Перспективы поиска новых ферментов с противоопухолевым действием

ПЕРСПЕКТИВЫ ПОИСКА НОВЫХ ФЕРМЕНТОВ С ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ДЕЙСТВИЕМ

Е.В. Лукашева, З.И. Лебедева, А.Х. Керамова, Т.Т. Березов

Кафедра биохимии Российский университет дружбы народов Ул. Миклухо-Маклая, 8, 117198 Москва, Россия

Е.М. Трещалина, Л.А. Седакова

ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН Шоссе Каширское, 24, 115478 Москва, Россия

Одним из основных научных направлений кафедры биохимии РУДН является исследование процессов обмена аминокислот в нормальных и опухолевых клетках, а также поиск ферментов бактериального происхождения, способных тормозить опухолевый рост. В результате скрининга были найдены штаммы-продуценты четырех ферментов катаболизма аминокислот: аспарагина, глутамина, метионина и лизина, разработаны методы их очистки до гомогенного состояния, изучены физико-химические свойства, а также показана их ан-типролиферативная активность in vitro. При углубленном изучении L-лизин-а-оксидазы из Trichoderma harzianum Rifai установлены терапевтические дозы и спектр чувствительных опухолей при парентеральном введении.

Систематическое изучение общих и частных путей обмена аминокислот и полиаминов в различных типах злокачественных опухолей человека и животных позволило сделать заключение о разной чувствительности нормальных и опухолевых клеток к недостатку незаменимых факторов роста [1; 2]. На основании вышесказанного можно сделать вывод, что современная стратегия и тактика применения ферментов катаболизма аминокислот в качестве ингибиторов роста опухолевых клеток базируются на фундаментальных биохимических различиях между нормальными и опухолевыми клетками. Получение противоопухолевых ферментов из животных тканей экономически не выгодно, поэтому были предприняты поиски источников ферментов среди микроорганизмов. В основу поиска положены требования к ферментам медицинского назначения, сформулированные в работах [2; 3]. Силами сотрудников кафедры биохимии РУДН и коллег из НИИ биомедицинской химии РАМН проведен систематический поиск продуцентов ферментов катаболизма аминокислот. В результате среди большого количества микроорганизмов отобран штамм E. coli, источник L-аспарагиназы (КФ 3.5.1.1), которая катализирует гидролиз аспарагина до аспарагиновой кислоты и аммиака. Позже был обнаружен штамм-продуцент Pseudomonas aurantiaca-548 глутамин(аспарагин)азы (L-глутамин-(Ь-аспарагин)амидогидролазы, КФ 3.5.1.38, сокращенно ГА [4]. Разработан усовершенствованный метод очистки ГА до гомогенного состояния и установлено, что фермент представляет собой тетрамер, состоящий из 4 идентичных субъединиц. Фермент катализирует гидролиз L-глутамина и L-аспарагина, а также их

D-изомеров. Оптимум ферментативной активности находится при физиологических значениях pH среды для глутаминазной активности и несколько смещен в щелочную область для аспарагиназной активности. Фермент обладает максимальной устойчивостью в области pH 6,0-8,0. ГА устойчива при температуре от 0° до 46°С, но быстро инактивируется при температуре выше 48°С [5].

Следующим бактериальным ферментом, выделенным на нашей кафедре в совместных исследованиях с Университетом г. Киото (Япония), была метионин-у-лиаза, из Ps.taetrolens [6; 7]. Уникальной функцией метионина в клетках человека является участие в инициации синтеза белка. Разрушая структуру метионина, фермент лишает клетки лабильной метильной группы, абсолютно необходимой для синтеза физиологически активных соединений. Кроме того, аминопро-пильный остаток декарбоксилированного S-аденозилметионина используется при синтезе регуляторов биосинтеза нуклеиновых кислот и белка - спермина и спермидина.

