СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ БИОХИМИЧЕСКОГО РЕЦИДИВА У БОЛЬНЫХ РАКОМ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПОСЛЕ ГОРМОНОЛУЧЕВОЙ ТЕРАПИИ
METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF BIOCHEMICAL RECURRENT IN PROSTATE CANCER PATIENTS AFTER RADIATION AND HORMONE THERAPY

Изобретение относится к области медицины и найдет применение в онкоурологии, в частности при лечении рака предстательной железы для прогнозирования риска развития биохимического рецидива (БР) у больных после гормонолучевой терапии (ГЛТ).
Рак предстательной железы (РПЖ) относится к одному из наиболее распространенных онкологических заболеваний мужчин среднего и пожилого возрастов в развитых странах.
Использование простатоспецифического антигена /ПСА/ сыворотки крови для диагностики РПЖ до сих пор является «золотым стандартом». Однако высокий уровень ложноотрицательных и ложноположительных результатов при его использовании, широкое разнообразие изоформ ПСА являются трудной проблемой диагностики РПЖ, требующей решения [Stamey Т. Preoperative serum prostate specific antigen levels between 2 and 22 ng/ml correlate poorly with post-radical prostatectomy cancer morphology: prostate specific antigen cure rates appear constant between 2 and 9 ng/ml. / T. Stamey, I. Johnstone, J.E. McNeal et al. // J. Urol. - 2002. - 167. - P. 103-111; Carling P. Targeting alternative splicing in prostate oncology / P. Carling, D. Elliott, C.N. Robso, et al. // Discov Med. - 2009. - 8 (41). - Р.74-80].
Таким образом, обладая органоспецифичностью, ПСА не является специфически опухолевым маркером. Нередки случаи выявления РПЖ или его рецидива и при низком уровне ПСА.
В 1999 г. в исследовании C.R. Pound [Pound C.R. Natural history of progress on after PSA elevation following radical prostatectomy./ C.R. Pound, A.W. Partin, R.A. Eisenberg // J.A.M.A. - 1999. - P. 1591-11597] было показано, что ни у одного больного рецидивы не диагностируются без сопутствующего повышения ПСА. С тех пор изолированное повышение этого маркера без клиникодиагностических признаков опухоли стали расценивать как ПСА-рецидив или так называемый биохимический рецидив. Биохимический рецидив регистрируется у 1/3 больных РПЖ, подвергнутых радикальному лечению.
Современные методы диагностики, как правило, не позволяют визуализировать источник маркера. Кинетика ПСА и характеристики первичной опухоли являются основными факторами, позволяющими заподозрить местное рецидивирование или метастазирование аденокарциномы у больных с ПСА-рецидивом. [Матвеев В.Б, Волкова М.И. Биохимический рецидив рака предстательной железы после радикального лечения, 03.2010, http://urotoday.ru/article/id-104]. Определения биохимического рецидива после разных методов радикального лечения существенно различаются. С целью стандартизации определения ПСА-рецидива после радикальной простатэктомии (РПЭ) предлагались различные пограничные значения маркера. Для подтверждения возникновения БР чаще всего необходимо как минимум двукратное определение уровня сывороточного ПСА. Временной интервал до развития БР и скорость повышения уровня ПСА оказывают определяющее влияние на особенности рецидива. Так, в случаях распознанного БР более чем через 2 года с момента начала радикального лечения и при повышении в два раза уровня ПСА (PSA doubling time (PSADT)) за ≥12 мес можно предположить локальный рецидив заболевания. В случае быстрого развития БР (до двух лет после РПЭ) и удвоения уровня ПСА наиболее вероятен системный рецидив. Частота развития БР довольно высока и составляет от 19 до 75% [Stephenson A.J. Defining biochemical recurrence of prostate cancer after radical prostatectomy: a proposal for a standardized definition. / A.J. Stephenson, M.W. Kattan, J.A. Eastham et al. // J Clin Oncol. - 2006. - 24(24). - P. 3973-3978]
Согласно рекомендациям Американского общества терапевтической радиологии и онкологии (ASTRO) критерием биохимической прогрессии после наружной лучевой терапии являются 3 последовательных повышения уровня ПСА. В соответствии с новым подходом началом рецидива считается повышение уровня ПСА ≥2 нг/мл относительно надир уровня ПСА, независимо от его значения [Roach M. 3rd Defining biochemical failure following radiotherapy with or without hormonal therapy in men with clinically localized prostate cancer: recommendations of the RTOG-ASTRO Phoenix Consensus Conference / M. Roach, G. Hanks, H. Jr. Thames et al. // Int. J. Radiat. Biol. Phys. 2006. Vol.65. - P. 965-974] Этот критерий начали применять независимо от проведения гормональной терапии. После лучевой терапии ПСА-рецидив выявляют при повышении его концентрации на 2 нг/мл по сравнению с достигнутым минимальным значением маркера (надиром). Благоприятные характеристики БР позволяют придерживаться принципа активного контроля, который оправданно используется в группе пациентов с начальными стадиями РПЖ [Переверзев А.С.Биохимический рецидив после куративной терапии рака предстательной железы. / А.С. Переверзев // Онкоурология. - 2012. - №2 (4). - С.10-14].
