Система CRISPR-Cas12 для выявления гена exoU, кодирующего экзотоксин системы секреции третьего типа, Pseudomonas aeruginosa, в ультранизких концентрациях
CRISPR-CAS12 SYSTEM FOR DETECTING THE EXOU GENE ENCODING THE TYPE 3 SECRETION SYSTEM EXOTOXIN, PSEUDOMONAS AERUGINOSA, AT ULTRA-LOW CONCENTRATIONS

Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к числу средств направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas 12 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) гена exoU, кодирующего экзотоксин системы секреции третьего типа, Pseudomonas aeruginosa.
Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии гена exoU Pseudomonas aeruginosa.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции гена exoU, кодирующего экзотоксин системы секреции третьего типа, Pseudomonas aeruginosa, после проведения специфической амплификации фрагмента ДНК гена exoU. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для борьбы с распространением антибиотикоустойчивых бактериальных патогенов и штаммов, которые вызывают наиболее тяжелую инфекцию с высоким риском смертельных исходов.
Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR-Cas. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR-Cas системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.
В 2018 году было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Cas12 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную, а также двухцепочечную ДНК. Такое свойство Cas12 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR транс репортер). Впервые DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека (HPV). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas12a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте HPV, флуоресцентную репортерную молекулу. Технология DETECTR используется для обнаружения целевой ДНК-мишени после предварительной амплификации [J.S. Chen, Е. Ma, L.B. Harrington, М. Da Costa, X. Tian, J.M. Palefsky, J.A. Doudna, CRISPR-Cas 12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity, Science 360(6387) (2018) 436-439].
He менее важным приложением системы CRISPR-Cas является идентификация бактериальных патогенов и детекция специфических бактериальных генов. Так, например, с помощью платформы SHERLOCK удалось корректно генотипировать ряд штаммов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa при низкой перекрестной реактивности. Кроме того, платформа SHERLOCK использована для дифференциации клинических изолятов Klebsiella pneumoniae с двумя различными генами антибиотикоустойчивости, что открывает значительные перспективы к созданию мультиплексных систем для одновременной идентификации бактеральных патогенов и выявления у них генов антибиотикоустойчивости.
В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления генов антибиотикоустойчивости и генов, кодирующих экзотоксины, у бактериальных патогенов, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR-Cas.
Из уровня техники также известны решения, направленные на разработку и получение направляющих РНК для регулирования состава микробных популяций с помощью программируемых нуклеаз, в том числе CRISPR-Cas (патент US 10760065), сенсибилизацию и/или устранения целевых патогенных бактерий и проведение дезинфекции (патенты CN 110029121, ЕР 3798304, WO 2019067621). По патенту RU 25313143 известно решение по созданию подходов на основе технологий CRISPR-Cas для генотипирования микроорганизмов.
Кроме того, известны научные статьи, описывающие применение системы направленного редактирования генома CRISPR-Cas для идентификации и изучения генов организма-хозяина, участвующих в цитотоксичности, обусловленной экзотоксином ExoU Pseudomonas aeruginosa [V. Deruelle, S. Bouillot, V. Job et al., The bacterial toxin ExoU requires a host trafficking chaperone for transportation and to induce necrosis, Nat Commun 12 (2021) 4024, https://doi.org/10.1038/s41467-021-24337-9; S. Bagayoko, S.A. Leon-Icaza, M. Pinilla et al., Host phospholipid peroxidation fuels ExoU-dependent cell necrosis and supports Pseudomonas aeruginosa-driven pathology, PLoS pathogens 17(9) (2021) e1009927, https://doi.org/10.1371/iournal.ppat.10099271.
