Редактирование эпигенетических модификаций ДНК

РЕДАКТИРОВАНИЕ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ МОДИФИКАЦИй ДНК

И.Р. Грин, Д.В. Петрова, Д.О. Жарков

ФГБНУ «Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН», Новосибирск, Россия Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия

Editing of DNA epigenetic modifications

I.R. Grin, D.V. Petrova, D.O. Zharkov

Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia

National Research University Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia

Геномное редактирование в последние годы прочно вошло в арсенал методов молекулярной и клеточной биологии. Однако у высших эукариот огромную роль в формировании фенотипа клеток и организма в целом играет также состояние эпигенома — системы ковалентных модификаций ДНК и связанных с ней белков, регулирующих экспрессию генов. Методы редактирования эпигенома только начинают появляться, и в сочетании с технологиями геномного редактирования должны обеспечить более надежный контроль состояния изменяемых клеток. В обзоре освещены механизмы метилирования и активного деметилирования ДНК в клетках высших организмов и способы их применения для направленного изменения состояния эпигенома.

Ключевые слова: эпигенетика, 5-метилцитозин, ДНК-метилтрансферазы, оксидативные деметилазы, репарация ДНК, цинковые пальцы, ТА1_-эффекторы, Cas9.

Genome editing has recently become a staple technology in molecular and cell biology. However, phenotypes of cells and organisms in higher eukaryotes depend to a great extent on the status of the epigenome, a system of covalent modifications of DNA and DNA-binding proteins, which regulates gene expression. Methods of epigenome editing are only now starting to appear, and, together with genome editing technologies, should provide a more reliable control over the fate of the edited cells. The review covers the mechanisms of methylation and active demethylation in higher eukaryotes and the approaches to use them for introducing targeted changes into the epigenome.

Keywords: epigenetics, 5-methylcytosine, DNA methyl-transferases, oxidative demethylases, DNA repair, zinc fingers, TAL effectors, Cas9.

Введение

Метилирование ДНК представляет собой особый механизм контроля активности генов, который получил максимальное развитие у высших эукариот. Азотистое основание 5-метилцитозин (тС), образующееся в результате метилирования цитозина по положению С5, считается обратимой эпигенетической меткой, которая играет важную роль в регуляции транскрипции генов и защите генома от мобильных элементов. Метилирование ДНК характерно для широкого круга эукариот от грибов до позвоночных, однако значение и функции метилирования у этих организмов сильно отличаются [1, 2]. Чаще всего метилирование происходит в палиндромных CpG-динуклеотидах, но встречаются и случаи метилирования в СрА- и СрТ-динуклеотидах, у млекопитающих характерные для эмбриональных стволовых клеток, в то время как у растений значительная доля метилирования приходится на тринуклеотиды CpNpG. Как правило, 60—90% CpG-динуклеотидов в геноме млекопитающих метилировано, однако CpG-островки — области в несколько сотен или тысяч пар нуклеотидов с большим содержанием CpG-динуклеотидов — преимущественно гипо-метилированы [3]. CpG-островки часто связаны с промоторами генов, которые зачастую остаются в гипометилированном состоянии, даже если ло-кус ДНК транскрипционно подавлен [3]. Напротив, постоянное гиперметилирование в геноме млекопитающих характерно для центромерных и около-центромерных областей и многих повторяющихся элементов [4].

Влияние т^ на активность генов главным образом опосредовано белками, содержащими метил-связывающий домен (МВШ) — небольшой участок полипептидной цепи (около 70 аминокислотных остатков), способный связывать полностью мети-

е-таП: dzharkov@niboch.nsc.ru

лированный CpG-динуклеотид в составе ДНК [5]. Содержащие его белки (MeCP2, МВС11, МВС12, МВС13 и др.) образуют комплексы с гистондеаце-тилазами или же сами обладают активностью ги-стон-специфичных метилтрансфераз, факторов ремоделирования хроматина и т. п. [6]. Эти функциональные взаимодействия ведут к конденсации хроматина в области метилированных CpG-богатых участков и подавлению транскрипции. Ранние оценки с использованием модельных плазмид и мини-хромосом в клетках человека давали величины порядка одного основания т^ на 100—300 п. н. для репрессии транскрипции более чем на 50% [7, 8]. Эти значения могут значительно варьировать для разных генов и областей хроматина, однако современные методы анализа полного метилома и транскриптома клеток показывают, что уровень метилирования про-моторных областей в целом демонстрирует сильную отрицательную корреляцию с транскрипционной активностью [9, 10].

Недавние исследования в области механизмов активного деметилирования ДНК показали, что эпигенетическую роль в геноме млекопитающих играет также окисленное производное 5-метилцитозина — 5-гидроксиметилцитозин (ЬтО [11]. В отличие от т^, Ьт^ обогащен в области промоторов активно экспрессируемых генов и рассматривается как активирующий эпигенетический маркер [12, 13]. Обнаружены белки, специфично связывающие Ьт^ в ДНК [14, 15], однако ясного понимания того, как именно это основание влияет на транскрипционную активность, пока не существует.

Разумеется, экспрессия генов эукариот регулируется множеством способов, не зависящих от эпигенетической модификации ДНК. Однако влияние метилирования и гидроксиметилирования на транскрипцию в настоящее время не вызывает сомнения. Таким об-

разом, целенаправленное изменение метилирования ДНК представляет собой многообещающий метод для искусственной регуляции активности генов.