Можно однозначно утверждать, что уровень ПСА и динамика его изменений на сегодня являются основными предикторами прогнозирования благоприятных или неблагоприятных событий после разных стратегий лечения рака предстательной железы. Однако с учетом очевидных недостатков данного маркера, главным образом, выражающиеся в малой его специфичности представляется актуальным поиск новых, более специфических предикторов диагностики и мониторирования заболевания.
1. Pinover и соавт. разработали алгоритм выбора лечебной тактики при ПСА-рецидиве после лучевой терапии (ЛТ), принятый во многих клиниках мира. Пациентам со временем удвоения ПСА >12 мес, надиром ПСА <1,5 нг/мл и суммой Глисона <7 может быть рекомендовано динамическое наблюдение; также под тщательным наблюдением могут находиться информированные пациенты с суммой Глисона 7-10. Во всех остальных случаях предпочтительным методом является паллиативная гормонотерапия (ГТ). Таким образом, ГТ рекомендуется больным, не подходящим для проведения радикального спасительного лечения и динамического наблюдения. В настоящее время к данной категории относится 92% случаев рецидивирования РПЖ после облучения. [Матвеев В.Б., Волкова М.И. Биохимический рецидив рака предстательной железы после радикального лечения // 03.2010, http://urotoday.ru/article/id-104].
До настоящего времени не обнаружены маркеры, позволяющие прогнозировать возникновение рецидива после проведенного лечения РПЖ. Необходимо создание предсказательных моделей, позволяющих выделить категории пациентов с благоприятным прогнозом, по отношению к которым более уместной будет выжидательная тактика, и с предположительно неблагоприятным течением опухолевого процесса и высоким риском неблагоприятного исхода заболевания, в отношении которых оправдана агрессивная лечебная тактика.
Известен способ (патент РФ№2224463, 27.02.2004) выявления местного рецидива рака предстательной железы после радикальной простатэктомии путем определения простатического специфического антигена и трансректального ультразвукового исследования с последующим анализом эхотомографических изображений, отличающийся тем, что трансректальное ультразвуковое исследование проводят при величине простатического специфического антигена 0,2 нг/мл и более; если величина простатического специфического антигена не выходит за пределы 0,2 нг/мл, то трансректальное ультразвуковое исследование проводят не позднее 8 месяцев после радикальной простатэктомии, а далее не реже 1 раза в 3 месяца, выполняя его в режиме энергетического картирования с последующей трехмерной ангиографией, анализ эхотомографических изображений осуществляют с последовательным угловым смещением их до 360° с шагом 5-15 и при обнаружении хотя бы на одном из полученных изображений зоны патологической васкуляризации судят о начальных признаках местного рецидива.
Недостаток данного способа заключается в малой специфичности ПСА и в отсутствие массового внедрения сложных методов визуализации.
