Выявление венгерского пандемического клона mrsa в России

Выявление венгерского пандемического клона MRSA в России

О.Е. Хохлова1,2, Вей-Чун Хунг4, В. Хигучи4, Т. Такано4, О.В. Перьянова1,2, А.Б. Салмина3, Т. Ямамото2,4

1 Кафедра микробиологии Красноярского государственного медицинского университета им. В.Ф. Войно-Ясенецкого (КрасГМУ), Красноярск, Россия

2 Российско-Японский центр микробиологии, эпидемиологии и инфекционных болезней, Красноярск, Россия

3 Отдел международных отношений КрасГМУ, Красноярск, Россия

4 Отделение бактериологии, кафедра контроля инфекционных болезней и международной медицины Медицинского Университета, Ниигата, Япония

Начиная с 1961 г., пандемические клоны мети-циллинорезистентных штаммов Staphylococcus aureus распространились во всем мире, вызывая тяжелые нозокомиальные инфекции. Венгерский клон с генотипом ST 239 и стафилококковой хромосомной кассетой mec (Staphylococcal cassette chromosome mec-SCCmec) III типа принадлежит к таким распространенным во всем мире клонам и является преобладающим в России. В данном исследовании предложен метод быстрого скрининга венгерского клона при помощи мультиплексной полимеразной цепной реакции (М-ПЦР). Результаты ПЦР показали, что среди десяти основных пандемических клонов MRSA только венгерский клон имеет уникальную комбинацию генов стафилококковых энтеротокси-нов (SE) - sea, sek и seq (что может ассоциироваться с высокой степенью тяжести инфекции и

иммунодепрессии) и гена адгезии - can (коллаген - адгезин). Основываясь на изучении генов вирулентности, созданы праймеры для М-ПЦР, необходимые для обнаружения генов sea, seq и can. В М-ПЦР также использовали праймеры для обнаружения mecA гена с целью дифференциации MRSA от MSSA и специфического для S. aureus термостабильного гена нуклеа-зы - nuc для дифференциации MRSA и MSSA от коагулазонегативных стафилококков (CNS). В результате М-ПЦР позволила быстро и точно дифференцировать венгерский клон MRSA из России.

Ключевые слова: Staphylococcus aureus, венгерский клон MRSA, гены вирулентности, мультиплексная полимеразная цепная реакция (М-ПЦР).

Контактный адрес: Ольга Евгеньевна Хохлова

660022 г. Красноярск, ул. Партизана Железняка, д.1.

Кафедра микробиологии КрасГМУ

Тел.: (391) 2201361

Эл. почта: khokhlovaol@mail.ru

Detection of Hungarian Pandemic MRSA Clone in Russia

O.E. Khokhlova1,2, Wei-Chun Hung3, W. Higuchi3, T. Takano3, O.V. Peryanova1,2, A.B. Salmina 1, T. Yamamoto2,3

1 Krasnoyarsk State Medical University named after professor V.F. Voyno-Yasenetsky, Krasnoyarsk, Russia

2 Russia-Japan Center of Microbiology, Epidemiology and Infectious Diseases, Krasnoyarsk, Russia

3 Division of Bacteriology, Department of Infectious Disease Control and International Medicine, Niigata University Graduate School of Medical and Dental Sciences, Niigata, Japan

Since 1961, pandemic methicillin-resistant S. aureus (MRSA) clones causing severe nosocomial infections have been distributed worldwide. The Hungarian clone having ST239 genotype and Staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec) type III is one of the common epidemic clones and prevalent in Russia. The rapid screening assay for Hungarian ST239-III clone using multiplex polymerase chain reaction (PCR) was proposed in this study. The PCR assay showed that the only Hungarian clone (of 10 common pandemic MRSA clones) carries a unique set of genes encoding staphylococcal enterotox-ins (SE) - sea, sek and seq (it may result in severe infec-

tion and immunosupression) and can (collagen-adhesin) gene. Specific primers and probes for three virulence genes (sea, seq, can) were designed for multiplex PCR. Primers for mecA gene (to distinguish between MRSA and MSSA) and S. aureus-specific nuclease gene nuc (to distinguish between MRSA/MSSA and coagulase-nega-tive staphylococci) were also used. This multiplex PCR assay rapidly and accurately detected Hungarian clone from Russia.

Key words: Staphylococcus aureus, MRSA, Hungarian clone, virulence genes, multiplex PCR.