Механизмы эпигенетического метилирования

ДНК

В клетках млекопитающих содержится три активных ДНК-метилтрансферазы: DNMT1, DNMT3a и DNMT3b, которые катализируют перенос метиль-ной группы с S-аденозилметионина на атом C5 основания цитозина [16]. Эти ферменты выполняют различные функции. С одной стороны, для сохранения mC в обоих цепях ДНК при полуконсервативной репликации необходим специальный механизм (поддерживающее метилирование), который узнавал бы полуметилированные CpG-динуклеотиды непосредственно во время репликации или сразу после нее и метилировал основания цитозина в дочерней цепи. Первый открытый эукариотический фермент с ДНК-метилтрансферазной активностью, DNMT1, играет именно эту роль. В ходе репликации полуметилированные CpG-динуклеотиды достаточно быстро восстанавливают полное метилирование за счет привлечения DNMT1 как непосредственно в репликативном комплексе, так и в пост-репликативном периоде за счет взаимодействия с PCNA и с рядом белков, специфичных для реплицируемого хроматина (DMAP1, UHRF1) [17— 19]. В поздней S-фазе и в G2-фазе DNMT1 может привлекаться к остаточным полуметилированным CpG-сайтам за счет взаимодействия с белками ремоделирования хроматина, обеспечивающими образование гетерохроматина, например, комплексами группы Polycomb [20].

Для двух других ДНК-метилтрансфераз, DNMT3a и DNMT3b, было показано участие в метилировании ДНК de novo — начиная с неметилированных CpG-динуклеотидов. Эти ферменты с одинаковой эффективностью используют в качестве субстратов как неметилированные, так и полуметилированные CpG-динуклеотиды в составе ДНК. DNMT3a, в частности, устанавливает паттерны метилирования ДНК в областях импринтинга в женских и мужских гаметах [21]. Гены DNMT3A и DNMT3B экспрессируются на разных этапах эмбриогенеза: DNMT3B специфичен для тотипотентных и ранних эмбриональных клеток — эпибластов и эмбриональных эктодермальных клеток, в то время как DNMT3A экспрессируется повсеместно, начиная со стадии E10.5, что может говорить о разных функциях, выполняемых этими белками во время эмбриогенеза [22]. На функциональную разницу между двумя метилтрансферазами указывает и то, что у мышей нокаут гена DNMT3B приводит к летальности эмбрионов, однако нокауты по DNMT3A частично жизнеспособны [23].

Белок DNMT3-like (DNMT3L) гомологичен ДНК-связывающему домену DNMT3a и DNMT3b, но у него отсутствует каталитический домен [24]. Несмотря на это, DNMT3L принимает участие в метилировании ДНК преимущественно в областях подконтрольных импринтингу в гаметах [25]. Хотя у DNMT3L нет каталитической активности, он непосредственно взаимодействует с DNMT3a и DNMT3b и стимулирует их активность [26]. Мыши-нокауты по гену DNMT3L жизнеспособны, однако отсутствие метилирования de novo в клетках зародышевой линии приводит к бесплодию как самцов, так и самок [25].

Помимо перечисленных белков, у млекопитающих имеется фермент TRDMT1 (DNMT2), вначале описанный как ДНК-метилтрансфераза, однако затем было показано, что он отвечает за метилирование тРНК аспарагиновой кислоты [27]. По структуре своего метилтрансферазного домена он отличается от DNMT1, DNMT3a и DNMT3b, но гомологичен бактериальным С5-цитозин ДНК-метилтрансферазам M.Hpaii, M.SssI, M.Haeiii, M.Hhal и др. [28], которые входят в систему рестрикции—модификации в соответствующих видах.

Механизмы активного деметилирования ДНК

При дифференцировке клеток паттерны метилирования, однажды установившись, сохраняются на протяжении последующих делений. В то же время эпигенетическое метилирование подвержено изменению в ходе развития организма, при дедиффе-ренцировке и трансдифференцировке клеток и при ответе на различные сигналы, требующие изменения экспрессии генов. В отличие от метилирования цитозина и деметилирования аминокислотных остатков в гистонах — процессов, каждый из которых представляет собой одну химическую реакцию и катализируется одним ферментом — деметилирование mC в клетках млекопитающих протекает либо в процессе репликации при отсутствии поддерживающего метилирования (т. н. пассивное деметилирование), либо с участием нескольких мультиферментных путей (активное деметилирование).

Пассивное деметилирование возможно только в случае выключения механизмов поддерживающего метилирования ДНК. Такой способ деметилирования эффективен, но возможен только в делящихся клетках и требует прохождения нескольких клеточных циклов для снятия большинства mC-маркеров. Более того, пассивное деметилирование носит глобальный характер и не имеет специфичности к локусам или к определенной последовательности [29].

Снятие mC в конкретных участках генома как в плюрипотентных, так и в дифференцированных клетках осуществляется путем активного деметилирования. Такие процессы показаны для многих случаев, когда деметилирование активирует специфические гены — например, при созревании нейронов и клеток иммунной системы или злокачественном перерождении клеток [30]. Процесс активного деметилиро-вания ДНК можно разделить на два основных этапа: на первом этапе происходит модификация mC под действием специфичных дезаминаз или оксигеназ, а на втором этапе привлекается путь репарации ДНК для замены модифицированного основания на канонический цитозин (рис.).

