Математическое моделирование эндотелий-зависимой релаксации клетки гладкой мускулатуры

immobilized on gelatin coated mica surfaces // Ultramicr. 2003. Vol. 97. P. 209-216.

20. Laurino P., Kikkeri R., Azzouz N., Seeberger P. H. Detection of bacteria using gluco-dendronized polylysine prepared by continuous flow photofunctionalization // Nano Lett. 2011. Vol. 11. P. 73-78.

21. Beech I. B., Smith J. R., Steele A. A., Penegar I., Campbell S. A. The use of atomic force microscopy for studying interaction of bacterial biofilms with surface // Coll. and surf. B: Bioint. 2002. Vol. 23. P. 231-247.

22. Inoue T., Shingaki R., SogawaN., Sogawa C. A., Asaumi J.-I., Kokeguchi S., Fukui K. Biofilm formation by a Fimbriae-Deficient mutant of Actinobacillus actinomycetemcomitans // Microbiol. Immunol. 2003. Vol. 47, № 11. P. 877-881.

23. Pham D. K., Ivanova E. P., Wright J. P., Nicolau D. V AFM analysis of the extracellular polymeric substances (EPS) released during bacterial attachment on polymeric surfaces // Proc. SPIE. 2003. Vol. 4962. P. 151-159.

24. Vu B., Chen M., CrawfordR. J., Ivanova E. P. Bacterial extracellular polysaccharides involved in biofilm formation // Molecules. 2009. Vol. 14. P. 2535-2554.

25. Hammer M. U., Brauser A., Olak C., Brezesinski G., Goldmann T., Gutsmann T., Andra J. Lipopolysaccharide interaction is decisive for the activity on the antimicrobial

peptide NK-2 against Escherichia coli and Proteus mura-bilis // Biochem. J. 2010. Vol. 427. P. 477-488.

26. Braga P. C., Ricci D. Atomic force microscopy: application to investigation of Escherichia coli morphology before and after exposure to cefodizime // Antimicrob. agents and chemother. 1998. Vol. 42, № 1. P. 18-22.

27. Дерябин Д. Г., Васильченко А. С., Алешина Е. С., Тлягу-ловаА. С., Никиян А. Н. Исследование взаимодействия углеродных наноматериалов с клетками Escherichia coli методом атомно-силовой микроскопии // Российские нанотехнологии. 2010. Т. 5, № 11-12. С. 136-141.

28. Fang J., Lyon D. Y., Wiesner M. R., Dong J., Alvarez P. J. J. Effect of a fullerene water suspension on bacterial phospholipids and membrane behavior // Environ. Sci. Technol. 2007. Vol. 41. P. 2636-2642.

29. Pelling A. E., Li Y., Wenyuan S., Gimzewski J. K. Nanoscale visualization and characterization of Mycococcus Xanthus cells with atomic force microscopy // PNAS. 2005. Vol. 102, № 18. P. 6484-6489.

30. Boyd J. M., Dacanay A., Knickle L. C., Touhami A., BrownL. L., Jericho M., Johnson S. C., Reith M. Contribution of Type IV Pili to the virulence of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida in Atlantic Salmon (Salmo salar L.) // Infect. and Immun. 2008. Vol. 76, № 4. P. 1445-1455.

УДК 577.31

МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ ЭНДОТЕЛИЙ-ЗАВИСИМОЙ РЕЛАКСАЦИИ КЛЕТКИ ГЛАДКОЙ МУСКУЛАТУРЫ

А. Ю. Неганова, Д. Э. Постнов

Саратовский государственный университет

E-mail: nasty1503@yandex.ru, E-mail: postnov@info.sgu.ru

Работа посвящена исследованию характеристик локальных механизмов регуляции сократительной активности клетки гладкой мускулатуры средствами компьютерного моделирования. Влияние эндотелия моделируется в виде роста концентрации оксида азота NO, который активирует производство циклического гуано-зинмонофосфата (cGMP). Последний влияет на баланс внутриклеточной концентрации кальция и, в конечном итоге, на сократительную активность клетки. Согласно результатам проведенных вычислительных экспериментов cGMP-индуцированное угнетение Ca2+-АТФазы, локализованной в мембране клетки (а) или в мембране саркоплазаматического ретикулума (б), по-разному влияет на характеристики кальциевых колебаний и, следовательно, потенциально имеет различное релаксирующее действие. Ключевые слова: клетка гладкой мускулатуры, кальциевые колебания, циклический гуанозинмонофосфат.

