Исследование адсорбции бактериофага фаb-sp7 на клеточной поверхности Azospirillum brasilense Sp7

препаратов при исследовании их в 5 повторностях. Показано, что взаимодействие тест-системы с препаратами гетерологичных вирусов и неинфицированными клетками/тканями было на уровне фона. При этом коэффициент вариации между лунками на планшете составил 2-4%, между отдельными планшетами он не превышал 4%, что свидетельствует о высокой чувствительности и специфичности сэндвич-ИФА.

На следующем этапе оценивали возможность разработанной тест-системы выявлять искомый антиген в биологическом материале.

Сравнительная оценка обнаружения 1РКУ-антигена методами ИФА, РН и обратнотранскриптазной ПЦР (ОТ-ПЦР) представлена в табл. 2.

Полученные данные позволяют утверждать, что разработанная тест-система специфично выявляет 1РКУ в нативной и лиофилизированной культуральной жидкости зараженных клеток, а также в биологическом материале от естественно и искусственно инфицированных рыб.

При сравнительном исследовании материала тремя методами на наличие вируса ГРК отмечена корреляция показателей. Однако при исследовании в РН биологического материала (гомогенизированных органов форели) результат был получен через 10 дней одновременно с выделением вируса в культуре клеток, что, несомненно, увеличивает время диагностики. При исследовании положительных образцов методом ПЦР во всех случаях был обнаружен 1РКУ, в пробах, отрицательных по результатам ИФА и РН, вирус не обнаруживали. Полученные данные подтверждают специфичность испытанных реакций.

Таким образом, нами разработана тест-система на основе сэндвич-ИФА, в которой в качестве антигенсвя-зывающих и антигендетектирующих антител были использованы кроличьи антитела к вирусу 1Р№ Диагно-стикум позволяет специфично выявлять 1РКУ в титре 1020ТЦД50/см3 и выше, при этом данные положительно коррелируют с результатами, полученными в РН и ОТ-ПЦР, следовательно, разработанная тест-система может быть применена для выявления 1РКУ при скрининговых исследованиях или в дополнение к другим диагностическим методам.

ЛИТЕРАТУРА

5. Гулюкин М.И., Завьялова Е.А., Дрошнев А.Е., Коломыцев С.А. Анализ эпизоотической ситуации по болезням рыб в России (2001-2011 гг.). Ветеринария. 2011; 8: 3-7.

6. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У, Джонс К. Справочник биохимика. М.: Издательство «Мир»; 1991.

7. Северин С.Е., Соловьева Г.А., ред. Практикум по биохимии. М.: Издательство МГУ; 1989.

10. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Издательство «Наука»; 1985.

REFERENCES

1. Johansen L.H., Sommer A.I. Infectious pancreatic necrosis virus infection in Atlantic salmon Salmo salar post-smolt affects the outcome of secondary infectiouns with infectious salmon anaemia virus or Vibrio salmonicida. Dis. Aquat. Organ. 2001; 47(2): 109-17.

2. Pedersen T., Skjesol A., J0rgensen J.B. VP3, a structural protein of infectious pancreatic necrosis virus, interact with RNA-depended RNA polymerase VP1 and with double-stranded RNA. J. Virol. 2007; 81(12): 6652-63.

3. OIE Manual of diagnostic tests for aquatic animals. 5th edition. 2006.

4. Evensen 0., Skjelstad B., Rimstad E., Brun E., Johansen L.H., Stagg R. et al. IPN in salmonids. A review. The Fisheriers and Aquaculture Industries Research Fund (FHF); 2003.

5. Gulyukin M.I., Zav'yalova E.A., Droshnev A.E., Kolomytsev S.A. The analysis of epizootic diseases offish in Russia

6. Doson R., Elliot D., Elliot U., Dzhons K. Handbook of Biochemist [Spravochnik biokhimika]. Moscow: Izdatel'stvo «Mir»; 1991.

