Аналитическая тест-система по определению чувствительности злокачественной опухоли конкретного пациента к онколитической биотерапии
ANALYTICAL TEST SYSTEM FOR DETERMINING SPECIFIC PATIENT'S MALIGNANT TUMOUR SENSITIVITY TO ONCOLYTIC BIOTHERAPY

Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к области молекулярной биологии, медицины, онкологии и касается аналитической тест-системы для определения чувствительности злокачественной опухоли конкретного пациента к онколитической биотерапии и подбора оптимального для терапии штамма онколитического вируса посредством определения в клетках опухоли уровня экспрессии генов-маркеров чувствительности к онколитическим вирусам методом мультиплексной ПЦР в режиме реального времени.
Уровень техники
Для широкомасштабного внедрения онколитической биотерапии в клинике требуется решить проблему непредсказуемости терапевтического действия и, как следствие, - пока еще мало впечатляющих результатов клинических испытаний. С одной стороны, у части пациентов наблюдается впечатляющий терапевтический эффект вплоть до полного выздоровления, а с другой - у многих пациентов данный штамм может вообще не оказывать действия, в то время как он может быть эффективным при лечении опухоли другого пациента. Причина таких различий кроется в особенностях опухолей разных пациентов, когда раковые клетки могут либо экспрессировать все необходимые для вирусного цикла клеточные компоненты (например, рецепторы для проникновения вируса, или факторы, способствующие образованию и выходу из клетки инфекционных вирионов, тем самым обеспечивая дальнейшие циклы заражения опухолевых клеток до их полного уничтожения), либо не экспрессировать, и в этом случае опухоль оказывается к данному штамму нечувствительна.
Восприимчивость опухолевых клеток к вирусам обусловлена также подавлением врожденного иммунитета, в частности интерфероновой системы [Gollamudi R., Ghalib М.Н., Desai K.K., Chaudhary I., Wong В., Einstein M., Coffey M., Gill G.M., Mettinger K., Mariadason J.M., et al. 2010. Intravenous administration of Reolysin, a live replication competent RNA virus is safe in patients with advanced solid tumors. Invest New Drugs. 28, 641-649]. В основе утраты этих механизмов лежит, по-видимому, тот факт, что при утрате функции гена р53, которая происходит в большинстве опухолей, происходит активация экспрессии транспозонов, синтез самокомплементарных транскриптов и индукции интерферона, что тормозит рост злокачественных клеток [Haseley A., Alvarez-Breckenridge С., Chaudhury A.R., Kaur В. 2009. Advances in oncolytic virus therapy for glioma. Recent Pat CNS Drug Discov. 4, 1-13]. Преодоление этого блока достигается инактивацией систем индукции интерферона и/или интерферонового ответа, что делает клетки чувствительными к вирусной инфекции. Врожденный противовирусный иммунитет обеспечивается функцией нескольких многокомпонентных сигнальных путей, которые в клетках разного тканевого происхождения функционируют в различающихся режимах. Поэтому и генетические повреждения, приводящие к их утрате, могут проявляться во множестве звеньев этих сигнальных путей. В зависимости от характера этих повреждений чувствительность данной опухоли к вирусам может сильно различаться, что сказывается на эффективности терапии [Stojdl, D.F., Lichty, В., Knowles, S., Marius, R., Atkins, H., Sonenberg, N. & Bell, J.C. (2000) Exploiting tumor-specific defects in the interferon pathway with a previously unknown oncolytic virus. Nature Medicine 6, 821-825].
Идентификация новых биомаркеров, сопряженных с реакцией опухолевых клеток на биотерапию, - новая зарождающаяся область биомедицинских исследований, которая создает основу для персонифицированной медицины. Ранее такие задачи не ставились, поскольку исследователи сосредотачивались на разработке отдельных штаммов онколитических вирусов, испытании их эффективности и механизмов действия. При этом исследователи не ставили вопрос о прогнозировании действия. Хотя для многих онколитических вирусов показана связь с экспрессией или дефектами некоторых молекул.
