Критерии оценки биологической и метастатической активности опухоли при немелкоклеточном раке легкого

2. Кузнецова С. М. Этиопатогенез инсульта. Клинические варианты //Doctor. - 2003. - №3. -С. 16 - 20.

3. Манвелов Л. С. О некоторых итогах изучения начальных проявлений недостаточности кровоснабжения мозга. Клиническая медицина. -1995. - №5. - С. 28 - 30.

4. Мищенко Т. С. Клинико-патогенетические особенности хронических ишемических нарушений мозгового кровообращения и программа реабилитации /Т. С. Мищенко, Л. Ф. Шестопалова, Т. В. Крыженко //Украинский вестник психоневрологии. - 2002. - №2. - С. 63 - 65.

5. Endothellium-dependent dilation in the systemic arteries of asymptomatic subjects relates to coronary risk factors and their interaction /D. S. Celermajer, K. E. Sorensen, C. Bull et al. //J. Am.

Coll. Cardiol. - 1994. - V. 24, P. 1468 - 1474.

6. Non-invasive detection of endothelial dysfunction in children and adults at risk of arteriosclerosis /D. S. Celermajer, K. E. Sorensen, V. M. Gooch et al. // Lancet. - 1992. - V. 340. - P. 1111 - 1115.

7. Serum proteins modified by neutrophil-derived oxidants as mediators of neutrophil stimulation. / G. F. Kormoczi, U. M. Wolfel, A. R. Rosenkranz et al. //J. Immunol. - 2001. - V. 167, №1. - P. 451 - 460.

8. Wiley K. E. Nitric oxide-mediated modulation of the endothelin-1 signalling pathway in the human cardiovascular system. Br. /K. E. Wiley, A. P. Davenport //J. Pharmacol. - 2001. - V. 132. - №1. -P. 213 - 220.

Поступила 14.06.07

M. K. Tundybayeva

IMPORTANCE OF INFRINGEMENT VASOMOTOR OF FUNCTION ENDOTHELIUM IN DEVELOPMENT OF INITIAL DISPLAYS CEREBRAL DYSCIRCULATION AT THE PATIENTS WITH ARTERIAL HYPERTENSION

The aim to define of the functional condition of endothelium at the patients with arterial hypertension with initial displays of insufficiency bloodstream of a brain. In patients with arterial hypertension with initial attributes of insufficiency bloodstream of a head brain it is marked endothelial dysfunction: infringement of the endo-thelium-dependent dilation at preservation of a normal level endothelin-1.

М. К. Тундыбаева

АРТЕРИЯЛЬЩ КАН КЫСЫМЫ ЖОРАРЫ АУРУЛАРДЫЦ МИДАРЫ ЦЕРЕБРАЛЬДЫ КАН АЙНАЛЫМЫ Б¥ЗЫЛУЫ ДАМУЫНЫЦ АЛРАШКЫ САТЫЛАРЫНДАРЫ ЭНДОТЕЛИЯНЫЦ КАН АЙНАЛЫМЫ КЫЗМЕТ1НЕ Н¥ЦСАН КЕЛУ1НЩ МЭН1

Мидары кан айналымы жеткпеуштИ бастапкы белгiлерi бар артериалык кан кысымы жорары аурулардыч эндотелишщ кан айналымы кызмет жардайын аныктау. Ми кан айналымы жетктказдИнщ бастапкы белгiлерi бар артериалык кан кысымы жорары аурулардыч эндотелия кызметi бузылраны белгiлендi: эндотелин дечгешнщ калпы сактала турып эндотелиге тэуелдi кан тамырларыныч кечеюг

А. М. Букенов, В. С. Перминов, Л. Н. Рубцова, А. В. Ким

КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ И МЕТАСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОПУХОЛИ ПРИ НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ЛЕГКОГО

Карагандинский областной онкологический центр

При лечении рака легкого имеет значение не только степень распространенности опухолевого процесса, но биологическая активность опухоли и степень ее дифференцировки. Для определения степени дифференцировки опухоли и ее биологической активности применяется гистологическое и иммуногистохимическое исследование (ИГХ), которое является более современным и перспективным.

