Модуляция пептидом Gly-Pro секреторной функции желудка собак после стресса

Модуляция пептидом СЬУ-РЯО секреторной функции желудка собак после стресса

Еськова Т.А.

Кафедра физиологии человека и животных Томского государственного

университета

Введение

Регуляторные пептиды играют ключевую роль в поддержании гомеостаза при стрессе [6, 14, 20]. В настоящее время принято считать, что для целенаправленной передачи информации достаточно иметь молекулы, построенные из 2 - 4 аминокислотных остатков [16]. Особого внимания заслуживают относительно устойчивые к протеолизу простейшие пролинсодержащие ди-, три- и тетрапептиды (01у-Рго, Рго-Иу-Рго, Рго-Рго-Иу-Рго), обладающие противоязвенным действием [1, 2, 3]. Они входят в состав известных регуляторных пептидов (бета - казоморфин, кальцитонин, гастрин) и некоторых пищевых белков (фрагменты глюторфинов, коллагенов). Эта группа пептидных регуляторов была выявлена сравнительно недавно [2].

Наиболее подверженной действию стресса, по мнению Г. Селье (1936), является пищеварительная система, а желудок - её главный орган-мишень. Приспособление, предупреждение или сглаживание возможных сдвигов функциональных показателей в пищеварительном тракте при стрессе осуществляется посредством информационных молекул - регуляторных пептидов. Необходимо отметить, что в значительной мере направление и величина ответной реакции желудка на возмущающие факторы определяются типологическими особенностями секреторного аппарата органа [8, 18, 19].

Цель настоящей работы состояла в изучении влияния Иу-Рш на секреторную функцию желудка после иммобилизационного стресса у собак с разным исходным уровнем секреции.

Материалы и методы исследования

Эксперименты выполнены в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных", утвержденных Приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. Хронические опыты проведены на 7 беспородных собаках - самцах весом 15 - 22 кг, оперированных под нембуталовым наркозом с образованием фистулы желудка по Басову [13]. Эксперимент начинали через 30 дней после операции. Все

животные находились на стационарном режиме питания и содержания. Исследуемый пептид Gly-Pro (производства «Senn Chemicals», Schweiz) вводили внутривенно в дозе 70 мкг/кг одновременно со стимулятором желудочной секреции карбахолином после стресса. Согласно литературным данным в данной дозе дипептид оказывал протекторное действие на слизистую оболочку желудка [3]. Контролем служили опыты с аналогичным способом введения эквиобъёмных количеств физиологического раствора. Иммобилизационный стресс создавали помещением животных на 18 часов в клетки, максимально ограничивающие их движение. Через 20 часов после помещения собак в клетки осуществляли забор крови, подсчитывали общее количество лейкоцитов и их морфологических форм, определяли концентрацию 11-оксикортикостероидов (11-ОКС) в плазме [12]. Показатели желудочной секреции исследовали в динамике сокоотделения, собирая сок 30-минутными пробами. Вызванная секреция продолжалась 2,5 часа с момента введения стимулятора желудочной секреции карбахолина («Reanal», Венгрия) в дозе 6 мкг/кг. О секреторной функции желудка судили по объему отделяемого секрета, концентрации ионов водорода [11], дебита соляной кислоты [21] и протеолитической активности [17] желудочного сока. Полученные данные были статистически обработаны с использованием пакета прикладных программ Statistica 5.0 for Windows. Использовался непараметрический критерий Mann-Whitney U test. Отличия считали достоверными при p<0,05.

Результаты исследований

В фоновых опытах у собак наблюдалась значительная вариабельность показателей секреторной активности желудка, лейкоцитарной формулы и концентрации 11-ОКС в плазме крови, что позволило разделить животных на две группы (табл. 1). Для собак первой группы характерна высокая секреторная активность желудка, что проявилось в значительном объёме желудочного сока с высокой продукцией соляной кислоты и протеолитической активностью. В лейкограмме этих животных обнаружено большое количество палочкоядерных нейтрофилов, эозинофилов и моноцитов, но малое содержание лимфоцитов. Концентрация 11-ОКС в плазме крови в первой группе собак была невысокой. Во вторую группу отнесены животные со сниженной секреторной активностью желудка. Лейкограмма этих собак характеризовалась низким процентным содержанием палочкоядерных нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов, и высоким -лимфоцитов. При этом концентрация 11-ОКС вдвое превышала соответствующий показатель у собак первой группы. Диапазон варьирования в группах процентного

содержания морфологических форм лейкоцитов и концентрации 11-ОКС в плазме крови оставался в пределах нормы [5, 7].

