УСТРОЙСТВО ДЛЯ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ ОДНОВРЕМЕННОЙ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ДЕТЕКЦИИ ФТОРХИНОЛОНОВЫХ АНТИБИОТИКОВ ОФЛОКСАЦИНА, ЭНРОФЛОКСАЦИНА И ЦИПРОФЛОКСАЦИНА В ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ

Полезная модель относится к определению токсичных контаминантов и может быть использована как экспрессное средство лабораторного и внелабораторного контроля для обеспечения безопасности пищевой потребительской продукции (молока и молочных продуктов, мяса и мясных продуктов, яиц, меда).
Устройство предназначено для иммунохроматографической экспрессной лабораторной и внелабораторной одновременной индивидуальной детекции токсичных контаминантов -фторхинолоновых антибиотиков офлоксацина, энрофлоксацина и ципрофлоксацина в продуктах питания.
На сегодняшний день одними из наиболее распространенных загрязнителей продуктов питания животного происхождения являются различные ветеринарные лекарственные препараты.
Фторхинолоны, пиперазиновые производные хинолона налидиксовой кислоты являются одной из наиболее перспективных групп препаратов современной антибактериальной химиотерапии, применяемых для лечения инфекций разнообразной этиологии и локализации у человека и животных. Ингибируя ДНК-гиразу или топоизомеразу II, фторхинолоны подавляют жизнедеятельность как грамотрицательных, так и грамположительных бактерий. Широкое ветеринарное использование фторхинолонов вызывает существенные риски для здоровья людей, связанные с поступлением этих контаминантов как по пищевым цепям (с продуктами животноводства), так и посредством загрязнения окружающей среды. Неконтролируемое попадание фторхинолонов в организм человека может привести к развитию устойчивых форм микроорганизмов, а также вызвать ряд патологических процессов, таких как дисбактериозы, аллергические реакции, подавление активности некоторых ферментов и др. С учетом этого установлены максимальные допустимые уровни остатков фторхинолонов в молоке, птице, говядине и свинине, равные 30-300 мкг/кг в Европе и России, 100-400 мкг/кг в Китае, 50-200 мкг/кг в Япония и 200 мкг/кг в США.
Для широкого скрининга контаминации пищевых продуктов фторхинолонами используются различные виды жидкостной хроматографии и метод протонного ядерного магнитного резонанса, однако они не решают задачу массового тестирования вне централизованных лабораторий, т.к. требуют сложного дорогостоящего оборудования, высокоочищенных растворителей, квалифицированного персонала. Более эффективны в этом отношении иммунохимические методы: иммуноферментный анализ, иммунофлуоресцентный анализ, электрохимические и оптические биосенсоры, иммунохроматографический анализ (ИХА).
Наиболее простой в использовании формой иммунохимического анализа является ИХА, который обнаруживает присутствие антигена (токсичного контаминанта) в жидкой пробе за 10-15 минут. ИХА основан на движении жидкой пробы вдоль мембраны, которое приводит к образованию на разных участках мембраны специфических иммунных комплексов. Конъюгированный со специфическими антителами окрашенный маркер (коллоидное золото) распределяется по мембране, и его наличие или отсутствие в определенных участках мембраны по окончании анализа является основанием для вывода о полученных результатах. Использование ИХА для детекции токсичных контаминантов обеспечивает достижение ряда преимуществ - проведение контроля в лабораторных и внелабораторных условиях, экспрессность анализа при минимальной пробоподготовке, проведение анализа в одну стадию без необходимости в дополнительных реагентах и манипуляциях и простоту детектирования и интерпретации результатов.
