ОБНАРУЖЕНИЕ МИШЕНИ TSG ПРАЙМЕРОМ

1. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот с использованием праймера, генерирующего сигнал от мишени (TSG-праймера), включающий стадии:
(a) гибридизации нуклеиновокислотной последовательности-мишени с TSG-праймером; при этом TSG-праймер содержит (1) гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом если TSG-праймер не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, то репортерная молекула и молекула-гаситель пространственно располагаются близко друг к другу, что позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы; при этом если TSG-праймер гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, то репортерная молекула и молекула-гаситель пространственно разделяются, что не позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы, в результате чего генерируется и выявляется сигнал, указывающий на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) приведения в контакт продукта со стадии (а) с матричной полимеразой нуклеиновых кислот в условиях удлинения праймера, так что реакция 3'-удлинения индуцируется по 3'-концу TSG-праймера; и
(c) детекции сигнала, указывающего на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени, тем самым данный сигнал указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени в ДНК или смеси нуклеиновых кислот.
2. Способ по п.1, где матричная полимераза нуклеиновых кислот представляет собой матричную полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую 5'→3'-нуклеазной активностью, и TSG-праймер удлиняется по своему 3'-концу под действием полимеразной активности матричной полимеразы нуклеиновых кислот и расщепляется на своем 5'-конце под действием 5'→3'-нуклеазной активности матричной полимеразы нуклеиновых кислот, в результате чего из TSG-праймера высвобождается либо репортерная молекула, либо молекула-гаситель, генерируя сигнал, указывающий на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
3. Способ по п.2, дополнительно включающий повторение по меньшей мере дважды стадий (а)-(b) или (а)-(с) вместе со стадией денатурации между повторяющимися циклами с целью усиления сигнала, указывающего на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
4. Способ по п.1 или 2, где репортерная молекула или молекула-гаситель на TSG-праймере расположена на его 5'-конце или на расстоянии 1-5 нуклеотидов от его 5'-конца.
5. Способ по п.1, где молекула-гаситель представляет собой флуоресцентную молекулу и где сигнал, указывающий на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени, детектируемый на стадии (с), представляет собой сигнал от флуоресцентной молекулы-гасителя.
6. Способ по п.1, где матричная полимераза нуклеиновых кислот представляет собой матричную полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую 3'→5'-экзонуклеазной активностью.
7. Способ по п.6, где TSG-праймер содержит по меньшей мере один ошибочно спаренный нуклеотид, имеющий остов, устойчивый в отношении 3'→5'-экзонуклеазной активности матричной полимеразы нуклеиновых кислот на своем 3'-концевом участке.
8. Способ по п.1, который осуществляют на твердой фазе и где TSG-праймер иммобилизован через свой 5'-конец на поверхности твердой подложки.
9. Способ по п.1 или 8, где нуклеиновокислотная последовательность-мишень включает по меньшей мере два типа нуклеиновокислотных последовательностей, и TSG-праймеры включают по меньшей мере два типа праймеров.
10. Способ по п.1 или 8, где нуклеиновокислотная последовательность-мишень имеет вариабельность нуклеотидов.
