Методы аналитического контроля в практике пищевых лабораторий

МЕТОДЫ АНАЛИТИЧЕСКОГО

КОНТРОЛЯ В ПРАКТИКЕ ПИЩЕВЫХ ЛАБОРАТОРИЙ

Куликовский А.В., канд. техн. наук, Чернуха И.М., доктор техн. наук, Кузнецова О.А., канд. техн. наук, Иванкин А.Н., доктор хим. наук

ФГБНУ «ВНИИМП им. В. М. Горбатова»

Арбитражные исследования образцов пищевой продукции требуют постоянного обновления приборной базы и внедрения современных химико-аналитических методов. В лаборатории «Научно-методические работы, биологические и аналитические исследования» внедрены методы атомно-абсорбционной спектрофотомерии с пламенной и электротермической атоми-зацией, инверсионно-вольтамперометрический метод, спектрометрический метод, метод ИК-спектроскопии, титриметриче-ские, потенциометрические, рефрактометрические методы, а так же хроматографические методы.

УДК 664:543 Ключевые слова:

безопасность, качество, хроматография, масс-спектрометрия, гормоны, канцерогены, фальсификация

Хроматографические методы представляют особый интерес, так как имеют ряд преимуществ, а именно: высокая эффективность; возможность разделения газообразных и жидких веществ любой природы; применимость для разделения смесей веществ, очень близких по своему составу, строению и свойствам; возможность использования как больших, так и малых количеств анализируемой смеси; возможность автоматизации и получение объективной информации; широкий интервал концентраций соединений; сочетание с другими физико-химическими методами; возможность изучения физико-химических свойств соединений и проведения качественного и количественного анализа. Спектр аналитических возможностей данного метода позволяет лаборатории проводить анализы и определять пестициды, полициклические ароматические углеводороды, углеводный состав и полисахариды, жирнокислотный состав, ами-

- ГОСТ 33422-2015 Мясо и мясные продукты. Определение массовой доли йодтирозинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором;

- ГОСТ 33429-2015 Мясо и мясные продукты. Определение содержания молочной кислоты и лакта-тов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии;

- ГОСТ Мясо и мясные продукты. Идентификация немясных ингредиентов растительного происхождения методом газовой хроматографии с масс-спектро-метрическим детектором;

- ГОСТ Мясо и мясные продукты. Определение бета-агонистов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором;

- ГОСТ Мясо и мясные продукты. Определение лимонной кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии;

Особенно остро в настоящее время стоит проблема бесконтрольного применения ветеринарных препаратов (гормонов и антибиотиков), не нормируемых в регламентирующих документах в РФ

нокислотный состава, водо- и жирорастворимые витамины, органические кислоты и консерванты, остатки ветеринарных препаратов (гормоны, антибиотики) и выявлять фальсификации молочных продуктов (определение фитостеринов) и др. В лаборатории в период 2012-2015 гг. было разработано более 10 нормативных документов (ГОСТ и МИ) на хроматографические методы исследований:

- ГОСТ 32307-2013 Мясо и мясные продукты. Определение содержания жирорастворимых витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии;

- ГОСТ Р 55482-2013 Мясо и мясные продукты. Метод определения содержания водорастворимых витаминов;

- ГОСТ Мясо и мясные продукты. Определение со-рбиновой и бензойной кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии;

- ГОСТ Мясо и мясные продукты. Определение состава летучих жирных кислот методом газовой хроматографии;

- МИ 103.5-132-2012 Определение содержания йод-тирозинов в йодированных молочных белках и БАДах на их основе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии;

- МИ 1035-135-2012 Определение содержания лимонной и молочной кислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в мясном сырье, мясных и мясосодержащих продуктах.

