Экологические аспекты вирулентности бактерий псевдотуберкулеза

Вестник ДВО РАН. 2009. № 3

УДК 577.124

С.И.БАХОЛДИНА, Т.Ф. СОЛОВЬЕВА

Экологические аспекты вирулентности бактерий псевдотуберкулеза

Приведены новые данные о факторах внешней среды, способствующих формированию в пр-ироде потенциально вирулентного фенотипа Yersinia pseudotuberculosis — возбудителя псевдотуберкулеза, актуального для Дальнего Востока инфекционного заболевания, вызываемого зараженными пищевыми продуктами. Полученные сведения представляют интерес для решения практических задач, связанных с разработкой мер профилактики псевдотуберкулезной инфекции.

Ключевые слова: Yersinia pseudotuberculosis, факторы вирулентности, адгезивная и инвазивная активность, липополисахариды.

Ecological aspects of Yersinia pseudotuberculosis virulence. S.I.BAKHOLDINA, T.F.SOLOV’EVA (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).

New data on environmental factors, facilitating formation ofpotentially virulent phenotype of Y. pseudotuberculosis in nature, are given. Yersinia pseudotuberculosis is a human pathogen, causing an enteric disease, actual for the Far Eastern region. The obtained results are of practical interest for Y. pseudotuberculosis infection prophylactic, processing and keeping foodstuffs.

Key words: Yersinia pseudotuberculosis, virulence factors, adhesive and invasive activity, lipopolysaccharides.

Бактерии псевдотуберкулеза относятся к роду Yersinia, семейству Enterobacte-riaceae. Они были открыты в 1883 г. французскими учеными Л.Маляссе и В.Виньялем. Однако много лет патогенность этих бактерий для человека воспринималась как казуистика. Положение изменилось в 1950-х годах, когда на Дальнем Востоке России были зарегистрированы вспышки нового заболевания, которое по сходству своих проявлений со скарлатиной было названо дальневосточной скарлатиноподобной лихорадкой (ДСЛ). Честь открытия возбудителя ДСЛ принадлежит военному врачу-бактериологу В.А.Знаменскому. Он не только выделил от больных чистую культуру бактерий псевдотуберкулеза, но и путем опыта самозаражения доказал роль этого микроорганизма в возникновении ДСЛ.

Интерес к возбудителю псевдотуберкулеза - Yersinia pseudotuberculosis до настоящего времени сохраняется у ученых и врачей во всем мире. Это связано с тем, что заболеваемость псевдотуберкулезом (экстраинтестинальный иерсиниоз) распространена во многих странах с умеренным климатом. В России это инфекционное заболевание в виде спорадических случаев или эпидемических вспышек наиболее часто встречается на Дальнем Востоке, в Сибири, Санкт-Петербурге и Ленинградской области. Следует отметить, что основная часть болеющих псевдотуберкулезом - дети в возрасте до 14 лет (более 65% от общего числа заболевших). Псевдотуберкулез характеризуется полиморфизмом клинических проявлений и частым развитием осложнений в ходе инфекционного процесса. Еще одной причиной пристального внимания ученых к бактериям псевдотуберкулеза является их фенотипическая и генотипическая близость (около 80% гомологии ДНК) к Yersinia pestis - возбудителю чумы. Есть мнение, что возбудитель чумы появился 1500 лет тому

БАХОЛДИНА Светлана Ивановна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, СОЛОВЬЕВА Тамара Федоровна - доктор химических наук, заведующая лабораторией (Тихоокеанский институт биооргани-ческой химии ДВО РАН, Владивосток). E-mail: bakholdina@piboc.dvo.ru

назад на основе штамма Y. pseudotuberculosis в результате потери части генов плазмиды вирулентности и приобретения двух новых плазмид.

Биология бактерий псевдотуберкулеза интересна тем, что они обладают двойственной природой - способностью как к паразитированию в организме человека и животных, так и к сапрофитическому существованию вне организма теплокровных хозяев.

