МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПЕПТИДЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
MODIFIED PEPTIDES AND THEIR APPLICATION FOR TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[001] Настоящее изобретение относится к модифицированному пептиду и его применению для лечения аутоиммунных заболеваний.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ
[002] Список последовательностей, содержащий SEQ ID NO: 1-6, подан в этой заявке и, таким образом, включен посредством ссылки в полном объеме.
ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[003] Аутоиммунные заболевания возникают в результате гиперактивного иммунного ответа иммунной системы на вещества и ткани, обычно присутствующие в многоклеточном организме, то есть иммунная система атакует собственные компоненты. Это может быть ограничено определенными органами или может вовлекать конкретную ткань в разных местах. Лечение аутоиммунных заболеваний обычно проводят путем иммуносупрессии - лекарственной терапии, которая снижает весь иммунный ответ.
[004] Волчанка представляет собой аутоиммунное заболевание, которое, по оценкам, поражает около 1,4 миллиона американцев, главным образом, женщин в возрасте 20-40 лет. Волчанка вовлекает в патологический процесс антитела, которые атакуют соединительную ткань. Основной формой волчанки является системная волчанка (системная красная волчанка; SLE). SLE представляет собой хроническое аутоиммунное заболевание с вполне определенными генетическими компонентами, а также компонентами среды (см., например, Hochberg М С, Dubois' Lupus Erythematosus. 5th ed., Wallace D J, Hahn В H, eds. Baltimore: Williams and Wilkins (1997); Wakeland E K, et al., Immunity 2001; 15(3):397-408; Nath S K, et al., Curr. Opin. Immunol. 2004; 16 (6):794-800; D'Cruz et al., Lancet (2007), 369:587-596). Известны различные дополнительные формы волчанки, включающие кожную красную волчанку (CLE), волчаночный нефрит (LN), психоневрологическую волчанку (NPLE) и неонатальную волчанку, но не только.
[005] В отсутствие лечения волчанка может быть смертельной, поскольку она прогрессирует от атаки на кожу и суставы до внутренних органов, включая легкие, сердце и почки (с заболеванием почек, имеющим особую важность), таким образом делая раннюю и точную диагностику и/или оценку риска развития волчанки особенно важной. Волчанка главным образом проявляется в виде серии обострений с наступающими периодами небольшого проявления болезни или без проявлений болезни. Поражение почек, определяемое по количеству белка в моче (протениурия), является одной из наиболее острых областей поражения, связанного с патогенностью при SLE, и обуславливает по меньшей мере 50% летальность и заболеваемость без какого-либо лечения.
[006] Клинически SLE представляет собой гетерогенное нарушение, характеризующееся высокоаффинными антителами (аутоАb). АутоАb играют важную роль в патогенезе SLE, и различные клинические проявления этого заболевания имеют место вследствие отложения содержащих антитела иммунных комплексов в кровеносных сосудах, что приводит к воспалению в почках, головном мозге и коже. АутоАb также оказывают прямые патогенные воздействия, которые вносят вклад в гемолитическую анемию и тромбоцитопению. SLE связана с продукцией противоядерных антител, циркулирующих иммунных комплексов и нарушением системы комплемента. Уровень заболеваемости SLE составляет примерно 1 на 700 женщин в возрасте от 20 до 60 лет в чернокожей популяции. SLE может поражать любую систему органов и может вызывать тяжелое поражение тканей. Многочисленные аутоАb различной специфичности присутствуют при SLE. У пациентов с SLE зачастую продуцируются аутоАb, имеющие анти-ДНК, анти-Ro и антитромбоцитарную специфичность и способные инициировать клинические особенности заболевания, такие как гломерулонефрит, артрит, серозит, полную предсердно-желудочковую блокаду у новорожденных и гематологические нарушения. Эти аутоАb также, возможно, связаны с нарушениями центральной нервной системы. Arbuckle et al. описали развитие аутоАb до клинического проявления SLE (Arbuckle et al. N. Engl. J. Med. 349 (16): 1526-1533 (2003)).
[007] АутоАb, распознающие РНК-связывающие белки (RBP; также называемые экстрагируемыми ядерными антигенами), впервые были охарактеризованы при SLE более 40 лет назад (Holman, Ann N Y Acad. Sci. 124(2):800-6 (1965)). Такие RBP содержат группу белков - SSA (Ro52/TRIM21 и Ro60/TROVE2), SSB (La), U1 белок малый ядерный нуклеопротеин (RNP) и белок Смита (Sm), играющих роль в процессинге РНК и биохимии. Анти-SSA- и анти-SSB IgG аутоАb обнаруживаются не только при SLE, а также при синдроме Шегрена и ревматоидном артрите. Анти-SSA аутоАb связаны с подострой кожной красной волчанкой, и с врожденной блокадой сердца и волчанкой новорожденных детей от женщин, позитивных по анти-SSA. Анти-SSB аутоАb почти всегда обнаруживаются вместе с анти-SSA аутоАb, и оба аутоантигена связаны с цитоплазматической hYPHK (Lerner et al., Science 211(4480):400-2 (1981)). Анти-Sm аутоАb являются высокоспецифичными для SLE и в основном обнаруживаются вместе с анти-RNP аутоАb. Как Sm, так и RNP белки связаны со специфичными видами snPHK в сплайсосоме ядерной РНК (Lerner et al., Proc Natl Acad Sci USA 76 (11): 5495-9 (1979)). Анти-RNP аутоАb также обнаруживаются у пациентов со смешанным заболеванием соединительных тканей. Предполагалось, что присутствие анти-RBP аутоАb может идентифицировать случаи SLE, которые демонстрируют менее длительные ответы после терапии, истощающей В-клетки (Cambridge et al., Ann Rheum Dis 67:1011-16 (2008)).
[008] В предшествующем уровне техники раскрыты лекарственные средства для лечения аутоиммунных заболеваний. Например, в обеих международных заявках WO 03/020747 и WO 03/025014 описывается фрагмент snRNP 7 0 кДа, который модифицирован фосфорилированием и/или ацетилированием для лечения таких патологий, то есть аутоиммунных заболеваний. Однако дальнейшие эксперименты показали, что пептиды, описанные в WO 03/020747 и WO 03/025014, являются относительно нестабильными и быстро выводятся при введении млекопитающим. Более того, некоторые из описанных пептидов являются неактивными.
[009] Следовательно, существует необходимость в предоставлении лучшего лечения аутоиммунных патологий.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010] Настоящее изобретение относится к композициям и способам их применения, которые основаны на удивительном и неожиданном открытии того, что некоторые модифицированные формы белка с последовательностью SEQ ID NO: 2 являются более стабильными при введении млекопитающим. Таким образом, в одном аспекте настоящее изобретение относится к композициям, содержащим такой белок и фармацевтически приемлемый носитель.
[0011] В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции или лекарственному средству, применимым для облегчения аутоиммунных заболеваний, предпочтительно для лечения волчанки.
[0012] В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения аутоиммунного заболевания, предусматривающим введение эффективного количества терапевтической композиции, описанной в настоящем изобретении.
[0013] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному пептиду (рекомбинантному или синтезированному) или его соли, содержащему или состоящему из аминокислотной последовательности:
[0014] IHMVYSKRSGKPRGYAFIEY [SEQ ID NO: 2],
[0015] в которой серин (S) в положении 9 является фосфорилированным, а метионин (М) в положении 3 является окисленным.
[0016] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду соединения I, имеющему следующую формулу:
[0017] Соединение I также может быть представлено последовательностью:
3
2
[0018] IHM(О)VYSKRS(РOН)GKPRGYAFIEY [SEQ ID NO: 5],
3
2
[0019] в которой «М(O)» представляет окисленный метионин, а «S(POH)» представляет фосфосерин.