В научной литературе есть описания разработок иммунохроматографических тестов для определения отдельных фторхинолоновых антибиотиков - ципрофлоксацина (1-3), энрофлоксацина (4-6), данофлоксацина (7), офлоксацина (8), в которых используются антитела с индивидуальной специфичностью, и для одновременного определения нескольких (до 12) фторхинолоновых антибиотиков (9), в которых используются антитела, специфичные на группу фторхинолоновых антибиотиков. В коммерческих иммунохроматографических тест-системах в основном используются групп-специфичные антитела, например в разработках фирм «АЕ Solution» (ЮАР), «Unisensor» (Бельгия), «Elabscience» (США), «Shenzhen Lvshiyuan Biotechnology)), «Ballya» и «Beijing Meizheng Bio-Tech» (все - Китай).
Наиболее близким аналогом заявляемой полезной модели является коммерческая иммунохроматографическая тест-система «QuinoSensor. Rapid test detecting all quinolones and fluoroquinolones in milk», KIT038, фирмы «Unisensor» (Бельгия), основанная на реакции антиген-антитело.
Тест-система представляет собой набор, состоящий из:
-8-ми тест-полосок с нанесенными реагентами, упакованных в алюминиевый контейнер с крышкой, в которую помещен осушитель;
-пластикового 8-луночного стрипа, в лунки которого нанесен и высушен конъюгат специфичных к фторхинолоновым антибиотикам (норфлоксацину, энрофлоксацину, данофлоксацину, дифлоксацину, сарафлоксацину, марбофлоксацину, ципрофлоксацину, оксолиновой кислоте, флумеквину, ломефлоксацину, пефлоксацину) антител с коллоидным золотом;
-инструкции по применению набора;
-картонной коробки с маркировкой для упаковки набора.
Тест-полоска представляет собой мультимембранный композит, который состоит из:
- нитроцеллюлозной рабочей мембраны на твердой основе с нанесенными в контрольную зону антивидовыми антителами и нанесенным в тестовую зону конъюгатом гаптена с белком-носителем (дизайн конъюгата гаптен-белок-носитель является ноу-хау производителя);
- мембраны для впитывания и сепарации исследуемой пробы;
- конечной адсорбирующей мембраны для впитывания компонентов образца после прохождения реакции;
- покрывающей защитной пленки с маркировкой.
Анализ проводят следующим образом:
1. Молоко и жидкие молочные продукты анализируют без предварительной пробоподготовки.
2. От стрипа отделяют 1 лунку с высушенным конъюгатом специфичных к фторхинолонам антител с коллоидным золотом.
3. В лунку с помощью пипетки вносят 200 мкл молока.
4. Лунку с пробой помещают в ячейку нагревательного блока, закрывают крышку и автоматически перемешивают пробу в течение 5-10 с.
5. Включают нагрев на 37°С и инкубируют лунку с пробой в течение 6 мин.
6. Открывают крышку блока и тест-полоску погружают вертикально нижним концом мембраны для впитывания образца в жидкую пробу на 4 мин.
7. Через 10 мин от начала анализа тест-полоску вынимают. Результат анализа фиксируют визуально или с использованием детектора READSENSOR АРР038.
Результат анализа интерпретируют следующим образом:
1. Если через 10 мин на рабочей мембране тест-полоски появляются две линии (контрольная и тестовая), окрашенные в темно-красный цвет, то результат анализа считается отрицательным, т.е. в образце не содержатся фторхинолоновые антибиотики или их концентрация ниже предела обнаружения.
2. Если через 10 мин на рабочей мембране тест-полоски появляются две темно-красные линии (контрольная и очень бледная тестовая) или одна темно-красная линия (контрольная), то результат анализа считается положительным, т.е. в образце содержатся фторхинолоновые антибиотики в концентрациях равных или выше предела обнаружения.
3. Если через 10 мин на рабочей мембране тест-полоски не образуется ни одной окрашенной линии или образуется только одна тестовая окрашенная линия, то результат анализа считается недействительным.
