СПОСОБ ВИТРИФИКАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ
METHOD FOR VITRIFICATION OF BIOLOGICAL OBJECTS

Предложение относится к области биологии и медицины, в частности к витрификации гамет и эмбрионов.
В настоящее время известен способ, в котором носитель для витрификации состоит из внутренней соломины объемом 0,25 мл, один из концов которой заполнен витрификационным раствором с витрифицируемыми объектами, и внешней соломины-кожуха объемом 0,5 мл, запаиваемой с обоих концов металлическими шариками и погружаемой затем в жидкий азот.(Aseptic technology of vitrification of human pronuclear oocytes using open-pulled straws, V. Isachenko et al. Hum. Reprod. (February 2005) 20(2); 492-496.) Размораживание объектов в данной системе осуществляется после вскрытия внешней соломины и извлечения внутренней соломины немедленным помещением заполненного витрификационным раствором с объектами конца внутренней соломины в раствор для размораживания.
Наиболее близким к патентуемому образцу является способ замораживания, при котором объекты помещаются в гибкую поликарбонатную предварительно укороченную пипетку для переноса гамет и эмбрионов, после чего пипетка помещается в запаянную с одного конца наружную соломину-кожух, которая затем запаивается с другого конца и погружается в жидкий азот; размораживание в данной системе осуществляется погружением конца пипетки с объектами в раствор для размораживания после вскрытия внешней соломины ножницами. (MicroSecure Vitrification (µ-S-VTF) Procedure: Optimum simplicity, security, cost-savings and effectiveness combining FDA-approved products, Mitchel C.Schiewe, The Journal of Clinical Embryology, Volume 13, Issue 2, 33-40).
Недостатками прототипа являются: сниженная скорость охлаждения объектов, возможность примерзания внутренней пипетки с эмбрионами к одному из концов наружной соломины за счет того, что пипетка не запаивается, необходимость использования большого (около 5 мл) объема раствора для размораживания.
Технической задачей и технологическим результатом способа является уменьшение себестоимости процедуры витрификации в сочетании с повышением скорости охлаждения объектов для оптимизации условий замораживания и обеспечением стопроцентной извлекаемости и безопасности хранения объектов за счет асептичности носителя.
Поставленная задача решается за счет того, что замораживание витрифицируемых биологических объектов осуществляется в гибкую поликарбонатную пипетку для переноса гамет, эмбрионов и кумулюсооцитарных комплексов диаметром 130-600 мкм; сначала в пипетку набирают небольшой объем витрификационного раствора без биологических объектов, затем в пипетку набирают витрификационный раствор с биологическими объектами, после чего осуществляют добавление витрификационного раствора так, чтобы биологические объекты были размещены на расстоянии не менее чем 10 мм от дистального конца поликарбонатной пипетки, после чего производят запаивание с дистального конца пипетки и проверку герметичности шва посредством стриппетора, далее запаивают проксимальный конец пипетки и погружают ее в азот на время, равное не менее 20 сек, после чего пипетку с витрифицированными объектами упаковывают в соломину-кожух объемом не менее 0,25 мл, содержащую металлический стержень с одного из концов, который предварительно герметично запаивают для смещения центра тяжести носителя, после помещения пипетки в соломину последнюю запаивают.
Способ поясняется прилагаемым графическим материалом, где:
на фиг.1 представлена внешняя соломина с хлопковым фильтром без внутреннего металлического стержня;
на фиг.2 - внешняя соломина с металлическим стержнем внутри, смещенным внутренним хлопковым фильтром, запаянная с дистального конца;
на фиг.3 - витрифицируемый биологический объект, находящийся внутри гибкой поликарбонатной пипетки, надетой на стриппетор;
на фиг.4 - запаянная с обоих концов гибкая поликарбонатная пипетка с находящимися внутри объектами;
на фиг.5 - запаянная поликарбонатная пипетка с находящимися внутри объектами и внешняя соломина погружены в жидкий азот;
на фиг.6 - запаянная поликарбонатная пипетка с витрифицированными объектами помещена и запаяна в наружную соломину.
Для реализации способа используют:
1 - внешнюю соломину-кожух, содержащую
2 - хлопковый фильтр и
3 - металлический стержень, смещающий центр тяжести соломины, которую предварительно
4 - запаивают. С помощью
5 - стриппетора в
6 - гибкую поликарбонатную пипетку набирают
7 - витрифицируемые объекты, затем
8 - пипетку запаивают и погружают в
9 - жидкий азот. Далее пипетку упаковывают в наружную соломину, которую затем герметично запаивают.