[0020] Эти пептиды происходят из U1 snRNP 70 кДа белка (SEQ ID NO: 3), соответствуют области, ограниченной аминокислотным сегментом, продолжающимся от остатка 132 до остатка 151 последовательности SEQ ID NO: 3. Формально, остаток, который является фосфорилированным, соответствует аминокислоте в положении 140 от первого метионина последовательности SEQ ID NO: 3, и остаток, который является окисленным, соответствует аминокислоте в положении 134 от первого метионина последовательности SEQ ID NO: 3.
[0021] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к выделенному пептиду, содержащему или состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или его соли, имеющему по меньшей мере одну пост-трансляционную модификацию, выбранную из группы, состоящей из фосфорилирования остатка серина, окисления остатка метионина и ацетилирования остатка лизина, и их сочетания. В одном из вариантов осуществления этого аспекта настоящее изобретение относится к композиции, содержащей выделенный пептид, имеющий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или его соль, где пептид содержит фосфосерин в положении 10 и окисленный остаток метионина в положении 4. В некоторых дополнительных вариантах осуществления указанный пептид с последовательностью SEQ ID NO: 1 также содержит ацетилированный остаток лизина. В частности, указанный пептид последовательности SEQ ID NO: 1 содержит фосфосерин в положении 10 и окисленный остаток метионина в положении 4, и ацетилирование одного или обоих лизинов в положении 8 и 12, и, более конкретно, дополнительно содержит фосфосерин в положении 7.
[0022] В дополнительных аспектах настоящее изобретение относится к выделенному пептиду, содержащему или состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, или его соли, имеющему по меньшей мере одну пост-трансляционную модификацию, выбранную из группы, состоящей из фосфорилирования остатка серина, окисления остатка метионина и ацетилирования остатка лизина, и их сочетания. В одном из вариантов осуществления этого аспекта настоящее изобретение относится к композиции, содержащей выделенный пептид, имеющий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, или его соль, где указанный пептид содержит фосфосерин в положении 9 и окисленный остаток метионина в положении 3. В некоторых дополнительных вариантах осуществления пептид последовательности SEQ ID NO: 2 также содержит ацетилированный остаток лизина.
[0023] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к композиции, содержащей эффективное количество одного или более пептидов, как описано в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного пептида или его соли, выбранного из группы, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, содержащей фосфосерин в положении 9 и окисленный метионин в положении 3; аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, содержащей фосфосерин в положении 10 и окисленный метионин в положении 4; и сочетание обоих.
[0024] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду соединения II, имеющему следующую формулу:
[0025] Соединение II также может быть представлено последовательностью:
3
2
3
2
[0026] RIHM(O) VYSKRS (РOН) GKPRGYAFIEY [SEQ ID NO: 4], в которой М(О) представляет окисление метионина, a S(POH) представляет фосфорилирование серина.
[0028] Таким образом, настоящее изобретение относится к пептидам или их солям, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5.
[0029] Настоящее изобретение будет лучше проиллюстрировано следующими фиг. 1-6, сопровождающими описание, примерами и прилагаемой формулой изобретения, все из которых иллюстрируют различные варианты осуществления изобретения, приводимые в качестве примера, и не рассматриваются как ограничивающие изобретение.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0030] Сопровождающие чертежи, которые включены в описание и составляют его часть, иллюстрируют некоторые варианты осуществления настоящего изобретения и вместе с описанием служат для пояснения изобретения. Чертежи предназначены только для целей иллюстрации варианта осуществления изобретения и не рассматриваются как ограничивающие настоящее изобретение.
[0031] На фиг. 1 представлена стабильность пептида по изобретению при 37°С (Соединение II) по сравнению со стабильностью пептида, состоящего из последовательности SEQ ID NO: 1, в котором серин в положении 10 является фосфорилированным. На этом графике представлен процент стабильности с течением времени (выражено в днях). Кривые А-С представляют стабильность соединения II в концентрации 200, 100 и 50 мкг/мл, соответственно. Кривые D-F представляют стабильность пептида, состоящего из последовательности SEQ ID NO: 1, в котором серин в положении 10 является фосфорилированным, в концентрации 200, 100 и 50 мкг/мл, соответственно.
[0032] На фиг. 2 представлен график Каплана-Мейера, демонстрирующий суммарную частоту выживания (в процентах) с течением времени (выражено в неделях) у мышей, которым вводили NaCl (линия с кружочками), пептид, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 1, где серин в положении 10 является фосфорилированным (линия с квадратиками), и соединение II по изобретению (линии с треугольниками).
[0033] На фиг. 3 представлены баллы протеинурии с течением времени (выражено в неделях) у мышей, которым вводили NaCl (линия с кружочками), пептид, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 1, где серин в положении 10 является фосфорилированным (линия с квадратиками), и соединение II по изобретению (линии с треугольниками).
6
[0034] На фиг. 4 представлено определение повышенного содержания паренхиматозных клеток у мышей MRL/lpr. По оси Y представлено число клеток на мл крови (×10) у мышей, получавших NaCl (кружочки), пептид, состоящий из SEQ ID NO: 1, где серин в положении 10 является фосфорилированным (квадратики), и соединение II по изобретению (треугольники).
[0035] На фиг. 5 представлено определение аффинности в отношении белка HSC70 пептида, состоящего из последовательности SEQ ID NO: 1, где серин в положении 10 является фосфорилированным. Кривые соответствуют ответу Biacore с течением времени (выражено в секундах) с использованием пептида, состоящего из последовательности SEQ ID NO: 1, где серин в положении 10 является фосфорилированным, в концентрации 25 мкМ(А), 12,5 мкМ(В), 6,25 мкМ(С), 3,12 мкM(D) и 1,56 мкМ (Е).
[0036] На фиг. 6 представлено определение аффинности соединения II по настоящему изобретению для белка HSC7 0. Кривые соответствуют ответу Biacore с течением времени (выражено в секундах) с использованием соединения II в концентрации 25 мкМ(А), 12,5 мкМ(В), 6,25 мкМ(С), 3,12 мкM(D) и 1,56 мкМ(Е).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0037] Следующее подробное описание представлено для того, чтобы помочь специалистам в данной области осуществить на практике настоящее изобретение. Специалисты в данной области могут осуществить модификации и изменения в вариантах осуществления, описанных в настоящей заявке, не отклоняясь от сущности или объема настоящего изобретения. Хотя любые способы и вещества, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящей заявке, также могут быть использованы при осуществлении на практике или тестировании настоящего изобретения, предпочтительные способы и вещества описаны сейчас. Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в той области, к которой относится настоящее изобретение. Терминология, используемая в описании настоящего изобретения, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения этого изобретения. Все публикации, патентные заявки, фигуры и другие ссылки, упомянутые в настоящем описании, специально включены посредством ссылки в полном объеме.
[0038] В контексте настоящего изобретения следующие термины могут иметь значения, данные им ниже, если не определено иное. Однако должно быть понятно, что другие значения, которые известны или понимаются специалистами в данной области, также возможны и входят в объем настоящего изобретения.
[0039] В тех случаях, когда представлен диапазон значений, следует понимать, что каждое промежуточное значение до десятых долей единицы нижнего предела, если из контекста явно не следует иное, между верхним и нижним пределом этого диапазона и любое указанное или промежуточное значение в этом указанном диапазоне входит в объем настоящего изобретения. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов, которые могут независимо быть включены в меньшие диапазоны, также входят в объем настоящего изобретения, на который распространяется любой конкретно исключенный предел в установленном диапазоне. Там, где установленный диапазон включает одни или оба предела, диапазоны, исключающие любые оба из тех включенных пределов, также входят в объем настоящего изобретения.
