Фармацевтически приемлемые соли пептида ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида
PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE ACETYL-(D-LYS)-LYS-ARG-ARG-AMIDE PEPTIDE SALTS

Область изобретения
Изобретение относится к области биохимии и фармакологии, в частности к фармацевтически приемлемой соли пептида ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида, выбранной из гидрохлорида и фосфата, а также к фармацевтическим композициям, которые ее содержат. Фармацевтически приемлемые соли по настоящему изобретению могут применяться для лечения нарушений деятельности головного мозга, таких как болезнь Альцгеймера или депрессии
Уровень техники
Ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амид представляет собой синтетический пептид, миметик фрагмента 14-17 адренокортикотропного гормона человека (АКТГ 15-18). Ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амид обладает нейропротекторной и ноотропной активностью за счет улучшения мозгового кровообращения и противовоспалительной активности и может применяться в терапии острых нарушений мозгового кровообращения, деменций, в т.ч. при болезни Альцгеймера, и депрессий.
По результатам проведенных лабораторных исследований ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амид проявляет большую церебропротекторную активность и эффективность в терапии когнитивных расстройств, чем ряд наиболее активно применяемых сейчас для этого препаратов из разных классов: ингибитор ацетилхолин-эстераз донепезил [1], ноотроп Пирацетам [2], а также чем наиболее близкий по механизму действия пептидный препарат Семакс, также являющийся фрагментом АКТГ [3].
Это определяет целесообразность и перспективность дальнейшей разработки и применения ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида как препарата для терапии когнитивных нарушений при различных деменциях, болезни Альцгеймера, острых нарушениях мозгового кровообращения и др.
Кроме того, ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амид обладает стресс-протекторной и антидепрессантной активностью выше, чем у его ближайшего аналога препарата Семакс [4], что позволяет использовать его в терапии депрессий.
Патент RU 2678987 раскрывает ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амид и способ его получения, в ходе которого соединение получают методом твердофазного химического синтеза с последующим отщеплением защитных групп и очисткой конечного продукта с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ). Структура, чистота и гомогенность полученного пептида подтверждается данными ВЭЖХ, аминокислотного и масс-спектрального анализов.
Ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амид разрабатывался как средство для терапии деменций и депрессий в форме дозированного назального спрея, содержащего 0,5% раствор ацетатной соли пептида. Недостатком имеющегося вещества является его недостаточная стабильность при длительном хранении. Недостатком разработанной готовой формы является отчетливый резкий запах уксусной кислоты, что может быть неудобным и неприятным для пациентов и снижать приверженность лечению. Для устранения этих недостатков представляется возможным разработать иную солевую форму ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида и в дальнейшем использовать ее для получения готовой лекарственной формы.
Краткое описание изобретения
Задачей настоящего изобретения являлась разработка фармацевтически приемлемой солевой формы пептида ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида для использования в лекарственных препаратах, обладающей большей стабильностью и менее выраженным запахом по сравнению с ацетатной солью этого пептида, а также обладающую не меньшей биологической активностью.
Поставленная задача решается тем, что для использования в лекарственном препарате предлагается соль пептида ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида, выбранная из гидрохлорида и фосфата.
Разрабатываемой готовой формой препарата для терапии деменций и депрессий на основе формы пептида ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида является водный раствор в форме дозированного назального спрея.
Выбор солевой формы пептида осуществляли по соответствию следующим критериям:
• Соль должна быть фармакологически приемлема [5].
• Биологическая активность соли должна быть не меньше, чем в случае ацетатной соли пептида.
• Стабильность соли при хранении должна быть выше, чем в случае ацетатной соли пептида.
• Соль должна быть растворима в воде в концентрации не меньше 1% (вес/объем).
• Раствор соли с концентрацией не выше 1% (вес/объем) не должен обладать выраженным резким или неприятным запахом.
Для подбора новой солевой формы пептида ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида, имеющей необходимые свойства, исследовали в первую очередь свойства солей неорганических кислот: соляной, фосфорной и серной. Сами соли получили из трифторацетатной соли ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида с помощью анионообменной смолы в соответствующей форме. Затем провели последовательный анализ соответствия свойств полученных солей пептида нашим требованиям (Таблица 1).
Общая фармакологическая приемлемость гидрохлоридов, фосфатов и сульфатов действующих веществ лекарственных препаратов известна из литературных данных [5].
При тестировании биологической активности гидрохлорида, фосфата и сульфата ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида исходили из предположения, что по крайней мере при интраназальном способе введения их биологическая активность будет соответствовать биологической активности описанного ранее ацетата ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида. Поэтому провели ограниченное количество ключевых тестов их стресс-протекторной, ноотропной и мнемотропной активностей в скополаминовой модели нейродегенерации. Биологическая активность всех исследованных солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида оказалась сходной и не меньше, чем в случае ацетатной соли пептида (Пример 1, Фигуры 1-3). На этом основании сделали вывод, что биологическая активность всех изученных солей пептида одинакова, и дальнейшее сравнение в других поведенческих тестах нецелесообразно.
