СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ РАКА С ПРИМЕНЕНИЕМ ИНГИБИТОРА АУТОФАГИИ НА ОСНОВЕ ТИОКСАНТОНА
METHODS FOR CANCER TREATMENT USING AUTOPHAGY INHIBITOR BASED ON THIOXANTHONE

ИСПРАШИВАЕМЫЙ ПРИОРИТЕТ
[01] Настоящая заявка на патент испрашивает приоритет согласно § 119 (е) Раздела 35 Свода законов США на основании предварительной заявки на патент США №61/131736, поданной 8 марта 2010 года, которая, тем самым, включена в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме.
ВВЕДЕНИЕ
[02] Рак является второй основной причиной смерти людей в США; по оценкам, в 1998 году было зафиксировано 1228600 новых случаев этого заболевания и 564800 смертей от рака. На протяжении последних 50 лет уровень смертности от рака неуклонно повышался за счет, главным образом, высокого роста уровня смертности от рака легких, вызванного курением. Рак встречается у людей всех возрастов, но его распространенность сильно возрастает среди людей в возрасте старше 45 лет. Однако в США рак является основной причиной смерти людей в возрасте от 35 до 65 лет, а также основной причиной не связанных с несчастным случаем смертей в США среди детей в возрасте до 15 лет. У мужчин коэффициент смертности от рака выше, чем у женщин, при этом темнокожее население имеет наибольший коэффициент смертности от рака среди основных расовых групп. В США риск развития рака в течение жизни для мужчин составляет примерно 1 к 2, а для женщин - примерно 1 к 3. С учетом ожидаемого непрерывного снижения количества смертей от заболеваний сердца и инсультов, к 2010 году раковые заболевания станут общей основной причиной смерти для всего американского населения.
[03] Диагностика рака обычно требует гистологического исследования специалистом образца биопсии ткани, хотя начальный признак злокачественности может представлять собой симптомы или отклонения от нормы на рентгеновских снимках. После постановки диагноза рак в большинстве случаев лечат путем хирургического вмешательства, химиотерапии, радиационной терапии или направленной терапии, такой как иммунотерапия, гормональная терапия или терапия с применением ингибитора ангиогенеза. Выбор терапии зависит от локализации и степени злокачественности опухоли и стадии заболевания, а также общего состояния пациента (функционального статуса). Более того, в зависимости от типа и стадии рака, можно комбинировать вместе два или более из указанных способов лечения рака или применять их один за другим. Хотя целью лечения является полное удаление рака без нанесения вреда остальному организму, современные подходы к лечению раковых заболеваний имеют ограниченный успех. Что касается хирургического вмешательства, проблемы частично обусловлены склонностью отдельных раковых клеток или небольшого количества раковых клеток поражать соседнюю ткань или метастазировать в отдаленные участки, ограничивая тем самым эффективность местных хирургических способов лечения. Эффективность химиотерапии и радиационной терапии часто ограничена токсичностью в отношении нормальных тканей тела или их повреждением. Поэтому очень востребованны соединения, композиции и способы, которые могут обеспечить более эффективное лечение рака. Кроме того, также были бы желательны соединения, композиции и способы, позволяющие лечить конкретный вид рака, для которого не существует современных способов лечения.
[04] Аутофагия (макроаутофагия или аутофагоцитоз), представляет собой катаболический процесс, при котором клетки разрушают поврежденные, избыточные или ненужные в других отношениях цитоплазматические компоненты, в том числе белки и органеллы, используя лизосомальный механизм. Будучи жестко контролируемым процессом, такой путь распада индуцируется недостаточностью питательных веществ, метаболическим стрессом или состоянием микросреды и обеспечивает энергетический баланс, клиренс поврежденных белков и адаптацию к стрессу. Аутофагия играет важную роль при нормальном клеточном росте и развитии, помогая сохранить баланс между синтезом и разрушением компонентов клетки. Кроме того, в результате этого процесса образуются продукты распада, которые могут служить в качестве альтернативного источника энергии при метаболическом стрессе для поддержания гомеостаза и жизнеспособности. По существу, аутофагия играет цитопротекторную роль в случаях недостатка питательных веществ.
[05] Процесс саморазрушения включает инкапсуляцию части цитоплазмы клеток в везикуле, ограниченной двойной мембраной, называемой аутофагосомой или аутофагической вакуолью и секвестирующей компоненты, в том числе белки и органеллы, из остатка цитоплазмы. Аутофагосомы образуются в результате элонгации малых мембранных структур, известных как предшественники аутофагосомы. Такого рода синтез инициируется фосфоинозитид-3-киназой класса III и геном, связанным с аутофагией (Atg) 6 (также известным как Beclin-1). Рост указанных предшественников аутофагосомы требует участия 2 убиквитино-подобных систем конъюгации, которые продуцируют модифицированные комплексы регуляторов аутофагии. Этот процесс включает конъюгацию комплекса ATG12-ATG5-ATG16 и комплекса фосфатидилэтаноламина (РЕ) с LC3/ATG8 и комплексом ATG4 протеазы. Далее, при завершении процесса образования аутофагосомы происходят нуклеация, расширение и сбрасывание оболочки. Затем наружная мембрана аутофагосомы сливается в цитоплазме с лизосомой с образованием аутолизосомы или аутофаголизосомы, где их содержимое разрушается под действием лизосомальных кислых гидролаз. Конечный результат активации аутофагии сильно зависит от клеточного окружения и силы и продолжительности сигнала, индуцирующего стресс.
[06] Продукты распада цитоплазмы и органелл, в том числе аминокислоты, липиды, нуклеиновые кислоты и сахара, с помощью пермеаз удаляются из лизосом и поступают в цитоплазму. Клетки используют указанные продукты клеточного распада в качестве строительных блоков для макромолекулярного синтеза или поддержания энергетического гомеостаза. По существу, аутофагия является основным механизмом, с помощью которого клетка рециркулирует и перераспределяет питательные вещества, обеспечивая ими более существенные клеточные процессы. Аутофагия также участвует в контроле качества белка и органелл путем разрушения поврежденных или старых компонентов клетки, таких как деполяризованные митохондрии и неструктурированные белки. Обновление белков и органелл за счет аутофагии имеет решающее значение для поддержания гомеостаза, так как позволяет предотвратить токсичное накопление старых и поврежденных компонентов клеток.
[07] Было обнаружено, что аутофагия представляет собой ранее неизвестный цитопротекторный механизм, который увеличивает выживаемость опухолевых клеток в условиях метаболического стресса и гипоксии, а также позволяет избежать некроза клеток, вызванного химиотерапией, радиационной терапией или направленной терапии. Например, в случае агрессивных видов рака аутофагия позволяет сохранить метаболизм, необходимый для поддержания выживаемости опухолевых клеток, в частности, в условиях гипоксии и недостатка питательных веществ. Кроме того, аутофагия продуцирует небольшое количество покоящихся опухолевых клеток, способных возобновить клеточную пролиферацию после устранения стресса. Тем самым аутофагия позволяет раковым клеткам за счет пластичности выдержать стресс, даже стресс, вызванный терапией, и возобновить рост при более благоприятных условиях. Такой процесс выживаемости при стрессе, покоя и регенерации, обеспечиваемый аутофагией, может быть главным препятствием для проведения успешного лечения ракового заболевания. Кроме того, основной аспект лечения рака, такой как, например, химиотерапия, направленная терапия и радиационная терапия, состоит в нанесении опухолевым клеткам повреждения, достаточного для их уничтожения посредством апоптоза, некроза или чередующихся форм гибели клеток. В дополнение к собственному метаболическому стрессу, имеющему место в микроокружении опухоли, указанные способы лечения усиливают клеточный стресс и инициируют аутофагию. По существу, аутофагия позволяет продлить выживаемость опухолевых клеток за счет обеспечения защитной функции, которая ограничивает некроз опухоли и воспаление и уменьшает повреждение генома в опухолевых клетках, в ответ на метаболический стресс и апоптоз, вызванный терапией.
[08] Поскольку аутофагия представляет собой путь выживания, используемый опухолевыми клетками для выдерживания метаболического стресса, ингибиторы аутофагии, как ожидают, могут подходить для лечения рака. Ингибиторы аутофагии являются особенно привлекательными, поскольку они могут нацеленно воздействовать на те опухолевые клетки на гипоксических участках опухоли, которые устойчивы к действию терапии, в частности, излучению. Кроме того, опухолевые клетки в процессе метастазирования могут, в частности, зависеть от аутофагии, что подтверждает правильность способов лечения, направленных на прекращение аутофагии в начале развития болезни и применение адъювантной терапии. В частности, подходящей противораковой терапией было бы применение агентов, ингибирующих аутофагический распад, с целью усиления эффективности традиционной химиотерапии, которая, как правило, активирует путь аутофагии. Можно было бы ожидать, что добавление ингибиторов аутофагии усилит цитотоксичность указанных агентов. Например, лечение с применением ингибитора аутофагии позволяет увеличить эффективность апоптоз-индуцирующей химиотерапии у пациентов-людей, болеющих раком. Таким образом, терапия рака, направленная на блокирование опосредованной аутофагией выживаемости клеток с помощью ингибиторов аутофагии, может иметь чрезвычайную ценность.
[09] Хотя идентификация ключевых ингибиторов аутофагии является крайне желательной, агенты, которые специфично и нацеленно воздействуют на путь аутофагии, в настоящее время отсутствуют. В настоящем описании предложены ингибиторы аутофагии, которые в комбинации с химиотерапевтическим соединением или излучением, вызывающем аутофагию, обеспечивают синергический положительный эффект при лечении широкого спектра раковых заболеваний.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
[010] Таким образом, аспекты настоящего описания изобретения включают ингибитор аутофагии на основе тиоксантона. Применяемые ингибиторы аутофагии на основе тиоксантона включают, без ограничения, 1-((2-(диэтиламино)этил)амино)-4-метилтиоксантен-9-он, 1-(2-диэтиламиноэтиламино)-4-(гидроксиметил)-9-тиоксантенон, Т-[[1-[[2-(диэтиламино)этил]амино]-9-оксо-9Н-тиаксантен-4-ил]метил]метансульфонамид, их индазольные аналоги или их соли.
[011] Другие аспекты настоящего описания изобретения включают вызывающее аутофагию соединение для лечения рака. Неограничивающие примеры таких соединений включают триоксид мышьяка, этопозид, рапамицин, ингибиторы гистондеацетилазы, ингибиторы тирозинкиназы, тамоксифен, темозоломид, иматиниб, бортезомиб ингибитор гистондеацетилазы. Подходящие ингибиторы гистондеацетилазы включают, без ограничения, ингибитор гистондеацетилазы гидроксаматного типа или ингибитор гистондеацетилазы бензамидного типа. Неограничивающие примеры таких ингибиторов включают (2Е,4Е,6R)-7-(4-диметиламинофенил)-N-гидрокси-4,6-диметил-7-оксогепта-2,4-диенамид,
N-гидрокси-N’-фенилоктандиамид, 4-диметиламино-N-(6-гидроксикарбамоилгексил)-бензамид, N-гидрокси-3-[(Е)-3-(гидроксиамино)-3-оксопроп-1-енил]бензамид, (2Е)-3-[3-(анилиносульфонил)фенил]-N-гидроксиакриламид, ((E)-N-гидрокси-3-[4-[[2-гидроксиэтил-[2-(1Н-индол-3-ил)этил]амино]метил] фенил]проп-2-енамид, (Е)-N-гидрокси-3-[4-[[2-(2-метил-1Н-индол-3-ил) этиламино]метил] фенил]проп-2-енамид, N-(2-аминофенил)-N’-фенилоктандиамид, 4-(2-аминофенилкарбамоил)бензилкарбамат, 4-ацетамидо-N-(2-аминофенил)бензамид, N-(2-аминофенил)-4-[[(4-пиридин-3-илпиримидин-2-ил)амино]метил]бензамид, 3-(диметиламинометил)-N-[2-[4-(гидроксикарбамоил)фенокси]этил]-1-бензофуран-2-карбоксамид или {6-[(диэтиламино) метил]-2-нафтил}метил {4-[(гидроксиамино)карбонил]фенил}карбамат или их соли.
[012] Другие аспекты настоящего описания изобретения включают фармацевтическую композицию, содержащую соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении. В одном из аспектов, фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество ингибитора аутофагии на основе тиоксантона. В другом аспекте, фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество вызывающего аутофагию соединения для лечения рака. В еще одном аспекте, фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество ингибитора аутофагии на основе тиоксантона; и терапевтически эффективное количество вызывающего аутофагию соединения для лечения рака. Фармацевтическая композиция, описанная в настоящей заявке, может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель.
[013] Другие аспекты настоящего описания изобретения включают применение соединения или соединений, предложенных в настоящем изобретении, или композиции, предложенной в настоящем изобретении, для получения лекарственного средства для лечения рака.
[014] Другие аспекты настоящего описания включают способ лечения рака, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, эффективного количества ингибитора аутофагии на основе тиоксантона, предложенного в настоящем изобретении; и введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, эффективного количества вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, предложенного в настоящем изобретении; при этом введение как ингибитора аутофагии на основе тиоксантона, так и вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, уменьшает симптом, связанный с раком, с обеспечением тем самым лечения рака. Ингибитор аутофагии на основе тиоксантона и вызывающее аутофагию соединение для лечения рака, можно ввести одновременно или последовательно. Последовательное введение ингибитора аутофагии на основе тиоксантона и вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, можно осуществить в пределах примерно трех часов относительно друг друга, в пределах примерно двух часов относительно друг друга или в пределах примерно одного часа относительно друг друга. Неограничивающий пример ракового заболевания, которое можно лечить с применением соединений, композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, включает рак легких, рак мозга, рак центральной нервной системы, рак молочной железы, рак толстой кишки, лейкемию, миелому, рак простаты или яичника. В дополнительных аспектах, способ также включает применение радиационной терапии.
[015] Дополнительные аспекты настоящего описания изобретения включают применение ингибитора аутофагии на основе тиоксантона и вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, предложенного в настоящем изобретении, или композиции, содержащей указанные соединения, предложенные в настоящем изобретении, для лечения рака, при этом введение как ингибитора аутофагии на основе тиоксантона, так и вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, уменьшает симптом, связанный с раком, с обеспечением тем самым лечения рака. Неограничивающий пример ракового заболевания, которое можно лечить с применением соединений, композиций и способов, описанных в настоящем документе, включают рак легких, рак мозга, рак центральной нервной системы, рак молочной железы, рак толстой кишки, лейкемию, миелому, рак простаты или яичника. В еще других аспектах, способ дополнительно включает применение радиационной терапии.