Центральная роль в окислительном активном деметилировании принадлежит белкам недавно открытого семейства TET (ten-eleven translocation) [31]. Они представляют собой Feг+/a-кетоглутарат-зависимые диоксигеназы, которые сначала конвертируют mC в hmC. Сам по себе hmC — достаточно стабильное основание, которое может существовать на протяжении всего клеточного цикла, не влияет на репликацию и служит самостоятельным эпигенетическим маркером. Однако те же ферменты TET могут далее окислять hmC до 5-формилцитозина (fC) и 5-карбоксицитозина (caC) [32, 33]. У млекопитающих семейство TET представлено тремя членами (TET1, TET2 и TET3), причем экспрессия кодирую-

щих их генов тканеспецифична и зависит от периода развития организма [31]. Содержание белков ТЕТ1 и ТЕТ2 повышено в эмбриональных стволовых клетках и первичных половых клетках (гоноцитах). Кроме того, белок ТЕТ2 важен для стволовых клеток костного мозга: мыши-нокауты по гену ТЕТ2 жизнеспособны, но к 4—6 месяцам у них развиваются злокачественные новообразования системы кроветворения [34]. Нокауты по гену ТЕТ1 также жизнеспособны, но и самцы, и самки отличаются сниженной фертильностью [35]. Ген ТЕТ3 перекрывается по профилю экспрессии с ТЕТ1 и ТЕТ2, а также активен в ооцитах, сперматозоидах, отцовском пронуклеу-се зиготы и в клетках раннего эмбриона перед имплантацией. Потеря ТЕТ3 в материнском организме приводит к увеличению эмбриональной летальности [36].

Вторая ветвь активного деметилирования основана на действии цитозиндезаминаз, которые могут превращать цитозин и тС в урацил и тимин соответственно [37]. Активное направленное дезаминирова-ние геномной ДНК было впервые показано для соматического гипермутагенеза и переключения классов в генах иммуноглобулинов — процессов, направленных на повышение разнообразия антител [38]. В эпигенетических процессах дезаминирование тС до тимина в ДНК может происходить при участии де-

заминазы AID (activation-induced cytidine deaminase) или комплекса белков APOBEC (apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide). Привлечение этих ферментов для деметилирования было показано при репрограммировании эпигенома в первичных половых клетках, эмбриональных и индуцированных стволовых клетках [39, 40]. Анализ ранних делений оплодотворенных ооцитов мышей-нокаутов подтвердил роль дезаминазы AID во второй фазе деметилирования отцовского эпигенома, независимой от hmC-опосредованного пути [29]. Дезаминирование продуктов окисления mC, за исключением hmC, затруднено из-за стерических ограничений в активном центре AID и APOBEC [41].

Для завершения активного деметилирования пи-римидиновое основание в CpG-динуклеотидах после окисления или дезаминирования узнается как субстраты одной из ДНК-гликозилаз, участвующих в процессе эксцизионной репарации оснований ДНК (BER, base excision repair) [42]. Привлечение аппарата репарации к местам активного деметилирова-ния опосредовано регуляторным белком GADD45A, однако механизм этого взаимодействия не вполне ясен [43]. Способность удалять окисленные или де-заминированные эпигенетические маркеры была показана для четырех ДНК-гликозилаз — TDG, MBD4, NEIL1 и SMUG1 [44]. ДНК-гликозилаза MBD4

А

Б

Рис. А — два основных пути активного эпигенетического деметилирования ДНК

обладает специфичностью к парам T:G и hmU:G в ДНК. Кроме гликозилазного домена, белок MBD4 содержит и канонический MBD-домен, локализующий его в mCpG-богатых регионах ДНК и облегчающий взаимодействие MBD4 с другими участниками активного деметилирования — TET1, AiD и GADD45A [45]. ДНК-гликозилаза TDG может удалять все известные продукты окисления и дезаминирования mC, и взаимодействует с рядом транскрипционных факторов [46, 47] и факторами ремоделирования хроматина, например, CBP/p300, повышающими доступность промоторных областей для связывания транскрипционных факторов [48].

Разница в субстратной специфичности TDG и MBD4 (а также NEiLI и SMUG1) может объяснять то, что эти ферменты, судя по фенотипу дефицитных по ним клеток и организмов, выполняют разные функции в редактировании эпигенома. За счет широкой специфичности TDG, вероятно, играет основную роль в глобальном деметилировании ДНК во время оплодотворения и гаметогенеза, что подтверждается эмбрионально-летальным фенотипом нокаутов по гену TDG [49]. Повышенный уровень экспрессии гена TDG во время эмбрионального развития и физическое взаимодействие TDG с ДНК-метилтрансферазами DNMT3a и DNMT3b свидетельствуют о согласованном процессе во время полного репрограммирова-ния эпигенома: ДНК-метилтрансферазы стимулируют гликозилазную активность TDG, а TDG ингибирует метилирующую активность [50, 51]. Кроме того, нокауты генов, кодирующих белки — ключевые элементы BER (APEX1, PARP1, ДНК-полимеразу ß) также летальны в эмбриональном периоде, что говорит о важности системы репарации в целом для эмбрионального развития [42]. Наконец, еще один возможный путь локализованного удаления эпигенетических меток состоит в повреждении ДНК по соседству с mCyt или hmCyt и деградации участка ДНК вокруг него; репарация при этом может идти по пути BER или репарации неканонических пар оснований (MMR, mismatch repair) [52] (рис.).

Направленное редактирование

эпигенетических маркеров ДНК

Установление механизмов метилирования и деметилирования ДНК во все больших деталях позволяет разрабатывать методы целенаправленного влияния на эти процессы с целью регуляции экспрессии генов. При этом представляют интерес способы, влияющие как на глобальное, так и на локализованное геномное метилирование.

Глобальное изменение уровня метилирования уже достаточно давно используется в медицине. В настоящее время два гипометилирующих агента — необратимые ковалентные ингибиторы ДНК-метилтрансфераз 5-азацитидин и 5-аза-2'-дезоксицитидин (децитабин) — одобрены для применения при лечении миелодиспластических синдромов. В этой группе новообразований в клетках костного мозга зачастую наблюдается гиперметилирование ряда генов-онкосупрессоров [53], и демети-лирование восстанавливает их функцию. Поскольку гиперметилирование при перерождении клеток не ограничивается одним-двумя генами, в этом случае оптимальной стратегией представляется именно глобальное деметилирование генома. Предлагается также использовать гипометилирующие агенты для

индукции в опухолевых клетках экспрессии генов, кодирующих антигены гистосовместимости, что значительно улучшает их узнавание цитотоксичными T-лимфоцитами [54].

