СОСТАВ СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТЕНИЙ СЕМЕЙСТВА РЯСКОВЫЕ (WOLFFIA ARRHIZA) В УСЛОВИЯХ IN VITRO
COMPOSITION OF MEDIUM FOR CULTURING DUCKWEED PLANTS (WOLFFIA ARRHIZA) IN VITRO

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для производства как высокобелковых кормов в отраслях кормопроизводства, так и разнообразных белковых препаратов в фармацевтике и ветеринарии.
При культивировании растений семейства рясковых (разные виды Lemna, Wolffia, Spirodela) в условиях in vitro рядом исследователей рекомендованы среды, составленные по прописям Мурасиге-Скуга (наиболее универсальная среда) (Воинов Н.А. и др. 2009), Гамборга, Шенка-Хильдебрандта (Schenk and Hildebrandt, 1972; Gamborg et al., 1968; Boehm et al., 2001; Kruse et al., 2001; Li J. et al., 2004; Friedrich A.S., 2005).
Наиболее распространенными средами для водных и песчаных культур являются среды, составленные по прописям Кнопа, Стейнберга и Хогланда-Арнона (Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М., 1973; Steinberg, R., 1946; Knop, 1865; Hoagland and Arnon., 1938) и имеющие более низкое, по сравнению с вышеупомянутыми, содержание минеральных веществ. Все указанные среды разработаны для культивирования широкого круга растений, поэтому не в полной мере удовлетворяют индивидуальным потребностям в элементах питания отдельно взятого объекта, что не позволяет максимально реализовать его потенциальную биологическую продуктивность.
Наиболее близкими по биологической сущности к изобретению являются среда Хогланда-Арнона (Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М., 1973; Hoagland and Arnon., 1938), включающая в свой состав следующие компоненты, мас.%:
KН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
0,45
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4Н<sub>2</sub>O
3,60
KNO<sub>3</sub>
1,67
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
1,63
FeCl<sub>3</sub>×6H<sub>2</sub>O
6,42
Nа<sub>2</sub>ЭДТА×2Н<sub>2</sub>O
19,89
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,0003
ZnSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
0,0007
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,0003
MnCl<sub>2</sub>×4H<sub>2</sub>O
0,006
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
0,009
Сахароза
Остальное
К недостаткам указанной среды для культивирования водных растений относятся: несбалансированность минерального питания для индивидуальных потребностей Wolffia arrhiza и практически полное отсутствие органических элементов питания за исключением сахарозы.
Задача изобретения - повышение биологической продуктивности Wolffia arrhiza за счет оптимизации содержания элементов питания в культивационной среде.
2
4
3
2
2
3
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
3
3
2
2
4
2
4
2
Поставленная задача достигается изменением баланса минеральных элементов в питательном растворе, заменой некоторых минеральных элементов и включением в раствор дополнительных как минеральных, так и органических компонентов. Для этого среда, включающая фосфат калия монозамещенный - KНРO, четырехводный нитрат кальция - Ca(NO)×4НO, нитрат калия - KNO, семиводный сульфат магния - MgSO×7HO, двуводный молибдат натрия - NaMoO×2HO, семиводный сульфат цинка - ZnSO×7HO, двунатриевый дигидрат этилендиаминтетрауксусной кислоты - NaЭДТА×2НO, пятиводный сульфат меди - CuSO×5HO и борную кислоту - НВO, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит калия йодид -KI, шестиводный хлорид кобальта - СоСl×6НO, аспарагин, глутамин, тиамин, пиридоксин, аскорбиновую кислоту, мезоинозит, семиводный сульфат железа - FeSO×7HO и пятиводный сульфат марганца - MnSO×5HO, при следующем содержании компонентов, мас.%:
KН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
1,044-1,050
Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4Н<sub>2</sub>O
3,90-4,00
KNO<sub>3</sub>
1,60-1,68
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
1,20-1,26
FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
0,040-0,046
Na<sub>2</sub>ЭДТА×2H<sub>2</sub>O
0,059-0,067
KI
0,0035-0,0051
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,00048-0,00060
ZnSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
0,00012-0,00022
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,00014-0,00022
MnSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,0023-0,0027
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>
0,011-0,017
СоСl<sub>2</sub>×6H<sub>2</sub>O
0,00060-0,00084
Аспарагин
0,22-0,28
Глутамин
0,35-0,45
Тиамин
0,0010-0,0016
Пиридоксин
0,009-0,017
Аскорбиновая кислота
0,041-0,049
Мезоинозит
1,31-1,39
Сахароза
Остальное
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав раствора отличается от известных по содержанию всех компонентов, ионной формой ряда компонентов и введением новых компонентов. Таким образом, заявляемое решение соответствует критерию «новизна». Разработанная среда обеспечила многократное повышение продуктивности Wolffia arrhiza по целому комплексу показателей, таких как: прирост биомассы популяции, содержание тотального белка в 100 мг сырой массы и процентное содержание белка в сухой массе, обеспечивая при этом достаточно высокий показатель содержания сухого вещества, и не вызывая видимых физиологических отклонений в архитектонике растения. Наиболее важный показатель - выход тотального белка с популяции - также превосходит аналогичный показатель при культивировании Wolffia arrhiza на ранее известных аналогах сред. Таким образом, данный состав компонентов среды действительно увеличивает продуктивность объекта, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «существенные отличия».
Для экспериментальной проверки заявляемого состава были подготовлены 4 варианта: прототип (среда Хогланда-Арнона (Hg)) и 3 варианта заявляемой среды (W3M«1» - среда составлена по наименьшей границе заявляемых допустимых интервалов масс компонентов, W3M«2» - среда составлена по средним величинам из заявляемых допустимых интервалов масс компонентов, W3M«3» - среда составлена по наибольшей границе заявляемых допустимых интервалов масс компонентов).
Смеси получили простым смешиванием. Среды готовили из концентрированных маточных растворов стандартной компоновки (Шевелуха B.C., 1998):
Раствор
Методика приготовления раствора
Количество раствора в мл/л среды
W3M«1»
W3M«2»
W3M«3»
Раствор четырехводного нитрата кальция
В 80 мл дистиллированной воды добавляют 23,6 г Ca(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>×4Н<sub>2</sub>O. Полученный раствор доводят дистиллированной водой до кондиционного объема в 100 мл
3,63
3,7 0
3,77
Раствор макроэлементов
В 400 мл дистиллированной воды добавляют:
18,2
20,0
21,8
KNO<sub>3</sub>
9,2 г
MgSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
6,7 г
KН<sub>2</sub>РO<sub>4</sub>
5,8 г
Полученный раствор доводят дистиллированной водой до кондиционного объема в 500 мл
Раствор микроэлементов
В 100 мл дистиллированной воды добавляют:
0,9
1,0
1,1
MnSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
0,18 г
Н<sub>3</sub>ВО<sub>3</sub>
0,31 г
ZnSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O
0,037 г
KI
0,096 г
CuSO<sub>4</sub>×5H<sub>2</sub>O
0,0038 г
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>×2H<sub>2</sub>O
0,012 г
СоСl<sub>2</sub>×6Н<sub>2</sub>O
0,016 г
Раствор хелата железа
1. Растворяют в 400 мл дистиллированной воды: 2,8 г FeSO<sub>4</sub>×7H<sub>2</sub>O.
1,77
1,95
2,13
2. Растворяют в 100 мл дистиллированной воды: 3,73 г Na<sub>2</sub>ЭДТА×2H<sub>2</sub>O.
3. Оба раствора смешивают и нагревают на водяной бане до константного состояния смеси.
