ТЕТРАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АНКСИОЛИТИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ
TETRAPEPTIDE POSSESSING ANXIOLYTIC ACTION

Изобретение относится к медицине, в частности к новому фармакологически активному соединению.
Невротические расстройства в настоящее время являются одной из ведущих медико-социальных проблем. Их распространенность в популяции чрезвычайно высока - 10-20% всего населения в развитых странах, причем средний ежегодный показатель прироста в мире превышает 10%. Поэтому проблема эффективного лечения невротических расстройств выходит сегодня на одно из первых мест в медицине и фармакологии.
Одним из наиболее характерных клинических проявлений неврозов, а также психоэмоциональных расстройств в рамках психосоматики являются тревожные расстройства.
Тревожно-депрессивные расстройства являются наиболее распространенными (до 70%) формами депрессивных состояний непсихотического генеза, в наибольшей степени способствующими дезадаптации и десоциализации личности, а также весьма сложными в фармакотерапевтическом плане. Следует подчеркнуть, что лечение тревожных состояний требует применения специфической фармакотерапии вне зависимости от рамок конкретной нозологической формы. При тяжелых формах тревожных расстройств (генерализованном тревожном расстройстве (ГТР), посттравматическом стрессовом расстройстве, панических атаках, социальной фобии) в сочетании с выраженной депрессивной симптоматикой целесообразно применение антидепрессантных препаратов (преимущественно селективных ингибиторов обратного захвата серотонина (СИОЗС) - сертралина, пароксетина) или атипичных нейролептиков (сульпирида). В то же время при начальных стадиях развития тревожных состояний, в том числе в рамках неврозов, при тревожно-депрессивных расстройствах с преобладанием тревожной симптоматики, психосоматической патологии, старческой тревожности, климактерическом синдроме (то есть при наиболее многочисленных и социально значимых формах тревожных расстройств) основным патогенетически обоснованным инструментом фармакотерапии следует считать назначение соответствующего анксиолитика.
Выбор адекватного препарата для лечения тревожных и тревожно-депрессивных расстройств должен базироваться как на известных механизмах формирования синдрома тревоги, так и на фармакологических характеристиках тех или иных средств.
Патогенез тревожных расстройств достаточно сложен. По современным представлениям, развитие тревоги не является результатом дисфункции какой-либо одной нейромедиаторной системы, а отражает возникновение системного регуляторного дисбаланса различных нейромедиаторов на самых разных уровнях структурно-функциональной организации - от молекулярного до уровня целостного мозга. В связи с этим сегодня анксиолитики, или транквилизаторы, представляют собой одну из наиболее многочисленных групп нейро- и психотропных средств.
В патенте RU 2155065 1999 г. описан гептапептид Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, обладающий анксиолитическим действием.
Следует отметить, что в данном патенте не исследовался антиагрессивный компонент анксиолитического действия препарата.
В патенте RU 2206573 2003 г. описаны пептиды, общей формулы А-Б-В-Г-Pro-Gly-Pro-X, обладающие различными психотропными эффектами.
Главным направлением исследований в рядах соединений было обнаружение способности исследованных пептидов стимулировать когнитивные процессы (память и обучение). Фармакологическая активность всех пептидов изучалась при парентеральных путях введения (подкожном или внутрибрюшинном).
Задачей является создание пептида, обладающего анксиолитическим действием.
2
Поставленная задача решается тетрапептидом формулы Phe-P-Ala-Gly-Trp-NH, обладающим анксиолитическим действием.
Основываясь на том, что при взаимодействии с рецептором ключевую роль играют остатки двух ароматических аминокислот: триптофана (Тrр) и фенилаланина (Phe), определили, что фрагменты боковых радикалов этих аминокислот являются главными фармакофорными элементами. Для соединения вышеуказанных аминокислот был использован безрадикальный спейсер, состоящий из β-аланина (β-Аlа) и глицина (Gly). Такие фрагменты молекулы позволяют получить желаемую конформацию и повысить биологическую активность молекулы пептида.
