Участие некоторых гепатопротекторов и иммуномодуляторов в регуляции апоптоза гепатоцитов, индуцированного противотуберкулезными препаратами основного ряда

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ФТИЗИАТРИИ

Д.С. Суханов1, Е.Д. Бажанова2, Д.Л. Теплый3

1 Северо-Западный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Российская Федерация 2 Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург, Российская Федерация 3Астраханский государственный университет, Российская Федерация

Участие некоторых гепатопротекторов и иммуномодуляторов в регуляции апоптоза гепатоцитов, индуцированного противотуберкулезными препаратами

основного ряда

В настоящее время показано, что гепатопатия вследствие лекарственной интоксикации связана с повышением уровня апоптоза гепатоцитов. Следовательно, большое значение получают препараты, регулирующие клеточную гибель. Цель: изучить участие в регуляции апоптоза некоторых гепатопротекторов (адеметионин, Реамберин, Ремаксол) и иммуномодуляторов (Циклоферон) на модели экспериментального поражения печени противотуберкулезными препаратами первого ряда (изониазид, рифампицин, пиразинамид). Материалы и методы: определяли уровень апоптоза (TUNEL), экспрессию CD95 (рецепторa фактора некроза опухоли — иммуногистохимически), экспрессию каспазы-8, -3, а также p53 (вестерн-блоттингом). Результаты: установлено, что введение противотуберкулезных препаратов первого ряда приводит к дистрофии клеток паренхимы печени с повышением уровня апоптоза гепатоцитов с активацией CD95, каспазы-8 (внешнерецепторный путь) и оверэкспрессией р53 и каспазы-3. Реамберин, Циклоферон и Ремаксол продемонстрировали гепатопротективное действие, улучшая гистологическую картину печени; адеметионин при внутрибрюшинном введении не показал положительных эффектов. Реамберин продемонстрировал апоптоз-ингибирующее действие в эксперименте, однако остальные препараты проявили себя как индукторы апоптоза гепатоцитов в условиях токсической гепатопатии. Выводы: регуляция апоптоза Циклофероном и Ремаксолом осуществляется по внешнерецепторному и р53-зависимому пути, о чем свидетельствует увеличение экспрессии белков CD95 и р53. Адеметионин, вероятно, индуцирует апоптоз посредством внутреннего пути.

Ключевые слова: гепатопротекторы, Циклоферон, апоптозпротективная активность, туберкулез, поражения печени, Реамберин, Ремаксол.

E.D. Bazhanova1, D.S. Sukhanov2, D.L. Teply3

1 Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, St. Petersburg, Russian Federation 2 Mechnikov Northwest Medical University, St. Petersburg, Russian Federation 3 Аstrakhan State University, Russian Federation

Role of Hepatoprotectors and Immunomodulators in Regulation of Hepatocyte Apoptosis Induced by Antituberculosis Treatment

It was currently shown that hepatopathy due to drug toxicity is associated with increased apoptosis of hepatocytes. Therefore, development of drugs which regulate cell death is of great importance. Aim: to involve some hepatoprotectors (ademethionine, reamberin, remaxol) and immunomodulators (cycloferon) into regulation of apoptosis in experimental models of liver first-line antituberculousis drugs (isoniazid, rifampicin, pyrazinamide). Materials and methods: levels of apoptosis (TUNEL), expression of CD95 (receptor of tumor necrosis factor — by immunohistochemistry), expression of caspase-8, caspase-3 andp53 (Western-blotting) were measured. Results: exposition of first-line antituberculousis drugs leads to dysthrophia of liver parenchyma cells with increased apoptosis of hepatocytes and activation of CD95, caspase-8 (external way) and overexpression of p53 and caspase-3. It was found that reamberin, cycloferon and remaxol have hepatoprotective effect improving liver histology; ademethionine administered by intraperitoneal injection showed no positive effects. Reamberin demonstrated apoptosis-inhibiting effect in the experiment whereas other drugs were found to be apoptosis inductors for hepatocytes in toxic hepatopathy. Conclusions: regulation of apoptosis by cycloferon and remaxol mediated by external and p53-dependent pathway is confirmed by increased expression of CD95 and p53 protein. Ademethionine might induce apoptosis by the intrinsic pathway.

Key words: hepatoprotectors, cycloferon, apoptosis prevention, tuberculosis, liver damage, reamberin, remaxol.

