ВЕКТОРНЫЕ КОМПОЗИЦИИ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ АДЕНОАССОЦИИРОВАННЫМ ВИРУСОМ
MODIFIED ADENO-ASSOCIATED VIRUS VECTOR COMPOSITIONS

Родственные заявки
Данная заявка на патент притязает на преимущество приоритета заявки на патент США, регистрационный №61/668839, зарегистрированной 6 июля 2012, включенной в данное описание в качестве ссылки.
Список последовательностей Данная заявка содержит список последовательностей, который представлен в формате ASCII через EFS-Web и таким образом включен в качестве ссылки. Копия указанного ASCII, созданная 14 марта 2013, называется 17023.126WOl_SL.txt и имеет размер 39215 байт.
Уровень техники
Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой малый непатогенный вирус семейства parvoviridae. AAV отличается от других членов этого семейства зависимостью от вируса-помощника для репликации. Геном AAV приблизительно в 5 кб состоит из одного сегмента одноцепочечной ДНК полярности или плюс или минус.Концы генома представляют собой короткие инвертированные концевые повторы, которые могут складываться в шпилькообразные структуры и служить в качестве точки начала репликации вирусной ДНК. Физически вирион парвовируса является безоболочечным, и его двадцатигранный капсид имеет приблизительно 20 нм в диаметре.
В настоящее время идентифицировано и выделено из организмов людей или приматов несколько серологически различных AAV (Govindasamy et al., «Structurally Mapping the Diverse Phenotype of Adeno-Associated Virus Serotype 4», J. Vir., 80(23): 11556-11570 (2006)). Например, геном AAV2 составляет 4680 нуклеотидов в длину и содержит две открытые рамки считывания (ORF). Левая ORF кодирует неструктурные белки Rep -Rep 40, Rep 52, Rep 68 и Rep 78, которые, кроме продуцирования геномов одноцепочечного потомства, вовлечены в регуляцию репликации и транскрипции. Также показано, что Rep68/78 обладают активностью связывания NTP, а также хеликазными активностями ДНК и РНК. Белки Rep обладают сигналом ядерной локализации, а также несколькими сайтами потенциального фосфорилирования. Мутация одного из таких киназных сайтов приводит к утрате активности репликации.
Концы генома представляют собой короткие инвертированные концевые повторы (ITR), которые имеют потенциал для складывания в Т-шпилькообразные структуры, которые служат началом репликации вирусной ДНК. В пределах участка ITR описаны два элемента, которые являются центральными для функции ITR - мотив повтора GACC и терминальный сайт расщепления (trs). Показано, что мотив повтора связывает Rep, когда ITR имеет или линейную или пшилькообразную конформацию. Связывание служит для локализации Rep68/78 для расщепления в trs, которое происходит сайт- или цепочесноспецифическим путем.
Указанные далее особенности AAV делают его привлекательным вектором для переноса генов. AAV векторы обладают широким интервалом хозяев, трансдуцируют как делящиеся, так и неделящиеся клетки in vitro и in vivo и поддерживают высокие уровни экспрессии трансдуцированных генов. Вирусные частицы теплоустойчивы, устойчивы к растворителям, детергентам, изменениям рН, температуры и могут быть концентрированы в градиентах CsCl. AAV не ассоциируется с каким-либо патогенным событием, и найдено, что трансдукция с помощью AAV векторов не вызывает каких-либо последующих негативных действий на рост или дифференцировку клеток. Показано, что ITR представляют собой только цис-элементы, требуемые для упаковки, допуская полное «разграбление» вирусных генов для создания векторных систем.
Существует потребность в AAV векторах, которые имеют улучшенные харктеристики упаковки.
