Способ количественного определения суммы флавоноидов в почках дуба черешчатого
METHOD FOR QUANTIFYING THE AMOUNT OF FLAVONOIDS IN THE BUDS OF QUERCUS ROBUR

Данное изобретение создано в рамках направления развития химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в почках дуба черешчатого (Quercus robur L.).
В настоящее время актуальным направлением современной фармации является изучение химического состава растительных объектов. Одними из перспективных биологически активных соединений (БАС) являются флавоноиды, поскольку данная группа веществ обладает широким спектром фармакологической активности, что является значимым при создании новых лекарственных препаратов на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС).
С целью стандартизации биологически активных соединений (БАС) лекарственного растительного сырья необходимо разрабатывать новые и усовершенствовать имеющиеся методы количественного определения БАС как в сырье фармакопейном так и в перспективном малоизученном сырье, каким являются почки дуба черешчатого.
Quercus robur
Fagaceae
Изучение химического состава перспективных растительных объектов является важным направлением в современной фармации.  Дуб черешчатый ( L.) представитель семейства буковые () является фармакопейным растением, в качестве ЛРС которого применяется кора [1, 4, 6, 7]. Кора дуба содержит дубильные вещества (галловая, эллаговая кислоты), флавоноиды (кверцетин, кверцитрин, лейкоантоциандин), тритерпены (фриделин, фриделинол, 3-фриделанол) и ряд других ценных веществ [1, 3, 5, 9]. На данный момент проведено морфолого-анатомическое исследование почек дуба черешчатого, в ходе которого изучены их диагностические признаки, имеющие важное значение в процессе стандартизации сырья [2].
Почки дуба черешчатого являются источником БАС фенольной природы, а именно флавоноида – цинарозида. Однако в научной литературе, отсутствуют данные относительно вопросов количественного определения и стандартизации веществ флавоноидной природы в почках дуба черешчатого.
Также для почек дуба черешчатого на сегодня отсутствуют методики спектрофотометрического определения флавоноидов. Однако, опираясь на имеющиеся данные фармакопейных методик анализа БАС в коре дуба черешчатого, предполагается, что будет рациональным использовать спектрофотометрический метод определения суммы флавоноидов в почках дуба черешчатого в пересчете на цинарозид, как на представителя группы флавоноидов.
Прототипом данной методики стал способ количественного определения суммы флавоноидов в листьях тополя черного, недостатком которого является невозможность его применения к почкам дуба черешчатого [8, 10]. Поэтому, целью изобретения является разработка способа количественного определения суммы флавоноидов в почках дуба черешчатого.
Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в почках дуба черешчатого в пересчете нацинарозид.
Технический результат достигается тем, что получают водно-спиртовое извлечение из почек дуба черешчатого путем однократной экстракции в течение 120 минут 70% этиловым спиртом воздушно-сухого сырья точной навеской массой 1 г, измельченного до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм, в соотношении «сырье-экстрагент» 1:50; количественное определение суммы флавоноидов проводят методом дифференциальной спектрофотомерии при длине волны 400 нм в пересчете на стандартный образец (СО) цинарозид и содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле:
где:
x
– содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид, %;
D
– оптическая плотность испытуемого раствора;
D
o
– оптическая плотность раствора стандартного образца цинарозида;
m
– масса сырья, г;
m
о
– масса стандартного образца цинарозида, г;
W
– потеря в массе при высушивании, %;
в случае отсутствия стандартного образца цинарозида для расчета целесообразно использовать теоретическое значение его удельного показателя поглощения, равное 334:
где:
x
– содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид, %;
D
– оптическая плотность испытуемого раствора;
m
– масса сырья, г;
334
– удельный показатель поглощения (E) стандартного образца цинарозида при длине волны 400 нм;
W
– потеря в массе при высушивании, %.
При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именноцинарозид определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из почек дуба черешчатого. Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения почек дуба черешчатого наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов (Фиг. 1), как и в случае цинарозида (Фиг. 2), где кривая 1 на фигуре 1 и фигуре 2 демонстрирует исходный раствор водно-спиртового извлечения из почек дуба черешчатого или исходный раствор цинарозида соответственно, а кривая 2 – раствор водно-спиртового извлечения из почек дуба черешчатого в присутствии алюминия хлорида или раствор цинарозида в присутствии алюминия хлорида соответственно.