Например, для вируса болезни Ньюкасла (NDV) показано, что он предпочтительно реплицируется в Rac1-активированных клетках. После проникновения в клетку NDV вирус взаимодействует с Rac1, реорганизует актин в синцитиальной клетке, который участвует в процессе репликации. В конечном счете, внутриклеточное напряжение принуждает зараженную клетку глиомы подвергнуться некрозу [Puhlmann J., Puehler F., Mumberg D., Boukamp P., Beier R. 2010. Racl is required for oncolytic NDV replication in human cancer cells and establishes a link between tumorigenesis and sensitivity to oncolytic virus. Oncogene. 29, 2205-2216].
А для парвовирусов необходимо, чтобы клетка находилась строго в S-фазе клеточного цикла, когда возможна амплификация их генома [Rommelaere, J. & Tattershall, P. (1990). Oncosuppression by parvoviruses, pp. 41-57. In Handbook of Parvoviruses. Edited by P. Tijssen. Boca Raton, FL: CRC Press]. В то же время, реовирус и вирус везикулярного стоматита (VSV) являются РНК-содержащими вирусами и сами кодируют белки, необходимые для репликации собственного генома, что делает их независимыми от S-фазы, но добавляет им дополнительную стадию, предшествующую репликации, - трансляцию и сопряженные с ней проблемы антивирусной защиты клетки. Снятие блока, препятствующего трансляции, происходит при активации ras-пути [Strong, J.Е., Coffey, М.С., Tang, D., Sabinin, P. & Lee, P.W.K. (1998). The molecular basis of viral oncolysis: usurpation of the Ras signaling pathway by reovirus. EMBO Journal 12, 3351-3362], что дает частичное обоснование этой селективности по отношению к трансформированным клеткам. VSV чрезвычайно чувствителен к IFN-опосредованным противовирусным эффектам и зависит от клеток, которые имеют неисправный EFN-путь, что делает репликацию возможной [Stojdl, D.F., Lichty, В., Knowles, S., Marius, R., Atkins, H., Sonenberg, N. & Bell, J.C. (2000) Exploiting tumor-specific defects in the interferon pathway with a previously unknown oncolytic virus. Nature Medicine 6, 821-825].
Некоторые клеточные факторы способствуют вирулентности, как правило, они участвуют в повышении транскрипции вирусных генов, содействуют слиянию вируса с клеткой и запускают сильные воспалительные реакции. Клеточные факторы, такие как белок теплового шока 72 (heat-shock protein 72, hsp72), nectin 1, TLR-2 и TLR-3 являются детерминантами вирулентности для вируса кори (MV), вируса осповакцины (VV) и вируса простого герпеса - 1 (HSV-1) соответственно [Carsillo Т, Traylor Z, Choi С, Niewiesk S, Oglesbee M. Hsp72, a host determinant of measles virus neurovirulence. J Virol 2006; 80:11031-9; Hutchens M, Luker KE, Sottile P, Sonstein J, Lukacs NW, Nunez G, et al. TLR3 increases disease morbidity and mortality from vaccinia infection. J Immunol 2008; 180:483-91; Kopp SJ, Banisadr G, Glajch K, Maurer UE, Grunewald K, Miller RJ, et al. Infection of neurons and encephalitis after intracranial inoculation of herpes simplex virus requires the entry receptor nectin-1. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106:17916-20]. Hsp72 может быть индуцирован физиологическими возбудителями, такими, как, например лихорадка, и он критичен для репликации VV [Hung JJ, Chung CS, Chang W. Molecular chaperone Hsp90 is important for vaccinia virus growth in cells. J Virol 2002; 76(3):1379-90], HSV-1 [Tanguy Le Gac N, Boehmer PE. Activation of the herpes simplex virus type-1 origin-binding protein (UL9) by heat shock proteins. J Biol Chem 2002; 277(7):5660-6], VSV [Qanungo KR, Shaji D, Mathur M, Banerjee AK. Two RNA polymerase complexes from vesicular stomatitis virus-infected cells that carry out transcription and replication of genome RNA. Proc Natl Acad Sci USA 2004; 101(16):5952-7] и MV [Vasconcelos DY, Cai XH, Oglesbee MJ. Constitutive overexpression of the major inducible 70 kDa heat shock protein mediates large plaque formation by measles virus. J Gen Virol 1998; 79(Pt 9):2239-47].