Известен способ прогнозирования локального рецидива опухоли предстательной железы после радикальной простатэктомии по патенту РФ №2275861, (10.05.2006), включающий оценку клинико-лабораторных факторов риска рецидивирования, отличающийся тем, что в дооперационный период определяют возраст больного, наличие тяжелой сопутствующей легочной патологии; клиническую стадию опухоли, прорастание капсулы простаты при пальцевом ректальном исследовании; локализацию опухоли в центральной зоне простаты при ультразвуковом исследовании; прорастание капсулы простаты при ультразвуковом исследовании; наличие у больного ближайших родственников, страдающих раком предстательной железы; наличие у больного ближайших родственников, страдающих раком иной локализации; рассчитывают показатель риска локального рецидива по формуле:
P=(0,046·AGE)+(1,01·SOPUTST)+0,45·(KLINT)+(1,78·PERRECT)+(0,65·TRUZI 1)+(0,74·TRUZI 2)+(0,87·RELATIV 1)+(0,05·RELATIV 2),
где AGE - возраст больных (кол-во лет);
SOPUTST - наличие тяжелой сопутствующей легочной патологии: 0 - нет, 1 - есть;
KLIN Τ - клиническая стадия опухоли: 1 - Т1; 2 - Т2; 3 - Т3,
PERRECT - прорастание капсулы простаты при пальцевом ректальном исследовании: 0 - отсутствует; 1 - имеется;
TRUZI 1 - локализация опухоли простаты в центральной зоне простаты при трансректальном ультразвуковом исследовании: 0 - отсутствует; 1 - имеется;
TRUZI 2 - прорастание капсулы простаты при трансректальном ультразвуковом исследовании: 0 - отсутствует; 1 - имеется;
RELATIV 1 - наличие у больного ближайших родственников, страдающих раком предстательной железы: 0 - отсутствуют; 1 - имеются;
RELATIV 2 - наличие у больного ближайших родственников, страдающих раком иной, нежели простата, локализации: 0 - отсутствуют; 1 - имеются и при значениях Р>0 прогнозируют риск локального рецидива в течение пяти лет.
Недостаток способа состоит в том, что приведенные в формуле параметры обладают малой специфичностью, при этом, определение прорастания капсулы простаты при пальцевом исследовании является достаточно неточным методом.
Известен способ прогнозирования локального рецидива опухоли предстательной железы после радикальной простатэктомии [Horiguchi А, Prediction ofextraprostatic cancer by prostate specific antigen density, endorectal MRJ, and biopsy Gleason score in clinically localized prostate canser. / A.J. Horiguchi, J. Nakashima, Y. Horiguchi et al. // Prostate. - 2003. - 56(1). - 23-29]. Факторами, наиболее информативными в отношении предсказания появления локального рецидива опухоли предстательной железы, являются: процент (%) позитивных биопсийных столбиков, дооперационный уровень простатического специфического антигена (ПСА), степень злокачественности опухоли предстательной железы при трансректальной (TP) биопсии простаты (сумма Глисона).
Недостатки данного способа состоят в следующем:
1. Осуществляется изолированная оценка факторов риска возникновения локального рецидива опухоли предстательной железы после радикальной простатэктомии.
2. Не учитывается индивидуальная клиническая значимость каждого фактора риска.
3. Не проводится оценка вероятности появления локального рецидива опухоли в числовом эквиваленте.
4. Отсутствует возможность определить степень риска рецидива до операции.
Известен способ прогнозирования пятилетней безрецидивной выживаемости больных раком предстательной железы после радикальной простатэктомии по патенту РФ №2351285, (10.04.2009), заключающийся в том, что дооперационно определяют степень дифференцировки новообразования по результатам мультифокальной биопсии простаты, а после радикальной простатэктомии определяют следующие показатели: патоморфологическую стадию рака предстательной железы, степень злокачественности новообразования по шкале Глисона, наличие позитивного хирургического края, прорастание опухолью простаты в семенные пузырьки и метастазы в подвздошные лимфатические узлы, а затем рассчитывают показатель пятилетней безрецидивной выживаемости по формуле
D=-0,72·B+0,08·T+0,08·G+8,0·S+0,47·V+0,47·L.
Недостатки: перечисленные методы оказались недостаточно специфичными, трудно воспроизводимыми и не нашли до настоящего времени клинического применения [Злокачественные новообразования в России в 2002 году. Заболеваемость и смертность. / Ред. В.И. Чиссов, В.В. Старинский, Г.В. Петрова, М., Из-во "МЕДпресс-информ". 2004. С. 5-22].
