Особенности структуры генома штаммов возбудителя чумы из разных природных очагов, позволяющие проводить внутривидовую дифференциацию

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Особенности структуры генома штаммов возбудителя чумы ив равных природных очагов, позволяющие проводить внутривидовую дифференциацию

Трухачев А.Л.1, Лебедева С.А.1, Васильева Е.А.1, Ракин А.В.2

1 ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора, Ростов-на-Дону, Россия

2 Институт гигиены и медицинской микробиологии им. Петтенкофера, Мюнхен, Германия

Геномы штаммов различных подвидов возбудителя чумы неоднородны. В процессе формирования различных подвидов и биотипов Yersim'a pestis при эволюционном развитии появились специфические метки в геномах этих групп штаммов. Одним из отличительных признаков является неоднородность нуклеотид-ных последовательностей плазмиды pFra у различных подвидов.

Материал и методы. В статье представлены данные о структурной организации pFra плазмиды у различных подвидов возбудителя чумы.

Результаты и обсуждение. Изучение 87 штаммов Y. pestis подтвердило наличие нуклеотидной последовательности (CDS38-CDS40). Эти последовательности стабильно присутствуют в плазмиде pFra штаммов неосновных подвидов и отсутствуют у штаммов основного подвида. Характерной особенностью штаммов подвида caucasica также является присутствие в pFra большого фрагмента ДНК, содержащего гены tra-оперона. Исследование состава генов tra-оперона выявило ряд стабильно присутствующих генов в pFra этого подвида. На основании результатов исследования выбраны специфические последовательности, использованные для создания набора, который позволяет дифференцировать штаммы основного подвида от штаммов неосновных подвидов, а также выявлять штаммы подвида caucasica. Представлен вариант схемы идентификации внутривидовой дифференциации Y. pestis.

Ключевые слова:

чума, внутривидовая дифференциация Y. pestis, плазмида pFra

Для цитирования: Трухачев А.Л., Лебедева С.А., Васильева Е.А., Ракин А.В. Особенности структуры генома штаммов возбудителя чумы из разных природных очагов, позволяющие проводить внутривидовую дифференциацию // Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2019. Т. 8, № 1. С. 64-73. doi: 10.24411/2305-3496-2019-11009. Статья поступила в редакцию 12.09.2018. Принята в печать 24.12.2018.

Features of the genome structure of the plague pathogens from different natural foci, allowing for intra-species differentiation

Trukhachev A.L.1, Lebedeva S.A.1, 1 Rostov-on-Don Research Anti-Plague Institute, Rostov-on-Don, Vasilyeva E.A.1, Rakin A.V.2 Russia

2 Max von Pettenkofer-Institute for Hygiene and Clinical Microbiology, Munich, Germany

64

Журнал для непрерывного медицинского образования врачей

Трухачев А.Л., Лебедева С.А., Васильева Е.А., Ракин А.В. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ ИЗ РАЗНЫХ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ,

ПОЗВОЛЯЮЩИЕ ПРОВОДИТЬ ВНУТРИВИДОВУЮ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЮ

Aim. Genomes of strains of various subspecies of the causative agent of plague are non-uniform. In the course of formation of various subspecies and the Yersinia pestis biotypes at evolutionary development specific tags in genomes of these groups of strains have appeared. One of distinctive signs is heterogeneity of the nucleotide sequences of a plasmid of pFra at various subspecies

Material and methods. Data on the structural organization pFra of a plasmid at various subspecies of the causative agent of plague are presented in article.

Results and conclusions. Studying more than 87 strains of Yersinia pestis has confirmed existence of the nucleotide sequence (CDS38-CDS40). These sequences steadily are present at a plasmid (pFra) of strains of non-main subspecies and are absent at strains of the main subspecies. Characteristic of strains of ssp. caucasica also is presence at pFra of the big fragment of DNA containing genes of tra-operon. The research of structure of tra-operon has revealed a number of steadily present genes in pFra of these subspecies. On the basis of results of a research the specific sequences which have been used for creation of set of reagents which allows to differentiate strains of the main subspecies from strains of non-main subspecies are chosen, and also to reveal caucasica subspecies strains. The version of the scheme of identification of intraspecific differentiation Yersinia pestis is presented.

Keywords:

plague, intraspecific differentiation Yersinia pestis, plasmid pFra, pYT

For citation: Trukhachev A.L., Lebedeva S.A., Vasilyeva E.A., Rakin A.V. Features of the genome structure of the plague pathogens from different natural foci, allowing for intra-species differentiation. Infektsionnye bolezni: novosti, mneniya, obuchenie [Infectious Diseases: News, Opinions, Training]. 2019; 8 (1): 64-73. doi: 10.24411/2305-3496-2019-11009. (in Russian) Received 12.09.2018. Accepted 24.12.2018.

Возбудитель чумы в эволюционном плане сравнительно молодой микроорганизм. Формирование его произошло, скорее всего, поэтапно в процессе эволюции. Приобретение сначала одной, затем второй видоспецифи-ческой плазмиды, целый ряд микроэволюционных мутационных изменений в хромосомных генах за счет делеций или встройки дополнительных фрагментов - все это определило специфичность микроба и появление особых биологических свойств, определивших его патогенность для грызунов и человека. Известная современная полиморфность вида Y. pestis - свидетельство его продолжающейся прогрессивной и регрессивной эволюции в различных географических группах, которая обеспечивает выживание микроба в конкретных условиях природного очага. Географическая обособленность очагов распространения фенотипиче-ски дискретных групп Y. pestis и особенности необычной рамнозопозитивной полевочьей разновидности чумного микроба [1] позволили специалистам предложить деление вида Y. pestis на подвиды. В результате вид оказался представлен одним основным рамнозонегативным подвидом ssp. pestis и пятью неосновными рамнозопозитивными подвидами: caucasica, altaica, hissarica, ulegeica, talassica.

