ МСК (DiD+TMRE+), где:
5 A – поверхность клетки-реципиента с включениями мембраны МВ-ЦВ МСК. Флуоресценция в темно-красной области спектра – DiD (указаны стрелками),
5 Б – митохондрии клетки-реципиента. Флуоресценция в зеленой области спектра - MitoTracker Green (указаны стрелками),
5 В – привнесенные митохондрии МВ-ЦВ МСК. Флуоресценция в красной области спектра – TMRE (указаны стрелками),
5 Г – ядро клетки-реципиента. Флуоресценция в синей области спектра – Hoechst 33342),
5 Д – наложение фотографий. Масштабный отрезок 10 микрометров.
На Фиг. 6
– представлено сравнение митохондриальных потенциалов клеток-доноров и клеток-реципиентов, где:
6 А - митохондриальный потенциал МСК;
6 Б - митохондриальный потенциал Фб;
6 В - митохондриальный потенциал А549;
о.е. – относительные единицы;
Δψ – потенциал митохондриальной мембраны.
На Фиг. 7
- представлена оценка митохондриального потенциала клеток-реципиентов до и после обработки с помощью МВ-ЦВ МСК, где
7 А – митохондриальный потенциал клеток-реципиентов МСК до и после обработки с помощью МВ-ЦВ МСК,
7 Б - митохондриальный потенциал клеток-реципиентов Фб до и после обработки с помощью МВ-ЦВ МСК,
7 В - митохондриальный потенциал клеток-реципиентов A549 до и после обработки с помощью МВ-ЦВ МСК.
* - статистически значимое различие (p <0,05);
о.е. – относительные единицы;
Δψ – потенциал митохондриальной мембраны;
24 часа, 2 дня, 4 дня – период роста клеточной культуры.
На Фиг. 8
– представлена Таблица результатов оценки митохондриального потенциала.
о.е. – относительные единицы;
Δψ – потенциал митохондриальной мембраны;
-
К - контрольные клетки, необработанные МВ-ЦВ МСК.
В представленных далее испытаниях показано наличие функционально активных митохондрий в составе мембранных везикул мультипотентных стромальных клеток, индуцированных цитохалазином В (МВ-ЦВ МСК).
В настоящей заявке представлены экспериментальные данные, подтверждающие, что заявленное техническое решение выполняет функцию доставки содержащихся в нем митохондрий в клетки-реципиенты. То есть МВ-ЦВ МСК обладают эффективностью действия по назначению в области повышения митохондриальной функции.
При этом следует обратить внимание на то, что в отличие от аналогов, заявленное техническое решение удовлетворяет требованиям, предъявляемым к фармацевтическим средствам по биологической безопасности, эффективности и промышленной применимости.
осуществление заявленного технического решения
Далее заявителем приведено .
Цели и технический результат заявленного технического решения достигают тем, что для получения мембранных везикул используют МСК, выделенные из подкожной жировой клетчатки человека (Фиг.1).
Далее клетки человека выращивают на культуральных чашках, затем открепляют от культурального сосуда, добавляют вещество – цитохалазин В. Цитохалазин B нарушает структуру цитоскелета, что позволяет далее с помощью серии центрифугирований отделить микровезикулы от целых жизнеспособных клеток [9 – Pick, Н. et al., Investigating Cellular Signaling Reactions in Single Attoliter Vesicles. JACS, 2005. V.127: p. 2908–2912]. Это позволит получать микровезикулы в промышленном масштабе. Далее клетки подвергают механическому воздействию с целью отделения везикул от клеток человека. Полученную суспензию, содержащую клетки и везикулы человека, подвергают серии последовательных центрифугирований с целью разделения везикул от целых клеток человека и клеточного дебриса. Полученные после процесса выделения везикулы называются индуцированными цитохалазином В мембранными везикулами мультипотентных стромальных клеток (МВ-ЦВ МСК), при этом полученная суспензия не содержит жизнеспособных клеток (Фиг.2). МВ-ЦВ МСК защищают митохондрии от разрушения и поддерживают их в функционально активном состоянии, а также способствуют эффективному проникновению митохондрий в клетки-реципиенты. Предлагаемая разработка позволит повысить выход мембранных везикул.
