СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ МОДУЛИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ АПОЛИПОПРОТЕИНА (А)
METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODELING EXPRESSION OF APOLIPOPROTEIN (A)

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка подается вместе со списком последовательностей в электронном формате. Перечень последовательностей обеспечивается в виде файла под названием BIOL0177WOSEQ.txt, созданного 22 мая 2013, который имеет размер 396 Кб. Информация, содержащаяся в электронном виде в перечне последовательностей, включена в данный документ в виде ссылки во всей своей полноте.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Варианты реализации, описанные в данном документе, обеспечивают способы, соединения и композиции для снижения экспрессии mRNA аполипопротеина (а) и протеина у животного. Подобные способы, соединения и композиции применяются для лечения, профилактики или улучшения сердечно-сосудистых и/или метаболических болезней, расстройств или состояний.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Липопротеины представляют собой глобулярные, мицеллоподобные частицы, которые состоят из неполярного ядра ацилглицеролов и сложных эфиров холестерина, окруженного амфифильным слоем из белков, фосфолипидов и холестерина. Липопротеины разделяют на пять основных категорий на основе их функциональных и физических свойств: хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности (VLDL), липопротеиды средней плотности (IDL), липопротеины низкой плотности (LDL) и липопротеины высокой плотности (HDL). Хиломикроны транспортируют пищевые липиды из кишечника в ткани. Все VLDL, IDL и LDL транспортируют триглицериды и холестерин из печени в ткани. HDL транспортируют эндогенный холестерин из тканей в печень.
Липопротеиновые частицы подвергаются непрерывной метаболической обработке и имеют различные свойства и композиции. Плотности липопротеина увеличиваются без увеличения диаметра частиц, так как плотность их внешних слоев меньше, чем таковая у внутреннего ядра. Белковые компоненты липопротеинов известны как аполипопротеины. Среди различных липопротеинов человека по меньшей мере девять аполипопротеинов распределены в значительных количествах.
Частица липопротеина(а) [Lp(a)] была определена почти 50 лет назад и состоит из весьма уникальной частицы LDL, в которой отдельный протеин аполипопротеин В (аро(а)) связан посредством дисульфидной связи с отдельным протеином аполипопротеина (а) [аро(а)]. Протеин аро(а) разделяет высокую степень гомологии с плазминогеном, в частности, в рамках повторяющегося домена 2-го типа двойной петли IV. Уровни циркулирующего Lp(a) обратно пропорциональны количеству варьирующихся повторов двойной петли IV 2-го типа, присутствующих в молекуле, и, так как обе аллели коэкспрессируются у отдельных индивидуумов, могут отображать гетерозиготные профили изоформ в плазме (Kraft et al., Eur J Hum Genet, 1996; 4(2): 74-87). Считается, что этот повторяющийся домен двойной петли в аро(а) может быть ответственным за его протромботические и антифибринолитические свойства, потенциально повышая атеросклеротическое прогрессирование.
Аро(а) транскрипционно регулируют с помощью IL-6 и в исследованиях с пациентами с ревматоидным артритом, получавшими ингибитор IL-6 (тоцилизумаб), снижают уровни в плазме на 30% после 3-месячного лечения (Schultz et al., PLoS One 2010; 5:el4328).
Apo(a) был показан для преимущественно связанных окисленных фосфолипидов и усиления васкулярного воспаления (Bergmark et al., J Lipid Res 2008; 49:2230-2239; Tsimikas et al., Circulation. 2009; 119(13):1711-1719).
Кроме того, исследования демонстрируют, что частица Lp(a) может также стимулировать эндотелиальную проницаемость, вызывать экспрессию ингибитора активатора плазминогена типа-1 и активировать секрецию макрофагального интерлейкина-8 (Koschinsky и Marcovina, Curr Opin Lipidol 2004; 15:167-174). Важно отметить, что недавние исследования генетической связи показали, что Lp(a) является независимым фактором риска развития инфаркта миокарда, инсульта, заболевания периферических сосудов и аневризмы брюшной аорты (Rifai et al., Clin Chem 2004; 50:1364-71; Erqou et al., JAMA 2009;302:412-23; Kamstrup et al., Circulation 2008; 117:176-84). Кроме того, в недавнем исследовании Precocious Coronary Artery Disease (PROCARDIS), Clarke et al. (Clarke et al., NEJM (2009)361; 2518-2528) описаны надежные и независимые связи между ишемической болезнью сердца и концентрацией Lp(a) в плазме. Дополнительно, Solfrizzi et al. предполагают, что увеличение Lp(a) в сыворотке может быть связано с повышенным риском развития болезни Альцгеймера (AD) (Solfrizzi et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry 2002, 72:732-736. В настоящее время, в условиях клиники, примеры непрямых ингибиторов аро(а) для лечения сердечно-сосудистых заболеваний содержат аспирин, Niaspan, Mipomersen, Anacetrapib, Epirotirome и Lomitapide, которые снижают в плазме уровни Lp(a) на 18%, 39%, 32%, 36%, 43% и 17%, соответственно. Кроме того, аферез Lp(a) используют в клиническом испытании для снижения аро(а), который содержит частицы Lp(a).
На сегодняшний день терапевтические стратегии для лечения сердечно-сосудистых заболеваний с помощью непосредственно направленных уровней аро(а) были ограничены. Были разработаны рибозимные олигонуклеотиды (патент США 5877022) и антисмысловые олигонуклеотиды (WO 2005/000201; WO 2003/014397; патент США 8138328; Merki et al., J Am Coll Cardiol 2011; 57:1611-1621), но ни одно из соединений, непосредственно нацеленное на аро(а), в настоящее время не используется в клинике.
Таким образом, существует явно выраженная неудовлетворенная медицинская потребность в новых средствах, которые могут эффективно и селективно снижать уровни аро(а) у больных с повышенным риском сердечно-сосудистых осложнений в связи с хронически повышенными уровнями Lp(a) в плазме.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Обеспечиваемое в данном документе представляет собой композиции и способы модулирования экспрессии mRNA аро(а) и протеина. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения аро(а)-специфичный ингибитор уменьшает экспрессию mRNA аро(а) и протеина.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения композиция представляет собой аро(а)-специфичный ингибитор. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения аро(а)-специфичный ингибитор представляет собой нуклеиновую кислоту, протеин или малую молекулу. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения аро(а)-специфичный ингибитор представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения аро(а)-специфичный модифицированный олигонуклеотид, который состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и содержит нуклеотидную последовательность, содержащую сегмент из по меньшей мере 8 последовательных нуклеотидов, комплементарную равной длине сегмента нуклеиновых оснований от 3901 до 3920 из SEQ ID NO: 1, при том что последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида по меньшей мере на 80% комплементарна последовательности SEQ ID NO: 1. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения аро(а)-специфичный ингибитор представляет собой модифицированный олигонуклеотид состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 1-130, 133, 134. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения аро(а)-специфичный ингибитор представляет собой модифицированный олигонуклеотид, который состоит из 20 связанных нуклеозидов и имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований любой из SEQ ID NO: 58, при том что модифицированный олигонуклеотид содержит: (а) сегмент разрыва, состоящий из десяти связанных дезоксинуклеозидов; (б) 5'-концевой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; (в) 3'-концевой сегмент, состоящий из пяти связанных нуклеозидов; и в котором сегмент зазора расположен между 5'-концевым сегментом и 3'-концевым сегментом, при том что каждый нуклеозид каждого концевого сегмента содержит 2'-O-метоксиэтилированный сахар, причем каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь, при том что каждый остаток цитозина представляет собой 5-метилцитозин.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают композицию, которая содержит соединение, описанное в данном документе, или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модуляция экспрессии аро(а) происходит в клетке или ткани. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модуляции происходят в клетке или ткани у животного. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения животное представляет собой человека. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модуляция представляет собой снижение уровня mRNA аро(а). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модуляция представляет собой снижение уровня протеина аро(а). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения снижают уровни mRNA аро(а) и протеина. Такое уменьшение может происходить в зависимости от времени или дозозависимо.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивает композиции и способы для применения в терапии. Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают композиции и способы для профилактики, лечения, запаздывания, замедления прогрессирования и/или уменьшения интенсивности связанных с аро(а) болезней, расстройств и заболеваний. Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают композиции и способы для профилактики, лечения, запаздывания, замедления прогрессирования и/или уменьшения интенсивности связанных с Lp(a) болезней, расстройств и заболеваний. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения подобные болезни, расстройства и заболевания представляют собой воспалительные, сердечно-сосудистые и/или метаболические болезни, расстройства и состояния. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения композиции и способы терапии содержат введение аро(а)-специфичного ингибитора индивидууму, нуждающемуся в этом. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения аро(а)-специфичный ингибитор представляет собой нуклеиновую кислоту. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловое соединение представляет собой модифицированный олигонуклеотид.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Следует понимать, что и предшествующее общее описание, и последующее подробное описание являются исключительно примерными и пояснительными и не ограничивают настоящее изобретение, как заявлено. В данном документе использование единственного числа содержит множественное число, если специально не указано иное. Как используется в данном описании, использование "или" подразумевает "и/или", если не указано иное. Кроме того, как используют в данном описании, использование "и" подразумевает "и/или", если не указано иное. Кроме того, использование термина "который содержит", а также других форм, таких как "содержит" и "содержится", не ограничено. Кроме того, такие термины, как "элемент" или "компонент" охватывают элементы и компоненты, которые содержат одну единицу, элементы и компоненты, имеющие больше одной субъединицы, если специально не указано иное.
Заголовки разделов, используемых в данном документе, предназначены только для организационных целей и не должны быть истолкованы как описанный предмет изобретения. Все документы или части документов, цитируемые в данном описании, в том числе, но без ограничения ими, патенты, патентные заявки, опубликованные патентные заявки, статьи, книги, монографии и регистрационные номера GENBANK и связанная с ними информация о последовательности, получаемая из таких баз данных, как National Center for Biotechnology Information (NCBI), и другие данные, указанные по всему объему описания, тем самым явно включены в качестве ссылки в частях документа, обсуждаемых в данном документе, а также во всей их полноте.
Определения
Если не предусматривают конкретные определения, используемая номенклатура, связанная и с методиками, и со способами аналитической химии, химии органического синтез, медицинской и фармацевтической химии, описанными в данном документе, является хорошо известной и широко используемой в данной области техники. Стандартные способы могут быть использованы для химического синтеза и химического анализа.
Если не указано иное, следующие термины имеют следующие значения:
2
2
3
"2'-O-метоксиэтил" (либо 2'-МОЕ, МОЕ, 2'-O(СН)-ОСН и 2'-O-(2-метоксиэтил)) соответствует модификации О-метоксиэтилом положения 2' фуранозного кольца. 2'-O-метоксиэтилированный сахар представляет собой модифицированный сахар.
"2'-дезоксирибонуклеозид" означает нуклеозид, который содержит 2'-Н фуранозильный остаток сахара, как обнаружено в случае встречающихся в природе дезоксирибонуклеозидов (DNA).
"2'-МОЕ нуклеозид" (либо 2'-метоксиэтилнуклеозид) означает нуклеозид, который содержит модифицированный 2'-МОЕ остаток сахара. "2'-O-метоксиэтилнуклеотид" означает нуклеотид, который содержит модифицированный 2'-O-метоксиэтилом остаток сахара.
"3'-фтор-HNA" (либо "F-HNA" или "3'-F-HNA") означает остаток сахара нуклеозида, который имеет следующую структуру:
где Вх представляет собой нуклеиновое основание.
"Сайт-мишень 3"' соответствует нуклеотиду нуклеиновой кислоты-мишени, который является комплементарной крайнему 3' нуклеотиду конкретного антисмыслового соединения.
"Сайт-мишень 5"' соответствует нуклеотиду нуклеиновой кислоты-мишени, который является комплементарной крайнему 5' нуклеотиду конкретного антисмыслового соединения.
"5-метилцитозин" означает цитозин, модифицированный метильной группой, присоединенной в положении 5'. 5-метилцитозин представляет собой модифицированное нуклеиновое основание.
"Около" означает в пределах ±10% величины. Например, если указано, что "маркер может быть увеличен на около 50%", подразумевается, что маркер может быть увеличен на 45%-55%.
"Активное фармацевтическое средство" означает вещество или вещества в фармацевтической композиции, которые при введении индивидууму обеспечивают терапевтический эффект. Например, в отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловой олигонуклеотид, направленный на аро(а), представляет собой активное фармацевтическое средство.
"Активная область-мишень" или "область-мишень" означает область, к которой одно или несколько активных антисмысловых соединений являются специфичными. "Активные антисмысловые соединения" означает антисмысловое соединения, которое снижает уровни нуклеиновой кислоты-мишени или уровни протеина.
"Осуществляют параллельно" относится к совместному введению двух средств любым путем, при котором фармакологические эффекты обоих проявляются у пациента в одно и то же время. Одновременное введение не требует, чтобы оба средства могли быть введены в виде отдельной фармацевтической композиции, в той же лекарственной форме или же с помощью того же способа введения. Эффекты обоих средств могут не проявиться в то же время. Эффекты должны быть перекрывающимися только в течение периода времени и не обязательно должны иметь одинаковое протяжение во времени.
"Применение" или "введение" означает обеспечение фармацевтического средства индивидууму и содержит, но без ограничения ими, введение медицинским работником и самостоятельное введение. Введение фармацевтического средства индивидууму может быть непрерывным, хроническим, коротким или периодическим. Введение может быть парентеральным или энтеральным.
"Средство" означает активное вещество, которое при введении животному может обеспечивать терапевтический эффект. "Первое средство" означает терапевтическое соединение по настоящему изобретению. Например, первое средство может быть антисмысловым олигонуклеотидом, специфичным по отношению к аро(а). "Второе средство" означает второе терапевтическое соединение по настоящему изобретению (например, второй антисмысловой олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а)), и/или терапевтическое соединение отличное от аро(а).
"Нейтрализация" или "деинтенсификация" или "уменьшение интенсивности" относится к уменьшению по меньшей мере одного индикатора, признака или симптома ассоциированной болезни, расстройства или заболевания. Тяжесть индикаторов можно определить с помощью субъективных и объективных мер, которые известны специалистам в данной области техники.
"Животное" соответствует человеку или животному, отличному от человека, в том числе, но без ограничения ими, мышам, крысам, кроликам, собакам, кошкам, свиньям и приматам, в том числе, но без ограничения ими, обезьянам и шимпанзе.
"Антитело" соответствует молекуле, которая характеризуется специфичным взаимодействием с антигеном таким способом, где каждое антитело и антиген определено в терминах другого. Антитело может относиться к полной молекуле антитела или любому его фрагменту или области, такой как тяжелая цепь, легкая цепь, область Fab и область Fc.
"Антисмысловая активность" означает заметную или измеримую активность, обусловленную гибридизацией антисмыслового соединения со своей нуклеиновой кислотой-мишенью. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловая активность представляет собой уменьшение количества или экспрессии нуклеиновой кислоты-мишени или протеина, кодируемого такой нуклеиновой кислотой-мишенью.
"Антисмысловое соединение" означает олигомерное соединение, которое способно вступать в гибридизацию с нуклеиновой кислотой-мишенью с помощью водородных связей. Примеры антисмысловых соединений содержат одноцепочечные и двухцепочечные соединения, такие как, антисмысловые олигонуклеотиды, siRNA, shRNA, snoRNA, miRNA и сателлитные повторы. Как используют в данном документе, термин "антисмысловое соединение" охватывает фармацевтически приемлемые производные соединений, описанных в данном документе.
"Антисмысловое ингибирование" означает снижение уровней нуклеиновой кислоты-мишени или уровней протеина-мишени в присутствии антисмыслового соединения, комплементарного нуклеиновой кислоте-мишени по сравнению с уровнями нуклеиновой кислоты-мишени или уровнями протеина-мишени при отсутствии антисмыслового соединения.
"Антисмысловой олигонуклеотид" означает одноцепочечный олигонуклеотид, имеющий последовательность нуклеиновых оснований, которая делает возможной гибридизацию соответствующей области или сегмента нуклеиновой кислоты-мишени. Как используют в данном документе, термин "антисмысловой олигонуклеотид" охватывает фармацевтически приемлемые производные соединений, описанных в данном документе.
"Аро(а)" означает любую нуклеиновую кислоту или белковую последовательность, кодирующую аро(а). Например, в отдельных вариантах реализации настоящего изобретения аро(а) содержит последовательность DNA, кодирующую аро(а), последовательность RNA, транскрибируемую из DNA, кодирующей аро(а) (в том числе геномных DNA, содержащей интроны и экзоны), последовательность mRNA, кодирующую аро(а) или последовательность, кодирующую пептид аро(а).
"Нуклеиновая кислота аро(а)" означает любую нуклеиновую кислоту, которая кодирует аро(а). Например, в отдельных вариантах реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота аро(а) содержит последовательность DNA, кодирующую аро(а), последовательность RNA, транскрибируемую из DNA, кодирующей аро(а) (в том числе геномной DNA, содержащей интроны и экзоны) и последовательность mRNA, кодирующую аро(а).
"mRNA аро(а)" означает mRNA, кодирующую протеин аро(а).
"Протеин аро(а)" означает любую белковую последовательность, кодирующую Аро(а).
"Аро(а)-специфичный ингибитор" соответствует любому средству, способному специфично ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты аро(а) и/или протеина аро(а). Например, аро(а)-специфичный ингибитор содержит нуклеиновые кислоты (в том числе антисмысловые соединения), пептиды, антитела, малые молекулы и другие средства, способные ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты аро(а) и/или протеина аро(а). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения с помощью специфичного модулирования экспрессии нуклеиновой кислоты аро(а) и/или экспрессии протеина аро(а), аро(а)-специфичный ингибитор может влиять на другие компоненты системы транспорта липидов, в том числе компоненты ниже по потоку. Аналогичным образом, в отдельных вариантах реализации настоящего изобретения аро(а)-специфичные ингибиторы могут влиять на другие молекулярные процессы в организме животного.
"Атеросклероз" означает артериосклероз, затрагивающий большие и средние артерии и характеризующийся наличием жировых отложений. Жировые отложения называются "атеромы" или "бляшки", которые состоят в основном из холестерина и других жиров, кальция и рубцовой ткани, и повреждают оболочку артерий.
"Бициклический сахар" означает фуранозильное кольцо, модифицированное мостиком из двух атомов. Бициклический сахар является модифицированным сахаром.
"Бициклический нуклеозид" (либо BNA) означает нуклеозид, который имеет остаток сахара, содержащий мостик, соединяющий два атома углерода кольца сахара, тем самым образуя бициклическую кольцевую систему. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения мостик соединяет углерод 4' и углерод 2' кольца сахара.
"Структура кэпа" или "концевой остаток кэпа" означает химические модификации, которые содержатся на любом конце антисмыслового соединения.
"Сердечно-сосудистое заболевание" или "сердечно-сосудистое расстройство" относится к группе заболеваний, связанных с сердцем, кровеносными сосудами или циркуляцией. Примеры сердечно-сосудистых болезней содержат, но без ограничения ими, аневризму, стенокардию, аритмию, атеросклероз, болезни сосудов головного мозга (удар), ишемическую болезнь сердца, гипертензию, дислипидемию, гиперлипидемию, гипертриглицеридемию и гиперхолестеринемию.
"Химически индивидуальная область" относится к области антисмыслового соединения, которая является в некотором роде химически отличной от другой области того же антисмыслового соединения. Например, область, которая имеет 2'-O-метоксиэтилнуклеотиды, является химически отличной от области, которая имеет нуклеотиды без модификации 2'-O-метоксиэтилом.
"Гибридное антисмысловое соединение" означает антисмысловое соединение, которое имеет по меньшей мере две химически различные области.
"Холестерин" представляет собой молекулу стерина, обнаруживаемую в клеточных мембранах всех тканей животных. Холестерин должен переноситься в плазме крови животного с помощью липопротеинов, в том числе липопротеинов очень низкой плотности (VLDL), липопротеидов средней плотности (IDL), липопротеинов низкой плотности (LDL) и липопротеинов высокой плотности (HDL). "Холестерин плазмы" соответствует сумме всех липопротеинов (VDL, IDL, LDL, HDL) этерифицированного и/или этерифицированного холестерина, присутствующего в плазме или сыворотке.
"Ингибитор поглощения холестерина" означает средство, которое ингибирует всасывание экзогенного холестерина, полученного из питания.
"Совместное введение" означает введение индивидууму двух или более средств. Два или более средств могут быть в одной фармацевтической композиции или могут быть в виде отдельных фармацевтических композиций. Каждое из двух или более средств может быть введено с помощью одинаковых или различных путей введения. Совместное введение охватывает параллельное или последовательное введение.
"Комплементарность" означает способность к спариванию между нуклеиновыми основаниями первой нуклеиновой кислоты и второй нуклеиновой кислоты. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения комплементарность между первой и второй нуклеиновыми кислотами может быть между двумя нитями DNA, между двумя нитями RNA или между нитями DNA и RNA. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения некоторые из нуклеотидов в одной нити совпадают с комплементарным, в соответствии с образованием водородных связей, основанием на другой нити. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения все из нуклеотидов на одной нити совпадают с комплементарными, в соответствии с образованием водородных связей, основаниями другой нити. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение, а вторая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту-мишень. В отдельных подобных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловой олигонуклеотид представляет собой первую нуклеиновую кислоту, а нуклеиновая кислота-мишень представляет собой вторую нуклеиновую кислоту.
3
"Этил с ограниченной конформационной свободой" или "cEt" соответствует бициклическому нуклеозиду, который имеет фуранозный сахар, содержащий мостик метил(метиленокси) (4'-СН(СН)-O-2') между атомами углерода 4' и 2'.
3
"Этилнуклеозид с ограниченной конформационной свободой" (либо нуклеозид cEt) означает нуклеозид, который содержит бициклический остаток сахара, содержащий мостик 4'-СН(СН)-O-2'.
"Смежные нуклеиновые основания" означают нуклеиновые основания в непосредственной близости друг к другу.
"Перекрестно-реагирующий" означает, что олигомерное соединение, специфичное по отношению к одной последовательности нуклеиновой кислоты, может гибридизоваться с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, в некоторых случаях антисмысловой олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а) человека, может перекрестно реагировать с аро(а) другого вида. Не смотря на то, что олигомерное соединение перекрестно реагирует с последовательностью нуклеиновой кислоты не так, как это задумано, мишень зависит от степени комплементарности соединения, которую имеет с последовательностью, отличной от последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Чем выше комплементарность между олигомерным соединением и нуклеиновой кислотой, отличной от нуклеиновой кислоты-мишени, более вероятно, что олигомерное соединение будет перекрестно реагировать с нуклеиновой кислотой.
"Лечение" означает способ, который восстанавливает здоровье или предписанное лечение в случае болезни.
"Ишемическая болезнь сердца (CHD)" означает сужение мелких кровеносных сосудов, снабжающих кровь и кислород к сердцу, что часто является результатом атеросклероза.
"Дезоксирибонуклеотид" означает нуклеотид, который имеет водород в 2' положении остатка сахара нуклеотида. Дезоксирибонуклеотиды могут быть модифицированы любым из множества заместителей.
"Сахарный диабет" или "диабет" представляет собой синдром, характеризующийся расстроенным метаболизмом и аномально высоким уровнем сахара в крови (гипергликемией) в результате недостаточного уровня инсулина или снижения чувствительности к инсулину. Характерными симптомами являются чрезмерное производство мочи (полиурия) за счет высоких уровней глюкозы в крови, чрезмерная жажда и повышенное потребления жидкости (полидипсии), которые приводят к компенсированию повышенного мочеиспускания, нарушения зрения, в связи с высокими влияниями глюкозы крови на оптику глаза, необъяснимая потеря веса и вялость.
"Диабетическая дислипидемия" или "диабет 2-го типа с дислипидемией" означает заболевание, которое характеризуется сахарным диабетом 2-го типа, снижением HDL-C, повышенными триглицеридами (ТГ) и повышенными маленькими, плотными частицами LDL.
"Разбавитель" означает ингредиент в композиции, которая испытывает недостаток фармакологической активности, но фармацевтически необходимый или желателен. Например, разбавитель в инъектируемой композиции может представлять собой жидкость, например, солевой раствор.
"Дислипидемия" относится к расстройству липидного и/или липопротеинового метаболизма, в том числе перепроизводства или дефицита липида и/или липопротеина. Дислипидемии могут проявляться с помощью повышения липидов, таких как хиломикрон, холестерин и триглицериды, а также липопротеины, такие как липопротеины низкой плотности (LDL).
"Единица дозирования" означает форму, в которой фармацевтическое средство обеспечивают, например, пилюли, таблетки или другую единицу дозирования, известную в данной области. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения единица дозирования представляет собой пробирку, которая содержит лиофилизированный антисмысловой олигонуклеотид. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения единица дозирования представляет собой пробирку, которая содержит восстановленный антисмысловой олигонуклеотид.
"Доза" означает указанное количество фармацевтического средства, обеспеченного в отдельном введении или в течение определенного периода времени. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения доза может быть введена в виде одного, двух или более болюсов, таблеток или инъекций. Например, в отдельных вариантах реализации настоящего изобретения, если желательно подкожное введение, а желаемая доза требует объем, который не так легко разместить с помощью одной инъекции, то для достижения требуемой дозы могут быть использованы две или более инъекций. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения фармацевтическое средство вводят с помощью инфузии в течение длительного периода времени или непрерывно. Дозы могут быть выражены в качестве количества фармацевтического средства за час, день, неделю или месяц. Дозы могут быть выражены как мг/кг или г/кг.
"Эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" означает количество активного фармацевтического средства, достаточное для осуществления желаемого физиологического результата у индивидуума, нуждающегося в средстве. Эффективное количество может варьироваться между отдельными людьми в зависимости от здоровья и физического состояния человека, которого лечат, таксономической группы лиц, которых лечат, состава композиции, оценки состояния здоровья индивида и других соответствующих факторов.
