БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД
BIFUNCTIONAL PEPTIDE

Настоящее изобретение относится к пептиду, который найдет применение именно в косметической и фармацевтической областях.
Настоящее изобретение найдет применение в основном в области восстановления или регенерации кожной ткани, пострадавшей, в частности, в результате старения колеи.
Старение кожи связано с более или менее большим дисбалансом механизмов контроля синтеза и деградацией компонентов внеклеточного матрикса дермы, причем последний составляет самый внутренний слой кожи. Таким образом, при старении кожи во внеклеточном матриксе дермы наблюдается, с одной стороны, уменьшение синтеза определенных макромолекул, а именно коллагена и эластина, а с другой стороны, увеличение экспрессии определенных ферментов, таких как матриксные металлопротеиназы, или ММР. Именно последние обладают коллагенолитической и эластолитической активностью и тем самым способствуют деградации макромолекул матрикса дермы. Как следствие, дерма теряет свой тонус, кожа растягивается, что приводит к образованию морщин. Это явление также может быть усилено внешними факторами, такими как воздействие ультрафиолетовых лучей, загрязнение окружающей среды, стресс или также табак.
Традиционно, из предшествующего уровня техники известны стратегии, которые направлены на замедление образования морщин. Такие стратегии состоят в следующем:
- отшелушивание или дермабразия, что соответствует инвазивному методу лечения кожи с целью уменьшения ее толщины;
- инъекции против морщин гиалуроновой кислоты или ботулинического токсина, которые обладают эффектом заполнения морщин и целенаправленного паралича мышц, временно уменьшающего морщины, соответственно; эти методы, однако, дорогие и дают только краткосрочные эффекты;
- применение поверхностной обработки, такой как увлажнители, кремы против морщин или разглаживающие кремы, которые замедляют образование морщин, но без корректировки уже образовавшихся;
- методы лечения, основанные на аутогенных стволовых клетках, которые еще плохо контролируются.
Уже в течение нескольких лет в целях борьбы с последствиями старения кожи лабораториями внедряются другие стратегии.
В частности, в европейской патентной заявке ЕР 1275372 предложено использование химических соединений, таких как производные N-ациламиноамида. Более конкретно, в этом документе предложена композиция, в которую включен, дополнительно к вышеупомянутому N-ациламиноамиду, ингибирующий металлопротеиназу белок, причем последний участвует в деградации коллагена.
Но такое решение не оптимальное, в частности потому, что оно требует, с одной стороны, комбинации нескольких соединений, а с другой стороны, не позволяет положительно воздействовать на синтез коллагена.
С целью предотвращения именно симптомов старения кожи разработано применение некоторых пептидных производных.
Следовательно, например, из FR 285489 известны косметические композиции, которые включают пептидные производные, которые исходят из волокнистого белка. Более конкретно, пептидное производное может иметь следующую последовательность R1-(AA)n-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-OR2, в которой
- R1 соответствует Н или алкильной цепи, содержащей от 2 до 22 атомов углерода,
- (АА)n соответствует пептидной цепи с АА, состоящей из любой аминокислоты или производного аминокислоты и в которой n изменяется от 0 до 3,
- R2 соответствует H или алкильной цепи, содержащей от 1 до 24 атомов углерода.
Косметическая композиция, включающая такое пептидное производное, дает возможность получать укрепляющий и реструктурирующий эффект.
Однако такое пептидное производное или композиция, включающая это производное, не разрешает ингибировать активность и/или экспрессию протеиназ ММР, участвующих в деградации коллагенов, которые составляют основные белки внеклеточного матрикса тканей тела, а именно дермы. Коллаген позволяет придать тканям устойчивость к растягивающим силам. Таким образом, пептид, описанный в вышеупомянутом документе, не дает возможности предотвратить деградацию этого белка, важного для сохранения тонуса кожи.
Из WO 2006053688 известна также комбинация, включающая несколько пептидов и используемая в лечении для предотвращения образования морщин. В частности, эти пептиды данной комбинации участвуют на нескольких уровнях процесса синтеза коллагена и/или фибронектина, а именно путем стимулирования этого синтеза.
В DE 102004055541, в свою очередь, раскрыта композиция, включающая комбинацию пептидов для стимулирования высвобождения фактора роста TGF-B, причем последний способен индуцировать синтез коллагена.
Тем не менее, пептиды, описанные в этих патентных документах, имеют те же недостатки, что и приведенное выше, а именно то, что предложенная в них последовательность не разрешает снизить экспрессию ферментов, отвечающих за деградацию белков внеклеточного матрикса, и в частности коллагена.
В настоящем изобретении предлагается возможность борьбы с различными недостатками предшествующего уровня техники за счет использования бифункционального пептида, обладающего как свойством стимулирования синтеза коллагенов, так и свойством ингибирования протеиназ, участвующих в каскаде деградации последних.
В связи с этим настоящее изобретение относится к бифункциональному пептиду, способному активировать синтез коллагена и ингибировать продуцирование матриксных металлопротеиназ, причем указанный пептид имеет последовательность, включающую три пептидных участка А, В и С,
- первый пептидный участок А, соответствующий гексапептиду, повторенному по меньшей мере три раза, причем указанный участок А способен связываться с эластинсвязывающим рецепторным белком, чтобы стимулировать синтез коллагена,
- второй пептидный участок В, соответствующий тетрапептиду, способному действовать как конкурентный ингибитор протеазы урокиназы и расщепляться указанной протеазой, и
- третий пептидный участок С, соответствующий трипептиду, занимающему по меньшей мере один активный сайт матриксных металлопротеиназ, чтобы разрешить ингибирование указанных протеиназ.
