СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ ИСКУССТВЕННОГО ИММУНИТЕТА

1. Композиция, включающая:
(a) многообразие праймеров V сегмента, где каждый праймер включает последовательность, которая комплементарна отдельному функциональному V сегменту или небольшому семейству V сегментов; и
(b) многообразие праймеров J-сегмента, где каждый праймер включает последовательность, которая комплементарна J сегменту;
где праймеры V сегмента и J-сегмента обеспечивают амплификацию CDR3 участка TCR или IG путем многократной полимеразной цепной реакции (PCR) с продуцированном многообразия амплифицированных молекул ДНК, достаточных для определения разнообразия TCR или IG генов.
2. Композиция по п.1, где каждый праймер V-сегмента включает последовательность, которая комплементарна отдельному Vγ сегменту или семейству подобных Vγ сегментов, а каждый праймер J сегмента включает последовательность, которая комплементарна Jγ сегменту, и где праймеры V сегмента и J-сегмента обеспечивают амплификацию CDR3 участка TCRγ.
3. Композиция по п.1, где каждый праймер V сегмента включает последовательность, которая комплементарна отдельному Vδ сегменту или семейству подобных Vδ сегментов, а каждый праймер J сегмента включает последовательность, которая комплементарна Jδ сегменту, и где праймеры V сегмента и J-сегмента обеспечивают амплификацию CDR3 участка TCRδ.
4. Композиция по п.1, где каждый праймер V сегмента включает последовательность, которая комплементарна отдельному Vα сегменту или семейству подобных Vα сегментов, а каждый праймер J сегмента включает последовательность, которая комплементарна Ja сегменту, и где праймеры V сегмента и J-сегмента обеспечивают амплификацию CDR3 участка TCRα.
5. Композиция по п.1, где каждый праймер V сегмента включает последовательность, которая комплементарна отдельному Vβ сегменту или семейству подобных Vβ сегментов, а каждый праймер J сегмента включает последовательность, которая комплементарна Jβ сегменту, и где праймеры V сегмента и J-сегмепта обеспечивают амплификацию CDR3 участка TCRβ.
6. Композиция по п.1, где V сегмент имеет сходную прочность отжига.
7. Композиция по п.1, где все праймеры J сегмента отжигаются с одинаковым мотивом консервативного каркасного участка.
8. Композиция по п.1, где амплифицированная молекула ДНК начинается с указанного консервативного мотива, диагностически определяет J сегмент, и включает соединение, и его часть в V сегменте.
9. Композиция по п.1, кроме того, включающая совокупность секвенируемых олигонуклеотидов, где секвенируемые олигопуклеотиды гибридизируются с участками в амплифицироваппых молекулах ДНК.
10. Композиция по п.1, где амплифицированная ДНК охватывает V-D-J соединение.
11. Композиция по п.1, где V-сегмент или J-сегмент выбраны так, чтобы он содержал коррекцию ошибок последовательности путем слияния близко родственных последовательностей.
12. Композиция по п.1, кроме того, включающая универсальный праймер С сегмента для генерирования кДНК из мРНК.
13. Композиция по п.5, где праймер V сегмента заякорен в положении -43 в Vβ сегменте относительно сигнальной последовательности рекомбинации (RSS).
14. Композиция по п.5, где многообразие праймеров V сегмента состоит по меньшей мере из 14 праймеров, специфических к 14 различным Vβ генам.
15. Композиция по п.5, где праймеры V сегмента имеют последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NOS:1-45.
16. Композиция по п.5, где праймеры V сегмента имеют последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NOS:58-102.
17. Композиция по п.5, где имеется праймер V сегмента для каждого Vβ сегмента или семейства Vβ сегментов.
18. Композиция по п.5, где праймеры не пересекают границу интрона/экзона.
19. Композиция по п.5, где праймеры J сегмента гибридизируются с консервативным элементом Jβ сегмента и имеют сходную прочность отжига.
20. Композиция по п.5, где многообразие праймеров J сегмента включает по меньшей мере пять праймеров специфических к пяти различным Jβ генам.
21. Композиция по п.5, где праймеры J сегмента имеют последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NOS:46-57 и 483.
22. Композиция по п.5, где праймеры J сегмента имеют последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID NOS:103-113, 468 и 484.
