Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и современные методы их получения

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ ПРИКЛАДНОЙ БИОЛОГИИ И БИОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Н. С. Волкова, А. С. Ермаков

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки и современные методы их получения

Стволовые клетки и их типы

Стволовые клетки - клоногенные клетки, способные к самообновлению и дающие начало различным специализированным клеткам организма (Weissman, 2000). Имеют следующие отличительные характеристики: 1. Клоногенность (происхождение популяции клеток из одной). 2. Самообновление (способность к самовоспроизведению в недифференцированном состоянии). 3. Высокая потентность (способность клеток к дифференцировке в различные типы клеток) (Kolios, Moodley, 2013).

Тотипотентная клетка обладает самой высокой потентностью и способна сформировать организм, а также внезародышевые оболочки (Kolios, Moodley, 2013). Плюрипотентные клетки обладают меньшей потентностью, они способны дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков (эктодермы, мезодермы и эндодермы) и дают начало всем клеткам организма, включая половые клетки (Kolios, Moodley, 2013). Мультипотентные и олигопотентные клетки обладают меньшим потенциалом и способны дать начало клеткам в пределах одного зародышевого листка. (Ratajczak et al., 2012, Augello et al, 2010). Унипотентные клетки - предшественники клеток одного типа, имеют ограниченное число делений, это незрелые тканеспецифичные клетки (Kolios, Moodley, 2013, Dulak et al., 2015).

Стволовые клетки в зависимости от происхождения можно разделить на эмбриональные, взрослые и индуцированные.

Эмбриональные стволовые клетки - плюрипотентные стволовые клетки, выделенные из внутренней клеточной массы бластоцисты. В 1981 г. две группы исследователей впервые получили эмбриональные стволовые клетки мыши путем высаживания бластоцист на слой фидерных клеток (Martin, 1981, Evans, Kaufman, 1981). В 1998 г. группа исследователей во главе с Д. Томсоном впервые разработала метод выделения и культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток (Thomson et al., 1998), используя человеческие бластоцисты. Клетки обладали плюрипотентностью, при подсадке таких клеток имму-нодефицитным мышам образовывались тератомы, содержащие производные всех трех зародышевых листков (Thomson et al., 1998).

Взрослые стволовые клетки мульти-, олиго- или унипотентны, т. е. имеют довольно ограниченный дифференцировочный потенциал. Тка-неспецифичные стволовые клетки, необходимые для регенерации, возникают в течение онтогенеза и остаются в спокойном состоянии, пока местные раздражители не активируют их пролиферацию, дифференциацию или миграцию (Уоод е! а1., 2010).

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) -это репрограммированные дифференцированные клетки, которые приобретают характеристики эмбриональных стволовых клеток. В 2006 К. Такахаши и С. Яманака впервые получили индуцированные (репрограммированные) плюрипотентные клетки мыши (ТакаИаэМ, Уатапака, 2006), используя четыре репрограммирующих фактора: Ос!4, К^4, Бох2 и с-Мус, доставленных в ядро с помощью ретровирусных конструкций. В 2007 г. ими были получены индуцированные стволовые клетки человека (ТакаИаэЫ е! а1., 2007). Эти клетки были практически идентичны эмбриональным стволовым клеткам в плане морфологии, экспрессии генов, те-ломеразной активности, имели те же поверхностные антигены и были плюрипотентными (ТакаИаэЫ е! а1., 2007).

Перспективы практического применения иПСК

Как эмбриональные или взрослые стволовые клетки, так и иПСК могут быть использованы для моделирования болезней, скрининга лекарств, проверки токсичности препаратов. Важным применением является возможное использование этих клеток непосредственно в терапевтических целях для лечения пациентов с помощью клеточной терапии. Взрослые стволовые клетки, полученные от конкретного пациента, могли бы быть оптимальным типом клеток, поскольку в данном случае отсутствует риск иммунного отторжения, однако они имеют ограниченный дифференцировочный потенциал и, кроме того, их трудно выделить и быстро нарастить в достаточном для терапевтического использования количестве.

Эмбриональные стволовые клетки очень привлекательны для медицинского применения, они плюрипотентны и их можно нарастить практически в неограниченном количестве. Однако, для их получения необходимо разрушить человеческий эмбрион, что создает этические проблемы. Кроме того, в данном случае возможен риск иммунного отторжения (Тгоипэоп, 2006).

