Экспериментальное обоснование возможности получения концентрата микробных клеток штамма Yersinia pestis ev методом микрофильтрации

БИО

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 JUX Л^П^РЕПАРАТЫ

УДК 579.61

5 Экспериментальное обоснование

возможности получения концентрата 2 микробных клеток штамма Yersinia pestis EV

методом микрофильтрации

•Q

^ А.А. Лещенко, В.В. Тетерин, А.Г. Лазыкин, А.В. Ежов, Д.А. Мохов, В.В. Бирюков, С.В. Багин,

С.В. Логвинов

X

S Научно-исследовательский центр Федерального государственного бюджетного учреждения

«48 Центральный научно-исследовательский институт» ^ Министерства обороны Российской Федерации, Киров, Россия

О

Experimental justification of the possibility of obtaining microbial Yersinia pestis EV strain concentrate by microfiltration

A.A. Leshenko, V.V. Teterin,A.G. Lazykin,A.V. Ezhov, D.A. Mokhov, V.V. Biryukov,S.V. Bagin, S.V. Logvinov

Research Center of Federal State Budgetary Institution «48 Central Research and Testing Institute»

of the Ministry of Defence of the Russian Federation, Kirov, Russia ✓ >

Таблетированные препараты живой противочумной вакцины позволяют при угрозе развития вспышки чумы быстро иммунизировать большие контингенты людей. Однако до настоящего времени для концентрирования биомассы вакцинного штамма Yersinia pestis EV используется метод седиментации, снижающий качество конечного препарата и не позволяющий воспроизводимо получать осадок с заданным содержанием микробных клеток. Цель настоящей работы - экспериментально обосновать возможность получения концентрата микробных клеток штамма Y. pestis EV методом микрофильтрации. Установлено, что общая концентрация микробов штамма Y. pestis EV в суспензии, полученной методами седиментации и микрофильтрации, составляла не менее 150 млрд. м.к./мл. Однако концентрат, приготовленный на микрофильтрационном оборудовании, содержал на 10-15% больше живых микроорганизмов. Сравнительное изучение влияния методов концентрирования на характеристики микробных культур, по которым можно судить о качестве готового препарата, показало, что содержание живых клеток в концентрированных суспензиях оставалось достаточно высоким и не зависело от способа разделения. При этом уровни окислительного метаболизма бактерий в составе концентрированных суспензий, полученных различными методами, не имеют существенных различий. Время производства вакцины сократилось на 2 суток, т.е. в 2 раза, а препарат имел более высокое содержание живых микробов. Вакцина, приготовленная из концентратов клеток, полученных методом микрофильтрации, удовлетворяет требованиям утвержденной нормативной документации. При оценке стабильности препарата в течение срока хранения (плюс 6 мес.) было показано, что вакцина, полученная с использованием метода микрофильтрации, сохраняет свои биологические и физико-химические свойства. Приведенные данные показывают возможность получения таблетированной противочумной вакцины на основе микробных клеток штамма Y. pestis EV, сконцентрированных методом микрофильтрации.

Ключевые слова: микробные клетки; штамм Yersinia pestis EV; вакцина; микрофильтрация; технология; таблетка; морфология; окислительный метаболизм.

Библиографическое описание: Лещенко АА, Тетерин ВВ, Лазыкин АГ, Ежов АВ, Мохов ДА, Бирюков ВВ, Багин СВ, Логвинов СВ. Экспериментальное обоснование возможности получения концентрата микробных клеток штамма Yersinia pestis EV методом микрофильтрации. Биопрепараты 2014; 1(49): 31-36.

Live plaque vaccine preparations in a tablet form allow quick immunization of large populations in case of a possible plaque outbreak. However, to the present day, the sedimentation method has been used for biomass concentration of Yersinia pestis EV vaccinal strain, which lowers the quality of the final product and does not yield reproducible precipitate with a specified amount of microbial cells. The aim of present research was to justify possibility of obtaining microbial Yersinia pestis EV strain concentrate by microfiltration. It was shown, that overall concentration of Y. pestis EV strain microorganisms in suspensions obtained by sedimentation and microfiltration was not less than 150 pillion microbial cells per ml. However, concentration of live microorganisms in a microfiltered suspension was about

10-15% higher. Comparative study of the correlation between the concentration method used and microbial culture characteristics, which are indicative of the quality of the final product, demonstrated, that live cells content in suspensions remained at a high level and was independent of the separation technique. The bacterial oxidative metabolism level in suspensions concentrated by different methods also did not show significant differences. The vaccine production time was reduced by two days, i.e. twofold, and the product contained more live microorganisms. The vaccine prepared from cell concentrate obtained by microfiltration complied with the requirements of regulatory documents. During the stability study it was demonstrated, that the microfiltered vaccine retained its physico-chemical and biological properties during the proposed shelf-life (6 months). Reported data suggest the possibility of preparation of live plaque vaccine from Y. pestis EV strain, concentrated by microfiltration, in a tablet form. Key words: microbial cells; Yersinia pestis EV strain; vaccine; microfiltration; technology; tablet; morphology; oxidative metabolism.

