ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ИЗ УБИТОЙ БАКТЕРИИ ЛЕПТОСПИРЫ
DEAD LEPTOSPIRA BACTERIUM IMMUNOGENIC COMPOSITION

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к композиции, содержащей иммуногенный препарат клеток убитой бактерии Leptospira, вакцине для защиты животных от заражения бактерией лептоспирой и применению кислоты для стабилизации иммуногенного препарата убитой бактерии Leptospira.
Уровень техники
Лептоспироз является широко распространенным в мире зоонозом, вызванным заражением любым из большого числа патогенетических серотипов Leptospira. Данный род организмов является чрезвычайно вариабельным и содержит свыше 250 серотипов. Распространение отдельных патогенетических серотипов отличается в различных районах, вероятно, под влиянием таких факторов, как климат, местная фауна и агротехнические приемы. Лептоспироз воздействует фактически на все виды млекопитающих. Человеческий лептоспироз также является важным и встречается эндемично в тропиках и в виде эпидемий в умеренном климате. Однако в отличие от других видов люди не играют важной роли в сохранении заболевания в природе, и передача от человека к человеку является редкой.
Вакцинация людей против лептоспироза является целью научного сообщества, но прогресс идет очень медленно. Ввиду того, что собачий лептоспироз является важным заболеванием и что собаки являются источником лептоспироза, доступно множество вакцин против заболевания собак. Коммерческие вакцины против собачьего лептоспироза обычно содержат инактивированные антигены серогрупп Canicola и Icterohaemorrhagiae (Ictero) и являются доступными более пятидесяти лет. Последними рекомендациями для Европы являются продолжение включения в вакцину антигена серогрупп Canicola и Ictero, а также включение антигена серогрупп Grippotyphosa (Grippo) и Australis. Тогда как в США в настоящее время доступно четыре собачьи вакцины с антигенами четырех серогрупп (Canicola, Ictero, Grippo и Pomona), в Европе в настоящее время доступно много традиционных бивалентных вакцин (Canicola, Ictero) и только одна тривалентная вакцина (Canicola, Ictero и Grippo).
Наиболее доступные на рынке вакцины против лептоспироза, если не все, содержат иммуногенный препарат клеток убитой бактерии Leptospira, такой как, например, формалинизированные убитые цельные клетки. Данные вакцины известны своей высокой стабильностью при температуре хранения ниже комнатной температуры, как правило, от 2°С до 8°С. Однако, особенно ввиду того, что лептоспироз является эндемичным для тропиков, важным преимуществом может стать стабильность вакцины при температуре выше комнатной температуры, при этом станет возможным хранение в условиях окружающей среды без необходимости в охлаждающем оборудовании. Ранее проверяли на денатурацию белки, которые присутствуют в данных вакцинах с убитыми цельными клетками (например, путем применения воздействия тепловым шоком, которое не повреждает антигены лептоспиры), если бы данные белки были ответственны за дестабилизацию антигенов лептоспиры, это могло привести к значительному увеличению стабильности. Результат, однако, был отрицательным.
Задача изобретения
Существует необходимость в значительном повышении стабильности композиций, содержащих иммуногенный препарат клеток убитой бактерии Leptospira, в частности в получении композиции, которая эффективна для индукции иммунного ответа даже после по меньшей мере трех месяцев хранения при температуре выше комнатной температуры. В частности, существует необходимость в вакцине против лептоспироза, которая остается эффективной, по меньшей мере способствует предотвращению заражения бактерией Leptospira, даже после трех месяцев хранения вакцины при 37°С, в частности после девяти месяцев хранения при данной температуре.
Сущность изобретения
Для решения задачи изобретения, была разработана композиция, где иммуногенный препарат клеток убитой бактерии Leptospira присутствует в растворе лимонной кислоты (где термин «кислота» включает сопряженное с кислотой основание). Было показано, что благодаря содержанию антигенов в данном растворе, стабильность антигенов заметно увеличилась. Вакцина, согласно настоящему изобретению, хранилась по меньшей мере три месяца при 37°С с сохранением уровня массы антигенов, достаточных для обеспечения по существу полной защиты от заражения бактерией Leptospira.
