Способ дифференциации штаммов Francisella tularensis путем молекулярно-генетического типирования
DIFFERENTIATION OF FRANCISELLA TULARENSIS STRAINS BY MOLECULAR GENETIC TYPING

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии, а именно к способам молекулярно-генетического типирования штаммов возбудителей инфекционных заболеваний, которые используются при микробиологическом и молекулярно-генетическом мониторинге штаммов F. tularensis, циркулирующих на различных территориях, с целью их дифференциации.
Francisella tularensis, этиологический агент туляремии, относится к факультативным внутриклеточным патогенам, вызывающим тяжелое заболевание у многих видов животных и человека [1], и является агентом биотерроризма категории А [2]. В настоящее время F. tularensis делится на четыре подвида: F. tularensis subsp. tularensis(nearctica), F. tularensis subsp. holarctica, F. tularensis subsp. mediasiatica, F. tularensis subsp novicida, которые различаются по своей патогенности и географическому распределению [3]. Исторически такое разделение было обусловлено различным ареалом циркуляции штаммов, их отличиями в биохимической активности и патогенностью для разных хозяев [4, 5]. F. novicida, официально признанная четвертым подвидом вида F. tularensis, обладает высокой гомологией ДНК с другими подвидами F. tularensis, но не является возбудителем типичной туляремийной инфекции [3]. Высоковирулентные штаммы F. tularensis subsp. tularensis (тип А) распространены только в Северной Америке, а менее патогенные штаммы F. tularensis subsp. holarctica (тип В) циркулируют, в основном, в Северном полушарии. F. tularensis subsp. mediasiatica по степени вирулентности близка F. tularensis subsp. holarctica, но географически ограничена только Центральной Азией [3]. Однако недавно выявлено расширение ареала ее обитания с изоляцией штаммов на территории РФ [6]. F. tularensis subsp. novicida относится к слабо патогенному для человека подвиду, который редко выделяется в Северной Америке [3] и в одном случае в Австралии [7]. Как установлено, все упомянутые подвиды отличаются по степени их генетического полиморфизма. Редко встречающиеся подвиды (F. tularensis subsp. mediasiatica и F. tularensis subsp. novicida) проявляют высокий полиморфизм [8], но из-за небольшого количества исследованных штаммов их реальное генетическое разнообразие до сих пор в полной мере не изучено. Доминирующие и высоковирулентные подвиды (F. tularensis subsp. tularensis и F. tularensis subsp. holarctica) значительно различаются по уровню генетического полиморфизма. Например, F. tularensis subsp. tularensis представлен двумя генетически различными субпопуляциями (А.I и А.II) с различным географическим распространением [8, 9, 3, 10, 11]. Это подтверждено с помощью многих молекулярно-генетических методов, включая полногеномный анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP) [3], мультилокусное секвенирование-типирование (MLST) [11], риботипирование [12], анализ регионов различия (RD) [13], пульс-гель электрофорез [10, 12], AFLP [12, 14], анализ канонических INDEL-маркеров [15], и мультилокусный VNTR- анализ (MLVA) [8, 16]. Однако практическое использование многих из них ограничивается как сложностью методического характера, так и проблемами с воспроизводимостью и оценкой результатов [9].
Известен способ анализа вариабельных тандемных повторов - VNTR-анализ [8,16], позволяющий определять уникальную аллельную формулу для каждой культуры и тем самым четко дифференцировать штаммы самых различных возбудителей. VNTR-анализ заключается в том, что проводят амплификацию ДНК исследуемого штамма с набором специфических праймеров к индивидуальному VNTR-локусу, причем полученные специфические фрагменты исследуют различными методами с целью точного определения молекулярной массы амплифицированного фрагмента ДНК. В зависимости от установленной массы каждого фрагмента вычисляют число тандемных повторов для исследуемого локуса. Подобное исследование проводят для нескольких локусов. Сочетание чисел, характеризующих число повторов каждого из изученных локусов, составляет уникальную аллельную VNTR-формулу для анализируемого штамма F. tularensis.
Однако данный способ имеет ряд существенных недостатков. Индивидуальные амплифицированные VNTR-фрагменты обладают большой молекулярной массой, и соседние аллели отличаются весьма незначительно: обычно всего три или более нуклеотидов, что и делает весьма затруднительным определение их истинного веса с точностью до нуклеотида. Для точного определения размера аллелей необходимы сложные и трудоемкие методики определения молекулярной массы амплифицированного фрагмента.
