iPHK-ОПОСРЕДОВАННОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ СВЯЗАННЫХ С ФАКТОРОМ НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА СОСТОЯНИЙ
iRNA-MEDIATED INHIBITION OF TUMOUR NECROSIS FACTOR-( RELATED CONDITIONS

Родственные заявки
Представленная заявка претендует на приоритет по совместно поданной предварительной патентной заявке США, серийный номер 60/801788, поданной 19 мая 2006 г., озаглавленной «iРНК-опосредованное ингибирование связанных с фактором некроза опухоли α состояний», текст которой включен в настоящее описание в виде ссылки.
Область изобретения
Представленное изобретение относится к области композиций интерферирующей РНК для подавления фактора некроза опухоли α (TNF-α) путем подавления мРНК рецептора TNF-α на поверхности клеток (Рецептора-1 TNF, или TNFR1), или мРНК TNF-α-превращающего фермента (NFCT/ADAM17). Подавление таких мишеней TNF-α полезно при лечении пациентов, имеющих связанное с TNF-α состояние или имеющих риск развития подобного состояния.
Область техники
Лечение воспалений обычно проводят с использованием стандартных противовоспалительных режимов, включая лечение стероидами и/или нестероидными противовоспалительными препаратами (NSAIDS). Аллергические конъюктивиты, воспаление глаза, дерматиты, риниты и астма исторически подвергались лечению с использованием режимов орального, интраназального или наружного применения антигистаминов в дополнение к оральному или интраназальному применению стероидов. Системное лечение обычно требует введения более высоких концентраций лекарственного соединения для того, чтобы эффективная концентрация достигла необходимого участка лечения. Известно, что антигистаминные препараты воздействуют на центральную нервную систему; сонливость и сухость слизистых оболочек являются обычным побочным эффектом применения антигистаминов. Стероиды и NSAIDS имеют потенциальные побочные эффекты, включая увеличение внутриглазного давления, катаракту, глаукому или расплавление роговицы.
Сухость глаз, также известная как сухой кератоконъюктивит, является распространенным офтальмологическим расстройством, вовлекающим распад слезной пленки на глазу, приводящий к дегидратации обнаженной внешней поверхности глаза. На сегодняшний день лечение сухости глаз проводится путем наружного применения синтетических растворов слез. Некоторые из этих растворов содержат слизеподобные вещества для временной замены или восполнения муцинового слоя у пациентов с дефицитом муцина. Для кратковременного «импульсного» лечения обострений сухости глаз было предложено применение метилпреднизолона. Предложенная «импульсная» терапия требуется для того, чтобы избегнуть осложнений, связанных с традиционной терапией воспалительных состояний стероидами, таких как увеличенное внутриглазное давление и образование катаракты.
Цитокин TNF-α является мишенью противовоспалительной терапии сухости глаз и увеитов. В модели сухости глаз, вызванной воспалением слезной железы на кролике, ингибирование окрашивания роговицы и восстановление времени разрушения слезы достигалось путем специфической модуляции уровней TNF-α на поверхности глаза. Терапия сухости глаз производилась путем ингибирования синтеза TNF-α (RDP58) или путем специфической нейтрализации TNF-α с применением моноклональных антител (REMICADE) или растворимого рецептора (ENBREL). Каждый из этих направленных на TNF-α видов лечения приводил к изменению эффективности на несколько порядков при местном применении глазных противовоспалительных стероидов.
Патентная заявка США 2005/0227935, опубликованная 13 октября 2005 г., McSwiggen et al., относится к РНК-опосредованному ингибированию экспрессии генов TNF и рецептора TNF. Однако в упомянутой публикации не приводятся конкретные последовательности-мишени для РНК-интерференции, предложенные здесь.
Варианты осуществления представленного здесь изобретения связаны с удовлетворением потребностей в данной области в лекарственных средствах и методах лечения сухости глаз и воспалений, и предложен альтернативный вариант их лечения.
Сущность изобретения
В вариантах осуществления представленного изобретения предложен мощный и эффективный способ лечения, предотвращения или вмешательства в связанные с TNF-α состояния при отсутствии побочных эффектов, связанных со стероидами или NSAIDS. В одном аспекте способы согласно изобретению включают лечение субъекта, имеющего связанные с TNF-α состояния или риск возникновения связанного с TNF-α состояния путем назначения ему интерферирующей РНК, которая подавляет экспрессию мРНК TACE или мРНК TNFR1, таким образом препятствуя связыванию TNF-α с его рецептором на поверхности клеток, соответственно, таким образом, ослабляя действие TNF-α и предотвращая каскад событий, связанных с апоптозом и воспалением.
Состояния, связанные с TNF-α, включают такие состояния как сухость глаз и связанные с TNF-α воспалительные состояния. Связанные с TNF-α воспалительные состояния включают такие состояния как, например, глазные воспаления, аллергические конъюктивиты, дерматиты, риниты и астму, а также клеточные изменения, вызванные активностью TNF-α, которая прямо или косвенно приводит к связанным с TNF-α воспалительным состояниям. Связанные с TNF-α состояния, в частности, включают связанные с TNF-α глазные состояния, такие как сухость глаз, аллергический конъюктивит и глазные воспаления. Предложенная здесь интерферирующая РНК осуществляет подавление мРНК-мишени TNF-α TACE или мРНК TNFR1, не вызывая при этом нежелательных побочных эффектов, связанных с неспецифическими препаратами.
Вариантом осуществления изобретения является способ ослабления экспрессии мРНК TACE у субъекта. Способ включает в себя введение субъекту композиции, содержащей эффективное количество интерферирующей РНК, имеющей длину от 19 до 49 нуклеотидов, и фармацевтически приемлемый носитель, при этом интерферирующая РНК содержит участок не менее чем из 13 расположенных рядом нуклеотидов, имеющих по меньшей мере 90% комплементарность последовательности или по меньшей мере 90% идентичность последовательности предпоследним 13 нуклеотидам с 3'-конца мРНК, соответствующей любой из SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:14 - SEQ ID NO:58, и SEQ ID NO:155 - SEQ ID NO:201. Таким образом ослабляют экспрессию мРНК TACE.
Другим вариантом осуществления изобретения является способ лечения связанных с TNF-α состояний у субъектов, нуждающихся в этом. Способ включает в себя назначение субъекту композиции, содержащей эффективное количество интерферирующей РНК, имеющей длину от 19 до 49 нуклеотидов, и фармацевтически приемлемый носитель, причем интерферирующая РНК содержит участок не менее чем из 13 расположенных рядом нуклеотидов, имеющих по меньшей мере 90% комплементарность последовательности или по меньшей мере 90% идентичность последовательности предпоследним 13 нуклеотидам с 3'-конца мРНК, соответствующей любой из SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:14 - SEQ ID NO:58 и SEQ ID NO:155 - SEQ ID NO:201. Таким образом проводится лечение связанного с TNF-α состояния.
В еще одном варианте осуществления изобретения способ ослабления действия TNF-α у субъекта путем подавления у субъекта экспрессии мРНК TACE или мРНК TNFR1 включает в себя назначение субъекту композиции, содержащей эффективное количество интерферирующей РНК, имеющей длину от 19 до 49 нуклеотидов и фармацевтически приемлемый носитель, интерферирующая РНК содержит смысловую нуклеотидную цепь, антисмысловую нуклеотидную цепь, и участок по меньшей мере почти идеальной непрерывной комплементарности не менее чем из 19 нуклеотидов, где антисмысловая цепь гибридизуется в физиологических условиях с частью мРНК, соответствующей SEQ ID NO:1 и включающей в себя нуклеотиды 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332 или 3337, или где антисмысловая цепь гибридизуется в физиологических условиях с частью мРНК, соответствующей SEQ ID NO:2, начиная с нуклеотида 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091, 2092 или 2098. Экспрессия мРНК TACE уменьшена в тех вариантах осуществления, где антисмысловая цепь гибридизуется с частью мРНК, соответствующей SEQ ID NO:1, как приведено выше. Экспрессия мРНК TNFR1 уменьшена в тех вариантах осуществления, где антисмысловая цепь гибридизуется с частью мРНК, соответствующей SEQ ID NO:2, как приведено выше.
Также вариантом осуществления изобретения является способ лечения связанного с TNF-α состояния у субъекта, нуждающегося в этом, способ включает в себя назначение субъекту композиции, содержащей эффективное количество интерферирующей РНК, имеющей длину от 19 до 49 нуклеотидов и фармацевтически приемлемый носитель, интерферирующая РНК содержит смысловую нуклеотидную цепь, антисмысловую нуклеотидную цепь, и участок по меньшей мере почти идеальной непрерывной комплементарности не менее чем из 19 нуклеотидов; где антисмысловая цепь гибридизуется в физиологических условиях с частью мРНК, соответствующей SEQ ID NO:1 и включающей в себя нуклеотиды 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332 или 3337. Таким образом проводится лечение связанного с TNF-α состояния.
Дальнейшим вариантом осуществления изобретения является способ лечения связанного с TNF-α состояния у субъекта, нуждающегося в этом, способ включает в себя назначение субъекту композиции, содержащей эффективное количество интерферирующей РНК, имеющей длину от 19 до 49 нуклеотидов, и фармацевтически приемлемый носитель, интерферирующая РНК содержит смысловую нуклеотидную цепь, антисмысловую нуклеотидную цепь, и участок по меньшей мере почти идеальной непрерывной комплементарности не менее чем из 19 нуклеотидов; где антисмысловая цепь гибридизуется в физиологических условиях с частью мРНК, соответствующей SEQ ID NO:2, включающей в себя нуклеотид 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091, 2092 или 2098. Таким образом проводится лечение связанного с TNF-α состояния.
