Получение ферментолизатов мицелиальной биомассы для создания пищевых и кормовых биодобавок

ИННОВАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ НОВЫХ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ

11 ТЕМА НОМЕРА Л

УДК 663.11:579.87

Получение ферментолизатов мицелиальнои биомассы

для создания пищевых и кормовых биодобавок

Е. М. Серба, д-р биол. наук, профессор; Л. В. Римарева, д-р техн. наук, профессор, чл.-корр. РАН; М. Б. Оверченко, канд. техн. наук; Е. И. Курбатова, канд. техн. наук; К. В. Рачков, канд. биол. наук; Н. И. Игнатова; В. Е. Давыдкина

ВНИИ пищевой биотехнологии

Важной проблемой, с которой сталкивается современный человек, является несбалансированность питания, обусловленная дефицитом питательных веществ, макро- и микроэлементов, незаменимых аминокислот и др. Поэтому в линейке выпускаемых пищевых продуктов стали появляться различные так называемые функциональные и обогащенные продукты. Перспективным источником биологически ценных ингредиентов для создания таких продуктов является сырье микробного происхождения [1-7].

В настоящее время определенный интерес представляют работы по использованию мицелиальных грибов как субстратов для получения биологически активных добавок (БАД). При этом большое внимание уделяется мицелиальным грибам рода Aspergillus, имеющим промышленное значение в качестве продуцентов гидролитических ферментов. В биомассе микромицетов содержатся белковые вещества и полисахариды, в том числе хитин. Содержание хитина в клеточных стенках варьирует от 5 до 25%, что существенно больше, чем в дрожжевой биомассе.

Это, по-видимому, влияет на биологические функции препаратов [8-11]. Для повышения усвояемости микробной биомассы необходима разработка биокаталитических процессов деструкции биополимеров сырья, обеспечивающих максимальное извлечение внутриклеточных биологически ценных компонентов и перевод их в биодоступные формы. Поэтому исследование функциональных свойств БАД, получаемых на основе ферментативной деструкции грибной биомассы, содержащей белковые вещества и аминополиса-хариды, является актуальным.

Целью исследований была разработка направленного биокатализа биомассы мицелиального гриба Aspergillus oryzae для получения натуральных биологически активных добавок.

В качестве объекта исследования использовали штамм гриба Aspergillus oryzae RCAM 01133, полученный из коллекции микроорганизмов ФГБНУ ВНИИПБТ. Штамм депонирован в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения и отличается низкой способностью

к образованию конидий. Микроми-цет культивировали на натуральных питательных средах глубинным способом. Полученную грибную биомассу отделяли от культуральной жидкости и промывали дистиллированной водой. Содержание полисахаридов в биомассе определяли колориметрическим методом по количеству общих редуцирующих веществ (ОРВ), образовавшихся после кислотного гидролиза [12]. Количественное определение аминного азота проводили медным способом в отсутствие аммонийных солей [13]. Содержание общего белка определяли по методу Къельдаля на автоматической установке [14].

В связи с тем, что в культуральной жидкости гриба Aspergillus oryzae RCAM 01133 практически отсутствуют ферменты протеолитического действия, для осуществления биокаталитической деструкции белковых полимеров грибной биомассы необходимо подобрать комплекс ферментов, вызывающий наиболее

INNOVATIVE TECHNOLOGIES FOR NEW FOODS

высокую степень конверсии внутриклеточных углеводных и белковых полимеров.

На первом этапе моделирования процесса биоконверсии грибной биомассы использовали подобранную ранее экзогенную ферментативную систему (ФС-1), катализирующую деструкцию клеточных стенок. ФС-1 включала ферменты р-глюканазы (300 ед/ г), маннаназы, хитиназы и протеазы бактериального происхождения эндодействия (10 ед/г). Для исключения действия внутриклеточных ферментов биомассу гриба подвергали термообработке при 85 °С в течение 15 мин. Исследовали также процесс гидролиза внутриклеточных полимеров биомассы под действием как собственных ферментов, так и экзогенных. Длительность процесса и состав ферментативных систем варьировались.