Mathematical Modeling of Endothelium-Induced Smooth Muscle Cell Relaxation

A. Yu. Neganova, D. E. Postnov

By means of computer modeling we investigate the characteristics of the local mechanisms of regulation of contractile activity of smooth muscle cells. Influence of the endothelium is modeled as the increase of nitric oxide (NO) concentration and subsequent production of cyclic quanosine monophosphate (cGMP). The latter affects the balance of intracellular calcium concentration and, ultimately, the contractile activity of the cell.

Our computations show, that cGMP-induced inhibition of Ca2 +-ATPase, localized (i) in the cell membrane or (ii) in the membrane of sarcoplasmic reticulum has a different effect on the characteristics of calcium oscillations and, therefore, potentially has a different relaxing effect. Key words: smooth muscle cell, calcium oscillations, cyclic guanosine monophosphate.

Введение

Сократительная активность клеток гладкой мускулатуры (КГМ) является основным фактором, управляющим просветом сосуда. Известно, что нарушения в регуляции тонуса сосудов связаны с такими заболеваниями, как, например, гипертония или диабет. Несмотря на отсутствие детальной информации о причинно-следственных связях и механизмах этих нарушений, нет никаких сомнений в том, что они есть. Поэтому очень важно изучать механизмы работы КГМ для того, чтобы понять, какие именно сбои в их работе могут быть связаны с возникновением тех или иных заболеваний.

Механическое сокращение КГМ контролируется Ca2+ регулируемым ферментом [1, с. 340]. В свою очередь изменение внутриклеточной концен-

© Неганова Л. Ю., Постнов Д. Э, 2012

трации Ca2+ играет основную роль в сокращении КГМ и контролируется различными путями. Так, базальный тонус сосуда поддерживается фоновой активностью симпатических нервных окончаний. Нейромедиатор (норадреналин) высвобождается в ответ на поступление по аксону нейрона потенциала действия и вызывает усиление сократительной активности КГМ посредством активации внутриклеточного производства вторичного мессенджера IP3 [2]. IP3 вызывает значительный рост внутриклеточной концентрации Ca2+ и, как следствие, сокращение КГМ. Другой механизм регуляции тонуса сосуда основан на активации механочувствительных ионных каналов, активирующихся при растяжении его стенки. В ответ активируются сокращательные механизмы КГМ и наступает ответное сокращение сосуда.

Циклический гуанозинмонофосфат (cyclic guanosine monophosphate - cGMP) вырабатывается в КГМ под влиянием оксида азота (nitric oxide -NO), поступающего из клеток эндотелия, которые выстилают внутреннюю поверхность сосуда. Согласно экспериментальным данным действие cGMP на процессы в КГМ разнонаправленно, однако два основных его результата это: 1) понижение концентрации Ca2+ во внутриклеточной жидкости, 2) снижение чувствительности к Ca2+ сократительного механизма. Оба эти эффекта в конечном итоге приводят к расслаблению КГМ [3-6].

Как можно видеть, путей влияния на тонус сосудов много. Наряду с экспериментальным изучением такой сложной системы взаимодействие всех этих механизмов пытаются понять с помощью математического моделирования [2,7]. Количественная математическая модель позволяет в рамках вычислительного эксперимента воспроизвести ситуации, которые крайне трудно или невозможно реализовать на живом объекте. Кроме того, в этом случае возможно одновременно фиксировать изменение целого ряда величин, что также затруднительно в натурном эксперименте.

В данной работе мы используем метод вычислительного эксперимента для исследования того, как изменение концентрации оксида азота NO влияет на активный транспорт кальция и колебания его внутриклеточной концентрации.