7. Severin S.E., Solov'eva G.A., eds. Workshop on Biochemistry [Praktikum po biokhimii]. Moscow: Izdatel'stvo MGU; 1989.

8. Wilson M.B., Nakane P.K. Recent development in the periodate method of conjugating horseradish peroxides (HRPO) to antibodies. In: Knapp W., Holubar K., Wick G., eds. Immunofluo-Rescence and Related Staining Techniques. Vienna, Austria: Elsevier/North-Holland; 1978; 215-44.

9. Van der Marel P., Snyder D.B., Lutticken D. Antigenic characterization of IBDV field isolates by their reactivity with a panel of monoclonal antibodies. Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 1990; 97(2): 81-3.

10. Osterman L.A. Chromatography ofProteins and Nucleic Acids [Khro-matografiya belkov i nukleinovykh kislot]. Moscow: Izdatel'stvo «Nauka»; 1985.

Поступила 13.03.14

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 578.81.083.2

Гулий о. И.1'3, Караваева о.А.1, великов в. А.14, Соколов о. И.1, Павлий С.А.4, Ларионова о.С.2, Буров А. М.1,

Игнатов о. в.1

ИССЛЕДОВАНИЕ АДСОРБЦИИ БАКТЕРИОФАГА ФАВ^Р7 НА КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ АZOSPIRILLUMBRASILENSE SP7

1ФГБУН «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов» РАН, Саратов; 2ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова»; 3ФГБНУ «Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт»; 4ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный университет им. Н. Г. Чернышевского»

Из клеток Azospirillum brasilense Sp7 выделен бактериофаг ФАЬ^р7. Описана его морфология, дана характеристика «негативных колоний» бактериального газона, определен диапазон литического действия в отношении других штаммов и видов азоспирилл. Выделена ДНК фага, проведен ее электрофоретический и рестрикционный анализ, определен размер генома, который составляет примерно 50 тыс. пар нуклеоти-дов. Проведено электронно-микроскопическое изучение адсорбции выделенного бактериофага ФАЬ^р7 на поверхности бактерий A. brasilense Sp7.

Ключевые слова: Azospirillum brasilense; бактериофаг; электрофорез; ДНК; электронная микроскопия; адсорбция.

Для цитирования: Вопросы вирусологии. 2016; 61(1): 45-48. DOI 10.18821/0507-4088-2016-61-1-45-48

Для корреспонденции: Гулий Ольга Ивановна, д-р. биол. наук, ведущий научный сотрудник; e-mail: guliy_olga@mail.ru

Guliy O.I.1'2'3, Karavaeva O.A.1, Velikov V.A.14, Sokolov O.I.1, Pavliy S.A.4, Larionova O.S.2, Burov A.M.1,

Ignatov O.V.1

A STUDY OF THE ISOLATED BACTERIOPHAGE OAB-SP7 ADSORPTION ON THE CELL SURFACE

OF THE AZOSPIRILLUM BRASILENSE SP7

1 Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Russian Academy of Sciences, 410049, Saratov, Russia; 2 Saratov State Vavilov Agrarian University, 410012, Saratov, Russia; 3 Scientific Research Veterinary Institute, 410028, Saratov, Russia; 4 Saratov State University, 410005, Saratov, Russia

The bacteriophage OAb-Sp7 was isolated from the cells of the Azospirillum brasilense Sp7. The morphology, size of the gram-negative colonies, and range of lytic activity against other strains and species of the genus Azospirillum was tested. The isolated phage DNA was examined using electrophoretic and restriction analysis, and the size of the genome were established. The electron microscopy results show that the phage (capsid) has a strand-like form. The electron microscopy study of the bacteriophage QAb-Sp7 adsorption on the A. brasilense Sp7 bacterial surface was performed.