Таким образом, на сегодняшний день, исходя из уровня техники, существует потребность в создании подобных аналитических тест-систем для определения чувствительности злокачественной опухоли конкретного пациента к онколитической биотерапии и подбора оптимального для терапии штамма онколитического вируса посредством определения в клетках опухоли уровня экспрессии генов-маркеров чувствительности к виротерапевтическим агентам.
Раскрытие сущности изобретения
Сущность изобретения заключается в обеспечении способа определения чувствительности злокачественной опухоли конкретного пациента к онколитической биотерапии и подбора оптимального для терапии штамма онколитического вируса. Для решения этой задачи была создана аналитическая тест-система для определения уровней экспрессии генов-маркеров чувствительности к онколитическим вирусам методом мультиплексной ПЦР.
Основным признаком данного изобретения является список генов, состоящий из генов-маркеров чувствительности злокачественных опухолей к онколитическим вирусам и референсных генов-хаускиперов, специфичных для злокачественных новообразований определенного гистогенеза (опухоли мозга, легкого, предстательной, молочной и поджелудочной желез). Список генов для ПЦР приведен в табл. 1, №:1-25 для генов-маркеров, №:26-29 для генов-хаускиперов.
Второй важный признак изобретения - праймеры для амплификации генов, список которых приведен в табл. 1, и олигонуклеотидные зонды, меченные флуоресцентными метками для детекции продуктов амплификации. Последовательности специфических праймеров и олигонуклеотидных зондов приведены в табл. 2 и перечне последовательностей SEQ ID NO: 1-87.
Третий важный признак изобретения - разделение генов маркеров на группы с целью совместного анализа в мультиплексной схеме ПЦР в режиме реального времени с целью повышения воспроизводимости результатов и сокращения времени проведения процедуры. Схема разделения на группы генов приведена на Фиг. 1.
Определение уровня экспрессии генов маркеров, которые вошли в список, приведенный в табл. 1, №:1-25, в образцах злокачественных опухолей позволяет проводить прогноз чувствительности данной опухоли к различным онколитическим вирусам, тем самым позволяет проводить персонифицированный подбор противоопухолевой вирусной терапии. Для нормирования результатов используется совместное определение уровня экспрессии генов маркеров с тканеспецифичными генами-хаускиперами (табл. 1, №:26-29).
Для определения уровня экспрессии генов маркеров и генов «домашнего хозяйства, список которых приведен в табл. 1, №:1-29, проводится ПЦР в режиме реального времени с использованием набора специфических праймеров для амплификации участков генов и олигонуклеотидных зондов, меченных парой флуорофор-гаситель, для детекции продуктов амплификации. Последовательности праймеров и зондов представлены в табл. 2 и перечне последовательностей SEQ ID NO: 1-87.
Краткое описание чертежей и таблиц
Фиг. 1. Схема разделения списка определяемых генов на группы для совместного определения путем проведения мультиплексной ПЦР. Над чертой представлены гены-маркеры, а под чертой указан(ы) ген(ы) - хаускипер(ы), если генов несколько, это означает, что ген-хаускипер тканеспецифичен и его следует выбирать в зависимости от типа исследуемой ткани. В нижней части лунки указан примерный размер ампликона (п.о.).
Таблица 1. Список генов-маркеров и тканеспецифичных генов-хаускиперов, определяемых с помощью аналитической тест-системы. В первом столбце указано сокращенное название гена, а во втором - полное, в третьем столбце для гена-маркера соответствующий ему вирус, а для гена-хаускипера - тканеспецифичность.
Таблица 2. Праймеры для амплификации генов маркеров, генов-хаускиперов и олигонуклеотидные зонды для детекции продуктов амплификации. Для каждого из праймеров и зондов приведена информация о определяемом гене, их последовательность, температура отжига и GC-состав.
Таблица 3. Изменение онколитических свойств вируса кори в отношении линий с модифицированной экспрессией генов-биомаркеров. В таблице представлены результаты изучения способности вируса кори селективно убивать и реплицироваться на модельных линиях опухолевых клеток с нормальной (столбец 3) и модифицированной (столбец 4) экспрессией генов-маркеров (S100PBP, IL1RAPL2, ТМЕМ54, LEPR, DNAJC24, PDIK1L), где sh - линии с подавленной экспрессией генов; expr - линии с гиперэкспрессией генов.