Ближайшими аналогами заявляемого решения являются изобретения по патентам RU 2743861, RU 2734520, RU 2745637, направленные на получение направляющих РНК, предназначенных для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения для выявления гена антибиотикоустойчивости blaVIM-2 Pseudomonas aeruginosa на основе CRISPR технологий. Однако, для расширения спектра подобных диагностических систем и совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний необходимо разрабатывать новые методы для выявления Pseudomonas aeruginosa, обладающих отличными от blaVIM-2 генетическими маркерами.
Исходя из вышеизложенного, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости разработки и получения направляющих РНК для выявления единичных копий гена exoU, кодирующего экзотоксин системы секреции третьего типа, Pseudomonas aeruginosa, in vitro.
Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология основанная на CRISPR-Cas является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, генотипирование инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости и генов, кодирующих экзотоксины, бактериальных патогенов.
Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:
• высокая чувствительность;
• возможность проведения диагностики у постели больного;
• возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;
• скорость и простота анализа;
• сниженная стоимость анализа;
• отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;
• отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.
Изобретение относится к новым средствам - направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции гена exoU, кодирующего экзотоксин системы секреции третьего типа, Pseudomonas aeruginosa, в биологических образцах.
Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 с белками Cas12, например, LbCpf1 из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления гена exoU Pseudomonas aeruginosa.
При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления гена exoU Pseudomonas aeruginosa до единичных копий ДНК в одной реакции. Изобретение не имеет коммерчески доступных аналогов и обладает высокой эффективностью выявления гена exoU Pseudomonas aeruginosa.
Технический результат достигается за счет:
• разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультра чувствительного выявления гена exoU Pseudomonas aeruginosa, где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 1-3, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками гена exoU Pseudomonas aeruginosa, содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий гена exoU Pseudomonas aeruginosa.
• применения РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, полученной согласно способу, разработанному авторами ранее (Патент РФ №2707542, дата приоритета 28.03.2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR-Cas, пригодных для детекции гена exoU Pseudomonas aeruginosa в ультра низких концентрациях (единичные копии).
• разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-7, для предварительной амплификации фрагмента гена exoU Pseudomonas aeruginosa.
• оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагмента гена exoU Pseudomonas aeruginosa.
• определения условий проведения ультрачувствительной детекции гена exoU Pseudomonas aeruginosa и установления последовательности стадий метода.
Предложена молекула направляющей РНК системы CRISPR-Cas, которая способна связываться с целевыми высококонсервативными участками гена exoU Pseudomonas aeruginosa. Нуклеотидная последовательность, раскрытой в настоящей заявке, направляющей РНК выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 1-3.
Молекула направляющей РНК содержит в своем составе РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae.
Молекула направляющей РНК обеспечивает выявление единичных копий гена exoU Pseudomonas aeruginosa.
Направляющие РНК согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным фрагментам гена exoU Pseudomonas aeruginosa. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:
• SEQIDNO: 1;
• SEQ ID NO: 2;
• SEQ ID NO: 3;
• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,
• или комплементарной любой из них,
• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.
Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы системы CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, пригодные для использования для выявления гена exoU Pseudomonas aeruginosa в ультранизких концентрациях (единичные копии).
Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas для выявления гена exoU Pseudomonas aeruginosa, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК.
Предложенный рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR-Cas пригоден для выявления единичных копий гена exoU Pseudomonas aeruginosa.
Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1-3, объединенную с белком системы CRISPR-Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.
Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения гена exoU Pseudomonas aeruginosa, с инструкцией по применению.
Набор для обнаружения гена exoU Pseudomonas aeruginosa, может содержать рибонуклеопротеиновый комплекс и инструкцию по применению.
При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR-Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.
Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высококонсервативных фрагментов гена exoU Pseudomonas aeruginosa, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 4-7.
Специфические олигонуклеотиды для проведения предварительной амплификации фрагмента гена exoU Pseudomonas aeruginosa согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативному участку гена exoU Pseudomonas aeruginosa. Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:
• SEQ ID NO: 4;
• SEQ ID NO: 5;
• SEQ ID NO: 6;
• SEQ ID NO: 7;
• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,
• или комплементарной любой из них,
или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.
