СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОРОЗОСТОЙКОСТИ ОЗИМЫХ ЗЕРНОВЫХ КУЛЬТУР
METHOD OF DETERMINING FROST-RESISTANCE OF WINTER GRAIN CROPS

Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к определению морозостойкости зерновых культур, и может быть использовано при селекции морозостойких генотипов озимых зерновых культур.
Большие потери урожая зерновых культур происходят из-за повреждения и гибели растений при неблагоприятных условиях перезимовки, главным из которых является действие низких температур в позднеосенний, зимний и ранневесенний периоды. Задача определения морозостойкости озимых зерновых культур простым и быстрым способом является актуальной.
Известны способы определения морозостойкости растений, в основе которых лежит изменчивость электропроводности растительных тканей (АС СССР №353684, 1972) интенсивности сверхслабого свечения (АС СССР №488548, 1975) и накопление в листьях связанной воды (Патент РФ №21451943, 1999).
Для реализации названных способов требуется наличие современной лаборатории, оснащенной сложным оборудованием, а также высокая квалификация исполнителей, что существенно препятствует их широкому использованию в селекционном процессе.
Известен способ определения морозостойкости растений путем промораживания целых растений при постепенно снижающейся с интервалом в одни сутки температуре (-7°С, -10°С, -13°С, -16°С). Затем их переносят для оттаивания в камеру с температурой 2°С. Через сутки эти растения высаживают в почву, а спустя три недели учитывают число отросших растений. Морозостойкость выражают в процентах от числа промороженных при определенной температуре. (Алексидзе Г.Я., Королев Н.П., Семенов И.Л., Выскребенцева Э.И. // Физиология растений. 1983. Т. 30. В. 6. С.1069.)
Недостатком способа являются длительность и трудоемкость. Известен способ оценки морозостойкости растений по содержанию связанной воды в листьях. Для оценки морозостойкости растений проводят проращивание семян в термостате в течение 20 суток на фильтровальной бумаге при круглосуточном освещении 5 тыс.лк. Закаливание проводят в холодильной камере в специальном режиме: первые семь суток при 1=0…+2°С, последующие трое суток при Т=-4…-5°С. В качестве оценочного показателя морозостойкости используют степень устойчивости, которая выражается соотношением содержания связанной воды в третьем листе проростков после и до закаливания, что обеспечивает большую степень объективности оценки. Для сравнительной оценки применяют сорта-дифференциаторы с известной степенью морозостойкости. (Патент РФ №2143194, кл. А01H 1/04, on. 27.12.99).
Недостатком способа являются длительность и трудоемкость. Наиболее ближайшим к заявляемому способу - прототипом - является способ определения морозостойкости растений путем помещения высечек из листьев на определенный срок при отрицательных температурах и определения с помощью микроскопа жизнеспособности клеток. Из листьев исследуемых растений острым бритвенным лезвием нарезают высечки размером 5-7 мм, которые насаживают на иглу и помещают в полупроводниковый микрохолодильник. После промораживания высечки микроскопируют.(С.Н.Дроздов, В.К.Курец, Н.П.Будыкин, Н.И.Балагурова, «Определение устойчивости растений к заморозкам.». В кн.: «Методы оценки устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды». Л.: Колос, 1976). Данные, полученные методом промораживания высечек из листьев, хорошо согласуются с результатами прямого промораживания целых растений в холодильных камерах.
Недостатками прототипа являются сложность, необходимость использования специального микрохолодильника и микроскопа, большая длительность экспозиции (около 40 мин. при каждом изменении температуры), общая трудоемкость.
Технической задачей изобретения является упрощение способа определения морозостойкости растений, уменьшение его длительности и повышение производительности.
