КОМПОЗИЦИЯ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
COMPOSITION OF INDIVIDUAL PROTEOLYTIC FERMENTS

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению композиции индивидуальных ферментов, обладающих широким спектром протеолитической активности, что делает композицию способной гидролизовать белковые субстраты вплоть до индивидуальных аминокислот.
В состав композиции входят протеолитические ферменты (эндо- и экзопептидазы), которые четко индивидуализированы, включая N-концевую последовательность и молекулярный вес, и характеризуются высокой активностью по отношению к многим пептидным и белковым субстратам, в том числе коллагенам различных типов.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Протеолитические ферменты выполняют многие физиологические функции, от переваривания белка до более специфичных, таких как активация зимогенов и системы комплемента, участвуют в процессе свертывания белка и лизисе сгустков фибрина, созревании гормонов и биологически активных пептидов из белков-предшественников и транспорте белков через клеточные мембраны. Сравнение аминокислотных последовательностей, трехмерных структур и механизмов ферментативных реакций позволяет разделить протеолитические ферменты на несколько групп.
Классификация протеолитических ферментов, основанная на их механизме катализа, позволяет выделить 4 класса: сериновые протеазы; металлопротеазы; тиоловые (цистеиновые) и кислые (аспарагиновые) протеазы. Эти протеазы отличаются по чувствительности к различным ингибиторам, например, сериновые протеазы ингибируются фенилметилсульфонилфторидом (PMSF) и диизопропилфторфосфатом (DFP); металлопротеазы - хелатирующими агентами, такими, как ЭДТА, ЭГТА, о-фенантролин; цистеиновые протеазы - йодоацетамидом и тяжелыми металлами и аспарагиновые - пепстатином. Сериновые протеазы обычно имеют слабощелочной оптимум рН, металлопротеазы - нейтральный, а цистеиновые и аспарагиновые протеазы - кислый.
Скорость гидролиза определенной пептидной связи большинством протеаз зависит, как правило, от субстратной специфичности фермента, пространственной доступности данной пептидной связи (особенно в случае, если субстратом является нативный, а не денатурированный белок) и не зависит от размеров молекулы субстрата (от длины полипептидной цепи). Субстратная специфичность заключается в способности данного фермента с наибольшей скоростью гидролизовать пептидные связи между определенными аминокислотными остатками.
Характерными представителями самого многочисленного класса сериновых протеаз являются пищеварительные протеазы млекопитающих, имеющие сходные между собой аминокислотные последовательности и пространственные структуры, способные гидролизовать субстраты до мелких фрагментов и различающиеся по типу расщепляемой пептидной связи. Так, химотрипсин гидролизует пептидные связи с участием аминокислот с ароматическими боковыми цепями, трипсин - положительно заряженными, эластаза - аминокислотными остатками глицина, в меньшей степени - лейцина. Механизм наблюдаемой специфичности обусловлен различиями в строении активных центров протеолитических ферментов.
Протеолитические ферменты, обладающие узкой субстратной специфичностью, используются в молекулярной биологии в качестве инструментов для изучения первичной структуры белков и пептидов, а также сами протеазы являются удобными объектами для изучения структуры белков и механизмов их функционирования. Многие протеазы, такие как трипсин, химотрипсин, папаин и другие служат активным началом многих лекарственных средств, используются в косметологии и ветеринарии.
Известны сериновые протеазы, выделенные из пищеварительных органов беспозвоночных и рыб (Zwilling R., et аl., 1975 г, FEBS Lett. 60, 247-9; Gran G.A., et al., 1981 г., Methods Enzymol 80, 722-734; Reeck G.R. and H. Neurath. 1972 г., Biochem. 11: 503-510, O.A.Klimova, et al., 1990 г., BBRC, v.166, N3, 1411-1420).
Сходные между собой N-концевые аминокислотные последовательности этих ферментов позволяют классифицировать их как сериновые протеазы. Изучение субстратной специфичности показывает, что, в отличие от пищеварительных протеаз млекопитающих, они способны гидролизовать более широкий спектр субстратов, например, коллагены различных типов, которые, вследствие особенностей аминокислотной последовательности и пространственной структуры, устойчивы к действию большинства протеаз и доступны для гидролиза только специфическими ферментами - коллагеназами.
Истинные коллагеназы (тканевые и микробного происхождения), относящиеся к классу металлопротеаз, расщепляют нативный коллаген в одной точке одной из трех полипептидных цепей основного структурного элемента нативного коллагена - тропоколлагена.
