Молекулярные основы генетического контроля толщины скорлупы яйца домашней курицы

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БИОЛОГИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ РАЗВИТИЯ НАУКИ

О. Ю. Баркова, А. Л. Сазанова, А. А. Сазанов, К. А. Фомичев

Молекулярные основы генетического контроля толщины скорлупы яйца домашней курицы

Одной из важнейших задач геномики животных является выявление генов, влияющих на проявление хозяйственно полезных признаков. Степень проявления многих количественных признаков определяется широкой вариабельностью экспрессии генов, находящихся в QTL (локусах количественных признаков).

QTL для многих признаков, включая рост, эффективность кормления, качество тушки, устойчивость к болезни Марека, ожирение и качество яйца, были идентифицированы на основе генетических карт высокого разрешения домашней курицы. Вардецкая с сотрудниками в 2002 г. провели исследование по влиянию генотипов яичной линии породы род-айленд и локальной польской породы зеленоногая куропатчатая на яйценоскость и качество яйца по сцеплению с 23 микросателлитными локусами.

Ранее нами был проведен ряд экспериментов по позиционному клонированию района хромосомы 4 домашней курицы, содержащего QTL толщины скорлупы на 53-неделе жизни (ST53) несушки. Методом гибридологического анализа косегрегации микросателлитных ДНК-маркеров и количественных признаков определены маркеры интервала генетической карты (районов хромосом), контролирующего QTL ST53. Определены координаты двадцати BAC-клонов, имеющих гомологию последовательностей ДНК вставки с микросателлитными локусами MCW0170, LEI0081, MCW0114 и ADL0241. Методом флуоресцентной гибридизации ДНК-ДНК in situ (FISH) установлена их локализация на хромосоме 4. С использованием данных полного сиквенса установлен интервал величиной 1,2 млн п. н., являющийся критическим для признака ST53. Идентифицировано 20 генов, являющихся позиционными кандидатами для признака ST53. В группе неспециализированной польской зеленоногой были выявлены достоверные на уровне значимости 0,01 двукратные различия между группами с тонкой и толстой скорлупой по уровню экспрессии

181

последовательности ChEST985k21 (идентификационный номер CR523443). Коэффициент корреляции уровня экспрессии этой последовательности и толщины скорлупы составил 0,85. В данной работе проведен анализ влияния rSNP экспрессирующейся последовательности ChEST985k21 на толщину скорлупы домашней курицы. Последовательность CR523443 длиной 2102 пар оснований, представляющая собой клон полностью секвенированной комплементарной ДНК ChEST985k21 домашней курицы, впервые была найдена в матричной РНК, экстрагированной из мышц взрослых птиц, и затем обнаружена в мозге, хрящевой ткани и в женских гениталиях (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/UniGene).

Нами был проведен дизайн праймеров и секвенирование кодирующей и регуляторной частей последовательности CR523443 с целью поиска мононуклеотидных полиморфных сайтов, оказывающих влияние на экспрессию данной последовательности и на толщину скорлупы яйца.

Использованы биологические образцы кур породы зеленоногая куропатчая, на которых ранее проводили анализ экспрессии генов-кандидатов признака толщина скорлупы яйца. Дизайн олигонуклеотидов-праймеров для секвенирования проводили на основании информации баз данных сети Интернет (www.nlm.ncbi.nih.gov и www.ensembl.org) при помощи компьютерной программы PRIMER_3 (wwwgenome.wi.mit.edu).

Использованы последовательности 6 пар праймеров для амплификации последовательностей, удовлетворяющих условиям се-квенирования:

ST53Seq_1_FW: AGCAAAGGCAAGCTCGTAAG ST53Seq_1_RV: TTTTCTGCTTTAGAAGTCCTGCTT ST53Seq_2_FW: AGTTGCTGAGTACCTCAAACTACA ST53Seq_2_RV: TTCCAAGGTAAAGACAGAAGTCG ST53Seq_3_FW: TGTGAAATGTAAGGGGGTTG ST53Seq_3_RV: AGCAGAACCTCCAAACTCCA ST53Seq_4_FW: CTCAGGATGGTGGAGTTTGG ST53Seq_4_RV: TGCGACAGGAATCCAATACA ST53Seq_5_FW: TGGATTCCTGTCGCATTAGTC ST53Seq_5_RV: GCAAACACCTCGATTGCTCT ST53Seq_6_FW: GTGCTGAGTATGGGGTGCTT ST53Seq_6_RV: TCAAGGCTTCAACGTCACTC.