Важным преимуществом иПСК перед ЭСК является то, что они могут быть получены из клеток взрослого организма, а не из эмбриона, что, во-первых, решает этическую проблему, а во-вторых, позволит получать «родные» клетки без риска отторжения.

Но существуют и проблемы, связанные с возможным применением иПСК, и основная из них - потенциальная онкогенность иПСК, так как основные пути, обеспечивающие плюрипотентность эмбриональных стволовых клеток, частично совпадают с процессами при онкогенезе.

Еще одной важной проблемой было использование вирусов в качестве генетических векторов. иПСК, полученные с помощью генетических векторов, могут иметь непредсказуемые генетические дисфункции. Разработанный С. Яманака и его коллегами метод оказался неприемлимым для использования в практической медицине. Поэтому за прошедшие десять лет усилия исследователей были направлены на поиски альтернативных методов получения иПСК, более подходящих для практической медицины.

Основные методы получения индуцированных плюрипо-тентных стволовых клеток

Интеграционные методы:

Ретровирусные конструкции. К. Такахаши и C. Яманака, пионеры в области получения иПСК, определили четыре репрограммирующих фактора: Oct4, Klf4, Sox2 и c-Myc. Эти репрограммирующие факторы были доставлены ретровирусным вектором. Недостатками использования ре-тровирусного вектора являются потенциальная генетическая нестабильность клеток и его низкая внедряемость в неделящиеся клетки, т. е. невозможность его использования для репрограммирования неделя-щихся или медленно делящихся клеток (например, нейронов) (Takahashi, Yamanaka, 2006, Takahashi et al., 2007).

Лентивирусные конструкции. Также для доставки генного материала используются летивирусы, их особенностью является способность заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, что позволяет их использовать при перепрограммировании всех видов соматических клеток (Yu et al., 2007). Кроме того, они обладают большей вместимостью и менее подвержены иммунному ответу.

Общим недостатком использования вирусных векторов является сам принцип, при котором гены внедряются в геном клетки, что может повлечь появление мутаций (инсерционный мутагенез); эффективность репрограммирования сильно зависит от «эффекта положения», т. е. место, куда внедрился вирусный вектор, влияет на экспрессию закодированных в нем генов. Также снижению эффективности данного способа способствует естественный клеточный иммунитет, защищающий клетку от внедрения чужеродных генов.

Основной же проблемой использования интеграционных методов является высокий риск канцерогенеза. Существуют эпигенетические механизмы, «выключающие» гены плюрипотентности, что обеспечивает дальнейшую нормальную дифференцировку клеток. Эти же механизмы действуют и на гены, внедренные вирусными векторами. Однако, существует вероятность того, что внедренные гены, которые по сути являются онкогенами для соматических клеток и клеток, начавших процесс дифференцировки, будут продолжать экспрессироваться. В таком случае это приведет к развитию злокачественных опухолей из иПСК (Hotta, Ellis, 2008).

Неинтеграционные методы

Для решения проблемы инсерционного мутагенеза и снижения риска канцерогенеза были разработаны неинтеграционные методы, использующие векторы на основе аденовирусов и вируса Сендай.

В 2008 г. группа ученых во главе с С. Дунканом получила ИПСК неинтеграционным методом. В качестве вектора для доставки репрограм-мирующих факторов (Ос!4, Бох2, К^4, и с-Мус) был использован аденовирус. Аденовирусы способны переносить генетический материал как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, обеспечивают достаточно высокую экспрессию и, как правило, не встраиваются в геном клетки. Риск канцерогенеза был сведен к минимуму, но эффективность данного метода оказалась намного ниже, чем эффективность при использовании интеграционных векторов (Б1а^е№ е! а1., 2008).

В 2009 г. Н. Фузаки и коллеги получили иПСК, используя вектор на основе вируса Сендай (Риэак е! а1., 2009). Вирус Сендай содержит РНК, и, следовательно, не сможет встроиться в геном клетки. При использовании вектора на основе вируса Сендай довольно трудно было убрать вектор по завершении репрограммирования. И хотя вирус спонтанно утрачивается в процессе деления клеток, необходимо применение дополнительных процедур по селекции иПСК либо модификация векторов. Основным препятствием для использования таких векторов остается низкая эффективность репрограммирования.

