Независимое приобретение резистентности к хинолонам у клонально-родственных нозокомиальных штаммов Salmonella Typhimurium вследствие гипермутабельности

Независимое приобретение резистентности к хинолонам у клонально-родственных нозокомиальных штаммов Salmonella Typhimurium вследствие гипермутабельности

В.К. Козырева1, М.В. Эйдельштейн1, Д.В. Тапальский2, И.С. Азизов3, Р.С. Козлов1

1 НИИ антимикробной химиотерапии, ГБОУ ВПО «Смоленская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития РФ, Смоленск, Россия

2 Гомельский государственный медицинский университет, Гомель, Беларусь

3 Карагандинский государственный медицинский университет, Караганда, Казахстан

У выделенных на территории России, Беларуси и Казахстана нозокомиальных штаммов Salmonella Typhimurium, продуцирующих b-лактамазу расширенного спектра CTX-M-5 и принадлежащих к одной генетической группе, выявлена высокая частота устойчивости к хинолонам (43,1%). Резистентность во всех случаях была связана с наличием единичных точечных мутаций в QRDR области субъединицы А ДНК гиразы (GyrA), однако у разных штаммов были обнаружены различные аминокислотные

замены в позициях 83 или 87 GyrA, что свидетельствует об их независимом приобретении. Высокая частота резистентности к хинолонам и разнообразие замен в QRDR объясняются повышенной частотой мутирования (гипермутабель-ностью), которая была выявлена у всех изолятов описанной клональной группы.

Ключевые слова: Salmonella Typhimurium, нозокомиальные инфекции, антибиотикорези-стентность, хинолоны, гипермутабельность.

Independent Acquisition of Quinolone Resistance in Clonally Related Nosocomial Strains of Salmonella Typhimurium Due to Hypermutability

V.K. Kozyreva1, M.V. Edelstein1, D.V. Tapalski2, I.S. Azizov3, R.S. Kozlov1

1 Institute of Antimicrobial Chemotherapy, Smolensk, Russia

2 Gomel State Medical University, Gomel, Belarus

3 Karaganda State Medical University, Karaganda, Kazakhstan

Here we report on a high incidence of quinolone resistance (43,1%) among nosocomial CTX-M-5 ESBL-producing S. Typhimurium isolates belonging to a single clonal group isolated in Russia, Belarus, and Kazakhstan. The resistance mechanism in all cases was a single point mutation in quinolone resistance-determining region (QRDR) of DNA-gyrase subunit A (GyrA), however the discovered amino acid substitutions at GyrA positions 83 or

87 were different. The high incidence of quinolone resistance and the apparent diversity of GyrA mutations are likely explained by increased mutation rate (hypermutabil-ity) observed in all isolates of the described clonal group.

Key words: Salmonella Typhimurium, nosocomial infections, antimicrobial resistance, quinolones, hyper-mutability.

Контактный адрес:

Варвара Константиновна Козырева

Эл. почта: barbara.kozyreva@gmail.com

Введение

В настоящее время приобретенная резистентность к антибиотикам, давно используемым в клинической практике - аминопенициллинам, три-метоприму, сульфаниламидам, хлорамфениколу, тетрациклину, стрептомицину и спектиномицину, является широко распространенной среди штаммов сальмонелл, выделяемых у человека и животных. Для многих штаммов Salmonella enterica характерно наличие геномного островка SGI1 и плазмид резистентности, несущих гены устойчивости к большинству или ко всем перечисленным антибиотикам в виде интегронных кассет [1-4]. Особую проблему представляет распространение у сальмонелл кодируемых плазмидами детерминант резистентности к цефалоспоринам III поколения - ß-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) и цефалоспориназ класса С (AmpC) [5-7].

Несмотря на широкое клиническое использование фторхинолонов, резистентность к ним у сальмонелл встречается реже, чем к другим антибиотикам [8-10]. Это позволяет рассматривать фторхинолоны как препараты выбора для лечения инвазивных сальмонеллезов у взрослых [11]. Тем не менее, тенденция роста устойчивости характерна и для данной группы препаратов [12-15], особенно среди штаммов Salmonella Typhimurium, вызывающих нозокомиальные инфекции [1, 16, 17].

