Спектрологическое исследование фармакокинетики эндогенного фотосенсибилизатора пропорфирина IX в тканях самок мышей

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ТЕРАПИЯ 35

УДК 576.7:616.153.979.733:616-073.584 L.A. Belyaeva12, L. V. Adamyan1, A.A. Stepanyan1, С. Yu. Vasilchenko2, М. Taraz2, V.B. Loschenov2 SPECTROSCOPIC RESEARCH OF THE PROTOPORPHYRIN IX PHARMACOKINETICS IN THE TISSUES OF FEMALE MICE 1Dept. of Reproductive Medicine and Surgery, Faculty of Postgraduate Education, Moscow State Medical — Stomatologic University; 2Center of Natural Research, A.M. Prokhorov General Physics Institute, RAS ABSTRACT In this work we present the results of laser fluorescence spectroscopy of 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX in tissues of mice This experimental research is devoted to studying of the pharmacokinetics of protoporphyrin IX metabolized from 5-aminolevulinic acid (5-ALA, Alasens) by laser fluorescent spectroscopy. Work was carried out on female mice owing to primary studying of genital organs and a proving of a potential of realization of the fluorescent diagnostics in gynecology by spectral analysis. Oral 5-ALA administration (300 mg kg-1) results in the significant elevation of Pp IX levels 2-8 hours later, with levels returning to normal by 24 hours. Key words: fluorescence diagnostics, photosensitizer, 5-aminolevulinic acid, pharmacokinetics. JI.A. Беляева1,2, JI.B. Адамян1, А.А. Степанян1, С.Ю. Васильченко 2, М. Тараз2, В.Б. Лощеное2 СПЕКТРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФАРМАКОКИНЕТИКИ ЭНДОГЕННОГО ФОТОСЕНСИБИЛИЗАТОРА ПРОТОПОРФИРИНАIX В ТКАНЯХ САМОК МЫШЕЙ 'Кафедра репродуктивной медицины и хирургии факультета последипломного образования Московского государственного медико-стоматологического университета 2Центр естественно-научных исследований Института общей физики им. акад. А.М. Прохорова РАН РЕЗЮМЕ Данное экспериментальное исследование посвящено изучению с помощью лазерной флюоресцентной спектроскопии фармакокинетики протопорфирина IX (Пп IX) после перорального введения 5-аминолевуленовой кислоты (Аласенса). Работа проводилась на самках мышей вследствие преимущественного изучения органов репродуктивной системы и обоснования возможности проведения флюоресцентной диагностики, основанной на методе спектрального анализа, в гинекологии. Пероральное введение Аласенса в дозе 300 мг/кг веса мышей приводило к накоплению диагностически значимых концентраций протопорфирина IX в органах и тканях в интервале 2-8 ч после введения препарата с практически полной его элиминацией через 24 ч. Ключевые слова: флюоресцентная диагностика, фотосенсибилизатор, 5-аминолевуленовая кислота, фармакокинетика. ВВЕДЕНИЕ монстрировали, что после системного введения 5-AJIK 5-Аминолевуленовая кислота (5-AJIK) использует- в основном клетки эпидермального происхождения ся для флюоресцентной диагностики (ФД) и фотодина- накапливают протопорфирин IX (Пп IX) и в основе мической терапии (ФДТ) раковых, предраковых и ряда ФД лежит повышенное накопление Пп IX в патологи-неопухолевых заболеваний. Многочисленные иссле- чески быстро пролиферирующих клетках по сравне-дования in vitro и эксперименты на животных проде- нию с клетками нормальной ткани [3; 5; 7; 8; 13; 14].

№4/том2/2003 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ

5-АЛК не является фотосенсибилизатором, она участвует в биосинтезе тема и индуцирует синтез прото-порфирина IX (рис. 1), обладающего флюоресцентными и фототоксическими свойствами [9]. Биосинтез гема —жизненно необходимый процесс, он происходит во всех аэробных клетках. Присоединение иона железа к Пп IX при участии фермента феррохелатаза приводит к образованию гема, это относительно медленный процесс. Поэтому введение экзогенной 5-АЛК ведет к продукции и накоплению Пп IX [2]. Продолжительность фотодинамического эффекта Пп IX коррелирует с временем его превращения в фотонеактивный гем. В отличие от гема свободный Пп IX не обладает внутренней биоактивностью, однако он является естественным нетоксичным фотосенсибилизатором, и облучение светом определенной длины волны в ультрафиолетовом диапазоне или диапазоне видимого света обуславливает значительные фотодинамические эффекты [10]. Присутствие гема в норме ингибирует синтез 5-АЛК, однако механизм этой отрицательной обратной связи временно нарушается при экзогенном введении чрезмерно большого количества 5-АЛК. А поскольку лимитирует скорость биосинтеза гема этап конверсии Пп IX в гем, указанные механизмы обуславливают аккумуляцию именно фотоактивного Пп IX. Накопление промежуточных продуктов, таких, как уропорфириноген, копропорфириноген пренебрежимо мало [6]. В отличие от их деоксигенированных форм, уропорфирин и копропорфирин также являются фотоактивными.

