МУЛЬТИПЛЕКСНАЯ ДИАГНОСТИКА НА ОСНОВЕ ЭФФЕКТОРНОЙ СИСТЕМЫ CRISPR

1. Система обнаружения нуклеиновой кислоты, включающая:
i) две или более систем CRISPR, при этом каждая система CRISPR содержит белок Cas и направляющую молекулу, содержащую направляющую последовательность, способную связывать соответствующую целевую молекулу и предназначенную для образования комплекса с белком Cas; и
ii) набор детектирующих конструкций, при этом каждая детектирующая конструкция содержит последовательность мотива разрезания, которая предпочтительно разрезается одним из белков Cas,
где белок Cas каждой системы CRISPR проявляет коллатеральную активность в отношении расщепления нуклеиновой кислоты и предпочтительно расщепляет последовательность мотивов разрезания одной или более из набора детектирующих конструкций.
2. Система для обнаружения наличия двух или более целевых полипептидов в пробе in vitro, содержащая:
i) набор детектирующих конструкций, при этом каждая детектирующая конструкция содержит последовательность мотива разрезания, которая предпочтительно разрезается одним из белков Cas;
ii) набор детектирующих аптамеров, каждый из которых предназначен для связывания с одним из двух или более целевых полипептидов, и при этом каждый детектирующий аптамер содержит последовательность мотивов разрезания, которая предпочтительно разрезается белком Cas одной из двух или более систем CRISPR; сайт связывания маскированного промотора РНК-полимеразы или сайт связывания маскированного праймера; и шаблон последовательности запуска, кодирующий последовательность запуска;
iii) две или более систем CRISPR, при этом каждая система CRISPR содержит белок Cas и направляющий полинуклеотид, содержащий направляющую последовательность, способную связывать триггерную последовательность, кодируемую шаблоном триггерной последовательности;
где белок Cas проявляет коллатеральную активность в отношении расщепления нуклеиновой кислоты и расщепляет нецелевую последовательность маскирующей конструкции на основе нуклеиновой кислоты после активации триггерной последовательностью.
3. Система по п. 1, дополнительно содержащая реагенты для амплификации нуклеиновых кислот для амплификации целевой последовательности.
4. Система по п. 2, дополнительно содержащая реагенты для амплификации нуклеиновых кислот для амплификации целевой последовательности.
5. Система по любому из предыдущих пунктов, в которой две или более систем CRISPR представляют собой РНК-нацеленные белки Cas, ДНК-нацеленные белки Cas или их комбинацию.
6. Система по п. 5, в которой РНК-нацеленные белки Cas содержат один или более доменов HEPN.
7. Система по п. 6, в которой один или более доменов HEPN содержат последовательность мотива RxxxxH.
1
2
3
8. Система по п. 7, в которой мотив RxxxH содержит последовательность R{N/H/K]XXXH.
1
2
3
9. Система по п. 8, в которой X представляет собой R, S, D, Е, Q, N, G или Y, и Х независимо представляет собой I, S, Т, V или L, и Х независимо представляет собой L, F, N, Y, V, I, S, D, Е или А.
10. Система по любому из пп. 19, в которой белок Cas представляет собой РНК-нацеленный белок CRISPR Cas13.
11. Система по п. 10, в которой белок Cas13 представляет собой белок Cas13a, Cas13b или Cas13c.
12. Система по п. 11, в которой белок Cas13 представляет собой белок Cas13a.
13. Система по п. 12, в которой белок Cas13a получен из организма рода, выбранного из группы, состоящей из: Leptotrichia, Listeria, Corynebacter, Sutterella, Legionella, Treponema, Filifactor, Eubacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Mycoplasma, Bacteroides, Flaviivola, Flavobacterium, Sphaerochaeta, Azospirillum, Gluconacetobacter, Neisseria, Roseburia, Parvibaculum, Staphylococcus, Nitratifr actor, Mycoplasma, Campylobacter и Lachnospira.
14. Система по n. 12, в которой белок Cas13a выбран из таблицы 1, таблицы 2 или их комбинации.
15. Система по п. 11, в которой белок Cas13 представляет собой белок Cas13b.
16. Система по п. 15, в которой белок Cas13b получен из организма рода, выбранного из группы, состоящей из: Bergeyella, Prevotella, Porphyromonas, Bacterioides, Alistipes, Riemerella, Myroides, Capnocytophaga, Porphyromonas, Flavobacterium, Porphyromonas, Chryseobacterium, Paludibacter, Psychroflexus, Riemerella, Phaeodactylibacter, Sinomicrobium, Reichenbachiella.
