СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНАНТИОМЕРОВ ПЕРВИЧНЫХ АМИНОСОЕДИНЕНИЙ
METHOD OF DETECTING ENANTIOMERS OF PRIMARY AMINE COMPOUNDS

Настоящее изобретение относится к способу определения энантиомеров первичных аминосоединений методом жидкостной хроматографии, основанного на разделении стереоизомерных изоиндолов, образующихся в результате дериватизации первичных аминогрупп соединений, подлежащих анализу, стандартным раствором орто-фталевого альдегида (ОФА) и хирального тиола (SH-реагент). Сущность изобретения состоит в том, что в качестве SH-реагента предлагается использовать полифункционализированные тиолы из числа N-ацильных производных S-цистеина, олигопептидов и их миметиков, содержащих S-цистеин. Изобретение позволяет достичь более эффективного разделения, чем в случае использования ранее описанных гомохиральных SH-реагентов.
Обоснование, уровень техники, область возможного применения: Энантиомеры аминосоединений являются ключевыми структурными элементами физиологически активных соединений, поэтому они представляют большой интерес как для фундаментальной науки, так и для многих отраслей промышленности - фармацевтической, агрохимической, пищевой, косметической и др. Мировой рынок хиральных соединений за 2006 г. по прогнозам аналитиков Frost&Sullivan Ltd. превысит 15 млр долларов США. Требования к оптической чистоте препаратов неуклонно растут, что обуславливает необходимость разработки и усовершенствования методов получения и контроля качества энантиомеров.
Наиболее широкое применение для определения энантиомерной чистоты нашли методы на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Одним из методов косвенного анализа является метод обращенно-фазовой ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией аминогрупп стандартным раствором орто-фталевого альдегида (ОФА) и энантиомерно чистого сульфгидрильного реагента (SH-реагента) (J.Chromatogr. 315 (1984) 279. Патенты JP 60038652 от 28.02.1985, US 4670403 от 02.06.1987). В результате предварительной дериватизации аминогрупп препарата, содержащего два энантиомера, образуются два стереоизомерных изоиндола, которые могут быть разделены методами жидкосной хроматографии, например, методом ВЭЖХ на обычной обращенно-фазовой хроматографической колонке. До настоящего времени в качестве SH-реагента использовали тиосахара (J.Chromatogr. 558 (1991) 311. J.Chromatogr. 434 (1988) 417) и нефункционализированные гомохиральные тиолы - N-ацильные производные цистеина без функциональных групп в ацильной части, как, например, гомологический ряд от ацетил- до н-октаноил-, изовалерил-, пивалоил-, бензоил-, трет-бутилоксикарбонил-, N-изобутирил-S-цистеин (патент JP 60038652 от 28.02.1985, Anal. Biochem. 137 (1984) 405, J.Chromatogr. 315 (1984) 279, J.Chromatogr. 483 (1989) 239, J.Chromatogr. A 666 (1994) 259), N-ацетил-R-пеницилламин (J.Chromatogr. 387 (1987) 255), R-3-меркапто-2-метилпропионовая кислота (J.Chromatogr. 623 (1992) 237), что обуславливало достаточно низкую разрешающую способность и, тем самым, ограничивает их использование для хирального анализа. Поэтому метод применяли для решения более простой задачи - определения содержания только активных, S-энантиомеров аминокислот (J.Chromatogr. A 987 (2003) 311, J.Chromatogr. A 870 (2000) 271, J.Chromatogr. В. 666 (1995) 241).
Цель настоящего изобретения состоит в том, чтобы обеспечить способ, позволяющий количественно определять в препаратах первичных аминосоединений, таких как нефункционализированные амины, аминоспирты, аминокислоты и их элементоорганические аналоги, содержание каждого из оптических изомеров.