Bibliographic description: Leshenko AA, Teterin VV, Lazykin AG, Ezhov AV, Mokhov DA, Biryukov VV, Bagin SV, Logvinov SV. Experimental justification of the possibility of obtaining microbial Yersinia pestis EV strain concentrate by microfiltration. Biopreparation (Biopharmaceuticals) 2014; 1(49): 31-36. V_S

В системе противоэпидемических мероприятий по борьбе с чумой большое значение придается массовой вакцинации [1, 2]. Наиболее перспективными формами живых вакцин, позволяющими быстро иммунизировать большие контингенты людей, являются таблетирован-ные препараты. Они состоят из биологически активной субстанции и специального наполнителя, которые придают таблетке необходимые физико-химические и вкусовые качества. Это в полной мере относится и к вакцине чумной живой в виде таблеток для рассасывания, на основе штамма Yersinia pestis EV, обладающей высокой иммуногенностью, низкой реактогенностью и предназначенной для специфической профилактики чумной инфекции [3, 4].

Одним из важных этапов в технологии таблетирован-ной формы вакцины чумной живой, по-прежнему, остается процесс концентрирования микробной взвеси, который в значительной мере влияет на качественные характеристики готового препарата.

Стадия концентрирования биомассы в процессе получения вакцинного препарата до сих пор базируется на отделении микробных клеток от среды культивирования с использованием метода седиментации [5]. К достоинствам данного метода концентрирования следует отнести то, что для оснащения аппаратурно-техно-логической линии не требуется дополнительного сложного оборудования. Технологический процесс ведется непосредственно в ферментере или в другом емкостном оборудовании при заданных регламентированных условиях (температуре, продолжительности и т.д.).

Однако данный метод имеет ряд существенных недостатков (продолжительность стадии, длительное нахождение микробных клеток в среде при пониженной температуре), которые негативно сказываются на выживаемости клеток чумного микроба на последующих стадиях производства и в целом качестве конечного препарата. Кроме этого, метод седиментации является нерегулируемым, что не всегда позволяет получать осадок с заданным содержанием микробных клеток. В ряде случаев при полном соблюдении технологических режимов выращивания микробной взвеси, не удается достигнуть требуемой концентрации осадка из биологически полноценных культур.

В настоящее время в микробиологических производствах находит все более широкое применение метод селективного разделения микробных культур на пористых мембранах, в частности микрофильтрация [6].

По сравнению с седиментацией микрофильтрация имеет ряд достоинств: возможность получать микробный концентрат с заданными параметрами, практическое отсутствие негативных воздействий на живые клетки, простота аппаратурного оформления, технологичность, и, как следствие, высокая экономическая эффективность [7]. Вместе с тем, данный способ позволяет проводить процесс концентрирования в асептических условиях, что немаловажно в производстве вакцинных препаратов, предназначенных для людей.

Цель настоящей работы - экспериментальное обоснование возможности получения концентрата микробных клеток штамма Yersinia pestis EV методом микрофильтрации.

Материалы и методы

Концентрирование микробной культуры штамма Yersinia pestis EV осуществляли методом седиментации в стеклянных бутылях вместимостью 20 дм3 в течение 48 ч при температуре 4-8оС и методом микрофильтрации на установке «Сартокон-мини», снаряженной мембранными модулями из полипропилена с размером пор 0,2 мкм, при температуре 18-20оС.

Содержание живых микробных клеток определяли ци-торефрактометрическим методом в микроскопе МБИ-6 с аноптральным контрастом. Содержание делящихся клеток оценивали в фазовом контрасте в микроскопе «Люмам И3». Размеры клеток определяли с помощью программы морфометрического анализа «Axio Vision».

Метаболическую активность клеток и физиологическое состояние культур чумного микроба исследовали с использованием хроноамперометрического метода измерения скорости дыхания [8].

