СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ
METHOD FOR OBTAINING ALKALOIDS

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу накопления фармакологически ценных алкалоидов аймалина и йохимбина при выращивании культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. (раувольфии змеиной).
Исходная культура ткани Rauwolfia serpentina Benth. получена в 1964 году Р.Г.Бутенко (Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964, с.272). Однако она характеризовалась низким содержанием алкалоидов. В результате направленного мутагенеза и оптимизации состава питательной среды был получен штамм К-27 (Каталог. Всесоюзная коллекция клеточных культур. Л.: Наука, 1991), превосходящий интактное растение по уровню накопления алкалоидов в 2 раза. Этот штамм рассматривается как основной источник промышленного получения индольных алкалоидов, в том числе и аймалина.
Культивирование штамма К-27 осуществляется на специальной питательной среде, состав которой разработан в лаборатории культур клеток и растений Ленинградского химико-фармацевтического института (Воллосович А.Г., Николаева Л.А., Пучинина Т.Н., Позднякова Н.Н. Питательная среда для выращивания культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. - продуцента алкалоидов. А.С. № 679625, СССР, кл. С12К 9/00, заявл. 3.05.77, опубл. в БИ 15.08.79, № 30).
Пик синтеза алкалоидов штаммом К-27 культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. при пересеве на 38-40 сутки приходится на 65 сутки роста, при более раннем или более позднем пересеве - смещается на 75-85 сутки (Каухова И.Е. Теоретические и экспериментальные основы разработки эффективных ресурсосберегающих технологий лекарственных средств растительного происхождения // автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук, Санкт-Петербург, 2007).
Известно, что для увеличения выхода биомассы и алкалоидов использовались различные химические добавки, в том числе фитогормоны. Добавление в среду для выращивания культуры ткани ауксинов, гиббереллинов и цитокининов не влияет на прирост биомассы, но резко ингибирует накопление алкалоидов (Березнеговская Л.Н. Метаболизм вторичных азотистых соединений в изолированной культуре ткани растений. Томск. Изд. Томского ун-та, 1978; Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1964, с.272; Воллосович А.Г. Культура изолированных тканей и клеток растений. М.: Наука, 1970, с.234-235; Vollosovich F. Highlights Mod. Biochemie: Proc.14. th. int. Congr. Biochem. Prague., 10-15 July 1988 Vol.2, Utrecht-tokyo 1989).
-2
В то же время показано (Чечеткин И.Р., Неуструева С.Н., Сиянова Н.С., Винтер В.Г. Стимуляция образования алкалоидов в культуре ткани Rauwolfia serpentina Benth. под действием экстремальных факторов. Всероссийское совещание. Лесохимия и органический синтез. Тезисы докладов. Сыктывкар, 1998), что при внесении в питательную среду 113,5 мкМ (3·10 г/л) в течение 1 пассажа абсцизовой кислоты, обладающей свойствами дефолианта и ингибитора роста многих культур (Мельников Н.Н. Пестициды. М.: Химия, 1987, с.144), приводит к увеличению синтеза аймалина на 80% по сравнению с контролем. Однако недостатком абсцизовой кислоты является ее дороговизна, поскольку она получается фотохимическим окислением витамина А (Муромцева Г.С. и др. Гормоны растений гиббериллины. М.: Наука, 1973, 270 с.; Муромцева Г.С. и др. Регуляторы роста растений. М.: Колос, 1979, 246 с.).
