СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИЛИ ПОДДЕРЖАНИЯ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ КЛЕТОК

1. Культура in vitro, содержащая:
(a) популяцию человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC); и
(b) среду с низкой осмоляльностью, содержащую основную среду и добавки, причем среда с низкой осмоляльностью содержит:
(i) полипептид, являющийся фактором, ингибирующим лейкемию (LIF);
(ii) ингибитор гликоген-синтазы-киназы 3 (GSK3); и
(iii) ингибитор MEK;
причем среда с низкой осмоляльностью имеет осмоляльность от приблизительно 200 до приблизительно 250 мОсм/кг.
2. Популяция человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC), которые получены или поддерживаются в среде с низкой осмоляльностью, содержащей основную среду и добавки, причем среда с низкой осмоляльностью содержит:
(a) полипептид, являющийся фактором, ингибирующим лейкемию (LIF);
(b) ингибитор гликоген-синтазы-киназы 3 (GSK3); и
(c) ингибитор MEK;
причем среда с низкой осмоляльностью имеет осмоляльность от приблизительно 200 до приблизительно 250 мОсм/кг.
3. Культура in vitro по п. 1 или популяция по п. 2, в которой hiPSC:
(a) представляют собой интактные или выглядящие интактными hiPSC;
(b) экспрессируют один или более маркеров плюрипотентности;
(c) проявляют морфологию, характеризующуюся компактными куполообразными колониями;
(d) могут дифференцироваться в клетки любого из зародышевых листков эндодермы, эктодермы или мезодермы;
(e) имеют время удвоения от приблизительно 16 часов до приблизительно 24 часов; или
(f) любая комбинация (а)-(е).
4. Культура in vitro по п. 1 или 3 или популяция по п. 2 или 3, в которой hiPSC имеют нормальный кариотип.
5. Культура in vitro или популяция по п. 3 или 4, причем маркеры плюрипотентности включают в себя NANOG, щелочную фосфатазу или их комбинацию.
6. Культура in vitro по любому из пп. 1 и 3-5 или популяция по любому из пп. 2-5, в которой hiPSC происходят от неплюрипотентных клеток, трансформированных для экспрессии плюрипотентного состояния.
7. Культура in vitro или популяция по п. 6, в которой трансформированные клетки экспрессируют репрограммирующие гены, включающие в себя Oct4, Sox2, Klf4, Myc или любую их комбинацию.
8. Культура in vitro или популяция по п. 6 или 7, в которой трансформированные клетки содержат праймированные hiPSC.
9. Культура in vitro или популяция по любому из пп. 6-8, в которой трансформированные клетки сначала культивируют в среде с высокой осмоляльностью до культивирования в среде с низкой осмоляльностью, причем среда с высокой осмоляльностью содержит bFGF.
10. Культура in vitro или популяция по п. 9, в которой среда с высокой осмоляльностью имеет осмоляльность по меньшей мере приблизительно 290 мОсм/кг.
11. Культура in vitro или популяция по п. 9 или 10, в которой:
(а) трансформированные клетки сначала культивируют в среде с высокой осмоляльностью до тех пор, пока они не проявят характеристики интактного или выглядящего интактным состояния;
(b) трансформированные клетки сначала культивируют в среде с высокой осмоляльностью в течение периода приблизительно двух месяцев;
(c) трансформированные клетки сначала культивируют в среде с высокой осмоляльностью до тех пор, пока они не проявят морфологию, характеризующуюся трехмерными скоплениями клеток; или
(d) их комбинация.
12. Культура in vitro по любому из пп. 1 и 3-11 или популяция по любому из пп. 2-11, в которой основная среда имеет осмоляльность от приблизительно 180 до приблизительно 250 мОсм/кг.
13. Культура in vitro по любому из пп. 1 и 3-12 или популяция по любому из пп. 2-12, в которой основная среда содержит NaCl в концентрации приблизительно 3 мг/мл, бикарбонат натрия в концентрации приблизительно 2,2 мг/мл и имеет осмоляльность приблизительно 200 мОсм/кг.