Одной из особенностей штаммов неосновных подвидов является увеличение молекулярной массы самой высокомолекулярной видоспецифической плазмиды pFra, определяющей у основного подвида продукцию капсульного антигена F1 и мышиного токсина [2-4]. У всех штаммов подвида caucasica величина плазмиды достигает 90 МДа, тогда как у представителей остальных неосновных подвидов она может варьировать от 85 до 70 МДа, хотя некоторые штаммы из этой зоны несут типичную плазмиду с молекулярной массой 65 МДа. По имеющимся данным [5, 6], происхождение этой видоспецифической плазмиды чумного микроба связано

с плазмидой, типичной для S. enterica серовар typhi, которая в ходе микроэволюционных перестроек превратилась в чумную.

При сравнении последовательностей нуклеотидов плазмиды pFra штамма Pestoides G 8786 (подвид caucasica) с подобными у плазмид типовых для основного подвида Y. pestis штаммов в ней обнаружены 2 дополнительных больших области кодирования [7]. Область 1 содержит 3 открытые рамки считывания (CDS38-40) с высоким уровнем подобия некоторым генам плазмиды pHCM2 от S.enterica серовар typhi штамма CT18 [5, 6] которые отвечают за синтез а-и р-субъединиц рибонуклеозид-дифосфатредуктазы и неизвестного белка. Область 2 локализована между ymt (гены мышиного токсина) и caf (гены антигена Caf1) детерминантами и содержит большую группу генов, гомологичных локализованным в tra-оперонах F- и R-плазмид некоторых энте-робактерий.

Пока нет данных о том, насколько эти факты, обнаруженные в разных лабораториях на нескольких штаммах, закономерны для всех рамнозопозитивных штаммов Y. pestis. Выяснение этих закономерностей позволит уточнить гено-типические различия групп штаммов вида Y. pestis и предложить эффективный и быстрый прием внутривидовой дифференциации штаммов основного и неосновных подвидов. Определение штаммов возбудителя чумы к основному или к одному из неосновных подвидов может также характеризовать эпидемическую значимость этих штаммов для человека. Штаммы основного подвида являются эпидемически значимыми, а неосновных подвидов - эпидемически не значимыми [8].

Цель работы - определение наличия ряда генетических маркеров штаммов неосновных подвидов возбудителя чумы, таких как гены tra-оперона и области 1 в рFrа/Tox плазмидах,

65

ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ: новости, мнения, обучение. Том 8, № 1, 2019

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

делеции в гене araC и возможность с их помощью проводить внутривидовую дифференциацию Y. pestis и идентификацию отдельных подвидов.

Материал и методы

В работе была использована коллекция, включающая 82 штамма Y. pestis, выделенных в различных природных очагах чумы, 9 штаммов Y. pseudotuberculosis различных сероваров, 3 штамма Y. enterocolitica, 5 штаммов E. coli, 4 из которых содержали в своем геноме последовательности различных tra-оперонов. Среди штаммов возбудителя чумы - 38 основного подвида (Rha-) и 44 - Y. pestis неосновных подвидов (Rha+), выделенных в различных мезо-очагах Кавказа, Монголии, Горного Алтая и Памира. Изучены также полученные в ходе исследований 5 изогенных штаммов неосновного подвида (4 ssp. caucasica и 1 ssp. altaica), у которых отсутствовала плазмида pFra. Изогенные штаммы были отобраны путем анализа клонов исследуемых штаммов на наличие плазмидной ДНК. Клоны получали при высеве штаммов на плотный (1,5%) агар LB (Difco, США) после длительного хранения на полужидком (0,7%) агаре LB в условиях холодильника (4-8 °C).

Характеристика штаммов представлена в табл. 1.

Для генотипирования применяли полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с праймерами, представленными в табл. 2. Подготовку проб и обеззараживание тестируемых штаммов проводили согласно методическим указаниям МУ 1.3.2569-09 [9]. Идентификацию штаммов возбудителя чумы и псевдотуберкулеза осуществляли с использованием праймеров, рекомендованных МУК 4.2.2940-11 (тест-система «ГенПест»), а также праймеров vLm12for/ISrev216 и ^в составе ранее предложенного набора реагентов для идентификации штаммов возбудителя чумы [10-12]. Праймеры, комплементарные генам tra-оперона и области 1 плазмиды pFra (traA, traP, traH, copB/tapA, finO, cds39, cds40) были сконструированы на основе сиквенса плазмиды G 8786 из одноименного штамма Y. pestis. Сохранение протяженности гена araC арабинозного оперона выявляли праймерами «ypo2258» [13]. Амплификацию ДНК с праймерами «vLm12for/ISrev216», «traA», «cds39», «JS» проводили в режиме: первый этап при 94 °С - 5 мин, далее -30 циклов, состоящих из следующих этапов: 94 °С - 15 с, 65 °С - 15 с, 72 °С - 30 с, третий этап 72 °С - 5 мин; с праймерами «cds40», «traP», «traH», «finO», «copB/tapA»: первый этап 94 °С - 5 мин, далее следуют 30 циклов, состоящих из шагов: 94 °С - 15 с, 58 °С - 15 с, 72 °С - 30 с, третий этап 72 °С - 5 мин; с праймерами, предложенными в других исследованиях, условия постановки ПЦР соответствовали рекомендациям авторов.

