Роль капсаицин-чувствительных нейронов в регуляции гормонсинтезирующей активности эпителиоцитов тимуса крыс

УДК 616.42: 612.821.8.

Е.М. Жукова

РОЛЬ КАПСАИЦИН-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ НЕЙРОНОВ В РЕГУЛЯЦИИ ГОРМОНСИНТЕЗИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ЭИИТЕЛИОЦИТОВ ТИМУСА КРЫС

ГУ НИИ физиологии СО РАМН, Новосибирск

Исследовали влияние фармакологической блокады капсаицин-чувствительных нейронов (КЧН) на функциональную активность эпителиальных клеток тимуса. В первую неделю действия капсаицина, на фоне выброса нейропептидов КЧН, гистохимическим методом выявлено усиление гормонсинтезирующей активности эпителиоцитов тимуса. Блокада нейропептидов в окончаниях КЧН приводила к истощению структурных резервов тимуса и снижению числа активных тимических эпителиоцитов. Во все сроки эксперимента росло число альдегидфуксинположительных макрофагов в субкапсулярной зоне тимуса, что свидетельствует о развитии защитной реакции — нейрогенного воспаления. Отмечено сходство реакции эпителиоцитов тимуса при фармакологической де-афферентации, иммунизации, старении и действии хронического стресса.

Ключевые слова: тимические эпителиоциты, гормональная активность, нейропептиды, капсаицин-чувствительные нейроны, капсаицин.

Тимус — это не только центральный орган иммуногенеза, но и эндокринная железа. Его эндокринная функция связана с продукцией гормонов эпителиальными клетками [1]. Эпителиоциты составляют опорную структуру железы и продуцируют гормоны: светлые субкап-сулярные — местнодействующие (тимозины, тимопоэтин), а темные внутрикортикальные и медуллярные — дистантнодействующие (ти-мулин), секретируемые в кровь. Дендритные окончания псевдоуниполярных нейропептидсодержащих афферентных нейронов спинальных ганглиев C2-C4 обильно иннервируют тимус [2]. В зоне локализации периферических сенсорных отростков отмечена высокая иммунореактивность к веществу P [3] и значительная плотность N^1 рецепторов к нейропептидам [8].

Первичные афферентные нейроны, согласно современным представлениям, не только передают информацию в ЦНС, но и оказывают локальное действие на периферии. Это — новый аспект изучения физиологических механизмов регуляции гомеостаза. Их роль в регуляции структурной организации и функциональной активности лимфоидных органов не исследована. Имеются лишь отдельные сведения о влиянии неонатального введения капсаицина на иммунный ответ лимфоцитов крови у новорожденных и у взрослых крыс, о снижении в этих

условиях цитотоксическои активности натуральных киллеров, нарушении отдельных этапов дифференцировки тимоцитов [5]. Однако неонатальное введение капсаицина приводит к полной дегенерации сенсорных окончаний, что компенсируется за счет усиления функции адренергических и холинергических нейронов. Такая модель непригодна для исследований физиологической роли КЧН. В связи с этим, проводилась работа с целью выявления изменения функциональной активности эпителиоцитов тимуса в динамике после введения половозрелым крысам нейротоксической дозы капсаицина, позволяющей временно «выключать» афферентную импульсацию.

Материалы и методы

Эксперименты выполнены на 40 половозрелых самцах крыс линии Вистар одного возраста, массой 150-250 г. (питомник РАМН «Столбовая»). Животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении и обычной диете. Капсаицин (Sigma, США, 1% раствор в растворителе) вводили подкожно под легким эфирным наркозом в течение двух дней с интервалом в 12 часов, чтобы устранить эффект сенситизации, в дозах 25, 25, 50 и 50 мг (суммарная нейротоксическая доза 150 мг/кг). Состав растворителя для капсаицина: 10% этиловый спирт, 10% Твин-80, 80% физиологический раствор. Контролем служили 10 живот-