В следующем варианте осуществления субъекту может также быть введена вторая интерферирующая РНК, имеющая длину от 19 до 49 нуклеотидов; вторая интерферирующая РНК содержит смысловую нуклеотидную цепь, антисмысловую нуклеотидную цепь и участок по меньшей мере почти идеальной комплементарности по меньшей мере из 19 нуклеотидов, где антисмысловая цепь второй интерферирующей РНК гибридизуется в физиологических условиях с частью мРНК, соответствующей SEQ ID NO:2, начиная с нуклеотида 124, 328, 387, 391, 393, 395, 406, 421, 423, 444, 447, 455, 459, 460, 467, 469, 470, 471, 475, 479, 513, 517, 531, 543, 556, 576, 587, 588, 589, 595, 601, 602, 611, 612, 651, 664, 667, 668, 669, 677, 678, 785, 786, 788, 791, 792, 804, 813, 824, 838, 843, 877, 884, 929, 959, 960, 961, 963, 964, 965, 970, 973, 974, 1000, 1002, 1013, 1026, 1053, 1056, 1057, 1058, 1161, 1315, 1318, 1324, 1357, 1360, 1383, 1393, 1420, 1471, 1573, 1671, 2044, 2045, 2046, 2047, 2048, 2089, 2090, 2091, 2092 или 2098.
Когда мишенью первой интерферирующей РНК является SEQ ID NO:1, мишенью второй интерферирующей РНК может являться или SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, и наоборот, когда мишенью первой интерферирующей РНК является SEQ ID NO:2, мишенью второй интерферирующей РНК может являться или SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2. В дальнейших вариантах осуществления могут быть введены третья, четвертая или более интерферирующих РНК.
Дальнейший вариант осуществления изобретения представляет собой способ лечения связанного с TNF-α состояния у субъекта, нуждающегося в этом, способ включает в себя введение субъекту композиции, содержащей двухцепочечную молекулу siРНК, которая отрицательно регулирует экспрессию гена TACE посредством интерференции РНК, где каждая цепь молекулы siРНК независимо имеет длину от 19 до 27 нуклеотидов; и одна цепь молекулы siРНК содержит нуклеотидную последовательность, имеющую значительную комплементарность с мРНК, соответствующей гену TACE, так что молекула siРНК направляет расщепление мРНК путем РНК-интерференции.
Следующий вариант осуществления изобретения представляет собой способ лечения связанного с TNF-α глазного состояния у субъекта, нуждающегося в этом, метод включает в себя введение субъекту композиции, содержащей двухцепочечную молекулу siРНК, которая способствует отрицательной регуляции экспрессии гена TNFR1 посредством интерференции РНК, где каждая цепь молекулы siРНК независимо имеет длину от 19 до 27 нуклеотидов; и одна цепь молекулы siРНК содержит нуклеотидную последовательность, имеющую значительную степень комплементарности мРНК, соответствующей гену TACE, так что молекула siРНК направляет расщепление мРНК путем РНК-интерференции.
Способ уменьшения экспрессии мРНК TACE у субъекта, включающий в себя введение субъекту композиции, содержащей эффективное количество одноцепочечной интерферирующей РНК, и фармацевтически приемлемый носитель является еще одним вариантом осуществления. Одноцепочечная интерферирующая РНК имеет длину от 19 до 49 нуклеотидов и гибридизуется в физиологических условиях с частью мРНК, соответствующей SEQ ID NO:1 и включающей нуклеотиды 297, 333, 334, 335, 434, 470, 493, 547, 570, 573, 618, 649, 689, 755, 842, 844, 846, 860, 878, 894, 900, 909, 910, 913, 942, 970, 984, 1002, 1010, 1053, 1064, 1137, 1162, 1215, 1330, 1334, 1340, 1386, 1393, 1428, 1505, 1508, 1541, 1553, 1557, 1591, 1592, 1593, 1597, 1604, 1605, 1626, 1632, 1658, 1661, 1691, 1794, 1856, 1945, 1946, 1947, 1958, 2022, 2094, 2100, 2121, 2263, 2277, 2347, 2349, 2549, 2578, 2595, 2606, 2608, 2629, 2639, 2764, 2766, 2767, 2769, 3027, 3028, 3261, 3264, 3284, 3313, 3317, 3332 или 3337, интерферирующая РНК имеет участок почти совершенной непрерывной комплементарности с гибридизуемым участком мРНК, соответствующим SEQ ID NO:1. Таким образом уменьшается экспрессия мРНК TACE.
В качестве еще одного варианта осуществления изобретение включает в себя композицию, содержащую интерферирующую РНК, имеющую длину от 19 до 49 нуклеотидов, и содержащую нуклеотидную последовательность, соответствующую любой из последовательностей SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:14 - SEQ ID NO:58 и SEQ ID NO:155 - SEQ ID NO:201, или комплементарную им последовательность, и фармацевтически приемлемый носитель.
В качестве еще одного из вариантов осуществления изобретение включает в себя композицию, содержащую интерферирующую РНК, в основном состоящую из любой из последовательностей SEQ ID NO:59 - SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71 - SEQ ID NO:92 и SEQ ID NO:94 - SEQ ID NO:154, или комплементарных им последовательностей; и фармацевтически приемлемый носитель.
Использование любого из вариантов осуществления, описанных здесь при приготовлении лекарственного средства для уменьшения экспрессии мРНК TACE или мРНК TNFR1 в качестве способа уменьшения активности TNF-α и лечения таким образом связанных с TNF-α состояний, как это изложено здесь, также является вариантом осуществления представленного изобретения.
Краткое описание чертежей
Для того чтобы показать способы, с применением которых были получены приведенные выше и иные преимущества и объекты изобретения, будет приведено более детальное описание кратко описанного выше изобретения путем ссылки на конкретные варианты его осуществления, которые проиллюстрированы в прилагаемых изображениях.
Понимая, что эти изображения демонстрируют только типичные варианты осуществления изобретения и таким образом не должны считаться ограничивающими область действия изобретения, изобретение будет описано с дополнительной точностью и деталями путем использования сопутствующих изображений, на которых:
На Фиг. 1 представлена картина вестерн-блоттинга клеток GTM-3, трансфицированных siРНК TNFR1 №1, №2, №3 и №4, и контрольной siРНК без RISC, каждая в концентрации 10 нМ, 1 нМ, и 0,1 нМ; ненацеленная контрольная siРНК (NTC2) в концентрации 10 нМ; и контроль буфера (без siРНК). Стрелки указывают положение полос 55 кДа TNFR1 и 42 кДа актина.
Подробное описание изобретения
Цитируемые здесь ссылки, в той степени, в которой они представляют иллюстративные процедурные или иные детали, дополняющие изложенные здесь, введены сюда особо в виде ссылки.
Специалистам в данной области, в свете представленного раскрытия, должно быть понятно, что в объеме, охватываемом настоящим изобретением, возможны модификации. Все варианты осуществления, раскрытые здесь, могут быть созданы и исполнены без проведения излишних экспериментов в свете представленного раскрытия. Полный объем, охватываемый изобретением, определяется его раскрытием и его эквивалентными вариантами осуществления. Описание не должно толковаться как сужение объема защиты, на который претендует представленное изобретение.
Показанные здесь детали приведены в качестве примера и только для иллюстрации предпочтительных вариантов осуществления изобретения и представлены здесь для наибольшей эффективности и легкости восприятия принципов и концептуальных аспектов различных вариантов осуществления изобретения. В этом отношении структурные подробности изобретения приведены в том объеме, который необходим для фундаментального понимания изобретения, описание, взятое вместе с иллюстрациями и/или примерами, дано для уяснения специалистами в данной области того, каким образом некоторые варианты изобретения могут быть воплощены на практике.
Последующие определения и объяснения должны считаться определяющими в любых дальнейших конструкциях, за исключением случаев, когда они четко и однозначно изменены в последующих примерах или когда применение этих значений делает какие-либо конструкции бессмысленными или в основном бессмысленными. В случаях, когда включающие термины конструкции сделают их бессмысленными или практически бессмысленными, определение должно быть взято из словаря Webster's 3-го издания.
Если не указано иное, все использованные здесь проценты являются весовыми процентами.
Если не указано иначе, существительные в единственном числе могут также относиться и к множественному числу.
Термин «сухость глаз», также известный как сухой конъюктивит или сухой кератоконъюктивит, является часто встречающимся офтальмологическим расстройством, вовлекающим распад слезной пленки на глазу, приводящий к дегидратации оголенной внешней поверхности глаза.
Используемый здесь термин «глазное воспаление» включает, например, ирит, увеит, эписклерит, склерит, кератит, эндофтальмит, блефарит, и ятрогенные воспалительные состояния.
Здесь термин «аллергические конъюктивиты» относится к воспалению конъюнктивы, которая представляет собой тонкую мембрану, которая находится под веками и покрывает наружную поверхность склеры. Термин «аллергический конъюктивит» включает, например, атопический кератоконъюктивит, конъюктивит гигантоклеточный папиллярный, связанный с сенной лихорадкой конъюктивит, хронический аллергический конъюктивит, и весенний кератоконъюктивит.
Здесь термин «дерматит» относится к воспалению кожи и включает, например, аллергический контактный дерматит, крапивницу, астеатозный дерматит (сухость кожи в нижней части ног), атопический дерматит, контактный дерматит, включая контактный дерматит вследствие действия раздражающих веществ и урушиол-индуцированный контактный дерматит, отит наружного уха, периоральный дерматит и себорейный дерматит.