[016] Дополнительные аспекты настоящего описания включают фармацевтический набор, содержащий фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество ингибитора аутофагии на основе тиоксантона и фармацевтически приемлемый носитель, и фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, и фармацевтически приемлемый носитель.
[017] Другие аспекты настоящего описания включают способ лечения рака, включающий введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, эффективного количества ингибитора аутофагии на основе тиоксантона, предложенного в настоящем изобретении; и воздействие на млекопитающее, нуждающееся в этом, эффективной дозы радиационной терапии, предложенной в настоящем изобретении; при этом как введение ингибитора аутофагии на основе тиоксантона, так и применение радиационной терапии уменьшает симптом, связанный с раком, с обеспечением тем самым лечения рака. Ингибитор аутофагии на основе тиоксантона и радиационную терапию можно использовать одновременно или последовательно. Последовательное применением ингибитора аутофагии на основе тиоксантона и радиационной терапии можно осуществить в пределах примерно трех часов относительно друг друга, в пределах примерно двух часов относительно друг друга или в пределах примерно одного часа относительно друг друга. Неограничивающий пример ракового заболевания, которое можно лечить с применением соединений, композиций и способов, описанных в настоящем документе, включает рак легких, рак мозга, рак центральной нервной системы, рак молочной железы, рак толстой кишки, лейкемию, миелому, рак простаты или яичника.
[018] Дополнительные аспекты настоящего описания изобретения включают применение ингибитора аутофагии на основе тиоксантона или композиции, содержащей такое соединение, и радиационной терапии, описанной в настоящем изобретении, для лечения рака, при этом как введение ингибитора аутофагии на основе тиоксантона, так и применение радиационной терапии уменьшает симптом, связанный с раком, с обеспечением тем самым лечения рака. Неограничивающий пример ракового заболевания, которое можно лечить с применением соединений, композиций и способов, предложенных в настоящем изобретении, включает рак легких, рак мозга, рак центральной нервной системы, рак молочной железы, рак толстой кишки, лейкемию, миелому, рак простаты или яичника.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[019] Фиг.1. Лукантон ингибирует аутофагию. Фиг.1А. Индукция лукантоном образования LC3-II, вакуолизации и пермеабилизации лизосомальных мембран (LMP). Присутствие LC3-II обнаруживали при помощи иммуноцитохимии, вакуолизацию (стрелки) - с помощью окрашивания с применением Giemsa и пермеабилизацию лизосомальных мембран - по потере интенсивности флуоресценции акридинового оранжевого. Электронная микроскопия демонстрирует вакуолизацию и аккумуляцию электроноплотных частиц (стрелки), что предполагает аккумуляцию недеградированного белка. Фиг.1В. Количественное определение пермеабилизации лизосомальных мембран. Среднее значение ± стандартное отклонение, n=5. Указывает на значительное отличие от контрольных экспериментов. P<0,05. Фиг.1С. Лукантон стимулирует аккумуляцию SQSTM1/p62. Фиг.1D. Лукантон стимулирует агрегацию SQSTM1/p62, как наглядно показано с помощью флуоресцентной микроскопии (Фиг.1D) и путем количественного определения относительной флуоресценции (Фиг.1Е). Фиг.1F. Лукантон, бафиломицин А1 и их комбинация индуцируют образование LC3-II и аккумуляцию SQSTM1/p62. Фиг.1G. Лукантон, бафиломицин А1 и их комбинация индуцируют апоптоз в клеточных линиях рака молочной железы.
[020] Фиг.2. Обработка с применением лукантона и хлорохина уменьшает жизнеспособность клеток. Фиг.2А. Кривая зависимости ответа от дозы лукантона для семи клеточных линий рака молочной железы. Фиг.2В. Кривая зависимости ответа от дозы хлорохина для семи клеточных линий рака молочной железы.
[021] Фиг.3. Экспрессия катепсина D резко повышается после обработки лукантоном. Фиг.3А. Экспрессионные биочипы Affymetrix идентифицируют катепсин D (CTSD) в клетках рака молочной железы как сильно активированный ген. Фиг.3В. Количественный анализ экспрессии катепсина D в клетках рака молочной железы в реальном масштабе времени на основе полимеразной цепной реакции (PCR). Среднее значение ± стандартное отклонение, n=4. Указывает на значительное отличие от контрольных экспериментов. P<0,05. Фиг.3С. Лукантон увеличивает уровни катепсин D и стимулирует его агрегацию.
[022] Фиг.4. Индукция катепсина D способствует апоптозу, опосредованному лукантоном. Фиг.4А. Лукантон индуцирует экспрессию катепсина D и образование LC3-II. Фиг.4 В. Лукантон индуцирует апоптоз в четырех различных клеточных линиях рака молочной железы. Среднее значение ± стандартное отклонение, n=3. Указывает на значительное отличие от контрольных экспериментов. P<0,05. Фиг.4С. Нокдаун катепсина D уменьшает апоптоз, индуцированный лукантоном, как показано с помощью иммуноблоттинга. Фиг.D. Количественное определение уменьшения апоптоза, индуцированного лукантоном, при нокдауне катепсина D. Среднее значение ± СО, n=3. Указывает на значительное отличие от нецелевых трансфицированных siRNA клеток, обработанных лукантоном. P<0,05.
[023] Фиг.5. Лукантон индуцирует экспрессию катепсина D и уменьшает жизнеспособность клеток независимо от р53. Фиг.5А. Клетки НСТ116 р53+/+ и р53-/- применяли для оценки, является ли необходимым белок р53 для апоптоза, опосредованного лукантоном. Фиг.5В. Лукантон увеличивает уровни катепсина D в клетках НСТ116, независимо от состояния р53. Фиг.5С. Клетки НСТ1 16 р53+/+ и р53-/- в равной степени чувствительны к лукантону. Среднее значение ± стандартное отклонение, n=3.
[024] Фиг.6. Лукантон усиливает противораковую активность вориностата. Фиг.6А. Комбинация лукантона и вориностата увеличивает уровни катепсина D. Фиг.6В. Количественное определение воздействия лукантона и вориностата на жизнеспособность клеток рака молочной железы. Среднее значение ± стандартное отклонение, n=3. Указывает на значительное отличие по сравнению с контрольными пробами. * Указывает на значительное отличие по сравнению с группами, включающими один агент. P<0,05. Фиг.6С. Лукантон усиливает апоптоз, опосредованный вориностатом. Среднее значение ± стандартное отклонение, n=3. Указывает на значительное отличие по сравнению с контрольными пробами. ** Указывает на значительное отличие по сравнению с группами, включающими один агент. P<0,05.
[025] Фиг.7. Лукантон усиливает противораковую активность белиностата. Фиг.7А. Количественное определение воздействия лукантона и белиностата на жизнеспособность клеток рака молочной железы. Среднее значение ± стандартное отклонение, n=3. Указывает на значительное отличие по сравнению с контрольными пробами. ** Указывает на значительное отличие по сравнению с группами, включающими один агент. P<0,05. Фиг.7В. Лукантон усиливает апоптоз, опосредованный белиностатом. Среднее значение ± стандартное отклонение, n=3. Указывает на значительное отличие по сравнению с контрольными пробами. ** Указывает на значительное отличие по сравнению с группами, включающими один агент. P<0,05. Фиг.7С. Кривая зависимости от дозы белиностата в клетках из клеточных линий рака молочной железы MDA-MB-231. Фиг.7D. Кривая зависимости от дозы белиностата в клетках из клеточных линий ВТ-20 рака молочной железы.
ОПИСАНИЕ
[026] Поскольку неконтролируемый клеточный рост является первопричиной всех раковых заболеваний, соединения, композиции и способы, которые позволяют уменьшить или предотвратить такой неконтролируемый рост клеток, будут эффективными при лечении рака. В настоящем описании изобретения предложены соединения, композиции и способы, позволяющие уменьшить или предотвратить неконтролируемый клеточный рост, проявляемый раковыми клетками. Соединения содержат, частично, ингибитор аутофагии на основе тиоксантона (TAPI) и вызывающее аутофагию соединение для лечения рака (CTAPIC). TAPI ингибируют опосредованную аутофагией выживаемость опухолевых клеток, делая их более чувствительными к метаболическому стрессу, гипоксии и лечению рака, такому как, например, химиотерапия, радиационная терапия или направленные терапии, такие как иммунотерапия, гормональная терапия или терапия с применением ингибитора ангиогенеза. CTAPIC являются общепринятыми химиотерапевтическими или целенаправленными терапевтическими агентами, которые вызывают аутофагию как последствие механизма их действия. Неожиданным образом, хотя TAPI и CTAPIC оказывают противоположное воздействие на опухолевые клетки, было обнаружено, что комбинация соединений TAPI и HDACI (ингибитор гистондеацетилазы) обеспечивает синергический эффект, который значительно улучшает терапевтический лечебный результат и обеспечивает более эффективное лечение ракового заболевания. В качестве вывода из этого обнаруженного факта, комбинированное лечение с применением TAPI и радиационной терапии за счет синергического эффекта будет также способствовать благоприятному лечению рака, поскольку радиационная терапия также индуцирует аутофагию.
[027] Аспекты настоящего описания изобретения включают, частично, ингибитор аутофагии на основе тиоксантона (TAPI). Как показано в разделе Примеры, TAPI ингибирует аутофагию, разрушает лизосомную функцию, индуцирует экспрессию катепсина D, является цитотоксичным для раковых клеток, обладает противораковой активностью, которая не зависит от состояния р53, и усиливает противораковую активность CTAPIC. TAPI, подходящий для применения в способах, предложенных в настоящем изобретении, включает любое соединение на основе тиоксантона, содержащее присоединенные короткие цепи, напоминающие кольцо дезоксирибозного сахара без присоединенного основания и фосфодиэфирной связи. Неограничивающие примеры TAPI включают лукантон (мирацил D), 1-((2-(диэтиламино)этил)амино)-4-метилтиоксантен-9-он, гикантон 1-(2-диэтиламиноэтиламино)-4-(гидроксиметил)-9-тиоксантенон, индазольные аналоги лукантона и гикантона, (WIN33377) N-[[1-[[2-(диэтиламино)этил]амино]-9-оксо-9Н-тиаксантен-4-ил]метил]метансульфонамид, наряду с их физиологически допустимыми производными, аналогами и солями. Другие тиоксантоновые ингибиторы апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы описаны, например, в публикациях Thomas Corbett с соавторами, Antitumor Activity of N-[[1-[[2-(diethylamino)ethyl]amino]-9-oxo-9H-thiaxanthen-4-yl]methyl] meth anesulfonamide (WIN33377) и Analogues, Exp. Opin. Invest. Drugs 3:1281-1292 (1994), и Mark P. Wentland с соавторами, Anti-solid Tumor Efficacy and Preparation of N-[[1-[[2-(diethylamino)ethyl]amino]-9-oxo-9H-thiaxanthen-4-yl]methyl]meth anesulfonamide (WIN33377) и Related Derivatives, Bioorg. Med. Chem. Lett. 4:609-614 (1994), каждая из которых в полном объеме включена в настоящую заявку посредством ссылки.
[028] В аспектах данного варианта реализации изобретения, TAPI представляет собой 1-((2-(диэтиламино)этил)амино)-4-метилтиоксантен-9-он, 1 -(2-диэтиламиноэтиламино)-4-(гидроксиметил)-9-тиоксантенон или N-[[1-[[2-(диэтиламино)этил]амино]-9-оксо-9Н-тиаксантен-4-ил]метил]метансульфонамид. Химическая структура указанных соединений показана ниже.
Тиоксатенон
Лукантон (Мирацил D)
1-((2-(диэтиламино)этил)амино)-4-метилтиоксантен-9-он
Гикантон
1-(2-диэтиламиноэтиламино)-4-(гидроксиметил)-9 тиоксантенон
WIN-33377 (SR-233377)
N-[[1-[[2-(диэтиламино)этил]амино]-9-оксо-9Н-тиаксантен-4-ил]метил]метансульфонамид
[029] Аспекты настоящего описания изобретения включают, частично, вызывающее аутофагию соединение для лечения рака. Вызывающее аутофагию соединение для лечения рака (CTAPIC), относится к классу противораковых соединений, применимых при лечении широкого ряда раковых заболеваний, которые, тем не менее, вызывают аутофагию и, тем самым, ингибируют апоптоз. Многие противораковые терапевтические средства индуцируют аутофагию, поскольку они вызывают повреждение (цитотоксичная химиотерапия), метаболический стресс (ингибиторы ангиогенеза, 2-дезоксиглюкоза) или блокируют развитие сигнальных путей (целенаправленные нецитотоксические препараты, ингибиторы киназы) за счет имитирования депривации факторов или голодания. По существу, CTAPIC включает химиотерапевтические и целенаправленные терапевтические соединения, такие как иммунотерапевтические соединения, гормональные терапевтические соединения или соединения ингибиторы ангиогенезы. Неограничивающие примеры таких соединений включают противо-ангиогенезесные соединения, ингибиторы тирозинкиназы, ингибиторы фактора роста эндотелия сосудов (VEGFR), ингибиторы гистондеацетилазы, ингибиторы фарнезилтрансферазы, ингибиторы mTOR, ингибиторы гликолиза и аналоги витамина D и ретиноиды. Другие CTAPIC включают, без ограничения, мышьяковистый ангидрид, бевацизумаб карбоплатин 1/11, бортезомиб, дезоксиглюкозу, доцетаксел, эндостатин, этопозид, эверолимус, гефинитиб, иматиниб, иксабепилон, лонафарниб, рапамицин, яблочнокислый сунитиниб, тамоксифен, темозоломид и темсиролимус.