Key words: Azospirillum brasilense; bacteriophage; DNA electrophoresis; electron microscopy; adsorption. Citation: Voprosy virusologii. 2016; 61(1): 45-48. (in Russian). DOI 10.18821/0507-4088-2016-61-1-45-48 For correspondence: Ol'ga Guliy, MD, PhD, DSc; e-mail: guliy_olga@mail.ru

Received 29.08.14

Чувствительность бактерий к бактериофагам является относительно стабильным признаком, связанным с наличием соответствующих рецепторов у фаговых частиц и комплементарных сайтов на поверхности бактериальной клетки. Поэтому изучение такого рода взаимодействий имеет большое значение для микробиологии и вирусологии в целом, а также существенное прикладное значение. Изучение взаимодействия бактериофагов с микробными клетками во многом основано на использовании световых, электронных, атомно-силовых и зондовых микроскопов. Например, для изучения взаимодействия фага сальмонелл с гомологичными микроорганизмами была применена криоэлектронная микроскопия, в результате которой показаны структурные изменения бактериофага Epsilon15 в процессе инфекции на всех ее этапах [1]. Методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) было изучено взаимодействие диагностических холерных бактериофагов со штаммами V. cholerae [2]. С. В. Краевским [3] показана возможность исследования процесса инфицирования фагом клеток бактерий и аффинных взаимодействий, в частности бактерий с гомологичными антителами с помощью АСМ. Для изучения взаимодействия бактериофагов и антифаговых антител с поверхностью клеток часто применяется электронная микроскопия [4].

Несмотря на то что история изучения взаимодействия бактериофагов с микробными клетками насчитывает несколько десятилетий, методов оценки адсорбции бактериофагов почвенных микроорганизмов с гомологичными клетками сравнительно мало [5]. К почвенным бактериям, способствующим росту растений, относятся и бактерии, принадлежащие к роду Azospirillum. К настоящему времени описаны умеренные бактериофаги, способные инфицировать бактерии рода Azospirillum. [6, 7]. Французскими исследователями [8] были выделены и описаны бактериофаги из 24 штаммов 4 видов бактерий, принадлежащих к роду Azospirillum. Важное место при выделении и изучении бактериофагов почвенных микроорганизмов занимают знания об особенностях их строения и адсорбции на поверхности микробной клетки. Поэтому целью данной работы был поиск и выделение бактериофага из культуры Azospirillum brasilense штамма Sp7 и изучение адсорбции выделенного бактериофага на клетке-хозяине с использованием электронной микроскопии.

Материал и методы

Микроорганизмы. В работе использовали клетки Azospirillum brasilense штаммов Sp7, Cd, Sp107, Br14, KR77, S27, SR55, Sr75, Sp245, Jm6B2, S17, A. lipoferum штаммов Sp59b, SR65, RG20a, A. brasilense Cd, A. amazonense Am14, A. halopraeferans Au4, A. irakense KBC1 и KA3, Escherichia coli XL-1, Pseudomonas putida C-11, Acinetobacter calcoaceticum A-122, полученные из коллекции культур ИБФРМ РАН.

Выделение бактериофагов. Суточную культуру клеток A. brasilense Sp7 охлаждали в течение 2 ч при 4°С. После

этого клетки осаждали центрифугированием при 2500g в течение 40 мин. Для флокуляции фаговых частиц к супер-натанту добавляли полиэтиленгликоль (ПЭГ) 6000 (Pan-reac) - 2,5 M в количестве 1/5 объема супернатанта и NaCl до концентрации 1,6 M, затем колбу с супернатантом обкладывали льдом и помещали в холодильник при 4°С на 18-20 ч. По прошествии указанного времени суспензию центрифугировали при 12 000g в течение 30 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 1 мл ТЕ-буфера (трис HCl, pH 8,0-10 мМ, EDTA - 1 мМ).

Морфологию негативных колоний бактерий, зараженных фагами, изучали при посевах методом агаровых слоев (метод Грациа) [9].

Диапазон литической активности и специфичность селектированных фагов определяли методом нанесения фага на газон гомологичных или гетерологичных бактериальных культур [9].

Электронная микроскопия. Для электронно-микроскопической идентификации выделенных бактериофагов из клеток A. brasilense Sp7 готовили препараты бактериофагов с концентрацией ~106 частиц/мл, как описано в работе [10]. Анализ препаратов проводили на электронном микроскопе Carl Zeiss Libra-120 (Германия).

Выделение фаговой ДНК и гель-электрофорез ДНК проводили с использованием стандартных методов [11].

