СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО АНКСИОЛИТИЧЕСКИМ И АНТИДЕПРЕССИВНЫМ ДЕЙСТВИЕМ
METHOD FOR PRODUCING AGENT OF VEGETABLE ORIGIN WITH ANXIOLYTIC AND ANTIDEPRESSANT ACTION

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего анксиолитическим и антидепрессивным действием.
Биологически активные соединения растительных видов семейства Lamiaceae обладают широким спектром биологической активности, включая действие на нервную систему (анксиолитическое, антиноцицептивное, антиконвульсантное) [1]. Химической особенностью видов рода Котовник, входящего в данное семейство, является их способность к накоплению отдельных соединений, обладающих анксиолитическим и антидепрессивным действием, в том числе производных лютеолина [2], розмариновой кислоты [3] и пулегона [4]. На территории Восточной Сибири широко распространен котовник многонадрезанный (Nepeta multifida L., синоним Schizonepeta multifida (L.) Briq.), в составе которого присутствуют указанные соединения. К настоящему времени не существует экстракционных препаратов из котовника многонадрезанного, обладающих анксиолитическим и антидепрессивным действием. Данный растительный вид входит в состав 10-компонентного средства «Таблетки для ума» в виде травы (необработанного сырья), что указывает на обедненный состав готового продукта [5]. Также известен способ получения 21-компонентного средства, содержащего котовник многонадрезанный, в виде жидкого экстракта на 20% этаноле, полученного в результате настаивания при комнатной температуре [6]. Использованный способ неинтенсивной экстракции растительного сырья и низкое содержание котовника многонадрезанного в общей растительной смеси свидетельствует о невысоком содержании действующих веществ в готовом продукте.
Задачей изобретения является создание суммарного растительного препарата, содержащего фенольные соединения и монотерпены, а также повышение анксиолитического и антидепрессивного действия средства за счет более высокого содержания действующих веществ.
Техническим результатом изобретения является повышенное анксиолитическое и антидепрессивное действие средства из надземной части котовника многонадрезанного, полученного заявленным способом.
Для достижения указанного технического результата измельченный растительный материал (траву котовника многонадрезанного) помещают в перегонную колбу аппарата для гидродистилляции, приливают воду в соотношении сырье : вода 1:(8-10) и нагревают до кипения в течение 30-40 мин. По истечении указанного времени начинается процесс отгонки эфирного масла, которое собирается в приемник в течение 60-80 мин. После этого смесь растительного сырья и воды из перегонной колбы фильтруют в сборник, промывая остаток растительного сырья на фильтре дополнительным объемом воды (10-12% от взятого на гидродистилляцию). Далее растительное сырье заливают 90% этанолом в соотношении сырье : экстрагент 1:(10-12) и подвергают смесь ультразвуковой обработке частотой 50 кГц при 70°С в течение 45-60 мин. Извлечение фильтруют в сборник, промывая остаток растительного сырья на фильтре дополнительным объемом 60% этанола (20-25% от взятого на этанольную экстракцию). Водное и спиртовое извлечения концентрируют в вакууме до 1/4-1/6 от первоначального объема. Сгущенные экстракты, полученные от водной и этанольной экстракций, объединяют, высушивают в вакуум-сушильном шкафу и измельчают на мельнице пропеллерного типа. После этого к измельченному сухому экстракту добавляют эфирное масло, полученное в результате гидродистилляции, и перемешивают на мельнице пропеллерного типа. Выход готового продукта (сухого экстракта) составляет 34.9-36.2% от массы растительного сырья.
Выявленные отличительные признаки позволяют сделать вывод о соответствии предлагаемого технологического решения критерию “новизна”.
Предложенный способ позволяет получить сухой экстракт (далее - средство) в виде рассыпчатого негигроскопичного порошка темно-коричневого цвета с горьким вкусом и выраженным специфическим запахом. Потеря массы при высушивании - 3-5%.
Способ иллюстрируется нижеследующими примерами.
