АНТИТЕЛА К CD40 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ANTIBODIES TO CD40 AND METHODS OF USE THEREOF

Родственные заявки
Настоящее изобретение испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/168425, поданной 29 мая 2015 года, полное содержание которой настоящим включено посредством ссылки в данный документ.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был предоставлен в электронном виде в формате ASCII и настоящим включен посредством ссылки во всей полноте. Указанная ASCII-копия, созданная 12 мая 2016 года, называется 117813-10420_SL.txt и имеет размер 91019 байт.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам к CD40 (CD40) и их антиген-связывающим частям, а также способам их применения в предупреждении и/или лечении различных заболеваний.
Предпосылки изобретения
CD40 является представителем семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF), который играет важную роль в развитии В-клеток, активации лимфоцитов и функционировании антиген-презентирующих клеток (АРС). Экспрессия CD40 на эпителии, лейкоцитах и эндотелии сосудов повышена при органоспецифических аутоиммунных заболеваниях, а также системном аутоиммунитете, как, например, системной красной волчанке (SLE). Нарушение пути передачи сигнала CD40L/CD40 снижает выработку провоспалительных цитокинов, таких как IL-23 и TNF, замедляет дифференцировку Т-хелперных клеток и ослабляет их функцию, а также подавляет активацию макрофагов у пациентов с хроническими воспалительными заболеваниями, такими как болезнь Крона. Взаимодействие CD40 с CD40L индуцирует как гуморальные, так и клеточные иммунные ответы. CD40 управляет этой парой лиганд-рецептор с активацией В-клеток и других антиген-презентирующих клеток (АРС), включая дендритные клетки (DC).
CD40 представляет собой трансмембранный белок I типа размером 48 кДа (van Kooten, J Leukoc Biol. 2000 Jan; 67(1):2-17), который экспрессируется на целом ряде гемопоэтических (лимфоциты, моноциты, дендритные клетки) и отличных от гемопоэтических (эпителий, эндотелий, фибробласты) типах клеток. CD40L экспрессируется преимущественно на активированных Т-клетках, В-клетках и тромбоцитах. Большая часть понимания природы CD40/CD40L происходит из изучения взаимодействия между АРС (экспрессия CD40 либо на дендритных клетках (DC), либо на В-клетках) и Т-клетками, экспрессирующими CD40L. В случае покоящихся В-клеток вовлечение CD40L запускает активацию, пролиферацию В-клеток, а также развитие В-клеток памяти (Kehry, Immunol. 1996 Apr 1; 156(7):2345-8). Передача сигнала с помощью CD40 также требуется для переключения класса иммуноглобулинов и образования герминативного центра. Важность пути передачи сигнала CD40/CD40L для биологии В-клеток отчетливо выражена у мышей с дефицитом по CD40 или CD40L, у которых отсутствуют герминативные центры, а Т-зависимые гуморальные ответы супрессированы. Однако Т-независимые ответы с IgG у CD40-/- мышей остаются неизмененными, что позволяет предположить, что у этих мышей отсутствует взаимодействие между клетками. Мыши с дефицитом по CD40 также характеризуются дефицитами в отношении Т-клеточного компартмента. Передача сигнала через CD40 на дендритных клетках увеличивает количество молекул МНС класса II, а также различных костимулирующих молекул, таких как CD80 и CD86, и стимулирует созревание DC. Зрелая DC стимулирует активацию и выживание CD4+ Т-клеток посредством выработки цитокинов, таких как IL-2 и IL-12. Неэффективное примирование Т-клеток, по-видимому, является главной причиной нарушенных Т-зависимых гуморальных ответов у CD40L-/- мышей (Grewal, Nature. 1995 Dec 7; 378(6557):617-20). Аналогичный фенотип В-клеток можно наблюдать у людей со сцепленным с Х-хромосомой гипер-IgM-синдромом. Такие пациенты страдают от первичного иммунодефицита вследствие мутаций в локусе CD40L, что делает невозможной передачу сигнала CD40/CD40L. Эти индивидуумы характеризуются повышенными уровнями IgM и не могут вырабатывать IgA, IgG и IgE, что приводит к повышенному риску оппортунистических инфекций (Adriana, J Clin Immunol. 2008 May; 28 Suppl 1:S62-6).
Путь передачи сигнала с помощью CD40 является центральным в переходе покоящихся или наивных лимфоцитов и АРС в активированный/зрелый фенотип. Хотя примирование Т-клеток и активация В-клеток могут происходить в отсутствие передачи сигнала CD40/CD40L, этот путь требуется для развития устойчивого адаптивного иммунного ответа. Вовлечение CD40 под действием CD40L приводит к привлечению факторов, ассоциированных с TNF-рецептором (TRAF), к цитоплазматическому домену CD40 (Bishop, Adv Exp Med Biol. 2007; 597:131-51). Фосфорилирование различных белков TRAF приводит к активации как канонического, так и неканонического NFkB-путей. В дополнение, ассоциация JAK3 с цитоплазматическим хвостом CD40 приводит к активации STAT5, что индуцирует созревание DC, а также выработку TNF и IFNγ. TRAF6-зависимая активация PI3K представляет собой ключевой сигнал выживания DC, тогда как TRAF2/TRAF6 обладают резервными функциями при активации NFkB и повышающей регуляции экспрессии CD80 (Hostager, J Biol Chem. 2003 Nov 14; 278(46):45382-90). Было показано, что все TRAF 2, 3, 5 и 6 играют важную роль в переключении класса иммуноглобулинов, опосредованном передачей сигнала с помощью CD40 (Leo, Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Feb 16; 96(4): 1421-1426).
Стало известно, что путь передачи сигнала CD40/CD40L вовлечен в патогенез многих аутоиммунных заболеваний, включая системную красную волчанку (SLE), воспалительное заболевание кишечника (IBD), рассеянный склероз, ревматоидный артрит и синдром Шегрена (Law and Grewal, Adv Exp Med Biol. 2009; 647:8-36). Уровень экспрессии CD40 повышается на макрофагах, эндотелии, эпителии и В-клетках в тканях, пораженных хроническим аутоиммунитетом, в том числе в почке, кишечнике и суставах (Borcherding, Am J Pathol. 2010 Apr; 176(4):1816-27; Sawada-Hase, Am J Gastroenterol. 2000 Jun; 95(6): 1516-23). Уровень растворимого CD40L повышен у пациентов, страдающих от SLE, IBD и синдрома Шегрена, что согласуется с воспалительной нагрузкой у данных пациентов.
