ПРОФИЛАКТИЧЕСКИ-ЛЕЧЕБНОЕ АНТИМУТАГЕННОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
PREVENTIVE-MEDICINAL ANTIMUTAGENIC MEDICATION AND METHOD OF ITS APPLICATION

Изобретение относится к медицине, а именно к генетической токсикологии, и касается средств, проявляющих антимутагенный эффект.
Профилактика мутагенных воздействий генотоксикантов окружающей среды является одной из наиболее актуальных задач в современной медицинской науке.
В связи с невозможностью ограничения воздействия факторов окружающей среды на человека возникает необходимость поиска средств, препятствующих проникновению мутагенов в клетки организма и элиминирующих уже возникшие генетические повреждения, тем самым снижая давление генетического груза в популяциях людей.
Антимутагенные свойства выявлены у многих природных и синтетических веществ: витаминов, аминокислот, флавоноидов. естественных метаболитов, лекарственных средств.
Известно применение препаратов: "Жир печени акулы" и "Супер Хрящ Акулы" для уменьшения негативного действия неблагоприятных биологических факторов ионизирующего излучения, последствий химио- и лучевой терапии (см. Зуева Е.А. Справочник по биодобавкам. Ростов н/Д: Феникс, 2003 г., с.242; 265). Хорошими результатами применения обладают препараты импортные, изготовляемые из дефицитного океанического сырья, имеющие высокую цену.
Известно также использование рыбьего жира с ламинарией в виде капсул (производства ЗАО "Био Контур" г.Мурманск) при лечении и профилактики патологических процессов, связанных с воздействием неблагоприятных экологических факторов, ионизирующего облучения. Состав включает натуральный рыбий жир - 93%, экстракт ламинарии - 7,0%, витамины А, D, Е и обладает антимутагенным действием. Дозировка взрослым по 5 капсул 3-4 раза в день (см. Зуева Е.А. Справочник по биодобавкам. Ростов н/Д: Феникс, 2003 г., с.283). К некоторым недостаткам такого состава относятся довольно большие дозы и курсы применения и использование в производстве жира океанических и морских рыб, что сужает сырьевую базу производства препарата.
Известен также "Лечебно-профилактический комплекс" с иммуностимулирующим и регулирующим метаболические процессы в организме действием, содержащий лососевый жир, включающий полиненасыщенные кислоты класса «Омега-3», масло примулы вечерней (онагра), ацетат альфа-токоферола, Coviox T70, помещенный в желатиновые капсулы по 475-525 мг. Рекомендуемый курс применения лечебно-профилактического комплекса до 3 месяцев (см. Патент РФ №2194522, А61К 35/78, опубл. 20.12.2002. Бюл. №35). Сложный состав комплекса сдерживает широкое производство и применение.
Задачей изобретения является расширение ассортимента и доступности препаратов, включающих жир гидробионтов, содержащий полиненасыщенные жирные кислоты класса «Омега 3» и используемых для профилактики, лечения мутагенных воздействий антропогенных факторов и для восстановления поражений ДНК, в частности, от ионизирующего излучения и повышенного радиационного фона, как природного так и техногенного характера.
Задача решается тем, что после уточнения и дополнительного изучения свойств в качестве профилактически-лечебного антимутагенного средства и для коррекции поражений ДНК предложено применение препарата "Эйкозавитол", ранее разработанного и известного как дополнительный источник полиненасыщенных жирных кислот «Омега 3», производства ОАО "Тюменский химико-фармацевтический завод" ТУ-9281-00134458166-2005 (свидетельство о государственной регистрации выдано ООО "Фарнавит»" №77.99.23.3У.9639.8.05. от 24.08.2005 г.; санитарно-эпидемиологическое заключение №77.99.03.003.Т.001588.08.05. от 24.08.2005 г.)