3
3
3
3
3
3
3
Пример 1. 39.59 кг цветков котовника многонадрезанного с влажностью 3.1% измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2-3 мм. 39 кг измельченного сырья загружают в перегонную колбу аппарата для гидродистилляции вместимостью 450 л, приливают 312 л воды и нагревают до кипения в течение 30 мин. По истечении указанного времени начинается процесс отгонки эфирного масла, которое собирается в приемник в течение 60 мин. Получают 1.25 кг эфирного масла (3.2% от массы растительного сырья) с плотностью 1.100 г/см. Смесь растительного сырья и воды из перегонной колбы фильтруют через сукно в сборник, промывая остаток растительного сырья на фильтре 31 л воды. В результате получено 232 л водного экстракта с плотностью 0.992 г/см, который концентрируют в вакууме до объема 46.4 л (плотность концентрата 1.128 г/см). Отгон воды объемом 181 л далее может быть повторно использован на стадиях гидродистилляции и экстракции растительного сырья. Растительное сырье после фильтрования переносят в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 468 л 90% этанола. Полученную смесь перемешивают, вносят стержневой ультразвуковой процессор и обрабатывают смесь ультразвуком мощностью 50 кГц в импульсном режиме при температуре 70°С в течение 60 мин. После этого ультразвуковой процессор удаляют и смесь фильтруют через сукно в сборник, промывая остаток растительного сырья на фильтре 94 л 60% этанола. В результате получено 554 л этанольного экстракта с плотностью 0.899 г/см, который концентрируют в вакууме до объема 92 л (плотность концентрата 1.034 г/см). Отгон этанола объемом 462 л (плотность 0.850 г/см) далее может быть повторно использован на стадии экстракции растительного сырья. Полученные концентраты после водной и этанольной экстракций объединяют (объем объединенного концентрата 135 л, плотность 1.067 г/см), сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 55°С и давлении 0.1 атм в течение 10 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 12.81 кг полупродукта, что составляет 32.8% от массы растительного сырья. Далее к полупродукту добавляют 1.25 кг эфирного масла, полученного методом гидродистилляции. Получают 14.06 кг готового продукта (средства), что составляет 36.0% от массы растительного сырья. Средство представляет собой рассыпчатый негигроскопичный порошок, темно-коричневого цвета, с горьким вкусом и выраженным специфическим запахом. Потеря массы при высушивании составляет 3.1%. Шрот растительного сырья массой 142 кг и влажностью 82.4% далее не используют и направляют в отвал.
3
3
3
3
3
3
3
Пример 2. 45.72 кг листьев котовника многонадрезанного с влажностью 4.6% измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2-3 мм. 45 кг измельченного сырья загружают в перегонную колбу аппарата для гидродистилляции вместимостью 600 л, приливают 450 л воды и нагревают до кипения в течение 40 мин. По истечении указанного времени начинается процесс отгонки эфирного масла, которое собирается в приемник в течение 80 мин. Получают 0.32 кг эфирного масла (0.71% от массы растительного сырья) с плотностью 1.114 г/см. Смесь растительного сырья и воды из перегонной колбы фильтруют через сукно в сборник, промывая остаток растительного сырья на фильтре 54 л воды. В результате получено 274 л водного экстракта с плотностью 0.998 г/см, который концентрируют в вакууме до объема 68.5 л (плотность концентрата 1.122 г/см). Отгон воды объемом 195 л далее может быть повторно использован на стадиях гидродистилляции и экстракции растительного сырья. Растительное сырье после фильтрования переносят в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 450 л 90% этанола. Полученную смесь перемешивают, вносят стержневой ультразвуковой процессор и обрабатывают смесь ультразвуком мощностью 50 кГц в импульсном режиме при температуре 70°С в течение 45 мин. После этого ультразвуковой процессор удаляют и смесь фильтруют через сукно в сборник, промывая остаток растительного сырья на фильтре 112 л 60% этанола. В результате получено 562 л этанольного экстракта с плотностью 0.871 г/см, который концентрируют в вакууме до объема 94 л (плотность концентрата 1.039 г/см). Отгон этанола объемом 465 л (плотность 0.852 г/см) далее может быть повторно использован на стадии экстракции растительного сырья. Полученные концентраты после водной и этанольной экстракций объединяют (объем объединенного концентрата 162.5 л, плотность 1.091 г/см), сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 55°С и давлении 0.1 атм в течение 10 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 15.98 кг полупродукта, что составляет 35.5% от массы растительного сырья. Далее к полупродукту добавляют 0.32 кг эфирного масла, полученного методом гидродистилляции. Получают 16.30 кг готового продукта (средства), что составляет 36.2% от массы растительного сырья. Средство представляет собой рассыпчатый негигроскопичный порошок, темно-коричневого цвета, с горьким вкусом и выраженным специфическим запахом. Потеря массы при высушивании составляет 3.6%. Шрот растительного сырья массой 158 кг и влажностью 81.8% далее не используют и направляют в отвал.
