СПОСОБ ТЕРАПИИ ЯЗВЕННОГО КОЛИТА И БОЛЕЗНИ КРОНА
METHOD OF ULCERATIVE COLITIS AND CROHN'S DISEASE THERAPY

Изобретение относится к медицине и может быть применено при лечении язвенного колита и болезни Крона.
Известен способ терапии воспалительных заболеваний кишечника преднизолоном (1 - P.Korrea et al. J.Natl. Cancer Inst. 2000, 92, 1881-1888). Способ принят в качестве аналога.
Известен способ терапии воспалительных заболеваний кишечника, заключающийся в том, что при резистентной к стероидам болезни Крона назначают метотрексат, что позволяет снизить дозу преднизолона, в 78% случаев не снижая эффективности терапии. Данный способ принят за прототип (2 - R.Y.Chang et al. Aliment. Pharmacol. Ther. 2001, 15; 35-44).
Однако способ-прототип может привести к развитию побочных эффектов, в частности язв и желудочно-кишечных кровотечений, гингивитов, фарингитов, стоматитов.
Целью настоящего изобретения является повышение эффективности терапии язвенного колита и болезни Крона.
Технический результат достигается тем, что предварительно проводят пероральный прием пробиотика бифиформа в дозе 2-3 капсулы, с последующим 4-5-кратным введением в слизистую оболочку измененных участков кишки мезенхимальных стволовых клеток в количестве 150-200 млн клеток в объеме 0,5 до 1,5 мл раствора, с последующим пероральным приемом пробиотика бифиформа в дозе 1 капсулы 3 раза в день в течение 3 недель.
Способ реализуется следующим образом.
У больных с язвенным колитом и болезнью Крона выясняют наличие температурной реакции, схваткообразных болей в правой и левой половине живота, примеси крови в стуле в виде отдельных мазков и сгустков, учащение стула до 5-20 раз в сутки, снижение аппетита. В клиническом анализе крови отмечается выраженная анемия со снижением гемоглобина до 40-60 ед, увеличение СОЭ до 35-60 мм/ч, умеренная диспротеинемия, С-реактивный белок - 20-58 мкм/л.
При эндоскопическом исследовании находят гиперемию, отек и зернистость слизистой оболочки толстой кишки, оценивают состояние сосудистого рисунка, ранимость слизистой оболочки, а также наличие повреждений слизистой оболочки - фибрин, гной, эрозии, трещины и небольшие поверхностные язвы.
При рентгенологическом исследовании больных с язвенным колитом обнаруживают деформацию гаустр, зазубренность контуров; в некоторых случаях - уменьшение просвета и укорочение толстой кишки со сглаженностью ее физиологических изгибов.
У больных с болезнью Крона при глубокой эндоскопии слизистая оболочка отечна, гиперемирована, с неровными выбуханиями. У одних больных язвы отсутствуют, у других - обнаруживаются глубокие язвы с подрытыми краями. Характерна асимметричность поражения с вовлечением в процесс стенки кишки.
Рентгенологически отмечается одновременное поражение подвздошной и толстой кишки. Пораженные сегменты выглядят суженными и ригидными.
При иммунологическом исследовании сыворотки крови у больных неспецифическим язвенным колитом и болезнью Крона выявляют сниженное содержание в сыворотке крови ИЛ-1β, иммуноглобулинов IgM, IgG и IgA, относительно высокий уровень аутоантител к нейтрофилам и париетальным клеткам.
При электрофизиологическом исследовании восходящего отдела толстой кишки выявляют сравнительно высокий уровень электромоторной активности - частота медленных волн электромоторной активности восходящего отдела толстой кишки 16-22 в мин, амплитуда - 0,26-0,36 мВ; частота медленных волн электромоторной активности нисходящего отдела толстой кишки 14-20 в мин, амплитуда - 0,24-0,34 мВ.
Проводят морфологическое исследование, при котором отмечают уменьшение количества бокаловидных клеток, увеличение глубины крипт, скопление лейкоцитов в просвете крипт, увеличение количества межэпителиальных лимфоцитов и усиление диффузной лимфо-плазмоцитарной инфильтрации собственной пластинки; в отдельных случаях наблюдались крипт-абсцессы, дистрофия эпителия.
