Роль липидов при действии абсцизовой кислоты в колеоптилях кукурузы

2005 ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА. Сер. 3. Вып. 1

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 581.1

Н. Ф. Синютина, Е. Д. Коузова

РОЛЬ ЛИПИДОВ ПРИ ДЕЙСТВИИ АБСЦИЗОВОЙ КИСЛОТЫ В КОЛЕОПТИ-ЛЯХ КУКУРУЗЫ

Участие гормонов в регуляции жизнедеятельности растений поддерживает постоянный интерес к механизмам их действий. Вместе с тем в последние десятилетия широко исследуется биоэффекторная функция липидов, их участие в регуляции и трансдукции клеточных сигналов. Начало таким исследованиям было положено открытием роли метаболитов фосфотидилинозитольного цикла в качестве вторичных мессенджеров при передаче сигналов в клетках животных, а позднее аналогичное действие было обнаружено и в растениях [10, 7].

В настоящее время появилось множество данных о включении в сигнальные каскады липидов с участием фосфолипаз А2, С и D. В этот круг входят не только фосфоинозити-ды, но и фосфатидилхолины, лизофосфатйдилхолины, фосфатидилэтаноламины, фосфа-тидная кислота, диацилглицериды, а также полиненасыщенные жирные кислоты и продукты их липоксигенирования и сфинголипиды [3].

Сигнальные системы клеток в первую очередь изучались на животных объектах, но большинство из них существует и в растениях, хотя знания о последовательности рецепции и трансдукции сигнала в последних до сих пор фрагментарны [16].

Активно исследуются механизмы действия абсцизовой кислоты (АБК), которая тормозит рост [13]. Показано, что в трансдукции данного гормонального сигнала принимают участие такие ферменты, как протеинкиназы, фосфатазы, МАП-киназы и фосфолипазы А2, С и D, а также ионы Са2+.

Действие АБК осуществляется, по мнению М. Халуина [12], через каскад реакций, запущенных фосфолипазой Р, что выражается в увеличении содержания фосфатидной кислоты и снижением содержания других фосфолипидов. Считают, что стимуляция фосфолипазы D происходит через экспрессию ДЛ£-генов. Г. Шерер [20] полагает, что активируется фосфолипаза С. Поскольку фосфолипазы С и D, Са2+-зависимые, то, возможно, . имеет место разветвление каскадов [21], к тому же известно, что АБК повышает концентрацию ионов Са2+. Эти работы проведены на устьичных клетках ячменя и гороха [19].

И. А. Гущина и соавторы отмечают изменение жирнокислотного состава и скорости включения 214С-ацетата в липиды мхов при действии АБК [11]. Другие исследователи полагают, что АБК запускает экспрессито генов, связанных с кетоацилсинтетазой (КАС), с десатуразами и элонгазами [18]. Если раньше жирные кислоты рассматривали, как элементы, обеспечивающие целостность и функциональность мембран [8], то сейчас обращают внимание и на их роль в клеточной регуляции особенно полиненасыщенных жирных кислот, как вторичных мессенджеров при активации фосфолипазы Аг

© Н.Ф. Синютина, Е.Д. Коузова, 2005

АБК влияет на перекисное окисление липидов (ПОЛ)..Некоторые авторы считают, что АБК может запустить липоксигеназную сигнальную систему [2].

И тем не менее работ, связанных с механизмом действия АБК и роли липидных молекул, не так и много. Кроме того, некоторые данные весьма противоречивы. Поэтому в своей работе мы задались целью изучить метаболизм липидов как один из ключевых моментов в ответе организма на действие АБК, а также проверить, какие из сигнальных систем растений, связанных с липидами, работают при действии данного гормона. Так как объектом исследования выбраны колеоптили кукурузы, то прежде всего нас интересовало действие АБК на ростовые процессы. В связи с этим определили содержание и соотношение отдельных фосфолипидов. На основании данного анализа можно сделать заключение об изменении активности ряда липаз при действии АБК.

