ШТАММ RHODOCOCCUS RHODOCHROUS NCIMB 41164 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В КАЧЕСТВЕ ПРОДУЦЕНТА НИТРИЛГИДРАТАЗЫ
RHODOCOCCUS RHODOCHROUS NCIMB 41164 STRAIN AND USE THEREOF AS NITRILE HYDRASE PRODUCER

Настоящее изобретение относится к микроорганизму и способам культивирования и хранения микроорганизма. Изобретение относится также к новому ферменту нитрилгидратазе, а также к способу превращения нитрила в амид с помощью фермента нитрилгидратазы.
Хорошо известно применение биокатализаторов, таких как содержащие ферменты микроорганизмы, для осуществления химических реакций. Установлено, что ферменты нитрилгидратазы катализируют гидратацию нитрилов, непосредственно приводящую к образованию соответствующих амидов. Как правило, ферменты нитрилгидратазы могут продуцироваться различными микроорганизмами, например микроорганизмами, относящимися к роду Bacillus, Bacteridium, Micrococcus, Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas, Acinetobacter, Xanthobacter, Streptomyces, Rhizobium, Klebsiella, Enterobacter, Erwinia, Aeromonas, Citrobacter, Achromobacter, Agrobacterium, Pseudonocardia и Rhodococcus.
Во многих публикациях описан синтез нитрилгидратазы микроорганизмами. У Arnaud и др., Agric. Biol. Chem. 41: (11), 1977, сс.2183-2191 описаны характеристики фермента, который авторы назвали “ацетонитролазой”, продуцируемого Brevibacterium sp.R312, который расщепляет ацетонитрил до ацетата с образованием амидного промежуточного продукта. Asano и др., Agric. Biol. Chem. 46: (5), 1982, сс.1183-1189 выделили штамм Pseudomonas chlororaphis B23, который продуцирует нитрилгидратазу, катализирующую превращение акрилонитрила в акриламид, что позволяет получать 400 г/л акриламида. В статье Yamada и др., Agric. Biol. Chem. 50: (11), 1986, сс.2859-2865, озаглавленной "Optimum culture conditions for production by Pseudomonas chlororaphis B23 of nitrile hydratase", рассмотрена оптимизация компонентов питательной среды, в том числе добавление индуктора для синтеза нитрилгидратазы. Было установлено, что для рассматриваемого микроорганизма наилучшим индуктором является метакриламид. Метакриламид добавляли в культуру на начальной стадии роста.
Было установлено, что различные штаммы видов Rhodococcus rhodochrous очень эффективно продуцируют фермент нитрилгидратазу.
В ЕР-0307926 описано культивирование Rhodococcus rhodochrous, прежде всего штамма J1, в культуральной среде, содержащей ионы кобальта. Описан процесс биологического получения амида, заключающийся в том, что нитрил гидратируют с помощью нитрилгидратазы, продуцируемой штаммом Rhodococcus rhodochrous J1, который культивируют в присутствии иона кобальта. Описано применение различных индукторов (включая кротонамид) для синтеза нитрилгидратазы. В одном варианте осуществления изобретения амид получают в культуральной среде для микроорганизма, в которой присутствует субстрат, представляющий собой нитрил. В другом варианте осуществления изобретения субстрат, представляющий собой нитрил, добавляют в культуральную среду, в которой накоплена нитрилгидратаза, для осуществления реакции гидратации. Приведено также описание метода выделения клеток микроорганизма и поддерживания их в пригодном носителе, например путем иммобилизации, и последующего приведения в контакт с субстратом. Нитрилгидратазу можно применять для гидратации нитрилов с образованием амидов и, в частности, для превращения 3-цианпиридина в никотинамид.
В ЕР-0362829 описан метод культивирования бактерий вида Rhodococcus rhodochrous,
в котором используют по меньшей мере один ион мочевины и кобальта для получения клеток Rhodococcus rhodochrous, обладающих нитрилгидратазной активностью. В частности, описана индукция производства нитрилгидратазы штаммом Rhodococcus rhodochrous J1 с использованием мочевины или производных мочевины, которые существенно повышают нитрилгидратазную активность. Мочевину или ее производные добавляют в культуральную среду в виде одной партии однократно или последовательно и осуществляют культивирование в течение 30 ч или более, например, в течение периода времени вплоть до 120 ч.
В статье Nagasawa и др., Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, 1991, сс.783-788, озаглавленной "Optimum culture conditions for the production of cobalt-containing nitrile hydratase by Rhodococcus rhodochrous J1”, описано выделение штамма J1 в качестве штамма, использующего ацетонитрил для синтеза двух различных нитрилгидратаз и нитрилазы в зависимости от применяемых условий культивирования. Мочевина и аналоги мочевины оптимально индуцируют производство одной из нитрилгидратаз. Мочевину добавляют в начале процесса культивирования и, по-видимому, она является эффективным индуктором только в том случае, если основная среда обогащена питательными веществами. Индукция фермента начинается постепенно и возрастает до тех пор, пока не достигнет максимума после культивирования в течение 5 дней. Было установлено, что активность снижается при продолжении культивирования.
Штамм Rhodococcus rhodochrous J1 применяют также в промышленном масштабе для получения мономера акриламида из акрилонитрила и этот процесс описан у Nagasawa и Yamada, Pure Appl. Chem. 67, 1995, сс.1241-1256.
В статье Leonova и др., Appl. Biochem. Biotechnol. 88, 2000, сс.231-241, озаглавленной "Nitrile Hydratase of Rhodococcus", описаны выращивание штамма Rhodococcus rhodochrous M8 и синтез им нитрилгидратазы. Синтез нитрилгидратазы этим штаммом индуцируют в присутствии мочевины в среде, где мочевина является также источником азота для роста указанного микроорганизма. Для обеспечения высокой активности нитрилгидратазы требуется также кобальт. В этой публикации рассматривается также в целом индукция и метаболические воздействия.