3
В отличие от истинных коллагеназ сериновые протеазы беспозвоночных расщепляют все три полипептидных цепи тропоколлагена, причем образующиеся пептиды подвергаются дальнейшему гидролизу вплоть до индивидуальных аминокислот, которые либо включаются в процессы анаболизма, либо быстро выводятся из организма, не вызывая интоксикации. Очевидно, что способность сериновых протеаз беспозвоночных и рыб гидролизовать широкий спектр субстратов связана с особенностями строения не только их активных центров, но и структурой субстрат связывающих участков - вторичные взаимодействия субстрата с субстрат связывающим участком вносят существенный вклад в увеличение каталитической активности. Таким образом, активность этих протеаз по гидролизу длинных полипептидов выше, а коротких синтетических субстратов ВАЕЕ, ВТЕЕ и Ac(Ala)pNA гораздо ниже, чем у трипсина, химотрипсина и эластазы, соответственно.
Однако в ряде случаев стоит задача тотального протеолиза различных белковых субстратов, вплоть до индивидуальных аминокислот, с тем, чтобы полученные при этом аминокислоты могли использоваться в процессах анаболизма как строительные блоки.
Известен ферментный препарат коллаза (Collasum), представляющий собой смесь двух изоферментов сериновой коллагенолитической протеазы А и С (Патент РФ №2121503 от 1996.09.05, МПК: C12N 9/48; 9/64), обладающий некролитической активностью, а также фибринолитическими и тромболитическими свойствами. Однако, смесь этих двух протеаз не способна полностью гидролизовать многие полипептидные субстраты, например коллагеновые волокна гидролизуются лишь частично, и раны, содержащие частично поврежденные коллагеновые волокна, очистить с помощью коллазы представляется проблематичным.
В патентах США №4.801.451 и 4.963.491 заявлена смесь экзо- и эндопептидаз, выделенных из антарктического криля, и использование этой смеси в виде очищенного раствора, а в патенте №4801451 заявляется использование этих ферментов для очищения гнойно-некротической ткани из ран.
Однако в этих патентах заявлены неочищенные и плохо охарактеризованные вещества. Сами авторы называют их «мультифункциональными протеолитическими ферментами», что, по определению, означает их неспецифичность и неизвестность механизма действия.
Наиболее близка к заявляемой нами композиции смесь сериновых протеаз, полученных из рыб (атлантической трески), патент РФ на изобретение №2264824. В этом патенте заявлены фармацевтически и/или косметически активные композиции, содержащие в качестве активного компонента трипсины и химотрипсины, полученные из трески, а именно атлантической трески. Существуют три основных изоформы трипсина в атлантической треске, которые уже очищены и охарактеризованы. Они были названы трипсин I, II и III (Asgeirsson et al., Eur. J. Biochem. 180:85-94, 1989 г.). Трипсины трески имеют N-концевую последовательность I-V-G-G-Y-Q/E-C-E/T-K/R-H-S-Q-A-H-Q-V-S-L-N-S, тогда как трипсины млекопитающих, например бычий трипсин, имеют N-концевую последовательность I-V-G-G-Y-T-C-G-A-N-T-V-P-Y-Q-V-S-L-N-S. Все три изоформы трипсина трески имеют сходную молекулярную массу около 24 кДа.
Однако известно, что сериновые протеазы являются эндопептидазами и гидролизуют полипептидные субстраты до состояния мелких пептидов, но не до индивидуальных аминокислот, кроме того, они не способны гидролизовать ряд субстратов, например нативный коллаген, что сужает возможности дальнейшего применения такой ферментной композиции.
Задача данного изобретения состоит в создании композиции, состоящей из протеолитических ферментов, которая обладает активностью, стабильностью в широких температурном и рН диапазонах и устойчивостью к автолизу и предназначена для широкого использования в диагностических, терапевтических целях, в косметологии и фармакологии, а также в биотехнологии.
В результате исследований авторов из пищеварительных органов гидробионтов были получены природные комплексы протеолитических ферментов (протеаз) с молекулярными массами 100-11 килодальтон. С помощью комбинации хроматических методов из протеолитических комплексов были выделены и очищены до гомогенного состояния индивидуальные компоненты с молекулярными массами 23-26 килодальтон со следующими N-концевыми аминокислотными последовательностями:
I V G G T E V T P G E I P Y Q L S L Q D -
I V G G T E V T P G E I P Y Q L S F Q D -
I V G G Q E A S P G S W P X Q V G L F F -
I V G G S E A T S G Q F P Y Q X S F Q D -
I V G G Q E A T P H T W V H Q V A L F I -
I V G G Q E A T P H T X V H Q V A L F I -
A M D X T A Y X D Y D E I Q A X L K G L -
A F D X T N Y N T F E E I N S I L D G V -
A A I L G D E Y L X S G G V V P Y V F G -
Созданные на основе комплексов протеаз и/или индивидуальных компонентов с молекулярными массами 23-36 килодальтон новые протеолитические композиции по сравнению с ранее известными обладают более высокой ферментативной активностью и глубиной гидролиза по отношению к многим пептидным и белковым субстратам (в том числе коллагенам различных типов).