Позже на кафедре приступили к поиску продуцента фермента L-лизин-а-оксидазы (К.Ф.1.4.3.14) (JIO), относящегося к классу оксидоредуктаз. JIO была впервые получена в лаборатории проф. К. Soda (Япония), а несколько позже на кафедре биохимии РУДН из Trichoderma harzianum Rifai [7]. В ходе катализируемой этим ферментом реакции поглощается кислород, образуются 2-оксо-6-аминокапроновая, аммиак и пероксид водорода. L-лизин не синтезируется в организме, поскольку его кето-аналог — 2-оксо-6-аминокапроновая кислота не вступает в реакции трансаминирования. Следует отметить, что L-лизин, кроме участия в синтезе белков, выполняет ряд уникальных функций в организме.

Японские исследователи получали гомогенный фермент, используя восьми стадийный метод очистки, с выходом гомогенного фермента всего 8%. В нашей лаборатории первоначально ЛО получали четырехстадийным методом с выходом 22% и удельной активностью 29 Е/мг белка [8]. Но поскольку для широких предклинических исследований требовалось располагать большими количествами гомогенного фермента, на нашей кафедре совместно с НПО Фермент (Вильнюс, Литовская Республика) были разработаны методы глубинного выращивания гриба Trichoderma harzianum Rifai и метод полупромышленной очистки фермента [9]. Партии ЛО с удельной ферментативной активностью 42-55 Е/мг использовали для испытания в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН.

Исследование физико-химических свойств показало, что молекулярная масса ЛО из Trichoderma harzianum Rifai составляет 120 кДа, причем молекула состоит их 2-х идентичных субъединиц с молекулярной массой 60 кДа [9]. JIO обнаруживает относительно высокую стабильность: при 60°С после инкубации в течение 3 часов сохраняется более 60% ферментативной активности, причем в разбавленных растворах термостабильность существенно повышается. При хранении ЛО в лиофилизированном виде при +4°С или в виде замороженного раствора при 18°С в течение года практически не наблюдали уменьшения ферментативной активности.

Таким образом, если на первом этапе работы выполнен скрининг подходящих штаммов-продуцентов, то последующие этапы включали отработку оптимальных условий культивирования микроорганизмов, разработку высокочувствительных методов определения активности и оптимальных методов получения ферментов в гомогенном виде, а также, изучение каталитических и физико-химических свойств. Большинство оригинальных методов защищено авторскими свидетельствами и па-

тентами на изобретение. Как следует из табл.1, три фермента: Ь-аспарагиназа, ГА и ДО имеют высокое сродство к субстратам и низкие значения константы Михаэлиса, что удовлетворяет требованиям, предъявляемым противоопухолевым ферментам и свидетельствует о существенном понижении концентрации аминокислот-субстратов в организме. Высокие показатели числа оборотов показывают, сколько молекул субстрата превращаются на одной молекуле фермента за минуту. Для применения ферментов в терапевтических целях важно, чтобы кофермент не диссоциировал из активного центра при введении в организм. Этому требованию удовлетворяют те же три фермента, поскольку Ь-аспарагиназа и ГА не содержат коферментов в составе молекулы, а ЛО содержит прочно связанный флавинаде-ниндинуклеотид.

Таблица 1

Кинетические параметры исследованных ферментов

Фермент *Є Ї w- Число оборотов

L-аспарагиназа 0,01 1000 200

Ь-глутамин(аспарагин)аза 0,004 2800 160

L-метионин-у-лиаза 1,3 700 19,1

L-лизин-а-оксидаза 0,014 7200 35-50

Примечание: ’Международные единицы ферментативной активности

Исследования in vitro показали, что ГА из Pseudomonas boreopolis-526 оказывает существенное ингибирующее действие на рост мышиного лимфолейкоза Р-388, на который не действуют коммерческие препараты L-аспарагиназы. ЛО подавляет синтез белка и ДНК в опухолевых клетках рака яичника человека CaOv и лимфомы Беркитта [10].