17. Система по п. 15, в которой белок Cas13b выбран из таблицы 4, 5 или их комбинации.
18. Система по п. 11, в которой белок Cas 13 представляет собой белок Cas13c.
19. Система по п. 18, в которой белок Cas13c получен из организма рода, выбранного из группы, состоящей из: Fusobacterium и Anaerosalibacter.
20. Система по п. 18, в которой белок Cas13c выбран из таблицы 6.
21. Система по п. 5, в которой ДНК-нацеленный белок Cas представляет собой белок Cas12.
22. Система по п. 21, в которой белок Cas12 представляет собой белок Cpf1.
23. Система по п. 22, в которой Cpf1 выбран из организма рода, выбранного из:
Streptococcus, Campylobacter, Nitratifractor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuheribacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium или Acidaminococcus; например, химерный белок Cas, содержащий первый фрагмент и второй фрагмент, причем каждый из первого и второго фрагментов выбран из Cpfl организма, включающего Streptococcus, Campylobacter, Nitratifr actor, Staphylococcus, Parvibaculum, Roseburia, Neisseria, Gluconacetobacter, Azospirillum, Sphaerochaeta, Lactobacillus, Eubacterium, Corynebacter, Carnobacterium, Rhodobacter, Listeria, Paludibacter, Clostridium, Lachnospiraceae, Clostridiaridium, Leptotrichia, Francisella, Legionella, Alicyclobacillus, Methanomethyophilus, Porphyromonas, Prevotella, Bacteroidetes, Helcococcus, Letospira, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacilus, Methylobacterium или Acidaminococcus.
24. Система по п. 23, в которой Cpf1 выбран из одного или более из следующих: вида Acidaminococcus BV3L6 Cpf1 (AsCpf1); подвида Francisella tularensis Novicida U112 Cpf1 (FnCpf1); L. bacterium MC2017 Cpf1 (Lb3Cpf1); Butyrivibrio proteoclasticus Cpf1 (BpCpf1); Parcubacteria bacterium GWC2011GWC2 44 17 Cpf1 (PbCpf1); Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA_33_10_Cpf1 (PeCpf1); Leptospira inadai Cpf1 (LiCpf1); вида Smithella SC K08D17 Cpf1 (SsCpf1); L. bacterium MA2020 Cpf1 (Lb2Cpf1); Porphyromonas crevioricanis Cpf1 (PeCpf1); Porphyromonas macacae Cpf1 (PmCpf1); Candidatus Methanoplasma termitum Cpf1 (CMtCpf1); Eubacterium eligens Cpf1 (EeCpf1); Moraxella bovoculi 237 Cpf1 (MbCpf1); Prevotella disiens Cpf1 (PdCpf1); или L., bacterium ND2006 Cpf1 (LbCpf1).
25. Система по п. 21, в котором система Cas12 представляет собой систему C2c1.
26. Система по п. 25, в которой С2с1 выбран из организма из рода, выбранного из:
Alicyclobacillus, Desulfovibrio, Desulfonatronum, Opitutaceae, Tuberibacillus, Bacillus, Brevibacillus, Candidatus, Desulfatirhabdium, Elusimicrobia, Citrobacter, Methylobacterium, Omnitrophicai, Phycisphaerae, Planctomycetes, Spirochaetes и Verrucomicrobiaceae.
27. Система по п. 26, в которой C2c1 выбран из одного или более из: Alicyclobacillus acidoterrestris (например, АТСС 49025), Alicyclobacillus contaminans (например, DSM 17975), Alicyclobacillus macrosporangiidus (например DSM 17980), Bacillus hisashii штамм С4, Candidatus Lindowbacteria bacterium RIFCSPLOWO2, Desulfovibrio inopinatus (например, DSM 10711), Desulfonatronum thiodismutans (например, штамм MLF-1), Elusimicrobia bacterium RIFOXYA12, Omnitrophica WOR_2 bacterium RIFCSPHIGHO2, Opitutaceae bacterium TAV5, Phycisphaerae bacterium ST-NAGAB-D1, Planctomycetes bacterium RBG_13_46_10, Spirochaetes bacterium GWB1_27_13, Verrucomicrobiaceae bacterium UBA2429, Tuberibacillus calidus (например, DSM 17572), Bacillus thermoamylovorans (например, штамм B4166), вид Brevibacillus CF112, вид Bacillus NSP2.1, Desulfatirhabdium butyrativorans (например, DSM 18734), Alicyclobacillus herbarius (например, DSM 13609), Citrobacter freundii (например, ATCC 8090), Brevibacillus agri (например, В AB-2500), Methylobacterium nodularis (например, ORS 2060).