Таблица 1

Показатели секреторной активности желудка и периферической крови у интактных собак

Показатели Первая группа Вторая группа

Суммарный объём желудочного сока, мл 98,9 ± 7,34 70,5 ± 7,53 *

Концентрация Н+, мкмоль/мл 60,3 ± 3,96 64,2 ± 2,74

Дебит соляной кислоты, ммоль/2,5ч 7,9 ± 1,13 3,8 ± 0,37 *

Протеолитическая активность, мкмоль/мл 80,9 ± 7,38 9,4 ± 1,92 *

Концентрация 11-ОКС, мкмоль/л 0,3 ± 0,04 0,6 ± 0,08 *

Лейкограмма (%):

палочкоядерные нейтрофилы 12,0 ± 0,99 2,0 ± 0,22 *

сегментоядерные нейтрофилы 57,3 ± 1,21 56,0 ± 6,15

эозинофилы 2,2 ± 0,16 0,8 ± 0,40 *

моноциты 5,6 ± 0,31 4,0 ± 0,38 *

лимфоциты 22,3 ± 0,60 37,3 ± 6,49 *

Примечание: здесь и далее п - число экспериментов. * - отличие статистически значимо при р<0,05.

Различия между группами являются отражением «индивидуальной нормы», что обусловлено конституциональными особенностями гуморальной регуляции и структуры желудочных желез [18, 19]. Высокая кислотность желудочного сока, высокая секреция соляной кислоты и пепсина в большинстве случаев имеют морфологическую основу, и коррелируют с количеством секреторных клеток желудочных желез. Увеличенное количество главных и обкладочных клеток сочетается с увеличенным количеством О, Ес1 и Ес - клеток, что генетически обусловлено особенностью строения секреторного аппарата желудка [10].

Существенные различия между группами отмечены по степени выраженности стрессорной реакции. Так, после иммобилизации у собак первой группы уровень 11-ОКС увеличился в 4,3 раза (с 0,3 ± 0,04 до 1,2 ± 0,04 мкмоль/л, р<0,05), а у животных второй группы - в 2,5 раза (с 0,6 ± 0,08 до 1,6 ± 0,08 мкмоль/л, р<0,05). Изменения лейкограммы заключались в резко выраженном нейтрофилёзе (за счёт сегментоядерных форм у первой группы собак и палочкоядерных форм у второй), моноцитозе и лимфопении. Содержание

эозинофилов снижалось в первой группе собак и имело тенденцию к увеличению во второй группе. Суммарное количество лейкоцитов у собак обеих групп после иммобилизации увеличивалось на 95% (с 10061 ± 577,0 до 19617 ± 570,0 х109 / л, p<0,05). В реализации отмеченных количественных сдвигов показателей периферической крови участвуют гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая и симпато-адреналовая системы, активированные стрессом [6]. Развитие нейтрофильного лейкоцитоза связано с выбросом в циркулирующую кровь костномозгового пула лейкоцитов при стимуляции а -адренорецепторов под действием стресса [7]. Кроме того, лимфопения и эозинопения связаны с повышением уровня глюкокортикоидов [6]. Используемая модель иммобилизации вызывала изменения в уровне 11-ОКС и периферической крови, характерные для комплекса реакций, описанных в ряде работ [6, 7], которые указывают на развитие первой стадии стресс-реакции - стадии тревоги.

Изменения секреторной активности желудка после действия стресса были различны у собак с высокой и низкой секрецией органа (табл. 2). Восемнадцатичасовое стрессорное воздействие приводило к снижению суммарного объёма желудочного секрета у собак с исходно высоким уровнем секреторной функции желудка на 30% ф<0,05) и тенденции к увеличению ф>0,05) у собак с исходно низким уровнем секреции органа.

