Способ оценки заряженности клубневой нематодой Ditylenchus destructor клубней картофеля, пораженных мокрой гнилью
METHOD FOR ASSESSMENT OF INFECTION WITH TUBEROUS NEMATODE DITYLENCHUS DESTRUCTOR OF POTATO TUBERS AFFECTED BY WET ROT

Изобретение относится к защите растений, семеноводству, картофелеводству и может быть использовано в сельском хозяйстве.
Возбудителем дитиленхоза картофеля является клубневая нематода Ditylenchus destructor Thome, 1945, которую ошибочно называют стеблевой нематодой. В то же время стеблевой нематодой называют вид D. dipsaci, который также поражает картофель, но вызывает симптомы на надземных органах (укороченность, утолщенность, искривление и ломкость междоузлий, утолщения на стеблях, столонах, клубнях). Поэтому клубневой дитиленх-Z). destructor, который вызывает сухую гниль клубней картофеля, будем называется клубневой нематодой, а стеблевой нематодой картофеля - D. Dipsaci [10]
Клубневая нематода (КН) D. Destructor впервые описана в США, встречается в Канаде. Она широко распространена в Европе: Австрия, Бельгия, Великобритания, Венгрия, Германия, Греция, Дания, Ирландия, Испания, Люксембург, Нидерланды, Норвегия, Польша, Румыния, Словакия, Финляндия, Франция, Чехия, Швейцария, Швеция. В Азии клубневой дитиленх обнаружен в Бангладеш, Китае, Японии, в Африке - Южно-Африканская Республика. Во многих странах является карантинным видом [11, 13, 14].
Из близлежащих стран дитиленхоз был зарегистрирован в Украине, Молдове, Белоруссии, Казахстане, Узбекистане, Армении, Азербайджане, Литве, Латвии, Эстонии [4, 9, 11].
В России клубневая нематода встречается в большинстве областей, краев, республик на западе, в центре европейской территории, Кавказе, Сибири, за исключением Дальнего Востока [6, 9].
Эпифитотии дитиленхоза клубней чаще всего проявляются при хранении продовольственного, технического (для производства чипсов и хрустящего картофеля) или кормового картофеля (15-30% пораженных клубней) [4].
При семенном контроле клубневого материала не допускается наличия клубневой нематоды в супер-суперэлите, суперэлите, элите и 1 репродукции. Во 2 и 3 репродукциях семенного картофеля допускается зараженность клубней на уровне 0,3-0,5% [2, 3, 9].
Как и в России, в Белоруссии в последние годы болезнь получила широкое распространение. Если с 1991 по 1999 гг. распространенность дитиленхоза на клубнях картофеля в конце периода хранения колебалась от 0,3% до 1,1%, то в последние годы распространенность дитиленхоза достигла 6,5% (Иванюк и др., 2005). Потери картофеля в период хранения во многих случаях достигали 30-80 [3, 4].
Потери от сухой гнили, вызываемой клубневой нематодой, в хранилищах колеблются от 2 до 30% в зависимости от сорта, репродукции семян, температуры хранения, течения эпифитотического процесса [4, 6]. Вредоносность дитиленхоза картофеля в условиях крестьянских и личных подсобных хозяйств (ЛПХ) значительно выше, чем в коллективных и фермерских хозяйствах, что вызвано несовершенством технологии возделывания и хранения картофеля в условиях ЛПХ, а также отсутствие систематического контроля качества семенного материала в них по сравнению с коллективными и фермерскими хозяйствами [1, 9].
Для дитиленхоза картофеля характерен продолжительный бессимптомный период во время роста растения. Заболевание особенно сильно проявляется в период хранения, снижая семенные и товарные качества клубней, вызывая значительные отходы. Из сильно зараженных клубней вырастают слабые растения, которые обычно погибают. Раннее заражение может быть обнаружено при очистке клубня, которая позволяет выявить мелкие белые точки с отмершей тканью среди здоровой мякоти. Они разрастаются, темнеют, приобретают волокнистую структуру, в середине могут образовываться пустоты [3, 4].
За вегетационный период может развиться 6-7 генераций. В пораженных клубнях можно наблюдать все стадии развития паразита одновременно. Многочисленные молодые и зрелые самки, самцы, а также личинки, вылупившиеся из яиц, усиленно питаются за счет ткани картофельного клубня, преимущественно под кожицей (численность дитиленхов достигает 300-700 нематод на 10 г ткани) [10].
