Исследование процессов культивирования споровых пробиотиков на средах с гидролизатами белков, глюкозой и сахарозой

Р. Т. Валеева, О. В. Федорова, С. Г. Мухачев

ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ СПОРОВЫХ ПРОБИОТИКОВ НА СРЕДАХ С ГИДРОЛИЗАТАМИ БЕЛКОВ, ГЛЮКОЗОЙ И САХАРОЗОЙ

Ключевые слова: культивирование, спорообразующие культуры, оптическая плотность, титр клеток.

Проведены экспериментальные исследования по технологии получения жидкого препарата спорового пробиотика на основе двух штаммов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis с использованием гидролизатов белков, глюкозы и сахарозы.

Keywords: cultivation, spore culture, optical density, titer cells.

Experimental research on technology for liquid preparation of probiotic spores from two strains of Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis using protein hydrolysates, glucose and sucrose.

ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 619.15

Введение

Направление работы по интенсификации технологических процессов получения

высокоэффективных препаратов для лечения и профилактики заболеваемости людей и сельскохозяйственных животных является в настоящее время весьма актуальным.

Одним из основных факторов, влияющих на рост микроорганизмов и биологический синтез различных активных веществ, является состав питательной среды. При подборе питательный среды следует учитывать ее полноценность, т.е. обоснованный и сбалансированный набор различных компонентов, необходимых

микроорганизму для построения растущей клетки и синтеза конечного целевого продукта.

Рыбная мука - один из основных ценных белковых компонентов комбикормов,

вырабатываемый сушкой и размолом отходов переработки рыбы, морских млекопитающих, ракообразных, а также из отходов, полученных при разделке и переработке морских продуктов. По оценке продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (ФАО), мировое производство рыбной муки в настоящее время составляет 5-7 млн. тонн при потребности 10 млн. тонн. Россия в настоящий момент производит на кормовые цели всего около 60 тыс. т рыбной муки [1]. При этом по данным Минсельхоза России, реальная потребность (в случае насыщения рынка отечественной продукцией) в рыбной муке составляет 500 тыс. т в год. Импорт этой продукции в РФ на кормовые цели достигает 100 тыс. т в год и будет расти при интенсивном развитии животноводства, птицеводства и аквакультуры [2].

Рыбная мука - источник концентрированного белка высокого качества, жира, богатого незаменимыми жирными кислотами (типа Омега-3). Она включает в себя набор незаменимых аминокислот и удивительно широкий комплекс природных веществ. Рыбная мука характеризуется высоким содержанием минеральных веществ, в частности фосфора и кальция - соответственно 5-

5,5% и до 13%, в то время как в кормах растительного происхождения, как правило, содержится не более 1% каждого из этих элементов. Уровень фосфора и кальция в муке зависит от состава исходного сырья. Так, в муке, полученной из отходов филейного производства, содержание этих минеральных веществ больше, чем в муке из внутренностей рыб. Однако при использовании костной ткани в муке повышается уровень коллагеновых белков, являющихся неполноценными с кормовой точки зрения. Поэтому в кормовой рыбной муке содержание фосфора должно быть не более 5,5%, кальция - не более 13% [3].

Материалы и методы исследования

Нами ведутся экспериментальные работы по интенсификации технологии получения жидкого препарата спорового пробиотика на основе двух штаммов Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis [4, 5], вырабатывающих до 35 видов антибиотиков в малых дозах, безвредных для полезной микрофлоры кишечника.

Первые экспериментальные процессы культивирования спорообразующих культур проводили с использованием в качестве углеводного питания растворов сахарозы и в качестве аминокислотного питания гидролизатов

кукурузного экстракта и рыбной муки [6]. Кукурузный экстракт, содержащий осадок более 70% по объему, гидролизовался с целью получения дополнительного количества аминокислот, снижения обсемененности за счет разрушения клеток посторонних микроорганизмов. Эта мера позволяет более полно использовать данный компонент питания.

Для приготовления питательной среды использовали следующие минеральные соли: сульфаты магния, железа (II), марганца, фосфаты калия, хлорид натрия. Минеральные компоненты растворяли в отдельных колбах при несколько отличающихся значениях рН так, чтобы исключить образование осадков.

