СОПОЛИМЕРЫ НА ОСНОВЕ N-ВИНИЛПИРРОЛИДОНА В ФОРМЕ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИ ПРИЕМЛЕМЫХ СОЛЕЙ КИСЛОТ
N-VINYLPYRROLIDONE-BASED COPOLYMERS IN FORM OF PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE SALTS OF ACIDS

Область техники
Изобретение относится к химии биологически активных полимеров. Более конкретно, изобретение обеспечивает сополимер на основе N-винилпирролидона в форме фармацевтически приемлемых аддитивных солей кислот, представленный общей формулой (I):
где R обозначает водород или метил;
содержание мономерных звеньев n составляет 25-90 мольн.%;
X обозначает анион фармацевтически приемлемой неорганической или органической кислоты;
k равно 1 или 2;
m принимает значения от 0,1 до 1,0;
µ
и средневязкостная молекулярная масса сополимера M равна 15-150 кДа.
Уровень техники
В патенте RU 2000004 (опубл. 15.02.1993) раскрыты сополимеры N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина со средневязкостной молекулярной массой в диапазоне 29-45 кДа, содержащие 25-40 мольн.% 2-метил-5-винилпиридиновых звеньев, обладающие иммуностимулирующим действием, а также пролонгирующим действием при введении антибиотиков.
В патенте RU 2015993 (опубл. 15.07.1994) раскрыто получение группы сополимеров со средневязкостной молекулярной массой 40 кДа, аналогичных описанным в публикации RU 2000004, в которых среднестатистическое число 2-метил-5-винилпиридиновых звеньев n равно 35, а также показано их противоопухолевое действие.
В патенте RU 2415876 (опубл. 10.04.2011) раскрыты сополимеры на основе N-винилпирролидона, представленные общей формулой:
µ
где мономерное звено M представляет фрагмент 2-метил-5-винилтетразола (МВТ) или 2-метил-5-винилпиридина (МВП), содержание мономерных звеньев n составляет 25-90 мольн.%, а средневязкостная молекулярная масса сополимера M=46-150 кДа, если М представляет МВП, пригодные для применения в качестве адъювантов при изготовлении вакцин.
В патенте RU 2430932 (опубл. 10.10.2011) раскрыты сополимеры на основе N-винилпирролидона, представленные общей формулой:
µ
где мономерное звено M представляет фрагмент 2-метил-5-винилтетразола (МВТ) или 2-метил-5-винилпиридина (МВП), содержание мономерных звеньев n составляет 25-50 мольн.%, а средневязкостная молекулярная масса сополимера M=15-28 кДа, если M представляет МВП, которые являются активаторами продуцирования интерлейкинов-1, вследствие чего могут быть полезны в качестве противораковых агентов.
В патенте RU 2430933 (опубл. 10.10.2011) раскрыто применение сополимеров на основе М-винилпирролидона, структура которых описывается приведенной выше общей формулой, в качестве активаторов фагоцитоза.
Все перечисленные сополимеры на основе N-винилпирролидона, содержащие фрагменты 2-метил-5-винилпиридина, рассматриваются авторами данного изобретения как его ближайшие аналоги. Их главным недостатком является малая растворимость в слабокислых и нейтральных водных средах (pH 6-7), что затрудняет их эффективное применение при изготовлении инъекционных лекарственных форм. При этом растворимость сополимеров в таких средах при постоянстве их средневязкостной молекулярной массы довольно резко уменьшается с увеличением доли 2-метил-5-винилпиридиновых фрагментов. В результате в слабокислых и нейтральных водных растворах сополимеров, содержащих свыше 55 мольн.% фрагментов МВП, не достигаются эффективные концентрации.
Целью данного изобретения является расширение арсенала биологически активных сополимеров на основе N-винилпирролидона, обладающих улучшенными характеристиками растворимости и активности, которые могут найти применение в медицине и ветеринарии.
