СПОСОБ КОМПЛЕКСНОЙ ОЧИСТКИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ
METHOD OF COMPLEX PURIFICATION OF PHYSIOLOGICAL FLUIDS

Изобретение относится к медицине, а именно к способам очистки крови и других физиологических жидкостей (ФЖ), в частности к способам обработки крови в отводном канале системы кровообращения. Изобретение может быть использовано в форме экстракорпорального взаимодействия ФЖ с гранулированным пористым сорбентом.
Проблема комплексной очистки ФЖ, то есть одновременного удаления из крови и других ФЖ микроорганизмов, в частности бактерий, их токсинов, грибов, а также избыточного количества медиаторов воспаления (про- и противовоспалительные цитокины, эйкозаноиды, лейкотриены и т.д.), является актуальной при таких тяжелых системных состояниях как бактериемия, системная воспалительная реакция, сепсис, септический шок, а также для очистки крови или плазмы, предназначенных для переливания.
Однако большинство известных к настоящему времени способов очистки ФЖ предоставляют возможность только частичного решения указанной проблемы.
Известен полимерный адсорбент, предназначенный для очистки крови, селективный для извлечения протеинов средних размеров, таких как цитокины, и β2 микроглобулина (Size-selective hemoperfusion polymeric adsorbents WO 2008/063666). Однако при контакте с известным адсорбентом микроорганизмы, а также факторы, инициирующие воспаление, остаются в ФЖ.
Известен способ очистки ФЖ организма, включающий пропускание ФЖ через материал, который имеет размер, форму и структуру, позволяющие селективно извлекать токсины из ФЖ (Method of purification of physiological liquids of organism US 6159377). В данном случае под токсинами подразумевается β2-микроглобулин - низкомолекулярный белок (11800 Дальтон), присутствующий на поверхности ядросодержащих клеток в качестве легкой цепи антигена главного комплекса гистосовместимости, тогда как в терапии сепсиса принципиально важным является удаление микроорганизмов и их токсинов в комплексе с медиаторными молекулами цитокинового каскада.
Известен способ детоксикации организма, включающий удаление из организма эндотоксинов, в том числе продуктов перекисного окисления липидов путем пропускания крови через сорбент (РФ 2189835). Однако при сепсисе удаление из крови только бактериальных эндотоксинов не является эффективным терапевтическим решением, поскольку развитие системной воспалительной реакции опосредуется цитокиновым каскадом, который будучи запущен, способен к самоподдержанию. Кроме того, грамотрицательные микроорганизмы из первичного гнойного очага, а также микрофлоры толстого кишечника, благодаря усиленной трансинтестинальной транслокации являются постоянными источниками эндотоксинов при гнойно-септических осложнениях.
Известен аффинный сорбент для удаления фактора некроза опухоли. Известный сорбент предназначен для лечения заболеваний, вызванных массивным поступлением цитокинов в кровь, например септического шока (РФ 2123860). Данный сорбент предусматривает удаление провоспалительного цитокина фактора некроза опухоли с помощью иммобилизированного модифицированного α2-макроглобулина человека как из физиологического раствора, так и из крови человека. Этот цитокин является одним из медиаторов запускаемого вследствие контакта бактерий и их токсинов с иммунными клетками каскада, через который реализуется развитие синдрома системной воспалительной реакции - первой стадии сепсиса. Однако фактор некроза опухоли является не единственным медиатором воспаления. Кроме него в механизме развития сепсиса принимают участие другие эндогенные биорегуляторы (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8). Поэтому для эффективной терапии сепсиса целесообразно удаление избыточных количеств широкого спектра цитокинов, причем не только про-, но и противовоспалительных (ИЛ-4, ИЛ-10), а также бактерий и их токсинов.
Для решения задачи комплексной очистки ФЖ является целесообразным использование неселективных сорбционных колонок, позволяющих удалять наряду с микроорганизмами и бактериальными токсинами также избыток медиаторов из организма больного.