Материалы и методы. В работе использовали 4-дневные этиолированные отрезки колеоп-тилей кукурузы (гибрид НАРД-150). В опытах по изучению метаболизму отрезки инкубировали в воде с 2l4C-aueTaTOM-Na (концентрация 4мкКи на 10мл ) в течение одного часа в термостате при температуре 27 "С, в опытном варианте добавляли АБК (10"4М). Выделение мембранных фракций проводили стандартным методом [5]. Мембранные липиды выделяли по Кейтсу [4], для определения жирнокислотных конъюгатов липиды экстрагировали по Фолчу [6]. Тонкослойную хроматографию липидов проводили ранее опубликованным способом [6]. Количество нейтральных липидов определяли по Аменту, фосфолипиды — по Герляху [5j, содержание конъюгатов жирных кислот — по Клейну [15]. Удельную радиоактивность липидов регистрировали с использованием сцинтилляционного счетчика Beckman LS-100 [14), белок определяли по Бредфорду [9].

Результаты и их обсуждение. Данные по включению 2|4С-ацетата-Ыа в нейтральные липиды представлены в таблице. Наиболее активно 214С-ацетат-№ включается в жирные кислоты (УА их в митохондриях 17158 имп мир"1мг_| и в микросомах 6811 имп-мин"' мг"1). Уровень радиоактивности этих липидных фракций возрастает при действии АБК в наибольшей степени в митохондриях, подобная картина была получена при действии ИУК [2]. Стерины и триацилглицериды имели уровень радиоактивности в 2,5-3 раза ниже жирных кислот, а при действии АБК удельная радиоактивность триацилглицеридов возрастала на 56% в митохондриях и на 33% в микросомах. Аналогичные данные получены Гущиной на мхах [11]. Высокий уровень удельной радиоактивности жирных кислот, с одной стороны, связан с особенностями радиоактивного предшественника, известно, что ацетат на 80% включается в жирные кислоты, с другой — их возможной функциональной ролью. Возрастание удельной радиоактивности жирных кислот при действии АБК, вероятно, связано с активацией КАС, что приводит к усилению- их синтеза de novo, а также активацией элонгаз и удлинением углеводородной цепочки [18].

Наряду с этим в работе определяли ПОЛ при одночасовой инкубации с АБК. Известно, что липоксигенирование начинается с освобождения жирных кислот из липидных молекул, и первая реакция окисления свободных жирных кислот связана с образованием конъюгированных связей [13]. Содержание первичных продуктов окисления и было взято за критерий уровня окисления жирных кислот липидов. Из рис. 2 видно, что при действии АБК возрастало количество диеновых конъюгатов жирных кислот (А,=232 нм) и дальнейших продуктов окисления (триеновых конъюгатов и кетопроизводных жирных кислот) (?i-274 нм) на 37 и 21 % соответственно. Эти данные свидетельствуют о запуске липоксигеназной сигнальной системы при действии АБК. Вместе с тем дальнейший анализ фосфолипидов (рис. 2) убеждает нас, что АБК ведет к возрастанию и лизофосфолипидов. Известно, что АБК активирует фосфолипазу А2, что определяет возрастание лизофосфолипидов и свободных жирных кислот, однако уровень последних не изменялся. И этот факт объясняется тем, что хотя и активируется синтез жирных кислот, но возрастает их липоксигенирование, о-чем свидетельствуют наши данные по возрастанию уровня конъюгатов жир-

Содержание и удельная радиоактивность (УА) нейтральных липидов мембранных фракций колеоптилей кукурузы

Митохондрии Микросомы

Фракция липидов Контроль АБК Контроль АБК '

Мг лип/10 г колеоптилей УА Мглип/10 г колеоптилей УА Мг лип/10 г колеоптилей УА Мглип/10 г колеоптилей УА

Стерииы 0/1310,01 36801772. 0,1710,03 31911704 0,2110,07 24831642 0,2610,06 20941392

ЖК 0,14±0,02 17158+2603 0,1310,02 25577131^5 0,1210,2 .68111634 0,1310,02 74491702

ТАГ ОДНО,02 53981918 0,1710,03 84361917 0,09610,01 27491245 . 0,1210,02 36691372

Эфиры стеринов 0,1210,02 23971423 0,1410,02 24771397 0,1210,02 12331202 0,1410,03 14301206

Примечание. ЖК — жирные кислоты, ТАГ — триацилглицериды, УА — имп-мин"'-мг~!.