Плазмиды. Еще одним неинтеграционным методом является использование плазмид (небольших кольцевых молекул ДНК) для доставки репрограммирующих факторов. Использование плазмид - довольно простой, доступный метод. Применение плазмид позволяет избежать интеграции в геном, однако в первых экспериментах, проведенных К. Окита, была обнаружена интеграция плазмидного вектора в геном клетки. Оптимизация протокола позволила избежать интеграции экзогенной ДНК (ОкИа е! а1., 2008). В 2010 г. другая группа ученых также получила иПСК, используя плазмидный вектор. Проведенные анализы показали отсутствие внедренной плазмидной ДНК в геном иПСК (БМауеЬ е! а1., 2010). Недостатком использования плазмид является низкая эффективность репрограммирования.

Современные альтернативные методы

Искуственные хромосы. Обладают большой вместимостью и сохраняются при делении клетки. Экспрессия генов, внедренных с использование искусственных хромосом, гораздо более стабильна и менее зависит от эффекта положения. М. Хирацука и коллеги разработали искусственную хромосому, содержащую ДНК, в которой закодированы 4 репрограммирующих фактора: К^4, с-Мус, Бох2 и Ос!4, а также ген, «выключающий» белок р-53 (Н^эика е! а1., 2011). Белок р53 является опухолевым супрессором, он также выполняет множество других функций,

например, принимает участие в дифференцировке и регуляции клеточного цикла; в данном случае его «отключение» позволяет повысить эффективность репрограммирования. Недостатками этого метода является сохранение возможности интеграции внедренных генов в геном клетки, довольно низкая эффективность метода и возможные отрицательные последствия подавления белка р53 в процессе репрограммирования.

мРНК. Метод, разработанный Л. Варрен и коллегами, заключается в периодическом введении в культуру соматических клеток синтетической мРНК, кодирующей 5 репрограмирующих факторов (KLF4, c-MYC, OCT4, SOX2, LIN28) (Warren et al., 2010). Основной проблемой использования экзогенной мРНК является слишком быстрая ее деградация и необходимость периодического введения синтетической мРНК, что может привести к повреждению клеток.

Использование рекомбинантных репрограммирующих белков

Доставка белков в клетку может быть осуществлена как инвазивны-ми методами (микроинъекция, электропорация), так и неинвазивным методом (создание рекомбинантного белка, путем присоединения к исходному белку короткого катионного пептида, способного проникать через клеточную мембрану). Использование неинвазивного метода очень привлекательно, так как не повреждает клетки и не требует специального оборудования. Х.Чжоу и его коллеги разработали метод получения иПСК с помощью внедрения в клетки рекомбинантных белков, в которых полиаргинин (выполняющий транспортную функцию) связан с С-концевыми доменами 4 репрограммирующих факторов Oct4, Sox2, Klf4, и c-Myc (Zhou et al., 2009).

Риск инсерционного мутагенеза отсутствует, но эффективность данного метода является низкой. Сам процесс репрограммирования довольно длительный и содержит несколько циклов внедрения, также при использовании данного метода необходимо получать достаточное количество хорошо очищенного рекомбинантного белка.

Использование смесей («коктейлей») низкомолекулярных соединений для получения иПСК

В последние годы растет интерес к использованию малых молекул для репрограммирования соматических клеток и получения иПСК. Надежду на разработку таких методов дает факт существования в цитоплазме яйцеклетки факторов, приводящих к репрограмированию пересаженного ядра. Некоторые низкомолекулярные соединения повышают эффективность репрограммирования, а некоторые из них, либо их комбинации, могут функционально заменить транскрипционные факторы. Исследователями были предприняты попытки получить иПСК путем использования лишь низкомолекулярных соединений (Lin, Wu, 2015, Hou et al., 2013).

В 2013 г. группе П. Хоу и коллегам удалось получить мышиные иПСК (Hou et al., 2013), подобрав молекулы, заменяющие действие четырех транскрипционных факторов. С помощью «коктейля» из 7 низкомолекулярных соединений они получили линию иПСК из мышиных фибробластов. Основным недостатком такого подхода является сложная трехступенчатая процедура обработки клеток комбинациями из малых молекул.

Однако пока не удается подобрать «коктейль» из малых молекул для получения человеческих иПСК, вероятно, из-за большей сложности молекулярных процессов, происходящих при репрограммировании клеток у человека (Lin, Wu, 2015).

Заключение

Бурное развитие фундаментальной биологии в последние десятилетия идет в тесном взаимодействии с разработкой новых медицинских технологий. Плюрипотентные стволовые клетки дают нам большие надежды на создание новых методов клеточной терапии и их внедрение в медицинскую практику. Особенно перспективны для практического применения в медицине индуцированные плюрипотентные клетки (иПСК), так как они могут быть получены индивидуально для каждого пациента и, кроме того, для их получения не нужно разрушать человеческий эмбрион.

