Способ получения координационного комплекса иона Gd3+ с синтетическим рекомбинантным белком с целью получения контрастирующего агента для магнитно-резонансной томографии
METHOD FOR OBTAINING COORDINATION COMPLEX OF THE Gd3 + ION WITH SYNTHETIC RECOMBINANT PROTEIN IN ORDER TO OBTAIN CONTRASTING AGENT FOR MAGNETIC RESONANCE IMAGING

3+
3+
3+
Изобретение относится к медицинской биотехнологии, диагностике опухолей, магнитно-резонансной томографии и может быть использовано для получения координационного комплекса искусственною рекомбинантного белка W4, прочно удерживающего ион Gd. Комплекс белка W4 с ионами Gd, может быть использован для получения физиологически приемлемого Cd -содержащего агента, необходимого для контрастирования опухолей с помощью спектроскопии парамагнитного резонанса, а также для радиотерапии опухолей по принципу термоаблации.
Уровень техники
3+
3+
3+
3+
Ион гадолиния (Gd) обладает уникальными парамагнитными свойствами, которые широко используются в медицинской диагностике для визуализации новообразований, сосудистой сети, включая капилляры методом магнитно-резонансной томографии (МРТ), а также для поражения опухолевых клеток вторичным тепловым излучением по принципу термоаблации [Goischke Н.K. MRI with gadolinium-based contrast agents: practical help to ensure patient safety // J. Am. Coll.Radiol. 2016. Vol. 1546-1440(16), P. 30315-30315]. За счет изменения времени релаксации Т1 в комплексе с органическими молекулами ион Gd существенно отличается от растворителя, что позволяет наблюдать за тонкими морфологическими деталями ткани, насыщенной контрастирующим агентом на основе иона Gd [Dinger S.C., Fridjhon P., Rubin D.M. Thermal Excitation of Gadolinium-Based Contrast Agents Using Spin Resonance //PLoSOne. 2016. Vol. 11(6), P. e0158194]. Использование иона Gdв качестве контрастирующего агента для МРТ осложнено тем, что он обладает высокой токсичностью для животных и человека. Однако, эта токсичность может быть подавлена за счет введения его в прочные координационные комплексы с различными мономерными и полимерными органическими соединениями, в частности, описанные в патентах WO 0071526, RU 2388762 С2, RU 2388762 и RU 2649402.
3+
3+
3+
2+
3+
3+
3+
3+
3+
Из уровня техники известен способ получения полностью искусственного Gd-связывающего белка W4, описанный в патенте РФ № RU 2713792. Белок W4 содержит пептид F3, обладающий сродством к нуклеолину - перспективному поверхностному маркеру многих быстрорастущих опухолей, что обеспечивает высокую избирательность доставки Gd в опухолевые клетки, а также основной Gd связывающий блок гетероповторов состава Е2-М-Е4-М-Е2, где Е - эластиноподобный пептид, а М - N-концевой кальций-связывающий мотив кальмодулина человека. В патенте описан способ очистки белка W4, использующий методы ионообменной хроматографии и принцип осаждения избирательного белка в присутствии ионов Са, Gd и гидрофильного хелатирующего агента ЭДТА. Однако, практическое применение белка W4 в качестве контрастирующего агента требует формирования устойчивого комплекса с ионами Gd. В прототипном изобретении описание способа получения белка W4 с ионами Gd отсутствует. Между тем, простое смешивание нитрата Gd с белком W4 в эквимолярньгх соотношениях не приводит к образованию пригодного к использованию продукта (контрастирующего агента для МРТ), так как при нейтральных и щелочных значениях рН наряду с прочным (координационным) комплексом W4 образуется слабый (солевой) комплекс, в котором ион Gd сохраняет токсичность. При кислых значениях рН (ниже 6,8) слабый (солевой) комплекс белка W4 с ионом Gd практически не образуется, но белок утрачивает растворимость в воде и выпадает в осадок, что не позволяет осуществлять его внутривенное введение в качестве контрастирующего агента.
3+
Таким образом, научно-технической задачей, решаемой в ходе осуществления изобретения, является разработка способа, позволяющего с высоким выходом получать растворимый в воде прочный комплекс белка W4 с ионом Gd, не обладающий токсичностью и пригодный для использования в качестве контрастирующего агента для МРТ.
Осуществление изобретения
Для наработки белка W4 используют штамм-продуцент, получаемый химической трансформацией клеток Е. coli BL21 (DE3) плазмидной ДНК pW4. Очистку белка до гомогенного состояния проводят с использованием колоночной ионнобменной хроматографии и способами бесколоночного фракционирования, как описано в патенте РФ № RU 2713792. Концентрацию очищенного белка W4 в растворе определяют, используя метод Бредфорд с помощью набора Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США), как описано в работе [Bradford, М.М. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254]. Для построения калибровочного графика используют бычий сывороточный альбумин, входящий в состав набора Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США), в концентрациях 25, 50, 100, 250, 500, 1000 мкг/мл. Измерение А595 в ходе построения калибровочного графика и при определении концентрации белка W4 производят в плоскодонных иммунологических планшетах Costar, США (каталожный № 2240096) с помощью планшетного спектрофотометра Униплан (ЗАО Пикон, Россия). Образцы белка W4 вносят в реакционную смесь без разведения в объеме 5 мкл.