Сущность изобретения
В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к заполняющему компоненту (также называемому «последовательностью-вставкой (stuffer)») аденоассоциированного вируса (AAV), включающему нуклеиновую кислоту от 3300 до 4200 нуклеотидов в длину, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичность с SEQ ID NO: 1или SEQ ID NO: 2.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к заполняющему компоненту аденоассоциированного вируса (AAV), состоящему из нуклеиновой кислоты от 3300 до 4200 нуклеотидов в длину, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичность с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к AAV вектору, включающему заполняющий компонент, описанный выше.
Краткое описание чертежей и таблицы
Фигура 1 представляет собой карту плазмиды 5pFBAAVmU6miHDS1-вставка (9110 п. о.).
Фигура 2 представляет собой последовательность 5pFBAAVmU6miHDS1-вставки (вставка №1) (SEQ ID NO: 3).
Фигура 3 показывает последовательности различных отдельных компонентов 5pFBAAVmU6miHDS1-вставки (SEQ ID NO: 1,4-11).
Фигура 4 представляет собой диаграмму, показывающую относительную экспрессию Htt.
Фигура 5 представляет собой карту плазмиды 5pFBAAVmU6miHDS1-вставка.
Фигура 6 представляет собой последовательность плазмиды для 5pFBAAVmU6miHDS1-вставки (SEQ ID NO: 12).
Фигура 7 представляет собой последовательность-вставку (вставка №2) (SEQ ID NO: 2).
Фигура 8. ЭМ-оценка полных вирионов против пустых вирйонов. Два примера пустых вирионов показаны стрелками. Данный преп.имеет только ~4% пустых вирионов, что является достаточно низким уровнем.
Фигура 9. Окрашивание серебром для проверки целостности капсида очищенных вирионов. Несколько различных миРНК-экспрессирующих конструкций вставлены в «челночный» вектор вместе с интроном I/вставкой II для генерации генома размером почти дикого типа. Очищенные вирусы показывают оптимальные соотношения белков VP1, VP2 и VP3.
Таблица 1. Эффективность упаковок miR-интрон/II вирионов и % загрязнений.
Подробное описание
AAV векторы и экспрессируюшие кассеты
Вирусные векторы по изобретению используют AAV вектор. «AAV» вектором называется аденоассоциированный вирус, что может использоваться для обозначения самого вируса дикого типа, встречающегося в природе, или его производных. Термин перекрывает все подтипы, серотипы и псевдотипы и формы как встречающиеся в природе, так и рекомбинантные, за исключением, где требуется иное. Используемый в данном описании термин «серотип» относится к AAV, который идентифицирован и отличается от других AAV на основании реакционной способности капсидного белка в отношении определенных антисывороток, например, известны восемь серотипов AAV приматов с AAV-1 по AAV-8. Например, серотип AAV-2 используют как относящийся к AAV, который содержит капсидные белки, кодированные от кэпового гена AAV-2, и геном, содержащий последовательности 5'и 3' ITR из того же серотипа AAV-2.
Псевдотипированный AAV относится к AAV, который содержит капсидные белки от одного серотипа и вирусный геном, включающий 5'-3' ITR второго серотипа. Можно было ожидать, что псевдотипированный rAAV имеет связывающие свойства клеточной поверхности капсидного серотипа и генетические свойства, соответствующие серотипу ITR. Псевдотипированный rAAV получают с использованием стандартных методов, описанных в технике. В данном описании, например, rAAV1 может быть использован как относящийся к AAV, имеющему оба капсидных белка и 5'-3' ITR от одного и того же серотипа, или может относиться к AAV, имеющему капсидные белки от серотипа 1 и 5'-3' ITR от другого серотипа AAV, например, серотипа 2 AAV.
Аббревиатура «rAAV» относится к рекомбинантному аденоассоциированному вирусу, также называемому рекомбинантным AAV вектором (или «rAAV»вектором». В одном воплощении AAV экспрессирующие векторы конструируют с использованием известных методов для предоставления, по меньшей мере, в виде оперативно связанных компонентов в направлении транскрипции, контрольных элементов, включающих участок инициации транскрипции, ДНК, представляющую интерес, и участок терминации транскрипции. Выбирают контрольные элементы, функциональные в клетке млекопитающего. Полученную конструкцию, которая содержит оперативно связанные компоненты, фланкируют (по 5' и 3') функциональными последовательностями AAV ITR.