Устойчивость к хинолонам, как правило, связана с мутациями хромосомных генов ДНК-гиразы и/ или топоизомеразы IV. Чаще всего резистентность к налидиксовой кислоте и пониженная чувствительность к фторхинолонам являются результатом появления единичных аминокислотных замен в первичной мишени хинолонов-QRDR области А-субъединицы ДНК-гиразы (GyrA). Мутации в B-субъединице ДНК-гиразы (GyrB) или же в субъединицах C и E топоизомеразы IV (ParC и ParE), приводящие к снижению чувствительности к хино-лонам, встречаются у сальмонелл гораздо реже [18]. Аминокислотные замены в GyrA, обеспечивающие резистентность к фторхинолонам, обычно происходят в позициях 83 и 87: остаток Ser83 может быть замещен на Phe, Tyr или Ala, а Asp87 - на Gly, Asn или Tyr [19]. Наличие единичных мутаций в QRDR GyrA приводит к значительному увеличению МПК налидиксовой кислоты и менее заметному (как правило, на 1-2 разведения) увеличению МПК ципрофлоксацина [20]. Однако такие изменения могут являться причиной неэффективности стандартных курсов терапии с использованием фтор-хинолонов [21]. При наличии нескольких мутаций в QRDR GyrA или парных мутаций в GyrA и

GyrB возникает резистентность высокого уровня к ципрофлоксацину [20].

У сальмонелл встречаются и другие механизмы, обеспечивающие снижение чувствительности к хинолонам. Во-первых, это активное выведение антибиотика из клетки: в геноме 5. ТурЫтигшт найдено 5 эффлюксных систем, повышенная экспрессия которых способствует эффективному выведению фторхинолонов [22]. Снижение проницаемости наружной мембраны, связанное с вариациями экспрессии OmpF поринов внешней мембраны или липополисахаридов, рассматривается скорее как дополнительный механизм резистентности сальмонелл к фторхинолонам и едва ли может само по себе обеспечивать заметное снижение чувствительности [19]. Все более распространенной в последние годы становится плазмидоопосредо-ванная резистентность к хинолонам [23]. Лучше всего описаны плазмидные Одг белки, которые непосредственно взаимодействуют с комплексом ДНК и ДНК-гиразы или ДНК и топоизомеразы IV, препятствуя их связыванию с фторхинолонами [24, 25]. Другой ген, встречающийся на плазмидах - аас(6')-1Ь-сг, кодирует вариант фермента амино-гликозид-ацетилтрансферазы, который способен инактивировать ципрофлоксацин посредством его ацетилирования [26]. Кроме того, описанные ранее как хромосомные гены систем эффлюкса OqxAB и 0,ерА также были найдены на плазмидах [23]. Перечисленные выше механизмы обеспечивают небольшое повышение МПК хинолонов, но могут дополнять мутации гена-мишени, что позволяет достичь высокого уровня резистентности [23, 27].

Таким образом, распространение устойчивости к фторхинолонам у сальмонелл может быть связано как с горизонтальным переносом кодируемых плаз-мидами детерминант резистентности между разными штаммами [28], так и, в случае классических мутаций хромосомных генов, с клональной экспансией штаммов [29]. Существует также возможность независимого приобретения одинаковых мутаций резистентности в QRDR GyrA неродственными штаммами вследствие положительного селективного давления, создаваемого при широком применении хинолонов в медицине и ветеринарии [30].

Согласно данным исследования антибиотико-резистентности сальмонелл в отдельных регионах России, циркулирующие во внебольничной среде штаммы 5. еМепса отличаются хорошей чувствительностью к цефалоспоринам III поколения и фторхинолонам [31, 32]. Гораздо большую проблему представляет высокий уровень антибио-тикорезистентности у нозокомиальных штаммов сальмонелл, среди которых преобладают полирези-

стентные штаммы серовара Typhimurium [33, 34]. В одном из последних исследований нами была описана длительная (с 1996 г. по 2009 г.) циркуляция в стационарах на территории России, Беларуси и Казахстана штаммов S. Typhimurium, принадлежащих к одной клональной группе и проявляющих устойчивость к цефалоспоринам за счет продукции БЛРС CTX-M-5. Помимо устойчивости к цефало-споринам, у многих изолятов данной генетической группы была выявлена резистентность также к налидиксовой кислоте и пониженная чувствительность к фторхинолонам [35].

В настоящей работе нами были изучены механизмы резистентности к хинолонам и биологические особенности описанных изолятов S. Typhimurium, способствующие приобретению данного типа устойчивости.

Материалы и методы

Клинические штаммы Salmonella Typhimurium.

