Исследование фенолокисляющих бактериальных штаммов, выделенных из акватории Северного Каспия

ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 579.695:628.35

И. В.Соколова, О. В. Колотова, И. В. Владимцева, Н. Б. Водовский, Е. А. Кочеткова

ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕНОЛОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ АКВАТОРИИ СЕВЕРНОГО КАСПИЯ

Ключевые слова: фенолсодержащие воды; утилизация фенолов; штамм-деструктор.

В ходе мониторинга состояния вод вблизи донных станций, находящихся в районе Северного Каспия, определена численность фенолокисляющих микроорганизмов. Из водных образцов проб с донными отложениями с наибольшей численностью первой группы микроорганизмов были выделены 18 штаммов. Исследована их способность к росту в селективной среде Егоровой. Отобраны штаммы, способные расти при концентрациях фенола 1,0 -1,5 г/л. Определена их активность по потреблению фенола с помощью фотоколориметрического метода. Исследован бактериальный штамм, обладающий наибольшей способностью к утилизации фенола, подобраны оптимальная температура и среда для его культивирования при начальной концентрации загрязнителя в модельной среде 1,5 г /л. В указанных условиях степень утилизации фенола составила практически 100 %.

Keywords: phenoloxidasewaters; phenolutilization; strain- destructor.

During the water monitoring nearby bottom stations in The North Caspian region the number of phenoloxidase microorganisms were defined. 18 strains with most phenoloxidase number were isolated from water sediment samples. There were researched their capability for growth in selective nutrient medium of Egorovа. The most active strains with capability to consume 1,5 g/l phenol in Egorova тМеМ medium were selected. Their activity to phenol using was defined with photocolorimetric method. The bacterial strain was selected for detailed research as the most strong destructor of phenol, the optimum temperature and medium for growth with initial phenol concentration 1,5 g/l were found. The utilization amounted to 100 % insuchconditions.

Введение

Фенолы широко распространены среди загрязнений, поступающих в поверхностные воды со стоками промышленных предприятий. Использование этих соединений связано с их высокой реакционной способностью. Фенол применяют в нефтехимии, в синтезе фенолформальдегидных смол, в производстве красителей, фармацевтических препаратов, в процессах добычи и транспортировки нефти, его производные входят в состав растений и продуктов их разложения [1].

Фенол относится к высокотоксичным веществам. Его ПДК в воде составляет 0,001 мг/л. Особенно жесткие требования по содержанию фенола и его ближайших гомологов - крезолов предъявляются к воде, которая подвергается обработке хлорированием, так как хлорпроизводные фенола и крезолов являются ещё более токсичными и имеют неприятный запах даже в самых малых концентрациях.

Сброс сточных вод, содержащих различные фенольные соединения, в водоемы и водотоки значительно влияет на их санитарное состояние, изменяя в худшую сторону условия жизнедеятельности живых организмов. Такие негативные изменения связаны с увеличением токсичности воды и изменением содержания биогенных элементов, растворенных в ней кислорода и углекислого газа [2,3] .

Микроорганизмы наиболее резко реагируют на изменение качества воды природных водоёмов,

поэтому микробная индикация часто используется для контроля за состоянием водных экосистем. В природных водах микроорганизмы выполняют основную роль в процессах деструкции разнообразных органических веществ, т.е. в самоочищении водных объектов. [4]. Однако самоочищение водоемов от фенольных соединений протекает медленно и их следы могут распространяться на большие расстояния.

В настоящее время для биологической очистки сточных вод и ремедиации почвы все шире используютсявысокоэффективные биопрепараты, содержащие чистые культуры микроорганизмов-деструкторов [5, 6, 7]. Использование биопрепаратов не требует дополнительных энергозатрат, они работают интенсивно и абсолютно надежно, не допуская загрязнения окружающей среды. Работы по выявлению роли микроорганизмов, осуществляющих биодеструкцию фенолов в водных объектах, и их использованию для повышения экологической безопасности окружающей среды крайне малочислены.

Целью данного исследования являлось выделение и изучение свойств чистой культуры микроорганизмов, способной к активной деструкции фенола в водной среде.

