Изучение процессов регенерации брюшины в изолированных условиях

УДК 616.381-003.93-089

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ РЕГЕНЕРАЦИИ БРЮШИНЫ В ИЗОЛИРОВАННЫХ УСЛОВИЯХ

© Нетяга А.А., Липатов В.А., Гайдукова Л.В.

Кафедра оперативной хирургии и топографической анатомии Курского государственного медицинского университета

Для изучения регенерации брюшины в изолированных условиях после десерозирования вентральной стенки у крыс были использованы методы гистологического исследования области дефекта серозного покрова на различных уровнях по отношению к десерозированному участку, цитологического исследования поверхности дефекта и перитонеальной жидкости. Было установлено, что восстановление морфологически полноценного серозного покрова происходит на 7 сутки при участии клеточных элементов раневой поверхности и перитонеальной жидкости. Сделано заключение о возможности использования полученных результатов в разработке новых противоспаечных барьерных средств с заданным сроком рассасывания.

Ключевые слова: регенерация брюшины, перитонеальная жидкость, барьерные средства, спаечный процесс брюшной полости.

STUDYING THE PERITONEUM REGENERATION IN THE ISOLATED MODEL Netyaga A.A., Lipatov V.A., Gaydukova L. V.

Operative Surgery and Topographic Anatomy Department of the Kursk State Medical University

The peritoneum regeneration in the isolated model after ventral wall damage in rats was investigated. By standard histological studying a serous covering wound and cytological researching a wound surface and a peritoneal fluid. The restoration of a morphologically full serous covering occurred on the 7-th day with the participation of the wound cells and the cells of peritoneal fluid. It has been concluded that the received results may be used in the development of a new absorbable adhesion barrier with the set term of the resorption.

Key words: peritoneum regeneration, peritoneal fluid, adhesion barrier, intraabdominal adhesion formation.

Несмотря на современный прогресс в медицинской науке, проблема лечения и профилактики послеоперационного спаечного процесса брюшной полости и спаечной болезни брюшины остается одной из актуальных проблем общей хирургии. Число больных продолжает увеличиваться пропорционально количеству оперативных вмешательств, а спаечные осложнения занимают одно из первых мест в структуре послеоперационной летальности [2, 4, 7, 13, 14, 15]. Многие вопросы этиологии и патогенеза послеоперационного спаечного процесса брюшной полости, как указывают многие авторы, мало изучены [1, 6, 11, 16, 18].

Закономерности физиологии и патологии брюшины лежат в основе многих механизмов развития заболеваний органов брюшной полости, в частности перитонита и спаечной болезни. На основе знаний о механизмах ре-

генерации перитонеального покрова и патогенеза спайкообразования могут быть разработаны новые способы лечения и профилактики спаечной болезни [3, 5].

Восстановительные процессы, протекающие в серозных покровах после их повреждения, имеют свои особенности. Это связано с активной защитной функцией данной эпителиальной ткани, с возможностью соприкосновения нескольких раневых поверхностей (в отличие от поверхностных ран и внутритканевых повреждений), с наличием в брюшной полости такого органа, как большой сальник, обладающего уникальными и до конца не изученными функциями, с экссудативной и резорбционной способностью перитонеаль-ного покрова, а также с многими другими специфическими условиями, в которых протекает репарация поврежденных тканей в брюшной полости.

В последние годы активно разрабатываются и внедряются в клиническую практику различные барьерные противоспаечные средства [12]. Использование с профилактической целью этих средств является патогенетически обоснованным. С одной стороны, данные препараты разобщают раневые поверхности на время, необходимое для восстановления поврежденной брюшины, препятствуют их склеиванию фибрином и спайкообразованию, с другой стороны, поврежденная брюшина покрывается защитным слоем профилактического средства, способствующего ее регенерации [9, 10, 17]. Однако существующие на сегодняшний день барьерные средства либо обладают недостаточной противоспаечной эффективностью, либо дорогостоящи и труднодоступны отечественному потребителю. В связи с этим считаем актуальным разработку новых рассасывающихся барьерных средств для профилактики послеоперационного спаечного процесса и апробацию их в условиях эксперимента.

