СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕПРОЦЕССИРОВАННОГО И ЧАСТИЧНО ПРОЦЕССИРОВАННОГО НЕЙРОТОКСИНА НЕЙРОТОКСИНА ТИПА А
SYSTEM FOR DETECTING FULL-LENGTH AND PARTIALLY TRUNCATED TYPE A NEUROTOXIN

Настоящее изобретение относится к инструментам для контроля качества и безопасности в ходе производства нейротоксинов. В частности, изобретение относится к способу определения количества частично процессированного и/или непроцессированного полипептида нейротоксина типа A (BoNT/A) в растворе, содержащем процессированный и частично процессированный и/или непроцессированный BoNT/A, где указанный способ содержит стадию контактирования образца указанного раствора с захватывающим антителом, которое специфически связывается с частично процессированным и непроцессированным BoNT/A в условиях, допускающих связывание указанного антитела с указанным частично процессированным и непроцессированным BoNT/A, в результате чего образуется комплекс, и стадию определения количества образованного комплекса, где количество комплекса является показателем количества частичного процессированного и/или непроцессированного BoNT/A в указанном растворе. Кроме того, настоящее изобретение предполагает устройство и набор для осуществления указанного способа.
Clostridium botuiinum и Clostndium tetani продуцируют высокоиммуногенные нейротоксины, т.е. ботулотоксины (BoNTs) и тетанотоксин (TeNT), соответственно. Эти клостридиальные нейротоксины специфически связываются с нервными клетками и нарушают процесс высвобождения нейромедиаторов. Каждый токсин синтезируется в виде неактивного непроцессированного одноцепочечного белка массой приблизительно 150 кДа. Посттрансляционный процессинг включает образование дисульфидных мостиков, и ограниченный протеолиз (однонитевой разрыв) бактериальной(ыми) протеазой(ами). Активные нейротоксины состоят из двух цепей, N-концевая легкая цепь массой приблизительно 50 кДа и C-концевой тяжелой цепи массой приблизительно 100 кДа, которые связаны дисульфидной связью. Нейротоксины структурно и функционально состоят из трех доменов, т.е. каталитической легкой цепи, N-концевой половины тяжелой цепи, включающей транслокационный домен, и С-концевой половины тяжелой цепи, содержащей сайт(ы) связывания с рецептором, см. Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; rieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49. Ботулинические нейротоксины синтезируются в виде молекулярных комплексов, содержащих белок нейротоксин массой 150 кДа и связанные с ним нетоксичные комплексообразующие белки. Размеры комплексов отличаются в зависимости от штамма клостридий и разных серотипов нейротоксина, варьируя от 300 кДа, свыше 500 кДа, вплоть до 900 кДа. Нетоксичные комплексообразующие белки в этих комплексах стабилизируют нейротоксин и защищают его от разрушения, см. Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19 ~ S26.
2+
Clostridium botulinum секретирует семь антигенно различных серотипов нейротоксинов, обозначаемых A-G. Все серотипы, вместе с родственными TeNT, секретируемыми Clostridium tetani, являются Zn-эндопротеазами, которые блокируют синаптический экзоцитоз, расщепляя белки SNARE, см. Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. Нейротоксины клостридий (CNTs) вызывают периферический мышечный паралич, наблюдаемый при ботулизме и тетанусе, см. Fischer 2007, PNAS 104, 10447.
Несмотря на наличие токсических эффектов, ботулотоксический комплекс применяется в качестве терапевтического средства для большого количества заболеваний. Ботулотоксин серотипа A (BoNT/A) был одобрен в США для использования на людях в 1989 году для лечения косоглазия, блефароспазма и других расстройств, и следовательно, составляет особую важность. Он является коммерчески доступным как BoNT/А белковый препарат, например, под торговым наименованием ВОТОХ (Allergan Inc) или торговым наименованием DYSPORT (Ipsen Ltd). Усовершенствованный препарат BoNT/A, в котором не содержится комплексообразующих белков, является коммерчески доступным под торговым наименованием XEOMiN (Merz Pharmaceuticals GmbH). В лечебных целях препарат впрыскивается прямо в мышцу, подвергаемую лечению. При физиологическом рН токсин высвобождается из белкового комплекса и достигается желаемый фармакологический эффект. Действие ботулотоксина является только временным, что является причиной, почему для поддержания терапевтического эффекта необходимы повторные введения ботулотоксина.
Клостридиальные нейротоксины ослабляют сокращение мышц и являются эффективной терапией при косоглазии, фокальной дистонии, включая цервикальную дистонию, и доброкачественном эссенциальном блефароспазме. Также они показаны для ослабления гемифациального спазма и фокальной спастичности, более того, они эффективны для широкого диапазона других назначений, как, например, желудочно-кишечные расстройства, гипергидроз и косметическая коррекция морщин, см. Jost 2007, Drugs 67, 669.
В ходе получения клостридиальных нейротоксинов наибольшую важность составляют качественное и количественное определение, также как и контроль качества активного нейротоксин полипептида. Доступные в настоящее время препараты нейротоксинов содержат различные количества протеолитически непроцессированных предшественников и/или частично процессированных нейротоксических полипептидов, помимо желательных активных (процессированных или зрелых) нейротоксинов. Протеолитически непроцессированный предшественник или частично процессированные нейротоксические полипептиды отличаются от зрелых (активных, процессированных) нейротоксических полипептидов только несколькими аминокислотами. Поэтому их едва ли можно качественно отличить по химическим и физическим свойствам. С другой стороны, часть, занимаемая протеолитически непроцессированным предшественником и/или частично процессированными нейротоксическими полипептидами, по отношению к полному содержанию белков может быть значительной в таких препаратах, т.е. релевантной конкретной активности препарата.
В уровне техники хорошо известны анализы на определение полного содержания нейротоксинов. Эти анализы основаны на иммуно-ПЦР или сэндвич-ELISA (Lindstrom 2006, Clin Microbiol. Rev. 19(2):298-314; Volland 2008, J Immunnol Methods 330(1-2):120-129). Тем не менее, как уже указывалось выше, содержание нежелательных частично процессированных или непроцессированных нейротоксинов невозможно определить, применяя эти методики для анализа полного содержания нейротоксинов.
Соответственно, средства и способы определения содержания частично процессированных или непроцессированных нейротоксических молекул, и в, частности, молекул BoNT/А, в препарате пока недоступны, хотя и чрезвычайно необходимы.
Настоящее изобретение, таким образом, относится к способу определения количества частично процессированного и/или непроцессированного нейротоксин A (BoNT/A) полипептида в растворе, содержащем процессированный и частично процессированный и/или непроцессированный BoNT/A, при этом способ содержит стадии:
i) контактирование образца указанного раствора с захватывающим антителом, которое специфически связывается с частично процессированным и непроцессированным BoNT/A в условиях, допускающих связывание указанного антитела с указанными частично процессированным и непроцессированным BoNT/A, в результате чего формируется комплекс, и
ii) определение количества комплекса, образованного на стадии i), где количество комплекса является показателем количества частичного процессированного и/или непроцессированного BoNT/A в указанном растворе,
где захватывающее антитело получено способом, который содержит:
a) контактирование поликлональной антисыворотки из животного, которое было иммунизировано пептидным иммуногеном, содержащим аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1 (TKSLDKGYNKA), со следующими захватывающими пептидами SLD, LDK и YNK в условиях, допускающих формирование захватывающих комплексов, содержащих неспецифические антитела, составленных поликлональной антисывороткой и захватывающими пептидами;
b) извлечение захватывающих комплексов из поликлональной антисыворотки;
c) контактирование поликлональной антисыворотки с пептидом, содержащим или по существу состоящим из SEQ ID NO:1, в условиях, допускающих формирование комплекса, содержащего указанный выше пептид и антитело, которое специфически связывается с непроцессированным или частично процессированным нейротоксическим полипептидом;
d) извлечение комплекса, образованного на стадии с), из антисыворотки; и
e) высвобождение антитела, которое специфически связывается с непроцессированным или частично процессированным нейротоксическим полипептидом, из указанного комплекса.