2
6
7
2
2
8
I0W
v
+/
Предварительно получали и размножали мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в необходимом для системной трансплантации количестве (150-200 млн клеток) в соответствии с разрешением Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития МЗиСР РФ (лицензия ФС-2006/206). Клетки костного мозга (0,5-1 мл) получали путем пункции грудины или гребня подвздошной кости донора под местной анестезией в строго стерильных условиях, которые соблюдали в процессе всей дальнейшей работы с клетками в культуральном боксе. После отстаивания эритроцитов в течение 1-2 часов при комнатой температуре супернатант из суспензии костномозговых клеток отсасывали пастеровской пипеткой, выделенные клетки переносили в среду 199. Полученную суспензию клеток центрифугировали при 1000 об/мин Е в течение 10 мин для получения осадка, который ресуспендировали в ростовой среде. Использовали ростовую среду RPMI-1640, содержащую пенициллин (100 ЕД/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин (2 мМ) и 20% эмбриональной бычьей сыворотки. Культивирование проводили в пластиковых флаконах Карреля с площадью дна 25 см, в которые вносили 5×10-10 клеток костного мозга в 8 мл ростовой среды. Флаконы продували газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещали в термостат на 37°С. Продувание флаконов такой газовой смесью проводили каждый раз, когда меняли среду или пересевали клетки в новые культуральные флаконы. При достижении сливного (конфлюентного) монослоя клетки пересевали с использованием 0,25% раствора трипсина в новые флаконы, вначале с той же площадью дна (25 см), а впоследствии - при нарастании клеточной массы - с площадью дна 175 см. Такой метод культивирования позволял к концу 5-6-й недели добиться получения популяции мезенхимальных стволовых клеток пациента в количестве (1,5-2)×10 клеток, необходимой для трансплантации в организм донора исходного костного мозга. Дополнительно проведенными исследованиями было показано, что полученные в условиях примененного в нашей работе способа культивирования клетки человека во всех исследованных случаях имели фенотип CD10/CD34/CD45CD105c-kit-, что характерно для клеток, относимых в настоящее время к МСК. В выполненных на лабораторных животных опытах была показана безопасность применения полученных таким способом культур МСК в отношении мутагенного, тератогенного и канцерогенного эффектов. Перед внутривенным введением больным клеток из полученных выращиванием в культуре популяций делался посев для контроля возможного бактериального загрязнения (его не было выявлено ни в одном случае).
До начала проведения эндоскопического исследования больному назначали пробиотик бифиформ в дозе 2-3 капсулы в сутки при пероральном приеме.
Затем готовили раствор культуры МСК и проводили эндоскопическое исследование. Полученную культуру МСК (150-200 млн) растворяли в 0,5-1,5 мл стерильного физиологического раствора, содержащего гепарин в концентрации 10 ед/мл, и проводили обкалывание инъектором, проведенным через инструментальный канал эндоскопа, измененных участков слизистой в 4-5 точках равными объемами МСК, причем объем каждого введения составил 0,1-0,3 мл. Затем проводят пероральный прием пробиотика бифиформа в дозе 1 капсулы 3 раза в день в течение 3 недель.
Проведенное лечение показало, что наблюдается увеличение уровня ИЛ-1β на 30-42% и более, IgM - до 2,18 г/л; IgG - до 14,8 г/л, IgA - до 2,84 г/л; отмечалось снижение уровня аутоантител к нейтрофилам до 28 Е/мл и к париетальным клеткам - до 32 Е/мл; и регистрировалось уменьшение частоты медленных волн электромоторной активности восходящего отдела толстой кишки - до 15 в мин, амплитуды - до 0,2 мВ.
При эндоскопическом исследовании складки нормальной высоты. Слизистая розовая, гладкая, блестящая. Сосудистый рисунок усилен, перестроен. Контактная кровоточивость отсутствует.
При гистологическом исследовании биоптата определялась резкая активизация пролиферативных процессов, что приводило к гиперплазии эпителия и усиливало образование мелких и крупных фолликулов в слизистой оболочке и подслизистом слое, увеличивалось количество бокаловидных клеток в эпителии слизистой оболочки толстой кишки по сравнению с исходным уровнем, структура кишечных крипт приближалась к нормальной, что свидетельствует об эффективности проведенного лечения болезни Крона и язвенного колита.
Способ реализации далее поясняется следующими примерами.
Пример 1
Больной К., 28 лет, поступил с диагнозом язвенный колит, дистальная форма. При поступлении отмечается наличие схваткообразных болей в левой половине живота, примеси крови в стуле в виде сгустков, учащение стула до 12 раз в сутки, снижение аппетита и повышение температуры до 37,5°С. В клиническом анализе крови отмечается снижение гемоглобина до 64 ед, увеличение СОЭ до 38 мм/ч, умеренная диспротеинемия, С-реактивный белок - 22 мкм/л (норма 12 мкм/л).