Исходя из этого, целью настоящего исследования явилось изучение закономерностей и темпов регенерации поврежденного перитонеального покрова в изолированных условиях с перспективой дальнейшего использования полученных результатов в качестве эталона при разработке новых противо-спаечных средств с барьерным действием, обладающих заданными сроками рассасывания.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты были проведены на 60 белых крысах-самцах линии Вистар. Всем животным под эфирным наркозом в стерильных условиях производилась срединная лапаро-томия. На внутренней поверхности вентральной стенки формировался десерозированный участок путем гидравлической препаровки 0,9% раствором натрия хлорида с последующим иссечением париетальной брюшины до мышечного слоя площадью 1 см . Для изоляции полученной раневой поверхности от органов брюшной полости использовалось устройство собственной конструкции диаметром 1,5 см, изготовленное из полимеров медицинского назначения (шприц одноразового использования). Устройство фиксировалось над десерозированным участком полипропиленовой мононитью 4/0 так, чтоб края устройства не соприкасались с раной (рис. 1).

Расположенное таким образом устройство надежно предупреждало адгезию органов брюшной полости к раневой поверхности, одновременно не препятствуя циркуляции перитонеальной жидкости через многочисленные отверстия, сформированные в его корпусе.

Животные выводились из эксперимента на сроках 1, 3, 6, 12 часов, 1, 3, 7 и 14 суток с

Рис. 1. а - внешний вид устройства, б - устройство, расположенное над десерозированным участком и фиксированное к внутренней поверхности вентральной стенки.

момента операции путем передозировки средств для наркоза. Макроскопически оценивали выраженность спаечного процесса в области фиксации устройства и состояние десерозированного участка, фиксировали наличие выпота в брюшной полости и под устройством.

Гистологическому исследованию были подвергнуты участки брюшной стенки в месте созданного дефекта, которые фиксировались в 10% растворе нейтрального формалина. Гистологические препараты изготовлялись по стандартной методике и окрашивались гематоксилином и эозином. Срезы проводились в плоскости, перпендикулярной слоям брюшной стенки на разных уровнях по отношению к десерозированному участку. На препаратах оценивали динамику морфологических изменений поверхностных слоев дефекта серозного покрова.

Для цитологического исследования с раневой поверхности снимались мазки-отпечатки. Кроме этого, цитологическому исследованию были подвергнуты жидкость, взятая из под устройства и смыв из брюшной полости. Аспираты центрифугировались (1500 об/мин, 3 минуты), из полученного осадка готовились мазки. Цитологический материал окрашивали по Романовскому-Гимза и изучали с использованием световой иммерсионной микроскопии. При этом во всех случаях оценивали качественный и количественный состав клеточных элементов.

Морфологические исследования сопровождались цифровым фотопротоколированием. Все количественные показатели были обработаны статистически с использованием методов однофакторного дисперсионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При макроскопическом исследовании было выявлено, что через 1 час после нанесения травмы в брюшной полости содержалось небольшое количество серозно-геморраги-ческого выпота. Через 3 часа под устройством определялось наличие небольших сгустков крови. На сроке 6 часов устройство частично окутывалось большим сальником при

сохранении сообщения свободной брюшной полости с раневой поверхностью, к которой прилежали хлопья выпавшего фибрина. Через 12 часов под устройством обнаруживалось небольшое количество геморрагического выпота. Десерозированный участок практически полностью был закрыт фибриновыми массами, легко отделяющимися от его поверхности. Брюшина в месте фиксации устройства была незначительно гиперемирована. В дальнейшем, на сроках 1 - 3 суток экссудат под устройством приобретал серозный характер с большим количеством фибрина, а поверхность дефекта брюшины закрывалась фибри-новыми массами, трудноотделимыми от раневой поверхности. При удалении фибрина наблюдалось появление геморрагий в виде "кровавой россы". На сроке 7 суток после нанесения травмы жидкости в свободной брюшной полости и под устройством не определялось, поверхность десерозированного участка была гладкая и блестящая. На более позднем сроке (14 суток) дефект серозного покрова определялся в виде небольших белесоватых рубцов на гладкой блестящей брюшине.