Для постановки ПЦР с учетом результатов в электрофорезе и реальном времени использовали стандартные наборы реактивов производства «Интерлабсервис» (Россия). Реакционная смесь для постановки ПЦР в варианте учета результатов с помощью электрофореза имела объем 25 мкл и содержала: 1х (однократный) ПЦР-буфер; MgCL2 - 2 ммоль; dNTP mix - 0,4 ммоль; праймер 1 - 1-2 пмоль; праймер 2 - 1-2 пмоль; TaqDNA полимераза - 1 ед.; исследуемая

ДНК - 5 мкл; воды деионизованной до 25 мкл. Реакционная смесь для постановки ПЦР в варианте учета результатов в реальном времени имела объем 35 мкл и содержала: 1х (однократный) ПЦР буфер; MgCl2 - 1,5 ммоль; dNTP mix -0,4 ммоль; праймер 1 - 1-2 пмоль; праймер 2 - 1-2 пмоль; зонд - 5-7 пмоль; TaqDNA полимераза - 2 ед.; исследуемая ДНК - 5 мкл; воды деионизованной до 35 мкл. Коммерческие наборы реагентов использовали согласно рекомендациям производителей.

ПЦР проводили в амплификаторах «Терцик» (ДНК-технология, Россия; для большинства праймеров) и «ДТ-lite» (ДНК-технология, Россия; для праймеров alt и cds39z). Учет результатов при электрофоретическом разделении ампли-фицированных фрагментов ДНК проводили в 2% агарозных гелях с использованием трис-ацетатного буфера.

Изогенные штаммы с утраченной плазмидой pFra отбирали при поклональном анализе с помощью скрининга плазмид методом Kado [14] и электрофоретического анализа выделенной ДНК в 0,7% агарозном геле с окраской этидий бромидом

Результаты и обсуждение

Изученные рамнозопозитивные штаммы Y. pestis из Закавказья, которые были выделены в 3 раздельных поле-вочьих мезоочагах: Ленинаканский (Армения), Зангезуро-Карабахский (Азербайджан) и Кокмандагский (Дагестан), в ПЦР со всеми праймерами, комплементарными ДНК pFra, показали следующие результаты: с помощью праймеров cds39, cds40, traA, ШР и ^Н определена продукция специфических по длине амплификатов во всех случаях, если присутствовали определяемые последовательности ДНК. Этот результат свидетельствовал о наличии в штаммах подвида caucasica как фрагментов ДНК «области 1», комплементарных «cds39» и «cds40», так и последовательностей tra-оперона (см. табл. 1). Положительная реакция с праймерами «traA», «^Р» и «tra^», мишени которых расположены на обоих концах и в середине tra-оперона, позволяла предположить наличие в pFra плазмиде закавказских поле-вочьих штаммов Y. pestis значительной его части. В ряде штаммов не были получены положительные результаты с праймерами «copB/tapA» или «finO», что могло свидетельствовать о мутациях в данных участках плазмидной ДНК. Однако другие праймеры, комплементарные генам tra-оперона в этих штаммах, имели свои мишени.

ДНК штаммов, выделенных в очагах Азиатского материка и в соответствии с их характеристикой, отнесенных к подвидам hissarica, altaica, ulegeica и talassica, не реагировали ни с одним из праймеров, выявляющих гены tra-оперона (см. табл. 1), но давали специфическую положительную реакцию с праймерами «cds39» и «cds40», что выражалось появлением специфических по длине фрагментов амплификации. Для подтверждения того, что праймеры «cds39» и «cds40» выявляют комплементарные последовательности, находящиеся в плазмиде pFra исследованных штаммов, был полу-

66

Журнал для непрерывного медицинского образования врачей

e

m

/s P s

0

1 I СГ

m m

0 >

m ш

1

X

О ш О

x

го

I

о

СП <

х го

X

51

со

I4J О Ш

Таблица 1. Штаммы, использованные в работе, и результаты их тестирования методом полимеразной цепной реакции

О)

-vi

№ Штамм Место выделения/ Подвид 1 Праймеры 1

1гаА йэг/ 1гаА геу traHfor/ traH rev traP for/ traP rev finO for / finO rev сорВ йэг/ 1арА геу cds39 cds40 \\ml2/ Y PO 2258 Ген Пест pla/caf