Экспериментальная часть

В ходе мониторинга состояния вод вблизи донных станций, находящихся в районе Северного Каспия были отобраны и проанализированы 24 образца морской воды и 23 пробы донных отложений. Глубина отбора проб составляла от 5 до

28 м, при этом средняя температура воды на станциях - 20,8 0С, соленость - в интервале 12,0 -18,2 мг/л, рН 7,6 - 9,3. Для установления численности фенолокисляющих микроорганизмов в морской воде и донных отложениях применяли метод предельных разведений и определение их наиболее вероятного числа в 1 мл морской воды или в 1 г донных отложений. Посев разведений воды и донных отложений (готовили 5 последовательных разведений в изотоническом растворе) по 2 повторности для каждого разведения проводили в жидкую селективную среду Егоровой следующего состава (г/л) [9]: К2НРО4 - 1,0; (МН4)2 SO4 - 0,1; MgSO4 - 0,2; №С1 - 0,2; СаС12 - 0,1; Feaз - 0,02; М^04 - 0,01; (]Ж4)2 НР04 - 0,5; фенол - 1,0.

Культивирование посевов осуществляли при температуре 28 - 30°С, учет результатов производили через 7 - 14 суток, отмечая пробирки с помутнением питательной среды. Полученные результаты оценивали по таблицам Мак-Креди, разработанной на основании методов вариационной статистики [10] и методики [8].

Для выделения чистых культур фенолокисляющих микроорганизмов применяли метод накопительных культур [10]. В жидкую питательную среду Егоровой объёмом 90 мл засевали 5 мл водных образцов, или 2-3 г донных отложений. Объемная концентрация фенола в среде составила 0,1%. Посевы культивировали в течение 6 суток при температуре 300С, затем еще 7 суток при температуре 220С. Накопительную культуру фенолокисляющих микроорганизмов десятикратно разводили изотоническим раствором, из 5 и 6 разведений производили посевы на плотную питательную среду Егоровой с содержанием фенола 1 г/л. Полученные изолированные колонии отсевали на пробирки со скошеным агаром.

С целью сравнительного анализа скорости роста и накопления биомассы фенолокисляющими микроорганизмами осуществляли стационарное культивирование выделенных бактерий в жидкой среде Егоровой с различными исходными концентрациями фенола. Посев 1 мл бактериальной взвеси чистой культурыкаждого исследуемого штамма с концентрацией 109 м.к./мл, приготовленной по оптическому стандарту мутности, осуществляли в 10 мл среды Егоровой с концентрациями фенола 0,5 г/л, 1,0 г/л, 1,5 г/л и 2,0 г/л. Стационарное культивирование осуществляли при температуре 300С в течение 6 суток. Относительную скорость накопления бактериальной массы определяли оптическим методом с помощью фотоколориметра КФК-2-УХЛ-4.2 при длине волны светофильтра 750 нм в кюветах с длиной оптического пути 5,065 мм, сравнивая оптические плотности культуральной жидкости и незасеянной среды Егоровой с соответствующей концентрацией фенола.

Для оценки скорости роста и накопления биомассы выделенными фенолокисляющими штаммами использовали минеральную основу среды Диановой - Ворошиловой следующего состава (мг/л): К2НРО4 - 1,0; КН2РО4 - 1,0; :ЫН4Ш3-

1,0; MgSO4- 0,2;СаС12-6Н20- 0,01; Fea3•6H2O- 3 капли насыщенного раствора [9]. В качестве источника углерода добавляли фенол в концентрации 1,5 г/л.

Определение остаточного количества фенола в культуральной жидкостипроводили оптическим методом с использованием фотоколориметра при длине волны светофильтра 550 нм в кюветах с длиной оптического пути 5.065 мм. Для установления концентрации фенола использовали метод, основанный на образовании окрашенного соединения в результате реакции фенола с продуктом диазотирования п-нитроанилина [12]. Культуральную жидкость в количестве 10 мл предварительно отделяли от биомассы на центрифугеСМ-6 МТ (ELMI Латвия) в течение 10 мин при 3000 об./мин. Через 20 минут после проведения химической реакции измеряли оптическую плотность растворов. Концентрацию фенола определяли по калибровочному графику, построенному по известной концентрации этого соединения.

Глубинное культивирование наиболее активного фенолокисляющего штамма производили в ферментере LKBBЮTEKPOLYFERM 1607 с объемом культурального сосуда 500 мл, скоростью перемешивания 200 об./мин, подача кислорода 0,5 л/мин, температура культивирования 370С, длительность выращивания определяли по остаточному содержанию фенола.

Результаты и обсуждение

В ходе мониторингасостояния вод в районах установки донных станций в Северной частиакватории Каспийского моря были

выявленыточки с наибольшим содержанием фенолокисляющих микроорганизмов в образцах морской воды и донных отложений. Результаты мониторинга и определения численности микроорганизмов данной группы в обоих видах проб представлены, ниже на рисунках 1 и 2.

