СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЗЪЯДЕРНЫХ ЭРИТРОИДНЫХ КЛЕТОК, ПРОИСХОДЯЩИХ ИЗ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

1. Способ получения безъядерной эритроидной клетки, полученной из плюрипотентной стволовой клетки, включающий:
получение плюрипотентной стволовой клетки; и
дифференцировку указанной плюрипотентной стволовой клетки в безъядерные эритроидные клетки путем культивирования указанной плюрипотентной стволовой клетки со стромальными клетками OP9 мыши или мезенхимальными стволовыми клетками человека (MSC).
2. Способ по п.1, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку или полученную из эмбриона клетку.
3. Способ по п.1, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку.
4. Способ по п.1, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка является клеткой человека.
5. Способ по п.1, в котором указанную плюрипотентную стволовую клетку генетически модифицируют перед дифференцировкой.
6. Способ по п.1, в котором дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки в безъядерные эритроидные клетки включает дифференцировку указанной плюрипотентной стволовой клетки в гемангиобласт, неприживающуюся гемангиоклетку или бластную клетку.
7. Способ по п.6, в котором указанный гемангиобласт, неприживающуюся гемангиоклетку или бластную клетку выращивают перед дифференцировкой в указанную безъядерную эритроидную клетку.
8. Способ по п.7, в котором указанные гемангиобласты, неприживающиеся гемангиоклетки или бластные клетки выращивают в среде Stemline II с Epo, IL-3 и SCF.
in vitro
9. Способ по п.6, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка является плюрипотентной стволовой клеткой человека и дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки человека в указанный гемангиобласт осуществляется способом, включающим:
(а) культивирование клеточной культуры, содержащей плюрипотентныую стволовую клетку человека, в бессывороточной среде в присутствии по меньшей мере одного фактора роста в количестве, достаточном для индуцирования дифференцировки указанной плюрипотентной стволовой клетки человека в эмбриоидные тельца; и
(b) добавление по меньшей мере двух факторов роста к указанной культуре, содержащей эмбриоидные тельца, и продолжение культивирования указанной культуры в бессывороточной среде, где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания указанного гемангиобласта человека в указанной культуре эмбриоидных телец,
где указанные плюрипотентные стволовые клетки человека, эмбриоидные тельца и гемангиобласты выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а) и (b) указанного способа и
где указанные по меньшей мере два фактора роста на стадии (b) включают BMP4 и VEGF.
10. Способ по п.9, в котором дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки человека в указанный гемангиобласт дополнительно включает:
(c) дезагрегирование указанных эмбриоидных телец до отдельных клеток; и
(d) добавление по меньшей мере одного фактора роста к указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки, и продолжение культивирования указанной культуры в бессывороточной среде, где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания гемангиобластов человека в указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки, и
где указанные плюрипотентные стволовые клетки человека, эмбриоидные тельца и колониеобразующие гемангиоклетки выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а)-(d) указанного способа.
11. Способ по п.9, в котором указанный фактор роста представляет собой слитый белок, содержащий HOXB4 и домен белковой трансдукции (PTD).
12. Способ по п.11, в котором указанный HOXB4 представляет собой HOXB4 млекопитающего.
13. Способ по п.12, в котором указанный HOXB4 млекопитающего представляет собой HOXB4 мыши или человека.
14. Способ по п.9, в котором указанный фактор роста выбран из группы, состоящей из фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), морфогенетических белков кости (BMP), фактора роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL) тромбопоэтина (TPO) и эритропоэтина (EPO).
15. Способ по п.14, в котором указанный фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), морфогенетический белок кости (BMP), или оба, добавляют на стадии (а) в период 0-48 ч клеточной культуры.
16. Способ по п.14, в котором указанный фактор роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL) или тромбопоэтин (TPO), или любую их комбинацию, добавляют к указанной культуре в период 48-72 ч от начала стадии (а).
17. Способ по п.9, дополнительно включающий стадию добавления эритропоэтина (EPO) на стадии (а).