При гистологическом исследовании на сроке 1 час препараты были представлены фрагментами мышечной ткани без существенных изменений. Брюшинный покров отсутствовал. На поверхности дефекта отмечались скопления эритроцитов с единичными лейкоцитарно-макрофагальными клеточными элементами. На сроке 3 часа между отдельными мышечными волокнами и в парава-зальных зонах определялись лимфоцитарная инфильтрация, отек и полнокровие сосудов. Серозный покров по-прежнему отсутствовал. В поверхностных участках дефекта выявлялись обширные зоны кровоизлияний и наложения фибриновых масс (рис. 2а). Через 6 часов отмечалась очаговая лейкоцитарная инфильтрация слоев вентральной стенки. На поверхности дефекта определялись наложения фибриновых масс, инфильтрированных макрофагами, лейкоцитами и лимфоцитами. Через 12 часов в непосредственной близости к дефекту выявлялась выраженная воспалительная реакция в виде лейкоцитарной ин-

фильтрации рыхлой соединительной и мышечной ткани. На поверхности дефекта по-прежнему отмечалось наложение фибрино-вых масс с большим количеством клеточных элементов (лейкоцитов, макрофагов и лимфоцитов) (рис. 2б). Среди указанных элементов наблюдались лежащие поверхностно крупные клетки с округлым ядром и светлой цитоплазмой - промезотелиоциты. На сроке 1 сутки на поверхности дефекта отмечались явления организации фибриновых масс, что к 3 суткам приводило к образованию молодой грануляционной ткани (рис. 2в). К 7 суткам на поверхности дефекта наблюдалось формирование брюшинного покрова, состоящего из поверхностно расположенных плоских мезо-телиоцитов с крупными округлыми ядрами и глубжележащей соединительнотканой основы, тонкие волокна которой приобретали в большей степени продольное направление (рис. 2г). На сроке 14 суток гистологически на всем протяжении созданного дефекта определялся морфологически полноценный пе-ритонеальный покров.

Следовательно, в изолированных условиях серозный покров на предварительно десе-розированном участке появляется к 7 суткам

после нанесения травмы. Интересным является факт, что описанные изменения имели место не только по периферии дефекта, но и в его центральных отделах. Это подчеркивает возможную роль как самой раневой поверхности, так и клеточных элементов перитонеальной жидкости в восстановительных процессах брюшины.

Для подтверждения этого нами было выполнено цитологическое исследование перитонеальной жидкости, жидкости из-под устройства и мазков-отпечатков с раневой поверхности.

Результаты цитологического исследования показали, что уже через 1 час после нанесения травмы в мазках-отпечатках с раневой поверхности появлялись полипотентные бла-стоподобные клетки с крупным округлым ядром и нечеткими контурами цитоплазмы, которые с учетом их дальнейших морфологических изменений можно отнести к промезо-телиоцитам (рис. 3а). Так, максимального количества эти клетки достигали к 1 - 3 суткам, что можно объяснить их рыхлой связью с раневой поверхностью. Затем содержание этих клеток постепенно снижалось до начальных цифр вследствие прочной фиксации в тканях

Рис. 2. Морфологические изменения на поверхности дефекта брюшины: а - 3 часа после травмы: отек и воспалительная инфильтрация мышечной ткани, кровоизлияния и наложения фибри-новых масс; окраска гематоксилин-эозин, ув. х 200;

б - 12 часов после травмы: наложение фибриновых масс с большим количеством клеточных элементов; окраска гематоксилин-эозин, ув. х 200;

в - 3 сутки после травмы: молодая грануляционная ткань; окраска гематоксилин-эозин, ув. х 200;

г - 7 сутки после травмы: брюшинный покров; а, б, в, г - окраска гематоксилин-эозин, ув. х 200, окраска гематоксилин-эозин, ув. х 200.

и дифференцировки в мезотелиоциты. Аналогичная динамика количества бластоподобных клеток была выявлена нами в перитонеальной жидкости из свободной брюшной полости и в жидкости из-под устройства. Однако в последнем случае обращало на себя внимание повышение их количества вплоть до 7-х суток, что может быть связано с интенсивностью процессов мезотелизации. Увеличение количества полипотентных бластоподобных клеток в перитонеальной жидкости, вероятно, указывает на начало процессов спайкообра-зования вследствие дифференцировки их как в фибробласты, так и в мезотелиоциты.

Максимальное количество мезотелиоци-тов в мазках-отпечатках и в жидкости из свободной брюшной полости отмечалось на 3 сутки (рис. 3б), с последующим резким снижением к 7 и практически полным исчезновением к 14 суткам, что отражает динамику течения и полное завершение процесса мезо-телизации. Наличие мезотелиоцитов в жидкости из свободной брюшной полости можно объяснить перитонеальной травмой на ранних сроках (3 часа), а на поздних (1 - 7 суток) - участием этих клеток в мезотелизации вновь образованных спаек между сальником и устройством. О спайкообразовании говорит и наличие в перитонеальной жидкости фиб-робластов на 1 - 3 сутки (рис. 3в).

