АМИНОПИРАЗОЛЫ В КАЧЕСТВЕ СЕЛЕКТИВНЫХ ИНГИБИТОРОВ ЯНУС-КИНАЗЫ
AMINOPYRAZOLES AS SELECTIVE JANUS KINASE INHIBITORS

Уровень техники изобретения
Протеинкиназы представляют собой группу ферментов, которые регулируют активность белков-мишеней путем присоединения фосфатных групп к белковому субстрату. Киназы можно разделить по своей цели на серин/треонинкиназы и тирозинкиназы, и они играют важную роль во многих физиологических процессах, включая деление клеток, дифференциацию, клеточный гомеостаз и передачу сигнала.
Семейство нерецепторных тирозинкиназ Janus киназы млекопитающих (JAK) имеет четыре члена: JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2. Семейство JAK вовлечено во внутриклеточную передачу сигнала от >70 различных цитокинов. Цитокины связываются с их рецепторами клеточной поверхности, что приводит к димеризации рецептора и последующей активации/фосфорилированию JAK тирозинкиназ. Специфические остатки тирозина на рецепторе затем фосфорилируются активированными JAK и служат в качестве сайтов связывания для STAT белков. STAT фосфорилируются посредством JAK, димеризуются, затем транслоцируются к ядру, где они связываются со специфическими элементами ДНК и активируют транскрипцию генов. JAK1 осуществляет передачу сигналов вместе со всеми JAK изоформами цитокин-зависимым образом.
Immunol. Rev.
Nat. Rev. Drug Discov.
et al.
Immunity.
JAK являются существенными для многих физиологических функций. Об этом свидетельствуют исследования с использованием генно-инженерных мышиных моделей с дефицитом специфических JAK (K. Ghoreschi, A. Laurence, J. J. O'Shea,  228, 273 (2009)), и и выявление мутаций в ферментах JAK, которые были связаны с заболеваниями у людей. (J. J. O'Shea, M. Pesu, D. C. Borie, P. S. Changelian,  3, 555 (2004)). (Y. Minegishi,  25, 745 (2006)).
Эти генетические данные мыши и человека связывают путь Jak/STAT с различными заболеваниями и расстройствами, включая, но не ограничиваясь ими, гиперпролиферативные расстройства и рак, такие как лейкоз и лимфомы, иммунологические и воспалительные расстройства, такие как отторжение трансплантата, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, аллергии, ревматоидный артрит, аллергический и атопический дерматит, диабет I типа, боковой амиотрофический склероз и рассеянный склероз.
В WO 2013/041042 раскрыт пиразолкарбоксамидин в качестве ингибиторов янус-киназы, которые являются полезными для лечения ревматоидного артрита, астмы, ХОБЛ и рака. Соединения данного раскрытия имеют следующую формулу
В WO2013/040863 раскрыты замещенные циклоалкилнитрил пиразолкарбоксамиды, которые являются ингибиторами янус-киназы 1, полезными для лечения, например, астмы, обструктивных заболеваний дыхательных путей, артрита, эмфиземы, рака, миастении гравис, болезни Грейвcа и болезни Альцгеймера.
В WO 2014/146490 раскрыты замещенные соединения 2-(3-амино-4-оксо-4,5-дигидро-пиразоло(4,3-c)пиридин-1-ил)-циклобутанкарбонитрила, которые являются ингибиторами Янус-киназы, используемыми для лечения, например, ревматоидного артрита, хронической астмы, хронической обструктивной болезни легких, диабета.
Цитокины, которые используют сигнальный путь JAK-STAT, вовлечены в патогенез и поддержание атопического и аллергического дерматита. К ним относятся провоспалительные IL-4 и IL-6, и IL-13 [Carmi-Levy et al., Clinic Rev Allerg Immunol (2011), 41:245), Ong and Leung, Curr. Allergy Asthma Rep. (2006), 6(5):384)], цитокины, участвующие в аллергическом ответе, а также IL-31, цитокин, участвующий в возникновении зуда [Dillon et al., Nat. Immunol. (2004), 5(7): 752]. Важно отметить, что рецепторы этих вышеупомянутых цитокинов, вовлеченных в атопический и аллергический дерматит, используют JAK1, в комплексе с JAK2, JAK3 или Tyk2, чтобы генерировать внутриклеточную передачу сигналов и вызывать биологические эффекты [Yamaoka K, Saharinen P, Pesu M, Holt VE 3rd, Silvennoinen O, O'Shea JJ., Genome Biol. 2004;5(12):253].
У собак с аллергическим или атопическим дерматитом введение оклацитиниба, ингибитора JAK с умеренной селективностью в отношении JAK1, вызывает быстрое облегчение зуда и уменьшает поражения [Cosgrove et al., Vet. Derm. (2013), 24:479; Cosgrove et al., Vet. Derm. (2013), 24:587]. В более высоких дозах, оклацитиниб вызывает уменьшение количества гематокрита, гемоглобина и ретикулоцитов, вероятно, вследствие ингибирования JAK2 [FOI Summary NADA 141-345; Gonzales et al., J. Vet. Pharmacol. Therapeut. (2014), 37:317]. В совокупности эти данные дают веские основания предполагать, что ингибирование JAK1 является эффективным лечением аллергического и атопического дерматита у собак, и что соединение с более высокой селективностью в отношении JAK1 по сравнению с другими ферментами JAK обеспечит улучшенный терапевтический индекс.
Апоквел (Apoquel) представляет собой лекарственное средство для животных, активным ингредиентом которого является оклацитиниб, которое разрешено для контроля зуда, ассоциированного с атопическим дерматитом, и для контроля атопического дерматита у собак в возрасте не менее 12 месяцев (см. обзор FOI для NADA 141-345, May 14, 2013). См. также патенты США номера 6890929; 7687507; 8133899 и 8987283.
Безопасность Apoquel была оценена в базовом 6-месячном исследовании предела безопасности надлежащей лабораторной практики (GLP). Препарат вводили перорально два раза в день в течение 6 недель, затем один раз в день в течение 20 недель собакам в 1, 3 и 5 раз максимальной дозы воздействия 0,6 мг/кг (рекомендуемая клиническая доза составляет 0,4 мг/кг) в общей сложности 26 недель (6 месяцев). Хотя препарат в целом хорошо переносился во всех дозах, во всех группах отмечались эффекты тестируемого препарата в соответствии с фармакологическим действием класса препарата. Они включают: папилломы (считается связанным с тестируемым препаратом, но не связанным с дозой); межпальцевые кисты (пододерматит и т.д.) (возможно, в зависимости от дозы); уменьшение массы эритроцитов; снижение сывороточного альбумина; снижение насыщенности клетками кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани (GALT), селезенки и шейных/брыжеечных лимфатических узлов; снижение насыщенности клетками грудинного костного мозга и костного мозга бедренной кости. Большинство из этих эффектов были слабыми и выглядели непрогрессирующими (см. отчет об оценке CVMP для APOQUEL (EMEA/V/C/002688/0000); EMA/481054/2013).
Сущность изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает новые соединения, которые являются ингибиторами JAK. Изобретение также обеспечивает способ лечения и профилактики заболеваний, опосредованных JAK и расстройств с использованием новых соединений, а также фармацевтические композиции, содержащие соединения.
Описание фигур
На фиг. 1 показаны результаты соединения 1 при испытании на модели IL-31 индуцированного зуда.
На фиг.1А показано сравнение соединения 1 с плацебо и Apoquel.
На фиг. 1В показан эффект трех разных доз соединения 1.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к соединениям формулы I или их фармацевтически приемлемым солям или стереоизомерам:
В варианте осуществления, соединение формулы I представляет собой
50
50
50
50
В одном варианте осуществления, соединения по настоящему изобретению являются селективными ингибиторами JAK1 относительно JAK2 и JAK3. В варианте осуществления, соединения по настоящему изобретению являются селективными ингибиторами JAK1 относительно JAK2 или JAK3. Определение относительной селективности для данного соединения ингибирования JAK1 определяется как относительное отношение (значение IC JAK2/значение IC JAK1), равное по меньшей мере 2. Кроме того, относительное отношение (значение IC JAK3/ значение IC JAK1) составляет по меньшей мере 500.
50
50
50
50
В еще одном варианте осуществления для данного соединения относительные отношения (значение IC JAK2/значение IC JAK1) составляет по меньшей мере 5 или по меньшей мере 10. В другом варианте осуществления, относительное отношение (значение IC JAK3/значение IC JAK1) составляет по меньшей мере 500, или составляет по меньшей мере 750, или составляет по меньшей мере 1000.
Другим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, включающая соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, или его стереоизомер и фармацевтически приемлемый носитель.
Другим вариантом осуществления является способ лечения JAK-1-опосредованного заболевания, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции, включающей соединение формулы I.
Еще одним вариантом осуществления является способ лечения, где JAK-1-опосредованное заболевание представляет собой заболевание, которое можно облегчить путем селективного ингибирования Янус-киназы JAK1 относительно JAK 2 и JAK 3.