Одним из наиболее важных для эпидемиологии псевдотуберкулеза свойств возбудителя является его психрофильность, т.е. способность расти и размножаться при низкой температуре в объектах окружающей среды (вода, почва), а также на пищевых продуктах, хранящихся в холодильниках (овощи, фрукты, мясо, молочные продукты). В то же время было установлено, что вирулентность бактерий псевдотуберкулеза при росте на холоде может значительно возрастать [11]. Однако механизм этого явления неизвестен. Он может быть комплексным, так как бактерии в абиотической среде находятся под воздействием множества физических и химических факторов. Эти факторы могут активировать синтез различных детерминант вирулентности, необходимых для выживания в условиях макроорганизма.

В лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета Тихоокеанского института биоорганической химии ДВО РАН проводится систематическое исследование влияния различных условий роста на экспрессию основных факторов патогенности Y. pseudotuberculosis', факторов с функцией проникновения и распространения бактерий, обеспечивающих развитие начальной стадии инфекционного процесса (адгезивная и инвазивная активность), а также факторов, которые отвечают за устойчивость бактерий к действию защитных сил макроорганизма и за развитие типичного патологического процесса (эндотоксины (липополисахариды)).

Нами были получены новые данные о факторах внешней среды, способствующих формированию в природе потенциально вирулентного фенотипа Y. pseudotuberculosis, которые представляют большой интерес не только для понимания экологии возбудителя, но и для решения практических задач по реализации более действенных мер контроля над псевдотуберкулезной инфекцией.

Влияние абиотических факторов на экспрессию детерминант вирулентности Y. pseudotuberculosis с функцией адгезии и инвазии

Энтероинвазивные Y pseudotuberculosis попадают в желудочно-кишечный тракт человека с зараженной пищей и быстро проходят через эпителиальный барьер. Прикрепление и проникновение бактерий в эпителиальные клетки кишечника представляют начальный этап в развитии инфекционного процесса. Адгезивная и инвазивная способности бактерий формируются до поступления их в организм хозяина под влиянием различных факторов окружающей среды: низкой температуры, состава ростовой среды и содержания кислорода.

Основными питательными субстратами и источниками углерода у бактерий являются углеводы. Мы изучили влияние двух широко распространенных в природе углеводов -глюкозы и галактозы (молочные продукты, овощи, фрукты) [1], а также различных режимов аэрации (интенсивное перемешивание питательной среды и стационарный режим без перемешивания) на адгезивные и инвазивные свойства бактерий псевдотуберкулеза [4]. Бактерии выращивали при низкой температуре (8°С).

Было показано, что рост Y. pseudotuberculosis на среде с галактозой приводит к увеличению тканевой инвазивной активности, а также к возрастанию выхода биомассы и устойчивости клеток к антибиотикам (ампициллин, эритромицин, стрептомицин) [1].

Добавление глюкозы в питательный бульон ингибирует инвазивную активность бактерий псевдотуберкулеза в 6 раз, но не влияет (либо даже несколько усиливает) на адгезивные свойства бактерий псевдотуберкулеза [4].

В экспериментах на культуре клеток нами было установлено, что в условиях дефицита кислорода (стационарный режим культивирования) у бактерий псевдотуберкулеза также происходит усиление адгезивной и инвазивной активности [4].

Как известно, энтеропатогенные иерсинии обладают множественными факторами, обеспечивающими их проникновение в клетки хозяина. К ним относятся прежде всего белки, кодируемые хромосомными inv (invasion), ail (attachment-invasion locus) и плаз-мидным yadA (Yersinia adhesion) генами [12]. Однако в исследуемых вариантах бесплаз-мидной культуры увеличение инвазивной способности бактерий псевдотуберкулеза под действием галактозы и низкой аэрации среды, вероятно, вызвано накоплением в наружной мембране белка инвазина (продукт гена inv), так как он кодируется хромосомным геном, экспрессируется при низкой температуре и является первичным фактором адгезии и инвазии, в отличие от белка ail, который синтезируется в клетках при 37°С. Инвазин обусловливает захват бактерий псевдотуберкулеза клетками хозяина, связываясь с Pj-ин-тегриновыми рецепторами и тем самым запуская механизм изменения конформации мембраны и цитоскелета клетки в сайте адгезии [12]. Ингибирующее действие глюкозы на гены, контролирующие инвазию, может быть связано как с катаболитной репрессией, так и с закислением среды за счет продуктов метаболизма глюкозы [15, 20]. Эффект глюкозы на инвазивные свойства Y. pseudotuberculosis, видимо, определяется последней причиной. Ранее мы показали, что культивирование псевдотуберкулезного микроба в присутствии глюкозы приводит к понижению рН среды до 5,0 [5].