Описание изобретения
В результате проведенных исследований авторы изобретения установили, что недостатки известного уровня техники могут быть преодолены путем перевода сополимеров на основе N-винилпирролидона в форму их фармацевтически приемлемых аддитивных солей кислот, представленных общей формулой (I):
где R обозначает водород или метил;
содержание мономерных звеньев n составляет 25-90 мольн.%;
X обозначает анион фармацевтически приемлемой неорганической или органической кислоты;
k равно 1 или 23;
m принимает значения от 0,1 до 1,0;
µ
и средневязкостная молекулярная масса сополимера M равна 15-150 кДа.
Неожиданно было обнаружено, что, по сравнению с соответствующими основными формами, предлагаемые солевые формы сополимеров общей формулы (I) обладают большей физиологической активностью, например в качестве иммуностимуляторов, активаторов продуцирования цитокинов, таких как интерлейкины-1, пролонгаторов действия антибиотиков при лечении тяжелых бактериальных инфекций и активаторов фагоцитоза. Это позволяет рассматривать их как потенциальные активные компоненты лекарственных средств, в частности, эффективных при лучевых, онкологических и бактериальных поражениях организма.
Предлагаемые солевые формы сополимеров формулы (I) получают радикальной сополимеризацией N-винилпирролидона (N-ВП) и любого из незамещенных (НВП) или замещенных (ЗВП) коммерчески доступных винилпиридинов: 2-винилипиридина (CAS 100-69-6), 4-винилпиридина (CAS 100-43-6), 2-метил-5-винилпиридина (CAS 140-76-1), 3-метил-5-винилпиридина (CAS 51961-51-4), 4-метил-2-винилпиридина (CAS 13959-34-7), 6-метил-2-винилпиридина (CAS 1122-70-9), а также 4-метил-3-винилпиридина в присутствии инициатора, например, динитрила азобис-изомасляной кислоты (ДАК) и агентов обрыва цепи, таких как пероксид водорода и циклогексан, с последующим взаимодействием с кислотой, взятой в виде раствора или в свободном виде.
Ввиду большого различия в константах сополимеризации N-ВП и НВП или N-ВП и ЗВП, последние сомономеры быстро расходуются в процессе сополимеризации, поэтому синтез сополимера заданного состава обеспечивается поддержанием их постоянного соотношения путем компенсации расхода более реакционно-способных мономеров добавлением смеси, содержащей такие мономеры и агенты обрыва цепи. Объем указанной смеси вычисляют каждые 20 минут по результатам определения соотношения концентраций N-ВП и НВП (N-ВП и ЗВП) в реакционной смеси.
Реакцию сополимеризации проводят при температуре 60-70°C. По достижении степени конверсии по мономерам 15-30% реакционную массу охлаждают до 20°C и передают на стадию получения аддитивной соли фармацевтически приемлемой кислоты.
a
Было установлено, что атомы азота пиридиновых фрагментов сополимеров на основе N-винилпирролидона обладают достаточной основностью для образования солей заданного стехиометрического состава при взаимодействии в водных растворах с сильными неорганическими кислотами, а также с органическими кислотами, имеющими pK порядка 5. Это позволяет получать сополимеры на основе N-винилпирролидона общей формулы (I) с требуемой растворимостью в водных системах, таких как, например, физиологический солевой раствор.
a
Не существует принципиальных ограничений, налагаемых на применяемую кислоту, кроме ее силы (pK порядка 5), физиологической переносимости ее солей и достаточной растворимости получаемой соли общей формулы (I) в заданной водной среде. Поэтому примерами кислот, пригодных для целей изобретения, являются хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, уксусная кислота [в формуле (I) k равно 1], серная кислота, янтарная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота [в формуле (I) k равно 2]. Наиболее предпочтительны хлористоводородная кислота, уксусная кислота, лимонная кислота и янтарная кислота.
Перед взаимодействием с кислотой продукт сополимеризации предпочтительно выделяют осаждением диэтиловым эфиром (ДЭ), отфильтровывают и растворяют в ином растворителе, например, в воде или водно-органическом растворителе, содержащем ацетон или этанол. Такой вариант осуществления изобретения предпочтителен при получении солей прибавлением рассчитанного количества раствора кислоты с последующим выпариванием растворителя.