В другом варианте осуществления, заболевание выбрано из аллергического дерматита, атопического дерматита, артрита, сухого кератоконъюнктивита, аутоиммунных заболеваний или нарушений и рака.
В другом варианте осуществления заболевание представляет собой атопический дерматит.
В варианте осуществления, заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание или нарушение.
В варианте осуществления, заболевание представляет собой артрит.
В другом варианте осуществления, млекопитающее представляет собой животное-компаньон.
В другом варианте осуществления, животное-компаньон представляет собой собаку, кошку или лошадь.
В варианте осуществления, заболевание представляет собой сухой кератоконъюнктивит.
В дополнительном варианте осуществления, введение представляет собой пероральное, парентеральное или местное введение.
В другом варианте осуществления, селективное ингибирование происходит в отношении Янус-киназы JAK1 относительно JAK 2.
В другом варианте осуществления, селективное ингибирование происходит в отношении Янус-киназы JAK1 относительно JAK 3.
50
50
В дополнительном варианте осуществления, соотношение JAK2(IC)/JAK1(IC) составляет по меньшей мере 5, по меньшей мере 10, по меньшей мере 12.
50
50
В другом варианте осуществления, соотношение JAK3(IC)/JAK1(IC) составляет по меньшей мере 1000 или составляет по меньшей мере 750 или составляет по меньшей мере 500.
В другом варианте осуществления, суточная доза соединения составляет от примерно 0,001 мг/кг до примерно 100 мг/кг или от примерно 0,01 мг/кг до примерно 10 мг/кг или от примерно 0,1 мг/кг до примерно 3,0 мг/кг или от примерно 0,2 мг/кг до примерно 1,0 мг/кг массы тела.
Доказательства, подтверждающие ингибирование и селективность JAK1
Результаты клинических испытаний с несколькими ингибиторами JAK тофацитиниб (JAK1/JAK2/JAK3) (Kremer et al., Arthritis and Rheumatism 2009 ʺThe safety and efficacy of a JAK inhibitor in patients with active RAʺ, Fleishman et al, Arthritis and Rheumatism 2010 ʺTofacitinib in patients with active RAʺ, Fleishman et al, NEJM 2012 ʺPlacebo controlled trial of Tofacitinib monotherapy in RAʺ) и барицитиниб (JAK1/JAK2) (Greenwald et al, ACR annual meeting Nov 2010 ʺA randomized dose-ranmging, PBO-controlled study of TNCB028050, a selective JAK1 and JAK2 inhibitor, in subjects with active RAʺ) подтверждают гипотезу о том, что высокие уровни эффективности могут быть достигнуты путем целевого ингибирования JAK. Однако ограничивающие дозу побочные эффекты ограничивают эффективность и применение этих агентов. У пациентов, принимавших тофацитиниб и барицитиниб, наблюдались значительные гематопоэтические АЕ, в частности, анемия, с большей частотой и тяжестью при более высоких дозах. Предполагается, что это связано с ингибированием передачи сигналов EPO, фактора роста, критического для развития эритроцитов, который передает сигналы через JAK2. Ингибирование EPO также приводит к невозможности выздоровления от анемии хронического заболевания. Приблизительно 40% пациентов с RA страдают анемией хронического заболевания (Masson. Joint Bone Spine 2011 ʺRheumatopid Anemiaʺ, Han et al, J Rheumatology 2007 ʺAssociation of anemia and physical disability among patients with RAʺ). Современная парадигма лечения заключается в лечении воспаления, которое вызывает эту анемию, однако лечение ингибиторами мульти-JAK, которые также ингибируют передачу сигналов EPO, сводит на нет преимущества лечения уровня гемоглобина от лечения воспаления. Специфические ингибиторы JAK1 не будут влиять на передачу сигналов EPO, не будут ограничиваться анемией AE и позволят уровням гемоглобина восстановиться после регрессии воспаления.
Дополнительные клинические доказательства, подтверждающие гипотезу JAK1, получены от тоцилизумаба, антитела, нацеленного на рецептор IL-6 (сигналы IL-6 через JAK1 и JAK2). Высокий уровень эффективности достигается с помощью этого биологического агента без индукции анемии, и анемия воспаления успешно устраняется (Emery et al, Ann Rheum Dis 2008 ʺIL-6 receptor inhibition with tocilizumab improves treatment outcomes in patients with RA refractory to anti-TNF biologicals: results of a 24-week multicenter randomized placebo-controlled trialʺ, Mashizume et al, Rheumatol Int. 2010 ʺTocilizumab, a humanized anti-IL-6 receptor antibody, improved anemia in monkey arthritis by suppressing IL-6 induced hepcidin productionʺ).
"Пациент", как используется в настоящем документе, относится к млекопитающему, которое было объектом лечения, наблюдения или эксперимента.
«Млекопитающее» означает животных млекопитающих. Млекопитающее может быть самцом или самкой. Млекопитающее может быть одним или несколькими, выбранными из группы, состоящей из человека, крупного рогатого скота (например, коровы), porcine (например, поросята), ovine (например, овцы), capra (например, козы), equine (например, лошади), canine (например, домашние собаки), feline (например, домашние кошки), Lagomorpha (кролики), грызунов (например, крысы или мыши), Procyon lotor (например, еноты). В конкретных вариантах осуществления млекопитающее является домашним животным (например, собакой, кошкой или лошадью).
«Терапевтически эффективное количество» означает такое количество лекарственного средства или фармацевтического средства, которое вызывает биологический или медицинский ответ ткани, системы, животного или человека, который определяется исследователем, ветеринаром, врачом или другим клиницистом.
Термин «лечение» или «лечить» включает уменьшение, облегчение, ослабление или иное уменьшение признаков и симптомов, связанных с заболеванием или расстройством.
Термин «композиция», как и в фармацевтической композиции, предназначен для охвата продукта, включающего активный ингредиент(ы) и инертный ингредиент(ы) (фармацевтически приемлемые эксципиенты), которые составляют носитель, а также любой продукт, который прямо или косвенно образуется путем комбинирования, комплексообразования или агрегации любых двух или более ингредиентов, или путем диссоциации одного или нескольких ингредиентов, или вследствие других типов реакций или взаимодействий одного или нескольких ингредиентов. Соответственно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению охватывают любую композицию, полученную смешиванием соединения формулы I и фармацевтически приемлемых эксципиентов.
Оптические изомеры - Диастереомеры - Геометрические изомеры - Таутомеры
Соединения формулы I содержат один или несколько асимметрических центров и, таким образом, могут существовать в виде рацематов и рацемических смесей, индивидуальных энантиомеров, диастереомерных смесей и индивидуальных диастереомеров. Настоящее изобретение подразумевает охват всех таких изомерных форм соединений формулы I как отдельных видов, так и их смесей.
Некоторые из описанных в настоящем документе соединений содержат олефиновые двойные связи, и, если не указано иное, подразумевается, что они включают как E, так и Z геометрические изомеры.
Конкретные варианты осуществления настоящего изобретения включают соединение, которое выбрано из группы, состоящей из соединений примеров в настоящем документе или их фармацевтически приемлемой соли.
Соединения по настоящему изобретению могут содержать один или несколько асимметрических центров и, таким образом, могут существовать в виде «стереоизомеров», включая рацематы и рацемические смеси, энантиомерные смеси, индивидуальные энантиомеры, диастереомерные смеси и индивидуальные диастереомеры. Каждый такой асимметрический центр будет независимо образовывать два оптических изомера, и предполагается, что все возможные оптические изомеры и диастереомеры в смесях и в виде чистых или частично очищенных соединений включены в объем настоящего изобретения. Настоящее изобретение охватывает все такие изомерные формы этих соединений. Когда связи с хиральным углеродом изображены в виде прямых линий в формулах изобретения, подразумевается, что как (R), так и (S) конфигурации хирального углерода и, следовательно, как энантиомеры, так и их смеси включены в формулу. Например, формула I показывает структуру класса соединений без определенной стереохимии. Когда соединения по настоящему изобретению содержат один хиральный центр, термин «стереоизомер» включает как энантиомеры, так и смеси энантиомеров, такие как конкретная смесь 50:50, называемая рацемическими смесями.
Диастереомерные смеси могут быть разделены на их индивидуальные диастереомеры на основе их физико-химических различий способами, хорошо известными специалистам в данной области, такими как, например, хроматография и/или фракционная кристаллизация. Энантиомеры могут быть разделены путем превращения энантиомерной смеси в диастереомерную смесь путем взаимодействия с соответствующим оптически активным соединением (например, хиральным вспомогательным веществом, таким как хиральный спирт или хлорангидрид кислоты Мошера), разделением диастереомеров и превращением (например, гидролизом) индивидуальных диастереомеров. в соответствующие чистые энантиомеры. Энантиомеры также могут быть разделены с использованием хиральной ВЭЖХ колонки.
Хиральные центры по настоящему изобретению могут иметь S или R конфигурацию, как определено Рекомендациями IUPAC 1974. Использование терминов «соль», «сольват», «сложный эфир», «пролекарство» и тому подобное в равной степени относится к соли, сольвату, сложному эфиру и пролекарству энантиомеров, стереоизомеров, ротамеров, таутомеров, позиционных изомеров, рацематов или пролекарств заявляемых соединений.