«Аденоассоциированными вирусными инвертированными повторами» или «AAV ITR» называют признанные в технике участки, обнаруженные в каждом конце генома AAV, которые функционируют вместе в цис как точки начала репликации ДНК и как сигналы упаковки для вируса.
Нуклеотидные последовательности AAV ITR известны. Используемый в данном описании «AAV ITR» не нуждается в наличии отображенной нуклеотидной последовательности дикого типа, но она может быть изменена, например, путем вставки, делеции или замены нуклеотидов. Кроме того, AAV ITR может быть получен из любого из нескольких серотипов AAV, включая, и без ограничения, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-7 и т.д.. Кроме того, 5' и 3' ITR, которые фланкируют выбранную нуклеотидную последовательность в AAV векторе, не должны обязательно быть идентичными или происходить или быть выделены из AAV одного и того же серотипа до тех пор, пока они функционируют как предполагается, т.е., допускают вырезание или освобождение последовательности, представляющей интерес, из генома клетки-хозяина или вектора.
2
AAV ITR могут быть вырезаны из AAV векторной плазмиды, содержащей одинаковые и слитые 5' и 3' выбранной нуклеотидной конструкции, которая присутствует в другом векторе, с использованием стандартных методов лигирования, таких как описанные в Sambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NY (2001). Например, лигирования могут быть выполнены в 20 мМ трис-Cl, рН 7,5,10 мМ MgCl,10 мМ DTT, 33 мкг/мл BSA, 10 мМ-50 мМ NaCl и или 40 мкМ АТФ, 0,01-0,02 (Weiss) единиц ДНК-лигазы Т4 при 0°С (для лигирования «липких концов») или 1 мМ АТФ, 0,3-0,6 (Weiss) единиц ДНК-лигазы Т4 при 14°С (для лигирования «тупых концов). Внутримолекулярные лигирования «липких концов» обычно выполняют при общих концентрациях ДНК 30-100 мкг/мл (общая конечная концентрация 5-100 нМ). AAV векторы, которые содержат ITR, описаны, например, в пат. США №5139941. В частности, в указанном патенте описаны некоторые AAV векторы, которые доступны от Американской коллекции типовых культур («АТСС») под инвентарными номерами 53222, 53223, 53224, 53225 и 53226.
Аденоассоциированный вирус предпочтительно упаковывает полноразмерный геном, т.е. геном, который имеет приблизительно такой же размер, как нативный геном, и не слишком большой или не слишком маленький. Многие нуклеотидные последовательности-мишени или экспрессирующие кассеты, кодирующие нуклеотидные последовательности-мишени, являются весьма малыми. Для того чтобы избежать упаковки фрагментированных геномов, авторы настоящего изобретения создали и проверили нуклеотидную последовательность, которая соединяется с экспрессирующей кассетой, приводя к геному, размер которого почти нормальный по длине между ITR. Исходная последовательность происходит от млекопитающего, но существенно модифицирована для уверенности в том, что такой «заполняющий компонент» (также называемый «последовательностью-вставкой») лишен, среди прочего, энхансеров, промоторов, регуляторов сплайсинга, некодирующих РНК или антисмысловых последовательностей. Иными словами, последовательности-вставки являются «молчащими» и не придают активность экспрессирующей кассете.