[0040] Следует отметить, что в контексте настоящего изобретения и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число (т.е. ссылка на одно или более, а не одно или по меньшей мере одно) для этого грамматического объекта. В качестве примера, «элемент» означает один элемент или более чем один элемент.
[0041] Термин «примерно» в контексте настоящего изобретения вместе с численными значениями или диапазонами отражает тот факт, что существует определенный уровень отклонения, который является установленным и допустимым в данной области вследствие практических и/или теоретических ограничений. Например, минимальное отклонение является допустимым вследствие отклонений, присущих работе определенных устройств и/или проведению измерений. В соответствии с вышеизложенным, фраза «примерно», как правило, используется для обозначения значений в пределах стандартного отклонения или стандартной ошибки.
[0042] В контексте настоящего изобретения «производные» представляют собой композиции, образованные из исходных соединений либо напрямую, путем модификации, либо путем частичного замещения. В контексте настоящего изобретения «аналоги» представляют собой композиции, которые имеют структуру, аналогичную, но не идентичную исходному соединению.
[0043] Термин «эффективное количество/доза», «фармацевтически эффективное количество/доза» или «терапевтически эффективное количество/доза» может означать, но никоим образом не ограничиваться этим, что количество/доза активного фармацевтического ингредиента достаточна для профилактики, ингибирования возникновения, облегчения, задержки или лечения (облегчения симптома до некоторой степени, предпочтительно полностью) симптомов патологического состояния, нарушения или болезни. Эффективное количество зависит от типа заболевания, используемой композиции, пути введения, типа млекопитающего, подвергаемого лечению, физических характеристик конкретно рассматриваемого млекопитающего, сопутствующего лечения и других факторов, которые известны специалистам в области медицины. В основном количество активных ингредиентов от 0,1 мг/кг до 1000 мг/кг массы тела в день вводят в зависимости от эффективности действующего вещества. Токсичность и терапевтическую эффективность таких соединений можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур в клеточных культурах или на экспериментальных животных, например, для определения LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс и может быть выражено как соотношение LD50/ED50. Соединения, которые демонстрируют большие терапевтические индексы, являются предпочтительными. Хотя могут быть использованы соединения, которые проявляют токсические побочные эффекты, следует соблюдать осторожность, чтобы разработать систему доставки, которая направляет такие соединения к месту пораженной ткани, с тем, чтобы свести к минимуму возможность повреждения неинфицированных клеток и тем самым уменьшить побочные эффекты. Данные, полученные в результате анализов клеточных культур и исследований на животных, могут быть использованы при составлении интервала доз для использования у людей. Дозировка таких соединений предпочтительно находится в пределах интервала циркулирующих концентраций, который включает ED50 с небольшой токсичностью или без нее. Доза может варьировать в пределах этого интервала в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого пути введения. Для любого соединения, используемого в способе по изобретению, терапевтически эффективную дозу первоначально можно оценить по результатам анализов клеточных культур. Доза может быть составлена на животных моделях для достижения интервала циркулирующей в плазме концентрации, который включает IC50 (то есть, концентрации тестируемого соединения, при которой достигается полумаксимальное ингибирование симптомов), как определено в клеточной культуре. Такая информация может быть использована для более точного определения используемых доз у людей. Могут быть измерены уровни в плазме, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.
[0044] Термин «фармакологическая композиция», «терапевтическая композиция», «терапевтический состав» или «фармацевтически приемлемый состав» может означать, но это никоим образом не ограничивается, композицию или состав, который позволяет осуществлять эффективное распределение действующего вещества, представленного в настоящем изобретении, которое находится в форме, подходящей для введения в физическое местоположение, наиболее подходящее для их желаемой активности, например, системное введение.
[0045] Термин «фармацевтически приемлемый» или «фармакологически приемлемый» может означать, но это никоим образом не ограничивается, соединения и композиции, которые не вызывают побочных, аллергических или других нежелательных реакций при введении животному или человеку должным образом.
[0046] Термин «фармацевтически приемлемый носитель» или «фармакологически приемлемый носитель» может означать, но это никоим образом не ограничивается, всевозможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические вещества и вещества, задерживающие абсорбцию, и подобные, совместимые с фармацевтическим введением. Подходящие носители описаны в последнем издании Remington's Pharmaceutical Sciences, стандартном справочнике в данной области, включенном в настоящее описание посредством ссылки. Предпочтительные примеры таких носителей или разбавителей включают, но не ограничиваются, воду, физиологический раствор, растворы «finger's», раствор декстрозы и 5% сывороточный альбумин человека. Могут быть использованы липосомы и неводные носители, такие как нелетучие масла. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно из уровня техники. За исключением случаев, когда любые обычные среды или агенты несовместимы с активным соединением, предусмотрено их применение в композициях. Дополнительные активные соединения также могут быть включены в композиции.
[0047] Термин «системное введение» относится к пути введения, то есть энтеральному или парентеральному, который результате приводит к системному распределению вещества, приводя к системной абсорбции или накоплению лекарственных средств в кровотоке с последующим распределением по всему организму. Подходящие формы, частично, зависят от использования или пути введения, например, перорального, чрескожного пути или введения посредством инъекции. Такие формы не должны препятствовать достижению композицией или составом клетки-мишени (то есть клетки, к которой желательна доставка отрицательно заряженного полимера). Например, фармакологические композиции, вводимые в кровоток, должны быть растворимыми. Другие факторы, известные из уровня техники, включают такие аспекты, как токсичность, и формы, которые препятствуют композиции или составу осуществлять их действие. Пути введения, которые приводят к системной абсорбции, включают, без ограничения: внутривенный, подкожный, внутрибрюшинный, ингаляционный, пероральный, внутрилегочный и внутримышечный. Было показано, что скорость вхождения лекарственного средства в кровоток зависит от молекулярной массы или размера. Применение липосомы или другого носителя лекарственного средства, содержащего соединения по настоящему изобретению, потенциально может локализовать это лекарственное средство, например, в определенных типах тканей, например, тканях ретикулоэндотелиальной системы (RES). Также можно использовать липосомный состав, который может облегчать связывание лекарственного средства с поверхностью клеток, например, лимфоцитами и макрофагами.
[0048] Термин «местное введение» относится к пути введения, при котором вещество доставляют в место, которое является подходящим или близким, например, в пределах примерно 10 см к месту повреждения или нарушения.
[0049] Термин «производные» может означать, но это никоим образом не ограничивается, химические соединения, например, нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, полипептиды или аминокислоты, образованные из природных соединений либо напрямую, либо путем модификации, или путем частичного замещения. Термин «аналоги» может означать, но это никоим образом не ограничивается, химические соединения, например, нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, полипептиды или аминокислоты, которые имеют структуру, аналогичную, но не идентичную природному соединению.
[0050] Термин «консервативные мутации» относится к замещению, делеции или добавлению нуклеиновых кислот, которые изменяют, добавляют или удаляют одну аминокислоту или небольшое число аминокислот в кодирующей последовательности, где изменения нуклеиновых кислот в результате приводит к замене химически сходной аминокислоты. Аминокислоты, которые могут служить в качестве консервативных аминокислотных замен друг для друга, включают следующие: основные: аргинин (R), лизин (К), гистидин (Н); кислые: аспарагиновую кислоту (D), глутаминовую кислоту (Е), аспарагин (N), глутамин (Q); гидрофильные: глицин (G), аланин (А), валин (V), лейцин (L), изолейцин (I); гидрофобные: фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W); серосодержащие: метионин (М), цистеин (С). Кроме того, последовательности, которые отличаются консервативными изменениями, в основном являются гомологичными.
