УСТРОЙСТВО ДЛЯ МУЛЬТИСУБСТРАТНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ МИКРООБЪЕКТОВ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

Устройство относится к области идентификации микроорганизмов: микробов, клеток организмов - и других биологических микрообъектов и определения их биологических свойств по фенотипическим характеристикам, в частности, путем измерения оптическими методами реакций идентифицируемого биологического микрообъекта на специальные тест-субстраты.
Существует направление таксономической фенотипической диагностики, называемое мультисубстратным тестированием, которое представляет собой совокупность устройств и технологий таксономической идентификации биологических микрообъектов и их биологических характеристик путем определения их реакций на набор тест-субстратов (обычно в наборе содержится от 5 до 100 штук тест-субстратов).
В настоящее время известны разнообразные устройства, обеспечивающие определение указанных характеристик микроорганизмов путем проведения специфических тестов идентифицируемого микроорганизма.
Рассматриваются устройства для измерения функциональных реакций микроорганизмов на тест-субстраты указанными методами, и определения таких их характеристик, как, например, таксономическая принадлежность к таксону данного уровня (семейству, роду, виду, штамму) чистой культуры микроорганизма или в смеси с другими микроорганизмами, чувствительность к антибиотикам, концентрация микроорганизмов, их активность, жизнеспособность и др.
Современные устройства для измерения функциональных реакций микроорганизмов имеют в своем составе тест-планшеты, содержащие одинаковые ячейки, закрепленные в узлах плоской решетчатой конструкции, эти ячейки содержат тест-субстраты с минеральными компонентами, введенные вместе с микроорганизмами и химическими индикаторами, например, солями тетразотия. Тест-планшеты помещаются в инкубатор (как правило, обычный термостат) на определенное время для инкубации идентифицируемых культур микроорганизмов, введенных в тест-планшеты, и проявления специфических реакций на субстраты (размножение клеток микроорганизмов, его отсутствие или гибель клеток, что рассматривается как увеличение или уменьшение их концентрации), после чего характеристики микроорганизмов в каждой ячейке тест-планшета определяются либо путем визуального сравнения измеряемых параметров индикатора с аналогичными параметрами из эталонного спектра параметров или балльной шкалы из базы данных, либо с использованием, например, фотометра, спектрометрического оборудования и/или компьютера для регистрации и расчета указанных характеристик и, например, автоматизации процесса идентификации микроорганизмов.
(Примечание авторов. Тест-субстратами служат, как правило, однокомпонентные или сложные органические вещества и смеси (в том числе, синтетические смеси определенного, стандартизованного состава или, гораздо реже многокомпонентные не стандартизованные среды, например, природные среды, типа пептона или дрожжевого экстракта), поддерживающие рост микроорганизмов определенной таксономической группы или нескольких групп или угнетающие жизнедеятельность микроорганизмов таких групп. При этом, минеральные компоненты в составе тест-субстрата, не являются узкоселективными тест-субстратами, но лишь дополнительно оптимизированы по своему качественному и количественному составу для развития всей совокупности тех групп микроорганизмов, на дифференциальную диагностику которых ориентирован данный набор тест-субстратов.
Химические индикаторы - это вещества специально подобранного состава и концентрации в тестовых средах, обычно не оказывающие влияния на исследуемые микроорганизмы, и при этом сами специфично изменяющие свои характеристики по известному закону при воздействии микроорганизмов или других микрообъектов. Обычно изменение концентрации исследуемых микрообъектов определяет изменение оптических характеристик химического индикатора, которые измеряются приборными средствами или визуально и сравниваются с аналогичными значениями для известных параметров микрообъектов).
