ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ДОЗИРОВАННОГО ВЗЯТИЯ КЛЕТОЧНОГО МАТЕРИАЛА С КОНЪЮНКТИВЫ "ГЛАЗНОЙ ПОВЕРХНОСТИ"
INSTRUMENT FOR MEASURED SAMPLING OF CELL MATERIAL FROM EYE SURFACE CONJUNCTIVA

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и может быть использовано в клинической практике для верификации морфологических изменений конъюнктивы «глазной поверхности», оптимизации диагностики синдрома «сухого глаза», а также для контроля эффективности терапевтических мероприятий.
Синдром «сухого глаза» в настоящее время является одним из наиболее распространенных заболеваний органа зрения [The Epidemiology Subcommittee of the International Dry Eye Work Shop // The epidemiology of dry eye disease // Ocul. Surf, 2007. - Vol.5, №2.- P.93-107]. В течение последних десятилетий разработаны и предложены к использованию различные способы диагностики данного заболевания, однако, по свидетельству отечественных и зарубежных авторов, данная проблема все еще далека от своего оптимального решения, особенно при начальных и бессимптомных проявлениях синдрома «сухого глаза» [Бржесский В.В. и соавт. Роговично-конъюнктивальный ксероз. Изд. 2-е. - СПб., 2003. - С.119; Д.Ю.Майчук. Патогенетическая роль воспаления в формировании вторичного сухого глаза // Материалы научно-практической конференции - Федоровские чтения - 2006 - «Современные методы диагностики в офтальмологии. - М., 2006. - С.255-258; The Research Subcommittee of International Dry Eye Work Shop // Research in dry eye // Ocul. Surf, 2007. - Vol.5, №2. - P.179-193].
Одним из направлений верификации морфологических изменений тканей «глазной поверхности» при синдроме «сухого глаза» является импрессионная цитология конъюнктивы с использованием целлюлозно-ацетатных фильтров Millipore с размером поры от 0,22 до 0,45 мкм [Vadrevu V.L. et al. Enhancement to the cjnjunctival impression cytology technique and examples of applications in a clinico-biocheical study of dry eye. - CLAO J., 1994. - Vol.20; №1. - P.59-63; Singh R. et al. Impression cytology of the ocular surface. - Br. J. of Ophthalmol, 2005. - Vol.89; №7. - P.1655-1659]. После забора материала путем прижатия фильтра к слизистой оболочке отпечатки эпителиальных клеток фиксируются и окрашиваются либо непосредственно на фильтровальной бумаге, либо после перенесения отпечатка на предметное стекло, затем проводятся различные варианты визуального морфометрического анализа.
В различных модификациях фильтровальную бумагу прижимают к конъюнктиве «глазной поверхности» стеклянной палочкой или поверхностью «головки» тонометра Гольдмана, при этом авторы описывают оказываемое на ткани давление различными субъективными терминами, характеризуя его как «нежное прижатие» или «легкое давление» [Murube J. Impression cytology on conjunctiva and cornea in dry eye patients establishes a correlation between squamous metaplasia and dry eye clinical severity. - Eur. J. Ophthalmol., 2003. - Vol 13; №2. - P.115-127; Singh R. et al. Impression cytology of the ocular surface. - Br. J. Of Ophthalmol, 2005. - Vol.89; №7. - P.1655-1659].
Недостатком данного подхода является недостаточная дозированность забора клеточного материала из-за отсутствия объективных показателей необходимого усилия компрессии (прижатия) фильтровальной бумаги к конъюнктиве «глазной поверхности», что может быть причиной недостаточной воспроизводимости результатов исследования.
Таким образом, приведенные данные обусловливают актуальность оптимизации импрессионной цитологии, а именно разработку инструмента для дозированного взятия клеточного материала конъюнктивы «глазной поверхности», с целью повышения воспроизводимости результатов исследования.
За ближайший аналог взятия клеточного материала принята импрессионная цитология в модификации Singh R. et al. (2005) [Singh R. et al. Impression cytology of the ocular surface. - Br. J. of Ophthalmol, 2005. - Vol.89; №7. - P.1655-1659]. Забор клеток конъюнктивы проводят следующим образом: целлюлозно-ацетатный фильтр помещают на конъюнктиву глаза пинцетом, затем осуществляют его «нежное прижатие» к слизистой оболочке «головкой» тонометра Гольдмана в течение 5-10 с, после чего фильтровальную бумагу извлекают из конъюнктивальной полости пинцетом.