"Полностью комплементарный" или "100% комплементарный" означает, что каждое нуклеиновое основание из последовательности нуклеиновых оснований первой нуклеиновой кислоты имеет комплементарное ему нуклеиновое основание во второй последовательности нуклеиновых оснований второй нуклеиновой кислоты. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения первая нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение, а вторая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеиновую кислоту-мишень.
"Фуранозил" означает структуру, которая содержит 5-членное кольцо, содержащее четыре атома углерода и один атом кислорода.
"Гэпмер" означает гибридное антисмысловое соединение, в котором внутренняя область, имеющая множество нуклеозидов, которые поддерживают расщепление RNaзой H, расположено между внешними областями, имеющими один или несколько нуклеозидов, при том что нуклеозиды содержат внутреннюю область, химически отличную от нуклеозида или нуклеозидов, которые содержат внешние регионы. Внутренняя область может упоминаться как "разрыв", а внешние области могут упоминаться как "концы".
"С увеличенным разрывом" означает гибридное антисмысловое соединение, которое имеет сегмент разрыва из 12 или более смежных 2'-дезоксирибонуклеотидов, расположенных между и в непосредственной близости к сегментам 5' и 3' конца, которые имеют от одного до шести нуклеозидов.
"Глюкоза" является моносахаридом, который используют с помощью клеток в качестве источника энергии и промежуточного продукта воспаления. "Глюкоза в плазме" соответствует глюкозе, которая присутствует в плазме.
"Высокая плотность липопротеина-С" или "HDL-C" означает уровень холестерина, связанного с частицами липопротеинов высокой плотности. Концентрация HDL-C в сыворотке крови (или плазме), как правило, количественно определяют в мг/дл или нмоль/л. "HDL-C в сыворотке" и "HDL-C в плазме" означает HDL-C в сыворотке крови и плазмы, соответственно.
"Ингибитор HMG-CoA редуктазы" означает средство, которое действует через ингибирование фермента HMG-CoA-редуктазы, такое как аторвастатин, розувастатин, флувастатин, ловастатин, правастатин и симвастатин.
"Гибридизация" означает ренатурацию комплементарных молекул нуклеиновых кислот. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения комплементарные молекулы нуклеиновых кислот содержат антисмысловое соединение и нуклеиновую кислоту-мишень.
"Гиперхолестеринемия" означает заболевание, характеризующееся повышенным уровнем холестерина или циркулирующего (в плазме) холестерина, LDL-холестерина и VLDL-холестерина, в соответствии с рекомендациями Expert Panel Report National Cholesterol Educational Program (NCEP) of Detection, Evaluation of Treatment касательно высокого уровня холестерина у взрослых (смотри, Arch. Int. Med. (1988) 148, 36-39).
"Гиперлипидемия" или "гиперлипемия" является заболеванием, характеризующимся повышенными липидами в сыворотке или циркулирующими липидами (в плазме). Это заболевание проявляет аномально высокую концентрацию жиров. Липидные фракции в циркулирующей крови представляют собой холестерин, липопротеины низкой плотности, липопротеины очень низкой плотности, хиломикроны и триглицериды. Классификация гиперлипидемий по Фредриксону основана на структуре TG и липопротеиновых частицы богатых на холестерин, что измеряют с помощью электрофореза или ультрацентрифугированием и обычно используют для определения основных причин гиперлипидемий, таких как гипертриглицеридемия (Fredrickson и Lee, Circulation, 1965, 31:321-327; Fredrickson et al., New Eng J Med, 1967, 276 (1): 34-42).
"Гипертриглицеридемия" означает заболевание, которое характеризуется повышенными уровнями триглицерида. Этиология содержит первичные (т.е. генетические причины) и вторичные (другие лежащие в основе причины, такие как диабеты, метаболический синдром/инсулинорезистентность, ожирение, отсутствие физической активности, курение, избыток алкоголя и диета с очень высоким содержанием углеводов) факторы или, чаще всего, комбинация обоих (Yuan et al. CMAJ, 2007, 176:1113-1120).
"Идентификация" или "выбор животного с метаболическим или сердечно-сосудистым заболеванием" означает определение или выбор пациента, склонного к, или имеющего, диагнозу метаболического заболевания, сердечно-сосудистого заболевания или метаболического синдрома; или, идентификация или выбор пациента, который имеет любой симптом метаболического заболевания, сердечно-сосудистого заболевания или метаболического синдрома, в том числе, но без ограничения ими, гиперхолестеринемии, гипергликемии, гиперлипидемии, гипертриглицеридемии, инсулинорезистентности, вызванной гипертонии, снижения чувствительности к инсулину, массы тела выше нормальной и/или содержания жира выше нормального или их любую комбинацию. Такая идентификация может быть выполнена любым способом, который включает, но без ограничения ими, стандартные клинические тесты или оценки, такие как измерения холестерина в сыворотке или циркулирующего (в плазме) холестерина, измерения глюкозы в сыворотке или глюкозы, циркулирующей (в плазме) в крови, измерения триглицеридов в сыворотке или триглицеридов, циркулирующих (в плазме) в крови, измерение кровяного давления, измерение содержания жира, измерение массы тела и подобные.
"Улучшенный сердечно-сосудистый результат" означает снижение возникновения неблагоприятных сердечно-сосудистых осложнений или их риска. Примеры неблагоприятных сердечно-сосудистых событий содержат, но без ограничения ими, смерть, повторный инфаркт, инсульт, кардиогенный шок, отек легких, остановку сердца и предсердную аритмию.
"В непосредственной близости" означает отсутствие промежуточных элементов между непосредственно примыкающими элементами, например, между областями, сегментами, нуклеотидами и/или нуклеозидами.
"Повышение HDL" или "рост HDL" означает повышение уровня HDL у животного после введения по меньшей мере одного соединения по настоящему изобретению, по сравнению с уровнем HDL у животного, которому не вводили никакого соединения.
"Индивидуум", "пациент" или "животное" означает человека или отличного от человека животного, выбранного для лечения или терапии.
"Индивидуум, нуждающийся в этом" соответствует человеку или отличному от человека животного, выбранному для лечения или терапии, который нуждается в таком лечении или терапии.
"Индуцирование", "ингибирование", "усиление действия", "повышение", "увеличение", "уменьшение", "снижение" или подобное обозначает количественные различия между двумя состояниями. Например, "количество, эффективное для ингибирования активности или экспрессии аро(а)" означает, что уровень активности или экспрессии аро(а) в обработанном образце будет отличаться от уровня активности или экспрессии аро(а) в необработанном образце. Такие термины применяют к, например, уровням экспрессии и уровням активности.
"Воспалительное заболевание" соответствует болезни, болезненному состоянию, синдрому или другому состоянию, к которому приводит воспаление. Например, ревматоидный артрит и фиброз печени являются воспалительными заболеваниями. Другие примеры воспалительных заболеваний содержат сепсис, ишемию миокарда/реперфузионное повреждение, респираторный дистресс-синдром у взрослых, нефрит, отторжение трансплантата, воспалительное заболевание кишечника, рассеянный склероз, артериосклероз, атеросклероз и васкулит.
"Ингибирование экспрессии или активности" соответствует снижению или блокировке экспрессии или активности RNA или протеина и, необязательно, указывает на полную ликвидацию экспрессии или активности.
"Инсулинорезистентность" определяют как заболевание, в котором нормальные количества инсулина являются недостаточными для получения нормальной инсулиновой реакции от жировых, мышечных и печеночных клеток. Инсулинорезистентность в жировых клетках приводит к гидролизу запасенных триглицеридов, что поднимает свободные жирные кислоты в плазме крови. Инсулинорезистентность в мышцах снижает поглощение глюкозы, в то время как резистентность к инсулину в печени уменьшает хранение глюкозы, причем оба эффекта служат для повышения глюкозы в крови. Высокие уровни инсулина и глюкозы в плазме, в связи с резистентностью к инсулину, часто приводят к метаболическому синдрому и сахарному диабету 2-го типа.
"Чувствительность к инсулину" является мерой того, насколько эффективно индивидуум перерабатывает глюкозу. Индивидуум, имеющий высокую чувствительность к инсулину, перерабатывает глюкозу, тогда как индивидуум с низкой чувствительностью к инсулину перерабатывает глюкозу неэффективно.
"Межнуклеозидная связь" относится к химической связи между нуклеозидами.
"Внутривенное введение" означает введение в вену.
"Связанные нуклеозиды" означают смежные нуклеозиды, которые связаны между собой.
"Гиполипидемия" означает снижение одного или более липидов (например, LDL, VLDL) у пациента. "Гиперлипидемия" означает увеличение липида (например, HDL) у пациента. Гиполипидемия или гиперлипидемия могут наблюдаться при одной или нескольких дозах в течение времени.
"Гиполипидемическая терапия" или "гиполипидемическое средство" означает терапевтический режим, обеспечиваемый пациенту для того, чтобы снизить один или несколько липидов у пациента. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения гиполипидемическую терапию обеспечивают для того, чтобы снизить один или несколько из аро(а), СЕТР, ароВ, общего холестерина, LDL-C, VLDL-C, IDL-C, non-HDL-C, триглицеридов, небольших плотных частиц LDL и Lp(a) у пациента. Примеры гиполипидемической терапии содержат, но без ограничения ими, ингибиторы ароВ, статины, фибраты и ингибиторы МТР.
"Липопротеин", такой как VLDL, LDL и HDL, соответствует группе протеинов, обнаруженных в сыворотке, плазме и лимфе и играет важную роль в транспорте липидов. Химическая композиция каждого липопротеина отличается, например, тем, что HDL, по сравнению с липидом, имеет более высокую долю протеина, в то время как VLDL, по сравнению с липидом, имеет меньшую долю протеина.
"Lp(a)" содержит аро(а) и LDL-подобную частицу, которая содержит ароВ. Аро(а) связывается с ароВ с помощью дисульфидной связи.
"Липопротеины низкой плотности-холестерин (LDL-C)" означает холестерин, который переносят в частицах липопротеинов низкой плотности. Концентрацию LDL-C в сыворотке (или плазме), как правило, количественно определяют в мг/дл или нмоль/л. "LDL-C в сыворотке" и "LDL-С в плазме" означает LDL-C в сыворотке и в плазме, соответственно.
"Основные факторы риска" соответствуют тем факторам, которые способствуют высокому риску конкретной болезни или заболевания. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения основные факторы риска ишемической болезни сердца содержат, без ограничения, курение, гипертонию, высокий уровень LDL, низкий уровень HDL-C, семейный анамнез заболеваний сердечно-сосудистой системы, возраст и другие факторы, описанные в данном документе.
"Метаболическое расстройство" или "метаболическая болезнь" соответствует заболеванию, которое характеризуется изменением или нарушением метаболической функции. "Метаболический" и "метаболизм" представляют собой термины, хорошо известные в данной области техники и, как правило, содержат целый ряд биохимических процессов, протекающих в живом организме. Нарушения обмена веществ содержат, но без ограничения ими, гипергликемию, преддиабеты, диабеты (1-го типа и 2-го типа), ожирение, инсулинорезистентность, метаболический синдром и дислипидемию вследствие диабета 2-го типа.
"Метаболический синдром" означает заболевание, которое характеризуется кластеризацией липидов и нелипидных сердечно-сосудистых факторов риска метаболического происхождения. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения метаболический синдром определяют присутствием любого из 3 следующих факторов: окружности талии более 102 см у мужчин или больше 88 см у женщин; триглицериды в сыворотке по меньшей мере 150 мг/дл; HDL-C менее 40 мг/дл у мужчин или менее 50 мг/дл у женщин; кровяное давление по меньшей мере 130/85 мм рт. ст.; и уровень глюкозы в крови натощак по меньшей мере ПО мг/дл. Эти детерминанты могут быть легко измерены в клинической практике (JAMA, 2001, 285: 2486-2497).
"Несоответствие" или "некомплементарное нуклеиновое основание" соответствует случаю, когда олигонуклеотид из первой нуклеиновой кислоты не способен образовать пару с соответствующим нуклеиновым основанием второй нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты-мишени.
"Смешанная дислипидемия" означает заболевание, которое характеризуется повышенным холестерином и повышенными триглицеридами.
"Модифицированная межнуклеозидная связь" относится к замещению или любому изменению встречающейся в природе межнуклеозидной связи (т.е. фосфодиэфирной межнуклеозидной связи). Например, тиофосфатная связь представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.
"Модифицированное нуклеиновое основание" соответствует любому нуклеиновому основанию, кроме аденина, цитозина, гуанина, тимидина или урацила. Например, 5-метилцитозин представляет собой модифицированное нуклеиновое основание. "Немодифицированное нуклеиновое основание" означает пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G) и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U).
"Модифицированный нуклеозид" означает нуклеозид, который имеет по меньшей мере один модифицированный остаток сахара и/или модифицированное нуклеиновое основание.
"Модифицированный нуклеотид" означает нуклеотид, который имеет по меньшей мере один модифицированный остаток сахара, модифицированную межнуклеозидную связь и/или модифицированное нуклеиновое основание.
"Модифицированный олигонуклеотид" означает олигонуклеотид, который содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.
"Модифицированный сахар" соответствует замещению или изменению по сравнению с природным сахаром. Например, модифицированный 2'-O-метоксиэтилом сахар представляет собой модифицированный сахар.
"Нуклеозид МОЕ" означает нуклеозид, содержащий 2'-замещенный остаток сахара, который содержит МОЕ в 2'-положении.
"Мотив" означает образец химически индивидуальных областей в антисмысловом соединении.
"Встречающаяся в природе межнуклеозидная связь" означает фосфодиэфирную связь между 3' и 5'.
"Природный остаток сахара" означает сахар, который присутствует в DNA (2'-Н) или RNA (2'-ОН).
"Нуклеиновая кислота" соответствует молекулам, состоящим из мономерных нуклеотидов. Нуклеиновая кислота содержит рибонуклеиновые кислоты (RNA), дезоксирибонуклеиновые кислоты (DNA), одноцепочечные нуклеиновые кислоты (ssDNA), двухцепочечные нуклеиновые кислоты (dsDNA), малые интерферирующие рибонуклеиновые кислоты (siRNA) и microRNA (miRNA). Нуклеиновая кислота может также содержать любую комбинацию этих элементов в одной молекуле.
"Нуклеиновое основание" означает гетероциклический остаток, способный образовывать пару с основанием другой нуклеиновой кислоты.
"Комплементарность нуклеинового основания" соответствует нуклеиновому основанию, которое способно образовывать пару с другой нуклеиновой кислотой. Например, в DNA, аденин (А) комплементарен тимину (Т). Например, в RNA, аденин (А) комплементарен урацилу (U). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения комплементарное нуклеиновое основание относится к нуклеиновому основанию антисмыслового соединения, которое способно образовывать пару оснований с нуклеиновым основанием его нуклеиновой кислоты-мишени. Например, если нуклеиновое основание в определенном положении антисмыслового соединения способно к образованию водородных связей с нуклеиновым основанием в определенном положении нуклеиновой кислоты-мишени, то олигонуклеотид и нуклеиновая кислота-мишень, как полагают, являются комплементарными в этой паре нуклеиновых оснований.
"Последовательность нуклеиновых оснований" означает порядок смежных нуклеиновых оснований, независимых от любого сахара, связи или модификации нуклеинового основания.
"Нуклеозид" означает нуклеиновое основание, связанное с сахаром.
"Миметик нуклеозида" содержит в себе те структуры, которые используют для замены сахара или сахара и основания, и, не обязательно, связь в одной или нескольких позициях олигомерного соединения; например миметики нуклеозидов, которые имеют морфолиновые, циклогексенильные, циклогексильные, тетрагидропиранильные, бициклические или трициклические миметики сахара, такие как не-фуранозные единицы сахара.
"Нуклеотид" означает нуклеозид, который имеет фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида.
"Миметик нуклеотида" содержит те структуры, используемые для замены нуклеозида и связь в одном или нескольких положениях олигомерного соединения, такие как, например, пептидные нуклеиновые кислоты или морфолины (морфолины, соединенные -N(H)-C(=O)-O- или другой связью, отличной от фосфодиэфирной).
"Олигомерное соединение" или "олигомер" означает полимер из связанных мономерных субъединиц, которые способны к гибридизации с областью молекулы нуклеиновой кислоты. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения олигомерные соединения представляют собой олигонуклеозиды. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения олигомерные соединения представляют собой олигонуклеотиды. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения олигомерные соединения представляют собой антисмысловые соединения. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения олигомерные соединения представляют собой антисмысловые олигонуклеотиды. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения олигомерные соединения представляют собой гибридные олигонуклеотиды.
"Олигонуклеотид" означает полимер из связанных нуклеозидов, каждый из которых может быть модифицированным или немодифицированным независимо друг от друга.
"Парентеральное введение" означает введение с помощью инъекции или инфузии. Парентеральное введение содержит подкожное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, внутриартериальное введение, внутрибрюшинное введение или внутричерепное введение, например, интратекальное или интрацеребровентрикулярное введение. Введение может быть непрерывным, хроническим, коротким или периодическим.
"Пептид" означает молекулу, образованную путем соединения с помощью амидных связей по меньшей мере двух аминокислот. Пептид относится к полипептидам и протеинам.
"Фармацевтическое средство" означает вещество, которое обеспечивает терапевтический эффект при введении индивидууму. Например, в отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловой олигонуклеотид, направленный на аро(а), представляет собой фармацевтическое средство.
"Фармацевтическая композиция" или "композиция" означает смесь веществ, подходящих для введения индивидууму. Например, фармацевтическая композиция может содержать одно или несколько активных средств и фармацевтический носитель, например, стерильный водный раствор.
"Фармацевтически приемлемый носитель" означает среду или разбавитель, которые не нарушают структуру соединения. Некоторые из таких носителей позволяют фармацевтическим композициям быть составленными в виде, например, таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, взвесей, суспензий и пастилок для перорального введения пациенту. Некоторые из таких носителей позволяют фармацевтическим композициям быть составленными в виде инъекции, инфузии или инъекции для местного введения. Например, фармацевтически приемлемый носитель может быть стерильным водным раствором.
"Фармацевтически приемлемое производное" охватывает производные соединений, описанных в данном документе, такие как сольваты, гидраты, сложные эфиры, пролекарства, полиморфы, изомеры, меченные изотопами варианты, фармацевтически приемлемые соли и другие производные, известные в данной области техники.
"Фармацевтически приемлемые соли" означает физиологически и фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, напр., соли, которые сохраняют желаемую биологическую активность исходного соединения и не придают ему нежелательные токсикологические эффекты. Термин "фармацевтически приемлемая соль" или "соль" содержит соль, полученную из фармацевтически приемлемых нетоксичных кислот или оснований, в том числе неорганических или органических кислот и оснований. "Фармацевтически приемлемые соли" соединений, описанных в данном документе, могут быть получены с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Для обзора фармацевтически приемлемых солей см. Stahl и Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002). Могут быть использованы и хорошо подходят для терапевтического введения людям натриевые соли антисмысловых олигонуклеотидов. Соответственно, в отдельном варианте реализации настоящего изобретения соединения, описанные в данном документе, существуют в форме натриевой соли.
"Тиофосфатная связь" означает связь между нуклеозидами, при том что фосфодиэфирную связь модифицируют с помощью замены одного из немостиковых атомов кислорода атомом серы. Тиофосфатная связь (P=S) представляет собой модифицированную межнуклеозидную связь.
"Сегмент" означает определенное количество последовательных (т.е. связанных) нуклеиновых оснований нуклеиновой кислоты. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения часть представляет собой определенное количество последовательных нуклеотидов нуклеиновой кислоты-мишени. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения сегмент представляет собой определенное количество последовательных нуклеотидов антисмыслового соединения.
"Профилактика" или "предотвращение" соответствует запаздыванию или предупреждению начала или развития болезни, расстройства или состояния в течение периода времени от нескольких минут до бесконечности. Профилактика также означает снижение риска развития болезни, расстройства или состояния.
"Пролекарство" означает терапевтическое средство, которое готовят в неактивной форме, превращающейся в активную форму (т.е. лекарственное средство) в организме или его клетках под действием эндогенных ферментов или других химических веществ или условий.
"Повышение" означает увеличение количества. Например, повышение уровней HDL в плазме означает увеличение количества HDL в плазме.
"Снижение" означает снижение до меньшей степени, размера, количества, или числа. Например, снижение уровня триглицеридов в плазме означает, снижение количества триглицеридов в плазме.
"Область" или "область-мишень" определяют как сегмент нуклеиновой кислоты-мишени, которая имеет по меньшей мере одну идентифицируемую структуру, функцию или характеристику. Например, область мишень может охватывать 3 'UTR, 5' UTR, экзон, интрон, переход экзон/интрон, кодирующую область, область инициации трансляции, область терминации трансляции или другую определенную область нуклеиновой кислоты. Структурно определенные области в случае аро(а) могут быть получены с помощью номера доступа из баз данных последовательностей, таких как NCBI, а такая информация содержится в данном документе в виде ссылки. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения область мишень может содержать в себе последовательность от сайта-мишени 5' одного сегмента-мишени в пределах области-мишени до 3' сайта-мишени другого сегмента-мишени в области-мишени.
"Рибонуклеотид" означает нуклеотид, который имеет гидроксильную группу в положении 2' сахарной части нуклеотида. Рибонуклеотиды могут быть модифицированы любым из множества заместителей.
"Второе средство" или "второе терапевтическое средство" означает средство, которое может быть использовано в сочетании с "первым средством". Второе терапевтическое средство может содержать, но без ограничения ими, антисмысловые олигонуклеотиды, специфичные по отношению к аро(а) или ароВ. Второе средство может также содержать анти -аро(а) антитела, пептидные ингибиторы аро(а), понижающие уровень холестерина средства, гиполипидемические средства, средства, понижающие глюкозу и противовоспалительные средства.
"Сегменты" определяют как небольшие субфрагменты областей в пределах нуклеиновой кислоты. Например, "сегмент-мишень" означает последовательность нуклеотидов нуклеиновой кислоты-мишени, на которое действуют одно или несколько антисмысловых соединений. "Сайт-мишень 5"' соответствует крайнему 5' нуклеотиду сегмента-мишени. "Сайт-мишень 3"' соответствует крайнему 3' нуклеотиду сегмента-мишени. Кроме того, "начальный сайт" может относиться к крайнему 5' нуклеотиду сегмента-мишени, а "сайт остановки" относится к крайнему 3' нуклеотиду сегмента-мишени. Сегмент-мишень может также начинаться на "начальном сайте" последовательности и заканчиваться на "сайте остановки" другой последовательности.
"Укороченные" или "усеченные" версии антисмысловых олигонуклеотидов или нуклеиновых кислот-мишеней, описанных в данном документе, имеют один, два или несколько удаленных нуклеозидов.
"Побочные эффекты" означают физиологические реакции, относящиеся к лечению, отличные от желаемого эффекта. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения побочные эффекты содержат реакции в месте инъекции, отклонения от нормы печеночной пробы, отклонения от нормы почечной функции, гепатотоксичность, нефротоксичность, отклонения от нормы центральной нервной системы, миопатии и недомогание. Например, увеличенные уровни аминотрансфераз в сыворотке могут указывать на гепатотоксичность или отклонение от нормы функции печени. Например, увеличенный билирубин может указывать на гепатотоксичность или отклонение от нормы функции печени.
"Одноцепочечный олигонуклеотид" означает олигонуклеотид, который не гибридизован с комплементарной цепью.
"Специфично поддающийся гибридизации" относится к антисмысловому соединению, которое имеет достаточную степень комплементарности к нуклеиновой кислоте-мишени, чтобы индуцировать желаемый эффект во время экспонирования минимального влияния, или без влияния, на нуклеиновые кислоты, которые не являются мишенями, в условиях, когда специфичное связывание является желательным, то есть в физиологических условиях в случае in vivo анализов и терапевтических лечений.
"Статин" означает средство, которое ингибирует активность HMG-CoA-редуктазы.
"Подкожное введение" означает введение под кожу.
"Пациент" означает человека или не являющегося человеком животное, выбранное для лечения или терапии.
"Остаток сахара" означает встречающийся в природе остаток сахара или модифицированный остаток сахара нуклеозида.
"Симптом сердечно-сосудистой болезни или расстройства" означает явление, которое возникает из-за, и сопровождает, сердечно-сосудистую болезнь или расстройства и служит его признаком. Например, стенокардия; боль в груди; одышка; сердцебиение; слабость; головокружение; тошнота; потливость; тахикардия; брадикардия; аритмия; мерцательная аритмия; отек нижних конечностей; цианоз; усталость; обморок; онемение лица; онемение конечностей; хромота или спазмы мышц; вздутие живота; или лихорадка являются симптомами сердечно-сосудистой болезни или расстройства.
"Специфичный по отношению к" или "направленный на" означает способ создания и выбора антисмыслового соединения, которое специфично гибридизуется с нуклеиновой кислотой-мишенью и вызывает желаемый эффект.
"Нуклеиновая кислота-мишень," "RNA-мишень" и "транскрипт RNA-мишени", все они относятся к нуклеиновой кислоте, способной быть мишенью антисмысловых соединений.
"Терапевтически эффективное количество" означает количество фармацевтического средства, которое обеспечивает индивидууму терапевтический эффект.
"Терапевтическое изменение образа жизни" означает изменения питания и образа жизни, направленные для снижения жира/массы жировой ткани и/или холестерина. Такое изменение может снизить риск развития сердечных заболеваний и может содержать рекомендации для диетического потребления общего количества ежедневных калорий, жира, насыщенных жиров, полиненасыщенных жиров, мононенасыщенных жиров, углеводов, белков, холестерина, нерастворимых волокон, а также рекомендации по физической активности.
"Лечить" или "лечение" соответствуют введению соединения, описанного в данном документе для влияния на изменение или улучшение в случае болезни, расстройства или состояния.