Таблица 2

Изменение секреторной активности желудка после действия восемнадцатичасового стресса у собак с разными уровнями исходной секреции

Показатели Секреции Уровень секреции Фон

Суммарный объём сока, мл высокий 98,8±7,33 68,9±9,27 *

низкий 70,5±7,53 86,1±7,71

Концентрация протонов, мкмоль/мл высокий 60,3±3,95 40,3±5,77 *

низкий 64,2±2,74 83,6±2,76 *

Дебит соляной кислоты, ммоль/2,5ч высокий 7,9±1,13 5,4±0,78

низкий 3,8±0,37 4,7±0,59

Протеолитическая активность сока, мкмоль/мл высокий 80,9±7,38 52,2±6,71 *

низкий 9,4±1,92 26,9±2,95 *

Примечание: п1, п2 - количество опытов соответственно в группах у собак с высоким и низким уровнем секреции

Концентрация ионов водорода в желудочном соке у собак группы 1 под действием стресса снижалась на 33% ф<0,05), а у животных группы 2 - увеличивалась на 30% ф<0,05).

Вместе с тем, отмечено и изменение протеолитической активности желудочного сока. Исходно высокая протеолитическая активность под влиянием стресса снижалась на 35% (p<0,05), а у собак с исходно низкой - стресс вызывал увеличение протеолитической активности в 1,8 раза (p<0,05).

Таким образом, секреторный ответ желудка как высокочувствительного индикатора организма на чрезвычайные воздействия зависит от исходного уровня секреции. Иммобилизация угнетает секреторную функцию желудка у собак с исходно высоким и стимулирует кислотно-пептический фактор у собак с исходно низким уровнем секреторной активности желудка.

Внутривенное введение Gly-Pro животным после иммобилизационного стресса снижало концентрацию 11-ОКС в плазме крови у первой (с 1,1±0,04 до 0,9±0,03 мкмоль/л, p<0,05) и второй (с 1,5±0,07 до 0,9±0,09 мкмоль/л, p<0,05) групп собак. Таким образом, ингибирующее влияние глицилпролина на уровень 11-ОКС может быть следствием ограничения активации глюкокортикоидной функции надпочечников, которая была индуцирована стрессом.

Введение Gly-Pro после иммобилизации увеличивало на 64% (p<0,05) количество секретируемого желудочного сока, уменьшенного воздействием стресса у собак с исходно высоким уровнем секреторной функции желудка (табл. 3). Введение пептида после

Таблица 3

Влияние введения дипептида на секреторную функцию желудка у собак с разным уровнем секреции после действия стресса

Показатели Уровень секреции Стресс

Суммарный объём сока, мл высокий 68,9±9,27 112,9±11,65 *

низкий 86,1±7,71 68,4±2,84 *

Концентрация Н+, мкмоль/мл высокий 40,3±5,77 76,7±1,95 *

низкий 83,6±2,76 76,8±2,59 *

Дебит соляной кислоты, ммоль/2,5ч высокий 5,4±0,78 8,7±0,81 *

низкий 5,2±0,33 4,1±0,23 *

Протеолитическая активность сока, мкмоль/мл высокий 52,2±6,71 18,6±2,02 *

низкий 26,9±2,95 33,2±1,95

стресса собакам с исходно низкой секреторной активностью желудка вызывало снижение объёма сока на 16% (р<0,05), тем самым, практически восстанавливая уровень объёма секрета, нарушенного стрессом. Использование глицилпролина после стресса привело к

увеличению в соке на 90% (р<0,05) концентрации ионов водорода, сниженной действием иммобилизации у животных с исходно высокой секреторной активностью желудка. Увеличенную стрессом кислотность в группе собак с исходно низким уровнем секреторной активности желудка пептид уменьшал на 10% (р<0,05). Продукция соляной кислоты под влиянием глицилпролина после стресса увеличивалась на 61% (р<0,05) в группе с исходно высоким уровнем секреции, а с исходно низкой секреторной активностью желудка - уменьшалась на 21% (р<0,05). Введение Иу-Рш после иммобилизации уменьшало на 69% (р<0,05) протеолитическую активность, сниженную действием стресса у животных с исходно высоким уровнем секреторной функции желудка. Увеличенную действием иммобилизации активность протеолитических ферментов в группе с исходно низкой секреторной функцией желудка пептид не изменял.