Оценку физико-химических и иммунобиологических свойств вакцины чумной живой, таблетки для рассасывания, осуществляли в соответствии с ФСП 42-8198-06 «Вакцина чумная живая, таблетки для рассасывания» [3].

.ПРЕПАРАТЫ

Таблица 1. Характеристика морфометрических показателей микробных клеток штамма Y. pestis EV до и после концентрирования

Исследуемая культура Количество клеток..., процент Линейные размеры клеток, мкм

живых делящихся длина диаметр

Глубинная культура, выращенная в ферментере 95,9+1,6 8,0+3,8 1,82+0,09 0,76+0,04

Суспензия, полученная методом... микрофильтрации 91,6+4,6 4,2+2,6 1,74+0,10 0,67+0,03

седиментации 84,2+3,4 4,3+2,2 1,79+0,12 0,72+0,04

Таблица 2. Сравнительная оценка средних показателей окислительного метаболизма штамма Y. pestis EVпри разных способах концентрирования

Исследуемый показатель Глубинная культура, выращенная в ферментере Микробная суспензия, полученная методом.

микрофильтрации седиментации

Удельная скорость эндогенного дыхания, пМО2 (млрдмин)-1 14,81 14,21 14,14

Коэффициент стимуляции дыхания глюкозой 0,0025 М, отн. ед. 1,00 1,00 1,00

Коэффициент стимуляции дыхания глюкозой 0,1 М, отн. ед. 1,00 1,00 1,00

Коэффициент стимуляции дыхания 2,4-динитрофенолом, отн. ед. 1,21 1,21 1,20

Примечание. Результаты, представленные в таблице, являются средней величиной трех измерений.

Статистическую обработку результатов экспериментальных данных производили в соответствии с рекомендациями [9].

Результаты и обсуждение

На первом этапе исследований из выращенных глубинным способом культур получали микробные концентраты методами седиментации и микрофильтрации.

Процесс концентрирования микробной культуры методом седиментации выполняли в стеклянных бутылях вместимостью 20 дм3 в течение 48 ч при температуре 4-8оС. При этом общая концентрация микробов штамма Y. pestis EV в суспензии, определенная по ОСО мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича, составляла не менее 150 млрд. м.к./мл.

Проведение фильтрации культуры позволяло добиться в полученной суспензии аналогичной общей концентрации микробов (не менее 150 млрд. м.к./мл). В этом случае концентрат штамма Y. pestis EV, приготовленный на микрофильтрационном оборудовании, содержал на 10-15% больше живых микробов, а продолжительность процесса концентрирования сократилась в 2 раза.

В ходе дальнейшей работы провели сравнительное изучение влияния вышеприведенных методов концентрирования на характеристики микробных культур, по которым можно судить о качестве готового препарата.

Общеизвестно, что данные морфологического анализа (размеры, количество живых и делящихся микробных клеток) позволяют прогнозировать выживаемость бактерий на последующих этапах приготовления вакцины и в процессе хранения готового препарата. Результаты исследований по оценке характеристик морфометрических показателей микробных клеток представлены в таблице 1.

Из данных, представленных в таблице 1, видно, что количество живых и делящихся клеток несколько выше

в культуре до концентрирования. Данный факт объясняется дефицитом питательного субстрата, возникшим в результате концентрирования и отмывания клеток. Содержание живых клеток в концентрированных суспензиях оставалось достаточно высоким и практически не зависело от способа разделения. Линейные размеры клеток также оказались несколько больше в исходной культуре, но достоверно не отличались от размеров клеток в концентрированных суспензиях. Уменьшение указанных параметров связано как с отсутствием питательных веществ, так и с концентрационным механизмом регуляции размеров, что является приспособительной реакцией микробной популяции к изменившимся условиям.

Наряду живой в виде таблеток для рассасывания и проводили сравнительную оценку показателей приготовленных препаратов на соответствие требованиям нормативной документации. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 3.

Данные, представленные в таблице 3, позволяют утверждать, что обе вакцины в равной степени отвечают требованиям нормативной документации. В тоже время препарат, приготовленный методом микрофильтрации, имеет более высокие показатели по содержанию живых микробов и меньшую степень контаминации посторонней микрофлорой. При этом регламентное времени приготовления вакцины сократилось на 2 суток

На заключительном этапе исследований проводилась оценка показателей качества вакцины чумной живой, таблетки для рассасывания, полученной методом микрофильтрации, в процессе хранения через 18 месяцев (срок годности плюс 6 месяцев) при температуре от 0 до 8°С. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Из данных, представленных в таблице 4, следует, что вакцина чумная живая, таблетки для рассасывания

Таблица 3. Характеристика показателей образцов вакцины чумной живой, таблетки для рассасывания, полученных с использованием различных методов концентрирования

Наименование показателя Требования нормативной документации Результаты оценки вакцины, полученной с применением метода...

