СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АКТИВИРОВАННОГО ПОРОШКА ЧАГИ
METHOD OF PRODUCING ACTIVATED SHELF FUNGUS POWDER

Изобретение относится к медицинской промышленности, а именно к способам получения медицинских препаратов натуральных сорбентов и биологически активных добавок к питанию энтеросорбирующего действия, содержащих источник нерастворимых растительных волокон.
В настоящее время в медицине широко применяются сорбенты органического и неорганического происхождения. По химической природе энтеросорбенты можно разделить на несколько групп: 1) углеродные, получаемые методом пиролиза натурального сырья, например, фруктовой косточки, скорлупы кокосового ореха, древесины в виде активированных углей с различными связующими; 2) на основе природных и синтетических смол; 3) кремнийсодержащие, включающие аэросилы и глины, 4) природные органические на основе пищевых волокон и гидролизатов - лигнин, хитин, пектин, альгинаты, микрокристаллическая целлюлоза; 5) комбинированные [1].
Согласно данным литературы сорбенты четвертой группы имеют ряд преимуществ перед углеродными и кремнийсодержащими, так как сочетают детоксикационное и пребиотическое действие. В частности, отмечено общее положительное влияние пищевых волокон на функции ЖКТ. Показано, что дефицит этого компонента диеты в среднем составляет 15-20 г/сут. Имеются данные, что эффективность сорбции токсинов, холестерина лигнином находится на уровне активированного угля [2]. Кроме упомянутых выше положительных влияний пищевых волокон на функции ЖКТ следует отметить связывание (возможно, с частичным сохранением активности) панкреатических ферментов, снижение содержания глюкозы и уплощение гликемических кривых, благоприятные изменения в спектре липидов крови, поглощение желчных кислот и компенсаторное увеличение их синтеза в печени, связывание пестицидов и некоторых канцерогенов [1]. Эти обстоятельства открывают перспективы для использования пищевых волокон в качестве добавок как в обычных пищевых продуктах, так и отдельно, т.е. в составе энтеросорбентов. Кроме того, по мнению большинства врачей, энтеросорбенты являются средством с многогранной эффективностью, определяемой не только их патогенетическим (дезинтоксикационным, антидиарейным и др.), но и этиотропным действием как в отношении патогенных бактерий, так и вирусов» [3].
Однако природные сорбенты на основе пищевых волокон и гидролизатов имеют недостатки: низкая сорбционная эффективность, способность снижать поглощение в ЖКТ ионов кальция, железа, цинка, магния, увеличивать выведение азота из организма. По некоторым данным, длительное потребление пищевых волокон может отрицательно влиять на баланс витаминов А, С, Е [4]. Побочным действием энтеросорбентов является запор [5].
Березовый гриб Чага издавна используется для лечения заболеваний ЖКТ [6] в виде жидких (экстракт чаги, сироп «Чага», «Бефунгин», «Гастрофунгин») и твердых лекарственных форм «Чага-драже».
Известен способ получения сухого экстракта чаги, включающий сушку сырья, двухстадийную экстракцию чаги водой при повышенной температуре с помощью ультразвука и последующую сушку из тонкой пленки [7]. Способ повышает противоязвенную и адаптогенную активность препарата из сухого экстракта чаги, однако не позволяет достичь высокой биодоступности биологически активных веществ чаги, что не обеспечивает радиопротекторных свойств конечного продукта и возможность коррекции аминокислотного состава кроветворных органов при внешнем облучении. Кроме того, получаемый препарат не обладает сорбционной активностью.
Известны препараты чаги в виде порошка размолотого нативного сырья.
В патенте [8] предложен способ получения порошка чаги, включающий сушку сырья и последующий криопомол, то есть измельчение чаги в кавитационном диспергаторе в среде охлаждающего реагента.
Наиболее близким к заявленному способу по конечной форме продукта (порошок) и исходному сырью (чага) является способ получения порошка чаги, включающий: измельчение сырья в среде инертного сжиженного газа (жидкий азот и/или гелий), отличающийся тем, что свежее заготовленное сырье предварительно обрабатывают инертным сжиженным газом в течение 30-60 мин, затем сушат путем вакуумной сублимации до остаточной влажности 1-8%, причем соотношение сырья и инертного сжиженного газа при предварительной обработке свежее заготовленного сырья и при его измельчении в среде инертного сжиженного газа составляет (1:1)-(1:3), а размол проводят до размера частиц 15-20 мкм /прототип/ [9].