Для биодеструкции внутриклеточных полимеров термолизирован-ной биомассы гриба использовали различные комплексы ферментов, включающие комплекс протеаз экзо-и эндодействия (пептидазы и протеи-назы), и ферменты, гидролизующие небелковые полимеры.

Исследовали влияние дозировки экзопептидаз, добавляемых к основной системе ФС-1, обеспечивающей гидролиз клеточных стенок (рис.).

ФС-2, ФС-3 и ФС-4 дополнительно содержали комплекс протеиназ и пептидаз грибного происхождения (соответственно 5, 10 и 15 ед. ПС/г биомассы), катализирующих глубокий гидролиз белковых веществ протоплазмы грибной клетки до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот. Наиболее глубокая степень гидролиза белка (70 мг %) была достигнута в ферментолизате грибной биомассы за 5 ч при исполь-

Длительность гидролиза

Рис. Влияние дозировки экзогенных протеаз на накопление аминного азота в гидролизатах грибной биомассы Aspergillus oryzae RCAM 01133

зовании дозировки экзопептидаз 15 ед. ПС/г. При этом снижение дозировки до 10 ед. ПС/г обеспечивало образование такого же уровня аминного азота за 18 ч (рис.).

Проведены сравнительные исследования ферментолизатов биомассы гриба Aspergillus oryzae RCAM 01133, полученных с использованием методов автолитической деструкции биополимеров и ферментативной -под действием экзогенных ферментов. В наработанных образцах исследовали содержание аминного азота (NH2+), количество растворимого белка и редуцирующих углеводов (РВ) (табл. 1).

В результате исследований разработан направленный процесс биокаталитической конверсии полимеров гриба с получением ферментолизатов мицелиальной биомассы с различной степенью деструкции. Наиболее высокая степень деструкции белковых веществ достигнута при использовании ФС-3 и ФС-4 в течение 18 ч, при этом содержание аминного азота составило соответственно 67,7 и 70,1 мг %. Автолитическая конверсия гриба из-за низкого содержания внутриклеточных протеаз не позволила достигнуть подобных результатов.

Наработана экспериментальная партия грибной биомассы Aspergillus

огу1ае КСДМ 01133, которую подвергли биокаталитическому гидролизу под действием экзогенных ферментативных систем (ФС). При проведении ферментолиза варьировали их состав и дозировку ферментов, а также длительность процесса. В зависимости от использованных ФС и длительности гидролиза различалась степень деструкции белков (табл. 2).

В полученных образцах проведены спектральный и аминокислотный анализы наработанных образцов (табл. 2, 3), которые подтвердили, что с увеличением количества ферментов и длительности их воздействия на образцы возрастает содержание свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов (с массой до 1000 Да). После 2-часового гидролиза содержание свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов составило 50,73 % от общей массы веществ белковой природы. После 5-часового гидролиза этот показатель вырос до 67,65 %. Длительный ферментативный гидролиз в течение 18 ч обеспечил преобладание пептидов с массой до 350 Да. Содержание свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов составило соответственно 83,93 и 87,18% от общей массы веществ белковой природы.

Таблица 1

Гидролиз биомассы гриба Aspergillus oryzae RCAM 01133 различными ферментативными комплексами

Вариант Длительность Биохимические показатели ферментолизатов

Содержание РВ, % Содержание N^^ мг % Количество белка по Лоури, мг/см3

Термолиз 15 мин 0,16 25,8 4,3

Автолиз 18ч 0,26 36,7 6,54

2 ч 0,29 43,4 5,47

ФС-3 5 ч 0,33 57,0 6,79

18 ч 0,36 67,7 8,26

ФС-4 18 ч 0,38 70,1 8,76

ИННОВАЦИОННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ДЛЯ НОВЫХ ПРОДУКТОВ ПИТАНИЯ

11 ТЕМА НОМЕРА I

Таблица 2

Содержание свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов в гидролизатах грибной биомассы Aspergillus oryzae RCAM 01133

Ферментативная система Длительность гидролиза, ч R*, % Содержание свободных АК, % от общего количества

2 50,73 23,4

ФС-3 5 67,65 38,9

18 83,93 74,0

ФС-4 18 87,18 84,7

К* - содержание свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов в общей массе веществ белковой природы по данным спектрального анализа

Результаты исследований состава свободных аминокислот, образовавшихся в процессе протеолиза, подтвердили полученные спектральные данные фракционного состава белковых веществ в ферментолизатах грибной биомассы (табл. 3).

