СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА С ИММУНОМЕТАБОЛИЧЕСКОЙ И АНТГЕЛЬМИНТНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
METHOD FOR PRODUCING COMPLEX PREPARATION HAVING IMMUNOMETABOLIC AND ANTHELMINTHIC ACTIVITY

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам получения иммунометаболических препаратов.
В настоящее время актуальнейшими проблемами ветеринарной медицины являются приобретенные иммунодефициты и глубокие нарушения обменных процессов, обусловленные множеством факторов, в том числе нарушением питания и содержания, инфекционными и инвазионными заболеваниями животных, сопровождающимися явлениями окислительного стресса. В этой связи возникает необходимость применения препаратов, обладающих сочетанным антиоксидантным, метаболическим и иммуностимулирующим действием.
Решение концептуальной задачи по одновременной коррекции оксидантного, метаболического и иммунного статуса животных возможно на основе разработки комбинированных препаратов.
Известен иммунометаболический антгельминтный препарат (патент РФ №2411944 от 20 февраля 2011 г.)
Данный препарат получают добавлением в стандартный раствор 7,5% антигельминтика левамизола, порошка янтарной кислоты из расчета 10 мг/ мл и растворением при нагревании до 38-40°С.
Препарат обеспечивает высокую антгельминтную и гепатопротекторную активность. Однако, как свидетельствуют наблюдения, он недостаточно эффективен при состояниях, сопровождающихся явлениями окислительного стресса.
Задачей изобретения является разработка комплексного препарата, обладающего повышенным антиоксидантным, иммунометаболическим и антигельминтным действием, введение которого вызывало бы системный лечебно-профилактический эффект, направленный на нормализацию энергетических, обменных и иммунных процессов, а также антигельминтной активностью.
Для усиления метаболической активности янтарной кислоты и повышения факторов естественной резистентности организма животных может быть использована лимонная кислота.
Лимонная кислота является активатором янтарной кислоты в цикле трикарбоновых кислот Кребса. Комплексное соединение янтарной и лимонной кислот нашло применение в хорошо известном таблетированном препарате Лимонтар (патент РФ №2039556).
Механизм действия комплекса янтарной и лимонной кислот заключается в их способности связывать свободные радикалы, оказывающее повреждающее действие на белки, липиды и биомембраны клеток, что является базисным в патогенезе многих заболеваний, а также в процессе старения клеток и тканей организма.
На основании биохимических исследований установлено, что добавление лимонной кислоты к янтарной в соотношении 1:10-15 позволяет выражено усилить метаболическую активность.
В качестве антгельминтика и иммуномодулятора в состав комплексного препарата включен левамизол.
Левамизол - высокоэффективный антгельминтик и иммуномодулятор преимущественно клеточной системы иммунитета. Однако обладает выраженным побочным, преимущественно судорожным действием на организм, в связи с чем его неохотно используют в клинике лечения больных животных.
Предложенный иммунометаболический антгельминтный препарат в качестве антгельминтика и иммуностимулятора содержит левамизол, а в качестве метаболических корректоров и антиоксидантов - янтарную (ЯК) и лимонную (ЛК) кислоты, при этом компоненты, входящие в его состав, взяты в следующем соотношении (мас.%):
Левамизол - 7,5
Янтарная кислота - 1,0
Лимонная кислота - 0,1
Вода - остальное.
Получили комплексный препарат путем добавления в деминерализованную воду порошка левамизола - 75 мг/мл; порошка янтарной кислоты - 10 мг/ мл и лимонной кислоты 1 мг/мл. При нагревании до 38-40°С и постоянном перемешивании указанные компоненты растворились. Полученный раствор был прозрачен. Добавлением 10% раствора гидроокиси натрия довели рН до 4-4,5. Полученный препарат расфасовали по флаконам емкостью 50,0 мл и подвергли стерилизации автоклавированием в режиме 1-1,1 атм в течение 20 минут. Стерилизация автоклавированием не изменила физико-химических свойств комплексного препарата.
Полученный комплексный препарат представляет собой прозрачный бесцветный стерильный раствор. Качественный и количественный состав предлагаемого препарата, по сравнению с прототипом, позволяет выраженно повысить иммунометаболический и антиоксидантный эффект, сохранив на высоком уровне антигельминтную активность. Качественный и количественный состав предлагаемого препарата обеспечивает достижение синергетического эффекта, что иллюстрируется примерами его экспериментального испытания.