Предпочтительно, первый участок пептида А, стимулирующий синтез коллагена, имеет последовательность X1-Gly-X2-X3-Pro-Gly, причем эта последовательность повторяется по меньшей мере три раза, в которой:
- X1 соответствует любой аминокислоте,
- Х2 соответствует аминокислоте, выбранной из Val, Thr, Gln, Ala, Leu,
- Х3 соответствует аминокислоте, выбранной из Ala, Leu, Ile.
Более предпочтительно, первый пептидный участок А упомянутого пептида имеет последовательность Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly.
Предпочтительно, второй пептидный участок В, расщепляемый протеазой, имеет последовательность Arg-Y1-Arg-Y2, причем каждый из Y1 и Y2 соответствует аминокислоте, выбранной из Ser, Tyr, Gly, Ala, Arg, Val, Leu.
Более предпочтительно, второй пептидный участок В указанного пептида имеет последовательность Arg-Val-Arg-Leu.
В соответствии с одним интересным вариантом осуществления третий участок С, разрешающий ингибирование матриксных металлопротеиназ, имеет последовательность Z1-Ile-Z2, в которой:
- Z1 соответствует аминокислоте, выбранной из Gly, Ile, Leu, и
- Z2 соответствует аминокислоте, выбранной из Leu, Phe, Ala, Ile, Val.
Еще более предпочтительно, третий пептидный участок С указанного пептида имеет последовательность Gly-Ile-Leu.
В соответствии с предпочтительным вариантом осуществления пептид в соответствии с изобретением имеет следующую последовательность S1, соответствующую последовательности
SEQ ID No. 1:S1:N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)n-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-OH,
где N и ОН соответствуют N-концевой и С-концевой областям, соответственно, указанного пептида
и где N=3.
Однако последовательность бифункционального пептида в соответствии с изобретением также может соответствовать одной из последовательностей от SEQ ID Nо. 2 до SEQ ID No. 26.
Предпочтительно, бифункциональный пептид в соответствии с изобретением получают путем химического синтеза. Кроме того, пептид может успешно сохраняться в лиофилизированной форме.
Преимущественно, бифункциональный пептид в соответствии с изобретением может использоваться для лечения хронических рубцующихся заболеваний, а именно при лечении язв или пролежней.
Бифункциональный пептид в соответствии с изобретением также может использоваться для восстановления и/или регенерации кожной ткани, а именно для лечения старения кожи.
Изобретение также относится к косметической и/или фармацевтической композиции, включающей бифункциональный пептид в соответствии с изобретением.
Предпочтительно, концентрация бифункционального пептида в косметической композиции находится в диапазоне от 10 мкг/мл до 1 мг/мл и предпочтительно, по существу, равна 100 мкг/мл.
Бифункциональный пептид в соответствии с настоящим изобретением имеет много преимуществ. С одной стороны, он разрешает стимуляцию синтеза белков коллагена, а именно коллагенов типа I и типа III. Увеличение продуцирования коллагена последнего типа представляет особенный интерес; действительно, этот тип коллагена называется коллагеном «эмбрионального» типа, потому что он в основном синтезируется на эмбриональной стадии и в детстве. Этот тип коллагена обеспечивает особо оптимальное заживление тканей, известное как «идеальное» заживление. С другой стороны, указанный пептид позволяет уменьшить коллагенолиз с помощью протеаз. Кроме того, стимуляция синтеза коллагена и ингибирование металлопротеиназ достигаются одновременно благодаря пептидным участкам А и С, соответственно, бифункционального пептида, который дополнительно включает пептидный участок В, соединяющий два других участка и способный расщепляться урокиназой. В результате пептид в соответствии с изобретением может иметь короткую последовательность из примерно 25 аминокислот, что упрощает его химический синтез.
Дополнительные признаки и преимущества изобретения станут очевидны из следующего подробного описания неограничительного варианта осуществления изобретения со ссылкой на прилагаемые фигуры:
- Фигура 1 - схематическое изображение механизма действия пептида в соответствии с изобретением.
- Фигура 2 - схематическое изображение ферментативного каскада системы плазминоген/плазмин.
- Фигуры 3А и 3В соответствуют гистограммам, иллюстрирующим синтез коллагена типа I и типа III, соответственно, с помощью фибробласт, обработанных пептидом в соответствии с изобретением в концентрации 100 мкг/мл или фрагментами того же пептида.
- Фигура 4 представляет, в виде гистограмм, экспрессию генов COL1A1 и COL3A1 генов, кодирующих соответственно коллагены типа I и типа III в культурах дермальных фибробластов, обработанных пептидом в соответствии с изобретением или фрагментами того же пептида.
- На Фигуре 5 иллюстрируется, в зависимости от возраста пациентов (35-и, 42-х и 53-х лет), действие бифункционального пептида в соответствии с изобретением на экспрессию белка коллагенов типа I и III, соответственно, из дермальных фибробластов от этих пациентов.
- Фигуры 6А и 6В иллюстрируют действие бифункционального пептида на активность урокиназы по отношению к синтетическому субстрату.
- Фигуры 7А и 7В иллюстрируют действие бифункционального пептида на активность ММР-1 по отношению к синтетическому субстрату.
- На Фигурах 8А и 8В показан профиль элюции пептида в соответствии с изобретением, соответственно, без обработки и при обработке урокиназой.
Путем предварительной и информационной индикации в данном патентном описании для обозначения аминокислот используется международный трехбуквенный код. Таким образом, Ala соответствует аланину (A), Cys - цистеину (С), Asp - аспарагиновой кислоте (D), Glu - глутаминовой кислоте (Е), Phe - фенилаланину (F), Gly - глицину (G), His - гистидину (Н), Ile - изолейцину (I), Lys - лизину (K), Leu - лейцину (L), Met - метионину (М), Asn - аспарагину (N), Pro - пролину (P), Gln - глутамину (Q), Arg - аргинину (R), Ser - серину (S), Thr - треонину (Т), Val - валину (V), Trp - триптофану (W) и Tyr - тирозину (Y).