Известны исследования, которые показали наличие в генах различных живых организмов особых стабильно наследуемых генетических характеристик, заключающихся во вставках-делециях (insertions/deletions) коротких фрагментов ДНК, при этом такие гены обозначают как INDEL-гены. Изучение полиморфизма INDEL-генов в настоящее время широко используется при молекулярном типировании [15].
За прототип выбран способ мультилокусного секвенирования-типирования (MLST) генов "домашнего хозяйства" [11], который заключается в выделении ДНК из исследуемой культуры, постановки ПЦР со специфическими праймерами к семи генам F. tularensis (aroA, parC, pgm, tpiA, trpE, atpA, and uup), затем проводят секвенирование всех семи амплифицированных фрагментов, определяют позиции всех нуклеотидных замен и с помощью сложного программного обеспечения изучают генотип каждого штамма.
Известный способ имеет ряд недостатков. Для проведения исследования необходим сложный и дорогостоящий импортный ДНК-секвенатор, а само проведение анализа требует использования дорогостоящих импортных расходных материалов, и сложной процедуры интерпретации полученных результатов с помощью дорогостоящего программного обеспечения. Эти обстоятельства приводит к крайне высокой стоимости анализа, его большой продолжительности во времени (от нескольких дней до нескольких недель) и полной зависимости исследователя от поставок производителем расходных материалов из-за рубежа.
Технической задачей настоящего изобретения является разработка нового способа позволяющего достоверно, быстро и с невысокой себестоимостью осуществлять дифференциацию штаммов F. tularensis, выделенных в различных регионах, областях и странах.
Поставленная задача достигается тем, что в известном способе дифференциации штаммов F. tularensis путем молекулярно-генетического типирования, включающем выделение ДНК из исследуемого штамма F. tularensis, постановку ПЦР со специфическими праймерами и учет реакции с помощью электрофореза, отличие заключается в том, что из ДНК F. tularensis выявляют пять общих INDEL-генов, имеющих делеции определенного размера а именно ft263, ft.278, ft502, ft 1779 и ft.09, с последующей их амплификацией с помощью сконструированных специфических праймеров, выявляющих два альтернативных аллеля:
к гену ft263- праймеры  и  с длиной амплифицированного фрагмента 62 п.н. или 69 п.н.,
к гену ft278 - праймеры  и  с длиной амплифицированного фрагмента 59 п.н. или 74 п.н., или отсутствие фрагмента,
к гену ft502 - праймеры  и  с длиной амплифицированного фрагмента 201 п.н. или 339 п.н.,
к гену ft1779 - праймеры  и  с длиной амплифицированного фрагмента 98 п.н. или 107 п.н., или 800 п.н.,
к гену ft09 - праймеры  и  с длиной амплифицированного фрагмента 134 п.н. или 235 п.н.,
при этом учет результатов дифференциации проводят визуально после электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по пяти INDEL-генам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов F. tularensis.
При этом ПЦР проводят в объеме 25 мкл и реакционная смесь содержит:
2 мМ Mg-буфер,
0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера),
25 нг ДНК-матрицы,
1 ед. ДНК-полимеразы, оставшийся объем - вода, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК, объемом 5 мкл, которую получают из разных штаммов F. tularensis.
Кроме того ПЦР проводят с соблюдением режимов:
1 этап - денатурация при 95°С - 3 мин (1 цикл);
2 этап - денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 55°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с (35 циклов);
3 этап - досинтез при 72°С - 5 мин (1 цикл).
Обоснование выбора праймеров.
С помощью программного обеспечения, разработанного авторами ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора было проанализировано более 2500 генов F. tularensis в базе данных GenBank. В процессе компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей штаммов F. tularensis в базе данных GenBank авторы идентифицировали ряд INDEL-генов, отличающихся по размеру у штаммов F. tularensis различного происхождения, и имеющих только два альтернативных варианта размера ампликона.
В результате было выделено 5 общих генов, имеющих делеции определенного размера, а именно:
ft263, ft278, ft502, ft1779 и ft09 (см. табл. 1).
С помощью программного обеспечения Primer3Plus и BLAST NCBI к варьирующим участкам указанных генов ft263, ft278, ft502, ft1779 и ft09 были сконструированы специфические праймеры.
Набор значений размера фрагментов для каждого штамма по каждому из пяти INDEL-генов является его индивидуальной характеристикой и позволяет дифференцировать один штамм от другого и определять их происхождение с помощью кластерного анализа.
Способ осуществляется следующим образом.