Ниже приведены примеры составов композиций с перечисленными выше компонентами.
Компоненты композиции с молекулярным весом 100-37 и 22-11 кДальтон идентифицировали методом электрофореза в полиакриамидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях (в присутствии додецилсульфата натрия); N-концевые аминокислотные последовательности не определяли в связи с незначительным содержанием компонентов в композиции. Процентное содержание компонентов в композиции определяли по окраске электрофореграммы в ПААГ с последующим сканированием геля. Для этого по завершении электофореза гель фиксировали в 5%-ном растворе трихлоруксусной кислоты, окрашивали раствором Coomassie R-250 по стандартной методике (Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981 г., 288 с.) и проводили денситометрический анализ с помощью системы гель-документации Biometra, Германия (кат. №035-300), которая обеспечивает компьютерное считывание информации по оптической плотности предварительно окрашенного геля, анализ и хранение результатов.
Таблица 1
Примеры состава композиций на основе индивидуальных протеолитических ферментов
Молекулярный вес индивидуального протеолитического фермента-компонента композиции, кДальтон
N-концевая аминокислотная последовательность
Содержание компонента в композиции, %
примеры:
1
2
3
100-37
0,6
0,3
-
36
I V G G T E V T P G E I P Y Q L S L Q D -
6,0
11,0
13,0
35-II
I V G G T E V T P G E I P Y Q L S F Q D -
22,0
20,0
34,0
28
I V G G Q E A S P G S W P X Q V G L F F -
13,0
11,0
8,0
25-I
I V G G S E A T S G Q F P Y Q X S F Q D -
12,0
9,0
-
25-II
I V G G Q E A T P H T W V H Q V A L F I -
6,0
6,0
-
25-III
I V G G Q E A T P H T X V H Q V A L F I -
14,0
14,0
5,0
32
A M D X T A Y X D Y D E I Q A X L K G L -
6,0
4,0
40,0
35-I
A F D X T N Y N T F E E I N S I L D G V -
4,0
4,0
23
A A I L G D E Y L X S G G V V P Y V F G -
15,0
20,0
22-11
1,4
0,7
Предлагаемые варианты композиций протеолитических ферментов в процессе исследований показали более высокую ферментативную активность и отсутствие аллергических реакций при длительном применении. Преимущества заявляемой композиции (в частности, глубина протеолиза) подтверждаются результатами сравнительных испытаний композиций с различным содержанием компонентов (по примерам 1 и 3 таблицы 1) при воздействии на коллаген I типа (таблица 2). Испытания композиции по примеру 2 из таблицы 1 дали результаты, сходные с результатами композиции по примеру 1, поэтому в таблицу 2 они не включены.
2
В пластиковую пробирку типа «Эппендорф» с отрезанной крышкой помещали 200 мкл растворимого коллагена из кожи КРС (Sigma №С 8919), диализовали против дистиллированной воды в течение 12 часов при +40°С, добавляли 300 мкл 0.05 М раствора TES с 0.36 mM CaCl, pH 7.5, перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 15 мин, затем добавляли 10 мкл раствора композиции протеолитических ферментов. Аликвоты реакционной смеси по 50 мкл отбирали автоматической пипеткой через интервалы времени, указанные в таблице, и переносили в пластиковые пробирки типа «Эппендорф», содержащие по 10 мкл 50%-ного (W/V) раствора трихлоруксусной кислоты, замораживали при -70°С в течение 1 часа, оттаивали и центрифугировали при 5000 g в течение 5 минут. Супернатанты осторожно и тщательно удаляли, осадки растворяли в 10 мкл 2%-ного раствора додецилсульфата натрия, добавляли к каждой пробе по 20 мкл буферного раствора для приготовления образцов, а затем анализировали образцы методом электрофореза в полиакриламидном геле по методу Laemmli (Nature (1970) 277, 680).
Гель окрашивали 0,2% раствором Coomassie R-250 в 25% растворе изопропанола и 10% уксусной кислоты, отмывали 7% раствором уксусной кислоты и высушивали.
