Взаимоотношения ферментов нейтрофилов и их ингибиторов в патогенезе острого респираторного дистресс-синдрома на фоне гриппозной пневмонии

Медицинская иммунология 2012, Т. 14, № 3, стр. 227-232 © 2012, СПб РО РААКИ

Краткие сообщения

ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ НЕЙТРОФИЛОВ И их ИНГИБИТОРОВ В ПАТОГЕНЕЗЕ ОСТРОГО РЕСПИРАТОРНОГО ДИСТРЕСС-СИНДРОМА НА ФОНЕ

гриппозной пневмонии

Пруткина Е.В., Цыбиков Н.Н., Исакова Н.В., Сепп А.В.

ГБОУ ВПО «Читинская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ, г. Чита

Резюме. У 52 больных различными формами гриппа A/H1N1, у 16 из которых развился респираторный дистресс-синдром, в плазме крови определяли содержание ферментов нейтрофилов: эластазы, миелопероксидазы (МРО), ММР-2; и их локальных ингибиторов — белка клеток Клара (CC16) и HSP-70. Показано, что при неосложненном гриппе уровень эластазы и МРО увеличивается, а ММР-2 не изменяется на фоне роста содержания HSP-70 и неизменного количества СС16. При развитии пневмонии, по сравнению с неосложненным гриппом, концентрация эластазы и МРО увеличивается, а ММР-2 уменьшается на фоне неизменного количества CC16 и HSP-70. При формировании дистресс-синдрома резко снижается содержание CC16, количество остальных веществ остается на уровне пациентов с пневмонией. Было доказано, что одним из механизмов формирования пневмонии является повышение концентрации нейтрофильной эластазы и МРО с формированием относительного дефицита CC16 и уменьшением ММР-2; снижение концентрации CC16 может служить одним из предикторов развития острого респираторного дистресс-синдрома.

Ключевые слова: ферменты нейтрофилов, белок клеток Клара, HSP-70, дистресс-синдром, грипп A/H1N1.

Prutkina E. V., Tsybikov N.N., Isakova N.V., Sepp A.V.

INTERRELATIONS BETWEEN NEUTROPHIL ENZYMES AND THEIR INHIBITORS IN PATHOGENESIS OF ACuTE RESpIRATORY Distress Syndrome Associated With influenza pneumonia

Abstract. Amounts of several neutrophil enzymes (elastase, myeloperoxidase (MPO), MMP-2) and their local inhibitors, i.e., Clara cell protein (CC16) and HSP-70, have been determined in blood plasma from fifty-two patients with various forms of influenza A/H1N1. Sixteen patients have developed acute respiratory distress syndrome (ARDS). In cases of uncomplicated influenza, elastase and MPO levels were shown to be increased, while MMP-2 levels did not change, along with higher contents of HSP-70 and unchanged CC16 amounts. Upon development of influenza-associated pneumonia, elastase and MPO concentrations became elevated, whereas MMP-2 levels were decreased, along with unchanged amounts of CC16 and HSP-70. In cases of ARDS development, CC16 amounts exhibited a sharp decrease. Meanwhile, contents of other proteins remained at the levels shown for pneumonia patients. It has been shown that increased concentrations

_________________________________________________ of neutrophil elastase and MPO with a relative CC16

Адрес для переписки: deficiency and decreased MMP-2 may represent a

Пруткина Елена Владимировна, mechanism of pneumonia development. Decreased

Читинская медицинская академия, кафедра CC16 concentration may serve as a risk predictor of

патофизиологии ARDS development. (Med. Immunol., 2012, vol. 14,

672090, г. Чита, ул. Горького, 39а. N3, pp 227-232)

Тел.: (3022) 32-18-59.

Факс: (3022) 32-30-58. Keywords: neutrophil enzymes, Clara cell protein, HSP-70, acute

E-mail: lenap75@mail.ru respiratory distress syndrome, influenza A/H1N1.

227

Пруткина Е.В. и др.

Медицинская Иммунология

Одной из проблем современной медицины является острый респираторный дистресс-синдром (ОРДС). До сих пор не решены многие вопросы его этиологии и патогенеза, что ведет к разногласиям в классификации, трудностям в диагностике и лечении. Наиболее частой «легочной» причиной развития синдрома является пневмония неаспирационного генеза. В настоящее время до конца неясно, почему в одних случаях воздействие патогена ограничивается развитием пневмонии, в других — сопровождается повреждением альвеолярно-капиллярной мембраны с развитием некардиогенного отека легких, т.е. ОРДС [7, 9]. Прояснить эту проблему может детальное изучение особенностей взаимодействий ферментов нейтрофилов и их ингибиторов как основы процессов повреждения и воспаления легких.