"Эйкозавитол" представляет собой особо обработанный внутренний жир деликатесных пород рыб Обского бассейна (муксуна, нельмы, осетра) уникален по составу, содержит до 15% незаменимых высших жирных кислот семейства «Омега 3», витамины А, D, Е, F. "Эйкозавитол" выделяется по запатентованной технологии, обеспечивающей природное качество липидов, и представляет экологически чистый продукт. Известно, что "Эйкозавитол" в лечебных дозах (по 1 столовой ложке 3 раза в день) снижает уровень холестерина, корректирует нарушение липидного обмена, уменьшает свертываемость крови, повышает иммунитет, проявляет гипоаллергенное действие, улучшает заживление ран (см. Аннотация. Биологически активная добавка к пицце "Эйкозавитол", ОАО "Тюменский химикофармацевтический завод", г.Тюмень). "Эйкозавитол" выпускают в жидком виде (флаконы до 1000 мл) и в виде капсул по 0,385 г. Применение препарата "Эйкозавитол" в качестве антимутагенного средства ранее неизвестно.
Настоящее изобретение направлено на обоснование способа антимутагенного воздействия на организм с использованием препарата "Эйкозавитол", который представляет собой еще недостаточно изученный комплекс, содержащий полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) класса «Омега 3», преимущественно в виде эйкозапенатаевой и докозагексаеновой кислот, являющихся предшественниками биологически активных веществ (простагландинов, тромбоксанов, простациклинов), полученный из деликатесных рыб: муксуна, осетра, нельмы, пеляди, обитающих в акватории р.Оби.
У ПНЖК в организме множество различных функций. Они используются для образования жира, который покрывает и защищает внутренние органы. Расщепляясь, жирные кислоты выделяют энергию и участвуют в синтезе эйкозаноидов: простагландинов, лейкотриенов и тромбоксанов. Эти соединения регулируют важные функции организма, такие как артериальное давление, сокращение отдельных мышц, температура тела, агрегация тромбоцитов и воспаление. Чтобы контролировать все эти функции, организм синтезирует указанные специфические соединения из жирных кислот, содержащихся в пищевых жирах, которые мы потребляем. Каждое из этих соединений (простаглатин, лейкотриен или тромбоксан) должно производится в нужном количестве, в нужное время и в нужном месте.
К «Омега 3» жирным кислотам относятся а-линоленовая, эйкозапентаеновая кислота и докозагексаеновая кислота, которые присутствуют в основном в рыбе, а также могут синтезироваться в организме из а-линоленовой кислоты. Эти вещества помогают также справится с воспалительными процессами, способствуют уменьшению содержания триглицеридов в крови, которые связаны напрямую с заболевание сердца и инсультом.
Известно, что в клетках из полиненасыщенных жирных кислот класса «Омега 3» синтезируется комплекс эйкозаноидов, воздействующий на процессы репликации и репарации в клетках организма.
Для обоснования антимутагенных свойств предложенного препарата были проведены исследования с использованием импортных приборов и аппаратов нового поколения.
I этап - лабораторные исследования воздействия эйкозаноидов на процессы репликации и репарации;
II этап - непосредственные исследования антимутагенных и репатогенных свойств предложенного препарата «Эйкозавитол».
Исследования проводились с использованием систем бесклеточного матричного синтеза ДНК в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя, эйкозаноидов, а также меченых нуклеотидов (Amersham PB). Показания регистрировались на жидкостном автоматическом сцинтилляционном счетчике «Бета-2». Результаты проведенных исследований в рамках первого этапа свидетельствуют о том, что:
1. Эйкозаноиды продемонстрировали способность стимулировать синтез ДНК в 2-4 раза относительно контрольного уровня
2. Впервые установлено, что эйкозаноиды в отношении ДНК демонстрируют гиперхромный эффект, сопровождающий денатурацию ДНК и обусловленный снижением взаимной маскировки нуклеотидных оснований, а это свидетельствует о том, что эйкозаноиды уже в первые минуты после внесения в раствор, содержащий ДНК, вызывают изменение конформации полинуклеотидной молекулы. Этот эффект снижается к 15-й минуте и полностью исчезает в дальнейшем (спустя 60 минут), а обратимость гиперхромизма особо отчетлива на фоне изменения показателя светопоглощения денатурированной ДНК.