При анализе опухолей легких в повседневной работе патолога при ИГХ исследовании используются антитела к цитокератинам (ЦКР), эмбриональным мембранным антигенам (ЭМА), раково-эмбриональным антигенам (РЭА), нейро-

эндокринным антигенам. Антитела к широкому спектру цитокератинов и ЭМА выявляются практически во всех раковых опухоля легкого. Антитела к ЦКР ярко окрашивают высокодифферен-цированный плоскоклеточный рак и значительно слабее - низкодифференцированный [1, 2]. Ци-токератины плоских эпителиев в аденокарцино-мах выявляются только очагово. Антитела к ци-токератинам «простых» эпителиев № 7, 8, 18, 19 интенсивно связываются с аденокарциномами легкого и менее ярко - с плоскоклеточным раком и карциномами. Виментин в злокачественных опухолях легкого, как правило, не выявляется. При плоскоклеточном веретеноклеточном раке отмечается коэкспрессия цитокератинов и вимен-тина, причем в ряде опухолей отмечается преобладание экспрессии виментина [3].

Если в плоскоклеточном раке антитела к компонентам базальной мембраны окрашивают базальную мембрану опухолевых гнезд непрерывной линией, то такие опухоли являются вы-сокодифференцированными и менее агрессивными, чем рак с разрушенной базальной мембраной.

Медицина и экология, 2007, 3

По последним литературным данным, экспрессия р53 является фактором прогноза 5-летней безрецидивной выживаемости больных немелкоклеточным раком легкого [1, 2].

Бронхиолоальвеолярный рак позитивен на ЦКР № 7, 8, 18, 19, РЭА, ЭМА и эпителиальный антиген ВЕР-ЕР4, в то время как реакция на ви-ментин всегда негативная.

Нейроэндокринные опухоли легкого на основе их морфологии и иммуногистохимических характеристик принято делить на 4 типа: типичный карциноид, атипичный карциноид, мелкоклеточный рак и крупноклеточный нейроэндокрин-ный рак. До 80% всех этих новообразований реагирует с антителами к цитокератинам простых эпителиев. Около 50% карциноидов может давать негативную реакцию с панцитокератино-выми антителами различных клонов, в то время как мелкоклеточный рак окрашивается на эти маркеры всегда. По наблюдениям ряда авторов [1, 2], до 80% мелкоклеточного рака дает негативную реакцию на цитокератины 7 и 20.

Крупноклеточный нейроэндокринный рак отличается постоянной экспрессией цитокерати-нов, РЭА, высокой частотой окрашивания на нейрон-специфическую энолазу ^СЕ), хромогра-нина А, СD 56. С частотой менее 40% выявляются синаптофизин, адренокортикотропный гормон (АКТГ), кальцитонин.

Необходимо отметить, что до 30% первичного плоскоклеточного рака, аденокарцином и крупноклеточного рака легкого могут с различной интенсивностью экспрессировать.

До 50% крупноклеточного недифференцированного рака и низкодифференцированных аденокарцином легкого дают гетерогенную ко-экспрессию цитокератинов и виментина, а также содержат группы клеток, реагирующих с антителами к нейроэндокринным антигенам. Некоторые авторы предлагают называть такие новообразования крупноклеточным нейроэндокринным раком и для выявления этой группы опухолей проводить во всех случаях крупноклеточного рака анализ нейроэндокринных маркеров. Это связано с плохим прогнозом заболевания и необходимостью проведения у таких больных различных режимов химиотерапии.

В патогенезе рака легкого наибольшее значение имеют клеточные онкогены четырех семейств мус, га8, вс1, сегЬВ.

Высокая экспрессия вс1-2 (ингибитор апоптоза) отмечается при мелкоклеточном (МРЛ) и немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ), тогда как высокая экспрессия СегЬВ-2 (HER2/neu) отмечается только при НМРЛ.