Спектроскопические исследования приводят к лучшему пониманию биологических и физиологических процессов, происходящих при ФД и ФДТ, — образование эндогенных фотосенсибилизаторов, их распределение в различных органах и тканях организма, фо-тоиндуцированные явления [1; 4; 11; 12]. Оптическая спектроскопия играет ключевую роль в научных исследованиях, направленных на развитие неинвазивных технологий для диагностики тканей, и часто называется «оптической биопсией».

Основанием проведения данной работы являлось изучение спектральных свойств тканей методом лазерной флюоресцентной спектроскопии тканей и органов самок мышей и определение накопления Пп IX в зависимости от времени после введения 5-АЛК. Доза и способ введения 5-АЛК были выбраны как эквивалентные параметры для последующих клинических исследований заболеваний органов репродуктивной системы в гинекологии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Всего исследовано 33 половозрелых самок мышей породы ВАЬВ в периоде диэструса, массой около 20 мг. Исследовались 11 групп — по 3 мыши в каждой: одна группа—контрольная (без введения Аласенса), 10 групп — после введения Аласенса с интервалом 1; 2; 3; 4; 6; 8; 10; 24; 48 и 72 ч.

Применялась 5-аминолевуленовая кислота, коммерческое название препарата—Апасенс (ГНЦ НИОПИК, Москва, Россия). Он вводился мышам перорально в дозе 300 мг/кг, которая эквивалентна дозе 25 мг/кг д ля человека, в объеме 0,3 мл физиологического раствора. Через определенные интервалы времени животных забивали, после чего сразу же проводилась флюоресцентная спектрометрия тканей половых органов, а также брюшины, кишечника, печени, желчного пузыря, почек, мочевого пузыря, кожи.

Фармакокинетика Аласенс-индуцированного Пп IX методом флюоресцентной спектроскопии изучалась на лазерной электронно-спектральной установке ЛЭСА--ОГ'Биоспек” (Москва, Россия). Основные компоненты ее—источник лазерного излучения (633 нм, выходная мощность —1-10 мВт) для возбуждения фотосенсибилизатора и спектроанализатор для приема флюоресценции и рассеянного лазерного излучения и последующего анализа (рис.2). Для подведения лазерного излучения к исследуемому объекту и передачи получаемого сигнала на спектроанализатор применялась волоконно-оптическая система. Система светофильтров обеспе-

Феррохелатаза

5-АЛК-синтетаза

Глицин

-ь - »

' Сукцинил СоА

Отрицательная / обратная связь '

Fe2* + Протопорфирин IX

Протопорфириноген IУу

'^Митохондрия^'

Захват экзогенной 5-АЛК

5-АЛК

♦

Порфобилиноген

»Порфобилиноген-деаминаза (высокая активность в опухолевых клетках) Уропорфириноген III

♦

Копропорфириноген I

Цитоплазма

Рис.1. Схема биосинтеза гема. Экзогенно введенная 5-АЛК обходит отрицательную обратную связь между ге-мом и образованием внутриклеточной 5-АЛК, что приводит к накоплению Пп IX

Рис.2. Портативная спектроскопическая система ЛЭСА-01-“Биоспек”.

чивала регистрацию сигналов флюоресценции и рассеянного лазерного излучения одновременно в диапазоне 630-750 нм. Получаемая информация обрабатывалась на специализированной программе компьютера.

Учитывая миниатюрные размеры и малую толщину тканей исследовавшихся органов у мышей, мы использовали специальное диагностическое волокно общим диаметром 0,7 мм (диаметр стандартного волокна 1,8 мм), внутри которого размещались 3 волокна: одно волокно для подведения лазерного излучения к ткани и два — для приема флюоресценции и рассеянного лазерного излучения и передачи сигнала к спектрометру. Это позволило проводить оптическое зондирование тканей на необходимой малой глубине и уменьшило погрешности измерений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Спектры анализировались по форме и амплитуде сигнала, затем автоматически при построении гистограммы рассчитывался коэффициент флюоресценции к-

Ф Бг ’

где: Б, — флюоресценция;

82—рассеянное лазерное излучение.

