IL-17A-СВЯЗЫВАЮЩИЙ АГЕНТ И СПОСОБЫ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
IL-17A LINKING AGENT AND METHODS FOR USE THEREOF

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к IL-17A- связывающему агенту и к его применению в качестве терапевтического средства, в частности, в качестве терапевтического средства для различных воспалительных или аутоиммунных заболеваний.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Цитокины из семейства интерлейкина-17 названы, соответственно, IL-17А - IL-17F. В то же время, также обнаружено семейство их рецепторов, IL-17 рецептор А - IL-17 рецептор Е. Эти цитокины IL-17 связываются с соответствующим рецептором, опосредуя таким образом различные воспалительные ответы.
Наиболее типичным представителем семейства является IL-17A. Лимфоциты, которые мигрируют к сайту инфекции или повреждения, могут секретировать IL-17A. С одной стороны, IL-17A индуцирует экспрессию воспалительных цитокинов и хемокинов, привлекая тем самым больше клеток иммунной системы к сайту воспаления и усиливая воспалительный ответ; с другой стороны, IL-17A индуцирует экспрессию некоторых факторов, имеющих отношение к восстановлению тканей, ускоряя таким образом восстановление организма. Несмотря на то, что интерлейкин-17А влияет на усиление защитного иммунного ответа и на защиту организмов в процессе борьбы с инфекцией и в ходе восстановления тканей хозяина, у многих пациентов, страдающих от аутоиммунных заболеваний и рака, интерлейкин-17А имеет высокий уровень экспрессии; чрезмерная экспрессия интерлейкина-17А отрицательно влияет на процесс развития патологии, так как он может индуцировать экспрессию различных воспалительных факторов. Во многих экспериментах на животных доказано, что патологическая тяжесть различных аутоиммунных заболеваний может быть эффективно подавлена с помощью дефицита интерлейкина-17А или нейтрализации интерлейкина-17А за счет антител. Существует доказательство того, что сигнал IL-17 продемонстрировал определенный эффект в качестве мишени для лечения аутоиммунных заболеваний, в том числе ревматоидного артрита (РА), псориаза, болезни Крона, рассеянного склероза (PC), астмы и волчанки (см, например, Aggarwal et al., J. Leukoc. Biol, 71 (1): 1-8 (2002); Lubberts et al.)
Человеческий IL-17 представляет собой ген, кодирующий полипептид, имеющий до 155 аминокислот. Полипептид включает в себя 19-аминокислотную сигнальную последовательность и 132-аминокислотную зрелую область. При относительной молекулярной массе 17000 Да, человеческий IL-17A представляет собой гликопротеин, существующий в форме гомодимера или гетеродимера (Spriggs et al, J. Clin. Immunol, 17: 366-369 (1997)). IL-17F, гомолог, может связываться с IL-17A с образованием гетеродимера IL-17A/F. Аминокислотная последовательность IL-17F (IL-24, ML-1) имеет до 55% сходства с последовательностью IL-17A, при этом оба имеют один и тот же рецептор, IL-17R. IL-17R экспрессируется повсеместно во многих клетках, в том числе в клетках эндотелия сосудов, в периферических Т-клетках, В-клетках, фибробластах, миеломоноцитах и в стромальных клетках костного мозга (Kolls et al, Immunity, 21: 467-476 (2004); Kawaguchi et al, J. AIIergy Clin. Immunol, 114 (6): 1267-1273 (2004); Moseley et al, Cytokine Growth Factor Rev, 14(2): 155-174 (2003)).
С момента открытия интерлейкина-17А и до настоящего времени было обнаружено множество анти-IL-17А антител, таких как CN101001645A, CN101326195A, CN101646690A, однако все еще существует потребность в разработке различных видов усовершенствованных антител для эффективного уменьшения или устранения активности IL -17 при воспалительном ответе и аутоиммунных заболеваниях.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предложено анти-IL-17А антитело с более высокой аффинностью и более длительным периодом полувыведения.
В настоящем изобретении предложен IL-17А-связывающий агент, включающий:
Вариабельную область легкой цепи антитела, включающую 0-3 областей LCDR (гипервариабельных областей легкой цепи), выбранных из представленных в SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15; а также
Вариабельную область тяжелой цепи антитела, включающую 0-3 областей HCDR (гипервариабельных областей тяжелой цепи), выбранных из представленных в SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12;
где числа областей CDR вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи антитела одновременно не равны 0.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, IL-17А-связывающий агент содержит SEQ ID NO: 13.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, IL-17А-связывающий агент содержит SEQ ID NO: 14.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, IL-17А-связывающий агент содержит SEQ ID NO: 15.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, IL-17А-связывющий агент содержит SEQ ID NO: 10.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, IL-17А-связывающий агент содержит SEQ ID NO: 11.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, IL-17А-связывающий агент содержит SEQ ID NO: 12.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, IL-17А-связывающий агент, содержит одну область LCDR, выбранную из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, IL-17А-связывающий агент содержит одну область HCDR, выбранную из SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, IL-17А-связывающий агент содержит две области LCDR, выбранные из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, IL-17А-связывающий агент содержит две области HCDR, выбранные из SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, IL-17А-связывающий агент содержит три области LCDR, где аминокислотная последовательность LCDR1 представлена в SEQ ID NO: 13, аминокислотная последовательность LCDR2 представлена в SEQ ID NO: 14, аминокислотная последовательность LCDR3 представлена в SEQ ID NO: 15.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, IL-17А-связывающий агент содержит три области HCDR, где аминокислотная последовательность HCDR1 представлена в SEQ ID NO: 10, аминокислотная последовательность HCDR2 представлена в SEQ ID NO: 11, аминокислотная последовательность HCDR3 представлена в SEQ ID NO: 12.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, IL-17А-связывающий агент, в котором вариабельная область легкой цепи антитела дополнительно содержит область FR (каркасную) легкой цепи, полученную из мышиной цепи κ, λ, или ее вариант. В некоторых вариантах воплощения аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела представляет собой последовательность SEQ ID NO: 2. Кроме того, IL-17А-связывающий агент содержит константную область легкой цепи, полученную из мышиной цепи κ, λ, или ее вариант.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, IL-17А-связывающий агент, в котором вариабельная область тяжелой цепи антитела дополнительно содержит область тяжелой цепи FR, полученную из мышиного lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, или ее вариант. В некоторых вариантах воплощения аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела представляет собой SEQ ID NO: 1. Кроме того, IL-17А-связывающий агент содержит константную область тяжелой цепи, полученную из мышиных lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, или ее вариант.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения IL-17А-связывающий агент, в котором вариабельная область легкой цепи антитела дополнительно содержит область легкой цепи FR, полученную из человеческой цепи κ, λ, или ее вариант; в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения областью легкой цепи FR вариабельной области легкой цепи антитела является область А10 FR легкой цепи зародышевой линии человека, аминокислоты которой представлены в SEQ ID NO: 4, или ее вариант. В некоторых вариантах воплощения вариант области FR вариабельной области легкой цепи антитела относится к области А10 FR легкой цепи зародышевой линии человека с 0-10 аминокислотными мутациями. В некоторых вариантах воплощения аминокислотная мутация в варианте области FR вариабельной области легкой цепи представляет собой одну или несколько мутаций, выбранных из группы, включающей F71Y, K49Y, Y36F и L47W. В некоторых вариантах воплощения легкую цепь антитела выбирают из SEQ ID NO: 9, и ее варианта. Кроме того, IL-17А-связывающий агент содержит константную область легкой цепи, полученную из человеческой цепи κ, λ, или ее вариант.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения IL-17А-связывающий агент, в котором вариабельная область тяжелой цепи антитела дополнительно содержит область тяжелой цепи FR, полученную из человеческого lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, или ее вариант; в некоторых вариантах воплощения настоящего изобретения областью тяжелой цепи FR вариабельной области тяжелой цепи антитела является облает FR тяжелой цепи зародышевой линии человека VH1-18, аминокислотная последовательность которой представлена в SEQ ID NO: 3, или ее вариант. В некоторых вариантах воплощения вариант области FR вариабельной области тяжелой цепи антитела относится к VH1-18 тяжелой цепи зародышевой линии человека с 0-10 аминокислотными мутациями. В некоторых вариантах воплощения аминокислотная мутация в вариантах области FR вариабельной области тяжелой цепи представляет собой одну или несколько мутаций, выбранных из группы, включающей А93Т, Т71А, M48I, V67A, M69L, T73D, и S76N. В некоторых вариантах воплощения тяжелую цепь антитела выбирают из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8. Кроме того, IL-17A-связывающий агент содержит константную область тяжелой цепи, полученную из человеческого lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, или его вариант.
