СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИН-СЕКРЕТИРУЮЩИХ КЛЕТОК
METHOD OF PRODUCING INSULIN-SECRETING CELLS

Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии. В настоящем изобретении предлагается способ стимуляции дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток в инсулин-продуцирующие клетки. В частности, в настоящем изобретении предлагается способ получения инсулин-секретирующих клеток энтодермы поджелудочной железы методом дифференцировки эпигенетическирепрограммированных соматических клеток или других плюрипотентных стволовых клеток человека.
Уровень техники
Стволовые клетки представляют собой клетки, которые способны при симметричном или несимметричном делении давать клетки с полностью сходными свойствами, т.н. самообновляться или/и давать при делении клетки с другими функциональными свойствами, т.е. дифференцироваться. Стволовые клетки характеризуются способностью дифференцироваться invivo и invitro в функциональные клетки различной специализации.
Стволовые клетки классифицируют по потенциалу развития следующим образом: (1) тотипотентные, способные дифференцироваться в любой тип клеток будущего организма, в том числе и в экстраэмбриональные ткани; (2) плюрипотентные, способные дифференцироваться в любые клетки трех зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы), а также в клетки зародышевого пути; (3) мультипотентные, способные дифференцироваться в клетки различной специализации, но в рамках одной ткани (например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК); (4) олигопотентные или предшественники способные дифференцироваться в более ограниченное множество специализированных клеток.
Дифференцирование представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например, нервной или мышечной клетки.
Примером плюрипотентной клетки является эмбриональные стволовые клетки (ЭСК). ЭСК - это искусственно поддерживаемые клетки, выделенные из внутренней клеточной массы бластоцисты (эмбриона до имплантации), способные пролиферировать неограниченное время. Для получения новых линий ЭСК человека ранее были использованы различные источники: бластоциста (Thomsonetal. 1998), морула (Strelchenkoetal. 2004), late-arrestedembryo (Fekietal. 2008; Gavrilovetal. 2009; Zhangetal. 2006) или бластомеры (Geensetal. 2009; Klimanskayaetal. 2006). Вне зависимости от способов получения и культивирования недифференцированные ЭСК человека растут плотными колониями, размер клеток внутри колонии около 20 микрон, наблюдается высокое соотношение ядро-цитоплазма, хорошо видны ядрышки. В колонии может содержаться до нескольких тысяч клеток. На сегодняшний день существует два самых распространенных способа культивирования ЭСК человека: на фидере из митотически инактивированных эмбриональных фибробластов мыши (mouseembryonicfibroblasts - MEF) в среде с заменителем сыворотки (knockoutserumreplacement - KOSR), и на коммерческой подложке matrigel в среде mTeSR1 (Stemcelltechnologies).
Важным свойством ЭСК мыши является то, что, несмотря на длительное существование в культуре invitro, они могут полностью выполнить программу эмбрионального и онтогенетического развития при помещении их обратно в бластоцисту. В химерной мыши производные ЭСК могут присутствовать во всех тканях, включая клетки зародышевого пути. Уникальное свойство ЭСК человека -способность неограниченно пролиферировать invitro, не теряя своих плюрипотентных свойств, т.е. возможность дифференцироваться в любой специализированный тип клеток, включая клетки энтодермы и инсулин-продуцирующие клетки. Успехи в расшифровке генома в ходе последних десятилетий, изучение функции многих генов и развитие методов генной инженерии привели к тому, что стало возможно эффективно менять состояние клетки, изменяя ее функции и специализацию.
Известны три способа возвращения клетки в плюрипотентное состояние: 1) перенос ядра соматической клетки в энуклеированный ооцит (somaticcellnucleartransfer, SCNT), 2) слияние дифференцированной соматической клетки с плюрипотентной клеткой и 3) генетическое репрограммирование.Развитие технологий полногеномного анализа позволило достаточно точно охарактеризовать транскрипционный профиль генов, экспрессирующихся в различных специализированных клетках, в том числе и в ЭСК. Целый ряд транскрипционных факторов оказался уникальным для плюрипотентного состояния и, скорее всего, они определяли его. Были идентифицированы 4 гена транскрипционных факторов: Oct-4, Sox2, с-Мус и Klf4, которые переводят фибробласты в плюрипотентное состояние. Клетки, полученные таким образом, назвали индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК).Технология репрограммирования оказалась столь универсальной, что позволила получать плюрипотентные клетки не только из различных типов клеток, включая фибробласты кожи, клетки крови (Hanna J. etal. 2008), нервные клетки (Kim J.B. etal. 2008), эндотелиальные клетки (Шутова М.В. и др. 2009), но и из клеток различных организмов: крысы (Liao J. etal. 2008), свиньи (Wu Ζ. etal.. 2009) и других животных.
В области способов получения популяции панкреатических эндокринных клеток, известны патенты, в которых описываются способы дифференцирования плюрипотентных стволовых клетокв популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы.
В патенте RU 2528861 описывается способ дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток, включающий следующие этапы: а) культивирование плюрипотентных стволовых клеток, b) дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, с) дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии сформированной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, и d) дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дифференцирования в клетки панкреатической эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дифференцирования в панкреатические эндокринные клетки. При этом для увеличения экспрессии маркеров, ассоциированных с линией панкреатических эндокринных клеток, способ включает обработку клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, средой, содержащей достаточное количество агониста рецептора TGF-β, чтобы вызвать увеличение экспрессии маркеров, ассоциированных с линией панкреатических эндокринных клеток.
Еще в одном примере, приведенном в патенте RU 2701335, описывается способ получения популяции панкреатических эндокринных клеток, соэкспрессирующих NKX6.1 и инсулин, и минимальное количество глюкагона. Предлагаемый способ включает следующие стадии: а) культивирование плюрипотентных стволовых клеток, b) дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, с) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной эндодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дифференцировки в клетки панкреатической эндодермы, и d)дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии эндодермы поджелудочной железы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии эндокринной поджелудочной железы, соэкспрессирующие NKX6.1, инсулин и минимальное количество глюкагона, путем обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической эндодермы, средой, обогащенной активатором протеинкиназы С.
В других примерах, приведенных в патентах RU 2587634 и RU 2663339 описаны способы дифференцирования популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, содержащий следующие стадии: а) культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток; b) дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы; и с) дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, посредством обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, средой, в которую добавлен активатор протеинкиназы С.
В одном варианте осуществления более 50% клеток в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые получены способами, составляющими предмет настоящего изобретения, одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.
В другом примере, приведенном в патенте RU 2664226, предлагается повышение эффективности способа получения линии панкреатических эндокринных клеток, включающий в себя этапы культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, за счет увеличения экспрессии MAFA в клетках, за счет использования достаточного количества ингибитора циклин-зависимой киназы.
В патенте RU 2701335 предлагается способ лечения диабета, включающий получение панкреатических эндокринных клеток и имплантирование указанных клеток.
В патенте RU 2663339 дополнительно патентуется способ лечения диабета, включающий: (а) дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток в клетки панкреатической энтодермы или дифференцирование клеток дефинитивной энтодермы в клетки панкреатической энтодермы; (b) имплантацию клеток пациенту, страдающему диабетом, где плюрипотентные стволовые клетки представляют собой клетки из стабильных линий эмбриональных стволовых клеток человека H1, Н7 или Н9, которые экспрессируют по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, ОСТ4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 или Tra 1-81.
Применение популяции зрелых инсулин-продуцирующих клеток для снижения уровня глюкозы в крови у пациента, описано в патенте RU2682719.
Анализ технических решений показывает,что сохраняется потребность в разработке новых способов создания функционально экспрессирующихинсулин клеток и их применения для лечения пациентов.
Техническая задачасостоит в создании способа получения инсулин-секретирующих клеток энтодермы поджелудочной железы методом дифференцировки эпигенетическирепрограммированных соматических клеток или других плюрипотентных стволовых клеток человека, в которых проведено исправление мутации гена приводящего к диабету.
Другая техническая задача состоит в повышении эффективности способа за счет создания вектора, в состав которого входит кДНК гена PDX1 человека для получения высокопродуктивных и стабильных систем экспрессиитранскипционного фактора PDX1 при получении из клеток дефинитивной эндодермы инсулин-продуцирующих клеток.
Технический результат состоит в том, что заявленный способ получения инсулин-продуцирующих клеток и его применение для снижения уровня глюкозы в крови у пациента позволяет расширить спектр использования инсулин-продуцирующих клеток для профилактики и лечения диабета.
