ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ КОНСОРЦИУМА АЗОТФИКСИРУЮЩИХ И ФОСФАТМОБИЛИЗУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
CULTURE MEDIUM FOR GROWING CONSORTIUM OF NITROGEN-FIXING AND PHOSPHATE-MOBILISING MICROORGANISMS

Изобретение относится к области создания биопрепаратов на основе индивидуальных микроорганизмов и их сочетаний (консорциумов) и может быть использовано в микробиологии и сельском хозяйстве.
Известна питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая глюкозу, аспарагин, сульфат калия, кукурузный экстракт, хлорид кальция, фосфат натрия и воду [1]. Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста азотфиксирующих микроорганизмов, вследствие чего она малопригодна для выращивания их консорциума.
Известна питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, карбонат кальция, сахарозу и воду [2]. Недостатком данной питательной среды является относительно низкая скорость роста на ней азотфиксирующих микроорганизмов, а также практическое отсутствие на ней роста фосфатмобилизующих микроорганизмов, вследствие чего она также малопригодна для выращивания их консорциума.
Наиболее близким к заявляемому нами объекту по совокупности признаков и достигаемому техническому эффекту является питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II), сахарозу и воду (т.н. среда Берка), описанная в [3]. Недостатком данной питательной среды, которая в связи с указанным обстоятельством взята нами за прототип, также является сравнительно низкая скорость роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов, и, следовательно, их консорциума в целом.
Цель настоящего изобретения - увеличение скорости роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов на питательной среде при выращивании консорциума на их основе.
Поставленная цель достигается тем, что питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат кальция, молибдат натрия, сульфат железа(II) и воду, дополнительно содержит фосфорит при следующем соотношении компонентов (г/л):
Дигидрофосфат калия
0.60-0.70
Гидрофосфат калия
0.12-0.20
Сульфат магния гептагидрат
0.15-0.25
Хлорид натрия
0.15-0.25
Сульфат кальция дигидрат
0.02-0.06
Молибдат натрия
0.0005-0.0007
Сульфат железа(II)
0.002-0.004
Сахароза
18.0-22.0
Фосфорит
1.0-1.5
Вода дистиллированная
До 1 л
В результате использования данной питательной смеси скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов возрастает более чем в 15 раз, фосфатмобилизующих - почти на порядок по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3].
До настоящего времени в литературе не была кем-либо описана питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, содержащая вышеуказанную совокупность ингредиентов вообще и фосфорит в частности. Это обстоятельство дает нам основание считать, что заявляемый нами объект соответствует первому критериальному признаку изобретения по патентному законодательству РФ - новизна. С другой стороны, сопоставление известных признаков питательной среды-прототипа [3] и отличительных признаков заявляемой нами питательной среды (а именно введение в нее фосфорита) не позволяют предсказать априори появления у нее новых по сравнению с прототипом свойств, а именно указанного выше резкого увеличения скорости роста как азотфиксирующих, так и фосфатмобилизующих микроорганизмов в рамках вышеуказанного консорциума (в обоих случаях - на порядок и более). Указанное обстоятельство дает нам право утверждать, что заявляемый объект явным образом не следует из известного в данной отрасли техники уровня; следовательно, налицо его соответствие второму критериальному признаку изобретения по патентному законодательству РФ - изобретательский уровень. Предлагаемая нами питательная среда достаточно без особого труда может быть создана в промышленном масштабе и ее применение для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов осуществимо без каких-либо проблем, в связи с чем есть все основания утверждать: заявляемому нами объекту присущ и третий установленный патентным законодательством РФ критериальный признак изобретения, а именно промышленная применимость.
Заявляемая на предмет изобретения питательная среда для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов может быть проиллюстрирована нижеследующими примерами.
Пример 1
Приготавливают питательную среду для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов состава, г/л:
Дигидрофосфат калия
0.60
Гидрофосфат калия
0.12
Сульфат магния гептагидрат
0.15
Хлорид натрия
0.15
Сульфат кальция дигидрат
0.02
Молибдат натрия
0.0005
Сульфат железа(II)
0.002
Сахароза
18.0
Фосфорит
1.0
Вода дистиллированная
До 1 л
-1
-1
Составляют консорциум азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов на основе коллекционных (депонированных) штаммов поименованных микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10388) и (Sphingobacterium multivorum. Регистрационный номер в ВКПМ В-10385), соответственно, с соотношением 1:1 по количеству КОЕ (колониеобразующих единиц). Для этого предварительно выращивают азотфиксирующие микроорганизмы на агаризованной среде Эшби, а фосфатмобилизующие - на агаризованной среде Муромцева, после чего обе эти культуры высеваются на питательную среду указанного выше состава. Выращивание ведут в течение того периода времени, в котором имеет место прирост их численности (5.0 сут), после чего этот процесс прекращают. Для определения численности микроорганизмов сразу же проводят посев консорциума на агаризованные питательные среды (среда Эшби в случае азотфиксирующих и среда Муромцева в случае фосфатмобилизирующих) и определяют среднюю скорость их роста в (млн·г·сут) как частное от деления числа микроорганизмов (в миллионах единиц) на массу питательной среды (в г) и время выращивания (в сут). Данные по скорости роста азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов для вышеуказанной питательной среды представлены в Таблице 1.