При этом следует обратить внимание на то, что существует  возможность введения этапа сортировки полученных мембранных везикул, с целью получения однородной по размерам фракции, содержащих функционально активные митохондрии в составе, что по предположению заявителя приведет к возможности стандартизации формы получаемой фармацевтической композиции (так как на дату предоставления заявочных материалов выявлена соответствующая тенденция), однако подтверждающие данные могут быть представлены заявителем только после завершения дополнительных исследований, которые на дату представления заявочных материалов не доведены до завершающего этапа.
подробное описание
в четыре этапа
Далее заявителем приведено  осуществления заявленного технического решения, которое проводят, например, .
Варианты наиболее предпочтительных этапов приведены ниже.
Первый этап. Выделение, культивирование МСК.
На первом этапе проводят выделение мультипотентных стромальных клеток человека из подкожной жировой ткани. Жировую ткань получают от здоровых доноров с письменного согласия после операции липосакции. Сбор жировой ткани осуществляют в стерильных условиях. Выделение стволовых клеток осуществляют стандартной ферментативной обработкой 0.2 % раствором коллагеназы II (Диа-М, Россия). Инкубацию ткани проводят при 37 °С на шейкере в режиме 120 об/мин в течение часа. Клетки трижды промывают PBS (от англ. phosphate buffered saline) (ПанЭко, Россия). Полученный клеточный осадок ресуспензируют в среде α-MEM, с добавлением 10% сыворотки крови плодов коровы (Sigma, США), 2 мМ L-глутамина (ПанЭко, Россия). Все работы с культурой клеток проводят в стерильном ламинарном боксе согласно общепринятым правилам работы в лаборатории 2-го класса биобезопасности.
МСК поддерживают в среде DMEM (ПанЭко, Россия), к которой добавляют 10% сыворотки крови плодов коровы (FBS – fetal bovine serum) (Sigma-Aldrich, США), 2 мM L-глутамина (ПанЭко, Россия) и смесь антибиотиков пенициллина и стрептомицина (10 ед/мл пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина) (ПанЭко, Россия). Культуры клеток культивируют в инкубаторе inCusaFeMCO-15AC (SANYO Electric Co., Ltd., США) при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2.
При пассировании клеточных культур с них удаляют питательную среду, промывают монослой клеток раствором PBS (ПанЭко, Россия), с целью удаления остатков питательной среды и ионов Ca2+ и Mg2+, которые ингибируют действие фермента. В культуральный флакон добавляют 0.25% раствор трипсина-ЭДТА в объеме 2 мл, чтобы покрыть монослой клеток. Инкубируют культуральный флакон в инкубаторе inCusaFeMCO-15AC (SANYO Electric Co., Ltd., США) при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2 в течение 5 минут. Далее инактивируют трипсин путем добавления полной питательной среды в соотношении 1:2. Для избавления от остатков трипсина центрифугируют клетки при 1400 об/мин 5 минут. Осадок клеток ресуспензируют в 1 мл полной питательной среды. Подсчет клеток проводят с помощью камеры Горяева (Линза, Россия) и добавляют необходимое количество клеток в культуральный флакон.
С помощью метода проточной цитофлуориметрии проводят иммунофенотипирование МСК, с целью подтверждения экспрессии поверхностных маркеров характерных для человеческих МСК. Мультипотентные стромальные клетки находились в суспензии с раствором PBS. Далее к суспензии клеток добавляют моноклональные антитела – специфичные поверхностные маркеры стволовых клеток, в рекомендуемых производителем разведении, инкубируют в течение 20 минут. Затем центрифугируют 5 мин при скорости 500 g. Отмывют от антител с помощью PBS. Анализ полученных результатов проводят с помощью проточного цитофлуориметра – сортера: BD FACS Aria III (BD Bioscience, США). Получением мультипотентных стромальных клеток, обладающих повышенным митохондриальным потенциалом, завершают первый этап осуществления предлагаемого способа и приступают ко второму этапу.