Рис. 1 - Численность фенолокисляющих микроорганизмов в пробах воды

Результаты, приведенные на рисунках 1 и 2, свидетельствуют, что максимальной численностью микроорганизмов, утилизирующих фенол, отличались 4 водных и 4 донных пробы, которые

были использованы для фенолокисляющих штаммов.

выделения

Рис. 2 - Численность фенолокисляющих микроорганизмов в донных пробах

При посеве из накопительных культурна чашки с плотной средой Егоровой по результатам визуальной оценки вида и размеров колоний были отобраны изолированные колонии 18 штаммов фенолокисляющих микроорганизмов.

Отбор штамма, обладающего наибольшей скоростью накопления биомассы, проводили в жидкой питательной среде при разных концентрациях фенола в условиях стационарного культивирования (табл. 1.).

Таблица 1 - Результаты исследования способности выделенных штаммов к

использованию фенола в качестве единственного источника углерода

Наименование штаммов Оптическая плотность D, усл. ед.

Конц-ция фенола в среде 0,05 % 0,10% 0,15% 0,20%

Ф1-01.1 0,33 0,11 0,085 0,055

Ф1-01.2 0,35 0,01 0,07 0,045

Ф1-03 0,2 0,1 0,05 0,075

Ф2-04.1 0,21 0,05 0,035 0,035

Продолжение табл.1

Ф1-04.2 0,33 0,1 0,07 0,07

Ф1-05.1 0,2 0,065 0,025 0,05

Ф1-05.2 0,38 0,22 0,055 0,095

Ф1-06 0 0,015 0,05 0,075

Ф2-07 0,29 0,18 0,01 0,035

Ф1-08 0,03 0 0,015 0,06

Ф1-09 0,07 0,015 0,02 0,055

Ф-11 0,11 0,025 0,04 0,1

Ф1-12 0,005 0,14 0 0,015

Ф2-13 0,3 0,42 0,48 0,005

Ф-15 0,12 0,37 0 0

Ф-16 0,175 0,035 0 0

Ф-17 0,26 0,06 0 0

Ф-18 0,27 0,27 0,18 0,015

роста исследуемых микроорганизмов. Из 18 исследуемых штаммов были отобраны 5 культур, обладающих наилучшими ростовыми

характеристиками при концентрации фенола от 0,05 до 0,15%. У данных штаммов была детально изучена возможность утилизации фенола в условиях стационарного культивирования (рис.3).

Рис. 3 - Оптические плотности бактериальных взвесей наиболее активных фенолокисляющих микроорганизмов

Все представленные на диаграмме штаммы были выделены из проб донных отложений. Штаммы Ф1-05.1, Ф2-13.1, и Ф-18.3 показали лучший рост при более высокой концентрации фенола (0,10% и 0,15%), поэтому они были отобраны для дальнейшего исследования.

По данным литературы для выращивания микроорганизмов, утилизирующих нефть и нефтепродукты, используют среду Диановой -Ворошиловой [9]. В связи с этим был проведен сравнительный анализ роста полученных штаммов на средах Егоровой и Диановой - Ворошиловой, содержащих в качестве единственного источника углерода 0,1% фенола (1,5 г/л). Результаты эксперимента приведены на рис.4.

СП

ф

к с;

СП о

ё " <В н т _0

- £ 1= о

О £

о с

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 о

¿Ь-

<3-> V1 КУ

.V Л' V V Л' 13 Я (3 к «

Среда Егоровой ч  144ч

Среда

Диановой-

Ворошиловой

При концентрации фенола в питательной среде 0,20% было отмечено существенное торможение

Рис. 4 - Сравнение скорости накопления биомассы фенолокисляющих штаммов на средах Егоровой и Диановой - Ворошиловой

Представленные на рисунке 4 данные свидетельствуют о более активном росте всех трех штаммов на среде Диановой-Ворошиловой с фенолом в качестве источника углерода. В связи с полученными результатами в дальнейших

экспериментах для культивирования выше указанных штаммов использовали среду Диановой-Ворошиловой с добавлением фенола в количестве 1,5 г/л. Для определения оптимальных температурных и временных условий деструкции фенола бактериальные штаммывыращивали при 30 и 37°С с различной длительностью культивирования (от 72 до 240ч). Результаты микробиологической деструкции фенола определяли фотометрическим методом по его остаточной концентрации в культуральной жидкости. Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты определения остаточной концентрации фенола при стационарном культивировании бактериальных культур

