Экспрессия белков — маркеров фунциональной активности эндометрия при нормальной и неразвивающейся беременности

ЭКСПРЕССИЯ БЕЛКОВ - МАРКЕРОВ ФУНЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЭНДОМЕТРИЯ ПРИ НОРМАЛЬНОЙ И НЕРАЗВИВАЮЩЕЙСЯ БЕРЕМЕННОСТИ

М.Н. Болтовская, С.В. Назимова, Н.А. Старосветская, Т.В. Фокина, А.П. Милованов

НИИ морфологии человека РАМН ул. Цюрупы, 3, Москва, Россия, 117418

Проведено количественное определение эндометриальных белков, гистологическое и имму-ногистохимическое с использованием моноклональных антител против цитокератина, гликодели-на, IGFBP-1 исследование соскобов из полости матки, полученных от 47 здоровых женщин, пожелавших прервать беременность в сроках 6—10 нед. после оплодотворения, и 44 женщин с неразвивающейся беременностью, обусловленной эндокринными нарушениями. При неразвивающейся беременности выделены два обособленных патогенетических типа реакции эндометрия: 1) ретардация желез с резким падением продукции гликоделина, основного локального иммуносупрессора, при гипоэстрогении; 2) неполная децидуализация с задержкой дифференцировки стромальных клеток на стадиях предецидуальных и IGFBP-1-продуцирующих децидуальных клеток, ограничивающих миграцию и инвазию цитотрофобласта, при дефиците прогестерона. Каждый данный клинический и морфологический тип эндокринных нарушений при неразвивающейся беременности требует индивидуального подхода к обследованию и терапии пациенток.

Среди ранних репродуктивных потерь доминирующее значение имеют спонтанные аборты и несостоявшиеся выкидыши (неразвивающаяся беременность), суммарная частота которых достигает 10—15% всех беременностей; ежечасно в мире происходит около 114 подобных эпизодов [3, 6]. Причины неразвивающейся беременности (НБ) многообразны (генетические, инфекционные, иммунологические факторы), но чаще всего у пациенток обнаруживают эндокринные нарушения, составляющие около 35% этиологических факторов НБ. Структурно-функциональные механизмы возникновения НБ до сих пор точно не установлены.

Развитие ранних этапов беременности (имплантация и плацентация) осуществляется путем тесного взаимодействия между погружающейся бластоцистой, а затем хориальным мешком с окружающим цитотрофобластическим щитом и де-цидуализированным эндометрием, т.е. сопряжением процессов цитотрофобласти-ческой инвазии (ЦТИ) и гравидарной перестройки стромального и железистого компонентов эндометрия. Прогестеронзависимый процесс децидуализации компактного и спонгиозного слоев эндометрия подробно описан в ряде работ [2, 5], однако остается неясным роль децидуальных клеток в регуляции цитотрофобла-стической инвазии. Не оценив взаимодействия фенотипически различных деци-дуальных клеток (ДК) и инвазирующего цитотрофобласта при нормальной беременности, трудно расшифровать механизмы ранних репродуктивных потерь, в частности, НБ эндокринного генеза.

Цель данного исследования — оценить функциональную активность децидуальных клеток и эпителиоцитов желез в динамике ЦТИ в I триместре неослож-ненной беременности, а также их роль в патогенезе НБ эндокринной природы

с помощью количественного определения эндометриальных белков в гомогена-тах ткани и иммуногистохимической визуализации клеток-продуцентов в соско-бах эндометрия. Основными секреторными продуктами ДК и эпителия желез являются, соответственно, белки IGFBP1 (белок, связывающий инсулиноподобные факторы роста, антигенно идентичный плацентарному альфа1-микроглобулину, ПАМГ) и гликоделин (альфа2-микроглобулин фертильности, АМГФ), обладающий мощной иммуносупрессорной активностью [1].