В динамике эксперимента действие глицилпролина после стресса более выражено в химическую фазу желудочного пищеварения (рис.). Зарегистрированы значимые

л п о

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

30 60 90 120 150 мин

л п о

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

г3 2 1

30 60 90 120 150 мин

Рис. Динамика изменения концентрации ионов водорода при введении глицилпролина после стресса у животных с исходно высоким (А) и низким (Б) уровнем секреции желудка Примечание: по оси ординат - концентрация ионов водорода; по оси абсцисс - время эксперимента; 1 - фон, 2 - стресс, 3 - стресс+Иу-Рго. *, + -отличие статистически значимо относительно фона и стресса соответственно при р<0,05

3

изменения показателей секреторной функции желудка в основном на протяжении всех 2,5 часов, начиная с 60 минуты опыта. Наиболее выраженным при введении дипептида после стресса является изменение концентрации ионов водорода в желудочном соке.

Направление влияния глицилпролина было противоположным направлению действия стресса. Увеличение кислотности после стресса у собак с исходно высоким уровнем секреторной активности желудка (А) и уменьшение таковой у собак с исходно низким уровнем секреции (Б) при введении глицилпролина возвращало и даже немного повышало исходную концентрацию протонов желудочного сока в группах.

Таким образом, настоящее исследование показало, что внутривенное введение короткого пролинсодержащего дипептида Gly-Pro в дозе 70 мкг/кг собакам после иммобилизации, судя по снижению 11-ОКС в плазме крови, оказывает антистрессорное действие. Направление изменений показателей секреторной функции желудка после введения глицилпролина стрессированным собакам определялось исходным уровнем секреторной активности органа животных. Действие глицилпролина, введённого после иммобилизации, на объём секрета, продукцию соляной кислоты и концентрацию протонов в желудочном соке было противоположно стрессорному влиянию в группах собак. Амбивалентное влияние Gly-Pro после стресса, возможно, обеспечивается включением одного из гомеостатических механизмов, которым является «правило исходного уровня». Согласно данному правилу саморегуляции направление и величина изменений гомеостатической константы под влиянием возмущающего фактора зависит от её исходного значения. Потенцирующее влияние глицилпролина на действие стресса отмечали при оценке протеолитической активности желудочного сока. Введение дипептида на фоне иммобилизации уменьшало протеолитическую активность сока в группе с исходно высоким уровнем секреции желудка. У животных с исходно низким уровнем секреторной активности желудка, увеличенная стрессом протеолитическая активность после введения Gly-Pro не изменялась, по-видимому, по причине недостатка функционального потенциала и энергоснабжения желудочных желёз.

Модулирующий эффект Gly-Pro на секреторную функцию желудка может осуществляться как на центральном, так и на периферическом уровнях регуляции. Пролинсодержащий пептид способен реализовывать свой модулирующий эффект, во-первых, через изменение содержания дофамина, норадреналина и компонентов серотонинергической системы в мозге [9, 15, 23], во-вторых, оказывать непосредственное воздействие на ткани желудка [1, 2, 3], и, наконец, он может блокировать рецепторы норадреналина [4], возможно через взаимодействие с собственными рецепторами [22].

Выводы

1. Экспериментальные животные с разной секреторной активностью желудка отличаются по концентрации 11-ОКС в плазме крови. Собаки с исходно высокой

секрецией желудка характеризуются невысокой концентрацией 11-ОКС, а сниженная секреторная активность органа сочетается с высоким уровнем глюкокортикоидов в плазме крови собак.

