Сравнительная оценка антибактериальной активности полигексаметиленгуанидина гидрохлорида и полигексаметиленгуанидина сукцината в опытах in vitro

Сравнительная оценка антибактериальной активности полигексаметиленгуанидина гидрохлорида и полигексаметиленгуанидина сукцината в опытах in vitro

КАМ АНЬ ХА', Н. Э. ГРАММАТИКОВА2, И. А. ВАСИЛЕНКО', С. А. КЕДИК1

1 Московский государственный университет тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова

2 Первый московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова

Comparative in vitro Antibacterial Activity of Polyhexamethylene Guanidine Hydrochloride and Polyhexamethylene Guanidine Succinate

CHA KAM AN, N. E. GRAMMATIKOVA, I. A. VASILENKO, S. A. KEDIK

M. V. Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Engineering, Moscow I. M. Sechenov 1st Moscow State Medical University, Moscow

Инфекционные заболевания глаз являются одной из причин временной нетрудоспособности и как следствие могут вызывать слепоту. Ранее были были предложены полигексаметиленгуанидина (ПГМГ) гидрохлорид и ПГМГ фосфат в качестве антибактериального компонента в составе глазных капель. Представлена модифицированная форма ПГМГ в виде соли сукцината, сохраняющая антибактериальные свойства и обладающая меньшей токсичностью. Изучена сравнительная оценка по спектру антибактериальной активности ПГМГ сукцината и известного соединения ПГМГ гидрохлорида.

Ключевые слова: заболевания глаз, полигексаметиленгуанидина гидрохлорид, полигексаметиленгуанидина сукцинат, антибактериальная активность.

Eye infection is one of the temporary invalidity causes that can lead to blindness. The former antibacterial components of eye drops were polyhexamethylene guanidine hydrochloride and polyhexamethylene guanidine phosphate. Polyhexamethylene guanidine in the form of form of succinate with preserved activity and lover toxicity is described. The antibacterial activity spectra of polyhexa-methylene guanidine succinate and polyhexamethylene guanidine hydrochloride were comparatively estimated.

Key words: eye infection, polyhexamethylene guanidine hydrochloride, polyhexamethylene guanidine succinate, antibacterial activity.

В настоящее время инфекционные заболевания глаз являются одной из причин временной нетрудоспособности (80%) и как следствие могут вызывать слепоту (10—30%) [1]. В зависимости от локализации инфекционного агента выделяют основные клинические формы глазных инфекций: конъюнктивит (66,7% от общего числа воспалительных заболеваний глаз), блефарит (23,3%), воспалительные поражения роговицы (4,2%), невриты (5,8%) [2]. На современном фармацевтическом рынке существует многообразие антибиотиков с высокой антимикробной эффективностью, которые можно использовать в офтальмологии, однако их применении в течение длительного времени приводит к возникновению резистентных микроорганизмов. При бактериальной инфекции рого-

© Коллектив авторов, 2013

Адрес для корреспонденции: 119571 Москва, проспект Вернадского, д. 86. МИТХТ им. М. В. Ломоносова

вицы, вызванной Pseudomonas, чувствительны к ампициллину только 20% штаммов, к цефалексину — 14% [3]. При инфекции переднего отдела глаза, вызываемого S.epidermitis и S.aureus, устойчивость к ампицилину определена для 67,3% изолятов, рок-ситромицину — у 42,1%, к азитромицину — у 38,9% и хлорамфениколу — у 28,6% [4]. Среди возбудителей конъюнктивита — S.aureus и Haemophilus influenzae — резистентны к тетрациклину 20,7% [5].

Инфекции глаз часто сопровождаются развитием хронических форм. Один из факторов, влияющих на развитие хронического процесса, это микробные биоплёнки (группы клеток, заключённые в защитную матрицу полисахаридного полимера). Микроорганизмы, существующие в виде биоплёнок, более устойчивы к различным антимикробным агентам, чем планктонные культуры, и для лечения таких персистирующих форм требуются более высокие концентрации антиби-

отиков, что может вызывать нежелательные токсические эффекты [6, 7].

Несмотря на успехи в лечении глазных инфекций с применением антибактериальных препаратов и их комбинаций, необходимо совершенствовать подходы к их терапии.