Одним из ключевых звеньев развития ОРДС является системная воспалительная реакция с избыточной адгезией полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) в легочных капиллярах [7], что сопровождается феноменом их гиперактивации. При последнем происходит нерегулируемое высвобождение микробицидных соединений не в фагосому, а в экстраклеточное пространство. Наибольшую опасность для тканей хозяина представляет мобилизация азурофильных гранул, ферменты которых (миелопероксидаза, эластаза, металлопротеиназы и др.) являются аутоагрессивными [1, 3, 6]. В свою очередь, эласта-за способна активировать семейство матриксных металлопротеиназ (ММР), которые выделяются лейкоцитами, фибробластами в интерстиций в неактивной форме с последующим формированием местного «протеазного взрыва» [1, 12]. Избыточный протеолиз компенсируется ингибиторами: а:-антитрипсином, а2-макроглобулином, антитромбином III и другими плазменными белками [1], динамика которых при развитии ОРДС достаточно изучена [9]. На наш взгляд, при этом упускаются из внимания взаимоотношения между агрессивными энзимами нейтрофилов и их локальными ингибиторами, составляющими «первую линию обороны», активность которых определяет: произойдет ли повреждение аэроге-матического барьера.

В легких уникальным источником биологически активных веществ (БАВ) с противовоспалительным эффектом являются секреторные бронхиолярные клетки (клетки Клара). Белковый компонент их секрета — белок клеток Клара (CC16) — обладает антипротеазной активностью, особенно по отношению к эластазе нейтрофилов, трипсину; ингибирует фосфолипазу А2 и фактор активации тромбоцитов; подавляет продукцию IFNy, модулирует синтез сурфактанта, его гидро-

фобный сайт способен связывать фосфолипиды, ксенобиотики [2, 11].

В фокусе воспаления различные клетки (легких, форменные элементы крови) для противостояния токсинам микроорганизмов, действию цитокинов, оксидативному стрессу активируют самозащитный стресс-ответ, ключевым механизмом которого является накопление индуци-бельного белка теплового шока HSP-70. Ранее HSP-70 считался типичным внутриклеточным протеином, однако, в последнее время доказано его существование в экстрацелюллярной среде: он выделяется путем экзоцитоза, а также высвобождается из некротизированных клеток. Защитные эффекты HSP-70 обеспечиваются шапе-ронной активностью, способностью к фолдингу белков, активацией антиоксидантной защиты, ограничением гиперпродукции оксида азота, антиапоптическими и иммуномодулирующими свойствами [4, 5]. На экспериментальной модели сепсис-индуцированного ОРДС показано: дополнительное введение животным HSP-70 приводит к уменьшению выработки провоспалительных цитокинов, препятствует активации нейтрофилов и подавляет их миграцию в легочную ткань [13].

В Забайкальском крае эпидемия гриппа A/H1N1 2009-10 гг. была расценена Роспотребнадзором как тяжелая (третья) степень развития пандемии [8]. В крае было зарегистрировано 57 летальных исходов от гриппа A/H1N1 (летальность составила 6,8%) [10]. В этот период подавляющее большинство пациентов стационаров составляли больные пневмониями, отмечалось необычно частое развитие ОРДС. Во время эпидемии появилась уникальная возможность последовательно проследить взаимодействия ферментов нейтрофилов и их ингибиторов на всех этапах развития заболевания: от неосложненного гриппа — к пневмонии, вплоть до ОРДС, что явилось целью нашей работы.

Материалы и методы

В исследование были включены 52 больных, находившихся на лечении в стационарах г. Читы во время эпидемии гриппа 2009-10 гг., обоего пола, в возрасте от 19 до 40 лет. Диагноз пандемического гриппа A/H1N1 был верифицирован путем обнаружения вируса в назофарингиаль-ных мазках (методом полимеразной цепной реакции) либо в случае нарастания в сыворотке крови антител к его антигенам. Основную группу составили больные гриппом, осложненным тяжелой пневмонией, приведшей к развитию ОРДС I-II стадий (n = 16). ОРДС диагностировали в соответствии с критериями, рекомендован-

228

2012, Т. 14, № 3

Ферменты нейтрофилов при респираторном дистресс-синдроме

ными Американо-Европейской Согласительной Конференцией, его стадии выделяли по клинической классификации, являющейся модифицированной методикой J.F. Murray [7]. У 14 из 16 больных группы наступил летальный исход от нарастающей острой дыхательной недостаточности. У всех умерших диагноз дистресс-синдрома был подтвержден морфологическим исследованием. По результатам аутопсий в 75% случаев он развился на фоне вирусной пневмонии, а в 24,5% — вирусно-бактериальной, наиболее частой причиной ко-инфекции был Staphylococcus aureus. Для сравнения исследовались: 2-ая группа — больные гриппом тяжелого течения в форме трахеобронхита без осложнений (n = 16); 3-ая — больные гриппом, осложненным внебольничной полисегментарной пневмонией средней степени тяжести (n = 20). В качестве контроля использовалась кровь доноров соответствующего возраста (n = 16).