Старение кожи и в результате образование морщин характеризуются на клеточном и молекулярном уровне снижением экспрессии генов, отвечающих за синтез макромолекул, входящих в состав внеклеточного матрикса, таких как коллагены или эластин. Кроме того, снижение продуцирования этих матриксных белков обычно сопровождается чрезмерной экспрессией ферментов, которые отвечают за деградацию матриксных белков; эти ферменты, матриксные металлопротеиназы или ММР, таким образом, частично отвечают за снижение тонуса на уровне дермы, растяжение кожи и, в конце концов, к образованию морщин.
Коллагеновые белки являются преобладающими белками в построении внеклеточного матрикса тканей организма. В частности, коллагены присутствуют примерно на 90% на уровне дермы, которая составляет прочную опору кожи и играет роль и питательного вещества, и температурного контроля, а также роль защиты от патогенных микроорганизмов. Дерма формируется в основном из так называемых фибробластных клеток, которые принимают участие в синтезе, а именно коллагена, а также в организации внеклеточного матрикса.
Таким образом, остов внеклеточного матрикса формируется из коллагена, но также из эластина, структурных гликопротеинов и протеогликанов. Более конкретно, дермальный матрикс включает фибриллы коллагена типа I и III и сердцевину коллагена типа V.
Последний, вероятно, подвергается деградации так называемыми белками ММР, семейство которых включает не менее 26 членов. Более конкретно, эти белки соответствуют эндопептидазам, т.е., которые разрушают пептидные связи внутри белка.
Исследования, проведенные учеными (Voorhes et al., Hornebeck et al., 2009), позволяют продемонстрировать, что дряхление клеток кожи, фибробластов, характеризуется повышенной экспрессией этих эндопептидаз, а именно в отношении ММР-1. Последняя относится к группе интерстициальных коллагеназ и отвечает за расщепление белков коллагена типа I и III. ММР-1 рассматривается как главная коллагеназа, участвующая в старении кожи, хронологическом или фотоиндуцированном.
Таким образом, уменьшение дермальных матриксных белков, а именно коллагенов, связанных с увеличением ферментов деградации, а именно ММР-1, являются важными элементами, участвующими в старении кожи, что приводит к уменьшению тонуса кожи и образованию видимых морщин.
Таким образом, в рамках изобретательского уровня авторами разработан пептид, имеющий многие функции и разрешающий действовать как на уровне процессов синтеза молекул коллагена, так и на разных уровнях каскадов деградации этих же молекул.
И особенно выгодным является то, что бифункциональный пептид в соответствии с настоящим изобретением обладает отличительным свойством активизировать восстановление баланса между анаболическим (синтез) и катаболическим (распад) процессами внеклеточного, а именно дермального, матрикса.
Особо предпочтительно то, что пептид в соответствии с изобретением является бифункциональным и включает последовательность, которая может быть разделена на три участка:
- первый пептидный участок, называемый участком А, который предпочтительно обладает способностью увеличивать синтез коллагена;
- второй пептидный участок, называемый участком В, который предпочтительно имеет последовательность, распознаваемую протеазой урокиназой, в соответствии с чем указанный пептидный участок В может затем расщепляться этой протеазой;
- третий пептидный участок, называемый участком С, причем последний способен ингибировать ММР.
Пептид в соответствии с настоящим изобретением разрешает, таким образом, с одной стороны, стимулировать синтез коллагена и, с другой стороны, уменьшать деградацию указанного коллагена путем ингибирования урокиназы и протеаз ММР, а именно ММР-1.
Более конкретно, пептидный участок А, разрешающий увеличение синтеза коллагена, состоит из гексапептида, т.е. последовательность 6 аминокислотных остатков. Преимущественно, этот гексапептид повторяется по меньшей мере 3 раза в бифункциональном пептиде в соответствии с настоящим изобретением.
Более предпочтительно, пептидный участок А бифункционального пептида имеет следующую последовательность: X1-Gly-X2-X3-Pro-Gly, причем X1, Х2 и Х3 соответствуют аминокислотам. Как указано выше, эта последовательность гексапептида X-Gly-X2-X3-Pro-Gly повторяется по меньшей мере три раза в пептиде в соответствии с изобретением. Действительно, некоторые исследования показали, что при трех повторах указанная последовательность дала разные, даже более интересные, результаты с точки зрения активности последовательности (Alix 2001).
В соответствии с интересным вариантом осуществления остаток XI пептидного участка А соответствует любой из аминокислот. Остаток Х2, в свою очередь, преимущественно соответствует аминокислоте, выбранной из Val, Thr, Gln, Ala и Leu. Наконец, остаток Х3 предпочтительно соответствует аминокислоте, выбранной из Ala, Leu и Ile.
Еще более предпочтительно, X1 и Х2 соответствуют Val, а Х3 соответствует Ala. Таким образом, гексапептид, соответствующий участку А бифункционального пептида, имеет предпочтительно последовательность Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly.
Последовательность, повторенная не менее трех раз и связанная с пептидными участками В и С, разрешает существенную стимуляцию экспрессии белка коллагенов, а именно в отношении коллагена типа III, как показано на прилагаемых Фигурах 3А и 3В и описано в примере 1 ниже.
Пептид в соответствии с изобретением также разрешает увеличение экспрессии генов COL1A1 и COL3A1, как показано на Фигуре 4, соответственно, кодирующих коллаген типа I и коллагена типа III. Действие бифункционального пептида на синтез коллагена типа III представляет особый интерес; действительно, последний известен как доминирующий коллаген на эмбриональном уровне и его продуцирование постепенно уменьшается в детстве, пока не достигнет очень низкого уровня продуцирования у взрослых. В качестве примера, наличие коллагена типа III в 6 раз меньше у взрослых, чем коллагена типа I (Melissopoulos 1998; Herbage, 1997). Коллаген типа III синтезируется главным образом миофибробластами во время заживления, чтобы заменить поврежденные ткани. На эмбриональном уровне коллаген типа III разрешает так называемое «идеальное» заживление (Lorena et al, 2002. Ferguson & O'Kane, 2004).