В настоящее время известно, что молекула ДНК может находиться в нескольких конформационных состояниях, различающихся шагом спирали, углами поворота между соседними парами оснований, наклоном плоскости пар к оси спирали, а также правой и левой формами. В частности, показано, что при внешних воздействиях ДНК способна из В-формы (правая) переходить в Z-форму (левая), причем переход в Z-форму играет большую регуляторную роль в связи с облегчением взаимодействия молекулы с ферментами (ДНК-полимеразой). В то же время можно считать доказанным, что эйкозаноиды уже в первые минуты изменяют конформационное состояние ДНК, проявляющееся разделением полинуклеотидных цепей («плавлением» ДНК) и гиперхромизмом.
3. На ДНК определяются участки связывания эйкозаноидов, обладающие выраженным аффинитетом. Оказалось, что нативная молекула ДНК имеет значительное число специфических сайтов связывания с высоким аффинитетом ко всем исследованным эйкозаноидам. В то же время температурная денатурация, сопровождающаяся лишь расхождением цепей ДНК, приводила к исчезновению сайтов связывания (хотя для ПГ Е1, PC 12 и Lt C4 эти участки сохраняются, но в значительно меньшем количестве - таблица 1).
Таблица 1.
Число (n) и аффинитет (Kac) рецепторов к эйкозаноидам на нативной и денатурированной ДНК
Единицы измерения
Нативная ДНК
Денатурированная ДНК
ПГ А1
n/10<sup>-12</sup> М/мг
4.40±0.88
0.00±0.00*
Kac 10<sup>9</sup> М
70.00±14.00
0.00±0.00*
ПГ А2
n/10<sup>-12</sup> М/мг
7.93±1.59
0.00±0.00*
Kac 10<sup>9</sup> М
29.00±6.00
0.00±0.00*
ПГ Е1
n/10<sup>-12</sup> М/мг
36.79±5.36
2.46±0.49*
Kac 10<sup>9</sup> М
34.00±7.00
35.90±720*
ПГ Е2
n/10<sup>-12</sup> М/мг
10.57±2.11
0.00±0.00*
Kac 10<sup>9</sup> М
39.00±8,00
0.00±0.00*
ПГ F2а
n/10<sup>-12</sup> М/мг
4.09±0.82
0.00±0.00*
Kac 10<sup>9</sup> М
156.00±31.00
0.00±0.00*
Рс 12
n/10<sup>-12</sup> М/мг
8.03±1.61
0.85±0.17*
Kac 10<sup>9</sup> М
27.00±5.00
25.0±5.00
ТхВ2
n/10<sup>-12</sup> М/мг
113±0.23
0.00±0.00*
Kac 10<sup>9</sup> М
242.00±48.00
0.00±0.00*
LtC4
n/10<sup>-12</sup> М/мг
6.33±1.27
0.46±0.09*
Kac 10<sup>9</sup> М
3100±6.00
39.00±8.00
* - здесь и далее, достоверность отличий показателя (р<0,05) по отношению к соответствующему контролю
В свою очередь, обратимость гиперхромизма и отсутствие высокочувствительных сайтов связывания на термически денатурированной молекуле позволяет с известной долей допущения определиться с областью связывания эйкозаноидов с молекулой нативной ДНК: аденин-тиминовые пары полинуклеотидных цепей. Это обусловлено большей прочностью гуанин-цитидиновых пар ввиду наличия у них сразу трех водородных связей, а гиперхромный эффект, регистрируемый до полного расхождения цепей молекулы, и его обратимость свидетельствует о сохранении гуанин-цитидиновых пар, являющихся формообразующими как для В, так и для Z-конформаций ДНК.