получения Fam,Rox- 1э216 геу

cds39z Рат-аИ

Yersinia pestis

1 652 Армения caucasica + + + + - + + + + -/+

2 564 Армения caucasica + - + + + + + + + -/+

3 564 Fra- Лабораторный штамм caucasica - - - - - - - + + -/-

4 280a Армения caucasica + + + + + + + + + -/+

5 110 Армения caucasica + + + + - + + + + -/+

6 107 Армения caucasica + + + + + + + + + -/+

7 192 Армения caucasica + + + + + + + + + -/+

8 8356 Армения caucasica + + + - - + + + + -/+

9 M-999 Армения caucasica + + + + - + + + + -/+

10 C-715 Дагестан caucasica + + + - + + + + + -/+

11 C-716 Дагестан caucasica + + + - + + + + + -/+

12 C-717 Дагестан caucasica + + + - - + + + + -/+

13 C-500 Дагестан caucasica + + + - + + + + + -/+

14 C-500 Fra- Лабораторный штамм caucasica - - - - - - - + + -/-

15 C-537 Дагестан caucasica + + + - - + + + + -/+

16 C-535 Дагестан caucasica + + + + - + + -/+

17 C-539 Дагестан caucasica + + + + - + + + + -/+

18 C-676 Дагестан caucasica + + + + - + + + + -/+

19 C-776 Дагестан caucasica + + + + - + + + + -/+

20 80 Азербайджан caucasica + + + + + + + + + -/+

21 377 Азербайджан caucasica + + - + + + + + + -/+

22 377 Fra- Лабораторный штамм caucasica - - - - - - - + + -/+

23 336 Азербайджан caucasica + + + + + + + + + -/+

24 336 Fra- Лабораторный штамм caucasica - - - - - - - + + -/-

25 1323 Азербайджан caucasica + + + - + + + + + -/+

26 1695 Азербайджан caucasica + + + + + + + + + -/+

27 173 Манчжурия ulegeica - - - - - + + + + +/+

28 И-126 Алтай altaica - - - - - + + + - +/+

29 И-126 Fra- Лабораторный штамм altaica - - - - - - - + - +/+

30 436 МНР altaica - - - - - + + + - +/+

31 2420 МНР altaica - - - - - + + + - +/+

32 2563 МНР altaica - - - - - + + + - +/+

33 887 МНР altaica - - - - - + + + + +/+

О О О

=1 >

° 1= со Е

Ü 3

5 ° В го

t го m О -m СО ; Q1

"о -< о

Го S

-с >

I 3 §.

^ Eg 5 rí го

S W ш

со >

0 X

ГО СГ ГО

5 * S

> И г

II ф в "О в ° т? П

"О I >

m CT :

Í XTJ

5o»

Sí1

й > I

1 3 >

5 СО ro

О) 00

<

TD X

QJ

>

> >

Л] X IT) =1 TD IT) TD CT Ш I О

IT) >

X

n

о

О СП TD QJ Ш

0 ш

QJ

1 S Л] Ш TD QJ X IT)

№ Штамм Место выделения/ получения Подвид

traA for/ traA rev traH for/ traH rev

34 1068 МНР ulegeica - -

36 A-819 Киргизия talassica - -

37 A-1805 Киргизия talassica - -

38 A-1807 Киргизия talassica - -

39 A-1806 Киргизия talassica - -

40 A-513 Алтай altaica - -

41 A-1724 Таджикистан hissarica - -

42 95 Забайкалье pestis - -

43 EV1290 Мадагаскар pestis - -

44 363 Киргизия pestis - -

45 231 Киргизия pestis - -

46 98 Индия pestis - -

47 100 Африка pestis - -

48 923 Китай pestis - -

49 Nhatranng 64 Вьетнам pestis - -

50 Nhatranng 65 Вьетнам pestis - -

51 Kenia Osola Африка pestis - -

52 Kenia 75 Африка pestis - -

53 Kenia 23 Африка pestis - -

54 Senegal Ma Kan Африка pestis - -

55 210 Африка pestis - -

56 Saigon 62/3 Вьетнам pestis - -

57 Yava 1135 Азия pestis - -

58 C-71 Вьетнам pestis - -

59 P-146, Россия (Прикаспий) pestis - -

60 P-120 Россия (Прикаспий) pestis - -

61 308 Туркмения pestis - -

62 326 Туркмения pestis - -

63 336 Туркмения pestis - -

64 358 Туркмения pestis - -

65 Hamburg 15 Германия pestis - -

66 Madagaskar 1/64 Мадагаскар pestis - -

67 A-559 Turgejk Турция pestis - -

68 Harbin 35 Китай pestis - -

69 963ax Центральный Кавказ pestis - -

Продолжение табл. 1

Праймеры |

КаР Ш/ 1гаР геу АпО Ш / АпО геу сорВ йэг/ 1арА геу СС)539 СС)540 у1т12/ УРО 2258 Ген Пест pla/caf

Рат.Рох- 1э216 геу

сс^ЗЭг Гат-аИ

- - - + + + + +/+

- - - + + + + +/+

- - - + + + + +/+

- - - + + + + +/+

- - - + + + + +/+

- - - + + + + +/+

- - - + + + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + -

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

- - - - - + + +/+

e

m

/s P s

0

1 I СГ

m m

0 >

m ш

1

X

О ш О

I ID X

0

СП <

X

го

1

51

со

INJ О

ш

Окончание табл. 1

Праймеры

№ Штамм Место выделения/ Подвид 1гаА 1ог/ 1гаА геу traHfor/ traH rev traP for/ traP rev finO for / finO rev сорВ Л) г/ 1арА геу cds39 у1т12/ YP0 2258 Ген Пест р1а/саГ

