Способ определения атерогенных микроРНК у пациентов с каротидным атеросклерозом
METHOD FOR DETERMINATION OF ATHEROGENIC MICRORNAS IN PATIENTS WITH CAROTID ATHEROSCLEROSIS

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии, в частности к способу выделения и определения атерогенных микроРНК из биологических жидкостей у больных с атеросклерозом.
МикроРНК - небольшие (около 22 нуклеотидов), состоящие из одной цепочки некодирующие последовательности РНК, которые, по всей видимости, влияют на большинство биологических процессов [Раскуражев А.А., Танашян М.М. Роль микроРНК в цереброваскулярной патологии. Анналы клинической и экспериментальной неврологии., 2019, т. 13, №3, с. 41-46]. Они действуют в качестве значимых пост-транскрипционных модуляторов/регуляторов экспрессии генов. В типичном варианте микроРНК подавляют экспрессию гена путем взаимодействия с 3' нетранслируемым регионом целевой матричной РНК (мРНК), вызывая ее деградацию или блокируя трансляцию продукта гена. Одна микроРНК может модулировать множество мРНК, участвующих в различных биологических процессах; в то же время, одна мРНК может регулироваться несколькими микроРНК. Было продемонстрировано, что микроРНК играют регулирующую роль также в онтогенезе стволовой клетки жировой ткани, поддерживая пролиферацию и дифференцировку клеток. Предполагается, что некоторые микроРНК непосредственно контролируют множественные гены, задействованные в ангиогенном процессе [Di Stefano А. В. et al., "Adipose tissue, angiogenesis and angio-MIR under physiological and pathological conditions," Eur. J. Cell Biol., vol. 98, no. 2-4, pp.53-64, Jun. 2019].
Циркулирующие микроРНК имеют большие перспективы использования в качестве новых биомаркеров для диагностики рака и других заболеваний. В частности микроРНК участвуют (в той или иной степени) практически во всех молекулярных звеньях патогенеза атеросклероза, включая функцию эндотелия, нарушения обмена холестерина, активацию моноцитов и инвазию ими сосудистой стенки, активацию тромбоцитов и гладкомышечных клеток эндотелия, формирование бляшки. Из уровня техники известно изучение микроРНК в липидном обмене и атеросклерозе. Было в частности идентифицировано несколько miRNA при атеросклерозе, например, такие как miR-33a,b, miR-92a, miR-126 и другие, которые являются релевантными медиаторами патологических процессов, включая регуляцию биосинтеза холестерина и липидов, метаболизма липопротеинов и оттока холестерина. В этой работе также отражено, что дальнейшее понимание специфической роли miRNAs в различных типах клеток, участвующих в инициации, прогрессировании и разрешении атеросклероза, может выявить новые стратегии вмешательства для профилактики и лечения атеросклеротического сердечно-сосудистого заболевания [Giral Н. С.et al MicroRNAs in lipid metabolism and atherosclerosis. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2016 Oct;30(5):665-676].
На сегодняшний день известен способ выделения и определения микроРНК, ассоциированных с атеросклерозом с использованием набора miRNeasy Mini Kit (QIAGEN, США). Выделение производили согласно рекомендованной производителем инструкции. Концентрация водного раствора РНК определялась на спектрофотометре Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, США). Обратная транскрипция проводилась, используя набор реагентов для обратной транскрипции микроРНК TaqMan (MicroRNA Reverse Transcription Kit). Перед проведением реакции обратной транскрипции концентрации РНК выравнивались в контрольных и экспериментальных образцах. Количественное определение экспрессии генов осуществлялось с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ) на приборе Step One Plus фирмы Applied Biosystems (США). ПЦР-РВ проводилось с использованием наборов для определения экспрессии всех исследуемых микроРНК производства Applied Biosystems (США) TaqMan Gene Expression Assays в соответствии с инструкцией изготовителя. У пациентов с ИБС экспрессия миРНК-33а в плазме в 8 раз ниже в сравнении с пациентами с СД2 и ожирением и в 4,4 раза ниже в сравнении с пациентами с ожирением без СД2 и ИБС; экспрессия миРНК-26а в 2 раза ниже в сравнении с пациентами с СД2 и ожирением и в 1,2 раза ниже в сравнении с пациентами с ожирением без СД2 и ИБС.Таким образом, подавление экспрессии миРНК-33а и миРНК-26а может указывать на наличие значимого атеросклеротического поражения коронарных артерий. (Швангирадзе Т.А. Сигнальные молекулы жировой ткани и микроРНК: ассоциация с коронарным атеросклерозом у пациентов с ожирением и сахарным диабетом 2 типа. Автореферат дисс.на соискхтеп.канд.мед.наук, Москва, 2019, с. 18-103). Однако данных по микроРНК ассоциированных с каротидным атеросклерозом в данной работе не представлено. Помимо этого, в работе использовался сравнительный метод оценки экспрессии микроРНК, что в отношении нескольких молекул возможно не позволило получить достоверный результат. Указанный источник информации рассмотрен в качестве ближайшего аналога.