Второй этап. Выделение МВ-ЦВ МСК.
Далее получают мембранные везикулы, индуцированные цитохалазином В, из клеток, обладающих повышенным митохондриальным потенциалом. Получение мембранных везикул клеток человека, не содержащих целые жизнеспособные клетки, позволяет исключить опасность образования опухоли в результате бесконтрольного деления клеток. Таким образом, используя потенциал МСК, получают биологически безопасный препарат мембранных везикул клеток человека.
Поскольку известно, что количество естественно выделяемых клетками мембранных везикул не обеспечивает возможность их широкого клинического применения, вследствие чего может быть использовано исключительно для исследовательских целей, в заявленном техническом решении предлагается устранить данный недостаток. Недостаток устраняют посредством стимуляции клеток человека для получения большего количества везикул веществом, нарушающим структуру цитоскелета - цитохалазином B.
Получение мембранных везикул, индуцированных цитохалазином В, из культуры клеток МСК осуществляют следующим образом.
При достижении культурой клеток плотности монослоя 90%, отбирают питательную среду, дважды промывют культуру с помощью PBS (ПанЭко, Россия) от остатков среды. Клетки открепляют с помощью 0.25% раствора трипсина-ЭДТА (ПанЭко, Россия), затем отмывают клетки с помощью PBS (ПанЭко, Россия).
2
Инкубируют клетки в модифицированной Дульбекко среде Игла DMEM без сыворотки крови, содержащей 10 мкг/мл цитохалазина B (Sigma-Aldrich, США) в течение 30 мин при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO, подвергают активному перемешиванию в течение 30 сек.
Далее осуществляют серию последовательных центрифугирований: 500 об/мин 10 мин, супернатант отбирают и центрифугируют 700 об/мин 10 минут, супернатант отбирают и центрифугируют 4000 об/мин 25 минут. Осадок, содержащий МВ-ЦВ, отмывают большим количеством PBS (ПанЭко, Россия), центрифугируют при 4000 об/мин 25 мин. Полученный осадок МВ-ЦВ используют далее в работе.
Полученный биологически безопасный продукт – мембранные везикулы клеток человека является фармацевтическим средством, создаваемой на основе заявленного технического решения. При необходимости возможно введение этапа сортировки полученного средства, с целью получения более однородной по размерам фракции мембранных везикул клеток человека, содержащих функционально активные митохондрии.  Результаты второго этапа – получения везикул клеток человека, представлены на Фиг. 2. Получением везикул клеток человека завершают второй этап и переходят к выполнению третьего этапа осуществления предлагаемого применения по назначению.
Таким образом, на втором этапе, получают достаточное для широкого клинического применения количество везикул. При этом метод стимуляции клеток человека с высоким митохондриальным потенциалом, а также выделения везикул клеток человека не является сложным с технологической точки зрения, не требует много времени и специального дорогостоящего оборудования, что отвечает критерию промышленной применимости. Количество получаемых везикул клеток человека в результате осуществления второго этапа изготовления заявленного технического решения зависит лишь от количества исходного сырья (клеток человека с функционирующими митохондриями).
Третий этап. Оценка наличия функционально активных митохондрий в МВ-ЦВ МСК.
Проводят анализ состава мембранных везикул, индуцированных цитохалазином В, на предмет наличия функционально активных митохондрий. Мембранные везикулы мультипотентных стромальных клеток окрашивают митохондриальным и мембранным красителями для визуализации содержащихся в них митохондрий. Для достижения цели используют красители DiD и MitoTracker Green.
MitoTracker Green – предназначен для маркировки митохондрий в живых клетках, обладает флуоресценцией в зеленой области спектра (Ex/Em = 490/520 нм). Краситель сохраняется в митохондриях в течение длительного времени. Эта ключевая особенность значительно повышает эффективность окрашивания. Для окрашивания митохондрий с помощью MitoTracker Green добавляют краситель в конечной концентрации 200 нМ [10 –Fu, D. et al., Monitoring the Effects of Pharmacological Reagents on Mitochondrial Morphology. Current Protocols in Cell Biology, 2018. V.79: p. 34-37].
