Экспрессный способ определения афлатоксинов В1, b2, G1, g2 в зерне и кормах

К.П. Юров, С.В. Алексеенкова, М.Г. Савкова

3. Burrows R., Goodridge D. In vivo and in vitro studies of equine rhinopneumonitis virus strains / In Proceedings of the Third International Conference on Equine Infectious Diseases (edited by J.T. Bryans &

H. Gerber. — Basel: S. Karger, 1973.

4. Crabb B.B., Studdert M.J. Epitopes of glycoprotein G of equine herpesviruses 4 and 1 located near the C termini elicit type-specific antibody responses in the natural host // Journal of Virology, 1993; 67 (10): 6332-6338.

5. Dimock W.W., Edwards P.R. Is there a filterable virus of abortion in mares? // Kentucky Agricultural Experiment Station Bulletin, 1933; 33: 297-30I.

6. Greenwood R.E. Equine rhinopneumonitis outbreak in Newmarket // Veterinary Research, 1979; 104 (23): 534-535.

7. Nugent J., Birch-Machin I., Smith K.C., Mumford J.A., Swann Z., Newton J.R., Bowden R.J., Allen G.P., Davis-Poynter N. Analysis of Equid Herpesvirus 1 Strain Variation Reveals a Point Mutation of the DNA Polymerase Strongly Associated with Neuropatho-genic versus Nonneuropathogenic Disease Outbreaks // Journal of Virology, 2006; 80 (8): 4047-4060.

8. Randall C.C., Ryden F.W., Doll E.R. and Schell F.S. Cultivation of equine abortion virus in fetal horse tissue in vitro // American Journal of Pathology, I953; 29: I39-I53.

9. Studdert M.J., Fitzpatrick D.R., Horner G.W., Westbury H.A., Glee-son L.J. Molecular epidemiology and pathogenesis of some equine herpesvirus type 1 (equine abortion virus) and type 4 (equine rhinopneumonitis virus) isolates // Australian Veterinary Journal, 1984; 61 (11): 345-348.

Summary

K.P. Yurov., S.V. Alexeyenkova, M.G. Savkova. Control of EHV-1 and EHV-4 Infections Due Horses Export. Some probes of sera from breeding horses out of different districts of the Trans-Baikal region were tested with purpose to reveal antibodies to equine rhinopneumonitis virus in NT and gG (Ab) ELISA due the horses export to Mongolia. Antibodies in diagnostic titer to respiratory EHV-4 were dominated in most probes. The obtained results allow to eliminate the restrictive measures necessary for EHV-1 on export of these horses.

УДК 619:615.9: 616-076

Экспрессный способ определения афлатоксинов В1, B2, G1, G2 в зерне и кормах

В.Г. Амелин, доктор химических наук, Т.Б. Никешина, кандидат биологических наук, Н.М. Карасева, аспирант Федеральный центр охраны здоровья животных (Владимир).

Ключевые слова: афлатоксины В1, В2, G1, G2, ВЭЖХ, дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция, зерно, корма, QuEChERS Сокращения: ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография, ДЖЖМЭ — дисперсионная жидкостно-жидкостная микроэкстракция, ПДК— предельно допустимая концентрация, QuEChERS— Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe

Введение

Актуальность проблемы загрязнения зерновых кормов и комбикормов микотоксинами, а также заболевание животных и птицы микотоксикозами на сегодняшний день общеизвестна. Среди микотоксинов наиболее широко распространены афлатоксины В1, В2, G1, G2, продуцируемые микроскопическими грибами Aspergillus flavus и Aspergillus раrasiticus [6].

Предложено большое число методик определения афлатоксинов посредством ВЭЖХ с флуориметри-ческим детектором [4...8]. Для очистки экстрактов

в данных случаях применяют иммуноаффинные колонки [4, 8].

В последнее время для извлечения афлатоксинов стали использовать методы QuEChERS [4] и ДЖЖМЭ [5]. Метод QuEChERS основан на растворении пробы в водном ацетонитриле и добавлении органических солей, которые являются буферирующими смесями и высаливателями. Полученный экстракт очищают на насыпном сорбенте, что позволяет удалить оставшиеся примеси (жирные кислоты, жиры и сахара).

Суть метода ДЖЖМЭ заключается в использовании системы растворителей: диспергатор, экстрагент, вода (водный раствор). При выборе растворителей важно, чтобы диспергатор неограниченно растворялся в воде, а экстрагент, наоборот, не растворялся в ней. Смесь диспергатора и экстрагента вводят в воду, после чего экстрагент выделяется в виде микрочастиц отдельной фазы, концентрирующей аналиты. Оба эти способа появились сравнительно недавно, однако уже имеют широкую популярность в области исследования микотоксинов.

