ОБЪЕДИНЕННАЯ АВТОМАТИЗИРОВАННАЯ ФИЛЬТРАЦИЯ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ, ПРОМЫВКИ И СУШКИ КРИСТАЛЛОВ ПЕПТИДОВ
COMBINED AUTOMATED FILTRATION FOR ISOLATION, WASHING AND DRYING OF PEPTIDE CRYSTALS

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к технологии производства и выделения биологических препаратов, более конкретно, технологии производства и выделения инсулина и его аналогов. Настоящее изобретение также относится к объединению стадий выделения кристаллов, последующей промывки кристаллов и сублимационной сушки в единый непрерывный способ для очистки инсулина и его аналогов.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Традиционно, препаративная кристаллизация белков включает в себя ряд стадий промывки (осажденных кристаллов) и гравитационного осаждения.
Конечный продукт препаративной кристаллизации белков далее подвергают вакуумной сублимационной сушке, получая лекарственную субстанцию (ЛС) в форме сухого порошка. Полученная лекарственная субстанция должна соответствовать универсальным стандартам качества и нормативным требованиям по чистоте в анализе остаточного вещества (RS), по содержанию влаги (LOD, потери в массе при высушивании), по содержанию сульфатной золы (ROI, остаток при сжигании) и по предельно допустимому содержанию остаточных растворителей. В целом для осуществления в промышленном масштабе процесса препаративной кристаллизации, осаждения кристаллов в резервуаре и промывки для удовлетворения желаемых требований к качеству, а также сублимационной сушки требуется как минимум 7 суток. Очевидно, что прерывистый и модульный характер этого процесса делает его энергоемким, дорогостоящим и затратным по времени.
Способы кристаллизации и очистки инсулина или аналогов инсулина раскрыты в WO2015084694, US8769841, WO1996040730, CN103512318 и US6408536, а также в WO 201603286930.
В WO2015084694 описан способ кристаллизации инсулина или аналогов инсулина в щелочных условиях, очистки кристаллов фильтрованием и сушки кристаллов, осажденных на фильтре, для получения композиций на основе кристаллического инсулина или аналогов инсулина. После проведения кристаллизации весь объем декантированной суспензии кристаллов далее переносят в фильтровальную установку. Фильтровальная установка, описанная в WO2015084694, представляет собой нутч-фильтр с перемешиванием, в конструкцию которого входит сетка из нержавеющей стали с размером пор примерно 5 мкм.
В US8769841 раскрыт способ сублимационной сушки по существу водного раствора, включающий по меньшей мере одну первую стадию, характеризующуюся первым уровнем температуры и давления (т.е. фазу первичной сушки), и по меньшей мере одну вторую стадию, характеризующуюся вторым уровнем температуры и давления, которая следует за первой стадией (т.е. фазу вторичной сушки).
В WO1996040730 раскрыт способ извлечения ацилированного белка, извлечение которого вызывает затруднение, посредством осаждения или кристаллизации и последующего фильтрования из водных растворов с получением в виде порошка. Ацилированными белками являются определенные ацилированные проинсулины, инсулины и аналоги инсулина. Данный способ включает сочетание подведения pH водного раствора до значения, близкого к изоэлектрическому значению pH белка, и добавления спирта в подходящей концентрации, чтобы вызвать осаждение белка в форме отделяемых фильтрованием частиц при таком подведенном значении pH.
В CN103512318 раскрыт способ сушки в ходе очистки лекарственных средств, который относится к обработке инсулина посредством лиофилизации, при этом в данном способе раскрыт способ сублимационной сушки инсулина. Здесь содержание примесей ниже, чем при использовании традиционной технологии. В этом способе исключено применение органических растворителей, что устраняет возможное неблагоприятное влияние на людей и окружающую среду и экономит 2-3 суток за счет уменьшения продолжительности сушки, и повышена производительность для случая промышленного применения.
