Стимуляция гемангиогенеза, лимфангиогенеза и васкулогенной мимикрии при различных нарушениях функции опухолевого супрессора р53 в ксенографтах рака ободочной кишки

Стимуляция гемангиогенеза, лимфангиогенеза и васкулогенной мимикрии при различных нарушениях функции опухолевого супрессора р53 в ксенографтах рака ободочной кишки

Н.В. Хромова, П.Б. Копнин, Б.П. Копнин

НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, Москва

Контакты: Наталья Викторовна Хромова nkhromova@gmail.com

Вступление. Мутации гена ТР53, кодирующего опухолевый супрессор р53, играют важную роль в возникновении и/или прогрессии рака ободочной кишки у человека. Потеря экспрессии р53 стимулирует гемангиогенез, однако влияние миссенс-мутаций р53 — наиболее распространенных нарушений р53 в различных новообразованиях человека, на опухолевый гемангиогенез, васкулогенную мимикрию и лимфангиогенез практически не изучено.

Методы. Клетки рака ободочной кишки человека НСТ116 прививали бестимусным мышам, в тканях сформировавшихся опухолей определяли плотность сосудов и сосудоподобных структур с помощью иммуногистохимического окрашивания антителами к СБ34, LYVE-1 и ламинину. Экспрессию генов VEGF-A и VEGF-С изучали методом ОТ-ПЦР анализа, содержаниер53 определяли с помощью Вестерн-блот анализа.

Результаты и обсуждение. Было обнаружено, что экспрессия р53 с аминокислотными заменами в кодонах 175, 248 и 273 изменяют экспрессию генов VEGF-A и VEGF-С, что приводит к повышению плотности кровеносных и лимфатических сосудов в ксенографтах НСТ116, увеличению в них выраженности васкулогенной мимикрии и в результате ускорению опухолевого роста.

Ключевые слова: рак ободочной кишки, мутации р53, ангиогенез, васкулогенная мимикрия.

Stimulation hemangiogenesis, lymphangiogenesis and vasculogenic mimicry in various lesions of tumor suppressor p53 in colon cancer xenografts

N.V. Khromova, P.B. Kopnin, B.P. Kopnin

Institute of Carcinogenesis, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow

Introduction. Mutations in the gene TP53, encoding the tumor suppressor p53 plays an important role in the development and/or progression of colon cancer. Loss of p53 expression stimulates hemangiogenesis, however effect of p53 missense-mutations, most frequent alterations of p53 function in various human tumors, on tumor hemangiogenesis, vasculogenic mimicry and lymphangiogenesis was not studied. Methods. Human colon carcinoma HCT116 xenografts in athymic mice were studied. Density of vessels and vasculogenic mimicry was determined by immunohistochemical staining with antibodies to CD34, LYVE-1 and laminin. Expression of VEGF-A and VEGF-C genes was determined by RT-PCR analysis, p53 content was studied by Western-blot analysis.

Results and discussion. It was found that expression of p53 proteins with amino acid substitutions at codons 175, 248 and 273 altered expression of VEGF-A and VEGF-C genes that led to increased density of blood and lymphatic vessels and vasculogenic mimicry in HCT116 xenografts, and, as a result, accelerated tumor growth.

Key words: colon cancer, p53 mutations, angiogenesis, vasculogenic mimicry

Вступление

Мутации гена ТР53, кодирующего опухолевый супрессор р53, наблюдаются примерно в 60 % случаев рака ободочной кишки (РОК) (www.p53.free.fr) и играют существенную роль в возникновении и/или прогрессии заболевания. Вызываемая ими инактивация функции р53 приводит к ослаблению G1- и G2-чекпойнтов клеточного цикла, подавлению апоптоза, уменьшению эффективности репарации ДНК, более эффективной адаптация к гипоксии и стимуляции ангиогенной активности неопластических клеток [1].