2,
Инкубируют клетки (106 клеток/1 мл) в DMEM (ПанЭко, Россия) в инкубаторе inCusaFeMCO-15AC (SANYO Electric Co., Ltd., США) при 37 °С во влажной атмосфере, содержащей 5% COв течение 20 минут. Анализируют флуоресцентный сигнал с помощью проточного цитофлуориметра – сортера: BD FACS Aria III (BD Bioscience, США). Для окрашивания цитоплазматической мембраны (ЦПМ) клеток человека используют витальный, краситель DiD (кат. № V22889, Life technologies, США). Это липофильное соединение нелипидной природы, являются стойкими красителями и обнаруживаются в составе ЦПМ клетки даже через три недели [12 – Yumoto, K. et al., A novel method for monitoring tumor proliferation in vivo using fluorescent dye DiD. Cytometry A, 2014. V.85, №6: p. 548-555].
2
Отмывают клетки человека от питательной среды дважды PBS, ресуспендируют в среде без сыворотки из расчета 106 клеток/1 мл. Добавляют краситель до конечной концентрации 5 мМ и инкубируют клетки в инкубаторе inCusaFeMCO-15AC (SANYO Electric Co., Ltd., США) при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% CO, в течение 15 минут. Промывают клетки трижды полной питательной средой. Анализируют с помощью лазерного конфокального микроскопа Zeiss LSM780 (Carl Zeiss, Германия). Краситель DiD окрашивает цитоплазматическую мембрану везикул (Фиг. 3), тогда как MitoTracker Green проникает в функционально активные митохондрии, в результате чего митохондрии флуоресцировали в зеленой области спектра (Фиг. 3).
Наложение фотографий с MitoTracker Green и DiD показывает, что полученные везикулы человека содержат функционально активные митохондрии и окружены мембраной.
Таким путем завершают оценку наличия функционально активных митохондрий в составе мембранных везикул мультипотентных стромальных клеток и приступают к четвертому этапу.
Четвертый этап. Доставка МВ-ЦВ МСК в клетки человека и оценка митохондриального потенциала.
Проводят анализ эффективности действия по назначению полученных мембранных везикул, индуцированных цитохалазином В, на предмет переноса функционально активных митохондрий в клетки-реципиенты in vitro путем нанесения везикул клеток человека, выделенных из МСК, следующим типам клеток: МСК, фибробласты и А549.
С целью оценки биологической активности мембранных везикул МСК человека, несущих функционально активные митохондрии, наносят мембранные везикулы МСК на клетки-реципиенты и оценивают изменение митохондриального потенциала клеток-реципиентов.
На первом этапе оценивают митохондриальный потенциал клеток-доноров – МСК, а также клеток-реципиентов - фибробластов и А549. Согласно полученным данным (Фиг. 6) митохондриальный потенциал МСК составил 1,85±0,2 о.е., фибробластов – 1,03±0,1 о.е., А549 - 0,72±0,2 о.е. Заявителем установлено, что фибробласты и А549 имеют сниженный митохондриальный потентцал (подобно стареющим и дефектным клеткам). МСК имеют повышенный митохондриальный потенциал, который превышает митохондриальный потенциал фибробластов в 1,8 раз, а митохондриальный потенциал А549 в 2,5 раза (Фиг. 6).
Таким образом, заявителем установлено, что МСК-доноры, из которых получают МВ-ЦВ, несущие митохондрии клеток-доноров, обладают повышенным митохондриальным потенциалом. На втором этапе обрабатывют клетки-реципиенты (МСК, фибробласты, A549), имеющие равный (МСК) и пониженный (фибробласты, A549) потенциалы митохондрий, с целью оценки активности привнесенных с помощью МВ-ЦВ МСК митохондрий и, как следствие, изменение митохондриального потенциала в клетках-реципиентах.