28. Система по п. 1, в которой две или более систем CRISPR содержат два или более белков Cas13, два или более белков Cas12 или комбинацию белков Cas13 и Cas12.
29. Система по п. 128, в которой маскирующая конструкция подавляет генерацию детектируемого положительного сигнала до тех пор, пока он не будет расщеплен активированным белком Cas CRISPR.
30. Система по п. 29, в которой маскирующая конструкция подавляет генерацию детектируемого положительного сигнала, маскируя детектируемый положительный сигнал или генерируя вместо этого детектируемый отрицательный сигнал.
31. Система по п. 29, в которой маскирующая конструкция содержит подавляющую РНК, которая подавляет генерацию генного продукта, кодируемого репортерной конструкцией, причем генный продукт при экспрессии генерирует обнаруживаемый положительный сигнал.
32. Система по п. 29, в которой маскирующая конструкция представляет собой рибозим, который генерирует отрицательный детектируемый сигнал, и в котором позитивный детектируемый сигнал генерируется при деактивации рибозима.
33. Система по п. 32, в которой рибозим окрашивает подложку в первый цвет, и при этом подложка окрашивается во второй цвет при деактивации рибозима.
34. Система по п. 29, в которой маскирующая конструкция представляет собой аптамер ДНК или РНК и/или содержит ингибитор, связанный с ДНК или РНК.
35. Система по п. 34, в которой аптамер или связанный с ДНК или РНК ингибитор секвестирует фермент, причем фермент генерирует детектируемый сигнал при высвобождении из аптамера связанного с или ДНК или РНК ингибитора, воздействуя на подложку.
36. Система по п. 34, в которой аптамер представляет собой аптамер-ингибитор, который ингибирует фермент и препятствует катализации ферментом генерации детектируемого сигнала из вещества, или в котором связанный с ДНК или РНК ингибитор ингибирует фермент и препятствует катализации ферментом генерации детектируемого сигнала от подложки.
37. Система по п. 36, в которой фермент представляет собой тромбин, а подложка представляет собой пара-нитроанилид, ковалентно связанный с пептидной подложкой для тромбина, или 7-амино-4-метилкумарин, ковалентно связанный с пептидной подложкой для тромбина.
38. Система по п. 34, в которой аптамер секвестирует пару агентов, которые при высвобождении из аптамеров объединяются для генерации детектируемого сигнала.
39. Система по п. 29, в которой маскирующая конструкция содержит олигонуклеотид ДНК или РНК, к которому присоединены детектирумый лиганд и маскирующий компонент.
40. Система по п. 29, в которой маскирующая конструкция содержит наночастицу, удерживаемую в совокупности с помощью мостиковых молекул, где по меньшей мере часть мостиковых молекул содержит ДНК или РНК, и где раствор претерпевает изменение цвета при выделении наночастицы в растворе.
41. Система по п. 40, в которой наночастица представляет собой коллоидный металл.
42. Система по п. 41, в которой коллоидный металл представляет собой коллоидное золото.
43. Система по п. 29, в которой маскирующая конструкция содержит квантовую точку, связанную с одной или более молекулами-гасителями связывающей молекулой, где по меньшей мере часть связывающей молекулы содержит ДНК или РНК.
44. Система по п. 43, в которой маскирующая конструкция содержит ДНК или РНК в комплексе с интеркалирующим агентом, где интеркалирующий агент изменяет абсорбцию при расщеплении ДНК или РНК.
45. Система по п. 44, в которой интеркалирующий агент представляет собой пиронин-Y или метиленовый синий.
46. Система по п. 39, в которой детектируемый лиганд представляет собой флуорофор, а маскирующий компонент представляет собой молекулу-гаситель.
47. Система по любому из пп. 1-46, в которой одна или более направляющих молекул, сконструированных для связывания с соответствующими целевыми молекулами, содержат (синтетическое) несовпадение.
48. Система по п. 47, в которой указанное несовпадение расположено выше или ниже по потоку относительно ОНП или другой однонуклеотидной вариации в указанной целевой молекуле.
49. Система по любому из пп. 1-48, в которой одна или более направляющих молекул сконструированы для обнаружения однонуклеотидного полиморфизма в целевой РНК или целевой ДНК, или варианта сплайсинга РНК-транскрипта.
50. Система по любому из пп. 1-49, в которой одна или более направляющих молекул сконструированы для связывания с одной или более целевыми молекулами, которые являются диагностическими в отношении болезненного состояния.
51. Система по п. 50, в котором болезненное состояние представляет собой онкологическое заболевание.
52. Система по п. 50, в котором болезненное состояние представляет собой аутоиммунное заболевание.