Соли
Термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к солям, полученным из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований, включая неорганические основания и органические основания. Соли, полученные из неорганических оснований, включают соли алюминия, аммония, кальция, меди, трехвалентного железа, двухвалентного железа, лития, магния, соли трехвалентного марганца, двухвалентного марганца, калия, натрия, цинка и тому подобное. Соли, полученные из фармацевтически приемлемых органических нетоксичных оснований, включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, замещенных аминов, включая встречающиеся в природе замещенные амины, циклических аминов и основных ионообменных смол, таких как аргинин, бетаин, кофеин, холин, N,N'-дибензилэтилендиамин, диэтиламин, 2-диэтиламиноэтанол, 2-диметиламиноэтанол, этаноламин, этилендиамин, N-этилморфолин, N-этилпиперидин, глюкамин, глюкозамин, гистидин, гидрабамин, изопропиламин, лизин, метилглюкамин, морфолин, пиперазин, пиперидин, полиаминные смолы, прокаин, пурины, теобромин, триэтиламин, триметиламин, трипропиламин, трометамин и тому подобное.
Если соединения настоящего изобретения являются основными, соли могут быть получены из фармацевтически приемлемых нетоксичных кислот, включая неорганические и органические кислоты. Такие кислоты включают уксусную, бензолсульфоновую, бензойную, камфорсульфоновую, лимонную, этансульфоновую, фумаровую, глюконовую, глутаминовую, бромистоводородную, хлористоводородную, изетионовую, молочную, малеиновую, яблочную, миндальную, метансульфоновую, муциновую, азотную, памовую, пантотеновую, фосфорную, янтарную, серную, винную, п-толуолсульфоновую кислоту и тому подобное.
Следует понимать, что, если не указано иное, ссылки на соединение формулы I, а также на конкретные соединения подразумевают также включение фармацевтически приемлемых солей.
Кроме того, некоторые кристаллические формы соединений по настоящему изобретению могут существовать в виде полиморфов, и как таковые все формы включены в настоящее изобретение. Кроме того, некоторые из соединений по настоящему изобретению могут образовывать сольваты с водой (гидраты) или с обычными органическими растворителями. Такие сольваты включены в объем настоящего изобретения.
Меченые соединения
1
2
В соединениях общей формулы I атомы могут проявлять свой природный изотопный состав, или один или несколько атомов могут быть искусственно обогащены конкретным изотопом, имеющим тот же атомный номер, но атомную массу или массовое число, отличное от атомной массы или массового числа, преимущественно встречающихся в природе. Подразумевается, что настоящее изобретение включает все подходящие изотопные варианты соединений общей формулы I. Например, различные изотопные формы водорода (Н) включают протий (Н) и дейтерий (Н). Протий является преобладающим изотопом водорода, встречающимся в природе. Обогащение дейтерием может дать определенные терапевтические преимущества, такие как увеличение периода полувыведения in vivo или уменьшение требуемой дозировки, или может обеспечить соединение, пригодное в качестве стандарта для характеристики биологических образцов. Изотопно-обогащенные соединения в общей формуле I могут быть получены без чрезмерного экспериментирования обычными методами, хорошо известными специалистам в данной области, или способами, аналогичными тем, которые описаны в схемах и примерах в настоящем документе, с использованием подходящих изотопно-обогащенных реагентов и/или промежуточных соединений.
Применимость
Соединение формулы I или его фармацевтически приемлемые соли и фармацевтические композиции могут быть использованы для лечения или профилактики различных состояний или заболеваний, опосредованных Янус-киназами, в частности, заболеваний или состояний, которые могут быть облегчены путем ингибирования Янус-киназы, такой как JAK1, JAK2 или JAK3. Такие состояния и заболевания включают, но не ограничиваются ими:
(1) артрит, включая ревматоидный артрит, ювенильный артрит и псориатический артрит; (2) астму и другие обструктивные заболевания дыхательных путей, включая хроническую астму, позднюю астму, гиперчувствительность дыхательных путей, бронхит, бронхиальную астму, аллергическую астму, внутреннюю астму, внешнюю астму, пылевую астму, рецидивирующую обструкцию дыхательных путей и хроническую обструктивную болезнь легких, включая эмфизему; (3) аутоиммунные заболевания или расстройства, включая те, которые обозначены как аутоиммунные расстройства одного органа или отдельного типа клеток, например, аутоиммунный тиреоидит, аутоиммунная гемолитическая анемия, аутоиммунный атрофический гастрит пернициозной анемии, аутоиммунный энцефаломиелит, аутоиммунный орхит, аутоиммунная тромбоцитопения, симпатическая офтальмия, миастения гравис, болезнь Грейвса, первичный билиарный цирроз, хронический активный гепатит, язвенный колит и мембранозная гломерулопатия, те, которые обозначены как включающие системное аутоиммунное расстройство, например, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, Шегрен-подобный синдром, полимиозит-дерматомиозит, системный склероз, узелковый полиартериит и пузырчатка, а также дополнительные аутоиммунные заболевания, которые могут быть на основе B-клеток (гуморальных) или T-клеток, включая анкилозирующий спондилит, гранулематоз Вегенера, аутоиммунную алопецию, диабет I типа или ювенильный диабет и тироидит; (4) раковые заболевания или опухоли, включая алиментарный рак/рак желудочно-кишечного тракта, рак толстой кишки, рак печени, рак кожи, включая мастоцитому и плоскоклеточный рак, рак груди и молочной железы, рак яичников, рак простаты, лимфома, лейкоз, включая острый миелоцитарный лейкоз и хронический миелоидный лейкоз, рак почки, рак легких, рак мышц, рак костей, рак мочевого пузыря, рак головного мозга, меланому, включая оральную и метастатическую меланому, саркому Капоши, миеломы, включая множественную миелому, миелопролиферативные расстройства, пролиферативную диабетическую ретинопатию и ангиогенные расстройства, включая солидные опухоли; (5) диабет, включая диабет I типа и осложнения от диабета; (6) глазные заболевания, расстройства или состояния, включая аутоиммунные заболевания глаза, кератоконъюнктивит, весенний конъюнктивит, увеит и факогенный увеит, кератит, герпетический кератит, конусоподобный кератит, эпителиальнокорнеальную дистрофию, кератолейкому, пузырчатку глаз, склерит, синдром Фогта-Коянаги-Харада, сухой кератоконъюнктивит (сухой глаз), фликтену, иридоциклит, саркоидоз, эндокринную офтальмопатию, симпатический офтальмит, аллергический конъюнктивит и неоваскуляризацию глаза; (7) воспаления, аллергии или состояния кишечника, включая болезнь Крона и/или язвенный колит, воспалительное заболевание кишечника, целиакию, проктит, эозинофильный гастроэнтерит и мастоцитоз; (8) нейродегенеративные заболевания, включая болезнь двигательного нейрона, синдром когнитивной дисфункции, болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз, церебральную ишемию, или нейродегенеративное заболевание, вызванное травматическим повреждением, ударом, нейротоксичностью глутамата или гипоксией; ишемическое/реперфузионное повреждение при инсульте, ишемии миокарда, ишемии почек, сердечных приступах, гипертрофии сердца, атеросклерозе и артериосклерозе, гипоксии органов и агрегации тромбоцитов; (9) кожные заболевания, состояния или расстройства, включая атопический дерматит, экзему, псориаз, склеродермию, зуд и другие зудящие состояния; (10) аллергические реакции, включая анафилаксию, аллергический ринит, аллергический дерматит, аллергическую крапивницу, ангиоэдему, аллергическую астму или аллергическую реакцию на укусы насекомых, пищу, лекарственные средства или пыльцу; (11) отторжение трансплантата, включая отторжение трансплантата островка поджелудочной железы, отторжение трансплантата костного мозга, болезнь трансплантат против хозяина, отторжение трансплантата органа и клетки, такого как костный мозг, хрящ, роговица, сердце, межпозвонковый диск, островок, почка, конечность, печень, легкое, мышцы, миобласты, нервы, поджелудочная железа, кожа, тонкая кишка или трахея и ксенотрансплантация.
Соответственно, другой аспект настоящего изобретения обеспечивает способ лечения или профилактики JAK-опосредованного заболевания или расстройства, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения формулы I. В одном варианте осуществления такие заболевания включают астму и ревматоидный артрит. В другом варианте осуществления заболевание представляет собой атопический дерматит.
Другой аспект настоящего изобретения обеспечивает применение соединения формулы I при изготовлении лекарственного средства для лечения или профилактики Заболеваний, опосредованных JAK или расстройства.