Выпускаемые в настоящее время неселективные колонки для гемосорбции (ГС) чаще всего содержат гранулированный активированный уголь, покрытый целлюлозой (Norit RBX в Adsorba 300 С and Adsorba 150C, Gambro), poly-НЕМА (Hemosorba, Asahi Medical and Nextron Medical Technologies), или гидрогелем с гепарином (dark R&D). Несмотря на то, что прекрасные сорбционные качества угля известны давно, широкому внедрению этого ГС в клиническую практику препятствует то, что в ходе процедуры от гранул отделяются мельчайшие частички, которые ведут к затруднению кровотока в мелких сосудах и капиллярах.
Для того чтобы избежать этого, было предложено покрывать гранулы тонкой биосовместимой мелкопористой мембраной, как в сорбенте Adsorba 300С (Gambro, Швеция) [Mikhalovsky S.V. Emerging technologies in extracorporeal treatment: focus on adsorption // Perfusion. - 2003 - Vоl.18 - №1. - P.47-54]. Таким образом, у конечного продукта несколько улучшились показатели биосовместимости, но понизились сорбционные характеристики, касающиеся поглощения молекул с высоким (выше 15000) и средним молекулярным весом между (300 и 15000), поскольку спектр элиминируемых ими молекул лимитирован размерами мембранных пор, обеспечивающих контакт целевых молекул с активной основой. Этот факт обусловливает еще одну отрицательную черту применения угольных сорбентов - происходит активное истощение низкомолекулярной белковой фракции сыворотки крови.
Известны био- и гемосовместимые сорбенты на основе сверхсшитых полимеров стирола с модифицированной поверхностью, созданные с целью замены всех видов активированных углей в процессе гемоперфузии и перфузии плазмы (РФ 2089283). Адсорбционный спектр известных сверхсшитых полистирольных сорбентов включает вещества мол.м. 100-20000 Дальтон. Наиболее эффективно сорбируются молекулы массой 300-1500 Дальтон, клинически идентифицируемые как «средние молекулы», которые присутствуют в завышенных количествах у больных уремией и многими другими заболеваниями и не полностью удаляются обычными процедурами гемодиализа. Однако при сепсисе необходимо преимущественное удаление высокомолекулярных белковых молекул мол.м. 5000-30000 Дальтон, и липополисахарида, основного компонента эндотоксина, чья мол.м. может достигать 1000000 Дальтон, а также живых микроорганизмов, при максимальном сохранении низкомолекулярных плазменных белков.
Заявляемое изобретение направлено на решение задачи комплексной очистки ФЖ от микроорганизмов, факторов, инициирующих воспаление и цитокинов.
Использование в клинической практике заявляемого способа позволяет достичь нескольких технических (лечебных) результатов:
- удаление из ФЖ факторов, инициирующих воспаление (бактерии и их токсины, грибы);
- эффективная элиминация из ФЖ избыточного количества медиаторов воспаления (про- и противовоспалительных цитокинов, эйкозаноидов, лейкотриенов и т.д.);
- сохранение альбуминовой фракции сыворотки крови;
- гемосовместимость;
- отсутствие заметного токсического воздействия на форменные элементы крови.
Указанные технические и лечебные результаты при осуществлении изобретения достигаются за счет того, что комплексная очистка ФЖ включает экстракорпоральное взаимодействие ФЖ с сорбентом.
Особенность заявляемого способа заключается в том, что в качестве сорбента используют сорбенты серии Стиросорб.
Сущность изобретения заключается в следующем.
Перспективным направлением решения проблемы комплексной очистки ФЖ особенно при лечении гнойно-септических состояний является использование новых высокоэффективных биосовместимых наносорбентов, в частности неспецифических гидрофобных сорбентов, являющихся продуктом нанотехнологий.
Сорбенты, пригодные для решения поставленной задачи, должны отвечать следующим требованиям:
- гемосовместимостью, приемлемой для клинических условий,
- широким спектром связываемых молекул преимущественно с высоким и средним молекулярным весом.
