НАБОР СИНТЕТИЧЕСКИХ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ДНК ПРОСТЕЙШИХ И ГЕЛЬМИНТОВ
SET OF SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES FOR IDENTIFICATION AND GENETIC STUDY OF DNA OF PROTOISTS AND HELMINTHS

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к выявлению и генетическому исследованию ДНК простейших и гельминтов в образцах биологического материала человека и животных.
Информативное (с достаточной чувствительностью и специфичностью) выявление широкого спектра известных простейших и гельминтов, паразитирующих в организме человека, необходимо для эпидемиологического надзора за паразитозами, для диагностики паразитарных инфекций и установлению возможной ассоциации различных заболеваний с инфицированием пациентов любыми простейшими и гельминтами, в том числе в виде микст-инфекций.
Уровень техники
Основным известным, относительно дешевым морфологическим способом лабораторной диагностики протозоозов и гельминтозов является световая или флуоресцентная микроскопия биологических образцов, для которой используются влажных препараты мокроты, мочи, вагинальных мазков, дуоденальных аспиратов, сигмоидоскопического материала, абсцессов и биоптатов тканей. Образцы могут помещаться в физиологический раствор или йод, также используются влажные препараты крови и солевые препараты поверхностных срезов кожи (Autier В., Belaz S., Razakandrainibe R., Gangneux J.-P., Robert-Gangneux F. Comparison of three commercial multiplex PCR assays for the diagnosis of intestinal protozoa // Parasite. - 2018. - Vol.25. -Article 48. - DOI: 10.105 l/parasite/2018049; Momčilović S., Cantacessi C., Arsić-Arsenijević V., Otranto D., Tasić-Otašević S. Rapid diagnosis of parasitic diseases: current scenario and future needs // Clinical microbiology and infection. - 2019 Vol.25, Issue 3. - P. 290-309. - DOI: 10.1016/j.cmi.2018.04.028; Rijsman L.H., Monkelbaan J.F., Kusters J.G. Clinical consequences of polymerase chain reaction-based diagnosis of intestinal parasitic infections // Journal of gastroenterology and hepatology. - 2016. - Vol.31, Issue 11. - P. 1808-1815. - DOI: 10.1111/jgh.13412).
Общеизвестными недостатками микроскопической диагностики протозоозов и гельминтозов являются: возможность получения ложноотрицательных результатов, которая связана с различными факторами (в том числе с недостаточным опытом специалиста, с небольшим количеством в образце и/или нечеткими морфологическими признаками паразитов, с небольшим сроком пригодности образца для исследования); сравнительно высокий риск внутрилабораторных инфекций при некоторых паразитозах; сложность автоматизации лабораторных исследований на основе микроскопии.
Также известны серологические способы лабораторной диагностики протозоозов и гельминтозов, преимущественно основанные на определении специфических антител методом ИФА (Momčilović S., Cantacessi С, Arsić-Arsenijević V., Otranto D., Tasić-Otašević S. Rapid diagnosis of parasitic diseases: current scenario and future needs // Clinical microbiology and infection. - 2019 Vol.25, Issue 3. - P. 290-309. -DOI: 10.1016/j.cmi.2018.04.028; Rijsman L.H., Monkelbaan J.F., Kusters J.G. Clinical consequences of polymerase chain reaction-based diagnosis of intestinal parasitic infections // Journal of gastroenterology and hepatology. - 2016. - Vol.31, Issue 11. - P. 1808-1815. -DOI: 10.1111/jgh.l3412).
Основными недостатками серологических способов лабораторной диагностики протозоозов и гельминтозов являются: недостаточная информативность с связи с зависимостью от иммунного статуса организма пациента и предшествующей аналогичной инфекции; невозможность универсального использования наборов для диагностики любой паразитарной инфекции в связи со специфической реакцией антиген-антитело.