Всего исследовано 88 цефотаксиморезистентных изолятов Salmonella enterica подвид enterica серовар Typhimurium, выделенных у госпитализированных пациентов в 15 населенных пунктах 10 регионов России, Беларуси и Казахстана в 1996-2009 гг. Все изоляты были неповторяющимися (по одному от каждого пациента), пятнадцать из них были выделены у детей в возрасте до 3 лет. Первичная видовая и серологическая идентификация проводилась в локальных микробиологических лабораториях в соответствии с принятыми стандартами. Повторно все штаммы были идентифицированы в НИИ антимикробной химиотерапии СГМА с помощью биохимических идентификационных систем API20E (bioMerieux, Франция) и наборов сывороток к О- и Н-антигенам Salmonella (BioRad, Франция).

Определение чувствительности к антибиотикам. Значения минимальной подавляющей концентрации налидиксовой кислоты и ципрофлоксацина были определены с помощью метода последовательных разведений в агаре Мюллера-Хинтон [36]. Для контроля качества определения чувствительности были использованы штаммы E. coli ATCC25922 и E. coli ATCC35218. Интерпретация результатов определения чувствительности к ципрофлок-сацину проводилась с использованием критериев Европейского комитета по оценке антибиотикочув-ствительности (EUCAST) 2012 г. [37]. Для оценки чувствительности к налидиксовой кислоте использовались критерии Института клинических лабораторных стандартов (CLSI) 2011 г. [36].

Определение мутаций в QRDR области гена gyrA. Для предварительного выявления мутаций в QRDR области гена gyrA был использован метод

ПЦР в режиме реального времени с последующим анализом кривых плавления флуоресцентного зонда. Короткий фрагмент гена gyrA, включающий QRDR область, амплифицировали с помощью пары праймеров (таблица) из которых обратный праймер (Sty_gyrA_Rpm) содержал внутренний гаситель флуоресценции и использовался в большей концентрации (0,8 мкМ), чем прямой праймер (Sty_gyrA_Fpm;0,2 мкМ), с целью обеспечения более эффективной амплификации одной из цепей ДНК, комплементарной зонду (ассиме-тричной ПЦР). В реакции был также использован 3'-флуоресцентно-меченный зонд (Sty_gyrA_Pb) в концентрации 0,2 мкМ, нуклеотидная последовательность которого была полностью комплементарна участку QRDR дикого типа (WT), соответствующему аминокислотным остаткам 82-88 GyrA (S. Typhimurium GenBank Acc. № U21957). Расчет температур плавления (Tm) дуплексов зонда с WT и мутированными последовательностями целевого гена был произведен с помощью программного обеспечения MeltCalc (E. Schütz и N. von Ahsen, 1999). В состав ПЦР смесей общим объемом 25 мкл входили: 2,5 ед. TaqF ДНК-полимеразы с коммерческим буфером (Интерлабсервис, Россия), 2 мМ MgSO4 и 3 мкл бактериальной ДНК, выделенной с помощью наборов InstaGene Matrix (Bio-Rad, США). Амплификацию проводили с помощью системы RotorGene 2000 (Corbett Research, Австралия) согласно следующему протоколу: начальная денатурация при температуре 95 °С - 15 мин, затем 45 циклов: 95 °C - 15 с и 55 °C - 20 с, финальная инкубация при 37 °C - 3 мин. После завершения амплификации проводили анализ температуры плавления зонда путем регистрации его флуоресценции при увеличении температуры на 1 °С каждые 10 с в диапазоне от 37 °С до 75 °С. О наличии мутаций в QRDR области судили по снижению Tm зонда по сравнению с WT контролем.

Для всех изолятов характер выявленных мутаций в QRDR gyrA был установлен путем амплификации и прямого секвенирования внутреннего фрагмента гена gyrA с помощью праймеров STGYRA1 и STGYRA12-GT (см. таблицу), как описано ранее [38]. Секвенирование проводили с использованием наборов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit и генетического анализатора ABI Prism 310 (Applied Biosystems, США).