Диапазоны доз
Величина профилактической или терапевтической дозы соединения формулы I, конечно, будет варьироваться в зависимости от природы и тяжести состояния, подлежащего лечению, и от конкретного соединения формулы I и способа его введения. Она также будет варьироваться в зависимости от множества факторов, включая возраст, вес, общее состояние здоровья, пол, диету, время введения, скорость выведения, комбинацию лекарственных средств и реакцию отдельного пациента. Обычно суточная доза составляет от приблизительно 0,001 мг до приблизительно 100 мг на кг массы тела млекопитающего, предпочтительно от 0,01 мг до приблизительно 10 мг на кг. В другом варианте осуществления суточная доза составляет от приблизительно 0,2 мг на кг до приблизительно 1,0 мг/кг массы тела млекопитающего. В другом варианте осуществления суточная доза составляет от приблизительно 0,1 мг на кг до приблизительно 3,0 мг/кг массы тела млекопитающего. С другой стороны, в некоторых случаях может возникать необходимость использовать дозировки, выходящие за эти пределы.
Количество активного ингредиента, которое можно комбинировать с носителями для получения стандартной лекарственной формы, будет варьироваться в зависимости от хозяина, подвергаемого лечению, и конкретного способа введения. Например, композиция, предназначенная для перорального введения, может содержать от 0,05 мг до 5 г активного средства, смешанного с подходящим и удобным количеством носителя, количество которого может варьироваться от приблизительно 5 до приблизительно 99,95 процентов от всей композиции. Стандартные лекарственные формы обычно содержат от приблизительно 0,1 мг до приблизительно 0,4 г активного ингредиента, обычно 0,5 мг, 1 мг, 2 мг, 5 мг, 10 мг, 25 мг, 50 мг, 100 мг, 200 мг или 400 мг.
Фармацевтические композиции
th
Другой аспект настоящего изобретения обеспечивает фармацевтические композиции, включающие соединение формулы I с фармацевтически приемлемым носителем. Физиологически приемлемые композиции носителей и эксципиентов известны в данной области и описаны, например, в ʺGennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacyʺ (20 Edition, 2000). Все такие ингредиенты, носители и эксципиенты должны быть по существу фармацевтически чистыми или чистыми для применения в ветеринарии и нетоксичными в используемых количествах и должны быть совместимы с фармацевтически активными ингредиентами (то есть соединением формулы I). Для лечения любых заболеваний, соединения формулы I можно вводить перорально, посредством ингаляционного спрея, местно, парентерально или ректально, в композициях дозированных единиц, содержащих обычные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и наполнители. Термин парентеральный, используемый в настоящем документе, включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, интрастернальные инъекции или инфузии. Помимо лечения теплокровных животных, таких как мыши, крысы, лошади, крупный рогатый скот, овцы, собаки, кошки и т.п., соединение по настоящему изобретению является эффективным для лечения людей.
Фармацевтические композиции, содержащие активный ингредиент, могут быть в форме, подходящей для перорального введения, например, в форме таблеток, лепешек, пастилок, водных или масляных суспензий, диспергируемых порошков или гранул, эмульсий, твердых или мягких капсул или сиропов или эликсиров. Композиции, предназначенные для перорального введения, могут быть изготовлены с соответствии с любым способом, известным для производства фармацевтических композиций, и указанные композиции могут содержать один или более агентов, выбранных из группы, состоящей из подсластителей, вкусовых агентов, красителей и консервантов, с целью изготовления фармацевтически хороших и приятных на вкус препаратов. Таблетки содержат активный ингредиент в смеси с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, которые являются подходящими для изготовления таблеток. Указанные эксципиенты могут представлять собой, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и разрыхляющие агенты, например, кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связывающие агенты, например, крахмал, желатин или аравийская камедь, и смазывающие агенты, например, стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут не иметь покрытия или иметь покрытие, нанесенное известными способами, для задержки распада и всасывания в желудочно-кишечном тракте и, таким образом, обеспечивать продолжительное действие в течение более длительного периода времени. Например, можно применять материал, обеспечивающий задержку времени высвобождения, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат. На них также можно наносить покрытие с помощью методики, описанной в патентах США 4256108, 4166452 и 4265874, с целью изготовления осмотических терапевтических таблеток с контролируемым высвобождением.
Композиции для перорального введения могут быть также представлены в форме твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в форме мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан со смешивающимися с водой растворителями, такими как пропиленгликоль, PEG и этанол, или с масляной средой, например, арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.
Водные суспензии содержат активный материал в смеси с эксципиентами, подходящими для получения водных суспензий. Такие эксципиенты представляют собой суспендирующие агенты, например, натрий-карбоксиметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовую камедь и аравийскую камедь; диспергирующие или увлажняющие агенты могут представлять собой натуральный фосфатид, например, лецитин, или продукты конденсации алкиленоксида с жирными кислотами, например, полиоксиэтиленстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например, гептадекаэтиленоксицетанол, или продукты конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, полученными из жирных кислот и гексита, такие как моноолеат полиоксиэтиленсорбита, или продукты конденсации этиленоксида с частичными сложными эфирами, полученными из ангидридов жирных кислот и гексита, например, моноолеат полиэтиленсорбитана. Водные суспензии могут также содержать один или более консервантов, например, этил или н-пропил, п-гидроксибензоат, один или более окрашивающих агентов, один или более вкусовых агентов и один или более подсластителей, таких как сахароза, сахарин или аспартам.
Масляные суспензии могут быть изготовлены суспендированием активного ингредиента в растительном масле, например, арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или кокосовом масле, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Масляные суспензии могут содержать загуститель, например, пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Подсластители, такие, которые перечислены выше, и вкусовые агенты можно добавлять для получения приятного на вкус препарата для перорального введения. Указанные композиции можно сохранять путем добавления антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.
Диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для получения водной суспензии путем добавления воды, содержат активный ингредиент в смеси с диспергирующим или увлажняющим агентом, суспендирующим агентом и одним или более консервантами. Примеры подходящих диспергирующих или увлажняющих агентов и суспендирующих агентов уже упоминались выше. Могут присутствовать также дополнительные эксципиенты, например, подсластители, вкусовые и окрашивающие агенты.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут также быть в форме эмульсии типа "масло-в-воде". Масляная фаза может представлять собой растительное масло, например, оливковое масло или арахисовое масло, или минеральное масло, например, жидкий парафин, или их смеси. Подходящие эмульгирующие агенты могут представлять собой натуральные фосфатиды, например, соевые фосфатиды, лецитин или сложные эфиры или частичные эфиры, полученные из ангидридов жирных кислот и гексита, например, моноолеат сорбитана, и продукты конденсации указанных частичных сложных эфиров с этиленоксидом, например, моноолеат полиоксиэтиленсорбитана. Эмульсии могут также содержать подсластители и вкусовые агенты.
Сиропы и эликсиры можно изготавливать с подсластителями, например, глицерином, пропиленгликолем, сорбитом или сахарозой. Такие композиции могут также содержать уменьшающий раздражение агент, консервант и вкусовой и окрашивающие агенты. Фармацевтические композиции могут быть в форме стерильной водной или масляной суспензии для инъекций. Данную суспензию можно изготовить в соответствии с известным уровнем техники с использованием подходящих диспергирующих или увлажняющих агентов и суспендирующих агентов, которые были упомянуты выше. Стерильный препарат для инъекций может также представлять собой стерильный раствор или суспензию для инъекций в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например, раствор в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые можно использовать, находятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Также можно использовать сорастворители, такие как этанол, пропиленгликоль или полиэтиленгликоли. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды обычно используют стерильные нелетучие масла. Для указанной цели можно использовать любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, при изготовлении препаратов для инъекций используются жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.
Соединения формулы I также можно вводить в форме суппозиториев для ректального введения лекарственного средства.
Для местного применения используют кремы, мази, гели, растворы или суспензии и т.п., содержащие соединение формулы I. (Для целей настоящей заявки местное применение будет включать средства для полоскания ротовой полости и горла.) Композиции для местного применения обычно могут включать фармацевтический носитель, сорастворитель, эмульгатор, усилитель проникновения, систему консервантов и смягчающее вещество.
В альтернативном варианте осуществления композиции по настоящему изобретению могут быть созданы для офтальмологического введения.
