ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ИЛИ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОСТЕОАРТРИТА
THERAPEUTIC OR PREVENTIVE DRUG FOR TREATING OSTEOARTHRITIS

Область техники, к которой относится изобретение
[0001]
Настоящее изобретение относится к терапевтическому или профилактическому средству для лечения остеоартрита и артрита (синовита), возникшего в результате остеоартрита, содержащему анти-Fas IgM антитело в качестве активного ингредиента.
Предпосылки создания изобретения
[0002]
Остеоартрит является заболеванием, вызванным старением или механическим стрессом, приводящим к разрушению поверхности суставного хряща и к пролиферации нового периферийного хряща, связанной с таким разрушением, к суставной деформации и разрушению суставной конформации, а также к дальнейшему прогрессированию артросиновита. С другой стороны, ревматоидный артрит, типичная артропатия, обусловленный иммунными нарушениями или инфекцией, вызывает инфильтрацию воспалительных клеток в синовиальную оболочку, усиливает пролиферацию синовиального фибропласта, связанную с васкуляризацией, способствует разрушению костной или хрящевой ткани и приводит к необратимому повреждению сустава. Таким образом, ревматоидный артрит является аутоиммунным заболеванием, называемым воспалительным заболеванием, в то время как остеоартрит называется невоспалительным заболеванием. Таким образом, терапевтические средства, используемые при лечении ревматоидного артрита, в целом рассматриваются как не оказывающие лечебный эффект на остеоартрит.
[0003]
Для целей лечения ревматоидного артрита были разработаны с использованием стандартных способов различные фармацевтические композиции. Одним примером таких фармацевтических композиций является анти-Fas антитело (Kokai (нерассмотренная патентная заявка) No. 2004-59582 (см. Патентный документ 1)). Однако, по имеющейся информации анти-Fas антитело оказывает апоптоз-индуцирующее действие на синовиальные клетки, взятые у пациента с ревматоидным артритом, но оно не оказывает апоптоз-индуцирующего действия на синовиальные клетки, взятые у пациента с остеоартритом (NAKAJIMA et al., "APOPTOSIS AND FUNCTIONAL FAS АНТИГЕН IN RHEUMATOID ARTHRITIS ASYNOVICYTES", ARTHRITIS & RHEUMATISM, 38 (4), 1995, P.485-P.491 (см. Непатентный документ 1)).
[0004]
С другой стороны, нестероидные противовоспалительные препараты (NSAIDs), обладающие противовоспалительным и анальгезирующим действием, использовались при лечении остеоартрита. Кроме того, применялись такие методы терапии, как удаление синовиальной жидкости с помощью шприца и т.д., либо инъецирование адреналового кортикостероида или веществ, обеспечивающих защиту суставного хряща, таких как хондроитин сульфат натрия или гиалуроновая кислота (НА).
[0005]
Кроме того, в качестве терапевтических средств для лечения остеоартрита использовали ингибитор р21-активированной киназы (РАК) (Kohyo (национальная публикация переведенного варианта) No. 2007-537134 (см. Патентный документ 2)), являющийся сигнальным ингибитором, либо фармацевтические композиции, содержащие антисмысловой полинуклеотид, рибозим, низкомолекулярную интерференционную РНК и т.д. (Kohyo (национальная публикация переведенного варианта) No. 2008-516593 (см. Патентный документ 3)). Тем не менее, до сих пор не был достигнут достаточно высокий эффект.
[0006]
Кроме того, в процессе ведущейся в настоящее время работы по созданию терапевтических средств для лечения были разработаны терапевтические средства, воздействие которых направлено на стимуляторы регенерации хряща, такие как интерлейкин (IL)-1, либо предпринимались попытки применить индуцирующие восстановление или регенерацию хряща факторы к лекарственным препаратам. Тем не менее, до сих пор не был достигнут достаточно высокий эффект. Предшествующий уровень техники Патентные документы
[0007]
Патентный документ 1: Kokai (нерассмотренная патентная заявка) No. 2004-59582
Патентный документ 2: Kohyo (национальная публикация переведенного варианта) No. 2007-537134
Патентный документ 3: Kohyo (национальная публикация переведенного варианта) No. 2008-516593
Патентный документ 4: Kokai (нерассмотренная патентная заявка) No. Н8-40897
Патентный документ 5: Kokai (нерассмотренная патентная заявка) No. 2006-151843
Патентный документ 6: Kokai (нерассмотренная патентная заявка) No. 2007-51077
Непатентные документы
[0008]
Непатентный документ 1: NAKAJIMA et al., "APOPTOSIS AND FUNCTIONAL FAS АНТИГЕН IN RHEUMATOID ARTHRITIS ASYNOVICYTES", ARTHRITIS & RHEUMATISM, 38(4), 1995, p.485-p.491
Непатентный документ 2: ARTHRITIS ARHEUM, 2001, VOL. 44, No. 8, pp.1800-1807
Описание изобретения
Проблемы, решаемые настоящим изобретением
[0009]
Цель настоящего изобретения заключается в создании терапевтических средств или профилактических средств для лечения остеоартрита и артрита (синовита), возникшего в результате остеоартрита. Дополнительная цель настоящего изобретения заключается в создании ингибирующего средства, препятствующего дегенерации хрящевого матрикса, средства, стимулирующего синтез хрящевого матрикса, и индуцирующего апоптоз средства против макрофагов, вызванных остеоартритом.
Способы решения проблем
[0010]
Настоящее изобретение основано на знании того, что применение анти-Fas IgM антитела способно препятствовать дегенерации хряща при остеоартрите. В частности, настоящее изобретение основано на знании того, что применение анти-Fas IgM антитела способно препятствовать выработке фермента, разрушающего хрящевой матрикс. Более того, настоящее изобретение основано на знании того, что применение анти-Fas IgM антитела позволяет усилить выработку хрящевого матрикса. Кроме того, настоящее изобретение основано на знании того, обеспечивается стимулирование апоптоза макрофага, индуцированного остеоартритом. Информация о том, что анти-Fas IgM антитело может быть применено при остеоартрите, является впервые приобретенной информацией на данный момент.
[0011]
Первая особенность настоящего изобретения относится к терапевтическому средству или профилактическому средству для лечения или профилактики заболевания, классифицируемого по стадиям от ранней стадии до поздней стадии остеоартрита, содержащему анти-Fas IgM антитело в качестве активного ингредиента. Каждая стадия - от начальной стадии до поздней стадии остеоартрита - классифицируется в соответствии с классификацией Международного общества восстановления хрящевой ткани, классификацией Kellgren-Lawrence, классификацией Outerbridg, либо в соответствии с баллами остеоартрита по модифицированной шкале Манкина. При классификации от начальной стадии до поздней стадии остеоартрита в соответствии с вышеприведенной классификацией заболевания согласно настоящего изобретения включают: (1) заболевания, классифицируемые на 1-3 степени поражения хряща по классификации остеоартрита Международного общества восстановления хрящевой ткани; (2) заболевания, классифицируемые на 1-3 степени поражения хряща по классификации остеоартрита Kellgren-Lawrence; (3) заболевания, классифицируемые на 1-3 степени поражения хряща по классификации остеоартрита Аутебриджа; или (4) заболевания, классифицируемые на 1-7 степени поражения хряща в соответствии с баллами остеоартрита по модифицированной шкале Манкина.
[0012]
При остеоартрите заболевания, классифицируемые на любые из вышеуказанных степеней поражения хряща или по баллам, сопровождаются дегенерацией хряща как состоянием заболевания. Как указывалось выше, IgM антитело в соответствии с настоящим изобретением способно препятствовать дегенерации хряща. Таким образом, средство в соответствии с настоящим изобретением, содержащее анти-Fas IgM антитело в качестве активного ингредиента, может быть использовано для эффективного лечения или профилактики заболеваний, сопровождаемых дегенерацией хряща, т.е. средство в соответствии с настоящим изобретением может быть использовано для эффективного лечения или профилактики заболеваний, классифицируемых по стадиям от ранней стадии до поздней стадии остеоартрита.
[0013]
Более того, анти-Fas IgM антитело способно препятствовать выработке матриксной металлопротеиназы-1 и матриксной металлопротеиназы-3, которые являются медиаторами дегенерацией хряща, как показано в приведенных ниже примерах. Матриксная металлопротеиназа представляет собой один из видов ферментов, разрушающих хрящевой матрикс. Разложение суставной хрящевой ткани ферментом, разрушающим хрящевой матрикс, может явиться причиной возникновения остеоартрита или ухудшения состояния остеоартрита. Таким образом, ввиду того, что анти-Fas IgM антитело способно препятствовать выработке матриксной металлопротеиназы, оно может быть предпочтительно использовано в качестве терапевтического средства или профилактического средства для лечения заболеваний, сопровождаемых остеоартритом. Более того, как показано в приведенных ниже примерах, анти-Fas IgM антитело способно усиливать синтез протеогликана хрящевого матрикса. При остеоартрите причиной выработки матриксной металлопротеиназы также может являться разрушение суставного хряща. Усиление синтеза хрящевых матриксов позволяет восстанавливать разрушенный суставной хрящ. Таким образом, средство в соответствии с настоящим изобретением может быть использовано для эффективного лечения или профилактики заболеваний, классифицируемых по стадиям от ранней стадии до поздней стадии остеоартрита, т.е., настоящее изобретение также предусматривает создание средства, ингибирующего разрушение суставного хряща, содержащего анти-Fas IgM антитело в качестве активного ингредиента.
[0014]
Предпочтительным вариантом в соответствии с первой особенностью настоящего изобретения является указанное выше средство, в котором анти-Fas антитело является антителом против пептида, состоящего из аминокислотной последовательности, являющейся аналогичной внеклеточному домену (аминокислотная последовательность, представленная в аминокислотах 26-173 SEQ ID NO: 1), либо из аминокислотной последовательности, в которой ее один аминокислотный остаток заменен, исключен, добавлен или введен.
[0015]
Предпочтительным вариантом в соответствии с первой особенностью настоящего изобретения является указанное выше средство, в котором анти-Fas IgM антитело является СН11 или 7С11. Как показано в нижеприведенных примерах, СН11 или С711 способны эффективно препятствовать выработке матриксной металлопротеиназы-1 и матриксной металлопротеиназы-3. Кроме того, СН11 способен усилить синтез протеогликана хрящевого матрикса. Таким образом, средство в соответствии с настоящим изобретением может быть использовано для эффективного лечения или профилактики заболеваний, классифицированных по стадиям от ранней стадии до поздней стадии остеоартрита, сопровождаемого дегенерацией хряща.
[0016]
Вторая особенность настоящего изобретения относится к терапевтическому средству или профилактическому средству для лечения артрита (синовита), возникшего в результате остеоартрита, содержащему анти-Fas IgM антитело в качестве активного ингредиента. Как показано в нижеприведенных примерах, анти-Fas IgM антитело способно препятствовать выработке воспалительных цитокинов макрофагами. Более того, анти-Fas IgM антитело способно препятствовать выработке матриксной металлопротеиназы-1 и матриксной металлопротеиназы-3, вовлеченных в иммунный ответ. Таким образом, средство, относящееся ко второй особенности настоящего изобретения, может являться приемлемым для применения в качестве терапевтического средства или профилактического средства для лечения артрита, вызванного остеоартритом.
[0017]
Предпочтительным вариантом в соответствии со второй особенностью настоящего изобретения является указанное выше средство, в котором анти-Fas антитело является антителом против пептида, состоящего из аминокислотной последовательности, являющейся аналогичной внеклеточному домену (аминокислотная последовательность, представленная в аминокислотах 26-173 SEQ ID NO: 1), либо из аминокислотной последовательности, в которой ее один аминокислотный остаток заменен, исключен, добавлен или введен.
[0018]
Предпочтительным вариантом в соответствии со второй особенностью настоящего изобретения является указанное выше средство, в котором анти-Fas IgM антитело является СН11 или 7С11. Как показано в нижеприведенных примерах, СН11 или С711 способны эффективно препятствовать выработке воспалительных цитокинов микрофагом. Кроме того, СН11 или С711 препятствуют выработке матриксной металлопротеиназы-1 и матриксной металлопротеиназы-3, вовлеченных в иммунный ответ. Таким образом, средство может быть приемлемым образом использовано в качестве терапевтического средства или профилактического средства для лечения артрита, вызванного остеоартритом.
[0019]
Третьей особенностью настоящего изобретения является ингибирующее средство, препятствующее выработке фермента, разрушающего хрящевой матрикс, и содержащее анти-Fas IgM антитело в качестве активного ингредиента. Как показано в нижеприведенных примерах, анти-Fas IgM антитело предпочтительно является СН11 или 7С11. Как продемонстрировано в примерах, анти-Fas IgM антитело в соответствии с настоящим изобретением способно эффективно препятствовать выработке фермента, разрушающего хрящевой матрикс. Таким образом, средство в соответствии с настоящим изобретением может быть приемлемым образом использовано в качестве ингибирующего средства, препятствующего выработке фермента, разрушающего хрящевой матрикс.
[0020]
Четвертой особенностью настоящего изобретения является средство для выработки хрящевого матрикса, содержащее анти-Fas IgM антитело в качестве активного ингредиента. Как показано в примере ниже, анти-Fas IgM (антитело) предпочтительно является СН11. Как продемонстрировано в примерах, анти-Fas IgM антитело в соответствии с настоящим изобретением позволяет усилить восстановление хрящевого матрикса (протеогликана). Таким образом, средство в соответствии с настоящим изобретением может быть приемлемым образом использовано в качестве средства для выработки хрящевого матрикса.
[0021]
Пятой особенностью настоящего изобретения является индуцирующее апоптоз средство, препятствующее макрофагу, вызванному остеоартритом, и содержащее анти-Fas IgM антитело в качестве активного ингредиента. Как показано в примере, приведенном ниже, анти-Fas IgM антитело предпочтительно является СН11 или 7С11. Как продемонстрировано в примерах, анти-Fas IgM антитело в соответствии с настоящим изобретением способно индуцировать апоптоз макрофага, вызванного остеоартритом. Таким образом, средство в соответствии с настоящим изобретением может быть приемлемым образом использовано в качестве индуцирующего апоптоз средства, препятствующего макрофагу, индуцированному остеоартритом.
Эффект изобретения
[0022]
В соответствии с настоящим изобретением целью настоящего изобретения является создание терапевтического средства и профилактического средства для лечения остеоартрита и артрита (синовита), вызванного остеоартритом. Кроме того, дополнительной целью настоящего изобретения является создание ингибирующего средства, препятствующего дегенерации хрящевого матрикса, средства, стимулирующего синтез хрящевого матрикса, и индуцирующего апоптоз средства против макрофагов, вызванных остеоартритом.
Краткое описание чертежей
[0023]
На Фиг.1 представлены изображения патологических состояний суставного хряща по каждой степени поражения в соответствии с классификацией Международного общества восстановления хрящевой ткани.
Фиг.1А - хрящ в нормальном состоянии со степенью поражения 0.
Фиг.1В - хрящ в состоянии, при котором в поверхности хряща имеется небольшая складчатость с 1-й степенью поражения.
Фиг.1C - хрящ в состоянии, при котором на поверхности хряща образуются трещины с 1-й степенью поражения.
Фиг.1D - хрящ в состоянии, при котором дефект хряща достиг глубины приблизительно 50% хрящевой ткани со 2-й степенью поражения.