Последовательность Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly бифункционального пептида в соответствии с изобретением смоделирована из пептидов эластина или эластокинов, полученных в результате деградации эластичных волокон. Такая последовательность принимает форму 6-изгиба типа VIII благодаря присутствию остатков пролина и глицина в указанной последовательности X1-Gly-X2-X3-Pro-Gly (Floquet et al. 2004). Эта структурная схема распознается рецепторным белком эластина, который традиционно упоминается под английским названием Elastin Binding Protein [Эластин-Связывающий Белок] и сокращенно ЕВР. Последний иммобилизируется на поверхности клеток совместно с двумя другими субъединицами: защитный белок или катепсин А (РРСА) и нейраминидаза (Neu-1), которые связаны с клеточной мембраной. Захват рецепторного белка ЕВР пептидным участком А бифункционального пептида, показано на Фигуре 1, вызывает активацию молекулярной единицы, что вызывает синтез коллагена типа I и типа III.
Такая активация молекулярной единицы может также действовать на хемотаксис, пролиферацию, адгезию и выживание фибробластов, а также на ангиогенез, который важен в процессе реваскуляризации хронических ран, таких как язвы или пролежни.
Что касается пептидного участка В, то он предпочтительно состоит из тетрапептида, т.е. последовательности, включающей 4 аминокислоты.
Более конкретно, этот тетрапептид представляет собой рычаг, который может взаимодействовать как субстрат или конкурентный ингибитор с сериновой протеазой урокиназой. Таким образом, это разрешает высвобождение двух других пептидных участков А и С вблизи клетки.
Урокиназа предпочтительно расщепляет последовательность, имеющую две аминокислоты Arg. Следовательно, пептидный участок В предпочтительно имеет последовательность Arg-Y1-Arg-Y2, где Y1 и Y2 соответствуют аминокислотам.
В соответствии с конкретным иллюстративным примером варианта осуществления каждый из Y1 и Y2 соответствует аминокислоте, выбранной из Ser, Tyr, Gly, Ala, Arg, Leu и Val. Эти аминокислоты, связанные с сайтом расщепляемой Arg, предпочтительно расщепляются протеазой урокиназой.
Еще более предпочтительно, пептидный участок В бифункционального пептида в соответствии с изобретением включает последовательность Arg-Val-Leu-Arg.
Протеаза урокиназа является одним из активаторов системы плазминоген-плазмин. Плазминоген является физиологическим субстратом урокиназы, что позволит активировать его в форме плазмина. Такая активация запускает протеолитический каскад, который заканчивается активацией ММР-1 и ММР-3. Ферментный каскад системы плазминоген/плазмин, запущенный протеазой урокиназой, представлен на прилагаемой Фигуре 2.
Таким образом, действие урокиназы на плазминоген косвенно отвечает за деградацию коллагена, и именно коллагена типа I и типа III. Следовательно, присутствие пептидного участка В в бифункциональном пептиде в соответствии с изобретением будет действовать как субстрат или конкурентный ингибитор урокиназы. Как следствие, последняя будет расщеплять сайты Arg, присутствующие на пептидном участке В и будет менее доступна, чтобы вызвать ингибирование плазминогена в плазмине; деградация молекул коллагена, таким образом, уменьшится. Действие пептида в соответствии с изобретением на активность урокиназы, в частности, показано на Фигурах 6А и 6В.
Далее что касается пептидного участка С бифункционального пептида, он преимущественно состоит из трипептида, это последовательность, включающая 3 аминокислоты.
Предпочтительно, пептидный участок С имеет последовательность Z1-Ile-Z2, причем каждый из Z1 и Z2 соответствует остатку аминокислот.
В соответствии с одним интересным иллюстративным примером варианта осуществления Z1 представляет собой аминокислоту, выбранную из Gly, Leu и Ile, a Z2 выбирают из Leu, Phe, Ala, Ile, Val.
Еще более предпочтительно, Z1 соответствует Gly, a Z2 соответствует Leu. Таким образом, пептидный участок С бифункциональным пептидом предпочтительно имеет последовательность Gly-Ile-Leu. Трипептид Gly-Ile-Leu действительно может занимать часть активного сайта ММР-1 и действовать как конкурентный ингибитор фермента.
2+
Действительно, эти аминокислоты представляют особый интерес, потому что они, вероятно, имеют три кармана ММР типа I, карманы Р'1, Р'2 и Р'3. Как следствие, активный сайт коллагеназы типа I больше не может хелатировать ионы Zn, которые важны для активности указанной коллагеназы. Деградация молекул коллагена с помощью ММР-1, таким образом, уменьшается благодаря бифункциональному пептиду в соответствии с изобретением. Это иллюстрируется, в частности, прилагаемыми Фигурами 7А и 7В.
Таким образом, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления, который позволяет получить интересные результаты в плане синтеза коллагена и ингибирования металлопротеиназ, в частности, ММР-1, бифункциональный пептид в соответствии с настоящим изобретением имеет следующую последовательность, обозначенную как последовательность S1 и соответствующую SEQ ID No: 1:
S1: N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)n-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-OH.
Предпочтительно, последовательность Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly повторяется 3 раза; другими словами, значение n предпочтительно равно 3. Однако повторов последовательности также может быть больше 3.
Пептид в соответствии с изобретением может также иметь, например, последовательности, обозначенные как SEQ ID No: 2 до SEQ ID No: 26.