Кроме того, в соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения, предлагается вектор, экспрессирующий упомянутый выше IL-17A. Клетки-хозяева после трансфицирования вектором экспрессируют и секретируют IL-17А-связывающий агент.
В соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения вектор содержит нуклеотид, кодирующий IL-17А-связывающий агент по настоящему изобретению.
Кроме того, в соответствии с некоторыми вариантами воплощения настоящего изобретения предлагается фармацевтическая композиция, содержащая IL-17А-связывающий агент, как описано выше, и фармацевтически приемлемый эксципиент, разбавитель или носитель.
Кроме того, в соответствии с некоторыми вариантами воплощения, настоящее изобретение также предлагает применение вышеуказанного IL-17A-связывающий агента или содержащей его фармацевтической композиции для получения лекарственного средства для лечения заболеваний или расстройств, опосредованных IL-17. Эти заболевания являются воспалительными или аутоиммунными заболеваниями; заболевания выбраны из псориаза, псориатического артрита, анкилозирующего спондилита, рассеянного склероза, воспалительного артрита; воспалительное заболевание предпочтительно является воспалительным артритом. Воспалительный артрит выбирают из остеоартрита, ревматоидного артрита, ревматического артрита или остеопороза, предпочтительно ревматического артрита.
Согласно некоторым вариантам воплощения, настоящее изобретение также предлагает применение вышеуказанного IL-17A антитела или фармацевтической композиции, содержащей его, для получения лекарственного средства для лечения заболеваний или расстройств, опосредованных IL-17. Эти заболевания являются воспалительными или аутоиммунными заболеваниями. Воспалительное заболевание предпочтительно является воспалительным артритом. Воспалительный артрит выбирают из остеоартрита, ревматоидного артрита или остеопороза.
Согласно некоторым вариантам воплощения, настоящее изобретение также предлагает способ лечения заболевания или расстройства, опосредованного IL-17, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества IL-17А-связывающего агент, как описано выше, или гуманизированного IL-17A антитела, или фармацевтической композиции, содержащей его.
Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже специально определены некоторые технические и научные термины. Если это конкретно не указано в данном документе, то все остальные технические и научные термины, используемые здесь, имеют значение, как правило, понятное рядовому специалисту в области техники, к которой принадлежит данное изобретение.
I. Термины
Используемый в данном документе однобуквенный код и трехбуквенный код для аминокислот являются такими, как описано в J. Biol. Chem, 243, (1968) р3558.
Используемый в данном документе термин «связывающий агент» относится к растворимому рецептору, или его фрагментам, или его аналогам, или к антителам, или их фрагментам, или их аналогам, способным связываться с мишенью. «IL-17А-связывающий агент» в соответствии с настоящим изобретением относится к антителу, или его фрагменту, или его аналогу, способному специфически распознавать IL-17A и связываться с IL-17A.
Термин «IL-17A» в целом относится к природному или рекомбинантному человеческому IL-17A, и к не-человеческим гомологам человеческого IL-17A. Если не указано иное, для расчета молярной концентрации IL-17A берут молекулярную массу гомодимера IL-17A (например, 30 кДа для человеческого IL-17A).
Используемый в данном документе термин «антитело» относится к иммуноглобулину, структуре из четырех пептидных цепей, состоящей из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, соединенных посредством дисульфидной связи. Константные области тяжелой цепи иммуноглобулина имеют различный состав и порядок аминокислот и, следовательно, демонстрируют различные антигенные свойства. Соответственно, иммуноглобулины можно разделить на пять категорий, или так называемых изотипов иммуноглобулина, а именно - IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. В соответствии с аминокислотным составом шарнирной области, а также с количеством и расположением дисульфидных связей тяжелой цепи, lg одной и той же категории могут быть дополнительно разделены на различные подтипы, например, lgG можно разделить на lgG1, lgG2, lgG3 и lgG4. Легкую цепь можно разделить на κ или λ-цепь с разными константными областями.
Область с последовательностями длиной около 110 аминокислот вблизи N-конца тяжелой и легкой цепей антитела меняется в значительной степени и известна как вариабельная область (область V); область с оставшимися аминокислотными последовательности вблизи С-конца относительно стабильна и известна как константная область (область С). Вариабельная область включает в себя три гипервариабельные области (HVR) и четыре относительно консервативные области FR (FR). Три гипервариабельные области определяют специфичность антитела, они также известны как область, определяющая комплементарность (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR), и каждая вариабельная область тяжелой цепи (HCVR) состоит из трех областей CDR и четырех областей FR; последовательный порядок от N-конца к С-концу следующий: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три области CDR легкой цепи, а именно гипервариабельные области легкой цепи (LCDR) называют LCDR1, LCDR2 и LCDR3; Три области CDR тяжелой цепи, а именно гипервариабельные области тяжелой цепи (HCDR) называют HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Число и расположение аминокислотных остатков области CDR в областях LCVR и HCVR антитела или его антиген-связывающего фрагмента в данном документе соответствуют известным критериям нумерации Kabat (LCDR1-3, HCDE2-3), или соответствуют критериям нумерации Kabat и Chothia (HCDR1).
Используемый в данном документе термин «антиген-связывающий фрагмент» относится к фрагменту Fab, фрагменту Fab', фрагменту F(ab')2 или одиночному фрагменту Fv, проявляющему антиген-связывающую активность. Антитело Fv представляет собой минимальный фрагмент антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, вариабельную область легкой цепи и все антиген-связывающие сайты без константной области. Как правило, антитело Fv дополнительно содержит полипептидный линкер между доменами VH и VL и способно образовывать структуру, необходимую для связывания антигена.
Используемый в данном документе термин «антигенная детерминанта» настоящего изобретения относится к трехмерным сайтам, которые являются дискретными на антигене и распознаются антителом или его антиген-связывающим фрагментом настоящего изобретения.
«Введение» и «воздействие» применительно к животным, людям, экспериментальным объектам, клеткам, тканям, органам или биологическим жидкостям, относятся к контакту животных, людей, объектов, клеток, тканей, органов или биологических жидкостей с экзогенными медикаментами, терапевтическими агентами, диагностическими агентами или композициями. «Введение» и «воздействие» могут относиться, например, к терапевтическим, лечебным, диагностическим, исследовательским и экспериментальным методам. Обработка клеток включает в себя контактирование клеток с агентом, а также контактирование жидкости с агентом, где жидкость находится в контакте с клетками. «Введение» и «воздействие» также означает обработку in vitro и ex vivo, например, клеток агентом, диагностической или связывающей композицией или другими клетками. «Воздействие» по отношению к человеку, ветеринарным или исследовательским субъектам, относится к терапевтическому воздействию, профилактическим или превентивным мерам для исследовательских и диагностических целей. «Воздействие» по отношению к человеку, ветеринарным или исследовательским субъектам, или клеткам, тканям или органам, включает в себя контактирование человека или животного субъекта, клеток, тканей, физиологических компартментов или физиологической жидкости с агонистом IL-17A или антагонистом IL-17A. «Воздействие на клетки» также включает в себя ситуации, когда агонист IL-17A или антагонист IL-17A контактирует с рецептором IL-17A, например, в жидкой фазе или коллоидной фазе, а также включает в себя ситуации, когда агонист или антагонист не контактирует с клетками или рецепторами.
