Влияние индолил-3-уксусной кислоты на окисление о-дианизидина и гидрохинона в присутствии пероксидазы

Влияние индолил-3-уксусной кислоты на кисление о-дианизидина и гидрохинона в присутствии

пероксидазы

В.В. Рогожин (vrogozhin@mail.ru ), Т.В. Рогожина Якутская государственная сельскохозяйственная академия,

Индолил-3-уксусная кислота (ИУК) входит в группу природных фитогормонов - ауксинов. Наиболее богаты содержанием ИУК растущие части растительного организма: верхушки стебля, молодые части листьев, почки, завязи, прорастающие семена. Образование ИУК в большинстве случаев идет в меристематических тканях. Основным источником для образования ИУК является аминокислота триптофан. В растениях разрушение ИУК происходит с участием специализированной ИУК-оксидазы. Наряду с ферментативным окислением ИУК может разрушаться под действием ультрафиолетовых лучей с длиной волны около 280 нм [1].

ИУК активирует деление и растяжение клеток, необходима для формирования проводящих пучков и корней, способствует растяжению околоплодника. Проникая в клетки, ИУК связывается со специфическими рецепторами, оказывая влияние на функциональную активность мембран, полирибосом и ядерного аппарата. Установлено, что в плазмалемме ауксин индуцирует работу Н+-помпы, в результате чего матрикс клеточных стенок закисляется. Это приводит к усилению активности кислых гидролаз и размягчению клеточных стенок, что является необходимым условием для роста клеток растяжением [2]. В конце роста растяжением усиливается лигнификация клеточных стенок, накапливаются ингибиторы фенольной природы и абсцизовая кислота, возрастает активность пероксидазы и оксидазы ИУК, снижающие общее содержание ауксина в тканях [3]. Участие пероксидазы в этих процессах обусловлено тем, что ИУК является субстратом фермента. Известно, что окисление ИУК пероксидазой протекает через образование тройного комплекса фермент-ИУК-кислород.

Исследования механизма окисления ИУК пероксидазой растений показали, что на поверхности белковой глобулы должен располагаться участок связывания ауксина [4-6], который может находиться в составе дистального домена фермента [7]. При этом считается, что активную роль в катализе пероксидазы принимает участие остаток Trp-117, удаленный на 8-9 А от атомов азота порфиринового цикла, т.е. находящегося в зоне туннелирования электронов. При этом субдомен, включающий структурно сходные участки в дистальном домене пероксидазы, формируется в направлении от активного центра к поверхности дистального домена, противоположной входу в активный центр. Таким образом предполагается, что центр связывания ИУК может располагаться вдали от активного центра пероксидазы [7]. Причем оксидазное окисление ИУК может возрастать в присутствии гидрофобных аминокислот, тогда как полярные аминокислоты почти не оказывают влияние на каталитический процесс оксидазного окисления ауксина. Установлена прямая корреляция между гидрофобностью аминокислот и степенью их влияния на скорость окисления ИУК [5]. Однако в литературе отсутствуют данные по влиянию ИУК на пероксидазное окисление различных неорганических и органических субстратов, катализируемое пероксидазой растений. Возможно, что проведение таких исследований позволило бы определить расположение активного центра фермента на поверхности белковой глобулы, установить участки индивидуального связывания ИУК и исследуемых субстратов на ферменте.

Поэтому целью данной работы было изучить влияние индолил-3-уксусной кислоты на пероксидазное окисление о-дианизидина (ОДН), гидрохинона (ГХ) и ферроцианида калия (ФК) в широком диапазоне рН; предложить механизм пероксидазного окисления выбранных субстратов в присутствии ИУК.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Реактивы. В работе использовали пероксидазу хрена производства "Reanal" (Венгрия) со спектральным показателем чистоты RZ=1,0. Концентрацию фермента определяли спектрофотометрически при 403 нм (s=100 мМ-1см-1 [8]) и по пиридингемохромогену [9]. Использовали гидрохинон и индолил-3-уксусную кислоту фирмы "Serva" (Германия), а ферроцианид калия -"Реахим" (Россия); о-дианизидин марки ч. очищали возгонкой в вакууме. Концентрацию перекиси водорода ("Реахим", Россия) определяли спектрофотометрически, используя молярный коэффициент поглощения при 230 нм 72,7 М-1 см-1 [10].

