ПЦР СПОСОБ, ИСПОЛЬЗУЮЩИЙ ПОЛИМЕРНЫЙ МАТЕРИАЛ В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЯ
PCR METHOD, APPLYING POLYMER MATERIAL AS CARRIER

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к способам и устройствам для забора образцов нуклеиновой кислоты для применения в реакциях амплификации нуклеиновой кислоты. Изобретение конкретно относится к способам и устройствам, которые применяются для забора образцов для криминалистического анализа, которые могут использоваться, например, на месте преступления или несчастного случая или на месте, в котором произошло биологическое загрязнение, и относится к способам и устройствам, которые подходят для применения с минимальным ручным вмешательством.
Уровень техники
Перечисление или обсуждение ранее опубликованного документа в этом описании изобретения не должно обязательно рассматриваться как подтверждение того, что документ является частью утверждений текущего уровня техники или относится к области общих знаний.
В настоящее время для стандартного лабораторного получения ДНК млекопитающего (включая человека) для анализа из твердых биологических образцов требуется некоторое или все из следующего:
Образец необходимо обработать некоторым образом посредством некоторой формы увлажнения или с помощью раствора так, чтобы клетки были удалены из матрикса, в случае его наличия, примером чего является кровь, высохшая внутри ткани, или клетки кожи на ватной палочке и т.п. Другими словами, перенос образца достигается путем солюбилизации в жидкости.
Образец должен быть обработан некоторым образом для облегчения отделения ДНК от клеточного матрикса белков, углеводов, других нуклеиновых кислот и т.п.(т.е. необходимо выделить ДНК).
Выделенная ДНК должна быть очищена от связанных с ней белков и т.п. так, чтобы была возможность начать процесс анализа ДНК-например, обеспечить доступ ДНК-полимеразы для копирования ДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР), или доступ для ферментов, имеющих отношение к другим процессам ДНК-амплификации, или ферментов рестрикции для связывания и расщепления ДНК-последовательности (т.е. необходима очистка ДНК).
Процесс получения нуждается в очистке образца от ингибиторов, ДНКаз и т.п. (т.е. необходимо устранение химического ингибирования анализа ДНК).
Сухие образцы должны быть сольватированы для растворения клеточного материала в растворе для протекания любых из вышеописанных реакций (т.е. необходимо, чтобы клетки/ДНК находились в растворе).
Вышеописанный процесс требует тщательных манипуляций с образцом, измерения аликвот препаративных реактивов и т.п., и для каждой из этих операций, как правило, требуется лабораторное оборудование и квалифицированный персонал для их осуществления.
Следовательно, общий смысл заключается в том, что клетки млекопитающих (включая человека) должны находиться в растворе для обработки и/или препаративных манипуляций и должны быть предварительно обработаны при подготовке к анализу ДНК.
Перенос образцов в виде клеточных растворов непосредственно в реакции анализа ДНК возможен без необходимости проведения препаративных стадий, хотя и предусматривает ограниченные типы образцов, и/или включает специализированную обработку для эффективного анализа ДНК. Было установлено, что слюна может быть помещена в реакции ПЦР непосредственно или в разведенном виде, и таким образом может быть проанализирована геномная ДНК. Было продемонстрировано, что для получения результата с некоторой степенью воспроизводимости помещение крови в реакции ПЦР непосредственно или в разведенном виде требует специализированных буферов и ферментов. Необходимо устранить ингибиторы ПЦР в клеточных растворах, часто с помощью разведения. Перед помещением в реакцию ПЦР тканевые клеточные культуры необходимо собрать из их культуральной среды и промыть, чтобы избавиться от среды и т.п.
Другими словами, клетки, как правило, необходимо непосредственно поместить в оборудование для анализа ПЦР при условии, что для оптимизации анализа применяются подходящее разведение или полимеразные ферменты.
Было установлено, что стеклянные поверхности и материалы для клеток и ДНК являются гидрофильными связывающими поверхностями, а также являются подходящими поверхностями для затравки или осуществления реакции ПЦР (например, в работе Nanassy et al Analytical Biochemistry 2007, vol 365 p 240-245 показано, что геномная ДНК эффективно извлекается из необработанных предметных стекол (с подходящим для ПЦР качеством)).
WO 03/057910 относится к способу выделения ДНК с использованием материала с немодифицированной поверхностью из диоксида кремния и с последующей амплификацией в присутствии немодифицированного диоксида кремния. Все примеры предполагают, что реакции лизиса осуществляются, прежде всего, для того, чтобы сделать доступной ДНК.
WO 01/14590 описывает методологию использования магнитных микросфер, содержащих диоксид кремния, путем помещения в смесь с ДНК-мишенью, с последующим отделением ДНК, связанной с матриксом из диоксида кремния, из смеси с помощью силы внешнего магнитного поля. Примеры демонстрируют, что ДНК становится доступной диоксиду кремния в ходе предшествующей процедуры лизиса клеток.
Не было разработано ни одного стеклянного устройства для специфического забора образца посредством контакта либо с влажным, либо с сухим образцом без предварительной препаративной обработки, и для переноса клеток с помощью контакта непосредственно из источника в реакцию ПЦР. В настоящее время не существует устройства для забора образцов, в котором используется известное свойство стекла собирать и переносить клетки/ДНК, путем применения его, например, на сухих/твердых поверхностях с последующим переносом непосредственно в реакцию амплификации ДНК/РНК.
Были проведены исследования использования других твердых поверхностей для захвата клеток и ДНК, подходящих для анализа амплификации ДНК/РНК, а для микробных культур, известно, что бактериальные колонии могут быть непосредственно забраны (например, с помощью деревянной зубочистки), а бактериальные клетки могут быть перенесены в реакции ПЦР без какой-либо обработки (для плазмид и генома).
Липкие поверхности, например, почтовые марки, могут связывать клетки при облизывании. Липкий материал не подходит для непосредственного помещения в ПЦР и сперва должен быть обработан для растворения клеевых материалов (например, с помощью предварительной обработки марок ксилолом перед осуществлением экстракции ДНК). В ЕР 1 972 688 предлагается способ амплификации нуклеиновой кислоты из микроорганизма, включающий твердую поверхность, с промывкой поверхности при низком рН (3-6) для удаления несвязанных материалов и с последующим использованием поверхности для ПЦР с помощью последовательных стадий внутри одного и того же сосуда. В WO 2006/036243 и WO 2006/036246 раскрыто применение материалов для связывания клеточных растворов, так чтобы нуклеиновая кислота подходила для последующего высвобождения для анализа с последующей обработкой. В предпочтительных материалах твердой подложки используются участки с четвертичными ониевыми солями, связывающими нуклеиновые кислоты.
US 5496562, US 5807527, US 627226 и US 6645717 относятся к целлюлозной или к стекловолоконной матрице, которую предварительно выдерживают в химических реактивах для лизиса клеток, так чтобы при помещении на поверхность крови или слюны, они адсорбировались и одновременно консервировались с помощью химических реактивов, а затем высушивались. Перед применением в реакции ПЦР ДНК-содержащий материал следует предварительно обработать для отмывки химических реактивов.
Поверхности силикона (а также сантопрена и других термопластичных эластомеров) традиционно рассматривались в качестве инертных к процессу захвата ДНК и обеспечению поверхностей, сохраняющих естественным сохраняют ДНК в форме, подходящей для анализа ПЦР. В зависимости от боковых групп, присоединенных к полисилоксановому остову, силикон может иметь множество форм. Было установлено, что ДНК связывают гидрофильные боковые группы, такие как полимеры, созданные с использованием гидроксильных групп, а силикон, как правило, составляют алкильпые или арильные группы, создающие гидрофобный источник, который, как предполагается, биологически инертен.
В IE 20040589 показано использование силикона в качестве инертного жидкого носителя. В JP 2007244389 показано использование силикона в качестве инертного слоя, в котором делаются канавки для проведения возможности протекания около поверхности стекла при ПЦР с предотвращением протекания (т.е. предполагается, что в данном процессе силикон является инертным). В JP 2008012434 показано, что силикон представляет собой матрицу, в которую с помощью амфифильного раствора, смешанного с органическим растворителем для внесения ДНК внутрь сетевой структуры силикона, может быть иммобилизована ДНК, после чего ДНК фиксируют удалением растворителя. Это не естественный процесс абсорбции, поскольку амфифильные растворители содержат гидрофильные и гидрофобные части и поэтому могут использоваться для переноса гидрофильных частей и/или могут использоваться для переноса гидрофильной ДНК в гидрофобные структуры. Растворитель затем удаляют для депонирования ДНК, преодолевая, таким образом, предполагаемое ингибирование абсорбции ДНК. Было обнаружено, что присутствие неполимеризованных молекул силоксана внутри PDMS (полидиметилсилоксана) улучшает применение PDMS в качестве штампа при печати растворов ДНК в микрочипах/струйных устройствах (Thibault et al Langmuir 2007, 23, 10706-10714). Механизм не ясен, но экстракция из растворителя неполимеризованного силоксана уменьшает (предположительно) адсорбцию и перенос ДНК в процессе печати. Ранее исследования сухого контакта с источником ДНК не проводилось.
Таким образом, другие патентные заявки и публикации, по всей видимости, основываются на предпосылке того, что силикон и термопластические эластомеры представляют собой инертные материалы в отношении связывания клеток/ДНК, и что свойство инертной поверхности может быть модифицировано для повышения адсорбции ДНК при жидкостном контакте с растворами ДНК.
Исторически считалось, что пластиковые поверхности являются нейтральными по отношению к процессу захвата клеток и что на них возможно проведение анализа ПЦР. Пластик, по существу, представляет собой гидрофобную поверхность и считается, что ему требуется обработка, чтобы он стал подходящим для связывания клеток или ДНК. В качестве примера можно рассмотреть обработку пластиковых поверхностей для придания им способности к адгезии с клетками тканевых культур. Для создания гидрофильной поверхности поликарбонатные поверхности, как правило, обрабатывают с помощью сильного УФ-облучения или с помощью озона. См. работу Yanchao et al (2007) Anal. Chem. 79, 426-433, в которой описаны различные обработки полистирола, поликарбоната, полиметакрилата и полипропилена с получением более подходящего связывания. Прикрепление ДНК-зонда к пластиковые поверхности и микроструйные устройства для матриксной гибридизации в канале с осциляцией образцов описаны в работе Liu & Rauch, Analytical Biochemistry 2003, vol 317, p 76-84. В ЕР 0389063 показано, что полистирол может использоваться для выделения нуклеиновой кислоты из биологических материалов в присутствии хаотропных веществ, таких как соль гуанидина, йодид натрия, йодид калия, изотиоцианат натрия и т.п. Полипропилен предлагается в качестве предпочтительного материала для реакционных сосудов ПЦР, поскольку является высокоинертным материалом (см., исследования «ABgene», опубликованные в INSights vol 13 2002, Anne van der Valk). Связывание, рассчитанное для поверхности целой пробирки, экспонированной 200 нг человеческой геномной ДНК, составило менее чем 5 нг.
Таким образом, парадигма заключается в том, что необработанный пластик без предварительной обработки представляет собой неподходящую поверхность для захвата клеток или ДНК.
В ЕР 1 675 511 описано устройство для взятия мазков, которое вводится в сосуд, в котором при манипуляции с устройством мазок приводится в контакт с реактивами, а затем с тест-полоской, но данное устройство не используется для анализа нуклеиновых кислот. Изобретение WO 2005/047451 относится к ложечке со съемным концом, сконструированным для забора клеток ротовой полости и помещения их в пробирку со стабилизационным раствором. ДНК извлекают из клеток для дальнейшего анализа. В US 2008/0131876 описан способ амплификации нуклеиновых кислот из клеточного образца путем контакта его со специальным раствором, который модифицирует клетки до готовности к ПЦР без проведения экстракции ДНК. Изобретение WO 2008/006501 относится к устройству, которое доставляет мазок непосредственно в сосуд, связанный с микроструйным устройством для осуществления реакции ПЦР. В ЕР 1049801 упоминается применение полимерной мембраны, на которой может быть создан заряд для связывания ДНК, которую затем можно элюировать. Работа Nikiforor & Rogers (1995) Anal. Biochem. Ill, 201-209 относится к применению 96-луночных полистироловых планшетов для анализа на основе гибридизации ДНК. Работа Inouye & Hondo (1990) J. Clin. Microbiol. 28, 1469-1472 относится к гибридизации амплифицированных сегментов вирусной ДНК в микропланшетах.
В настоящее время, образцы с места преступления берутся либо в виде мазков (например, с пятен крови или отпечатков пальцев) или вырезаются из материала (например, из пятен семенной жидкости на нижнем белье), а мазок или материал помещают в буфер для лизиса клеток, из которого затем экстрагируется ДНК (см., например, Walsh et al (1991) Biotechniques 10, 506-513).
В WO 2005/032377 описан набор для забора биологических образцов, включающий противомикробный агент, и его применения.
В US 2008/0058676 описана система сегментированного коллектора мазков.
В WO 2010/027283 описано устройство забора образцов, подходящее для экстракции из малых объемов.
В WO 2009/129397 описан высокопроизводительный дозатор.
В US 2003/0059345 описано двухконтактное устройство для забора жидких образцов.
Barbany et al (1999) Biomolecular Engineering 16, 105-111 описывают молекулярно-генетические применения разнообразных подложек со стрептавидиновым покрытием.
В WO 99/34214 описаны твердофазные наконечники и связанные с ними применения.
В US 2002/0110812 описаны барьерный способ и устройство сбора нуклеиновой кислоты.
В US 6103192 описывает иммобилизацию и процессирование образцов на матриксных материалах для идентификации последовательностей нуклеиновых кислот.
Barbaro et al (2004) Forensic Science International 146S, S127-S128 описывают детекцию STR из жидкостей организма, собранных на устройстве на основе бумаги «IsoCode».
В US 2004/0152085 описана поверхность для сбора и/или очистки нуклеиновых кислот.
Таким образом, в настоящее время не удовлетворена потребность в способах и устройствах, применяемых при криминалистическом анализе для забора образцов, содержащих нуклеиновую кислоту, которые могут быть использованы на месте преступления, несчастного случая или другого события, и которые подходят для применения с минимальным ручным вмешательством в способе «contact and go» или «collect and go».
Раскрытие изобретения
В настоящем изобретении предлагаются среди прочего способы и устройства, требующие только контакта образца (твердого или жидкого) как для захвата, так и для предоставления нуклеиновой кислоты (как правило, ДНК млекопитающего) в форме, подходящей для амплификации ДНК (с помощью ПЦР или другого способа), при последующем помещении в реактивы для амплификации. Устройство по настоящему изобретению или его часть вместе с реактивами не препятствует ни процессу амплификации, ни последующему процессу аналитической (например, флуоресцентной) детекции.