Технический результат заявленного изобретения заключается в выделении и определении атерогенных микроРНК из крови пациентов с каротидным атеросклерозом с высокой точностью.
Технический результат достигается тем, что способ определения атерогенных микроРНК у пациентов с каротидным атеросклерозом включает выделение микроРНК с последующим проведением ПЦР с обратной транскрипцией и определением микро-РНК, при этом выделение из крови атерогенных микроРНК выполняют в три этапа, на первом этапе проводят лизис эритроцитов путем перемешивания на вортексе образца крови в течение 10 секунд с Лизис буфером RBC, затем инкубируют 3-5 минут при комнатной температуре, после чего центрифугируют в течение 3 минут при 1000 об/мин для осаждения клеток, к полученному осадку вновь добавляют Лизис буфер RBC, после чего к полученной лейкоцитарной взвеси добавляют буфер RL и встряхивают на вортоксе до получения гомогенного состояния -лизата, на втором этапе лизат пропускают через колонку и центрифугируют в течение 3 минут при 14000 об/мин, к полученной суспензии-смеси добавляют 70% спирт, вновь пропускают через колонку и центрифугируют в течение одной минуты при 6000 об/мин, полученную суспензию еще раз вносят в колонку и добавляют промывочный раствор А и центрифугируют в течение одной минуты при 14 об/мин, затем вносят в колонку DNase I и вновь центрифугируют в течение одной минуты при 14 об/мин, полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут, на третьем этапе в колонку вновь дважды вносят промывочный раствор А и дважды центрифугируют в течение одной минуты при 14000 об/мин, затем колонку с образцом высушивают на воздухе в течение 2 минут и вносят в нее Elution solution А для элюирования микро-РНК, после чего центрифугируют в течение одной минуты при 2000 об/мин и затем в течение двух минут при 14000 об/мин, далее проводят определение в полученном образце микро-РНК количества их копий на амплификаторе CFX Touch, полученный образец вносят в мини-пробирку Эппендорфа в количеств 2 мкл, добавляют к образцу буфер 3 мкл Polly А, 3 мкл АТФ, 1,8 мкл фермента Polly А и 10,2 мкл дистиллированной воды, инкубируют при 65°С в течение 10 минут, после чего вносят - 18 мкл лигазного буфера, 27 мкл PEG 800 А, 3,6 мкл адаптера для лигирования, 9 мкл РНК-лигазы, 2,4 мкл дистиллированной воды и вновь полученную смесь инкубируют при 16°С в течение 1 часа, затем добавляют следующее: 36 мкл 5х BufferRT, 7,2 мкл смеси dNTP, 9 мкл праймера Universal RT, 15 мкл смеси Enzyme, 20 мкл дистиллированной воды, инкубируют при 85°С в течение 5 минут получая экстрагированный образец и далее готовят раствор перемешивания 300 мкл MiR Amp master Mix, 30 мкл MiR Amp primer Mix и 210 мкл дистиллированной воды, после чего 45 мкл полученного раствора добавляют к 5 мкл экстрагированного образца и проводят ПЦР, начиная с этапа обратной транскрипции по следующей программе РНК-1: 1 цикл - 5 минут при температуре 95°С, 14 циклов - 30 секунд при температуре 60°С, и 14 циклов -10 минут при температуре 99°С, затем удержание при температуре 4°С, далее образец вносят в 5 чистых мини-пробирок Эппендорфа по 5 мкл в каждую, в которые затем вносят по 4 мкл дистиллированной воды и праймеры-зонды микроРНК в количестве 2 мкл при следующем порядке внесения праймеров - зондов микро-РНК: в первую - 126-5р; во вторую - 126-3р; в третью - 33а-5р; в четвертую - 21-5р; в пятую - 21-3р, затем в каждую пробирку добавляют 10 мкл раствора основной смеси, содержащей TaqMan Fast Advanced и буфер TaqMan Fast Advanced Buffe в соотношении 1:100 соответственно и проводят программу амплификации РНК-2: 1 цикл - 20 мин при температуре 95°С, 40 циклов по 1 минуте при температуре 95°С, затем удержание при температуре 4°С, получая при этом количество копий атерогенных микроРНК.