Поставленная техническая задача достигается заявляемым способом, заключающимся в том, что морозостойкость озимых зерновых культур определяют промораживанием фрагментов листьев, наклеенных на липкую ленту и помещенных между двумя металлическими пластинами в морозильной камере. После наклеивания всех листьев на липкую ленту острым скальпелем по линейке отрезают верхушку листьев шириной 3-4 мм и переносят в емкость с 0,1-0,5% раствора резорцина. Эта полоска служит контролем, так как не промораживалась и, соответственно, не окрашивается красителем. Промораживание ведут, начиная с выбранной экспериментально оптимальной температуры -13°С с постепенным понижением до -19°С за период 6 часов. Через определенные интервалы времени, преимущественно через 1, 3, 9, 30, 60, 120, 240, 480 минут ленту с наклеенными листьями достают из морозильной камеры, острым скальпелем отрезают часть липкой ленты с фрагментами листьев шириной 2-3 мм и помещают в резервуар с 0,1-0,5% раствором резорцина, который окрашивает убитые холодом фрагменты листьев в темно-синий цвет. Оставшуюся ленту с листьями помещают обратно между металлическими пластинами в морозильную камеру для дальнейшего промораживания. Промораживание продолжают до тех пор, пока все фрагменты листьев на очередной обрезанной полоске не окрасятся.
Оценочным показателем морозостойкости является степень устойчивости растений к холоду, которая выражается во времени промораживания, при котором происходит необратимое повреждение фрагментов листьев холодом, проявляющееся в растворе резорцина окрашиванием в темно-синий цвет, а также выделяют три группы растений по морозостойкости: морозостойкую (время промораживания 60 мин и выше), среднеморозостойкую (время промораживания 9-30 мин) и слабоморозостойкую (3 мин и ниже). Для сравнительной оценки морозостойкости используют предварительно срезанные верхушки испытываемых листьев, которые не подвергают промораживанию.
Изобретение позволяет определять морозостойкость срезанных листьев растений на любой стадии развития, начиная со стадии проростка высотой 5-10 см и до состояния зрелого растения. При этом анализируемые растения легко переносят потерю отрезанных фрагментов листьев и продолжают расти. За один прием можно проанализировать от 100 до 300 фрагментов листьев.
Определяющими отличиями заявляемого способа от прототипа являются:
- для наклейки анализируемых листьев используют липкую ленту, что позволяет повысить производительность способа, так как за один прием можно анализировать большое количество образцов листьев;
- перед промораживанием отрезают верхушку листьев шириной 3-4 мм и переносят в емкость с 0,1-0,5% раствора резорцина для использования в качестве контроля;
- промораживание ленты с наклеенными листьями осуществляют между металлическими пластинами при экспериментально подобранном оптимальном температурном режиме (-13°С -19°С), что позволяет ускорить способ и обеспечить хорошую повторяемость результатов анализа;
- через определенные интервалы времени, преимущественно через 1, 3, 9, 30, 60, 120, 240, 480 минут, ленту с наклеенными листьями достают из морозильной камеры, острым скальпелем отрезают часть липкой ленты с фрагментами листьев шириной 2-3 мм и выявляют убитые холодом растения;
- выявление убитых холодом фрагментов листьев растений осуществляют с использованием 0,1-0,5% раствора красителя - резорцина, что позволяет получить быстрое и стойкое окрашивание;
- в качестве оценочного показателя морозостойкости растений используют время промораживания, при котором происходит необратимое повреждение фрагментов листьев холодом, проявляющееся в растворе резорцина окрашиванием в темно-синий цвет.
Процедура промораживания не требует дорогостоящего оборудования. Можно использовать бытовую морозильную камеру или холодильник. Все это позволяет упростить известный способ определения морозостойкости и значительно увеличить его производительность.
Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1.
Проводили определение морозостойкости листьев 10-дневных проростков двух сортов озимой пшеницы и 10 различных генотипов пырея сизого.