В настоящем изобретении подходящие молекулы ДНК для применения в AAV векторах будут включать, например, последовательность-вставку и экспрессирующую кассету, кодирующую молекулу миРНК по изобретению. Многие экспрессирующие кассеты являются достаточно малыми, например, кассеты, экспрессирующие ингибирующие РНК (миРНК и shRNA). Таким образом, существует потребность в добавлении последовательностей к кассете, так что она дает полноразмерный или почти полноразмерный геном AAV. Если при получении AAV используют только малый геном, рекомбинантные вирионы могут быть гетерогенными и содержать геномы различных размеров. Это имеет место, поскольку вирус предпочитает упаковывать полноразмерные геномы, так что он может захватить другие фрагменты ДНК для того, чтобы заполнить это пространство. Вставка не может быть слишком крупной, так как геномы AAV свыше 105% от размера генома дикого типа, как правило, упаковываться не будут.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к заполняющему компоненту (также называемому «последовательностью-втавкой») аденоассоциированного вируса (AAV), заключающему нуклеиновую кислоту от 3300 до 4200 нуклеотидов в длину, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичность с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
В некоторых воплощениях изобретение относится к заполняющему компоненту аденоассоциированного вируса (AAV), состоящему из нуклеиновой кислоты от 3300 до 4200 нуклеотидов в длину, имеющую, по меньшей мере, 90% идентичность с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях заполняющий компонент имеет, по меньшей мере, 90% идентичность с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях заполняющий компонент имеет 95% идентичность, 98% идентичность, 99% идентичность или даже 100% идентичность с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. В некоторых воплощениях заполняющий компонент имеет длину в примерно 3500-4000 нуклеотидов или примерно 3700-3850 нуклеотидов. В настоящем изобретении заполняющий компонент является «молчащим» в смысле биологической активности, в том, что он лишен энхансеров, промоторов, регуляторов сплайсинга, некодирующих РНК, антисмысловых последовательностей или кодирующих последовательностей.
Термин «нуклеиновая кислота» относится к дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) или рибонуклеиновой кислоте (РНК) и их полимерам в любой одно- или двухцепочечной форме, состоящим из мономеров (нуклеотидов), содержащих сахар, фосфат и основание, которое представляет собой или пурин или пиримидин. Если отсутствует конкретное ограничение, термин охватывает нуклеиновые кислоты, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют схожие свойства связывания с эталонной нуклеиновой кислотой и метаболизированы схожим образом с нуклеотидами, встречающимися в природе. Если не указано иное, определенная нуклеотидная последовательность также охватывает ее консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденного кодона) и комплементарные последовательности, а также ясно указанную последовательность. Конкретно замен вырожденного кодона можно достичь путем генерации последовательностей, в которых третья позиция одного или нескольких (или всех) кодонов заменена смешанно основанием и/или дезоксиинозиновыми остатками. «Фрагмент нуклеиновой кислоты» представляет собой часть молекулы данной нуклеиновой кислоты.
«Нуклеотидная последовательность» представляет собой полимер ДНК или РНК, который может быть одноцепочечным или двухцепочечным, необязательно содержащим синтетические, неприродные или измененные нуклеотидные основания, способные внедриться в полимеры ДНК или РНК. Термины «нуклеиновая кислота», «молекула нуклеиновой кислоты», «фрагмент нуклеиновой кислоты», «последовательность или сегмент нуклеиновой кислоты» или «полинуклеотид» используются как взаимозаменяемые и также могут использоваться как взаимозаменяемые с геном, кДНК, ДНК или РНК, кодированными геном.