Наиболее близкими аналогами заявляемого технического решения -прототипами - являются информативные для диагностики и оценки эффективности лечения наборы для мультиплексных ПЦР, обеспечивающие выявление ДНК нескольких простейших и гельминтов в биологических образцах, создающие условия для автоматизации лабораторных исследований (например: Hanieh S., Mahanty S., Gurruwiwi G., Kearns Т., Dhurrkay R., Gondarra V., Shield J., Ryan N., Azzato F., Ballard S.A., Orlando N., Nicholson S., Gibney K., Brimblecombe J., Page W., Harrison L.C., Biggs B.A., Child Health and Nutrition Study team. Enteric pathogen infection and consequences for child growth in young Aboriginal Australian children: a cross-sectional study // BMC Infectious Diseases. - 2021. - Vol.21. - Article 9. - DOI: 10.1186/s 12879-020-05685-1; Autier В., Belaz S., Razakandrainibe R., Gangneux J.-P., Robert-Gangneux F. Comparison of three commercial multiplex PCR assays for the diagnosis of intestinal protozoa // Parasite. -2018. - Vol.25. - Article 48. - DOI: 10.1051/parasite/2018049; Momčilović S., Cantacessi C., Arsić-Arsenijević V., Otranto D., Tasić-Otašević S. Rapid diagnosis of parasitic diseases: current scenario and future needs // Clinical microbiology and infection. - 2019 Vol.25, Issue 3. - P. 290-309. - DOI: 10.1016/j.cmi.2018.04.028; Rijsman L.H., Monkelbaan J.F., Kusters J.G. Clinical consequences of polymerase chain reaction-based diagnosis of intestinal parasitic infections // Journal of gastroenterology and hepatology. - 2016. - Vol.31, Issue 11. - P. 1808-1815. - DOI: 10.1111/jgh. 13412; https://alphalabs.ru/produkcziya/test-sistemyi-dlya-diagnostiki-parazitarnyix-zabolevanij/gelmo-skrin.html; https://alphalabs.ru/produkcziya/test-sistemyi-dlya-diagnostiki-parazitarnyix-zabolevanij/proto-skrin.html).
Основными недостатками прототипов является невозможность универсального использования наборов для лабораторной диагностики любых протозоозов и гельминтозов в связи с родовой и/или видовой специфичностью праймеров, входящих в состав наборов, и необходимость разработки большого числа пар праймеров, позволяющих проводить мультиплексную ПЦР, что является общеизвестным невыполнимым условием, ограничивающим число определяемых видов возбудителей инфекций. При этом общеизвестным недостатком мультиплексной ПЦР в реальном времени является ограничение современной реагентной и приборной базы, позволяющей одновременно детектировать не более шести мишеней в одной реакции (ПЦР в реальном времени / Д.В. Ребриков [и др.]; под ред. д.б.н. Д.В. Ребрикова. - 7-е изд. - М: Лаборатория знаний, 2018. - 223 с. - URL: https://glavkniga. su/filecont/49956.pdf).
Решаемой технической проблемой в настоящем изобретении является автоматизированная лабораторная диагностика до 27 этиологически наиболее значимых видов возбудителей протозоозов и гельминтозов, в том числе в любом их сочетании при микст-инфекциях протозойной, гельминтной и протозойно-гельминтной этиологии, с использованием ПЦР.
Раскрытие сущности изобретения
Достигаемым техническим результатом является автоматизированная лабораторная диагностика до 27 этиологически наиболее значимых видов возбудителей протозоозов и паразитозов, в том числе в любом их сочетании при микст-инфекциях протозойной, гельминтной и протозойно-гельминтной этиологии, с использованием ПЦР.
Достижение указанного технического результата обусловлено следующей совокупностью существенных признаков - набором синтетических олигонуклеодитов, которые специфически отжигаются на консервативных участках гена, кодирующего 18S рибосомальную РНК, и позволяют проводить ПЦР. Пара праймеров 5'-AACAAGTCTGGTGCCAGCAG-3' и 5'-GTGTACAAAGGGCAGGGACG-3' способна специфически отжигаться на консервативных участках гена, кодирующего 18S рибосомальную РНК простейших и гельминтов, имеющих следующую видовую принадлежность: Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis, Entamoeba histolytica, Giardia intestinalis, Anisakis simplex, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Opisthorchis viverrini, Opisthorchis felineus, Fasciola hepatica, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichinella spiralis, Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Toxocara canis, Toxocara cati, Trichuris trichiura, Strongyloides stercoralis, Taenia saginata, Hymenolepis nana, Dipylidium caninum, Taenia solium, Diphyllobothrium latum.