Способ осуществляется следующим образом.
Взятие крови для анализа производят при кубитальной венепункции натощак в пробирку с ЭДТА К3. Выделение микро-РНК проводится в три последовательных этапа.
Этап 1. Подготавливают эппендорф объемом 1,5 мл. Дозатором пипетируют 250 мкл цельной крови и вносят в эппендорф с ЭДТА К3. К каждому образцу крови добавляют 1 250 мкл Лизис буфер RBC. Проводят встряхивание каждого образца на вортексе в течение 10 секунд и инкубируют при комнатной температуре в течение 3-5 минут. Далее образцы центрифугируют на 1000 об/мин в течение 3 минут. Осторожно дозатором отбирают супернатант (на дне остается белесый осадок). К осадку добавляют 1250 мкл Лизис буфера RBC и к полученной лейкоцитарной взвеси добавляют 60 мкл Buffer RL. Проводят встряхивание каждого образца на вортексе до достижения гомогенного состояния (лизата).
Этап 2. Подготавливают колонку №1 для гомогенизации лизата, куда вносят все количество полученного на предыдущем этапе лизата; центрифугируют 3 минуты на 14000 об/мин. К суспензии - смеси, вытекшей в собирательную пробирку, добавляют 600 мкл. 70% спирта. Подготавливают колонка №2, куда вносят 650 мкл суспензии-смеси, центрифугируют в течение 1 минуты на 6000 об/мин. Суспензию-смесь, вытекшую в собирательную пробирку, еще раз вносят в эту же колонку. В колонку вносят 600 мкл промывочного раствора A (Wash solution А), центрифугируют в течение 1 минуты на 14000 об/мин. То, что вытекло в собирательную пробирку, выливают. Далее вносят в колонку 70 мкл ранее разведенной DNase I, центрифугируют в течение 1 минуты на 14000 об/мин. Полученную смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин.
Этап 3. В колонку вносят 600 мкл Wash solution А, центрифугируют в течение 1 минуты на 14000 об/мин. То, что вытекло в собирательную пробирку, выливают, а в колонку снова вносят 600 мкл Wash solution А, центрифугируют в течение 1 минуты на 14000 об/мин. То, что вытекло в собирательную пробирку, выливают, а собирательную пробирку утилизируют. Колонку с образцом высушивают на воздухе в течение 2 минут. Далее готовят чистую собирательную пробирку или эппендорф (1,7 мл). В колонку вносят 10-20 мкл Elution solution А для элюирования микро РНК; затем центрифугируют в течение 1 минуты на 2000 об/мин, затем 2 минуты на 14000 об/мин. В итоге получают 10 -20 мкл готового выделенного материала микроРНК.
Полученный материал можно: использовать сразу для дальнейшей амплификации; сохранять при -20°С в течение 7 дней; сохранять при -70°С долгосрочно (в течение 12 месяцев).
Следующим этапом проводят определение в полученном образце микро-РНК количества их копий на амплификаторе CFX Touch. Для подготовки материала берут 2 мкл ранее экстрагированного (и размороженного, при необходимости) образца микроРНК в мини-пробирке Эппендорфа и вносят: 3 мкл буфера Polly А, 3 мкл АТФ, 1,8 мкл фермента Polly А, 10,2 мкл дистиллированной воды. Этот раствор инкубируют при 65°С в течение 10 минут, после чего вносят - 18 мкл лигазного буфера, 27 мкл PEG 800 А, 3,6 мкл адаптера для лигирования, 9 мкл РНК-лигазы, 2,4 мкл дистиллированной воды. Эту смесь инкубируют при 16°С в течение 1 часа, затем добавляют следующее: 36 мкл 5х BufferRT, 7,2 мкл смеси dNTP, 9 мкл праймера Universal RT, 15 мкл смеси Enzyme, 20 мкл дистиллированной воды, инкубируют при 85°С в течение 5 минут, получая экстрагированный образец. Далее дополнительно готовят раствор перемешивания 300 мкл MiR Amp master Mix, 30 мкл MiR Amp primer Mix и 210 мкл дистиллированной воды. После чего 45 мкл полученного раствора добавляют к 5 мкл экстрагированного образца и проводят ПЦР.