"Триглицерид" или "TG" означает липид или нейтральный жир, состоящий из глицерина в сочетании с тремя молекулами жирной кислоты.
"Диабет 2-го типа" (также известный как "сахарный диабет 2-го типа", "сахарный диабет, тип 2", "инсулиннезависимый диабет", "NIDDM", "связанный с ожирением диабет" или "диабет зрелого возраста") является метаболическим расстройством, которое в первую очередь характеризуется резистентностью к инсулину, относительной недостаточностью инсулина и гипергликемией.
"Немодифицированный нуклеотид" означает нуклеотид, который состоит из встречающихся в природе нуклеиновых оснований, сахарных остатков и межнуклеозидных связей. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения немодифицированный нуклеотид представляет собой нуклеотид RNA (напр. β-D-рибонуклеозиды) или нуклеотид DNA (напр., β-D-дезоксирибонуклеозид).
"Концевой сегмент" означает один или множество нуклеозидов, модифицированных для того, чтобы предать олигонуклеотиду таких свойств, как, например, усиление ингибиторной активности, увеличенную аффинность связывания в случае нуклеиновой кислоты-мишени или устойчивость к разрушению нуклеазами in vivo.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединения и способы уменьшения экспрессии mRNA аро(а) и протеина. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения соединение представляет собой аро(а)-специфичный ингибитор для лечения, предотвращения или уменьшения интенсивности болезни, связанной с аро(а). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а).
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединения и способы уменьшения уровней Lp(a). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения соединение представляет собой аро(а)-специфичный ингибитор для лечения, предотвращения или уменьшения интенсивности болезни, связанной с аро(а). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а).
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), который состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из от 15 до 30, от 18 до 24, от 19 до 22, от 13 до 25, от 14 до 25, от 15 до 25 связанных нуклеозидов. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по крайней мере 22, по крайней мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29 или 30 связанных нуклеозидов. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), содержащему по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных нуклеиновых кислот, комплементарных сегменту любой из SEQ ID NO: 1-4 эквивалентной длины. Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению сегменту аро(а), который содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, или 20 смежных нуклеиновых оснований, комплементарных сегменту эквивалентной длины любого из сегментов-мишеней, приведенных в Таблицах 3-13 и 28-30. В таблицах, "начальный сайт" относится к крайнему 5' нуклеотиду сегмента-мишени и "сайт остановки" относится к крайнему 3' нуклеотиду сегмента-мишени. Сегмент-мишень может изменяться в диапазоне от начального сайта до сайта остановки каждой последовательности, указанной в таблицах. Кроме того, сегмент-мишень может изменяться в диапазоне от начального сайта одной последовательности до конца в сайте остановки в другой последовательности. Например, как приведено в Таблице 5, сегмент-мишень может изменяться в диапазоне 3901-3920, от начального сайта до сайта остановки SEQ ID NO: 58. В другом примере, как приведено в Таблице 5, сегмент-мишень может изменяться в диапазоне 3900-3923, от начального сайта SEQ ID NO: 57 до сайта остановки SEQ ID NO: 61.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), при том что последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% комплементарна к любой из SEQ ID NO: 1-4. Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), при том что последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида на по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или 100% комплементарна любому из сегментов-мишеней, приведенных в Таблицах 3-13 и 28-30.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), который состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и который содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит сегмент из по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований, комплементарных эквивалентной длине сегмента нуклеиновых оснований от 3901 до 3920 SEQ ID NO: 1, при том что последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида на по крайней мере 80% комплементарна SEQ ID NO: 1.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), который состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и который содержит последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19, по меньшей мере 20, по меньшей мере 21, по меньшей мере 22, по меньшей мере 23, по меньшей мере 24, по меньшей мере 25, по меньшей мере 26, по меньшей мере 27, по меньшей мере 28, по меньшей мере 29 или 30 смежных нуклеиновых оснований, комплементарных эквивалентной длине части нуклеиновых оснований от 3900 до 3923 SEQ ID NO: 1, при том что последовательность нуклеиновых оснований модифицированного олигонуклеотида на по крайней мере 80% комплементарна SEQ ID NO: 1.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), состоящий из 12 до 30 связанных нуклеозидов и имеющий последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных нуклеиновых основания в любой из последовательностей нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 12-130, 133, 134. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований любой из последовательностей нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 12-130, 133, 134.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), который состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований любой из последовательностей нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 12-20, 22-33, 35-44, 47-50, 51, 53,57-62, 65-66, 68, 70-79, 81, 85-86, 89-90, 92-94, 97, 105-110, 103-104, 133-134.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), который состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований любой из последовательностей нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 12-19, 26-30, 32, 35, 38-44, 46-47, 50, 57-58, 61, 64-66, 68, 72-74, 76-77, 92-94, 103-110.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), который состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований любой из последовательностей нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 111, 114-121, 123-129.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), который состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований любой из последовательностей нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 14, 17, 18, 26-28, 39, 71, 106-107.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), который состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований любой из последовательностей нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 14, 26-29, 39-40, 82.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), который состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований любой из последовательностей нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 14, 16-18.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), который состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований любой из последовательностей нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 26-27,107.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), который состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований любой из последовательностей нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 28-29, 39-40, 47.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), который состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований любой из последовательностей нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 28, 93, 104, 134.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), который состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и который имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 11, по меньшей мере 12, по меньшей мере 13, по меньшей мере 14, по меньшей мере 15, по меньшей мере 16, по меньшей мере 17, по меньшей мере 18, по меньшей мере 19 или 20 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 58.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированный олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований последовательности нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 58.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), при том что модифицированный олигонуклеотид является одноцепочечным.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), при том что по меньшей мере одна межнуклеозидная связь является модифицированной межнуклеозидной связью. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), при том что по меньшей мере один нуклеозид содержит модифицированное нуклеиновое основание. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин.
2
n
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), при том что модифицированный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один модифицированный сахар. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированный сахар представляет собой бициклический сахар. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированный сахар содержит 2'-O-метоксиэтил, этил с ограниченной конформационной свободой, 3'-фтор-HNA или мостик 4'-(СН)-O-2', где n составляет 1 или 2.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), при том что модифицированный олигонуклеотид состоит из от 12 до 30 связанных нуклеозидов и содержит: (а) сегмент разрыва, который состоит из связанных дезоксирибонуклеозидов; (b) 5'-концевой сегмент, который состоит из связанных нуклеозидов; (с) 3'-концевой сегмент, который состоит из связанных нуклеозидов; и при этом сегмент разрыва располагают между 5'-концевым сегментом и 3'-концевым сегментом, при том что каждый нуклеозид каждого концевого сегмента содержит модифицированный сахар.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), при том что модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов и содержит: (а) сегмент разрыва, который состоит из десяти связанных дезоксирибонуклеозидов; (b) 5'-концевой сегмент, который состоит из пяти связанных нуклеозидов; (с) 3'-концевой сегмент, который состоит из пяти связанных нуклеозидов; и при этом сегмент разрыва располагают между 5'-концевым сегментом и 3'-концевым сегментом, причем каждый нуклеозид каждого концевого сегмента содержит 2'-O-метоксиэтилсахар, при том что каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь и при этом каждый остаток цитозина представляет собой 5-метилцитозин.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), при том что модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов и имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований любой из SEQ ID NO: 12-130, 133, 134, причем модифицированный олигонуклеотид содержит: (а) сегмент разрыва, который состоит из десяти связанных дезоксирибонуклеозидов; (b) 5'-концевой сегмент, который состоит из пяти связанных нуклеозидов; (с) 3'-концевой сегмент, который состоит из пяти связанных нуклеозидов; и при этом сегмент разрыва располагают между 5'-концевым сегментом и 3'-концевым сегментом, при том что каждый нуклеозид каждого концевого сегмента содержит 2'-O-метоксиэтилсахар, причем каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь и при этом каждый остаток цитозина представляет собой 5-метилцитозин.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), при том что модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов и имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая содержит по меньшей мере 8 смежных нуклеиновых оснований из SEQ ID NO: 58, при том что модифицированный олигонуклеотид содержит: (а) сегмент разрыва состоит из десяти связанных дезоксирибонуклеозидов; (b) 5'-концевой сегмент, который состоит из пяти связанных нуклеозидов; (с) 3'-концевой сегмент, который состоит из пяти связанных нуклеозидов; и при этом сегмент разрыва располагают между 5'-концевым сегментом и 3'-концевым сегментом, при том что каждый нуклеозид каждого концевого сегмента содержит 2'-O-метоксиэтилсахар, причем каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь и при этом каждый остаток цитозина представляет собой 5-метилцитозин.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), при том что модифицированный олигонуклеотид состоит из 20 связанных нуклеозидов с последовательность нуклеиновых оснований SEQ ID NO: 58, при том что модифицированный олигонуклеотид содержит: (а) сегмент разрыва, который состоит из десяти связанных дезоксирибонуклеозидов; (b) 5'-концевой сегмент, который состоит из пяти связанных нуклеозидов; (с) 3'-концевой сегмент, который состоит из пяти связанных нуклеозидов; и при этом сегмент разрыва располагают между 5'-концевым сегментом и 3'-концевым сегментом, при том что каждый нуклеозид каждого концевого сегмента содержит 2'-O-метоксиэтилсахар, причем каждая межнуклеозидная связь представляет собой тиофосфатную связь и при этом каждый остаток цитозина представляет собой 5-метилцитозин.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения соединение находится в форме соли. В дополнительных вариантах реализации настоящего изобретения соединение дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения соединение, которое содержит модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), или его соль и фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают композицию, которая содержит соединение, как описано в данном документе, при том что степень вязкости соединения составляет менее 40 сантипуаз (сП). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения, как описано в данном документе, являются эффективными в силу того, что имеют вязкость менее чем 40 сП, менее чем 35 сП, менее чем 30 сП, менее чем 25 сП, менее чем 20 сП или менее чем 15 сП, при измерении параметров, как описано в Примере 13.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают композиции и способы для применения в терапии для лечения заболеваний, расстройств или состояний, связанных с аро(а). Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают композиции и способы для применения в терапии для лечения заболеваний, расстройств или состояний, связанных с Lp(a). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения композиция представляет собой соединение, которое содержит аро(а)-специфичный ингибитор. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения аро(а)-специфичный ингибитор представляет собой нуклеиновую кислоту. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения нуклеиновая кислота представляет собой антисмысловое соединение. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловое соединение представляет собой модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированный олигонуклеотид, специфичный по отношению к аро(а), используют при лечении, предотвращении, замедлении прогрессирования, уменьшении интенсивности сердечно-сосудистого и/или метаболического болезни, расстройства или состояния. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения композиции и способы терапии содержат введение аро(а)-специфичного ингибитора индивидууму, нуждающемуся в этом.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают композиции и способы снижения уровней аро(а). Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают композиции и способы снижения уровней Lp(a). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения снижение уровней аро(а) в тканях, органе или у пациента улучшает отношение LDL к HDL или отношение TG к HDL.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают композиции и способы предотвращения, лечения, запаздывания, замедления прогрессирования и/или уменьшения интенсивности болезней, расстройств и заболеваний, связанных аро(а), у пациента, нуждающегося в этом. Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают композиции и способы предотвращения, лечения, запаздывания, замедления прогрессирования и/или уменьшения интенсивности болезней, расстройств и заболеваний, связанных Lp(a), у пациента, нуждающегося в этом. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения подобные болезни, расстройства и заболевания содержат воспалительные, сердечно-сосудистые и/или метаболические болезни, расстройства и заболевания. Некоторые такие сердечно-сосудистые болезни, расстройства или заболевания содержат, но без ограничения ими, аневризму (например, аневризму брюшной аорты), стенокардию, аритмию, атеросклероз, болезнь сосудов головного мозга, коронарную болезнь сердца, ишемическую болезнь сердца, дислипидемию, гиперхолестеринемию, гиперлипидемию, гипертензию, гипертриглицеридемию, инфаркт миокарда, заболевание периферических сосудов (например, заболевание периферических артерий, окклюзионную болезнь периферических артерий), ретинальную окклюзию сосудов или инсульт. Некоторые такие метаболические болезни, нарушения или заболевания содержат, но без ограничения ими, гипергликемию, преддиабет, сахарный диабет (тип I и тип II), ожирение, резистентность к инсулину, метаболический синдром и диабетическую дислипидемию. Некоторые такие воспалительные болезни, расстройства или заболевания содержат, но без ограничения ими, коронарную болезнь сердца (CAD), болезнь Альцгеймера и тромбоэмболические болезни, расстройства или заболевания. Некоторые тромбоэмболические болезни, расстройства или заболевания содержат, но без ограничения ими, инсульт, тромбоз (например, венозный тромбоз), инфаркт миокарда и заболевание периферических сосудов.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают способ снижения по меньшей мере одного симптома сердечно-сосудистой болезни, расстройства или заболевания. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения симптомы содержат, но без ограничения ими, стенокардию, боль в груди, одышку, сердцебиение, слабость, головокружение, тошноту, потливость, тахикардию, брадикардию, аритмию, мерцательную аритмию, отеки нижних конечностях, цианоз, усталость, обмороки, онемение лица, онемение конечностей, хромоту или спазмы мышц, вздутие живота и лихорадку.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модуляция экспрессии аро(а) или Lp(a) происходит в клетке, ткани или органа. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модуляция происходит в клетке или ткани у животного. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модуляция представляет собой снижение уровня mRNA аро(а). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модуляция представляет собой снижение уровня протеина аро(а). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения снижают уровни mRNA аро(а) и протеина. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модуляция представляет собой снижение уровня Lp(a). Такое уменьшение может происходить в зависимости от времени или дозозависимо.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения пациент или животное является человеком.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения соединение вводят парентерально. В дополнительных вариантах реализации настоящего изобретения парентеральное введение является подкожным.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения соединение вводят совместно со вторым средством или терапией. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения второе средство представляет собой глюкозопонижающее средство. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения второе средство представляет собой LDL, TG или холестерин-понижающее средство. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения второе средство представляет собой противовоспалительное средство. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения второе средство представляет собой лекарственное средство против болезни Альцгеймера. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения второе средство может представлять собой, но без ограничения ими, нестероидное противовоспалительное лекарственное средство (NSAID напр., аспирин), ниацин (напр., Niaspan), никотиновую кислоту, ингибитор ароВ (напр., Mipomersen), ингибитор СЕТР (напр., Anacetrapib), ингибитор аро(а), аналоговый тироидного гормона (напр., Eprotirome), ингибитор HMG-CoA-редуктазы (напр., статин), фибрат (напр., Gemfibrozil) и ингибитор микросомального протеина передачи триглицеридов (напр., Lomitapide). Терапия может представлять собой, но без ограничения им, аферез Lp(a). Средства или терапии могут вводить совместно или параллельно. Средства или терапии могут вводить последовательно или последовательно.
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают использование соединения, направленного на аро(а), для уменьшения уровней аро(а) у животного. Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают использование соединения, направленного на аро(а), для уменьшения уровней Lp(a) у животного. Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают использование соединений, направленных на аро(а), для лечения, профилактики или уменьшения интенсивности болезни, расстройства или заболевания, связанного с аро(а). Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают использование соединений, направленных на аро(а) для лечения, профилактики или уменьшения интенсивности болезни, расстройства или заболевания, связанного с Lp(a).
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают использование соединения, направленного на аро(а), при получении лекарственного препарата для уменьшения уровней аро(а) у животного. Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают использование соединения, направленного на аро(а), при получении лекарственного препарата для уменьшения уровней Lp(a) у животного. Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают использование соединения при получении лекарственного препарата для лечения, профилактики или уменьшения интенсивности болезни, расстройства или заболевания, связанного с аро(а). Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают использование соединения при получении лекарственного препарата для лечения, профилактики или уменьшения интенсивности болезни, расстройства или заболевания, связанного с Lp(a).
Отдельные варианты реализации настоящего изобретения обеспечивают набор для лечения, профилактики или уменьшения интенсивности болезни, расстройства или заболевания, как описано в данном документе, при том что набор содержит: (i) аро(а)-специфичный ингибитор, как описано в данном документе; и, необязательно, (ii) второе средство или терапию, как описано в данном документе.
Набор по настоящему изобретению может дополнительно содержать инструкции по использованию набора для лечения, профилактики или уменьшения интенсивности болезни, расстройства или заболевания, описанных в данном документе, в виде комбинированной терапии, как описано в данном документе.
Антисмысловые соединения
Олигомерные соединения содержат, но без ограничения ими, олигонуклеотиды, олигонуклеозиды, аналоги олигонуклеотида, миметики олигонуклеотидов, антисмысловые соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, microRNA и siRNA. Олигомерное соединение может быть "антисмысловым" к нуклеиновой кислоте-мишени, что означает то, что она способна вступать в гибридизацию нуклеиновой кислоты-мишени с помощью водородных связей.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловое соединение имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая, в направлении от 5' до 3', содержит обратный комплемент сегмента-мишени нуклеиновой кислоты-мишени, на который она направлена. В отдельных подобных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловой олигонуклеотид имеет последовательность нуклеиновых оснований, которая, в направлении от 5' до 3', содержит обратный комплемент сегмента-мишени нуклеиновой кислоты-мишени, на который она направлена.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту аро(а), содержит от 12 до 30 субъединиц в длину. Другими словами, подобные антисмысловые соединения содержат от 12 до 30 связанных субъединиц. В дополнительных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловое соединение имеет от 8 до 80, от 10 до 80, от 12 до 50, от 15 до 30, от 18 до 24, от 19 до 22, от 13 до 25, от 14 до 25 или от 15 до 25 связанных субъединиц. В отдельных подобных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения имеют 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 связанных субъединиц в длину или диапазон определяется любыми двумя из указанных выше значений. В отдельных подобных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения имеют 8 связанных субъединиц в длину. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловое соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения связанные субъединицы представляют собой нуклеозиды.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловое соединение содержит укороченный или усеченный модифицированный олигонуклеотид. Укороченный или усеченный модифицированный олигонуклеотид может иметь один или несколько нуклеозидов, удаленных от 5 'конца (5' усечение), один или несколько нуклеозидов, удаленных от 3'конца (3' усечение) или один или несколько нуклеозидов, удаленных из центральной части. С другой стороны, удаленные нуклеозиды могут быть рассредоточены по всему модифицированному олигонуклеотиду, например, в антисмысловом соединении, имеющем один нуклеозид, удаленный с 5' конца, и один нуклеозид, удаленный с 3' конца.
Когда один дополнительный нуклеозид присутствует в удлиненном олигонуклеотиде, дополнительный нуклеозид может быть расположен в центральной части, на 5' или 3' конце олигонуклеотида. Когда присутствуют два или более дополнительных нуклеозидов, добавленные нуклеозиды могут быть рядом друг с другом, например, в олигонуклеотиде, который имеет два нуклеозида, добавленных к центральной части, к концу 5' (5' присоединение) или, альтернативно, к 3' концу (3' присоединение) олигонуклеотида. С другой стороны, добавленные нуклеозиды могут быть рассредоточены по всему антисмысловому соединению, например, по олигонуклеотиду, который имеет один нуклеозид, добавленный к 5'-концу, и одну субъединицу, добавленную к 3'-концу.
Можно увеличивать или уменьшать длину антисмыслового соединения, такого как антисмысловой олигонуклеотид и/или вводить несовпадающие основания без устранения активности. Например, у Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), серии антисмысловых олигонуклеотидов из 13-25 нуклеиновых оснований в длину проверяют на их способность индуцировать расщепление RNA-мишени в модели инъекции ооцитов. Антисмысловые олигонуклеотиды из 25 нуклеиновых оснований в длину, с 8 или 11 несовпадающими основаниями у концов антисмысловых олигонуклеотидов, могут направлять специфичное расщепление mRNA-мишени, хоть и в меньшей степени, чем антисмысловые олигонуклеотиды, которые не содержат несоответствия. Аналогичным образом, специфичное к мишени расщепление достигают с помощью антисмысловых олигонуклеотидов с 13 нуклеиновыми основаниями, в том числе с 1 или 3 несоответствиями.
Gautschi et al. (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001) демонстрируют способность олигонуклеотида, который имеет 100% комплементарности к bcl-2 mRNA и имеет 3 несоответствия с bcl-xL mRNA, к снижению экспрессии и bcl-2, и bcl-xL in vitro и in vivo. Кроме того, этот олигонуклеотид проявляет потенциальную противоопухолевую активность in vivo.
Maher и Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358,1988) исследовали серию антисмысловых олигонуклеотидов из 14 спаренных нуклеиновых оснований 28 и 42 нуклеиновых оснований, которые состоят из последовательности из двух или трех спаренных антисмысловых олигонуклеотидов, соответственно, на их способность к задержке трансляции DHFR человека в анализе ретикулоцитов кролика. Каждый из трех антисмысловых олигонуклеотидов из 14 нуклеиновых оснований отдельно может ингибировать трансляцию, хоть и на более скромном уровне, чем антисмысловые олигонуклеотиды из 28 или 42 нуклеиновых оснований.
Мотивы антисмыслового соединения
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту аро(а), имеют химически модифицированные субъединицы, организованные в паттерны или мотивы, чтобы придать антисмысловым соединениям такие свойства, как усиленную ингибирующую активность, увеличенную аффинность связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью или устойчивость к деградации нуклеазами in vivo.
Гибридные антисмысловые соединения, как правило, содержат по меньшей мере одну область, модифицированную таким образом, чтобы придать повышенную устойчивость к деградации нуклеазами, увеличение клеточного поглощения, увеличение аффинности связывания с нуклеиновой кислотой-мишенью и/или увеличение ингибирующей активности. Вторая область гибридного антисмыслового соединения может, необязательно, служить в качестве подложки для клеточной эндонуклеазы РНКазы Н, которая расщепляет RNA-нити RNA:DNA-дуплекса.
3
Антисмысловые соединения, которые имеют гэпмерный мотив, представляют собой рассматриваемые гибридные антисмысловые соединения. В гэпмере внутренняя область, которая имеет множество нуклеотидов, поддерживающих расщепление РНКазой Н, расположена между внешними регионами, имеющими множество нуклеотидов, которые химически отличаются от нуклеозидов внутренней области. В случае антисмыслового олигонуклеотида, который имеет гэпмерный мотив, сегмент разрыва, как правило, служит в качестве субстрата для расщепления эндонуклеазой, в то время как концевые сегменты содержат модифицированные нуклеозиды. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения области гэпмера дифференцируют по видам остатков сахар, которые входят в каждую отдельную область. Типы остатков сахара, которые используют, чтобы дифференцировать области гэпмера, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения могут содержать β-D-рибонуклеозиды, β-D-деоксирибонуклеозиды, 2'-модифицированные нуклеозиды (подобные 2'-модифицированные нуклеозиды могут содержать 2'-МОЕ и 2'-O-СН, в частности) и модифицированные бициклическим сахаром нуклеозиды (подобные модифицированные бициклическим сахаром нуклеозиды могут содержать те, которые имеют мостик 4'-(СН2)n-O-2', где n=1 или n=2). Предпочтительно, каждая отдельная область содержит одинаковые остатки сахара. Мотив конец-разрыв-конец часто описывают как "X-Y-Z", где "X" представляет длину 5'-концевой области, "Y" представляет длину области разрыва, a "Z" представляет длину 3'-концевой области. Как используют в данном документе, гэпмер, описанный в виде "X-Y-Z", имеет такую конформацию, что сегмент разрыва располагается в непосредственной близости к каждому 5'-концевому и 3'-концевому сегменту. Таким образом, не существует никаких промежуточных нуклеотидов между 5'-концевым сегментом и сегментом разрыва или сегментом разрыва и 3'-концевым сегментом. Любое из антисмысловых соединений, описанных в данном документе, может иметь гэпмерный мотив. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения X и Ζ являются одинаковыми; в отличных вариантах реализации настоящего изобретения они являются отличными. В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения Y имеет от 8 до 15 нуклеотидов. X, Y или Ζ могут иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 или более нуклеотидов. Так, гэпмеры содержат, но без ограничения ими, например, 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-12-2, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 6-8-6, 5-8-5, 1-8-1, 2-6-2, 2-13-2, 1-8-2, 2-8-3, 3-10-2, 1-18-2 или 2-18-2.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловое соединение, такое как "концевой" мотив, имеет конформацию конец-разрыв или разрыв-конец, напр. конформацию Χ-Υ или Υ-Ζ, как описано выше в случае конформации гэпмера. Так, конформации концевого мотива содержат, но без ограничения ими, например, 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13 или 5-13.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту аро(а), имеют гэпмерный мотив 5-10-5.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту аро(а), имеет расширенный разрывом мотив.
Нуклеиновые кислоты-мишени, области-мишени и последовательности нуклеотидов
Последовательности нуклеотидов, которые кодируют последовательность-мишень аро(а), содержат, без ограничения, следующие: регистрационный номер GENBANK ΝΜ_005577.2, который содержится в данном документе в виде SEQ ID NO: 1; регистрационный номер GENBANK NT_007422.12, усеченный из нуклеотидов от 3230000 до 3380000, который содержится в данном документе в виде SEQ ID NO: 2; регистрационный номер GENBANK NT_025741.15, который усечен из нуклеотидов от 65120000 до 65258000, созданный в данном документе в виде SEQ ID NO: 3; и регистрационный номер GENBANK NM_005577.1, который содержится в данном документе в виде SEQ ID NO: 4.