«Воздействовать» означает вводить терапевтический агент, такой как композицию, содержащую любое из связывающих соединений по настоящему изобретению, внутрь или наружно пациенту, имеющему один или более симптомов заболевания, к которому агент проявляет известную терапевтическую активность. Как правило, агент вводят в количестве, эффективном для облегчения одного или более симптомов заболевания пациента или популяции, подлежащих лечению, либо путем индукции регрессии, либо путем ингибирования развития такого симптома(-ов) в любой клинически измеримой степени. Количество терапевтического агента, которое является эффективным для облегчения какого-либо конкретного симптома заболевания (также называемое как «терапевтически эффективное количество»), может варьироваться в зависимости от различных факторов, таких как состояние болезни, возраст и вес пациента, а также способность препарата вызывать желаемый ответ у пациента.
В настоящем документе упоминаются четыре варианта человеческого белка IL-17A:
1) Используемые в данном документе термины «человеческий IL-17A (hIL-17A)» и «природный человеческий IL-17A» относятся к зрелым формам (т.е. остатки 24-155) человеческого белка IL-17A с номерами доступа NP_002181 и ААТ22064, и встречающимся в природе их вариантам и полиморфизмам.
2) Используемые в данном документе термин «rhIL-17A» относится к рекомбинантному человеческому IL-17A, эта номенклатура принята для удобства по отношению к различным формам IL-17A и может не соответствовать используемой в литературе.
3) Используемые в данном документе термин "His-hIL-17A" относится к рекомбинантному человеческому IL-17A, имеющему присоединенную N-концевую гистидиновую метку, «FLAG-hIL-17A" относится к рекомбинантному человеческому IL-17A, имеющему присоединенную метку FLAG. В некоторых экспериментах FLAG-hIL-17A биотинилируют.
4) Человеческий IL-17A R&D Systems, упоминаемый здесь, представляет собой рекомбинантный человеческий IL-17A, приобретенный у R&D Systems.
Используемый в данном документе термин «моноклональное антитело» означает антитело, секретируемое клоном, полученным из одной клетки. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против одного эпитопа. Клетка не ограничивается эукариотическими, прокариотическими или фаговыми клонированными клеточными линиями.
Моноклональное антитело в настоящем документе, в частности, включает в себя «химерное» антитело, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученным из конкретных видов или принадлежащих к конкретному типу или подтипу антитела, в то время как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям антител, полученным из другого вида или принадлежащим к другому типу или подтипу антитела, а также фрагмент такого антитела, если они проявляют желаемую биологическую активность.
Используемый в данном документе термин «гуманизированное антитело» представляет собой форму мышиного антитела с модифицированным вариабельным участком в соответствии с настоящим изобретением, имеющую области CDR, полученные из (или полученные в основном из) нечеловеческого антитела (предпочтительно, мышиного моноклонального антитела), и области FR и константные области, полученные в основном из человеческого антитела; то есть, последовательности областей CDR мышиного антитела имплантированы в различные типы каркасных последовательностей человеческих антител зародышевой линии. Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК или опубликованных ссылок, которые включают в себя генные последовательности антител зародышевой линии. Например, последовательности ДНК зародышевой линии вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи человека можно найти в базе данных последовательностей зародышевой линии человека «VBase» (доступна в сети Интернет по адресу www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), а также найти в Kabat, ЕА. 1991 «Последовательности белков, представляющих иммунологический интерес», 5-е изд. Поскольку последовательности CDR отвечают за большинство взаимодействий антитела с антигеном, целесообразно сконструировать экспрессирующий вектор для экспрессии рекомбинантного антитела, которое может имитировать специфическую особенность природного антитела.
«Необязательный» или «необязательно» означает, что следующее событие или ситуация может, но не обязательно, произойти, и описание включает случаи, в которых событие или ситуация происходят или не происходят. Например, «необязательно содержит 1-3 вариабельные области тяжелой цепи антитела» означает, что вариабельная область тяжелой цепи антитела, обладающая специфическими последовательностями, может присутствовать, но не обязательно присутствует, и если присутствует, то может содержаться в количестве 1, 2 или 3.
Трансформация клетки-хозяина рекомбинантной ДНК может быть осуществлена с помощью традиционных методик, хорошо известных специалистам в данной области техники. Полученные трансформанты культивируют с использованием традиционных способов, чтобы экспрессировать полипептид, кодируемый геном настоящего изобретения. Питательная среда может быть выбрана из различных обычных культурных сред в зависимости от используемых клеток-хозяев. Клетки-хозяева растут в надлежащих условиях.
II. Антитела, специфичные к человеческому IL-17A
Настоящее изобретение предлагает сконструированные анти-IL-17А антитела и их применение в лечении различных воспалительных, иммунных и пролиферативных нарушений, включая ревматоидный артрит (РА), остеоартрит, остеопороз, воспалительный фиброз (например, склеродермия, фиброз легких и цирроз печени), воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и воспалительная болезнь кишечника), астму (в том числе аллергическую астму), аллергию, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), рассеянный склероз, псориаз и рак.
Для создания анти-IL-17А антител согласно настоящему изобретению может быть использован любой подходящий способ создания моноклональных антител. Например, животное реципиент может быть иммунизировано сшитым или, например, природным гомодимером IL-17A или его фрагментом. Может быть использован любой подходящий способ иммунизации. Такие способы могут включать в себя адъюванты, другие иммуностимуляторы, повторные бустерные иммунизации и использование одного или нескольких путей иммунизации.
Любая подходящая форма IL-17A может быть использована в качестве иммуногена (антигена) для создания нечеловеческого антитела, специфичного к IL-17A, антитело может быть отобрано согласно его биологической активности. Вызывающий иммуноген может быть полноразмерным зрелым человеческим IL-17A, включающим сшитые природные гомодимеры, или его пептидами, содержащими один или несколько эпитопов. Иммуноген может быть использован отдельно или в сочетании с одним или несколькими агентами, усиливающими иммуногенность, известными в данной области техники. Иммуноген может быть выделен из природного источника или произведен в генетически модифицированных клетках. ДНК, кодирующая иммуноген, может быть получена из геномных ДНК или из негеномных (например, кДНК) ДНК. Для экспрессии ДНК, кодирующих иммуноген, могут быть использованы подходящие генетические векторы, указанные векторы включают, но не ограничиваются указанным, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, бакуловирусные векторы, плазмиды и невирусные векторы.
Пример способа получения антител к человеческому IL-17A согласно настоящему изобретению описан в Примере 1.
III. Гуманизация IL-17A специфичных антител
Гуманизированное антитело может быть выбрано из любого типа иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE. В одном варианте воплощения изобретения антитело представляет собой антитело IgG. Любой изотип IgG может быть использован, в том числе lgG1, lgG2, lgG3 и lgG4. Также предполагаются варианты изотипов IgG. Гуманизированное антитело может содержать последовательности, полученные из более чем одного типа или изотипа. Оптимизация необходимых последовательностей константного домена для достижения желаемой биологической активности легко достигается путем скрининга антител в биологических анализах, описанных ниже в Примерах.