Таким образом, галактоза в качестве субстрата и дефицит кислорода при низкой температуре роста Y. pseudotuberculosis, вызывающие повышение инвазивной активности, будут способствовать увеличению патогенного потенциала бактерий.

Следует отметить, что эти же абиотические сигналы, за исключением низкой температуры, действуют на Y. pseudotuberculosis в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) хозяина. Как известно, анаэробные условия существуют именно в кишечнике, а галактоза входит в состав гликопротеинов и гликолипидов муцинового слоя, который покрывает эпителий ЖКТ. Можно ожидать, что бактерии, которые адаптированы к этим факторам (анаэробные условия, галактоза) в природном окружении, будут более приспособленными к условиям макроорганизма. Это позволит им достичь такой скорости размножения, которая в наибольшей степени будет способствовать использованию ресурсов хозяина при данной стратегии паразитизма, а следовательно приведет к развитию болезни. Можно также предположить, что бактерии псевдотуберкулеза приобрели в процессе эволюции способность использовать галактозу хозяина в качестве питательного субстрата. В пользу этого свидетельствуют наличие у Y. pseudotuberculosis ферментов галактозидаз соответствующей специфичности [11], а также полученные нами результаты, согласно которым муцин в ростовой среде, подобно галактозе, стимулирует рост бактерий псевдотуберкулеза.

Регуляция структуры и эндотоксической активности липополисахаридов условиями роста Y. pseudotuberculosis

Липополисахариды (ЛПС) относятся к группе факторов патогенности грамот-рицательных бактерий с токсической функцией, поэтому их часто называют бактериальными эндотоксинами [6].

ЛПС располагаются во внешнем монослое наружной мембраны грамотрицательных бактерий, занимая около 70% ее поверхности. Амфифильная молекула ЛПС в S-форме (S-ЛПС), характерная для большинства встречающихся в природе диких штаммов бактерий, образующих колонии гладкой формы, состоит из трех частей: липида А, олигосахарида кора и О-полисахаридной цепи (О-цепь) [7]. Микроорганизмы, дающие колонии шероховатой формы, продуцируют ЛПС в R-форме (R-ЛПС), для которых типичным является полное отсутствие О-цепи или ее очень маленькая длина.

Липид А энтеробактерий представляет собой дисахарид, замещенный по гидроксильным и аминогруппам остатками длинноцепочечных жирных кислот (ЖК), среди которых основной является 3-гидроксиалкановая кислота [7]. Эта жирная кислота в свою очередь может быть замещена по оксигруппе жирной кислотой, и степень ее ацилирования (СА) может варьировать от 25 до 50%. Общее число остатков ЖК липида А обычно колеблется от пяти до семи. Молекула ЛПС закреплена в наружной мембране ее липидным фрагментом, О-цепь ориентирована в сторону окружающей среды.

О-полисахаридный фрагмент молекулы ЛПС отвечает за устойчивость бактерий к факторам защиты хозяина и в большой степени определяет адгезивные свойства ЛПС. ЛПС с длинными О-цепями обладают большей адгезивностью, чем ЛПС с короткими О-цепями [14]. Липид А обусловливает токсические свойства ЛПС, которые зависят от его структуры. Максимальная токсичность наблюдается у ЛПС, липид А которых имеет гексаацильный тип структуры (общее количество остатков ЖК - 6, степень ацилирования остатков 3-оксиалкановой кислоты близка к 50%) [7].