получения Fam,Rox- cds40 1э216 геу

cds39z Рат-аИ

70 603э Центральный Кавказ pestis - - - - - - - + + +/+

71 715эх Центральный Кавказ pestis - - - - - - - + + +/+

73 4 Астрахань pestis - - - - - - - + + +/+

74 923 Китай pestis - - - - - - - + + +/+

75 67 Астрахань pestis - - - - - - - + + +/+

76 1072 Астрахань pestis - - - - - - - + + +/+

77 205 Гурьев pestis - - - - - - - + + +/+

78 115 Астрахань pestis - - - - - - - + + +/+

79 261 Аральск pestis - - - - - - - + + +/+

80 1060tten Неизвестно pestis - - - - - - - + + +/-

81 1480 Монголия pestis - - - - - - - + + +/+

82 Р-291 Гурьев pestis - - - - - - - + + +/+

Yersinia pseudotuberculosis

1 Н141/84 Германия 0:1a - н/и +

2 Н706/86 Япония 0:1b - н/и +

з Н143/84 Германия 0:2b - н/и +

4 Н460/86 Япония 0:2c н/и +

5 Н146/84 Германия 0:3 н/и +

6 Н452/86 Франция 0:4a н/и +

7 Н715/86 Япония 0:4b - н/и +

8 Н719/86 Япония 0:5a - н/и +

9 Н450/86 Япония 0:5b н/и +

Yersinia enterocolitica

1 5505 Происхождение в паспорте не указано 3-й биовар - - - - - - - - н/и -

2 5515 Происхождение в паспорте не указано 2-й биовар - - - - - - - - н/и -

3 2000 Происхождение в паспорте не указано 3-й биовар - - - - - - - - н/и -

E. coli

1 HfrH Лабораторный штамм - - н/и -

2 HfrC Лабораторный штамм н н/и

з С/А Лабораторный штамм  ^н н/и

4 НВ101pRP4 Лабораторный штамм - - н/и -

5 HB101pR527 Лабораторный штамм н/и

о о о

о аз - го

Sgg

СПх

Э >< Ш

Iii

S m >

г -С >

^ о

_ CD ^ го

СО ш

W > X -

сг со х о

=1 5

"О f

X CD -п Го

о ш m

I?*

х -о

о £

Л i

> х

3 >

аз со

О)

со

Примечание, н/и - не исследовали.

Таблица 2. Праймеры и зонды, использованные в работе

№ Пары прай- Нуклеотидная последовательность праймеров Расположение праймеров согласно данным сиквенса У. pestis С092, У. pestis Длина фраг- Ссылка

меров и зонда 5~-3~ PG87861 мента, п.н.

altfor TCCTGAATCAGGAGAGCAGATTACC 3276961-3276985 AJJ88222.1transposase for insertion sequence IS100 224 Настоящее исследование

1 altrev TGAAGCCGCTCACACGATGT 3277165-3277184 AJJ87892.1 type IV/ VI secretion system protein, DotU family

Fam-alt Fam -TTTGAAGGCGATAATGACGGCGGGA-BHQ-1 Зонд

cds39zfor TAAACAG ATAGTCAG CCCAG CG СА 38855-38878 Предположительно рибонуклеозид-дифосфатредуктаза Р-субъединица1 155

2 cds39zrev G CATTG CGAAGGTACTGAACGCAT 38986-39009 Предположительно рибонуклеозид-дифосфатредуктаза Р-субъединица1 Настоящее исследование

Fam-cds39z Fam -AGACCTTCACGACCGGTACGCATAAA -BHQ-1 Зонд

Rox-cds39z Rox -AGACCTTCACGACCGGTACGCATAAA -BHQ-2 Зонд

3 IS216 rev G CTC AG ATTTTG CCTG СА A A 3276825-3276844 А_и88222.1 транспозаза 15100 390 [Ю]

vlml2 for TATCGTCCG CTATTG CCTGT 3277198-3277217 А_и87892.1 гипотетический протеин

4 cds39 for TTAAAG GTCTG CG AACTG G CTC 38595-38616 Предположительно рибонуклеозид-дифосфатредуктаза Р-субъединица1 418 Настоящее

cds39 rev TCTG CATTGCGAAGGTACTGAAC 38990-39012 Предположительно рибонуклеозид-дифосфатредуктаза Р-субъединица1 исследование

5 cds40for CGCGCGACGTGACACATAGT 41402-41421 Предположительно рибонуклеозид-дифосфатредуктаза а-субъединица1 486 Настоящее

cds40rev G G G CAGTATG ACTACCCG AATTTC 41864-41887 Предположительно рибонуклеозид-дифосфатредуктаза а-субъединица1 исследование

6 traAfor TGTCTATTATTAACGCTGTACCCGC 82140-82164 Субъединица 1гаА конъюгативной фимбрии1 472

traA rev CAG CTG G CAGTATG GAAATACCTG 82588-82611 Межгенное пространство1

7 traPfor G ATG CTTAAG CTTCTGTCCGTCC 87124-87102 ТгаР протеин 448

traPrev GGCAGAAATACGGACGGCAT 87531-87550 ТгаР протеин

finOfor CAAAGCGGAGCCAGAAGGTC 110360-110379 Р1пО протеин 587 Настоящее

finOrev TTAG CGTG CTCCTG AG CCCT 110928-110947 Р1пО протеин исследование

9 copBfor tcatacagttgaggctggtagctt 112356-112379 САС27519.1 СорВ протеин 543

tap A rev G CACAG AAACG G GTATTG CAGT 112878-112899 САС27520.1 ТарА протеин

10 traH for TGATGATAAACCTGTTCAGACACCG 96564-96588 ТгаН протеин (рС8786) 550

traH rev AAACATGTTG CTCTCACCG G С 97094-97114 ТгаН протеин

11 YP02258 for AACCG CAACCCAATCCTTTG 2537819-2537838 Регуляторный протеин арабинозного оперона АгаС 140 [13]

YP02258 rev ATATAG CCCTTCATG CCG CC 2537929-2537948 Регуляторный протеин арабинозного оперона АгаС

12 JS for G CAG CTTAG G CTGTCATCG 2432013-2432031 Предположительно фаговый протеин 223 [11]

JS rev CTATCGCCTGATTGGAGAG 2431809-2431827 Предположительно фаговый протеин

Трухачев А.Л., Лебедева С.А., Васильева Е.А., Ракин А.В. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ ИЗ РАЗНЫХ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ,

ПОЗВОЛЯЮЩИЕ ПРОВОДИТЬ ВНУТРИВИДОВУЮ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЮ

чен изогенный вариант одного из штаммов подвида altaica (Y. pestisИ-126), у которого отсутствовала плазмида pFra. С ДНК этого штамма праймеры cds39 и cds40 не взаимодействовали. Подобные изогены получены и при элиминировании плазмиды pFra из нескольких штаммов, относящихся к подвиду caucasica (Y. Pestis 336 Fra-, 377 Fra-, 564 Fra-, С-500 Fra-). Результаты ПЦР-анализа ДНК этих штаммов с праймерами cds39 - cds40 а также traA, traH, traP подтвердили вывод о том, что перечисленные праймеры реагируют только с ДНК плазмид этих штаммов.