Сущность изобретения: Настоящее изобретение представляет собой способ количественного определения энантиомеров аминосоединений общей формулы (I)
где
1
2
3
- R, R и R могут быть соединены между собой, образуя (би)циклическую структуру вместе с атомом углерода, к которому присоединены, или не связаны между собой, и каждый из которых представляет Н, замещенный или незамещенный (цикло)алкильный, или арильный, или алкиларильный, или арилалкильный радикал, содержащий или не содержащий гетероатом/гетероатомы О, N, S, Р, галоген. В, Si или функциональные группы на их основе,
при котором энантиомерно чистый тиол из числа N-ацильных производных (S)-цистеина и олигопептидов и их миметиков, содержащих цистеин, следующей общей формулы (II),
где
- {Cys} - S-цистеин, природный или неприродный олигопептид или их миметик, содержащий S-цистеин со свободной сульфгидрильной группой,
0
- Z - атом О, S или замещенная аминогруппа,
1
- Z - атом Н, замещенный или незамещенный циклоалкильный, алкильный, арильный, алкиларильный, или арилалкильный радикал, содержащий или не содержащий гетероатом/гетероатомы О, N, F,
2
- Z - атом Н, замещений или незамещенный алкильный или арильный радикал,
3
- Z - атом Н, F, гидрокси-, алкокси-, -NHOH, замещенная аминогруппа,
- m - число, выбранное из 0, 1,
- n - число, выбранное из 0, 1, 2,
- таким образом, что соединение (II) в сравнении с незамещенными N-ацильными производными S-цистеина, например N-ацетил-S-цистеином, содержит один и более дополнительных хиральных центров и/или один и более дополнительных гетероатомов О, N, F и называется далее по тексту "функционализированным" хиральным SH-реагентом,
приводится в контакт с препаратом, содержащим аминосоединения формулы (I), в присутствии воды и ОФА, после чего производится количественное определение образующихся стереоизомерных изоиндолов одним из методов физико-химического анализа, например, из числа хроматографических методов анализа (в частности, высокоэффективная жидкостная хроматография или капиллярный электрофорез).
Названный способ включает стадии:
- контакта препарата первичного аминосоединения в присутствии воды и/или растворителя органической или неорганической природы с ОФА и оптически активным SH-реагентом, приводящего к образованию стереоизомерных изоиндольных аддуктов и
- их разделения и определения методом хроматографического анализа.
Названный способ применителен для количественного определения аминосоединений общей формулы (I), которые могут содержать один или несколько хиральных центров, а также ахиральных первичных аминосоединений, удовлетворяющие формуле (I).
Применение описанного метода позволяет количественно анализировать энантиомеры различных классов аминосоединений благодаря высокой стереоизбирательности при использовании функционализированных хиральных тиолов.
S
r
Применение предложенных функционализированных SH-реагентов общей формулы (II) обеспечивает высокую стереоселективность (фактор разделения R достигает величин более 0,9-1,0, преимущественно - более 1,3-1,5), чувствительность (предел обнаружения при спектрофотометрическом детектировании менее 1-3 пкмоль, при флюориметрическом детектировании - менее 1-3 fмоль) и воспроизводимость (s, менее 0,3-1,0%) анализа, а также высокую растворимость и стабильность соответствующих изоиндолов в условиях хроматографического анализа, позволяющее анализировать различные аминосоединения общей формулы (I), включая гидрофобные амины. В настоящей заявке термин “хроматографическое разделение” должен пониматься как число и/или величина свойств, которыми различаются полученные стереоизомерные изоиндольные формы в ходе дериватизации аминогрупп. Так, их физическое разделение в пространстве не является непременным условием и может быть проведено в дальнейшем.
1
2
3
Предпочтительным вариантом осуществления заявляемого способа является использование набора аминосоединений, имеющих общую формулу (I), который может быть охарактеризован тем, что R это Н, R представляет собой карбокси-, амидную, сложноэфирную, гидрокси-, алкокси-, метальную группу, а R представляет группу, выбранную из набора, содержащего алкильный, циклоалкильный, арильный, алкиларильный, арилалкильный радикал, каждый из которых может содержать или не содержать один или несколько галоген атомов.
В качестве хирального SH-реагента для предколоночной модификации в случае определения энантиомеров ароматических аминосоединений предпочтительно использование реагентов общей формулы (II), содержащий один или несколько ароматических заместителей, как например S-NMC, R-NMC (см. табл.1), с элюированием при температуре предпочтительно выше комнатной, например, 25-60°С, а в случае определения энантиомеров алифатических аминосоединений предпочтительно использование реагентов общей формулы (II) с большим содержанием алифатических радикалов, как например соединений 1-Б, представленных в таблице 1, с ВЭЖХ анализом предпочтительно при температурах при 1-25°С.
1
2
3
Наиболее предпочтительным вариантом осуществления заявляемого способа является такой, когда испытуемым веществом является аминосоединение общей формулы (I), где R это Н, R представляет собой карбокси-, сложноэфирную, гидрокси- группу, R это замещенный или незамещенный алкильный, циклоалкильный или арильный радикал. Дериватизацию аминосоединений испытуемого образца предпочтительно проводить при высоком значении рН, например при рН в интервале 6 и 12, в частности 8 и 10.