В US6408536 раскрыт способ сушки кристаллов белков из водной суспензии кристаллов белков. Способ включает отфильтровывание кристаллов из водной суспензии, промывку осадка на фильтре, его сушку центрифугированием, сушку кристаллов в псевдоожиженном слое в потоке увлажненного азота и выгрузку высушенных кристаллов в контейнер с фланцем с использованием скачка давления азота.
В WO 2016032869 раскрыт способ кристаллизации инсулина или аналогов инсулина в щелочных условиях в присутствии цинка, который включает стадии получения раствора, содержащего инсулин или аналог инсулина, смешивающийся с водой органический растворитель и стабилизатор кристаллов, при этом раствор имеет рН, который составляет примерно от 7,0 до 8,5; добавления соли цинка к раствору для получения раствора для кристаллизации, инкубирования раствора для кристаллизации для кристаллизации инсулина или аналога инсулина с получением кристаллов инсулина или аналога инсулина. Затем кристаллам инсулина или аналога инсулина дают осесть для декантации раствора для кристаллизации с получением суспензии кристаллов, которую подают в фильтрующее устройство для удаления оставшегося раствора для кристаллизации из суспензии кристаллов с получением осадка кристаллов на фильтре, где поддерживается давление от 0,020 МПа до 0,048 МПа с использованием сухого азота, с промывкой осадка кристаллов на фильтре раствором для промывки осадка и сушкой осадка кристаллов с получением кристаллического инсулина или аналога инсулина. Это техническое решение является наиболее близким аналогом настоящего изобретения.
Несмотря на то, что для кристаллизации инсулина и его аналогов применяют несколько способов, существует потребность в разработке альтернативного способа, позволяющего иметь простой и оптимизированный способ кристаллизации, промывки и выделения кристаллов, а также их сушки, который может быть применен на практике в промышленности на оборудовании большего масштаба, работа которого могла бы быть основана на том же самом принципе.
Согласно настоящему изобретению предложен простой объединенный способ выделения и сушки инсулина и его аналогов.
ЦЕЛЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Цель настоящего изобретения заключается в объединении отдельных процессов кристаллизации, промывки кристаллов и сублимационной сушки в единый непрерывный способ с использованием фильтрации под давлением при одновременном достижении сопоставимых стандартов основных показателей качества и характеристик технологического процесса.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении описано объединение процессов препаративной кристаллизации, выделения кристаллов и сублимационной сушки инсулина и аналогов инсулина в единый непрерывный способ с использованием фильтрации под давлением. Данный способ способствует уменьшению затрат времени и описывает новую схему использования многократных промывок органическим растворителем и продувания газообразным азотом для удаления впитавшейся воды для получения конечной лекарственной субстанции, которая удовлетворяет основным предъявляемым к качеству требованиям.
В частном воплощении изобретения инсулин или аналоги инсулина имеют размер кристаллов в диапазоне 1-40 мкм.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 представлена блок-схема способа фильтрации под давлением для очистки инсулина и аналогов инсулина.
На Фиг. 2 представлено репрезентативное изображение лабораторного фильтра для работы под давлением.
На Фиг. 3 представлена лекарственная субстанция, полученная традиционным (слева) и новым (справа) способом.
На Фиг. 4 представлена диаграмма вариабельности для потерь/извлечения продукта в виде потерь в 15 %.
На Фиг. 5 представлена диаграмма вариабельности для содержания остаточной влаги в лекарственной субстанции в виде LOD (потери в массе при высушивании) в %.
На Фиг. 6 представлена диаграмма вариабельности для содержания высокомолекулярных продуктов (HMWP20) в %.
На Фиг. 7 представлена диаграмма отклонений для оценки чистоты в %.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
2
Термин “суспензия кристаллов” относится к образцу раствора, полученного путем добавления хлорида цинка (ZnCl) к раствору инсулина или аналога инсулина, за которым следует подведение pH до значения в диапазоне 4,5-8,5 с использованием кислоты/щелочи. Добавление цинка улучшает физическую стабильность инсулина благодаря мультимеризации.