Сущность изобретения
В одном варианте осуществления настоящее изобретение описывает способ получения инсулин-секретирующих клеток энтодермы поджелудочной железы путем дифференцировки эпигенетическирепрограммированных соматических клеток или других плюрипотентных стволовых клеток человека. Способ включает следующие стадии:
(а) получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ИПСК;
(б) исправление мутации в ИПСК;
(в) индукция дифференцировки ИПСК в эндотермальном направлении;
(г) получение из клеток дефинитивной эндодермы инсулин-продуцирующих клеток, используя лентивирус;
(д) получение зрелых инсулин-продуцирующих клеток;
где на первой стадии (а) для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток используют персональные дермальные фибробласты пациента, которые имеют мутацию, приводящую к диабету;
где на второй стадии (б) для исправление мутации в ИПСК применяют систему CRISPR-Cas9, котораяпозволяет проводить разрезание и введение вставки лишь в мутантном аллеле, не затрагивая нормальную аллель, при этом редактирование мутации проводят в последовательности интрона гена инсулина, содержащего мутацию с. 188-31G>А в участке с последовательностью SEQ ID NO 4, где последовательности специфической части (gRNA) выбирают из группы SEQ ID NO 1 - SEQ ID NO 3, а последовательности для гомологичной рекомбинации выбирают из группы SEQ ID NO 5 - SEQ ID NO 7;
где на третьей стадии (в) за счет дифференцировки ИПСК в дефинитивную эндодерму получаютэнтодермальные клетки-предшественники;
где на четвертой стадии (г) проводят дифференцировку энтодермальных клеток-предшественников в инсулин секретирующие клетки поджелудочной железы и через сутки культивирования клетки трансдуцируют кДНК гена PDX1 человека SEQID NO 8, имеющего свой сайт полиаденилирования под контролем конститутивного промотора CMVSEQ ID NO 9 или EF1a SEQ ID NO 10 в составе лентивирусного вектора;
где на пятой стадии (д) получение зрелых инсулин-продуцирующих клеток осуществляют путем проведения: стадии эндокринной индукции в течение 5 дней; стадии созревания эндокринных предшественников в течение 14 дней; стадии получения зрелых бета-клеток в течение 7 дней, при этом на стадии получения зрелых бета-клеток в состав среды входят компоненты входящие в группу DMEM, Glutamax, NaHCO3, BSA, глюкоза ITS-X, гепарин, ALK5inhII, GC1, Trolox, N-Acetylcysteine.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение описываетприменение популяции зрелых инсулин-продуцирующих клеток в производстве лекарственного средства для снижения уровня глюкозы в крови у пациента,где зрелые инсулин-продуцирующие клетки получены на основе способа основанного на исправление мутаций в новых инсулин-продуцирующих клетках.
Перечень фигур
Фиг. 1 Результаты рестрикционного анализа 36 клонов ИПСК с гетерозиготной мутацией в интроне гена INS с. 188-31G>А с использованием направляющей РНК -gPvNA#2. В клоне 19 произошла гомологичная рекомбинация.
Фиг. 2 Результаты анализа клона №19, полученного с использованием направляющей РНК - gRNA#2, с помощью секвенирования по Сенгеру.
Фиг. 3 Этапы дифференцировки эпигенетическирепрограммированных соматических клеток или других плюрипотентных стволовых клеток человека в инсулин продуцирующие клетки. Где 3А световая микрофотография индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в начале дифференцировки, 3Б дифференцировка эпигенетическирепрограммированньгх соматических клеток или других плюрипотентных плюрипотентных стволовых клеток человека по примеру 2 в клетки примитивной энтодермы день 5,3 В дифференцировка в клетки переднего отдела кишки день 10,3Г дифференцировка в задний отдел примитивной кишки день 14,4Д трехмерные органоиды панкреатических клеток, содержащие бета клетки день 18.
Фиг. 4 Анализ доли PDX1/NKX6.1 -позитивных клеток в культуре, полученной путем дифференцировки плюрипотентной линии клеток человека endo-iPS12 в панкреатическом направлении. Данные проточнойцитофлуориметрии. Верхняя панель: контроль автофлуоресценции (неокрашенные клетки) и фоновой флуоресценции вторичных меченных флуорофором антител (клетки без добавления первичных антител). Нижняя панель: окраска клеток антителами к маркерам панкреатических предшественников PDX1 (канал FITC) и NKX6.1 (канал РЕ).
Фиг. 5 Анализ этапов дифференцировки специфических маркеров. Где:5А дифференцировка в дефинитивную энтодерму на 5 день, иммуногистохимическое окрашивание клеток антителами к транскрипционному фактору FOXA2 и рецептору CXCR4,5Б дифференцировка в клетки переднего отдела примитивной кишки,иммуногистохимическое окрашивание клеток антителами к транскрипционному фактору PDX1. 5 В дифференцировка в эндокринные предшественники, иммуногистохимическое окрашивание антителами на транскрипционный фактор ΝΚΧ6.1,5Γ дифференцировка в бета клетки секретирующие инсулин 21 день. Иммуногистохимическое окрашивание на транскрипционный фактор Neurogenin 3 (зеленый) и С-пептид (красный).
Описание изобретения
Используемые в настоящей заявке термины «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для плюрипотентных клеток» относится к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: Oct3/4, Sox2, Nanog, TRA160, SSEA4. Используемые в настоящей заявке термины «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы» относятся к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, FGF8, Brachyury, GATA6, CXCR4. Термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы» в настоящем документе обозначает клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1. Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под экспрессией подразумевается повышение уровня проявления (детекции) положительного маркера и понижение уровня проявления (детекции) для отрицательного маркера.
Лидирующее положение среди редких вариантов диабета 1 типа занимают моногенные формы, ассоциированные с мутациями в генах, обеспечивающих нормальное развитие и функцию β-клеток поджелудочной железы. Прогресс в области геномных исследований позволил определить целый ряд генов, таких как INS, HNF1A, GCK, HNF4A, РАХ4 и другие, которые приводят к проявлению заболевания. Помочь таким пациентам избежать ежедневных инсулиновых инъекций можно сделав им пересадку бета-клеток поджелудочной железы, вырабатывающих инсулин. Эдмонтонский протокол - это серия научных исследований эффективности аллотрансплантации островков поджелудочной железы больным сахарным диабетом 1 типа, проведенных до 2010 года. По результатам Эдмонтонского протокола менее 50% пациентов, подвергшихся трансплантации, сохранили "инсулинонезависимость" в течение первого года после операции, еще через год более 80% участников исследования получали инсулин. Последние исследования (Hering B.etal. 2016, Rickels M.etal. 2016) показали, что через 1 год после трансплантации островковых клеток практически у всех реципиентов трансплантата уровень гликогемоглобина был ниже 7% и не было эпизодов тяжелой гипогликемии. Через два года после трансплантации островков у 70% уровень гликогемоглобина был ниже 7%, и у них не было эпизодов тяжелой гипогликемии, а 40% не нуждались в инсулине. Однако, такие клетки получают из трупного материала, их количество невелико, в среднем требуется 2-2,5 органа для проведения одной трансплантации в зависимости от возраста и веса пациента. Кроме того, пациентам с трансплантированными чужеродными β-клетками приходится постоянно принимать лекарства, угнетающими иммунную систему и подавляющие иммунный ответ на трансплантат. Лекарства же эти далеко не безопасны и могут, например, провоцировать развитие почечной недостаточности.
Решение проблемы в случае моногенных форм диабета может лежать в области генетической коррекции мутации в бета-клетках пациента. Появившейся недавно системы редактирования генома произвела настоящую революцию в клеточной генной инженерии. Нужная последовательность ДНК распознается комплементарной ей последовательностью РНК, которая связана с ферментом. Система редактирования CRISPR/Cas не требует длительных клонирований, создания продуцентов и т.д, олигонуклеотидный синтез сегодня осуществляется роботами и занимает несколько часов, а весь процесс создания системы редактирования конкретной последовательности ДНК сокращается до 1-2 недель. Аббревиатура CRISPR расшифровывается как кластеризованные регулярно разделенные промежуточными последовательностями короткие палиндромные повторы ДНК. (Ishino Y, etal. 2018). Рядом с этими районами находились эволюционно консервативные гены, которые получили название CRISPR ассоциированных (Cas) генов. Дальнейший анализ показал, что промежуточные последовательности представлены фрагментами бактериофагов и мобильных генетических элементов (Bolotin A, etal. 2005). Биоинформационными подходами были проанализированы возможные молекулярные механизмы свойств этих районов (MakarovaK,etal. 2006), однако экспериментально существование адаптивной системы защиты бактерий от вирусной инфекции было показано несколько позднее (Barrangou R, etal. 2007). Принципиальной отличительной чертой системы распознавания и разрезания ДНК CRISPR/Cas9 является то, что эта система использует Уотсон-Криковское распознавание комплементарных нуклеотидов (РНК-ДНК) вместо распознавания сложными рекомбинантными белками конкретных последовательностей ДНК. Система может быть разработана для распознавания любого генетического текста в любом геноме.
В процессе разработки нового способа было обнаружено, что для получения высокопродуктивных и стабильных систем экспрессии транскипционного фактора PDX1 при получении из клеток дефинитивной эндодермы инсулин-продуцирующих клеток и создания вектора, входящего в лентивирус, содержащего кДНК гена PDX1 человека, система экспрессии была усовершенствована на столько, что позволило сократить этапы дифференцировки по сравнению со способом описанным в RU 2528861.
Способ осуществляется следующим образом. На первой стадии (а) для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток используют персональные дермальные фибробласты пациента которые имеют мутацию, приводящую к диабету. На второй стадии (б) для исправление мутации в ИПСК применяют систему CRISPR-Cas9, которая позволяет проводить разрезание и введение вставки лишь в мутантном аллеле, не затрагивая нормальную аллель. При этом редактирование мутации проводят в последовательности интрона гена инсулина, содержащего мутацию с. 188-31G>А в участке с последовательностью SEQ ID NO 4. Последовательности специфической части (gRNA) выбирают из группы SEQ ID NO 1 -SEQ ID NO 3, а последовательности для гомологичной рекомбинации выбирают из группы SEQ ID NO 5 - SEQ ID NO 7. На третьей стадии (в) за счет дифференцировки ИПСК в дефинитивную эндодерму получают энтодермальные клетки-предшественники. На четвертой стадии (г) проводят дифференцировку энтодермальных клеток-предшественников в инсулин секретирующие клетки поджелудочной железы и через сутки культивирования клетки трансдуцируют кДНК гена PDX1 человека SEQID NO 8, имеющего свой сайт полиаденилирования под контролем конститутивного промотора CMVSEQ ID NO 9 или EF1a SEQ ID NO 10 в составе лентивирусного вектора. На пятой стадии (д) получение зрелых инсулин-продуцирующих клеток осуществляют путем проведения: стадии эндокринной индукции в течение 5 дней; стадии созревания эндокринных предшественников в течение 14 дней; стадии получения зрелых бета-клеток в течение 7 дней, при этом на стадии получения зрелых бета-клеток в состав среды входят компоненты входящие в группу DMEM, Glutamax, NaHCO3, BSA, глюкоза ITS-X, гепарин, ALK5inhII, GC1, Trolox, N-Acetylcysteine.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение описываетприменениепопуляциизрелых инсулин-продуцирующих клетоквпроизводствелекарственногосредствадлясниженияуровняглюкозывкровиуп ациента, гдезрелыеинсулин-продуцирующиеклеткиполученынаосновеспособаоснованногонаисправлениемутац ийвновыхинсулин-продуцирующихклетках.
