СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ КОМПЛЕКСА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ИЗ БИОМАССЫ КОРНЕВОЙ КУЛЬТУРЫ IN VITRO ЛАПЧАТКИ БЕЛОЙ (POTENTILLA ALBA L.)
METHOD OF EXTRACTING A COMPLEX OF BIOLOGICALLY ACTIVE SUBSTANCES FROM BIOMASS OF ROOT CULTURES OF POTENTILLA ALBA L_ IN VITRO

Изобретение относится к биотехнологической промышленности и касается способа получения экстрактов биологически активных веществ (БАВ) из биомассы клеточных культур растений in vitro.
Лапчатка белая (Potentilla alba L., семейство Розоцветные - Rosaceae) представляет значительный интерес в связи с накоплением большого количества вторичных метаболитов. Биологически активными составляющими лапчатки белой являются такие компоненты, как флавоноиды, регулирующие проницаемость и эластичность стенок кровеносных сосудов, предотвращающие атеросклеротические изменения, нейтрализующие свободные радикалы, фенолкарбоновые кислоты, обладающие антимутагенными и мочегонными свойствами, и сапонины, гликозиды, имеющие кардиотоническое, нейротропное, гипохолестеринемическое, кортикотропное, адаптогенное и седативное действие [1-3].
Природные лекарственные препараты имеют основной недостаток: ограниченность природных источников, крупномасштабное использование которых влечет за собой вполне определенные экологические проблемы [4]. Поэтому важнейшей задачей для развития фармацевтической и пищевой промышленности является обеспечение возобновляемым сырьем с необходимыми свойствами.
Проблему дефицита растительного сырья редких и исчезающих видов растений позволяет решить использование вместо интактных растений культур клеток, тканей и органов in vitro лекарственных растений (каллусных, суспензионных и корневых культур - так называемых «бородатых корней», "hairy roots") в качестве «фабрик» для производства БАВ.
Технологии in vitro имеют ряд преимуществ перед традиционным сбором сырья лекарственных растений, которые состоят в возможности круглогодичного получения ценных метаболитов в контролируемых условиях, обеспечивающих стандартизацию процесса. Поскольку в большинстве случаев биосинтез вторичных метаболитов в каллусных и суспензионных культурах протекает не так активно, как в исходных растениях, наиболее перспективной системой in vitro является корневая культура. Культуры "hairy roots" способны продуцировать как ценные метаболиты, характерные для исходного растения, так и новые вещества, являющиеся их предшественниками или производными. Следует отметить, что уровень биосинтеза этих веществ сопоставим, а в некоторых случаях превышает уровень их биосинтеза в интактных растениях [5].
Из уровня техники известно противовирусное средство на основе экстракта культуры «бородатых корней» ("hairy roots") селитрянки Шобера (Nitraria schoberi L.), где предложен способ получения сухого экстракта из культуры "hairy roots" Nitraria schoberi L. методом высушивания этанольного извлечения из измельченного и гомогенизированного сырья (патент РФ №2615376, опубл. 04.04.2017). Для этого 5 г измельченного и гомогенизированного сухого сырья культуры "hairy roots" Nitraria schoberi L. суспендируют в 100 мл 70%-ного водного раствора этанола трехкратно в течение 8 ч общего времени экстрагирования при температуре 60°С. Затем объединенные охлажденные экстракты фильтруют через стеклянные фильтры, выпаривают на ротационном испарителе и высушивают при температуре 60°С в сушильном шкафу.
В качестве недостатков предложенного способа следует отметить высокую продолжительность экстракции и высокую температуру процесса.
Так же из уровня техники известно средство, обладающее гемостимулирующим, антимутагенным, противоопухолевым, церебропротекторным, антигипоксическим, ноотропным, анксиолитическим и противоневротическим действием, которое представляет собой продукт экстрагирования "hairy roots" культуры корней шлемника байкальского Scutellaria baicalensis Georg 70%-ным этанолом при следующих условиях: продолжительность 1-3 ч, соотношение сырье : экстрагент 1:20, температура 80-85°С (патент РФ №2438691, опубл. 10.01.2012).
Основными недостатками заявленного способа являются высокая температура экстракции и низкий выход экстрактивных веществ.
Задачей настоящего изобретения является получение комплекса биологически активных веществ из биомассы корневой культуры in vitro лапчатки белой (Potentilla alba L), причем процесс экстракции биологически активных веществ осуществляют при пониженной температуре.
Ранее коллективом Научно-исследовательского института биотехнологии ФГБОУ ВО «Кемеровский государственный университет» предложен способ получения корневой культуры in vitro Potentilla alba L. - продуцента флавоноидов (заявка на выдачу патента на изобретение РФ №2019108252 от 06.05.2019). По этому способу получают биомассу корневой культуры in vitro Potentilla alba L. Далее биомассу корневой культуры in vitro Potentilla alba L. направляют на сушку, измельчают в ступке и подвергают экстрагированию 70%-ным водным раствором этанола при соотношении растительного сырья и экстрагента 1:20-1:5 при комнатной температуре в течении 360-120 мин. Сухую массу отделяют от раствора фильтрованием, фильтрат дополнительно центрифугируют для удаления взвешенных частиц. Растворитель из экстракта упаривают с помощью ротационного испарителя. Колбу взвешивают и определяют выход экстракта.