Особенно остро в настоящее время стоит проблема бесконтрольного применения ветеринарных препаратов (гормонов и антибиотиков), не нормируемых в регламентирующих документах в РФ. Использование гормонов в качестве стимулятора роста для повышения продуктивности животных запрещено в 160 странах, включая Китай и страны Европейского Союза (Council Directive 96/22/ ЕС; Directive 2003/74/ЕС) [1]. В РФ разработана методика определения остаточных количеств 5 6-агонистов в кормах, физиологических жидкостях, органах и тканях животных с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (ГХ-МС) (ГОСТ Р 54032-2010) [2]. Недостатками этой методики являются сложная пробоподготовка и необходимость предварительной дериватизации пробы. Также она не позволяет определять 6-агонисты нового поколения, в том числе рактопамин и зилпатерол, наиболее широко распространенные в США, Аргентине и Австралии. Поэтому задача разработки подтверждающей методики для определения 6-агонистов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (ВЭЖХ-МС/МС), является крайне актуальной. Разработанный во ВНИИМП ГОСТ позволяет определять 11 6-агонистов в мясе и мясной продукции. Метод основан на ферментативном гидролизе пробы пищевого продукта, извлечении бета-агонистов смесью изопропилового спирта с этилацетатом и очистке твердофазной экстракцией (ТФЭ). Детектирование 6-агонистов проводят в режиме мониторинга множественных реакций (MRM). Предел

4 К )-И

5«

if

j»

ut if

91 ift srt

J'i Va 07 )« m

)4)

oi

1Я

î-f

(4 0»

L.JJ Di

«je

T* if t9

Û 1 J LU ft» «Jt

ал

ÎJ

s nt. t» Ян J ni 51

sa

Kf Mi

количественного определения для всех б-агони-стов составил не менее 1 мкг/кг. Перечень определяемых веществ включает кленбутерол, саль-бутамол, рактопамин, тербуталин, сальметерол, пропранолол, тулобутерол, циматерол, мабутерол, мапентерол, зилпатерол. Полученные хромато-граммы стандартных образцов б-агонистов и калибровочные кривые представлены на рисунке 1.

Так же особенно остро на данный момент стоит проблема пищевых канцерогенов. При переработке животного, растительного или рыбного сырья в атмосфере коптильного дыма часть вредных полиароматических углеводородов (ПАУ) из тлеющей древесины может переходить в конечный пищевой продукт, делая его небезопасным для здоровья человека [3]. Наличие высоких остаточных концентраций ПАУ в пище часто способствует развитию различных заболеваний у потребителя. Поэтому, контроль за наличием ПАУ в продуктах питания является важной задачей [4]. В ЕС выделены приоритетные ПАУ, которые подлежат контролю. Так согласно нормативу ЕС 1881/2006, а именно постановление 835/2011 от 19.08.2011, с 01.09.2014 в пищевых продуктах контролю подлежат бенз(а)пирен, бенз(а)антрацен, бенз(Ь) флуорантен и хризен, суммарное содержание которых не должно превышать 12 мкг/кг [5]. В РФ, согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 и ТР ТС 021/2011, нормируется только бенз(а)пирен - не более 1 мкг/кг.

Для идентификации ПАУ в лаборатории была разработана методика определения ПАУ с помощью тандемной жидкостной хромато-масс-спек-трометрии (ВЭЖХ-МС/МС) с ионизацией при атмосферном давлении. Чувствительность ВЭЖХ

т

ТЕ

Т.-!-Е-

т

т

Т-ЪГ

Рис. 1. Хроматограмма градуировочных растворов В-агонистов - общий ионный ток и MRM переходы

с флуоресцентным детектором позволяли идентифицировать следовые количества ПАУ, однако, при извлечении ПАУ из сложных матриц, таких как пищевые продукты, готовые пробы содержали посторонние органические примеси, и возникали ошибки, вследствие присутствия веществ, дающих перекрестные сигналы. В последнее десятилетие особенно активно развивается и внедряется в практику аналитических лабораторий метод газовой

лизировать зависимости их накопления от технологии копчения, рецептуры, технологии производства и от типа упаковочного материала, установить индикаторы присутствия ПАУ в мясной продукции и оценить потенциальную опасность ПАУ. Результаты исследований подтвердили применимость использованной методики выделения, очистки и анализа ПАУ для оценки их содержания в копченой пищевой продукции, полученной в различных условиях.