Еще одно заболевание, при котором могут найти применение гипометилирующие агенты — серповид-ноклеточная анемия. При этой болезни мутация E6V в гене р-глобина (HBB) приводит к синтезу гемоглобина S — формы гемоглобина, которая связывает 02 хуже, чем нормальный гемоглобин, и полимери-зуется в условиях низкого парциального давления 02. В качестве одной из терапевтических стратегий при серповидноклеточной анемии используется индукция фетального гемоглобина, содержащего у-глобин вместо р-глобина. Гены HBG1 и HBG2, кодирующие у-глобин, инактивируются к возрасту около полугода за счет гиперметилирования [55]. В начале 1980-х гг было предложено использовать 5-азацитидин и децитабин для глобального демети-лирования генома, что ведет к индукции экспрессии у-глобиновых генов, при этом уровень фетального гемоглобина возрастает в среднем в 5 раз [55]. В этом случае, однако, необходимости в глобальном деметилировании нет, поэтому большую ценность имеют попытки селективного деметилирования генов глобинов (см. ниже).

Несмотря на то, что 5-азацитидин и децитабин действуют на ДНК-метилтрансферазы и вызывают деметилирование, повышение экспрессии генов под их действием вызвано не только удалением mC из ДНК. Происходит также деметилирование гистонов и изменение структуры хроматина в области промоторов активированных генов [55]. Известные взаимодействия между белками метилирования/ деметилирования ДНК и факторами ремоделирова-ния хроматина, описанные выше, свидетельствуют о тесной функциональной связи этих процессов; по всей вероятности, они взаимно регулируют друг друга в сторону активации либо подавления экспрессии генов.

Мощной технологией для изучения влияния метилирования на активность генов стал разработанный недавно метод, основанный на встраивании в геном автономных элементов регуляции метилирования (methylation-determining regions, MDR) поблизости от регулируемого гена [56]. Несмотря на то, что в данном случае изменяется собственно геном, фенотипические изменения вносятся именно за счет стабильной эпигенетической модификации по соседству с MDR. Так, внедрение искусственно созданного MDR, сочетающего три сильных индуцирующих метилирование элемента, на расстоянии ~1 т. п. н. от промотора гена-онкосупрессора CDKN2A (p16Ink4a) вызывает его стабильное гиперметилирование как в культуре клеток, так и в организме трансгенных мышей, и вызывало спонтанное образование опухолей [57].

До разработки современных технологий, основанных на узнавании ДНК белками с заданной специфичностью, главным способом адресации активных молекул в определенные части генома был принцип комплементарности. На основании того, что поддерживающее метилирование частично протекает непосредственно в ходе репликации, было предложено использовать олигонуклеотиды или одноцепочечные ДНК, содержащие mCpG, для адресного метилирования родительских цепей ДНК. Такие олигонуклео-тиды образуют дуплекс с родительской цепью, нахо-

дящейся в одноцепочечном состоянии, и он узнается

NMT1, которая метилирует вторую, т. е. родительскую цепь. Несмотря на то, что образование в ходе репликации дуплекса с экзогенными олигонуклеоти-дами — процесс достаточно малоэффективный, сообщалось об успешном использовании такого подхода для направленного метилирования промоторов генов TRIP10 и CASP8AP2 в мезенхимальных стволовых клетках костного мозга человека и в ряде клеточных линий, хотя для закрепления статуса метилирования требовались множественные трансфекции [58—60]. Адресное метилирование при помощи этой технологии промоторов генов HIC1 и RASSF1, которые ги-перметилированы во многих опухолях, приводило к

NMT-зависимой трансформации мезенхимальных стволовых клеток. При введении иммунодефицит-ным мышам такие трансформированные клетки образовывали саркомоподобные опухоли, напоминающие опухоли у гетерозиготных нокаутных мышей HIC1wt/- [61]. Следует отметить, что в этом случае специфичность метилирования была не абсолютной, и введение одноцепочечной метилированной ДНК, соответствующей промоторам HIC1 и RASSF1, вызывала широкое изменение значительной части эпи-генома [61].

Интересная разновидость олигонуклеотид-на-правленного подхода для адресного метилирования заключается в использовании конъю-гата триплексобразующего олигонуклеотида с ДНК-метилтрансферазой. Такие конъюгаты с M.Sssi были способны к очень высокоспецифичному метилированию промотора гена EPCAM in vitro [62], однако in vivo не испытывались.

Появление инструментов для специфичной адресации функциональных белков к определенным последовательностям генома — цинковых пальцев, TAL-эффекторов и РНК-направляемой системы CRiSPR/ Cas9 — естественным образом привело к попыткам использовать их для адресованной эпигенетической модификации. Впервые такой подход был применен в 1997 г., когда было показано, что модулярный полипептид, состоящий из адресующего модуля — белка Zif268 (EGR1) или его искусственного аналога с измененной узнаваемой последовательностью (Zip53) и эффекторного модуля — бактериальной CpG-ДНК-метилазы M.Sssi, способен in vitro специфично метилировать CpG-динуклеотид, расположенный в 16—22 нуклеотидах от места связывания цинковых пальцев [63]. В 2003 г. такая возможность была впервые реализована in vivo — в клетках дрожжей (которые в норме не используют mC в качестве эпигенетического сигнала) ДНК-метилазы M.Sssi и M.Cw'PI, слитые с Zif268 и Zip53, метилировали ДНК вблизи соответствующих сайтов узнавания [64].

