СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАКТЕРИЦИДНЫХ СВОЙСТВ ВЕЩЕСТВ
METHOD OF DETERMINING BACTERICIDAL PROPERTIES OF SUBSTANCES

Изобретение относится к области биоизмерительных технологий, а именно к способам оценки с помощью тестовых микроорганизмов бактерицидных свойств различных веществ.
Известен «Способ определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным веществам» (патент RU №2505813, МПК G01N 33/48, дата приоритета 06.11.2012, опубликовано 27.01.2014), в котором антимикробную активность тестируемых веществ по отношению к тому или иному биоматериалу предлагается определять, исходя из количества колоний микроорганизмов, исходно содержащихся в означенном биоматериале и выросших на плотной накопительной питательной среде в присутствии тестируемого препарата, а также времени проявления видимого роста этих колоний. Недостатками этого способа являются его длительность (до 3-х суток), большая трудоемкость, большая материалоемкость по компонентам питательных сред, а также то, что антимикробная активность тестируемых веществ определяется визуально, и, следовательно, достаточно субъективно.
Известен «Способ оценки эффективности антимикробного воздействия антисептиков на бактерии, существующие в форме биопленки» (патент RU №2603100, МПК C12Q, дата приоритета 29.10.2015, опубликовано 20.11.2016), в котором эффективность действия антисептиков на бактерии, выделенные из клинического материала пациента и существующие в жидкой питательной среде (ЖПС) в форме биопленки, предлагается определять как отношение рабочей концентрации антисептика к его минимальной подавляющей концентрации. При этом регистрацию эффективности действия той или иной концентрации тестируемого антисептика на биопленку предлагается проводить с помощью фотометра - по изменению цвета и помутнению ЖПС с тестовыми микроорганизмами, инкубируемой при заданной температуре в течение заданного времени (от 5-и суток и более) в присутствии тестируемого антисептика, взятого в упомянутой концентрации. Основными недостатками этого способа, как и в предыдущих случаях, являются его большая длительность и трудоемкость, а также невысокая объективность, поскольку рассматриваемый способ позволяет оценивать влияние тестируемых веществ лишь на скорость роста тестовых микроорганизмов, но не на интенсивность их метаболизма.
Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является «Способ определения бактерицидных свойств сыворотки крови» (патент RU №2489489, МПК C12Q 1/18, дата приоритета 26.12.2011, опубликовано 10.08.2013), в котором бактерицидные свойства проб сыворотки крови определяют по уменьшению интенсивности люминесценции инкубируемого в LB-бульоне в присутствии тестируемых проб тестового трансгенного штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-10548, эффективно экспрессирующего luxAB-гены грамотрицательного морского микроорганизма Photobacterium leiognathi (в результате чего синтезируется фермент люцифераза, обеспечивающий активное свечение, интенсивность которого зависит от общего количества жизнеспособных тестовых микроорганизмов и активности их метаболизма). При этом анализ осуществляют следующим образом:
на первом (подготовительном) этапе выращивают штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 на LB-arape в присутствии канамицина в конечной концентрации 40 мкг/мл (что позволяет исключить рост не люминесцирующих штаммов) при 37°С в течение 24 часов. Полученную биомассу смывают стерильным LB-бульоном, после чего полученную суспензию стандартизуют до оптической плотности 1,2 отн. ед. при 540 нм (измеряемой в кюветах с длиной оптического пути 1 см);
-6
на втором (основном) этапе смешивают суспензию бактериальных клеток и исследуемого образца сыворотки крови в соотношении 1:1 и инкубируют полученную смесь при 37°С в течение 30 минут. При этом до и после инкубации из тестовой смеси производят отбор аликвот по 250 мкл в кюветы для биолюминометра. И дополнительно вносят в них по 2 мкл деканаля в конечной концентрации 7×10 М (окисляемого в присутствии молекулярного кислорода ферментом люциферазой - что и обеспечивает активное свечение тестового штамма).
На завершающем этапе осуществляют регистрацию уровня свечения в пробах в видимой сине-зеленой области спектра (420-600 им). При этом в качестве измерительного прибора могут использоваться биохемилюминометр «Биоток-10М», а также прочие отечественные и зарубежные люминометры, работающие в обозначенной области спектра и обеспечивающие соответствующую чувствительность измерений.