Далее оценивают митохондриальный потенциал клеток-реципиентов до и после обработки МВ-ЦВ МСК. Перенос митохондрий с помощью индуцированных цитохалазином В мембранных везикул из мультипотентных стромальных клеток человека, проводят на трех клеточных линиях: МСК, фибробласты человека и A549 in vitro (Фиг. 7). Измерения проводят через 24 часа, 2 дня и 4 дня после обработки клеток-реципиентов МВ-ЦВ МСК. Окрашивают клетки флуоресцентным красителем jc-1 (Thermo Fisher Scientific, США) (Фиг. 7).
jc-1 - катионный краситель, который демонстрирует потенциал-зависимое накопление в митохондриях, на что указывает сдвиг флуоресцентного излучения от зеленого (~ 525 нм) к красному (~ 590 нм). jc-1 более специфичен для митохондрий и более точен в своем ответе на деполяризацию, чем другие катионные красители. Этот краситель в мономерной форме окрашивает цитоплазму клеток зеленым цветом, а агрегаты красителя окрашивают митохондрии красным. Соотношение зеленой и красной флуоресценции зависит только от мембранного потенциала, а не от других факторов, таких как размер, форма и плотность митохондрий, которые могут влиять на флуоресценцию.
Подсчет митохондриального потенциала (Δψ) в популяции клеток осуществляют по формуле:
Δψ =R/G
Δψ – потенциал митохондриальной мембраны;
R - количество клеток с флуоресценцией в красной области спектра (окрашивание красителем jc-1 митохондрий клетки);
G - количество клеток с флуоресценцией в зеленой области спектра (окрашивание мономерной формы красителя jc-1 цитоплазмы клетки).
Согласно полученным данным (Фиг.7 - Фиг.8), митохондриальный потенциал необработанных МСК-реципиентов (контрольные клетки) через 24 часа составил 2,56±0,4 о.е., через 2 дня – 5,87±0,4 о.е., через 4 дня – 3,47±0,5 о.е. Митохондриальный потенциал МСК-реципиентов через 24 часа после обработки их МВ-ЦВ МСК (опыт) составил 3,59±0,5 о.е., через 2 дня – 7,39±0,3 о.е., через 4 дня – 6,77±1,5 о.е.
Митохондриальный потенциал необработанных клеток-реципиентов Фб (контрольные клетки) через 24 часа составил 1,52±0,6 о.е., через 2 дня – 4,61±0,2 о.е., через 4 дня – 3,43±0,4 о.е. Митохондриальный потенциал клеток-реципиентов Фб через 24 часа после обработки их МВ-ЦВ МСК(опыт) составил 2,69±0,4 о.е., через 2 дня – 7,49±0,8о.е., через 4 дня – 6,91±0,6 о.е.
Митохондриальный потенциал необработанных клеток-реципиентов A549 (контрольные клетки) через 24 часа составил 0,81±0,1 о.е., через 2 дня – 1,49±0,2 о.е., через 4 дня – 2,02±0,1 о.е. Митохондриальный потенциал клеток-реципиентов A549 через 24 часа после обработки их МВ-ЦВ МСК (опыт) составил 1,11±0,1 о.е., через 2 дня – 3,16±0,2 о.е., через 4 дня – 2,56±0,2 о.е.
Увеличение митохондриального потенциала в процессе роста культуры, который наблюдался во всех культурах клеток-реципиентов с течением времени (24 часа - 4 дня) (Фиг. 7-8), вероятно, связано с логарифмическим ростом культуры после пересева в культуральную чашку, сопровождающимся увеличением метаболической активности [11 – Miettinen, T.P. Cellular Allometry of Mitochondrial Functionality Establishes the Optimal Cell Size. Dev Cell, 2016. V.39, P.370-382.]. На фоне естественного увеличения митохондриального потенциала в культурах клеток-реципиентов, обработка МВ-ЦВ МСК привела к статистически значимому увеличению митохондриального потенциала в клетках-реципиентах на всех сроках наблюдения (p <0,05) (Фиг. 7).