В работе были исследованы условия ферментативной деструкции субклеточных полимеров мицели-альной биомассы гриба Aspergillus oryzae RCAM 01133. Подобрана ферментативная система, обеспечивающая высокую степень конверсии биополимеров в легкоусвояемые низкомолекулярные пептиды, свободные аминокислоты, растворимые углеводы.

Показано, что степень деструкции белковых веществ биомассы зависит от состава ферментативной системы,

Аминокислотный состав ферментолизатов биомассы гриба Aspergillus oryzae RCAM 01133

Таблица 3

Аминокислота Содержание свободных аминокислот, мг/г

Гидролиз ФС-3, ч Гидролиз ФС-4, ч

2 5 18 18

Aспарагиновая кислота 1,06 0,709 2,172 2,188

Серин 0,93 1,207 1,785 1,597

Треонин 0,65 0,710 1,355 1,650

Глутаминовая кислота 1,81 2,177 4,404 5,183

Пролин - - - -

Глицин 0,27 0,282 1,291 1,024

Аланин 0,78 1,056 3,358 3,787

Цистин - - - -

Валин 0,87 1,008 1,355 1,838

Метионин 0,23 0,154 0,236 0,482

Изолейцин 0,75 0,874 2,058 1,690

Лейцин 1,52 2,169 2,310 2,847

Тирозин 0,62 1,019 1,166 1,533

Фенолаланин 0,85 1,660 1,879 1,659

Гистидин 3,41 4,671 6,978 7,165

Лизин 1,07 1,332 1,275 1,577

Триптофан 7,51 15,386 39,601 45,983

Аргинин 1,10 3,521 3,818 4,511

Общее количество 23,43 38,935 74,041 84,714

дозировки ферментов и длительности гидролиза.

Результаты исследований подтверждают возможность проведения регулируемого получения биопрепаратов с заданным структурно-фракционным составом на основе ферментативного гидролиза полимеров мицелиальной биомассы. Полученные ферментолизаты грибной биомассы могут быть использованы для обогащения продуктов питания и кормов легкоусвояемыми низкомолекулярными пептидами, незаменимыми аминокислотами и углеводами.

Исследования выполнены при поддержке гранта Российского научного фонда № 16-16-00104.

ЛИТЕРАТУРА

1. Серба, Е. М. Медико-биологические и биотехнологические аспекты создания продукции геродиетического питания/ Е. М. Серба, Л. В. Римарева, М. Б. Оверченко, Е. В. Орлова // Пищевая промышленность. - 2009. - № 3. -С. 29-30.

2. Римарева, Л. В. Биотехнологические аспекты создания пищевых добавок биокоррегирующего действия на основе микробной биомассы/ Л. В. Римарева, Е. И. Курбатова, Н. А. Фурсова, Е. Н. Соколова, А. В. Макарова // Хранение и переработка сельхозсырья. - 2011. -№ 2. - С. 45-47.

3. Поляков, В. А. Белковые обогатители пищи на основе ферментативной деструкции белково-полисахаридного комплекса клеточных стенок дрожжей/ В. А. Поляков, Л. В. Римарева, Е. И. Курбатова, Е. Н. Соколова, Ю. А. Борщева, А. В. Тесля // Пищевая промышленность. - 2012. - № 11. -С. 42-44.

4. Римарева,Л. В. Эффективная для животноводства белково-аминокислотная добавка, полученная на основе микробной биомассы/Л. В. Римарева, И. Ф. Горлов, М. Б. Оверченко, Н. С. Погоржель-ская // Ветеринария и кормление. -

2012. - № 6. - С. 47-48.