Термин “фильтр” относится к простой установке, похожей на воронку Бюхнера, с размером пор используемой фильтровальной мембраны, варьирующим в диапазоне 1-15 мкм, для работы которой не требуется никакой центробежной силы.
Термин “фильтрация под давлением” относится к фильтрации смеси твердое вещество/жидкость, которая осуществляется под действием регулируемого давления, прижимающего раствор к фильтровальной мембране, в результате чего твердое вещество (кристаллический инсулин и аналог инсулина) остается в виде осадка на фильтре, в то время как маточная жидкость (органический растворитель) проходит в виде пермеата. Это внешнее давление приводит к увеличению эффективной скорости потока, формированию градиента высокого давления на мембране, а применение инертного газа обеспечивает стабильность конечного продукта. Фильтрация под давлением представляет собой быстрый процесс, характеризующийся временем исполнения в интервале 2-5 минут в лабораторном масштабе и 45-60 минут в промышленном масштабе.
Термин “инсулин” или “аналог инсулина” относится к пептидному гормону из 51 аминокислоты, используемому для лечения диабета. Он также относится к другим относящимся к инсулину формам, таким как предшественник инсулина или предшественник аналога инсулина, промежуточные молекулы инсулина или аналогов инсулина, получаемым в ходе осуществления технологии производства и выделения целевого продукта.
Описание изобретения
Инсулин и аналоги инсулина экспрессировали, применяя процесс ферментации с секрецией во внеклеточную среду, основанный на использовании рекомбинантного штамма Pichia. Трансфицированный штамм дрожжей Pichia pastoris ферментируют в культуральной среде. Секретированные инсулин или аналоги инсулина выделяли методом хроматографии.
Инсулин и аналог инсулина кристаллизовали из совокупного элюата после хроматографии. Затем в присутствии хлорида цинка (ZnCl2) и при соответствующем значении pH (в диапазоне 4,5-8,5) готовили суспензию кристаллов путем добавления кислоты или щелочи. Определяли характеристики суспензии кристаллов (процентное содержание твердых веществ, чистоту). Полученные кристаллы инсулина или аналога инсулина характеризовались высокой чистотой. Весь объем суспензии кристаллов промывали водой для удаления свободного осаждающего агента, использованного для кристаллизации, и переносили для дальнейшего проведения стадии сушки.
Сначала суспензию кристаллов в целях выделения обрабатывали с применением процесса фильтрации, получая подсушенный осадок на фильтре. В этом способе выделения не используется сила гравитации и центробежная сила.
Этот подсушенный осадок на фильтре содержал впитавшуюся воду, которую удаляют на стадиях его промывки органическим растворителем и продувки через него газообразного азота.
Единый непрерывный способ может быть представлен приведенными далее четырьмя стадиями.
1. Фильтрация под давлением суспензии кристаллов (первоначальная стадия выделения кристаллов).
2. Сушка: промывка органическими растворителями для вытеснения впитавшейся воды.
3. Сушка: окончательная продувка азотом для удаления остаточных органических растворителей.
4. Автоматическое дозирование высушенного порошка с соблюдением условий текущей надлежащей производственной практики (cGMP).
Аналогичное объединение стадий выделения, промывки и сушки кристаллов может быть выполнено в ходе комплексной предшествующей стадии кристаллизации во время осуществления технологии производства и выделения инсулина и аналогов инсулина.
Использовали исходное(ые) вещество(а), реагент(ы) и оборудование, которое(ые) приведено(ы) ниже в Таблицах 1, 2 и 3, соответственно.
2
Испытания проводили на лабораторной установке с фильтром для работы под давлением с площадью поперечного сечения фильтра приблизительно от 80 до 100 см. Установка также содержит входное отверстие для подачи под давлением сжатого инертного газа (азота), манометр и предохранительный выпускной клапан, входное и выходное отверстия для образца и водяную рубашку (Фиг. 2).