Таким образом, заявителем показано, что МВ-ЦВ МСК содержат функционально активные митохондрии, которые могут быть доставлены в клетки-реципиенты. При этом доставка митохондрий с помощью МВ-ЦВ МСК в клетки-реципиенты с равным и пониженным митохондриальным потенциалом приводит к увеличению митохондриального потенциала в клетках-реципиентах. При этом не наблюдается образования опухоли, что свидетельствует о безопасности применения МВ-ЦВ МСК на основе везикул клеток человека.
Полученный после завершения четвертого этапа продукт является мембранными везикулами, индуцированными цитохалазином В, содержащими функционально активные митохондрии, обладающие повышенной (по сравнению с аналогами) эффективностью действия при применении по назначению, а также отвечающие критерию биобезопасности, так как являются естественными клеточными образованиями.
Так, получением заявляемых мембранных везикул, индуцированных цитохалазином В, содержащих функционально активные митохондрии, завершают четвертый, заключительный этап осуществления заявленного технического решения. Полученные везикулы применялись заявителем непосредственно после получения.
Основываясь на изложенном, возможно сделать вывод в целом, о том, что получены подтвержденные опытами данные, доказывающие эффективность применения индуцированных цитохалазином В мембранных везикул МСК, содержащих функционально активные митохондрии, а именно доказан факт увеличения митохондриального потенциала у клеток-реципиентов МСК, фибробластов и А549 in vitro (Фиг.7). Количественное соотношение представлено на Фиг.8.
Мембранные везикулы МСК человека принципиально не способны к делению и образованию опухоли, что является неопровержимым доказательством, по мнению заявителя, соответствия заявленного технического решения критерию «неочевидность» для специалистов данной области.
Кроме того, на дату регистрации заявки мембранные везикулы мультипотентных стромальных клеток, содержащие митохондрии, находятся на стадии дальнейших испытаний, однако уже на данной стадии исследований возможно констатировать факт того, что мембранные везикулы мультипотентных стромальных клеток обладают способностью увеличивать митохондриальный потенциал in vitro (Фиг.7). При этом, в отличие от известных технических решений, мембранные везикулы клеток человека, полученные с помощью цитохалазина В, несут в своем составе биоактивные молекулы, оказываются защищены цитоплазматической мембраной от негативного воздействия внеклеточных ферментов и их количество заметно превышает количество естественно выделяемых клетками везикул. При этом мембранные везикулы МСК не несут риска опухолевого образования, что приводит к увеличению эффективности применения по назначению заявленного технического решения. Кроме того, МВ-ЦВ МСК человека обладают способностью осуществлять целенаправленную доставку в клетки-реципиенты своего содержимого, так как в их оболочке присутствуют специфические рецепторы, обеспечивающие распознавание и целевую доставку.
Заявленное техническое решение представляется возможным реализовать в другом варианте, а именно, выполняя указанные выше действия, препарат везикул клеток человека хранят и применяют по мере надобности. Препарат везикул клеток человека сохраняет свою целостность и эффективность при хранении. Таким образом, препарат везикул клеток человека отвечает критерию «промышленная применимость», предъявляемого к изобретениям.
Полученные по приведенному примеру МВ-ЦВ МСТ могут быть применены для лечения заболеваний человека и животных. МВ-ЦВ МСТ, полученные с использованием заявленного технического решения, могут быть применены в лечебных целях по конкретному назначению, а именно для лечения митохондриальных заболеваний или заболеваний, следствием которых является нарушение митохондриальной функции, что обеспечит лечебный эффект, например – путем непосредственного введения мембранных везикул клеток человека (трансплантации) пациенту.
В качестве клеточного материала для производства мембранных везикул человека используют клетки, обладающие повышенным митохондриальным потенциалом. Данному условию отвечают мультипотентные стромальные клетки. Известно, что стромальные клетки положительно влияют на процессы регенерации с замещением утраченных клеток организма, а также с паракринной стимуляцией соседних клеток. Заявленное техническое решение применения МВ-ЦВ МСК сочетает в себе все положительные свойства МСК, не способно к размножению и образованию опухоли, и при этом обладает достаточной эффективностью действия по назначению, так как заключенные внутри мембранных везикул митохондрии защищены липидным бислоем мембраны от разрушающего воздействия литических ферментов, указанный факт также является неочевидным для специалистов и дополнительно является доказательством наличия изобретательского уровня (неочевидности).