-4
Заслуживают внимания данные, приведенные в источнике (Жегалова И.В., Сиянова Н.С., Неуструева С.Н., Винтер В.Г. Стимуляция рибонуклеазой Bacillus Intermedius роста и накопления индолиновых алкалоидов в каллусной культуре Rauwolfia serpentina Benth. Растительные ресурсы, вып.2, 1995). Стимуляция и накопление в ней индолиновых алкалоидов (аймалина) достигалось за счет добавления в питательную среду рибонуклеазы Bacillus Intermedius (биназы) в количестве 1·10 г/л. Фермент не является регулятором роста, его биологический эффект связан с ассоциативными свойствами фермента с мембранными структурами нуклеотидной природы. Эффект стимуляции прироста биомассы составляет 61%, а накопление алкалоидов - 82-121%. Однако при длительном пассировании прирост биомассы падал с 22-го пассажа до 16%, а к 27-му пассажу - ниже контрольного, а эффект стимуляции образования алкалоидов составлял 103 и 69% соответственно. При этом дороговизна выделения и очистки фермента увеличивает стоимость получаемого продукта.
Описано также, что для повышения продуктивности культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. был использован малотоксичный синтетический регулятор роста растений Мелафен (меламиновая соль бис(оксиметил)фосфиновой кислоты) (RU 2158735 С1, 10.11.2000).
-3
-6
-3
-4
-4
-3
Известно, что мелафен при внесении в течение 1 пассажа в концентрациях 1·10-1·10 г/л оказывает стимулирующее действие на накопление аймалиновых алкалоидов культурой ткани Rauwolfia serpentina Benth., которое было максимальным при концентрациях мелафена 1·10-1·10 г/л питательной среды. При концентрации 10 г/л на 80 сутки прирост аймалиновых алкалоидов относительно контроля составил 60%. (RU 2174555 С1, 10.10.2001). Оптимальной концентрацией мелафена, стимулирующей накопление как аймалиновых, так и суммарного количества алкалоидов, является 1·10 г/л, а оптимальным временем снятия биомассы при применении мелафена в 1 пассаже являются 60 сутки роста культуры. При этом прирост синтеза аймалиновых алкалоидов при концентрации мелафена относительно контроля составил 80%, суммы алкалоидов 85%, что отвечает содержанию алкалоидов соответственно 1,3 и 3,8% от воздушно-сухой биомассы.
Способ, описанный в данном источнике, является наиболее близким к заявляемому решению и выбран за прототип.
Задачей предлагаемого изобретения является новый способ получения алкалоидов, расширяющий ассортимент известных способов их получения.
-3
-10
-15
-13
Задача решается заявляемым способом получения алкалоидов, включающим культивирование ткани Rauwolfia serpentina Benth. штамм К-27 на питательной среде заданного состава в присутствии мелафена (меламиновой соли бис(оксиметил)фосфиновой кислоты) с последующим накоплением целевого продукта, при этом культуру ткани Rauwolfia serpentina Benth. штамм К-27 на питательной среде в присутствии мелафена культивируют длительное время - выращивают 10-17 пассажей при концентрации мелафена 1·10 г/л, затем пересаживают на питательную среду того же состава со сверхмалыми концентрациями мелафена 1·10-1·10 г/л, преимущественно 1·10 г/л, и выращивают в течение 1 пассажа.
Техническим результатом изобретения является увеличения выхода аймалина и йохимбина и сокращения цикла выращивания культуры ткани клеток Rauwolfia serpentina Benth.
Способ осуществляют следующим образом.
-3
В заявляемом способе используют штамм К-27. Для определения эффективности мелафена увеличивают выход аймалина и йохимбина и сокращают цикл выращивания культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth., проводят сравнение качественного и количественного состава алкалоидов в выращенной культуре ткани клеток Rauwolfia serpentina Benth. в присутствии мелафена в концентрации 1·10 г/л (опыт) и без него (контроль).
Состав питательной среды, условия ее стерилизации, а также посадки и культивирования ткани, как в контроле, так и в опытных вариантах были одинаковыми, за исключением того, что в контрольных вариантах в питательной среде отсутствовал мелафен.
Состав питательной среды:
А. Макросоли, г/л
Нитрат калия
0,4
Нитрат аммония
2,5
Сульфат магния
1,3
Фосфат аммония однозамещ.
0,3
Сульфат аммония
0,2
Фосфат аммония двузамещ.