Метициллинорезистентные штаммы S. aureus (MRSA) были выделены в 1960-х годах и стали одними из основных возбудителей нозокомиаль-ных инфекций [1]. Ограниченное число подобных клонов MRSA распространились во всем мире как пандемические клоны [2, 3], включая Венгерский тип ST 239 и SCCmec тип III, который является основным MRSA клоном в России, так же как и в некоторых других европейских и азиатских странах

[4].

Для точного определения генотипа MRSA клонов необходимо проводить генотипирование (например, ST-типирование), что требует много времени и является дорогостоящим. В данной работе предложено использовать мультиплексную ПЦР (М-ПЦР) для выявления пяти генов, с целью быстрого скрининга венгерского пандемического клона MRSA.

Материал и методы исследования_

В работе использовали девять пандемических MRSA клонов, включая нью-йоркский/японский клон (ST5/SCCmecII), педиатрический клон (ST5/SCCmecIV или IVa), EMRSA-15 (ST22/ SCCmecIV), EMRSA-16 (ST36/SCCmecII), берлинский клон (ST45/SCCmecIVa), венгерский клон (ST239/SCCmecIII), бразильский клон (ST239/SCCmecIIIA), иберийский клон (ST247/ SCCmecIA) и архаический клон (ST250/SCCmecI). Они были любезно предоставлены H. de Lencastre (Университет Рокфеллера, США). Клинические

штаммы MRSA из России являются частью лабораторной коллекции Университета г. Ниигата (Япония). Также использовался MSSA штамм ATCC 29213. Устойчивые к метициллину штаммы S. epidermidis (MRSE) KE1 и S. epidermidis ATCC 14990 были использованы как коагулазонегативные (CNS).

Для культивирования бактерий использовали бульон LB (Difco, Детройт, MI). Посевы инкубировали при температуре 37 °C до фазы логарифмического роста. В качестве плотной питательной среды использовали питательный агар (Eiken Chemical, Токио).

ПЦР исследование 18 генов стафилококковых энтеротоксинов (SE) - tst (токсин синдрома токсического шока 1), sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, sej, sek, sel, sem, sen, seo, sep, seq, seu, 2 генов адгезии cna (коллагеновый адгезин) и bbp гена (адгезин костного сиалопротеина) было проведено с использованием праймеров, представленных в табл. 1 [5, 6]. В данном ПЦР исследовании гены адгезии cna и bbp были выбраны, потому что только некоторые клоны MRSA несут в себе эти гены [5].

Праймеры, используемые в М-ПЦР, представлены в табл. 1. Праймеры для выявления генов энте-ротоксинов sea и seq были разработаны на основе изучения последовательностей генома MW2 (банк генов, № NC-003923) и USA300 (банк генов, № NC-007793) соответственно. Праймеры для выявления генов cna, bbp и mecA были разработаны на основе