Результаты и обсуждение

Нами были опробованы различные методики выделения бактериофагов из клеток A. brasilense Sp7, при этом в результате предварительно проведенных экспериментов было показано, что максимальный выход бактериофагов наблюдается после предварительной обработки клеток азоспирилл низкой температурой (4°C) в течение 2 ч. После выделения бактериофагов проводили их титрование методом агаровых слоев. Было установлено, что бактериофаг, выделенный из клеток A. brasilense Sp7 (ФАЬ^р7), на газоне индикаторного штамма A. brasilense Sp7 образует округлые, с ровным четким краем, прозрачные негативные колонии диаметром от 0,1 до 0,2 мм. Анализ газонов после длительного культивирования (до 5 сут) показал, что пятна остаются прозрачными на протяжении всего культивирования.

На следующем этапе работы проводили электрофорез ДНК бактериофага в агарозном геле (рис.1, а). В качестве контроля использовали ДНК бактериофага лямбда. По результатам электрофореза можно заключить, что бактериофаг ФАЬ^р7 является ДНК-содержащим (полоса четкая, продуктов деградации нет). Размер генома у выделенного бактериофага несколько меньше генома фага лямбда (48 тыс. пар нуклеоти-дов - тыс. п. н). Дополнительно проводили рестрикцию ДНК бактериофага, как описано [11], результаты которой показывают (рис. 1, б), что геном исследуемого бактериофага представлен дезоксирибонуклеиновой кислотой.

1234 1 2345678

-Л -

t—

Рис. 1. Электрофореграмма фаговой ДНК из бактериофага A. brasilense Sp7 (а): 1 - ДНК фага лямбда (48 502 п. н.); 2 - ДНК фага Sр7; 3 - маркер молекулярной массы (м. м.) GeneRuler SM0383 («Fermentas»); размер фрагментов ДНК начиная сверху: 1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 80 п. н.; 4 - маркер м. м. 500 п. н. (ПЦР-продукт гена неомицин-фосфотрансферазы nptII). Электрофореграмма рестрикции двумя ре-стриктазами бактериофага, выделенного из клеток A. brasilense Sp7 (б). 1 - ДНК фага лямбда (48 502 п. н.); 2 - ДНК фага Sp7; 3 - маркер м. м. GeneRuler SM0383 («Fermentas»); размер фрагментов ДНК начиная сверху: 1031, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 80 п. н.; 4 - ДНК фага Sp7, гидролизованная рестриктазой HindIII; 5 - ДНК фага лямбда, гидролизованная рестриктазой HindIII; 6 - ДНК фага Sp7, гидролизованная рестриктазой BamHI; 7 - ДНК фага лямбда, гидролизованная рестриктазой BamHI.

Рис. 2. Электронно-микроскопическое изображение бактерий A. brasilense Sp7 при взаимодействии с бактериофагом ФАЬ-Sp7. Масштаб 500 нм.

дуемый бактериофаг (из расчета ~ 20 фагов на бактерию), затем инкубировали при 27°С в течение 3 мин. Затем суспензию наносили на покрытые нитроцеллюлозой электронно-микроскопические сеточки и контрастировали препараты 1% уранилацетатом. На рис. 2 представлены результаты электронно-микроскопического исследования специфической адсорбции бактериофага ФАЬ^р7 на поверхности клеток Л. Ьга$Нете Sp7. Как видно, бактериофаги хорошо адсорбируются на поверхности клеток азоспирилл (рис. 2).

Для исключения неспецифического взаимодействия бактериофага ФАЬ^р7 было проведено электронно-микроскопическое исследование взаимодействия фага с клетками другого, не комплементарного, штамма. Поскольку было показано, что бактериофаг не проявляет активности в отношении клеток Л. ЬгаА'Иете штамма Jm6B2 (см. таблицу), то

Спектр литического действия бактериофагов, являющийся одним из важных биологических свойств вирусов, определяли для бактериофага ФАЬ^р7 по отношению к 18 штаммам бактерий рода Azospirillum. Показано, что бактериофаг ФАЬ^р7 вызывает лизис гомологичных фагу бактерий по серологической группе A. brasilense Sp7, Cd, Sp107, Br14, KR77, S27, SR55, A. lipoferum SR65, A. amazonense Am14, A. halopraeferans Au4, A. irakense штаммов KBC1 и KA3, но не проявляет активность в отношении клеток A. brasilense штаммов Sp245, Jm6B2, S17, SR75, A. lipoferum штаммов Sp59b и RG20a. Таким образом, бактериофаг ФАЬ^р7 является специфичным по отношению к некоторым видам бактерий рода Azospirillum. Анализ литической активности выделенного бактериофага по отношению к ге-терологичным бактериям родов: Escherichia, Pseudomonas, Acinetobacter дал отрицательные результаты. Результаты представлены в таблице.

