ЦИНКОВЫЙ КОМПЛЕКС ПЕПТИДА HAEE ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
HAEE PEPTIDE ZINC COMPLEX FOR THE TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASES

m
n
Изобретение относится к цинковому комплексу пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний, который описывается формулой [Zn(НАЕЕ)]X, где Zn представляет собой двухзарядный катион цинка (II), m = 1 для однозарядных и двухзарядных анионов, m = 3 для трехзарядных анионов, HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, Х – фармацевтически приемлемый анион, n = 1 для двухзарядных анионов, n = 2 для однозарядных и трехзарядных анионов. Настоящее изобретение также относится к способу получения цинкового комплекса пептида HAEE, к фармацевтическим композициям на его основе и применению цинкового комплекса пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний.
Предшествующий уровень техники
Нейродегенеративные заболевания имеют ряд общих факторов развития и целый ряд других обобщающих механизмов (Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modern conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(6-2):3-10. (In Russ.). doi: 10.17116/jnevro2017117623-10), что может связывать болезнь Альцгеймера (БА), сосудистую деменцию, нейродегенерацию при рассеянном склерозе (РС), болезнь Паркинсона, а также болезнь Альцгеймера в условиях активации системного воспаления (Williams-Gray C.H., Wijeyekoon R., Yarnall A.J. et al. ICICLE-PD study group. Serum immune markers and disease progression in an incident Parkinson’s disease cohort (ICICLE-PD). Movement Disorders. 2016;31(7):995-1003. https://doi.org/10.1002/mds.26563). Воспаление относится к типовым патологическим процессам организма человека. Типовой патологический процесс проявляется определенным набором характерных признаков. В настоящее время считается, что нейродегенеративный процесс является вторичным по отношению к воспалительному (Mostafa A., Jalilvand S., Shoja Z. Et al. Multiple sclerosis-associated retrovirus, Epstein-barr virus, and vitamin D status in patients with relapsing remitting multiple sclerosis. Journal of Medical Virology. 2017. doi: 10.1002/jmv.24774; Litvinenko I.V., Krasakov I.V., Bisaga G.N. et al. Modern conception of the pathogenesis of neurodegenerative diseases and therapeutic strategy. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii imeni S.S. Korsakova. 2017;117(6-2):3-10. (In Russ.). doi: 10.17116/jnevro2017117623-10).
Болезнь Альцгеймера является одним из наиболее распространённых нейродегенеративных заболеваний среди людей пожилого возраста и характеризуется нейритными бляшками, основным компонентом которых является пептид бета-амилоид (Аβ).  N-концевая область 1-16 бета-амилоида является металл-связывающим доменом, где цинк (Zn) и медь (Cu) присоединяются к пептиду Аβ (Guilloreau L., Damian L., Coppel Y., et al. (2006). Structural and thermodynamical properties of CuII amyloid-β16/28 complexes associated with Alzheimer’s disease. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry, 11(8), 1024-1038, doi: 10.1007/s00775-006-0154-1). Снижение уровня ионов цинка в крови за счет связывания ионов цинка специфическими хелатирующими агентами и/или блокирование взаимодействий пептида Аβ с ионами цинка может предотвратить патологии, связанные с этими взаимодействиями (Ayton S., Lei P., Bush A. Biometals and Their Therapeutic Implications in Alzheimer’s Disease. Neurotherapeutics. 2015. 12(1): p. 109-120). Высокие концентрации цинка вызывают преципитацию пептида Аβ и влияют на образование в специфических отделах мозга (гиппокамп, кортекс, таламические ядра) внеклеточных агрегатов Аβ (амилоидных бляшек), которые ассоциированы с развитием болезни Альцгеймера ((Frederickson C.J., Bush A.I. (2001). Synaptically released zinc: physiological functions and pathological effects. Biometals, 14(3), 353-366, doi: 10.1023/A:1012934207456). Таким образом, применение ионов цинка в фармацевтических препаратах для лечения нейродегенеративных заболеваний, в частности болезнь Альцгеймера, является нетривиальной решением.
На сегодняшний день нет действующих эффективных препаратов, которые бы излечивали нейродегенеративные заболевания. Из научной и патентной литературы известны ряд пептидов, которые могли бы применяться при лечении таких заболеваний.
2
Из WO 2012/056157 и патента РФ № 2679080 известно соединение, представляющее собой Ac-HAEE-NH (далее – HAEE). В аббревиатуре НАЕЕ буквы означают: Н –гистидин, А – аланин, Е – глутаминовая кислота. НАЕЕ способно ингибировать взаимодействие пептидов Аβ с ионами Zn (II), вызывая уменьшение или предотвращение агрегации пептида Аβ в присутствии ионов Zn (II) при физиологических концентрациях ионов Zn (II) 100-400 мкМ. Более высокие концентрации ионов Zn (II), порядка 1 ммоль (мМ), подавляют взаимодействия между НАЕЕ и 1-16 областью Aβ. Было показано, что инкубация агрегатов Аβ с HAEE в течение минимум 1 часа при 20, 40, 80, 100 и 150 мкМ HAEE приводит к дезагрегации таких агрегатов.
Из патента РФ № 2679059 известно, что несмотря на ингибирование образования амилоидных бляшек, влияние известных препаратов, в частности НАЕЕ, на улучшение когнитивных функций при болезни Альцгеймера в среднем является очень ограниченным и существует необходимость получения альтернативных эффективных средств для лечения болезни Альцгеймера, в том числе за счет снижения или предотвращения связывания ионов Zn(II) с пептидом Аβ. В качестве альтернативного средства для лечения болезни Альцгеймера было предложено использовать пептид с аминокислотной последовательностью (в стандартных однобуквенных кодах) H[isoD][pS]GYEVHH (где isoD обозначает изомеризованный остаток аспарагиновой кислоты, а pS относится к фосфорилированному остатку серина) с открытыми или защищенными концами основной полипептидной цепи.
Из патента РФ № 2709539 известно, что короткие заряженные пептиды типа HAEE имеют очень короткое время жизни в плазме крови (от нескольких секунд до нескольких минут) и с трудом проходят через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), что существенно ослабляет эффективность их терапевтического воздействия. С целью преодоления этих недостатков авторы патента РФ № 2709539 разработали фармацевтическую композицию для доставки HAEE через ГЭБ для лечения нейродегенеративных заболеваний, включая деменцию Альцгеймеровского типа (болезнь Альцгеймера), которая позволяет улучшить фармакокинетические характеристики и увеличить биодоступность HAEE.
Данная композиция содержит эффективное количество субстанции в виде комплекса HAЕЕ с цинком и человеческим сывороточным альбумином (HAEE-Zn-HSA) в форме раствора для введения с фармацевтически приемлемым носителем, выбранным из круга нейтральных носителей и разбавителей, например, в физиологическом растворе. Полученная фармацевтическая композиция позволяет увеличить в пять раз биодоступность субстанции в мозге, увеличить время полувыведения из организма в два раза; улучшить когнитивные функции экспериментальных животных на 20%.
Изобретение по патенту РФ № 2709539 было выбрано в качестве ближайшего аналога, поскольку только оно представляет собой единственный известный для НАЕЕ комплекс. Из патента РФ № 2709539 известно, что с человеческим альбумином (HSA) пептид HAEE в присутствии ионов цинка образует специфический тройной комплекс (HAEE-Zn-HSA). При этом в отсутствии ионов цинка взаимодействий между HAEE и HSA не наблюдалось. Данный комплекс характеризуется тем, что с помощью иона цинка удалось получить межмолекулярное связывание между молекулами НАЕЕ и НSA. Катион цинка является координирующим катионом между этими двумя молекулами. В твердом виде данный комплекс получен не был.
Из патента РФ № 2709539 известно, что фармацевтическая композиция HAEE-Zn-HSA является стабильной в подходящей водной буферной системе, в диапазоне значений pH от 4 до 8, в присутствии или в отсутствии различных солей.
Известно, что заряд альбумина в нейтральной среде равен -1, в щелочной среде равен -2, а в слабокислой среде равен 0 (изоэлектрическое состояние) и альбумин выпадает в осадок (Биохимия с упражнениями и задачами. Под ред. А.И. Глухова, Е.С. Северина. ГЭОТАР-Медиа, Москва. 2019. С.19), поэтому данный комплекс не должен существовать в слабокислой среде при pH 4-5,5.