Комбинации с другими лекарственными средствами
Для лечения и профилактики Заболеваний, опосредованных JAK соединение формулы I можно вводить совместно с другими терапевтическими средствами. Таким образом, в другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям для лечения Заболеваний, опосредованных JAK, включающим терапевтически эффективное количество соединения формулы I и одного или нескольких других терапевтических средств. В частности, для лечения воспалительных заболеваний ревматоидного артрита, псориаза, воспалительных заболеваний кишечника, ХОБЛ, астмы и аллергического ринита соединение формулы I можно комбинировать с такими средствами, как: (1) ингибиторы TNF-α, такие как ремикейд (Remicade) и энбрел (Enbrel)); (2) неселективные ингибиторы COX-I/COX-2 (такие как пироксикам, диклофенак, пропионовые кислоты, такие как напроксен, флубипрофен, фенопрофен, кетопрофен и ибупрофен, фенаматы, такие как мефенамовая кислота, индометацин, сулиндак, апазон, пиразолоны, такие как фенилбутазон, салицилаты, такие как аспирин); (3) ингибиторы СОХ-2 (такие как мелоксикам, целекоксиб, рофекоксиб, вальдекоксиб и эторикоксиб); (4) другие средства для лечения ревматоидного артрита, включая низкие дозы метотрексата, лефуномида, циклесонида, гидроксихлорохина, d-пеницилламина, ауранофина или парентерального или перорального золота; (5) ингибитор биосинтеза лейкотриенов, ингибитор 5-липоксигеназы (5-LO) или антагонист 5-липоксигеназа-активирующего белка (FLAP), такой как зилеутон; (6) антагонист рецептора LTD4, такой как зафирлукаст, монтелукаст и пранлукаст; (7) ингибитор PDE4, такой как рофлумиласт; (8) антигистаминные антагонисты H1-рецептора, такие как цетиризин, лоратадин, дезлоратадин, фексофенадин, астемизол, азеластин и хлорфенирамин; (9) агонист α1- и α2-адренорецептора сосудосуживающее симпатомиметическое средство, такое как пропилгекседрин, фенилэфрин, фенилпропаноламин, псевдоэфедрин, гидрохлорид нафазолина, гидрохлорид оксиметазолина, гидрохлорид тетрагидрозолина, гидрохлорид ксилометазолина и гидрохлорид этилнорепинефрина; (10) антихолинергические средства, такие как ипратропия бромид, тиотропия бромид, окситропия бромид, аклиндиния бромид, гликопирролат, пирензепин и телензепин; (11) агонисты β-адренорецептора, такие как метапротеренол, изопротеренол, изопреналин, альбутерол, сальбутамол, формотерол, сальметерол, тербуталин, орципреналин, мезилат битолтерола и пирбутерол или метилксантины, включая теофиллин и аминофиллин, натрия кромогликат; (12) миметик инсулиноподобного фактора роста I типа (IGF-1); (13) ингаляционный глюкокортикоид с уменьшенными системными побочными эффектами, такой как преднизон, преднизолон, флунизолид, триамцинолона ацетонид, беклометазон дипропионат, будесонид, флутиказон пропионат, циклесонид и мометазон фуроат.
СПОСОБЫ СИНТЕЗА
СХЕМЫ И ПРИМЕРЫ
Используемые в настоящем описании аббревиатуры имеют следующие сведенные в таблицу значения. Аббревиатуры, не приведенные в таблице ниже, имеют свое обычное значение, если специально не указано иное.
ACN
Ацетонитрил
хиральная SFC
хиральная сверхкритическая флюидная хроматография
DBU
1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен
DCM
дихлорметан
DMSO
диметилсульфоксид
DTT
Трео-1,4-димеркапто-2,3-бутандиол (реагент Клиланда)
EtOAc
этилацетат
GST
Глутатион S-трансфераза
HEPES
4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этансульфоновая кислота, N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2- этансульфоновая кислота)
HTRF
гомогенная флуоресценция с временным разрешением
ВЭЖХ
высокоэффективная жидкостная хроматография
LCMS
жидкостная хромотография масс-спектрометрия
MPLC
жидкостная хромотография при среднем давлении
Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>
сульфат натрия
NaOMe
метоксид натрия
Pd<sub>2</sub>(dba)<sub>3</sub>
трис(дибензилиденацетон)дипалладий(0)
POCl<sub>3</sub>
оксихлорид фосфора(V)
t-BuOH
<i>трет-</i>бутанол
THF
Тетрагидрофуран
X-Phos
2-дициклогексилфосфино-2′,4′,6′-триизопропилбифенил
Me<sub>4</sub>-<sup>t</sup>Bu-X-Phos
ди-трет-бутил[3,4,5,6-тетраметил-2',4',6'-три(пропан-2-ил)бифенил-2-ил]фосфан
ЯМР
ядерный магнитный резонанс
TLC
тонкослойная хроматография
TMS
триметилсилан
TRF
флуоресценция с временным разрешением
Сокращения Алкильных Групп
Me
Метил
Et
этил
н-Pr
нормальный пропил
i-Pr
изопропил
n-Bu
нормальный бутил
i-Bu
изобутил
s-Bu
вторичный бутил
t-Bu
третичный бутил
c-Pr
Циклопропил
c-Bu
циклобутил
c-Pen
циклопентил
c-Hex
Циклогексил
СПОСОБЫ СИНТЕЗА
Соединения по настоящему изобретению могут быть получены в соответствии со следующими общими схемами с использованием соответствующих материалов, и дополнительно иллюстрируются последующими конкретными примерами. Соединения, проиллюстрированные в примерах, не должны рассматриваться как образующие единственную форму, которая рассматривается как изобретение. Поэтому приведенные ниже иллюстративные примеры не ограничиваются перечисленными соединениями или какими-либо конкретными заместителями, используемыми в иллюстративных целях. Нумерация заместителей, показанная на схемах, необязательно коррелирует с нумерацией, используемой в формуле изобретения, и часто, для ясности, показан единственный заместитель, присоединенный к соединению, где допускаются множественные заместители в соответствии с определениями настоящего изобретения, приведенными выше.
Специалисты в данной области легко поймут, что известные вариации условий и способов следующих препаративных процедур могут быть использованы для получения этих соединений. Изобретение теперь будет проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами, в которых, если не указано иное:
Все реакции перемешивали (механически, магнитной мешалкой/пластиной для смешивания или встряхивали) и проводили в инертной атмосфере азота или аргона, если специально не указано иное.
Все температуры указаны в градусах Цельсия (°C), если не.
Температура окружающей среды составляет 15-25°C.
Большинство соединений очищали препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой, MPLC на силикагеле, перекристаллизацией и/или промывкой (суспензия в растворителе с последующей фильтрацией твердого вещества).
За ходом реакций следили с помощью тонкослойной хроматографии (TLC) и/или LCMS и/или ЯМР, а время реакции дано только для иллюстрации.
Все конечные продукты анализировали с помощью ЯМР и LCMS.
Промежуточные соединения анализировали с помощью ЯМР и/или TLC и/или LCMS.
Способ 1
КОММЕРЧЕСКИ ДОСТУПНЫЕ/РАНЕЕ ОПИСАННЫЕ МАТЕРИАЛЫ
В следующей таблице перечислены коммерческие источники и ранее раскрытые пути синтеза химических веществ, используемых для синтеза промежуточных соединений, и примеры настоящего изобретения. Этот список не является исчерпывающим, исключительным или ограничивающим каким-либо образом.
Структура
Название IUPAC
Продавец
<img file="00000004.jpg" he="22" wi="24" img-content="undefined" img-format="jpg" />
тетрагидро-2H-пиран-3-карбальдегид
J&W Pharmlab LLC
<img file="00000005.jpg" he="19" wi="33" img-content="undefined" img-format="jpg" />
тетрагидро-2H-пиран-4-илацетальдегид
Maybridge
Промежуточные соединения
Следующие экспериментальные способы представлены как подробно описывающие получение химических веществ, используемых в синтезе примеров настоящего изобретения. Приведенные в качестве примера способы предназначены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения каким-либо образом.
Схема синтеза:
Промежуточное соединение 2: 3,6-Дигидро-2Н-пиран-4-карбонитрил
1
3
К раствору триметилсилилцианида (28,0 г, 288 ммоль) в дихлорметане (100 мл) последовательно добавляли тетрагидро-4Н-пиран-4-он 1 (24 г, 243 ммоль) и триметилсилилтрифлат (1.6 г, 7,2 ммоль) при 0°C. Полученный раствор перемешивали при 0°C в течение 1 часа перед добавлением пиридина (300 мл) и фосфорилхлорида (110 г, 719 ммоль). Смесь кипятили с обратным холодильником в течение 12 часов и затем выливали в смесь 2 н. водного раствора хлористоводородной кислоты (600 мл), колотого льда (180 мл) и эфира (600 мл) при 0°С. Смесь энергично перемешивали в течение 15 минут и затем экстрагировали эфиром (3×1 л). Весь органический раствор промывали насыщенным солевым раствором (2×300 мл), сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный остаток очищали колоночной флэш-хроматографией с 1-2% этилацетата в гексане с получением указанного в заголовке соединения в виде желтого масла. H ЯМР (300 МГц, CDCl) δ 6,62-6,59 (м, 1H), 4,29-4,21 (м, 2H), 3,78 (т, J=5,4 Гц, 2H), 2,34-2,30 (м, 2H).
R
S
или
S
R
Промежуточное соединение 5: 3-амино-1-((3,4)  (3,4)-4-цианотетрагидро-2H-пиран-3-ил)-1H-пиразол-4-карбоксамид
Смесь 3-амино-1Н-пиразол-4-карбоксамида 4 (804 г, 4,59 моль), 3,6-дигидро-2Н-пиран-4-карбонитрила 2 (1000 г, 9,17 моль) и DBU (2435 г, 16 моль) в этаноле (800 мл) перемешивали при 70°С в течение ночи в атмосфере азота и затем концентрировали в вакууме. Неочищенный остаток очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии на силикагеле с 2-5% метанолом в дихлорметане с получением рацемической смеси указанного в заголовке соединения и его энантиомера в виде желтого твердого вещества (269 г, выход 25%).
