СПОСОБ ОЧИСТКИ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ФАКТОРА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО КОЛОНИИ ГРАНУЛОЦИТОВ, ИЗ РЕКОМБИНАНТНЫХ Е. coli

1. Способ очистки человеческих факторов, стимулирующих колонии гранулоцитов (hG-CSF), из рекомбинантных E. coli с высоким выходом, включающий стадии:
(a) культивирования hG-CSF-экспрессирующих рекомбинантных E. coli с получением клеточного осадка путем центрифугирования;
(b) отделения hG-CSF-содержащей надосадочной жидкости от клеточного осадка, полученного на стадии (a);
(c) обработки надосадочной жидкости, полученной на стадии (b), с помощью кислоты для отделения полученного в результате осадка путем фильтрации;
(d) применения к фильтрату, полученному на стадии (c), катионообменной хроматографии;
(e) применения к элюату, полученному на стадии (d), хроматографии гидрофобного взаимодействия; и
(f) применения к элюату, полученному на стадии (e), анионообменной хроматографии.
2. Способ по п.1, где на стадии (a), hG-CSF экспрессируются в периплазматическое пространство рекомбинантных E. coli.
3. Способ по п.2, где рекомбинантные E. coli представляют собой один или более видов бактерий, выбранных из группы, состоящей из E. coli BL21(DE3)/pT14SS1SG(HM 10310), E. coli BL21(DE3)/pT14SS1S17SEG (HM 10311; регистрационный No. KCCM-10154), E. coli BL21(DE3)/pTO1SG (HM 10409), E. coli BL21(DE3)/pTO1S17SG (HM 10410; регистрационный No. KCCM-10151), E. coli BL21(DE3)/pTO17SG (HM 10411; регистрационный No. KCCM-10152), E. coli BL21(DE3)/pTO17TG (HM 10413), E. coli BL21(DE3)/pTO17AG(HM 10414), E. coli BL21(DE3)/pTO17GG(HM 10415), E. coli BL21(DE3)/pBAD2M3VG (HM 10510; регистрационный No. KCCM-10153), E. coli BL21(DE3)/pBAD17SG (HM 10511) и E. coli BL21(DE3)/pBAD2M3V17SG (HM 10512).
4. Способ по п.1, где в стадии (b), hG-CSF-содержащую надосадочную жидкость отделяют от клеточного осадка с помощью осмотической экстракции.
5. Способ по п.4, где осмотическую экстракцию осуществляют путем обработки клеточного осадка с помощью буферного раствора, содержащего 10-30% сахарозу, с получением клеточного осадка путем центрифугирования, добавления дистиллированной воды к клеточному осадку и затем осуществления центрифугирования.
6. Способ по п.1, где на стадии (c), pH надосадочной жидкости регулируют до 5-5,8 путем обработки кислотой.
7. Способ по п.1, где кислота стадии (c) выбрана из группы, состоящей из уксусной кислоты, фосфорной кислоты и лимонной кислоты.
8. Способ по п.1, где катионообменную хроматографию стадии (d) осуществляют с использованием колонки, выбранной из группы, состоящей из сефарозы, сефадекса, агарозы, сефацела, полистирола, полиакрилата, целлюлозы и тойоперла.
9. Способ по п.8, где катионообменную хроматографию стадии (d) осуществляют с использованием SP-сефарозной колонки.
10. Способ по п.1, где катионообменную хроматографию стадии (d) осуществляют с использованием буферного раствора, содержащего уксусную кислоту, в интервале pH от pH 4 до 6 и с концентрацией соли 200-500 мМ.
11. Способ по п.10, где катионообменную хроматографию стадии (d) осуществляют с использованием буферного раствора, содержащего 200-500 мМ хлорида натрия и 5-20 мМ ацетата натрия при pH 5-6.
12. Способ по п.1, где хроматографию гидрофобного взаимодействия стадии (e) осуществляют с использованием сефарозной колонки, колонки Bio-Gel A или колонки Minileak, содержащих функциональную группу, выбранную из группы, состоящей из пропила, бутила, пентила, гексила, гептила и октила, изоалкила, неоалкила и олигоэтиленгликоля.
13. Способ по п.12, где хроматографию гидрофобного взаимодействия стадии (e) осуществляют с использованием бутил-сефарозной колонки.
14. Способ по п.1, где хроматографию гидрофобного взаимодействия стадии (e) осуществляют с использованием буферного раствора в интервале pH 7-8,5 и с концентрацией соли 0-100 мМ.
15. Способ по п.14, где хроматографию гидрофобного взаимодействия стадии (e) осуществляют с использованием буферного раствора, содержащего 5-20 мМ Tris при pH 7-8.
16. Способ по п.1, где анионообменную хроматографию стадии (f) осуществляют с использованием колонки, выбранной из группы, состоящей из Q-сефарозы, Macro-Prep Q, Q-HyperD и Fractogel EMD-TMAE 650.
17. Способ по п.16, где анионообменную хроматографию стадии (f) осуществляют с использованием Q-сефарозной колонки.
18. Способ по п.1, где анионообменную хроматографию стадии (f) осуществляют с использованием буферного раствора в интервале pH 6,5-8,5 и с концентрацией соли 100-300 мМ.
19. Способ по п.18, где анионообменную хроматографию стадии (f) осуществляют с использованием буферного раствора, содержащего 100-300 мМ хлорида натрия и 5-20 мМ Tris и 50-200 мМ мочевины при pH 7-8.
20. Человеческий фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов (hG-CSF), имеющий высокую степень чистоты, выделенный и очищенный из рекомбинантных E. coli согласно способу по п.1.