2. Иммобилизационный стресс способствует ослаблению секреторной функции желудка в группе с исходно высоким уровнем секреции органа. В группе с исходно низким уровнем секреторной активности желудка происходит усиление агрессивных свойств желудочного сока под влиянием стресса.

3. Дипептид Gly-Pro в обеих группах животных снижает повышенную при стрессе концентрацию глюкокортикоидов в сыворотке крови.

4. Направление и величина действия глицилпролина после стресса на объём секрета, продукцию соляной кислоты и концентрацию протонов в желудочном соке определяется исходным уровнем секреторной активности желудка.

5. Gly-Pro потенцировал постстрессорное ослабление протеолитической активности желудочного сока в группе с исходно высокой секрецией, но не влиял на усиленную стрессом протеолитическую активность в группе с исходно низкой секрецией.

Список литературы

1. Абрамова М.А., Самонина Г.Е., Ашмарин И.П. // Нейрохимия. 1996. Т. 13, вып. 3. С. 209-214.

2. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П. // Успехи физиологических наук. 2003. Т. 34, №1. С. 14-19.

3. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П., Ляпина Л.А., Самонина Г.Е. // Биохимия. 1998. Т. 63, вып. 2. С. 149 - 155.

4. Бакаева З.В., Бадмаева К.Е., Сергеев И.Ю., Самонина Г.Е. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 135, № 4. С. 390-393.

5. Бесядовский Р.А., Иванов К.В., Козюра А.К. Справочное руководство для радиобиологов. М.: Атомиздат. 1978.

6. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Удут В.В. и др. Закономерности структурной организации систем жизнеобеспечения в норме и патологическом процессе. Томск: Изд-во ТГУ, 1996.

7. Горизонтов П. Д., Белоусова О.И., Федотова М.И. Стресс и система крови. М.: Медицина, 1983.

8. Гриднева В.И. // Доклады МАНВШ. Минск, 2004, № 1. С. 48-59.

9. Доведова Е.Л., Самонина Г.Е., Монаков М.Ю., Серпа Р., Ашмарин И.П., Герштейн Л.М. // Нейрохимия. 1998. Т. 15, вып. 2. С. 146 - 151.

10. Дорофеев Г.И., Успенский В.М. Гастродуоденальные заболевания в молодом возрасте. М.: Медицина, 1984.

11. Канищев И. А., Коваленко Л.Г. // Лаб. дело. 1977, №12. С. 707 - 710.

12. Колб В.Г., Камышников В.С. Клиническая биохимия. Минск: Беларусь, 1976. С. 240 - 247.

13. Лопухин Ю.М. Экспериментальная хирургия. М.: Мед., 1971.

14. Просекина Е.Ю., Гриднева В.И., Еськова Т.А. // Тез. докладов 3-го Всероссийского Международного симпозиума. - Иваново. - 1999. - С. 128.

15. Самонина Г.Е., Копылова Г.Н., Сергеев В.И., Жуйкова С.Е., Бакаева З.В. // Рос. физиол. журнал им. И.М. Сеченова. 2001. Т. 87, №11. С. 1488 - 1492.

16. Тутельян В.А., Хавинсон В.Х., Малинин В.В. // Бюл. эксперим. биол. и мед. -2003. - Т. 135, № 1. - С. 4 - 10.

17. Уголев А. М. Исследование пищеварительного аппарата у человека. Л.: Наука,

1969.

18. Успенский В.М. Предъязвенное состояние. Л.: Медицина, 1982.

19. Успенский В.М., Галузо В.В. // Терапев. архив. 1981. Т. 53, №10. С. 58 - 61.

20. Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Ашмарин И.П. // Успехи современной биологии. 2002. Т. 122, № 2. С. 190 - 203.

21. Шевченко И. А. Лабораторные методы исследования при заболеваниях органов пищеварения. М.: Медицина, 1982.

22. Asselin S., Knight C.G., Farndale R.W., Barnes M.J., Watson S.P. // Biochem. J. 1999. V. 339 (Pt.2). P. 413 - 418.

23. Byun H.G., Kim S.K. // J. Biochem. Mol. Biol. 2002. V. 35, № 2. P. 239 - 243.