11. Способ детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот с использованием праймера, генерирующего сигнал от мишени, (TSG-праймера) в реакции амплификации, включающий стадии:
(а) гибридизации нуклеиновокислотной последовательности-мишени с использованием пары праймеров, состоящей из двух праймеров в качестве прямого праймера и обратного праймера, способных амплифицировать нуклеиновокислотную последовательность-мишень; при этом по меньшей мере один из этих двух праймеров представляет собой TSG-праймер; при этом TSG-праймер содержит (1) гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом если TSG-праймер не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, то репортерная молекула и молекула-гаситель пространственно располагаются близко друг к другу, что позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы; при этом если TSG-праймер гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, то репортерная молекула и молекула-гаситель пространственно разделяются, что не позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы, в результате чего генерируется и выявляется сигнал, указывающий на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) приведения в контакт продукта со стадии (а) с матричной полимеразой нуклеиновых кислот в условиях удлинения праймера, так что реакция 3'-удлинения индуцируется по 3'-концам этих двух праймеров;
(c) денатурации продукта со стадии (b);
(d) повторение стадий (а)-(с) по меньшей мере дважды с целью как амплификации нуклеиновокислотной последовательности-мишени, так и усиления сигнала, указывающего на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени; и
(e) детекции сигнала, указывающего на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени, при этом детекцию осуществляют для каждого цикла повторного проведения стадии (d), в конце повторного проведения стадии (d) или в каждый из предварительно заданных интервалов времени в процессе повторного проведения, тем самым данный сигнал указывает на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
12. Способ по п.11, где матричная полимераза нуклеиновых кислот представляет собой матричную полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую 5'→3'-нуклеазной активностью, и TSG-праймер удлиняется по своему 3'-концу под действием полимеразной активности матричной полимеразы нуклеиновых кислот и расщепляется на своем 5'-конце под действием 5'→3'-нуклеазной активности матричной полимеразы нуклеиновых кислот, в результате чего из TSG-праймера высвобождается либо репортерная молекула, либо молекула-гаситель, генерируя сигнал, указывающий на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
13. Способ по п.11 или 12, где репортерная молекула или молекула-гаситель на TSG-праймере расположена на его 5'-конце или на расстоянии 1-5 нуклеотидов от его 5'-конца.
14. Способ по п.11, где молекула-гаситель представляет собой флуоресцентную молекулу и где сигнал, указывающий на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени, детектируемый на стадии (е), представляет собой сигнал от флуоресцентной молекулы-гасителя.
15. Способ по п.11, где матричная полимераза нуклеиновых кислот представляет собой матричную полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую 3'→5'-экзонуклеазной активностью.
16. Способ по п.11, который осуществляют на твердой фазе, где по меньшей мере один из этих двух праймеров иммобилизован через свой 5'-конец на поверхности твердой подложки и где иммобилизованный праймер представляет собой TSG-праймер.
17. Набор для детекции нуклеиновокислотной последовательности-мишени из ДНК или смеси нуклеиновых кислот с использованием праймера, генерирующего сигнал от мишени, (TSG-праймера), содержащий:
(a) TSG-праймер, содержащий (1) гибридизующуюся нуклеотидную последовательность, комплементарную нуклеиновокислотной последовательности-мишени, и (2) репортерную молекулу и молекулу-гаситель; при этом если TSG-праймер не гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, то репортерная молекула и молекула-гаситель пространственно располагаются близко друг к другу, что позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы; при этом если TSG-праймер гибридизуется с нуклеиновокислотной последовательностью-мишенью, то репортерная молекула и молекула-гаситель пространственно разделяются, что не позволяет молекуле-гасителю гасить сигнал от репортерной молекулы, в результате чего генерируется и выявляется сигнал, указывающий на присутствие нуклеиновокислотной последовательности-мишени;
(b) матричную полимеразу нуклеиновых кислот, способную индуцировать реакцию 3'-удлинения по 3'-концу TSG-праймера в результате действия на продукт гибридизации TSG-праймера и нуклеиновокислотной последовательности-мишени.
18. Набор по п.17, содержащий пару праймеров, состоящую из двух праймеров в качестве прямого праймера и обратного праймера, способных амплифицировать нуклеиновокислотную последовательность-мишень; при этом по меньшей мере один из этих двух праймеров представляет собой TSG-праймер.
19. Набор по п.17 или 18, где матричная полимераза нуклеиновых кислот обладает 5'→3'-нуклеазной активностью для индукции как реакции 3'-удлинения по 3'-концу TSG-праймера в результате проявления ее полимеразной активности, так и реакции 5'-расщепления на 5'-конце TSG-праймера в результате проявления ее 5'→3'-нуклеазной активности.
20. Набор по любому из пп.17 и 18, где репортерная молекула или молекула-гаситель на TSG-праймере расположена на его 5'-конце или на расстоянии 1-5 нуклеотидов от его 5'-конца.
21. Набор по п.17 или 18, где матричная полимераза нуклеиновых кислот представляет собой матричную полимеразу нуклеиновых кислот, обладающую 3'→5'-экзонуклеазной активностью.