53. Система по п. 50, в котором болезненное состояние представляет собой инфекцию.
54. Система по п. 53, в котором инфекция вызвана вирусом, бактерией, грибком, простейшим организмом или паразитом.
55. Система по п. 53, в которой инфекция является вирусной инфекцией.
56. Система по п. 55, в которой вирусная инфекция вызвана ДНК-вирусом.
57. Система по п. 56, в которой ДНК-вирус представляет собой Myoviridae, Podoviridae, Siphoviridae, Alloherpesviridae, Herpesviridae (включая вирус герпеса человека и вирус ветряной оспы), Malocoherpesviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Adenoviridae, Ampullaviridae, Ascoviridae, Asfarviridae (включая вирус африканской чумы свиней), Baculoviridae, Cicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Fuselloviridae, Globuloviridae, Guttaviridae, Hytrosaviridae, Iridoviridae, Maseilleviridae, Mimiviridae, Nudiviridae, Nimaviridae, Pandoraviridae, Papillomaviridae, Phycodnaviridae, Plasmaviridae, Polydnaviruses, Polyomaviridae (включая вирус обезьян 40, вирус JC, вирус BK), Poxviridae (включая коровью оспу и черную оспу), Sphaerolipoviridae, Tectiviridae, Turriviridae, Dinodnavirus, Salterprovirus или Rhizido virus.
58. Система по п. 55, в которой вирусная инфекция вызвана вирусом, содержащим двухцепочечную РНК, вирусом, содержащим положительно-полярную РНК, вирусом, содержащим отрицательно-полярную РНК, ретровирусом или их комбинацией.
59. Система по п. 58, в которой вирусная инфекция вызвана коронавирусом, пикорнавирусом, калицивирусом, флавивирусом, тогавирусом, борнавирусом, филовирусом, парамиксовирусом, пневмовирусом, рабдовирусом, аренавирусом, буньявирусом, ортомиксовирусом или дельтавирусом.
60. Система по п. 59, в которой вирусная инфекция вызвана коронавирусом, коронавирусом человека, полиовирусом, риновирусом, вирусом гепатита А, вирусом Норуолк, вирусом желтой лихорадки, вирусом Западного Нила, вирусом гепатита С, вирусом лихорадки Денге, вирусом Зика, вирусом краснухи, вирусом Росс-ривер, вирусом Синдбис, вирусом Чикунгунья, вирусом болезни Борна, вирусом Эбола, вирусом Марбург, вирусом кори, вирусом свинки, вирусом Нипах, вирусом Хендра, вирусом ньюкаслской болезни, респираторным синцитиальным вирусом человека, вирусом бешенства, вирусом Ласса, хантавирусом, вирусом конго-крымской геморрагической лихорадки, вирусом гриппа или вирусом гепатита D.
61. Система по п. 60, в которой вирусная инфекция вызвана вирусом лихорадки Денге.
62. Система по п. 54, в которой инфекция является бактериальной инфекцией.
63. Система по п. 62, в которой бактерия, вызывающая бактериальную инфекцию, представляет вид Acinetobacter, вид Actinobacillus, вид Actinomycetes, вид Actinomyces, Aerococcus species вид Aeromonas, вид Anaplasma, вид Alcaligenes, вид Bacillus, вид Bacteriodes, вид Bartonella, вид Bifidobacterium, вид Bordetella, вид Borrelia, вид Brucella, вид Burkholderia, вид Campylobacter, вид Capnocytophaga, вид Chlamydia, вид Citrobacter, вид Coxiella, вид Corynbacterium speces, вид Clostridium, вид Eikenella, вид Enterobacter, вид Escherichia, вид Enterococcus, вид Ehlichia, вид Epidermophyton, вид Erysipelothrix, вид Eubacterium, вид Francisella, вид Fusobacterium, вид Gardnerella, вид Gemella, вид Haemophilus, вид Helicobacter, вид Kingella, вид Klebsiella, вид Lactobacillus, вид Lactococcus, вид Listeria, вид Leptospira, вид Legionella, вид Leptospira, Leuconostoc, вид Mannheimia, вид Microsporum, вид Micrococcus, вид Moraxella, вид Morganell, вид Mobiluncus, вид Micrococcus, Mycobacterium, вид Mycoplasm, вид Nocardia, вид Neisseria, вид Pasteurelaa, вид Pediococcus, вид Peptostreptococcus, вид Pityrosporum, вид Plesiomonas, вид Prevotella, вид Porphyromonas, вид Proteus, вид Providencia, вид Pseudomonas, вид Propionibacteriums, вид Rhodococcus, вид Rickettsia, вид Rhodococcus, вид Serratia, вид Stenotrophomonas, вид Salmonella, вид Serratia, вид Shigella, вид Staphylococcus, вид Streptococcus, вид Spirillum, вид Streptobacillus, вид Treponema, вид Tropheryma, вид Trichophyton, вид Ureaplasma, вид Veillonella, вид Vibrio, вид Yersinia, вид Xanthomonas или их комбинацию.