Понятно, что последовательность, изложенная в каждом № SEQ ID в Примерах, которые содержатся в настоящем документе, не зависит от любых модификаций в остатке сахара, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. Как таковые, антисмысловые соединения, определенные с помощью № SEQ ID, могут содержать, независимо друг от друга, одну или несколько модификаций в остатке сахара, межнуклеозидной связи или нуклеинового основания. Антисмысловые соединения, описанные с помощью Isis Number (номер Isis), означают комбинацию последовательности нуклеиновых оснований и мотива.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения "область-мишень" представляет собой структурно опрелеленную область нуклеиновой кислоты-мишени. Например, область-мишень может охватывать 3' UTR, 5' UTR, экзон, интрон, точка сплайсинга, кодирующую область, область инициации трансляции, область терминации трансляции или другую определенную область нуклеиновой кислоты. Структурно определенные области в случае аро(а) могут быть получены с помощью номера доступа из баз данных последовательностей, таких как NCBI, а такая информация содержится в данном документе в виде ссылки. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения область-мишень может включать в себя последовательность от 5' сайта-мишени одного сегмента-мишени в пределах области-мишени до 3' сайта-мишени другого сегмента-мишени в пределах той же области-мишени.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения "сегмент-мишень" является более малым, субфрагментом области-мишени в пределах нуклеиновой кислоты. Например, сегмент-мишень может быть последовательностью нуклеотидов нуклеиновой кислоты-мишени, на которую направлены одно или несколько антисмысловых соединений. "Сайт-мишень 5"' соответствует крайнему 5' нуклеотиду сегмента-мишени. "Сайт-мишень 3"' соответствует крайнему 3' нуклеотиду сегменту-мишени.
Область-мишень может содержать один или несколько сегментов-мишеней. Несколько сегментов-мишеней в пределах области-мишени могут перекрываться. Альтернативно, они могут не перекрываться. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения сегменты-мишени в пределах области-мишени разделяют не более чем около 300 нуклеотидов. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения сегменты-мишени в пределах области-мишени разделяют с помощью количества нуклеотидов, которое составляет, около, не более чем, не более чем около, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10 нуклеотидов в нуклеиновой кислоте-мишени, или представляет собой диапазон, который определяют с помощью любых двух из предшествующих значений. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения сегменты-мишени в пределах области-мишени разделяют с помощью не более чем, или не более чем около, 5 нуклеотидов в нуклеиновой кислоте-мишени. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения сегменты-мишени являются смежными. Предполагаемыми являются области-мишени, определенные в диапазоне, который имеет исходную нуклеиновую кислоту, которая представляет собой любой из 5' сайтов-мишеней или 3' сайтов-мишеней, приведенных в данном документе.
Направленное воздействие содержит в себе определение, по меньшей мере, одного сегмента-мишени, к которому антисмысловое соединение гибридизуется таким образом, что возникает желаемый эффект. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения желаемый эффект представляет собой снижение уровней нуклеиновой кислоты-мишени mRNA. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения желаемый эффект представляет собой снижение уровней протеина, кодируемых с помощью нуклеиновой кислоты-мишени, или фенотипическое изменение, связанное с нуклеиновой кислотой-мишенью.
Подходящие сегменты-мишени можно найти в пределах 5 'UTR, кодирующей области, в 3' UTR, интрона, экзона, или точке сплайсинга. Сегменты-мишени, которые содержат инициирующий кодон или стоп-кодон, также представляют собой подходящие сегменты-мишени. Подходящий сегмент-мишень может специально исключать определенную структурно определенную область, например, инициирующий кодон или стоп-кодон.
Определение подходящих сегментов-мишеней может содержать сравнение последовательности нуклеиновой кислоты-мишени с другими последовательностями по всему геному. Например, алгоритм BLAST могут использовать для идентификации областей сходства различных нуклеиновых кислот. Это сравнение может предотвратить выбор последовательностей антисмысловых соединений, которые могут гибридизовать неспецифическим путем с отличной от выбранной нуклеиновой кислоты-мишени (т.е. последовательности не-мишени или вне последовательности-мишени).
Возможно изменение в активности (напр., как определено с помощью процентного снижения уровней нуклеиновой кислоты-мишени) антисмысловых соединений в пределах активной области-мишени. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения снижения уровней mRNA аро(а) могут свидетельствовать об ингибировании экспрессии аро(а). Снижения уровней протеина аро(а) могут свидетельствовать об ингибировании экспрессии mRNA-мишени. Кроме того, фенотипические изменения могут свидетельствовать об ингибировании экспрессии аро(а). Например, увеличение уровней HDL, уменьшение уровней LDL, уменьшение уровней холестерина или уменьшение уровней триглицеридов находятся среди фенотипических изменений, которые могут быть оценены в случае ингибирования экспрессии аро(а). Также могут быть оценены другие фенотипические признаки, напр., симптомы, связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями; например, стенокардия; боль в груди; одышка; сердцебиение; слабость; головокружение; тошнота; потливость; тахикардия; брадикардия; аритмия; мерцательная аритмия; отеки на нижних конечностях; цианоз; усталость; обмороки; онемение лица; онемение конечностей; хромота или судороги мышц; вздутие живота; или лихорадка.
Гибридизация
В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения гибридизация происходит между антисмысловым соединением, описанным в данном документе, и нуклеиновой кислотой аро(а). Наиболее распространенный механизм гибридизации содержит образование водородной связи (например, уотсонкриковское, хугстиновское или обратное хугстиновское спаривание) между комплементарными нуклеиновыми основаниями молекул нуклеиновых кислот.
Гибридизация может происходить в различных условиях. Жесткие условия являются последовательность-зависимыми и определяются природой и композицией молекул нуклеиновых кислот, которые будут гибридизоваться.
rd
Способы определения того, является ли последовательность специфично гибридизуемой нуклеиновой кислотой-мишенью, хорошо известны в данной области техники (Sambrooke и Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3 Ed., 2001). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения, обеспечиваемые в данном документе, являются специфически гибридизуемыми нуклеиновой кислотой аро(а).
Комплементарностъ
Антисмысловое соединение и нуклеиновая кислота-мишень являются комплементарными друг другу, если достаточное количество нуклеиновых оснований антисмыслового соединения может образовывать водородную связь с соответствующими нуклеиновыми основаниями нуклеиновой кислоты-мишени, так, чтобы наблюдался желаемый эффект (например, антисмысловое ингибирование нуклеиновой кислотой-мишенью, такой как нуклеиновая кислота аро(а)).
Некомплементарные нуклеиновые основания между антисмысловым соединением и нуклеиновой кислотой аро(а) можно допустить при условии, что антисмысловое соединение остается в состоянии специфично гибридизоваться с нуклеиновой кислотой-мишенью. Кроме того, антисмысловое соединение может гибридизоваться в одном или нескольких таких сегментах нуклеиновой кислоты аро(а), что промежуточные или смежные сегменты не участвуют в случае гибридизации (например, петлеобразная структура, несоответствие или шпилечная структура).
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения, обеспечиваемые в данном документе, или их определенная часть, являются, или являются по меньшей мере, на 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарными нуклеиновой кислоте аро(а), области-мишени, сегменту-мишени или определенной ее части. Процент комплементарности антисмыслового соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью может быть определен с помощью стандартных способов.
Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеиновых основания антисмыслового соединения являются комплементарными к области-мишени, и, следовательно, могут специфично гибридизоваться, может представлять 90 процентов комплементарности. В этом примере, остальные некомплементарные нуклеиновые кислоты могут быть сгруппированными или рассеянными с комплементарными нуклеиновыми основаниями и не должны быть смежными друг с другом или с комплементарными нуклеиновыми основаниями. Таким образом, антисмысловое соединение, которое представляет собой 18 нуклеиновых оснований в длину, имеющее 4 (четыре) некомплементарные нуклеотидные основания, которые окружены двумя областями с полной комплементарностью с нуклеиновой кислотой-мишенью, будут иметь 77,8% общей комплементарности с нуклеиновой кислотой-мишенью и, таким образом, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения с областью нуклеиновой кислоты-мишени может быть определен обычным способом с использованием программ BLAST (средство поиска основного локального выравнивания) и программ PowerBLAST, известных в данной области техники (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410; Zhang и Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). Процент гомологии, идентичность последовательности или комплементарность могут быть определены, например, с помощью программы Gap(Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 8 для Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), используя настройки по умолчанию, которые используют алгоритм Smith и Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489).
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения, обеспечиваемые в данном документе, или их определенные части являются полностью комплементарными (напр., на 100% комплементарны) нуклеиновой кислоте-мишени или ее определенной части. Например, антисмысловое соединение может быть полностью комплементарным к нуклеиновой кислоте аро(а), или области-мишени, или сегменту-мишени, или его последовательности-мишени. Как используют в данном документе, "полностью комплементарный" означает каждое нуклеиновое основание антисмыслового соединения, способное к точному образованию пары оснований с соответствующими нуклеиновыми основаниями нуклеиновой кислоты-мишени. Например, антисмысловое соединение из 20 нуклеиновых оснований, полностью комплементарных последовательности-мишени, которая имеет длину в 400 нуклеиновых оснований, при условии, что существует соответствующий сегмент нуклеиновой кислоты-мишени из 20 нуклеиновых оснований, который полностью комплементарен антисмысловому соединению. Полностью комплементарный также может быть использован по отношению к определенному сегменту первой и/или второй нуклеиновой кислоты. Например, сегмент из 20 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения из 30 нуклеиновых оснований может быть "полностью комплементарным" последовательности-мишени, которая имеет в длину 400 нуклеиновых оснований. Сегмент антисмыслового соединения из 20 нуклеиновых оснований из 30 нуклеиновых оснований полностью комплементарен последовательности-мишени, если последовательность-мишень имеет соответствующий сегмент из 20 нуклеиновых оснований, в котором каждое нуклеиновое основание комплементарно сегменту антисмыслового соединения из 20 нуклеиновых оснований. В то же время, антисмысловое соединение из 30 нуклеиновых оснований может быть полностью, или может быть не полностью, комплементарным последовательности-мишени, в зависимости от того, являются ли также остальные 10 нуклеиновых оснований антисмыслового соединения комплементарными последовательности-мишени.
Расположение некомплементарного нуклеоснования(ий) может быть на 5' конце или 3' конце антисмыслового соединения. С другой стороны, некомплементарный олигонуклеотид(ы) может быть во внутреннем положении антисмыслового соединения. Когда присутствуют две или более некомплементарные нуклеиновые кислоты, то они могут быть смежными (то есть связанными) или несмежными. В отдельном варианте реализации настоящего изобретения некомплементарное нуклеиновое основание расположено в концевом сегменте антисмыслового олигонуклеотида гэпмера.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения, которые имеют, или имеют до, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеиновых оснований в длину, содержат не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного нуклеинового основания(й), по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени, такой как нуклеиновая кислота аро(а), или ее определенному сегменту.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения, которые имеют, или имеют до, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеиновых оснований в длину, содержат не более 6, не более 5, не более 4, не более 3, не более 2 или не более 1 некомплементарного нуклеинового основания(й) по отношению к нуклеиновой кислоте-мишени, такой как нуклеиновая кислота аро(а), или ее определенному сегменту.
Антисмысловые соединения, обеспечиваемые в данном документе, также содержат те, которые являются комплементарными к сегменту нуклеиновой кислоты-мишени. Как используют в данном документе, "сегмент" соответствует определенному количеству смежных (т.е. связанных) нуклеиновых оснований в пределах области или сегмента нуклеиновой кислоты-мишени. "Сегмент" может также относиться к определенному количеству смежных нуклеиновых оснований антисмыслового соединения. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными к сегменту из по меньшей мере 8 нуклеиновых оснований сегмента-мишени. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными к сегменту из по меньшей мере 12 нуклеиновых оснований сегмента-мишени. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения являются комплементарными к сегменту из по меньшей мере 15 нуклеиновых оснований сегмента-мишени. Также рассматривают антисмысловые соединения, которые являются комплементарными к сегменту сегмента-мишени из по меньшей мере 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более нуклеиновых оснований или в диапазоне, определенном с помощью любых двух из этих значений.
Идентичность
Антисмысловые соединения, обеспечиваемые в данном документе, также могут иметь определенный процент идентичности с конкретной нуклеотидной последовательностью, SEQ ID NO, соединением, представленным с помощью определенного номера Isis, или его сегментом. Как используется в данном документе, антисмысловое соединение является идентичным последовательности, раскрытой в данном описании, если оно имеет такую же способность образовывать пару с нуклеиновым основанием. Например, RNA, которая содержит урацил вместо тимидина в раскрытой последовательности DNA, может быть рассмотрена как идентичная последовательности DNA, так как урацил и тимидин образуют пару с аденином. Также рассматриваются укороченные и удлиненные варианты антисмысловых соединений, описанных в данном документе, а также соединения, которые имеют неидентичные основания по сравнению с антисмысловыми соединениями, обеспечиваемыми в данном документе. Неидентичные основания могут быть смежными друг с другом или распределенными по всему антисмысловому соединению. Процент идентичности антисмыслового соединения рассчитывают в соответствии с количеством оснований, которые имеют одинаковое спаривание оснований по сравнению с последовательностью, с которой она сравнивается.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения или их сегменты на по меньшей мере 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны одному или нескольким антисмысловым соединениям, SEQ ID NO или их сегментам, раскрытым в данном документе.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения сегмент антисмыслового соединения сравнивают с сегментом нуклеиновой кислоты-мишени эквивалентной длины. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения сегмент из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеиновых оснований сравнивают с сегментом нуклеиновой кислоты-мишени эквивалентной длины.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения часть антисмыслового олигонуклеотида сравнивают с частью нуклеиновой кислоты-мишени эквивалентной длины. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения сегмент из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеиновых оснований сравнивают с сегментом нуклеиновой кислоты-мишени эквивалентной длины.
Модификации
Нуклеозид представляет собой комбинацию основание-сахар. Часть нуклеозида, нуклеиновое основание (также известное как основание), как правило, представляет собой остаток гетероциклического основания. Нуклеотиды представляют собой нуклеозиды, которые дополнительно содержат фосфатную группу, ковалентно связанную с сахарной частью нуклеозида. Для этих нуклеозидов, которые содержат пентофуранозный сахар, фосфатная группа может быть связана с 2', 3' или 5' гидроксильным остатком сахара. Олигонуклеотиды образуют путем ковалентного связывания смежных нуклеозидов друг к другу, чтобы образовать линейный полимерный олигонуклеотид. В структуре олигонуклеотида фосфатные группы, как правило, соответствуют образованию межнуклеозидных связей олигонуклеотида.
Изменения в антисмысловых соединениях охватывают замены или изменения в межнуклеозидных связях, остатках сахара или нуклеиновых основаниях. Модифицированные антисмысловые соединения часто являются более предпочтительными, чем нативные формы, ввиду желательных свойств, таких как, например, повышенное клеточное поглощение, повышенная аффинность к мишени нуклеиновой кислоты, повышенная стабильность в присутствии нуклеаз или увеличение ингибиторной активности.
Химически модифицированные нуклеозиды могут быть также использованы для увеличения аффинности связывания укороченного или усеченного антисмыслового олигонуклеотида с его нуклеиновой кислотой-мишенью. Следовательно, сравнимые результаты зачастую могут быть получены с более короткими антисмысловыми соединениями, которые имеют подобные химически модифицированные нуклеозиды.
Модифицированные межнуклеозидные связи
Встречающаяся в природе межнуклеозидная связь RNA и DNA представляет собой 3'-5' фосфодиэфирную связь. Антисмысловые соединения, которые имеют модифицированные один раз или более, т.е. не встречающиеся в природе, межнуклеозидные связи, часто выбирают из антисмысловых соединений, которые имеют встречающиеся в природе межнуклеозидные связи, из-за таких желательных свойств, как, например, повышенное клеточное поглощение, повышенная аффинность к нуклеиновой кислоте-мишени и увеличенная стабильность в присутствии нуклеаз.
Олигонуклеотиды, которые имеют модифицированные межнуклеозидные связи, содержат межнуклеозидные связи, которые сохраняют атом фосфора, а также межнуклеозидные связи, которые не имеют атом фосфора. Типичные фосфорсодержащие межнуклеозидные связи содержат, но без ограничения ими, фосфодиэфиры, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, фосфорамидат и фосфоротиоаты. Способы получения фосфорсодержащих и не фосфорсодержащих связей хорошо известны.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту аро(а), содержат одну или несколько модифицированных межнуклеозидных связей. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированные межнуклеозидные связи представляют собой тиофосфатные связи. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения каждая межнуклеозидная связь антисмыслового соединения представляет собой тиофосфатную межнуклеозидную связь.
Модифицированные остатки сахара
1
2
1
2
1
12
Антисмысловые соединения могут необязательно содержать один или несколько нуклеозидов, в которых сахарная группа была модифицирована. Такие модифицированные по сахару нуклеозиды по отношению к антисмысловым соединениям могут придавать повышенную устойчивость к нуклеазе, увеличенную аффинность связывания или некоторое другое полезное биологические свойство. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения нуклеозиды содержат химически модифицированные остатки рибофуранозных колец. Примеры химически модифицированных рибофуранозных колец содержат, без ограничения, добавление замещающих групп (в том числе 5' и 2' замещающих групп), связывание не-геминальных атомов кольца с образованием бициклических нуклеиновых кислот (BNA), замены атома кислорода рибозильного кольца на S, N(R) или (R)(R) (каждый R, R и R независимо представляет собой Н, алкил C-C или защитная группа) и их комбинации. Примеры химически модифицированных Сахаров содержат замещенный 2'-F-5'-метилнуклеозид (см. международную заявку РСТ WO 2008/101157, опубликованную 8/21/08, в случае других раскрытых замещенных 5',2'-бис-нуклеозидов) или замену атома кислорода рибозильного кольца на S с дальнейшей заменой по 2'-положению (см. опубликованную патентную заявку США 2005-0130923, опубликованную 16 июня 2005 г. ) или, альтернативно, 5'-замещение BNA (см. международную заявку РСТ WO 2007/134181, опубликованную 11/22/07, где LNA замещают, например, 5'-метил- или 5'-винильной группой).
3
2
3
2
2
2
2
3
1
10
3
2
2
2
3
2
2
m
n
2
m
n
2
1
2
2
m
n
1
m
n
1
10
Примеры нуклеозидов, которые имеют измененные сахарные группы, содержат, без ограничения, нуклеозиды, которые содержат 5'-винил, 5'-метил (R или S), 4'-S, 2'-F, 2'-ОСН, 2'-ОСНСН, 2'-OСНСНF и 2'-O(СН)OСН замещающие группы. Заместитель в положении 2' также может быть выбран из аллил, амино, азидо, тио, О-аллил, О-С-С алкил, OCF, OСНF, O(СН)SCH, O(СН)-O-N(R)(R), O-СН-C(=O)-N(R)(R) и O-СН-C(=O)-N(R)-(СН)-N(R)(R), где каждый R, R и R представляет собой, независимо, H или замещенный или незамещенный алкил С-С.
2
2
2
2
3
2
3
3
3
2
3
2
3
2
1
12
2
3
2
2
Как используют в данном документе, "бициклические нуклеозиды" соответствуют модифицированным нуклеозидам, которые содержат бициклический остаток сахара. Примеры бициклических нуклеозидов содержат, без ограничения, нуклеозиды, которые содержат мостик между атомами 4' и 2' рибозильных колец. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения, обеспечиваемые в данном документе, содержат один или несколько бициклических нуклеозидов, которые содержат мостик от 4' к 2'. Примеры подобных бициклических нуклеозидов с мостиком от 4' к 2' содержат, но без ограничения одной из формул: 4'-(СН)-O-2' (LNA); 4'-(СН)-S-2'; 4'-(СН)-O-2' (ENA); 4'-СН(СН)-O-2' и 4'-СН(СНОСН)-O-2' (и их аналоги, смотри патент США 7399845, опубликованный 15 июля 2008); 4'-С(СН)(СН)-O-2' (и их аналоги, смотри опубликованную международную заявку WO/2009/006478, опубликованную 8 января 2009); 4'-СН-N(OCH)-2' (и их аналоги, смотри опубликованную международную заявку WO/2008/150729, опубликованную 11 декабря 2008); 4'-СН-O-N(CH)-2' (смотри опубликованную заявку на патент США US2004-0171570, опубликованную 2 сентября 2004); 4'-СН-N(R)-O-2', где R представляет собой Н, алкил C-C или защищающую группу (смотри патент США 7427672, опубликованный 23 сентября 2008); 4'-СН-С(Н)(СН)-2' (смотри Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); и 4'-СН-C(=СН)-2' (и их аналоги, смотри опубликованную международную заявку WO 2008/154401, опубликованную 8 декабря 2008).
Дополнительные сообщения, связанные с бициклическими нуклеозидами, также могут быть найдены в опубликованной литературе (смотри, например: Singh et al, Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl Acad. Sci. U. S. Α., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc, 2007,129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; и Oram et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; патенты США №№6268490; 6525191; 6670461; 6770748; 6794499; 7034133; 7053207; 7399845; 7547684; и 7696345; заявку на патент США №US2008-0039618; US2009-0012281; патенты США №№60/989,574; 61/026,995; 61/026,998; 61/056,564; 61/086,231; 61/097,787; и 61/099,844; опубликованные международные заявки РСТ WO 1994/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/150729; WO 2008/154401; и WO 2009/006478. Может быть получен каждый из вышеупомянутых бициклических нуклеозидов, имеющих одну или более стереохимических конфигураций сахара, в том числе, например, α-L-рибофураноза и β-D-рибофураноза (смотри международную РСТ заявку PCT/DK98/00393, опубликованную 25 марта 1999 как W099/14226).
a
b
n
a
b
a
a
a
2
x
a
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения бициклические остатки сахара нуклеозидов BNA, содержат, но без ограничения ими, соединения, которые имеют по меньшей мере один мостик между 4' и 2' положениями пентафуранозильного фрагмента сахара, причем такие мосты независимо содержат от 1 или от 2 до 4 связанных групп, независимо выбранных из -[C(R)(R)]-, -C(R)=C(R)-, -C(R)=N-, -С(=O)-, -C(=NR)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R)-, -S(=O)- и -N(R);
где x представляет собой 0, 1, или 2;
n представляет собой 1, 2, 3, или 4;
a
b
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
5
7
5
7
1
1
2
1
3
1
2
1
1
каждый R и R представляют собой, независимо, Н, замещающую группу, гидроксил, алкил C-C, замещенный алкил C-C, алкенил C-C, замещенный алкенил С-С, алкенил C-C, замещенный алкенил C-C, арил С-С, замещенный арил С-С, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, гетероарил, замещенный гетероарил, алициклический радикал С-С, замещенный алициклический радикал С-С, галоген, OJ, NJJ, SJ, N, COOJ, ацил (C(=O)-H), замещенный ацил, CN, сульфонил (S(=O)-J) или сульфоксил (S(=O)-J); и
1
2
1
12
1
2
2
12
2
12
2
12
2
12
5
20
5
20
1
12
1
12
каждый J и J представляет собой, независимо, Н, алкил C-С, замещенный алкил C-С, С-C алкенил, замещенный алкенил C-C, алкенил C-C, замещенный алкенил C-C, арил С-С, замещенный арил С-С, ацил (С(=O)-Н), замещенный ацил, гетероциклический радикал, замещенный гетероциклический радикал, аминоалкил C-C, замещенный аминоалкил C-C или защищающая группа.
a
b
n
a
b
n
a
b
a
b
2
2
2
2
3
2
2
2
2
2
1
12
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения мостик бициклического остатка сахара представляет собой -[C(R)(R)]-, -[C(R)(R)]-O-, -C(RR)-N(R)-O- или -C(RR)-O-N(R)-. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения мостик представляет собой 4'-СН-2', 4'-(СН)-2', 4'-(СН)-2', 4'-СН-O-2', 4'-(СН)-O-2', 4'-СН-O-N(R)-2' и 4'-СН-N(R)-O-2'-, где каждый R представляет собой, независимо, Н, защищающую группу или алкил С-С.
2
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения бициклические нуклеозиды дополнительно определяют с помощью изомерной конформации. Например, нуклеозид, который содержит оксиметиленовый мостик 4'-2', может существовать в α-L-конформации или в β-D-конформации. Ранее, α-L-метиленокси (4'-СН-O-2') BNA были включены в антисмысловые олигонуклеотиды, которые демонстрируют антисмысловую активность (Frieden et al, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
2
2
2
2
2
2
3
2
2
2
3
2
3
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения бициклические нуклеозиды содержат, но без ограничения ими, (А) α-L-метиленокси (4'-СН-O-2') BNA, (В) β-D-метиленокси (4'-СН-O-2') BNA, (С) этиленокси (4'-(СН)-O-2') BNA, (D) аминоокси (4'-СН-O-N(R)-2') BNA, (Е) оксиамино (4'-СН-N(R)-O-2') BNA и (F) метил(метиленокси) (4'-СН(СН)-O-2') BNA, (G) метилен-тио (4'-СН-S-2') BNA, (Н) метилен-амино (4'-СН-N(R)-2') BNA, (I) карбоциклический метил (4'-СН-СН(СН)-2') BNA и (J) карбоциклический пропилен (4'-(СН)-2') BNA, как изображено ниже.