[030] Аспекты настоящего описания изобретения включают, частично, ингибитор гистондеацетилазы. Ингибиторы гистондеацетилазы (ингибиторы гистондеацетилазы (HDAC, HDACI), или ингибиторы гистондеацтилаз (HDI)) представляют собой класс соединений, которые препятствуют функционированию HDAC и могут привести к гиперацетилированию гистонов, воздействуя, тем самым, на экспрессию генов. Ингибиторы HDAC классифицируют согласно их химическим структурам, при этом они обладают различной специфичностью и сродством в отношении HDAC класса 1, 2 и 4. Среди ингибиторов HDAC, наиболее сильнодействующими являются гидроксаматного типа ингибиторы HDAC (типа гидроксамовой кислоты), которые проявляют дозозависимую противоопухолевую активность в отношении рака молочной железы и были недавно одобрены в качестве терапевтического средства для лечения лимфом кожных Т-клеток. Неограничивающие примеры гидроксаматного типа ингибиторов HDAC включают трихостатин А, вориностат, М-344, СВНА, белиностат, дациностат и панобиностат. Другим важным классом клинически эффективных ингибиторов HDAC являются бензамидного тира ингибиторы HDAC, которые демонстрировали низкую токсичность и активность в твердых и гематологических неоплазмах. Неограничивающие примеры бензамидного типа ингибиторов HDAC включают энтиностат, тацединалин и моцетиностат. Другие классы ингибиторов HDAC представляют собой короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA), такие как, например, фенилбутират, вальпроевая кислота и подобные соединения алифатических кислот; циклические тетрапептиды, содержащие эпоксикетон и не содержащие эпоксикетон, такие как, например, трапоксин B и депсипептиды; электрофильные кетоны и гибридные молекулы. SCFA, хотя и широко применяемые (в частности, вальпроевая кислота) и клинически эффективные, имеют низкие константы ингибирования HDAC. Сиртуиновые HDAC класса III зависят от NAD+ и, следовательно, ингибируются никотинамидом, а также производными NAD, дигидрокумарином, нафтопираноном и 2-гидроксинафальдегидами. Ингибиторы HDAC также являются сильнодействующими радиосенсибилизаторами.
[031] Эпигенетические модификации представляют собой обратимые перегруппировки хроматина, которые в нормальных клетках модулируют транскрипционную экспрессию генов, не изменяя последовательность ДНК. Транскрипция является одной из стадий, участвующих в продуцировании белков из ДНК. Для протекания транскрипции транскрипционные факторы должны связываться со специфическими участками связывания в ДНК. Когда ДНК находится в своей конденсированной форме, транскрипционным факторам физически трудно получить доступ к их акцессорным участкам связывания, с конечным результатом, который нечасто имеет место.
[032] Гистоны представляют собой белки, которые играют основную роль в транскрипционной регуляции генов. Такие глобулярные белки имеют гибкие N-концы, обычно положительно заряженные благодаря аминовым группам, присутствующим в лизиновых и аргининовых остатках. Такие положительные заряды помогают N-концевой части гистонов взаимодействовать с отрицательно заряженными фосфатными группами на основной цепи ДНК и связывать их. Именно такое взаимодействие гистон-ДНК помогает конденсировать ДНК в ее компактную хроматиновую форму в виде хромосом. Таким образом, при обеспечении упаковки ДНК в ее конденсированную форму гистоны играют основную роль в ограничении связывания транскрипционных факторов с ДНК.
[033] Связывание гистонов с ДНК регулируется различными ферментами, присутствующими в клетке. В условиях, при которых имеется поддержка транскрипции определенного гена, ферменты, известные как гистон-ацетилтрансферазы (HATs) или лизин-деацетилазы (KDAC), добавляют ацетиловые группы к ε-N-ацетиллизиновым остаткам в гистонах. Ацетилирование нейтрализует положительные заряды на N-концевом участке гистонов, в результате чего ацетилированные гистоны больше не способны взаимодействовать с основной цепью ДНК. Такое уменьшение связывания приводит к увеличению количества хроматина (или деконденсации хроматина), что обеспечивает протекание транскрипции гена, поскольку транскрипционные факторы могут теперь получить доступ к их ДНК-участкам связывания и активировать транскрипцию гена. В условиях, при которых отсутствует поддержка транскрипции гена, ферменты, известные как гистондеацетилазы (HDAC), удаляют добавленные ацетиловые группы с помощью HAT. Деацетилирование увеличивает положительный заряд N-концевых групп гистонов, стимулируя, тем самым, высокоаффинное связывание гистонов и основной цепи ДНК. Возникающая конденсация хроматина предотвращает транскрипцию гена, поскольку транскрипционные факторы физически заблокированы от взаимодействия с их ДНК-участками связывания. Таким образом, HAT облегчают деконденсацию хроматина и по существу способствуют транскрипции гена, тогда как HDAC облегчают конденсацию хроматина и по существу подавляют транскрипцию генов.
[034] Существует 18 известных человеческих HDAC, сгруппированных в четыре класса на основе сходства функций и последовательностей ДНК их вспомогательных доменов. Первые два класса считаются «классическими» HDAC, активность которых ингибирует трихостатин (TSA), тогда как третья группа представляет собой семейство NAD+-зависимых белков, на которые не воздействует TSA. Четвертый класс рассматривается как атипичная категория, основанная исключительно на отличии их последовательности ДНК от других. Класс I включает HDAC1, HDAC2, HDAC3 и HDAC8 и имеет гомологию подобную дрожжевому белку 3 (RPD3) с пониженной калиевой зависимостью. HDAC4, HDAC5, HDAC7 и HDAC9 принадлежат к классу II и имеют гомологию подобную дрожжевой гистондеацетилазе 1 (HDA1). HDAC6 и HDAC 10 содержат два каталитических участка и относятся к классу На. Класс III, также известный как сиртуины, связан с SIR2 и включает SIRT1-7, тогда как HDAC11 относят к классу IV, поскольку он сохранил в своем каталитическом центре остатки, которые являются общими как для класса I, так и класса II HDAC.
[035] Известны несколько противоопухолевых соединений, которые действуют как ингибиторы HDAC. По существу, полагают, что ингибирование конденсации хроматина сможет обеспечить терапевтически целебный эффект при лечении рака, поскольку такое ремоделирование хроматина приводит к 1) транскрипционной супрессии регуляторных генов ключевого апоптоза и клеточного цикла, что, тем самым, стимулирует остановку клеточного цикла и апоптоз; 2) повышенной гетерозиготности опухолевого супрессора, и/или 3) ингибированию ангиогенеза. Таким образом, эпигенетическая регуляция транскрипции генов за счет конденсации хроматина становится важным механизмом, приводящим к образованию опухолей.
[036] В аспектах такого варианта реализации изобретения ингибитор гистондеацетилазы представляет собой гистондеацетилазу гидроксаматного типа или гистондеацетилазу бензамидного типа. В других аспектах таких вариантов реализации изобретения, ингибитор гистондеацетилазы представляет собой (2E,4E,6R)-7-(4-диметиламинофенил)-N-гидрокси-4,6-диметил-7-оксогепта-2,4-диенамид, N-гидрокси-N’-фенилоктандиамид, 4-диметиламино-N-(6-гидроксикарбамоилгексил)-бензамид, N-гидрокси-3-[(Е)-3-(гидроксиамино)-3-оксопроп-1-енил] бензамид, (2Е)-3-[3-(анилиносульфонил)фенил]-N-гидроксиакриламид, ((Е)-N-гидрокси-3-[4-[[2-гидроксиэтил-[2-(1Н-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]проп-2-енамид, (E)-N-гидрокси-3-[4-[[2-(2-метил-1Н-индол-3-ил)этиламино]метил]фенил]проп-2-енамид, N-(2-аминофенил)-N’-фенил-октандиамид, 4-(2-аминофенилкарбамоил)бензилкарбамат, 4-ацетамидо-N-(2-аминофенил) бензамид, N-(2-аминофенил)-4-[[(4-пиридин-3-илпиримидин-2-ил)амино]метил] бензамид, 3-(диметиламинометил)-N-[2-[4-(гидроксикарбамоил)фенокси]этил]-1-бензофуран-2-карбоксамид или {6-[(диэтиламино)метил] -2-нафтил} метил {4-[(гидроксиамино)карбонил] фенил} карбамат. Химическая структура таких ингибиторов показана ниже.
Трихостатин А
(2Е,4Е,6R)-7-(4-диметиламинофенил)-N-гидрокси-4,6-диметил-7-оксогепта-2,4-диенамид
Вориностат (SAHA, золинза)
N-гидрокси-N’-фенилоктандиамид
М-344 (D-237)
4-Диметиламино-N-(6-гидроксикарбамоилгексил)-бензамид
СВНА
N-гидрокси-3-[(Е)-3-(гидроксиамино)-3-оксопроп-1-енил]бензамид
Белиностат (PXD-101, РХ-105684)
(2Е)-3-[3-(анилиносульфонил)фенил]-N-гидроксиакриламид
Дациностат (LAQ-824, NVP-LAQ824,)
((Е)-N-гидрокси-3-[4-[[2-гидроксиэтил-[2-(1Н-индол-3-ил)этил]амино]метил] фенил]проп-2-енамид
Панобиностат (LBH-589, NVP-LBH589)
(Е)-N-гидрокси-3-[4-[[2-(2-метил-1Н-индол-3-ил)этиламино]метил]фенил]проп-2-енамид
BML-210
N-(2-аминофенил)-N’-фенил-октандиамид
Энтиностат (MS-275, SNDX-275, MS-27-275)
4-(2-аминофенилкарбамоил)бензилкарбамат
Тацединалин (CI-994, PD-123654, GOE-5549)
4-ацетамидо-N-(2-аминофенил)бензамид
Моцетиностат (MGCD-0103)
N-(2-аминофенил)-4-[[(4-пиридин-3-илпиримидин-2-ил)амино]метил]бензамид
PCI-24781
3-(диметиламинометил)-N-[2-[4-(гидроксикарбамоил)фенокси]этил]-1-бензофуран-2-карбоксамид
ITF-2357
{6-[(диэтиламино)метил]-2-нафтил}метил{4-[(гидроксиамино)карбонил]фенил }карбамат
[037] Аспекты настоящего описания представляют, частично, целенаправленное терапевтическое средство. Целенаправленное терапевтическое соединение включает, без ограничения, иммунотерапевтическое средство, гормональное терапевтическое средство и ингибитор ангиогенеза. Гормональная терапия включает регулирование эндокринной системой путем экзогенного введения специфических гормонов, в частности, стероидных гормонов, или лекарственных препаратов, ингибирующих продуцирование или активность таких гормонов (антагонистов гормонов). Поскольку стероидные гормоны в некоторых раковых клетках представляют собой мощные драйверы экспрессии генов, изменение уровней или активности определенных гормонов может привести к прекращению роста определенных раковых клеток или даже к их некрозу. Хирургическое удаление эндокринных органов, такое как орхиэктомия и овариэктомия, также можно использовать как форму гормональной терапии.
[038] Иммунотерапия представляет собой способы лечения, в которых используют природные вещества, содержащиеся в теле, или лекарственные препараты, полученные из природных веществ, содержащихся в теле. Такие вещества стимулируют тело атаковать раковые клетки и преодолевать побочные эффекты, вызванные другими способами лечения рака. В иммунотерапии применяют иммунную систему для отторжения рака. Основной замысел состоит в стимулировании иммунной системы пациента с целью атаки на злокачественные опухолевые клетки, которые ответственны за такое заболевание. Реализовать этот замысел можно либо путем иммунизации пациента, при которой собственную иммунную систему пациента обучают распознавать опухолевые клетки как мишени для уничтожения, либо путем введения терапевтических антител в качестве лекарственных препаратов, при этом иммунную систему пациента мобилизуют для уничтожения опухолевых клеток с помощью терапевтических антител.
[039] Композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут включать, или не включать, любое количество и любую комбинацию ингибиторов аутофагии на основе тиоксантона и вызывающих аутофагию соединений для лечения рака, перечисленных в настоящем заявке. В частности, композиция может содержать, например, два или более ингибиторов аутофагии на основе тиоксантона и/или вызывающих аутофагию соединений для лечения рака, три или более ингибиторов аутофагии на основе тиоксантона и/или вызывающих аутофагию соединений для лечения рака, четыре или более ингибиторов аутофагии на основе тиоксантона и/или вызывающих аутофагию соединений для лечения рака, или пять или более ингибиторов аутофагии на основе тиоксантона и/или вызывающих аутофагию соединений для лечения рака.
[040] Ингибитор аутофагии на основе тиоксантона и вызывающее аутофагию соединение для лечения рака, предложенные в настоящем изобретении, или композицию, содержащую указанное соединение или соединения, как правило, вводят субъекту в виде фармацевтической композиции. Фармацевтические композиции можно приготовить путем комбинирования терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного соединения, предложенного в настоящем изобретении, или его фармацевтически приемлемой соли присоединения кислоты, в качестве активного ингредиента, с общепринятыми приемлемыми фармацевтическими наполнителями и путем приготовления стандартных лекарственных форм, подходящих для терапевтического применения. В настоящем документе, термин «фармацевтическая композиция» относится к терапевтически эффективной концентрации активного соединения, такого как, например, любое соединение, описанное в настоящем документе. Предпочтительно, если фармацевтическая композиция не вызывает побочной, аллергической или другой неблагоприятной или нежелательной реакции при введении субъекту. Фармацевтическую композицию, предложенную в настоящем изобретении, можно применять с медицинскими и ветеринарными целями. Фармацевтическую композицию можно ввести субъекту отдельно или в комбинации с другими дополнительными активными соединениями, агентами, лекарственными средствами или гормонами. Фармацевтические композиции можно изготавливать, используя любые разнообразные процессы, в том числе, без ограничения, традиционное смешивание, растворение, гранулирование, изготовление драже, растирание в порошок, эмульгирование, инкапсулирование, захватывание и лиофилизацию. Фармацевтическая композиция может принимать любые разнообразные формы, в том числе, без ограничения, форму стерильного раствора, суспензию, эмульсии, лиофилизата, таблетки, пилюли, пеллета, капсулы, порошка, сиропа, эликсира или любую другую лекарственную форму, подходящую для введения.
[041] Жидкие лекарственные формы, подходящие для парентеральной инъекции могут включать физиологически приемлемые стерильные водные или неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии и стерильные порошки для восстановления влагосодержания с получением стерильных инъецируемых растворов или дисперсий. Примеры подходящих водных и неводных носителей, разбавителей, растворителей или сред включают воду, этанол, высокомолекулярные спирты (пропиленгликоль, полиэтиленгликоль (PEG), глицерин и т.п.), их подходящие смеси, растительные масла (такое как оливковое масло) и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как, этилолеат. Подходящую текучесть можно сохранить, например, путем применения покрытия, такого как лецитиновое покрытие, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и путем применения поверхностно-активных веществ. В жидких составах, терапевтически эффективное количество обычно составляет от примерно 0,0001% (масс./об.) до примерно 50% (масс./об.), предпочтительно, от примерно 0,001% (масс./об.) до примерно 1,0% (масс./об.).