64. Система по п. 54, в которой инфекция вызвана грибком.
65. Система по п. 64, в которой грибок представляет собой Aspergillus, Blastomyces, Candidiasis, Coccidiodomycosis, Cryptococcus neoformans, вид Cryptococcus gatti, вид Histoplasma (такой как Histoplasma capsulatum), вид Pneumocystis (такой как Pneumocystis jirovecii), Stachybotrys (такой как Stachybotrys chartarum), Mucroymcosis, Sporothrix, глазные грибковые инфекции, трихофитию, Exserohilum, Cladosporium, Geotrichum, Saccharomyces, вид Hansenula, вид Candida, вид Kluyveromyces, вид Debaryomyces, вид Pichia, вид Penicillium, вид Cladosporium, вид Byssochlamys или их комбинацию.
66. Система по п. 54, в которой инфекция вызвана простейшим организмом.
67. Система по п. 66, в которой простейший организм представляет собой Euglenozoa, Heterolobosea, Diplomonadida, Amoebozoa, Blastocystic, Apicomplexa или их комбинацию.
68. Система по п. 54, в которой инфекция вызвана паразитом.
69. Система по п. 68, в которой паразит представляет собой Trypanosoma cruzi (болезнь Шагаса), Т. brucei gambiense, Т. brucei rhodesiense, Leishmania braziliensis, L. infantum, L. mexicana, L. major, L. tropica, L. donovani, Naegleria fowleri, Giardia intestinalis (G. lamblia, G. duodenalis), canthamoeba castellanii, Balamuthia madrillaris, Entamoeba histolytica, Blastocystic hominis, Babesia microti, Cryptosporidium parvum, Cyclospora cayetanensis, Plasmodium falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae и Toxoplasma gondii или их комбинацию.
70. Система по любому из пп. 1-69, в которой реагенты для амплификации целевых молекул РНК включают амплификацию на основе последовательностей нуклеиновых кислот (NASBA), рекомбиназную полимеразную амплификацию (РПА), петлеопосредованную изотермическую амплификацию (LAMP), амплификацию с замещением цепей (SDA), геликазо-зависимую амплификацию (HDA), реакцию амплификации с ферментом, создающим одноцепочечный разрыв (NEAR), ПЦР, амплификацию с множественным замещением (MDA), амплификацию по типу катящегося кольца (RCA), лигазную цепную реакцию (LCR) или рамификационный метод амплификации (RAM).
71. Система по любому из пп. 1-70, дополнительно содержащая систему обогащения CRISPR, в которой система обогащения CRISPR предназначена для связывания соответствующих целевых молекул перед обнаружением системой для обнаружения CRISPR.
72. Система по п. 71, в которой система обогащения CRISPR содержит каталитически неактивный белок CRISPR Cas.
73. Система по п. 72, в которой каталитически неактивный белок CRISPR Cas представляет собой каталитически неактивный С2с2.
74. Система по любому из пп. 71-73, в которой белок Cas системы обогащения CRISPR дополнительно содержит метку, причем метка используется для специфического выделения системы обогащения CRISPR Cas или для связывания системы обогащения CRISPR с твердой подложкой.
75. Система по п. 74, в которой твердая подложка представляет собой проточную кювету.
76. Диагностическое устройство, содержащее один или более отдельных дискретных объемов, при этом каждый отдельный дискретный объем состоит из системы CRISPR по любому из пп. 1-75.
77. Диагностическое устройство по п. 76, в котором каждый отдельный дискретный объем дополнительно содержит один или более детектирующих аптамеров, содержащих маскированный сайт связывания промотора РНК-полимеразы или маскированный сайт связывания праймера.
78. Устройство по п. 76 или 77, в котором каждый отдельный дискретный объем дополнительно содержит реагенты для амплификации нуклеиновых кислот.
79. Устройство по п. 76, в котором целевой молекулой является целевая ДНК, и указанные отдельные дискретные объемы дополнительно содержат праймер, который связывает целевую ДНК и содержит промотор РНК-полимеразы.
80. Устройство по любому из пп. 76-79, в котором указанные отдельные дискретные объемы представляют собой капли.
81. Устройство по любому из пп. 76-80, в котором указанные отдельные дискретные объемы определены на твердой подложке.