Методы. Реакцию окисления о-дианизидина (17,2-172 мкМ), гидрохинона (0,1-0,5 мМ) или ферроцианида калия (0,36-1,44 мМ) перекисью водорода (0,64 мМ) проводили при 23о в среде 0,1 М натрий-ацетатного, рН 4,5-6,0, или 0,1 М натрий-фосфатного, рН 6,0-7,5, буферов объемом 2,5 мл при различных концентрациях пероксидазы хрена. Окисление о-дианизидина регистрировали по возрастанию поглощения при 460 нм (s=30 мМ-1см-1 [11]), ферроцианида калия - при 420 нм (s=1050 М-1см-1 [12]). За окислением гидрохинона наблюдали по уменьшению поглощения при 290 нм (s=2,2 мМ-1см-1 [13]).

Ингибирование пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона индолил-3-уксусной кислотой изучали путем добавления в кювету вместе с субстратами (при насыщающей концентрации одного из субстратов) пероксидазы ингибитора. Кинетические кривые снимали на двухлучевом спектрофотометре DMS 100 S фирмы "Varian" (США). За единицу активности фермента принимали его количество, окисляющее 1 мкмоль субстрата (о-дианизидина, гидрохинона и ферроцианида калия) за 1 мин. Кажущиеся константы скорости окисления субстратов пероксидазы определяли из данных по стационарной кинетике [14].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучено влияние индолил-3-уксусной кислоты на пероксидазное окисление о-дианизидина, гидрохинона и ферроцианида калия, катализируемое пероксидазой хрена. Показано, что при рН 4,5-7,0 зависимости начальных скоростей пероксидазного окисления о-дианизидина в присутствии ИУК в координатах Лайнуивера-Берка имели вид пучка прямых, пересекающихся на оси ординат, что соответствует конкурентному типу ингибирования (рис. 1).

Графики зависимостей обратных начальных скоростей пероксидазного окисления гидрохинона в присутствии ИУК при рН 4,5-6,5 имели вид семейства прямых, пересекающихся на оси абсцисс, что указывает на неконкурентный характер ингибирования (рис. 2). При рН 7,0-7,5 характер зависимостей изменялся и соответствовал смешанному типу ингибирования, при котором кривые пересекаются в общей точке в левом верхнем квадранте (рис. 3).

Индолил-3-уксусная кислота в концентрациях 10-300 мкМ не влияла на пероксидазное окисление ферроцианида калия при рН 4,5-7,0.

Известно, что пероксидаза катализирует окисление неорганических и органических соединений, различающихся между собой по строению. Широкая субстратная специфичность фермента, позволяет предположить о наличии различных механизмов пероксидазного окисления, реализуемых ферментом [15]. К числу неорганических субстратов пероксидазы относятся ферроцианид-, сульфит-, нитрит-, тиоцианат- и др. ионы, тогда как в группу органических соединений входят НАДН, аскорбиновая кислота, о-дианизидин, гидрохинон, фенотиазины и др. [16]. В реакциях индивидуального окисления субстраты пероксидазы могут подразделяться

-40

-20

0

20

40

4

2 1

60

1/ОДН, мМ-1

Рис. 1. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления о-дианизидина от его концентрации, в двойных обратных координатах, при различных концентрациях индолил-3-уксусной кислоты, мкМ: 1-0, 2-10, 3-20, 4-30; пероксидаза - 0,56 нМ; перекись водорода - 0,64 мМ; 0,1 М натрий-фосфатный буфер, рН 7.

3

1/ГХ, мМ-1

Рис. 2. Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления гидрохинона от его концентрации, в координатах Лайнуивера-Берка, при различных концентрациях индолил-3-уксусной кислоты, мкМ: 1-0, 2-20, 3-40, 4-60; пероксидаза - 4,0 нМ; перекись водорода - 0,64 мМ; 0,1 М натрий-ацетатный буфер, рН 5.

40 -. 30 -20 -10

1/У, мин мМ

-1

4

2 1

-4 -2 0 2 4

6

8 10

1/ГХ, мМ-1

3

Рис. 3. Зависимости начальной скорости пероксидазного окисления гидрохинона от его концентрации, в двойных обратных координатах, при различных концентрациях индолил-3-уксусной кислоты, мкМ: 1-0, 2-20, 3-40, 4-80; пероксидаза - 4,0 нМ; перекись водорода - 0,64 мМ; 0,1 М натрий-фосфатный буфер, рН 7,5.