Известно, что условия обитания бактерий могут вызывать модификацию структуры основных элементов молекулы ЛПС (О-цепь, липид А), что, в свою очередь, приводит к изменению физико-химических свойств наружной мембраны (жидкостность, гидрофоб-ность, целостность), а в случае патогенных бактерий - к изменению их вирулентности. Наличие у бактерий хорошо отлаженного механизма регуляции биосинтеза ЛПС в ответ на действие экзогенных факторов имеет большое значение в их приспособлении к различным условиям окружающей среды, особенно в адаптации патогенных микроорганизмов к организму хозяина.

Мы изучили влияние температуры (4-8 и 37°C, «холодовой» и «тепловой» варианты), способа культивирования (суспензионная культура в жидкой среде и колониальная культура на плотной среда) и фазы роста на структуру и острую токсичность ЛПС [3, 8, 10].

Нами было показано, что бактерии псевдотуберкулеза при «холодовом» варианте дольше сохраняют жизнеспособность и дают более высокие выходы биомассы как на жидких, так и на плотных питательных средах [2, 9]. Это свидетельствует о том, что для роста Y. pseudotuberculosis низкая температура является более благоприятной, чем 37°C.

Липополисахариды «тепловых» и «холодовых» вариантов бактерий псевдотуберкулеза содержали только насыщенные жирные кислоты [8]. Это отличает Y. pseudotuberculosis от других энтеробактерий, которые на холоде синтезируют ЛПС с ненасыщенными, а при 37°С - с насыщенными ЖК [17]. Действие температурного фактора на состав жирных кислот ЛПС псевдотуберкулезного микроба проявлялось в изменении степени ацилирования остатков 3-гидрокситетрадекановой кислоты (3ОН14 : 0), которая достигала максимума у «холодовых» вариантов [8]. Это дает основание полагать, что в ЛПС псевдотуберкулезного микроба функции мононенасыщенных ЖК выполняют 3-ацилоксиалкановые кислоты. Они препятствуют плотной упаковке углеводородных цепей, способствуют уменьшению температуры фазовых переходов ЛПС, тем самым обеспечивают жидкокристаллическое состояние мембраны, необходимое для нормального функционирования клетки при низкой температуре.

Температура культивирования оказывала также существенное влияние на размер О-полисахаридной цепи ЛПС Y. pseudotuberculosis [10]. ЛПС «теплового» варианта бактерий имели короткие О-полисахаридные цепи. Понижение температуры культивирования псевдотуберкулезного микроба приводило к повышению синтеза ЛПС с длинными О-цепями. Таким образом, ЛПС «холодовых» вариантов бактерий могут выступать как эффективный фактор адгезии [14]. Интересно отметить, что у иерсиний наблюдается корреляция между длиной О-цепи ЛПС и уровнем экспрессии инвазина. Так, было показано, что в R-мутантах Y. enterocolitica, синтезирующих ЛПС без О-цепи, происходит снижение уровня экспрессии инвазина [16]. Следовательно, низкая температура роста стимулирует синтез факторов вирулентности с функцией адгезии и инвазии: ЛПС

с длинными О-цепями, инвазина, тем самым повышая патогенный потенциал бактерий псевдотуберкулеза.

Следует отметить, что подобную зависимость размера специфической углеводной цепи от температуры роста бактерий наблюдали и для ЛПС Y enterocolitica [13]. В то же время для ЛПС других кишечных патогенов, типичных мезофилов (Salmonella и др.), отмечена обратная зависимость: длина О-полисахаридных фрагментов ЛПС возрастала с повышением температуры культивирования бактерий [18]. Возможно, различие в регуляции структуры ЛПС в ответ на изменение температуры между иерсиниями и другими энтеробактериями определяется разной стратегией их выживания в условиях макроорганизма. Поскольку известно, что прекращение экспрессии О-полисахаридных цепей ЛПС в иерсиниях при 37° С (температуре тела человека при инфекционном процессе) необходимо для увеличения доступности других факторов вирулентности (поверхностных белков), которые синтезируются в этих условиях.