Аналогично, любой тип легкой цепи может быть использован в соединениях и способах согласно настоящему изобретению. В частности, каппа(κ), лямбда(λ) или их вариант применимы в настоящих соединениях и способах.
Пример способа гуманизации антител против человеческого IL-17A согласно настоящему изобретению описан в Примере 2.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее настоящее изобретение описано со ссылкой на примеры; тем не менее, объем настоящего изобретения не ограничивается этим.
В примерах настоящего изобретения, где специфические условия не описаны, эксперименты, как правило, проводят в обычных условиях, или в условиях, предложенных производителями материалов или продуктов. См. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Greene Publishing Associates, Wiley InterScience, NY. Там, где источник реагентов конкретно не указан, реагенты являются коммерчески доступными традиционными реагентами.
Пример 1. Мышиное моноклональное антитело против человеческого IL-17А
Моноклональные антитела против человеческого IL-17A были получены следующим образом. Самок мышей BALB/c возрастом 6-8 недель (Shanghai Super В&К Laboratory Animal Corp. Ltd, сертификат на производство лабораторных животных No: SCXK (HU) 2008-0016) и самок мышей SJL возрастом 6-8 недель (Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co. Ltd, сертификат на производство лабораторных животных No: SCXK (Beijing) 2012-0001) разделили на две группы: группу с высокой дозой и группу с низкой дозой. Было взято 10 мышей BALB/c и 10 мышей SJL для каждой группы.
Группы с низкой и высокой дозой серийно иммунизировали природным вариантом hIL-17A (His-hIL-17A, аминокислотная последовательность hIL-17A относится к человеческому белку IL-17A, номер доступа в Genbank NP-002181, полученный белок очищали с помощью никелевой колонки (Superdex) 75SEC последовательно), к которому была пришита гистидиновая метка на N-конце и который был создан с помощью системы экспрессии НЕК293Е (293-EBNA, Invitrogen, Lot Num: 493985). Инокуляции были выполнены на 0, 14, 35 и 56 день.
В день 0 группе с высокой дозой вводили His-hIL-17А, 500 мкг/мышь, с помощью подкожной (п.к.) инъекции, и вводили полный адъювант Фрейнда (CFA) с помощью внутрибрюшинной (в.б.) инъекции в то же время. На 14 и 35 день вводили His-hIL-17A, 25 мкг/мышь с помощью п.к. инъекции, и в то же время, вводили неполный адъювант Фрейнда (IFA,) с помощью в.б. инъекции. На 56 день, до слияния спленоцитов, проводили бустерную иммунизацию с помощью в.б. инъекции His-hIL-17А, 25 мг/мышь, растворенного в физиологическом растворе. График и способ иммунизации группы с низкой дозой были аналогичны таковым в группе с высокой дозой, за исключением того, что введенная доза His-hIL-17A на 0 день составляла 10 мкг/мышь, введенная доза His-hIL-17A на 14, 35, и 56 день составляла 5 мкг/мышь.
Анализы крови были проведены на 22 день и 43 день. Сыворотку мышей подвергали иммуноферментному анализу (ИФА), описанному в Примере 1, для определения титра антител в сыворотке крови. На 56 день мыши с более высокими титрами антител в сыворотке были выбраны для слияния спленоцитов. Гибридома была получена путем слияния селезеночных лимфоцитов с миеломными клетками Sp2/0 (АТСС CRL-8287TM) с помощью оптимизированной полиэтиленгликоль(ПЭГ)-опосредованной процедуры слияния.
Процедуры иммунизации были следующими:
Схема 1, высокая доза, 10 мышей Balb/c и 10 мышей SJL, процедуры были следующими:
Схема 2, низкая доза, процедуры были следующими:
Первичный скрининг полученных гибридом проводили с помощью непрямого антиген-антитело ИФА в Тестовом Примере 1. Штаммы моноклональных клеток были получены с помощью лимитирующего разведения положительных клеточных штаммов.
Полученные моноклональные клеточные линии скринировали дополнительно, включая:
1. Тестирование с блокированием рецептора, см. Тестовый Пример 2, с результатами, представленными в Таблице 5, была отобрана и получена моноклональная клеточная линия IL17-mAb049, обладающая активностью, превосходящей положительный контроль;
Тестирование на аффинность, см. Тестовый Пример 3, с результатами, представленными в Таблице 6, которое показало, что моноклональная клеточная линия IL17-mAb049, отобранная и полученная в настоящем изобретении, продемонстрировала сопоставимую или более высокую активность по сравнению с положительным контролем;
3. Биологический анализ на клеточном уровне (анализ GROα (связанного с ростом онкогена α)), см. Тестовый пример 4, с результатами, представленными в таблице 8, в котором установлено, что моноклональная клеточная линия IL17-mAb049, отобранная и полученная в настоящем изобретении, продемонстрировала сопоставимую или более высокужю активность по сравнению с положительным контролем.
Двенадцать моноклонов были изучены далее после первого и второго скринирований. Один ведущий моноклон (ведущий mAb) из IL17-mAb049 был выбран с помощью группировки эпитопов, испытания биологической активности. Специфические последовательности тяжелой цепи (VH) и легкой цепи (LH) мышиного антитела к мышиному IL-17A mAb049 (IL-17mAb) были следующими:
IL-17 mAb049 VH SEQ ID NO: 1
IL-17mAb049 VL SEQ ID NO: 2
Пример 2. Гуманизация мышиных антител против человеческого IL-17A
Гуманизацию мышиного моноклонального антитела против человеческого IL-17A mAb049 проводили, по существу, так, как описано в большей части литературы, известной в данной области техники. Вкратце, были использованы константные домены человека для замены родительских (мышиное антитело) константных доменов. Последовательности зародышевой линии человека, используемые для гуманизации, были выбраны в соответствии с гомологией между мышиным антителом и человеческим антителом.
1. Области CDR мышиного анти- IL17A антитела
Аминокислотные остатки VH/VL CDR были идентифицированы и аннотированны с помощью системы нумерации Kabat. Последовательности CDR мышиного тАb049 из настоящего изобретения приведены в следующей таблице:
2. Селекция последовательностей FR зародышевой линии человека
На основе типовых структур VH/VL CDR полученного мышиного антитела, последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей сравнивали с базой данных антител. VH1-18 (SEQ ID NO: 3) тяжелой цепи и А10 (SEQ ID NO: 4) легкой цепи зародышевой линии человека с высокой степенью гомологии были получены и использованы в качестве гуманизированных последовательностей FR. Конкретные последовательности являются следующими:
VH1-18 SEQ ID NO:3
А10 SEQ ID NO: 4
3. Конструирование гуманизированных антител:
Были определены аминокислотные остатки, образующие конформацию кольца и границу VH. Принимая во внимание следующие факторы, мутация Q1E должна была устранить образование N-концевой пироглутаминовой кислоты. Мутации также включают в себя мутации, сохраняющие постоянство в пределах выбранного семейства VH, с тем чтобы сохранить типичную структуру CDR и границу раздела VH/VL и избежать N-гликозилированного паттерна (N-{P}-S/T), присутствующего в гуманизированной структуре.