Способу согласно настоящему изобретению можно способствовать автоматизацией процесса - либо полностью, либо по меньшей мере частично. Такая автоматизация может включать применение роботизированных устройств, также как компьютерных систем, имеющих встроенный подходящий алгоритм для определения количества указанных частично процессированных и/или непроцессированных BoNT/A в указанном растворе. Более того, способ согласно изобретению может содержать дополнительные стадии, которые проводятся до, после или между стадиями i) и ii). Такие дополнительные стадии в одном аспекте изобретения могут включать стадии предварительной обработки образцов, стадии промывки или очистки, также как стадии сбора данных. В одном аспекте изобретения указанные дополнительные стадии включают те, которые упоминаются в приведенных далее Примерах.
Используемый здесь термин "частично процессированный и непроцессированный нейротоксин А (BoNT/А) полипептид" относится к полипептидам нейротоксина серотипа А, которые пока являются незрелыми, то есть которые не были процессированы в зрелый двухцепочечный полипептид из одноцепочечного предшественника или которые были просто частично процессированы. BoNT/А является одним из семи серотипов ботулинических нейротоксинов. Он продуцируется в виде одноцепочечной молекулы предшественника, которая протеолитически процессируется после трансляции. Одноцепочечная молекула содержит N-концевую легкую цепь, линкерный пептид и C-концевую тяжелую цепь. В ходе протеолитического процессинга одноцепочечной молекулы линкерный пептид удаляется, в результате образуется зрелая двухцепочечная молекула, содержащая тяжелую и легкую цепь, но в отсутствие линкерного пептида. Линкерный пептид, соответственно, фланкирован двумя сайтами для расщепления протеазами. Следовательно, во время процесса протеолитической активации будут встречаться частично процессированные молекулы. Эти частично процессированные молекулы просто расщепляются на одном из фланкирующих сайтов для расщепления протеазами, в результате линкерный пептид все еще будет связанным либо с легкой, либо с тяжелой цепью. При применении в целях настоящего изобретения такие молекулы называются частично процессированными BoNT/A полипептидами.
В результате правильного процессинга получается "процессированный BoNT/A". Такой процессированный BoNT/A полипептид проявляет биологические свойства, характерные для нейротоксина, а именно (а) связывание с рецепторами, (b) интернализация, (с) транслокация легкой цепи через эндосомальную мембрану в цитозоль, и/или (d) эндопротеолитическое расщепление белков, вовлеченных в слияние мембран синаптических везикул. Поэтому процессированный BoNT/A полипептид иногда именуется здесь активным или зрелым нейротоксическим полипептидом. Биологическая активность в одном аспекте настоящего изобретения обусловлена всеми вышеупомянутыми биологическими свойствами. Анализы in vivo для оценки биологической активности включают анализ LD50 на мышах и анализ ех vivo одного купола диафрагмы мышей, как описано Pearce 1994, Toxicol Appl Pharmacol 128:69-77 и Dressier 2005, Mov Disord 20:1617-1619. Биологическая активность обычно выражается в мышиных единицах действия (МЕД). При использовании в настоящем описании 1 МЕД представляет собой количество нейротоксического компонента, которое убивает 50% конкретной популяции мышей после внутрибрюшного введения, т.е. LD50 для мышей, в/бр.
В одном аспекте настоящего изобретения BoNT/А получают из штамма Hall бактерий Clostridium botulinum и в другом аспекте он имеет структуру (т.е. аминокислотную последовательность), которая раскрыта в Beecher 1997, J Protein Chem 16:701-712 или Krieglstein 1994, J Protein Chem 13:49-57. Более того, аминокислотная последовательность BoNT/A и последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей BoNT/A, должны быть найдены под номерами доступа GenBank ABD65472.1 или GI:89258592 или приведены здесь далее как SEQ ID NOs; 2 или 3, соответственно. Сайты для расщепления протеазами, фланкирующие линкерные пептид, находятся, в одном аспекте настоящего изобретения, между аминокислотами K438/Т439 и K448/А449. Таким образом, линкерный пептид состоит по существу из последовательности, которая продолжается от аминокислоты Т439 до аминокислоты K448.
Кроме того, варианты вышеупомянутого BoNT/A также охватываются способом согласно изобретению. Указанными вариантами в одном аспекте изобретения являются нейротоксические полипептиды, имеющие аминокислотную последовательность, содержащую по меньшей мере одну аминокислотную вставку, замещение и/или делецию по сравнению с аминокислотной последовательностью BoNT/A, приведенной в SEQ ID NO:2, или аминокислотной последовательностью, кодируемой SEQ ID NO:3. В другом аспекте настоящего изобретения вариантные нейротоксины содержат аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40% идентична аминокислотной последовательности BoNT/А, представленной SEQ ID NO:2, или аминокислотной последовательности, кодируемой SEQ ID NO:3. Вышеуказанные аминокислотные последовательности представляют собой аминокислотную последовательность непроцессированного BoNT/А полипептида. Последовательности соответствующих частично процессированных или процессированных нейротоксических полипептидов могут быть выведены из указанных последовательностей на основании информации о сайтах расщепления и линкерном пептиде, данной здесь в описании. В другом аспекте изобретения вариантный BoNT/A полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, или аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:3. Термин «идентичный», используемый в настоящем изобретении, относится к идентичности аминокислотных последовательностей, при этом последовательности выравниваются таким образом, что достигается наивысший порядок совместимости. Этого можно достичь, используя опубликованные методики или способы, закодированные в компьютерных программах, таких как, например, BLASTP, BLASTN, FASTA, Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403. Показатели идентичности в процентах, в одном аспекте изобретения, вычисляются по полной аминокислотной последовательности. Для сравнения различных последовательностей специалисту в данной области техники доступен ряд программ, основанных на разнообразных алгоритмах. В этом контексте, особенно надежные результаты дают алгоритмы Needleman и Wunsch или Smith и Waterman. Чтобы провести выравнивание последовательностей, следует использовать программу PileUp (1987, J Mol Evolution 25, 351; Higgins 1989 CABIOS 5, 151) или программы Gap и BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482), которые являются частью программного пакета GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711). Показатели идентичности последовательностей, указанные выше в процентах, в одном аспекте изобретения должны определяться, используя программу GAP для полной последовательности со следующими настройками: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10.000 и Average Mismatch: 0.000, которые, если не указано иначе, всегда должны использоваться в качестве стандартных настроек для выравнивания последовательностей.