Некоторые из самых ранних доказательств вовлечения пути CD40/CD40L в хронические воспаления кишечника взяты из доклинических моделей, в которых mAb к CD40L защищали грызунов от экспериментального колита (de Jong, Gastroenterology. 2000 Sep; 119(3):715-23; Liu, J Immunol. 2000 Jun 1; 164(11):6005-14; Stuber, J Exp Med 1996 Feb 1, 183(2):693-8). Снижение показателей активности заболевания было связано со сниженной выработкой провоспалительных цитокинов в пищеварительном канале и защитой от хронической потери массы тела. Аналогичные результаты наблюдали у животных, которые имели генетический дефицит по CD40 или CD40L (de Jong, Gastroenterology. 2000 Sep; 119(3):715-23). Обработка мышей с помощью mAb CD40L после развития заболевания все еще была эффективной в снижении активности заболевания, что позволяет предположить, что данный путь является критически важным для поддержания хронического воспалительного заболевания. В дополнение, антител-агонистов CD40 достаточно, чтобы вызывать воспаление кишечника у мышей, у которых отсутствовали лимфоциты (Uhlig, Immunity. 2006 Aug; 25(2):309-18). Более поздние данные, полученные с применением siRNA CD40, также указали на важную роль передачи сигнала с помощью CD40 при колите (Arranz, J Control Release 2013 Feb 10; 165(3):163-72). При болезни Крона в моноцитах собственной пластинки и эпителии экспрессируются высокие уровни CD40, и содержание CD40+ моноцитов увеличено в периферической крови. Кроме того, была установлена связь между полиморфизмами в локусе гена CD40 и повышенной восприимчивостью к IBD. У пациентов с болезнью Крона, получавших лечение с помощью антител к TNF, транскрипционный анализ показывает, что уровни mRNA CD40 у пациентов снижены с удовлетворительным ответом на медикаментозное лечение. Однако у пациентов со слабым ответом на ингибиторы TNF уровни mRNA CD40 остаются без изменения, что позволяет предположить, что CD40-зависимые, TNF-независимые пути могут стимулировать воспаление у таких пациентов. Исследования позволяют предположить, что подавление передачи сигнала, опосредованной CD40, является важным при патогенезе IBD, а также других аутоиммунных заболеваний. Соответственно, остается необходимость в антителах-антагонистах к CD40 и их антиген-связывающих частях, которые можно применять в терапевтических целях для лечения хронических воспалительных заболеваний и нарушений, таких как болезнь Крона.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам-антагонистам к CD40 или их антиген-связывающим частям. Антитела по настоящему изобретению включают без ограничений гуманизированные антитела-антагонисты и их антиген- связывающие части, которые способны связывать CD40 человека и практически не проявляют агонистическую активность.
В первом аспекте настоящего изобретения представлено выделенное антитело или его антиген-связывающая часть, где антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывают эпитоп CD40 человека, определяемый топографическими областями Cys62-Phe67, Gln79-Cys83, Arg90-Thr99 и Thr24-Cys37 из SEQ ID NO: 1. В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть представляют собой антитело-антагонист. В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть представляют собой антитело-антагонист, которое фактически не проявляет агонистическую активность.
В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 8, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 12. В дополнительном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 111, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 11. В другом дополнительном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 42, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 11. В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 6, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 21.
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть относятся к изотипу IgG. В дополнительном связанном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть относятся к изотипу IgG1 или IgG4.
50
В одном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть характеризуются IC, составляющей по меньшей мере 50 нМ, в анализе с геном-репортером на клетках Jurkat.
В другом аспекте настоящего изобретения представлено антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12, и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8. В одном варианте осуществления вариабельная область легкой цепи антитела-антагониста к CD40 или его антиген-связывающей части содержит CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12, и где вариабельная область тяжелой цепи содержит CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8. В другом варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи из антитела-антагониста к CD40 или его антиген-связывающей части дополнительно содержит CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 42. В другом дополнительном варианте осуществления вариабельная область легкой цепи из антитела-антагониста к CD40 или его антиген-связывающей части дополнительно содержит CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11. В другом варианте осуществления вариабельная область тяжелой цепи из антитела-антагониста к CD40 или его антиген-связывающей части дополнительно содержит CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 6. В другом дополнительном варианте осуществления вариабельная область легкой цепи из антитела-антагониста к CD40 или его антиген-связывающей части дополнительно содержит CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 21.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую набор CDR под SEQ ID NO: 6, 42 и 8, и вариабельную область легкой цепи, содержащую набор CDR под SEQ ID NO: 21, 11 и 12.
В одном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть являются гуманизированными. В дополнительном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген связывающая часть дополнительно содержат акцепторный каркасный участок человека. В дополнительном связанном варианте осуществления акцепторный каркасный участок человека содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 82-106. В другом варианте осуществления акцепторная каркасная область человека содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену каркасной области, где аминокислотная последовательность каркасной области по меньшей мере на 65% идентична последовательности указанной акцепторной каркасной области человека и содержит по меньшей мере 70 аминокислотных остатков, идентичных указанной акцепторной каркасной области человека. В дополнительном варианте осуществления акцепторная каркасная область человека содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену каркасной области по ключевому остатку, причем указанный ключевой остаток выбран из:
остатка, смежного с CDR;
остатка с сайтом гликозилирования;
редкого остатка;
остатка, способного взаимодействовать с CD40 человека;
остатка, способного взаимодействовать с CDR;
канонического остатка;
контактного остатка между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи;
остатка в пределах зоны Vernier и
остатка в области, которая перекрывается между CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, определенной по Chothia, и первой каркасной областью тяжелой цепи, определенной по Kabat.
В дополнительном связанном варианте осуществления ключевой остаток выбран из 48Н, 49Н и 36L. В одном варианте осуществления замена ключевого остатка происходит в вариабельной области тяжелой цепи и представляет собой V48I или S49A. В другом варианте осуществления замена ключевого остатка происходит в вариабельной области легкой цепи и представляет собой Y36F.
В одном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 28. В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 20.
В одном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть фактически не проявляет агонистическую активность. В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть подавляют связывание CD40 с лигандом CD40 (CD40L) или с растворимым лигандом CD40 (sCD40L). В другом дополнительном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть связывают CD40 макака-крабоеда. В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающая часть связывают CD40 человека и макака-крабоеда, но не связывают CD40 крысы, кролика или мыши.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть способны модулировать биологическую функцию CD40. В дополнительном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть способны нейтрализовать CD40. В еще одном дополнительном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть подавляют активацию NF-κB.
on
2
-1
-1
3
-1
-1
4
-1
-1
5
-1
-1
6
-1
-1
В одном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть характеризуются константой ассоциации (K) с CD40, выбранной из по меньшей мере приблизительно 10 Mc; по меньшей мере приблизительно 10 Mc; по меньшей мере приблизительно 10 Mc; по меньшей мере приблизительно 10 Mc и по меньшей мере приблизительно 10 Mc; как измерено с помощью поверхностного плазмонного резонанса.