1
12
где Вх представляет собой остаток основания и R представляет собой, независимо, Н, защищающую группу или алкил C-C.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечивают бициклические нуклеозиды, которые имеют Формулу I:
где Вх представляет собой остаток гетероциклического основания;
a
b
c
2
c
2
c
2
2
c
2
c
c
2
-Q-Q-Q- представляет собой -СН-N(R)-СН-, -C(=O)-N(R)-СН-, -СН-O-N(R)-, -СН-N(R)-O- или -N(R)-O-СН;
c
1
12
R представляет собой C-C алкил или амино защищающую группу; и
а
b
каждый Т и Т независимо представляет собой Н, гидроксил защищающую группу, группу, содержащую сопряженные двойные связи, реакционно-способную фосфорную группу, остаток фосфора или ковалентное присоединение к иммобилизирующему носителю.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечивают бициклические нуклеозиды, которые имеют Формулу II:
где Вх представляет собой остаток гетероциклического основания;
а
b
каждый Т и Т независимо представляет собой Н, гидроксил защищающую группу, группу, содержащую сопряженные двойные связи, реакционно-способную фосфорную группу, остаток фосфора или ковалентное присоединение к иммобилизирующему носителю;
a
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
2
6
Z представляет собой алкил C-C, алкенил С-С, алкенил С-С, замещенный алкил С-С, замещенный алкенил С-С, замещенный алкенил С-С, ацил, замещенный ацил, замещенный амид, тиол или замещенный тио.
c
c
d
c
3
c
e
c
d
c
d
e
1
6
1
6
с
В отдельном варианте реализации настоящего изобретения каждая из замещенных групп представляет собой, независимо, моно или поли замещенную с замещающими группами, независимо выбранными из галогена, оксо, гидроксил, OJ, NJJ, SJ, N, OC(=X)J и NJC(=X)NJJ, где каждый J, J и J независимо представляет собой Н, алкил С-С или замещенный алкил C-C и X представляет собой О или NJ.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечивают бициклические нуклеозиды, которые имеют Формулу III:
где Вх представляет собой остаток гетероциклического основания;
а
b
каждый Т и Т независимо представляет собой Н, гидроксил защищающую группу, группу, содержащую сопряженные двойные связи, реакционно-способную фосфорную группу, остаток фосфора или ковалентное присоединение к иммобилизирующему носителю;
b
1
6
2
6
2
6
1
6
2
6
2
6
Z представляет собой алкил С-С, алкенил С-С, алкенил С-С, замещенный алкил С-С, замещенный алкенил С-С, замещенный алкенил С-С или замещенный ацил (С(=O)-).
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечивают бициклические нуклеозиды, которые имеют Формулу IV:
где Вх представляет собой остаток гетероциклического основания;
а
b
каждый Т и Т независимо представляет собой Н, гидроксил защищающую группу, группу, содержащую сопряженные двойные связи, реакционно-способную фосфорную группу, остаток фосфора или ковалентное присоединение к иммобилизирующему носителю;
d
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
R представляет собой алкил С-С, замещенный алкил C-C, алкенил С-С, замещенный алкенил С-С, алкенил С-С или замещенный алкенил С-С;
a
b
c
d
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
1
6
1
6
1
6
1
6
каждый q, q, q и q независимо представляет собой Н, галоген, алкил С-С, замещенный алкил С-С, алкенил С-С, замещенный алкенил С-С, алкенил С-С или замещенный алкенил С-С, алкоксил С-С, замещенный алкоксил С-С, ацил, замещенный ацил, аминоалкил С-С или замещенный аминоалкил C-C;
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечивают бициклические нуклеозиды, которые имеют Формулу V:
где Вх представляет собой остаток гетероциклического основания;
а
b
каждый Т и Т независимо представляет собой Н, гидроксил защищающую группу, группу, содержащую сопряженные двойные связи, реакционно-способную фосфорную группу, остаток фосфора или ковалентное присоединение к иммобилизирующему носителю;
а
b
е
f
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
2
12
2
12
j
j
j
2
j
j
k
3
j
j
k
j
j
k
j
k
j
k
j
k
q, q, q и q независимо каждый представляет собой, водород, галоген, алкил C-C, замещенный алкил C-C, алкенил C-C, замещенный алкенил C-C, алкенил C-C, замещенный алкенил C-C, алкокси C-C, замещенный алкокси C-C, OJ, SJ, SOJ, SOJ, NJJ, N, CN, C(=O)OJ, C(=O)NJJ, C(=O)J, O-C(=O)NJJ, N(H)C(=NH)NJJ, N(H)C(=O)NJJ или N(H)C(=S)NJJ;
e
f
g
h
или q и q вместе представляют собой =C(q)(q);
g
h
1
12
1
12
каждый q и q представляет собой, Н, галоген, алкил С-С или замещенный алкил С-С.
2
Синтез и получение метиленокси (4'-СН-O-2') мономеров BNA аденина, цитозина, гуанина, 5-метил-цитозина, тимина и урацила, вместе с их олигомеризацией и свойствами узнавания нуклеиновых кислот, были описаны (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). BNAs, а их получение также описано у WO 98/39352 и WO 99/14226.
2
Также были получены аналоги метиленокси (4'-СН-O-2') BNA и 2'-тио-BNA (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). Также описано получение заблокированных аналогов нуклеозида, которые содержат дуплексы олигодезоксирибонуклеотида в качестве субстратов для полимераз нуклеиновых кислот (Wengel et al., WO 99/14226). Кроме того, в данной области техники был описан синтез 2'-амино-ВТЧА, нового конформационно ограниченого аналога с высоким сродством к олигонуклеотиду (Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Кроме того, были получены 2'-амино-и 2'-метиламино-ВМА и ранее сообщалось о термической стабильности их дуплексов с комплементарными цепочками RNA и DNA.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечивают бициклические нуклеозиды, которые имеют Формулу VI:
где Вх представляет собой остаток гетероциклического основания;
а
b
каждый Т и Т независимо представляет собой Н, гидроксил защищающую группу, группу, содержащую сопряженные двойные связи, реакционно-способную фосфорную группу, остаток фосфора или ковалентное присоединение к иммобилизирующему носителю;
i
j
k
1
1
12
1
12
2
12
2
12
2
12
2
12
1
12
1
12
j
j
j
2
j
j
k
3
j
j
k
j
j
k
j
k
j
k
j
k
каждый q, q, q и q независимо представляет собой Н, галоген, алкил C-C, замещенный алкил С-С, алкенил С-С, замещенный алкенил С-С, алкенил С-С, замещенный алкенил С-С, алкоксил C-C, замещенный алкоксил С-С, OJ, SJ, SOJ, SOJ, NJJ, N, CN, C(=O)OJ, C(=O)NJJ, C(=O)J, O-C(=O)NJJ, N(H)C(=NH)NJJ, N(H)C(=O)NJJ или N(H)C(=S)NJJ; и
i
j
l
k
g
h
g
h
1
12
1
12
q и q или q и q вместе представляют собой =C(q)(q), где каждый q и q независимо представляет собой, Н, галоген, алкил С-Сили замещенный алкил C-C.
2
3
2
Описан карбоциклический бициклический нуклеозид, который имеет мостик 4'-(СН)-2' и подобный алкенильный мостик 4'-СН=СН-СН-2' (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 и Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). Также были описаны синтез и получение карбоциклических бициклических нуклеозидов вместе с их олигомеризацией и биохимическими исследованиями (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc, 2007, 129(26), 8362-8379).
Как используют в данном документе, "4'-2' бициклический нуклеозид" или "от 4' к 2' бициклический нуклеозид" соответствует бициклическому нуклеозиду, который содержит фуранозное кольцо, содержащее мостик, соединяющий два атома углерода в фуранозном кольце, соединяющем атом углерода 2' и атом углерода 4' кольца сахара.
Как используют в данном документе, "моноциклические нуклеозиды" соответствуют нуклеозидам, которые содержат модифицированные остатки сахара, не являющиеся остатками бициклического сахара. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения остаток сахара, или аналог остатка сахара, нуклеозида может быть модифицирован или замещен в любом положении.
2
n
m
3
2
n
2
2
n
3
2
n
2
n
2
2
3
2
n
2
n
3
2
1
12
3
3
3
3
2
3
2
2
3
2
Как используют в данном документе, ”2'-модифицированный сахар" означает фуранозный сахар, модифицированный в положении 2'. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения подобные модификации содержат заместители, выбранные из: галогенида, который содержит, но без ограничения ими, замещенный и незамещенный алкокси, замещенный и незамещенный тиоалкил, замещенный и незамещенный амино-алкил, замещенный и незамещенный алкил, замещенный и незамещенный аллил и замещенный и незамещенный алкинил. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения 2' модификации выбирают из заместителей, которые содержат, но без ограничения ими: O[(СН)O]CH, O(СН)NH, O(СН)CH, O(СН)F, O(СН)ONH, OСНC(=O)N(H)CH и O(СН)ON[(СН)CH], где n и m составляют от 1 до около 10. Другие 2'- замещающие группы также могут быть выбраны из: С-С алкила, замещенного алкила, алкенила, алкенила, алкарила, аралкила, О-алкарила или О-аралкила, SH, SCH, OCN, Cl, Br, CN, F, CF, OCF, SOCH, SOCH, ONO, NO, N, NH, гетероциклоалкила, гетероциклоалкарила, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенного силила, RNA расщепляющей группы, "репортерной" группы, интеркалятора, группы для улучшения фармакокинетических свойств или группы для улучшения фармакодинамических свойств антисмыслового соединения и других заместителей, имеющих аналогичные свойства. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированные нуклеозиды содержат боковую цепь 2'-МОЕ (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Подобное замещение 2-MOE было описано как обладающее улучшенной аффинностью связывания, по сравнению с немодифицированными нуклеозидами и другими модифицированными нуклеозидами, такими как 2'- О-метил, О-пропил и О-аминопропил. Также было показано, что олигонуклеотиды, которые имеют заместитель 2-МОЕ, выступают антисмысловыми ингибиторами экспрессии генов с перспективными возможностями для использования in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; и Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Как используют в данном документе, "модифицированный тетрагидропираннуклеозид" или "модифицированный нуклеозид ТНР" означает нуклеозид, который имеет шестичленный тетрагидропирановый "сахар", замещенный по пентофуранозильному остатку в обычных нуклеозидах (заменитель сахара). Модифицированные нуклеозиды ТНР содержат, но без ограничения ими, то, что называют в данной области гекситол нуклеиновой кислоты (HNA), анитол нуклеиновой кислоты (ANA), маннит нуклеиновой кислоты (MNA) (смотри Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854), фтор-HNA (F-HNA) или соединения, которые имеют Формулу VII:
где независимо в случае каждого из упомянутого по меньшей мере одного тетрагидропираннуклеозида Формулы VII:
Вх представляет собой остаток гетероциклического основания;
а
b
а
b
а
b
каждый Т и Т независимо представляют собой межнуклеозидную связующую группу, которая связывает аналог тетрагидропираннуклеозида с антисмысловым соединением или один из Ти T представляет собой межнуклеозидную связующую группу, которая связывает тетрагидропираннуклеозид с антисмысловым соединением, а оставшийся из Т и Т представляет собой Н, гидроксильную защитную группу, связанную группу, содержащую сопряженные двойные связи или 5' или 3'-концевую группу;
1
2
3
4
5
6
7
1
6
1
6
2
6
2
6
2
6
2
6
1
2
1
2
1
3
1
1
2
3
1
2
1
1
2
3
1
6
каждый q, q, q, q, q, q и q независимо представляет собой Н, алкил C-C, замещенный алкил C-С, алкенил С-С, алкенил замещенный С-С, алкенил С-С или замещенный алкенил С-С; а каждый из R и R выбирают из водорода, гидроксила, галогена, замещенного или незамещенного алкокси, NJJ, SJ, N, OC(=X)J, ОС(=Х)NJJ, NJC(=X)NJJ и CN, где X представляет собой О, S или NJ и каждый J, J и J независимо представляют собой H или C-C алкил.
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечивают модифицированные нуклеозиды ТНР Формулы VII, где каждый q, q, q, q, q, q и q представляет собой H. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения по меньшей мере один из q, q, q, q, q, q и q отличается от H. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения по меньшей мере один из q, q, q, q, q, q и q представляет собой метил. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечивают нуклеозиды ТНР Формулы VII, где один из R и R представляет собой фтор. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения R представляет собой фтор, a R представляет собой H; R представляет собой метокси, a R представляет собой H, R представляет собой метоксиэтокси и R представляет собой Н. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения R представляет собой H и R представляет собой фтор; R представляет собой H и R представляет собой метокси, R представляет собой H и R представляет собой метоксиэтокси.
1
10
3
2
2
3
2
2
3
2
2
m
n
2
m
n
m
n
1
10
Как используют в данном документе, “2'-модифицированный" или "2'-замещенный" соответствует нуклеозиду, который содержит сахар, содержащий заместитель в положении 2', отличный от H или ОН. 2'-модифицированные нуклеозиды, содержат, но без ограничения ими, бициклические нуклеозиды, при том что мостик, соединяющий два атома цикла в сахаре, соединяет атом углерода 2' и другой атом углерода цикла сахара; и нуклеозиды и несвязанными 2'-заместителями, такими как аллил, амино, азидо, тио, О-аллил, O-С-С алкил, -OCF, O-(СН)-O-СН, 2'-O(СН)SCH, O-(СН)-O-N(R)(R), или O-СН-C(=O)-N(R)(R), где каждый R и R независимо представляет собой H или замещенный или незамещенный алкил С-С. 2'-модифицированные нуклеозиды могут дополнительно содержать другие модификации, например, при других положениях сахара и/или нуклеинового основания.
Как используют в данном документе, "2'-F" соответствует нуклеозиду, который содержит сахар, содержащий группу фтора в положении 2'.
3
3
Как используют в данном документе, каждый "2'-ОМе" или "2'-ОСН" или "2'-O-метил" соответствует нуклеозиду, который содержит сахар, содержащий группу -ОСН в положении 2' кольца сахара.
2
2
3
2
2
3
Как используют в данном документе, каждый "МОЕ" или "2'-МОЕ" или "2'-ОСНСНОСН" или "2'-O-метоксиэтил" соответствует нуклеозиду, который содержит сахар, содержащий группу -ОСНСНОСН в положении 2' кольца сахара.
Как используют в данном документе, "олигонуклеотид" соответствует соединению, которое содержит множество связанных нуклеозидов. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения один или несколько нуклеозидов из множества являются модифицированными. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения олигонуклеотид содержит один или несколько рибонуклеозидов (RNA) и/или дезоксирибонуклеозидов (DNA).
Также в данной области техники известны многие другие бициклические и трициклические циклические системы суррогата сахара, которые могут быть использованы для модификации нуклеозидов в случае включения в антисмысловые соединения (смотри, например, обзорную статью: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-854). Такие кольцевые системы могут претерпевать различные дополнительные замены, чтобы повысить активность.
Способы получения модифицированных сахаров хорошо известны специалистам в данной области техники.
В нуклеотидах, которые имеют модифицированные остатки сахара, нуклеотидные фрагменты (природные, модифицированные или их комбинации) поддерживают для гибридизации с соответствующей нуклеиновой кислотой-мишенью.
3
3
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения содержат один или несколько нуклеозидов, которые имеют модифицированные остатки сахара. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированный остаток сахара представляет собой 2'-МОЕ. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения 2'-МОЕ модифицированные нуклеозиды располагают в гэпмерном мотиве. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированный остаток сахара представляет собой бициклический нуклеозид, который имеет мостиковую группу (4'-СН(СН)-O-2'). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения (4'-СН(СН)-O-2') модифицированные нуклеозиды располагают на всех концах гэпмерного мотива. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированный остаток сахара представляет собой cEt. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированные cEt нуклеотиды располагают на всех концах гэпмерного мотива.
Модифицированные нуклеиновые основания
Модификации нуклеинового основания (или основания) или замещения конструктивно отличаются от, но функционально взаимозаменяемы, природных или синтетических немодифицированных нуклеиновых оснований. И природные, и модифицированные нуклеиновые основания способны участвовать в образовании водородной связи. Такие модификации нуклеиновых оснований могут придавать антисмысловым соединениям нуклеазную стабильность, аффинность связывания или другое благоприятное биологическое свойство. Модифицированные нуклеиновые основания содержат синтетические и природные нуклеиновые кислоты, такие как, например, 5-метилцитозин (5-mе-С). Некоторые замещения нуклеиновых оснований, в том числе замещения 5-метилцитозина, особенно полезны для увеличения аффинности связывания антисмыслового соединения в случае нуклеиновой кислоты-мишени. Например, замещения 5-метилцитозина, как было показано, увеличивают стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2°С (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. и Lebleu, В., eds., Antisense Research и Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278).
3
Дополнительные модифицированные нуклеиновые основания содержат 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинил(-С≡C-СН) урацил и цитозин и другие алкинильные производные пиримидиновых оснований, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино-, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозина, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 2-Р-аденин, 2-амино-аденин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин.
Остатки гетероциклических оснований могут содержать те, в которых пуриновое или пиримидиновое основание заменяют другими гетероциклами, например, 7-деаза-аденином, 7-деазагуанозином, 2-аминопиридином и 2-пиридоном. Нуклеиновые основания, которые особенно полезны для увеличения аффинности связывания антисмысловых соединений, содержат 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины, в том числе 2 аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения, направленные на нуклеиновую кислоту аро(а), содержат один или несколько модифицированных нуклеиновых оснований. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловые соединения с расширенным разрывом, направленные на нуклеиновую кислоту аро(а), содержат одно или несколько модифицированных нуклеиновых оснований. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модифицированное нуклеиновое основание представляет собой 5-метилцитозин. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения каждый цитозин представляет собой 5-метилцитозин.
Композиции и способы составления фармацевтических композиций
Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть смешаны с фармацевтически приемлемым активным или инертным веществом для получения фармацевтических композиций или составов. Композиции и способы разработки фармацевтических композиций зависят от ряда критериев, в том числе, но без ограничения ими, пути введения, степени заболевания или дозы для введения.
Антисмысловое соединение, направленное на нуклеиновую кислоту аро(а), может быть использовано в фармацевтических композициях путем объединения антисмыслового соединения с подходящим фармацевтически приемлемым растворителем или носителем.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения "фармацевтический носитель" или "вспомогательное вещество" представляет собой фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующее средство или любой другой фармакологически инертный носитель для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот в организм животного. Вспомогательное вещество может быть жидким или твердым и может быть выбрано с учетом предполагаемого способа введения с учетом обеспечения желаемого объема, консистенции и т.д., в сочетании с нуклеиновой кислотой и другими компонентами данной фармацевтической композиции. Типичные фармацевтические носители содержат, но без ограничения ими, связующие средства (например, предварительно желатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлоза и т.п.); наполнители (например, лактоза и другие сахара, микрокристаллическая целлюлоза, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлоза, полиакрилаты или гидрофосфат кальция и т.д.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, диоксид кремния, коллоидный диоксид кремния, стеариновая кислота, стеараты металлов, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т.п.); разрыхлители (например, крахмал, натрия крахмала гликолят, и т.д.); и смачивающие средства (например, лаурилсульфат натрия и т.д.).
Фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, которые не реагируют вредным образом с нуклеиновыми кислотами, подходящие для парентерального или не парентерального введения, также могут быть использованы при составлении композиций по настоящему изобретению. Подходящие фармацевтически приемлемые носители содержат, но без ограничения ими, воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и тому подобное.
Фармацевтически приемлемый разбавитель содержит фосфатно-солевой буфер (PBS). PBS представляет собой разбавитель, подходящий для использования в композициях, которые должны быть доставлены парентерально. Соответственно, в отдельном варианте реализации настоящего изобретения используемое в способах, описанных в данном документе, представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую соединение, направленное на нуклеиновую кислоту аро(а) и фармацевтически приемлемый разбавитель. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения фармацевтически приемлемый разбавитель представляет собой PBS. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения антисмысловое соединение представляет собой антисмысловой олигонуклеотид.
Фармацевтические композиции, которые содержат антисмысловые соединения, содержат любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких эфиров, или олигонуклеотид, который при введении животному, в том числе и человеку, способен обеспечить (непосредственно или косвенно) биологически активный метаболит или его остаток. Соответственно, например, раскрытие также демонстрирует также фармацевтически приемлемые соли антисмысловых соединений, пролекарства, фармацевтически приемлемые соли таких пролекарств и другие биоэквиваленты. Подходящие фармацевтически приемлемые соли содержат, но без ограничения ими, соли натрия и калия.
Пролекарство может содержать включение дополнительных нуклеозидов на одном или обоих концах антисмыслового соединения, которые расщепляются эндогенными нуклеазами внутри тела, чтобы сформировать активное антисмысловое соединение.
Конъюгированные антисмысловые соединения
Антисмысловые соединения могут быть ковалентно связаны с одним или несколькими фрагментами или конъюгатами, которые повышают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение получаемых антисмысловых олигонуклеотидов. Типичные группы, содержащие сопряженные двойные связи, содержат остатки холестерина и остатки липида. Дополнительные группы, содержащие сопряженные двойные связи содержат углеводы, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители.
Антисмысловые соединения также могут быть модифицированы, чтобы иметь одну или несколько стабилизирующих групп, которые, как правило, прикреплены к одному или обоим концам антисмысловых соединений для повышения таких свойств, как, например, нуклеазная стабильность. Группы, относящиеся к стабилизирующим группам, являются кэп-структурами. Эти концевые модификации защищают антисмысловое соединение, которое имеет концевую нуклеиновую кислоту, от экзонуклеазной деградации и может помочь в доставке и/или локализации в клетке. Кэп может присутствовать на 5'-конце (5'-кэп), или на 3'-конце (3'-кэп), или может присутствовать на обоих концах. Кэп-структуры хорошо известны в данной области техники и содержат, например, обратные дезоксикэпы с удаленными азотистыми основаниями. Кроме того, 3' и 5'-стабилизирующие группы, которые могут быть использованы, чтобы ограничить один или оба конца антисмыслового соединения для придания нуклеазной устойчивости содержат те, которые раскрыты в WO 03/004602, опубликованной 16 января 2003.
Клеточная культура и лечение антисмысловыми соединениями
Влияние антисмысловых соединений на уровень, активность или экспрессию нуклеиновых кислот аро(а) может быть исследовано in vitro в различных типах клеток. Типы клеток, используемые для таких анализов, доступны от коммерческих поставщиков (напр. American Type Culture Collection, Манассус, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Волкерсвиль, MD) и их культивируют в соответствии с инструкциями поставщика с использованием коммерчески доступных реагентов (напр., Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, СА).Иллюстративные типы клеток, содержат, но без ограничения ими, клетки HepG2, клетки Нер3В, клетки Huh7 (гепатоцеллюлярной карциномы), первичные гепатоциты, клетки А549, фибробласты GM04281 и клетки LLC-MK2.
In Vitro исследование антисмысловых олигонуклеотидов
В данном документе описаны способы обработки клеток антисмысловыми олигонуклеотидами, которые могут быть изменены соответствующим образом для обработки другими антисмысловыми соединениями.
В общем, клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами, если клетки достигают примерно 60-80% конфлуентности в культуре.

Реагент, обычно используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, содержит реагент для трансфекции катионного липида LIPOFECTIN (Invitrogen, Карлсбад, СА). Антисмысловые олигонуклеотиды смешивают с LIPOFECTIN в OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Карлсбад, СА), чтобы достичь желаемой конечной концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTIN, которая обычно находится в диапазоне от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Другой реагент, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, содержит LIPOFECTAMINE 2000 (Invitrogen, Карлсбад, СА). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с LIPOFECTAMINE 2000 в среде с пониженным количеством сыворотки OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Карлсбад, СА), чтобы достичь желаемой концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации LIPOFECTAMINE, которая обычно находится в диапазоне от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.

Другой реагент, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, содержит Cytofectin (Invitrogen, Карлсбад, СА). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с LIPOFECTAMINE 2000 в среде с пониженным количеством сыворотки OPTI-MEM 1 (Invitrogen, Карлсбад, СА), чтобы достичь желаемой концентрации антисмыслового олигонуклеотида и концентрации Cytofectin, которая обычно находится в диапазоне от 2 до 12 мкг/мл на 100 нМ антисмыслового олигонуклеотида.
Другой реагент, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, содержит Oligofectamine™ (Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, CA). Антисмысловой олигонуклеотид смешивают с Oligofectamine™ в среде Opti-MEM™-1 с пониженным количеством сыворотки (Invitrogen Life Technologies, Карлсбад, СА), чтобы достичь желаемой концентрации олигонуклеотида с отношением Oligofectamine™ к олигонуклеотиду приблизительно от 0,2 до 0,8 мкл на 100 нМ.
Другой реагент, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, содержит FuGENE 6 (Roche Diagnostics Corp., Индианаполис, IN). Антисмысловые олигомерного соединение смешивают с FuGENE 6 в 1 мл бессывороточной среды RPMI, чтобы достичь желаемой концентрации олигонуклеотида к Fugene 6 с соотношением олигомерного соединения от 1 до 4 мкл FuGENE 6 на 100 нМ.
Еще один способ, используемый для введения антисмысловых олигонуклеотидов в культивируемые клетки, содержит электропорацию (Sambrooke и Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001).
Клетки обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами с помощью обычных способов. Клетки собирают, как правило, через 16-24 часов после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами, после чего уровни RNA или протеина нуклеиновых кислот-мишеней измеряют с помощью способов, известных в данной области техники и описанных в данном документе (Sambrooke и Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001). В общем, если обработки проводят в нескольких повторах, данные представляют в виде среднего значения повторных обработок.

Концентрация используемого антисмыслового олигонуклеотида варьируется от клеточной линии к клеточной линии. Способы определения оптимальной концентрации антисмыслового олигонуклеотида для конкретной линии клеток хорошо известны в данной области техники (Sambrooke и Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001). Антисмысловые олигонуклеотиды обычно используют в концентрациях от 1 нМ до 300 нМ при трансфекции LIPOFECTAMINE2000 (Invitrogen, Карлсбад, СА), Lipofectin (Invitrogen, Карлсбад, СА) или Cytofectin™ (Genlantis, Сан Диего, СА). Антисмысловые олигонуклеотиды используют при более высоких концентрациях в пределах от 625 до 20000 нМ при трансфекции с помощью электропорации.
Выделение RNA

Анализ RNA может быть выполнен на общей клеточной RNA или поли(А)+mRNA. Способы выделения RNA широко известны в данной области техники (Sambrooke и Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001). Например, RNA может быть получена с использованием TRIZOL (Invitrogen, Карлсбад, СА) в соответствии с рекомендованными протоколами изготовителя.