Ранее были предложены полигексаметилен-гуанидина (ПГМГ) гидрохлорид и ПГМГ фосфат в концентрации 0,2 и 0,5% в качестве антибактериального компонента в составе глазных капель [8]. Минимальная подавляющая рост микроба концентрация обоих препаратов составляет для S.aureus 0,6 мкг/мл, для P.aeruginosa — 9,7 мкг/мл, для E.coli — 0,3 мкг/мл [9]. ПГМГ гидрохлорид относится к соединениям на основе гуа-нидиновой группы. По литературным данным, ПГМГ гидрохлорид обладает выраженной дезинфицирующей активностью как в отношении бактерии, дрожжей, так и в отношении вегетативных клеток и спор грибов [9]. По оценке общетоксических, специфических отдалённых эффектов действия ПГМГ гидрохлорида. установлено, что он относится к III классу умеренно опасных веществ при введении в желудок и к IV классу при нанесении на кожу по ГОСТ 12.1.007-76. Вероятно, поэтому применение ПГМГ гидрохлорида в глазных каплях вызывало раздражение в предварительных опытах на кроликах. Одним из возможных путей снижения токсичности образцов ПГМГ является удаление остаточного высокотоксичного гексаметилен-диамина (ГМДА) [10, 11]. Публикации, рассматривающие роль биоцидов в селекции резистентных штаммов к основным антимикробным препаратам, показывают, что роль четвертичных соединений в возникновении перекрестной резистентности не доказана [12].

Нами предложена модифицированная форма ПГМГ в виде соли сукцината, сохраняющая антибактериальные свойства и обладающая меньшей токсичностью. В соответствии с этим была разработана технология получения высокоочи-щенного ПГМГ сукцината для применения в качестве антибактериального средства в составе лекарственных средств в виде глазных капель.

В задачи исследования входила сравнительная характеристика ПГМГ сукцината и известного соединения ПГМГ гидрохлорида по спектру антибактериальной активности.

Материал и методы

Штаммы микроорганизмов. В работе использованы клинические штаммы микроорганизмов из коллекции ООО «Ол-фарм» и эталонные штаммы.

Препараты: ПГМГ сукцинат, порошок, серия 30.03.12; ПГМГ гидрохлорид (Полисепт) кристаллический; изготовлен в соответствии с ТУ 9392-001- 32963622-99, серия 13.12.11; Сульфацитамид натрия кристаллический, серия 200212060, производитель: ООО «Славянская аптека».

Методы. Сравнение минимальной подавляющей рост микроорганизмов концентрации (МПК) и минимальной бактерицидной концентрации (МБК) ПГМГ сукцината, ПГМГ гидрохлорида и сульфацила натрия («Альбуцид») проводили в отношении тест-микроорганизмов и клинических изолятов, в том числе потенциальных возбудителей глазных инфекций.

Исследования осуществляли микрометодом серийных двукратных разведений в бульоне Мюллера-Хинтон (Oxoid) в соответствии с рекомендациями «Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (МУК 4.2 1890 - 04) [13] диапазон исследуемых концентраций составлял (128—1,5)х10-5 мкг/мл. Минимальную бактерицидную концентрацию определяли высевом из лунок планшетов, в которых отсутствовал видимый рост микроорганизмов, на агаризованную питательную среду без препаратов. Анализ МБК проводили после 24—72 ч при соответствующих температурных режимах инкубации по наличию или отсутствию роста.

Сравнение бактерицидной эффективности осуществляли суспензионным методом в соответствии с руководством Р 4.2.2643-10 «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности» [14].

Изучение нейтрализующего действия сыворотки двух препаратов осуществляли с использованием тест-микроорганизмов S.aureus ATCC 29213 и ATCC 43300 (MRSA), E.coli ATCC 27952, P.aemginosa ATCC 27853, C.albicans 608М, C.trop-icalis 30.1.9 и C.kruzei 600М (клиничекие изоляты), B.subtilis ATCC 6633, Aniger 37а (ГНЦА).

Суспензии микроорганизмов в титре 103 КОЕ/мл в количестве 0,5 мл переносили в 4,5 мл лошадиной сыворотки и добавляли 0,5 мл исследуемого препарата. Через 5 мин по 0,1 мл суспензии переносили в 5 мл жидкой питательной среды и на поверхность питательной агаризованной среды (Биотехнова-ция). После инкубации в течение 48—72 часов при 37°С (для грибных культур — 25—30°С) результаты оценивали по наличию или отсутствию роста.

Изучение воздействия на биоплёнку P.aeruginosa осуществляли методом, основанным на определении плотности бактериальной культуры по количеству красителя, связавшегося с клетками тест-микроорганизма. По оптической плотности при спектрофотометрии элюента определяли количество красителя, связавшегося с клетками, и соответственно плотность биоплёнки P.aeruginosa в присутствии препаратов относительно контроля без препаратов [15, 16].