Тест-система «QuinoSensor» дает информацию только о суммарной контаминации образца фторхинолоновыми антибиотиками, тогда как заявляемая полезная модель позволяет идентифицировать токсичный контаминант. Анализ с использованием тест-системы «QuinoSensor» предполагает промежуточную стадию инкубации пробы с конъюгатом специфических антител с коллоидным золотом. Анализ с использованием заявляемой полезной модели является одностадийным, т.к. все необходимые реагенты нанесены на тест-полоску. Также для проведения анализа с использованием тест-системы «QuinoSensor» требуется дополнительное оборудование - нагревательный блок со встроенным перемешивающим устройством, что усложняет анализ по сравнению с анализом с использованием заявляемой полезной модели.
Технической задачей заявляемой полезной модели является одновременная индивидуальная детекция трех токсичных контаминантов - офлоксацина, энрофлоксацина и ципрофлоксацина в продуктах питания.
Технический результат заявляемой полезной модели заключается в одновременной индивидуальной детекции на одной тест-полоске трех токсичных контаминантов -фторхинолоновых антибиотиков офлоксацина, энрофлоксацина и ципрофлоксацина с использованием простой одностадийной процедуры проведения анализа, обеспечиваемой за счет нанесения на тест-полоску всех необходимых реагентов.
Предлагаемое устройство представляет собой мультимембранный композит с нанесенными иммунореагентами (тест-полоску). Мультимембранный композит состоит из рабочей нитроцеллюлозной мембраны на твердой полистироловой основе с нанесенными иммунореагентами, стекловолоконной мембраны с нанесенными иммунореагентами, мембраны для впитывания и сепарации исследуемого образца и конечной адсорбирующей мембраны для впитывания компонентов образца после прохождения реакции.
Указанный технический результат достигается тем, что:
- в К.З. нанесены поликлональные козьи антитела, специфичные к иммуноглобулинам кролика;
- в Т.З.1 нанесен конъюгат офлоксацина с белком-носителем СИТ;
- в Т.З.2 нанесен конъюгат энрофлоксацина с белком-носителем СИТ;
- в Т.З.3 нанесен конъюгат ципрофлоксацина с белком-носителем СИТ;
- на стекловолоконную мембрану нанесена смесь конъюгатов с коллоидным золотом поликлональных кроличьих антител, специфичных к офлоксацину, энрофлоксацину и ципрофлоксацину.
На прилагаемом чертеже (рис. 1) представлено заявляемое устройство, где 1 - твердая основа рабочей нитроцеллюлозной мембраны из полистирола, 2 - рабочая нитроцеллюлозная мембрана с нанесенными и высушенными иммунореагентами, 3 - конечная адсорбирующая мембрана для впитывания компонентов образца после прохождения реакции, 4 -стекловолоконная мембрана с нанесенными и высушенными иммунореагентами, 5 - мембрана для впитывания и сепарации исследуемой пробы, А - К.З. с нанесенными поликлональными козьими антителами, специфичными к иммуноглобулинам кролика, Б - Т.З.3 с нанесенным конъюгатом ципрофлоксацина с белком-носителем СИТ, В - Т.З.2 с нанесенным конъюгатом энрофлоксацина с белком-носителем СИТ, Г - Т.З.1 с нанесенным конъюгатом офлоксацина с белком-носителем СИТ.
В таблице 1 приведена характеристика материалов, из которых изготовлены элементы заявляемого устройства.
Анализ с помощью заявляемого устройства проводят следующим образом:
1. 100-120 мкл анализируемой пробы (молоко, жидкий молочный продукт, экстракт из мяса или яиц, разбавленный мед, вода) вносят в пластиковую пробирку вместимостью 1,5 мл.
2. Тест-полоску погружают вертикально нижним концом мембраны для впитывания образца на глубину 0,5 см в жидкость и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин.
3. Вынимают тест-полоску и помещают ее на сухую горизонтальную поверхность на 7 мин.
4. Через 10 мин после начала движения жидкости по тест-полоске результат анализа фиксируют визуально или с использованием детектора с видеоцифровой регистрацией.