[042] Твердые лекарственные формы, подходящие для перорального введения, включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах, активное соединение можно смешивать по меньшей мере с одним инертным привычным наполнителем (или носителем), таким как цитрат натрия или дикальция фосфат, или (а) наполнителями или расширителями, такими как, например, крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, манитол и кремниевая кислота, (b) связующими веществами, такими как, например, карбоксиметилцеллюлоза, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и гуммиарабик, (с) смачивающими средствами, такими как, например, глицерин, (d) веществами для улучшения распадаемости таблеток, такими как, например, агар-агар, карбонат кальция, картофельный крахмал или крахмал тапиоки, альгиновая кислота, некоторые сложные силикаты и карбонат натрия, (e) замедлителями растворения, такими как, например, парафин, (f) ускорителями впитывания, такими как, например, четвертичные аммониевые соединения, (g) смачивающими реагентами, такими как, например, цетиловый спирт и глицеролмоностеарат, (h) адсорбирующими веществами, такими как, например, каолин и бентонит и (i) смазывающими веществами, такими как, например, тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия или их смеси. В случае капсул, таблеток и пилюль, лекарственные формы могут также содержать буферные вещества. В твердых составах, терапевтически эффективное количество обычно составляет от примерно 0,001 мг/кг до примерно 100 мг/кг, предпочтительно, от примерно 0,1 мг/кг до примерно 10 мг/кг.
th
th
th
th
[043] Фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, может включать фармацевтически приемлемый носитель, который облегчает обработку активного соединения для получения фармацевтически приемлемых композиций. В настоящей заявке, термин "фармацевтически приемлемый" относится к таким соединениям, материалам, композициям и/или лекарственным формам, которые, по результатам тщательной медицинской оценки, подходят для контакта с тканями людей и животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблемных осложнений, соразмерных с разумным соотношением польза/риск. В настоящей заявке, термин "фармакологически приемлемый носитель" является синонимом "фармакологического носителя" и относится к любому носителю, который по существу не оказывает продолжительного или постоянного вредного воздействия при введении и включает такие термины, как "фармакологически приемлемая среда, стабилизатор, разбавитель, дополнительное вещество, вспомогательное вещество или наполнитель". Такой носитель, как правило, смешивается с активным соединением или используется для разбавления или размещения активного соединения и может представлять собой твердое, полутвердое или жидкое вещество. Понятно, что активные соединения могут быть растворимыми или их можно вводить в виде суспензии в предпочтительном носителе или разбавителе. Можно использовать любые разнообразные фармацевтически приемлемые носители, в том числе, без ограничения, водную среду, такую как, например, воду, солевой раствор, глицин, гиалуроновую кислоту и т.п.; твердые носители, такие как, например, крахмал, стеарат магния, манитол, сахарин натрия, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, лактозу, трегалозу, карбонат магния и т.п.; растворители; дисперсионные среды; покрытия; антибактериальные и противогрибковые препараты; изотонические вещества и вещества, замедляющие абсорбцию; или любой другой неактивный ингредиент. Выбор фармакологически приемлемого носителя может зависеть от режима введения. За исключением случаев несовместимости какого-либо фармакологически приемлемого носителя с активным соединением, предполагается его применением в фармацевтически приемлемых композициях. Неограничивающие примеры специфических применений таких фармацевтических носителей можно найти в публикациях Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (Howard C. Ansel et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 7 ed. 1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy (Alfonso R. Gennaro ed., Lippincott, Williams & Wilkins, 20 ed. 2000); Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics (Joel G. Hardman et al., eds., McGraw-Hill Professional, 10 ed. 2001); и Handbook of Pharmaceutical Excipients (Raymond C. Rowe et al., APhA Publications, 4 edition 2003). Вышеприведенные протоколы являются общепризнанными, при этом могут быть сделаны любые модификации в пределах компетенции специалиста в данной области техники и вытекающие из описания настоящей заявки.
[044] Фармацевтическая композиция, предложенная в настоящем изобретении, может включать, без ограничения, другие фармацевтически приемлемые компоненты (или фармацевтические компоненты), в том числе, без ограничения, буферные растворы, консерванты, вещества, регулирующие тоничность, соли, антиоксиданты, вещества, регулирующие осмотическую концентрацию раствора, физиологические вещества, фармакологические вещества, объемообразующие агенты, эмульгаторы, смачивающие вещества, подсластители или ароматизирующие вещества и т.п. Для приготовления фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, можно использовать различные буферные растворы и средства регулирования рН при условии, что образующийся в результате препарат является фармацевтически приемлемым. Такие буферные растворы включают, без ограничения, ацетатные буферные растворы, боратные буферные растворы, цитратные буферные растворы, фосфатные буферные растворы, нейтральный буферизованный солевой раствор и фосфатный буферизованный солевой раствор. Понятно, что для регулирования рН композиции можно, при необходимости, использовать кислоты или основания. Фармацевтически приемлемые антиоксиданты включают, без ограничения, метабисульфит натрия, тиосульфат натрия, ацетилцистеин, бутилированный гидроксианизол и бутилированный гидрокситолуол. Применимые консерванты включают, без ограничения, бензалконий хлорид, хлорбутанол, тимеросал, фенилртутьацетат, фенилртутьнитрат, стабилизированный состав, содержащий оксихлор группировку, такую как, например, хлорит натрия, и хелатирующие агенты, такие как, например, DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота) или DTPA-бисамид, кальция DTPA и CaNaDTPA-бисамид. Вещества, регулирующие тоничность, применимые в фармацевтической композиции, включают, без ограничения, соли, такие как, например, хлорид натрия, хлорид калия, манитол или глицерин и другие фармацевтически приемлемые вещества, регулирующие тоничность. Фармацевтические композиции можно обеспечить в виде соли и можно получить в применением многих кислот, в том числе, но не ограничиваясь ими, соляной, серной, уксусной, молочной, виннокаменной, яблочной, янтарной и т.п. Соли проявляют склонность к большей растворимости в водных или других протонсодержащих растворителях, чем соответствующие формы свободного основания. Понятно, что перечисленные и другие вещества, известные в области фармакологии, могут быть включены в фармацевтическую композицию, применимую согласно настоящему изобретению.
[045] Ингибитор аутофагии на основе тиоксантона и вызывающее аутофагию соединение для лечения рака, предложенные в настоящем изобретении, можно также включить в платформу для доставки лекарственного средства, чтобы обеспечить контролируемый во времени профиль высвобождения соединения. Такая платформа для доставки лекарственного средства содержит соединение, описанное в настоящем документе, диспергированное в полимерной матрице, обычно биодеградируемой, биоразрушаемой и/или саморассасывающейся полимерной матрице. В настоящем документе, термин "полимер" относится к синтетическим гомо- или сополимерам, природным гомо- или сополимерам, а также их синтетическим модификациям или производным, имеющим линейную, разветвленную или звездообразную структуру. Сополимеры могут быть скомпонованы в любой форме, такой как, например, произвольная форма, в виде блока, сегментированных, конических блоков, привитых блоков или трех блоков. Как правило, полимеры представляют собой конденсационные полимеры. Полимеры можно дополнительно модифицировать для усиления их механических свойств или способности к деградации путем введения сшивающих агентов или изменения гидрофобности боковых остатков. В случае сшивания, полимеры обычно содержат менее чем 5% сшитых связей, обычно менее чем 1% сшитых связей.
[046] Подходящие полимеры включают, без ограничения, альгинаты, алифатические сложные полиэфиры, полиалкиленоксалаты, полиамиды, полиамидоэфиры, полиангидриды, поликарбонаты, сложные полиэфиры, полиэтиленгликоль, полигидроксиалифатические карбоновые кислоты, полиортоэфиры, полиоксаэфиры, полипептиды, полифосфазены, полисахариды и полиуретаны. Полимер обычно составляет по меньшей мере примерно 10% (масс./масс.%), по меньшей мере примерно 20% (масс./масс.%), по меньшей мере примерно 30% (масс./масс.%), по меньшей мере примерно 40% (масс./масс.%), по меньшей мере примерно 50% (масс./масс.%), по меньшей мере примерно 60% (масс./масс.%), по меньшей мере примерно 70% (масс./масс.%), по меньшей мере примерно 80% (масс./масс.%) или по меньшей мере примерно 90% (масс./масс.%) от платформы для доставки лекарственного средства. Примеры биодеградируемых, биоразрушаемых и/или биорассасывающихся полимеров и способов, подходящих для получения платформы для доставки лекарственного средства, описаны, например, в Drost с соавторами, Controlled Release Formulation, патент США 4756911; Smith с соавторами, Sustained Release Drug Delivery Devices, патент США 5378475; Wong и Kochinke, Formulation for Controlled Release of Drugs by Combining Hyrophilic and Hydrophobic Agents, патент США 7048946; Hughes с соавторами, Compositions and Methods for Localized Therapy of the Eye, патентная публикация США 2005/0181017; Hughes, Hypotensive Lipid-Containing Biodegradable Intraocular Implants and Related Methods, публикация патента США 2005/0244464; Altman с соавторами, Silk Fibroin Hydrogels and Uses Thereof, патентная публикация США 201 1/0008437; при этом каждая указанная публикация в полном объеме включена в настоящую заявку посредством ссылки.
[047] В аспектах такого варианта реализации изобретения, полимер, содержащий матрицу, представляет собой полипептид, такой как, например, фиброин шелка, кератин или коллаген. В других аспектах такого варианта реализации изобретения, полимер, содержащий матрицу, представляет собой полисахарид, такой как, например, целлюлоза, агароза, эластин, хитозан, хитин или гликозаминогликан, такой как хондроитинсульфат, дерматансульфат, кератансульфат или гиалуроновая кислота. В еще других аспектах указанного варианта реализации изобретения, полимер содержащий матрицу, представляет собой сложный полиэфир, такой как, например, D-молочная кислота, L-молочная кислота, рацемическая молочная кислота, гликолевая кислота, капролактон и их комбинации.
[048] Обычному специалисту в данной области техники понятно, что выбор подходящего полимера для создания подходящей предложенной платформы для доставки лекарственного средства зависит от нескольких факторов. Наиболее релевантные факторы при выборе подходящего полимера (полимеров), включают, без ограничения, совместимость полимера с лекарственным препаратом, предпочтительную кинетику высвобождения лекарственного средства, предпочтительную кинетику биодеградации платформы в месте имплантации, предпочтительную кинетику биоразрушения платформы в месте имплантации, предпочтительную кинетику саморассасывания платформы в месте имплантации, механические свойства платформы in vivo, температуры обработки, биосовместимость платформы и переносимость пациентом. Другие релевантные факторы, которые, в некоторой степени, диктуют поведение полимера in vitro и in vivo, включают химический состав, пространственное распределение компонентов, молекулярную массу полимера и степень кристалличности.
[049] Платформа для доставки лекарственного средства включает как платформу для доставки средства с непрерывным высвобождением, так и платформу для доставки средства с длительным высвобождением. В настоящем документе, термин "непрерывное высвобождение" относится к высвобождению соединения, предложенного в настоящем изобретении, на протяжении примерно семи дней или более. В настоящем документе, термин "длительное высвобождение" относится к высвобождению соединения, предложенного в настоящем изобретении, в течение менее чем примерно семи дней.
[050] В аспектах такого варианта реализации изобретения, платформа для доставки лекарственного средства с непрерывным высвобождением выделяет соединение, описанное в настоящем документе, с кинетикой высвобождения по существу первого порядка на протяжении, например, примерно 7 дней после введения, примерно 15 дней после введения, примерно 30 дней после введения, примерно 45 дней после введения, примерно 60 дней после введения, примерно 75 дней после введения или примерно 90 дней после введения. В других аспектах такого варианта реализации изобретения, платформа для доставки лекарственного средства с непрерывным высвобождением выделяет соединение, описанное в настоящем документе, с кинетикой высвобождения по существу первого порядка на протяжении, например, по меньшей мере 7 дней после введения, по меньшей мере 15 дней после введения, по меньшей мере 30 дней после введения, по меньшей мере 45 дней после введения, по меньшей мере 60 дней после введения, по меньшей мере 75 дней после введения или по меньшей мере 90 дней после введения.
[051] В аспектах такого варианта реализации изобретения, платформа для доставки лекарственного средства выделяет соединение, описанное в настоящем документе, с кинетикой высвобождения по существу первого порядка на протяжении, например, примерно 1 дня после введения, примерно 2 дней после введения, примерно 3 дней после введения, примерно 4 дней после введения, примерно 5 дней после введения или примерно 6 дней после введения. В других аспектах такого варианта реализации изобретения, платформа для доставки лекарственного средства выделяет соединение, описанное в настоящем документе, с кинетикой высвобождения по существу первого порядка на протяжении, например, самое большое 1 дня после введения, самое большое 2 дней после введения, самое большое 3 дней после введения, самое большое 4 дней после введения, самое большое 5 дней после введения или самое большое 6 дней после введения.
[052] Аспекты настоящего описания изобретения относятся, частично, к фармацевтическому набору, содержащему фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество ингибитора аутофагии на основе тиоксантона и фармацевтически приемлемый носитель, и фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество вызывающего аутофагию соединения для лечения рака и фармацевтически приемлемый носитель.
[053] Аспекты настоящего изобретения касаются, частично, ракового заболевания. Ингибиторы аутофагии на основе тиоксантона, вызывающие аутофагию соединения для лечения рака, композиции, содержащие такие соединения, и способы, предложенные в настоящем изобретении, можно применять для лечения любого ракового заболевания. Рак относится к группе, состоящей из более чем 100 заболеваний, при которых группа клеток проявляет неконтролируемую пролиферацию в теле млекопитающего и, по существу, представляет собой заболевание, которое воздействует на регуляторный механизм, посредством которого тело контролирует деление и рост клеток. В большинстве случаев, раковые клетки образуют скопление клеток, называемое опухолью, хотя при некоторых раках, подобно лейкемии, клетки не формируют опухоли. Опухоли могут быть злокачественными или доброкачественными. Кроме того, злокачественные опухоли (или раки) содержат клетки с анормальным генетическим материалом и обычно подвергаются быстрому неконтролируемому клеточному росту, поражают и разрушают соседнюю ткань и иногда проникают в другие участки тела через лимфу или кровь (т.е., метастазируют). Рак связан с высоким уровнем смертности, поскольку если не остановить инвазию и метастазирование раковых клеток по всему телу, раковые клетки будут поражать жизненно важные органы и приведут к их дисфункции и в конечном результате, смерти. Злокачественные свойства раков отличают их от доброкачественных опухолей, которые обычно являются медленно растущими и самоограничивающими, не поражают органы или не метастазируют и по существу, как правило, не представляют угрозу для жизни. Раки на местной, региональной или отдаленной стадии считаются инвазивными. Очень ранний рак, обнаруженный только в нескольких слоях клеток, называемый раком in situ, считают не инвазивным.