Здесь термин «ринит» относится к воспалению слизистых мембран носа и включает, например, аллергический ринит, атопический ринит, эозинофильный неаллергический ринит, медикаментозный ринит и нейтрофильный риносинусит.
Термин «астма» относится к воспалению дыхательных путей, приводящему к сужению дыхательных путей, которые проводят воздух из носа и рта в легкие, и включает, например, аллергическую астму, атопическую астму, атопическую бронхиальную IgE-опосредованную астму, бронхиальную астму, бронхиолит, эмфизематозную астму, первичную астму, астму напряжения, экзогенную астму, вызванную факторами внешней среды, раннюю астму, эндогенную астму, вызванную патофизиологическими расстройствами, неаллергическую астму, не-атопическую астму и синдром бронхита новорожденных.
Фраза «непрерывный участок не менее чем из 13 нуклеотидов, имеющий по меньшей мере 90% комплементарность последовательности или по меньшей мере 90% идентичность последовательности с предпоследними 13 нуклеотидами 3'-конца мРНК, соответствующей любой из (идентификатор последовательности)» допускает одну нуклеотидную замену. Две нуклеотидные замены (например, 11/13=85% идентичности/комплементарности) не включены в подобную фразу.
Термин «процент идентичности» описывает процент непрерывных нуклеотидов в первой молекуле нуклеиновой кислоты, являющихся такими же, что и в наборе непрерывных нуклеотидов той же длины во второй молекуле нуклеиновой кислоты. Термин «процент комплементарности» описывает процент непрерывных нуклеотидов в первой молекуле нуклеиновой кислоты, которые способны образовывать пары оснований в Уотсон-Криковском смысле с набором непрерывных нуклеотидов во второй молекуле нуклеиновой кислоты.
Использованный здесь, термин «гибридизация» обозначает и относится к процессу, в котором одноцепочечные нуклеиновые кислоты с комплементарными или почти комплементарными последовательностями оснований взаимодействуют, образуя связанные водородными связями комплексы, называемые гибридами. Реакции гибридизации являются чувствительными и избирательными. Специфичность гибридизации (т.е. ее жесткость) in vitro управляется, например, концентрациями соли или формамида в растворах для прегибридизации и гибридизации, и температурой гибридизации; подобные процедуры хорошо известны в данной области. В частности, жесткость увеличивается при уменьшении концентрации соли, увеличении концентрации формамида, или при повышении температуры гибридизации.
m
m
m
10
Например, условия высокой жесткости могут иметь место при приблизительно 50% формамида при температуре от 37°С до 42°С. Условия пониженной жесткости могут иметь место при приблизительно от 35% до 25% формамида при температуре от 30°С до 35°С. Примеры жестких условий для гибридизации приведены в Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Дальнейшие примеры жестких условий гибридизации включают 400 мM NaCl, 40 мM PIPES pH 6,4, 1 мM EDTA, 50°C или 70°C в течение 12-16 часов с последующей промывкой, или гибридизацию при 70°C в IXSSC или при 50°C в IXSSC с 50% формамида с последующей промывкой при 70°C в 0,3XSSC, или гибридизацию при 70°C в 4XSSC или при 50°C в 4XSSC с 50% с последующей промывкой при 67°C в IXSSC. Температура гибридизации приблизительно на 5-10°С меньше, чем температура плавления (T) гибрида, где T определяется для гибридов длиной между 19 и 49 парами оснований с использованием следующих вычислений: T,°C=81,5+16,6(log[Na+])+0,41(%G+C)-(600/N), где N представляет собой число оснований в гибриде и [Na+] является концентрацией ионов натрия в буфере для гибридизации.
Приведенные здесь последовательности нуклеиновых кислот записаны в направлении от 5' к 3', если не указано иное. Термин «нуклеиновая кислота» относится или к ДНК, или к РНК, или к их модифицированной форме, содержащей пуриновые или пиримидиновые основания, присутствующие в ДНК (аденин «A», цитозин «С», гуанин «G», тимин «T») или в РНК (аденин «A», цитозин «C», гуанин «G», урацил «U»). Предложенные здесь интерферирующие РНК могут содержать основания «Т», особенно на 3'-конце, несмотря на то, что «Т» обычно не встречается в РНК. Термин «нуклеиновая кислота» включает термины «олигонуклеотид» и «полинуклеотид», и может относиться к одноцепочечным молекулам и к двухцепочечным молекулам. Двухцепочечная молекула образована путем Уотсон-Криковского спаривания оснований между основаниями А и Т, основаниями С и G и между основаниями А и U. Цепи двухцепочечной молекулы могут иметь частичную, значительную или полную комплементарность друг другу и будут формировать гибридный дуплекс, сила связывания в котором зависит от природы и степени комплементарности последовательности оснований.
Последовательность мРНК может быть легко выведена логически на основании последовательности соответствующей ДНК. Например, SEQ ID NO:1 представляет собой последовательность смысловой цепи, соответствующей мРНК TACE. Последовательность мРНК идентична последовательности ДНК смысловой цепи, где основания «Т» заменены основаниями «U». Таким образом последовательность мРНК TACE известна из SEQ ID NO:1, и последовательность мРНК TNFR1 известна из SEQ ID NO:2.
Интерференция РНК (iРНК) представляет собой процесс, при котором двухцепочечная РНК (dsРНК) используется для подавления экспрессии гена. Если не отдавать предпочтение конкретной теории, РНК-ингибирование начинается с расщепления более длинных двухцепочечных dsРНК на маленькие интерферирующие РНК (siРНК) подобным РНКазеIII ферментом, дайсером. siРНК представляют собой dsРНК, которые обычно имеют длину от 19 до 28 нуклеотидов, или от 20 до 25 нуклеотидов, или от 21 до 22 нуклеотидов и часто содержат 2-нуклеотидные 3'-нависающие концы и 5'-фосфатные и 3'-гидроксильные концевые группы. Одна из цепей siРНК включается в рибонуклеопротеиновый комплекс, известный как РНК-индуцируемый подавляющий комплекс (RISC). RISC использует цепь siРНК для идентификации молекул мРНК, которые по меньшей мере частично комплементарны встроенной цепи siРНК, после чего расщепляет эти мРНК-мишени или подавляет их трансляцию. Таким образом, цепь siРНК, которая встраивается в RISC известна как направляющая цепь или антисмысловая цепь. Другая цепь siРНК, известная как цепь-пассажир или смысловая цепь, удаляется из siРНК и является по меньшей мере частично гомологичной мРНК-мишени. Специалисты в данной области техники поймут, что, в принципе, любая цепь siРНК может быть встроена в RISC и функционировать в качестве направляющей цепи. Однако конструкция siРНК (например, пониженная стабильность РНК-дуплекса на 5'-конце желаемой направляющей цепи) может создавать преимущества встраиванию в RISC желаемой цепи.
RISC-опосредованное расщепление мРНК, имеющей последовательность, по меньшей мере частично комплементарную направляющей цепи приводит к уменьшению уровня этой мРНК и соответствующего белка, кодируемого этой мРНК, в состоянии покоя. Альтернативно, RISC может также понижать экспрессию соответствующего белка путем репрессирования трансляции без расщепления РНК-мишени. Другие молекулы РНК и РНК-подобные молекулы могут взаимодействовать с RISC и подавлять экспрессию генов. Примеры других молекул РНК, которые способны взаимодействовать с RISC, включают РНК с короткой шпилькой (shРНК), одноцепочечные siРНК, микроРНК (miРНК) и 27-членные дуплексные субстраты дайсера. Использованный здесь термин «siРНК» относится к двухцепочечной интерферирующей РНК, если не указано иное. Примеры РНК-подобных молекул, которые могут взаимодействовать с RISC включают молекулы РНК, содержащие один или более химически модифицированных нуклеотидов, один или более дезоксирибонуклеотидов, и/или одну или более не-фосфодиэфирных связей. Для целей представленного обсуждения все РНК и РНК-подобные молекулы, которые способны взаимодействовать с RISC и участвовать в RISC-опосредованных изменениях экспрессии генов будут упоминаться как «интерферирующие РНК». Таким образом, siРНК, shРНК, miРНК, и 27-членные дуплексные субстраты дайсера являются подтипами «интерферирующих РНК».
Интерферирующие РНК в соответствии с вариантами осуществления изобретения, по всей видимости, действуют как катализаторы расщепления РНК-мишени, то есть интерферирующая РНК способна воздействовать на ингибирование мРНК-мишени в субстехиометрических количествах. При таких условиях расщепления для достижения терапевтического эффекта требуется значительно меньше интерферирующей РНК по сравнению с терапией антисмысловыми цепями.
Представленное изобретение относится к применению интерферирующей РНК для ингибирования экспрессии рецептора TNF-1 (TNFR1), рецептора TNF-α на поверхности клеток или TNF-α-превращающего фермента (TACE/ADAM17, обозначенного здесь «TACE»), ингибирование которых уменьшает активность фактора некроза опухоли α (TNF-α). Связывание TNF-α с его рецептором на поверхности клеток, рецептором TNF-1(TNFR1), активирует сигнальный каскад, который воздействует на различные ответы клетки, включая апоптоз и воспаление. Сам TNF-α экспрессируется сначала в виде неактивного связанного с мембраной предшественника. Высвобождение активной формы TNF-α с поверхности клетки требует протеолитического процессинга предшественника TNF-α с участием TNF-α-превращающего фермента (TACE/ADAM17), члена семейства 1А дизинтегринов и металлопротеаз (ADAM).