У Leonova и др., Appl. Biochem. Biotechnol. 88, 2000, сс.231-241, указано также, что в России акриламид получают в промышленном масштабе с использованием штамма Rhodococcus rhodochrous M8. Штамм Rhodococcus rhodochrous M8 описан в патенте России 1731814.
Штамм Rhodococcus rhodochrous M33, продуцирующий нитрилгидратазу без индуктора, такого как мочевина, описан в US-A-5827699. Этот штамм микроорганизма выведен из штамма Rhodococcus rhodochrous M8.
Получать мономер акриламида целесообразно, в частности, путем биокатализа. В обзоре Yamada и Kobayashi, Biosci. Biotech. Biochem. 60, (9), 1996, сс.1391-1400, озаглавленном "Nitrile Hydratase and its Application to Industrial Production of Acrylamide", приведены подробные сведения о разработке биокаталитического метода получения акриламида. Приведены некоторые данные о трех наиболее эффективных катализаторах и их характеристиках с точки зрения получения акриламида и, в частности, катализатор третьего поколения Rhodococcus rhodochrous J1.
Основным недостатком применения биокатализаторов является в целом недостаточная стабильность влажного микроорганического продукта при хранении, транспортировке и применении. Даже при использовании относительно стабильных ферментов и бактерий, например нитрилгидратаз, продуцируемых клетками Rhodococcal, возможность порчи до применения приводит в данной отрасли промышленности к необходимости осуществления определенной обработки предназначенной для биокатализа клеточной суспензии, например путем замораживания или сушки вымораживанием водной смеси или в альтернативном варианте путем иммобилизации клеток в определенном полимерном матриксе. Для достижения максимальной продуктивности биокатализатора важно, чтобы его максимальная биокаталитическая активность сохранялась в процессе его получения и хранения до применения. У Chaplin и Bucke в: Enzyme Technology, изд-во Cambridge University Press, 1990, с.47 (Получение и применение фермента) указано, что инактивация фермента может обусловливаться нагревом, протеолизом субоптимальным значением рН, окислительными денатурирующими агентами (денатурантами) и необратимыми ингибиторами. Многие субстанции могут приводить к снижению способности ферментов катализировать реакцию. К ним относятся субстанции, являющиеся неспецифическими денатурантами белков, такими как мочевина.
В презентации Willem J.H. van Berkel, «Protein Stability», Wageningen University, рассмотрены факторы, которые могут вызывать деактивацию или нарушение укладки, и они включают протеазы, окисление, вызываемое присутствием кислорода или кислородных радикалов, и денатурирующие агенты, вызывающие необратимое нарушение укладки, такие как мочевина.
У Chaplin и Bucke в: Enzyme Technology, изд-во Cambridge University Press, 1990, с.47 (Получение и применение фермента) указано, что имеющим решающее значение фактором с точки зрения сохранения ферментативной активности является поддержание конформации структуры фермента. Таким образом, важно обеспечивать предупреждения нарушения укладки, агрегации и изменений ковалентной структуры. Для этой цели предложены три подхода: (1) применение добавок; (2) контролируемое применение ковалентной модификации; и (3) иммобилизация фермента.
В ЕР-В-0243967 описан метод сохранения нитрилгидратазной активности нитрилазы путем добавления стабилизирующих соединений, выбранных из группы, включающей нитрилы, амиды и органические кислоты и их соли, к раствору или суспензии фермента, либо к иммобилизованной форме фермента. В описании однозначно указано, что поскольку раствор или суспензия микроорганизма способна продуцировать нитралазу, которая гидратирует нитрилы, такие как акрилонитрил, с получением соответствующих амидов, таких как акриламид, то ее можно хранить при комнатной температуре в течение короткого периода времени, предпочтительно хранить ее при пониженной температуре, прежде всего при температуре примерно 0°С. В ЕР-А-0707061 указано, что добавление неорганических солей в концентрации от примерно 100 мМ до насыщающей концентрации неорганических солей к водной среде, содержащей либо суспензию клеток микроорганизмов, либо иммобилизованные клетки микроорганизмов, позволяет сохранять клетки и ферментативную активность в течение продолжительного периода времени. Этот метод описан применительно к сохранению клеток микроорганизмов, обладающих нитрилгидратазной или нитрилазной активностью. Добавление бикарбонатов или карбонатов к водному раствору иммобилизованных или неиммобилизованных клеток микроорганизмов, обладающих нитрилазной активностью, описано в US-B-6368804. Иммобилизацию часто применяют для удаления фермента из целой клетки перед иммобилизацией фермента в матриксе. Однако, хотя такая иммобилизация обеспечивает очень хорошую защиту фермента, экстракция фермента из целой клетки представляет собой сложную стадию, которая требует больших временных затрат, является дорогостоящей и может приводить к потере фермента. Кроме того, можно иммобилизовывать целые клетки микроорганизмов. В US-A-5567608 описан процесс иммобилизации биокатализатора, представляющего собой целые клетки, в катионном сополимере, обеспечивающий хорошую стабильность при хранении и предупреждающий разложение.
Штамм Rhodococcus rhodochrous J1, который применяют в промышленном масштабе для производства акриламидного мономера, иммобилизуют для (а) обеспечения транспортировки и (б) увеличения срока службы (долговечности) применяемого биокатализатора. В US-A-5567608 авторами указано, что биокатализаторы при применении в промышленном масштабе, как правило, иммобилизуют, для облегчения отделения биокатализатора от продукта реакции, предупреждения элюирования примесей из биокатализатора в продукт и для облегчения непрерывных процессов и восстановления биокатализатора. Однако иммобилизация представляет собой дополнительную стадию обработки, которая требует дополнительных производственных мощностей и возможного использования многих других исходных продуктов, таких как альгинат, каррагенин, акриламид и другие акрилатные мономеры, и виниловый спирт. Таким образом, она является дорогостоящей стадией обработки.
