Геропротекторные пептиды и их роль в поддержании пула мезенхимальных стволовых клеток

Materials of conference

УДК 615.27:611-013.385

ГЕРОПРОТЕКТОРНЫЕ ПЕПТИДЫ И ИХ РОЛЬ В ПОДДЕРЖАНИИ ПУЛА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Е. А. Морозова, С. И. Тарновская, Е. В. Елашкина, Т. Е. Ничик, С. С. Коновалов Санкт-Петербургский институт биорегуляции и геронтологии, Санкт-Петербург, Россия

GEROPROTECTIVE PEPTIDES AND THEIR ROLE IN MAINTENANCE OF MESENCHYMAL STEM CELL POOL

E. A. Morozova, S. I. Tarnovskaya, E. V. Elashkina, T. E. Nitchik, S. S. Konovalov Saint-Petersburg Institute of Bioregulation and Gerontology, St. Petersburg, Russia

© Коллектив авторов, 2013 г.

Исследована зависимость пролиферативной активности мезенхимальных стволовых клеток от времени культивирования под влиянием трипептидов H-Glu-Asp-Arg-OH и H-Lys-Glu-Asp-OH по сравнению с контролем. Методом компьютерного моделирования высокотемпературного отжига были найдены биологически активные конформации трипептидов H-Glu-Asp-Arg-OH и H-Lys-Glu-Asp-OH. Также изучены и сопоставлены основные структурные характеристики трипептидов: значение полной энергии, длина основной цепи молекулы, торсионные углы. Проведена оценка зависимости влияния трипептидов на пролифератив-ный потенциал от их структурных характеристик.

Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, трипептиды, компьютерное моделирование, кон-формационный поиск.

We studied dependence of proliferative mesenchymal stem cells activity on cultivation time under influence of H-Glu-Asp-Arg-OH and H-Lys-Glu-Asp-OH tripeptides in comparison with control. Using computer modeling methods, particularly high-temperature annealing, we found out biologically active conformations of H-Glu-Asp-Arg-OH and H-Lys-Glu-Asp-OH tripeptides. Also the main structural characteristics of tripeptides were studied and compared: total energy, main chain length of the peptide, torsion angles. The assessment of dependence of tripeptide influence on proliferative potential from their structural characteristics was carried out.

Keywords: mesenchymal stem cells, tripeptides, computer modeling, conformational search.

Известно, что некоторые короткие пептиды (до 10 аминокислот) проявляют биологическую активность. Они участвуют в функционировании различных систем в организме. Исследование функциональной активности коротких пептидов и определение механизма их действия открывает новые перспективы для их использования в качестве регуляторов различных биологических процессов, в том числе возрастной патологии [1—5].

Помимо пептидных биорегуляторов другим современным направлением клеточной геронтологии является исследование резервных возможностей стволовых клеток. Известно, что стволовые клетки способны давать начало клеткам гемопоэтического ряда, что было установлено при совместном культивировании эмбриональных клеток человека с линиями стромальных фибробла-стов, а также при использовании факторов роста гемопоэтических клеток. Помимо этого, в эмбрио-идных тельцах были обнаружены популяции клеток, обладающих свойствами предшественников гемопоэтических и эндотелиальных клеток [6, 7]. Таким образом, стволовые клетки способны дифференцироваться в направлении различных субпопуляций функционально активных клеток: кар-диомиоцитов, нейронов, эндотелиоцитов, капилля-

ров. Оптимальный подбор условий направленной дифференцировки стволовых клеток является важнейшей задачей современной молекулярной биологии и позволяет открыть перспективы их применения в лечении важнейших возрастных заболеваний: болезни Альцгеймера, болезни Пар-кинсона, ишемической болезни сердца и сердечнососудистой патологии. Однако влияние пептидных биорегуляторов на различные свойства стволовых клеток до сих пор недостаточно изучено.

В нашем исследовании были использованы короткие пептиды H-Glu-Asp-Arg-OH (вилон) и H-Lys-Glu-Asp-OH (везуген), полученные на основе анализа аминокислотных последовательностей природных полипептидных экстрактов, выделенных из органов крупного рогатого скота. В опытах на животных и клеточных культурах было установлено, что эти пептиды способствуют индукции синтеза регуляторных белков, влияют на пролиферацию и дифференцировку клеток, проявляют тканеспецифичность [4, 5, 8]. В частности, пептид H-Glu-Asp-Arg-OH способствует регенерации нейронов центральной нервной системы (ЦНС) за счет стимуляции синтеза тканеспеци-фических антиоксидантных белков, нормализации метаболизма и электрической активности нейро-

Материалы конференции

нов. Пептид H-Lys-Glu-Asp-OH стимулирует пролиферацию клеток сосудов крыс в органотипиче-ской культуре.

В связи с этим целью нашего исследования явилось изучение влияния коротких синтетических пептидов на пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека.

Первым этапом эксперимента явилось исследование влияния трипептидов H-Glu-Asp-Arg-ОН и H-Lys-Glu-Asp-OH на культуру МСК человека. На втором этапе был проведен конформаци-онный поиск трипептидов для оценки влияния H-Glu-Asp-Arg-OH и H-Lys-Glu-Asp-OH на про-лиферативный потенциал в зависимости от их структурных характеристик.

