ШТАММ BIFIDOBACTERIUM BREVE OV-12, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИЙНЫХ ПРЕПАРАТОВ, БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ДОБАВОК К ПИЩЕ, ФЕРМЕНТИРОВАННЫХ И НЕФЕРМЕНТИРОВАННЫХ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ, ГИГИЕНИЧЕСКИХ И КОСМЕТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ
BIFIDOBACTERIUM BREVE OV-12 STRAIN, USED FOR MAKING BACTERIAL PREPARATIONS, BIOLIGICALLY ACTIVE ADDITIVES TO FOOD, FERMENTED AND UNFERMENTED FOOD PRODUCTS, HYGIENIC AND COSMETIC AGENTS

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой, косметической и медицинской промышленности и может быть использовано в производстве бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.
Средства, содержащие в своем составе бифидобактерии с пробиотическими свойствами, предназначены для нормализации микрофлоры различных биотопов человеческого организма, поврежденных под влиянием неблагоприятных воздействий экологических факторов, перенесенных заболеваний, длительного приема антибиотиков и прочих лекарственных препаратов, лучевой и химиотерапии и множества других причин [1, 4].
Эффективность лечебных продуктов и биопрепаратов зависит прежде всего от характеристик штамма-продуцента, его технологических свойств и специфической активности. Большой ассортимент производственных штаммов, обладающих ценными медико-биологическими свойствами, делает возможным конструирование новых средств коррекции микрофлоры - как моно-, так и многокомпонентных, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, кожных покровов, урогенитальной сферы и устранять дисбиотические нарушения.
Исследования видового состава бифидофлоры, проводившиеся ранее с применением биохимических методов идентификации, позволили сделать заключение о том, что бифидобактерии в организме человека представлены пятью видами - Bifidobacterium bifidum, В. longum, В. adolescentis, В. breve и В. infantis (патенты РФ 1347221, 849779, 2108383, 2152993, 863639, 2120991, 2078814, 2111248). При этом анализ полученных данных показал, что виды В. bifidum и В. longum выявляются у здоровых людей всех возрастных групп, но с возрастом их доля в составе микробиоценоза постепенно снижается. Вид В. adolescentis свойственен только взрослым людям и детям старшего возраста; у пожилых людей он становится преобладающим. Виды В. infantis и В. breve обнаруживаются только у детей грудного возраста [3,6].
Применение современных подходов генотипирования бифидобактерии подтвердило присутствие В. breve в составе микрофлоры грудных детей [2, 5, 6, 8].
Включение новых производственных штаммов бифидобактерии расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микроэкологических нарушений в различных биотопах и позволит проводить данные мероприятия более рационально.
Целью настоящего изобретения является штамм Bifidobacterium breve OV-12, который выделен из содержимого кишечника здорового грудного ребенка, находившегося на грудном вскармливании, и депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов нормальной микрофлоры ФГУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора под №217.
Заявляемый штамм может быть использован при производстве бактерийных препаратов в различных формах, в том числе биологически активных добавок, капсул, таблеток, суспензий, суппозиториев; ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, в том числе детского питания, соков, напитков и т.д. Также штамм В. breve OV-12 может быть применен в производстве гигиенических средств, например кремов, гелей, косметических масок.
Техническим результатом заявленного изобретения является получение бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, которые в качестве действующего начала пробиотической направленности содержат штамм В. breve OV-12, в ходе технологического процесса на производственных средах в короткие сроки накапливающего биомассу с высоким содержанием бифидобактерий, обладающего антагонистической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, широким спектром устойчивости к антибактериальным средствам, органическим кислотам, а также внешним воздействиям, что обеспечивает активную колонизацию биотопа и восстановление резидентной микрофлоры.
Применение данного штамма расширит номенклатуру разрабатываемых бифидосодержащих средств коррекции микрофлоры человека и позволит создать формулу симбиотической ассоциации штаммов бифидобактерий, наиболее приближенную к составу микробиоценоза кишечника современного здорового человека.
Заявляемый штамм обладает следующими свойствами.
Морфологические свойства
Клетки штамма В. breve OV-12 представляют собой Грам+ полиморфные, бесспоровые неподвижные крупные палочки с бифуркацией на одном конце, расположенные попарно крестообразно в виде хромосомы, буквы Х, Т, «рожек улитки».
В полужидких питательных средах клетки растут по всему объему, кроме зоны аэробиоза; отдельно выросшие колонии имеют вид «комет» в форме елочек длиной до 1 см. Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.