Молярное отношение концентраций хирального SH-реагента и ОФА при дериватизации предпочтительно составляет от 1 до 100, в частности в пределах 2-10.
Молярное отношение ОФА и предполагаемой общей концентрации аминогрупп при дериватизации предпочтительно составляет от 1 до 100, в частности 2-10.
Температура, при которой проводится дериватизация аминогрупп, не играет решающего значения и может быть, например, в интервале от 0 до +90°С, предпочтительно между 0 и +50°С, в частности при комнатной температуре.
Время, за которое проводится дериватизация, предпочтительно составляет от 1 минуты до 100 часов, в частности 10 минут.
Испытуемый образец аминосоединений приводится в контакт с ОФА и хиральным SH-реагентом предпочтительно в присутствии воды/водного раствора, предпочтительно содержащего растворимые неорганические соединения, например борат, и/или смешивающиеся с водой органические соединения, например метанол, ацетон, диметилсулфоксид.
Хроматографический анализ смеси, полученной после дериватизации, предпочтительно проводить при использовании колонки для обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии или капиллярного электрофореза.
В качестве подвижной фазы предпочтительно использовать воду или водные растворы, содержащие смешивающиеся с водой органические и/или неорганические соединения, например, такие как метанол, ацетонитрил, фосфат калия. Кислотность подвижной фазы может варьироваться в интервале рН от 1 до 11, предпочтительно рН 4-7, в частности pH 6-7.
Режим подачи подвижной фазы предпочтительно изократический, в частности градиентный.
Скорость подачи мобильной фазы может варьироваться в интервале от 0,01 до 3 мл/мин, предпочтительно 0,1-1,0 мл/мин.
Элюирование предпочтительно проводить при температуре от 0 до +70°С, в частности между +5 и +50°С.
Способ регистрации сигнала предпочтительно использовать флюориметрический или спектрофотометрический.
Настоящее изобретение продемонстрировано нижеследующими примерами, которые никоим образом не ограничивают его применение. В качестве SH-реагентов использовали, с одной стороны, гомохиральные тиолы, среди которых коммерчески доступный и традиционно используемый для этих целей N-ацетил-S-цистеин (NAC), а также новый NPC (таблица 1), и, с другой стороны, функционализированные N-ацильные производные S-цистеина и глутатиона.
ВЭЖХ-анализ проведен на хроматографической системе Perkin Elmer 200 Series при использовании различных колонок для обращенно-фазовой хроматографии. Изоиндольные стереоизомеры анализировали спектрофотометрически при 340 нм, и флюориметрически с возбуждением при 340 нм и эмиссией при 450 нм.
2
1
S
R2
R1
2
1
1
2
n
Rn
m
m
R2
R1
m
2
1
Хроматографические параметры рассчитывались по формулам: коэффициент селективности α=k/k, фактор разделения R=1,18·(t-t)/(w+w), где k, k - коэффициенты емкости определяемых веществ, рассчитанные по формуле k=(t-t)/t, a t, t - времена удерживания определяемых веществ, t - мертвое время хроматографической системы, w, w - полуширины пиков удерживаемых веществ.
Таблица 1.
Структура рассмотренных хиральных SH-реагентов.
Структура хирального SH-реагента
N-ацильный радикал (R-)тиолов*
<img file="00000003.tif" he="8" wi="12" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000004.tif" he="13" wi="17" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000005.tif" he="13" wi="21" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000006.tif" he="13" wi="23" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000007.tif" he="14" wi="24" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000008.tif" he="17" wi="19" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000009.tif" he="20" wi="22" img-content="undefined" img-format="tif" />
<img file="00000010.tif" he="16" wi="18" img-content="undefined" img-format="tif" />
I-A
<img file="00000011.tif" he="25" wi="25" img-content="undefined" img-format="tif" />
NAC
S-NLC
NPC
NPOC
p-OH-NPC
R-NMC
S-NMC
R-NAPC
I-Б
<img file="00000012.tif" he="31" wi="41" img-content="undefined" img-format="tif" />
NAGSB
S-NLGSH
NPGSH
NPOGSH
p-OH-NPGSH
R-NMGSH
S-NMGSH
R-NAPC
I-A - N-ацильные производные цистеина,
I-Б - N-ацильные производные глутатиона (GSH) - природного трипептида, содержащего циотеин со свободной сульфгидрильной группой,
* структуры функционализированных тиолов выделены жирным шрифтом.