Собран кюретажный материал от 47 женщин (22—27 лет) без соматических, в том числе эндокринных заболеваний, пожелавших прервать беременность в сроках 6—10 нед. До аборта проводили ультразвуковое исследование матки для уточнения гестационного срока после оплодотворения по копчиково-теменному размеру эмбриона. Группу патологии составили 44 женщины (25—35 лет) с НБ, обусловленной эндокринными нарушениями при исключении других причин. Для количественного определения эндометриальных белков фрагменты эндометрия гомогенизировали в физиологическом растворе (1 : 1 вес/объем) и проводили твердофазный иммуноферментный анализ с использованием оригинальных мо-ноклональных антител, полученных в ГУ НИИ морфологии человека РАМН [1]. Для иммуногистохимического исследования из соскобов выбирали фрагменты эндометрия, фиксировали в 10% формалине, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 5—7 мкм. Визуализацию клеток-продуцентов выполняли на депарафи-нированных срезах непрямым иммунопероксидазным методом. Для идентификации интерстициального цитотрофобласта (ЦТ) использовали первичные мышиные моноклональные антитела против цитокератина-8 (Novocastra, клон CKT-TS1, ready to use); для определения фенотипа ДК — оригинальные моноклональные антитела против IGFBP-1 (НИИ МЧ РАМН, клон ПВ-4, культуральный суперна-тант, разведение 1 : 600); для эпителия желез — против гликоделина (НИИ МЧ РАМН, клон A4f8, культуральный супернатант, разведение 1 : 400). Для проявления реакции использовали систему детекции UltraVision TL-015-HD (LabVision), срезы докрашивали гематоксилином Майера. Контроль иммуноокрашивания осуществляли замещением первичных антител 0,1% раствором лошадиного сывороточного альбумина и исключением вторичных антител. Микропрепараты просматривали в микроскопе «Ortoplan Leica». Уровень экспрессии маркеров оценивали полуколичественным способом в баллах/плюсах: 0 (-) — отрицательная реакция, 1 (+) — небольшое, 2 (++) — умеренное, 3 (+++) — большое количество маркер-позитивных клеток. Статистическую обработку данных проводили в программе «Sigma Stat 3.5» с применением параметрического теста (t-критерий Стьюдента*) и рангового дисперсионного анализа Краскалла-Уоллеса (**). Результаты выражали как среднее ± стандартное отклонение. Различия считали достоверными при пороговом уровне достоверности при р* < 0,05 и р** < 0,001.

В динамике физиологической беременности (ФБ) отмечены возрастающие темпы децидуализации стромы при одновременной структурной регрессии железистого компонента. Начало первой волны ЦТИ (6 нед.) протекало на фоне отсутствия IGFBP-1-положительных ДК промежуточного типа в маточно-плацентар-

ной области (МПО) и присутствии единичных ЮFBP-1-шложительных ДК в париетальной эндометрии, что соответствовало низкой концентрации этого белка (89,5 ± 14,8 нг/мл) в гомогенатах ткани. Большинство желез париетального эндометрия продуцировали гликоделин, в железах МПО гликоделин экспрессировался в отдельных железах; концентрация белка в гомогенатах ткани была максимальной для исследованных сроков ФБ (184,6 ± 22,2 мкг/мл). На 7-й нед. сохранялась высокая активность ЦТИ, однако в периферических зонах миграции появлялись двух и многоядерные «тупиковые» формы ЦТ. В микроокружении ЦТ увеличивалось количество IGFBP-1-продуцирующих ДК (15—20% ДК промежуточного типа). Экспрессия гликоделина в эпителиоцитах желез снижалась, концентрация белка в гомогенатах эндометрия уменьшалась вдвое. Восьмая неделя характеризовалась продолжением ЦТИ как за счет интерстициального, так и внутрисосудисто-го компонентов. В этом сроке была документирована глубокая инвазия ЦТ, проникающего в спонгиозный слой эндометрия, количество многоядерных элементов ЦТ увеличивалось. Вместе с тем наблюдалось ограничение ЦТИ, связанное с приростом IGFBP-1-положительных ДК в париетальном и базальном эндометрии, что соответствовало дальнейшему увеличению концентрации этого белка в ткани. В МПО появлялись терминально дифференцированные ДК эпителиоидного типа, не экспрессирующие IGFBP-1. В конце I триместра (9—10 нед.) первая волна ЦТИ завершалась, о чем свидетельствовало уменьшение плотности и глубины распространения интерстициального ЦТ, уменьшение внутрисосудистого компонента, появление большого количества многоядерных гигантских клеток — тупиковых форм ЦТ. В компактном слое вокруг спиральных артерий преобладали ДК эпите-лиоидного типа. В париетальном и базальном эндометрии доля IGFBP-1-проду-цирующих ДК, достигала максимума, что отражалось в высокой тканевой концентрации белка (297,8 ± 73,9 нг/мл). В МПО IGFBP-1-негативные ДК промежуточного типа выявлялись в участках продолжающейся инвазии, в соседних зонах, где отсутствовала активная миграция интерстициального и внутрисосудистого ЦТ, располагались IGFBP-1-положительные ДК.

Таким образом, исследование точно датированной структурно-функциональной гравидарной перестройки эндометрия в сопоставлении с темпами и глубиной миграции ЦТ выявило фенотипические особенности ДК (IGFBP-1-продуцирующие ДК промежуточного типа), участвующих в регуляции I волны ЦТИ, и морфологически подтвердило роль IGFBP-1 как естественного «ограничителя» активности ЦТ. Пока неясной остается функциональная роль ДК эпителиоидного типа, составляющих большинство клеток децидуализированного эндометрия. По предварительным данным наших исследований, часть из них продуцирует пролактин, начиная с 7-й нед. и до 10-й нед. ФБ.