Несмотря на специфичность, придаваемую адресующими модулями, уровень эпигенетической модификации при использовании химерных метилаз обычно повышен и в нецелевых сайтах. Для решения этой проблемы были предприняты попытки модификации эффекторного модуля. При использовании в качестве эффекторных модулей ДНК-метилтрансфераз M.HpalI и M.Hhal, узнающих соответственно сайты CCGG и GCGC и метилирующих CpG-динуклеотид только внутри них, специфичность метилирования может быть значительно повышена как in vitro [65, 66], так и in vivo [67]. Для еще большего увеличения специфичности M.SssI и M.Hhal могут быть разделены на два домена, каждый из которых сливается

с отдельным адресующим модулем [68-70], хотя в случае разделенной M.Hhai преимущественное метилирование по сайту узнавания цинковыми пальцами было поставлено под сомнение [71]. Наконец, в следующем поколении этой системы в результате селекции на снижение нецелевого метилирования были получены варианты разделенной M.Sssi с повышенной специфичностью [72].

Расшифровка «кода цинковых пальцев» позволила впервые адресовать эффекторы эпигенетической модификации практически в любое место генома. Многие исследования по адресованному эпигенетическому метилированию проводились на генах, изменение статуса метилирования которых наблюдается в опухолях. Так, ген EPCAM кодирует эпителиальный белок клеточной адгезии и активирован во многих опухолях, где ассоциирован с неблагоприятным исходом заболевания. Химерный фермент, сочетающий эффекторный модуль DMNT3a и три цинковых пальца, узнающие последовательность GGGGGAGGG в промоторе гена EPCAM, успешно использовался для метилирования промотора этого гена (до 48%) и снижения его экспрессии (на 60—80%) в клетках рака яичника; неспецифичного метилирования промоторов других генов при этом не наблюдалось [73]. Аналогичный подход был использован для специфичного метилирования промотора гена VEGFA, кодирующего фактор роста эндотелия сосудов A, повышенная экспрессия которого необходима для васкуляризации солидных опухолей и вызывает несколько распространенных форм ретинопатии. При этом адресация к промотору VEGFA также осуществлялась цинковыми пальцами, а в качестве эффекторного модуля использовался химерный полипептид, состоящий из каталитического домена DNMT3a и C-концевого домена белка DNMT3L, который сам не обладает метилтрансферазной активностью, но связывается с DNMT3a и активирует его [74]. В работе [75] авторы адресно подавляли активность генов PI5 (Maspin) и SOX2, статус метилирования которых разнонаправленно измерен в клетках рака молочной железы и показали, что метилирование промоторов этих генов оказывает противоположное влияние на способность клеток к пролиферации. Наконец, была показана способность конструкции, несущей цинковые пальцы, эффекторный модуль DNMT3a и сигналы митохондриальной локализации и ядерного экспорта, проникать в митохондрии и селективно метилировать митохондриальную ДНК в области патогенной мутации 8993T>G в гене MT-ATP6 [76].

TAL-эффекторные конструкции на сегодня нашли меньшее применение в редактировании эпигенетического метилирования. Частично это связано с тем, что HD, стандартный мотив узнавания цитозина в составе TAL, слабо связывается с mC, и наоборот, mC-специфичный мотив NG плохо узнает цитозин [77]; таким образом, сложно получить адресующий TAL-модуль, нечувствительный к вариациям метилирования в целевой ДНК. Среди немногих известных примеров — метилирование и инактивация промотора гена CDKN2A конструкцией с адресующим TAL-модулем и каталитическим модулем DNMT3a— DNMT3L [78] и химерный белок, состоящий из адресующего TAL-модуля и каталитического домена TET1 в качестве эффекторного модуля, способный деметилировать интрон 2 в гене KLF4 и промоторы генов RHOXF2 и HBB в клетках человека и тем

самым активировать эти гены [79]. При использовании полноразмерного ТЕТ1 в качестве эффекторной части специфичное деметилирование гораздо менее выражено, что, возможно, связано с неэффективным синтезом белка большого размера. Интересно, что при непосредственном сравнении эффективности ТА1_-повторов и цинковых пальцев в качестве адресующих частей заметных различий обнаружено не было [79].

Каталитический домен ТЕТ2, слитый с цинковыми пальцами, адресованными к промоторам генов ICAM-1 и EPCAM, деметилировал промоторы и увеличивал экспрессию целевых генов [80]. При использовании каталитического домена ТЕТ2 активность такой конструкции была ниже, а адресованный каталитический домен ТЕТ3 был неспособен деметилировать ДНК. Сообщалось даже о том, что деметилирование промотора гена индуцируемой 1\10-синтазы (NOS2) может быть достигнуто за счет адресации к нему ТШ; в качестве адресующего модуля могут выступать цинковые пальцы [81] или ДНК-связывающий домен фактора транскрипции ^-кВ [82]. Однако в данном случае остается непонятным, как инициируется деметилирование, поскольку ТС^ не удаляет тС [83].

Конструкции, использующие систему С1^Р1Т/ Cas9 для адресации эффекторов эпигенетической модификации, в литературе пока не описаны. Однако нет сомнений, что эта технология имеет большое будущее в эпигенетическом редактировании не только из-за простоты и эффективности, но и ввиду своей нечувствительности к ковалентным модификациям ДНК, в том числе тС и ЬитС, что делает маловероятными проблемы, стоящие перед ТА1_-эффекторами [84].

Направленное метилирование можно использовать не только для подавления экспрессии генов в эукариотическом геноме, но и для сайленсинга вирусных генов как при продуктивной инфекции,

так и при интеграции. Метилирование промотора iE175k вируса простого герпеса (HSV-1) при помощи DNMT3a, слитой со специфичными цинковыми пальцами, снижает число вирусных частиц при ли-тической инфекции культуры клеток примерно на порядок [85]. Адресное метилирование при помощи метилированной одноцепочечной ДНК снижает активность интегрированных промоторов CMV цитоме-галовируса и E1A аденовируса типа 5 [86].