Простейшими аналогами заявляемого устройства являются системы API test (BioMerieaux, Франция), MICRO-LA-TEST (PLIVA Lachema, Чехия) /1, 2/. Они состоят из тест-планшетов с наборами тест-субстратов, адаптированных для экспресс-идентификации чистых культур клеток микрообъектов (к какому виду или подвиду они относится). В ячейки тест-планшетов вместе с тест-субстратами и химическими индикаторами вносятся суспензии клеток чистой культуры, которую требуется идентифицировать. Далее подготовленные тест-планшеты устанавливают в инкубатор для инкубации (размножения) микроорганизмов на 4-48 часов в зависимости от их вида. После этого визуально проводится определение принадлежности тестируемой чистой культуры к таксону данного уровня (отдел, семейство, род, вид, штамм), путем сравнения реакций данной культуры на тест-субстраты, регистрируемых по изменению химических индикаторов, с эталонными спектрами реакций микроорганизмов известной таксономической принадлежности.
Недостатками аналогов являются: ограниченность сферы применения относительно узкими таксономическими группами чистых культур микроорганизмов, принадлежность к которым идентифицируемой культуры необходимо установить предварительно с помощью других бактериологических методов; использование для учета реакций микроорганизмов на тест-субстраты специальных химических индикаторов, способных иногда приводить к появлению ошибочных результатов в связи с химическим взаимодействием между химическим индикатором и посторонними компонентами исследуемой пробы (появлению ложноотрицательных и ложноположительных реакций); необходимость значительных затрат времени на идентификацию (во многих случаях требуется 24 - 48 часов); значительная погрешность из-за использования операций визуального сравнения данных с субъективной количественной оценкой их оператором. За счет этих недостатков устройства-аналоги имеют относительно высокую стоимость анализов и оборудования при недостаточном использовании полезной информации, предоставляемой совокупностью реакций на набор тест-субстратов.
Большой группой известных устройств являются системы идентификации чистых культур микроорганизмов Vitek (Франция) /1, 3/, BBL Crystal (США) /3, 4/, Phoenix (США) /3, 4/, МТС (Россия) /2/, «МИКРОБ-2» (Россия) /1, 2/, Microscan Rapid (Siemens, Германия) /3, 4/. В их составе имеются тест-планшеты, устройства для приборной регистрации реакций микроорганизмов и различное программное обеспечение, в том числе, для автоматизированной регистрации результатов тестирования чистых культур микроорганизмов. В тест-планшетах в этой группе аналогов используются различные и более разнообразные наборы тест-субстратов и химических индикаторов, чем ранее, что позволяет с большей точностью осуществлять идентификацию и дифференциальную диагностику таксономической принадлежности более широких групп микроорганизмов, а также повысить качество определения их чувствительности к антибиотикам.
Особенностью аналога Microscan Rapid является то, что в его составе, в том числе, используются флуорогенные индикаторы роста бактерий, многоканальный флуориметр, имеющий встроенный микрокомпьютер со специализированным программным обеспечением. Система Microscan Rapid осуществляет таксономическую идентификацию и определение чувствительности к антибиотикам за 2-48 часов, обработка результатов тестирования микроорганизма и его идентификация осуществляются автоматически.
К описанной выше группе аналогов относится еще одно устройство - система фенотипической идентификации микроорганизмов BIOLOG (США) /5/. Эта система включает в себя тест-планшеты с 96 ячейками, каждая из которых содержит определенный тест-субстрат и среду, общую для всех ячеек, а также рабочую станцию, включающую в себя инкубатор тест-планшетов и автоматический многоканальный фотометр, и персональный компьютер. Продолжительность исследования составляет от 4 до 72 часов, что обусловлено особенностью выращивания выбранных для идентификации культур клеток в присутствии тест-субстратов. Результат тестирования чистых культур на стандартных наборах тест-субстратов оценивается в устройстве BIOLOG качественными и количественными признаками, представляющими собой образование взвеси нерастворимых в воде формазанов, возникающих в ходе биохимических реакций в клетках микроорганизмов из индикаторных веществ - солей трифенилтетразолия (реакция положительная), или отсутствие этой взвеси (отрицательная реакция). За счет использования в устройстве до 8-ми различных наборов приспособлений и реактивов к тест-планшетам система BIOLOG обеспечивает биологически информативную идентификацию чистых культур и сообществ микроорганизмов, а также значительного числа других биологических микрообъектов разных групп (мицелиальные грибы и дрожжи, клетки млекопитающих и др.).