Альтернативно, гидрохлориды указанных сополимеров могут быть получены барботированием осушенного хлористого водорода через раствор основания сополимера в безводном полярном органическом растворителе, таком как ацетон, хлороформ, хлористый метилен или их смеси.
Строение любого полученного сополимера на основе N-винилпирролидона характеризуется, в частности, числом мономерных звеньев НВП или ЗВП (n) и числом присоединенных молекул кислоты (m). Число n может быть вычислено по данным элементного анализа с учетом стехиометрии сополимера. Число m определяют по результатам титрования. Например, содержание хлорид-, сукцинат- и сульфат-анионов может быть установлено по результатам аргентометрического и бариметрического титрований. Получение необходимых расчетных формул доступно среднему специалисту в данной области.
1
13
15
Альтернативно строение полученного продукта определяют по данным ЯМР-спектрометрии, например H-, C- или N-ЯМР, по соотношениям интегральных интенсивностей сигналов определенных ядер. Решение данной задачи также доступно среднему специалисту в данной области.
Полученные продукты в форме оснований также характеризуют средневязкостной молекулярной массой, которую вычисляют по характеристической вязкости сополимеров. Это необходимо для расчета количества кислот, которое следует прибавить для переведения сополимеров в форму аддитивных солей. Выбор методики и подбор условий измерения вязкости являются рутинной процедурой, доступной среднему специалисту в данной области. В одном варианте изобретения характеристическую вязкость определяют в растворителе, состоящем из 85 об.% ДМФА и 15 об.% 0,1 М водного раствора LiBr.
Сополимер в форме аддитивной соли фармацевтически приемлемой кислоты в соответствии с любым из вариантов осуществления настоящего изобретения является нетоксичным, что может быть подтверждено исследованиями in vivo. В качестве признаков токсического воздействия сополимера на подопытных животных могут рассматриваться, например, гибель, снижение массы тела, изменения походки и поведения, цвета мочи, консистенции экскрементов, состояния глаз и ушей, выпадение зубов и шерсти, а также раздражение кожи в месте введения препарата.
Предлагаемые сополимеры в форме аддитивной соли фармацевтически приемлемой кислоты обладают иммуностимулирующим действием, а также продлевают период эффективного действия антибиотиками. Последнее позволяет снизить терапевтически эффективную дозу антибиотика или повысить эффективность лечения как в отношении срока выздоровления, так и в отношении процента случаев успешного излечения.
Предлагаемые сополимеры в форме аддитивной соли фармацевтически приемлемой кислоты стимулируют производство интерлейкинов-1 в организме, а также активируют фагоцитоз в организме. При этом в любом из перечисленных проявлений своей биологической активности предлагаемые сополимеры в форме аддитивной соли фармацевтически приемлемой кислоты значимо превосходят действие соответствующих основных форм, что будет показано далее на адекватных моделях in vivo. Выбор подопытных животных, в качестве которых могут быть использованы млекопитающие и птицы, не представляет затруднений для специалиста в данной области. Например, млекопитающими предпочтительно являются беспородные белые мыши, кролики или морские свинки.
Достижение технического результата при осуществлении изобретения будет далее проиллюстрировано примерами, способствующими точному и полному пониманию его сути. Специалисту в каждой конкретной области очевидны возможные модификации и замены, например, относящиеся к протоколам исследований, которые не выходят за рамки объема изобретения, определяемые его формулой.