Клинико-морфологический и иммуногистохимический анализ материала со-скобов из полости матки при НБ позволил выделить два типа реакций эндометрия, обусловленных эндокринными причинами: ретардация желез с резким падением продукции гликоделина на фоне гипоэстрогении (А тип эндокринопатии) и незавершенная децидуализация стромы с накоплением IGFBP-1-продуцирующих ДК промежуточного типа при дефиците прогестинов (В тип эндокринопатии).

При эндокринопатии А типа в соскобах преобладала мозаичная патология спонгиозного слоя эндометрия. В одних участках были видны редко расположенные железы цилиндрической формы, с высокими эпителиоцитами и локализацией их ядер вблизи базального слоя. Просветы желез были узкими, без внутренних выростов и скудным количеством секрета, что характерно для строения желез в ранней секреторной фазе менструального цикла. Рядом с ними присутствовали резко расширенные железы с атрофичным эпителием, формирующие сетчатые структуры из-за слабого развития стромы межжелезистых перегородок. Компактный слой был истончен и состоял из рыхло расположенных деци-дуальных клеток промежуточного типа. Иммуногистохимическое исследование эндометрия выявило резкое снижение продукции эпителиоцитами основного секреторного эндометриального белка — гликоделина, который отсутствовал в большинстве желез и выявлялся лишь в отдельных эпителиальных клетках в отличие от его выраженной экспрессии в железах при ФБ. Тканевая концентрация гликоделина уменьшалась почти в два раза по сравнению с нормой. Среди дециду-альных клеток компактного слоя париетального эндометрия и МПО были обнаружены единичные IGFBP-1-положительные клетки, что проявилось в снижении тканевого уровня белка по сравнению с нормой (167,5 ± 36,3 нг/мл и 197,3 ± ± 50,5 нг/мл, соответственно. ЦТИ становилась менее выраженной, чем при ФБ. Таким образом, уменьшение числа эндометриальных желез, сохранение среди них участков с узкими, цилиндрическими формами и, напротив, с микрокистозной их перестройкой, а также снижение экспрессии гликоделина в эпителиоцитах свидетельствует о том, что ретардация железистого компонента эндометрия уходит своими корнями в недостаточность пролиферативной фазы цикла. Под влиянием дефицита эстрогена, слабо продуцируемого созревающими фолликулами в яичниках, снижается количество рецепторов к эстрогену и прогестерону, задерживается формирование основного массива желез спонгиозного слоя. Не препятствуя оплодотворению и имплантации бластоцисты, эти изменения желез приводят к снижению концентрации гликоделина, который в норме создает оптимальное микроокружение для развивающегося эмбриона и экстраэмбриональных структур, предотвращающее иммунную атаку со стороны материнского организма. Очевидно, дефицит гликоделина является главным патогенетическим механизмом возникновения данного типа НБ. Если судить по биоптатам эндометрия, полученным в межгравидарном периоде у пациенток с НБ в анамнезе, то ретардация железистого компонента эндометрия более всего похожа на аберрантную (искаженную) форму недостаточности пролиферативной фазы цикла [7]. Данный тип эндокринопатии возникает вследствие гипопродукции фолликулостимулирующего гормона, дефицита эстрогена и его рецепторов в пролиферативной фазе цикла, приводящих к последующему уменьшению синтеза рецепторов прогестерона, и проявляется в первые недели беременности. Иными словами, ретардация железистого компонента обусловлена преимущественно нарушением функции ги-поталамо-гипофизарной системы и поэтому требует более тщательного обследования всей эндокринной системы. Морфологическое выявление доминирующей ретардации эндометриальных желез должно ориентировать акушеров-гинеко-

логов на привлечение эндокринологов к системной оценке функции эндокринных органов женщин для коррекции причин данного типа НБ.