В настоящее время в РФ афлатоксины определяют согласно ГОСТ Р 53162-2008 [1]. Методика заключается в экстракции проб смесью ацетонитрил/вода/ метанол и очистке экстракта с использованием имму-ноаффинных колонок. Недостатки данной методики — длительность анализа (около 3 ч), а также высокая себестоимость из-за использования коммерческих колонок и большого количества токсичных органических растворителей.

Цель исследования

Разработать более дешевую экспресс-методику определения афлатоксинов в зерне и кормах.

Материалы и методы

Аппаратура. В работе использовали жидкостной хроматограф Flexar LC («Perkin-Elmer», США); колонку Kromasil 100-5 С18, 5|xm, 4,6 х 150 мм; флуо-риметрический детектор («Perkin-Elmer», США): длины волн возбуждения и детектирования 340 нм и 450 нм, соответственно, объем пробы 10 мкл; градиентное элюирование: скорость потока (мл/мин) 0,7...1,1; подвижная фаза — ацетонитрил/вода (от 0 до 11 мин 30/70; от 12 до 25 мин 35/65); центрифугу ОПН-ЗМ («DASTAN», Россия), аналитическую мельницу («IKA Werke», Германия).

Реактивы и материалы. Стандартная смесь афлатоксинов в ацетонитриле (TS-108, «Trilogy Analytical Laboratory», США): В1, G1 (2,0 мкг/мл), В2, G2 (0,50 мкг/мл).

Использовали ацетонитрил для хроматографии («Merck», Германия), дихлорметан 99,9 % («Carl Roth GmbH», Германия), бромбензол, MgSO4 х.ч., натрий цитрат тризамещенный двойной гидрат (Na3C6H5O7 • 2H2O) х.ч., натрий цитрат двузамещенный полуторный гидрат (Na2HC6H5O7 . 1,5H2O) х.ч., сорбенты Bon-desil-PSA, Discovery DSC-18 («Supelco», США).

Российские стандартные образцы кукурузы (ОСО 10-141-2007), люпина (ОСО 10-153-2008), овса (ОСО 10-124-2007), пшеницы (ОСО 10-147-2007), соломы (ОСО 10-139-2006), шрота подсолнечного (ОСО 10-1482007) и ячменя (ОСО 10-143-2007). Стандартный образец пшеницы (BCR-471) («IRMM», Бельгия).

Пробоподготовка QuEChERS. Пробу (не менее 100 г) измельчали, отбирали 2,0 г в центрифужную пробирку на 50 мл, добавляли 10 мл ацетонитрила и 10 мл воды, интенсивно встряхивали 5 мин. Добавляли 4,0 г MgSO4, 1,0 г NaCl, 1,0 г Na3C6H5O7 . 2H2O и 0,5 г Na2HC6H5O7 . 1,5H2O. Экстракт с солями интенсивно встряхивали 1.2 мин и центрифугировали 5 мин при 1500 мин-1. Полученный экстракт объемом 8 мл переносили в центрифужную пробирку, содержащую

0,9 г MgSO4, 0,2 г сорбента BondeSil PSA и 0,2 г сорбента DSC-18, интенсивно встряхивали и центрифугировали 5 мин при 2700 мин-1. Отбирали 2 мл экстракта для ДЖЖМЭ.

ДЖЖМЭ. В центрифужную пробирку (на 15 мл) вносили 5 мл дистиллированной воды и затем с помощью шприца — смесь из ацетонитрильного экстракта пробы (2 мл) и хлороформа (300 мкл). Встря-

хивали 20...30 с и центрифугировали в течение 10 мин при 2700 мин-1, отбирали нижний слой экстракта в микрофлакон, упаривали досуха в токе азота, остаток растворяли в 50 мкл 0,3%-го раствора йода в метаноле, перемешивали, выдерживали 5 мин при комнатной температуре в темноте и хроматографировали.

Результаты и обсуждение

Оптимизация условий ДЖЖМЭ. Микроэкстракция является одним из наиболее важных этапов во время пробоподготовки при извлечении афлатокси-нов. Для получения наилучших результатов экспериментально были подобраны условия проведения ДЖЖМЭ.

Выбор диспергатора и его объема. В качестве диспергатора использовали очищенный ацето-нитрильный экстракт, полученный после стадии QuEChERS. Объем диспергатора варьировали от 1 до 3 мл при постоянном объеме экстрагента (200 мкл). Установлено, что с увеличением объема диспергатора площади хроматографических пиков увеличиваются (рис. 1). Наибольшее их значение наблюдали при использовании 3 мл ацето-нитрильного экстракта. Но органическая фаза, полученная в данном случае в ходе микроэкстракции, находилась вверху раствора, что затрудняет ее отбор. При использовании 2 мл диспергатора таких трудностей не возникает, поэтому данный объем выбран оптимальным.