Объектом исследования служила плазма крови, которая забиралась на 2-5 сутки болезни. Концентрации исследуемых веществ определяли методом иммуноферментного анализа фирменными наборами по протоколам производителей: эластазы и миелопероксидазы (МРО) — «Hycult

biotech», Нидерланды; MMP-2 — «Quantikine», США; СС16 — «BioVender», Чехия; индуцибель-ного HSP-70 — «Assay Designs», США.

Статистическая обработка проведена с использованием пакета программ BIOSTAT. При сравнении групп использовался критерий Манна—Уитни, различия считали значимыми при р < 0,05. Данные представлены в виде медианы (Ме) и интерквартильного (25-й и 75-й персен-тили) интервала — указан в скобках.

Результаты и обсуждение

В группах больных динамика концентраций аутоагрессивных лейкоцитарных БАВ имела отличия: изменения эластазы и МРО были схожими, а MMP-2 носили иной характер (табл. 1). Уровень нейтрофильной эластазы при всех формах гриппа A/H1N1 был значительно выше, чем у здоровых лиц. У пациентов с неосложненным гриппом он увеличивался почти вдвое (р = 0,002), а у больных пневмонией средней степени тяжести и при развитии ОРДС — в 4 раза (в обоих случаях р = 0,000). При этом формирование ОРДС не сопровождалось дополнительным ростом концентрации эластазы (р = 0,81). Содержание

таблица 1. уровень ферментов нейтрофилов при различных формах гриппа A/H1N1

Фермент Здоровые

Эластаза (нг/мл) 57,8 (16,0; 66,5) 99,9 (79,2; 134,9) Z = 3,1; р = 0,002* 206,1 (119,3; 265,4) Z = 3,8; р = 0,000* Z = 2,6; р1 = 0,008* 199,4 (137,7; 271,9) Z = 3,8; р = 0,000* Z = 2,8; р1 = 0,004* Z = 0,2; р2 = 0,81

МРО (нг/мл) 71,1 (66,7; 80,3) 84,8 (79,8; 92,9) Z = 2,9; р = 0,004* 102,7 (92,2; 142,3) Z = 3,9; р = 0,000* Z = 2,4; р1 = 0,01* 111,9 (78,4; 122,6) Z = 3,2; р = 0,002* Z = 1,9; р1 = 0,05* Z = 0,4; р2 = 0,68

ММР-2 (нг/мл) 190,0 (184,9; 198,1) 196,4 (147,1; 257,4) Z = 0,3; р = 0,75 152,4 (138; 177,4) Z = 2,6; р = 0,01* Z = 1,6; р1 = 0,11 162,9 (140,2; 195,9) Z = 2,0; р = 0,044* Z = 1,2; р1 = 0,27 Z = 1,1; р2 = 0,29

Примечание. р - значение различий по сравнению со здоровыми;

р, - значение различий по сравнению с больными неосложненным гриппом;

р2 - значение различий по сравнению с больными пневмонией средней степени тяжести;

Z - коэффициент Манна-Уитни; * - значимые различия.

229

Пруткина Е.В. и др.

Медицинская Иммунология

таблица 2. уровень ингибиторов ферментов нейтрофилов при различных формах гриппа a/hini

Ингибитор Здоровые

CC16 (нг/мл) 18,2 (15,7; 20,4) 19,3 (15,7; 26,8) Z = 0,6; р = 0,55 20,2 (16,5; 21,6) Z = 1,0; р = 0,28 Z = 0,1; р1 = 0,9 8,5 (6,6; 11,8) Z = 4,7; р = 0,000* Z = 4,1; р1 = 0,000* Z = 5,0; р2 = 0,000*

HSP-70 индуцибельный (нг/мл) 0,13 (0,1; 0,5) 0,85 (0,4; 0,9) Z = 2,9; р = 0,004* 0,88 (0,7; 0,9) Z = 3,4; р = 0,000* Z = 0,3; р1 = 0,75 0,82 (0,5; 1,3) Z = 2,8; р = 0,004* Z = 1,2; р1 = 0,21 Z = 0,5; р2 = 0,60

Примечание. р - значение различий по сравнению со здоровыми;

р, - значение различий по сравнению с больными неосложненным гриппом;

р2 - значение различий по сравнению с больными пневмонией средней степени тяжести;

Z - коэффициент Манна-Уитни; * - значимые различия.