2
2
2
Остаток растворяют в минимальном объеме 70%-ного этанола и фракционный состав полученного раствора исследуют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ). В случае использования ТСХ на силикагеле без модификации хроматографию проводят в градиентном режиме в системе СНСl:МеОН с градиентом метанола 0-10%, с шагом в 1 %. В случае обращенно-фазовой хроматографии используют элюентную систему HO:MeCN с градиентом ацетонитрила 0-20% с шагом 2%, в качестве модификатора используют трифторуксусную кислоту.
На фиг. 1 приведены результаты ТСХ-анализа экстракта биомассы корневой культуры in vitro лапчатки белой.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Биомассу корневой культуры in vitro Potentilla alba L. направляют на сушку в сушильном шкафу при 100°С, измельчают в ступке и подвергают экстрагированию 70%-ным водным раствором этанола. Для этого навеску 4 г сухого растительного сырья помещают в пластиковую пробирку объемом 100 мл, добавляют 40 мл 70%-ного этанола, помещают на шейкер и перемешивают в течение 240 мин. Сухую массу отделяют от раствора фильтрованием, фильтрат дополнительно центрифугируют при 3900 об/мин. для удаления взвешенных частиц. Растворитель из экстракта упаривают при пониженном давлении из предварительно взвешенной колбы объемом 100 мл с помощью ротационного испарителя RV 10 digital V-C (IKA, Германия). Колбу взвешивают и определяют выход экстракта.
2
2
2
Остаток растворяют в 1 мл 70%-ного этанола и фракционный состав полученного раствора исследуют методом тонкослойной хроматографии. Для этого каплю полученного раствора наносят на пластинку для тонкослойной хроматографии с помощью стеклянного капилляра. Пластинку помещают в камеру для ТСХ, в которую добавляют соответствующий элюент. В случае использования ТСХ на силикагеле без модификации хроматографию проводят в градиентном режиме в системе СНСl:МеОН с градиентом метанола 0-10%, с шагом в 1%. В случае обращенно-фазовой хроматографии используют элюентную систему HO:MeCN с градиентом ацетонитрила 0-20% с шагом 2%, в качестве модификатора используют трифторуксусную кислоту, которую добавляют в количестве 0,1%.
Пример 2
Аналогичен примеру 1, но для экстрагирования используют 20 мл 70%-ного водного раствора этанола, а процесс экстракции ведут в течение 360 мин.
Пример 3
Аналогичен примеру 1, но для экстрагирования используют 80 мл 70%-ного водного раствора этанола, а процесс экстракции ведут в течение 120 мин.
В результате исследования экстракта лапчатки белой удалось с высокой селективностью выделить фракции, обогащенные астрагалином, монохаетином, кверцитин-3,7-дигликозидами (фиг. 1).
Результаты определения суммарного выхода индивидуальных БАВ, извлеченных из биомассы корневой культуры in vitro лапчатки белой, представлены в таблице 1.
Таким образом, при реализации предлагаемого изобретения достигается получают комплекс биологически активных веществ из биомассы корневой культуры in vitro лапчатки белой (Potentilla alba L), причем процесс экстракции биологически активных веществ осуществляют при пониженной (комнатной) температуре.
Источники информации:
1. Сравнительная оценка накопления фенольных соединений в надземных и подземных органах лапчатки в условиях Беларуси / Ж.А. Рупасова, В.А. Игнатенко, Т.И. Василевская и др. // Бюллетень Главного ботанического сада. - 2002. - Вып. 183. - С. 34.
2. Семенова, Е.Ф. Химический состав лапчатки белой и применение ее с лечебной целью / Е.Ф. Семенова, Е.В. Преснякова // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. - 2001. - №5. URL: http://chem.kstu.ru/butlerov_comm/vol2/cd-a2/data/jchem&cs/russian/n5/1vr103/103.htm.
3. Роговский, B.C. Перспективы применения препаратов кверцетина для профилактики и лечения атеросклероза / B.C. Роговский, А.И. Матюшин, Н.Л. Шимановский // Международный медицинский журнал. - 2011. - Т. 17. -№3. - С. 114-118.
4. Племенков, В.В. Природные соединения - основной базис поиска химиотерапевтических субстанций // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: материалы IV Всероссийской научной конференции. - Барнаул. - 2009. - Т. 2. - С. 11-14.
5. Sevon, N. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation: root cultures as source of alkaloids / N. Sevon, K.M. Oksman-Caldentey // Planta Med. - 2002. - V. 68. - P. 859-868.