[0051] Под «гомологией» подразумевается, что нуклеотидная последовательность из двух или более молекул нуклеиновых кислот или двух или более последовательностей нуклеиновых кислот или аминокислот является частично или полностью идентичной. В некоторых вариантах осуществления гомологичные последовательности нуклеиновых кислот или аминокислотные последовательности имеют 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% сходство последовательностей или идентичность нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 1, соответственно.
[0052] «Гомологи» могут быть природными или созданы путем искусственного синтеза одной или более нуклеиновых кислот, имеющих родственные последовательности, или путем модификации одной или более нуклеиновых кислот для получения родственных нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты являются гомологичными, когда они происходят, природно или искусственно, из последовательности общего предшественника (например, ортологи или паралоги). Если гомология между двумя нуклеиновыми кислотами не описана точно, гомология может быть выведена путем сравнения нуклеиновых кислот между двумя или более последовательностями. Если последовательности демонстрируют одинаковую степень сходства последовательностей, например, примерно больше 30% на уровне первичной аминокислотной структуры, делается вывод, что у них общий предшественник. Для целей настоящего изобретения гены являются гомологичными, если последовательности нуклеиновых кислот являются достаточно сходными, чтобы допустить рекомбинацию и/или гибридизацию в условиях низкой строгости. Кроме того, полипептиды называются гомологичными, если их последовательности нуклеиновых кислот являются достаточно сходными, чтобы допустить рекомбинацию или гибридизацию в условиях низкой строгости, и, необязательно, они демонстрируют мембранную репарационную активность, и, необязательно, они могут распознаваться (например, перекрестно реагировать) антителом, специфичным в отношении эпитопа, содержащегося в пределах аминокислотной последовательности по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID NO: 1-6.
[0053] Термин «клетка» может означать, но это никоим образом не ограничивается, его обычный биологический смысл и не относится к целому многоклеточному организму. Клетка может, например, находиться in vivo, in vitro или ex vivo, например, в клеточной культуре или находиться в многоклеточном организме, включая, например, птиц, растения и млекопитающих, таких как люди, коровы, овцы, приматы, обезьяны, свиньи, собаки и кошки. Клетка может быть прокариотической (например, бактериальная клетка) или эукариотической (например, клеткой млекопитающих или клеткой растения).
[0054] Термин «клетка-хозяин» может означать, но это никоим образом не ограничивается, клетку, которая может быть использована для переноса гетерологичной нуклеиновой кислоты или которая экспрессирует пептид или белок, кодируемый гетерологичной нуклеиновой кислотой. Клетка-хозяин может содержать гены, которые не находятся в нативной (нерекомбинантной) форме клетки, гены, находящиеся в нативной форме клетки, где эти гены модифицированы и повторно введены в эту клетку искусственным путем, или нуклеиновую кислоту, эндогенную для этой клетки, которая была искусственно модифицирована без удаления нуклеиновой кислоты из этой клетки. Клетка-хозяин может быть эукариотической или прокариотической. Основные условия роста, необходимые для культуры бактерий, можно найти в руководствах, таких как BERGEY'S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY, Vol.1, N. R. Krieg, ed., Williams and Wilkins, Baltimore/London (1984). «Клетка-хозяин» также может представлять собой клетку, в которой эндогенные гены или промоторы, или и те, и другие, были модифицированы для продуцирования одного или более полипептидных компонентов комплекса в соответствии с настоящим изобретением.
[0055] В контексте настоящего изобретения «Р140» относится к пептиду, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, в которой серин в положении 10 является фосфорилированным.
[0056] Термин «терапевтически эффективное количество или доза» включает дозу лекарственного средства, которая способна оказывать терапевтический эффект у пациента, нуждающегося в этом, например, терапевтически эффективным количеством лекарственного средства может быть количество, которое способно предотвращать или облегчать один или более симптомов, связанных с заболеванием или нарушением, например, повреждение ткани или заболевание или нарушение, связанное с мышцами. Точное количество может быть установлено специалистом в данной области с использованием известных методик (см., например, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); и Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).
[0057] Набор представляет собой любое изделие (например, упаковку или контейнер), содержащее по меньшей мере один реагент, например зонд, для специфического определения маркера настоящего изобретения. Это изделие можно производить, распространять или продавать как единое целое для осуществления способов по настоящему изобретению. Реактивы, включенные в такой набор, содержат зонды/праймеры и/или антитела для использования при определении чувствительности и резистентности генной экспрессии. Кроме того, наборы по настоящему изобретению предпочтительно могут содержать инструкции, которые описывают подходящий анализ на определение. Такие наборы можно удобно использовать, например, в клинических условиях, для диагностики пациентов, у которых демонстрируются симптомы злокачественного заболевания, у конкретных пациентов, у которых проявляется возможное присутствие опухоли.
[0058] Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, что и обычно понимаемое специалистом в той области, которой принадлежит настоящее изобретение. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, упомянутые в настоящей заявке, включены посредством ссылки в полном объеме. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, вещества, способы и примеры являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения.
nd
th
[0059] Следующие ссылки, полное описание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки, предоставляют специалисту общее определение многих терминов, используемых в настоящем изобретении: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2 ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5 Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); и Hale & Marham, the Harper Collins Dictionary of Biology (1991).
[0060] Настоящее изобретение относится к композициям и способам их применения, которые основаны на удивительном и неожиданном открытии того, что определенные модифицированные формы пептида последовательности SEQ ID NO: 2 являются стабильными при введении млекопитающим. Таким образом, в одном аспекте настоящее описание относится к композициям, содержащим такие пептиды и фармацевтически приемлемый носитель.
[0061] В другом аспекте настоящее описание относится к фармацевтической композиции или лекарственному средству, применимому для облегчения аутоиммунных заболеваний, преимущественно для лечения волчанки.
[0062] В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способам лечения аутоиммунного заболевания, включающим введение эффективного количества терапевтической композиции, как описано в настоящей заявке.
[0063] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенному пептиду (рекомбинантному или синтезированному) или его соли, содержащему или состоящему из аминокислотной последовательности:
[0064] IHMVYSKRSGKPRGYAFIEY [SEQ ID NO: 2],
[0065] в которой серин (S) в положении 9 является фосфорилированным, и метионин (М) в положении 3 является окисленным.
[0066] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду соединения I, имеющего следующую формулу:
[0067] Соединение I также может быть представлено последовательностью:
3
2
[0068] IHM(O)VYSKRS(POH)GKPRGYAFIEY [SEQ ID NO: 5],
3
2
[0069] в которой «M(O)» представляет окисленный метионин, и «S(POH)» представляет фосфосерин.
[0070] Эти пептиды происходят из белка человека U1 snRNP 70 кДа (SEQ ID NO: 3) и соответствуют области, ограниченной аминокислотным сегментом, продолжающимся от остатка 132 до остатка 151 последовательности SEQ ID NO: 3. Формально, остаток, который является фосфорилированным, соответствует аминокислоте в положении 140 от первого метионина последовательности SEQ ID NO: 3, и остаток, который является окисленным, соответствует аминокислоте в положении 134 от первого метионина последовательности SEQ ID NO: 3.