Физиолого-биохимические свойства
Облигатный анаэроб. Оптимальная температура выращивания - 37,5-38°С. Каталазу не образует, желатину не разжижает. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и L+молочной кислоты без образования газа, закисляя среду до рН 3,9-4,1. Ферментирует мальтозу, фруктозу, галактозу, лактозу, мелецитозу, сахарозу, маннозу, вариабельно сбраживает раффинозу, ксилозу, арабинозу. Не ферментирует салицин, трегалозу, рамнозу, маннозу, эскулин, целлобиозу, сорбитол. На уреазу, нитраты и индол реакция отрицательна.
Генотипирование штамма В. breve OV-12 осуществлялось на основе амплификации, клонирования и последующего секвенирования фрагментов генов, кодирующих 16S рибосомальную РНК и трансальдолазу.
Прочитанные последовательности ДНК зарегистрированы в GenBank под номерами EU 272015 и EU 272021.
Культуральные свойства
Штамм активно накапливает биомассу на производственных средах различного состава до высоких показателей содержания КОЕ/мл бифидобактерий и органических кислот (таблица 1). Логарифмическая фаза роста заканчивается к 16-24 часам.
Таблица 1
Накопление биомассы и органических кислот при культивировании штамма В. breve OV-12 на различных питательных средах.
Питательная среда
КОЕ/мл
°T
Среда для культивирования бифидобактерий (БС)
5,0×10<sup>9</sup>
178
МРС
5,6×10<sup>9</sup>
205
Гидролизатно-молочная среда
6,0 ×10<sup>9</sup>
210
Печеночная среда
5,8×10<sup>9</sup>
210
Молоко восстановленное обезжиренное
2,0×10<sup>8</sup>
135
9
Данные, представленные в таблице 1, показывают, что штамм В. breve OV-12 накапливает на производственных средах биомассу бифидобактерий с содержанием не ниже 10 КОЕ/мл и органические кислоты - ценные продукты метаболизма, с которыми, преимущественно, связан уровень антагонистической активности штамма. Молоко сквашивает к 24 часам до 90°Т с образованием плотного сгустка. Максимальная кислотность в молоке - 150°Т.
Данные изучения динамики накопления микробной массы и органических кислот (продуктов метаболизма) в процессе культивирования представлены в таблице 2.
Таблица 2
Динамика культивирования штамма В.breve OV-12 в молоке и среде для выделения и культивирования бифидобактерий в стационарных условиях
Время выращивания после посева, (ч)
Выращивание на молоке
Выращивание на БС среде
°T
КОЕ/мл
°T
КОЕ/мл
0
18
1,2×10<sup>7</sup>
34
2,lxl0<sup>6</sup>
24
90
2,0×10<sup>8</sup>
140
3,5х10<sup>9</sup>
48
135
2,2×10<sup>8</sup>
260
4,0х10<sup>9</sup>
Как видно из таблицы 2, в процессе культивирования происходит динамичное накопление микробной массы и органических кислот. Максимальные величины этих показателей отмечались к 24 часам культивирования.
Таким образом, из приведенных данных видно, что штамм В. breve OV-12 отличается высокой технологичностью, активно наращивает биомассу бифидобактерий на производственных и лабораторных средах с высокими показателями значения КОЕ/мл.
Антагонистическая активность штамма изучалась на плотных питательных средах методом отсроченного антагонизма с тест-культурами условно-патогенных микроорганизмов.
Результаты, представленные в таблице 3, показали, что В. breve OV-12 проявляет высокие антагонистические свойства в отношении тестируемых штаммов.
Таблица 3
Антагонистическая активность штамма В. breve OV-12
№
Штамм тестируемого микроорганизма
Зона задержки роста в присутствии штамма В. breve OV-12, мм
1
Staphylococcus aureus ATCC 6538-P
20±3
2
Shigella flexneri 337
28±3
3
Shigella sonnei 177
26±5
4
Proteus vulgaris 1274
28±2
5
Escherichia coli 157
26±3
Чувствительность к антибиотикам штамма В. breve OV-12 изучалась на модели 32 антимикробных препаратов, применяемых в медицинской практике. Изучение проводили диско-диффузионным методом в интерпретации, разработанной в лаборатории биологии бифидобактерий ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского с учетом рекомендаций МУК 4.2.1890-04 [7]. Полученные данные представлены в таблице 4.