300

12 3

Объем, диспергатора, мл Рис. 1. Площади хроматографических пиков афлатоксинов при различных объемах диспергатора

120

СНС13 СН2С12 С6Н5Вг

Экстрагент

Рис. 2. Площади хроматографических пиков афлатоксинов при использовании различных экстрагентов

РВЖ • СХЖ • № 3/2013

В.Г. Амелин, Т.Б. Никешина, Н.М. Карасева

Выбор экстрагента и его объема. В качестве экстрагентов использовали хлороформ, бромбензол и дихлорметан (рис. 2). Установлено, что применение данных растворителей позволяет извлекать афлаток-сины из экстракта примерно на одном и том же уровне. Однако только при использовании хлороформа слой органической фазы после ДЖЖМЭ образуется внизу раствора, что упрощает ее отбор. Поэтому данный растворитель выбрали в качестве экстрагента. Его объем варьировали от 200 до 300 мкл. Наибольшие значения площадей хроматографических пиков афлатоксинов были получены при использовании 300 мкл хлороформа.

Выбор условий дериватизации афлатоксинов. Для более чувствительного определения афлатоксины В1, G1, В2, G2 переводили в йод-производные. Наибольшие значения площадей хроматографических пиков получены при проведении дериватизации после ДЖЖМЭ, путем растворения сухого остатка экстракта в 50 мкл 0,3%-го раствора йода.

Определение афлатоксинов в кормах и зерне. Совместное применение метода QuEChERS и микроэкстракции является улучшенным способом извлечения афлатоксинов, благодаря которому удалось дополнительно очистить экстракт и повысить эффективность определения микотоксинов, чего нельзя добиться при использовании данных методов по отдельности. По сравнению с методом, закрепленным в ГОСТ [1], продолжительность анализа по предложенной нами методике сокращается в 1,5_2 раза, что является явным преимуще-

ством. Кроме того, наш способ позволяет заменить дорогостоящие иммуноаффинные колонки для очистки экстрактов на малые количества сорбентов и растворителей для твердофазовой экстракции и ДЖЖМЭ, благодаря чему снижается себестоимость анализа.

По разработанной методике проанализированы три образца фуражного зерна (пшеница, ячмень, ку-

куруза) и пяти видов кормов (премикс, комбикорм, жмых соевый, кормовая смесь, шрот рапсовый). Установлены пределы обнаружения (по соотношению сигнал/шум = 3) афлатоксинов, мкг/кг: В1 — 0,1, G1 — 0,1; В2 — 0,08, G2 — 0,08 и пределы определения (по соотношению сигнал/шум = 10), мкг/кг: В1 — 0,3, G1 — 0,3, В2 — 0,25, G2 — 0,25. Степень извлечения добавок микотоксинов из анализируемых образцов составила от 50 до 75 % (табл. 1). Относительное стандартное отклонение результатов анализа не превышает 0,1. Продолжительность анализа — 1_1,5 ч.

Афлатоксины присутствуют практически во всех исследуемых образцах (табл. 2). В качестве примера приведена хроматограмма экстракта пре-микса (рис. 3). Концентрации афлатокснов в исследуемых образцах не превышают максимально допустимых уровней, установленных в РФ [2, 3] (см. табл. 1).

Рис. 3. Хроматограмма экстракта премикса

Выводы

Разработан простой и быстрый способ определения афлатоксинов В1, G1, В2, G2 в зерне и кормах. Сочетание QuEChERS и ДЖЖМЭ позволило сократить время анализа, упростить и удешевить методику извлечения и определения микотоксинов.

1. Аналитические характеристики методики определения афлатоксинов В1, 01, В2, 02

Токсин ів, мин (п=3) Диапазон линейности градуировочного графика, мкг/мл Предел обнаружения, мкг/кг Предел определения, мкг/кг Степень извлечения, % ПДК для зерна, мкг/кг ПДК для кормов, мкг/кг

В1 18,95 0,004...0,04 0,1 0,3 5 7 2 7 5 50

G1 16,01 0,004...0,04 0,1 0,3 4 7 0 7 н/н* н/н*

В2 10,10 0,001.0,01 0,08 0,25 8 5 2 5 н/н* н/н*

G2 7,80 0,001.0,01 0,08 0,25 5 5 51 н/н* н/н*

Примечание: *— не нормируется

2. Определение афлатоксинов В1, 01, В2, 02 в зерновых культурах и кормах

Концентрация микотоксинов в образце, мкг/кг

Токсин Ячмень фуражная Пшеница фуражная Кукуруза фуражная Шрот рапсовый Жмых соевый Премикс Кормовая смесь Комбикорм

В1 -* - - - 0,20±0,4 5,8±0,03 - 15,0±0,02

G1 - - 0,23±0,04 17,0±0,03 0,40±0,03 - - -

В2 0,20±0,01 - 0,21±0,03 - - - - -

G2 - - - 0,60±0,03 - - - -

Примечание: *— не нормируется

Библиография

1. ГОСТР 53162-2008. Продукты пищевые. Определение аф-латоксина B1 и общего содержания афлатоксинов B1, B2, G1 и G2 в зерновых культурах, орехах и продуктах их переработки. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. — М.: Стандар-тинформ, 2009.