82. Устройство по п. 81, в котором указанные отдельные дискретные объемы представляют собой микролунки.
83. Диагностическое устройство по любому из пп. 76-82, в котором указанные отдельные дискретные объемы представляют собой пятна, определенные на подложке.
84. Устройство по п. 83, в котором подложка представляет собой подложку из гибкого материала.
85. Устройство по п. 84, в котором подложка из гибкого материала представляет собой бумажную подложку или подложку на основе гибкого полимера.
86. Способ выявления целевых нуклеиновых кислот в образцах, включающий:
распределение образца или набора образцов по одному или более отдельным дискретным объемам, причем отдельные дискретные объемы содержат систему CRISPR по любому из пп. 1-75;
инкубацию образца или набора образцов в условиях, достаточных для обеспечения связывания одной или более направляющих молекул с одной или более целевыми молекулами;
активацию белка CRISPR Cas посредством связывания одной или более направляющих молекул с одной или более целевыми молекулами, причем активация белка CRISPR Cas приводит к модификации маскирующей конструкции на основе РНК так, чтобы происходила генерация обнаруживаемого положительного сигнала; и
обнаружение одного или более детектируемого положительного сигнала, при этом обнаружение детектируемого положительного сигнала указывает на присутствие одной или более целевых молекул в образце.
87. Способ обнаружения полипептидов в образцах, включающий:
распределение образца или набора образцов в набор отдельных дискретных объемов, причем отдельные дискретные объемы содержат аптамеры для обнаружения пептидов, систему CRISPR по любому из пп. 1-75;
инкубацию образца или набора образцов в условиях, достаточных для связывания аптамеров для обнаружения пептидов с одной или более целевыми молекулами, где связывание аптамера с соответствующей целевой молекулой открывает сайт связывания РНК-полимеразы или сайт связывания праймера, в результате чего происходит генерация триггерной РНК;
активацию белка РНК Cas посредством связывания одной или более направляющих молекул с триггерной РНК, причем активация белка РНК Cas приводит к модификации маскирующей конструкции на основе РНК, так что вырабатывается детектируемый положительный сигнал; и
обнаружение детектируемого положительного сигнала, при этом обнаружение детектируемого положительного сигнала указывает на присутствие одной или более целевых молекул в образце.
88. Способ выявления целевых нуклеиновых кислот в образцах, включающий:
приведение в контакт одного или более образцов с
i) двумя или более системами CRISPR, при этом каждая система CRISPR содержит белок Cas и направляющую молекулу, содержащую направляющую последовательность, способную связывать соответствующую целевую молекулу и предназначенную для образования комплекса с белком Cas; и
ii) набор детектирующих конструкций, при этом каждая детектирующая конструкция содержит последовательность мотива разрезания, которая предпочтительно разрезается одним из белков Cas,
где белок Cas каждой системы CRISPR проявляет коллатеральную активность в отношении расщепления нуклеиновой кислоты и предпочтительно расщепляет последовательность мотивов разрезания одной или более из набора детектирующих конструкций; и
обнаружение сигнала вследствие расщепления последовательности мотива разрезания конструкции обнаружения, тем самым обнаруживая одну или более последовательностей целевой нуклеиновой кислоты в образце.
89. Способ выявления целевых нуклеиновых кислот в образцах, включающий:
приведение в контакт одного или более образцов с
i) набором детектирующих конструкций, при этом каждая детектирующая конструкция содержит последовательность мотива разрезания, которая предпочтительно разрезается одним из белков Cas;
ii) набором детектирующих аптамеров, каждый из которых предназначен для связывания с одним из двух или более целевых полипептидов, и каждый детектирующий аптамер содержит последовательность мотивов разрезания, которая предпочтительно разрезается белком Cas одной из двух или более систем CRISPR;
сайт связывания маскированного промотора РНК-полимеразы или сайт связывания маскированного праймера; и шаблон последовательности запуска, кодирующий последовательность запуска;
iii) двумя или более системами CRISPR, при этом каждая система CRISPR содержит белок Cas и направляющий полинуклеотид, содержащий направляющую последовательность, способную связывать триггерную последовательность, кодируемую шаблоном триггерной последовательности;
где белок Cas проявляет коллатеральную активность в отношении расщепления нуклеиновой кислоты и расщепляет нецелевую последовательность маскирующей конструкции на основе нуклеиновой кислоты после активации триггерной последовательностью; и
обнаружение сигнала вследствие расщепления последовательности мотива разрезания конструкции обнаружения, тем самым обнаруживая одну или более последовательностей целевой нуклеиновой кислоты в образце.
