ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ БОЛИГОЛОВА ПЯТНИСТОГО (Conium maculatum L)
NUTRIENT MEDIUM FOR CULTIVATION OF CALLUS CULTURE OF SPOTTED HEMLOCK (Conium maculatum L)

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию клеточных культур лекарственных растений, и может быть использовано в медицине для получения сырья, содержащего биологически активные вещества, а также при введении в культуру in vitro других представителей лекарственных растений, получение которых затруднено из-за выделения ядовитых соединений в питательную среду.
Область применения - медицинская (фармацевтическая) промышленность, получение нового вида сырья в качестве источника биологически активных веществ растительного происхождения (в частности, алкалоидов) для получения новых высокоэффективных лекарственных препаратов.
3
4
3
2
2
4
2
2
4
4
2
2
2
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
Питательная среда содержит KNO, NHNO, CaCl×2HO, MgSO×7HO, KHPO, FeSO×7HO, NaEDTA×2HO, НВО, MnSO×4HO, ZnSO×7HO, KI, NaMoO2HO, CuSO×5HO, CoCl×6HO, никотиновую кислоту, тиамин, пиридоксин, НУК, 6-БАП, сахарозу, агар-агар и воду при заданных соотношениях компонентов. Изобретение позволяет культивировать клеточную культуру Conium maculatum.
Болиголов пятнистый обладает широким спектром фармакологической активности. В народной медицине спиртовые настойки из болиголова применяются в качестве антибактериальных, гемостатических, общеукрепляющих средств, оказывают противовоспалительное, жаропонижающее и др. эффекты.
Известна питательная среда для культивирования каллусной ткани silene vulgaris (moench) garcke (Патент РФ 2169769, МПК C12N 5/04).
Питательная среда для культивирования каллусной ткани silene vulgaris (moench) garcke содержит макро- и микросоли по Мурасиге и Скугу; витамины, мг/л: фолиевую кислоту 0,5; рибофлавин 0,5; биотин 1,0; Са-пантотенат 1,0; пиридоксин 1,0; тиамин хлорид 1,0; никотинамид 2,0; кобаламин 0,0015; кинетин 1,5 мг/л или 6-БАП 0,5 мг/л; 2,4-Д 1,5-2,0 мг/л; сахарозу 1,5%; глюкозу 1,5%; агар 8000 мг/л, воду до 1 л.
Известна питательная среда для культивирования каллусной культуры artemisia annua 1. (Патент РФ, 2393217,  МПК C12N 5/04).
Питательная среда для культивирования каллусной ткани Artemisia annua L. содержит агаризованную среду с макро- и микросолями по Мурасиге и Скугу, витамины, сахарозу, в качестве гормонов добавляют 6-БАП (6-бензиламинопурин) и НУК (α-нафтилуксусную кислоту) в соотношении 6-БАП - 0,2/ НУК - 0,5-1,0.
Известна питательная среда для выращивания культуры ткани раувольфии змеиной - продуцента алкалоидов (Патент РФ 2081561,  МПК C12N 5/02, C12N 5, А01Н 4).
2
4
2
4
2
4
2
4
4
3
4
2
3
2
2
4
4
2
3
3
2
2
4
2
4
2
4
2
4
2
среде следующего состава (мг/л): KHPO-300-500; KHPO3HO-300-500; (NH)SO-800-1000; NHNO 2500-3800; MgSO7HO 1000-1500; Ca(NO)4HO - 1000-2000; NHCl 100-200; FeSO4HO 60-80; NaEDTA - 100-200; НВО 10-12; KJ 700-1000; CoCl6HO - 800-1000; NaMoO2HO 0,2-0,3; MnSO5HO - 0,22-0,23; CuSO5HO 0,015-0,025; ZnSO4HO - 1,7-8,6; тиамин 1-1,5; агар-агар 65000; сахароза 120000-130000.
Недостатками известных аналогов является их направленность на культивирование определенных видов растений: silene vulgaris, artemisia annua 1. раувольфии змеиной, следовательно, оптимизированная среда для выращивания этих видов не подойдет для выращивания Conium maculatum L.
Дополнительно в среду для культивирования silene vulgaris (moench) garcke добавляют фолиевую кислоту, рибофлавин, биотин, Са-пантотенат, кобаламин и глюкозу, среда для выращивания культуры ткани раувольфии змеиной содержит повышенное содержание сахарозы, это усложняет приготовление питательной среды и увеличивает ее стоимость.
Питательные среды для выращивания каллусной ткани Conium maculatum L из литературных источников нами не выявлены.