D
-7
-8
-9
-10
-11
-12
-13
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть характеризуются константой диссоциации (K) с CD40, выбранной из группы, состоящей из не более приблизительно 10 М; не более приблизительно 10 М; не более приблизительно 10 М; не более приблизительно 10 М; не более приблизительно 10 М; не более приблизительно 10 М и не более 10 М.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть содержат константный домен тяжелой цепи иммуноглобулина из константного домена IgM человека, константного домена IgG1 человека, константного домена IgG2 человека, константного домена IgG3 человека, константного домена IgG4 человека, константного домена IgA человека или константного домена IgE человека. В связанном варианте осуществления константный домен области тяжелой цепи иммуноглобулина из антитела-антагониста к CD40 или его антиген-связывающей части представляет собой константный домен IgG1 человека. В дополнительном связанном варианте осуществления константный домен IgG1 человека из антитела-антагониста к CD40 или его антиген-связывающей части содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть дополнительно содержат константный домен легкой цепи иммуноглобулина, содержащий константный домен каппа-цепи Ig человека или константный домен лямбда-цепи Ig человека. В связанном варианте осуществления константный домен каппа-цепи Ig человека из антитела-антагониста к CD40 или его антиген-связывающей части содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, или где константный домен лямбда-цепи Ig человека содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 81.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения также представлено антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть, которая конкурирует с антителом или его антиген-связывающей частью, изложенными в любых аспектах и вариантах осуществления, описанных в данном документе.
В другом аспекте настоящего изобретения представлено антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть, которые содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 6, CDR2 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 42, CDR3 тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 8, CDR1 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 21, CDR2 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 11, и CDR3 легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 12.
В другом аспекте настоящего изобретения представлено антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID N0: 28, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 20. В другом аспекте настоящего изобретения представлено антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 28, и/или вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 20.
В другом аспекте настоящего изобретения представлено антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть, содержащие тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 41, или последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 41, и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 40, или последовательность, которая характеризуется по меньшей мере 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 40. В одном варианте осуществления тяжелая цепь антитела-антагониста к CD40 или его антиген-связывающей части содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 41, а легкая цепь антитела-антагониста к CD40 или его антиген-связывающей части содержит аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 40.
В другом аспекте настоящего изобретения представлено антитело к CD40, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 41, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 40.
В одном варианте осуществления антитела или их антиген-связывающие части по настоящему изобретению являются рекомбинантными.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения также представлена фармацевтическая композиция, содержащая антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть, изложенные в любых аспектах и вариантах осуществления, описанных в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения также представлена фармацевтическая композиция, содержащая антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть, изложенные в любых аспектах и вариантах осуществления, описанных в данном документе, и полисорбат. В дополнительном связанном варианте осуществления полисорбат представляет собой полисорбат 80.
В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит гистидиновый буфер.
В другом дополнительном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит полиол. В связанном варианте осуществления полиол выбран из маннита, сорбита, трегалозы или сахарозы.
В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция характеризуется pH, составляющим от приблизительно 4 до приблизительно 8. В связанном варианте осуществления фармацевтическая композиция характеризуется pH, составляющим от приблизительно 5 до приблизительно 7.
В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция является лиофилизированной.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения также представлена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая аминокислотную последовательность антитела-антагониста к CD40 по любому из аспектов и вариантов осуществления, описанных в данном документе. В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения представлен вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту. В связанном варианте осуществления вектор выбран из векторов pcDNA, рТТ, рТТ3, pEFBOS, pBV, pJV и pBJ.
В другом варианте осуществления клетка-хозяин содержит вектор. В связанном варианте осуществления клетка-хозяин является прокариотической клеткой или эукариотической клеткой. В дополнительном варианте осуществления эукариотическая клетка представляет собой клетку простейшего, животную клетку, растительную клетку, грибную клетку, клетку дрожжей, клетку млекопитающего, клетку птицы или клетку насекомого. В другом дополнительном варианте осуществления клетка млекопитающего представляет собой клетку СНО или клетку COS.
В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения также представлен способ получения антитела-антагониста к CD40 или его антиген-связывающей части, причем способ предусматривает стадии культивирования клетки-хозяина по любому из аспектов и вариантов осуществления, описанных в данном документе, в среде для культивирования в условиях, подходящих для выработки антитела-антагониста к CD40 или его антиген-связывающей части. В дополнительных вариантах осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть получены с помощью способа.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения также представлен способ снижения активности CD40 человека, причем способ предусматривает стадии приведения CD40 человека в контакт с антителом или его антиген-связывающей частью по любому из аспектов и вариантов осуществления, описанных в данном документе, вследствие чего активность CD40 человека снижается. В дополнительном варианте осуществления способ представляет собой in vitro способ.
В других определенных вариантах осуществления настоящего изобретения также представлен способ лечения субъекта-человека с нарушением, при котором CD40 оказывает негативное воздействие, предусматривающий введение субъекту эффективного количества антитела к CD40 или его антиген-связывающей части по любому из аспектов и вариантов осуществления, описанных в данном документе.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения также представлен способ снижения активности CD40 человека у субъекта-человека с нарушением, при котором активность CD40 оказывает негативное воздействие, причем способ предусматривает стадию введения субъекту-человеку антитела или его антиген-связывающей части по любому из аспектов и вариантов осуществления, описанных в данном документе, вследствие чего активность CD40 человека у субъекта-человека снижается.
В дополнительном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающую часть вводят до введения субъекту второго средства, одновременно с этим или после этого. В дополнительном связанном варианте осуществления второе средство выбрано из антитела или его фрагмента, способных связывать IL-12 человека; PGE2; LPA; NGF; CGRP; SubP; RAGE; гистамин; блокатора гистаминовых рецепторов; брадикинина; IL-1 альфа; IL-1-бета; VEGF; PLGF; метотрексата; кортикостероида, модулятора глюкокортикоидных рецепторов; циклоспорина, рапамицина, FK506, нестероидного противовоспалительного средства, ингаляционного стероида; бета-агониста; бета-агониста короткого действия или длительного действия; антагониста лейкотриенов или лейкотриеновых рецепторов; ADVA1R; ингибитора IgE; антител к IgE; XOLAIR; ингибитора фосфодиэстеразы; ингибитора PDE4; ксантина; антихолинергического лекарственного средства; средства, стабилизирующего мастоциты; кромолина; ингибитора IL-4; ингибитора IL-5; ингибиторов эотаксина/ССR3, антагонистов гистамина или его рецепторов, включая H1, Н2, Н3 и Н4; антагонистов простагландина D или его рецепторов DP1 и CRTH2; антагониста TNF; растворимого фрагмента рецептора TNF; ENBREL; антагониста TNF-фермента; ингибитора TNF-превращающего фермента (ТАСЕ); антагониста мускариновых рецепторов; антагониста TGF-бета; интерферона-гамма; перфенидона; химиотерапевтического средства, метотрексата; лефлуномида; сиролимуса (рапамицина) или его аналога, CCI-779; СОХ2 или ингибитора cPLA2; NSAID; иммуномодулятора; ингибитора р38; TPL-2, МК-2 и ингибитора NFkB; буденосида; эпидермального фактора роста; кортикостероида; циклоспорина; сульфасалазина; аминосалицилата; 6-меркаптопурина; азатиоприна; метронидазола; ингибитора липоксигеназы; месаламина; олсалазина; балсалазида; антиоксиданта; ингибитора тромбоксана; антагониста рецептора IL-1; антитела к IL-1β; антитела к IL-6; фактора роста; ингибитора эластазы; пиридинил-имидазольного соединения; антитела или агониста к LT, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, ЕМАР-II, GM-CSF, FGF или PDGF; антитела к CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 или их лиганду; FK506; рапамицина; микофенолата мофетила; ибупрофена; преднизолона; ингибитора фосфодиэстеразы; агониста аденозинового рецептора; антитромбического средства; ингибитора комплемента; адренергического средства; ингибитора IRAK, NIK, IKK, р38 или МАР-киназы; ингибитора IL-1β-превращающего фермента; ингибитора TNF-α-превращающего фермента; ингибитора передачи сигнала в Т-клетках; ингибитора металлопротеиназы; 6-меркаптопурина; ингибитора ангиотензин-превращающего фермента; растворимого цитокинового рецептора; растворимого p55-TNF-рецептора; растворимого p75-TNF-рецептора; s1L-1RI; sIL-lRII; sIL-6R; противовоспалительного цитокина; IL-4; IL-10; IL-11 или TGF-β.
