Оценка иммунобиологических свойств О1 и О139 антигенов холерных вибрионов

УДК 616.932:576.809.7

Т.П.Шмелькова, С.Н.Клюева, С.А.Бугоркова, А.Л.Кравцов, О.В.Громова, О.А.Волох, С.А.Еремин, А.К.Никифоров, Т.Н.Щуковская

оценка иммунобиологических свойств О1 и О139 антигенов

холерных вибрионов

ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов

Проведена оценка иммунобиологических свойств экспериментальных препаратов О-антигена Vibrio cholerae О1 и О139 серогрупп на лабораторных мышах: определение токсичности, анализ морфологических изменений в органах и проточно-цитометрический мониторинг клеточного цикла лейкоцитов, спленоцитов и клеток костного мозга. Показано, что в дозе 100 мкг на мышь О-антиген не вызывает значимых повреждений паренхиматозных органов, нарушения баланса апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток. Комплексная оценка иммунобиологических свойств препаратов позволяет получить представление об их влиянии на макроорганизм, возможности дальнейшего изучения и использования в качестве компонентов химической вакцины.

Ключевые слова: О1 и О139 антигены холерного вибриона, токсичность, морфологический анализ, апоптоз, пролиферация.

T.P.Shmel’kova, S.N.Klyueva, S.A.Bugorkova, A.L.Kravtsov, O.V.Gromova, O.A.Volokh, S.A.Eremin, A.K.Nikiforov, T.N.Shchukovskaya

Evaluation of Immunobiological Properties of Cholera Vibrio O1 and O139 Antigens

Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov

Evaluated are immunobiological properties of experimental preparation on the basis of Vibrio cholerae O-antigen, O1 and O139 serogroups on the mouse model: determination of toxicity, analysis of morphological changes in organs, and flow-cytometric monitoring of cell cycle of leukocytes, splenocytes and bone marrow cells. It is demonstrated that O-antigen 100 ^g dose per mouse does not initiate either significant changes in parenchymatous organs, or imbalance of apoptosis and proliferation of immune-competent cells. Comprehensive assessment of immunobiological properties of the preparations allows to get an insight about their effect on macroorganism, possibility for further studies and their application as chemical vaccine components.

Key words: cholera vibrio O1 and O139 antigens, toxicity,

Согласно мнению экспертов Независимой группы ООН по расследованию причин вспышки холеры на Гаити в 2011 г. вакцинация - один из наиболее действенных способов предотвращения эпидемий холеры [8]. Разработка безопасных, эффективных, простых в применении и экономичных вакцин нового поколения с использованием современных достижений молекулярной биологии, генной инженерии и биотехнологии является приоритетным направлением развития вакцинологии [2, 7]. Особое внимание уделяют исследованиям, направленным на разработку химической вакцины против холеры, вызываемой как V. cholerae О1 серогруппы, так и V. cholerae О139. Так, по данным ВОЗ, в странах Азии холера, обусловленная V. cholerae О139, ежегодно составляет до 30 % и более от общей заболеваемости холерой [3]

О-антиген V. cholerae - важный протективный антиген, ответственный за выработку противобак-териального иммунитета [1]. Использование О1 и О139 антигенов в качестве компонентов химической вакцины предполагает их тщательное изучение, в первую очередь, с позиции токсичности и безопасности.

Цель работы - оценка иммунобиологических свойств экспериментальных препаратов О-антигена

morphological analysis, apoptosis, proliferation.

холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп как компонентов химической вакцины против холеры.

Материалы и методы

Экспериментальные препараты О-антигена получены из культур V. cholerae О1 серогруппы классического биовара серовара Огава (штамм M-41) и эльтор биовара серовара Инаба (штамм M-569), V cholerae О139 серогруппы (штамм М 377/1) с использованием установки по ультрафильтрации на различных мембранных модулях и последующим осаждением сульфатом аммония. Все препараты прошли контроль специфической стерильности. Лиофильно высушенные антигены растворяли в физиологическом растворе и вводили аутбредным и инбредным мышам в дозах 100 или 250 мкг/мышь. В контрольную группу входили мыши, которым вводили 0,9 % раствор натрия хлорида. Токсичность препаратов оценивали в классическом тесте на смешанном поголовье аутбредных мышей массой 18-20 г по следующим признакам: особенность поведения, интенсивность и характер двигательной активности, состояние волосяного и кожного покровов, консистенция фекальных масс, изменению массы тела, уровень смертности. Наблюдение за животными осуществля-