Хиральное разделение: 380 г рацемического соединения растворяли в ACN/MeOH (1:1) до концентрации 25 мг/мл. Инъекции по 16 мл делали на препаративном SFC Thar 350 (колонка: ChiralPak IC-10 мкМ, 300×50 мм; подвижная фаза: 45% 2-пропанол, 55% CO2; скорость потока: 220 мл/мин; температура колонки: 38°C). После разделения фракции высушивали ротационным выпариванием. Второй пик (медленное элюирование) использовали для получения следующих соединений.
1
+
6
10
14
5
2
J
J
J
H ЯМР (500 МГц, DMSO-d) δ 8,03 (с, 1H), 7,36 (шир.с, 1H), 6,80 (шир.с, 1H), 5,36 (с, 2H), 4,86-4,31 (тд, =10,5, 4,5 Гц, 1H), 3,91-3,88 (дд, =11,5, 4,5 Гц 1H), 3,86-3,83 (м, 1H), 3,53-3,50 (м, 2H), 3,39-3,33 (тд, =11,5, 2 Гц, 1H), 2,10-2,07 (м, 1H), 1,95-1,87 (м, 1H). LRMS (ESI) рассчитано для CHNO [M+H]: 236, найдено: 236.
Промежуточное соединение 10: 2,6-дифтор-4-гидразинилпиридин
1
6
В высушенную в печи круглодонную колбу с магнитной мешалкой в атмосфере N2, добавляли 2,4,6-трифторпиридин 9 (7 г, 52,6 ммоль, 1 экв), THF (52,6 мл, 1 М) и гидразин (5,1 мл, 105 ммоль, 2 экв.). Реакционную смесь нагревали до 50°С в течение 2 ч, и затем охлаждали до комнатной температуры. Неочищенное вещество растирали с водой (2×25 мл) и гексаном (25 мл), а затем сушили в вакууме в течение ночи. Полученное твердое вещество перекристаллизовывали в EtOAc с получением 2,6-дифтор-4-гидразинилпиридина 10 (4,5 г, 31 ммоль). H ЯМР (500 МГц, DMSO-d) δ 8,42 (с, 1H), 6,16 (шир.с, 2H), 4,46 (с, 2H).
Промежуточное соединение 11: 4-бром-2,6-дифторпиридин
2
3
2
4
3
1
В высушенную в печи круглодонную колбу с магнитной мешалкой в атмосфере N2 добавляли 2,6-дифтор-4-гидразинилпиридин 10 (13,24 г, 91 ммоль) и хлороформ (97 мл, 0,78 М) с последующим добавлением по каплям (через капельную воронку) брома (9,40 мл, 182 ммоль, 2 эквив.) при комнатной температуре. Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 6 часов, и затем охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через целит. Фильтрат промывали насыщ. водн. NaCO (25 мл), насыщенным солевым раствором (25 мл), сушат над NaSO, и затем фильтровали через целит и концентрировали в вакууме. Неочищенный 4-бром-2,6-дифторпиридин 11 (11,8 г, 60,8 ммоль) использовали без дальнейшей очистки. H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ 7,04 (с, 2H).
Промежуточное соединение 8: 4-бром-2-фтор-6-метоксипиридин
2
2
4
3
1
В высушенную в печи круглодонную колбу с магнитной мешалкой в атмосфере N добавляли 4-бром-2,6-дифторпиридин 11 (10,8 г, 55,7 ммоль) и метанол (111 мл, 0,5 М), затем метоксид натрия (10,83 г, 50,1 ммоль, 0,9 эквив) при комнатной температуре. Реакционную смесь нагревали до 40°С в течение 1 часа, а затем охлаждали до комнатной температуры. Суспензию разделяли между EtAOc (100 мл) и водой (50 мл). Органические вещества промывали насыщенным солевым раствором (25 мл), сушили над NaSO, фильтровали через целит и концентрировали в вакууме. Неочищенный остаток очищали с использованием колоночной хроматографии (0-100% EtOAc в гексане, градиент) с получением 4-бром-2-фтор-6-метоксипиридина 8 (7,29 г, 35,4 ммоль). H ЯМР (500 МГц, CDCl) δ 7,77 (с, 1H), 7,63 (с, 1H), 3,86 (2, 3H).
или
S
R
Пример 1: 1-((3R,4S)  (3,4)-4-цианотетрагидро-2Н-пиран-3-ил)-3-((2-фтор-6-метоксипиридин-4-ил)амино)-1Н-пиразол-4-карбоксамид
2
3
Трехгорлую колбу 500 мл снабжали обратным холодильником и термопарой J-KEM, затем загружали 3-амино-1-((3R,4S)-4-цианотетрагидро-2H-пиран-3-ил)-1H-пиразол-4-карбоксамид 5 (10,0 г, 42,5 ммоль), 4-бром-2-фтор-6-метоксипиридин 8 (14,1 г, 63,7 ммоль), ацетат калия (6,26 г, 63,8 ммоль) и 2-пропанол (150 мл). Реакционную смесь продували газообразным азотом в течение 20 мин, затем добавляли Pd(dba) (1,95 г, 2,13 ммоль) и 2-ди-трет-бутилфосфино-2',4',6'-триизопропилбифенил (2,00 г, 4,71 ммоль). Реакционную смесь затем нагревали до 80°C в течение 16,5 часов. После охлаждения до 23°С добавляли ацетон (150 мл) и смесь перемешивали в течение 10 минут, затем фильтровали через целит с элюированием ацетоном. Фильтрат концентрировали на силикагеле в вакууме и очищали с помощью колоночной флэш-хроматографии (картридж ISCO 220 г, градиентное элюирование 3-6% метанол-дихлорметан). Фракции, содержащие продукт, концентрировали с получением 1-((3R,4S) или (3S,4R)-4-цианотетрагидро-2H-пиран-3-ил)-3-((2-фтор-6-метоксипиридин-4-ил)амино)-1Н-пиразол-4-карбоксамида в виде твердого вещества ярко-желтого цвета.
1
+
16
17
6
3
H ЯМР (600 МГц, DMSO-d6): δ 9,63 (с, 1H), 8,34 (с, 1H), 7,29 (с, 1H), 7,28 (с, 1H), 6,66 (д, 2H), 4,59 (м, 1H), 4,00 (м, 1H), 3,87 (м, 1H), 3,76 (с, 3H), 3,65-3,58 (м, 2H), 3,46 (м, 1H), 2,12 (м, 1H), 1,94 (м, 1H). LRMS (ESI) рассчитано для CHFNO [M+H]: 361, найдено: 361.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ
Экспериментальные способы
Протокол биохимического ферментного анализа HTRF Jak
Способность соединений ингибировать каталитическую активность JAK1, JAK2, JAK3 и TYK2 определяли количественно с использованием рекомбинантного очищенного GST-меченного каталитического домена для каждого фермента (InVitrogen/ Life Technologies/ ThermoFisher, catalogue #s: JAK1, #M4290; JAK2, #M4290; JAK3, #M4290; TYK2 #M4290) в биохимическом анализе в формате HTRF. В реакциях использовали обычный пептидный субстрат, LCB-EQEDEPEGDYFEWLW-NH2 (Merck). Основной протокол анализа заключается в следующем: сначала 50 нл разбавленных соединений в DMSO вносили в лунки сухого 384-луночного аналитического планшета (Perkin Elmer Opti-plate, catalogue # 6007290) с использованием акустического дозатора Labcyte Echo 555. В последующих добавлениях реагентов использовали автоматизированный манипулятор для жидкости Agilent Bravo. Затем добавляли 18 мкл 1.11X фермента, добавленного в минимально возможной концентрации для получения для получения в 10 раз выше фонового контроля, который поддерживал реакцию на начальной скорости в течение реакции (см. таблицу ниже), и 1.11X субстрат в 1X буфере для анализа (буфер Invitrogen kinase buffer # PV3189, 2 мМ DTT, 0,05% BSA) добавляли в лунки, встряхивали и затем инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, чтобы обеспечить связывание соединения и достижение равновесия. После этой стадии добавляли 2 мкл 10X ATP в 1Х буфере для анализа, чтобы инициировать реакцию киназы, поддерживая концентрацию ATP при концентрации, равной кажущейся Km, рассчитанной для каждого ферментного препарата (см. таблицу ниже), и планшеты встряхивали и затем инкубировали при 23°С в течение 80 минут. В конце инкубации добавляли 20 мкл 2X стоп-буфера (стрептавидин-Dylight 650 (ThermoFisher #84547B/100 мл), меченные европием антитела pY20 (Perkin Elmer #AD0067), EDTA, HEPES и тритон) для гашения реакция. Планшеты встряхивали и центрифугировали, а затем инкубировали в течение 60 минут при комнатной температуре и затем считывали с помощью Perkin Elmer Envision (λex=337 нм, λem=665 и 615 нм, время задержки TRF=20 мкс). HTRF-сигнал=10000*665 нм считывание/615 нм считывание. После нормализации к необработанным контролям рассчитывали процент ингибирования сигнала HTRF при каждой концентрации соединения. График процента ингибирования в зависимости от логарифмического значения концентрации соединения выполняли, как описано выше для клеточных анализов, для расчета значений IC50. Конечные условия реакции были:
фермент
[E](нM)
[пептид](мкM)
[ATP](мкM)
[Eu-pY20] (нM)
[SA-Dylight] (нM)
JAK1
1,0
0,75
30,1
9
312,5
JAK2
0,0075
0,75
7,0
9
312,5
JAK3
0,015
0,75
1,7
9
312,5
Tyk2
2,0
0,75
9,3
9
312,5
Испытуемые концентрации соединений составляли 1496, 499, 175, 49,9, 18,7, 6,2, 2,1, 0,75, 0,24, 0,075 и 0,0125 нM. Конечный [DMSO] был скорректирован на 0,25%.