Предложенная технология позволяет определить единичные копии гена exoU Pseudomonas aeruginosa, в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих Pseudomonas aeruginosa. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие гена exoU Pseudomonas aeruginosa.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Визуализация амплифицированного фрагмента exoU-1 гена exoU Pseudomonas aeruginosa (размером 144 п.о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов For 1104 и Rev 1104 при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-9 обозначены:
1 Продукт, полученный в ходе амплификации 20000 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-1;
2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2000 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-1;
3 Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-1;
4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-1;
5 Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-1;
6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-1;
7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-1;
8 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-1;
9 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T- pGEM-T-exoU-1;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 2. Визуализация амплифицированного фрагмента exoU-2 гена exoU Pseudomonas aeruginosa (размером 125 п. о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов For 2018/1982 и Rev 2018/1982при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-9 обозначены:
1 Продукт, полученный в ходе амплификации 20000 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-2;
2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2000 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-2;
3 Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-2;
4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-2;
5 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-2;
6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-2;
7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-2;
8 Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-exoU-2;
9 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T- pGEM-T-exoU-2;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).
Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени exoU-1 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA exoU №1104 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы PGEM-T-EXOU-1 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA exoU №1104, где:
- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;
- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;
- на кривых 1-9 показано количество копий ДНК на реакцию, а именно:
1 -58 900 копий/реакция;
2 5890000 копий/реакция;
3 - 589000 копий/реакция;
4 - 5 890 копий/реакция;
5 - 589 копий/реакция;
6 - 58,9 копий/реакция;
7 - 5,89 копий/реакция;
8 - 1,77 копий/реакция;
9 - mQ (маркер молекулярных масс).
Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени exoU-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA exoU №1982 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы PGEM-T-EXOU-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA exoU №1982, где:
- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;
- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;
- на кривых 1-9 показано количество копий ДНК на реакцию, а именно:
10 5 890 копий/реакция;
11 -5 890000 копий/реакция;
12 - 58 900 копий/реакция;
13 - 589000 копий/реакция;
14 589 копий/реакция;
15 - 58,9 копий/реакция; 16-5,89 копий/реакция;
17 - 1,77 копий/реакция;
18 - mQ (маркер молекулярных масс).
Фиг. 5. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени exoU-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA exoU №2018 и белок LbCpf1, на котором посредством графика визуализировано выявление модельной матрицы PGEM-T-EXOU-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющую РНК crRNA exoU №2018, где:
- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;
- по горизонтали указано время флуоресценции, в минутах;
- на кривых 1-9 показано количество копий ДНК на реакцию, а именно:
19 - 5 890000 копий/реакция;
20 589000 копий/реакция;
21 - 589 копий/реакция; 22-5 890 копий/реакция;
23 - 58,9 копий/реакция;
24 - 1,77 копий/реакция;
25 - 58 900 копий/реакция;
26 - 5,89 копий/реакция;
27 - mQ (маркер молекулярных масс).
Фиг. 6. Фиг. 6. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней exoU-1 и exoU-2 Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащим направляющие РНК crRNA exoU №1104, crRNA exoU №1982, crRNA exoU №2018, где посредством графика визуализировано выявление гена exoU-2 Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, при этом:
- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;
- по горизонтали указано количество копий модельной матрицы в реакции;
- столбцом  визуализирована эффективность выявления единичных копий гена exoU Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе модельных матриц, с использованием crRNA exoU №1104;
- столбцом визуализирована эффективность выявления единичных копий гена exoU Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе модельных матриц, с использованием crRNA exoU №1982;
- столбцом  визуализирована эффективность выявления единичных копий гена exoU Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе модельных матриц, с использованием crRNA exoU №2018.