Загрузка замораживаемых объектов в пипетку и ее запаивание ультразвуковым или термическим запаивателем осуществляются следующим образом: сначала в пипетку набирают небольшой объем витрификационного раствора без замораживаемых объектов, далее набирают витрификационный раствор с объектами, затем витрификационный раствор, при этом необходимо, чтобы объекты располагались не менее чем на расстоянии 10 мм от дистального конца пипетки, что контролируется визуально в стереомикроскопе, для предотвращения их возможного повреждения при запаивании; после заполнения пипетки дистальный ее конец (через который загружались объекты) запаивается, герметичность образовавшегося шва контролируется следующим образом - на поршень стриппетора, с которым соединена пипетка осуществляются надавливания и в это время визуально контролируется перемещение мениска раствора внутри пипетки или истечение его наружу через место шва, в случае если имеется движение мениска или истечение раствора через несостоятельный шов, необходимо перезапаять пипетку выше первоначального уровня. После запаивания дистального конца пипетки ее снимают со стриппетора и запаивают противоположный уже запаянному конец.
После этого пипетка сразу же погружается в жидкий азот не менее чем на 20 секунд, затем она перемещается в предварительно маркированную наружную соломину-кожух со смещенным центром тяжести, причем утяжеленный конец внешней соломины находится в жидком азоте, а противоположный конец находится над его поверхностью, через него осуществляется загрузка пипетки в соломину. После загрузки пипетки в наружную соломину последнюю запаивают ультразвуковым или термическим запаивателем, не вынимая из жидкого азота, причем так, чтобы верхний конец расположенной внутри пипетки с замораживаемыми объектами не был запаян вместе с наружной соломиной в одном шве.
Наружная соломина-кожух изготавливается из коммерчески доступной соломины для медленного замораживания гамет и эмбрионов объемом не менее 0,25 мл, содержащей с одного из концов хлопковую пробку. Металлический стержень, соответствующий по диаметру внутреннему диаметру соломины, длиной 1-1,5 см вводится в соломину со стороны конца, на котором находится хлопковая пробка, таким образом, чтобы стержень сместил пробку кнутри и наружным концом углублялся на не менее чем 5 мм внутрь соломины. После введения стержня производится запаивание соломины, чтобы герметизировать ее и препятствовать выпадению металлического стержня. Данный стержень смещает центр тяжести носителя и препятствует всплытию того конца его, ближе к которому находятся витрифицированные объекты, что является дополнительным фактором температурной стабильности хранения и защиты от девитрификации.
Размораживание объектов, хранящихся в представленном носителе, осуществляется следующим образом: наружная соломина-кожух вскрывается при помощи приспособления для очистки проводов от обмотки таким образом, чтобы была нарушена целостность внешней соломины и не нарушена целостность внутренней пипетки. При этом большая часть носителя находится в жидком азоте и возвышается над его поверхностью только минимально необходимая часть для вскрытия. Далее откушенный фрагмент наружной соломины снимается и внутренняя пипетка извлекается за широкий запаянный конец, после чего она немедленно помещается в водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия на 5-7 секунд. Затем пипетку обрабатывают 70% раствором этилового спирта и приступают к вскрытию с помощью острого лезвия либо стерильных острых ножниц. Частным случаем приспособления для вскрытия является бритвенное лезвие, фиксированное в хирургическом зажиме. Вскрытие осуществляется следующим образом: сначала отрезается запаянный конец пипетки с той ее стороны, где нет витрифицированных объектов, затем тотчас за местом запаивания отрезается конец, где находятся объекты. После вскрытия пипетки с обоих концов на широкий ее конец надевают грушу и, слегка надавливая на нее, выпускают объекты в раствор для размораживания. Далее порядок манипуляции с объектами соответствует инструкции к используемым растворам.
Таким образом, положительным результатом применения данного способа является уменьшение себестоимости носителя для витрификации и снижение расхода растворов для замораживания и размораживания, что в итоге выливается в уменьшение себестоимости всей процедуры. При этом обеспечивается стопроцентная извлекаемость объектов и высокая безопасность хранения за счет асептичности носителя.