Задачей настоящего изобретения является ускорение роста каллусной ткани с высоким выходом биомассы.
Поставленная задача решается следующим образо: культивирование ткани производится на питательной агаризованной среде MS с добавлением витаминов, фитогормонов, сахарозы.
Содержание компонентов в питательной среде Мурасиге-Скуга представлено в таблице 1.
Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей, при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей, хлорида кальция, хелата железа, витаминов. Макро- и микросоли, хлорид кальция, хелат железа, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Затем к полученной смеси добавляют сахарозу и все тщательно перемешивают. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, разливают среду по 300 мл, закрывают фольгой и бумагой стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,2-1,4 атм. В простерилизованную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют стимуляторы роста 1-3 НУК и 0,1 - 16-БАП, перемешивают и разливают в стерильные культуральные сосуды по 15 мл в каждый.
Ткань пересаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной ткани проводится при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.
Прирост каллусной ткани болиголова пятнистого оценивали в виде индекса прироста массы (таблица 2), который рассчитывается по формуле:
,
0
где m - начальная масса, г; m - конечная масса, г.
Технический результат - культивирование каллусной ткани Conium maculatum L, а также получение высоких значений прироста биомассы.
Пример 1
3
4
3
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
2
2
2
2
Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO - 1900 мг/л, NHNO - 1650 мг/л, MgSO×7HO 370 мг/л, KHPO - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (НВО - 6,2 мг/л, MnSO×4HO - 32,3 мг/л, ZnSO×7HO - 8,6 мг/л, NaMoO×2HO - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO×5HO - 0,025 мг/л, CoCl×6HO - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO×7HO - 37,3 мг/л, NaEDTA×2HO - 27,8 мг/л), CaCl×2HO, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl×2HO, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, разливают среду по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем в стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют НУК (2 мг/л) и 6-БАП (0,5 мг/л), размещают ее по культуральным сосудам. Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.
Пример 2
3
4
3
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
2
2
2
2
Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO - 1900 мг/л, NHNO - 1650 мг/л, MgSO×7HO 370 мг/л, KHPO - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (НВО - 6,2 мг/л, MnSO×4HO - 32,3 мг/л, ZnSO×7HO - 8,6 мг/л, NaMoO×2HO - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO×5HO - 0,025 мг/л, CoCl×6HO - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO×7HO - 37,3 мг/л, NaEDTA×2HO - 27,8 мг/л), CaCl×2HO, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl -0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl×2HO, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, разливают среду по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем в стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют НУК (2 мг/л) и 6-БАП (1 мг/л), размещают ее по культуральным сосудам. Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.
Пример 3
3
4
3
4
2
2
4
3
3
4
2
4
2
2
4
2
4
2
2
2
4
2
2
2
2
2
2
2
Для приготовления питательной среды готовят концентрат макросолей (KNO - 1900 мг/л, NHNO - 1650 мг/л, MgSO×7HO 370 мг/л, KHPO - 170 мг/л), при этом каждая из макросолей растворяется последовательно в небольшом количестве воды, а затем объем доводится до 1 л. Аналогично готовятся концентраты микросолей (НВО - 6,2 мг/л, MnSO×4HO - 32,3 мг/л, ZnSO×7HO - 8,6 мг/л, NaMoO×2HO - 0,25 мг/л, KI - 0,83 мг/л, CuSO×5HO - 0,025 мг/л, CoCl×6HO - 0,025 мг/л), Fe-хелата (FeSO×7HO - 37,3 мг/л, NaEDTA×2HO - 27,8 мг/л), CaCl×2HO, витаминов (пиридоксин-HCl - 0,4-0,6 мг/л, тиамин-HCl - 0,5-1,5 мг/л, никотиновая кислота-HCl - 0,4-0,6 мг/л). Макро- и микросоли, Fe-хелат, CaCl×2HO, витамины в виде концентратов смешивают в небольшом количестве воды. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л. В колбы на 500 мл насыпают по 3 г агара, по 9 г сахарозы, разливают среду по 300 мл, закрывают фольгой и стерилизуют в автоклаве 20 мин при 1,0 атм. Чашки Петри, сосуды для культивирования, пинцеты и скальпель стерилизуют в течение 2,5 часа в сухожаровом шкафу при 160°С. Затем в стерильную питательную среду в условиях ламинарного бокса добавляют НУК (1 мг/л) и 6-БАП (0,5 мг/л), размещают ее по культуральным сосудам. Ткань высаживают в возрасте 30 суток. Культивирование каллусной культуры проводится при 26±1°С, влажности - 70%, в темноте.