Заключение

Современное состояние знаний о ферментативных механизмах метилирования и активного демети-лирования и способность адресно направлять белки в любое место генома позволяют конструировать ферменты для селективного изменения статуса метилирования конкретных последовательностей in vivo. Таким образом, в ближайшем будущем можно ожидать появления все большего числа инструментов для редактирования эпигенома. Помимо совершенствования систем адресации, большой интерес представляют новые эффекторные модули, например, дезаминазы или гликозилазы помимо TDG. В этом плане примечательны специализированные ДНК-гликозилазы растений DEMETER и ROS1, которые способны непосредственно удалять из ДНК основания mC [87]. Можно ожидать и появления инструментов селективного изменения белков хроматина в области конкретных последовательностей ДНК. В конечном итоге редактирование эпигенома должно дополнить подходы геномного редактирования для создания новых клеточных линий, пригодных в использовании в лаборатории и в медицине.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 14-24-00093.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Lee T.-f., Zhai J., Meyers B.C. Conservation and divergence in eukaryotic DNA methylation. PNAS USA 2010; 107: 9027-8.

2. Zemach A., Zilberman D. Evolution of eukaryotic DNA methylation and the pursuit of safer sex. Curr. Biol. 2010; 20: R780-R5.

3. Deaton A.M., Bird A. CpG islands and the regulation of transcription. Genes Dev. 2011; 25: 1010-22.

4. Weber M., Schübeler D. Genomic patterns of DNA methylation: Targets and function of an epigenetic mark. Curr. Opin. Cell Biol. 2007; 19: 273-80.

5. Ballestar E., Wolffe A.P. Methyl-CpG-binding proteins. Eur. J. Biochem. 2001; 268: 1-6.

6. Baubec T., Ivanek R., Lienert F., Schübeler D. Methylation-dependent and -independent genomic targeting principles of the MBD protein family. Cell 2013; 153: 480-92.

7. Boyes J., Bird A. Repression of genes by DNA methylation depends on CpG density and promoter strength: Evidence for involvement of a methyl-CpG binding protein. EMBO J. 1992; 11: 327-33.

8. Hsieh C.-L. Dependence of transcriptional repression on CpG methylation density. Mol. Cell. Biol. 1994; 14: 5487-94.

9. Weber M., Hellmann I., Stadler M.B., Ramos L., Pääbo S., Rebhan M., Schübeler D. Distribution, silencing potential and evolutionary impact of promoter DNA methylation in the human genome. Nat. Genet. 2007; 39: 457-66.

10. Singer M., Kosti I., Pachter L., Mandel-Gutfreund Y. A diverse epigenetic landscape at human exons with implication for expression. Nucleic Acids Res. 2015; 43: 3498-508.

11. Branco M.R., Ficz G., Reik W. Uncovering the role of 5-hydroxymethylcytosine in the epigenome. Nat. Rev. Genet. 2011; 13: 7-13.

12. Pastor W.A., Pape U.J., Huang Y. et al. Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells. Nature 2011; 473: 394-7.

13. Yu M., Hon G.C., Szulwach K.E. et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell 2012; 149: 1368-80.

14. Spruijt C.G., Gnerlich F., Smits A.H. et al. Dynamic readers for 5-thydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell 2013; 152: 1146-59.

15. Takai H., Masuda K., Sato T. et al. 5-Hydroxymethylcytosine plays a critical role in glioblastomagenesis by recruiting the CHTOP-methylosome complex. Cell Rep. 2014; 9: 48-60.

16. Jurkowska R.Z., Jurkowski T.P., Jeltsch A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. Chembiochem. 2011; 12: 206-22.

17. Chuang L.S.-H., ian H.-i., Koh T.-W. et al. Human DNA-tcytosine-5) methyltransferase-PCNA complex as a target for p21WAF1. Science 1997; 277: 1996-2000.

18. iida T., Suetake i., Tajima S. et al. PCNA clamp facilitates action of DNA cytosine methyltransferase 1 on hemimethylated DNA. Genes Cells 2002; 7: 997-1007.

19. Rountree M.R., Bachman K.E., Baylin S.B. DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci. Nat. Genet. 2000; 25: 269-77.

20. Viré E., Brenner C., Deplus R. et al. The Polycomb group protein EZH2 directly controls DNA methylation. Nature 2006; 439: 871-4.

21. Kato Y., Kaneda M., Hata K. et al. Role of the Dnmt3 family in de novo methylation of imprinted and repetitive sequences during male germ cell development in the mouse. Hum. Mol. Genet. 2007; 16: 2272-80.

22. Watanabe D., Suetake i., Tada T., Tajima S. Stage- and cell-specific expression of Dnmt3a and Dnmt3b during embryogenesis. Mech. Dev. 2002; 118: 187-90.

23. Okano M., Bell D.W., Haber D.A., Li E. DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development. Cell 1999; 99: 247-57.

24. Aapola U., Shibuya K., Scott H.S. et al. Isolation and initial characterization of a novel zinc finger gene, DNMT3L, on 21q22.3, related to the cytosine-5-methyltransferase 3 gene family. Genomics. 2000; 65: 293-8.

25. Bourc'his D., Xu G.-L., Lin C.-S. et al. Dnmt3L and the establishment of maternal genomic imprints. Science 2001; 294: 2536-9.

26. Jia D., Jurkowska R.Z., Zhang X. et al. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature 2007; 449: 248-51.

27. Goll M.G., Kirpekar F., Maggert K.A. et al. Methylation of tRNAAsp by the DNA methyltransferase homolog Dnmt2. Science 2006; 311: 395-8.

28. Bheemanaik S., Reddy Y.V.R., Rao D.N. Structure, function and mechanism of exocyclic DNA methyltransferases. Biochem. J. 2006; 399: 177-90.