В соответствии с представленным изобретением, ингибирование экспрессии мРНК TNFR1, мРНК TACE или обеих МРНК TNFR1 и TACE эффективно уменьшает действие TNF-α. Далее, интерферирующие РНК, как изложено здесь, введенные экзогенно или экспрессированные эндогенно, весьма эффективны для подавления мРНК TNFR1 или мРНК TACE.
мРНК фактор некроза опухоли α-превращающего фермента (TACE/ADAM17): база данных GenBank предоставляет последовательность ДНК для TACE под номером доступа NM_003183, приведенную в «списке последовательностей» как SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:1 представляет собой последовательность смысловой цепи ДНК, которая соответствует мРНК, кодирующей TACE (с заменой оснований «Т» на основания «U»). Кодирующая последовательность TACE состоит из нуклеотидов 184-2658.
Эквивалентами приведенной выше последовательности мРНК TACE являются альтернативные формы сплайсинга, аллельные формы, изозимы или родственные им формы. Родственной является мРНК фактор некроза опухоли α-превращающего фермента из другого вида млекопитающих, которая гомологична SEQ ID NO:1 (т.е. является ортологом).
мРНК рецептора фактора некроза опухоли 1 (TNFR1): база данных GenBank предоставляет последовательность ДНК для TACE под номером доступа NM_001065, приведенную в «списке последовательностей» как SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:2 представляет собой последовательность смысловой цепи ДНК, которая соответствует мРНК, кодирующей TNFR1 (с заменой оснований «Т» на основания «U»). Кодирующая последовательность TACE состоит из нуклеотидов 282-1649.
Эквивалентами приведенной выше последовательности мРНК TACE являются альтернативные формы сплайсинга, аллельные формы, изозимы или их родственники. Родственной является мРНК рецептора фактора некроза опухоли 1 из другого вида млекопитающих, которая гомологична SEQ ID NO:2 (т.е. является ортологом).
Ослабление экспрессии мРНК: здесь фраза «ослабление экспрессии мРНК» означает введение или экспрессирование количества интерферирующей РНК (например, siРНК) для уменьшения трансляции мРНК-мишени в белок либо путем расщепления РНК, либо путем прямого ингибирования трансляции. Уменьшение экспрессии мРНК или соответствующего протеина обычно упоминается как «нокдаун» и показывается относительно уровней, присутствующих после введения или экспрессии ненацеленной контрольной РНК (например, ненацеленной контрольной siРНК). Вариантами осуществления здесь рассматривается нокдаун экспрессии на величину от 50% до 100%, включая и сами эти значения. Однако для целей представленного изобретения не является необходимым достижение таких уровней нокдауна. В одном варианте осуществления пациенту назначается единственная интерферирующая РНК, нацеленная на мРНК TACE или на мРНК TNFR1. В других вариантах осуществления назначаются две или более интерферирующих РНК, нацеленных на мРНК TACE или на мРНК TNFR1. В дальнейших вариантах осуществления интерферирующие РНК, каждая из которых нацелена на мРНК TACE или на мРНК TNFR1, назначаются в сочетании или с таким интервалом, чтобы их действия перекрывались.
Нокдаун часто оценивается путем измерения уровней мРНК с использованием амплификации в количественной полимеразной цепной реакции (qПЦР) или путем измерения уровней протеина методом вестерн-блот или иммуноферментного анализа (ИФА). Анализ уровня протеина позволяет оценить и расщепление РНК, и ингибирование трансляции. Другие способы измерения нокдауна включают гибридизацию РНК в растворе, защиту от нуклеаз, нозерн-гибридизацию, мониторинг экспрессии генов при помощи микроанализа, связывание антител, радиоиммунный анализ и анализ с применением анализа активированных флуоресцентных клеток.
Ингибирование TACE или TNFR1 может также быть определено in vitro путем оценки уровней мРНК-мишени или белка-мишени например, в клетках эпителия роговицы человека после трансфекции РНК, интерферирующей с TACE или TNFR1, как описано ниже.
Также можно сделать вывод об ингибировании активности TNF-α вследствие ингибирования экспрессии мРНК TACE или мРНК TNFR1 у человека или млекопитающего на основании наблюдения улучшений симптомов связанного с TNF-α состояния, такого как улучшение симптомов, относящихся к сухости глаз, аллергическим конъюктивитам, воспалению глаза, дерматиту, ринитам или астме. Улучшения в любых симптомах, например, сухости глаз, отеков, чесотки, воспаления, или переносимости к неблагоприятным условиям среды, являются показательными в отношении ингибирования активности TNF-α.
Интерферирующие РНК: в одном варианте осуществления изобретения интерферирующие РНК (например, siРНК) имеют смысловую цепь и антисмысловую цепь, включающую участок почти идеальной непрерывной комплементарности не менее чем из 19 нуклеотидов.
В дальнейших вариантах осуществления изобретения интерферирующие РНК (например, siРНК) имели смысловую цепь и антисмысловую цепь, соответственно, антисмысловая цепь содержала участок по меньшей мере почти идеальной непрерывной комплементарности по отношению к последовательности-мишени мРНК TACE или мРНК TNFR1, состоящий не менее чем из 19 нуклеотидов, и смысловая цепь содержала участок по меньшей мере почти идеальной непрерывной идентичности по отношению к последовательности-мишени мРНК или мРНК TNFR1, состоящий не менее чем из 19 нуклеотидов.
В дальнейших вариантах осуществления изобретения интерферирующая РНК содержит непрерывный участок не менее чем из 13, 14, 15, 16, 17 или 18 нуклеотидов, имеющих процент комплементарности последовательности или процент идентичности последовательности с предпоследними 13, 14, 15, 16, 17 или 18 нуклеотидами 3'-конца соответствующей последовательности-мишени мРНК.
Длина каждой цепи интерферирующей РНК составляет от 19 до 49 нуклеотидов, что включает длину в 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или 49 нуклеотидов.
Антисмысловая цепь siРНК является активным направляющим фактором siРНК, антисмысловая цепь встраивается в RISC, позволяя таким образом RISC идентифицировать мРНК-мишени, которые по меньшей мере частично комплементарны антисмысловой цепи siРНК для их расщепления или подавления их трансляции.
В вариантах осуществления представленного изобретения последовательности-мишени интерферирующей РНК (например, последовательности-мишени siРНК) внутри последовательности мРНК-мишени отбираются с использованием доступных инструментов конструирования. Интерферирующие РНК, соответствующие последовательностям-мишеням TACE или TNFR1, затем проверяются путем трансфекции клеток, экспрессирующих РНК-мишень с последующей оценкой нокдауна, описанной выше.
Техника отбора последовательностей-мишеней для siРНК предложена Tuschl, T. et al, "The siRNA User Guide," переработано 6 мая 2004 г., доступно на интернет-сайте Университета Рокфеллера; в Technical Bulletin #506, "siRNA Design Guidelines," Ambion Inc. На интернет-сайте Ambion; или с использованием любых других сетевых инструментов дизайна, например, доступные на интернет-сайтах Invitrogen, Dharmacon, Integrated DNA Technologies, Genscript, или Proligo. Начальные параметры поиска могут включать содержание G/C между 35% и 55% и длину siРНК между 19 и 27 нуклеотидами. Последовательность-мишень может быть расположена в кодирующем участке или на 5'- или 3'-нетранслируемых участках мРНК.
Вариант 19-членной нуклеотидной ДНК-последовательности-мишени для мРНК TACE соответствует нуклеотидам 297-315 последовательности SEQ ID NO:1:
5'-GCTCTCAGACTACGATATT-3' SEQ ID NO:3.
siРНК согласно изобретению, нацеленная на соответствующую последовательность мРНК SEQ ID NO:3 и имеющая 21-членные нуклеотидные цепи и 2-членный нуклеотидный 3'-нависающий конец:
5'-GCUCUCAGACUACGAUAUUNN-3 SEQ ID NO:4
3'-NNCGAGAGUCUGAUGCUAUAA-5' SEQ ID NO:5
Каждый остаток «N» может быть любым нуклеотидом (A, C, G, U T) или модифицированным нуклеотидом. На 3'-конце может находиться число остатков «N» от 1 до 6, включая 1, 2, 3, 4, 5 и 6. Остатки «N» на каждой цепи могут быть одним и тем же остатком (например, UU, AA, CC, GG или TT) или могут быть различными остатками (например, AC, AG, AU, CA, CG, CU, GA, GC, GU, UA, UC или UG). Нависающие 3'-концы могут быть одинаковыми на обеих цепях или различными. В одном варианте осуществления оба нависающих конца являются концами 3 'UU.
siРНК согласно изобретению для нацеливания на соответствующую SEQ ID NO:3 последовательность мРНК и имеющая 21-членные нуклеотидные цепи и 3' UU нависающий конец на обеих цепях:
5'-GCUCUCAGACUACGAUAUUUU-3 ' SEQ ID NO:6
3'-UUCGAGAGUCUGAUGCUAUAA-5' SEQ ID NO:7.
Интерферирующая РНК может также иметь 5'-нависающие концевые нуклеотиды или являться тупой. siРНК согласно изобретению для нацеливания на соответствующую SEQ ID NO:3 последовательность мРНК и имеющая 19-членные нуклеотидные цепи и тупой конец:
5'-GCUCUCAGACUACGAUAUU-3' SEQ ID NO:8
3'-CGAGAGUCUGAUGCUAUAA-5' SEQ ID NO:9.