Подразумевается, что упомянутые выше варианты в одном аспекте изобретения должны сохранять по меньшей мере одно, а в другом аспекте изобретения - все биологические свойства BoNT/A. В еще одном аспекте изобретения предполагается, что частично процессированные и непроцессированные вариантные BoNT/A полипептиды могут быть специфически связаны с антителом для применения в способе согласно изобретению. В одном аспекте изобретения это может быть достигнуто за счет присутствия пептидной последовательности, содержащей SEQ ID NO:1 в линкерном пептиде.
В другом аспекте изобретения варианты BoNT/A могут быть нейротоксинами, имеющими улучшенные или измененные биологические свойства, например, они могут содержать сайты расщепления, которые улучшены для узнавания ферментами или могут быть улучшены для связывания с рецепторами или для любого другого свойства, указанного выше.
В целом, возможно модифицировать способ согласно изобретению, поскольку лежащая в основе концепция основывается на присутствии по меньшей мере одного сайта расщепления между легкой и тяжелой цепью нейротоксического полипептида, в то время как природа сайтов расщепления и конкретная аминокислотная последовательность между ними не имеет значения, до тех пор пока антитело, которое применяется в способе, способно специфически узнавать частично процессированные или непроцессированные нейротоксические полипептиды. Соответственно, другим аспектом является применение вариантных нейротоксинов, в которых сайты узнавания протеазами и/или линкерный пептид между тяжелой и легкой целью были заменены. Подразумевается, что антитело, которое будет применяться в этом аспекте изобретения, тем не менее, должно специфически связываться с линкерным пептидом или его эпитопом.
В еще одном аспекте изобретения линкерный пептид нейротоксина BoNT/A, содержащий SEQ ID NO:1, может быть введен, например с помощью методик рекомбинации нуклеиновых кислот, в линкер других серотипов нейротоксинов, при этом количество непроцессированных и частично процессированных полипептидов указанных других серотипов нейротоксинов можно определить в образце, применив способ согласно изобретению.
Термин "количество", используемый в способе согласно изобретению, охватывает абсолютное количество полипептида, относительное количество или концентрацию указанного полипептида, а также любое значение или параметр, которые коррелируют с ними или могут происходить от них.
Термин "раствор" при использовании в настоящем описании относится к любой растворяющей системе, содержащей зрелые BoNT/A полипептиды и частично процессированные и/или непроцессированные предшественники BoNT/A полипептидов. Кроме того, растворяющая система содержит растворитель. Растворителями, охватываемыми различными объектами изобретения, являются вода, водные буферные системы, органические растворители и ионные жидкости. В одном объекте изобретения растворителем является водная растворяющая система. Более того, растворяющая система, помимо зрелых BoNT/A полипептидов и частично процессированных или непроцессированных полипептидных предшественников и растворителя, также может содержать другие молекулы, включая другие бактериальные полипептиды. В одном аспекте изобретения, раствор, применяемый в способе согласно настоящему изобретению, будет представлять собой бактериальную клеточную среду либо частично очищенный или очищенный препарат, полученный из такой бактериальной клеточной среды.
Термин "образец" при использовании в настоящем описании относится к части указанного раствора, который будет исследоваться в способе согласно настоящему изобретению. Подразумевается, что образец должен также содержать BoNT/A и частично процессированные и/или непроцессированные BoNT/A предшественники. В одном аспекте способа согласно изобретению указанный образец имеет заданный объем и/или заданное суммарное содержание белков. В другом аспекте образец может содержать молекулярные стандарты, предоставленные независимыми поставщиками.
Контактирование образца раствора с захватывающими антителами, как происходит согласно заявленному способу изобретения, относится к привнесению в физическую близость вышеупомянутых непроцессированных и/или частично процессированных BoNT/A полипептидов, которые содержатся в образце, и захватывающего антитела, с тем чтобы обеспечить физическое и/или химическое взаимодействие. Подходящие условия, которые допускают специфическое взаимодействие, в принципе, хорошо известны специалисту в данной области техники. Эти условия будут зависеть от антител и раствора, применяемых в способе согласно настоящему изобретению, и могут быть запросто подобраны специалистом. Более того, время, достаточное для обеспечения взаимодействия, также может быть запросто определено специалистом. Подразумевается, что указанное время будет зависеть от экзогенных факторов, при которых проводится способ, таких как температура, растворяющая композиция, значение рН и т.д. Кроме того, следует понимать, что между индивидуальными стадиями контактирования, указанными в способе согласно настоящему изобретению, могут быть проведены стадии промывки, чтобы получить подходящие условия для контактирования. Например, после формирования комплекса на стадии i) оставшийся раствор должен быть удален до применения маркирующего вещества для указанного комплекса.
В одном аспекте способа согласно настоящему изобретению на стадии i) присутствует детергент. Соответственно, предполагается, что до или во время стадии i) детергент должен быть добавлен к образцу. Подходящие детергенты включают ионные и неионные детергенты. В одном аспекте изобретения детергент является неионным, а в другом аспекте им является Tween 20.
В одном аспекте способа согласно настоящему изобретению указанный детергент присутствует в концентрации в диапазоне от 0,01% (об./об.) до 10% (об./об.). В другом аспекте указанная концентрация находится в диапазоне от 0,2% (об./об.) до 0,8% (об./об.) или в диапазоне от 0,3% (об./об.) до 0,6% (об./об.), и в еще одном аспекте концентрация составляет 0,5% (об./об.).
В другом аспекте способа согласно настоящему изобретению указанные условия на стадии i) включают присутствие физиологического раствора с фосфатным буфером или трис буфером. В одном аспекте изобретения указанный физиологический раствор содержит NaCl в концентрации в диапазоне от 150 до 350 мМ. В другом аспекте изобретения указанная концентрация находится в диапазоне от 200 до 300 мМ, и в еще одном аспекте концентрация составляет 250 мМ.
Термин "определение количества" при использовании в настоящем изобретении относится к измерению абсолютного количества, относительного количества или концентрации количественным или полуколичественным способом. Измерение будет производиться на основании химических, физических или биологических свойств комплекса, сформированного на стадии i). Данное количество указанного комплекса можно определить прямо или косвенно. В одном аспекте изобретения будет применяться маркирующее вещество, которое взаимодействует со сформированными комплексами. Маркирующее вещество будет содержать или формировать детектируемую метку, которая коррелирует с количеством искомых комплексов и, таким образом, делает возможным определение их количества. В одном аспекте изобретения указанное маркирующее вещество связывается с захватывающим антителом или непроцессированным или частично процессированным BoNT/A, которые присутствуют в комплексах. Соответственно, в другом аспекте изобретения маркирующее вещество должно быть антителом, связывающим пептидом (например рецептором BoNT/A или его частью), аптамером или низкомолекулярным соединением, которые связываются либо с захватывающим антителом, либо с частично процессированным или непроцессированным BoNT/A, либо с обоими, когда они присутствуют в комплексе, сформированном на стадии i).