ли ежедневно в течение 7 сут [4]. Морфологическую оценку изменений у мышей на введение О-антигена холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп, а также проточно-цитометрический мониторинг клеточного цикла иммунокомпетентных клеток проводили на инбредных мышах линии BALb/c массой 18-20 г на 1-е и 7-е сутки после иммунизации. Для морфо -логического исследования у декапитированных животных были забраны кусочки внутренних органов (сердца, легких, почки, печени, селезенки, тонкого и толстого кишечника), которые фиксировали в 10 % водном растворе формалина. Приготовленные по стандартной методике [5] полутонкие парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином и просматривали на световом микроскопе. Количество клеточных элементов подсчитывали в 10 полях зрения правильно ориентированных срезах органов. При проточно-цитометрическом анализе в качестве показателя безопасности препаратов определяли баланс процессов апоптоза и пролиферации иммунокомпе-тентных клеток в процессе формирования иммунного ответа посредством распределения лейкоцитов крови, спленоцитов и клеток костного мозга по клеточному циклу с определением коэффициента соотношения апоптотических и пролиферирирующих клеток [10]. Клетки в апоптозе идентифицировали как клетки с пониженным содержанием ДНК (<2С), пролиферирующие клетки характеризовались повышенным содержанием ДНК (>2С). Содержание ДНК в клетках соотносили с интенсивностью флуоресценции клеток, выделенных и окрашенных смесью красителей митрамицина и этидиум бромида [8].

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel. Определяли среднее значение (М), стандартную ошибку (m). Достоверность различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. Разница считалась достоверной при значении р<0,05.

Результаты и обсуждение

Все препараты О-антигена холерного вибриона О1 и О139 серогрупп не обладали токсичностью в дозе 100 мкг/мышь. При увеличении дозы О-анти-гена в 2,5 раза мыши, иммунизированные О-анти-геном О1 серогруппы серовара Огава или О-антиге-ном О139 серогруппы, к концу срока наблюдения имели обычное поведение, удовлетворительный внешний вид, не отказывались от пищи, прибавили в весе. Однако первые 2 сут у животных, иммунизированных О-антигеном О1 серогруппы серовара Огава, наблюдали внешние признаки интоксикации - взъерошенный вид, сонливость, снижение массы тела на (3,2±1,7) %. В последующие дни периода наблюдения мыши возвратились к исходному состоянию, отмечалось увеличение массы тела на (7,6±2,6) %. Через 1 сут после иммунизации О-антигеном О1 се-рогруппы серовара Инаба регистрировалась гибель 4 мышей из 5. Общее состояние оставшейся мыши из

данной группы оставалось в пределах нормы, прибавка в весе в конце эксперимента составила 11 %.

Дальнейшие морфологические и проточно-цитометрические исследования О-антигена холерного вибриона О1 и О139 серогрупп проводили с заведомо нетоксичной дозой для всех препаратов -100 мкг/мышь.