Семена пшеницы и пырея высаживали по 25 шт. в пластиковые стаканчики объемом 200 мл, заполненные почвой. После 10 суток выращивания при комнатной температуре +20°С, у каждого проростка отрезали верхнюю часть листа длиной 3 см и наклеивали на полосу липкой ленты (скотч) (фиг.1). После наклеивания всех листьев острым скальпелем по линейке отрезали верхнюю полоску шириной 3 мм с кончиками листьев и переносили в резервуар с красителем - 0,1% раствором резорцина. Эта полоска служила контролем, так как не промораживалась и не окрашивалась красителем. Остальную полосу с листьями помещали между двумя металлическими пластинами, имеющими размер 100×400×3 мм с зазором 2,5 мм, которую предварительно охлаждали в морозильном отделе холодильника до исходной температуры -13°С. После этого включали секундомер, переводили холодильник в режим непрерывного охлаждения с постепенным понижением температуры на 1°С в час за период 6 часов. Через интервалы времени 1, 3, 9, 30, 60, 90, 120, 240 и 480 минут полосу с листьями вынимали и, отрезав очередную полоску шириной 3 мм, опять помещали между пластинами для дальнейшего промораживания. Отрезанные полоски с фрагментами листьев укладывали в емкость с 0,1% раствором резорцина ниже контрольной полоски в порядке, в каком они были срезаны. Уже через несколько минут погружения в краситель убитые холодом фрагменты листьев окрашивались в темно-синий цвет, тогда как контрольные и не убитые фрагменты не окрашивались и выглядели более светлыми. Это различие в окраске сохраняется очень долго - вплоть до полного испарения красящего раствора, поэтому определение морозостойкости можно вести как в процессе, так и через несколько суток после окончания промораживания. На фиг.2 представлен результат одного из экспериментов по определению морозостойкости.
Пример 2.
Предлагаемым способом, аналогично примеру 1, определили морозостойкость листьев 27 растений 5 генотипов пырея сизого. Для отдельных растений были получены значения морозостойкости листьев от М=3 мин. до М=90 мин. Далее, растения двух контрастных по значению М групп: с низкой (М≤3) и высокой (М≥60) морозостойкостью листьев переносили из тепла в холодильник на 10 суток при температуре +2°С. Результаты, приведенные в таблице 1 показывают, что в группе растений с низкой (М≤3) морозостойкостью листьев выжили 45% растений, тогда, как в группе растений с высокой (М≥60) морозостойкостью выжили 95% растений. Полученные данные показывают, что морозостойкость листьев растения коррелирует с морозостойкостью целого растения.
Пример 3.
Предлагаемым способом, аналогично примеру 1, определили морозостойкость листьев 10-дневных проростков озимой пшеницы двух морозостойких сортов: сорта Багратионовка, который в России длительное время был чемпионом по морозостойкости, и сорта Филатовка и 10 генотипов пырея сизого. В таблице 2 приведены средние значения морозостойкости листьев (Мср) и процент растений с низкой (МЗ) и высокой (М60) морозостойкостью. Как видно из табл.2, сорт озимой пшеницы Багратионовка имеет в среднем в 1,7 раза большую морозостойкость листьев (Мср=29), чем сорт Филатовка (Мср=17,2). Из исследованных генотипов пырея сизого только один генотип А-1 по морозостойкости листьев (Мср=37,5) в 1,3 раза превышал сорт озимой пшеницы Багратионовка (М=29). Генотип пырея А-2 имел среднюю морозостойкость листьев (М=26) незначительно уступающую сорту Багратионовка, но одно из 12 исследованных растений генотипа А-2 имело в 14 раз более высокую морозостойкость (М=540). Таким образом, предлагаемым способом обнаружены генотипы пырея сизого, со значительно большей морозостойкостью, чем у наиболее морозостойкого сорта озимой пшеницы Багратионовка. Выбранные морозостойкие генотипы пырея являются ценными донорами признака морозостойкости и могут быть использованы в технологии отдаленной гибридизации для получения морозостойких форм и сортов пшенично-пырейных гибридов.
Таким образом, предлагаемый способ можно использовать в качестве простого и быстрого метода анализа морозостойкости растений для отбора высокоморозостойких форм.
Способ определения морозостойкости озимых зерновых культур.
Таблица 1
Группы растений пырея сизого
Исследовано растений
Кол-во растений, выживших после обработки холодом
Процент живых растений
с высокой морозостойкостью листьев М≥60
40
38
95
с низкой морозостойкостью листьев М≤3
42
19
45
Таблица 2
Вид злака
Пырей сизый
Озимая пшеница
Генотип
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Багратионовка
Филатовка
Кол-во растений
20
12
16
10
20
11
14
22
11
14
10
12
Морозостойкость М ср (мин)
38
26
15
9
13
7
12
9
2
12
29
17
% растений
М≥60
75
58
19
10
20
18
29
19
0
36
60
34
М≤3
25
42
81
90
80
82
71
81
100
64
40
66