Пример 1. Получение сополимера N-винилпирролидона и 2-метил-5-винилпиридина (2-М-5-ВП) в форме гидрохлорида
А. Синтез основания
2
В реактор загружают исходную реакционную смесь, содержащую 1,00 кг (960 мл) N-ВП, 16,8 г (17,6 мл) 2-М-5-ВП, 1,6 г (1,7 мл) 30% водного раствора пероксида водорода, 109,2 г (140 мл) циклогексана и 35 г динитрила азо-бис-изомасляной кислоты (ДАК). Реакционную массу нагревают до 65-70°C и в течение 5 часов ведут синтез при данной температуре, периодически отбирая пробы для хроматографического анализа (ВЭЖХ, Сферисорб С-18, 5 мкм, 4,6×250 мм, EtOR/HO 6:94, 2,5 мл/мин (50°C), 254 нм). Подают смесь, содержащую 150 г (144 мл) N-ВП, 57,3 г (55 мл) 2-М-5-ВП, 0,51 г (0,5 мл) 30% водного раствора пероксида водорода и 7,5 г ДАК. По достижении степени конверсии по мономерам 20% реакционную массу охлаждают до 20°C и выливают при перемешивании в 30 л диэтилового эфира, оставляют при перемешивании на ночь, образовавшийся осадок выделяют фильтрацией и сушат: сначала при атмосферном давлении при 40-60°C, а затем - в вакуумном сушильном шкафу при 80-90°C. Получают 167,4 г продукта со средневязкостной молекулярной массой 15-21 кДа и n, равным 25 мольн.%.
Б. Получение гидрохлорида в водном растворе
µ
В 2,0 л дистиллированной воды при перемешивании растворяют 100,0 г полученного сомономера, добавляют 0,5 мл 35% соляной кислоты и перемешивают в течение 1 часа. Целевой гидрохлорид выделяют выпариванием воды при пониженном давлении, после чего высушивают до постоянной массы в вакуумном сушильном шкафу при 80-90°C. Получают гидрохлорид сополимера общей формулы (I), в которой, по данным аргентометрического титрования, m имеет значение 0,97±0,02 (M принята равной 18 кДа).
В. Получение гидрохлорида в неводном растворителе
µ
В 1,0 л безводного хлороформа растворяют 50,0 г полученного сомономера и при перемешивании в течение 15 минут барботируют осушенный хлористый водород с расходом 10 мл/мин. Полученный раствор выпаривают при пониженном давлении, твердое вещество высушивают как описано выше. Получают гидрохлорид сополимера общей формулы (I), в которой, по данным аргентометрического титрования, m имеет значение 0,98±0,02 (M принята равной 18 кДа).
Примеры 2-6. Получение сополимеров N-винилпирролидона и других НВП или ЗВП в форме фармацевтически приемлемых солей
Аналогично методике, раскрытой в примере 1, и используя указанные в таблице 1 количества веществ, получают следующие сополимеры на основе N-винилпирролидона (загрузка 1,00 кг) в форме фармацевтически приемлемых солей.
Таблица 1
Пр.
Исходная смесь
Подаваемая смесь
НВП/ЗВП (масса, г)
30% H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (мл)
ЦГ (мл)
ДАК (Г)
N-ВП (г)
НВП/ЗВП (масса, г)
30% H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> (мл)
ДАК (г)
2
3-М-5-ВП (17,5)
6,2
105
4,1
187,5
3-М-5-ВП (71,7)
2,1
1,0
3
3-М-5-ВП (21,3)
5,9
110
3,8
154,7
3-М-5-ВП (175,0)
1,8
0,8
4
4-М-3-ВП (18,1)
5,7
75
2,5
164,3
4-М-3-ВП (149,3)
1,5
0,6
5
4-ВП (16,0)
5,0
66,2
2,2
145,0
4-ВП (131,7)
1,3
0,5
6
4-ВП (18,8)
5,2
97,1
3,4
136,5
4-ВП (154,4)
1,6
0,7
Выход и характеристики сополимеров, полученных в соответствии с примерами, представлены в таблице 2. Уксусную кислоту прибавляют в виде 70% раствора (в таблице 2 отмечено *), другие кислоты прибавляют в виде водных растворов, близких к насыщенным.
Таблица 2
Пр.