2
Из патента РФ № 2709539 известно, что для приготовления фармацевтической композиции HAEE-Zn-HSA, пригодной для проведения доклинических исследований, 5 мг HAEE, 600 мг человеческого альбумина и 0,5 мг хлорида цинка (ZnCl) растворяли в 20 миллилитрах физиологического раствора. В качестве источника НАЕЕ использовался лиофилизированный препарат синтетического пептида HAEE (чистота более 98%). При известной молекулярной массе HAEE равной 525,52 г/моль соотношение компонентов в комплексе HAEE-Zn-HSA составляет примерно HAEE : Zn : HSA ~ 1 : 2,6 : 1 по молям.
Недостатком данного изобретения является высокое содержание человеческого альбумина, которое превышает в 120 раз по массе содержание активного вещества НАЕЕ, а также высокое содержание цинка, которое в 2,6 раза превышает по массе содержание активного вещества НАЕЕ и может привести к образованию комплекса с нестехиометрическим соотношением входящих в него компонентов.
Высокие концентрации человеческого альбумина могут оказывать различные негативные эффекты на организм как экспериментальных животных, так и человека (Gales B.J., Erstad B.L. (1993). Adverse reactions to human serum albumin. Annals of Pharmacotherapy, 27(1), 87-94, doi: 10.1177/106002809302700119; Kremer H., Baron-Menguy C., Tesse A. et al. (2011). Human serum albumin improves endothelial dysfunction and survival during experimental endotoxemia: concentration-dependent properties. Critical care medicine, 39(6), 1414-1422, doi: 10.1097/CCM.0b013e318211ff6e). Некоторые образцы HSA, в отличие от бычьего сывороточного альбумина (BSA), при культивировании мышиных эмбрионов не доводили их до стадии бластоцисты (Léveillé M.C., Carnegie J., Tanphaichitr N. (1992). Effects of human sera and human serum albumin on mouse embryo culture. Journal of assisted reproduction and genetics, 9(1), 45-52, doi: 10.1007/BF01204114). HSA может вызывать иммунный ответ у мышей после его введения (Favoretto B.C., Ricardi R., Silva, S.R. et al. (2011). Immunomodulatory effects of crotoxin isolated from Crotalus durissus terrificus venom in mice immunised with human serum albumin. Toxicon, 57(4), 600-607, doi: 10.1016/j.toxicon.2010.12.023).
Известно, что HSA может быть использован для улучшения когнитивных функций при лечении болезни Альцгеймера, однако только при интрацеребровентрикулярном (внутричерепном) введении. Введение HSA в плазму крови может снижать его эффективность (Ezra, A., Rabinovich-Nikitin, I., Rabinovich-Toidman, P., & Solomon, B. (2016). Multifunctional effect of human serum albumin reduces Alzheimer’s disease related pathologies in the 3xTg mouse model. Journal of Alzheimer's Disease, 50(1), 175-188, doi: 10.3233/JAD-150694).
Поэтому уменьшение количества человеческого альбумина или возможность полностью отказаться от него в лекарственном препарате, замена сложного и травмоопасного интрацеребровентрикулярного введения на внутривенное, при одновременном усилении терапевтического эффекта является важной медицинской задачей при лечении нейродегенеративных заболеваний.
Ранее НАЕЕ и комплекс HAEE-Zn-HSA не характеризовались в твердой фазе и их свойства в твердой фазе неизвестны.
Таким образом, задачи, на решение которых направлено изобретение, заключаются в получении нового эффективного цинкового комплекса пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний, в том числе в твердой форме, разработке фармацевтических композиций на его основе и его применении для лечения нейродегенеративных заболеваний.
m
n
В соответствии с настоящим изобретением описывается цинковый комплекс пептида HAEE для лечения нейродегенеративных заболеваний,  который описывается формулой [Zn(НАЕЕ)]X, где Zn представляет собой двухзарядный катион цинка (II), m = 1 для однозарядных и двухзарядных анионов, m = 2 для трехзарядных анионов, HAEE представляет собой синтетический пептид, ацетилированный по N-концу и амидированный по C-концу, с аминокислотной последовательностью His-Ala-Glu-Glu, Х – фармацевтически приемлемый анион, n = 1 для двухзарядных анионов, n = 2 для однозарядных и трехзарядных анионов.
2
3
2
В описываемом комплексе мольное содержание катиона цинка (II) и пептида HAEE является эквимолярным (1:1). Таким образом, если X является однозарядным анионом, то заявляемый цинковый комплекс пептида HAEE описывается формулой [Zn(HAEE)]X. Если X является двухзарядным анионом, то заявляемый цинковый комплекс пептида HAEE описывается формулой [Zn(HAEE)]X. Если X является трёхзарядным анионом, то заявляемый цинковый комплекс пептида HAEE описывается формулой [Zn(HAEE)]X.
Взаимодействие пептида HAEEс цинком наблюдалось и при других молярных соотношениях HAEE: Zn, а именно, в диапазоне от 1:0,1 до 1:10, что связано с наличием множества донорно-акцепторных центров (азот, кислород) в молекуле НАЕЕ и взаимодействие между НАЕЕ и Zn может быть нестехиометрическим. Использование более высокого содержания цинка (>1:10) приводили к получению в твердой форме смеси из цинкового комплекса пептида HAEE и соответствующей соли цинка, при использование малого количества цинка (<1:0,1) его взаимодействие  с пептидом HAEE не фиксировали физико-химическими методами.
В настоящем изобретении было обнаружено, что для усиления терапевтического действия пептида НАЕЕ для лечения нейроденегеративных заболеваний, в частности опосредованно вызываемых воспалительными причинами, нет необходимости использования одновременно ионов цинка и человеческого альбумина. Для улучшения когнитивных функций, нарушенных вследствие нейродегенеративных заболеваний, достаточным является использование только пептида НАЕЕ и цинка в одном комплексе без необходимости использования высоких количеств человеческого альбумина. Также, если использование HAEE-Zn-HSA улучшает фармакокинетические параметры пептида НАЕЕ, то в настоящем изобретении использование цинкового комплекса пептида НАЕЕ для лечения нейродегенеративных заболеваний изменяет механизм действия пептида НАЕЕ, связанный с конформационной структурой пептида HAEE, что приводит к неожиданно высокому терапевтическому эффекту.
Это подтверждается экспериментальным введением нативного пептида НАЕЕ и полученного по данному изобретению цинкового комплекса пептида HAEE в организм экспериментальных животных. Было обнаружено, что 3D-структура нативного пептида НАЕЕ, который в виде водного раствора был помещён на 2 минуты в плазму крови мышей дикого типа, отличается  от 3D-структуры нативного HAEE в исходном водном растворе, что подтверждается методом ВЭЖХ по изменению времени выходa с хроматографической колонки пробы HAEE, экстрагированной из плазмы крови, относительно времени выхода пробы HAEE, экстрагированной из исходного водного раствора. В то же время 3D-структура цинкового комплекса пептида HAEE оставалась неизменной в аналогичных экспериментальных условиях (то есть после экстрагирования из исходного водного раствора цинкового комплекса пептида HAEE и после экстрагирования из плазмы крови мышей дикого типа после 2-х минутной экспозиции) и соответствовала 3D-структуре нативного пептида HAEE, экстрагированного из исходного водного раствора.  По данным масс-спектрометрии химическая структура пептида HAEE во всех экспериментальных пробах сохранялась неизменной как для нативного пептида, так и для пептида в составе цинкового комплекса. Изменение времени выхода нативного пептида HAEE или цинкового комплекса пептида HAEE с хроматографической колонки связано в основном с различиями в гидрофобных взаимодействиях пептида HAEE с материалом колонки, а эти взаимодействия в свою очередь определяются превалирующей 3D-структурой пептида HAEE в конкретной пробе. Таким образом, из полученных экспериментальных данных следует, что 3D-структура пептида HAEE, которая соответствует «развёрнутой» конформации пептида и является превалирующей для нативного пептида HAEE в исходном водном растворе, соответствует 3D-структуре цинкового комплекса пептида HAEE в водном растворе и остаётся неизменной в случае экспозиции цинкового комплекса пептида HAEE в плазме крови, в то время как нативный пептид HAEE в плазме крови утрачивает «развёрнутую» конформацию.
В данном случае термин 3D-структура используется как синоним пространственной структуры или взаимного расположения атомов в молекуле HAEE в трехмерном пространстве. Метод ВЭЖХ основан на преимущественно межмолекулярных взаимодействиях на границе раздела фаз. Изменение времени выхода НАЕЕ с хроматографической колонки отражает изменение межмолекулярных взаимодействий HAEE с сорбентом, что является следствием различий пространственной структуры молекул НАЕЕ в нативном состоянии и в виде цинкового комплекса.