Классический метод получения иПСК с помощью введения в клетки ретровирусных генетических конструкций потенциально может привести к генетической нестабильности клеток. В настоящее время разрабатываются альтернатиные методы получения иПСК. Наиболее перспективной, с нашей точки зрения, является разработка методов репрограммирования сомтических клеток в иПСК с помощью мРНК и подбора смесей («коктейлей») малых молекул, так как в данных случаях не нарушается геном клеток, и риск генетической нестабильности исключен.

Список литературы

1. Augello A, Kurth TB, De BC: Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches. EurCell Mater 2010; 20: 121-133.

2. Bayart E, Cohen-Haguenauer O.Technological Overview of iPS Induction from Human Adult Somatic Cells. Curr Gene Ther. 2013; 13(2): 73-92.

3. Dulak J, Szade K, Szade A, Nowak W, Jozkowicz A. Adult stem cells: hopes and hypes of regenerative medicine. Acta Biochim Pol. 2015;62(3):329-37.

4. Fusaki N, Ban H, Nishiyama A, Saeki K, Hasegawa M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2009;85(8):348-62.

5. Hiratsuka M, Uno N, Ueda K, Kurosaki H, Imaoka N, Kazuki K, Ueno E, Akakura Y, Katoh M, Osaki M, Kazuki Y, Nakagawa M, Yamanaka S, Oshimura M. Integration-free iPS cells engineered using human artificial chromosomevectors. PLoS One. 2011;6(10):e25961.

6. Hou P, Li Y, Zhang X, Liu C, Guan J, Li H, Zhao T, Ye J, Yang W, Liu K, Ge J, Xu J, Zhang Q, Zhao Y, Deng H. Pluripotent stem cells induced from mouse somatic cells by small-molecule compounds. Science. 2013;341(6146):651-4.

7. Hotta A, Ellis J. Retroviral vector silencing during iPS cell induction: an epigenetic beacon that signals distinct pluripotent states. J Cell Biochem. 2008;105(4):940-8.

8. Kolios G, Moodley Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 2013;85(1):3-10.

9. Lin T, Wu S.Reprogramming with Small Molecules instead of Exogenous Transcription Factors. Stem Cells Int. 2015;2015:794632.

10. Martin GR. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 1981;78(12):7634-8.

11. Okita K, Nakagawa M, Hyenjong H, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of mouse induced pluripotent stem cells without viral vectors. Science. 2008;322(5903):949-53.

12. Ratajczak MZ, Zuba-Surma E, Kucia M, Poniewierska A, Suszynska M, Ratajczak J: Pluripotent and multipotent stem cells in adult tissues. Adv Med Sci. 2012; 57: 1-17.

13. Si-Tayeb K, Noto FK, Sepac A, Sedlic F, Bosnjak ZJ, Lough JW, Duncan SA. Generation of human induced pluripotent stem cells by simple transient transfection of plasmid DNA encoding reprogramming factors. BMC Dev Biol. 2010;10:81.

14. Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, Weir G, Hochedlinger K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science. 2008;322(5903):945-9.

15. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S: Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007; 131: 861-872.

16. Takahashi K, Yamanaka S: Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 2006; 126: 663-676.

17. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, Marshall VS, Jones JM. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 1998;282(5391):1145-7.

18. Trounson A. The production and directed differentiation of human embryonic stem cells. Endocr Rev. 2006;27(2):208-19.

19. Voog J, Jones DL: Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell 2010; 6: 103-115.

20. Warren L, Manos PD, Ahfeldt T, Loh YH, Li H, Lau F, Ebina W, Mandal PK, Smith ZD, Meissner A, Daley GQ, Brack AS, Collins JJ, Cowan C, Schlaeger TM, Rossi DJ. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 2010 Nov 5;7(5):618-30.

21. Weissman IL Stem cells: units of development units of regeneration and units in evolution. Cell. 2000; 100: 157-168).

22. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane JL, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 2007;318(5858):1917-20.

23. Zhou H, Wu S, Joo JY, Zhu S, Han DW, Lin T, Trauger S, Bien G, Yao S, Zhu Y, Siuzdak G, Schöler HR, Duan L, Ding S. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 2009;4(5):381-4.