#

45

ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 8

Введение

Доказано, что апоптоз гепатоцитов играет важную роль в патогенезе многих заболеваний: вирусных гепатитов [1, 2], алкогольных поражений печени [3] и других патологических состояний [4, 5]. В настоящее время отмечено увеличение числа лекарственных поражений печени [6]. Значительную долю заболеваний печени составляет лекарственная интоксикация при лечении хронических болезней, в первую очередь туберкулеза. При этом на фоне применения препаратов основного ряда лекарственные поражения печени встречаются у 60% пациентов, а при использовании препаратов резервного ряда — в 42,4% случаев [7]. Большое значение имеет исследование механизмов гибели клеток в условиях патологии и поиск возможности фармакологического воздействия на те или иные точки апоптотического каскада. Как известно, реализация апоптоза осуществляется посредством внешнерецепторного пути (с участием рецепторов фактора некроза опухоли — tumor necrosis factor receptor, TNF), митохондриального пути и с помощью активации р53-зависимого каскада.

Цель исследования: изучить роль TNF-зависимой и р53-опосредуемой индукции апоптоза на модели экспериментальной интоксикации печени с помощью противо-46 туберкулезных препаратов (ПТП) 1-го ряда, исследовать участие ряда гепатопротекторов (Реамберин, Ремаксол, адеметионин) и иммуномодуляторов (Циклоферон) в регуляции апоптоза гепатоцитов при токсическом поражении печени ПТП 1-го ряда в опытах на половозрелых крысах.

Материалы и методы Участники исследования

Эксперимент проведен на 36 крысах-самцах линии Wistar с исходной массой тела 174—240 мг. Повреждение печени моделировали путем введения ПТП в течение 14 сут в следующих дозах: изониазид (50 мг/кг, подкожно) + рифампицин (250 мг/кг, внутрижелудочно) + пиразинамид (45 мг/кг, внутрижелудочно) [8]. Гепато-протекторные препараты (адеметионин, Реамберин, Ре-максол) использовали ежедневно в течение 14 сут за 1,5 ч до введения ПТП. Были сформированы следующие группы: 1) интактные крысы — контроль; 2) крысы, получавшие ПТП; 3) крысы, получавшие ПТП + Ремаксол раствор внутрибрюшинно 25 мл/кг; 4) крысы, получавшие ПТП + раствор адеметионина внутрибрюшинно 0,09 мл/100 г; 5) крысы, получавшие ПТП + Циклоферон раствор подкожно 14 сут по 3,6 мг/кг; 6) крысы, получавшие ПТП + Реамберин раствор внутрибрюшинно 25 мл/кг. Животных выводили из опыта путем декапитации, при вскрытии извлекали печень для исследования.

Методы исследования

Для оценки уровня апоптоза в ткани печени применяли метод детекции апоптоза TUNEL (Terminal De-oxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling — нерадиоактивное мечение биотином, выявление диаминобензидином) с использованием терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы для выявления разрывов ДНК (набор для TUNEL «Sileks», Россия). На срезах печени проводили иммуногистохимические реакции с использованием немеченных поликлональных антител к члену суперсемейства TNF CD95 («Abcam», USA). Для определения уровня экспрессии апоптоз-ассоци-

ированных молекул в печени проводили вестерн-блот с немечеными поликлональными антителами к проапоп-тотическим белкам каспаза-8 («Abcam», USA) и каспаза-3 («Cell Signaling», USA), а также с немечеными моноклональными антителами к онкосупрессору p53 («Abcam», USA). В качестве контроля количества белка был сделан вестерн-блот с немечеными моноклональными антителами к GAPDH («Abcam», USA).

Анализ изображений после выполнения иммуногистохимических реакций и TUNEL выполняли при помощи микроскопа «PFM» («WPI», США) и видеокамеры «DIC-Е» («WPI», США), Leika DFC 300 FX (Германия), разрешение 1392х1040 пикселей с последующей денситометрией («VideoTest Software», Россия). Определяли оптическую плотность иммунореактивного вещества в CD95 клетках на 5—6 срезах печени для каждого животного, далее — для группы крыс. Число апоптотических клеток (TUNEL-позитивных гепатоцитов) подсчитывали на 5—6 срезах печени у каждой крысы с последующим определением среднего числа на группу. Уровень экспрессии каспаз-8 и -3, а также p53 и GAPDH в печени после вестерн-блоттинга определяли с помощью денситометрии («ImageJ», USA).

Для морфологического подтверждения развития моделируемых патологических процессов и в комплексной оценке эффективности препаратов было проведено гистологическое исследование и морфологическое описание изменений на срезах печени — фиксация в 4% формалине с последующей заморозкой, окраска гематоксилином и эозином («БИОЛАМ И», Россия).