Электрофореграмму анализировали, и процентное содержание фрагментов оценивали методом денситометрии окрашенного геля (Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96).
Таблица 2
Эффект воздействия композиции протеолитических ферментов на коллаген I типа из кожи КРС
Время воздействия, мин
5
10
15
30
60
90
120
Размер фрагментов коллагена, кДа
Композиция № (№ примера из Таблицы 1)
1
3
1
3
1
3
1
3
1
3
1
3
1
3
200-350
92%
92%
88%
92%
48%
88%
80%
80%
0%
76%
0%
70%
0%
67%
100-200
6%
8%
10%
8%
22%
10%
20%
12%
8%
12%
0%
12%
0%
10%
70-100
2%
0
1%
0
18%
2%
34%
6%
18%
6%
4%
8%
0%
10%
45-70
0
0
1%
0
10%
0
32%
2%
31%
6%
16%
6%
1%
5%
25-45
0
0
0
0
1%
0
4%
0
28%
0
24%
3%
0
6%
10-25
0
0
0
0
1%
0
1%
0
8%
0
39%
0
12%
0
0-10
0
0
0
0
0%
0
1%
0%
7%
0
10%
1%
87%
2%
Различия в динамике накопления низкомолекулярных составляющих в продуктах гидролиза коллагена I типа позволяют, составляя композицию на основе индивидуальных протеолитических ферментов в зависимости от конкретной задачи, регулировать скорость и глубину гидролиза белковых субстратов.
Гепатоциты из печени взрослого человека и эмбриона (5-8 недель) получали по стандартной методике. Полученный осадок собрали и ресуспендировали в 1%-ном альбуминовом гидролизате. Для подсчета живых клеток отобрали 1 мл клеточной взвеси, содержание интактных клеток определяли по окрашиванию 0,2%-ным раствором трипанового синего с последующим микроскопированием.
Таблица 3.
Действие композиции протеолитических ферментов на гепатоциты человека.
Печень, использованная для выделения гепатоцитов
Протеолитический фермент, использованный для дезагрегации ткани печени (концентрация в растворе)
Трипсин (Sigma, Т 7409), 0,1% р-р
Коллагеназа (Sigma, C 9407), 0,05% р-р
Композиция индивидуальных протеолитических ферментов 0,01% р-р
+4°С
+16°С
+4°С
+16°С
+4°С
+16°С
Печень взрослого человека
Общий выход гепатоцитов, %
19,02
36,43
19,28
44,22
54,31
58,45
Содержание живых гепатоцитов, %
54,11
41,37
70,51
47,22
88,29
70,14
Печень эмбриона (5-8 недель)
Общий выход гепатоцитов, %
24,33
38,41
29,52
36,29
55,90
56,46
Содержание живых гепатоцитов, %
58,62
52,49
76,11
52,12
92,22
77,72
Выявленные преимущества новой композиции протеолитических ферментов позволили использовать ее в медицине для коррекции, лечения и профилактики развития патологических (гипертрофических и келоидных) рубцов кожи, спаек, а также для лечения ран различного генеза (раны, ожоги, отморожения, язвы).
Для ускорения заживления ожогов за счет эффективного удаления струпа известно применение мази, в состав активного начала которой входит препарат эластазы и полимер на основе акриловой кислоты (патент США №4.276.281). Эластазу получали из поджелудочной железы млекопитающих (конкретно, лошадей). Это сериновая протеаза с молекулярным весом 25 900 дальтон, состоящая из 240 аминокислотных остатков, с известной аминокислотной последовательностью (Shotten, D.M., Hartley, В.S. Biochem J. 131, 643, 1973). Применение эластазы основано на ее высокой эффективности для удаления струпа и другого макромолекулярного дебриса (остатков поврежденных клеток, частично или полностью денатурированного коллагена и т.д.) с поверхности пораженной ожогом кожи млекопитающих, ускоряя тем самым очистку пораженной поверхности и ее подготовку к грануляции.
Главным недостатком применения эластазы в этом качестве является ее низкая активность по отношению к целому ряду полипептидных субстратов, в том числе коллагенам различных типов, и неглубокий гидролиз полипептидных субстратов (до крупных фрагментов), которые приходится удалять с пораженных поверхностей другими способами (механическими или химическими), дополнительно травмируя пациента.
Кроме того, при частом нанесении на кожу такого компонента, как эластаза, последняя может вызывать некоторые заболевания вследствие ее токсического и аллергического действия. В этой связи данное лечебное средство на основе эластазы требует ограничения по длительности применения, а для части пользователей, склонных к аллергии, оно может быть вовсе противопоказано.