Примеры
Приведенные ниже примеры включают, но не ограничивают варианты использования аналогов действующих веществ, входящих в состав сред.
Пример 1 Репрограммирование клеток фибробластов до плюрипотентного состояния и получение, размножение и культивирование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК).
2
Для получения ИПСК использовали персональные дермальные фибробласты пациента. Для репрограммирования фибробластов до плюрипотентного состояния использовали набор ReproRNA™-OKSGM (StemcellTechnologies). Для проведения репрограммирования фибробласты человека (2-5 пассажа) рассаживали в плотности 10 тыс.клеток на см в среде для культивирования фибробластов на 35 мм чашку (Corning), покрытую матригелем (BD), и инкубировали при 37°С ночь. На следующий день удаляли среду, промывали клетки PBS и добавляли 1 мл среды, содержащей ингибитор иммунного ответа B18R. Трансфекционный коктейль с РНК и трансфекционным агентом готовили в стерильной пробирке и инкубировали при комнатной температуре не более 5 мин. Затем по каплям добавляли к культуре фибробластов, перемешивая от края к краю чашки, инкубировали в течение ночи в CO2-инкубаторе. На следующий день проводили замену среды на среду, содержащую помимо ингибитора иммунного ответа B18R пуромицин в концентрации 2,5 мкг/мл (концентрацию пуромицинаопределеяли как описано выше). Продолжали инкубацию на протяжении последующих дней с ежедневной заменой среды, содержащей антибиотик и B18R. На 6 день отменяли внесение антибиотика, продолжали инкубацию клеток еще 7 дней, после чего отменяли добавление B18R. Формирование колоний ИПСК наблюдалось 15-20 день после трансфекции. После достижения размера в несколько сотен клеток, колонии переносились механическим отделением с помощью инсулиновой иглы в лунки 24-луночного планшета (Corning), покрытые матригелем (BD), в среду TeSR-E8 (StemCellTechnologies) с 10 мкМ Y26732. Последующее пассирование ИПСК осуществлялось по достижению колониями 60% конфлюэнтности с помощью раствора GentleCellDissociationReagent или раствора Версен. Эффективность репрограммирования определяется как соотношение количества полученных клонов в результате репрограммирование к начальному количеству клеток при трансфекции конструкцией для репрограммирования. Все полученные линии ИПСК имели морфологию, характерную для плюрипотентных стволовых клеток.Для соблюдения критерия соответствия репрограммированных клеток плюрипотентным и для валидации примененного экспериментального подхода, необходимо провести молекулярно-генетическую и функциональную характеристику полученных персональных клеточных линий. Молекулярно-генетическая характеристика полученных линий ИПСК проводилась с помощью метода ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), а также с помощью иммуноцитохимического окрашивания на маркеры плюрипотентности. Для исследования экспрессии генов ОСТ4, SOX2, NANOG, DPPA4, характерных для плюрипотентного состояния, проводили ОТ-ПЦР. Для этого культивировали линию ИПСК в среде TesR-E8 на матригеле в 35 мм чашке Петри. Далее клетки промываются раствором PBS и добавляется лизирующий раствор. Далее выделяется РНК набором для выделения тотальной РНК PureLink™ RNA MiniKit (Invitrogen) в соответствии с инструкцией производителя. РНК после выделения хранится в элюирующем буфере при температуре -80 ; одноцепочечную кДНК синтезировали из 1-2 мкг РНК с помощью обратной транскрипции (ОТ) с помощью набора Mint, содержащего обратную транскриптазу и случайных праймеров (Евроген, Россия); экспрессия генов NANOG, ОСТ4, SOX2 и DPPA4 оценивалась с помощью ПЦР (ScreenMix, Евроген, Россия), для нормировки количества кДНК использовали уровень экспрессии гена домашнего хозяйства бета-актина (АСТВ). Для визуализации результатов ОТ-ПЦР проводили электрофорез в 2% агарозном геле. В полученных линиях ИПСК наблюдается экспрессия генов, характерных для плюрипотентного состояния: NANOG, ОСТ4, SOX2 и DPPA4. Для проведения дополнительной молекулярной характеристики и валидации маркеров на уровне белков было проведено иммуноцитохимического окрашивание первичными антителами, специфичными к плюрипотентным маркерам ИПСК человека: ядерным транскрипционным факторам -ОСТ4, SOX2, поверхностным антигенам - SSEA-4, TRA-1-60, с последующим связыванием с вторичными антителами с флуоресцентной меткой. Для этого культивировали линию ИПСК в среде TesR-E8 на матригеле в 24-луночном планшете до достижения 50-70%-ной конфлюентности. Клетки промывали раствором PBS, фиксировали 5 минут в 4% параформальдегиде. После фиксации препарат дважды промывали раствором PBS, содержащим 0,1% Tween 20. Далее проводили пермеабилизацию клеток в PBS, содержащем 0,5% TritonX100. Далее дважды промывали раствором PBS, содержащим 0,1% Tween 20. Затем осуществляли блокировку неспецифической сорбции антител инкубацией при комнатной температуре в течение 30 мин в блокирующем растворе: PBS, содержащем 2,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,1% Tween 20. Первичные антитела наносили в разведениях, рекомендованных производителем в блокирующем растворе. Инкубировали ночь при 4°С.После инкубации препарат трижды отмывали по 5 мин в растворе PBS, содержащем 0,1% Tween 20. Вторичные антитела наносили в разведениях, рекомендованных производителем, инкубировали 30 мин при комнатной температуре в темноте. Клетки дважды отмывали по 5 мин в растворе PBS, содержащем 0,1% Tween 20. Инкубировали в растворе PBS, содержащем DAPI в конечной концентрации 0,1 мкг/мл, в течение 10 мин. После инкубации осуществляли отмывку в растворе PBS, содержащем 0,1% Tween 20. Анализ полученного окрашивания проводили с помощью системы для визуализации Celena (LogosBiosystems) на 40-200-кратном увеличении с использованием соответствующих фильтров. Для окрашивания использовались первичные антитела: кроличьеполиклональные Anti-OCT4 antibody (Abcam, США), кроличьи Anti-SOX2 antibody (Abcam, США), мышиные моноклональные anti-SSEA-4 (Stemcelltechnologies, Канада), мышиные моноклональные anti-Tra-1-60; вторичные антитела: goatanti-rabbitAlexaFluor 488-conjugated goatIgG (Invitrogen, США), goatanti-mouseAlexaFluor 555-conjugated goatlgG (Invitrogen, США). В результате иммуноцитохимического анализа было показано, что полученные клоны ИПСК специфично окрашиваются на ядерные и поверхностные маркеры плюрипотентности ОСТ4, SOX2, SSEA-4, TRA-1-60, что подтверждает то, что полученные линии ИПСК содержат, кодируемые указанными генами белки, что дополнительно валидирует полученные клеточные линии как плюрипотентные. Для количественной оценки результатов окрашивания на маркеры плюрипотентности было проведено окрашивание клеток ИПСК на поверхностный маркер плюрипотеных клеток TRA-1-60, напрямую меченный флуорофором. Для этого культивировали линию ИПСК в среде TesR-E8 на матригеле до достижения 50-70%-ной конфлюентности, клетки промывали раствором PBS, снимали с помощью раствора Версена, суспендировали по получение одноклеточной суспензии. Клетки фиксировали 2% параформальдегидов 5 мин, 100 тыс.клеток суспендировали в 100 мкл PBS, добавляли 1 мкл мышиных моноклональных антител anti-TRA-1-60 (ThermoFisher), конъюгированные с флуоресцентной меткой DyLight 488, инкубировали в течение 1 ч, отмывали раствором PBS. Долю клеток, специфично связывающихся с антителами анализировали на приборе NovoCyteFlowCytometer (ACEA Biosciences). В качестве контроля использовали клетки, не окрашенные антителами. В результате анализа было определено, что 90,75% клеток полученной линии ИПСК окрашиваются на поверхностный маркер плюрипотентности, что дополнительно валидирует полученные клеточные линии и способ получения плюрипотентных ИПСК. Для валидации идентичности полученных клеточных линий исходному биоматериалу пациентов был использован метод ПЦР и секвенирования по Сэнгеру для определения наличия мутации в гене инсулина в полученных пациент-специфичных ИПСК. Из культуры клеток ИПСК, полученных из фибробластов пациента #1 и пациента #2, при достижении 80-90%-ной конфлюентности была выделена геномная ДНК. Для выделения геномной ДНК использовали набор ExtractDNABlood (Евроген, Россия) и протокол, предоставленный производителем. Затем с использованием пары праймеров, позволяющих амплифицировать фрагмент гена INS, содержащий мутацию, проводили ПЦР. Далее ПЦР продукт очищали с помощью набора CleanupStandard (Евроген, Россия) и проводили секвенирование. В результате анализа данных секвенирования было показано, что в ИПСК, полученных из фибробластов от пациента #1 и пациента #2, обнаруживаются исходно выявленные гетерозиготные мутации.