7
Недостатками данной группы аналогов является: ограниченность сферы применения, так как они предназначены для анализа, в основном, чистых культур микроорганизмов или ограниченного числа их сообществ; использование для учета реакций микроорганизмов на тест-субстраты специальных химических индикаторов, способных приводить к неконтролируемому влиянию на развитие микроорганизмов и появлению ошибочных (ложно-положительных или ложно-отрицательных) результатов идентификации микроорганизмов; необходимость достаточно высокой плотности клеток в пробе для получения результата (10 клеток в миллилитре пробы к началу анализа); большие затраты времени на проведение анализа, сложность и высокая стоимость проведения анализов; значительная погрешность результатов.
Прототипом заявляемой полезной модели является устройство «Программно-аппаратный комплекс микробиологического мониторинга МСТ «ЭкоЛог» (Россия) /6, 7/.
Устройство представляет собой аппаратный комплекс из отдельных узлов и блоков, выполненный в виде стационарной настольной системы. В своем составе устройство содержит:
- подготовленный, в соответствии с методикой /6/, набор тест-субстратов, растворенных в воде вместе с минеральными компонентами,
- подготовленные, в соответствии с методикой /6/, пробы, содержащие исследуемые аэробные гетеротрофные бактерии и общий для всех проб химический индикатор в водном растворе фосфатного буфера,
- 96-ячеечный тест-планшет, содержащий в узлах плоской горизонтальной прямоугольной решетки одинаковые ячейки, в которые дозатором внесены подготовленные тест-субстраты, по одному из набора, пробы микроорганизмов с химическим индикатором и другие компоненты подготовленных сред, образующих в ячейках тестовые среды, при этом в составе тестовых сред проба микрооганизмов, химический индикатор и минеральная среда для всех ячеек - одинаковы, и при этом тестовая среда, содержащаяся в одной контрольной ячейке, не содержит в своем составе тест-субстрат,
- термостатированный инкубатор, в который устанавливался тест-планшет с ячейками, заполненными тестовыми средами для инкубации в течение 12-72 часов (время инкубации зависит от характеристик микрообъекта и поставленных задач идентификации),
- многоканальный фотометр оптической плотности среды, в состав которого входят:
источник узкополосного оптического излучения на фиксированых длинах волн (использовалось излучение на длине волны - 510 нм), оптическая коллимирующая многоканальная система формирования пучков света, освещающих (зондирующих) ячейки с тестовой средой тест-планшета, соответствующая оптическая система приема оптического излучения на той же длине волны после прохождения через исследуемую тестовую среду в каждой ячейке, узел фотоприемников оптического излучения и преобразования его в электрический сигнал, узел первичной обработки и нормирования принятой информации от узла фотоприемников,
- при этом степень помутнения и соответствующее изменение оптической плотности среды являлось измеряемым откликом на реакцию микроорганизмов (рост или уменьшение их концентрации в среде в ячейке), возникающим за счет образования взвеси нерастворимых в воде формазанов в ходе биохимических реакций превращения индикаторных веществ - солей трифенилтетразолия - в живых клетках микроорганизмов,
- измерения проводились фотометром, в зависимости от поставленных задач, непосредственно перед инкубацией и в процессе инкубации при заданной температуре с периодичностью не чаще, чем через три часа, и/или по его завершению с общей длительностью до 72 часов,
- персональный компьютер со специализированным программным обеспечением, предназначенным для обработки данных измерения оптической плотности тестовой среды в каждой ячейке тест-планшета по заданной временной программе, сравнения полученных данных с заранее подготовленной базой данных аналогичных параметров, и их дальнейшей компьютерной обработки, в том числе, с использованием методов энтропийного анализа.