18. Способ по п.10, дополнительно включающий стадию добавления эритропоэтина (EPO) на стадии (а) или (d).
in vitro
19. Способ по п.6, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка является плюрипотентной стволовой клеткой человека и дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки человека в указанную неприживающуюся гемангиоклетку осуществляют способом, включающим:
(а) культивирование клеточной культуры, содержащей указанную плюрипотентную стволовую клетку человека, в бессывороточной среде в присутствии по меньшей мере одного фактора роста в количестве, достаточном для индуцирования дифференцировки указанной плюрипотентной стволовой клетки человека в эмбриоидные тельца; и
(b) добавление по меньшей мере одного фактор роста к указанной культуре, содержащей эмбриоидные тельца, и продолжение культивирования указанной культуры в бессывороточной среде,
где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания указанной неприживающейся гемангиоклетки человека в указанной культуре эмбриоидных телец,
где указанные эмбриоидные тельца культивируют в течение 10-13 дней, и
где указанная плюрипотентная стволовая клетка человека, эмбриоидные тельца и неприживающиеся гемангиоклетки выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а) и (b) указанного способа.
20. Способ по п.19, в котором дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки в указанную неприживающуюся гемангиоклетку дополнительно включает:
(c) дезагрегирование указанных эмбриоидных телец до отдельных клеток; и
(d) добавление по меньшей мере одного фактора роста к указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки, и продолжение культивирования указанной культуры в бессывороточной среде, где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания указанной неприживающейся гемангиоклетки человека в указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки,
где указанные полученные из эмбрионов клетки, эмбриоидные тельца и неприживающиеся гемангиоклетки выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а)-(d) указанного способа.
21. Способ по п.19, в котором указанный фактор роста представляет собой слитый белок, содержащий HOXB4 и домен белковой трансдукции (PTD).
22. Способ по п.21, в котором указанный HOXB4 представляет собой HOXB4 млекопитающего.
23. Способ по п.22, в котором указанный HOXB4 млекопитающего представляет собой HOXB4 мыши или человека.
24. Способ по п.19, в котором указанный фактор роста выбран из группы, состоящей из фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), морфогенетических белков кости (BMP), фактора роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL) тромбопоэтина (TPO) и эритропоэтина (EPO).
25. Способ по п.24, в котором указанный фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), морфогенетический белок кости (BMP), или оба, добавляют на стадии (а) в период 0-48 ч клеточной культуры.
26. Способ по п.24, в котором указанный фактор роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL) или тромбопоэтин (TPO), или любую их комбинацию, добавляют к указанной культуре в период 48-72 ч от начала стадии (а).
27. Способ по п.19, дополнительно включающий стадию добавления эритропоэтина (EPO) на стадии (а).
28. Способ по п.20, дополнительно включающий стадию добавления эритропоэтина (EPO) на стадии (а) или (d).
29. Способ по п.1, в котором дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки в указанную безъядерную эритроидную клетку дополнительно включает культивирование указанной плюрипотентной стволовой клетки в культуральной среде, содержащей EPO.
30. Способ по п.29, в котором дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки в указанную безъядерную эритроидную клетку дополнительно включает:
культивирование указанной плюрипотентной стволовой клетки в культуральной среде, содержащей добавку, выбранную из группы, состоящей из инозита, фолиевой кислоты, монотиоглицерина, трансферрина, инсулина, нитрата железа, сульфата железа, BSA, L-глутамина, пенициллина-стрептомицина и их комбинаций; и
культивирование указанной плюрипотентной стволовой клетки в указанной культуральной среде, где указанная культуральная среда дополнительно содержит агент, выбранный из группы, состоящей из гидрокортизона, SCF, IL3, Epo и их комбинаций.
31. Безъядерная эритроидная клетка, полученная способом по любому из пп.1-30.
32. Способ получения эритроидной клетки, полученной из плюрипотентной стволовой клетки, включающий:
получение плюрипотентной стволовой клетки; и
дифференцировку указанной плюрипотентной стволовой клетки в эритроидную клетку путем культивирования указанной плюрипотентной стволовой клетки в среде, содержащей EPO.
33. Способ по п.32, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку или полученную из эмбриона клетку.
34. Способ по п.32, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку.
35. Способ по п.32, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка является клеткой человека.
36. Способ по п.32, в котором указанную плюрипотентную стволовую клетку генетически модифицируют перед дифференцировкой.