Материалами для исследования стали препараты пептидов H-Glu-Asp-Arg-OH и H-Lys-Glu-Asp-OH, полученные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии, и культура МСК человека.

МСК выделяли из липоаспирата, полученного из абдоминальной жировой ткани человека. После выделения МСК из липоаспирата их культивировали в среде, содержащей 15% фетальной бычьей сыворотки, 82,5% DМЕМ, 1,5% НЕРЕS, L-глутамин и гентамицин, до 3-го пассажа, после чего клетки 1-го пассажа разделяли на 3 группы: 1-я — контроль (введение физраствора), 2-я — введение пептида H-Lys-Glu-Asp-OH и 3-я — введение пептида H-Glu-Asp-Arg-OH и рассаживали в 24-луночный планшет. На 1-е, 3-е, 5-е и 8-е сут клетки подсчитывали в камере Горяе-ва. Под влиянием пептида H-Lys-Glu-Asp-OH на 3-е сут количество МСК возросло на 25% по отношению к контролю. При этом введение пептида H-Glu-Asp-Arg-OH в культуру МСК на 3-е сут приводило к снижению численности клеток на 65%. На 5-е сут полученный эффект был выражен еще сильнее. Так, под действием пептида H-Lys-Glu-Asp-OH численность МСК возросла в 2 раза по отношению к контролю и снижалась под влиянием пептида H-Glu-Asp-Arg-OH в 1,6 раза.

К 8-м сут эффект пептида H-Lys-Glu-Asp-OH сохранялся, а действие пептида H-Glu-Asp-Arg-ОН нивелировалось.

Таким образом, пептид H-Lys-Glu-Asp-OH стимулировал пролиферативную активность МСК, а пептид H-Glu-Asp-Arg-OH обладал ингибирую-щим действием.

Нами был выполнен конформационный поиск оптимальных структурных конформеров пептидов Н^1и^р-А^-ОН и H-Lys-Glu-Asp-OH с использованием метода высокотемпературного отжига. В результате были получены структуры трипептидов, соответствующие оптимальному интервалу значений полной энергии. Предполагается, что найденные конформации пептидов обладают наибольшей биологической активностью.

Значения энергий и геометрических параметров найденных конформаций пептидов Н^1и-Asp-Arg-OH и H-Lys-Glu-Asp-OH различались. В частности, оптимальная конформация пептида H-Glu-Asp-Arg-OH соответствовала меньшему значению энергии по сравнению с пептидом H-Lys-Glu-Asp-OH. Аминокислоты пептида H-Glu-Asp-А^-ОН были менее лабильны по сравнению с аминокислотами H-Lys-Glu-Asp-OH.

Поскольку ранее было показано, что короткие пептиды влияют на пролиферативную активность и дифференцировку клеток через регуляцию экспрессии различных транскрипционных факторов, связываясь с промоторными зонами их генов, можно сделать следующее предположение [5].

Вероятно, трипептид H-Glu-Asp-Arg-OH, обладая рассчитанными характеристиками, образует стабильный комплекс с промоторной зоной одного из генов, ответственных за пролиферацию МСК, ингибируя его, тогда как трипептид H-Lys-Glu-Asp-OH обладает обратным действием. Таким образом, короткие пептиды способны активировать пролиферацию МСК, способствуя поддержанию резервных возможностей организма, что особенно важно при ускоренном и естественном старении различных органов и тканей.

Литература

1. Хавинсон В. Х., Соловьев А. Ю., Жилинский Д. В. и соавт. Эпигенетические аспекты пептидной регуляции старения // Успехи геронтологии. — 2012. — Т. 25. — № 1. — С. 11-22.

2. Хавинсон В. Х., Тарновская С. И., Линькова Н. С., Проняева В. Е., Шатаева Л. К., Якуцени П. П. Короткие пептиды, проникающие в клетку: модель взаимодействия с промоторными участками генов // Бюлл. эксп. би-ол. мед. — 2012. — № 10. — С. 391-396.

3. Khavinson V. Kh, Malinin V. V. Gerontological aspects of genome peptide regulation. — Basel (Switzerland): Karger AG. — 2005. — 104 p.

4. Khavinson V. Kh., Polyakova V. O., Linkova N. S., Dudkov A. V., Kvetnoy I. M. Peptides Regulate Cortical Thymocytes Differentiation, Proliferation and Apoptosis // J. of Amino Acids. — 2011. — http://dx.doi. org/10.4061/2011/517137. — Последнее посещение сайта 01.09.2013 г.

5. Lin'kova N. S., Trofimov A. V. and Dudkov A. V. Peptides from the Pituitary Gland and Cortex Stimulate Differentiation of Polypotent Embryonic Tissue // Bull. Exp. Biol. Med. — 2011. — Vol. 151. — № 2. — P. 530-531.

6. Dawn B., Bolli R. Bone marrow cells and regeneration // Basic Research in Cardiology. — 2005. — Vol. 100. — № 6. — P. 494-501.

7. Ferrari G., Cusella-De Angelis G., Coletta M. et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors // Science. — 1998. — № 279. — P. 1528-1530.

8. Хавинсон В. Х., Соловьев А. Ю., Шатаева Л. К. Плавление двойной спирали ДНК при связывании с геро-протекторным тетрапептидом // Биогеронтология. — 2008. — Т. 146. — № 11. — C. 561-562.