Для минимизации вредных воздействий инактивации фермента с целью уменьшения негативного влияния на процесс химической реакции предложены различные другие пути.
Известен также метод сушки вымораживанием для сохранения активности фермента при хранении в течение продолжительного периода времени. Это также представляет собой потенциально дорогостоящую стадию обработки, которую, как правило, осуществляют для биокатализаторов, приготавливаемых для маломасштабного производства. Криоконсервация в жидком азоте или паровой фазе жидкого азота также позволяет обеспечивать хранение клеток микроорганизмов в течение продолжительного периода времени, но требует постоянной подачи жидкого азота. Известно также применение замораживания выделенной биомассы либо получистых или чистых ферментов при температурах <-18°С с целью сохранения биокаталитической активности в течение продолжительных периодов времени.
Кроме того, когда клеточную массу вносят в реактор и происходит реакция, минимизация потери эффективности имеет решающее значение для эффективности эксплуатации и экономичности процесса. И в этом случае также стандартной процедурой оптимизации параметров этого процесса является иммобилизация клеток микроорганизмов в определенном полимерном матриксе.
Таким образом, существует необходимость в разработке процесса и биокатализатора, которые позволяют преодолеть указанные недостатки.
В настоящем изобретении предложен микроорганизм, представляющий собой штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 или его мутант.
Было установлено, что этот новый микроорганизм эффективно продуцирует нитрилгидратазу. При создании изобретения было установлено, что этот новый микроорганизм (и продуцируемую им нитрилгидратазу) можно использовать в процессе превращения нитрилов в амид. Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 наиболее предпочтительно применяют для превращения (мет)акрилонитрила в (мет)акриламид. Было установлено, что микроорганизм и фермент сохраняют активность и в некоторых случаях их активность даже повышается в течение при хранении продолжительных периодов времени и, кроме того, их можно выделять из реакционной смеси после получения акриламида в количестве >50 мас.% без понижения активности. Таким образом, при необходимости его можно использовать повторно либо сразу, либо после дополнительного периода хранения.
Ниже приведены характеристики нового штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164:
1. Происхождение и депонирование
При создании изобретения штамм Rhodococcus rhodochrous был выделен из почвы в Брадфорде, Великобритания, и согласно Будапештскому договору депонирован 5 марта 2003 в Национальной коллекции промышленных и морских бактерий (National Collection of Industrial and Marine Bacteria) (NCIMB) под регистрационным номером NCIMB 41164.
2. Таксономическая идентификация микроорганизма
Идентификацию почвенного изолята проводили с помощью метода анализа на основе 168-рДНК. Последовательность гена 168-рДНК, полученную из почвенного изолята, сравнивали с базами данных нуклеотидных последовательностей. Полученную последовательность сравнивали с последовательностями, обнаруженными в соответствующей безе данных (Microseq™) и выявляли 20 наиболее близких последовательностей. Сравнение последовательности с этой базой данных позволило установить наибольшее сходство с Rhodococcus rhodochrous (сходство на 97,48%). Хотя это сходство было определено на уровне рода, наиболее вероятно, что штамм относился к виду Rhodococcus rhodochrous. В результате дальнейшего поиска с использованием доступной для научной общественности базы данных Европейской лаборатории молекулярной биологии (EMBL) был установлен наиболее высокий уровень сходства в этой базе данных с видом Rhodococcus rhodochrous (составляющее 99,698%).
3. Морфологические и культуральные характеристики
(1) Полиморфный рост
(2) Подвижность: неподвижный
(3) Неспорообразующий
(4) Грамположительный
(5) Аэробный
(6) При выращивании на культуральном агаре в течение 48 ч при 30°С образует круглые колонии оранжево-розового цвета
4. Культивирование и синтез нитрилгидратазы
Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164, предлагаемый в настоящем изобретении, можно культивировать в любых условиях, пригодных для рассматриваемой цели с помощью любых известных методов, например, описанных в указанных выше прототипах. Предпочтительно микроорганизм культивируют в культуральной среде, которая содержит мочевину или производное мочевины. При создании изобретения было установлено, что этот микроорганизм можно выращивать в среде, содержащей ацетонитрил или акрилонитрил в качестве индуктора нитрилгидратазы. В присутствии мочевины или производного мочевины в качестве индуктора и хлорида кобальта в качестве источника ионов кобальта можно достигать очень высоких уровней нитрилгидратазной активности. Мочевину и кобальт можно, например, добавлять в среду, описанную в экспериментальных примерах.
-1
Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 предпочтительно следует культивировать до достижения высокой ферментативной активности, составляющей, например, примерно 250-300000 мкмолей мин/г сухой биомассы при 15°С. Высокую нитрилгидратазную активность можно обеспечивать, если в культуральной среде присутствует мочевина или производное мочевины. Они могут присутствовать при начале культивирования или их можно добавлять в определенный момент времени в процессе роста, но, как правило, их следует добавлять до наступления стационарной фазы роста. Предпочтительно высокой нитрилгидратазной активности можно достигать в том случае, если мочевина или производное мочевины не присутствуют в каких-либо заметных количествах в культуральной среде в начале роста микроорганизма, а их вносят позднее. Это означает, что мочевина или производное мочевины не присутствует совсем или присутствует в концентрации менее 0,2 г/л, предпочтительно менее 0,1 г/л. Более предпочтительно культуральная среда практически не содержит мочевины или производного мочевины (т.е. их концентрация составляет менее 0,2 г/л) в течение по меньшей мере первых шести часов роста микроорганизма. Наиболее предпочтительно, когда культуральная среда для микроорганизма практически не содержит мочевины или производного мочевины в течение по меньшей мере 12 ч, а в некоторых случаях по меньшей мере в течение 24 ч до внесения мочевины или производного мочевины, поскольку скорость роста микроорганизма выше в отсутствии мочевины или производного мочевины, но когда ее добавляют не позднее 48 ч после начала культивирования микроорганизма. При создании изобретения было установлено, что это обеспечивает достижение более высокой нитрилгидратазной активности в течение более короткого периода времени по сравнению с вариантом, когда мочевину или производное мочевины добавляют в начале культивирования.