Электронно-микроскопическое изучение препаратов бактериофага, выделенного из клеток A. brasilense Sp7, показало, что исследуемый фаг имеет изометрическую головку размером около 27 нм и хвостовой отросток длиной около 16 нм. Представленные нами результаты согласуются с данными, полученными другими исследователями [12].

Процесс взаимодействия фага с клеткой довольно сложен и зависит от строения самого фага [13, 14] и наличия у бактерий F-пилей [15, 16] и других факторов. Понимание особенностей взаимодействия бактериофагов с микробными клетками является необходимым условием для их успешного применения в прикладной микробиологии. Поэтому на следующем этапе проводили исследование адсорбции бактериофага ФАЬ^р7 на клеточной поверхности специфического штамма Sp7 с применением электронной микроскопии. Для этого к суспензии клеток штамма Sp7 добавляли иссле-

Спектр литической активности бактериофага ФАЬ^р7 на газоне индикаторных культур

Культура клеток

Действие ФАЬ^р7

A. amazonense Am14 +

A. brasilense Sp7 +

A. brasilense Cd +

A. brasilense Sp107 +

A. brasilense Sp245 -

A. brasilense Jm6B2 -

A. brasilense Br14 +

A. brasilense KR77 +

A. brasilense S17 -

A. brasilense S27 +

A. brasilense SR55 +

A. lipoferum SR65 +

A. brasilense SR75 -

A. halopraeferans Au4 +

A. irakense KBC1 +

A. irakense KA3 +

A. lipoferum Sp59b -

A. lipoferum RG20a -

P.putida С-11 -

P. putida ВА-11 -

E. coli XL-1 -

E. coli B-878 -

A. calcoaceticum A-122 -

П р и м е ч а н и е. + наличие лизиса бактериальной культуры; - отсутствие лизиса бактериальной культуры.

Рис. 3. Электронно-микроскопическое изображение бактерий A. brasilense Jm6B2 при взаимодействии с бактериофагом ФАЬ-Sp?.

в качестве контроля использовали клетки данного штамма. Условия подготовки образца были аналогичны таковым при использовании клеток штамма Sр7. Показано (рис. 3), что адсорбция бактериофага ФАЬ^р7 на микробной клетке штамма Jm6B2 не происходит.

Таким образом, в результате исследований был выделен бактериофаг из азотфиксирующих микроорганизмов A. brasilense Sp7 (ФАЬ^р7). Бактериофаг отличается низкой репродуктивной способностью, поскольку выделяется только после воздействия на клетки низкой температуры. На газоне индикаторной культуры исследуемый бактериофаг образует прозрачные негативные колонии. Показано, что бактериофаг ФАЬ^р7 вызывает лизис гомологичных фагу бактерий по серологической группе A. brasilense Sp7, Cd, Sp107, Br14, KR77, S27, SR55, A. lipoferum SR65, A. amazonense Am14, A. halopraeferans Au4, A. irakense KBC1 и KA3, но не проявляет активности в отношении клеток A. brasilense штаммов Sp245, Jm6B2, S17, SR75, A. lipoferum штаммов Sp59b и RG20a. Установлено, что бактериофаг ФАЬ^р7 является специфичным по отношению к бактериям рода Azospirillum, но не активным в отношении бактерий гетерологичных родов. Электронно-микроскопический анализ показал, что выделенный бактериофаг хорошо адсорбируется на поверхности бактерий A. brasilense Sp7. С помощью электронной микроскопии также изучены морфологические параметры и определены размеры самих фаговых частиц.