Фиг.1E - хрящ в состоянии, при котором глубина дефекта хряща достигла 50% или более хрящевой ткани с 3-й степенью поражения.
Фиг.1F - хрящ в состоянии, при котором дефект достиг кальцифицированного слоя с 3-й степенью поражения.
Фиг.1Н - хрящ в состоянии, при котором возникло опухание с 3-й степенью поражения.
Фиг.I и Фиг.J - хрящ в состоянии, при котором патологическое нарушение достигло субхондральной кости с 4-й степенью поражения.
На Фиг.2 представлены диаграммы, на которых проиллюстрировано, каким образом анти-Fas IgM антитело влияет на способность хрящевых клеток вырабатывать матриксную металлопротеиназу.
На Фиг.2А представлена диаграмма, на которой проиллюстрировано, каким образом анти-Fas IgM антитело влияет на способность хрящевых клеток вырабатывать матриксную металлопротеиназу-1.
На Фиг.2В представлена диаграмма, на которой проиллюстрировано, каким образом анти-Fas IgM антитело влияет на способность хрящевых клеток вырабатывать матриксную металлопротеиназу-3.
На Фиг.3 представлена диаграмма, на которой проиллюстрировано влияние анти-Fas IgM антитела на снижение способности выработки хрящевого матрикса (протеогликана).
На Фиг.4 представлена диаграмма, на которой проиллюстрирован эффект супрессии апоптоза анти-Fas IgM антитела.
На Фиг.5 представлены диаграммы, на которых проиллюстрировано, каким образом анти-Fas IgM антитело или анти-Fas IgG антитело влияет на способность хрящевых клеток вырабатывать матриксную металлопротеиназу.
На Фиг.5А представлена диаграмма, на которой проиллюстрировано, каким образом анти-Fas IgM антитело или анти-Fas IgG антитело влияет на способность хрящевых клеток вырабатывать матриксную металлопротеиназу-1.
На Фиг.5В представлена диаграмма, на которой проиллюстрировано, каким образом анти-Fas IgM антитело или анти-Fas IgG антитело влияет на способность хрящевых клеток вырабатывать матриксную металлопротеиназу-3.
На Фиг.6 представлена диаграмма, на которой проиллюстрирован эффект супрессии апоптоза анти-Fas IgM антитела или анти-Fas IgG антитела.
На Фиг.7 представлены графики, на которых представлена шкала оценки патологической ткани модели остеоартрита у крысы.
Фиг.7А - результат окрашивания сафранином О.
Фиг.7В - результат дефекта хрящевых клеток.
Фиг.7С - результат хрящевой структуры.
Фиг.8 - снимки, на которых представлены гистопатологические образцы, взятые у крыс с моделью остеоартрита через 12 недель после проведения лечения.
Фиг.8А-8F - снимки, на которых представлены гистопатологические образцы, взятые у крыс с моделью остеоартрита в контрольной группе.
Фиг.8G-8J - снимки, на которых представлены гистопатологические образцы, взятые у крыс с моделью остеоартрита в группе крыс, которым вводились низкие дозы СН-11 (СН-11: доза - 1,0 нг/мл).
Фиг.8К-8N - снимки, на которых представлены гистопатологические образцы, взятые у крыс с моделью остеоартрита в группе крыс, которым вводились высокие дозы СН-11 (СН-11: доза - 10,0 нг/мл).
Фиг.8O - снимок, на котором представлен гистопатологический образец, взятый у крыс с моделью остеоартрита в контрольной группе.
Фиг.8Р - снимок, на котором представлен гистопатологический образец, взятый у крыс с моделью остеоартрита в группе крыс, которым вводились низкие дозы СН-11 (СН-11: доза - 1,0 нг/мл).
Фиг.9 - снимки, на которых представлены гистопатологические образцы, взятые у крыс с моделью остеоартрита, через 24 недели после проведения лечения.
Фиг.9А-9Н - снимки, на которых представлены гистопатологические образцы, взятые у крыс с моделью остеоартрита в контрольной группе.
Фиг.91-9L - снимки, на которых представлены гистопатологические образцы, взятые у крыс с моделью остеоартрита в группе крыс, которым вводились низкие дозы СН-11 (СН-11: доза - 1,0 нг/мл).
Фиг.9М-9Р - снимки, на которых представлены гистопатологические образцы, взятые у крыс с моделью остеоартрита в группе крыс, которым вводились высокие дозы СН-11 (СН-11: доза - 10,0 нг/мл).
Фиг.9В, Фиг.9D, Фиг.9F, Фиг.9Н, Фиг.91, Фиг.9К, Фиг.9М и Фиг.9O - увеличенные снимки частей, окруженных квадратом, на Фиг.9А, Фиг.9С, Фиг.9Е, Фиг.9G, Фиг.9J, Фиг.9L, Фиг.9N и Фиг.9Р, соответственно.
Лучший вариант осуществления изобретения
[0024]
Ниже приведено описание настоящего изобретения. Первая особенность настоящего изобретения относится к терапевтическому средству или профилактическому средству для лечения или профилактики заболевания, классифицируемого по стадиям от ранней стадии до поздней стадии остеоартрита, содержащему анти-Fas IgM антитело в качестве активного ингредиента. Остеоартрит является заболеванием, развивающимся в межфаланговом суставе, первом пястно-запястном суставе, межпозвоночном диске позвоночника или поясничном отделе позвоночника, первом плюсне-фаланговом суставе, тазобедренном суставе и коленном суставе. Лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением может быть использовано для лечения указанных суставов. Кроме этого, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно используется для восстановления тазобедренного сустава, коленного сустава и хрящевой ткани коленного сустава.
[0025]
Заболевания, которые предусматривается лечить с использованием лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением, являются заболеваниями, классифицируемыми на стадии от начальной стадии до поздней стадии остеоартрита, сопровождаемого дегенерацией хряща. Стадии остеоартрита классифицируются в соответствии с классификацией, приведенной в таблицах 1-4 ниже, с учетом патологического состояния. Ниже будет приведено описание стадий остеоартрита с использованием стандартов стадий, приведенных в таблицах 1-4 ниже.
[0026]
В таблице 1 приведена классификация (также ниже по тексту называемая классификацией дефектов хряща при остеоартрите Международного общества восстановления хрящевой ткани).
[Таблица 1]
Классификация Международного общества восстановления хрящевой ткани
0-я степень поражения
Нормальная хрящевая ткань
1-я степень поражения
Практически нормальная хрящевая ткань Патологические изменения в хрящевом покрытии Небольшая складчатость Трещины в хрящевом покрытии
2-я степень поражения
Патологические изменения Патологические изменения с дефектом хрящевого покрытия на глубину до 50%
3-я степень поражения
Серьезные патологические изменения Дефектом хрящевого покрытия на глубину 50% или более Дальнейшее развитие дефекта до кальцифицированного слоя, но не затрагивающего субхондральную кость, а также возникновение опухания
4-я степень поражения
Серьезные патологические изменения Патологические изменения с глубиной дефекта до субхондральной кости
[0027]
В соответствии с классификацией Международного общества восстановления хрящевой ткани остеоартрит классифицируется по степеням поражения 0-4. В соответствии с классификацией Международного общества восстановления хрящевой ткани 0-я степень поражения является стадией, на которой не наблюдается развитие остеоартрита. 1-я степень поражения является начальной стадией развития остеоартрита. 2-3-я степени поражения являются поздними стадиями развития остеоартрита. 4-я степень поражения является последней стадией развития остеоартрита. Как указывалось выше, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением предназначено для лечения заболеваний, классифицируемых от начальной до поздней стадии остеоартрита, то есть, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением предназначено для лечения заболеваний, классифицируемых по любой из степеней поражения от 1-й до 3-й степени поражения в соответствии с классификацией остеоартрита Международного общества восстановления хрящевой ткани.
[0028]
Состояния хряща в соответствии с каждой степенью поражения по классификации остеоартрита Международного общества восстановления хрящевой ткани представлены на Фиг.1. Хрящ имеет слоистую структуру, состоящую из поверхностного слоя, внутреннего слоя, глубокого слоя и кальцифицированного слоя (Фиг.1А). Кроме того, хрящ соединен с костью (субхондральная кость) через кальцифицированный слой. На Фиг.1А проиллюстрирован хрящ в нормальном состоянии с 0-й степенью поражения. На Фиг.1В представлен хрящ в состоянии, при котором на его поверхности имеется небольшая складчатость при 1-й степени поражения. На Фиг.1C проиллюстрирован хрящ в состоянии, при котором в хрящевом покрытии имеются трещины при 1-й степени поражения. На Фиг.ID проиллюстрирован хрящ в состоянии, при котором дефект хряща достиг глубины до 50% хряща при 2-й степени поражения. На Фиг.1Е проиллюстрирован хрящ в состоянии, при котором глубина дефекта хряща достигла 50% или более при 3-й степени поражения. На Фиг.1F проиллюстрирован хрящ в состоянии, при котором глубина дефекта хряща достигла кальцифицированного слоя при 3-й степени поражения. На Фиг.1Н проиллюстрирован хрящ в состоянии, при котором возникает опухание при 3-й степени поражения. На Фиг.I и Фиг.1Н проиллюстрирован хрящ в состоянии, при котором патологические нарушения достигли субхондральной кости при 4-й степени поражения. Как указывалось выше, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением предназначено для лечения и профилактики дегенерации хряща. Как продемонстрировано в примерах, приведенных ниже, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением обеспечивает лечение патологических состояний остеоартрита, соответствующих 1-3-м степеням поражения (от начальной стадии до поздней стадии остеоартрита) в соответствии с классификацией дефектов хряща Международного общество восстановления хрящевой ткани. Таким образом, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением может быть использовано для лечения или профилактики заболеваний, классифицируемых от начальной до поздней стадии остеоартрита.
[0029]
В таблице 2 приведена классификация Kellgren-Lawrence (далее по тексту называемая «классификация KL») степеней поражения остеоартритом.
[Таблица 2]
Классификация Kellgren-Lawrence
0-я степень поражения
Без патологии (отсутствие костных шпор, отсутствие суженного суставного пространства)
1-я степень поражения
Подозрение на формирование микроскопических костных шпор отсутствие суженного суставного пространства
2-я степень поражения
Легкая форма остеоартрита Формирование микроскопических костных шпор Суженное суставное пространство (более 1/2 от оставшегося суставного пространства)
3-я степень поражения
Остеоартрит средней тяжести Формирование костных шпор Суженное суставное пространство (более 1/2 от оставшегося суставного пространства)
4-я степень поражения
Тяжелая форма остеоартрита Формирование крупных костных шпор Существенно суженное суставное пространство (частичное отсутствие суставного пространства)
[0030]
В соответствии с классификацией KL остеоартрит классифицируется на 0-4 степени поражения. В соответствии с классификацией KL 0-я степень поражения является стадией, на которой не наблюдается развитие остеоартрита. 1-я степень поражения является начальной стадией развития остеоартрита. 2-3-я степени поражения являются поздними стадиями развития остеоартрита. 4-я степень поражения является последней стадией развития остеоартрита. В соответствии с классификацией KL сужение суставного пространства обусловлено дегенерацией хряща, такой как гибель хрящевых клеток. Как указывалось выше, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением предназначено для лечения заболеваний, классифицируемых от начальной до поздней стадии остеоартрита, т.е., лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением предназначено для лечения заболеваний, классифицируемых по любой из 1-3-й степеней поражения по классификации KL остеоартрита. В таблице 2 степени поражения от 0-4 по классификации KL эквиваленты степеням поражения 0-4, соответственно, по классификации Международного общества восстановления хрящевой ткани.
[0031]
В таблице 3 приведена классификация Аутебриджа (далее по тексту называемая «классификация OB») остеоартрита.
[Таблица 3]
классификация Аутебриджа
0-я степень поражения
Отсутствие патологии
1-я степень поражения
Размягчение и складчатость хряща
2-я степень поражения
Трещина части поверхностного слоя, не достигающая субхондральной кости или имеющая диаметр приблизительно 1,5 см
3-я степень поражения
Трещина с диаметром более 1,5 см, достигающая субхондральной кости
4-я степень поражения
Обнажение субхондральной кости
[0032]
В соответствии с классификацией OB остеоартрит классифицируется на 0-4 степени поражения. В соответствии с классификацией OB 0-я степень поражения является стадией, на которой не наблюдается развитие остеоартрита. 1-я степень поражения является начальной стадией развития остеоартрита. 2-3-я степени поражения являются поздними стадиями развития остеоартрита. 4-я степень поражения является последней стадией развития остеоартрита. В соответствии с классификацией OB сужение суставного пространства обусловлено дегенерацией хряща, такой как гибель хрящевых клеток. Как указывалось выше, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением предназначено для лечения заболеваний, классифицируемых от начальной до поздней стадии остеоартрита, т.е., лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением предназначено для лечения заболеваний, классифицируемых по любой из 1-3-й степеней поражения по классификации OB остеоартрита. В таблице 2 степени поражения от 0-4 по классификации KL эквиваленты степеням поражения 0-4, соответственно, по классификации OB.
[0033]
В таблице 4 представлена классификация остеоартрита по модифицированной шкале Mankin.
[Таблица 4]
Модифицированная шкала Mankin
Окрашивание прочным зеленым сафранином O
0 баллов
Однородное повсеместное окрашивание хрящевого сустава
1 балл
Изменение окрашивания в поверхностном слое приблизительно менее 1/2 верхней суставной поверхности
2 балла
Изменение окрашивания в поверхностном слое приблизительно более 1/2 верхней суставной поверхности
3 балла
Изменение окрашивания в поверхностном слое и внутреннем слое приблизительно менее 1/2 верхней суставной поверхности
4 балла
Изменение окрашивания в поверхностном слое и внутреннем слое приблизительно более 1/2 верхней суставной поверхности
5 баллов
Изменение окрашивания во всех трех слоях приблизительно менее 1/2 верхней суставной поверхности
6 баллов
Изменение окрашивания во всех трех слоях приблизительно более 1/2 верхней суставной поверхности
Дефект хрящевых клеток
0 баллов
Не наблюдается сокращения количества клеток
1 балл
Незначительное сокращение количества клеток
2 балла
Умеренное сокращение количества клеток
3 балла
Существенное сокращение количества клеток
4 балла
Сокращение практически всех клеток
Структура
0 баллов
Без патологии
1 балл
Патология в поверхностном слое
2 балла
1-3 поверхностных трещины
3 балла
Более 4-х поверхностных трещин
4 балла
Углубление 1-3-х трещин до внутреннего слоя
5 баллов
Углубление более 4-х трещин до внутреннего слоя
6 баллов
Углубление 1-3-х трещин до глубокого слоя
7 баллов
Углубление более 4-х трещин до глубокого слоя
8 баллов
Углубление трещины (трещин) до кальцифицированного слоя
[0034]
При окрашивании прочным зеленым сафранином О по модифицированной шкале Mankin остеоартрит классифицируется в зависимости от степени окрашивания в момент окрашивания суставной хрящевой ткани. При наличии дефектов хрящевых клеток остеоартрит классифицируется в зависимости от окрашенной хрящевой клеточной массы. И по структуре остеоартрит классифицируется в зависимости от степени поврежденности трещиной (трещинами), возникающими в суставном хряще. На Фиг.4 баллы 1-3 указывают на начальные стадии остеоартрита соответствующей 1-й степени поражения по классификации Международного общества восстановления хрящевой ткани. Балы 4-5 указывают на поздние стадии остеоартрита, соответствующие 2-й степени поражения по классификации Международного общества восстановления хрящевой ткани. Баллы 6-8 также указывают на поздние стадии остеоартрита, соответствующие 3-й степени поражения по классификации Международного общества восстановления хрящевой ткани. Как указывалось выше, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением предназначено для лечения заболеваний, классифицируемых от начальной до поздней стадии остеоартрита, то есть, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением предназначено для лечения заболеваний, классифицируемых в соответствии с любым из баллов от 1-7 по классификации остеоартрита в соответствии с модифицированной шкалой Mankin.