Объектом изобретения является также нитрилгидратаза, полученная из микроорганизма, представляющего собой штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB
41164 или его мутант.
Следующим объектом изобретения является способ получения амида из соответствующего нитрила, заключающийся в том, что нитрил подвергают реакции гидратации в водной среде в присутствии биокатализатора, выбранного из группы, включающей микроорганизм, представляющий собой штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164, его мутант, и нитрилгидратазу получают с помощью штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 или его мутанта. Ниже в настоящем описании понятие “биокатализатор” относится к нитрилгидратазе, которую синтезирует клетка Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164, и может относиться также к самой клетке Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164. Таким образом, биокатализатор можно применять как в виде препарата, содержащего целые клетки в ферментативной среде, такой как водная суспензия, выделенная клеточная паста, например препарат иммобилизованных клеток, так и в виде любой другой формы нитрилгидратазы, пригодной для превращения нитрила в амид, которая удовлетворяет условиям настоящего изобретения.
Указанный способ наиболее пригоден для быстрого получения амида из соответствующего нитрила. В частности, можно получать высококонцентрированные водные растворы амида. Способ особенно предпочтителен для получения акриламида или метакриламида.
Для получения амида из нитрила можно применять биокатализатор в виде катализатора, представляющего собой целые клетки. Биокатализатор может быть иммобилизован, например погружен в гель, или предпочтительно его можно применять в виде суспензии свободных клеток. В альтернативном варианте можно экстрагировать фермент нитрилгидратазу и применять, например, непосредственно в способе получения амида.
В одном предпочтительном варианте осуществления способа биокатализатор вносят в водную среду, пригодную для культивирования микроорганизма. Как правило, можно получать суспензию биокатализатора, например, целых клеток микроорганизма. Нитрил, например акрилонитрил или метакрилонитрил, вносят в водную среду, содержащую биокатализатор, таким образом, чтобы концентрация (мет)акрилонитрила в водной среде поддерживалась на уровне вплоть до 6 мас.%. Более предпочтительно нитрил, такой как акрилонитрил или метакрилонитрил, вносят в реакционную среду и реакции дают происходить до тех пор, пока концентрация амида, например акриламида или метакриламида, не достигнет требуемого уровня, составляющего, в частности, например от 30 до 55 мас.%. Наиболее предпочтительно концентрация составляет примерно 50 мас.%.
Указанный новый штамм Rhodococcus rhodochrous (NCIMB 41164) обладает способностью продуцировать высокие концентрации акриламида в водных растворах (содержащих, например 50% акриламида). Предпочтительно реакцию следует осуществлять на основе способа с использованием свободных клеток в биореакторе периодического типа с подпиткой, в который биокатализатор (штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164) добавляют в форме ферментативного бульона или в виде собранной биомассы.
Активность биокатализатора (штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164) и продуцируемой им нитрилгидратазы должна быть такой, чтобы их можно было рециркулировать и повторно использовать для дальнейшей гидратации нитрила с образованием соответствующего амида.
Рециркуляция биокатализатора особенно предпочтительна для любого варианта превращения (мет)акрилонитрила в (мет)акриламид. Так, при производстве акриламида после завершения процесса реакции и получения акриламида в соответствующей концентрации катализатор можно удалять и повторно использовать без потери нитрилгидратазной активности для получения другой партии акриламида. Это можно осуществлять даже после того, как биокатализатор хранят в воде в течение нескольких дней (например, трех дней) перед повторным применением. Можно даже приготавливать третью партию акриламида даже после дополнительного хранения.
Одним из объектов изобретения является водная композиция, содержащая биокатализатор, который получен или может быть получен из микроорганизма, представляющего собой штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 или его мутант, причем биокатализатор находится в форме неактивно растущих свободных клеток микроорганизма. В заявке предложен также способ хранения биокатализатора, который находится в форме неактивно растущих свободных клеток микроорганизма.
Клетки микроорганизма, представляющие собой биокатализатор, используемые для осуществления превращения нитрила в амид, можно рассматривать как неактивно растущую культуру. В контексте настоящего описания это означает, что среда и условия хранения, в которых содержат микроорганизм, не должны стимулировать рост. Среда для хранения может представлять собой, например, клетки штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164, которые могут быть выделены из ферментативной среды. Клетки можно применять непосредственно в ферментативной среде или они могут находится в виде водной суспензии в пригодной для суспендирования среде, например воде, физиологическом солевом растворе, пригодном буферном растворе, таком как фосфатный буфер или любой аналогичный буфер, или в культуральной среде, в которой метаболизм клеток микроорганизма практически отсутствует, что определяют путем измерения скорости роста или концентрации биомассы, или поглощения кислорода, или поглощения питательных веществ, либо другого метода измерения, обычно применяемого для мониторинга роста и метаболизма микроорганизма.
Композиция или среда для хранения могут содержать любые остаточные компоненты ферментативного бульона. Ферментативный бульон может содержать любые обычные ингредиенты, применяемые для культивирования микроорганизма, может содержать также продукты и побочные продукты, продуцируемые микроорганизмом. К обычным компонентам ферментативного бульона относятся сахара, полисахариды, белки, пептиды, аминокислоты, источники азота, неорганические соли, витамины, регуляторы роста и индукторы ферментов. В частности, они могут представлять собой моносахариды или дисахариды в качестве сахаров; аммониевые соли или другие источники азота; неорганические соли, такие как фосфаты, сульфаты, соли магния, кальция, натрия и калия; содержащие металл соединения; витамины; и сложные компоненты ферментативной среды, например жидкость, полученную после замачивания зерен кукурузы до набухания; пептон; дрожжевой экстракт; органические или неорганические соединения, которые можно применять для обеспечения конкретных требований к росту микроорганизма; специфические индукторы фермента (такие как мочевина, которую применяют для индукции нитрилгидратазы, продуцируемой штаммом Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164); и органические кислоты, такие как цитрат или пируват; а также любые другие органические или неорганические соединения, которые могут требоваться для обеспечения соответствующего роста штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164.