Конструирование гуманизированных мутаций в вариабельных областях мышиного антитела mAb049 представлено следующим образом:
4. Экспрессия и очистка гуманизированного антитела
Вышеуказанные антитела клонировали, экспрессировали и очищали с помощью генетических рекомбинантных методов. Гуманизированные антитела с хорошими показателями в конечном итоге были отобраны с помощью ИФА, анализа ингибирования связывания с рецептором, анализа Biacore, теста на жизнеспособность клеток и т.д. Специфические антитела приведены в следующей таблице:
Специфические последовательности гуманизированного антитела mAb049 перечислены ниже:
Hu049-17.VH SEQ ID NO: 5
Hu049-18.VH SEQ ID NO: 6
Hu049-19.VH SEQ ID NO: 7
Hu049-20.VH SEQ ID NO: 8
Hu049VL SEQ ID NO: 9
Пример 3. Исследования in vivo фармакокинетики и фармакодинамики гуманизированного анти-IL-17 антитела
Человеческий IL-17 может связываться и стимулировать мышиный IL-17 рецептор, что приводит к увеличению количества и последующему выделению кератиноцит-производных хемокинов (КС) у самцов мышей (CXCL1). Для определения максимальной дозы человеческого IL-17 и наилучшее время для индукции КС мышей проводили эксперименты в различные сроки и при различных дозах (см. Тестовый Пример 5). Эти эксперименты демонстрируют, что 150 мг/кг человеческого IL-17 через 2 часа после введения индуцируют наивысший уровень КС в мышиной сыворотке. Полноразмерные антитела согласно настоящему изобретению вводили мышам внутривенно в концентрации 3, 30, 300, 3000 мкг/кг, за 20 часов до подкожной инъекции человеческого IL-17. Через 2 часа после введения человеческого IL-17 мышей умерщвляли и определяли уровень КС с использованием коммерчески доступного набора для ИФА в соответствии с инструкцией производителя (Mouse CXCL1 / КС Quantikine ELISA Kit, R&D SYSTEM, # SMKC00B). Изотипически сходные антитела использовали в качестве отрицательного контроля. Антитела блокируют способность человеческого IL-17 стимулировать мышиный рецептор IL-17, что приводит к ингибированию повышения КС у мышей в зависимости от дозы. По сравнению с неэффективным контрольным антителом, антитело Hu049-18 по настоящему изобретению снижало средний уровень КС приблизительно до 1/6 при описанных условиях и дозе 3000 мкг/мышь.
Фармакокинетику в сыворотке у крыс и макак-резусов определяли после внутривенного или подкожного введения антитела Нu049-18 настоящего изобретения (см. Тестовый Пример). У крыс период полувыведения составлял 9,91 дней после внутривенного введения 5 мг/кг, а период полувыведения после подкожного введения 5 мг/кг составлял 11,5 дней. У макак период полувыведения составлял 24,4 дня после внутривенного введения 1 мг/кг.
Тестовые Примеры
Тестовый Пример 1. Непрямой ИФА
Цель:
Непрямой метод ИФА был выбран для обеспечения выбора антител, которые могут распознавать конформационные эпитопы, а также для скрининга мышиных гибридом из Примера 1 настоящего изобретения.
Материалы:
Человеческий IL-17A (hIL-17A) клонировали в соответствии со способами, известными в данной области техники, с использованием белковых последовательностей человеческого IL-17A с номером доступа в базе GenBank NP-002181, и временно трансфицировали в клетки НЕК293Е для экспрессии.
Человеческий IL-17A/F (гетеродимер, hIL-17A/F), клонировали в соответствии со способами, известными в данной области техники, с использованием белковых последовательностей человеческого IL-17A с номером доступа в базе GenBank NP-002181 и белковых последовательностей человеческого IL-17F с номером доступа в базе GenBank NP_443104, и временно трансфицировали в клетки НЕК293Е для экспрессии.
В качестве положительного контроля, мышиные анти-IL-17 антитела Lilly и Novartis (Lilly mAb, Novartis mAb) клонировали с использованием мышиных последовательностей, раскрытых в US7,838,638B2 (LY 2439821) и US 7,807,155 В2 (AIN 457), соответственно, и временно трансфицировали в клетки НЕК293Е для экспрессии.
Мышиные моноклональные антитела mAb, полученные из гибридомы мыши, описаны в Примере 1 настоящего изобретения.
Протокол:
1. Планшеты для микротитрования напрямую покрывали 1 мкг/мл стрептавидина, инкубировали при 4°С в течение ночи;
2. Планшеты для микротитрования блокировали 300 мкл ФСБТ (фосфатно-солевым буфером с твином), содержащим 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) (объемное содержание), термостатически инкубировали при 37°С в течение 1 ч, в то время как непокрытые лунки блокировали в качестве контроля;
3. Промывали ФСБТ три раза, все операции промывания были выполнены на автоматическом промывателе Biotek (Εlx 405);
4. 100 мкл ФСБ, содержащего hIL-17А или ML-17A/F (1 мкг/мл) добавляли в каждую лунку, термостатически инкубировали при 37°С в течение 1 ч;
5. Промывали ФСБТ 3 раза.
6. Положительные контроли Lilly mAb и Novartis mAb или мышиные антитела mAbs из настоящего изобретения титровали в разведении 1:5, начальная концентрация составляла 1 мкг/мл. 100 мкл разведенного положительного контроля или мышиных антител согласно настоящему изобретению добавляли в каждую лунку, термостатически инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Каждую концентрацию титровали в двух лунках;
7. Промывали ФСБТ 3 раза;
8. 100 мкл антимышиных вторичных антител HRP (коньюгированных пероксидазой хрена) (Santa Cruz Cat.No.sc-2005) (1:5000) добавляли в каждую лунку, термостатически инкубировали при 37°С в течение 1 ч;
2
4
9. Промывли ФСБТ 3 раза. 100 мкл субстрата ТМВ (3,3',5,5'-тетраметилбензидина) добавляли в каждую лунку, термостатически инкубировали при 37°С в течение 5 мин. Затем реакцию останавливали добавлением 100 мкл 2М HSO в каждую лунку;
10. Считывали значение OD при длине волны 450 нм микропланшетным ридером ИФА (Molecular Devices, Spectra Max).
11. Значения OD мышиных антител mAb сравнивали с таковыми у положительных контролей. Отбирали моноклональные клеточные линии с коэффициентом больше 1, включающие IL17-mAb049.
Тестовый Пример 2. Анализ блокирования рецепторов IL-17 (RBA)
Цель:
Целью анализа блокирования рецепторов является выбор антител, способных блокировать связывание IL-17 с рецептором IL-17 (например, hIL-17RA). Тестирование основано на функциональном тесте и может быть использовано для скрининга гибридом с высокой пропускной способностью.
Материалы и оборудование:
Антитело против человеческого кристаллизующегося фрагмента иммуноглобулина (Fc) (козье специфическое антитело против человеческого фрагмента IgG-Fc (доступно из Jackson ImmunoResearch, 109-005-008))
Человеческий IL-17RA-Fc, используемый в данном документе, клонировали в соответствии со способами, известными в данной области техники, с использованием аминокислотных последовательностей человеческого рецептора IL-17A с номером в базе Genbank ADY18334.1, и трансфицировали в клетки НЕК293Е клетки для экспрессии, при этом фрагменты Fc были получены из человеческого lgG1.
В качестве положительного контроля клонировали мышиные анти-IL-17 антитела Lilly и Novartis (Lilly mAb, Novartis mAb) в соответствии с мышиными последовательностями, раскрытыми в US 7,838,638 В2 (LY 2439821) и US 7,807,155 В2 (AIN 457), и временно трансфицировали в клетки НЕК293Е для экспрессии.
mlgG: Мышиный IgG (Millipore Cat.No.PP54), используемый в качестве бланкового контроля
Планшетный ридер для ИФА: Molecular Devices, Spectra Max
Моноклональные клеточные штаммы, полученные из Примера 1 настоящего изобретения.