Анализ ингибирования целевых уровней или экспрессии
Ингибирование уровней или экспрессия нуклеиновой кислоты аро(а) может быть проанализировано различными способами, известными в данной области техники (Sambrooke и Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001). Например, уровни нуклеиновой кислоты-мишени могут быть определены количественно с помощью, напр., нозерн-блоттинга, конкурентной полимеразной цепной реакции (PCR) или количественной PCR в реальном времени. Анализ RNA может быть выполнен на общей клеточной RNA или поли(А)+mRNA. Способы выделения RNA хорошо известны в данной области техники. Нозерн-блоттинг также является обычным способом в данной области техники. Количественная PCR в реальном времени может быть легко осуществлена с использованием коммерчески доступного ABI PRISM 7600, 7700 или 7900 Sequence Detection System, доступной от PE-Applied Biosystems (Фостер Сити, СА) и используется в соответствии с инструкциями изготовителя.
Анализ уровней RNA-мишени с помощью количественной PCR в реальном времени

Количественное определение уровней RNA-мишени может быть достигнуто путем количественной PCR в реальном времени с помощью ABI PRISM 7600, 7700 или 7900 Sequence Detection System (PE-Applied Biosystems, Фостер Сити, СА) в соответствии с инструкциями производителя. Способы количественной PCR в реальном времени хорошо известны в данной области техники.
Перед PCR в реальном времени, выделенную RNA подвергают реакции обратной транскриптазы (RT), которая производит комплементарную DNA (cDNA), которую затем используют в качестве субстрата для PCR-амплификации в реальном времени. Реакции RT и PCR в реальном времени проводят последовательно в той же лунке для пробы. Реагенты RT и PCR в реальном времени получают от Invitrogen (Карлсбад, СА). Реакции RT и PCR в реальном времени выполняют с помощью способов, хорошо известных специалистам в данной области техники.

Целевые количества гена (или RNA), полученные с помощью PCR в реальном времени, могут быть нормализованы либо с помощью уровня экспрессии гена, экспрессия которого является постоянной, такого как циклоспорин А или GAPDH, либо с помощью количественного определения общего количества RNA с использованием RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Карлсбад, СА). Экспрессия циклоспорина А или GAPDH может быть определена количественно с помощью PCR в реальном времени, осуществляемом одновременно с мишенью, комбинировано или отдельно. Общее количество RNA определяют количественно с использованием реагента для количественного определения RIBOGREEN RNA (Invitrogen, Inc. Карлсбад, СА). Способы количественного определения RNA с помощью RIBOGREEN изложены в Jones, L.J., et al., (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374). Прибор CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems, Фостер Сити, СА) используют для измерения флуоресценции RIBOGREEN.

Зонды и праймеры могут быть сконструированы для гибридизации с нуклеиновой кислотой аро(а). Способы конструирования зондов и праймеров PCR в реальном времени хорошо известны в данной области техники и могут включать использование такого программного обеспечения, как PRIMER EXPRESS Software (Applied Biosystems, Фостер Сити, СА).
Анализ уровней протеина
Антисмысловое ингибирование нуклеиновых кислот аро(а) может быть оценено с помощью измерения уровней протеина аро(а). Уровни протеина аро(а) могут быть оценены или определены количественно различными способами, хорошо известными в данной области техники, такими как иммунопреципитация, вестерн-блоттинг (иммуноблоттинг), иммуноферментный анализ (ELISA), количественные анализы протеина, анализы активности протеина (например, анализы активности каспазы), иммуногистохимия, иммуноцитохимия или сортировка клеток с возбуждением флуоресценции (FACS) (Sambrooke и Russell in Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 2001). Антитела, направленные на мишень, могут быть выделены и получены из различных источников, таких как каталог антител MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), или могут быть получены с помощью обычных моноклональных или поликлональных антител способами генерации, хорошо известными в данной области техники. Антитела, используемые для обнаружения аро(а), являются коммерчески доступными.
In vivo исследование антисмысловых соединений
Антисмысловые соединения, например, антисмысловые олигонуклеотиды, исследуют на животных, чтобы оценить их способность ингибировать экспрессию аро(а) и производить фенотипические изменения. Исследование можно проводить на нормальных животных или на экспериментальных моделях заболеваний. Для введения животным, антисмысловые олигонуклеотиды составлены в фармацевтически приемлемом растворителе, таком как физиологический раствор или фосфатно-солевой буфер. Введение содержит парентеральные пути введения. Расчет дозировки антисмыслового олигонуклеотида и частоты дозирования зависит от таких факторов, как пути введения и масса тела животного. После периода лечения антисмысловыми олигонуклеотидами RNA выделяют из ткани и измеряют изменения экспрессии нуклеиновой кислоты аро(а). Также измеряют изменения уровней протеина аро(а).
Отдельные признаки
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечиваемое в данном документе представляет собой способы лечения индивидуума, который включает введение одной или более фармацевтических композиций, как описано в данном документе. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения индивидуум имеет связанную с аро(а) болезнь. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения индивидуум имеет связанную с Lp(a) болезнь. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения индивидуум имеет воспалительную, сердечно-сосудистую и/или метаболическую болезнь, расстройство или заболевание.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения сердечно-сосудистые болезни, расстройства или заболевания содержат, но без ограничения ими, аневризм (например, аневризм брюшной аорты), стенокардию, аритмию, атеросклероз, болезнь сосудов головного мозга, коронарную болезнь сердца, ишемическую болезнь сердца, дислипидемию, гиперхолестеринемию, гиперлипидемию, гипертензию, гипертриглицеридемию, инфаркт миокарда, заболевание периферических сосудов (например, заболевание периферических артерий), инсульт и тому подобное.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения соединения, направленные на аро(а), описанные в данном документе, модулируют физиологические маркеры или фенотипы сердечно-сосудистой болезни, расстройства или заболевания. Например, введение соединений животным может снизить уровни LDL и холестерина у этих животных по сравнению с необработанными животными. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модуляция физиологических маркеров или фенотипов может быть связана с ингибированием аро(а) соединениями.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения физиологические маркеры сердечно-сосудистой болезни, расстройства или заболевания могут быть определены количественно. Например, уровни LDL или холестерина могут быть измерены и определены количественно с помощью, например, стандартных исследований липидов. В случае подобных маркеров, в отдельных вариантах реализации настоящего изобретения маркер может быть уменьшен на около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или диапазон, определенный любыми двумя из этих значений.
Кроме того, обеспечиваемое в данном документе представляет собой способы предотвращения, лечения или уменьшения интенсивности симптома, связанного с сердечно-сосудистой болезнью, расстройством или заболеванием у пациента, нуждающегося в этом. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечиваемое представляет собой способ снижения темпов наступления симптома, связанного с сердечно-сосудистой болезнью, расстройством или заболеванием. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечиваемое представляет собой способ снижения тяжесть симптома, связанного с сердечно-сосудистой болезнью, расстройством или заболеванием. В подобных вариантах реализации настоящего изобретения способы включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения, направленного на нуклеиновую кислоту аро(а).
Сердечно-сосудистую болезнь, расстройство или заболевание можно охарактеризовать многочисленными физическими симптомами. Любой симптом, известный специалистам в данной области техники, связанный с сердечно-сосудистой болезнью, расстройством или заболеванием, может быть предотвращен, вылечен, уменьшен в своей интенсивности или иным образом модулирован с помощью соединений и способов, описанных в данном документе. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения симптом может быть любым из, но без ограничения ими, стенокардии, боли в груди, одышки, сердцебиения, слабости, головокружения, тошноты, потливости, тахикардии, брадикардии, аритмии, фибрилляции предсердий, отека нижних конечностей, цианоза, усталости, обморока, онемения лица, онемения конечностей, хромоты или спазма мышц, вздутия живота или лихорадки.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения метаболические болезни, нарушения или заболевания содержат, но без ограничения ими, гипергликемию, преддиабет, сахарный диабет (тип I и тип II), ожирение, резистентность к инсулину, метаболический синдром и диабетическую дислипидемию.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения соединения направленные на аро(а), описанные в данном документе, модулируют физиологические маркеры или фенотипы метаболической болезни, расстройства или заболевания. Например, введение соединений животным может снизить у животных уровни глюкозы и резистентности к инсулину по сравнению с необработанными животными. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модуляция физиологических маркеров или фенотипов может быть связана с ингибированием аро(а) соединениями.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения физиологические маркеры метаболической болезни, расстройства или заболевания могут быть определены количественно. Например, уровни глюкозы или резистентности к инсулину могут быть измерены и количественно определены с помощью стандартных исследований, известных в данной области техники. В случае подобных маркеров, в отдельных вариантах реализации настоящего изобретения маркер может быть уменьшен на около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или на диапазон, определенный любыми двумя из этих значений. В другом примере, чувствительность к инсулину может быть измерена и количественно определена с помощью стандартных исследований, известных в данной области техники. В случае подобных маркеров, в отдельных вариантах реализации настоящего изобретения маркер может быть увеличен на около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или на диапазон, определенный любыми двумя из этих значений.
Кроме того, обеспечиваемое в данном документе представляет собой способы предотвращения, лечения или уменьшения интенсивности симптома, связанного с метаболической болезнью, расстройством или заболеванием у пациента, нуждающегося в этом. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечиваемое представляет собой способ снижения темпов наступления симптома, связанного с метаболической болезнью, расстройством или заболеванием. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечиваемое представляет собой способ снижения тяжесть симптома, связанного с метаболической болезнью, расстройством или заболеванием. В подобных вариантах реализации настоящего изобретения способы включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения, направленного на нуклеиновую кислоту аро(а).
Метаболическую болезнь, расстройство или заболевание можно охарактеризовать многочисленными физическими симптомами. Любой симптом, известный специалистам в данной области техники, связанный с метаболической болезнью, расстройством или заболеванием, может быть предотвращен, вылечен, уменьшен в своей интенсивности или иным образом модулирован с помощью соединений и способов, описанных в данном документе. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения симптом может быть любым из, но без ограничения ими, чрезмерного мочеотделения (полиурии), чрезмерной жажды и увеличения потребления жидкости (полидипсии), затуманенного зрения, необъяснимой потери веса и вялости.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения воспалительные болезни, нарушения или заболевания содержат, но без ограничения ими, ишемическую болезнь сердца (CAD), болезнь Альцгеймера и тромбоэмболические болезни, расстройства или заболевания. Некоторые тромбоэмболических болезни, расстройства или заболевания содержат, но без ограничения ими, инсульт, тромбоз, инфаркт миокарда и болезнь периферических сосудов.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения соединения направленные на аро(а), описанные в данном документе, модулируют физиологические маркеры или фенотипы воспалительной болезни, расстройства или заболевания. Например, введение соединений животным может уменьшить уровни воспалительных цитокинов или другие маркеры воспаления у этих животных по сравнению с необработанными животными. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения модуляция физиологических маркеров или фенотипов может быть связана с ингибированием аро(а) соединениями.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения физиологические маркеры воспалительной болезни, расстройства или заболевания могут быть определены количественно. Например, уровни цитокина могут быть измерены и количественно определены с помощью стандартных исследований, известных в данной области техники. В случае подобных маркеров, в отдельных вариантах реализации настоящего изобретения маркер может быть уменьшен на около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или на диапазон, определенный любыми двумя из этих значений.
Кроме того, обеспечиваемое в данном документе представляет собой способы предотвращения, лечения или уменьшения интенсивности симптома, связанного с воспалительной болезнью, расстройством или заболеванием у пациента, нуждающегося в этом. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечиваемое представляет собой способ снижения темпов наступления симптома, связанного с воспалительной болезнью, расстройством или заболеванием. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечиваемое представляет собой способ снижения тяжесть симптома, связанного с воспалительной болезнью, расстройством или заболеванием. В подобных вариантах реализации настоящего изобретения способы включают введение индивидууму, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества соединения, направленного на нуклеиновую кислоту аро(а).
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечиваемое представляет собой способы лечения индивидуума со связанными с аро(а) болезнями, расстройствами или состояниями, которые содержат введение терапевтически эффективного количества одной или нескольких фармацевтических композиций, как описано в данном документе. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения индивидуум имеет повышенные уровни аро(а). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения обеспечиваемое представляет собой способы лечения индивидуума со связанными с Lp(a) болезнями, расстройствами или состояниями, которые содержат введение терапевтически эффективного количества одной или нескольких фармацевтических композиций, как описано в данном документе. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения индивидуум имеет повышенные уровни Lp(a). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения индивидуум имеет воспалительную, сердечно-сосудистую и/или метаболическую болезнь, расстройство или заболевание. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту аро(а), сопровождают мониторингом уровней аро(а) или Lp(a). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения введение терапевтически эффективного количества антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту аро(а), сопровождается мониторингом маркеров воспалительной, сердечно-сосудистой и/или метаболической болезни или другого процесса заболевания, связанного с экспрессией аро(а), для определения индивидуального ответа на антисмысловое соединение. Индивидуальный ответ на введение антисмыслового соединения, специфического по отношению к воздействию аро(а), может быть использован по назначению врача, чтобы определить количество и продолжительность терапевтического вмешательства с соединением.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения введение антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту аро(а), приводит к снижению экспрессии аро(а) на по меньшей мере около 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или в диапазоне, определенном с помощью любых двух из этих значений. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения аро(а) экспрессия снижают на<100 мг/дл, ≤90 мг/дл, ≤80 мг/дл, ≤70 мг/дл, ≤60 мг/дл, ≤50 мг/дл, ≤40 мг/дл, ≤30 мг/дл, ≤20 мг/дл или ≤10 мг/дл.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения введение антисмыслового соединения, направленного на нуклеиновую кислоту аро(а), приводит к снижению экспрессии Lp(a) на по меньшей мере около 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99%, или в диапазоне, определенном с помощью любых двух из этих значений.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции, которые содержит антисмысловое соединение, направленное на аро(а), используют для получения лекарственного препарата для лечения пациента, страдающего, или подверженного, противовоспалительной, сердечно-сосудистой и/или метаболической болезни, расстройству или заболеванию.
Дозировка
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения фармацевтические композиции вводят в соответствии с режимом дозирования (напр., дозой, частотой введения дозы и длительностью), при том что для достижения желаемого эффекта может быть выбран режим дозирования. Желаемый эффект может быть, например, снижением аро(а) или профилактикой, снижением, уменьшением интенсивности или замедлением прогрессирования болезни или заболевания, связанного с аро(а).
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения переменные схемы дозирования корректируют, чтобы привести к желаемой концентрации фармацевтической композиции у пациента. "Концентрация фармацевтической композиции", как используют по отношению к режиму дозирования, может относиться к соединению, олигонуклеотиду или активному ингредиенту фармацевтической композиции. Например, в отдельных вариантах реализации настоящего изобретения дозу и частоту введения дозы корректируют, чтобы обеспечить концентрацию фармацевтической композиции в ткани или концентрацию фармацевтической композиции в плазме в количестве, достаточном для достижения желаемого эффекта.
Дозирование зависит от тяжести и отзывчивости болезненного состояния, подлежащего лечению, с курсом лечения продолжительностью от нескольких дней до нескольких месяцев, или до тех пор, пока лечение не возымеет эффект или не будет достигнуто уменьшение болезненного состояния. Дозирование зависит также от действенности лекарственного средства и метаболизма. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения доза составляет от 0,01 мкг до 100 мг на кг массы тела или в диапазоне дозирования от 0,001 мг до 1000 мг и может быть дана один раз или более ежедневно, еженедельно, ежемесячно или ежегодно, или даже один раз каждые от 2 до 20 лет. После успешного лечения, это может быть желательно, чтобы пациент подвергался поддерживающей терапии, чтобы предотвратить рецидив болезненного состояния, при том что олигонуклеотид вводят в поддерживающих дозах, начиная от дозирования 0,01 мкг до 100 мг на кг массы тела, или от 0,001 мг до 1000 мг, один раз или более ежедневно, еженедельно, ежемесячно, ежегодно, один раз от 2 до 20 лет.
Некоторые комплексные терапии
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения первое средство, которое содержит соединение, описанное в данном документе, вводят совместно с одним или несколькими вторичными средствами или терапией. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения подобные вторые средства предназначены для лечения той же болезни, расстройства или заболевания, что и в случае первого средства, описанного в данном документе. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения подобные вторые средства предназначены для лечения болезни, расстройства или заболевания, отличной от случая первого средства, описанного в данном документе. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения первое средство предназначено для лечения нежелательного побочного эффекта второго средства. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения вторые средства вводят совместно с первым средством для лечения нежелательного эффекта первого средства. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения такого второго средства предназначены для лечения нежелательного побочного эффекта, одной или более фармацевтических композиций, как описано в данном документе. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения вторые средства вводят совместно с первым средством для получения комбинированного эффекта. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения вторые средства вводят совместно с первым средством для получения синергического эффекта. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения совместное введение первого и второго средств позволяет использовать более низкие дозировки, чем требовалось бы для достижения терапевтического или профилактического эффекта, если средства вводят в виде независимой терапии.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения одна или несколько композиций, описанных в данном документе, и одно или несколько других фармацевтических средств вводят в одно и тоже время. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения одна или несколько композиций по настоящему изобретению и одно или несколько других фармацевтических средств вводят в разное время. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения одна или несколько композиций, описанных в данном документе, и одно или несколько других фармацевтических средств вводят вместе в одном состав. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения одна или несколько композиций, описанных в данном документе, и одно или несколько других фармацевтических средств вводят раздельно.
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения вторые средства содержат, но без ограничения ими, аро(а)-понижающее средство, Lp(а)-понижающее средство, средство для лечения болезни Альцгеймера, средство уменьшения образование тромбоэмболии, холестерин-понижающее средство, средство, понижающее уровень липидов, отличных от HDL (например, LDL), разрыхлитель HDL, рыбий жир, ниацин, никотиновую кислоту, фибрат, статин, DCCR (соль диазоксидом), глюкозо-понижающее средство, противовоспалительное средство и/или антидиабетическое средство. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения первое средство вводят в комбинации с максимально переносимой дозой второго средства. В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения первое средство вводят пациенту, который не реагирует на максимально переносимую дозу второго средства.
Примеры аро(а)-понижающих средств содержат антисмысловой олигонуклеотид аро(а), отличный от первого средства, ниацина, никотиновой кислоты или антисмыслового олигонуклеотида ароВ (напр. Mipomersen). Пример аро(а)-понижающей терапии представляет собой аферез Lp(a).
Примеры сахароснижающих и/или антидиабетических средств содержат, но без ограничения ими, терапевтическое изменение образа жизни, агонист PPAR, ингибитор дипептидилпептидазы (IV), аналог GLP-1, инсулин или аналог инсулина, стимулятор секреции инсулина, ингибитор SGLT2, аналог амилина человека, бигуанид, ингибитор альфа-глюкозидазы, метформин, сульфонилмочевину, розиглитазон, меглитинид, тиазолидиндион, ингибитор альфа-глюкозидазы и тому подобное. Сульфонилмочевина может быть ацетогексамидом, хлорпропамидом, толбутамидом, толазамидом, глимепиридом, глипизидом, глибуридом или гликлазидом. Меглитинид может быть натеглинидом или репаглинидом. Тиазолидиндион может быть пиоглитазоном или розиглитазоном. Альфа-глюкозидаза может быть акарбозой или миглитолом.
Примеры холестериновой или гиполипидемической терапии содержат, но без ограничения ими, терапевтическое изменение образа жизни, статины, секвестранты желчных кислот, ниацин, никотиновую кислоту, ингибиторы СЕТР и агонистов рецептора, активирующего пролиферацию пероксисомы, таких как фибраты. Статины могут быть аторвастатином, флувастатином, ловастатином, правастатином, розувастатином и симвастатином и тому подобным. Секвестранты желчных кислот могут быть колесевеламомом, холестирамином, колестиполом и тому подобным. Фибраты могут быть гемфиброзилом, фенофибратом, клофибратом и тому подобным. Ингибитор СЕТР может быть антисмысловым олигонуклеотидом СЕТР или Torcetrapib.
Некоторые выборки лечения
Некоторые пациенты с высокими уровнями Lp(a) имеют значительный риск различных болезней (Lippi et al., Clinica Chimica Acta, 2011, 412:797-801; Solfrizz et al.). У многих пациентов с высокими уровнями Lp(a), современные методы лечения не могут сократить их уровни Lp(a) до безопасных уровней. Аро(а) играет важную роль в образовании Lp(a), а, следовательно, снижение аро(а) может уменьшить Lp(a) и предотвратить, вылечить или облегчить симптомы болезни, связанной с Lp(a).
В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения лечение с помощью соединений и способов, раскрытых в данном документе, указывает на человека и животного с повышенными уровнями аро(а) и/или Lp(a). В отдельных вариантах реализации настоящего изобретения человек имеет повышенные уровни аро(а)≥30 мг/дл, ≥40 мг/дл, ≥50 мг/дл, ≥60 мг/дл, ≥70 мг/дл, ≥80 мг/дл, ≥90 мг/дл или ≥100 мг/дл.
Некоторые соединения
Выбранные антисмысловые олигонуклеотиды гэпмера из заявки РСТ WO2005/000201 (содержится в данном документ в виде ссылки во всей своей полноте) оценивают (Пример 1), а наиболее высокоактивное соединение, ISIS 144367, используют в качестве эталона для сравнения со недавно создаваемыми антисмысловыми олигонуклеотидами, описанными в данном документе.
Из недавно созданных антисмысловых олигонуклеотидов было найдено около 90, которые являются более высокоактивными, чем контрольное соединение, ISIS 144367, по оценке отдельной дозы в in vitro исследованиях (Примеры 2-3, 5). Из около 90 антисмысловых олигонуклеотидов, около 83 выбирают для in vitro исследования влияния величины многократной дозы, а 64 антисмысловых олигонуклеотидов, как было обнаружено, являются более высокоактивными, чем контрольное соединение (Примеры 4, 6).
Около 32 антисмысловых олигонуклеотидов дополнительно выбирают для in vivo исследований трансгенных мышей с аро(а) человека (Пример 7). Несколько антисмысловых олигонуклеотидов были определены как те, которые являются более высокоактивными, чем контрольное соединение in vivo.
Около 24 антисмысловых олигонуклеотидов дополнительно выбирают для исследования вязкости in vitro (Пример 13). Антисмысловые олигонуклеотиды, которые были вязкими, не принимают участие в дальнейшие исследования.
Около 14 антисмысловых олигонуклеотидов дополнительно выбирают для in vivo исследований переносимости грызунами и фармакокинетических свойств (Примеры 8-10). Исследования показали, что ISIS 494372 является наиболее хорошо переносимым антисмысловым олигонуклеотидом.
ISIS 494283, 494284, 494286, 494301, 494302 и 494372 проверяют на яванских макаках (Примеры 11-12). Исследования показали, что ISIS 494372 является хорошо переносимым и высокоактивным в случае обезьян.
ПРИМЕРЫ
Неограничивающее раскрытие и приведение с помощью ссылки
В то время как были описаны некоторые соединения, композиции и способы, описанные в данном документе, со специфичностью в соответствии с отдельными вариантами реализации настоящего изобретения, следующие примеры служат только для иллюстрации соединений, описанных в данном документе, и не предназначены для их ограничения. Каждая из ссылок, приведенных в настоящей заявке, приведена в данном документе в виде ссылки во всей своей полноте.
Пример 1: Дозозависимое антисмысловое ингибирование аполипопротеина (а) человека (аро(а)) в первичных гепатоцитах человека
Выбранные антисмысловые олигонуклеотиды гэпмера из предыдущей публикации (WO 2005/000201, содержание которой приведено в данном документе в виде ссылки во всей ее полноте) исследуют с помощью анализа с однократным введением в первичных гепатоцитах человека. Клетки получают от Tissue Transformation Technologies (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) и обрабатывают 150 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После периода лечения приблизительно 16 часов, из клеток выделяют RN А и измеряют уровни mRNA аро(а) с помощью количественной PCR в реальном времени. Набор праймер-зонда аро(а) человека hAPO(a)3' (прямая последовательность ACAGCAATCAAACGAAGACACTG, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 5; обратная последовательность AGCTTATACACAAAAATACCAAAAATGC, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 6; меченая последовательность TCCCAGCTACCAGCTATGCCAAACCTT, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: No: 7) используют для измерения уровней mRNA. Кроме того, уровни mRNA были также измерены с использованием набора праймер-зонда аро(а) человека пАРО(а)12 т.н. (прямая последовательность CCACAGTGGCCCCGGT, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 8; обратная последовательность ACAGGGCTTTTCTCAGGTGGT, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 9; меченая последовательность CCAAGCACAGAGGCTCCTTCTGAACAAG, обозначенная в данном документе как SEQ ID NO: 10). Уровни mRNA аро(а) нормализуют для экспрессии mRNA GAPDH. Результаты представлены в Таблице 1 в виде процента ингибирования аро(а) по отношению к необработанным контрольным клеткам.
Отдельные антисмысловые олигонуклеотиды отбирают для дальнейшего исследования с помощью анализа эффекта дозы.
Выбранные антисмысловые олигонуклеотиды исследуют в первичных гепатоцитах человека с 25 нМ, 50 нМ, 150 нМ или 300 нМ концентрациями антисмыслового олигонуклеотида, как указано в Таблице 2 ниже. После периода лечения приблизительно 16 часов, из клеток выделяют RNA и измеряют уровни mRNA аро(а) с помощью количественной PCR в реальном времени. Набор праймер-зонда аро(а) человека hAPO(a)3' используют для измерения уровней mRNA. Уровни mRNA аро(а) нормализуют для экспрессии mRNA GAPDH. Результаты представлены в виде процента ингибирования аро(а) по отношению к необработанным контрольным клеткам.