Изобретение охватывает композиции изолированных или по существу очищенных нуклеиновых кислот. В контексте настоящего изобретения «изолированная» или «по существу очищенная» молекула ДНК или молекула РНК представляет собой молекулу ДНК или молекулу РНК, которая существует отдельно от ее нативной окружающей среды и поэтому не является продуктом природы. Изолированная молекула ДНК или молекула РНК может существовать в очищенной форме или может существовать в ненативной окружающей среде, такой как, например, трансгенная клетка-хозяин. Например, «изолированная» или «очищенная» молекула нуклеиновой кислоты или ее биологически активная часть по существу не содержат другой клеточный материал или культуральную среду при получении рекомбинантными методами или по существу не содержат химические предшественники или другие химические вещества, когда синтезированы химически. В одном воплощении «изолированная» молекула нуклеиновой кислоты не содержит последовательности, которые в природе фланкируют нуклеиновую кислоту (т.е. последовательности, расположенные в 5'- и 3'-концах нуклеиновой кислоты) в геномной ДНК организма, от которого нуклеиновая кислота происходит. Например, в различных воплощениях изолированная молекула нуклеиновой кислоты может содержать менее примерно 5 кб, 4 кб, 3 кб, 2 кб, 1 кб, 0,5 кб или 0,1 кб нуклеотидных последовательностей, которые в природе фланкируют молекулу нуклеиновой кислоты в геномной ДНК клетки, из которой нуклеиновая кислота получена. Фрагменты и варианты раскрытых нуклеотидньгх последовательностей также охватываются настоящим изобретением. «Фрагмент» или «часть» обозначает полноразмерную или меньшую, чем полноразмерная, нуклеотидную последовательность.
Определения «встречающийся в природе», «нативный» или «дикого типа» используют для описания объекта, который можно обнаружить в природе как отличающийся от получаемого искусственно. Например, белок или нуклеотидная последовательность, присутствующие в организме (включая вирус), которые можно изолировать из источника в природе, и которые не модифицированы умышленно специалистом в лаборатории, являются встречающимися в природе.
Термин «геном» относится к полному генетическому материалу организма.
«Вектор» является определением, включающим, среди прочего, любой вирусный вектор, а также любую плазмиду, космиду, фаг или бинарный вектор в двух- или одноцепочечной линейной или кольцевой форме, которые могут или не могут быть самотрансмиссивными или способными к самомобилизации, и которые могут трансформировать прокариотного или эукариотного хозяина.
AAV ITR
Термины «AAV вирус» или «AAV вирусная частица» относятся к вирусной частице, состоящей из, по меньшей мере, одного AAV капсидного белка (предпочтительно, всех капсидных белков дикого типа) и инкапсидированного полинуклеотида. Если частица включает гетерологичный полинуклеотид (т.е. полинуклеотид иной, чем геном AAV дикого типа, такой как трансген, доставляемый в клетку млекопитающего), ее обычно называют «rAAV».
В одном воплощении AAV экспрессирующие векторы конструируют с использованием известных методов для получения, по меньшей мере, оперативно связанных компонентов в направлении транскрипции, контрольных элементов, включая участок инициации транскрипции, ДНК, представляющую интерес, и участок терминации транскрипции. Выбирают контрольные элементы, функциональные в клетке млекопитающего. Полученную конструкцию, которая содержит оперативно связанные компоненты, фланкируют (по 5' и 3') функциональными последовательностями AAV ITR.
Термины «аденоассоциированные вирусные инвертированные концевые повторы» или «AAV ITR» обозначают признанные в технике участки, обнаруженные в каждом конце генома AAV, которые функционируют вместе в цис как точки начала репликации ДНК и как сигналы упаковки для вируса. AAV ITR вместе с кодирующим участком AAV-rep обеспечивают эффективное вырезание из плазмид, экспрессирующих их.
Нуклеотидные последовательности участков AAV ITR известны. Используемый в данном описании «AAV ITR» не нуждается в наличии отображенной нуклеотидной последовательности дикого типа, но она может быть изменена, например, путем вставки, делеции или замены нуклеотидов. Кроме того, AAV ITR может быть получен из любого из нескольких серотипов AAV, включая, и без ограничений, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 и т.д. Кроме того, 5' и 3' ITR, которые фланкируют выбранную нуклеотидную последовательность в AAV векторе, не должны обязательно быть идентичными или происходить или быть выделены из AAV одного и того же серотипа до тех пор, пока они функционируют как предполагается, т.е. допускают вырезание и освобождение из вектора последовательности, представляющей интерес, и упаковку нужного генома в AAV вирион.