S
S
Отметим, что R≥1,5 является условием полного разделения пиков двух энантиомерных форм (до базовой линии), а R≈1,1-1,2 - условие удовлетворительного разделения пиков. Дериватизацию первичных аминогрупп можно проводить различными способами смешивая растворы анализируемого аминосоединения и реагентов, например: к 900 мкл раствора аминосоединения (общее содержание первичных аминогрупп не превышает 0,5 ммоль/л) в 0,2 М боратном буфере (рН 9,6) добавлять 50 мкл 60 мМ метанольного раствора SH-реагента и 50 мкл 20 мМ ОФА, полученную смесь перемешивать, через 15 мин после начала реакции разбавляли подвижной фазой, центрифугировали в течение 3 мин при 12000 об/мин и анализировали.
1
Изобретение иллюстрируется следующими примерами и чертежом, на котором изображена структура рассмотренных аминосоединений общей формулы (I), где R это Н.
Пример 1. Энантиомерный анализ ароматических аминов, аминоспиртов и аминокислот методом ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией.
Предколоночную дериватизацию рацемататов (1, 3, 8, 11, 14) проводили согласно вышеописанной процедуре. ВЭЖХ анализ проводили при использовании колонки для обращенно-фазовой хроматографии Phenomenex Luna 5u С-18 (250×4,6 мм, 5 мкм), скорость потока 0,8 мл/мин. В качестве подвижной фазы использовали 6 мМ фосфатный буфер (рН 6,8), содержащий ацетонитрил (25-40% по объему). Элюирование проводили в изократическом режиме при 25°С. Данные показаны в таблице 2.
Пример 2. Определение энантиомеров ароматических и алифатических аминоспиртов и аминокислот (градиентное элюирование).
Предколоночную дериватизацию рацематов (9, 11, 14, 15) проводили согласно вышеописанной процедуре. ВЭЖХ анализ проводили при использовании колонки для обращенно-фазовой хроматографии Nucleosil С-18 Chrompack Varian (150×4,6 мм, 5 мкм), скорость потока 0,8 мл/мин. В качестве подвижной фазы использовали линейный градиент на основе 6 мМ фосфатного буфера, рН 6,8 (А) и ацетонитрила (Б): 0 мин - 5% Б, 90 мин - 50% Б.
Данные показаны в таблицах 3 и 4.
Таблица 2
№<sup>А</sup>
NAC
NPC
NPOC
R-NMC
S-NMC
k<sub>1</sub>'
α
R
СЭ<sup>Б</sup>
k<sub>1</sub>'
α
R
СЭ
k<sub>1</sub>'
α
R
СЭ
k<sub>1</sub>'
α
R
СЭ
k<sub>1</sub>'
α
R
СЭ
1
20
1,00
0
В
26
1,00
0
Г
30
1,04
0,71
Г
15
1,04
1,32
Г
20
1,05
1,50
Г
3
30
1,00
0
Б
15
1,03
1,14
Г
25
1,03
0,80
Г
20
1,05
1,42
В
35
1,06
1,77
В
8
20
1,03
1,15
А
7,7
1,06
1,46
В
12
1,04
1,06
В
15
1,07
1,70
Б
29
1,10
2,97
Б
11
4,7
1,08
1,93
А
4,4
1,00
0
В
5,3
1,06
1,41
В
8,1
1,08
2,28
Б
13
1,08
2,49
Б
14
2,3
1,13
2,16
А
3,8
1,17
3,75
Б
5,9
1,12
3,00
Б
2,2
1,27
4,37
Б
2,5
1,59
9,45
Б
<sup>А</sup> структуры аминосоединений представлены на чертеже;
<sup>Б</sup>СЭ содержание ацетонитрила (V/V) в подвижной фазе (А - 25%, Б - 30%, В - 35%, Г - 40%).Примечание: Использование функционализированных SH-реагентов увеличивает стереоселективность и позволяет определять энантиомеры различных классов аминосоединений.