Как правило, когда биокатализатор, такой, который продуцирует нитрилгидратазу, хранят без продолжения роста в течение некоторого периода времени, даже в течение нескольких дней, обычно удаляют клетки микроорганизма из ферментативного бульона, независимо от того, представляет ли биокатализатор клетки, используемые в качестве катализатора, или фермент, выделенный из клеток или ферментативной среды. Необходимо предотвращать рост микробов в ферментативном бульоне, вызывающий разложение бульона, и снижать протеазную активность, которая может вызывать расщепление требуемого фермента. Таким образом, обычно для сохранения ферментативного бульона per se или для удаления клеток предупреждают расщепление биокатализатора, обусловленное нецелевой биологической активностью, например, вызванной микробным загрязнением. Как правило, если не осуществлять такие мероприятия, то следует ожидать очень быстрого снижения биокаталитической активности, например в течение одного дня, и безусловно в течение менее чем двух дней.
Методы сохранения активности в процессе хранения биокатализатора даже в течение периодов времени вплоть до одной недели, как правило, заключаются в том, что биокатализатор удаляют из ферментативного бульона и/или иммобилизуют биокатализатор в пригодном матриксе, и/или стабилизируют с помощью стабилизаторов, которые либо становятся примесями в реакционной смеси, что может явиться проблемой в дальнейшем, либо это требует дополнительной стадии обработки для удаления стабилизатора или добавки из суспензии клеток микроорганизма перед использованием в качестве биокатализатора.
При отсутствии таких консервирующих обработок, как правило, биокатализаторы, которые хранят при температуре окружающей среды, имеют тенденцию терять активность до такого уровня, когда они становятся неэффективными или даже непригодными для каталитических реакций.
Рост микроорганизма, применяемого в качестве биокатализатора, может происходить в течение нескольких дней. В течение этого периода времени происходит активный рост микроорганизма, это означает, что происходит сбалансированный рост, при котором увеличивается биомасса одновременно с увеличением и поддержанием общего химического состава клетки.
Как правило, рост микроорганизмов ограничивается либо истощением питательных веществ, либо накоплением токсичных продуктов метаболизма, что приводит к снижению скорости роста. Рост поддерживают путем внесения соответствующих питательных веществ и поддержания требуемых для роста температуры и значения рН и при необходимости путем подачи кислорода.
Представленный в настоящем описании способ хранения обеспечивает необходимую стабильность, так что биокатализатор легко можно использовать без какой-либо значительной потери активности. Устойчивость при хранении обеспечивают, не прибегая, например к иммобилизации, добавлению стабилизаторов или сушке вымораживанием. Устойчивость при хранении можно обеспечивать, не прибегая к удалению каких-либо компонентов бульона, таких как мочевина или производные мочевины, даже несмотря на то, что мочевина является известным деактиватором белка.
Композиция или окружающая среда, используемые в способе хранения, могут содержать кислород или представлять собой практически бескислородную окружающую среду. В контексте настоящего описания понятие «бескислородный» означает, что концентрация растворенного кислорода должна составлять менее 1%. Удаление кислорода из ферментативного бульона можно осуществлять любыми стандартными методами удаления кислорода. К ним относятся продувание в течение определенного периода времени инертным газом, удаление любых продуктов в свободном пространстве над жидкостью в контейнере для хранения, хранение при пониженном давлении или добавление известных акцепторов кислорода, таких как аскорбиновая кислота или гидразин, или гидразид.
Следовало ожидать, что после 2 и особенно после нескольких дней хранения может происходить некоторая потеря нитрилгидратазной активности. Это следовало ожидать даже в отсутствии кислорода. Это следовало ожидать прежде всего в присутствии остаточных компонентов ферментативного бульона, таких как мочевина, а также при хранении при температурах выше 0°С. Это обусловлено тем, что ферменты в биокатализаторе, представляющие собой протеазы, могут расщеплять другие белки в клетке, включая нитрилгидратазу. Кроме того, присутствие мочевины или производного мочевины может оказаться вредным, поскольку известно, что мочевина является деактиватором белка. Однако биокатализатор не имеет никаких ожидаемых недостатков и, таким образом, не приводит к каким-либо значительным потерям нитрилгидратазной активности.
Напротив, при создании изобретения было установлено, что в течение периода хранения активность биокатализатора, содержащего нитрилгидратазу, в некоторых случаях фактически может повышаться. Таким образом, еще одним объектом изобретения является способ повышения нитрилгидратазной активности биокатализатора, способного продуцировать нитрилгидратазу, заключающийся в том, что биокатализатор хранят в среде для хранения согласно способу хранения, предлагаемому в настоящем изобретении. Следовательно, способ может позволять получать новую биокаталитическую композицию посредством повышения ее активности. Таким образом, нитрилгидратаза, входящая в состав биокаталитической композиции и, в частности, образующаяся в процессе хранения биокатализатора, является новой. Кроме того, биокатализатор не создает неприятных запахов, связанных с разложением в течение периода хранения.
Предпочтительно способ хранения позволяет хранить биокатализатор в течение по меньшей мере двух дней и более предпочтительно в течение одной или нескольких недель. В частности, биокатализатор можно хранить в течение периода времени от 3 до 28 дней, например, от 3 до 14 дней.