35
125
32
33
Маркирующее вещество в одном аспекте изобретения содержит детектируемую метку. В одном аспекте изобретения детектируемая метка имеет флуоресцентные или хемолюминесцентные свойства и, таким образом, позволяет проводить прямое определение маркирующего вещества. Типичные флуоресцентные метки включают флуоресцентные белки (как, например, зеленый флуоресцентный белок и его производные), Су3, Су5, красители Texas Red, флуоресцеин и флуорохромы Alexa (например Alexa 568). В еще одном аспекте изобретения метка может быть радиоактивной. Типичные радиоактивные метки включают S, I, P, P и т.п. В еще одном аспекте изобретения маркирующее вещество может обладать ферментативной активностью, которая способна генерировать детектируемый сигнал, например, за счет превращения субстрата. Обычно таким ферментом может быть пероксидаза (например пероксидаза хрена), люцифераза светлячков или щелочная фосфатаза. Метки вышеуказанных типов могут быть напрямую присоединены (ковалентно или нековалентно) к маркирующему веществу. Кроме указанного прямого мечения, маркирующее вещество в другом аспекте способа согласно изобретению может быть помечено не напрямую. Такое косвенное мечение включает связывание (ковалентное или нековалентное) вещества, которое специфически связывается с маркирующим веществом и которое несет детектируемую метку. Таким веществом, например, может быть вторичное (более высокого порядка) антитело, которое специфически связывается с маркирующим веществом. Вторичное антитело в таком случае будет связано с детектируемой меткой. Подразумевается, что дополнительно могут применяться другие антитела высокого порядка для определения детектируемого комплекса. Антитела высокого порядка часто применяются для усиления сигнала. Подходящие антитела высокого порядка могут также включать коммерческие доступные системы мечения, такие как стрептавидин-биотиновая система (Vector Laboratories, Inc.), система Dako LSAB™2 и LSAB™+ (меченый стрептавидин-биотин), или Dako PAP система (пероксида-антипероксидаза).
Подразумевается, что количество детектируемой метки, которая содержится в маркирующем веществе или генерируется им, коррелирует прямо пропорционально с количеством комплексов. Количество комплексов опять-таки коррелирует с количеством видов молекул, которые будут детектироваться, т.е. непроцессированных и/или частично процессированных нейротоксических молекул, присутствующих в образце. Кроме того, подразумевается, что образец является представительной частью раствора. Соответственно, количество непроцессированных и/или частично процессированных BoNT/A полипептидов, определяемых в образце, являются показателем количества, присутствующего в растворе.
Определение количества непроцессированных и частично процессированных нейротоксических полипептидов, в одном аспекте изобретения, также требует калибровки способа с применением стандартных растворов с заданными количествами указанных полипептидов. Как осуществить такую калибровку, хорошо известно специалистам в данной области техники. В одном аспекте изобретения проводят несколько определений, используя способ согласно настоящему изобретению для образцов двух или более упомянутых выше стандартных растворов, различающихся заданным количеством непроцессированных и/или частично процессированных нейротоксинов.
Соответственно, в одном аспекте способа согласно настоящему изобретению указанная стадия ii) включает сравнение найденного количества комплекса со стандартом. В одном аспекте изобретения стандартом является калибровочная кривая, построенная для двух или более стандартных растворов, описанных выше. В результате сравнения, определенные количества комплексов могут быть соотнесены с заданными количествами непроцессированных и/или частично процессированных BoNT/A полипептидов.
Непроцессировамные BoNT/A полипептиды могут быть получены из мутантной Clostridium botulinum, экспрессирующей предшественники BoNT/A полипептидов, которые имеют мутации в сайтах расщепления для протеазы. Такие мутанты можно ввести с помощью стандартных методик молекулярной биологии, которые хорошо известны в уровне техники. Более того, непроцессированные BoNT/A могут быть получены путем BoNT/A рекомбинантно в Е.coli или других бактериях, в которых не хватает протеазы, способной активировать BoNT/A путем протеолитического расщепления. В другом аспекте изобретения бактериальные клетки Clostridium botulinum или другие экспрессирующие системы могут быть мутированы с целью отбора мутантов, имеющих значительно сниженную или даже отсутствующую протеазную активность, и, таким образом, продуцирования только непроцессированных нейротоксинов.
В способе согласно настоящему изобретению требуется участие захватывающего антитела, которое специфически связывается с частично процессированными и непроцессированными BoNT/A полипептидами. В одном аспекте изобретения такое антитело получено способом, о котором шла речь выше и который содержит стадии а) - е), также описанные выше. Термины, используемые в этом контексте, объясняются далее.
Термин "антитело" при использовании в настоящем изобретении охватывает моноклональное антитело, поликлональное антитело, одноцепочечное антитело, человеческое, гуманизированное, приматизированное или химеризованное антитело, биспецифическое антитело, искусственное антитело, химически или ферментативно модифицированные производные, фрагмент любого из указанных антител или аптамеры, состоящие из природных и/или химически модифицированных нуклеиновых кислот. Фрагменты указанных антител включают фрагменты F(ab')2, F(ab), Fv, или scFv, или химически, или ферментативно модифицированные производные любых из этих фрагментов. Антитело согласно настоящему изобретению должно специфически связываться с эпитопом, состоящим из указанного выше пептида, если указанный пептид содержится в частично процессированном или непроцессированном нейротоксическом полипептиде.
a
d
d
a
D
D
D
Термин "специфически связываться" означает, что антитело согласно настоящему изобретению не дает перекрестных реакций в значительной степени с другими эпитопами либо на указанных частично процессированных, либо на указанных непроцессированных нейротоксических полипептидах, либо на других полипептидах в целом. В одном аспекте антитело согласно настоящему изобретению не дает перекрестных реакций с указанным активным полностью процессированным нейротоксическим полипептидом. Эпитопная специфичность является важной характеристикой антитела согласно настоящему изобретению. Специфичность антитела по отношению к частично процессированному или непроцессированному нейротоксину в сравнении с процессированным нейротоксином должна быть, в одном аспекте изобретения, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%. Специфичное связывание можно оценить с помощью различных хорошо известных методик, включая, например, сравнительные исследования или вестерн-блоттинг с использованием гель-электрофореза SDS-PAGE. Другой важной характеристикой является чувствительность антитела. В одном аспекте изобретения чувствительность должна быть такой, что по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% процессированного нейротоксина в составе образца являются связанными. Чувствительность может быть определена с помощью хорошо известных методик. Специалисты в данной области техники смогут определить рабочие и оптимальные условия проведения анализа для каждого определения, осуществив стандартное экспериментирование. Обычные методики для исследований связывания включают радиоиммунный анализ, ELISA, равновесный диализ, изотермическая микрокалориметрия, анализы BIACORE (поверхностный плазменный резонанс, ППР) или другие поверхностные адсорбционные способы. Характеристики связывания, такие как чувствительность антитела согласно настоящему изобретению, в принципе, могут быть определены с помощью исследований связывания, используя иммобилизованный антиген (лиганд), присутствующий на поверхности сенсора. Антитело, которое подвергается тестированию (аналит), будет находиться в подвижной фазе, т.е. в растворе. В некоторых случаях антиген не напрямую присоединен к поверхности за счет связывания с другой иммобилизованной молекулой, которая именуется захватывающей молекулой. Когда антитело вводится дискретными импульсами по поверхности с иммобилизованными антигенами, по существу три фазы могут быть выделены: (i) Ассоциация антитела с антигеном во время ввода образца; (ii) Равновесное или спокойное состояние во время впрыскивания образца, когда скорость связывания антитела уравновешивается диссоциацией из комплекса антитело-антиген; (iii) Диссоциация антитела с поверхности вместе с потоком буфера. Подразумевается, что такой анализ в альтернативном случае может быть выполнен с исследуемыми иммобилизованными антителами и раствором, содержащим антиген, в качестве подвижной фазы. Фазы ассоциации и диссоциации обеспечивают информацию по кинетике взаимодействия аналит-лиганд (k и k, скорости образования и диссоциации комплекса, k/k=K). Равновесная фаза обеспечивает информацию об аффинности взаимодействия аналит-лиганд (K). В одном аспекте изобретения антитело согласно настоящему изобретению имеет K менее чем 0,5 µМ, в одном аспекте изобретения - менее чем 0,05 µМ и в другом аспекте - менее чем 0,02 µM.