При колоноскопии находят гиперемию и отек слизистой оболочки дистальных отделов толстой кишки, слизистая оболочка ранима, контактно кровоточит, определяются поверхностные язвы, покрытые фибрином.
При рентгенологическом исследовании больного обнаруживают деформацию гаустр, зазубренность контуров со сглаженностью физиологических изгибов дистальных отделов кишки.
При иммунологическом исследовании сыворотки крови у больного выявляют сниженный уровень интерлейкинов ИЛ-1β, уровень IgM составляет 1,8 г/л, IgG - 12,3 г/л, IgA - 1,38 г/л, уровень аутоантител к нейтрофилам - 38 Е/мл, уровень антител к париетальным клеткам - 36 Е/мл.
2
Регистрацию сокращений и биоэлектрической активности гладких мышц желудочно-кишечного тракта проводили с помощью накожных электродов, помещенных в область проекции восходящего отдела толстой кишки на переднюю брюшную стенку. Серебряные электроды для регистрации электромоторной активности (ЭМА) имели контактную поверхность площадью 0,5-0,6 см. Регистрацию проводили в течение 30 минут в условиях предусиления и с использованием аппаратурно-программного комплекса Conan-М с полосой пропускания от 0,01 - до 10 кГц и уровнем шумов менее 1-5 мкВ. Регистрировали амплитудно-частотные показатели медленных волн.
При электрофизиологическом исследовании нисходящего отдела толстой кишки выявляют сравнительно высокий уровень электромоторной активности - частота медленных волн электромоторной активности нисходящего отдела толстой кишки 14 в мин, амплитуда - 0,24 мВ.
Проводят морфологическое исследование, при котором отмечают наличие трещин слизистой, уменьшение количества бокаловидных клеток, увеличение глубины крипт, скопление лейкоцитов в просвете крипт, увеличение количества межэпителиальных лимфоцитов и усиление диффузной лимфо-плазмоцитарной инфильтрации собственной пластинки, дистрофия эпителия.
2
6
2
2
8
I0W
v
+/
Предварительно получали и размножали мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в необходимом для системной трансплантации количестве (150 млн клеток) в соответствии с разрешением Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития МЗиСР РФ (лицензия ФС-2006/206). Клетки костного мозга (0,5 мл) получали путем пункции грудины донора под местной анестезией в строго стерильных условиях, которые соблюдали в процессе всей дальнейшей работы с клетками в культуральном боксе. После отстаивания эритроцитов в течение 1 часа при комнатой температуре супернатант из суспензии костномозговых клеток отсасывали пастеровской пипеткой, выделенные клетки переносили в среду 199. Полученную суспензию клеток центрифугировали при 1000 об/мин Е в течение 10 мин для получения осадка, который ресуспендировали в ростовой среде. Использовали ростовую среду RPMI-1640, содержащую пенициллин (100 ЕД/мл), амфотерицин (100 нг/мл), L-глютамин (2 мМ) и 20% эмбриональной бычьей сыворотки. Культивирование проводили в пластиковых флаконах Карреля с площадью дна 25 см, в которые вносили 5×10 клеток костного мозга в 8 мл ростовой среды. Флаконы продували газовой смесью, содержащей 5% углекислого газа и 95% воздуха, и помещали в термостат на 37°С. Продувание флаконов такой газовой смесью проводили каждый раз, когда меняли среду или пересевали клетки в новые культуральные флаконы. При достижении сливного (конфлюентного) монослоя клетки пересевали с использованием 0,25% раствора трипсина в новые флаконы, вначале с той же площадью дна (25 см), а впоследствии - при нарастании клеточной массы - с площадью дна 175 см. Такой метод культивирования позволял к концу 5-й недели добиться получения популяции мезенхимальных стволовых клеток пациента в количестве 1,5×10клеток, необходимой для трансплантации в организм донора исходного костного мозга. Дополнительно проведенными исследованиями было показано, что полученные в условиях примененного в нашей работе способа культивирования клетки человека во всех исследованных случаях имели фенотип CD10/CD34/CD45CD105c-kit-, что характерно для клеток, относимых в настоящее время к МСК. В выполненных на лабораторных животных опытах была показана безопасность применения полученных таким способом культур МСК в отношении мутагенного, тератогенного и канцерогенного эффектов. Перед внутривенным введением больному клеток из полученных выращиванием в культуре популяций делался посев для контроля возможного бактериального загрязнения.
До начала проведения эндоскопического исследования больному назначали пробиотик бифиформ в дозе 2 капсулы в сутки при пероральном приеме. Затем готовили раствор лекарственного средства (культура МСК) и проводили эндоскопическое исследование.