Представленная информация о рассмотренных выше аналогах, в том числе, и о прототипе, ранжирована по росту объема информации о биологических микрообъектах, которую можно получить от того или иного устройства из числа аналогов. Прототип является наиболее близким аналогом к заявляемому устройству по объему и качественным характеристикам измеряемой и перерабатываемой информации, а главное, по своим существенным признакам.
Основным недостатком прототипа, как и предыдущих аналогов, является использование только химических индикаторов как единственных индикаторов идентификации микроорганизмов и диагностирования их характеристик. Обладая высокой избирательностью, химические индикаторы имеют ряд принципиальных недостатков при использовании в устройствах для таксономической идентификации такого класса, к которому принадлежат аналоги. Причиной недостатков является то, что собственно процесс идентификации осуществляется опосредованно - по изменению физических характеристик химических индикаторов, таких как цветность или спектральные характеристики излучения, показатели рассеяния, поглощения света, воздействующего на химические индикаторы, а не по характеристикам самих микрообъектов. Внесение химических индикаторов в тестовые среды способно приводить к неконтролируемому влиянию на развитие микроорганизмов (в том числе, к их отравлению) и появлению ошибочных (ложно-положительных или ложно-отрицательных) результатов идентификации и диагностирования характеристик микроорганизмов. Например, при определения взаимодействия болезнетворных микроорганизмов с лекарственными препаратами воздействие фенольных колец химических индикаторов может привести к полной потере информации о реакции микроорганизмов на препарат.
5
7
Кроме того, в ряде случаев необходимо исследовать, например, сложные смеси неизвестных микроорганизмов разных культур, видов и т.д., при этом использование химических индикаторов обычно не позволяет определить, каким именно микроорганизмом из состава смеси обеспечивается положительная реакция на тест-субстрат, либо для этого требуется большое количество специфичных химических индикаторов, вспомогательных реагентов и процедур, представляющих собой отдельные исследования, в частности, генотипирование на основе принципа полимеразной цепной реакции (ПЦР). Это приводит к ограничению области применения метода и устройства (прототипа), в частности в данном случае, прототип позволяет идентифицировать чистые культуры микроорганизмов и клеток и некоторые виды штаммов прокариотических микроорганизмов (бактерий) и грибов. Для надежного диагностирования в ряде случаев требуется обеспечить достаточно высокую концентрацию клеток в пробе для получения результата (10 - 10 клеток в миллилитре пробы к началу анализа). Также требуются большие затраты времени на проведение анализа. Все это значительно увеличивает стоимость и длительность проведения анализов и устройства в целом.
Многие химические индикаторы являются вредными веществами для человека и для окружающей среды, поэтому требуется санитарная защита от этих веществ человека и обеспечение мероприятий по их утилизации, что добавляет затраты на проведение анализов.
Техническими задачами, решаемыми предлагаемой полезной моделью - устройством для мультисубстратной флуоресцентной идентификации биологических микрообъектов и их биологических свойств - являются: повышение информативности и чувствительности функциональных фенотипических тестов, за счет использования собственных физических параметров микрообъектов в качестве индикаторов реакций этих микрообъектов на тест-субстраты, а именно спектров собственной флуоресценции и некоторых других оптических характеристик. Это обеспечит возможность идентификации отдельных микроорганизмов в составе сложной многокомпонентной пробы без ее предварительного разделения на чистые культуры; а также обеспечит удешевление и упрощение процедуры тестирования микроорганизмов. При этом возможно использовать унифицированные наборы тест-субстратов для идентификации более широкого круга микроорганизмов и их свойств, чем ранее; сократить диапазон продолжительности исследования до 2-6 часов, считая с момента начала анализа до момента получения информации о таксономической принадлежности и отдельных биологических свойствах данного микроорганизма. При одновременном использовании в заявляемой полезной модели вместе с физическими индикаторными характеристиками дополнительно химических индикаторов можно значительно сократить разнообразие наборов тест-субстратов и химических индикаторов и их количество в наборе, по сравнению с аналогами, что позволит соответственно снизить стоимость и длительность проведения анализов и устройства в целом.