Семейство генов вс1 [3], состоящее из Ьс1-2, Ьах, Ьак, Ьс^, Ьс^ и других, белковые продукты которых способны образовывать гомо- и гетеродимеры, оказывают порой диаметрально противоположное действие на пролиферацию и апоптоз опухолевых клеток. Наиболее изученный Ьс1-2 локализуется на внутренней мембране ми-

тохондрий, а также в ядре, стимулирует пролиферацию клеток и ингибирует апоптоз, что определяет сдвиг в сторону пролиферации или апоптоза в опухоли. Экспрессия Ьс1-2 обнаруживается в цитоплазме и ядрах опухолевых клеток примерно в 90% случаев МРЛ, значительно реже - при НМРЛ. Ни в одном из изученных карциноидов легких экспрессия Ьс1-2 не выявлена. Ядерная локализация онкопротеина Ьс1-2 может соответствовать его неактивной фосфорилированной форме, не способной блокировать апоптоз. Обнаружена также достоверная корреляция между экспрессией Ьс1-2 и стадией опухоли. Имеется положительная корреляция Ьс1-2 с лучшими показателями выживаемости больных МРЛ. Данные при НМРЛ относительно корреляции экспрессии Ьс1-2 с выживаемостью больных противоречивы. В целом можно сделать вывод, что иммуногисто-химия Ьс1-2 имеет значение в определении прогноза при раке легкого.

Ген-супрессор при раке легкого [3] р53 подвергается наиболее частым изменениям при опухолевом росте. Мутированный р53 вызывает образование антител, которые выявляются в крови больных, что послужило поводом для разработки иммунодиагностики и иммунотерапии рака легкого.

Мутация вызывает конформационные изменения в протеине р53 и тот накапливается в ядрах клеток, что позволяет определять его им-муногистохимическим методом. Напротив, дикий тип р53 обладает очень коротким полупериодом и поэтому его невозможно определить иммуноги-стохимически. Накопление мутанного р53 обнаруживается в 70-100% случаев культуры клеток МРЛ, в 50-70% МРЛ операционного и секционного материала и 45-75% НМРЛ. Аккумуляция в ядрах клеток может достоверно свидетельствовать о появлении мутации в гене р53 при условии, что имеется не менее 20% позитивных клеток, выявленных не менее чем двумя методами. р53 негативные случаи - это не только случаи с диким р53, но и случаи с отсутствием синтеза какого-либо белка р53. Эти случаи имеют неопределяемые и сплайсинговые мутации, которые невозможно выявить иммуногистохимически, и составляют примерно 20% негативных по р53 наблюдений. В целом инактивация р53 при раке легкого наблюдается в 70% случаев. Исследования по корреляции экспрессии р53 с выживаемостью противоречивы. Имеются доказательства о значении мутации р53 на ранних стадиях канцерогенеза легкого. р53 мутантные формы никогда не выявляются при базально-клеточной гиперплазии или плоскоклеточной метаплазии без признаков дисплазии. Однако следует помнить, что примерно 50% случаев рака легкого развивается без р53 мутации. То есть мутация - это не обязательный феномен, характерный для рака легкого, и поэтому отсутствие р53 не является прогностическим признаком. Найдена достоверная корреляция между уровнем экспрессии р53 и

£

а> Ь К

с к а

¡а

ш и о й о

к л

ю

о о

Корреляция параметрическая онкомаркеров в зависимости от пола и возраста больных НМР/1

Таблица 1.

УапаЫе в-Р 401 Р01. РА1\1-гк1* 1КЯ8-18 1КЯ-7 У1МЕМТШ Н-С1*АР БЮО К167 Р53 ВС 1.2

1,00 -,40* -,32* ,15 -,58* -,74* ,16 ,19 -Д4 ,74* ,73* ,21 ,33* ,05 -,24

-,40* 1,00 ,11 -,05 0,5 ,28* -,27* -,01 ,37* -,41* -,33* -,16 Д9 ,38* -,28*

401 -,32* ,11 1,00 -,37* ,33* ,06 ,29* ,38* Д9 -,47* -,62* -,09* -,25 -,02 ,23

Р01. ,15 -,05 -,37* 1,00 -Д7 -,05 ,05 -дз -ДЗ ,24 ,24 -,07 ,00 -,02 -,07

РА1\1_гк1* -,58* 0,5 ,33* -Д7 1,00 ,61* ,19 ,29* -,16 -,65* -,69* -,28 -,52* -,27* ,44*

