Иммунофлуоресцентный анализ экспрессии бета-iii тубулина в опухолевой и окружающей нормальной ткани пациентов с немелкоклеточным раком легкого

Оригинальные статьи

ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ БЕТА-Ш ТУБУЛИНА В ОПУХОЛЕВОЙ И ОКРУЖАЮЩЕЙ НОРМАЛЬНОЙ ТКАНИ ПАЦИЕНТОВ С НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНЫМ РАКОМ ЛЕГКОГО

Введение. Бета-Штубулин (ТиВВЗ) — одна из 8 изоформ белка микротрубочек бета-тубулина, экспрессирующаяся в организме взрослого человека исключительно в нейронах и клетках Сертоли. В то же время экспрессия ТиВВЗ выявляется в клетках солидных опухолей, в частности немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), где его экспрессию обычно связывают с неблагоприятным прогнозом и устойчивостью к терапии препаратами платины и таксанами.

Цель исследования — проверка выдвинутой нами гипотезы, что ТиВВЗ может экспрессироваться не только в первичном опухолевом узле, но и за его пределами. Исследовано 60 хирургических биопсийных образцов немелкоклеточного рака легкого и морфологически нормальной окружающей ткани 30пациентов, оперированных в ФГБУ «РОНЦим. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Материалы и методы. Образцы переводили в одноклеточную суспензию, фильтровали, фиксировали в 4 % растворе формальдегида, окрашивали моноклональными антителами к ТиВВЗ и анализировали методом проточной цитофлуориметрии, разработанным в лаборатории медицинской химии НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина и запатентованным.

Результаты. Экспрессия ТиВВЗ в группе образцов НМРЛ была выше, чем в группе образцов морфологически нормальной ткани. Тем не менее в подавляющем большинстве образцов морфологически нормальной ткани (25 из З0) ТиВВЗ экспресси-ровался, достигая значения в З9 % окрашенных клеток.

Выводы. В целом, полученные данные свидетельствуют о принципиальной возможности присутствия ТиВВЗ-позитивных клеток за пределами первичной опухоли - в ткани, визуально не вовлеченной в опухолевый процесс.

Ключевые слова: немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), нормальная ткань легкого, бета-Ш тубулин (ТиВВЗ), проточная цитофлуориметрия

DOI: 10.17650/1726-9784-2016-15-2-16-18

IMMUNOFLUORESCENT ANALYSES OF TUMOR MARKER BETA-III TUBUILIN EXPRESSION IN TUMOR AND AJACENT NORMAL LUNG TISSUE DERIVED FROM PATIENTS WITH NON-SMALL CELL LUNG CANCER

I.A. Mamichev, T.A. Bogush, E.A. Dudko, O.M. Ryabinina, A.N. Grishanina, V.E. Kirsanov, B.E. Polotsky, M.M. Davydov

N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Ministry of Health of Russia; 24 Kashyrskoe shosse, Moscow, 115478, Russia

Background. Class III beta-tubulin (TUBB3) is one of the eight beta tubulin isotypes identified in human. It is constitutively expressed in brain and testis but not in lung tissue. TUBB3 is also known to appear in solid tumors, in particular in non-small cell lung cancer (NSCLC), and it is often associated with poor prognosis and resistance to taxanes and Vinka alkaloids.

Objective: We have suggested that TUBB3 expression may cover not only the primary tumor but also a wide adjacent area of morphologically normal lung tissue. To check the hypothesis we have measured TUBB3 expression both in the non-small cell lung carcinoma (NSCLC) and remote lung tissue derived from the same lung. 60surgical biopsy specimens of NSCLC and morphologically normal lung tissue of 30patients were investigated. Materials and methods. Biopsy specimens were converted to suspension, fixed in 4 % formaldehyde and analyzed by flow cytometry using monoclonal antibodies to TUBB3. The method was developed in the laboratory of medicinal chemistry research Institute of experimental diagnostics and therapy of tumors (N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center) and patented.

Results. Fraction of TUBB3-positive cells in the group of adjacent lung tissue specimens was lower compared to NSCLC group but still positive in the majority of adjacent lung tissue specimens (25 of 30) and achieved up to 39 % of cells.

Conclusion. We suggest that TUBB3 expression in adjacent morphologically normal lung tissue indicates presence of transformed and potentially malignant cells far from the primary site.