[0071] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к выделенному пептиду, содержащему или состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или его соли, имеющему по меньшей мере одну пост-трансляционную модификацию, выбранную из группы, состоящей из фосфорилирования остатка серина, окисления остатка метионина и ацетилирования остатка лизина, и их сочетания. В одном варианте осуществления этого аспекта настоящее изобретение относится к композиции, содержащей выделенный пептид, имеющий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, или его соли, где указанный пептид содержит фосфосерин в положении 10 и окисленный остаток метионина в положении 4. В некоторых дополнительных вариантах осуществления пептид последовательности SEQ ID NO: 1 также содержит ацетилированный остаток лизина.
[0072] В дополнительных аспектах настоящее описание относится к выделенному пептиду, содержащему или состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, или его соли, имеющему по меньшей мере одну пост-трансляционную модификацию, выбранную из группы, состоящей из фосфорилирования остатка серина, окисления остатка метионина и ацетилирования остатка лизина, и их сочетания. В одном варианте осуществления этого аспекта настоящее изобретение относится к композиции, содержащей выделенный пептид, имеющий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, или его соль, где указанный пептид содержит фосфосерин в положении 9 и окисленный остаток метионина в положении 3. В некоторых дополнительных вариантах осуществления пептид последовательности SEQ ID NO: 2 также содержит ацетилированный остаток лизина.
[0073] В некоторых аспектах настоящее изобретение относится к композиции, содержащей эффективное количество одного или более пептидов, как описано в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к композиции, содержащей эффективное количество по меньшей мере одного пептида или его соли, выбранного из группы, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, содержащей фосфосерин в положении 9 и окисленный метионин в положении 3; аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, содержащей фосфосерин в положении 10 и окисленный метионин в положении 4; и сочетания того и другого.
[0074] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду соединения II, имеющему следующую формулу:
[0075] Соединение II также может быть представлено последовательностью:
3
2
[0076] RIHM(O)VYSKRS(РOН)GKPRGYAFIEY [SEQ ID NO: 4],
3
2
[0077] в которой М(О) представляет окисление, и S(POH) представляет фосфорилирование.
[0078] Настоящее изобретение относится к пептидам и/или их солям, содержащим или состоящим из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и их сочетания, а также композициям, их содержащим.
[0079] В некоторых вариантах осуществления настоящее описание относится к выделенному пептиду, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, содержащую фосфосерин в положении 10 и окисленный метионин в положении 4 (например, SEQ ID NO: 4) (в настоящем описании также называется Соединением II или Р140(МО)).
[0080] В соответствии с настоящим изобретением выделенные полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или 5, соответственно, являются модифицированными по меньшей мере двумя пост-трансляционными модификациями (модификации, которые имеют место после синтеза пептидов). В некоторых вариантах осуществления пост-трансляционная
3
2
модификация выбрана из группы, состоящей из фосфорилирования (добавление фосфата РОН), например, фосфорилирования остатка серина; окисления, например, окисления остатка метионина; ацетилирования, например, ацетилирование остатка лизина; и их сочетаний.
[0081] В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, содержащему фосфосерин в положении 9 и окисленный метионин в положении 3, или его соли. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, содержащему фосфосерин в положении 9 и окисленный метионин в положении 3, или его соли, и носителю, например, фармацевтически приемлемому носителю. В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композиции, например, терапевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, содержащую фосфосерин в положении 9 и окисленный метионин в положении 3, или его соли, и носитель, например, фармацевтически приемлемый носитель.
[0082] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, содержащую фосфосерин в положении 10 и окисленный метионин в положении 4, или его соли. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, содержащую фосфосерин в положении 10 и окисленный метионин в положении 4, или его соли, и носителю, например, фармацевтически приемлемому носителю. В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композиции, например, терапевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида, имеющего аминокислотную последовательность,
представленную в SEQ ID NO: 4, содержащую фосфосерин в положении 10 и окисленный метионин в положении 4, или его соли и носитель, например, фармацевтически приемлемый носитель.
[0083] В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к выделенному пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, содержащую фосфосерин в положении 9 и окисленный метионин в положении 3, или его соли. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к пептиду, имеющему аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, содержащую фосфосерин в положении 9 и окисленный метионин в положении 3, или его соли и носителю, например, фармацевтически приемлемому носителю. В некоторых дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к композиции, например, терапевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида, имеющего аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5, содержащую фосфосерин в положении 9 и окисленный метионин в положении 3, или его соли, и носитель, например, фармацевтически приемлемый носитель.
[0084] Удивительно и неожиданно было обнаружено, что пептиды, описанные в настоящей заявке, являются более стабильными in vitro по сравнению с не окисленным аналогом. Стабильность определяют, как описано в разделе «Примеры». Фосфорилированный-окисленный пептид меньше спонтанно разрушается в растворе по сравнению с не окисленным аналогом, указанная стабильность усиливает его биологические свойства.
[0085] Кроме того, авторы изобретения неожиданно установили, что окисление метионина повышает стабильность пептида, не влияя на биологическое действие такого пептида, вопреки сведениям предшествующего уровня техники. Действительно, в уровне техники в основном сообщается, что белки или пептиды, содержащие окисленный метионин, имеют нарушения трехмерной структуры и/или биологической активности. Модифицированные пептиды, описанные в настоящей заявке, имеют аффинность в отношении белка HSC70 по существу идентичную не окисленному аналогу, как описано в разделе «Примеры».
[0086] В некоторых вариантах осуществления окисление имеет место у метионина (М) в положении 9 последовательности SEQ ID NO: 2 или в положении 10 последовательности SEQ ID NO: 1, которые являются эквивалентными положениями положению 134 последовательности SEQ ID NO: 3. Атом серы является окисленным, как проиллюстрировано ниже.
[0087] Представленные выше пептиды (SEQ IDNO: 1, 2, 4 и 5) могут быть синтезированы с помощью методик, широко используемых в данной области, таких как биологический синтез или химический синтез. Биологический синтез относится к получению in vivo, in vitro или ex vivo пептида интересующей последовательности путем транскрипции и трансляции молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанные пептиды.
[0088] Например, последовательность нуклеиновой кислоты:
[0089] MGNATHCAYATGGTNTAYWSNAARMGNWSNGGNAARCCNMGNGG NTAYGCNTTYATHGARTAYTRR [SEQ ID NO: 6]
[0090] транскрибируется и транслируется либо в in vitro системе, либо в организме-хозяине для продукции пептида последовательности SEQ ID NO: 1. Продуцированный пептид, таким образом, очищают в соответствии с известными методиками.
[0091] Химический синтез включает полимеризацию желаемого пептида путем добавления необходимых аминокислот. Этот способ описан в разделе «Примеры».
[0092] Возможно химически синтезировать пептиды с последовательностями SEQ ID NO: 1 и 2 путем классической твердофазной химии Fmoc (N-[9-флуоренил]метоксикарбонил) и очистить с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (HPLC; Neimark and Briand, 1993; Monneaux et al., 2003, Eur. J. Immunol. 33,287-296; Page et al., 2009, PloS ONE 4, e5273).
[0093] Также возможно напрямую синтезировать пептиды с последовательностями SEQ ID NO: 1 и 2, в которых соответствующие остатки в положении 10 и 9 являются фосфорилированными. Для этой цели во время пептидного синтеза использовали производное серина Fmoc-Ser(РО(Obz)ОН)-ОН-типа в желаемом положении.
3
2
[0094] Фосфатная группа (-РОН) также может быть добавлена после синтеза пептида в соответствии с протоколами, хорошо известными из уровня техники.
[0095] Серин может быть фосфорилирован путем инкубирования пептидов с последовательностями SEQ ID NO: 1 или 2 со специфичной сериновой киназой, выбранной из протеинкиназы А или С (РКА или РКС) или казеинкиназы II, в присутствии аденозинтрифосфата (АТФ). Пептиды, таким образом, являются фосфорилированными по одному серину (в положении 6 или 9 последовательности SEQ ID NO: 2 или в положении 7 или 10 последовательности SEQ ID NO: 1) или по обоим серинам. Желаемый фосфорилированный пептид отделяют от остальных, например, с помощью хроматографии.