т, 0С Номер штамма Остаточная концентрация фенола в пробе, мкг/мл

72ч 120ч 164ч 240ч

о Ф1-05.1 4,24 2,54 0,5 0,45

СП Ф2-13.1 4,24 3,6 2,5 0,48

Ф1-18.3 4,1 3,08 1,4 0,75

72ч 120ч 164ч 240ч

Ф1-05.1 4,6 2,4 0,34 0,18

СП Ф2-13.1 5,2 2,64 2,5 0,06

Ф1-18.3 3,8 1,3 0,9 0,76

Данные, приведенные в таблице2, свидетельствуют о том, что штаммы Ф1-05.1 и Ф2-13.1 обеспечивают практически равные остаточные концентрации фенола при температуре культивирования 300С. При 370С более низкое содержание фенола обнаружено в культуральной жидкости штамма Ф2-13.1. Концентрации фенола в пробах штамма Ф1-18.3 остаются практически одинаковыми при обеих температурах по истечении 10 суток выращивания, но более высокими, чем в пробах с культурами Ф1-05.1 и Ф2-13.1. Все штаммы были проверены на наличие пирокатехина (промежуточного продукта при биологическом окислении фенола). Установлено его отсутствие только в культуральной жидкости штамма Ф2-13.1, что свидетельствует о более полном окислении фенолау этого микроорганизма [11].

Таким образом, для дальнейших исследований был отобран штамм Ф2-13.1, который способен с наибольшей скоростью и практически полностью расщеплять фенол, содержащийся в среде культивирования. Отобранный штамм относится к аэробам, видимые колонии на плотной питательной среде вырастают в течение 72 ч. На селективной среде колонии размером 1 мм формируются в течение 24-48 ч. Колонии круглые, гладкие, со временем приобретают розоватый оттенок, на 7 сутки появляется видимый субстратный мицелий, который при рассмотрении на небольшом увеличении микроскопа (х40) представляет собой синнемы. Воздушный мицелий отсутствует. Штамм обладает подвижностью, кислотоустойчивостью, по Граму клетки окрашиваются положительно. Температурный оптимум 28-370С (сплошной рост на плотной питательной среде за 24 ч), при 210С и 430С скорость роста снижается (сплошной рост на

скошенном агаре за 48 ч). По описанным выше признакам выделенный штамм был отнесен к семейству Actinomycetaceae, роду Rhodococcus и обозначен Rhodococcus spp.

Для более адекватной оценки возможности выделенной культуры проводить биологическую очистку сточных вод, содержащих фенол, проводили моделирование биоочистки в условиях глубинного культивирования штамма Rhodococcus spp.в ферментере при непрерывном аэрировании жидкой питательной среды. Концентрацию фенола в пробах определяли через 24, 48, 72 и 120 ч после начала выращивания микроорганизмов. При глубинном культивировании штамма Rhodococcus spp. в среде, содержащей фенол, происходит практически полная деструкция этого опасного токсиканта. Остаточная концентрация фенола после глубинного выращивания культуры (0,067 мкг/мл) практически соответствует его конечной концентрации после стационарного

культивирования данного штамма (0,060мкг/мл), однако скорость достижения этой концентрации при выращивании бактерий в ферментере увеличивается в 2 раза [13].

Выводы

1. При мониторинге состояния вод вблизи донных станций, находящихся в районе Северного Каспия, проанализированы 47 образцов воды и донных отложений, из которых отобраны 4 водных и 4 донных пробы, отличающиеся максимальной численностью фенолокисляющих микроорганизмов.

2. Из образцов морской воды и донных отложенийвыделено 18 бактериальных штаммов, утилизирующих фенол в качестве единственного источника углерода. Исследована их способность к росту в селективной среде Егоровой с концентрацией фенола 0,5 - 2 г/л.

3. По результатам изучения фенолокисляющей активности отобрана культура с наибольшей способностью утилизации токсиканта. Исследование культуральных и морфологических свойств позволило отнести данный фенолокисляющий штамм к роду Rhodococcus spp.

4. Определены оптимальные температурные условия и время выращивания Rhodococcus spp., подобрана среда для культивирования штамма при начальной концентрации загрязнителя 1,5 г /л. Выявлена практически полная очистка воды от фенола как при стационарных, так и при глубинных условиях выращивания выделенной культуры.

Литература

1. Изучение термодинамики сорбции фенола на отходах валяльно-войлочного производства / Р.З. Галимова, И. Г. Шайхиев, Г. А. Алмазова // Вестник технологического университета, 2016. - Т.19, №14. - С. 169-171.

2. Галимова, Р. З. Изучение термодинамики сорбции фенола на осиновых опилках/ Р.З. Галимова, И. Г. Шайхиев, Г. А. Алмазова // Вестник технологического университета, 2016. - Т.1, №19. - С. 60-63.