Key words: non-small cell lung carcinoma (NSCLC), normal lung tissue, class IIIbeta-tubulin (TUBB3), flow cytometry

И.А. Мамичев, Т.А. Богуш, Е.А. Дудко, О.М. Рябинина, А.Н. Гришанина, В.Ю. Кирсанов, Б.Е. Полоцкий, М.М. Давыдов

ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478, Москва, Каширское шоссе, 24

Контакты: Мамичев Иван Андреевич labmedchem@mail.ru

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BIOTHERAPY

2'2016 ТОМ 15 | VOL.15

Оригинальные статьи 17

Введение

Микротрубочки — важнейший компонент эука-риотической клетки, обеспечивающий ее архитектонику, локомоцию, пролиферацию, расхождение хромосом в митозе и мейозе, транспорт органоидов. На ультраструктурном уровне каждая микротрубочка представляет собой свернутый лист, состоящий из повторяющихся гетеродимеров белков альфа- и бета-тубулинов [1]. У человека насчитывается 8 изоформ белка бета-тубулина, которые кодируются разными генами с тканеспецифичной экспрессией [2].

В клиническом контексте активно изучается бета-111 тубулин (ТиВВЗ) — потенциальный прогностический маркер агрессивности заболевания и пре-диктивный маркер устойчивости к таксанам [3]. Экспрессия ТИВВЗ, как показывают многочисленные исследования на культурах опухолевых клеток, связана с развитием агрессивного клеточного фенотипа, устойчивого к таксанам [4], оксидативному стрессу [5, 6] и анойкису [7]. В норме белок экспрес-сируется только в нейронах и клетках Сертоли, но выявляется и в ткани солидных опухолей разной локализации, в том числе в ткани немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), что дает надежду на использование данного маркера в качестве дифференци-ровочного, позволяющего отличить опухолевую ткань от здоровой.

Мы предположили, что в случае выявления ТИВВЗ в нормальной ткани, окружающей первичный опухолевый очаг, белок может быть также маркером локальной распространенности опухолевого процесса и, таким образом, маркером агрессивности течения болезни. Справедливость этого предположения проверена на примере НМРЛ при сравнительной количественной оценке экспрессии ТИВВЗ в опухолевой и морфологически нормальной ткани органа.

Материалы и методы

Исследовано 60 хирургических биопсийных образцов НМРЛ и морфологически нормальной окружающей ткани органа, взятых у 30 пациентов, оперированных в ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» Минздрава России. Образцы тщательно измельчали, инкубировали в растворе Версена при 37 °С в течение 30 мин, гомогенизировали и пропускали через фильтры диаметром 40 мкм. Полученную клеточную суспензию центрифугировали, осадок ресуспензи-ровали в фосфатном буферном растворе (pH = 7,4) и фиксировали в 4 % растворе формальдегида. Суспензионные образцы инкубировали с первичными (ab7751) антителами в течение ночи и затем 1,5 ч с вторичными (ab98729) антителами, конъюгирован-ными с DyLight650. Полученную суспензию анализировали на проточном цитофлуориметре Navios (производитель «Beckman Coulter», США). Методика, разработанная и запатентованная в лаборатории медицинской химии НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н. Н. Бло-хина, неоднократно использовалась для выявления экспрессии различных белковых маркеров [8].

Уровень экспрессии TUBB3 определяли как количество специфически флуоресцирующих клеток относительно общего количества клеток, включенных в анализ, вычисленное в программе FlowJo 10.0 с использованием статистического критерия Колмогорова—Смирнова. Пороговое значение уровня экспрессии маркера — 5 % и менее специфически флуоресцирующих клеток.

Статистический анализ проведен с использованием пакета прикладных программ STATISTICA фирмы StatSoft (США) версии 6.0. Анализ соответствия распределения уровня экспрессии TUBB3 параметрам нормального распределения проведен

7 6

>s

S

i 5 с;

ю 4 го ^ i

0

н 3

и ф

у

1 2 о

1 0

б

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70

ожидаемая кривая нормального распределения

значения экспрессии, принятые за нулевые

Доля клеток, экспрессирующих Т11ВВ3, %

Гистограммы распределения экспрессии ТиББШ в ткани немелкоклеточного рака легкого (а) и морфологически нормальной ткани легкого (б).

а

2'2016 ТОМ 15 | VOL.15

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BIOTHERAPY

1B

Оригинальные статьи

с помощью критерия Шапиро—Уилка. Для оценки различий между попарно сравниваемыми группами по доле специфически флуоресцирующих клеток использован непараметрический W-критерий Вилкок-сона для связанных групп. За пороговый уровень значимости принимали величинуp < 0,05.

Результаты

Экспрессия TUBB3 зарегистрирована в 100 % исследованных образцов НМРЛ. При этом отмечена значительная гетерогенность количественных показателей уровня экспрессии маркера в опухоли у разных пациентов — от 6 до 62 % клеток, экспрессирую-щих TUBB3. Данные, представленные на рисунке (а), показывают, что распределение значений признака соответствует нормальному (p = 0,662 по критерию Шапиро—Уилка). Средний уровень экспрессии составляет 32,3 ± 15,4 %, медиана — 33,5 % клеток, экс-прессирующих TUBB3.