Таблица 1. Праймеры, использованные для проведения ПЦР и М-ПЦР

Изучаемые гены Праймеры Нуклеотидная последовательность Размер продукта ПЦР, пн

1 2 3 4

Полимеразная цепная реакция

Стафилококковые энтеротоксины

tst TST-3 5'-AAGCCCTTTGTTGCTTGCG 445

TST-6 5'-ATCGAACTTTGGCCCATACTTT

sea SEA-3 5'-CCT TTGGAAACGGTTAAAACG 127

SEA-4 5'-TCTGAACCTTCCCATCAAAAAC

seb SEB-1 5'-TCGCATCAAACTGACAAACG 477

SEB-4 5'-GCAGGTACTCTATAAGTGCCTGC

sec SEC-3 5'-CTCAAGAACTAGACATAAAAGCTAGG 271

SEC-4 5'-TCAAAATCGGATTAACATTATCC

sed SED-3 5'-CTAGTTTGGTAATATCTCCTTTAAACG 319

SED-4 5'-TTAATGCTATATCTTATAGGGTAAACATC

see SEE-3 5'-CAGTACCTATAGATAAAGTTAAAACAAGC 178

SEE-2 5'-TAACTTACCGTGGACCCTTC

seg SEG-1 5'-AATTATGTGAATGCTCAACCCGATC 642

SEG-2 5'-AACTTATATGGAACAAAAGGTACTAGTTC

seh SEH-1 5'-CAATCACATCATATGCGAAAGCAG 376

SEH-2 5'-CATCTACCCAAACATTAGCACC

sei SEI-1 5'-CTCAAGGTGATATTGGTGTAGG 576

SEI-2 5'-AAAAAACTTACAGGCAGTCCATCTC

sej ZDR 5'-GAGCTCTCAATAAATTTGAGCACC 1731

ZID 5'-TCTAGAATAGTAGGTTCTGCTCTT

sek sek-F 5'-GGTGTCTCTAATAGTGCCAG 284

sek-R 5'-TCGTTAGTAGCTGTGACTCC

sel sel-F 5'-ATCAATGGCAAGCATCAAACAG 264

sel-R 5'-TGGAAGACCGTATCCTGTG

sem mpSEM-1 5'-CTATTAATCTTTGGGTTAATGGAGAAC 300

mpSEM-2 5'-TTCAGTTTCGACAGTTTTGTTGTCAT

sen mpSEN-1 5'-ATGAGATTGTTCTACATAGCTGCAAT 680

mpSEN-2 5'-AACTCTGCTCCCACTGAAC

seo mpSEO-1 5'-AGTTTGTGTAAGAAGTCAAGTGTAGA 180

mpSEO-2 5'- ATCTTTAAATTCAGCAGATATTCCATCTAAC

sep sep-F 5'-CTGAATTGCAGGGAACTGCT 187

sep-R 5'-CAAGTTTTCTGTGGCGGTTA

seq seq-F 5'-TCTAGCATATGCTGATGTAGG 383

seq-R 5'-CAATCTCTTGAGCAGTTAC(C/T)TC

seu PSE2 5'-TAAAATAAATGGCTCTAAAATTGATGG 790

PSE4 5'-CGTCTAATTGCCACGTTATATCAGT

Продолжение табл. 1 на с.

1 2 3 4

Адгезины

cna cnaF 5'-GTCAAGCAGTTATTAACACCAGAC 423

cnaF 5'-AATCAGTAATTGCACTTTGTCCACTG

bbp bbpF 5'-AACTACATCTAGTACTCAACAACAG 575

bbpR 5'-ATGTGCTTGAATAACACCATCATCT

Мультиплексная ПЦР

cna cna-QF1 5'-GGGAATAAATCAACGAATGTTACGG 461

cna-QR1 5'-ACTTCTTCCTTACCATGCTCTTG

sea sea-F1 5'-CTTGTAAATGGTAGCGAGAA 373

sea-R1 5'-CGGTCAATCGATTATTATCATG

nuc nuc1 5'-GCGATTGATGGTGATACGGTT 279

nuc2 5'-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC

seq seq-F2 5'-CGCTTCAAGGAGTTAGTTCT 210

seq-R2 5'-CTAAATTTTGATTCGCCAAC

mecA mecA-QF2 5'-GGGATCATAGCGTCATTATTCC 141

mecA-QR2 5'-CGATGCCTATCTCATATGC

изучения последовательностей генома ST30, CA-MRSA штамма NN1 (банк генов, №№ AB266874, AB246401 и AB245470 соответственно). Праймеры для выявления гена nuc были необходимы для дифференциации MRSA и MSSA от CNS, как было описано ранее [7].

Режим амплификации для всех праймеров включал начальный цикл при 94 °C в течение 3 мин. Следующие этапы амлификации включали: денатурацию ДНК при 94 °C в течение 90 с, отжиг при 55 °C - 60 с, синтез - в течение 60 с при 72 °C (30 циклов) и завершающий цикл в течение 10 мин при 72 °C. Детекцию продуктов амплификации ПЦР проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с использованием этидия бромида. В качестве контроля молекулярной массы использовали 100 bp DNA ladder (Sigma-Aldrich Japan, Токио).

Мультилокусное секвенирование (MLST) было использовано для выявления принадлежности штаммов к определенной клональной группе на основании сравнения частичных нуклеотидных последовательностей 7 стафилококковых генов [8]. Аллельные профили исследованных штаммов сопоставляли с таковыми из международной базы данных (http://www.mlst.net/). Полученные данные были проанализированы с помощью программного обеспечения eBURST для определения принадлежности ST к определенному клональному комплексу (CC). Типы SCCmec (I-VIII) были определены с помощью ПЦР с использованием референтных штаммов [9, 10].

Результаты исследования и их обсуждение_

У референтных штаммов девяти пандемических клонов MRSA были изучены 18 генов энтеротокси-нов и два гена адгезии (cna и bbp) с помощью ПЦР (табл. 2). У венгерского клона выявлена уникальная комбинация четырех генов - sea, sek, seq и cna. Гены sek и seq были определены у архаичного и венгерского клонов. В то же время венгерские и бразильские клоны, принадлежащие к ST239, имеют различные наборы генов вирулентности. Бразильский клон имеет только ген cna.