В дополнительном варианте осуществления нарушение выбрано из нарушения со стороны дыхательной системы; астмы; аллергической и неаллергической астмы; астмы вследствие инфицирования; астмы вследствие инфицирования респираторно-синцитиальным вирусом (RSV); хронического обструктивного заболевания легких (COPD); патологического состояния с вовлечением воспаления дыхательных путей; эозинофилии; фиброза и избыточной выработки слизи; муковисцидоза; пневмофиброза; атопического нарушения; атопического дерматита; крапивницы; экземы; аллергического ринита; аллергического гастроэнтерита; воспалительного и/или аутоиммунного патологического состояния кожи; воспалительного и/или аутоиммунного патологического состояния органов желудочно-кишечного тракта; воспалительных заболеваний кишечника (IBD); язвенного колита; болезни Крона; воспалительного и/или аутоиммунного патологического состояния печени; цирроза печени; фиброза печени; фиброза печени, вызванного вирусом гепатита В и/или С; склеродермии; опухолей или типов рака; гепатоцеллюлярной карциномы; глиобластомы; лимфомы; лимфомы Ходжкина; вирусной инфекции; бактериальной инфекции; паразитарной инфекции; инфицирования HTLV-1; супрессии проявления защитных иммунных ответов 1 типа и супрессии проявления защитного иммунного ответа 1 типа во время вакцинации.
В другом дополнительном варианте осуществления нарушение выбрано из аутоиммунного или воспалительного заболевания, такого как системная красная волчанка (SLE), дискоидная волчанка, люпус-нефрит, саркоидоз, воспалительный артрит, включая без ограничений ювенильный артрит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, синдром Рейтера, анкилозирующий спондилоартрит и подагрический артрит, отторжение трансплантата органа или ткани, сверхострое, острое или хроническое отторжение и/или реакция "трансплантат против хозяина", рассеянный склероз, гипер-IgE-синдром, узелковый полиартериит, первичный билиарный цирроз печени, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, целиакия (глютензависимая энтеропатия), аутоиммунный гепатит, пернициозная анемия, аутоиммунная гемолитическая анемия, псориаз, склеродермия, тяжелая миастения, аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура, аутоиммунный тиреоидит, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, болезнь иммунных комплексов, синдром хронической усталости и иммунной дисфункции (CFIDS), полимиозит и дерматомиозит, криоглобулинемия, тромболизис, кардиомиопатия, обыкновенная пузырчатка, интерстициальный фиброз легких, саркоидоз, сахарный диабет I типа и II типа, гиперчувствительность 1, 2, 3 и 4 замедленного типа, аллергия или аллергические нарушения, нежелательные/непредусмотренные иммунные ответы на терапевтические белки, астма, синдром Черджа-Строса (аллергический гранулематоз), атопический дерматит, аллергический и простой контактный дерматит, крапивница, IgE-опосредованная аллергия, атеросклероз, васкулит, идиопатические воспалительные миопатии, гемолитическая болезнь, болезнь Альцгеймера, хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия, синдром Шегрена и псориаз.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения воспалительного заболевания кишечника (IBD).
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения язвенного колита.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения болезни Крона.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения системной красной волчанки (SLE).
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения саркоидоза.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения ювенильного артрита.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения ревматоидного артрита.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения псориатического артрита.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения анкилозирующего спондилоартрита.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения гнойного гидраденита.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения увеита.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения синдрома Шегрена.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения псориаза.
В другом дополнительном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент вводят с помощью по меньшей мере одного пути, выбранного из парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, внутрибрюшного, внутрикапсулярного, внутрихрящевого, внутриполостного, интрацелиального, внутримозжечкового, интрацеребровентрикулярного, внутритолстокишечного, интрацервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, внутримиокардиального, внутрикостного, внутритазового, внутриперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, внутрипростатического, внутрилегочного, внутриректального, внутрипочечного, интраретинального, интраспинального, интрасиновиалъного, интраторакального, внутриматочного, внутрипузырного, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального и трансдермального.
В других определенных вариантах осуществления настоящего изобретения также представлен способ определения присутствия CD40 или его фрагмента в тестируемом образце с помощью иммунологического анализа, где иммунологический анализ предусматривает приведение тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним антителом или его антиген-связывающей частью по любому из аспектов и вариантов осуществления, описанных в данном документе, и по меньшей мере с одной детектируемой меткой. В дополнительном варианте осуществления способ дополнительно предусматривает стадии: (i) приведения тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним антителом или его антиген-связывающей частью, где антитело или его антиген-связывающая часть связываются с эпитопом на CD40 или его фрагменте, так что образуется первый комплекс; (ii) приведения комплекса в контакт по меньшей мере с одной детектируемой меткой, где детектируемая метка связывается с эпитопом на первом комплексе или на CD40 или его фрагменте, который не связан антителом или его антиген-связывающей частью, с образованием второго комплекса; и (iii) обнаружения присутствия CD40 или его фрагмента в тестируемом образце на основании сигнала, генерируемого детектируемой меткой во втором комплексе, где присутствие CD40 или его фрагмента прямо коррелирует с сигналом, генерируемым детектируемой меткой. В дополнительном связанном варианте осуществления способ дополнительно предусматривает стадии: (i) приведения тестируемого образца в контакт по меньшей мере с одним антителом или его антиген-связывающей частью, где антитело или его антиген-связывающая часть связываются с эпитопом на CD40 или его фрагменте, так что образуется первый комплекс; (ii) приведения комплекса в контакт по меньшей мере с одной детектируемой меткой, где детектируемая метка конкурирует с CD40 или его фрагментом за связывание с антителом или его антиген-связывающей частью, так что образуется второй комплекс; и (iii) обнаружения присутствия CD40 или его фрагмента в тестируемом образце на основании сигнала, генерируемого детектируемой меткой во втором комплексе, где присутствие CD40 или его фрагмента опосредованно коррелирует с сигналом, генерируемым детектируемой меткой.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен DVD-Ig, который содержит связывающие области, например CDR, описанные в данном документе. В одном варианте осуществления DVD-Ig по настоящему изобретению содержит четыре полипептидные цепи, где две полипептидные цепи содержат VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен тяжелой цепи, VD2 представляет собой второй вариабельный домен тяжелой цепи, С представляет собой константный домен тяжелой цепи, X1 представляет собой линкер, при условии, что он не является CH1, а Х2 представляет собой Fc-область; и две полипептидные цепи содержат VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, где VD1 представляет собой первый вариабельный домен легкой цепи, VD2 представляет собой второй вариабельный домен легкой цепи, С представляет собой константный домен легкой цепи, X1 представляет собой линкер, при условии, что он не является CH1, а Х2 не содержит Fc-область; и n равняется 0 или 1; где указанные четыре полипептидные цепи указанного связывающего белка образуют четыре функциональных антиген-связывающих сайта. В одном варианте осуществления первая (и/или вторая) тяжелая цепь DVD содержит набор CDR, изложенный под SEQ ID NO: 6, 42 и 8. В одном варианте осуществления первая (и/или вторая) вариабельная область легкой цепи содержит набор CDR, изложенный под SEQ ID NO: 21, 11 и 12. В одном варианте осуществления DVD-Ig по настоящему изобретению является моноспецифическим и связывает huCD40. В другом варианте осуществления DVD-Ig по настоящему изобретению является мультиспецифическим и связывает CD40 и вторую молекулу-мишень.