Коэффициент флюоресценции использовался как диагностический критерий относительной концентрации Пп IX в различных тканях. Полученные значения кф нормировались относительно нормальной кожи руки, принятой за единицу.

Результаты флюоресцентной спектрометрии показали максимум накопления Аласенс-индуцированного Пп IX в тканях матки (рис. 3) через 4 ч после перораль-ного введения Аласенса, в тканях вагины (рис. 4), маточных трубах и яичниках—через 4-6 ч. Полученные данные продемонстрировали быструю элиминацию Пп IX из этих тканей—через 24 ч интенсивность флюоресценции была близка к интенсивности собственной флюоресценции аналогичных тканей мышей контрольной группы. Интенсивность Аласенс-индуцированного Пп IX (&.) была выше в тканях матки, чем в вагине, в 2 раза. Низкие значения /сф получены в тканях маточных труб, яичников, а также брюшины.

Самая высокая концентрация Пп IX наблюдалась в желчном пузыре (кф в 10 раз выше, чем к. матки) и в печени (кф в 3-4 раз выше, чем /сф матки). Кроме того, спектральный анализ показал высокое содержание Пп IX в ткани печени мышей контрольной группы, сравнимое с содержанием Пп IX в матке в периоде на-

Рис.З. Фармакокинетика Аласенс-индуцированного Пп1Х в тканях вагины мышей:

по оси х — длина волны в нм;

по оси у — интенсивность флюоресценции в относительных единицах.

Представленные спектры соотносятся по нумерации со значениями гистограммы, отражающими интенсивность флюоресценции Пп IX в исследуемых тканях (кф).

Рис.4. Фармакокинетика Аласенс-индуцированного Пп1Х в тканях матки мышей:

по оси х — длина волны в нм;

по оси у — интенсивность флюоресценции в относительных единицах.

Представленные спектры соотносятся по нумерации со значениями гистограммы, отражающими интенсивность флюоресценции Пп IX в исследуемых тканях (кф).

копления (1-2 ч после введения Аласенса) и выведения препарата (10 ч), и еще более высокое содержание эндогенного Пп IX в желчном пузыре. При этом значения /сф Аласенс-индуцированного Пп IX возвращались к исходному уровню только через 3 сут.

Анализ формы спектра тканей тонкого и толстого отделов кишечника показал преобладание копропор-фиринов над Аласенс-индуцированным Пп IX: пик флюоресценции смещен в область 670 нм, тогда как для Пп IX характерен пик флюоресценции в области 700 нм (рис. 5). Максимальный /сф наблюдался в тонком кишечнике через 3 ч, в толстом — через 8-10 ч. При этом в тканях ануса определялись спектры флюоресценции, характерные для Пп IX, и, в отличие от других отделов кишечника, там не выявлено высокой собственной флюоресценции эндогенных флюорохромов.

Из органов мочевыделительной системы наибольшее содержание Пп IX определено в уретре — через 6 ч после приема Аласенса, к концу суток параметры возвращались к исходным значениям. В тканях почек, мочеточников и мочевого пузыря обнаружено низкое содержание Пп IX. Флюоресцентная спектроскопия тканей почек позволила выявить умеренную собственную флюоресценцию этих тканей, обусловленную содержанием в них уропорфиринов.

Исследование динамики накопления Аласенс-индуцированного Пп IX в коже экспериментальных животных показало невысокое содержание в них Пп IX с максимумом интенсивности флюоресценции через 6 ч после перорального введения Аласенса. Незначительная концентрация Пп IX определялось в коже через 72 ч.

Данная работа продемонстрировала возможность изучения фармакокинетики фотосенсибилизатор-индуци-рующего препарата методом флюоресцентной спектроскопии. Различная степень и динамика накопления Пп IX зависела от типа тканей. Из обследованных органов

половой системы наибольшая концентрация Пп IX наблюдалась в функционально активных тканях матки. Элиминация эндогенного флюорохрома проявлялась уменьшением и исчезновением флюоресценции—фото-бличингом. Высокая скорость синтеза Аласенс-индуци-рованного Пп IX и последующего фотобличинга имеет важное практическое значение. Препарат Аласенс обуславливает низкую кожную фототоксичность лишь в течение 24 ч. Достижение фотобличинга говорит о нецелесообразности проведения световой экспозиции.