Известен способ прогнозирования рецидива ракового заболевания, по патенту РФ №2471191, (27.12.2012), характеризующийся тем, что перед и после операции по удалению саркомы мягких тканей у мужчин и женщин проводят биохимическое определение уровня креатинкиназы в крови больного; при показателе фермента до и после операции в пределах нормы для мужчин и женщин прогнозируют длительный безрецидивный период, а при уровне фермента, значительно превышающем норму после операции, прогнозируют появление рецидива в ближайшие месяцы после операции.
Недостатки: метод для рака простаты не может быть использован с высокой точностью и специфичностью, так как львиная доля РПЖ это опухоль из эпителия протоков ацинарных желез.
Известен способ прогнозирования вероятности биохимической процессии (рецидив ПСА) после радикальной простатэктомии (номограммы Kattan) с учетом оценки лимфоваскулярной инвазии, коррелирующей со степенью злокачественности опухоли по шкале Глисона, наличием фокальной или протяженной экстракапсулярной экстензии и вовлечения в опухолевый процесс семенных пузырьков [Herman С.М. Lymphovascular invasion as a predictor of disease progression in prostate cancer/ Herman СМ., Wilcox G.E., Kattan M.W. et al. // Am. J. Surg. Pathol. - 2000. - Vol. 24, 6. - P. 859-863]. Данный метод принят нами за прототип.
К недостаткам данного метода, как и для всех микроскопических методов, можно отнести относительно высокий фактор субъективности оценки наблюдаемой картины. Биопсия простаты, особенно на ранних стадиях развития РПЖ зачастую не имеет возможности дать объективную гистологическую картину опухолевого процесса простаты, и требует повторных болезненных процедур.
Задачей изобретения является создание способа прогнозирования биохимического рецидива после гормонолучевой терапии опухоли предстательной железы, позволяющего на дооперационном этапе проводить комплексную оценку наиболее информативных факторов риска в числовом эквиваленте, учитывая индивидуальную клиническую значимость каждого фактора риска.
Поставленная задача решается предлагаемым способом прогнозирования риска развития биохимического рецидива у больных РПЖ после гормонолучевой терапии путем исследования биологического материала, отличающийся тем, что пациенту с РПЖ проводят биопсию ПЖ и в ядрах эпителиальных клеток ПЖ иммуногистохимическим способом определяют экспрессию рецепторов с антителами к AT2-R опухолевых клеток, подсчитывают долю иммунопозитивных клеток от общего числа опухолевых клеток в поле зрения микроскопа ×40 и при значениях этой доли менее 0,7 прогнозируют возникновение биохимического рецидива рака ПЖ.
Новым техническим результатом предлагаемого способа является то, что он позволяет с высокой точностью осуществлять прогнозирование биохимического рецидива РПЖ после гормонолучевой терапии за счет использования определения доли иммунопозитивных клеток от общего числа опухолевых клеток в тканях предстательной железы. Метод доступен и воспроизводим.
Несмотря на совершенствование технических приемов удаления простаты и новые подходы в радиологической терапии, уровень рецидивирования РПЖ остается высоким. Согласно большинству опубликованных сообщений, которые обобщают отчеты по многим выполненным оперативным вмешательствам, частота возникновения рецидивов, наблюдаемых на протяжении пяти лет после операции, составляет более 30% [Переверзев А.С. Биохимический рецидив после куративной терапии рака предстательной железы. / А.С. Переверзев // Онкоурология. - 2012. - №2 (4). - С. 10-14]. Некоторые специалисты предлагают проводить мультифокальную биопсию простатического ложа с целью морфологического подтверждения местного рецидива. Так, Е.И. Велиев и Р.И. Гуспанов (2011) выполнили мультифокальную биопсию везико-уретрального анастомоза у 43 больных под трансректальным ультразвуковым контролем. Подтверждено наличие опухолевого рецидива у 40% больных. Авторы не испытывали осложнений при проведении этого исследования и ратуют за его эффективность [Велиев Е.И., Гуспанов Р.И. Мультифокальная биопсия простатического ложа при биохимическом рецидиве после радикальной простатэктомии: новые перспективы. В кн.: Материалы IV Конгресса Рос. об-ва онкоурологов. - М., 2011: 61-62]. Биопсия простатического ложа проведена из шейки мочевого пузыря, стриарного сфинктера и ложа предстательной железы. Большинству пациентов выполнена 12-польная биопсия.