Присутствие компонентов ферментативного бульона, таких как мочевина, не является существенным для композиции или способа хранения, предлагаемых в этом варианте осуществления изобретения. Когда присутствуют компоненты ферментативного бульона, они могут представлять собой мочевину или производное мочевины. Производное мочевины может представлять собой, например, алкильное производное мочевины.
Мочевина или производное мочевины могут присутствовать в биокаталитической композиции в результате ее включения в ферментативную смесь. В одном из вариантов осуществления изобретения композиция или среда для хранения, содержащая биокатализатор, может быть деоксигенирована и содержать компоненты ферментативного бульона, такие как мочевина.
Наиболее предпочтительным отличительным признаком этого варианта осуществления изобретения является то, что в отличие от прототипов не требуется отделять биокатализатор от ферментативной среды, в которой его культивировали. Это имеет существенное значение, поскольку позволяет избежать дополнительной стадии обработки. Таким образом, композиция может содержать также ферментативную смесь, которую затем помещают на хранение. При разработке способа хранения биокатализатора было установлено также, что его можно осуществлять в присутствии ферментативной смеси, что не оказывает каких-либо неблагоприятных воздействий на активность фермента. Кроме того, это позволяет применять ферментативный бульон либо сразу же для катализа реакции, либо его можно хранить без ущерба в течение нескольких дней или даже недель, пока осуществляют стадию биопревращения, которая занимает также несколько дней, что гарантирует постоянное снабжение легко пригодным для использования биокатализатором без необходимости осуществления дополнительных стадий обработки, упрощая тем самым стадию биопревращения и уменьшая ее стоимость.
Биокатализатор можно хранить при температурах выше его точки замерзания. Как правило, биокатализатор можно хранить при температурах окружающей среды, например вплоть до 30 или 40°С. Преимущество способа, предлагаемого в настоящем изобретении, заключается в том, что биокатализатор можно хранить при температурах окружающей среды без специальных мер предосторожности в отношении мониторинга и контроля температуры. Предпочтительно биокатализатор хранят при температуре от 4 до 30 или 40°С, более предпочтительно от 5 до 25°С, например от 10 до 25°С и прежде всего от 15 до 25°С.
Следующим объектом настоящего изобретения является способ получения амида, заключающийся в том, что приводят в контакт нитрил с нитрилгидратазой, где биокатализатор представляет собой часть композиции или его хранят в форме неактивно растущего свободноклеточного микроорганизм в среде для хранения, причем композиция или среда для хранения представляют собой ферментативный бульон, а биокатализатор является (или его получают из) микроорганизмом, представляющим собой штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 или его мутант.
Таким образом, согласно этому объекту изобретения биокатализатор можно хранить в содержащей кислород окружающей среде или содержать в бескислородной окружающей среде. Перед началом превращения нитрила она может содержать или может не содержать остаточные компоненты ферментативного бульона, такие как мочевина. Она может быть получена путем хранения биокатализатора согласно способу хранения, предлагаемому в настоящем изобретении, или в альтернативном варианте она может представлять собой композицию, предлагаемую в настоящем изобретении.
Как указано выше, не требуется удалять биокатализатор из ферментативной смеси, в которой получают биокатализатор. Таким образом, в предпочтительном варианте осуществления изобретения окружающая среда, в которой хранят биокатализатор, содержит также компоненты ферментативного бульона. Следовательно, биокаталитическую композицию, содержащую компоненты ферментативного бульона, можно объединять с нитрилом, который затем в результате гидратации превращается в соответствующий амид. При создании изобретения неожиданно было установлено, что в отличие от известных прототипов, например US-A-5567608, в котором указано, что для предотвращения элюирования примесей из биокатализатора в продукт реакции предпочтительной является иммобилизация биокатализатора, включение ферментативного бульона в реакционную смесь не ухудшает качество конечного продукта, что описано в поданной в соавторстве заявке UK 0327901.5, зарегистрированной в деле под номером ВТ/3-22349/Р1.
Ферментативная смесь должна содержать необходимые компоненты для обеспечения роста и поддержания микроорганизмов. В целом смесь должна содержать по меньшей мере источник углерода, источник азота и различные питательные вещества. Они могут представлять собой сахарид, например моносахарид, такой как глюкоза или другой сахар, либо дисахарид или полисахарид, аммониевые соли, компоненты сложной среды, такие как дрожжевой экстракт и пептон, аминокислоты, витамины, фосфаты, соли калия, натрия, магния и кальция, микроэлементы, такие как железо, кобальт, марганец, медь, цинк и т.п. Эти и другие ингредиенты можно включать в ферментативную смесь в концентрациях, пригодных для конкретного микроорганизма. Известно, что процесс ферментации может изменяться в зависимости от продуктивности биокатализатора и ферментативный бульон можно использовать на различных стадиях роста и поэтому важно иметь возможность сохранять таким путем биокатализатор после получения продукта.
При создании изобретения было установлено, что активность биокатализатора не уменьшается существенно в течение продолжительного периода времени. Следовательно, биокатализатор можно заменять менее часто. Предпочтительно биокатализатор используют в течение по меньшей мере 2 дней и в этот период практически не происходит потери активности.
Как правило, использование в реакции в качестве катализатора нитрилгидратазы позволяет осуществлять превращение нитрила в соответствующий амид в одну стадию. Этот процесс наиболее предпочтителен, когда нитрил представляет собой акрилонитрил и амид представляет собой акриламид. Целесообразно осуществлять эту стадию превращения несколько раз с использованием одной партии биокатализатора, из которой в течение периода времени, составляющего несколько дней, выделяют определенные порции для осуществления нескольких реакций, в которых нитрил превращается в амид. Таким образом, способ позволяет максимально удешевить сохранение биокатализатора без ухудшения свойств катализатора, осуществляя при этом одновременно стадию биопревращения. Таким образом, для осуществления этого одну партию биокатализатора можно хранить в форме, готовой для применения, для приготовления нескольких партий продукта, например, акриламида. Несколько партий составляют, например, от 5 до 10 и более партий, даже от 15 до 20 партий.