[0035]
Как продемонстрировано в примерах, приведенных ниже, анти-Fas IgM антитело способно подавлять состояние (дегенерацию хряща) остеоартрита при 2-7 баллах по модифицированной шкале Mankin. Кроме того, как продемонстрировано в примерах, приведенных ниже, анти-Fas IgM антитело способно устранять дефект хрящевого матрикса. Более того, анти-Fas IgM антитело способствует повышению выработки хрящевого матрикса. Как указывалось выше, баллы 2-7 по шкале Mankin указывают на стадии от начальной до поздней стадии остеоартрита, сопровождаемого дегенерацией хряща, как его патологического состояния. Таким образом, анти-Fas IgM антитело может найти эффективное применение в качестве терапевтического средства или профилактического средства для лечения заболеваний, классифицируемых по стадиям от начальной до поздней стадии остеоартрита.
[0036]
Как продемонстрировано в примерах, приведенных ниже, анти-Fas IgM антитело способно подавлять состояние (дегенерацию хряща) остеоартрита при 2-7 баллах по модифицированной шкале Mankin. Кроме того, как продемонстрировано в примерах, приведенных ниже, анти-Fas IgM антитело способно устранять дефект хрящевого матрикса. Более того, анти-Fas IgM антитело способствует повышению выработки хрящевого матрикса. Как указывалось выше, баллы 2-7 по шкале Mankin указывают на стадии от начальной до поздней стадии остеоартрита, сопровождаемого дегенерацией хряща, как его патологического состояния. Таким образом, анти-Fas IgM антитело может найти эффективное применение в качестве терапевтического средства или профилактического средства для лечения заболеваний, классифицируемых по стадиям от начальной до поздней стадии остеоартрита.
[0037]
Вторая особенность настоящего изобретения относится к терапевтическому средству или профилактическому средству для лечения артрита, вызванного осте о артритом, содержащему анти-Fas IgM антитело в качестве активного ингредиента. Синовит при остеоартрите является вторичным воспалительным ответом при остеоартрите. При остеоартрите разрушение поверхностного суставного хряща, сопровождающее пролиферацию нового хряща на периферии сустава, дегенерация сустава и т.д. стимулируют периферийные клетки и вызывают вторичный воспалительный ответ. Лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением может быть предпочтительно использовано в качестве терапевтического средства или профилактического средства для лечения такого синовита при остеоартрите.
[0038]
Кроме того, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением может быть использовано в качестве ингибирующего средства, препятствующего дегенерации хрящевого матрикса, средства, стимулирующего синтез хрящевого матрикса, и индуцирующего апоптоз средства, препятствующего макрофагу, вызванному остеоартритом, и содержащего анти-Fas IgM антитело в качестве активного ингредиента. Анти-Fas IgM антитело предпочтительно является СН11, AGR098 или 7С11. Как продемонстрировано в примерах, приведенных ниже, такое анти-Fas IgM антитело может найти эффективное применение в качестве ингибирующего средства, препятствующего дегенерации хрящевого матрикса, средства, стимулирующего синтез хрящевого матрикса, и индуцирующего апоптоз средства, препятствующего макрофагу, вызванному остеоартритом.
[0039]
В данном описании настоящего изобретения антитело является белком, введенным в живой организм. Примерами таких живых организмов является млекопитающие и птицы. Примером антитела в соответствии с настоящим изобретением является анти-Fas антитело, полученное из организма млекопитающих, таких как человек, мыши и крысы. Антитело в соответствии с настоящим изобретением может быть использовано в качестве лекарственных средств для лечения животных, таких как собаки и кошки, а также человек. С целью предотвращения побочных эффектов после введения средства антитело предпочтительно получают из живого организма, в который предусматривается введение антитела. Примеры типов антитела, вводимых человеку, включают мышиное антитело, химерическое антитело, гуманизированное антитело и (полностью) человеческое антитело.
[0040]
Такое антитело может быть получено с использованием хорошо известного способа (например, Tadaomi Takenawa, "Protein Experiment Handbook", Yodosha Co., Ltd., 2003, p.86-p.105). Иммунизированному животному, вырабатывающему антитело, вводят белок или пептид, являющийся антигеном, с которым происходит связывание антитела. В качестве иммунизированного животного может быть использовано общеизвестное животное, такое как мышь, крыса, хомячок, кролик и коза. Иммунизированному животному периодически однократно или многократно вводят антиген (например, через 2-4 недели). После введения антигена периодически собирают кровь (например, через 1-2 недели) и проводится контроль за выработкой целевого антитела (титр антитела). Хорошо известный способ может быть использован в качестве способа для проверки титра антитела, такой как Вестерн-блоттинг и твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA). Антитело из иммунизированного животного (например, мышиное антитело для мыши) может быть получено с помощью такого способа.
[0041]
Химерическое антитело является антителом, состоящим из вариабельной области мышиного антитела, соединенной с константной областью человеческого антитела, которое может быть получено с помощью широко известного способа (например, Kokai (нерассмотренная патентная заявка) No. H7-194384). Гуманизированное антитело является антителом, в котором комплементарно определяемая область (CDR) мышиного антитела трансплантирована в вариабельную область человеческого тела, которое может быть получено с помощью широко известного способа (Патент No.2828340, Kokai (нерассмотренная патентная заявка) No. H11-4694, и т.д.). Человеческое антитело является антителом, поученным путем введения гена человеческого иммуноглобулина нокаутному животному с выключенным геном иммуноглобулина, который наследственно имелся у иммунизированного животного, который может быть получен с помощью широко известного способа (Kokai (нерассмотренная патентная заявка) No. H10-146194, Kokai (нерассмотренная патентная заявка) No. Н10-155492, и т.д.). Полностью человеческое антитело является антителом, выработанным человеческими клетками, которое может быть изготовлено с помощью широко известного способа (Kokai (нерассмотренная патентная заявка) No. 2007-141, Kokai (нерассмотренная патентная заявка) No. 2005-34154, и т.д.). Специалисты в данной области техники могут выбрать любой из указанных хорошо известных способов для получения антител с целью получения антитела в соответствии с настоящим изобретением.
[0042]
Fas антиген является трансмембранным гликопротеином, также называемым АРО-1, CD95, ALPS1A, АРТ1, Fas1, FasL-рецептором, членом 6 суперсемейства TNF-рецепторов 6, TNFR6 и т.д. Как известно, Fas антиген, развивающийся на клеточной поверхности, действует в качестве рецептора, индуцирующего апоптоз в клетках (Fas-опосредованный апоптоз) за счет стимулирования Fas лиганда (FasL), анти-Fas антитела и т.д. Fas антиген широко распространен в клетках, образующих вид ткани в живом организме. Кроме того, Fas антиген также развивается в макрофагах, естественных клетках-убийцах, В клетках, Т клетках и в клетках воспаления, таких как зернистые лейкоциты и моноциты. Как известно, FasL развивается в Т-клетках, естественных клетках-убийцах, эффекторных клетках и т.д. При связывании Fas антигена с Fas лигандом или анти-Fas антителом образуется тример. Кроме того, как известно, тримеризированный внутриклеточный домен Fas антигена передает сигналы апоптоза в клетки. Как известно, Fas лиганд образует и тример в живом организме, и считается, что связывание тримеризированного Fas лиганда с Fas антигеном приводит к тримеризации внутриклеточного домена Fas антигена, в результате чего обеспечивается передача сигналов апоптоза.
[0043]
Анти-Fas антитело включает антитело, индуцирующее Fas-опосредованный апоптоз (антитело-агонист), антитело, ингибирующее Fas-опосредованный апоптоз (антагонистическое антитело) и т.д. Предпочтительным анти-Fas антителом в соответствии с настоящим изобретением является антитело, индуцирующее Fas-опосредованный апоптоз (антитело-агонист). Такое анти-Fas антитело включает антитело против пептида, состоящего из аминокислотной последовательности, являющейся аналогичной аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, или аминокислотной последовательности, в которой 1-10 аминокислотных остатков, например, заменены, исключены, добавлены или введены. SEQ ID NO: 1 является аминокислотной последовательностью человеческого Fas антигена. Среди аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 1, количество замененных, исключенных, добавленных или введенных аминокислотных остатков составляет 1-10, например, предпочтительно 1-5, более предпочтительно 1-2 и наиболее предпочтительно 1. Лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением, включающее анти-Fas антитело, также может быть предназначено для лечения кроме человека таких животных, как собаки и кошки. При использовании лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением, включающего анти-Fas антитело в качестве лекарственного препарата для лечения животных, анти-Fas антитело предпочтительно является антителом против пептида, состоящим из аминокислотной последовательности, являющейся аналогичной аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1, содержащей Fas антиген, полученный из организма человека, либо состоящим из аминокислотной последовательности, в которой ее 1-10 аминокислотных остатков заменены, исключены, добавлены или введены, а не антителом против пептида, состоящим из аминокислотной последовательности, являющейся аналогичной аминокислотной последовательности, образующей Fas антиген, полученный из введенного животному белка, либо аминокислотной последовательностью, в которой ее 1-10 аминокислотных остатков заменены, исключены, добавлены или введены. Аминокислотная последовательность, образующая такого рода Fas антиген животного происхождения, может быть получен с помощью широко известного сайта, такого как GenBank.
[0044]
В предпочтительном объекте настоящего изобретения анти-Fas антитело является антителом, распознающим внеклеточный домен Fas антигена. В частности, анти-Fas антитело является антителом против пептида, состоящим из аминокислотной последовательности, являющейся аналогичной аминокислотной последовательности, представленной в аминокислотах 26-173 SEQ ID NO: 1, или аминокислотной последовательности, в которой ее 1-5 аминокислотные остатки заменены, исключены, добавлены или введены. Среди аминокислотных последовательностей, представленных в аминокислотах 26-173 SEQ ID NO: 1, количество замененных, исключенных, добавленных или введенных аминокислотных остатков составляет 1-15, например, предпочтительно 1-2, более предпочтительно 1. Пример указанных, замененных, исключенных, добавленных или введенных аминокислотных остатков описан в UniProt (универсальный протеиновых ресурс (http://www.pir.uniprot.org/)) № доступа No: P25445. Аминокислотная последовательность, представленная в аминокислотах 26-173 SEQ ID NO: 1, является последовательностью, содержащей внеклеточный домен Fas антиген. Предпочтительное Fas антитело в соответствии с настоящим изобретением, является антителом, индуцирующим Fas-опосредованный апоптоз, т.е. Fas антитело в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно является антителом, способным связываться с Fas антигеном, вызывать тримеризацию Fas антигена и передавать сигналы апоптоза в клетки. Выполняя анти-Fas антитело в соответствии с настоящим изобретением в виде антитела против внеклеточного домена Fas антигена при введение средства, включающего анти-Fas антитело, оно способно предпочтительно связываться с Fas антигеном, вызывать его тримеризацию и способствовать передаче внутриклеточных сигналов.
[0045]
Анти-Fas антитело в соответствии с настоящим изобретением может являться поликлональным антителом или моноклональным антителом. Однако существуют трудности с созданием стабильного титра антитела у поликлонального антитела. Таким образом, моноклональное антитело со стабильным титром антитела является более предпочтительным. Несмотря на то, что изотипы антитела (молекула иммуноглобулина (Ig)) включает IgG, IgM, IgA, IgE и IgD, антитело в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно является IgG антителом, IgA антителом или IgM антителом, более предпочтительно IgA антителом или IgM антителом, и еще более предпочтительно IgM антителом. Указанные антитела могут быть получены с использованием нижеуказанного способа (но не ограничены им), а также с помощью широко известных технологических способов.
[0046]
2
2
2
2
H
L
H
H
H
L
H
L
Антитело (молекула иммуноглобулина (Ig)) имеет базовые структуры, являющиеся общими для каждого изотипа (IgG, IgM, IgA, IgE, IgD), и состоит из Н цепи (тяжелой цепи) с молекулярным весом от 50000 до 70000 и из L цепи (легкой цепи) с молекулярным весом от 20000 до 25000. При этом Н цепь имеет характерные структуры для каждого изотипа, называемые γ цепью, µ цепью, α цепью, δ цепью и ε цепью, соответствующие IgG, IgM, IgA, IgD и IgE, соответственно. Кроме того, известны два типа L цепи - L и К, называемые λ цепью и к цепью, соответственно. В базовой структуре - структуре пептидной цепи - две Н цепи и две L цепи, являющиеся гомологичными по отношению друг к другу, связаны дисульфидной связью (S-S связь) и нековалентной связью. Два типа L цепи могут быть спарены с любыми типами Н цепи. Например, в случае с IgM сочетание µ цепи, λ цепи и κ цепи образует µλ и µκ. Существует четыре внутрицепьевые пептидные связи в Н цепи (пять в случае µ цепи и ε цепи), в то время как существует две внутрицепьевые сульфидные связи в L цепи, и одна петля образуется для каждого из аминокислотных остатков 100-110, и единица называется доменом. Н цепь и L цепь имеют домены, называемые вариабельными (V) областями (обозначенными V и V, соответственно), расположенными в N-концевом домене. Кроме того, аминокислотные последовательности, расположенные ближе к С-концу, чем к N-концу, имеют домены, называемые константными (С) областями (обозначенными C1, C2, C3, C), имеющими почти константные аминокислотные последовательности для каждого изотипа. Антиген-связывающий сайт (эпитоп) антитела состоит из V и V, и специфичность антигена изменяется с последовательностью указанного сайта. Такое антитело образует различные полимеризированные структуры в зависимости от изотипов. Например, в то время как IgM антитело является антителом, состоящим из двух Нµ цепей и двух L цепей, оно существует в форме пентамера или гексамера, связанного с дополнительным полипептидом, называемым J цепью. В то время как IgA антитело является антителом, состоящим из двух Нα цепей и двух L цепей, оно существует в формах мономера, димера или тримера. При этом димер или тример IgA антитела связан J цепью или секреторным компонентом. IgG антитело существует в форме мономера. Любой тип указанных антител может быть использован для анти-Fas антитела в соответствии с настоящим изобретением. Кроме того, как указывалось выше, в Fas-опосредованном апоптозе связывание тримерического Fas лиганда с Fas антигеном способствует тримеризации внутриклеточного домена Fas антигена, в результате чего обеспечивается передача сигналов апоптоза. Как указывалось выше, поскольку IgM антитело образует полимеризированную структуру (пентамер или гексамер), IgM антитело связывается для удержания более трех Fas антигенов. Благодаря этому эффективно запускается процесс тримеризации Fas антигена, в результате чего обеспечивается передача сигналов апоптоза. Таким образом, с указанной точки зрения предпочтительно использовать IgM антитело для анти-Fas антитела в соответствии с настоящим изобретением.