Антитело, которое предназначено для применения в способе согласно изобретению, в одном аспекте изобретения, позволяет провести детектирование частично процессированного и/или непроцессированного нейротоксического полипептида с высокой чувствительностью и специфичностью, в одном аспекте изобретения с пределом обнаружения <1000 пг/мл, <300 пг/мл, <100 пг/мл, в одном аспекте изобретения - 50-80 пг/мл, и в другом аспекте изобретения - 69 пг/мл. В еще одном аспекте изобретения предел обнаружения даже может быть <30 пг/мл, <10 пг/мл, <3 пг/мл, и в одном аспекте изобретения около или <1 пг/мл.
Антитело при использовании в настоящем изобретении может быть получено обычными способами, которые описаны, например, в Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Моноклональные антитела могут быть получены с помощью методик, изначально описанных в Kohler 1975, Nature 256, 495, и Galfre 1981, Meth Enzymol 73, 3. Указанные методики включают слияние мышиных клеток миеломы с клетками селезенки, полученными от иммунизированных млекопитающих. Антитела могут быть дополнительно усовершенствованы с помощью методик, хорошо известных в уровне техники. Например, поверхностный плазменный резонанс, применяемый в системе BIACORE, может быть использован для увеличения эффективности фаговых антител, которые связываются с вышеупомянутым эпитопом в протеолитически непроцессированном нейротоксическом полипептиде, см. Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7, 97; Malmborg 1995, J, Immunol Methods 183, 7.
Используемый выше термин "пептидный иммуноген" относится к олигопептиду, имеющему аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1, который обеспечивается таким образом, чтобы вызвать иммунный ответ в животном, не являющемся человеком.
В одном аспекте изобретения указанный пептид, имеющий последовательность SEQ ID NO:1, связан с белком-носителем через любой линкер или с помощью любой методики связывания, известной в уровне техники.
В другом аспекте изобретения указанный иммуноген дополнительно содержит KLH. В другом аспекте изобретения указанный KLH связан с пептидом, имеющим SEQ ID NO:1, через линкер N-[гамма-малеимидобутирилокси] сукцинимидный эфир (ГМБС). В еще одном аспекте изобретения указанный KLH связан через цистеин, а в случае C-концевого цистеина - с пептидом, имеющим последовательность SEQ ID NO:1, через линкер ГМБС. Как связать KLH с пептидом посредством линкерной молекулы, такой как ГМБС, хорошо известно в уровне техники или описано в прилагаемых примерах ниже.
В другом аспекте изобретения овальбумин может применяться в качестве иммуногена. Указанный овальбумин будет поперечно-сшитым через линкер сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (сульфо-СМЦК) с цистеиновым остатком, в одном аспекте изобретения - с C-концевым цистеиновым остатком. В этом аспекте изобретения предполагается применять пентапептид, состоящий из аминокислот X-Y последовательности SEQ ID NO:1, к которой вышеупомянутый цистеин добавлен с С-конца.
В другом аспекте изобретения не являющееся человеком животное является млекопитающим, также в аспекте изобретения - крысой, мышью, кроликом, овцой или козой. До проведения способа согласно изобретению не являющееся человеком животное, которому предстоит стать источником поликлональной антисыворотки, будет иммунизироваться, применяя вышеупомянутый пептидный иммуноген. Как иммунизировать не являющееся человеком животное, хорошо известно в уровне техники, а также описано в прилагаемых дальше Примерах. В результате такой иммунизации не являющееся человеком животное будет продуцировать поликлональные антитела против пептидного иммуногена.
Поликлональная антисыворотка может быть получена из не являющегося человеком животного с помощью различных методик. В одном аспекте изобретения она получена из крови, сыворотки или плазмы с помощью стандартных методик, хорошо известных в уровне техники и описанных в прилагаемых дальше Примерах. Термин "поликлональная антисыворотка", таким образом, включает очищенные и частично очищенные сыворотки из указанных животных. Такая поликлональная антисыворотка является исходным материалом для вышеуказанного способа. Помимо желательного одного или большего количества антител, которые специфически связываются с непроцессированным и частично процессированным BoNT/A полипептидом, поликлональная антисыворотка может содержать дополнительные антитела, которые неспецифически связываются с непроцессированным и частично процессированным BoNT/A полипептидом.
Эти нежелательные перекрестно реагирующие антитела отделяются от желательных специфических антител путем контактирования указанной поликлональной антисыворотки с захватывающими пептидами SLD, LDK и YNK в условиях, допускающих формирование захватывающих комплексов, содержащих неспецифические антитела, составленные поликлональной антисывороткой и захватывающими пептидами, и путем удаления захватывающих комплексов из поликлональной антисыворотки, чтобы получить частично очищенную поликлональную антисыворотку. Вышеупомянутые захватывающие пептиды, в одном аспекте изобретения, могут применяться в способе в форме их производных, раскрытых в прилагаемых ниже примерах.
Указанная частично очищенная поликлональная антисыворотка затем вводится в контакт с пептидом, также имеющим аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1. В одном аспекте изобретения указанный пептид иммобилизуется на носитель, который подробно описывается в этом описании. В результате такого контактирования формируется комплекс пептида и специфических антител, который затем может быть удален из оставшейся поликлональной сыворотки. Специфические антитела затем могут быть выделены из удаленного комплекса. Подходящие методики выделения антител из такого комплекса описаны в данном описании.
В одном аспекте изобретения стадии от а) до е) способа получения антитела осуществляются посредством аффинной хроматографии. Термин «аффинная хроматография», используемый в настоящем изобретении, относится к методике разделения молекул в подвижной фазе, исходя из их различной аффинности по отношению к неподвижной фазе, используемой в хроматографии. В одном аспекте изобретения указанная методика относится к избирательной адсорбции и последующему восстановлению соединения из иммобилизованного лиганда. В другом аспекте изобретения указанная методика разработана для высокой специфической и эффективной очистки белков и родственных соединений, используя подходящие селективные лиганды на зернистых и пористых матрицах для связывания целевых соединений, которые затем могут быть восстановлены в мягких условиях. Указанная методика основана на высоко специфическом взаимодействии, таком, который происходит между антигеном и антителом, ферментом и субстратом, или рецептором и лигандом. В другом аспекте изобретения данная аффинная хроматография выполняется в виде колоночной хроматографии.
Аффинная хроматография, описанная подробно выше, является в одном аспекте изобретения иммунносорбционной хроматографией и гидрофобной хроматографией (ГХ), обращено-фазовой хроматографией и - в другом аспекте - иммуноаффинной хроматографией, использующей связующий агент, который является в еще одном аспекте антителом согласно настоящему изобретению. Неподвижная фаза при использовании в настоящем описании в одном аспекте состоит из вышеупомянутого вещества в качестве твердой матрицы. Указанное вещество является в одном аспекте изобретения связанным с полипептидным носителем, соединенным с твердой матрицей, и в другом аспекте изобретения - связанным с белком А, соединенным с твердой матрицей.