Тест на мутабельность. Фенотип гипермута-бельности клинических изолятов S. Typhimurium определяли с помощью скринирующего теста с диском налидиксовой кислоты (30 мкг) согласно методике, предложенной J.C. Galán и соавт. [39]. С этой целью суспензии тестируемых микроорга-

Использованные олигонуклеотиды

№ п/п Наименование Последовательность (5'-3') Назначение Ссылка

1 2 3 Sty_gyrA_Fpm Sty gyrA Rpm Sty_gyrA_Pb AAATACCATCCCCACGGC TGCGCCATACGAACGA(T-RTQ1)G CGATTCCGCAGTGTATGACA-FAM Первичный скрининг мутаций в QRDR GyrA Данная работа

4 5 STGYRA1 STGYRA12-GT TGTCCGAGATGGCCTGAAGC CGTTGATGACTTCCGTCAGGT ПЦР и секвенирование QRDR GyrA [38]

низмов в физиологическом растворе плотностью 2 по McFarland наносили с помощью тампонов на поверхность агара Мюллера-Хинтон и через 24 ч инкубирования при 35 °C оценивали наличие отдельных колоний мутантов внутри зоны подавления роста налидиксовой кислотой. Возникновение спонтанных мутантов, резистентных к налидик-совой кислоте, у исходно чувствительных изоля-тов определяли с помощью стандартного метода: суточные культуры микроорганизмов в разведении от 10-1 до 10-12 рассевали на агар с налидиксовой кислотой (32 мг/л) и без антибиотика;частоту спонтанных мутантов рассчитывали как отношение количества колоний, выросших на чашках с налидиксовой кислотой, к количеству колоний, выросших на чашках без антибиотика. В качестве положительного и отрицательного контрольных штаммов использовали соответственно мутатор E. coli GM2995 (mutD5) [40] и E. coli ATCC25922.

Типирование изолятов с помощью мультило-кусного анализа тандемных повторов (MLVA). MLVA-типирование проводили по пяти VNTR локусам (STTR3, STTR5, STTR6, STTR9, STTR10) как описано ранее [35, 41]. Кластерный анализ MLVA-профилей выполнен с использованием программного пакета BioNumerics Software v. 6.1 (Applied Maths, Бельгия) с применением алгоритма минимального остовного дерева (minimum spanning tree - MST) для категориальных значений VNTR локусов.

Результаты

Чувствительность к хинолонам. Согласно представленным ранее данным [35], все исследованные изоляты S. Typhimurium (n=88) проявляли устойчивость ко всем цефалоспоринам в сочетании с резистентностью как минимум к одному не-З-лактамному антибиотику. В соответствии с критериями CLSI устойчивость к налидиксовой кислоте была выявлена у 38 (43,1%) изолятов. Значения МПК ципрофлоксацина для чувствительных к налидиксовой кислоте изолятов не пре-

вышали 0,06 мг/л, тогда как для резистентных они варьировали в диапазоне от 0,06 мг/л (у одного штамма) до 0,5 мг/л. Несмотря на то что указанные значения МПК ципрофлоксацина были ниже пограничных значений CLSI (>1 мг/л) и EUCAST (>0,5 мг/л) для нечувствительных штаммов семейства Enterobacteriaceae, 37 (42%) изолятов были отнесены к категории нечувствительных к фтор-хинолонам на основании рекомендаций EUCAST, предписывающих использование более строгих критериев (МПК ципрофлоксацина >0,06 мг/л) для предсказания возможной терапевтической неэффективности любых фторхинолонов в отношении инфекций, вызванных Salmonella spp. [37, 42].

Молекулярная характеристика детерминант резистентности. С помощью метода ПЦР в режиме реального времени у всех устойчивых к налидик-совой кислоте изолятов были выявлены мутации в QRDR GyrA. У 30 изолятов (34,1%) значения Tm зонда были характерны для замен в аминокислотной позиции 87, а у 8 (9,1%) - в позиции 83 (рис. 1).

Секвенирование показало, что выявленные точечные мутации соответствуют различным аминокислотным заменам: Asn-87, Gly-87, Tyr-87 и Phe-83 (рис. 2). Во всех случаях точечные мутации в QRDR GyrA были единичными. Данные, пред-

deg

Рис. 1. Пример детекции мутаций в QRDR GyrA с помощью ПЦР в режиме реального времени и анализа кривых плавления зонда

48 46 18'

5 8

<0,03 0,06 0,125 0,25 0,5

МПК CIP, мг/л

Мутация Количество изолятов Диапазон МПК, мг/л

NAL CIP

Нет (WT) Asn-87 Gly-87 Tyr-87 Phe-83 50 (56,8%) 25 (28,4) 3 (3,4%) 2 (2,3%) 8 (9,1%) 4-16 128->512 256- >512 128-256 >512 <0,03-0,06 0,125-0,5 0,06-0,5 0,125-0,25 0,25-0,5