Известно, что нарушение 3D-структуры олигопептидов может приводить к снижению их функций и уменьшению терапевтического действия (Sikora, K., Jaśkiewicz, M., Neubauer, D., Migoń, D., & Kamysz, W. (2020). The role of counter-ions in peptides—an overview. Pharmaceuticals, 13(12), 442.). Ранее было показано, что для оптимального взаимодействия с партнёрами белковой природы пептид HAEE должен находиться в «развёрнутой» конформации (Barykin E. P., Garifulina A. I., Tolstova A. P., Anashkina A. A., Adzhubei A. A., Mezentsev Y. V., Shelukhina I. V., Kozin S. A., Tsetlin V. I., Makarov A. A. Tetrapeptide Ac-HAEE-NH(2) Protects α4β2 nAChR from Inhibition by Aβ // International journal of molecular sciences. ‒ 2020. ‒ T. 21, № 17. ‒ C. 6272; Zolotarev YA, Mitkevich VA, Shram SI, Adzhubei AA, Tolstova AP, Talibov OB, Dadayan AK, Myasoyedov NF, Makarov AA, Kozin SA. Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRα4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood-Brain Barrier. Biomolecules. 2021 Jun 18;11(6):909). В нативном пептиде HAEE имидазольная группа аминокислотного остатка гистидина может образовывать стабильные полярные связи с карбоксильными группами боковых цепей аминокислотных остатков глутаминовой кислоты, что не способствует поддержанию биологически значимой «развёрнутой» конформации данного пептида и, как следствие, снижает полезные терапевтические эффекты HAEE.
Таким образом, одним из преимуществ данного изобретения является повышение терапевтической эффективности цинкового комплекса пептида НАЕЕ вследствие сохранения 3D-структуры данного комплекса в «развернутой» конформации.
Также было обнаружено, что введение в плазму крови мышей комплекса НАЕЕ-Zn-HSA, полученного по описанному в патенте РФ № 2709539 способу, приводит к их стрессу, изменению внешнего вида и даже гибели, что может быть связано с высокой массовой концентрацией HSA в этом комплексе. Напротив, введение в плазму крови здоровых мышей цинкового комплекса пептида HAEE не приводило к каким-либо нарушениям в поведении и в физическом состоянии животных по сравнению с животными контрольной группы, которым вводился физиологический раствор, что указывает на отсутствие побочных эффектов цинкового комплекса пептида HAEE и является дополнительным преимуществом настоящего изобретения.
Таким образом, отличием настоящего изобретения от ближайшего аналога, патента РФ № 2709539, состоит в том, что заявляемый цинковый комплекс не содержит HSA, молярная концентрация ионов цинка в этом комплексе снижена по сравнению с комплексом HAEE-Zn-HSA с 2,6, как описано в примере патента РФ № 2709539, до 1 (эквимолярное количество), как описано в настоящем изобретении.
Изобретение также имеет отношение к применению цинкового комплекса для лечения нейродегенеративных заболеваний, а также патологий, сопровождающихся нейровоспалительными процессами. Заявляемый цинковый комплекс может эффективно влиять на нейродегенеративные заболевания, в частности, вызванные воспалительными причинами, восстанавливая нарушенные когнитивные функции.
Цинковый комплекс может быть использован как в твердой, так и в жидкой форме, сохраняя свою стабильность в течение по меньшей мере 2 лет.
Техническим результатом изобретения является:
- возможность использования заявляемого цинкового комплекса при лечении нейродегенеративных заболеваний, в частности вызванных опосредованно воспалительными причинами, которое приводит к эффективному восстановлению когнитивных функций;
- повышенная стабильность заявляемого цинкового комплекса по сравнению с НАЕЕ;
- устойчивость «развернутой» конформации 3D-структуры заявляемого цинкового комплекса в плазме крови по сравнению с НАЕЕ;
- отсутствие побочных эффектов у заявляемого цинкового комплекса по сравнению с НАЕЕ-Zn-HSA.
Заявляемый в настоящем изобретении цинковый комплекс в соответствии с используемым способом получения может быть получен в аморфной форме, что подтверждается рентгенофазовым анализом (Фиг. 1,2).
Сравнение данных рентгенофазового анализа комплекса НАЕЕ-Zn-HSA нецелесообразно, поскольку при соотношении масс HSA:HAEE ~ 120 на дифрактограмме будет представлен только HSA, а вещество НАЕЕ будет представлено в виде минорной примеси, не проявляющейся на дифрактограмме.
о
о
о
о
о
о
о
о
о
Цинковый комплекс характеризуется кривой дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) с термогравиометрией (ТГ) (ДСК-ТГА). Молекула НАЕЕ на ДСК-кривой характеризуется: широким пиком с началом при 62 С и максимумом при 89 С; двойным пиком плавления при температуре 203 и 227,5 С с началом при 188 С (Фиг. 3). Погрешность при многократном измерении оценивается в ± 3 С. Заявляемый цинковый комплекс на ДСК-кривой характеризуется: широким пиком с началом при 62 С и максимумом при 87 С; широким пиком плавления с началом при 224 С и максимумом при 255 С (Фиг. 4).
ДСК-кривые показывают, что температура плавления цинкового комплекса выше по сравнению с температурой плавления НАЕЕ, что обеспечивает более высокую стабильность комплекса, что подтверждается результатами теста ускоренного хранения.
Сравнение данных ДСК-анализа комплекса НАЕЕ-Zn-HSA нецелесообразно, поскольку при соотношении масс HSA:HAEE > 120 на ДСК-кривой будет представлен только HSA, а вещество НАЕЕ представлено в виде минорной примеси, не проявляющейся на ДСК-кривой.
-1
-1
-1
-1
-1
ИК-спектр с Фурье преобразованием заявляемого цинкового комплекса представлен на Фиг. 5. ИК-спектр комплекса повторяет все основные линии ИК-спектра НАЕЕ. Отличиями в полосах колебаний комплекса по сравнению с НАЕЕ и проявлением их в ИК-спектре являются смещение максимума при 1130 см в область 1115 см (C–N вал.) и новый максимум при 970 см. Таким образом цинковый комплекс, на примере ацетата, отличается от НАЕЕ наличием максимумов при 1115 см и 970 см.
Сравнение ИК-спектра комплекса НАЕЕ-Zn-HSA нецелесообразно, поскольку при соотношении масс HSA:HAEE > 120 на ИК-спектре будет представлен только HSA, а вещество НАЕЕ представлено в виде минорной примеси, не проявляющейся на ИК-спектре.
Заявляемый цинковый комплекс может быть получен в виде лиофилизата методом стандартной сублимационной (лиофильной) сушки.
Получение цинкового комплекса заключается в смешивании водных растворов HAEE и водорастворимой цинковой соли в эквимолярных соотношениях при комнатной температуре, перемешивании в течение 10-60 мин, замораживании раствора и лиофильном высушивании.
Водорастворимые цинковые соли представляют собой нитрат, сульфат, ацетат и хлорид цинка. Для получения цинкового комплекса с другим фармацевтически приемлемым анионом, после перемешивания раствора и перед замораживанием проводится анионно-обменная хроматография или диализ, для удаления первичного аниона. После чего в раствор добавляется другой соответствующий фармацевтически приемлемый анион, раствор замораживается и лиофильно высушивается.
Анионы могут быть одно-, дву- или трехзарядными и выбираться из группы сульфата, ацетата, бензоата, нитрата, салицилата, тартрата, цитрата. Необходимость удаления анионов из раствора обусловлена заменой одного аниона на другой анион. Наличие анионов разной природы в составе комплекса в жидкой или в твердой фазе не влияет на терапевтическую эффективность цинкового комплекса. Предполагается, что только внутренняя сфера цинкового комплекса проявляет терапевтическую эффективность независимо от природы аниона.
Также анионы для цинкового комплекса выбираются из группы глюконата, лактата, трифторацетата, пирувата, галактуроната, бромида, глутарата, сукцината, малеата, фумарата, бензолсульфоната, тозилата и других фармацевтически приемлемых анионов.
Использование каждого из вышеперечисленных анионов для получения цинкового комплекса в твердой фазе методом сублимационной сушки показало, что в таком комплексе может частично оставаться гидратированная или связанная вода, однако, данный комплекс не набирает дополнительную воду при хранении и стабилен в течение длительного времени.
Еще одним объектом изобретения является фармацевтические композиции с эффективным количеством цинкового комплекса и наличием вспомогательных веществ. В качестве лекарственного средства цинковый комплекс может быть использован без вспомогательных веществ в виде лиофилизированной субстанции.
Эффективное количество цинкового комплекса зависит от типа нейродегенеративного заболевания, веса тела, способа введения, поэтому может варьироваться в широких пределах от 0,1 до 100 мг, более желательно от 5 до 50 мг.