Протокол:
1. Планшеты для микротитрования напрямую покрывали 10 мкг/мл антителами против человеческого Fc, инкубировали при 4°С в течение ночи;
2. Планшеты для микротитрования блокировали 300 мкл ФСБТ, содержащим 2% бычьего сывороточного альбумина (объемное содержание), термостатически инкубировали при 37°С в течение 1 ч, в то время как непокрытые лунки блокировали в качестве контроля;
3. Промывали ФСБТ три раза, все операции промывания были выполнены на автоматическом промывателе Biotek (Elx 405);
4. 100 мкл ФСБ, содержащего hIL-17 RA-FC (60 нг/мл) добавляли в каждую лунку, термостатически инкубировали при 37°С в течение 2 ч;
5. Промывали ФСБТ 3 раза.
6. Положительные контроли Lilly mAb и Novartis mAb или антитела настоящего изобретения разводили в соотношении 1:5, начальная концентрация составляла 40 мкг/мл. mlgG разводили таким же способом. 50 мкл разведенного положительного контроля или мышиных антител настоящего изобретения добавляли в каждую лунку, в то же время 50 мкл 0,2 нМ меченого биотином IL-17A добавляли к разведенному положительному контролю или к антителам настоящего изобретения, аккуратно перемешивали и термостатически инкубировали при 37°С в течение 1 ч.
7. Промывание ФСБТ 3 раза;
8. 100 мкл помеченного HRP стрептавидинового комплекса (1:5000) добавляли в каждую лунку, термостатически инкубировали при 37°С в течение 1 ч;
2
4
9. Промывание ФСБТ 3 раза. 100 мкл субстрата ТМВ добавляли в каждую лунку, термостатически инкубировали при 37°С в течение 5 мин. Затем реакцию останавливали добавлением 100 мкл 2М HSO в каждую лунку;
10. Считывали значение OD при длине волны 450 микропланшетным ридером ИФА.
50
11. Значения IC тестируемых антител рассчитывали для блокирования связывания IL-17 с рецептором IL-17.
50
Значение IC (концентрация антител при значении OD, сниженном до 50%, т.е. RBA (относительные значения сродства к связыванию)) получали в соответствии с градиентом кривой значений OD в зависимости от концентрации антител.
Результаты эксперимента:
В соответствии с указанным выше способом, гибридому, полученную в Примере 1, подвергали скринингу для получения мышиного моноклонального антитела, обозначенного как IL17-mAb049, результаты были следующими:
Вывод: мышиные антитела IL17-mAb 049, отобранные из гибридом, показали более высокую активность, чем положительные антитела Lilly mAb и Novartis mAb.
Тестовый Пример 3. Тестирование аффинности.
Цель:
Для определения аффинности и кинетики связывания антигена с антителом использовали метод BIACORE.
Материалы и оборудование:
1.1 Белки:
Человеческий IL-17A (hIL-17A) клонировали в соответствии со способами, известными в данной области техники, с использованием белковых последовательностей человеческого IL-17A с номером доступа в базе GenBank NP-002181, и временно трансфицировали в клетки НЕК293Е для экспрессии.
Человеческий IL-17A/F (гетеродимер, hIL-17A/F) клонировали в соответствии со способами, известными в данной области техники, с использованием белковых последовательностей человеческого IL-17A с номером доступа в базе GenBank NP-002181 и белковых последовательностей человеческого IL-17F номером доступа в базе GenBank NP_443104, и временно трансфицировали в клетки НЕК293Е для экспрессии.
Мышиный IL-17A (Mu IL-17A) и крысиный IL-17A (Rat IL-17A) клонировали в соответствии со способами, известными в данной области техники, с использованием мышиного белка IL-17A с номером доступа в базе Genbank NP_034682 и крысиного белка IL-17A с номером доступа в базе Genbank NP_001100367, соответственно, и временно трансфицировали в клетки НЕК293Е для экспрессии.
В качестве положительных контролей клонировали мышиные анти-IL-17 антитела Lilly и Novartis (Lilly mAb, Novartis mAb) в соответствии с мышиными последовательностями, раскрытыми в US 7,838,638 В2 (LY 2439821) и US 7,807,155 В2 (AIN 457), соответственно, и временно трансфицировали в клетки HEK293E для экспрессии.
В качестве положительного контроля, гуманизированные анти-IL-17 антитела Lilly (Lilly mAb (hu)) клонировали в соответствии с гуманизированными последовательностями, раскрытыми в US 7,838,638 В2 (LY 2439821), и временно трансфицировали в клетки НЕК293Е для экспрессии.
Мышиные моноклональные клеточные штаммы, полученные из Примера 1 настоящего изобретения.
Гуманизированные IL-17 антитела, полученные из Примера 2 настоящего изобретения.
1.2BIACORE модель: BIACOREX 100, GE;
1.3BIACORE чипы и реагенты (торговые названия перечислены ниже, не подтвержденный перевод):
Протокол:
1. Антитело настоящего изобретения иммобилизировали на чипе СМ5: готовили 1:1 50 мМ NHS(N-гидроксисукцинимид): 200 мМ EDC(1,2-дихлорэтан) и вводили в канал FC2 (Проточная ячейка 2) со скоростью 10 мкл/минуту в течение 7 минут для активации сенсорного чипа СМ5. Антитело настоящего изобретения растворяли в буфере из 10 мМ ацетата натрия при концентрации 30 мкг/мл, рН 5,0, и вводили в активированный чип (буфер подвижной фазы HBS-EP: 10 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), 150 мМ NaCl, 3,4 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 0,005% поверхностно-активного вещества Р20, рН 7,4) со скоростью 5 мкл/мин. 1М этаноламин вводили со скоростью 10 мкл/минуту в течение 7 минут, чтобы запечатать оставшиеся активированные места сочетания. Было генерировано около 8000RU.
2. Тестирование кинетики связывания: FC1 (проточная ячейка 1) использовали в качестве референсного канала, FC2 (проточная ячейка 2) использовали в качестве анализируемого канала, мышиное или гуманизированное контрольное антитело или антитело настоящего изобретения было захвачено в канале FC2 в 300RU, с последующей инъекцией различных концентраций IL-17 (включая hIL-17A, MuIL-17, Rat IL-17). Условия цикла были следующими: инъекция аналитов во все каналы FC при скорости 30 мкл/минуту в течение 3 минут, диссоциация в течение 20 мин, инъекция 10 мМ глицина, рН 1,5, в течение 60 секунд (со скоростью 10 мкл/мин) для регенерации поверхности. Разницу между сигналом с захваченным антителом и сигналом без захваченного антитела вычисляли с помощью программного оценочного обеспечения Biacore Х100 ver 2.0 (Biacore), подвижный буфер был следующим: 10 мМ HEPES, 650 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,05% Tween-20.
Результаты эксперимента:
1. В соответствии с указанным выше способом, гибридомы, полученные в Примере 1, подвергали скринингу, результаты были следующими:
Заключение: аффинность мышиного антитела IL17-mAb 049, отобранного из гибридом, эквивалентна аффинности положительных антител Lilly mAb, и выше, чем таковая у Novartis mAb.
2. В соответствии с указанным выше способом, были протестированы гуманизированные IL-17 антитела, полученные из Примера 2, результаты были следующими:
Вывод: аффинность гуманизированного антитела была увеличена в 10 раз по сравнению с положительным антителом Lilly (1.48Е-11М).
Тестовый Пример 4. Биоанализ на клеточном уровне (анализ GROα)
Цель:
Следующий эксперимент был предназначен для обнаружения клеточной биологической активности анти-IL-17А антитела путем ингибирования стимулированной IL-17 секреции GROα из клеток Hs27 анти-IL-17А антителом.