Определения
Вакцина изобретения в данном описании имеет состав, подходящий для применения на животных (включая людей), содержащий один или более антигенов, как правило, комбинированных с фармацевтически приемлемым носителем, таким как содержащая воду жидкость, необязательно содержащих иммуностимулирующие агенты (адъюванты), соли, буферы, стабилизаторы, модификаторы вязкости и др., которая после введения животному индуцирует иммунный ответ при лечении заболевания или расстройства, т.е. способствует предотвращению, облегчению протекания или выздоровлению от заболевания или расстройства.
Носитель представляет собой средство для переноса антигенов с целью обеспечения и представления их в требуемой форме. Обычными носителями являются вода или другие гидрофильные жидкости, но твердые частицы также часто используются (например, для антигенов, вводимых посредством небулайзера в форме сухого порошка).
Клеточный препарат убитой бактерии представляет собой препарат, главным образом содержащий убитые бактериальные клетки, также дополнительно обработанный (может включать, по меньшей мере частично, лизирующие клетки), например, для получения более стабильного или более иммуногенного препарата. Клеточный препарат действует противоположно препарату, который содержит экстракт бактериальных клеток, такой как экстрагированные поверхностные белки и/или полисахариды.
Варианты осуществления изобретения
В варианте осуществления изобретения раствор содержит 20 ммоль/л лимонной кислоты.
В другом варианте осуществления изобретения раствор является буферным с рН от 5 до 6.
В еще одном варианте осуществления изобретения бактерия Leptospira выбрана из Leptospira Interrogans серогруппы Canicola серотипа Portland-Vere, Leptospira interrogans серогруппы Australis серотипа Bratislava, Leptospira interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae серотипа Copenhageni и Leptospira kirschneri серогруппы Grippotyphosa серотипа Dadas, в частности бактерия Leptospira представлена Leptospira interrogans серогруппы Australis серотипа Bratislava.
Использование лимонной кислоты для стабилизации иммуногенного препарата убитой бактерии Leptospira в жидком носителе путем растворения лимонной кислоты в носителе осуществляется в частных вариантах осуществления в тех случаях, где в препарате сохраняется по меньшей мере 25% от массы антигенов (определяется в ELISA единицах по сравнению с аналогичным препаратом, хранящимся при температуре 2-8°С) в течение 3 месяцев хранения при температуре выше 18°С, в частности при 37°С.
Примеры
Ниже следует дополнительное описание изобретения, основанное на следующих примерах.
Пример 1: Определение на собаках эффективности антигенов убитой лептоспиры, как присутствующих в коммерчески доступной вакцине.
Пример 2: Определение стабильности антигенов лептоспиры при хранении при 37°С.
Пример 3: Определение стабильности антигенов лептоспиры, помещенных в лимонную кислоту при хранении при 37°С.