Приведенные данные дают возможность изложить общие моменты участия эйкозаноидов в индукции репликации ДНК, позволяющие описать их участие в репарации повреждений (мутагенеза) ДНК.
Эйкозаноиды взаимодействуют с высокочувствительными сайтами связывания двунитевой молекулы ДНК, что приводит к ее плавлению по аденин-тиминовым парам нуклеотидов, которое сопровождается обратимым гиперхромизмом, конформационным переходом ДНК, а новое конформационное состояние молекулы ДНК отличается от предыдущего новыми свойствами. Последнее выражается в потере способности ДНК реагировать на эйкозаноиды дальнейшим изменением конформации, облегчении присоединения праймера и ДНК-полимеразы и активации репликации ДНК. По мере образования двойной цепи при наличии эйкозаноидов в среде процесс повторяется.
Серией проведенных экспериментов установлено, что двойная спираль ДНК способна к непрерывному изменению конформации, в пределах двойной спирали переходить из В-формы в Z-форму, подвергаться локальному плавлению с образованием доступных участков однонитевой молекулы ДНК с последующим присоединением фермента и началом репликации ДНК. Изменение конформации и активация репликации ДНК может происходить при взаимодействии нуклеиновых оснований с эйкозаноидами. Подобная активация способна привести либо к интенсификации деления клеток, либо к увеличению клеточной популяции.
Обнаруженная неспецифическая стимуляция репликации ДНК посредством эйкозаноидов является одним из компонентов репарационных систем клетки, что указывает на антимутагенный эффект данного класса соединений.
В то же время применение эйкозаноидов для введения в организм нецелесообразно, так как срок их полужизни при парентеральном введении не превышает пяти минут. Еще одним аргументом в пользу применения препарата ПНЖК является то, что эйкозаноиды - внутриклеточные месседжеры и эффективны внутри клетки. Поэтому используя данные первого этапа исследований, для практического использования был предложен препарат «Эйкозавитол», включающий в свой состав доступные для эйкозаноидообразования ПНЖК.
На втором этапе исследований проводился плацебо-контролируемый эксперимент в группе людей (102 человека), проживающих в МО «г.Карпинск» Свердловской области, где наблюдается повышенный радиационный фон и высокое содержание генотоксикантов в воздухе, воде и почве.
Дозы и схема введения препарата «Эйкозавитол» определены на основании обзора по аналогам лабораторных опытов на животных и исследованиях на добровольцах и приняты из расчета 1-3 капсулы 3-4 раза в день при курсе приема 30-60 дней (по показаниям).
Медицинский контроль обследования отобранных пациентов в начале и в конце курса приема предложенного препарата, взятие и обработку необходимых анализов проводили сотрудники лаборатории молекулярных медицинских технологий Средне-Уральского Научного центра РАМН и Правительства Свердловской области при Уральской Государственной медицинской академии (г.Екатеринбург).
Испытуемые были разделены на 2 группы:
1. Испытуемые, принимавшие предложенный препарат, содержащий ПНЖК «Эйкозавитол», - 82 человека;
2. Контрольная группа испытуемых, не принимавших препарат - 20 человек.
Материалом для исследования послужили лейкоциты периферической крови, которые выделялись к градиенте фиколл-верографин (1,077).
3
3
3
Для оценки генотоксичности и состояния репарационных систем клетки применялся RAPD-анализ (анализ длин случайно амплифицированных последовательностей), в основе которого лежит полимеразная цепная реакция, по стандартным протоколам с применением меченных радионуклидами нуклеотидов (H-dTTP, H-dCTP, H-dATP).