В одном воплощении AAV ITR могут быть получены из любого из нескольких серотипов AAV, включая, и без ограничений, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 и т.д. Кроме того, 5' и 3' ITR, которые фланкируют выбранную нуклеотидную последовательность в AAV векторе, не должны обязательно быть идентичными или происходить или быть выделены из AAV одного и того же серотипа до тех пор, пока они функционируют как предполагается, т.е. допускают вырезание и освобождение из вектора последовательности, представляющей интерес, и упаковку нужного генома в AAV вирион.
В некоторых воплощениях настоящее изобретение относится к аденоассоциированному вирусному (AAV) вектору, включающему заполняющий компонент, описанный выше, функционально связанный с экспрессирующей кассетой. В некоторых воплощениях экспрессирующая кассета включает промотор. В некоторых воплощениях промотор представляет собой промотор pol III. В некоторых воплощениях промотор представляет собой промотор mU6. В некоторых воплощениях AAV вектор также включает последовательность-мишень. В некоторых воплощениях последовательность-мишень представляет собой молекулу RNAi.
Термин «экспрессирующая кассета», используемый в данном описании, обозначает нуклеотидную последовательность, способную управлять экспрессией определенной нуклеотидной последовательности в соответствующей клетке-хозяине, которая может включать промотор, функционально связанный с нуклеотидной последовательностью, представляющей интерес, которая может быть функционально связана с сигналами терминации. Кодирующий участок обычно кодирует функциональную РНК, представляющую интерес, например, молекулу RNAi. Экспрессирующая кассета, включающая нуклеотидную последовательность, представляющую интерес, может быть химерной. Экспрессирующая кассета также может представлять собой кассету, встречающуюся в природе, но не полученную в рекомбинантной форме, применимой для гетерологичной экспрессии.
Двухцепочечная РНК (дцРНК) может индуцировать последовательность-специфический посттранскрипционный сайленсинг гена во многих организмах способом, известным как РНК-интерференция (RNAi). Фрагменты РНК являются последовательность-специфическими медиаторами RNAi. Интерференция экспрессии генов такими молекулами РНК-интерференции (RNAi) в настоящее время признана как встречающаяся в природе стратегия сайленсинга генов в клетках многих организмов.
Некоторые воплощения настоящего изобретения относятся к вектору, который кодирует изолированную молекулу RNAi. Используемый в данном описании термин «кодированный...» используется в широком смысле, схожим с термином «включающий» в патентной терминологии. Молекулы RNAi включают миРНК, shRNA и другие малые РНК, которые могут или способны модулировать экспрессию гена-мишени, например, через интерференцию РНК. Такие малые РНК включают, без ограничения, shRNA и мирРНК (миРНК).
Термин «функционально связанные» относится к ассоциации нуклеотидньгх последовательностей в одном фрагменте нуклеиновой кислоты, такой, что функция одной из последовательностей затрагивается другой. Например, говорят, что регуляторная ДНК последовательность «функционально связана» или «ассоциирована с» последовательностью ДНК, которая кодирует РНК или полипептид, если две последовательности устроены так, что регуляторная ДНК последовательность влияет на экспрессию кодирующей ДНК последовательности (т.е., что кодирующая последовательность или функциональная РНК находится под транскрипционным контролем промотора). Кодирующие последовательности могут быть функционально связаны с регуляторными последовательностями в смысловой или антисмысловой ориентации.
Функционально связанные нуклеиновые кислоты являются нуклеиновыми кислотами, поставленными в функциональное соотношение с другой нуклеотидной последовательностью. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью, если он располагается так, что облегчается трансляция. Как правило, функционально связанные ДНК последовательности представляют собой ДНК последовательности, которые соединены и являются контигом. Однако энхансеры не должны быть контигом. Связывание выполняется путем лигирования в подходящих сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, используют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры согласно обычной практике.
Теперь изобретение будет поясняться приведенным далее неограничивающими примерами.