Таблица 4
Антибиотикочувствительность штамма В. breve OV-12
№
Название антибиотика
Интерпретация зон
Содержание препарата в диске, мкг
Диаметр зоны ингибирования роста в мм
Устойчив
Промежуточно устойчив
Чувствителен
1
Бензилпенициллин
≤19
20-27
≥28
10
37±1
2
Оксациллин
≤10
11-13
≥14
10
35±0
3
Ампициллин
≤10
11-14
≥16
10
40±2
4
Карбенициллин
≤14
15-18
≥19
25
42±2
5
Азлоциллин
≤13
14-16
≥16
75
40±2
6
Цефалотин
≤14
15-18
≥19
30
40±2
7
Цефалексин
≤14
15-18
≥19
30
32±2
8
Цефазолин
≤14
15-18
≥19
30
30±2
9
Цефтазидим
≤14
15-17
≥18
30
33±2
10
Цефотаксим
≤14
15-20
≥21
30
35±2
11
Имипенем
≤13
14-15
≥16
10
40±0
12
Стрептомицин
≤16
17-19
≥20
30
15±2
13
Неомицин
≤12
13-16
≥17
30
0±0
14
Канамицин
≤14
15-18
≥19
30
0±0
15
Гентамицин
≤12
13-14
≥15
10
12±2
16
Амикацин
≤14
15-16
≥17
30
0±0
17
Тетрациклин
≤16
17-21
≥22
30
27±2
18
Доксициклин
≤15
16-19
≥20
10
34±0
19
Эритромицин
≤17
18-21
≥22
15
30±0
20
Азитромицин
≤13
14-17
≥18
15
20±2
21
Кларитромицин
≤13
14-17
≥18
15
25±3
22
Рокситромицин
≤13
15-18
≥19
30
37±2
23
Линкомицин
≤19
20-23
≥24
15
35±1
24
Клиндамицин
≤14
15-20
≥21
2
32±2
25
Ванкомицин
≤14
15-16
≥17
30
38±3
26
Хлорамфеникол (левомицитин)
≤15
16-18
≥19
30
21±2
27
Рифампицин
≤12
13-15
≥16
5
35±2
28
Полимиксин
≤11
12-14
≥15
300 ЕД
0±0
29
Налидиксовая кислота
≤12
13-17
≥18
30
0±0
30
Ципрофлоксацин
≤15
16-20
≥21
5
12±2
31
Пефлоксацин
≤14
15-21
≥22
10
0±0
32
Ломефлоксацин
≤18
19-21
≥22
10
25±2
Как видно из таблицы 4, штамм устойчив к полимиксину, налидиксовой кислоте, амикацину, неомицину, канамицину, пефлоксацину, гентамицину, ципрофлоксацину, стрептомицину. К остальным антибиотикам, используемым в исследовании, штамм чувствителен.
Безвредность
7
В опыте изучения острой токсичности штамма В.breve OV-12 показана его полная безвредность: при введении белым мышам дозы per os микробной взвеси бифидобактерий в количестве 5×10 КОЕ на животное, гибели мышей не отмечено.
9
Таким образом, из приведенных данных видно, что новый штамм В. breve OV-12 отличается высокой технологичностью, при культивировании на производственных средах активно накапливает биомассу бифидобактерий не ниже 10 КОЕ/мл и органические кислоты, обладает высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам, устойчивостью к широкому спектру антибиотиков. Безвреден при введении лабораторным животным.
Представленные данные изучения штамма В. breve OV-12 позволяют сделать заключение о перспективности его использования как основы для бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, а также средств гигиенического и косметического назначения.
Пример 1. Использование штамма В. breve OV-12 для получения биологически активной добавки к пище в жидкой форме
7-8
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
6-8
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (1 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (20 литров) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
9
4-й пассаж: производственную закваску вносят в объеме 3-5% в аппарат для культивирования со стерильной гидролизатно-молочной средой следующего состава (в расчете на 1 литр среды): гидролизат молока - 0,5 л, пептон - 2 г, лактоза - 10 г, хлористый натрий - 5 г, цистеин - 0,2 г, агар-агар - 1 г, дистиллированная вода - 0,5 литра; рН среды - 7,0-7,2. Проводят культивирование в течение 16-24 часа при температуре 37-38°С. Выросшая биомасса представляет собой жидкий концентрат бифидобактерий с содержанием бифидобактерий не менее 10 КОЕ/мл, который можно непосредственно использовать в качестве биологически активной добавки лечебно-профилактического назначения. Готовый продукт разливают по 100 мл во флаконы и герметично укупоривают.