Краткое описание графических материалов
На фигуре 1А графически изображена антагонистическая активность химерного антитела (антитело 1 (Ab1)) в сравнении с контрольным агонистом и известными антителами-антагонистами (4D11 (Astellas) и Bib (Boehringer)). На фигуре 1В графически изображена активность того же химерного антитела Ab1 в анализе на агонистическую активность с применением тех же контрольных агонистов и антагонистов, что и на фигуре 1А.
На фигуре 2 графически изображена агонистическая активность (фигура 2А) и антагонистическая активность (фигура 2В) гуманизированного антитела Ab101 в сравнении с антителом 4D11, антителом Blb, IgG-антителом (контроль) и контрольным антителом-агонистом (2141).
На фигуре 3 графически изображены результаты из in vivo исследований гуманизированного антитела Ab101. На фигуре 3А графически изображена выработка IgG у huscid-мышей, которые получали РВМС человека в комбинации с Ig-контролем, слиянием CTLA4-Ig или антителом Ab101. На фигуре 3В графически изображено выживание В-клеток у той же мышиной модели, которой вводили те же средства, что и на фигуре 3А.
На фигуре 4 показано выравнивание аминокислотных последовательностей мышиных антител-антагонистов к CD40 человека и выравнивание консенсусных последовательностей. На фигуре 4А показано выравнивание последовательностей вариабельной области легких цепей антитела 3 (Ab3) (SEQ ID NO: 48), Ab1 (SEQ ID NO: 9) и антитела 2 (Ab2) (SEQ ID NO: 76) и консенсусная последовательность вариабельной области легкой цепи (SEQ ID NO: 116). На фигуре 4В показано выравнивание последовательностей вариабельной области тяжелых цепей Ab3 (SEQ ID NO: 44), Ab1 (SEQ ID NO: 5) и Ab2 (SEQ ID NO: 75) и консенсусная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (SEQ ID NO: 117).
На фигурах 5А и 5В графически изображена типичная эффективность нейтрализации (антагонистическая активность) (фигура 5А) и агонистическая активность (фигура 5В) Ab102 в отношении CD40 человека в анализе активации моноцитов, описанном в примере 7. Активация моноцитов соответствовала повышению концентрации TNF в каждом анализе.
На фигуре 6 графически изображено дозозависимое снижение балла на основании эндоскопии в случае профилактического введения антитела 138 (Ab138). Антитело 138 тестировали при дозах, составляющих 15, 5, 1,5 и 0,5 мг/кг. Применяли IgG отрицательного контроля. Лекарственный препарат против p40IL-12/23 применяли в качестве положительного контроля. Заболевание опосредуют клетки CD45Rbhi, которые переносили в животных. RBlow обозначает группу отрицательного контроля. Клетки CD45RBlow не опосредуют заболевание.
На фигуре 7 графически изображены результаты иммуногистохимического анализа для определения IBA1 + макрофагов в толстой кишке при введении антитела 138 (Ab138). Гистологический анализ срезов толстой кишки показал снижение числа макрофагов (общая мера воспаления). Применяли IgG отрицательного контроля. Лекарственный препарат против p40IL-12/23 применяли в качестве положительного контроля.
trough
На фигуре 8 графически изображены уровни циркулирующего антитела 138 (Ab138) через 96 часов (равны C) после введения конечной дозы в модели колита, полученной путем переноса Т-клеток. Было показано, что уровни в сыворотке крови являются дозозависимыми. Лекарственный препарат против p40IL-12/23 применяли в качестве положительного контроля. Только 1 животное в группе с дозой 0,5 мг/кг имело измеряемые уровни Ab138.
На фигуре 9А графически изображены результаты эндоскопии после введения антитела 138 на мышиной модели колита. Лечение с помощью антитела 138 (Ab138) начинали через три недели после инъекции клеток, после эндоскопического подтверждения заболевания, и было отмечено дозозависимое снижение суммарного балла MEDAI. Самая высокая доза (15 мг/кг) достигала статистической значимости (фигура 9А).
На фигуре 9В графически изображены гистологические результаты после введения антитела 138. Гистологический анализ IBA1 + макрофагов в толстой кишке, в качестве меры миелоидного воспаления, показан на фигуре 9В.
На фигуре 10 графически изображены результаты, показывающие, что Ab102 подавляло IgM к KLH и IgG к KLH (пунктирная линия) в сравнении с контрольными животными, получавшими лечение только с помощью среды (сплошные линии). Макакам-крабоедам (два животных/пол/группа) вводили Ab102 при дозах, составляющих 0 (только среда) или 10 мг/кг подкожно (SC), в течение 5 недель. Гемоцианин фисуреллы (KLH) вводили всем животным в день 8. Образцы сыворотки крови собирали от каждого животного в дни -11, -7, 0, 4, 7, 10, 14 и 21 относительно введения KLH (дни KLH).
Фигура 11А представляет собой график, на котором показано, что лечение с помощью антитела 138 к CD40, предупреждало протеинурию у мышей MRL/lpr. Мышам вводили дозы, составляющие 15 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 5 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг антитела 2 раза в неделю или 15 мг/кг антитела 1 раз в неделю. Введение только среды в виде фосфатно-солевого буфера (PBS) применяли в качестве контроля. Состояние протеинурии определяли как процент мышей с содержанием белка в моче <300 мг/дл.