Материалы и оборудование:
Клетки Hs27: АТСС Cat.No.CRL-1634 (Примечание: клетки, культивируемые в течение более шести недель, не рекомендуется использовать для биоанализа);
Среда для культивирования клеток Hs27: DMEM (минимальная эссенциальная среда Игла, модифицированная по способу Дульбекко) + 10% FBS (фетальная бычья сыворотка)
DMEM: АТСС Cat.No.30-2002;
FBS: GIBCO Cat.No.10099, лот 8122818;
Рекомбинантный человеческий IL-17A (rhIL-17A): R&D Systems Cat.No.317-ILB, лот SOA161109B;
Рекомбинантный человеческий IL-17A/F (rhIL-17A/F): R&D Systems Cat No.5194-IL/CF, лот RXT101109A;
Набор Human CXCL1/GRO alpha Quantikine PharmPak kit: R&D Systems Cat. No. PDGR00
Оборудование: микропланшетный ридер Biotek ELx808.
Мышиный моноклональный штамм клеток, полученный из Примера 1 настоящего изобретения.
Гуманизированное IL-17 антитело, полученное из Примера 2 настоящего изобретения.
Протокол:
1. Культура клеток Hs27:
Клетки Hs27 культивировали в 50 мл среды DMEM + 10% FBS в колбе Т175; клетки (плотность около 90%) культивировали с разбавлением в соотношении 1:3 каждые 3 дня; клетки были использованы для биоанализа в течение месяца, или повторно разморожены из жидкого азота; повторно размороженные клетки следует культивировать почти за неделю до биоанализа.
2. Экспериментальная процедура биоанализа (IL-17A)
2.1 Клетки Hs27 центрифугировали при 950 об./минуту в течение 4 минут (полное удаление трипсин-ЭДТА) и собирали. Жизнеспособность клеток анализировали с помощью красителя трипанового синего, для эксперимента использовали только клетки с >80% жизнеспособности;
2.2 Среду добавляли в 96-луночный планшет по 50 мкл/лунку;
2.3 Клетки Hs27 разбавляли DMEM + 10% FBS и добавляли в 96-луночный планшет при плотности, составляющей 10000 клеток/50 мкл/лунку;
2.4 25 мкл человеческих IL-17 антител добавляли в каждую двойную лунку; антитела разводили в соотношении 1:3 с начальной концентрацией 10 нМ;
2.5 25 мкл рекомбинантного человеческого IL-17A добавляли в каждую лунку с конечной концентрацией 0.3 нМ. 96-луночный планшет центрифугировали при 500 об./минуту в течение 1 минуты;
2.6 Клетки термостатически инкубировали при 37°С в течение 17 ч;
2.7 Супернатант клеточной культуры собирали, концентрацию GROα детектировали в супернатанте с помощью набора human CACL1/GRO alpha Quantikine (в соответствии с инструкциями производителя);
3. Экспериментальные процедуры биоанализа (IL-17A/F):
Процедуры биоанализа IL-17A/F аналогичны процедурам биоанализа IL-17А, за исключением того, что IL-17A был замещен на IL-17A/F.
Результаты эксперимента:
1. В соответствии с указанными выше способами, гибридомы, полученные в Примере 1, подвергали скринингу, результаты были следующими:
Заключение: биологическая активность антитела IL17-mAb049, полученного из гибридомы, эквивалентна активности положительного антитела Lilly mAb и выше, чем активность Novartis mAb.
2. В соответствии с указанными выше способами, были детектированы гуманизированные антитела, полученные из Примера 2, результаты были следующими:
Заключение: Эти результаты указывают на то, что все из гуманизированных антител проявляют клеточную биологическую активность. Hu049-17, 18, 19 и 20 имеют значение IC50 (0.04 нМ-0.066нМ), сходное с таковым у положительных антител (0.04 нМ). Кроме того, эти антитела демонстрируют перекрестную реакцию с IL-17A яванских макак (IC50 составляет 0,03 нМ-0,039 нМ). Активность по отношению к человеческому IL-17A/F примерно в 10 раз слабее, чем к IL-17A.
Тестовый Пример 5. Тест нейтрализации человеческого IL-17 in vivo
Цель:
Цель тестирования нейтрализации in vivo заключается в подтверждении того, что антитела, предлагаемые в изобретении, могут блокировать in vivo связывание IL-17 с рецептором IL-17 (например, hIL-17RA) и таким образом ингибировать экспрессию CXCR1, индуцированную IL-17.
Материалы и оборудование:
Белок: Человеческий IL-17A (hIL-17A) клонировали в соответствии со способами, известными в данной области техники, с использованием белковых последовательностей человеческого IL-17A с номером доступа в базе GenBank NP-002181, и временно трансфицировали в НЕК293Е клетки для экспрессии.
В качестве положительного контроля, гуманизированные анти-IL-17 антитела Lilly (Lilly mAb (hu)) клонировали в соответствии с гуманизированными последовательностями, описанными в US 7,838,638 В2 (LY 2439821), и временно трансфицировали в НЕК293Е клетки для экспрессии.
Человеческий IgG (HulgG): (Millipore, Cat.No. AG711).
Животные: мыши-самцы С57/В6 7-недельного возраста (приобретенные у SINO-Britsh SIPPR / ВК LAB ANIMAL LTD, СО, Сертификат №.: SCXK (Shanghai) 2008-0016.), 6 мышей в каждой группе.
Реагенты: Раствор для разведения антител: цитратный буфер (рН 5,0): 10 мМ цитрат натрия, 50 мМ NaCl
Раствор для разведения hIL-17A: PBS (натрий-фосфатный буфер, рН 7,2).
Набор для ИФА Mouse CXCL1/KC Quantikine, 6-луночные планшеты, R&D SYSTEM, # SMKC00B.
Протокол:
1) Мыши были разделены на 15 групп, по 6 в каждой из групп.
2) 100 мкл Hu049-18 или контрольного антитела (HulgG или Lilly mAb (hu)) или разбавленный раствор внутрибрюшинно (в.б.) вводили каждой мыши, дозы введения препарата составляли 3000 мкг/кг, 300 мкг/кг, 30 мкг/кг и 3 мкг/кг, соответственно.
3) Через 20 часов hIL-17А впрыскивали подкожно (п.к.) в концентрации 150 мкг/кг, каждой мыши вводили 100 мкл.
4) Через 2 часа брали образцы крови, оставляли при комнатной температуре в течение 2-х часов до коагуляции, или при 2-8°С в течение ночи до коагуляции, а затем центрифугировали при 2000х g в течение 20 минут. Супернатант удаляли, детектирование проводили сразу или аликвоты проб хранили при -20°С. Следует избегать повторного замораживания и размораживания.
5) Образцы, полученные из этапе 4, были проанализированы с помощью набора для ИФА CXCL1/KC Quantikine.
Результаты эксперимента:
В соответствии с указанным выше способом, гуманизированное антитело Нu049-18, полученное в Примере 2, было протестировано, результаты были следующими:
Заключение: По сравнению с неэффективным контрольным антителом, антитело Hu-049-18 настоящего изобретения уменьшает средний уровень КС примерно до 1/6 при дозе 3000 мкг/мышь при описанных условиях. По сравнению с контрольным антителом, антитело Hu-049-18 настоящего изобретения проявляет эквивалентную способность ингибировать КС при дозе 3000 мкг/мышь в описанных условиях.
Тестовый Пример 6 Определение периода полувыведения (Т1/2) антител in vivo
Цель:
Определение параметров фармакокинетики антитела Нu049-18 настоящего изобретения у крыс или яванских макак in vivo.
Материалы и реагенты:
Белок: Человеческий IL-17A (hIL-17A) клонировали в соответствии со способами, известными в данной области техники, с использованием белковых последовательностей человеческого IL-17A из GenBank, No. NP-002181, и временно трансфицировали в клетки НЕК293Е для экспрессии.