Варьировали следующие параметры: растворитель для промывки, объем растворителя, число промывок, продолжительность продувания азотом для каждой промывки, и существовала возможность замены фильтровального материала, что зависит от размера подвергаемых обработке кристаллов. Характеристики технологического процесса и показатели качества полученной лекарственной субстанции измеряли, анализируя выраженную в процентах потерю кристаллов в пермеате и потери в массе при высушивании (LOD), чистоту и молекулярную массу (HMWP). Температуру установки поддерживали в диапазоне от 25°C до 35°C. Осадок на фильтре, образованный в процессе фильтрации под давлением суспензии кристаллов инсулина и аналога инсулина, имел необходимую толщину и консистенцию. Однако задача состояла в том, чтобы высушить осадок на фильтре для достижения приемлемых стандартов по LOD и, что очень важно, объединить кристаллизацию и сублимационную сушку, применяемые в традиционном способе, в единый непрерывный способ. Чтобы достичь необходимого вытеснения впитавшейся остаточной воды из осадка на фильтре, были изучены стратегии однократной промывки и многократных промывок разными органическими растворителями. Кроме этого, были разработаны стадии промывки для обеспечения эффективного удаления осаждающих агентов и остаточных растворителей, которые присутствуют в совокупном элюате после обращенно-фазовой хроматографии, и получения лекарственной субстанции, которая соответствует универсальным стандартам качества и нормативным требованиям.
Конструкция установки(ок) для получения высушенного порошка непрерывным и автоматизированным способом была такой, как приведено ниже:
1) оборудование представляло собой цилиндрическую установку из нержавеющей стали (SS) с кожухом для поддержания необходимой внутренней температуры, а также для обеспечения прохождения (инертного) газа. Для этих испытаний использовали баллон с газообразным азотом и устройство для охлаждения воды Julabo. Температуру поддерживали в диапазоне 25-35°C;
2
2) фильтровальный материал площадью от 80 до 100 см помещали на подложку, представляющую собой сетку из SS и размещали в установке.
Материал для фильтра выбирали из PET 1703 (полиэфирного материал25 а) и SK-011 (полипропиленового материала);
3) установку герметично закрывали диском из SS с уплотнительной силиконовой прокладкой и закрепляли зажимы, чтобы сделать отсек герметичным, после чего заливали гомогенную неразбавленную суспензию из верхней части сосуда, чтобы начать фильтрацию под давлением;
4) через клапан одностороннего действия (NRV)/входное отверстие подавали газообразный азот под давлением в диапазоне от 1 бар (100 кПа) до 2,5 бар (250 кПа);
5) фильтрат/пермеат собирали через выходное отверстие для образца в нижней части;
6) стадии (3) и (4) повторяли для однократной промывки или многократных промывок осадка на фильтре с использованием органического растворителя;
7) сушку осуществляли путем добавления органического растворителя и последующего пропускания газообразного N2 5 в течение примерно трех минут, после чего установку открывали;
8) материал, содержащий осадок на фильтре, аккуратно извлекали и осторожно постукивали, чтобы извлечь осадок на фильтре, который затем переносили в стерильный воздухонепроницаемый цветной контейнер и хранили при -20°C до последующего анализа.
Проводили два испытания. Первое представляло собой предварительный скрининг (испытание I), а второе (испытание II) представляло собой план эксперимента (DOE).
Предварительные скрининговые испытания (испытание 1) проводили на лабораторном прототипе промышленного фильтра для работы под давлением (Фиг. 2) с применением разных органических растворителей, используя план, описанный в Таблице 4. В предпочтительном воплощении ацетонитрил был признан наилучшим рабочим органическим растворителем. Проводили изучение и скрининг фильтровальных материалов в отношении размера их пор, т.е. в отношении удерживания кристаллов, консистенции, пригодности в промышленном масштабе и стойкости/инертности в отношении pH и температурных условий данного способа. Использовали два типа фильтровального материала, а именно: полиэфирный материал и полипропиленовый материал. Органические растворители выбирали на основании их способности вытеснять воду из осадка на фильтре и их способности к испарению (Таблица 4). При выборе растворителей также учитывали рекомендации Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) в отношении приемлемых растворителей и их предельно допустимого остаточного содержания в конечной лекарственной субстанции.