В период появления всходов клубневые нематоды мигрируют из клубней в подземную часть стеблей и в ризосферу, где их регистрировали на протяжении всей вегетации. Позднее, перед цветением картофеля, дитиленхи проникали в надземные части стеблей, но не поднимались выше 10-15 см от поверхности почвы. В столоны и молодые клубни они мигрировали, как только начали формироваться эти органы. Заражение клубней происходило преимущественно со стороны столонов. Клубневая нематода может внедряться в клубни через глазки, чечевички или поврежденную кожицу клубня [1, 4].
Развитие и размножение дитиленхов в клубнях продолжается в период хранения. Решающим фактором становится температура хранения. При температуре равной +3-5°С численность дитиленхов с декабря по апрель возросла в 6 раз, при t=+2-3°C - в 2 раза, при +0,5-1°С - численность практически не увеличивалась. В буртах, где температура хранения картофеля колебалась от 1 до 10°С, численность дитиленхов возросла в 7-8 раз и число пораженных клубней - в 2-4 раза [3, 10].
С целью выявления дитиленхоза проводят клубневой анализ весной до посадки и осенью перед закладкой картофеля на хранение, методика проведения которого наиболее полно изложена в ГОСТ 55329-2012. Для этого от каждой партии картофеля весом до 10 тонн отбирается из 10 разных мест не менее 100 клубней и от каждых последующих 10 тонн по 50 клубней из 3 разных мест. Отобранные клубни тщательно моют в воде, а затем ножом снимают тонкий слой кожуры. У больных клубней снимают кожуру на границе здоровой и поврежденной ткани. Наличие клубневой нематоды определяют внешним осмотром, микропрепарированием или вороночным методом с просмотром осадка под бинокуляром и идентификацией вида обнаруженных нематод под микроскопом в соответствии с описанными параметрами КН [2, 9].
Проблема диагностики дитиленхоза, вызванного D. Destructor, состоит в том что основной внешний симптом поражения клубней дитиленхами - сухая гниль. Этот симптом вызывают и другие патогены.
При легком заражении клубневой нематодой признаки поражения можно наблюдать, лишь сняв с клубней кожицу. В местах проникновения паразита можно обнаружить белые пятна рыхлой ткани, в которой под бинокуляром можно увидеть нематод и их яйца.
При более сильном заражении на поверхности возникают свинцово-серые пятна, которые постепенно темнеют и приобретают темно-коричневую окраску, с характерным металлическим блеском. Пораженные участки вследствие ферментативного разрушения клеток клубней ссыхаются и сморщиваются, в дальнейшем отмирают. В отдельных местах кожура отстает и при продавливании легко проваливается, на кожице появляются трещины, в которых видна светло-коричневая пораженная ткань. Клубни загнивают из-за проникновения в них бактерий, грибов и сапробиотических нематод [1, 10].
Поражение органов растений клубневой нематодой внешне похоже на поражение фитофторозом и сухой гнилью, вызванную грибами. Эти заболевания можно различить, сделав разрезы клубней.
У фитофторозных клубней буровато-коричневые пятна тверды на ощупь, вдавлены слабо, кожица у них не растрескивается. На разрезе обнаруживается ржавая гниль, языки которой уходят глубоко в клубень.
Поверхность пораженных сухой гнилью клубней покрывается бурыми пятнами разной величины. Кожура в этих местах сморщивается и покрывается подушечками спороношения гриба. Внутри пораженная ткань имеет пустоты, заполненные белым, желтым или розовым мицелием [5, 12].
Клубневые нематоды же обычно располагаются только у поверхности, мягкие на ощупь дитиленхозные пятна не проникают в мякоть [9].