Обнаруженные отличия при изучении tra-оперона у штаммов возбудителя чумы подтверждают свидетельства, послужившие основой для выделения полевочьих штаммов из Закавказья в особую полевочью разновидность [1] или подвид caucasica. Эти штаммы, наиболее близкие по свойствам к Y. pseudotuberculosis, отличаются по многим признакам не только от классических штаммов возбудителя чумы, но и от штаммов других неосновных подвидов.

Следует также отметить, что такие штаммы, как Y. pestis Angola и Microtus str. 91001, Pestoides B, Pestoides G и другие штаммы неосновных подвидов, полный сиквенс которых имеется в доступных базах данных, содержат в составе плазмид pFra комплементарные праймерам cds39 последовательности и могут быть также детектированы этими праймерами. Согласно данным, полученным c помощью программы Blast, последовательности, комплементарные праймерам traA, помимо штаммов, ранее упоминавшихся в работе, представлены в плазмидной ДНК других штаммов, относящихся к подвиду caucasica. Интересно также отметить, что сравнительный анализ последовательностей области 1 плазмиды pFra штаммов неосновного подвида и других последовательностей из базы данных GenBank с помощью Blast позволил обнаружить сальмонеллезный фаг - Salmonella phage SSU5 (GenBank: JQ965645.1), имеющий в своем составе гомологичные области. Авторы, описавшие этот фаг, предполагают, что он является филогенетическим предшественником плазмиды pHCM2 из S.typhi CT18 [15], которая, в свою очередь, связана с образованием плазмиды pFra штаммов Y. pestis неосновных подвидов. Следует также обратить внимание на то, что все штаммы неосновных подвидов в проведенном исследовании имели в составе генома нуклеотидную последовательность области 1, которая отсутствовала у штаммов основного подвида. Это может свидетельствовать о том, что либо генетический маркер этих штаммов (область 1) был получен клоном, предшественником всех Pestoides после ответвления от основного ствола филогенетического дерева, на котором в дальнейшем появились клоны, относящиеся к основному подвиду, либо этот маркер изначально присутствовал у общего предка, а потом у клона предшественника всех штаммов основного подвида был утрачен.

Представленные результаты позволяют рекомендовать использование специфических участков плазмидной ДНК в качестве мишеней для выявления штаммов неосновных подвидов и их дифференциации от штаммов основного подвида. С целью идентификации штаммов неосновного подвида предложено использовать праймеры cds39, а для выявления штаммов ssp. caucasica - traA.

Алгоритм применения набора праймеров в ПЦР (см. рисунок) предполагает на первом этапе исследования идентификацию возбудителя чумы и его дифференциацию от близкородственного возбудителя псевдотуберкулеза с помощью набора праймеров vLm12for/ISrev216 и JS, предложенного для этих целей ранее [12, 16]. Следующим этапом является внутривидовая дифференциация на штаммы основного и неосновных подвидов с помощью праймеров cds39. Штаммы неосновных подвидов на следующем этапе могут быть исследованы дополнительно для определения их позиции внутри этой группы с помощью праймеров traA и ypo2258. Праймеры ypo2258 используют для выявления делеции 112 пар нуклеотидов в гене araC, что является одним из отличительных признаков штаммов, выделенных в Китае [13, 17]. Тестирование всех штаммов неосновных подвидов, имеющихся в коллекции, с праймерами ypo2258 в ПЦР позволило выявить 4 штамма, ранее идентифицированные как подвид altaica Y. pestis (И-126, 2420, 2563, 436), выделенных не в Китае, а в Монголии, но имеющие ранее описанную делецию в гене araC. Эти штаммы можно было бы по этому признаку отнести к группе неосновных подвидов, сходных с китайскими.

Представленный алгоритм позволяет на любом этапе лабораторного исследования материала, подозрительного на наличие Y. pestis, оперативно, без привлечения сложных приборов и дорогостоящих методов, с минимальными затратами получить важный для эпидемиологического анализа ответ: относится ли выделенный штамм к основному подвиду - потенциально эпидемически опасному либо его можно причислить к неосновным подвидам - эпидемически не опасным.

Существующий алгоритм генетического исследования и внутривидовой дифференциации штаммов Y. pestis предназначен в основном для его использования на более поздних этапах лабораторного исследования, так как требует

уро2258- traA- уро2258+ traA- traA+ уро2258+

Y. pestis, ssp. altaica, microtus-like

Y. pestis, ssp. hisarica, ssp. talassica, ssp. altaica, ssp. ulegeica angola

Y. pestis ssp. caucasica

Алгоритм применения набора праймеров в полимеразной цепной реакции для идентификации возбудителя чумы

ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ: новости, мнения, обучение. Том 8, № 1, 2019

71

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

более сложного оборудования и квалифицированного персонала [18]. Хотя отдельные методические приемы, используемые в этом алгоритме, а именно дифференциация на основной и неосновные подвиды, могут быть применены также на ранних этапах исследования.

