МОДИФИЦИРОВАННАЯ СУЛЬФАМИДАЗА И СПОСОБ ЕЁ ПОЛУЧЕНИЯ
MODIFIED SULPHAMIDASE AND METHOD FOR PRODUCTION THEREOF

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к модифицированной сульфамидазе, композициям, включающим модифицированную сульфамидазу, и способам получения модифицированной сульфамидазы. Кроме того, раскрыто применение модифицированной сульфамидазы в лечении лизосомной болезни накопления.
Уровень техники
Лизосомная болезнь накопления
Лизосомальный компартмент выполняет функцию катаболического механизма, который расщепляет отходы в клетках. Расщепление достигается посредством целого ряда гидролаз и переносчиков, содержащихся в лизосомах. На сегодняшний день существует свыше 40 установленных наследственных заболеваний, для которых определена связь между заболеванием и мутациями в генах, кодирующих лизосомальные белки. Эти заболевания определены как лизосомные болезни накопления (ЛБН) и характеризуются накоплением метаболита (или метаболитов), которые невозможно расщепить по причине недостаточной способности к расщеплению. В результате избыточного лизосомального накопления метаболита лизосомы увеличиваются в размере. Хотя патология процесса накопления аккумулированного вещества не полностью понятна, она может включать такие механизмы, как ингибирование аутофагии и индуцирование апоптоза клеток (Сох & , J Pathol 226: 241-254 (2012)).
Ферментозаместительная терапия
Накопление может быть уменьшено введением лизосомального фермента из гетерологичного источника. Точно установлено, что внутривенное введение лизосомального фермента приводит к его быстрому захвату клетками посредством механизма, названного рецепторно-опосредованным эндоцитозом. Этот эндоцитоз опосредован рецепторами на клеточной поверхности, и, в частности, показано, что основное значение в захвате некоторых лизосомальных ферментов имеют два маннозо-6-фосфатных рецептора (М6ФР) (Neufeld; Birth Defects Orig Artic Ser 16: 77-84 (1980)). М6ФР различают фосфорилированные олигоманнозные гликаны, которые характерны для лизосомальных белков.
На сегодняшний день методы ферментозаместительной терапии (ФЗТ), основанные на принципе рецепторно-опосредованного эндоцитоза, доступны для шести ЛБН (болезни Гоше, болезни Фабри, болезни Помпе и мукополисахаридозов I, II и VI типа). Эти методы лечения являются эффективными в снижении лизосомального накопления в различных периферических органах и таким образом улучшают некоторые симптомы, связанные с патологией.
Однако большинство ЛБН вызывает лизосомальное накопление в центральной нервной системе (ЦНС) и, следовательно, дает набор признаков и симптомов, связанных с ЦНС. Основным недостатком внутривенно введенной ФЗТ является плохое распределение в ЦНС. ЦНС защищена от воздействия передаваемых через кровь соединений гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ), образованным эндотелием ЦНС. Эндотелиальные клетки ГЭБ представляют собой непроницаемые перегородки, которые предотвращают парацеллюлярный транспорт, ограничивают пассивный эндоцитоз и кроме этого лишены способности к рецепторно-опосредованному трансцитозу, встречающемуся в других тканях. Например, у мышей М6ФР опосредованный перенос через ГЭБ наблюдается только до двух недель после рождения (Urayama et al, Mol Ther 16: 1261-1266 (2008)).
Гликозилирование лизосомальных ферментов
В большинстве случаев процессы N-гликозилирования происходят в мотиве последовательности Asn-X-Ser/Thr. К этому мотиву первичная сердцевинная структура N-гликана переносится под действием гликозилтрансферазы олигосахарилтрансферазы в пределах ретикулума. Эта общая основа для всех несвязанных гликанов состоит из 14 остатков: 3 глюкоз, 9 манноз и 2 N-ацетилглюкозаминов. Этот предшественник превращается в три основных типа N-гликанов; олигоманнозный, комплексный и гибридный (фигура 7), под действием многочисленных ферментов, которые как уменьшают начальную сердцевину, так и добавляют новые сахарные группировки. Каждый зрелый N-гликан содержит общую сердцевину Man(Man)2-GlcNAc-GlcNAc-Asn, где Asn является местом присоединения к белку.
nd
Кроме того, белки, направленные к лизосоме, несут один или более N-гликанов, которые фосфорилируются. Фосфорилирование происходит в комплексе Гольджи и инициируется добавлением N-ацетилглюкозамин-1-фосфата к С-6 маннозным остаткам N-гликанов олигоманнозного типа. N-ацетилглюкозамин расщепляется, образуя остатки маннозо-6-фосфата (М6Ф), которые распознаются М6ФР и вызывают перенос лизосомального белка к лизосоме. Полученный в результате N-гликан обрезается в точке, где М6Ф является концевой группой цепи N-гликана (Essentials of Glycobiology. 2 edition. Varki A, Cummings RD, Esko JD, et al., editors. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009).
Сайту связывания М6ФР требуется концевая М6Ф группа, которая является целой, поэтому и сахарная группировка, и фосфатная группа участвуют в связывании с рецептором (Kim et al., Curr Opin Struct Biol 19(5):534-42 (2009)).
Ферментозаместительная терапия, направленно действующая на мозг посредством модификации гликана
Возможная стратегия увеличения распредения лизосомального фермента в ЦНС раскрыта в WO 2008/109677. В этой опубликованной заявке описана химическая модификация В-глюкуронидазы при использовании метапериодата натрия и боргидрида натрия (смотрите также Grubb et al., Proc Natl Acad Sci USA 105: 2616-2621 (2008)). Эта модификация, заключающаяся в окислении 20 мМ периодатом натрия в течение 6,5 часов с последующим гашением, диализом и восстановлением 100 мМ раствором боргидридом натрия в течение ночи (называемая далее в этом документе как известный способ), по существу улучшила распределение в ЦНС β-глюкуронидазы и привела в результате к выведению нейронального накопления на мышиной модели ЛБН мукополисахаридоза VII. Несмотря на то, что лежащий в основе механизм распределения в головном мозге не совсем ясен, было отмечено, что химическая модификация разрушала структуру гликана до β-глюкуронидазы, и кроме того было показано, что рецепторно-опосредованный эндоцитоз под действием М6ФР был сильно понижен.
Стратегию химической модификации исследовали для других лизосомальных ферментов. Например, модификация согласно известному способу не улучшала распределение в головном мозге внутривенно введенной протеазы трипептидилпептидазы I (Meng et al., PLoS One (2012)). He было получено удовлетворительных результатов для сульфамидазы. Сульфамидаза, химически модифицированная согласно известному способу, действительно демонстрировала увеличенный период полувыведения у мышей, но не влияла на мукополисахаридоз IIIA типа (МПС IIIA) в головном мозге мышей. Химически модифицированная сульфамидаза не распределялась в паренхиме головного мозга при повторном внутривенном введении (Rozaklis et al, Exp Neurol 230: 123-130 (2011)).
Таким образом, все еще не существует эффективной ФЗТ для лечения ЛБН с неврологическими последствиями, таких как МПС IIIA. Новые соединения сульфамидазы, способные проникать через ГЭБ, в то же время оставаясь ферментативно активными, имели бы большое значение в разработке вводимых в системный кровоток соединений для методов ферментозаместительной терапии для лечения ЛБН со связанной с ЦНС патологией, таких как МПС IIIA.
Раскрытие изобретения
Объектом настоящего изобретения являются новые соединения сульфамидазы, позволяющие разработать ферментозаместительную терапию для ЛБН, таких как МПС IIIA.
Другим объектом настоящего изобретения является новое соединение сульфамидазы, которое способно проникать через гематоэнцефалический барьер у млекопитающих и проявлять ферментативную (каталитическую) активность в головном мозге указанного млекопитающего.
Еще одним объектом настоящего изобретения является новое соединение сульфамидазы, проявляющее улучшенную стабильность.
Эти и другие объекты, являющиеся очевидными квалифицированному специалисту в области настоящего изобретения, осуществимы разными аспектами изобретения, определенными в прилагаемой формуле изобретения и большей частью раскрытыми в данном документе.
В одном из аспектов изобретения предложена модифицированная сульфамидаза, не включающая по существу эпитопы, распознаваемые гликан-распознающими рецепторами, что позволяет проникать указанной сульфамидазе через гематоэнцефалический барьер млекопитающего и проявлять каталитическую активность в головном мозге указанного млекопитающего.
Модифицированная сульфамидаза согласно изобретению изменена таким образом, что эпитопы, распознаваемые гликан-распознающими рецепторами, удалены, например, в сравнении с немодифицированной сульфамидазой (SEQ ID NO 1). Как показано заявителем, например в прилагаемых примерах, такая модифицированная сульфамидаза менее подвержена клеточному захвату, что является следствием удаления эпитопов, распознаваемых гликан-распознающими рецепторами, такими как два маннозо-6-фосфатных рецептора (М6ФР) (смотрите примеры 6 и 7). Почти полное отсутствие указанных эпитопов уменьшает сродство модифицированной сульфамидазы к рецепторам, распознающих гликаны. В частности, это может уменьшить рецепторно-опосредованный эндоцитоз модифицированной сульфамидазы в периферической ткани, что в свою очередь может привести к пониженному выведению модифицированной сульфамидазы из плазмы, например, при внутривенном введении млекопитающему. Это, вероятно, происходит, по меньшей мере, частично из-за ингибирования опосредованного рецепторами захвата в периферической ткани после химической модификации сульфамидазы (как показано в исследованиях клеточного захвата в примере 6). С точки зрения перспективного дозирования пониженное выведение модифицированной сульфамидазы может преимущественно позволить разработать лекарства пролонгированного действия, которые можно реже вводить пациентам.
Под гликан-распознающими рецепторами понимают рецепторы, которые распознают и связывают белки главным образом посредством белковых гликановых группировок. В дополнение к маннозо-6-фосфатным рецепторам примером таких рецепторов может служить маннозный рецептор, который избирательно связывает белки, в которых гликаны имеют подвергающиеся воздействию концевые маннозные остатки. Лектины составляют другое большое семейство рецепторов, распознающих гликаны, примером которых может быть распознающий концевую галактозу асиалогликопротеиновый рецептор 1, распознающий концевые остатки галактозы на гликанах. Таким образом, эпитопы, распознаваемые гликан-распознающими рецепторами можно считать (от части) гликановыми группировками, распознаваемыми указанными рецепторами.
В данном контексте под модифицированной сульфамидазой, по существу не включающей эпитопы, распознаваемые гликан-распознающими рецепторами, предпочтительно следует понимать модифицированную сульфамидазу, почти не содержащую эпитопы, распознаваемые гликан-распознающими рецепторами, или содержащую незначительные количества таких эпитопов. В предпочтительных вариантах изобретения модифицированная сульфамидаза не включает (детектируемые) эпитопы, распознаваемые гликан-распознающими рецепторами. В частности, модифицированная сульфамидаза не включает (детектируемые) маннозо-6-фосфатные группировки, маннозные группировки или группировки галактозы, которые образуют эпитопы, распознаваемые эндоцитозными М6ФР 1 и 2 типа, маннозным рецептором и рецептором галактозы, соответственно. В одном из воплощений изобретения указанные эпитопы могут распознаваться таким образом, по меньшей мере, одним гликан-распознающим рецептором, выбранным из М6ФР 1 и 2 типа, маннозного рецептора и рецептора галактозы. В частности, указанный, по меньшей мере, один гликан-распознающий рецептор, может быть выбран из М6ФР 1 и 2 типа. В соответствии с вышеуказанным, эпитопы, обнаруживаемые на природных гликановых группировках, представляют собой, по меньшей мере, один тип группировки, выбранной из маннозо-6-фосфатной группировки, маннозной группировки и галактозной групировки. В конкретных воплощениях изобретения они отсутствуют в модифицированной сульфамидазе, как раскрыто в данном документе.
Кроме того, модифицированная сульфамидаза согласно аспектам, описанным в данном документе, не только проникает в головной мозг млекопитающего, но и проявляет в нем (сохраненную) ферментативную или каталитическую активность. Ферментативная активность модифицированной сульфамидазы сохраняется, по меньшей мере частично от немодифицированной формы сульфамидазы. Кроме того, ферментативная активность сохраняется по сравнению с сульфамидазой, модифицированной согласно способам предшествующего уровня техники, которая не проявляет ферментативную активность в головном мозге мышей. Таким образом, модифицированная сульфамидаза, как раскрыто в данном документе, может воздействовать на лизосомальное накопление в головном мозге млекопитающих, а именно, уменьшать лизосомальное накопление, например, лизосомальное накопление гексозамин-N-сульфат[α-1,4]уроновой кислоты (ГС-УК), как показано, например, в примере 8. Сохраненная каталитическая активность, например, в зависимости от модификации может зависеть от степени сохранения каталитического аминокислотного остатка на активном участке сульфамидазы.
Сульфамидаза принадлежит к семейству белков сульфатаз. Сульфатазы являются семейством белков общего эволюционного происхождения, которые катализируют гидролиз связей сульфатных эфиров целого ряда субстратов. Таким образом, под термином "каталитическая активность" модифицированной сульфамидазы, применяемом в данном описании, понимают гидролиз связей сульфатных эфиров, предпочтительно в лизосомах периферической ткани и/или в лизосомах в головном мозге млекопитающего. Каталитическая активность модифицированной сульфамидазы может таким образом приводить к снижению лизосомального накопления, такого как накопление гепарансульфата, в головном мозге млекопитающего, страдающего от лизосомной болезни накопления. Каталитическую активность можно измерить на животной модели, например, как изложено в примере 8.
Сульфатазы отделяют от общей укладки цепи основной β-лист, который состоит из 10 β-нитей. Активный участок сульфамидазы расположен в конце основного β-листа и содержит сохраненный цистеин в положении 50 SEQ ID NO 1, который посттрансляционно модифицирован до Сα-формилглицина (FGly, от англ. "formylglycine"). Эта реакция проходит в эндоплазматическом ретикулуме под действием FGly-образующего фермента. Остаток FGly в положении 50 (FGly50) принимает непосредственное участие в гидролизе сульфатных эфирных связей, а модификация является необходимой для активации ферментов. Примечательно, что мутация сохранившегося цистеина в серии (Ser) в арилсульфатазе А и В препятствует образованию FGly и приводит к инактивации ферментов (Recksiek et al., J Biol Chem 13; 273(11):6096-103 (1998)). Под термином «сохранение активного сайта», применяемом в данном описании, в первую очередь следует понимать сохранение посттрансляционного FGly50 SEQ ID NO 1. Таким образом, в таких случаях, под термином «модифицированная сульфамидаза» следует понимать модифицированную сульфамидазу, включающую полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO 1, или аминокислотную последовательность, идентичную ей, как определено ниже.