Кроме сухой гнили клубни поражает мокрая гниль. Ее.возбудители - бактерии Pectobacterium atrosepticum, Pectobacterium carotovorum, Dickeya subsp, Clavibacter michiganensis subsp. Sepedonicum (Cms), Erwinia carotorora, Jones., Hall, E., aroideal, Tewrs. Hall, E. Atroseptica, van Hall, Jennison & Pseudomonas ranthochola., Sehstapp. Ткани пораженного клубня размягчаются и превращаются в слизистую гниющую массу с неприятным запахом. Окраска пораженных клубней сначала светлая, затем темно-бурая или розовая. Со стороны столонного конца мякоть у клубня превращается в мягкую слизистую массу с неприятным запахом. Гниющая мякоть клубней, вначале бесцветная, позже темнеет. На границе между пораженной и здоровой тканями имеется более темная полоса из опробковевших клеток. В дальнейшем клубни погибают от мокрых гнилей [3, 5, 12].
Клубневая нематода часто является переносчиком этих бактерий и открывает «ворота инфекции» в клубни. Поэтому в клубнях, пораженных мокрой гнилью, могут быть клубневая и другие нематоды.
Все методы выделения клубневой нематоды из растений и клубней основаны на способности активных нематод выходить из тканей растений в воду. Для выделения нематод используют вороночный метод Бермана, для которого необходимо специальное оборудование. Кроме этого метода клубневых нематод из проб клубней можно выделять в чашках Петри [5, 7, 10, 15]. На рисунке 1 (Приложение) хорошо просматриваются клубневые нематоды выходящие из пораженной дитиленхозом тканей клубня. Однако, из клубней, пораженных мокрой гнилью, выделить КН этими методами не удается. При вороночном методе из-за быстрого размножения бактерий в воде не остается кислорода, КН без него не могут двигаться и опускаться на дно пробирки. В чашках Петри из-за разложившихся тканей КН не видно в воде (Приложение рис. 2). Из-за сильно неприятного запаха исследовать эти клубни довольно сложно.
Проанализировав предыдущие исследования [1, 3, 4, 6, 7, 11, 13, 14, 15], мы установили, что выявление КН в клубнях, пораженных мокрой гнилью не описано.
Целью изобретения является сокращение сроков и повышение эффективности оценки зараженности КН клубней картофеля, пораженных мокрой гнилью при клубневом анализе.
Порядок проведения диагностических исследований на зараженность КН клубней картофеля, пораженных мокрой гнилью.
При проведении клубневого анализа образцов из партии семенного, продовольственного, технического, кормового картофеля или образцов клубней при проведении НИР отбирают клубни, пораженные мягкой гнилью, помещают их в полиэтиленовые мешки с этикеткой, заносят количественные данные в Протокол оценки образцов клубней или в рабочий журнал.
Отобранные клубни в полиэтиленовых мешках помешают в морозильные камеры с Т 17-18С°.
Фитогельминтологический анализ отобранных клубней проводят сразу после замораживания или в течение продолжительного времени при возможности диагностирования.
Подходы в проведении диагностических исследований в зависимости от целей.
Пример 1. Метод выявления КН в клубнях
В чашку Петри помещают срезанные части замороженного клубня на границах непораженной и пораженной мокрой гнилью, заливают водой. Замороженная ткань клубней в воде распадается на крахмальные зерна и неподвижные нематоды хорошо видны и их можно посчитать (Приложение рис. 3). После этого иголкой сдвигают растительный материал в одну сторону и просматривают содержимое под бинокуляром. В случае обнаружения клубневой нематоды просмотр заканчивают. Если в первой половине чашки клубневой нематоды не обнаружено, передвигают растительный материал с другой половины и просматривают под бинокуляром. В случае сомнения пипеткой отсасывают суспензию нематод, помещают их на предметное стекло и просматривают их под микроскопом с целью определения до вида.
Полученные данные записывают в Протокол оценки образцов клубней картофеля.
Пример 2. Метод для подсчета численности КН
2
Замороженный клубень осматривают, выявляют зоны поражения клубня дитиленхозом или мокрой гнили. В трех местах клубня осторожно в зоне поражения срезают скальпелем кусочек ткани размером 1 см и переносят их в чашки Петри с водой. В чашке Петри этот кусочек измельчают и оставляют в воде. Осторожно иголкой сдвигают растительный материал в одну сторону и просматривают содержимое под бинокуляром. Подсчет численности клубневых нематод в трех местах чашки Петри, где лежали срезанные пластинки ткани, ведут под бинокуляром МБС-1 или МБС-2 при увеличении в 40-60 раз.
Полученные данные записывают в рабочий журнал по оценке образцов клубней картофеля.