Полученную культуру МСК (150 млн) растворяли в 0,5 мл стерильного физиологического раствора, содержащего гепарин в концентрации 10 ед/мл, и проводили обкалывание инъектором, проведенным через инструментальный канал эндоскопа, измененных участков слизистой в 4 точках равными объемами МСК, причем объем каждого введения составил 0,125 мл. Затем проводят пероральный прием пробиотика бифиформа в дозе 1 капсулы 3 раза в день в течение 3 недель.
Проведенное лечение показало, что наблюдается увеличение уровня ИЛ-1β на 43%, IgM - до 2,16 г/л; IgG - до 15,2 г/л, IgA - до 2,64 г/л; отмечалось снижение уровня аутоантител к нейтрофилам до 26 Е/мл и к париетальным клеткам - до 30 Е/мл; и регистрировалось уменьшение частоты медленных волн электромоторной активности восходящего отдела толстой кишки - до 12 в мин, амплитуды - до 0,18 мВ.
При повторном эндоскопическом исследовании слизистая розовая, гладкая, блестящая. Сосудистый рисунок усилен, перестроен. Контактная кровоточивость отсутствует.
При повторном гистологическом исследовании биоптата определялась резкая активизация пролиферативных процессов, усиленное образование мелких и крупных фолликулов в слизистой оболочке и подслизистом слое, увеличивалось количество бокаловидных клеток в эпителии слизистой оболочки толстой кишки по сравнению с исходным уровнем, глубина кишечных крипт уменьшилась, что позволяет считать лечение язвенного колита эффективным.
Пример 2
Больной З., 18 лет, с болезнью Крона поступил с жалобами на схваткообразные боли в правой половине живота; примесь крови в стуле в виде отдельных мазков, учащение стула до 6 раз в сутки, снижение аппетита, повышение температуры до 38,5°С. В клиническом анализе крови отмечается выраженная анемия со снижением гемоглобина до 50 ед, увеличение СОЭ до 45 мм/ч, умеренная диспротеинемия, С-реактивный белок - до 38 мкм/л.
У больного при глубокой эндоскопии слизистая оболочка отечна, гиперемирована, с неровными выбуханиями, с глубокими язвами с подрытыми краями. Характерна асимметричность поражения с вовлечением в процесс стенки кишки.
Рентгенологически отмечается одновременное поражение подвздошной и восходящего отдела толстой кишки. Пораженные сегменты выглядят суженными и ригидными.
При иммунологическом исследовании сыворотки крови у больного выявляют снижение содержания в сыворотке крови ИЛ-1β, иммуноглобулинов IgM, IgG и IgA, относительно высокий уровень аутоантител к нейтрофилам и париетальным клеткам. Так, уровень IgM составляет 1,5 г/л, IgG - 11,0 г/л, IgA - 1,42 г/л, уровень аутоантител к нейтрофилам - 44 Е/мл, уровень антител к париетальным клеткам - 43 Е/мл.
При электрофизиологическом исследовании восходящего отдела толстой кишки выявляют сравнительно высокий уровень электромоторной активности - частота медленных волн электромоторной активности восходящего отдела толстой кишки 22 в мин, амплитуда - 0,36 мВ.
Проводят морфологическое исследование, при котором отмечают уменьшение количества бокаловидных клеток, увеличение глубины крипт, увеличение количества межэпителиальных лимфоцитов и усиление диффузной лимфо-плазмоцитарной инфильтрации собственной пластинки; наблюдались крипт-абсцессы, дистрофия и некроз эпителия.
До начала проведения эндоскопического исследования больному назначали пробиотик бифиформ в дозе 3 капсулы в сутки.
Затем готовили раствор лекарственного средства (культура МСК) и проводили эндоскопическое исследование. Полученную культуру МСК (200 млн) растворяли в 1,5 мл стерильного физиологического раствора, содержащего гепарин в концентрации 10 ед/мл, и проводили обкалывание инъектором, проведенным через инструментальный канал эндоскопа, измененных участков слизистой в 5 точках равными объемами МСК, причем объем каждого введения составил 0,3 мл. Затем проводят пероральный прием пробиотика бифиформа в дозе 1 капсулы 3 раза в день в течение 3 недель.
Проведенное лечение показало, что наблюдается увеличение уровня ИЛ-1β на 35%, IgM - до 1,98 г/л; IgG - до 12,0 г/л, IgA - до 2,5 г/л; отмечалось снижение уровня аутоантител к нейтрофилам до 28 Е/мл и к париетальным клеткам - до 32 Е/мл; и регистрировалось уменьшение частоты медленных волн электромоторной активности восходящего отдела толстой кишки - до 12 в мин, амплитуды - до 0,18 мВ.