В одном из воплощений указанный активный участок включает каталитический остаток в положении, соответствующем положению 50 SEQ ID NO 1, обеспечивая указанную каталитическую активность. В дополнительном воплощении этот каталитический остаток представляет собой FGly50.
В одном из воплощений модифицированная сульфамидаза имеет относительное содержание природных гликановых группировок приблизительно 25% от содержания природных гликановых группировок в немодифицированной рекомбинантной сульфамидазе. Таким образом, указанные эпитопы, распознаваемые гликан-распознающими рецепторами, могут находиться на природных гликановых группировках, которые по существу отсутствуют в модифицированной сульфамидазе, как описано в данном документе. В предпочтительных воплощениях относительное содержание природных гликановых группировок в модифицированной сульфамидазе может составлять менее 25%, например, менее 20%, например, менее 15%, например, менее 10%, например, менее 5%. В конкретном воплощении содержание природных гликановых группировок составляет менее 1%. Под термином «относительное содержание» гликановых группировок следует понимать содержание природных гликановых группировок, оставшихся неизменными после модификации сульфамидазы. Как показано в прилагаемых примерах, относительное количественное определение гликопептидов может быть основывано на жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (ЖХ-МС) и площадях пиков на реконструированных ионных хроматограммах. Альтернативные способы определения количества известны квалифицированному специалисту в данной области техники. Относительное содержание природных гликанов на уровне менее 25% может преимущественно снижать рецепторно-опосредованный эндоцитоз сульфамидазы в клетках под действием рецепторов, распознающих гликаны, и улучшать прохождение через гематоэнцефалический барьер. Относительное содержание природных гликанов на уровне 25% может быть представлено на одном из природных гликанов, как показано на примере ниже. В этом отношении под термином «природные гликановые группировками» следует понимать естественные гликановые группировки сульфамидазы, которые посттрансляционно модифицированы в эндоплазматическом ретикулуме и компартментах Гольджи эукариотических клеток.
В одном из воплощений изобретения указанные природные гликановые группировки в модифицированной сульфамидазе разрушаются в результате разрывов одинарных и двойных связей, при этом разрушение гликана в результате разрыва одинарных связей является преобладающим. В частности, природные гликановые группировки указанной сульфамидазы разрушаются в результате разрывов одинарных и двойных связей, при этом частота разрывов одинарных связей составляет, по меньшей мере 60% в олигоманнозных гликанах. В конкретных воплощениях изобретения частота разрывов одинарных связей составляет, по меньшей мере 65%, например, по меньшей мере 70%, например, по меньшей мере 75%, например по меньшей мере 80%, например по меньшей мере, 82%, например, по меньшей мере 85% в гликанах олигоманнозного типа. Частоту разрывов одинарных связей по сравнению с разрывами двойных связей можно измерить, как описано в примерах 10 и 11. Как описано в других аспектах данного изобретения, сульфамидазу можно модифицировать в ходе реакции с периодатом, разрушив структуру естественных гликановых группировок сульфамидазы. Оставшуюся гликановую структуру модифицированной сульфамидазы можно, по меньшей мере, частично разрушить одним расщеплением, катализируемым периодатом, т.е. разрыв, по меньшей мере, одной одинарной связи, может происходить в каждой из естественных гликановых группировок. "Модификация" указанной модифицированной сульфамидазы в сравнении с немодифицированной сульфамидазой, по меньшей мере частично представлена указанным разрушением природных гликановых группировок.
В одном из воплощений изобретения модифицированная сульфамидаза включает полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, или полипептид, имеющий, по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1. В неограничивающем примере указанный полипептид имеет, по меньшей мере 90% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1, например, по меньшей мере 95% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1, например, по меньшей мере 98% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 1. Таким образом, модифицированная сульфамидаза согласно данному изобретению может содержать полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, которая в высокой степени идентична SEQ ID NO 1. Указанный полипептид может быть удлинен, например, одной или более С- и/или N-концевой аминокислотой(ами), в результате чего фактическая последовательность модифицированной сульфамидазы длиннее, чем последовательность SEQ ID NO 1. Подобным образом в других случаях модифицированная сульфамидаза может иметь аминокислотную последовательность, которая короче, чем аминокислотная последовательность SEQ ID NO 1, разница в длине, например, может быть результатом удаления(й) аминокислотного остатка(ов) в конкретном положении(ях) последовательности.
В одном из воплощений изобретения указанные эпитопы отсутствуют, по меньшей мере на четырех из пяти участков N-гликозилирования: аспарагин (N) в положении 21 (N(21)), N в положении 122 (N(122)), N в положении 131 (N(131)), N в положении 244 (N(244)) и N в положении 393 (N(393)) SEQ ID NO 1. Другими словами, указанная модифицированная сульфамидаза включает природные гликановые группировки не более чем на одном из указанных участков N-гликозилирования. В конкретных воплощениях изобретения указанная модифицированная сульфамидаза включает природные гликановые группировки на одном из указанных участков N-гликозилирования; указанный участок N-гликозилирования необязательно представляет собой N(131). Другими словами, указанные эпитопы или гликановые группировки отсутствуют в N(21), N(122), N(244) и N(393) указанного полипептида модифицированной сульфамидазы. Преимущества такой модифицированной сульфамидазы, не имеющей гликановые группировки на определенных участках, приведены выше, а именно клеточный захват может быть дополнительно уменьшен, а прохождение через гематоэнцефалический барьер может быть дополнительно облегчено.
В одном из воплощений указанные природные гликановые группировки указанной сульфамидазы соответствуют N-гликозилированию по N в положении 21 (N(21)), N в положении 131 (N(131)), N в положении 244 (N(244)) и N в положении 393 (N(393)) SEQ ID NO 1. Следовательно, немодифицированная сульфамидаза может быть подвергнута естественному гликозилированию на этих четырех участках. В этом воплощении модифицированная таким образом сульфамидаза может иметь относительное содержание природных гликановых группировок в указанных положениях приблизительно или менее 25% от содержания гликановых группировок в соответствующих положениях немодифицированной рекомбинантной сульфамидазы. В одном из контректных воплощений модифицированной сульфамидазы, по меньшей мере три из четырех естественных участков гликозилирования, определенных выше, не имеют эпитопов, распознаваемых гликан-распознающими рецепторами.
Как указано выше, гликановая группировка на участке N-гликозилирования N(131) сульфамидазы представляет собой естественную гликановую группировку, немодифицированной рекомбинантной сульфамидазы. N(131) является участком гликозилирования сульфамидазы, который, как считается, после гликозилирования вызывает основную часть опосредованного рецепторами захвата в периферических тканях по сравнению с другими участками гликозилирования. Разрушение естественной гликановой группировки на N(131), которая относится к олигоманнозному типу, может влиять на выведение модифицированной сульфамидазы из плазмы. Разрушение указанной N(131) олигоманнозы может характеризоваться частотой, по меньшей мере 60% разрывов одинарных связей. Таким образом, разрушение в результате разрывов одинарных связей происходит чаще, чем разрушение в результате разрывов двойных связей.
В одном из воплощений указанные эпитопы отсутствуют на всех указанных пяти участках N-гликозилирования модифицированной сульфамидазы. Следовательно, гликановые группировки отсутствуют на всех пяти участках N-гликозилирования: N в положении 21 (N(21)), N в положении 122 (N(122)), N в положении 131 (N(131)), N в положении 244 (N(244)) и N в положении 393 (N(393)) SEQ ID NO 1. Модифицированная сульфамидаза, не имеющая гликановых группировок в этих пяти участках, может кроме того улучшать фармакокинетику модифицированного фермента, например, дополнительно снижать выведение из плазмы у млекопитающего. Следовательно, частота дозирования модифицированной сульфамидазы может быть уменьшена.
Сульфамидаза человека (классификация ферментов КФ 3.10.1.1; SEQ ID NO 1) кодируется геном N-сульфоглюкозамин сульфогидролаза (SGSH, от англ. N-sulfoglucosamine sulfohydrolase). Также сульфамидаза известна под названиями сульфамидаза, N-сульфоглюкозамин сульфогидролаза, сульфамат сульфогидролаза, гепарансульфат сульфатаза, гепарин сульфамидаза, 2-дезокси-D-глюкозид-2-сульфамат сульфогидролаза и N-сульфо-D-глюкозамин сульфогидролаза, и под термином "сульфамидаза", который используется в данном документе, следует понимать эквивалент этим альтернативным названиям.
В одном из воплощений изобретения указанная модифицированная сульфамидаза выделена.
В одном из воплощений изобретения указанная сульфамидаза представляет собой сульфамидазу человека.
В одном из воплощений изобретения указанная сульфамидаза подвергается гликозилированию перед модификацией.
В одном из воплощений изобретения указанная модифицированная сульфамидаза является рекомбинантной. Сульфамидаза может быть получена рекомбинантно, например, как описано в примере 1 данного документа. Сульфамидаза может быть получена в эукариотических клетках, неограничивающими примерами которых являются клетки яичника китайского хомячка (СНО, от англ. "Chinese ovary hamster"), человеческие эмбриональные клетки почек или лимфоидные клеточные линии мышиного происхождения. Кроме того, сульфамидаза может быть получена в клетках насекомых, клетках растений или дрожжевых клетках. Рекомбинантная человеческая сульфамидаза известна, например, из патентов № US 5,863,782; US 5,972,333; US 6,200,563; US 6,458,579 и US 6,491,913. Следует понимать, что для целей настоящего изобретения, человеческая сульфамидаза может быть получена, как описано в любом из приведенных патентов США, которые включены в данный документ в виде ссылок.
В одном из воплощений указанная модифицированная сульфамидаза включает полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, или полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичности последовательности с полипептидом, как определено в SEQ ID NO 1, где гликановые группировки отсутствуют по меньшей мере на четырех из пяти участков N-гликозилирования: N в положении 21 (N(21)), N в положении 122 (N(122)), N в положении 131 (N(131)), N в положении 244 (N(244)) и N в положении 393 (N(393)) SEQ ID NO 1, и указанная сульфамидаза необязательно имеет неизмененный С-конец. В одном из воплощений этого изобретения С-концевая часть, представленная аминокислотами 436-484 SEQ ID NO 1, является неизмененной.
В одном из аспектов предложена композиция сульфамидазы, включающая модифицированную сульфамидазу, не имеющую по существу эпитопов, распознаваемых гликан-распознающими рецепторами, что позволяет проникать указанной сульфамидазе через гематоэнцефалический барьер млекопитающего, а отношение Сα-формилглицина (FGly) к серину (Ser) на активном участке больше 1, что обеспечивает каталитическую активность в головном мозге млекопитающего. Например, указанная модифицированная сульфамидаза включает полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, или полипептид, имеющий по меньшей мере 95% идентичности последовательности с полипептидом, как определено в SEQ ID NO 1. В таких примерах отношение FGly к Ser может называться отношением FGly50 к Ser50. Определенное таким образом отношение означает, что FGly50 присутствует в большей степени, чем Ser50. Предпочтительно отношение больше 1,5, более предпочтительно больше 2,3, еще более предпочтительно больше 4, и наиболее предпочтительно отношение составляет приблизительно 9. Большое отношение указывает на то, что каталитическая активность модифицированной сульфамидазы в значительной степени может сохраняться от немодифицированной формы сульфамидазы.
Преимущества композиции, включающей модифицированную сульфамидазу, похожи на преимущества модифицированной сульфамидазы. Соответственно, композиция, включающая модифицированную сульфамидазу, может проявлять увеличенный период полураспада в плазме по сравнению с немодифицированной сульфамидазой или композицией, включающей немодифицированную сульфамидазу. Кроме того, указанная модифицированная сульфамидаза может показывать улучшенное распределение в головном мозге млекопитающего, а также сохраненную каталитическую активность в головном мозге по сравнению, например, с немодифицированной сульфамидазой.
В одном из воплощений композиция сульфамидазы имеет относительное содержание природных гликановых группировок приблизительно 25% от содержания природных гликановых группировок в немодифицированной рекомбинантной сульфамидазе. Таким образом, указанные эпитопы, распознаваемые гликан-распознающими рецепторами, могут находиться на природных гликановых группировках, и, следовательно, такие природные гликановые группировки по существу отсутствуют в композиции сульфамидазы, как описано в данном документе. Композиция модифицированной сульфамидазы, где относительное содержание природных гликановых группировок композиции как таковой составляет приблизительно 25%, может, например, быть представлена композицией модифицированной сульфамидазы, в которой каждая сульфамидаза содержит один природный гликан, например одну природную гликановую группировку на одном из вышеприведенных участков N-гликозилирования. Относительное содержание природных гликановых эпитопов в композиции сульфамидазы в предпочтительных воплощениях может составлять менее 20%, менее 15%, менее 10%, менее 5%. В некоторых случаях относительное содержание природных гликановых группировок составляет менее 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, например, менее 0,1%, например, менее 0,01%. Композиция сульфамидазы, имеющей относительное содержание природных гликановых группировок на этих уровнях, является композицией, в которой могут находиться только следовые количества природных гликановых группировок. Таким образом, композиция представляет собой смесь модифицированных сульфамидаз, в которых природные гликановые группировки более или менее разрушены. В конкретном воплощении содержание природных гликановых группировок составляет менее 1%. Относительное содержание природных гликанов на уровне приблизительно или менее 25% может преимущественно снижать рецепторно-опосредованный эндоцитоз сульфамидазы в клетках посредством рецепторов, распознающих гликаны, и улучшать прохождение через гематоэнцефалический барьер.
В одном из конкретных воплощений композиции указанные эпитопы отсутствуют по меньшей мере на четырех из пяти участков N-гликозилирования: аспарагин (N) в положении 21 (N(21)), N в положении 122 (N(122)), N в положении 131 (N(131)), N в положении 244 (N(244)) и N в положении 393 (N(393)) SEQ ID NO 1, предпочтительно указанные эпитопы отсутствуют в N(21), N(122), N(244) и N(393). Другими словами, указанная модифицированная сульфамидаза, содержащаяся в композиции имеет природные гликановые группировки не более чем на одном из указанных участков N-гликозилирования, указанный участок N-гликозилирования необязательно представляет собой N(131).