3
3
3
3
3
3
3
Пример 3. 40.6 кг травы котовника многонадрезанного с влажностью 4.3% измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 2-3 мм. 40 кг измельченного сырья загружают в перегонную колбу аппарата для гидродистилляции вместимостью 600 л, приливают 360 л воды и нагревают до кипения в течение 35 мин. По истечении указанного времени начинается процесс отгонки эфирного масла, которое собирается в приемник в течение 70 мин. Получают 0.74 кг эфирного масла (1.84% от массы растительного сырья) с плотностью 1.102 г/см. Смесь растительного сырья и воды из перегонной колбы фильтруют через сукно в сборник, промывая остаток растительного сырья на фильтре 40 л воды. В результате получено 220 л водного экстракта с плотностью 0.995 г/см, который концентрируют в вакууме до объема 45 л (плотность концентрата 1.125 г/см). Отгон воды объемом 172 л далее может быть повторно использован на стадиях гидродистилляции и экстракции растительного сырья. Растительное сырье после фильтрования переносят в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревателем и заливают 440 л 90% этанола. Полученную смесь перемешивают, вносят стержневой ультразвуковой процессор и обрабатывают смесь ультразвуком мощностью 50 кГц в импульсном режиме при температуре 70°С в течение 50 мин. После этого ультразвуковой процессор удаляют и смесь фильтруют через сукно в сборник, промывая остаток растительного сырья на фильтре 97 л 60% этанола. В результате получено 532 л этанольного экстракта с плотностью 0.882 г/см, который концентрируют в вакууме до объема 89 л (плотность концентрата 1.035 г/см). Отгон этанола объемом 441 л (плотность 0.851 г/см) далее может быть повторно использован на стадии экстракции растительного сырья. Полученные концентраты после водной и этанольной экстракций объединяют (объем объединенного концентрата 134 л, плотность 1.065 г/см), сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 55°С и давлении 0.1 атм в течение 10 часов и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 13.20 кг полупродукта, что составляет 35.5% от массы растительного сырья. Далее к полупродукту добавляют 0.74 кг эфирного масла, полученного методом гидродистилляции. Получают 13.94 кг готового продукта (средства), что составляет 34.9% от массы растительного сырья. Средство представляет собой рассыпчатый негигроскопичный порошок, темно-коричневого цвета, с горьким вкусом и выраженным специфическим запахом. Потеря массы при высушивании составляет 3.8%. Шрот растительного сырья массой 134 кг и влажностью 80.6% далее не используют и направляют в отвал.
