СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ РАСТЕНИЙ ВИНОГРАДА В КОЛЛЕКЦИИ IN VITRO
METHOD FOR CULTIVATION OF GRAPE PLANTS IN THE IN VITRO COLLECTION

Изобретение относится к области биотехнологии растений и сельского хозяйства, в частности к сохранению генофонда вегетативно размножаемых растений.
В настоящее время актуальна проблема сохранения генофонда растений как дикорастущих видов, так и культурных растений, представляющих ценный материал для селекционной работы. Для этого широко используются методы биотехнологии, такие как микроклональное размножение in vitro, эмбриокультура, сохранение коллекций в условиях in vitro, криосохранение.
В последние десятилетия во многих странах возрос интерес к биотехнологическим коллекциям растительных объектов, прежде всего редких и исчезающих видов растений, а также видов, для которых традиционные методы сохранения неэффективны.
В практике создания, поддержания и использования биотехнологических коллекций существуют следующие основные направления: сохранение генетических ресурсов в пересадочных коллекциях (растения in vitro, культуры органов и клеток); депонирование растительных объектов при пониженных температурах и хранение растительных объектов в криобанках. Недостатком пересадочных коллекций in vitro является необходимость частых пересадок образцов, что повышает риск повторного инфицирования, нарушения генетической стабильности, приводит к дополнительным расходам материалов, реактивов и людских ресурсов. Создание условий надежного сохранения коллекций, способствующих замедлению ростовых процессов растений, может существенно повысить эффективность поддержания подобных коллекций.
Целью изобретения является повышение эффективности длительного сохранения in vitro микрорастений винограда при пониженной положительной температуре 2-4°С, без пересадок в течение одного года и более.
Изобретение может быть использовано в виноградарстве, для поддержания и сохранения ценного генетического материала в вегетирующей коллекции, может быть источником первичного оздоровленного посадочного материала для массового производства саженцев категории оригинальный в целях закладки элитных (базисных) маточников. Поддержание в условиях in vitro коллекции ценных сортов и перспективных клонов винограда позволяет постоянно иметь первичный оздоровленный материал и в нужный момент приступить к процедуре ускоренного размножения. При предлагаемом способе культивирования коллекция будет занимать небольшое пространство, обходиться минимальными концентрациями минеральных веществ и нуждаться в редких пересадках растительного материала.
Аналог 1. Известен «Способ длительного хранения in vitro микрорастений березы» (патент на изобретение № 2634409, РФ), включающий культивирование микропобегов на питательной среде ½MS без гормонов с повышенным содержанием аскорбиновой кислоты 2,0 мг/л, с добавлением агар-агара 6 г/л при хранении пробирочных растений при температуре 4-7°С в темноте.
Общим с заявленным способом является подход к условиям сохранения при температуре 4°С в темноте. Отличием от заявленного способа является объект сохранения - береза, среда культивирования, также отсутствие поэтапной адаптации от активного роста к состоянию глубокого покоя. Возможность использования данного способа для растений винограда не описана.
Аналог 2. Известен «Способ длительного сохранения in vitro растений винограда» (патент на изобретение № 2110172, РФ), который предполагает в качестве ингибитора роста растений вносить в среду тонкоразмолотые семена винограда в концентрации, в об.%: 1,0-2,0.
Недостатком данного способа является короткий период между пересадками (четыре месяца).
Заявляемый способ предполагает увеличение периода между пересадками до 1-2 лет.
Прототип. Наиболее близким к заявляемому способу является «Способ размножения винограда» (а.с. № 1695853, СССР) который заключается в том, что для последнего пассажа используется модифицированная обедненная среда, и укорененные на такой среде растения доращивают при 8-часовом фотопериоде до вызревания не менее одного узла побега.
Общим является технологическое решение, заключающееся в стимулировании одревеснения лозы, на основе изменения показателей факторов культивирования. Прототип основан на изменении факторов: среды культивирования (обедненная макро- и микроэлементами) и фотопериода.
В прототипе не указывается период и условия сохранения полученных растений. Проведенные нами исследования, показали нецелесообразность использования обедненных сред для сохранения вегетирующих коллекций, т.к. вследствие недостатка питательных веществ формируются слабые растения.