Отдельно протестировали антиишемическую активность гидрохлорида ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида в модели билатеральной каротидной окклюзии. Она оказалась идентична активности ацетата ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида (Пример 2, Фигура 4).
Все исследованные соли ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида оказались растворимы в воде в концентрации 1%.
Гидрохлорид и фосфат ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида оказались стабильны при хранении в течение 2 лет.Ацетат и сульфат пептида деградировали при хранении (Пример 2, Фигура 4). Растворы всех исследованных солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида, кроме ацетата, в концентрации 1% (вес/объем) не обладали выраженным резким или неприятным запахом.
Таким образом, проведенные исследования свойств ацетата, гидрохлорида, фосфата и сульфата пептида ацетил-(D-rys)-Lys-Arg-Arg-амида показало, что техническая задача решается при использовании гидрохлорида и фосфата ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида.
Дополнительным техническим результатом гидрохлорида ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида, оказалась низкая гигроскопичность по сравнению с фосфатом, который активнее других солей поглощал влагу из воздуха, что затрудняло работу с ним, например, получение точных навесок пептида.
Оптимальной готовой лекарственной формой для этого пептида по нашим представлениям в большинстве случаев является дозированный назальный спрей. Однако, в случаях, когда требуется введение больших количеств пептида, оптимальным решением может являться лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного введения.
Например, эффективная доза препарата для коррекции нарушений памяти у мышей составляет 0,1 мг/кг в сутки (Пример 1). При пересчете дозы для человека с учетом поправочных коэффициентов это соответствует введению 0,625 мг в сутки для человека весом 75 кг. Такое количество препарата удобно вводить интраназально с помощью спрея-дозатора по 50 мкл 0,75% раствора 2 раза в день или по 50 мкл 0,25% раствора 5 раз в день.
В зависимости от назначения конкретной готовой формы препарата оптимальной будет различная концентрация действующего вещества в ней. В любом случае форма назального спрея позволяет вводить препарат многократно, тем самым регулируя суточную дозу в широком диапазоне. Вероятно, целесообразно создавать спреи с относительно низкой концентрацией пептида. Это обеспечит возможность широкого регулирования суточной дозы, а относительно частое введение препарата обеспечит поддержание постоянной концентрации пептида в крови.
В то же время, эффективная доза препарата для терапии последствий острых нарушений мозгового кровообращения у мышей составляет 2 мг/кг в сутки (Пример 2). При пересчете дозы для человека с учетом поправочных коэффициентов это соответствует введению 12,5 мг в сутки для человека весом 75 кг. Такие количества препарата неудобно вводить интраназально, т.к. требуется или применение высококонцентрированных растворов пептида, устойчивость которых при хранении сомнительна, или введение препарата десятки раз в день. В этом случае представляется более целесообразным внутривенное введение препарата. При этом оптимальной готовой лекарственной формой представляется лиофилизат пептида для приготовления раствора для внутривенного введения.
Важно отметить, что клинические исследования препаратов на основе солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида могут выявить необходимость коррекции доз и, следовательно, количества и концентрации пептида в различных готовых лекарственных формах.
Описание фигур
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.
На Фиг. 1 представлена диаграмма, отображающая влияние солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида и донепезила на поведение крыс после введения скополамина в тесте открытого поля (ОП). Двигательная активность - количество пересеченных квадратов на поле; ориентировочно-исследовательская активность - сумма количества стоек и обследованных отверстий; эмоциональные реакции - сумма выделенных болюсов, актов уринации и актов груминга; сумма всех видов активности - сумма всех действий в других категориях. *р<0,05 (t-критерий Стьюдента) по сравнению с группой, получавшей только скополамин.
На Фиг. 2 представлена диаграмма, отображающая влияние солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида и донепезила на когнитивные функции крыс после введения скополамина в тесте экстраполяционного избавления (ЭИ).
На Фиг. 3 представлена диаграмма, отображающая влияние солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида и донепезила на латентное время входа крыс с нейродегерацией после введения скополамина в темный отсек прибора а тесте по развитию условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) на 1-е и 10-е сутки после начала введения препаратов. *р<0,05 (t-критерий Стьюдента) по сравнению с группой, получавшей только скополамин.
На Фиг. 4 представлена диаграмма, отображающая влияние солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида на выживаемость животных, перенесших окклюзию каротидных артерий, т.е. острое нарушение мозгового кровообращения. *р<0,05 (логарифмический ранговый критерий) по сравнению с контрольной группой, получавшей только физиологический раствор.