Выход, г
M<sub>µ</sub>, кДа
n
Кислота
m
название
масса, г (объем, мл*)
2
233,4
46
37
уксусная
(0,80)
0,5
3
228,7
77
85
янтарная
0,25
0,85
4
241,4
89
74
лимонная (дигидрат)
0,35
0,75
5
209,3
86
69
лимонная (дигидрат)
0,19
0,5
6
202,1
64
81
уксусная
(0,16)
0,75
Пример 7. Исследование острой токсичности сополимеров N-винилпирролидона и НВП или ЗВП в форме фармацевтически приемлемых солей in vivo
57
Испытание проводят на 5 здоровых мышах гибридах F1 (СВА×СВ1) весом 18-20 г. Испытуемые соединения растворяют в стерильном изотоническом растворе NaCl из расчета 10 масс.% и вводят каждому животному 0,4 мл этого раствора. Время наблюдения за животными составляет 7 суток. Препарат считают выдержавшим испытание, если в течение предусмотренного срока наблюдения не погибнет ни одна подопытная мышь.
50
Гибели животных в опыте не наблюдали, что указывает на величину LD для мышей, превышающую 5000 мг/кг. Таким образом, сополимеры, полученные в соответствии с примерами 1-6, можно отнести к нетоксичным веществам.
Кроме того, установлено, что соединения примеров 1-6 в дозе 500 мг/кг в месте подкожного введения не вызывают раздражающего действия на белых мышей, а также выпадения волосяного покрова.
Пример 8. Исследование иммуностимулирующего действия соединений методом миграционной активности колониеобразующих клеток селезенки (эндогенное колониеобразование)
137
Методика выполнения исследования описана в монографии Переверзев А.Е. Кроветворные колониеобразующие клетки и физические стресс-факторы. - Л.: Наука, 1986. - 172 с. стр.43-44. Мышей линии BALB в кассетах по 30 мышей облучают γ-излучением Cs с экспозиционной дозой 600 рентген (поглощенная доза 1,5 Гр, что вызывает гибель 50% животных в течение 1-2 месяцев). За 24 часа до облучения мышам подкожно (в область холки) вводят 0,5 мл растворов соединений с концентрацией 2500 мг/кг (доза соединений составляет 1250 мг/мышь) или равный объем стерильного изотонического раствора NaCl (контрольная группа). На 10 сутки мышей умерщвляют разрывом шейного отдела позвоночника, извлекают селезенки, которые помещают в фиксатор Боэна. Колонии подсчитывают визуально под лупой.
Иммуностимулирующее действие полимеров оценивают по разности числа колоний в опытных группах по сравнению с контрольной группой. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3
Пр.
Свойства сополимеров
Среднее число колоний на 1 селезенку
M<sub>µ</sub>, кДа
n
форма
m
1
18
25
гидрохлорид
0,97
>35,0 (сливной рост)
2
46
37
ацетат
0,5
31,3±2,6
3
77
85
сукцинат
0,85
>35,0 (сливной рост)
4
89
74
цитрат
0,75
>35,0 (сливной рост)
5
86
69
цитрат
0,5
27,9±3,2
6
64
81
ацетат
0,75
29,6±3,8
1c
40
35
основание
0
25,1±2,8
2c
45
25
основание
0
28,0±3,7
3c
38
31
основание
0
>35,0 (сливной рост)
Контрольная группа
11,3±2,6
Приведенные данные показывают, что фармацевтически приемлемые соли сополимеров, полученные в соответствии с изобретением, на 10-30% активнее соединений, раскрытых в публикации RU 2000004 (примеры 1c, 2c и 3c в таблице выше).
Пример 9. Исследование сочетанного действия антибиотиков и сополимеров на основе N-винилпирролидона при сибирской язве
2
Исследования проводят на беспородных белых мышах массой 18-20 г, разделенных на группы по 10 особей. За 24 часа до введения препаратов мышей заражают подкожной инъекцией (10 спор/1 мл) вирулентного штамма №76 возбудителя сибирской язвы. Антибиотики (тетрациклин, 500 Ед; стрептомицин, 1500 Ед) вводят подкожно в объеме 0,2 мл 2%-ного раствора сополимера в физиологическом растворе однократно (I) или в течение 7 суток (VII). Оценкой эффективности является процент выживания мышей в опытных группах по сравнению с контрольной группой и сроки гибели мышей за период наблюдения 14 суток. Результаты представлены в таблице 4.
