Способ повышения эффективности клонального микроразмножения вечнозеленых сортов Рододендрона
METHOD FOR INCREASING THE EFFICIENCY OF CLONAL MICRO-PROPAGATION OF EVERGREEN VARIETIES OF RHODODENDRON

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии растений и может быть использовано для сохранения генетических ресурсов и массового производства посадочного материала рододендронов путем клонального микроразмножения.
В настоящее время клональное микроразмножение является наиболее эффективной технологией массового воспроизводства Рододендронов (Pavingerova, D. The influence of thidiazuron on shoot regeneration from leaf explants of fifteen cultivars of Rhododendron / D. Pavingerova // Biologia Plantarum. - 2009. - Vol. 54. - P. 797-799), которая позволяет за короткий период времени получить оздоровленный и генетически однородный посадочный материал высокого качества вне зависимости от сезона и климатических условий региона. Традиционно для для получения микроклонов Рододендрона используют уже существующие меристемы, которые инокулируют на питательную среду по прописи Андерсена (АМ), дополненную 15 мг/л 2-изопентиниладенина (2-iP) и 4 мг/л индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) (Anderson, W.C. A revised tissue culture medium for shoot multiplication of rhododendron / W.C. Anderson // Journal of American Society for Horticultural Science - 1984. - Vol. 109. - P. 343-347; Кутас, Е.Н. Клональное микроразмножение рододендронов и их практическое использование / Е.Н. Кутас. - Минск, 2009. - 188 с.). Общеизвестно, что среди представителей рода Рододендрон очень сильны генотипические различия, поэтому протоколы, разработанные для листопадных сортовых и дикорастущих представителей рода, не эффективны для вечнозеленых сортов и должны подбираться экспериментально (Eeckhaut, T. Micropropagation of Rhododendron / T. Eeckhaut,. K. Janssens, E. Keyser, J. Riek // Protocols for in vitro propagation of ornamental plants: Methods in molecular biology. - 2010. - Vol. 589. - P. 141-152). Однако, современные прорывные инновации в области размножения древесных растений были сделаны с использованием синтетического соединения - тидиазурона (ТДЗ), которое используют в качестве регулятора роста растений в питательных средах. ТДЗ индуцирует более высокий уровень регенерации по сравнению с 2-iP, а также проявляет как ауксиновый, так и цитокининовый эффекты (Ahmad, N. Thidiazuron: from urea derivative to plant growth regulator / N. Ahmad, M. Faisal. - Singapore, 2018. - 491 р.). Кроме того, использование ТДЗ вместо традиционных цитокининов и ауксинов снижает затраты на производство посадочного материала и удешевляет технологию клонального микроразмножения. В современных литературных и других источниках нет данных о применении ТДЗ для размножения вечнозеленых сортов рододендронов из эксплантов состоящих из одной пазушной почки. В этой связи ниже приводится способ повышения эффективности клонального микроразмножения на основе применения ТДЗ, в результате которого получают микрорастения высокодекоративных перспективных для озеленения Сибирского региона морозостойких сортов Рододендрона ‘Helsinki University’, ‘Haaga’ и R. catawbiense “Grandiflorum”.
Известен способ повышения эффективности культивирования in vitro рододендрона, согласно которому стимуляцию регенерации пазушных побегов листопадного сорта ‘Golden Light’ осуществляют из эсплантов, состоящих из двух почек на питательной агаризованной среде WPM, дополненной 2 мг/л 2-iP и 0,5 мг/л ИУК (Патент РФ №2619177, МПК A01H 4/00, A01H 5/00, опубл. 12.05.2017).
Недостатком этого способа, с точки зрения настоящего изобретения, является то, что на стадии собственно микроразмножения использовали экспланты, состоящие из 2 почек, а также не был применен ТДЗ, что не позволило использовать экспланты меньшего размера, а именно состоящие из одной пазушной почки (далее будем обозначать его как одноузловой эксплант), в итоге из-за недостаточной стимуляции активности пазушных меристем был получен низкий коэффициент размножения (5, 9). Кроме того, результат был достигнут на примере листопадного сорта и в силу значительных генотипических различий представителей рода Рододендрон не может быть напрямую применен к вечнозеленым сортам.