Изучение УФ-спектров (Фиг. 4), где кривая 1 – раствор цинарозида, а кривая 2 - раствор цинарозида с добавлением алюминия хлорида показало, что раствор СО цинарозида в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 400 нм. В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из почек дуба черешчатого в дифференциальном варианте на (Фиг. 3) так же обнаруживается при длине волны 400 нм максимум поглощения, который соответствует максимуму поглощения спиртового раствора цинарозида.
Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в почках дуба черешчатого при аналитической длине волны 400 нм.
Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. На (Фиг. 5) представлена зависимость выхода флавоноидов почек дуба черешчатого от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 70% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.
Далее нами был изучен вопрос относительно продолжительности экстракции на кипящей водяной бане, на (Фиг. 6) представлена зависимость выхода флавоноидов почек дуба черешчатого от времени экстракции на кипящей водяной бане, при этом было выбрано время экстракции 120 минут.
На (Фиг. 7) представлена зависимость выхода флавоноидов почек дуба черешчатого от соотношения «сырье-экстрагент». Из Фиг. 7 видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при соотношении «сырье-экстрагент» 1:50, по этой причине данное соотношение было выбрано нами в качестве оптимального.
На (Фиг.8) представлена зависимость выхода флавоноидов почек дуба черешчатого от степени измельчения почек. Из Фиг. 8 видно, что максимальный выход действующих веществ наблюдается при степени измельчения – 2 мм.
Учитывая, что увеличение числа операций на стадии пробоподготовки ведет к возрастанию ошибки, выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции с подтверждением требуемой точности количественного определения.
Таким образом, было определено, что оптимальными параметрами экстракции являются: однократное извлечение 70% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 120 минут в соотношении «сырье-экстрагент» – 1:50, оптимальная степень измельчения  – 2 мм.
Следует обратить внимание, что для почек дуба черешчатого цинарозид не является специфичным веществом, однако пересчет на него производился исходя из схожих максимумов поглощения раствора цинарозида и водно-спиртового извлечения поек дуба черешчатого находятся в области 400 нм и  характерного для цинарозида кратковолнового и длинноволнового спектров, целесообразным является определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид при длине волны 400 нм.
Способ реализуется следующим образом.
Методика количественного определения суммы флавоноидов в почках дуба черешчатого.Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 120 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса). Испытуемый раствор готовят следующим образом: 5 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор А). Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 400нм через 40 минут после приготовления. В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный следующим образом: 5 мл извлечения (1:50) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора спиртом этиловым 96% до метки.
Примечание:
Приготовление раствора стандартного образца - цинарозида.
Около 0,01 г (точная навеска) цинарозида помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А цинарозида). 2 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор Б цинарозида). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 400 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, который готовят следующим образом: 2 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (раствор сравнения Б цинарозида).
X
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье в процентах () вычисляют по формуле:
D
где  – оптическая плотность испытуемого раствора;
D
o
– оптическая плотность раствора СО цинарозида;
m
– масса сырья, г;
m
о
– масса СО цинарозида, г;
W
– потеря в массе при высушивании в процентах.
В случае отсутствия стандартного образца цинарозида целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения – 334.
D
где  – оптическая плотность испытуемого раствора;
m
– масса сырья, г;
334
– удельный показатель поглощения (E) СО цинарозида при 400 нм;
W
– потеря в массе при высушивании в процентах.
Значение удельного показателя поглощения (E) для СО цинарозида при 400 нм рассчитывалось экспериментально по формуле:
D
где  – оптическая плотность испытуемого раствора;
m
0
– масса СО цинарозида, г;
V
1
– Объем колбы 1, мл;
V
2
– Объем колбы 2, мл;
q
– Объем аликвоты, мл;
Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.
Пример 1.
Аналитическую пробу сырья почек дуба черешчатого (заготовлено в Самарской области, Похвистневский район, с. Первомайск, июль-август 2020 г.) измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 120 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса). Испытуемый раствор готовят следующим образом: 5 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (испытуемый раствор А). Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 400нм через 40 минут после приготовления. В качестве раствора сравнения используют раствор, полученный следующим образом: 5 мл извлечения (1:50) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора спиртом этиловым 96% до метки.
Для расчета содержания суммы флавоноидов готовят раствор стандартного образца цинарозида, добавляют к нему 3% спиртовой раствор хлорида алюминия, измеряют оптическую плотность окрашенного комплекса при длине волны 400 нм и определенное значение оптической плотности используют в формуле расчета.
Приготовление раствора стандартного образца цинарозида.
Около 0,01 г (точная навеска) цинарозида помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 30 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А цинарозида). 2 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 1 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор Б цинарозида). Измеряют оптическую плотность раствора Б на спектрофотометре при длине волны 400 нм. В качестве раствора сравнения используют раствор, который готовят следующим образом: 2 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96% (раствор сравнения Б цинарозида).