Пример 2. Использование штамма В. breve OV-12 в качестве ингредиента неферментированного пищевого продукта
7-8
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
6-8
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
9
4-й пассаж: производственную закваску вносят в гидролизатно-молочную среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38 С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10 КОЕ/мл бифидобактерий.
6-7
Готовая биомасса служит для обогащения пищевых продуктов. Ее вносят в молоко, соки, детское питание, мороженое и другие продукты, перемешивают и разливают или фасуют в емкости, получая продукт с концентрацией бифидобактерий 10 КОЕ/мл или КОЕ/г.
Пример 3. Использование штамма В. breve OV-12 для получения бактерийного препарата
7-8
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде до 10 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
6-8
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
4-й пассаж: производственную закваску вносят в казеиново-дрожжевую среду в количестве 5% к объему среды и культивируют при 37-38°С в течение 24 часов. Готовая биомасса содержит не менее 10 КОЕ/мл бифидобактерий.
К готовой биомассе добавляют сахарозо-желатиновую защитную среду высушивания в объеме 10-15% и 15-20% обезжиренного молока. Полученную суспензию разливают по 5 мл в пенициллиновые флаконы, замораживают при -40-45°С и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат имеет не менее 10 КОЕ/г живых клеток бифидобактерий.
Пример 4. Использование штамма В. breve OV-12 для получения капсулированной формы биологически активной добавки к пище
9
8
Для капсулирования готовят смесь, в которую входят следующие ингредиенты: 1 часть сухой биомассы, содержащая не менее 10 КОЕ/г бифидобактерий, 6 частей инулина и 3 части яблочного пектина. К смеси из расчета получившейся массы добавляют 0,5% аэросила и 1% аскорбиновой кислоты. После тщательного перемешивания проводят капсулирование в капсулы №0 по 0,4 г. В1 г БАД к пище содержится не менее 10 KОЕ жизнеспособных бифидобактерий.
Пример 5. Использование штамма В. breve OV-12 для получения гигиенических и косметических средств
9
Сухую биомассу бифидобактерий штамма В. breve OV-12 с содержанием бифидобактерий не менее 10 КОЕ/г вводят в состав питательного крема из расчета 1 г на 100 г крема.
Пример 6. Использование штамма В. breve OV-12 для получения кисломолочного продукта
1-й пассаж: лиофилизированную стартерную культуру штамма В. breve OV-12 регидратируют средой для культивирования либо физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведений в питательной среде
7-8
до 10 раз. Инкубируют при температуре 37-38°С в течение 48 часов.
6-8
2-й пассаж: выросшую культуру из разведения в 10 раз в объеме 5% вводят в среду накопления (0,2 л) и культивируют 16-24 часа при 37-38°С (лабораторная закваска).
3-й пассаж: лабораторную закваску вносят в среду накопления (4 л) в объеме не более 5% и инкубируют при 37-38°С (производственная закваска).
8
4-й пассаж: производственную закваску вносят в стерильное обезжиренное молоко в количестве 5% к его объему и культивируют при 37-38°С до сквашивания (в течение 16-18 часов). Готовый продукт охлаждают и разливают по 0,2 л в пластиковые стаканчики и укупоривают крышками из металлической фольги. Продукт содержит не менее 10КОЕ/мл бифидобактерий.
Литература
1. Бондаренко В.М., Мапулевич Т.В. / Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром: современное состояние проблемы. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007, с.300.
2. Воронина О.Л., Субботина М.Е., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. /Дифференцирование видов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы - Научно-практический журнал «Клиническое питание», 2007, №1-2, с.31.
3. Гончарова Г.И., Вилыпанская Ф.Л., Ж. микробиол., 1968, №7, с.55.
4. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. / Функциональное питание. М., Грант, 2002, с.295.
5. Карзанова М.Е., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. / Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. - Научно-теоретический журнал «Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук», 2006, №5, с.9-12.
6. Козлова Э.П., Курносова Н.А., Феклисова Л.В. / Теоретические и медико-биологические аспекты использования различных видов бифидобактерий в составе средств профилактики и лечения дисбактериозов кишечника, - Сб. научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского, 1986, с.64-69.
7. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2. 1890-04, 2004., 52 с.
8. Шкопоров А.Н., Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. / Бифидобактерий: традиционный взгляд и современные генетические исследования: Журнал «Вопросы практической педиатрии», 2007, т.2, №5, с.76-79.