Система олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления ДНК Mycoplasma bovis
SYSTEM OF OLIGONUCLEOTIDE PRIMERS AND PROBE FOR DETECTING DNA MYCOPLASMA BOVIS

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и ветеринарии, и может быть использовано для диагностики заболеваний животных вирусной, бактериальной и др. этиологии, а также выявления носительства Mycoplasma bovis у крупного рогатого скота, контроля качества сырья для биотехнологической промышленности и материалов для исследовательской работы.
Сконструирована система, в состав которой входят пара олигонуклеотидных праймеров, комплементарных видоспецифичному участку в составе гена сахар-киназы Mycoplasma bovis, и обладающих активностью прямого и обратного праймера и имеющих структуру
M.bov1 F 5'-GAACTAAGATTGGCGTCAAGACA-3'
M.bov1 R 5'-GTTGCTGCAAGCGACACTAA-3'
и флуоресцентно меченный гидролизный зонд для идентификации ДНК Mycoplasma bovis в ходе реакции ПЦР в реальном времени, комплементарный видоспецифичному участку в составе гена сахар-киназы Mycoplasma bovis, расположенному в составе последовательности, фланкируемой вышеуказанными праймерами и имеющий структуру
M.bov1 Pr 5'-FAM CAGGTCATTATAGTCAATAGATTCAGTA BHQ1-3'
Использование разработанной системы праймеров и зонда позволяет идентифицировать М. bovis, дифференцировать ее от филогенетически близкородственных микоплазм М. bovigenitalium и детектировать в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью ДНК этого возбудителя микоплазмоза в биологическом материале от крупного рогатого скота и сырье для биотехнологической промышленности и материалов для лабораторной исследовательской работы.
Изобретение может быть использовано в ветеринарии для выявления генетического материала одного из возбудителей микоплазмозов крупного рогатого скота - М. bovis, в целях диагностики ассоциированных с ним инфекционных заболеваний, выявления бессимптомного носительства и научных исследований.
Изобретение может применяться в биотехнологии для контроля контаминации сырья животного происхождения микоплазмами вида М. bovis, а также выявления М. bovis в сыворотках, являющихся реактивами для лабораторных исследований, связанных с работой с культурами клеток.
М. bovis является возбудителем различных заболеваний взрослого крупного рогатого скота и телят ( S., 2015). Заболевания, связанные с данным патогеном, распространены во всем мире. При этом распространенность носительства, при котором колонизация организма М. bovis протекает бессимптомно, может быть значительной, например до 6% телят на животноводческих предприятиях, благополучных по бронхопневмониям молодняка могут быть носителями М. bovis (Kirkbride С.А., 1987). Данный патоген приводит к развитию маститов, бронхопневмоний, артритов и заболеваний репродуктивной системы. Часто отмечается сочетанное поражение различных органов и систем органов. Заболевания, вызываемые М. bovis тяжело поддаются лечению из-за чего часто приводят к выбраковке животных (Maunsell F.P., 2011).
Также М. bovis может выступать в качестве контаминанта сырья биологического происхождения для биотехнологического производства, что может вести к производственному браку продукции предприятий отрасли.
Для культивирования М. bovis необходимы специализированные многокомпонентные среды, при этом ее фенотипическая дифференциация от близкородственных микоплазм вида М. bovigenitalium, вызывающих заболевания с более легким течением, затруднена.
Метод полимеразной цепной реакции в реальном времени является чувствительным и специфичным методом выявления ДНК М. bovis (Parker A.M., 2017). В основе данного метода лежит процесс специфической амплификации (накопления) фрагментов ДНК путем матричной репликации, осуществляемой с участием фермента ДНК-полимеразы. При этом процесс амплификации оценивается в ходе осуществления реакции (в реальном времени). В данном случае оценка проводится путем измерения накопления флуоресценции испускаемой флуорохромами, связанными с зондом в составе системы. Необходимым условием для испускания флуоресценции данными флуорохромами является разрушение зонда, происходящее при его связывании с комплементарной последовательностью в присутствии фермента ДНК-полимеразы. При этом активность расщепления зондов и освобождения флуорохромов находится в прямой зависимости от содержания целевых ампликонов в реакционной смеси.