Пример 1. Изучение иммуностимулирующего и метаболического действия комплексного препарата провели на поросятах - гипотрофиках 25-30 дневного возраста. Опытной группе поросят (n=5) внутримышечно инъецировали предлагаемый состав (левамизол + ЯК+ЛК) в дозе 2,0 мл. Контрольной группе (n=5) ввели иммунометаболический антгельминтный препарат (левамизол + ЯК) в той же дозе. Побочного действия на введение препарата не отмечено ни в опытной, ни в контрольной группе.
Контрольные исследования влияния препаратов на иммунобиохимический статус поросят провели на 5 и 14 сутки. Результаты иммунобиохимических исследований представлены в таблице 1.
Из представленных данных видно, что введение комплексного препарата, содержащего ЯК и ЛК, оказывает более выраженное иммунометаболическое действие уже на 5 день после введения и эффект сохраняется до 14 дня.
Пример 2. Изучение действия предлагаемого состава на состояние системы ПОЛ-АОЗ у телят проводили на 27 телятах, больных гастроэнтеритом смешанной вирусно-бактериальной этиологии, с острым течением, сопровождающимся явлениями окислительного стресса, токсикоза и обезвоживания. Все больные были разделены на 3 группы - две опытные и контрольную, по 9 голов в каждой. Контрольную группу составили телята, получавшие традиционный комплекс лечения антибиотиками, принятый в хозяйстве. Для лечения больных первой опытной группы дополнительно включался комплексный испытуемый препарат (левамизол + ЯК+ЛК), один раз в день, в дозе 2 мл, внутримышечно. Для лечения больных второй опытной группы, кроме антибиотикотерапии, дополнительно назначался известный препарат (левамизол и ЯК) в дозе 2 мл на голову, внутримышечно, один раз в день в дозе 2 мл.
Для изучения состояния ПОЛ определяли содержание диеновых конъюгатов (ДК) плазмы крови по методу Гаврилова В.Б., Мишкорудной М.И.,1983. Из антиоксидантных параметров исследовались уровни каталазной активности (КА), методом М.А. Королюк, 1988, и глутатионпероксидазы (ГП) в крови (В.С. Бузлама и др., 1997). Результаты исследований представлены в таблице 2.
1
2
Полученные данные показали, что применение комплексного иммунометаболического антигельминтного препарата (левамизол + ЯК) привело к существенным сдвигам всех анализируемых параметров. Отмечено существенное снижение интенсивности ПОЛ по показателям ДК (P<0,01). Однако уровня здоровых телят достигнуто не было. Применение препарата оказало положительное влияние на активность АОЗ. Так, наблюдалось нарастание уровня КА и ПА плазмы крови (Р<0,01). Тем не менее и эти параметры не поднялись до уровня активности АОЗ у здоровых телят.
Применение препарата, в состав которого включены левамизол, ЯК и ЛК, привело к более выраженным положительным сдвигам в системе "ПОЛ-АОЗ" не только в сравнении с контрольной группой, но и I опытной группой.
Пример 3. Изучение антгельминтной активности. Опыт проведен на поросятах 2-2,5 месячного возраста, спонтанно инвазированных аскаридами. Из подопытных поросят были сформированы три опытные группы. Животным первой группы внутримышечно инъецировали испытуемый препарат (левамизол + ЯК+ЛК) в дозе 1 мл на 10 кг массы тела, поросятам второй группы в той же дозе вводили известный препарат (левамизол + ЯК). Поросятам третьей группы в аналогичном объеме вводился стандартный раствор левамизола.
При клиническом наблюдении за подопытными животными установлено, что в ответ на введение стандартного раствора левамизола, спустя 20-30 минут, у всех животных стали проявляться выраженные симптомы нервного возбуждения и рвота. У поросят первой и второй групп признаков возбуждения не обнаружено. Это свидетельствует о том, что включение ЯК, а также ЯК в сочетании с ЛК, в состав препарата позволило выраженно снизить токсическое действие левамизола на нервную систему организма животных.