Таблица 4. Взаимосвязь изменения экспрессии биомаркеров и изменения чувствительности к самонацеливающемуся штамму вируса кори.
Осуществление изобретения
Задача настоящего изобретения состоит в создании способа определения чувствительности злокачественной опухоли конкретного пациента к онколитической биотерапии и подбора оптимального для терапии штамма онколитического вируса.
Для определения чувствительности злокачественной опухоли конкретного пациента к онколитической биотерапии были выбраны гены-маркеры, определение экспрессии которых позволяет прогнозировать чувствительность опухоли к различным онколитическим вирусам. Выбор генов-маркеров чувствительности к различным онколитическим вирусам производился на основе биоинформатического анализа результатов транскриптомного секвенирования, а затем для функциональной оценки значимости выбранных маркеров было проведено изучение репликативной способности различных онколитических вирусов при размножении в модельных культурах злокачественных опухолей человека с искусственно модифицированной экспрессией, выявленных биомаркеров in vitro. Окончательный список генов приведен в табл. 1. Оптимальное нормирование результатов осуществляется путем определения уровня экспрессии референсных тканеспецифичных генов-хаускиперов.
Для обеспечения оптимальных условий ПЦР необходимо использовать специфические праймеры для амплификации и специфические олигонуклеотидные зонды для детекции продуктов амплификации. Выбор последовательности праймеров для проведения ПЦР, является важнейшим этапом разработки тест-системы. К праймерам для ПЦР в режиме реального времени выдвигались следующие основные требования:
- длина - 18-30 п.н
- GC-состав - 40-60%
т
- температура отжига (Т) - 50-65°С
- длина ампликона - 90-150 п.н.
т
Также желательно, чтобы Т праймеров была близка между собой, в то же время температура плавления зондов должна быть на 5-10°С выше (при этом примерно одинакова для всех зондов). Это условие диктуется необходимостью взаимодействия зонда с ампликоном до того, как полимераза начнет синтезировать комплементарную цепь ДНК. Только в этом случае будет обеспечено эффективное разрушение зонда за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы (пик 5'-экзонуклеазной активности - около 60°С). Для исключения возможности формирования димеров праймеров как минимум четыре 3'-концевых нуклеотида не должны быть комплементарны самому праймеру, праймеру в паре или зонду. Желательно, чтобы последовательность не содержала повторов и протяженных участков из одного типа нуклеотидов (более 4-5 азотистых оснований одного типа подряд). В результате проведения работ были подобраны специфические праймеры и зонды, отвечающие приведенным выше требованиям, соответствующие последовательности приведены в табл. 2 и перечне последовательностей SEQ ID NO: 1-183.
Для обеспечения мультиплексного формата ПЦР было проведено компьютерное моделирование взаимодействия всех праймеров и зондов с последовательностями кДНК и между собой. Кроме этого, была исключена возможность неспецифической гибридизации (с использованием сервиса www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) для предотвращения получения ложноположительных результатов. Все определяемые гены были объединены в группы для совместного определения, схема представлена на фиг. 1. Концентрации каждой пары праймеров и флуоресцентных зондов определялись эмпирически.
Приведем последовательность анализа с использованием данной аналитической тест-системы. Выделение РНК проводится на специальных колонках. Затем на матрице РНК проводится синтез кДНК с использованием олиго(дТ) праймеров и обратной транскриптазы M-MLV.
Для проведения мультиплексной ПЦР в режиме реального времени проводится в 96-луночном планшете, в лунках которого лиофилизированы специфические праймеры и флуоресцентные олигонуклеотидные зонды. В лунки планшета вносится образцы кДНК и смесь для амплификации, содержащая Taq-полимеразу в соответствующем буфере и смесь дНТФ (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ).
Для синтеза праймеров и олигонуклеотидных зондов используют фосфоамидитный синтез с помощью автоматических ДНК/РНК синтезаторов.
Для детекции используются олигонуклеотидные зонды, меченные следующими парами флуорофоров и тушителей:
- FAM-BHQ1 (492/518 нм);
- TAMRA-BHQ2 (553/580 нм);
- JOE-BHQ1 (520/548 нм);
- Су5-BHQ2 (643/672 нм).