Действие изучаемых образцов осуществляли на биоплёнках клинического изолята Pseudomonas aeruginosa 71. Данный микроорганизм был отобран в процессе отработки метода среди клинических изолятов P.aeruginosa. Формирование биоплёнок P.aeruginosa 71 осуществляли в 96 луночных полистироловых планшетах для иммунологических исследований. Тест-культуру P.aeruginosa 71 выращивали на питательной агаризованной среде (Биотехновация) в течение ночи. Суспензию P.aeruginosa 71 готовили по стандарту мутности 2.0 McFarland в жидкой питательной среде (Биотехновация), что соответствует 109 КОЕ/мл, вносили в лунки планшета в количестве 100 мкл и инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Формирование биоплёнок проводили в три цикла. По окончании каждого цикла из лунок удаляли суспензию планктонной культуры, оставляли прикрепленные биоплёнки в лунках, приливали свежую питательную среду и вновь инкубировали.

При испытании воздействия препаратов на сформированные биоплёнки, после удаления планктонной суспензии вносили 100 мкл исследуемых растворов ПГМГ гидрохлорида и ПГМГ сукцината с концентрацией 0,05 и 0,2% в количестве 100 мкл, в контрольные лунки добавляли 100 мкл воды. Экспозицию с препаратами осуществляли при комнатной температуре в течение 30 мин. По окончании экспозиции биоплёнки окрашивали 0,03% раствором метиленовой сини в течение 10 мин, несвязанный с клетками краситель смывали дистил-

Сравнительная антибактериальная активность антисептиков (мкг/мл), ПГМГ гидрохлорида и ПГМГ сукцината*

Препарат МПК

S.aureus E.coli Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa

Октенидин 1,0 1,0 2,0 3,9

Хлоргексидин* 0,2 0,5 15,6 15,6

Хлоргексидин диацетат 1,0—2,0 4,0 — —

Алексидин* 0,5 2,0 31,3 15,6

ПГМГ гидрохлорид 1,0 2,0 1,0 4,0

ПГМГ сукцинат 0,5 2,0 1,0 8,0

Примечание. * — по данным Bailey et al 1984 [17].

лированной водой до полного обесцвечивания промывного раствора. Для оценки интенсивности окраски и соответственно плотности биоплёнки, краситель экстрагировали из клеток смесью ацетон — этанол в соотношении (1:3), окрашенный экстракт переносили в чистый планшет. Интенсивность окраски экстрагента (оптическую плотность) определяли спектро-фотометрически (на приборе Labsystems bioscreen) при длине волны 540 нм. Плотность биоплёнок, полученных в присутствии исследуемых веществ, оценивали по отношению к контролю (биоплёнки обработанной дистиллированной водой), принятой за 100%.

Результаты исследования

Проведённые сравнительные исследования показали, что препараты ПГМГ гидрохлорид и ПГМГ сукцинат схожи по антимикробному спектру, являются высокоэффективными в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Определено, что значения МПК и МБК для большинства клинических штаммов совпадают и составляют 0,125—8,0 мкг/мл. Значения МПК сульфацитамида натрия значительно выше, диапазон концентрации составляет 32—128 мкг/мл в зависимости от штамма.

Сравнительная оценка полученных данных антимикробной активности ПГМГ гидрохлорида и ПГМГ сукцината с антисептиками аналогичного действия, представленная в табл. 1, показала, что эффективность исследуемых препаратов схожа с октенидином, применяемым в медицине. Для подавления роста Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa требуются более высокие концентрации хлоргексидина, чем аналогичные по воздействию концентрации ПГМГ гидрохлорида и ПГМГ сукцината.

Одна из характеристик лекарственных форм — бактерицидная эффективность, свойство, связанное с фармакокинетическими параметрами. Для офтальмологических препаратов, в частности глазных капель, эффективность лекарственной формы определяется взаимодействием с компонентами слёзной жидкости и временем контакта препарата с инфицированной поверхностью глаза [18].

