СПОСОБ ФИКСАЦИИ И ПРИГОТОВЛЕНИЯ ГИСТОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
METHOD FOR FIXING AND PRODUCING HISTOLOGICAL PREPARATIONS

Изобретение относится к медицине, в частности к офтальмологии, и может быть использовано для приготовления гистологических препаратов энуклированного глаза.
Известен способ фиксации и приготовления гистологических препаратов, включающий фиксацию полученного биологического материала в 10%-ном растворе нейтрального формалина, его заливку в парафин, после чего изготавливают срезы на микротоме (см. RU №2446398, МПК G01N 33/48, 2009 г.).
Известны способы фиксации и приготовления гистологических препаратов (биоптатов), включающие:
- использование микрокассет с множеством нумерованных отделений, в каждое из которых укладывается образец. Затем кассету помещают в фиксирующий раствор (Use and rationale of a multicompartment microcassette for site-specific biopsies of the prostate in a consecutive cohort of men / M.E. Laniado, I. McMullen, M.M. Walker, A. Patel // Prostate Cancer and Prostatic Diseases. - 2003. - Vol.6. - P.50-52);
- укладку образца на сгиб бумажного контейнера между двумя слоями бумаги или другого пористого материала с последующим помещением бумажного контейнера в фиксирующий раствор (Усовершенствование методики исследования толстоигольных биоптатов предстательной железы / А.И. Урбанский, А.Б. Маркочев, А.Ю. Плеханов и др. // Архив патологии. - 2005. - №2. - С.50).
Названные способы предназначены для получения микрогистологических препаратов. Часто размеры биоптата очень малы, что вызывает сложности в процессе подготовки микропрепаратов, в частности, на этапе дегидратации тканевых объектов. Проблемы связаны с потерей микропрепарата еще до начала гистологической проводки, так, после фиксации биоптат помещают в марлевые мешочки, через широкие отверстия которых небольшие фрагменты биоптатов выпадают. Во время обезвоживания и обезжиривания биоптаты теряют свою форму, значительно уменьшаясь в размерах, сморщиваясь и распадаясь на отдельные клетки, что приводит к невозможности постановки диагноза или ложному диагнозу, то есть неинформативности столь малого по размерам биоптата.
Наиболее близким к предлагаемому решению является способ фиксации и приготовления гистологических препаратов энуклированного глаза, включающий взятие материала и его фиксацию в жидкости, обезвоживание и заливку в парафин, приготовление срезов (см. «Гистология», авторы Елисеев В.Г., Афанасьев Ю.И., Юрина Н.А. и другие, М.: Медицина, 1983 г., с.9-10).
Недостаток этого решения в том, что при получении срезов глаза после его фиксации в жидкости невозможно установить его исходную топографию, например установить, где находится его назальная или височная часть, поэтому невозможно формирование срезов, точно сориентированных в соответствии с исходной ориентацией глаза в пространстве (в черепной коробке).
Задачей изобретения является обеспечение возможности формирования срезов, точно сориентированных в соответствии с исходной ориентацией глаза в пространстве.
Техническим результатом изобретения является обеспечение сохранения исходного положения образца от момента энуклиации глаза до приготовления срезов.
Поставленная задача решается тем, что в способе фиксации и приготовления гистологических препаратов энуклированного глаза, характеризующемся тем, что включает взятие материала и его фиксацию в жидкости, обезвоживание и заливку в парафин, приготовление срезов, перед фиксацией энуклированного глаза его склеру прошивают нитками на глубину порядка 1 мм как минимум в двух местах - сверху или снизу, а также с боков - с назальной или височной стороны, при этом используют нить из материала, инертного к материалам, используемым при подготовке среза, - льняную или синтетическую, при этом цвет ниток варьируют по участкам прошивания, кроме того, после фиксации маркированного глаза в жидкости и его заливки в парафин глаз перед его делением на срезы располагают с учетом его исходной ориентации в пространстве, для чего ориентируются на вышеописанные нитяные метки.
Сопоставительный анализ признаков заявленного решения с признаками прототипа и аналогов свидетельствует о соответствии заявленного решения критерию "новизна".
При этом существенные признаки отличительной части формулы изобретения решают следующие функциональные задачи.