В работе, описанной в данном документе, продемонстрировано, что непосредственный захват и доставка клеток млекопитающего (включая человека) для анализа амплификации нуклеиновых кислот могут быть произведены за одну стадию только путем контактного переноса («contact and go» или «collect and go») с помощью определенных полимерных поверхностей, включающих пластик, силикон и стекло, которые не требуют увлажнения, сольватации клеток-мишеней для захвата или переноса в реакцию амплификации, и что определенных простых стандартных пластиковых и/или силиконовых поверхностей достаточно (как правило, без модификации, хотя могут использоваться обработки, которые «ДНК-стерилизуют» полимер, такие как УФ-облучение или обработка газом этиленоксидом) для функционирования в виде части устройства для забора образцов для переноса клеток с влажной или сухой поверхности или с пятна, которые содержат клетки, при этом свойство захвата клеток на поверхности такое, что ДНК подходит для анализа ПЦР и остается связанной и способна использоваться повторно для помещения во вторую реакцию ПЦР, при необходимости, и что полимерные устройства для забора образцов или, по меньшей мере, их части могут оставаться внутри реакции амплификации без какого-либо ущерба для реакции.
В работе, описанной в данном документе, предлагаются такие устройства, с помощью которых клетки на поверхности могут контактировать и переноситься не только в одну реакцию анализа ДНК, но также, при необходимости, во множество дискретных одновременных реакций.
В изобретении установлено, что в отличие от догмы, согласно которой пластик, силикон и термопластические эластомеры следует специально обрабатывать для связывания нуклеиновой кислоты, иначе они будут не способны захватывать образцы млекопитающих (включающих человека), и для непосредственной затравки реакций амплификации, определенные пластиковые и силиконовые поверхности могут функционировать в качестве устройства для забора образцов, подходящего для затравки реакции амплификации нуклеиновой кислоты, просто путем приведения поверхности в непосредственный контакт с образцом с последующим помещением контактной поверхности в реакцию анализа ДНК. Эти поверхности могут быть не обработаны или обработаны для «ДНК-стерилизации», так чтобы они не имели ассоциированной с ними какой-либо детектируемой нуклеиновой кислоты, которая бы препятствовала реакции амплификации и детекции нуклеиновой кислоты, как это описано более подробно ниже. При испытаниях в качестве устройств для непосредственного забора образцов других естественных поверхностей, таких как древесина, латекс и металлы, была обнаружена их непригодность для этих целей.
Способы и устройства, описанные в данном документе, обеспечивают портативность, легкость в применении и анализ в течение короткого периода времени в месте забора нуклеиновой кислоты.
В первом аспекте изобретения предлагается способ получения реакционного сосуда, который содержит реакционную смесь и материал, содержащий нуклеиновую кислоту, и который готов к проведению реакции амплификации нуклеиновой кислоты, причем способ включает
(a) обеспечение реакционного сосуда с единственной ячейкой, которая содержит реакционную смесь для проведения реакции амплификации, где реакционный сосуд является закупоренным;
(b) обеспечение устройства для забора образцов;
(c) контакт устройства для забора образцов с материалом, содержащим нуклеиновую кислоту, в результате чего указанный материал, содержащий нуклеиновую кислоту, налипает, по меньшей мере, на часть устройства для забора образцов;
(d) откупорку реакционного сосуда;
(e) помещение устройства для забора образцов или его части, на которую налип материал, содержащий нуклеиновую кислоту, в реакционный сосуд, так чтобы материал, содержащий нуклеиновую кислоту, контактировал с реакционной смесью;
(f) повторная закупорка реакционного сосуда так, чтобы он стал герметичным, с помощью устройства для забора образцов или его части, на которую налип материал, содержащий нуклеиновую кислоту, все еще присутствующий в реакционном сосуде.
Реакционный сосуд может быть любым подходящим реакционным сосудом, в котором проводят реакцию амплификации нуклеиновой кислоты. Как правило, реакционный сосуд сделан из пластика, конкретно, из полипропилена. Удобно, если реакционный сосуд имеет объем от 50 мкл до 3 мл, предпочтительно, от 100 мкл до 1,5 мл. Как правило, реакционный сосуд имеет круглое поперечное сечение от 3 мм до 10 мм, как правило, около 5 мм.
Хотя способ может быть осуществлен с использованием единственного реакционного сосуда, в случае множества реакционных сосудов удобно, если они соединены вместе или находятся в общем штативе и реакции в них проводятся одновременно. Таким образом, как правило, две или три, или четыре, или шесть, или восемь, или десять реакционных сосудов соединены вместе образуя регулярное расположение. Каждый реакционный сосуд может содержать одинаковую реакционную смесь (например, одинаковую смесь для реакции ПЦР для возможности амплификации и детекции одного генетического локуса или локусов), или может содержать различные реакционные смеси (например, различные смеси для реакций ПЦР для возможности амплификации и детекции различных генетических локусов). Регулярное расположение реакционных сосудов представляет собой стандартную конфигурацию для привлечения подходящих инструментов проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты и/или для детекции продуктов. Подходящие инструменты включают инструменты в виде амплификатора и инструменты флуоресцентной детекции. В некоторых воплощениях расположение реакционных сосудов может включать реакционный сосуд, который в качестве контроля уже содержит известный и заранее определенный материал, содержащий нуклеиновую кислоту.
Материал, содержащий нуклеиновую кислоту, помещают в реакционные сосуды с использованием устройств для забора образцов, так чтобы устройство для забора образцов или часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, находились в реакционном сосуде. Как правило, материал, содержащий нуклеиновую кислоту, сохраняется на устройстве для забора образцов или на его части, и погружается в реакционную смесь. Во время реакции амплификации нуклеиновой кислоты амплифицированные копии ДНК высвобождаются в раствор реакционной смеси.
В случае наличия множества реакционных сосудов, соединенных вместе, как указано выше, то, как правило, устройство для забора образцов или его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, конструируется таким образом, чтобы была возможность распределения материала, содержащего нуклеиновую кислоту, между множеством реакционных сосудов. Таким образом, например, когда имеется N реакционных сосудов, то устройство для забора образцов стандартно конфигурируется так, чтобы была возможность распределения материала, содержащего нуклеиновую кислоту, в каждую из N реакционных сосудов. Предпочтительно, если материал распределен между реакционными сосудами в основном поровну. Как правило, N может быть равно 2, 3, 4, 6 или 8. Предпочтительно, если N равно 4. Предпочтительно, если N равно 4, то реакционные сосуды располагаются по углам квадрата.
Следует понимать, что реакционный сосуд, предлагаемый в стадии (а), закупорена. Как правило, затвор воздухонепроницаем. Это означает, что реакционная смесь может оставаться неконтаминированной до момента применения. При применении затвор вскрывают перед стадией (е), но понятно, что стадии (с) и (d) могут проводиться в любом порядке. Затвор может быть любым подходящим затвором, который обычно легко удаляется. Типичный затвор для применения в реакционном сосуде представляет собой фольгу или пластиковую пленку, которые могут сниматься. Другие затворы, например, в виде пробок «push-in stopper», также предусматриваются для реакционных сосудов, предлагаемых в стадии (а). В стадии (f), повторное закупоривание реакционного сосуда предотвращает испарение или утечку во время последующих аналитических процедур. Материал, содержащий нуклеиновую кислоту, как правило, остается в контакте с реакционной смесью.
Устройство для забора образцов имеет несколько важных свойств. При контакте материала, содержащего нуклеиновую кислоту, на устройство для забора образцов налипает количество материала, достаточное для амплификации нуклеиновой кислоты, при помещении устройства или части, на которую налип материал, содержащий нуклеиновую кислоту, в реакционный сосуд и осуществлении реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Следовательно, обычно устройство для забора образцов или, по меньшей мере, его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, способно связывать клеточный материал, конкретно клеточный материал млекопитающего, который присутствует в сухом образце, как более подробно описано ниже. Термин «налипает» означает, что материал, содержащий нуклеиновую кислоту, становится прикрепленным к устройству для забора образцов или к его части непосредственно не требуя при этом отдельного адгезивного материала. Этого достигают путем контакта устройства для забора образцов или его части с материалом, содержащим нуклеиновую кислоту, например, путем соприкосновения устройства или его части с материалом. Устройство для забора образцов или его часть, как правило, не является пористым.
Устройство для забора образцов или его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, остается в реакционном сосуде в процессе реакции амплификации, и таким образом, должно быть совместимо с условиями реакции амплификации нуклеиновой кислоты.
Неожиданно было обнаружено, что представленные ниже полимеры без какой-либо химической модификации или предварительной обработки способны собирать достаточное количество материала, содержащего нуклеиновую кислоту, при контакте с образцом и не препятствуют реакции амплификации нуклеиновой кислоты, присутствуя в реакции. Кроме того, неожиданно было обнаружено, что после реакции амплификации нуклеиновой кислоты достаточное количество материала, содержащего нуклеиновую кислоту, остается ассоциированным с этими полимерами, в результате чего они могут использоваться в следующей реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Образец может быть влажным или сухим. Влажный образец может налипать на устройство или его часть посредством жидкостной адгезии или переноса. Как правило, адгезия клеточного материала, содержащего нуклеиновую кислоту, происходит в случае, когда образец является сухим образцом. Предпочтительно, если образец является сухим.
Полимерами являются стекло, сополимер циклического олефина, такого как Topas, акриловый полимер, такой как полиметилметакрилат (РММА), кристаллический полистирол, полипропилен, полиэтилен высокой плотности (HDPE), поликарбонат, полистирол средней ударной прочности, поливинилхлорид (PVC), жидкокристаллический полимер 30%, транс сополимер акрилонитрила, бутадиена и стирола (Trans ABS), сополимер ацеталя, полиэфир, полиэфиримид, полиэтилен, нейлон, полиэфир полиуретана, блок-сополимер стирола и бутадиена, статистический сополимер полипропилена, этиленвинилацетат, силоксан, такой как полидиметилсилоксан (PDMS), и термопластический эластомер, такой как сантопрен. Предпочтительно, если полимер является полимером, на который налипает материал, содержащий сухую нуклеиновую кислоту, такой как сухой образец клеточного материала, при контакте устройства или его части, которые состоят из полимера, и образца. Таким образом, особенно предпочтительно, если устройство для забора образцов или, по меньшей мере, его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, состоит из одного или нескольких из числа перечисленных полимеров. Предпочтительно, если полимер не представлен в виде вспененного материала, в частности, в виде рыхлого вспененного материала. Полимер не является латексом. Полимер может быть любым подходящим полимером, импрегнированным стеклом, таким как любой из вышеописанных полимеров (за исключением стекла), который импрегнирован стеклом. Как правило, полимер выдерживает температуру 100°C. Например, он не разрушается или не деформируется при данной температуре.
Особенно предпочтительно, если полимер представляет собой любой из РММА, полипропилена, поликарбоната и PDMS. Поликарбонат является более предпочтительным.
Для применения по изобретению подходит ряд различных конструкций устройств для забора образцов, некоторые из которых более подробно описаны ниже. Они делятся на две основные категории, включающие во-первых те, в которых устройство для забора образцов или его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, вставляется в реакционный сосуд (после ее раскупоривания) и позволяет повторно закупорить реакционный сосуд с помощью отдельного затвора в стадии (f). Отдельным затвором может быть, например, фольга, пластиковая пленка или пробка «push-in stopper». Во второй, предпочтительной, категории устройство для забора образцов или его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, обеспечивает затвор, который закупоривает реакционный сосуд в стадии (f). Воплощения данной категории подробно описаны ниже.
Удобно, если устройство для забора образцов или его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, помещают непосредственно в реакционный сосуд без дополнительной обработки после забора образца.
Реакционная смесь предназначена для проведения любой подходящей реакции амплификации нуклеиновой кислоты, включающей, в частности, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), или изотермические методы, такие как лигазная цепная реакция (англ. ligase chain reaction, LCR), петлевая изотермическая амплификация (англ. Loop Mediated Isothermal Amplification, LAMP), транскрипционно-опосредованная амплификация (англ. transcription mediated amplification, TMA), технология сигнально-опосредованной амплификации РНК (англ. signal mediated amplification of RNA technology, SMART), амплификация с замещением цепи (англ. strand displacement amplification, SDA), амплификация по типу катящегося кольца (англ. rolling circle amplification, RCA), изотермическая амплификация с множественным вытеснением цепи (англ. isothermal multiple displacement amplification, IMDA), геликаза-зависимая амплификация (англ. helicase dependent amplification, HAD), изотермическая амплификация с единственным праймером (англ. single primer isothermal amplification, SPIA), циклическая хеликаза-зависима амплификация (англ. circular helicase dependent amplification, CDHA) или амплификация на основе последовательности нуклеиновых кислот (англ. nucleic acid sequence-based amplification, NASBA). ПЦР является предпочтительным; однако в Примерах можно заметить, что для получения ДНК, доступной для амплификации, не требуется высокотемпературная обработка (около 100°C) и поэтому подходят низкотемпературные методы, такие как LAMP, который является изотермическим.
При этом реакционная смесь содержит все из необходимых ингредиентов, за исключением анализируемой нуклеиновой кислоты, для проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты.
Таким образом, например, для ПЦР, реакционная смесь содержит праймеры ПЦР, дезоксинуклеотиды, ДНК-полимеразу, ионы Mg+ и буферный раствор с pH около 7-8. Для других методов амплификации нуклеиновой кислоты, необходимо присутствие других ферментов, таких как РНКаза Н или лигаза.
Было обнаружено, что перед реакцией амплификации нуклеиновой кислоты отсутствует необходимость проведения предварительной обработки материала, содержащего нуклеиновую кислоту. Кроме того, наличие каких-либо специальных реактивов в смеси реакции амплификации нуклеиновой кислоты помимо тех, что требуются для реакции, не является необходимым. Таким образом, предпочтительно, если реакционная смесь по существу не содержит хаотропных агентов. Подобным образом предпочтительно, если реакционная смесь является по существу не содержит агентов, лизирующих клетки. Однако в некоторых воплощениях может присутствовать неионный детергент, такой как Tween-20. С помощью термина «по существу не содержит» указанных агентов мы подразумеваем, что агент отсутствует или что он присутствует в настолько низкой концентрации, что не вызывает того хаотропного воздействия или воздействия, лизирующего клетку, которые могут иметь место. Особенно предпочтительно, если реакционная смесь по существу не содержит вещества, выбранного из числа мочевины, солей гуанидина (таких как гуанидин гидрохлорид), детергента, особенно ионного детергента.