2
Резкое охлаждение сырья в процессе предварительной обработки приводит к растрескиванию чаги, что ослабляет связь между лигниновой матрицей (своеобразным каркасом чаги) и хромогенным полифенолкарбоновым комплексом (биологически активным веществом чаги). В результате освобождения от лигниновой матрицы резко повышается биодоступность хромогенного комплекса. Кроме того, деструкция лигниновой матрицы способствует дополнительному порообразованию, что обеспечивает высокую сорбционную активность продукта. Полученный в результате измельчения в среде охлаждающего реагента тонкодисперсный порошок с размером частиц менее 20 мкм с удельной поверхностью не менее 5,4 м/г используют для приготовления и последующего приема в виде настоя. Реализация данного способа позволяет получать порошок чаги, обладающий свойствами нормализации обмена веществ, способностью выводить из организма токсины, тяжелые металлы и радионуклиды.
Недостатками способа получения порошка чаги являются:
- низкая сорбционная активность порошка, связанная с наличием полифенольного хромогенного комплекса в структурном скелете чаги;
- микробиологическая обсемененность порошка, обусловленная низкотемпературным технологическим процессом;
- неудовлетворительные для промышленного фасования технологические свойства (сыпучесть);
- высокая стоимость готового продукта вследствие использования трудно реализуемой технологии охлаждения сырья в среде инертных газов.
4
Целью настоящего изобретения является повышение сорбционной активности порошка чаги, улучшение технологических характеристик, увеличение стабильности потребительских свойств при хранении и снижение стоимости производства при условии сорбционной активности, не менее 120 мг/г метиленового синего, сыпучести, не менее 1,0 г/сек, микробиологической чистоты, не более 10/г аэробных бактерий, грибов - не более 10 в 1 г, при отсутствии патогенных микроорганизмов, стабильного при хранении в течение 1 года.
Поставленная цель достигается тем, заявленный способ получения активированного порошка чаги отличается тем, что проводят последовательно предварительное измельчение плодового тела чаги, затем активирование водой, отделение полученного осадка, его промывку, сушку, при этом предварительное измельчение проводят до размера частиц не более 0,63 мм, активирование осуществляют водой при соотношении 1:20-1:50 при температуре 90-100°С в течение 1,0-2,0 час, отделение осадка реализуют путем фильтрования, промывку проводят водой до прозрачного или слегка желтоватого цвета промывных вод, сушку ведут при температуре 100-105°С до влажности 2-10%, повторное измельчение проводят до размера частиц не более 0,2 мм.
Ведение процесса получения активированного порошка чаги в таких технологических параметрах позволяет получать продукт с применением экстрагентов и оборудования, доступных в фармацевтической промышленности, заданного уровня качества, с удовлетворительной сорбционной активностью по метиленовому синему и по йоду, микробиологической чистоты (по требованиям изм. №3 ГФ X1), стабильного при производстве и хранении в течение одного года и относительно низкой стоимости.
Способ осуществляют следующим образом: измельчают сырье чаги (плодовое тело гриба) до размера частиц 0,2-0,63 мм. Выбор данного интервала основывается на том, что увеличение размера частиц более 0,63 мм приводит к снижению сорбционной активности за счет неполного удаления хромогенного комплекса из структуры измельченного плодового тела. Это подтверждается количественным определением хромогенного комплекса в активированном порошке чаги - 17,7±3,9% (см. пример 1, табл. 1, опыт №1). Хромогенный комплекс связан с поверхностью чаги, снижая ее сорбционную способность, поэтому его удаление необходимо для получения порошка, который может применяться в качестве энтеросорбента.
Снижение размера частиц менее 0,2 мм приводит к значительному снижению скорости фильтрации, не приводя при этом к улучшению сорбционной активности, по сравнению с порошком с размером частиц более 0,2 мм (см. пример 1, табл. 1, опыты №2-4 и 5).
Далее измельченный порошок активируют (удаляют балластные вещества хромогенного комплекса), используя в качестве экстрагента воду в соотношении 1:20-1:50 (масс./об.). Данное соотношение определяется необходимостью наиболее полной экстракции. Установлено, что снижение отношения растительного сырья к воде ниже чем 1:20, приводит к недостаточному извлечению балластных веществ из порошка и, как следствие, к ухудшению сорбционной активности (см. пример 1, опыт №1). Увеличение соотношения более чем 1:50 не приводит к значительному увеличению сорбционной активности (см. пример 1, опыты №4 и 5), поэтому является нецелесообразным.