Пик количества нейтрофилов в мазках-отпечатках приходился на 12 часов. В этот же срок в мазках были отмечены минимальные количества лимфоцитов. Все это указывало на воспалительную фазу течения раневого процесса. К 3 - 7 суткам, наоборот, количество нейтрофилов приходило к норме, а количество макрофагов и лимфоцитов увеличивалось (рис. 3г). Данные изменения говорят о переходе воспалительной фазы раневого процесса в регенераторную, что согласуются с вышеописанной динамикой изменения тканевых клеточных элементов.

К 14 суткам количество всех клеточных элементов резко уменьшалось. В перитоне-альной жидкости и в мазках-отпечатках преобладали стареющие и распадающиеся клетки, указывающие на угнетение процессов регенерации.

Суммируя вышесказанное, процесс мезотелизации дефекта париетальной брюшины в изолированных от свободной брюшной полости условиях с помощью предложенного нами устройства представляется следующим образом. В первые часы после нанесенной травмы на десерозированном участке отмечаются явления экссудации и диапедеза эритроцитов. На поверхности дефекта выпадает фибрин, который четко визуализируется макроскопически. Параллельно в тканях нарастают воспалительные явления: развивается полнокровие сосудов, отек, воспалительная, преимущественно нейтрофильная инфильтрация. Помимо нейтрофилов в инфильтратах значительно в меньшей степени присутствуют макрофаги и лимфоциты. На поверхности дефекта появляются предшественники мезо-телиоцитов. К 12 часам продолжает увеличиваться количество нейтрофилов при уменьшении содержания макрофагов и лимфоцитов (воспалительная фаза раневого процесса). К 24 часам воспалительные явления уменьшаются. Одновременно увеличивается количество макрофагов, лимфоцитов и промезоте-лиоцитов, что говорит о переходе раневого процесса в регенераторную фазу. Фибрино-вые массы организуются к 3 суткам на поверхности дефекта появляется молодая грануляционная ткань, которую покрывают про-и мезотелиоциты, рыхло связанные с поверхностью. К 7-м суткам наступает полная мезо-телизация дефекта. Вновь образованные кол-лагеновые волокна, приобретающие продольное направление, образуют волокнистую основу, а мезотелиоциты, располагающиеся поверхностно, дополняют ее с формированием морфологически полноценного серозного покрова.

Наши исследования подтверждают данные, описанные в 1936 году профессором Р.А. Черток [8]. Он отмечал, что в окружности ранения серозного покрова образуется фибринозный вал, который превращается в соединительную ткань и покрывается эндоте-лиальными (мезотелиальными) клетками.

Следовательно, фибрин, выпавший на поверхности дефекта серозного покрова в первые часы, и образующаяся в последующем

Рис. 3. Цитологическое исследование: а - промезотелиоциты на раневой поверхности через 1 час после травмы, окр. по Романовскому-Гимза, ув. х 900; б - мезотелиоциты на раневой поверхности через 3 суток после травмы, окр. по Романовскому-Гимза, ув. х 900; в - фибробласты в перитонеальной жидкости через 3 суток после травмы, окр. по Романовскому-Гимза, ув. х 900; г - лимфоциты раневой поверхности через 7 суток после травмы, окр. по Романовскому-Гимза, ув. х 900.

грануляционная ткань являются основным матриксом, необходимым для развития и дифференцировки как будущих клеток соединительной ткани (фиброцитов), так и клеток серозного покрова (мезотелиоцитов). Это подчеркивает однонаправленность процессов спайкообразования и восстановления серозного покрова, а также обосновывает целесообразность применения барьерных средств для профилактики спаечного процесса

брюшной полости. Так, при отсутствии барьерного средства, в качестве которого в наших экспериментах было использовано изолирующее устройство, фибрин и образующаяся грануляционная ткань могут служить основой для формирования не брюшинного покрова, а спаек. Схематично процесс регенерации брюшины с барьерными средствами и без них представлен на рисунке 4.

Таким образом, проведенные нами иссле-

Повреждение серозного покрова

I

Рис. 4. Схема процесса регенерации брюшины при использовании барьерных средств и без них. 62

дования показали, что морфологически полноценный серозный покров на поверхности дефекта при использовании изолирующего устройства формируется на 7 сутки, что необходимо учитывать при разработке новых

ЛИТЕРАТУРА

1. Алиев С.А. Особенности диагностики и хирургической тактики при спаечной кишечной непроходимости / С.А. Алиев // Хирургия. -1994. - № 2. - С. 13-17.