10
В одном из воплощений композиции не более 5 мас. % указанной модифицированной сульфамидазы находится в мультимерных формах, имеющих молекулярную массу свыше 10 кДа.
В одном из воплощений композиции не более 5 мас. % указанной модифицированной сульфамидазы находится в олигомерных формах, указанные олигомерные формы имеют молекулярную массу между 180 и 480 кДа. Наличие олигомерных, мультимерных или агрегированных форм можно, например, определить с помощью динамического светорассеяния или с помощью гель-проникающей хроматографии. В этой связи под агрегированными формами следует понимать высокомолекулярные формы белка, состоящие из структур, изменяющихся от исходно свернутых до несвернутых мономеров. Агрегированные формы белка могут усиливать иммунный ответ на мономерную форму белка. Наиболее вероятное объяснение увеличенного иммунного ответа заключается в том, что многовалентные формы антигена сшиваются с В-клеточными рецепторами и таким образом вызывают иммунный ответ. Это явление было использовано при производстве вакцины, где антиген представлен хозяину в агрегированной форме, что гарантирует высокий иммунный ответ. Для терапевтических белков это убеждение является противоположным; любое содержание высокомолекулярных форм должно быть сведено к минимуму или устранено, чтобы минимизировать иммунный ответ (Rosenberg, AAPS J, 8:Е501-7 (2006)). Таким образом, уменьшение олигомерных, мультимерных и/или агрегированных форм может способствовать получению фермента, более подходящего для применения в лечении.
Другой аспект агрегации состоит в том, что наличие даже небольшого ее количества в образце может вызвать агрегацию обычно свернутых белков. Агрегированное вещество, как правило, не имеет или имеет низкую остаточную активность и плохую растворимость. Появление агрегатов может быть одним из факторов, которые определяют срок годности биологического лекарства (Wang, Int J Pharm, 185:129-88(1999)).
Термин "композиция", который используется здесь, охватывает твердые и жидкие формы. Композиция предпочтительно может представлять собой фармацевтическую композицию, подходящую для введения пациенту (например, млекопитающему), например, в виде инъекции или перорально.
Кроме того следует понимать, что воплощения и их преимущества, раскрытые в отношении аспектов модифицированной сульфамидазы, также являются воплощениями аспектов композиции. Таким же образом воплощения аспектов композиции также должны рассматриваться как воплощения аспектов модифицированной сульфамидазы, где это применимо.
В одном из воплощений указанная модифицированная сульфамидаза или указанная композиция сульфамидазы предназначена для применения в лечении.
В одном из воплощений указанный головной мозг млекопитающего является головным мозгом человека. В близком воплощении указанное млекопитающее является человеком.
В одном из воплощений указанный головной мозг млекопитающего является головным мозгом мыши. В близком воплощении указанное млекопитающее является мышью.
В одном из воплощений указанная модифицированная сульфамидаза или композиция сульфамидазы предназначена для применения в лечении млекопитающего, страдающего от лизосомной болезни накопления, в частности мукополисахаридоза IIIA (МПС IIIA).
В одном из воплощений указанная модифицированная сульфамидаза или композиция сульфамидазы для применения снижает накопление гепарансульфата в головном мозге указанного млекопитающего. А именно, указанное накопление гепарансульфата уменьшается по меньшей мере на 30%, например, на модели животного, например, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40% или по меньшей мере на 50%.
В одном из аспектов предложена модифицированная сульфамидаза, которую получали в ходе последовательной реакции с периодатом щелочного металла и боргидридом щелочного металла, модифицируя таким образом эпитопы, распознаваемые гликан-распознающими рецепторами сульфамидазы и снижая активность сульфамидазы в отношении указанных рецепторов, в то же время сохраняя каталитическую активность указанной сульфамидазы. Сульфамидазу модифицируют так, что ее эпитопы, или гликановые группировки, находящиеся в ее природной, гликозилированной форме до модификации по существу инактивируются в ходе указанной модификации. Наличие эпитопов, распознаваемых гликан-распознающими рецепторами, было понижено в модифицированной сульфамидазе. Следует понимать, что воплощения и их преимущества, раскрытые в отношении других аспектов, раскрытых в данном документе, таких как аспекты, относящиеся к модифицированной сульфамидазе, композиции и способу получения, также являются воплощениями этого аспекта. А именно, разные воплощения способа, раскрытые далее, дают дополнительное примерное определение получения указанной модифицированной сульфамидазы с точки зрения особых реакционных условий. Подобным образом воплощения, раскрытые выше в отношении аспектов модифицированной сульфамидазы и композиции, дают дополнительное примерное определение модифицированной сульфамидазы.
В одном из аспектов предложен способ получения модифицированной сульфамидазы, согласно которому: а) гликозилированную сульфамидазу подвергают взаимодействию с периодатом щелочного металла, и b) указанную сульфамидазу подвергают взаимодействию с боргидридом щелочного металла в течение периода времени не больше, чем 2 часа; при этом модифицируют гликановые группировки сульфамидазы и снижают активность сульфамидазы в отношении рецепторов, распознающих гликаны, в то же время сохраняют каталитическую активность указанной сульфамидазы. Указанный боргидрид необязательно используют в концентрации между 10 и 80 ммоль/л, например, в концентрации между 10 и 80 ммоль/л.
Таким образом, согласно вышеприведенному способу предложена мягкая химическая модификация сульфамидазы, с помощью которой уменьшают наличие эпитопов, распознаваемых гликан-распознающими рецепторами, указанные эпитопы, например, представлены природными гликановыми группировками, как описано в данном документе. Это преимущественно может давать модифицированную сульфамидазу, подходящую для направленного воздействия на головной мозг млекопитающего. Кроме того, с помощью мягкого способа модифицируют указанные эпитопы по существу без изменения каталитической активности сульфамидазы. В частности, каталитическую активность можно сохранить, сохраняя FGly50 на активном участке сульфамидазы. Таким образом, улучшая распределительные свойства фермента этим способом, не подавляют его каталитическую активность. Дополнительные преимущества модифицированной сульфамидазы, полученной мягким способом, приведены выше, например, для аспектов сульфамидазы и композиции.
Согласно способу проводят модификацию гликана в ходе периодатного расщепления углеродных связей между двумя соседними гидроксильными группами гликановых (углеводных) группировок. В общем, периодатное окислительное расщепление происходит, когда присутствуют вицинальные диолы. Диолы должны находиться в экваториальном - экваториальном или аксиальном - экваториальном положении. Если диолы находятся в жестком аксиальном - аксиальном положении, то реакции не происходит (Kristiansen et al., Car. Res (2010)). Обработка периодатом разрывает связь между С2 и С3 и/или С3 и С4 группировки М6Ф, что дает структуру, которая не способна связываться с М6Ф-рецептором. В общем, другие концевые гексозы будут преобразовываться подобным образом. Неконцевые 1-4 связанные остатки расщепляются только между С2 и С3, тогда как неконцевые (1-3) связанные остатки устойчивы к расщеплению. На фигуре 7 места возможной модификации отмечены звездочкой у трех основных типов N-гликанов; олигоманнозном, комплексном и гибридном. Как дополнительно показано на прилагаемых фигурах 8-10, способ, раскрытый в данном документе, дает модифицированную сульфамидазу, где природные гликановые группировки разрушены в результате ограниченного числа разрывов связей по сравнению с сульфамидазой, модифицированной согласно ранее известным способам. Раскрываемый способ преимущественно дает однотипные разрывы связей в сахарных компонентах гликановых группировок сульфамидазы (см. фигуру 8). Частичное окисление гликана преимущественно с разрывами одинарных связей в сахарных компонентах гликановых группировок является характерным для относительно мягких способов химической модификации, описанных в данном документе. Для получения сульфамидазы с частичным окислением гликана и преимущественными разрывами одинарных связей в сахарных компонентах гликановых группировок можно использовать условия, как описано ниже и как пояснено в примере 4.
Способ получения модифицированной сульфамидазы и модифицированная сульфамидаза, приведенные в данном описании, улучшены относительно способов и соединений предшествующего уровня техники. Прежде всего, изобретатели неожиданно обнаружили, что новая модифицированная сульфамидаза распределяется и проявляет каталитическую активность в головном мозге млекопитающего. Более того в примерах 3 и 5 приведены сравнения между способами и сульфамидазами предшествующего уровня техники и способами и сульфамидазами, приведенными в данном описании. Результаты в этих примерах показывают, что сульфамидаза, модифицированная согласно известным способам, содержит модификации аминокислотных остатков, имеет расщепления полипептидной цепи и агрегацию белка. Особенно интересно наблюдаемое превращение каталитического остатка FGly в остаток Ser на активном участке в сульфамидазе, модифицированной согласно предшествующему способу. Относительно короткая продолжительность стадии восстановления в новом способе вероятно положительно влияет на каталитическую активность модифицированного фермента.
В одном из воплощений аспекта способа указанный гликозилированный полипептид сульфамидазы включает гликановые группировки по меньшей мере на четырех остатках аспарагина (участки N-гликозилирования).
В одном из воплощений аспекта способа указанные гликозилированные остатки аспарагинов представляют собой: N в положении 21 (N(21)), N в положении 131 (N(131)), N в положении 244 (N(244)) и N в положении 393 (N(393)) SEQ ID NO 1. Таким образом, эти участки N-гликозилирования соответствуют природным гликановым группировкам.
В одном из воплощений аспекта способа указанный периодат щелочного металла окисляет цис-гликольные группы гликановых группировок до альдегидных групп.
В одном из воплощений аспекта способа указанный боргидрид щелочного металла восстанавливает указанные альдегиды до спиртов.
В одном из воплощений аспекта способа стадию а) и стадию b) проводят последовательно, не выполняя промежуточную стадию. Изобретатели обнаружили, что стадию b) можно проводить сразу же после стадии а), или после необязательной стадии гашения а2), как описано ниже, тем самым исключая промежуточную стадию для удаления реакционноспособных реагентов, например в ходе диализа, ультрафильтрации, осаждения или замены буфера, и таким образом избегая длительного воздействия реакционноспособных промежуточных альдегидных соединений на сульфамидазу. При выполнении стадии b) после стадии а), или необязательно а2), также преимущественно снижена общая продолжительность реакции.
В следующих абзацах раскрыты конкретные воплощения стадии а). Следует понимать, что если не определено иное, то конкретные воплощения аспектов, раскрытых в данном документе, могут быть объединены.
В одном из воплощений указанный периодат щелочного металла представляет собой метапериодат натрия.
В одном из воплощений указанную реакцию стадии а) проводят в течение периода времени не больше, чем 4 часа, например не больше, чем 3 часа, например не больше, чем 2 часа, например не больше чем 1 час, например приблизительно 0,5 часа. В конкретных воплощениях реакцию стадии а) выполняют в течение по меньшей мере 0,5 часа. Предпочтительно продолжительность реакции составляет приблизительно 3 часа, 2 часа, 1 час или менее 1 часа. Изобретатели обнаружили, что продолжительность стадии а) не больше чем 4 часа, эффективно инактивирует эпитопы, распознаваемые гликан-распознающими рецепторами. Кроме того, продолжительность не больше, чем 4 часа дает меньшую степень нитевых разрывов полипептидной цепи по сравнению со степенью нитевых разрывов, наблюдаемых для сульфамидазы, полученной согласно известным способам. Это было продемонстрировано изобретателями, например, в примерах 4 и 5.
В одном из воплощений указанный периодат используют в (конечной) концентрации не более 20 ммоль/л, например, не более 15 ммоль/л, например приблизительно 10 ммоль/л. Периодат можно использовать в концентрации 8-20 ммоль/л, предпочтительно приблизительно 10 ммоль/л. Альтернативно, периодат используют в концентрации менее 20 ммоль/л, например между 10 и 19 ммоль/л. Обнаружено, что более низкая концентрация периодата щелочного металла, например, метапериодата натрия, снижает степень нитевых разрывов полипептидной цепи, а также сопутствующее окисление аминокислот в боковых цепях, например окисление остатка метионина в положении 226 SEQ ID NO 1 (Met226).
В одном из воплощений указанную реакцию стадии а) проводят при температуре окружающей среды, и предпочтительно при температуре от 0 до 22°С. В предпочтительном воплощении реакцию указанной стадии а) проводят при температуре 0 - 8°С, например, при температуре 0 - 4°С. В предпочтительном воплощении реакцию стадии а) проводят при температуре приблизительно 8°С, при температуре приблизительно 4°С или при температуре приблизительно 0°С.
В одном из воплощений указанную реакцию стадии а) проводят при рН от 3 до 7. Под этим рН следует понимать рН в начале реакции. В конкретных воплощениях рН, используемый на стадии а), составляет 3-6, например 4-5. В конкретных воплощениях рН, используемый на стадии а), составляет приблизительно 6, приблизительно 5 или приблизительно 4. При снижении рН стадии а) можно уменьшить концентрацию периодата или время реакции стадии а).
В одном из воплощений указанный периодат представляет собой метапериодат натрия, и его используют в (конечной) концентрации не более 20 ммоль/л, например, не более 15 ммоль/л, например приблизительно 10 ммоль/л. В одном из воплощений указанный метапериодат натрия используют в концентрации 8-20 ммоль/л. В предпочтительных воплощениях метапериодат натрия используют в концентрации приблизительно 10 ммоль/л.
В одном из воплощений указанный периодат представляет собой метапериодат натрия, и его используют в (конечной) концентрации не более 20 ммоль/л, например не более 15 ммоль/л, например приблизительно 10 ммоль/л, и указанную реакцию стадии а) проводят в течение периода времени не больше, чем 4 часа, например не больше, чем 3 часа, например не больше, чем 2 часа, например не больше, чем 1 час, например, приблизительно 0,5 часа. Таким образом, по сравнению со способами предшествующего уровня техники концентрация периодата 20 ммоль/л и продолжительность реакции не больше, чем 4 часа, могут давать в результате меньше нитевого разрыва и окисления. Снижение концентрации периодата при дополнительном сохранении относительно короткой продолжительности реакции положительно влияет на нитевой разрыв и последующее окисление. Концентрация менее 20 ммоль/л дает в результате меньше нитевого разрыва и окисления, концентрация не более 15 ммоль/л дает в результате еще меньше нитевого разрыва и окисления, а концентрация приблизительно 10 ммоль/л дает в результате наименьшую степень нитевого разрыва и окисления. Как показано в примере 5, модифицированная сульфамидаза согласно аспектам, описанным в данном изобретении, показывает меньше нитевого разрыва, особенно в С-концевой части сульфамидазы, как представлено, например аминокислотами 436-484 SEQ ID NO 1. Обнаружено, что эта С-концевая часть является неизмененной в сульфамидазе, полученной, как описано в данном документе. Кроме того, окисление метионина в положении 226 (Met226) происходит реже.