При эндокринопатии В типа (изолированная форма прогестероновой недостаточности) гистоструктура эндометрия (париетальная часть и МПО) существенно отличалась от первого типа эндокринопатий и группы ФБ. Так, при относительной сохранности спонгиозного слоя отмечалась более высокая функциональная активность эндометриальных желез, проявляющаяся в сохранении продукции гли-коделина и большей концентрацией этого белка в ткани по сравнению с первым типом НБ (90,2 ± 14,2 мкг/мл и 76,2 ± 11,4 мкг/мл, соответственно). В компактной части эндометрия преобладали рыхло расположенные предецидуальные и де-цидуальные клетки промежуточного типа, продуцирующие IGFBP-1. Концентрация белка в гомогенатах ткани почти вдвое превышала показатели нормальной беременности (675,6 ± 108,2 нг/мл и 197,3 ± 50,5 нг/мл, соответственно). Следовательно, данный тип эндокринных нарушений матери реализуется в секреторной фазе цикла при явном дефиците прогестерона. В результате происходит задержка инициальной стадии децидуализации — на этапе предецидуальных клеток. Этот процесс продолжается в I триместре беременности, когда к предецидуальным клеткам добавляются ДК промежуточного типа, экспрессирующие IGFBP-1, при минимальном количестве высоко дифференцированных ДК эпителиоидного вида. ЦТИ была ограничен лишь поверхностным слоем МПО. По данным биоптатов эндометрия, полученным в межгравидарном периоде у женщин с НБ, вышеизложенная гистологическая картина соответствовала неполной предецидуальной реакции в поздней секреторной фазе цикла [7]. Дефицит прогестерона является главным, но не единственным механизмом незавершенной децидуализации эндометрия [4]. Незавершенная децидуализация эндометрия инициируется на клеточном уровне, в частности, в лютеиновых клетках бывшего доминирующего фолликула или гравидарного желтого тела яичника, приводя к дефициту прогестерона в крови у женщин с НБ и остановке дифференцировки ДК на стадии малодифференциро-ванных предецидуальных ДК и ДК промежуточного типа, экспрессирующих IGFBP-1, сдерживающих ЦТИ. Из этого следует обоснование основного принципа лечения данного типа эндокринных причин НБ — заместительная терапия прогестероном.

Таким образом, следует подчеркнуть, что заключения по соскобам эндометрии у пациенток с НБ типа «обратное развитие маточной беременности» или «недостаточность гравидарного желтого тела» сейчас являются явно устаревшими, поскольку эти данные уже известны акушерам-гинекологам после УЗИ и не дают новой, полезной информации для выявления патогенетических причин ранней потери беременности. Современный гистологический анализ и иммуногистохими-ческое исследование париетального эндометрия и маточно-плацентарной области в соскобах из полости матки после НБ позволяют конкретизировать ее эндокринные причины и ориентировать клиницистов на целенаправленное гормональное обследование и патогенетически обусловленную терапию раннего невынашивания беременности.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Болтовская М.Н. Роль эндометриальных белков и клеток-продуцентов в репродукции человека: Дисс. ... д-ра биол. наук. — М., 2001.

[2] Глуховец Б.И., Глуховец Н.Г. Патоморфологическая диагностика ранних самопроизвольных выкидышей. — СПб., 1999.

[3] Милованов А.П., Болтовская М.Н., Фокина Т.В. и др. // Арх. патологии. — 2008. — Вып. 6. — С. 22—25.

[4] Сидельникова В.М. Привычная потеря беременности. — М., 2002. — 303 с.

[5] Топчиева О.И., Прянишникова В.А., Жемкова З.П. Биопсии эндометрия. — М., 1978.

[6] Coulam C.B., Stephenson M., Stern J.J. et al. // Early Pregn. — 2000. — Vol. IV. — P. 19—29.

[7] Li T.C., Tuckermann E.M., Laird S.M. // Hum. Reprod. Update. —2002. — Vol. 8. — P. 43—52.

EXPRESSION OF ENDOMETRIAL FUNCTION PROTEIN MARKERS IN NORMAL PREGNANCY AND MISSED ABORTION

M.N. Boltovskaya, S.V. Nazimova, N.A. Starosvetkaya, T.V. Fokina, A.P. Milovanov

Research Institute of Human Morphology, Russian Academy of Medical Sciences Tsurupa str., 3, Moscow, Russia, 117418

Histological and immunohistological studies using monoclonal antibodies against cytokeratin, gly-codelin, IGFBP1 and quantitation of endometrial proteins in tissue were carried out to examine uterine scrapes from 47 healthy women- medical abortions from 6 to 10 weeks of conception and from 44 patients after missed abortion of hormonal genesis. Among them two isolated pathogenetic types were identified: 1) uterine glands retardation accompanied by drastic reduction in the expression of glycodelin, the major local immunosuppressor, in oestrogen deficiency; 2) incomplete decidualization in progesterone deficiency with delayed differentiation of stromal cell at the state predecidual and IGFBP-1-producing decidual cells, thus inhibiting extravillous cytotrophoblast migration and invasion. Each of the given clinical and morphological types of endocrinopathy leading to missed abortion requires that an individual approach be applied to examining and treating these patients.