Химический состав средства
На предварительно этапе исследования нами был изучен химический состав средства с применением метода ВЭЖХ-УФ [7]. Идентификацию соединений проводили по данным хроматографической подвижности, спектров поглощения, спектральных отношений и метода добавок. В результате в трех образцах средства, полученных из цветков, листьев и травы котовника многонадрезанного, было установлено присутствие шести флавоноидов - лютеолин-7-О-рутинозида, лютеолин-7-О-глюкуронида, лютеолин-7-О-глюкозида, апигенин-7-О-рутинозида, апигенин-7-О-глюкуронида, апигенин-7-О-глюкозида, и четырех фенилпропаноидов - 3-О-кофеилхинной кислоты, розмариновой кислоты, сальвианоловых кислот А и В. Также в сухом экстракте было выявлено присутствие пулегона - основного компонента эфирного масла. Все упомянутые соединения были ранее обнаружены в растительных видах рода Котовник [8].
Таблица 1
Химический состав средства, мг/г
Соединение
Тип растительного сырья
цветки
листья
трава
лютеолин-7-О-глюкуронид
35.70 ± 0.90
40.17 ± 0.92
38.11 ± 0.92
розмариновая кислота
54.21 ± 1.24
57.98 ± 1.38
55.63 ± 1.29
пулегон
62.23 ± 1.49
19.63 ±0.47
37.14 ± 0.96
С использованием метода количественной ВЭЖХ-УФ было показано, что лютеолин-7-О-глюкуронид, розмариновая кислота и пулегон являются доминирующими компонентами, содержание которых в сухих экстрактах составило 35.70-40.17, 54.21-57.98 и 19.63-62.23 мг/г соответственно (таблица 1).
Количественный анализ и показатели качества средства
Для осуществления химической стандартизации средства разработаны методика количественного анализа лютеолин-7-О-глюкуронида, розмариновой кислоты и пулегона в средстве методом ВЭЖХ-УФ.
Методика количественного анализа лютеолин-7-О-глюкуронида, розмариновой кислоты и пулегона в средстве методом ВЭЖХ. Испытуемый раствор. 20 мг средства помещают в пластиковую пробирку типа Эппендорф вместимостью 2 мл, прибавляют 1 мл 70% этанола и растворяют в ультразвуковой ванне при 30°С в течение 15 мин. Охлаждают и центрифугируют при 3000 об/мин 10 мин. Надосадочную жидкость фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 0.45 мкм.
Раствор сравнения. 1 мг лютеолин-7-О-глюкуронида, 1 мг розмариновой кислоты и 1 мг пулегона растворяют в метаноле и доводят до объема 5 мл этим же растворителем.
Условия хроматографирования:
- колонка длиной 75 мм и внутренним диаметром 2 мм, заполненная силикагелем октадецилсилильным для хроматографии с размером частиц 5 мкм;
- температура: 35°С;
- подвижная фаза:
-- подвижная фаза А: 21 г/л лития перхлората раствор в 1 г/л кислоте перхлорной;
-- подвижная фаза В: ацетонитрил;
- спектрофотометрический детектор, длина волны 210 нм;
- время уравновешивания системы: 3 мин перед каждым вводом (5% В);
- объем вводимой пробы: 1 мкл.
- программа градиентного режима элюирования представлена в таблице 2.
Таблица 2
Программа градиентного режима элюирования
Время (мин)
Подвижная фаза А (%, об/об)
Подвижная фаза В (%, об/об)
Скорость подвижной фазы (мкл/мин)
0 - 15
80 → 50
20 → 50
150
Результаты: на хроматограмме должно быть три основных пика, совпадающих по подвижности с веществами в растворе сравнения (лютеолин-7-О-глюкуронид, розмариновая кислота, пулегон).
Порядок выхода пиков раствора сравнения: лютеолин-7-О-глюкуронид → розмариновая кислота → пулегон.
Пригодность хроматографической системы. Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия: разрешение между пиками лютеолин-7-О-глюкуронида и розмариновой кислоты не менее 2.
Расчет: содержание соединения в средстве в процентах (X) вычисляют по формуле:
,
S
S
где S - площадь пика соединения в исследуемом растворе; m - масса навески средства, г; S - площадь пика соединения в растворе сравнения; m - масса навески соединения, г.