Праймеры являются компонентами реакционной смеси, обеспечивающими специфичность реакции удвоения нуклеиновых кислот. Они представляют собой короткие олигонуклеотидные последовательности, получаемые путем химического синтеза. По своей структуре праймеры комплементарны высококонсервативным и высокоспецифичным последовательностям в составе целевой ДНК. В случае диагностики инфекционных заболеваний в качестве целевой ДНК выступает ДНК патогена, на идентификацию которого направлена диагностическая система. Зонды являются компонентами реакционной смеси, обеспечивающими специфическую детекцию целевого продукта. Они комплементарны участку последовательности целевых ампликонов и не вступают во взаимодействие с другими последовательностями ДНК в исследуемом материале.
Специфичность реакции ПЦР в реальном времени является ее важной характеристикой, определяющей качество исследования. Наиболее принципиальным для обеспечения специфичности амплификации является выбор фрагмента для подбора праймеров и зонда, а также нуклеотидный состав этих коротких синтетических олигонуклеотидов.
Наиболее близким аналогом разработанной системы праймеров и зондов являются специфические системы олигонуклеотидных праймеров и зондов, фланкирующие фрагмент гена фактора элонгации Jus А (Boonyayatra S., 2012) и фрагмент гена белка, участвующего в репарации ДНК uvrC (Righter D.J., 2011, Gioia G., 2016). Сконструированные системы праймеров и зондов авторы использовали в ПЦР в реальном времени для идентификации М. bovis. Применение данных праймеров позволяло дифференцировать М. bovis как от М. bovigenitalium, так и от других микоплазм. Отличительной особенностью предлагаемой системы праймеров и зондов для выявления ДНК Mycoplasma bovis является выбор в качестве видоспецифической мишени в геноме микоплазм указанного вида фрагмента гена сахар-киназы.
Целью настоящего изобретения является разработка системы олигонуклеотидных праймеров и зонда для идентификации М. bovis методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Цель достигается конструированием системы специфичных праймеров и зонда для идентификации ДНК одного из возбудителей микоплазмозов крупного рогатого скота М. bovis, имеющих следующую структуру:
M.bov1 F 5'-GAACTAAGATTGGCGTCAAGACA-3'
M.bov1 R 5'-GTTGCTGCAAGCGACACTAA-3'
M.bov1 Pr 5'-FAM CAGGTCATTATAGTCAATAGATTCAGTA BHQ1-3'
Характеристика олигонуклеотидных праймеров и участка амплифицируемой ДНК.
На основе данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), были подобраны праймеры, обозначенные M.bov1 F и M.bov1 R, комплементарные фрагменту гена сахарк-иназы М. bovis и обладающие активностью прямого и обратного праймера. Также был подобран олигонуклеотидный зонд M.bov1, комплементарный участку последовательности генома М. bovis, находящемуся между участками, распознаваемыми праймерами M.bov1 F и M.bov1 R.
В качестве положительного контроля эксперименты проводили на клиническом материале от крупного рогатого скота, полученном при обследовании животных на животноводческих предприятиях, где были выявлены случаи бронхопневмонии телят и маститов с симптоматикой, характерной для инфекций, ассоциированных с М. bovis, используя для выделения ДНК мазки из носовой полости молодняка крупного рогатого скота и преддверия влагалища коров.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров и зонда для идентификации ДНК возбудителя микоплазмоза крупного рогатого скота М. bovis методом ПЦР в реальном времени
На основании изучения секвенированных полногеномных последовательностей возбудителя микоплазмозов крупного рогатого скота М. bovis, представленных в международной базе данных Genbank для конструирования праймеров, была выбрана последовательность гена сахар-киназы М. bovis. Размер данного гена составляет составляет 899 п.н. (GenBank NCBI, СР038861.1). В составе указанного гена были выбраны специфические участки ДНК, имеющие нуклеотидные отличия от филогенетически близкородственного вида М. bovigenitalium и других микроорганизмов. Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами составила 113 п. н.. К данному фрагменту была подобрана специфическая для М. bovis последовательность зонда.