[054] Рак относится к классу разнообразных заболеваний, которые в значительной степени отличаются по своим причинам и биологи. Раки вызываются различными факторами, работающими в отдельности или в комбинации. Некоторые раки вызваны внешними факторами, такими как табак, режим питания, некоторые химические вещества, излучение и вирусы. Другие раки вызваны внутренними факторами, такими как гормоны, иммунные состояния и наследственные генетические мутации. Обычно проходит десять или более лет между воздействием фактора, вызывающего рак, и поддающимся обнаружению заболеванием.
[055] Раки, как правило, классифицирует по типу клетки, которая имеет сходство с опухолью, следовательно, тканью, которая, как полагают, дает начало опухоли. Карциномы представляют собой злокачественные опухоли, образующиеся из эпителиальных клеток. Эта группа представляет собой наиболее распространенные раки, в том числе, распространенные формы рака легких, рака мозга, рака центральной нервной системы, рака молочной железы, рака толстой кишки, лейкемию, миелому, рак простаты и яичника. Саркомы представляют собой злокачественные опухоли, образующиеся из соединительной ткани или мезенхимных клеток. Бластомы обычно представляют собой злокачественные опухоли, которые имеют сходство с незрелой или эмбриональной тканью. Многие из указанных опухолей наиболее часто встречаются у детей. Лимфомы и лейкемии представляют собой злокачественности, образующиеся из гемопоэтических (кровеобразующих) клеток. Наконец, эмбрионально-клеточные опухоли представляют собой опухоли, образующиеся из тотипотентных клеток. У взрослых такие опухоли наиболее часто встречаются в яичке и яичнике; у плодов, младенцев и маленьких детей их наиболее часто находят в органах, расположенных в середине тела, в частности, на кончике копчика. По существу, в настоящем документе, термин "рак" включает первичный рак и метастазирующий рак, который может представлять собой карциному, саркому, лимфому, лейкемию, бластому или эмбрионально-клеточную опухоль.
[056] Аспекты настоящего изобретения обеспечивают, частично, уменьшения симптома, связанного с раком. В одном аспекте такого варианта реализации изобретения, уменьшенный симптом представляет собой увеличение скорости роста раковых клеток. В еще одном аспекте такого варианта реализации изобретения, уменьшенный симптом представляет собой увеличение скорости деления раковых клеток. В еще одном аспекте такого варианта реализации изобретения, уменьшенный симптом представляет собой увеличение степени инвазии раковых клеток в соседнюю ткань или органы. В другом аспекте такого варианта реализации изобретения, уменьшенный симптом представляет собой увеличение степени метастазирования. В дополнительном аспекте такого варианта реализации изобретения, уменьшенный симптом представляет собой увеличение ангиогенеза. В еще дополнительном аспекте такого варианта реализации изобретения, уменьшенный симптом представляет собой уменьшение апоптоза. В еще дополнительном аспекте такого варианта реализации изобретения, уменьшенный симптом представляет собой снижение гибели или некроза клеток. Таким образом, лечение с применением соединений, композиций и способов, описанных в настоящем документе, уменьшит скорость роста раковых клеток, уменьшит скорость деления раковых клеток, уменьшает степень инвазии раковых клеток в соседнюю ткань или органы, уменьшит степень метастазирования, уменьшит ангиогенез, увеличит апоптоз и/или увеличит гибель и/или некроз клеток.
[057] Аспекты настоящего изобретения касаются, частично, млекопитающего. Млекопитающее включает человека и человек может быть пациентом. Другие аспекты настоящего изобретения касаются, частично, субъекта. Субъект включает млекопитающее и человека, при этом человек может быть пациентом.
[058] Аспекты настоящего изобретения касаются, частично, введения композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении. В настоящей заявке, термин "введение" означает любой механизм доставки, обеспечивающий введение субъекту композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, что потенциально приводит к клиническому, терапевтическому или экспериментальному лечебному результату.
[059] Композицию, содержащую соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, можно вводить одновременно или последовательно. По существу, композицию, содержащую ингибитор аутофагии на основе тиоксантона, можно ввести одновременно с композицией, содержащей вызывающее аутофагию соединение для лечения рака, (одновременно) или последовательно в любом порядке в различные моменты времени. Кроме того, применяемое в настоящем описание слово «одновременно» может означать, что ингибитор аутофагии на основе тиоксантона и вызывающее аутофагию соединение для лечения рака, можно принимать вместе в одно и то же время в виде одной фармацевтической композиции или вместе в одно и то же время, но в виде отдельных фармацевтических композиций. Таким образом, каждый компонент можно ввести порознь, но достаточно близко по времени с тем, чтобы обеспечить требуемый терапевтический эффект. В качестве альтернативы, введение ингибитора аутофагии на основе тиоксантона и вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, может находиться в пределах примерно одного часа относительно друг друга, в пределах примерно двух часов относительно друг друга или в пределах примерно трех часов относительно друг друга.
[060] Композицию, содержащую соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, можно вводить на протяжении одного или более циклов. Согласно одному варианту реализации изобретения, один цикл включает семиразовое введение каждые четыре дня.
[061] Введение композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, включает различные энтеральные или парентеральные способы, в том числе, без ограничения, пероральное введение в любой приемлемой форме, такой как, например, таблетки, жидкость, капсула, порошок или т.п.;
местное введение в любой приемлемой форме, такой как, например, капли, спрей, кремы, гели или мази; буккальное, назальное и/или ингаляционное введение в любой приемлемой форме; ректальное введение в любой приемлемой форме; вагинальное введение в любой приемлемой форме; внутрисосудистое введение в любой приемлемой форме, такой как, например, внутривенная болюсная инъекция, внутривенная инфузия, внутриартериальная болюсная инъекция, внутриартериальная инфузия и инстилляция катетера в сосудистую сеть; около- и внутритканевое введение в любой приемлемой форме, такой как, например, внутрибрюшинная инъекция, внутримышечная инъекция, подкожная инъекция, подкожная инфузия, внутриглазная инъекция, ретинальная инъекция или субретинальная инъекция или эпидуральная инъекция; внутрипузырное введение в любой приемлемой форме, такой как, например, инстилляция катетера; и с применением устройства для размещения, такого как, например, имплантат, стент, пластырь, пеллет, катетер, осмотический насос, суппозиторий, биоразрушаемая система доставки, бионеразрушаемая система доставки или другая имплантированная система длительного или медленного высвобождения. Типичный перечень биодеградируемых полимеров и способов применения описаны, например, в Handbook of Biodegradable Polymers (Abraham J. Domb et al., eds., Overseas Publishers Association, 1997).
[062] Композицию, содержащую соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, можно вводить млекопитающему различными путями. Пути введения, подходящие для способа лечения рака, предложенные в настоящем изобретении, включают как местное, так и системное введение. Местное введение приводит к значительно большей доставке композиции в конкретное место по сравнению со всем телом млекопитающего, тогда как, системное введение приводит доставке композиции по существу во все тело субъекта. Пути введения, подходящие для способа лечения рака, предложенного в настоящем изобретении, также включают как центральное, так и периферическое введение. Центральное введение приводит к доставке композиции по существу в центральную нервную систему субъекта и включает, например, интратекальное введение, эпидуральное введение, а также краниальную инъекцию или имплантат. Периферическое введение приводит к доставке композиции по существу в любую область субъекта, кроме центральной нервной системы, и включает любой путь введения, отличный от прямого введения в позвоночник или мозг. Фактический путь введения композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, применяемый в случае млекопитающего, может определить обычный специалист в данной области техники, принимая во внимание различные факторы, в том числе, без ограничения, вид рака, локализацию рака, причину рака, серьезность рака, необходимую степень ослабления заболевания, необходимую продолжительность ослабления заболевания, конкретное применяемое соединение или соединения, скорость экскреции применяемого соединения или соединений, фармакодинамики применяемого соединения или соединений, природу других соединений, включенных в композицию, конкретный путь введения, конкретные характеристики, историю и факторы риска субъекта, такие как, например, возраст, масса, общее состояние здоровья и т.п., или любые их комбинации.
[063] Согласно одному варианту реализации изобретения, композицию, содержащую соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, вводят млекопитающему системно. Согласно еще одному варианту реализации изобретения, композицию, содержащую соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, вводят млекопитающему местно. В аспекте такого варианта реализации изобретения, композицию, содержащую соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, вводят в опухоль, имеющуюся у млекопитающего. В еще одном аспекте такого варианта реализации изобретения, композицию, содержащую соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, вводят в участок, окружающий опухоль, имеющуюся у млекопитающего.
[064] Аспекты настоящего изобретения касаются, частично, введения терапевтически эффективного количества композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении. В настоящем документе, термин "терапевтически эффективное количество" является синонимом "терапевтически эффективной дозы" и при применении со ссылкой на лечение рака обозначает минимальную дозу соединения или соединений, описанных в настоящем документе, необходимую для достижения требуемого терапевтического эффекта и включает дозу, достаточную для уменьшения симптома, связанного с раком. В аспектах такого варианта реализации изобретения, терапевтически эффективное количество композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, уменьшает симптом, связанный с раком, например, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 100%. В других аспектах такого варианта реализации изобретения, терапевтически эффективное количество композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, уменьшает симптом, связанный с раком, например, самое большое на 10%, самое большое на 20%, самое большое на 30%, самое большое на 40%, самое большое на 50%, самое большое на 60%, самое большое на 70%, самое большое на 80%, самое большое на 90% или самое большое на 100%. В еще других аспектах такого варианта реализации изобретения, терапевтически эффективное количество композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, уменьшает симптом, связанный с раком, например, от примерно 10% до примерно 100%, от примерно 10% до примерно 90%, от примерно 10% до примерно 80%, от примерно 10% до примерно 70%, от примерно 10% до примерно 60%, от примерно 10% до примерно 50%, от примерно 10% до примерно 40%, от примерно 20% до примерно 100%, от примерно 20% до примерно 90%, от примерно 20% до примерно 80%, от примерно 20% до примерно 20%, от примерно 20% до примерно 60%, от примерно 20% до примерно 50%, от примерно 20% до примерно 40%, от примерно 30% до примерно 100%, от примерно 30% до примерно 90%, от примерно 30% до примерно 80%, от примерно 30% до примерно 70%, от примерно 30% до примерно 60% или от примерно 30% до примерно 50%. В еще других аспектах такого варианта реализации изобретения, терапевтически эффективное количество соединения или соединений, описанных в настоящем документе, представляет собой дозировку, достаточную для уменьшения симптома, связанного с раком, в течение, например, по меньшей мере одной недели, по меньшей мере одного месяца, по меньшей мере двух месяцев, по меньшей мере трех месяцев, по меньшей мере четырех месяцев, по меньшей мере пяти месяцев, по меньшей мере шести месяцев, по меньшей мере семи месяцев, по меньшей мере восьми месяцев, по меньшей мере девяти месяцев, по меньшей мере десяти месяцев, по меньшей мере одиннадцати месяцев или по меньшей мере двенадцати месяцев.
[065] Для получения подходящей дозировки можно изменять количество активного компонента в композиции и способ лечения рака. Фактическое терапевтически эффективное количество композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, которое следует ввести млекопитающему, может определить обычный специалист в данной области техники, принимая во внимание различные факторы, в том числе, без ограничения, тип рака, локализацию рака, причину рака, серьезность рака, продолжительность лечения, необходимую степень ослабления заболевания, необходимую продолжительность ослабления заболевания, конкретное применяемое соединение или соединения, скорость экскреции применяемого соединения или соединений, фармакодинамики применяемого соединения или соединений, природу других соединений, включенных в композицию, конкретный путь введения, конкретные характеристики, историю и факторы риска субъекта, такие как, например, возраст, масса, общее состояние здоровья и т.п., реакцию субъекта на лечение или любую их комбинацию. Таким образом, обычный специалист в данной области техники может легко определить эффективный размер дозировки активного компонента с учетом всех критериев и применяя свою наилучшую оценку на благо субъекта.
[066] Кроме того, при повторном введении композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, фактическое эффективное количество композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, будет дополнительно зависеть от различных факторов, в том числе, без ограничения, частоты введения, периода полужизни композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, или любой их комбинацию. Обычному специалисту в данной области техники известно, что эффективное количество композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, можно экстраполировать из результатов анализов in vitro и исследований введения in vivo, используя перед введением людям экспериментальные модели на животных. С учетом отличающейся эффективности при различных путях введения можно ожидать варьирование в широких пределах необходимого эффективного количества. Например, можно ожидать, что пероральное введение, в общем, потребует более высоких уровней дозировки, чем введение путем внутривенной или интравитреальной инъекции. Варьирование указанных уровней дозирования можно регулировать, применяя стандартные эмпирические способы оптимизации, которые хорошо известны обычному специалисту в данной области техники. Точные терапевтически эффективные уровни и схемы дозирования предпочтительно устанавливает лечащий врач при рассмотрении вышеперечисленных факторов.
[067] В качестве неограничивающего примера, при введении млекопитающему композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, терапевтически эффективное количество, как правило, находится в диапазоне от примерно 0,001 мг/кг до примерно 100,0 мг/кг. В аспектах такого варианта реализации изобретения, эффективное количество композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, может составлять, например, примерно от 0,01 мг/кг до примерно 0,1 мг/кг, от примерно 0,03 мг/кг до примерно 3,0 мг/кг, от примерно 0,1 мг/кг до примерно 3,0 мг/кг или от примерно 0,3 мг/кг до примерно 3,0 мг/кг. В еще других аспектах такого варианта реализации изобретения, терапевтически эффективное количество композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, может составлять, например, по меньшей мере 0,001 мг/кг, по меньшей мере 0,01 мг/кг, по меньшей мере 0,1 мг/кг, по меньшей мере 1,0 мг/кг, по меньшей мере 10 мг/кг или по меньшей мере 100 мг/кг. В еще других аспектах такого варианта реализации изобретения, терапевтически эффективное количество композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, может составлять, например, самое большое 0,001 мг/кг, самое большое 0,01 мг/кг, самое большое 0,1 мг/кг, самое большое 1,0 мг/кг, самое большое 10 мг/кг или самое большое 100 мг/кг.