Для решения поставленной задачи авторами изобретения были опробованы неспецифические гидрофобные сорбенты серии Стиросорб, полученные на основе полистирола, представляющие собой пористые гранулы, обладающие прекрасными сорбционными характеристиками за счет наличия в структуре гранул большого количества пор с предельно широким диапазоном размера (0,6-60 нм). Макропоры микронного и субмикронного размера необходимы для сорбции бактериальных клеток и эндотоксинов (фрагментов клеточных оболочек). Поры размером 3-50 нм (мезопоры) должны быть ответственны за сорбцию разнообразных цитокинов и медиаторов воспаления, тогда как более тонкая пористая (ажурная) структура полимера, характерная для сверхсшитых сорбентов, резко повышает гемосовместимость материала и сорбцию низкомолекулярных токсинов.
Установлено, что сорбенты серии Стиросорб характеризуются прекрасной гемосовместимостью и широким спектром связываемых молекул, преимущественно с высоким и средним молекулярным весом. Химия поверхности и полимодальная пористая структура указанных сорбентов подобраны таким образом, чтобы одновременно сорбировать бактериальные клетки, эндотоксины и широкий спектр про- и противовоспалительных цитокинов, не оказывая негативного воздействия на клеточную формулу крови и состав жизненно важных белков и минеральных компонентов крови.
В процессе экспериментальных исследований авторами заявляемого изобретения установлено, что сорбенты серии Стиросорб отвечают перечисленным выше условиям.
Данные сорбенты способны связывать избыточные количества эндогенных медиаторов, а также способствовать удалению бактерий и других микроорганизмов из ФЖ, и могут быть эффективно использованы в качестве ГС для лечения сепсиса, септического шока и бактериемии людей и животных.
Все тестируемые сорбенты (Стиросорб 414, Стиросорб 516, Стиросорб 514) представляли собой гранулы диаметром 0,3-1,0 мм с развитой внутренней структурой.
Эксперименты осуществляли следующим образом.
1. Элиминация предлагаемыми сорбентами ряда Стиросорб широкого спектра цитокинов и липополисахарида (ЛПС).
Подготовка сорбентов включала их промывку этиловым спиртом, водой и физиологическим раствором. Одинаковые навески (35 мг) набухших в воде сорбентов инкубировали с 5 мл раствора, содержащего следующие цитокины: ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-4, ФНОα, ФНОβ, ЛПС (Sigma, USA) на орбитальном шейкере (350 об/мин) в течение 30 минут. В супернатанте и в исходном растворе (контроль) определяли концентрацию ЛПС в LAL-тесте с помощью коммерческих тест-систем (Hycult biotechnology, The Netherlands) и цитокинов с помощью ELISA kit (Bender MedSystems, USA).
В смеси цитокинов сорбцию проводили в течение 30 мин, что вполне позволяло выявить специфику их взаимодействия с тестируемыми сорбентами.
Установлено, что наиболее активно все 3 типа сорбентов элиминировали про- (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОα, ФИОβ) и противоинфекционные цитокины (IL-4, -10), а также бактериальные эндотоксины (ЛПС), а наименее активно - самый «тяжелый» цитокин ИЛ-6 (MW21-28кДa).
На фиг.1 приведены данные, характеризующие интенсивность связывания цитокинов сорбентами Стиросорб 516, 514 и 414 в физиологическом растворе.
На фиг.2 приведены результаты оценки способности сорбентов Стиросорб 414, 514 и 516 удалять из раствора ЛПС. Согласно приведенным данным, все 3 исследованных сорбента обладают способностью эффективно (более чем на 50%) снижать уровень ЛПС в изотоническом растворе.
Приведенные на фигурах 1 и 2 результаты убедительно свидетельствуют о способности исследуемых сорбентов эффективно элиминировать из изотонических растворов про- (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОα, ФНОβ) и противоинфекционные цитокины (IL-4, -10), а также бактериальные эндотоксины (ЛПС).
2. Оценка биосовместимости сорбентов ряда Стиросорб.