На сегодняшний день в литературе нет работ, описывающих морфологические особенности (электронно-микроскопическое изучение) взаимодействия бактериофагов почвенных бактерий с соответствующими микробными клетками. Помимо этого, метод электронной микроскопии позволил быстро на уровне отдельных клеток, регистрировать начальные стадии адсорбции бактериофагов на комплементарных бактериях по сравнению с традиционными методами, что позволило существенно сократить время диагностики культур.

ЛИТЕРАТУРА

2. Уткин Д.В., Ерохин П.С., Осина Н.А., Конов Н.П. Оценка фаго-лизабельности штаммов холерных вибрионов с использованием атомно-силовой микроскопии. Известия Саратовского университета. Новая серия. Серия: Химия. Биология. Экология. 2013; 13 (3): 81-4.

3. Краевский С.В. Атомно-силовая микроскопия аффинных взаимодействий в микробиологии: Дисс. ... канд. биол. наук. Обо-ленск; 2011.

REFERENCES

1. Chang J.T., Schmid M.F., Haase-Pettingell C., Weigele P.R., King J.A., Chiu W. Visualizing the structural changes of bacteriophage Ep-silon15 and its Salmonella host during infection. J. Mol. Biol. 2010; 402(4): 731-40.

2. Utkin D.V., Erokhin P.S., Osina N.A., Konov N.P. Assessment fagolizabelnosti strains of V. cholerae using atomic force microscopy. Izvestiya Saratovskogo universiteta. Novaya seriya. Seriya: Khimiya. Biologiya. Ekologiya. 2013; 13

3. Kraevskiy S.V. Atomic Force Microscopy of Affinity Interactions in Microbiology: Diss. Obolensk; 2011.

4. Kang A.S., Barbas C.F., Janda K.D., Benkovic S.J., Lerner R.A. Linkage of recognition and replication functions by assembling combinatorial antibody Fab libraries along phage surfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991; 88(10): 4363-6.

5. Suttle C.A. Viruses in the sea. Nature. 2005; 437: 356-61.

6. Ewing B., Hillier L., Wendl M.C., Green P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment. Genome Res. 1998; 8(3): 175-85.

7. Germida J.J., Khachatourians G.G. Transduction of Escherichia coli in soil. Can. J. Microbiol. 1988; 34(2): 190-3.

8. Boyer M., Haurat J., Samain S., Segurens B., Gavory F., González V. et al. Bacteriophage prevalence in the genus Azospirillum and analyses of the first genome sequence of an Azospirillum brasilense integrative phage. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74(3): 861-74.

9. Gerhardt P., ed. Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Microbiology, Washington, DC; 1981.

10. Martha R.J.Clokie, AndrewM.Kropinski, eds. Bacteriophages Methods and Protocols. Vol.1: Isolation, Characterization, and Interaction. Humana Press; 2008: 113-26.

11. Sambrook J., Fritsch D.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. (v. 1-3). Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Lab. Press; 1989.

12. Boyer M., Haurat J., Samain S., Segurens B., Gavory F., González V. et al. Bacteriophage prevalence in the genus Azospirillum and analyses of the first genome sequence of an Azospirillum brasilense integrative phage. Appl. Environ. Microbiol. 2008; 74(3): 861-74.

13. Stengele I., Bross P., Garces X., Giray J., Rasched I. Dissection of functional domains in phage fd adsorption protein. Discrimination between attachment and penetration sites. J. Mol. Biol. 1990; 212(1): 143-9.

14. Jakes K.S., Davis N.G., Zinder N.D. A hybrid toxin from bacterio-phage f1 attachment protein and colicin E3 has altered cell receptor specificity. J. Bacteriol. 1988; 170(9): 4231-8.

15. Russel M., Whirlow H., Sun T.P., Webster R.E. Low-frequency infection of F-bacteria by transducing particles of Filamentous bacterio-phages. J. Bacteriol. 1988; 170(11): 5312-6.

16. Krebber C., Spada S., Desplancq D., Krebber A., Ge L., Pluckthun A. Selectively infective phage (SIP): a mechanistic dissection of a novel in vivo selection for protein-ligand interactions. J. Mol. Biol. 1997; 268(3): 607-18.

Поступила 29.08.14