ZKR.PL -,74* ,28* ,06 -,05 ,61* 1,00 -Д9 -,38* ,01 -,44* -,44* -ДЗ -,20 ,06 Д4

1КЯ8-18 ,16 -,27* ,29* ,05 ,19 -Д9 1,00 ,60* -ДО -Д2 -,18 -,15 -,31* -Д9 ,30*

1КЯ_7 Д9 -,01 ,38* -дз ,29* -,38* ,60* 1,00 ,08 -,30* -,32* -ДО -,31* -,26 ,26

У1МЕМТШ -Д4 ,37* ,19 -дз -,16 ,01 -ДО ,08 1,00 -Д2 -Д1 -,03 ,01 ,21 -,16

Н_С1*АР ,74* -,41* -,47* ,24 -,65* -,44* -Д2 -,30* -Д2 1,00 ,84* Д9 ,38* Д4 -,27*

МБЕ ,73* -,33* -,62* ,24 -,69* -,44* -,18 -,32* -Д1 ,84* 1,00 ,37* ,30* -,06 -,26

БЮО ,21 -,16 -,09* -,07 -,28 -дз -,15 -ДО -,03 Д9 ,37* 1,00 ,03 ,02 -,09

К167 33* ,19 -,25 ,00 -,52* -,20 -,31* -,31* ,01 ,38* ,30* ,03 1,00 ,57* -,53*

Р53 ,05 ,38* -,02 -,02 -,27* ,06 -Д9 -,26 ,21 Д4 -,06 ,02 ,57* 1,00 -,45*

ВС 1.2 -,24 -,28* ,23 -,07 ,44* ,14 ,30* ,26 -,16 -,27* -,26 -,09 -,53* -,45* 1,00

о\

Я

Ьа

ЕС X

Г6 Г5

К м 33

Г6

в

ЕС м

стадией заболевания. Таким образом, инактивация р53 гена супрессора имеет значительно большее значение для развития прогрессии МРЛ, чем НМРЛ.

Несмотря на применяемые методы диагностики и лечения рака легкого после постановки диагноза, лишь у 10-15% больных продолжительность жизни превышает 5 лет. Широкомасштабные скрининговые исследования, проводившиеся в последние 15-20 лет с применением рентгенологических и цитологических методов диагностики и направленные на выявление рака легкого на ранней стадии, никак не отразились на показателях выживаемости больных. Рак легкого диагностируется, как правило, на поздних стадиях, когда лечение становится неэффективным. До недавних пор опухолевые заболевания рассматривались лишь как следствие нарушения регуляции клеточной пролиферации. Только в середине 80-х гг. опухолевый процесс стали рассматривать как нарушение равновесия между процессами пролиферации, дифференцировки и клеточной гибели. После изучения 4 классов генов, регулирующих опухолевый рост - протоонкогенов, генов-супрессоров, генов репарации ДНК и генов апоптоза - стало очевидным, что в каждой опухоли имеется определенный набор стойких генетических изменений. В последнее время накоплена масса информации о молекулярных основах патогенеза, а также особенностях апоптоза и пролиферации в раке легкого, однако результаты этих исследований зачастую противоречивы, морфологической гетерогенности опухолей зачастую уделяется недостаточное внимание.

Цель исследования - определение критериев биологической и метастатической активности опухоли при НМРЛ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследования выполнены на операционном материале (части легкого), полученном от 54 больных раком легкого. Мужчин было 42, женщин - 12. Возраст больных составил от 24 до 72 лет. Изучали макропрепарат, гистологическую верификацию опухоли проводили на парафиновых препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином иммуногистохимически с помощью мо-ноклонеальных антител (МКАТ).