Наиболее близким лекарственным средством к заявляемому является средство, предложенное в изобретении «Способ лечения заболеваний, сопровождающихся образованием гноя и/или некротических тканей» по патенту РФ №2149644, МПК: A61K 38/48, приоритет от 28.11.1997 г., в котором в качестве активного начала использован комплекс коллагенолитических протеиназ с молекулярной массой 10-40 килодальтон, обладающий протеолитической активностью и полученный из пищеварительных органов гидробионтов. Недостатком указанного средства является то, что основной биологически активный компонент представляет собой комплекс, включающий в качестве минорных компонентов ферменты, обладающие неспецифической активностью, вследствие чего повреждающее действие комплекса протеаз по отношению к живым клеткам является значительным. Кроме того, состав комплекса протеаз сильно зависит от физиологического цикла гидробионтов, из которых этот комплекс был получен. При этом содержание компонентов комплекса и, следовательно, его свойства варьируются в широких пределах, что затрудняет применение препарата.
Лекарственное средство, содержащее в качестве активного начала предлагаемую композицию протеолитических ферментов, состоящую из индивидуальных ферментов с высокой степенью очистки, позволяет снизить концентрацию композиции при применении за счет более высокой ферментативной активности и не вызывает аллергических реакций при длительном применении. Кроме того, состав композиции может быть оптимизирован (в том числе стандартизован) применительно к объекту воздействия, что увеличивает его эффективность и снижает побочные эффекты от применения.
Примеры применения композиции индивидуальных протеолитических ферментов.
Пример №1.
Пациентка К., 41 год, обратилась за консультацией по поводу рубцов на лице, которые образовались около года назад в ходе самостоятельного лечения угревой сыпи уринотерапией в виде аппликаций собственной мочи. В результате развилась буллезно-некротическая форма рожистого воспаления.
Применение известных препаратов для лечения рубцовых изменений кожи лица было неэффективным.
Пациентке было назначено амбулаторное лечение на кафедре курортологии и физиотерапии Военно-медицинской академии и проведено 3 курса электрофореза по 10 сеансов с композицией протеолитических ферментов на рубцы кожи лица.
Перерывы между курсами составляли 1 месяц.
В результате рубцы стали практически незаметными, снизились их плотность и интенсивность окраски по сравнению с исходным состоянием.
Пример №2.
Больная К., 25 лет, обратилась по поводу рубцов области лба и век. Из анамнеза известно, что 3 месяца тому назад попала в автомобильную катастрофу, в ходе которой получила множественные ранения мягких тканей лица осколками стекла, Рана левого верхнего века ушита. Пациентку беспокоят: наличие зуда в области рубцов, наличие пальпируемых мелких инкапсулированных инородных тел под кожей, обезображивание.
Выполнено 15 сеансов электрофореза с композицией протеолитических ферментов. В результате проведенного лечения наступило разрушение капсул и выход осколков стекла наружу. Всего вышло более 20 осколков. Впоследствии пациентке был выполнен химический пилинг средней силы с использованием трихлоруксусной кислоты. Конечным результатом лечения было очищение лица от мелких инкапсулированных инородных тел, коррекция рубцов, а также восстановление эстетичного вида лица пациентки.
Пример №3.
Больная П., 21 год. Обратилась по поводу рубцового выворота левого верхнего века. Травму получила 2,5 месяца тому назад во время автомобильной катастрофы. Из жалоб отмечает постоянно увеличивающуюся степень выворота века, конъюктивит (из-за подсушивания глазного яблока). Выполнено 10 сеансов электрофореза и 10 сеансов фонофореза с «композицией протеолитических ферментов». Кроме того, 3 раза выполнены инъекции препаратом «Коллализин».
В результате проведенного в течение 2-х месяцев лечения, веко стало лучше опускаться и практически смыкается.
Пример №4.
Пациетка З., 42 года, обратилась по поводу длительно незаживающей раны на передней поверхности грудной клетки слева. 2 месяца тому назад была выполнена операция - удаление молочной железы по Холстеду. Впоследствии произошел краевой некроз кожного лоскута. При местном лечении использовали мази «Левосин» и препарат «Куриозин».
При осмотре: гранулирующая рана продолговатой формы размером 3,5×6 см. Дно раны выполнено бледно-розовыми грануляциями, покрытиями налетом фибрина. Краевая эпителизация вялая.
На раневые поверхности в течение недели накладывали повязки с композицией протеолитических ферментов, после чего перешли на повязки с мазью «Левосин». Заживление раны завершилось к исходу 10-х суток.