5. Серба, Е. М. Создание натуральных биокорректоров пищи для функциональных продуктов/Е. М. Серба, К. В. Рачков, Н. И. Игнатова, Л. В. Римарева, В. А. Поляков // Пищевая промышленность. -

2013. - № 9. - С. 18-20.

6. Серба, Е. М. Исследование фракционного состава биокорректоров пищи из дрожжевой биомассы для создания на их основе функциональных продуктов целевого назначения/ Е. М. Серба, К. В. Рачков, Е. В. Орлова, М. Б. Оверчен-ко, Л. В. Римарева, В. А. Поляков // Хранение и переработка сельхозсырья. -2013. - № 11. - С. 18-21.

7. Хованова, И. В. Улучшение пищевых

INNOVATIVE TECHNOLOGIES FOR NEW FOODS

и биологических свойств молочных продуктов для геродиетического питания за счет использования в них биологически активного компонента/И. В. Ховано-ва, С. Е. Дмитриева, Г. М. Лесь, Л. В. Рима-рева, Е. Н. Соколова, В. Е. Давыдкина // Пищевая промышленность. - 2015. -№ 3. - 17-19.

8. Римарева, Л. В. Использование биомассы гриба АзрегдШиз огу7ае в качестве источника биологически активных веществ/Л. В. Римарева, Е. М. Серба, М. Б. Оверченко, К. В. Рачков, И. М. Абрамова // Хранение и переработка сель-хозсырья. - 2012. - № 9. - С. 46-49.

9. Феофилова, Е. П. Клеточная стенка грибов: современные представления о составе и биологической функ-ции/Е. П. Феофилова // Микробиология. - 2010. - Т. 79. - № 6. - С. 723-733.

10. Серба, Е. М. Научно-практические аспекты получения БАД на основе конверсии вторичных биоресур-

сов/ Е. М. Серба, М. Б. Оверченко, В. Е. Давыдкина, Н. В. Шелехова, Л. В. Римарева, В. А. Поляков // Хранение и переработка сельхозсырья. -2015. - № 2. - С. 44-50.

11. Андриянова, Д. А. Новые биологические функции клеточной стенки и ее аминополисахаридов у мицелиальных грибов/Д. А. Андриянова, Н. Р. Мейчик, Ю. И. Николаева, Е. П. Феофилова // Иммунопатология. Аллергология. Инфекто-логия. - 2009. - № 2. - С. 2-3.

12. Серба, Е. М. Разработка метода определения содержания полисахаридов в биомассах микроорга-низмов/Е. М. Серба, М. Б. Оверченко, А. Ю. Кривова, Н. И. Игнатова, Л. В. Римарева // Хранение и переработка сель-хозсырья. - 2015— № 7. - С. 42-47.

13. Белозерский, А. Н. Практическое руководство по биохимии растений/А. Н. Белозерский, Н. И. Проскуряков. - М.: Сов. наука, 1951, 338 с.

14. Поляков, В. А. Инструкция по техно-химическому и микробиологическому контролю спиртового производства / В. А. Поляков, И. М. Абрамова, Г. В. Полыгалина, Л. В. Римарева, Г. Т. Корчагина, Е. Н. Пискарева. - М.: ДеЛипринт, 2007. - 480 с.

Получение ферментолизатов мицелиальной биомассы для создания пищевых и кормовых биодобавок

Ключевые слова

биологически активные добавки; биомасса гриба; полисахариды; ферментативные системы; ферментолизаты