37. Способ по п.32, в котором дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки в эритроидную клетку включает дифференцировку указанной плюрипотентной стволовой клетки в гемангиобласт, неприживающуюся гемангиоклетку или бластную клетку.
38. Способ по п.37, в котором указанный гемангиобласт, неприживающуюся гемангиоклетку или бластную клетку выращивают перед дифференцировкой в указанную эритроидную клетку.
39. Способ по п.38, в котором указанные гемангиобласты, неприживающиеся гемангиоклетки или бластные клетки выращивают в среде Stemline II с Epo, IL-3 и SCF.
in vitro
40. Способ по п.32, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка является плюрипотентной стволовой клеткой человека и дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки человека в указанный гемангиобласт осуществляется способом, включающим:
(а) культивирование клеточной культуры, содержащей указанную плюрипотентную стволовую клетку человека, в бессывороточной среде в присутствии по меньшей мере одного фактора роста в количестве, достаточном для индуцирования дифференцировки указанной плюрипотентной стволовой клетки человека в эмбриоидные тельца; и
(b) добавление по меньшей мере двух факторов роста к указанной культуре, содержащей эмбриоидные тельца, и продолжение культивирования указанной культуры в бессывороточной среде, где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания указанного гемангиобласта человека в указанной культуре эмбриоидных телец,
где указанные плюрипотентные стволовые клетки человека, эмбриоидные тельца и гемангиобласты выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а) и (b) указанного способа и
где указанные по меньшей мере два фактора роста на стадии (b) включают BMP4 и VEGF.
41. Способ по п.40, в котором дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки человека в указанный гемангиобласт дополнительно включает:
(c) дезагрегирование указанных эмбриоидных телец до отдельных клеток; и
(d) добавление по меньшей мере одного фактора роста к указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки, и продолжение культивирования указанной культуры в бессывороточной среде, где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания гемангиобластов человека в указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки, и
где указанные плюрипотентные стволовые клетки, эмбриоидные тельца и колониеобразующие гемангиоклетки выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а)-(d) указанного способа.
42. Способ по п.40, в котором указанный фактор роста представляет собой слитый белок, содержащий HOXB4 и домен белковой трансдукции (PTD).
43. Способ по п.42, в котором указанный HOXB4 представляет собой HOXB4 млекопитающего.
44. Способ по п.43, в котором указанный HOXB4 млекопитающего представляет собой HOXB4 мыши или человека.
45. Способ по п.40, в котором указанный фактор роста выбран из группы, состоящей из фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), морфогенетических белков кости (BMP), фактора роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL) тромбопоэтина (TPO) и эритропоэтина (EPO).
46. Способ по п.45, в котором указанный фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), морфогенетический белок кости (BMP), или оба, добавляют на стадии (а) в период 0-48 ч клеточной культуры.
47. Способ по п.45, в котором указанный фактор роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL) или тромбопоэтин (TPO), или любую их комбинацию, добавляют к указанной культуре в период 48-72 ч от начала стадии (а).
48. Способ по п.40, дополнительно включающий стадию добавления эритропоэтина (EPO) на стадии (а).
49. Способ по п.41, дополнительно включающий стадию добавления эритропоэтина (EPO) на стадии (а) или (d).
in vitro
50. Способ по п.32, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка является плюрипотентной стволовой клеткой человека и дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки в указанную неприживающуюся гемангиоклетку осуществляется способом, включающим:
(а) культивирование клеточной культуры, содержащей плюрипотентные стволовые клетки человека, в бессывороточной среде в присутствии по меньшей мере одного фактора роста в количестве, достаточном для индуцирования дифференцировки указанной плюрипотентной стволовой клетки человека в эмбриоидные тельца; и
(b) добавление по меньшей мере одного фактора роста к указанной культуре, содержащей эмбриоидные тельца, и продолжение культивирования указанной культуры в бессывороточной среде,
где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания указанных неприживающихся гемангиоклеток человека в указанной культуре эмбриоидных телец,
где указанные эмбриоидные тельца культивируют в течение 10-13 дней, и
где указанная плюрипотентная стволовая клетка человека, эмбриоидные тельца и неприживающиеся гемангиоклетки выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а) и (b) указанного способа.