Так как МБК ПГМГ сукцината лежит в диапазоне 0,125—8,0 мкг/мл, а биодоступность глазных капель не более 5% [5], возможная терапевтическая концентрация ПГМГ сукцината для использования в составе глазных капель состав-

ляет не менее 160 мкг/мл (0,016%). Исследования показали, что ПГМГ гидрохлорид и ПГМГ сукцинат 0,05 и 0,2% схожи при сравнении одинаковых концентраций и значительно превышают бактерицидную эффективность. Экспериментальные данные доказывают быстродействие солей полигексаметиленгуанидина. Нет различия по эффективности препаратов в отношении клинических изолятов Candida tropicalis 30.1.9, Candida albicans 608M, Candida kruzei 600M и в отношении контрольных штаммов Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, S.aureus ATCC 2921, S.aureus (MRSA) ATCC 43300, E.coli ATCC 2592. Возможно, в дальнейших исследованиях необходимо рассмотреть более широкий диапазон концентраций и, возможно, в сторону уменьшения.

Раствор ПГМГ сукцината обладает более выраженным спороцидным эффектом по отношению к Aspergillus niger, чем ПГМГ гидрохлорида. Губительное воздействие в отношении Aspergillus niger оказывает экспозиция в течение 5 и 1 мин (для растворов ПГМГ сукцината 0,05 и 0,2% соответственно), 15 и 5 мин (для растворов ПГМГ гидрохлорида 0,05 и 0,2% соответственно).

Связывание лекарственных препаратов с белками, входящими в состав слёзной жидкости, может изменить химическую структуру активного начала, и следовательно частично или полностью инактивировать его действие [19, 20].

Экспериментальные данные изучения активности ПГМГ сукцината и ПГМГ гидрохлорида в отношении микроорганизмов, использованных в исследовании, в присутствии сыворотки показали, что эффективность препаратов не снижается. Можно предположить, что изучаемые препараты при применении в составе глазных капель будут сохранять свою эффективность.

Влияние на биоплёнку P.aeruginosa. Одна из проблем, возникающих при применении различных антибактериальных агентов (биоцидов, антибиотиков), — это способность бактерий, состоящих из представителей одного вида или ассоциации микроорганизмов, образовывать биоплёнки, в которых они защищены от воздействия любых антимикробных препаратов и способны аккумулировать экзо- и эндотоксины, что характеризует их как высоковирулентные [21].

Динамика изменения плотности биопленки Pseudomonas aeruginosa после воздействия ПГМГ гидрохлорида и ПГМГ сукцината выраженная в процентах от контроля (вода).

Интерес к препаратам, способным предотвращать развитие биоплёнок или нарушать их структуру, в настоящее время выиыгаает большой интерес во всем мире [22].

В задачу исследований входило изучение влияния ПГМГ гидрохлорида и ПГМГ сукцината на микробную пленку Pseudomonas aeruginosa, микроорганизма, наиболее часто образующего биоплёнки как на биологических, так и на других поверхностях, наряду со Staphylococcus aureus и грибами Candida spp.

Результаты изучения влияния ПГМГ гидрохлорида и ПГМГ сукцината на способность разрушать сформированные микробные плёнки представлены в на рисунке.

Из приведенных данных видно, что все исследованные концентрации ПГМГ гидрохлорида и ПГМГ сукцината приводят к деструкции сформированной микробной плёнки Pseudomonas aeruginosa. Препарат ПГМГ сукцинат значительно превосходит ПГМГ гидрохлорид по дезинтеграции биоплёнок. При этом ПГМГ гидрохлорид оказы-

ЛИТЕРАТУРА

1. Майчук Ю. Ф. Терапия инфекционных заболеваний глаз. Офталь-мол журн 1996; 4: 193-202.

2. Timothy L. et al. Besifloxacin: a novel anti-infective for the treatment of bacterial conjunctivitis. Clin Ophthalmol 2010; 4: 215—225.

3. Майчук Ю. Ф. Современные возможности лечения конъюнктивитов. Труды XVII Рос нац конгресса «Человек и лекарств». Москва 2011; 2: 215—225.

4. Белоусов Ю. Б. Антибиотикотерапия сегодня. Вопр врач практ 2010; 9: 54—57.

5. Bharathi M. J., Ramanrishnan R, Vasu S. et al. In vitro efficacy of antibacterials against bacterial isolates from corneal ulcers. Indian J Ophthalmol 2002; 2: 109—114.

6. Rybak M. J. The pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of vancomycin. Clin Infect Dis 2006; 1: 35—39.

7. Tally F. P., Zeckel M, Wasilewski M. M. et al. Daptomycin: a novel agent for Gram-positive infections. Exp Opinion Investigat Drugs 1999; 8: 8:1223—1238.

8. Абрикосова Ю. E. Разработка и исследование офтальмологических лекарственных форм с антисептиками гуанидинового ряда.