Пример 1
2
4
2
4
В первом примере эффективность антигенов убитой лептоспиры, как присутствующих в коммерчески доступной вакцине, определяли на стандартных собаках, антигены присутствовали согласно маркировке вакцины (100%) или разбавляли в четыре раза (25%). Заданные концентрации химически инактивированной бактерии Leptospira того же вида и серотипов, что присутствуют в коммерчески доступной вакцине Nobivac L4 (доступна от MSD Animal Health, Boxmeer, The Netherlands; см. также публикацию, касающуюся Nobivac L4 от 21 Мая 2012 Summary of Opinion Комитета по ветеринарным лекарственным препаратам Европейского агентства по лекарственным средствам), а именно Leptospira Interrogans серогруппы Canicola серотипа Portland-Vere (Leptospira сanicola; 5300 ELISA штук/мл), Leptospira Interrogans серогруппы Australis серотипа Bratislava (Leptospira Вratislava; 1000 ELISA единиц/мл), Leptospira Interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae серотипа Copenhageni (Leptospira icterohaemorrhagiae; 540 ELISA единиц/мл) и Leptospira kirschneri серогруппы Grippotyphosa серотипа Dadas (Leptospira grippotyphosa; 1000 ELISA единиц/мл) помещали в 10 мМ забуференного фосфатом солевого раствора при рН 7,2 (буфер содержит на литр воды 8,9 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г NaHPO и 0,2 г KHPO). Конечным раствором наполняли пробирки на 3 мл, закрывали резиновыми крышками и герметизировали алюминиевыми винтовыми крышками. Данную вакцину хранили при 2-8°С (стабильна в течение 39 месяцев). После данной вакцины, разведенную вакцину получали разведением антигена в аналогичном забуференном фосфатом солевом растворе до достижения окончательной концентрации, которая содержит 25% от количества Elisa единиц/мл. Вакцины проверяли, как описано ниже.
Условия содержания лабораторных животных
Стандартные собаки породы бигль шестинедельного возраста без определяемых агглютинирующих сывороточных антител против каждой из серогрупп лептоспиры, указанной выше в данном описании, предоставлены частным поставщиком. В каждом опыте экспериментальная группа (n=8) состояла из щенков обоих полов и щенков, выбранных из разных приплодов для предотвращения гендерных и генетических эффектов, влияющих на экспериментальные эффекты. У выбранных собак не было клинических патологий или заболеваний перед включением в данные исследования. Условия были аналогичными в каждом опыте.
Вакцинация
Во всех опытах собак вакцинировали подкожно дважды, в возрасте 6 и 10 недель, 1 мл соответствующей вакцины.
Опыт
9
Опытными штаммами были Leptospira Interrogans серогруппы Canicola серотипа Canicola штамм Moulton, Leptospira Interrogans серогруппы Icterohaemorrhagiae серотипа Copenhageni штамм CF1 (оба штамма получены от National Leptospirosis Reference Centre, KIT Biomedical Research, Амстердам, Нидерланды), Leptospira kirschneri серогруппы Grippotyphosa серотипа Bananal/Liangguang штамм 11808 и Leptospira Interrogans серогруппы Australis серотипа Bratislava штамм As-05-101 (оба получены от Министерства сельского хозяйства США, Национального центра заболеваний животных). Для каждого из четырех штаммов была проведена следующая процедура. Соответствующий опытный материал готовили из культуры, хранящейся в жидком азоте, и дважды промывали в среде Ellinghausen-McCullough, преобразованной Johnson и Harris (Faine 1994; Клинический лептоспироз у людей, клинический лептоспироз у животных; о лептоспире и лептоспирозе, CRC Press, 1994; стр. 1-13, 199-225). Культуры, хранящиеся в жидком азоте, повторно выделяли из экспериментально зараженных животных: штаммы CF1 и 11808 повторно выделяли из почки хомяка, штамм Moulton повторно выделяли из почки собаки и штамм As-05-101 повторно выделяли из мочи собаки. Во всех опытах данный этап занимал три недели после второй вакцинации при комбинации двух способов постановки опыта: внутрибрюшинная (в/б) инъекция (2 мл) и конъюнктивальная инстилляция (0,25 мл в вентральную оболочку конъюнктивы каждого глаза). Концентрации бактериальных клеток (клетки/мл) в опытных материалах определяли путем общего прямого подсчета под темнопольным микроскопом и составляли от 0,5 до 10×10 клетки/мл.
Обследование
Собак регулярно обследовали на протяжении каждого эксперимента, включая измерение температуры тела после опыта с использованием подкожных датчиков. Образцы крови и сыворотки брали путем пункции яремной вены через регулярные интервалы в течение эксперимента для проверки количества тромбоцитов, бактериальной культуры, ПЦР и антител к лептоспире. Образцы сыворотки анализировали с помощью реакции микроагглютинации (МАР) против серогрупп Canicola, Ictero, Grippo и Australis (Faine 1994). Титры микроагглютинации соответствовали обратным величинам наибольших разведений сыворотки, которые индуцировали 50% агглютинацию. Образцы крови с использованием EDTA в качестве антикоагулянта использовали для оценки количества тромбоцитов после опыта при помощи счетчика клеток Cell-Dyn 3500 (Abbott Laboratories, Abbott Park, Иллинойс, США).