В конкретном предпочтительном воплощении реакционная смесь также содержит реактивы для детекции продукта реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Таким образом, как правило, реакционная смесь также содержит меченные детектируемыми метками нуклеотидные зонды. Особенно предпочтительными зондами являются флуоресцентно-меченные олигонуклеотидные зонды, которые способны гибридизоваться с продуктом реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Подходящие олигонуклеотидные зонды и системы флуоресцентной детекции описаны, например, в WO 2001/73118, WO 2007/010268, WO 2009/053679, каждый из которых включен в данный документ ссылкой. Особенно предпочтительно, если осуществляется анализ с использованием коротких тандемных повторов (STR), например, при проведении метода «отпечатка пальцев» с ДНК человека. Следует понимать, что предпочтительно, если детекция может осуществляться во время или после реакции амплификации нуклеиновой кислоты, в закупоренном реакционном сосуде, так как незакупоренный реакционный сосуд имеет потенциал внесения загрязнений. Результаты амплификации могут наблюдаться непосредственно в реакционном сосуде, например, с помощью световой флуоресценции или путем забора образцов из раствора реакционной смеси, оставляя устройство для забора образцов в сосуде, и анализируя амплифицированную ДНК, например, путем гель-электрофореза.
Материал, содержащий нуклеиновую кислоту, может иметь любое происхождение, но предпочтительно, имеет происхождение из высших эукариот, таких как млекопитающие, или имеет растительное происхождение. Высшие эукариоты включают животных, в том числе позвоночных. Предпочтительным является происхождение нуклеиновой кислоты из млекопитающего. Предпочтительной нуклеиновой кислотой является ДНК. Предпочтительно, если нуклеиновая кислота является геномной ДНК, но также термином «происхождение из высших эукариот» охватывается вирусная нуклеиновая кислота, которая получена из клетки высших эукариот. Как правило, нуклеиновая кислота присутствует в клетках млекопитающего, и материал, содержащий нуклеиновую кислоту, представляет собой клеточный материал из млекопитающего. Клеточный материал млекопитающего, в том числе человека, включает кровь, слюну, семенную жидкость, клетки, такие как клетки кожи, и клеточный материал, депонированный на твердой поверхности, например, клетки кожи, которые могут оставаться как часть отпечатка пальцев. Материал, содержащий нуклеиновую кислоту, может быть по существу не содержать материала, не содержащего нуклеиновые кислоты.
Для многих применений материал, содержащий нуклеиновую кислоту, является по существу сухим. Под термином «по существу сухой» мы подразумеваем, что образец не имеет видимых признаков ассоциированной с ним влаги. Например, материал, содержащий нуклеиновую кислоту, может представлять собой клетки, такие как клетки кожи, высохшую кровь, высохшую семенную жидкость, высохшую слюну или другие высохшие жидкости организма. Неожиданно было обнаружено, что нет необходимости сольватировать высохший материал перед забором образца, а также было обнаружено, что высохший образец может быть помещен непосредственно в реакционный сосуд без предварительной обработки.
Даже если и не ограничиваться этим применением, легко можно понять, что изобретение имеет приложение в криминалистической науке, конкретно на месте преступления. Также предполагаются клинические применения, такие как тестирование генетического заболевания и тестирование «источника происхождения» пищевых, растительных или животных материалов. Аналогично, способы и устройства по изобретению охватывают забор нуклеиновой кислоты, например, из области поражения заболеванием. В качестве примеров можно рассмотреть места, в которых происходит заражение патогенами инфекционных заболеваний (такими как птичий грипп, синдром атипичной пневмонии (SARS), так называемый «свиной грипп» и ящур). В таких местах особенно важно быстро идентифицировать штамм заболевания, вызвавший заражение.
Во втором аспекте изобретения предлагается способ амплификации нуклеиновой кислоты, причем способ включает приготовление реакционного сосуда согласно первому аспекту изобретения и осуществление реакции амплификации нуклеиновой кислоты в реакционном сосуде. После приготовления реакционного сосуда, который таким образом содержит реакционную смесь, включающую реактивы для проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты, а также содержит материал, содержащий нуклеиновую кислоту, осуществляется реакция амплификации нуклеиновой кислоты обычным способом согласно типу реакции. Таким образом, например, ПЦР может проводиться в подходящем амплификаторе.
Как отмечено выше, неожиданно было обнаружена возможность повторного использование устройства для забора образцов или, по меньшей мере, его части, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, в следующей реакции амплификации нуклеиновой кислоты, поскольку остается достаточное количество материала, по меньшей мере, для следующей реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Таким образом, в третьем аспекте изобретения предлагается способ амплификации нуклеиновой кислоты, причем способ включает проведение способа первого аспекта изобретения, удаление устройства для забора образцов (или его части, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту), и помещение его в следующий реакционный сосуд и осуществление реакции амплификации нуклеиновой кислоты в следующем реакционном сосуде. В одном воплощении третьего аспекта изобретения устройство для забора образцов удаляют и, в случае необходимости, подвергают промывкам раствором для удаления любого компонента из первой реакционной смеси перед помещением в следующий реакционный сосуд. Нет необходимости подвергать устройство для забора образцов промывкам, если другой зонд, детектирующий новую последовательность-мишень, помечен флуорофором другого цвета, так как любой остаток первой реакции будет «невидим» для последующего анализа.
В другом воплощении второго аспекта изобретения реакционную смесь удаляют из реакционного сосуда после осуществления первой реакции амплификации, устройство для забора образцов или его часть промывают in situ в реакционном сосуде, а затем добавляют в реакционный сосуд вторую реакционную смесь. В следующем воплощении устройство для забора образцов или его часть может содержать магнитный материал, и удерживание в реакционном сосуде может осуществляться путем применения подходящего магнитного поля.
Как правило, следующий реакционный сосуд по существу готовят согласно описанию первого аспекта изобретения. Хотя, как правило, нет необходимости в проведении следующей реакции амплификации нуклеиновой кислоты, изобретение позволяет осуществить ее и это может найти конкретное применение в случае проведения следующей подтверждающей или независимой реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Следующая реакция амплификации может проводиться через некоторое время после первой реакции амплификации нуклеиновой кислоты.
В четвертом аспекте изобретения предлагается способ амплификации нуклеиновой кислоты из высших эукариот, например, из источника нуклеиновых кислот млекопитающего или растения, который включает
(a) контакт устройства для забора образцов с источником нуклеиновой кислоты высших эукариот, таких как млекопитающее или растение, так что после следующего указанного контакта материал, содержащий нуклеиновую кислоту высших эукариот, таких как млекопитающее или растение, налипает, по меньшей мере, на часть устройства для забора образцов, где устройство для забора образцов или его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, сделан из подходящего полимерного материала;
(b) введение устройства для забора образцов или его части, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, в реакционный сосуд, который содержит реакционную смесь для проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты без какой-либо предварительной обработки материала, содержащего нуклеиновую кислоту; и
(c) осуществление реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Полимерный материал представляет собой материал, на который налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, после контакта с источником нуклеиновой кислоты, например, при трении. Полимерный материал также представляет собой материал, который не мешает или в существенной степени не препятствует реакции амплификации нуклеиновой кислоты, в случае присутствия полимерного материала в реакционной смеси. Является или нет полимер подходящим полимером, можно определить, например, согласно описанию в примерах. В частности, протокол, описанный в Примере 2, можно использовать для определения пригодности полимера, или можно использовать протокол Примера 11, в котором РММА заменен на другой полимер, чью стабильность тестировали, а также можно использовать зонд D16.
Предпочтительно, если полимерный материал является любым из числа стекла, сополимера циклического олефина, такого как Topas, акрилового полимера, такого как РММА, кристаллического полистирола, полипропилена, HDPE, поликарбоната, полистирола средней ударной прочности, PVC, жидкокристаллического полимера 30%, Trans ABS, сополимера ацеталя, полиэфира, полиэфиримида, полиэтилена, нейлона, полиэфира полиуретана, блок-сополимер стирола и бутадиена, статистического сополимера полипропилена, этиленвинилацетата, силоксана, такого как PDMS, и термопластического эластомера, такого как сантопрен.
Удобно, если источник нуклеиновых кислот высших эукариот, таких как млекопитающие или растения, является в существенной степени сухим, как обсуждалось выше. Удобно, если устройство для забора образцов или его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, остается в реакционном сосуде во время стадии (с).
В пятом аспекте изобретения предлагается способ амплификации нуклеиновой кислоты из высших эукариот, например, из источника нуклеиновых кислот млекопитающих или растений, который включает
(a) контакт устройства для забора образцов с источником нуклеиновой кислоты высших эукариот, таких как млекопитающее или растение, так чтобы после указанного контакта материал, содержащий нуклеиновую кислоту высших эукариот, таких как млекопитающее или растение, налип, по меньшей мере, на часть устройства для забора образцов, где источник нуклеиновых кислот высших эукариот, таких как млекопитающее или растение, является в существенной степени сухим;
(b) введение устройства для забора образцов или его части, на которую налип материал, содержащий нуклеиновую кислоту, в реакционный сосуд, который содержит реакционную смесь для проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты без какой-либо предварительной обработки материала, содержащего нуклеиновую кислоту; и
(c) осуществление реакции амплификации нуклеиновой кислоты. Удобно, если устройство для забора образцов или его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, сделаны из любого материала из числа стекла, сополимера циклического олефина, такого как Topas, акрилового полимера, такого как РММА, кристаллического полистирол, полипропилена, HDPE, поликарбоната, полистирола средней ударной прочности, PVC, жидкокристаллического полимера 30%, Trans ABS, сополимера ацеталя, полиэфира, полиэфиримида, полиэтилена, нейлона, полиэфира полиуретана, блок-сополимер стирола и бутадиена, статистического сополимера полипропилена, этиленвинилацетата, силоксана, такого как PDMS, и термопластического эластомера, такого как сантопрен.
Удобно, если устройство для забора образцов или его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, остается в реакционном сосуде во время стадии (с).
Как правило, реакционная смесь в четвертом и в пятом аспектах изобретения в существенной степени не содержит хаотропных агентов и/или в существенной степени не содержит агентов, лизирующих клетку (см. обсуждения, приведенные выше, в отношении первого аспекта изобретения).
В шестом аспекте изобретения предлагается способ конструкции носителя данных, который записывает генотип, ассоциированный с нуклеиновой кислотой, материала, содержащего нуклеиновую кислоту, причем способ включает проведение способа согласно второму, четвертому или пятому аспекту изобретения, определение генотипа нуклеиновой кислоты в материале, содержащем нуклеиновую кислоту, и запись генотипа на носитель данных. Генотипирование может быть связано с SNP (однонуклеотидный полиморфизм) или может быть связано с STR (короткий тандемный повтор). Генотипирование может представлять собой «ДНК-фингерпринт». Носитель данных может быть любым носителем данных, но, как правило, это электронный носитель данных в виде компьютерного диска или флэш-памяти. Следует понимать, что носитель данных и данные на нем могут использоваться для сравнения генотипа нуклеиновой кислоты из анализируемого образца с генотипом из других образцов или с генотипом, хранящимся в базе данных. Это особенно применимо к воплощениям изобретения, которые связаны с раскрытием преступлений и с правоохранительными мерами.
В седьмом аспекте изобретения предлагается применение устройства для забора образцов нуклеиновой кислоты для получения нуклеиновой кислоты из источника высших эукариот, таких как млекопитающее или растение, с последующим введением без предварительной обработки источника нуклеиновой кислоты высших эукариот, таких как млекопитающее или растение, в реакционный сосуд, содержащий реакционную смесь реакции амплификации нуклеиновых кислот, где источник нуклеиновых кислот высших эукариот, таких как млекопитающее или растение, является, по существу сухим. Предпочтительно, если нуклеиновая кислота налипла на устройство для забора образцов или на его часть, причем устройство для забора образцов или его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, сделаны из любого материала из числа стекла, сополимера циклического олефипа, такого как Topas, акрилового полимера, такого как РММА, кристаллического полистирол, полипропилена, HDPE, поликарбоната, полистирола средней ударной прочности, PVC, жидкокристаллического полимера 30%, Trans ABS, сополимера ацеталя, полиэфира, полиэфиримида, полиэтилена, нейлона, полиэфира полиуретана, блок-сополимер стирола и бутадиена, статистического сополимера полипропилена, этиленвинилацетата, силоксана, такого как PDMS, и термопластического эластомера, такого как сантопрен. Удобно, если устройство для забора образцов или его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, остается в реакционном сосуде во время стадии (с).
В восьмом аспекте изобретения предлагается набор реактивов, включающий (а) закупоренный реакционный сосуд, который содержит реакционную смесь для проведения реакции амплификации нуклеиновой кислоты, и (b) устройство для забора образцов, по меньшей мере, на часть которого может налипать материал, содержащий нуклеиновую кислоту, после контакта с указанным материалом, где устройство для забора образцов или его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, может быть введено в реакционный сосуд, а реакция амплификации нуклеиновой кислоты может быть осуществлена в сосуде в присутствии устройства для забора образцов или его части, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту. Реакционный сосуд, реакционная смесь, устройство для забора образцов, материал, содержащий нуклеиновую кислоту и так далее, могут быть любыми, согласно описанию предыдущих аспектов изобретения. Предпочтения для этих признаков в данном аспекте изобретения являются такими же.
Как правило, набор реактивов содержит множество реакционных сосудов, которые соединены вместе, как обсуждалось выше в контексте первого аспекта изобретения. Как правило, устройство для забора образцов или его часть, на которую может налипнуть материал, содержащий нуклеиновую кислоту, конфигурируется таким образом, чтобы была возможность распределения материала, содержащего нуклеиновую кислоту, между множеством реакционных сосудов, как обсуждалось выше в контексте первого аспекта изобретения.
В некоторых воплощениях удобно, если устройство для забора образцов или его часть, на которую может налипнуть материал, содержащий нуклеиновую кислоту, обеспечивает закупорку реакционного сосуда после удаления исходного затвора. Предпочтительно, если устройство для забора образцов или его часть, на которую налипает материал, содержащий нуклеиновую кислоту, сделан из любого материала из числа стекла, сополимера циклического олефина, такого как Topas, акрилового полимера, такого как РММА, кристаллического полистирол, полипропилена, HDPE, поликарбоната, полистирола средней ударной прочности, PVC, жидкокристаллического полимера 30%, Trans ABS, сополимера ацеталя, полиэфира, полиэфиримида, полиэтилена, нейлона, полиэфира полиуретана, блок-сополимер стирола и бутадиена, статистического сополимера полипропилена, этиленвинилацетата, силоксана, такого как PDMS, и термопластического эластомера, такого как сантопрен. Удобно, если реакционная смесь, присутствующая в реакционном сосуде, представляет собой любую реакционную смесь, описанную выше в отношении предыдущих аспектов изобретения.