Цепи двухцепочечной интерферирующей РНК (например, siРНК) могут быть соединены, образуя шпильку или структуру «стебель-петля» (например, shРНК). shРНК согласно изобретению, нацеленная на соответствующую SEQ ID NO:3 последовательность мРНК и имеющая 19-членный нуклеотидный двухцепочечный участок стебля и нависающими 3'-концами UU:
N является нуклеотидом A, T, C, G, U или модифицированной формой, известной специалисту с обычными знаниями в данной области. Количество нуклеотидов N в петле является числом между 3 и 23 включительно, или между 5 и 15, или между 7 и 13, или между 4 и 9, или между 9 и 11, или число нуклеотидов N равно 9. Некоторые нуклеотиды петли могут быть вовлечены в образование нуклеотидных пар с другими нуклеотидами петли. Примеры олигонуклеотидных последовательностей, которые могут быть использованы для образования петли включают 5'-UUCAAGAGA-3' (Brummelkamp, T.R. et al. (2002) Science 296: 550) и 5'-UUUGUGUAG-3' (Castanotto, D. et al. (2002) RNA 8:1454). Специалистом в данной области будет признано, что полученный одноцепочечный олигонуклеотид, образующий структуру «стебель-петля» или шпилечную структуру способен взаимодействовать с механизмом РНКi.
Приведенная выше последовательность siРНК может быть расширена в направлении 3'-конца для облегчения разработки 27-членных дуплексов-субстратов дайсера. Расширение 19-членной нуклеотидной ДНК-последовательности-мишени (SEQ ID NO:3), идентифицируемой в последовательности ДНК TACE (SEQ ID NO:1) по 6 нуклеотидам дает 25-членную нуклеотидную последовательность-мишень ДНК, соответствующую нуклеотидам 297-321 последовательности SEQ ID NO:1:
5'-GCTCTCAGACTACGATATTCTCTCT-3' SEQ ID NO:11.
27-членный дуплекс согласно изобретению, являющийся субстратом дайсера, нацеленный на мРНК, соответствующую последовательности SEQ ID NO:11:
5'-GCUCUCAGACUACGAUAUUCUCUCU-3' SEQ ID NO:12
3'-UUCGAGAGUCUGAUGCUAUAAGAGAGA-5' SEQ ID NO:13.
Два нуклеотида на 3'-конце смысловой цепи (например, нуклеотиды CU в последовательности SEQ ID NO:12) могут быть дезоксинуклеотидами для улучшения обработки. Разработка 27-членных дуплексов-субстратов дайсера на основе 19-21 нуклеотидных последовательностей-мишеней, таких как приведенные здесь, далее обсуждается на интернет-сайте Integrated DNA Technologies (IDT) и в Kim, D.-H. et al, (February, 2005) Nature Biotechnology 23:2; 222-226.
Когда интерферирующие РНК производятся путем химического синтеза, фосфорилирование в положении 5' нуклеотида на 5'-конце одной или обеих цепей (если присутствуют две) может усилить эффективность siРНК и специфичность связывания комплекса RISC, но не обязательно, поскольку фосфорилирование может происходить внутриклеточно.
В таблице 1 перечислены последовательности-мишени в ДНК TACE из SEQ ID NO:1, на основе которых с использованием изложенной выше методики сконструированы siРНК. Как указано выше, TACE кодирует фактор некроза опухоли α-превращающий фермент.
Таблица 1
Последовательности-мишени для siРНК TACE
В таблице 2 перечислены последовательности-мишени в ДНК TNFR1 из SEQ ID NO:2, на основе которых с использованием изложенной выше методики сконструированы siРНК. Как указано выше, TNFR1 кодирует рецептор-1 фактора некроза опухоли α.
Таблица 2
Последовательности-мишени для siРНК TNFR1.
Как упомянуто в приведенных выше примерах, специалист в данной области будет способен использовать информацию о последовательностях, представленную в таблицах 1 и 2 для разработки интерферирующих РНК, имеющих длину, большую или меньшую, чем у последовательностей, представленных в таблицах, определения положения последовательности-мишени в последовательности SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 и добавления или удаления нуклеотидов, комплементарных или почти комплементарных SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 соответственно.
Реакция расщепления РНК-мишени, направляемая siРНК и другими формами интерферирующих РНК, является весьма специфичной в отношении последовательностей. Обычно siРНК, содержащие смысловую нуклеотидную цепь, идентичную по последовательности участку мРНК-мишени, и антисмысловую нуклеотидную цепь, полностью комплементарную участку мРНК-мишени, являются вариантами осуществления siРНК для ингибирования описанных здесь мРНК. Однако 100% комплементарность последовательности между антисмысловой цепью siРНК и мРНК-мишенью или между антисмысловой цепью siРНК и смысловой цепью siРНК не является необходимой для практической реализации представленного изобретения. Таким образом, например, изобретение допускает вариации последовательности, которые можно ожидать в связи с генетическими мутациями, полиморфизмом линий или эволюционной дивергенцией.
В одном варианте осуществления изобретения антисмысловая цепь siРНК имела непрерывный участок по меньшей мере почти идеальной комплементарности с ДНК-мишенью из по меньшей мере 19 нуклеотидов. Использованный здесь термин «почти идеальная» означает, что антисмысловая цепь siРНК «в основном комплементарна», и смысловая цепь «в основном идентична» по меньшей мере, части мРНК-мишени. Термин «идентичность», как это известно любому специалисту в данной области, представляет собой степень соответствия между нуклеотидными последовательностями, определяемой как соответствие порядка и идентичности нуклеотидов между последовательностями. В одном варианте осуществления, антисмысловая цепь siРНК, имеющая 80% или от 80% до 100% комплементарности, например 85%, 90% или 95% комплементарности последовательности мРНК-мишени считается почти идеально комплементарной и может быть использована в представленном изобретении. «Идеальная» непрерывная комплементарность представляет собой стандартное образование Уотсон-Криковских пар прилегающими друг к другу парами оснований. Использованный здесь, термин «по меньшей мере, почти идеальная» непрерывная комплементарность включает «идеальную» комплементарность. Разработаны компьютерные методы выявления наибольшей степени совпадения нуклеотидных последовательностей, например, BLASTN (Altschul, S.F., et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410).
Взаимосвязь между мРНК-мишенью (смысловой цепью) и одной из цепей siРНК (смысловой цепью) связана с вопросом об их идентичности.
Смысловая цепь siРНК, если присутствует, называется также цепью-пассажиром. Взаимосвязь между мРНК-мишенью (смысловой цепью) и одной из цепей siРНК (антисмысловой цепью) связана с вопросом об их комплементарности. Антисмысловая цепь siРНК называется также направляющей цепью.
Предпоследним основанием в последовательности нуклеиновой кислоты является основание, записанное в направлении от 5' к 3' рядом с последним основанием, т.е. основание, соседнее с основанием 3'. Предпоследними 13 основаниями последовательности нуклеиновой кислоты, записанными в направлении от 5' к 3', являются последние 13 оснований последовательности, примыкающие к 3'-основанию, не включая его. Сходным образом, предпоследними 14, 15, 16, 17 или 18 основаниями последовательности нуклеиновой кислоты, записанными в направлении от 5' к 3', являются последние 14, 15, 16, 17 или 18 оснований последовательности, примыкающие к основанию на 3'-конце, не включая само основание на 3'-конце.
В одном варианте осуществления изобретения участком непрерывной последовательности нуклеотидов является непрерывный участок не менее чем из 13 нуклеотидов, имеющий по меньшей мере 90% комплементарность последовательности или по меньшей мере 90% идентичность последовательности предпоследним 13 нуклеотидам с 3'-конца мРНК, соответствующей последовательности, обозначенной каждым идентификатором последовательности.
В одном варианте осуществления изобретения участком непрерывной последовательности нуклеотидов является непрерывный участок не менее чем из 14 непрерывных нуклеотидов, имеющий по меньшей мере 85% комплементарность последовательности или по меньшей мере 85% идентичность последовательности предпоследним 14 нуклеотидам с 3'-конца мРНК, соответствующей последовательности, обозначенной каждым идентификатором последовательности. В такую фразу включены две нуклеотидные замены (т.е. 12/14=86% идентичности/комплементарности).
В дальнейшем варианте осуществления изобретения, участком непрерывных нуклеотидов является непрерывный участок не менее чем из 15, 16, 17 или 18 нуклеотидов, имеющий по меньшей мере 80% комплементарность последовательности или по меньшей мере 80% идентичность последовательности предпоследним 14 нуклеотидам с 3'-конца мРНК, соответствующей последовательности, обозначенной каждым идентификатором последовательности. В такую фразу включены три нуклеотидные замены.
Последовательности-мишени в мРНК, соответствующие SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 могут находиться как в 5' и 3' нетранслируемых участках мРНК, а также в кодирующем участке мРНК.
Одна или обе цепи двухцепочечной интерферирующей РНК могут иметь 3'-нависающий конец, длиной от 1 до 6 нуклеотидов, которые могут быть рибонуклеотидами или дезоксирибонуклеотидами или их смесью. Нуклеотиды нависающего конца не спарены. В одном варианте осуществления изобретения интерферирующая РНК имеет 3'-нависающий конец TT или UU. В другом варианте осуществления изобретения интерферирующая РНК содержит, по меньшей мере, один тупой конец. Концы обычно имеют 5' фосфатную или 3' нуклеотидную группы. В других вариантах осуществления антисмысловая цепь имела 5' фосфатную группу и смысловая цепь имела 5' гидроксильную группу. В других вариантах осуществления, концы были далее модифицированы путем ковалентного добавления других молекул и функциональных групп.