Для специфической детекции венгерского MRSA клона с помощью М-ПЦР выявляли три гена - sea, seq и cna, что было связано с особенностями набора генов вирулентности. Определение гена mecA включено в исследование для дифференциации MRSA от MSSA и гена nuc для дифференциации MRSA (или MSSA) от коагулазонегативных стафилококков. Таким образом, если в М-ПЦР выявляли пять вышеназванных генов, то результаты оценивали как положительные, и исследуемый штамм относили к венгерскому клону MRSA; если выявляли 4 и менее генов, то результаты оценивали как отрицательные.

Результаты М-ПЦР, используемой для определения пяти генов, характерных для венгерского клона, приведены на рисунке (А, линия 3); размеры продуктов ПЦР составили: 461 bp для cna, 373 bp для sea, 279 bp для nuc, 210 bp для seq и 141 bp - для mecA. У других восьми пандемических клонов MRSA выявили четыре и меньше полос (см. рисунок A, линии 4-12). Штамм MSSA ATCC 29213 дал

Таблица 2. Характеристика пандемических клонов (штаммов) MRSA

<о Ко

. тг TT« «/тт тт Эпидемическим Эпидемиче- г

Архаиче- Иберии- Венгер- Ьразиль- Нью-иоркскии/ Педиатри- Педиатри- « Ьерлии-

^ „ ^ « ¿ ^ « ^ К К штамм скии штамм ^ „

Тип гена скии скии скии скии японскии ческии ческии шпол л г шпол лп скии

MRSAa-15

MRSA-16

Типы:

СС

ST

SCC тес

Стафилококковые энтеротоксины:

tst

sea

seb

sec

sed

see

seg

seh

sei

sej

sek

sel

sern

sen

seo

sep

seq

seu

Адгезины: ena

8

250 I

247 IA

239 III

8

239 III A

5 5 II

5 5 IVa

5 5

VI

22 22 IV

30 36 II

45 45 IVa

X

о *

Примечание: «+» - наличие гена, «-» - его отсутствие.

10 11 12

ШттШШЛЛ

спа

А

спа

Б

Результаты использования М-ПЦР для выявления пяти генов, характерных для венгерского пандемического клона MRSA.

только две полосы (sea и nuc), штамм MRSE KE1 - только одну полосу (mecA) и у штамма SE ATCC 14990 не обнаружено ни одной из полос (см. рисунок Б, линии 2-4).

По результатам М-ПЦР два штамма из России были отнесены к венгерскому клону (см. рисунок A, линии 1 и 2). Для более точной идентификации было проведено генотипирование этих двух штаммов: оба штамма принадлежали к группе ST239 (CCS) и типу SCCmecIII, что также свидетельствует об их принадлежности к венгерскому клону.

S. aureus, включая MRSA, остается одним из важнейших возбудителей инфекций кожи и мягких тканей (буллёзный импетиго, абсцессы, фурункулёз, раневые инфекции, «синдром ошпаренной кожи»); инфекций мочевыводящих путей; инвазивных инфекций (бактериемия, сепсис, остеомиелит, острый эндокардит, постстернотомичес-кий медиастинит, пневмония); токсинобусловлен-ные заболевания, такие как синдром токсического

шока (TSS) или экзантемическая болезнь новорожденных (NTED), пищевые токсикоинфекции [11, 12]. Традиционные факторы риска развития инфекций, вызванных MRSA, включают инвазивные медицинские манипуляции, иммунодефицитные состояния [13], пожилой возраст (65 и более лет), наличие в анамнезе MRSA-инфекций и бактерионосительство MRSA [14]. MRSA - причина генерализованных инфекций в лечебных учреждениях.

Инвазивные MRSA-инфекции являются жизнеугрожающими и во многих странах рассматриваются как серьезная проблема. Например, в США в 2005 г. насчитывалось 94360 таких больных, из них 18 650 летальных исходов [15].

В современных условиях нозо-комиальные инфекции, вызванные MRSA, ассоциированы с несколькими пандемическими клонами, включая нью-йоркский/японский, педиатрический, бразильский, венгерский, иберийский, EMRSA-15, EMRSA-16. Архаический клон считается родоначальником MRSA. Из перечисленных клонов бразильский (ST239: SCCmecIII/IIIA) распространен преимущественно в Южной Америке (Аргентина, Уругвай, Чили), в Европе (Португалия, Германия, Чехия) и в странах Азии. Венгерский клон (ST239:SCCmecIII) распространен в таких странах, как Тайвань, Китай, Индия, Польша и Норвегия [1, 4, 16]. Венгерский клон был выявлен в Венгрии в 1993 г. Данный клон был доминирующим в 1994-1998 гг., однако практически исчез в 2003-2004 гг. и в настоящее время вытеснен южным германским (ST228: SCCmecI) и нью-йоркским/японским (ST5:SCCmecII) клонами [4].