1 700 1 600

Рис.5 Типичные формы спектров протопорфирина IX и копропорфирина:

по оси х — дайна волны в нм;

по оси у — интенсивность флюоресценции в относительных единицах.

ВЫВОД

Пероральное введение Аласенса в дозе 300 мг/кг веса мышей приводит к накоплению диагностически значимых концентраций протопорфирина IX в органах и тканях в интервале 2-8 ч после введения препарата. Знание временной зависимости необходимо для правильного выбора времени проведения флюоресцентной диагностики, подбора дозы, пути введения препарата и времени проведения фотодинамической терапии.

ЛИТЕРАТУРА

1. Aalders М.С., Sterenborg H.J., Stewart F.A. et al. Photodetection with 5-Aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX in the rat abdominal cavity: drug-dose-dependent fluorescence kinetics // Photochem. Photobiol. — 2000. — Vol. 72(4). — P. 521-525.

2. Bagdonas S., Ma L. W., Iani V. et al. Phototransformations of 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX in vitro: a spectroscopic study // Photochem. Photobiol. — 2000, —Vol. 72(2).—P. 186-192.

3. Juzenas P., Sorensen R., Iani V., Moan J. Uptake of topically applied 5-aminolevulinic acid and production of protoporphyrin IX in normal mouse skin: dependence on skin temperature // Photochem. Photobiol. — 1999. — Vol. 69(4).—P. 478-481.

4. Hewett J., Nadeau V., Ferguson J. et al. The application of a compact multispectral imaging system with integrated excitation source to in vivo monitoring of fluorescence during topical photodynamic therapy of superficial skin cancers // Photochem. Photobiol. — 2001.

— Vol. 73(3). — P. 278-282.

5. Gerscher S., Connelly J.P., Griffiths J. et al. Comparison of the pharmacokinetics and phototoxicity of protoporphyrin IX metabolized from 5-aminolevulinic acid and two derivatives in human skin in vivo // Photochem. Photobiol.

— 2000. — Vol. 72(4). — P. 569-574.

6. Kennedy J.C., Pottier R.H. Endogenous protoporphyrin IX, a clinically useful photosensitizer for photodynamic therapy // J. Photochem. Photobiol. B. Biol. — 1992,- Vol. 14. — P. 275,

7. Moan J., Ma L. W., Iani V. On the pharmacokinetics of topically applied 5-aminolevulinic acid and two of its esters // Int. J. Cancer. — 2001.—Vol. 92(1).— P. 139-143.

8. Pereira B., Curi R., Kokubun E. et al. 5-aminolevulinic acid-induced alterations of oxidative metabolism in sedentary and exercise-trained rats // J. Appl. Physiol. — 1992. — Vol. 72(1). — P. 226-230.

9. Rick K., Sroka R., Stepp H., Kriegmair M. et al. Pharmacokinetics of 5-aminolevulinic acid-induced protoporphyrin IX in skin and blood // J. Photochem. Photobiol. B. — 1997. — Vol. 40(3). — P. 313-319.

10. Sorensen R., Iani V., Moan J. Kinetics of photobleaching of protoporphyrin IX in the skin of nude mice exposed to different fluence rates of red light // Photochem. Photobiol. — 1998. — Vol. 68(6). — P. 835-840.

11. Steinbach P., Weingandt II., Baumgartner R. et al. Cellular fluorescence of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX following exposure to 5-aminolevulinic acid // Photochem. Photobiol. — 1995. — Vol. 62(5). —P. 887-895.

12. Sroka R., Beyer W., Gossner L. et al. Pharmacokinetics of 5-aminolevulinic-acid-induced porphyrins in tumour-bearing mice // J. Photochem. Photobiol. B. — 1996. — Vol. 34(1). —P. 13-19.

13. Van den Akker J.T., Iani V., Star W.M. et al. Topical application of 5-aminolevulinic acid hexyl ester and 5-aminolevulinic acid to normal nude mouse skin: differences in protoporphyrin IX fluorescence kinetics and the role of the stratum corneum // Photochem. Photobiol. — 2000. — Vol. 72(5). — P. 681-689.

14. Van den Boogert J., Houtsmuller A.B., de Rooij F. W. et al. Kinetics, localization, and mechanism of 5-aminolevulinic acid-induced porphyrin accumulation in normal and Barrett’s-like rat esophagus // Lasers Surg. Med. —1999. — Vol. 24(1). — P. 3-13.