В одном из воплощений указанный периодат представляет собой метапериодат натрия, и его используют в (конечной) концентрации не более 20 ммоль/л, например не более 15 ммоль/л, например приблизительно 10 ммоль/л, и указанную реакцию стадии а) проводят в течение периода времени не больше, чем 4 часа, например не больше, чем 3 часа, например не больше, чем 2 часа, например не больше, чем 1 час, например приблизительно 0,5 часа, при температуре от 0 до 22°С, например приблизительно 8°С, например приблизительно 0°С.
В одном из воплощений указанный периодат используют в концентрации не более 20 ммоль/л, например не более 15 ммоль/л, например, приблизительно 10 ммоль/л, и указанную реакцию стадии а) проводят в течение периода времени не больше чем 4 часа, например, не больше чем 3 часа, например, не больше чем 2 часа, например, не больше чем 1 час, например, приблизительно 0,5 часа, при температуре от 0 до 22°С, например, при температуре 0 - 8°С, например при температуре 0 - 4°С, например, приблизительно 8°С, например, приблизительно 0°С.
В одном из воплощений указанный периодат представляет собой метапериодат натрия, и указанную реакцию стадии а) проводят в течение периода времени не больше чем 4 часа, например, не больше чем 3 часа, например, не больше чем 2 часа, например, не больше, чем 1 час, например, приблизительно 0,5 часа, при температуре от 0 до 22°С, например, при температуре 0 - 8°С, например, при температуре 0 - 4°С, например, приблизительно 8°С, например, приблизительно 0°С.
В одном из воплощений указанный периодат представляет собой метапериодат натрия, который используют в концентрации не более 20 ммоль/л, например не более 15 ммоль/л, например приблизительно 10 ммоль/л, и указанную реакцию стадии а) проводят при температуре от 0 до 22°С, например, при температуре 0 - 8°С, например, при температуре 0 - 4°С, например, приблизительно 8°С, например, приблизительно 0°С.
В одном из воплощений указанный периодат представляет собой метапериодат натрия, который используют в концентрации приблизительно 10 ммоль/л, и указанную реакцию стадии а) проводят при температуре приблизительно 8°С и в течение периода времени не больше чем 2 часа.
В одном из воплощений указанный периодат представляет собой метапериодат натрия, который используют в концентрации приблизительно 10 ммоль/л, и указанную реакцию стадии а) проводят при температуре 0 - 8°С и в течение периода времени не больше чем 3 часа.
В следующих абзацах раскрыты конкретные воплощения стадии b). Следует понимать, что если не определено иное, то конкретные воплощения могут быть объединены, в частности конкретные воплощения стадии а) и стадии b).
В одном из воплощений указанный боргидрид щелочного металла представляет собой боргидрид натрия.
В некоторых случаях обнаружено, что условия, используемые на стадии b), частично зависят от условий, используемых на стадии а). В тех случаях, когда количество боргидрида, используемого на стадии b), предпочтительно поддерживают как можно ниже, молярное отношение боргидрида к периодату составляет 0,5 - 4 к 1. Таким образом, боргидрид можно использовать на стадии b) в 4 кратном молярном избытке по отношению к количеству периодата, используемого на стадии а). В одном из воплощений указанный боргидрид используют в (конечной) молярной концентрации, не превышающей больше чем в 4 раза (конечную) концентрацию указанного периодата. Например, боргидрид можно использовать в концентрации не превышающей больше чем в 3 раза концентрацию указанного периодата, например, не превышающей больше чем в 2,5 раза концентрацию указанного периодата, например не превышающей больше чем в 2 раза концентрацию указанного периодата, например не превышающей больше чем в 1,5 раза концентрацию указанного периодата, например, в концентрации, приблизительно соответствующей концентрации указанного периодата. Однако в конкретных воплощениях боргидрид используют в концентрации, соответствующей половине концентрации периодата, или в 0,5 кратном избытке. Таким образом, если периодат используют в концентрации приблизительно 20 ммоль/л, боргидрид можно использовать в концентрации не больше чем 80 ммоль/л, или даже в концентрации между 10 и 80 ммоль/л, например в концентрации между 10 и 50 ммоль/л. Если периодат используют в концентрации между 10 и 20 ммоль/л, то боргидрид можно использовать в концентрации между 25 и 80 ммоль/л, такой как, например, 50 ммоль/л. Подобным образом, если периодат используют в концентрации приблизительно 10 ммоль/л, то боргидрид можно использовать в концентрации не больше чем 40 ммоль/л, такой как, например, не больше чем 25 ммоль/л. Кроме того, в таком воплощении боргидрид предпочтительно можно использовать в концентрации между 12 ммоль/л и 50 ммоль/л. Изобретатели обнаружили, что концентрация боргидрида влияла на степень сохранения каталитического аминокислотного остатка на активном участке сульфамидазы, таким образом относительно низкая концентрация боргидрида может давать модифицированную сульфамидазу, сохраняющую каталитическую активность.
В одном из воплощений указанную реакцию стадии b) проводят в течение периода времени не больше чем 1,5 часа, например, не больше чем 1 час, например, не больше чем 0,75 часа, например, приблизительно 0,5 часа. Продолжительность реакции предпочтительно составляет приблизительно 1 час или менее 1 часа. В некоторых случаях продолжительность реакции стадии b) составляет приблизительно 0,25 часа. В дополнительных воплощениях реакцию стадии b) можно проводить в течение периода времени от 0,25 часа до 2 часов. Как объяснено выше, обнаружено, что продолжительность стадии восстановления влияет на каталитическую активность сульфамидазы. Таким образом, относительно короткая продолжительность реакции может давать модифицированную сульфамидазу, содержащую скорее FGly50, чем Ser50. Более того обнаружено, что короткая продолжительность реакции благоприятно влияет на общую структурную целостность фермента. А именно, агрегация белка, приводящая к высокомолекулярным формам сульфамидазы, а также возникновению нитевого разрыва, вероятно в некоторой мере связана с временем реакции. Таким образом, относительно короткая продолжительность реакции стадии b) может уменьшать возникновение агрегатов, а также нитевых разрывов. Как уже объяснялось в этом тексте, уменьшенное присутствие агрегированных форм может делать белок более подходящим для применения в лечении.
В одном из воплощений указанную реакцию стадии b) проводят при температуре от 0 до 8°С. Обнаружено, что температура реакции стадии b) по меньшей мере частично влияет на каталитическую активность продукта реакции. В частности, превращение каталитического остатка на активном участке сульфамидазы связано с температурой реакции. Таким образом, может быть полезно выполнять стадию b) при температуре ниже 8°С. Предпочтительная температура составляет приблизительно 0°С.
В одном из воплощений указанный боргидрид щелочного металла представляет собой боргидрид натрия, который используют в концентрации 0,5 - 4 кратной концентрации указанного периодата, например, в концентрации, не превышающей больше чем в 2,5 раза концентрацию указанного периодата.
В одном из воплощений указанный боргидрид щелочного металла представляет собой боргидрид натрия, который используют в концентрации 0,5 - 4 кратной концентрации указанного периодата, например в концентрации не превышающей больше чем в 2,5 раза концентрацию указанного периодата, и указанную реакцию стадии b) проводят в течение периода времени не больше чем 1 час, например приблизительно 0,5 часа.
В одном из воплощений указанный боргидрид щелочного металла представляет собой боргидрид натрия, который используют в концентрации 0,5 - 4 кратной концентрации указанного периодата, например, в концентрации, не превышающей больше чем в 2,5 раза концентрацию указанного периодата, и указанную реакцию стадии b) проводят в течение периода времени не больше чем 1 час, например приблизительно 0,5 часа, при температуре от 0 до 8°С.
В одном из воплощений указанный боргидрид щелочного металла используют в концентрации 0,5 - 4 кратной концентрации указанного периодата, например, в концентрации не превышающей, чем в 2,5 раза концентрацию указанного периодата, и указанную реакцию стадии b) проводят в течение периода времени не больше чем 1 час, например приблизительно 0,5 часа, при температуре от 0 до 8°С.
В одном из воплощений указанный боргидрид щелочного металла представляет собой боргидрид натрия, и указанную реакцию стадии b) проводят в течение периода времени не больше чем 1 час, например, приблизительно 0,5 часа, при температуре от 0 до 8°С.
В одном из воплощений указанный боргидрид щелочного металла представляет собой боргидрид натрия, который используют в концентрации 0,5 - 4 кратной концентрации указанного периодата, например в концентрации, не превышающей больше чем в 2,5 раза концентрацию указанного периодата, и указанную реакцию стадии b) проводят при температуре от 0 до 8°С.
В одном из воплощений указанный боргидрид щелочного металла представляет собой боргидрид натрия, который используют в концентрации 0,5 - 4 кратной концентрации указанного периодата, например, в концентрации 2,5 кратной концентрации указанного периодата, и указанную реакцию стадии b) проводят при температуре приблизительно 0°С в течение периода времени приблизительно 0,5 часа.
В одном из воплощении указанный периодат представляет собой метапериодат натрия, и указанный боргидрид щелочного металла представляет собой боргидрид натрия.
В одном из воплощений стадии а) и b) каждую проводят по отдельности в течение периода времени не больше чем 2 часа, например не больше чем 1 час, например, приблизительно 1 час или приблизительно 0,5 часа. Указанный боргидрид используют в концентрации необязательно 0,5 - 4 кратной концентрации указанного периодата, предпочтительно 0,5 - 2,5 кратной концентрации указанного периодата. В конкретных воплощениях указанный боргидрид используют в концентрации 0,5 кратной концентрации периодата, или в концентрации 2,5 кратной концентрации указанного периодата.
В одном из воплощений стадию а) проводят в течение периода времени не больше, чем 3 часа, и стадию b) проводят в течение не больше чем 1 часа. Указанный боргидрид используют в концентрации необязательно не превышающей больше, чем в 4 раза концентрацию указанного периодата, предпочтительно не превышающей больше, чем в 2,5 раза концентрацию указанного периодата.
Квалифицированный специалист в данной области техники знает способы регулирования продолжительности химической реакции, такой как продолжительность реакции каждой из стадий а) и b). Таким образом, в одном воплощении указанный аспект способа дополнительно включает стадию а2), согласно которой гасят реакцию, проходящую на стадии а). Указанное гашение продолжается, например, менее 30 минут, например, менее 15 минут. В некоторых случаях указанное гашение проводят сразу же после стадии а). Гашение можно, например, выполнять, добавляя этиленгликоль. Этиленгликоль можно добавлять в конечной концентрации 192 ммоль/л. Предпочтительно стадия b) следует сразу же после гашения. Это может свести к минимуму период воздействия реакционноспособных альдегидных групп на сульфамидазу. Реакционноспособные альдегиды могут ускорять инактивацию и агрегацию белка.
В одном из воплощений указанный способ дополнительно включает стадию b2), согласно которой гасят реакцию, проходящую на стадии b). Это гашение можно, например, проводить, добавляя молекулу, которая содержит кетонную или альдегидную группу, такую как циклогексанон или ацетон, указанная молекула предпочтительно растворима в воде. Альтернативно, указанное гашение можно проводить, понижая рН реакционной смеси ниже 6, добавляя уксусную кислоту или другую кислоту. В некоторых случаях указанное гашение проводят, добавляя ацетон в конечной концентрации приблизительно 0,1 моль/л. Необязательная стадия гашения позволяет точно регулировать продолжительность реакции стадии b). Регулируя продолжительность реакции таким образом, можно дополнительно обеспечить воспроизводимость способа с точки зрения содержания FGly50.
Таким образом, согласно способу, раскрытому в данном документе, получают модифицированную сульфамидазу, обладающую рядом преимуществ по сравнению с сульфамидазой, модифицированной согласно предшествующему уровню техники. Следовательно, изобретатели определили условия химической модификации сульфамидазы с минимальным отрицательным влиянием на структурную целостность полипептидной цепи сульфамидазы, одновременно получая в результате по существу отсутствие природных гликановых структур, что предполагает почти полную модификацию гликанов на всех четырех природных гликозилированных участках с сохранением каталитической активности. Неожиданно на конкретном примере были обнаружены условия, используемые на стадии а), которые облегчают условия проведения стадии b). Примеры воплощений способа изображены на фигуре 1В, 1С и 1D.
В одном из аспектов предложена модифицированная сульфамидаза, получаемая способом согласно определенному выше аспекту способа.
В одном из аспектов предложена модифицированная сульфамидаза, получаемая согласно аспекту способа, как описано выше, для применения в лечении.
В одном из аспектов предложена модифицированная сульфамидаза, получаемая согласно аспекту способа, как описано выше, для применения в лечении лизосомной болезни накопления, в частности мукополисахаридоза IIIA (МПС IIIA).
В одном из аспектов предложено применение модифицированной сульфамидазы в изготовлении лекарства для прохождения через гематоэнцефалический барьер, чтобы лечить лизосомную болезнь накопления, такую как мукополисахаридоз IIIA (МПС IIIA), в головном мозге млекопитающего, указанная модификация включает гликановые группировки, химически модифицированные в ходе последовательной обработки фермента периодатом щелочного металла и боргидридом щелочного металла, тем самым снижается активность сульфамидазы в отношении рецепторов, распознающих гликаны, таких как маннозные и маннозо-6-фосфатные клеточные системы доставки, при этом сохраняется каталитическая активность указанной сульфамидазы.
В одном из аспектов предложен способ лечения млекопитающего, страдающего от лизосомной болезни накопления, такой как мукополисахаридоз IIIA (МПС IIIA), согласно которому вводят млекопитающему терапевтически эффективное количество модифицированной сульфамидазы, указанная модифицированная сульфамидаза выбрана из:
a) модифицированной сульфамидазы, как описано в аспектах и воплощениях в данном документе;
b) композиции сульфамидазы, как описано в аспектах и воплощениях в данном документе, и
c) модифицированной сульфамидазы, где модификация включает последовательную обработку указанной модифицированной сульфамидазы периодатом щелочного металла и боргидридом щелочного металла, в результате чего гликановые группировки сульфамидазы оказываются химически модифицированными, чтобы уменьшить ее активность в отношении рецепторов, распознающих гликаны, таких как маннозные и маннозо-6-фосфатные клеточные системы доставки, при этом сохраняется каталитическая ферментативная активность.