Решение данных технических задач достигается тем, что заявляемое устройство для мультисубстратной флуоресцентной идентификации биологических микрообъектов и их биологических свойств, в соответствии с прототипом, представляет собой аппаратный комплекс, выполненный из отдельных узлов и блоков, и содержит:
- подготовленный набор образцов органических тест-субстратов, либо в сухом виде, либо в виде раствора, с возможностью введения в состав образцов минеральных компонентов, в соответствии с методикой /6, 7/,
- подготовленные пробы, содержащие исследуемые биологические микрообъекты в водном растворе с возможностью введения в состав проб химических индикаторов, в соответствии с методикой /6, 7/,
- по меньшей мере, один тест-планшет, содержащий в узлах плоской решетчатой конструкции одинаковые ячейки, в которые могут быть внесены подготовленные образцы тест-субстратов, по одному из набора, могут быть внесены пробы с растворами, содержащими биологические микрообъекты, и другие компоненты подготовленных сред, которые в ячейках вместе образуют тестовые среды, при этом необходимо обеспечить возможность, чтобы тестовая среда, содержащаяся, по меньшей мере, в одной контрольной ячейке, не содержала в своем составе тест-субстрат,
при этом имеется возможность закрыть герметично или не герметично по меньшей мере, одной крышкой, по меньшей мере, одну ячейку,
при этом стенки, дно и/или крышки ячеек, по меньшей мере, в части поверхности являются оптически прозрачными,
- термостатированный инкубатор, в который устанавливается, по меньшей мере, один тест-планшет с ячейками, заполненными тестовыми средами для инкубации,
- по меньшей мере, один источник оптического излучения, в составе которого имеется возможность использовать оптическую систему, в том числе, многоканальную, для формирования потоков излучения, с целью зондирования тестовых сред в каждой ячейке одного тест-планшета напрямую или через прозрачные поверхности ячейки,
- узел приема излучения, испускаемого тестовыми средами с биологическими микрообъектами, из каждой ячейки при зондировании их излучением от источника оптического излучения, и преобразования принятого излучения в электрический сигнал, с возможностью использовать в своем составе оптическую систему, в том числе, многоканальную, для формирования оптических потоков, поступающих из тестовой среды, по меньшей мере, одной ячейки, при воздействии на среду зондирующего излучения,
- узел обработки и регистрации информации, полученной от узлов приема, преобразования принятого излучения в электрический сигнал.
В отличие от прототипа, заявляемая полезная модель - устройство для мультисубстратной флуоресцентной идентификации биологических микрообъектов и их биологических свойств - имеет следующие отличительные существенные признаки.
Тест-планшеты с ячейками и/или с крышками изготовлены из не флуоресцирующего материала, при этом стенки, дно и/или крышки ячеек, по меньшей мере, в части поверхности не являются прозрачными, с возможностью покрытия, по меньшей мере, части поверхности стенок, дна и/или крышек ячеек свето-поглощающим или свето-отражающим материалом.
В устройстве имеется возможность использовать вместе и/или порознь отдельные источники излучения, спектр излучения которых представляет собой узкие и/или широкие полосы и/или линии в диапазоне от ультрафиолетовой до ближней ИК области спектра, при этом имеется возможность оптического зондирования тестовых сред, по меньшей мере, от одного источника, имеющего излучение с соответствующей полосой спектра, выбранной для зондирования.
Узел приема и преобразования оптического излучения и узел обработки и регистрации информации имеют или не имеют в своем составе блоки, обеспечивающие возможность приема излучения флуоресценции, поступающего из тестовой среды, от отдельных составляющих ее биологических микрообъектов и/или от других ее компонентов, и селекции сигнала, соответствующего заданным характеристикам флуоресценции принятого излучения, от сигнала, соответствующего остальному поступающему излучению, в том числе, возможно - с использованием спектрофлуориметра,
и/или блоки, обеспечивающие возможность приема и анализа параметров излучения, рассеянного определяемыми микрообъектами (в том числе, поляризации и индикатрисы рассеяния), и селекции сигнала, соответствующего рассеянию излучения этими микрообъектами, от сигнала других источников рассеяния в тестовой среде ячейки.