Фиг. 7. Визуализация амплифицированного с клинических образцов фрагмента exoU-1 гена exoU Pseudomonas aeruginosa (размером 144 п.о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов For 1104 и Rev 1104 при помощи электрофореза в агарозном геле, где каждому образцу присвоен идентификатор - буквенно-числовое значение.
Фиг.8. Визуализация амплифицированного с клинических образцов фрагмента exoU-2 гена exoU Pseudomonas aeruginosa (размером 125 п.о.) после предварительной амплификации с использованием олигонуклеотидов For 2018/1982 и Rev 2018/1982при помощи электрофореза в агарозном геле, где каждому образцу присвоен идентификатор -буквенно-числовое значение.
Фиг. 9. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней exoU-1 и exoU-2 гена exoU Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащим направляющие РНК crRNA exoU №1104, crRNA exoU №1982, crRNA exoU №2018, где посредством графика визуализировано выявление гена exoU Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae на ограниченной панели клинических образцов, при этом:
- по вертикали указаны значения нормализированного флуоресцентного сигнала, создаваемого красителем;
- по горизонтали указаны идентификаторы образца;
- столбцом  показана эффективность выявления гена exoU Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA exoU №1104;
- столбцом показана эффективность выявления гена exoU Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA exoU №1982;
- столбцом  показана эффективность выявления гена exoU Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов, с использованием crRNA exoU №2018.
Примеры осуществления изобретения
ПРИМЕР 1: ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНЕ EXOU PSEUDOMONAS AERUGINOSA PSEUDOMONAS AERUGINOSA ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК
Для подбора последовательностей-мишеней в гене exoU Pseudomonas aeruginosa для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology/). Был составлен перечень участков в гене exoU Pseudomonas aeruginosa с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1). Направляющие РНК, специфически узнающие высоко консервативный участок гена exoU Pseudomonas aeruginosa, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-3.
ПРИМЕР 2: ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНА EXOU PSEUDOMONAS AERUGINOSA МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИ
Подготовку материала для обнаружения гена exoU Pseudomonas aeruginosa проводили методом предварительной амплификации. В качестве модельных матриц гена exoU Pseudomonas aeruginosa биологического образца использовали плазмидные ДНК:
1) pGEM-T-exoU-1, содержащую в своем составе фрагмент гена exoU Pseudomonas aeruginosa с 1053 по 1196 п. о. (размером 144 п.о.), и
2) pGEM-T-exoU-2, содержащую в своем составе фрагмент гена exoU Pseudomonas aeruginosa с 1934 по 2058 п. о. (размером 125 п.о.)
Предварительную амплификацию участков, соответствующих фрагментам гена exoU Pseudomonas aeruginosa, проводили с использованием специфических олигонуклеотидов с SEQIDNO: 4 и SEQIDNO: 5 для получения фрагмента exoU-1 и SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 для получения фрагмента exoU-2, приведенных в Таблице 2.
ПЦР-продукты, кодирующие фрагменты exoU-1 и exoU-2 гена exoU Pseudomonas aeruginosa, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов For 1104 и Rev 1104, For 2018/1982 и Rev 2018/1982, соответственно (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента exoU-1 составлял 144 пары нуклеотидов, exoU-2 - 125 пар нуклеотидов (Таблица 3).
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов фрагментов гена exoU Pseudomonas aeruginosa:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;
2. 40 циклов амплификации:
95°С - 15 сек,
55°С - 45 сек,
72°С - 30 сек;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.
В ходе подготовки материала для обнаружения гена exoU Pseudomonas aeruginosa методом предварительной амплификации проводили титрование модельных матриц pGEM-T-exoU-1 и pGEM-T-exoU-2 путем приготовления серийных разведений (Таблица 4).
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные фрагменты гена exoU Pseudomonas aeruginosa визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле (фиг.1, 2).
Подготовленный описанным способом материал использовали для экспериментов по выявлению гена exoU Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК crRNA exoU №1104, crRNA exoU №1982, crRNA exoU №2018, без предварительной очистки.
