БЕСКЛЕТОЧНАЯ ПРОДУКЦИЯ РИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

1. Бесклеточный способ биосинтезирования рибонуклеиновой кислоты (РНК), предусматривающий:
(a) инкубирование смеси клеточного лизата, которая содержит РНК и по меньшей мере одну молекулу с ферментативной активностью, выбранную из группы, состоящей из молекул с ферментативной активностью, которые деполимеризируют РНК, термостабильных молекул с киназной активностью и термостабильных молекул с РНК-полимеразной активностью, в условиях, которые обеспечивают в результате деполимеризацию РНК, с получением смеси клеточного лизата, которая содержит нуклеозидмонофосфаты;
(b) нагревание смеси клеточного лизата, полученной на стадии (а), до температуры, которая обеспечивает инактивацию или частичную инактивацию эндогенных нуклеаз и фосфатаз без полного инактивирования термостабильных молекул с киназной активностью и термостабильных молекул с РНК-полимеразной активностью, с получением смеси клеточного лизата, которая содержит термоинактивированные нуклеазы и фосфатазы; и
(c) инкубирование смеси клеточного лизата, полученной на стадии (b), в присутствии источника энергии и матрицы в виде дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), кодирующей представляющую интерес РНК, в условиях, которые обеспечивают в результате продукцию нуклеозидтрифосфатов и полимеризацию нуклеозидтрифосфатов с получением смеси клеточного лизата, которая содержит представляющую интерес РНК.
2. Способ по п. 1, в котором смесь клеточного лизата содержит один клеточный лизат, полученный из клеток, которые содержат РНК и экспрессируют по меньшей мере один фермент или слитый фермент, который действует как рибонуклеаза, действует как киназа и/или действует как РНК-полимераза.
3. Способ по п. 1, в котором смесь клеточного лизата содержит по меньшей мере два клеточных лизата, где по меньшей мере один клеточный лизат получен из клеток, которые содержат РНК, и по меньшей мере один клеточный лизат получен из клеток, которые экспрессируют по меньшей мере один фермент или слитый фермент, который действует как нуклеаза, действует как киназа и/или действует как РНК-полимераза.
4. Способ по любому из пп. 1-3, в котором РНК на стадии (а) представляет собой матричную РНК (мРНК), транспортную РНК (тРНК) или рибосомальную РНК (рРНК).
5. Способ по любому из пп. 1-4, в котором смесь клеточного лизата содержит по меньшей мере одну рибонуклеазу, по меньшей мере одну термостабильную киназу и/или по меньшей мере одну термостабильную РНК-полимеразу.
6. Способ по п. 5, в котором по меньшей мере одна рибонуклеаза выбрана из группы, состоящей нуклеазы S1, нуклеазы Р1, РНКазы II, РНКазы III, РНКазы R, РНКазы JI, NucA, РЫРазы, РНКазы Т, РНКазы Е и РНКазы G.
7. Способ по п. 6, в котором по меньшей мере одна рибонуклеаза представляет собой РНКазу R Escherichia coli.
8. Способ по любому из пп. 5-7, в котором по меньшей мере одна термостабильная киназа выбрана из группы, состоящей из термостабильных нуклеозидмонофосфаткиназ, термостабильных нуклеозиддифосфаткиназ и термостабильных полифосфаткиназ.
9. Способ по п. 8, в котором термостабильные нуклеозидмонофосфаткиназы выбраны из группы, состоящей из термостабильных уридилаткиназ, термостабильных цитидилаткиназ, термостабильных гуанилаткиназ и термостабильных аденилаткиназ.
10. Способ по п. 9, в котором термостабильные нуклеозидмонофосфаткиназы выбраны из группы, состоящей из термостабильных уридилаткиназ Pyrococcus furiosus, кодируемых геном pyrH (PfPyrH), термостабильных аденилаткиназ Thermus thermophilus, кодируемых геном adk (TthAdk), термостабильных цитидилаткиназ Thermus thermophilus, кодируемых геном cmk (TthCmk), и термостабильных гуанилаткиназ Thermotoga maritima, кодируемых геном gmk (TmGmk).
