СПОСОБ ПОДГОТОВКИ НЕМАТОД ДЛЯ МОРФОЛОГИЧЕСКОГО И ГИСТОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
METHOD FOR NEMATODE PREPARATION FOR MORPHOLOGICAL AND HISTOLOGICAL EXAMINATION

Изобретение относится к ветеринарной медицине, и биологии, в частности к гистологической технике, и может быть использовано для изготовления гистологических препаратов нематод (круглых гельминтов) при проведении научных морфологических исследований в ВУЗах и НИИ ветеринарного и биологического профиля.
В настоящее время в нашей стране и за рубежом используется стандартный способ изготовления гистологических препаратов, который не изменился за последние 60 лет (Роскин Г.И. Микроскопическая техника. Изд-во «Наука», М., 1951, 447 с., Семченко В.В., Барашкова С.А., Ноздрин В.П., Артемьев В.Н. Гистологическая техника - 3-е изд. - Омск - Орел, 2006. - 290 с.). Стандартная схема изготовления гистологических препаратов при использовании заливки в парафин обязательно включает следующие операции.
1. Фиксация гистологического материала (кусочков различных органов и тканей). Для фиксации чаще всего используют нейтральный или забуференный раствор формалина.
2. Промывка фиксированного материала в проточной воде.
3. Обезвоживание с помощью батареи спиртов возрастающей концентрации (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% и 100% этанол).
4. Пропитывание в хлороформе (или бензоле, толуоле).
5. Пропитывание в смеси хлороформа (или бензола, толуола) и парафина в термостате при 37 градусах.
6. Пропитывание расплавленным парафином в термостате при 56 градусах и заливка в парафин. Время экспозиции во всех предыдущих операциях зависят от размеров кусочков органов.
Также известен способ подготовки биологического материала для морфологического и гистологического исследования, включающий фиксацию исследуемого материала смесью 70% этилового спирта с 10% нейтральным формалином, его обезвоживание в спиртах, заливку смесью равных частей касторового масла и целлоидина, промывку материала от касторового масла, пропитку парафином посредством термостатирования и дополнительную заливку парафином (Г.А. Меркулов, Курс патологогистологической техники, Изд-во «Медицина», 1969 г., с.60-61 - прототип).
Недостатками известных технических решений являются - длительность процесса изготовления препаратов из-за продолжительного времени фиксации, подбора батареи спиртов возрастающей концентрации для обезвоживания и недостаточный срок хранения без изменения гистологических структур исследуемого материала, а также отсутствие возможности качественного морфологического и гистологического исследования срезов нематод, организм которых состоит из дыхательной, пищеварительной и других систем, состоящих из разного вида тканей, насыщенных жидкостью, что препятствует изготовлению качественных срезов, для исследования которых требуются разные смеси для фиксации и методы обезвоживания.
Техническим результатом является сокращение срока, повышение срока хранения без изменения гистологических структур исследуемого материала и качество окраски ткани исследуемого материала для исследований.
Технический результат достигается тем, что в способе подготовки нематод для морфологического и гистологического исследования, включающем фиксацию исследуемого материала смесью этилового спирта с 10% нейтральным формалином, его обезвоживание в спиртах, заливку смесью равных частей касторового масла и целлоидина, промывку материала от касторового масла, пропитку парафином посредством термостатирования и дополнительную заливку парафином, согласно изобретению в качестве исследуемого материала используют нематоды, фиксирующая смесь дополнительно содержит хлорид натрия в количестве не более 1 г на 100 мл смеси, при этом используют 70% этиловый спирт и берут его с 10% нейтральным формалином при следующем соотношении: 9:1, при этом фиксацию осуществляют в течение 3-4 часов, обезвоживание проводят пятикратно 96% этиловым спиртом и заливку исследуемого материала смесью касторового масла и целлоидина выдерживают в течение 10-12 часов.
Новизна заявляемого способа заключается в том, что использование новой совокупности признаков, а именно: фиксирующая смесь, содержащая хлорид натрия в количестве не более 1 г на 100 мл смеси, 70% этиловый спирт и 10% нейтральный формалин, взятые соответственно при соотношении: 9:1, обезвоживание которое проводят пятикратно 96% этиловым спиртом; осуществление фиксации в течение 3-4 часов и заливка исследуемого материала смесью касторового масла и целлоидина, которую выдерживают в течение 10-12 часов, обеспечивает сокращение срока и повышение качества подготовки нематод для морфологического и гистологического исследования за счет исключения набухания и сморщивания тканей исследуемого материала, а также увеличение срока хранения без изменения гистологических структур исследуемого материала. Причем следует отметить, что, по заключению паразитологов, заявляемый способ применим для исследования всех видов нематод, вызывающих болезни как у растений, так у животных и человека, например Dirofilaria immitis, Dirofilaria repens - вызывают дирофиляриоз, геманхоз у животных и человека; Askaridia suis - вызывает заболевание у свиней - аскаридоз и гетерокидоз. Качественно полученный срез нематод позволяет точно описать новые виды нематод и точнее определить вид или класс, к которому они относятся, а значит, появляется возможность более точно определить метод лечения болезней, вызываемых нематодами.