Перед постановкой способа дифференциации штаммов F. tularensis выделяют ДНК исследуемой культуры. Бактериальную суспензию исследуемого штамма в дистиллированной воде вносят в микропробирку объемом 1,5 мл, после чего проводят обеззараживание материала и выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [17]. Затем в ПЦР проводят амплификацию выделенной ДНК со специфическими праймерами: к гену ft263 - праймеры  и  с длиной амплифицированного фрагмента 62 п.н. или 69 п.н.,
к гену ft278 - праймеры  и  с длиной амплифицированного фрагмента 59 п.н. или 74 п.н., или отсутствие фрагмента,
к гену ft502 - праймеры  и  с длиной амплифицированного фрагмента 201 п.н. или 339 п.н.,
к гену ft1779- праймеры  и  с длиной амплифицированного фрагмента 98 п.н. или 107 п.н., или 800 п.н.,
к гену ft09 - праймеры  и  с длиной амплифицированного фрагмента 134 п.н. или 235 п.н.
Условия проведения реакции амлификации.
Амплификацию проводят по следующей схеме: денатурация при 95°С -3 мин (1 цикл); затем 35 циклов: денатурация при 95°С - 20 с, отжиг при 55°С - 20 с, синтез при 72°С - 20 с; синтез при 72°С - 5 мин (1 цикл).
Инкубационную смесь объемом 25 мкл готовят из расчета: 2 мМ Mg-буфер, 0,2 мМ смеси дНТФ, 1,0 мкМ смеси праймеров (по 0,5 мкМ каждого праймера) 25 нг ДНК-матрицы, 1 ед.. ДНК-полимеразы, оставшийся объем -вода. В качестве матрицы используют геномную ДНК (объемом 5 мкл), полученную из разных штаммов F. tularensis. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК.
При этом учет результатов типирования проводят визуально после электофореза, причем для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип по пяти INDEL-генам, а путем сравнения выявленных INDEL-генотипов между собой и с известными генотипами идентификационной таблицы, устанавливают общее или различное происхождение исследуемых штаммов F. tularensis (штаммы Schu, ACole(tularensisAI), nov(F. novicida), 503(holarctica), LVS(holarctica - вакцинный штамм 15/10), что дает возможность дифференцировать один штамм от другого.
Проведенные исследования доказывают, что использование разработанного способа молекулярно-генетического типирования штаммов F. tularensis по структуре INDEL-генов позволяет выявлять штаммы с различными аллельными вариантами INDEL-генов.
Пример 1.
В эксперименте использованы штаммы F. tularensis из коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института. Бактерии F. tularensis (штаммы Schu, ACole(tularensisAI), nov(F. novicida), 503(holarctica), LVS(holarctica -вакцинный штамм 15/10) суспендировали в 150 мкл деионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводили выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [17]. Для постановки полимеразной цепной реакции используют праймеры к гену ft278 -  и  с длиной амплифицированного фрагмента 59 п.н. или 74 п.н. или отсутствие фрагмента, и праймеры к гену ft1779- и  с длиной амплифицированного фрагмента 98 п.н. или 107 п.н., или 800 п.н.,
В реакционную ПНР смесь добавляли по 1 микролитру специфических праймеров, 1 микролитр термостабильной ДНК-полимеразы и вносили 5 микролитров супернатанта ДНК. Общий объем реакционной смеси составляет 25 микролитров. Смесь перемешивали на вортексе и амплифицировали при условиях: 95°С - 3 мин (1 цикл); 95°С - 20 сек, 55°С - 20 сек, 72°С - 20 сек (35 циклов), 72°С - 5 мин. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК (фото 1). На фото 1 видим: электрофорез продуктов амплификации INDEL-генов ft278 и ft1779.
М-маркерная ДНК, стрелки указывают позиции аллелей 59 и 74 п.н. для гена ft278 и аллелей 107 и 800 п.н. для гена ft1779.
Вывод: анализ продуктов амплификации INDEL-гена ft278 показывает, что два штамма (Schu и ACole) имеют аллель 59 п.н., штамм F. novicida - 60 п.н., а у штамма 503(holarctica) фрагмент отсутствует, что является дифференцирующим признаком для подвида holarctica. Данные по размерам аллелей для каждого штамма заносят в таблицу, и проводят сравнительный анализ выявленных INDEL-генов между собой и с идентификационной таблицей 1 для штаммов F. tularensis из базы данных GenBank.
Пример 2.