Рис. 2. Распределение исследованных изолятов S. Typhimurium по МПК налидиксовой кислоты (NAL) и ципрофлоксацина (CIP) в зависимости от характера мутаций в QRDR GyrA

Рис. 3. Примеры выявления фенотипа гипермутабель-ности с помощью быстрого теста с диском налидиксовой кислоты

а, б - клинические изоляты S. Typhimurium; в - отрицательный контроль - E. coli ATCC25922; г - положительный контроль - E. coli GM2995. Стрелкой отмечены мутантные колонии внутри зон подавления роста.

ставленные на рис. 2, показывают соответствие между характером выявленных мутаций и значениями МПК хинолонов.

Тест на мутабельность. При постановке скри-нирующего теста с диском налидиксовой кислоты у всех хинолоночувствительных штаммов S.Typhimurium, так же как и у контрольного штам-ма-мутатора E. coli GM2995 (mutD5), наблюдался рост многочисленных мутантных колоний внутри зоны подавления роста. Подобного роста у нормомутабельного контрольного штамма E. coli ATCC25922 отмечено не было (рис. 3).

Частота мутаций у исследованных изо-лятов превышала таковую у обычных штаммов S. Typhimurium [43, 44] на 4 порядка и составила приблизительно 1х10-5. Следовательно, все штаммы изучаемой группы были расценены как сильные мутаторы.

Следует также отметить, что у произвольно выбранных мутантов, полученных in vitro, методом секвенирования было установлено наличие мутаций в QRDR GyrA, идентичных выявленным у хинолонорезистентных клинических изолятов.

Обсуждение

Известно, что наличие у штаммов Salmonella единичных мутации в QRDR GyrA является причиной устойчивости низкого уровня к ципроф-локсацину и, кроме того, увеличивает риск селекции дополнительных (кооперативных) мутаций и формирования резистентности высокого уровня [45]. Согласно современным рекомендациям CLSI, определение чувствительности сальмонелл к налидиксовой кислоте является обязательным для выявления резистентности низкого уровня к фтор-хинолонам и предсказания их возможной клинической неэффективности при терапии инвазивного сальмонеллеза [36]. Вместе с тем, EUCAST рекомендует непосредственное тестирование сальмонелл к ципрофлоксацину и использование низкой пограничной концентрации для оценки чувствительности к данному препарату (МПК <0,06 мг/л). Критерии EUCAST для налидиксовой кислоты в настоящее время отсутствуют.

У исследованных нами изолятов S. Typhimurium резистентность к хинолонам во всех случаях была вызвана мутациями gyrA, при этом у чувствительных к налидиксовой кислоте изолятов соответствующие мутации не были обнаружены. Таким образом, фенотип чувствительности к налидиксо-вой кислоте строго коррелировал с генотипом gyrA. Большинство штаммов с характерными мутациями в QRDR GyrA также проявляли устойчивость низкого уровня к ципрофлоксацину, однако один изолят (SE079/Ka-5120) с заменой Gly-87 формально сохранял чувствительность к ципрофлоксацину (МПК 0,06 мг/л). Данное наблюдение свидетельствует, на наш взгляд, о том, что налидиксовая кислота является более чувствительным маркером для выявления хромосомоопосредованной резистентности к хинолонам.

Выявленные в ходе данного исследования мутации в 83 и 87 позициях GyrA являются типичными для хинолонорезистентных клинических штаммов и встречаются у различных видов семейства Enterobacteriaceae [46]. Эффект данных мутаций, в частности наиболее часто встречавшихся у исследованных нами изолятов замен Asn-87 (28,4%) и Phe-83

(9,1%), хорошо изучен для штаммов сальмонелл [47]. Последняя из перечисленных мутаций была предсказуемо связана с более высокими значениями МПК как налидиксовой кислоты, так и ципроф-локсацина.

Принадлежность всех исследованных нозокомиальных изолятов 5. ТурЫтигшт, выделенных на территории трех государств, к одной генетической группе и общность выявленных у них механизмов резистентности к цефалоспоринам (продукции БЛРС СТХ-М-5) были продемонстрированы нами ранее [35]. В этой связи, факт обнаружения различных мутаций в gyrA среди клонально-род-ственных изолятов является, с нашей точки зрения, наиболее интересным и важным, хотя и неожиданным. Данные кластерного анализа штаммов, выполненного по результатам МЦУА-типирования (рис. 4), свидетельствуют о том, что распространение резистентности к хинолонам в изучаемой генетической линии 5. ТурЫтигшт лишь отчасти носит клональный характер и в значительной мере связано с независимым приобретением мутаций в gyrA исходно чувствительным штаммом.