Амплификаторы, которые могут быть использованы для проведения анализа, должны содержать соответствующие каналы детекции, например следующие амплификаторы: StepOnePlus ("AppliedBiosystems", США), Bio-RadCFX96 ("BioRad", США), Rotor-GeneQ («QIAGEN», Германия) и LightCycler 96 Real-Time PCR System («RocheDiagnostics», Швейцария).
Описание алгоритма автоматического анализа данных выходит за рамки данного изобретения. Далее приводятся примеры, которые показывают применение созданной аналитической тест-системы. Следует понимать, что приводимые примеры служат исключительно для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема притязаний, выраженных в формуле изобретения. На основании настоящего описания специалист в данной области сможет легко предложить свои варианты и модификации осуществления изобретения, не отходя от общей концепции настоящего изобретения и без привлечения собственной изобретательской деятельности, так что должно быть понятно, что такие варианты и модификации также будут входить в объем притязаний настоящего изобретения.
Примеры осуществления изобретения
Пример 1. Верификация взаимосвязи генных маркеров с чувствительностью к онколитическому вирусу кори путем подавления и гиперэкспрессии соответствующих генов
Методом лентивирусной трансдукции был получен ряд модельных линий с измененной экспрессией (подавлением и гиперэкспрессией) генов-маркеров чувствительности к панели онколитических вирусов. Для функциональной оценки значимости следующих генов-маркеров: S100PBP, IL1RAPL2, ТМЕМ54, LEPR, DNAJC24, PDIK1L, было проведено изучение репликативной способности онколитического вируса кори при размножении в модельных культурах злокачественных опухолей человека с искусственно модифицированной экспрессией выявленных биомаркеров in vitro. В таблице 3 представлены результаты изучения способности вируса кори селективно убивать и реплицироваться на модельных линиях опухолевых клеток с нормальной (столбец 3) и модифицированной (столбец 4) экспрессией генов-маркеров (S100PBP, IL1RAPL2, ТМЕМ54, LEPR, DNAJC24, PDIK1L). В таблице 4 представлены данные, отражающие взаимосвязь изменения экспрессии отдельного биомаркера и связанное с этим изменение чувствительности к вирусу. Было показано, что изменение уровня экспрессии всех генов-маркеров влияет на онколитические свойства вируса кори, но наиболее значительное влияние (изменение чувствительности ~ на 2 порядка) обнаружено при подавлении экспрессии гена IL1RAPL2 и гиперэкспрессии генов ТМЕМ54, LEPR, DNAJC24, PDIK1L.
Пример 2.
Образцы опухолей получали из Национального медицинского исследовательского радиологического центра, часть образца помещали в раствор RNAlater и выделяли из нее РНК с помощью набора RNAqueous-96 kit (Ambion), а из второй части образца получали первичные культуры. Затем на матрице РНК синтезировали кДНК с помощью набора Mint (Евроген). кДНК использовали для анализа экспрессии генов-маркеров с помощью данной аналитической тест-системы. Полученные первичные культуры тестировали на чувствительность к онколитическим вирусам.
Всего было получено и протестировано 67 образцов опухолей различного гистогенеза. Полученные данные ПЦР соответствовали результатам тестирования первичных линий на чувствительность к вирусам in vitro.
Аналитические тест-системы по определению чувствительности злокачественной опухоли конкретного пациента к онколитической биотерапии
Таблица 2.