Заявляемое устройство функционирует следующим образом (см. рис. 1):
Если в пробе присутствуют офлоксацин, энрофлоксацин и/или ципрофлоксацин, то они с потоком жидкости перемещаются по впитывающей мембране (5), доходят до стекловолоконной мембраны (4) и реагируют с конъюгатами коллоидного золота со специфическими антителами с образованием двойных комплексов (растворенный антиген - антитела, меченные коллоидным золотом). Комплексы под действием капиллярных сил движутся вдоль рабочей нитроцеллюлозной мембраны (2) и взаимодействуют с иммобилизованными в Т.З.1 (Г), Т.З.2 (В) и Т.З.3 (Б) конъюгатами антигенов офлоксацина с белком-носителем СИТ (Т.З.1, Г), энрофлоксацина с белком-носителем СИТ (Т.З.2, В) и ципрофлоксацина с белком-носителем СИТ (Т.З.3, Б) с образованием тройных комплексов (иммобилизованный на мембране через белок-носитель антиген - меченные коллоидным золотом антитела - антиген из раствора). Избыток не связавшихся двойных комплексов продолжает двигаться вдоль рабочей нитроцеллюлозной мембраны (2) и взаимодействует с антивидовыми антителами, иммобилизованными в К.З. (А), с образованием двойных комплексов (иммобилизованные на мембране антивидовые антитела - антитела, меченные коллоидным золотом).
Интерпретация результатов анализа производится в соответствие со схемой, представленной на рис. 2:
1. Если через 10 мин на рабочей мембране тест-полоски появляются четыре красные линии (К.З., Т.З.1, Т.З.2 и Т.З.3), то результат анализа считается отрицательным, т.е. в пробе не содержатся офлоксацин, энрофлоксацин и ципрофлоксацин или их концентрации ниже пределов обнаружения (рис. 2а).
2. Если через 10 мин на рабочей мембране тест-полоски появляются две красные линии (К.З. и первая по ходу движения жидкости Т.З.1), то результат анализа считается отрицательным по офлоксацину и положительным по энрофлоксацину и ципрофлоксацину, т.е. в пробе не содержится офлоксацин (или его концентрация ниже предела обнаружения) и содержатся энрофлоксацин и ципрофлоксацин в концентрациях, равных или выше пределов обнаружения (рис. 2б).
3. Если через 10 мин на рабочей мембране тест-полоски появляются две красные линии (К.З. и вторая по ходу движения жидкости Т.З.2), то результат анализа считается отрицательным по энрофлоксацину и положительным по офлоксацину и ципрофлоксацину, т.е. в пробе не содержится энрофлоксацин (или его концентрация ниже предела обнаружения) и содержатся офлоксацин и ципрофлоксацин в концентрациях, равных или выше пределов обнаружения (рис. 2в).
4. Если через 10 мин на рабочей мембране тест-полоски появляются две красные линии (К.З. и третья по ходу движения жидкости Т.З.3), то результат анализа считается отрицательным по ципрофлоксацину и положительным по офлоксацину и энрофлоксацину, т.е. в пробе не содержится ципрофлоксацин (или его концентрация ниже предела обнаружения) и содержатся офлоксацин и энрофлоксацин в концентрациях, равных или выше пределов обнаружения (рис. 2г).
5. Если через 10 мин на рабочей мембране тест-полоски появляются три красные линии (К.З., вторая и третья по ходу движения жидкости, Т.З.2 и Т.З.3), то результат анализа считается положительным по офлоксацину и отрицательным по энрофлоксацину и ципрофлоксацину, т.е. в пробе содержится офлоксацин в концентрации, равной или выше предела обнаружения, и не содержатся энрофлоксацин и ципрофлоксацин (или их концентрации ниже предела обнаружения) (рис. 2д).
6. Если через 10 мин на рабочей мембране тест-полоски появляются три красные линии (К.З., первая и третья по ходу движения жидкости, Т.З.1 и Т.З.3), то результат анализа считается положительным по энрофлоксацину и отрицательным по офлоксацину и ципрофлоксацину, т.е. в пробе содержится энрофлоксацин в концентрации, равной или выше предела обнаружения, и не содержатся офлоксацин и ципрофлоксацин (или их концентрации ниже предела обнаружения) (рис. 2е).
