СПОСОБ СШИВАНИЯ БИОПОЛИМЕРОВ
BIOPOLYMER CROSS-LINKING METHOD

Настоящее изобретение относится к способу сшивания биополимеров экстрактами облепихи и к получению и применению экстрактов облепихи в качестве нетоксичных агентов для сшивания биополимеров, таких как белки, пептиды или полисахариды. Такие биополимеры используются, в частности, в пищевых продуктах, кормах для животных, фармацевтических препаратах или медицине или в других промышленных применениях.
Сшитые биополимеры, такие как белки или полисахариды, являются распространенными в природе и широко используются в производстве продуктов питания, кормов для животных, ферментов, упаковочных материалов или в биомедицинских применениях, а также в промышленных применениях. Кроме того, сшивание биополимеров используется при дублении шкур и кож и при отделке текстиля.
Для иммобилизации или сшивания биополимеров используются различные способы, в которых используются, например, альдегиды или диальдегиды, такие как формальдегид или  глутаровый диальдегид или уксусная кислота, или ферменты или сшивки с помощью комплексов солей металлов, как при дублении шкур. Использование иридоидов и секоиридоидов листьев оливы, в частности, описано как использование природных компонентов для сшивания биополимеров (EP 1 489 135 A1).
В EP 1 489 135 A1 подробно описаны недостатки известного уровня техники. В частности, токсикологические свойства таких веществ, как формальдегид или глутаровый диальдегид,  ограничивают использование в пищевых продуктах, кормах для животных, косметике или медицине. Использование тяжелых металлов в кожевенном дублении имеет существенные недостатки с точки зрения человека и окружающей среды и токсикологии и предусматривает комплексную очистку сточных вод или удаление отходов.
Существует растущая потребность в натуральных, в частности, травяных альтернативах для сшивания белков, которые могут быть получены в достаточном количестве и по разумной цене.
Облепиха растет по всему миру на более чем 2 млн. Га. Использование фруктов хорошо описано. При сборе плодов производится значительное количество древесины, листьев и коры. Это сырье до настоящего времени использовалось только в промышленных масштабах в ограниченном объеме, но также имело потенциальную возможность повысить ценность для фермеров.
Целью изобретения является создание способа сшивания биополимеров с помощью растительных экстрактов. Другой целью изобретения является создание натуральных экстрактов облепихи для сшивания биополимеров.
Указанные цели достигается путем создания способа сшивания биополимеров, при котором биополимеры приводят в контакт с экстрактами облепихи для сшивания указанных биополимеров.
Экстракты надземных компонентов облепихи или остатков переработки плодов облепихи используются в качестве экстрактов облепихи. Отходы переработки плодов облепихи представляют собой компоненты остатков облепихи или неиспользованные компоненты растений, полученные при переработке плодов облепихи. Ягоды облепихи зарезервированы для переработки фруктов. Низкие пропорции ягод при извлечении надземных компонентов растения облепихи не вредят сшивающим свойствам экстракта.
В одном варианте осуществления компоненты остатков облепихи или неиспользованные компоненты растения, полученные во время обработки плодов облепихи, представляют собой древесину, листья, кору и/или побеги.
В одном варианте осуществления экстракты облепихи выбраны из сортов облепихи Ascola,  Hergo,  Leikora,  Pollmix 1 и/или Pollmix 4, предпочтительно, из сорта облепихи Hergo.
Экстракты облепихи содержат полифенолы с содержанием 10-95 мас.% (в расчете на сухую массу в экстракте), причем полифенолы происходят из группы дубильных веществ, флавоноидов и катехинов. Полифенолы могут быть определены с использованием модифицированного метода Folin-Ciocalteu (Singleton and Rossi (1965)) колориметрии тотальных фенолов с реагентами фосфорно-молибден-фосфорновольфрамовой кислоты. Am J Enol Vitic.  16: 144-158).
В предпочтительном варианте осуществления экстракты облепихи содержат полифенолы с содержанием от 25 до 50 мас.% (в расчете на сухую массу экстракта облепихи).
Полифенолы, в частности гидролизуемые и конденсированные дубильные вещества, преимущественно приводят к сшиванию биополимеров.
В одном варианте осуществления экстракты облепихи состоят исключительно из натуральных ингредиентов, причем под «натуральными ингредиентами» понимают немодифицированные растительные вещества, которые встречаются в природе.