0,2
Нитрат кальция
0,9
Б. Микросоли, мг/л
Борная кислота
12,0
Сульфат марганца
22,0
Сульфат цинка
8,6
Молибдат натрия
0,25
Сульфат меди
0,025
Хлорид кобальта
0,1
Трилон Б
38,0
Калий йод
0,83
В. Другие компоненты, г/л
Мелафен
1·10<sup>-3</sup>
Сахароза
100
Тиамин бромид
5
Агар-агар
5
-3
Мелафен добавляют в питательную среду в концентрации 1·10 г/л непосредственно перед автоклавированием. Стерилизацию объектов осуществляют при избыточном давлении 0,7 атм в течение 40 мин.
В качестве посевного материала используют кусочки 40-суточного каллуса культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. массой около 2 г. Выращивание каллуса проводят в темноте при температуре 27°С в банках на 250 мл. Для получения статистически достоверных результатов каждый вариант опыта пассируют в баночках в количестве 10 штук. Анализ культуры проводят на 30, 50, 70 и 90-е сутки роста каллуса.
Содержание аймалиновых алкалоидов определяют по методике, предложенной Шахом и модифицированной Воллосовичем (Воллосович А.Г. Метод количественного определения алкалоидов группы индолина в культуре ткани Rauwolfia serpentina Benth. / А.Г.Воллосович, Л.А.Николаева, Н.Н.Поздняков и др. // Растительные ресурсы. - 1977. - Т.13. - №1. - С.127-132). Для определения общего содержания алкалоидов применяют методику, разработанную Неуструевой с соавторами (Неуструева С.Н. Влияние биназы на динамику основных метаболических процессов культуры ткани Rauwolfia Serpentina Bants. / С.Н.Неуструева, А.В.Кунин, Н.С.Сиянова, И.В.Жиганова, В.Г.Винтер, Г.Н.Марданова // Ученые записки Казанского государственного университета, естественные науки. - 2005. - Т.147. - кн.2. - С.149-160). Качественный и полуколичественный анализ алкалоидов (аймалина и йохимбина) проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Установлено, что длительное выращивание культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. на питательной среде с мелафеном приводит к тому, что уже после 10 пассажа культура откликается повышенным накоплением алкалоидов по сравнению с опытами по однократному внесению мелафена (RU 2174555 С1, 10.10.2001).
-3
На фигуре 1 представлены результаты накопления алкалоидов при выращивании культуры ткани в течение 17 пассажей (более 1,5 лет) на питательной среде, содержащей мелафен в концентрации 1·10 г/л. Эти результаты показывают, что в контрольной культуре пик накопления алкалоидов приходится на 90 сутки роста культуры, а под действием мелафена смещается на 50 сутки. Как видно из фигуры 1, под действием мелафена уровень накопления суммарного количества алкалоидов на 50 сутки примерно такой же, как в 90-суточном контроле, а аймалиновых алкалоидов на 50 сутки под действием мелафена выше, чем у 90-суточной контрольной культуры. Причем уровень накопления аймалиновых алкалоидов у длительно пассируемой на мелафене культуре на 50 сутки значительно выше, чем при однократном внесении мелафена в среду соответствующей концентрации, установленной ранее (RU 2174555 С1, 10.10.2001). Так, уже на 50 сутки культура 17-го пассажа характеризуется содержанием аймалиновых алкалоидов 2,2%, а суммарного количества алкалоидов 3,4% от воздушно-сухой массы, что соответствует приросту накопления аймалиновых алкалоидов на 200% и суммарнго количества алкалоидов на 100% больше, чем в контрольной культуре.
На фигуре 2 представлен профиль ВЭЖХ 50-суточных образцов:
-3
(а) контроль; б) 17 пассаж на среде с мелафеном в концентрации 1·10 г/л.
-3
ВЭЖХ показала, что пассирование культуры на среде с мелафеном 1·10 г/л на протяжении длительного времени явно привело к значительному увеличению накопления аймалина, что хорошо иллюстрируют данные по количественному анализу аймалиновых алкалоидов исследуемого образца, приведенные в таблице 1.