Углубленное изучение противоопухолевой активности in vivo проведено при ежедневном введении ЛО в течение 5 дней в дозах 35-350 Е/кг на опухолевых моделях, рекомендованных Минздравсоцразвития РФ для изучения противоопухолевой активности фармакологических веществ. В качестве критериев оценки использовали Т/С% — соотношение «treatment/control», которое вычисляется как отношение средней продолжительности жизни животных в опыте к средней продолжительности жизни животных в контроле в процентах и TPO%=[(Vo-VK)/VK]100%, где V0 и VK средний объем опухолей в опыте и контроле. Эффект считали значимым при Т/С>70% и ТРО=136-150%. В случае излечения (CR — «complete remission») мышей наблюдали 120 дней для подтверждения эффекта.

Показано (табл. 2,3), что плазмацитома МОПС-406 мышей и карциносаркома Уокера W-256 крыс оказались не чувствительными к ЛО. Среди чувствительных опухолей помимо Р-388 гемобластозы L-1210 и La, Т/С=136 и 140%, соответственно. Лучшие результаты получены на мышах с асцитной гепатомой 22. Продолжительность жизни мышей существенно увеличивалась, Т/С=201%; полностью излечены от опухоли более половины мышей.

Таблица 2 Спектр противоопухолевого действия Ь-лизин-а-оксидазы на асцитные опухоли и гемобластозы в сравнении с Ь-аспарагиназой Е.соН

Препарат Максимальная эффективность, Т/С

Ь-5178у Р-388 Ь-1210 Ьа МОРС-406 Г-22а \V-256**

Ь-лизин- а-оксидаза 112 154 136 140 119 201* 111

Ь- аспарагиназа 200* 100 100 110 100 121 113

Примечание: * полная ремиссия 29-66%, ** опухоль крыс

Таблица 3 Спектр противоопухолевого действия Ь-лизин-а-оксидазы на штаммы солидных опухолей в сравнении с Ь-аспарагиназой Е.соН

Препарат Максимальная эффективность, ТРО

Са-755 В-16 АКАТОЛ РШМ-5 С-180

Ь-лизин- а-оксидаза 96 81 75 79 61

Ь-аспарагиназа 12 0 46 24 15

Среди солидных опухолей противоопухолевый эффект ЛО получен на Са-755 в пределах ТРС)=90-96%, на В-16 и РШМ-5 в пределах ТРО=75-81%. Пограничная активность отмечена на С-180, ТРО=61%. Лучшие результаты получены на мышах с асцитной опухолью АГ-22. При применении ЛО продолжительность жизни мышей увеличивалась в 4 раза, Т/С=401%, а 29-66% мышей полностью излечивались от опухоли. Интересно, что на аденокарциноме толстой кишки АКАТОЛ, которая отличается резистентностью к большинству известных цитостатиков, но чувствительна к препаратам платины, при введении ЛО получено ТРО=81%. Таким образом, в спектр чувствительных к ЛО опухолей вошли АГ-22, Са-755, АКАТОЛ, меланома В-16, РШМ-5, Р-388, Ь-1210 и Ьа.

В обзорах [11; 12] представлены данные о критериях отбора противоопухолевых ферментов и о том, что наряду с противоопухолевыми свойствами ЛО наделена также иммуномодулирующим, противовирусным, антибактериальным и антиме-тастазным действием.

По разработкам сотрудников кафедры биохимии РУДН и ряда других научных центров на заводе биохимических препаратов в г. Олайне (Латвийская Республика, СССР) был осуществлен также промышленный выпуск Ь-аспарагиназы. В настоящее время Ь-аспарагиназа из различных источников является единственным ферментом, используемым в мире для лечения острых лимфобластных лейкозов, лим-фогрануломатозов, лимфо- и ретикулобластом. При комбинированной химиотерапии Ь-аспарагиназой этих заболеваний у 80% детей наблюдается полная ремиссия. В связи с распадом СССР в настоящее время Россия лишена стабильного производства Ь-аспарагиназы. Продолжается исследование противоопухолевой активности Ь-лизин-а-оксидазы, в научные планы кафедры входит завершение доклинических испытаний и проведение клинических испытаний препарата.