Известен способ клонального микроразмножения рододендрона, а именно дикорастущих листопадных и полулистопадных видов (R. sichotense, R. dauricum, R. japonicum, R. luteum, R. viscosum), который заключается в применении модифицированной питательной среды Андерсона (АМ) с добавлением в качестве фитогормонов 7 мг/л 2-iP и 3 мг/л ИУК для получения регенерантов из эксплантов содержащих одну или две пазушные почки (Патент РФ №2679835, МПК A01H 4/00, опубл. 13.02.2019).
Недостатком данного технического решения, с точки зрения настоящего изобретения, является то, что на этапе собственно микроразмножения не был использован ТДЗ. Заявленное в данном изобретении применение традиционных фитогормонов (2-iP и ИУК) для стимуляции роста пазушных меристем не позволило достичь существенного увеличения коэффициента размножения, который составил от 6,3 до 7,5. Описанный выше способ предусматривает использование высоких концентраций двух типов фитогормонов, что приводит к усложнению и удорожанию технологии в целом. Кроме того, результат был достигнут на примере дикорастущих листопадных и полулистопадных представителях рода Рододендрон и в силу значительных генотипических различий не может быть использован при клональном размножении вечнозеленых сортов.
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение эффективности клонального микроразмножения вечнозеленых сортов Рододендрона из одноузловых эксплантов на основе применения ТДЗ с целью получить максимальное число побегов высотой более 10 мм.
Поставленная задача решается благодаря заявляемому способу повышения эффективности клонального микроразмножения вечнозеленых сортов Рододендрона, включающий культивирование эксплантов на искусственных питательных средах, отличающийся тем, что в качестве эксплантов используют части микропобегов, содержащие одну пазушную почку, которые культивируют 8 недель на питательной среде, дополненной 0,25 мкМ ТДЗ, с последующим культивированием 6 недель на безгормональной среде.
Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является повышение эффективности клонального микроразмножения вечнозеленых сортов Рододендрона, а именно ‘Helsinki University’, ‘Haaga’ и R. catawbiense “Grandiflorum” за счет использования в качестве эксплантов одноузловых побегов изолированных от растений in vitro и культивирования эксплантов на питательной среде, содержащей 0,25 мкМ ТДЗ, что в результате привело к существенному повышению коэффициента размножения до 33,5 побегов на эксплант (более чем в пять раз по сравнению с другими известными способами), при этом высота побегов в зависимости от генотипа составила 19,33-28,57 мм.
Успешность клонального микроразмножения определяется многими факторами, среди которых особое значение имеет выбор экспланта для инициации стабильно растущей культуры in vitro. Известно, что эксплантаты побегов рододендронов обладают слабой способностью к ветвлению при обработке аминопуриновыми цитокининами, такими как 2-iP, особенно это проявляется при культивировании эксплантов небольших размеров, таких как одноузловые экспланты. Использование синтетического регулятора роста, ТДЗ, для обработки одноузловых эксплантов позволило достоверно повысить коэффициент размножения заявленных генотипов Рододендрона. Полученный результат объясняется тем, что ТДЗ обладает мощной цитокининоподобной активностью в 50-100 раз более низких концентрациях, чем пуриновые цитокинины, что способствует интенсивной пролиферации пазушных меристем. Однако, ТДЗ вызывает ряд аномалий развития побегов, среди которых высота побегов - наиболее критичный параметр для последующего успешного укоренения и адаптации к нестерильным условиям. Преодолеть указанные ограничения можно с помощью экспериментального подбора оптимальной концентрации ТДЗ, причем с повышением концентрации частота появления аномалий возрастает. Введение в питательную среду ТДЗ в диапазоне концентраций от 0,1 до 0,5 мкМ позволило по сочетанию таких параметров как коэффициент размножения и высота побегов установить, что 0,25 мкМ ТДЗ - оптимальная концентрация для получения хорошо развитых побегов высотой более 10 мм. Для преодоления аномалий развития, вызванных действием ТДЗ, в частности укорочения побегов, использовано последующее культивирование на безгормональной среде. Этот прием позволяет растениям восстановить баланс эндогенных фитогормонов, что выражается в интенсивном росте растений в высоту и уменьшении выраженности других аномалий развития.