Смысловые и антисмысловые цепи двухцепочечных siРНК могут находиться в состоянии дуплекса, или в виде двух одиночных цепей, как описано выше, или могут являться одной молекулой, в которой спаренные участки ковалентно связаны петлей шпильки таким образом, что образуется одна цепь. Считается, что шпилька расщепляется внутри клетки белком, называемым дайсером, и образует интерферирующую РНК из двух отдельных спаренных молекул РНК.
Интерферирующие РНК могут отличаться от встречающихся в природе РНК вставками, делециями, заменами или модификацией одного или более нуклеотидов. Не-нуклеотидный материал может быть прикреплен к интерферирующей РНК или на 5'-конце или на 3'-конце или внутри цепи. Подобные модификации обычно создаются для увеличения устойчивости интерферирующей РНК к нуклеазам, для улучшения поглощения клеткой, для улучшения нацеливания на клетки, для облегчения отслеживания интерферирующей РНК, для дальнейшего увеличения стабильности, или для уменьшения способности активировать путь интерферона. Например, интерферирующие РНК могут включать пуриновый нуклеотид на конце нависающего участка. Конъюгация холестерина на 3'-конце смысловой цепи молекулы siРНК, например, посредством пирролидинового линкера, также обеспечивает стабильность siРНК.
Дальнейшие модификации включают, например, молекулу биотина на 3'-конце, пептид с известными свойствами проникновения в клетку, наночастицу, пептидомиметик, флуоресцентный краситель, или дендример.
Нуклеотиды могут быть модифицированы в части молекулы, происходящей из основания, в части молекулы, происходящей из сахара или в фосфатной части молекулы и играть роль в вариантах осуществления представленного изобретения. Модификации включают, например, замещение алкильными, алкокси, амино, деза, гало, гидроксильными, тиоловыми группами или их сочетанием.
Нуклеотиды могут быть замещены аналогами с более высокой стабильностью, такими как замещение рибонуклеотида дезоксирибонуклеотидом, или модификацией сахаров, например, такой как замена 2' OH на 2' аминогруппы, 2' О-метильные группы, 2' метоксиэтильные группы, или 2' О, 4'-С метиленовые мостики. Примеры пуриновых или пиримидиновых аналогов нуклеотидов включают ксантин, гипоксантин, азапурин, метилтиоаденин, 7-деза-аденозин и О- и N-модифицированные нуклеотиды. Фосфатная группа нуклеотида может быть модифицирована путем замещения одного или более атомов кислорода в фосфатной группе атомами азота или серы (фосфотионаты). Модификации полезны, например, для улучшения функций, для увеличения стабильности или проникающей способности или для направления локализации или нацеливания.
В антисмысловой цепи интерферирующей РНК может иметься один или несколько участков, которые не комплементарны участкам SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2. Некомплементарные участки могут быть на 3'- или на 5'-конце комплементарного участка или между двумя комплементарными участками.
Интерферирующие РНК могут быть получены экзогенно путем химического синтеза, путем транскрипции in vitro или путем расщепления более длинной двухцепочечной РНК дайсером или иной соответствующей нуклеазой со сходной активностью. Синтезированные химически интерферирующие РНК, получаемые из защищенных фосфорамидитов рибонуклеозидов с использованием обычного ДНК/РНК-синтезатора, могут быть получены от коммерческих поставщиков, таких как Ambion Inc. (Austin, TX), Invitrogen (Carlsbad, CA), или Dharmacon (Lafayette, CO). Интерферирующие РНК очищают, например, путем экстракции растворителем или смолой, преципитации, электрофореза, хроматографии, или их комбинации. Альтернативно, интерферирующие РНК могут быть использованы с минимальной очисткой или вообще без очистки во избежание потерь в процессе обработки образца.
Интерферирующие РНК могут также производиться путем эндогенной экспрессии с плазмидных или вирусных экспрессирующих векторов или с минимальных экспрессирующих кассет, например, с полученных в ПЦР фрагментов, содержащих один или более промоторов и соответствующую матрицу или матрицы для интерферирующих РНК. Примеры коммерчески доступных плазмидных векторов для интерферирующих РНК включают серии pSilencer (Ambion, Austin, TX) и pCpG-siРНК (InvivoGen, San Diego, CA). Вирусные векторы для экспрессии интерферирующих РНК могут быть получены из различных вирусов, включая аденовирус, аденоассоциированный вирус, лентивирус (например, HIV, FIV и EIAV) и вирус герпеса. Примеры коммерчески доступных вирусных векторов для экспрессии shРНК включают pSilencer adeno (Ambion, Austin, TX) и pLenti6/BLOCK-iT™-DEST (Invitrogen, Carlsbad, CA). Выбор вирусных векторов, способов экспрессии интерферирующей РНК из вектора и способов доставки вирусного вектора находится в пределах знаний специалиста в данной области. Примеры наборов для получения создаваемых при помощи ПЦР экспрессирующих кассет shРНК включают Silencer Express (Ambion, Austin, TX) и siXpress (Minis, Madison, WI). Первая интерферирующая РНК может быть введена путем экспрессии in vivo с первого экспрессирующего вектора, способного экспрессировать первую интерферирующую РНК, вторая интерферирующая РНК может быть введена путем экспрессии in vivo со второго экспрессирующего вектора, способного экспрессировать вторую интерферирующую РНК, или обе интерферирующие РНК могут быть введены путем экспрессии in vivo с одного экспрессирующего вектора, способного экспрессировать обе интерферирующие РНК.
Интерферирующие РНК могут экспрессироваться с различных эукариотических промоторов, известных специалисту с обычными знаниями в данной области, включая промоторы pol III, такие как промоторы U6 или H1 или промоторы pol II, такие как промотор цитомегаловируса. Специалисты в данной области признают, что эти промоторы могут также быть адаптированы для того, чтобы обеспечивать индуцибельную экспрессию интерферирующей РНК.
Гибридизация в физиологических условиях: В некоторых вариантах осуществления представленного изобретения, антисмысловая цепь интерферирующей РНК гибридизуется с мРНК in vivo в качестве части комплекса RISC.
m
m
10
Например, условия высокой жесткости могут иметь место при приблизительно 50% формамида при температуре от 37°C до 42°C. Условия пониженной жесткости могут иметь место при приблизительно от 35% до 25% формамида при температуре от 30°C до 35°C. Примеры жестких условий для гибридизации приведены в Sambrook, J., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Дальнейшие примеры жестких условий гибридизации включают 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES pH 6,4, 1 мМ EDTA при 50°C или 70°C в течение 12-16 часов с последующей отмывкой, или гибридизацию при 70°C в IxSSC или при 50°C в IxSSC с 50% формамида с последующей отмывкой при 70°C 0,3хSSC, или гибридизацию при 70°C в 4хSSC или при 50°C в 4хSSC c 50% формамида с последующей отмывкой при 67°C в IxSSC. Температура гибридизации приблизительно на 5-10°C ниже, чем температура плавления гибрида T, температуру плавления для гибридов длиной от 19 до 49 пар оснований вычисляют по следующей формуле: T°C=81,5+16,6(log[Na+])+0,41(%G+C)-(600/N), где N представляет собой число нуклеотидов в гибриде и [Na+] означает концентрацию ионов натрия в буфере для гибридизации.
Описанное выше исследование гибридизации in vitro предлагает способ предсказания того, будет ли связывание между siРНК и мишенью иметь специфичность. Однако в контексте комплекса RISC специфическое расщепление мишени может происходить и с антисмысловой цепью, которая не демонстрирует высокой жесткости гибридизации in vitro.
Одноцепочечная интерферирующая РНК: Как указано выше, в конечном счете, интерферирующая РНК действует в виде отдельных цепей. Обнаружено, что одноцепочечная (ss) интерферирующая РНК имеет способность подавлять мРНК, хотя и менее эффективно, чем двухцепочечная (ds) РНК. Поэтому варианты осуществления представленного изобретения также предполагают введение интерферирующей ssРНК, которая гибридизуется в физиологических условиях с частью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 и имеет участок по меньшей мере почти идеальной непрерывной комплементарности с участком гибридизации SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2 соответственно, состоящий по меньшей мере из 19 нуклеотидов. Интерферирующая ssРНК в соответствии с таблицей 1 или таблицей 2 имеет длину от 19 до 49 нуклеотидов, как и ds интерферирующая РНК, описанная выше. Интерферирующая ssРНК имеет 5'-фосфат или фосфорилируется в положении 5' in situ или in vivo. Термин «5'-фосфорилированный» используется для описания, например, полинуклеотидов или олигонуклеотидов, имеющих фосфатную группу, присоединенную посредством эфирной связи к C5 гидроксилу сахара (например, рибозы, дезоксирибозы или подобному аналогу), на 5'-конце полинуклеотида или олигонуклеотида.
Интерферирующие ssРНК синтезируются химически или путем транскрипции in vitro или экспрессируются эндогенно с векторов или экспрессирующих кассет, как для ds интерферирующих РНК. 5'-фосфатные группы могут быть добавлены киназой или 5'-фосфат может являться результатом расщепления РНК. Доставка такая же, как и для интерферирующих dsРНК. В одном варианте осуществления для подавления мРНК вводится интерферирующая ssРНК, имеющая защищенные концы и модификации, устойчивые к нуклеазам. Интерферирующие ssРНК могут быть высушены для хранения или растворены в водном растворе. Раствор может содержать буферы или соли для подавления отжига или для стабилизации.