ISIS 144367 продемонстрирует более высокую эффективность и зависимость от дозы, чем другие антисмысловые олигонуклеотиды. Следовательно, ISIS 144367 считают контрольным антисмысловым олигонуклеотидом для сравнения специфичной активности недавно разработанных антисмысловых олигонуклеотидов, раскрытых в данном документе.
Пример 2: Антисмысловое ингибирование аро(а) человека в первичных гепатоцитах трансгенных мышей
Не так давно были созданы антисмысловые олигонуклеотиды, специфичные по отношению к нуклеиновой кислоте аро(а), и было исследовано их воздействие на mRNA аро(а) in vitro. Антисмысловые олигонуклеотиды исследуют на специфическую активность в серии параллельных экспериментов, которые имеют одинаковые условия культивирования. В этом исследовании используют первичные гепатоциты от трансгенных мышей с аро(а) человека (Frazer, К.A. et al., Nat. Genet. 1995. 9: 424-431). Гепатоциты при плотности 35000 клеток на лунку трансфецируют с помощью электропорации с 1000 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После периода лечения приблизительно 24 часов, из клеток выделяют RNA и измеряют уровни mRNA аро(а) с помощью количественной PCR в реальном времени. Набор праймер-зонда человека hAPO(a)12 т.н. используют для измерения уровней mRNA. Уровни mRNA аро(а) корректируют в соответствии с общим содержанием RNA, которое измеряют с помощью RIBOGREEN. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. ISIS 144367 используют в качестве контрольного соединения в случае новых антисмысловых олигонуклеотидов, которые также содержатся в исследовании. Результаты представлены в виде процента ингибирования аро(а) по отношению к необработанным контрольным клеткам. В общей сложности при этих условиях культивирования исследуют 1511 гэпмеров. Только те антисмысловые олигонуклеотиды, которые были выбраны для дальнейшего исследования, представлены в таблице ниже, причем каждая таблица представляет отдельный эксперимент.
Недавно разработанные гибридные антисмысловые олигонуклеотиды создают в виде гэпмеров 5-10-5 МОЕ. Гэпмеры имеют 20 нуклеозидов в длину, при том что центральный сегмент разрыва состоит из десяти 2-дезоксинуклеозидов и окружен концевыми сегментами в 5' направлении и в 3' направлении, каждое из которых содержит пять нуклеозидов. Каждый нуклеозид в 5' концевом сегменте и каждый нуклеозид в 3' концевом сегменте имеют модификацию 2-МОЕ. Межнуклеозидные связи в каждом гэпмере представляют собой тиофосфатные (P=S) связи. Все остатки цитозина в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитозины.
Последовательность-мишень аро(а) содержит несколько повторяющихся последовательностей двойной петли, и, следовательно, антисмысловой олигонуклеотид может быть специфическим к одной или нескольким областям аро(а), в зависимости от того, присутствует ли в олигонуклеотиде-мишени последовательность двойной петли, или нет. "Начальный сайт" указывает на 5'-крайний нуклеозид, к которому направлен гэпмер в последовательности человека. "Сайт остановки" указывает на 3'-крайний нуклеозид, к которому направлен гэпмер в последовательности человека. Антисмысловой олигонуклеотид аро(а) может иметь более одного "начального сайта" или "сайта остановки", в зависимости от того, присутствует или нет повторение двойной петли.
Большинство гэпмеров, приведенных в Таблицах, имеют специфичность со 100% комплементарностью к одной или более области либо mRNA аро(а) человека, обозначенной в данном документе как SEQ ID NO: 1 (регистрационный номер GENBANK NM_005577.2), либо геномной последовательности аро(а) человека, обозначенной в данном документе в виде SEQ ID NO: 2 (регистрационный номер GENBANK NT_007422.12, усеченная из нуклеотидов от 3230000 до 3380000), либо обе. 'н/д' указывает на то, что антисмысловой олигонуклеотид не специфичен к этой конкретной последовательности со 100% комплементарностью.
Таблица 10
Пример 3: дозозависимое антисмысловое ингибирование аро(а) в первичных гепатоцитах трансгенных мышей
Гэпмеры из исследований, описанные выше, которые демонстрируют значительное in vitro ингибирование mRNA аро(а), отбирают и исследуют при различных дозах в первичных гепатоцитах трансгенных мышей в серии параллельных исследований с одинаковыми условиями культивирования. Клетки высевают при плотности 35000 на лунку и трансфицируют с помощью электропорации с концентрациями антисмыслового олигонуклеотида 0,0625 мкМ, 0,125 мкМ, 0,25 мкМ, 0,500 мкМ или 1,000 мкМ. После периода лечения приблизительно 16 часов, из клеток выделяют RNA и измеряют уровни mRNA аро(а) с помощью количественной PCR в реальном времени. Набор праймер-зонда аро(а) человека hAPO(a)12 т.н. используют для измерения уровней mRNA. Уровни mRNA аро(а) корректируют в соответствии с общим содержанием RNA, которое измеряют с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования аро(а) по отношению к необработанным контрольным клеткам.
50
Результаты каждого из исследований изображены в Таблицах, представленных ниже, при том что каждая таблица представляет отдельный эксперимент. Также в таблицах представлена половина максимальной ингибирующей концентрации (IС) каждого олигонуклеотида. В клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, уровни mRNA аро(а) были значительно дозозависимо снижены. Специфическую активность недавно созданных олигонуклеотидов сравнивают с контрольным олигонуклеотидом ISIS 144367.
Как представлено в Таблицах выше, ISIS 494157 (SEQ ID NO: 12), ISIS 494158 (SEQ ID NO: 13), ISIS 494159 (SEQ ID NO: 14), ISIS 494160 (SEQ ID NO: 15), ISIS 494161 (SEQ ID NO: 16), ISIS 494162 (SEQ ID NO: 17), ISIS 494163 (SEQ ID NO: 18), ISIS 494164 (SEQ ID NO: 19), ISIS 494165 (SEQ ID NO: 20), ISIS 494167 (SEQ ID NO: 22), ISIS 494168 (SEQ ID NO: 23), ISIS 494169 (SEQ ID NO: 24), ISIS 494170 (SEQ ID NO: 25), ISIS 494230 (SEQ ID NO: 105), ISIS 494243 (SEQ ID NO: 106), ISIS 494244 (SEQ ID NO: 107), ISIS 494283 (SEQ ID NO: 26), ISIS 494284 (SEQ ID NO: 27), ISIS 494285 (SEQ ID NO: 28), ISIS 494286 (SEQ ID NO: 29), ISIS 494287 (SEQ ID NO: 30), ISIS 494288 (SEQ ID NO: 31), ISIS 494290 (SEQ ID NO: 32), ISIS 494291 (SEQ ID NO: 33), ISIS 494292 (SEQ ID NO: 35), ISIS 494294 (SEQ ID NO: 36), ISIS 494299 (SEQ ID NO: 37), ISIS 494300 (SEQ ID NO: 38), ISIS 494301 (SEQ ID NO: 39), ISIS 494302 (SEQ ID NO: 40), ISIS 494303 (SEQ ID NO: 41), ISIS 494304 (SEQ ID NO: 42), ISIS 494305 (SEQ ID NO:43), ISIS 494306 (SEQ ID NO: 44), ISIS 494311 (SEQ ID NO: 47), ISIS 494334 (SEQ ID NO: 48), ISIS 494336 (SEQ ID NO: 49), ISIS 494337 (SEQ ID NO: 50), ISIS 494338 (SEQ ID NO: 133), ISIS 494371 (SEQ ID NO: 57), ISIS 494372 (SEQ ID NO: 58), ISIS 494373 (SEQ ID NO: 59), ISIS 494374 (SEQ ID NO: 60), ISIS 494375 (SEQ ID NO: 61), ISIS 494386 (SEQ ID NO: 62), ISIS 494389 (SEQ ID NO: 65), ISIS 494390 (SEQ ID NO: 66), ISIS 494392 (SEQ ID NO: 68), ISIS 494466 (SEQ ID NO: 108), ISIS 494470 (SEQ ID NO: 109), ISIS 494472 (SEQ ID NO: 110), ISIS 494521 (SEQ ID NO: 51), ISIS 494530 (SEQ ID NO: 53), ISIS 498229 (SEQ ID NO: 75), ISIS 498238 (SEQ ID NO: 76), ISIS 498239 (SEQ ID NO: 77), ISIS 498240 (SEQ ID NO: 78), ISIS 498241 (SEQ ID NO: 79), ISIS 498243 (SEQ ID NO: 81), ISIS 498379 (SEQ ID NO: 70), ISIS 498408 (SEQ ID NO: 71), ISIS 498433 (SEQ ID NO: 72), ISIS 498434 (SEQ ID NO: 73), ISIS 498435 (SEQ ID NO: 74), ISIS 498517 (SEQ ID NO: 85), ISIS 498523 (SEQ ID NO: 92), ISIS 498524 (SEQ ID NO: 93), ISIS 498525 (SEQ ID NO: 94), ISIS 498550 (SEQ ID NO: 97), ISIS 498580 (SEQ ID NO: 103), ISIS 498581 (SEQ ID NO: 104), ISIS 498721 (ATGCCTCGATAACTCCGTCC; SEQ ID NO: 134), ISIS 498833 (SEQ ID NO: 86), ISIS 498875 (SEQ ID NO: 89) и ISIS 499020 (SEQ ID NO: 90) являются более высокоактивными, чем ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Пример 4: дозозависимое антисмысловое ингибирование аро(а) в первичных гепатоцитах трансгенных мышей
Высокоактивные гэпмеры из исследований, описанных выше, дополнительно отбирают и исследуют при различных дозах первичных гепатоцитах трансгенных мышей в серии исследований с аналогичными условиями культивирования. Клетки высевают при плотности 35000 на лунку и трансфицируют с использованием электропорации с концентрациями антисмыслового олигонуклеотида 0,049 мкМ, 0,148 мкМ, 0,444 мкМ, 1,333 мкМ или 4,000 мкМ, как указано в Таблицах ниже. После периода лечения приблизительно 16 часов, из клеток выделяют RNA и измеряют уровни mRNA аро(а) с помощью количественной PCR в реальном времени. Набор праймер-зонда аро(а) человека hAPO(a)12 т.н. используют для измерения уровней mRNA. Уровни mRNA аро(а) корректируют в соответствии с общим содержанием RNA, которое измеряют с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования аро(а) по отношению к необработанным контрольным клеткам.
50
Результаты каждого из исследований изображены в Таблицах, представленных ниже, при том что каждая таблица представляет отдельный эксперимент. Также в таблицах представлена половина максимальной ингибирующей концентрации (IС) каждого олигонуклеотида. В клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, уровни mRNA аро(а) были значительно дозозависимо снижены. Специфическую активность недавно созданных олигонуклеотидов сравнивают с контрольным олигонуклеотидом, ISIS 144367. Как представлено в Таблицах выше, ISIS 494157 (SEQ ID NO: 12), ISIS 494158 (SEQ ID NO:13), ISIS 494159 (SEQ ID NO:14), ISIS 494160 (SEQ ID NO: 15), ISIS 494161 (SEQ ID NO:16), ISIS 494162 (SEQ ID NO: 17), ISIS 494163 (SEQ ID NO: 18), ISIS 494164 (SEQ ID NO: 19), ISIS 494230 (SEQ ID NO: 105), ISIS 494243 (SEQ ID NO: 106), ISIS 494244 (SEQ ID NO: 107), ISIS 494283 (SEQ ID NO: 26), ISIS 494284 (SEQ ID NO: 27), ISIS 494285 (SEQ ID NO: 28), ISIS 494286 (SEQ ID NO: 29), ISIS 494287 (SEQ ID NO: 30), ISIS 494290 (SEQ ID NO: 32), ISIS 494292 (SEQ ID NO: 35), ISIS 494300 (SEQ ID NO: 38), ISIS 494301 (SEQ ID NO: 39), ISIS 494302 (SEQ ID NO: 40), ISIS 494303 (SEQ ID NO: 41), ISIS 494304 (SEQ ID NO: 42), ISIS 494305 (SEQ ID NO: 43), ISIS 494306 (SEQ ID NO: 44), ISIS 494310 (SEQ ID NO: 46), ISIS 494311 (SEQ ID NO: 47), ISIS 494337 (SEQ ID NO: 50), ISIS 494371 (SEQ ID NO: 57), ISIS 494372 (SEQ ID NO: 58), ISIS 494375 (SEQ ID NO: 61), ISIS 494388 (SEQ ID NO: 64), ISIS 494389 (SEQ ID NO: 65), ISIS 494390 (SEQ ID NO: 66), ISIS 494392 (SEQ ID NO: 68), ISIS 494466 (SEQ ID NO: 108), ISIS 494470 (SEQ ID NO: 109), ISIS 494472 (SEQ ID NO: 110), ISIS 498238 (SEQ ID NO: 76), ISIS 498239 (SEQ ID NO: 77), ISIS 498433 (SEQ ID NO: 72), ISIS 498434 (SEQ ID NO: 73), ISIS 498435 (SEQ ID NO: 74), ISIS 498523 (SEQ ID NO: 92), ISIS 498524 (SEQ ID NO: 93), ISIS 498525 (SEQ ID NO: 94), ISIS 498580 (SEQ ID NO: 103) и ISIS 498581 (SEQ ID NO: 104) являются более высокоактивными, чем ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Пример 5: Антисмысловое ингибирование аро(а) человека в первичных гепатоцитах трансгенных мышей
Не так давно были созданы антисмысловые олигонуклеотиды, специфические по отношению к нуклеиновой кислоте аро(а), и было исследовано их воздействие на mRNA аро(а) in vitro. Антисмысловые олигонуклеотиды исследуют в серии экспериментов, которые имеют одинаковые условия культивирования. В этом исследовании используют первичные гепатоциты от трансгенных мышей с аро(а) человека. Гепатоциты при плотности 35000 клеток на лунку трансфецируют с помощью электропорации с 1000 нМ антисмыслового олигонуклеотида. После периода лечения приблизительно 24 часов, из клеток выделяют RNA и измеряют уровни mRNA аро(а) с помощью количественной PCR в реальном времени. Набор праймер-зонда человека hAPO(a)12 т.н. используют для измерения уровней mRNA. Уровни mRNA аро(а) корректируют в соответствии с общим содержанием RNA, которое измеряют с помощью RIBOGREEN. Результаты каждого эксперимента представлены в отдельных таблицах, приведенных ниже. Также в исследованиях для сравнения содержится ISIS 144367. Результаты представлены в виде процента ингибирования аро(а) по отношению к необработанным контрольным клеткам. В общей сложности, при этих условиях культивирования исследуют 231 гэпмеров. Ниже представлены только те антисмысловые олигонуклеотиды, которые были выбраны для дальнейшего исследования.
Недавно разработанные гибридные антисмысловые олигонуклеотиды создают в виде гэпмеров 3-10-4 МОЕ. Гэпмеры имеют 17 нуклеозидов в длину, при том что центральный сегмент разрыва состоит из десяти 2'-дезоксинуклеозидов и окружен концевыми сегментами 5'-направлении и в 3'-направлении, которые содержат три нуклеозида и четыре нуклеозида, соответственно. Каждый нуклеозид в 5' концевом сегменте и каждый нуклеозид в 3' концевом сегменте имеют модификацию 2'-МОЕ. Межнуклеозидные связи в каждом гэпмере представляют собой тиофосфатные (P=S) связи. Все остатки цитозина в каждом гэпмере представляют собой 5-метилцитозины.
Последовательность-мишень аро(а) содержит несколько повторяющихся последовательностей двойной петли, и, следовательно, антисмысловой олигонуклеотид может быть специфическим к одной или нескольким областям аро(а), в зависимости от того, присутствует ли в олигонуклеотиде-мишени последовательность двойной петли, или нет."Начальный сайт" указывает на 5'-крайний нуклеозид, к которому направлен гэпмер в последовательности человека. "Сайт остановки" указывает на 3'-крайний нуклеозид, к которому направлен гэпмер в последовательности человека. Антисмысловой олигонуклеотид аро(а) может иметь более одного "начального сайта" или "сайта остановки", в зависимости от того, присутствует или нет повторение двойной петли.
Большинство гэпмеров, приведенных в Таблицах, специфичны со 100% комплементарностью ко множеству областей либо mRNA аро(а) человека, обозначенного в данном документе как SEQ ID NO: 1 (регистрационный номер GENBANK NM_005577.2), либо геномной последовательности аро(а) человека, обозначенной в данном документе в виде SEQ ID NO: 2 (регистрационный номер GENBANK NT_007422.12, усеченная из нуклеотидов от 3230000 до 3380000), либо на обе. 'н/д' указывает на то, что антисмысловой олигонуклеотид не специфичен к этой конкретной последовательности со 100% комплементарностью.
Пример 6: дозозависимое антисмысловое ингибирование аро(а) в первичных гепатоцитах трансгенных мышей
Высокоактивные гэпмеры из исследований, описанных выше, дополнительно отбирают и исследуют при различных дозах первичных гепатоцитах трансгенных мышей в серии исследований с аналогичными условиями культивирования. Клетки высевают при плотности 35000 на лунку и трансфицируют с использованием электропорации с концентрациями антисмыслового олигонуклеотида 0,156 мкМ, 0,313 мкМ, 0,625 мкМ, 1,250 мкМ или 2,500 мкМ, как указано в Таблицах ниже. После периода лечения приблизительно 16 часов, из клеток выделяют RNA и измеряют уровни mRNA аро(а) с помощью количественной PCR в реальном времени. Набор праймер-зонда аро(а) человека hAPO(a)12 т.н. используют для измерения уровней mRNA. Уровни mRNA аро(а) корректируют в соответствии с общим содержанием RNA, которое измеряют с помощью RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования аро(а) по отношению к необработанным контрольным клеткам.
50
Результаты каждого из исследований изображены в Таблицах, представленных ниже, при том что каждая таблица представляет отдельный эксперимент. Также в таблицах представлена половина максимальной ингибирующей концентрации (IС) каждого олигонуклеотида.
В клетках, обработанных антисмысловым олигонуклеотидом, уровни mRNA аро(а) были значительно дозозависимо снижены. Специфическую активность недавно созданных олигонуклеотидов сравнивают с контрольным олигонуклеотидом, ISIS 144367. Как представлено в Таблицах выше, ISIS 510542 (SEQ ID NO: 111), ISIS 510545 (SEQ ID NO: 114), ISIS 510546 (SEQ ID NO: 115), ISIS 510547 (SEQ ID NO: 116), ISIS 510548 (SEQ ID NO: 117), ISIS 510549 (SEQ ID NO: 118), ISIS 510595 (SEQ ID NO: 119), ISIS 510597 (SEQ ID NO: 120), ISIS 510598 (SEQ ID NO: 121), ISIS 510701 (SEQ ID NO: 127), ISIS 510702 (SEQ ID NO: 128), ISIS 510704 (SEQ ID NO: 129), ISIS 512944 (SEQ ID NO: 123), ISIS 512947 (SEQ ID NO: 124), ISIS 512958 (SEQ ID NO: 125) и ISIS 512959 (SEQ ID NO: 126) являются более высокоактивными, чем ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Пример 7: эффект in vivo антисмыслового ингибирования apo(a) человека у трансгенных мышей с аро(а) человека
Трансгенные мыши с геном аро(а) человека (Frazer, К.A. et al., Nat. Genet. 1995. 9: 424-431) используют в исследованиях, описанных ниже. Антисмысловые олигонуклеотиды ISIS, которые продемонстрируют статистически значимое ингибирование mRNA аро(а) in vitro, как описано выше, в этой модели оценивают дополнительно.
Исследование 1
Самок трансгенных мышей с аро(а) человека содержат при 12-часовом цикле свет/темнота и кормят ad libitum обычной лабораторной едой. Мышей разделяют на терапевтические группы, которые состоят из 4 мышей каждая. Эти группы получают внутрибрюшинные инъекции ISIS 494159, ISIS 494160, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494163, ISIS 494230, ISIS 494243, ISIS 494244, ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302, ISIS 494304, ISIS 494466, ISIS 494470, ISIS 494472, ISIS 498239, ISIS 498408, ISIS 498517, ISIS 494158, ISIS 494311, ISIS 494337, ISIS 494372, ISIS 498238, ISIS 498523, ISIS 498525, ISIS 510548, ISIS 512944, ISIS 512947 или ISIS 512958 при дозе 25 мг/кг два раза в неделю в течение 2 недель. Одна группа мышей получает внутрибрюшинные инъекции PBS дважды в неделю в течение 2 недель. Группа PBS служит в качестве контрольной группы. Через два дня после последней дозы, мышей умерщвляют, органы собирают и осуществляют анализы.
Ингибирование mRNA аро(а) человека
Суммарную RNA экстрагируют из печени некоторых из терапевтических групп и количественно определяют mRNA аро(а) человека с помощью RT-PCR. Результаты представлены в Таблице 35, выраженные в виде процента ингибирования mRNA аро(а) по сравнению с контролем PBS.
Данные демонстрируют значительное ингибирование mRNA аро(а) несколькими олигонуклеотидами ISIS. ISIS 494159 (SEQ ID NO: 14), ISIS 494162 (SEQ ID NO: 17), ISIS 494163 (SEQ ID NO: 18), ISIS 494243 (SEQ ID NO: 106), ISIS 494244 (SEQ ID NO: 107), ISIS 494283 (SEQ ID NO: 26), ISIS 494284 (SEQ ID NO: 27), ISIS 494285 (SEQ ID NO: 28), ISIS 494301 (SEQ ID NO: 39) и ISIS 498408 (SEQ ID NO: 71) являются более высокоактивными, чем контрольное соединение ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Ингибирование протеина аро(а) человека
Протеин аро(а) человека в плазме измеряют во всех терапевтических группах с использованием набора Аро(а) ELISA (Mercodia 10-1106-01, Уппсала, Швеция). Результаты представлены в Таблице 36, выраженные в виде процента ингибирования mRNA аро(а) по сравнению с контролем PBS.
Данные демонстрируют значительное ингибирование mRNA аро(а) несколькими олигонуклеотидами ISIS. ISIS 494159 (SEQ ID NO: 14), ISIS 494244 (SEQ ID NO: 82), ISIS 494283 (SEQ ID NO: 26), ISIS 494284 (SEQ ID NO: 27), ISIS 494285 (SEQ ID NO: 28), ISIS 494286 (SEQ ID NO: 29), ISIS 494301 (SEQ ID NO: 39) и ISIS 494302 (SEQ ID NO: 40) были также высокоактивны, или более высокоактивны, чем контрольное соединение ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Исследование 2
ISIS 494159, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494163 и ISIS 494243 дополнительно оценивают на этой трансгенной модели. ISIS 144367 представлен для сравнения.
Лечение
Самцов трансгенных мышей с аро(а) человека разделяют на терапевтические группы, которые состоят из 4 мышей каждая. Эти группы получают внутрибрюшинные инъекции ISIS 144367, ISIS 494159, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494163 или ISIS 494243 при дозах 1,5 мг/кг, 5 мг/кг, 15 мг/кг или 50 мг/кг два раза в неделю в течение 2 недель. Одна группа мышей получает внутрибрюшинные инъекции PBS дважды в неделю в течение 2 недель. Группа PBS служит в качестве контрольной группы. Через два дня после последней дозы, мышей умерщвляют, органы собирают и осуществляют анализы.
Ингибирование mRNA аро(а) человека
Суммарную RNA экстрагируют из печени терапевтических групп и количественно определяют mRNA аро(а) человека с помощью RT-PCR. Результаты представлены в Таблице 37, выраженные в виде процента ингибирования mRNA аро(а) по сравнению с контролем PBS.
Данные демонстрируют значительное ингибирование mRNA аро(а) несколькими олигонуклеотидами ISIS. ISIS 494159 (SEQ ID NO: 14), ISIS 494161 (SEQ ID NO: 16), 494162 (SEQ ID NO:17) и ISIS 94163 (SEQ ID NO: 18) были более эффективными, чем контрольное соединение ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11). Снижение уровней протеина аро(а) человека
Кровь собирают в терапевтических группах, а уровни протеина аро(а) человека количественно определяют с помощью набора Аро(а) ELISA (Mercodia 10-1106-01, Уппсала, Швеция). Результаты представлены в Таблице 38, выраженные в виде снижения уровней протеина аро(а) по сравнению с контролем PBS.
Данные демонстрируют значительное снижение уровней протеина аро(а) в плазме с помощью отдельных олигонуклеотидов ISIS. ISIS 494159 (SEQ ID NO: 14), ISIS 494161 (SEQ ID NO: 16), ISIS 494162 (SEQ ID NO: 17) и ISIS 494163 (SEQ ID NO: 18) были более эффективными, чем контрольное соединение ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Исследование 3
ISIS 494244, ISIS 494283 и ISIS 494284 дополнительно оценивают на этой трансгенной модели. ISIS 144367 представлен для сравнения.
Лечение
Самцов трансгенных мышей с аро(а) человека разделяют на терапевтические группы, которые состоят из 4 мышей каждая. Эти группы получают внутрибрюшинные инъекции ISIS 144367, ISIS 494244, ISIS 494283 или ISIS 494284 в дозах 0,75 мг/кг, 2,5 мг/кг, 7,5 мг/кг или 25 мг/кг два раза в неделю в течение 2 недель. Одна группа мышей получает внутрибрюшинные инъекции PBS дважды в неделю в течение 2 недель. Группа PBS служит в качестве контрольной группы. Через два дня после последней дозы, мышей умерщвляют, органы собирают и осуществляют анализы. Ингибирование mRNA аро(а) человека
Суммарную RNA экстрагируют из печени терапевтических групп и количественно определяют mRNA аро(а) человека с помощью RT-PCR. Результаты представлены в Таблице 39, выраженные в виде процента ингибирования mRNA аро(а) по сравнению с контролем PBS.