51. Способ по п.50, в котором дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки в указанную неприживающуюся гемангиоклетку дополнительно включает:
(c) дезагрегирование указанных эмбриоидных телец до отдельных клеток; и
(d) добавление по меньшей мере одного фактора роста к указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки, и продолжение культивирования указанной культуры в бессывороточной среде, где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания неприживающихся гемангиоклеток человека в указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки,
где указанная плюрипотентная стволовая клетка человека, эмбриоидные тельца и неприживающиеся гемангиоклетки выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а)-(d) указанного способа.
52. Способ по п.50, в котором указанный фактор роста представляет собой слитый белок, содержащий HOXB4 и домен белковой трансдукции (PTD).
53. Способ по п.52, в котором указанный HOXB4 представляет собой HOXB4 млекопитающего.
54. Способ по п.53, в котором указанный HOXB4 млекопитающего представляет собой HOXB4 мыши или человека.
55. Способ по п.50, в котором указанный фактор роста выбран из группы, состоящей из фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), морфогенетических белков кости (BMP), фактора роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL) тромбопоэтина (TPO) и эритропоэтина (EPO).
56. Способ по п.55, в котором указанный фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), морфогенетический белок кости (BMP), или оба, добавляют на стадии (а) в период 0-48 ч клеточной культуры.
57. Способ по п.55, в котором указанный фактор роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL) или тромбопоэтин (TPO), или любую их комбинацию, добавляют к указанной культуре в период 48-72 ч от начала стадии (а).
58. Эритроидная клетка, полученная любым из способов по пп.32-57.
59. Способ получения мегакариоцита или тромбоцита, включающий:
получение плюрипотентной стволовой клетки;
дифференцировку указанной плюрипотентной стволовой клетки в гемангиобласт, неприживающуюся гемангиоклетку или бластную клетку; и
дифференцировку указанного гемангиобласта, неприживающейся гемангиоклетки или бластной клетки в указанный мегакариоцит или указанный тромбоцит путем культивирования в культуральной среде для мегакариоцитов (MK), содержащей TPO.
60. Способ по п.59, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка представляет собой эмбриональную стволовую клетку или полученную из эмбриона клетку.
61. Способ по п.59, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка представляет собой индуцированную плюрипотентную стволовую клетку.
62. Способ по п.59, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка является клеткой человека.
63. Способ по п.59, в котором указанную плюрипотентную стволовую клетку генетически модифицируют перед дифференцировкой.
64. Способ по п.59, в котором указанный гемангиобласт, неприживающуюся гемангиоклетку или бластную клетку выращивают перед дифференцировкой в указанный мегакариоцит или указанный тромбоцит.
65. Способ по п.64, в котором указанные гемангиобласты, неприживающиеся гемангиоклетки или бластные клетки выращивают в среде Stemline II с Epo, IL-3 и SCF.
in vitro
66. Способ по п.59, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка является плюрипотентной стволовой клеткой человека и дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки человека в указанный гемангиобласт осуществляется способом, включающим:
(а) культивирование клеточной культуры, содержащей плюрипотентную стволовую клетку человека, в бессывороточной среде в присутствии по меньшей мере одного фактора роста в количестве, достаточном для индуцирования дифференцировки указанной плюрипотентной стволовой клетки человека в эмбриоидные тельца; и
(b) добавление по меньшей мере двух факторов роста к указанной культуре, содержащей эмбриоидные тельца, и продолжение культивирования указанной культуры в бессывороточной среде, где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания указанного гемангиобласта человека в указанной культуре эмбриоидных телец,
где указанные плюрипотентные стволовые клетки человека, эмбриоидные тельца и гемангиобласты выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а) и (b) указанного способа, и
где указанные по меньшей мере два фактора роста на стадии (b) включают BMP4 и VEGF.
67. Способ по п.66, в котором дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки человека в указанный гемангиобласт дополнительно включает:
(c) дезагрегирирование указанных эмбриоидных телец до отдельных клеток; и
(d) добавление по меньшей мере одного фактора роста к указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки, и продолжение культивирования указанной культуры в бессывороточной среде, где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания гемангиобластов человека в указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки, и
где указанные плюрипотентные стволовые клетки человека, эмбриоидные тельца и колониеобразующие гемангиоклетки выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а)-(d) указанного способа.