Статистическая обработка данных

В связи с однородностью содержания животных в исследуемых группах и невозможностью опровергнуть нулевую гипотезу о нормальности распределения ввиду небольшого числа единиц наблюдения, в статистической обработке были использованы методы, применяемые для нормального распределения данных. Результаты подвергались статистической обработке путем расчета среднего арифметического (M), стандартной ошибки среднего (±m). Обработка полученных результатов проведена с помощью метода однофакторного дисперсионного анализа ANOVA для множественного сравнения выборочных средних. При опровержении нулевой гипотезы о равенстве средних исследуемых групп использовалось попарное сравнение с помощью теста Тьюки. Различия считали статистически значимыми приp <0,05.

Результаты и обсуждение

В регуляции апоптоза гепатоцитов участвует множество факторов. В частности, показано участие цитокинов (TNF а, интерлейкинов) [1, 9], различных ростовых факторов и их рецепторов [9]. Важную роль в активации апоптоза отводят изменению баланса анти- и прооксидантов [10]. Однако данные о механизмах апоптоза при интоксикации печени ПТП немногочисленны и противоречивы.

Одной из целей эксперимента было выявить механизм развития программированной клеточной гибели гепато-цитов при токсической гепатопатии. В нашем эксперименте показано, что введение изониазида, рифампицина и пиразинамида в течение 14 сут приводило к токсическому поражению печени. Повышалась интенсивность апоптоза гепатоцитов (рис. 1, 2), сочетающаяся с обна-

#

#

АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ФТИЗИАТРИИ

Ф

руженными при гистологическом анализе препаратов очагами некроза. Наблюдалось значительное повышение уровня экспрессии CD95 и коррелирующее с ним увеличение ативности инициаторной каспазы-8 (рис. 3). Таким образом, при введении ПТП апоптоз идет по внешнерецепторному пути при участии поверхностно-клеточных рецепторов, членов суперсемейства рецепторов TNF CD95 (FAS/APO1), с последующей активацией каспазы-8 (превращением ее в активную форму) и разворачиванием дальнейшего каскада. Белок р53 является онкосупрессором, это один из основных проапоптотических белков, играющий важную роль в инициации апоптотическо-го каскада. Показана индукция его синтеза (рис. 4, 5) и далее — эффекторной каспазы-3 (см. рис. 4), результирующая в фрагментации ДНК. В данном эксперименте отмечено усиление экспрессии каспазы-3 во всех случаях повышения уровня апоптоза гепатоцитов (введение ПТП, а также введение ПТП одновременно с Ремаксолом, аде-метионином, Циклофероном). Невысокая экспрессия каспазы-3 в контрольной группе крыс соответствует низкому уровню апоптоза гепатоцитов в этой группе.

Препараты Ремаксол и Реамберин на данной модели патологии обладают выраженным гепатопротективным действием, уменьшая гистологические признаки дистрофии печени. Можно предположить, что янтарная кислота, входящая в их состав, нормализует клеточное дыхание, и этим обусловлен позитивный эффект данной терапии.

Известно, что янтарная кислота является мембранопротектором и играет важную роль в регуляции свободнорадикального окисления, выступая как антиоксидант. Таким образом, можно было ожидать апоптозпротек-тивного действия всех сукцинатсодержащих препаратов, но, по-видимому, здесь проявился дозозависимый эффект. Так, слишком маленькие дозы янтарной кислоты (Ремаксол) не оказывали влияния на апоптоз, тогда как Реамберин, содержащий больше данного ингредиента, ингибировал апоптоз, вызываемый ПТП.

Установлено, что из изученных препаратов в данных условиях только Реамберин обладает апоптозпро-текторным действием. Применение его при введении ПТП не только улучшало морфологическое состояние

%

Группы животных

Уровень апоптоза

Рис. 1. Влияние противотуберкулезных препаратов Ремаксол, адеметионина раствор Циклоферон и Реамберин на уровень апоптоза гепатоцитов у крыс исследуемых групп.

Примечание (здесь и далее). * — p <0,05 по сравнению с контрольной группой животных, # — по сравнению с группой животных, получавших противотуберкулезные препараты 1-го ряда.