ПРИМЕР 2
Выполняют, как и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
Дигидрофосфат калия
0.64
Гидрофосфат калия
0.16
Сульфат магния гептагидрат
0.20
Хлорид натрия
0.20
Сульфат кальция дигидрат
0.05
Молибдат натрия
0.0006
Сульфат железа(II)
0.003
Сахароза
20.0
Фосфорит
1.2
Вода дистиллированная
До 1 л
Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая представлены в Таблице 1.
Пример 3
Проводят таким же образом, как и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:
Дигидрофосфат калия
0.70
Гидрофосфат калия
0.20
Сульфат магния гептагидрат
0.25
Хлорид натрия
0.25
Сульфат кальция дигидрат
0.06
Молибдат натрия
0.0007
Сульфат железа(II)
0.004
Сахароза
22.0
Фосфорит
1.5
Вода дистиллированная
До 1 л
Данные по определению скорости роста поименовавнных выше микроорганизмов для указанного случая приведены в Таблице 1.
Пример 4 (сравнительный)
Осуществляют по типу примера 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов приготавливают питательную среду состава, г/л:
Дигидрофосфат калия
0.64
Гидрофосфат калия
0.16
Сульфат магния гептагидрат
0.20
Хлорид натрия
0.20
Сульфат кальция дигидрат
0.05
Молибдат натрия
0.0005
Сульфат железа(II)
0.003
Сахароза
20.0
Фосфорит
0.8
Вода дистиллированная
До 1 л
Показатели скорости роста вышеуказанных микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.
Пример 5 (сравнительный)
Выполняют подобно примеру 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов применяют питательную среду состава, г/л:
Дигидрофосфат калия
0.64
Гидрофосфат калия
0.16
Сульфат магния гептагидрат
0.20
Хлорид натрия
0.20
Сульфат кальция дигидрат
0.05
Молибдат натрия
0.0005
Сульфат железа(II)
0.003
Сахароза
20.0
Фосфорит
1.8
Вода дистиллированная
До 1 л
Данные по определению скорости роста микроорганизмов для этого случая приведены в Таблице 1.
Пример 6 (сравнительный)
Выполняют по той же общей технологии, что и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
Дигидрофосфат калия
0.50
Гидрофосфат калия
0.09
Сульфат магния гептагидрат
0.10
Хлорид натрия
0.15
Сульфат кальция дигидрат
0.015
Молибдат натрия
0.0003
Сульфат железа(II)
0.001
Сахароза
14.0
Фосфорит
1.2
Вода дистиллированная
До 1 л
Результаты по определению скорости роста микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.
Пример 7 (сравнительный)
Проводят, как и пример 1, но выращивание консорциума вышеуказанных микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:
Дигидрофосфат калия
0.90
Гидрофосфат калия
0.30
Сульфат магния гептагидрат
0.30
Хлорид натрия
0.35
Сульфат кальция дигидрат
0.09
Молибдат натрия
0.0010
Сульфат железа(II)
0.006
Сахароза
28.0
Фосфорит
1.2
Вода дистиллированная
До 1 л
Данные по скорости роста обоих этих микроорганизмов для указанного случая представлены в Таблице 1.
Пример 8 (сравнительный)
Осуществляют, как и пример 1, но для выращивания консорциума микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
Дигидрофосфат калия
0.50
Гидрофосфат калия
0.09
Сульфат магния гептагидрат
0.10
Хлорид натрия
0.15
Сульфат кальция дигидрат
0.015
Молибдат натрия
0.0003
Сульфат железа(II)
0.001
Сахароза
14.0
Фосфорит
1.8
Вода дистиллированная
До 1 л
Значения скорости роста микроорганизмов для данного случая см. в Таблице 1.