Известно, что одним из важнейших факторов, способствующих быстрому формированию хромо-сомоопосредованной резистентности к хинолонам, является повышенная частота мутирования [48].

Рис. 4. Кластеризация MLVA-профилей на основании алгоритма минимального остовного дерева

Примечание: Каждому MLVA-типу соответствует круг, размер которого отражает количество изолятов, имеющих соответствующий MLVA-профиль. Длина и тип соединительных отрезков отражает генетическое расстояние (число отличающихся VNTR локусов) между двумя ближайшими типами: короткая непрерывная линия соединяет два MLVA-типа, отличающихся друг от друга единственным VNTR локусом, длинная пунктирная линия соединяет двухлокусные варианты. MLVA-типы, отличающиеся не более чем на 2 локуса, объединены в одну клональную группу (выделена серым фоновым цветом). Заливка круга отражает доли изолятов с разными мутациями в QRDR GyrA, принадлежащих данному MLVA-типу.

Гипермутабельность широко распространена среди нозокомиальных штаммов многих видов бактерий, включая Salmonella enterica [49]. Ранее было показано, что у штаммов S. Typhimurium с нарушенной системой репарации повреждений ДНК (mutS-) частота мутаций резистентности к налидиксовой кислоте возрастает на 3 порядка: с 3,3 х10-9 до 3,4х10-6 [43].

У исследованных нами изолятов частота спонтанных мутаций устойчивости к налидиксовой кислоте составила приблизительно 1х10-5, что позволило считать их гипермутабельными. Увеличение частоты мутаций на 4 порядка (по сравнению с обычными штаммами [43]) наблюдалось у всех исходно чувствительных к налидиксовой кислоте изолятов, относящихся к разным MLVA-субтипам внутри одной клональной группы. Таким образом, гипермутабельность является важной характеристикой всех штаммов описанной генетической

линии S. Typhimurium, способствующей их адаптации в нозокомиальной среде.

Полученные нами данные о высокой частоте устойчивости к хинолонам и наличию гипермута-бельности у изученных штаммов S. Typhimurium ставят под сомнение возможность эффективного использования ципрофлоксацина для терапии инфекций, вызванных данными штаммами, даже при выявлении in vitro чувствительности у отдельных изолятов. В случае штаммов, обладающих единичными мутациями в QRDR gyrA, применение фторхинолонов может быть сопряжено с риском аккумуляции дополнительных мутаций и формирования резистентности высокого уровня. Сочетание механизмов устойчивости к хинолонам и цефалоспоринам крайне затрудняет выбор антибиотиков, активных в отношении описанных штаммов S. Typhimurium.

Литература

1. Yu F., Chen Q., Yu X., et al. High prevalence of extended-spectrum beta-lactamases among Salmonella enterica Typhimurium isolates from pediatric patients with diarrhea in China. PLoS One 2011; 6(3):e16801.

2. Dionisi A.M., Graziani C., Lucarelli C., et al. Molecular characterization of multidrug-resistant strains of Salmonella enterica serotype Typhimurium and monophasic variant (S. 4,[5],12:i:-) isolated from human infections in Italy. Foodborne Pathog Dis 2009; 6(6):711-7.

3. Targant H., Ponsin C., Brunet C., et al. Characterization of resistance genes in multidrug-resistant Salmonella enterica serotype Typhimurium isolated from diseased cattle in France (2002 to 2007). Foodborne Pathog Dis 2010; 7(4):419-25.

4. dos Reis E.M., Rodrigues Ddos P., de Freitas-Almeida A.C., Hofer E. Prevalence of R-type ACSSuT in strains of Salmonella serovar Typhimurium DT193 isolated from human infections in Brazil. Rev Panam Salud Publica 2011; 29(6):387-92.

5. Rodriguez I., Barownick W., Helmuth R., et al. Extended-spectrum {beta}-lactamases and AmpC {beta}-lactamases in ceftiofur-resistant Salmonella enterica isolates from food and livestock obtained in Germany during 2003-07. J Antimicrob Chemother 2009; 64(2):301-9.