В ходе проведенного исследования были дополнительно сконструированы пары праймеров aLtfor/aLtrev и cds39zfor/cds39zrev, а также соответствующие им флуоресцентно меченные зонды, которые комплементарны мишеням для праймеров vLm12for/ISrev216 и cds39, позволяющие проводить оперативную идентификацию и внутривидовую дифференциацию Y. pestis в ПЦР с учетом результатов в режиме реального времени. Результаты ПЦР с этими наборами реагентов не отличались от таковых, полученных при использовании метода электрофорезного разделения амплифицированных фрагментов. Установлено, что предложенные праймеры и зонды специфичны и могут быть использованы для идентификации штаммов возбудителя чумы и их внутривидовой дифференциации (см. табл. 1).

Таким образом, на значительном числе штаммов неосновных подвидов Y. pestis подтверждено присутствие в их геноме уникальных областей, которых нет у основного подвида. Скрининг области 1 Y. pestis показал ее наличие только в ДНК штаммов неосновных подвидов. Присутствие области 2 с генами tra-оперона было подтверждено только у штаммов Y. pestis ssp. caucasica. Не все гены tra-оперона стабильно выявляются в штаммах возбудителя чумы, однако такие как traA, traH, traP были определены у всех штаммов Y. pestis ssp. caucasica. На основании выявленных генетических маркеров предложен алгоритм идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов Y. pestis. Описанная выше дифференциация штаммов, прежде всего по стабильным структурным особенностям видоспецифической плаз-миды Y. pestis, помогает в оценке степени их эпидемической опасности и в выборе мероприятий в рамках эпидемиологического надзора за чумой в различных по активности очагах.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Трухачев Алексей Леонидович (Trukhachev Aleksei L.) - кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией микробиологии чумы ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора, Ростов-на-Дону, Россия E-mail: trukhachev_aL@antipLague.ru https://orcid.org/0000-0002-3531-1146

Лебедева Светлана Александровна (Lebedeva Svetlana A.) - доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории микробиологии чумы ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный института» Роспотребнадзора, Ростов-на-Дону, Россия E-mail: plague@aaanet.ru

Васильева Екатерина Анатольевна (Vasilyeva Elena A.) - научный сотрудник лаборатории микробиологии чумы ФКУЗ «Ростовский-на-Дону противочумный институт» Роспотребнадзора, Ростов-на-Дону, Россия E-mail: ekaterina9045@mail.ru

Ракин Александр Владимирович (Rakin Alexandr V.) - кандидат медицинских наук, заведующий лабораторией иерсиний Института гигиены и медицинской микробиологии им. Петтенкофера, Мюнхен, Германия E-mail: rakin@mvp.uni-muenchen.de

ЛИТЕРАТУРА

1. Леви М.И., Канатов Ю.В., Сагатовская Л.А., Канатова Е.А. Новая разновидность чумного микроба // Тр. Ростовск. н/Д н. противочум. инта. 1961. № 18. С. 3-23.

2. Гончарова Н.А., Иванова В.С., Лебедева С.А., Заренков М.И. Генетический анализ высокомолекулярных плазмид полевочьих штаммов чумного микроба // Эпидемиол., микробиол., иммунол. бактер. и вирус. инф. Ростов н/Д, 1989. С. 145-147.

3. Иванова В.С., Лебедева С.А., Гончарова Н.А., Гурлева Г.Г. Скрининг плазмид у музейных штаммов чумного микроба, выделенных из разных природных очагов // Молекул. генетика. 1990. № 3. С. 16-18.

4. Филиппов А.А., Солодовников Н.С., Куклева Л.М., Проценко О.А. Изучение плазмидного состава штаммов возбудителя чумы из разных природных очагов // Журн. микробиол. 1992. № 3. С. 10-13.

5. Hu P., Elliot J., McCready P., Skowronskl E. et al. Structural organization of virulence-associated plasmids of Yersinia pestis // J. Bacteriol. 1998. Vol. 180. P. 5192-5202.

6. Linder E., Plano G.V., Burland V., Mayhew G.F. et al. Complete DNA sequence and detailed analysis of the Yersinia pestis // Infect. Immun. 1998. Vol. 66, N 12. P. 5731-5742.

7. Golubov A., Neubauer H., Nolting Ch., Heesemann J. et al. Structural organization of the pFra virulence-asociated plasmid of rhamnose-positive Yersinia pestis // Infect. Immun. 2004. Vol. 72, N 10. P. 1-9.

8. Кокушкин А.М. Социально-биологические аспекты эпидемиологии чумы : автореф. дис. ... д-ра мед. наук. Саратов; 1995.

9. МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

10. Motin V.L., Georgescu A.M., Elliott J.M., Hu P. et al. Genetic variability of Yersinia pestis isolates as predicted by PCR-based IS100 genotyping and analysis of structural genes encoding Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase (glpD) // J. Bacteriol. 2002. Vol. 184, N 4. P. 10191027.

11. Radnedge L., Gamez-Chin S., McCready P.M., Worsham P.L. et al. Identification on nucleotide sequences of the specific and rapid detection of Yersinia pestis // Appl. Environ. Microbiol. 2001. Vol. 67, N 8. P. 37593762.

12. Трухачев А.Л., Иванова В.С., Арсеньева Т.Е., Лебедева С.А. и др. Поиск праймеров на основе хромосомной ДНК Yersinia pestis для наиболее эффективной ПЦР - идентификации типичных и атипичных

72

Журнал для непрерывного медицинского образования врачей

Трухачев А.Л., Лебедева С.А., Васильева Е.А., Ракин А.В. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ ИЗ РАЗНЫХ ПРИРОДНЫХ ОЧАГОВ,

ПОЗВОЛЯЮЩИЕ ПРОВОДИТЬ ВНУТРИВИДОВУЮ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЮ

штаммов возбудителя чумы // Клин. лаб. диагностика. 2008. № 12. С. 49-52.