Этот перечень последовательностей, однако, не исчерпывающий и, следовательно, не является ограничительным для изобретения.
Более конкретно, аминокислоты последовательностей от SEQ ID No. 1 до 26 могут быть, например, замещены аминокислотами, являющимися химически эквивалентными, т.е. имеющими эквивалентные физические и химические характеристики; замещения между эквивалентными аминокислотами выполняются, например, между неполярными алифатическими аминокислотами Ala, Val, Ile, Leu или между полярными аминокислотами, содержащими гидроксильную группу Ser и Thr, между аминокислотами Asn и Gln, между аминокислотами, выполняющими две кислотные функции Asp и Glu, и т.д. Эта информация приведена в базе данных протеаз, Merops (http://merops.sanger.ac.uk/).
Бифункциональный пептид в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно получают путем химического синтеза.
Предпочтительно, удлинение пептидных цепей на смолах Fmoc-Leu-Wang PS осуществляется флуоренилметоксикарбонильным методом (Fmoc) с трет-бутильной (tBu) защитой.
Однако такой вариант осуществления не является ограничительным для изобретения и химический синтез бифункционального пептида может выполняться любым другим подходящим методом для этой цели, известным специалистам в данной области.
Предпочтительно, пептид в соответствии с изобретением лиофилизируют для обеспечения его оптимального сохранения.
Бифункциональный пептид в соответствии с настоящим изобретением представляет особый интерес для использования в производстве косметических композиций, направленных на активизацию восстановления и/или регенерации кожной ткани. Действительно, за счет его действия на продуцирование коллагена указанный пептид позволяет ограничить образование морщин.
Кроме того, авторы продемонстрировали, что влияние бифункционального пептида в соответствии с изобретением на продуцирование коллагена, похоже, зависит от возраста пациентов. Действительно, результаты, представленные в примере 3 ниже, в сочетании с Фигурой 5, показывают, что экспрессия коллагена типа I и особенно экспрессия коллагена типа III более высокая у пациентов старшего возраста. Такие результаты, таким образом, подтверждают пользу указанного пептида для использования в косметических композициях для борьбы со старением кожи.
Но такой вариант не является ограничительным для изобретения. Например, бифункциональный пептид в соответствии с изобретением также может быть использован для получения фармацевтических композиций.
Действительно, оказывается, что нарушение баланса между синтезом белков матрикса, таких как коллаген, и деградацией этих же белков может привести к развитию хронических ран, также известных под названием хронических рубцующихся заболеваний, таких как пролежни, язвы, или также люди с тяжелыми ожогами. Эти заболевания, в частности, характеризуются сверхэкспрессией матриксных протеаз ММР и, как правило, связаны с такими заболеваниями, как диабет или сосудистые заболевания.
Хронические рубцующиеся заболевания неуклонно увеличиваются в развитых странах, в основном за счет старения населения. Таким образом, лечение и управление этими заболеваниями требуют немалых затрат.
На клеточном уровне было показано, что большое количество протеаз, а именно металлопротеиназ типа ММР-1, высвобождается возле таких хронических ран типа пролежней. Исследования также предоставили доказательства того, что активность коллагеназы типа I, или ММР-1, значительно увеличивалась в экссудатах хронических ран. Такое увеличение отвечает за деградацию молекул коллагена типа I и типа III, которые присутствуют возле указанной раны (Barone et al, 1998. Shi et al, 2006.).
Далее в отношении, в частности, язв, было также продемонстрировано, что возле этих ран были обнаружены большие количества протеаз. В частности, исследования позволили определить скорость ММР-1, которая в 65 раз больше обычной, причем эти ММР затем вызывают чрезмерную и длительную деградацию белков внеклеточного матрикса, а также факторы роста, ведущие к задержке заживления (Fischer et al. 2009).
Наконец, было продемонстрировано, что концентрация урокиназного активатора системы плазминоген/плазмин, как видно на Фигуре 2, и косвенно отвечающая за активацию определенных ММР, была значительно повышена в язвах на ногах, а также на уровне пролежней (Werckroth et al. 2004).
Таким образом, оказывается, что пептид в соответствии с изобретением, который способен и уменьшить активность протеаз ММР, и увеличить синтез белков матрикса, смог бы способствовать облегчению лечения этих хронических ран и заменить существующие медицинские процедуры, тяжелые, дорогие и неэффективные.
В соответствии с конкретным вариантом осуществления бифункциональный пептида в соответствии с изобретением вводят в пластырь, который должен крепиться на область тела, пораженной хронической раной.
Однако такой вариант осуществления ни в коем случае не является ограничительным для изобретения, и можно легко предположить, что возможно включать бифункциональный пептид в соответствии с изобретением в такие препараты, как крем, мазь, гель и т.д., которые можно наносить на рану, подлежащего лечению.
В соответствии с вариантом осуществления бифункциональный пептид предпочтительно используется в концентрации, в основном, от 10 мкг/мл до 1 мг/мл. Действительно, никакой токсичности пептида в соответствии с изобретением не наблюдалось на дермальных фибробластах, обработанных пептидными концентрациями вплоть до 1 мг/мл. Кроме того, исследования, проведенные, чтобы обнаружить гены токсичности с помощью статистического метода SAM (Significance Analysis of Microarrays), показали, что гибель клеток, разрушение соединительной ткани и опухолевая инвазия индуцируются только в результате высокой концентрацией бифункционального пептида, выше, чем 1 мг/мл.
Еще более предпочтительно, рекомендуемая концентрация для использования пептида, а именно в фармацевтических и/или косметических композициях, в основном, равна 100 мкг/мл.
Дополнительные признаки и преимущества настоящего изобретения будут также ясны при прочтении следующих примеров, приведенных в качестве иллюстрации и не являющихся ограничительными.