Раствор органических веществ
В 100 мл дистиллированной воды добавляют:
0,9
1,0
1,1
Тиамин
0,03 г
Пиридоксин
0,3 г
Аскорбиновая кислота
1,0 г
Вещества, добавляемые в виде сухих препаратов
Количество вещества в г/л среды
Мезоинозит
0,29
0,3
0,31
Глутамин
0,0782
0,0894
0,1006
Аспарагин
0,0488
0,0555
0,0622
Сахароза
20,06
20,0
19,94
Растения помещали на жидкие питательные среды в количестве 100 растений в одну колбу общим объемом 500 мл в трехкратной повторности для каждого из вариантов. Объем среды в каждой колбе составлял 300 мл, культивацию осуществляли на шейкере при 90 об/мин. Учетный период - 1 месяц со дня посадки.
Среда
Биомасса популяции в г
Масса тотального белка в мкг/100 мг сырой массы
Масса белка популяции в мг
Содержание сухого вещества в %
Белка в сухом веществе в %
W3M «1»
11,72
1471,22
170,89
4,5
32,9
W3M «2»
19,05
1813,20
392,15
4,9
40,1
W3M «3»
13,48
1435,65
193,14
4,6
31,6
Hg
6,99
846,13
58,97
3,9
22,1
Приведенные в таблице данные по результатам дисперсионного анализа показали наличие достоверных различий фактора на 95% уровне значимости.
Из таблицы следует, что заявляемая среда существенно превосходит по всем показателям продуктивности прототип. Также полученные данные свидетельствуют о том, что при использовании граничных значений заявляемых допустимых интервалов масс компонентов происходит снижение продуктивности Wolffia arrhiza по всем показателям в связи с дефицитом либо избытком элементов питания в среде.
Источники информации
1. Воинов Н.А., Волова Т.Г., Зобова Н.В., Маркова С.В., Франк Л.А., Шишацкая Е.И. Современные проблемы и методы биотехнологии / Учеб. пособие. - Красноярск, ИПК СФУ, 2009. - 418 с.
2. Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М. (1973). Краткий справочник по физиологии растений. Изд 2, испр., доп. - Киев: Наукова думка. - 590 с.
3. Сельскохозяйственная биотехнология / В.С. Шевелуха, С.В. Калашникова, Е.З. Кочиева [и др.]. - М.: Высш. шк., 1998. - 416 с.
4. Boehm R., Kruse С., Voeste D., Barth S. and Schnabl H. (2001) A transient transformation system for duckweed (Wolffia columbiana) using Agrobacterium-mediated gene transfer. J Appl Bot 75:107-111.
5. Friedrich A.S. (2005). Untersuchungen zu Kultivierung, Transformation und Fermentation von Wolffia spec. - Inaugural - Dissertation. - 177 s.
6. Gamborg O.L., Miller R.A. and Ojima K. (1968). Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research 50, 151-158.
7. Gamborg O.L., Constabel F., La Rue, T.A.G., Miller R.A. & Steck W. (1971). The influence of hormones on secondary metabolite formation in plant cell cultures. In Les Cultures de Tissas de Plantes, pp.335-44. Paris: Centre National de la Recherche Scientifique.
8. Hoagland D.R. and Arnon D.I. (1938). The water-culture method for growing plants without soil Univ. Calif. Coll. Agric. Exp. Sta. Circ. Berkeley, CA 347-353.
9. Knop W. (1865). Quantitative Utersuchungen Über den ErnährungensprozeB der Pflanze. Landw. Versuchssat. 7:93.
10. Knop W. (1865) Arbeiten aus dem Laboratorio der Versuchs-Station zu Moecern. Die Landwirtschaftlichen Versuchs-Stationen 7: 436-450.
11. Kruse C., Boehm R., Voeste D., Barth S. and Schnabl H. (2001). Transient transformation of Wolffia columbiana by particle bombardment. Aquatic Bot 72:175-181.
12. Li J., Jain M., Vunsh R., Vishnevetsky J., Hanania U., Flaishman M., Perl A., Edelman M. Callus induction and regeneration in Spirodela and Lemna // Plant Cell Rep (2004) 22:457-464.
13. Steinberg R., 1946: Mineral requirement of Lemna minor. Plant Physiology, 21, 42-48.