Сущностью процесса активации является удаление балластных веществ хромогенного комплекса и освобождение внутренней поверхности лигнинового скелета плодового тела гриба чаги с образованием стереорегулярной структуры (пример 2), обладающего сорбционными свойствами, на уровне активированного угля и выше, чем «Фильтрум-сти», «Белый уголь» (пример 3).
Известно, что на интенсивность экстракции влияет температура. В связи с этим были установлены необходимые температурные пределы ведения процесса. При снижении температуры до 80°С (пример 1, опыт №1) полученный активированный порошок имеет незначительную сорбционную активность в сравнении с опытами, где активацию проводили при более высокой температуре. Сорбционная активность составила 26 мг метиленового синего на 1 г чаги, что значительно меньше показателей, полученных в опытах №2-4 (пример 1, табл. 1, опыты №1 и 2-4 соответственно).
Увеличение температуры выше 100°С нецелесообразно, поскольку потребует больших затрат на автоклавирование при организации производства по более сложной технологической схеме. Кроме того, микробиологическая чистота препарата, полученного при экспозиции 100°С 1,5 часа, позволяет получать готовый продукт, соответствующий требованиям ГФ Х1, изм. №3.
Метод устанавливает также длительность процесса активации, которая должна составлять 1-2 часа. Менее длительное активирование (опыт 1 - в течение 30 минут) приводит к ухудшению сорбционной активности в сравнении с опытами №2-4. Более длительная экспозиция не приводит к существенному положительному результату (опыт 5, табл. 1), поэтому нецелесообразна.
Отделение осадка проводят путем фильтрования, промывку осуществляют водой, очищенной до прозрачного или желтоватого цвета промывных вод. Сушку проводят при температуре 100-105°С до влажности 2-10%. Измельчение проводят до размера частиц не более 0,2 мм.
Уменьшение или увеличение параметров ведения процесса в сторону от заявленных пределов приводит либо к снижению выхода активированного порошка чаги, либо к снижению сорбционной емкости порошка (см. таблицу, опыты №1 и 5 в сравнении с  опытами №2-4).
Результаты испытаний заявленного способа получения порошка чаги в сравнении с прототипом (см. опыт №6 в сравнении с опытами №2-4 табл. 1), а также с препаратами (уголь активированный, «Фильтрум-сти», «Белый уголь») свидетельствуют о том, что ведение технологического процесса в заявленных пределах позволяет получать активированный порошок чаги, сорбционной активностью in vitro на уровне активированного угля и выше, чем препараты «Фильтрум-сти» и «Белый уголь» и прототип (пример 3), а также in vivo (пример 6), стабильного при производстве (пример 4) и хранении (пример 5). Технологический процесс реализуется с применением стандартного оборудования, используемого в фармацевтической и пищевой промышленности (пример 4).
Пример 1
Для проведения лабораторных экспериментов исходное сырье «Чага» по Р № ЛСР-002138/08 от 27.03.2008 серия 201113 от 11.2013 подвергали предварительному измельчению с помощью ротационной мельницы ударного типа PolarisPCG 0615. Измельченный порошок чаги просеивали через сита с различными диаметрами отверстий, отбирая соответствующие фракции. Активирование (освобождение от балластных веществ) проводили в лабораторном реакторе, снабженном рамной мешалкой. Активирование проводили при различных соотношениях сырья к экстрагенту (вода очищенная), температурных режимах в течение разного времени. Активированный порошок чаги отделяли фильтрацией под вакуумом через лавсановый фильтр; промывали водой до прозрачного или желтоватого цвета при комнатной температуре. Осадок снимали с фильтра и высушивали при различных температурах до влажности не более 10%. Высушенный активированный порошок чаги вторично размалывали с помощью ротационной мельницы ударного типа Polaris PCG0615. Измельченный активированный порошок чаги просеивали через сита с различными диаметрами отверстий, отбирая соответствующие фракции.
Сорбционную активность опытных и контрольных образцов определяли по модифицированной методике ГФ X стр. 161 «Уголь активированный» с учетом оптической плотности получаемого фильтрата с дополнительным осаждением хромогенного комплекса чаги свинца ацетатом [10]. Методика основана на определении оптической плотности раствора метиленового синего после его обработки сорбентом.