Узел обработки и регистрации информации, полученной от узлов приема, преобразования принятого излучения, выполнен в виде электронно-вычислительного блока, в том числе, как части компьютера, имеющего программное обеспечение для обработки данных, в том числе, спектральных характеристик флуоресценции компонентов тестовых сред, полученных автоматически в текущем времени от узлов и блоков устройства и/или данных, введенных вручную, и/или подготовленных заранее баз данных, в том числе, данных об аналогичных спектральных характеристиках флуоресценции известных компонентов тестовых сред.
В составе подготовленных образцов тест-субстратов в качестве растворителя наряду с водой может использоваться этиловый спирт, и/или физиологический раствор, по отдельности или в смеси.
В состав подготовленных проб определяемых микрообъектов имеется возможность дополнительно включить растворы солей органических и неорганических веществ, в том числе, буферные системы.
В составе подготовленных образцов тест-субстратов, в составе подготовленных проб определяемых микрообъектов и/или в составе, по меньшей мере, некоторых биологических микрообъектов в подготовленных пробах содержатся/введены или не содержатся/не введены квантовые точки и/или другие тестовые биологические микрообъекты, обладающие и/или не обладающие свойствами флуоресценции при облучении их оптическим излучением.
Среди источников оптического излучения имеется возможность использовать, по меньшей мере, один лазерный и/или светодиодный источник узкополосного и/или линейного спектра излучения в заданной области спектра и/или имеется возможность использования средств, в том числе, оптических фильтров, для формирования требуемых спектральных характеристик оптического излучения от источника.
Обеспечена возможность отбора пробы тестовой среды из, по меньшей мере, одной ячейки тест-планшета, переноса указанной пробы в отдельную кювету и/или ячейку, в том числе, того же или другого тест-планшета, например, в отдельную оптическую микрокювету в составе устройства или вне его, с обеспечением возможности измерения характеристик тестовой среды и ее компонентов, в том числе, флуоресценции биологических микрообъектов, с целью идентификации измеряемых биологических микрообъектов и их биологических свойств.
Аппаратный комплекс устройства может быть выполнен либо в стационарном настольном, либо в компактном переносном исполнении, с узлами и блоками устройства, собранными, по меньшей мере, частично, в едином защитном кожухе, с возможностью вывести наружу кожуха дисплей электронно-вычислительного блока, панель и элементы управления работой устройства и отдельных узлов.
Работа устройства заключается в обеспечении одинаковых начальных условий для тестовых сред в ячейках тест-планшета, одинаковых заданных условий их инкубации и оптического зондирования и поступления оптического излучения от тестовых сред в узлы приема и преобразования излучения и обработки и регистрации информации.
Период инкубации зависит от вида микрообъектов, их начальной концентрации в пробе, поставленных задач идентификации и длится от 2 до 10 часов. Дополнительная информация о характеристиках микрообъектов, заложенная в базы данных устройства, возможность использования химических индикаторов, в том числе на основе квантовых точек, в дополнение к спектральным характеристикам собственной флуоресценции микрообъектов также поможет снизить период инкубации и количество тест-субстратов в наборе для идентификации по сравнению с аналогами и прототипом.
Использование в узле обработки предварительно подготовленных баз данных и современных методов математической обработки полученной информации, например, модифицированного метода наименьших квадратов для статистического анализа спектральных характеристик флуоресценции компонентов тестовых сред, позволяет получить искомые характеристики идентификации биологических микрообъектов и их биологических свойств из проб чистых культур, штаммов и/или из смеси биологических микрообъектов различного вида.