Данные демонстрируют значительное ингибирование mRNA аро(а) несколькими олигонуклеотидами ISIS. ISIS 494244 (SEQ ID NO: 107), ISIS 494283 (SEQ ID NO: 26) и ISIS 494284 (SEQ ID NO: 27) были более эффективными, чем контрольное соединение ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Снижение уровней протеина аро(а) человека
Кровь собирают в терапевтических группах, а уровни протеина аро(а) человека количественно определяют с помощью набора Аро(а) ELISA (Mercodia 10-1106-01, Уппсала, Швеция). Результаты представлены в Таблице 40, выраженные в виде снижения уровней протеина аро(а) по сравнению с контролем PBS.
Данные демонстрируют значительное снижение уровней протеина аро(а) в плазме с помощью отдельных олигонуклеотидов ISIS. ISIS 494244 (SEQ ID NO: 107), ISIS 494283 (SEQ ID NO: 26) и ISIS 494284 (SEQ ID NO: 27) были более эффективными, чем контрольное соединение ISIS 144367 (SEQ ID NO: 11).
Исследование 4
ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302 и ISIS 494311 дополнительно оценивают на этой трансгенной модели.
Лечение
Самцов трансгенных мышей с аро(а) человека разделяют на терапевтические группы, которые состоят из 4 мышей каждая. Эти группы получают внутрибрюшинные инъекции ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302 или ISIS 494311 в дозах 5 мг/кг, 15 мг/кг, или 50 мг/кг один раз в неделю в течение 2 недель. Одна группа из 3 мышей получает внутрибрюшинные инъекции PBS один раз в неделю в течение 2 недель. Группа PBS служит в качестве контрольной группы. Через два дня после последней дозы, мышей умерщвляют, органы собирают и осуществляют анализы.
Ингибирование mRNA аро(а) человека
Суммарную RNA экстрагируют из печени терапевтических групп и количественно определяют mRNA аро(а) человека с помощью RT-PCR. Результаты представлены в Таблице 41, выраженные в виде процента ингибирования mRNA аро(а) по сравнению с контролем PBS. Данные демонстрируют значительное ингибирование mRNA аро(а) ISIS 494285 (SEQ ID NO: 28), ISIS 494286 (SEQ ID NO: 29), ISIS 494301 (SEQ ID NO: 39), ISIS 494302 (SEQ ID NO: 40) и ISIS 494311 (SEQ ID NO: 47).
Снижение уровней протеина аро(а) человека
Кровь собирают в терапевтических группах, а уровни протеина аро(а) человека количественно определяют с помощью набора Аро(а) ELISA (Mercodia 10-1106-01, Уппсала, Швеция). Результаты представлены в Таблице 42, выраженные в виде снижения уровней протеина аро(а) по сравнению с контролем PBS. Данные демонстрируют значительное снижение уровней протеина аро(а) в плазме с помощью ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302 и ISIS 494311.
Исследование 5
ISIS 494372, ISIS 498524, ISIS 498581, ISIS 498721 и ISIS 498833 дополнительно оценивают на этой трансгенной модели.
Лечение
Самцов трансгенных мышей с аро(а) человека разделяют на терапевтические группы, которые состоят из 4 мышей каждая. Эти группы получают внутрибрюшинные инъекции ISIS 494372, ISIS 498524, ISIS 498581, ISIS 498721 или ISIS 498833 в дозах 5 мг/кг, 15 мг/кг или 50 мг/кг один раз в неделю в течение 2 недель. Одна группа из 3 мышей получает внутрибрюшинные инъекции PBS один раз в неделю в течение 2 недель. Группа PBS служит в качестве контрольной группы. Через два дня после последней дозы, мышей умерщвляют, органы собирают и осуществляют анализы.
Ингибирование mRNA аро(а) человека
Суммарную RNA экстрагируют из печени терапевтических групп и количественно определяют mRNA аро(а) человека с помощью RT-PCR. Результаты представлены в Таблице 43, выраженные в виде процента ингибирования mRNA аро(а) по сравнению с контролем PBS. Данные демонстрируют значительное ингибирование mRNA аро(а) ISIS 494372 (SEQ ID NO: 28), ISIS 498524 (SEQ ID NO: 93), ISIS 498581 (SEQ ID NO: 104) и ISIS 498721 (ATGCCTCGATAACTCCGTCC; SEQ ID NO: 134).
Снижение уровней протеина apo(a) человека
Кровь собирают в терапевтических группах, а уровни протеина аро(а) человека количественно определяют с помощью набора Аро(а) ELISA (Mercodia 10-1106-01, Уппсала, Швеция). Результаты представлены в Таблице 44, выраженные в виде снижения уровней протеина аро(а) по сравнению с контролем PBS. Данные демонстрируют значительное ингибирование уровней протеин аро(а) в плазме ISIS 494372 (SEQ ID NO: 28), ISIS 498581 (SEQ ID NO: 104) и ISIS 498721 (ATGCCTCGATAACTCCGTCC; SEQ ID NO: 134).
Пример 8: Переносимость антисмысловых олигонуклеотидов, направленных на аро(а) человека в моделях грызунов
Антисмысловые олигонуклеотиды гэпмера, направленные на аро(а) человека, отбирают из исследований, описанных выше, для исследований переносимости на мышах CD1 и крысах Sprague Dawley. Грызуны не экспрессируют эндогенные аро(а), а, следовательно, эти исследования изучают переносимость каждого антисмыслового олигонуклеотида человека у животного, а не любых фенотипических изменений, которые могут быть вызваны с помощью ингибирования аро(а) у животного.
Переносимость у мышей CD1: Исследование 1
Мыши CD1 (Charles River, MA) представляют собой мышиную модель, имеющую несколько назначений, часто используемую для исследования безопасности и эффективности. Мышей обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, выбранными из исследований, описанных выше, и оценивают на изменения уровней различных маркеров химии плазмы.
Лечение
Группам самцов мышей CD1 вводят подкожно два раза в неделю в течение 6 недель 50 мг/кг ISIS 494159, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494244, ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302, ISIS 494311, ISIS 494337, ISIS 494372 и ISIS 510548. Одной группе шестинедельных мышей CD1 вводят внутрибрюшинные инъекции PBS дважды в неделю в течение 6 недель. Мышей умерщвляют через 48 часов после последней дозы и собирают органы и плазму для дальнейшего анализа.
Маркеры химии плазмы
Чтобы оценить влияние олигонуклеотидов ISIS на функции печени и почек, измеряют плазменные уровни трансаминаз, билирубина, альбумина, креатинина и мочевины с использованием автоматического биохимического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилль, NY). Результаты представлены в Таблице 45. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывают изменения в уровнях любого из маркеров функции печени или почек за пределами ожидаемого диапазона в случае антисмысловых олигонуклеотидов, исключают из дальнейших исследований.
Массы органов
Массы печени, селезенки и почек измеряют в конце исследования и представляют в Таблице 46. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывают изменения в массах органов за пределами ожидаемого диапазона в случае антисмысловых олигонуклеотидов, исключают из дальнейших исследований.
Переносимость у крыс Sprague Dawlev
Крысы Sprague-Dawley представляют собой модель, используемую для исследования безопасности и эффективности. Крыс обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, выбранными из исследований, описанных выше, и оценивают на изменения уровней различных маркеров химии плазмы.
Лечение
Группам самцов крыс Sprague-Dawley вводят подкожно два раза в неделю в течение 8 недель 30 мг/кг ISIS 494159, ISIS 494161, ISIS 494162, ISIS 494244, ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494285, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302, ISIS 494311, ISIS 494337, ISIS 494372 и ISIS 510548. Одной группе из шести самцов крыс Sprague Dawley вводят PBS подкожно два раза в неделю в течение 8 недель. Крыс умерщвляют через 48 часов после последней дозы и собирают органы и плазму для дальнейшего анализа.
Маркеры химии плазмы
Чтобы оценить влияние олигонуклеотидов ISIS на функции печени и почек, измеряют плазменные уровни трансаминаз, билирубина, альбумина, креатинина и мочевины с использованием автоматического биохимического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилль, NY). Результаты представлены в Таблице 47. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывают изменения в уровнях любого из маркеров функции печени или почек за пределами ожидаемого диапазона, в случае антисмысловых олигонуклеотидов исключают из дальнейших исследований.
Функция почки
Чтобы оценить влияние олигонуклеотидов ISIS на функцию почек, измеряют уровни общего белка и креатинина в мочевине с использованием автоматического биохимического анализатора (Hitachi Olympus AU400e, Мелвилль, NY). Результаты представлены в Таблице 48, выраженные в мг/дл.
Массы органов
Массы печени, селезенки и почек измеряют в конце исследования и представляют в таблице 49. Олигонуклеотиды ISIS, которые вызывают изменения в массах органов за пределами ожидаемого диапазона в случае антисмысловых олигонуклеотидов, исключают из дальнейших исследований.
Результаты исследований переносимости на грызунах показали, что, в целом, с учетом того, что все маркеры переносимость экранированы, ISIS 494372 является наиболее хорошо переносимым антисмысловым соединением как в мышиной модели CD1, так и модели крыс Sprague Dawley.
Пример 9: Фармакокинетика антисмыслового олигонуклеотида у мышей CD1
Мышей CD1 обрабатывают олигонуклеотидами ISIS и оценивают концентрации олигонуклеотидов в печени и почках. Лечение
Группам самцов мышей CD1 вводят подкожно два раза в неделю в течение 6 недель 50 мг/кг ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302 или ISIS 494372. Мышей умерщвляют через 2 дня после последней дозы. Печень собирают для анализа. Измерение концентрации олигонуклеотида
Измеряют концентрацию общей концентрации олигонуклеотида. Используемый способ является модификацией ранее опубликованных способов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), которая состоит из экстракции фенол-хлороформ (жидкостно-жидкостной), за которой следует твердофазная экстракция. Внутренний стандарт (ISIS 355868, 27-мер 2'-O-метоксиэтил модифицированный тиофосфатный олигонуклеотид, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, созданный в данном документе в виде SEQ ID NO: 131) добавляют перед экстракцией. Концентрации образцов ткани рассчитывают с использованием калибровочных кривых с нижним пределом количественного определения (LLOQ) от приблизительно 1,14 мкг/г. Периоды полураспада затем рассчитывают с использованием программного обеспечения WinNonlin (PHARSIGHT).
Результаты представлены в Таблице 50, выраженные в мкг/г печеночной или почечной ткани. Данные демонстрируют, что ISIS 494372 в печени и почках был на приемлемой концентрации.
Пример 10: Фармакокинетика антисмыслового олигонуклеотида у крыс Sprague Dawley
Крыс Sprague Dawley обрабатывают олигонуклеотидами ISIS и оценивают концентрации олигонуклеотидов в печени и почках. Лечение
Группам самцов мышей CD1 вводят подкожно два раза в неделю в течение 3 недель 10 мг/кг ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302 или ISIS 494372. Крыс умерщвляют через 2 дня после последней дозы. Печень собирают для анализа.
Измерение концентрации олигонуклеотида
Измеряют концентрацию общей концентрации олигонуклеотида. Используемый способ является модификацией ранее опубликованных способов (Leeds et al., 1996; Geary et al., 1999), которая состоит из экстракции фенол-хлороформом (жидкостно-жидкостной), за которой следует твердофазная экстракция. Внутренний стандарт (ISIS 355868, 27-мер 2'-O-метоксиэтил модифицированный тиофосфатный олигонуклеотид, GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCGTTTTTT, созданный в данном документе в виде SEQ ID NO: 131), добавляют перед экстракцией. Концентрации образцов ткани рассчитывают с использованием калибровочных кривых с нижним пределом количественного определения (LLOQ) от приблизительно 1,14 мкг/г. Периоды полураспада затем рассчитывают с использованием программного обеспечения WinNonlin (PHARSIGHT).
Результаты представлены в Таблице 51, выраженные в мкг/г печеночной или почечной ткани. Данные демонстрируют, что ISIS 494372 в печени и почках был на приемлемой концентрации.
Пример 11: эффект антисмысловых олигонуклеотидов ISIS, направленных на аро(а) человека у яванских макак
Макак обрабатывают антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS, выбранными из исследований, описанных выше. В то время, как проводилось данное исследование, геномная последовательность яванских макак не была доступна в базе данных National Center for Biotechnology Information (NCBI); поэтому, перекрестная реактивности с последовательностью гена яванских макак не может быть подтверждена. Вместо этого, последовательности антисмысловых олигонуклеотидов ISIS, используемых у яванских макак, сравнивают с последовательности макаки-резуса на гомологию. Ожидается, что олигонуклеотиды ISIS с гомологией к последовательности макаки-резуса также являются полностью перекрестно-реактивными с последовательностью яванских макак.
Исследуемые антисмысловые олигонуклеотиды человека также являются перекрестно-реактивными с последовательностью mRNA макаки-резуса (ХМ 001098061.1; созданная в данном документе в виде SEQ ID NO: 132). Чем больше взаимодополняемость между олигонуклеотидом человека и последовательностью макаки-резуса, тем более вероятно, что олигонуклеотид человека может перекрестно реагировать с последовательностью макаки-резуса. Начальный сайты и сайт остановки каждого олигонуклеотида с SEQ ID NO: 132 представлены в таблице 52. Каждая из мишеней антисмысловых олигонуклеотидов находится более чем в одной области в SEQ ID NO: 132 и имеют несколько начальных сайтов. "Начальный сайт" указывает на 5'-крайний нуклеозид, к которому направлен гэпмер в последовательности макаки-резуса. 'Несоответствия' указывает на количество нуклеотидов, несоответствующих между последовательностью олигонуклеотида человека и последовательностью макаки-резуса.
Оценивают переносимость антисмыслового олигонуклеотида, а также его фармакокинетический профиль в печени и почках.
Лечение
Перед исследованием, обезьяны находятся в карантине в течение по крайней мере 30-дневного периода, в течение которого животные наблюдаются ежедневно на предмет общего состояния здоровья. Обезьяны были 2-4-летними и весили от 2 до 4 кг. Каждому из семи групп по четыре рандомизированных самцов яванских макак подкожно вводят олигонуклеотид ISIS или PBS с использованием для дозирования иглы из нержавеющей стали и шприца соответствующего размера в одно из четырех мест на спине обезьян. Инъекции вводят с вращением по часовой стрелке; одно место за дозирования. Обезьянам вводят четыре раза в неделю в течение первой недели (дни 1, 3, 5 и 7) в качестве ударных доз, а впоследствии один раз в неделю в течение 2-12 недель, 40 мг/кг ISIS 494283, ISIS 494284, ISIS 494286, ISIS 494301, ISIS 494302 или ISIS 494372. Контрольной группе из 8 яванских макак PBS вводят подкожно трижды четыре раза в неделю в течение первой недели (дни 1, 3, 5 и 7), а впоследствии несколько раз в неделю в течение 2-12 недель.
За исследуемый период, за обезьянами наблюдают по крайней мере один раз в день на предмет наличия признаков болезни или патологического состояния. Любое животное испытывает более чем кратковременную или легкую боль или патологическое состояние в связи с лечением, травмой или болезнью, которую ветеринар лечит утвержденными анальгетиками или средствами для облегчения боли после консультации с руководителем исследования. Любое животное при плохом состояние здоровья или при возможном состоянии угасания определяют для дальнейшего мониторинга и возможной эвтаназии. Например, одно животное в группе лечения ISIS 494302 было обнаружено умирающим на 56 день и было умерщвлено. Запланированную эвтаназию животных проводят в дни 86 и 87 с помощью обескровливания под глубоким наркозом. Протоколы, описанные в Примере, были одобрены Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
Целевое снижение
Анализ RNA
RNA экстрагируют на 86 день из ткани печени для PCR анализа аро(а) в реальном времени с использованием набора праймера-зонда ABI Hs00916691_ml (Applied Biosystems, Карлсбад, СА). Результаты представлены в виде процента ингибирования mRNA аро(а) по отношению к контролю PBS. Как показано в таблице 53, обработка антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS приводит к значительному снижению mRNA аро(а) по сравнению с контролем PBS.
Также измеряют уровни mRNA плазминогена, другого протеина, содержащего двойную петлю. Обработка ISIS 494372 не изменяет уровни mRNA плазминогена.
Анализ протеина
В разные дни, собирают один мл крови из головной, подкожной или бедренной вены у всех исследуемых обезьян. Образцы крови помещают в пробирки, которые содержат K2-EDTA для разделения плазмы. Чтобы получить плазму, пробирки центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 10 мин при комнатной температуре. Уровни протеина Аро(а) изучают с помощью набора Аро(а) ELISA (Mercodia 10-1106-01, Уппсала, Швеция). Результаты представлены в виде процентного изменения уровней от исходного значения. Как показано в Таблице 54, обработка отдельными антисмысловыми олигонуклеотидами ISIS приводит к значительному снижению уровней протеина аро(а) по сравнению с контролем PBS. В частности, лечение ISIS 494372 снижает уровни протеин аро(а) в плазме яванских макак.
Также в исследуемых группах измеряют уровни протеина ароВ. Антисмысловое ингибирование аро(а) не имеет никакого влияния на уровни ароВ.
Исследования переносимости
Измерения массы тела и органов
Чтобы оценить влияние олигонуклеотидов ISIS на общее состояние здоровья животных, массы тела и органов определяют на 86 день. Массу тела измеряют и представляют в Таблице 55. Массы органов измеряют и данные представляют в Таблице 56. Результаты демонстрируют, что лечение ISIS 494372 хорошо переносится в терминах массы тела и органов обезьян.
Функция печени
Чтобы оценить влияние олигонуклеотидов ISIS на функции печени, обезьяны голодают в течение ночи перед забором крови. У каждого животного отбирают приблизительно 1,5 мл крови и помещают их в пробирки без антикоагулянта для разделения сыворотки. Пробирки выдерживают при комнатной температуре в течение как минимум 90 мин, а затем центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы получить сыворотку. Уровни различных маркеров функции печени измеряют с использованием химического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Япония). Измеряют уровни ALT и AST в плазме, а результаты представляют в Таблице 57, выраженные в МЕ/л. Билирубин, маркер функции печени, измеряют аналогичным образом и представляют в Таблице 57, выраженный в мг/дл. Результаты демонстрируют, что лечение ISIS 494372 хорошо переносится в терминах функции печени у обезьян.
Анализ уровня С-реактивного белка
Чтобы оценить любой воспалительный эффект олигонуклеотидов ISIS у яванских макак, для анализа берут образцы крови. Обезьяны голодают в течение ночи перед забором крови. У каждого животного отбирают приблизительно 1,5 мл крови и помещают их в пробирки без антикоагулянта для разделения сыворотки. Пробирки выдерживают при комнатной температуре в течение как минимум 90 мин, а затем центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы получить сыворотку. С-реактивный белок (CRP), который синтезируется в печени и который служит в качестве маркера воспаления, измеряют с использованием химического анализатора Toshiba 200FR NEO(Toshiba Co., Япония). Результаты демонстрируют, что лечение ISIS 494372 не вызывает воспаление у обезьян.
Анализ комплемента С3
Чтобы оценить любое воздействие олигонуклеотидов ISIS на путь метаболизма комплемента у яванских макак, образцы крови для анализа отбирают на 84 день (перед использованием препарата) и на 85 день (через 24 часа после использования препарата). У каждого животного отбирают приблизительно 0,5 мл крови и помещают их в пробирки без антикоагулянта для разделения сыворотки. Пробирки выдерживают при комнатной температуре в течение как минимум 90 мин, а затем центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 10 мин при комнатной температуре, чтобы получить сыворотку. С3 измеряют с использованием химического анализатора Toshiba 200FR NEO (Toshiba Co., Япония). Результаты демонстрируют, что лечение ISIS 494372 не вызывает никакого влияния на путь метаболизма комплемента у обезьян.
Гематология
Для оценки влияния олигонуклеотидов ISIS у яванских макак на гематологические параметры, собирают образцы крови около 0,5 мл крови на 87 день от каждого из имеющихся исследуемых животных в пробирки, содержащие K2-EDTA. Образцы анализируют на количество красных кровяных клеток (RBC), белых кровяных клеток (WBC), а также количество тромбоцитов с использованием анализатора гематологии ADVIA120 (Bayer, USA). Данные представлены в Таблице 60.
Полученные данные свидетельствуют о том, что лечение с помощью ISIS 494372 хорошо переносится в терминах гематологических параметров обезьян.
Пример 12: Характеристика фармакологической активности ISIS 494372 у яванских макак
Фармакологическую активность ISIS 494372 характеризуют с помощью измерения уровней mRNA аро(а) в печени и аро(а) в плазме у обезьян, которым вводят соединение в течение 13 недель и оставляют для восстановления в течение еще 13 недель.
Лечение
Каждой из пяти групп 14 рандомизированных самцов и самок яванских макак вводят подкожно олигонуклеотид ISIS или PBS с использованием иглы для дозирования из нержавеющей стали и шприца соответствующего размера в одно из четырех мест на спине обезьян. Обезьянам вводят четыре раза в неделю в течение первой недели (дни 1, 3, 5 и 7) в качестве ударных доз, а впоследствии один раз в неделю в течение 2-13 недель в качестве поддерживающих доз, как показано в Таблице ниже. Ударная доза в течение первой недели выражается в мг/кг/дозу, в то время как поддерживающие дозы на 2-13 неделю выражены в мг/кг/неделю.
Образцы печени животных берут на промежуточных, конечных этапах и при возвращении к норме после исследования для анализа mRNA аро(а). Кроме того, образцы плазмы собирают в различные дни для измерения уровней протеина аро(а). Это неклиническое исследование проводят в соответствии с United States Food and Drug Administration (FDA) Good Laboratory Practice (GLP) Regulations, CFR 21 часть 58.
Анализ RNA
Образцы печени собирают у обезьян в дни 30, 93 и 182 и замораживают. Если коротко, то часть (0,2 г) замороженной печени гомогенизируют в 2 мл раствора RLT (Qiagen). Полученный лизат наносят на мини-колонки Qiagen RNeasy. После очистки и количественного определения ткани подвергают анализу RT-PCR. Perkin-Elmer ABI Prism 7700 Sequence Detection System, который использует в режиме реального времени флуоресцентной детекции RT-PCR, используют для количественной оценки mRNA аро(а). Анализ основан на мишень-специфическом зонде, меченном флуоресцентным репортером и красителями-гасителями люминисценции на противоположных концах. Зонд подвергают гидролизу с помощью 5'-экзонуклеазной активности полимеразы Taq DNA, что приводит к увеличению эмиссии флуоресценции репортерного красителя, который может быть обнаружен в ходе реакции. Набор зондов (набор зондов ABI Rhesus LPA ID Rh02789275_ml, Applied Biosystems, Карлсбад, CA), специфичный по отношению к положению 1512 последовательности транскрипта mRNA аро(а) макаки-резуса регистрационный номер GENBANK ХМ_001098061.2 (SEQ ID NO: XXX), используют для измерения уровней экспрессии mRNA аро(а) в печени яванских макак. Экспрессию Аро(а) нормализуют с использованием RIBOGREEN. Результаты представлены в виде процента ингибирования mRNA аро(а)по отношению к контролю PBS.
Как показано в Таблице 62, лечение ISIS 494372 приводит к дозозависимому снижению mRNA аро(а) по сравнению с контролем PBS. На 30 день, экспрессию печеночного mRNA аро(а) снижают дозозависимо на 74% и 99% в группах дозирования 12 мг/кг/неделю и 40 мг/кг/неделю, соответственно. Эти снижения являются статистически значимыми по однофакторному дисперсионному анализу (критерий множественных сравнений Dunnett's, Р<0,05).
Уровни mRNA аро(а) измеряют во время этапа возвращения к норме. Уровни экспрессии в печени, на 88 день после последней дозы, все еще снижена на 49% и 69% в группах дозирования 12 мг/кг/неделю и 40 мг/кг/неделю, соответственно.
Анализ протеина
Приблизительно 20 мкл плазмы анализируют с использованием коммерчески доступного набора аро(а) ELISA (Mercodia 10-1106-01, Уппсала, Швеция). Протокол анализа осуществляют таким образом, как описано производителем. Результаты представлены в Таблицах 63 и 64, как процентное изменение относительно 1 Дня перед использованием концентрации протеин аро(а) в плазме. Статистически значимые различия от исходного значения аро(а) в плазме в 1 День с использованием критерия множественных сравнений Dunnett отмечен звездочкой.
Максимальное снижение протеина аро(а) в плазме наблюдают для всех групп дозирования на 93 День. На этапе возвращения к норме, уровни протеин аро(а) в плазме в группе дозирования 40 мг/кг/неделю составляют 22% и 93% от исходного уровня после 4 и 13 недель (Дни 121 и 182) восстановления, соответственно. Скорость восстановления в группе 12 мг/кг/неделю была такой же, как и в группе 40 мг/кг/неделю.
Пример 13: измерение вязкости антисмысловых олигонуклеотидов ISIS, направленных на аро(а) человека
Вязкость отдельных антисмысловых олигонуклеотидов из исследований, описанных выше, измеряют с целью отсеивания антисмысловых олигонуклеотидов, которые имеют вязкость более 40 сП. Олигонуклеотиды, имеющие вязкость больше, чем 40 сП, могут иметь вязкость меньше оптимальной.
Олигонуклеотиды ISIS (32-35 мг) навешивают в стеклянную пробирку, добавляют 120 мкл воды, а антисмысловой олигонуклеотид растворяют в растворе с помощью нагрева пробирки при 50°С. Часть (75 мкл) предварительно нагретой пробы отмеряют пипеткой в микро-вискозиметр (Cambridge). Температуру микро-вискозиметра устанавливают на 25°С и измеряют вязкость образца. Другую часть (20 мкл) из предварительно нагретого образца отмеряют пипеткой в 10 мл воды для UV чтения при 260 нМ при 85°С (прибор Сагу UV). Результаты представлены в Таблице 65 и демонстрируют, что большинство растворов антисмысловых олигонуклеотидов являются оптимальными в их вязкости по критерию, указанному выше. Те, что не были оптимальными, помечают как 'вязкие'. В частности, ISIS 494372 является оптимальной по своей вязкости относительно критерия, указанного выше.