ЛИТЕРАТУРА

1. Березов Т.Т. Обмен аминокислот нормальных тканей и злокачественных опухолей. — М.: Медицина, 1969. — 220 с.

2. Березов Т.Т. Биохимические основы энзимотерапии опухолей. Актовые речи ученых Университета. — М., Изд-во УДН, 1989. — С.3-15.

3. Holsenberg J.S. Enzymes as Drugs // Ann.Rev. Pharmacol. Toxicol. — 1977. — V17. —P. 97-116.

4.Лебедева З.И., Березов T.T. Микробная глутамин(аспарагин)аза // Успехи биол. химии. — 1995. — Т. 35. — С. 161-187.

5. Лебедева З.И., Березов Т.Т. Молекулярные и каталитические свойства глута-мин(аспарагин)азы // Вестник РАМН. — 1995. — № 2. — С. 57-61.

6. Nakayama Т., Berezov Т.Т., Esaki N., Sugie К., Tanaka H., Soda К. Purification of bacterial L-methionine y-lyase // Analytical biochemistry. — 1984. — V. 138. — P.421-424.

7.Занин В.А., Лукина В.И., Березов Т.Т Выделение, некоторые физикохимические и каталитические свойства L-метионин-у-лиазы из Ps.taetrolens // Вопр. мед. химии. — 1989. — №4. — С. 84-89.

8.Хадуев С.Х. Лукашева Е.В., Смирнова И.П., Березов Т.Т. Выделение и очистка лизиноксидазы из Trichoderma sp. // Вопр. мед. химии. — 1985. — Т. 31. — № 5. — С. 130-134.

9. Лукашева Е.В., Веса B.C., Корпела Т.Т., Березов Т.Т. Сравнительное физикохимическое изучение L-лизин-а-оксидазы из поверхностно и глубинно выращенной Trichoderma sp. // Вопр. мед. химии. — 1993. — Т. 39. — № 1. — С. 45-47.

10.Хадуев С.Х., Жукова О.С., Добрынин Я.В., Сода К, Березов Т.Т. Сравнительное изучение влияния L-лизин-а-оксидазы из Tr.harzianum Rifai и Tr.viride на синтез нуклеиновых кислот в опухолевых клетках человека in vitro // Бюлл. экспер. биол. мед. — 1986. — № 4. — С. 458-460.

11. Лукашева Е.В., Березов Т.Т. L-Лизин-а-оксидаза: физико-химические и биологические свойства // Биохимия. — 2002. — Т. 67. — № 10. — С. 1394-1402.

12.Березов Т.Т. Молекулярные и биохимические принципы антиопухолевой энзимотерапии // Биомедицинская химия. — 2005. — Т. 51. — № 3. — С. 235-247.

THE SEARCH OF THE NEW ANTITUMOR ENZYMES

E.V. Lukasheva, Z.I. Lebedeva, A.H. Keramova, T.T. Berezov

Department of Biochemistry Peoples’ Friendship University of Russia Miklukho-Maklaya St., 8, 117198 Moscow, Russia

E.M. Treshalina, L.A. Sedakova

Blokhin Cancer Research Center of Russian Academy of Medical Sciences Shosse Kashirskoje, 24,115478 Moscow, Russia

One of the main scientific directions of Biochemistry Department of Russian Peoples’ Friendship University is the investigation of amino acids’ metabolism in normal and tumor cells and the search for microbial enzymes which are capable to inhibit the tumor growth. Four strains-producers of enzymes which catalyze L-asparagine, L-glutamine, L-methionine and L-lysine catabolism were found. The methods of these four enzymes purification to homogeneity and activity determination have been elaborated. Their physico-chemical, catalytical and cytotoxic properties have been studied. The range of tumors sensitive to L-lysine a-oxidase therapy was determined.