ДНК из ядер лейкоцитов выделялась по методу фенольной депротеинизации. Перед постановкой полимеразной цепной реакции материал подвергался обработке лизирующим буфером для направленного расщепления цепей ДНК в щелочно-лабильных сайтах и местах одноцепочечных разрывов. В дальнейшем производилась отмывка фрагментов от лизирующего буфера и дополнительное их переосаждение. После чего материал ДНК вносился в реакционную ПЦР-смесь («НПО СибЭнзим»)
По окончании амплификации материал разделялся в агарозном геле с последующим переносом фрагментов на нитроцеллюлозные фильтры. Детекция результатов проводилась посредством регистрации сигнала на жидкостном автоматическом сцинтилляционном счетчике «Бета-2».
Указанный метод является достаточно информативным и позволяет получать количественные результаты для обоснования действия препарата. В основе его лежит то, что неповрежденная ДНК, имея размеры порядка 3-4 тыс. пар нуклеотидов, имеет крайне низкую подвижность в агарозном геле и соответственно проходит незначительное расстояние от места внесения в называемое образно «ядро». В отличие от нее участки ДНК, называемые «хвост», имеющие щелочно-лабильные сайты и места одноцепочечных разрывов, при обработке лизирующим буфером и амплификации дают фрагменты размером от 50 до 500 нуклеотидных пар и распределяются в геле на некотором расстоянии от «ядерной» ДНК. Таким образом, рассчитывая соотношение между «ядерной» и «хвостовой» ДНК (коэффициент фрагментации), можно в количественном выражении дать оценку степени повреждения ДНК клетки.
Для подтверждения эффективности предложенного препарата на втором этапе исследования до приема препарата «Эйкозавитол» у всех испытуемых был произведен забор периферической крови, которая была исследована на предмет уже имеющихся повреждений генома клеток.
Таблица 2
Показатели фрагментации ДНК до приема препарата «Эйкозавитол».
Группа
Активность «ядра». Бк/нг ДНК
Активность «хвоста», Бк/нг ДНК
Коэффициент фрагментации
Испытуемые
1056,74±97,23
803, 82±69,42
0,76
Контроль
921,51±86,5
681,92±46,85
0,74
Полученные результаты (Таблица 2) свидетельствуют о том, что степень повреждения генетического аппарата в группах испытуемых практически равны и составляют 0,76 и 0,74 соответственно, что позволило перейти непосредственно к проверке гипотезы об антимутагенных свойствах препарата «Эйкозавитол».
Первая группа испытуемых принимала препарат «Эйкозавитол» производства ООО «Тюменский химикофармацевтический завод" в течение месяца (30 дней) в количестве по 1 капсуле 3 раза в день (минимум по курсу), в то время как контрольная группа принимала плацебо, представляющее собой желатиновые капсулы, в том же количестве.
После окончания эксперимента был произведен вторичный забор периферической крови у всех испытуемых с последующим проведением RAPD-анализа.
Таблица 3
Показатели фрагментации ДНК после приема препарата «Эйкозавитол».
Группа
Активность «ядра», Бк/нг ДНК
Активность «хвоста», Бк/нг ДНК
Коэффициент фрагментации
Испытуемые
749,63±52,95
442,28±35,71
0,59*
Контроль
872,38±78,28
663,12±44,67
0,76
фр
фр
Исходя из представленных данных (Таблица 3) следует, что в группе контрольных лиц, принимавших обычные желатиновые капсулы (плацебо), коэффициент фрагментации значимо не изменился по сравнению с показателем до исследования. В группе испытуемых, принимавших препарат «Эйкозавитол», в указанных дозах (по минимуму) коэффициент фрагментации достоверно снизился по сравнению с К до исследования на 22.3% (p≥0,05) и на 22,4% (р>≥0,05) по сравнению с К в контрольной группе лиц.
Таким образом, в эксперименте на людях была практически доказана возможность и эффективность применения препарата «Эйкозавитол» в качестве средства, обладающего антимутагенными свойствами, за счет стимуляции репликативной активности в клетке посредством своих метаболитов - эйкозаноидов, и возможной активации репаративных механизмов защиты генома клетки, обоснованная на первом этапе исследований.