печени, но и возвращало уровень гибели гепатоцитов к контрольным значениям (см. рис. 1, 2). При его введении наблюдалась супрессия синтеза CD95, каспа-зы-8 (см. рис. 3), низкий уровень апоптоза гепатоцитов коррелировал с нормальной экспрессией онкогена р53 (см. рис. 4). Таким образом, можно предположить, что механизм действия реамберина связан с подавлением внешнерецепторного и р53-зависимого пути. Повышение интенсивности синтеза каспазы-3 при введении Реамберина при нормальном уровне апоптоза может указывать на ее неапоптотическую функцию, что показано и другими авторами [11].

а б

Рис. 2. Печень крысы, получавшей противотуберкулезные препараты.

Примечание. а — увеличение числа апоптотических клеток (темноокрашенные клетки на препарате) печени крысы, получавшей противотуберкулезные препараты с одновременным введением Реамберина: б — незначительное число апоптотических клеток (темноокрашенные клетки на препарате). TUNEL, об. х40, ок. х10.

#

47

ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 8

48

Группы животных 1=1 CD95 Каспаза -8

Рис. 3. Влияние противотуберкулезных препаратов Ремаксол, раствор адеметионина, Циклоферон и Реамберин на количество CD95 (FAS)- и каспаза-8-иммунореактивного материала в гепатоцитах крыс исследуемых групп.

14 и

1210* 8-О)

I 6420-1-------------,-------,--------,--------,--------,--------,

1 2 3 4 5 6

Группы животных

Каспаза-3

Рис. 4. Влияние противотуберкулезных препаратов Ремаксол, раствор адеметионина, Циклоферон и Реамберин на количество р53- и каспаза-3-иммунореактивного материала в гепатоцитах крыс исследуемых групп.

ABC D

Рис. 5. Экспрессия р53 (вестерн-блоттинг).

Примечание. A, B — образцы печени контрольной крысы; С, D — образцы печени крысы, получавшей противотуберкулезные препараты.

Ремаксол, как и иммуномодулятор Циклоферон, оказывали гепатопротекторное действие, одновременно повышая уровень апоптоза (см. рис. 1). Сигнальный каскад апоптоза протекал в этом случае как по р53-зависимому пути, с обязательной активацией ка-спазы-3 (см. рис. 4), так и по внешнему пути (семейство TNFR, каспаза-8) (см. рис. 3). Ранее нами было показано апоптоз-ингибирующее действие Циклоферона на нейроны гипоталамуса в условиях стресса при старении

[12] . Это свидетельствует о том, что роль Циклоферона в регуляции апоптоза зависит от определенных условий (физиологического состояния клеток, органов). Улучшение микроструктурного состояния печени в этом случае можно объяснить заменой очагов некроза, обнаруженных при действии ПТП, на более упорядоченный процесс апоптоза, протекающий без воспалительных явлений [13].

Один из изучаемых препаратов — адеметионин — не оказывал позитивного влияния на микроструктуру печени, что совпадает с нашими предыдущими данными

[13] , и при этом апоптоз был значительно повышен (см. рис. 1); также наблюдалась оверэкспрессия каспа-зы-8 и -3 (см. рис. 3, 4). Поскольку экспрессия CD95 не повышалась, можно предположить, что активация каспа-зы-8 происходила через других членов семейства TNFR; можно также предположить включение внутреннего пути активации апоптоза.

Заключение

Таким образом, апоптоз, индуцированный введением гепатотоксических препаратов (в данном случае ПТП), является каспазозависимым и активируется посредством внешнерецепторного (TNF-зависимого) и р53-зависимого пути. Адеметионин при парентеральном введении не оказывает позитивных эффектов на гепатоциты, что может быть связано с реакциями карбоксиметилирования белков с последующим образованием токсичных продуктов [14] и слишком резким поступлением в организм высоких доз метионина. Кроме того, инъекции раствора адеметионина усиливают апоптоз гепатоцитов, вызванный введением ПТП, вероятно, посредством внутреннего пути активации. Ре-амберин обладает выраженным гепатопротективным и апоптозпротективным действием на выбранной модели патологии, ингибируя именно задействованные пути клеточной гибели. Ремаксол и Циклоферон, напротив, показали некоторый апоптозстимулирующий эффект вместе с торможением некротических процессов, что добавляет новые характеристики в фармакодинамику данных препаратов.

#

ЛИТЕРАТУРА

1. Balasubramanian A., Munshi N., Koziel M.J. Hu Z., Liang T.J., Groopman J.E., Ganju R.K. Structural proteins of hepatitis С virus induce interleukin 8 production and apoptosis in human endothelial cells. J. Gen. Virol. 2005; 86: 3291-3301.