Недостатки: заявителями не выявлены какие-либо инструменты, обеспечивающие стандартное единообразное прижатие целлюлозно-ацетатного фильтра к конъюнктиве «глазной поверхности» с приложением одинакового усилия компрессии, за исключением использования «головки» тонометра Гольдмана. Необходимое усилие прижатия целлюлозно-ацетатного фильтра к конъюнктиве глазной поверхности описывается авторами субъективным термином «нежное прижатие» и не имеет какого-либо объективного количественного выражения. Указанная особенность может приводить к недостаточной воспроизводимости полученных результатов.
Кроме этого, при указанном подходе взятия клеточного материала требуется последовательное трехэтапное использование двух инструментов: пинцета для помещения целлюлозно-ацетатного фильтра на поверхность конъюнктивы, «головки» тонометра Гольдмана для прижатия фильтра к слизистой, пинцета для удаления фильтра с поверхности конъюнктивы. Указанная особенность, с одной стороны, может снижать воспроизводимость результатов исследования, а с другой, не исключает ятрогенное повреждение конъюнктивы «глазной поверхности» браншами пинцета при попытке захвата края целлюлозно-ацетатного фильтра, плотно прижатого к поверхности слизистой оболочки.
Задачи:
1. Разработать инструмент для дозированного взятия клеточного материала с конъюнктивы «глазной поверхности».
2. Обеспечить адекватную воспроизводимость взятия клеточного материала конъюнктивы «глазной поверхности».
Сущность изобретения: разработанный заявителями инструмент для дозированного взятия клеточного материала имеет корпус в форме полого цилиндра, глухо закрытого с торца, пружину, ориентированную вдоль оси цилиндра, закрепленную перед торцом на фиксаторе, причем пружина откалибрована на ее сжатие при усилии 15 граммов, с рабочего конца корпус имеет шток с упорной втулкой-ограничителем движения штока, опирающийся на пружину, на конце штока расположен сменный стерилизуемый наконечник с резьбой, на внешней стороне наконечника при помощи сменного кольца зафиксирован целлюлозно-ацетатный фильтр.
Техническим результатом изобретения является обеспечение адекватных условий получения клеточного материала с конъюнктивы «глазной поверхности», что позволяет объективизировать диагностику, просто и оперативно провести в динамике контроль за результатами лечения. Устройство легко стерилизуется, конструктивно удобно в использовании, так как дозированное усилие в 15 грамм при переносе фильтра на конъюнктиву осуществляется просто однократным прикосновением к конъюнктиве «глазной поверхности» в течение 5 секунд.
Кроме этого, использование разработанного инструмента позволяет сделать процедуру забора клеточного материала конъюнктивы более безопасной, так как исключается возможность травматизации конъюнктивы при извлечении целлюлозно-ацетатного фильтра браншами пинцета, что не исключено при проведении манипуляции с помощью известных приемов.
Для лучшего понимания предлагаемый инструмент для дозированного взятия клеточного материала конъюнктивы «глазной поверхности» показан на чертеже, где: 1 - корпус; 2 - шток; 3 - пружина; 4 - упорная втулка; 5 - фиксатор пружины; 6 - торец; 7 - сменный стерилизуемый наконечник; 8 - полоска целлюлозно-ацетатного фильтра; 9 - сменное стерилизуемое кольцо для фиксации фильтра. Все элементы инструмента выполнены из нержавеющей стали 12Х18Н10Т.
Инструмент для дозированного взятия клеточного материала с конъюнктивы «глазной поверхности» используют следующим образом. Забор клеточного материала проводят после однократной инстилляции в конъюнктивальную полость 0,4% раствора оксибупрокаина («Инокаин»). Веки исследуемого глаза фиксируют пальцами левой руки врача-исследователя. Корпус инструмента 1 удерживается тремя пальцами правой руки исследователя (большим, указательным и средним); безымянный палец и мизинец правой руки врача фиксируют на окологлазничной области пациента. Предварительно, на внешней поверхности сменного стерилизуемого наконечника 7 при помощи сменного стерилизуемого кольца 9 фиксируют стерильная полоска целлюлозно-ацетатного фильтра 8 марки НАТН размером 10×8 мм (корпорации Millipore). Полоску стерильной фильтровальной бумаги 8, закрепленную на сменном наконечнике 7, прижимают к конъюнктиве «глазной поверхности». При этом шток инструмента 2 за счет сжатия пружины 3, фиксированной на фиксаторе пружины 5, полностью погружается в корпус инструмента 1. Полный ход штока 2 до контакта сменного наконечника 7 и упорной втулки 4 обеспечивает приложение к конъюнктиве глазной поверхности усилия, равного 15 граммам. Необходимое время прижатия целлюлозно-ацетатного фильтра к конъюнктиве «глазной поверхности» - 5 секунд.
