СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА

1. Способ получения интересующего белка, включающий введение по меньшей мере одного экспрессионного вектора, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую интересующий белок, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, в суспензионную клетку млекопитающего; интеграцию генного фрагмента, содержащего ДНК, кодирующую интересующий белок, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего для получения клетки млекопитающего, которая экспрессирует интересующий белок; и суспензионное культивирование клетки млекопитающего.
2. Способ получения интересующего белка, включающий следующие этапы (А)-(С):
(A) этап одновременного введения следующих экспрессионных векторов (а) и (b) в суспензионную клетку млекопитающего:
(a) по меньшей мере один экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую интересующий белок, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента;
(b) экспрессионный вектор, который содержит ДНК, кодирующую транспозазу, которая узнает транспозонные последовательности и обладает способностью перемещать генный фрагмент, вставленный между парой транспозонных последовательностей, в хромосому;
(B) этап получения суспензионной клетки млекопитающего, которая экспрессирует интересующий белок в результате временной экспрессии транспозазы с экспрессионного вектора, введенного в суспензионную клетку млекопитающего на этапе (А), с целью интеграции генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего, и
(С) этап суспензионного культивирования суспензионной клетки млекопитающего, которая экспрессирует интересующий белок, полученной на этапе (В), для получения интересующего белка.
3. Способ получения суспензионной клетки млекопитающего, которая экспрессирует интересующий белок, включающий введение по меньшей мере одного экспрессионного вектора, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую интересующий белок, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, в суспензионную клетку млекопитающего и интеграцию генного фрагмента, вставленного между парой транспозонных последовательностей, в хромосому клетки млекопитающего.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором по меньшей мере один из экспрессионных векторов, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую интересующий белок, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, представляет собой экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую интересующий белок, и ген селектируемого маркера, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента.
5. Способ по п.1, включающий введение экспрессионного вектора, который содержит генный фрагмент, содержащий селектируемый маркер, и содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, в клетку млекопитающего в дополнение к экспрессионному вектору, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую интересующий белок, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента.
6. Способ по п.1, в котором ДНК, кодирующая интересующий белок, представляет собой ДНК, кодирующую антитело.
7. Способ по п.6, в котором ДНК, кодирующая антитело, представляет собой по меньшей мере одну из ДНК, кодирующей Н-цепь антитела, и ДНК, кодирующей L-цепь антитела.
8. Способ по п.4, в котором экспрессионный вектор, выбранный из следующих пунктов (а)-(d), вводят в суспензионную клетку млекопитающего:
(a) экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую Н-цепь антитела, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую L-цепь антитела, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, и экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ген селектируемого маркера, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента;
(b) экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую Н-цепь антитела, и ген селектируемого маркера, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, и экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую L-цепь антитела, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента;
(c) экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую L-цепь антитела, и ген селектируемого маркера, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, и экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую Н-цепь антитела, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, и
(d) экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую Н-цепь и L-цепь антитела, и ген селектируемого маркера, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента.
9. Способ по любому из пп.1-3, в котором суспензионная клетка млекопитающего представляет собой клетку, способную выживать и пролиферировать в бессывороточной среде.
10. Способ по любому из пп.1-3, в котором суспензионная клетка млекопитающего представляет собой по меньшей мере клетку, выбранную из суспензионной клетки СНО, при этом клетка СНО адаптирована к суспензионному культивированию, клетки PER.C6, клетки крысиной миеломы YB2/3HL.Р2.G11.16Ag.20 (или также называемой YB2/0) и суспензионной клетки мышиной миеломы NS0, адаптированной к суспензионному культивированию.
11. Способ по п.10, в котором клетка СНО представляет собой по меньшей мере клетку, выбранную из СНО-К1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 и СНО-S.
12. Способ по п.4, в котором ген селектируемого маркера представляет собой ген устойчивости к циклогексимиду.
13. Способ по п.12, в котором ген устойчивости к циклогексимиду соответствует рибосомному белку.
14. Способ по любому из пп.1-3, в котором пара транспозонных последовательностей представляет собой нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов ДНК-типа, которые функционируют в клетке млекопитающего.
15. Способ по п.14, в котором нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов ДНК-типа, представляют собой нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов Tol1, или нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов Tol2.
16. Способ по п.15, в котором нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов Tol2, представляют собой нуклеотидную последовательность, содержащую нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3.