заявителем достигнуты все поставленные цели и заявленный технический результат
Таким образом, из описанного выше можно сделать вывод, что , а именно:
1 - применены  безопасные, эффективные при использовании, неиммуногенные мембранные везикулы мультипотентных стромальных клеток, индуцированные цитохалазином В, которые несут в своем составе функционально активные митохондрии и мало экспрессируют либо вовсе не экспрессируют молекулы главного комплекса гистосовместимости;
2 - доставлены функционально активные митохондрии, находящиеся внутри МВ-ЦВ МСТ, и защищенные цитоплазматической мембраной от внешних факторов внеклеточной среды, что увеличивает срок жизни митохондрий и, как следствие, повышает эффективность действия фармацевтической композиции по назначению;
3 - повышена эффективность действия по назначению, увеличена скорость действия и точность дозирования МВ-ЦВ МСТ благодаря внутривенному введению;
4 - получены мембранные везикулы из мультипотентных стромальных клеток млекопитающих, не содержащие каких-либо токсинов и не характерных для животной клетки компонентов;
5 - достигнута замена клеточной терапии на везикулярную терапию, что позволит избежать угрозы неограниченного деления и опухолевой трансформации;
6 - применено высокоэффективное, конкурентоспособное, импортозамещающее средство нового поколения, которое не требует значительного временного интервала, не требует использования специального дорогостоящего оборудования;
7 - получены мембранные везикулы мультипотентных стромальных клеток, содержащие функционально активные митохондрии и подтверждено их наличие в составе мембранных везикул.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как при определении уровня техники не обнаружены технические решения, которым присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в независимом пункте формулы изобретения.
Заявленный способ удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, по приведенным выше основаниям, поскольку из исследованного уровня техники не выявлены технические решения, имеющие признаки, совпадающие с существенными признаками заявленного технического решения и обеспечивающие реализацию поставленных целей, посредством применения заявленной совокупности признаков в соответствии с приведённой формулой. При этом по мнению заявителя заявленное техническое решение не является очевидным для специалиста вследствие того, что заявленное техническое решение не является известным для специалистов в исследуемой области техники.
Заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, т.к. его возможно реализовать в промышленном производстве мембранных везикул, выделенных из клеток человека, и применять заявленное техническое решение в деятельности организаций здравоохранения и ветеринарии посредством использования известных стандартных технических устройств и оборудования.
Источники информации
1. Патент № WO2018140726.
2. Патент № US2018036344.
3. Zhu, M. et al., Mitochondria Released by Apoptotic Cell Death Initiate Innate Immune Responses. Immunohorizons, V.11: p. 384-397.
4. Патент № IL247447.
5. Патент № KR20190026045.
6. Патент № SG11201901689Y.
7. Islam, M. N. et al., Mitochondrial transfer from bone-marrow-derived stromal cells to pulmonary alveoli protects against acute lung injury. Nat Med, 2012. V.18: p. 759-765.
8. Патент № RU2605853.
9. Pick, Н. et al., Investigating Cellular Signaling Reactions in Single Attoliter Vesicles. JACS, 2005. V.127: p. 2908–2912.
10. Fu, D. et al., Monitoring the Effects of Pharmacological Reagents on Mitochondrial Morphology. Current Protocols in Cell Biology, 2018. V.79: p. 34-37.
11. Miettinen, T.P. Cellular Allometry of Mitochondrial Functionality Establishes the Optimal Cell Size. Dev Cell, 2016. V.39, P.370-382.
12. Yumoto, K. et al., A novel method for monitoring tumor proliferation in vivo using fluorescent dye DiD. Cytometry A, 2014. V.85, №6: p. 548-555.