Биосовместимость предлагаемых сорбентов оценивали, исследуя структурные и функциональные изменения клеток крови после коинкубации с тестируемыми сорбентами in vitro. С этой целью оценивали повреждение мембран эритроцитов после контакта с сорбентом в процессе инкубации по степени наблюдаемого гемолиза эритроцитов. Также были проведены исследования воздействия сорбентов на физиологическую активность мононуклеарных клеток крови. Результаты данного исследования приведены в таблице 1.
Полученные данные свидетельствуют о минимальном повреждении эритроцитов, вызывающем гемолиз, в результате инкубации в течение 2-4 ч в контакте с сорбентами:
интенсивность гемолиза соответствует 5% после контакта клеток со Стиросорбом 514 и не детектировалась после воздействия Стиросорбом 516 и 414. Измерения через 1 сутки провели для интегральной оценки последствий взаимодействия эритроцитов с сорбентами. Сорбент 414 вызывал наименьший гемолиз. Даже после 24 ч коинкубации с сорбентом гемолиз не превысил 4%. Этот показатель для сорбента 516 составил 22%, а для 514 - 12,1%. Данные, приведенные в таблице 1, указывают на отсутствие статистически значимых негативных последствий для мононуклеарных лейкоцитов в результате контакта с испытуемыми сорбентами.
По результатам оценки биосовместимости можно заключить, что все протестированные сорбенты обладают удовлетворительными характеристиками, поскольку через сутки их совместной инкубации с изолированными клетками крови интенсивность гемолиза эритроцитов не превышала 22%, а гибель мононуклеарных лейкоцитов - 13%.
3. Изучение эффективности применения сорбента Стиросорб-514 для экстракорпоральной детоксикации при системной воспалительной реакции, индуцированной ЛПС и фактором некроза опухоли на модели эндотоксического шока у кроликов.
В опытах использовались кролики породы шиншилла, прошедшие карантин в течение 2 недель. Во время карантина проводился контроль здоровья лабораторных животных в соответствии с РД 64-126-91. Вес кроликов составлял 3-3,5 кг. Для наркоза использовали 5% хлоралгидрат (0,4 г/кг). Тестируемый сорбент представлял собой гранулы диаметром 0,3-1,0 мм с развитой внутренней структурой. Подготовка сорбента к исследованию включала 3-кратное промывание этанолом, стерильными водой и физиологическим раствором хлорида натрия. Подготовленным сорбентом (10 г) набивали макеты ГС колонок. Перед началом гемоперфузии колонку с ГС Стиросорб-514 промывали 10 объемами стерильного физиологического раствора. Кролику внутривенно вводили раствор ЛПС Klebsiella pneumoniae (Sigma, USA) - 5 мг и раствор human TNFβ - 1000 ME (Biosourse, USA). Кроликам опытной группы через 3 минуты начинали процедуру ГС. У кроликов катетеризировались сонная артерия и яремная вена и по артерио-венозному контуру включалась колонка с ГС Стиросорб-514. Объем колонки 10 мл. Скорость перфузии: 4 мл в минуту. Гепаринизация кролика - 500 ед/кг. Время перфузии 1 час. Пробы крови брали из ушной вены до начала проведения ГС, после введения растворов ЛПС и цитокина и после окончания процедуры ГС (через 1 час). Кроликам контрольной группы ГС не проводили. Пробы крови брали из ушной вены до начала эксперимента, после введения растворов ЛПС и цитокина через 3 минуты и через 1 час. Определение концентрации ЛПС проводили с использованием ЛАЛ-теста на коммерческих тест-системах фирмы HyClon (USA). Измерение концентрации hTNFβ осуществляли иммуно-ферментным анализом с использованием коммерческих тест-систем фирмы ВекторБест (Россия).
Результаты исследования приведены на фигурах 3, 4. Эти данные показывают, что применение ГС приводит к практически полной элиминации из кровотока свободного ЛПС. У кроликов контрольной группы концентрация этого эндотоксина в сыворотке крови через 1 час после введения ЛПС в организм животного была в 11,7 раз выше, чем у кроликов опытной группы.
Исследование динамики изменения в крови цитокина TNFβ показало, что экстракорпоральная детоксикация в течение 1 часа с использованием колонки с испытуемым сорбентом приводила к более выраженному снижению в крови уровня этого провоспалительного цитокина (в 2,3 раза) в сравнении с контрольной группой.
Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что через 1 час после введения ЛПС и TNFβ у кроликов контрольной группы наблюдалось снижение относительного количества нейтрофилов в периферической крови, сопряженное с увеличением доли лимфоцитов. Этот эффект обусловлен усилением адгезии нейтрофилов к стенкам сосудов, с последующим выходом в межтканевое пространство. Это свидетельствует о нарастании каскада воспалительной реакции организма, обусловленного ЛПС и провоспалительным цитокином TNFβ.
В то же время применение ГС у кроликов опытной группы способствовало нормализации показателей лейкоцитарной формулы периферической крови. Так, через 1 час после введения провоспалительных агентов в крови кролика, подвергавшегося экстракорпоральной детоксикации с помощью ГС, не наблюдалось истощения какой-либо фракции лейкоцитов. С высокой степенью вероятности этот факт можно расценивать как следствие ингибирования развития воспалительной реакции за счет масштабной и быстрой элиминации из крови животного цитокинов, инициирующих системный воспалительный ответ.
В результате исследований на кроликах, проведенных на модели эндотоксического шока, индуцированного бактериальным эндотоксином и фактором некроза опухоли, было установлено, что экстракорпоральная детоксикация с использованием сорбента Стиросорб-514 позволяет эффективно удалять из системного кровотока бактериальные токсины и медиаторы воспаления. Эти данные свидетельствуют о целесообразности применения сорбента Стиросорб-514 для комплексной интенсивной терапии больных сепсисом с использованием метода ГС.
4. Изучение способности сорбентов ряда Стиросорб иммобилизировать различные микроорганизмы из ФЖ.
Все тестируемые сорбенты (Стиросорб 414, Стиросорб 516, Стиросорб 514) представляли собой гранулы диаметром 0,3-1,0 мм с развитой внутренней структурой. Подготовка сорбентов к исследованию включала 3-кратное промывание этанолом, стерильными водой и физиологическим раствором хлорида натрия.
Для исследований использовали взвеси 20-часовых бактериальных культур. Разведение взвесей соответствовало 0,5 единицы по шкале мутности McFarland. В пробирки с кровью здоровых доноров (450 мл) вводили по 5 мл взвеси грамположительных (S.aureus) и грамотрицательных микроорганизмов (K.pneumoniae pneumoniae и C.fomata). Подготовленную таким образом кровь пятикратно пропускали под давлением через макеты ГС колонок, заполненных тестируемыми сорбентами. Далее производили посев на чашки с плотной питательной средой равных объемов крови после процедуры ГС и крови, не подвергавшейся контакту с сорбентом. Кровь, содержащую S.aureus, высевали на маннит-солевой агар (Panadisa, Испания), K. pneum. pneumoniae - на среду Эндо (Panadisa, Испания), а С.fomata - на кровяной агар (Panadisa, Испания). Все работы производили с соблюдением условий стерильности. Учет результатов проводили через 24 ч, вычисляя показатель торможения колониеобразования (ТКО) гемокультуры после ГС по формуле
после ГС
конроль
ТКО=КК/КК×100%,
2
где КК - среднее количество колоний в 1 см поверхности зоны культурального роста (расчет не менее чем по 10 квадратам).
В контрольном опыте рост бактериальной культуры за счет утилизации маннита, содержащегося в питательной среде, приводит к сдвигу рН среды в кислую сторону и, соответственно, к изменению цвета агара с розового на желтый. В культуре крови после контакта с испытуемыми сорбентами наблюдается снижение колониеобразования S.aureus, что проявляется в существенно меньшем изменении первоначального розового цвета агара.