68. Способ по п.66, в котором указанный фактор роста представляет собой слитый белок, содержащий HOXB4 и домен белковой трансдукции (PTD).
69. Способ по п.68, в котором указанный HOXB4 представляет собой HOXB4 млекопитающего.
70. Способ по п.69, в котором указанный HOXB4 млекопитающего представляет собой HOXB4 мыши или человека.
71. Способ по п.66, в котором указанный фактор роста выбран из группы, состоящей из фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), морфогенетических белков кости (BMP), фактора роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL) тромбопоэтина (TPO) и эритропоэтина (EPO).
72. Способ по п.71, в котором указанный фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), морфогенетический белок кости (BMP), или оба, добавляют на стадии (а) в период 0-48 ч клеточной культуры.
73. Способ по п.71, в котором указанный фактор роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL) или тромбопоэтин (TPO), или любую их комбинацию, добавляют к указанной культуре в период 48-72 часов от начала стадии (а).
74. Способ по п.59, в котором дифференцировку указанного гемангиобласта, неприживающейся гемангиоклетки или бластной клетки в указанный мегакариоцит или указанный тромбоцит осуществляют после примерно 6-8 дней культуры гемангиобластов, неприживающихся гемангиоклеток или бластных клеток.
in vitro
75. Способ по п.59, в котором указанная плюрипотентная стволовая клетка является плюрипотентной стволовой клеткой человека и дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки человека в указанную неприживающуюся гемангиоклетку осуществляют способом, включающим:
(а) культивирование клеточной культуры, содержащей указанную плюрипотентную стволовую клетку человека, в бессывороточной среде в присутствии по меньшей мере одного фактора роста в количестве, достаточном для индуцирования дифференцировки указанной плюрипотентной стволовой клетки человека в эмбриоидные тельца; и
(b) добавление по меньшей мере одного фактора роста к указанной культуре, содержащей эмбриоидные тельца, и продолжение культивирования указанной культуры в бессывороточной среде,
где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания указанной неприживающейся гемангиоклетки человека в указанной культуре эмбриоидных телец,
где указанные эмбриоидные тельца культивируют в течение 10-13 дней, и
где указанные плюрипотентная стволовая клетка человека, эмбриоидные тельца и неприживающиеся гемангиоклетки выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а) и (b) указанного способа.
76. Способ по п.75, в котором дифференцировка указанной плюрипотентной стволовой клетки в указанную неприживающуюся гемангиоклетку дополнительно включает:
(c) дезагрегирование указанных эмбриоидных телец до отдельных клеток; и
(d) добавление по меньшей мере одного фактора роста к указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки, и продолжение культивирования указанной культуры в бессывороточной среде, где указанный фактор роста присутствует в количестве, достаточном для выращивания указанной неприживающейся гемангиоклетки человека в указанной культуре, содержащей указанные отдельные клетки,
где указанные полученные из эмбрионов клетки, эмбриоидные тельца и неприживающиеся гемангиоклетки выращивают в бессывороточной среде на стадиях (а)-(d) указанного способа.
77. Способ по п.75, в котором указанный фактор роста представляет собой слитый белок, содержащий HOXB4 и домен белковой трансдукции (PTD).
78. Способ по п.77, в котором указанный HOXB4 представляет собой HOXB4 млекопитающего.
79. Способ по п.78, в котором указанный HOXB4 млекопитающего представляет собой HOXB4 мыши или человека.
80. Способ по п.75, в котором указанный фактор роста выбран из группы, состоящей из фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF), морфогенетических белков кости (BMP), фактора роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL) тромбопоэтина (TPO) и эритропоэтина (EPO).
81. Способ по п.80, в котором указанный фактор роста сосудистого эндотелия (VEGF), морфогенетический белок кости (BMP), или оба, добавляют на стадии (а) в период 0-48 ч клеточной культуры.
82. Способ по п.80, в котором указанный фактор роста стволовых клеток (SCF), Flt-3L (FL) или тромбопоэтин (TPO), или любую их комбинацию, добавляют к указанной культуре в период 48-72 ч от начала стадии (а).
83. Мегакариоцит или тромбоцит, полученный способом по любому из пп.59-82.