Согласно девятому аспекту изобретения предлагается устройство (аппарат) для забора нуклеиновой кислоты, включающее, по меньшей мере, один зонд, несущий образец нуклеиновой кислоты; и манипулятор, который может присоединяться к зонду так, чтобы была возможность маневрирования зондом, причем зонд способен отделяться от манипулятора.
Необязательно устройство включает приемник, включающий запаиваемое отверстие для контакта одного или нескольких реактивов и образца нуклеиновой кислоты;
функциональную часть манипулятора, которая обуславливает или обеспечивает вставку зонда через отверстия для помещения образца в приемник; и зонд, включающий укупорочное средство, которое при помещении образца в приемник закрывает приемник от выхода или входа материала, содержащего нуклеиновую кислоту.
Дополнительные необязательные аспекты устройства по изобретению определены в зависимых пунктах формулы изобретения. В частности, в рамках изобретения необязательная конструкция устройства включает приемник, включающий закупориваемое отверстие для контакта одного или нескольких реактивов и образца нуклеиновой кислоты; функциональную часть манипулятора, которая обуславливает или обеспечивает вставку зонда через отверстия для помещения образца в приемник.
Изобретение будет описано более подробно со ссылкой на следующие частные примеры, воплощения и фигуры.
Краткое описание фигур
На фигуре 1 показаны пиковые значения, полученные в анализе «SGMPlus» (Applied Biosystems) для ряда пластиковых «микросфер», используемых для переноса буккальных клеток и ДНК из мазка ротовой полости. Пластиковые микросферы, проанализированные трижды, были изготовлены из 1) Topas, 2) акрила, 3) кристаллического полистирола, 4) полипропилена, 5) HDPE, 6) поликарбоната, 7) полистирола средней ударной прочности, 8) PVC, 9) блок-сополимера полиэтилена и полиэтиленгликоля, 10) сополимера полиэтилена и полиакриловой кислоты, 11) сополимера поливинилового спирта и полиэтилена, 12) сополимера этилена и винилацетата с привитым малеиновым ангидридом, 13) жидкокристаллического полимера 30%, 14) Trans ABS, 15) циклического олефинового сополимера, Topas 16) сополимера ацеталя, 17) полиэфира, 18) полиэфиримида, 19) полиэтилена, 20) нейлона, 21) полиэфира полиуретана, 22) блок-сополимера стирола и бутадиена, 23) статистического сополимера полипропилена и 24) этиленвинилацетата.
На фигуре 2 показан ряд пиков, полученных посредством анализа «SGMPlus» для пластиковых «микросфер», используемых для переноса буккальных клеток и ДНК из мазка ротовой полости. Пластиковые микросферы, проанализированные трижды, были изготовлены из 1) Topas, 2) Акрила, 3) кристаллического полистирола, 4) полипропилена, 5) HDPE, 6) поликарбоната, 7) полистирола средней ударной прочности, 8) PVC, 9) блок-сополимера полиэтилена и полиэтиленгликоля, 10) сополимера полиэтилена и полиакриловой кислоты, 11) сополимера поливинилового спирта и полиэтилена, 12) сополимера этилена и винилацетата с привитым малеиновым ангидридом, 13) жидкокристаллического полимера 30%, 14) Trans ABS, 15) циклического олефинового сополимера, Topas 16) сополимера ацеталя, 17) полиэфира, 18) полиэфиримида, 19) полиэтилена, 20) нейлона, 21) полиэфира полиуретана, 22) блок-сополимера стирола и бутадиена, 23) статистического сополимера полипропилена и 24) этиленвинилацетата. Если все мишени успешно амплифицированы, то должны быть образованы ДНК-продукты в количестве 21.
Фигура 3 иллюстрирует данные пиковых значений плавления, полученные с помощью теста «D16S539 HyBeacon», А) Результаты для РММА, полученные с использованием метода натирания при контакте с образцом крови на ткани и образцом слюны на стекле. В) Результаты для PDMS, полученные с использованием метода натирания при контакте с образцом крови на ткани, крови на стекле, слюны на ткани и слюны на стекле. С) Результаты для сантопрена (8281-75MED), также полученные с использованием метода натирания при контакте с образцом крови на ткани, крови на стекле, слюны на ткани и слюны на стекле.
Фигура 4 иллюстрирует данные пиковых значений плавления, полученные с использованием теста «D16S539 HyBeacon», А) Результаты для РММА в присутствии экстрагируемой ДНК. В) Результаты для PDMS в присутствии экстрагируемой ДНК. С) Результаты для сантопрена (8281-75MED) в присутствии экстрагируемой ДНК. Контроли экстрагируемой ДНК представлены более темными следами.
Фигура 5 иллюстрирует данные пиковых значений плавления, полученные с использованием теста D16S539, А) Результаты для РММА в присутствии обработанного буккалыюго мазка. В) Результаты для PDMS в присутствии обработанного буккального мазка. С) Результаты для сантопрена (8281-75MED) в присутствии обработанного буккального мазка. Контроли обработанного мазка представлены более темными следами.
Фигура 6 иллюстрирует i) данные пиковых значений плавления, полученные с использованием теста D16S539. А) Результаты для РММА с использованием метода натирания образца слюны на стекле. В) Результаты для PDMS с использованием метода натирания образца слюны на стекле. С) Результаты для сантопрена (8281-75MED), с использованием метода натирания образца слюны на стекле.
Фигура 7 иллюстрирует данные пиковых значений плавления, полученные с использованием теста D18S51. Поверхности-образцы удаляли из теста D16S539, мягко промывали, помещали в реакции D18S51 и амплифицировали. А) Результаты для РММА с использованием метода натирания образца слюны на стекле. В) Результаты для PDMS, с использованием образца слюны на стекле. С) Результаты для сантопрена (8281-75MED), с использованием образца слюны на стекле.
Фигура 8 демонстрирует А) кривые амплификации и В) пиковые значения плавления, полученные с использованием теста петлевой изотермической амплификации (LAMP), для анализа участка гена SLC6A4. Образцы получали путем натирания PDMS высохшего пятна слюны на стекле.
Фигура 9 демонстрирует сравнение PDMS, который содержал несвязанный силоксан, удаленный посредством экстракции в экстракторе Сокслета с использованием этанола.
Фигуры 10а - 10d представляют собой вид сбоку (фигуры 10а и 10d), вид сверху (фигура 10b) и перспективное изображение (фигура 10 с) частей первого воплощения устройства для забора образцов нуклеиновой кислоты по изобретению.
Фигуры 11-16 демонстрируют перспективное изображение частей другого воплощения устройства по изобретению.
Фигура 17 демонстрирует перспективное изображение варианта конструкции фигур 11-16.
Фигуры 18-20 демонстрируют вид сбоку и виды в разрезе дополнительного воплощения изобретения, в котором индивидуальные зонды для забора образцов могут выдвигаться из манипулятора.
Фигуры 21-24 иллюстрируют другую конструкцию, в которой может использоваться механическая компьютеризированная конструкция, чтобы вызывать разведение исходно сведенных частей наконечников перед выдвижением из манипулятора.
На фигуре 25 показано, что стекло можно использовать для получения из образца материала, содержащего нуклеиновую кислоту, не препятствуя реакции амплификации.
Фигура 26 демонстрирует, что УФ-облучение с целью «стерилизации полимера от ДНК» не оказывает какого-либо воздействия на способность получения после контакта с образцом материала, содержащего нуклеиновую кислоту, и на осуществление амплификации.
Фигура 27 представляет собой сравнение РММА с КОН-протравленным РММА для реакции D16. Линейные графики демонстрируют средние пики плавления из восьми повторенных анализов.
В данном описании некоторые термины используются взаимозаменяемо с целью указания широкой применимости принципов изобретения. Следующая согласованная таблица суммирует термины, имеющие эквивалентные значения:
Термин 1
Термин 2 (Эквивалент)
Реакционный сосуд
Приемник
Материал, содержащий нуклеиновую кислоту
Образец нуклеиновой кислоты
Устройство для забора образцов (Sampling device)
Аппарат для забора образцов (Sampling apparatus)
Кроме того, термины «затвор» и «деталь-затвор» используются взаимозаменяемо в данном документе в зависимости от контекста. Осуществление изобретения Пример 1: Материалы и методы, касающиеся дальнейших Примеров
Изготовление микросфер
У поставщиков пластиковых материалов («Sovereign»; «Slough», «Matrix Plastics»; «Slough», «EuroPlaz»; «Southminster») получали пластиковые гранулы из следующих пластиков: 1) Topas, 2) акриловый полимер, 3) кристаллический полистирол, 4) полипропилен, 5) HDPE, 6) поликарбонат, 7) полистирол средней ударной прочности, 8) PVC, 9) блок-сополимер полиэтилена и полиэтиленгликоля, 10) сополимер полиэтилена и полиакр иловой кислоты, 11) сополимер поливинилового спирта и полиэтилена и 12) сополимер этилена и винилацетата с привитым малеиновым ангидридом, 13) жидкокристаллический полимер 30%, 14) Trans ABS, 15) сополимер циклического олефина, 16) сополимер ацеталя, 17) полимер сложного эфира, 18) полиэтеримид, 19) полиэтилен, 20) нейлон, 21) полиэфир полиуретана, 22) блок-сополимер бутадиена и стирола, 23) статистический сополимер полипропилена, и 24) этиленвинилацетат.Их использовали в немодифицированном виде, а в дальнейших экспериментах разрезали скальпелем для получения похожих по размеру осколков пластика, размер которых составлял примерно 1,5 мм. Все пластики облучали УФ-излучением при длине волны 257 нм для удаления возможной контаминирующей ДНК. Краткое описание пластиков представлено в Таблице 1.
Таблица 1
Совокупность свойств используемых пластиков.
Пластик
Цвет
Прочность
Приблизительный размер
Форма
Topas
Прозрачный
Очень прочный
H=3 мм, r=1 мм
Цилиндрический
акриловый полимер
Прозрачный
Очень прочный
H=3 мм, r=2 мм
Цилиндрический
кристаллический полистирол
Прозрачный
Очень прочный
H=3 мм, r=1 мм
Цилиндрический
Полипропилен
Матово-черный
Прочный
H=3 мм, r=1 мм
Цилиндрический
HDPE
Матово-белый
Очень прочный
H=2 мм, r=1,5 мм
Выпуклый диск
Поликарбонат
Прозрачный
Очень прочный
H=3 мм, r=1 мм
Цилиндрический
полистирол средней ударной прочности
Матово-белый
Очень прочный
H=3 мм, r=1 мм
Цилиндрический
PVC
Прозрачный
Прочность от средней до мягкой, почти гибкий.
H=2 мм, r=1,5 мм
Выпуклый диск
Блок-сополимер полиэтилена и полиэтиленгликоля
Почти матово-белый
Материл типа очень мягкого воска. (Растворяется в реакционной смеси)
Используется часть размером приблизительно 1,5 мм
Неправильная форма
сополимер полиэтилена и акриловой кислоты
Прозрачный
Очень прочный
H=2,5 мм, r=1,5 мм
Овальный
сополимер винилового спирта и полиэтилена
Прозрачный
Очень прочный
H=3 мм,r=1 мм
Цилиндрический
сополимер винилового спирта и полиэтилена
Прозрачный
Очень прочный
H=3 мм, r=1 мм
Цилиндрический
Жидкокристаллический полимер 30%
Матовая паста
Очень прочный
H=4 мм, r=1 мм
Цилиндрический
Trans ABS
Прозрачный
Очень прочный
H=3 мм, r=1 мм
Цилиндрический
сополимер циклического олефина
Прозрачный
Очень прочный
H=3 мм, r=1 мм
Цилиндрический
ацеталь хостаформ
Матово-белый
Очень прочный
H=2 мм, r=2 мм
Выпуклый диск
Полиэфир
Матово-белый
Очень прочный
H=3 мм, r=1 мм
Цилиндрический
Полиэфиримид
Желтый прозрачный
Очень прочный
H=3 мм, r=1 мм
Цилиндрический
Плиэтилен
Прозрачный
Очень прочный
H=3 мм, r=1 мм
Цилиндрический
Нейлон
Матово-белый
Очень прочный
H=3 мм, r=1 мм
Цилиндрический
полиэфир полиуретана
Прозрачный
Почти эластичный
H=3 мм, r=1,5 мм
Цилиндрический
Блок-сополимер стирола и бутадиена
Прозрачный
Очень прочный
r=4 мм
Сферический
статистический сополимер полипропилена
Полупрозрачный
Очень прочный
r=4 мм
Сферический
Этиленвинилацетат
Прозрачный
Умеренно прочный
r=4 мм
Сферический/Выпуклые диски
Способ забора образца
Для оценки пригодности различных пластиков для анализа неочищенных образцов использовали разные способы:
1) Способ с вибрационным смесителем; трансбукальный соскоб забирали с помощью «OmniSwab» («Whatman Ltd»). Очищенные УФ образцы пластика помещали в 6 мл стерильную пробирку Бижу с образцом мазка и смешивали на высокой скорости в течение 10 секунд с помощью вибрационного смесителя для приведения в контакт с материалом, содержащим нуклеиновую кислоту. Затем пластик переносили в реакционный сосуд с помощью стерильного тонкозаточенного пинцета.
2) Способ натирания; Очищенные УФ образцы пластика удерживали чистым тонкозаточенным пинцетом. Затем с его помощью натирали одной из поверхностей пластика образец (например, сухое пятно крови на ткани/стекле, сухое пятно слюны на ткани/стекле и т.п.) для приведения в контакт пластика с материалом, содержащим нуклеиновую кислоту. После чего поверхность пластика с образцом переносили в реакционный сосуд, при этом натертая поверхность была направлена вниз к реакционной смеси. Поверхность пластика оставалась т situ в обоих методах.