[0047]
[Поликлональное антитело]
Пример способа для получения поликлонального антитела приведен ниже. Тем не менее, указанный способ может быть приемлемым образом заменен широко известным способом, являющимся должным образом очевидным для специалистов в данной области техники. Поликлональное антитело может быть получено путем инъецирования антигена (иммуногена) иммунизированному животному, указанному выше. В качестве антигена (иммуногена), инъецированного иммунизированному животному, могут быть использованы клетки экспресии антиген, (неочищенный) очищенный белок, рекомбинантный белок или синтетический пептид. Такой антиген включает пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, являющейся аналогичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, описание которой приведено выше или аминокислотной последовательности, в которой ее 1-10 аминокислотные остатки были заменены, исключены, добавлены или введены. Как указывалось выше, анти-Fas антитело в соответствии с настоящим изобретением является антителом, вызывающим Fas-опосредованный апоптоз, и антиген предпочтительно является пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, являющейся аналогичной аминокислотной последовательности, описанной в аминокислотах 26-173 SEQ ID NO: 1, или аминокислотной последовательности, в которой ее 1-5 аминокислотные остатки заменены, исключены, добавлены или введены, и количество аминокислотных остатков, замененных вышеуказанной аминокислотной последовательностью, исключенных из нее, добавленных к ней или введенных в нее, предпочтительно составляет 1-2, и более предпочтительно 1. Кроме того, поскольку анти-Fas антитело в соответствии с настоящим изобретением является антителом, связывающимся с Fas антигеном и индуцирующим Fas-опосредованный апоптоз, в виде пептида (антигена), используемого при получении антитела, может быть использован более короткий пептид по сравнению с пептидом, состоящим из аминокислотной последовательности, представленной в аминокислотах 26-173 SEQ ID NO: 1. Специалисты в данной области техники могут приемлемым образом отрегулировать длину пептида.
[0048]
При получении поликлонального антитела антиген смешивают с адъювантом, инъецируемым иммунизированному животному. В соответствии со значением, используемом в настоящем контексте, адъювант относится к веществу, используемому для усиления иммунного ответа на антиген, и включающему, например, алюминиевый адъювант, неполный адъювант Фрейнда и адъювант Bordetella pertussis. Антиген инъецируют иммунизированному животному через каждые 2-4 недели. После проведения более двух инъекций собирают кровь через 1-2 недели после инъекции и далее проводят проверку титра антитела. Доза инъекции и количество инъекций (количество иммунизации) иммунизированному животному изменяются в зависимости от типа иммунизированного животного или каждого индивида. Специалисты в данной области техники могут приемлемым образом скорректировать дозы и количество инъекций в зависимости от результата проверки титра антитела. После иммунизации выдавливают цельную кровь, от которой отделяют сыворотку с помощью широко известного способа, такого как разделение центрифугированием. Сыворотку очищают с целью удаления содержащихся в сыворотке эндогенных антител. В качестве способа очистки могут быть использованы широко известные способы, такие как аффинная хроматография. Таким образом, может быть получено поликлональное антитело.
[0049]
[Антигенпрезентирующая клетка]
Антигенпрезентирующая клетка, используемая в качестве антигена, предпочтительно является клеткой, на клеточной мембране которой экспрессируется антигенный белок (например, культивируемая клетка). Такая антигенпрезентирующая клетка может быть получена с помощью широко известного способа. В частности, ДНК-кодируемый антигенный белок может быть введен в экспрессируемую культивируемую клетку. Культивируемая клетка (далее по тексту также называемая «хозяин»), представляющая антиген, в частности, не является ограниченной; может быть использована широко известная клетка, такая как В-клетка или дендритная клетка, известная как антигенпрезентирующая клетка. В качестве способа для представления антигенного белка на указанных клетках может быть приготовлен вектор экспрессии антигена, внедренный в ДНК-кодируемый антигенный белок, и может быть введен в клетку, представляющую антиген. В том случае, если внедренная в вектор экспрессии ДНК не содержит последовательности доменов клеточной мембраны, последовательность доменов клеточной мембраны может содержаться в «хозяине», в который введен вектор экспрессии. Содержание такого вида последовательности способно эффективно представлять белок (антиген) на клеточной мембране. Специалисты в данной области техники могут приемлемым образом получить указанный вид последовательности доменов клеточной мембраны, которая будет содержаться в последовательности ДНК, внедренной в вектор экспрессии. В качестве такого вида вектора экспресии могут быть использованы промотор, энхансер, сигнал сплайсинга, поли А сигнал, селективный маркер, вещество, содержащее точку начала репликации SV40 и т.д. Когда «хозяин» является животной клеткой, промотором, например, может являться SRα промотор, SV40 промотор, HIV-LTR промотор, CMV промотор и HSV-TK промотор. Селективным маркером может являться, например, ген дигидрофолат редуктазы (резистентность к метотрексату (МТХ)), ген резистентности к ампициллину, ген резистентности к неомицину (резистентность к G418), ген резистентности к гидромицину, ген резистентности к бластицидину и т.д. в качестве указанного вида вектора экспрессии может быть использован широко известный вектор экспрессии, который специалисты в данной области техники могут выбрать приемлемым образом в зависимости от «хозяина». В качестве метода для внедрения вектора экспрессии антигена могут быть использованы широко известные методы, такие как метод преципитации фосфата кальция, метод липофекции и метод электропорации. В качестве метода проверки экспрессирования антигена в клетке может быть использован приемлемым образом широко известный метод, такой как метод иммуноокрашивания. Клетка, в которой экспрессировался антиген, может быть собрана с помощью хорошо известного метода и может быть использована в качестве антигена, инъецируемого иммунизированному животному.
[0050]
[(Неочищенный) очищенный белок]
(Неочищенный) очищенный белок получают путем очистки белка, который экспрессирует культивируемая клетка и т.д. Указанный вид белка может быть экспрессирован путем стимулирования культивируемой клетки и т.д. с помощью лекарственного средства или фактора, воздействующего на сигнальный путь клеток, либо воздействующего на транскрипционный фактор. Экспрессированный белок может быть очищен с помощью широко известного метода и использован в качестве очищенного белка. Например, секретируемый белок, после сбора его надосадочной жидкости, может быть очищен методом высаливания, колончатой хроматографии, мембранной обработки и т.д. Метод хроматографии может представлять собой метод ионообменной хроматографии, гель-фильтрационной хроматографии, аффинной хроматографии, гидрофобной хроматографии и т.д., который специалисты в данной области техники могут использовать приемлемым образом в соответствии с природой белка. Белок, не секретируемый из клетки, может быть собран путем сбора культивируемых клеток и разрывания указанных клеток методом ультразвуковой обработки и т.д. Далее белок может быть очищен с помощью вышеприведенных методов. Указанные методы для получения очищенного белка широко известны, и специалисты в данной области техники могут использовать их приемлемым образом в зависимости от природы белка.
[0051]
[Рекомбинантный белок]
Рекомбинантный белок, используемый в качестве антигена, может быть получен с помощью широко известного метода. В частности, ДНК кодируемый рекомбинантный белок, используемый в качестве антигена, вводят в вектор с помощью широко известного метода, и внедряют в «хозяина», экспрессирующего рекомбинантный белок. Могут быть использованы широко известные векторы, причем специалисты в данной области техники могут выбрать в зависимости от внедренного «хозяина». В качестве указанного типа «хозяина» может быть использован широко известный «хозяин», такой как бактерии, клетка насекомого, клетка растения, клетка животного и т.д. В качестве метода для внедрения вектора в «хозяина» могут быть использованы широко известные методы, такие как метод электроимпульсного открытия клеточных пор, метод преципитации фосфата кальция и метод липофекции в зависимости от хозяина. Рекомбинантный белок может представлять собой слитый белок с маркером (меткой), таким как глутатион S трансфераза, НА (гемагглютинин), или (олиго) гистидин. Указанные маркеры могут быть связаны на N-конце или С-конце ДНК, кодирующей целевой антиген. Указанный тип маркер (метка)-связанного слитого белка может легко очищать экспрессированный белок. Белок, экспрессированный на «хозяине», может быть собран, например, путем сбора надосадочной жидкости культуры в случае с секретируемым белком и дальнейшего разрывания клетки-«хозяина» методом ультразвуковой обработки и т.д. В качестве метода для очистки белка могут быть использованы такие методы, как метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, колонка для проведения хроматографии по сродству и т.д. Кроме того, рекомбинантный белок может быть получен с использованием системы экспрессии белка in vitro или живого организма, такого как насекомое, животное, растение и т.д. Указанные методы широко известны, и специалисты в данной области техники могут приемлемым образом внести в них любые изменения.
[0052]
[Синтетический пептид]
Метод синтезирования пептида включает твердофазный метод, жидкофазный метод и т.д. Синтез пептида включает прерывистый метод удлинения для последовательного связывания целевых аминокислотных последовательностей из N-конца или С-конца или метод фрагментной конденсации для разбиения аминокислотных последовательностей на соответствующие фрагменты и конденсирования указанных фрагментов для синтеза целевого пептида. Кроме того, метод синтезирования пептида включает твердофазный метод для связывания аминокислот с нерастворимой смолой, на которой аминокислоты связываются одна за другой на основе информации аминокислотной последовательности, за счет чего происходит удлинение цепи, либо жидкофазный метод, в котором не используется такой носитель как смола. Более того, пептид может быть успешно синтезирован путем сочетания указанных методов. Указанные типы методов широко известны, и специалисты в данной области техники могут использовать их приемлемым образом для синтезирования целевых аминокислотных последовательностей. Кроме того, синтезированный пептид может быть подвергнут очистке. Очистка синтетического пептида может быть проведена с использованием широко известных методов, таких как метод преципитации, метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, метод ионообменной хроматографии и гель-фильтрационной хроматографии. При использовании синтетического пептида в качестве антигена, ввиду того, что он лишен антигенности как таковой, он находит более эффективное применение в том случае, когда он ковалентно связан с носителем, таким как BSA (бычий сывороточный альбумин) или K.LH (гемоцианин лимфы улитки) с перекрестносшивающим агентом (таким как MBS (эфир m-малеимидобензойной кислоты) или DMS (диметилсуберимидат).
[0053]
[Моноклональное антитело]
Моноклональное антитело может быть получено с помощью широко известного метода. В частности, вышеуказанный антиген инъецируют (иммунизируют) иммунизированному животному (например, мыши) с интервалами 2-4 недели в течение 1-6 месяцев, и проводят проверку (тестирование) титра антитела, как и в случае с методом для получения поликлонального антитела. После получения желаемого титра антитела путем теста (контроля) селезенку удаляют из иммунизированного животного. Удаленную селезенку суспендируют в не содержащей сыворотке среде (например, среда Iscove) для получения суспензии спленоцитов. Спленоциты и клетки миеломы смешивают для слияния с использованием полиэтиленгликоля (PEG). Далее, путем культивирования в селективной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (HAT), обеспечивается рост только гибридомы (клетки, состоящей из слитых спленоцитов и клеток миеломы). Далее, с целью выбора гибридомы, продуцирующей целевое антитело, одновременно с проведением контроля на целевое антитело проводится клонирование тест-позитивной гибридомы. Многократное повторение указанной процедуры позволяет получить клонированную гибридому, продуцирующую целевое антитело. Далее, инъецирование клонированной гибридомы в брюшинную полость иммунизированного животного, сбор асцитов спустя 2-4 недели и очистка асцитов позволяют получить моноклональное антитело. В качестве метода для очистки асцитов может быть использован широко известный метод, такой как метод аффинной хроматографии или гель-фильтрационной хроматографии.
[0054]
[Метод получения рекомбинантного антитела]
Более того, антитело в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой рекомбинантное антитело. Рекомбинантное антитело является рекомбинантным моноклональным антителом, в котором не используется гибридома в процессах продуцирования антител. Пример гибридомы включает антитело, имеющее только минимальные антиген-связывающие сайты, антитело, имеющее поливалентные антиген-связывающие сайты, секретируемый тип антитела, состоящего из комбинации IgG и IgA, химеры ксеногенных животных или гуманизированное антитело. Указанные рекомбинантные антитела могут быть получены путем экспрессии иммуноглобулина каждого изотипа на «хозяине». Примеры системы продуцирования с использованием указанного типа хозяина включают метод, в котором используются кишечная палочка, метод, в котором используются культивируемые клетки, метод, обеспечивающий продуцирование растениями, метод, обеспечивающий продуцирование трансгенными мышами и т.д.
[0055]
Указанные рекомбинантные антитела могут быть получены с использованием широко известного метода. Конкретным примером такого метода является метод фагового дисплея (например, система экспресии рекомбинантного антитела (Amersham Biosciences)). Метод фагового дисплея представляет собой систему, вынуждающую чуждые гены экспрессировать в виде слитого белка на оболочечном белке фиброзного фага, такого как М13, одного из бактерий группы кишечной палочки таким образом, чтобы не была потеряна инфекционная способность фага. Фаг является вирусом, инфицирующим бактерии, и, если чуждый ген вводят в ДНК, фаг обретает способность избежать «хозяина» в момент инфекции и расти.
[0056]
[Метод фагового дисплея]
Несмотря на то, что один пример метода получения моноклонального антитела с помощью метода фагового дисплея приведен ниже, настоящее изобретение не ограничено нижеприведенным методом получения моноклонального антитела, и специалисты в данной области техники могут приемлемым образом изменить каждый этап, используя другие широко известные методы. Кроме того, специалисты в данной области техники могут установить такие параметры, как температура, время реакции, используемую концентрацию раствора и количество используемого раствора на каждом этапе и внести любые изменения для реализации метода. При использовании метода фагового дисплея сначала создают фаговую библиотеку антител, и затем проводят скрининг на продуцирующий антитело фаг для получения моноклонального антитела.
[0057]
Создание фаговой библиотеки антител
(1) Необходимо выделить мРНК из В-клетки и провести полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией (RT-PCR) для создания кДНК библиотеки.
Клетки, извлеченные из организма мыши, человека и т.д., могут быть использованы вместо В-клетки. Выделение РНК из В-клетки может быть осуществлено, например, с использованием кислотно-гуанидин-фенол-хлороформного метода (AGPC) и т.д. При использовании кислотно-гуанидин-фенол-хлороформного метода, сначала раствор гуанидинтиоцианата добавляют к В-клетке для гомогенизации. Далее к гомогенезированному раствору клеток добавляют ацетат натрия, фенол и хлороформ для смешивания и центрифугирования. После центрифугирования собирают водный слой раствора. К собранному водному слою добавляют изопропанол, перемешивают и центрифугируют для осаждения РНК. Осадок (РНК) снова растворяют раствором гуанидинтиоцианата и затем взбалтывают с добавленными ацетатом натрия, фенолом и хлороформом. После взбалтывания водной слой ценрифугируют и снова собирают. Снова добавляют изопропинол к собранному водному слою и центрифугируют для осаждения РНК. К осажденной РНК добавляют 70% этанол, суспендируют и снова центрифугируют для осаждения РНК, в результате получают тотальную РНК. Далее, для выделения мРНК из тотальной РНК мРНК амплифицируют ПНР методом с использованием праймера (олиго dT праймера), связывающегося с поли-А-последовательностью, имеющейся у С-конца мРНК, которая выделяется /очищается с использованием олиго dT колонки (например, выпускаемой компанией «QIAGEN»). В других случаях мРНК может быть выделена/очищена методом аффинной хроматографии с использованием магнитных микроносителей (например, выпускаемых «Nacalai Tesque, Inc.») с покрытием из олиго dT. Очищенная мРНК позволяет создать кДНК библиотеку с использованием ПНР метода в реакционном растворе, содержащем обратную транскриптазу.