седиментации микрофильтрации

Распадаемость Должна распадаться на мелкие кусочки или рыхлую массу в течение 15 мин 13,9+0,9 13,9+0,9

Средняя масса, г От 0,6 до 1,0 0,923+0,04 0,925+0,04

Прочность на истирание, % 97,0, не менее 98,0 98,0

Потеря в массе при высушивании, % 10,0, не более 6,5+0,2 6,5+0,2

Микробиологическая чистота Таблетка может содержать не более 1*103 м.к. непатогенных микроорганизмов 180+21 155+25

Специфическая безопасность Должна быть специфически безопасной Безопасна

Количество живых микробных клеток в таблетке, *109 От 30 до 50 40,3+6,2 43,8+5,3

Иммуногенность, ЕД_0 для белых мышей, ж.м.к. 4*104, не более 8251 8422

Таблица 4. Характеристика вакцины чумной живой, таблеток для рассасывания, хранившейся при температуре от 0 до 8оС

Наименование Требования нормативной документации Срок наблюдения, ... мес.

показателя 0 6 12 18

Распадаемость Должна распадаться на мелкие кусочки или рыхлую массу в течение 15 мин 13,9+0,9 13,7+0,9 13,9+0,9 14,2+0,8

Средняя масса, г От 0,6 до 1,0 0,925+0,04 0,923+0,04 0,925+0,04 0,920+0,03

Прочность на истирание, % 97,0, не менее 98,0 98,1 98,0 97,2

Потеря в массе при высушивании, % 10,0, не более 6,5+0,2 6,5+0,2 6,5+0,2 6,6+0,3

Микробиологическая чистота Таблетка может содержать не более 1*103 м.к. непатогенных микроорганизмов 155+25 180+21 210+36 240+21

Специфическая безопасность Должна быть специфически безопасной Безопасна

Количество живых микробных клеток в таблетке, *109 От 30 до 50 43,8+5,3 42,4+6,3 40,3+6,2 38,1+1,8

Иммуногенность, ЕД50 для белых мышей, ж.м.к. 4*104, не более 8422 8531 8562 8673

соответствует требованиям нормативной документации после 18 месяцев хранения (срок годности плюс 6 месяцев).

Таким образом, в ходе проведенных исследований экспериментально обоснована возможность получения концентрата микробных клеток штамма Y. pestis EV методом микрофильтрации в технологии вакцины чумной живой, таблетки для рассасывания. Сравнительное изучение морфометрических показателей микробов и их физиологического статуса в процессе получения концентрированных суспензий различными методами не выявило существенных различий (по результатам пяти опытов). Показано, что вакцинные препараты, приготовленные из концентратов микробных клеток, полученных методом мембранного разделения, удовлетворяют требованиям нормативной документации. Одновременно с этим время производства вакцины сократилось на 2 суток, а препарат имел более высокие показатели по содержанию живых микробов. Оценка стабильности препарата в течение срока хранения

э

(плюс 6 мес.) показала, что вакцина, полученная с использованием метода микрофильтрации, сохраняет свои биологические и физико-химические свойства в течение всего срока наблюдения.

Литература:

1. Онищенко ГГ, Кутырев ВВ, Кривуля СД, Федоров ЮМ, Топорков ВП. Санитарная охрана территорий РФ: современное нормативно-методическое, организационное и научное обеспечение. Проблемы особо опасных инфекций 2007; 1: 3-10.

2. Борисевич ИВ, Дармов ИВ. К 80-летию основания Федерального государственного учреждения «48-й Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации». В кн.: Материалы Всероссийской научной конференции «Диагностика, лечение, и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология». Киров; 2008. С. 5-16.

3. ФСП 42-8198-06. Вакцина чумная живая, таблетки для рассасывания. Введ. 09.10.06.

.ПРЕПАРАТЫ

4. Регламент: ПР № 08461552-01-07 на производство вакцины чумной живой, таблетки для рассасывания. Утв. 02.04.07.

5. Сазыкин ЮО, Орехов СН, Чаканаева ИИ. Биотехнология. М.: Академия; 2008.