2. Kuo C.Y., Chou T.Y., Chen C.M., Tsai Y.F., Hwang G.Y., Hwang T.L. Hepatitis B virus X protein disrupts stress fiber formation and triggers apoptosis. Virus Res. 2013; 175 (1): 20-29.

3. Morio Y., Tsuji M., Inagaki M., Nakagawa M., Asaka Y., Oyamada H., Furuya K., Oguchi K. Ethanol-induced apoptosis in human liver adenocarcinoma cells (SK-Hep1): Fas- and mito-chondria-mediated pathways and interaction with MAPK signaling system. Toxicol. In Vitro. 2013; 27 (6): 1820-1829.

4. Miao H.L., Pan Z.J., Lei C.J., Wen J.Y, Li M.Y., Liu Z.K., Qiu Z.D., Lin M.Z., Chen N.P., Chen M. Knockdown of GPC3 inhibits the proliferation of Huh7 hepatocellular carcinoma cells through down-regulation of YAP. J. Cell Biochem. 2013; 114 (3): 625-631.

5. Ghavami S., Hashemi M., Kadkhoda K., Alavian S.M., Bay G.H., Los M. Apoptosis in liver diseases — detection and therapeutic applications. Med. Sci. Monit. 2005; 11 (11): 3337-3345.

6. An J., Mehrhof F., Harms C., Lattig-Tunnemann G., Lee S.L., Endres M., Li M., Sellge G., Mandic A.D., Trautwein C., Donath S. ARC is a novel therapeutic approach against acetaminophen-induced hepatocellular necrosis. J. Hepatol. 2013; 58 (2) : 297-305.

#

50

ВЕСТНИК РАМН /2013/ № 8

7. Больф С.Б., Суханов Д.С., Романцов М.Г. Медикаментозный поражения печени при полихимиотерапии туберкулеза. Вестн. С.Пб. Гос. мед. акад. И.И. Мечникова. 2009; 1: 172—176.

8. Сливка Ю.И. Сравнительная характеристика гепатотоксич-ности изониазида, рифампицина и пиразинамида. Фармакол. и токсикол. 1989; 4: 82—85.

9. Зейц Г. Алкогольная болезнь печени. Росс. журн. гастроэнт. гепатол. колопроктол. 2001; 4: 62—65.

10. Garcia-Vaquero M., Benedito J.L., Lapez-Alonso M., Miranda M. Histochemistry evaluation of the oxidative stress and the antioxidant status in Cu-supplemented cattle. Animal. 2012; 6 (9): 1435-1443.

11. Lu Y., Chen G.Q. Effector caspases and leukemia. Int. J. Cell Biol. 2011; 738301. doi: 10.1155/2011/738301.

12. Бажанова Е.Д. Циклоферон: механизм действия, функции и применение в клинике. Журн. эксперим. и клинич. фармакол. 2012; 75 (7): 40-44.

13. Шевырева Е.В., Иванов А.К., Суханов Д.С., Мурзина А.А. Гепатопротекторная терапия ремаксолом у больнвгх туберкулезом и ВИЧ-инфекцией в дневном стационаре противотуберкулезного диспансера. Антибиотики и химиотер. 2012; 7 (8): 31-37.

14. Lee E.S., Chen H., Hardman C., Simm A., Charlton C. Excessive S-adenosyl-L-methionine-dependent methylation increases levels of methanol, formaldehyde and formic acid in rat brain striatal homogenates: possible role in S-adenosyl-L-methionine-induced Parkinson’s disease-like disorders. Life Sci. 2008; 83 (25-26): 821-827.

КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Суханов Дмитрий Сергеевич, кандидат медицинских наук, доцент кафедры фтизиопульмонологии и торакальной хирургии Северо-Западного медицинского университета им. И.И. Мечникова Адрес: Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41, тел.: (812) 303-50-00, e-mail: dmitriysukhanovl@mail.ru Бажанова Елена Давыдовна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории сравнительной сомнологии и нейроэндокринологии ФГБУН «Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова» РАН

Адрес: 194223, Санкт-Петербург, пр-т Тореза, д. 44, тел.: (812) 552-32-27, e-mail: bazhanovae@mail.ru

Теплый Давид Львович, доктор биологических наук, профессор, академик РАЕН, заведующий кафедрой физиологии

и морфологии человека и животных Астраханского государственного университета

Адрес: 414040, Астрахань, ул. Татищева, д. 20а, тел.: (8512) 22-93-47, e-mail: dima.tepliy@yandex.ru

#

#