В одном из воплощений указанное лечение приводит к выведению приблизительно по меньшей мере 48% лизосомального накопления из головного мозга млекопитающего после введения 10 доз модифицированной сульфамидазы в течение 70 дней. Кроме того, указанное лечение приводит к выведению приблизительно по меньшей мере 30% лизосомального накопления из головного мозга млекопитающего после введения 13 доз модифицированной сульфамидазы в течение 25 дней.
Далее изобретение будет проиллюстрировано следующими неограничивающими примерами. Краткое описание чертежей
На Фигуре 1 представлена схема, показывающая различия между способами химической модификации, разработанными изобретателями, раскрытыми в примере 4, и известным способом, раскрытым в WO 2008/109677.
На Фигуре 2А представлены электрофореграммы в полиакриламидном геле в присутствии додецил сульфата натрия (ДСН-ПААГ) сульфамидазы, модифицированной согласно известному способу. Определены четыре полосы белка, обозначенные 1-4, полученные в ходе процесса модификации гликана.
На Фигуре 2В представлены ДСН-ПААГ как сульфамидазы, модифицированной согласно известному способу, так и сульфамидазы, модифицированной согласно новому способу 1, раскрытому в данном документе.
На Фигуре 3А представлены хроматограммы, полученные методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ), сульфамидазы, модифицированной согласно известному способу.
На Фигуре 3В представлены ГПХ сульфамидазы, модифицированной согласно новому способу 1, раскрытому в данном документе. Стрелкой отмечено количество мультимерных форм модифицированной сульфамидазы.
На Фигуре 4А представлена интенсивность рассеянного излучения, измеренная при динамическом рассеянии света сульфамидазой, модифицированной согласно известному способу.
На Фигуре 4В представлена интенсивность рассеянного излучения, измеренная при динамическом рассеянии света сульфамидазой, модифицированной согласно новому способу 1, как описано в данном документе.
На Фигуре 5 представлена диаграмма визуализации рецепторно-опосредованного эндоцитоза в клетках MEF-1 (от англ. "mouse embryonic fibroblast" - фибробласт эмбриона мыши) немодифицированной рекомбинантной сульфамидазы, сульфамидазы, модифицированной согласно известному способу, и сульфамидазы, модифицированной согласно новым способам 1 и 2, как описано в данном документе.
На Фигуре 6А представлены результаты обработки in vivo МПС IIIA дефицитных мышей. Диаграмма показывает выведение накопления гепарансульфата в головном мозге мышей после внутривенного дозирования раз в два дня (13 доз) сульфамидазы, модифицированной согласно новому способу 1, при 30 мг/кг.
На Фигуре 6В представлены результаты обработки in vivo МПС IIIA дефицитных мышей. Диаграмма показывает выведение накопления гепарансульфата в печени мышей после внутривенного дозирования раз в два дня (13 доз) сульфамидазы, модифицированной согласно новому способу 1, при 30 мг/кг.
На Фигуре 6С представлены результаты обработки in vivo МПС IIIA дефицитных мышей. Диаграмма показывает выведение накопления гепарансульфата в головном мозге мышей после внутривенного дозирования раз в неделю (10 доз) сульфамидазы, модифицированной согласно новому способу 1, при 30 мг/кг и 10 мг/кг, соответственно.
На Фигуре 7 представлено схематическое изображение трех первичных N-гликановых структур, как правило, присущих белкам. Левый гликан относится к олигоманнозному типу, средний - к комплексному типу, и правый - к гибридному типу. На фигуре изображены следующие соединения: ромбы, закрашенные черным, соответствуют N-ацетилнейраминовой кислоте; круги, закрашенные черным, соответствуют маннозе; квадраты соответствуют N-ацетилглюкозамину; треугольник, закрашенный черным, соответствует фукозе; круг соответствует галактозе. Сахарные компоненты, отмеченные звездочкой, могут быть модифицированы в ходе обработки периодатом/боргидридом, раскрытой в данном документе.
На Фигуре 8А представлено схематическое изображение, иллюстрирующее прогнозируемые разрывы связей на маннозе после химической модификации.
На Фигуре 8В представлено схематическое изображение, иллюстрирующее модель Ман-6 гликана. Указаны сахарные компоненты, подверженные разрывам связей при окислении периодатом. Серые круги соответствуют маннозе, черные квадраты соответствуют N-ацетилглюкозамину, Т13 соответствует триптическому пептиду NITR с включенным участком N-гликозилирования N(131).
На Фигуре 9 представлены масс-спектры двухзарядных ионов, соответствующих триптическому пептиду Т13 с Ман-6 гликаном, присоединенным к N(131) (Т13+Ман-6 гликан), до (А) и после химической модификации (B-D) согласно ранее известному способу (S. - разрывы одинарных связей; D. - разрывы двойных связей; например D.x3 - разрывы 3 двойных связей).
На Фигуре 10А представлена диаграмма визуализации частоты разрыва связей триптического пептида Т13+Ман-6 гликан после химической модификации согласно ранее известному способу (черная полоса), новому способу 1 (черные точки), новому способу 3 (белая полоса) и новому способу 4 (в поперечную клетку).
На Фигуре 10В представлена диаграмма визуализации относительной распространенности разрывов одинарных связей в триптическом пептиде Т13+Ман-6 гликан после химической модификации согласно ранее известному способу (черная полоса), новому способу 1 (черные точки), новому способу 3 (белая полоса) и новому способу 4 (в поперечную клетку).
На Фигуре 11 представлена таблица со списком аминокислотных последовательностей сульфамидазы человека, где SEQ ID NO 1 соответствует аминокислотной последовательности сульфамидазы человека, SEQ ID NO 2 соответствует GS-сульфамидазе, и SEQ ID NO 3 соответствует сульфамидазе-GS.
Примеры
Следующие примеры раскрывают разработку модифицированного полипептида сульфамидазы согласно настоящему изобретению.
Пример 1. Культивирование, очистка и характеристика сульфамидазы
Вещества и способы
Конструкция векторов экспрессии сульфамидазы: Синтетические гены, кодирующие сульфамидазу человека, были синтезированы Geneart (Life Technologies), оба в кодон-оптимизированных версиях Н. sapiens или С. griseus (клетки СНО) и оригинальной последовательности человека. Синтетические гены были клонированы в разных векторах экспрессии млекопитающих, таких как pcDNA3.1(+) (Invitrogen) или pQMCFI (Icosagen).
Получение сульфамидазы: Две транзиторные экспрессирующие системы оценивали для получения сульфамидазы, транзиторная экспрессия в клетках HEK293 (от англ. "Human Embryonic Kidney " - человеческие эмбриональные клетки почек) при использовании векторов pcDNA3.1(+) и эписомальная экспрессирующая система Quattromed Cell Factory (QMCF) (Icosagen AS) при использовании вектора pQMCF1. В обеих системах клетки выращивали в стандартной среде, и секретируемый белок собирали обычно на 6-8 день после трансфекции. Кроме того, стабильную клеточную линию, установленную при использовании имеющейся в продаже экспрессирующей системы СНО, оценивали для получения сульфамидазы.
Сульфамидазу выделяли из среды с помощью анионообменной хроматографии (АОХ) на колонке с Q-сефарозой (GE Healthcare), уравновешенной 20 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0, и элюируемой градиентом NaCl. Выделенную сульфамидазу затем очищали с помощью хроматографии на 4-меркапто-этил-пиридине (МЭП); содержащие сульфамидазу фракции загружали на хроматографическую колонку МЭП HyperCel и потом элюировали, используя изократическое элюирование в 50 мМ NaAc, 0,1 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, рН 4,6. Конечную доочистку выполняли в ходе катионообменной хроматографии (КОХ) на колонке SP Sepharose FF (GE Healthcare), уравновешенной 25 мМ NaAc, 2 мМ ДТТ, рН 4,5. Для элюирования использовали градиент NaCl. Чистоту и подлинность проб сульфамидазы из разных экспрессирующих систем анализировали с помощью ДСН-ПААГ и MALDI-TOF-MS, данные не показаны.
4
3
4
3
4
3
2
Анализ гликозилирования: Картину гликозилирования определяли для разных полученных проб сульфамидазы. Перед анализом гликопептида сульфамидазу (приблизительно 10 мкг) восстанавливали, алкилировали и расщепляли с трипсином. Восстановление белка выполняли в ходе инкубации в 5 мкл 10 мМ ДТТ в 50 мМ NHHCO при 70°С в течение 1 часа. Последующее алкилирование с 5 мкл 55 мМ йодацетамида в 50 мМ NHHCO выполняли при комнатной температуре (к.т.) и в темноте в течение 45 минут. В конце выполняли триптическое расщепление, добавляя 30 мкл 50 мМ NHHCO, 5 мМ CaCl, рН 8, и 0,2 мкг/мкл трипсин в 50 мМ уксусной кислоте (соотношение протеаза : белок 1:20 (масс./масс.)). Расщепление проводили в течение ночи при 37°С.
Пять пептидных фрагментов расщепленной трипсином сульфамидазы содержали возможные участки N-гликозилирования. Эти фрагменты пептида, содержащие возможные участки гликозилирования N(x), где х относится к положению аспарагина в аминокислотной последовательности сульфамидазы, как определено в SEQ ID NO 1, представляли собой:
N(21) содержащий фрагмент (остаток 4-35 SEQ ID NO 1, 3269,63 Да),
N(122) содержащий фрагмент (остаток 105-130 SEQ ID NO 1, 2910,38 Да),
N(131) содержащий фрагмент (остаток 131-134 SEQ ID NO 1, 502,29 Да),
N(244) содержащий фрагмент (остаток 239-262 SEQ ID NO 1, 2504,25 Да),
N(393) содержащий фрагмент (остаток 374-394 SEQ ID NO 1, 2542,22 Да).
Аспарагин каждого возможного участка гликозилирования выделен жирным шрифтом и приведена молекулярная масса каждого фрагмента пептида.
Возможные варианты гликозилирования пяти фрагментов триптического пептида исследовали в ходе анализа гликопептида. Анализ выполняли с помощью жидкостной хроматографии с последующей масс-спектрометрией (ЖХ-МС) на системе ВЭЖХ Agilent 1200, соединенной с квадрупольным времяпролетным масс-спектрометром Agilent 6510 (Q-TOF-MS, от англ. "Quadrupole time-of-flight mass spectrometer"). Обеими системами управляли с помощью программного обеспечения MassHunter Workstation. Разделение ЖХ проводили, используя колонку Waters XSELECT CSH 130 С18 (150 × 2,1 мм), температура колонки составляла 40°С. Подвижная фаза А содержала 5% ацетонитрила, 0,1% пропионовой кислоты и 0,02% трифторуксусной кислоты (ТФК), подвижная фаза В содержала 95% ацетонитрила, 0,1% пропионовой кислоты и 0,02% ТФК. Использовали градиент от 0% до 10% В в течение 10 минут, затем от 10% до 70% В в течение еще 25 минут при скорости потока 0,2 мл/мин. Вводимый объем составлял 10 мкл. Q-TOF работал в режиме положительной ионизации электрораспылением. В процессе сбора данных напряжение фрагментора, напряжение скиммера и октупольное высокочастотное напряжение составили 90, 65 и 650 В, соответственно. Диапазон масс находился между 300 и 2800 m/z.
Результаты
Транзиторная экспрессия в клетках HEK293 давала в результате низкие уровни секретируемой сульфамидазы (менее 0,3 мг/л среды, SEQ ID NO 3). Стабильная эписомальная экспрессирующая система QMCF (Icosagen AS) приводила в результате к выработке сульфамидазы (SEQ ID NO 2) в титрах свыше 10 мг/л в клетках СНО. Стабильная клеточная линия, установленная из экспрессирующей системы СНО, давала в результате титры сульфамидазы (SEQ ID NO 1) более 40 мг/л.
Сульфамидазу очищали до заметной однородности с молекулярной массой в диапазоне 61-63 кДа. С учетом теоретической массы пептидной цепи 55 кДа это указывает на наличие гликанов с общей молекулярной массой 6-8 кДа. Чистоту и подлинность проб сульфамидазы анализировали с помощью ДСН-ПААГ и MALDI-TOF-MS (результаты не показаны).
Анализ гликозилирования триптических расщепленных пептидов выполняли с помощью ЖХ-МС. Осуществляли ручной поиск 30 разных видов гликозилирования на каждом гликопептиде. Относительный количественный анализ выполняли, измеряя площади пиков на реконструированных ионных хроматограммах (без поправки на эффективность ионизации). Четыре из пяти предполагаемых участков N-гликозилирования (N(21), N(131), N(244) и N(393)) были подвергнуты гликозилированию последовательно во всех пробах сульфамидазы. N(21) и N(393) преимущественно были заняты гликанами комплексного типа с низкой степенью полного сиалирования. N(131) был полностью занят гликанами олигоманнозного типа. Степень фосфорилирования гликанов составляла приблизительно 50% для всех проб. Участок N(131) был устойчив к дефосфорилированию под действием щелочной фосфатазы. Четвертый участок, N(244), отличался по составу между клетками СНО (SEQ ID NO 2) и клетками HEK293 (SEQ ID NO 3), вырабатывающими сульфамидазу олигоманнозного типа в пробах СНО и смеси олигоманнозного/комплексного типов в пробах HEK293. Был обнаружен триптический пептид, содержащий N(122), без присоединения каких-либо гликанов.
Пример 2. Химическая модификация сульфамидазы согласно ранее известному способу
Вещества и способы
Химическая модификация согласно известному способу (как раскрыто в WO 2008/109677): Чтобы модифицировать гликановые группировки сульфамидазы, сульфамидазу (SEQ ID NO 2), полученную, как описано в примере 1, в эписомальной экспрессирующей системе Quattromed Cell Factory (QMCF) (Icosagen AS), сначала инкубировали с 20 мМ метапериодатом натрия при 0°С в течение 6,5 часа в 20 мМ фосфате натрия, 100 мМ NaCl (рН 6,0). Окисление гликана гасили, добавляя этиленгликоль до конечной концентрации 192 ммоль/л. Гашение продолжалось в течение 15 минут при 0°С перед проведением диализа против 20 мМ фосфата натрия, 100 мМ NaCl (рН 6,0) в течение ночи при 4°С. После диализа осуществляли восстановление, добавляя боргидрид натрия к реакционной смеси до конечной концентрации 100 ммоль/л. Реакция восстановления продолжалась в течение ночи. В конце ферментный препарат подвергали диализу против 20 мМ фосфата натрия, 100 мМ NaCl (рН 7,5). Все инкубации выполняли в темноте.