Таким образом, разработанный инструмент позволяет в течение всего времени исследования оказывать равномерное усилие - 15 грамм - на конъюнктиву «глазной поверхности». После пятисекундной дозированной компрессии фильтровальную бумагу извлекают с поверхности конъюнктивы вместе с инструментом. В глаз пациента инсталлируют капли антибиотика ципрофлоксацина 0,3%.
В отличие от известных приемов усилие компрессии стандартизировано, так как имеет объективное количественное выражение (прикладываемая сила - 15 грамм). Фиксация фильтровальной бумаги на сменной стерилизуемой головке инструмента позволяет упростить манипуляцию и сделать ее более безопасной для пациента. В известных аналогах в ходе исследования требуется поочередное трехэтапное использование двух инструментов: пинцета для помещения целлюлозно-ацетатного фильтра на конъюнктиву, «головки» тонометра Гольдмана для «нежного прижатия» фильтра к конъюнктиве, пинцета для извлечения фильтра с поверхности слизистой оболочки «глазной поверхности». При этом возможно ятрогенное повреждение конъюнктивы, так как при захвате края целлюлозно-ацетатного фильтра, плотно прижатого к слизистой глаза, не исключено захватывание браншами пинцета непосредственно ткани конъюнктивы и ее травматизация.
После этого клетки конъюнктивы переносят с полоски фильтровальной бумаги 8 на обезжиренное предметное стекло. Для этого врач-исследователь удерживает корпус инструмента 1 в правой руке, целлюлозно-ацетатный фильтр прижимают к поверхности предметного стекла. При этом шток инструмента 2 за счет сжатия пружины 3, фиксированной на фиксаторе пружины 5, полностью погружают в корпус инструмента, то есть до достижения усилия в 15 грамм. Необходимое время контакта фильтровальной бумаги и предметного стекла - 5 секунд.
Затем клетки конъюнктивы, перенесенные на предметное стекло, подсушивают на воздухе 30-40 минут и подвергают фиксации, окрашиванию и патоморфологическому исследованию.
Инструмент был апробирован в условиях клиники. Для сравнительной оценки воспроизводимости результатов забора клеточного материала конъюнктивы «глазной поверхности» было проведено взятие 7 проб по Singh R. et al. (2005), а также 7 проб с использованием разработанного инструмента. Взятие проб проводили у одного человека-добровольца в возрасте 60 лет без признаков какой-либо глазной патологии. Взятие всех образцов эпителия конъюнктивы у одного и того же человека обусловлено необходимостью обеспечить единообразие проб изучаемой ткани. Таким образом, в основную группу вошли 7 отпечатков эпителия конъюнктивы, полученных с использованием разработанного инструмента; контрольную группу составили 7 отпечатков эпителия конъюнктивы, полученные без использования указанного инструмента. В каждом отпечатке, окрашенном по Май-Грюнвальду, подсчитывали по 5 полей зрения и рассчитывали среднее количество эпителиоцитов в расчете на одно поле зрения для данного образца.
Основным критерием в оценке воспроизводимости результатов исследования был коэффициент вариации (CV). Все полученные результаты подвергали обработке методами вариационной статистики.
Результаты сравнительной оценки воспризводимости результатов забора клеточного материала конъюнктивы «глазной поверхности» с использованием разработанного инструмента и без его использования (по Singh R. et al., 2005) представлены в таблице 1.
Таблица 1Сравнительная оценка воспроизводимости результатов забора клеточного материала с использованием разработанного инструмента и без его использования
Способ забора материала
Среднее количество эпителиоцитов в образцах конъюнктивы в расчете на одно поле зрения микроскопа МББ-1a при общем увеличении 400 х
образец 1
образец 2
образец 3
образец 4
образец 5
образец 6
образец 7
С использованием разработанного инструмента
20
19
19
20
20
20
18
Без использования разработанного инструмента
11
13
18
19
12
20
26
Примечание:
А) Результаты статистической обработки для всех образцов, взятых с использованием инструмента для дозированного забора материала: 9,43±0,30 Коэффициент вариации (CV)=4,05%.
Б) Результаты статистической обработки для всех образцов, взятых без использования инструмента для дозированного забора материала: 17±2,02 Коэффициент вариации (CV)=31,49%.
Таким образом, при использовании разработанного инструмента для дозированного забора клеточного материала конъюнктивы «глазной поверхности» вариабельность результатов снижается в 7,8 раз, что свидетельствует о существенном повышении воспроизводимости результатов забора клеточного материала.