Для осуществления способа согласно изобретению захватывающее антитело может быть связано ковалентно или нековалентно с твердой подложкой. Материалы для таких твердых подложек хорошо известны из уровня техники и включают, среди прочего, коммерчески доступные полисахаридные матрицы, выбранные из группы, состоящей из: сефароза (sepharose), сефадекс (sephadex); агароза (agarose), сефацел (sephacell), микроцеллюлоза и шарики альгината, полипептидные матрицы, полистирольные шарики, латексные шарики, магнитные шарики, коллоидные металлические частицы, стекло, пластиковые и/или кремниевые чипы и поверхности, нитроцеллюлозные полоски, мембраны, листы, стабилизированные эритроциты (duracytes), лунки и стенки реакционных планшетов, пластиковые пробирки. В одном аспекте изобретения указанная твердая подложка сделана из облученного гамма-лучами полистирола. В зависимости от предполагаемого применения указанная твердая подложка может состоять из или быть в форме отдельных виал. В качестве альтернативного варианта твердая подложка может состоять из или быть в форме многолуночных планшетов. В зависимости от твердой подложки может стать необходимым проводить стадии постановки блоков до применения твердой подложки в способе согласно настоящему изобретению, чтобы заблокировать свободные сайты связывания твердой подложки для пептидов и белков.
Преимущественно, способ согласно настоящему изобретению позволяет проводить специфическое определение молекул-предшественников BoNT/А, т.е. непроцессированных, одноцепочечных BoNT/A и/или частично процессированных BoNT/A. Эти молекулы-предшественники обычно являются нежелательными загрязняющими компонентами в препаратах BoNT/A, которые предназначены для применения в терапевтических или косметических целях. Соответственно, их содержание должно быть снижено до минимального значения. Способ согласно настоящему изобретению делает возможным проведение эффективного контроля качества и менеджмента безопасности продукта при производстве препаратов BoNT/A. Кроме того, можно контролировать эффективность очистки и/или стадий обработки при производстве препаратов BoNT/A. В исследованиях, лежащих в основе изобретения, была использована поликлональная сыворотка против непроцессированного ботулинического нейротоксина типа А (BoNT/A), применяя линкерный пептид, соединенный с KLH, в качестве иммуногена (антисыворотка против линкерпептид-scBoNT/A) на козах. Даже после аффинной очистки сыворотка показала перекрестную реактивность по отношению к процессированному BoNT/A в вестерн-блоттинге с использованием гель-электрофореза SDS-PAGE. Было продемонстрировано, что перекрестная реактивность зависела от узнавания трипептидов (SLD, LDK и YNK), которые находились в линкерном пептиде, а также в легких и тяжелых цепях процессированного BoNT/A. Вторая партия иммунной козлиной сыворотки очищалась посредством двухступенчатой аффинной хроматографии, удаляющей перекрестно реагирующие трипептид-антитела. Вторая антисыворотка против линкерпептид-scBoNT/A не показала никакой перекрестной реактивности по отношению к процессированному BoNT/A в вестерн-блоттинге.
В одном аспекте изобретения способ согласно настоящему изобретению, который содержит вышеупомянутые основные стадии, содержит дополнительно следующие специфические стадии:
1) Иммобилизация на твердой подложке (например, на многолуночном планшете) захватывающих антител, полученных вышеупомянутым способом;
2) Удаление промывкой захватывающих антител, которые не иммобилизировались;
3) Блокирование пептидных/белковых свободных сайтов связывания на твердой подложке путем применения подходящего блокирующего буфера (см. примеры ниже);
4) Удаление промывкой блокирующего буфера;
5) Нанесение образцов растворов, которые будут анализироваться, или стандартных растворов, используемых для калибровки, в условиях, допускающих формирование захватывающего комплекса;
6) Удаление промывкой несвязанного образца материала;
7) Нанесение маркирующего вещества (например, маркирующего вещества первого и, необязательно, более высокого порядка, который напрямую или не напрямую связан с ферментом, таким как пероксидаза) в условиях, допускающих формирование детектируемого комплекса;
8) Удаление промывкой несвязанного маркирующего вещества;
9) Определение детектируемого сигнала, появившегося благодаря маркирующему веществу (например, применяя хромогенный субстрат к детектируемому комплексу и измеряя превращение субстрата путем определения оптической плотности).
Тем не менее подразумевается, что способ согласно изобретению также может быть осуществлен с помощью любых других специфических стадий, которые являются производными от указанных выше.
Настоящее изобретение также предполагает устройство для определения количества частично процессированного и/или непроцессированного нейротоксин A (BoNT/A) полипептида в растворе, содержащем процессированные и частично процессированные и/или непроцессированные BoNT/A полипептиды, которое содержит:
i) блок анализа, содержащий захватывающее антитело, которое описано выше, где блок анализа предусматривает контактирование образца указанного раствора с указанным захватывающим антителом, и
ii) блок оценки, содержащий систему считывания для определения количества комплекса, сформированного в блоке анализа, и систему обработки данных, которая предусматривает вычисление количества частично процессированных и/или непроцессированных BoNT/A полипептидов в указанном растворе на основании выявленного количества комплекса.
Термин "устройство" при использовании в данном описании относится к системе, содержащей по меньшей мере вышеупомянутую конфигурацию из блока анализа и блока оценки, которые функционально связаны друг с другом, делая возможным определение. В одном аспекте изобретения конфигурация может представлять собой твердую подложку с иммобилизованными захватывающими антителами, упомянутой выше, которые могут присутствовать на твердой подложке, описанной выше, например в форме виалы, чтобы дать возможность образцу раствора контактировать с захватывающим антителом. Более того, устройство может содержать, в одном аспекте изобретения, считывающую систему для определения количества детектируемых комплексов. В зависимости от типа используемого маркирующего вещества такая система будет содержать детектор генерируемых сигналов. Кроме того, в аспекте изобретения блок также может содержать реализуемый ЭВМ алгоритм для обработки данных, полученных считывающей системой. Данный алгоритм должен обеспечить подсчет количества целевых полипептидов. В аспекте изобретения это достигается сравниванием измеренных сигналов с калибровочными стандартами, чтобы определить количества полипептидов, присутствующих в растворе или их образцах.
Кроме того, настоящее изобретения охватывает набор для определения количества частично процессированного и/или непроцессированного нейротоксин А полипептида (BoNT/A) в растворе, содержащем процессированные и частично процессированные и/или непроцессированные BoNT/А полипептиды, при этом набор содержит захватывающее антитело, которое описано выше.
Термин "набор" при использовании в данном описании относится к системе вышеупомянутого захватывающего антитела и, в аспекте изобретения, маркирующего вещества и/или одного или большего количества калибровочных стандартов, которые описаны в этом документе. Указанные компоненты набора могут быть либо упакованы, либо не упакованы вместе. Компоненты набора могут состоять из отдельных виал (т.е. как набор из отдельных частей), либо предоставляться в одной виале. Кроме того, следует понимать, что набор согласно настоящему изобретению должен применяться для воплощения способов, описанных здесь выше. В одном аспекте изобретения предполагается, что все компоненты предоставлены в готовом виде для воплощения описанных выше способов. В другом аспекте изобретения набор содержит инструкции для осуществления указанных способов. Инструкции могут быть предоставлены в виде руководства по эксплуатации в бумажной или электронной форме. Например, руководство может содержать инструкции по расшифровке результатов, полученных при осуществлении вышеупомянутых способов, при помощи набора согласно изобретению.
