Влияние повышенной Са 2+-зависимой калиевой проницаемости на деформируемость эритроцитов

УДК 612 . 1

О. А. Трубачева, Е. В. Шахристова, А. И. Галич, И. В. Петрова

ВЛИЯНИЕ ПОВЫШЕННОЙ Са2+-ЗАВИСИМОЙ КАЛИЕВОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ НА ДЕФОРМИРУЕМОСТЬ эРИТРОЦИТОВ1

Методами лазерной эктацитометрии и спектрофотометрии установлено, что увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция вызывает снижение деформируемости и уменьшение объема эритроцитов человека.

Ключевые слова: эритроциты, Са2+-зависимая калиевая проницаемость, деформируемость.

Деформируемость является важнейшим свойством эритроцитов, обусловливающим их способность выполнять физиологические функции. Проходя через капилляры, эритроциты подвергаются существенным деформациям, но при этом не изменяют свои объем и площадь поверхности, что поддерживает процессы диффузии газов на высоком уровне. Одной из причин снижения деформируемости эритроцитов служит увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция [1, 2]. Другим следствием роста внутриклеточной концентрации ионов кальция является открывание Са2+-активируемых К+-каналов, обеспечивающих выход ионов калия из эритроцитов [3]. Не исключено, что утечка ионов калия из эритроцитов оказывает определенное влияние на деформируемость эритроцитов.

Цель исследования - изучить влияние Са2+-за-висимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов на их деформируемость.

Материал и методы

В работе использовалась кровь практически здоровых добровольцев (12 человек). Кровь забиралась из локтевой вены утром натощак в пробирки с гепарином (25 ед/мл крови). После центрифугирования (1000 g, 5 мин, 4 °С) плазму и клетки белой крови удаляли, а эритроциты дважды промывали тремя частями изоосмотического раствора NaCl (150 мМ), содержащего 5 мМ Na-фосфатный буфер (рН 7.4) при тех же условиях центрифугирования. Для дальнейших исследований осажденные эритроциты помещали в изоосмотическую среду N (320 мосм) (150 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 10 мМ глюкозы), в гиперкалиевую среду (10 мМ NaCl, 140 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 10 мМ глюкозы), гипоосмотическую среду (220 мосм) (100 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 1 мМ MgCl2, 10 мМ глюкозы) либо в гиперосмотическую среду (420 мосм) (100 мМ сахароза, 150 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 1 мМ MgQ2, 10 мМ глюкозы) в соотношении 1:20. Для исследования деформируемости осажденные эритроциты помещали в вязкую среду, содержащую

0.2 % высокомолекулярного полиэтиленоксида с

молекулярной массой М = 5.8 106, 2 % альбумина и 0.9 % натрия хлорида.

Исследование деформируемости эритроцитов проводили методом лазерной дифрактометрии, или эктацитометрии [4] в диапазоне скоростей сдвига от 90 до 890 с-1. В основу метода положено явление дифракции световых лучей при прохождении через тонкий слой жидкости с взвешенными в ней частицами [4]. В результате на экране отображается дифрактограмма, представляющая собой ряд чередующихся концентрических окружностей: светлых - дифракционных максимумов и темных - минимумов. Изменение этой картины отражает изменения в форме взвешенных рассеивателей, в данном случае - эритроцитов при приложении напряжения сдвига [5]. Для количественной оценки деформируемости эритроцитов рассчитывался индекс деформируемости эритроцитов (ИДЭ): ИДЭ = (L-H)/(L+H), где L - больший диаметр эллипса; Н - меньший диаметр эллипса. Значения ИДЭ, полученные для клеток прединкубирован-ных в среде N (контроль) принимали за 100 %.

Для регистрации изменений объема эритроцитов использовался метод, предложенный в работе [6] и основанный на том, что при изменении объема эритроцитов изменяется светорассеяние суспензии клеток.

Для активации Са2+-зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов в среду инкубации клеток добавляли 0.5 мкМ Са2+-ионофора А23187 и 50 или 300 мкМ CaCl2. Как было показано ранее, в этих условиях развивалась гиперполяризация мембраны эритроцитов вследствие утечки ионов калия [7].

Анализ данных проводили при помощи программы Statistica 6.0 for Windows фирмы Statsoft [8]. Фактические данные представлены в виде X ± m, где Х - среднее значение, m - стандартная ошибка среднего. Для проверки гипотезы об однородности двух независимых выборок использовался U-критерий Манна - Уитни. Для проверки однородности парных или зависимых выборок был использован Т-критерий Вилкоксона. Различия счи-

1 Работа выполнена при поддержке ФЦП (госконтракт П445) .

тали достоверными при уровне значимости р < 0.01 или р < 0.05.