17. Способ по п.15, в котором нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов Tol1, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15.
18. Суспензионная клетка млекопитающего, которая имеет хромосому, в которую интегрирован генный фрагмент, вставленный между парой транспозонов, и которая продуцирует интересующий белок, получаемый путем одновременного введения по меньшей мере одного экспрессионного вектора (а), который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую интересующий белок, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, и экспрессионного вектора (b), который содержит ДНК, кодирующую транспозазу (трансферазу), способную узнавать транспозонные последовательности и обладающую способностью переносить генный фрагмент, вставленный между парой транспозонных последовательностей, в хромосому.
19. Клетка млекопитающего по п.18, в которой по меньшей мере один из экспрессионного вектора (а), который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую интересующий белок, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, представляет собой экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую интересующий белок, и ген селектируемого маркера, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента.
20. Клетка млекопитающего по п.18, которая представляет собой клетку, полученную в результате дополнительного введения экспрессионного вектора (с), который содержит генный фрагмент, содержащий ген селектируемого маркера, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, в дополнение к экспрессионным векторам (а) и (b).
21. Клетка млекопитающего по любому из пп.18-20, в которой ДНК, кодирующая интересующий белок, представляет собой ДНК, кодирующую антитело.
22. Клетка млекопитающего по п.21, в которой ДНК, кодирующая антитело, представляет собой по меньшей мере одну из ДНК, кодирующей Н-цепь антитела, и ДНК, кодирующей L-цепь антитела.
23. Клетка млекопитающего по любому из пп.18-20, в которую введен экспрессионный вектор, выбранный из следующих пунктов (a)-(d):
(a) экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую Н-цепь антитела, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую L-цепь антитела, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, и экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ген селектируемого маркера, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента;
(b) экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую Н-цепь антитела, и ген селектируемого маркера, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, и экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую L-цепь антитела, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента;
(c) экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую L-цепь антитела, и ген селектируемого маркера, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, и экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую Н-цепь антитела, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента, и
(d) экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую Н-цепь и L-цепь антитела, и ген селектируемого маркера, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента.
24. Клетка млекопитающего по любому из пп.18-20, представляющая собой клетку, способную выживать и пролиферировать в бессывороточной среде.
25. Клетка млекопитающего по любому из пп.18-20, представляющая собой любую суспензионную клетку млекопитающего, выбранную из суспензионной клетки СНО, при этом клетка СНО адаптирована к суспензионному культивированию, клетки PER.C6, клетки крысиной миеломы YB2/3HL.Р2.G11.16Ag.20 (или также называемой YB2/0) и суспензионной клетки мышиной миеломы NS0, адаптированной к суспензионному культивированию.
26. Клетка млекопитающего по п.25, при этом клетка СНО представляет собой любую клетку, выбранную из СНО-К1, CHO-K1SV, DUKXB11, CHO/DG44, Pro-3 и CHO-S.
27. Клетка млекопитающего по п.19 или 20, в которой ген селектируемого маркера представляет собой ген устойчивости к циклогексимиду.
28. Клетка млекопитающего по п.27, в которой ген устойчивости к циклогексимиду представляет собой ген, кодирующий мутант человеческого рибосомного белка L36a.
29. Клетка млекопитающего по п.19 или 20, в которой пара транспозонных последовательностей представляет собой нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов ДНК-типа, которые функционируют в клетке млекопитающего.
30. Клетка млекопитающего по п.29, в которой нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов ДНК-типа, представляют собой нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов Tol1, или нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов Tol2.
31. Клетка млекопитающего по п.30, в которой нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов Tol2, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3.
32. Клетка млекопитающего по п.30, в которой нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов Tol1, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15.
33. Экспрессионный вектор, который содержит генный фрагмент, содержащий ДНК, кодирующую интересующий белок, и также содержит пару транспозонных последовательностей на обоих концах генного фрагмента.
34. Экспрессионный вектор по п.33, в котором пара транспозонных последовательностей представляет собой нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов Tol1, или нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов Tol2.
35. Экспрессионный вектор для белка по п.34, в котором нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов Tol2, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 3.
36. Экспрессионный вектор по п.34, в котором нуклеотидные последовательности, полученные из пары транспозонов Tol1, представляют собой нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 14, и нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 15.