на медленно и быстро окисляемые. При этом величины констант Михаэлиса у них различаются незначительно, при наибольшей разнице в величинах каталитических констант. В группу медленно окисляемых субстратов входят как неорганические, так и органические соединения - доноры электронов. Тогда как доноры водорода являются быстро окисляемыми субстратами пероксидазы. При рассмотрении механизма действия пероксидазы в реакциях окисления различных субстратов применяется модель, в которой действие пероксидазы объясняется в рамках представления о ферменте как белке-проводнике, реализующим несколько каналов транспорта электронов с субстратов, контактирующих с поверхностью белковой глобулы на железо гема [15]. Однако вопрос об участке связывания субстратов в активном центре пероксидазы пока остается не выясненным. Хотя с помощью компьютерных методов показано, что аминокислотные последовательности пероксидаз растений и ауксин-связывающих белков содержат близкие по структуре участки. При этом определенные пять из шести структурно сходных участков находятся в составе дистального домена пероксидаз и формируют субдомен, включающий последовательность, координирующую гем с дистальной стороны активного центра [7]. Поэтому проведенные исследования по влиянию ИУК на пероксидазное окисление субстратов пероксидазы позволяют высказать некоторые предположения о местах связывания субстратов на поверхности фермента.

Конкурентный тип ингибирования реакции пероксидазного окисления о-дианизидина ИУК позволяет предположить, что ОДН и индолил-3-уксусная кислота связывается в одном и том же месте активного центра фермента. При этом связывание ИУК препятствует как связыванию, так и превращению о-дианизидина. Тогда как по отношению к гидрохинону тип ингибирования несколько другой. ИУК и гидрохинон связываются в различных местах активного центра, однако, если индолил-3-уксусная кислота связывается на поверхности фермента, то дальнейшее превращение гидрохинона становиться невозможным. Это может наблюдаться вследствие

удаленности мест связывания эффектора и субстрата или в результате конформационных изменений глобулы фермента при связывании ингибитора [17]. Причем при рН 4,5-6,5 тип ингибирования неконкурентный, однако при увеличении рН он меняется и становиться смешанным. При этом а увеличивается (а>1), а в уменьшается (в<1). Изменение этих постоянных характеризует ухудшение связывания субстрата в 2,8-4,2 раза, т.е. при наличии ИУК происходит понижение сродства гидрохинона к активному центру фермента. Однако, если все таки гидрохинон связался в активном центре, то дальнейшее его превращение ухудшается в 1,7-5,3 раза. Связывание ИУК с пероксидазой зависит от рН среды. Так в реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина величина К при рН 4,5-7,0 изменяется в диапазоне от 9,6 до 0,72 мкМ, т.е. с возрастанием рН сродство ингибитора к ферменту может повышаться в 13,3 раза. Тогда как в реакциях окисления гидрохинона величина К в этом же диапазоне рН изменяется от 113 до 17 мкМ, т.е. константа ингибирования понижается в 6,6 раза. При этом эффективность связывания ИУК с пероксидазой, например, при рН 4,5 и 7,0 лучше связывания о-дианизидина в 4,2 и 20,8 раз, а гидрохинона - 5,8 и 8,8 раз соответственно. В реакциях пероксидазного окисления о-дианизидина связывание ИУК с ферментом при рН 4,5 и 7,0 было в 11,8 и 23,6 раза соответственно эффективнее, чем в реакциях окисления гидрохинона. По-видимому, на сродство ингибитора к ферменту оказывает влияние природа субстрата. Причем субстраты, имеющие близкую с ИУК полярность, значительно повышают эффективность связывание ингибитора с пероксидазой. Аналогичные зависимости были получены при изучении связывания ИУК в присутствии гидрофобных и полярных аминокислот [5]. Показано, что увеличение гидрофобности аминокислоты повышает сродство ауксина к ферменту. Поэтому, преимущественным местом связывания ИУК и о-дианизидина в активном центре пероксидазы, по-видимому, должна быть гидрофобная область. Тогда как для гидрохинона местом связывания

является область на поверхности фермента, содержащая большее число полярных или заряженных аминокислотных остатков. Подтверждением различных мест связывание о-дианизидина и гидрохинона в активном центре пероксидазы служат данные по совместному пероксидазному окислению этих субстратов. Пероксидазное окисление о-дианизидина и гидрохинона происходит дифференцированно. При этом окисление о-дианизидина не наблюдается до полного превращения гидрохинона. Причем скорость окисления гидрохинона в присутствии о-дианизидина превышает скорость его индивидуального окисления в 3-10 раз. Механизм совместного окисления субстратов проявляется в том, что предварительное связывание о-дианизидина улучшает последующее связывание гидрохинона, ускоряя процесс его пероксидазного окисления [18]. Несколько иной механизм отмечается при совместном окислении ферроцианида калия и гидрохинона. Окисление ферроцианида не происходило до тех пор, пока полностью не окислялся весь гидрохинон. Это происходит из-за того, что гидрохинон и ферроцианид связываются в одном и том же месте. Поэтому предварительное связывание гидрохинона препятствует последующему связыванию, а следовательно, и окислению ферроцианида. Однако индолил-3-уксусная кислота не оказывала влияние на пероксидазное окисление ферроцианида калия, что, возможно, обусловлено удаленностью участка связывания субстрата от области связывания ИУК.