Метрологический анализ разработанных методик показал, что относительная ошибка определения лютеолин-7-О-глюкуронида, розмариновой кислоты и пулегона методом ВЭЖХ не превышает 2% (таблица 3). Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительных валидационных параметрах методик, что указывает на возможность их использования в практике фармакопейного анализа для определения показателей качества разработанного средства.
Таблица 3
Метрологические характеристики методик количественного анализа
<maths num="2"><img file="00000002.jpg" he="5" wi="4" img-content="undefined" img-format="jpg" /></maths>, мг/г
S<sup>2</sup>
S<sub>x</sub>
±Δ<maths num="3"><img file="00000003.jpg" he="6" wi="3" img-content="undefined" img-format="jpg" /></maths>, %
E, %
Лютеолин-7-О-глюкуронид. ВЭЖХ (n = 5, P = 0.95, t<sub>P,f</sub> = 2.78)
38.11
0.32
0.25
0.70
1.84
Розмариновая кислота. ВЭЖХ (n = 5, P = 0.95, t<sub>P,f</sub> = 2.78)
55.63
0.46
0.30
0.85
1.52
Пулегон. ВЭЖХ (n = 5, P = 0.95, t<sub>P,f</sub> = 2.78)
37.14
0.35
0.26
0.73
1.97
По данным проведенных исследований определены общие показатели качества средства, обобщенные в таблице 4. Для стандартизации средства было предложено определение внешнего вида, подлинности (присутствие изопулегона), потери в массе при высушивании, золы сульфатной, тяжелых металлов, количественное определение лютеолин-7-О-глюкуронида, розмариновой кислоты и пулегона (ВЭЖХ) и микробиологической чистоты.
Таблица 4
Показатели качества средства
Показатель
Метод
Норма
Описание, внешние признаки
Визуальный,органолептический
Рассыпчатый негигроскопичный порошок, цвет от коричневого до темно-коричневого, запах выраженный специфический, вкус 0.01% водного раствора - выраженный, горький.
Подлинность:- изопулегон.
ВЭЖХ
На хроматограмме должен присутствовать пик, совпадающий по подвижности с таковым изопулегона.
Потеря в массе при высушивании
Гравиметрический
Не более 5%
Зола сульфатная
Гравиметрический
Не более 0.1%
Тяжелые металлы
Спектро-фотометрический
Не более 0.01%
Количественноеопределение:- лютеолин-7-О-глюкуронид;- розмариновая кислота;- пулегон.
ВЭЖХВЭЖХВЭЖХ
Не менее 3%Не менее 5%Не менее 1.5%
Микробиологическая чистота
Бактериологический
Категория 3Б
Хранение
В защищенном от света месте при температуре 12-15°С
Срок годности
5 лет
Предлагаемый способ, по сравнению с известным, позволяет получить препарат постоянного состава с более выраженной активностью за счет более высокого содержания действующих веществ (фенольных соединений и монотерпеноидов).
Рассчитать экономическую целесообразность предлагаемого способа в настоящее время не представляется возможным, однако вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствуют рациональному использованию лекарственного растительного сырья и определяют перспективность внедрения данного способа в фармацевтическую промышленность.
Фармакотерапевтические свойства средства.
Исследования выполнены на белых крысах линии Wistar с исходной массой 180-200 г. Содержание животных соответствовало «Правилам лабораторной практики» (GLP) и Приказу МЗ РФ № 708Н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Перед началом экспериментов животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, распределялись на группы с учетом пола, возраста, массы и принципа рандомизации. Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР №755 от 12.08.77 г.), «Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986). Средство в дозах 50, 100, 200 и 300 мг/кг и валерианы экстракт (препарат сравнения; Дальхимфарм) в дозе 120 мг/кг, вводили животным внутрижелудочно в форме водного раствора в объеме 10 мл/кг один раз в сутки в течение в течение 7 дней, последний раз за 30 мин до тестирования. Анксиолитическое действие средства исследовали согласно методическим указаниям [9] в тестах «приподнятый крестообразный лабиринт», «светлая/темная камера», «конфликтная ситуация в варианте Vogel», антидепрессивное действие - в тесте «поведенческого отчаяния по Порсолту». Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью пакета программ «Biostat-2006» с использованием t-критерия Стьюдента. Различия между сравниваемыми группами считали статистически значимыми при р ≤ 0.05.
