КОМБИНАЦИИ ЭЛЕМЕНТОВ ЭКСПРЕССИОННОГО ВЕКТОРА, НОВЫЕ СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОК-ПРОДУЦЕНТОВ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ

1. Способ селекции рекомбинантных клеток млекопитающих, включающий следующие этапы:
a) трансфекция клеток млекопитающего экспрессионным вектором, содержащим
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и последовательность терминатора hGT,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и последовательность терминатора hGT, и
таким образом, получение множества рекомбинантных клеток млекопитающего,
b) селекция из множества рекомбинантных клеток млекопитающего (единичных) рекомбинантных клеток млекопитающего.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
3. Способ по любому из пп. 1 или 2, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в одном направлении для селекции стабильно трансфецированных клеток.
5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в разных направлениях для селекции кратковременно трансфецированных клеток.
6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты и селекционный маркер расположены в одном направлении.
8. Способ по п. 6, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты расположены в последовательности LC-HC-SM.
9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетки млекопитающих выбраны из клеток CHO, HEK, BHK, NS0 и клеток SP2/0.
10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки CHO для селекции стабильно трансфецированных клеток.
11. Способ по п. 1, отличающийся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки НЕК для селекции кратковременно трансфецированных клеток.
12. Способ получения антитела, включающий следующие этапы:
a) культивирование клеток млекопитающих, содержащих
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора, и
b) получение антитела из клетки или культуральной среды.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
14. Способ по любому из п.п. 12-13, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
15. Способ по п. 12, отличающийся тем, что первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в одном направлении для стабильной продукции антитела.
16. Способ по п. 12, отличающийся тем, что первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в разных направлениях для кратковременной продукции антитела.
17. Способ по п. 12, отличающийся тем, что экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты и селекционный маркер расположены в одном направлении.
19. Способ по п. 17, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты расположены в последовательности LC-HC-SM.
20. Способ по п. 12, отличающийся тем, что клетки млекопитающих выбраны из клеток CHO, HEK, BHK, NS0 и клеток SP2/0.
21. Способ по п. 12, отличающийся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки CHO для стабильной продукции антитела.
22. Способ по п. 12, отличающийся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки HEK для кратковременной продукции антитела.
23. Экспрессионный вектор, содержащий
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор hCMV, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность и hGT последовательность терминатора.
24. Экспрессионный вектор по п. 23, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
25. Экспрессионный вектор по любому из пп. 23 или 24, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
26. Экспрессионный вектор по п. 23, отличающийся тем, что первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в одном направлении для селекции стабильно трансфецированных клеток.
27. Экспрессионный вектор по п. 23, отличающийся тем, что первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в разных направлениях для селекции кратковременно трансфецированных клеток.
28. Экспрессионный вектор по п. 23, отличающийся тем, что экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер.
29. Экспрессионный вектор по п. 28, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты и селекционный маркер расположены в одном направлении.
30. Экспрессионный вектор по п. 28, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты расположены в последовательности LC-HC-SM.
31. Способ селекции рекомбинантных клеток млекопитающих, содержащий следующие этапы:
a) трансфекция клеток млекопитающих при помощи экспрессионного вектора, содержащего
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела и bGH поли(А)-сигнальную последовательность,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и
таким образом, получение множества рекомбинантных клеток млекопитающих,
b) селекция из множества рекомбинантных клеток млекопитающих (единичных) рекомбинантных клеток млекопитающих.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
33. Способ по любому из пп. 31 или 32, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
34. Способ по п. 31, отличающийся тем, что первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в одном направлении для селекции стабильно трансфецированных клеток.
35. Способ по п. 31, отличающийся тем, что первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в разных направлениях для селекции кратковременно трансфецированных клеток.
36. Способ по п. 31, отличающийся тем, что экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер.
37. Способ по п. 36, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты и селекционный маркер расположены в одном направлении.
38. Способ по п. 36, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты расположены в последовательности LC-HC-SM.
39. Способ по п. 31, отличающийся тем, что промотор фактора элонгации человека 1 альфа содержит интрон А.
40. Способ по п. 31, отличающийся тем, что экспрессионный вектор не содержит какие-либо последовательностей терминатора транскрипции.
41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что последовательность терминатора представляет собой последовательность hGT.
42. Способ по п. 31, отличающийся тем, что клетки млекопитающих выбраны из клеток CHO, HEK, BHK, NS0 и клеток SP2/0.