Из коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института были взяты штаммы F. tularensis (штаммы Schu(tularensisAI), nov(F. novicida), 503(holarctica), LVS(holarctica -вакцинный штамм 15/10)). Бактерии F. tularensis суспендировали в 150 мкл деионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводили выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [17].
Для постановки полимеразной цепной реакции используют праймеры к гену ft263 - праймеры  и  с длиной амплифицированного фрагмента 62 п.н. или 69 п.н., праймеры к гену ft502 - праймеры  и  с длиной амплифицированного фрагмента 201 п.н. или 339 п.н.
В реакционную ПЦР смесь добавляли по 1 микролитру специфических праймеров, 1 микролитр термостабильной ДНК-полимеразы и вносили 5 микролитров супернатанта ДНК. Общий объем реакционной смеси составляет 25 микролитров. Смесь перемешивали на вортексе и амплифицировали при условиях: 95°С - 3 мин (1 цикл); 95°С - 20 сек, 55°С -20 сек, 72°С - 20 сек (35 циклов), 72°С - 5 мин. Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК (см.фото 2). М-маркерная ДНК, стрелки указывают позиции аллелей 69 и 62 п.н. для гена ft263 и аллелей 201 и 339 п.н. для гена ft502.
Вывод: анализ продуктов амплификации INDEL-гена ft263 показывает, что два штамма (503 и LVS(holarctica)) имеют аллель 62 п.н., а два - аллель 69 п.н. Анализ продуктов амплификации INDEL-гена ft502 показывает, что три изученных штамма имеют аллель 339 п.н., а один - аллель 85 п.н. (Schu). Для дифференцирования подвида в данном случае необходимо провести дополнительные исследования к другим INDEL-генам. Данные по размерам аллелей для каждого штамма заносят в таблицу, и проводят сравнительный анализ выявленных INDEL-генов между собой и с идентификационной таблицей 1.
Пример 3.
Из коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института были взяты штаммы F. tularensis (штаммы Schu(tularensisAI), nov(F. novicida), 503(holarctica), LVS(holarctica -вакцинный штамм 15/10)). Бактерии F. tularensis суспендировали в 150 мкл деионизованной воды, не содержащей нуклеаз. Далее проводили выделение ДНК согласно МУ 1.3.2569-09 [17].
Для постановки полимеразной цепной реакции используют праймеры к гену ft09 -  и  с длиной амплифицированного фрагмента 134 п.н. или 235 п.н.
ПЦР проводят по технологии описанной в примерах 1,2.
Учет результатов амплификации проводят с помощью электрофореза в 8% полиакриламидном геле в присутствии маркера молекулярных масс ДНК (см.фото 3). На фото видно, что М-маркерная ДНК, стрелка указывает позицию аллеля 235 п.н. для гена ft09.
Вывод: анализ продуктов амплификации INDEL-гена ft09 показывает, что все изученные штаммы имеют аллель 235 п.н. Данные по размерам аллелей для каждого штамма заносят в таблицу, и сравнивают с таблицей 1.
Следовательно, для дифференциации указанных штаммов необходимо провести дополнительные исследования к другим INDEL-генам.
Пример 4.
Из коллекции Ростовского-на-Дону научно-исследовательского противочумного института были выбраны 5 штаммов F. tularensis, выделенных в Ростовской области в 2020 г. Последние были дифференцированы методом молекулярно-генетического типирования с помощью предложенного способа (см. табл. 2).
Полученные результаты свидетельствуют о возможности дифференциации штаммов F. tularensis по указанным пяти INDEL-генам.
Анализ коллекции штаммов F. tularensis, выделенных в Ростовской области, подтвердил существование полиморфизма длин указанных генов и подтвердил их принадлежность к подвиду holarctica.
Вывод: Набор значений размера фрагментов аллелей для каждого штамма по каждому из пяти INDEL-генов является его индивидуальной характеристикой и позволяет дифференцировать один штамм от другого и определять их происхождение.
Использование предполагаемого изобретения позволяет достоверно и быстро за счет подбора праймеров унифицировать и создать набор значений размера фрагментов аллелей для каждого штамма F. tularensis по каждому из пяти INDEL-генов, которые являются его индивидуальной характеристикой и позволяют дифференцировать один штамм от другого и определять их подвидовую принадлежность.
Источники информации
1. Hopla, С.Е., and А.K. Hopla. 1994. Tularemia, p.113-126. In G. W. Beran (ed.), Handbook of zoonoses, 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, FL.
2. Centers for Disease Control and Prevention, Office of Inspector General, Department of Health and Human Services (HHS). 2005. Possession, use, and transfer of select agents and toxins. Final rule. Fed. Regist. 70:13293-13325.