90. Способ по любому из пп. 86-89, в котором целевая молекула представляет собой целевую ДНК, и способ дополнительно включает связывание целевой ДНК с праймером, содержащим сайт РНК-полимеразы.
91. Способ по любому из пп. 86-89, дополнительно включающий амплификацию образца нуклеиновой кислоты или триггерной нуклеиновой кислоты.
92. Способ по п. 91, в котором амплификация нуклеиновой кислоты включает амплификацию с помощью NASBA.
93. Способ по п. 91, в котором амплификация нуклеиновой кислоты включает амплификацию с помощью РПА.
94. Способ по любому из пп. 88-93, в котором образец представляет собой биологический образец или образец окружающей среды.
95. Способ по п. 94, в котором биологический образец представляет собой кровь, плазму, сыворотку, мочу, кал, мокроту, слизь, лимфатическую жидкость, синовиальную жидкость, желчь, асциты, плевральный выпот, серому, слюну, цереброспинальную жидкость, внутриглазную жидкость или стекловидное тело или любые выделения организма, транссудат, экссудат (например, жидкость, полученную из абсцесса или любого другого участка инфекции или воспаления) или жидкость, полученную из сустава (например, нормального сустава или сустава, пораженного заболеванием, таким как ревматоидный артрит, остеоартрит, подагра или септический артрит), или мазок с поверхности кожи или слизистой оболочки.
96. Способ по п. 94, в котором образец окружающей среды получен из пробы пищи, бумажной поверхности, ткани, металлической поверхности, деревянной поверхности, пластиковой поверхности, пробы почвы, пробы свежей воды, пробы сточной воды, пробы соленой воды, или их комбинации.
97. Способ по любому из пп. 88-96, в котором одна или более направляющих молекул сконструированы для обнаружения однонуклеотидного полиморфизма в целевой РНК или целевой ДНК, или варианта сплайсинга РНК-транскрипта.
98. Способ по любому из пп. 88-97, в котором одна или более направляющих молекул сконструированы для связывания с одной или более целевыми молекулами, которые являются диагностическими в отношении болезненного состояния.
99. Способ по любому из пп. 97 или 98, в котором одна или более направляющих молекул сконструированы для связывания с внеклеточными нуклеиновыми кислотами.
100. Способ по п. 98, в котором болезненное состояние представляет собой инфекцию, заболевание органа, заболевание крови, заболевание иммунной системы, рак, заболевание головного мозга и нервной системы, эндокринное заболевание, заболевание, связанное с беременностью или рождением ребенка, наследственное заболевание или приобретенное вследствие влияния окружающей среды заболевание.
101. Система по п. 50, в котором указанное болезненное состояние характеризуется наличием или отсутствием гена, или транскрипта, или полипептида устойчивости или чувствительности к антибиотику или лекарственному препарату, предпочтительно в патогене или клетке.
102. Система по п. 50, в которой указанной целевой молекулой является ген, или транскрипт, или полипептид устойчивости или чувствительности к антибиотику или лекарственному препарату.
103. Система по п. 47, в которой синтетическое несовпадение в указанной направляющей молекуле находится в позиции 3, 4, 5 или 6 спейсера, предпочтительно в позиции 3.
104. Система по п. 47 или 48, в которой указанное несовпадение указанной направляющей молекулы находится в позиции 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 спейсера, предпочтительно в позиции 5.
105. Система по п. 47, в которой указанное несовпадение составляет 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидов выше или ниже по потоку, предпочтительно 2 нуклеотида, предпочтительно ниже по потоку от указанного ОНП или другой однонуклеотидной вариации в указанной направляющей молекуле.
106. Система по любому из пп. 1-69 или 101-105, в которой указанная направляющая молекула содержит спейсер, который усечен относительно спейсера дикого типа.
107. Система по любому из пп. 1-69 или 101-106, в которой указанная направляющая молекула содержит спейсер, который содержит менее 28 нуклеотидов, предпочтительно от 20 до 27 нуклеотидов включительно.
108. Система по любому из пп. 1-69 или 101-106, в которой указанная направляющая молекула содержит спейсер, который состоит из 20 25 нуклеотидов или 20 23 нуклеотидов, такой как предпочтительно 20 или 23 нуклеотида.
109. Система по любому из пп. 1-69 или 101-108, в которой указанная маскирующая конструкция содержит олигонуклеотид РНК, сконструированный для связывания последовательности, образующей G-квадруплекс, где структура G-квадруплекса образована последовательностью, образующей G-квадруплекс, после расщепления маскирующей конструкции, и где структура G-квадруплекса генерирует детектируемый положительный сигнал.
110. Способ по любому из пп. 86-100, дополнительно содержащий сравнение детектируемого положительного сигнала с (синтетическим) стандартным сигналом.