С целью определения специфичности подобранной системы праймеров и зондов была проведена оценка гомологии распознаваемого ею участка сходным последовательностям в геномах других организмов in silico путем сравнения указанного участка с генетическими последовательностями, представленными в базе данных GenBank, с помощью алгоритма BLASTN на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI)
(http://www.ncbi.nlm.mh.gov/BLAST/). На момент проведения анализа in silico гомологии выявлено не было.
В качестве компонентов олигонуклеотидного зонда выбраны молекулы флуоресцеина (FAM) и BHQ-1. При этом фотоны, испускаемый флуоресцеином при возбуждении, имеют длину волны около 518 нм, а BHQ-1 обладает высокой способностью к поглощению фотонов с длинами волн данного диапазона.
Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК возбудителя микоплазмоза крупного рогатого скота М. bovis с детекцией накопления специфического фрагмента ДНК методом ПЦР в реальном времени.
С использованием разработанной системы праймеров и зондов были приготовлены реакционные смеси, включавшие по 10 пмоль каждого из компонентов системы для идентификации возбудителя микоплазмозов крупного рогатого скота М. bovis и другие компоненты, необходимые для проведения ПЦР в реальном времени.
Общий объем реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу. Для его приготовления в пробирке смешивали следующие компоненты:
Готовая смесь для ПЦР марки qPCRmix-HS (ООО "Евроген", Москва) - 5 мкл
Праймер M.bov1 F (10 пМ/ мкл) - 1 мкл
Праймер M.bov1 R (10 пМ/ мкл) - 1 мкл
Зонд M.bov1 Pr (10 пМ/ мкл) - 1 мкл
вода деионизированная - 15 мкл
исследуемая проба ДНК - 2 мкл.
Условия проведения реакции для амплификатора «CFX96» (Bio-Rad, США): этап предварительной денатурации ДНК при 94°С - 5 мин, затем в течение 50 циклов - денатурация ДНК при 94°С - 15 сек; отжиг праймеров при 60°С - 30 сек; элонгация цепи при 70°С - 30 сек. Оценка уровня флуоресценции в пробе проводилась в конце каждого цикла. При наличии в пробе ДНК М. bovis отмечался рост флуоресценции в ходе прохождения реакции (фиг. 1).
Пример 3. Определение специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров и зонда для идентификации ДНК возбудителя микоплазмоза крупного рогатого скота М. bovis.
Специфичность реакции определяли путем постановки реакции с клиническими образцами, содержащими ДНК близкородственных патогенов крупного рогатого скота М. bovigenitalium и Ureaplasma diversum, а также образцами ДНК, выделенной из культур близкородственных патогенов человека М. hominis, U. parvum и U. urealyticum.
Выделение ДНК из клинических образцов проводили путем сорбции на кремниевых частицах, ДНК из культур микроорганизмов выделяли путем термического разрушения. Постановку реакции ПЦР осуществляли, как описано в примере 2. При постановке ПЦР с материалом, содержащим ДНК близкородственных микроорганизмов накопления продукта не отмечалось (фиг. 2).
Таким образом, разработанная система праймеров и зонда, отличающаяся от аналогов тем, что в качестве мишени используется видоспецифическая последовательность гена сахар-киназы, может быть использована для идентификации М. bovis, позволяет дифференцировать его от близкородственного вида М. bovigenitalium и детектировать в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью ДНК этого возбудителя микоплазмозов крупного рогатого скота в биологическом материале от животных, а также в биологическом сырье животного происхождения и продуктах на его основе.