Контроль осуществления анализа и качества данных:
Эффективность ферментных анализов отслеживали путем расчета значений минимального значимого отношения (MSR) в ходе анализов для эталонных молекул пан- и селективного-JAK:
эталонное соединение
Структура
Название
Источник
A
<img file="00000013.jpg" he="31" wi="39" img-content="undefined" img-format="jpg" />
3-[(4-хлорфенил)амино]-1-[(1S,2S,4S или 1R,2R,4R)-2-циано-4-(диметиламино)циклогексил]-1<i>H</i>-пиразол-4-карбоксамид
WO2013/040863, стр. 225, соединение 28-117
B
<img file="00000014.jpg" he="31" wi="37" img-content="undefined" img-format="jpg" />
(1<i>S</i>,2<i>S</i>)-2-(3-{[4-(метилсульфонил)фенил]амино}-4-оксо-4,5-дигидро-1<i>H</i>-пиразоло[4,3-<i>c</i>]пиридин-1-ил)циклогексанкарбонитрил
WO2014/146490, стр. 163, соединение 3-5
Активности для эталонного соединения No. 1, JAK1 селективного, составляли: JAK1 IC50=1,47 нM +/- 0,40, N=392; JAK2 IC50=19,04 +/- 4,15 нM, N=393; JAK3 IC50=1351,45 нM +/- 129,93, N=398 и TYK2 IC50=13,96 пM +/- 3,17, N=394.
Активности для эталонного соединения No. 2, пан-ингибитор JAK1, были: JAK1 IC50=0,17 нM +/- 0,06, N=399; JAK2 IC50=1,00 +/- 0,29 нM, N=400; JAK3 IC50=21,95 нM +/- 6,08, N=404 и TYK2 IC50=0,28 нM +/- 0,09, N=401.
Анализы JAK с участием клеточного пути:
TM
TM
2
Ингибирование активности киназ JAK1 и JAK2 в интактных клетках определяли количественно в режиме антагониста с использованием технологии транскрипционного репортера CellSensor (Life Technologies/ ThermoFisher: https://www.thermofisher.com/us/en/home/industrial/pharma-biopharma/drug-discovery- development/target-and-lead-identification-and-validation/pathway-biology/cellular-pathway-analysis/cellsensor-cell-lines.html), в двух независимых клеточных линиях, разработанных для обнаружения передачи сигналов IL4, IL6 и EPO. Вкратце, клеточные линии CellSensor (подробности см. ниже для каждого анализа), несущие стабильно интегрированный репортерный ген L-лактамазы под контролем специфических цис-регуляторных элементов STAT, чувствительных к контролируемому пути, предварительно обрабатывали тестируемыми соединениями, серийно разбавленными в DMSO (см. раздел «Получение и дозировка соединений и агонистов цитокинов»). После инкубации с соединениями к каждой родственной клеточной линии добавляли IL6 или ЕРО в концентрации, равной дозе, необходимой для достижения 80% максимального ответа (ЕС80). После стимуляции цитокинами клеточные уровни активности β-лактамазы были обнаружены in situ с использованием набора для загрузки LiveBLAzer Loading Kit (субстрат LiveBLAzer™-FRET B/G, CCF4-AM от Life Technologies), где наблюдается флуоресценция субстрата (излучение флуоресценции при 405 нм) и расщепленного продукта (излучение флуоресценции при 488 нм) определяли количественно на ридере Acumen Explorer ex3 (TTP Labtech). Нормализованные значения флуоресценции, сообщающие о процентном ингибировании лунок, обработанных тестируемыми соединениями, наносили на график против логарифмического значения концентрации каждой из десяти доз, выбранных для построения кривой доза-ответ (DRC), используя 4-параметрическую подгонку уравнения доза-отклик для расчета концентрации, необходимой для достижения 50% ингибирования максимальной активности (IC50 или значение активности) в программном обеспечении Assay Data Analyzer (Merck Frosst Canada & Co - 2003). Процент ингибирования рассчитывали как функцию уровней бета-лактамазы, измеренных в лунках, обработанных DMSO-контролем, 0% ингибирования, по сравнению с уровнями β-лактамазы в лунках, обработанных дозой пан-JAK ингибитора, достаточной для достижения 100% блокады продукции β-лактамазы. Инкубацию с соединениями, цитокинами и LiveBLAzer проводили при 37°С в инкубаторе для тканевых культур, поддерживаемом при 90% влажности и 5% CO.
Агонисты и пары клеточных линий, используемые для количественной оценки функционального ингибирования JAK-регулируемых путей, были следующими:
Путь интерлейкин 6 (IL6) - JAK1/JAK2 - STAT4
: CellSensor™ SIE-bla ME-180 клетки, несущие стабильно интегрированный репортерный ген L-лактамазы под контролем Sis-индуцируемого элемента (SIE).
Путь эритропоэтин (EPO) - JAK2 - STAT5
: CellSensor irf1-bla TF-1 клетки, несут стабильно интегрированный репортерный ген β-лактамазы под контролем элементов ответа STAT5, присутствующих в промоторе гена регуляторного фактора интерферонов I (IRF1).
Получение и дозирование соединений и цитокинов
: Исходные растворы 10 мМ исходных соединений, приготовленные в DMSO, серийно разбавляли 1:3 десять раз, в DMSO с использованием автоматического устройства для манипуляций с жидкостями Tecan Freedom EVO-2 200 в 384-луночном полипропиленовом микропланшете Echo Qualified (384PP), прозрачные с плоским дном, (Labcyte, Cat# P-05525). Шестьдесят нл каждой дозы соединения распределяли с использованием акустического дозатора ECHO Acoustic Dispenser 550 (Labcyte) в сухие 384-луночные микропланшеты с плоским прозрачным дном из черного полистирола, обработанные TC, (Corning Cat# 3712). Каждую клеточную линию CellSensor впоследствии высевали в соответствии с инструкциями поставщика (30000 клеток в 32 мкл/лунку) и смешивали с соединением. После 60 минут инкубации клетки затем стимулировали добавлением 8 мкл родственного цитокина (доза EC80 IL6 и EPO) и инкубировали в течение дополнительных 3 часов перед добавлением субстрата LiveBLAzer™-FRET B/G. Конечные дозы тестируемого соединения составляли: 14977; 4992; 1664; 554; 184; 61,6; 20,5; 6,8; 2,3 и 0,76 нM. Конечная концентрация DMSO поддерживалась на уровне 0,15%.
Контроль осуществления анализа и качества данных: Использовали три параметра для подтверждения качества каждого отдельного анализа и для обеспечения развития узкой зависимости активности от структуры (SAR), что позволило выявить различия между соединениями, активность которых варьировалась в 3-4 раза ниже:
(A) Чтобы убедиться, что стимуляция цитокином находилась в пределах приемлемых +/- 5% от дозы, необходимой для достижения 80% стимуляции, EC80, 16-точечная кривая доза агониста-ответ (DRC) была включена для каждого планшета, и эту DRC использовали для получения обратным пересчетом уровня стимуляции, достигнутого в планшете. Максимальные дозы DRC составляли: 500 нг/мл для IL6 и 100 нг/мл для EPO.
(B) DRC для двух эталонных соединений были включены в каждый планшет для анализа, содержащий в общей сложности 32 соединения на чашку:
Эталонное соединение No. A, JAK1 селективная молекула, в двенадцать раз более эффективная в анализе CellSensor IL6: IC50=51,9 +/- 23,6 нM, N=627 по сравнению с анализом CellSensor EPO составляла: IC50=623,5 +/- 132,3 нM, N=617. Активность в анализе CellSensor IL4 составляла: IC50=25,7 +/- 8,4 нM, N=307
Эталонное соединение No. B., пан-JAK ингибитор, который показал активность в два-три раза в обоих анализах. Анализ IL6/JAK1-JAK2: IC50=21+/-9,1 нM, N=652 сверх и анализ EPO/JAK2: IC50=39,5+/-12,4 нM, N=626
(C) Воспроизводимость анализа на повторяющихся планшетах и независимых опытах контролировали путем расчета минимально значимого соотношения (MSR, см. Eastwood et al., Journal of Biomolecular Screening 11(X); 2006), отслеживающего значения активности IC50 для обоих эталонных соединений.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ
in vitro
in vitro
Примеры настоящего изобретения оценивали в анализах связывания  JAK1, JAK2 и JAK3, а также в анализах вовлечения клеточного пути IL-6 и EPO, как описано выше. В таблице 1 приведены значения IC50 по настоящему изобретению в JAK1, JAK2 и JAK3 в анализах связывания , а также в анализах вовлечения клеточного пути IL-6 и EPO, а также в соотношении JAK2/JAK1 IC50, JAK3/JAK1 IC50, и EPO/IL-6 IC50. В таблице 2 приведены фармакокинетические параметры настоящего изобретения у собаки после внутривенного введения. В таблице 3 приведены сопоставимые данные для других JAK1 соединений.