11. Способ по любому из пп. 8-10, в котором термостабильные нуклеозиддифосфаткиназы выбраны из группы, состоящей из термостабильных нуклеозиддифосфаткиназ, кодируемых геном ndk Aquifex aeolicus.
12. Способ по любому из пп. 8-10, в котором термостабильные полифосфаткиназы выбраны из группы, состоящей из термостабильных ферментов полифосфаткиназы 1 (РРК1), и термостабильных ферментов полифосфаткиназы 2 (РРК2).
13. Способ по п. 12, в котором термостабильные ферменты РРК1 выбраны из группы, состоящей из термостабильных ферментов РРК1 Thermosynechococcus elongatus.
14. Способ по п. 12 или 13, в котором термостабильные ферменты РРК2 выбраны из группы, состоящей из термостабильных ферментов РРК2 класса III.
15. Способ по п. 14, в котором термостабильные ферменты РРК2 класса III выбраны из группы, состоящей из ферментов РРК2 Meiothermus ruber, Meiothermus silvanus, Deinococcus geothermalis, Thermosynechococcus elongates, Anaerolinea thermophila, Caldilinea aerophila, Chlorobaculum tepidum, Oceanithermus profundus, Roseiflexus castenholzii, Roseiflexus sp.и Truepera radiovictrix.
16. Способ по п. 15, в котором термостабильные ферменты РРК2 класса III выбраны из группы, состоящей из термостабильных ферментов РРК2 класса III, которые содержат аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична аминокислотной последовательности, представленной в любом из SEQ ID NO: 8-18.
17. Способ по п. 16, в котором термостабильные ферменты РРК2 класса III выбраны из группы, состоящей из термостабильных ферментов РРК2 класса III, которые содержат аминокислотную последовательность, которая является идентичной аминокислотной последовательности, представленной в любом из SEQ ID NO: 8-18.
18. Способ по любому из пп. 1-17, в котором смесь клеточного лизата содержит по меньшей мере одну рибонуклеазу, по меньшей мере одну термостабильную нуклеозидмонофосфаткиназу, по меньшей мере одну термостабильную нуклеозиддифосфаткиназу и по меньшей мере одну полифосфаткиназу.
19. Способ по любому из пп. 5-18, в котором по меньшей мере одна термостабильная РНК-полимераза выбрана из группы, состоящей из термостабильных ДНК-зависимых РНК-полимераз.
20. Способ по п. 19, в котором термостабильные ДНК-зависимые РНК-полимеразы выбраны из группы, состоящей из термостабильных Т7 РНК-полимераз, термостабильных SP6 РНК-полимераз и термостабильных Т3 РНК-полимераз.
21. Способ по п. 20, в котором по меньшей мере одна термостабильная РНК-полимераза представляет собой термостабильную Т7 РНК-полимеразу.
22. Способ по любому из пп. 1-21, в котором источником энергии является аденозинтрифосфат (АТФ).
23. Способ по любому из пп. 1-21, в котором источником энергии является система регенерации АТФ.
24. Способ по п. 23, в котором система регенерации АТФ предусматривает полифосфат, необязательно гексаметафосфат, нуклеозидмонофосфаты и полифосфаткиназу.
25. Способ по любому из пп. 1-24, в котором источник энергии или по меньшей мере один компонент источника энергии добавляют к смеси клеточного лизата со стадии (с).
26. Способ по любому из пп. 1-25, в котором по меньшей мере один очищенный фермент или слитый фермент добавляют к смеси клеточного лизата со стадии (а), и в котором по меньшей мере один очищенный фермент или слитый фермент обладает ферментативной активностью, выбранной из группы, состоящей из видов ферментативной активности, которые обеспечивают деполимеризацию РНК, видов активности, присущей термостабильной киназе, и видов активности, присущей термостабильной РНК-полимеразе, в условиях, которые обеспечивают в результате деполимеризацию РНК, с получением смеси клеточного лизата, которая содержит нуклеозидмонофосфаты.