Экстракты облепихи для сшивания биополимеров получают экстракцией растительного материала облепихи в сухом или свежем виде с использованием воды, органического растворителя или смеси воды и органического растворителя в качестве экстрагента и/или растворителя.
В одном варианте осуществления способ получения экстрактов облепихи для сшивания биополимеров осуществляют путем экстракции растительного материала облепихи в высушенном или свежем виде, используя воду, органический растворитель или смесь воды и органического растворителя в качестве экстрагента и/или растворитель. В дополнительном варианте осуществления способ получения экстрактов облепихи для сшивания биополимеров осуществляют путем экстракции растительного материала облепихи в замороженном виде, используя воду, органический растворитель или смесь воды и органического растворителя в качестве экстрагента и/или растворитель.
Экстракты получают из надземных частей растений, таких как листья, древесина и кора или побеги облепихи или из остатков переработки плодов облепихи. В этом случае материал может быть обработан свежим, предпочтительно высушенным. Отходы переработки плодов облепихи представляют собой компоненты остатков облепихи или неиспользованные компоненты растений, полученные при переработке плодов облепихи. Ягоды облепихи зарезервированы для переработки фруктов. Низкие пропорции ягод при извлечении надземных компонентов растения облепихи не вредят сшивающим свойствам экстракта.
В качестве экстрагентов можно использовать воду, полярные органические растворители или смеси полярных органических растворителей с водой. Полярные органические растворители в контексте настоящего изобретения представляют собой спирты или кетоны согласно одному варианту осуществления изобретения. Особенно предпочтительными являются спирты с 1-4 атомами углерода или кетоны с 1-4 атомами углерода. Примерами органических растворителей являются метанол, этанол, 1-пропанол, изопропанол, 1-бутанол, 2-бутанол, этиленгликоль, ацетон, бутанон или любые требуемые смеси упомянутых растворителей.
Предпочтительно экстрагент или растворитель представляет собой смесь водного раствора и, по меньшей мере, одного полярного органического растворителя. Полярный органический растворитель в смеси обычно составляет от 10 до 95% по объему. Предпочтительно доля полярного органического растворителя составляет от 10 до 90 об.%, Более предпочтительно от 20 до 80 об.%, Наиболее предпочтительно от 30 до 70 об.%. Предпочтительные полярные органические растворители в смеси соответствуют предпочтительным полярным органическим растворителям, приведенным выше. Особенно предпочтительной является смесь вода/спирт или вода/кетон с содержанием растворителя от 20 до 80 об.%.
Вспомогательные вещества могут быть добавлены к экстрагенту для регулирования pH или уменьшения поверхностного натяжения. Экстракция происходит при температуре от 20 до 95°С и рН от 2 до 11.
Согласно одному варианту осуществления изобретения добавки, в частности кислоты или щелочи и/или анионные, неионные или амфотерные поверхностно-активные вещества, могут быть добавлены к экстрагенту, в частности к воде.
Экстракция может проводиться общеизвестными способами, такими как мацерация, перколяция или расщепление, непрерывным, прерывистым, одностадийным или многостадийным способом при нормальном или повышенном давлении.
Обработку необработанных экстрактов для обогащения полифенолов можно проводить мембранными методами или адсорбцией. Кроме того, обработка необработанных экстрактов для обогащения полифенолов может осуществляться посредством жидкостно-жидкостной экстракции.
В одном варианте осуществления обогащение полифенолов осуществляется с помощью адсорбирующей смолы.
После осуществления способа экстракты подвергают ферментативной или кислотно-каталитической обработке.
Кислотно-каталитическое или ферментативное расщепление связанных моносахаридов приводит к улучшенной активации экстрактов.
В одном варианте осуществления способа расщепление связанных моносахаридов происходит кислотно-каталитической или ферментативной обработкой экстрактов, что приводит к агликонам. «Агликоны» означают органические соединения, которые являются немоносахаридным компонентом в гликозиде. Например, в качестве агликона изохамнетин может быть образован из изорхаметин-3-O-гликозида и/или кверцетина из кверцетин-3-O-рутинозида.
После осуществления способа ферментативное лечение проводится с помощью глюкозидаз. Под «глюкозидазами» понимают группу ферментов, которые катализируют гидролиз гликозидно-связанной глюкозы.