Математическая модель

При моделировании внутриклеточной динамики кальция широко используются модели «двух ёмкостей» и «одной ёмкости» [2,8]. Расширенная и уточненная версия модели «двух емкостей» была предложена в работе G. Houart, G. Dupont и A. Goldbeter [7]. Она содержит 3 дифференциаль-

ных уравнения и описывает изменение во времени трех переменных: концентрацию свободного Са2+ в цитозоле (2), его концентрацию во внутриклеточных хранилищах (У) и концентрацию 1Р3 (А). Уравнения модели имеют вид:

— = - Г2 + Гз + кгУ - к2,

М

dY_

dt

= V - V3 - kfY,

где

dA = V (1 + a( - Z 0))-V5-eA, dt

Vin = Vo + Vie,

V = V _____

2 'm 2 „2

V =V

'3 M 3

Z*

K* + Zffl K2 + Y2 KA + A4

V =V

5 v M5 „P

A1

Kp + AP Kn + Zn 7

где V0 - постоянное поступление Ca2+ из внеклеточного пространства; Vj - максимальное поступление Ca2+ из внеклеточного пространства под действием стимула; в - степень стимуляции клетки агонистом, изменяется от 0 до 1; V2 - вкачивание цитозольного Ca2+ во внутриклеточные хранилища; V3 - выход Ca2+ из внутриклеточных хранилищ под действием кальций-индуциру-емого освобождения кальция (calcium-induced calcium release - CICR); VM2, VM3 - максимальное значение для V2 и V3 соответственно; K2, KY, Kz и KA - вкачивание Ca2+ в хранилища, его выход оттуда и активация выхода под действием Ca2+ и IP3, соответственно; f - пассивная утечка кальция из хранилищ в цитозоль; k - транспорт (откачка) цитозольного Ca2+ в межклеточную жидкость; V4 - максимальная интенсивность стимул-ин-дуцированного образования IP3; V5 - значение фосфориляции IP3 3-киназой (ее максимальное значение Vm5, K5 - константа полунасыщения); a - степень влияния Ca2+ на стимуляцию фосфо-липазы С (phospholipase C - PLC); Z0 - равновесная концентрация Ca2+ в цитозоле.

Тот факт, что 3-киназа стимулируется кальцием [9,10], отражен неявно через константу Kd. Так как распад IP3 может осуществляться также кальциево независимым путем (при помощи 5-фосфатазы) [9,11], в уравнение (3) включено слагаемое еА, где е - параметр.

2

n

Известно, что свМР, образующийся внутри клетки, активирует АТФазу мембраны КГМ и АТФазу саркоплазматического ретикулума [12]. На основе этих фактов нами в уравнение (1) модели и в соотношение для ^2 были введены следующие изменения:

1 гу

---= Vin - V2 + V, + kfY - k (1 + cG1 \cGMP], dt

V = V

2 M 2

K22 (1 - cG2 [cGMP]) + Z2 В приведенных выражениях введены новые параметры, которые характеризуют: cGl - увеличение выхода Са2+ во внеклеточное пространство под влиянием свМР; cG2 - увеличение скорости активного транспорта Са2+ во внутриклеточные хранилища; [свМР] - концентрация цитозольного свМР.

Динамика концентрации внутриклеточного свМР в рамках нашей модели описывалась следующими уравнениями и функциями [3]:

^ = -кх Еь [Ю] + k-l Б6с + k4 Е5С, dt

= кх Еь [N0] - k_l Е6с - k2 Е6с - kзЕ6с [N0] dE5

dE6(

dt

J5c

dt

= к3E6c [NO] + k2 E6c к4 E5c ,

d [NO]

dt

= Jno - kdno [NO],

d [cGMP] = V E [cGMP]Vm

^ = Vmax,sGCE5C т. Г ^1/ГГ>1’

dt , Km.pde + [cGMP]