Для проведения процедуры сорбции белка на колонку готовят два концентрированных раствора 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES) в концентрации 1 М, используя в качестве растворителя стерильную апирогенную деионизованную воду. рН концентрированных растворов доводят до 7,0 и до 7,4, соответственно, с помощью 1 М NaOH. Далее три аликвоты белка W4, каждая из которых содержит 17,5 мг общего белка, разводят (1) в 17,5 мл буфера HEPES 10 мМ, рН 7,0; (2) в 17,5 мл буфера HEPES 20 мМ, рН 7,0; (3) (1) в 17,5 мл буфера HEPES 10 мМ, рН7,4.
Девять самотечных колонок (Disposable Gravity Flow Columns, 6 mL, with 20 um frits, Marvelgent Biosciences Inc.), содержащих no 5 мл ионообменного сорбента DEAE-сефароза (Pharmacia) уравновешивают буферами следующего состава: 1, 2 и 3 - HEPES 10 мМ, рН 7,0; 4, 5 и 6 - HEPES 20 мМ, рН 7,0; 7, 8 и 9 - HEPES 10 мМ, рН 7,4.
На колонку 1 наносят 10 мл аликвоты 1 белка W4, на колонку 2-5 мл аликвоты 1 белка W4, на колонку 3-2,5 мл аликвоты 1 белка W4.
На колонку 4 наносят 10 мл аликвоты 2 белка W4, на колонку 5-5 мл аликвоты 2 белка W4, на колонку 6-2,5 мл аликвоты 1 белка W4.
На колонку 7 наносят 10 мл аликвоты 3 белка W4, на колонку 8-5 мл аликвоты 3 белка W4, на колонку 9-2,5 мл аликвоты 3 белка W4.
Колонки 1, 2 и 3 с нанесенным белком W4 промывают 10 мл буфера состава HEPES 10 мМ рН 7,0. Колонки 4, 5 и 6 с нанесенным белком W4 промывают 10 мл буфера состава HEPES 20 мМ рН 7,0. Колонки 7, 8 и 9 с нанесенным белком W4 промывают 10 мл буфера состава HEPES 10 мМ рН 7,4.
Концентрированный раствор нитрата гадолиния (Acros Organics BVBA, США) в концентрации 1 М (157,2 г/л) готовят на деионизованной воде. Раствор для нанесения нитрата гадолиния на колонку получают на деионизованной воде, смешивая концентрированные растворы HEPES и нитрата гадолиния таким образом, чтобы в рабочем растворе концентрация HEPES составила 10 мМ, рН 7,0 для колонок 1, 2 и 3; 20 мМ, рН 7,0 для колонок 4, 5 и 6, 10 мМ, рН 7,4 для колонок 7, 8 и 9, а нитрата гадолиния - 1 мМ. Полученный раствор в объеме 1 мл наносят на колонки 1-9 с сорбированным белком W4.
Колонки 1, 2 и 3 с нанесенным нитратом гадолиния промывают 50 мл буфера состава HEPES 10 мМ рН 7,0; колонки 4, 5 и 6-50 мл буфера состава HEPES 20 мМ рН 7,0; колонки 7, 8 и 9-50 мл буфера состава HEPES 10 мМ рН 7,4. В момент завершения промывки колонки отбирают аликвоту объемом 1 мл для определения следов гадолиния.
3+
3+
488
488
595
Десорбцию комплекса белка W4 с ионом Gd осуществляют 15 мл буфера состава HEPES 10 мМ рН 7,0, 0,5 М NaCl, собирая фракции по 500 мкл. Затем определяют А каждой фракции на спектрофотометре Сагу 50 (Agilent, США) и объединяют фракции, А которых равно или превышает 0,05. В собранной объединенной фракции объемом 2,5 мл определяют общее содержание белка по методу Бредфорд с использованием набора Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США) и калибровочной кривой, построенной с использованием сывороточного альбумина, входящего в состав набора Quick Start Bradford Protein Assay (Bio-Rad, США), в концентрациях 25, 50, 100, 250, 500, 1000 мкг/мл. Измерение А в ходе построения калибровочного графика и при определении концентрации белка W4 производят в плоскодонных иммунологических планшетах Costar, США (каталожный №2240096) с помощью планшетного спектрофотометра Униплан (ЗАО Пикон, Россия). Образцы комплекса белка W4 с ионом Gd вносят в реакционную смесь без разведения в объеме 5 мкл.
3+
3+
-7
-7
3+
3
3
3
3
Для определения содержания иона Gdв образцах комплекса белка W4 с ионом Gd используют метод атомной эмиссионной спектрофотометрии с применением установки Agilent 4200 MP-AES (Agilent, США). Для построения калибровочной кривой готовят растворы Gd(NO) с концентрацией 5, 10, 15 и 20×10% (по гадолинию), что эквивалентно 0,318, 0,636, 0,954 и 1,272×10 М, используя стандартный раствор Gd(NO) с концентрацией 1 мг/мл (0,006359 М по Gd) (Acros Organics BVBA, США) в 2% (об/об) азотной кислоте квалификации «Для атомной эмиссионной спектрофотометрии» (Merck, США). Для определения фонового поглощения готовят 2% водный раствор той же азотной кислоты.
3+
Для проведения анализа на содержание иона Gd отбирают 10 мкл раствора комплекса, элюированного с ионообменного сорбента (содержит 20 мкг белка), разводят деионизованной водой в 10000 раз, используя промежуточные серийные разведения в 100 раз, и выполняют определение на установке Agilent 4200 MP-AES.
3+
3+
С помощью калибровочной кривой устанавливают содержание Gd в каждом образце и вычисляют молярное соотношение расчете на моль белка W4 в зависимости от условий получения комплекса. К анализу допускают образцы только с тех колонок, содержание иона Gd в последней аликвотс объемом 1 мл, полученной при промывке колонки, не превышает 1 мкм.
Результаты определения представляют в виде Таблицы 1.