14. Культура in vitro по любому из пп. 1 и 3-13 или популяция по любому из пп. 2-13, в которой основная среда содержит глюкозу в концентрации приблизительно 4,5 мг/мл.
15. Культура in vitro по любому из пп. 1 и 3-14 или популяция по любому из пп. 2-14, в которой среда с низкой осмоляльностью имеет осмоляльность от приблизительно 220 до приблизительно 240 мОсм/кг.
16. Культура in vitro по любому из пп. 1 и 3-15 или популяция по любому из пп. 2-15, в которой среда с низкой осмоляльностью имеет осмоляльность от приблизительно 225 до приблизительно 235 мОсм/кг.
17. Культура in vitro по любому из пп. 1 и 3-16 или популяция по любому из пп. 2-16, в которой среда с низкой осмоляльностью имеет осмоляльность приблизительно 233 мОсм/кг.
18. Культура in vitro по любому из пп. 1 и 3-17 или популяция по любому из пп. 2-17, в которой:
(a) добавки содержат:
(i) среду F-12;
(ii) добавку N2;
(iii) среду NEUROBASAL;
(iv) добавку В-27;
(v) L-глутамин;
(vi) 2-меркаптоэтанол; или
(vii) любую комбинацию (i)-(vi);
(b) полипептид LIF представляет собой человеческий полипептид LIF (hLIF);
(c) ингибитор GSK3 представляет собой CHIR99021;
(d) ингибитор MEK представляет собой PD0325901; или
(e) любая комбинация (a)-(d).
19. Культура in vitro по любому из пп. 1 и 3-18 или популяция по любому из пп. 2-18, в которой среда с низкой осмоляльностью содержит ингибиторы, состоящие по существу из ингибитора гликоген-синтазы-киназы 3 (GSK3) и ингибитора MEK.
20. Культура in vitro по любому из пп. 1 и 3-19 или популяция по любому из пп. 2-19, причем среда с низкой осмоляльностью содержит основную среду в концентрации приблизительно 24,75% (об/об), среду F-12 в концентрации приблизительно 24,75% (об/об), добавку N2 в концентрации приблизительно 0,5% (об/об), среду NEUROBASAL в концентрации приблизительно 49% (об/об), добавку В-27 в концентрации приблизительно 1% (об/об), L-глутамин в концентрации приблизительно 2 мМ, 2-меркаптоэтанол в концентрации приблизительно 0,1 мМ, hLIF в концентрации приблизительно 100 единиц/мл, CHIR99021 в концентрации приблизительно 3 мкМ и PD0325901 в концентрации приблизительно 0,5 мкМ.
21. Культура in vitro по любому из пп. 1 и 3-20 или популяция по любому из пп. 2-20, в которой среда с низкой осмоляльностью не содержит одного или более из следующего: добавки bFGF; добавки TGF-β1; ингибитора JNK; ингибитора р38; ингибитора ROCK и ингибитора PKC.
22. Культура in vitro по любому из пп. 1 и 3-21 или популяция по любому из пп. 2-21, в которой среда с низкой осмоляльностью не содержит добавку bFGF.
23. Культура in vitro по любому из пп. 1 и 3-22 или популяция по любому из пп. 2-22, в которой hiPSC культивируют на MATRIGEL, питающих клетках NuFF или GELTREX.
24. Культура in vitro по любому из пп. 1 и 3-23 или популяция по любому из пп. 2-23, в которой hiPSC можно подвергать ферментативной диссоциации в суспензию одиночных клеток и пересеивать.
25. Культура in vitro или популяция по п. 24, в которой ферментативную диссоциацию:
(a) выполняют с использованием трипсина;
(b) выполняют в отсутствие ингибитора ROCK; или
(c) их комбинация.
26. Культура in vitro или популяция по п. 24 или 25, в которой пересеянные hiPSC:
(a) продолжают экспрессировать один или более маркеров плюрипотентности;
(b) сохраняют интактное или выглядящее интактным состояние и проявляют морфологию, характеризующуюся компактными куполообразными колониями; или
(c) их комбинация.