В отличие от других опухолевых супрессоров, для которых характерны мутации, прекращающие синтез белка, подавляющее большинство мутаций ТР53 пред-

ставляет собой миссенс-мутации, приводящие к замене одной аминокислоты в молекуле белка на другую. Кроме этого, в отличие от мутаций других опухолевых супрессоров, мутации ТР53 являются гетерозиготными, т. е. поражают только 1 из 2 аллелей гена. Мутации обнаруживаются в разных участках молекулы р53, но чаще всего в ДНК-связывающем домене, причем с наибольшей частотой в кодонах 175, 245, 248, 249, 273 и 282 — «горячих точках» мутаций. Спектр мутаций несколько изменяется в зависимости от типа новообразования [2], в случае РОК мутации обнаруживаются с наибольшей частотой в кодонах 175, 248 и 273 (www. p53.free.fr). Характерные для опухолевых клеток миссенс-мутации приводят к изменению конформа-

Оригинальные исследования

Оригинальные исследования

ции молекулы белка р53, что в значительной степени затрагивает все его активности. Происходит потеря или ослабление способности связывать и активировать гены с р53-респонсивными элементами, репрессировать другие специфические гены-мишени, ингибировать репликацию ДНК и стимулировать репарацию ДНК. Важно подчеркнуть, что р53 играет важную роль в контроле гемангиогенеза: он регулирует экспрессию многих проангиогенных факторов и ингибиторов ге-мангиогенеза, и полная потеря его экспрессии может стимулировать рост кровеносных сосудов. Однако влияние миссенс-мутаций р53 на гемангиогенез и другие способы васкуляризации опухолей практически не изучено.

Формирование кровеносных и лимфатических сосудов, а также сосудоподобных структур (васкулоген-ная мимикрия), обеспечивающих кровоснабжение и дренирование опухолевых тканей, определяется способностью неопластических клеток продуцировать различные ангиогенные факторы, в первую очередь цитокины семейства VEGF — VEGF-А, VEGF-С и VEGF-D, гены которых являются мишенями транскрипционной активности белка р53. В большинстве типов новообразований, в том числе и в РОК, повышенная экспрессия цитокинов VEGF коррелирует с неблагоприятным прогнозом заболевания [3, 4, 5]. Нормально функционирующий р53 эффективно сдерживает гемангиогенную активность клеток, не только репрессируя в них гены VEGF-A и некоторых других индукторов ангиогенеза (bFGF, bFGF-BP) [6, 7]), но и активируя гены ряда ингибиторов гемангиогене-за — тромбоспондинов ТБр-1 и ТБр-2 [8], семафорина 3F [9], маспина [2; 10], эндостатина [11], коллагенов

4 и 18 (COL4A1, COL18A) [12], а(11) 4-пролил гидрок-силазы (а(11)РН) [13, 14]. Очевидно, что потеря функции р53 в процессе канцерогенеза представляет собой основной шаг в «переключении» опухоли на ангиоген-ный фенотип [15]. Роль р53 в регуляции лимфангио-генеза и васкулогенной мимикрии (образовании сети не выстланных эндотелием каналов, которые соединяются с истинными кровеносными сосудами и участвуют в кровоснабжении опухолевых тканей [16, 17]) не изучена.

В настоящей работе исследована роль наиболее характерных для РОК миссенс-мутаций р53, а также потери экспрессии р53, на васкуляризацию ксено-графтов РОК. В качестве экспериментальной модели использованы клетки РОК человека линии НСТ116, в которых экспрессируется белок р53 дикого типа и ее производная с нокаутом обоих аллелей ТР53, что привело к полной потере синтеза белка р53. На основе этих клеток был получен набор сублиний, экспрессирующих белки р53 с миссенс-мутациями в кодонах 175, 248 и 273. В результате их анализа впервые показано, что наиболее характерные для РОК нарушения функции р53 изменяют экспрессию генов VEGF-A

и VEGF-С, что приводит к повышению плотности кровеносных и лимфатических сосудов в опухолевых тканях, увеличению в них выраженности васкулоген-ной мимикрии и ускорению опухолевого роста.