27. Способ по любому из пп. 1-26, в котором по меньшей мере один очищенный фермент или слитый фермент добавляют к смеси клеточного лизата со стадии (с), и в котором по меньшей мере один очищенный фермент или слитый фермент обладает ферментативной активностью, выбранной из группы, состоящей из видов ферментативной активности, которые обеспечивают деполимеризацию РНК, видов активности, присущей термостабильной киназе, и видов активности, присущей термостабильной РНК-полимеразе, в условиях, которые обеспечивают в результате деполимеризацию РНК, с получением смеси клеточного лизата, которая содержит нуклеозидмонофосфаты.
28. Способ по любому из пп. 1-27, в котором смесь клеточного лизата со стадии (а) содержит ДНК-матрицу, кодирующую представляющую интерес РНК.
29. Способ по любому из пп. 1-27, в котором ДНК-матрицу, кодирующую представляющую интерес РНК, добавляют к смеси клеточного лизата со стадии (с).
30. Способ по любому из пп. 1-29, в котором представляющей интерес РНК является однонитевая РНК.
31. Способ по п. 30, в котором однонитевая РНК представляет собой матричную РНК (мРНК).
32. Способ по п. 30, в котором однонитевая РНК представляет собой антисмысловую РНК.
33. Способ по любому из пп. 1-29, в котором представляющей интерес РНК является двунитевая РНК.
34. Способ по п. 33, в котором двунитевая РНК представляет собой малую интерферирующую РНК (siRNA) или короткую РНК, образующую шпильки (shRNA).
35. Способ по любому из пп. 1-29, в котором представляющей интерес РНК является однонитевая РНК, содержащая комплементарные домены, связанные друг с другом посредством шарнирного домена.
2+
36. Способ по любому из пп. 1-35, в котором смесь клеточного лизата со стадии (а) дополнительно содержит Mg-хелатирующее средство.
2+
37. Способ по п. 36, в котором Mg-хелатирующее средство представляет собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).
2
4
38. Способ по любому из пп. 1-37, в котором смесь клеточного лизата со стадии (а) дополнительно содержит хлорид марганца (MgCl) и/или сульфат магния (MgSO).
39. Способ по любому из пп. 1-38, в котором температура на стадии (b) составляет 50°С-80°С.
40. Способ по любому из пп. 1-39, в котором представляющую интерес РНК получают в концентрации по меньшей мере 1 г/л.
41. Способ по п. 40, в котором представляющую интерес РНК получают в концентрации по меньшей мере 5 г/л.
42. Способ по п. 40, в котором представляющую интерес РНК получают в концентрации по меньшей мере 10 г/л.
43. Способ по любому из пп. 1-42, дополнительно предусматривающий очистку представляющей интерес РНК, необязательно путем объединения термоинактивированной смеси клеточного лизата со средством, осаждающим белок, и удаления осажденного белка, липидов и ДНК.
44. Способ по любому из пп. 1-43, в котором клетки представляют собой клетки бактерий.
45. Способ по п. 44, в котором клетки бактерий представляют собой клетки Escherichia coli.
46. Способ по любому из пп. 1-43, в котором клетки представляют собой клетки дрожжей.
47. Способ, предусматривающий: культивирование в среде для культивирования клеток (а) клеток, которые содержат РНК, и (b) клеток, которые содержат по меньшей мере одну рибонуклеазу, по меньшей мере одну термостабильную киназу и необязательно по меньшей мере одну термостабильную РНК-полимеразу.
48. Способ по п. 47, дополнительно предусматривающий лизирование клеток из (а) и (b) с получением клеточных лизатов и объединение клеточных лизатов с получением смеси, предусматривающей несколько видов ферментативной активности; или объединение клеток из (а) и (b) и лизирование объединенных клеток с получением смеси, предусматривающей несколько видов ферментативной активности.
49. Способ по п. 48, дополнительно предусматривающий нагревание клеточного лизата до температуры, которая обеспечивает инактивацию или частичную инактивацию эндогенных нуклеаз и фосфатаз без полного инактивирования термостабильных киназ, с получением термоинактивированного клеточного лизата.
50. Способ по п. 49, дополнительно предусматривающий инкубирование термоинактивированного клеточного лизата в присутствии источника энергии и матрицы в виде дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), кодирующей представляющую интерес РНК, в условиях, которые обеспечивают в результате продукцию нуклеозидтрифосфатов и полимеризацию нуклеозидтрифосфатов, с получением смеси клеточного лизата, которая содержит представляющую интерес РНК.