Для больных с MRSA-инфекциями быстрое определение данной инфекции и адекватный выбор терапии являются очень важными [13]. В данной работе предложено использовать М-ПЦР для быстрой детекции венгерского клона MRSA, который является доминирующим в России (неопубликованные данные). Для этого изучены гены вирулентности разных клонов MRSA и установлено, что комбинации четырех генов (sea, sek, seq, cna) или даже трех генов (sea, seq, cna) были специфическими для венгерского клона.

MRSA, продуцирующие энтеротоксин, кодируемый геном sea (в комбинации с sec-геном), вызывают синдром токсического шока [17], пищевые ток-сикоинфекции и антибиотикассоциированную диарею (в комбинации с LukE-D-генами) [18]. Кроме того, они вызывают такие тяжелые инфекции, как септический шок или инвазивные инфекции [19]. Два других гена энтеротоксина (sek и seq) входят в состав островков патогенности SaPI3 [20] и SaPI5, характерных для ST8 MRSA-клона (USA300) [21], а также в геном бактериофага <Sa3mw [MW2] клона MRSA ST1 (USA400) [22]. Результатом действия энтеротоксинов, закодированных в данных двух генах, является иммуносупрессия хозяина, которая способствует колонизации и передаче инфекции, что, в свою очередь, играет роль в эволюции MRSA [23]. Заслуживает внимания тот факт, что у бразильского клона (ST239:SCCmecIII/IIIA), который считается родственным венгерскому клону (ST239: SCCmecIII), отсутствовали гены энтеротоксинов (sea, sek и seq). Это можно объяснить географическими различиями в распространении венгерского клона (который распространен в Южной Америке и Европе, в частности в Португалии, Германии и Чехии) и бразильского клона (который распространен на Тайване, в Китае, Индии, России и Европе, в частности в Польше и Норвегии) [1, 4]. В Японии сейчас в основном распространен нью-йоркский/ японский клон, а венгерский клон не выявлен [24].

Коллагенадгезин, кодируемый геном can, характерен для S. aureus или MRSA, вызывающих повреждение коллагена в пораженных тканях, что способствует развитию пневмонии [25], а также таких инфекций, как остеомиелит [26] и артрит [27].

Основываясь на полученных данных, для детекции венгерского клона MRSA предложено использование М-ПЦР, основанной на выявлении трех генов вирулентности (sea, seq и cna) и двух дополнительных генов mecA (для идентификации MRSA) и nuc (для дифференциации S. aureus от коагу-лазонегативных стафилококков). Разработанный М-ПЦР позволяет быстро и точно проводить определение венгерского клона MRSA, распространенного в России.

Генотипирование, в частности ST-типирование -это золотой стандарт, позволяющий идентифицировать клоны MRSA. Недостатком его является сложность выполнения во многих клинических лабораториях. M-ПЦР можно проводить с использованием имеющегося в лабораториях оборудования, причем этот метод менее трудоемкий, чем генотипирование.

Выражения признательности

Мы благодарим H. de Lencastre за предоставленные штаммы пандемического MRSA и Lee-Jene Teng - за поддержку в проведении исследования MRSA.

Литература

1. Gordon R.J., Lowy F.D. Pathogenesis of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection. Clin. Infect. Dis. 2008; 46(Suppl 5):350-9.

2. Noto M.J., Kreiswirth B.N., Monk A.B., Archer G.L. Gene acquisition at the insertion site for SCCmec, the genomic island conferring methicillin resistance in Staphylococcus aureus. J Bacteriol 2008; 190:1276-83.

3. Aires de Sousa M., Concei^äo T., Simas C. and Lencastre H. Comparison of genetic backgrounds of methicillin-resistant and -susceptible Staphylococcus aureus isolates from Portuguese hospitals and the community. J Clin Microbiol 2005; 43:5150-7.

4. Conceicao T., Aires-de-Sousa M., Füzi M., et al. Replacement of methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in Hungary over time: a 10-year surveillance study. Clin Microbiol Infect 2007; 13:971-9.