Сущность изобретения поясняется таблицами, в которых приведены результаты исследования по поиску оптимальной концентрации ТДЗ для повышения эффективности клонального микроразмножения вечнозеленых сотов Рододендрона: табл. 1 - влияние различных концентраций ТДЗ на коэффициент размножения вечнозеленых сортов Рододендрона, табл. 2 - влияние различных концентраций ТДЗ на высоту побегов вечнозеленых сортов Рододендрона.
Анализ известных способов клонального микроразмножения вечнозеленых сортов Рододендрона, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что совокупность существенных признаков заявляемого способа неизвестна из уровня техники, следовательно, он соответствует условию патентоспособности изобретения-«новизна».
Заявленное изобретение осуществляется следующим образом и показано на примерах.
Пример 1.
В качестве объектов были выбраны высокодекоративные перспективные для озеленения городских территорий Сибирского региона морозостойкие сорта вечнозеленых рододендронов: ‘Helsinki University’, ‘Haaga’, R. catawbiense “Grandiflorum”. Одноузловые микрочеренки изолированные с помощью скальпеля от микропобегов асептической культуры использовали в качестве эксплантов. Для микроразмножения рододендронов использовали питательную среду Андерсена (АМ), основой которой является смесь солей микро- и макроэлементов, дополненная витаминами 30,0 г/л сахарозы, 6,0 г/л Бактоагара (Panreac, Испания). Перед автоклавированием pH среды доводили до 5,0. Тидиазурон в концентрации 0,1 мкМ добавляли в питательную среду после автоклавирования в стерильных условиях. Для индукции пролиферации пазушных меристем экспланты помещали на стерильную АМ с 0,1 мкМ ТДЗ. Культивировали в течение 8 недель. Затем экспланты с развившимися на них конгломератами побегов переносили на АМ0 и культивировали еще 6 недель для элонгации. Стерильные культуры выращивали в условиях 16-часового фотопериода с интенсивностью освещения 4000 лк люминесцентными лампами дневного света при температуре 23±2°С. В экспериментах использовали по 15 эксплантов для каждой из обработок и повторили трижды.
Результаты культивирования представлены в таблицах 1 и 2.
Пример 2.
Культивирование на питательной среде Рододендронов ведут по примеру 1, но с единственным отличием: для индукции пролиферации пазушных меристем в питательную среду добавляли 0,25 мкМ ТДЗ. Результаты культивирования представлены в таблицах 1 и 2.
Пример 3.
Культивирование на питательной среде Рододендронов ведут по примеру 1, но с единственным отличием: для индукции пролиферации пазушных меристем в питательную среду добавляли 0,5 мкМ ТДЗ. Результаты культивирования представлены в таблицах 1 и 2.
Результаты, продемонстрированные на примерах и приведенные в таблицах 1 и 2, показали, что учитывая такие показатели как число побегов на эксплант и высоту побегов, среда, дополненная 0,25 мкМ является оптимальной на этапе собственно микроразмножения всех исследуемых сортов рододендронов. Этот этап включает культивирование на ТДЗ-содержащей среде (0,25 мкМ) и на среде АМ0 для элонгации побегов для преодоления аномалий развития. Т.о. из одного узлового экспланта можно получить около 33,5 побегов сорта ‘Helsinki University’, 15,75 побегов сорта R. catawbiense ‘Grandiflorum’ и 10,85 побегов сорта ‘Haaga’, при этом вновь образованные побеги высокого качества и пригодны для успешного прохождения дальнейших этапов технологии клонального микроразмножения рододендронов. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о существовании значительных генотипических различий среди исследованных сортов, проявляющихся в разной интенсивности пролиферации пазушных меристем в ответ на воздействие ТДЗ. Таким образом заявленное изобретение позволяет достичь заявленного технического результата - существенно повысить коэффициент размножения по сравнению с прототипом и получить побеги высотой значительно более чем 10 мм.