Согласно еще одному варианту осуществления способа экстракты подвергают ферментации с использованием микроорганизмов. В одном варианте осуществления ферментацию проводят с использованием микроорганизмов, которые образуют глюкозидазы.
Экстракты могут быть использованы в растворе или в виде порошка. Сушка экстрактов может быть осуществлена известными способами сушки.
Биополимеры в контексте изобретения представляют собой полимеры, которые синтезируются в клетке живого существа. В одном варианте осуществления биополимеры выбраны из белков, пептидов и полисахаридов, причем биополимеры предпочтительно представляют собой белки.
В одном варианте осуществления белки могут быть выбраны из молочных белков, предпочтительно казеина или в-лактоглобулина; и/или зерновые белки, предпочтительно глиадины, глютенин, альбумины или глобулины; коллаген или желатин.
Преимущественно в способе согласно изобретению нет необходимости модифицировать биополимеры до сшивания путем приведения биополимеров в контакт с экстрактами облепихи.
В одном варианте осуществления способа сшивание биополимеров происходит в водной среде. Под «средой» понимается химическая среда, в которой находится биополимер и биополимер сшит. В одном варианте осуществления способа водная среда содержит воду или водный буферный раствор.
В дополнительном варианте осуществления способа биополимеры сшивают путем добавления экстракта облепихи в водную среду.
В дополнительном варианте осуществления способа биополимеры сшивают путем добавления от 0,1 до 100 мас.% экстракта облепихи в расчете на биополимер, предпочтительно от 0,5 до 50 мас.% экстракта облепихи в расчете на биополимер.
В дополнительном варианте осуществления способа сшивание биополимеров происходит в течение периода от 1 до 72 часов.
Изобретение также относится к применению экстрактов облепихи согласно изобретению, по отдельности или в смеси, для поперечного сшивания биополимеров в пищевых продуктах, кормах для животных, косметике и фармацевтике, а также в медицинских продуктах или для промышленного применения, для дубление шкур и кож, а также для текстильной отделки.
В одном варианте осуществления экстракты облепихи используются для сшивания биополимеров в пищевых продуктах, кормах для животных, косметике и фармацевтике, а также в медицинских продуктах или в промышленных применениях, для дубления шкур и кож и для отделки текстиля.
В одном варианте осуществления экстракты надземных компонентов растения облепихи или остатков переработки плодов облепихи используются в качестве экстрактов облепихи.
В одном варианте осуществления экстракты облепихи используют для сшивания биополимеров путем экстракции растительного материала облепихи в высушенном или свежем виде с использованием воды, органического растворителя или смеси воды и органического растворителя в качестве экстрагента и/или растворителя.
В одном варианте осуществления экстракты облепихи используют для сшивания биополимеров, где смесь воды и органического растворителя, используемого в качестве экстрагента, содержит от 10 до 95 об.% органического растворителя.
В одном варианте осуществления экстракты облепихи используют для сшивания биополимеров, причем к экстрагенту добавляют добавки, в частности, кислоты или щелочи и/или анионные, неионные или амфотерные поверхностно-активные вещества.
В одном варианте осуществления экстракты облепихи используют для сшивания биополимеров, причем экстракты подвергают ферментативной или кислотно-каталитической обработке.
Изобретение будет объяснено более подробно со ссылкой на последующие практические примеры.
Определение полифенолов:
Полифенолы определяют с использованием модифицированного метода Folin-Ciocalteu (Singleton und Rossi (1965)) колориметрии суммарных фенольных соединений с реагентами фосфорно-молибден-фосфорновольфрамовой кислоты. Am J Enol Vitic.  16: 144-158).
Определение флавоноидов:
Флавоноиды измеряют с помощью ВЭЖХ на колонке RP 18. Содержание рассчитывается с использованием внешних стандартов (кверцетин-3-О-рутинозид, изорхаметин-3-О-рутинозид, изорхаметин-3-О-глюкозид, кверцетин и изорхаметин).
Содержание белка, сахара, жира и золы определяется в соответствии с методиками немецкого Кодекса о пищевых продуктах и кормах (Lebensmittel-,  Bedarfsgegenstдnde- und Futtermittelgesetzbuch - LFGB 2013).
Пример 1
Высушенные и молотые листья облепихи тщательно экстрагируют водой при температуре 40°С. Экстракт фильтруют, концентрируют и сушат. Содержание полифенолов в полученном экстракте составляет 20 мас.% (в расчете на сухую массу в экстракте).
