СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБИОТИКАМ НА ОСНОВАНИИ ИЗМЕРЕНИЯ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФОСФОДИЭСТЕРАЗ, РАСЩЕПЛЯЮЩИХ ЦИКЛИЧЕСКИЙ ДИГУАНОЗИНМОНОФОСФАТ

Способ определения неспецифической устойчивости патогенных микроорганизмов к антибиотикам и факта присутствия бактериальных биопленок на основании измерения каталитической активности фосфодиэстераз, расщепляющих циклический дигуанозинмонофосфат, включающий:
1) формирование иммунных комплексов между фосфодиэстеразой-мишенью и биотинилированным антителом или иным аффинным лигандом, модифицированным биотином и специфичным к некаталитическим доменам фосфодиэстеразы;
2) аффинную очистку комплексов, сформированных фосфодиэстеразой-мишенью и биотинилированным антителом или иным аффинным лигандом, модифицированным биотином, при помощи парамагнитных частиц, содержащих нейтравидин или его аналоги, связывающие биотин;
/
3) взаимодействиекомплексов фосфодиэстеразабиотинилированноеантитело, иммобилизованных на парамагнитных частицах, с комплексами, содержащими с-di-GMP в форме G-квадруплексов с интеркалированным красителем, сопровождающееся падением интенсивности флуоресценции по мере разрушения комплексов интеркалирующего красителя c-di-GMP;
4) измерение падения флуоресценции при гидролизе c-di-GMP и разрушении комплекса c-di-GMP с интеркалирующим красителем с последующим количественным определением активности фосфодиэстеразы на основании калибровочных кривых, построенных с использованием известных количеств рекомбинантного фермента фосфодиэстеразы, идентичного исследуемой мишени.