Сыпучесть измеряли с помощью прибора ВП-12А по принятой методике [11]. Насыпную плотность определяли с помощью прибора 545Р-АК-3 по [9].
Микробиологическая чистота по ГФ XI изд., вып. 2, стр. 193 с изм.
Хромогенный комплекс по ГФ X1, вып. 2, стр. 342. Влажность по ГФ X1, вып. 1, стр. 176.
В таблице 1 представлены технологические параметры ведения процесса и результаты оценки параметров качества получаемого порошка. В качестве контроля использован порошок чаги, полученный согласно способу, заявленному в прототипе.
Из таблицы 1 видно, что процесс предварительного измельчения необходимо вести до размера частиц 0,2-0,63 мм. Выбор данного интервала основывается на том, что увеличение размера частиц более 0,63 мм (опыт №1 табл. 1) приводит к снижению сорбционной активности в сравнении с препаратом, предварительно измельченным до размера частиц менее 0,63 мм (опыты №2-5 табл. 1) со 130-150 мг/г метиленового синего до 26. По нашему мнению, это происходит за счет снижения эффективности экстракции балластных веществ хромогенного комплекса из структуры крупных частиц. Это подтверждается количественным определением хромогенного комплекса в активированном порошке чаги опытов №1-5. Снижение размера частиц  при предварительном измельчении с размера частиц 0,2 мм до 0,1 мм (табл. 1, опыты №4 и 5) приводит к снижению скорости фильтрации.
Далее измельченный порошок помещают в колбу, снабженную якорной мешалкой и проводят процесс активации (удаление балластных веществ хромогенного комплекса), используя в качестве экстрагента воду в соотношении 1:20-1:50 (масс./об.). Данное соотношение является оптимальным и позволяет наиболее полно экстрагировать хромогенный комплекс и достичь сорбционной активности 130-150 мг/г по метиленовому синему (табл. 1, оп. №№2-4).
Изменение соотношения сырья к экстрагенту и выход за пределы, заявленные в данном способе, нецелесообразно. Из опыта 1 видно, что порошок, активирование которого проводилось при соотношении 1:10 сырья к воде, обладает сниженной сорбционной активностью (26 мг/г по метиленовому синему). Увеличение соотношения более чем 1:50 (табл. 1, опыт №5) не приводит к дальнейшему улучшению сорбционной активности.
Полученную суспензию порошка чаги в воде активируют при температуре 90-100°С в течение 1,0-2,0 часа. Показано, что выход за рамки предложенных технологических параметров приводит к снижению сорбционной активности по сравнению с опытами №2-4 с 130-150 мг/г до 26 мг/г по метиленовому синему (опыт №1) в связи с недостаточным извлечением балластных веществ хромогенного комплекса либо является нерациональным, поскольку более длительный процесс активации (опыт №5) не приводит к значительному улучшению технологических свойств активированного порошка. Увеличение температуры выше 100°С также нецелесообразно, поскольку потребует больших затрат при организации производства по более сложной технологической схеме.
Далее осуществляют сушку активированного порошка при температуре 100-105°С. Опыты №2-4 показывают, что данный режим сушки обеспечивает влажность 2-10% и, соответственно, удовлетворительную сыпучесть активированного порошка (1,1-1,3 г/сек).
Пример 2
2
Хромогенный комплекс связан с поверхностью чаги, закупоривает поры, снижает сорбционную способность. На рис. 1 представлены микрофотографии поверхности частиц порошка чаги до и после активации кипячением с водой (см. табл. 1, опыт №3). Из рисунка видно увеличение размера пор (от 0,62 мкм до 7 мкм) и их количества (от 80 до 115 на мм) у порошка после активации в сравнении с исходным образцом. Таким образом, сущность активации порошка чаги состоит в удалении балластных веществ хромогенного комплекса с поверхности и внутри обрабатываемого материала.
2
2
Удельную поверхность порошка чаги измеряли методом равновесной интервальной сорбции с помощью автоматизированного анализатора TriStar 3000 (Micromeritics) с помощью сорбции/десорбции гелия. В результате удаления балластных веществ хромогенного комплекса (активации) площадь поверхности порошка при неизменном фракционном составе увеличивается с 2,6 до 3,3 м/г. Поверхность прототипа в два раза больше и составляет 5,4 м/г. При этом сорбционная активность прототипа (табл. 1, опыт №6) в 15 раз меньше (см. табл. 1, опыт №3). Данный факт объясняется тем, что прототип обладает высокой наружной поверхностью, но не внутренней, которая необходима для эффективной сорбции.