Комбинации растворителей и промывок, дающие высокое выраженное в процентах значение LOD (потерь в массе при высушивании) в упомянутой выше схеме, исключали. Набор данных представлен в Таблице 5 и Таблице 6.
Зарегистрированные данные, приведенные в Таблице 5 и Таблице 6, свидетельствовали о том, что полученная лекарственная субстанция для производства препаратов инсулина и аналогов инсулина имеет показатели качества, сопоставимые с таковыми для лекарственной субстанции, получаемой в результате выполнения традиционного способа кристаллизации и сублимационной сушки, при оптимальном извлечении продукта (Фиг. 3).
Две промывки ацетонитрилом, запланированные в испытании I, дают соответствующий требованиям результат в отношении выраженного в процентах значения LOD. Однако для того, чтобы соответствовать нормативным требованиям, необходимо дальнейшее снижение LOD. Параметры, которые изучали в этой экспериментальной модели, включали: a) число промывок; b) продолжительность сушки и c) температуру в процессе фильтрования для изучения возможности влияния температуры на ускорение выпаривания остаточного органического растворителя, захваченного в осадок на фильтре.
В случае испытания II (DOE) также определяли HMWP.
Значения LOD, выделенные жирным шрифтом, являются истинными значениями, остальные представляют собой теоретические значения, основанные на концентрации продукта в неразбавленной суспензии.
LA: ацетонитрил, LP1: изопропанол,
LB1: бутанол, LEA: этилацетат, NS: неразбавленная суспензия, W1/2: промывка 1 и промывка 2, T1/2: испытание 1 и испытание 2; LOD: потери в массе при высушивании; NAP: данные отсутствуют, NAV: нет данных.
Полное многофакторное экспериментальное планирование наряду с полученными данными представлены в Таблице 6. Как показано ниже, было выполнено пятьдесят отдельных экспериментов (Таблица 6).
Лекарственные субстанции из испытаний 12, 23 и 34 демонстрировали самые низкие значения LOD, т.е. меньше 10% (Таблица 7), в то время как лекарственные субстанции из испытаний 11 и 42 демонстрировали значения LOD меньше 12%. Никаких существенных изменений в характеристиках чистоты и HMWP обнаружено не было, и постадийные потери оказались в пределах диапазона.
Результаты оценки вариабельности также представлены на Фиг. 4, 5, 6 и 7 для выраженной в процентах потери продукта, выраженного в процентах значения LOD, выраженного в процентах значения HMWP и выраженной в процентах чистоты, соответственно.
На основании этих многопараметрических исследований было установлено, что большее число промывок органическим растворителем (3>2>1) приводило к достаточному вытеснению из осадка на фильтре впитавшейся воды. Три промывки, включая промывку 1 с содержанием растворителя 10%, промывку 2 с содержанием 5% или 10% и промывку 3 с содержанием 5% или 10%, оказались наиболее эффективными для снижения LOD. Объем промывок может быть далее отрегулирован в соответствии с требованиями способа. Увеличение продолжительности сушки способствовало 10 вытеснению некоторого количества растворителя, впитавшегося в осадок на фильтре после промывки. Повышение температуры в ходе фильтрования не приводило к снижению значения LOD для лекарственной субстанции, а также не оказывало значительного влияния на характеристики лекарственной субстанции. Таким образом, температуру поддерживали в диапазоне от 25°C до 35°C. На основании результатов этого многопараметрического исследования могут быть разработаны и выполнены дальнейшие испытания с целью дальнейшего уменьшения LOD до значения <4%.
Результаты этого многопараметрического исследования были удовлетворительными и незамедлительно привлекли внимание к новому способу, который является менее продолжительным, является непрерывным, менее ресурсоемким и является автоматизированным.