Фигура 11В представляет собой график, на котором изображены результаты, показывающие, что лечение с помощью антитела 138 к CD40 продлевает выживание мышей MRL/lpr. Животным вводили дозы, составляющие 15 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 5 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг антитела 2 раза в неделю или 15 мг/кг антитела 1 раз в неделю. Введение только среды применяли в качестве контроля. Процент выживших животных показан с течением времени.
Фигура 12А представляет собой график, на котором изображены результаты, показывающие, что лечение с помощью антитела 138 к CD40 предупреждало развитие нефрита. На фигуре 12А показан эффект антитела 138 в отношении гломерулонефрита у мышей, которым вводили дозы, составляющие 15 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 5 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг антитела 2 раза в неделю или 15 мг/кг антитела 1 раз в неделю, в день 29 и день 63. Введение только среды PBS применяли в качестве контроля. Гломерулонефрит оценивали по шкале 0-4. Поскольку тяжесть гломерулонефрита усиливалась у мышей MRL с возрастом, лечение с помощью антитела 138 сохраняло эффективность в сведении к минимуму гломерулонефрита при дозах 5 и 15 мг/кг. Периваскулярное воспаление оценивали в баллах по шкале 0-4 на основании следующих критериев: 0 - вплоть до небольшого числа редких лимфоцитов; 1 - небольшое число лимфоцитов, образующих рыхлые агрегаты; 2 - лимфоциты, образующие дискретные небольшие агрегаты; 3 - поляризованные агрегаты из лимфоцитов, которые выпячиваются в просвет прилегающей вены, но не могут полностью окружить дуговую артерию; 4 - агрегаты лимфоцитов полностью окружают и распространяются в адвентициальную оболочку дуговой артерии.
Фигура 12В представляет собой график, на котором изображены результаты, показывающие, что лечение с помощью антитела к CD40 предупреждало развитие нефрита. На фигуре 12В изображены результаты, показывающие эффект антитела 138 в отношении периваскулярного (PV) воспаления в почках у мышей, которым вводили дозы, составляющие 15 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 5 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг антитела 2 раза в неделю или 15 мг/кг антитела 1 раз в неделю, в день 29 и день 63. Введение только среды PBS применяли в качестве контроля. Антитело к CD40 из расчета 5 и 15 мг/кг было эффективным в уменьшении периваскулярных (PV) инфильтратов в почках в дни 29 и 63.
Фигура 12С представляет собой график, на котором показано, что лечение с помощью антитела 138 к CD40 предупреждало развитие нефрита. На фигуре 12С показан эффект антитела 138 в отношении тубулоинтерстициального воспаления (TI) у мышей, которым вводили дозы, составляющие 15 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 5 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг антитела 2 раза в неделю или 15 мг/кг антитела 1 раз в неделю, в день 29 и день 60. Введение только среды PBS применяли в качестве контроля. TI уменьшались на раннем этапе заболевания.
Фигура 13А представляет собой график, на котором показано, что лечение с помощью антитела 138 к CD40 предупреждало воспаление слюнных желез. На фигуре 13А показан эффект антитела 138 в отношении воспаления слюнных желез у мышей, которым вводили дозы, составляющие 15 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 5 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг антитела 2 раза в неделю или 15 мг/кг антитела 1 раз в неделю, в день 29 и день 60. Введение только среды PBS применяли в качестве контроля. Перидуктулярное воспаление оценивали в баллах по шкале 0-4 на основании следующих критериев: 0 - вплоть до небольшого числа редких лейкоцитов; 1 - небольшое число лейкоцитов, образующих рыхлые агрегаты; 2 - лейкоциты, образующие дискретные небольшие агрегаты; 3 - поляризованные агрегаты из лейкоцитов, которые полностью окружают проток; 4 - агрегаты лейкоцитов, распространяющиеся в железистую паренхиму слюнной железы.
Фигура 13В представляет собой график, на котором показано, что лечение с помощью антитела 138 к CD40 предупреждает воспаление суставов. На фигуре 13В показан эффект антитела 138 в отношении воспаления суставов у мышей, которым вводили дозы, составляющие 15 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 5 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг антитела 2 раза в неделю или 15 мг/кг антитела 1 раз в неделю, в день 29 и день 60. Введение только среды PBS применяли в качестве контроля. Воспаление суставов оценивали в баллах для каждой из двух лап мыши по шкале 0-4 на основании следующих критериев: 0 - отсутствие воспаления; 1 - небольшое число лейкоцитов в суставной щели; 2 - часто встречающиеся лейкоциты в пределах суставной щели со слабой синовиальной пролиферацией; 3 - увеличивающееся число лейкоцитов в суставных щелях с умеренной синовиальной пролиферацией; 4 - лейкоциты и синовиальная пролиферация распространяются и объединяются во всех суставных щелях с явно различимой эрозией кости и/или пролиферацией. Баллы суммировали, при этом общий возможный балл для мыши составлял 8.
Фигура 14 представляет собой панель из четырех графиков (i-iv), на которых показано, что антитело 138 к CD40 предотвращало распространение фолликулярных Т-хелперных клеток (Tfh) и В-клеток герминативного центра (GC) в селезенке, как определено с помощью проточной цитометрии. Мышам вводили дозы, составляющие 15 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 5 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг антитела 2 раза в неделю или 15 мг/кг антитела 1 раз в неделю. Введение только среды PBS применяли в качестве контроля. На панели (i) показано количество Tfh-клеток в селезенке в день 29. На панели (ii) показано количество Tfh-клеток в селезенке в день 63. На панели (iii) показано количество В-клеток GC в селезенке в день 29. На панели (iv) показано количество В-клеток GC в селезенке в день 63.
Фигура 15А представляет собой график, на котором показано, что лечение с помощью антитела 138 к CD40 предупреждало повышение уровней общих циркулирующих IgG в день 29. Мышам вводили дозы, составляющие 15 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 5 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг антитела 2 раза в неделю и 15 мг/кг антитела 1 раз в неделю. Введение только среды PBS применяли в качестве контроля.
Фигура 15В представляет собой график, на котором показано, что лечение с помощью антитела 138 к CD40 предупреждало повышение уровней общих циркулирующих IgG в день 63. Мышам вводили дозы, составляющие 15 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 5 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг антитела 2 раза в неделю и 15 мг/кг антитела 1 раз в неделю. Введение только среды PBS применяли в качестве контроля.
Фигура 16А представляет собой график, на котором показан эффект лечения с помощью антитела 138 к CD40 в отношении титров антитела к двухнитевой ДНК (антитело к dsDNA) в день 29. Мышам вводили дозы, составляющие 15 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 5 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг антитела 2 раза в неделю или 15 мг/кг антитела 1 раз в неделю. Введение только среды PBS применяли в качестве контроля. Определяли титры антитела к dsDNA в день 29.
Фигура 16В представляет собой график, на котором показано лечение с помощью антитела 138 к CD40 в отношении титров антитела к двухнитевой ДНК (антитело к dsDNA) в день 63. Мышам вводили дозы, составляющие 15 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 5 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг антитела 2 раза в неделю или 15 мг/кг антитела 1 раз в неделю. Введение только среды PBS применяли в качестве контроля. Определяли титры антитела к dsDNA в день 63.