В аспекте набора согласно изобретению указанный набор дополнительно содержит по меньшей мере одно маркирующее вещество для определения количества комплекса, содержащего захватывающее антитело и непроцессированные и/или частично процессированные BoNT/А полипептиды.
Все ссылки, приведенные в данном описании, включены сюда в качестве ссылки по отношению к их полному содержанию и содержанию, конкретно раскрытому в настоящем описании.
Примеры
Пример 1: Получение иммуногена и антител
Получение иммуногенов
2
1. Линкерпептид-Иммуноген I: Пептид с последовательностью NH-TKSLDKGYNK-Cys-COOH был предоставлен независимым поставщиком и затем связан через линкер ГМБС с белком-носителем KLH.
2
2. Линкерпептид-Иммуноген II: а) Активация овальбумина; 2,18 мг сульфо-СМЦК (сульфосукцинимидил-4(N-малеимидометил)циклогексан-1 -карбоксилат) были растворены в 50 мкл ДМСО. Затем добавили 2,5 мл раствора овальбумина, содержащего 7,5 мг/мл овальбумина (буфер: 5 мМ фосфат натрия; 0,9% NaCl), и раствор инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с вращением. Смена буфера была проведена при помощи колонок PD10, активированный овальбумин элюировали 3,5 миллилитрами буфера, содержащего 10 мМ фосфата натрия; 0,9% NaCl. b) Связывание пептида с овальбумином; 8 мг пептида Ac-DKGYN-Cys-COOH растворяли в 250 мкл HO и 2,5 мкл 500 мМ ТКЭФ · HCl (трис[2-карбоксиэтил]фосфин гидрохлорид) и затем нейтрализовали с помощью 1 мМ NaOH. Наконец, добавляли активированный овальбумин и инкубировали реакционную смесь при комнатной температуре в течение 4,4 ч с вращением. Оставшиеся реакционно-способные группы блокировались путем добавления 10 мМ раствора цистеина при инкубации в течение 1 ч с вращением. Диализ проводили, используя 10 мМ фосфат натрия; 0.9% NaCl.
Иммунизация
Антисыворотки получали путем иммунизации.
1.) Антисыворотка против линкерпептид-scBoNT/A I: В качестве иммуногена применялся Линкерпептид-Иммуноген I, который был связан через линкер ГМБС с носителем-белком KLH. Двух коз иммунизировали, вводя подкожно Линкерпептид-Иммуноген I, каждую - сначала 300 г Линкерпептид-Иммуногена I, растворенного в адъюванте Фрейнда, и в заключение иммунизировали четыре раза с двухнедельной периодичностью 100 г Линкерпептид-Иммуногена I в неполном адъюванте Фрейнда. Сбор антисыворотки проводили после 49, 63, 77 и 84 дней. Аффинную хроматографию проводили, используя сыворотку, собранную из финального забора крови на 84-й день.
2.) Антисыворотка против линкерпептид-scBoNT/A II: В качестве иммуногена применялся Линкерный пептид-Иммуноген II, который был связан с носителем-белком овальбумином через линкер СМЦК. Двух кроликов иммунизировали, вводя подкожно Линкерпептид-Иммуноген II, каждый сначала с помощью 300 г Линкерпептид-Иммуногена II в адъюванте Фрейнда и в заключение иммунизировали четыре раза с двухнедельной периодичностью с помощью 150 г Линкерпептид-Иммуногена II в адъюванте Montanide ISA 206. Аффинную хроматографию проводили, используя сыворотку, собранную из финального забора крови на 60-й или 110-й день, соответственно.
Двухступенчатая аффинная хроматография сывороток
1. Получение матрицы: Для двухступенчатой аффинной хроматографии получали две разные йодацильные матрицы Ultralink, содержащие различные пептиды.
2
2
С одной стороны, перекрестно реагирующие пептиды SLD, LDK и YNK были предоставлены в форме следующих пептидов: Ac-ELDKYN-Cys-СООН (SEQ ID NO:4), NH-NISLDL-Cys-COOH (SEQ ID NO:5) и NH-YYNKF-Cys-COOH (SEQ ID NO:6) и были связаны с матрицей, используя общее описание, данное ниже. С другой стороны, линкерный пептид (SEQ ID NO:1) был связан с матрицей, используя общее описание, данное ниже, в форме следующего производного: Ac-TKSLDKGYNKA-Cys-COOH.
Общее описание:
Связывающий буфер: 50 мМ Трис, 5 мМ ЭДТА-Na, рН 8,5. Приготовление объема буфера, равное 20-кратному объему используемого UitraLink Йодацильного геля.
L-Цистеин HCl; Промывочный раствор: 1 мМ хлорид натрия (NaCl).
Пустая гравитационная колонка или центрифужная колонка, которые могут быть прикрыты колпачками как сверху, так и снизу.
Приготовление пептидного или белкового образца
Растворить пептид в связывающем буфере.
Связывание с UltraLink Йодацильным гелем:
1. С прикрытым нижним колпачком на гравитационной колонке добавить необходимое количество суспензии UltraLink Йодацильного геля, давая гелю осесть в течение 15 минут.
2. Дать стечь жидкости из заполненной колонки и промыть/уравновесить the UltraLink Йодацильный гель 5 объемами связывающего буфера (один объем равен объему гелевого слоя) путем добавления буфера сверху слоя геля, давая ему вытечь через колонку. Не позволять гелевому слою пересохнуть.
3. Поставить обратно нижний колпачок и добавить подготовленный сульфгидрил-содержащий образец. Можно применять приблизительно 1 мл раствора образца на мл UltraLink Йодацильного геля.
4. Поставить обратно верхний колпачок и перемешать колонку при комнатной температуре в течение 15 минут.
5. Установить колонку в вертикальное положение и инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут без перемешивания.
6. Затем снять верхний и нижний колпачки колонки и дать раствору стечь.
7. Промыть колонку тремя объемами связывающего раствора.
Блокирование неспецифических связывающих сайтов на Геле.
1. Поставить обратно на колонку верхний колпачок.
2. Приготовить раствор 50 мМ L-Цистеина HCl в связывающем буфере и добавить 1 мл этого раствора в колонку на каждый миллилитр геля.
3. Поставить обратно верхний колпачок и смешивать в течение 15 минут при комнатной температуре, затем проинкубировать реакцию без смешивания в течение дополнительных 30 минут при комнатной температуре.
2. Двухступенчатая аффинная хроматография: Сыворотки, которые подвергаются очистке, сначала отделяются от крови. Неочищенную сыворотку наносят на первую колонку, содержащую перекрестно реагирующие трипептиды. Перекрестно реагирующие антитела связываются с трипептидами и, таким образом, отделяются от неочищенной сыворотки. Элюат этой первой колонки наносится на вторую колонку, содержащую связанный линкерный пептид. Специфические к линкерному пептиду антитела связываются с линкерным пептидом и, таким образом, отделяются от неочищенной сыворотки, которая окажется во втором элюате второй колонки. Низкоаффинные антитела против линкерпептид-scBoNT/A удаляются из колонки путем промывки в строгих условиях фосфатно-солевым буфером (0.5 М NaCl). Затем связанные высокоаффинные антитела против линкерпептид-scBoNT/A элюируются и концентрируются. Этот концентрат соответствует используемой антисыворотке против линкерпептид-scBoNT/A.