Фармацевтическая композиция цинкового комплекса может быть в твердом виде или в виде водного раствора. Твердые композиции цинкового комплекса содержат его эффективное количество и необязательно вспомогательные вещества. Твердая фармацевтическая композиция может быть получена лиофилизацией цинкового комплекса и набором вспомогательных компонентов или добавлением вспомогательных веществ к лиофилизированному цинковому комплексу.
Лиофилизированной цинковый комплекс может быть в аморфной форме, которая соответствует дифрактограмме на Фиг. 1,2.
Вспомогательные вещества выбираются из фармацевтически приемлемых добавок. Такими веществами могут быть маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407, и другие фармацевтически приемлемые добавки.
Фармацевтическая композиция цинкового комплекса в виде водного раствора содержат эффективное количество цинкового комплекса, воду, а также набор фармацевтически приемлемых добавок и солей. Такими веществами могут быть маннитол, повидон К 17, трометамол, динатрия эдетат, натрия хлорид, сахароза, гистидин, полоксамер 407, и другие фармацевтически приемлемые добавки.
Еще одним объектом изобретения является применение цинкового комплекса для лечения нейродегенеративных заболеваний, которое заключается во введении цинкового комплекса в составе описанных фармацевтических композиций пациенту в эффективном количестве. Эффективное количество цинкового комплекса зависит от типа нейродегенеративного заболевания, веса тела, способа введения, поэтому может варьироваться в широких пределах от 0,1 до 100 мг, предпочтительно от 5 до 50 мг.
Введение цинкового комплекса пациенту может осуществляться с помощью всех возможных видов наружного, энтерального, ингаляционного и парентерального способов применения (включая внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, подкожное, накожное, трансдермальное, внутримышечное, интратекальное, субарахноидальное, пероральное, интраназальное, сублингвальное, буккальное, ректальное введение). При введении цинкового комплекса в твердой форме предпочтительным способом введения является сублингвальный. При введении цинкового комплекса в форме раствора предпочтительными способами введения являются внутривенный и интраназальный.
Возможность терапевтического лечения нейродегенеративных заболеваний была показана на примере болезни Альцгеймера, смоделированной на трансгенных мышах линии APPswe/PSEN1dE9 (APP/PS1) (Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., & Borchelt, D. R. (2001). Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomolecular engineering, 17(6), 157-165, doi: 10.1016/S1389-0344(01)00067-3), которые проявляют характерные когнитивные признаки патологии. Данная модель может считаться моделью опосредованного воспалительного действия при нарушении когнитивных функций.
2
В настоящем изобретении цинковый комплекс [Zn(НАЕЕ)](Ac), вводили шестикратно внутривенно в дозе 0,05 мг/кг, после чего проводили валидный тест на когнитивные способности «Закапывание шариков» (англ. Marble Burying Test) [Santana-Santana M., Bayascas J.R., Giménez-Llort L. (2021). Sex-Dependent Signatures, Time Frames and Longitudinal Fine-Tuning of the Marble Burying Test in Normal and AD-Pathological Aging Mice. Biomedicines, 9(8), 994, doi: 10.3390/biomedicines9080994), определяя количество более чем на 2/3 закопанных шариков в процентах от общего количества шариков. Чем больше количество закопанных шариков (КЗШ), тем выше когнитивные способности у мышей.
По результатам тестирования у контрольной группы мышей дикого типа, которым вводили физиологический раствор, значение КЗШ равнялось 50,6 ±13,3 %. Это значение принималось в качестве референсного. У контрольной группы трансгенных мышей линии APP/PS1, которым вводили физиологический раствор, значение КЗШ = 12,6 ±4,2 %, что указывает на сильное ухудшение поведенческих рефлексов трансгенных мышей линии APP/PS1 по сравнению с животными дикого типа и отражает инвалидизирующее влияние оверэкспрессии человеческого бета-амилоида, ассоциированное с нейроваоспалением и образования амилоидных бляшек, на процессы нервной деятельности. Трансгенные мыши линии APP/PS1, инъецированные препаратами HAEE или цинкового комплекса, показали значения КЗШ = 20,6 ±7,3(%) или КЗШ = 45,6 ±11,9(%), соответственно. Эти данные свидетельствуют о том, что использование цинкового комплекса существенно улучшает поведенческие рефлексы трансгенных мышей APP/PS1, а эффект от этого использования значительно превышает таковой, наблюдаемый для HAEE.
Таким образом, заявляемый цинковый комплекс может эффективно применяться при лечении нейродегенеративных заболеваний, в частности вызванными воспалительными осложнениями, восстанавливая когнитивные функции до нормального состояния.
Гистохимический анализ области гиппокампа головного мозга экспериментальных мышей показал, что число бляшек (ЧБ) на один срез мозга у контрольной группы диких мышей равно нулю, у контрольной группы трансгенных мышей APP/PS1 значение ЧБ оказалось равным 31,7 ± 4,9, в группе получавших НАЕЕ значение ЧБ составило 24,7 ± 3,4, в группе получавших цинковый комплекс значение ЧБ составило 8,2 ±2,9.
Таким образом, результаты гистохимического анализа показали, что внутривенные инъекции цинкового комплекса приводили к почти 4-кратному уменьшению амилоидной нагрузки в гиппокампе трансгенных мышей APP/PS1, и по этому показателю эффективность цинкового комплекса примерно в три раза выше таковой, выявленной для HAEE. Для ближайшего аналога HAEE-Zn-BSA данный тест не проводился из-за гибели мышей в группе и нарушения их функционального состояния на ранних этапах исследования.
on
off
D
D
3
-1
-1
-3
-1
-6
-4
В качестве одного из механизмов действия цинкового комплекса на возможность лечения нейродегенеративных заболеваний может являться его связывание с бета-амилоидом. Были рассчитаны кинетические характеристики взаимодействия цинкового комплекса и иммобилизованного человеческого бета-амилоида, которые оказались равны k = (1,37±0,06) × 10 Ms; k = (5,89±0,06) × 10 s; K = (4,3±0,3) × 10 М. Поскольку значение K ≤ 10 М, то такое взаимодействие является биологически значимым.  В отличие от цинкового комплекса, пептид НАЕЕ не связывался с бета-амилоидом в аналогичных экспериментальных условиях.
Это различие между нативным НАЕЕ и цинковым комплексом может влиять на фармакологические свойства, что подтвердили различающиеся тесты восстановления когнитивных функций – эффективность НАЕЕ была значительно ниже эффективности заявляемого цинкового комплекса. Этот эффект можно связать с вышеупомянутыми данными ВЭЖХ-МС, которые показали изменения в 3D структуре нативного НАЕЕ после его введения в плазму крови, тогда как цинковый комплекс до и после его введения в плазму крови имеет одно и то же время удерживания на хроматограмме ВЭЖХ и, соответственно, устойчивую 3D структуру. Это означает, что ион цинка в цинковом комплексе играет защитную роль для сохранения «развёрнутой» конформации пептида HAEE в данном комплексе, что, возможно, также предотвращает взаимодействия цинкового комплекса с элементами плазмы крови, поскольку известно, что введение нативного HAEE в периферическую кровеносную систему мышей, крыс и кроликов приводит к образованию стабильных комплексов HAEE с транспортными и рецепторными белками (Zolotarev Y.A., Mitkevich V.A., Shram S.I. et al. Pharmacokinetics and Molecular Modeling Indicate nAChRα4-Derived Peptide HAEE Goes through the Blood–Brain Barrier. Biomolecules. 2021. 11(6): p. 909, doi: 10.3390/biom11060909).
В совокупности можно сделать вывод о том, что цинковый комплекс имеет намного большую терапевтическую эффективность по сравнению с НАЕЕ и эти вещества между собой бионеэквивалентны, поскольку цинковый комплекс существует в растворе плазмы крови в «развернутой» конформации и имеет отличный от НАЕЕ механизм действия.
Описание фигур.
2
Фиг. 1. Дифрактограмма цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac).
2
Фиг. 2. Дифрактограмма цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)]Cl.
Фиг. 3. ДСК-ТГА кривая НАЕЕ. 1 – ДСК-кривая; 2 – ТГ-кривая.
2
Фиг. 4. ДСК-ТГА кривая цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac) ; 1 – ДСК-кривая; 2 – ТГ-кривая.
2
2
Фиг. 5. ИК-спектр c Фурье преобразованием НАЕЕ (1) и цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac) (2), ([Zn(НАЕЕ)]Cl. (3).
1
Фиг. 6. Расположение атомов в молекуле НАЕЕ для Н-ЯМР-анализа.
1
Фиг. 7. Н-ЯМР спектр НАЕЕ.
