СПОСОБ АМПЛИФИКАЦИИ КОЛЬЦЕВОЙ ДНК

1. Способ амплификации кольцевой ДНК, включающий следующие стадии:
(1) образования реакционной смеси кольцевой ДНК в качестве матрицы с реакционным раствором, содержащим
первую группу ферментов, которые катализируют репликацию кольцевой ДНК;
вторую группу ферментов, которые катализируют созревание фрагмента Оказаки и синтезируют две сестринских кольцевых ДНК, состоящих из катенана;
третью группу ферментов, которые катализируют разделение двух сестринских кольцевых ДНК;
буфер;
ATP;
GTP, CTP и UTP;
dNTP;
источник иона магния; и
источник иона щелочного металла,
где кольцевая ДНК включает последовательность ориджина репликации (ориджина хромосомы (oriC)), которая может связываться с ферментом, обладающим DnaA-активностью; и
(2) поддерживания температуры реакционной смеси, полученной в (1) в изотермических условиях.
2. Способ амплификации кольцевой ДНК, включающий следующие стадии:
(1) образования реакционной смеси кольцевой ДНК в качестве матрицы с реакционным раствором, содержащим
первую группу ферментов, которые катализируют репликацию кольцевой ДНК;
вторую группу ферментов, которые катализируют созревание фрагмента Оказаки и синтезируют две сестринских кольцевых ДНК, состоящих из катенана;
третью группу ферментов, которые катализируют разделение двух сестринских кольцевых ДНК;
буфер;
ATP;
GTP, CTP и UTP;
dNTP;
источник иона магния; и
источник иона щелочного металла,
где кольцевая ДНК включает последовательность ориджина репликации (ориджина хромосомы (oriC)), которая может связываться с ферментом, обладающим DnaA-активностью; и
(2) инкубирования реакционной смеси, полученной в стадии (1) в термическом цикле с повторением инкубирования при 30°C или выше и инкубирования при 27°C или ниже.
3. Способ по п. 1 или 2, где реакционный раствор также содержит неспецифический ингибитор адсорбции белка и/или неспецифический ингибитор адсорбции нуклеиновой кислоты.
4. Способ по п. 1 или 2, где реакционный раствор также содержит экзонуклеазу, специфичную к линейной ДНК, и/или геликазу RecG-типа.
5. Способ по п. 1 или 2, где реакционный раствор также содержит соль аммония.
6. Способ по п. 1 или 2, где
первая группа ферментов содержит комбинацию фермента, обладающего DnaA-активностью; нуклеоидного белка одного или более типов; фермента или группы ферментов, обладающих ДНК-гиразной активностью; белка, связывающегося с одноцепочечной ДНК (SSB); фермента, обладающего геликазной активностью DnaB-типа; фермента, обладающего ДНК-геликазной загрузочной активностью; фермента, обладающего ДНК-примазной активностью; фермента, обладающего ДНК-захватывающей активностью; и фермента или группы ферментов, обладающих активностью ДНК-полимеразы III*;
вторая группа ферментов содержит комбинацию фермента, обладающего активностью ДНК-полимеразы I, и фермента, обладающего ДНК-лигазной активностью; и
третья группа ферментов содержит фермент, обладающий активностью топоизомеразы III, и/или фермент, обладающий активностью топоизомеразы IV.
7. Способ по п. 6, где вторая группа ферментов также включает фермент, обладающий активностью РНКазы Н.
8. Способ по п. 6, где третья группа ферментов также включает фермент, обладающий геликазной активностью RecQ-типа.
9. Способ по п. 6, где
в первой группе ферментов
один или более нуклеоидных белков представляют собой IHF или HU,
ферментом или группой ферментов, обладающих ДНК-гиразной активностью, является комплекс GyrA и GyrB,
ферментом, обладающим геликазной активностью DnaB-типа, является DnaB-геликаза,
ферментом, обладающим ДНК-геликазной загрузочной активностью, является загрузочный фермент DnaC-геликаза,
ферментом, обладающим ДНК-примазной активностью, является DnaG-примаза,
ферментом, обладающим ДНК-захватывающей активностью, является фермент, захватывающий DnaN,
ферментом или группой ферментов, обладающих активностью ДНК-полимеразы III*, являются фермент или группа ферментов, содержащих любые из DnaX, HolA, HolB, HolC, HolD, DnaE, DnaQ и HolE.