Анксиолитическое действие средства в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт». Для проведения исследований животных помещали на центральную площадку приподнятого крестообразного лабиринта и в течение 5 мин регистрировали следующие показатели: время пребывания животных в открытых и закрытых рукавах, а также на центральной площадке, количество заходов в открытые и закрытые рукава, число свещиваний и вертикальных стоек, а также количество актов дефекации. Результаты тестирования животных в приподнятом крестообразном лабиринте показали, что контрольные животные предпочитают большую часть времени проводить в закрытых рукавах, чем открытых (таблица 5). Курсовое введение животным средства в дозах 100, 200 и 300 мг/кг и валерианы экстракта в дозе 120 мг/кг подавляло у крыс чувство страха открытого пространства, в результате чего количество заходов в открытые рукава установки в данных группах увеличилось в 6.0, 8.0, 4.0 и 7.0 раза, а время, проведенное в них в 7.2, 13.3, 1.9 и 12.3 раза, соответственно по сравнению с показателями контрольных животных. У животных данных опытных групп отмечалось статистически значимое увеличение времени нахождения на центральной площадке лабиринта по сравнению с контролем.
Таблица 5
Влияние средства и валерианы экстракта на поведение белых крыс в тесте «приподнятый крестообразный лабиринт»
Показатели
Контрольная (Н<sub>2</sub>О), n=18
Опытная 1 (средство, 50 мг/кг), n=20
Опытная 2 (средство, 100 мг/кг), n=18
Опытная 3 (средство, 200 мг/кг), n=22
Опытная 4 (средство, 300 мг/кг), n=20
Опытная 5 (валерианы экстракт, 120 мг/кг), n=15
Количество заходов
закрытый рукав
1.2±0.1
1.2±0.1
1.8±0.2*
1.9±0.2*
1.6±0.3
1.7±0.2*
открытый рукав
0.1±0.0
0.1±0.0
0.6±0.1*
0.8±0.2*
0.4±0.2
0.7±0.2*
Время пребывания
закрытый рукав
291.4±2.1
290.1±2.7
273.6±6.3*
256.7±10.7*
277.9±8.7
256.2±8.5*
открытый рукав
1.9±1.0
2.4±1.2
13.7±3.7
25.2±8.1*
4.5±2.2
23.3±7.5*
центральная площадка
6.7±1.5
7.6±2.0
12.8±2.4
18.1±3.4*
17.6±6.4
20.5±2.6*
Количество
свешиваний
0
0.1±0.0
0.2±0.0
0.3±0.1
0
0.3±0.1
вертикальных стоек
2.4±0.4
2.5±0.4
3.9±0.6
4.5±0.9
3.9±0.5
4.7±1.1
актов дефекации
1.9±0.1
0.8±0.3
1.2±0.3
0.7±0.2*
0.5±0.2*
0.5±0.2
Примечание: * - различия статистически значимы при р≤0.05 между данными контрольной и опытной групп; n - число животных в группе.
Применение испытуемого средства в дозе 50 мг/кг не вызывало значимых изменений количества заходов в открытые и закрытые рукава лабиринта, при этом у животных первой опытной группы отмечалась тенденция к увеличению времени проведения в открытых рукавах установки. Проведенные исследования показали, что использование средства и валерианы экстракта вызывает увеличение общей двигательной активности животных в данном тесте (таблица 5). Так у животных, получавших средство в дозах 100, 200 и 300 мг/кг и валерианы экстракт в дозе 120 мг/кг, количество заходов в закрытые рукава лабиринта увеличилось на 50, 58, 33 и 42% по сравнению с показателем контрольных животных.