<mi>ℓ</mi>
Краткое описание «Ampf
STR© SGMplus™»
<mi>ℓ</mi>
<mi>ℓ</mi>
<mi>ℓ</mi>
<mi>ℓ</mi>
<mi>ℓ</mi>
Амплификация и исследование STR-мишеней проводили с помощью набора «Ampf
STR© SGMplus™» («Applied Biosystems»). Набор «The Ampf
STR© SGMplus™» содержит десять STR (D16S539, D18S51, D19S433, D2S1338, D21S11, D3S1358, D8S1179, FGA, TH01 и vWA) и тест для установления половой принадлежности по амелогенину. Набор «Ampf
STR© SGMplus™» применяли, как описано в пользовательском руководстве для этого набора, за исключением использования половинных объемов реакций. На половину объема реакционной смеси на образец приходилось: 10,5 мкл реакционной смеси AmpF
STR PCR, 5,5 мкл AmpF
STR SGM 0,5 мкл набора праймеров. 15 мкл реакционной смеси и 10 мкл воды добавляли в каждый образец до общего объема реакционной смеси 25 мкл.
Амплификацию и исследование последовательностей-мишеней осуществляли с помощью прибора «Applied Biosystems 9700» («Applied Biosystems»). После начальной денатурации для активации фермента горячим стартом (95°С, 11 минут), мишени амплифицировали 28 циклов, включающих денатурацию (95°С, 1 минута), отжиг праймеров (59°C, 1 минута) и стадию удлинения продукта (72°С, 1 минута). После амплификации проводили аденилирование продукта (60°C, 45 минут). Затем образцы хранили при 4°С до дальнейшей обработки.
Амплификацию и исследование последовательностей-мишеней осуществляли с помощью прибора «Applied Biosystems 3100» («Applied Biosystems»). Для анализа 1 мкл амплифицированного продукта добавляли к 8,9 мкл формамида Hi-Di («Applied Biosystems») и 0,1 мкл размерного стандарта «Genescan 500 ROX». Образцы инъецировали в 36 см капиллярный эррей при 3 кВ в течение 10 секунд. Образцы анализировали с помощью «Genemapper ID».
Анализ STR с помощью зондов «НуВеасоп»
Амплификацию и исследование STR-мишеней осуществляли на основе метода, опубликованного French et al 2008 (источник 1), с использованием флуоресцентных олигонуклеотидных зондов, нефлуоресцентных блокирующих олигонуклеотидов и анализа кривой плавления.
Объемы ПЦР составляли 20 мкл, включая 1х буфер «SpeedSTAR Buffer I» (TaKaRa) или 1 единица буфера «Phire Buffer» (Finnzymes), 1 единица полимеразы «SpeedSTAR» («TaKaRa») или 1 единица полимеразы «Phire» («Finnzymes»), 3% БСА (Roche), 0,5% Tween-20 («Sigma») и 1 мМ dNTP (0,25 мМ каждого - «GE Healthcare», Амершам, Великобритания). В зависимости от осуществляемого анализа (т.е. анализа D16S539 или D18S51), использовали 1 мкМ прямой праймер, 0,1 мкМ обратный праймер и 75 нМ зонд для соответствующего теста. Анализы D16S539 и D18S51 также включали 1цМ и 375 нМ нефлуоресцентного блокера, соответственно. Ассиметричный ПЦР использовали для получения избытка цепи-мишени, так чтобы при отжиге с амплифицированными последовательностями преимущество имела гибридизация с зондом (см. WO 2007/010268 А2).
Амплификацию и исследование последовательностей-мишеней осуществляли с помощью приборов «Rotor-Gene 6000» («Corbett Research») и «CFX96» («Bio-Rad»). После начальной денатурации для активации фермента горячим стартом (95°С, 1 минута), мишени амплифицировали 50 циклов, включающих денатурацию (95°C, 1 секунда), отжиг праймеров (64°С, 4 секунды) и стадию удлинения продукта (72°С, 4 секунды). После амплификации реакции денатурировали (95°С, 1 минута) и охлаждали (20°С, 2 минуты) перед анализом кривой плавления.
Анализ кривой плавления осуществляли нагреванием реакций от 20°С до 70°С, считывая данные флуоресценции с шагом 0.5°C, с 5 секундной выдержкой при каждой температуре. Пики плавления получали путем построения графика зависимости отрицательной производной флуоресценции по температуре (-dF/dT на y-оси) от температуры (на х-оси).
Анализ гена SLC6A4 и перечень использованных олигонуклеотидов
2
Амплификацию и детекцию полиморфных мишеней гена SLC6A4 осуществляли на основе метода петлевой изотермальной амплификации (LAMP), описанного Masaomi Iwasaki, Toshihiro Yonekawa, et al (2003). Иитеркалирующий флуоресцентный краситель «EvaGreen» использовали для обнаружения амплификации мишени в реальном времени посредством анализа кривой плавления.
Объемы ПЦР составляли 25 µл, включая 1х смесь «Isothermal Mastermix» («Genesys»), 0,8 мкМ внутренних праймеров, 0,2 мкМ внешних праймеров, 0,2 мкМ петлевых праймеров.
Амплификацию и исследование последовательностей-мишеней осуществляли с помощью прибора «CFX96» («Bio-Rad»). Мишени амплифицировали инкубацией образцов при 59°C в течение 30 минут с помощью прибора «CFX96» («Bio-Rad»), считывая данные флуоресценции каждые 30 секунд. После амплификации реакции денатурировали (95°С, 3 минуты) перед проведением анализа кривой плавления.
Анализ кривой плавления осуществляли нагреванием реакций от 40°C до 90°С, считывая данные флуоресценции в канале FAM с шагом 0.5°C, с 5 секундной выдержкой при каждой температуре. Пики плавления получали путем построения графика зависимости отрицательной производной флуоресценции по температуре (-dF/dT на y-оси) от температуры (на х-оси).
Получение экстрагированных по Сокслету поверхностей PDMS и ссылка на метод
3
Поверхности PDMS очищали от несвязанного силоксана этанолом в экстракторе Сокслета. Используемый метод был основан на описанном в работе Thibault et al (2007).
Для проверки воздействия несвязанного силоксана, примерно 20 поверхностей PDMS помещали в патрон из пористого материала в 100 мл устройстве Сокслета. Устройство Сокслета поместили в 250 мл химический стакан со 180 мл абсолютного этанола. Устройство Сокслета было настроено примерно на 8 кратный обратный ток жидкости в час в течение 12 часового периода. Взвешивания материалов и реактивов не проводили, поскольку экстрагированный силоксан не представлял дальнейшего интереса для эксперимента. Свободные от несвязанного силоксана поверхности использовали, как описано выше.
Получение поверхностей, модифицированных КОН
Поверхности РММА протравливали КОН встряхиванием в 1 М KOH (гидроксиде калия) в течение 24 часов при 85°C. Для проверки прохождения модификации, поверхности (модифицированные и исходные) встряхивали в 0,1% малахитовом зеленом в воде. После инкубации в течение 10 минут надосадочную жидкость удаляли и микросферы промывали избытком воды. Из-за карбоксильных групп на поверхности модифицированных микросфер, положительно заряженные красители удерживаются, тогда как исходные микросферы не связывают каких-либо красителей. Успешно модифицированные микросферы стали зелеными.
Пример 2: Оценка пластиковых материалов для изготовления устройств взятия мазков
<mi>ℓ</mi>
Различные пластиковые (как указано на фигуре 1) микросферы различных размеров недолго смешивали вибрационным смесителем с зондами-тампонами для слизистой рта («Omniswabs», «Whatman»), а затем помещали в коммерческий набор реакций ПЦР, разработанный для обнаружения 10 различных типов коротких концевых повторов плюс тест для установления половой принадлежности по амелогенину («Ampf
STR© SGMplus™»; «Applied Biosystems»). Реакции проводили в рекомендованных производителем условиях, в половинном объеме реакции, 25 мкл. Полученные продукты ПЦР разделяли капиллярным электрофорезом с помощью прибора «Applied Biosystems 3100». На фигуре 1 показано, что некоторые пластики (Topas, акриловый полимер, кристаллический полистирол, полипропилен, HDPE, поликарбонат, полистирол средней ударной прочности, PVC, жидкокристаллический полимер 30%, Trans ABS, сополимер циклического олефина, сополимер ацеталя, полиэстер, полиэтеримид, полиэтилен, нейлон, полиэфир полиуретана, блок-сополимер бутадиена и стирола, статистический сополимер полипропилена и этиленвинилацетат) обеспечивали возможность сбора, переноса и выделения ДНК из клеток с зондов-тампонов для слизистой рта. В стандартных применениях этой технологии высота пика больше 25 ОЕФ рассматривается как отражающая реальный продукт ПЦР относительно фона (Custodian Document; CUSTP-GS-003). Можно видеть, что контакт со многими пластиками позволяет получить существенные уровни детекции. Наблюдаемое в этом исследовании отсутствие работы некоторых пластиков (например, блок-сополимера полиэтилена и полиэтиленгликоля, сополимера этилена и акриловой кислоты, сополимера этилена и винилового спирта, сополимера этилена и винилацетата с привитым малеиновым ангидридом) указывает на то, что наблюдаемые положительные результаты не были связаны с артефактом механического переноса клеток с зонда-тампона на пластик. Данные были получены из трех отдельных образцов, полученных от одного индивидуума. Все продукты, амплифицированные с пластмасс, были специфичными для доноров мазка. Фрагменты ДНК вплоть до и свыше 350 пар оснований были успешно детектированы (определены по типу STR донора), что подтверждает, что пластмассы не ингибируют ПЦР, если остаются в реакционной пробирке. На фигуре 1 показано, что диапазон пластмасс подходит для адсорбции биологических материалов и что эффективность варьирует в зависимости от типа материала.
Пример 3: Оценка пластиковых материалов для изготовления устройств взятия мазков
Экспериментальные условия такие же, что и в примере 2. В этом исследовании проверялось, будут ли в мультиплексной реакции детектироваться все 10 различных продуктов реакций ПЦР на короткие концевые повторы плюс локус амелогенина. При успешной амплификации всех мишеней должны быть обнаружены 21 ДНК-продукт. На фигуре 2 показано, что диапазон пластиковых материалов подходит для адсорбции биологических материалов и что эффективность варьирует в зависимости от типа материала. Наиболее эффективными были Topas, акриловый полимер, кристаллический полистирол, полипропилен, HDPE, поликарбонат, полистирол средней ударной прочности, PVC, жидкокристаллический полимер 30%, Trans ABS, сополимер циклического олефина, сополимер ацеталя, полиэстер, полиэтеримид, полиэтилен, нейлон, полиэфир полиуретана, блок-сополимер бутадиена и стирола, статистический сополимер полипропилена и этиленвинилацетат. Наихудшими исполнителями были блок-сополимер полиэтилена и полиэтиленгликоля, сополимер полиэтилена и полиакриловой кислоты, сополимер поливинилового спирта и полиэтилена, сополимер этилена и винилацетата с привитым малеиновым ангидридом.
Пример 4: Оценка пластика, силикона, термопластических эластомеров (ТРЕ) и стекла в качестве материалов для применения в анализе «HyBeacon».
С помощью чистого стерильного пинцета поверхности РММА (акрилового пластика), PDMS (силикона) и Сантопрена (ТРЕ) одинакового размера натирали стеклом и тканью с пятнами крови и слюны. Как описано во второй части описания сбора проб, образцы затем помещали в реакции ПЦР для синглплексной амплификации коротких концевых повторов локусов, названных D16S539 (D16S539). Анализ (похожий на описанный в работе French et al (2008)) является гомогенной реакцией, включающей не только праймеры ПЦР для этих локусов, но также и отдельный флуоресцентный олигонуклеотидный зонд (зонд D16S539, меченный флуоресцеин-dT) и конкурирующий 'блокирующий' олигонуклеотид, который подробно описан выше. После амплификации ПЦР, реакцию процессировали в температурном диапазоне, широко известном как кривая плавления (см. масштаб оси х на фигуре) и скорость изменения флуоресценции отмечали на графике для демонстрации диссоциации связанного зонда от его мишени. Результаты говорят о том, что пластиковые, силиконовые и ТРЕ-поверхности обеспечивают достаточный контакт с клетками, что позволяет помещать образцы напрямую в реакцию не только для поддержки корректной амплификации при ПЦР, но также не создает помех для последующих гибридизации и флуоресцентного анализа. Во флуоресцентном канале D16S539 FAM наблюдался только ожидаемый в данном анализе STR-повтор 11 'типа'.
Для проведения данного эксперимента использовались праймеры ПЦР и температурные условия проведения циклов, отличные от тех, что описаны в фигурах 1 и 2, а также использовались зонд и блокирующие олигонуклеотиды, отсутствующие в этих экспериментах, что говорит о том, что связывание ДНК с контактными поверхностями из пластика, силикона и ТРЕ не является специфичным для реакции ПЦР, не оказывает ингибирующего воздействия на имеющие место процедуры флуоресцентной детекции или комплексной гибридизации (основываясь на контрольной ДНК только входящие образцы, как указано), как показано на фигуре 3.
Немодифицированные 1,5 мм стеклянные микросферы натирали сухими буккальными мазками. ДНК-контроль и результаты мазков представлены на фигуре 25. Пики, отмеченные как 11 и 14, являются STR анализа типирования D16S539.
Пример 5: Оценка пластика, силикона и термопластических эластомеров: воздействие на эффективность амплификации.
Чистые поверхности РММА, PDMS и сантопрена помещали в реакционные сосуды, содержащие реактивы «D16S539 HyBeacon», как описано выше в разделе материалов и методов. В каждую реакцию, содержащую поверхности-образцы, добавляли 2 нг экстрагированной ДНК. Их сравнивали с контролем «D16S539 HyBeacon» с матрицей в виде 2 нг экстрагированной геномной ДНК в отсутствии поверхностей-образцов. Во флуоресцентном канале D16S539 FAM наблюдался только ожидаемый в данном анализе STR-повтор 11 'типа'. Никаких отличий не было отмечено между контрольной реакцией и реакциями, опосредованными PDMS и РММА. Наблюдали уменьшение высоты пика в реакции с сантопреном, используемого в качестве среды-переносчика. Данное уменьшение может быть результатом непрозрачности материала, блокирующего детекцию флуоресценции. РММА и PDMS не оказывают влияние на эффективность анализа «D16S539 HyBeacon», что показано на фигуре 4. Сантопрен уменьшает силу получаемого сигнала.
Пример 6: Оценка пластика, силикона и термопластических эластомеров:
воздействие на эффективность лизиса клеток в неэкстрагированных биологических образцах.