Культивирование спорообразующих бактерий проводили на качалочных колбах с рабочим объемом питательный среды 88 мл при температуре 29-30оС и рН 6,5-7,0. Концентрация сахарозы соответствовала 40 г/л.

В процессе выращивания спорообразующих культур контролировали температуру, кислотность среды, динамику роста культур и образование спор, содержание редуцирующих веществ в культуральной жидкости [7]. В процессе роста культур вели наблюдения за состоянием дрожжевых клеток под микроскопом, определяли биомассу дрожжевой суспензии на фотометре КФК - 3 - 01 -«ЗОМ». Контроль редуцирующих веществ и оптической плотности в отбираемых пробах осуществляли 1 раз в 3 - 4 часа в период 0 - 21 час процесса, а при необходимости продолжения процесса - 1 раз в час. При исчерпании субстрата и не достижении заданной плотности популяции, вносили стерильный концентрат среды - подпитку. После достижения заданной плотности культуры, процесс продолжали в рабочем режиме перемешивания и аэрации в течение 1 - 2 суток. Контроль спорообразования осуществляли с помощью камеры Горяева 1 раз в 4 часа.

Все процессы были проведены в трех повторностях, полученные результаты анализов усреднены. Обработка информации велась в среде табличного процессора Excel.

Результаты и обсуждения

Проведена экспериментальная оценка параметров роста спорообразующих бактерий Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis с использованием гидролизата рыбной муки на средах, содержащих в качестве источника углерода сахарозу и глюкозу. Во всех процессах начальное содержание редуцирующих веществ, гидролизата кукурузного экстракта и большинства минеральных компонентов отличалось незначительно или было полностью идентично.

Содержание минеральных компонентов, сахарозы и глюкозы в использованных питательных средах в процессах культивирования спорообразующих культур Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis представлено в таблице 1.

Таблица 1 - Содержание минеральных компонентов, сахарозы и глюкозы в использованных питательных средах

Кроме того в среды добавляли гидролизаты кукурузного экстракта и рыбной муки. Гидролиз

осуществляли с использованием 6% раствора HCl, при гидромодуле 4 : 1 в автоклаве при температуре 130°С в течение 2 часов. Гидролизат отфильтровывали через плотную льняную ткань и фуговали на центрифуге «ROTINA 380 R» при 7000 об/мин 7 минут. Полученные фугаты в среды добавляли в количестве: фугат гидролизата рыбной муки - 200 мл, а кукурузного экстракта - 100 мл на 1 л среды.

Такая богатая минеральными компонентами и аминокислотами среда использовалась с целью исключения лимитирования всеми этими компонентами и выявления влияния углеводного питания на жизнедеятельность бактерий.

Полученные экспериментальные данные процессов культивирования культур Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis представлены на рис. 1, 2.

i 1,4

О 0,8 Н-1-1-1-1-1-1-1-

0 5 10 15 20 25 30 35 40 Воемя Docra. час

0 Bacillus subtilis  Bacillus licheniformis

Рис. 1 - Изменение оптической плотности культуральных жидкостей прироста споровых культур Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis с использованием растворов сахарозы

0 10 20 30 40 50 60 70 80 Время роста, час

-Bacillus subtilis  Bacillus licheniformis

Рис. 2 - Изменение оптической плотности культуральных жидкостей прироста споровых культур Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis с использованием растворов глюкозы

Титры клеток бактерий в конце процессов составляли (1,0 - 1,9) • 108.

Из полученных результатов экспериментов следует, что замена сахарозы глюкозой приводит к интенсификации роста Bacillus subtilis, но не сказывается на характере роста Bacillus licheniformis. Но спорообразование в популяциях обеих культур протекает более интенсивно, что связано, по-видимому, с более интенсивным

Состав питательных сред, г/л

Процесс с использованием сахарозы

О т ад 2 О т й 2 NaCI О т (N О Рч О Рч Сахароза Глюкоза

0,068 0,011 0,056 0,005 0,075 4,545

Процесс с использованием глюкозы

0,061 0,010 0,051 0,004 0,068 4,123

потреблением глюкозы и более ранним исчерпыванием ее в среде.