43. Способ по п. 42, отличающийся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки CHO для селекции стабильно трансфецированных клеток.
44. Способ по п. 42, отличающийся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки HEK для селекции кратковременно трансфецированных клеток.
45. Способ получения антитела, содержащий следующие этапы: а) культивирование клеток млекопитающих, содержащих
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела и bGH поли(А)-сигнальную последовательность,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела и bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и
b) получение антитела из клеток или культуральной среды.
46. Способ по п. 45, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
47. Способ по любому из пп. 45 или 46, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
48. Способ по п. 45, отличающийся тем, что первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в одном направлении для селекции стабильно трансфецированных клеток.
49. Способ по п. 45, отличающийся тем, что первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в разных направлениях для селекции кратковременно трансфецированных клеток.
50. Способ по п. 45, отличающийся тем, что экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер.
51. Способ по п. 50, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты и селекционный маркер расположены в одном направлении.
52. Способ по п. 50, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты расположены в последовательности LC-HC-SM.
53. Способ по п. 45, отличающийся тем, что промотор фактора элонгации 1 альфа человека содержит интрон А.
54. Способ по п. 45, отличающийся тем, что экспрессионный вектор не содержит каких-либо последовательностей терминатора транскрипции.
55. Способ по п. 54, отличающийся тем, что последовательность терминатора представляет собой последовательность hGT.
56. Способ по п. 45, отличающийся тем, что клетки млекопитающих выбраны из клеток CHO, HEK, BHK, NS0 и клеток SP2/0.
57. Способ по п. 56, отличающийся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки CHO для стабильной продукции антитела.
58. Способ по п. 56, отличающийся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки HEK для кратковременной продукции антитела.
59. Экспрессионный вектор, содержащий
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела и bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор hEF1alpha, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела и bGH поли(А)-сигнальную последовательность.
60. Экспрессионный вектор по п. 59, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
61. Экспрессионный вектор по любому из пп. 59 или 60, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
62. Экспрессионный вектор по п. 59, отличающийся тем, что первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в одном направлении для селекции стабильно трансфецированных клеток.
63. Экспрессионный вектор по п. 59, отличающийся тем, что первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в разных направлениях для селекции кратковременно трансфецированных клеток.
64. Экспрессионный вектор по п. 59, отличающийся тем, что экспрессионная плазмида дополнительно содержит селекционный маркер.
65. Экспрессионный вектор по п. 64, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты и селекционный маркер расположены в одном направлении.
66. Экспрессионный вектор по п. 64, отличающийся тем, что экспрессионные кассеты расположены в последовательности LC-HC-SM.
67. Экспрессионный вектор по п. 59, отличающийся тем, что промотор фактора элонгации 1 альфа человека содержит интрон А.
68. Экспрессионный вектор по п. 59, отличающийся тем, что экспрессионный вектор не содержит каких-либо последовательностей терминатора транскрипции.
69. Экспрессионный вектор по п. 68, отличающийся тем, что последовательность терминатора представляет собой последовательность hGT.
70. Применение экспрессионного вектора, содержащего
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ первый промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, первую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность первого терминатора транскрипции,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ второй промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, вторую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность второго терминатора транскрипции, и
- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ третий промотор, нуклеиновую кислоту, придающую устойчивость к селекционному агенту, третью поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность третьего терминатора транскрипции, где три экспрессионные кассеты расположены в одном направлении и в последовательности: первая экспрессионная кассета-вторая экспрессионная кассета-третья экспрессионная кассета, для стабильной рекомбинантной продукции антитела в клетках млекопитающих.
71. Применение по п. 70, характеризующееся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
72. Применение по любому из пп. 70 или 71, характеризующееся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
73. Применение по п. 70, характеризующееся тем, что первый и второй промотор представляют собой промотор hCMV, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность и последовательность терминатора транскрипции присутствует и представляет собой hGT последовательность терминатора.
74. Применение по п. 70, характеризующееся тем, что первый и второй промотор представляют собой промотор hEF1alpha, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность и экспрессионные кассеты не содержат последовательности терминатора транскрипции.
75. Применение по п. 70, характеризующееся тем, что клетки млекопитающих выбраны из клеток CHO, HEK, BHK, NS0 и клеток SP2/0.
76. Применение по п. 70, характеризующееся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки CHO.