Результаты и обсуждение

Индексы деформируемости эритроцитов, инкубированных в среде N и гиперкалиевой среде в отсутствие Са2+-ионофора и хлорида кальция, не отличались. Прединкубация эритроцитов в среде N. содержащей 0.5 мкМ Са2+-ионофора А23187 и 300 мкМ СаС12, приводила к снижению ИДЭ на всех скоростях сдвига в среднем на 30-45 % (п = 7. р < 0.05) (таблица). По нашему предположению, одной из причин снижения деформируемости эритроцитов в этих условиях может быть активация Са2+-

Другим приемом для прекращения выхода ионов калия из эритроцитов является устранение калиевого градиента, к чему приводит инкубация клеток в гиперкалиевой среде. Действительно, инкубация эритроцитов в гиперкалиевой среде, содержащей 0.5 мкМ Са2+-ионофора А23187 и 300 мкМ СаС12, также вызывала рост ИДЭ по сравнению со значениями, полученными в среде N в присутствии А23187 и 300 мкМ СаС12 (таблица). Внесение клотримазола в гиперкалиевую среду приводило к еще более выраженному увеличению исследуемого параметра. Однако полного восстановления индекса деформируемости эритроцитов в этих условиях не происходило, поскольку увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция помимо открывания Са2+-активируемых К+-каналов приводит к нарушению состояния белков мембранного каркаса, изменениям в липидном матриксе мембраны, что играет важную роль в деформируемости эритроцитов [3, 9].

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об участии Са2+-зависимой калиевой проницаемости в изменении деформируемости эритроцитов.

Известно, что изменение транспорта ионов через эритроцитарную мембрану может приводить к изменению объема этих клеток [6]. Выход ионов калия из эритроцитов влечет за собой их дегидратацию и, следовательно, сжатие [3]. Имеются сведения, что при инкубации эритроцитов с кальцие-

зависимой калиевой проницаемости мембраны эритроцитов, которая обусловлена открыванием Са2+-активируемых К+-каналов. Для проверки этого предположения был использован подход, связанный с прекращением выхода ионов калия из клеток: обработка эритроцитов блокатором Са2+-акти-вируемых К+-каналов клотримазолом и прединкубация эритроцитов в гиперкалиевой среде. Внесение 2 мкМ клотримазола в среду инкубации эритроцитов (среду N в присутствии А23187 и 300 мкМ СаС12 приводило к достоверному увеличению ИДЭ в среднем на 15-20 % по сравнению со значениями, полученными в отсутствие блокатора.

вым ионофором иономицином клетки из дискоци-тов переходят в эхиноциты и сфероциты [10]. Возможно, именно уменьшение объема и изменение формы эритроцитов является причиной снижения их деформируемости.

В настоящей работе спектрофотометрическим методом также изучено изменение объема эритроцитов в условиях активации Са2+-зависимой калиевой проницаемости клеток. Предварительно было проведено исследование изменений объема эритроцитов при их инкубации в гипо- и гиперосмо-тической средах. Перенос эритроцитов в гипоос-мотическую среду приводил к достоверному снижению показателя светорассеяния суспензии клеток, а инкубация эритроцитов в гиперосмотиче-ской среде вызывала увеличение этого показателя (рис. 1), что свидетельствовало о набухании и сжатии клеток крови соответственно.

Внесение 0.5 мкМ А23187 в суспензию клеток, инкубированных в среде N в присутствии 50 мкМ СаС12, приводило к увеличению показателя светорассеяния, что свидетельствовало о сжатии клеток (рис. 2).

Подтверждением участия Са2+-активируемых К+-каналов в уменьшении объема эритроцитов служат данные о возвращении показателя светорассеяния к контрольным значениям при инкубации клеток в присутствии блокатора каналов клотримазола (2 мкМ) на фоне 0.5 мкМ А23187 и 50 мкМ СаС12.

Индекс деформируемости эритроцитов (%), измеренный в различных условиях

Факторы, влияющие на деформируемость эритроцитов

Скорость сдвига Среда N Гиперкалиевая среда

с-1 0.5 мкМ А23187, 300 мкМ СаС12

2 мкМ клотримазола 2 мкМ клотримазола

90 70.266 ± 0.2 %* 87.45 ± 0.5 %# 74.08 ± 0.84 % 90.61 ± 0.06 %#

180 57.54 ± 1.26 %* 74.061 ± 0.46 %# 63.67 ± 0.11 % # 78.0 ± 2.16 %#

360 50.59 ± 0.40 %* 63.99 ± 0.4 %# 69.48 ± 0.23 %# 71.58 ± 1.83 %#

890 55.46 ±20.46 %* 65.33 ± 0.05 %# 67.125 ± 0.76 %# 74.98 ± 0.37 %#

Примечание: за 100 % приняты значения ИДЭ в контрольных экспериментах. * - р < 0.05 (п = 7) по сравнению с контролем (среда N в отсутствии А23187 и СаС12); # - р < 0.05 (п = 7) по сравнению со значениями ИДЭ, полученными в присутствии 0.5 мкМ А23187 и 300 мкМ СаС12.