Таблица 3
Опыт 2А. Энантиомерный анализ первичных аминосоединений (элюирование при 50°С)
№<sup>А</sup>
NAC
NPC
NPOC
R-NMC
S-NMC
k<sub>1</sub>'
α
R
k<sub>1</sub>'
α
R
k<sub>1</sub>'
α
R
k<sub>1</sub>'
α
R
k<sub>1</sub>'
α
R
9
20
1,00
0
27
1,00
0
28
1,01
0,51
23
1,02
1,23
26
1,02
2,07
11
15
1,03
1,84
24
1,01
0,88
24
1,02
0,95
19
1,02
1,35
22
1,02
1,82
14
11
1,00
0
17
1,07
4,87
18
1,01
0,55
13
1,10
5,76
15
1,16
10,4
15
6,1
1,06
1,64
13
1,10
5,45
15
1,07
5,97
9,4
1,16
5,38
11
1,19
9,85
<sup>А </sup>структуры аминосоединений представлены на чертеже.
Таблица 4
Опыт 2Б. Энантиомерный анализ первичных аминосоединений (элюирование при 8°С)
№<sup>A</sup>
NAC
R-NMC
S-NMC
NPGSH
R-NMGSH
k<sub>1</sub>'
α
R
k<sub>1</sub>'
α
R
k<sub>1</sub>'
α
R
k<sub>1</sub>'
α
R
k<sub>1</sub>'
α
R
9
23
1,01
0,42
27
1,02
1,58
27
1,02
1,58
23
1,01
1,39
20
1,01
1,38
11
19
1,03
3,05
23
1,02
1,40
23
1,02
1,40
20
1,01
1,53
17
1,02
1,72
14
15
1,00
0
16
1,17
9,22
16
1,17
9,22
17
1,27
26,6
14
1,01
0,65
15
11
1,03
1,71
13
1,21
6,85
13
1,21
6,85
14
1,01
0,82
11
1,05
3,28
<sup>A </sup>структуры аминосоединений представлены на чертеже.Примечание: Использование функционализированных SH-реатентов увеличивает стереоселективность и позволяет определять энантиомеры алифатических и ароматических аминосоединений.
Пример 3. Энантиомерный анализ аминов и аминоспиртов при использовании R-NMC и NAC.
Предколоночную дериватизацию рацематов аминов и аминоспиртов проводили согласно вышеописанной процедуре. ВЭЖХ анализ проводили при использовании колонки для обращенно-фазовой хроматографии Phenomenex Luna 5u C-18 (250×4,6 мм, 5 мкм), скорость потока 0,8 мл/мин. В качестве подвижной фазы использовали 6 мМ фосфатный буфер (рН 6,8), содержащий ацетонитрил (25-37% по объему). Элюирование проводили в изократическом режиме при 25°С.
Таблица 5
№<sup>А</sup>
NAC
R-NMC
k<sub>1</sub>'
α
R
СЭ<sup>Б</sup>
k<sub>1</sub>'
α
R
СЭ<sup>Б</sup>
1
26
1,00
0
30%
13
1,04
1,35
37%
2
16
1,00
0
27%
9,4
1,05
1,35
37%
3
31
1,00
0
27%
20
1,05
1,42
35%
4
15
1,00
0
25%
21
1,02
1,10
33%
5
46
1,00
0
27%
23
1,03
0,90
37%
6
49
1,02
0,45
27%
19
1,03
1,00
33%
7
2,7
1,23
3,47
30%
1,8
1,10
2,24
37%
8
17
1,04
0,86
25%
15
1,13
4,20
27%
9
13
1,03
0,81
25%
10
1,13
3,50
27%
10
19
1,05
1,34
22%
3,4
1,06
1,81
37%
11
3,0
1,11
1,61
25%
7,9
1,16
3,26
27%
12
3,8
1,13
2,40
20%
1,5
1,08
1,63
27%
20
26
1,06
1,76
27%
10
1,05
1,53
33%
<sup>А</sup> структуры аминосоединений представлены на чертеже,
<sup>Б</sup> содержание ацетонитрила (V/V) в подвижной фазе.Примечание: Использование функционализированного R-NMC увеличивает стереоселективность разделения аминоспиртов и в отличие от гомохирального NAC, позволяет определять энантиомеры нефункционализированных аминов.
Пример 4. Определение энантиомеров амидов и эфиров аминокислот.
Предколоночную дериватизацию рацемата (16 и 19) проводили согласно вышеописанной процедуре. ВЭЖХ анализ проводили при использовании колонки для обращенно-фазовой хроматографии Nucleosil С-18 Chrompack Varian (150×4,6 мм, 5 мкм), скорость потока 0,8 мл/мин. В качестве подвижной фазы использовали 6 мМ фосфатный буфер (рН 6,8), содержащий ацетонитрил (18-30% по объему). Элюирование проводили в изократическом режиме при 25°С.