Материалы и методы

Клеточные линии. Использована линия клеток РОК человека HCT116 (ATCC #CCL-247) и ее сублиния НСТ116/р53-/- с делецией обоих аллелей ТР53 (предоставлена B. Vogelstein, Johns Hopkins University, США). Клетки культивировали в среде DMEM с добавлением 10 % эмбриональной телячьей сыворотки и пенициллина/стрептомицина при 37 °С и 5 % содержанием СО2.

Получение клеточных линий, экспрессирующих мутантные формы р53. Использованы созданные на основе вектора pL6 лентивирусные конструкции, экспрессирующие мутантные р53 с аминокислотными заменами в кодонах 175 (R175H: аргинин ^ гистидин), 248 (R248W: аргинин ^ триптофан) и 273 (R273H: аргинин ^ гистидин), созданные на основе вектора pL6 (любезно предоставлены П.М. Чумаковым, Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН). Их введение в клетки проводили, как описано нами ранее [18]; экспрессия трансдуцированных мутантных р53 в полученных сублиниях клеток была подтверждена с помощью Вестерн-блот анализа (рис. 1а), проведенного по ранее описанным нами методам [18].

Определение уровня экспрессии VEGF-А и VEGF-C методом ОТ-ПЦР. Тотальную мРНК выделяли с помощью TRI Reagent (Sigma). Реакцию обратной транскрипции проводили, как описано ранее [19]. Для определения уровня экспрессии VEGF-C использовали праймеры: прямой 5’-CAGTTACGGTCTGTGTCCAGTGTAG-3’, обратный 5’- GGACACACATGGAGGTTTAAAGAAG-3’; уровень экспрессии VEGF-А определяли, используя праймеры: прямой 5’- CCCTGATGAGATCGAGTACATCTT-3’ и обратный 5’- ACCGCCTCGGCTTGTCAC-3’; уровень экспрессии VEGF-D определяли, используя праймеры: прямой

5 ’ -TCCAGATCCCTGAAGAAGATCGCTG-3 ’ и обратный 5’-ATGCTTTGCACATGCTGTTTTGC-3’ для выравнивания кДНК использовали праймеры к а-тубулину: прямой 5’-GTTGGTCTGGAATTCTGTCAG-3’, обратный 5’-AAGAAGTCCAAGCTGGAGTTC-3’.

Определение скорости роста клеточных культур. Клетки НСТ116 рассевали по 25 тыс в 6-луночные плашки. Для определения скорости роста проводили подсчет количества клеток в культуре в камере Горяева с интервалом в 2 сут. Счет продолжался до момента образования монослоя.

Анализ роста опухолевых ксенографтов. В работе использовали самок бестимусных мышей линии D2 х J в возрасте 6—8 нед. Каждому животному подкожно прививали по 2 опухоли (106 клеток, суспендированных в 100 мкл физиологического раствора). Размер опухолей измеряли каждые 3 дня, их объем высчиты-

вали по формуле: (ширина)2 х (длина) х 0,5. Продолжительность эксперимента составляла 3 нед.

Прививка опухолевых клеток в подслизистый слой стенки слепой кишки бестимусным мышам. Для операций использовали самок бестимусных мышей линии D2 х J в возрасте 10—12 нед, по 15 животных в каждой экспериментальной группе. Под наркозом у мыши на поверхность тела извлекали слепую кишку. Клетки НСТ116 (2 х 106, разведенные в 50 мкл физиологического раствора) вводили в подслизистый слой стенки слепой кишки стеклянным капилляром (наружный диаметр капилляра составляет 250 мкм) под углом к кишке 30о. Вокруг места инъекции кишку обрабатывали 3 % раствором йода для предотвращения диссеминации опухолевых клеток в брюшную полость [20]. Продолжительность эксперимента составляла 40—60 дней.

Иммуногистохимический (ИГХ) анализ препаратов тканей опухолей. Ткани опухолей фиксировали в 4 % формалине в течение 24 ч и заключали в парафин. Срезы толщиной 5 мкм окрашивали антителами к CD34 (550537, BD Pharmingen) и LYVE-1 (103-PA50S, ReliaTech GmbH) и ламинину (Z0097, Dako). Связывание первичных антител детектировали с помощью проявочной системы EnVision-HRP (Dako). После этого препараты окрашивали гематоксилином.