[0058]
(2) Необходимо амплифицировать вариабельные области L цепи (легкой цепи) и Н цепи (тяжелой цепи), соответственно с помощью метода полимеразной цепной реакции, используя специфические праймеры.
H
L
H
L
L
H
Последовательности V и V, вариабельные области Н цепи и L цепи антитела (молекула иммуноглобулина (Ig)) могут быть получены, например, из GenBank и т.д. С целью получения человеческого IgA антитела, например, должны быть получены V и V последовательности человеческого IgA, необходимо создать дизайн праймера для увеличения указанных последовательностей, и обе последовательности должны быть амплифицированы с помощью ПЦР метода с использованием вышеуказанной кДНК в качестве матрицы. Специалисты в данной области техники могут приемлемым образом создать дизайн праймера в зависимости от получаемого антитела и могут приемлемым образом установить параметры ПЦР метода и т.д. Амплифицированные V и V могут быть очищены с помощью широко известного метода.
[0059]
(3) Конструирование библиотеки
L
H
H
H
Очищенные V и V соединяют с помощью линкера для создания одиночной цепи, которую включают в фагемидный вектор для конструирования библиотеки одноцепочечного гена (вариабельная область (фрагмент вариабельной области)). Линкер является последовательностью для соединения каждого фрагмента. В качестве данного типа линкера может быть использован широко известный линкер. Фагемидный вектор является плазмидным вектором, включающим точку начала репликации (IG область), необходимую для продуцирования одноцепочечной ДНК М13 фага или f1 фага. Фагемидный вектор имеет характеристики плазмида и характеристики фага одноцепочечной ДНК, которым можно манипулировать как общим плазмидом двухцепочечной ДНК, и который также может вызвать продуцирование частицами фиброзного фага, содержащими одну ДНК цепь плазмида. Может быть использован широко известный фагемидный вектор (например, pCANTAB5E (Amersham Biosciences)). В противоположном случае могут быть амплифицированы фрагменты гена антитела с помощью ПЦР метода с использованием праймера специфического для Fd секции цепи Н антитела (V и C1 области) и секции L цепи, и указанные фрагменты гена могут быть включены в фагемидный вектор для конструирования библиотеки генов, соответствующей антителу Fab.
[0060]
Скрининг на наличие фага, продуцирующего антитело
(4) Концентрация антителопрезентрующей фаговой библиотеки
Антителопрезентрующую фаговую библиотеку создают путем введения библиотеки генов антитела, сконструированной с использованием фагемидного вектора, в кишечную палочку и путем инфицирования фага-помощника (например, М13К07, VCSM13). Одним из методов концентрирования указанной фаговой библиотеки является метод трамбования. С помощью указанного метода фаговая группа, презентирующая целевое антитело, может быть сконцентрирована с помощью твердофазного метода с использованием очищенного антигена (антиген, очищенный с помощью вышеуказанного метода). При использовании метода трамбования этапы реакции между твердофазным антигеном и фаговой библиотекой, промывки (удаления фаговой библиотеки, не связанной с твердофазным антигеном), элюирования антиген-связующего фага, амплификации путем инфицирования кишечной палочки повторяют несколько раз (например, 4-5 раз). Благодаря этому обеспечивается концентрирование антиген-специфического фага (фага, продуцирующего антитело).
[0061]
(5) Отбор клона антиген-специфического фага и получение моноклонального антитела
В качестве метода отбора клона антиген-специфического фага, например, может быть использован метод твердофазного иммуноферментного анализа и т.д. Фаг, продуцирующий антитело, реагирует с очищенным антигеном, нанесенным на планшету ELISA, и проводится проверка реактивности (связующего характера) с очищенным антигеном. Путем повторения указанного этапа и отбора клонов могут быть получены фаги, продуцирующие моноклональные антитела. Моноклональные антитела могут быть получены путем обеспечения роста указанных фагов в кишечной палочке и отбора антител. Указанные антитела могут быть очищены с использованием хорошо известного метода очистки, такого как метод аффинной хроматографии.
[0062]
Предпочтительный пример настоящего изобретения предусматривает использование антитела в соответствии с настоящим изобретением для получения терапевтического средства или профилактического средства для лечения остеоартрита и артрита (синовита) при остеоартрите, ингибирующего средства, препятствующего дегенерации хрящевого матрикса, средства, продуцирующего хрящевой матрикс, и апоптоз-индуцирующего средства против макрофага, индуцируемого остеоартритом. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает: способ лечения остеоартрита; способ лечения синовита при остеоартрите; использование анти-Fas IgM антитела для получения ингибирующего средства, препятствующего выработке фермента, разрушающего хрящевой матрикс; и использование анти-Fas IgM антитела для получения апоптоз-индуцирующего средства против макрофага, индуцированного остеоартритом. Кроме того, при использовании указанного анти-Fas IgM антитела каждый способ, описание которого было приведено выше, может быть использован с иными способами.
[0063]
Лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением может быть получено с помощью широко известного специалистам в данной области техники метода. Несмотря на то, что лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением может быть получено в виде перорального препарата и парентерального препарата, последний является более предпочтительным. Указанный тип парентерального препарата может представлять собой жидкий лекарственный препарат (такой как жидкий лекарственный препарат на водной основе, жидкий лекарственный препарат на неводной основе, суспендированный жидкий лекарственный препарат и эмульгированный жидкий лекарственный препарат), либо может представлять собой твердый лекарственный препарат (такой как порошкообразный препарат и лиофилизированный препарат). В противоположном случае, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой препарат с пролонгированным действием.
[0064]
Жидкий лекарственный препарат может быть получен с помощью широко известного метода. Например, жидкий лекарственный препарат может быть получен путем растворения антител в фармацевтически приемлемом растворителе и заполнения стерилизованного контейнера для жидкого лекарственного препарата. Фармацевтически приемлемый растворитель может представлять собой, например, растворитель инъекционных лекарств, дистиллированную воду, физиологический солевой раствор, вещество для растворения электролита и т.д., при этом предпочтительно использовать стерилизованные растворители. Стерилизованный контейнер для жидкого лекарственного препарата может представлять собой ампулу, флакон, пакетик и т.д. В качестве указанных контейнеров могут быть использованы широко известные выполненные из стекла или пластика контейнеры. Специальные контейнеры из пластика могут быть выполнены из такого материала, как поливинилхлорид, полиэтилен, полипропилен, этилен, и сополимер винилацетата. В качестве метода стерилизации указанных контейнеров и растворителей может быть использован метод нагрева (например, метод стерилизации в пламени, метод стерилизации сушкой, метод стерилизации высокотемпературным паром, метод стерилизации свободно текучим паром и метод стерилизации кипячением), фильтрационный метод, иррадиационный метод (например, метод стерилизации ионизирующей радиацией, метод стерилизации ультрафиолетовым светом и высокочастотный метод стерилизации), газовый метод, спиртовой метод и т.д. Специалисты в данной области техники могут выбрать приемлемым образом любой из указанных методов стерилизации в зависимости от материала контейнера или свойств растворителя.
[0065]
В качестве метода изготовления твердых лекарственных препаратов могут быть использованы широко известные методы, такие как метод лиофилизации, метод сушки распылением и метод стерильной рекристаллизации. Например, лиофилизированный препарат может быть получен при осуществлении следующих технологических этапов: (1) выдерживание кристаллизированных антител при температуре помещения 4°С и при нормальном давлении в течение 2-3 часов для охлаждения (этап охлаждения); (2) выдерживание при температуре помещения -50°С и при нормальном давлении в течение 12-15 часов для замораживания (этап замораживания); (3) выдерживание при температуре помещения -20°С и при нормальном давлении в течение 4-6 часов для рекристаллизации (этап рекристаллизации); (4) выдерживание при температуре помещения -50°С и при нормальном давлении в течение 14-16 часов для повторного замораживания (этап повторного замораживания); (5) выдерживание при температуре помещения -13°С и при давлении 10-20 кПа (под глубоким вакуумом) в течение 24-26 часов (первый этап сушки); (6) выдерживание при температуре помещения 24°С и под давлением 10-20 кПа (под глубоким вакуумом) в течение 10-121 часов (второй этап сушки); (7) выдерживание при температуре помещения 24°С и при нормальном давлении. Таким образом, метод лиофилизации позволяет производить замораживание при низкой температуре и сублимировать жидкость (лед) для удаления. Лиофилизированный препарат в соответствии с настоящим изобретением может быть получен с использованием вышеуказанного метода, но не ограничен им, и специалисты в данной области техники могут внести любые изменения приемлемым образом. Кроме того, также могут быть произвольно изменены такие параметры, как температура, давление, время и т.д. на каждом технологическом этапе.
[0066]
Кроме того, настоящее изобретение также предусматривает создание комплектного изделия, включающее лекарственное средство, содержащее анти-Fas IgM антитело в соответствии с настоящим изобретением, и медицинский инструмент. Например, средство, содержащее анти-Fas IgM антитело в соответствии с настоящим изобретением, может быть помещено в медицинский инструмент, такой как шприц. В другом случае, твердый медицинский лекарственный препарат может быть размещен с одной стороны мягкого пакетика, в то время как растворитель может быть помещен с другой стороны пакетика и отделен от лекарственного препарата перегородкой, при этом оба компонента могут быть смешены путем устранения перегородки при использовании лекарственного препарата. Такие комплектные изделия позволяют не только облегчить работу медицинских работников при приготовлении препарата на месте его применения, но и предотвратить бактериальное загрязнение, попадание в препарат инородных объектов, в результате чего применение таких комплектов является предпочтительным. Медицинские работники могут приемлемым образом использовать такие шприцы или мягкие пакетики, так как они широко применяются.
[0067]
Средство, содержащее анти-Fas IgM антитело в соответствии с настоящим изобретением, может быть введено с помощью широко известного метода, такого как внутривенное введение, внутриартериальное введение, внутримышечное введение, подкожное введение, интраперитонеальное введение и внутриназальное введение. Введение путем инъецирования является предпочтительным, и также допускается инстилляция (капельное введение лекарственных веществ). Кроме того, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением может быть непосредственно инъецировано в пораженный участок (например, сустав), либо может быть введено путем хирургического вскрытия пораженного участка. Несмотря на то, что лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением может быть получено в виде пероральной лекарственной формы и парентеральной лекарственной формы, парентеральная лекарственная форма является более предпочтительной. Указанный тип парентеральной лекарственной формы может представлять собой жидкий лекарственный препарат (жидкий лекарственный препарат на водной основе, жидкий лекарственный препарат на неводной основе, суспендированный жидкий лекарственный препарат и эмульгированный жидкий лекарственный препарат, и т.д.), либо может представлять собой твердый лекарственный препарат (порошкообразный препарат и лиофилизированный препарат и т.д.). При введении твердого лекарственного препарата его применяют в растворенном или суспендированном виде с фармацевтически приемлемым растворителем в требуемой концентрации. Указанный тип твердого лекарственного препарата может быть применен с помощью таких методов введения как инъекция или инстилляция.
[0068]
При составлении лекарственной формы средства, содержащего анти-Fas IgM антитело в соответствии с настоящим изобретением, его лекарственная форма может быть составлена, при необходимости, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем или средой. Кроме того, лекарственное средство может содержать лекарственное вещество. Более того, лекарственное средство, содержащее анти-Fas IgM антитело в соответствии с настоящим изобретением, может содержать белок, ингибирующий действие антитела в соответствии с настоящим изобретением, такой как альбумин, липопротеин и глобулин. Включение такого белка позволяет повысить стабильность антител, содержащихся в жидком лекарственном препарате. В том случае, если лекарственную форму лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением составляют в виде жидкого лекарственного препарата, такой белок может содержаться в жидком лекарственном препарате. В том случае, если лекарственную форму лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением составляют в виде твердого лекарственного препарата, вышеуказанный белок может содержаться при отверждении анти-Fas антитела в соответствии с настоящим изобретением, либо может содержаться в жидком лекарственном препарате, в котором растворен твердый лекарственный препарат. Содержание такого белка составляет 0,01-5 весовых частей при допущении того, что мера жидкости в момент введения составляет 100 весовых частей, и специалисты в данной области техники могут приемлемым образом отрегулировать содержание белка в зависимости от количества вводимых антител или иных содержащихся в препарате веществ.
[0069]
[Фармацевтически приемлемый носитель или среда]
Фармацевтически приемлемый носитель или среда может включать, например, вспомогательное вещество, стабилизатор, растворитель, эмульгатор, суспендирующее вещество, буферное вещество, вещество, регулирующее тоничность, антиокислительное вещество или консервант. В другом случае, может быть использовано высокомолекулярное вещество, такое как полиэтиленгликоль (PEG), или конъюгатное соединение, такое как циклодекстрин. Несмотря на то, что ниже приведены конкретные примеры носителей или сред, настоящее изобретение не ограничено ими; могут быть использованы широко известные носители или среды. В качестве вспомогательного вещества предпочтительными являются крахмал, лактоза и т.д., не оказывающие фармакологического действия как таковые. Стабилизатор может включать альбумин, желатин, сорбитол, маннитол, лактозу, сахарозу, трегалозу, мальтозу, глюкозу и т.д. Из указанных веществ лактоза или трегалоза является предпочтительной. Растворитель может включать этанол, глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.д. Эмульгатор может включать лецитин, стеарат алюминия, сесквиолеат сорбитана и т.д. Суспендирующее вещество может включать макрогол, поливинилпирроидон (PVP) или кармеллозу (CMC). Вещество, регулирующее тоничность, может включать хлорид натрия, глюкозу и т.д. Буферное вещество может включать лимоннокислую соль, ацетат, борную кислоту, фосфат и т.д. Антиокислительное вещество может включать аскорбиновую кислоту, гидросульфит натрия, пиросульфит натрия и т.д. Консервант может включать фенол, тимерозал, хлорид бензалкония и т.д.
[0070]
Лекарственный препарат в сочетании с антителом в соответствии с настоящим изобретением может включать широко известный лекарственный препарат для лечения болезней суставов, такой как терапевтическое средство для лечения болезней суставов, противовоспалительное средство, анальгетик, средство костной регенерации, остеокластический ингибитор, антибиотик, агент роста и т.д. Кроме того, в лекарственном препарате может содержаться успокаивающее средство, так как инъецирование может вызывать боль при введении средства, содержащего анти-Fas антитело в соответствии с настоящим изобретением с помощью шприца. Можно комбинировать один или несколько указанных лекарственных препаратов.
[0071]
Терапевтическое средство для лечения болезней суставов может включать ингибитор разрушения хрящевого внеклеточного матрикса (WO 2004/017996), защитный агент суставного хряща, такой как адреналовый кортикостероид, хондроитин сульфат натрия или гиалуроновая кислота (НА), или ингибитор р21-активированной киназы (РАК) (Kohyo (национальная публикация переведенного варианта)) No. 2007-537134), и т.д.