Пример 3
Сорбционная активность опытного (табл. 1, опыт №3) и контрольных образцов по метиленовому синему [10], йоду [12], кислоте и щелочи [13] представлена в таблице 3. Сорбционную активность по рибофлавину определяли по методике, аналогичной метиленовому синему (пример 1), за исключением того, что в качестве испытуемого использован раствор рибофлавина 0,02%, РСО 0,0002%, а измерение вели при длине волны 444 нм. В качестве контрольных образцов использовали порошок прототипа, порошок измельченных до размера частиц менее 0,2 мм, таблеток угля активированного, «Фильтрум-сти», «Белый уголь».
2
Из таблицы 3 видно, что сорбционная активность активированного порошка чаги в сравнении с углем ниже и по метиленовому синему (150 мг/г и 210 мг/г), и по йоду (20,3% и 62,2%) соответственно. Это объясняется значительно большей площадью удельной поверхности образцов (3,3 и 556,3 м/г) соответственно.
Установлено, что активированный порошок чаги проявляет сорбционную активность по метиленовому синему и по йоду, сравнимую с используемым в медицинской практике сорбентом на растительной основе - «Фильтрум-сти». Кроме того, можно отметить некоторое преимущество в показателе сорбционной активности над БАД «Белый уголь».
Сорбционная активность по кислоте и по щелочи для активированного порошка чаги сравнима с данными показателями угля активированного, превышает сорбционную активность «Фильтрум-сти» по кислоте в 3 и по щелочи в 2 раза, сорбция по кислоте и по щелочи так же более активная по сравнению с «Белым углем».
Порошок чаги (прототип) уступает активированному порошку чаги, проявляя более низкую сорбционную активность по метиленовому синему, по йоду, по кислоте и по щелочи. Это подтверждает необходимость активации (экстракция балластных веществ хромогенного комплекса) для увеличения площади поверхности, доступной для сорбции.
Пример 4
Оптимальные значения параметров многократно проверяли сначала в лабораторных условиях, а затем в условиях промышленного производства. Сырье чаги измельчали с помощью роторной ударной мельницы SR 300. Полученный порошок просевали через сито с размером ячеек 0,63 мм. Выход на стадии измельчения составил 98,4%. Отсев дополнительно размалывали до заданного размера частиц.
В реактор, снабженный якорной мешалкой и паровой рубашкой, загружали 440 кг воды очищенной и 12,3 кг порошка, полученного на стадии 1; нагревали до 90-100°С, вели активирование при постоянном перемешивании (скорость оборотов мешалки 30 оборотов в минуту) в течение 1,5 часов. После чего проводили фильтрацию и промывку порошка водой очищенной в количестве 60 кг. Выход на стадии активирования составляет 90,24%.
Полученный активированный порошок чаги подвергали сушке в камерной сушилке при температуре 100-105°С до влажности 5,0%. Высушенный порошок повторно измельчали до размера частиц не более 0,2 мм. Выход на стадии повторного измельчения составил 90,1%. Выход производства активированного порошка чаги составляет 80%.
В таблице 4 представлен материальный баланс производства активированного порошка чаги.
Пример 5
Полученный в примере 4 порошок расфасовывали в пакеты из ламинированной бумаги, герметично запаивали и исследовали стабильность методом ускоренного старения [14]. Качество активированного порошка оценивали по таким показателям, как сыпучесть, насыпная плотность, влажность, сорбционная активность по метиленовому синему, микробиологическая чистота. Представленные в таблице 5 данные свидетельствуют о том, что разработанный способ получения активированного порошка чаги обеспечивает стабильность при хранении в течение одного года [15].
Данные таблицы 5 свидетельствуют о стабильности активированного порошка чаги в процессе хранения в течение 1 года. Также видно, что сорбционная активность по метиленовому синему сохраняется в течение 1,5 лет. Прототип (порошок чаги) так же незначительно изменяет свои свойства в процессе хранения, однако обладает изначально неудовлетворительными микробиологическими характеристиками.