Пример 1
Получают плазмиду FBAAVmU6miHDS1-вставка, который включает AAV2 ITR, промотор mU6, последовательность-мишень miHDSl, вставку заполняющего компонента и основную цепь AAV (фигура 1). Последовательность для 5pFBAAVmU6miHDSlAAV-вставки приводится на фигуре 2, и последовательности для отдельных компонентов плазмиды приводятся на фигуре 3. Полноразмерный заполняющий компонент («последовательность-вставка») состоит из 3776 нуклеотидов.
Пример 2
Сравнивают эффективность сайленсинга in vivo векторов, экспрессирующих miHDS1. Конструируют четыре вектора: (1) вектор, экспрессирующий контрольную последовательность (miSAFE) и содержащий контрольную последовательность (eGFP), (2) вектор, экспрессирующий последовательность-мишень (miHDS1) и содержащий контрольную последовательность (eGFP), (3) вектор, экспрессирующий контрольную последовательность(гш8АРЕ) и содержащий последовательность-вставку, описанную в примере 1, и (4) вектор, экспрессирующий последовательность-мишень (miHDSl) и последовательность-вставку, описанную в примере 1.
(1) AAV2/1 mU6miSAFE - eGFP (4,81Е12 мкг/мл)
(2) AAV2/1 mU6miHDSl - eGFP (4,81Е12 мкг/мл)
(3) AAV2/1 mU6miSAFE - вставка (4,81Е12 мкг/мл)
(4) AAV2/1 mU6miHDSl - вставка (4,81Е12 мкг/мл)
Последовательности для miSAFE и miHDSl обсуждались ранее (см. PCT/US2012/024904, включена в данное описание в качестве ссылки). Мышам дикого типа инъецируют в полосатое тело четыре вектора. Через один месяц мышей умерщвляют, и определяют экспрессию Htt относительно уровней экспрессии Actb методом QPCR. Фигура 4 показывает, что имеется 20% снижение экспрессии между экспрессирующими кассетами miSAFE/eGFP и miHDS1/eGFP, в то время как между эксгфессирующими кассетами miSAFE/вставка и miHDS1/вставка имеет место 60% снижение экспрессии, т.е. снижение на 60%, когда используют вставку.
Пример 3
Получают плазмиду 5pFBAAVmU6rniHDS1 вставка, которая включает AAV2 ITR, промотор mU6, последовательность-мишень miHDS1, вставку заполняющего компонента и основную цепь AAV (фигура 5). Последовательность для плазмиды 5pFBAAVmU6miHDSlAAV-вставка приводится на фигуре 6. Последовательность для вставки (вставка №2) приводится на фигуре 7.
Пример 4
Одним из соображений в связи с упаковкой AAV является размер генома. Когда это имеет место, пропорция вирионов, которые образуются, которые являются недостающими геномами, минимизируется. Выполняют эксперименты по проверке эффективности упаковки новых последовательностей-вставок и находят высокую эффективность упаковки. Например, см. таблицу 1 «Средняя незаполненность» и фигуру 8). Также определяют, содержит ли генетический материал, который упакован, последовательности-вставки не-миРНК: интрон. Находят, что включение непредусмотренного генетического материала, используемого при продуцировании вируса, исключительно низкое (Cap/rAAV, Amp/rAAV, Gent/rAAV). Наконец, анализируют качество вирусов окрашиванием серебром после электрофореза в полиакриламидном геле и находят, что они содержат в соответствующих пропорциях различные капсидные белки (VP1, VP2 и VP3; фигура 9). В итоге последовательность интрон I/II-заполнитель делает возможной оптимальную упаковку желательных трансгенов в капсиды AAV.
Все публикации, патенты и заявки на патент включены в данное описание в качестве ссылок. Хотя в приведенном выше описании данное изобретение описывается в связи с некоторыми его предпочтительными воплощениями, и многие подробности приведены в целях пояснения, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что изобретение допускает другие воплощения, и что некоторые детали, описанные в данном описании, можно значительно изменить без отхода от основных положений изобретения.