Установлено, что способ культивирования бактерий псевдотуберкулеза также оказывал влияние на структуру ЛПС [3]. Когда клетки росли на плотной среде, в них происходил более интенсивный синтез молекул ЛПС, которые имели в среднем более длинные О-по-лисахаридные цепи в сравнении с ЛПС суспензионных культур. При обоих способах культивирования содержание ЛПС зависело от фазы роста бактерий, но динамика изменения их содержания по мере старения клеток в колониальных и суспензионных культурах была различна. С изменением возраста клеток степень ацилирования ЛПС оставалась величиной постоянной, в то время как длина О-цепи варьировала и у обеих культур достигала максимального значения в стационарной фазе роста [3].

Было исследовано влияние структуры ЛПС (длина О-цепи, степень ацилирования 3ОН14 : 0) на их эндотоксическую активность. С этой целью была определена 50%-ная летальная доза (LD50) для мышей ЛПС разной структуры, полученных из бактерий псевдотуберкулеза, выращенных при различных условиях (см. таблицу).

Токсичность ЛПС Y pseudotuberculosis различного состава

Препарат Температура роста, 0С Среда роста Характеристика ЛПС

Длина О-цепи* СА, % LD50, нг/мышь

ЛПС-1 5 Плотная 80 55,0 10

ЛПС-2 5 -//- 60 41,2 35

ЛПС-3 5 Жидкая 12 45,0 112

ЛПС-4 37 -//- 5 28,5 281

* Число моносахаридных остатков.

Как можно видеть из таблицы, токсичность ЛПС прямо пропорциональна их степени ацилирования и длине углеводной цепи. Интересно, что ЛПС-2 и ЛПС-3, имеющие близкие значения СА, проявляли различную токсичность: более токсичным был имеющий более длинную О-полисахаридную цепь. Подобное влияние размера О-цепи на токсичность ЛПС было отмечено ранее для ЛПС других бактерий [19].

Низкая температура культивирования, способствующая увеличению длины цепи О-по-лисахарида и СА остатков 3ОН14 : 0 (в результате чего липидные фрагменты ЛПС-1, -2, -3 приобретают гексаацильный тип структуры), с одной стороны, и рост Y. pseudotuberculosis в виде колоний, приводящий к еще большему увеличению длины цепи О-полисахарида при сохранении гексаацильного типа структуры липида А (ЛПС-1, 2), - с другой, делают ЛПС более токсичным, а клетку, способную синтезировать такие молекулы ЛПС, - не только более токсичной, но и, вероятно, более устойчивой к действию защитных факторов макроорганизма и, следовательно, более вирулентной.

Таким образом, к факторам окружающей среды, усиливающим патогенный потенциал бактерий псевдотуберкулеза при низкой температуре роста, относятся присутствие галактозы в питательной среде и недостаток кислорода. Также имеет значение способ культивирования бактерий, а именно рост в виде колоний на плотных средах.

ЛИТЕРАТУРА

1. Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф., Шубин Ф.Н., Тимченко Н.Ф. Влияние глюкозы и галактозы на морфологию и биологические свойства Yersinia pseudotuberculosis // Журн. микробиол. 2005. № 5. C. 6-10.

2. Бахолдина С.И., Красикова И.Н., Шубин Ф.Н., Бузолева Л.С., Соловьева Т.Ф. Влияние способа культивирования и фазы роста на липидный состав Yersinia pseudotuberculosis // Биохимия. 2001. Т. 66, № 4. C. 511-519.

3. Бахолдина С.И., Красикова И.Н., Соловьева Т.Ф. Влияние способа культивирования и фазы роста на липополисахаридный состав Yersinia pseudotuberculosis // Биоорган. химия. 2001. Т. 27, № 2. С. 151-155.

4. Бахолдина С.И., Шубин Ф.Н., Соловьева Т.Ф. Дефицит кислорода увеличивает инвазивную активность и устойчивость к тепловому стрессу Yersinia pseudotuberculosis // Журн. микробиол. 2009. № 3. С. 18-23.