77. Экспрессионный вектор, содержащий
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ первый промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, первую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность первого терминатора транскрипции,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ второй промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, вторую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность второго терминатора транскрипции, и
- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ третий промотор, нуклеиновую кислоту, придающую устойчивость к селекционному агенту, третью поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность третьего терминатора транскрипции,
где три экспрессионные кассеты расположены в одном направлении и в последовательности: первая экспрессионная кассета-вторая экспрессионная кассета-третья экспресионная кассета.
78. Экспрессионный вектор по п. 77, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
79. Экспрессионный вектор по любому из п.п. 77-78, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляют собой кДНК.
80. Экспрессионный вектор по п. 77, отличающийся тем, что первый и второй промотор представляют собой промотор hCMV, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и последовательность терминатора транскрипции присутствует и представляет собой hGT последовательность терминатора.
81. Экспрессионный вектор по п. 77, отличающийся тем, что первый и второй промотор представляют собой промотор hEF1alpha, первая и вторая поли(А)-сигнальные последовательности представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и экспрессионные кассеты не содержат последовательности терминатора транскрипции.
82. Применение экспрессионного вектора, содержащего
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ первый промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, первую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность первого терминатора транскрипции,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ второй промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, вторую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность второго терминатора транскрипции, и
- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ третий промотор, нуклеиновую кислоту, придающую устойчивость к селекционному агенту, третью поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность третьего терминатора транскрипции,
где экспрессионные кассеты расположены в разных направлениях, таким образом, первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в противоположном направлении для кратковременной рекомбинантной продукции антитела в клетках млекопитающих.
83. Применение по п. 82, характеризующееся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
84. Применение по любому из пп. 82 или 83, характеризующееся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
85. Применение по п. 82, характеризующееся тем, что первый и второй промотор представляют собой промотор hCMV, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляет собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и последовательность терминатора транскрипции присутствует и представляет собой hGT последовательность терминатора.
86. Применение по п. 82, характеризующееся тем, что первый и второй промотор представляют собой промотор hEF1alpha, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность и экспрессионные кассеты не содержат последовательности терминатора транскрипции.
87. Применение по п. 82, характеризующееся тем, что клетки млекопитающих выбраны из клеток CHO, HEK, BHK, NS0 и клеток SP2/0.
88. Применение по п. 82, характеризующееся тем, что клетки млекопитающих представляют собой клетки HEK.
89. Экспрессионный вектор, содержащий
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ первый промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, первую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность первого терминатора транскрипции,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ второй промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, вторую поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность второго терминатора транскрипции, и
- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ третий промотор, нуклеиновую кислоту, придающую устойчивость к селекционному агенту, третью поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность третьего терминатора транскрипции,
где экспрессионные кассеты расположены в разных направлениях, таким образом, первая экспрессионная кассета и вторая экспрессионная кассета расположены в противоположных направлениях.
90. Экспрессионный вектор по п. 89, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, содержит по меньшей мере один интрон.
91. Экспрессионный вектор по любому из пп. 89 или 90, отличающийся тем, что нуклеиновая кислота, кодирующая легкую цепь антитела, и/или нуклеиновая кислота, кодирующая тяжелую цепь антитела, представляет собой кДНК.
92. Экспрессионный вектор по п. 89, отличающийся тем, что первый и второй промотор представляют собой промотор hCMV, первая и вторая поли(А)-сигнальная последовательность представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность, и последовательность терминатора транскрипции присутствует и представляет собой hGT последовательность терминатора.
93. Экспрессионный вектор по п. 89, отличающийся тем, что первый и второй промотор представляют собой промотор hEF1alpha, первая и вторая поли(А)-сигнальные последовательности представляют собой bGH поли(А)-сигнальную последовательность и экспрессионные кассеты не содержат последовательности терминатора транскрипции.
94. Экспрессионная плазмида, содержащая в направлении 5′-3′ последовательность промотора, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела или легкую цепь антитела, IRES элемент, нуклеиновую кислоту, кодирующую селекционный маркер и поли(А)-сигнальную последовательность, где IRES элемент представляет собой EMCV-IRES элемент.
95. Применение экспрессионной кассеты, содержащей в направлении 5′-3′ последовательность промотора, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела или легкую цепь антитела, IRES элемент, нуклеиновую кислоту, кодирующую селекционный маркер, и поли(А)-сигнальную последовательность для селекции клеток, продуцирующих антитело, где IRES элемент представляет собой EMCV-IRES элемент.