EDTA или кровь с гепарином использовали для повторного выделения опытных организмов из крови до 21 дня после опыта. Для той же цели собирали образцы мочи через регулярные интервалы путем цистоцентеза, также брали образец ткани почки при проведении вскрытия на 4 неделе после опыта и проводили процедуры, описанные выше (Klaasen HLBM, Molkenboer MJCH, Vrijenhoek MP и др. Длительность иммунитета у собак, привитых против лептоспироза бивалентной инактивированной вакциной. Vet Microbiol 2003; 95:121-132). Образцы крови, мочи и гомогенат ткани почки высевали на EMJH среду, и инкубировали и исследовали культуры, как описано Klaasen.
Образцы сыворотки 0, 3 и 7 дней после опыта исследовали на присутствие ДНК опытных организмов с помощью ПЦР в реальном времени, направленной на ген secY. Данная ПЦР представляет собой валидированный анализ и удобна для обнаружения ДНК всех патогенных видов Leptospira (Ahmed A, Engelberts MFM, Boer KR и др. Развитие и валидация ПЦР в реальном времени для обнаружения патогенных видов Leptospira в клинических материалах. PLoS ONE 2009; 4(9):e7093). ПЦР была представлена WHO/FAO/OIE и National Leptospirosis Reference Centre, KIT Biomedical Research, Амстердам, Нидерланды. Результаты ПЦР были разделены на положительные, допустимые и отрицательные.
Собак с тяжелыми клиническими проявлениями после опыта подвергали гуманной эвтаназии. Патологоанатомическое исследование, включающее гистопатологическое исследование с особой тщательностью, привело к обнаружению интерстициального нефрита [Klaasen 2003], развивавшегося в данных случаях.
К собакам с положительной пробой на заражение относили собаку по меньшей мере с двумя положительными образцами крови (по культуре) или сыворотки (по ПЦР) или мочи/почки (по культуре) в разные дни, или собаку с нефритом, индуцированным опытом, или клиническим или гематологическим признаком (тромбоцитопения) лептоспироза. К собакам с положительной пробой на почечную инфекцию (животное-переносчик, постоянный носитель) относили собаку по меньшей мере с одним положительным образцом мочи/почки на 14 день после опыта и позже или с нефритом, индуцированным опытом (обнаруженном на гистопатологическом исследовании).
Результаты
Ниже представлены результаты для четырех вакцин (разведенной и неразведенной). Показано, что вакцины даже при 25% разведении обеспечивают защиту собак от заражения и защищают почти всех лабораторных животных от почечной инфекции.
Таблица 1Опытный штамм Canicola
Вакцина
Собаки с положительной пробой на инфекцию
Собаки с положительной пробой на почечную инфекцию
100% сanicola
2/8
0/8
25% сanicola
1/8
1/8
контроль
8/8
8/8
Таблица 2Опытный штамм Icterohaemorrhagiae
Вакцина
Собаки с положительной пробой на инфекцию
Собаки с положительной пробой на почечную инфекцию
100% сanicola
0/7
0/7
25% сanicola
3/7
0/7
контроль
7/7
7/7
Таблица 3Опытный штамм Grippotyphosa
Вакцина
Собаки с положительной пробой на инфекцию
Собаки с положительной пробой на почечную инфекцию
100% сanicola
0/8
0/8
25% сanicola
0/8
0/8
контроль
7/8
6/8
Таблица 4Опытный штамм Bratislava
Вакцина
Собаки с положительной пробой на инфекцию
Собаки с положительной пробой на почечную инфекцию
100% сanicola
0/8
0/8
25% сanicola
0/8
0/8
контроль
6/8
1/8
Пример 2
Убитая бактерия лептоспиры стабильна при 2-8°С на протяжении по меньшей мере 39 месяцев (маркировка доступной на рынке вакцины Nobivac L4). В данном эксперименте для четырех антигенов, присутствующих, как указано в примере 1 (100% вакцины), определяли поддержание уровня по меньшей мере 25% ELISA количества при хранении при 37°С в течение трех месяцев. Результаты отражены ниже. Результирующую массу антигенов (отражает значение трех различных проб) рассчитывали как процент от результирующей массы антигенов аналогичных вакцин, хранящихся при 2-8°С.