23. Композиция по п.5, где имеется праймер J сегмента для каждого Jβ сегмента.
24. Композиция по п.5, где каждый амплифицированный Jβ генный сегмент имеет уникальный свободный конец из четырех оснований в положениях от +11 до +14 вниз по RSS сайту.
25. Композиция по п.24, где секвенируемые олигонуклеотиды гибридизируются рядом со свободным концом из четырех оснований в амплифицированных Jp генных сегментах в положениях от +11 до +14 вниз по RSS сайту.
26. Композиция но п.24, где секвенируемые олигонуклеотиды выбраны из группы, включающей SEG ID NOS:470-482.
27. Композиция, включающая:
(a) многообразие праймеров V сегмента, где каждый праймер V сегмента включает последовательность, которая комплементарна отдельному функциональному V сегменту или небольшому семейству V сегментов; и
(b) многообразие праймеров J сегмента, где каждый праймер J сегмента включает последовательность, которая комплементарна J сегменту;
H
где праймеры V сегмента и J сегмента предоставляют амплификацию V участка тяжелой цепи (IGII) антитела путем многократной полимеразной цепной реакции (PCR) с продуцированном многообразия амплифицированных молекул ДНК, достаточных для определения разнообразия генов тяжелой цепи антитела.
28. Композиция, включающая:
(a) многообразие праймеров V сегмента, где каждый праймер V сегмента включает последовательность, которая комплементарна отдельному функциональному V сегменту или небольшому семейству V сегментов; и
(b) многообразие праймеров J сегмента, где каждый праймер J сегмента включает последовательность, которая комплементарна J сегменту;
L
где праймеры V сегмента и J сегмента предоставляют амплификацию V участка легкой цепи (IGL) антитела путем многократной полимеразной цепной реакции (PCR) с продуцированном многообразия амплифицированных молекул ДНК, достаточных для определения разнообразия генов легкой цепи антитела.
29. Способ, при котором
(a) отбирают многообразие праймеров V сегмента, где каждый праймер V сегмента включает последовательность, которая комплементарна отдельному функциональному V сегменту или небольшому семейству V сегментов; и
(b) отбирают многообразие нраймеров J сегмента, где каждый нраймер J сегмента включает последовательность, которая комплементарна J сегменту;
(с) комбинируют праймеры V сегмента и J сегмента с образцом геномной ДНК для предоставления амплификации CDR3 участка TCR путем многократной полимеразной цепной реакции (PCR) с продуцированием многообразия амплифицированных молекул ДНК, достаточных для определения разнообразия TCR генов.
30. Способ по п.29, где каждый праймер V сегмента включает последовательность, которая комплементарна отдельному Vβ сегменту или семейству Vβ сегментов, и каждый праймер J сегмента включает последовательность, которая комплементарна Jβ сегменту; и где комбинирование праймеров V сегмента и J сегмента с образцом геномной ДНК предоставления амплификацию CDR3 участка TCRB путем многократной полимеразной ценной реакции (PCR) и продуцирует многообразие амплифицированных молекул ДНК.
31. Способ по п.30, кроме того, включающий этап ссквепирования амплифицированных молекул ДНК.
32. Способ по п.31, где на этапе секвенирования используют совокупность секвенируемых олигонуклеотидов, которые гибридизируются с определенным участком в амплифицированных молекулах ДНК.
33. Способ по п.32, кроме того, включающий этап расчета общего разнообразия CDR3 последовательностей TCRβ среди амплифицированных молекул ДНК.
6
34. Способ по п.33, где способ показывает, что общее разнообразие нормального субъекта-человека составляет более 1·10 последовательностей.
6
35. Способ по п.33, где способ показывает, что общее разнообразие нормального субъекта-человека составляет более 2·10 последовательностей.
6
36. Способ по п.33, где способ показывает, что общее разнообразие нормального субъекта-человека составляет более 3·10 последовательностей.
37. Способ диагностики иммунодефицита у пациента-человека, при котором измеряют разнообразие CDR3 последовательностей TCR пациента и сравнивают разнообразие субъекта с разнообразием, полученным от нормального субъекта.