Предлагаемый способ работоспособный, воспроизводимый и нашел применение в ветеринарной медицине, в частности используется на кафедре анатомии Кубанского агроуниверситета и в лаборатории гистологии Краснодарского ветеринарного НИИ, что отвечает критерию охраноспособности «промышленная применимость».
По данным научно-технической и патентной литературы не обнаружена аналогичная совокупность признаков, позволяющая достигать технический результат, получаемый заявленным способом, что позволяет утверждать о наличии «изобретательского уровня».
Сущность изобретения поясняется иллюстрирующим материалом, где на фото 1 представлен окрашенный срез нематоды, полученный стандартным способом подготовки; на фото 2 представлен окрашенный срез нематоды, полученный заявляемым способом подготовки.
Способ подготовки нематод для морфологического и гистологического исследования осуществляется следующим образом.
Для исследования были отобраны нематоды вида Dirofilaria immitis, в половозрелой стадии, имеющие размер от 8 см до 24 см. Для опыта были отобраны особи размером от 1 до 2 (см).
Для подготовки нематод предварительно их помещают в фиксирующую смесь, состоящую из 70% этилового спирта с 10% нейтральным формалином, взятых в соотношении 9:1 и 1 г хлорида натрия на 100 мл смеси на 3-4 часа. Количество компонентов, входящих в состав смеси, обусловлено следующим: при использовании 70% этанола происходит не такое резкое сжатие белковых молекул, как при использовании 96% этилового спирта. С целью смягчения действия этанола добавляют 10% нейтральный формалин, который способствует физико-химическому процессу сжатия материала, потом набухания и затем вторичного сжатия, для того чтобы обеспечить баланс действия этанола и формалина, их берут в соотношении 9:1, при нарушении этого соотношения, например, если этанола будет больше, то будет большее количество не восстановленных молекул белков, а при меньшем количестве не будет осуществляться достаточное осаждение белков, что касается количества формалина, то при большем его количестве будут происходить необратимые процессы, приводящие к разрушению молекул, при меньшем количестве - будет происходить не полноценный физико-химический процесс. Таким образом, нарушение соотношения между этанолом и формалином приведет к не качественному приготовлению тканей нематод. Добавление в фиксирующую смесь хлорида натрия в количестве 1 г обеспечивает равномерную диффузию этанола с формалином в толщу материала, обеспечивая осмотическое давление, аналогичное прижизненному, сохраняя при этом физико-химические свойства ткани. При количестве меньше или больше 1 грамма нарушается равномерность диффузии, что ухудшает качество ткани. Кроме того, использование такого состава фиксирующей смеси обеспечивает возможность проводить фиксацию в более короткие сроки в течение 3-4 часов, что доказано экспериментально. При фиксации более 3-х часов уже сохраняются ткани и клетки прижизненного строения нематод, содержание и локализация химических веществ. После фиксации проводят промывку нематод от различных осадков фиксирующей смеси и пятикратное обезвоживание исследуемого материала 96% этиловым спиртом. Обезвоживание проводят в пяти чистых высушенных емкостях, заполненных 96% этиловым спиртом. Экспериментально доказано, что нет необходимости использовать батарею спиртов с повышающей концентрацией для обезвоживания нематод, ткани которых насыщены жидкостью, именно пятикратное использование 96% этилового спирта обеспечивает качественное обезвоживание, а при меньшем количестве происходит недостаточное обезвоживание, а при большем - происходит сморщивание. Далее исследуемый материал заливают смесью равных частей касторового масла и целлоидина, выдерживают в течение 10-12 часов. Использование касторового масла обеспечивает долгосрочное хранение без изменения гистологических структур исследуемого материала. Затем осуществляют промывку материала от касторового масла, пропитку парафином посредством термостатирования и дополнительную заливку парафином. После процесса заливки парафином делают срез нематод специальным режущим инструментом, например микротомом.
В условиях научно-исследовательской лаборатории кафедры анатомии Кубанского агроуниверситета проводились опыты по подготовке нематод для гистологических исследований разными способами. В результате научных исследований выяснилось, что срез (фото 2), полученный из нематод, подготовленных предложенным способом, оказался более четким, чем срез (фото 1), полученный из нематод, подготовленных стандартным способом подготовки.