Шпилечная интерферирующая РНК: шпилечная интерферирующая РНК представляет собой одну молекулу (например, одиночную олигонуклеотидную цепь), которая содержит одновременно смысловую и антисмысловую цепи интерферирующей РНК в виде структуры стебель-петля или шпилька (например, shРНК). Например, shРНК могут быть экспрессированы с ДНК-векторов, в которых олигонуклеотиды ДНК, кодирующие смысловую цепь интерферирующей РНК, связаны с олигонуклеотидами ДНК, кодирующими обратно комплементарную антисмысловую цепь интерферирующей РНК посредством короткого спейсера. Если это требуется для выбранного экспрессирующего вектора, могут быть добавлены «Т» на 3'-конце, и нуклеотиды, образующие сайты рестрикции. Полученный в результате РНК-транскрипт приобретает пространственную упаковку, складываясь обратно на самого себя, с образованием структуры стебель-петля.
Способ введения: Интерферирующие РНК могут быть введены, например, с помощью аэрозольного, буккального, накожного, внутрикожного, ингаляционного, внутримышечного, интрагназального, внутриглазного, внутрилегочного, внутривенного, внутрибрюшинного, назального, глазного, орального, ушного, парентерального, накожного, подкожного, подъязычного, местного или трансдермального введения.
Введение может проводиться непосредственно в глаз, путем введения в ткани глаза, такого как периокулярное, конъюнктивальное, субтеноновое, внутрикамерное, введение в стекловидное тело, внутриглазное, субретинальное, подконъюктивально, ретробульбарно, внутриканально или супрахороидально; путем инъекции, путем прямого нанесения на глаз с использованием катетера или другого аппарата для нанесения, такого как глазная пилюля, внутриглазная вставка, суппозиторий или имплантат, содержащий пористый, непористый или желеобразный материал; с использованием наружных глазных капель или мазей; или с применением устройства медленного высвобождения в слепом мешке или имплантированном возле склеры (транссклерально) или внутри глаза. Инъекция внутрь камеры может проводиться через роговицу в переднюю камеру для того, чтобы позволить препарату достичь трабекулярной сети. Внутриканальная инъекция может проводиться в отводящие от канала Шлемма венозные коллекторные каналы, или в канал Шлемма.
Вводить можно непосредственно в ухо, с использованием, например, наружных ушных капель или мазей, устройств замедленного высвобождения в ухе или имплантированных возле уха. Местное введение включает инъекции, ушные внутримышечные, в барабанную полость, а также внутриулиточные пути введения. Кроме того, препараты могут быть введены во внутреннее ухо путем помещения гелевой пены или сходного адсорбента и клейкого продукта, пропитанного интерферирующей РНК напротив мембраны окна среднего/внутреннего уха или прилегающих структур.
Вводить можно непосредственно в легкие, например, используя аэрозольный препарат, или путем ингаляции с применением, например, ингалятора или распылителя.
Дальнейшие способы введения включают таблетки, пилюли и капсулы, все из них могут быть составлены специалистом с обычными знаниями в данной области техники.
Субъект: субъектом, нуждающимся в лечении связанного с TNF-α состояния или относящегося к группе риска, связанного с вероятностью возникновения связанного с TNF-α состояния, является человек или иное млекопитающее, имеющее связанное с TNF-α воспалительное состояние или имеющее сухость глаз или имеющее риск развития связанного с TNF-α воспалительного состояния или сухости глаз. Связанные с TNF-α воспалительные состояния включают в себя, например, аллергические конъюктивиты, воспаление глаз, дерматиты, риниты или астму, связанную с описанной здесь нежелательной или неуместной активностью TNF-α.
Глазные структуры, связанные со связанными с TNF-α условиями могут включать, например, глаз, сетчатку, хороид, хрусталик, роговицу, трабекулярную сеть, радужную оболочку, зрительный нерв, диск зрительного нерва, склеру, переднюю и заднюю камеры глаза, стекловидную камеру глаза, ресничное тело или задний сегмент.
Структуры уха, связанные с подобными расстройствами могут включать, например, внутреннее ухо, среднее ухо, внешнее ухо, барабанную полость или перепонку, улитку или Евстахиеву трубу.
Легочные структуры, связанные с подобными расстройствами могут включать нос, рот, глотку, гортань, бронхиальные трубки, трахеи, carina (гребень, разделяющий отверстия правого и левого основных бронхов), и легких, в частности, нижних легких, таких как бронхиолы и альвеолы.
Субъектом может также являться клетка слухового органа, клетка легких, клетка глаза, культура клеток, орган или орган или ткань ex vivo.
Композиции и дозировки: фармацевтические композиции содержат интерферирующие РНК или их соли согласно изобретению до 99% по весу, смешанные с физиологически приемлемой средой-носителем, такой как вода, буфер, солевой раствор, глицин, гилауроновая кислота, маннит и подобные.
Интерферирующие РНК согласно изобретению вводят в виде растворов, суспензий или эмульсий. Далее приведены примеры возможных композиций, являющихся вариантами осуществления данного изобретения.
Количество, в % по весу
Интерферирующая РНК
До 99; 0,1-99; 0,1-50; 0,5-10,0
Гидроксипропилметилцеллюлоза
0,5
Хлорид натрия
0,8
Хлорид бензалкония
0,01
ЭДТА
0,01
NaOH/HCl
до рН 7,4
Очищенная вода
до 100 мл
Количество, в % по весу
Интерферирующая РНК
до 99; 0,1-99; 0,1-50; 0,5-10,0
Фосфатно-солевой буфер
1,0
Хлорид бензалкония
0,01
Полисорбат 80
0,5
Очищенная вода (без РНКаз)
до 100 мл
Количество, в % по весу
Интерферирующая РНК
до 99; 0,1-99; 0,1-50; 0,5-10,0
Одноосновный фосфат натрия
0,05
Двухосновный фосфат натрия (безводный)
0,15
Хлорид натрия
0,75
ЭДТА натрия
0,05
Кремофор EL
0,1
Хлорид бензалкония
0,01
HCl и/или NaOH
до pH 7,3-7,4
Очищенная вода (без РНКаз)
до 100 мл
Количество, в % по весу
Интерферирующая РНК
до 99; 0,1-99; 0,1-50; 0,5-10,0
Фосфатно-солевой буфер
1,0
Гидроксипропил-β-циклодекстрин
4,0
Очищенная вода (без РНКаз)
до 100 мл
Обычно эффективное количество интерферирующей РНК в соответствии с вариантами осуществления изобретения приводит к внеклеточной концентрации на поверхности клеток-мишеней от 100 пкМ до 1000 нМ, или от 1 нМ до 400 нМ, или от 5 нМ до приблизительно 100 нМ, или приблизительно 10 нМ. Дозировка, необходимая для достижения этой местной концентрации, будет изменяться в зависимости от нескольких факторов, включая метод доставки, место введения, количество слоев клеток между местом введения и тканью или клеткой-мишенью, является ли введение местным или системным, и т.д. Концентрация на участке введения может быть значительно более высокой, чем на поверхности ткани или клетки-мишени. Наружные композиции наносятся на поверхность органа-мишени от одного до четырех раз в день, или по расширенному расписанию введения, такому как ежедневное, раз в неделю, раз в две недели, раз в месяц или реже, в соответствии с выбором практикующего врача-специалиста. pH состава составляет приблизительно pH 4-9 или от pH 4,5 до pH 7,4.
Ожидается, что терапевтическое лечение пациентов при помощи siРНК, направленных против мРНК TACE или мРНК TNFR1, будет иметь преимущество по сравнению с лечением низкомолекулярными соединениями, выражающееся в увеличении продолжительности действия, таким образом, позволяя менее частое введение дозы и большее удобство для пациента.
Эффективное количество композиции может зависеть, например, от таких факторов как возраст, раса и пол субъекта, тяжести связанного с TNF-α состояния, скорости оборота транскриптов и белков гена-мишени, эффективности интерферирующей РНК и стабильности интерферирующей РНК.
В одном варианте осуществления, интерферирующая РНК доставляется местно к органу-мишени и достигает ткани, содержащей мРНК TACE или мРНК TNFR1 в терапевтической дозировке, таким образом, приводя к улучшениям при связанном с TNF-α процессе.
Приемлемые носители: термин «приемлемые носители» относится к носителям, которые вызывают, самое большее, минимальное или не вызывают вовсе раздражения глаз, обеспечивают достаточное хранение, если это необходимо, и доставляют одну или более интерферирующих РНК в соответствии с представленным изобретением в гомогенной дозировке. Приемлемые носители для введения интерферирующей РНК в соответствии с вариантами осуществления представленного изобретения включают катионные основанные на липидах реактивы для трансфекции TransIT-TKO (Minis Corporation, Madison, WI), LIPOFECTIN, липофектамил, OLIGOFECTAMINE™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), или DHARMAFECT™ (Dharmacon, Lafayette, CO); поликатионы, такие как полиэтиленимин; катионные пептиды, такие как Tat, полиаргинин или пенетратин (пептид Antp); или липосомы. Липосомы образуются из стандартных образующих везикулы липидов и стеринов, таких как холестерин и могут включать нацеливающую молекулу, такую как, например, моноклональное антитело, имеющее сродство связывания с поверхностными антигенами эндотелиальных клеток. Далее, липосомы могут быть пегилированными липосомами.