Пример 1: Действие бифункционального пептида на синтез коллагена - анализ белков
Дермальные фибробласты были выделены из биопсий кожи живота, полученных во время хирургических операций, проведенных на здоровых пациентах в возрасте от 35 до 75 лет.
После удаления эпидермиса фибробласты извлекли путем ферментативного расщепления, а затем культивировали при 37°С в среде DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина.
Фибробласты затем обработали пептидом, имеющим последовательность S1 или различные фрагменты этой последовательности, в концентрации 100 мкг/мл. Протестированы следующие различные фрагменты:
- пептид 1 (pept 1): пептид, имеющий последовательность S1
3
- пептид 2 (pept 2): последовательность N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly) Arg-Val-Arg-Leu-OH
3
- пептид 3 (pept 3): N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)-OH
- пептид 4 (pept 4): N-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-OH
- пептид 5 (pept 5): N-Gly-Ile-Leu-OH
Экспрессия белка коллагена типа I и коллагена типа III была затем продемонстрирована с помощью вестернблоттинга и выражена количественно с помощью Image J. Результаты представлены соответственно на прилагаемых Фигурах 3А и 3В. Контроль (Ctrl) соответствует экспрессии коллагена типа I и III на уровне клеток, не обработанных пептидами. Эксперименты проводились в трех повторностях.
Представленные на Фигуре 3А результаты показывают, что пептид в соответствии с изобретением (pept 1), а также фрагменты (pept 2 и pept 3), включающие последовательность Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly, которая соответствует участку А пептида в соответствии с изобретением стимулируют на 30% экспрессию белка коллагена типа I. Пептидные фрагменты (pept 4 и 5 pept), которые не содержат участок А пептида в соответствии с изобретением, не разрешают стимуляцию синтеза коллагена типа I; напротив, доля коллагена синтезированного, когда фибробласты контактируют с pept 4 и pept 5, по-видимому, меньше. Последовательность Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly, следовательно, действительно отвечает за стимулирование синтеза коллагена типа I.
На Фигуре 3В показано, что пептид в соответствии с изобретением, имеющий последовательность S1, позволяет увеличить синтез коллагена типа III; действительно, как видно на гистограмме, продуцирование коллагена типа III более чем в два раза выше, когда фибробласты обрабатываются пептидом, имеющим последовательность S1.
3
Также интересно отметить, что обработка фибробластов пептидом, имеющим последовательность S1 (pept 1), разрешает увеличение синтеза коллагена типа III на 36%, по сравнению с фибробластами, обработанными пептидом, имеющим только последовательность (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly) (pept 3). Остальные участки пептида в соответствии с изобретением, таким образом, также имеют значение в увеличении синтеза коллагена типа III.
Пептид в соответствии с изобретением, таким образом, представляет особый интерес; действительно, дополнительно к разрешению увеличения синтеза коллагена типа I, он также способствует продуцированию коллагена типа III.
Пример 2: Действие бифункционального пептида на синтез коллагена - анализ экспрессии гена
Экспрессия гена коллагенов типа I и III в культурах фибробластов также протестировали в присутствии различных пептидов (от pept 1 до pept 5) в концентрации 100 мкг/мл.
2
2
Через 24 часа после обработки различными пептидами рибонуклеиновые кислоты [РНК] экстрагировали из культур с помощью набора RNeasy (QIAGEN), затем вновь транскрибировали в комплементарные ДНК (кДНК) с помощью набора для синтеза первой цепи RT [RT First Strand Kit] производства SABiosciences™.
2
-ΔΔCT
Далее выполнили анализы ПЦР в реальном времени с помощью термоциклера Mx3000p производства Stratagene в 96-луночном планшете. Каждый образец проанализировали в трех повторностях. КДНК служат в качестве матриц в реакционной смеси, содержащей реагенты RT SYBR Green/ROX™ qPCR Master Mix (SABiosciences™) и смысловой и антисмысловой праймеры, специфичные для гена, подлежащего амплификации. В конце каждого цикла снимали показания флюоресценции и анализировали с помощью программного обеспечения MxPro (Stratagene). Относительная экспрессия исследуемых генов COL1A1 и COL3A1, кодирующих коллаген типа I и типа III, была получена путем нормализации количества продуктов для амплификации гена, исследуемого с помощью количества ДНК, амплифицированного из гена «домашнего хозяйства», в данном случае РНК гена, кодирующего глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу (GAPDH). Что касается числа циклов, соответствующих амплификации с 100% эффективностью, относительное количество исследуемых кДНК было рассчитано с помощью метода 2 (Livak & Schmittgen, 2001).
3
3
Результаты, представленные на Фигуре 4, подтверждают результаты, полученные при исследовании экспрессии белка. Бифункциональный пептид в соответствии с изобретением, а также пептидные фрагменты pept 2 и pept 3, содержащие последовательность (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly), стимулируют экспрессию гена коллагенов типа I и III. Увеличение синтеза коллагена типа III также наблюдалось, когда фибробласты обрабатывали с помощью пептида, имеющего последовательность S1 (pept 1) по отношению к клеткам, введенным в присутствии пептида 3, содержащего только последовательность (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly).
Производные пептиды pept 4 и pept 5, содержащие последовательность Gly-Ile-Leu, не влияют на экспрессию генов, кодирующих коллагены типа I и III.
Контроль (Ctrl) соответствует экспрессии генов, кодирующих оба типа коллагена, когда фибробласты не обрабатываются.