Указанные консервативные участки гена 18S рибосомальной РНК, специфичных для Blastocystis hominis, Dientamoeba fragilis, Entamoeba histolytica, Giardia intestinalis, Anisakis simplex, Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Opisthorchis viverrini, Opisthorchis felineus, Fasciola hepatica, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis, Trichinella spiralis, Ancylostoma caninum, Ancylostoma ceylanicum, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Toxocara canis, Toxocara cati, Trichuris trichiura, Strongyloides stercoralis, Taenia saginata, Hymenolepis nana, Dipylidium caninum, Taenia solium, Diphyllobothrium latum, фланкирующие вариабельные участки гена 18S рибосомальной РНК и находящиеся на расстоянии друг от друга, составляющем от 847 нуклеотидов до 1786 нуклеотидов, которое позволяет проводить ПЦР, были выявлены в результате проведенного авторами настоящего изобретения биоинформатического анализа известных нуклеотидных последовательностей гена 18S рибосомальной РНК простейших и гельминтов.
Набор синтетических олигонуклеодитов, может дополнительно включать пару праймеров 5'-AACAAGTCTGGTGCCAGCAG-3' и 5'-GTGTACAAAGGGCAGGGACT-3', которая способна специфически отжигаться на консервативных участках гена, кодирующего 18S рибосомальную РНК контрольных организмов Homo sapiens, Bos taurus, Gallus gallus, Salmo salar и может быть использована в качестве внутреннего контроля при проведении ПЦР. При этом праймер 5'-GTGTACAAAGGGCAGGGACT-3' не способен отжигаться на участках гена кодирующего 18S рибосомальную РНК простейших и гельминтов. Указанные консервативные участки гена 18S рибосомальной РНК, специфичных для Homo sapiens, Bos taurus, Gallus gallus, Salmo salar, фланкирующие вариабельные участки гена 18S рибосомальной РНК и находящиеся на расстоянии друг от друга, составляющем 1059, 1061, 1052, 1056 нуклеотидов соответственно, которое позволяет проводить ПЦР, были выявлены в результате проведенного авторами настоящего изобретения биоинформатического анализа известных нуклеотидных последовательностей гена 18S рибосомальной РНК контрольных организмов.
Из патентно-технической литературы и практики лабораторной диагностики паразитозов и протозоозов неизвестно о наборе синтетических олигонуклеотидов для выявления и генетического исследования ДНК простейших и гельминтов, который был бы идентичен заявленному.
Отсюда правомерен вывод о соответствия заявленного решения критерию «новизна».
Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для достижения технического результата - автоматизированной лабораторной диагностики до 27 этиологически наиболее значимых видов возбудителей протозоозов и паразитозов, в том числе в любом их сочетании при микст-инфекциях протозойной, гельминтной и протозойно-гельминтной этиологии, с использованием ПЦР.
Предлагаемый набор может быть получен многократно, а, значит, заявленное техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».
Осуществление изобретения
Сущность изобретения поясняется на следующих примерах, показывающих получение набора, обеспечивающего автоматизированную лабораторную диагностику до 27 этиологически наиболее значимых видов возбудителей протозоозов и паразитозов, в том числе в любом их сочетании при микст-инфекциях протозойной, гельминтной и протозойно-гельминтной этиологии, с использованием ПЦР. При этом приведенные примеры набора показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.
Пример 1. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов выявления и генетического исследования ДНК простейших и гельминтов, включающий в себя пару праймеров  и  Данный набор был использован для исследования образца ДНК, полученного из биологического материала (кала) от больного с подозрением на лямблиоз, который был отрицательный при микроскопическом исследовании биологического материала. Проводили ПЦР в реальном времени с использованием пары праймеров  и  термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования по Сэнгеру.
В результате проведенного исследования была установлена положительная ПЦР с праймерами  и  В результате секвенирования ампликонов ПЦР была получена нуклеотидная последовательность, которая соответствовала нуклеотидной последовательности Giardia intestinalis.
На основании результатов ПЦР была диагностирована инфекция, вызванная лямблией Giardia intestinalis.