27. Культура in vitro или популяция по любому из пп. 24-26, в которой пересеянные hiPSC сохраняют нормальный кариотип.
28. Способ получения популяции человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC), включающий культивирование in vitro популяции неплюрипотентных клеток, трансформированных для экспрессии плюрипотентного состояния, в среде с низкой осмоляльностью, содержащей основную среду и добавки, в котором среда с низкой осмоляльностью содержит:
(a) полипептид, являющийся фактором, ингибирующим лейкемию (LIF);
(b) ингибитор гликоген-синтазы-киназы 3 (GSK3); и
(c) ингибитор MEK;
причем среда с низкой осмоляльностью имеет осмоляльность от приблизительно 200 до приблизительно 250 мОсм/кг.
29. Способ по п. 28, в котором способ обогащает популяцию интактными или выглядящими интактными hiPSC.
30. Способ поддержания популяции человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC) в культуре in vitro, включающий культивирование популяции клеток hiPSC в среде с низкой осмоляльностью, содержащей основную среду и добавки, в котором среда с низкой осмоляльностью содержит:
(a) полипептид, являющийся фактором, ингибирующим лейкемию (LIF);
(b) ингибитор гликоген-синтазы-киназы 3 (GSK3); и
(c) ингибитор MEK;
причем среда с низкой осмоляльностью имеет осмоляльность от приблизительно 200 до приблизительно 250 мОсм/кг.
31. Способ по любому из пп. 28-30, в котором hiPSC можно подвергать ферментативной диссоциации в суспензию одиночных клеток и пересеивать.
32. Способ по п. 29, в котором ферментативную диссоциацию:
(a) выполняют с использованием трипсина;
(b) выполняют в отсутствие ингибитора ROCK; или
(c) их комбинация.
33. Способ по п. 31 или 32, в котором пересеянные hiPSC:
(а) продолжают экспрессировать один или более маркеров плюрипотентности;
(b) сохраняют интактное или выглядящее интактным состояние и проявляют морфологию, характеризующуюся компактными куполообразными колониями; или
(c) их комбинация.
34. Способ по любому из пп. 31-33, в котором пересеянные hiPSC сохраняют нормальный кариотип.
35. Способ модификации целевого геномного локуса в человеческой индуцированной плюрипотентной стволовой клетке (hiPSC), включающий:
(a) введение в hiPSC нацеливающего вектора, содержащего полинуклеотидную вставку, фланкированную 5'- и 3'-гомологичными плечами, соответствующими 5'- и 3'-целевым сайтам в целевом геномном локусе; и
(b) идентификацию генетически модифицированной hiPSC, содержащей в своем геноме полинуклеотидную вставку, встроенную в целевой геномный локус;
причем hiPSC культивируют в среде с низкой осмоляльностью, содержащей основную среду и добавки, причем среда с низкой осмоляльностью содержит:
(i) полипептид, являющийся фактором, ингибирующим лейкемию (LIF);
(ii) ингибитор гликоген-синтазы-киназы 3 (GSK3); и
(iii) ингибитор MEK;
причем среда с низкой осмоляльностью имеет осмоляльность от приблизительно 200 до приблизительно 250 мОсм/кг.
36. Способ по п. 35, в котором нацеливающий вектор представляет собой большой нацеливающий вектор (LTVEC), причем общая суммарная длина 5'- и 3'-гомологичных плеч составляет по меньшей мере 10 т.п.н.
37. Способ по п. 35 или 36, в котором начальный этап (а) дополнительно включает введение нуклеазного агента, стимулирующего гомологичную рекомбинацию между нацеливающим вектором и целевым геномным локусом в hiPSC.
38. Способ по любому из пп. 35-37, в котором нацеленная генетическая модификация включает:
(a) делецию эндогенной человеческой нуклеотидной последовательности;
(b) вставку экзогенной нуклеотидной последовательности; или
(c) замену эндогенной человеческой нуклеотидной последовательности экзогенной нуклеотидной последовательностью.