Заявленный способ предполагает: культивирование на безгормональной среде без пересадок на всем продолжении цикла сохранения, которое осуществляется как в условиях активного роста, так и в состоянии глубокого покоя; для перехода растений в состояние глубокого покоя используется климатическая камера, где на основе изменения показателей двух факторов: фотопериода, температуры, при неизменном освещение и влажности моделируются условия культивирования, что позволяет в дальнейшем успешно сохранять растения в условиях низких положительных температур (2-4°С) в темноте без пересадок в течение одного и более лет.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является повышение эффективности длительного сохранения in vitro микрорастений винограда при пониженной положительной температуре 2-4°С, без пересадок в течение одного года и более.
Поставленный технический результат достигается за счет перехода растений в состояние глубокого покоя в моделируемых условиях климатической камеры на основе изменения показателей двух факторов: фотопериода, температуры, что позволяет в дальнейшем успешно сохранять растения в условиях низких положительных температур в темноте без пересадок в течение одного года и более.
Изобретение представляет собой способ беспересадочного (свыше одного года) сохранения микрорастений (пробирочных растений) винограда в условиях in vitro, что позволяет уменьшить затраты труда и времени, сэкономить расходы на реактивы.
2
2
Сущность патента заключается в том, что растения в вегетирующей коллекции культивируют поэтапно в разных режимах и в разных физиологических состояниях: 1 - период активного роста в световой комнате при 16-часовом фотопериоде интенсивностью 1500 кд⋅ср/м и температуре 27°С; 2 - переходный период из состояния активного роста в состояние глубокого покоя (моделируется в климатической камере); 3 - сохранение в состоянии глубокого покоя при 2-4°С. Для моделирования условий переходного периода перевода растений в состояние глубокого покоя (освещение, температура, влажность, фотопериод) используется климатическая камера Binder KBWF 240, с микропроцессорным управлением с цветным жидкокристаллическим дисплеем. Программируемый контроллер МВ1 позволяет управлять следующими параметрами внутри климатической камеры: температура (изменяется от минус 5°С (без влажности) до 100°С); относительная влажность в %:10-90. Устанавливаемые значения отображаются на дисплее при программировании. Одновременно на дисплее отображаются действительные значения контролируемых параметров в камере. Культивирование растений происходит при постепенном изменении фотопериода от 22/2 часов до 12/12 часов, волновом изменении температуры от 27°С/27°С до 20°С/5°С, дневной освещенности 2000 кд⋅ср/м и постоянной влажности 30% в климатической камере в течение 264 часов; Данный режим культивирования позволяет создать условия для постепенного перехода от активного роста побегов к резкому снижению скорости роста и интенсивности обмена веществ, что положительно влияет на длительное пребывание растений в состоянии глубокого покоя. Глубокий покой связывают с закаливанием растений, поэтому культивирование в данном режиме приводит к частичному одревеснению побега и осенней окраске листа. Затем растения сохраняют в состоянии глубокого покоя в беспересадочном режиме при 2°-4°С в темноте в течение одного года и более.
Новым в предложенном способе является то, что растения культивируют в разных условиях и в разных физиологических состояниях, перевод растений в состояние глубокого покоя происходит в моделируемых условиях на основе изменения показателей двух факторов: фотопериода и температуры, при постоянных освещении и влажности. Затем сохранение растений осуществляется при низких положительных температурах в темноте.
Способ состоит из 3-х этапов и осуществляется следующим образом.
4
3
3
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
3
3
4
2
2
4
2
4
2
2
2
2
Первый этап культивирования. В условиях ламинарного бокса растения in vitro черенкуют на одно-двуглазковые экспланты, пересаживают в культуральные сосуды с питательной средой. Культивируют на безгормональной среде Н3[19] следующего состава (в мг/л): NHNO 308; KNO 922; MgSO⋅7HO 597; НРО 122; CaCl 331; FeSO⋅7HO 28; Na ЭДТА⋅НО 37; MnSO⋅4HO 22,3; HBO 6,2; ZnSO⋅7НО 8,6; NaMoO⋅2HO 0,25; CuSO⋅5HO 0,025; CoCl⋅6HO 0,025; KJ 0,83; мезо-инозит 20; никотиновая кислота 0,5; пиридоксина-HCl 0,2; сахароза 15000; гумат Na 30; рН 5,7. Культивирование растений осуществляют в световой комнате при 16 - часовом фотопериоде, освещенности интенсивностью 1500 кд⋅ср/м и температуре 27°С в течение трех-четырех недель.