К основным недостаткам данного технического решения можно отнести:
- узкую область применения (анализ бактерицидных свойств только лишь сыворотки крови человека и животных);
- необходимость использования специально выведенного, трансгенного, узкоспециализированного штамма тестовых микроорганизмов - что дополнительно ограничивает область применения данного технического решения, поскольку для тестирования про- и антибиотических свойств разных веществ могут требоваться разные тестовые организмы (либо лучше даже совокупность из нескольких разных видов и штаммов тестовых организмов);
- кроме того, штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-10548, применяемый при реализации данного технического решения, не является широко доступным, и потому достаточно трудно сначала получить данный штамм, а затем длительное время поддерживать его чистоту, жизнеспособность и специфические свойства (выражающиеся, в частности, в активном синтезе фермента люциферазы);
- а также то, что рассматриваемый метод обладает не очень высокой объективностью, поскольку влияние тестируемых объектов (в качестве которых в данном случае выступают образцы сыворотки крови животных и человека) на тестовые организмы определяется всего лишь по одному косвенному параметру (интенсивности хемилюминесценции этих объектов) и с использованием тест-культуры с метаболизмом, не типичным по ряду параметров для большинства живых организмов.
Решается задача расширения области применения, а также повышения объективности и обеспечения доступности для использования более широким кругом пользователей способа определения бактерицидных свойств различных веществ.
5
6
s
Iod
Е
Х
Iod
Е
Х
Y
Сущность заключается в том, что в предлагаемом способе (который включает такие операции как: подготовка тестовых образцов, инкубирование этих образцов, как в присутствии тестируемых веществ, так и в их отсутствие, сопровождающееся измерением свойств этих образцов в начале и в конце их инкубации, и последующее определение бактерицидных свойств тестируемых веществ на основании упомянутых измерений) тестовые образцы перед началом их инкубирования представляют собой Escherichia coli в количестве от 5×10 до 5×10 жизнеспособных клеток на мл, суспендированную в водном растворе, изначально содержащем 4-6 г/л глюкозы, 16-20 г/л белкового гидролизата и 1,8-2,2 г/л NaCI, и имеющем рН 6,8-7,4; инкубирование этих образцов в присутствии тестируемых веществ проводят в течение 4-8 часов при 36-38°С; свойства образцов определяют путем измерения значений интенсивности упругого светорассеяния (Iod), редокс потенциала (Е) и электропроводности (X); после чего общую степень активирования или ин-гибирования (+/-) жизнедеятельности тестовых микроорганизмов тестируемыми веществами определяют по формуле: ε=(ε+0,5ε+0,5ε)/2, где ε, ε и ε определяют по формулам ε=100×(ΔYt-ΔYc)/ΔYc, где ΔY=Ye-Yb - разности значений Iod, E или X, регистрируемых в начале (Yb) и в конце (Ye) инкубации тестовых образцов в присутствии тестируемых веществ (ΔYt) и в их отсутствие (ΔYc).
При этом выбор Escherichia coli в качестве тестовых микроорганизмов связан с тем, что E. coli является общепринятым санитарно-показательным микроорганизмом, официально рекомендуемым, в частности, для оценки качества воды, пищевой продукции, фармакологических и иных препаратов и т.п. (ГОСТ 18963-73. Вода питьевая. Методы санитарно-бактериологического анализа. + ГОСТ 30726-2001. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида Escherichia coli + Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. / Под. ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.); способна к активной жизнедеятельности как в аэробных, так и в анаэробных условиях, в широком диапазоне температур и на самых разнообразных субстратах (включая полное отсутствие органических веществ); является типичным представителем микрофлоры большинства природных водоемов и территорий, производственных и бытовых помещений, кишечника человека и большинства млекопитающих; легко доступна в получении, выделении (при необходимости) и культивировании; а также обладает весьма развитой ферментной системой, позволяющей E. coli осуществлять широкий спектр метаболических процессов, типичных для других живых организмов, и соответственно, типично для большинства живых организмов реагировать на присутствие широкого круга тестируемых объектов.
5
6
Выбор количества жизнеспособных тестовых микроорганизмов, которое должно присутствовать в тестовых образцах перед началом их инкубации в присутствии и в отсутствие тестируемых веществ (от 5×10 до 5×10 кл/мл), определяется тем, что при меньшем количестве таковых микроорганизмов увеличивается длительность инкубации, необходимая для достижения максимальной чувствительности заявляемого способа анализа; а при большем количестве тестовых микроорганизмов снижается интенсивность их роста и метаболизма, что приводит к уменьшению чувствительности анализа.