Пример 9 (сравнительный)
Осуществляют, применяя описанную в примере 1 общую схему, но выращивание консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов осуществляют на питательной среде состава, г/л:
Дигидрофосфат калия
0.90
Гидрофосфат калия
0.30
Сульфат магния гептагидрат
0.30
Хлорид натрия
0.35
Сульфат кальция дигидрат
0.09
Молибдат натрия
0.0010
Сульфат железа(II)
0.006
Сахароза
28.0
Фосфорит
1.8
Вода дистиллированная
До 1 л
Значения скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая приведены в Таблице 1.
Пример 10 (по прототипу [3])
Выполняют по той же технологической схеме, что и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
Дигидрофосфат калия
0.64
Гидрофосфат калия
0.16
Сульфат магния гептагидрат
0.20
Хлорид натрия
0.20
Сульфат кальция дигидрат
0.05
Молибдат натрия
0.0005
Сульфат железа(II)
0.003
Сахароза
20.0
Вода дистиллированная
До 1 л
Данные о скорости роста микроорганизмов для рассматриваемого случая см. в Таблице 1.
Пример 11 (по аналогу [1])
Осуществляют таким же образом, как и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
Сульфат калия
0.20
Хлорид кальция гексагидрат
3.30
Фосфат натрия додекагидрат
3.80
Кукурузный экстракт
0.20
Глюкоза
10.0
Аспарагин
1.00
Вода дистиллированная
До 1 л
Сведения о скорости роста микроорганизмов для данного случая представлены в Таблице 1.
Пример 12 (по аналогу [2])
Выполняют по той же технологической схеме, что и пример 1, но для выращивания консорциума азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов используют питательную среду состава, г/л:
Дигидрофосфат калия
0.10
Гидрофосфат калия
0.20
Сульфат магния гептагидрат
0.20
Хлорид натрия
0.20
Карбонат кальция
5.00
Сахароза
20.0
Вода дистиллированная
До 1 л
Данные по скорости роста микроорганизмов для этого случая также представлены в Таблице 1.
Таблица 1
№ примера
Содержание фосфорита в питательной смеси, г/л
Средняя скорость роста азотфиксирующих микроорганизмов (Pseudomonas brassicacearum), млн·г<sup>-1</sup>·сут<sup>-1</sup>
Средняя скорость роста фосфатмобилизующих микроорганизмов {Sphingobacterium multivorum), млн·г<sup>-1</sup>·сут<sup>-1</sup>
1
1.0
600/5
1750/5
2
1.2
620/5
1780/5
3
1.5
610/5
1730/5
4 (сравнительный)
0.8
490/5
1520/5
5 (сравнительный)
1.8
600/5
1690/5
6 (сравнительный)
1.2
540/5
1650/5
7 (сравнительный)
1.2
590/5
1700/5
8 (сравнительный)
1.8
550/5
1620/5
9 (сравнительный)
1.8
570/5
1660/5
10 (по прототипу)
-
36/5
175/5
11 (по аналогу [1])
-
12/5
180/5
12 (по аналогу [2])
-
55/5
6/5
Как можно видеть из приведенных в Таблице 1 данных, применение заявляемой питательной среды, содержащей фосфорит в количестве (1.0-1.5) г/л, позволяет резко увеличить скорости роста азотфиксирующих (Pseudomonas brassicacearum) и фосфатмобилизующих (Sphingobacterium multivorum) микроорганизмов в рамках их консорциума по сравнению с таковыми для питательной среды-прототипа [3] и сред-аналогов [1] и [2]. Заявляемые нами количества фосфорита в питательной смеси являются существенными: увеличение этого количества сверх указанного верхнего заявляемого значения (1.5 г/л) не приводит к дальнейшему возрастанию скорости роста как тех, так и других микроорганизмов и даже происходит некоторое ее снижение, при уменьшении же ниже указанного нижнего заявляемого значения (1.0 г/л) имеет место снижение скорости роста.
Аналогичные результаты были зафиксированы нами и на других культурах азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов (в частности, Azotobacter chroococcum, Регистрационный номер в ВКПМ В-10387 и Achromobacter xylosoxidans, Регистрационный номер в ВКПМ В-10386).
ЛИТЕРАТУРА
[1] Основные микробиологические и биохимические методы исследования почвы (Методические рекомендации) / Под ред. Ю.М.Возняковской. - Л.: ВНИИСХМ, 1987. С.31.
[2] Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 3-е издание переработанное, под ред. Н.С.Егорова. М: Издательство Московского университета. 1995. - С.204.
[3] Патент РФ 2.177.466 (2001), МПК C05F 11/08, C12N 1/20 (прототип).