6. Карпов АМ, Лялин ВА и др. Состояние и перспективы мембранной техники в микробиологической, медицинской и пищевой отраслях промышленности. Биотехнология 1989; 5:260-276.

7. Бирюков ВВ. Основы промышленной биотехнологии. М.: Колосс; 2004.

8. Мартынов НВ, Чеботарев ЕВ, Лебединский ВА, Чичерин ЮВ, Додонов НП, Нестеренко АА. Полярографический метод в оценке культуральных свойств вакцинного штамма ЕВ. Журнал микробиологии, эпидемиологии, иммунобиологии 1990; 12: 18-21.

9. Лакин ГФ. Биометрия. М.: Высшая школа; 1990.

References

1. Onischenko GG, Kutyrev VV, Krivulya SD, Fedorov YM, Toporkov VP. Sanitary protection of the territories of the Russian Federation: the current regulatory and methodical, organizational and scientific support. Problemy osobo opasnyh infektsiy 2007; 1: 3-10 (in Russian).

2. Borisevich IV, Darmov IV. On the 80th anniversary of the founding of the Federal State Institution "48th Central Scientific Research Institute of the Ministry of Defense of the Russian Federation". In: All-Russian Scientific Conference "Diagnosis, treatment, and prevention of dangerous infectious diseases. Biotechnology ". Kirov; 2008. P. 5-16(in Russian).

3. Pharmacopoeial article of concern 42-8198-06. Plague vaccine live, lozenges. 09.10.06 (in Russian).

4. Rules: PR № 08461552-01-07 to produce the vaccine plague live, lozenges. 02.04.07 (in Russian).

5. Sazykin YO, Orehov SN, Chakanaeva II. Biotechnology. Moscow: Akademiya; 2008 (in Russian).

6. Karpov AM, Lyalin VA et al. Status and prospects of membrane technology in microbiology, medical and food industries. Biotehnologiya 1989; 5:260-276(in Russian).

7. Biryukov VV. Basics of industrial biotechnology. Moscow: Koloss; 2004 (in Russian).

8. Martynov NV, Chebotarev EV, Lebedinsky EV, Chicherin YV, Dodonov NP, Nesterenko AA. Polarographic method in the evaluation of cultural properties of the vaccine strain EV. Zhur-nal mikrobiologii, epidemiologii, immunobiologii 1990; 12: 18-21 (in Russian).

9. Lakin GF. Biometrics. Moscow: Vysshaya shkola; 1990 (in Russian).

Authors:

Research Center of Federal State Budgetary Institution «48 Central Research and Testing Institute» of the Ministry of Defence of the Russian Federation. 118 Oktyabrsky prospect, Kirov, 610000, Russian Federation.

Bagin SV. Researcher. Candidate of Technical Sciences.

Logviniv SV. Researcher. Candidate of Biological Sciences.

Leschenko AA. Leading researcher. Doctor of Technical Sciences, professor.

Teterin VV. Head of department. Candidate of Biological Sciences.

Lazykin AG. Senior researcher. Candidate of Biological Sciences, docent.

Ezhov AV. Senior researcher. Doctor of Medical Sciences.

MohovDA. Researcher. Candidate of Biological Sciences.

Biryukov VV. Head of department. Candidate of Technical Sciences.

Об авторах:

Научно-исследовательский центр Федерального государственного бюджетного учреждения «48 Центральный научно-исследовательский институт» Министерства обороны Российской Федерации. Российская Федерация, 610000, Киров, Октябрьский проспект, 118.

Багин Сергей Валерьевич. Научный сотрудник, канд. тех. наук.

Логвинов Сергей Владимирович. Научный сотрудник, канд. биол. наук.

Лещенко Андрей Анатольевич. Ведущий научный сотрудник, д-р техн. наук, профессор.

Тетерин Владимир Валентинович. Начальник отдела, канд. биол. наук.

Лазыкин Алексей Геннадьевич. Старший научный сотрудник, канд. биол. наук, доцент.

Ежов Андрей Владимирович. Старший научный сотрудник, д-р мед. наук.

Мохов Дмитрий Александрович. Научный сотрудник, канд. биол. наук.

Бирюков Василий Васильевич. Начальник отдела, канд. техн. наук.

Адрес для переписки:

Лещенко Андрей Анатольевич; Российская Федерация, 610000, Киров, Октябрьский проспект, 118.

Поступила 10.07.2013 г.

Принята 20.08.2013 г.