Фигура 17А представляет собой график, на котором показано, что профилактическое введение доз антитела 138 к CD40 предупреждало протеинурию. Профилактическое лечение начинали у мышей возрастом 26 недель, а мышей с протеинурией исключали из исследования. Мышам вводили дозы, составляющие 15 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг антитела 2 раза в неделю или 15 мг/кг антитела 1 раз в неделю. Введение только среды PBS применяли в качестве контроля. Состояние протеинурии определяли как процент мышей с содержанием белка в моче <300 мг/дл.
Фигура 17В представляет собой график, на котором показано, что профилактическое введение доз антитела 138 к CD40 продлевало выживание при применении мышиной модели SLE. Профилактическое лечение начинали у мышей возрастом 26 недель, а мышей с протеинурией исключали из исследования. Мышам вводили дозы, составляющие 15 мг/кг антитела 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг антитела 2 раза в неделю или 15 мг/кг антитела 1 раз в неделю. Введение только среды PBS применяли в качестве контроля. Процент выживания оценивали до возраста 36 недель.
Фигура 18А представляет собой график, на котором показано, что у мышей, получавших лечение с помощью антитела 138 в дозе, составляющей 15 мг/кг IP 2 раза в неделю, со временем развивалась слабая протеинурия, как показано с помощью уровня белка в моче (эквивалентно мг/дл). Среду PBS, которую вводили IP 2 раза в неделю, применяли в качестве контроля. Преднизолон вводили в дозе, составляющей 10 мг/кг, перорально (РО) один раз в день (SID). Ни у одной из не получавших лечение контрольных мышей, которым вводили среду PBS, ни у мышей, получавших лечение с помощью преднизолона, не развивалась слабая протеинурия. Граничное значение для протеинурии указано как 300 мг/дл.
Фигура 18В представляет собой график, на котором показана скорость нормализации протеинурии у мышей, получавших лечение с помощью антитела 138 в дозе, составляющей 15 мг/кг IP 2 раза в неделю. Исходя из скорости нормализации протеинурии, как определено по проценту мышей с нормальным содержанием белка в моче, среднее время нормализации протеинурии составляло 23±7 дней. Среду PBS, которую вводили IP 2 раза в неделю, применяли в качестве контроля. Преднизолон вводили в дозе, составляющей 10 мг/кг, перорально (РО) один раз в день (SID).
Фигура 18С представляет собой график, на котором показано, что у мышей, получавших лечение с помощью антитела 138 к CD40 в дозе, составляющей 15 мг/кг IP 2 раза в неделю, значительно продлевалось выживание, как показано с помощью процента выживания. Среду PBS, которую вводили IP 2 раза в неделю, применяли в качестве контроля. Преднизолон вводили перорально (РО) один раз в день (SID).
Фигура 19А представляет собой график, на котором показано, что выработка слюны сохраняется при профилактическом лечении с помощью антитела 138 при дозе, составляющей 15 мг/кг IP 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг 2 раза в неделю, 15 мг/кг 1 раз в неделю. Среду PBS применяли в качестве контроля. Преднизолон вводили при дозе, составляющей 10 мг/кг. Выработку слюны у мышей NZBWF-1 возрастом 7 недель, которые представляли собой незаболевших более молодых мышей, применяли в качестве дальнейшего сравнения. Определяли количество слюны (мг). Выработка слюны у мышей, получавших лечение с помощью антитела к CD40, была сравнительно постоянной.
Фигура 19В представляет собой график, на котором показано, что объем слюны сохраняется при профилактическом лечении с помощью антитела 138 к CD40 при дозе, составляющей 15 мг/кг IP 2 раза в неделю, 1,5 мг/кг 2 раза в неделю, 15 мг/кг 1 раз в неделю. Среду PBS применяли в качестве контроля. Преднизолон вводили при дозе, составляющей 10 мг/кг. Определяли соотношение объем слюны/масса тела (мг/г). Выработка слюны у мышей, получавших лечение с помощью антитела к CD40, была значительно большей, чем у необработанных контрольных мышей.
Фигура 20А представляет собой график, на котором показано, что выработка слюны сохранялась при терапевтическом лечении с помощью антитела 138 к CD40 при дозе, составляющей 15 мг/кг. Преднизолон вводили при дозе, составляющей 10 мг/кг. Выработку слюны у мышей возрастом 11 недель применяли в качестве дальнейшего сравнения. Определяли количество слюны (мг).
Фигура 20В представляет собой график, на котором показано, что выработка слюны сохранялась при терапевтическом лечении с помощью антитела 138 к CD40 при дозе, составляющей 15 мг/кг. Преднизолон вводили при дозе, составляющей 10 мг/кг. Выработку слюны у мышей возрастом 11 недель применяли в качестве дальнейшего сравнения. Определяли соотношение объем слюны/масса тела (мг/г).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к антителам-антагонистам к CD40 или их антиген-связывающим частям, а также к способам их применения. Различные аспекты настоящего изобретения относятся к антителам и фрагментам антител, а также к фармацевтическим композициям на их основе, а также нуклеиновым кислотам, рекомбинантным векторам экспрессии и клеткам-хозяевам для получения таких антител и фрагментов. Способы применения антител по настоящему изобретению для обнаружения CD40 человека, для подавления активности CD40/CD40L человека, как in vitro, так и in vivo; и для предупреждения или лечения заболеваний или нарушений, таких как хроническое воспалительное заболевание и болезнь Крона, также охватываются настоящим изобретением.
Если в настоящем документе не определено иное, научные и технические выражения, применяемые в связи с настоящим изобретением, будут иметь значения, которые в большинстве случаев понимают рядовые специалисты в данной области. Однако значение и объем терминов должны быть четкими в случае любой латентной неясности, при этом определения, предусмотренные в данном документе, имеют преимущества над любым словарным или посторонним определением. Более того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе будут включать множественное число, а термины в множественном числе будут включать единственное число. В настоящей заявке применение "или" означает "и/или", если не указано иное. Кроме того, применение термина "включающий", а также других форм, таких как "включает" и "включенный", не является ограничивающим. Также термины, такие как "элемент" или "компонент", охватывают как элементы и компоненты, составляющие единое целое, так и элементы и компоненты, которые содержат более одной субъединицы, если специально не указано иное.
В целом, терминологии и методики, связанные с культурой клеток и тканей, молекулярной биологией, иммунологией, микробиологией, генетикой, а также химией и гибридизацией белков и нуклеиновых кислот, описанные в данном документе, хорошо известны и обычно применяются в данной области техники. Способы и методики по настоящему изобретению осуществляют в целом в соответствии с традиционными способами, хорошо известными из уровня техники, и как описано в различных общих и более специальных библиографических ссылках, которые процитированы и обсуждаются по всему настоящему описанию, если не указано иное. Ферментативные реакции и методики очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как обычно осуществляется в данной области техники или как описано в настоящем документе. Применяемые терминологии и лабораторные процедуры и методики, связанные с аналитической химией, химией органического синтеза и медицинской и фармацевтической химией, описанные в данном документе, хорошо известны и обычно применяются в данной области техники. Для химических синтезов, химических анализов, получения фармацевтических препаратов, составления, а также доставки и лечения пациентов применяют стандартные методики.