Признаки «…перед фиксацией энуклированного глаза его склеру прошивают нитками на глубину порядка 1 мм как минимум в двух местах…» обеспечивают возможность надежной фиксации на глазе маркеров, позволяющих надежно идентифицировать топографию глаза на всех этапах подготовки среза, при этом маркер легко убирается, когда необходимость в нем отпадает.
Признаки, указывающие, что склеру глаза прошивают «сверху или снизу, а также с боков - с назальной или височной стороны», обеспечивают возможность четкой топографической привязки глаза к его исходному положению перед его разделением на срезы.
Признаки, указывающие, что в качестве материала для маркеров «используют нить из материала, инертного к материалам, используемым при подготовке среза, - льняную или синтетическую», позволяют избежать участия маркеров в химических реакциях с реактивами, используемыми на различных этапах подготовки глаза к формированию срезов.
Признаки, указывающие, что «цвет ниток варьируют по участкам прошивания», упрощают процедуру топографической привязки глаза к его исходной ориентации в пространстве.
Признаки, указывающие, что «после фиксации маркированного глаза в жидкости и его заливки в парафин глаз перед его делением на срезы располагают с учетом его исходной ориентации в пространстве», обеспечивают возможность получения срезов точно «привязанных» к исходной ориентации глаза в пространстве.
Признаки, указывающие, что при расположении глаза в микротоме в соответствии с его исходной ориентацией в пространстве «ориентируются на вышеописанные нитяные метки», раскрывают процедуру пространственного ориентирования глаза.
В соответствии с заявленным способом осуществляют известным образом энуклиацию глаза, далее в энуклированном глазе формируют маркеры его пространственного положения - его склеру прошивают льняными или синтетическими нитками на глубину порядка 1 мм, оставляя «хвостики» длиной как минимум 5-10 мм в каждой метке. Метки достаточно проставить в двух местах - сверху или снизу, а также с боков - с назальной или височной стороны, хотя возможна маркировка четырех сторон глаза. При этом цвет ниток варьируют по участкам прошивания, например красный, синий, черный, зеленый и т.п.
Последующие операции заявленного способа не отличаются от известных: маркированный описанным образом глаз помещают в фиксирующий раствор (например, 10% раствор формалина) на 24 часа.
После фиксации глаз промывают проточной водой в течение нескольких часов, и в таком виде он проходит следующие этапы гистологической обработки:
обезвоживание - «проводят» по батарее растворов этилового спирта с возрастающей концентрацией: 70%, 80%, 96% и 100%;
заливка в парафин (уплотнение) - глаз помещают в ксилол-парафин, затем в жидкий парафин на 1 час при 56°C, после остывания и затвердевания парафина известным образом вырезают блок с заключенным в нем глазом и известным образом закрепляют на деревянном (пластмассовом) бруске, при этом блок располагают так, чтобы пространственное положение глаза соответствовало его исходной ориентации в пространстве, для чего парафиновый блок, содержащий глаз, ориентируют по вышеописанным нитяным меткам.
Приготовление срезов осуществляют известным образом с использованием микротома известной конструкции после закрепления брусков на объектодержателе. Затем с помощью подающего устройства объектодержатель вместе с бруском перемещается за каждый шаг на фиксированное расстояние 3-5 мкм. Микротомный нож срезает с парафинового блока слой - срез - заданной толщины. После чего срезы помещают на поверхность теплой воды для их расправления, а затем на предметное стекло.
Окрашивание - перед окраской срезов удаляют уплотняющую среду, освобождают от парафина (депарафинизация) с помощью спиртов (100%, 96%, 80%, 70% и 60%) и затем с помощью окраски гематоксилином и эозином достигают контрастности изучаемого гистологического препарата.
Таким образом, энуклированный глаз проходит все этапы стандартной гистологической обработки вплоть до изготовления срезов и окрашивания, полностью сохраняя исходное положение гистологического препарата, исключая возможность его потери, не вызывая сложностей при постановке диагноза.
Таким образом, использование заявленного способа позволяет сохранять биоптат в исходном положении, не повреждая его структуры и формы, не нарушая его целостности, что значительно повышает информативность полученных срезов гистологических препаратов энуклированного глаза и повышает точность установления диагноза.