В качестве положительного контроля, гуманизированное анти-IL-17 антитело Lilly (Lilly mAb (hu)) клонировали в соответствии с гуманизированными последовательностями, раскрытыми в US 7,838,638 В2 (LY 2439821), и временно трансфицировали в клетки НЕК293Е для экспрессии.
Человеческий IgG (HulgG): человеческий IgG, поликлональный, Millipore Cat.No. AG711
Животные: 230-250 г крысы вида Sprague-Dawley (SD) (самцы, приобретенные у компании Shanghai SLAC laboratory Animal Co., Ltd., Сертификат №: SCXK (Shanghai) 2007-0005) были разделены на две группы - группу для внутривенных инъекций (в.в.) (тыл стопы) и группу для подкожных инъекций (п.к.), по 5 крыс в каждой группе.
Макаки: 2-3 кг яванские макаки (Hainan Jingang Biotechnology Co., Ltd. Сертификат №: SCXK (ΗΝ) 2010-0001, 0000152.)
Реагенты: раствор для разведения антител: цитратный буфер (рН 5,0): 10 мМ цитрат натрия, 50 мМ NaCl
Раствор для разведения hIL-17A: PBS (буферный раствор фосфата натрия, рН 7,2)
Козьи антитела против человеческого IgG (FAB-специфические), конъюгированные пероксидазой, Sigma, Cat.No.121М4811
Протокол:
1. Процедуры для детекции у крыс:
(1) Введение in vivo
Крысы SD были случайным образом разделены на две группы - группу для внутривенных инъекций (в.в.) (тыл стопы) и группу для подкожных инъекций (п.к.), 5 крыс в каждой группе;
В стерильных условиях Hu049-18 растворяли в цитратном буферном растворе (рН 5,0) до конечной концентрации 2,5 мг/мл;
Каждой крысе в.в. или п. к. вводили дозу 5 мг/кг;
Для группы в.в. брали пробу крови через хвостовую вену через 0 минут, 5 минут, 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 24 часа, 2 дня, 4 дня, 7 дней, 10 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней после введения, 200 мкл (эквивалентно 80 мкл сыворотки) каждый раз; Для группы п. к. брали пробу крови через хвостовую вену через 0 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 12 часов, 24 часа, 2 дня, 4 дня, 7 дней, 10 дней, 14 дней, 21 день, 28 дней после введения, 200 мкл (эквивалентно 80 мкл сыворотки) каждый раз;
Образцы крови собирали и оставляли в течение получаса при комнатной температуре до коагуляции, а затем центрифугировали при 4°С при 10000 g в течение 5 минут. Супернатант собирали для немедленного анализа или аликвоты проб хранили при -80°С. Следует избегать повторного замораживания и размораживания.
(2) Образцы сыворотки, полученной на этапе (1), были проанализированы с помощью ИФА
1) Стандартная кривая
a) планшет для микротитрования непосредственно покрывали 1 мкг/мл стрептавидина, при 4°С в течение ночи;
b) планет для микротитрования блокировали посредством 300 мкл ФСБТ, содержащего 2% бычьего сывороточного альбумина (объемное соотношение), термостатически инкубировали при 37°С в течение 1 часа, в то время как непокрытые лунки блокировали в качестве контроля;
c) промывали ФСБТ три раза, все этапы промывания выполняли на автоматическом микропланшетном промывателе Biotek (Elx 405);
d) по 100 мкл ФСБ, содержащего hIL-17 А (0,2 мкг/мл), добавляли в каждую лунку, термостатически инкубировали при 37°С в течение 1 ч;
e) промывали ФСБТ 3 раза.
f) титрование Hu049-18: разведенным в соотношении 1: 2 раствором для разведения антител, начальная концентрация составляла 0.8 мкг/мл. 100 мкл разбавленного Hu049-18 добавляли в каждую лунку, строили стандартную кривую. 96-луночный планшет инкубировали термостатически при 37°С в течение 1 ч.
g) промывали ФСБТ 3 раза;
h) 100 мкл козьих антител против человеческого IgG (FAB-специфических), конъюгированных с пероксидазой (Sigma, Cat. No. 121М4811) (1:5000), добавляли в каждую лунку, термостатически инкубировали при 37°С в течение 1 ч;
i) промывали ФСБТ 3 раза. 100 мкл субстрата ТМВ добавляли в каждую лунку, термостатически инкубировали при 37°С в течение 5 мин. Затем реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1М HCl в каждую лунку;
j) Значение OD при длине волны 450 нм/630 нм считывали микропланшетным ридером ИФА (Molecular Devices, Spectra Max).
2) Тестирование образца:
a) планшет для микротитрования непосредственно покрывали 1 мкг/мл стрептавидина, при 4°С в течение ночи;
b) планет для микротитрования блокировали посредством 300 мкл ФСБТ, содержащего 2% бычьего сывороточного альбумина (V/V), термостатически инкубировали при 37°С в течение 1 ч, в то время как непокрытые лунки блокировали в качестве контроля;
c) промывали ФСБТ три раза, все этапы промывания выполняли на автоматическом промывателе Biotek (Elx 405);
d) по 100 мкл ФСБ, содержащего hIL-17А (0,2 мкг/мл), добавляли в каждую лунку, термостатически инкубировали при 37°С в течение 1 ч;
e) промывали ФСБТ 3 раза.
f) титрование образцов сыворотки: Перед экспериментом образец сыворотки крысы разводили в различных соотношениях для получения оптимального коэффициента разбавления, при котором концентрация антитела в сыворотке находилась как раз в середине стандартной кривой. Образцы сыворотки были разведены в соответствии с оптимальным коэффициентом разбавления, в то время как Нu049-18 разбавляли до 25 нг/мл. 100 мкл разбавленного образца сыворотки и Hu049-18 добавляли в каждую лунку, и термостатически инкубированы при 37°С в течение 1 ч. Каждую концентрацию титровали в двух лунках;
g) Промывание ФСБТ 3 раза;
h) 100 мкл козьих антител против человеческого IgG (FAB-специфических), конъюгированных пероксидазой (Sigma, Cat.No. 121М4811) (1:5000), добавляли в каждую лунку, термостатически инкубировали при 37°С в течение 1 ч;
i) Промывание ФСБТ 3 раза. 100 мкл субстрата ТМВ добавляли в каждую лунку, термостатически инкубировали при 37°С в течение 5 мин. Затем реакцию останавливали добавлением 100 мкл 1М HCl в каждую лунку;
j) Значение OD при длине волны 450 нм/630 нм считывали микропланшетным ридером ИФА (Molecular Devices, Spectra Max).
2. Процедуры для детекции у макак:
Процедуры для детекции in vivo у макак (Масаса fascicularis) были аналогичны таковым для крыс, различия были следующими: введение яванским макакам осуществлялось только с помощью внутривенных инъекций (в.в.), в дозе 1 мг/кг, пробу крови брали через хвостовую вену через 0 минут, 5 минут, 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 24 часа, 32 часа, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 9 дней, 12 дней, 14 дней, 17 дней, 21 день, 28 дней, 35 дней после введения, 500 мкл каждый раз. Образец сыворотки после центрифугирования разделяли на 3 части (следует убедиться, что каждая из 2-х частей содержит образец 60 мкл) и замораживали при -80°С для анализа.
Результаты эксперимента:
В соответствии с указанным выше способом, гуманизированные антитела Hu049-18, полученные в Примере 2, протестировали, результаты были следующими:
Заключение: Эти результаты показывают, что по сравнению с контрольным антителом Lilly (величина Т1/2 положительного антитела у макак была описана на 6,5 день (в.в.) и 10,3 день (п.к.)), антитело Нu049-18 настоящему изобретению значительно продлевает период полувыведения in vivo в описанных условиях.