Последовательности праймеров для амплификации и олигонуклеотидных зондов для детекции продуктов амплификации
<b>SEQ ID NO</b>
<b>Название гена</b>
<b>Длина ампликона (п.н.) и GC-состав, %</b>
<b>Тип олигонуклеотида</b>
<b>Нуклеотидная последовательность 5' ^ 3'</b>
<b>Длина, п.н.</b>
<b>Температура отжига, °С</b>
<b>GC состав, %</b>
1
CD74
197 (60)
Прямой праймер
ACAAACTGACAGTCACCTCC
20
56
50
2
Обратный праймер
GTGCATCACATGGTCCTCTG
20
56
5
3
Зонд
TTCCCAAGCCTCCCAAGCCTGTGAGCAA
28
67
57
4
CFI
190 (42)
Прямой праймер
GTGAGGTGGACTGCATTACA
20
55
50
5
Обратный праймер
AAGGAAACGAATTGTGGGAGG
20
56
48
6
Зонд
GTTGGCTGTGCAGGCTTTGCATCTGTG
27
66
56
7
CSF3
193 (65)
Прямой праймер
AGTTGGGTCCCACCTTGG
18
56.5
61
8
Обратный праймер
TCCAGGAAGCTCTGCAGAT
19
55.5
53
9
Зонд
GCAGATGGAAGAACTGGGAATGGCCCC
27
66
59
10
DNAJC24
178(39)
Прямой праймер
ATGATGGCGGTTGAGCAG
18
56
56
11
Обратный праймер
TGAACTTCTGTACACATTCCTCC
23
55
43
12
Зонд
GGGAGCAGACCCATCTGCAAATATATCAGACCT
33
65
48
13
FGF5
195 (62)
Прямой праймер
ACTGATAGGAACCCTAGAGGC
21
56
52
14
Обратный праймер
GCAGATGGAAACCGATGCC
19
56.5
58
15
Зонд
CTTGGAGCAGAGCAGTTTCCAGTGGAGC
28
65
57
16
HCFC2
174 (44)
Прямой праймер
AACACGGCTACGAATCAGTG
20
56
50
17
Обратный праймер
CCATAACCAACGACTTGCTTGTA
23
56
43
18
Зонд
CTGCCCATGGATTTGTCTGTGATGGTACCAG
31
65
52
19
HCK
179 (56)
Прямой праймер
ATCCGGGATAGCGAGACC
18
56
61
20
Обратный праймер
CCCTTCTTGTAGTGGTCCAC
20
55
55
21
Зонд
TTTGTCCGTGCGAGACTACGACCCTCG
27
66
59
22
IL15
190 (37)
Прямой праймер
TTGGGAACCATAGATTTGTGCAG
23
56
43
23
Обратный праймер
AGAGAAAGCACTTCATTGCTGTT
23
56
39
24
Зонд
GCTTCCTAAAACAGAAGCCAACTGGGTGAATGT
33
65
45
25
IL1RAPL2
175 (42)
Прямой праймер
AGAGTCTGGGCCAATGATCTA
21
55
48
26
Обратный праймер
GCAGGTATAATTCGCCAGGT
20
56
50
27
Зонд
GGTGAAATAAGGCTTCTCAAAGAGCATCTTGGAG
34
64
44
28
IL8
186 (44)
Прямой праймер
TGCCAAGGAGTGCTAAAGAAC
21
56
48
29
Обратный праймер
TCTGCACCCAGTTTTCCTT
19
55
47
30
Зонд
CTGAGAGTGATTGAGAGTGGACCACACTGCG
31
66
55
31
ITGA7
193 (58)
Прямой праймер
CTGACTCCATGTTCGGGATC
20
55
50
32
Обратный праймер
TAGCCGAAGCTCTTGATGC
19
56
53
33
Зонд
CTTTCCAGATATTGCAGTGGGTGCCCCC
28
66
57
34
LEPR
192 (41)
Прямой праймер
CTTGTGTGCAGTCTATGCTGT
21
56
48
35
Обратный праймер
GGCTTCCAAAGTAAAGTGACATT
23
55
39
36
Зонд
ATTGGAGCAATCCAGCCTACACAGTTGTCATG
32
65
47
37
MAP3K13
184 (43)
Прямой праймер
AAGTCTCAGGCTGAATGGAG
20
55
50
38
Обратный праймер
CCATGTATAAATTATTCGCCCGC
23
56
43
39
Зонд
GAAGAACTGATTCGAAGGCGCAGAGAAGAGCTC
33
66
52
40
MAPKAPK3
160 (48)
Прямой праймер
AGATAATGCGGGATATTGGCAC
22
56
45
41