МРО в плазме крови также увеличивалось в ряду: здоровые — больные неосложненным гриппом (р = 0,004) — пациенты с пневмонией (р = 0,01), а при развитии ОРДС оно оставалось таким же, как и у больных пневмонией средней степени тяжести (р = 0,68). При этом степень роста концентрации МРО была меньшей, чем эласта-зы: не превышала 50% от содержания фермента у здоровых.

Количество ММР-2 у пациентов с неосложненным гриппом оставалось таким же, как у здоровых лиц (р = 0,75), при присоединении пневмонии (р = 0,01), а также при развитии ОРДС (р = 0,044) оно уменьшалось. Разницы уровней металлопротеиназы в плазме больных пневмонией средней степени тяжести и у пациентов с ОРДС не наблюдалось (р = 0,29).

При параллельном изучении содержания CC16 в плазме крови обнаружено: у пациентов с неосложненной гриппозной инфекцией и больных пневмонией средней степени тяжести оно оставалось на уровне показателей здоровых лиц (р = 0,55 и р = 0,28 соответственно) (табл. 2). При развитии на фоне тяжелой пневмонии ОРДС количество CC16 резко снижалось по сравнению не только со здоровыми, но и страдающими другими формами гриппа (при всех сравнениях р = 0,000). Уровень инду-цибельного HSP-70 во всех группах больных был значительно выше (в 6-7 раз), чем у здоровых, но между пациентами c различными формами

вирусной инфекции разницы в содержании протеина не зафиксировано.

Нейтрофильные лейкоциты являются первым эшелоном защиты организма от инфекции трансформированных или поврежденных клеток. Увеличенная адгезия нейтрофилов, ведущая к их гиперактивации, приводит к высвобождению биологически активных соединений во внеклеточное пространство [3, 6], поэтому мы видим рост их концентрации в плазме крови.

При неосложненном гриппе повышение уровня эластазы и МРО уравновешивается, в том числе эффектами CC16 в концентрациях, не отличающихся от содержания у здоровых лиц, а также активацией синтеза индуцибельного HSP-70. По всей видимости, одним из механизмов развития пневмонии на фоне гриппозной инфекции является повышение содержания агрессивных лейкоцитарных ферментов (при ней уровень эластазы и МРО выше, чем при неосложненном гриппе), вследствие чего формируется относительная недостаточность локальных ингибиторных систем, в том числе CC16 и HSP-70.

Избыточное скопление ПМЯЛ в легочных капиллярах и паренхиме, наблюдаемое при ОРДС [7], приводит не только к уничтожению возбудителей инфекции (в нашем случае вируса A/H1N1), оно может повредить компоненты сурфактанта, базальной мембраны альвеол, эндотелиоцитов. Нарушение целостности альвеолярно-капиллярной мембраны при ОРДС на фоне пневмонии происходит не за счет прироста концентраций

230

2012, Т. 14, № 3

Ферменты нейтрофилов при респираторном дистресс-синдроме

эластазы и МРО, а вследствие локального уменьшения содержания CC16 и его защитных свойств, эффектов с участием продолжающего выделяться HSP-70 в этом случае уже недостаточно.

Необычная динамика содержания ММР-2 при изучаемых процессах, на наш взгляд, объяснима следующими фактами. Несмотря на то, что ММР-2 называют нейтрофильной желатиназой, в ряде исследований установлено, что она прежде всего экспрессируется фибробластами в период активной регенерации ткани [12, 15]. Основным субстратом этого фермента является коллаген базальных мембран (IV типа), с интерстициальным коллагеном он не взаимодействует. Есть данные, что ММР-2 активирует трансформирующий фактор роста р (TGF-P), высвобождая его из матрикса [15], кроме того, инактивирует важнейший провоспалительный цитокин IL-1 в [14]. В связи с этим ММР-2 нельзя однозначно отнести к повреждающим БАВ, так как она способна в очаге воспаления оказывать значимые протективные эффекты. ММР-2 может препятствовать адгезии ПМЯЛ к эндотелию и их гиперактивации (нивелируются свойства IL-1P), а также опосредованно привлекать в очаг моноциты крови (TGF-P является их хемоаттрактантом). Уменьшение количества ММР-2, обнаруженное нами, вероятно, является одним из механизмов развития осложнений гриппа, так как способствует нарушению смены субпопуляций лейкоцитов в очаге воспаления легочной паренхимы: нейтрофилы кумулируются, а миграция макрофагов тормозится. В итоге в локусе воспаления становится невозможной полноценная регенерация поврежденных структур.