Кроме того, прирост биомассы исследованных культур определяется величиной рН культуральной жидкости и возрастает с увеличением рН.

Полученные экспериментальные данные по изменению рН культуральных жидкстей в ходе процесса культивирования спорообразующих культур Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis с использованием растворов сахарозы и глюкозы представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Динамика рН в процессах культивирования спорообразующих культур с использованием сахарозы и глюкозы

Процесс с использованием сахарозы

Культура Sä о 4 час 8 час 32 час 36 час

B. subtilis 6,04 6,13 5,43 5,82 5,83

B.licheniformis 6,17 6,52 6,11 5,91 5,76

Процесс с использованием глюкозы

Культура Sä о 4,5 час 8,5 час 32 час 46,2 час

B. subtilis 6,92 6,78 6,11 5,35 6,04

B.licheniformis 6,91 6,90 6,81 7,49 8,20

При полном использовании углеводного питания, что наблюдается в процессах с использованием глюкозы, бактерии переходят на использование в качестве источника энергии не потребленного избытка аминокислот, содержащихся в среде. При этом рН возрстает за счет дезаминирования аминокислот.

После исчерпывания субстрата (концентрация РВ < 0,2 % масс.) во всех процессах начиналось спорообразование. При этом титр клеток не изменялся. Следовательно, снижение величины оптической плотности культуральной жидкости, наблюдаемое в конце процесса после 30-40 часа, имеет причиной не гибель клеток, а спорообразование.

Выводы

Для производства пробиотических препаратов можно рекомендовать использование питательных сред с глюкозой, обеспечивающих более высокую скорость роста и, следовательно, продуктивность биореактора.

Длительность стадии спорообразования равна или несколько превышает период активного роста исследованных культур. Для более эффективного использования биореакторного оборудования целесообразно проведение стадии спорообразования в отдельном аппарате.

Для увеличения титра клеток бактерий необходимо перейти о периодического процесса к доливному, т.е. устранить лимитирование субстратом, наступающее к 30-му часу процесса.

Литература

1. Состояние мирового рыболовства и аквакультуры 2008. - Рим: Продовольственная и сельскохозяйственная Организация Объединенных Наций, 2009. - 198 с.

2. А.М. Хлыстун, С.Д. Угрюмова, Научные труды Дальрыбвтуза, 2011. Т. 23, С. 211-214.

3. А.М. Ершов, В.В. Баранов, И.Э. Бражная, В.А. Гроховский, Технология рыбы и рыбных продуктов: Колос, Москва, 2006, 720 с.

4. И.А. Миннегараев, О.В. Федорова, Р.Р. Рафикова, А. И. Назмиева, Р.Т. Валеева, С.Г. Мухачев, Е.Н. Нуруллина, Материалы XIV Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, Россия, Май 13-14, 2015) . Казань, 2015. С. 112113.

5. Иванов Ю.И., Мухачев С.Г., Валеева Р.Т Материалы международной научной конференции «Биотехнологии в химико-лесном комплексе». (Архангельск, Россия, Сентябрь 11-12, 2014). Архангельск, ИД Сев. Арктич. Федер. ун-т, 2014. С.170-171.

6. О.Л. Старцева, дисс. канд. биол. наук, Федеральное государственное учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт роспотребнадзора», Ставрополь, 2005. 165 с.

7. И.З. Емельянова, Химико-технологический контроль гидролизных производств, Лесная промышленность, Москва, 1976, 405 с.

© Р. Т. Валеева - канд. техн. наук, доцент кафедры химической кибернетики КНИТУ, valrt2008@rambler.ru; О. В. Федорова - магистр 2 курса группы 615-М9 той же кафедры; С. Г. Мухачев - канд. техн. наук, доцент кафедры химической кибернетики КНИТУ.

© R. T. Valeeva - candidate of chemical science, associate Professor Department of Chemical Cybernetics, KNRTU, valrt2008@rambler.ru; O. V. Fedorova - master, Department of Chemical Cybernetics, KNRTU; S. G. Muhachev - candidate of chemical science, associate Professor Department of Chemical Cybernetics, KNRTU.