2
Второй этап переходный. Переход в состояние глубокого покоя. Растения помещают в климатическую камеру, культивируют в моделируемых условиях, 264 часа. Рекомендуется следующий порядок культивирования растений винограда в режиме адаптации к условиям глубокого покоя, который заключается в постепенном изменении фотопериода от 22/2 часов до 12/12 часов, волновом изменении температуры от 27°С/27°С до 20°С/5°С, дневной освещенности 2000 кд⋅ср/м и постоянной влажности 30% в климатической камере в течение 264 часов (Табл. 1, 2).
Третий этап. Сохранение растений в состоянии глубокого покоя в темноте при низких положительных температурах. После закаливания сосуды с растениями помещают в бытовой холодильник и культивируют при температуре 2-4°С в течение года и более.
Предложенный способ позволяет без применения ингибиторов роста, на основе моделирования условий для ускоренного перехода к состоянию покоя подготовить образцы к длительному хранению в темноте при низких положительных температурах (Фиг. 1). Пересадки в течение всего периода не предполагаются. Жизнеспособность растений после сохранения оценивается по регенерирующей способности почки. Использование предлагаемого режима культивирования позволяет удлинить интервал между пересадками (до одного года и более), минимизировать появление аномальных растений и сомаклональной изменчивости, что обеспечит при необходимости получение качественного посадочного материала с сохранением у него хозяйственно ценных признаков и генетической идентичности.
Пример применения способа культивирования растений винограда в коллекции in vitro испытан на 34 образцах двух сортов: Спартанец Магарача и Антей магарачский.
4
3
3
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
3
3
4
2
2
4
2
4
2
2
2
2
На первом этапе, экспланты побегов растений винограда двух сортов Антей магарачский и Спартанец Магарача в стерильных условиях высажены на безгормональную среду, содержащую в мг/л: NHNO 308; KNO 922; MgSO⋅7HO 597; HPO 122; CaCl 331; FeSO⋅7HO 28; Na ЭДТА⋅НО 37; MnSO⋅4НО 22,3; HBO 6,2; ZnSO⋅7НО 8,6; NaMoO⋅2HO 0,25; CuSO⋅5HO 0,025; CoCl⋅6НО 0,025; KJ 0,83; мезо-инозит 20; никотиновая кислота 0,5; пиридоксина-HCl 0,2; сахароза 15000; гумат Na 30; рН 5,7. В каждый культуральный сосуд помещали по 4-5 эксплантов. Культивируют на свету при 16-часовом фотопериоде, освещенности интенсивностью 1500 кд⋅ср/м и температуре 27°С в течение трех-четырех недель.
2
На втором этапе, на дисплее климатической камеры устанавливают режим, обеспечивающий плавный переход растений из состояния активного роста в состояние глубокого покоя. Сосуды с растениями помещают на полки камеры и культивируют в разработанном режиме в течение 264 часов. Глубокий покой связывают с закаливанием растений, поэтому культивирование в данном режиме приводит к частичному одревеснению побега и осенней окраске листа. Культивирование растений осуществляется на свету при 16-часовом фотопериоде, освещенности интенсивностью 1500 кд⋅ср/м и температуре 27°С в течение трех-четырех недель. Одна партия сосудов с растениями обоих сортов закладывалась на сохранение непосредственно после культивирования в световой комнате. Другую партию сосудов с растениями поместили в климатическую камеру (Таб. 1, 2).
2
Растения культивировали в заданном режиме при постепенном изменении фотопериода от 22/2 часов до 12/12 часов, волновом изменении температуры от 27°С/27°С до 20°С/5°С, дневной освещенности 2000 кд⋅ср/м и постоянной влажности 30% в климатической камере в течение 264 часов.
На третьем этапе, после климатической камеры сосуды с растениями закладывали в бытовой холодильник при 2-4°С и сохраняли в течение года в темноте.
После периода сохранения растения сорта Антей магарачский по внешним признакам были более жизнеспособными, чем растения сорта Спартанец Магарача. У значительной части растений этого сорта частично или полностью сохранились зеленые листья (Табл. 3).
О жизнеспособности растений после периода сохранения судили по регенерирующей способности почки. Регенерирующая способность почки при трех этапном режиме была культивирования существенно выше по сравнению с двух этапным способом культивирования коллекции без использования климатической камеры.