Выявленные при морфологическом исследовании изменения у мышей, иммунизированных препаратами О-антигена, носили адаптационнокомпенсаторный характер и заключались в умеренном полнокровии сосудов внутренних органов, очаговом функциональном напряжении отдельных паренхимных элементов на фоне относительной активации звездчатых ретикулоэндотелиальных клеток в печени (клеток Купфера), различной степени выраженности гиперпластических процессов в селезенке и отсутствии альтеративно-экссудативных реакций в кишечнике. При этом установлены некоторые колебания описываемых адаптационно-компенсаторных процессов у животных в ответ на введение препаратов О-антигена холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп. Так, на введение О139 антигена были отмечены компенсированные гемодинамические нарушения и очаговые дистрофические изменения эпителия извитых канальцев почек и признаки функционального напряжения гепатоцитов, сохраняющиеся до 7-х суток наблюдения, более выраженные гиперпла-стические процессы в селезенке регистрировались при введении О-антигена холерных вибрионов О1 серогруппы сероваров Инаба и Огава. Сравнивая реакцию клеток эффекторной зоны иммунной системы кишечника: клеток собственной пластинки слизистой (СПС) и межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ), отмечали умеренную лимфогистиоцитарную инфильтрацию и появление зрелых плазматических клеток в СПС тонкого кишечника всех иммунизированных мышей, но при введении О-антигена холерного вибриона O139 серогруппы регистрировали в этой зоне еще и незначительное увеличение количества лейкоцитов и эозинофилов. Активация МЭЛ в тонком кишечнике животных была достоверной в ответ на введение О-антигенов холерного вибриона О1 серогруппы. Со стороны клеток Панета - клеток кишечника, обеспечивающих антибактериальную защиту [6], в указанные сроки отмечали на введение О-антигена холерных вибрионов О1 серогруппы сероваров Инаба и Огава умеренное опустошение, в то время как при введении О-антигана холерного вибриона О139 серогруппы регистрировали гипертрофию этих элементов.

Проточно-цитометрический мониторинг распределения лейкоцитов крови, спленоцитов и клеток костного мозга показал, что под влиянием О-антигена холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп происходило повышение количества клеток пролиферирующих и в апоптозе среди спленоцитов и клеток костного мозга. Наибольшей способностью вызывать изменения в клеточном цикле иммунокомпетентных

Показатели апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток мышей под воздействием О-антигена V cholerae

Препараты О-антигена Лейкоциты крови, % Спленоциты, % Клетки костного мозга, %

анонтоз пролиферация апонтоз пролиферация анонтоз пролиферация

1 сут 7 сут 1 сут 7 сут 1 сут 7 сут 1 сут 7 сут 1 сут 7 сут 1 сут 7 сут

Инаба 1,8±0,5 1,9±0,7 11,1±2,5 5,9±1,3 6,8±1,1* 5,4±1,3* 17,3±2,3 20,3±2,9* 1,5±0,2* 2,2±0,4 32,2±3,4 26,1±3,5

Огава 2,3±0,6 1,9±0,4 13,1±0,8 4,7±0,4 4,5±1,4 4,5±0,4** 18,6±2,0 20,8±5,4 0,7±0,2 1,1±0,2 34,3±2,0 30,7±1,8

О139 1,8±0,4 1,6±0,2 16,3±0,9 5,5±0,8 3,3±0,8 3,1±0,3* 20,2±2,3 16,6±1,4 0,8±0,2 2,6±0,2** 31,1±1,7 27,4±0,7

Контроль 2,3±1,0 1,9±0,1 13,3±3,0 6,2±0,3 3,7±1,0 1,7±0,5 17,0±2,6 12,7±0,7 1,0±0,1 1,3±0,3 28,1±2,7 27,1±1,2

Примечание. Достоверность различия между опытом и контролем: *- р<0,05, ** - р<0,001.

клеток обладал О-антиген холерного вибриона О1 серогруппы серовара Инаба. Все зарегистрированные показатели пролиферации и апоптоза (таблица) являются реакцией макроорганизма на введение препарата, обладающего иммунобиологической активностью. В целом, препараты О-антигена холерных вибрионов О1- и О139 серогрупп не вызывали нарушения баланса апоптоза и пролиферации иммуно-компетентных клеток в процессе иммуногенеза (коэффициент соотношения < 1, т.е. количество клеток в апоптозе не превысило количество пролиферирующих клеток).

Интересно отметить, что О-антиген О1 серо-группы серовара Инаба обладал токсичностью в дозе 250 мкг/мышь и способностью вызывать наибольшие изменения в клеточном цикле спленоцитов и клеток костного мозга в нетоксичной для мышей дозе 100 мкг, в отличие от О-антигена О1 серогруппы серовара Огава и О139 антигена. Установление связи между этими событиями требует дальнейших наблюдений.