вает дозозависимый эффект (ПГМГ гидрохлорид 0,05% снижает плотность на 16%, ПГМГ гидрохлорид 0,2% — на 24%). Действие ПГМГсукцината в меньшей степени зависит от концентрации. Исследованные концентрации ПГМГ сукцината 0,2 и 0,05% разрушают плёнку Pseudomonas aeruginosa на 36 и 33% соответственно.

Из полученных данных можно сделать вывод, что биологическое действие значительно усиливается при воздействии ПГМГ в виде соли сукци-ната (по сравнению с гидрохлоридом).

Заключение

Проведённые исследования показали, что вновь синтезированное соединение ПГМГ сукцинат по спектру антимикробной активности схоже с ПГМГ гидрохлоридом и составляют 0,125—8,0 мкг/мл, значительно превосходит по антимикробной активности сульфацитамид натрия. Это определяет возможность снижение предлагаемой концентрации ПГМГ сукцината для офтальмологии до 0,05%.

Сравнительная оценка ПГМГ гидрохлорида и ПГМ сукцината с известными антисептиками, относящимися к четвертичным аммонийным соединениям, показала, что ПГМГ гидрохлорид и ПГМГ сукцинат в отношении E.coli и S.aureus (МПК 4 мкг/мл) превосходят хлоргексидин (МПК 15,6 мкг/мл) и алексидин (МПК 15,6 мкг/мл) и схожи с октенидином (МПК 3,9 мкг/мл).

ПГМГ сукцинат значительно превосходит ПГМГ гидрохлорид по дезинтегрирующему действию на сформированные биоплёнки P.aeruginosa. ПГМГ гидрохлорид оказывает до-зозависимое воздействие (ПГМГ гидрохлорид 0,05% разрушает биоплёнки на 16%, ПГМГ гидрохлорид 0,2 на 24%). Действие ПГМГ сукцината в меньшей степени зависит от концентрации. Исследованные концентрации ПГМГ сукцина-та 0,2 и 0,05% разрушают биоплёнку на 36 и 33% соответственно.

Диссертация кандидата фармацевтических наук: 15.00.01. М.: 2005; 186.

9. Кузнецова Л. С. «Полисепт». Полимерный биоцид пролонгированного действия. М.: МГУП 2001; 170.

10. Воинцева И. И., Гембицкий П. А. Полигуанидины — дезинфекционные средства и полифункциональные добавки в композиционные материалы. М.: 2009; 304.

11. Тарасевич В. А., Макатун В. Н, Белясова Н. А., Антоновская Л. И., Добыш В. А. Синтез и биоцидные свойства производных полигек-саметиленгуанидина. Весщ нацыянальчай акадедэмп навук Бела-рус 2010; 3: 78—83.

12. Peter Gilbert and Andrew J. McBain. Potential impact of increased use of biocides in consumer products on prevalence of antibiotic resistance. Clin Microbiol Rev 2003; 16: 2: 189—208,

13. «Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» (МУК 4.2 189004)., Клин микробиол антимикроб химиотер 2004; 6: 54.

14. Р 4.2.2643-10 «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности». Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование Российской Федерации 2010; 617.

15. Hu J., Garo E. et al. Bacterial biofilm inhibitors from Diospyrosdendo, Nat Prod 2006; 69: 118—120.

16. Rhani-Juy AbadF., Abdi-Ali A., Gharavi S. Antibiofilm activities of cer- 20. tain biocides in Pseudomonas aeruginosa. Iran. J Microbiolol Decembar 2009; 1: 4: 23-27.

17. Bailey D. M. et al. Bispyridinamines: a new class of topical antimicrobial 21. agents as inhibitors of dental plaque. J Med Chem 1984; 27: 1457—1464.

18. Urtti A., Salminen L. Minimizing systemic absorption of topically administered ophthalmic drugs. Surv Ophthalmol 1993; 37: 435—457. 22.

19. Chrai S. S, Robinson JR. Binding of sulfisoxazole to protein fractions of tears. J Pharmaceut Science 1976; 6: 3: 437—439.

Craig W. A, Ebert S. C. Protein binding and its significance in antibacterial therapy. Source Department of Medicine, University of Wisconsin Madison. Infect Dis Clin North Am 1989; 3: 3: 407—414. Николаев Ю. А., Плакунов В. К. Биопленка — «город микробов» или аналог многоклеточного организма. Микробиология 2007; 76: 2: 149—163.

Bos R, van der Mei H. C, Busscher H. J. Physico-chemistry of initial microbial adhesive interactions — its mechanisms and methods for study. FEMS Microbiol Rev 1999; 23: 179—230.