осмолярность, мосм

Рис . 1. Зависимость показателя светорассеяния суспензии эритроцитов от осмолярности среды инкубации . * Отмечены показатели светорассеяния эритроцитов, достоверно

1.50

1.45

1.40

1.35

1.30

1.25

1.20

1.15

1.10

1

2

Рис . 2 . Изменения показателя светорассеяния суспензии эритроцитов в средах разного состава . 1 - изоосмотическая среда;

2 - изоосмотическая среда содержит 0 . 5 мкМ А23187 и 50 мкМ СаС12 . * Обозначены показатели, достоверно (р<0 . 01, п = 45) отличающиеся от измеренных в отсутствие А23187

*

Таким образом, в настоящем исследовании уста- увеличение Са2+-зависимой калиевой проницаемо-

новлено, что одной из причин снижения деформиру- сти мембраны эритроцитов, обусловленное открыва-

емости эритроцитов в условиях повышения внутри- нием Са2+-активируемых К+-каналов, что приводит к

клеточной концентрации ионов кальция является дегидратации клеток и уменьшению их объема.

Список литературы

1. Катюхин Л . Н . Реологические свойства эритроцитов . Современные методы исследования // Рос . физиол . журнал им . И . М . Сеченова . 1995. № 6 (81) .С .122-129 .

2 . Яхонтов С .В .и др . Механизмы и факторы взаимодействия звеньев сердечно-сосудистой системы при переходных процессах // Вестн .

Томского гос . пед . ун-та . 2010 . Вып . 3(93) . С . 149-155.

3 . Freedman J . C ., Bifano E . M . , Crespo L . M . еі al . Membrane potential and cytotoxic Ca cascade of human red blood cell // Physiol . Blood: 41st

Annu . Symp . Soc . Gen . Physiol . Woods Hole, Mass . 9-12 Sept. 1987 . N . -Y 1988. P. 217-231.

4 . Bessis M . , Mohandas N .A diffractometric method for the measurement of cellular deformability // Blood cells . 1975. № . 2 (1) .P. 307-313.

5 . Bessis M . et al . Automated ektacytometry: a new method of measuring red cell deformability and red cell indices // Blood Cells . 1980 . № 3(6) .

P. 315-327 .

6 . Орлов С . Н ., Покудин Н . И . , Ряжский Г. Г. и др . О механизме регуляции транспорта ионов через плазматическую мембрану при измене-

нии объема клетки // Биол . мембраны . 1988. № 8(5) . С . 1030-1041.

7 . Орлов С . Н . , Петрова И . В . , Покудин Н . И . и др . Са2+-активируемые калиевые каналы эритроцитов, исследованные методом регистра-

ции Са2+-индуцированных изменений мембранного потенциала // Биол . мембраны . 1992 . № 8(9) . С . 885-903.

8 . Боровиков В . П ., Боровиков И . П . Статистический анализ и обработка данных в среде Windows. М . : Филинъ, 1997 . 608 с.

9 . Weed R . I . et al . Metabolic dependence of red cell deformability // J . Clin . Invest . 1969 . V. 48 . P. 795-809 .

10 . Миндукшев И . В . , Кривошлык В . В . , Добрылко И . А. и др . Нарушение деформационных и транспортных характеристик эритроцитов при

развитии у них апоптоза // Биол . мембраны . 2010 . № 1(27) . С . 28-38.

Трубачева О. А., младший научный сотрудник.

Научно-исследовательский институт кардиологии Сибирского отделения РАМН.

Ул. Киевская, 111 а, г. Томск, Томская область, Россия, 634012.

E-mail: otrubacheva@inbox.ru

Шахристова Е. В., зав. лабораторией.

Сибирский государственный медицинский университет.

Московский тракт, 2, г. Томск, Томская область, Россия, 634050. E-mail: shaxristova@yandex.ru

Галич А. И., студент.

Сибирский государственный медицинский университет.

Московский тракт, 2, г. Томск, Томская область, Россия, 634050.

E-mail: galalyona@mail.ru

Петрова И. В., доктор биологических наук, профессор кафедры.

Сибирский государственный медицинский университет.

Московский тракт, 2, г. Томск, Томская область, Россия, 634050.

E-mail: ivpetrova57@yandex.ru

Материал поступил в редакцию 24.02.2011. O. A. Trubacheva, E. V. Shakhristova, A. I. Galich, I. V. Petrova

the effect of elevated ca2+-dependent potassium permeability of erythrocyte deformability

Methods of laser ektacytometry and spectrophotometry revealed that the increase in intracellular calcium ion concentration causes a decrease in deformability and a reduction in human erythrocytes.

Key words: erythrocytes, Ca2+-dependentpotassium permeability, deformability.

Trubacheva O. A.

Research Institute of Cardiology, Siberian Branch of RAMS.

Ul. Kiyevskaya, 111 a, Tomsk, Tomsk region, Russia, 634012.

E-mail: otrubacheva@inbox.ru

Shakhristova E. V

Siberian State Medical University.

Moskovskiy trakt, 2, Tomsk, Tomsk region, Russia, 634050.

E-mail: shaxristova@yandex.ru

Galich A. I.

Siberian State Medical University.

Moskovskiy trakt, 2, Tomsk, Tomsk region, Russia, 634050.

E-mail: galalyona@mail.ru

Petrova I. V

Siberian State Medical University.

Moskovskiy trakt, 2, Tomsk, Tomsk region, Russia, 634050.

E-mail: ivpetrova57@yandex.ru