[068] Дозировка может представлять собой однократную дозу или суммарную дозу (последовательное дозирование) и легко может быть установлена специалистом в данной области техники. Например, лечение рака может включать одноразовое введение эффективной дозы композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении. В качестве неограничивающего примера, эффективную дозу композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, можно ввести млекопитающему один раз, например, в виде однократной инъекции или депонирования в участок, проявляющий симптом рака, или около него, или путем однократного перорального введения лекарственного средства. В качестве альтернативы, лечение рака может включать многократное введение эффективной дозы композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, выполняемое в течение периода времени, такого как, например, ежедневно, один раз каждые несколько дней, еженедельно, ежемесячно или ежегодно. В качестве неограничивающего примера, композиции, содержащие соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, можно вводить млекопитающему один раз или два раза в неделю. Временной режим введения может изменяться от млекопитающего до млекопитающего в зависимости от таких факторов, как серьезность симптомов млекопитающего. Например, эффективную дозу композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, можно вводить млекопитающему один раз в месяц в течение неопределенного периода времени или до тех пор, пока млекопитающему не потребуется дополнительная терапия. Обычный специалист в данной области техники поймет, что состояние млекопитающего можно контролировать на протяжении всего курса лечения и что, соответственно, можно регулировать эффективное количество вводимой композиции, содержащей соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении.
[069] Комбинированное введение, либо одновременное, либо последовательное, ингибитора аутофагии на основе тиоксантона и вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, обеспечивает синергический терапевтический эффект, который является благотворным при лечении рака, как описано в настоящем документе. Синергический терапевтический эффект представляет собой эффект, при котором симптом, связанный с раком, уменьшается в большей степени, когда соединения или композиции, предложенные в настоящем изобретении, вводят в комбинации в противоположность режиму, при котором эти же соединения вводят по отдельности.
В аспектах такого варианта реализации изобретения, введение соединения или композиции, описанной в настоящем документе, в комбинации уменьшает симптом, связанный с раком, например, на по меньшей мере более 10%, на по меньшей мере более 20%, на по меньшей мере более 30%, на по меньшей мере более 40%, на по меньшей мере более 50%, на по меньшей мере более 60%, на по меньшей мере более 70%, на по меньшей мере более 80%, на по меньшей мере более 90% или на по меньшей мере более 100% относительно введения по отдельности либо этого же ингибитора аутофагии на основе тиоксантона либо этого же вызывающего аутофагию соединения для лечения рака.
[070] Композицию, содержащую соединение или соединения, предложенные в настоящем изобретении, можно также ввести млекопитающему в комбинации с другими терапевтическими соединениями для увеличения общего терапевтического эффекта лечения. Применение нескольких соединений для лечения симптома заболевания, может увеличить целебные эффекты при уменьшении присутствующих побочных эффектов.
[071] Аспекты настоящего описания изобретения включают, частично, радиационную терапию. Согласно одному варианту реализации изобретения, способ лечения рака путем введения TAPI и CTAPIC, описанных в настоящем документе, может дополнительно включать использование радиационной терапии. Радиационную терапию можно использовать перед введением соединений и композиций, описанных в настоящем документе, после или во время такого введения. Согласно еще одному варианту реализации изобретения, способ лечения рака включает введение TAPI и использование радиационной терапии, но не CTAPIC.
[072] Воздействовать излучением можно различными способами. Например, излучение может быть по природе электромагнитным или корпускулярным. Электромагнитное излучение, применимое при практическом использовании настоящего изобретения, включает, но не ограничивается ими, рентгеновское излучение и гамма-излучение. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения, при практическом использовании настоящего изобретения можно применять рентгеновское излучение сверхвысокого напряжения (рентгеновские лучи >=4 МэВ). Корпускулярное излучение, применимое в практике настоящего изобретения, включает, но не ограничивается ими, электронные лучи, протонные лучи, нейтронные лучи, альфа-частицы и отрицательно заряженные пи-мезоны. Излучением можно воздействовать, применяя общепринятые медицинские рентгеновские аппараты и способы, а также с помощью интраоперационных и стереотаксических способов. Дополнительное обсуждение способов лечения на основе излучения, подходящих для применения при практическом использовании настоящего изобретения, можно найти в монографии Steven A. Leibel с соавторами, Textbook of Radiation Oncology (1998) (опубл. W.В.Saunders Company) и, в частности, в главах 13 и 14. Излучением можно также воздействовать другими способами, такими как целенаправленное воздействие, например, с помощью радиоактивных "затравок" или путем системного воздействия целенаправленных радиоактивных конъюгатов. J.Padawer с соавторами, Combined Treatment with Radioestradiol Lucanthone in Mouse C3HBA Mammary Adenocarcinoma and with Estradiol Lucanthone in an Estrogen Bioassay, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 7:347-357 (1981). При практическом использовании настоящего изобретения можно применять и другие способы доставки излучения.
[073] Доза излучения, воздействующая на требуемую мишень, может меняться. Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения, излучение можно ввести в количестве, эффективном для остановки или регрессии рака центральной нервной системы в организме хозяина, при применении излучения совместно с соединением или соединениями или композициями, описанными в настоящем документе. Согласно еще одному варианту реализации изобретения, доза излучения, воздействующая на объем мишени, составляет по меньшей мере примерно 1 грей (Гр) по меньшей мере один раз через день и, более предпочтительно, доза излучения, воздействующая на объем мишени, составляет по меньшей мере примерно 2 грея (Гр) по меньшей мере один раз в день, даже более предпочтительно, доза излучения, воздействующая на объем мишени, составляет по меньшей мере примерно 2 грея (Гр) по меньшей мере один раз в день в течение пяти последующих дней в неделю. Согласно еще одному варианту реализации изобретения, доза излучения, воздействующая на объем мишени, составляет 3 Гр через день три раза в неделю. Согласно еще одному варианту реализации изобретения, первыми 23 дозами воздействуют на начальный объем мишени, тогда как другие 7 лечебных доз применяют для облучения дополнительного объема мишени. Согласно еще одному варианту реализации изобретения, организм хозяина, нуждающегося в этом, облучают дозой, в общей сложности составляющей по меньшей мере примерно 20 Гр, еще более предпочтительно, по меньшей мере примерно 30 Гр, наиболее предпочтительно, по меньшей мере примерно 60 Гр. Согласно другому более предпочтительному варианту реализации изобретения, излучению подвергают не объем мишени, а мозг целиком. При облучении всего мозга, рекомендуют максимальную дозировку, составляющую 30 Гр. Согласно наиболее предпочтительному варианту реализации изобретения, мозг хозяина облучают целиком, при этом хозяин подвергается лечению от метастазирующего рака.
[074] Согласно предпочтительному варианту реализации изобретения, объем мишени содержит очаг повреждения, накапливающий контраст, на сканограмме компьютерной томографии или магнитной резонансной томографии, более предпочтительно, очаг повреждения, накапливающий контраст, и окружающий отек, еще более предпочтительно, очаг повреждения, накапливающий контраст, и окружающий отек на сканограмме компьютерной томографии или магнитной резонансной томографии плюс край по меньшей мере примерно 1 см.
[075] Схемы лечения могут включать, но не ограничиваться ими, методы с применением противолежащих латеральных полей, клиновой пары полей, вращающегося поля или многократного поля. Предполагают, что планирование лечения, регулируемое компьютерной томографией, улучшает правильность при выборе конфигураций поля. Изодозные распределения для начального объема мишени и объема мишени в виде направленного вниз конуса советуют для всех пациентов, в том числе, пациентов с параллельными противолежащими полями. Предпочтительны сложные схемы, показывающие распределение доз в начальном объеме мишени и дополнительном объеме мишени. Минимальную и максимальную дозу, воздействующую на объем мишени, предпочтительно поддерживать в диапазоне примерно 10% от дозы в центре объема мишени.
[076] Аспекты настоящего описания изобретения также могут быть представлены следующим образом:
1. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество ингибитора аутофагии на основе тиоксантона.
2. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество вызывающего аутофагию соединения для лечения рака.
3. Фармацевтическая композиция, содержащая:
a) терапевтически эффективное количество ингибитора аутофагии на основе тиоксантона; и
b) терапевтически эффективное количество вызывающего аутофагию соединения для лечения рака.
4. Композиция согласно вариантам реализации изобретения 1-3, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
5. Композиция согласно вариантам реализации изобретения 1, 3 или 4, отличающаяся тем, что ингибитор аутофагии на основе тиоксантона представляет собой 1-((2-(диэтиламино)этил)амино)-4-метилтиоксантен-9-он, 1-(2-диэтиламиноэтиламино)-4-(гидроксиметил)-9-тиоксантенон, N-[[1-[[2-(диэтиламино)этил]амино]-9-оксо-9Н-тиаксантен-4-ил]метил]метансульфонамид, их индазольные аналоги или их соли.
6. Композиция согласно вариантам реализации изобретения 2-4, отличающаяся тем, что вызывающее аутофагию соединение для лечения рака представляет собой триоксид мышьяка, этопозид, рапамицин, ингибитор гистондеацетилазы, ингибиторы тирозинкиназы, тамоксифен, темозоломид, иматиниб или бортезомиб.
7. Композиция согласно варианту реализации изобретения 6, отличающаяся тем, что ингибитор гистондеацетилазы представляет собой гидроксаматного типа ингибитор гистондеацетилазы или бензамидного типа ингибитор гистондеацетилазы.
8. Композиция согласно варианту реализации изобретения 6, отличающаяся тем, что ингибитор гистондеацетилазы представляет собой (2Е,4Е,6R)-7-(4-диметиламинофенил)-N-гидрокси-4,6-диметил-7-оксогепта-2,4-диенамид, N-гидрокси-N’-фенилоктандиамид, 4-диметиламино-N-(6-гидроксикарбамоилгексил)-бензамид, N-гидрокси-3-[(Е)-3-(гидроксиамино)-3-оксопроп-1-енил]бензамид, (2Е)-3-[3-(анилиносульфонил)фенил]-N-гидроксиакриламид, ((Е)-N-гидрокси-3-[4-[[2-гидроксиэтил-[2-(1 Н-индол-3-ил)этил]амино]метил]фенил]проп-2-енамид, (Е)-N-гидрокси-3-[4-[[2-(2-метил-1 Н-индол-3-ил)этиламино]метил]фенил]проп-2-енамид, N-(2-аминофенил)-N’-фенил-октандиамид, 4-(2-аминофенилкарбамоил)бензилкарбамат, 4-ацетамидо-N-(2-аминофенил)бензамид, N-(2-аминофенил)-4-[[(4-пиридин-3-илпиримидин-2-ил)амино]метил] бензамид, 3-(диметиламинометил)-N-[2-[4-(гидроксикарбамоил)фенокси]этил]-1-бензофуран-2-карбоксамид или {6-[(диэтиламино)метил]-2-нафтил}метил {4-[(гидроксиамино)карбонил] фенил} карбамат.
9. Применение композиции согласно вариантам реализации изобретения 1-8 для получения лекарственного средства для лечения рак.
10. Способ лечения рака, включающий
a) введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, эффективного количества ингибитора аутофагии на основе тиоксантона согласно вариантам реализации изобретения 1 или 3-6; и
b) введение млекопитающему, нуждающемуся в этом, эффективного количества вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, согласно вариантам реализации изобретения 2-6;
при этом введение как ингибитора аутофагии на основе тиоксантона, так и вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, уменьшает симптом, связанный с раком, с обеспечением тем самым лечения рака.
11. Применение композиции согласно вариантам реализации изобретения 1-8 для лечения рака, причем что введение как ингибитора аутофагии на основе тиоксантона, так и вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, уменьшает симптом, связанный с раком, с обеспечением тем самым лечения рака.
12. Способ согласно варианту реализации изобретения 10 или применение согласно варианту реализации изобретения 11, отличающиеся тем, что ингибитор аутофагии на основе тиоксантона и вызывающее аутофагию соединение для лечения рака, вводят одновременно.
13. Способ согласно варианту реализации изобретения 10 или применение согласно варианту реализации изобретения 11, отличающиеся тем, что ингибитор аутофагии на основе тиоксантона и вызывающее аутофагию соединение для лечения рака вводят последовательно.
14. Способ или применение согласно варианту реализации изобретения 13, отличающиеся тем, что ингибитор аутофагии на основе тиоксантона и вызывающее аутофагию соединение для лечения рака вводят в промежутке примерно трех часов относительно друг друга.
15. Способ или применение согласно варианту реализации изобретения 13, отличающиеся тем, что ингибитор аутофагии на основе тиоксантона и вызывающее аутофагию соединение для лечения рака вводят в промежутке примерно двух часов относительно друг друга.
16. Способ или применение согласно варианту реализации изобретения 13, отличающиеся тем, что ингибитор аутофагии на основе тиоксантона и вызывающее аутофагию соединение для лечения рака вводят в промежутке примерно одного часа относительно друг друга.
17. Способ согласно варианту реализации изобретения 10 или применение согласно варианту реализации изобретения 11, отличающиеся тем, что указанное терапевтически эффективное количество ингибитора аутофагии на основе тиоксантона и терапевтически эффективное количество вызывающего аутофагию соединения для лечения рака вводят в однократной суточной дозе или разделяют на более чем одну суточную дозу.
18. Способ или применение согласно варианту реализации изобретения 17, отличающиеся тем, что указанная более чем одна суточная доза представляет собой две суточные дозы.
19. Способ согласно варианту реализации изобретения 10 или применение согласно варианту реализации изобретения 11, отличающиеся тем, что ингибитор аутофагии на основе тиоксантона и вызывающее аутофагию соединение для лечения рака вводят перорально.
20. Способ согласно варианту реализации изобретения 10 или применение согласно варианту реализации изобретения 11, отличающиеся тем, что ингибитор аутофагии на основе тиоксантона и вызывающее аутофагию соединение для лечения рака вводят парентерально.
21. Способ согласно варианту реализации изобретения 10 или применение согласно варианту реализации изобретения 11, отличающиеся тем, что ингибитор аутофагии на основе тиоксантона и вызывающее аутофагию соединение для лечения рака вводят в форме капсулы или таблетки.
22. Способ согласно варианту реализации изобретения 10 или применение согласно варианту реализации изобретения 11, отличающиеся тем, что ингибитор аутофагии на основе тиоксантона и вызывающее аутофагию соединение для лечения рака вводят на протяжении одного или более циклов.