В отношении подтверждения предположения об активации репарации в клетках организма был проведен дополнительный эксперимент, в котором были совмещены RAPD-анализ и моделирование воздействия малых доз ионизирующего излучения.
Отобранную часть выделенной лейкоцитарной фракции испытуемых после окончания эксперимента, подвергали воздействию ионизирующего излучения (портативной рентгеновской установкой) в суммарной дозе, близкой к годовой дозе для «группы риска» (5 сГр). После облучения часть лейкоцитарной фракции исследовалась по методике RAPD-анализа, а другую в течение 2 часов культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением плазмы испытуемых с целью стимуляции репаративных процессов в ядросодержащих клетках крови. ДНК из клеток выделяли методом фенольной депротеинизации и проводили RAPD-анализ с использованной ранее группой праймеров в стандартных условиях.
Таблица 4
Показатели фрагментации ДНК облученных лейкоцитов периферической крови до культивирования
Группа
Активность «ядра», Бк/нг ДНК
Активность «хвоста», Бк/нг ДНК
Коэффициент фрагментации
Испытуемые
428,52±41,24
1251,28±94,26
2,92
Контроль
271,47±28,69
1009,87±95,94
3,72
Из полученных результатов (Таблица 4) следует, что ионизирующее излучение наносит достаточно серьезные повреждения ядерной ДНК, а доля наносимого им повреждения в 4,9 раза превышает уровень повреждений в ДНК без облучения (исследованные образцы после проведения эксперимента).
Таблица 5.
Показатели фрагментации ДНК облученных лейкоцитов периферической крови после культивирования
Группа
Активность «ядра», Бк/нг ДНК
Активность «хвоста», Бк/нг ДНК
Коэффициент фрагментации
Испытуемые
665,56±52,39
1457,58±98,65
2,19*
Контроль
342,39±37,57
1242,89±94,94
3,63
фр
фр
В то время как после проведения культивации облученных лейкоцитов (Таблица 5) с целью стимуляции репаративной активности показатель К контрольной группы снизился на 2,4% по сравнению с облученными образцами без культивации, К ядерной ДНК лейкоцитов испытуемых первой группы после культивации достоверно снизился (р≤0,05) на 25,1%.
Полученные результаты можно объяснить с привлечением двух механизмов:
1. Стимуляцией репаративной активности в клетках испытуемых, принимавших препарат «Эйкозавитол» по заданной схеме в профилактических целях.
2. Присутствием в сыворотке крови испытуемых первой группы «факторов, репарации», представляющих собой метаболиты препарата - эйкозаноиды, проявляющие выраженную активность в отношении стимуляции репликативных процессов в клетках.
Таким образом, представленные материалы исследований убедительно свидетельствуют о том, что предложенный препарат полиненасыщенных жирных кислот «Эйкозавитол» обладает выраженным новым неочевидным антимутагенным эффектом за счет способности его метаболитов стимулировать репликативную активность и соответственно репаративные процессы в клетках. Проведенные эксперименты на жителях МО «г.Карпинск» позволяют сделать вывод о том, что названный препарат в указанных дозах может быть эффективно использован в качестве нового антимутагенного средства для защиты генома человека от вредного воздействия факторов окружающий среды и может рассматриваться по новому назначению как профилактически-лечебное антимутагенное средство, расширяя ассортимент препаратов антимутагенного действия, полученных из оригинального сырья.
Новизной изобретения является то, что, основываясь на исследованиях действий эйкозаноидов на ДНК, в результате дополнительного изучения и детального исследования свойств препарата "Эйкозавитол" установлены его новые уникальные антимутагенные свойства и неизвестная раннее способность восстанавливать ДНК, поврежденную вследствие воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды, в частности, ионизирующим излучением природного или техногенного характера, причем эффективность выявленных новых свойств подтверждена в широкомасштабных производственных опытах на добровольцах в зоне экологического неблагополучия, а предложенные дозы применения препарата по новому назначению отличаются от ранее рекомендованных курсов приема по ранее известному назначению.