ных, которым вводили только растворитель для капсаицина. Для исследования методом световой микроскопии кусочки тимуса фиксировали в кислом фиксаторе Телесницкого и в жидкости Буена, заливали в парафин. Срезы окрашивали для обзорного просмотра гематоксилином-эозином, для цитологических исследований — азур В-эозином Y по Нохт-Максимову. Для исследования активности эпителиоцитов тимуса проводили окраску его срезов альдегидфукси-ном с докраской смесью Гельми по методу Гы-ба-Дыбана. Метод избирательно выявляет эпи-телиоциты, макрофаги корковой зоны, тканевые базофилы [6]. Высокая цветовая контрастность методики позволяет давать цитофизиологиче-скую характеристику клеточных элементов и судить о степени их функциональной активности. Работа выполнена в соответствии с гуманными нормами, предусмотренными международной ассоциацией исследований на экспериментальных животных и одобрена Этическим комитетом ГУ НИИ физиологии СО РАМН. Статистическую обработку полученных данных производили с помощью стандартной компьютерной программы. Оценку достоверности результатов экспериментов проводили по t-критерию Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Морфометрическими методами не выявлено достоверных количественных изменений эпителиального компонента тимуса после капсаи-циновой обработки, однако визуально отмечались признаки его возбуждения. Это сопровождалось потерей четко выраженной дольчатости гистологических срезов тимуса.

На окрашенных альдегидфуксином по Габа-Дыбану срезах тимуса у опытных крыс через неделю действия капсаицина часто встречались светлые эпителиальные клетки с интенсивно окрашенными в фиолетовый цвет пылевидными включениями вокруг ядра и мелкими вакуолями в цитоплазме. Альдегидфуксинположи-тельные эпителиоциты располагались на срезе рядом или контактировали друг с другом, и их количество было выше нормы (контроль: 13,4±2,7 опыт: 24±2,5; P < 0,01; рисунок).

Эти изменения могут быть результатом усиления процессов синтеза тимических гормонов в ответ на выброс нейропептидов из сенсорных окончаний под влиянием капсаицина. Известно, что эпителиальные клетки тимуса имеют специфические для нейропептидов NK-1 и ванил-лоидные рецепторы [7, 8]. В опытах in vitro от-

Рис. Изменение числа альдегидфуксинположительных эпителиоцитов (Эп АФ+) и макрофагов (Мф АФ+) на стандартной площади среза тимуса у контрольных крыс и в разные сроки после введения капсаицина (Кс, 150 мг/кг).

* — P < 0,05; ** — P < 0,01 к уровню контроля.

мечено усиление функциональной активности эпителиальных клеток разных органов после введения эндогенных нейропептидов и стимулирующих (малых) доз капсаицина [14].

Во вторую неделю действия препарата количество эпителиоцитов, окрашенных альдегидфуксином, снижалось в два раза по сравнению с контролем (Р < 0,05) и в три раза (Р < 0,01) по сравнению с предыдущим сроком наблюдения (8,1±1,5; рисунок). Наиболее заметно сократилось число окрашенных альдегидфуксином клеток в мозговом веществе тимуса, где локализуются темные эпителиоциты, секретирующие гормон дистантного действия — тимулин. В эпителиальной сети имелись крупные скопления макрофагов. Известно, что уменьшение числа альдегидфуксинположительных эпителиоцитов свидетельствует о снижении функциональной и пролиферативной активности эпителиоцитов тимуса [15]. Эффект связан, вероятно, со снижением уровня нейропептидов вследствие дегенерации периферических сенсорных окончаний, которая развивается во вторую неделю действия нейротоксической дозы капсаицина половозрелым крысам [16].

Ослабление гормонсинтезирующей активности эпителиоцитов тимуса характерны в условиях действия хронического стресса [17], при развитии аллергических, аутоим-мунных процессов [18] и старении [19]. Структурные изменения эпителиальных клеток тимуса у опытных крыс свидетельствовали о снижении функциональной и пролиферативной активности. Аналогичные явления отмечались у животных при старении [20], у генетической линии мышей NZB/W с врожденным аутоиммунным конфликтом,

у больных с ревматическими аутоиммунными и хроническими воспалительными заболеваниями [21].