Пример 3: Действие бифункционального пептида на синтез коллагена - испытания экспрессии белка и гена в зависимости от возраста пациентов
Дермальные фибробласты от молодых и пациентов более старшего возраста (35-и, 42-х и 53-х лет) культивировали и бифункциональный пептид в соответствии с изобретением, имеющий последовательность S1, испытали в отношении экспрессии белка и гена коллагена типа I и типа III. Полученные результаты относительно экспрессии белка двух типов коллагена представлены на Фигуре 5. Видно, что действие пептида в соответствии с изобретением на синтез коллагена сильнее, когда фибробласты происходят от пациентов более старшего возраста.
Пример 4: Конкурентное ингибирование урокиназы бифункциональным пептидом
Определили действие бифункционального пептида в соответствии с изобретением на урокиназу, фермент в обратном направлении каскада активации протеиназы ММР-1.
Протестировали активность урокиназы на ее синтетическом субстрате, D-Glu-Gly-Arg+NHPhNO2 (S2444) в присутствии и в отсутствие пептида в соответствии с изобретением в различных концентрациях.
Результаты представлены на прилагаемых Фигурах 6А и 6В.
-3
-4
-5
Кинетику гидролиза субстрата S2444 (0,3 нМ) с помощью урокиназы (9,25*10-6 мМ) проводили в присутствии бифункционального пептида, имеющего последовательность S1, и концентрировали при 10, 10 и 10 М в течение одного часа. Контроль соответствует кинетике в отсутствие пептида. Действие фермента оценивали путем измерения оптической плотности (DO) при 405 нм каждые 5 минут в течение 35 мин. Результаты показаны на Фигуре 6А.
50
50
-5
На Фигуре 6В представлено графическое изображение зависимости доза/эффект между действием урокиназы и концентрацией бифункционального пептида, используемого в момент 15 мин. Пунктирная линия на фигуре позволяет определить IC, т.е. концентрацию пептида, необходимую для уменьшения действия урокиназы на 50%. IC соответствует 0,83*10 М пептида, т.е. массовой концентрации пептида 19 мкг/мл.
Таким образом, оказывается, что бифункциональный пептида в соответствии с изобретением ведет себя как конкурентный ингибитор урокиназы.
Пример 5: Влияние бифункционального пептида на активность протеазы ММР-1
Затем оценили влияние бифункционального пептида в соответствии с изобретением непосредственно на активность ММР-1, которая представляет собой фермент в обратном направлении каскада, активированного урокиназой.
2
Субстрат ММР-1, который использовали для проверки ее активности в присутствии пептида, представляет собой синтетический субстрат, DNP-Pro-Cha-Gly-Cys (Me)-His-Ala-Lys (N-Me-Abz)-NH.
-3
-4
-5
Концентрацию 80 нг/µл ММР-1 получили в присутствии 0,4 нг/µл синтетического субстрата, в присутствии или в отсутствие бифункционального пептида, концентрированного при 10, 10 и 10 М в течение одного часа. Результаты представлены на Фигурах 7А и 7В.
Более конкретно, на Фигуре 7А представлена кинетика гидролиза синтетического субстрата ММР-1 в присутствии или в отсутствие (контроль) пептида в различных концентрациях. Ферментативную активность ММР-1 оценивали путем измерения оптической плотности (DO) при 465 нм каждые 5 минут в течение 35 мин.
50
На Фигуре 7В представлено графическое изображение зависимости доза-эффект между активностью ММР-1 и концентрацией используемого бифункционального пептида в момент 15 мин. Пунктирная линия на фигуре позволяет определить концентрацию IC, которая здесь соответствует 0,4*10-4 М, т.е. концентрации бифункционального пептида, равной 91 мкг/мл.
Также протестировали влияние пептида в соответствии с изобретением на активность ММР-1 в присутствии ее природного субстрата, т.е. коллагеновых волокон дермы человека.
Для этой цели ММР-1 предварительно активировали с помощью АРМА (4-аминофенилртутьацетат) при 20 мМ в течение 1 часа 30 минут при температуре 37°С. Активированную таким образом ММР-1 затем нанесли на срезы кожи толщиной 5μ в присутствии или в отсутствие пептида в соответствии с изобретением (100 мкг/мл). Через 3 часа срезы кожи окрасили с использованием иммунной метки, чтобы выявить присутствие коллагена типа I и III, после этого исследовали с помощью конфокальной микроскопии. Результаты, не представлены, показывают, что на уровне среза, который не был обработан пептидом, коллагены I и III были полностью деградированы с помощью ММР-1. С другой стороны, в присутствии бифункционального пептида действие упомянутой ММР-1 ингибируется; действительно, коллагены I и III были обнаружены.
Бифункциональный пептид в соответствии с изобретением ингибирует деградацию коллагенов путем ингибирования на месте активности ММР-1.
Пример 6: Расщепление бифункционального пептида с помощью урокиназы
-4
На околоклеточном уровне наблюдался избыток урокиназы, примерно 10 М. Пептид мог бы быть, таким образом, расщеплен урокиназой, действующей, в частности, на уровне остатков аргинина (Arg) участка В пептида в соответствии с изобретением.
Были выполнены исследования с помощью ВЭЖХ на колонке С18 Jupiter Chromolith (50×4,6 мм) и с применением линейного градиента 0,1% TFA ацетонитрила в 0,1% TFA [трифторуксусная кислота] в воде, от 0 до 100% в течение 100 мин. Результаты показали наличие спектрального пика на 11,75 минуте, что характерно для бифункционального пептида (Фигура 8А). Однако после действия избытка урокиназы на бифункциональный пептид (0,45 мМ), спектральный пик был другой; действительно, на 20 минуте был элюирован новый пик, что, таким образом, характеризует расщепление бифункционального пептида урокиназой (Фигура 8В).
Таким образом, в условиях старения кожи в присутствии больших количеств урокиназы бифункциональный пептид в соответствии с изобретением расщепляется, таким образом, высвобождая С-конец указанного пептида, содержащего последовательность Gly-Ile-Leu.