Рост концентрации ПСА, т.е. БР, однозначно предшествует клиническому и радиологическому прогрессированию. Считается, что ПСА не должен определяться в сыворотке крови спустя 3 нед после РПЭ [Stamey Т.А. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. II Radical prostatectomy treated patients / T.A. Stamey, J.N. Kabalin, J.E. McNeal // J. Urol. - 1989. - 141(5). P. 1076-1083]. Впрочем, необходимо отметить, что незначительные колебания величины этого маркера доказывают возможность оставшихся доброкачественных аденоматозных клеток в ограниченном объеме продуцировать ПСА. Именно этим объясняется тот факт, что не всякий ПСА-рецидив может закончиться развитием клинически значимой опухоли. Основными факторами прогноза БР являются патологическая степень распространенности опухоли, количество баллов по шкале Глисона и дооперационный уровень ПСА. Для выработки дальнейшей тактики лечения биохимического рецидива РПЖ необходимо отдифференцировать местный рецидив заболевания от генерализации процесса.
Действие ангиотензина II осуществляется по меньшей мере через два различных типа рецепторов, получивших название AT1 и AT2-R. В литературе имеются немногочисленные и довольно противоречивые данные о функционировании этих рецепторов в предстательной железе в норме и патологии. Так, O′Mahony et al. (2005) сообщили о преимущественной локализации ATI в железистом эпителии a Dinh et al. (2002) привели убедительные доказательства наличия их экспрессии в стромальных гладкомышечных клетках периуретрального пространства, что было подтверждено иммуногистохимической реакцией на гладкомышечный актин. Ангиотензин II функционирует путем взаимодействия с двумя типами рецепторов на мембранах клеток - AT1 и AT2-R. О распределении AT1 в ткани предстательной железы в литературе имеются некоторые сведения [Dinh D.T. Evidence for activation of the renin-angiotensin system in the human prostate: increased angiotensin II and reduced AT(1) receptor expression in benign prostatic hyperplasia / D.T. Dinh, A.G. Frauman, G.R. Somers et al. // J. Pathol. - 2002. - Vol.196, N 2. - P. 213-219; O′Mahony O.A. Synthesis and Secretion of Angiotensin II by the Prostate Gland in Vitro / O.A. O′Mahony, S. Barker, J.S. Puddefoot, J.P. Vinson // Endocrinology. - 2005. - Vol.146. - P. 392-398; Uemura H. Antiproliferative activity of angiotensin II receptor blocker through cross-talk between stromal and epithelial prostate cancer cells / H. Uemura, H. Ishiguro, Y. Nagashima et al. // Mol. Cancer Ther. - 2005. - N 4. - P. 1699-1709]. Однако об AT2-R не известно практически ничего. В связи с этим мы оценили характер распределения рецепторов AT2R в ткани предстательной железы при ДТП и РПЖ различной степени дифференцировки. Во всех без исключения исследованных образцах ДТП нами выявлена ядерная экспрессия AT2-R в клетках эпителия предстательной железы. Иммуноокрашивание с антителами к AT2-R опухолевых клеток присутствует и в ядрах клеток эпителия предстательной железы при неопластических процессах.
Считается, что большинство эффектов ангиотензина II реализуется через активацию рецепторов AT1, тогда как рецепторы AT2-R являются негативными регуляторами сигнальных путей, зависимых от AT1. Показана экспрессия рецепторов AT2-R в ядрах эпителиальных клеток при ДГПЖ и опухолевых клеток при РПЖ [Чибичян М.Б. Новые канцерспецифичные маркеры крови и секрета простаты в диагностике и мониторинге рака предстательной железы: дис.… д-ра мед. наук / М.Б. Чибичян. - Ростов-на-Дону, 2014. - 316 с; Chow L. Role of the renin-angiotensin system in prostate cancer./ L. Chow, L. Rezmann, K. Catt // Mol. Cell. Endocrinol. - 2009. - 302(2). - P.219-229]. Поскольку интенсивность окрашивания анти AT2-R антителами для каждого конкретного случая одинакова по всей площади среза (гистологического препарата), иммуногистохимическую реакцию можно оценить по следующей схеме:
- подсчитать долю иммунопозитивных клеток от общего числа опухолевых клеток в поле зрения микроскопа ×40,
- при значениях этой доли менее 0,7 прогнозировать возникновение биохимического рецидива рака ПЖ.