Пример 2 Генетическая коррекция мутаций в ИПСК
Для редактирования мутации в гене INS была выбрана система GeneArt CRISPR NucleaseVectorwith OFP ReporterKit (Invitrogen™) - вектор для экспрессии всех функциональных компонентов, необходимых для CRISPR/Cas9 геномного редактирования клеток млекопитающих с флуоресцентным репортером - оранжевым флуоресцентным белком (OFP). Репортерная система с флуоресцентным белком позволяет отслеживать эффективности трансфекции, а также провести сортировку клеток, экспрессирующих CRISPR/Cas9 для дальнейшего отбора клонов мутации с. 188-31G>A. Проведен анализ и подобраны последовательности gRNA для дальнейшего геномного редактирования. Последовательности gRNA клонированы в вектор GeneArt CRISPR NucleaseVectorwith OFP ReporterKit (Invitrogen™) - вектор для экспрессии всех функциональных компонентов, необходимых для CRISPR/Cas9 геномного редактирования клеток млекопитающих. Последовательность хнРНК состоит из конститутивной части размером около 100 нуклеотидов и специфической части (gRNA), представленной 20 нуклеотидами на 5'-конце, которые выбираются из приведенных в таблице 1.
Для получения векторов, содержащих последовательность направляющей gRNA к участку последовательности интрона гена инсулина, содержащему мутацию с. 188-31G>А, необходимо использовать одноцепочечныеолигонуклеотиды, содержащие на концах последовательности, необходимые для лигирования в вектор GeneArt CRISPR NucleaseVectorwith OFP ReporterKit (Invitrogen™). Последовательность направляющей gRNA в векторе не должна содержать последовательность NGG (РАМ), которая должна присутствовать только в таргетируемой последовательности геномной ДНК в клетке. Таким образом, для клонирования каждой из последовательностей для смысловой цепи необходимо добавить последовательность на 3' конце: GTTTT-3', а для антисмысловой - CGGTG-3'. Для большей эффективности лигирования на 5' конце каждого олигонуклеотида были добавлены фосфатные группы. Ниже в таблице 2 представлены последовательности использованные для клонирования в вектор для создания трех специфичных направляющих gRNA. Поскольку мутация в геноме пациента является гетерозиготной, и в данном исследовании требуется исправить мутацию лишь в одномаллеле, было принято решение использовать направляющую аллель-специфичную gRNA. Такая gRNA должна в своей последовательности содержать замену, соответствующую мутации пациента, что позволит проводить разрезание с помощью системы CRISPR-Cas9 лишь в мутантномаллеле, не затрагивая нормальную аллель.
Выбран участок интрона и 2 го экзона гена INS (референсный геном) (SEQ ID NO 4):
Мутация: SNV: chrl 1:2,181,258 С/Т (rs797045623). По кДНК эта позиция -NM_000207:c.188-31G>A.
Для максимально специфичного разрезания именно мутантного аллеля необходимо, чтобы мутация была в последовательности РАМ (а именно GG) или как можно ближе к РАМ для специфичного разрезания именно мутантного аллеля. Для гомологичной рекомбинации выбирали последовательности из приведенных в таблице 2.
Тип трансфекции - обратная. Формат проведения трансфекции - 24-луночные планшеты. Необходимые условия ведения клеток: как минимум 3 пассирования культуры в условиях одиночных клеток, при достижении монослоя не более 85% конфлюэнтности (каждые 4-5 дней). В день 0 клетки накануне трансфекции культивировали на чашке 35 мм с конфлюентностью не более 85%. В день 1 покрывали матригелем 8 лунок 24-луночного планшета и инкубировали при комнатной температуре на 60 мин. Далее отбирали матригель и добавляли в лунки по 0,2 мл среды mTeSR™I+ROCK inhibitor (Y-27632 ROCK Inhibitor - 10 μΜ). Заранее согревали MirasReagent при комнатной температуре и мягко перемешивали на вортексе. Готовили трансфекционную смесь. Для определения оптимальных условий трансфекции учитываются следующие критичные параметры: соотношение плазмидной ДНК и трансфицирующего агента. Из расчета на 1 лунку необходимо поместить в эппендорф 50 мкл среды OptiMEM Reduced-SerumMedium. Добавляют 0,8 μg суммарной ДНК, в которую входит плазмидная ДНК GeneArt CRISPR NucleaseVectorwith OFP ReporterKit, содержащая выбранную выше из табл 1. направляющую gRNA в количестве от 0,1 до 0,7 мкг и одноцепочечный олигонуклеотид для гомологичной рекомбинации, выбранный из табл.2 в количестве о 0,1 до 0,7 мкг. Перемешивают пипетированием. Далее, в зависимости от соотношения ДНК/реагента, добавляют от 1,6 до 3,2 μlMirusReagent. Инкубируют трансфекционную смесь при комнатной температуре 15-20 минут. Пока происходит инкубация трансфекционной смеси, снимают ИПСК с помощью 1 мл Accutase™ или 0,5mM EDTA на чашку 35 мм и проводят инкубацию при 37°С.Отбирают Accutase™ или 0,5mM EDTA и добавляют 1 ml mTeSR™1+ROCK. Суспендируют до получения одноклеточной суспензии. Подсчитывают количество клеток. Ресуспендируют клетки в среде mTeSR™l+ROCK в конечной концентрации: 300.000/150 мкл. Добавляют тансфекционную смесь в соответствующие лунки 24-луночного планшета. Инкубируют в течение оставшегося времени (общее время не более. 15-20 мин). День 3 (через 18-24 часа после трансфекции) - анализ эффективности трансфекции. При культивировании отредактированных клонов после трансфекции и сортировки трансфицированных OFP+ клеток критическим является выживаемость одиночных клеток при получении клонов. Через 24-48 часов после трансфекции клетки можно селектировать для отбора именно тех клеток, в которые попала и экспрессируется вводимая конструкция. Селекцию можно осуществлять как с помощью добавления антибиотика, в случае использования конструкции с геном устойчивости к антибиотику, так и с репортерной флуоресцентным белком, отбирая лишь клетки с наличием свечения. В данном эксперименте мы использовали вектор GeneArt CRISPR NucleaseVectorwith OFP ReporterKit (Invitrogen™) для редактирования генома, содержащий оранжевый флуоресцентный белок OFP, и селекцию осуществляли с помощью клеточного copTepaSony МА900, отбирая OFP+ клетки. Для увеличения выживаемости одиночных клеток ИПСК после сортинга использовали среду mTesR1 (StemCellTechnologies), содержащую 10 мкМ Y-27632 (StemCellTechnologies), с добавлением кондиционированной среды mTesR1, или также с добавлением KSR в первые 5 суток после сортировки клеток. В качестве подложки использовали либо матригель, либо фибробласты кожи человека, обработанные митомицином С.
Клетки после сортировки растили на фидере, рассеянном на матригель. Среду mTesR1, с добавлением кондиционированной mTesR1, меняли ежедневно по 100 мкл на 1 лунку 96-луночного планшета. При достижении размера колонии 100-150 клеток, клетки снимались с помощью раствора Версена, и пересевались на 1 лунку 48-луночного планшета на матригель в среду mTesR1 (StemCellTechnologies), содержащую 10 мкМ RHO/ROCK pathwayinhibitor (Y-27632) (StemCellTechnologies). При достижении монослоя, клетки пересевались в дубле на 2 лунки 24-луночного планшета.
Для детекции события гомологичной рекомбинации в полученных клонах ИПСК, в олигонуклеотид для гомологичной рекомбинации была внесена синонимичная замена в первый кодон 2 экзона гена инсулина GTG (Valine) → GTC (Valine). Данная замена не изменяет кодируемой аминокислоты, но нарушает последовательность сайта эндонуклеазы рестрикции BtsaI: GCAGTGNN. Таким образом, при отсутствии гомологичной рекомбинации ПЦР-продукт, полученный из ДНК данного клона будет биаллельно разрезаться на фрагменты 92 пн и 279 пн. А при наличии гомологичной рекомбинации в клоне, в одном из аллелей будет исправляться мутация и вносится замена, приводящая к нарушению сайта рестрикции. Таким образом, в таком клоне присутствует неразрезанный фрагмент размером 371 пн. Из анализированных клонов отбираются те, которые имеют гомологичную рекомбинацию и исправленную мутацию (Фиг. 1 и Фиг. 2)
В результате редактирования было получено и проанализировано 80 клонов с использованием направляющей РНК - Ins-KO-gRNA-3, и 65 клонов с использованием направляющей РНК - Ins-KO-gRNA-2 различными методами. Были выбраны 2 клона, в которых произошла гомологичная рекомбинация, приводящая к исправлению гетерозиготной мутации с. 188-31G>A.
Пример 3 Индукция дифференцировки ИПСК с исправленными генетическими мутациями в энтодермальном направлении.