На Фиг. 5 представлен график изменения содержания основного вещества в образцах солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида, хранившихся при +4°С, с течением времени. *р<0,05 (t-критерий Стьюдента) по сравнению с солянокислой солью ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида.
Примеры
Промышленная применимость изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Исследование стресс-протекторной, ноотропной и мнемотропной активностей солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида в скополаминовой модели нейродегенерации.
Биологическую активность гидрохлорида, фосфата и сульфата пептида ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида сравнивали с биологической активностью описанного ранее ацетата пептида ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида (Патент RU 2678987) и с активностью препарата сравнения донепезила в скополаминовой модели нейродегенерации. Эту модель также можно рассматривать как модель когнитивных нарушений при болезни Альцгеймера [6].
Функциональное состояние ЦНС животных сравнивали в тестах открытого поля (ОП), экстраполяционного избавления (ЭИ), условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ). Дизайн эксперимента соответствовал описанному ранее для ацетата ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида (патент RU 2678987), но не включал анализ биохимических показателей.
В эксперименте использовали белых беспородных половозрелых самцов крыс массой 200-240 г. Формировали группы животных по 7 особей в каждой: группа отрицательного контроля получала только плацебо, группа положительного контроля получала скополамин и плацебо, остальные группы получали скополамин и один из исследуемых препаратов - донепезил или одну из исследуемых солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида.
Скополамин вводили животным всех групп, кроме группы отрицательного контроля, внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг ежедневно один раз в сутки на протяжении 27 дней. С 28 дня в течение 10 суток животным опытных групп вводили либо донепезил, либо одну из исследуемых солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида. Препараты вводили ежедневно 1 раз в сутки.
Донепезил вводили внутрижелудочно в дозе 1 мг/кг. Соли ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида вводили интраназально в дозе 0,1 мг/кг. Животные группы положительного контроля получали 0,9% раствор натрия хлорида в качестве плацебо интраназально и внутрижелудочно.
После курсовой терапии препаратами оценивали функциональное состояние ЦНС животных по тестам открытого поля (ОП), экстраполяционного избавления (ЭИ) и условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) [7, 8], а также плавательного теста Порсолта (ПТП) [9, 10].
Тесты ОП и ЭИ выполняли на 1 день, ПТП - на второй день, УРПИ - на первый и десятый день после терапии препаратами. После этого животных выводили из эксперимента введением наркозного препарата с последующей декапитацией.
Количественные данные обрабатывали статистически. Результаты представлены в виде арифметического среднего и ее стандартного отклонения (Mean±SD). Для оценки статистической значимости межгрупповых различий в зависимости от характера распределения в вариационном ряду использованы t-критерий Стьюдента либо Т-критерий Манна-Уитни.
Открытое поле
Все исследуемые соли ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида восстанавливают ориентировочно-исследовательскую активность крыс в тесте открытого поля (Фиг. 1). Это проявляется в первую очередь увеличением числа обследованных отверстий.
Все изученные соли ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида оказывают одинаковое влияние на двигательную, ориентировочно-исследовательскую активность, эмоциональные реакции крыс и их вегетативное сопровождение. Полученные результаты свидетельствует о способности нормализовать поведенческие реакции животных при нейродегенерации и характеризуют их активность как стресс-протекторную.
Экстраполяционное избавление
В тесте экстраполяционного избавления исследованные препараты в 3-4 раза уменьшают время, необходимое животным для подныривания под край цилиндра (избавления) в тесте ЭИ (Фиг. 2). Различия между количеством справившихся с заданием (поднырнувших) животных в каждой группе отсутствуют.
Все исследованные соли ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида в равной степени улучшают когнитивные функции крыс наравне с донепезилом.
Полученные результаты свидетельствуют о способности исследованных солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида стимулировать когнитивные функции животных с нейродегенерацией и характеризуют их активность как ноотропную.
УРПИ
Другим аспектом ноотропного действия ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида в целом и его солей в частности является их антиамнестическая активность. Она исследована в тесте на сохранение условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ).
Тест проводили на первый и десятый день после терапии препаратами. Критерий обученности животных УРПИ - пребывание в светлом отсеке прибора УРПИ на протяжении не менее 180 с. В группе, получавшей скополамин, но не обработанной препаратами, наблюдается типичное для блокады холинергической нейротрансмиссии снижение времени входа в темный отсек прибора, свидетельствующее об амнестическом действии.