7. Если через 10 мин на рабочей мембране тест-полоски появляются три красные линии (К.З., первая и вторая по ходу движения жидкости, Т.З.1 и Т.З.2), то результат анализа считается положительным по ципрофлоксацину и отрицательным по офлоксацину и энрофлоксацину, т.е. в пробе содержится ципрофлоксацин в концентрации, равной или выше предела обнаружения, и не содержатся офлоксацин и энрофлоксацин (или их концентрации ниже предела обнаружения) (рис. 2ж).
8. Если через 10 мин на рабочей мембране тест-полоски появляется одна красная линия (К.З.), то результат анализа считается положительным по офлоксацину, энрофлоксацину и ципрофлоксацину, т.е. в пробе содержатся офлоксацин, энрофлоксацин и ципрофлоксацин в концентрациях, равных или выше пределов обнаружения (рис. 2з).
9. Если через 10 мин на рабочей мембране тест-полоски не образуется ни одной окрашенной линии или образуются только тестовые линии (одна, две или три в любых комбинациях), то результат анализа считается недействительным (рис. 2и).
Эффективность данного подхода подтверждается следующими представленными ниже примерами:
Пример 1 (исследование времени получения отрицательных по офлоксацину, энрофлоксацину и ципрофлоксацину результатов анализа с использованием заявляемого устройства):
С использованием заявляемого устройства проводят анализ молока с содержанием жира 3,2%, не содержащего офлоксацин, энрофлоксацин и ципрофлоксацин по данным ИФА. 120 мкл образца вносят в пробирку. Заявляемое устройство (тест-полоску) погружают вертикально нижним концом мембраны для впитывания образца на глубину 0,5 см в образец и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Вынимают тест-полоску и помещают ее в паз выдвижной каретки детектирующего устройства для видеоцифровой регистрации. Результат анализа оценивают через 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15 мин с помощью программного обеспечения видеоцифрового детектора. Время анализа контролируют с помощью секундомера. Анализ проводят в пяти повторностях, используя тест-полоски пяти разных серий (полоски №№1-5).
Результаты анализа приведены в таблице 2. Интенсивности окрашивания каждой из зон связывания нормированы на ее среднее значение, полученное через 15 мин после начала анализа. Из приведенных экспериментальных данных видно, что через 10 мин после начала анализа интенсивности окрашивания К.З. достигают 100,0-100,5%, зон связывания офлоксацина (Т.З.1) - 100,0-100,1%, зон связывания энрофлоксацина (Т.З.2) - 99,7-100,1%, зон связывания ципрофлоксацина (Т.З.3) - 99,2-99,8% и практически не изменяются в течение следующих пяти минут, т.е. время анализа с использованием заявленного устройства при отсутствии в пробе офлоксацина, энрофлоксацина и ципрофлоксацина составляет 10 мин.
Пример 2 (исследование времени получения положительного по офлоксацину и отрицательного по энрофлоксацину и ципрофлоксацину результатов анализа с использованием заявляемого устройства):
С использованием заявляемого устройства проводят анализ молока с содержанием жира 3,2%, содержащего офлоксацин в концентрации 30 нг/мл и не содержащего энрофлоксацин и ципрофлоксацин по данным ИФА. 120 мкл образца вносят в пробирку. Заявляемое устройство (тест-полоску) погружают вертикально нижним концом мембраны для впитывания образца на глубину 0,5 см в образец и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Вынимают тест-полоску и помещают ее в паз выдвижной каретки детектирующего устройства для видеоцифровой регистрации. Результат анализа оценивают через 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15 мин с помощью программного обеспечения видеоцифрового детектора. Время анализа контролируют с помощью секундомера. Анализ проводят в пяти повторностях, используя тест-полоски пяти разных серий (полоски №№1-5).