Обратный праймер
GCATTTTGGGTGGTCTCCTTA
21
56
48
42
Зонд
AAGGAGAAAGACGCAGTGCTTAAGCTCACC
30
65
50
43
MDK
184 (67)
Прямой праймер
GCGGTCGCCAAAAAGAAAG
19
56
53
44
Обратный праймер
CAAACTCCTTCTTCCAGTTGCA
22
56
45
45
Зонд
AGCGAGTGCGCTGAGTGGGC
20
66
70
46
PDGFRA
193 (48)
Прямой праймер
TTGAAGGCAGGCACATTTACA
21
56
43
47
Обратный праймер
TGTCTGCTGTCGTAGGAGG
19
56
58
48
Зонд
TTCTGCCATTATACCTTGTCGCACAACTGATCC
65
33
45
49
PDIK1L
168 (40)
Прямой праймер
GATGTCCCACGGCTCTAATTC
21
56
52
50
Обратный праймер
TTACGATTGGGTTTCCTGGAC
21
55
48
51
Зонд
TGATCCCAGAAGCGCCTATTATTTGTGGTTTGTG
34
65
44
52
PIK3CA
167 (41)
Прямой праймер
AGTAGGCAACCGTGAAGAAAAG
22
56
45
53
Обратный праймер
GAGGTGAATTGAGGTCCCTAAGA
23
56
48
54
Зонд
TTGCTATCGGCATGCCAGTGTGTGAATT
28
65
46
55
S100PBP
196 (45)
Прямой праймер
TGAAGGGATCAGCCCCAATA
20
56
50
56
Обратный праймер
TTGACTTGTGTGAACCACCAT
21
55
43
57
Зонд
TGCCTGACAGTGAGAACCCTACGTCTGTATTC
32
65
50
58
SCARB2
143 (42)
Прямой праймер
AGATGGAGATTCTTTTCACCCAC
23
55
43
59
Обратный праймер
CAGGAACTTTATACCGAAAGGCA
23
56
43
60
Зонд
TGTCTTCCCATCTGACTTTTGCAGGTCAGTGT
32
65
47
61
STK4
191 (51)
Прямой праймер
GGATTCTGGCACGATGGTT
19
56
53
62
Обратный праймер
GCATGGTCTCATCCCTTCTTTT
22
56
45
63
Зонд
GCCAGCACCATGACTGATGGAGCCAATAC
29
66
55
64
TMEM54
173 (59)
Прямой праймер
GGGCCATGTGAGCTTCAT
18
56
56
65
Обратный праймер
GGTAGCGTGACAACACGAT
19
56
53
66
Зонд
CTCAAGATGCGGTGGCTCTGCAGTACTG
28
65
57
67
TNFAIP6
141 (50)
Прямой праймер
TCTGGCAAATACAAGCTCACC
21
56
48
68
Обратный праймер
GCCCTTAGCCATCCATCC
18
56
61
69
Зонд
GGCGGCCATCTCGCAACTTACAAGC
25
66
60
70
TNFRSF1B
178 (57)
Прямой праймер
CGGGCCAACATGCAAAAG
18
56
56
71
Обратный праймер
CAGATGCGGTTCTGTTCCC
19
56
58
72
Зонд
TCTGGAACTGGGTTCCCGAGTGCTTGAG
28
66
57
73
TRAF4
204(60)
Прямой праймер
CAGGAGAGTGTCTACTGTGAGAA
23
56
48
74
Обратный праймер
AGTGCCCACACCACATTG
18
56
56
75
Зонд
CGTCTTTGACACCATCCAGAGCCACCAGT
29
66
55
76
GAPDH
131 (45)
Прямой праймер
TGATTTGGTCGTATTGGGCG
20
56
50
77
Обратный праймер
TGGGTGGAATCATATTGGAACAT
23
55
39
78
Зонд
GGATATTGTTGCCATCAATGACCCCTTCATTG
32
63,5
44
79
ACTB
164 (62)
Прямой праймер
TCTTCCCCTCCATCGTGGG
19
57
63
80
Обратный праймер
TTTCTCCATGTCGTCCCAGTT
21
56
48
81
Зонд
CAGAGCAAGAGAGGCATCCTCACCCTGA
29
65
57
82
RPN1
125 (54)
Прямой праймер
ACCCTCAACAGTGGCAAGAA
20
56
50
83
Обратный праймер
TGCATTTCGCTCACTCTGTC
20
55
50
84
Зонд
CAGTCCAGGCTGAAGACAGAGGGC
24
64
63
85
GUSB
171 (56)
Прямой праймер
GATGGAAGAAGTGGTGCGTAG
21
57
52
86
Обратный праймер
TTAGAGTTGCTCACAAAGGTCA
22
55
41
87
Зонд
CGTCCCACCTAGAATCTGCTGGCTACTACTT
31
65
52