СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ ПОДСОЛНЕЧНИКА К СУХОЙ ГНИЛИ КОРЗИНКИ
METHOD FOR DETECTION OF SUNFLOWER PLANTS RESISTANCE TO DRY ROT OF HEAD

Изобретение относится к области сельского хозяйства и может быть использовано в селекции подсолнечника, в частности в выведении форм подсолнечника, устойчивых к сухой гнили корзинок подсолнечника.
Известно около 40 видов грибов рода Rhizopus Ehrenb. Они поражают многие сельскохозяйственные культуры - початки кукурузы, клубни картофеля, плоды томатов, ягоды земляники, малины, клубники, волокно хлопчатника, вызывают гниль кожицы плодов, кагатную гниль сахарной свеклы (Ячевский А.А., 1929; Пересыпкин В.Ф., 1974; Билай В.И. и др., 1988). У сои вызывают потерю жизнеспособности семян и разрушение белка (Лобик А.И., 1930; Катаева О.Е., 1931; Заянчковская М.С., 1938; Жуковская С.А., 1980). На клещевине грибы рода Rhizopus Ehrenb. вызывают черную гниль соцветий (Пересыпкин В.Ф., 1974, 1986). Большой вред этот патоген наносит и подсолнечнику. В Краснодарском крае подсолнечник поражают три вида грибов из рода Rhizopus Ehrenb.: Rh. oryzae Went et Pringle, Rh. stolonifer Ehrenb., Fr. Vuill, Rh. microsporus V.Tiegh, вызывая сухую гниль корзинок. Поражение подсолнечника грибами рода Rhizopus Ehrenb. приводит к снижению качества и количества семенного материала. Существуют разные способы защиты подсолнечника от сухой гнили: агротехнические, химические. Наиболее эффективным способом защиты подсолнечника от сухой гнили является селекция подсолнечника на устойчивость к этому патогену. Способов определения устойчивости подсолнечника к сухой гнили нет.
Настоящим изобретением решается задача расширения арсенала методов и средств для осуществления селекции подсолнечника на устойчивость к гнилям, в частности к сухой гнили корзинки, за счет простого, удобного и достоверного выявления устойчивых к сухой гнили форм подсолнечника при заражении ею корзинок подсолнечника.
Цель изобретения - обеспечить оптимальные условия и надежность заражения корзинок подсолнечника сухой гнилью и приблизить эти условия к естественным, в фазу развития растений, наиболее восприимчивую к этому патогену, а оценку иммунитета растений осуществлять после уборки по качественному показателю семян, обеспечивающему высокую точность оценки.
Технический результат достигается тем, что выращивают 7-дневную культуру гриба Rhizopus Ehrenb. в чашках Петри, из нее приготовляют водную суспензию инокулюма с концентрацией 4500-5000 спор/мл, инокулируют корзинку в фазу «конец цветения» путем опрыскивания ее поверхности водной суспензией инокулюма в количестве 4-5 мл на одну корзинку, надевают на обработанные корзинки изоляторы, через трое суток изоляторы снимают, в фазу созревания корзинок осуществляют оценку иммунологической реакции растения по качественному показателю семян зараженных корзинок - кислотному числу масла, а также проводят дифференциацию устойчивости по относительной величине кислотного числа масла семян, относя к устойчивым те, у которых кислотное число масла семян выше на 0-10%, к среднеустойчивым - на 11-15%, к восприимчивым - на 16-40%, к сильно восприимчивым - 41% и выше, чем кислотное число масла семян растений данной формы подсолнечника, не подвергавшихся инокуляции, при этом в частности опрыскивают водной суспензией инокулюма лицевую сторону корзинки, опрыскивание осуществляют с помощью пульверизатора, изоляторы надевают на обработанные инокулюмом корзинки пергаментные, а после снятия их с зараженных корзинок из опыта сразу же удаляют растения с полностью сгнившими корзинками.
Предлагаемое техническое решение является новым, поскольку из общедоступных сведений не известен способ определения устойчивости растений подсолнечника к сухой гнили корзинки, т.е. оно соответствует критерию патентоспособности «НОВИЗНА».