13. Zhou D., Tong Z., Song Y., Han Y. et al. Genetics of metabolic variants between Yersinia pestis biovars and proposal of a new biovar microtus // J. Bacteriol. 2004. Vol. 186, N 15. P. 5147-5152.

14. Kado C.J., Liu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids // J. Bacteriol. 1981. Vol. 145, N 3. P. 13651373.

15. Kim M., Kim S., Ryu S. Complete Genome Sequence of Bacteriophage SSU5 Specific for Salmonella enterica serovar Typhimurium rough strains // J. Virol. 2012. Vol. 86, N 19. Article ID 10894.

16. Трухачев А.Л., Лебедева С.А., Васильева Е.А., Иванова В.С. и др. Способ идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов вида Yersinia pestis. Пат. № 2404251. С1 МПК d2Q 1/00. Изобретение, заявка № 2009116579/10 от 29.04.2009 г. Опубл.: 20.11.2010. Бюл. № 32, 12 с.

17. Ерошенко Г.А., Видяева Н.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М. и др. Структурно-функциональный анализ гена araC у штаммов Yersinia pestis различного происхождения // Мол. генетика. 2009. № 3. С. 21-25.

18. Ерошенко Г.А., Одиноков Г.Н., Куклева Л.М., Павлова А.И. и др. Стандартный алгоритм молекулярного типирования штаммов Yersinia pestis // Журн. микробиол.. 2012. № 3. С. 25-35.

REFERENCES

1. Levi M.I., Kanatov Yu.V., Sagatovskaya L.A., Kanatova E.A. New species of the plague microbe. In: Proceedings of the Rostov-on-Don Anti-Plague Institute. 1961;

2. Goncharova N.A., Ivanova V.S., Lebedeva S.A., Zarenkov M.I. Genetic analysis of macromolecular plasmids of vegetational strains of the plague bacteria. In: Epidemiology, microbiology, immunology of bacterial and viral infections. Rostov-on-Don, 1989: 145-7.

3. Ivanova V.S., Lebedeva S.A., Goncharova N.A., Gurleva G.G. Plasmid screening in archival strains of the plague microbe isolated from various natural foci. Molecular Genetics [Molekulyarnaya genetika]. 1990;

4. Filippov A.A., Solodovnikov N.S., Kukleva L.M., Protsenko O.A. Study of the plasmid composition of plague pathogen strains from various natural foci. Zhurnal mikrobiologii [Journal of Microbiology]. 1992;

5. Hu P., Elliot J., McCready P., Skowronski E., et al. Structural organization of virulence-associated plasmids of Yersinia pestis. J Bacteriol. 1998; 180: 5192-202.

6. Linder E., Plano G.V., Burland V., Mayhew G.F., et al. Complete DNA sequence and detailed analysis of the Yersinia pestis. Infect Immun. 1998; 66 (12): 5731-42.

7. Golubov A., Neubauer H., Nolting Ch., Heesemann J., et al. Structural organization of the pFra virulence-asociated plasmid of rhamnose-positive Yersinia pestis. Infect Immun. 2004; 72 (10): 1-9.

8. Kokushkin A.M. Socio-biological aspects of the epidemiology of plague: Autobstract of Diss. Saratov; 1995.

9. Organization of laboratories using nucleic acid amplification methods for the work with materials containing microorganisms I-IV pathogenicity groups, MU 1.3.2569-09.

10. Motin V.L., Georgescu A.M., Elliott J.M., Hu P., et al. Genetic variability of Yersinia pestis isolates as predicted by PCR-based IS100

genotyping and analysis of structural genes encoding Glycerol-3-Phosphate Dehydrogenase (glpD). J Bacteriol. 2002; 184 (4): 1019-27.

11. Radnedge L., Gamez-Chin S., McCready P.M., Worsham P.L., et al. Identification on nucleotide sequences of the specific and rapid detection of Yersinia pestis. Appl Environ Microbiol. 2001; 67 (8): 3759-62.

12. Trukhachev A.L., Ivanova V.S., Arsen'eva T.E., Lebedeva S.A., et al. Search for primers on the basis of Yersinia pestis chromosomal DNA for effective PCR identification of typical and atypical plague pathogen strains. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika [Russian Clinical Laboratory Diagnostics Journal]. 2008;

13. Zhou D., Tong Z., Song Y., Han Y., et al. Genetics of metabolic variants between Yersinia pestis biovars and proposal of a new biovar microtus. J Bacteriol. 2004; 186; 15: 5147-52.

14. Kado C.J., Liu S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J Bacteriol. 1981; 145 (3): 1365-73.

15. Kim M., Kim S., Ryu S. Complete Genome Sequence of Bacteriophage SSU5 Specific for Salmonella enterica serovar Typhimurium rough strains. J Virol. 2012; 86 (19): 10894.

16. Trukhachev A.L., Lebedeva S.A., Vasilieva E.A., Ivanova V.S., et al. Yersinia pestis strains identification and intragroup differentiation method. Pat. No. 2404251. C1 IPC S12Q 1/00. Invention, application number 2009116579/10 dated 04.29.2009. Publ.: 20.11.2010. Bul. No. 32: 12 p.

17. Eroshenko G.A., Vidyaeva N.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., et al. Structural and functional analysis of araC gene in Yersinia pestis of various origins. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2009;

18. Eroshenko G.A., Odinokov G.N., Kukleva L.M., Pavlova A.I., et al. Standard algorithm of molecular typing of Yersinia pestis strains. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii [Journal of Microbiology, Epidemiology and Immunobiology]. 2012;

ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ: новости, мнения, обучение. Том 8, № 1, 2019

73