На 21 день после введения капсаицина гор-монсинтезирующая активность эпителиоцитов тимуса восстанавливалась, количество альде-гидфуксинположительных эптелиоцитов не отличалось от уровня контроля (10,6±1,8; Р < 0,01; рисунок).

Во все сроки действия капсаицина на срезах тимуса, окрашенных по методу Габа-Дыбана, увеличилось количество альдегидфуксинполо-жительных гранул внутри макрофагов коры и субкапсулярной зоны. Альдегидфуксинофи-лия свидетельствует об усилении фагоцитарной активности. Возможно, при этом усиливаются и другие проявления функциональной активности мононуклеарных фагоцитов. Согласно данным литературы, при действии на тахикинино-вые рецепторы усиливается продукция цитоки-нов культивируемыми моноцитами крови [22]. Под действием капсаицина выросло количество альдегидфуксинположительных макрофагов на срезах тимуса (контроль: 6,5±1,6, семь суток действия капсаицина: 11,7±1,5; две недели — 27,6±3,4, три недели — 21,4±2,2, рисунок). Этот рост может вызывать нарушение эвакуации гормонов тимуса.

Интенсивно окрашенные альдегидфуксином макрофаги у обработанных капсаицином крыс в области кортико-медуллярного соединения тимуса контактировали с кровеносными капиллярами, что принято рассматривать как активацию механизмов переноса аутоантигенов из кровеносного русла к внутрити-мусным лимфоцитам для формирования у них естественной толерантности. Увеличение числа макрофагов в субкапсулярной зоне, вероятно, связано с нарушением механизмов эвакуации тимических гормонов. В литературе показано, что при культивировании моноцитов в среде с добавлением субстанции П отмечается повышение их функциональной активности [23]. На 21 сутки после введения капсаицина структура эпителиоцитов тимуса нормализовалась, лишь на отдельных участках присутствовали эпителиоциты, окружающие макрофаги.

Заключение

Полученные результаты можно связать с фазными перестройками уровня сенсорных нейропептидов в разные сроки действия капсаицина. Вероятно, выброс нейропептидов сопровождался значительным усилением синтетических

процессов в эпителиоцитах тимуса и умеренным увеличением фагоцитарной активности макрофагов, при дефиците сенсорных нейропептидов гормонсинтезирующая активность эпителиоцитов снижается, тогда как количество и функциональная активность макрофагов возрастает. В ранние сроки действия препарата на фоне интенсивного выброса нейропептидов из КЧН отмечали расширение микроциркуля-торного русла. Ослабление контроля со стороны сенсорных нейропептидов приводило к уменьшению структурных резервов тимуса, что выражалось в сокращении объема структурнофункциональных зон. На фоне дефицита нейропептидов КЧН гормонсинтезирующая активность эпителиоцитов снижалась, а фагоцитарная активность макрофагов — усиливалась.

ROLE OF CAPSAICINE RESPONSIVE NEURONES IN A REGULATION HORMONAL SYNTHESING ACTIVITY OF EPITHELIAL CELLS OF A THYMUS GLAND OF RATS E.M. Zhukova

Influence of pharmacological blockade capsaicin-sensitive neurons (KSN) on functional activity of thymic epithelial cells was investigated. In the first week of action of a capsaicin, on a background of emission neuropeptides KSN, amplification activity of hormonal synthesis thymic epithelial cells thymus revealed by gistochemical method. The exhaustion of neuropeptides in endings KSN resulted in decreasing of structural reserves тимуса and to reduction of number active thymic epithelial cells. In all terms of experiment the number aldegidfucsinplus macrophages in subcapsular thymic zone grew, that testifies to development of specific protective reaction - neurogenic inflammations. Similarity of reaction thymic epithelial cells in conditions of pharmacological deafferentation, immunizations, ageing and action of chronic stress is marked.

Литература

1. Новых А.А. Особенности ультраструктурной организации эпителио-ретикулярных элементов тимуса / А.А. Новых, Н.Н. Новых, М.А. Саморядова // Морфология. - 2002. - Т.121. - № 2-3. - С. 89.