Из рН-зависимостей ^км/Кт для о-дианизидина и гидрохинона видно, что формы кривых имеют сложную зависимость, затрудняющие определение природы ионогенных групп нативного фермента, принимающих участие в катализе этих субстратов (рис. 4). По-видимому, ионогенные группы, принимающие участие в каталитическом процессе пероксидазы, находятся в окружении гидрофобных аминокислотных остатков, что проявляется в затруднении определения рКа этих

8 н

7 -

6

2

8

рН

Рис. 4. рН-Зависимости ^(км/Кт) для реакций пероксидазного окисления о-дианизидина (1) и гидрохинона (2).

1

функциональных групп на рН-зависимостях каталитических констант реакций пероксидазного окисления о-дианизидина и гидрохинона. Поскольку сами субстраты содержат функциональные группы с высокими значениями рКа и в исследованном диапазоне рН могут находиться только в протонированной форме. (Например, рКа групп гидрохинона 9,85 и 11,4 [19]). Данные утверждения подтверждаются исследованиями по антигенному картированию пероксидазы хрена [20]. Выявленные эпитопы содержали несколько функционально важных остатков: Б^-42 и А^-38, входящих в активный центр пероксидазы, вблизи которых находятся гидрофобные аминокислотные остатки (Phe-142 и 143), формирующие канал доступа ароматических субстратов к активному центру фермента.

Из рН-зависимостей в реакциях окисления о-дианизидина,

определяются две ионогенные группы с рКа 4,69 и 6,49 (рис. 5, кривая 1), а гидрохинона - одна ионогенная группа с рКа 6,8 (рис. 5, кривая 2). Проявление этих групп, по-видимому, вызвано наличием в составе молекулы индолил-3-уксусной кислоты карбоксильной группы с рКа 4,54 [19], протонирование и депротонирование которой позволяет выявить две ионогенные функциональные группы активного центра пероксидазы, принимающие участие в пероксидазном окислении о-дианизидина и одну - в окислении гидрохинона.

Известно, что в области активного центра пероксидазы располагаются несколько ионогенных групп, принимающих участие в катализе. Так, например, в пероксидазном окислении ^крезола, ферроцианида и йодида выявлены ионогенные группы фермента с рКа 5,7 и 8,6, которые участвуют в каталитическом процессе [21]. В комплексообразовании пероксидазы с N этиламид о-сульфобензоилуксусной кислоты принимают участие две ионогенные группы с рКа 3,5 и 5,5, протонирование и депротонирование которых влияло на спектральные характеристики фермент-субстратного комплекса [22]. В работе [11] высказывается предположение, что некоторое

-3,5

-4,5

-5,5

№

2

1

7

рн

Рис. 5. рН-Зависимости константы ингибирования реакций пероксидазного окисления о-дианизидина (1) и гидрохинона (2) индолил-3-уксусной кислотой. Кривые являются теоретическими для рКа(ОДн+иУК)=4,69, Ка(Нт)=23,8 мкМ; рКВ(ОДН+ИУК)=6,49, КВ(Ит)=22,6 мкМ; рКВ(гх+иук)=6,80, Кв(Нт)=104 мкМ.

расхождение в величинах рКа-групп активного центра пероксидазы, по-видимому, можно объяснить за счет того, что окисленное состояние железа гема оказывает сильное влияние на диссоциации близлежащих групп. Поэтому группы с рКа 3,5 и 5,7, а также с рКа 5,5 и 8,6, выявляемые у нативной и окисленной формах пероксидазы, можно отнести к одним и тем же двум разным группам активного центра фермента. Одной из них может быть карбоксильная группа [22], а другой имидазол гистидина [23]. Эти же группы проявляют себя в реакциях ингибирования пероксидазы ИУК в реакциях окисления о-дианизидина и гидрохинона.

Выявленные закономерности имеют важное биологическое значение, поскольку раскрывают роль пероксидазы в процессах прорастания семян. На основании полученных данных можно предположить, что ИУК связываясь в составе дистального домена активного центра фермента, способна ингибировать протекание пероксидазных реакций переключая их на оксидазные. При этом пероксидаза будет выполнять роль высокоспецифичной оксигеназы ауксина. Это, возможно, является условием проявления функциональной роли фермента в прорастающих семенах растений.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Якушкин Н.И. Физиология растений. М.:Просвещение, 1993. С.275-279.