Результаты
Модифицированную сульфамидазу получали в трех параллельных опытах согласно последовательности стадий, изображенных на фигуре 1А.
Пример 3. Анализ сульфамидазы, модифицированной согласно известному способу
Вещества и способы
Сульфамидазу, модифицированную согласно примеру 2, соответствующему известному способу, подвергали следующим анализам.
Анализ ДСН-ПААГ: 5 мкг модифицированной сульфамидазы загружали в каждую ячейку NuPAGE с 4-12% бис-трис гелем. Использовали маркер Seeblue 2 plus, и гель окрашивали с помощью Instant Blue (C.B.S Scientific).
Анализ в ходе гель-проникающей хроматографии (ГПХ): Модифицированный фермент анализировали с помощью аналитической гель-проникающей хроматографии, выполняемой на системе AKTAmicro (GE Healthcare). Использовали колонку Superdex 200 PC 3,2/30 со скоростью потока 40 мкл/мин буферной смеси. Объем пробы составил 10 мкл и содержал 10 мкг фермента.
Анализ динамического рассеяния света (ДРС): Модифицированную сульфамидазу дегазировали в ходе центрифугирования при 12000 об/мин в течение 3 минут при комнатной температуре (к.т.). Опыты ДРС проводили на приборе DynaPro Titan (Wyatt Technology Corp), используя 25% мощности лазера, в 3 параллельных опытах по 75 мкл для каждого.
Расщепление в геле и анализ MALDI-TOF-MS: Анализ ДСН-ПААГ показал несколько дополнительных полос, которые удаляли, обесцвечивали и подвергали расщеплению в геле с трипсином. Процесс был следующим:
3
3
i. Удаление красителя Кумасси: отделенные гелевые полосы помещали в пробирки типа Эппендорф. Пробирки встряхивали два раза в 100 мМ NHHCO в 50% ацетонитриле при 30°С в течение 1 часа. Надосадочные жидкости отбрасывали.
3
3
3
3
3
3
ii. Восстановление и алкилирование: гелевые образцы дегидратировали в ацетонитриле, сушили в Speed Vac и затем покрывали 10 мМ ДТТ в 100 мМ NHHCO. Восстановление продолжалось в течение 1 часа при 57°С. Надосадочную жидкость отбрасывали и заменяли 55 мМ йодацетамидом в 100 мМ NHHCO. Алкилирование выполняли в течение 45 минут при к.т. в темноте и при слабом встряхивании. Надосадочную жидкость снова отбрасывали. Гель промывали 100 мМ NHHCO в 50% ацетонитриле в течение 20-30 минут при 30°С, после чего надосадочную жидкость отбрасывали. Гелевые образцы полностью высушивали в Speed Vac.
3
3
3
3
iii. Расщепление в геле с трипсином: 2-5 мкл 50 мМ NHHCO добавляли в высушенные гелевые образцы, после чего добавляли 5 мкл раствора трипсина (0,1 мкг/мкл в 1% уксусной кислоте). Добавляли еще 50 мМ NHHCO, чтобы вызвать разбухание геля. Расщепление проводили в течение ночи при 37°С (при встряхивании). Надосадочную жидкость переносили в новую пробирку и экстрагировали 60% ацетонитрилом, 0,1% ТФК (3 × 20 минут) при к.т. Полученные в результате надосадочные жидкости выпаривали в Speed Vac почти досуха. Концентрированный раствор смешивали 1:1 с раствором альфа-циано-4-гидроксикоричной кислоты (10 мг/мл) и 0,6 мкл наносили на пластину MALDI.
Молекулярные массы фрагментов триптического пептида определяли, используя времяпролетный масс-спектрометр с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией Sciex 5800 (MALDI-TOF7TOF MS). Анализы осуществляли в рефлектронном режиме для положительных ионов с лазерной энергией 3550 и 400 импульсов.
Сохранение активного участка: Любое воздействие химической модификации на активный участок сульфамидазы исследовали, используя анализы ЖХ-МС и ЖХ-МС/МС. Образцы получали согласно способу ЖХ-МС, описанному в разделе "Анализ гликозилирования" в примере 1. Полученные в результате триптические пептиды, содержащие варианты цистеина 50 (цистеин 50 (алкилированный), окисленный цистеин 50, FGly50 и Ser50), определяли полуколичественно, используя вычисления площадей пиков из реконструированных ионных хроматограмм. Подлинность пептидов устанавливали в ходе секвенирования МСМС. Параметры МСМС были следующими: энергии столкновений составляли 10, 15, и 20 В, диапазон сканирования 100-1800 m/z и скорость сканирования 1 скан/сек.
Результаты
Анализ ДСН-ПААГ: Как видно из анализа ДСН-ПААГ, некоторые пептиды размеров, не совпадающих с размером сульфамидазы полной длины, образовывались в результате химической модификации (фигура 2А).
Анализ в ходе ГПХ и ДРС: Обнаружено, что процесс химической модификации активирует агрегацию сульфамидазы, как показано в виде пика, расположенного перед основным пиком на хроматограмме фигуры 3А. Найдено, что высота пика, расположенного перед основным пиком на хроматограмме, составляет приблизительно 3% от высоты основного пика.
10
Более того, анализ ДРС показал, что тот же самое вещество содержало 15-20% белка от общего содержания белка в высокомолекулярных формах (т.е. свыше 10 кДа) (фигура 4А).
Анализ полос ДСН-ПААГ: В ходе анализа MALDI-TOF MS четыре гелевые полосы #1-4, наблюдаемые на ДСН-ПААГ (фигура 2А), могут быть определены как фрагменты сульфамидазы, полученные при нитевых разрывах в ходе химической модификации.
Гелевые полосы #1 и #2 фигуры 2А определены как два усечения С-концевой части с молекулярными массами 6 кДа и 30 кДа, гелевая полоса #3 - как одно усечение N-концевой части в 41 кДа, и гелевая полоса #4 - как одна димерная форма сульфамидазы (полоса 111 кДа), образованные в результате химической модификации (MALDI спектры не показаны).
Таким образом, было установлено, что химическая модификация сульфамидазы согласно известному способу не только модифицирует гликаны, но также вызывает нитевые разрывы в определенных положениях в полипептидной цепи сульфамидазы.
Также установлено, что химическая модификация согласно известному способу приводит к окислению на некоторых метиониновых остатках сульфамидазы, в частности на метионине 184 и метионине 443, которые почти полностью окисляются. Метионин 226 (обнаружен в триптическом пептиде Т23, который соответствует аминокислотным остаткам 226-238) окислен в наименьшей степени, но это окисление очевидно приводит к более неустойчивому белку, чем сульфамидаза как таковая, давая усечение N-концевой части в 41 кДа (гелевая полоса # 3 фигуры 2А). Таким образом показано, что окисление метионина 226 и нитевые разрывы связаны, как наблюдалось в анализе МС. Кроме того, димерная полоса (#4 фигуры 2А) также преимущественно содержала окисленный метионин 226 (фигура 2А).
Следовательно, известный процесс модификации гликанов катализирует окисление аминокислотных остатков, определяющих структурную целостность фермента.
Сохранение активного участка: Более того, при использовании ЖХ-МСМС было обнаружено, что на стадии восстановления (фигура 1А) восстанавливается остаток FGly в положении 50 активного участка SEQ ID NO 1 до Ser. Ser в этом положении не совместим с эффективным катализом (Recksiek et al, J Biol Chem 273(11):6096-103 (1998)). Относительное количество Ser, полученного из FGly, вычисляли, исходя из измерений площадей пиков двухзарядных ионов в масс-спектре, соответствующем двум фрагментам триптического пептида, содержащим FGly50 и Ser50. Площади пиков основывались на МС отклике без поправки на эффективность ионизации. Из таблицы 1 ниже видно, что превращение FGly в Ser составляет приблизительно 56% после модификации согласно известному способу (смотрите также пример 5, таблица 2).
Таким образом, известная методика химической модификации в дополнение к вышеуказанным модификациям приводит к уменьшению количества аминокислотных остатков, определяющих каталитическую активность фермента.
Пример 4. Новые способы химической модификации сульфамидазы Вещества и способы
Новый способ 1: Сульфамидазу, полученную в эписомальной экспрессирующей системе Quattromed Cell Factory (QMCF) (Icosagen AS) согласно примеру 1, окисляли при инкубации с 20 мМ метапериодатом натрия при 0°С в темноте в течение 120 минут в фосфатных буферах, имеющих рН 6,0. Окисление гликана гасили добавлением этиленгликоля в конечной концентрации 192 ммоль/л. Гашение продолжалось в течение 15 минут при 6°С, после чего к реакционной смеси добавляли боргидрид натрия в конечной концентрации 50 ммоль/л. Препарат сульфамидазы, полученный после инкубации при 0°С в течение 120 минут в темноте, подвергали ультрафильтрации против 20 мМ фосфата натрия, 100 мМ NaCl, рН 6,0. Новый способ 1 химической модификации изображен на фигуре 1 В.
Новый способ 2: Выполняли как новый способ 1 за исключением того, что концентрация боргидрида натрия на стадии восстановления составляла 10 ммоль/л. Новый способ 2 химической модификации изображен на фигуре 1С.
Новый способ 3: Сульфамидазу, полученную в стабильной клеточной линии согласно примеру 1, окисляли при инкубации с 10 мМ метапериодатом натрия при 0°С в темноте в течение 180 минут в ацетатном буфере, имеющем начальный рН между 4,5 и 5,7. Окисление гликана гасили, добавляя этиленгликоль до конечной концентрации 192 ммоль/л. Гашение продолжалось в течение 15 минут при 6°С, затем добавляли боргидрид натрия к реакционной смеси в конечной концентрации 25 ммоль/л. Препарат сульфамидазы, полученный после инкубации при 0°С в течение 60 минут в темноте, подвергали ультрафильтрации против 10 мМ фосфата натрия, 100 мМ NaCl, рН 7,4. Новый способ 3 химической модификации изображен на фигуре 1D.
Новый способ 4: Сульфамидазу, полученную в стабильной клеточной линии согласно примеру 1, окисляли при инкубации с 10 мМ метапериодатом натрия при 8°С в темноте в течение 60 минут в ацетатном буфере, имеющем начальный рН 4,5. Окисление гликана гасили, добавляя этиленгликоль в конечной концентрации 192 ммоль/л. Гашение продолжалось в течение 15 минут при 6°С, затем добавляли боргидрид натрия к реакционной смеси в конечной концентрации 25 ммоль/л. Препарат сульфамидазы, полученный после инкубации при 0°С в течение 60 минут в темноте, подвергали ультрафильтрации против 10 мМ фосфата натрия, 100 мМ NaCl, рН 7,4.
Изучение второй стадии гашения: Влияние гашения на вторую стадию изучали, добавляя 0,1 М ацетон после стадии инкубации с боргидридом натрия, описанной в новом способе 1. Вещество получали в параллельных опытах согласно новому способу 1 до добавления борогидрида натрия и инкубации и включая добавление боргидрида натрия и инкубацию, после чего реакцию в одном образце гасили добавлением ацетона. Оба образца затем подвергали стадии ультрафильтрации, описанной в новом способе 1.
Новый способ 5: Сульфамидазу, полученную в стабильной клеточной линии согласно примеру 1, окисляли при инкубации с 10 мМ метапериодатом натрия при 8°С в темноте в течение 60 минут в ацетатном буфере, имеющем начальный рН 4,5. Окисление гликана гасили, добавляя этиленгликоль до конечной концентрации 192 ммоль/л. Гашение продолжалось в течение 15 минут при 6°С, затем добавляли боргидрид натрия к реакционной смеси до конечной концентрации 25 ммоль/л. Препарат сульфамидазы, полученный после инкубации при 0°С в течение 45 минут в темноте и гашения реакции 0,1 М ацетоном, подвергали ультрафильтрации против 10 мМ фосфата натрия, 100 мМ NaCl, рН 7,4.
Результаты
Как уже обсуждалось ранее, метапериодат натрия является окислителем, который превращает цис-гликольные группы углеводов в альдегидные группы, тогда как боргидрид является восстановителем, который восстанавливает альдегиды до более инертных спиртов. Таким образом, структура углевода необратимо разрушается.
Для определения оптимального способа химической модификации гликанов, а именно, способа, который дает модифицированную сульфамидазу с улучшенными свойствами, оценивали разные реакционные условия. Сделано заключение, что как окисление метапериодатом натрия, так и восстановление боргидридом натрия приводили к модификациям и агрегации полипептида; свойствам, которые отрицательно влияют на каталитическую активность и иммунногенную предрасположенность.
Были определены условия для улучшенного способа химической модификации. Неожиданно эти условия были упрощены тем, что стадию восстановления можно проводить сразу же после стадии гашения этиленгликолем, исключая замену буфера и длительное воздействие реакционноспособных альдегидных промежуточных соединений на сульфамидазу. Новые способы химической модификации изображены на фигуре 1В, фигуре 1С и фигуре 1D.
Пример 5. Анализ сульфамидазы, модифицированной согласно новым способам
Вещества и способы
Сульфамидазу, модифицированную согласно новым способам, описанным в примере 4, подвергали следующим анализам.
Анализ ДСН-ПААГ: 5 мкг сульфамидазы, модифицированной согласно известному способу (пример 2), а также новым способам 1 и 2 (пример 4), загружали в изолированные отдельные ячейки согласно описанию в примере 3. Подобным образом 5 мкг сульфамидазы, модифицированной согласно новому способу 1 (пример 4), а также новым способам 3, 4 и 5, загружали в изолированные отдельные ячейки согласно описанию в примере 3.
Анализ методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ): Сульфамидазу, модифицированную согласно новым способам 1-4, анализировали с помощью аналитической гель-проникающей хроматографии согласно примеру 3.
Анализ динамического рассеяния света (ДРС): Сульфамидазу, модифицированную согласно новому способу 1, анализировали с помощью ДРС согласно примеру 3.
Сохранение активного участка: Любое воздействие химической модификации на активный участок сульфамидазы, полученной согласно новым способам 1-5, а также второй исследуемой стадии гашения, исследовали согласно описанию в примере 3.