Предлагаемое техническое решение имеет ИЗОБРЕТАТЕЛЬСКИЙ УРОВЕНЬ, поскольку из опубликованных научных данных и известных технических решений для специалиста в области селекции подсолнечника явным образом не следует заявленная совокупность признаков. Отдельные признаки заявляемого изобретения или их части, например «выращивание культуры гриба», «приготовление инокулюма», сами по себе известны, но они (эти операции, приемы) используются в сочетании с другими (нежели в заявляемом изобретении) признаками и для определения устойчивости растений подсолнечника к другим (нежели в заявляемом изобретении) патогенам. Нашими опытами и исследованиями были выявлены: возраст чистой культуры гриба сухой гнили, в котором он обладает максимальной патогенной силой, необходимой для эффективного заражения корзинок подсолнечника; фазу растений подсолнечника и качественный показатель для эффективного проведения оценки иммунологической реакции растений на заражение грибом сухой гнили, а также дифференцированные показатели устойчивости растений к указанной гнили.
Предлагаемое техническое решение ПРОМЫШЛЕННО ПРИМЕНИМО, т.к. для его реализации могут быть использованы стандартное лабораторное оборудование, приспособления, в том числе чашки Петри и другое, а также патогенный материал (пораженные сухой гнилью корзинки подсолнечника) и оно может быть применимо в сельском хозяйстве, в частности в области селекции.
Способ осуществляют следующим образом, начинают с того, что за семь дней до конца цветения подсолнечника (фаза «конец цветения» наступает на 53-59-й день от начала всходов для сортов различных групп спелости) начинают выращивание гриба сухой гнили в чашках Петри по общеизвестной методике для приготовления инокулюма. Из выращенной 7-дневной культуры патогена готовят водную суспензию инокулюма с концентрацией 4500-5000 спор/мл. Инокулируют корзинку подсолнечника (в фазу «конец цветения») путем опрыскивания ее поверхности приготовленной водной суспензией в количестве 4-5 мл на одну корзинку, после чего на обработанные корзинки надевают изоляторы. Через трое суток изоляторы снимают. В фазу созревания корзинок осуществляют оценку иммунологической реакции растения по качественному показателю семян зараженных корзинок - кислотному числу масла семян, для чего корзинки после уборки обмолачивают в отдельные пакеты, и в условиях лаборатории определяют кислотное число масла семян, а также проводят дифференциацию устойчивости, относя к устойчивым те, у которых кислотное число масла семян выше на 0-10%, к среднеустойчивым - на 11-15%, к восприимчивым - на 16-40%, к сильно восприимчивым - 41% и выше, чем кислотное число масла семян растений данной формы подсолнечника, не подвергавшихся инокуляции. При этом, в частности, опрыскивают водной суспензией инокулюма лицевую сторону корзинки с помощью пульверизатора, изоляторы надевают на обработанные корзинки пергаментные, а после снятия их с зараженных корзинок из опыта сразу же удаляют растения с полностью сгнившими корзинками.
ПРИМЕР осуществления способа
Опыт проводили в условиях Краснодарского края.
В Краснодарском крае подсолнечник поражают три вида грибов из рода Rhizopus Ehrenb. Видовой состав и их морфологические признаки представлены в таблице 1, из показателей которой видно, что наиболее встречаемым на подсолнечнике является вид Rhizopus oryzae Went et Pringle.
Опыт проводили так. Осенью года, предшествующего году проведения опыта, на посевах подсолнечника отбирали пораженные сухой гнилью корзинки, которые затем высушивали и хранили в эксикаторе. Весной семена испытуемых сортов подсолнечника (Альбатрос, СПК, Лакомка и другие) высевали в поле в оптимальные для развития растений сроки. Так как известно, что фаза «конец цветения» наступает на 53-59-й день от начала всходов (в зависимости от скороспелости сорта), то фиксировали срок всходов и за 7 дней до фазы «конец цветения» корзинок подсолнечника начинали выращивание чистой культуры гриба Rh. oryzae Went et Pringle по общепринятой методике.