Подсчет CD34-позитивных кровеносных капилляров проводили под микроскопом при увеличении х100. Гемангиогенез в опухолях оценивали по среднему суммарному количеству капилляров с просветами и относительно крупных (> 100 мкм) капилляров, как описано нами ранее [18]. Подсчет внутриопухолевых LYVE-1-позитивных лимфатических сосудов проводили при увеличении х 200. В каждой экспериментальной группе исследовали срезы 8—12 опухолей, для каждой опухоли анализировали 20 полей зрения.

Содержание в опухолях ламининовых и сосудоподобных структур. Долю (%) площади, занимаемую ламинин-позитивными структурами, определяли от площади поверхности препарата (одного поля зрения) с помощью программы ImageJ. Таким же способом на серийных срезах определяли % площади CD34-позитивных структур. Долю площади лами-нин+/ CD34- сосудоподобных структур определяли как разность между относительными площадями ламинин-позитивных и CD34-позитивных структур (кровеносных капилляров). Анализировали 7—10 полей зрения в каждой из 8—12 опухолей.

Результаты

В первую очередь, мы определили, как различные изменения статуса р53 влияют на скорость размножения клеток НСТ116. Оказалось, что синтез экзогенных мутантных белков р53, равно как и потеря экспрессии р53, не влияет на скорость роста клеточных культур in vitro (рис. 1б), но при этом ускоряет рост опухолей,

формируемых такими клетками при подкожной прививке бестимусным мышам (рис. 1в). Увеличение скорости роста опухолевых клеток in vivo, но не in vitro могло быть связано с их более эффективной васкуля-ризацией, обеспечивающей приток питательных веществ и кислорода. Для проверки этого предположения мы использовали ИГХ-окрашивание парафиновых срезов опухолей антителами к маркеру эндотелия кровеносных сосудов CD34. Мы обнаружили, что плотность кровеносных капилляров в ксенографтах не экспрессирующих эндогенный р53 или экспрессирующих наряду с эндогенным экзогенные мутантные р53, значительно выше, чем в ксенографтах контрольных опухолей, экспрессирующих р53 дикого типа (рис. 2, таблица). При

&

р53

а-тубулин

&

V-

*

150

300

150

гИ

S юо

3 5

Дни инкубации

р53PL6 р53+/+, R175H . р53+/+, R248W - р53+/+, R273H -р53-/-, pL6

8 11 14 17 20 23

Дни после прививки

Рис. 1. Влияние синтеза мутантных белков р53 в клетках НСТ116 и нокаута гена р53 на скорость роста клеточных культур in vitro и подкожных опухолей in vivo: а — Вестерн-блот анализ содержания белка р53 в полученных сублиниях клеток HCT116, образцы нормализовали по белку а-тубулина; б — скорость роста сублиний НСТ116 in vitro. Каждая точка — средние величины для 3 лунок, представлены типичные данные 1 из 3 экспериментов; в — скорость роста ксено-графтов НСТ116 с различным статусом р53. Приведены средние значения, полученные при анализе 8—12 опухолей в каждом из 3 экспериментов. Различия достоверны по критерию Стьюдента

а

в

Оригинальные исследования

Оригинальные исследования

Влияние экспрессии мутантных белков р53 на количество СВ34-позитивных структур. Различия между значениями в контрольной и экспериментальных группах достоверны по критерию Стьюдента; *р < 0,05, **р < 0,01

р53+/+ (контроль) р53+/++ Ю75Н р53+/++ Я248^г р53+/++ Я273Н р53-/-

Капилляры с просветами 6,9 ± 0,7 10,2 ± 0,9* 12,9 ± 1,1** 10,9 ± 0,8* 14,2 ± 1,0**

Крупные капилляры (> 100 мкм) 1,1 ± 0,1 3,2 ± 0,3* 5,7 ± 0,6** 2,9 ± 0,3* 3,8 ± 0,4**

этом наибольшая эффективность васкуляризации (количество капилляров > 100 мкм) обнаружена в ксено-графтах НСТ116, экспрессирующих р53 К248*ЭД