Заключение

Одним из механизмов формирования пневмонии при гриппе является повышение уровня ней-трофильной эластазы и МРО, с возникновением относительного дефицита белка клеток Клара; а также уменьшение концентрации ММР-2. Снижение содержания CC16 в плазме крови — важнейшее звено развития ОРДС при тяжелых формах гриппозной пневмонии — может служить одним из предикторов развития синдрома.

Список литературы

1. Аверьянов А.В., Поливанова А.Э. Нейтро-фильная эластаза и болезни органов дыхания // Пульмонология. — 2006. — № 5. — С. 74-79.

2. Боркина А.Н. Роль клеток Клара в гистофизиологии бронхиолярного эпителия и их зна-

чение в развитии легочной патологии // Пульмонология. — 2007. — № 5. — С. 94-99.

3. Галкин А.А., Демидова В.С. Роль адгезии в активации нейтрофилов и цитотоксическом взаимодействии нейтрофилов с эндотелием // Успехи современной биологии. — 2011. — Т. 131, № 1. - С. 62-78.

4. Евдонин А.Л., Медведева Н.Д. Внеклеточный белок теплового шока 70 и его функции // Цитология. - 2009. - Т. 51, № 2. - С. 130-137.

5. Малайцев В.В., Богданова И.М., Макарова О.В. Белки теплового шока и их роль в развитии патологических процессов // Архив патологии. - 2008. - Т. 80, № 6. - С. 31-38.

6. Мальцева В.Н., Сафронова В.Г. Неоднозначность роли нейтрофила в генезе опухоли // Цитология. - 2009. - Т. 51, № 6. - С. 467-474.

7. Мороз В.В., Власенко А.В., Голубев А.М., Яковлев В.Н., Алексеев В.Г., Булатов Н.Н., Смелая Т.В. Дифференцированное лечение острого респираторного дистресс-синдрома, обусловленного прямыми и непрямыми этиологическими факторами // Общая реаниматология. - 2011. -Т. VII, № 4. - С. 5-15.

8. Об усилении мероприятий в группах риска в период пандемического распространения гриппа. Письмо Роспотребнадзора № 01/16326-9-23 от 01.11.2009.

9. Павлов К.А., Дубова Е.А., Мишнев О.Д., Щеголев А.И. Медиаторные взаимодействия при остром респираторном дистресс-синдроме // Общая реаниматология. - 2007. - Т. III, № 5-6. -С. 208-212.

10. Родина Н.Н., Скрипченко Е.М., Дорож-кова А.А. Клинико-эпидемиологическая характеристика гриппа A (H1N1)/09 // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Итоги эпидемии гриппа А/НШ1». - Чита, 2010. - С. 65-167.

11. Романова Л.К., Горячкина В.Л. Цитофизиология секреторных бронхиолярных клеток легкого - источника «антимедиаторов» воспаления // Архив патологии. - 1999. - Т. 61, № 2. -С. 20-27.

12. Шойхет Я.Н., Кореновский Ю.В., Мо-тин Ю.Г., Лепилов А.В., Лель Н.В. Роль матрикс-ных металлопротеиназ при воспалительных заболеваниях легких // Проблемы клинической медицины. - 2008. - № 3 (15). - С. 99-101.

13. Bromberg Z., Raj N., Goloubinoff P, Deutschman C.S., Weiss Y.G. Enhanced expression of 70-kilidalton heat shock protein limits cell division

231

Пруткина Е.В. и др.

Медицинская Иммунология

in a sepsis-induced model of acute respiratory distress syndrome // Crit. Care Med. — 2008. — Vol. 36 (1). — P. 246-255.

14. Hiller O. Matrix metalloproteinases collagenase-2, macrophage elastase, collagenase-3 and membrane type 1-matrix metalloproteinase impair clotting by degradation of fibrinogen and factor XII // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275. -P. 8-13.

15. Mohammed F.F., Smookler D., Khokha R. Metalloproteinases, inflammation and rheumatoid arthritis // Ann. Rheum. Dis. — 2003. — Vol. 62, Suppl. (II). - P. 1143-1147.

поступила в редакцию 16.01.2012 отправлена на доработку 29.01.2012 принята к печати 02.02.2012

232