max, pde

Уравнения (10), (11) и (12) описывают процессы активирования базовой формы (Eb) растворимой гуанилат циклазы (soluble guanylate cyclase -sGC) при помощи NO в два этапа, с образованием промежуточного (£6с) и активированного (^5С) комплексов; kj, k-1 - константы скорости для процесса связывания NO с базовой формой sGC и обратного процесса соответственно; к2 - константа скорости процесса естественного распада состояния E6c в E^; к3 - константа скорости для NO-зависимого пути превращения E6c в E5c; k4 - константа скорости для процесса необратимого перехода состояния E5c в Eb; Kmpde - константа Михаэлиса-Ментен. Уравнение (13) описывает динамику концентрации NO, исходя из предположения, что NO утилизируется сразу же после отсоединения от E5c так называемыми «мусорщиками» (миоглобин, гемоглобин и др.), а также за счет связывания с sGC. При этом Jno - это эндогенный (произведенный в эндотелии) или экзогенный (принесенный потоком крови) приток NO, выражающий физиологическую доступность NO, а kdno - константа смешанного потребления NO, которая отражает активность «мусорщиков» NO. Уравнение (14) описывает динамику концентрации cGMP во времени. Причем Vmax sGC представляет собой максимальную скорость производства cGMP, когда E5c= 1, а

V

максимальная скорость гидролиза

тах.рее

свМР. кр(ее - константа пропорциональности между скоростью гидролиза свМР и его концентрацией в цитозоле. В формуле (16) т отражает силу обратной связи между конечным продуктом свМР и особым регуляторным механизмом,

Vmax,pde = kpde [cGMPl k4 = K 4 [cGMP]m. снижающим чувствительность sGC к N0, а К4 - константа. Приведем численные значения модельных параметров:

NO 220 10-9 мольл-1 V0 0.333 10-7 мольл-1с-1

k1 2.0109 моль-1с-1л V1 0.333 10-7 мольл-1с-1

k-1 100 с-1 в 0.035

4 0.011 VM2 0.110-6 мольл-1с-1

k2 0.1 с-1 VM3 0.333 10-6 мольл-1с-1

2 2k 0.003 109 моль-1с-1л VM5 0.08333 10-6 мольл-1с-1

Vmax,sGC K m.pde kpde k/ k 0.852 10-6 молыс-1^-1 2.010-6 мольл-1 0.0195 с-1 0.01667 с-1 0.1667 с-1 K2 KZ KY KA V4 0.110-6 мольл-1 0.510-6 мольл-1 0.210-6 мольл-1 0.210-6 мольл-1 0.333 10-7 мольс-1л-1

m 2 Kd 0.410-6 мольл-1

є 0.001667 с-1 K5 110-6 мольл-1

2

Результаты

В ходе работы был проведен ряд вычислительных экспериментов, в процессе которых было исследовано влияние изменения отдельных параметров, описывающих силу воздействие cGMP на режим кальциевых колебаний.

На рис. 1 изображен результат вычислительного эксперимента, в ходе которого ступенчато изменялось значение параметра cG1, характеризующего увеличение скорости откачки Са2+ во внеклеточное пространство под влиянием cGMP. Концентрация N0 при этом была зафиксирована на уровне 220 нмоль/л. Начальная концентрация cGMP при этом составляла 0 мкмоль/л. Как видно из рис. 1, а, при переключении параметра со значения cG1 = 0.0 на значение cG1 = 0.003 амплитуда колебаний заметно уменьшается, при этом не наблюдается заметного изменения частоты колебаний концентрации кальция. Последующее увеличение параметра до значения cG1=0.004 создает такой же эффект, при этом форма колебаний меняется мало. Таким образом, данный путь влияния N0-cGMP относительно мало изменяет среднее значение внутриклеточной концентрации кальция, тогда как ее пиковые значения уменьшаются значительно.

На вставке рис. 1, б приведены зависимости амплитуды и частоты колебаний концентрации внутриклеточного Са2+ от параметра cG1. Как можно видеть, в пределах данного интервала значений cG1 амплитуда колебаний А снижается практически линейно. Частота / растет сначала медленно, а затем при значении параметра cG1 > 0.0015 быстрее. При этом конечное значение частоты на ~ 30% больше начального, в то время как значение амплитуды уменьшилось в ~ 4 раза.

На рис. 2, а приведены результаты другого вычислительного эксперимента, в ходе которого ступенчато изменялся параметр cG2, характеризующий увеличение скорости активного транспорта cGMP во внутриклеточные хранилища. При изменении параметра с cG2 = 0.0 на cG2 = 0.065 хорошо заметно увеличение амплитуды колебаний концентрации кальция. Однако при увеличении с cG2 = 0.065 до cG2 = 0.08 характер колебаний сильно меняется. Амплитуда возрастает еще больше, а частота сильно падает, вместо регулярных колебаний появляются редкие всплески концентраций кальция, между которыми концентрация Са2+ в цитоплазме мала.