1
2
Фиг. 8. Н-ЯМР спектр [Zn(НАЕЕ)](Ac).
Описание приборов.
Порошковый рентгенофазовый анализ (РФА) выполнялся на дифрактометре Rigaku Ultima IV (Япония), напряжение на трубке – 40 кВ, ток трубки – 30 мА, материал анода трубки – Cu. Гониометр: Θ/Θ вертикального типа, образец неподвижен. Радиус гониометра – 185 мм /285 мм. Максимумы на дифрактограмме накапливались в течение 1 ч. Угол 2Θ составил от 3 до 70 градусов.
Исследование температуры плавления, термического поведения и потери массы выполняли методом дифференциальной сканирующей калориметрии и термогравиметрии (ДСК-ТГА) на приборе NETZSCH STA 449 С (Германия) в инертной атмосфере при скорости нагрева 10 град/мин.
2
Элементный анализ выполнен методом энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии с приставкой EDXA на микроскопе TESCAN MIRA3 (Чехия). Площадь измеряемого участка 0,04 мм, количество измерений – 3.
-1
-1
Спектры инфракрасного излучения (ИК-спектры) получали на ИК-Фурье спектрометре Spectrum Two (Perkin Elmer, США) c приставкой диффузного отражения в диапазоне 4000-600 см с разрешением 2 см, количество сканов – 10.
1
1
Н-спектры ЯМР получали на ЯМР-спектрометре Bruker Avance IIIHD 500, рабочая частота 500,13 Mhz для ядер H.
2
Характеризация цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac) в водном растворе проводилась методом масс-спектрометрии высокого разрешения с использованием масс-спектрометра LTQ FT Ultra (Thermo Scientific, Германия), который сочетает в себе технологии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье и ионной ловушки. Ионизацию электрораспылением (ESI) проводили с использованием источника Ion Max (Thermo Scientific, Германия) с металлическим капилляром для распыления. Использовались следующие параметры источника IonMax: скорость потока составляла 3 мкл/мин; температура нагретого капилляра составляла 200°C; распыляемый газ был отключен; напряжение на капилляре электрораспыления составляло +3,8 кВ в положительной моде и -2,5кВ в отрицательно моде. Идентификация молекулярных ионов проводилась с помощью специализированного программного обеспечения Qual Browser (Thermo Corp., Germany). Возможность характеризации катионных комплексов пептидов с помощью метода масс-спектрометрии была ранее описана (Zirah S., Rebuffat S., Kozin, S.A. et al (2003). Zinc binding properties of the amyloid fragment Aβ(1–16) studied by electrospray-ionization mass spectrometry. International Journal of Mass Spectrometry, 228(2-3), 999-101.
Образование комплекса фиксировали биосенсором на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (БППР) в водных буферных системах при физиологических значениях pH. БППР эксперименты были проведены на инструменте «BIAcore 3000» (GE Healthcare, США) с использованием оптического чипа CM4 в соответствии с протоколами компании-производителя. Синтетический аналог 42-членного человеческого бета-амилоида (Aβ42), на C-конце которого добавлен тетраглицилцистеиновый пептидный фрагмент (-Gly-Gly-Gly-Gly-Cys), был использован в качестве лиганда. Лиганд  (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIAGGGGC) иммобилизовали на поверхности оптического чипа через дисульфидную связь тиоловой группы С-концевого остатка цистеина. В качестве аналитов использовали цинковый комплекс или HAEE.
Высушивание замороженных образцов выполнялось в пенициллиновых пузырьках на сублиматоре Heto FD 2.5 при давлении 0,1-0,2 мбар.
о
Тест ускоренного хранения проводили в камере Memmert HCP50 при 40 С и 75% влажности. Образцы отбирали раз в месяц в течение 6 месяцев и определяли содержание действующего вещества методом ВЭЖХ.
Варианты осуществления изобретения
Изобретение иллюстрируется нижеприведенными примерами, но не ограничивается ими.
Пример 1.
.
Получениецинкового комплекса пептида HAEE
Для получения комплекса в качестве источника цинка использовались ацетат, хлорид, сульфат и нитрат цинка в разных соотношениях. В таблице 1 приведены различные соотношения солей цинка для получения комплекса.
-5
-3
о
Для получения комплекса готовили раствор НАЕЕ с концентрацией 10 М. В него добавляли раствор соли цинка с концентрацией 10 М (Таблица 1). Перемешивание осуществляли в течение 5-60 мин. Эквимолярные цинковые комплексы образовывались при молярном соотношении НАЕЕ и соли цинка равные 1:1. Раствор медленно замораживали в холодильной установке при -20 или -80 С и затем осуществляли лиофильную сушку в стандартном режиме. Далее детально изучали свойства полученного лиофилизированного цинкового комплекса.
При молярном соотношении компонентов менее 0,1 комплекс в растворе не обнаруживался методом ЯМР (сигналы основного вещества не смещались). При увеличении концентрации соли цинка более 1:10 образовывались смесь из цинкового комплекса и соответствующей соли цинка.
При получении цинкового комплекса с анионом, который изначально мало или совсем не растворяется в воде (например, тартрат цинка, цитрат цинка и т.п.) использовали на первой стадии водорастворимую соль цинка (нитрат, ацетат, хлорид, сульфат), анион удаляли известным способом – анион-обменной хроматографией или диализом и добавляли в раствор другое соединение – винную кислоту, лимонную кислоту и т.п в эквимолярных количествах. После чего совершали аналогичные операции по замораживанию и лиофильному высушиванию цинкового комплекса.
m
n
Таким образом, получение цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)]X, где Х - бензоат, салицилат, тартрат, цитрат и т.п. осуществляли в три этапа. Сначала готовили раствор цинкового комплекса по описанным в Таблице 1 соотношениям, затем хроматографически отделяли неорганические анионы и добавляли для получения бензоата – бензойную кислоту, салицилата – салициловую кислоту, тартрата – винную кислоту, цитрата – лимонную кислоту в эквимолярных количествах.
о
Для получения цинкового комплекса в твердой форме полученные растворы замораживали в морозильной камере (-20 С) в пенициллиновых пузырьках в течение 2 ч. Замороженные образцы помещали в сублиматор с предварительно охлажденными полками и высушивали в течение 16-30 ч. Все высушенные образцы имели белый цвет. Выход продукта 99%. Высокий выход продукта обусловлен отсутствием потерь при высушивании образцов.
о
о
о
о
о
Полученные твердые образцы комплекса характеризуются аморфной формой на дифрактограмме (Фиг. 1,2). На ДСК кривой в отличие от НАЕЕ (Фиг. 3) комплекс характеризуется широким пиком с началом при 62 С и максимумом при 87 С; широким пиком плавления с началом при 224 С и максимумом при 255 С (Фиг. 4). Методом ДСК-ТГА было показано, что цинковый комплекс в твердой форме может содержать гидратированную или остаточную воду, содержание которой для разных образцов не превышало 5% (потеря массы при нагревании до 100 С).
Элементный анализ (EDXA) цинкового комплекса показал содержание цинка в образцах (при молекулярном соотношении НАЕЕ : Zn = 1:1), от 5±0,5 до 10±1 % масс. в зависимости от  природы аниона.
-1
-1
ИК-спектр с Фурье преобразованием комплекса характеризуется наличием максимумов при 1115 см и 970 см (Фиг. 5), что отличает заявляемый цинковый комплекс от НАЕЕ.
1
2
3
3
2
2
3
2
2
2
2
Исходный образец НАЕЕ характеризовался ЯМР H[500.13Mhz; DO; 298K; d, м.д.]:1.27 (3H, d, j=7.13Hz, CH(16)), 1.87 (5H, m, CH(3), 1/2CH(21),1/2CH(33)), 1.92 (0.22H, s, CH(Imp. - Ac)), 1.99 (2H, sx, j=7.45Hz 1/2CH(21),1/2CH(33)), 2.28 (4H, m, 2CH(22,34 )), 3.13, 3,03 (2H, m, CH(8)), 4.19 (3H, m, 3CH (15,20,29)), 4.56 (1H, t, j=6.86Hz, CH(5)), 7.19 (1H, s, CH(10)), 8.50 (1H, s, CH(12)) (Фиг. 6,7).