Вертикальная активность у животных на фоне введения средства в дозах 100 и 300 мг/кг повысилась в 1.6 раза, при применении испытуемого средства в дозе 200 мг/кг и валерианы экстракта - в 1.9 раза по отношению к контролю. В опытных групп отмечались свешивания животных с установки, тогда как в контрольной группе ни одно животное не выполняло данное действие. Увеличение исследовательской активности и понижение чувства страха и тревоги у животных опытных групп можно объяснить снижением у них уровня эмоциональности (таблица 5). Так, у животных опытных групп количество актов дефекаций было ниже такового показателя контрольных животных в среднем в 1.6 раза. Таким образом, средство в диапазоне доз 100-300 мг/кг оказывает выраженное анксиолитическое действие в условиях ненаказуемого поведения, увеличивая количество заходов и время пребывания животных в открытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта. Данный эффект сопоставим с таковым у препарата сравнения - валерианы экстрактом.
Анксиолитическое действие средства в тесте «светлая/темная камера». Результаты тестирования животных в тесте «светлая/темная камера» показали, что контрольные животные предпочитают большую часть времени проводить в темном отсеке установки (таблица 6). Курсовое введение животным средства в дозах 50, 100 и 200 мг/кг угнетало чувство страха и тревоги, о чем свидетельствовало увеличение количества переходов между камерами на 69, 54 и 62% и времени пребывания животных в светлом отсеке установки на 56, 58 и 88% соответственно по сравнению с таковыми показателями животных контрольной группы (таблица 6). Таким образом, средство в диапазоне доз 50-200 мг/кг оказывает выраженное анксиолитическое действие в условиях ненаказуемого поведения, увеличивая количество переходов и время пребывания в светлом отсеке «светлой/темной» камеры. Данный эффект сопоставим с таковым у препарата сравнения - валерианы экстрактом.
Таблица 6
Влияние средства и валерианы экстракта на поведение белых крыс в тесте «светлая/темная камера»
Группы животных
Показатели
Количество переходов
Время пребывания в светлом отсеке, сек
Контрольная (Н<sub>2</sub>О), n=13
1.3 ± 0.1
39.5 ± 8.7
Опытная 1 (средство, 50 мг/кг), n=12
2.2 ± 0.5
61.5 ± 17.2
Опытная 2 (средство, 100 мг/кг), n=13
2.0 ± 0.3
62.4 ± 17.4
Опытная 3 (средство, 200 мг/кг), n=12
2.1 ± 0.3*
74.1 ± 16.1
Опытная 4 (валерианы экстракт, 120 мг/кг), n=11
2.2 ± 0.6
69.5 ± 13.5
Примечание: * - различия статистически значимы при р≤0.05 между данными контрольной и опытной групп; n - число животных в группе.
Анксиолитическое действие средства в тесте «конфликтная ситуация по Vogel». Конфликтную ситуацию создавали, сталкивая питьевую и оборонительную мотивации, путем подавления болевым электрическим раздражителем питьевого рефлекса при потреблении крысами воды из чашки. Об анксиолитическом влиянии средства судили по числу наказуемых взятий воды животным за 3 мин нахождения в камере. Установлено, что курсовое введение животным средства в диапазоне доз 100-300 мг/кг устраняло чувство тревоги и страха, увеличивая число наказуемых взятий воды в среднем в 3.3 раза по сравнению с таковым показателем у контрольных животных (таблица 7).
Таблица 7
Влияние средства и валерианы экстракта на поведение белых крыс в тесте «конфликтная ситуация по Vogel» (А) и тесте «поведенческого отчаяния по Порсолту» (Б)
Группы животных
А: Количество взятий воды
Б: Время иммобильности, сек
Контрольная (Н<sub>2</sub>О), n=12
0.7 ± 0.2
94.9 ± 5.8
Опытная 1 (средство, 50 мг/кг), n=14
1.3 ± 0.2
78.3 ± 3.1
Опытная 2 (средство, 100 мг/кг), n=14
2.4 ± 0.2*
62.7 ± 4.3*
Опытная 3 (средство, 200 мг/кг), n=14
2.2 ± 0.1*
71.4 ± 3.8*
Опытная 4 (средство, 300 мг/кг), n=14
2.0 ± 0.2*
-
Опытная 5 (валерианы экстракт, 120 мг/кг), n=14
1.4 ± 0.1
98.1 ± 6.9
Примечание: * - различия статистически значимы при р ≤ 0.05 между данными контрольной и опытной групп; n - число животных в группе.