6. Dierikx C., van Essen-Zandbergen A., Veldman K., Smith H., Mevius D. Increased detection of extended spectrum beta-lactamase producing Salmonella enterica and Escherichia coli isolates from poultry. Vet Microbiol 2010; 145(3-4):273-8.

7. Biedenbach D.J., Toleman M., Walsh T.R., Jones R.N. Analysis of Salmonella spp. with resistance to extended-spectrum cephalosporins and fluoroquinolones isolated in North America and Latin America: report from the

SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (19972004). Diagn Microbiol Infect Dis 2006; 54(1):13-21.

8. Bouchrif B., Paglietti B., Murgia M., et al. Prevalence and antibiotic-resistance of Salmonella isolated from food in Morocco. J Infect Dev Ctries 2009; 3(1):35-40.

9. Herikstad H., Hayes P., Mokhtar M., Fracaro M.L., Threlfall E.J., Angulo F.J. Emerging quinolone-resistant Salmonella in the United States. Emerg Infect Dis 1997; 3(3):371-2.

10. Medalla F., Sjolund-Karlsson M., Shin S., et al. Cipro-floxacin-resistant Salmonella enterica serotype Typhi, United States, 1999-2008. Emerg Infect Dis 2011; 17(6):1095-8.

11. Arlet G., Barrett T.J., Butaye P., Cloeckaert A., Mulvey M.R., White D.G. Salmonella resistant to extended-spectrum cephalosporins: prevalence and epidemiology. Microbes Infect 2006; 8(7):1945-54.

12. Chiu C.H., Wu T.L., Su L.H., et al. The emergence in Taiwan of fluoroquinolone resistance in Salmonella enterica serotype choleraesuis. N Engl J Med 2002; 346(6):413-9.

13. Majtan J., Majtanova L., Majtan V. Increasing trend of resistance to nalidixic acid and emerging ceftriaxone and ciprofloxacin resistance in Salmonella enterica serovar Typhimurium in Slovakia, 2005 to 2009. Diagn Microbiol Infect Dis 2010; 68(1):86-8.

14. Crump J.A., Medalla F.M., Joyce K.W., et al. Antimicrobial resistance among invasive nontyphoidal Salmonella enterica isolates in the United States: National Antimicrobial Resistance Monitoring System, 1996 to 2007. Antimicrob Agents Chemother 2011; 55(3):1148-54.

15. Marimon J.M., Gomariz M., Zigorraga C., Cilla G., Perez-Trallero E. Increasing prevalence of quinolone resistance in human nontyphoid Salmonella enterica isolates obtained in Spain from 1981 to 2003. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48(10):3789-93.

16. Keddy K.H., Dwarika S., Crowther P., et al. Genotypic and demographic characterization of invasive isolates of Salmonella Typhimurium in HIV co-infected patients in South Africa. J Infect Dev Ctries 2009; 3(8):585-92.

17. Robins-Browne R.M., Rowe B., Ramsaroop R., et al. A hospital outbreak of multiresistant Salmonella typhimurium belonging to phage type 193. J Infect Dis 1983; 147(2):210-6.

18. Tamang M.D., Nam H.M., Kim A., et al. Prevalence and mechanisms of quinolone resistance among selected nontyphoid Salmonella isolated from food animals and humans in Korea. Foodborne Pathog Dis 2011; 8(11):1199-206.

19. Cloeckaert A., Chaslus-Dancla E. Mechanisms of quinolone resistance in Salmonella. Vet Res 2001; 32(3-4):291-300.

20. Heisig P. High-level fluoroquinolone resistance in a Salmonella typhimurium isolate due to alterations in both GyrA and gyrB genes. J Antimicrob Chemother 1993; 32(3):367-77.

21. Aarestrup F.M., Wiuff C., Molbak K., Threlfall E.J. Is it time to change fluoroquinolone breakpoints for Salmonella spp.? Antimicrob Agents Chemother 2003; 47(2):827-9.

22. Nishino K., Latifi T., Groisman E.A. Virulence and drug resistance roles of multidrug efflux systems of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Mol Microbiol 2006; 59(1):126-41.

23. Strahilevitz J., Jacoby G.A., Hooper D.C., Robicsek A. Plasmid-mediated quinolone resistance: a multifaceted threat. Clin Microbiol Rev 2009; 22(4):664-89.