ПРИМЕР 3: ПОЛУЧЕНИЕ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК И СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ГЕНА EXOU PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Для получения направляющих РНК для обнаружения гена exoU Pseudomonas aeruginosa был разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 5. Получение направляющих РНК проводили в несколько этапов:
1. получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (табл.5), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым высоко консервативным участком гена exoU Pseudomonas aeruginosa, содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachno sp irac еае;
2. очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту гена exoU Pseudomonas aeruginosa;
3. синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту гена exoU Pseudomonas aeruginosa;
4. очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту гена exoU Pseudomonas aeruginosa.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA exoU №1104, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и crRNA 1104 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA exoU №1104, составлял 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA exoU №1982, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и crRNA 1982 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA exoU №1982, составлял 62 пары нуклеотидов.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA exoU №2018, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов Т7рг и crRNA 2018 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA exoU №2018, составлял 62 пары нуклеотидов.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;
2. 35 циклов амплификации:
95°С - 15 сек,
55°С - 45 сек,
72°С - 30 сек;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.
ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагментам гена exoU Pseudomonas aeruginosa, визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле.
Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагментам гена exoU Pseudomonas aeruginosa, проводили с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагментам гена exoU Pseudomonas aeruginosa, использовали в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК.
Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагментам гена exoU Pseudomonas aeruginosa, осуществляли методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждали из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.
Создание готового рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего белок семейства CRISPR-Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, и направляющую РНК авторы проводили по стандартному протоколу с некоторыми модификациями [С.Anders, М. Jinek, In vitro enzymology of Cas9, Methods Enzymol. 546 (2014) 1-20, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-51.
Непосредственно перед объединением с Cas-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 нг) прогревали при 90°С в течение 5 минут и позволяли медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов Cas-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.
Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг Cas-белка LbCpf1 из Lachnospiraceae и подготовленную направляющую РНК смешивали и инкубировали 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления гена exoU Pseudomonas aeruginosa.
ПРИМЕР 4: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ ГЕНА EXOU PSEUDOMONAS AERUGINOSA С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНОЙ МАТРИЦЫ
Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, использовали в качестве матрицы для обнаружения гена exoU Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.
Для обнаружения гена exoU Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas готовили реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:
• 10 × буфер (100 mM TrisHCl рН 8,0, 1 М NaCl);
• 50 mM MgC12 (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM);
• 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющие РНК crRNA exoU №1104, crRNA exoU №1982, crRNA exoU №2018);
• 10 pmol флуоресцентный зонд (6FAM-TTATT-BHQ1);
• Мишень (предварительно амплифицированные фрагменты гена exoU Pseudomonas aeruginosa);
• вода mQ.
Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещали в амплификатор QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) и задавали следующие параметры реакции:
30-60 циклов:
37°С - 35 сек,
37°С - 25 сек, съемка флуоресценции.
В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий гена exoU Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельных матриц - плазмидной ДНК pGEM-T-exoU-1, содержащей в своем составе фрагмент гена exoU Pseudomonas aeruginosa с 1053 по 1196 п.о. размером 144 п.о., и плазмидной ДНК pGEM-T-exoU-2, содержащей в своем составе фрагмент гена exoU Pseudomonas aeruginosa с 1934 по 2058 п. о. размером 125 п. о.
Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas обладают способностью выявлять единичные копий гена exoU Pseudomonas aeruginosa. Типичные результаты анализа приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированных мишеней exoU-1 и exoU-2 гена exoU Pseudomonas aeruginosa, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA exoU №1104, crRNA exoU №1982, crRNA exoU №2018 и белок LbCpf1, на Фиг. 3, Фиг. 4 и Фиг. 5, соответственно. Отметим, что в среднем уже на 18-ом цикле анализа (18 минут) значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,77 копий/реакция) гена exoU Pseudomonas aeruginosa, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) минимум в пять раз, а к 30-ому циклу (30 минут анализа) в 10 и более раз.