29. Santos F., Peat J., Burgess H. et al. Active demethylation in mouse zygotes involves cytosine deamination and base excision repair. Epigenetics Chromatin 2013; 6: 39.

30. Franchini D.-M., Schmitz K.-M., Petersen-Mahrt S.K. 5-Methylcytosine DNA demethylation: More than losing a methyl group. Annu. Rev. Genet. 2012; 46: 419-41.

31. Tahiliani M., Koh K.P., Shen Y. et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science 2009; 324: 930-5.

32. He Y.-F., Li B.-Z., Li Z. et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science 2011; 333: 1303-7.

33. Ito S., Shen L., Dai Q. et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science 2011; 333: 1300-3.

34. Moran-Crusio K., Reavie L., Shih A. et al. Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation. Cancer Cell 2011; 20: 11-24.

35. Dawlaty M.M., Ganz K., Powell B.E. et al. Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development. Cell Stem Cell 2011; 9: 166-75.

36. Gu T.-P., Guo F., Yang H. et al. The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes. Nature 2011; 477: 606-10.

37. Conticello S.G. The AID/APOBEC family of nucleic acid mutators. Genome Biol. 2008; 9: 229.

38. Storb U., Stavnezer J. Immunoglobulin genes: Generating diversity with AID and UNG. Curr. Biol. 2002; 12: R725-R7.

39. Popp C., Dean W., Feng S. et al. Genome-wide erasure of DNA methylation in mouse primordial germ cells is affected by AID deficiency. Nature 2010; 463: 1101-5.

40. Kumar R., DiMenna L., Schrode N. et al. AID stabilizes stem-cell phenotype by removing epigenetic memory of pluripotency genes. Nature 2013; 500: 89-92.

41. Nabel C.S., Jia H., Ye Y. et al. AID/APOBEC deaminases disfavor modified cytosines implicated in DNA demethylation. Nat. Chem. Biol. 2012; 8: 751-8.

42. Wallace S.S. Base excision repair: A critical player in many games. DNA Repair. 2014; 19: 14-26.

43. Barreto G., Schäfer A., Marhold J. et al. Gadd45a promotes epigenetic gene activation by repair-mediated DNA demethylation. Nature 2007; 445: 671-5.

44. Moréra S., Grin I., Vigouroux A. et al. Biochemical and structural characterization of the glycosylase domain of MBD4 bound to thymine and 5-hydroxymethyuracil-containing DNA. Nucleic Acids Res. 2012; 40: 9917-26.

45. Sabag O., Zamir A., Keshet I. et al. Establishment of methylation patterns in ES cells. Nat. Struct. Mol. Biol. 2014; 21: 110-2.

46. Lucey M.J., Chen D., Lopez-Garcia J. et al. T:G mismatch-specific thymine-DNA glycosylase tTDG) as a coregulator of transcription interacts with SRC1 family members through a novel tyrosine repeat motif. Nucleic Acids Res. 2005; 33: 6393-404.

47. Léger H., Smet-Nocca C., Attmane-Elakeb A. et al. A TDG/ CBP/RARa ternary complex mediates the retinoic acid-dependent expression of DNA methylation-sensitive genes. Genomics Prot. Bioinform. 2014; 12: 8-18.

48. Tini M., Benecke A., Um S.-J. et al. Association of CBP/ p300 acetylase and thymine DNA glycosylase links DNA repair and transcription. Mol. Cell 2002; 9: 265-77.

49. Cortázar D., Kunz C., Selfridge J. et al. Embryonic lethal phenotype reveals a function of TDG in maintaining epigenetic stability. Nature 2011; 470: 419-23.

50. Li Y.-Q., Zhou P.-Z., Zheng X.-D. et al. Association of Dnmt3a and thymine DNA glycosylase links DNA methylation with base-excision repair. Nucleic Acids Res. 2007; 35: 390-400.

51. Boland M.J., Christman J.K. Characterization of Dnmt3b:thymine-DNA glycosylase interaction and stimulation of thymine glycosylase-mediated repair by DNA methyltransferasets) and RNA. J. Mol. Biol. 2008; 379: 492-504.

52. Grin I., Ishchenko A.A. An interplay of the base excision repair and mismatch repair pathways in active DNA demethylation. Nucleic Acids Res. doi: 10.1093/nar/gkw059.

53. Herman J.G., Baylin S.B. Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation. N. Engl. J. Med. 2003; 349: 2042-54.

54. Hambach L., Ling K.-W., Pool J. et al. Hypomethylating drugs convert HA-1—negative solid tumors into targets for stem cell—based immunotherapy. Blood 2009; 113: 2715-22.

55. Saunthararajah Y., Lavelle D., DeSimone J. DNA hypomethylating agents and sickle cell disease. Br. J. Haematol. 2004; 126: 629-36.

56. Lienert F., Wirbelauer C., Som I. et al. Identification of genetic elements that autonomously determine DNA methylation states. Nat. Genet. 2011; 43: 1091-7.

57. Yu D.-H., Waterland R.A., Zhang P. et al. Targeted p16Ink4a epimutation causes tumorigenesis and reduces survival in mice. J. Clin. Invest. 2014; 124: 3708-12.

58. Hsiao S.-H., Lee K.-D., Hsu C.-C. et al. DNA methylation of the Trip10 promoter accelerates mesenchymal stem cell lineage determination. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010; 400: 305-12.

59. Lee K.-D., Pai M.-Y., Hsu C.-C. et al. Targeted Casp8AP2 methylation increases drug resistance in mesenchymal stem cells and cancer cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2012; 422: 578-85.

60. Leu Y.-W., Huang T.H.-M., Hsiao S.-H. Epigenetic reprogramming of mesenchymal stem cells. Adv. Exp. Med. Biol. 2013; 754: 195-211.