Чистые поверхности РММА, PDMS и сантопрена помещали в реакционные сосуды, содержащие реактивы «D16S539 HyBeacon», как описано выше в разделе материалов и методов. Буккальные мазки («Omniswab», «Whatman») перемешивали на вибрационном смесителе в 500 мкл водного растворителя. 2 мкл обработанных мазков сравнивали с 2 нг экстрагированной ДНК в отсутствии поверхности-образца. Во флуоресцентном канале D16S539 FAM наблюдался только ожидаемый в данном анализе повтор 11 'типа'. Незначительное отличие наблюдали между контрольной реакцией и реакциями с PDMS и РММА. Было отмечено снижение качества продуктов, полученных переносом с помощью сантопрена. Снижение может быть результатом непрозрачности материала. РММА и PDMS не изменяют амплификацию неэкстрагированного клеточного материала при проведении анализа «D16S539 HyBeacon», что показано на фигуре 5. Сантопрен уменьшает силу получаемого сигнала. Это также подтверждает мысль о непрозрачности поверхностей.
Пример 7: Оценка связывания биологического материала с пластиком, силиконом и термопластическим эластомером при применении во множестве реакций
Чистыми поверхностями РММА, PDMS и сантопрена натирали высохшее пятно слюны на чистом и ранее не используемом предметном стекле. Образцы анализировали с помощью анализа «D16S539 HyBeacon», как описано выше в разделе материалов и методов. Результаты представлены на фигуре 6. После амплификации смесь реактивов удаляли из реакционного сосуда и выбрасывали, затем для удаления любых остаточных компонентов анализа D16S539 и амплифицированных продуктов поверхность образца мягко промывали водой для тканевых культур с аспирацией пипеткой. Поверхностям подсушивали, а затем переносили в чистые реакционные сосуды. Чистые поверхности образцов затем использовали для анализа «D18S51 HyBeacon», как описано выше в разделе материалов и методов, для определения достаточности количества биологического материала на поверхности для проведения анализа второй независимой последовательности-мишени. Мишень D18S51 находится на отдельной хромосоме по отношению к мишени D16S539, зонд D18S51 не будет детектировать амплифицированные мишени D16S539, а реактивы для D16S539 не будут амплифицировать мишень D18S51. В тесте на D18S51 также используется окрашивающая метка, отличная от метки зонда D16S539, что гарантирует, что два теста полностью независимы друг от друга.
Фигура 7 демонстрирует, что переносимые поверхности содержат количество биологического материала, адсорбированного на поверхности образца, достаточное для осуществления амплификации второй последовательности-мишени. Как и ожидалось, во флуоресцентном канале FAM D16S539 наблюдался только 'тип' 11, а во флуоресцентном канале TAMRA D18S51 наблюдался только 'тип' 19. В тестах D16S539 и D18S51 получили существенно различные пиковые значения плавления Тm.
Пример 8: Оценка воздействия стадии исходной денатурации 95° при амплификации на доступность клеточного материала для амплификации
Чистую поверхность PDMS натирали на предметном стекле с пятном образца слюны, как описано выше в разделе материалов и методов. Поверхности PDMS анализировали, в тройном повторе, петлевой изотермической амплификацией (LAMP, Eiken), разработанной для амплификации и детекции последовательности-мишени SLC6A4. В данном анализе изотермической амплификации реактивы инкубировали при 59°C в течение 30 мин. Амплифицированный продукт детектировали с помощью интеркалирующего красителя. Три образца PDMS сравнивали с контролем, образцом экстрагированной ДНК от того же донора. Флуоресцентные пики плавления, представленные на фигуре 8, выявили успешную амплификацию мишени из пластиковых поверхностей.
Данный факт подтверждает, что стадия денатурации при 95°С не является существенной для амплификации клеточного материала, связанного с поверхностями PDMS.
Пример 9: Оценка воздействия несвязанного силоксана внутри PDMS на связывание клеточного материала.
3
В статье Thibault et al (2007) короткоцепочечные силоксаны и неполимеризованный силоксан упомянуты в качестве возможного механизма, с помощью которого ДНК связывается с PDMS. Чистые поверхности PDMS помещали в устройство Сокслета и дефлегмировали с использованием этанола в течение 12-ти часового интервала приблизительно с 8 кратным обратным током жидкости в час.Поверхностями PDMS, экстрагированными в устройстве Сокслета, удерживаемыми стерильными пинцетами, свободными от ДНК, натирали вдоль высохшее пятно слюны на ранее не используемом чистом предметном стекле. Получение образца осуществляли дополнительно образцам, полученным ранее натиранием высохшего пятна крови на ранее не используемом чистом предметном стекле. Образцы сравнивали с нативными поверхностями PDMS. Все образцы переносили в пробирку для ПЦР и амплифицировали с помощью реактивов «D16S539 HyBeacon». Все методы описаны выше в разделе материалов и методов. Согласно фигуре 9, в случае донорного образца наблюдался ожидаемый 11 аллель. Между результатами, полученными для нативной и ненативной поверхностей PDMS, не наблюдалось значительных различий. Это говорит о том, что несвязанные силоксаны не являются единственным механизмом, с помощью которого биологический материал адсорбируется па поверхности PDMS.
Пример 10: Сводная информация о дополнительных успешных экспериментах, не охваченных в приведенных выше примерах.
Таблица 2 раскрывает другие проведенные эксперименты, которые не покрываются фигурами, представленными выше.
Материал
Анализ, используемый для теста
Тестируемый матрикс
Метод забора образца
Результат
Акриловый полимер
D16S539/D18S51 Duplex Hybeacon
Буккальный мазок
Вибрационный смеситель
Успешная амплификация и детектирование
Полипропилен
D16S539/D18S51 Duplex Hybeacon
Буккальный мазок
Вибрационный смеситель
Успешная амплификация и детектирование
Акриловый полимер
D16S539 Hybeacon
Высушенная кровь на ткани/на стекле
Натирание
Успешная амплификация и детектирование
Полипропилен
D16S539 Hybeacon
Высушенная кровь на ткани/на стекле
Натирание
Успешная амплификация и детектирование
Гидрофобный пенопласт с закрытыми порами
D16S539 Hybeacon
Высушенная кровь/слюна на ткани/на стекле
Натирание
В некоторой степени успешная амплификация и детектирование из образцов слюны
Полиамидная щетка
D16S539 Hybeacon
Высушенная кровь/слюна на ткани/на стекле
Натирание
Успешная амплификация и детектирование
Гидрофобный пенопласт с закрытыми порами
SGMplus
Высушенная кровь/слюна на ткани/на стекле
Натирание
Слабая амплификация
Полиамидная щетка
SGMplus
Высушенная кровь/слюна на ткани/на стекле
Натирание
Слабая амплификация с кровью, успешная амплификация со слюной.
PDMS
SGMplus
Высушенная кровь/слюна на ткани/на стекле
Натирание
Успешная амплификация
Сантопрен (ТРЕ)
SGMplus
Высушенная кровь/слюна на ткани/на стекле
Натирание
Успешная амплификация
PDMS
D16S539 Hybeacon
Высушенная семенная жидкость на ткани
Натирание
Успешная амплификация
Сантопрен (ТРЕ)
D16S539 Hybeacon
Высушенная семенная жидкость на ткани
Натирание
Успешная амплификация
PDMS
D16S539 Hybeacon
Отпечаток пальца на стекле
Натирание
Успешная амплификация/низкий уровень и зависимость от донора
Сантопрен (ТРЕ)
D16S539 Hybeacon
Отпечаток пальца на стекле
Натирание
В некоторой степени успешная амплификация
Фрагмент карандашной резинки (Ластик)
D16S539 Hybeacon
Кровь/Слюна на Стекле
Натирание
Отсутствие амплификации
Латекс
D16S539 Hybeacon
Кровь/Слюна на Стекле
Натирание
Отсутствие амплификации
Пример 11: Отсутствие воздействия УФ-облучения при ДНК-стерилизации, оказываемого на забор образцов и последующую амплификацию
1,64 мм микросферами из РММА (акриловый пластик) с различными УФ-обработками натирали пятна слюны на стекле с использованием стерильного штатива, как описано во второй части метода забора образцов примера 1. Образцы затем помещали внутрь реакций ПЦР, содержащих реактивы для сингплексной амплификации ПЦР для локуса STR, называемого D16 (D16S539). Анализ (похожий на описанный в работе French et al (2008) (ссылка 1) является гомогенной реакцией, содержащей не только праймеры ПЦР для этих локусов, но также и отдельный флуоресцентный олигонуклеотидный зонд (зонд D16, меченный с помощью FAM) и конкурирующие 'блокирующие' олигонуклеотиды. После ПЦР реакцию процессировали в температурном диапазоне (см. масштаб оси х на фигуре 26) и отмечали на графике скорость изменения флуоресценции для выявления успешной гибридизации. Результаты выявили, что обработка РММА с помощью УФ оказывает очень незначительное влияние на способность материала собирать биологический материал.
Фигура 26 демонстрирует средние пиковые значения плавления, полученные из опытов в 4 повторах для необработанного УФ РММА (Среднее, Контроль), РММА, облученного УФ в течение 30 минут (Среднее, 30 мин), и РММА, облученного УФ в течение более чем 24 часов (Среднее 24 ч), и полученные из 2,5 нг ДНК (Положительный контроль).
Пример 12: Воздействие модификации КОН на поверхность РММА
Модифицированными и немодифицированными КОН поверхностями РММА натирали пятно слюны на стекле с помощью чистого стерильного штатива. Затем образцы помещали в реакции ПЦР на основе «Phire», содержащие STR-локус D16S539. Анализ (похожий на описанный в работе French et al (2008)) является гомогенной реакцией, содержащей не только праймеры ПЦР для этих локусов, но также и отдельный флуоресцентный олигонуклеотидный зонд (зонд D16, меченный FAM) и конкурирующие 'блокирующие' олигонуклеотиды. После ПЦР, реакцию процессировали в температурном диапазоне (см. масштаб оси х на фигуре 27) и скорость изменения флуоресценции отмечали на графике для выявления успешной гибридизации. Результаты показали, что обработка РММА с помощью КОН приводит к слабому уменьшению получаемых пиковых значений.
Устройство по изобретению
Согласно фигурам 10а - 10d, первое воплощение устройства устройство для забора образцов нуклеиновой кислоты 11, 12, 13 по изобретению включает в качестве основных компонентов ряд приемников 11, из которых один виден на фигуре 10d, несколько элементов-зондов 12, соответствующих по количеству приемникам 11 и манипулятор в виде трансформируемого держателя 13. Устройство для забора образцов 11, 12, 13 фигур 10а - 10d, и дополнительные устройства для забора образцов, описанные ниже, подходят и предназначены для осуществления способов и применений, описанных и определенных в данном документе.
Устройство фигур 10а - 10d имеет комплект (показано в предпочтительном воплощении) из четырех полых, вертикальных, вытянутых приемников 11, с соответствующим отверстием 14 на верхнем конце каждого.
Отверстия 14 в приемниках могут быть закупорены согласно конструкции, описанной ниже. Множество приемников 11 предпочтительно идентичны друг другу и предпочтительно расположены в ряд, как проиллюстрировано, в штативе (не показано). Предпочтительно, если размер штатива, поддерживающего приемники 11, удобен для переноски вручную, хранения в портфеле и, в целом, удобен для эксплуатации вручную.
В другой конструкции в рамках изобретения приемники 11 могут располагаться по сторонам квадрата или любого другого многоугольника, по ломаной линии или по овалу.
Приемники 11 могут быть изготовлены из полимера, известного инертностью к нуклеиновым кислотам и к реактивам, используемым для реакций амплификации, упомянутым выше, или, по меньшей мере, покрыты с внутренней поверхности таким полимером, так чтобы приемники 11 не оказывали какого-либо влияния на нуклеиновые кислоты внутри них или на реакцию амплификации. Штатив изготавливается из легковесного материала, такого как полимер, легкий металлический сплав или природный материал, который не вступает в реакцию с материалом приемников 11.
В ином случае, каркас может быть сделан из того же материала, что и приемники и может быть изготовлен одновременно с ними.
Таким образом, в предпочтительных воплощениях изобретения, приемники 11 могут прикрепляться или формироваться вместе с штативом, так что штатив и приемники используются и выбрасываются вместе. В некоторых обстоятельствах такая конструкция может давать преимущества с точки зрения маркировки комплектов образцов, отслеживаемости образцов и получения доказательства уничтожения или разрушения образцов по завершении следственных действий.
В еще одном воплощении изобретения, проиллюстрированном на фигуре 10d, можно обойтись без штатива, т.к. приемники 11 используются «индивидуальным» образом.
В указанной форме устройство фигур 10а - 10d включает множество вытянутых элементов-зондов 12а - 12d, прикрепленных к вытянутому держателю 13 и поддерживаемых им.
Фигура 10а демонстрирует конфигурацию элементов-зондов 12 и держателя 13 в начале действия устройства для забора образцов нуклеиновой кислоты.
Держатель 13 включает четыре (представленных в воплощении, хотя в рамках изобретения возможно другое количество) части в форме вытянутых секторов 13а, 13b, 13 с, 13d.
Каждый из секторов 13а - 13d соединен, по меньшей мере, с одним соседним сектором по поверхности контакта, протянувшейся, как правило, параллельно вдоль комбинации зонд/держатель 12, 13. Соединения образуются путем примыкания поверхностей секторов 15 с образованием соединения в виде штифта-фиксатора 15а и паза 15b, что позволяет разъемно скреплять вместе секторы 13а-13d. В результате, вместе при сборке секторы образуют круглый в сечении цилиндрический держатель 13, который может разделяться на четыре отдельных части 13а-13d.
В другой конструкции в рамках изобретения сегменты держателя могут быть соединены с помощью так называемых «живых шарниров», т.е. шарниров из материала секторов, достаточно тонких, чтобы быть гибкими и, необязательно, хрупких.
Одна поверхность каждого из секторов 13а - 13d выпукло изогнута. В каждом случае эта поверхность лежит на внешней стороне соединенной группы секторов, так что при соединении вместе они образуют держатель с круглым сечением 13.
При использовании выступающая часть нижнего конца каждого сектора 13а - 13d представляет собой соответствующий элемент-зонд 12а, 12b, 12 с, 12d в форме жесткого, зауженного к концу, вытянутого стержня.
Стержни одинаковой длины выдвигаются так, чтобы сходится друг с другом при соединении вместе секторов 13a-13d. Свободные концы стержней останавливаются поблизости друг от друга, когда секторы принимают конфигурацию, показанную на фигурах 10а и 10b. В данной конфигурации свободные концы элементов 12а, 12b, 12 с, 12d образуют составной зонд 12.
Когда держатель находится в такой конфигурации составной зонд 12, образованный свободными концами стержней 12а, 12b, 12 с, 12d, может одновременно контактировать ими с источником нуклеиновой кислоты. Контакт можно произвести простым ручным захватом путем проведения манипуляций держателем 13, образованным секторами 13a - 13d. Свободные концы элементов зонда 12а, 12b, 12 с, 12d могут иметь, например, площадки или другие выступающие части, которые примыкают друг к другу с образованием составного наконечника в форме по существу непрерывной поверхности для контакта с нуклеиновой кислотой.