В кровоснабжении опухоли могут принимать участие не только кровеносные сосуды, но и не выстланные клетками эндотелия сосудоподобные структуры, формируемые белками внеклеточного матрикса, в том числе ламининами (так называемая васкулогенная мимикрия). Для их детекции мы использовали ИГХ-окрашивание срезов опухолей антителами к ламинину. Такое окрашивание выявляет и васкулогенную мимикрию, и кровеносные сосуды, базальная мембрана которых формируется этими белками. Поэтому площадь васкулогенной мимикрии определяли как разность между относительными площадями ламинин-позитивных и CD34-позитивных структур (кровеносных капилляров) на серийных срезах. На рис. 3, где представлены типичные поля зрения серийных срезов опухолей, окрашенных антителами к ламинину и к CD34 (рис. За), и результаты подсчета площади ламинин+/CD34--сосудоподобных структур (рис. Зб) видно, что площадь сосудоподобных структур увеличивает (в 1,7—2 раза) как потеря экспрессии р53, так и экспрессия мутантного р53 Я273Н. При этом экспрессия мутантного р53 Я248^, наоборот, в 2,5 раза уменьшает площадь сосудоподобных структур, а экспрессия р53 Я175Н не приводит к статистически значимым изменениям площади васкулогенной мимикрии.

Для изучения влияния нарушений р53 на лимфан-гиогенез мы использовали ИГХ-окрашивание срезов ксенографтов НСТ116 антителами к Е^Е-1 — маркеру лимфатического эндотелия. Оказалось, что в подкож-

ных ксенографтах НСТ116/р53+/+ и НСТ116/р53—/— лимфатические сосуды не образуются. В связи с этим для изучения опухолевого лимфангиогенеза был применен метод прививки клеток НСТ116 в подслизистый слой стенки слепой кишки бестимусных мышей (рис. 4). При этом способе сохраняются более привычное для клеток НСТ116 микроокружение и физиологические коллекторные лимфатические сосуды. В результате были получены опухоли НСТ116, в которых, в отличие от подкожных ксенографтов, присутствуют внутриопухолевые лимфатические сосуды. Однако существенный недостаток этого метода — низкая выживаемость мышей после операции (30 % к 40-60-му дню после прививки) позволила нам к настоящему времени

со

1Л

О

X

со

1Л

о.

5

о

X

'• ' " V . « •. . -а" сиаШЙ •• \ * -* ^ * Чу * •

• т*.'•«> " -Ч У~— ^ ‘ . —

б у.

!* £ о 1 у I 6 •

и 5 * £ 2 * 4

^ 'й а Й 11 § 'В. 2

^ о

и 0 4х &

Рис. 2. Иммуногистохимическое окрашивание срезов опухолей НСТ116 с различным статусом р53 антителами к СБ34. Представлены типичные поля зрения для каждой экспериментальной группы. Увеличение х 100.

Рис. 3. Влияние различных аномалий р53 на площадь сосудоподобных структур в ксенографтах НСТ116: а — иммуногистохимическое окрашивание срезов опухолей антителами на ламинин и СБ34 на серийных срезах. Представлены типичные поля зрения. Увеличение х 100; б — площадь ламинин+/СБ34- сосудоподобных структур в ксенографтах НСТ116. Значения представлены как разность между площадью ламинин-позитивных и СВ34-позитивных структур. Представлены средние значения одного из трех экспериментов. Различия достоверны по критерию Стьюдента

а

изучить только влияние нокаута р53 на опухолевый лимфангиогенез. Оказалось, что при потере экспрессии р53 число внутриопухолевых лимфатических сосудов увеличивается примерно в 3 раза (рис. 4б).