51. Сконструированная клетка, содержащая по меньшей мере одну термостабильную нуклеозидмонофосфаткиназу, по меньшей мере одну термостабильную нуклеозиддифосфаткиназу и по меньшей мере одну термостабильную полифосфаткиназу.
52. Клетка по п. 51, дополнительно содержащая по меньшей мере одну рибонуклеазу и/или по меньшей мере одну термостабильную РНК-полимеразу.
53. Клеточный лизат, содержащий нуклеозидтрифосфаты, дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), кодирующую представляющую интерес рибонуклеиновую кислоту (РНК), и молекулу с РНК-полимеразной активностью.
54. Клеточный лизат по п. 53, дополнительно содержащий источник энергии, нуклеозидмонофосфаты и по меньшей мере одну молекулу с киназной активностью, которая прямо или опосредованно катализирует превращение 5'-нуклеозидмонофосфатов в 5'-нуклеозидтрифосфаты.
55. Клеточный лизат по п. 53 или 54, дополнительно содержащий полимерную РНК и молекулу с ферментативной активностью, которая деполимеризирует РНК.
56. Клеточный лизат по любому из пп. 53-55, где клеточный лизат и/или по меньшей мере один компонент клеточного лизата получены из сконструированных клеток.
57. Клеточный лизат по любому из пп. 53-56, где клеточный лизат и/или по меньшей мере один компонент клеточного лизата получены из клеток бактерий.
58. Клеточный лизат по п. 57, где клетки бактерий представляют собой клетки Escherichia coli.
59. Клеточный лизат по любому из пп. 53-58, где клеточный лизат получен из клеток, которые содержат РНК и экспрессируют по меньшей мере один фермент или слитый фермент, который действует как рибонуклеаза, действует как киназа и/или действует как РНК-полимераза.
60. Клеточный лизат по любому из пп. 53-58, где клеточный лизат предусматривает смесь по меньшей мере двух клеточных лизатов, где по меньшей мере один клеточный лизат получен из клеток, которые содержат РНК, и по меньшей мере один клеточный лизат получен из клеток, которые экспрессируют по меньшей мере один фермент или слитый фермент, который действует как нуклеаза, действует как киназа и/или действует как РНК-полимераза.
61. Клеточный лизат по любому из пп. 55-60, где полимерная РНК представляет собой матричную РНК (мРНК), транспортную РНК (тРНК) или рибосомальную РНК (рРНК).
62. Клеточный лизат по любому из пп. 53-61, где клеточный лизат содержит по меньшей мере одну рибонуклеазу, по меньшей мере одну киназу и/или по меньшей мере одну РНК-полимеразу.
63. Клеточный лизат по п. 62, где по меньшей мере одна рибонуклеаза выбрана из группы, состоящей нуклеазы S1, нуклеазы Р1, РНКазы II, РНКазы III, РНКазы R, РНКазы JI, NucA, PNPasbi, РНКазы Т, РНКазы Е и РНКазы G.
64. Клеточный лизат по п. 63, где по меньшей мере одна рибонуклеаза представляет собой РНКазу R Escherichia coli.
65. Клеточный лизат по любому из пп. 62-64, где по меньшей мере одна киназа представляет собой по меньшей мере одну термостабильную киназу и/или по меньшей мере одна РНК-полимераза представляет собой по меньшей мере одну термостабильную РНК-полимеразу.
66. Клеточный лизат по любому из пп. 62-65, где по меньшей мере одна киназа выбрана из группы, состоящей из нуклеозидмонофосфаткиназ, нуклеозиддифосфаткиназ и полифосфаткиназ.
67. Клеточный лизат по п. 65, где нуклеозидмонофосфаткиназы выбраны из группы, состоящей из уридилаткиназ, цитидилаткиназ, термостабильных гуанилаткиназ и аденилаткиназ.