Нашими исследованиями установлено, что у больных, в материале биопсий простаты которых была оценена экспрессия AT2-R, фактором риска развития биохимического рецидива являлось снижение доли с антителами к AT2-R опухолевых клеток до 0,7 и менее. При ДТП доля иммунопозитивных с AT2-R клеток всегда максимальна и равна 1.
Статистические данные (статистически значимые результаты теста Вальда; высокий R2, равный 0,754; показатель AUC, характеризующий качество математической модели и равный 0,929) свидетельствуют о том, что данная модель обладает высокой прогностической ценностью и информативно отражает вероятность биохимического рецидива в зависимости от значения AT2-R. Чувствительность теста составляет 87,5%, специфичность - 85,71%.
Подробное описание способа
Пункционную биопсию предстательной железы выполняют трансректальным доступом. Использовали многоплановый ректальный датчик частотой 7,5 МГц ультразвукового сканера СОНОМЕД-400 с направляющей биопсийной металлической насадкой, автоматическое устройство для биопсии предстательной железы фирмы Manan модели PRO-MAG 2,2L с иглами 16 или 18 калибра (16GA.TW × 20 cm, 18GA.TW × 20 cm) аналогичной фирмы-изготовителя с максимальной глубиной проникновения в ткань 22 мм.
Подготовка пациентов к пункционной биопсии простаты включает выполнение следующих процедур:
- беседа с пациентом и получение письменного согласия на биопсию;
- рекомендации относительно отмены антикоагулянтов, аспирина, нестероидных противовоспалительных препаратов за 2 недели до биопсии;
- за двое суток до биопсии простаты назначали пероральный прием препаратов фторхинолонового ряда (офлоксацин или ципрофлоксацин по 500 мг 2 раза в сутки) с продолжением антибиотикопрофилактики до 5 суток после процедуры;
- очистительная клизма накануне вечером и утром в день выполнения пункции как минимум за 3-4 часа до процедуры для обеспечения антисептики манипуляции и оптимальной визуализации при ТРУЗИ. Биопсию производили под местной анестезией, заключающейся в интраректальным введением 2% лидокаинового геля в количестве 10 мл за 15-20 минут до пункции, дополнительно внутримышечно вводились ненаркотические анальгетики.
Биопсию выполняют в положении больного на боку, с приведенными к животу ногами, после предварительной визуализации подозрительных очагов в простате с помощью разных режимов трансректального ультразвукового сканирования. Исходную локализацию кончика иглы в тканях и глубину ее проведения во время пункции в ткань предстательной железы контролировали на мониторе визуально. При выполнении биопсии периферических зон предстательной железы кончик иглы старались располагать в перипростатическом пространстве на границе с капсулой предстательной железы так, чтобы столбик биоптата содержал ткань простаты с капсулой и жировой клетчаткой, окружающей простату. При наличии показаний для выполнения биопсии переходной зоны кончик иглы проводили путем прокола под УЗИ-контролем через периферическую зону до границы с промежуточной, после чего, автоматическим движением иглы выполняли пункцию намеченного участка транзиторной зоны.
Всем пациентам на этапе первичного обследования биопсию выполняли по общепринятым схемам, включающих в себя: рандомизированную секстантную биопсию предстательной железы по парамедиальной линии попарно из правой (А) и левой (В) долей в условно определяемых верхушке (1), теле (2), основании (3) железы с обязательным включением в общую схему биопсии как минимум 2-4 латерализированных вколов (4-5). Решение о количестве биопсийных вколов принимали исходя из клинической картины, уровня ПСА, объема предстательной железы, результатов пальцевого ректального исследования, данных ультразвуковогог сканирования, возраста пациента и сопутствующих заболеваний. Количество вколов колебалось от 8-ми до 18 точек. По показаниям выполняли биопсию семенных пузырьков. Основная же часть первичных биопсий была выполнена по методике, предусматривавшей забор 12-ти биоптатов и латеропозицию при выполнении вколов.