Все исследованные соли ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида в равной степени увеличивает латентное время входа крыс в темный отсек камеры УРПИ как через 24 часа после его формирования, так и через 10 дней (Фигура 3). Увеличение этого показателя свидетельствует о положительном влиянии исследованных солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида на формирование условно-рефлекторного памятного следа у животных. Таким образом, все они обладают одинаково выраженным положительным мнемотропным действием.
Пример 2. Исследование антиишемической активности солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида в модели билатеральной каротидной окклюзии.
Острую церебральную ишемию моделировали путем полной, необратимой, одномоментной билатеральной окклюзии общих сонных артерий беспородных белых крыс под медикаментозным наркозом. В качестве наркоза использовался пропофол в дозе 15 мг/кг. После нанесения поражения все животные были разделены на 4 группы: контрольная -интраназально получала физиологический раствор, опытные -интраназально получали либо ацетат ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида, либо гидрохлорид ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида в дозе 2 мг/кг, группа препарата сравнения - внутривенно получала Пирацетам в дозе 400 мг/кг. В каждой группе было 10 животных, наблюдения проводили в течение 4 дней, регистрировали смертность.
В результате эксперимента было показано, что введение солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида достоверно снижало смертность животных, подвергнутых экспериментальной ишемии головного мозга путем перевязки сонных артерий, по сравнению с контрольными животными, получавшими физиологический раствор (Фигура 4). Введение препарата сравнения Пирацетама значительного воздействия на смертность не оказывало.
Пример 3. Исследование стабильности солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида при длительном хранении
Для удобства серийного производства препарата на основе пептида, соответствующая фармацевтическая субстанция должна быть стабильна при хранении. Требуемый минимальный срок хранения соли пептида определили как 2 года.
Образцы солей ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида были заложены на хранение при температуре +4°С на 2 года. В течение этого времени раз в 3 месяца анализировали содержание основного вещества и продуктов его распада с помощью ВЭЖХ. Исходное содержание основного вещества составляло от 97,1 до 97,7% для разных солей. Пороговым значением содержания основного вещества после 24 месяцев хранения считали 95%.
При хранении ацетата ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида в течение более чем 21 месяца происходит снижение содержания основного вещества до 95% и ниже (Фигура 5). То же самое происходит при хранении сульфата пептида в течение 24 месяцев и более (Фигура 5). При длительном хранении растворов гидрохлорида и фосфата ацетил-(D-Lys)-Lys-Arg-Arg-амида содержание основного вещества не падает ниже 95%.
Список литературы
1. Дейко РД, Штрыголь СЮ, Горбач ТВ, Колобов АА, Симбирцев АС. Ноотропные Свойства Тетрапептида Acetyl-(d-Lys)-Lys-Arg-Arg-Amide (кк-1) На Модели Болезни Альцгеймера У Крыс, Обусловленной Хроническим Введением Скополамина // Клiнiчна Фармащя - 2016 - 20 (4)
2. Дейко РД, Штрыголь СЮ, Прусаков АН, Колобов АА. Исследование психотропных свойств и взаимодействия с веществами угнетающего и возбуждающего действия новых олигопептидов, гомологичных первичной аминокислотной последовательности участка АКТГ 15-18 //  Бiофармацевтичний Журнал - 2015 -1 (36).
3. Deiko Roman D., Shtrygol Sergii Yu., Kolobov Alexandr A., Simbirtsev Andrey S. The Positive Mnemotropic Influence of the New Neuroprotective Oligopeptides, Homologous of Acth15-18 Sequence, on All Memory Stages // Wschod Czas Nauk - 2016
4. Кудина OB, Штрыголь СЮ, Цывунин BB, Колобов АА. Стресспротекторное действие новых олигопептидов - аналогов фрагмента АКТГ 15-18 - на модели острого иммобилизационного стресса. // Экспериментальная и клиническая фармакология - 2018 - 81(2) - с. 12-16.
5. Stahl РН, Wermuth CG, International Union of Pure and Applied Chemistry. Handbook of pharmaceutical salts: properties, selection, and use. / Weinheim, New York: VHCA: Wiley-VCH - 2002.
6. Bajo R, Pusil S, López ME, Canuet L, Pereda E, Osipova D, et al. Scopolamine effects on functional brain connectivity: a pharmacological model of Alzheimer's disease // Sci Rep.- 2015 - 5.
7. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. д. м. н. А.Н. Миронова. - Часть первая. / М.: ГрифиК-2012. - 944 с.
8. Methods of behavior analysis in neuroscience / London, New York, Washington: CRC Press - 2001. - 329 c.
9. Methods of behavior analysis in neuroscience / London, New York, Washington: CRC Press - 2001. - 329 c.
10. R.D. Porsolt, M. LePichon, M. Oalfre Depression: A new animal model sensitive to antidepressant treatments // Nature. - 1977. - Vol.266. - P. 730-732.