В результате контакт приводит к достаточно однородному покрытию свободных концов материалом нуклеиновой кислоты. Для содействия налипанию нуклеиновой кислоты на свободные концы элементов зонда 12a-12d, данные элементы могут быть сделаны из любого из материалов, обсуждаемых в данном документе, если он подходит для достижения данной цели, покрыты таким материалом или на них может быть надет наконечник из такого материала.
Комбинация зонд/держатель 12, 13 предоставляется в конфигурации, представленной на фигурах 10а и 10b. Пользователь захватывает держатель 13 и использует его в качестве манипулятора для контакта наконечника зонда 12, образованного свободными концами, с материалом, содержащим нуклеиновую кислоту, или внутри такого материала, без какого-либо значительного риска контакта ДНК пользователя с элементами зонда. Благодаря материалу свободных концов элементов 12а - 12d, и согласно принципам изобретения, описанным или определенным в данном документе, такой контакт в результате приводит к налипанию приблизительно равного количества материала, содержащего нуклеиновую кислоту, с каждым из свободных концов.
Приемники 11, необязательно удерживаемые в штативе, как описано выше, могут быть, в том числе, оборудованы затворами отверстий 14, способными к деформации пробками, снимающимися уплотнениями с прокладкой из фольги или подобными затворами, которые могут быть удалены для доступа во внутреннее пространство приемников 11.
Приемники 11 включают сохраняющиеся внутри них посредством пробок или других типов затворов реактивы, необходимые для реакции амплификации нуклеиновой кислоты, такие как те, что, в частности, обсуждались в данном документе. После контакта материала, содержащего нуклеиновую кислоту, со свободными концами зондов, замок или стопор любого рода, удерживающий секторы 13а - 13d в их соединенной конфигурации, высвобождается, как показано на фигуре 10 с.В результате секторы, индивидуальный пример которых представлен на фигуре 10d, могут отделяться друг от друга, принимая свободную конфигурацию, представленную на фигурах 10c и 10d.
Данное преобразование можно осуществить посредством ручного манипулирования секторами без какой-либо необходимости пользователя прикасаться к зондам. Следовательно, вероятность контакта ДНК пользователя со свободными концами, по существу, равна нулю.
Когда секторы 13а - 13d принимают свободную конфигурацию, представленную на фигурах 10c и 10d, элементы зонда 12 размещаются на расстоянии друг от друга.
Таким образом, в общих чертах устройство фигуры 10 включает несколько элементов зонда 12a-12d, которые способны перемещаться друг относительно друга между конфигурациями сведения и разнесения в пространстве, причем каждый элемент зонда 12а, 12b, 12 с и 12d включает наконечник, который в момент, когда элементы зонда принимают сведенную конфигурацию, объединяется с другими наконечниками для образования составного наконечника, который используется для контакта с материалом, содержащим нуклеиновую кислоту.
Секторы держателя 13a-13d могут затем использоваться для соотнесения соответствующих элементов зонда 12a-12d с отверстиями 14 в соответствующих приемниках 11, после удаления или вскрытия любого затвора общего типа, как описано выше.
В такой конструкции элементы зонда 12а - 12d могут быть продавлены через соответствующие отверстия 14а - 14d внутрь приемников.
На конце, удаленном от присоединенного элемента зонда, в каждом секторе 13a - 13d образована опора 17, протянувшаяся, как правило, параллельно вдоль сектора. Опора 17 может быть использована для облегчения тонкого маневрирования держателем элементами зонда 12a-12d во внутреннем пространстве каждого приемника 11.
Каждый из элементов зонда 12a - 12d прикреплен к ассоциированному с ним сектору держателя 13a - 13d с помощью цилиндрического запирающего элемента 16, который в зависимости от точной конструкции комбинации зонда/держателя, образован либо цельно, либо прикреплен к ним, например, в виде втулки.
Каждое из отверстий 14 является круглым в сечении. Диаметр каждого запирающего элемента 16 такой, что при вставке присоединяемого элемента зонда 12 внутри приемников 11 запирающий элемент 16 прочно закупоривает приемник в отношении входа или выхода жидкости, а особенно жидкости, содержащей или переносящей нуклеиновую кислоту. В результате нуклеиновая кислота, налипшая на элемент зонда 12, в каждом случае контактирует и помещается в реактивы, которые там находятся. В результате имеет место реакция амплификации нуклеиновой кислоты, например, обсуждаемая в данном документе.
Как правило, приемники 11 делают из прозрачных или полупрозрачных материалов или из материалов, которые включают одно или несколько прозрачных или полупрозрачных окон. В результате возможно осуществление оптической оценки результатов реакции, например, с помощью оптических устройств. Затвор 16 и/или приемник 11, таким образом, могут иметь форму и размер, удобные для использования в таком устройстве.
На фигурах 11-16 представлено перспективное изображение другого воплощения устройства для забора образцов нуклеиновой кислоты 21, 22, 23 по изобретению.
На фигуре 11 четыре приемника 21а, 21b, 21c, 21d формируются в виде полых элементов в форме усеченного конуса, протянувшихся сверху вниз из используемого в качестве днища жесткого листа полимерного материала 24, который является инертным по отношению к нуклеиновой кислоте (т.е. не оказывает на нее никакого воздействия). В предпочтительном воплощении изобретения приемники 21а - 21d образованы отливкой вместе с листом 24.
Приемники 21а - 21d, как показано, образуются по соседству в четырех углах квадратного листа 24, хотя в рамках изобретения возможны другое количество и профили приемников 21; лист 24 необязательно принимает представленную по существу квадратную форму.
Приемники 21а - 21d могут поставляться в виде исходно закупоренных закупоривающей мембраной, такой как фольга, которая закрывает отверстия 27а - 27d, которые образованы сверху на используемых концах приемников 21а - 21d. Таким образом, приемники могут поставляться заранее закупоренными и содержащими, например, реактивы для ПЦР или другие реактивы для амплификации, так, чтобы гарантировать чистоту этих реактивов до применения устройства. В момент применения имеющаяся фольга может быть отслоена от листа 24 так, чтобы открыть отверстия для вставки туда элементов зонда 22а, 22b, 22c, 22d, описанных в данном документе ниже.
Элементы зонда 22а - 22d получают в виде соответствующих конусов или конических секций из материалов, обсуждаемых в данном документе, на которые согласно принципам изобретения налипает нуклеиновая кислота. Однако в альтернативной конструкции в рамках изобретения конусы могут быть покрыты таким материалом или на них может быть надет наконечник из такого материала для того, чтобы обеспечить налипание нуклеиновой кислоты на части устройства, как требуется. Кроме того, могут быть представлены другие формы, отличные от конусов или их частей, хотя секционные конусы, как считается, являются наиболее подходящими элементами зонда.
Элементы зонда 22а - 22d выступают с одной стороны дополнительного листа 28, состоящего, например, из полимерного материала, особенно из материала, «инертного» по отношению к нуклеиновой кислоте, как объяснено выше. Фактически, как правило, лист 28 может быть сделан из того же материала, что и наконечники зонда.
Также лист 28, по существу, является квадратным или может иметь форму, напоминающую четырехлепестковый клевер так, чтобы соответствующие, по существу, круглые выступы протянулись от более широкого (верхнего) конца каждого конуса, образуя элементы зонда 22а - 22d. Края или другие образования листа 28, соседствующие с верхним концом каждого элемента зонда, соединены друг с другом с образованием описанной формы листа.
Показано, что четыре элемента зонда выходят с одной стороны листа 28, пo-существу, в одном направлении, если лист находится в расслабленной конфигурации, представленной на фигурах 11-16.
Со стороны, противоположной элементам зонда 22а - 22d, используемый лист 28 прикреплен к одному из концов удлиненного манипулятора 23 с возможностью высвобождения.
Размер манипулятора 23 подходит для ручного захвата, при этом манипулятор преимущественно изготавливают из прочного материала, такого как широкий спектр пластиковых материалов или из металлических сплавов. Использование природных материалов или стекла в качестве основных конструкционных материалов манипулятора 23 не исключается, но эти материалы, как считается, в меньшей степени подходят для образования держателя, по сравнению с пластиками и металлами, упомянутыми выше.
Манипулятор 23 имеет удлиненный, полый цилиндрический корпус 30, который расширяется с одного конца, к которому прикреплено разъемное крепление 31 и лист 28. На противоположном конце 29 корпус заканчивается захватываемым ручкой 32, который может принимать ряд возможных форм.
В проиллюстрированном воплощении держатель имеет две параллельные плоские пластины 32а, 32b, которые располагаются перпендикулярно длинной стороне корпуса 30 и отдалены друг от друга в этом направлении с помощью армированного соединения 32c.
Верхний конец корпуса 30 имеет пару выступов 26а, 26b расположенных друг против друга на противоположной стороне корпуса 30.
Каждый выступ 26а, 26b имеет канавки 26c, 26d. Соответствующие канавки 26c, 26d располагаются противоположно друг относительно друга на противоположных сторонах корпуса 30, как представлено на фигуре 11.
Из дна пластины 32а вытянут и прочно прикреплен к ней удлиненный поршень 29, который имеет свободно скользящее соединение с внутренней полостью корпуса 30. Поршень 29 передвигается посредством захвата верхней плоской пластины 32b, между частично выдвинутым положением, представленным на фигуре 11 и дополнительным положением, в котором поршень полностью входит во внутреннее пространство корпуса 30.
В последнем положении верхняя плоская пластина 32b может быть повернута так, чтобы параллельная плоская пластина 32а входила концами в противоположные канавки, которые образованы выступами 26а, 26b и посредством этого предотвращает поршень 29 от возвращения в частично выдвинутое положение до тех пор, пока верхняя плоская пластина 32b не будет специально повернута, чтобы освободить концы нижней плоской пластины 32а из вышеуказанных канавок.
Предназначение данной конструкции описано ниже.
Лист 28 прикреплен к концу крепления 31. Крепление 31 имеет полое внутреннее пространство, в котором нижний конец поршня 29 проходит в направлении, параллельном длинной стороне корпуса. Поршень 29 при движении между частично выдвинутым и взведенным положениями, которые описаны выше, действует в качестве активатора, вызывающего избирательное движение элементов зонда 22а - 22d между конфигурацией, в которой их наконечники 33, удаленные от листа 28, находятся в непрерывном контакте;
и конфигурацией, представленной на фигурах 11-16, в которой элементы зонда разнесены в пространстве друг от друга на расстояния, соответствующие расстояниям приемников 21a - 21d.
Поршень 29 приводит к достижению данного эффекта благодаря тому, что лист 28 является гибким. В исходном состоянии манипулятора 23 поршень 29 прикреплен к листу 28. Стержень способен двигаться внутри полого корпуса 30, как описано выше. Движение стержня во взведенное положение, таким образом, частично втягивает гибкий лист 28 во внутреннюю часть крепления 31. Это в свою очередь сводит наконечники 33 друг с другом так, что образуется составной наконечник, в котором части находятся в контакте друг с другом и образуют единый участок контакта с материалом, содержащим нуклеиновую кислоту.
Движение стержня вдоль внутреннего пространства корпуса 30 обычно осуществляется путем вытягивания пластины 32b, хотя этого также можно достичь рядом других способов.
Например, штырек 30а, как показано на фигуре 17, связанный со стержнем, может подвижно удерживаться в пазу 30b, выступая из корпуса 30. Пользователь может двигать стержень путем вращения колпачка 32", который соединен со стержнем с помощью конструкции, включающей механизм, который преобразует вращательное движение в линейное. Штырек во время движения стержня скользит вдоль паза, таким образом обозначая легко детектируемое положение конечной остановки стержня. Движение стержня, как описано, втягивает лист 28 во внутреннее пространство крепления 31, которое на фигуре 17 имеет коническую форму.
На фигуре 17, которая является вариантом устройства фигур 11-16, ручка 32, по существу, является цилиндрической по форме и образована из двух частей 32' (соединенной с корпусом 30) и 32" (отделенной от корпуса 30). Часть 32" способна вращаться относительно части 32' и соединена с блокирующим механизмом внутри ручки 32 и корпуса 30. Вращение части 32" относительно части 32' избирательно активирует блокирующий механизм с целью удержания стержня в его убранном положении, что показано, например, с помощью положения штырька 30а в пазе 30b.
Несмотря на точную регуляцию данной конструкции предпочтительно, однако, чтобы при освобождении поршня 29 упругость листа вызывала возвращение элементов зонда 22а - 22d в расслабленное состояние, во взаимно разнесенное расположение в пространстве, проиллюстрированное на фигурах 11-16, при движении поршня 29 в обратном направлении внутри корпуса 30.
Дополнительно к вышесказанному могут предлагаться другие типы блокирующих устройств, скоб или запоров высвобождаемого типа в целях избирательного удержания элементов зонда 22а - 22d в их сближенной конфигурации. Такие блокирующие устройства, и т.п., как правило, будут действовать путем удержания поршня 29 в положении, соответствующем описанной конструкции сближенного расположения наконечников.
В центральной части лист 28 имеет вытянутую, как правило, в том же направлении, хотя и на меньшее расстояние, что и элементы зонда, защитную метку контроля вскрытия в форме округлого «гарпунного» элемента 34. Цель и функция данного компонента описаны в данном документе ниже. В рамках изобретения находятся и другие формы захватов для зондов, известные специалистам в области приемников.
Элементы зондов 22а - 22d можно отрывать или по-другому высвобождать из манипулятора 23. Этого можно достичь, например, благодаря хрупкому соединению между краями и остальной частью листа 28. В предпочтительной конструкции представленный цельный лист 28 может временно удерживаться на манипуляторе 23 зажимным устройством, которое является избирательно высвобождаемым.
При использовании устройства фигур 11-16 или 17 поршень 29 исходно задвигается внутрь корпуса 30, инициируя активаторный механизм, такой как описанный выше, и блокируется (в случае наличия блокирующего устройства) в положении, соответствующем сведению наконечников вместе, как описано выше. Такое движение поршня 29 может происходить вверх или вниз относительно корпуса 30, в зависимости от выбранной конструкции. В воплощении фигуры 11 блокирования поршня добивались путем вращения верхней плоской пластины 32b, чтобы вызвать вход краев нижней плоской пластины 32а в канавки 26c, 26d.
Это движение поршня 29 заставляет наконечники 33а - 33d элементов зонда 22а - 22d принять сведенную конфигурацию, так чтобы по существу получился один зонд, имеющий поверхность, содержащую нуклеиновую кислоту.