3
2
[0096] Химическое добавление -РОН также может быть добавлено в конкретное положение (в положение 9 последовательности SEQ ID NO: 2 или в положении 10 последовательности SEQ ID NO: 1) путем использования специфической защитной группы, которую специалист в данной области легко может выбрать в соответствии со своими общими знаниями.
[0097] Могут быть использованы любые другие методики, известные из уровня техники, позволяющие осуществлять специфическое фосфорилирование серина.
[0098] В некоторых вариантах осуществления окисление метионина проводят в соответствии со следующим процессом:
2
2
[0099] обработка либо НO, 20 мМ, при 37°С в течение 4 часов,
2
[00100] либо в растворе диметилсульфоксида (DMSO; MeSO), 0,1 М плюс НСl 0,5 М, при 22°С в течение 30-180 мин.
[00101] Могут быть использованы любые другие методики, известные из уровня техники, позволяющие осуществлять специфическое окисление метионина.
[00102] В любом из аспектов или вариантов осуществления, описанных в настоящей заявке, пептид(ы), представленные в настоящем описании, могут находиться в форме соли, известной специалисту в данной области, как, например, соли натрия, соли аммония, соли кальция, соли магния, соли калия, ацетатные соли, карбонатные соли, цитратные соли, хлоридные соли, сульфатные соли, аминохлоргидратные соли, боргидратные соли, бензолсульфонатные соли, фосфатные соли, дигидрогенфосфатные соли, сукцинатные соли, цитратные соли, тартратные соли, лактатные соли, соли миндальной кислоты, метансульфонатные соли (мезилат) или п-толуолсульфонатные соли (тозилат). Этот перечень представлен в качестве примера и не означает ограничение настоящего изобретения. Например, специалист в данной области легко определит, в соответствии со своими знаниями, подходящую соль.
[00103] В дополнительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к пептиду, содержащему или состоящему из аминокислотной последовательности:
[00104] RIHMVYSKRSGKPRGYAFIEY [SEQ ID NO: 1],
[00105] содержащей фосфосерин в положении 10 и окисленный метионин в положении 4, или его соли. В одном предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к пептиду, определенному выше, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, или его соли.
[00106] В другом аспекте настоящее изобретение относится к терапевтической композиции, содержащей по меньшей мере пептид, описанный в настоящей заявке, или его соль, и лекарственное средство, обладающее иммуносупрессирующим действием. В некоторых вариантах осуществления терапевтическая композиция содержит эффективное количество пептида, описанного в настоящей заявке, и эффективное количество лекарственного средства, обладающего иммуносупрессирующим действием. В одном варианте осуществления этот пептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, содержащую фосфосерин в положении 10, и лекарственное средство, обладающее иммуносупрессирующим действием.
[00107] Пептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, в которой серин в положении 10 является фосфорилированным, соответствует представленному ниже Соединению III:
[00108] В контексте настоящего изобретения «лекарственное средство, обладающее иммуносупрессирующим или иммуномодулирующим действием» представляет собой лекарственное средство, которое ингибирует или предотвращает активность иммунной системы пациента (например, млекопитающего, такого как человек). Например, лекарственные средства, «обладающие иммуносупрессирующим действием», включают: кортикоиды, такие как метилпреднизолон; циклофосфамиды; азатиоприны; гидроксихлорохины; противомалярийные средства; мофетила микофенолят; метотрексат; биологические препараты, например, инфликсимаб, этанерцепт, голимумаб, адалимумаб, цертолизумаб; и сочетания указанного выше. Этот перечень не предназначен для ограничения изобретения. Например, специалист в данной области легко может определить другие известные лекарственные средства, обладающие иммуносупрессирующим или иммуномодулирующим эффектом, их эффективные количества и пути введения.
[00109] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к терапевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида, имеющего аминокислотную последовательность, представленную по меньшей мере в одной из последовательностей SEQ ID NO: 4, 5 или их сочетанием (то есть, содержащей пептиды с последовательностями SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 4), и эффективное количество лекарственного средства, обладающего иммуносупрессирующим или иммуномодулирующим действием. В дополнительном варианте осуществления композиция дополнительно может содержать пептид, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, содержащую фосфосерин в положении 10.
[00110] В дополнительном аспекте настоящее изобретение также относится к способам лечения аутоиммунного заболевания, включающим стадию введения пациенту, нуждающемуся в таком лечении (например, такому пациенту, как млекопитающее, например, человек), эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке, где указанная композиция является достаточной для осуществления указанного лечения. В другом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, описанной в настоящей заявке, для использования в способе лечения аутоиммунного заболевания, включающего стадию введения пациенту, нуждающемуся в этом, эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке, где композиция является достаточной для осуществления указанного лечения.
[00111] В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание выбирают из семейных аутоиммунных патологий заболеваний соединительных тканей (неспецифические системные органные заболевания), например, системной красной волчанки (SLE), ревматоидного артрита, смешанных заболеваний соединительных тканей, синдрома Шегрена или хронического ювенильного артрита; и/или органоспецифических аутоиммунных патологий, например, рассеянного склероза, инсулинзависимого диабета, болезни Крона или буллезных заболеваний. В предпочтительном варианте осуществления аутоиммунным заболеванием является SLE.
[00112] Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, содержащему пептид, описанный в настоящей заявке, и/или комбинацию, описанную в настоящей заявке, для его использования в качестве лекарственного средства, в частности, для лечения аутоиммунных заболеваний.
[00113] В некоторых вариантах осуществления аутоиммунное заболевание выбирают из семейных аутоиммунных патологий заболеваний соединительных тканей (неспецифические системные органные заболевания), например, системной красной волчанки (SLE), ревматоидного артрита, смешанных заболеваний соединительных тканей, синдрома Шегрена или хронического ювенильного артрита; и/или органоспецифических аутоиммунных патологий, например, рассеянного склероза, инсулинзависимого диабета, болезни Крона или буллезных заболеваний. В предпочтительном варианте осуществления аутоиммунным заболеванием является SLE.
[00114] Настоящее описание также относится к фармацевтическим композициям, содержащим по меньшей мере пептид, описанный в настоящей заявке, или комбинированный продукт, описанный выше, дополнительно включающим фармацевтически приемлемый носитель.
[00115] Пептиды (также называемые в настоящей заявке «активными соединениями»), описанные в настоящей заявке, могут быть включены в фармацевтические композиции, подходящие для введения. Такие композиции обычно содержат пептид и фармацевтически приемлемый носитель. В контексте настоящего изобретения выражение «фармацевтически приемлемый носитель» означает включение всевозможных растворителей, дисперсионных сред, покрытий, антибактериальных и противогрибковых агентов и подобного, совместимых с фармацевтическим введением. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ хорошо известно из уровня техники. За исключением случаев, когда любая обычно применяемая среда или агент является несовместимым с активным соединением, предполагается их применение в композициях. Дополнительные активные соединения также могут быть включены в эти композиции.
[00116] Настоящее изобретение относится к способам получения фармацевтических композиций. Такие способы включают объединение в процессе получения лекарственной формы фармацевтически приемлемого носителя с пептидом, описанным в настоящей заявке. Такие композиции дополнительно могут включать дополнительные активные агенты, описанные выше. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно включает способы получения фармацевтической композиции путем объединения фармацевтически приемлемого носителя с пептидом, описанным в настоящей заявке, и одного или более дополнительных активных соединений.