Накопительную амплификацию ДНК при помощи ПЦР проводили с использованием амплификатора IQ5 (Bio-Rad, США).

182

Полимеразную реакцию для секвенирования проводили в соответствии с рекомендациями производителя (Applied Biosistems, США).

Электрофоретическое разделение полученных фрагментов и анализ их нуклеотидной последовательности проводили автоматически при помощи секвенатора 3130 (Applied Biosistems).

Проведены эксперименты по ПЦР-амплификации шесть фрагментов регуляторной и кодирующей областей гена CR523443. Проведено по шесть реакций ПЦР на шести биологических образцах в трех технических повторностях. Поставлены реакции секвенирования 36 образцов амплифицированных фрагментов регуляторной и кодирующей областей гена CR523443. Выявлено шесть сайтов однонуклеотидного полиморфизма (SNP) в гена CR523443, из них пять - в регуляторной области и один - в кодирующей. На основе полученных данных создана система маркеров для селекции несушек по аллелям генов, оказывающих влияние на толщину скорлупы яйца. Эта система представляет собой набор олигонуклеотидных праймеров для ПЦР (температура отжига 60° С, полиморфные сайты выделены жирным шрифтом):

1. S2_1_Up_T: CTGCTCAGTGTCTTAGTCTGATCAGT S2_1_Up_C: CTGCTCAGTGTCTTAGTCTGATCAGC

S2_1_Dn: ACAGTCATGATGAGGAAACAGG

2. S3_1_Up_G: GCGACT CACT CACT CATTTT G S3_1_Up_A: GGC GACT CACTC ACT CATTTT A

S3_1_Dn: AGCAGAACCTCCAAACTCCA

3. S3_2_Up_T: TTGCTCTCATTAATTAATGAGTTCAGT S3_2_Up_C: TTGCTCT CATTAATTAAT GAGTT CAG C S3_2_Dn: AGAAGGAAGAGAGGTATCAACCAGT

4. S3_3_Up_T: TGGTCACAGGTGCCTGTAAAT S3_3_Up_C: TGGTCACAGGTGCCTGTAAAC

S3_3_Dn: CATCCTGAGGCACTGCATATT

5. S3_4_Up_T: ATAGCCCAATCCTGCAGAATT S3_4_Up_C: ATAGCCCAATCCTGCAGAATC

S3_4_Dn: AGCAGAACCTCCAAACTCCA

6. S6_1_Up_T: TGAGCTTATGAATCTTGCAGTTTTT S6_1_Up_C: T GAG CTTAT GAAT CTTG CAGTTTT C

183

S6_1_Dn: TCAACATTGTGGAAAGTAGATACAGA (толстая скорлупа - T, тонкая - C).

Определение нуклеотидной последовательности регуляторной и кодирующей частей гена CR523443, оказывающего решающее влияние на толщину скорлупы яйца у домашней курицы, позволило идентифицировать QTN (однонуклеотидные полиморфизмы, влияющие на количественные признаки), которые были использованы нами для создания системы молекулярных маркеров для селекции несушек по аллелям генов, оказывающих влияние на этот признак. Оптимизация толщины скорлупы яйца имеет большое экономическое значение, поскольку может помочь уменьшить потери птицеводческой продукции при транспортировке.

А. И. Дорохов

Полезные насекомые в фауне Ленинградской области

Уже в древние времена человек определил для себя степень полезности различных организмов, которые он использовал и охранял. И хотя в природе нет полезных и вредных видов (все они взаимосвязаны и важны), эти понятия используются человеком при оценке их значимости в практической деятельности и особенно широко при разработке биологических методов регуляции численности насекомых.

Изучение полезной фауны - один из разделов курса «Зоология беспозвоночных», освоение которого позволяет студентам биологического профиля грамотно использовать полученные знания при оценке состояния экосистем в условиях антропогенного пресса, при воспитании у школьников бережного отношения к природным объектам и при участии в природоохранной деятельности. В этом отношении кокцинеллиды, их ещё называют божьи коровки, являются наиболее доступными и интересными объектами для изучения и наблюдений в полевых условиях, так как встречаются повсеместно.

Кокцинеллиды - одно из крупных семейств отряда жёсткокрылых насекомых, насчитывающих более 5000 видов, из которых около 700 известны в Палеарктике (Кузнецов, 1997). Они являются заметными представителями нашей фауны. По характеру питания известны как растительноядные, так и хищные виды. Кокцинеллиды растительноядные (фитофаги) делятся на три группы: филлофаги,

184