Дифференцировка ИПСК в дефинитивную эндодерму проводится с использованием коммерческого набора STEMdiff™ DefmitiveEndodermKit (STEMCELL Technologies, Канада). В День 0 ПСК человека пересевали стандартным методом: инкубировали с раствором Версена (Панэко) либо с помощью реагента GentleCellDissociationReagent (StemCellTechnologies) в течение 5-8 минут, реагент отбирали, добавляли среду для культивирования, клетки суспендировали до одноклеточной суспензии и высевали из расчета 50 тысяч клеток на лунку 24-луночного планшета, покрытого Matrigel (BD), в среду TeSR-E8 (STEMCELL Technologies), содержащую 10 мкМ ингибитор ROCK (Y-27632, Stemgent). Через 24 часа, когда конфлюэнтность культуры достигала 30%, в День 1 дифференцировки культуральную среду заменяли на среду STEMdiff™ EndodermBasalMedium с добавлением Supplement А и Supplement В, разведенных в 100 раз. На следующий день в День 2 среду заменяли на среду STEMdiff™ EndodermBasalMedium с добавлением лишь Supplement В, разведенного в 100 раз. Далее в День 3 и 4 среду меняли на ту же, что и в День 2. На День 5 дифференцировки клетки анализировали или продолжали дифференцировку сменой среды для второй стадии дифференцировки. В результате были получены энтодермальные клетки-предшественники.
На основе проанализированных данных были разработаны и опробованы два протокола дифференцировки энтодермальных клеток в предшественники инсулин-продуцирующих клеток, детальное описание которых приведено ниже. Для дальнейшей работы были дифференцированы энтодермальные предшественники, полученные на основе линий ИПСК: endo-iPS12, ins-iPSC4 и ins-iPSC8.
Протокол 1.
На стадии первичной кишечной трубки (день 4) среда была заменена на RPMI 1640, содержащую GlutaMAX (кат. №61870-127, LifeTechnology)+1% Пенициллин-стрептомицин (PS) (Панэко)+1% В-27 бессывороточной добавки (50х) (Панэко)+50 нг/мл FGF7 (кат.№251-KG, R&D System) в течение 2 дней.
Далее имитировалась стадия развития проксимального отдела передней кишки (день 6 - 8). Среда заменялась на среду DMEM, содержащую GlutaMax (DMEM) (кат. №10569-044, LifeTechnology) с 1% PS (Панэко)+1% В-27 (Панэко)+0,25 мкМ KAAD-Циклопамин (кат.№04-0028, Stemgent)+2 мкМ ретиноевой кислоты (Кат. №04-0021, Stemgent)+0,25 мкМ LDN193189 (Кат. №04-0074, Stemgent) на 2 дня.
Стадия дифференцировки в панкреатические предшественники (день 8-11): среда была приготовлена на основе DMEM+1% PS (Панэко)+1% В27 (Панэко)+50 нг/мл EGF (Кат. №236-EG, R&D System). Дополнительно на этой стадии в среду были добавлены до конечных концентраций 50 нг/мл FGF10, 1 мкМ ALK5i (Кат.№04-0015, Stemgent), 50 нг/мл эксендина-4 (кат.№1933, Tocris), 10 нг/мл ВМР4 (кат.№314-ВР-010, R & D System), 0,25 мкМ LDN193189 и 50 нг/мл EGF.
Протокол 2.
Стадия индукции задней кишки (в течение 3 дней, среда менялась каждый день). Состав среды: DMEM+2 мМ Glutamax+1,5 г/л NaHCO3+0,5% BSA fV+10 мМ глюкоза+0,25 мМ аскорбиновая кислота (А4544, Sigma-Aldrich)+50 нг/мл FGF7 (Z03047, Stemgent).
Стадия индукции панкреатической энтодермы (в течение 2-х дней среда менялась каждый день). Состав среды: DMEM+2 MMGlutamax+2,5 г/л NaHCO3+2% BSA+10 мМ глюкоза+0,25 мМ аскорбиновая кислота+50 нг / мл FGF7+0,25 мМ SANT1 (S4572, Sigma-Aldrich)+1 мМ ретиноевая кислота+100 нМ LDN+1: 200 ITS-X (51500-056, LifeTechnologies)+200 нМ ТРВ активатор РКС (sc-204424, Санта Круз).
Стадия индукции панкреатических предшественников (3 дня, среда менялась каждый день. Состав среды: DMEM+2 мМ Glutamax+2,5 г/л NaHCO3+2% BSA+10 мМ глюкоза+0,25 мМ аскорбиновая кислота+2 нг/мл FGF7+0,25 мМ SANT1+0,1 мМ ретиноевая кислота+200 нМ LDN+1: 200 ITS-X+100 нг/мл EGF (AF-100-15, Peprotech)+10 мМ никотинамида (N0636, Sigma-Aldrich).
Пример 4Дифференцировка энтодермальных клеток-предшественников в инсулин секретирующие клетки поджелудочной железы.
Для дифференцировки энтодермальных клеток-предшественников в инсулин секретирующие клетки поджелудочной железы, полученные на предыдущей стадии клетки помещались без пересева в среду с составом: DMEM+2 мМ Glutamax+1,5 г/л NaHCO3+0,5% BSA fV+10 мМ глюкоза+от 0,05 до 0,5 мМ аскорбиновая кислота (А4544, Sigma-Aldrich)+от 5 до 50 нг/мл FGF7 (Z03047, Stemgent), в которой культивировались 24 часа. Через сутки культивирования клетки трансдуцировались кДНК гена PDX1 человека, имеющего свой сайт полиаденилирования под контролем конститутивного промотора (CMV, EF1 или аналогичного) в составе вирусного вектора. Наибольшей эффективность трансдукции обладали лентивирусные вектора третьего поколения (LEGO или аналогичные) для транзиторной экспрессии использовался вектор на основе аденовируса 5 серотипа, однако эффективность дифференцировки снижалась на 30-50%. MOI (множественность инфекции) составляла 1:3. На следующий день после инфекции среда менялась на аналогичную с добавлением LDN193189 (Stemgent), концентрацию выбирают от 25 нМ до 500 нМ и клетки культивировались в ней 2 дня. Через 2 дня среда менялась на среду содержащую DMEM+2 мМ Glutamax+1,5 г/л NaHCO3+0,5% BSA fV+10 мМ глюкоза+аскорбиновую кислоту (А4544, Sigma-Aldrich) в концентрации как выбрали выше+50 нг/мл FGF7 (Z03047, Stemgent)+LDN193189 в концентрации выбранной из диапазона не менее 1 нМ и не более 100 нМ+1 мкМ ТЗ+ингибитор Alk5 в концентрации выбранной от 1 до 50 мкМ, в которой клетки культивировались 4 дня с однократной заменой среды через 2 дня. В это период формировались клетки предшественники инсулин - секретирующих клеток. Для их дальнейшего созревания в гормон секретирующие клетки среда заменялась на DMEM с Glutmax, 1.5 g/L NaHC3, 20 mM глюкоза 1 мкМ GC1 (высокоаффинный агонист альфа- и бета-рецепторов гормона щитовидной железы (4554, Tocris) 10 10 мкΜ Trolox (кат. №648471-500MG, EMD Millipore)+R428 (тирозинкиназа ингибитор рецептора AXL) (кат. №А8329, ApexBio) в концентрации выбранной из диапазона 0,1 до 10 мкМ и культивируют еще от 3-х до 8 дней в зависимости от концентраций и появления маркеров. В зависимости от эффективности дифференцировки в дефинитивную энтодерму на первом этапе и трансдукции с помощью генетической конструкции продолжительность последнего этапа дифференцировки может составлять от 3 до 8 дней. Полученные дифференцированные клетки были оценены как морфологически, так и по уровню экспрессии специфических для данной стадии транскрипционных факторов NKX6.1 и PDX1 методом иммуноцитохимического анализа. Кроме того, был проведен анализ уровня экспрессии этих белков методом проточной цитофлуориметрии. Согласно данным проточной цитофлуориметрии позитивное окрашивание PDX1+/NKX6.1+в результате дифференцировки наблюдалось у 80% клеток (Фиг. 4)., а экспрессия С-пептида у 85% клеток (Фиг. 5).
Пример 5 Получение зрелых инсулин-продуцирующих клеток
На основании проведенного анализа нами было сформировано и использовано два протокола дифференцировки.
Протокол 3.
Начинали со стадии эндокринного предшественника поджелудочной железы (11 - 20 дни). После иммуноцитохимического анализа клеток на этой стадии на совместную экспрессию транскрипционных факторов PDX1 и NKX6.1 переходили к следующей стадии. Нужно подчеркнуть, что количество коэкспрессирующих клеток должно быть не менее 50% от общего числа проанализированных клеток. Культуры клеток были диссоциированы на отдельные клетки с помощью TrypLE™ Express (LifeTechnology) и высеяны на 96-луночные планшеты с низкой адгезией (кат. №7007, Corning) (одна чашка 35 мм или 1 лунка 6-луночного планшета на 50 лунок 96-луночного планшета) в DMEM+1% PS+1% В-27+0,25 мкМ циклопамина+1 мкМ гормон щитовидной железы (Т3) (кат. №Т6397, SIGMA)+10 мкМ Alk5i+10 мкМ сульфат цинка (кат. №Z4750, SIGMA-ALDRICH)+10 мкг/мл гепарина (кат.№Н3149, SIGMA-ALDRICH) для формирования трехмерных органоидов. Через 2 дня культивирования сформировавшиеся органоиды были перенесены в 6-луночные планшеты с низкой адгезией (кат. №07-200-601, ThermoFisherScientific) в среде DMEM+1% PS+1% В27+100 нМ LDN193189+1 мкМ Т3+10 мкМ Alk5i+10 мкМ сульфат цинка+100 нМ ингибитор γ-секретазы)+10 мкг/мл гепарина. Свежеприготовленная среда менялась через день.