Таблица 5Процентное содержание АГ массы после хранения при 37°С по сравнению с хранением при 2-8°С
Ictero
Bratislava
Grippo
Canicola
98
0
66
80
Показано, что антигены убитых цельных клеток серогрупп Icterohaemorrhagiae, Canicola и Grippotyphosa относительно стабильны при 37°С, но антигены серогруппы Australis серотипа Bratislava не очень стабильны и не достигают по меньшей мере уровня 25%, являющегося установленным критерием эффективности вакцины. Однако при комнатной температуре, обычно 20-25°С, остаточный уровень массы антигенов может быть выше, очевидно, что стабильность, в частности для антигенов Bratislava, но также для антигенов Grippotyphosa и Canicola, может быть увеличена.
Далее проводили испытания по увеличению стабильности в первую очередь с антигенами Bratislava с ожиданием, что какая-либо значительная коррекция также увеличит стабильность других антигенов.
Пример 3
Заданные концентрации (1000 ед/мл) аналогичных Bratislava антигенов, как описано в примере 1, помещали в лимонную кислоту путем растворения цитрата натрия в растворах с различным рН. Первый буфер использовали при приведении рН к 5 (4,1 г дегидратированного цитрата натрия и 1,3 г моногидрата лимонной кислоты на литр), и второй при приведении рН к 6 (5,4 г дегидратированного цитрата натрия и 0,33 г моногидрата лимонной кислоты на литр). Также, сам цитрат натрия разводили до получения рН 7. В качестве контроля антигены помещали в забуференный фосфатом солевой раствор, как приведено в примере 1 (рН 7,2), и 20 мМ ацетатного буфера (рН 5; 1,99 г тригидрата ацетата натрия и 0,32 г уксусной кислоты). Были достигнуты конечные концентрации, указанные в таблице 6 ниже. Данными растворами наполняли пробирки на 3 мл, закрыли резиновыми крышками и герметизировали алюминиевыми винтовыми крышками.
Таблица 6Растворы, использованные для опытов по стабильности антигенов Bratislava
Раствор
Содержание помимо 1000 ед/мл убитых цельных клеток Leptospira Bratislava
1
забуференный фосфатом солевой раствор
2
20 мМ цитрата, буферизованного до рН 5
3
20 мМ цитрата, буферизованного до рН 6
4
20 мМ цитрата, рН 7
5
20 мМ ацетатного буфера, рН 5
Половину пробирок инкубировали при 2-8°С, в то время как другую половину инкубировали при 37°С. Через 3 и 9 месяцев пробирки анализировали на антигены Leptospira Bratislava, используя ELISA тест на массу антигенов. Массу антигенов определяли по сравнению с массой антигенов стандартного образца. Результаты представлены ниже в таблице 7. Результирующую массу антигенов (отражает значение трех различных проб) рассчитывали как процент от результирующей массы антигенов аналогичных вакцин, хранящихся при 2-8°С.