X
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье в процентах () вычисляют по формуле:
D
где  – оптическая плотность испытуемого раствора;
D
o
– оптическая плотность раствора СО цинарозида;
m
– масса сырья, г;
m
о
– масса СО цинарозида, г;
W
– потеря в массе при высушивании в процентах.
В случае отсутствия стандартного образца цинарозида целесообразно использовать теоретическое значение удельного показателя поглощения – 334.
D
где  – оптическая плотность испытуемого раствора;
m
– масса сырья, г;
334
– удельный показатель поглощения (E) СО цинарозида при 400 нм;
W
– потеря в массе при высушивании в процентах.
Значение удельного показателя поглощения (E) для СО цинарозида при 400 нм рассчитывалось экспериментально по формуле:
D
где  – оптическая плотность испытуемого раствора;
m
0
– масса СО цинарозида, г;
V
1
– Объем колбы 1, мл;
V
2
– Объем колбы 2, мл;
q
– Объем аликвоты, мл;
±
Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид x=0,23%, что сравнимо со значением, полученном в примере 1 в пределах погрешности (0,0118).
Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±4,98%.
Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид в почках дуба черешчатого с использованием дифференциальной спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:
1. Разработанный метод разработан впервые, является специфичным и селективным и позволяет определять сумму флавоноидов в почках дуба черешчатого в пересчете на цинарозид, что обеспечивается проведением однократной экстракции сырья 70% этиловым спиртом, что способствует максимально извлекать целевые вещества (флавоноиды) из почек дуба.
2. Пересчет суммы флавоноидов идет на специфическое для почек дуба черешчатого вещество флавоноидной природы – цинарозид, определяющее характер кривой поглощения в УФ – спектре испытуемого раствора (длина волны 400 нм)
3. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±4,98%, что свидетельствует об объективности разработанного способа.
Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа почек дуба черешчатого.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:
Quercus robur
Quercus petraea
Quercus pubescens
1. Assessment report on  L.,  (Matt.) Liebl.,  Willd., cortex EMA/HMPC/3206/2009.
Quercus robur
2. Ryabov NA, Ryzhov VM, Tarasenko LV, Sokhina AA. Anatomical and morphological study of the buds of the English oak  L. Pharmaceutical botany: modernity and prospects: Collection of materials. FSBEI HE Samara State Medical University of the Ministry of Health of Russia; Edited by V.A. Kurkin. Samara. 2017; 149-158 (In Russ.).
Actinidiaceae-Malvaceae, Euphorbiaceae-Haloragaceae.
3. Буданцев А.Л., Растительные ресурсы России: Дикорастущие цветковые растения, их компонентный состав и биологическая активность. Том. 1. Семейства  / отв. ред. А.В. Буданцев. СПб.; М., Товарищество научных изданий КМК, 2009. 158 с.
4. Губанов И.А., Киселёва К.В., Новиков В.С., Тихомиров В.Н., Иллюстрированный определитель растений Средней России. Т.-2: Покрытосеменные (двудольные: раздельнолепестные). М.: Т-во научных изданий КМК, Ин-т технологических исследований. – 2003. – С. 34.
Quercus cortex
5. ГФ РФ XIV издания / ФС.2.5.0071.18 Дуба кора . –М.: Минздрав РФ. – 2018. – С. 6029-6033.
6. Кароматов И.Д., Махмудова Г.Ф.К. Дуб обыкновенный - применение в лечебной практике // Биология и интегративная медицина. - 2016. - № 3. - С. 41-47.
7. Киселева Т.Л., Смирнова Ю.А. Лекарственные растения в мировой медицинской практике: государственное регулирование номенклатуры и качества. – М.: Издательство профессиональной ассоциации натуротерапевтов. – 2009. - С. 183-184.
8. Куприянова Е.А., Куркин В.А. Разработка подходов к стандартизации листьев тополя черного // Аспирантский вестник Поволжья. – 2018. – № 5-6. – С. 17-21. doi:10.17816/2072-2354.2018.18.3.17-21
9. Куркин В.А. Фармакогнозия: Учебник для студентов фармацевтических вузов (факультетов) / В.А. Куркин. – 4-е, перераб. и доп. – Самара : ООО «Офорт», ФГБОУ ВО СамГМУ Минздрава России, 2019. – 966-969 с.
10. Патент РФ № 2701726 01.10.2019. Способ количественного определения суммы фдавоноидов в листьях тополя черного.