38. Способ по п.37, где измерение разнообразия последовательностей TCR включает этапы, на которых
(a) отбирают многообразие праймеров V сегмента, где каждый праймер V сегмента включает последовательность, которая комплементарна отдельному функциональному V сегменту или небольшому семейству V сегментов; и
(b) отбирают многообразие праймеров J сегмента, где каждый праймер J сегмента включает последовательность, которая комплементарна J сегменту;
(c) комбинируют праймеры V сегмента и J сегмента с образцом геномной ДНК для предоставления амплификации CDR3 участка TCR путем многократной полимеразной цепной реакции (PCR) с продуцированием многообразия амплифицированных молекул ДНК;
(d) секвенируют амплифицированные молекулы ДНК;
(e) рассчитывают общее разнообразие CDR3 последовательностей TCR среди амплифицированных молекул ДНК.
39. Способ по п.38, где сравнение разнообразия определяют расчетом с использованием следующего уравнения:
<mrow><mi>Δ</mi><mrow><mo>(</mo><mi>t</mi><mo>)</mo></mrow><mo>=</mo><mstyle displaystyle="true"><munder><mo>∑</mo><mi>x</mi></munder><mrow><mi>E</mi><msub><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><msub><mi>n</mi><mi>x</mi></msub></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mi>и</mi><mi>з</mi><mi>м</mi><mi>е</mi><mi>р</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mi>е</mi><mn>1</mn><mo>+</mo><mn>2</mn></mrow></msub></mrow></mstyle><mo>−</mo><mstyle displaystyle="true"><munder><mo>∑</mo><mi>x</mi></munder><mrow><mi>E</mi><msub><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><msub><mi>n</mi><mi>x</mi></msub></mrow><mo>)</mo></mrow></mrow><mrow><mi>и</mi><mi>з</mi><mi>м</mi><mi>е</mi><mi>р</mi><mi>е</mi><mi>н</mi><mi>и</mi><mi>е</mi><mn>2</mn></mrow></msub></mrow></mstyle><mo>=</mo><mi>S</mi><mstyle displaystyle="true"><mrow><munderover><mo>∫</mo><mn>0</mn><mi>∞</mi></munderover><mrow><msup><mi>e</mi><mrow><mo>−</mo><mi>λ</mi></mrow></msup><mrow><mo>(</mo><mrow><mn>1</mn><mo>−</mo><msup><mi>e</mi><mrow><mo>−</mo><mi>λ</mi><mi>t</mi></mrow></msup></mrow><mo>)</mo></mrow><mi>d</mi><mi>G</mi><mrow><mo>(</mo><mi>λ</mi><mo>)</mo></mrow></mrow></mrow></mstyle></mrow>
,
1
S
x
где G(λ) является эмпирической функцией распределения параметров λ, …, λ, n является числом клонотипов секвенированных строго x раз, и
<mrow><mi>E</mi><mrow><mo>(</mo><mrow><msub><mi>n</mi><mi>x</mi></msub></mrow><mo>)</mo></mrow><mo>=</mo><mi>S</mi><mstyle displaystyle="true"><mrow><munderover><mo>∫</mo><mn>0</mn><mi>∞</mi></munderover><mrow><mrow><mo>(</mo><mrow><mfrac><mrow><msup><mi>e</mi><mrow><mo>−</mo><mi>λ</mi></mrow></msup><msup><mi>λ</mi><mi>x</mi></msup></mrow><mrow><mi>x</mi><mo>!</mo></mrow></mfrac></mrow><mo>)</mo></mrow><mi>d</mi><mi>G</mi><mrow><mo>(</mo><mi>λ</mi><mo>)</mo></mrow></mrow></mrow></mstyle></mrow>
.
40. Способ по п.38, где сравнивают разнообразие по меньшей мере двух образцов геномной ДНК.
41. Способ по п.40, где один образец геномной ДНК является образцом от пациента, а другой образец - от нормального субъекта.
42. Способ по п.40, где один образец геномной ДНК является образцом от пациента перед терапевтическим курсом лечением, а другой образец - от пациента после курса лечения.
43. Способ по п.40, где два образца геномной ДНК являются образцами от одного и того же пациента в различные точки времени во время курса лечения.
44. Способ по п.40, при котором заболевание диагностируют на основе сравнения разнообразия среди образцов геномной ДНК.
45. Способ по п.40, где иммунокомпетентность пациента-человека оценивают путем сравнения.