[00117] Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению получают таким образом, чтобы она была совместима с выбранным путем введения. Примеры путей введения включают парентеральный, например, внутривенный, внутрикожный, подкожный, пероральный, назальный (например, ингаляция), чрескожный (местный), введение через слизистую оболочку и ректальное введение. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфат натрия; хелатообразующие вещества, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты; и вещества для установления тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. рН можно устанавливать с использованием кислот или оснований, таких как хлористоводородная кислота или гидроксид натрия. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы для многократных доз, сделанные из стекла или пластика.
[00118] Фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного использования, включают стерильные водные растворы (где водорастворимые) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий для немедленного использования. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL (BASF; Parsippany, N.J.) или фосфатно-солевой буферный раствор (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть текучей до той степени, чтобы существовала легкая проходимость через иглу. Композиция должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и подобное) и их подходящие смеси. Должная текучесть может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ.
Предотвращение действия микроорганизмов может достигаться посредством различных антибактериальных и противогрибковых средств, например, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты и подобных. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические агенты, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может осуществляться путем включения в композицию вещества, которое задерживает абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
[00119] Стерильные инъекционные растворы могут быть получены путем включения активного соединения (например, полипептида или антитела) в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним ингредиентом или сочетанием ингредиентов, перечисленных выше, в соответствии с установленными требованиями, с последующей фильтровальной стерилизацией. В основном, дисперсии получают путем включения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду, а затем, включая необходимые другие ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и лиофилизация, что дает на выходе порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из их предварительно стерилизованного фильтрованием раствора.
[00120] Пероральные композиции в основном включают инертный разбавитель или пищевой носитель. Их можно заключить в желатиновые капсулы или прессовать в таблетки. Для целей перорального терапевтического введения активное соединение может быть включено с эксципиентами и использовано в форме таблеток, пастилок или капсул. Пероральные композиции также могут быть получены с использованием жидкого носителя для использования в качестве жидкости для полоскания рта, где соединение в жидком носителе применяют перорально и полощут рот и выплевывают или проглатывают.
[00121] Для введения путем ингаляции, соединения доставляют в форме аэрозольного спрея из контейнера, находящегося под давлением, или дозатора, который содержит подходящий пропеллент, например газ, такой как диоксид углерода, или небулайзера.
[00122] Системное введение также можно осуществлять через слизистую оболочку или через кожу. Для введения через слизистую оболочку или через кожу в композиции используют проникающие вещества, подходящие для барьера, который подлежит прохождению. Такие проникающие вещества в основном известны из уровня техники и включают, например, для введения через слизистую оболочку, детергенты, соли желчных кислот и производные фусидовой кислоты. Введение через слизистую оболочку можно осуществлять путем использования назальных спреев или суппозиториев. Для чрескожного введения активные соединения получают в виде мазей, бальзамов, гелей или кремов, в целом известных из уровня техники.
[00123] Соединения также могут быть получены в форме суппозиториев (например, с обычно используемыми основами для суппозиториев, такими как масло какао и другие глицериды) или удерживающих клизм для ректальной доставки.
[00124] В одном варианте осуществления активные соединения получают с носителями, которые будут защищать соединение от быстрого выведения из организма, например, составы с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы получения таких составов будут очевидны специалистам в данной области. Материалы также могут быть получены коммерчески от Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. Липосомные суспензии (в том числе липосомы, содержащие включенные в них или на них моноклональные антитела) также могут быть использованы в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Такие суспензии могут быть получены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области, например, как описано в патенте США 4522811.
[00125] Особенно предпочтительно получать пероральные или парентеральные композиции в единичной дозированной форме для легкого введения и равномерного дозирования. Единичная дозированная форма в контексте настоящего изобретения относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для пациента, подвергающегося лечению; каждая единица, содержащая заранее определенное количество активного соединения, вычисленное таким образом, чтобы оказывать желаемое терапевтическое действие совместно с необходимым фармацевтическим носителем. Описание единичных дозированных форм по настоящему изобретению обусловлено и напрямую зависит от характерных особенностей активного соединения и конкретного достигаемого терапевтического эффекта, и ограничений, присущих составлению смеси такого активного соединения для лечения индивидуумов.
[00126] В некоторых вариантах осуществления способов, представленных в настоящей заявке, указанный способ включает стадию введения дозы примерно от 100 нг примерно до 5 мг терапевтической или фармацевтической композиции, описанной в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления, например, у людей, фармацевтическая композиция, как описано в настоящей заявке, может содержать маннит в качестве носителя, и композицию вводят от 10 мкг до 500 мкг, предпочтительно 200 мкг, за одно введение.
[00127] В некоторых дополнительных аспектах режим дозирования можно возобновлять от 1 до 3 раз в неделю, каждую неделю - каждую четвертую неделю, в течение всего времени, пока существует необходимость, с широтой терапевтического действия, и, следовательно, в течение нескольких лет. В предпочтительном варианте осуществления режим дозирования составляет 12 недель лечения, но может быть повторен дважды в год в течение нескольких лет. Примером введения является одна инъекция 200 мкг пептида, каждые 4 недели в течение 12 недель (то есть 3 инъекции, отделенные друг от друга 4 неделями).
[00128] Лечение может продолжаться путем введения каждые 6 месяцев.
[00129] Предпочтительные фармацевтически приемлемые носители могут содержать, например, ксантановую камедь, камедь бобов рожкового дерева, галактозу, другие сахариды, олигосахариды и/или полисахариды, крахмал, фрагменты крахмала, декстрины, желтый декстрин и их смеси. Предпочтителен фармацевтически приемлемый носитель природного происхождения. Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой или может дополнительно содержать инертный сахаридный разбавитель, выбранный из моносахарида или дисахарида. Предпочтительным сахаридом является маннит.
[00130] Предпочтительно, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, как определено выше, которая находится в форме леденца, таблетки, желатиновой капсулы, капель, пилюли, липосомы или наночастиц, или в форме раствора. Предпочтительный раствор представляет собой раствор, содержащий от 5 до 15%, в частности, примерно 10% маннита. Раствор должен быть изотоническим.
[00131] Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, содержащему комбинированный продукт, как описано выше, для одновременного, раздельного или последовательного применения.
[00132]
ПРИМЕРЫ
[00133] Статистика
[00134] Статистические тесты проводили с использованием GraphPad Prism версии 5.0. Двухфакторный тест ANOVA использовали для анализа статистической значимости различий протеинурии между контрольной группой мышей и группой, получавшей пептид. Выживание контрольных мышей и Р14 0 аналогично обработанных самок мышей MRL/lpr анализировали с использованием метода Каплана-Мейера и значимость различий определяли с помощью логарифмического рангового критерия. Для других переменных статистическую значимость определяли, используя t-критерий Стьюдента. Значения р менее 0,05 считаются значимыми.
[00135] Пример 1: Химический синтез пептидов
[00136] Пептид Р140 и Р140(МО) синтезировали, используя классическую твердофазную химию Fmoc (N-[9-флуоренил]метоксикарбонил), и очищали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (HPLC; Neimark and Briand, 1993; Monneaux et al., 2003, Eur. J. Immunol. 33,287-296; Page et al., 2009, PloS ONE 4,e5273). Их гомогенность проверяли с помощью аналитической HPLC и их идентичность оценивали с использованием LC/MS на системе Finnigan LCQ Advantage Max system (Thermo Fischer Scientific). После завершения реакции пептиды очищали с помощью HPLC.