Выбор исходного состава жидкой питательной среды, входящей в состав тестируемых образцов (водный раствор с рН 6,8-7,4, содержащий 4-6 г/л глюкозы, 16-20 г/л белкового гидролизата и 1,8-2,2 г/л NaCl), связан с необходимостью обеспечения оптимальных условий для развития в этой среде тестовых микроорганизмов - что, как и в предыдущем случае, нужно для увеличения чувствительности и снижения продолжительности анализа.
Выбор режима инкубирования тестовых образцов (4-8 часов при 36-38°С) связан с тем, что при более длительном инкубировании снижается интенсивность роста и метаболизма тестовых микроорганизмов (что приводит к соответствующему снижению чувствительности анализа); при других температурах инкубирования интенсивность роста и метаболизма тестовых микроорганизмов также снижается (что приводит к уменьшению чувствительности анализа и необходимости увеличения его длительности); а при меньшем времени инкубирования тестовые микроорганизмы не успевают в достаточной степени среагировать на изменения в окружающей их среде, вызванные присутствием там тестируемых объектов (что приводит к снижению, как чувствительности, так и объективности анализа).
Увеличение (по сравнению с прототипом) объективности и спектра применимости заявляемого способа анализа обеспечивается тем, что в ходе него осуществляется точная, инструментальная, количественная оценка изменения как интенсивности роста (оцениваемой нефелометрическим методом по изменению у тестовых образцов значений Iod), так и метаболической активности (оцениваемой по изменению у тестовых образцов значений Е и X) общепринятых санитарно-показательных тестовых микроорганизмов (E. coli) вследствие воздействия на них широкого круга тестируемых объектов (которые могут включать в себя как различные отдельные химические частицы, вещества и материалы, так и их разнообразные смеси). В то время как в прототипе влияние тестируемых веществ на тестовые микрорганизмы определялось всего лишь по одному параметру тестового образца (а именно, интенсивности его хемилюминесценции); причем данным способом предлагалось оценивать бактерицидные свойства весьма узкого круга тестируемых объектов (а именно, сыворотки крови человека и животных), и к тому же, с помощью трансгенного, узкоспециализированного штамма тестовых микроорганизмов Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 с метаболизмом, не типичным по ряду параметров для большинства живых организмов.
А доступность заявляемого способа анализа более широкому кругу пользователей обеспечивается, во-первых, возможностью применения для регистрации параметров тестовых образцов таких простых в эксплуатации, доступных и дешевых, переносных приборов, как например нефелометр «WGZ-2», иономер «Эксперт-001» и кондуктометр «Эксперт-002». Во-вторых, применением при анализе минимального числа дополнительных реагентов и ручных операций по засеву и оценке роста и метаболической активности тестовых микроорганизмов в присутствии тестируемых объектов (в то время как в прототипе предлагалось использовать такие специфические химические реагенты, как канамицин, деканаль и т.п., а также осуществлять множество дополнительных ручных операций по выращиванию тестовых микроорганизмов на LB-arape и последующему приготовлению суспензии бактериальных клеток в LB-бульоне). И, в-третьих, возможностью применения для анализа такого хорошо доступного и легко культивируемого вида тестовых микроорганизмов, как E. coli (в то время как в прототипе в качестве тестовых микроорганизмов предлагалось использовать штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-10548, малодоступный и трудно культивируемый в условиях необходимости поддержания требуемой степени чистоты и жизнеспособности данной микробиологической культуры, нужных для осуществления Bacillus subtilis ВКПМ В-10548 таких специфических свойств, как, в частности, активный синтез фермента люциферазы).
Реализация предлагаемого способа определения бактерицидных свойств веществ осуществляется следующим образом:
Этап 1. В две или несколько стерильных емкостей заливается необходимое количество жидкой питательной среды (ЖПС), представляющей собой водный раствор с рН 6,8-7,4, содержащий 4-6 г/л глюкозы, 16-20 г/л белкового гидролизата и 1,8-2,2 г/л NaCl. Далее, все емкости с ЖПС закрываются и стерилизуются. После чего все емкости со стерильной ЖПС (СЖПС) хранятся в закрытом виде, в отсутствие света при 2-4°С.