Синтез целевого соединения
Синтез пептида был выполнен на твердой фазе с использованием пептидного синтезатора Applied Biosystems 433A, используя Fmoc-стратегию. Она основана на последовательном присоединении остатков аминокислот к нерастворимой полимерной подложке. Базовая лабильная группа Fmoc используется для защиты N-групп каждого аминокислотного остатка. Те остатки, которые имеют потенциально реактивные боковые цепи, защищены кислотонеустойчивыми группами, типа третбутила.
После удаления группы Fmoc пиперидином следующая защищенная аминокислота добавляется, используя или реактив сцепления, или предварительно активированную производную аминокислоты.
В качестве активатора первой аминокислоты в Fmoc-стратегии в реакции присоединения ее к смоле выступает дициклогексилкарбодиимид (DCC). Реакция протекает в присутствие 4-диметиламинопиридина (DCC/DMAP), который играет роль катализатора процесса. В результате образуется активированная аминокислота.
В качестве активатора второй и последующих аминокислот в Fmoc-стратегии выступает 1-гидроксибензотриазол в дициклогексилкарбодиимиде (HOBt/DCC). Реакция протекает согласно с образованием активированной аминокислоты и N,N'-дициклогексилмочевины (DCU).
Все вышеперечисленные операции протекают в пептидном синтезаторе.
Для снятия пептида со смолы в вытяжном шкафу в полипропиленовой пробирке готовили смесь со следующим соотношением компонентов: TAN -2,5%, TIPS - 2,5%, EDT - 5%, TFA - 90%. Приготовленную смесь помещали на лед до остывания на 20-30 мин. Затем в холодную смесь для снятия пептида помещали пептид-смолу и мягко перемешивали. Помещали пробирку с пептид-смолой в полипропиленовую пробирку, закрывали, и выдерживали на качалке в течение 4 часов.
Экстракция пептида со смолы проводилась на стеклянном фильтре-воронке в вытяжном шкафу. Воронка предварительно ополаскивалась дважды МТВЕ (метилтретбутиловый эфир). По окончании снятия сливали смесь со смолой и пептидом на фильтр Шотта. Промывали пробирку, в которой шла реакция TFA, смыв сливали на фильтр. Фильтровали при небольшом вакууме до осушения смолы. Добавляли холодный МТВЕ, тщательно промывали смолу и фильтровали до осушения. Промывали пробирку, в которой находилась пептид-смола, трижды холодным МТВЕ, и добавляли смыв к основному сливу. Тщательно перемешивали взвесь. Оставляли смесь приблизительно на 2 минуты. Затем отбирали 100 µл полученного раствора для анализа (температура хранения 4°С до проведения анализа). Оставшуюся смесь оставляли не менее, чем на 1 час при -20°С. Центрифугировали смесь при 1500 g 6 мин, отделяли супернатант. К осадку добавляли МТВЕ, растирали шпателем и замораживали на 2 часа. Операцию замораживания - оттаивания повторяли дважды.
Сублимационную сушку пептида осуществляли из 0,01 М фосфатно-солевой буфера, после растворения полученного после экстракции осадка.
Очистку проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Условия ВЭЖХ: колонка Waters DeltaPak, C18, 5 µм, 100 Å, 3,9×150 мм. Могут использоваться другие обращеннофазные колонки C18 или С8.
а. Детекторная ячейка: аналитическая
b. Скорость потока - 1.0 мл/мин.
с. Длина волны: 214 нм
d. Диапазон детектирования: 0,5 AUFS.
е. Величина петли: 100 µл (петля заполняется 150 [±10] µл образца, то есть объем впрыска=100 µл)
f. Элюент А: 5.0% ацетонитрила, 0.1% трифторуксусной кислоты, в воде.
g. Элюент В: 60% ацетонитрила, 0.085% трифторуксусной кислоты, в воде.
h. Градиент: 0-60% В в течение 60 мин.
Анализ структуры и чистоты пептидов проводили методом жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором на аналитической колонке путем измерения времени удерживания для главного пика, которое затем сравнивалось с расчетным. Проба пептида растворялась в смеси ацетонитрил:тетрагидрофуран:вода в соотношении 40:40:20 и анализировалась методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием.