5. Otsuka T., Saito K., Dohmae S., et al. Key adhesin gene in community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Biochem Biophys Res Commun 2006; 346:123444.

6. Takano T., Higuchi W., Otsuka T., et al. Novel characteristics of community-acquired methicillin-resistant

Staphylococcus aureus strains belonging to multilocus sequence type 59 in Taiwan. Antimicrob Agents Chemother 2008; 52:837-45.

7. Zhang K., Sparling J., Chow B.L., et al. New quadriplex PCR assay for detection of methicillin and mupirocin resistance and simultaneous discrimination of Staphylococcus aureus from coagulase-negative staphylococci. J Clin Microbiol 2004; 42:4947-55.

8. Enright M.C., Day N.P., Davies C.E., Peacock S.J., Spratt B.G. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-suscep-tible clones of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2000; 38:1008-15.

9. Oliveira D.C., de Lencastre H. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 2002; 46:215561.

10. Higuchi W., Takano T., Teng L.J., Yamamoto T. Structure and specific detection of staphylococcal cassette chromosome mec type VII. Biochem Biophys Res Commun 2008; 377:752-6.

11. Lowy F.D. Staphylococcus aureus infections. N Engl J Med 1998; 339:520-32.

12. Takahashi N., Nishida H., Kato H., Imanishi K., Sakata Y., Uchiyama T. Exanthematous disease induced by toxic shock syndrome toxin 1 in the early neonatal period. Lancet 1998; 351:1614-9.

13. Centers for Disease Control and Prevention. MRSA in Healthcare settings. updated October 3, 2007

14. Tacconelli E., Cataldo M.A. Antimicrobial therapy of Staphylococcus aureus bloodstream infection. Expert Opin Pharmacother 2007; 8:2505-18.

15. Klevens R.M., Morrison M.A., Nadle J., et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA 2007; 298:1763-71.

16. Robinson D.A., Enright M.C. Evolutionary models of the emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47:3926-34.

17. Czachor J., Herchline T. Bacteremic nonmenstrual staphylococcal toxic shock syndrome associated with enterotoxins A and C. Clin Infect Dis 2001; 32:E53-E56.

18. Gravet A., Rondeau M., Harf-Monteil C.,et al. Predominant Staphylococcus aureus isolated from antibiotic-associated diarrhea is clinically relevant and produces enterotoxin A and the bicomponent toxin LukE-lukD. J Clin Microbiol 1999; 37:4012-9.

19. Ferry T., Thomas D., Genestier A.L., et al. Comparative prevalence of superantigen genes in Staphylococcus aureus isolates causing sepsis with and without septic shock. Clin Infect Dis 2005; 41:771-7.

20. Yarwood J.M., McCormick J.K., Paustian M.L., et al. Characterization and expression analysis of Staphylococcus aureus pathogenicity island 3. Implications for the evolution of staphylococcal pathogenicity islands. J Biol Chem 2002; 277:138-47.

21. Diep B.A., Gill S.R., Chang R.F., et al. Complete genome sequence of USA300, an epidemic clone of community-acquired meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet 2006; 367:731-9.

22. Baba T., Takeuchi F., Kuroda M., et al. Genome and virulence determinants of high virulence community-acquired MRSA. Lancet. 2002; 359:1819-27.

23. Diep B.A., Carleton H.A., Chang R.F., Sensabaugh G.F., Perdreau-Remington F. Roles of 34 virulence genes in the evolution of hospital- and community-associated strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Infect Dis 2006; 193:1495-503.

24. Takizawa Y., Taneike I., Nakagawa S., et al. Panton-Valentine leucocidin (PVL)-positive community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strain, another such strain carrying a multiple-drug resistance plasmid, and other more-typical PVL-negative MRSA strains found in Japan. J Clin Microbiol 2005; 43:3356-63.

25. de Bentzmann S., Tristan A., Etienne J., et al. Staphylococcus aureus isolates associated with necrotizing pneumonia bind to basement membrane type I and IV collagens and laminin. J Infect Dis 2004; 190:1506-15.

26. Elasri M.O., Thomas J.R., Skinner R.A., et al. Staphylo-coccus aureus collagen adhesin contributes to the pathogenesis of osteomyelitis. Bone 2002; 30:275-80.

27. Patti J.M., Bremell T., Krajewska-Pietrasik D., et al. The Staphylococcus aureus collagen adhesin is a virulence determinant in experimental septic arthritis. Infect Immun 1994; 62:152-61.