Таблица 1.
Соединение
JAK1IC50 (нM)
JAK2IC50 (нM)
JAK3 IC50 (нM)
соотношение JAK2/1
соотношение JAK3/1
IL-6IC50 (нM)
EPOIC50 (нM)
соотношение EPO/IL-6
1
<img file="00000015.jpg" he="38" wi="30" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0,43
5,89
1130
14
2628
41,8
459,7
11
<sub>Энантиомер1</sub>
<img file="00000016.jpg" he="44" wi="33" img-content="undefined" img-format="jpg" />
17,7
215,9
>1249
12,2
>70
2444,5
9484,8
3,9
Таблица 2
Фармакокинетические параметры (PK) у собаки соединения 1
PK параметры
Значение
Доза (мг/кг I.V.)
0,25
AUC (мкМ.ч)
1,29
CL (мл/мин/кг)
9,42
Vdss (л/кг)
1,95
T1/2 (ч)
4,38
Сравнительные примеры
Таблица 3
соединение
JAK1IC50 (нM)
JAK2IC50 (нM)
JAK2/1
IL-6IP (нM)
EPOIP (нM)
EPO/IL-6
тофацитиниб
<img file="00000017.jpg" he="34" wi="42" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1,35
1x
96
0,7x
барицитиниб
<img file="00000018.jpg" he="45" wi="47" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0,47
0,4x
40
0,43x
оклацитиниб
<img file="00000019.jpg" he="44" wi="43" img-content="undefined" img-format="jpg" />
3,4
2,0X
230
2,4X
JAKAFI
<img file="00000020.jpg" he="33" wi="36" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1
0,7x
40
0,2x
INCB39110
<img file="00000021.jpg" he="47" wi="45" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0,3
10x
97
5x
GLPG0634
<img file="00000022.jpg" he="57" wi="46" img-content="undefined" img-format="jpg" />
0,63
4,8x
40
5x
эталонное соединение A
<img file="00000023.jpg" he="48" wi="45" img-content="undefined" img-format="jpg" />
1,67
,11,4x
57
11x
Исследование безопасности соединения 1.
Для соединения 1 было проведено 6-недельное пилотное целевое исследование безопасности у животных. Лекарственное средство вводили перорально в виде прессованной таблетки два раза в день в течение 6 недель собакам в 1, 3 и 5 раз максимальной дозы воздействия 0,5 мг/кг или один раз в день в течение 6 недель для собак в 5 раз максимальной дозы воздействия 1 мг/кг. Никаких эффектов, связанных с исследуемым препаратом, не наблюдали в клинических наблюдениях, наблюдениях кала, массе тела, изменении массы тела, потреблении пищи, параметрах физического обследования, кровяном давлении, офтальмологии или кардиологии. При посмертных оценках не наблюдалось никаких эффектов, связанных с исследуемым препаратом, включая массу органов, а также данные макроскопических и микроскопических исследований. Основываясь на результатах этого исследования, доза, не вызывающая наблюдаемых нежелательных эффектов (NOAEL) составляет 5,0 мг/кг/день в виде дозы один раз в день или 2,5 мг/кг два раза в день. Предполагается, что JAK-1 селективность соединения 1 обеспечивает больший запас безопасности по сравнению с менее селективным соединением, таким как оклацитиниб (Apoquel). Эти данные из пилотного целевого исследования безопасности у животных подтверждают эту гипотезу и позволяют предположить, что соединение 1 может эффективно лечить атопический дерматит у собак с улучшенным запасом безопасности.
Соединение 1 в модели IL-31 индуцированного зуда
et al
Vet Dermatol
et al
Cytokine & Growth Factor Reviews
Vet Dermatol
В качестве меры ингибирования JAK-1 in vivo и, как следствие, ожидаемой клинической эффективности соединения 1, авторы изобретения оценили соединение 1 в соответствующей фармакодинамической модели и включили клиническую ссылку. Было продемонстрировано, что собачий интерлейкин-31 (cIL-31) вовлечен в зуд, связанный с атопическим и аллергическим дерматитом у собак [Gonzales .,  2013; 24: 48-e12], и IL-31 может активировать JAK-1 и JAK-2 сигнальные молекулы после связывания с его рецепторным комплексом [Zhang .,  19 (2008) 347-356]. Введение cIL-31 собакам породы бигль вызывает сильную зудящую реакцию, которая может быть подавлена предшествующим лечением ингибитором JAK оклацитинибом [Gonzales et al.,  2016; 27: 34-e10]. Используя рандомизированное, не-слепое, перекрестное исследование, соединение 1 (1 мг/кг массы тела), Apoquel или плацебо вводили лабораторным собакам породы бигль за 2 ч до введения cIL-31 (приблизительное Tmax для Соединения 1 и Apoquel). Собак наблюдали в течение 2 ч после введения cIL-31, и было зафиксировано время, когда у животных появлялся зуд. В этом исследовании соединение 1 значительно подавляло зуд, вызванный cIL-31; величина была подобна Apoquel. Во втором исследовании с использованием рандомизированного, не-слепого перекрестного исследования были оценены несколько доз соединения 1 (0,5, 0,1 и 0,05 мг/кг массы тела); лечение Apoquel и плацебо также были включены. Соединение 1 значительно подавляло зуд в дозе 0,5 мг/кг массы тела, но не в дозах 0,1 и 0,5 мг/кг массы тела. Величина эффекта была одинаковой между 0,5 мг/кг Соединения 1 и Apoquel. См. фиг. 1A и 1B.
Ссылки
Zhang Q., P. Putheti, Q. Zhou, Q. Liu, W. Gao. Structures and biological functions of IL-31 and IL-31 receptors. Cytokine & Growth Factor Reviews 19 (2008) 347-356.
Gonzales, A., W.R. Humphrey, J.E. Messamore, T.J. Fleck, G.J. Fici, J.A. Shelly, J.F. Teel, G.F. Bammert, S.A. Dunham, TE. Fuller and R.B. McCall. Interleukin-31: its role in canine pruritus and naturally occurring canine atopic dermatitis. Vet Dermatol 2013; 24: 48-e12.
Gonzales, A, T.J. Fleck, W.R. Humphrey, B. A. Galvan, M.M. Aleo, S.P. Mahabir, J.-K. Tena, K.G. Greenwood and R.B. McCall. IL-31-induced pruritus in dogs: a novel experimental model to evaluate nti-pruritic effects of canine therapeutics. Vet Dermatol 2016; 27: 34-e10.
Клиническая оценка: соединение оценивали в слепом и рандомизированном экспериментальной проверке концепции у собак с диагнозом атопический дерматит. Целью данного исследования является оценка эффективности и переносимости соединения против атопического дерматита у собак, принадлежащих клиенту. Соединение вводили в двух дозах и сравнивали с контролем плацебо. Собакам вводили перорально два раза в день в течение до 14 дней, затем один раз в день в течение до 28 дней, и оценивали на наличие зуда и кожных поражений с использованием инструментов оценки баллов, по визуально-аналоговой шкале зуда (PVAS) и по индексу степени и тяжести атопического дерматита у собак (CADESI-4), соответственно.
CADESI-4 представляет собой шкалу тяжести, используемую для оценки поражений кожи в клинических испытаниях лечения собак с атопическим дерматитом (АД). Три типа поражения (эритема, лихенификация и алопеция/экскориация) оценивали от 0 до 3 в каждом из 20 участков тела, при максимальном балле 180, с предлагаемыми критериями оценки для легких, умеренных и тяжелых поражений кожи при АД 10, 35 и 60, соответственно. PVAS представляет собой визуальную аналоговую шкалу, которая содержит признаки как зуда, так и поведения, связанного с зудом. Это обычно используется для определения тяжести зуда в клинических испытаниях для лечения собак с АД.
CADESI-4: Thierry, O., Manolis, S., Nuttall, T., Bensignor, E., Griffin, C., Hill, P., for the International Committee on Allergic Diseases of Animals (ICADA). Validation of the Canine Atopic Dermatitis Extent and Severity Index (CADESI)-4, a simplified severity scale for assessing skin lesions of atopic dermatitis in dogs. Vet, Dermatol. 25:77-e25, 2014
PVAS: Hill, P.B., Lau, P., and Rybnicek, J. Development of an owner-assessed scale to measure the severity of pruritus in dogs. Vet. Dermatol. 18:301-308, 2007.