Таблица 6<sup>Б</sup>
Опыт 4А.
Определение энантиомеров амида фенилаланина
Аминосоединение <sup>А</sup>
SH-реагент
Хроматографические
параметры
СЭ<sup>б</sup>
k<sub>1</sub>
α
R<sub>S</sub>
NAC
9,5
1,04
1,02
25%
16
R-NMC
8,5
1,11
3,06
30%
S-NMC
7,8
1,12
3,88
30%
<sup>А</sup> структуры аминосоединений представлены на чертеже,
<sup>Б</sup> содержание ацетонитрила (V/V) в подвижной фазе.
Таблица 7
Опыт 4Б.
Определение энантиомеров этилового эфира валина
Аминосоединение <sup>А</sup>
SH-реагент
Хроматографические параметры
Прорядок элюир.
СЭ<sup>Б</sup>
k<sub>1</sub>
α
R<sub>S</sub>
NAC
21
1,08
0,67
R,S
20%
19
R-NMC
15
1,09
0,60
22%
NPGSH
14
1,14
1,2
S,R
18%
<sup>А</sup> структуры аминосоединений представлены на чертеже
<sup>Б</sup> содержание ацетонитрила (V/V) в подвижной фазе.Примечание: Использование функционализированных SH-реагентов увеличивает стереоселективность разделения С-защищенных аминокислот.
Пример 5. Метрологические характеристики метода при определении энантиомеров аминов, аминоспиртов и аминокислот.
Предколоночную дериватизацию рацематов (9 и 15) проводили согласно вышеописанной процедуре. ВЭЖХ анализ проводили при использовании колонки для обращенно-фазовой хроматографии Nucleosil С-18 Chrompack Varian (150×4,6 мм, 5 мкм), скорость потока 0,8 мл/мин. В качестве подвижной фазы использовали линейный градиент на основе 6 мМ фосфатного буфера, рН 6,8 (А) и ацетонитрила (Б): 0 мин - 5% Б, 90 мин - 50% Б. Элюирование проводили при 25°С.
Воспроизводимость анализа при использовании. R-NMGSH в качестве хирального SH-реагента (УФ-детектирование при 340 нм, n=3, Р=0,95)
Таблица 8
Параметры пиков
Энантиомер
Номер анализа
Х<sub>ср.</sub> <sup>A</sup>
S<sub>x</sub> <sup>Б</sup>
S<sub>r</sub>,%<sup>B</sup>
µ<sup>Г</sup>
1
2
3
Высота, у.е.
S-
22405
22725
22569
22566
160
0,71
(22,6±0,5)·10<sup>3</sup>
R-
21986
22392
22345
22241
222
1,00
(22,2±0,6)·10<sup>3</sup>
Площадь, у.е.
S-
304947
305676
302867
304497
1458
0,48
(30,4±0,4)·10<sup>4</sup>
R-
286936
288943
290485
288788
1780
0,62
(28,9±0,4)·10<sup>4</sup>
Время элюирования, с
S-
2380
2380
2378
2380
1,20
0,05
2380±3
R-
2409
2410
2407
2409
1,36
0,06
2409±3
<sup>А</sup> среднее значение единичных результатов серии анализов, <sup>Б</sup> размах варьирования, в относительное стандартное отклонение, <sup>Г</sup> истинное значение.
Метрологические характеристики метода (УФ-детектирование при 340 нм, n=3, Р=0,95)
Таблица 9
Аминосоединение
SH-реагент
ε340 нм, М<sup>-1</sup>·см<sup>-1</sup>
Относительное стандартное отклонение s<sub>r</sub>, %
9
R-NMGSH
5900
0,5-1,0
9
NPGSH
5900
0,4-1,0
15
S-NMC
6000
0,5-1,0
Примечание:Применение предложенных функционализированных SH-реагентов наряду с высокой стереоселективностью обеспечивает высокую чувствительность (предел обнаружения при спектрофотометрическом детектировании составляет 1-3 пмоль, при флюориметрическом детектировании 1-3 фмоль) и воспроизводимость (s<sub>r</sub> 0,5-1,0%) анализа.Линейная зависимость сигнала от концентрации энантиомера аминосоединения сохраняется в частности во всем исследуемом интервале 50 пмоль - 10 нмоль и 50 фмоль - 10 пкмоль аминогрупп с коэффициентом корреляции более 0,99 в случае спектрофотометрического и флюориметрического детектирования соответственно.