Для иммуногистохимического исследования использовали серийные парафиновые срезы по общепринятой методике с помощью двойных антител, с предварительной демаскировкой антигена с применением микроволновой печи. В качестве первичных использовали следующие мо-ноклональные антитела: панцитокератины, хро-могранин А, нейронспецифическую энолазу (NSE), Ki-67 (clone MMI), p53 (clone D07), bcl-2. В качестве вторичных антител были мышиные био-тилированные иммуноглобулины. Проявление осуществляли с использованием авидинстрепто-видиновой метки и DAB (АВС kit, DAB kit), все антитела фирмы «Novocastra». Препараты докрашивали гематоксилином. Ставили контрольные

реакции (позитивный контроль) по материалам с заранее изученной положительной экспрессией онкомаркеров.

Результаты иммуногистохимических реакций в случаях ядерной локализации антител оценивали в процентах относительно 1 000 клеток (Ю-67, р53). Цитоплазматические и мембранные маркеры (Ьс1-2, ЦКР, хромографин А, NSE, виментин, S-l00) оценивали по интенсивности окраски: отрицательная (-), сомнительная (±), слабоположительная (+), умерено положительная (+2), высокоположительная (+3) и в баллах от 0 до 6.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Высокодифференцированная аденокарци-нома АК1 была выявлена в 6 случаях, умеренно-дифференцированная АК11 - в 6 случаях, низко-дифференцированная АКШ - в 6 случаях; плоскоклеточная карцинома (ПРЛ) высокодифферен-цированная ПРЛ1 - в 3 случаях, умереннодиффе-реницированный ПРЛП - в 12 случаях, низко-дифференцированный ПРЛШ - в 9. Мелкоклеточный рак легкого (МРЛ) составил 12 случаев.

Низкая эффективность современных методов диагностики и лечения рака легкого при его высокой распространенности заставляет искать новые подходы к определению злокачественного потенциала опухолей. Одним из перспективных направлений можно считать комплексную моле-кулярно-генетическую и морфологическую оценку процессов пролиферации, апоптоза, клеточной гибели при раке легкого.

Для изучения уровня пролиферации опухолевой ткани исследуется экспрессия КЬ67 -маркера клеток, находящихся в митотическом цикле. По данным литературы, в процессе деления пребывают от 3 до 68% опухолевых клеток плоскоклеточного, аденогенного и нейрогенного рака легкого.

Изучение уровня р53 связано с тем, что он участвует в процессах апоптоза и пролиферации опухолевых клеток рака легкого.

К благоприятному фактору прогноза (выживаемость, чувствительность опухоли к лучевой и химиотерапии) при различных опухолях относится экспрессия онкогена Ьс1-2, который является ведущим геном, определяющим механизм клеточной смерти путем подавления апоптоза. Интенсивность реакции и ее распространенность коррелируют с наличием гена-супрес-сора р53. При раке легкого влияние Ьс1-2 на выживаемость больных и чувствительность к лучевой и химиотерапии до конца не выяснены.

Частота значений онкомаркеров оказалась различной в зависимости от гистологической формы рака. Проанализированы статистически значимые онкомаркеры для всей группы (54) пролеченных больных, где значения со знаком «-» являются не значимыми, а со знаком «+» имеют существенное значение.

При малодифференцированной аденокар-циноме чаще обнаруживали Ю67 (степень выра-

женности 0,79; р<0,00009), РапЦКР (0,52; р<0,0027), ЦКР8/18 (0,47; р<0,0467), р53 (0,78; р<0,0001) и Ьс1-2 (0,85; р<0,000007).

При плоскоклеточном раке независимо от степени дифференцировки среди всех онкомар-керов преобладали р53 (0,5; р<0,013), и Ki-67, (0,5; р<0,013).

В результате исследований установлено, что наибольший уровень экспрессии панцитоке-ратинов (+3) в эпителиальных опухолях был при высокодифференцированной форме, наименьший - в низкодифференцированных опухолях (+). Отмечается коэкспрессия простых ЦКР с плоскими ЦКР в плоскоклеточных карциномах низкой степени дифференцировки. В мелкоклеточных карциномах отмечается коэкспрессия хромогранина А, NSE с простыми цитокератина-ми. В аденокарциномах наиболее выражена экспрессия ЦКР7, ЦКР 8/18, которая снижалась пропорционально степени дифференцировки опухоли.