Диеновые конъюгаты жк

Триеновые конъюгаты и кето производи ы е

Рис. 1. Изменение уровня коньюгатов жирных кислот липйдов при действии абсцизовой .

кислоты.

ных кислот. Процессы синтеза и распада жирных кислот создают динамическое равновесие, поэтому количественное содержание жирных кислот остается на одном уровне.

Изучая далее фосфолипиды, мы обнаружили, что содержание общих фосфолипидов под действием АБК практически не изменяется, а удельная радиоактивность незначительно возрастает, особенно во фракции микросом^то увеличение включения 214-С-ацетата-Ыа в фосфолипиды вызвано, вероятно, потребностью стабилизировать состояние мембран, так как АБК вызывает активацию липаз. ' .

Большой интерес представляют количественные, изменения отдельных мембранных фосфолипидов. Разделение фосфолипидов на фракции методом тонкослойной хроматографии и дальнейшее определение их количества позволило нам обнаружить, что основными фосфолипидами являются фосфатидилэтаноламин и фосфатидилхолин (см. рис. 2).

19%

25%

32%

43%

16%

4 23%

ШФИ+ФС ВФХ ПФЭА ШФК Микросомы

18%

19%

32%

27%

12%

15%

26%

Пластиды

12%

18%

23%

23%

24%

13%

16%

39%

12%

20%

ФИ+ФС №ФХ ПФЭА ШФК Митохондрии

лизо-ФЛ

Рис. 2. Соотношение мембранных фосфолипидов в норме (/) и при действии АБК (II).

АБК значительно изменяет соотношение фосфолипидов мембранных фракций колеопти-лей кукурузы. Фосфатидилхолин снижается во фракциях пластид, митохондрий и микро-сом. Фосфатидилэтаноламин- снижался во фракциях пластид и микросом. Суммарная фракция фосфоинозитидов и фосфатидилсерина под действием АБК уменьшалась в пластидах, митохондриях и микросомах. Фосфатидная кислота, напротив, возрастала в пластидах, митохондриях и микросомах. Доля лизофосфолипидов возрастала в пластидах.

Большой интерес представляют данные по накоплению фосфатидной кислоты и сни-/жению содержания других фракций фосфолипидов при действии АБК (см. рис. 2). Этот

факт свидетельствует об активации фосфолипазы D и участии фосфатидной кислоты как вторичного мессенджера при передаче гормонального сигнала [17].. По литературным данным [14], активация этого фермента наступает через 2,5-7,5 мин, а ее эффект, т.е. изменение содержания фосфолипидов, происходит через один час. что и подтверждают наши результаты, полученные на колеоптилях .кукурузы. Нами была проведена серия опытов с 10-минутной инкубацией с АБК, но изменений в соотношении фосфолипидов не было обнаружено. Вероятно, к этому сроку изменяется только активность фермента, не затрагивая еще субстрат. Кроме того, наши результаты позволяют полагать, что активируемая АБК фосфолипаза D является не специфичной, так как она действовала на все фракции фосфолипидов.

Комплексное исследование жирных кислот, включающее анализ их метаболизма (синтез и распад), позволило нам выявить роль липоксигеназной системы при действии АБК. Определение содержания основных фосфолипидов показало, что при действии АБК увеличивается содержание лизофосфолипидов и особенно фосфатидной кислоты, но уменьшается содержание других фракций фосфолипидов. Этот факт лег в основу нашего предположения об усилении акивности фосфолипаз А, и D: поскольку, с одной стороны, при действии фосфолипазы А2 высвобождаются ненасыщенные жирные кислоты, которые далее подвергаются окислению; с другой стороны, происходит активация фосфолипазы D, которая приводит к образованию фосфатидной кислоты и снижению содержания других фракций фосфолипидов.

На основании вышесказанного мы можем сделать вывод, что при действии АБК на колеоптили кукурузы включаются фосфатидная и липоксигеназные сигнальные системы.

Статья рекомендована проф. С. С. Медведевым. Summary

Sinyutina N. F., Coasova E. D. Role of lipids under effect abscisic acid of maize coleoptiles.

It was shown, that ABA increases the inclusion of 2C14-acetate-Na in the fatty acids and triacilglicerols of mitochondria and microsomes.