Результаты
Анализ ДСН-ПААГ: В результате нового способа химической модификации 1 образовывались пептиды с размерами, не совпадающими с размером сульфамидазы полной длины (фигура 2В). Однако, по сравнению с сульфамидазой, модифицированной согласно известному способу, новый способ 1 приводил к меньшей фрагментации. Фрагмент #1 (фигура 2А), определенный как С-концевые аминокислоты 434-482, не детектировался в пробах сульфамидазы, полученной новыми способами 1, 3 и 4, количества других фрагментов также были значительно снижены. Эта тенденция более ярко была выражена в веществе, полученном новым способом 2. Однако, при использовании нового способа 2 было больше высокомолекулярных форм, присутствующих в геле, что указывает на то, что количество восстановителя было недостаточным, чтобы восстановить все реакционноспособные альдегиды, полученные на стадии окисления (данные не показаны). При использовании новых способов 3, 4 и 5 было получено вещество модифицированной сульфамидазы, которое было похоже на вещество, полученное с помощью нового способа 1 (данные не показаны).
Таким образом, нитевые разрывы в полипептиде сульфамидазы, полученной с помощью новых способов, лимитированы по сравнению с появлением нитевых разрывов в сульфамидазе, полученной согласно примеру 2.
Анализ методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ): Обнаружено, что сульфамидаза, модифицированная согласно новому способу 1, содержала меньше агрегатов по сравнению с сульфамидазой, модифицированной известным способом. Это показано на хроматограммах фигуры 3, на которых высокомолекулярная форма изображена в виде пика, расположенного перед основным пиком. Высота пика, расположенного перед основным пиком на фигуре 3В, составляет приблизительно 0,5% относительно высоты основного пика, что меньше по сравнению с высотой пика (3%) на фигуре 3А. Такие же результаты были получены для сульфамидазы, модифицированной новыми способам 3, 4 и 5 (данные не показаны).
Анализ динамического рассеяния света (ДРС): Анализ ДРС (фигура 4В) подтвердил результаты анализа ГПХ: сульфамидаза, полученная согласно новому способу, содержала 5% белка в высокомолекулярных формах (свыше 1010 кДа). Таким образом, можно прийти к выводу, что образование агрегированных форм сульфамидазы ограничено при использовании новых способов по сравнению с известным способом (смотрите пример 3).
Сохранение активного участка: Восстановление FGly в Ser в положении 50 на активном участке сульфамидазы определяли с помощью ЖХ-МС/МС, были точно определены триптические пептиды, содержащие FGly и Ser,. Относительное количество фрагментов пептида анализировали с помощью ЖХ-МС, измеряя площади пиков на реконструированных ионных хроматограммах двухзарядных ионов (без поправки на эффективность ионизации). Были проанализированы образцы, полученные способами, используемыми в примере 4 для химической модификации (таблица 2).
Потеря FGly на активном участке существенно ограничена при использовании новых способов. Новые способы модификации гликанов в сульфамидазе значительно уменьшали количество образования Ser, от 56% при использовании известного способа (смотрите таблицу 1, пример 3) до 45%, 44%, 36% и 42% (новые способы 1, 3, 4 и 5, соответственно, таблица 2). Образование Ser в новом способе 2 составляло приблизительно 11%, что указывает на сильную зависимость превращения FGly в Ser от концентрации боргидрида натрия.
Вторая стадия гашения реакции давала модифицированную сульфамидазу, сравнимую с сульфамидазой, полученной без гашения реакции (модифицированная сульфамидаза, полученная согласно новому способу 1, имеет 45% образования Ser по сравнению с 43% образования Ser после гашения второй реакции с ацетоном). Это дополнительно подтверждается новым способом 5, который также включает стадию гашения.
Пример 6: Рецепторно-опосредованный эндоцитоз вне организма (in vitro)
Вещества и способы
Сульфамидазу получали, как описано в примерах 1, 2 и 4, в эписомальной экспрессирующей системе Quattromed Cell Factory (QMCF) (Icosagen AS) и модифицировали согласно известному способу и новым способам 1 и 2. Эндоцитоз оценивали в фибробластах MEF-1, экспрессирующих М6Ф рецепторы. Клетки MEF-1 инкубировали в течение 24 часов в среде Дульбекко (DMEM), дополненной 75 нМ сульфамидазой. Клетки дважды промывали DMEM и один раз 0,9% NaCl перед клеточным лизисом при использовании 1% Тритон Х100. Определяли активность лизата сульфамидазы и общее содержание белка и вычисляли удельную активность лизата. Активность контролировали по интенсивности флуоресценции при 460 нм, используя 0,25 мМ 4-метилумбеллиферил-альфа-D-N-сульфоглюкозаминид в качестве субстрата в 14,5 мМ диэтилбарбитуровой кислоте, 14,5 мМ ацетате натрия, 0,34% (мас./об.) NaCl и 0,1% бычьем сывороточном альбумине (БСА). Определяли суммарную концентрацию белка, используя набор реагентов для определения белка с помощью бицинхониновой кислоты (БХК) (Pierce) с БСА в качестве стандарта. Данные представлены в виде среднего значения плюс стандартное отклонение (СО) (n равно 4).
Результаты
Активность сульфамидазы для всех препаратов, оцененных в ходе анализа эндоцитоза, можно определить в клеточном гомогенате Модифицированная сульфамидаза, полученная известным способом, а также новыми способами 1 и 2, показала удельные активности в клеточном гомогенате ниже 10% от значения, полученного с немодифицированной рекомбинантной сульфамидазой (фигура 5). Активность, сохранившаяся в клетках, сначала загруженных и затем выращенных при отсутствии сульфамидазы в течение 2 дней, была сопоставима со всеми препаратами, тем самым показывая, что химическая модификация не влияет отрицательно на лизосомальную устойчивость.
Поэтому можно прийти к выводу, что химическая модификация делает сульфамидазу менее подверженной клеточному захвату, что является следствием удаления эпитопов, распознаваемых гликан-распознающими рецепторами, таких как М6ФР. На макроскопическом уровне эта потеря молекулярных взаимодействий приводит к пониженному выведению из плазмы при внутривенном введении. Пониженное выведение белка может позволить реже вводить дозу пациентам.
Пример 7. Плазменный клиренс in vivo модифицированной сульфамидазы, полученной новым способом 1
Вещества и способы
Плазменный клиренс (ПК) немодифицированной и модифицированной рекомбинантной сульфамидазы, полученной, как описано в примере 1, в эписомальной экспрессирующей системе Quattromed Cell Factory (QMCF) (Icosagen AS) и модифицированной согласно новому способу 1 примера 4, исследовали на мышах (C57BL/6J). Мышам внутривенно вводили в хвостовую вену однократную дозу 10 мг/кг сульфамидазы и 10 мг/кг модифицированной сульфамидазы. Сульфамидазу и модифицированную сульфамидазу готовили в количестве 2 мг/мл и вводили в количестве 5 мл/кг. Пробы крови брали из подкожной вены ноги или полой вены в разные моменты времени в пределах 24 часов после дозирования (3 мыши на момент времени). Кровь собирали в пробирки с ЭДТА, которые хранили во льду, плазму получали центрифугированием. Уровни сульфамидазы и модифицированной сульфамидазы в плазме анализировали с помощью электрохемилюминесценции (ЭХЛ). Плазменный клиренс вычисляли, используя версию 6.3 программного обеспечения WinNonlin (некомпартментный анализ, Phoenix, Pharsight Corp., USA).
Количественное определение сульфамидазы и модифицированной сульфамидазы в ходе иммуноанализа методом электрохемилюминесценции (ЭХЛ): Сульфамидазу и модифицированную сульфамидазу в фармакокинетических (ФК) пробах плазмы определяли в ходе иммуноанализа методом ЭХЛ, используя платформу Meso Scale Discovery (MSD). Покрытый стрептавидином планшет MSD блокировали 5% Blocker-A в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ). Планшет промывали, после чего разные растворы стандарта и ФК проб распределяли на планшете. Добавляли смесь биотинилированного мышиного моноклонального антитела (mAb, от англ. "monoclonal antibody") к анти-сульфамидазе и сульфо-Ru-меченых кроличьих антител к анти-сульфамидазе и планшет инкубировали при к.т. Комплексы сульфамидазы и меченых антител связывались с планшетом, покрытым стрептавидином, посредством биотинилированного mAb. После промывки количество связанных комплексов определяли, добавляя буфер для считывания в лунки, и планшет считывали на приборе MSD SI2400. Зарегистрированные импульсы ЭХЛ были пропорциональны количеству сульфамидазы в пробе, их оценивали относительно релевантного стандарта сульфамидазы.
Результаты
Плазменный клиренс модифицированной сульфамидазы у мышей был приблизительно в 10 раз ниже по сравнению с немодифицированной сульфамидазой, смотрите таблицу 3 ниже. Это вероятно, по меньшей мере частично является результатом ингибирования опосредованного рецепторами захвата в периферической ткани после химической модификации сульфамидазы (как показано в изучениях клеточного захвата примера 6).
Данные о выведении у мышей, полученные для модифицированной сульфамидазы, полученной в стабильной клеточной линии согласно примеру 1 и модифицированной согласно новому способу 3 примера 4, находятся в соответствии с данными, представленными в таблице 3 для модифицированной сульфамидазы, полученной в системе QMCF и модифицированной новым способом 1. Пониженное выведение белка может позволить реже вводить дозу пациентам.
Пример 8. Влияние in vivo модифицированной сульфамидазы на накопление гепарансульфата в головном мозге
Вещества и способы
Исследовали in vivo влияние внутривенно (вв) введенной модифицированной сульфамидазы, полученной, как описано в примере 1, в эписомальной экспрессирующей системе Quattromed Cell Factory (QMCF) (Icosagen AS) и модифицированной согласно новому способу 1 примера 4, на накопление гепарансульфата в головном мозге.
Получение образца для опытов: Модифицированную сульфамидазу готовили в количестве 6 мг/мл, стерильно фильтровали и замораживали при -70°С до использования. Замороженную модифицированную сульфамидазу и раствор соответствующего плацебо размораживали в день инъекции при комнатной температуре в течение периода времени от минимум одного часа до двух часов перед использованием. Хлорфенирамин растворяли в изотоническом растворе до концентрации 0,5 мг/мл и хранили при -20°С.
mps3a
Животные: Использовали самцов мышей, имеющих спонтанную гомозиготную мутацию в гене mps3a, B6.Cg-Sgsh/PstJ (МПС IIIA) (Jackson Laboratories, ME, USA). Животных содержали по отдельности в клетках при 23 плюс/минус 1°С и влажности 40-60%, и они имели свободный доступ к воде и стандартной лабораторной пищи. 12/12 часовой цикл дня и ночи устанавливали при включении света в 19:00. Животные акклиматизировались по меньшей мере в течение двух недель перед началом изучения. Сиблинги дикого типа из той же единицы потомства также были включены в качестве контрольных животных. В исследовании А мышам было 23 - 24 недели, в исследовании В мышам было 9-10 недель.
Ход экспериментального исследования А: Модифицированную сульфамидазу в количестве 30 мг/кг (n равно 8) и плацебо (n равно 7) вводили внутривенно мышам с МПС IIIA раз в два дня в течение двадцати пяти дней (13 инъекций). Хлорфенирамин дозировали (2,5 мг/кг) подкожно за 30-45 минут до введения модифицированной сульфамидазы или плацебо. Дозировать начинали приблизительно в 07:00 часов утра. Исследуемый образец и плацебо вводили в количестве 5 мл/кг. Конечный объем введения корректировали с учетом истинной массы тела в каждом случае дозирования. Эту схему повторяли для плацебо. Исследование завершалось через 2 часа после последней инъекции. Необработанные в соответствующей возрастной группе мыши дикого типа (n равно 5) были включены вместе с группами, обработанными исследуемым образцом. Мышам делали анестезию при помощи изофлурана. Кровь отбирали из ретроорбитального венозного сплетения. За перфузией следовала промывка 20 мл солевого раствора через левый желудочек сердца. Ткани вырезали (головной мозг, печень, селезенка, легкое и сердце), взвешивали и быстро замораживали в жидком азоте. Ткани и кровь подготавливали, чтобы измерить уровни гексозамин-N-сульфат[α-1,4]уроновой кислоты (ГС-УК), используя ЖХ-МС/МС. ГС-УК является дисахаридным маркером накопления гепарансульфата, и таким образом уменьшение уровней ГС-УК отражает разложение гепарансульфата. Данные ГС-УК вычисляли в относительных единицах в сравнении с внутренним стандартом, выражали на мг ткани и нормировали к среднему значению контрольной группы. Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, общее значение показывали также с помощью поправки Бонферрони для множественных сравнений ретроспективного анализа для критерия значимости между группами (*Р менее 0,05, **Р менее 0,01, ***Р менее 0,001).
Ход экспериментального исследования В: Модифицированную сульфамидазу в количестве 30 мг/кг (n равно 6), 10 мг/кг (n равно 6) и плацебо (n равно 6) вводили внутривенно мышам с МПС IIIA раз в неделю в течение 10 недель (10 инъекций). Хлорфенирамин дозировали (2,5 мг/кг) подкожно за 30-45 минут до введения модифицированной сульфамидазы или плацебо. Конечный объем введения корректировали с учетом истинной массы тела в каждом случае дозирования. Эту схему повторяли для плацебо. Исследование завершалось через 24 часа после последней инъекции. Необработанные в соответствующей возрастной группе мыши дикого типа (n равно 6) были включены вместе с группами, обработанными исследуемым образцом. Мышам делали анестезию при помощи изофлурана. Кровь отбирали из ретроорбитального венозного сплетения. За перфузией следовала промывка 20 мл солевого раствора через левый желудочек сердца. Ткани вырезали (головной мозг, печень, селезенка), взвешивали и быстро замораживали в жидком азоте. Ткани и кровь подготавливали, чтобы измерить уровни ГС-УК, используя ЖХ-МС/МС. Данные ГС-УК вычисляли в относительных единицах в сравнении с внутренним стандартом, выражали на мг ткани и нормировали к среднему значению контрольной группы. Данные анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, общее значение показывали с помощью поправки Бонферрони для множественных сравнений ретроспективного анализа для критерия значимости между группами (*Р менее 0,05, **Р менее 0,01, ***Р менее 0,001).