Интерферирующие РНК могут быть доставлены в виде раствора, суспензии, или в биодеградирующих или небиодеградирующих устройствах введения. Интерферирующие РНК могут быть доставлены самостоятельно или в качестве компонентов определенных, ковалентных конъюгатов. Интерферирующие РНК могут также образовывать комплексы с катионными липидами, катионными пептидами или катионными полимерами; образовывать комплексы с белками, слитными белками или доменами белков со способностью к связыванию нуклеиновых кислот (например, протамином); или быть инкапсулированы в наночастицы. Клетко- или тканеспецифичная доставка может быть осуществлена путем включения соответствующих нацеливающих групп, таких как антитела или фрагменты антител.
Для глазного, ушного или легочного введения интерферирующая РНК может быть скомбинирована с офтальмологически, оптически или пульмонально приемлемыми консервантами, сорастворителями, поверхностно-активными веществами, усилителями вязкости, усилителями проникновения, буферами, хлоридом натрия или водой для образования стерильной водной суспензии или раствора. Растворенные композиции могут быть приготовлены путем растворения интерферирующей РНК в физиологически приемлемом изотоническом водном буфере. Далее, растворы могут содержать приемлемое поверхностно-активное вещество для облегчения растворения ингибитора. Препараты для повышения вязкости, такие как гидроксиметилцеллюлоза, гидроксиэтилцеллюлоза, метилцеллюлоза, поливинилпирролидон или подобные, могут быть добавлены к композициям в соответствии с представленным изобретением для улучшения удержания композиции.

Для приготовления стерильной композиции в виде мази, интерферирующая РНК объединяется с консервантом в соответствующем носителе, таком как минеральное масло, жидкий ланолин, или белый вазелин. Стерильные композиции в виде геля могут быть получены путем суспендирования интерферирующей РНК в гидрофильной основе, полученной путем соединения, например, CARBOPOL-940 (BF Goodrich, Charlotte, NC), и ему подобных в соответствии с методами, известными в данной области. Например, для внутриглазной инъекции может быть использован VISCOAT (Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, TX). Другие композиции в соответствии с представленным изобретением могут содержать препараты, увеличивающие проникающую способность, такие как кремофор или TWEEN 80 (полиоксиэтиленсорбитанмонолауреат, Sigma Aldrich, St. Louis, MO), в случае если интерферирующая РНК слабее проникает в интересующий орган или ткань.
Наборы: варианты осуществления представленного изобретения предлагают набор, который включает реагенты для ослабления экспрессии мРНК в клетке описанным здесь способом. Набор содержит экспрессирующий вектор для siРНК или shРНК. Для siРНК или не-вирусных векторов для экспрессии shРНК набор может также содержать реактив для трансфекции или иной подходящий носитель для доставки. Для вирусных векторов, экспрессирующих shРНК, набор может содержать вирусный вектор и/или необходимые компоненты для производства вирусного вектора (например, линия клеток с дефектом упаковки, а также вектор, содержащий шаблон вирусного вектора и дополнительные векторы для упаковки). Набор может также содержать положительные и отрицательные контрольные siРНК или экспрессирующие векторы shРНК (например, ненацеленные контрольные siРНК или siРНК, нацеленные на неродственную мРНК). Набор может также содержать реактивы для оценки нокдауна предполагаемого гена-мишени (например, праймеры и зонды для количественной ПЦР для обнаружения мРНК-мишени и/или антитела против соответствующих белков для вестерн-блотов). Альтернативно, набор может содержать последовательность siРНК или последовательность shРНК и инструкции и материалы, необходимые для получения siРНК путем транскрипции in vitro или для конструирования экспрессирующего вектора для shРНК.
Далее предложено фармацевтическое сочетание в форме набора, включающее, в виде упакованного сочетания, средства-носители, приспособленные для использования со средствами-контейнерами в непосредственной близости с ними, и первое средство-контейнер содержит композицию на основе интерферирующей РНК и приемлемого носителя. Подобные наборы могут далее включать в себя, если это требуется, один или более обычных компонентов фармацевтических наборов, таких как, например, контейнеры с одним или более фармацевтически приемлемым носителем, дополнительные контейнеры и т.д., как это будет очевидно специалистам в данной области. Также в набор могут быть включены печатные инструкции, как в виде вкладышей, так и в виде этикеток, указывающие количества компонентов, подлежащих введению, рекомендации по введению, и/или рекомендации по смешиванию компонентов.
Способность РНК, интерферирующих с TACE или TNFR1, к нокдауну уровней эндогенной экспрессии TACE или TNFR1, например, в клетках эпителия роговицы человека может быть оценена in vitro следующим образом. Трансформированные клетки эпителия роговицы человека, например клеточную линию CEPI-17 (Offord et al. (1999) Invest Ophthalmol Vis Sci. 40:1091-1101), высевали за 24 часа до трансфекции в среду KGM для кератиноцитов (Cambrex, East Rutherford, NJ). Трансфекцию производили с использованием DharmaFECT™ 1 (Dharmacon, Lafayette, CO) в соответствии с инструкциями производителя при концентрациях РНК, интерферирующих с TACE или TNFR1, изменяющихся от 0,1 нМ до 100 нМ. В качестве контрольных были использованы ненацеленные контрольные интерферирующие РНК и интерферирующая РНК, нацеленная на ламин А/С (Dharmacon). Уровни мРНК-мишени были оценены с применением кПЦР через 24 часа после трансфекции с использованием, например, прямых и обратных праймеров TAQMAN и набора зондов, охватывающего участок-мишень (Applied Biosystems, Foster City, CA). Уровни белка-мишени могут быть оценены приблизительно через 72 часа после трансфекции (реальное время зависит от скорости оборота белка), например, при помощи вестерн-блоттинга. Стандартные техники выделения РНК и/или белка из культивированных клеток хорошо известны специалистам в данной области. Для уменьшения вероятности неспецифического действия не на желаемую цель используется наименьшая концентрация РНК, интерферирующих с TACE или TNFR1, дающая желаемый уровень нокдауна экспрессии гена-мишени.
Специалисты в данной области, в свете представленного раскрытия, признают, что без отклонения от духа представленного изобретения и области его действия могут быть сделаны явные модификации раскрытых здесь вариантов осуществления. Все раскрытые здесь варианты осуществления могут быть воспроизведены без излишних экспериментов в свете представленного изобретения. Полная область действия изобретения установлена его раскрытием и эквивалентными вариантами осуществления. Спецификации на должны рассматриваться как неправомерно сужающие полную область защиты, на которую имеет право представленное изобретение.
В то время как были показаны и описаны определенные варианты осуществления изобретения, многочисленные вариации и альтернативные варианты осуществления будут ясны специалистам в данной области. Соответственно, подразумевается, что изобретение ограничено только прилагаемой формулой изобретения.
Изобретение может быть реализовано в иных конкретных формах без отклонения от духа или основных характеристик. Описанные варианты осуществления должны считаться во всех отношениях только иллюстративными, а не ограничивающими. Область действия изобретения, таким образом, скорее указана в приложенной формуле изобретения, чем в предшествующем описании. Все изменения в формуле изобретения, которые происходят в пределах значения и диапазона эквивалентности формуле изобретения охватываются областью его действия. Далее, все опубликованные документы, патенты и заявки, упомянутые здесь, приведены таким образом в виде ссылки, как если бы они присутствовали в полном объеме.
Пример 1
Интерферирующая РНК для специфического подавления TNFR1 в клетках GTM-3
Представленное исследование изучает способность интерферирующей с TNFR1 РНК к нокдауну уровней эндогенной экспрессии белка TNFR1 в культивируемых клетках GTM-3.
2
Трансфекцию клеток GTM-3 (Pang, LH. et al.,. 1994. Curr. Eye Res. 13:51-63) проводили in vitro с использованием стандартных концентраций siРНК TNFR1, siCONTROL RISC-свободной siРНК #1, или siCONTROL ненацеленной siРНК #2 (NTC2) (0,1-10 нМ), и трансфекционного препарата DHARMAFECT #1 (Dharmacon, Lafayette, CO). Все siРНК растворяли в IX буфере для siРНК, водном растворе 20 мМ KCl, 6 мМ HEPES (pH 7,5), 0,2 мМ MgCl. Контрольные образцы включали контроль буфера, в котором объем siРНК заменен на равный объем IX буфера для siРНК (-siРНК). Для оценки экспрессии белка TNFR1 проводили вестерн-блоттинг с применением антител против TNFR1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). siРНК TNFR1 представляла собой двухцепочечную интерферирующую РНК, имеющую специфичность в отношении следующих мишеней: siTNFR1 #1 нацелена на последовательность CAAAGGAACCUACUUGUAC (SEQ ID NO:202), из которой получена последовательность SEQ ID NO:96; siTNFR1 #2 нацелена на последовательность GAGCUUGAAGGAACUACUA (SEQ ID NO:203), из которой получена последовательность SEQ ID NO:97; siTNFR1 #3 нацелена на последовательность CACAGAGCCUAGACACUGA (SEQ ID NO:204), из которой получена последовательность SEQ ID NO:98; siTNFR1 #4 нацелена на последовательность UCCAAGCUCUACUCCAUUG (SEQ ID NO:205), из которой получена последовательность SEQ ID NO:99. Как показано данными на фиг. 1, siРНК siTNFR1 #1, siTNFR1 #2 и siTNFR1 #3 заметно подавляли экспрессию белка TNFR1 по отношению к контрольным siРНК при концентрациях 10 нМ и 1 нМ, но демонстрировали пониженную эффективность при 0,1 нМ. Особенно эффективными были siРНК siTNFR1 #2 и siTNFR1 #3. siРНК siTNFR1 #4 также показала ожидаемое, зависящее от концентрации понижение экспрессии TNFR1.