ABA increases the dyen-and trien-conjugates of fetty acids. That hormone increases of phosphatidic acid and decreases other phospholipids. ABA is bound with phosphatidat and eipoxigenase signaling other systems of plant cells.

Литература

1. Волошина Т. В., Синютина Н. Ф., Полевой В. В. Влияние ауксина на липидный обмен мембранных фракций отрезков колеоптилей кукурузы / / Биол. науки. 1988. Т. 9. С. 90—93. 2. Гречкин А. Н., Тарчевский И. А. Липоксигеназная сигнальная система // Физиология растений. 1999. Т. 46., №1. С. 132-142. 3. Дятловицкая Э. В., Безуглов В. В. Липиды как биоэффекторы. Введение / / Биохимия. 1998. Т. 63. Вып. 1. С. 3-5. 4. Кейтс М. Техника липидологии. М., 1975. 5. Методы изучения мембран растительных клеток / / Учебное пособие / Под ред. В. В. Полевого, Г. Б. Максимова, Н. Ф. Синютиной. Л., 1986. 6. Синютина И. Ф., Толстикова Т. Д., Швеи, В. И. Выделение и фракционирование липидов колеоптилей кукурузы // Физиология растений. 1978. Т. 25. Вып. 3. С. 610-613. 7. Синютина Н.^Ф., Полевой В. В. Изменение фосфорилирования фосфолипидов под действием ИУК // Физиология растений. 1995. Т. 42. Вып. 6. С. 828-833. 8. Синютина И. Ф. Роль жирных кислот липидов в адаптации проростков кукурузы к тепловому стрессу // Вестн. С.-Петерб. ун-та. 1998. Сер. 3. Вып. 2. С. 85-89. 9. Bradford М. М. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of perotein utilizing the principle of protein-dye binding / / Anal. Biochem. 1976. Vol. 72, N1 /2. P. 248-254.10. Drobak В. K. The plant phosphoinositide system // Biochem. J. 1992. N288. P. 697-712.11. Gushina I. A., John L. Abscisic acid modifies the changes in lipids brought about by water stress Atrichum androgynum / / New phytologist. 2002. Vol.

156. P. 255-264. 12. Hallouin M., GhelisT. Plasmalemma abscisic acid perception leads to RAB18 expression via phosholipase D activation in arabidopsis suspension cells // Plant. Physiol. 2002. Vol. 130. P. 265-272.13. Himmelbach A. Signaling of abscisic acid to regulate plant growth /"/ The Royal ; Society. 1998. Vol. 353. P. 1439-1444.14. Jacob T., Rithe S. and Gilroy S. Abscisic acid signal transduction in guard cells is mediated by phospholipase D activity // Plant Biol. 1999. Vol. 96, N21. P. 12192-12197.15. Klein R. A. The detection of oxidation in liposome preparation / / Biochim. Biophys. Acad.1970. Vol. 170 (210). P. 486-489.16. Munnik, T., Irvine R. F., Musgrave A. Phospholipid signaling in plants // Biochim. Biophys. Acta 1998.Vol. 1389. P. 222-272.17. Munnik T. Phosphatidic acid: an emerging plant lipid second messenger // Trends in Plant Science. 2001. Vol. 6, N5. P. 227-233.18. Qi Q., Rose P., Abrams GTaylor D., Abrams S. (+)-. Abscisic acid matabolism, 3- ketoacyl-Coenzyme A synthase gene Expression, and very-long-chain monounsaturated fatty acid biosyntheses in Brassica napus embryos // Plant. Phisiol. 1998. Vol. 117. P. 979-987. 19. Rithe S., Gilroy S. Abscision acidstimulation phospholipase D-activity in the barley aleurone is G-protein-mediated and localizated to the plasma membrane // Plant. Physiol. 2000. Vol. 124. P. 693-702. 20. Scherer G. F. E. Guard cell abscisic acid signaling and engineering drought hardiness in plants / / Nature. 2001. Vol. 171. P. 327-330. 21. Wang X., Wang C. Networking of phospholipases in signal transduction / / Physiol. Plantarum. 2002. Vol. 115. P. 331-335.

CtaTbH nocTynmia b peaaKUHio 17 okth6ph 2004 r.