Для светооптического и иммуногистохимического исследования биоптаты фиксируют в 10% забуференном (нейтральном) формалине в течение 24 часов. После стандартной проводки и заливки в парафин изготавливают серийные срезы толщиной 4 мкм, срезы монтируют на заряженные или покрытые неиммунным адгезивом (poly-L-lysin) предметные стекла. Для светооптического исследования срезы окрашивают гематоксилином и эозином, трихромом по Массону для выявления коллагена и ставят ШИК-реакцию.
Порядок описания биопсийного материала был следующим:
1. Сторона биопсийного образца (доля предстательной железы);
2. Присутствие простатической интраэпителиальной неоплазии;
3. Длина зоны поражения столбиков и их количество;
4. Индекс Глисона;
5. Присутствие экстракапсулярного прорастания;
6. Наличие периневральной инвазии;
7. Сосудистая инвазия;
8. Присутствие атрофии, доброкачественной гиперплазии предстательной железы, воспаления и т.д.
При выявлении простатической интраэпителиальной неоплазии, являющейся предраковым состоянием, использовали двухстепенную классификацию (простатическая интраэпителиальная неоплазия низкой и высокой степени).
Иммуногистохимический метод исследования.
Для иммуногистохимического исследования срезы, изготовленные с парафиновых блоков, помещали в термостат на 30 минут при температуре 56°С. Парафин удаляли с неостывших срезов инкубацией в пяти сменах ксилола. Длительность одной инкубации от 5 до 10 минут, затем срезы выдерживали в трех сменах абсолютного этанола по 3 минуты и помещали в дистиллированную воду. При необходимости высокотемпературной демаскировки антигенов в соответствии с протоколом срезы обрабатывали в соответствующем рекомендованном производителем первичных антител буферном растворе с определенным рН в водяной бане Pascal (DakoCytomation, Германия) в течение 20 минут при 950 С, затем промывали в буфере. Эндогенную пероксидазную активность подавляли специальным блокирующим раствором на основе перекиси водорода в течение 5-7 минут при комнатной температуре. Иммуногистохимические реакции проводили в автоматическом роботизированном аппарате для постановки иммуногистохимических реакций DakoAutostainer Plus (Германия) по следующему протоколу: обработка первичными антителами (15-30 минут, в соответствии с инструкцией к антителам), обработка вторичными антителами (30 минут), обработка субстрат-хромогеном (8 минут), окраска ядер гематоксилином Майера (5 минут). Использовали систему визуализации Dako EnVision System + Peroxidase (antirabbit, antimouse). В промежутках срезы промывали промывочным буфером трис-HCl, содержащим Triton-X, что снижает фоновое окрашивание и способствует проникновению растворов в ткань. В каждой постановке для каждого исследуемого антигена имелся отрицательный контроль, когда вместо первичных антител на срезы наносили буфер, а также положительный контроль - ткань, заведомо содержащую этот антиген.
Использовали первичные антитела Angiotensin Туре 2 Receptor (AT2-R), rabbit polyclonal, 1:100 (Abcam).
В работе использованы системы визуализации, промывочные и демаскировочные растворы производства Dako (Германия). Постановка иммуногистохимических реакций, интерпретация полученных результатов осуществлялись в соответствии с общепринятыми правилами (Dabbs, 2006).
Материалом для исследований служит биоптат ПЖ. Экспрессию АТ2-R определяют иммуногистохимическим способом, подсчитывая долю иммунопозитивных клеток от общего числа опухолевых клеток в поле зрения микроскопа ×40.
Максимальное значение уровня антител к AT2-R опухолевых клеток равно 1 и соответствует доброкачественной гиперплазии ПЖ. При значениях AT2-R менее 0,7 считают прогноз для конкретного пациента с таким показателем в плане вероятности возникновения биохимического рецидива неблагоприятным, пациента выделяют в группу риска.
Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами:
Пример 1
3
Больной К-ев, 77 лет. Диагноз: Рак предстательной железы cT3NxMo Индекс Глиссона 6(3+3). Ректально: простата плотной консистенции, неоднородна. Уровень ПСА - 12,7 нг/мл. Объем простаты (при ТРУЗИ) - 37 см. Биопсия простаты: аденокарцинома во всех биоптатах, поражение столбика в биоптате 70%, прорастает капсулу простаты. Доля иммунопозитивных с антителами к AT2-R опухолевых клеток - 0,9, что больше порогового значения 0,7, и позволяет оценить вероятность развития биохимического рецидива как низкую. Лечение: а-ЛГРГ, лучевая терапия. ПСА надир - 1,2 нг/мл (через 1 мес), далее, через 6 мес - 1,9 нг/мл, через 12 мес - 1,7 нг/мл. Биохимический рецидив отсутствует.