Пример 2. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов выявления и генетического исследования ДНК простейших и гельминтов, включающий в себя пару праймеров  и  Данный набор был использован для исследования образца ДНК, полученного из биологического материала (кала) от больного с подозрением на гельминтоз, который был отрицательный при микроскопическом исследовании биологического материала. Проводили ПЦР в реальном времени с использованием пары праймеров  и  термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и нанопорового секвенирования.
В результате проведенного исследования были установлены положительная ПЦР с праймерами  и  В результате секвенирования ампликонов ПЦР были получены нуклеотидные последовательности, которые соответствовали нуклеотидным последовательностям Hymenolepis папа и Fasciola hepatica.
На основании результатов ПЦР была диагностирована микст-инфекция, вызванная карликовым цепнем Hymenolepis папа и печеночным сосальщиком Fasciola hepatica.
Пример 3. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов выявления и генетического исследования ДНК простейших и гельминтов, включающий в себя пары праймеров  и  и  Данный набор был использован для исследования образца ДНК, полученного из биологического материала (ретробульбарного пунктата) от больного с подозрением на токсокароз. Ранее проведенное серологическое исследование методом ИФА показало отрицательный результат по выявлению иммуноглобулинов класса G к антигенам токсокар в сыворотке (плазме) крови. Проводили ПЦР в реальном времени с использованием пар праймеров  и  и  термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и секвенирования на молекулярных кластерах с использованием флуоресцентно меченых нуклеотидов.
В результате проведенного исследования была установлена отрицательная ПЦР с парой праймеров  и  и положительная ПЦР с парой праймеров  и  В результате секвенирования ампликонов ПЦР с праймерами  и  были получены нуклеотидные последовательности, которые соответствовали нуклеотидным последовательностям Homo sapiens.
На основании результатов ПЦР была исключена инфекция, вызванная токсокарами Toxocara canis и Toxocara cati.
Пример 4. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов выявления и генетического исследования ДНК простейших и гельминтов, включающий в себя пары праймеров  и  и  Данный набор был использован для исследования образца ДНК, полученного из биологического материала (биоптат мышечной ткани) от особи крупного рогатого скота с подозрением на цистицеркоз. Проводили ПЦР с использованием пар праймеров  и  и  термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и ионного полупроводникового секвенирования.
В результате проведенного исследования были установлены положительные ПЦР с парой праймеров  и  и с парой праймеров  и  В результате секвенирования ампликонов ПЦР с праймерами  и  была получена нуклеотидная последовательность, которая соответствовала нуклеотидной последовательности Taenia saginata. В результате секвенирования ампликонов ПЦР с праймерами  и  были получены нуклеотидные последовательности, которые соответствовали нуклеотидным последовательностям Bos taurus.
На основании результатов ПЦР был диагностирован цистицеркоз животного, вызванного бычьим цепнем Taenia saginata.
Пример 5. Был получен набор синтетических олигонуклеотидов выявления и генетического исследования ДНК простейших и гельминтов, включающий в себя пару праймеров  и  Данный набор был использован для исследования образца ДНК, полученного из биологического материала (кала) от больного с подозрением на гельминтоз, который был отрицательный при микроскопическом исследовании биологического материала. Проводили ПЦР в реальном времени с использованием пары праймеров  и  термостабильного фермента Taq-полимеразы, буфера для постановки реакции, смеси четырех дезоксинуклеотидтрифосфатов, интеркалирующего красителя SYBR Green I, положительного контроля, отрицательного контроля, с последующим анализом графиков кривых нарастания флуоресценции, анализом продуктов амплификации методом горизонтального гель-электрофореза и нанопорового секвенирования.
В результате проведенного исследования были установлены положительная ПЦР с праймерами  и  В результате секвенирования ампликонов ПЦР были получены нуклеотидные последовательности, которые соответствовали нуклеотидным последовательностям Entamoeba histolytica и Ascaris lumbricoides.
На основании результатов ПЦР была диагностирована протозойно-гельминтная микст-инфекция, дизентерийной амебой и Entamoeba histolytica вызванная аскаридой Ascaris lumbricoides.