3. Keim, P., A. Johansson, and D. M. Wagner. 2007. Molecular epidemiology, evolution, and ecology of Francisella. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1105:30-66.
4. Олсуфьев, Н.Г. Внутривидовая таксономия возбудителя туляремии Francisella tularensis / Н.Г. Олсуфьев, И.С. Мещерякова // Ж. Гигиены Эпидемиол. Микробиол. Иммунол. - 1982. -№26. - С. 291-299.
5. Олсуфьев, Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии / Н.Г. Олсуфьев - М.: Медицина, 1975. - 192 с.
6. Мокриевич, А.Н. Выделение среднеазиатского подвида туляремийного микроба на территории Алтайского края /А.Н. Мокриевич, B.C. Тимофеев, Т.Ю. Кудрявцева, Г.И. Уланова, С.Б. Карбышева, Р.И. Миронова, Г.М. Вахрамеева, Т.И. Губарева, В.М. Павлов, И.А. Дятлов // Пробл. Особо Опасн. Инф. - 2013. - №1. - С.66-69.
7. Whipp, М.J., J.М. Davis, G. Lum, J. de Boer, Y. Zhou, S. W. Bearden, J.M. Petersen, M. C. Chu, and G. Hogg. 2003. Characterization of a novicida-like subspecies of Francisella tularensis isolated in Australia. J. Med. Microbiol. 52:839-842.
8. Johansson, A., J. Farlow, P. Larsson, M. Dukerich, E. Chambers, M.  J. Fox, M. Chu, M. Forsman, A.  and P. Keim. 2004. Worldwide genetic relationships among Francisella tularensis isolates determined by multiple-locus variable-number tandem repeat analysis. J. Bacteriol. 186:5808-5818.
9. Farlow, J., D. M. Wagner, M. Dukerich, M. Stanley, M. Chu, K. Kubota, J. Petersen, and P. Keim. 2005. Francisella tularensis in the United States. Emerg. Infect. Dis. 11:1835-1841.
10. Staples, J.E., K.A. Kubota, L.G. Chalcraft, P.S. Mead, and J.M. Petersen. 2006. Epidemiologic and molecular analysis of human tularemia, United States, 1964-2004. Emerg. Infect. Dis. 12:1113-1118.
11. Svensson, K., P. Larsson, D. Johansson, M. Bystrom, M. Forsman, and A. Johansson. 2005. Evolution of subspecies of Francisella tularensis. J. Bacteriol. 187:3903-3908.
12. Fey, P.D., M.M. Dempsey, M.E. Olson, M.S. Chrustowski, J.L. Engle, J.J. Jay, M.E. Dobson, K.S. Kalasinsky, A.A. Shea, P.C. Iwen, R.C. Wickert, S.C. Francesconi, R.M. Crawford, and S. H. Hinrichs. 2007. Molecular analysis of Francisella tularensis subspecies tularensis and holarctica. Am. J. Clin. Pathol. 128:926-935.
13. Dempsey, M.P., J. Nietfeldt, J. Ravel, S. Hinrichs, R. Crawford, and A.K. Benson. 2006. Paired-end sequence mapping detects extensive genomic rearrangement and translocation during divergence of Francisella tularensis subsp. tularensis and Francisella tularensis subsp. holarctica populations. J Bacteriol. 188:5904-5914.
14.  Del Blanco, N., M. E. Dobson, A. I. Vela, V. A. De La Puente, C.B. Gutie'rrez, T. L. Hadfield, P. Kuhnert, J. Frey, L. Dominguez, and E. F. Rodriguez Ferri. 2002. Genotyping of Francisella tularensis strains by pulsed field gel electrophoresis, amplified fragment length polymorphism fingerprinting, and 16S rRNA gene sequencing. J. Clin. Microbiol. 40:2964-2972.
15. Larsson, P., K. Svensson, L. Karlsson, D. Guala, M. Granberg, M. Forsman, and A. Johansson. 2007. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis. Emerg. Infect. Dis. 13:1725-1732.
16. Farlow, J., Smith, K. L., Wong, J., Abrams, M., Lytle, M., and Keim, P. (2001). Francisella tularensis strain typing using multiple-locus, variable number tandem repeat analysis. J. Clin. Microbiol. 39, 3186-3192. doi: 10.1128/JCM.39.9.3186-3192.2001
17-Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности: Методические указания. МУ 1.3.2569-09. - М.: Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2009. - 35 с.