Пример 6
Доклинические испытания проводили на лабораторных крысах линии Wistar. Для проведения испытаний были сформированы четыре группы по пять крыс: 1 - контрольная группа, 2 - группа, получавшая в качестве энтеросорбента активированный порошок чаги, 3 - группа получавшая порошок чаги (прототип), 4 - группа, получавшая порошок измельченных таблеток «Фильтрум-сти». Крысы содержались в стандартных условиях вивария [16], но в течение 12 часов перед испытанием не получали корм (во избежание дополнительной сорбции пищевыми волокнами, содержащимися в корме). Крысам вводили раствор рибофлавина-мононуклеотида (10 мг/мл) per os объемом 2 мл. Выбор данного раствора обусловлен тем, что рибофлавин в значительной степени выводится с мочой в течение первых суток после введения. Затем через 30 минут группе 2, 3, 4 вводили 2 мл 0,5% суспензии активированного порошка чаги, порошка чаги (прототипа) и порошка измельченных таблеток «Фильтрум-сти» соответственно. Оценка сорбции проводилась по остаточному содержанию рибофлавина-мононуклеотида в моче крыс, собранной в течение суток после введения. Количественное содержание остаточного рибофлавина в моче определяли методом ВЭЖХ [17].
В таблице 6 приведены результаты оценки количества остаточного рибофлавина в моче крыс.
Таблица 6 показывает, что остаточное количество рибофлавина в моче наименьшее в группе 2, то есть в группе крыс, получавшей активированный порошок чаги в качестве энтеросорбента.
Прототип не показал значительной сорбционной активности in vivo. Полученные данные позволяют сделать вывод о необходимости процесса активации порошка чаги для улучшения его фармацевтической активности.
Литература
1. Г. Николаев, С.В. Михаловский, Н.М. Гурина «СОВРЕМЕННЫЕ ЭНТЕРОСОРБЕНТЫ И МЕХАНИЗМЫ ИХ ДЕЙСТВИЯ», ЭФФЕРЕНТНАЯ ТЕРАПИЯ, 2005 г., ТОМ 11, №4.
2. "Полифепан" - натуральный энтеросорбент. Леванова В.П., Халецкий Н.А., Борзаковская B.C.
3. Учайкин В.Ф., Новокшонов А.А., Соколова Н.В., Бережкова Т.В. Энтеросорбция - роль энтеросорбентов в комплексной терапии острой и хронической гастроэнтерологической патологии. Пособие для врачей. М., 2008. 24 с.
4. Бондарев Е.В., Штрыголь С.Ю. Дырявый С.Б. Применение энтеросорбентов в медицинской практике. Национальный фармацевтический университет, г. Харьков.
5. Н.В. Нагорная, Е.В. Бордюгова, А.В. Дубовая. Использование энтеросорбции в лечении атопического дерматита. Современная педиатрия 4(9)/2005.
6. Епанчинов А.В. Лекарственные растения Урала и Зауралья. // М.: Медицина, 1990.
7. Патент РФ N 1805968, МПК 6 А61К 35/78, опубл. 30.03.93 г., Бюл. N 12, 1993 г., "Способ получения средства, обладающего противоязвенной и адаптогенной активностью.
8. Патент РФ N 2076728, МПК 6 А61К 35/78, опубл. 10.04.97 г., Бюл. N 10, "Способ профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний".
9. Патент РФ N 2167665, МПК: A61J A61K В02С, опубл. 27.05. 2001, «Способ получения порошка чаги».
10. Кох Е.С., Гаврилов А.С. Разработка методики анализа сорбционной активности активированного порошка чаги, Материалы конференции «Фармация и общественное здоровье», Екатеринбург, 2014, с. 421.
11. Вальтер М.Б., Тютенков О.Л., Филипин П.А. Постадийный контроль в производстве таблеток. - М.: Медицина, 1982. - 208 с.
12. ГОСТ 6217-74 Уголь активный древесный дробленый. Технические условия.
13. Гиндулин И.К., Юрьев Ю.Л. Технический анализ нанопористых материалов. Екатеринбург, 2011.
14. Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков хранения лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре.
15. ГФ XI вып. 2, с. 193 с изм. 3.
16. Хайнд Р. Поведение животных [Текст] / Р. Хайнд. - М.: "Мир",  1975.
17. Kurz W.G.W., Chatson К.В., Constabel F., Kutney J.P., Choi L.S.L., Kolodziejczyk P., Sleigh S.K., Stuart K.L., Worth B.R. Helv. Chim. Acta, 63, 1891 (1980).