Таким образом, иммуногистохимический анализ такни простаты подтвердил низкую вероятность биохимического рецидива после гормонолучевого лечения, что имеет место у пациента.
Пример 2
1
3
Больной Ш-ов, 63 г. Диагноз: Рак предстательной железы cT3NxM Индекс Глиссона 9(5+4). Ректально: простата плотной, каменистой консистенции, прямая кишка над ней малоподвижна. Уровень ПСА - 31 нг/мл. Объем простаты (при ТРУЗИ) - 133 см. Биопсия простаты: аденокарцинома во всех биоптатах, поражение столбика в биоптате 100%, прорастает капсулу простаты насквозь. Доля иммунопозитивных с антителами к AT2-R опухолевых клеток - 0,6, что меньше порогового значения 0,7, и позволяет оценить вероятность развития биохимического рецидива как высокую. Лечение: билатеральная кастрация, лучевая терапия. ПСА надир - 2,2 нг/мл (через 1 мес), далее, через 6 мес - 10 нг/мл, через 12 мес - 70 нг/мл. Метастазы в кости таза. Биохимический рецидив, опухолевая прогрессия.
Таким образом, иммуногистохимический анализ такни простаты подтвердил высокую вероятность биохимического рецидива после гормонолучевого лечения, что и наблюдается у больного.
Пример. 3
3
Больной А-ев, 71 г. Диагноз: Доброкачественная гиперплазия предстательной железы. Ректально: простата резко увеличена, по аденоматозному типу, в правой доле узел. Уровень ПСА - 4,18 нг/мл. Объем простаты (при ТРУЗИ) - 108 см. Биопсия простаты: аденоматозно-мышечная гиперплазия, с участками фиброза. Доля иммунопозитивных с антителами к AT2-R опухолевых клеток максимальна и равна 1, что соответствует диагнозу доброкачественной гиперплазии простаты.
Нами исследован материал пункционных биопсий простаты 20 мужчин с РПЖ. Во всех случаях рак гистологически представлял аденокарциному. Первую группу составили 10 мужчин с местнораспространенным РПЖ (T3аN0 - у 7, T3бN1 - у 2, и у одного - T4N1, средний возраст 64,7±2,4 года, ПСА - 21,8±14,2 нг/мл). Все пациенты получали лучевую терапию и непрерывную гормональную терапию. Пациенты после начала лечения не имели БР. Вторую группу составили 10 мужчин с РПЖ (у 8 - T3aN0, у 2-х - рТ3аN0, через два года после РПЭ - M1, средний возраст 62,2±1,4 года, ПСА - 28,8±0,5 нг/мл) Пациенты получали лучевую терапию и непрерывную ГТ и у всех отмечался БР.
Контрольная группа - 10 мужчин с доброкачественной гиперплазией простаты.
Нами построена модель предсказания биохимической прогрессии в зависимости от значения AT2-R с использованием бинарной логистической регрессии. Данный метод статистического анализа позволяет работать с переменными, имеющими любой вид распределения, в том числе и качественными, а в виде зависимой переменной использовать дихотомически распределенную переменную.
Для оценки достоверности отличий и корреляционного анализа полученных рядов мы применяли непараметрические критерии: U-критерий Манна-Уитни и коэффициент корреляции Спирмена соответственно [Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Мир 1998] с использованием программного пакета Statistica 6.1. Достоверность заявляемого способа составила 95%.
Использование предлагаемого способа позволяет эффективно, с высокой точностью прогнозировать биохимический рецидив рака предстательной железы, в том числе при низких значениях ПСА. Стоимость проведения исследования согласно заявляемому способу составила две тысячи рублей на одного пациента.
Предлагаемый способ предполагает использование стандартных методик, проводится в амбулаторных условиях и может быть широко внедрен в клиническую практику.
Заявляемый способ прогнозирования биохимического рецидива РПЖ является промышленно применимым. Он может быть воспроизведен и многократно повторен в хирургических клиниках общей лечебной сети и специализированных лечебных учреждениях здравоохранения.