Результаты анализа приведены в таблице 3. Интенсивности окрашивания К.З., Т.З.2 и Т.З.3 нормированы на их средние значения, полученные через 15 мин после начала анализа. Интенсивности окрашивания Т.З.1 нормированы на ее среднее значение, полученное при отсутствии офлоксацина в пробе (см. Пример 1).
Из приведенных экспериментальных данных видно, что через 10 мин после начала анализа интенсивности окрашивания К.З. достигают 99,8-100,5%, зон связывания энрофлоксацина (Т.З.2) - 99,5-100,0%, зон связывания ципрофлоксацина (Т.З.3) - 99,3-99,8%) и практически не изменяются в течение следующих пяти минут. Интенсивности окрашивания тестовых зон связывания офлоксацина (Т.З.1) через 10 мин после начала анализа составляют от 0 до 0,3% и практически не изменяются в течение следующих пяти минут. Таким образом, время анализа пробы, содержащей офлоксацин в концентрации 30,0 нг/мл и не содержащей энрофлоксацин и ципрофлоксацин по данным ИФА, с использованием заявленного устройства составляет 10 мин.
Пример 3 (исследование времени получения положительного по энрофлоксацину и отрицательного по офлоксацину и ципрофлоксацину результатов анализа с использованием заявляемого устройства):
С использованием заявляемого устройства проводят анализ молока с содержанием жира 3,2%, содержащего энрофлоксацин в концентрации 30 нг/мл и не содержащего офлоксацин и ципрофлоксацин по данным ИФА. 120 мкл образца вносят в пробирку. Заявляемое устройство (тест-полоску) погружают вертикально нижним концом мембраны для впитывания образца на глубину 0,5 см в образец и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Вынимают тест-полоску и помещают ее в паз выдвижной каретки детектирующего устройства для видеоцифровой регистрации. Результат анализа оценивают через 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15 мин с помощью программного обеспечения видеоцифрового детектора. Время анализа контролируют с помощью секундомера. Анализ проводят в пяти повторностях, используя тест-полоски пяти разных серий (полоски №№1-5).
Результаты анализа приведены в таблице 4. Интенсивности окрашивания К.З., Т.З.1 и Т.З.3 нормированы на их средние значения, полученные через 15 мин после начала анализа. Интенсивности окрашивания Т.З.2 нормированы на ее среднее значение, полученное при отсутствии энрофлоксацина в пробе (см. Пример 1).
Из приведенных экспериментальных данных видно, что через 10 мин после начала анализа интенсивности окрашивания К.З. достигают 99,8-100,5%, зон связывания офлоксацина (Т.З.1) - 99,6-100,4%, зон связывания ципрофлоксацина (Т.З.3) - 99,2-99,8% и практически не изменяются в течение следующих пяти минут. Интенсивности окрашивания тестовых зон связывания энрофлоксацина (Т.З.2) через 10 мин после начала анализа составляют от 0 до 0,3% и практически не изменяются в течение следующих пяти минут. Таким образом, время анализа пробы, содержащей энрофлоксацин в концентрации 30,0 нг/мл и не содержащей офлоксацин и ципрофлоксацин по данным ИФА, с использованием заявленного устройства составляет 10 мин.
Пример 4 (исследование времени получения положительного по ципрофлоксацину и отрицательного по офлоксацину и энрофлоксацину результатов анализа с использованием заявляемого устройства):
С использованием заявляемого устройства проводят анализ молока с содержанием жира 3,2%, содержащего ципрофлоксацин в концентрации 30 нг/мл и не содержащего офлоксацин и энрофлоксацин по данным ИФА. 120 мкл пробы вносят в пробирку. Заявляемое устройство (тест-полоску) погружают вертикально нижним концом мембраны для впитывания образца на глубину 0,5 см в образец и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Вынимают тест-полоску и помещают ее в паз выдвижной каретки детектирующего устройства для видеоцифровой регистрации. Результат анализа оценивают через 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15 мин с помощью программного обеспечения видеоцифрового детектора. Время анализа контролируют с помощью секундомера. Анализ проводят в пяти повторностях, используя тест-полоски пяти разных серий (полоски №№1-5).