Пример 7: Действие последовательности Gly-Ile-Leu на активность ММР-1
2
-5
-4
-3
Последовательность Gly-Ile-Leu была выбрана авторами за ее способность занимать Р'1 р'2 и Р'3 карманы коллагеназы типа I, ММР-1. Активность последней протестировали на синтетическом субстрате, DNP-Pro-Cha-Gly-Cys (Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz)-NH, в присутствии или в отсутствие пептида 5 с последовательностью Gly-Ile-Leu в концентрациях 10,10 and 10 М.
50
Результаты (не представлены) показывают, что пептид 5 уменьшает зависимым от дозы способом активность ММР-1 на его синтетическом субстрате. Измерили IC пептида Gly-Ile-Leu; измеренная величина составила 0,71*10-4 М, т.е. концентрация пептида 21,3 мкг/мл.
Концевой участок С, Gly-Ile-Leu, бифункционального пептида в соответствии с изобретением может, таким образом, вырабатываться в случае избытка урокиназы и вызывать ингибирование активности ММР-1. Эти данные подтверждают важность пептида для борьбы со старением кожи и/или для заживления хронических ран.
Исследования были также проведены на модели более всестороннего комплексного изучения: модели кожи ex vivo позволяют имитировать старение кожи и некоторые сопровождающие патологии. Полученные результаты не представлены, но они подтверждают результаты, полученные in vitro.
Конечно, изобретение не ограничено примерами, представленными и описанными выше, которые могут иметь вариации и модификации без отхода от объема настоящего изобретения.
БИБЛИОГРАФИЯ
- Alix, A.J. A turning point in the knowledge of the structure-function-activity relations of elastin. J Soc Biol 2001; 195 (2): 181-93.
- Barone, E.J., et al., Interleukin-1 alpha and collagenase activity are elevated in chronic wounds. Plast Reconstr. Surg, 1998 102(4): p. 1023-7; discussion 1028-9.
- Ferguson, M.W. and S. O'Kane, Scar-free healing: from 10 embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention. Philos Trans R Soc Lond В Biol Sci, 2004 359(1445): p. 839-50.
- Fisher, G.J., et al., Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin. Am J Pathol, 2009 174 (1): p. 101-14.
- Floquet, N., , S., Dauchez, M., Derreumaux, P., Tamburro, A.M., Alix, A.J. Structural characterization of VGVAPG, an  peptide. Biopolymers, 2004; 76 (3): 266-80. Review
- Herbage, D.  et  du derme:  actuelles, in Biologie de la peau. 1997
- Hornebeck, W.,  et cascades  et  Vol. 1. 2009: Elsevier Masson. 38-43
- Livak, K.J. and T.D. Schmittgen, Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 2001 25(4): p. 402-8.
- Lorena, D., et al., Normal scarring: importance of myofibroblasts. Wound Repair Regen, 2002 10(2): p. 86-92.
-  A., L.C., La peau.  et internationales ed. 1998.
- Shi, В., et al., Effect of vacuum assisted closure on collagenase activity in human chronic wound. Zhonghua Zheng Xing Wai Ke Za Zhi, 2006 22(6): p. 465-7.
- Voorhees, J.J., et al, Collagen degradation in aged/photodamaged skin in vivo and after exposure to matrix metalloproteinase-1 in vitro. J Invest Dermatol, 2003; 120(5): p. 842-8
- Weckroth, M., et al., Epithelial tissue-type plasminogen activator expression, unlike that of urokinase, its receptor, and plasminogen activator inhibitor-1, is increased in chronic venous ulcers. Br J Dermatol, 2004 151(6): p. 1189-96
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> РЕЖЕНТИС ИНТЕРНАСЬОНАЛЬ, FR,
РЕЙМСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ОБЛАСТИ ШАМПАНЬ-АРДЕННЫ, FR, НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ, FR
<120> БИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПЕПТИД
<130> 9R59 BT FR 1
<160> 26
<210> 1 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 1
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-                                                        10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 2 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 2
Val-Gly-Thr-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Thr-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Thr-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 3 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 3
Val-Gly-Gln-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Gln-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Gln-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 4 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 4
Val-Gly-Ala-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Ala-Ala-Pro-Gly-Val- 1 5 10
Gly-Ala-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 5 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 5
Val-Gly-Leu-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Leu-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Leu-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 6 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 6
Val-Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Leu-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 7 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 7
Val-Gly-Val-Ile-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ile-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ile-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 8 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 8
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Ile-Ile-Leu 15 20 25
<210> 9 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 9
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Leu-Ile-Leu 15 20 25
<210> 10 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 10
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 1 5 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Val-Leu 15 20 25
<210> 11 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 11
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ala-Leu 15 20 25
<210> 12 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 12
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Gly-Leu 15 20 25
<210> 13 <211> 25 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 13
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Phe 15 20 25
<210> 14 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 14
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 1 5 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Ala 15 20 25
<210> 15 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 15
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Ile 15 20 25
<210> 16 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 16
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 1 5 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Val 15 20 25
<210> 17 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 17
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Ser-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 18 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 18
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 1 5 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Tyr-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 19 <211> 25 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 19
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Gly-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 20 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 20
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Ala-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 21 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 21
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Arg-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 22 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 22
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Ser-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 23 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 23
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Tyr-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 24 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ <400> 24Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Gly-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 25 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 25
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 15 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Ala-Gly-Ile-Leu 15 20 25
<210> 26 <211> 25 <212> Белок
<213> Искусственная последовательность <220>
<223> Бифункциональный пептид, способный активировать синтез коллагена и ингибировать продукцию матричных металлопротеиназ
<400> 26
Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Val- 1 5 10
Gly-Val-Ala-Pro-Gly-Arg-Val-Arg-Arg-Gly-Ile-Leu 15 20 25