При создании изобретения был разработан способ повышения биокатилитической активности микроорганизма. Микроорганизм следует культивировать в культуральной среде, которая содержит мочевину или производное мочевины. Однако мочевину или производное мочевины вносят в культуральную среду по меньшей мере через шесть часов после начала роста микроорганизма. Как правило, культуральная среда практически не содержит мочевину или производное мочевины в течение по меньшей мере первых шести часов культивирования микроорганизма и после этого мочевину или производное мочевины добавляют в культуральную среду. Как указано ранее, понятие «практически не содержит» в контексте настоящего описания означает, что культуральная среда содержит менее 0,2 г/л, как правило, менее 0,1 г/л мочевины или производного мочевины, либо может совсем не содержать их. Предпочтительно культуральная среда практически не содержит мочевины или производного мочевины в течение по меньшей мере 12 ч и иногда в течение по меньшей мере 24 ч. Однако для достижения максимальной биокаталитической активности предпочтительно вносить мочевину или производное мочевины в течение первых 48 ч культивирования.
Биокаталитическую активность можно оценивать в понятиях ферментативной активности согласно описанному ниже методу.
Предпочтительно микроорганизм обладает способностью продуцировать нитрилгидратазу. Биокатализатор, содержащий такой микроорганизм, можно применять в способе получения амидов из соответствующего нитрила путем процесса гидратации, при котором нитрилгидратаза катализирует реакцию. Для указанной реакции целесообразно культивировать микроорганизм, внося мочевину или производное мочевины в более поздний период времени, что обеспечивает повышение нитрилгидратазной активности. Способ наиболее пригоден для получения (мет)акриламида из (мет)акрилонитрила. Такой способ представлен в настоящем описании. Кроме того, биокатализатор можно подвергать рециклизации и повторно использовать.
Особенно предпочтительно применять микроорганизм из рода Rhodococcus, предпочтительно виды Rhodococcus rhodochrous, наиболее предпочтительно штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164.
Ниже изобретение более подробно проиллюстрировано на примерах.
Пример 1
2
4
2
4
4
-1
Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 выделяли из почвы с помощью метода обогащения культуры и выращивали в среде, включающей следующие компоненты (г/л): KHPO, 7,0; KHPO, 3,0; пептон, 5,0; дрожжевой экстракт, 3,0; глюкоза, 5,0; MgSO, 0,5; раствор, содержащий минорные количества металлов, 5 мл; ацетонитрил, 20 мл. Значение рН доводили до 7,2. Активность нитрилгидратазы составляла 4000 мкмолей мин/г сухой массы клеток при 15°С после 3 дней роста при 28°С.
Пример 2
-1
(1) Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 выращивали в колбе Эрленмейера с перегородкой вместимостью 2 л, которая содержала 400 мл культуральной среды, включающей следующие компоненты (г/л): вторичный кислый фосфат калия 0,7; бисульфат калия 0,3; глюкозу 10,0; пептон, 1,0; дрожжевой экстракт 3,0; гептагидрат сульфата магния 0,5; мочевину 5,0; гексагидрат хлорида кобальта 0,01; водопроводную воду до 1 л. Значение рН среды доводили до 7,2. Культуру выращивали при 28°С в течение 5 дней, после чего нитрилгидратазная активность составляла 47900 мкмолей мин/г при 15°С.
(2) (а) Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 выращивали в среде, описанной в (1), за исключением того, что она не содержала пептон.
(б) Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 выращивали в среде, описанной в (2а), за исключением того, что она не содержала ни пептон, ни мочевину. Организм выращивали в течение 24 ч, после чего в культуру добавляли 5 г/л мочевины и выращивали еще в течение 5 дней.
(в) Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 выращивали в среде, описанной в (2а), за исключением того, что среда не содержала мочевину. Организм выращивали в течение 48 ч и затем в культуру добавляли 5 г/л мочевины и культуру выращивали еще в течение 4 дней.
(г) Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 выращивали в среде, описанной в (2а), за исключением того, что среда не содержала мочевину. Организм культивировали в течение 6 дней.
Из четырех описанных выше культур брали образцы через 1, 2, 3 и 6 дней после начала роста. Нитрилгидратазную активность измеряли при 15°С, см. таблицу 1.
Таблица 1
Время добавления мочевины (дни)
Нитрилгидратазная активность, мкмоли мин<sup>-1</sup>/мг сухих клеток
Т=1 день
Т=2 дня
Т=3 дня
Т=6 дня
0
9.1
24,2
24,8
37,6
1
1.0
21,6
49,3
41,3
2
н.о.
н.о.
15,1
15,3
без добавления
0,94
н.о.
0,46
0,98
н.о. - не определяли
Пример 3
-1
-1
(1) Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 выращивали в ферментере вместимостью 280 л, который содержал 180 л культуральной среды, включающей следующие компоненты (г/л): вторичный кислый фосфат калия 0,7; бисульфат калия 0,3; глюкозу 2,0; дрожжевой экстракт 3,0; гептагидрат сульфата магния 0,5; гексагидрат хлорида кобальта 0,01. Значение рН среды доводили до 7,2. Культуру выращивали при 30°С в течение 3 дней. Мочевину добавляли в культуру через 17 ч. Периодически измеряли нитрилгидратазную активность (при 30°С). Через 22 ч после добавления мочевины активность составляла примерно 176000 мкмолей мин/г при 30°С, а еще через 9 ч активность повышалась до 323000 мкмолей мин/г.
(2) В реактор, содержащий штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164, вносили 625 г воды. Смесь нагревали до 25°С. В реактор вносили 375 г акрилонитрила с такой скоростью, чтобы концентрация поддерживалась на уровне 2 мас.%. Через 175 мин акрилонитрил превращался в акриламид, конечная концентрация которого составляла примерно 50 мас.%.