Таким образом, в дозе 100 мкг/мышь все перечисленные препараты О1 и О139 антигенов холерных вибрионов не обладали токсичностью на уровне макроорганизма, не вызывали значимых изменений во внутренних органах и нарушения баланса процессов апоптоза и пролиферации иммунокомпетентных клеток в условиях данного эксперимента, что может служить обоснованием их дальнейшего изучения и использования в качестве компонентов холерной химической вакцины.

Работа проведена в рамках выполнения Распоряжения Правительства Российской Федерации № 1426-р от 02.10.2009 г.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Захарова Т.л., Заднова С.П., ливанова л.Ф., Киреев М.н., Смирнова н.И. Использование рекомбинантных штаммов для одновременного получения нескольких очищенных основных протективных антигенов холерного вибриона. Пробл. особо опасных инф. 2009; 2(100):68-71.

2. КутыревВ.В., Щуковская Т.н. Холерные вакцины. В кн.: Вакцина и вакцинация: национальное руководство. М.; 2011.

С. 431-45.

3. Яомов Ю.М., Москвитина Э.А. Эпидемиологическая обстановка по холере в мире, странах СНГ и России. Прогноз. Пробл. особо опасных инф. 2010; 2(104):11-3.

4. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. МУК 4.1/4.2.588-96. М.,1996.

5. Саркисова Д.С., Перова Ю.л., редакторы. Микроскопическая техника. Руководство. М.: Медицина; 1996. 544 с.

6. Шахламов В.А., Солнышкова Т.Г. Ультраструктурный и морфологический анализ реакции клеток Панета на введение холерного токсина. Бюл. эксп. биол. и мед. 1992; 63(4):415.

7. Щуковская Т.н., Саяпина л.В., Кутырев В.В. Вакцинопрофилактика холеры: современное состояние вопроса. Эпидемиол. и вакцинопрофилакт. 2009; 2(45):62-7.

8. Barlogie B., Spidzer G., Hart G. et al. DNA histogram analysis of human hemopoetic cells. Blood. 1976; 48(2):245-57.

9. Final Report of the Independent Panel of Experts on the Cholera Outbreak in Haiti. 04 May 2011. Available from: http://www. un.org/News/dh/infocus/haiti/UN-cholera-report-final

10. Lotzmanova E.Yu., Kravtzov A.L., Livanova L.F. et al. Flow cytofluorometric monitoring of leukocyte apoptosis in experimental cholera. Proc. SPIE. 2002; 5068:462-6.

References

1. Zakharova T.L., Zadnova S.P., Livanova L.F., Kireev M.N., Smirnova N.I. [Recombinant strains application for simultaneous preparation of several purified cholera vibrio antigens]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2009; (100):68-71.

2. Kutyrev V.V., Shchukovskaya T.N. [Cholera vaccines]. In: [Vaccine and Vaccination: National Guidelines]. M.; 2011. P. 431-45.

3. Lomov Yu.M., Moskvitina E.A. [Epidemiologic situation on cholera in the world, CIS countries and Russia. Prognosis]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2010; (104):11-3.

4. [Methods of quality control over immunobiological preparations administered to humans. MR 4.1/4.2.588-96]. M.; 1996.

5. Sarkisova D.S., Perova Yu.L., editors. [Microscopy Equipment: Operating Manual]. M.: Meditsina; 1996. 544 p.

6. Shakhlamov V.A., Solnyshkova T.G. [Ultra-structural and morphological analysis of Paneth cell reaction to cholera toxin administration]. Byul. Eksp. Biol. Med. 1992; 63(4):415.

7. Shchukovskaya T.N., Sayapina L.V, Kutyrev V.V. [Vaccine prophylaxis of cholera: current state of the issue]. Epidemiol. Vaktsinoprofilakt. 2009; 2(45):62-7.

Authors:

Shmel’kova T.P., Klyueva S.N., Bugorkova S.A., Kravtsov A.L., Gromova O.V., Volokh O.A., Eremin S.A., Nikiforov A.K., Shchukovskaya T.N. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russia. E-mail: rusrapi@microbe.ru

Об авторах:

Шмелькова Т.П., Клюева С.Н., Бугоркова С.А., Кравцов А.л., Громова О.В., Волох О.А., Еремин С.А., Никифоров А.К., Щуковская Т.Н. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru

Поступила 10.01.12.