10. Способ по п. 1, где изотермическим условием в стадии (2) является постоянная температура в пределах от 25°C до 50°C.
11. Способ по п. 1 или 2, где реакционный раствор также содержит геликазу RecG-типа и/или экзонуклеазу, специфичную к одноцепочечной ДНК.
12. Способ по п. 1 или 2, где реакционный раствор также содержит экзонуклеазу, специфичную к линейной ДНК, и/или экзонуклеазу, специфичную к одноцепочечной ДНК.
13. Способ по п. 1 или 2, где реакционный раствор также содержит ДНК-стабилизирующий фактор.
14. Способ по п. 1 или 2, где
стадия (1) включает
(1-1) предварительное инкубирование реакционного раствора, содержащего
первую группу ферментов, которые катализируют репликацию кольцевой ДНК;
вторую группу ферментов, которые катализируют созревание фрагмента Оказаки и синтезируют две сестринских кольцевых ДНК, состоящих из катенана;
третью группу ферментов, которые катализируют разделение двух сестринских кольцевых ДНК;
буфер;
ATP;
GTP, CTP и UTP;
dNTP;
источник иона магния; и
источник иона щелочного металла; и
(1-2) образование реакционной смеси реакционного раствора с кольцевой ДНК в качестве матрицы.
15. Способ по п. 1 или 2, где стадию (2) осуществляют в эмульсии типа «вода в масле».
16. Способ по п. 1 или 2, где после проведения стадии (2), указанный способ также включает
(3) обработку после реакции, где
обработкой после реакции является:
(i) обработка путем разведения реакционной смеси пять или более раз реакционным раствором, который не содержит ферментов 1-3 групп, с последующим повторным нагреванием полученного соединения;
(ii) обработка экзонуклеазой, специфичной к линейной ДНК, и/или обработка экзонуклеазой, специфичной к одноцепочечной ДНК; и/или
(iii) обработка ферментом для репарации гэпов.
17. Композиция для амплификации кольцевой ДНК, включающая
первую группу ферментов, которые катализируют репликацию кольцевой ДНК;
вторую группу ферментов, которые катализируют созревание фрагмента Оказаки и синтезируют две сестринских кольцевых ДНК, состоящих из катенана;
третью группу ферментов, которые катализируют разделение двух сестринских кольцевых ДНК;
буфер;
ATP;
GTP, CTP и UTP;
dNTP;
источник иона магния; и
источник иона щелочного металла.
18. Композиция по п. 17, также содержащая неспецифический ингибитор адсорбции белка и/или неспецифический ингибитор адсорбции нуклеиновой кислоты.
19. Композиция по п. 17, также содержащая экзонуклеазу, специфичную к линейной ДНК, и/или геликазу RecG-типа.
20. Композиция по п. 17, также содержащая геликазу RecG-типа и/или экзонуклеазу, специфичную к одноцепочечной ДНК.
21. Композиция по п. 17, также содержащая экзонуклеазу, специфичную к линейной ДНК, и/или экзонуклеазу, специфичную к одноцепочечной ДНК.
22. Композиция по п. 17, также содержащая ДНК-стабилизирующий фактор.
23. Набор для амплификации кольцевой ДНК, включающий комбинацию
первой группы ферментов, которые катализируют репликацию кольцевой ДНК;
второй группы ферментов, которые катализируют созревание фрагмента Оказаки и синтезируют две сестринских кольцевых ДНК, состоящих из катенана;
третьей группы ферментов, которые катализируют разделение двух сестринских кольцевых ДНК;
буфера;
ATP;
GTP, CTP и UTP;
dNTP;
источника иона магния; и
источника иона щелочного металла.
24. Набор по п. 23, также включающий комбинацию с неспецифическим ингибитором адсорбции белка и/или неспецифическим ингибитором адсорбции нуклеиновой кислоты.
25. Набор по п. 23, также включающий комбинацию с экзонуклеазой, специфичной к линейной ДНК, и/или с геликазой RecG-типа.
26. Набор по п. 23, также включающий геликазу RecG-типа и/или экзонуклеазу, специфичную к одноцепочечной ДНК.
27. Набор по п. 23, также включающий экзонуклеазу, специфичную к линейной ДНК, и/или экзонуклеазу, специфичную к одноцепочечной ДНК.
28. Набор по п. 23, также включающий ДНК-стабилизирующий фактор.
29. Набор по п. 23, также включающий фермент для репарации гэпов.