Благодаря своим существенным признакам, заявляемое устройство обеспечивает регистрацию совокупности реакций (ранжированных по набору тест-субстратов в ряду ячеек тест-планшета) биологических микрообъектов на тест-субстраты по собственной флуоресценции этих микрообъектов, выделяя, при этом, из суммарного спектра флуоресценции тестовых сред специфические компоненты спектра собственной флуоресценции, соответствующие однородным совокупностям микрообъектов (например, микробных клеток) и характеризующие их структурные специфические признаки. Для анализа данных, полученных от узлов приема и преобразования излучения в электрический сигнал, например, от спектрофлуориметра, в устройстве используется узел обработки и регистрации полученной информации в виде персонального компьютера. При этом для анализа данных спектрофлуориметрии используется специальное программное обеспечение и предварительно подготовленные базы данных по известным характеристикам тех же микрообъектов, которые идентифицируются устройством.
Замена химических индикаторов метаболизма на собственные спектрально-флуоресцентные характеристики микробных клеток, реализованная в данной полезной модели, обеспечивает независимость результатов тестирования клеток по отношению к тест-субстратам от артефактных реакций химического индикатора и снятие ограничений перечня идентифицируемых микроорганизмов, определяемого возможностью аналитически значимого взаимодействия с ними химического индикатора. Также это обеспечивает одновременное использование функциональных и структурных специфических информативных фенотипических признаков микроорганизмов для их идентификации и дифференциации.
Использование, например, в одном цикле измерений 47 функциональных тестов и, соответственно, признаков и 200-700 структурных характеристик, составляющих специфические компоненты спектра собственной флуоресценции клеток в каждом из указанных тестов, обеспечивает множество специфических фенотипических признаков мощностью до 32900 отдельных элементов, что вполне сопоставимо с мощностью множества генотипических признаков при гораздо более простой технологии определения фенотипических признаков.
Отбор проб тестовых сред с исследуемыми микроорганизмами из всех или некоторых определенных ячеек тест-планшета и проведение измерений их характеристик в отдельной кювете значительно повышает информативность результатов работы устройства и обеспечивает более высокую чувствительность и качество идентификации микрообъектов и их биологических характеристик.
На фигуре приводится общая схема варианта реализации устройства с детальным схематическим изображением тест-планшета (положение А - снаружи и Б - внутри инкубатора).
В представленной реализации устройство для мультисубстратной флуоресцентной идентификации биологических микрообъектов и их биологических свойств представляет собой аппаратный комплекс, выполненный из отдельных узлов и блоков.
В состав аппаратного комплекса входит тест-планшет (1), содержащий в узлах плоской горизонтальной прямоугольной решетки 8х12=96 одинаковых ячеек (2) объемом 0,25 мл каждая, в которые многоканальным дозатором внесены из предварительно подготовленного набора образцы тест-субстратов в растворе или в сухом виде, также внесены предварительно подготовленные пробы микроорганизмов в физрастворе и другие компоненты подготовленных сред. Они образуют в ячейках тестовые среды (3), при этом в данной реализации в составе тестовых сред проба микроорганизмов и минеральная среда для всех ячеек - одинаковы, а химические индикаторы везде отсутствуют, и при этом, в одной или в двух контрольных ячейках тестовая среда не содержит в своем составе тест-субстрат. Весь тест-планшет (1) выполнен из не флуоресцирующего материала, стенки ячеек выполнены непрозрачными, а дно - из оптически прозрачного не флуоресцирующего пластика.
Термостатированный инкубатор (4) в составе устройства обеспечивает инкубацию содержимого тест-планшета (1), помещенного в этот инкубатор. Период инкубации микрообъектов зависит от их вида, начальной концентрации в пробе, поставленных задач идентификации и длится от 2 до 10 часов. Дополнительная информация о характеристиках микрообъектов, заложенная в базы данных устройства, использование химических индикаторов в дополнение к спектральным характеристикам собственной флуоресценции микрообъектов помогает значительно снизить период инкубации и количество тест-субстратов в наборе для идентификации.
На схеме показано два положения тест-планшета в устройстве: А - снаружи (до начала инкубации и после инкубации) и Б - внутри инкубатора (до начала инкубации, в процессе и после инкубации). Вариант Б исполнения устройства предпочтителен, ввиду упрощения и компактности конструкции.