Таблица 7Процентное содержание массы АГ после хранения при 37°С по сравнению с хранением при 2-8°С
Раствор
Хранение в течение 3 месяцев
Хранение в течение 9 месяцев
1
0
0
2
93
Не обнаружено
3
93
86
4
47
Не обнаружено
5
13
Не обнаружено
Показано, что стабильность убитых бактериальных антигенов серогруппы Australis серотипа Bratislava значительно возрастает при добавлении лимонной кислоты в раствор. Установленный критерий в виде по меньшей мере 25% массы антигенов после трех месяцев хранения при 37°С (и даже значительно дольше) по сравнению с вакциной, хранящейся при стандартных условиях, встречался при различных уровнях рН, однако оказалось, что рН от 5 до 6 приводит к наилучшим результатам. Использование рН 5 без лимонной кислоты не привело к какому-либо приемлемому результату (раствор 5). Нижний предел для лимонной кислоты легче определить с помощью обычного опыта: при условии, что стабильность после трех месяцев хранения при 37°С составляет 25% или выше, установленный критерий стабильности встречается. Верхний предел можно найти аналогичным способом, однако тогда надежность раствора может стать критерием. Необходимый уровень надежности можно установить на любом требующемся уровне и не противоречит настоящему изобретению.
Из-за обозначенного высокого сходства антигенов можно обоснованно ожидать, что при использовании аналогичного критерия (добавление антигенов Leptospira к раствору лимонной кислоты) стабильность других убитых бактериальных антигенов лептоспиры можно повысить. Это было проверено на опыте и результаты представлены ниже в соответствии с таблицей 4.
Пример 4
Заданные концентрации аналогичных четырех антигенов Leptospira, как описано в примере 1, помещали в лимонную кислоту трех различных концентраций (10, 20 и 50 ммоль/л) при рН 6. Как и контроль, антигены помещали в забуференный фосфатом солевой раствор. Растворами наполняли пробирки на 3 мл, закрывали резиновыми крышками и герметизировали алюминиевыми винтовыми крышками.
Половину пробирок инкубировали при 2-8°С, в то время как другую половину инкубировали при 27°С. После 8 недель и 9 месяцев пробирки анализировали на антигены Leptospira, используя ELISA тест на массу антигенов. Массу антигенов определяли по сравнению с массой антигенов стандартного образца. Результаты для разных видов антигенов представлены ниже в таблицах 8, 9, 10 и 11. Результирующую массу антигенов (отражает значение трех различных проб) рассчитывали как процент от результирующей массы антигенов аналогичных вакцин, хранящихся при 2-8°С.
Таблица 8Процентное содержание массы АГ Bratislava после хранения при 27°С по сравнению с хранением при 2-8°С
Концентрация цитрата [мМ]
Хранение в течение 8 недель
Хранение в течение 9 месяцев
10
100
44
20
100
84
50
97
80
0 (контроль)
75
0
Таблица 9Процентное содержание массы АГ Grippotyphosa после хранения при 27°С по сравнению с хранением при 2-8°С
Концентрация цитрата [мМ]
Хранение в течение 8 недель
Хранение в течение 9 месяцев
10
100
100
20
100
100
50
94
94
0 (контроль)
100
59
Таблица 10Процентное содержание массы АГ Icterohaemorrhagiae после хранения при 27°С по сравнению с хранением при 2-8°С
Концентрация цитрата [мМ]
Хранение в течение 8 недель
Хранение в течение 9 месяцев
10
97
100
20
100
100
50
100
100
0 (контроль)
91
98
Таблица 11Процентное содержание массы АГ Canicola после хранения при 27°С по сравнению с хранением при 2-8°С
Концентрация цитрата [мМ]
Хранение в течение 8 недель
Хранение в течение 9 месяцев
10
92
100
20
93
98
50
89
82
0 (контроль)
74
51
Показано, что стабильность разных видов убитых бактериальных антигенов Leptospira значительно повышается при добавлении лимонной кислоты в раствор по аналогии с предположениями, основанными на результатах с антигенами Bratislava. Установленный критерий в виде по меньшей мере 25% массы антигенов после трех месяцев хранения при 27°С (и даже значительно дольше) по сравнению с вакциной, хранящейся при стандартных условиях, встречался в различных растворах лимонной кислоты.