Количественная оценка обнаруженного эффекта ТКО трех гемокультур после ГС приведена на фиг.5. Представленные данные демонстрируют значительное уменьшение колониеобразования S.aureus после очистки крови в процессе ГС. Наиболее значительной задержки колониеобразования (на 88%) удалось достичь в результате очистки крови Стиросорбом 414. Контакт крови с сорбентами Стиросорб 516 и Стиросорб 514 также приводил к резкому снижению количества выросших колоний (на 63% и 51% соответственно). Это свидетельствует о значительном снижении количества колониеобразующих единиц грамположительных микроорганизмов, оставшихся в крови после фильтрации через слой тестируемых сорбентов. Наибольший эффект очистки крови от физиологически активных грамотрицательных бактерий (K.pneum. pneumoniae) и грибов (C.fomata) был достигнут в результате применения для ГС Стиросорба 414 (ТКО=21% бактерий и 29% грибов).
Авторами также была изучена способность сорбентов серии Стиросорб удерживать клетки бактерий из крови пациентов. Для этой цели был использован сравнительный анализ количества колоний микроорганизмов, сформировавшихся на поверхности плотной питательной среды при высевании на нее равных объемов крови, содержащей бактериальные клетки, до и после контакта крови с сорбентом.
В результате проведенных исследований было выявлено уменьшение количеста: колониеобразующих единиц S.aureus и K.pneum. pneumoniae, при контакте содержащих бактерии образцов крови с тремя образцами материалов на основе сорбентов ряда Стиросорб. Исследованные микроорганизмы характеризуются различными размерами, формой, структурными и биохимическими характеристиками внешней мембраны. Именно этим был обусловлен различный эффект применения тестирумых сорбентов к данным культурам. Выявленное значительное снижение колониеобразования (на 51-88%) S.aureus - мелких 0,5×1 мкм кокков - после ГС может рассматриваться как результат связывания бактериальных клеток сорбентом, т.е. их элиминации из крови. Кроме того, проведенные авторами эксперименты позволяют сделать вывод о том, что сорбенты ряда Стиросорб могут связывать также грамотрицательные бактерии.
Таким образом, заявляемый способ комплексной очистки ФЖ может быть эффективно использован для лечения сепсиса, септического шока и бактериемии людей и животных, поскольку сорбенты ряда Стиросорб способны связывать не только избыточные количества эндогенных медиаторов, провоцирующих развитие патофизиологических нарушений, приводящих к развитию органной и полиорганной недостаточности, но и экзогенные триггерные и медиаторные факторы воспаления: липополисахарид (компонент бактериальной стенки грамотрицательных бактерий) и колониеобразующие клетки.
Изобретение иллюстрировано следующими фигурами:
Фиг.1 - Интенсивность связывания цитокинов сорбентами Стиросорб 516, 514 и 414 в физиологическом растворе.
Фиг.2 - Интенсивность извлечения ЛПС исследуемыми сорбентами из физиологического раствора.
Фиг.3 - Изменение динамики концентрации ЛПС в процессе гемосорбции.
Фиг.4 - Изменение динамики концентрации h TNFβ в процессе гемосорбции.
Фиг.5 - Торможение колониеобразования гемокультуры после гемосорбции (ТКО %).
Таблица 1 - Влияние сорбентов на жизнеспособность мононуклеарных лейкоцитов (МЛ) и гемолиз эритроцитов крови здорового донора в результате их коинкубации с тестируемыми сорбентами (медиана, min÷max).
Таблица 2 - Динамика изменения лейкоцитарной формулы крови животных в процессе гемосорбции.
Таблица 1
Наименование сорбента
Выживаемость МЛ, %
Гемолиз, %
Период коинкубации, ч
2
4
24
516
87
0
0
22
81÷91
0÷5,5
0÷6,1
19,1÷28,9
514
93
3
5
12
91÷100
1,3÷10,5
1,7÷7,1
11,2÷14,7
414
99
0
0
4
91÷100
0÷4,8
0÷4,3
3,1÷4,0
Таблица 2
Группа
Время
Нейтрофилы
Эозинофилы
Моноциты
Лимфоциты
Базофилы
животных
после введения ЛПС и hTNFβ
п/я
с/я
Опытная
Исходный
3
25
1
5
66
0
уровень
1 час
3
35
1
3
56
0
Контрольная
Исходный
4
28
3
3
60
2
уровень
1 час
2
21
0
2
75
0