2. Максимально допустимые уровни (МДУ) микотоксинов в кормах для сельскохозяйственных животных, утвержденные ГУВ Минсельхоза СССР N 434-7 от 01.02.89.

3. СанПиН 2.3.2.1078-01. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов санитарно-эпидемиологические правила и нормы. — М.: Академия, 2002.

4. Brera C., Debegnach F., Minardi V., Pannunzi Е., De Santis B., Miraglia М., Lombardi F.M.P. Immunoaffinity Column Cleanup with Liquid Chromatography for Determination of Aflatoxin B1 in Corn Samples: Interlaboratory Study // J. AOAC Int., 2007; 90 (3): 765-772.

Summary

V.G. Amelin, T.B. Nikeshina, N.M. Karaseva. Rapid Method for Detection of Aflatoxins B1, B2, G1, G2 in Grains and Feeds. Rapid method for detection of aflatoxins B1, B2, G1, G2 in grains and feeds by HPLC with fluo-remetric detector was developed. The possibility of usage of rapid sample preparation with QuEChERS in conjunction with dispersive liquid-liquid microextraction for aflatoxin B1, B2, G1, G2 extraction and determination was demonstrated. The detection limits for aflatoxins B1, G1 and B2, G2 were 0,1 Mg/kg and 0,08 Mg/kg, respectively. The analysis duration was 1...1,5 h.

УДК 619: 616.98: 616-078

Применение иммунохроматографического анализа для серодиагностики бруцеллеза крупного рогатого скота

Д.В. Сотников, Н.А. Бызова, Н.П. Староверова, А.В. Жердев, кандидат биологических наук,

Б.Б. Дзантиев, доктор химических наук Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН (Москва).

Ключевые слова: бруцеллез, иммунохроматография, крупный рогатый скот, липополисахарид, серодиагностика

Сокращения: БСА — бычий сывороточный альбумин, ИФА — иммуноферментный анализ, ИХА — иммунохроматографический анализ, КРС — крупный рогатый скот, ЛПС — липополисахарид, ПЦР — полимеразная цепная реакция

Введение

Бруцеллез является опасным заболеванием, которое наносит значительный экономический ущерб и приводит к негативным социальным последствиям. Наиболее широко бруцеллез распространен в странах Средиземноморья, Малой Азии, Африки, Центральной и Южной Америки [4], весьма неблагоприятна

ситуация по данной инфекции в России и странах СНГ [6, 8].

Одно из основных направлений в борьбе с бруцеллезом — своевременное выявление очагов инфекции. Эффективность выявления основана на достоверной, оперативной и информативной лабораторной диагностике заболевания.

Традиционно для выявления бруцеллеза используют различные методы: бактериологический, ПЦР, имму-ноаналитические, в том числе серологические анализы (выявление специфических антител против бактериальных антигенов) и др. [7]. Однако для подавляющего большинства методов характерна большая продолжительность (от нескольких часов до суток), требуется специальное оборудование и квалифицированный персонал. Развитие диагностики в последние годы показало, что

5. Campone L., Piccinelli A.L., Celano R., Rastrelli L. Application of dispersive liquid-liquid microextraction for the determination of aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in cereal products // J. Chromatogr. A., 2011; 1218: 7648-7654.

6. Guevara-Gonzalez R.G. Aflatoxins. Biochemistry and molecular biology. — Croatia: InTech, 2011.

7. Sirhan A., Tan G.H, Wong R.C.S. Method validation in the determination of aflatoxins in noodle samples using the QuEChERS method (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) and high performance liquid chromatography coupled to a fluorescence detector (HPLC-FLD) // Food Control., 2011; 22 (12): 1801-1813.

8. Trucksess M.W., Stack M. E., Nesheim S., Page S.W., Albert R., Hansen T.J., Donahue K.F. Immunoaffinity column coupled with solution fluorometry or liquid chromatography postcolumn derivatization for determination of aflatoxins in corn, peanuts, and peanut butter: collaborative study // J. AOAC Int., 1991; 74 (1): 81-88.

РВЖ • СХЖ • № 3/2013