Пример 2: Исследование и проверка специфичности антител
Реагенты для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA):
Покрывающий буфер: 0,005 М - 1 М Трис; 0.9% NaCl, предпочтительно 0,01 М - 0,2 М Трис; 0,9% NaCl, pH=8.5.
Захватывающее антитело: антисыворотка против линкерпептид-scBoNT/A.
Блокирующий и разбавляющий антитела буфер: 0.5% - 5% BSA в 0,01 М фосфате натрия; 0.9% NaCl, pH=7,4.
Буфер для образцов: 0,5% - 5% BSA в 0,005 М - 1 М фосфате натрия; 0,1 - 0,5 М NaCl; 0,01% - 1% Tween 20, предпочтительно 1% - 3% BSA в 0,005 - 0,1 М фосфате натрия; 0,15 М - 0,4 М NaCl; 0,05% - 0,5% Tween 20, pH=7.4.
Промывочный буфер: 0,01 М фосфат натрия; 0,9% NaCl; 0,05% Tween 20, pH=7.4.
Детектируемое антитело: моноклональное антитело против BoNT/A.
Вторичное антитело: поликлональное антитело против мышиных IgG (H&L), конъюгированное с пероксидазой.
Субстрат: ТМВ, коммерчески доступный.
2. Реагенты для вестерн-блоттинга:
Денатурирующий буфер для образцов, коммерчески доступный.
SDS гель, коммерчески доступный.
MES электродный буфер (SDS PAGE): коммерчески доступный.
PVDF мембрана: коммерчески доступная.
Буфер для переноса (для вестерн-блоттинга): коммерчески доступный.
Образец: Botulinum Neurotoxin А с двухцепочечным-BoNT/A и scBoNT/A (одноцепоченым).
Первичное антитело: антисыворотка против линкерпептид-scBoNT/A.
Вторичное антитело: ослиное поликлональное антитело против козлиных IgG (H&L), конъюгированное с щелочной фосфатазой.
Блокирующий и разбавляющий антитела буфер: 0,5% - 5% BSA в 0,01 М - 0.1 М Трис; 0.9% NaCl; 0.05% - 5% Tween 20, pH=7.4.
Промывочный буфер: 0,01 М - 0,1 М Трис; 0,9% NaCl; 0,05% - 5% Tween 20, pH=7,4.
Трис буфер: 0,025 М Трис, pH=8,0.
Субстрат: BCIP/NBT, коммерчески доступный.
а) Специфичность антисыворотки по отношению к BoNT/В и BoNT/E: Чтобы определить специфичность антисывороток по отношению к BoNT/B и BoNT/E, степень извлечения веществ анализировали методом твердофазного иммуноферментного анализа. Планшеты для микротитрования инкубируются со 100 мкл на лунку покрывающего буфера, содержащего 0.5 · г антисыворотки против линкерпептид-scBoNT/A на мл, в течение 16 часов при комнатной температуре и затем промываются три раза промывочным буфером. В планшеты для микротитрования добавляют 200 мкл на лунку блокирующего раствора и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. В качестве калибровочного стандарта применяется антиген scBoNT/A (серия разведении в буфере для образцов; концентрация в пикограммах/мл), планшеты для микротитрования инкубируются со 100 мкл на лунку калибровочного стандарта. BoNT/B или BoNT/E, соответственно, разбавляются буфером для образцов и наносятся на планшеты для титрования в количестве 100 мкл на лунку. Оба вещества наносятся в избытке, применяется разбавление 200 нг/мл. Образцы и стандарты инкубируются в течение 2 ч при 37°С. Планшеты для микротитрования промываются три раза промывочным буфером. Добавляют 100 мкл буфера для детекции на лунку и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты для микротитрования промывают три раза промывочным буфером. После этого проводят инкубацию со 100 мкл на лунку вторичного антитела в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем планшеты для микротитрования промывают три раза промывочным буфером.
2
4
Реакция детекции начинается с добавления 100 мкл субстрата на лунку. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре реакцию останавливают путем добавления 50 мкл 2 М HSO на лунку и определяют поглощение при длине волны 450 нм. Для определения специфичности путем стандартизации подсчитывали концентрации BoNT/B и BoNT/E. Специфичность антисыворотки против линкерпептид-scBoNT/A для серотипов В и Е может быть определена путем вычисления степени извлечения. Чем ниже степень извлечения, тем ниже перекрестная реактивность и лучше специфичность сыворотки по отношению к scBoNT/A.
b) Специфичность антисыворотки против линкерпептид-scBoNT/A по отношению к двухцепочечной BoNT/А:
Для определения специфичности антисыворотки по отношению к активированному двухцепочечному-BoNT/А проводят иммуногистологическое определение, используя для этого вестерн-блоттинг. Образец NT (scBoNT/A по меньшей мере 50 нг, двухцепочечный-BoNT/A в зависимости от используемого образца) разделяют в восстановительных условиях с помощью SDS-PAGE в соответствии с их молекулярным весом на scBoNT/A, легкую цепь (LC) и тяжелую цепь (НС) (двухцепочечный-BoNT/A). Белки затем подвергаются блоттингу на PVDF мембрану. Мембрана блокируется 20 миллилитрами блокирующего буфера в течение 1 ч при комнатной температуре. Блокирующий буфер удаляют и добавляют 20 мл раствора первичных антител, содержащего 0.005 г/мл антисыворотки протии линкерпептид-scBoNT/A. Первичное антитело инкубируют в течение ночи при 4°С. Раствор, содержащий антитела, удаляют, а мембрану промывают три раза в течение 30 минут 20 миллилитрами промывочного буфера при 37°С. После этого мембрану инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре 20 миллилитрами вторичного антитела с концентрацией 0.4  г/мл. Раствор вторичных антител удаляют, а мембрану промывают три раза в течение в течение 30 минут 20 миллилитрами промывочного буфера при 37°С. Дополнительно мембрану промывают один раз 20 миллилитрами 25 мМ Трис буфера в течение 5 минут при комнатной температуре.
Реакцию детекции проводят путем добавления субстрата. Субстрат инкубируют в течение 15 минут и останавливают цветную реакцию путем добавления воды. Специфичность определяют наличием полосы scBoNT/A массой 150 кДа. Специфичность анти-линкерпептида имелась, когда детектировалась только специфическая полоса массой 150 кДа и при этом отсутствовали полосы, специфические для двухцепочечного BoNT/A массой 100 кДа (НС) и 50 кДа (LC).
Содержание scBoNT/A различных загрузок определяли, используя анализ ELISA в условиях, описанных выше, и сравнивали с содержаниями, полученными методом SDS PAGE. Результаты показаны в таблице ниже.
Таблица
Содержание scBoNT/A, полученное методом SDS PAGE в сравнении с ELISA.
Образец №
scBoNT/A (%) SDS PAGE
scBoNT/A (%) ELISA
1
9,5
11,97
2
0,4
0,64
3
0,8
0,68
4
3,5
3,97
5
0,8
0,13
6
2,1
1,36
7
1,1
1,12
8
1,5
1,33
9
2,0
1,88