61. Teng I.-W., Hou P.-C., Lee K.-D. et al. Targeted methylation of two tumor suppressor genes is sufficient to transform mesenchymal stem cells into cancer stem/initiating cells. Cancer Res. 2011; 71: 4653-63.

62. van der Gun B.T.F., Maluszynska-Hoffman M., Kiss A. et al. Targeted DNA methylation by a DNA methyltransferase coupled to a triple helix forming oligonucleotide to down-regulate the epithelial cell adhesion molecule. Bioconjug. Chem. 2010; 21: 1239-45.

63. Xu G.-L., Bestor T.H. Cytosine methylation targetted to predetermined sequences. Nat. Genet. 1997; 17: 376-8.

64. Carvin C.D., Parr R.D., Kladde M.P. Site-selective in vivo targeting of cytosine-5 DNA methylation by zinc-finger proteins. Nucleic Acids Res. 2003; 31: 6493-501.

65. McNamara A.R., Hurd P.J., Smith A.E.F., Ford K.G. Characterisation of site - biased DNA methyltransferases: Specificity, affinity and subsite relationships. Nucleic Acids Res. 2002; 30: 3818-30.

66. Smith A.E., Ford K.G. Specific targeting of cytosine methylation to DNA sequences in vivo. Nucleic Acids Res. 2007; 35: 740-54.

67. Smith A.E., Hurd P.J., Bannister A.J., Kouzarides T., Ford K.G. Heritable gene repression through the action of a directed DNA methyltransferase at a chromosomal locus. J. Biol. Chem. 2008; 283: 9878-85.

68. Nomura W., Barbas C.F., III In vivo site-specific DNA methylation with a designed sequence-enabled DNA methylase. J. Am. Chem. Soc. 2007; 129: 8676-7.

69. Chaikind B., Kilambi K.P., Gray J.J., Ostermeier M. Targeted DNA methylation using an artificially bisected M.HhaI fused to zinc fingers. PLoS ONE. 2012; 7: e44852.

70. Slaska-Kiss K., Timar E., Kiss A. Complementation between inactive fragments of SssI DNA methyltransferase. BMC Mol. Biol. 2012; 13: 17.

71. Meister G.E., Chandrasegaran S., Ostermeier M. An engineered split M.HhaI-zinc finger fusion lacks the intended methyltransferase specificity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008; 377: 226-30.

72. Chaikind B., Ostermeier M. Directed evolution of improved zinc finger methyltransferases. PLoS ONE. 2014; 9: e96931.

73. Nunna S., Reinhardt R., Ragozin S., Jeltsch A. Targeted methylation of the epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) promoter to silence its expression in ovarian cancer cells. PLoS ONE. 2014; 9: e87703.

74. Siddique A.N., Nunna S., Rajavelu A. et al. Targeted methylation and gene silencing of VEGF-A in human cells by using a designed Dnmt3a-Dnmt3L single-chain fusion protein with increased DNA methylation activity. J. Mol. Biol. 2013; 425: 479-91.

75. Rivenbark A.G., Stolzenburg S., Beltran A.S. et al. Epigenetic reprogramming of cancer cells via targeted DNA methylation. Epigenetics 2012; 7: 350-60.

76. Minczuk M., Papworth M.A., Kolasinska P. et al. Sequence-specific modification of mitochondrial DNA using a chimeric zinc finger methylase. PNAS USA 2006; 103: 19689-94.

77. Valton J., Cabaniols J.-P., Galetto R. et al. fficient strategies for TALEN-mediated genome editing in mammalian cell lines. Methods 2014; 69: 151-70.

78. Bernstein D.L., Le Lay J.E., Ruano E.G., Kaestner K.H. TALEmediated epigenetic suppression of CDKN2A increases replication in human fibroblasts. J. Clin. Invest. 2015; 125: 1998-2006.

79. Maeder M.L., Angstman J.F., Richardson M.E. et al. Targeted DNA demethylation and activation of endogenous genes using programmable TALE-TET1 fusion proteins. Nat. Biotechnol. 2013; 31: 1137-42.

80. Chen H., Kazemier H.G., de Groote M.L. et al. Induced DNA demethylation by targeting Ten-Eleven Translocation 2 to the human ICAM-1 promoter. Nucleic Acids Res. 2014; 42: 1563-74.

81. Gregory D.J., Zhang Y., Kobzik L., Fedulov A.V. Specific transcriptional enhancement of inducible nitric oxide synthase by targeted promoter demethylation. Epigenetics 2013; 8: 1205-12.

82. Gregory D.J., Mikhaylova L., Fedulov A.V. Selective DNA demethylation by fusion of TDG with a sequence-specific DNA-binding domain. Epigenetics 2012; 7: 344-9.

83. Cortázar D., Kunz C., Saito Y. et al. The enigmatic thymine DNA glycosylase. DNA Repair 2007; 6: 489-504.

84. Yaung S.J., Esvelt K.M., Church G.M. CRISPR/Cas9-mediated phage resistance is not impeded by the DNA modifications of phage T4. PLoS ONE. 2014; 9: e98811.

85. Li F., Papworth M., Minczuk M., Rohde C., Zhang Y., Ragozin S., Jeltsch A. Chimeric DNA methyltransferases target DNA methylation to specific DNA sequences and repress expression of target genes. Nucleic Acids Res. 2007; 35: 100-12.

86. Hsu C.-C., Li H.-P., Hung Y.-H. et al. Targeted methylation of CMV and E1A viral promoters. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2010; 402: 228-34.

87. Law J.A., Jacobsen S.E. Establishing, maintaining and modifying DNA methylation patterns in plants and animals. Nat. Rev. Genet. 2010; 11: 204-20.

Поступила: 12.03.2016