2. Бова Л.С. Спаечная болезнь / Л.С. Бова, Н.М. Семенюта, М.М. Фульшес // Клиническая хирургия . - 1989. - № 6. - С. 57-59.

3. Воробьев А.А. Хирургическая анатомия оперированного живота и лапароскопическая хирургия спаек / А.А. Воробьев, А.Г. Бебури-швили. - Волгоград: Гос. учреждение "Издатель", 2001. - 240 с.

4. Гарелик П.В. Спаечная кишечная непроходимость. Классификация. Тактика / П.В. Гарелик, И.Я. Макшанов // Дек. чтения по неотложной хирургии. - Минск: ГИПП "Промпе-чать", 2000. - Т. 5. - С. 149-152.

5. Женчевский Р.А. Спаечная болезнь /

Р.А. Женчевский. - М.: Медицина, 1989. -191 с.

6. Майбородин И.В. Структурная организация спаек брюшной полости и стенок кишок при лечении перитонита сорбентом с адсорбированным метранидазолом или липооризином / И.В. Майбородин, Я.В. Величко, В.П. Плешаков // Вестник хирургии. - 1999. - № 2. -С. 24-28.

7. Чекмазов И.А. Хирургическое лечение спаечной болезни с применением изонидеза / И.А. Чекмазов, А.К. Акжигитов, Б.Д. Комаров // Хирургия. - 1995. - № 6. - С. 67-68.

8. Черток Р.А. Перитонезация и ее значение в гинекологии / Р.А. Черток. - Ташкент, 1936. -225 с.

9. A randomized clinical trial of oxidized regenerated cellulose adhésion barrier (Interceed, TC7) alone or in combination with heparin / R.L.

противоспаечных барьерных средств с заданным сроком рассасывания - одного из основных направлений в профилактике спаечного процесса брюшной полости.

Reid, P.M. Hahn, J.E. Spence et al. // Fertil. Steril. - 1997. - Vol. 67. - P. 23-29.

10. Adhesion reduction in the rabbit uterine horn model using an absorbable barrier / C.B. Linsky, M.P. Diamond, T. Gunningham et al. // J. Re-prod. Med. - 1987. - Vol. 32. - P. 17-20.

11. Ansary A. Y. Adhesions formation to insisional wound in responceund in responce "6" al abdominal wound in responce to polyamide "6" and polyglaktin "910" sutures / A Y Ansary // JPMA - J. Path - Med. - Assoc. - 1992. - Vol. 42. - P. 184-185.

12. De Tribolet N. Clinical assessment of a novel antiadhesion barrier gel: prospective, randomized, multicenter, clinical trial of ADCON-L to inhibit postoperative peridural fibrosis and related symptoms after lumbar discectomy / N. de Tribolet, F. Porchet, T.W. Lutz // Am. J. Orthop. - 1998. - Vol. 27. - P. 111-120.

13. Di Zerega G.S. Biochemical events in peritoneal tissue repair / G.S. Di Zerega // Eur. J. Surg. -1997. - Vol. 577. - P. 10-16.

14. Di Zerega G.S. Contemporary adhesion prevention / G.S. di Zerega // Fertility and Sterility. -1994. - Vol. 61 - P. 219-235.

15. Economic impact of hospitalizations for lower abdominal adhesiolysis in the United States in 1988/ N.F. Ray, I.W. Larsen, R.J. Stilman, R.I. Jacobs // Surg. Gynecol. Obstet. - 1993. - Vol. 176. - № 3. - P. 271-276.

16. Ellis H. The clinical significance of adhesions: focus on intestinal obstruction / H. Ellis // Eur. J. Surg. Suppl. - 1997. - Vol. 577. - P. 5-9.

17. Halverson A.L. Intraabdominal adhesion formation after preperitoneal dissection in the murine model / A.L. Halverson, W.L. Barrett, P. Bhanot // Surg. Endosc. - 1999. - Vol. 13. - P. 14-16.

18. The impact of stach powdered gloves on the formation of adhesions in rats / L. Holmdahl, M. al - Jabreen, G. Xia, B. Risberg // Eur. J. Surg. -1994. - Vol. 160. - P. 257-261.