39. Способ по п. 38, в котором экзогенная нуклеотидная последовательность содержит одно или более из следующего:
(a) нуклеотидной последовательности, которая является гомологичной или ортологичной эндогенной человеческой нуклеотидной последовательности;
(b) химерной нуклеотидной последовательности;
(c) условного аллеля, фланкированного целевыми последовательностями сайт-специфичной рекомбиназы; и
(d) репортерного гена, функционально связанного с промотором, активным в hiPSC.
40. Способ модификации целевого геномного локуса в человеческой индуцированной плюрипотентной стволовой клетке (hiPSC), включающий:
(a) внедрение в hiPSC одного или более нуклеазных агентов, которые создают один или более одноцепочечных или двухцепочечных разрывов в сайте распознавания в целевом геномном локусе; и
(b) идентификацию по меньшей мере одной клетки, содержащей в своем геноме модификацию целевого геномного локуса;
причем hiPSC культивируют в среде с низкой осмоляльностью, содержащей основную среду и добавки, причем среда с низкой осмоляльностью содержит:
(i) полипептид, являющийся фактором, ингибирующим лейкемию (LIF);
(ii) ингибитор гликоген-синтазы-киназы 3 (GSK3); и
(iii) ингибитор MEK;
причем среда с низкой осмоляльностью имеет осмоляльность от приблизительно 200 до приблизительно 250 мОсм/кг.
41. Способ по любому из пп. 35-10, в котором до этапа (a) hiPSC подвергают ферментативной диссоциации в суспензию одиночных клеток и пересеивают.
42. Способ по п. 41, в котором ферментативную диссоциацию:
(a) выполняют с использованием трипсина;
(b) выполняют в отсутствие ингибитора ROCK; или
(c) их комбинация.
43. Способ по п. 41 или 42, в котором пересеянные hiPSC:
(a) продолжают экспрессировать один или более маркеров плюрипотентности;
(b) сохраняют интактное или выглядящее интактным состояние и проявляют морфологию, характеризующуюся компактными куполообразными колониями; или
(c) их комбинация.
44. Способ по любому из пп. 41-43, в котором пересеянные hiPSC сохраняют нормальный кариотип.
45. Способ по любому из пп. 37-44, в котором нуклеазный агент содержит:
(a) нуклеазу с «цинковыми пальцами» (ZFN);
(b) эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN);
(c) мегануклеазу; или
(d) белок Cas, ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и гидовую РНК (гРНК), содержащую CRISPR РНК (крРНК), распознающую геномную целевую последовательность, и трансактивирующую CRISPR РНК (тракрРНК).
46. Способ по п. 45, в котором белок Cas представляет собой Cas9.
47. Способ по любому из пп. 35-46, в котором нацеленная генетическая модификация является биаллельной.
48. Способ по любому из пп. 28-47, в котором hiPSC:
(a) представляют собой интактные или выглядящие интактными hiPSC;
(b) экспрессируют один или более маркеров плюрипотентности;
(c) проявляют морфологию, характеризующуюся компактными куполообразными колониями;
(d) могут дифференцироваться в клетки любого из зародышевых листков эндодермы, эктодермы или мезодермы;
(e) имеют время удвоения от приблизительно 16 часов до приблизительно 24 часов; или
(f) любая комбинация (а)-(е).
49. Способ по любому из пп. 28-48, в котором hiPSC имеют нормальный кариотип.
50. Способ по п. 48 или 49, в котором маркеры плюрипотентности включают в себя NANOG, щелочную фосфатазу или их комбинацию.
51. Способ по любому из пп. 30-50, в котором hiPSC происходят от неплюрипотентных клеток, трансформированных для экспрессии плюрипотентного состояния.
52. Способ по любому из пп. 28, 29 и 51, в котором трансформированные клетки экспрессируют репрограммирующие гены, включающие в себя Oct4, Sox2, Klf4, Myc или любую их комбинацию.
53. Способ по любому из пп. 28, 29, 51 и 52, в котором трансформированные клетки содержат праймированные hiPSC.
54. Способ по любому из пп. 28, 29 и 51-53, в котором трансформированные клетки сначала культивируют в среде с высокой осмоляльностью до культивирования в среде с низкой осмоляльностью, причем среда с высокой осмоляльностью содержит bFGF.