ПЦР проводят, начиная с этапа обратной транскрипции. Программа РНК-1 выглядит следующим образом: 1 цикл - 5 минут при температуре 95°С, 14 циклов - 30 секунд при температуре 60°С, 14 циклов - 10 минут при температуре 99°С, затем удержание при температуре 4°С. Далее образец вносят в 5 чистых мини-пробирок
Эппендорфа по 5 мкл в каждую, в которые затем вносят по 4 мкл дистиллированной воды и праймеры-зонды микроРНК в количестве 2 мкл при следующем порядке внесения праймеров - зондов микро-РНК: в первую - 126-5р; во вторую - 126-3р; в третью - 33а-5р; в четвертую - 21-5р; в пятую - 21-3р. Затем готовят раствор основной смеси TaqMan (1:100), используя 1 мкл TaqMan Fast Advanced, 100 мкл буфера TaqMan Fast Advanced Buffer, из которых 10 мкл вносят в каждую пробирку. Затем используя программу амплификации РНК-2: 1 цикл - 20 мин при температуре 95°С, 40 циклов по 1 минуте при температуре 95°С, удержание при температуре 4°С, получают количество копий атерогенных микроРНК.
Предлагаемый способ позволяет выделить атерогенные микроРНК из крови пациентов с каротидным атеросклерозом и определить их с высокой точностью. С целью проверки способа нами проведено исследование следующих микроРНК - miR-126-(5p/3p), miR-33a-5p, miR-21-(5p/3p). В группу исследования были включены пациенты (n=25, средний возраст 67 лет, 60% мужчины) с атеросклеротическими стенозами внутренней сонной артерии (>50%) без указаний на перенесенные нарушения мозгового кровообращения (группа каротидного атеросклероза - КА). Группу сравнения составили 11 пациентов, сопоставимых по полу и возрасту, без признаков наличия атеросклеротических бляшек в сонных артериях. Каротидный атеросклероз был верифицирован с помощью ультразвукового дуплексного сканирования, степень стеноза определена по методу ECST.
К критериям исключения относились наличие декомпенсированных хронических заболеваний, опухолевых и паранеопластических процессов, патологии крови. Полученные результаты представлены в таблице 1.
По большинству исследованных микроРНК были получены статистически значимые различия между группами пациентов. Результаты статистической обработки полученных данных в таблице 1, представлены в таблице 2.
Так, особенные расхождения между обследованными группами пациентов получены по miR-126-(5p/3p), miR-33a-5p и miR-21-(5p/3p). Единственной микроРНК, которая оказалась значимо выше в группе исследования, является miR-33a-5p (4,44 vs. 3,67). Об атеропротективной роли miR-126-5p, miR-126-3р, miR21-5p и miR-21-3р свидетельствует более высокие их уровни в группе без каротидного атеросклероза.
Пример выполнения способа.
Пример 1.
Пациенту 68 лет, с каротидным атеросклерозом (стеноз правой внутренней сонной артерии 60%, верифицированный ультразвуковым методом), проведено исследование микроРНК по описанной выше методике. Получены следующие результаты: экспрессия miR-126-5p - 114 814 копий, miR-126-3р - 115 238 копий, miR-33a-5p - 487 525 копий, miR-21-5p - 1989145 копий, miR-21-3р - 2182325 копий. При сравнении с сопоставимым по возрасту пациентом без каротидного атеросклероза (экспрессия miR-126-5p - 242 845 копий, miR-126-3р - 244 329 копий, miR-33a-5p - 367 256 копий, miR-21-5p - 3015456 копий, miR-21-3р - 3156495 копий) обращает на себя внимание повышение уровня miR-33а, а также низкие уровне miR-126-5p, miR-126-3р, miR-21-5p и miR-21-3р у пациента с наличием каротидного атеросклероза. Данному пациенту помимо стандартной терапии рекомендовано динамическое наблюдение и проведение контрольного ультразвукового исследования сонных артерий через 6 месяцев для уточнения прогрессирования атеросклероза.
Таким образом, данный способ может быть использован в дальнейшем для диагностики прогрессирования каротидного атеросклероза, а также назначения (в случая выявления неблагоприятного профиля микроРНК) более агрессивной превентивной терапии.