2. Elfvin L.G. Primary sensory afferents in the thymus of the guinea pig demonstrated with anterogradely transported horseradish peroxidase conjugates / L.G. Elfvin, H. Aldskogius, J. Johansson // Neurosci. Lett. - 1993. -Vol. 5. - № 150(1). - P. 35-38.

3. Jurjus A.R. Distribution of substance P possible cells and nerve fibers in the rat thymus / A.R. Jurjus, N. More,

R.J. Walsh // J. Neuroimmunol. - 1998. - Vol.90. - № 2. -P. 143-148.

4. Cloning and functional expression of a human orthologue of rat vanilloid receptor-1 / P. Hayes, H. Meadows, M. Gunthorpe, et al. // Pain. - 2000. - Vol. 88. - № 2. -P. 205-215.

5. Expression of substance P and its neurokinin-1 receptor on thymocytes: functional relevance in the regulation of thymocyte apoptosis and proliferation / G. Santoni, C. Amantini, R. Lucciarini, et al. // Neuroimmunomodulation.

- 2003. - Vol. 10. - № 4. - P.232-246.

6. Пирс Э. Гистохимия / Э. Пирс. М., 1962. - С. 867.

7. Agonist- induced internalisation of the substance P (NK-1) receptor expressed in epithelial cells / A.M. Garland, E.F. Grady, D. Payan, et al. // Biochemical Journal. - 1994. -Vol. 303. - № 1. - P. 177-186.

8. Characterization of P2 receptors in thymic epithelial cells / R. Bisaggio, O. Nihei, P. Persechini, et al. //Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand). - 2001. - Vol. 47. - №.1. - P.19-31.

9. Expression of vanilloid receptor subtype 1 in cutaneous sensory nerve fibers, mast cells, and epithelial cells of appendage structures / S. Stander, C. Moormann, M. Schumacher, et al. // Exp. Dermatol. - 2004. - Vol. 13. -№ 3. - P. 129-139.

10. Henry K. The human thymus in disease myth particular emphasis on thymus and thymome / K. Henry // The thymus Gland. / Ed.: M. Kendall. - London, 1981. - P. 85-113.

11. Holzer P. Neuroqenic vasodilatation and plasma leakage in the skin / P. Holzer // Gen. Pharmacology. - 1998.

- Vol. 30. - № 1. - P. 5-11.

12. Петров C.A. Способ лечения миопий с использованием БАД / С.А. Петров, Ю.Г. Суховей, Г.А. Аргунова // Тез. V междунар. симп. «Биологически активные добавки к пище и проблемы здоровья семьи». - Красноярск, 2001. - С. 204-205.

13. Зайратьянц О.В. Продукция тимусом иммуномодулирующих полипептидов при его острой инволюции у детей / О.В. Зайратьянц, В.Х. Хавинсон, Л.Г. Кузьменко // Арх. патол. - 1990. - № 1. - С. 25-28.

14. Гриневич Ю.А. Иммунобиология гормонов тимуса / Ю.А. Гриневич, В.Ф. Чеботарев // Киев, 1989. - 124 с.

15. Age-dependent loss in Mew Zealand Mice of morphological functional characteristics of thymine epithelial cells / M. Gershwin, R. Ikeda, W. Kruse, et al. // J. Immunol. -1978. - Vol. 12. - P. 971-973.

16. Nitric oxide induces murine thymocite apoptosis by oxidative injury and a p53-dependent mechanism /

S.A. Gordon, W. Abou-Jaoude, R. Hoffman, et al. // J. Leukoc. Biol. - 2001. - Vol. 70. - № 1. - P.87-95.

17. Effect of substance P on cytokine production by human astrocytic cells: Characterization of novel tachykinin receptor antagonists / J.M. Derocq, M. Segui, C. Blazy, et al. // FEBS Letters. - 1996. - Vol. 399. - № 3. - P. 321-325.

18. Influence of several peptidase inhibitors on the pro-inflammatory effects of substance P, capsaicin and collagenase / J. Damas, V. Bourdon, J.F. Liegeois, et al. // Naunyn-Schmiedebergs Arch. of pharm. - 1996. - Vol. 354. - № 5. -P. 662-669.