2
2
3
1
После образования цинкового комплекса положение химических сдвигов протонов в молекуле НАЕЕ изменялась и представлено на Фиг. 8, что свидетельствует о сохранении комплекса после его растворения в воде, что важно для фармакологических свойств полученного комплекса. Так, сигнал при СН(12) смещался с 8,5 до 8,42 м.д., при CH(10) с 7.19 до 7,14 м.д., при CH(8) с 3,13 и 3,03 до 3,10 и 3,01, при 2CH(22,34 ) с 2,28 до 2,21, при CH(16) с 1,27 до 1,26 (Таблица 2). Смещение протонных сигналов от определенных групп в молекуле показывает их вклад в электростатическое взаимодействие с ионом цинка при образовании комплекса; чем больше взаимодействие, тем большее смещение наблюдается в Н-ЯМР-спектре у определенных СН-групп молекулы. Поэтому наибольшее взаимодействие наблюдается у СН(12) группы имидазола гистидинового фрагмента и α-групп (22, 34) глутаминовых фрагментов, что связано с координированием -СООН групп глутаминовой кислоты.
1
3
При наличии в твердой фазе ацетата, бензоата, салицилата, тартрата в Н-ЯМР-спектре цинкового комплекса помимо молекулы НАЕЕ фиксировались сигналы от этих анионов, например от ацетата (СН - 1,92 м.д.).
2
2
2
2
+1
+1
-1
-1
2+
Характеризация цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac) в водном растворе проводилась методом масс-спектрометрии высокого разрешения с использованием технологии ионного циклотронного резонанса с преобразованием Фурье путем измерения точной массы характерных молекулярных ионов как при положительной, так и при отрицательной модах ионизации. Для проведения измерений образцы цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac) в водном растворе c концентрацией 20 мкМ вносили в смесь воды и ацетонитрила в соотношении 1:1 с добавлением муравьиной кислоты (для достижении финальной концентрации 0,1%). Масс-спектрометрический анализ водного раствора цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac), проведенный при положительной моде электроспрейного ионизационного источника, показал наличие молекулярного иона [HAEE+H] с моноизотопной массой 526,2270 m/z и молекулярного иона [HAEE-H+Zn] с моноизотопной массой 588,1449 m/z. При использовании отрицательной моды электроспрейного ионизационного источника для анализа цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)](Ac) в водном растворе были идентифицированы молекулярный ион [HAEE-H] с моноизотопной массой 524,2189 m/z и молекулярный ион [HAEE-3H+Zn] с моноизотопной массой  586,1345 m/z. Таким образом, полученные данные подтверждают специфическое связывание катиона цинка (II) с пептидом HAEE, которое характеризует внутреннюю координационную сферу цинкового комплекса [Zn(НАЕЕ)] в водном растворе.
in vitro
in vitro
2
Сравнительный анализ цинкового комплекса методом ВЭЖХ-МС (2,5 нг/мл, 0,5% FA – муравьиная кислота, 50% МеОН (1:1)) показал, что в водных растворах  при физиологических значениях pH его хроматографическая подвижность практически идентична HAЕЕ в тех же хроматографических условиях. Время выхода хроматографического пика с колонки составляло 2,77 и 2,85 мин, соответственно. С учетом известных из литературы данных молекулярного моделирования (Barykin E.P., Garifulina A.I., Tolstova A.P. et al. (2020). Tetrapeptide Ac-HAEE-NH Protects α4β2 nAChR from Inhibition by Aβ. International journal of molecular sciences, 21(17), 6272, doi: 10.3390/ijms21176272), вышеприведённые результаты указывают на то, что пространственные структуры основной пептидной цепи цинкового комплекса и пептида HAEE в условиях  идентичны и характеризуется «развернутой» конформацией.
После введения цинкового комплекса HAEE внутривенно в организм здоровых мышей (n = 5) было показано, что время выхода хроматографического пика НАЕЕ, экстрагированного из образцов крови мыши, не изменялось и также составляло 2,77 мин. Однако, для HAEE, введенного в организм в нативной форме, экстрагированного из образцов крови, было неожиданно обнаружено, что время выхода хроматографического пика стало 1,27 мин. Только около 8% вещества продолжало выходить из колонки на времени 2,85 мин.
Полученные данные свидетельствует о том, что в образцах крови человека или мыши конформация пептида HAEE резко отличается от конформации, наблюдаемой при тех же условиях для цинкового комплекса. Лишь 8% НАЕЕ находится в «развернутой» конформации после его взаимодействия с элементами плазмы крови. Таким образом, в образцах крови цинковый комплекс сохраняет свою конформацию (предположительно, «развёрнутую») неизменной, в то время как HAEE приобретает иную конформацию, которая характеризуется гораздо более компактной структурой, предположительно, «спиральной». Это означает, что цинковый комплекс устойчив к изменению конформации в плазме крови. Согласно настоящему изобретению, для достижения терапевтического эффекта как от цинкового комплекса пептида HAEE, так и от HAEE требуется их введение в организм и присутствие в плазме крови, поэтому принципиальные различия в пространственной структуре этих молекул в плазме крови, исходя из общих представлений биохимии и физиологии, свидетельствуют о различном молекулярном механизме действия цинкового комплекса и HAEE, что исключает их биоэквивалентность.
Была определена стабильность цинкового комплекса в тесте ускоренного хранения в течение 6 месяцев, что соответствует 2 годам хранения в обычных условиях (Таблица 3). Цинковый комплекс, как очищенный от анионов, так и в смеси с указанными анионами за время хранения сохранил свой цвет, консистенцию, не набирал воды (масса образца не увеличивалась в пределах 1-2%) и не терял активное вещество. Образец НАЕЕ с течением времени набирал воду (до 7% масс.) и по данным ВЭЖХ деградировал до 67,4% активного вещества за 6 мес. Образец, полученный по патенту РФ № 2709539, представляющий собой комплекс НАЕЕ-Zn-HSA также набирал воду (до 16% масс.) и деградировал до содержания 71,9% от исходного количества. Таким образом, стабильность заявляемого цинкового комплекса оказалась значительно выше по сравнению с НАЕЕ и НАЕЕ-Zn-HSA.
Пример 2.
Фармацевтические композиции на основецинкового комплекса пептида HAEE.
Фармацевтические композиции на основе цинкового комплекса пептида HAEE могут содержать активное вещество в эффективном количестве (Таблица 4). Состав дозы рассчитывается индивидуально и может варьироваться от 0,1 мг до 100 мг на человека в сутки, более предпочтительно от 1 до 50 мг. Составы фармацевтических композиций представлены в Таблице 3. Пересчет выполнен на дозировку активного вещества. Возможны и другие соотношения активного вещества в фармацевтической композиции в диапазоне от 0,1 до 100 мг. Масса таблеток варьируется от 100 до 400 мг, таблетки могут быть покрыты оболочкой.
Пример 3.
Влияние цинкового комплекса пептида HAEE на поведенческие функции и степень тяжести церебрального амилоидоза у экспериментальных животных.
Для моделирования нейродегенеративного заболевания была выбрана модель болезни Альцгеймера, являющейся основным по распространённости нейродегенеративным заболеванием у людей пожилого возраста.
Для проведения экспериментов были использованы самцы трансгенных мышей линии APPswe/PSEN1dE9. Мыши данной линии также известны под названием APP/PS1: у контрольной группы мышей APP/PS1, начиная с 4-6-месячного возраста, проявляются характерные когнитивные признаки патологии, подобной болезни Альцгеймера, и имеется значительное количество конгофильных амилоидных бляшек в специфических отделах мозга, включая гиппокамп и кортекс (Borchelt D.R., Ratovitski T., Van Lare J., et al. (1997). Accelerated amyloid deposition in the brains of transgenic mice coexpressing mutant presenilin 1 and amyloid precursor proteins. Neuron, 19(4), 939-945, doi: 10.1016/S0896-6273(00)80974-5).
Для тестирования были использованы 8-месячные животные, сгруппированные в следующие экспериментальные группы (n = 12 в каждой группе):
1. контроль 1. Мыши дикого типа, которым внутривенно вводили физиологический раствор;
2. контроль 2. Трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили физиологический раствор;
3. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили HAEE;
4. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили HAEE-Zn-HSA (1:2,6);
2
5. трансгенные мыши APP/PS1, которым внутривенно вводили [Zn(НАЕЕ)](Ac).
Препараты HAEE, HAEE-Zn-HSA и заявляемый цинковый комплексвводили в ретроорбитальное венозное сплетение в соответствии с известной процедурой (Yardeni T., Eckhaus M., Morris H.D. et al. (2011). Retro-orbital injections in mice. Lab animal, 40(5), 155-160, doi: 10.1038/laban0511-155). Инъекции в дозе 0,05 мг/кг проводили ежемесячно, в возрасте от 2 до 7 месяцев (включительно), всего было сделано 6 инъекций препаратами HAEE и цинкового комплекса, однако, препаратом HAEE-Zn-HSA было сделано только две инъекции, а далее эксперименты с этим препаратом были прекращены из-за появления признаков ухудшения внешнего вида экспериментальных животных после первой инъекции и гибели 5 трансгенных мышей непосредственно после второй инъекции. Скорее всего, это связано с влиянием высоких концентраций HSA, который отличается по структуре от эндогенного мышиного альбумина (MSA).