55. Способ по п. 54, в котором среда с высокой осмоляльностью имеет осмоляльность по меньшей мере приблизительно 290 мОсм/кг.
56. Способ по п. 54 или 55, в котором:
(a) трансформированные клетки сначала культивируют в среде с высокой осмоляльностью до тех пор, пока они не проявят характеристики интактного или выглядящего интактным состояния;
(b) трансформированные клетки сначала культивируют в среде с высокой осмоляльностью в течение периода приблизительно двух месяцев;
(c) трансформированные клетки сначала культивируют в среде с высокой осмоляльностью до тех пор, пока они не проявят морфологию, характеризующуюся трехмерными скоплениями клеток; или
(d) их комбинация.
57. Способ по любому из пп. 28-56, причем основная среда имеет осмоляльность от приблизительно 180 до приблизительно 250 мОсм/кг.
58. Способ по любому из пп. 28-57, в котором основная среда содержит NaCl в концентрации приблизительно 3 мг/мл, бикарбонат натрия в концентрации приблизительно 2,2 мг/мл и имеет осмоляльность приблизительно 200 мОсм/кг.
59. Способ по любому из пп. 28-58, в котором основная среда содержит глюкозу в концентрации приблизительно 4,5 мг/мл.
60. Способ по любому из пп. 28-59, в котором среда с низкой осмоляльностью имеет осмоляльность от приблизительно 220 до приблизительно 240 мОсм/кг.
61. Способ по любому из пп. 28-60, в котором среда с низкой осмоляльностью имеет осмоляльность от приблизительно 225 до приблизительно 235 мОсм/кг.
62. Способ по любому из пп. 28-61, причем среда с низкой осмоляльностью имеет осмоляльность приблизительно 233 мОсм/кг.
63. Способ по любому из пп. 28-62, в котором:
(a) добавки содержат:
(i) среду F-12;
(ii) добавку N2;
(iii) среду NEUROBASAL;
(iv) добавку В-27;
(v) L-глутамин;
(vi) 2-меркаптоэтанол; или
(vii) любую комбинацию (i)-(vi);
(b) полипептид LIF представляет собой человеческий полипептид LIF (hLIF);
(c) ингибитор GSK3 представляет собой CHIR99021;
(d) ингибитор MEK представляет собой PD0325901; или
(e) любая комбинация (a)-(d).
64. Способ по любому из пп. 28-63, в котором среда с низкой осмоляльностью содержит ингибиторы, состоящие по существу из ингибитора гликоген-синтазы-киназы 3 (GSK3) и ингибитора MEK.
65. Способ по любому из пп. 28-64, причем среда с низкой осмоляльностью содержит основную среду в концентрации приблизительно 24,75% (об/об), среду F-12 в концентрации приблизительно 24,75% (об/об), добавку N2 в концентрации приблизительно 0,5% (об/об), среду NEUROBASAL в концентрации приблизительно 49% (об/об), добавку В-27 в концентрации приблизительно 1% (об/об), L-глутамин в концентрации приблизительно 2 мМ, 2-меркаптоэтанол в концентрации приблизительно 0,1 мМ, hLIF в концентрации приблизительно 100 единиц/мл, CHIR99021 в концентрации приблизительно 3 мкМ и PD0325901 в концентрации приблизительно 0,5 мкМ.
66. Способ по любому из пп. 28-65, в котором среда с низкой осмоляльностью не содержит одного или более из следующего: добавки bFGF; добавки TGF-β1; ингибитора JNK; ингибитора р38; ингибитора ROCK и ингибитора PKC.
67. Способ по любому из пп. 28-66, в котором среда с низкой осмоляльностью не содержит добавки bFGF.
68. Способ по любому из пп. 28-67, в котором hiPSC культивируют на MATRIGEL, питающих клетках NuFF или GELTREX.
69. Клетка hiPSC, полученная способом по любому из пп. 28, 29, 31-34, 48-50 и 52-68.
70. Модифицированная hiPSC, полученная способом по любому из пп. 35-68.