Этап 2. Отбирается определенное количество тестируемого объекта (вещества или смеси различных веществ). После чего отобранные пробы доставляются в лабораторию и хранятся там до начала анализа в темном месте, в закрытом виде, при 2-4°С.
5
6
5
6
Этап 3. Приготавливается ЖПС с тестовыми микроорганизмами (МЖПС). Для чего в одну или несколько емкостей с СЖПС стерильно вносится 1 об. % закваски, содержащей жизнеспособные клетки Escherichia coli, суспендированные в ЖПС; после чего все эти емкости закрываются и инкубируются при 36-38°С в течение 12 ч. Далее, в каждой из них нефелометриче-ским методом измеряется интенсивность упругого светорассеяния (Iod) МЖПС.И по предварительно построенному калибровочному графику (представляющему собой зависимость Iod МЖПС от концентрации содержащихся в ней клеток E. coli) удостоверяется, что полученное значение Iod соответствует концентрации E. coli в МЖПС от 5×10 до 5×10 клеток на мл. При этом, если Iod, измеренная в какой-либо из емкостей, соответствует концентрации E. coli в МЖПС меньше 5×10 кл/мл, то эта емкость инкубируется при 36-38°С в течение еще 3 ч; после чего для нее проводится повторное определение Iod. А если Iod, измеренная в какой-либо из емкостей, соответствует концентрации E. coli в МЖПС больше 5×10 кл/мл, то МЖПС в этой емкости разбавляется необходимым количеством СЖПС.
Этап 4. Если нас интересует концентрационная зависимость про- или антимикробного действия тестируемого объекта, содержащегося в пробах, отобранных на 2-м этапе анализа, либо эти пробы имеют слишком высокую исходную токсичность (так что ожидается, что в неразведенном виде они будут слишком сильно ингибировать развитие тестовых микроорганизмов), то делается необходимое количество разведений исходных проб. После чего каждая проба или каждое ее разведение делится на 3-5 равных частей, каждая из которых помещается в отдельную емкость (например, пробирку), куда также добавляется заданное количество смеси, содержащей СЖПС и МЖПС в соотношении от 9/1 до 3/2 по объему.
Этап 5. Все емкости с тестируемыми объектами, плюс некоторое количество контрольных емкостей, содержащих МЖПС без добавок (а также, в случае необходимости, МЖПС с заданным количеством вещества или смеси веществ, про- или антимикробная активность которых известны заранее) закрываются, перемешиваются и помещаются в термостат, где инкубируются в течение 4-8 часов при температуре 36-38°С.При этом непосредственно перед началом и после окончания инкубации регистрируются значения таких параметров МЖПС (изменяющихся вследствие роста и размножения тестовых микроорганизмов, а также преобразования ими в ходе метаболической активности одних веществ, входящих в состав МЖПС, в другие) как интенсивность упругого светорассеяния в видимой или ближней инфракрасной областях спектра (Iod), редокс потенциал (Е) и электропроводность (X).
Этап 6. После этого общая степень активирования или ингибирования (+/-) жизнедеятельности тестовых микроорганизмов тестируемыми объектами рассчитывается по формуле
s
Iod
Е
Х
ε=(ε+0,5ε+0,5ε)/2,
Y
где ε=100×(ΔYt-ΔYc)/ΔYc - частные степени активирования или ингибирования жизнедеятельности тестовых микроорганизмов тестируемыми объектами, рассчитываемые по изменениям Iod, Е или X;
a ΔY=Ye-Yb - разности значений Iod, Е или X, регистрируемых в начале (Yb) и в конце (Ye) инкубации тестовых образцов в присутствии тестируемых объектов (ΔYt) и в их отсутствие (ΔYc).
Заявляемый способ может быть реализован с применением таких основных измерительных приборов, как нефелометр («WGZ-2» или иной, позволяющий с достаточной степенью чувствительности измерять для жидких, водных образцов интенсивность упруго рассеиваемого света в видимой области спектра), иономер («Эксперт-001» или иной, позволяющий с достаточной степенью чувствительности измерять редокс потенциал жидких, водных образцов) и кондуктометр («Эксперт-002» или иной, позволяющий с достаточной степенью чувствительности измерять изменение электропроводности жидких, водных образцов).
Более детально настоящее изобретение описывается следующим конкретным примером.