Чтобы приблизиться к пониманию возможных механизмов воздействия изменений статуса р53 на ге-мангиогенез, лимфангиогенез и васкулогенную мимикрию, мы изучили их влияние на экспрессию генов семейства VEGF — ключевых регуляторов ангиоген-ной активности клеток. С помощью ОТ-ПЦР анализа было обнаружено, что экспрессия экзогенных мутантных р53, как и потеря его экспрессии, приводят к существенному увеличению уровня мРНК VEGF-A]2] и VEGF-A]6S — продуктов альтернативного сплайсинга гена VEGF-A [21] (рис. 5). Экспрессия экзогенных мутантных белков р53 повышала также экспрессию гена VEGF-С, причем наиболее сильный эффект наблюдался в клетках, содержащих Я273Н р53. Интересно, что полная потеря экспрессии р53, наоборот, подавляла экспрессию гена VEGF-С. Значимых изменений экспрессии гена VEGF-D при изменениях статуса р53 мы не обнаружили (рис. 5).

Обсуждение

Целью настоящей работы было изучение влияния мутантных белков р53 с аминокислотными заменами в кодонах 175, 248, 273, так называемых горячих точках

ч слизистый спой /

мышечный слои

мутаций в новообразованиях человека, на гемангиоге-нез, васкулогенную мимикрию и лимфангиогенез. Для этого были созданы сублинии клеток рака восходящей кишки HCT116, синтезирующие экзогенные мутантные р53 человека R175H, R248W и R273H. Вместе с клетками НСТ116/р53—/— с гомозиготным нокаутом гена ТР53 этот набор сублиний клеток HCT116 имитирует наиболее часто встречающиеся при РОК ситуации нарушений экспрессии р53: а) синтез только p53 дикого типа; б) одновременная продукция белков дикого типа и доминантно-негативного мутантного p53; в) полная потеря экспрессии p53.

Изученные нами нарушения экспрессии р53 не влияли на скорость роста клеток в культурах in vitro, но увеличивали скорость роста их ксенографтов в бес-тимусных мышах. Учитывая то, что опухоли для роста необходимо эффективное кровоснабжение, мы предположили, что основным лимитирующим фактором роста ксенографтов НСТ116 in vivo является ангио-генная активность опухолевых клеток. Поэтому мы исследовали влияние изменений статуса р53 на плотность кровеносных сосудов в опухолях. При окрашивании срезов опухолей, формируемых клетками НСТ116 с дисфункцией р53, антителами на CD34, было обнаружено, что синтез мутантных р53, также как и потеря экспрессии р53, увеличивают число функционирующих капилляров в ксенографтах.

Вероятным механизмом стимуляции гемангиоге-неза при дисфункции р53 является описанная нами ранее инактивация способности р53 сдерживать индукцию активных форм кислорода (АФК), которые активируют сигнальный путь HIF1/VEGF-A [18], играющий ключевую роль в стимуляции опухолевого ангиогенеза. Проведенный нами анализ влияния различных нарушений функции р53 на экспрессию гена VEGF-A подтвердил это предположение: при всех исследованных аномалиях экспрессии р53 наблюдалось сходное увеличение экспрессии VEGF-A]2] и VEGF-A]6S — продуктов альтернативного сплайсинга гена VEGF-A. Очевидно, способность мутантных форм р53 увеличивать экспрессию изоформ гена VEGF-A обеспечивается их

Р53+/+

Рис. 4. Влияние потери экспрессии р53 на лимфангиогенез во внутри-кишечных ксенографтах НСТ116 с различной экспрессией р53: а — ортотопические ксенографты НСТ116в подслизистом слое стенки слепой кишки бестимусных мышей. Звездочкой обозначены опухолевые клетки. Представлены типичные поля зрения. Увеличение х 100; б — типичные поля зрения срезов опухолей, окрашенных антителами против ЫУЕ-1, увеличение х 200

Рис. 5. Влияние экзогенных мутантных р53 и потери экспрессии р53 в клетках НСТ116 на экспрессию генов VEGF-А, VEGF-C и VEGF-D. Образцы нормализовали по мРНКа-тубулина

б

Оригинальные исследования

Оригинальные исследования

доминантно-негативным эффектом, который инактивирует функцию р53 дикого типа, а не их вновь приобретенными активностями ^ат-оГ-Аипсйоп), не присущими нормальному белку р53.