2. Полевой В.В. Физиология растений. М.:Высш.шк., 1989. С.39-42.

3. Grierson D., Covey S. Plant molecular biology. New York, 1984. 176 p.

4. Metodiewa D., Pieres de Melo M., Escobar J.A., Cilento G., Dunford H.B. Horseradish peroxidase-catalysed aerobic oxidation and peroxidation of indole-3-acetic acid.I.Optical spectra// Arch. Biochem. and Biophys.-1992.-V.296.-N 1.-P.27-33.

5. Park R.D., Park C.K. Oxidation of indole-3-acetic acid - amino acid conjugates by horseradish peroxidase//Plant Physiol.-1987.- V.84.-N 3.-P.826-829.

6. Pieres de Melo M., Escobar J.A., Metodiewa D., Dunford H.B., Cilento G. Horseradish peroxidase - catalyzed aerobic oxidation of indole-3-acetic acid. II.Oxygen uptake and chemiexcitation//Arch. Biochem. and Biophys.-1992.-V.296.-N 1.-P.34-39.

7. Савицкий П.А., Рожкова А.М., Тишков В.И., Упоров И.В., Руденская Г.Н., Газарян И.Г. Существование центра связывания индолил-3-уксусной кислоты в пероксидазах растений. Структурное сходство пероксидаз и ауксин-связывающих белков//Биохимия.- 1998.-Т.63.-Ы 6.-C.749-754.

8. Ogawa S., Shira Y., Morishima I. Calcium binding by horseradish peroxidase C and the heme enviromental structure.//Biochem. Biophys. Res. Commun.-1979.-V.90.-N2.-P.674-678.

9. Falk J.E. Porphyrins and Metalloporphyrins. Amsterdam.-N.Y.-London etc.: Elsevier, 1964. 236 p.

10. George P. The chemical nature of the second hydrogen peroxide compound formed by cytochrome C peroxidase and horseradish peroxidase:-.Titration with reducing agents.//Biocem.J.-1953.-V.54.-N2.-P.267-276.

11. Лебедева О.В., Угарова Н.Н., Березин И.В. Кинетическое изучение реакции окисления о-дианизидина перекисью водорода в присутствии пероксидазы из хрена.//Биохимия.-1977.-Т.42.-N8.-C.1372-1379.

12. Chance B. The properties of the enzyme substrate compounds of horseradish and lactoperoxidase//Science.-1949.-V.109.-N 103.-P.204-208.

13. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Механизм совместного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона в присутствии пероксидазы хрена//Биорган. химия.-1999.-Т.25.^ 5.-С.377-382.

14. Березин И.В., Клесов А. А. Практический курс химической и ферментативной кинетики.-М:МГУ, 1976. 320 с.

15. Лебедева О.В., Угарова Н.Н. Механизм пероксидазного окисления. Субстрат-субстратная активация в реакциях, катализируемых пероксидазой хрена//Известия РАН. Сер. химическая.-1996.-№ 1.-C.25-32.

16. Угарова Н.Н., Лебедева О.В., Савицкий А.П. Пероксидазный катализ и его применение.-М.:МГУ, 1981, 92 с.

17. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии.-М.:Мир, 1981. Т.1. С.261-266.

18. Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Стационарная кинетика совместного пероксидазного окисления гидрохинона и о-дианизидина в присутствии пероксидазы хрена//Биохимия.-1999.-Т. 64.-N 2.-С. 219-224.

19. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика, М:Мир, 1991. 544 с.

20. Аммосова Т.Н., Упоров И.В., Рубцова М.Ю., Игнатенко О.В., Егоров А.М., Колесанова Е.Ф., Арчаков А.И. Антигенное картирование пероксидазы хрена (изофермент С)//Биохимия.-1997.-Т.62.^ 4.-C.516-524.

21. Critchlow J.E., Dunford H.B. The kineties and stoichiometry of the transition from the primary to the secondary peroxidase peroxide complexes//J. Biol. Chem.-1972.-V. 247.-P.3714-3715.

22. Рогожин В.В. Роль карбоксильных и гуанидиновых групп в функционировании пероксидазы хрена. Дисс. канд. хим. наук, М:МГУ, 1984. 22 с.

23. Jamada H., Jamasaki J. Effect of modification of function groups on the reactivity of horseradish peroxidase //Arch. Biochem. and Biophys.-1974.-V.165.-P.728-738.