Таблица 4
Пр.
Свойства сополимеров
Кратность введения
% выживания
Сроки гибели, сутки
M<sub>µ</sub>, кДа
n
форма
m
1
18
25
гидрохлорид
0,97
(I)
10
3, 4, 5
(VII)
90
10
2
46
37
ацетат
0,5
(I)
20
4, 6
(VII)
100
-
3
77
85
сукцинат
0,85
(I)
30
5, 6
(VII)
100
-
4
89
74
цитрат
0,75
(I)
20
3, 5
(VII)
90
12
5
86
69
цитрат
0,5
(I)
20
6, 7
(VII)
80
9, 10
6
64
81
ацетат
0,75
(I)
20
3, 5
(VII)
100
-
1c
40
35
основание
0
(I)
0
3, 4, 6
(VII)
20
9, 11
2c
45
25
основание
0
(I)
0
3, 4, 5
(VII)
80
9
3c
38
31
основание
0
(I)
0
3, 4
(VII)
80
6
4c
30
40
основание
0
(I)
0
3, 4
(VII)
100
-
Приведенные данные показывают, что фармацевтически приемлемые соли сополимеров, полученные в соответствии с изобретением, эффективнее соединений, раскрытых в публикации RU 2000004 (примеры 1c, 2c, 3c и 4c в таблице выше).
Пример 10. Исследование действия сополимеров на основе N-винилпирролидона на продуцирование интерлейкина-1
Эффективность сополимеров, полученных в соответствии с изобретением, в качестве активаторов продуцирования интерлейкина-1α (IL-1α) и интерлейкина-1β (IL-1β) оценивают в соответствии с требованиями Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (Минздрав РФ, 2000, с.257-260). Полученные данные приведены в таблице 5.
Таблица 5
Пр.
Свойства сополимеров
IL
Норма
Уровень IL (y.e.) при концентрации сополимера в крови крыс (мкг/мл)
M<sub>µ</sub>, кДа
n
(Ф)
m
0,01
0,1
1
10
1
18
25
ГХ
0,97
1α
2,1±1,1
2,8±1,2
6,8±2,
7,0±2,1
4,7±1,7
1β
2,7±1,3
4,0±1,4
4,2±2,1
4,9±2,4
3,5±1,9
2
46
37
Ац
0,5
1α
2,1±1,1
2,9±1/3
6,5±2,4
7,1±2,3
4,9±1,6
1β
2,7±1,3
3,7±1,5
3,9±2,3
4,5±2,3
3,2±1,8
3
77
85
Сц
0,85
1α
2,1±1,1
2,7±0,9
6,4±2,5
6,5±2,5
4,6±1,7
Iβ
2,7±1,3
3,8±1,2
4,0±2,0
4,6±2,2
3,1±1,9
4
89
74
Цт
0,75
1α
2,1±1,1
3,0±1,1
6,9±2,2
7,2±2,7
5,0±1,5
1β
2,7±1,3
3,9±1,3
4,3±2,1
4,8±2,2
3,5±1,6
5
86
69
Цт
0,5
1α
2,1±1,1
2,7±1,2
6,4±2,6
6,6±2,4
4,6±1,8
1β
2,7±1,3
4,0±1,0
4,3±2,2
4,9±2,1
3,5±1,7
6
64
81
Ац
0,75
1α
2,1±1,1
2,9±1,2
6,6±2,4
6,9±2,5
4,8±1,5
1β
2,7±1,3
3,8±1,5
4,1±2,3
4,7±2,0
3,3±1,6
1с
22
25
Ос
0
1α
2,1±1,1
2,2±1,0
5,1±2,2
5,3±2,4
3,7±1,9
1α
2,7±1,3
3,1±2,1
3,3±2,4
3,8±1,8
2,7±1,7
Форма (Ф):
ГХ - гидрохлорид; Ац - ацетат; Сц - сукцинат; Цт - цитрат; Ос - основание.