Таблица 1.
Количественные показатели накопления алкалоидов образцов 50-суточной культуры ткани
Исследуемые образцы
Аймалиновые алкалоиды в в/с сырье, %
Сумма алкалоидов в в/с сырье, %
Контроль
0,48
1,25
Мелафен 1·10<sup>-3</sup> г/л
2,34
3,42
Выявлено также значительное накопление йохимбина по сравнению с контрольной культурой. Как видно из фигуры 2, уровень накопления как аймалина так и йохимбина под действием мелафена увеличивается по сравнению с контрольной культурой - для аймалина примерно в 3 раза, для йохимбина - примерно в 2 раза.
Таким образом, при длительном выращивании культуры Rauwolfia serpentina Benth. на питательной среде с мелафеном наблюдают укорачивание биотехнологического цикла получения нужных нам алкалоидов (аймалина и йохимбина) и накапливающийся эффект стимулирования синтеза этих алкалоидов.
-3
-10
-15
После длительного выращивания культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. на питательной среде с мелафеном в концентрации 1·10г/л культуру ткани пересаживают и выращивают в течение 1 пассажа на питательной среде, содержащей сверхмалые концентрации мелафена 1·10-1·10 г/л.
В качестве посевного материала используют кусочки 40-суточного каллуса культуры ткани Rauwolfia serpentina Benth. массой около 2 г. Выращивание каллуса проводят в темноте при температуре 27°С в банках на 250 мл. Для получения статистически достоверных результатов каждый вариант опыта пассируют в баночках в количестве 10 штук. Анализ культуры проводят на 30, 50, 70 и 90 сутки роста каллуса.
-3
-3
-10
-15
-13
-18
Для выявления эффектов мелафена при смене концентрации с 1·10г/л до сверхмалых культуру ткани после длительного пассирования на питательной среде с мелафеном в концентрации 1·10 г/л (17 пассаж) переносят на среду со сверхмалыми концентрациями (1·10-1·10 г/л, что в пересчете на молярную концентрацию составляет 3,9·10-3,9·10 М) и на чистую питательную среду (контроль).
Состав питательной среды, указанный ранее, условия ее стерилизации, а также посадки и культивирования ткани как в контроле, так и в опытных вариантах были одинаковы, за исключением того, что в контроле в питательной среде отсутствовал мелафен.
-3
-3
В данном опыте используют 2 вида контроля - культура ткани Rauwolfia serpentina Benth., выращенная на среде без мелафена (на фигуре 3 обозначено как «К»), и культура ткани Rauwolfia serpentina Benth., пересаженная после выращивания в течение 17 пассажей на среде с мелафеном в концентрации 10 г/л на среду без мелафена (на фигуре 3 обозначено как «К с мел 1·10 г/л»).
-3
-3
На фигуре 3 представлены результаты по накоплению алкалоидов в культуре ткани клеток Rauwolfia serpentina Benth., пересаженной после выращивания в течение 17 пассажей на среде с мелафеном в концентрации 1·10 г/л на среду без мелафена. Данные результаты свидетельствуют, что культура, пересеянная со среды с мелафеном в концентрации 1·10 г/л на чистую питательную среду, продолжает синтезировать повышенное количество алкалоидов, что может быть связано с остаточным влиянием мелафена, оставшегося при пересеве в кусочке маточной культуры, или с мутагенным эффектом мелафена, накапливающимся в процессе его длительного использования.
-3
Далее сравнивают результаты опытов, проведенных на культуре, пересаженной на питательную среду с мелафеном в сверхмалых концентрациях, с контролем, выращиваемым длительное время на среде с мелафеном в концентрации 1·10 г/л и пересаженным на среду без мелафена.
-3
-10
-15
На фигуре 4 представлено накопление алкалоидов на 50, 70 и 90 сутки в культуре ткани Rauwolfia serpentina Benth., пересаженной после выращивания в течение 17 пассажей на среде с мелафеном в концентрации 1·10 г/л на среду с мелафеном в сверхмалых концентрациях - 1·10-1·10 г/л.