68. Клеточный лизат по п. 67, где нуклеозидмонофосфаткиназы выбраны из группы, состоящей из уридилаткиназ Pyrococcus furiosus, кодируемых геном pyrH (PfPyrH), аденилаткиназ Thermus thermophilus, кодируемых геном adk (TthAdk), цитидилаткиназ Thermus thermophilus, кодируемых геном cmk (TthCmk), и гуанилаткиназ Thermotoga maritima, кодируемых геном gmk (TmGmk).
69. Клеточный лизат по любому из пп. 66-68, где нуклеозиддифосфаткиназы выбраны из группы, состоящей из нуклеозиддифосфаткиназ, кодируемых геном ndk Aquifex aeolicus.
70. Клеточный лизат по любому из пп. 66-69, где полифосфаткиназы выбраны из группы, состоящей из ферментов полифосфаткиназы 1 (РРК1) и ферментов полифосфаткиназы 2 (РРК2).
71. Клеточный лизат по п. 70, где ферменты РРК1 выбраны из группы, состоящей из ферментов РРК1 Thermosynechococcus elongatus.
72. Клеточный лизат по п. 70 или 71, где ферменты РРК2 выбраны из группы, состоящей из ферментов РРК2 класса III.
73. Клеточный лизат по п. 72, где ферменты РРК2 класса III выбраны из группы, состоящей из ферментов РРК2 Meiothermus ruber, Meiothermus silvanus, Deinococcus geothermalis, Thermosynechococcus elongates, Anaerolinea thermophila, Caldilinea aerophila, Chlorobaculum tepidum, Oceanithermus profundus, Roseiflexus castenholzii, Roseiflexus sp.и Truepera radiovictrix.
74. Клеточный лизат по п. 72 или 73, где ферменты РРК2 класса III выбраны из группы, состоящей из ферментов РРК2 класса III, которые содержат аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70% идентична аминокислотной последовательности, представленной в любом из SEQ ID NO: 8-18.
75. Клеточный лизат по п. 74, где ферменты РРК2 класса III выбраны из группы, состоящей из ферментов РРК2 класса III, которые содержат аминокислотную последовательность, которая является идентичной аминокислотной последовательности, представленной в любом из SEQ ID NO: 8-18.
76. Клеточный лизат по любому из пп. 53-75, где смесь клеточного лизата содержит по меньшей мере одну рибонуклеазу, по меньшей мере одну термостабильную нуклеозидмонофосфаткиназу, по меньшей мере одну термостабильную нуклеозиддифосфаткиназу и по меньшей мере одну полифосфаткиназу.
77. Клеточный лизат по любому из пп. 62-76, где по меньшей мере одна РНК-полимераза выбрана из группы, состоящей из ДНК-зависимых РНК-полимераз.
78. Клеточный лизат по п. 77, где ДНК-зависимые РНК-полимеразы выбраны из группы, состоящей из Т7 РНК-полимераз, SP6 РНК-полимераз и Т3 РНК-полимераз.
79. Клеточный лизат по п. 78, где по меньшей мере одна РНК-полимераза представляет собой Т7 РНК-полимеразу.
80. Клеточный лизат по любому из пп. 54-79, где источником энергии является аденозинтрифосфат (АТФ).
81. Клеточный лизат по любому из пп. 54-79, где источником энергии является система регенерации АТФ.
82. Клеточный лизат по п. 81, где система регенерации АТФ содержит полифосфат, необязательно гексаметафосфат, нуклеозидмонофосфаты и полифосфаткиназу.
83. Клеточный лизат по любому из пп. 53-82, где представляющей интерес РНК является однонитевая РНК.
84. Клеточный лизат по п. 83, где однонитевая РНК представляет собой матричную РНК (мРНК).
85. Клеточный лизат по п. 84, где однонитевая РНК представляет собой антисмысловую РНК.
86. Клеточный лизат по любому из пп. 53-82, где представляющей интерес РНК является двунитевая РНК.
87. Клеточный лизат по п. 86, где двунитевая РНК представляет собой малую интерферирующую РНК (siRNA) или короткую РНК, образующую шпильки (shRNA).
88. Клеточный лизат по любому из пп. 53-82, где представляющей интерес РНК является однонитевая РНК, содержащая комплементарные домены, связанные друг с другом посредством шарнирного домена.