Стадия получения и поддержания бета-клеток поджелудочной железы (20-27 дни). Культуральная среда менялась на DMEM+1% PS+1% В27+1 мкМ Т3+10 мкМ Alk5i+1 мМ N-ацетилцистеин (N-Cys) (кат.№A9165-5G, SIGMA-ALDRICH)+10 мкΜ Trolox (кат. №648471-500MG, EMD Millipore)+2 мкМ R428 (тирозинкиназа ингибитор рецептора AXL) (кат. №А8329, ApexBio)+10 мкМ сульфат цинка+10 мкг/мл гепарин. Замена на свежую среду проводилась через день.
Протокол 4.
2
Стадия эндокринной индукции (5 дней): клетки промывали 2 раза ЭДТА, снимали TrypLE в течение 10 минут при 37°С, 1 мл на 35 мм чашку. Клетки диссоциировали пипеткой и центрифугировали в течение 3 минут при 200 RCF. Клетки ресуспендировали в среде S5 с 10 мкМ ROCK ингибитора и при плотности один миллион клеток на 1 мл, в объеме 5 мл, переносили в 6-луночные планшеты с низкой адгезией (3471, Corning) и помещали на вращающуюся платформу при 95 об/мин в СО инкубатор на 37°С. Через 24 часа клетки формировали в суспензии округлые агрегаты, а среда заменялась на S5 без ROCK ингибитора: Состав среды S5 (в течение 4 дней, меняется каждый день): DMEM+2 MMGlutamax+1,5 г/л NaHCO3+2% BSA+20 мМ глюкоза+1: 200 ITS-X+10 мкг/мл гепарин (Н3149, Sigma-Aldrich)+0,25 мкМ SANT1+0.05 мкМ RA+100 nM LDN+10 мкМ ALK5inhII (S7233, Selleckchem)+1 мкМ GC1 высокоаффинный агонист альфа- и бета-рецепторов гормона щитовидной железы (4554, Tocris)+10 мкМ ZincSulfate (Z0251, Sigma-Aldrich)+20 нг/мл Betacellulin (100-50, Peprotech)+100 н MGSi ингибитор γ-секретазы XX (565789, Millipore).
Стадия созревания эндокринных предшественников (14 дней, смена среды через день). Состав среды: DMEM+2 MMGlutamax+1.5 г/л NaHCO3+2% BSA+20 мМ глюкоза+1:200 ITS-X+10 мг/мл гепарин+100 нМ LDN+10 мкМ ALK5inhII+1 мкМ GC1+100 нMGSi+10 ZincSulfate.
Стадия получения зрелых бета-клеток (7 дней, смена среды через 2 дня). Состав среды: DMEM+2 MMGlutamax+1.5 г/л NaHCO3+2% BSA+20 мМ глюкоза+1:200 ITS-X+10 мг/мл гепарин+10 мкМ ALK5inhII+1 мкМ GC1+10 мкМ Trolox+1 мкМ N-Acetylcysteine (А9165, Sigma-Aldrich).
В результате, с использованием как протокола №3, так и протокола №4 были получены эндокринные предшественники поджелудочной железы на основе дифференцированных ранее панкреатических предшественников.
На основании проведенного анализа нами было сформировано и использовано два протокола дифференцировки.
В результате, с использованием как протокола №3, так и протокола №4 были получены эндокринные предшественники поджелудочной железы на основе дифференцированных ранее панкреатических предшественников.
Промышленная применимость
Предложенное изобретение обеспечивает получение инсулин-секретирующих клеток энтодермы поджелудочной железы методом дифференцировки эпигенетическирепрограммированных соматических клеток или других плюрипотентных стволовых клеток человека. На некоторых этапах получения происходит генетическая индукция дифференцировки. Представленные примеры и протоколы позволяют полностью воспроизвести все этапы получения инсулин-секретирующих клеток энтодермы поджелудочной железы.
Источники информации
1. J. Thomson et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. 1998 Science, Nov 6;282(5391): 1145-7.
2. N. Strelchenko et al. Morula-derived human embryonic stem cells. Reproductive BioMedicine Online, Volume 9, Issue 6, 2004, Pages 623-629
3. A. Fekiet al. Derivation of human embryonic stem cell lines from single cells of 4-cell stage embryos: Be aware of the risks. Cell. 2008 Apr 18; 133(2): 250-264.
4. S. Gavrilov et al. Alternative Strategies for the Derivation of Human Embryonic Stem Cell Lines and the Role of Dead Embryos.2009, Current Stem Cell Research & Therapy 4(1):81-6
5. I. Klimanskaya et al. Human embryonic stem cell lines derived from single blastomeres.Nature volume 444, pages481-485(2006).
6. J. Hanna et al. Direct Reprogramming of Terminally Differentiated Mature В Lymphocytes To Pluripotency. Cell. 2008 Apr 18; 133(2): 250-264.
7. J. Kim et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature, 2008 Jul 31;454(7204):646-50.
8. M.B. Шутова и др. Получение и характеристика клеток человека с индуцированнойплюрипотентностью. ActaNaturae, 2009, vol 2 рр 104-106.
9. J. Liao et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell doi:10.1016/j.stem.2008.11.013 (2008).
10. Z.Wu et al. Generation of pig induced pluripotent stem cells with a drug-inducible system. J Mol Cell Biol.2009 Oct;l(l):46-54.
11. B. Hering et al. Phase 3 Trial of Transplantation of Human Islets in Type 1 Diabetes Complicated by Severe Hypoglycemia. Diabetes Care. 2016 Jul; 39(7): 1230-1240.
12. M. Rickels et al. Long-Term Improvement in Glucose Control and Counterregulation by Islet Transplantation for Type 1 Diabetes.The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, Volume 101, Issue 11, 1 November 2016, Pages 4421-4430.
13. Y. Ishino et al. History of CRISPR-Cas from Encounter with a Mysterious Repeated Sequence to Genome Editing Technology. J Bacteriol. 2018 Apr 1; 200(7): e00580-17.
14. A. Bolotinet al.Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin. Microbiology, 2005 Aug;151(Pt 8):2551-2561.
15. K. Makarova et al. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action.Biol Direct, 2006, Mar 16; 1:7.
16. R. Barrangouet al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science, 2007 Mar 23;315(5819):1709-12.
17. А. Резани Патент РФ RU2528861 Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток (20.09.2014).
18. Сюй Джин Патент РФ RU 2701335 Способ получения популяции панкреатических эндокринных клеток, соэкспрессирующих nkx6.1 и инсулин, и способ лечения диабета (25.09.2019).
19. Сюй Джин Патент РФ RU 2587634 Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека (20.06.2016).
20. Сюй Джин Патент РФ RU 2663339 Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека (03.08.2018).
21. Резаниа А. Патент РФ RU 2664226 Дифференцирование человеческой эмбриональной стволовой клетки в линию панкреатических эндокринных клеток (15.08.2018).