Наряду с увеличением транскрипции гена VEGF-A вклад в стимуляцию гемангионгенеза при дисфункциях р53 могут вносить изменения экспрессии и ряда других генов-мишеней р53, в частности активация таких индукторов ангиогенеза, как bFGF, bFGF-BP [6, 7], СОХ-2 [22] и репрессия ингибиторов ангиогенеза — тромбоспондинов [8], семафорина 3F [9].

В кровоснабжении опухолевых тканей может принимать участие не только гемангиогенез, но и другие механизмы, в частности васкулогенная мимикрия, наблюдаемая при РОК [23]. Молекулярные детерминанты и механизмы васкулогенной мимикрии пока практически не исследованы. Проведенное нами сравнение выраженности васкулогенной мимикрии (лами-нин+/CD34--сосудоподобных структур) в ксенограф-тах клеток НСТ116 с разным статусом р53 позволило впервые выявить влияние нарушений р53 на этот тип васкуляризации опухолей. При этом оказалось, что различные мутации р53 могут по-разному влиять на способы васкуляризации опухолевой ткани. Так, мутант р53 Я248^, в значительной степени стимулирующий гемангиогенез и, очевидно, за счет этого обеспечивающий достаточное кровоснабжение опухолевой ткани, подавляет васкулогенную мимикрию. При этом Я273Н мутант р53 стимулирует и гемангиогенез, и ва-скулогенную мимикрию, дополняющие друг друга механизмы кровоснабжения опухолей. Механизмы воздействия различных аномалий р53 на васкулоген-ную мимикрию пока совершенно непонятны и для их

выяснения необходимы дальнейшие углубленные исследования.

Также впервые нами было проведено исследование воздействия различных нарушений функции р53 на опухолевый лимфангиогенез, обеспечивающий отток тканевой жидкости от опухолевых тканей и, как следствие, играющий важнейшую роль в метастази-ровании [24, 25]. С помощью ИГХ-окрашивания антителами на LYVE-1 — надежный маркер лимфатического эндотелия, нами обнаружено, что гомозиготный нокаут гена ТР53 в клетках НСТ116 значительно увеличивает количество лимфатических сосудов в их вну-трикишечных ксенографтах. Так как наиболее изученными регуляторами лимфангиогенеза являются цитокины VEGF-C и VEGF-D, была изучена экспрессия их генов в клетках НСТ116 с разным статусом р53. Изменений экспрессии VEGF-D обнаружено не было, тогда как экспрессия VEGF-C изменялась разнонаправленно: при экспрессии мутантных р53 она увеличивалась, а при нокауте р53 — уменьшалась. Такая картина указывает на способность р53 транс-активировать ген VEGF-C и приобретение его онкогенными формами новых активностей ^ат-оГ-АипсИоп), увеличивающих экспрессию этого гена. Природа этих активностей нуждается в дальнейшем исследовании, их поиск может быть осуществлен с помощью масс-спектрометрического анализа секретома клеток, отличающих по статусу р53. Такие исследования, как и идентификация молекулярных детерминант васкуло-генной мимикрии, могут оказаться крайне полезными в поиске новых молекулярных мишеней для таргетной терапии, ингибирующей лимфогенное и гематогенное метастазирование колоректального рака.

ЛИТЕРАТУРА

1. Zilfou J.T., Lowe S.W. Tumor Suppressive Functions of p53. Cold Spring Harb Perspect Biol 2009;1(5):a001883.

2. Joerger A.C., Fersht A.R. Structural biology of the tumor suppressor p53. Annu Rev Biochem 2008;77:557-82.

3. Duff S.E., Jeziorska M., Kumar S.,

Haboubi N. et al. Lymphatic vessel density, microvessel density and lymphangiogenic growth factor expression in colorectal cancer. Colorectal Dis 2007;9(9):793-800.

4. Vidaurreta M., Sanchez-Munoz R., Veganzones S., Rafael S. et al. Vascular endothelial growth factor gene polymorphisms in patients with colorectal cancer. REV ESPEN FERM DIG 2010;102(1):20-31.

5. Tammela T., Alitalo K. Lymphangiogenesis: Molecular Mechanisms and Future Promise. Cell 2010;140:460-76.

6. Kaklamanis L., Trichas M., Amarantidis K., Spathari N. et al. VEGF expression in the colorectal adenoma-carcinoma sequence.