[0072]
Противовоспалительное средство может включать стероидное противовоспалительное средство или нестероидные противовоспалительные препараты и т.д. Стероидное противовоспалительное средство может включать дексаметазон, кортизон, гидрокортизон, преднизалон, метилпреднизалон, бетаметазон, триамцинолон, триамцинолон ацетонид, фторцинолон ацетонид, фторцинонид, беклометазон, этенезамид и т.д. Нестероидное противовоспалительное средство может включать, например, аспирин, ибупрофен, напроксен, диклофенак, индометацин, набтомен, фенилбутазон, рофекоксиб, целекоксиб, оксикам, пироксикам, пиразолон, азапропазон и т.д.
[0073]
Анальгетик может включать опиоидный анальгетик и т.д. дополнительно к анальгетическим нестероидным противовоспалительным средствам антифлогистического действия. Опиоидные анальгетики могут включать, например, эндорфин, динорфин, энкефалин, кодеин, дигидрокодеин, декстропропоксифен и т.д.
[0074]
Остеокластический ингибитор может представлять собой одну или несколько смесей эстрогенного вещества, кальцитонина и бисфосфоната.
[0075]
Антибиотик может включать пенициллиновый антибиотик, цефемовый антибиотик, аминогликозидный антибиотик, макролидный антибиотик, тетрациклиновый антибиотик, пептидный антибиотик и т.д. Пенициллиновый антибиотик может включать бензинпенициллин, феноксиметилпенициллин, метициллин, флуклоксациллин, амоксициллин, ампициллин, пиперациллин, азлоциллин, тикарциллин и т.д. Цефемовый антибиотик может включать цефазолин, цефуроксим, цефамандол, цефотаксим, цефоперазон, цефпирамид, цефалксин, цефаклор, цефиксим, цефтерам и т.д. Аминогликозидный антибиотик может включать гентамицин, нетилмицин, тобрамицин, стрептомицин, неомицин, канамицин, амикацин и т.д. Макролидный антибиотик может включать эритромицин, кларитромицин, рокситромицин, рокитамицин, клиндамицин, азитромицин и т.д. Тетрациклиновый антибиотик может включать тетрациклин, миноциклин, токсициклин и т.д. Кроме того, β-лактамовый антибиотик может включать латамоксеф, фломоксеф, азтреонам, имипенем и панипенем. Кроме того, другой антибиотик может включать ванкомицин, рифампицин, хлорамфеникол и т.д.
[0076]
Агент роста может включать костный морфогенетический белок (BMP), фактор роста кости (BGF), фактор роста тромбоцитов (PDGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), инсулин, инсулиноподобный фактор роста (IGF), гормон, цитокин, трансформирующий фактор роста (TGF) и т.д. Один или несколько из указанных агентов роста могут содержаться в лекарственных препаратах, и они также могут сочетаться с другими широко известными лекарственными препаратами.
[0077]
Различные лекарственные препараты используются в качестве успокаивающего средства в зависимости от того, вызвана ли боль при инъекции рН и осмотическим давлением жидкого лекарственного препарата, существенно отличающегося от биологической жидкости, либо боль вызвана действием лекарственного препарата как такового. В том случае, если боль вызвана различием значений рН и осмотического давления, предпочтительным является жидкий лекарственный препарат, содержащий буферное вещество, вещество, регулирующее тоничность и т.д. С другой стороны, если боль вызвана действием лекарственного препарата как такового, топикальный анестетик и подобные анестетики являются приемлемыми для применения. В качестве топикальных анестетиков могут быть, например, использованы широко известные лекарственные препараты, такие как бензиловый спирт, хлорбутанол, прокаин гидрохлорид, лидокаин гидрохлорид, дибукаин гидрохлорид, мепивакаин гидрохлорид и т.д.
[0078]
Полученное в соответствии с вышеприведенным способом средство, содержащее анти-Fas IgM антитело в соответствии с настоящим изобретением в качестве активного ингредиента, может быть использовано при реализации терапевтического метода или профилактического метода для введения его эффективного количества пациенту с остеоартритом и синовитом. Кроме того, средство, содержащее анти-Fas IgM антитело в соответствии с настоящим изобретением в качестве активного ингредиента, может быть использовано при реализации терапевтического метода или профилактического метода для ингибирования выработки фермента, разрушающего хрящевой матрикс, стимулирования или усиления выработки хрящевого матрикса и индуцирования вызывающего апоптоз средства против макрофага, индуцированного остеоартритом. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает: способ лечения синовита при остеоартрите, предусматривающий введение эффективного количества анти-Fas IgM антител в мишень для воздействия; способ для ингибирования продуцирования фермента, разрушающего хрящевой матрикс, предусматривающий введение эффективного количества анти-Fas IgM антител в мишень для воздействия; способ для выработки хрящевого матрикса, предусматривающий введение эффективного количества анти-Fas IgM антител в мишень для воздействия; способ для индуцирования вызывающего апоптоз средства против макрофага, индуцированного остеоартритом. При этом описанные выше соответствующие способы могут быть скомбинированы при применении указанных анти-Fas IgM антител.
[0079]
-3
-2
-1
-2
-1
Несмотря на то, что лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением используют в качестве пероральной или парентеральной лекарственной формы, предпочтительно использовать его в качестве парентеральной лекарственной формы для инъецируемого лекарственного вещества, вводимых внутривенно жидкостей и т.д. Широко известный метод может быть использован в качестве неограничивающего метода введения парентеральной лекарственной формы. Примеры могут включать внутривенное введение, внутриартериальное введение, подкожное введение, внутримышечное введение, инстилляцию и т.д. Кроме того, лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением может быть непосредственно инъецировано в пораженный участок (например, сустав), либо может быть введено путем хирургического вскрытия пораженного участка. Специалисты в данной области техники могут приемлемым образом выбрать метод введения лекарственного средства, приемлемый для пациента. Эффективное количество анти-Fas IgM антител - основного ингредиента лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением - может содержаться в лекарственном средстве в соответствии с настоящим изобретением. Допустив, что общий вес составляет 100 весовых частей, норма анти-Fas IgM антител в соответствии с настоящим изобретением может составлять 1×10-1×10 весовых частей, предпочтительно 1×10-1×10 весовых частей и более предпочтительно 5×10-5×10 весовых частей. Вводимое количество изменяется в зависимости от пациентов, их возраста, симптомов и т.д. Обычно, ежедневное вводимое количество составляет 1 нг - 100 мкг активного ингредиента антител на одного человека, предпочтительно 10 нг - 10 мкг и более предпочтительно 100 нг - 1 мкг. В иных случаях ежедневно вводимое количество составляет 10 пг - 2 мкг на 1 кг веса, предпочтительно 100 пг - 200 мкг и более предпочтительно 1 пг - 20 мкг. Предпочтительно вводить ежедневно вводимое количество в 2-5 дозах. Более того, количество доз в день может быть сокращено путем получения лекарственного средства в соответствии с настоящим изобретением в виде препарата с пролонгированным действием. Широко известный метод может быть использован при получении такого препарата с пролонгированным действием. Введение нескольких доз или получение препарата с пролонгированным действием позволяет легко поддерживать постоянную концентрацию лекарственного вещества, в результате чего достигается стойкий терапевтический эффект, а также сокращаются побочные эффекты, что позволяет снизить бремя болезни пациента.
[0080]
Несмотря на то, что пояснение настоящего изобретения основано на нижеприведенных конкретных примерах, настоящее изобретение не ограничено указанными примерами.
Пример 1
[0081]
Получение культивируемой клетки
После получения информированного согласия костно-хрящевые ткани и периферийная кровь пациента с остеоартритом были извлечены хирургическим путем, и с помощью нижеприведенного метода были получены синовиальные фибропласты, хрящевые клетки и макрофаг.
[0082]
Синовиальный фибропласт
2
2
2
После получения информированного согласия синовиальные ткани пациента с остеоартритом были извлечены хирургическим путем, которые были измельчены и выдерживались в течение ночи в жидкой модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с низким содержанием глюкозы (DMEM, выпускаемой компанией «Gibco»), культурной среде (37°С), содержащей 1,0 мг/мл коллагеназы, и было проведено отделение культивируемых синовиальных фибропластов. Клетки обычно культивировали в колбе для культивирования (область культивации - 25 см), и при использовании в эксперименте клетки культивировали в полиэтиленовой чашке для культивирования микроорганизмов (диаметр - 6 см). Культура клеток была получена с использованием культурной среды DMEM с добавлением инактивированной эмбриональной бычьей сыворотки (термоинактивированная эмбриональная бычья сыворотка, выпускаемая компанией «TRACE») на 10% от содержания среды, а также 2 мМ L-глютамина, 25 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой кислоты (HEPES), 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина, в CO-инкубаторе (среда с нормальной концентрацией кислорода), установленном на 37°C, влажность насыщения, 5% СО + 95% воздуха. Что касается переноса клеток, клетки промывали фосфатным буферным раствором (PBS, выпускаемым компанией «Nissui»), отслаивали смесью 0,25% раствора трипсина и фосфатного буферного раствора (выпускаемый компанией «Gibco»), диспергировали пипетированием и разбавляли до приемлемой концентрации в среде.
[0083]
Хрящевая клетка
2
2
2
После получения информированного согласия хрящевые ткани пациента с остеоартритом были извлечены хирургическим путем, которые были измельчены и выдерживались в течение ночи в жидкой модифицированной по способу Дульбекко среде Игла с низким содержанием глюкозы (DMEM, выпускаемой компанией «Gibco»), культурной среде (37°C), содержащей 1,5 мг/мл коллагеназы В (коллагеназа В), и проводили отделение культивированных хрящевых клеток. Клетки обычно культивировали в колбе для культивирования (область культивации - 25 см), и при использовании в эксперименте клетки культивировали в полиэтиленовой чашке для культивирования микроорганизмов (диаметр - 6 см). Культура клеток была получена с использованием культурной среды DMEM с добавлением инактивированной эмбриональной бычьей сыворотки (эмбриональная бычья сыворотка, выпускаемая компанией «TRACE») на 10% от содержания среды, а также 2 мМ L-глютамина, 25 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой кислоты (HEPES), 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина, в СО-инкубаторе (среда с нормальной концентрацией кислорода), установленном на 37°С, влажность насыщения, 5% СО + 95% воздуха. Что касается переноса клеток, клетки промывали фосфатным буферным раствором (PBS, выпускаемым компанией «Nissui»), отслаивали смесью 0,25% раствора трипсина и фосфатного буферного раствора (выпускаемый компанией «Gibco»), диспергировали пипетированием и разбавляли до приемлемой концентрации в среде.
[0084]
Макрофаг
2
2
После получения информированного согласия у пациента была взята порция крови объемом 50 мл для получения 1% гепаринизированной крови. Центрифужную пробирку, в которой указанную порцию крови помещали послойно, центрифугировали в течение 30 минут со скоростью 1500 об./мин, в результате чего происходило разделение лимфоцитов и макрофагов. Культура клеток была получена с использованием культурной среды RPMI с добавлением инактивированной эмбриональной бычьей сыворотки (эмбриональная бычья сыворотка, выпускаемая компанией «TRACE») на 10% от содержания среды, а также 2 мМ L-глютамина, 25 мМ N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновой кислоты (HEPES), 100 единиц/мл пенициллина и стрептомицина, в CO-инкубаторе (среда с нормальной концентрацией кислорода), установленном на 37°C, влажность насыщения, 5% CO + 95% воздуха.
[0085]
Получение культуры клеток с использованием двухслойной камеры transwell
6
6
6
Синовиальные фибропласты (1×10/лунку) или макрофаги (1×10/лунку) были диссеминированы в верхнюю часть, хрящевые клетки (1×10/лунку) были диссеминированы в нижнюю часть двухслойного трансвела камеры (Toyobo), разделенной пористым фильтром с размером пор 3 мкм и были культивированы. Верхний слой (слой культуры воспалительных клеток) указанной культуры клеток эквивалентен синовиту, в то время как нижний слой (слой культуры хрящевых клеток) эквивалентен хрящевой ткани. Анти-Fas IgM антитела различной концентрации (0,1, 1,0, 10,0 нг/мл) добавляли к верхнему слою камеры, либо воспалительные цитокины (TNF-α (фактор некроза опухоли-альфа): 10 нг/мл или IL-1β:10 нг/мл) добавляли к верхнему слою при условиях неаддитации и культивировали в течение 48 часов. Временно собирали надосадочную жидкость культуры и клетки и проводили анализ различных активностей клеток с помощью нижеприведенных экспериментальных методов.
Пример 2
[0086] Исследование ингибирующего действия анти-Fas IgM антител на продуцирование фермента (матриксной металлопротеиназы), разрушающего хрящевой матрикс
Действие анти-Fas IgM антител (СН11 (мышиное антитело) (выпускаемое компанией «MBL»)) на продуцирование фермента, разрушающего хрящевой матрикс, усиленное TNF-α фактором, индуцирующим катаболизм хряща, было проанализировано с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA). Анти-Fas IgM антитела (СН-11), использовавшиеся при проведении исследования, являлись антителами, полученными из гибридомы, созданной путем слияния клеток миеломы мыши N8-1 и спленоцитов мыши Balb/c. Гибридома была получена из антител, взятых из линии диплоидных клеток фибробласта человека FS-7.
[0087]
6
Хрящевые клетки отделенные/культивированные с помощью вышеуказанного метода, диссеминировали в нижний слой трансвела камеры, и синовиальные фибропласты диссеминировали в верхний слой камеры при плотности 1×10/лунку. К верхнему слою добавляли TNF-α (10 нг/мл). Кроме того, к верхнему слою добавляли анти-Fas IgM антитела различной концентрации (0,1, 1,0, 5,0, 10,0 нг/мл) или препарат гиалуронан (НА) в сочетаниях, как показано в нижеприведенной таблице 5, культивировали в течение 48 часов и собирали раствор культуры. Препарат гиалуронан (НА) также использовали в качестве контрольного препарата. Сочетание условий исследования приведено в таблице 5 ниже. В таблице 5 TNF-α концентрация TNF-α (+) составляет 10 нг/мл. Единица концентрации препарата гиалуронана составляет мг/мл, в то время как единица концентрации анти-Fas IgM антител СН-11 составляет нг/мл. No. 1 в таблице является негативным контролем, и No. 2 - позитивным контролем.
[Таблица 5]
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
TNF-α
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
НА
-
-
0.1
1,0
-
-
-
-
1,0
1,0
1,0
1,0
СН-11
-
-
-
-
0,1
1,0
5,0
10,0
0,1
1,0
5,0
10,0
[0088]
3
4
Концентрации матриксной металлопротеиназы-1 и матриксной металлопротеиназы-3 фермента, разрушающего хрящевой матрикс, в надосадочной жидкости культуры определяли с помощью набора реактивов ELISA (матриксная металлопротеиназа-1, матриксная металлопротеиназа-3: выпускаемые компанией «R&D»), что является стандартной технологией, известной в настоящее время в данной области техники. Твердофазный иммуноферментный анализ проводили с помощью стандартного метода, приведенного ниже. Твердофазный иммуноферментный анализ проводили с образцом примера номер 6 (n=6). Образец разбавленной надосадочной жидкости культуры в количестве 100 мкл помещали в каждую лунку сенсибилизационной планшеты и статично выдерживали в течение одного при комнатной температуре (первичная реакция). После первичной реакции каждую лунку полностью промывали более 4 раз фосфатным буферным раствором с помощью спринцовки. Козьи антикроличьи антитела IgG (H+L), меченые пероксидазой из хрена, 3000-кратно разбавленные 0,1% раствором Tween20-PBS, вводили в каждую лунку по отдельности по 100 мкл и статично выдерживали в течение одного часа при комнатной температуре (вторичная реакция). После вторичной реакции каждую лунку аналогичным образом промывали фосфатным буферным раствором, в который добавляли раствор 0,8 мМ тетраметибензидина по 100 мкл на лунку, и цветообразование отмечалось в течение 5-20 минут при 30°С (цветообразующая реакция). Цветообразующая реакция была прекращена путем добавления 1,5Н HPO по 100 мкл на лунку, и поглощающую способность измеряли при 450 нм с использованием спектрофотометра для прочтения титрационных микропланшетов.