-13
Результаты показывают, что во многих опытных вариантах наблюдается увеличение синтеза алкалоидов на протяжении всего роста культуры, особенно на 50 сутки при концентрации мелафена 1·10 г/л. 70-Суточная культура охарактеризовалась спадом накопления алкалоидов, а на 90 сутки накопление алкалоидов в культуре под действием мелафена опять сильно превысило контрольное, но было не намного больше, чем на 50 сутки роста культуры ткани.
-3
-3
Сравнивая данные, представленные на фигурах 1 и 4, можно видеть, что накопление алкалоидов под действием мелафена в сверхмалых концентрациях значительно превышает таковое в культуре, которая в течение 17 пассажей выращивалась на среде с мелафеном 1·10 г/л. Так, суммарное накопление алкалоидов на 50 сутки роста культуры составило 4,8% от воздушно-сухой биомассы против 3,5% в каллусе, выращиваемом на мелафене 1·10 г/л (37% прироста), а аймалиновых алкалоидов - 2,8% против, соответственно, 2,2% (27% прироста). При этом относительно контрольной культуры прирост накопления суммарного количества алкалоидов составил на 50 сутки роста культуры 460%, а аймалиновых алкалоидов 300%.
На фигуре 5 представлен профиль ВЭЖХ 50-суточных образцов:
-3
(а) контрольного с мелафеном 1·10 г/л;
-13
-3
(б) на среде с мелафеном в концентрации 1·10 г/л с 17 пассажа на среде с мелафеном в 10 г/л.
-3
-13
Данные ВЭЖХ (фигура 5) говорят о том, что под действием сверхмалых концентраций мелафена в культуре ткани, пересеянной после длительного выращивания на среде с мелафеном 1·10 г/л на среду с мелафеном 1·10 г/л, происходит значительное накопление аймалина - пик аймалина в 2 раза выше и значительно шире, чем в контроле, что свидетельствует о преобладании аймалина в общем количестве аймалиновых алкалоидов, представленных в таблице 2.
В таблице 2 представлены количественные показатели накопления алкалоидов образцов 50-суточной культуры ткани.
Таблица 2
Количественные показатели накопления алкалоидов образцов 50-суточной культуры ткани р. змеиной
Исследуемые образцы
Аймалиновые алкалоиды в в/с сырье, %
Сумма алкалоидов в в/с сырье, %
Контроль с мел 1·10<sup>-3</sup> г/л
0,76
2,02
Мелафен 1·10<sup>-13</sup> г/л
2,86
4,75
Также на хроматограмме (фигура 5) наблюдают не очень высокий, но уширенный пик йохимбина, что говорит о его значительном количестве. Таким образом, значительное снижение используемых концентраций мелафена (до сверхмалых) в длительно выращиваемой на мелафене культуре появляется интенсивный всплеск синтеза алкалоидов, в основном аймалина.
-3
-10
-15
Таким образом, заявляемый способ увеличения выхода аймалина и йохимбина и сокращения цикла выращивания культуры ткани раувольфии змеиной, включающий использование мелафена в качестве постоянного компонента питательной среды в концентрации 1·10 г/л с последующим через 10-17 пассажей выращиванием каллуса на среде с мелафеном концентрации 1·10-1·10 г/л, приводит к резкому подъему уровня накопления алкалоидов (суммарного количества алкалоидов до 460%, а аймалиновых алкалоидов - до 300%) и сужению спектра синтезируемых алкалоидов в сторону аймалина и йохимбина, а также к сокращению биотехнологического цикла выращивания культуры для достижения ею максимального накопления алкалоидов до 50 суток, что в конечном итоге приводит к удешевлению получаемого продукта.
Подобные эффекты мелафена, проявляющиеся при его длительном использовании, а также при снижении его концентрации до сверхмалых, могут иметь место при получении алкалоидов с использованием других культур тканей растений.