На рис. 2, б представлены зависимости амплитуды и частоты колебаний Са2+ от параметра cG2. Как видно частота меняется нелинейно,

вначале снижается, затем медленно растет, и в конце наступает резкий спад частоты, при котором она изменяется в ~ 15 раз от начального значения. В то же самое время амплитуда меняется плавно и медленно, однако при достижении значения параметра cG2 = 0.07 происходит ее резкое увеличение.

Обсуждение результатов и выводы

В данной работе нами была предложена и протестирована работоспособная математическая модель, описывающая, как изменение концентрации вазорелаксанта, оксида азота NO, приводит к изменению концентрации cGMP и в результате воздействует на параметры динамики внутриклеточной концентрации кальция. В ходе проведенных вычислительных экспериментов были получены зависимости, количественно характеризующие вышеуказанную причинноследственную цепочку.

Из целого ряда (не менее пяти) известных путей воздействия cGMP на баланс внутриклеточной концентрации кальция нами были выбраны те, которые управляют интенсивностью активного транспорта (откачки) кальция и «работают» на восстановление и поддержание нормально низкой его внутриклеточной концентрации. А именно Са2+-АТФаза в мембране клетки (параметр модели cG 1) и Са2+-АТФаза внутренних мембран клетки (sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase

- SERCA) - аналогичный ионный насос, но расположенный в мембране саркоплазматического ретикулума (параметр модели cG2). Как показывают полученные результаты, оба пути воздействия NO приводят к угнетению кальциевых колебаний (что отражает их вазорелаксирующее действие), однако конкретные проявления этого существенно различны. В то время как рост cGl плавно уменьшает амплитуду колебаний, при увеличении cG2 имеет место скачкообразный переход от одного к другому типу колебаний.

С точки зрения связи наблюдаемых эффектов с сократительной динамикой клетки гладкой мускулатуры описанные выше результаты, могут быть интерпретированы с учетом того, что зависимость степени активации актин-миозиновых комплексов от концентрации кальция носит ступенчатый характер (показатель функции Хилла равен 8-9), а сокращение практически прекращается при Z<0.25 мкмоль/л [13]. В случае воздействия на мембранную АТФазу максимальные значения внутриклеточной концентрации кальция плавно снижаются при сохранении частоты, и при cG1 >0.004 стимуляция сократительной активности прекратится. При воздействии на

Рис 1. Результат вычислительного эксперимента, имитирующего увеличение активности АТФазы клеточной мембраны: а - изменения в колебаниях концентрации кальция (2) при ступенчатом изменении cG1; б - зависимости амплитуды А (сплошная линия) и частоты колебаний / (пунктирная линия) концентрации цитоплазматического Са2+ от параметра cG1. По вертикальной оси справа отложены значения частоты, по вертикальной оси слева - амплитуды

Рис 2. Результаты вычислительного эксперимента, имитирующего увеличение активности АТФазы мембраны саркоплазматического ретикулума: а - временные реализации переменной 2 при различных значениях параметра cG2, б - зависимости амплитуды А (сплошная линия) и частоты колебаний / (пунктирная линия) концентрации цитоплазматического Са2+ от параметра cG2. По вертикальной оси справа отложены значения частоты, по вертикальной оси слева - амплитуды

SERCA сократительная активность стимулируется даже в случае редко следующих импульсов (при cG2 > 0.07), так как их амплитуда значительно превышает порог.

Результаты данной работы будут использованы для дальнейшей разработки более полной математической модели, пригодной для моделирования нейрогенных путей активации и расслабления КГМ.

Список литературы

1. Фундаментальная и клиническая физиология / пер с англ. и нем. под ред. А. Камкина, А. Каменского. М. : Академия, 2004. 340 с.; 342 c.

2. Keener J., Sneyd J. Mathematical Physiology. N.Y. : Springer-Verlag, 1998. P. 163.

3. Yang J., Clark J. W., Brayn R. M., Robertson C. S. Mathematical modeling of the nitric oxide/cGMP pathway in the vascular smooth muscle cell // Amer. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2005. Vol. 289. H886-H897.