У животных, получавших средство в дозе 50 мг/кг и препарат сравнения валерианы экстракт, данный показатель повысился по отношению к контролю в 2.0 раза. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что введение животным средства в диапазоне доз 50-300 мг/кг оказывает выраженное анксиолитическое действие в условиях наказуемого поведения, достоверно увеличивая количество взятий воды в методике «конфликтная ситуация по Vogel». При этом средство в дозах 100-300 мг/кг по эффективности превосходит валерианы экстракт.
Антидепрессивное действие средства в тесте «поведенческого отчаяния по Порсолту». Антидепрессивное действие средства исследовали в тесте «поведенческого отчаяния по Порсолту». Определяли время иммобилизации животных в течение 6 мин. Установлено, что введение крысам средства в дозах 50, 100 и 200 мг/кг снижает время иммобилизации животных в тесте «поведенческого отчаяния» на 17, 34 и 25% соответственно по сравнению с аналогичным показателем животных контрольной группы (таблица 7). Использование валерианы экстракта не оказывало влияние на поведение животных в данном тесте. Таким образом, полученные данные позволяют заключить, что средство во всех исследуемых дозах оказывает антидепрессивное действие, превосходящее таковое препарата сравнения.
Источники информации
1. Carović-Stanko K., Petek M., Grdiša M., Šatović Z. Medicinal plants of the family Lamiaceae as functional foods // Czech Journal of Food Sciences. - 2016. - Vol. 34. - P. 377-390. doi: 10.17221/504/2015-CJFS.
2. Trivellini A., Lucchesini M., Maggini R., Mosadegh H., Salomè T. Lamiaceae phenols as multifaceted compounds: bioactivity, industrial prospects and role of “positive-stress” // Industrial Crops and Products. - 2016. - Vol. 83. - P. 241-254. doi: 10.1016/j.indcrop.2015.12.039.
3. Takeda H., Tsuji M., Inazu M., Matsumiya T. Rosmarinic acid and caffeic acid produce antidepressive-like effect in forced swimming test in mice // European Journal of Pharmacology. - 2002. - Vol. 449. - P. 261-267. doi: 10.1016/S0014-2999(02)02037-X.
4. de Sousa D.P., Nóbrega F.F., de Lima M.R., de Almeida R.N. Pharmacological activity of (R)-(+)-pulegone, a chemical constituent of essential oils // Zeitschrift für Naturforschung C. - 2011. - Vol. 66. - P. 353-359. PMID: 21950159.
5. Патент на изобретение RU(11)2429001(13)C1. Средство «Таблетки для ума». Опубликовано: 20.09.2011. Бюл. № 26. - прототип.
6. Патент на изобретение RU(11)2199334(13)C1. Средство "Прасковья". Опубликовано: 27.02.2003. Бюл. № 6. - прототип.
2+
7. Olennikov D.N., Kashchenko N.I., Chirikova N.K. A novel HPLC-assisted method for investigation of the Fe-chelating activity of flavonoids and plant extracts // Molecules. - 2014. - Vol. 19. - P. 18296-18316. doi: 10.3390/molecules191118296.
8. Süntar I., Nabavi S.M., Barreca D., Fischer N., Efferth T. Pharmacological and chemical features of Nepeta L. genus: Its importance as a therapeutic agent // Phytotherapy Research. - 2018. - Vol. 32. - P. 185-198. doi: 10.1002/ptr.5946.
9. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / Под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.