Результаты анализа приведены в таблице 5. Интенсивности окрашивания К.З., Т.З.1 и Т.З.2 нормированы на их средние значения, полученные через 15 мин после начала анализа. Интенсивности окрашивания Т.З.3 нормированы на ее среднее значение, полученное при отсутствии ципрофлоксацина в пробе (см. Пример 1).
Из приведенных экспериментальных данных видно, что через 10 мин после начала анализа интенсивности окрашивания К.З. достигают 99,8-100,5%, зон связывания офлоксацина (Т.З.1) - 99,8-100,4%, зон связывания энрофлоксацина (Т.З.2) - 99,3-100,0%) и практически не изменяются в течение следующих пяти минут. Интенсивности окрашивания тестовых зон связывания ципрофлоксацина (Т.З.3) через 10 мин после начала анализа составляют от 0,2 до 0,6% и практически не изменяются в течение следующих пяти минут. Таким образом, время анализа пробы, содержащей ципрофлоксацин в концентрации 30,0 нг/мл и не содержащей энрофлоксацин и офлоксацин по данным ИФА, с использованием заявленного устройства составляет 10 мин.
Пример 5 (исследование времени получения положительного по офлоксацину, энрофлоксацину и ципрофлоксацину результатов анализа с использованием заявляемого устройства):
С использованием заявляемого устройства проводят анализ молока с содержанием жира 3,2%, содержащего офлоксацин, энрофлоксацин и ципрофлоксацин в концентрациях 30 нг/мл по данным ИФА. 120 мкл образца вносят в пробирку. Заявляемое устройство (тест-полоску) погружают вертикально нижним концом мембраны для впитывания образца на глубину 0,5 см в образец и инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Вынимают тест-полоску и помещают ее в паз выдвижной каретки детектирующего устройства для видеоцифровой регистрации. Результат анализа оценивают через 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15 мин с помощью программного обеспечения видеоцифрового детектора. Время анализа контролируют с помощью секундомера. Анализ проводят в пяти повторностях, используя тест-полоски пяти разных серий (полоски №№1-5).
Результаты анализа приведены в таблице 6. Интенсивности окрашивания К.З. нормированы на ее среднее значение, полученное через 15 мин после начала анализа. Интенсивности окрашивания Т.З.1, Т.З.2 и Т.З.3 нормированы на их средние значения, полученные при отсутствии офлоксацина, энрофлоксацина и ципрофлоксацина в пробе (см. Пример 1).
Из приведенных экспериментальных данных видно, что через 10 мин после начала анализа интенсивности окрашивания К.З. достигают 99,9-100,6% и практически не изменяются в течение следующих пяти минут. Интенсивности окрашивания тестовых зон связывания офлоксацина (Т.З.1), энрофлоксацина (Т.З.2) и ципрофлоксацина (Т.З.3) через 10 мин после начала анализа составляют от 0 до 0,5% и практически не изменяются в течение следующих пяти минут. Таким образом, время анализа пробы, содержащей офлоксацин, энрофлоксацин и ципрофлоксацин в концентрациях 30,0 нг/мл по данным ИФА, с использованием заявленного устройства составляет 10 мин.
Ссылки
1. Hendrickson O.D., Zvereva E.A., Shanin I.A., Zherdev A.V., Tarannum N., Dzantiev B.B. Appl. Biochem. Microbiol. 2018, 54(6), 670-676.
2. Yu L., Liu M., Wang Т., X. Wang. Anal.Meth. 2019, 11, 3244-3251.
3. Liu L., Luo L., Suryoprabowo S., Peng J., Kuang H., Xu C. Sensors. 2014, 14, 16785-16798.
4. Hendrickson O.D., Zvereva E.A., Shanin LA., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. J. Sci. Food Agric. 2019, 99, 3834-3842.