-3
-5
Для анализа было взято три образца, содержащих х.ч. н-гексан, толуол и уайт-спирит (представляющий собой смесь различных жидких алифатических и ароматических углеводородов). Каждый из этих образцов помещался в 6 пробирок (в 3-й в концентрации 2×10 об. %, плюс в 3-й в концентрации 2×10 об.%), в которые затем дополнительно было налито по 7 мл СЖПС (в качестве которой использовался стерилизуемый автоклавированием в течение 20 мин при 121°С водный раствор с рН 7,2±0,2, содержащий 5 г/л глюкозы, 18 г/л панкреатического гидролизата рыбной муки и 2 г/л NaCl) и 3 мл МЖПС (той же СЖПС, но содержащей дополнительно в 1 мл около 10 жизнеспособных клеток Escherichia coli АТСС 25922, что удостоверялось по бактериальному стандарту мутности).
Затем все эти пробирки (включая 3-й контрольные, также содержавшие смесь СЖПС и МЖПС в соотношении 7 к 3, но без добавления какого-либо из анализируемых образцов) закрывались пробками, перемешивались, помещались в жидкостной термостат «LOIP LT-117b» и инкубировались в нем при температуре 37±0,1°С (оптимальной для роста и развития тестовых микроорганизмов) в течение 5-и часов. При этом через 10 минут после начала инкубации и за 10 минут до ее окончания последовательно в каждой из пробирок регистрировались интенсивность упругого светорассеяния (Iod), редокс потенциал (Е, мВ) и удельная, линейная, низкочастотная электропроводность (X, мкСм/см). Причем значения Iod регистрировались с помощью нефелометра «WGZ-2». Значения Е регистрировались с помощью иономера «Эксперт-001» с комбинированным электродом «ЭРП-105». А значения X регистрировались с помощью кондуктометра «Эксперт-002», работающего на частоте 1,6 кГц, с погружным датчиком «УЭП-П-С».
Далее, изменения каждого из измеренных параметров инкубируемой среды рассчитывались по формуле: ΔY=Ye-Yb (где Yb и Ye - значения Iod, Е или X, зарегистрированные в каждой из контрольных и тестовых пробирок в начале и в конце их инкубирования). Затем все полученные значения AY/ усреднялись (по пробиркам, содержащим одни и те же концентрации одних и тех же образцов), и для каждого из усредненных значений рассчитывался 95% доверительный интервал. После чего общая степень активирования или ин-гибирования (+/-) жизнедеятельности тестовых микроорганизмов тестируемыми образцами рассчитывалась по формуле
s
Iod
Е
Х
ε=(ε+0,5ε+0,5ε)/2,
Y
где ε=100×(ΔYt-ΔYc)/ΔYc - частные степени активирования или ингибирования жизнедеятельности тестовых микроорганизмов тестируемыми объектами, рассчитываемые по изменениям Iod, Е или X;
a ΔYt и ΔYc - разности значений Iod, Е или X, регистрируемых в начале (Yb) и в конце (Ye) инкубации тестовых образцов в присутствии тестируемых объектов (ΔYt) и в их отсутствие (ΔYc).
Результаты этих расчетов представлены в таблице 1.
-3
-5
Примечания. Здесь индексами «рЗ» и «р5» обозначены концентрации тестируемых объектов, равные 2×10 и 2×10 об.% соответственно. УС -уайт-спирит, Тл - толуол, нГ - н-гексан.
-5
-3
Из представленных данных можно сделать следующие выводы. В присутствии любого из тестируемых объектов в концентрации 2×10 об.% наблюдалась активация жизнедеятельности тестовых микроорганизмов - наибольшая для гексана, в меньшей степени для толуола и в еще меньшей степени для уайт-спирита. В то же время, в концентрации 2×10 об.% толуол и уайт-спирит ингибировали жизнедеятельность E.coli. Причем толуол осуществлял такое ингибирование в существенно большей степени, чем уайт-спирит.А в присутствии последнего в гораздо большей степени происходило ингибирование активности метаболизма E.coli (выражаемой значениями Е и X) нежели интенсивности роста и размножения таковых микроорганизмов (выражаемой значениями Iod).
Таким образом, заявляемый способ может обеспечить расширение области применения определения бактерицидных свойств веществ, а также повышение объективности такого определения и доступности его для использования более широким кругом пользователей.