23. Способ согласно варианту реализации изобретения 10 или применение согласно варианту реализации изобретения 11, отличающиеся тем, что указанный один цикл включает 7-разовое введение каждые 4 дня.
24. Способ согласно вариантам реализации изобретения 10 или 12-23 или применение согласно вариантам реализации изобретения 11-23, отличающиеся тем, что раковое заболевание представляет собой рак легких, рак мозга, рак центральной нервной системы, рак молочной железы, рак толстой кишки, лейкемию, миелому, рак простаты или яичника.
25. Способ или применение согласно варианту реализации изобретения 24, отличающиеся тем, что рак легких представляет собой немелкоклеточный рак легких.
26. Способ или применение согласно вариантам реализации изобретения 10-25, отличающиеся тем, что указанный способ или применение дополнительно включает использование лучевой терапии, гормональной терапии или иммунотерапии.
27. Фармацевтический набор, содержащий:
a) фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество ингибитора аутофагии на основе тиоксантона и фармацевтически приемлемый носитель и
b) фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, и фармацевтически приемлемый носитель.
28. Способ лечения рака, включающий:
a) введение эффективного количества ингибитора аутофагии на основе тиоксантона согласно вариантам реализации изобретения 1, 4 или 5 млекопитающему, нуждающемуся в этом; и
b) введение эффективной дозы ионизирующего излучения млекопитающему, нуждающемуся в этом;
при этом введение как ингибитора аутофагии на основе тиоксантона, так и ионизирующего излучения уменьшает симптом, связанный с раком, с обеспечением тем самым лечения рака.
29. Способ лечения рака, включающий
a) введение эффективного количества ингибитора аутофагии на основе тиоксантона согласно вариантам реализации изобретения 1 или 3-6 млекопитающему, нуждающемуся в этом;
b) введение эффективного количества вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, согласно вариантам реализации изобретения 1, 4 или 6-8 млекопитающему, нуждающемуся в этом; и
c) введение эффективной дозы ионизирующего излучения млекопитающему, нуждающемуся в этом;
при этом введение ингибитора аутофагии на основе тиоксантона, вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, и ионизирующего излучения уменьшает симптом, связанный с раком, с обеспечением тем самым лечения рака.
30. Применение композиции согласно вариантам реализации изобретения 1, 4 или 5 для лечения рака у млекопитающего, нуждающегося в этом, отличающееся тем, что введение ингибитора аутофагии на основе тиоксантона в сочетании с введением эффективной дозы ионизирующего излучения уменьшает симптом, связанный с раком, с обеспечением тем самым лечения рака.
31. Применение композиции согласно вариантам реализации изобретения 1-8 для лечения рака у млекопитающего, нуждающегося в этом, отличающееся тем, что введение ингибитора аутофагии на основе тиоксантона, вызывающего аутофагию соединения для лечения рака, или того и другого, в сочетании с введением эффективной дозы ионизирующего излучения, уменьшает симптом, связанный с раком, с обеспечением тем самым лечения рака.
ПРИМЕРЫ
[077] Следующие неограничивающие примеры приведены исключительно с иллюстративными целями для облегчения более полного понимания репрезентативных вариантов реализации изобретения, рассмотренных в настоящей заявке. Указанные примеры не следует толковать как ограничивающие какие-либо варианты реализации изобретения, приведенные в настоящем описании, в том числе, варианты, относящиеся к соединениям, фармацевтическим композициям, фармацевтическим наборам или способам лечения рака.
Пример 1
Лукантон ингибирует аутофагическую деградацию
[078] Лукантон индуцирует пермеабилизацию лизосомальных мембран (LMP).
Аутофагия стимулирует выживаемость клеток и приводит к устойчивости к лекарственным средствам за счет способности раковых клеток повторно использовать компоненты клеток для генерирования АТР. В соответствии с этим процессом, ингибирование аутофагии генетически или при применении соединений, таких как 3-МА, усиливает активность многих противораковых препаратов. Лукантон представляет собой препарат против шистосомы, который на основе своей химической структуры может разрушать лизосомальную функцию и ингибировать последнюю стадию при аутофагической деградации. Чтобы проверить эту гипотезу, клетки рака молочной железы обрабатывали лукантоном или хлорохином и анализировали с точки зрения аккумуляции LC3-II, увеличения вакуолизации и появления пермеабилизации лизосомальных мембран.
[079] Аккумуляцию LC3-II визуализировали с помощью иммуноцитохимии. Клетки из клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231 высеивали на предметные стекла и оставляли для закрепления на всю ночь. Затем клетки обрабатывали в течение 48 часов с помощью 10 мкМ лукантона или 50 мкМ хлорохина. После обработки лекарственным препаратом, клетки фиксировали с помощью 4% параформальдегида, пермеабилизировали с применением 0,2% TRITON-X-100 и инкубировали всю ночь с применением указанных первичных антител. Краситель Alexa Fluor 488, конъюгированный с флуоресцирующими вторичными антителами, применяли для визуализации локализации белка. Изображения записывали, использую флуоресцирующий микроскоп Olympus (Center Valley, P А) с камерой DP71 и объективом 60Х. Для получения изображений использовали программное обеспечение Image-Pro Plus версия 6.2.1 (MediaCybemetics, Бетесда, Мэриленд).
[080] Повышенную вакуолизацию обнаруживали путем окрашивания Giemsa и с применением просвечивающей электронной микроскопии. Клетки из клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231 высеивали на предметные стекла и обрабатывали с применением 10 мкМ лукантона или 50 мкМ хлорохина в течение 48 часов. После обработки лекарственным препаратом, клетки промывали с помощью фосфатно-солевого буферного раствора и фиксировали в метаноле в течение 5 минут. Затем клетки инкубировали в течение 1 часа в красителе Giemsa, разбавленном 1:20 деионизированной водой. Клетки промывали водой и получали изображение, применяя флуоресцирующий микроскоп Olympus. Для сбора изображений использовали программное обеспечение Image-Pro Plus версия 6.2.1. Исследование клеток с помощью просвечивающей электронной микроскопии выполняли, используя стандартные процедуры. Срезы разрезали на микротоме LKB Ultracut (Leica, Дирфилд, Иллинойс), окрашивали с применением уранилацетата и цитрата свинца и исследовали на просвечивающем электронном микроскопе JEM 1230 (JEOL, USA, Inc., Пибоди, Массачусетс). Изображения записывали с помощью АМТ Imaging Imaging (Advanced Microscopy Techniques Corp, Данверс, Массачусетс).
[081] Появление LMP контролировали, отслеживая потерю флуоресценции акридинового оранжевого. Кислые лизосомы визуализировали путем окрашивания акридиновым оранжевым. После обработки с применением 10 мкМ лукантона или 50 мкМ хлорохина в течение 48 часов, клетки из клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-23 1 окрашивали с помощью 1 мкМ акридинового оранжевого в течение 15 минут при 37°С. Клетки промывали фосфатно-солевым буферным раствором и записывали изображения, применяя флуоресцирующий микроскоп Olympus. В зависимости от кислотности, лизосомы обнаруживались в виде оранжевых флуоресцирующих цитоплазматических везикул. Количественное определение 5 случайных полей интенсивности акридинового оранжевого осуществляли с помощью иммунофлуоресценции и получали изображение, применяя программное обеспечение Image-Pro Plus Версия 6.2.1.
[082] Лукантон индуцировал липидную модификацию LC3-1 с образованием LC3-II, характеризующуюся точечной локализацией LC3 в аутофагосомах (Фиг.1B). Лукантон также индуцировал цитоплазматическую вакуолизацию, которая характерна для пермеабилизации лизосомальных мембран и аутофагии (Фиг.1B). Кроме того, лукантон уменьшал интенсивность окрашивания в красный цвет лизосом при применении акридинового оранжевого, что указывает на потерю лизосомальной кислотности после обработки хлорохином и лукантоном (Фиг.1B и 1C).
[083] Ингибирование аутофагии приводит к накоплению белков. Лукантон или хлорохин вызвали аккумуляцию электроноплотных частиц, которую можно было наблюдать с помощью просвечивающей электронной микроскопии, что предполагает агрегацию белка (Фиг.1B). Для подтверждения этого факта, клетки рака молочной железы обрабатывали лукантоном или хлорохином и анализировали с точки зрения аккумуляции полиубиквитин-связывающего белка р62 или секвестосомы I (SQSTMI). Указанный белок разлагается в результате аутофагии, локализуется с образованием в клетках тельцевых включений и, как было предположено, играет роль в облегчении клиренса белковых агрегатов при аутофагии. По существу, прерывание этого процесса приведет к накоплению SQSTMI/p62.
[084] Уровни и агрегацию SQSTMI/p62 определяли с помощью иммуноблоттинга и иммуноцитохимии, соответственно. При применении иммуноблоттинга, раковые клетки клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231 инкубировали с применением 10 мкМ лукантона или 50 мкМ хлорохина в течение 48 часов. Клетки собирали и затем лизировали, применяя стандартные процедуры. Приблизительно 50 мкг общего клеточного белка из каждой пробы подвергали SDS-PAGE, белки переносили на нитроцеллюлозые мембраны и мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в Tris-буферизованном солевом растворе, содержащем 0,1% TWEEN-20, в течение 1 часа. Далее, блоты исследовали на всю ночь при 4°С с применением первичных антител, промывали и исследовали с применением видоспецифичных вторичных антител, связанных с пероксидазой хрена. Иммунореактивный материал обнаруживали по усилению хемилюминесценции (West Pico, Pierce, Inc., Роквилл, Иллинойс).
[085] С учетом других маркеров ингибирования аутофагии, уровни SQSTMI/p62 после обработки лукантоном сильно возрастали (Фиг.1D). Иммуноцитохимия показала, что SQSTMI/p62 проявлял диффузную картину окрашивания при базальных состояниях, но образовывал агрегаты в ответ на обработку лукантоном. Такие результаты свидетельствуют, что лукантон стимулирует аккумуляцию и агрегацию SQSTM1/p62, эффект в соответствии с описанным в литературе его взаимодействием с убиквитиновыми белками (Фиг.1D).
Пример 2
Лукантон цитотоксичен по отношению к клеткам рака молочной железы
[086] Как описано в литературе, пермеабилизация лизосомальных мембран и последующее ингибирование аутофагии вызывают гибель раковых клеток. Для исследования противораковой активности лукантона, жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа на основе бромида 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ), применяя выборку из семи клеточных линий рака молочной железы.
0
1
[087] Клетки из клеточных линий рака молочной железы MDA-MB-231, HCC1954, ВТ-474, SKBR-3, MDA-MB-435, HCC1937 и ВТ-20 высеивали в 96-луночные планшеты для микрокультуры при концентрации 10000 клеток на лунку и оставляли прикрепляться на 24 часа. Затем клетки обрабатывали с применением изменяющихся концентраций лукантона или хлорохина на протяжении 72 часов. После обработки лекарственными средствами, добавляли бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) и подсчитывали количество жизнеспособных клеток, используя считывающее устройство для микропланшетов BioTek (Уинуски, Вермонт). Проапоптозные эффекты после воздействия лекарственными средствами in vitro определяли количественно, применяя окрашивание с помощью пропидиума иодида (PI) и анализ сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) на содержание суб-G/G ДНК. Полученные данные отражают результаты трех независимых экспериментов. Значения 1Сзо рассчитывали на основе результатов МТТ-анализов.
50
[088] В выборке из семи клеточных линий рака молочной железы лукантон уменьшал жизнеспособность клеток в похожей степени (Фиг.2). Кроме того, прямое сравнение показало, что лукантон являлся значительно более сильнодействующим препаратом, чем хлорохин в отношении снижения жизнеспособности клеток рака молочной железы, при среднем значении IC 7,2 мкМ относительно 66 мкМ в случае хлорохина (Фиг.2).
Пример 3
Лукантон индуцирует экспрессию катепсина D
[089] Исследование действия лукантона на раковые клетки с применением биочипов Affymetrix для изучения экспрессии. Для дополнительного исследования действия лукантона на клетки рака молочной железы, получали профили экспрессии для клеточных линий рака молочной железы. Клетки из клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231 и ВТ-20 обрабатывали с применением 10 мкМ лукантона в течение 48 часов. Тотальную RNA выделяли, используя мини-набор RNeasy Plus (Qiagen, Джермантаун, Мэриленд) и обрабатывали с применением набора TURBO DNA-free™ (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния). В соответствии с инструкциям производителя, 300 нг тотальной RNA на пробу амплифицировали и гибридизировали с получением биочипов GENECHIP Human Gene 1.0 ST (Affymetrix, Inc., Санта-Клара, Калифорния). Указанные биочипы анализировали экспрессию примерно 28869 хорошо аннотированных генов с помощью 764885 отдельных зондов. Файлы Affymetrix CEL импортировали в PARTEK Genomics Suite™ 6.4 (Partek Inc., Сент-Луис, Миссури), используя параметры нормализации по умолчанию Partek и анализ на основе алгоритма Robust Multi-array Average (RMA), подходящий для исследования последовательности и содержания GC (GC-RMA). Нормализацию данных выполняли по всем чипам, применяя нормализацию квантилей. Были идентифицированы сильно активированные гены (p<0,05 и > 4-х кратное увеличение). Полученные данные отображают гены, активированные по меньшей мере в 4 раза после обработки лукантоном.
[090] Из генов, индуцированных лукантоном, катепсин D (CTSD), матрикс металлопротеиназа-1 (MMPI) и цитохром Р450, семейство 1, член Al (CYPIAI) возрастали в обеих клеточных линиях (Фиг.3А).
[091] Количественный анализ PCR (полимеразной цепной реакции) катепсина D в реальном времени. Лизосомальная протеаза катепсин D является ключевым медиатором апоптоза и, как сообщалось в литературе, ее высвобождение в цитозоль способствует гибели клеток. С учетом этого факта, мы дополнительно оценили роль катепсина D во время опосредованной лукантоном гибели клеток, применяя количественный анализ PCR в реальном масштабе времени (qRT-PCR). Для проведения qRT-PCR, клетки из MDA-MB-231 или клеточных линий ВТ-20 обрабатывали с применением 10 мкМ лукантона в течение 48 часов и затем собирали для анализа. Выделяли тотальную RNA, используя мини-набор RNeasy Plus (Qiagen, Джермантаун, Мэриленд) и обрабатывали с применением набора TURBO DNAfree™ (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния).