--->
Перечень последовательностей
<110> Общество с ограниченной ответственностью "ВитаМед"
<120> Способ получения инсулин-секретирующих клеток
<160> 10
<210> 1
<211> 20
<212> праймер
<213> искусственная последовательность
<400> 1
gttccаgaac ctgctctgcg                                                 20
<210> 2
<211> 20
<212> праймер
<213> искусственная последовательность
<400> 2
caggttctgg aacagcggcg                                                 20
<210> 3
<211> 20
<212> праймер
<213> искусственная последовательность
<400> 3
сagagcaggt tctggaacag                                                 20
<210> 4
<211> 201
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<223> нуклеотидная последовательность гена SNV: chr11:2,181,258 C/T
(rs797045623)
<400> 4
ccagggccaa gggctgcagg ctgcctgcac cagggccccc gcccagctcc acctgcccca     60
ctgccaggac gtgccgcgca gagcaggttc cggaacagcg gcgaggcaga gggacacagg    120
aggacacagt cagggagaca cagtgcccgc ctgcccgcca gccctaggtc gcactcccac    180
ccatctccag ccgggctgga c                                              201
<210> 5
<211> 93
<212> нуклеотидная последовательность
<213> искусственная последовательность
<223> олигонуклеотид
<400> 5
tcctgtgtcc ctctgcctcg ccgctgttcc ggaacctgct ctgcgcggca cgtcctggca     60
gtcgggcagg tggagctggg cgggggccct ggt                                  93
<210> 6
<211> 92
<212> нуклеотидная последовательность
<213> искусственная последовательность
<223> олигонуклеотид
<400> 6
gctattggct cctgtgtccc tctgcctcgc cgctgttccg gaacctgctc tgcgcggcac     60
gtcctggcag tcgggcaggt ggagctgggc gg                                   92
<210> 7
<211> 100
<212> нуклеотидная последовательность
<213> искусственная последовательность
<223> олигонуклеотид
<400> 7
cctctgcctc gccgctgttc cggaacctgc tctgcgcggc acgtcctggc agtcgggcag     60
gtggagctgg gcgggggccc tggtgtaaac tctggggact                          100
<210> 8
<211> 879
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<223> фрагмент кДНК гена PDX1 человека
<400> 8
ccgcagccat gaacggcgag gagcagtact acgcggccac gcagctttac aaggacccat     60
gcgcgttcca gcgaggcccg gcgccggagt tcagcgccag cccccctgcg tgcctgtaca    120
tgggccgcca gcccccgccg ccgccgccgc acccgttccc tggcgccctg ggcgcgctgg    180
agcagggcag ccccccggac atctccccgt acgaggtgcc ccccctcgcc gacgaccccg    240
cggtggcgca ccttcaccac cacctcccgg ctcagctcgc gctcccccac ccgcccgccg    300
ggcccttccc ggagggagcc gagccgggcg tcctggagga gcccaaccgc gtccagctgc    360
ctttcccatg gatgaagtct accaaagctc acgcgtggaa aggccagtgg gcaggcggcg    420
cctacgctgc ggagccggag gagaacaagc ggacgcgcac ggcctacacg cgcgcacagc    480
tgctagagct ggagaaggag ttcctattca acaagtacat ctcacggccg cgccgggtgg    540
agctggctgt catgttgaac ttgaccgaga gacacatcaa gatctggttc caaaaccgcc    600
gcatgaagtg gaaaaaggag gaggacaaga agcgcggcgg cgggacagct gtcgggggtg    660
gcggggtcgc ggagcctgag caggactgcg ccgtgacctc cggcgaggag cttctggcgc    720
tgccgccgcc gccgcccccc ggaggtgctg tgccgcccgc tgcccccgtt gccgcccgag    780
agggccgcct gccgcctggc cttagcgcgt cgccacagcc ctccagcgtc gcgcctcggc    840
ggccgcagga accacgatga gaggcaggag ctgctcctg                           879
<210> 9
<211> 7287
<212> плазмидная ДНК
<213> искусственная последовательность
<223> лентивирусный вектор с геном PDX1 человека под контролем CMV промотора
<400> 9
gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat    60
acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg    120
aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc    180
attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga    240
tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga    300
gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg    360
cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc    420
tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac    480
agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact    540
tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca    600
tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg    660
tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact    720
acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg    780
accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg    840
tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat    900
cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc    960
tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat   1020
actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt   1080
tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc   1140
cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt   1200
gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac   1260
tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt   1320
gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct   1380
gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga   1440
ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac   1500
acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg   1560
agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt   1620
cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc   1680
tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg   1740
gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc   1800
ttttgctcac atgctgctag agattttcca cactgactaa aagggtctga gggatctcta   1860
gttaccagag tcacacaaca gacgggcaca cactacttga agcactcaag gcaagcttta   1920
ttgaggctta agcagtgggt tccctagtta gccagagagc tcccaggctc agatctggtc   1980
taaccagaga gacccagtac agtccggatg cagctctcgg gccatgtgat gaaatgctag   2040
gcggctgtca aacctccact ctaatacttc tctctccggg tcatccatcc catgcaggct   2100
cacagggtgt aacaagcggg tgttctctcc ttcattggct tcttctacct tctcttgctc   2160
aactggtact agcttgtagc accatccaaa ggtcagtgga tatctgatcc ctggccctgg   2220
tgtgtagttc tgccaatcag ggaagtagcc ttgtgtgtgg tagatccaca gatcaaggat   2280
atcttgtctt cgttgggagt gaattagccc ttccagtccc cccttttctt ttaaaaagtg   2340
gctaagatct acagctgcct tgtaagtcat tggtcttaaa ggtacctgag gtgtgactgg   2400
aaaacccacc tcctcctcct cttgtgcttc tagccaggca caatcagcat tggtagctgc   2460
tgtattgcta cttgtgattg ctccatgttt ttctaggtct cgatcgaggt cgacggtatc   2520
gatgcgggga ggcggcccaa agggagatcc gactcgtctg agggcgaagg cgaagacgcg   2580
gaagaggccg cagagccggc agcaggccgc gggaaggaag gtccgctgga ttgagggccg   2640
aagggacgta gcagaaggac gtcccgcgca gaatccaggt ggcaacacag gcgagcagcc   2700
aaggaaagga cgatgatttc cccgacaaca ccacggaatt gtcagtgccc aacagccgag   2760
cccctgtcca gcagcgggca aggcaggcgg cgatgagttc cgccgtggca atagggaggg   2820
ggaaagcgaa agtcccggaa aggagctgac aggtggtggc aatgccccaa ccagtggggg   2880
ttgcgtcagc aaacacagtg cacaccacgc cacgttgcct gacaacgggc cacaactcct   2940
cataaagaga cagcaaccag gatttataca aggaggagaa aatgaaagcc atacgggaag   3000
caatagcatg atacaaaggc attaaagcag cgtatccaca tagcgtaaaa ggagcaacat   3060
agttaagaat accagtcaat ctttcacaaa ttttgtaatc cagaggttga ttatcgataa   3120
gcttgatatc gaattgtacc tagtggaacc ggaaccctta aacatgtata acttcgtata   3180
atgtatgcta tacgaagtta ttaggtccct cgacgaattc caggagcagc tcctgcctct   3240
catcgtggtt cctgcggccg ccgaggcgcg acgctggagg gctgtggcga cgcgctaagg   3300
ccaggcggca ggcggccctc tcgggcggca acgggggcag cgggcggcac agcacctccg   3360
gggggcggcg gcggcggcag cgccagaagc tcctcgccgg aggtcacggc gcagtcctgc   3420
tcaggctccg cgaccccgcc acccccgaca gctgtcccgc cgccgcgctt cttgtcctcc   3480
tcctttttcc acttcatgcg gcggttttgg aaccagatct tgatgtgtct ctcggtcaag   3540
ttcaacatga cagccagctc cacccggcgc ggccgtgaga tgtacttgtt gaataggaac   3600
tccttctcca gctctagcag ctgtgcgcgc gtgtaggccg tgcgcgtccg cttgttctcc   3660
tccggctccg cagcgtaggc gccgcctgcc cactggcctt tccacgcgtg agctttggta   3720
gacttcatcc atgggaaagg cagctggacg cggttgggct cctccaggac gcccggctcg   3780
gctccctccg ggaagggccc ggcgggcggg tgggggagcg cgagctgagc cgggaggtgg   3840
tggtgaaggt gcgccaccgc ggggtcgtcg gcgagggggg gcacctcgta cggggagatg   3900
tccggggggc tgccctgctc cagcgcgccc agggcgccag ggaacgggtg cggcggcggc   3960
ggcgggggct ggcggcccat gtacaggcac gcaggggggc tggcgctgaa ctccggcgcc   4020
gggcctcgct ggaacgcgca tgggtccttg taaagctgcg tggccgcgta gtactgctcc   4080
tcgccgttca tggctgcggg gatccgggcg actcagagct ctgcttatat agacctccca   4140
ccgtacacgc ctaccgccca tttgcgtcaa tggggcggag ttgttacgac attttggaaa   4200
gtcccgttga ttttggtgcc aaaacaaact cccattgacg tcaatggggt ggagacttgg   4260
aaatccccgt gagtcaaacc gctatccacg cccattgatg tactgccaaa accgcatcac   4320
tgttcttggc ctcgggccgg ggccgaaact gcggtgacca tctgttcttg gccccgggcc   4380
ggggccgaaa ctgctcaccg cagatatcct gtttggccca acgttagcta ttttcatgta   4440
cccgcccttg atctgaactt ctctattctt ggtttggtat ttttccatgc cttgcaaaat   4500
ggcgttactg cagctagctt gccaaaccta caggtggggt ctttcagcgg ccgcttaagc   4560
ttggaaccct taatataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatta ggtccctcga   4620
cctgctggaa tctcgtgaag cgagcttatc gataccgtcg acctcgacta gagcgggccc   4680
ggtactaacc aaactggatc tctgctgtcc ctgtaataaa cccgaaaatt ttgaattttt   4740
gtaatttgtt tttgtaattc tttagtttgt atgtctgttg ctattatgtc tactattctt   4800
tcccctgcac tgtacccccc aatcccccct tttcttttaa aattgtggat gaatactgcc   4860
atttgtctgc agaattggcg cacgcagtgc cgatccgttc actaatcgaa tggatctgtc   4920
tctgtctctc tctccacctt cttcttctat tccttcgggc ctgtcgggtc ccctcggggt   4980
tgggaggtgg gtctgaaacg ataatggtga atatccctgc ctaactctat tcactataga   5040
aagtacagca aaaactattc ttaaacctac caagcctcct actatcatta tgaataattt   5100
tatataccac agccaatttg ttatgttaaa ccaattccac aaacttgccc atttatctaa   5160
ttccaataat tcttgttcat tcttttcttg ctggttttgc gattcttcaa ttaaggagtg   5220
tattaagctt gtgtaattgt taatttctct gtcccactcc atccaggtcg tgtgattcca   5280
aatctgttcc agagatttat tactccaact agcattccaa ggcacagcag tggtgcaaat   5340
gagttttcca gagcaacccc aaatccccag gagctgttga tcctttaggt atctttccac   5400
agccaggatt cttgcctgga gctgcttgat gccccagact gtgagttgca acagatgctg   5460
ttgcgcctca atagccctca gcaaattgtt ctgctgctgc actataccag acaataattg   5520
tctggcctgt accgtcagcg tcattgacgc tgcgcccata gtgcttcctg ctgctcccaa   5580
gaacccaagg aacaaagctc ctattcccac tgctcttttt tctctctgca ccactcttct   5640
ctttgccttg gtgggtgcta ctcctaatgg ttcaattttt actactttat atttatataa   5700
ttcacttctc caattgtccc tcatatctcc tcctccaggt ctgaagatca gcgcggccgg   5760
ccgcttgctg tgcggtggtc ttacttttgt tttgctcttc ctctatcttg tctaaagctt   5820
ccttggtgtc ttttatctct atcctttgat gcacacaata gagggttgct actgtattat   5880
ataatgatct aagttcttct gatcctgtct gaagggatgg ttgtagctgt cccagtattt   5940