Результаты исследований показали, что наибольший уровень экспрессии КЬ67 наблюдался в низкодифференцированных аденокарцино-мах (64%) и мелкоклеточном раке легкого (55,6%). В плоскоклеточном умеренно дифференцированном раке легкого максимальный уровень экспрессии составил 42,1%. Самый низкий уровень наблюдался в высокодифференцирован-ных типах рака легкого: в плоскоклеточном -32%, в аденокарциномах - 21,5%.

Таким образом, иммуногистохимические исследования показали, что степень дифферен-цировки опухоли зависит от экспрессии маркеров, для плоскоклеточного рака - онкомаркера ЦКР 5, 6, 10, 14, а для аденокарциномы - ЦКР 7, 8, 18. При низком уровне ЦКР 7, 8, 18, bcl-2 повышается индекс пролиферации и апоптоза, т.е. увеличивается метастатическая агрессия рака легкого на организм пациента и эти больные нуждаются в комбинированном лечении, либо радиотерапии или полихимиотерапии в сочетании с операцией.

Следовательно, иммуногистохимическое исследование позволяет реально оценить биологическую активность опухоли и ее метастатическую агрессию на организм пациента на молекулярном уровне, что позволяет прогнозировать результаты лечения в зависимости от степени дифференцировки опухоли и экспрессии онко-маркеров, назначить своевременно адекватное лечение.

ЛИТЕРАТУРА

1. Иммуногистохимия клеточных онкогенов при предраке и раке легкого /Н. Е. Коган, Н. А. Mазуренко, П. В. Юшков и др. //Арх. патологии. -1999, №8. - С. 3 - 12.

2. Клеточная биология легких в норме при патологии /Под ред. В. В. Ерохина, Л. К. Романова - M., 2000. - С. 270 - 289.

3. Murtation in p53 gele fregnent in primary, resected non small all Lung cancer /J. Chiba, T. Takanoshi, N. Nam et al. //Onkogene. - 1990. -

А. M. Bukenov, V. S. Perminov, L. N. Rubtsova, А. V. Kim

EVALUATION CRITERIA OF BIOLOGICAL AND METASTATIC TUMOR ACTIVITIES IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER

The authors studied the results of immunohistochemical (IHC) investigation of advanced lung cancer patients. The results demonstrated that differentiation level correlates with expression of IHC markers. Squamous cell lung cancer expresses cytokeratins 5, 6, 10, 121; adenocarcinoma - cytokeratins 7, 8, 18. Immunohistochemical research allows to evaluate adequately the biological and metastatic influence of tumor to the patient organism on molecular level and to prescribe correct treatment on-time.

А. М. Бакенов, В. С. Перминов, Л. Н. Рубцова, А. В. Ким

6КПЕНЩ ¥САК ЕМЕС КЛЕТКАЛЫ КАТЕРЛ1 1С1Г1НДЕГ11С1КТЩ БИОЛОГИЯЛЬЩ Ж6НЕ МЕТАСТАТИКАЛЬЩ БЕЛСЕНД1Л1Г1Н БАРАЛАУ КРИТЕРИЙЛЕР1

Авторлар екпенщ катерлi юпнщ таралран тYрiмен ауырран 54 наукастыч гистопрепараттарын им-муногистохимиялык тексеру нэтижелер^ зерттедг Тексеру нэтижелерi юктердщ жктелу дэрежеа маркер-лердщ экспрессиясына байланысты екендИн керсетл. Жалпак клеткалы катерлi ¡ш^ 5, 6, 10, 12 ЦКР, ал аденокарциномара 7, 8, 18 ЦКР онкомаркерлерi тэн. Иммуногистохимиялык тексерулер юктердщ биологи-ялык белсендiлiгiн жэне оныч адам арзасына метастаздык агрессиясын молекулярлык дечгейде накты баралаура жэне оран уакытында адекватты ем тарайындаура мYмкiндiк бередi.

Медицина и экология, 2007, З