Измерение концентрации калибровали с использованием контрольного лиофилизирующего реагента в соответствии с инструкцией, предоставленной фирмой-производителем, и был проведен тест на существенные различия. На Фиг."*" указывает на то, что коэффициент отказа (Р значение) теста на существенные различия составляет менее 0,05 (Р<0,05), и "**" указывают на то, что коэффициент отказа (Р значение) теста на существенные различия менее, чем 0,01 (Р<0,01) (он является аналогичным и далее по тексту).
[0089]
На Фиг.2А представлена диаграмма, на которой проиллюстрировано, как анти-Fas IgM антитело влияет на способность продуцирования матриксной металлопротеиназы-1. На вертикальной оси Фиг.2А приведена матриксная металлопротеиназа-1, полученная из хрящевых клеток, в концентрации на 1 мл культурной среды. В соответствии с полученными результатами способность подавления продуцирования фермента, разрушающего хрящевой матрикс (матриксная металлопротеиназа-1), усиленная TNF-α, была выше в анти-Fas IgM антителах (номера 5-8), чем в одной гиалуроновой кислоте (номера 3 и 4). Таким образом, анти-Fas IgM антитела продемонстрировали способность эффективно препятствовать выработке матриксной металлопротеиназы-1.
[0090]
На Фиг.2В представлена диаграмма, на которой проиллюстрировано, как анти-Fas IgM антитело влияет на способность продуцирования матриксной металлопротеиназы-3. На вертикальной оси Фиг.2В приведена матриксная металлопротеиназа-3, полученная из хрящевых клеток, в концентрации на 1 мл культурной среды. В соответствии с полученными результатами способность подавления продуцирования фермента, разрушающего хрящевой матрикс (матриксная металлопротеиназа-3), усиленная TNF-α, была выше в анти-Fas IgM антителах (номера 5-8), чем в одной гиалуроновой кислоте (номера 3 и 4). Таким образом, анти-Fas IgM антитела продемонстрировали способность эффективно препятствовать выработке матриксной металлопротеиназы-3.
[0091]
На Фиг.2 анти-Fas IgM антитела продемонстрировали способность эффективно подавлять выработку матриксной металлопротеиназы фермента, разрушающего хрящевой матрикс. Как указывалось выше, матриксная металлопротеиназа разрушает суставной хрящ. Таким образом, матриксная металлопротеиназа может являться причиной, вызывающей остеоартрит или ухудшающей состояние остеоартрита. Как показано в настоящем примере, анти-Fas IgM антитело способно подавлять выработку матриксной металлопротеиназы. Таким образом, анти-Fas IgM антитело способно препятствовать возникновению остеоартрита и способно препятствовать ухудшению состояния остеоартрита. Таким образом, анти-Fas IgM антитело может быть использовано приемлемым образом в качестве профилактического средства для лечения остеоартрита. Кроме того, поскольку матриксная металлопротеиназа-1 и матриксная металлопротеиназа-3 также вовлечены в иммунный ответ, анти-Fas IgM антитело также может быть использовано в качестве профилактического средства или терапевтического средства для лечения синовита при остеоартрите, возникающего вследствие заболевания остеоартритом, за счет подавления выработки матриксной металлопротеиназы-1 и матриксной металлопротеиназы-3.
Пример 3
[0092] Исследование стимулирующего действия анти-Fas IgM антител на пониженную способность выработки хрящевого матрикса
Стимулирующее действие анти-Fas IgM антител на пониженную способность выработки хрящевого матрикса (протеогликана), обусловленную TNF-α фактором, индуцирующим катаболизм хряща или IL-1β, было проанализировано с использованием метода твердофазного иммуноферментного анализа.
6
Аналогичным способом, применявшимся в вышеприведенном примере "Исследование ингибирующего действия анти-Fas IgM антител на продуцирование фермента (матриксной металлопротеиназы), разрушающего хрящевой матрикс", хрящевые клетки диссеминировали в нижний слой камеры transwell, и синовиальные фибропласты диссеминировали в верхний слой камеры при плотности 1×10/лунку. К верхнему слою добавляли TNF-α (10 нг/мл) или IL-1β (10 нг/мл). Кроме того, к верхнему слою добавляли анти-Fas IgM антитела различной концентрации (0,1, 1,0, 5,0, 10,0 нг/мл) или препарат гиалуронан (НА), культивировали в течение 48 часов при условиях неаддитации и собирали раствор культуры. Хрящевые матриксы в надосадочной жидкости культуры определяли с использованием набора реактивов ELISA (протеогликан: выпускаемый компанией «Biosource»), что является стандартной технологией, известной в настоящее время в данной области техники. Результат приведен на Фиг.3.
[0093]
На Фиг.3 представлена диаграмма, иллюстрирующая действие анти-Fas IgM антитела на пониженную способность выработки хрящевого матрикса (протеогликана). На Фиг.3 на вертикальной оси приведено количество выработанного протеогликана. Более высокие значения на вертикальной оси указывают на большее количество выработанного протеогликана, то есть, данные указывают на то, что анти-Fas IgM антитела стимулировали способность выработки протеогликана, подавляемой TNF-a. В результате анти-Fas IgM антитела продемонстрировали способность усиления выработки протеогликана, подавляемой TNF-α и IL-1β.
[0094]
Как показано на Фиг.3, анти-Fas IgM антитело стимулирует синтез хрящевого матрикса (протеогликана). При остеоартрите наблюдается разрушение суставного хрящ как патологического состояния. Таким образом, ввиду того, что анти-Fas IgM антитело способно усиливать синтез хрящевого матрикса (протеогликана), необходимого для восстановления суставного хряща, разрушенного при остеоартрите, оно может быть использовано приемлемым образом в качестве терапевтического средства для лечения остеоартрита.
Пример 4
[0095] Ингибирующее действие анти-Fas IgM антитела на апоптоз
Ингибирующее действие анти-Fas IgM антитела на апоптоз хрящевых клеток, вызванный TNF-α фактором, индуцирующим катаболизм хряща, было исследовано с помощью прибора обнаружения апоптоза ApoStand ELISA (Biomol International). Указанный прибор способен количественно обнаруживать апоптоз путем денатурирования, в частности, ДНК апоптозных клеток формамидом и обнаруживать денатурированную ДНК с помощью антитела к анти-одноцепочечной ДНК.
[0096]
6
Аналогичным способом, применявшимся в вышеприведенном примере "Исследование ингибирующего действия анти-Fas IgM антител на продуцирование фермента (матриксной металлопротеиназы), разрушающего хрящевой матрикс", хрящевые клетки диссеминировали в нижний слой камеры transwell, и макрофаги диссеминировали в верхний слой камеры при плотности 1×10/лунку. К верхнему слою добавляли TNF-α (10 нг/мл). Кроме того, к верхнему слою добавляли анти-Fas IgM антитела (10,0 нг/мл) и культивировали в течение 48 часов при условиях неаддитации. Среду/индуцирующие вещества удаляли, к набору реактивов был добавлен раствор для связывания присоединенных клеток, и клетки фиксировались. Далее, раствор удаляли/высушивали, добавляли формамид, нагревали при 56°C и подвергали термической денатурации ДНК апоптозных клеток. После охлаждения формамид удаляли и добавляли блокирующий раствор для блокирования. Блокирующий раствор удаляли, добавляли антитело анти-одноцепочечной ДНК (ssДНК), и антитело культивировали в течение 4-х часов при комнатной температуре. После троекратного промывания фосфатным буферным раствором измеряли поглощающую способность при 405 нм спектрофотометром для прочтения титрационных микропланшетов. Результаты приведены на Фиг.4.
[0097]
На Фиг.4 представлена диаграмма, иллюстрирующая эффект супрессии апоптоза анти-Fas IgM антитела. На Фиг.4 на вертикальной оси приведен процент (%) апоптоза клеточного ядра, т.е. более низкое значение указывает на то, что апоптоз подавлялся в большей степени. Результаты указывают на то, что анти-Fas IgM антитело подавляет апоптоз хрящевых клеток, вызванный TNF-α. При остеоартрите, как известно, TNF-α находится в состоянии индуцирования. Таким образом, настоящий пример продемонстрировал, что анти-Fas IgM антитело способно препятствовать развитию апоптоза хрящевых клеток, вызываемого остеоартритом.
[0098]
На Фиг.4 продемонстрирована способность анти-Fas IgM антитела препятствовать гибели хрящевых клеток, вызванной макрофагом. Таким образом, анти-Fas антитело IgM типа рассматривается как антитело, способное препятствовать дегенерации хряща, и, следовательно, может быть предпочтительно использовано в качестве терапевтического средства или профилактического средства для лечения остеоартрита. Более того, считается, что указанное воздействие возникало ввиду того, что анти-Fas IgM антитело вызывало апоптоз макрофага. Как известно, макрофаг индуцирует воспалительный цитокин. Таким образом, анти-Fas IgM антитело подавляет высвобождение воспалительного цитокина и воспалительную реакцию путем индуцирования апоптоза макрофага. Следовательно, анти-Fas IgM антитело может быть использовано в качестве терапевтического средства или профилактического средства для подавления вторичной воспалительной реакции (синовита при остеоартрите), вызываемой остеоартритом.
Пример 5
[0099]
Что касается потенциала агонистического анти-Fas антитела, обладающего способностью индуцирования апоптоза, для использования в качестве терапевтического лекарственного вещества для лечения остеоартрита была проведена оценка в эксперименте in vitro различия потенциала ввиду различия изотипа (IgG или IgM) антитела. Клоны UB2 (выпускаемые компанией «MBL») и клоны ZB4 (выпускаемые компанией «MBL») использовали в качестве IgG антитела. Антитела СН-11 (выпускаемые компанией «MBL») и антитела 7С11 (выпускаемые компанией «Beckman Coulter») использовали в качестве IgM антитела. Контрольные антитела IgG изотипа (выпускаемые компанией «SouthernBiotech») и контрольные антитела IgM изотипа (выпускаемые компанией « SouthernBiotech») использовались в качестве контрольных антител.
[0100] Получение культивируемых клеток
После получения информированного согласия костно-хрящевые ткани и периферийная кровь пяти пациентов (n=5) с остеоартритом были извлечены хирургическим путем, и с помощью аналогичного метода, используемого в примере 1, были получены синовиальные фибропласты, хрящевые клетки и макрофаг.
[0101] Получение культуры клеток с использованием двухслойной камеры transwell
5
5
5
Синовиальные фибропласты (1×10/лунку) или макрофаги (1×10/лунку) были диссеминированы в верхнюю часть, хрящевые клетки (1×10/лунку) были диссеминированы в нижнюю часть двухслойной камеры transwell (Toyobo), разделенной пористым фильтром с размером пор 3 мкм и были культивированы. Верхний слой (слой культуры воспалительных клеток) указанной культуры клеток эквивалентен синовиту, в то время как нижний слой (слой культуры хрящевых клеток) эквивалентен хрящевой ткани. Анти-Fas IgM антитела различной концентрации или контрольное антитело изотопа добавляли к верхнему слою камеры, либо воспалительные цитокины (TNF-α: 10 нг/мл) добавляли к верхнему слою при условиях неаддитации и культивировали в течение 48 часов. Временно собирали надосадочную жидкость культуры и клетки и проводили анализ различных активностей клеток с помощью нижеприведенных экспериментальных методов.
[0102] Исследование ингибируюшего действия анти-Fas IgM антител каждого изотипа на продуцирование фермента (матриксной металлопротеиназы), разрушающего хрящевой матрикс
Действие анти-Fas IgM антител каждого изотипа на продуцирование фермента, разрушающего хрящевой матрикс, усиленного TNF-α фактором, индуцирующим катаболизм хряща, было проанализировано с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
5
Хрящевые клетки, отделенные/культивированные с использованием вышеуказанного метода, диссеминировали в нижний слой, трансвела камеры, и синовиальные фибробласты диссеминировали в верхний слой камеры при плотности 1×10/лунку. К верхнему слою добавляли TNF-α (10 нг/мл). Кроме того, к верхнему слою добавляли анти-Fas IgM антитела различной концентрации (0,01 нм/мл), культивировали в течение 48 часов при условиях неаддитации, и собирали раствор культуры.
Концентрации фермента, разрушающего хрящевой матрикс (матриксная металлопротеиназа-1 и матриксная металлопротеиназа-3), в надосадочной жидкости культуры определяли с помощью набора реактивов ELISA (матриксная металлопротеиназа-1, матриксная металлопротеиназа-3, выпускаемых компанией «R&D»), что является стандартной технологией, известной в настоящее время в данной области техники. Твердофазный иммуноферментный анализ проводили аналогичным образом, как указывалось выше. Результаты приведена на Фиг.5.
[0103]
На Фиг.5А приведена диаграмма, иллюстрирующая, как анти-Fas IgM антитело или анти-Fas IgG антитело влияет на способность продуцирования матриксной металлопротеиназы-1 хрящевых клеток. На вертикальной оси на Фиг.5А приведены значения матриксной металлопротеиназы-1, полученной из хрящевых клеток, в концентрации на 1 мл культурной среды. No. 1 на Фиг.5А указывает на негативный контроль, в то время как No. 2 показывает на позитивный контроль. В соответствии с полученными результатами способность подавления продуцирования фермента, разрушающего хрящевой матрикс (матриксная металлопротеиназа-1), усиленная TNF-α, была выше в анти-Fas IgM антителах (номера 7-8), чем в анти-Fas IgG антителах (номера 5 и 6). Таким образом, считается, что анти-Fas IgM антитела способны эффективно препятствовать выработке матриксной металлопротеиназы-1.
[0104]
На Фиг.5В приведена диаграмма, иллюстрирующая, как анти-Fas IgM антитело или анти-Fas IgG антитело влияет на способность продуцирования матриксной металлопротеиназы-3 хрящевых клеток. На вертикальной оси на Фиг.5В приведены значения матриксной металлопротеиназы-3, полученной из хрящевых клеток, в концентрации на 1 мл культурной среды. No. 1 на Фиг.5В указывает на негативный контроль, в то время как No. 2 показывает на позитивный контроль. В соответствии с полученными результатами способность подавления продуцирования фермента, разрушающего хрящевой матрикс (матриксная металлопротеиназа-3), усиленная TNF-α, была выше в анти-Fas IgM антителах (номера 7-8), чем в анти-Fas IgG антителах (номера 5 и 6). Таким образом, считается, что анти-Fas IgM антитела способны эффективно препятствовать выработке матриксной металлопротеиназы-3.