Oncol Res 2006; 15(9):445-51.

7. Sherif Z.A., Nakai S., Pirollo K.F., Rait A. et al. Downmodulation of bFGF-binding protein expression following restoration of p53 function. Cancer Gene Therapy 2001;8(10):771—82.

8. Kazerounian S., Yee K., Lawler J. Thrombospondins in cancer. Cell Mol Life Sci 2008;65(5):700-12.

9. Futamura M., Kamino H., Miyamoto Y., Kitamura N. et al. Possible role of semaphorin 3F, a candidate tumor suppressor gene

at 3p21.3 in, p53-regulated tumor angiogenesis suppression. Cancer Res 2007;67:1451-60.

10. Zhang M. PTEN in action: coordinating with p53 to regulate maspin gene expression. Cell Cycle 2009;8(8):1112—3.

11. Rege T.A., Fears C.Y., Gladson C.L. Endogenous inhibitors of angiogenesis

in malignant gliomas: nature's antiangiogenic therapy. Neuro Oncol 2005;7(2):106—21.

12. Assadian S., Teodoro J.G. Regulation of collagen-derived antiangiogenic factors

by p53. Expert Opin Biol Ther 2008;

8(7):941—50.

13. Folkman J. Tumor suppression by p53 is mediated in part by the antiangiogenic activity of endostatin and tumstatin. Sci STKE 2006;354:35.

14. Teodoro J.G., Parker A.E., Zhu X., Green M.R. p53-mediated inhibition of angiogenesis through up-regulation of a collagen prolyl hydroxylase. Science 2006;313:968—71.

15. Teodoro J.G., Evans S.K., Green M.R. Inhibition of tumor angiogenesis by p53: a new role for the guardian of the genome. J Mol Med 2007;85(11):1175—86.

16. Hendrix M., Seftor E., Hess A., Seftor R. Vasculogenic mimicry and tumour-cell plasticity: lessons from melanoma. Nat Rev Cancer 2003;3:411 —421.

17. Paulis Y.W., Soetekouw P.M., Verheul H.M., Tjan-Heijnen V.C. et al. Signalling pathways in vasculogenic mimicry. Biochim

Biophys Acta 2010; 1806(1):18—28.

18. Khromova N., Kopnin P., Stepanova E., Agapova L. et al. p53 hot-spot mutants increase tumor vascularization via ROS-mediated activation of the HIF-1/VEGF-A pathway. Cancer Letters 2009;276(2):143—51.

19. Kopnin P.B., Agapova L.S., Kopnin B.P., Chumakov P.M. Repression of sestrin family genes contributes to oncogenic Ras-induced reactive oxygen species up-regulation and genetic instability. Cancer Res 2007;67:4671—8.

20. Cespedes M.V., Espina C., Garcia-Cabezas M.A., Trias M. et al. Orthotopic

microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites.

Am J Pathol 2007;170(3):1077—85.

21. Wellmann S., Taube T., Paal K.

et al. Specific reverse transcription PCR quantification of vascular endothelial growth factor (VEGF) splice variants by LightCycler technology. Clin Chem 2001;47:654—60.

22. Masferrer J.L., Leahy K.M., Koki A.T., Zweifel B.S. et al. Antiangiogenic and antitumor activities of cyclooxygenase-2 inhibitors. Cancer Res 2000:60:1306—11.

23. Baeten C.I., Hillen F., Pauwels P., de Bruine A.P. et al. Prognostic role

of vasculogenic mimicry in colorectal cancer. Dis Colon Rectum 2009;52(12):2028—35.

24. Auguste P., Lemiere S., Larrieu-Lahargue F., Bikfalvi A. Molecular mechanisms of tumor vascularization. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 2005;54:53—61.

25. Dome B., Hendrix M., Paku S., Tovari J. et al. Alternative vascularization mechanisms in cancer. Pathology and therapeutic implications. Am J Pathol 2007;170:1—15.

Оригинальные исследования