В альтернативном варианте осуществления примера 1 используются листья облепихи сорта Hergo, и отношение массы высушенных и измельченных листьев облепихи к массе экстрагента составляет 1:10. Содержание полифенолов в полученном экстракте составляет 15 мас.% (В расчете на сухую массу в экстракте), а выход экстракта составляет 17%.
Под выходом экстракта понимают сухую массу экстракта в расчете на массу высушенных и измельченных листьев облепихи.
Пример 2
Высушенные и молотые листья облепихи тщательно экстрагируют водой при температуре 40°С. После фильтрации экстракта рН доводят до 7, после чего следует дозировка в-глюкозидазы (из миндаля). Инкубацию проводят при 25°С в течение 3 ч. Контроль за разложением гликозидно связанных полифенолов осуществляется с помощью молекул изохамнетин-3-О-глюкозида в изорхаметин и кверцетин-3-О-рутинозида в кверцетин с помощью ВЭЖХ. Более 80% гликозидов были разложены. Экстракт фильтруют, концентрируют и сушат.
Пример 3
Высушенные и измельченные листья облепихи сорта Hergo тщательно экстрагируют при температуре 40°С смесью этанол/вода, где массовая доля этанола составляет 60%. Соотношение массы высушенных и измельченных листьев облепихи к массе экстрагента составляет 1:10. Экстракт фильтруют, концентрируют и сушат. Содержание полифенолов в полученном экстракте составляет 20 мас.% (в расчете на сухую массу в экстракте). Выход экстракта составляет 20%.
Таблица 1. Содержание полифенолов, флавоноидов, белков, общего сахара и золы в экстрактах облепихи в соответствии с примерами 1 и 3: Значения основаны на сухой массе экстракта.
полифенолы
флавоноиды
белок
общий сахар
ясень
Экстракт согласно альтернативному варианту осуществления Пример 1
15 мас.%
2,9 мас.%
7 мас.%
21 мас.%
12 мас.%
Экстракт согласно Примеру 3
20 мас.%
3,8 мас.%
5 мас.%
16 мас.%
9 мас.%
Пример 4
Обезжиренный натуральный йогурт смешивают с 15 г/л сухого экстракта из примера 1. После 24-часового инкубационного периода при 11°С вязкость проверяли с помощью  консистометра Bostwick. Результат эксперимента показал, что добавление экстракта облепихи согласно изобретению приводит к увеличению вязкости.
Пример 5
Чтобы продемонстрировать сшивающие свойства экстракта облепихи из примера 1, используют раствор казеина. Раствор 10 г/л казеина в натрий-фосфатном буфере (рН 7) смешивают с 10 г/л экстракта облепихи согласно примеру 1. Инкубацию проводят при комнатной температуре в течение 45 мин. На основании мутности, возникающей в растворе, устанавливается сшивание раствора казеина.
Пример 6
Чтобы продемонстрировать сшивающие свойства экстракта облепихи в соответствии с примером 3, готовят 2,5 мас.% Водный раствор желатина. Высушенный экстракт облепихи в соответствии с примером 3 готовят в концентрации 2,5 мас.% в водном растворе и фильтруют до прозрачности через фильтр 0,45 мкм. Оба прозрачных раствора смешивают в соотношении 1:1 при комнатной температуре. Сшивание желатина путем добавления раствора экстракта облепихи визуализируется по немедленно возникающей мутности раствора.
Пример 7
В силосе из корма для животных на основе трав экстракт облепихи добавляют к силосу в соответствии с примером 1. Благодаря добавлению 5 мас.% экстракта облепихи в расчете на массу силоса белки в силосе могут быть защищены от гидролиза и, таким образом, его кормовая ценность может быть улучшена. Добавление экстракта облепихи снижает степень гидролиза белков в кормах для животных на 18%. Степень гидролиза белков определяют с помощью метода ОРА (Frister H, Meisel H, Schlimme E (1990) Einsatzmцglichkeiten der modifizierten OPA-Methode in Der Proteinanalytik). Ernдhrungs-Umschau 37: 442-445).
Пример 8
Экстракт облепихи в соответствии с примером 2 используют для дубления и додубливания овечьей шкуры.  Экстракт облепихи используется в количестве 25% от массы овечьей шкуры. Можно показать, что дубление овечьей шкуры возможно путем сшивки белковых структур. Достигнутые температуры усадки составляли от 68.