gtctacagcc ttctgatgtt tctaacaggc caggattaac tgcgaatcgt tctagctccc   6000
tgcttgccca tactatatgt tttaatttat attttttctt tccccctggc cttaaccgaa   6060
ttttttccca tcgcgatcta attctccccc gcttaatact gacgctctcg cacccatctc   6120
tctccttcta gcctccgcta gtcaaaattt ttggcgtact caccagtcgc cgcccctcgc   6180
ctcttgccgt gcgcgcttca gcaagccgag tcctgcgtcg agagagctcc tctggtttcc   6240
ctttcgcttt caagtccctg ttcgggcgcc actgctagag attttccaca ctgactaaaa   6300
gggtctgagg gatctctagt taccagagtc acacaacaga cgggcacaca ctacttgaag   6360
cactcaaggc aagctttatt gaggcttaag cagtgggttc cctagttagc cagagagctc   6420
ccaggctcag atctggtcta accagagaga cccagtacag gcaaaacgcg ctgcttatat   6480
agacctccca ccgtacacgc ctaccgccca tttgcgtcaa tggggcggag ttgttacgac   6540
attttggaaa gtcccgttga ttttggtgcc aaaacaaact cccattgacg tcaatggggt   6600
ggagacttgg aaatccccgt gagtcaaacc gctatccacg cccattgatg tactgccaaa   6660
accgcatcac catggtaata gcgatgacta atacgtagat gtactgccaa gtaggaaagt   6720
cccataaggt catgtactgg gcataatgcc aggcgggcca tttaccgtca ttgacgtcaa   6780
tagggggcgt acttggcata tgatacactt gatgtactgc caagtgggca gtttaccgta   6840
aatactccac ccattgacgt caatggaaag tccctattgg cgttactatg ggaacatacg   6900
tcattattga cgtcaatggg cgggggtcgt tgggcggtca gccaggcggg ccatttaccg   6960
taagttatgt aacgcggaac tccatatatg ggctatgaac taatgacccc gtaattgatt   7020
actattaata actagtcaat aatcaatgtc aacgcgtata tctggcccgt acatcgcgaa   7080
gcagcgcaaa acgcctaacc ctaagcagat tcttcatgca attgtcggtc aagccttgcc   7140
ttgttgtagc ttaaattttg ctcgcgcact actcagcgac ctccaacaca caagcaggga   7200
gcagatactg gcttaactat gcggcatcag agcagattgt actgagagtg caccataggg   7260
gatcgggaga tctcccgatc cgtcgac                                       7287
<210> 10
<211> 7271
<212> плазмидная ДНК
<213> искусственная последовательность
<223> лентивирусный вектор с геном PDX1 человека под контролем EF1a промотора
<400> 10
gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg     60
atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt    120
gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc    180
tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac    240
attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat    300
atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg    360
acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt    420
tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag    480
tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc    540
attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag    600
tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt    660
ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc    720
accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg    780
gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct    840
ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt    900
aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac    960
tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc   1020
gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc   1080
ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa   1140
ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg   1200
ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata   1260
aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc   1320
tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga   1380
caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc   1440
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca   1500
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg gccgcgctga tcttcagacc tggaggagga   1560
gatatgaggg acaattggag aagtgaatta tataaatata aagtagtaaa aattgaacca   1620
ttaggagtag cacccaccaa ggcaaagaga agagtggtgc agagagaaaa aagagcagtg   1680
ggaataggag ctttgttcct tgggttcttg ggagcagcag gaagcactat gggcgcagcg   1740
tcaatgacgc tgacggtaca ggccagacaa ttattgtctg gtatagtgca gcagcagaac   1800
aatttgctga gggctattga ggcgcaacag catctgttgc aactcacagt ctggggcatc   1860
aagcagctcc aggcaagaat cctggctgtg gaaagatacc taaaggatca acagctcctg   1920
gggatttggg gttgctctgg aaaactcatt tgcaccactg ctgtgccttg gaatgctagt   1980
tggagtaata aatctctgga acagatttgg aatcacacga cctggatgga gtgggacaga   2040
gaaattaaca attacacaag cttaatacac tccttaattg aagaatcgca aaaccagcaa   2100
gaaaagaatg aacaagaatt attggaatta gataaatggg caagtttgtg gaattggttt   2160
aacataacaa attggctgtg gtatataaaa ttattcataa tgatagtagg aggcttggta   2220
ggtttaagaa tagtttttgc tgtactttct atagtgaata gagttaggca gggatattca   2280
ccattatcgt ttcagaccca cctcccaacc ccgaggggac ccgacaggcc cgaaggaata   2340
gaagaagaag gtggagagag agacagagac agatccattc gattagtgaa cggatcggca   2400
ctgcgtgcgc caattctgca gacaaatggc agtattcatc cacaatttta aaagaaaagg   2460
ggggattggg gggtacagtg caggggaaag aatagtagac ataatagcaa cagacataca   2520
aactaaagaa ttacaaaaac aaattacaaa aattcaaaat tttcgggttt attacaggga   2580
cagcagagat ccagtttggt tagtaccggg cccgctctag tcgaggtcga cggtatcgat   2640
aagctcgctt cacgagattc cagcaggtcg agggacctaa taacttcgta tagcatacat   2700
tatacgaagt tatattaagg gttccaagct taagcggccg ctgaaagacc ccacctgtag   2760
gtttggcaag ctagctgcag taacgccatt ttgcaaggca tggaaaaata ccaaaccaag   2820
aatagagaag ttcagatcaa gggcgggtac atgaaaatag ctaacgttgg gccaaacagg   2880
atatctgcgg tgagcagttt cggccccggc ccggggccaa gaacagctcc ggtgcccgtc   2940
agtgggcaga gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt   3000
gaaccggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc   3060
tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg   3120
ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacagctgag tcgcccggat ccccgcagcc   3180
atgaacggcg aggagcagta ctacgcggcc acgcagcttt acaaggaccc atgcgcgttc   3240
cagcgaggcc cggcgccgga gttcagcgcc agcccccctg cgtgcctgta catgggccgc   3300
cagcccccgc cgccgccgcc gcacccgttc cctggcgccc tgggcgcgct ggagcagggc   3360
agccccccgg acatctcccc gtacgaggtg ccccccctcg ccgacgaccc cgcggtggcg   3420
caccttcacc accacctccc ggctcagctc gcgctccccc acccgcccgc cgggcccttc   3480
ccggagggag ccgagccggg cgtcctggag gagcccaacc gcgtccagct gcctttccca   3540
tggatgaagt ctaccaaagc tcacgcgtgg aaaggccagt gggcaggcgg cgcctacgct   3600
gcggagccgg aggagaacaa gcggacgcgc acggcctaca cgcgcgcaca gctgctagag   3660
ctggagaagg agttcctatt caacaagtac atctcacggc cgcgccgggt ggagctggct   3720
gtcatgttga acttgaccga gagacacatc aagatctggt tccaaaaccg ccgcatgaag   3780
tggaaaaagg aggaggacaa gaagcgcggc ggcgggacag ctgtcggggg tggcggggtc   3840
gcggagcctg agcaggactg cgccgtgacc tccggcgagg agcttctggc gctgccgccg   3900
ccgccgcccc ccggaggtgc tgtgccgccc gctgcccccg ttgccgcccg agagggccgc   3960
ctgccgcctg gccttagcgc gtcgccacag ccctccagcg tcgcgcctcg gcggccgcag   4020
gaaccacgat gagaggcagg agctgctcct ggaattcgtc gagggaccta ataacttcgt   4080
atagcataca ttatacgaag ttatacatgt ttaagggttc cggttccact aggtacaatt   4140
cgatatcaag cttatcgata atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg   4200
tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta   4260
tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct   4320
gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt   4380
tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac   4440
tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg   4500
ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc   4560
gtcctttcct tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg   4620
ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct   4680
gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc   4740
ctccccgcat cgataccgtc gacctcgatc gagacctaga aaaacatgga gcaatcacaa   4800
gtagcaatac agcagctacc aatgctgatt gtgcctggct agaagcacaa gaggaggagg   4860
aggtgggttt tccagtcaca cctcaggtac ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg   4920
tagatcttag ccacttttta aaagaaaagg ggggactgga agggctaatt cactcccaac   4980
gaagacaaga tatccttgat ctgtggatct accacacaca aggctacttc cctgattggc   5040
agaactacac accagggcca gggatcagat atccactgac ctttggatgg tgctacaagc   5100
tagtaccagt tgagcaagag aaggtagaag aagccaatga aggagagaac acccgcttgt   5160
tacaccctgt gagcctgcat gggatggatg acccggagag agaagtatta gagtggaggt   5220
ttgacagccg cctagcattt catcacatgg cccgagagct gcatccggac tgtactgggt   5280
ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg ctaactaggg aacccactgc   5340
ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg   5400
actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagca   5460
tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt   5520
tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc   5580
gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct   5640
ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg   5700
tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca   5760
agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact   5820
atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta   5880
acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta   5940
actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct   6000
tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt   6060
tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga   6120
tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca   6180
tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat   6240
caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg   6300
cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt   6360
agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag   6420
acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc   6480
gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag   6540
ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca   6600
tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa   6660
ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga   6720
tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata   6780
attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca   6840
agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg   6900
ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg   6960
ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg   7020
cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag   7080
gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac   7140
tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca   7200
tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag   7260
tgccacctga c                                                        7271
<---