Реферат

Исследованы условия ферментативной деструкции субклеточных полимеров мицелиальной биомассы гриба Aspergillus oryzae RCAM 01133. В результате разработан направленный процесс биокаталитической конверсии полимеров гриба с получением ферментолизатов мицелиальной биомассы с различной степенью деструкции. Наиболее высокая степень деструкции белковых полимеров достигнута при использовании ферментативных систем, содержащих ß-глюканазу (300 ед/г), протеазу бактериального происхождения эндодействия (10 ед/ г) и комплекс протеиназ и пептидаз грибного происхождения (10 и 15 ед/г), в течение 18 ч. Проведен спектральный и аминокислотный анализы белковых веществ ферментолизатов грибной биомассы, которые подтвердили, что с увеличением количества ферментов и времени их воздействия на образцы увеличивается содержание свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов до 87% от общей массы веществ белковой природы. После двухчасового гидролиза содержание свободных аминокислот и низкомолекулярных пептидов составило 50,73% от общей массы веществ белковой природы. После пятичасового гидролиза этот показатель вырос до 67,65%. Длительный ферментативный гидролиз в течение 18 ч обеспечил преобладание пептидов с массой до 350 Да. Анализ состава свободных аминокислот, образовавшихся в результате протеолиза, подтвердил полученные спектральные данные фракционного состава белковых веществ в ферментолизатах грибной биомассы. Результаты исследований подтверждают возможность проведения регулируемого процесса получения биопрепаратов с заданным структурно-фракционным составом на основе ферментативного гидролиза полимеров мицелиальной биомассы. Полученные ферментолизаты грибной биомассы могут быть использованы для обогащения продуктов питания и кормов легкоусвояемыми низкомолекулярными пептидами, незаменимыми аминокислотами и углеводами.

Авторы

Серба Елена Михайловна, д-р биол. наук, профессор, Римарева Любовь Вячеславовна, д-р техн. наук, профессор, чл.-корр. РАН, Оверченко Марина Борисовна, канд. техн. наук, Курбатова Елена Ивановна, канд. техн. наук, Рачков Кирилл Викторович, канд. биол. наук, Игнатова Наталья Иосифовна, Давыдкина Вера Евгеньевна,

ВНИИ пищевой биотехнологии, 111033, Москва, ул. Самокатная, д. 4б, lrimareva@mail.ru

Getting Mycelial Biomass Fermentative to Create Food and Feed Bioadditives

Key words

dietary supplements; fungal biomass; polysaccharides; enzymatic systems; fermentative

Abstracts

The conditions of enzymatic degradation of subcellular polymers mycelial biomass of the fungus Aspergillus oryzae RCAM 01133. As a result, developed a directed process of biocatalytic conversion of polymers to produce a mushroom mycelium fermentative biomass with varying degrees of destruction. The highest degree of degradation of protein polymers achieved by using enzymatic systems containing: p-glucanase (300 U/g), a protease of bacterial origin endoaction (10 U/g) and a set of proteinases and peptidases fungal origin (10 and 15 U/g) for 18 hours. Conducted spectral and amino acid analyses of proteins of fermentaiton fungal biomass, which confirmed that with increasing amounts of enzyme and time of specimen exposure, increases the content of free amino acids and low molecular peptides to 87% of the total weight of proteins. After two hours of hydrolysis, the content of free amino acids and low molecular weight peptides was 50,73% of the total weight of protein nature substances. After five hours of hydrolysis, the figure rose to 67,65%. Prolonged enzymatic hydrolysis for 18 hours provided a predominance peptides to mass 350 Da. Analysis of the composition of free amino acids formed as a result of proteolysis, acknowledge receipt of the spectral data of the fractional composition of proteins in the fermentative fungal biomass. The results confirm the possibility of a controlled process of obtaining biological products with the specified structural and fractional composition based on the enzymatic hydrolysis of polymers mycelial biomass. These fermentative fungal biomass can be used for the enrichment of food and feed digestible low molecular weight peptides, essential amino acids and carbohydrates.

Authors

Serba Elena Michailovna, Doctor of Biological Science, Professorof, Rimareva Lyubov Vyacheslavovna, Doctor of Technical Science, Professor, Academician of RAS,

Overchenko Marina Borisovna, Candidat of Technical Science, Kurbatova Elena Ivanovna, Candidat of Technical Science, Rachkov Kirill Viktorovich, Candidat of Biological Science, Ignatova Nadezhda losifovna, Davyidkina Vera Evgenevna,

Research Institute of Food Biotechnology, 4b, St. Samokatnaya, Moscow, 111033, lrimareva@mail.ru