В возрасте 8 месяцев проводили тестирование поведенческих функций, затем животные подвергались эвтаназии с последующим забором мозга и гистохимическим анализом числа конгофильных бляшек в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа согласно известной процедуре (Kozin S.A., Barykin E.P., Telegin G.B., et al. Intravenously Injected Amyloid-β Peptide With Isomerized Asp7 and Phosphorylated Ser8 Residues Inhibits Cerebral β-Amyloidosis in AβPP/PS1 Transgenic Mice Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in neuroscience, 2018, 12, 518-518, doi: 10.3389/fnins.2018.00518).
3.1 Анализ улучшения поведенческих функций
у 8-месячных самцов трансгенных мышей APP/PS1 под действием HAEE и цинкового комплекса пептида HAEE был проведён с помощью теста «Закапывание шариков». В качестве контроля использовались трансгенные мыши APP/PS1 и мыши дикого типа.  Для проведения теста мышей помещали в клетки со свежим подстилом с размещенными на нем восемнадцатью шариками, расположенными в виде матрицы 3 х 6. Мышей оставляли в клетке на 30 минут, после чего определяли количество более чем на 2/3 закопанных шариков (КЗШ) в процентах от общего количества шариков. Поведение закапывания является признаком обсессивно-компульсивного поведения. Из-за повторяющегося и персеверативного характера закапывания такое поведение может представлять нейропсихиатрические симптомы, такие как персеверативное поведение и/или стереотипное поведение. Оба являются нейропсихиатрическими симптомами, обычно присутствующими у пациентов с болезнью Альцгеймера и другими видами деменции.
По результатам тестирования, уровень поведения контрольной группы мышей дикого типа характеризовался значением КЗШ = 50,6 ±13,3 %. Это значение рассматривается в качестве референсного. У контрольной группы трансгенных мышей APP/PS1 значение КЗШ = 12,6 ±4,2 %, что указывает на сильное ухудшение поведенческих рефлексов мышей APP/PS1 по сравнению с животными дикого типа и отражает инвалидизирующее влияние оверпродукции человеческого бета-амилоида на процессы нервной деятельности. Мыши, инъецированные HAEE и цинковым комплексом пептида HAEE, показали значения КЗШ = 20,6 ±7,3 % и КЗШ = 45,6 ±11,9 %, соответственно (Таблица 5).
Эти данные свидетельствуют о том, что использование цинкового комплекса пептида HAEE существенно улучшает поведенческие рефлексы трансгенных мышей APP/PS1, а эффект от этого использования значительно превышает таковой, наблюдаемый для HAEE. Сравнительные эксперименты цинкового комплекса с другими анионами не выявили статистически значимых различий в биологическом эффекте. Введение ближайшего аналога HAEE-Zn-HSA приводило к нарушению физического состояния у мышей и к их гибели, что, по-видимому, связано с высокой дозировкой НSA.
3.2. Гистохимический анализ конгофильных амилоидных бляшек
в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа был проведен согласно ранее описанным процедурам (Kozin S.A., Barykin E.P., Telegin G.B., et al. Intravenously Injected Amyloid-β Peptide With Isomerized Asp7 and Phosphorylated Ser8 Residues Inhibits Cerebral β-Amyloidosis in AβPP/PS1 Transgenic Mice Model of Alzheimer's Disease. Frontiers in neuroscience, 2018, 12, 518-518, doi: 10.3389/fnins.2018.00518). Мозг мышей извлекали и фиксировали в 10% формалине. Процесс заливки образца в парафин проводили следующим образом: заливали 75% этанолом и оставляли на ночь, далее сменяли на 96% этанол и выдерживали 5 мин, 96% этанол – 10 мин, 100% этанол – 10 мин (две замены), этанол-хлороформ (1:1) – 30 мин, и оставляли в чистом хлороформе на ночь. Заливку парафином проводили при 60°С в течение 3 ч (три смены). Заливку тканей в парафиновые блоки осуществляли на приборе Leica EG1160. Серийные срезы головного мозга (8 мкм) вырезали с помощью микротома Leica RM2265 и помещали на предметные стекла. Для депарафинизации, гидратации и окрашивания срезов проводили следующие этапы: предметные стекла последовательно помещали в ксилол три смены (по 10 минут), 96% этанол – 5 мин, 90% этанол – 2 мин, 75% этанол – 2 мин, вода – 5 мин (три смены), раствор конго красного –  5 мин, далее добавлялся раствор гидроксида калия и вода. Для монтирования использовали среду ImMu-Mount (Thermo Scientific). Срезы, охватывающие область мозга от 0,48 до 1,92 мм относительно средней линии в латеральных стереотаксических координатах (Franklin K., Paxinos, G. (2008). The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. New York, NY: Academic Press), использовали для количественного определения конгофильных амилоидных бляшек в гиппокампе. Анализировали каждый 15-й срез, что давало 10 срезов на животное. Амилоидные бляшки идентифицировали окрашиванием конго красным и подсчитывали вручную. Для каждой группы мышей рассчитывали средние значения и стандартное отклонение количества бляшек на 1 срез. Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. Для попарного сравнения исследуемых групп использовали критерий Манна-Уитни. Применяемый уровень значимости составлял 99,9% (P <0,001).
У контрольной группы мышей дикого типа (группа 1) никаких амилоидных бляшек обнаружено не было (Таблица 4). Конгофильные амилоидные бляшки, визуализированные в областях СА1, СА2, СА3 и зубчатой извилине гиппокампа головного мозга трансгенных животных были сходны по локализации и распределению размеров в паренхиме головного мозга. Однако, количественная оценка амилоидных бляшек выявила существенные различия между группами. В контрольной группе 2 (трансгенные мыши APP/PS1) среднее число бляшек в областях на один срез мозга (ЧБ) составляло ЧБ = 31,7 ± 4,9. В группе 3, где трангсенным мышам APP/PS1 вводили HAEE, ЧБ = 24,7 ± 3,4. В группе 4, в которой трансгенным мышам APP/PS1 вводили заявляемый цинковый комплекс, ЧБ = 8,2 ±2,9. Таким образом, результаты гистохимического анализа показали, что внутривенные инъекции цинкового комплекса приводили к почти 4-кратному уменьшению амилоидной нагрузки в гиппокампе трансгенных мышей APP/PS1, и по этому показателю эффективность цинкового комплекса примерно в три раза выше таковой, выявленной для HAEE.
Пример 4.
Специфическое связывание цинкового комплекса пептида HAEE с человеческим бета-амилоидом (Aβ42).
D
D
-4
Дополнительно была проведена оценка связывания заявляемого цинкового комплекса с бета-амилоидом как одного из механизмов действия данного комплекса при нейродегенеративных поражениях, связанных с бета-амилоидом. Образование комплексов между находящимся в растворе аналитом (заявляемый цинковый комплекс или HAEE) и иммобилизованным 42-членным человеческим бета-амилоидом (лигандом) было исследовано с помощью БППР. По результатам таких экспериментов рассчитывали кинетические параметры взаимодействий и значение константы диссоциации (K) взаимодействия цинкового и иммобилизованного лиганда. Если значение K ≤ 10 М, то взаимодействие между цинковым комплексом и бета-амилоидом является биологически значимым.
on
off
D
3
-1
-1
-3
-1
-6
Взаимодействий между HAEE и лигандом обнаружено не было. Напротив, при введении цинкового комплекса пептида HAEE было обнаружено его взаимодействие с иммобилизованным Aβ42 при его различных концентрациях 150, 300, 500, 1000, 1500 мкМ. На основании полученных данных были рассчитаны кинетические характеристики взаимодействия цинкового комплекса пептида HAEE с иммобилизованным бета-амилоидом Aβ42: k = (1,37±0,06) × 10 Ms; k = (5,89±0,06) × 10 s; K = (4,3±0,3) × 10 М. Кинетические характеристики оставались в этих же значениях пределах погрешности при исследовании цинкового комплекса с разным набором анионов – нитрат, ацетат, хлорид, сульфат, тартрат, цитрат, салицилат.
Таким образом, на основании вышеприведенных результатов доказано образование стабильных межмолекулярных комплексов между 42-членным человеческим бета-амилоидом (Aβ42) и цинковым комплексом пептида HAEE. В отличие от цинкового комплекса пептида HAEE, нативный пептид HAEE в идентичных экспериментальных условиях не взаимодействует с Aβ42.