3
Для этого брали ткани заготовленных с осени и хранимых в эксикаторе пораженных ризопусом (сухой гнилью) корзинок с включенными в них пораженными семенами, закладывали во влажную камеру и держали там до появления мицелия, который пересевали затем на питательную среду (картофельно-глюкозный агар) в чашки Петри. Затем готовили инокулюм из 7-дневных чистых культур этого гриба в виде водной суспензии по общепринятой методике: путем смыва дистиллированной водой спорангиеносцев гриба. Подсчет спор осуществляли в камере Горяева также по общепринятой методике. Для этого к утолщенному предметному стеклу камеры с нанесенной на него сеткой осторожно притирали специальное покровное стекло так, чтобы по его краям появились цветные полосы интерференции, свидетельствующие о плотном прилегании покровного стекла к камере. Затем каплю приготовленной суспензии пипеткой вносили в желобок камеры, следя чтобы покровное стекло при этом не всплыло. После чего под микроскопом подсчитывали количество спор в пяти больших квадратах и определяли среднее. Плотность спор в исходной суспензии вычисляли по формуле N=а·250000, где а - среднее количество спор в одном большом квадрате. Концентрацию приготовленной суспензии доводили стерильной водой до 5×10 спор/мл (достаточное количество инфекционного материала для заражения). Инокуляцию корзинки проводили в фазу «конец цветения», т.к. эта фаза развития растения подсолнечника является наиболее восприимчивой к заражению корзинки ризопусом (см. табл.2).
Таблица 2
Способы заражения корзинки подсолнечника и распространенность болезни на ее поверхности
Краснодар, ВНИИМК, 2006-2007 гг.
Способы инокуляции корзинки подсолнечника
Фаза заражения
Распространенность болезни, %
Размещение зерновок овса, пораженных возбудителем сухой гнили, под лист обертки корзинки подсолнечника
бутонизация
16,0
начало цветения
30,0
конец цветения
60,0
Размещение семянок подсолнечника, пораженных возбудителем сухой гнили, под лист обертки корзинки подсолнечника
бутонизация
16,7
начало цветения
48,0
конец цветения
72,7
Опрыскивание корзинки подсолнечника водной суспензией патогена «сухая гниль» с концентрацией 5×10<sup>3</sup> спор/мл
бутонизация
25,0
начало цветения
76,0
конец цветения
95,0
Инокулировали корзинки испытуемых сортов подсолнечника в утренние часы путем опрыскивания лицевой поверхности корзинки водной суспензией инокулюма. Опрыскивание патогенной суспензией осуществляли при помощи пульверизатора в количестве 4,5 мл инокулма на лицевую сторону корзинки. В качестве контроля корзинки подсолнечника «инокулировали» тем же способом, но вместо патогена использовали дистиллированную воду. На обработанное растение надевали пергаментный изолятор на трехдневный период. После трех суток изоляторы снимали и, если в опыте обнаруживали растения с полностью сгнившими корзинками, то их удаляли из опыта.
Определение устойчивости растений подсолнечника к сухой гнили корзинок осуществляли в фазу созревания. Для этого на изолированных участках различных сортов подсолнечника отбирали не менее 50 больных и здоровых корзинок.
Семена с отобранных корзинок обмолачивали в отдельный пакет, и изучали некоторые хозяйственно ценные признаки, а в лабораторных условиях определяли важнейший показатель качества растительного масла семян - кислотное число в соответствии с ГОСТом 10858-77 «Семена масличных культур. Промышленное сырье. Методы определения кислотного числа масла.» (см. таблицу 3).
Таблица 3
Результаты влияния сухой гнили на некоторые хозяйственно ценные признаки семян
Краснодар, ВНИИМК, 2006-2007 гг.
Происхождение
Вариант
Масса 1000 семянок, г
Масличность абс. сухих семянок, %
Кислотное число масла, мг КОН
Альбатрос
Здоровые
94,3
47,3
0,8
Больные
65,6
40,4
6,9
НСР<sub>05</sub>
3,99
1,42
0,45
Лакомка
Здоровые
135,8
42,8
0,9
Больные
100,5
33,6
12,9
НСР<sub>05</sub>
3,87
2,72
0,43
СПК
Здоровые
134,5
40,8
0,7
больные
88,4
38,8
4,9
НСР<sub>05</sub>
4,06
2,26
0,17
Исследования показали, что при поражении корзинок грибами рода Rhizopus Ehrenb. масса 1000 семянок снижается в среднем по сортам на 30%, незначительно уменьшается масличность - 2-8%, а кислотное число в зависимости от сорта возрастает от 4,9 мг КОН у сорта СПК до 12,9 мг КОН у сорта Лакомка.