111. Способ выявления целевой нуклеиновой кислоты в образце, включающий:
приведение в контакт образца с системой обнаружения нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-75; и
подвергание указанного контактирующего образца иммунохроматографическому анализу латерального потока.
112. Способ по п. 111, в котором указанная система обнаружения нуклеиновой кислоты содержит маскирующую конструкцию на основе РНК, содержащую первую и вторую молекулу, и где указанный иммунохроматографический анализ латерального потока включает обнаружение указанной первой и второй молекулы, предпочтительно в отдельных точках обнаружения на тест-полоске с технологией латеральной диффузии.
113. Способ по п. 112, в котором указанная первая молекула и указанная вторая молекула обнаруживаются путем связывания с антителом, распознающим указанную первую или вторую молекулу, и обнаружения указанной связанной молекулы, предпочтительно с применением сэндвич-антител.
114. Способ по п. 112 или 113, в котором указанная тест-полоска латерального потока содержит первое антитело выше по потоку, направленное против указанной первой молекулы, и второе антитело ниже по потоку, направленное против указанной второй молекулы, и в котором нерасщепленная маскирующая конструкция на основе нерасщепленной РНК связывается с указанным первым антителом, если целевая нуклеиновая кислота отсутствует в указанном образце, и где маскирующая конструкция на основе расщепленной РНК связывается как с указанным первым антителом, так и с указанным вторым антителом, если целевая нуклеиновая кислота присутствует в указанном образце.
115. Латеральное проточное устройство, содержащее подложку, содержащую первый конец, причем первый конец содержит часть для загрузки образцов и первую область, в которую загружают детектируемый лиганд, две или более систем CRISPR Cas, две или более конструкций для обнаружения, одну или более первых областей захвата, каждая из которых содержит первый связывающий агент, две или более вторых областей захвата, каждая из которых содержит второй связывающий агент, причем каждая из двух или более систем CRISPR Cas содержит белок CRISPR Cas и одну или более направляющих последовательностей, при этом каждая направляющая последовательность сконструирована для связывания одной или более целевых молекул.
116. Латеральное проточное устройство по п. 115, в котором каждая из двух или более конструкций для обнаружения содержит РНК- или ДНК-олигонуклеотид, содержащий первую молекулу на первом конце и вторую молекулу на втором конце.
117. Латеральное проточное устройство по п. 116, содержащее две системы CRISPR Cas и две конструкции для обнаружения.
118. Латеральное проточное устройство по п. 117, содержащее четыре системы CRISPR Cas и четыре конструкции для обнаружения.
119. Латеральное проточное устройство по любому из пп. 115-118, в котором часть для загрузки образцов дополнительно содержит один или более амплификационных реагентов для амплификации одной или более целевых молекул.
120. Латеральное проточное устройство по п. 117, в котором первая конструкция для обнаружения содержит ФАМ в качестве первой молекулы и биотин в качестве второй молекулы или наоборот, а вторая конструкция для обнаружения содержит ФАМ в качестве первой молекулы и дигоксигенин (ДИГ) в качестве второй молекулы или наоборот.
121. Латеральное проточное устройство по п. 116, в котором белок CRISPR Cas представляет собой РНК-нацеленный белок Cas.
122. Латеральное проточное устройство по п. 121, в котором РНК-нацеленный белок Cas представляет собой С2с2.
123. Латеральное проточное устройство по п. 121, в котором РНК-нацеленный белок Cas представляет собой Cas13b.
124. Латеральное проточное устройство по п. 119, в котором первая конструкция для обнаружения содержит Туе665 в качестве первой молекулы и Alexa-fluor-488 в качестве второй молекулы или наоборот; причем вторая конструкция для обнаружения содержит Туе665 в качестве первой молекулы и ФАМ в качестве второй молекулы или наоборот; причем третья конструкция для обнаружения содержит Туе665 в качестве первой молекулы и биотин в качестве второй молекулы или наоборот; и при этом четвертая конструкция для обнаружения содержит Туе665 в качестве первой молекулы и ДИГ в качестве второй молекулы или наоборот.
125. Латеральное проточное устройство по п. 124, в котором белок CRISPR Cas представляет собой РНК-нацеленный или ДНК-нацеленный белок Cas.
126. Латеральное проточное устройство по п. 125, в котором РНК-нацеленный белок Cas представляет собой С2с2.
127. Латеральное проточное устройство по п. 125, в котором РНК-нацеленный белок Cas представляет собой Cas13b.
128. Латеральное проточное устройство по п. 125, в котором ДНК-нацеленный белок Cas представляет собой Cas12a.