Этот метод может быть использован при испытании препаратов для обеззараживания клубней от болезней и вредителей. Он необходим для оценки существующих сортов картофеля на устойчивость к клубневой нематоде картофеля для последующей совместной работы селекционеров и фитопаразитологов по созданию устойчивых к дитиленхозу сортов. Устойчивых к клубневой нематоде сортов картофеля не обнаружено в России, Белоруссии, Украине и в других странах [3, 8].
Таким образом, предложен способ по качественной, и количественной оценки зараженности картофельной нематодой клубней, пораженных мокрой гнилью, при клубневом анализе. Применяемые методы клубневого анализа не позволяет оценить зараженность клубней, пораженных мокрой гнилью. Предложенный способ диагностики позволяет проводить исследования в любое подходящее время и в течение длительного периода.
Описанный метод рекомендуется для проведения клубневого анализа партий картофеля в картофелеводстве, семеноводстве, защите растений, а также в научно-исследовательских целях для выведения нематодоустойчивых сортов картофеля и изучения взаимоотношений нематод и бактерий.
Предложенный метод дает возможность сохранять продолжительное время в холодильнике отобранные образы клубней, пораженных мокрой гнилью, что позволяет их анализировать в любое удобное время.
Источники информации, принятые во внимание при составлении заявки.
1. Бутенко К.О. Нематоды картофеля Центрального региона России: Фауна, эпифитотиология, меры борьбы: диссертация кандидата биологических наук (03.02.11 - паразитология) - Москва, 2004. - 231 с.
2. ГОСТ 55329-2012 НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАРТОФЕЛЬ СЕМЕННОЙ Приемка и методы анализа.
3. Иванюк В.Г., Банадысов С.А., Журомский Г.К. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков. - Мн.: РУП «Белорусский НИИ картофелеводства». 2003. - 550 с.
4. Ильяшенко Д.Ф. Особенности проявления дитиленхоза картофеля и меры борьбы с ним в условиях Беларуси. Автореферат дисс. Насоиск. уч. степени канд. с.-х. наук. - Прилуки, 2006. - 19 с.
5. Методы определения и болезней и вредителей с.-х. растений / Пер. с нем. К.В. Попковой, В.А. Шмыгли. - М.: Агропромиздат, 1987 - 224 с.
6. Рябцева Н.А. Дитиленхоз картофеля в зависимости от разновидности сорта // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. - 2015. - №6(128). - С. 31-35.
7. Федоренко С.В. Разработка лабораторного метода оценки устойчивости к дитиленхозу селекционного материала картофеля // В книге: Биотехнология: достижения и перспективы развития. Сборник материалов III международной научно-практической конференции. - 2018. - С. 44-46.
8. Шестеперов, А.А. и др. Создание нематодоустойчивых сортов и гибридов сельскохозяйственных культур: Учеб. пособие // РГАЗУ. - М. - 2004. - 97 с.
9. Шестеперов А.А., Черкашин В.И., Бутенко К.О. Дитиленхоз картофеля и меры борьбы с ним (Рекомендации). - М.:ФГНУ «Росинформагротех». 2006 - 72 с.
10. Шестеперов, А.А и др. Дитиленхозы сельскохозяйственных культур и декоративных растений, и меры борьбы с ними // Учебное пособие. Изд. ФГБОУ ВПО РГАЗУ. - 2014. - 178 с.
11. Шпаар Д. Защита растений в устойчивых системах земледелия (в 4-х книгах) // Под общей редакцией доктора с.-х. наук, профессора, иностранного члена РАСХН Д. Шпаара. - Берлин 2004. Книга 2. - 337 с.
12. Яковлева Н.П. Фитопатология. - М.: Колос, 1983. - 217 с.
13. Enfermedades causadas рог nematodos fitoparasitos en Espana M. F. A. Yeves; S. V. Lucas(Edts.) ISBN. 2011, 255 p.
14. Mwaura P., Niere B., Vidal S. Resistance and tolerance of potato varieties to potato rot nematode (Ditylenchus destructor) and stem nematode (Ditylenchus dipsaci) // Annals of Applied Biology. - Volume 166, Issue2. - 2015. - P. 257-270.
15. Southey J. F. (ed.). Laboratory methods for work with plant and soil nematodes. London. 1986, 202 p.