Кислотное число - условная величина, выраженная в мг КОН, необходимых для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г масла. Для анализа брали 50 г очищенных семян подсолнечника, размалывали на мельнице в течение 15 с. Навеску семян помещали в колбу и заливали 200 мл диэтилового эфира. Колбу закрывали корковой пробкой и выдерживали в течение 2 ч при комнатной температуре, периодически встряхивая. По истечении 2 ч смесь фильтровали. Автоматической пипеткой отбирали по 25 мл фильтрата в две конические колбы для титрования и добавляли по 15 мл этилового спирта, предварительно нейтрализовалного 0,1 н. раствором щелочи в присутствии фенолфталеина. Смесь титровали 0,1 н. раствором едкого калия или едкого натра в присутствии фенолфталеина до слабо-розовой окраски. Одновременно отбирали еще по 25 мл фильтрата в две предварительно высушенные и взвешенные до сотых долей грамма колбы, отгоняли эфир под тягой на водяной бане и высушивали масло в сушильном шкафу при температуре 90-95°С до постоянной массы. Затем колбу с высушенным маслом взвешивали до сотых долей грамма и определяли массу масла в 25 мл фильтрата, взятого для титрования, по разнице массы колбы с высушенным маслом и пустой колбы.
Кислотное число масла в семенах подсолнечника в миллиграммах КОН вычисляли по формуле:
X=V×K×5,611:m,
где V - объем 0,1 н. раствора щелочи, израсходованного при титровании, мл;
К - поправка к титру 0,1 н. раствора щелочи;
m - масса высушенного масла, г;
5,611 - постоянная величина, являющаяся: при использовании КОН его расчетной массой в 1 мл 0,1 н. раствора КОН, а при использовании NaOH - расчетной массой NaOH в 1 мл 0,1 н. раствора NaOH (равной 4,0), умноженной на 1,4 (отношение молекулярных масс КОН и NaOH). За результат определения кислотного числа масла принимали среднее арифметическое результатов двух параллельных титрований, расхождение между которыми не превышает 0,1 мг КОН.
Этот показатель сравнивали с показателем кислотного числа семян, полученных с контрольных (не заражаемых) растений. Проводили дифференциацию устойчивости, относя к устойчивым те растения, у которых кислотное число масла семян выше на 0-10%, к среднеустойчивым - на 11-15%, к восприимчивым - на 16-40%, к сильно восприимчивым - 41% и выше, чем кислотное число масла семян растений данной формы подсолнечника, не подвергавшихся инокуляции.
Семена с отобранных устойчивых растений высевали на следующий год, получали от них здоровое потомство и вовлекали в последующий селекционный процесс по методу B.C.Пустовойта.
Семидневный возраст чистой культуры гриба сухой гнили обеспечивает ему максимальную патогенную силу, необходимую для эффективного искусственного заражения корзинок подсолнечника и выявления в дальнейшем устойчивых его форм.
Использование инокулюма в виде «водной суспензии чистой культуры гриба» обеспечивает простоту и легкость нанесения патогена на корзинку и благоприятные условия для его развития, так как в суспензии присутствует вода - один из необходимых факторов для развития патогена, то есть обеспечивает надежность заражения корзинки, а следовательно, повышает точность определения устойчивости.
3
3
3
Используемая концентрация инокулюма 5×10 спор/мл водной суспензии в количестве 4-5 мл является оптимальной инфекционной нагрузкой и обеспечивает необходимое и достаточное количество спор гриба сухой гнили для достоверного заражения корзинки. Концентрация менее 5×10 спор/мл может не обеспечить достоверного заражения, а более 5×10 спор/мл не будет соответствовать количественному уровню действия патогена в естественных условиях и приведет к искажению оценки.
Инокуляция корзинок путем опрыскивания их водной суспензией чистой культуры гриба сухой гнили не требует больших трудозатрат, т.е. делает способ простым.
Операция надевания изоляторов на корзинки после их инокуляции обеспечивает надежные и одинаковые условия «работы» патогена для всех инокулированных корзинок подсолнечника, т.е. обеспечивает достоверность заявляемого способа.
Проведение инокуляции корзинки в фазу «конец цветения» и оценки иммунологической реакции растения в фазу «созревания корзинки» обеспечивает приближение заражения и оценки к естественных условиям, что делает заявляемый способ точным и простым.
Оценка устойчивости по качественному (биохимическому) признаку - кислотному числу масла - обеспечивает высокую точность оценки.
В целом вся совокупность существенных признаков заявляемого изобретения обеспечивает оптимальные условия заражения корзинок сухой гнилью, приближая их к естественным, и надежную оценку иммунологической реакции растения на этот патоген для простого, удобного и достоверного выявления устойчивых к сухой гнили форм, т.е. обеспечивает достижение поставленной цели и решение поставленной задачи.