3. Исследование сорбции фенола на листьях березы / Р. З. Тухватуллина, И. Г. Шайхиев, А. А. Багауетдинова, Г.

А. Алмазова // Вестник технологического университета, 2015. - Т.18, №13. - С. 249-251.

4. Оценка микробного состояния рек Тульской области /И.А. Нечаева, Е.В. Акатова // Известия Тульского государственного университета. Естественные науки, 2014. - Вып. 2. - С. 270-281.

5. Кобызева Н.В., Дубинина О.Н., Логинов О.Н., Четвериков СП., Бойко Т.Ф., Черняева Н.Ю., Хуснаризанова Р.Ф., Силищев Н.Н. Биопрепарат-нефтедеструктор «Ленойл» //Токсикологический вестник.-2008.-№ З.-С. 43-44.

6. Нечаева, И.А. Биодеградация углеводородов нефти психротрофными микроорганизмами-деструкторами: Дис.... канд. биол. наук: 03.00.23/ Нечаева Ирина Александровна. - Пущино, 2009. -133 c

7. Методы общей бактериологии: Пер. с англ./Под ред. Ф. Герхардта и др. - М.: Мир, 1984. - 264 с.

7. Плешакова Е.В.Получение нефтеокисляющего биопрепарата путём стимуляции аборигенной углеводородокисляющей микрофлоры / Е.В. Плешакова, H.H. Позднякова, О.В. Турковская // Прикл. биохим. и микробиол., 2005. - Т. 41. - № 6. - С. 634-639.

8. Методические указания по санитарно-бактериологической оценке рыбохозяйственных водоемов. Утв. Департаментом ветеринарии РФ 27.09.1999 № 13-4-2/1742.

9. Руководствопометодам гидробиологического анализа поверхностных вод и донных отложений / Под ред. В.А. Аббакумова Л.: Гидрометеоиздат, 1983. - 240 с.

10. Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии: учебное пособие для ВУЗов /Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева; под ред. Г.И. Переверзевой. - 5-е изд, пер. и доп. - М., Дрофа, 2004. - 256с.

11. Харборн, Дж. Биохимия фенольных соединений. Пер. с англ. / Под ред. Н. М. Эмануэля. - М.: Мир, 1968. -448с.

12. Коренман, И.М.. Фотометрический анализ. Методы определения органических соединений /И.М.Коренман/ - М:Химия. 1970. - 343с.

13. Выделение, культивирование и изучение основных свойств фенолокисляющих микроорганизмов с целью получения биопрепарата для биологической очистки промышленных сточных вод / И.В. Соколова, О.В. Колотова и др.// V Межд. конференция-школа по химической технологии ХТ'16: сб. тез. докл. сателлитной конф. XX Менделеевского съезда по общей и прикладной химии (г. Волгоград, 16-20 мая 2016 г.). В 3 т. Т. 3 / ВолгГТУ [и др.]. - Волгоград, 2016. - С. 228230.

© И. В. Соколова - к.б.н., доцент каф. ПЭБЖ ВолгГТУ, mogi-irina@yandex.ru; О. В. Колотова - к. т. н., доцент каф. ПЭБЖ ВолгГТУ, olgakolotova@mail.ru; И. В. Владимцева - д. б. н., профессор каф. ПЭБЖ ВолгГТУ, alexvlad32@yandex.ru; Н. Б. Водовский - научный сотрудникКаспийского филиала ФГБУН «Институт океанологии им. П.П. Ширшова» РАН, vodovsky@rambler.ru, Е. А. Кочеткова - магистрант каф. ПЭБЖВолгГТУ, 79044290801@yandex.ru.

© I. V. Sokolova - Ph.D. in Biology, docent of Industrial Ecology and Life Safety ^air of Volgograd State Technical University, mogi-irina@yandex.ru ; O. V. Kolotova - Ph.D. in Technics, docent of Industrial Ecology and Life Safety ^air of Volgograd State Technical University, olgakolotova@mail.ru; I. V. Vladimtseva - Ph.D. in Biology, Full Professor, of Industrial Ecology and Life Safety ^air of Volgograd State Technical University, alexvlad32@yandex.ru; N. B. Vodovsky - Researcherof Caspian branch of FSBUE "Institute of Oceanology named after P.P.Shirshov" RAS vodovsky@rambler.ru; Е. А. Kochetkova - umdergraduate of Industrial Ecology and Life Safety ^air of Volgograd State Technical University, 79044290801@yandex.ru.