5. Chen X., Xu H., Lai W., Chen Y., Yang X., Xiong Y. Food Add. Cont.: Part A, 2012, 29(3), 383-391.
6. Zhao Y., Zhang G., Liu Q., Teng M., Yang J., Wang J. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 12138-12142.
7. Yang X., Wang Y., Yang J., Sun Z., Yue Z., Li L., He L., Ни X. Food Anal. Meth. 2019, 12, 2430-2437.
8. Byzova N.A., Smirnova N.I., Zherdev A.V., Eremin S.A., Shanin LA., Lei H.-T., Sun Y., Dzantiev B.B. Talanta. 2014, 119, 125-132.
9. Zhu Y., Li L., Wang Z., Chen Y., Zhao Z., Zhu L., Wu X., Wan Y., He F., Shen J. J. Agric. Food Chem. 2008, 56, 5469-5474.
Краткое описание чертежей
На рис. 1 изображена схема заявляемого устройства для иммунохроматографической экспрессной лабораторной и внелабораторной одновременной индивидуальной детекции токсичных контаминантов - фторхинолоновых антибиотиков (офлоксацина, энрофлоксацина, ципрофлоксацина), в продуктах питания и объектах окружающей среды. 1 - твердая основа рабочей нитроцеллюлозной мембраны из полистирола, 2 - рабочая нитроцеллюлозная мембрана с нанесенными и высушенными иммунореагентами, 3 - конечная адсорбирующая мембрана для впитывания компонентов пробы после прохождения реакции, 4 - стекловолоконная мембрана с нанесенными и высушенными иммунореагентами, 5 - мембрана для впитывания и сепарации исследуемой пробы, А - К.З. с нанесенными поликлональными козьими антителами, специфичными к иммуноглобулинам кролика, Б - Т.З.3 с нанесенным конъюгатом ципрофлоксацина с белком-носителем СИТ, В - Т.З.2 с нанесенным конъюгатом энрофлоксацина с белком-носителем СИТ, Г - Т.3.1 с нанесенным конъюгатом офлоксацина с белком-носителем СИТ.
На рис. 2 изображен алгоритм интерпретации результатов анализа. Если на рабочей мембране тест-полоски появляются четыре красные линии (К.З., Т.З.1, Т.З.2 и Т.З.3), результат анализа считается отрицательным по трем антибиотикам (рис. 2а). Если на рабочей мембране тест-полоски появляются две красные линии (К.З. и Т.З.1), результат анализа считается отрицательным по офлоксацину и положительным по энрофлоксацину и ципрофлоксацину (рис. 2б). Если на рабочей мембране тест-полоски появляются две красные линии (К.З. и Т.З.2), результат анализа считается отрицательным по энрофлоксацину и положительным по офлоксацину и ципрофлоксацину (рис. 2в). Если на рабочей мембране тест-полоски появляются две красные линии (К.З. и Т.З.3), результат анализа считается отрицательным по ципрофлоксацину и положительным по офлоксацину и энрофлоксацину (рис. 2г). Если на рабочей мембране тест-полоски появляются три красные линии (К.З., Т.З.2 и Т.З.3), результат анализа считается отрицательным по ципрофлоксацину и энрофлоксацину и положительным по офлоксацину (рис. 2д). Если на рабочей мембране тест-полоски появляются три красные линии (К.З., Т.З.1 и Т.З.3), результат анализа считается отрицательным по офлоксацину и ципрофлоксацину и положительным по энрофлоксацину (рис. 2е). Если на рабочей мембране тест-полоски появляются три красные линии (К.З., Т.З.1 и Т.З.2), результат анализа считается отрицательным по офлоксацину и энрофлоксацину и положительным по ципрофлоксацину (рис. 2ж). Если на рабочей мембране тест-полоски появляется одна красная линия (К.З.), результат анализа считается положительным по трем антибиотикам (рис. 2з). Если на рабочей мембране тест-полоски не образуется ни одной окрашенной линии или образуются только тестовые линии (одна, две или три в любой комбинации), результат анализа считается недействительным (рис. 2и).