Оценку антгельминтной активности провели по результатам копрологического исследования на 18 сутки после введения препаратов, результаты которых отражены в таблице 3.
Таким образом, на основании проведенных экспериментальных исследований следует, что комплексный препарат на основе антгельминтика-иммуномодулятора левамизола и естественных метаболиков: янтарной и лимонной кислот при парентеральном введении в дозе 1 мл на 10 кг массы тела животного выраженно снижает токсический эффект на организм животных, обеспечивает более высокую иммунометаболическую, антиоксидантную, в том числе и антгельминтную активность по отношению к ближайшему аналогу и стандартному раствору левамизола.
Таблица 1.
Иммунобиохимические показатели у поросят - гипотрофиков на фоне применения левамизола в комплексе с ЯК и ЯК с ЛК
показатели
Левамизол + ЯК
Левамизол + ЯК+ЛК
фон
5 сутки
14 сутки
фон
5 сутки
14 сутки
Иммуноглобулины: М мг/мл
2,24±0,17
2,75±0,25
2,14±0,19
2,25±0,21
2,98±0,39
2,36±0,16
G мг/мл
7,02±1,02
9,12±1,39
8,94±1,27
7,24±1,06
9,26±0,98
8,98±1,02
Лейкоциты, тыс/м<sup>3</sup>
8,27±0,36
9,42±0,72
9,51±0,46
8,32±0,78
9,76±0,86
9,64±0,42
Т-лимфоциты 10<sup>9</sup>/л
2,34±0,42
3,45±0,38
3,97±0,23
2,86±0,24
3,82±0,42
3,96±0,34
В-лимфоциты 10<sup>9</sup>/л
1,95±0,18
2,03±0,22
2,48±0,31
2,02±0,12
2,26±0,14
2,58±0,12
Бактерицидная активность сыворотки крови, %
89,0±2,57
93,7±2,60
92,4±2,81
90,4±2,80
97,9±2,85
96,2±2,41
Лизоцимная активность сыворотки крови, мг/мл
1,49±0,16
1,74±0,39
1,92±0,14
1,44±0,13
1,86±0,26
1,93±0,28
Эритроциты, млн/м<sup>3</sup>
6,4±0,08
7,8±0,07
7,6±0,05
6,6±0,02
7,9±0,05
7,7±0,04
Гемоглобин, г%
8,32±0,56
11,44±0,32
11,46±0,42
8,46±0,24
11,78±0,28
11,71±0,32
Метгемоглобин, г%
1,74±0,38
0,62±0,08
0,73±0,05
1,82±0,24
0,54±0,16
0,62±0,18
Таблица 2.
Уровень ПОЛ и АОЗ крови телят, больных гастроэнтеритом, под влиянием проводимой терапии
Показатель
Здоровые телята
Контрольная группа
1-я опытная группа
2-я опытная группа
ДК<sub>232</sub>/мг липидов до лечения
0,14±0,05
0,38±0,05
0,39±0,02
0,37±0,05
после лечения
0,36±0,07
0,14±0,08
0,24±0,07
КА (мкМ Н<sub>2</sub>О<sub>2</sub>/л·мин) до лечения
45,05±4,85
28,15±1,73
27,93±2,64
25,75±4,23
после лечения
31,81±2,83
46,45±3,53
35,5±4,72
ГПА(мМGSН/л·мин) до лечения
11,28±0,02
7,32±0,15
6,43±0,52
5,85±0,22
после лечения
8,25±1,72
11,32±2,72
10,42±2,62
0,37±0,05
Таблица 3.
Антгельминтная активность левамизола + ЯК, левамизола + ЯК+ЛК и стандартного левамизола при аскаридозе
препарат
количество животных
инвазированность
до введения
через 18 дней
левамизол + ЯК
20
ЭИ - 12 (60%)
ИИ - 8,3±1,0
ЭИ - 4 (20%)
ИИ - 1,0±0,1
левамизол + ЯК+ЛК
20
ЭИ - 12 (60%)
ИИ - 8,5±1,2
ЭИ - 4 (15%)
ИИ - 1,2±0,1
левамизол
20
ЭИ - 10 (50%)
ИИ - 9,1±1,4
ЭИ - 5 (25%)
ИИ - 3,0±1,2