4. Carvajal J. A., Germain A. M., Huidobro-Toro J. P., Weiner C. P. Molecular mechanism of cGMP-mediated smooth muscle relaxation // J. Cell Physiol. 2000. Vol. 184. P. 409-420.

5. Lincoln T. M., Dey N., SellakH. cGMP-dependent protein kinase signaling mechanisms in smooth muscle : from the regulation of tone to gene expression // J. Appl. Physiol. 2001. Vol. 91. P. 1421-1430.

6. Lucas K. A., Pitari G. M., Kazerounian S., Ruiz-StewartI., Park J., Schulz S., Chepenik K. P., Waldman S. A. Guanylyl ceclases and signaling by cyclic GMP // Pharmacological reviews. 2000. Vol. 52. P. 375-414.

7. Houart G., Dupont G., Goldbeter A. Bursting, Chaos and Birhythmicity Originating from Self-modulation of the Inositol 1,4,5-trisphosphate Signal in a Model for Intracellular Ca2+ Oscillations // Bulletin of Mathematical Biology. 1999. № 61. P. 507-530.

8. Dupont G., Goldbeter A. One-pool model for Ca2+ oscillations involving Ca2+ and inositol 1,4,5-triphosphate as co-agonist for Ca2+ release // Cell Calcium. 1993. № 14. P. 311-322.

9. Takazawa K., Lemos M., Delvaux A., Lejeune C., Dumont J. E., Erneux C. Rat brain inositol 1,4,5-trisphos-phate 3-kinase. Ca2+sensitivity, purification and antibody production // Biochemical J. 1990. Vol. 268. P. 213-217.

10. Takazawa K., Passareiro H., Dumont J.E., Erneux C. Purification of bovine brain inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase. Identification of the enzyme by sodium dodecyl sulphate/polyacrylamide-gel electrophoresis // Biochemical J. 1989. Vol. 261. P. 483-488.

11. Berridge M. J. Inositol trisphosphate and calcium signaling // Nature. 1993. Vol. 361. P. 315-325.

12. Nillson H., Aalkjar C.Vasomotion : Mechanisms and Physiological Importance // Molecular Interventions. 2003. № 3. P. 79-89.

13. Bursztyn L., Eytan O., Jaffa A. J., Elad D. Mathematical model of excitation-contraction in a uterine smooth muscle cell // Amer. J. Physiol Cell. Physiol. 2007. № 292. P. 1816-1829.

УДК 579.23:53.086:615.281

КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ БИОПЛЕНОК МИКРООРГАНИЗМОВ МЕТОДОМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

П. С. Ерохин, О. С. Кузнецов, Н. П. Коннов, Н. А. Видяева, Д. В. Уткин

ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов E-mail: rusrapi@microbe.ru

Проведены исследования биопленок Staphylococcus aureus и Escherichia coli методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). С помощью комплексного подхода на основе полуконтактного режима АСМ показано, что биопленки S. aureus и E. coli представляют собой организованное сообщество микроорганизмов. Методами рассогласования и отображения фазы изучен внеклеточный матрикс биопленок S. aureus и E. coli, подтверждены размеры бактерий и биопленок. Полуконтактный метод позволяет выявлять S-слои на поверхности микроорганизмов, контактный

- различий в адгезии бактерий.

Ключевые слова: атомно-силовая микроскопия, внеклеточный матрикс, биопленка, микроорганизмы.

A Complex Approach for the Study of Biofilms of Microorganisms by Atomic Force Microscopy

P. S. Erokhin, O. S. Kuznetsov, N. P. Konnov,

N. A. Vidyaeva, D. V. Outkin

The biofilms of Staphylococcus aureus and Escherichia coli have been investigated by atomic force microscopy (AFM). The usage of complex approach of semi-contact AFM mode has shown that the S. aureus and E. coli biofilms represent an organized community of microorganisms. Semicontact error mode and phase imaging mode investigation of extracellular matrix of S. aureus and E. coli biofilms,

© Ерохин П. С., Кузнецов О. С., Коннов Н. П., Видяева Н. А., Уткин Д. В., 2012