В ходе работ была оценена эффективность выявления единичных копий гена exoU Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе модельных матриц, с использованием различных направляющих РНК. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas, сформированные на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющих РНК, выявляют единичные копии гена exoU Pseudomonas aeruginosa с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: crRNA exoU №2018 > crRNA exoU №1104 ≥ crRNA exoU №1982 (Фиг. 6).
ПРИМЕР 5: ОБНАРУЖЕНИЕ ГЕНА EXOU PSEUDOMONAS AERUGINOSA С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ОГРАНИЧЕННОЙ ПАНЕЛИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ
Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (17 шт. ), содержащих Pseudomonas aeruginosa, несущую ген exoU (ранее подтверждено методом секвенирования следующего поколения).
Для обнаружения единичных копий гена exoU Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas была проведена предварительная амплификация фрагментов этого гена. Для проведения предварительной амплификации из 17 биологических образцов, полученных от пациентов, с помощью коммерчески доступного набора DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, США) были выделены ДНК согласно инструкции производителя.
ПЦР-продукты, кодирующие фрагменты гена exoU Pseudomonas aeruginosa, получали в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации. Полученные продукты визуализировали при помощи электрофореза в агарозном геле (фиг.7, 8).
Полученный таким способом материал использовали в качестве матрицы для обнаружения единичных копий гена exoU Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.
Обнаружение единичных копий гена exoU Pseudomonas aeruginosa с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas проводили способом, описанным в Примере 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR-Cas обладают способностью выявлять ген exoU Pseudomonas aeruginosa в препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов. При этом в среднем уже на 20 цикле (20 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) более чем в 5 раз, а к 35 циклу (35 минут) анализа - более чем в 10 раз (Таблица 6).
Типичные результаты анализа приведены на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней exoU-1 и exoU-2 гена exoU Pseudomonas aeruginosa (17 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA exoU №1104, crRNA exoU №1982, crRNA exoU №2018 и белок LbCpf1, на Фиг. 9.
Эффективность выявления гена exoU Pseudomonas aeruginosa, содержащегося в составе препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов, с использованием различных направляющих РНК в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, оцененная по соотношению значений сигнала к значению «шума» при детекции, можно представить в следующем порядке по убыванию: crRNA exoU №2018 > crRNA exoU №1982 > crRNA exoU №1104 (Таблица 6).
Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют ультрачувствительно выявлять единичные копии гена exoU, кодирующего экзотоксин системы секреции третьего типа, Pseudomonas aeruginosa, и способны обнаруживать его препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов, после предварительной амплификации в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR-Cas.
--->
Перечень последовательностей
<110> ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
<120>
<160> NUMBER OF SEQ ID NO: NOS: 7
<210> SEQ ID NO: NO 1
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 1 (crRNA exoU №1104):
aau uuc uac uaa gug uag aua cag cgg gcc acu gcg gcg c 40
<210> SEQ ID NO: NO 2
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 2 (crRNA exoU №1982):
aau uuc uac uaa gug uag auc cga aac gca gga agc cuc g 40
<210> SEQ ID NO: NO 3
<211> 40
<212> RNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 3 (crRNA exoU №2018):
aau uuc uac uaa gug uag aug gca aac ccu uga guu cga c 40
<210> SEQ ID NO: NO 4
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 4 (For 1104):
gcc ggt ccc tga gat gat cg 20
<210> SEQ ID NO: NO 5
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 5 (Rev 1104):
acg acc cag ccc ttg agc gc 20
<210> SEQ ID NO: NO 6
<211> 20
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 6 (For 2018/1982):
cgg aaa tca atc aag cgc tg 20
<210> SEQ ID NO: NO 7
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
<400> SEQUENCE 7 (Rev 2018/1982):
gaa ctc ctt att ccg cca agc 21
<---