Данная поверхность посредством манипуляций с ручкой 32 может быть вставлена в материал, содержащий нуклеиновую кислоту, или натерта им. С учетом материала, из которого сделаны, по меньшей мере, наконечники 33а - 33d, в результате данные манипуляции, по существу, приводят к однородному налипанию нуклеиновой кислоты или материала, содержащего нуклеиновую кислоту, на составной наконечник, образованный наконечниками 33а - 33d.
В ходе данного процесса и фактически в течение последующей операции оператор держит захватывающую ручку 32 устройства. Это позволяет оператору избегать прикосновения к элементам зонда, которые разнесены в пространстве от рукоятки 32 на длину корпуса 30.
Натирание или другой контакт материала, содержащего нуклеиновую кислоту, составным наконечником в результате приводит к налипанию приблизительно равного количества нуклеиновой кислоты на каждую из частей наконечника 33.
После проведения контакта с образцом поршень 29 высвобождается (например, путем высвобождения блокирующего устройства или путем вращения верхней плоской пластины 32b, как описано ранее). Упругость листа 28 заставляет элементы зонда принимать ненагруженную разнесенную в пространстве конфигурацию, в которой они могут совпадать с отверстиями 27а - 27d в приемниках 21а - 21d. Это движение происходит благодаря движению поршня 29 в направлении, противоположном тому, при котором получается конфигурация соприкосновения наконечников 33.
После удаления какой-либо фольги, покрывающей приемники 21 (предпочтительно отслаиванием), элементы зонда 22а - 22d вставляются во внутреннее пространство приемников 21 так, чтобы нуклеиновая кислота, удерживаемая на элементах зонда, была экспонирована реактивам амплификации. Приемники 21а - 21d являются прозрачными или полупрозрачными, так чтобы результат реакции можно было оценить с помощью оптического оборудования.
Конусная форма элементов зонда 22а - 22d может быть выбрана так, чтобы при вставке в приемники 21а - 21d элементы зонда 22а - 22d закупоривали приемники благодаря тугой посадке в верхние участки поверхностей внутренней стенки приемников.
Конечно, в рамках изобретения находятся и другие способы закупоривания приемников, известные специалистам в данной области. В первую очередь важно удостовериться в эффективности затвора, поскольку устройство изобретения, как ожидается, найдет применение, например, в уголовных делах, в которых целостность подтверждающего материала является очень важной.
Лист 24, в котором приемники 21а - 21d отлиты в форме или сформированы другим способом, необязательно включает центральное сквозное отверстие. Назначение этого отверстия заключается в приеме (также необязательном) круглой конической фиксирующей детали 34 в ходе или после вставки элементов зонда 22а - 22d в приемники 21a - 21d.
Фиксирующая деталь 34 проходит преимущественно по той же стороне листа 28, что и элементы зонда 22а - 22d, и имеет скошенные поверхности и проточки, которые позволяют ей закрываться как защелке, в отверстии листа 24 при вставке элементов зонда 22а - 22d в приемники.
Следовательно, конечная цель фиксирующей детали 34 и отверстия заключается в обеспечении «контроля вскрытия» элементов зонда в приемниках 21a - 21d. Этот признак особенно полезен, когда устройство изобретения необходимо в качестве улики, например, в уголовном деле, или при публичном расследовании вспышки заболевания.
Как и в случае воплощения изобретения фигур 10а - 10d, в воплощении фигур 11-16 приемники предпочтительно являются полупрозрачными или прозрачными для облегчения оценки результатов амплификации без нарушения внутреннего состояния приемников. Материалы внутренней стороны приемников выбирают таким образом, чтобы они были инертны к реактивам, для перемещения которых они предназначены.
Характерным признаком зондов воплощений фигур 10-16 является образование тем или иным способом изолирующих вставок в необязательных приемниках. В результате элементы зонда могут оставаться подключенными к манипулятору во время проведения реакций амплификации ДНК.
В воплощениях, описанных ниже, элементы-зонды отделены от манипулятора в приемниках, для закупоривания которых используются отдельные затворы.
На фигурах 18-20 показано поперечное сечение и вид сбоку дополнительного воплощения изобретения, которое в определенной степени зависит от элементов зонда, имеющих некоторую способность к упругой деформации или «памяти формы». Этот признак позволяет преобразовывать расположение элементов зонда между сходящимся и взаимно удаленным, которые являются характеристикой воплощений, описанных выше.
В фигурах 18-20 элементы зонды 52а - 52d остаются заключенными внутри манипулятора в виде удлиненного корпуса 53. Элементы зонда принимают форму удлиненных стержней, имеющих одну длину. Каждый из стержней может быть изготовлен из сплавов с так называемой памятью формы, и каждый может иметь на свободном конце удаляемый наконечник 54, изготовленный из одного из материалов, описанных в данном документе в качестве подходящего для взятия образцов нуклеиновых кислот. На фигуре 20 показан один из наконечников 54 в увеличенном перспективном виде.
Концами, противоположными наконечникам, элементы зонда скреплены друг с другом в связку, в силу чего они зафиксированы во внутренней части держателя 56 корпуса 53.
Активатор элементов зонда в виде полой, цилиндрической оболочки 57 подвижно удерживается на корпусе 53, с возможностью передвижения вдоль связки элементов зонда 52а - 52d. В состоянии поставки оболочка перекрывает элементы зонда 52а - 52d на протяжении большей части их длины. На своем конце, удаленном от частей наконечника 54 оболочка 57 имеет кольцевой, упруго деформируемый фиксатор в форме кольца 51, выступающего во внутреннее пространство оболочки 57 из ее цилиндрической стенки. Кольцо 51 способно избирательно «защелкиваться» соответственно в передней 51 а и задней 51b кольцевых фиксирующих канавках, образованных на внешней стороне части держателя 56, в котором установлены стержни. Оболочка 57, скользя вдоль рукоятки 56 вынуждает кольцо 51, при необходимости, контактировать либо с канавкой 51 а, либо с канавкой 51b. Это в свою очередь вызывает высвобождаемое удержание оболочки 57 в одной из двух позиций на держателе 56.
Элементы зонда 52а - 52d изогнуты так, чтобы в их расслабленном состоянии их свободные концы поддерживали части-наконечники 54 отклоненными для обеспечения взаимной дистанции между ними. В данной конфигурации элементы зонда 52а - 52d подходят для вставки в приемники, такие как приемники 21а - 21d, описанные выше. Для получения этого состояния оболочка 57 может быть выдвинута вдоль корпуса 53 по направлению к держателю 56.
Передвижение оболочки 57 в противоположном направлении к наконечникам 54, так чтобы оболочка расположилась в непосредственной близости от наконечников, приводит к выпрямлению изогнутых частей элементов-зондов 52а - 52d. В результате наконечники 54 сходятся в одной точке против упругой деформации элементов зонда, и, располагаясь рядом друг с другом, образуют составной наконечник, который подходит для взаимодействия с материалом, содержащим нуклеиновую кислоту.
Взаимодействие полученного составного наконечника с таким материалом может быть обусловлено ручным захватом держателя 56. При необходимости оболочку можно передвигать вручную для перемещения между убранной и проксимальной позициями (с описанной выше фиксацией положения, вызванной временным удерживанием оболочки на том или ином конце диапазона ее перемещений) и, следовательно, можно перемещать элементы зонда 52а - 52d между сходящимся и расходящимся расположениями.
Стержни, образующие элементы зонда 52a - 52d являются полыми и имеют открытые концы. Как показано на фигуре 20 каждый наконечник состоит из цилиндра 54а фактически того же внешнего диаметра, что и один из стержней, с выступающим с одного конца цилиндрическим шипом 54b уменьшенного диаметра.
Каждый шип 54b имеет фрикционную посадку в открытом конце одного из стержней. Трение, удерживающее части-наконечники относительно стержней, достаточно легко может быть преодолено механизмом-толкателем, описанным ниже.
Механизм-толкатель частично состоит из цилиндрической нажимной кнопки 58, которая выдается из держателя 56 на конце, противоположном наконечникам 54.
Нажимная кнопка 58 перемещается вдоль оси под действием, например, надавливания большим пальцем против возвратной пружины 59 в удлиненном цилиндрическом отверстии 61, образованном концом вышеупомянутого держателя 56.
Внутри корпуса 53 нажимная кнопка 58 жестко присоединена к четырем гибким стержням-толкателям 62, которые проходят вдоль полости стержней, образующих элементы зондов 52a - 52d, контактируя с шипом 54b наконечников 54.
Очевидно, что обратный ход оболочки 57 вызовет разнесение наконечников 54, а введение наконечников 54, покрытых нуклеиновой кислотой, в соответствующие приемники 21a - 21d, и нажатие кнопки 58 вызовет сброс наконечников в приемники.
Приемники могут быть закрыты, например, с помощью закупоривающих устройств, таких как, без ограничения, пробки, после отвода элементов зонда 52a - 52d, в результате чего части-наконечники 54a - 54d раздельно закупориваются внутри приемников, в которых затем может быть проведена реакция ПЦР.
Освобождение нажимной кнопки 58 приводит к отдергиванию стержней-толкателей, так чтобы свежие части-наконечники 54 могли быть прикреплены к открытым концам элементов-зондов 52a - 52d, при необходимости после очистки. В ином случае весь узел может быть одноразовым. Перемещение оболочки 57 в позицию, показанную, например, на фигуре 18, приводит к тому, что наконечники 54 сходятся в одной точке и опять занимают сведенное расположение, готовые к осуществлению дальнейших операций по сбору образцов нуклеиновых кислот.
На фигурах 21-24 представлен другой вариант устройства.
На фигурах 21, 22 и 24 хорошо показано, что держатель 66 содержит применяемые верхнюю 67 и нижнюю 68 цилиндрические втулки, которые имеют одинаковый диаметр.
Нижняя втулка 68 имеет выступающий с ее свободного конца комплект четырех подвижных опор преимущественно в виде треугольных пластин 69a-69d.
Втулки 67, 68 вращаются относительно друг друга, как показано стрелкой на фигуре 21, что вызывает движение пластин 69a-69d под действием криволинейной поверхности, описанной ниже. Таким образом, пластины 69a-69d передвигаются из начальной позиции, показанной на фигуре 21, в которой несколько наконечников 71a, 71b, 71c, 71d располагаются непосредственно рядом друг с другом (для забора нуклеиновых кислот) близко к центру продольной оси устройства, к последующей позиции выброса наконечников, обозначенной пунктиром на фигуре 24, и представленной в перспективе на фигуре 22. В последней позиции наконечники 71 все лежат на расстоянии от центральной оси и расположены для выброса в соответствующие приемники, такие как приемники 21, описанные ниже.
Пластины 69a-69d по существу являются (как показано на фигуре 23, на которой в двух половинах изображения представлено боковое сечение, демонстрирующее части устройства, принявшие соответствующие функциональные позиции) прямоугольными треугольными пластинами, гипотенузы которых в начальной позиции на фигуре 21 сходятся с образование притупленного кончика 72.
Каждая из треугольных пластин 69 подвешена сверху с помощью поворотной оси 73. Каждая ось 73 соединяется с нижней частью верхней втулки с прилегающим негипотенузным краем 74 пластины 69 примерно на середине ее длины.
Вершина 76 пластины 69, лежащая радиально наружу от оси вращения 73, остается заключенной относительно нижней втулки 68 пружиной 77. Верхняя и нижняя втулки 67, 68 заключены относительно друг друга и могут двигаться аксиально относительно друг друга против действия (фактически, четырех) возвратных пружин 83, удерживаемых между верхней и нижней втулками 67, 68 и прилежащих к наружной границе устройства. Для согласования осевого движения втулок 67, 68, два стопорных кольца 78 и 79, образованных внутри и расположенных вокруг полого пространства нижней втулки 68, аксиально разнесены одно от другого, а между ними подвижно удерживается кольцевой или частично кольцевой выступ, образованный на внешней части верхней втулки 67, помещенной в нижнюю втулку 68.
Это расположение таково, что при вращении верхней и нижней втулок 67, 68 относительно друг друга каждая пластина 69 вращается вокруг вертикальной оси, определенной их осью 73.
Это приводит к тому, что вертикально удлиняясь, негипотенузный край 82 каждой из пластин 69 одновременно поворачивается из центральной, прилегающей позиции, показанной на фигурах 21, 24, и на левой половине фигуры 23, в позицию выброса, находящуюся на некотором расстоянии от оси устройства, показанную на фигуре 22, и на правой части фигуры 23.
В непосредственной близости от каждого края 82 каждая опора 69 является полой и образует удлиненные отверстия 84, простирающиеся от верхней до нижней части опоры.
Соответствующий наконечник 71 того же дизайна, что и наконечники 54, описанные выше, остается заключенным в нижнем конце отверстия 84, как показано, из-за того, что шип вталкивается в отверстие.
Толкатель 86, имеющий куполообразный колпачок 87, выступает из верхней части отверстия 84 и заканчивается чуть выше конца шипа наконечника 54. Расстояние между нижним концом толкателя 86 и шипом наконечника 54 немного меньше, чем расстояние между нижней частью куполообразного колпачка 87 и краем 74 каждой пластины 69.
Движение пластин 69 в позицию на фигуре 22 поворачивает каждый колпачок 87 толкателя 86 в совмещение с прижимным устройством 88, выступающим с нижней стороны верхней втулки 67.
Сжатие втулок 67, 68 вместе против сил возвратных пружин 83 вызывает приведение в контакт прижимных устройств 88 с колпачками 87. Это приводит к движению толкателей вниз в контакт с шипами, и тем самым выбрасывает наконечники 71 из пластин 69, соответственно, в приемники, которые затем могут быть закупорены, например, с помощью пробок или других закупоривающих устройств.
Список литературы
1 French DJ, Howard RL, Gale N, Brown T, McDowell DG, Debenham PG. (2008) Interrogation of short tandem repeats using fluorescent probes and melting curve analysis: a step towards rapid DNA identity screening. Forensic Sciint Genet. 4: 333-9.
2 Masaomi Iwasaki, Toshihiro Yonekawa, et al (2003) Validation of the Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Single Nucleotide Polymorphism Genotyping with Whole Blood. Genome Letters, Vol.2, No.3, 119-126.
3 Christophe Thibault, Childe'rick Se'verac, Anne-Franciioise Mingotaud, Christophe Vieu, Monique Mauzac (2007) Poly(dimethylsiloxane) Contamination in Microcontact Printing and Its Influence on Patterning Oligonucleotides Langmuir, 23(21), 10706-10714.