Полученные в данном Примере настоящего изобретения результаты указывают на отсутствие способности HAEE связываться с Aβ42. Напротив, цинковый комплекс пептида HAEE связывается с Aβ42. Несмотря на то, что и HAEE и заявляемый цинковый комплекс при введении в кровеносную систему трансгенных мышей APP/PS1 улучшают когнитивные функции и снижают количество амилоидных бляшек у экспериментальных животных (Примеры 3.1  и 3.2 настоящего изобретения), полученные результаты свидетельствует о различных молекулярных механизмах терапевтического воздействия HAEE и заявляемого цинкового комплекса, что, в свою очередь, исключает биоэквивалентность HAEE и заявляемого цинкового комплекса при их использовании для лечения нейродегенеративных заболеваний.
Таблица 1. Объемы реагентов для приготовления цинковых комплексов HAEE с различными анионами.
Молярное соотношение веществ
Объём раствора НАЕЕ с концентрацией 10<sup>-5</sup> М в мл
Объем раствора соли с коцентрацией 10<sup>-3</sup> М в мкл
HAEE + Zn(CH<sub>3</sub>COO)<sub>2 </sub>(1:1)
0,5
5
HAEE + Zn(CH<sub>3</sub>COO)<sub>2</sub> (1:10)
0,4
40
HAEE + Zn(CH<sub>3</sub>COO)<sub>2 </sub>(1:0,1)
0,5
0,5
HAEE + ZnCl<sub>2  </sub>(1:1)
0,4
4
HAEE + ZnSO<sub>4 </sub>(1:1)
0,5
5
HAEE + Zn(NO<sub>3</sub>)<sub>2 </sub>(1:1)
0,4
4
1 стадия: HAEE + Zn(CH<sub>3</sub>COO)<sub>2 </sub>(1:1)2 стадия: анион-обменная хроматография.3 стадия: добавление лимонной кислоты
0,5
5 мкл - Zn(CH<sub>3</sub>COO)<sub>2</sub>;15 мкл - лимонная кислота (с = 10<sup>-3</sup> М)
1
Таблица 2. Смещение сигналов протонов в Н-ЯМР-спектре заявляемого цинкового комплекса по сравнению c HAEE.
Номер СН-группы в молекуле НАЕЕ (Фиг. 6)/принадлежность аминокислоте
Сигнал в молекуле НАЕЕ, м.д. (Фиг. 7)
Сигнал в цинковом комплексе, м.д. (Фиг. 8)
Разница сигнала, Δ
His1
8
3.03/3.13
3.01/3.10
0.02/<b><u>0.03</u></b>
10
7.19
7.14
<b></b><b><u>0.03</u></b><b></b>
12
8.5
8.42
<b></b><b><u>0.08</u></b><b></b>
Glu3/Glu4
22, 34
2.28
2.21/2.23
<b></b><b><u>0.07</u></b><b></b>
Ala2
16
1.27
1.25
CαH: 15(Ala) 20(Glu) 29(Glu)
4.19
4.21
0.02
CβH2: 21(Glu), 33(Glu)
1.99
1.96
<b></b><b><u>0.03</u></b><b></b>
3 (Ас)
1.87
1.88
0,01
о
Таблица 3. Данные по стабильности цинкового комплекса пептида HAEE в тесте ускоренного хранения (40 С, 75% влажности).
Образец
Срок хранения, мес
0
1
2
3
5
6
Содержание действующего вещества в % (метод ВЭЖХ), погрешность 1%
[Zn(HAEE)](Ac)<sub>2</sub>
100,0
100,1
99,4
99,8
100,5
99,4
[Zn(HAEE)]SO<sub>4</sub>
100,0
99,5
99,7
100,4
99,7
100,1
[Zn(HAEE)](NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>
100,0
100,1
100,2
99,4
99,8
100,0
[Zn(HAEE)]Cl<sub>2</sub>
100,0
100,3
100,1
100,0
99,4
99,9
[Zn(HAEE)](тартрат)
100,0
99,8
100,0
100,3
100,1
99,8
[Zn(HAEE)](бензоат)<sub>2</sub>
100,0
99,7
100,4
99,7
100,1
100,2
[Zn(HAEE)](салицилат)<sub>2</sub>
100,0
99,8
99,7
100,4
99,7
99,8
[Zn(HAEE)](сукцинат)
100,0
99,4
99,6
99,5
99,5
99,7
[Zn(HAEE)]<sub>3</sub>(цитрат)<sub>2</sub>
100,0
99,1
99,2
99,9
100,1
99,4
НАЕЕ
100,0
94,6
85,2
77,1
72,7
67,4
НАЕЕ-Zn-HSA (1:2,6)
100,0
92,1
83,5
77,3
72,1
71,9
Таблица 4. Состав фармацевтических композиций с цинковым комплексом пептида HAEE. В/м – внутримышечное введение, в/в – внутривенное введение.
№
Кол-во комплекса (в пересчете на НАЕЕ), мг
Форма
Вспомогательные вещества
0,1
лиофилизат
–
0,5
лиофилизат
–
1
лиофилизат
–
5
лиофилизат
–
10
лиофилизат
–
25
лиофилизат
–
50
лиофилизат
–
100
лиофилизат
–
0,1
лиофилизат
маннитол – 0,1 мгповидон К 17 – 0,1 мг
10
лиофилизат
маннитол –1 мгповидон К 17 – 1 мг
50
лиофилизат
маннитол –10 мгповидон К 17 – 17 мг
100
лиофилизат
маннитол –100 мгповидон К 17 – 104 мг
5
таблетка
лактозы моногидрат - 71 мг, целлюлоза микрокристаллическая – 100 мг, магния стеарат – 0,5 мг
10
таблетка
лактозы моногидрат - 95 мг, целлюлоза микрокристаллическая – 140 мг, магния стеарат – 0,5 мг
25
таблетка
лактозы моногидрат - 105 мг, целлюлоза микрокристаллическая – 180 мг, магния стеарат – 0,5 мг
0,1
жидкая, для в/в
набор солей для поддержания осмотического давления 290-310 мОсм/л,вода до 100%
0,5
жидкая, для в/в
0,9% - хлорид натрия0,1 М раствор натрия гидроксида - до pH 5,0 - 7,5вода – до 100%
1
жидкая, р-р для в/м
0,9% - хлорид натрия0,1 М раствор хлористоводородной кислоты -до pH 5,0-7,5вода – до 100%
5
жидкая, р-р для в/в
Аналогично примеру 17
10
жидкая, р-р для в/м
Аналогично примеру 18
25
жидкая, р-р для в/м
Аналогично примеру 17
50
жидкая, р-р для в/м
Аналогично примеру 18
100
жидкая, р-р для в/в
– Аналогично примеру 18
1
жидкая, ингаляционная
0,9% - хлорид натрия,регулятор pH до 5,5-7сахароза – до 5%,гистидин, полоксамер 407 – до 1%вода – до 100%
5
жидкая, интроназальная
Аналогично примеру 24
10
жидкая, р-р для в/в
Аналогично примеру 24
25
Жидкая, р-р для в/в
Аналогично примеру 24
10
жидкая ингаляционная
0,9% - хлорид натрия,регулятор pH до 5,5-7,5вода – до 100%
100
жидкая, интроназальная
Аналогично примеру 28
1
Жидкая, в/в или в/м
маннитол – 0,5 мг;трометамол – 12 мг;динатрия эдетат - 1 мгвода – до 100%
Таблица 5. Влияние цинкового комплекса пептида HAEE на когнитивные функции у мышей в тесте «закапывание шариков» и на количество амилоидных бляшек. Применяемый уровень значимости составлял 99,9% (P <0,001).
№
Группа животных
Количество закопанных шариков более чем на 2/3 (КЗШ), %
Количество амилоидных бляшек на 1 срез мозга, гистологический анализ
1.
Группа 1. Контроль 1. Мыши дикого типа, физиологический раствор
50,6 ±13,3
отсутствуют
2.
Группа 2. Контроль 2. Трансгенные мыши APP/PS1, физиологический раствор
12,6 ±4,2
31,7 ± 4,9
3.
Группа 3. Трансгенные мыши APP/PS1, в/в HAEE 0,05 мг/кг
20,6 ±7,3
24,7 ± 3,4
4.
Группа 4. трансгенные мыши APP/PS1, в/в [Zn(НАЕЕ)](Ac)<sub>2</sub>, 0,05 мг/кг
45,6 ±11,9
8,2 ±2,9
5.
Группа 5. Трансгенные мыши APP/PS1, в/в HAEE-Zn-HSA (1:2,6), 0,05 мг/кг
-(побочные действия, гибель животных)
–