-∆Ct
Синтез первой цепи cDNA выполняли с применением 1 г RNA в 20 мкл реакционной смеси, применяя высокопроизводительный набор для обратной транскрипции cDNA (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния). Транскрипты катепсина D и GAPDH амплифицировали, применяя коммерчески доступные образцы для экспрессии генов TaqMan@ (Applied Biosystems, Фостер Сити, Калифорния). Уровни mRNAs стандартизировали относительно экспрессии GAPDH и рассчитывали относительную экспрессию генов с применением 2 способа.
[092] Количественный анализ в реальном времени на основе PCR (qRT-PCR) подтвердил, что лукантон индуцировал значительное увеличение уровней катепсина D в обеих клеточных линиях (Фиг.3В). Кроме того, лукантон также резко увеличивал уровни белка катепсина D и способствовал его цитозольной агрегации, которую измеряли с помощью иммуноцитохимии (Фиг.3С).
Пример 4
Индукция катепсина D способствует апоптозу, опосредованному лукантоном
0
1
[093] Экспрессия катепсина D при раке молочной железы. Поскольку катепсин D вносит значительный вклад в апоптоз, опосредованный лукантоном, исследовали экспрессию катепсина D с помощью иммуноблоттинга и апоптоз с помощью PI-FACS в четырех клеточных линиях рака молочной железы. Клетки из клеточных линий рака молочной железы MDA-MB-231, BT-474, SKBR-3 и ВТ-20 высеивали в 96-луночные планшеты для микрокультуры при концентрации 10000 клеток на лунку и оставляли прикрепляться на 24 часа. Затем клетки обрабатывали с применением 10 мкМ лукантона на протяжении 72 часов (48 часа для анализа апоптоза). Для иммуноблоттинга, клетки собирали после обработки и определяли уровни катепсин D, как описано выше. Проапоптозные эффекты после воздействия лекарственным препаратом in vitro определяли количественно, применяя окрашивание с помощью пропидиума иодида (PI) и анализ сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) на содержание суб-G/G ДНК. Полученные данные отражают результаты трех независимых экспериментов. Как и предполагали, уровни катепсин D были сильно повышены после обработки лукантоном (Фиг.4А) и коррелировали с апоптозом (Фиг.4В).
[094] Нокдаун катепсина D уменьшает апоптоз, вызванный лукантоном. С целью дополнительного доказательства механистической роли катепсина D в апоптозе, индуцированном лукантоном, применяли siRNA для воздействия нокдауном на его экспрессию (Фиг.4С). Препарат siRNAs катепсин D и нецелевой SMARTpool siRNA получали из компании Dharmacon (Лафейетт, Колорадо). Клетки из клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231 трансфицировали с применением 100 нМ либо нецелевой siRNA, либо катепсин D siRNA, применяя олигофектамин (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) согласно протоколу производителя. Трансфицированные клетки инкубировали при 37°С в течение 24 часов и затем обрабатывали с применением 10 мкМ лукантона в течение 48 часов. Эффективность RNAi измеряли через 48 часов с помощью иммуноблоттинга, применяя антитело α-катепсина D. Апоптоз определяли путем окрашивания с применением пропидиума иодида и с помощью проточной цитометрии. Полученные результаты показали, что клетки с пониженными уровнями катепсина D значительно менее чувствительны в отношении апоптоза, опосредованного лукантоном (Фиг.4D).
Пример 5
р53 не уменьшает аккумуляцию катепсина D или активность лукантона
+
-
+
-
[095] Потеря функции р53 является частым случаем при раке у человека, что связано с онкогенезом и устойчивостью к лекарственным средствам. Таким образом, крайне необходимы агенты, которые обладают эффективностью, независимо от состояния р53. Для исследования роли р53 при гибели клеток, опосредованном лукантоном, применяли изогенные клеточные линии колоректального рака р53+1 и р53-1 НСТ1 16 (Фиг.5А). Важно, что лукантон индуцировал аккумуляцию катепсина D в равной степени независимо от состояния р53 (Фиг.5В). В соответствии с равносильной индукцией катепсина D, лукантон уменьшал жизнеспособность клеток в той же степени как в клеточных линиях НСТ1 16 р53+1 так и р53-1 (Фиг.5С). По существу, потеря р53 не уменьшает аккумуляции катепсина D или активность лукантона.
Пример 6
Лукантон усиливает активность вориностата
[096] Поскольку лукантон ингибирует аутофагию, он также может усиливать активность химиотерапевтических агентов, которые индуцируют такой пути. Ингибитор аутофагии на основе тиоксантона вориностат индуцирует как апоптоз, так и аутофагию, при этом ингибирование аутофагии значительно усиливает действие его проапоптозную активность. Для определения, будет ли эффективным комбинирование лукантона и вориностата, в четырех клеточных линиях рака молочной железы исследовали экспрессию катепсина D с помощью иммуноблоттинга, жизнеспособность клеток - с помощью МТТ-анализа и апоптоз - с помощью PI-FACS.
0
1
[097] Клетки из клеточных линий рака молочной железы MDA-MB-231, ВТ-474, SKBR-3 и ВТ-20 высеивали в 96-луночные планшеты для микрокультуры при концентрации 10000 клеток на лунку и оставляли прикрепляться на 24 часа. Для иммуноблоттинга, клетки обрабатывали с применением 10 мкМ лукантона, 2,5 мкМ вориностата или их комбинации на протяжении 72 часов, собирали и определяли уровни катепсина D, как описано выше. Далее, для проведения МТТ-анализа жизнеспособности клеток, клетки обрабатывали с применением 10 мкМ лукантона, 2,5 мкМ вориностата или их комбинации на протяжении 72 часов. После обработки, добавляли бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) после и подсчитывали количество жизнеспособных клеток, применяя считывающее устройство для микропланшетов BioTek (Уинуски, Вермонт). Затем, для анализа апоптоза, клетки обрабатывали с применением 10 мкМ лукантона, 2,5 мкМ вориностата или их комбинации в течение 48 часов. Проапоптозные эффекты после воздействия лекарственным препаратом in vitro определяли количественно, применяя окрашивание с помощью пропидиума иодида (PI) и анализ сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) на содержание суб-G/G ДНК. Полученные данные отражают результаты трех независимых экспериментов.
[098] Комбинация лукантона и вориностата приводит к повышению индукции катепсина D в клетках MDA-MB-231 по сравнению с индукцией, достигаемой при обработке с применением одного из двух препаратов (Фиг.6А), что связано с уменьшением жизнеспособности клеток (Фиг.6В) и увеличением апоптоза (Фиг.6С). Полученные данные служат доказательством, что ингибирование аутофагии лукантоном позволяет успешно усиливать противораковую активность вориностата.
Пример 7
Лукантон усиливает активность белиностата
[099] Для дальнейшего изучения и подробного рассмотрения того факта, что лукантон может успешно усиливать противораковую активность ингибиторов HDAC, мы исследовали эффективность лукантона в комбинации с другим ингибитором HDAC, белиностатом, путем оценки жизнеспособности клеток с применением МТТ-анализа, и в четырех клеточных линиях рака молочной железы исследовали апоптоз с помощью Р1-FACS.
0
1
[0100] Клетки из клеточных линий рака молочной железы MDA-MB-231 и ВТ-20 высеивали в 96-луночные планшеты для микрокультуры при концентрации 10000 клеток на лунку и оставляли прикрепляться на 24 часа. Для МТТ-анализа жизнеспособности клеток клетки обрабатывали с применением 5 мкМ лукантона, 1 мкМ белиностата или их комбинации на протяжении 72 часов. После обработки, добавляли бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (МТТ) и подсчитывали количество жизнеспособных клеток, применяя считывающее устройство для микропланшетов BioTek (Уинуски, Вермонт). Далее, для анализа апоптоза, клетки подвергали обработке с применением 10 мкМ лукантона, 1 мкМ белиностата или их комбинации в течение 48 часов. Проапоптозные эффекты после воздействия лекарственными средствами in vitro определяли количественно, применяя окрашивание с помощью пропидиума иодида (PI) и анализ сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS) на содержание суб-G/G ДНК. Полученные данные отражают результаты трех независимых экспериментов.
[0101] Комбинация лукантона и белиностата приводила к уменьшению жизнеспособности клеток (Фиг.7А) и увеличению апоптоза (Фиг.7В). Полученные данные служат доказательством, что ингибирование аутофагии с помощью лукантона позволяет успешно усиливать противораковую активность белиностата.
[0102] В заключение, следует иметь в виду, что, хотя аспекты настоящего описания выделены путем ссылок на конкретные варианты реализации изобретения, специалист в данной области техники легко поймет, что такие варианты только иллюстрируют принципы изобретения, предложенного в настоящей заявке. Таким образом, следует понимать, что описанное изобретение никоим образом не ограничено конкретной методологией, протоколом и/или реагентом и т.п., описанными в настоящей заявке. По существу, в соответствии с положениями, представленными в настоящей заявке, могут быть сделаны различные модификации или изменения или альтернативные конфигурации описанного изобретения, не выходящие за рамки сущности настоящего описания. Наконец, терминология, используемая в настоящей заявке, предназначена только для цели описания конкретных вариантов реализации изобретения и не предполагает ограничить объем изобретения, определенный исключительно формулой изобретения. Соответственно, настоящее изобретение не ограничено строго той информацией, которая приведена и описана в настоящей заявке.
[0103] В настоящем документе описаны некоторые варианты реализации настоящего изобретения, в том числе, наилучший способ, известный авторам заявки, для реализации данного изобретения. Конечно, после прочтения приведенного выше описания, обычным специалистам в данной области техники станет очевидна возможность изменения приведенных вариантов реализации изобретения. Авторы изобретения предполагают, что опытные специалисты будут применять такие изменения, по мере необходимости, и авторы изобретения подразумевают, что настоящее изобретение можно реализовать на практике иначе, чем конкретные варианты, предложенные в настоящем документе. Соответственно, настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты предмета изобретения, перечисленные в прилагаемой формуле изобретения, как предусмотрено законом. Более того, настоящее изобретение охватывает любую комбинацию вышеописанных вариантов реализации изобретения во всех ее возможных вариациях, если не указано иное или иное явно не противоречит контексту.
[0104] Группирование альтернативных вариантов реализации, элементов и стадий настоящего изобретения не следует рассматривать как ограничения. Каждый член группы можно отнести к другим членам группы и рассматривать по отдельности или в любой комбинации с указанными членами, описанными в настоящем документе. Предполагается, что один или более членов группы могут быть включены в группу или исключены из нее из соображений удобства и/или патентоспособности. Когда имеет место любое такое включение или исключение, считают, что описание содержит такую группу в качестве модифицированной группы, что соответствует, таким образом, письменному описанию всех групп Маркуша, используемых в прилагаемой формуле изобретения.
[0105] Если не указано иное, следует понимать, что все численные значения, выражающие характеристику, элемент, количество, параметр, свойство, продолжительность и так далее, применяемые в настоящем описании и формуле изобретения, являются во всех случаях измененными за счет применения термина "примерно." В настоящем документе, термин "примерно" означает, что характеристика, элемент, количество, параметр, свойство или продолжительность, определенные таким образом, охватывает диапазон плюс/минус десять процентов выше и ниже значения заявленной характеристики, элемента, количества, параметра, свойства или продолжительности. Соответственно, если не указано обратное, численные параметры, приведенные в описании и прилагаемой формуле изобретения, являются приближенными значениями и могут меняться. По крайней мере, а не как попытка ограничить применение доктрины эквивалентов в отношении объема формулы изобретения, каждое численное обозначение следует истолковывать с учетом количества приведенных значащих цифр и на основе обычных методов округления. Несмотря на то, что численные диапазоны и значения, устанавливающие широкие рамки настоящего изобретения, представляют собой приближенные величины, числовые диапазоны и значения, установленные в конкретных примерах, приводятся как можно более точно. Однако любой численный диапазон или значение по своей природе содержит определенные ошибки, обязательно вытекающие из стандартного отклонения, определяемого при соответствующих экспериментальных измерениях. Подразумевают, что в настоящем документе перечисление численных диапазонов значений просто служит в качестве сокращенного метода отнесения по отдельности каждого отдельного числового значения, попадающего в указанный диапазон. Если не указано иное, каждое отдельное значение из числового диапазона включено в настоящее описание, как если бы оно было отдельно перечислено в настоящем документе.
[0106] Подразумевают, что термины в единственном числе и подобные объекты, применяемые в контексте настоящего изобретения (особенно в контексте следующей формулы изобретения) включают объекты, как в единственном, так и множественном числе, если не указано иное или иное явно не противоречит контексту. Все способы, предложенные в настоящем изобретении, можно реализовать в любом подходящем порядке, если не указано иное или иное явно не противоречит контексту. Использование в настоящем документе каких-либо и всех примеров или типичной формулировки (например, "такие как") предназначено исключительно для лучшего освещения настоящего изобретения и не накладывает ограничения на объем изобретения, описанный иначе. Ни одну формулировку, приведенную в настоящем описании, не следует толковать как указание на незаявленный элемент, необходимый для практического применения изобретения.
[0107] Конкретные варианты реализации изобретения, предложенные в настоящем изобретении, могут быть дополнительно ограничены формулой изобретения путем применения терминов состоящий из или по существу состоящий из. При использовании в формуле изобретения, переходный термин "состоящий из", независимо от того зарегистрирован ли он или внесен с помощью поправки, исключает любой элемент, стадию или ингредиент, не указанный в формуле изобретения. Переходный термин "по существу состоящий из" ограничивает объем пункта формулы до точно указанных материалов или стадий, и таких материалов или стадий, которые не оказывают существенного влияния на основную и новую характеристику (характеристики). Варианты реализации настоящего изобретения, заявленные таким образом, по своей природе или специально описаны и включены в настоящий документ.
[0108] Все патенты, патентные публикации и другие публикации, цитируемые и упоминаемые в настоящем описании, по отдельности и в прямой форме в полном объеме включены в настоящий документ посредством ссылки с целью описания и раскрытия, например, композиций и методик, описанных в таких публикациях, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. Эти публикации предназначены исключительно для их раскрытия до даты подачи настоящей заявки. В этой связи такие публикации не следует рассматривать как признание того факта, что изобретатели не уполномочены датировать задним числом такое раскрытие в силу предшествующего изобретения или по любой другой причине. Все заявления относительно даты или представления в отношении содержания указанных документов основаны на информации, доступной заявителям, и не являются заявлением, характеризующим точность дат или содержание этих документов.