[00137] Для введения фосфорилирования по остатку серина, эквивалентному остатку 140 последовательности SEQ ID NO: 3, использовали сериновое производное Fmoc-Ser(РО(Obz)ОН)-ОН-типа. Время взаимодействия повышают до 30 минут и второе присоединение проводят систематически. После расщепления в кислой среде каждый пептид осаждают холодным эфиром, растворяют в растворе воды и ацетонитрила и в конце лиофилизируют. Эти пептиды затем очищают с помощью RP-HPLC, их целостность и чистоту анализировали с помощью аналитической HPLC и масс-спектрометрии (Maldi-TOF).
[00138] Окисление вводят, как указано выше.
[00139] Пример 2: Стабильность пептидов
[00140] Стабильность пептида последовательности SEQ ID NO: 1, в которой серин в положении 10 является фосфорилированным, а метионин в положении 4 является окисленным (Р140(МО)), и пептида с последовательностью SEQ ID NO: 1, в которой серин в положении 10 является фосфорилированным (Р140), измеряли при 37°С в растворе 10% (об/об) маннита. Для каждого пептида было протестировано 3 концентрации 200, 100 и 50 мкг/мл.
[00141] В указанное время целостность пептидов Р140 и Р140(МО) измеряли в физиологическом растворе с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии от области пика, соответствующего интактному пептиду.
[00142] Результаты показаны на фиг. 1.
[00143] Результаты суммированы в следующих таблицах 1 и 2:
[00144]
[00145]
[00146] Стабильность измеряют, используя поверхность пика HPLC.
[00147] Стабильность Р140М(О) остается неизменной (100%, 99,1% и 99,4%) на протяжении 100 дней при температуре 37°С для каждой из тестируемых концентраций (50-200 мкг/мл).
[00148] Стабильность Р140 снижается с течением времени и уменьшается через 100 дней при 37°С (97,4%, 93,4% и 89,6%) для каждой тестируемой концентрации (50-200 мкг/мл).
[00149] Эти данные демонстрируют, что окисление метионина в пептиде Р140 повышает стабильность этого пептида. Р140(МО) является стабильным во всех тестируемых концентрациях на протяжении 100 дней.
[00150] Пример 2: Терапевтическое действие пептидов у мышей MRL/lpr.
[00151] Линия мышей MRL/lpr представляет собой сублинию мышей, которая генетически предрасположена к развитию синдрома, подобного системной красной волчанке, который, как было обнаружено, является клинически сходным с заболеванием у людей. Было определено, что эта линия мышей несет мутацию в гене fas. Также, MRL/lpr является моделью, применимой для исследования поведенческих и когнитивных нарушений при аутоиммунных заболеваниях и эффективности иммуносупрессирующих средств [Monneaux et al., 2003, Eur. J. Immunol. 33,287-296].
[00152] 2.1-Анализ выживания
[00153] Самкам мышей MRL/lpr в возрасте пяти недель внутривенно вводили пептид Р140 или пептид Р140(МО), как описано (Monneaux et al., 2003, Eur. J. Immunol. 33,287-296). Все экспериментальные протоколы выполняли с одобрения местного комитета по содержанию и использованию лабораторных животных (Institutional Animal Care and Use Committee (CREMEAS)). В качестве контроля мышам вводили NaCl.
[00154] Двадцать мышей использовали для каждого пептида или NaCl.
[00155] Результаты показаны на фиг. 2.
[00156] Применяли логарифмический ранговый критерий (Кокса-Мантеля), и результаты представляют собой следующее: NaCl по сравнению с Р140 р=0, 0686, NaCl по сравнению с Р140(МО) р=0,0026, Р140 по сравнению с Р140М(О) р=0,2366.
[00157] Средняя выживаемость мышей составляет: NaCl=25 недель, Р140=29 недель и Р140(МО)>40 недель. Эти результаты демонстрируют эффективность пептида Р140(МО) in vivo при лечении волчанки у мышей.
[00158] 2.2-Анализ протеинурии
[00159] Протеинурию у представленных выше мышей измеряли в свежей моче, используя Albustix (Bayer Diagnostics), и полуколичественно оценивали по шкале 0-4, рекомендованной производителем (отсутствие протеинурии = 0; следовая = 1; 1+=2; 2+=3; 3+=4; 4+=5).
[00160] Результаты показаны на фиг. 3.
[00161] На этой фигуре наблюдается, что протеинурия является менее значительной и появляется поздно у мышей, получавших Р140М(О) по сравнению с контрольными мышами.
[00162] 2.3-Анализ насыщенности клетками
[00163] Мышам MRL/lpr вводили с помощью инъекции 100 мкг/100 мкл Р140 или Р140(МО) и насыщенность клетками (периферической крови) изучали через 5 дней после этой единственной инъекции. Определение количества включает все лейкоциты. Ввиду малого количества мышей, был выполнен непараметрический статистический тест Манна-Уитни.
[00164] Результаты показаны на фиг. 4.
[00165] Таким образом, в острой мышиной модели волчанки пептид с последовательностью SEQ ID NO: 4 был способен снижать периферическое повышенное содержание клеток и задерживает биологические и клинические признаки заболевания с эффективностью, по меньшей мере сходной с таковой у Р140, или лучшей.
[00166] Пример 3: Аффинность пептидов в отношении белка HSC70
2
[00167] Систему BIAcore 3000 (Biacore АВ) использовали для оценки связывания пептидов Р140 с белком HSC70 (Page et al., 2009 и 2011). Сенсорный чип СМ5, поверхностно-активное вещество Р20, набор для присоединения амина, содержащий N-гидроксисукцинимид (NHS) и N-этил-N'-диметиламинопропилкарбодиимид (EDC), 2-(2-пиридинилдитио)этанамин (PDEA) и этаноламин были от Biacore АВ. Биосенсорные анализы проводили с использованием буфера HBS-EP в качестве подвижного буфера (10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,005% поверхностно-активного вещества Р20, рН 7,4). Соединения разбавляли в подвижном буфере. Поверхность сенсорного чипа обновляли после каждого эксперимента путем введения 10 мкл 10 мМ НСl. Рекомбинантный бычий HSC70 (Stressgen) иммобилизировали на проточных ячейках сенсорного чипа СМ5 через их тиоловые группы, используя 35 мкл PDEA в 50 мМ боратном буфере, рН 8,3 на NHS/EDC-активированной матрице. Затем, 35 мкл HSC70 (100 мкг/мл в формиатном буфере, рН 4,3) вводили до тех пор, пока не был иммобилизован ответ 13000 единиц ответа (RU), соответствующий 13 нг/мм HSC70. Двадцать мкл раствора 50 мМ цистеин/1 М NaCl использовали для насыщения незанятых участков чипа. Измерение непосредственного связывания пептидов Р140 с HSC70 проводили при 25°С с постоянной скоростью потока 20 мкл/мин. Пептид Р140 и аналоги вводили в поток с различными концентрациями в течение 3 мин, с последующей фазой диссоциацией 3 мин. Кинетические параметры вычисляли, используя программное обеспечение BIAeval 3.1 на персональном компьютере. Анализ проводили, используя простую 1:1 модель связывания Ленгмюра. Профили специфического связывания получали после вычитания ответного сигнала из контрольного пустого канала и инъекции пустого буфера. Аппроксимацию к каждой модели оценивали по % величины и случайности остаточного распределения по сравнению с теоретической.
[00168] Результаты показаны в таблицах 3 и 4 и на фиг. 5 и 6.
[00169] Эти таблицы демонстрируют, что аффинность в отношении HSC70 статистически не различается между пептидами Р140 и Р140М(О).
[00170] Таким образом, эти два пептида связываются с HSC70 с одинаковой эффективностью.
[00174]