24. Martinez-Martinez L., Eliecer Cano M., Manuel Rodriguez-Martinez J., Calvo J., Pascual A. Plasmid-mediated quinolone resistance. Expert Rev Anti Infect Ther 2008; 6(5):685-711.

25. Martinez-Martinez L., Pascual A., Jacoby G.A. Quinolone resistance from a transferable plasmid. Lancet 1998; 351(9105):797-9.

26. Robicsek A., Strahilevitz J., Jacoby G.A., et al. Fluoroquinolone-modifying enzyme: a new adaptation of a common aminoglycoside acetyltransferase. Nat Med 2006; 12(1):83-8.

27. Baucheron S., Tyler S., Boyd D., Mulvey M.R., Chaslus-Dancla E., Cloeckaert A. AcrAB-TolC directs efflux-mediated multidrug resistance in Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48(10):3729-35.

28. Gunell M., Webber M.A., Kotilainen P., et al. Mechanisms of resistance in nontyphoidal Salmonella enterica strains exhibiting a nonclassical quinolone resistance phenotype. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53(9):3832-6.

29. Butaye P., Michael G.B., Schwarz S., Barrett T.J., Brisabois A., White D.G. The clonal spread of multidrug-resistant non-typhi Salmonella serotypes. Microbes Infect 2006; 8(7):1891-7.

30. Randall L.P., Eaves D.J., Cooles S.W., et al. Fluoroquinolone treatment of experimental Salmonella enterica serovar Typhimurium DT104 infections in chickens selects for both GyrA mutations and changes

in efflux pump gene expression. J Antimicrob Chemother 2005; 56(2):297-306.

31. Ахметова Л.И., Розанова С.М. Чувствительность к антимикробным препаратам штаммов шигелл и сальмонелл, выделенных в Екатеринбурге. КМАХ 2000; 2(3):58-62.

32. Egorova S., Kaftyreva L., Grimont P.A., Weill F.X. Prevalence and characterization of extended-spectrum cephalosporin-resistant nontyphoidal Salmonella isolates in adults in Saint Petersburg, Russia (2002-2005). Microb Drug Resist 2007; 13(2):102-7.

33. Акимкин В.Г., Покровский В.И. Нозокомиальный сальмонеллез взрослых. Издательство РАМН 2002:35-72.

34. Edelstein M., Pimkin M., Dmitrachenko T., et al. Multiple outbreaks of nosocomial salmonellosis in Russia and Belarus caused by a single clone of Salmonella enterica serovar Typhimurium producing an extended-spectrum beta-lactamase. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48(8):2808-15.

35. Козырева В.К., Эйдельштейн М.В., Тапальский Д.В., Азизов И.С., Романов А.В., Козлов Р.С. Клональное распространение CTX-M-5-продуцирующих нозо-комиальных штаммов Salmonella Typhimurium в России, Беларуси и Казахстане. КМАХ 2012; 14(1):38-50.

36. CLSI Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;21st informational supplement. 2011; (31):165.

37. EUCAST Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 2.0. 2012:1-73.

38. Nakaya H., Yasuhara A., Yoshimura K., Oshihoi Y., Izumiya H., Watanabe H. Life-threatening infantile diarrhea from fluoroquinolone-resistant Salmonella enterica Typhimurium with mutations in both GyrA and parC. Emerg Infect Dis 2003; 9(2):255-7.

39. Galan J.C., Tato M., Baquero M.R., Turrientes C., Baquero F., Martinez J.L. Fosfomycin and rifampin disk diffusion tests for detection of Escherichia coli mutator strains. J Clin Microbiol 2004; 42(9):4310-2.

40. Stepanova M.N., Pimkin M., Nikulin A.A., Kozyreva V.K., Agapova E.D., Edelstein M.V. Convergent in vivo and in vitro selection of ceftazidime resistance mutations at position 167 of CTX-M-3 beta-lactamase in hypermutable Escherichia coli strains. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52(4):1297-301.

41. Lindstedt B.A., Vardund T., Aas L., Kapperud G. Multiple-locus variable-number tandem-repeats analysis of Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium using PCR multiplexing and multicolor capillary electrophoresis. J Microbiol Methods 2004; 59(2):163-72.

42. Leclercq R., Canton R., Brown D.F., et al. EUCAST expert rules in antimicrobial susceptibility testing. Clin Microbiol Infect 2011.

43. Levy D.D., Sharma B., Cebula T.A. Single-nucleotide polymorphism mutation spectra and resistance to quinolones in Salmonella enterica serovar Enteritidis with