[0105]
На Фиг.5 анти-Fas IgM антитела продемонстрировали способность эффективно подавлять выработку матриксной металлопротеиназы фермента, разрушающего хрящевой матрикс. Как указывалось выше, матриксная металлопротеиназа разрушает суставной хрящ. Следовательно, матриксная металлопротеиназа может являться причиной, вызывающей остеоартрит или ухудшающей состояние остеоартрита. Как показано в настоящем примере, анти-Fas IgM антитело способно подавлять выработку матриксной металлопротеиназы. Таким образом, анти-Fas IgM антитело способно препятствовать возникновению остеоартрита и способно препятствовать ухудшению состояния остеоартрита. Таким образом, анти-Fas IgM антитело может быть использовано приемлемым образом в качестве профилактического средства для лечения остеоартрита. Кроме того, поскольку матриксная металлопротеиназа-1 и матриксная металлопротеиназа-3 также вовлечены в иммунный ответ, анти-Fas IgM антитело также может быть использовано в качестве профилактического средства или терапевтического средства для лечения синовита при остеоартрите, возникающего вследствие заболевания остеоартритом, за счет подавления выработки матриксной металлопротеиназы-1 и матриксной металлопротеиназы-3.
Пример 6
[0106] Ингибирующее действие анти-Fas IgM антитела каждого изотопа на апоптоз
Ингибирующее действие анти-Fas IgM антитела каждого изотипа на апоптоз хрящевых клеток, вызванный TNF-α фактором, индуцирующим катаболизм хряща, было исследовано с помощью прибора обнаружения апоптоза ApoStand ELISA (Biomol International).
[0107]
5
Аналогичным способом, как указывалось выше, хрящевые клетки диссеминировали в нижний слой камеры transwell, и макрофаги диссеминировали в верхний слой камеры при плотности 1×l0/лунку. К верхнему слою добавляли TNF-α (10 нг/мл). Кроме того, к верхнему слою добавляли анти-Fas IgM антитела (0,01 нм/М) и культивировали в течение 48 часов при условиях неаддитации. Среду/индуцирующие вещества удаляли, к набору реактивов был добавлен раствор для связывания присоединенных клеток, и клетки фиксировались. Далее, раствор удаляли/высушивали, добавляли формамид, нагревали при 56°C и подвергали термической денатурации ДНК апоптозных клеток. После охлаждения формамид удаляли и добавляли блокирующий раствор для блокирования. Блокирующий раствор удаляли, добавляли антитело анти-одноцепочечной ДНК (ssДНК), и антитело культивировали в течение 4-х часов при комнатной температуре. После троекратного промывания фосфатным буферным раствором измеряли поглощающую способность при 405 нм спектрофотометром для прочтения титрационных микропланшетов. Результаты приведены на Фиг.6.
[0108]
На Фиг.4 продемонстрирована способность анти-Fas IgM антитела препятствовать гибели хрящевых клеток, вызванной макрофагом. Таким образом, анти-Fas антитело IgM типа рассматривается как антитело, способное препятствовать дегенерации хряща, и, следовательно, может быть предпочтительно использовано в качестве терапевтического средства или профилактического средства для лечения остеоартрита. Более того, считается, что указанное воздействие возникало ввиду того, что анти-Fas IgM антитело вызывало апоптоз макрофага. Как известно, макрофаг индуцирует воспалительный цитокин. Таким образом, анти-Fas IgM антитело подавляет высвобождение воспалительного цитокина и воспалительную реакцию путем индуцирования апоптоза макрофага. Следовательно, анти-Fas IgM антитело может быть использовано в качестве терапевтического средства или профилактического средства для подавления вторичной воспалительной реакции (синовита при остеоартрите), вызываемой остеоартритом.
[0109]
На Фиг.6 продемонстрирована способность анти-Fas IgM антитела препятствовать гибели хрящевых клеток, вызванной макрофагом. Таким образом, анти-Fas антитело IgM типа рассматривается как антитело, способное препятствовать дегенерации хряща, и, следовательно, может быть предпочтительно использовано в качестве терапевтического средства или профилактического средства для лечения остеоартрита. Более того, считается, что указанное воздействие возникало ввиду того, что анти-Fas IgM антитело вызывало апоптоз макрофага. Как известно, макрофаг индуцирует воспалительный цитокин. Таким образом, анти-Fas IgM антитело подавляет высвобождение воспалительного цитокина и воспалительную реакцию путем индуцирования апоптоза макрофага. Следовательно, анти-Fas IgM антитело может быть использовано в качестве терапевтического средства или профилактического средства для подавления вторичной воспалительной реакции (синовита при остеоартрите), вызываемой остеоартритом.
Пример 7
[0110] Действие анти-Fas IgM антитела на модель остеоартрита у крыс
Был проведен тест оценки лечебного эффекта анти-Fas IgM антитела СН-11 с использованием крыс, у которых был вызван остеоартрит.
[0111] Подготовка модели остеоартрита у крыс
После того, как крыс (крысы линии Wister, масса 200-250 г) подвергали карантину, приучали к новой обстановке и кормили в течение приблизительно одной недели, шерсть на участке коленного сустава левой лапы удаляли под комбинированной анестезией с применением кетамин гидрохлорида (Pflzer, Inc., Ketalar 100) и ксилазин гидрохлорида (внутримышечное введение), либо в случае неудовлетворительного анестезирующего действия анестезию проводили путем внутривенного введения комбинированного анестезирующего раствора или пентобарбитала натрия, и затем проводили дезинфекцию с помощью йодной системы антибактериального препарата Isodine. После дезинфекции эпидермис внутри коленного сустава был рассечен, внутренняя боковая связка коленного сустава была разрезана, и суставная капсула была осмотрена/вскрыта для обнажения и удаления всего медиального мениск. Далее иссеченные ткани и эпидермис суставной капсулы были сшиты. При сшивании хирургический участок промывали физиологическим солевым раствором (500 мг (фактор)/20 мл), содержащим антибиотик (ампициллин натрия для инъецирования)
Подготовленные крысы с моделью остеоартрита были разделены на две подгруппы, как показано в таблице 6 ниже, и путем внутрисуставного инъецирования крысам вводили иглой шприца 27 калибра исследуемые препараты или целевые растворы один раз в неделю в течение 24 недель.
[Таблица 6]
Экспериментальная группа
Проводимое лечение
Количество аутопсий /4 недели
Общее количество
А
Контрольная группа
Операция при артрите + физиологический раствор (средней концентрации)
-
5
В
Контрольная группа, получавшая неспецифическое антитело
Операция при артрите + введение IgM антитела
5
30
С
Группа, получавшая малые дозы исследуемого препарата
Операция при артрите + малая доза антитела СН-11
5
30
D
Группа, получавшая большие дозы исследуемого препарата
Операция при артрите + высокая доза антитела СН-11
5
30
Е
Группа хирургического контроля
Имитация операции + физиологический раствор (средней концентрации)
-
2
[0112] Патологическое (гистопатологическое) исследование
Через каждые 4 недели пять крыс умерщвляли, применяя путем кровопускания при глубокой анестезии пентобарбиталом натрия (внутривенное введение), и затем проводили аутопсию. Что касается образцов аутопсий, запланированных на 8-ю, 12-ю и 24-ю недели, были извлечены ткани правого и левого коленного сустава, сердце, легкие, печень, селезенка, почки, головной мозг, семенник и семенной пузырек, которые фиксировали 4% параф ормальдегида. Суставные ткани декальцифицировали с помощью декальцифицирующего раствора Planck-Rychlo и нейтролизовали, затем проводили окрашивание гематоксилин-эозином и сафранином О погруженных в парафин срезов образцов. Что касается других органов, проводили окрашивание гематоксилин-эозином и сафранином О погруженных в парафин срезов образцов и выполняли гистопатологические тесты с помощью оптического микроскопа.
[0113] Влияние введения анти-Fas IgM антитела на шкалу патологии ткани при артрозе
Подготовленные крысы с моделью остеоартрита были разделены на три группы, и в сустав левого колена мышей контрольной группы (А и В на Фиг.3) инъецировали 50,0 мкл физиологического раствора или раствора контрольного антитела (10,0 нг/мл), и в сустав левого колена группы, которой вводили СН-11 (С и D на Фиг.3) инъецировали 50,0 мкл СН-11 (группа, которой вводили малые дозы: 1,0 нг/мл, группа, которой вводили большие дозы: 10,0 нг/мл) один раз в неделю с использованием инъекционного шприца с микроиглой. В каждой группе использовали пример номер 4 (N=4). На 4-й, 8-й, 12-й, 16-й и 24-й неделях наблюдали состояние артрита и артроза (шкала патологии ткани при артрозе) после умерщвления, и проводили статистическое сравнение различий между двумя группами методом Student's Т. В обеих группах сустав правого колена не подвергался лечению и проводилось сравнительное наблюдение степени прогрессирования артроза, Результаты приведены на Фиг.7. В качестве шкалы патологии ткани при артрозе использовали модифицированную шкалу Mankin, приведенную на Фиг.4.
[0114]
На Фиг.7А приведены результаты окрашивания сафранином О. На Фиг.7В приведены дефекты хрящевых клеток. На Фиг.7С представлена структура хряща. На вертикальной оси на Фиг.7А-7С приведены баллы, и на горизонтальной оси приведено изменение во времени. Как показано на Фиг.7А-7С, по результатам наблюдений степень дегенерации хряща (модифицированная шкала Mankin) коленного сустава крыс в контрольной группе увеличилась со временем, и были подтверждены индуцирование и обострение симптомов (переход от начальной до поздней стадии остеоартрита) артроза. С другой стороны, проявляется тенденция к снижению количества баллов в группе крыс, которым вводили СН-11, по сравнению со средним количеством баллов в контрольной группе с 8-й недели после начала введения средства и после 12-й недели, статистически значимые различия наблюдались как в группе крыс, которым вводили малые дозы СН11, и в группе крыс, которым вводили большие дозы СН-11. Следовательно, было продемонстрировано, что анти-Fas IgM антитело СН-11 подавляет дегенерацию хряща у крыс с остеоартритом от начальной до поздней стадии. Таким образом, было продемонстрировано, что анти-Fas IgM антитело может быть эффективно использовано для лечения заболеваний, классифицируемых по стадиям от начальной до поздней стадии остеоартрита, сопровождаемого дегенерацией хряща.
Пример 8
[0115] Влияние введения анти-Fas IgM антитела на патологические ткани
Был проведен анализ влияния на каждый вид ткани при введении анти-Fas IgM антитела крысам с остеоартритом путем вышеуказанного гистопатологического исследования. Крысы с 12-недельной и 24-недельной моделью артрита после умерщвления были использованы в качестве крыс с моделью остеоартрита. Обследованные и сфотографированные с помощью оптического микроскопа патологические образцы тканей коленного сустава каждой крысы представлены на Фиг.8 и 9. На Фиг.8 и 9, "х40" и "х200" указывает на увеличение оптического микроскопа.
[0116]
На Фиг.8 представлены снимки, иллюстрирующие гистопатологические образцы крыс с моделью остеоартрита через 12 недель после лечения. На Фиг.8А-8F представлены гистопатологические образцы крыс с моделью остеоартрита в контрольной группе. На Фиг.8G-8J представлены гистопатологические образцы крыс с остеоартритом из группы, получавшей малые дозы СН-11 (СН-11: доза, составлявшая 1,0 нг/мл). На Фиг.8К-8N представлены гистопатологические образцы крыс с остеоартритом из группы, получавшей большие дозы СН-11 (СН-11: доза, составлявшая 10,0 нг/мл). На Фиг.80 представлены гистопатологические образцы крыс с моделью остеоартрита в контрольной группе. На Фиг.8Р представлены гистопатологические образцы крыс с моделью остеоартрита из группы, получавшей малые дозы (СН-11: доза, составлявшая 1,0 нг/мл). На Фиг.8В, Фиг.8D, Фиг.8F, Фиг.81, Фиг.8К и Фиг.8М представлены увеличенные снимки участков, окруженных квадратом на Фиг.8А, Фиг.8С, Фиг.8Е, Фиг.8Н, Фиг.8J, Фиг.8L и Фиг.8N, соответственно.
[0117]
В соответствии с результатами, представленными на Фиг.8, дегенерация хряща (скопление хрящевых клеток и исчезновение хрящевых клеток) была подтверждена в контрольной группе (Фиг.8A-8F и 80) по сравнению с группой крыс, получавшей СН-11 (Фиг.8G-8N и 8Р). Скопление хрящевых клеток может быть определено на основе увеличения участка окрашивания сафранином О. При этом исчезновение хрящевых клеток может быть определено на основе уменьшения участка окрашивания сафранином О, как показано на Фиг.8O и 8Р. Данный результат указывает на то, что введение СН-11 позволяет подавлять дегенерацию хряща, СН-11 способно обеспечить лечение и профилактику остеоартрита, сопровождаемого дегенерацией хряща.
[0118]
На Фиг.9 приведены снимки, иллюстрирующие гистопатологические образцы крыс с моделью остеоартрита через 24 недели после лечения. На Фиг.9А-9Н представлены гистопатологические образцы крыс с моделью остеоартрита в контрольной группе. На Фиг.9A-9L представлены гистопатологические образцы крыс с остеоартритом из группы, получавшей малые дозы СН-11 (СН-11: доза, составлявшая 1,0 нг/мл). На Фиг.9М - 9Р представлены гистопатологические образцы крыс с остеоартритом из группы, получавшей большие дозы СН-11 (СН-11: доза, составлявшая 10,0 нг/мл). На Фиг.9В, Фиг.9D, Фиг.9F, Фиг.9Н, Фиг.91, Фиг.9К, Фиг.9М и Фиг.9O представлены увеличенные снимки участков, окруженных квадратом на Фиг.9А, Фиг.9С, Фиг.9Е, Фиг.9G, Фиг.9J, Фиг.9L, Фиг.9N и Фиг.9Р, соответственно.
[0119]
В соответствии с результатами, представленными на Фиг.9, дегенерация хряща (исчезновение хрящевых клеток и структурная дегенерация хрящевого матрикса) была подтверждена в контрольной группе (Фиг.9А-9Н) по сравнению с группой крыс, которым вводили СН-11 (Фиг.9I-9P). Это указывает на то, что введение СН-11 позволяет подавлять дегенерацию хряща и что СН-11 позволяет проводить лечение и профилактику заболеваний, классифицируемых на стадии от начальной до поздней стадии остеоартрита, сопровождаемого дегенерацией хряща.
[0120]
Кроме того, наблюдалось, что у крыс с данной моделью остеоартрита в группе крыс, которым внутрисуставно вводили СН-11, обеспечивалось существенное подавление вторичного синовита (воспаления) и дегенерации хряща по сравнению с контрольной группой крыс. Более того, пролиферативное изменение костей (костные шпоры), которое наблюдалось в контрольной группе крыс на более поздней стадии проведения эксперимента, практически не наблюдалось в группе крыс, которым внутрисуставно вводили СН-11. Что касается внутренних органов, кроме коленных суставов (сердце, легкие, печень, селезенка, почки, головной мозг, семенник и семенной пузырек), не было обнаружено существенных гистологических различий между крысами контрольной группы и крысами группы, которым вводили СН-11. Таким образом, можно сделать вывод о том, что анти-Fas IgM антитело способно, в частности, препятствовать развитию заболеваний, классифицируемых на стадии от начальной до поздней стадии остеоартрита, сопровождаемого дегенерацией хряща у животных.
Промышленная применимость
[0121]
Терапевтическое средство или профилактическое средство в соответствии с настоящим изобретением может быть использовано в фармацевтической промышленности.