5. Бахолдина С.И., Санина Н.М., Шубин Ф.Н., Попова О.Б., Соловьева Т.Ф. Термотропное поведение липидов и морфология клеток Yersinia pseudotuberculosis с высоким содержанием лизофосфатидилэтаноламина // Микробиология. 2007. Т. 76. С. 321-328.

6. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. М.: Наука, 1977. 216 с.

7. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицательных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А // Биохимия. 1993. Т. 58, № 2. С. 166-181.

8. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Хотимченко С.В., Соловьева Т.Ф. Влияние температуры роста и плазмиды pVM82 на жирнокислотный состав липида А Yersinia pseudotuberculosis // Биохимия. 1999. Т. 64, № 3. С. 338-344.

9. Красикова И.Н., Бахолдина С.И., Соловьева Т.Ф. Глюкоза как фактор среды, регулирующий липидный состав Yersinia pseudotuberculosis // Биохимия. 2001. Т. 66, № 8. С. 1122-1127.

10. Соловьева Т.Ф., Ермак И.М., Мороз С.И., Красикова И.Н., Новикова О.Д., Хоменко В.А., Фролова ГМ., Иванова Е.П., Тимченко Н.Ф., Оводов Ю.С. Влияние температуры культивирования на состав основных компонентов внешней мембраны Yersinia pseudotuberculosis // Биол. мембраны. 1988. Т. 5, № 5. С. 492-500.

11. Сомов Г.П., Покровский В.И., Беседнова Н.Н., Антоненко Ф.Ф. Псевдотуберкулез. М.: Медицина, 2001. 256 с.

12. Ценева Г.Я., Солодовникова Н.Ю., Воскресенская Е. А. Молекулярные аспекты вирулентности иерсиний. // Клин. микробиология и антимикробн. химиотерапия. 2002. № 3. С. 248-266.

13. Al-Hendy A., Toivanen P., Skurnik M. The effect of growth temperature on the biosynthesis of Yersinia entero-colitica O:3 lipopolysaccharide: temperature regulates the transcription of the rfb but not rfa region // Microb. Pathog. 1991. Vol. 10, N 1. P 81-86.

14. Francki K.T., Chang B.J. Variable expression of O-antigen and the role of lipopolysaccharide as an adgesin in Aeromonas sobria // FEMS Microbiol. Lett. 1994. Vol. 122, N 1/2. P 97- 101.

15. Jaradat Z.W., Bhunia A.K. Glucose and nutrient concentrations affect the expression of a 104-kilodalton Listeria adhesion protein in Listeria monocytogenes // Appl. Environ. Microbiol. 2002. Vol. 68. P. 4876-4883.

16. Llompart C.M., Perez-Gutierrez C., Bengoechea J.A. Molecular analysis a regulatory network formed by LPS O-antigen, invasin and FLHDC // 9th Intern. Symp. on Yersinia. Lexington, Kentucky, USA. 2006. P. 47-48.

17. Rottem S., Markowitz O., Rasin S. Thermal regulation of the fatty acid composition of lypopolysaccharides and phospholipids of Proteus mirabilis // Eur. J. Biochem. 1978. Vol. 85, N 2. P. 445-450.

18. Schlecht S., Mayer H. The influence of low temperature on the amount of free R lipopolysaccharide, on the expression of R-core determinants and on O-chain lengths in Salmonella S forms // Zbl. Bakt. 1994. Vol. 280, N 4. P. 448-457.

19. Seydel U., Oikawa M., Fukase K., Kusumoto S., Brandenburg K. Intrinsic conformation of lipid A is responsible for agonistic and antagonistic activity // Eur. J. Biochem. 2000. Vol. 267, N 10. P. 3032-3039.

20. Yohannes E., Barnhart D.M., Slonczewski J.L. pH-Dependent catabolic protein expression during anaerobic growth of Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. 2004. Vol. 186. P. 192-199.