Приведенные данные показывают, что фармацевтически приемлемые соли сополимеров, полученные в соответствии с изобретением, на 20-30% эффективнее соединений, раскрытых в публикации RU 2430932 (пример 1c).
Пример 11. Исследование действия сополимеров на основе N-винилпирролидона в качестве активаторов фагоцитоза (активация перитонеальных макрофагов)
Беспородных белых мышей массой 18-25 г разделяют на группы по 5 животных. Животным внутримышечно вводят раствор сополимера в объеме около 250 мкл из расчета получения дозы 5 мг/кг или 50 мг/кг. Животным контрольной группы внутримышечно вводят 250 мкл физиологического раствора.
Исследование проводят через 24 часа после введения сополимера мышам. Через 10 минут после внутрибрюшинного введения 2 мл 0,05% суспензии коллоидной туши брюшную полость мышей промывают 5 мл изотонического раствора NaCl. Собранные клетки перитонеального экссудата трижды отмывают и суспендируют в 1 мл изотонического раствора NaCl. Процент фагоцитирующих клеток (% ФК) определяют по результатам микроскопического подсчета.
После этого клетки осаждают центрифугированием, удаляют супернатант и осадок клеток лизируют водой для инъекций. Лизаты помещают в фотометрические планшеты и определяют светопоглощение при длине волны 620 нм, пропорциональное количеству туши, поглощенной перитонеальными фагоцитами. Фагоцитарный индекс (ФИ), вычисляемый как отношение светопоглощения к числу фагоцитирующих клеток, отражает степень активации фагоцитоза. Индекс завершенности фагоцитоза (ИЗФ), т.е. отношение среднего числа частиц (ФК), поглощенное одной фагоцитирующей клеткой за 1 ч, к ФК за 2,5 ч, отражает переваривающую способность фагоцитов (таблица 6). Приведенные в ней данные показывают, что фармацевтически приемлемые соли сополимеров, полученные в соответствии с изобретением, на 25-35% эффективнее соединений, раскрытых в публикации RU 2430932 (пример 1c в таблице выше).
Таблица 6
Свойства сополимеров
Доза, мг/кг
Характеристики
Пр.
M<sub>µ</sub>, кДа
n
(Ф)
m
% ФК
ФИ
ИЗФ
1
18
25
ГХ
0,97
5
80,4±4,1
8,3±0,6
32,3±6,1
50
91,9±1,7
11,1±0,9
42,0±11,3
2
46
37
Ац
0,5
5
81,6±4,2
8,4±0,8
32,8±5,8
50
90,0±1,3
10,9±1,0
41,1±10,9
3
77
85
Сц
0,85
5
81,0±2,9
8,4±0,7
32,5±5,9
50
94,3±1,1
11,4±0,9
43,1±11,6
4
89
74
Цт
0/75
5
81,0±2,3
8,4±0,5
32,5±5,3
50
91,8±1,0
11,1±1,0
42,0±11,8
5
86
69
Цт
0,5
5
77,4±3,9
8,0±0,6
31,1±5,6
50
87,9±1,5
10,6±0,9
40,2±10,7
6
64
81
Ац
0,75
5
83,7±2,8
8,6±0,7
33,6±5,7
50
90,9±1,3
11,0±0,9
41,5±10,6
1с
22
25
Ос
0
5
61,0±3,9
6,3±0,7
24,5±5,5
50
68,7±1,3
8,3±1,0
31,4±12,8
Контрольная группа
0
56,0±5,7
7,0±1,0
13,5±5,1
Форма (Ф):
ГХ - гидрохлорид; Дц - ацетат; Сц - сукцинат; Цт - цитрат; Ос - основание.