96. Способ селекции эукариотических клеток, экспрессирующих антитело, включающий следующие этапы:
- культивирование эукариотических клеток, содержащих i) экспрессионную плазмиду по п. 94 и ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую соответствующую другую цепь антитела, не кодируемую экспрессионной плазмидой по п. 94,
- селекция клеток, экспрессирующих детектируемый полипептид.
97. Экспрессионная плазмида, содержащая в направлении 5′-3′ последовательность промотора, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, IRES элемент, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, и поли(А)-сигнальную последовательность, где IRES элемент представляет собой EV71-IRES элемент.
98. Применение экспрессионой плазмиды, содержащей в направлении 5′-3′ последовательность промотора, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, IRES элемент, нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела, и поли(А)-сигнальную последовательность для экспрессии антитела, где IRES элемент представляет собой EV71-IRES элемент.
99. Способ селекции эукариотических клеток, экспрессирующих антитело, включающий следующие этапы:
- культивирование эукариотических клеток, содержащих i) экспрессионную плазмиду по п. 97 и ii) нуклеиновую кислоту, кодирующую соответствующую другую цепь антитела, не кодируемую экспрессионной плазмидой по п. 97,
- селекция клеток, экспрессирующих детектируемый полипептид.
100. Экспрессионная плазмида по п. 94 или 97 или применение по любому из пп. 70, 82, 95 и 98 или способ по любому из пп. 1, 12, 31, 45, 96 и 99, отличающийся тем, что экспрессионный вектор содержит или
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую легкую цепь антитела, поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность терминатора,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую легкую цепь антитела, поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность терминатора,
- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь антитела, поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность терминатора,
- четвертую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую тяжелую цепь антитела, поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность терминатора,
или
- первую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела, поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность терминатора,
- вторую экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь антитела, поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность терминатора, и
- третью экспрессионную кассету, содержащую в направлении 5′-3′ промотор, нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую тяжелую цепь антитела, поли(А)-сигнальную последовательность и возможно последовательность терминатора,
где легкая цепь антитела является общей легкой цепью для обеих тяжелых цепей.
101. Экспрессионная плазмида по п. 94 или 97 или применение по любому из пп. 70, 82, 95 и 98 или способ по любому из пп. 1, 12, 31, 45, 96 и 99, отличающийся тем, что экспрессионный вектор кодирует биспецифичное антитело.
102. Экспрессионная плазмида или применение или способ по п. 101, отличающийся тем, что биспецифичное антитело обладает первой специфичностью связывания или сайтом связывания, который специфично связывается с первым антигеном или первым эпитопом на антигене, и биспецифическое антитело обладает второй специфичностью связывания или сайтом связывания, который специфически связывается с вторым антигеном или вторым эпитопом антигена.
103. Экспрессионная плазмида или применение или способ по п. 100, отличающийся тем, что экспрессионный вектор содержит
- экспрессионную кассету легкой цепи антитела,
- экспрессионную кассету первой тяжелой цепи антитела,
- экспрессионную кассету второй тяжелой цепи антитела, и
- экспрессионную кассету селекционного маркера.
104. Экспрессионная плазмида или применение или способ по п. 100, отличающийся тем, что экспрессионный вектор содержит
- экспрессионную касету первой легкой цепи антитела,
- экспрессионную касету второй легкой цепи антитела,
- экспрессионную касету первой тяжелой цепи антитела,
- экспрессионную касету второй тяжелой цепи антитела, и
- экспрессионную касету селекционного маркера.
105. Экспрессионная плазмида или применение или способ по п. 100, отличающийся тем, что одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую hole-мутацию.
106. Экспрессионная плазмида или применение или способ по п. 100, отличающийся тем, что одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую knob-мутацию.
107. Экспрессионная плазмида или применение или способ по п. 100, отличающийся тем, что одна из экспрессионных кассет легкой цепи антитела кодирует вариант легкой цепи антитела, содержащей вариабельный домен легкой цепи антитела и СН1 домен тяжелой цепи антитела в качестве константного домена, и/или одна из экспрессионных кассет легкой цепи антитела кодирует легкую цепь антитела, содержащую вариабельный домен легкой цепи антитела и CL домен легкой цепи антитела в качестве константного домена.
108. Экспрессионная плазмида или применение или способ по п. 100, отличающийся тем, что одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует вариант тяжелой цепи антитела, содержащей в качестве первого константного домена антитела константный домен легкой цепи антитела (CL), и/или одна из экспрессионных кассет тяжелой цепи антитела кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую в качестве первого константного домена СН1 домен тяжелой цепи антитела.