Так же особенно остро на данный момент стоит проблема пищевых канцерогенов

хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Применительно к ПАУ идентификация по библиотечным масс-спектрам не исключает возможность ошибки. Так как масс-спектры таких веществ, как бензо(Ь) флуорантен, бензо(к)флуорантен, а также бенз(а) пирен, практически идентичны, несмотря на то, что соединения принципиально отличаются строением [6]. Свой вклад в ошибку идентификации вносит низкая селективность разделения некоторых пар ПАУ. Возможности разделения, однозначность качественного анализа делает оптимальной техникой для исследования ПАУ метод тандемной жидкостной хромато-масс-спектрометрии. Проведенные исследования позволили определить факторы, влияющие на количественное содержание ПАУ, проана-Табл. 1. - Содержание ПАУ в копчено-вареном продукте из свинины (1. ^та) в зависимости от температуры

получения коптильного дыма

ПАУ Относительная опасность Содержание ПАУ, мкг/кг

250оС 350 оС 600 оС

Бенз [а] антрацен 0,01-0,15 2,75 2,90 3,01

Бенз [Ь] флуорантен 0,08-0,12 0,48 0,60 0,66

Бенз [)'] флуорантен 0,08-0,12 0,04 0,05 0,07

Бенз [к] флуорантен 0,004-0,05 0,12 0,14 0,16

Бенз ^Ы] перилен 0,01-0,02 0,54 0,72 0,79

Бенз [а] пирен 1,0 0,47 0,59 0,66

Хризен 0,001-0,12 2,33 2,50 2,71

Дибенз [а,к] пирен - 0,08 0,10 0,12

Дибенз [а,Ы] антрацен 0,7-1,11 0,17 0,20 0,22

Дибенз [а,е] пирен - 0,46 0,60 0,64

Дибенз [а,г] пирен - 0,04 0,05 0,06

Дибензо [а,1] пирен - 0,02 0,03 0,04

5-метилхризен - 0,13 0,15 0,16

Инден [1,2,3-сй] пирен 0,01-0,28 0,48 0,50 0,55

Циклопента [с,й] пирен - 1,39 1,6 1,68

Из данных таблицы 1 видно, что традиционно используемые режимы копчения позволяют получать продукцию, которая по содержанию бенз[а]пи-рена соответствует нормативным требованиям. При более высоких температурах термолиза древесины при копчении, количество попадаемого в мясную продукцию бенз[а]пирена может превышать допустимый уровень [7, 8]. Из данных таблицы 1 видна также реальная картина «безопасности» копченой продукции. Контроль только за одним показателем, содержанием бенз[а]пирена, токсичность которого условно принята за 1, является недостаточным, так как наличие остальных ПАУ с учетом фактора их относительной опасности является нежелательным. Суммарное содержание данных ПАУ в копченой продукции во много раз превышало уровень бенз[а] пирена. Это еще раз подтверждает тезис о необходимости постоянного контроля за содержанием канцерогенов в пищевой продукции [9].

В пищевой промышленности в России широко распространено применение растительных компонентов в качестве заменителей основного сырья, в частности соевые белки и др. При этом стандартизированные методики определения таких компонентов отсутствуют. Для молочной продукции обнаружение фальсификаций, а именно наличия растительных жиров, проводят по ГОСТ 319792012 «Молоко и молочные продукты. Метод обнаружения растительных жиров в жировой фазе газожидкостной хроматографией стеринов». Метод основан на обнаружении стеринов растительного происхождения. Стерины - природные соединения растительного и животного происхождения, относящиеся к классу стероидов. Стерины, в зависимости от источников получения, можно разделить на фитостерины (брассикастерин, кампестерин, стиг-мастерин, ^-ситостерин), выделяемые из неомыля-емой части липидов растений и зоостерины (холестерин) из жировой ткани животных. Присутствие в продукте фитостеринов, подтверждает наличие ингредиентов растительного происхождения. Так как стерины по химической природе являются высокомолекулярными циклическими спиртами, то оптимальной техникой для исследования является метод газовой хроматографии с масс-спектроме-трическим детектором (ГХ-МС). Задача разработки методики для эффективного государственного

контроля мяса и мясопродуктов на наличие в них немясных ингредиентов растительного происхождения была решена, и был разработан проект ГОСТ, упомянутый выше.