Среди образцов морфологически нормальной ткани легкого, окружающей первичный опухолевый узел, экспрессия TUBB3 зарегистрирована в 83 % случаев (25 из 30 исследованных образцов). Показатель уровня экспрессии маркера варьирует от 4 до 39 % специфически флуоресцирующих клеток. Гистограмма распределения значений признака среди исследованных образцов ткани, представленная на рисунке (б), демонстрирует, что распределение соответствует нормальному (p = 0,564 по критерию Шапиро—Уилка ). Средний уровень экспрессии TUBB3 составляет 17,7 ± 10,2 %, медиана — 17,5 % клеток, экспрессирующих TUBB3.

Таким образом, в нормальной ткани легкого, окружающей очаг немелкоклеточного рака, выявляется опухолевый маркер TUBB3, но его экспрессия слабее, чем в опухоли, что подтверждается попарным сравне-

нием уровня экспрессии маркера в этих группах с использованием статистического критерия Вилкоксона (р < 0,05). Средний уровень экспрессии ТиВВЗ в опухоли практически в 2 раза превышает этот показатель в окружающей нормальной ткани легкого (32,3 % vs 17,7 % клеток, экспрессирующих маркер).

Заключение

Так как экспрессия ТИВВЗ в норме нехарактерна для клеток, образующих паренхиму легкого, то полученные данные свидетельствуют о принципиальной возможности присутствия малигнизированных клеток за пределами первичной опухоли — в ткани, визуально не вовлеченной в опухолевый процесс. Это может быть как следствием «расселения» опухолевых клеток из первичного очага в окружающую нормальную ткань органа, так и свидетельством наличия в нормальной ткани легкого фокусов трансформированных клеток — возможных предшественников опухолевого узла.

Независимо от причин описанного феномена гетерогенность экспрессии ТИВВЗ за пределами первичной опухоли указывает на информативность количественной оценки маркера для молекулярной диагностики локальной распространенности заболевания, что подтверждает правомочность сформулированной авторами гипотезы. Более того, исследование ТИВВЗ может стать важным молекулярным дополнением к морфологическому исследованию лимфатических узлов при стадировании опухолевого процесса.

И, наконец, полученные данные являются молекулярным подтверждением обоснованности радикализма хирургического вмешательства по поводу НМРЛ даже на начальных стадиях заболевания.

Исследование выполнено при поддержке РФФИ(№15-04-06991-а, 16-З4-01049-мол-а) и гранта Президента РФ МК-7709.2016.7.

ЛИТЕРАТУРА I REFERENCES

1. Nogales E. Structural insights into microtu-bule function. Annu Rev Biochem 2000;69:277-302. PMID:10966460.

2. Leandro-García L.J., Leskelä S., Landa I. et al. Tumoral and tissue-specific expression of the major human beta-tubulin isotypes. Cy-toskeleton (Hoboken) 2010;67(4):214-23. doi: 10.1002/cm.20436. PMID: 20191564.

3. Jakobsen J.N., Santoni-Rugiu E., S0rensen J.B. Use of TUBBIII for patient stratification and prognosis in lung cancer. Lung Cancer Management 2015;4(2): 97-110. doi:10.2217/lmt.15.6.

4. Derry W.B., Wilson L., Khan I.A. et al. Taxol differentially modulates the dynamics

of microtubules assembled from unfraction-ated and purified beta-tubulin isotypes. Biochemistry 1997;36(12):3554-62. PMID: 9132006.

5. Carré M., André N., Carles G. et al. Tubu-lin is an inherent component of mitochondri-al membranes that interacts with the voltage-dependent anion channel. J Biol Chem 2002; 13;277(37):33664-9. Epub 2002 Jun 26. PMID: 12087096.

6. Luduena R.F. A Hypothesis

on the Origin and Evolution of Tubulin. Int Rev Cell Mol Biol 2013;302:41-185. doi: 10.1016/B978-0-12-407699-0.00002-9. PMID: 23351710.

7. McCarroll J.A., Gan P.P., Erlich R.B. et al. TUBB3/ßIII-tubulin acts through the PTEN/ AKT signaling axis to promote tumorigenesis and anoikis resistance in non-small cell lung cancer. Cancer Res 2015;75(2):415-25. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-2740. Epub 2014 Nov 20. PMID: 25414139.

8. Богуш Т.А., Шатурова А.С., Дудко Е.А. и др. Количественная иммунофлуо-ресцентная оценка с использованием проточной цитофлуориметрии экспрессии эстрогеновых рецепторов ß в солидных опухолях человека. Вестник московского университета, cер. 2. Химия 2011;52(4): 305-12.

РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ I RUSSIAN JOURNAL OF BIOTHERAPY

2'2016 ТОМ 15 I VOL.15