Для оптического зондирования тестовых сред используется лазерный и светодиодный источники света (5), испускающие излучение, в узкой полосе спектра каждый, на длинах волн 350 и 530 нм. Многоканальная оптическая коллимирующая система (6) формирует пучки света определенного спектрального состава, передает и направляет их через прозрачное дно в каждую ячейку (2), освещая содержащуюся в ней тестовую среду (3). Другая, соответственно, оптическая система (7) передает и направляет излучение флуоресценции тестовой среды от дна ячеек на спектрофлуориметр (8), для разложения излучения на спектральные составляющие и дальнейшей обработки.
Компьютер (9) в составе устройства, предназначенный для обработки, анализа спектроскопических данных и сохранения результатов измерений, обеспечен специальными программными средствами для анализа спектроскопических данных, полученных с выхода спектрофлуориметра (8), и имеет в своем контенте базу данных предварительно измеренных спектральных характеристик флуоресценции идентифицируемых или аналогичных им микрообъектов.
В составе аппаратного комплекса настоящей реализации устройства имеется, по меньшей мере, одна оптическая микрокювета (10), в которую производится (11) отбор пробы тестовой среды (3) из выбранной ячейки (2) тест-планшета (1) для проведения дополнительного или уточняющего определения характеристик измеряемых микрообъектов в составе пробы тестовой среды (3).
Все узлы и блоки устройства, кроме оптической микрокюветы (10), смонтированы внутри кожуха (на схеме не показан), при положении тест-планшета по варианту Б, образуя единый компактный переносной прибор. Снаружи кожуха находятся дисплей компьютера (9) и панель управления прибором.
Работа устройства заключается в обеспечении одинаковых начальных условий для тестовых сред (3) в ячейках тест-планшета (1), одинаковых заданных условий их инкубации и оптического зондирования и поступления оптического излучения от тестовых сред (3) в узлы приема и преобразования излучения и обработки и регистрации информации. Использование в узле обработки (9) предварительно подготовленных баз данных и современных методов математической обработки полученной информации, например, модифицированного метода наименьших квадратов для статистического анализа спектральных характеристик флуоресценции компонентов тестовых сред, позволяет получить искомые характеристики идентификации биологических микрообъектов и их биологических свойств из проб чистых культур, штаммов и/или из смеси биологических микрообъектов различного вида.
Заявленная полезная модель - устройство для мультисубстратной флуоресцентной идентификации биологических микрообъектов и их биологических свойств - может обеспечить повышение качества диагностики биологических и других микрообъектов и снижение затрат на подобные устройства в медицине, для диагностики заболеваний инфекционной и не инфекционной природы, в сельском хозяйстве, для оценки качества почв и продукции растениеводства и животноводства, в пищевой промышленности и биотехнологии, для оценки качества продукции и ее компонентов, в экологии, для оценки состояния компонентов природной среды, и в других отраслях народного хозяйства.
Источники информации:
1. Методики клинических лабораторных исследований. Под ред. В.В.Меньшикова. М., «Лабора», т.3. 2009. 879 с.
2. Руководство по медицинской микробиологии. Общая и санитарная микробиология. Под ред. А.С.Лабинской, Е.Г.Волиной. М., «Бином», 2008. 1077 с.
3. http://diagnostics.siemens.com/webapp/wcs/stores/servlet/CategoryDisplay~q_catalogI d~e_-
111~a_categoryId~e_1022066~a_catTree~e_100001,1023065,1022066~a_langId~e_-
111~a_storeId~e_10001.htm
4. Koneman's color atlas and textbook of diagnostic microbiology Eds. Washington C. Winn, Elmer W. Koneman. Whiley & Sons. 2009
5. http://www.biolog.com
6. Горленко М.В., Кожевин П.А. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ. М., «Макс-Пресс», 2006. 78 с.
7. Горленко М.В. и другие. Способ мультисубстратного тестирования микробных сообществ и его применение. Патент на изобретение №23335543 от 07.07.2006, МПК: C12Q 1/02.