1
2
Для того чтобы вычесть фон, первые / минуты снимали хроматограмму холостого растворителя (1% АсОН в воде) в положительных ионах, вторые полминуты - в отрицательных ионах. Далее вводили раствор пептида без остановки сканирования.
Масс спектр пептида получали прямым вводом с электроионизацией в режиме снятия положительных ионов.
Полученные данные ВЭЖХ и масс-спектрометрического анализа подтверждают структуру полученного соединения.
Фармакологическое действие
Анксиолитическое действие изучали в тесте «драка животных». Исследования проводились на белых беспородных мышах-самцах, массой 20-25 г. Животных делили на три группы по 20 животных в каждой. Поведение мышей на электродном полу изучали по изменению порогов агрессивной реакции. Пороги определяли при раздражении пары мышей постепенно увеличивающимся по силе прерывистым электротоком, подаваемым на электродный пол камеры [Т.А.Воронина, С.Б.Середенин. Методические указания по изучению анксиолитического действия фармакологических веществ // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общ. ред. Р.У.Хабриева. М.: Медицина, 2005, С.253-263].
С этой целью мышей парами помещали на электродный пол стандартной камеры из плексигласа размерами 15×15×30 см. Животным давали привыкать к камере в течение 5 мин, затем на пол подавали переменный ток постепенно увеличивавшейся амплитуды. Ток подавали периодами по 3 с, разделенными паузами продолжительностью 1 с. Начинали стимуляцию с напряжения 2 В. Если после трех предъявлений тока одной и той же интенсивности реакция агрессии не возникала, напряжение увеличивали на 1 В и продолжали стимуляцию до возникновения реакции агрессии. Реакцию агрессии считали достоверной в том случае, если при одном и том же уровне напряжения возникали не менее трех эпизодов «драки» животных (подъем мышей на задние лапы друг перед другом, голосовая реакция взаимные укусы и удары передними лапами).
При возникновении реакции агрессии фиксировали напряжение тока, вызывающего «драку».
2
Затем животным интраназально вводили лекарственные вещества. С этой целью в каждый носовой ход инсталлировали по 1 капле (50 мкл) водного раствора лекарственного вещества или изотонического раствора хлорида натрия. При этом животные делились на три группы. 1 группа (отрицательный контроль) получала изотонический раствор хлорида натрия. 2 группа (положительный контроль) получала интраназально 1% водный раствор препарата «Семакс» (пр-во «Пептоген», Россия). 3 группа (опыт) получала интраназально 1% водный раствор тетрапептида Phe-β-Ala-Gly-Trp-NH. Доза «Семакса» и оригинального пептида при таком способе введения составляла 5 мг/кг массы животного.
Через 60 минут после интраназального введения препаратов животных повторно парами помещали в камеру и регистрировали напряжение электрического тока, вызывающего агрессивную реакцию. Об анксиолитическом (антиагрессивном) действии препарата судили по увеличению напряжения электротока, вызывающего «драку» животных.
Результаты опытов представлены на чертеже.
По оси абсцисс указана сила тока в вольтах, при которой происходила драка. Первые слева направо два соединенных столбика - 1 группа; вторые два соединенных столбика - 2 группа; третьи два соединенных столбика - 3 группа. Левый столбик из двух соединенных показывает силу тока, при которой происходит драка, до введения препаратов, правый показывает силу тока, при которой происходит драка, после введения препаратов.
Представленные на чертеже данные показывают, что в группе отрицательного контроля наблюдается сенсибилизация животных к электрической стимуляции. При повторном электроболевом раздражении реакция агрессии возникает при более низких значениях электрического тока. В то же время в группах животных, получавших «Семакс» и оригинальный пептид, наблюдается повышение порога электротока, вызывающего агрессивную реакцию. Это свидетельствует об анксиолитическом (антиагрессивном) действии предлагаемого тетрапептида на уровне известного препарата «Семакса». А также о том, что пептид эффективен при интраназальном применении.