При эндоскопическом исследовании контактная кровоточивость отсутствует, дефектов слизистой не обнаружено. Сосудистый рисунок усилен, перестроен.
Морфологическое исследование: гиперплазия эпителия, увеличение количества бокаловидных клеток в эпителии слизистой оболочки толстой кишки по сравнению с исходным уровнем, уменьшение глубины кишечных крипт и снижение лимфоцитарной инфильтрации слизистой. Полученные результаты позволяют считать лечение болезни Крона эффективным.
Контроль за результатами лечения вели по динамике клинических проявлений заболевания, основываясь на индексах клинической активности болезни Крона и язвенного колита. Наблюдение продолжалось в течение 6 месяцев, обострения течения заболевания не отмечалось.
Пример 3
Больная К., 19 лет, поступила с диагнозом болезнь Крона с температурой 38,2°С, с наличием болей в правой и левой половине живота, наличием алой крови в стуле, учащением стула до 13-17 раз в сутки, снижением аппетита. В клиническом анализе крови отмечается выраженная анемия со снижением гемоглобина до 48 ед, увеличение СОЭ до 42 мм/ч, умеренная диспротеинемия, С-реактивный белок - 36 мкм/л.
Эндоскопически: гиперемия, отек и зернистость слизистой оболочки толстой кишки, контактная ранимость слизистой оболочки, трещины слизистой оболочки и небольшие поверхностные язвы.
Рентгенологически: деформация гаустр, уменьшение просвета в области сигмы -стеноз и укорочение толстой кишки со сглаженностью ее физиологических изгибов; глубокие язвы с подрытыми краями.
При иммунологическом исследовании сыворотки крови у больной выявляют сниженное содержание в сыворотке крови ИЛ-1β, иммуноглобулинов IgM, IgG и IgA, относительно высокий уровень аутоантител к нейтрофилам и париетальным клеткам.
При электрофизиологическом исследовании восходящего отдела толстой кишки выявляют сравнительно высокий уровень электромоторной активности - частота медленных волн электромоторной активности восходящего отдела толстой кишки 19 в мин, амплитуда - 0,31 мВ; частота медленных волн электромоторной активности нисходящего отдела толстой кишки 16 в мин, амплитуда - 0,27 мВ.
При морфологическом исследовании отмечают увеличение глубины крипт, скопление лейкоцитов в просвете крипт и в подслизистом слое, увеличение количества межэпителиальных лимфоцитов и усиление диффузной лимфо-плазмоцитарной инфильтрации собственной пластинки, дистрофия эпителия.
До начала проведения эндоскопического исследования больной назначали пробиотик бифиформ в дозе 3 капсулы в сутки при пероральном приеме.
Затем готовили раствор культуры МСК и проводили эндоскопическое исследование. Полученную культуру МСК (190 млн) растворяли в 1,3 мл стерильного физиологического раствора, содержащего гепарин в концентрации 10 ед/мл, и проводили обкалывание инъектором, проведенным через инструментальный канал эндоскопа, измененных участков слизистой в 5 точках равными объемами МСК, причем объем каждого введения составил 0,25 мл. Затем проводят пероральный прием пробиотика бифиформа в дозе 1 капсулы 3 раза в день в течение 3 недель.
Проведенное лечение показало, что наблюдается увеличение уровня ИЛ-1β на 34% и более, IgM - до 2,16 г/л; IgG - до 13,8 г/л, IgA - до 2,66 г/л; отмечалось снижение уровня аутоантител к нейтрофилам до 24 Е/мл и к париетальным клеткам - до 28 Е/мл; и регистрировалось уменьшение частоты медленных волн электромоторной активности восходящего отдела толстой кишки - до 14 в мин, амплитуды - до 0,18 мВ.
Эндоскопически: снижение высоты складок. Сосудистый рисунок усилен. Контактная кровоточивость отсутствует.
При гистологическом исследовании: усиление процессов эпителизации, увеличение количества бокаловидных клеток в эпителии слизистой оболочки толстой кишки по сравнению с исходным уровнем, структура кишечных крипт приближалась к нормальной, что свидетельствует об эффективности проведенного лечения болезни Крона.
Применение МСК в сочетании пробиотиком приводит к многократному увеличению эффективности лечения.
Проведено исследование эффективности лечения у 123 больных язвенным колитом и болезнью Крона. Проведенное исследование подтвердило достижение цели изобретения - повышение эффективности терапии болезни Крона и язвенного колита.