Особый интерес представляют протеомные методы исследования, одним из перспективных проте-омных методов является двумерный электрофорез (2DE), который представляет собой метод разделения смеси белков. При анализе проводится аналитическое фракционирование по двум независимым друг от друга физико-химическим свойствам полипептидных цепей, отражающих особенности их первичной структуры:

- изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), обеспечивает фракционирование по изоэлектрической точке (pI);

- электрофорез в присутствии SDS (SDS-ЭФ) обеспечивает разделение по молекулярной массе (Mm).

Основными задачами при анализе белков методом 2Д электрофореза, является выявление известных минорных белков, идентификация маркерных белков, характеризующих известные изменения в данной ткани, изучение посмертных изменений белков в мясном сырье, определение устойчивых и быстро деградирующих белков, определение немышечных белков в мясном сырье и мясных продуктах.

В настоящее время двумерный электрофорез занимает центральное место среди методов исследования белков и находит широкое применение в биологии, биотехнологии, клинической биохимии, фармакологии [9].

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Council Directive 96/22/ЕС of 29 April 1996 concerning on the use in stockfarming of certain substsnces having a hormonal or thyrostatic action and of beta-agonists, and repealing Directives 81/602/EEC, 88/146/EEC and 88/299/EEC // Official Journal of the European Communities. L. 125. P.3.

2. ГОСТ Р 54032-2010 Продукты пищевые, корма, продовольственное сырье. Метод определения содержания бета-адреностимуляторов с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометриче-ским детектором. - М.: Стандартинформ. 2011. C.16.

3. Куликовский А.В., Ревуцкая Н.М. Семенова А.А. Иванкин А.Н. Голованова П.М. К вопросу защиты мясной продукции от накопления потенциально опасных ПАУ// Теория и практика переработки мяса. Все о мясе. - 2014. - № 2. - С.36-42

4. Куликовский А.В., Иванкин А.Н., Вострикова Н.Л. Влияние термической обработки на безопасность пищевой продукции при копчении. Актуальные проблемы повышения конкурентоспособности продовольственного сырья и пищевых продуктов в условиях ВТО /Сб. материалов всеросс. науч-но-практ. конф. 4-5 сент. 2013.- Углич: ГНУ ВНИИМС Росссельхозакадемии, 2013, 163-167с.

5. Commission Regulation (EU) No 835/2011 of 19 August 2011, Official Journal of the European Union L 215/4

6. Куликовский А.В., Вострикова Н.Л., Чернуха И.М., Савчук С.А. Методология определения полициклических ароматических углеводородов в пищевых продуктах. Журнал аналитической химии, том 69, № 2, 2014. С.219

7. Иванкин А.Н., Куликовский А.В., Вострикова Н.Л., Прошина О.П. Традиции питания в XXI веке надо менять. Вредные вещества древесины в копченой пищевой продукции// Технология и оборудование для переработки древесины // Науч. тр. - Вып. 370. - М.: ФГБОУ ВПО МГУЛ, 2014. - C. 104-110

8. Куликовский А.В., Юшина Ю.К., Иванкин А.Н., Лисицын А.Б. О потенциальной опасности веществ ПАУ в пищевых продуктах, получаемых по технологиям копчения // Пищевая промышленность. -2015. - № 11. - С. 28-30

9. Лисицын А.Б., Чернуха И.М., Семенова А.А., Иванкин А.Н., Сусь И.В. и др. Мясная промышленность. Энциклопедический словарь - М. ВНИИМП, 2015. - 256 с.

Заключение

За период проведения постоянного мониторинга фактического состава отечественных мясных продуктов (с 2012 по 2015 год) отмечается значительный рост фальсификации преимущественно за счет применения нетрадиционных для мясопродуктов видов растительных добавок.

Недостаточный уровень входного контроля на предприятиях состава используемого мясного, растительного сырья и добавок зачастую приводит к непреднамеренной фальсификации мяса и готовой продукции. Необходим плановый постоянный контроль, выпускаемой продукции по показателям безопасности и качества.

КОНТАКТЫ

Куликовский Андрей Владимирович

+7 (495)676-9971 Чернуха Ирина Михайловна

+7 (495)676-9718

Кузнецова Оксана Александровна

+7 (495)676-721 1 ИванкинАндрей Николаевич

+7 (495) 676-9891