3
Анализ ЖХ-МС/МС ГС-УК в пробах ткани: Анализ жидкостной хроматографии тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС) гексозамин-N-сульфат[α-1,4]уроновой кислоты (ГС-УК) в пробах ткани отчасти выполняли согласно способам, описанным Fuller et al. (Pediatr Res 56: 733-738 (2004)) и Ramsay et al. (Mol Genet Metab 78:193-204 (2003)). Ткани (90-180 мг) гомогенизировали в субстратном буфере (29 мМ диэтилбарбитуровая кислота, 29 мМ ацетат натрия, 0,68% (масс/об) NaCl, 100 мл воды, рН 6,5), используя устройство Lysing Matrix D (MP Biomedicals, LLC, Ohio, US). Гомогенизацию осуществляли в течение 25 секунд в гомогенизаторе Savant FastPrep FP120/Bio101 (LabWrench, ON, Canada) и гомогенат потом центрифугировали в центрифуге Eppendorf 5417R при 10000 rcf (от англ. "relative centrifugal force" - относительное ускорение центрифуги). Надосадочную жидкость выпаривали почти досуха. Добавляли 150 мкл раствора для получения производных (250 мМ 3-метил-1-фенил-2-пиразолин-5-он (МФП), 400 мМ NH, рН 9,1) и 5 мкл исходного раствора внутреннего стандарта хондроитин дисахарид Δdi-4S натрия (AUA-GalNAc4S, 0,1 мг/мл). Получение производных осуществляли при 70°С в течение 90 минут при встряхивании, и затем растворы подкисляли 200 мкл 800 мМ муравьиной кислоты. Добавляли деионизированную воду к пробам до конечного объема 500 мкл, и экстракцию выполняли хлороформом (3 × 500 мкл), чтобы удалить избыток МФП. Центрифугирование осуществляли при 13000 × g в течение 5 минут и верхнюю фазу переносили в новую пробирку. Чтобы удалить избыток муравьиной кислоты и NH4COOH, водную фазу выпаривали досуха в вакуумном концентраторе SpeedVac (Savant Instruments Inc., Farmingdale, NY). Пробы разбавляли до суммарных 100 мкл 5% ацетонитрилом / 0,1% уксусной кислотой / 0,02% ТФК.
Анализ ЖХ-МС/МС выполняли на сверхпроизводительном жидкостном хроматографе (СПЖХ) Waters, соединенном с тройным квадрупольным масс-спектрометром Sciex API 4000. Управление прибором, регистрацию данных и оценку выполняли с помощью программного обеспечения Analyst.
Разделение с помощью ЖХ выполняли, используя колонку Acquity С18 CSH (50 × 2,1 мм, 1,7 мкм). Подвижная фаза А состояла из 5% ацетонитрила / 0,5% муравьиной кислоты, подвижная фаза В состояла из 95% ацетонитрила / 0,5% муравьиной кислоты. Использовали градиент от 1% до 99% В в течение 7 минут при скорости потока 0,35 мл/мин. Объем вводимой пробы составлял 10 мкл. API 4000 функционировал в режиме мониторинга множественных реакций (ММР) электрораспыления отрицательных ионов. Использовали напряжение распыления ионов 4,5 кВ, температура источника составляла 450°С. В качестве газа для соударений использовали аргон. Энергия соударения составляла 34 В. Переходы ММР составили 764,4/331,2 (МФП-ГС-УК) и 788,3/534,3 (МФП-внутренний стандарт). Относительное количество ГС-УК вычисляли относительно уровня внутреннего стандарта.
Результаты
Результаты исследования А, показанные на фигуре 6А, иллюстрируют, что сульфамидаза, модифицированная согласно новому способу 1, уменьшала уровни ГС-УК в головном мозге на 30% после повторного внутривенного введения через день в течение 25 дней (13 доз) в количестве 30 мг/кг.
Кроме того, обработка модифицированной сульфамидазой полностью снижала уровни ГС-УК в печени (фигура 6В) и легком (не показано).
Результаты исследования В показаны на фигуре 6С и иллюстрируют, что модифицированная сульфамидаза согласно новому способу 1 уменьшала уровни ГС-УК в головном мозге на 48% и 14% после повторного внутривенного введения раз в неделю в течение 10 недель в количестве 30 мг/кг и 10 мг/кг, соответственно.
Следовательно, эти результаты демонстрируют, что белок сульфамидаза, модифицированный согласно новому способу 1, описанному в данном документе, приводит, после продолжительного лечения, к устойчивому уменьшению уровней ГС-УК в головном мозге, а также по существу полному снижению уровней ГС-УК в периферических органах.
Пример 9. Оптимизация модификации сульфамидазы
В большинстве случаев способ химической модификации можно разделить на два этапа: окисление, являющееся первой стадией, обозначаемой в дальнейшем в этом документе R1, и восстановление, являющееся второй стадией, обозначаемой R2. Чтобы оптимизировать две стадии, составляли план полного факторного эксперимента (ППФЭ), исследуя влияние температуры, концентрации и времени для двух стадий.
Вещества и способы
Сульфамидазу, полученную, как описано в примере 1, в эписомальной экспрессирующей системе Quattromed Cell Factory (QMCF) (Icosagen AS), модифицировали по существу, как описано в примере 4 для нового способа 1, однако исследуемые параметры изменяли в соответствии с таблицей 4 (ниже). Исследование R1 проводили с таким же восстановлением и параметрами обработки, как описано в примере 4 (способ 1). Конечными точками анализа являются степень окисления гликанов, описанная в примере 1, и уровень клеточного захвата модифицированного белка, описанный в примере 6.
Число параметров и вид избранного плана дают десять экспериментов для каждой стадии, результаты которых оценивали, используя программное обеспечение MODDE 10 (Umetrics АВ).
Кроме того, влияние второй стадии гашения исследовали на сульфамидазе, полученной с параметрами R1 8°С, 60 минут и 20 мМ метапериодат натрия. Две дополнительные реакции выполняли параллельно в ППФЭ эксперименте и гасили, используя 0,1 М ацетон или добавляя уксусную кислоту до рН 6,0 или ниже. Конечную обработку выполняли согласно схеме других реакций. Полученную таким образом сульфамидазу оценивали, используя способ ДСН-ПААГ, описанный в примере 5.
Эксперименты R2 проводили с сульфамидазой, модифицированной согласно параметрам, которые были найдены наилучшими после анализа ППФЭ для R1.
Результаты
Результаты R1 обобщены далее в таблице 5:
Кроме того, проводили анализ гликозилирования согласно примеру 1 для сульфамидазы, модифицированной согласно известному способу. На участках N-гликозилирования N(21), N(131), N(244) и N(393) не были обнаружены остаточные первоначальные N-гликаны.
Оценка с помощью MODDE R1 (окисление) показала, что оптимальными условиями для R1 являются температура приблизительно 8°С, продолжительность реакции приблизительно 1 час и концентрация приблизительно 10 ммоль/л метапериодата натрия. Общее состояние белка (например, структурная целостность), вероятно выигрывает от наименьшей концентрации окислителя, что возможно ограничивает клеточный захват через рецепторы, распознающие гликаны, до уровня нового способа 1 (подробную информацию смотрите в примере 6).
Среди разных условий, раскрытых для R1, время реакции считалось важным параметром для степени модификации гликана. Кроме того, концентрация периодата может влиять на степень модификации гликана.
Таким образом, в плане R2 (восстановление) использовали вышеопределенные предпочтительные параметры для R1, т.е. используемые для окисления сульфамидазы. Критической конечной точкой для R2 является содержание FGly, поскольку было обнаружено, что оно влияет на активность модифицированной сульфамидазы (сравните примеры 3 и 5). Результаты показаны ниже в таблице 6. Относительное количество фрагментов пептида, содержащих FGly50 и Ser50, анализировали с помощью ЖХ-МС, измеряя площади пиков на реконструированных ионных хроматограммах (без поправки на эффективность ионизации).
ППФЭ для R2 показал, что образование Ser связано с концентрацией боргидрида натрия и температурой. Принимая во внимание образование Ser и присутствие высокомолекулярных форм (данные не показаны, результаты аналогичны тем, что получены для нового способа 2 в примере 4), предпочтительными условиями для R2 являются температура приблизительно 0°С, продолжительность реакции приблизительно 1 час или менее, и концентрация боргидрида натрия больше 12 ммоль/л и вплоть до и включая 50 ммоль/л.
В ходе ДСН-ПААГ подтверждается (данные не показаны), что сульфамидаза, полученная в реакции, в которой гасили стадию восстановления, сравнима с сульфамидазой, полученной без гашения. Это означает, что включение второй стадии гашения не влияет отрицательно на качество вещества либо при гашении 0,1 М ацетоном, либо при уменьшении рН ниже 6 при добавлении уксусной кислоты.
Пример 10. Анализ гликановой структуры после химической модификации сульфамидазы согласно ранее известному способу Вещества и способы
Химическая модификация согласно известному способу: Химическую модификацию сульфамидазы согласно известному способу выполняли, как описано в примере 2.
Анализ гликозилирования: Анализ гликановой структуры на сульфамидазе после химической модификации осуществляли согласно способу ЖХ-МС, описанному в примере 1.
Полученные в результате модификации на гликановых группировках на четырех фрагментах триптического пептида, содержащих участки N-гликозилирования N(21), N(131), N(244) и N(393), описанные в примере 1, исследовали с помощью анализа ЖХ-МС.
Результаты
Анализ гликозилирования: Как описано в примере 1, тип гликозилирования, обнаруженный на четырех участках гликозилирования до химической модификации, преимущественно представлял собой комплексные гликаны на N(21) и N(393) и олигоманнозный тип гликанов на N(131) и N(244).
После химической модификации подробное описание модифицированной гликановой структуры выполняли на преобладающих химически модифицированных гликопептидах (менее распространенные гликаны не детектировались из-за значительного уменьшения чувствительности в результате увеличенной неоднородности гликанов после химической модификации). В этом примере исследуют модификацию на Ман-6 гликане после химической модификации согласно известному способу.
Обработка периодатом гликанов расщепляет углеродные связи между двумя соседними гидроксильными группами углеводных группировок и изменяет молекулярную массу гликановой цепи. Фигура 8А иллюстрирует пример предполагаемых разрывов связей на маннозе после химической модификации. Фигура 8В изображает модель Ман-6 гликана, показывающую теоретические разрывы связей, которые могут иметь место после окисления периодатом натрия.
На фигуре 9 показаны масс-спектры триптического пептида NITR с Ман-6 гликаном, присоединенном к N(131) (Т13+Ман-6 гликан), до и после химической модификации согласно ранее известному способу. Установили ионы, соответствующие химически модифицированному гликопептиду с разной частотой разрыва связей. Для Ман-6 гликана теоретически это может быть максимально 3 разрыва двойных связей и один разрыв одинарной связи. При проведении модификации согласно известному способу было найдено, что самый интенсивный ионный сигнал в масс-спектре соответствовал разрывам 2 двойных связей и разрывам 2 одинарных связей, тогда как второй по интенсивности ионный сигнал соответствовал разрывам 3 двойных связей и разрыву одной одинарной связи, являющемуся возможно самым распространенным разрывом связей. Диаграмма визуализации частоты разрыва связей, обнаруженных в Т13+Ман-6 гликане после химической модификации согласно известному способу, показана на фигуре 10А (вследствие изотопного распределения наблюдаемых ионов результаты являются приблизительными, но сопоставимыми). Воспроизводимость химической модификации исследовали, используя три разные пробы химически модифицированной сульфамидазы, полученной согласно ранее известному способу. Ионы, соответствующие разной частоте разрыва связей, показали очень похожее распределение в МС спектрах трех разных проб.
Пример 11. Анализ гликановой структуры после химической модификации сульфамидазы согласно новым способам 1, 3 и 4.
Новые способы 1, 3 и 4: Химические модификации сульфамидазы согласно новым способам выполняли, как описано в примере 4.
Анализ гликозилирования: Анализ гликозилирования осуществляли методом ЖХ-МС, описанным в примере 1. Результат модификации на гликановых вариантах четырех фрагментов триптического пептида, содержащих участки N-гликозилирования N(21), N(131), N(244) и N(393), исследовали с помощью анализа ЖХ-МС.
Результаты
Анализ гликозилирования: Подробное описание модифицированного гликанового профиля сульфамидазы химически модифицированной согласно новым способам 1, 3 и 4, выполняли на преобладающих химически модифицированных гликопептидах. В этом примере 11 исследовали модификацию на Ман-6 гликане после химической модификации согласно новым способам 1, 3 и 4.
Установили ионы, соответствующие химически модифицированному гликопептиду Т13+Ман-6 гликан с разной частотой разрыва связей. Теоретически это могут быть максимально 3 разрыва двойных связей и один разрыв одинарной связи (смотрите на фигуре 8 В модель Ман-6 гликана, показывающую возможные разрывы связей, возникающие после окисления периодатом натрия). При проведении модификации согласно новому способу 1 было найдено, что самый интенсивный ионный сигнал в масс-спектре соответствовал разрыву одной двойной связи и разрывам 3 одинарных связей, тогда как второй по интенсивности ионный сигнал соответствовал разрывам 2 двойных связей и разрывам 2 одинарных связей. При проведении модификации согласно новым способам 3 и 4 разрывы связей в Ман-6 гликане были еще больше смещены в сторону преимущественно разрывов одинарных связей. На фигуре 10А показана диаграмма визуализации частоты разрыва связей Т13+Ман-6 гликана триптического пептида после химической модификации.
Воспроизводимость химической модификации исследовали, используя три пробы (новый способ 1) или две пробы (новый способ 3) химически модифицированной сульфамидазы.
При сравнении модификаций Ман-6 гликана, полученных из сульфамидазы, химически модифицированной согласно известному способу, с модификациями Ман-6 гликана, полученными из сульфамидазы, химически модифицированной согласно новым способам 1, 3 и 4, существовало большое различие в частоте разрыва связей. Это показано на фигуре 10А, где распределение разных частот разрыва связей представлено графически для четырех способов (вследствие изотопного распределения наблюдаемых ионов результаты являются приблизительными, но сопоставимыми).
Фигура 10В показывает относительную распространенность разрывов одинарных связей для используемых способов. Ранее известный способ дает модифицированную сульфамидазу, имеющую 45% разрывов одинарных связей в исследуемом Ман-6-гликане, тогда как новые способы 1, 3 и 4 дают 70, 80 и 82% разрывов одинарных связей, соответственно, после химической модификации.