(3) Клетки после стадии 2 выделяли путем центрифугирования и суспендировали в 625 г воды. Эту суспензию хранили при 4°С в течение 3 дней перед повторной загрузкой в реактор. Осуществляли процедуру, описанную в пункте 5, и снова через 175 мин весь акрилонитрил превращался в акриламид.
(4) Клетки после стадии 3 обрабатывали согласно методу, описанному выше в пункте 3, за исключением того, что перед применением их хранили в течение 2 дней. И в этом случае синтез акриламида составлял 50%.
Концентрации акриловой кислоты, измеренные для партий акриламида, полученных согласно методу, описанному в примере 3 (пункты 2-4), приведены в таблице 2.
Таблица 2
Концентрации акриловой кислоты, измеренные в каждой партии акриламида
Номер примера
концентрация акриловой кислоты (част./млн)
3-2
5650
3-3
102
3-4
не обнаружено (<10 част./млн)
Пример 4
(1) Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 выращивали в ферментере вместимостью 280 л, который содержал 180 л культуральной среды, содержащей следующие компоненты (г/л): вторичный кислый фосфат калия 0,7; бисульфат калия 0,3; глюкозу 1,0; дрожжевой экстракт 3,0; гептагидрат сульфата магния 0,5; гексагидрат хлорида кобальта 0,01, мочевину 5,0. Значение рН среды доводили до 7,2. Культуру выращивали при 30°С в течение 3 дней.
25 л ферментативного бульона подвергали дегазации с помощью азота в течение 20 мин перед помещением на хранение при температуре окружающей среды, составляющей примерно 5°С в течение 3Ѕ дней. Нитрилгидратазную активность измеряли через 15 ч после сбора и было установлено, что она составляла 242000 ед./г при 25°С. После повторного измерения нитрилгидратазной (NH) активности через 3 дня было установлено, что она составляла 293000 ед./г.
Пример 5
Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 выращивали в колбе Эрленмейера вместимостью 2 л в течение 5 дней при 28°С при встряхивании со скоростью 180 об./мин в культуральной среде, содержащей следующие компоненты (г/л): вторичный кислый фосфат калия 0,7; бисульфат калия 0,3; глюкозу 10,0; дрожжевой экстракт 3,0; мочевину 5,0; гептагидрат сульфата магния 0,5; гексагидрат хлорида кобальта 0,01. Значение рН среды доводили до 7,2. Культуральный бульон разделяли на две части, одну из которых деоксигенировали с помощью азота. Порции как деоксигенированного, так и оксигенированного культурального бульона инкубировали при 4, 15 и 25°С в течение 1 недели. Периодически измеряли нитрилгидратазную активность.
Результаты анализов нитрилгидратазной активности приведены в таблице 3. Результаты представлены в ед./мг сухой массы клеток.
Таблица 3
Температура инкубации
Время (дни)
0
1
2
3
5
7
4°С (O<sub>2</sub>)
140
286
232
267
257
4°С (после дегазации)
274
214
293
15°С (O<sub>2</sub>)
15°С (после дегазации)
140
218
25°С (O<sub>2</sub>)
140
143
25°С (после дегазации)
154
230
Результаты, приведенные в примере 5, свидетельствуют о том, что биокатализатор можно эффективно сохранять при температурах окружающей среды. Кроме того, обнаружено, что нитрилгидратазная активность в этом случае повышалась при хранении по сравнению с днем 0.
Пример 6
Размороженные клетки штамма Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 ресуспендировали в воде. Нитрилгидратазную активность измеряли в течение 1 недели. Данные об относительных уровнях нитрилгидратазных активностей приведены в таблице 4.
Таблица 4
Время (дни)
Относительная нитрилгидратазная активность (%)
4°С
15°С
25°С
0
100
100
100
1
66
64
66
2
78
77
76
5
72
72
74
7
68
74
73
Результаты, приведенные в таблице 4, свидетельствуют о том, что активность не снижалась при любой температуре хранения в течение периода инкубации от 1 до 7 дней.
Пример 7
(1) Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 выращивали в колбе Эрленмейера с перегородкой вместимостью 0,5 л, которая содержала 100 мл культуральной среды, включающей следующие компоненты (г/л): вторичный кислый фосфат калия 0,7; бисульфат калия 0,3; глюкозу 10,0; дрожжевой экстракт 3,0; гептагидрат сульфата магния 0,5; мочевину 5,0; гексагидрат хлорида кобальта 0,01; водопроводную воду до 1 л. Значение рН среды доводили до 7,2. Культуру выращивали при 30°С в течение 4 дней. Нитрилгидратазную активность измеряли при 25°С после выращивания в течение 2, 3 и 4 дней.
(2) (а) Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 выращивали в среде, описанной в (1), за исключением того, что мочевину заменяли диметилмочевиной.
(б) Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 выращивали в среде, описанной в (1), за исключением того, что мочевину заменяли этилмочевиной.
(в) Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 выращивали в среде, описанной в (1), за исключением того, что вместо 5 г/л мочевины добавляли 2,5 мочевины и 2,5 г/л диметилмочевины.
(г) Штамм Rhodococcus rhodochrous NCIMB 41164 выращивали в среде, описанной в (1), за исключением того, что вместо 5 г/л мочевины добавляли 2,5 г/л мочевины и 2,5 г/л этилмочевины.
Данные об уровнях нитрилгидратазных активностей представлены в таблице 5.
Таблица 5
Соединение, содержащее мочевину
Нитрилгидратазная активность (мкмоли/мин/г сухой массы клеток)
2 дня
3 дня
4 дня
мочевина
6,800
34,800
123,200
диметилмочевина
14,600
73,800
97.600
этилмочевина
14,500
110,100
не определяли
мочевина + диметилмочевина
7,400
27,000
19,400
мочевина + этилмочевина
6,000
6,900
73,850