Таким образом, чтобы можно было легче понять настоящее изобретение, ниже приведены определения отдельных терминов.
Используемый в данном документе термин "полипептид" обозначает любую полимерную цепь из аминокислот. Термины "пептид" и "белок" используются взаимозаменяемо с термином полипептид и также обозначают полимерную цепь из аминокислот. Термин "полипептид" охватывает естественные или искусственные белки, фрагменты белков и аналоги полипептидов с белковой последовательностью. Полипептид может быть мономерным или полимерным.
Термин "выделенный белок" или "выделенный полипептид" представляет собой белок или полипептид, которые, вследствие их происхождения или источника получения, не ассоциированы с природными ассоциированными компонентами, которые сопровождают их в их естественном состоянии; практически не содержат других белков того же вида; экспрессируются клеткой другого вида; или не существуют в природе. Так, полипептид, который синтезирован химическим путем или синтезирован в клеточной системе, отличной от клетки, из которой он происходит в природе, будет "выделенным" из его природных ассоциированных компонентов. Белок также можно обработать, чтобы он практически не содержал природных ассоциированных компонентов, путем выделения с применением методик очистки белка, хорошо известных из уровня техники. Примером выделенного полипептида является выделенное антитело или его антиген-связывающая часть.
Используемый в данном документе термин "извлечение" обозначает процесс обработки химической молекулы, такой как полипептид, чтобы она практически не содержала природных ассоциированных компонентов, с помощью выделения, например, с применением методик очистки белка, хорошо известных из уровня техники.
Используемые в данном документе термины "CD40 человека" и "CD40 дикого типа человека" (в данном документе сокращенные, как hCD40, hCD40wt) обозначают трансмембранный белок I типа. В одном варианте осуществления подразумевается, что термин CD40 человека включает рекомбинантный CD40 человека (rhCD40), который можно получить с помощью стандартных способов рекомбинантной экспрессии. В таблице 1 представлена аминокислотная последовательность CD40 человека (т.е. SEQ ID NO. 1) и его внеклеточного домена (т.е. SEQ ID NO: 107), которые известны из уровня техники.
Используемое в данном документе выражение "биологическая активность" обозначает все неотъемлемые биологические свойства CD40-рецептора. Биологические свойства CD40 включают без ограничений связывание CD40L; участие в развитии В-клеток; участие в активации лимфоцитов; участие в функционировании антиген-презентирующих клеток; регуляцию активности дендритных клеток, макрофагов и В-клеток; индуцирование выработки воспалительных цитокинов в макрофагах и дендритных клетках; повышающую регуляцию презентирования антигена; повышающую регуляцию стимуляции Т-клеток и способствование переключению класса иммуноглобулинов в В-клетках.
Термины "специфическое связывание" или "специфичное связывание", используемые в данном документе в отношении взаимодействия антитела, белка или пептида со второй химической молекулой, означают, что взаимодействие зависит от присутствия конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа) на химической молекуле; например, антитело распознает и связывается со специфической белковой структурой, а не с белками в целом. Если антитело является специфическим в отношении эпитопа "А", присутствие молекулы, содержащей эпитоп А (или свободный, немеченый А), в реакции, в состав которой входят меченый "А" и антитело, будет снижать количество меченого А, связанного с антителом.
Используемый в данном документе термин "агонист" обозначает модулятор, который при контакте с представляющей интерес молекулой, например CD40, вызывает повышение силы определенной активности или функции молекулы по сравнению с силой активности или функции, наблюдаемой в отсутствие агониста.
Используемый в данном документе термин "антагонист" или "ингибитор" обозначает модулятор, который при контакте с представляющей интерес молекулой вызывает снижение силы определенной активности или функции молекулы по сравнению с силой активности или функции, наблюдаемой в отсутствие антагониста. Конкретные представляющие интерес антагонисты включают таковые, которые блокируют или модулируют биологическую или иммунологическую активность CD40 человека (hCD40). Антитело-антагонист hCD40, например, может ингибировать повышение уровня CD86 на первичных В-клетках человека, которые культивируют в присутствии (или подвергают воздействию) CD40L (как, например, культивирование В-клеток с CD40L-экспрессирующими Т-клетками человека). В одном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть, которые практически не проявляют агонистическую активность, определены как характеризующиеся уровнем активности, который эквивалентен или находится в пределах одного стандартного отклонения от отрицательного контроля в анализе на агонистическую активность, таком как анализ на агонистическую активность с применением моноцитов, описанный в примере 7.
Антитело или его антиген-связывающая часть по настоящему изобретению представляют собой антитело-антагонист или его антиген-связывающую часть, которые вызывают снижение активности или функции CD40 по сравнению с активностью или функцией CD40 в отсутствие антитела или его антиген-связывающей части. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антиген-связывающая часть практически не проявляют агонистическую активность, т.е. антитело или его антиген-связывающая часть не вызывают увеличение силы активности или функции CD40 по сравнению с активностью или функцией CD40 в отсутствие антитела или его антиген-связывающей части. Агонистическую и антагонистическую активность также можно оценивать с применением способов, известных из уровня техники, например с применением CD40-экспрессирующей линии клеток с геном репортером, экспрессирующей CD40 человека, связанный с NFkB-активируемой щелочной фосфатазой (АР), или анализ с применением В-клеток. Также в одном варианте осуществления агонистическую и антагонистическую активность можно оценивать с применением in vitro анализов на агонистическую и антагонистическую активность с применением моноцитов, описанных в примере 7.
Термин "подавлять связывание с CD40L" обозначает способность антитела или его антиген-связывающего фрагмента предупреждать связывание CD40 с лигандом, CD40L. Такое подавление связывания с CD40L будет приводить к уменьшению или исчезновению биологической активности, опосредованной связыванием CD40 с CD40L.
Используемый в данном документе термин "антитело" в широком смысле обозначает любую молекулу иммуноглобулина (Ig), состоящую из четырех полипептидных цепей, двух тяжелых (Н) цепей и двух легких (L) цепей, или ее любой функциональный фрагмент, мутант, вариант или производное, которые сохраняют необходимые признаки связывания эпитопа молекулы Ig. Такие мутантные, вариантные или производные форматы антитела известны из уровня техники. Неограничивающие варианты осуществления таковых обсуждаются ниже.
В полноразмерном антителе каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (в данном документе сокращенной как HCVR или VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов: CH1, СН2 и СН3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (в данном документе сокращенной как LCVR или VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена - СL. VH- и VL-области можно дополнительно подразделить на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), перемежающиеся с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоят из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Молекулы иммуноглобулинов могут принадлежать к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), классу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) или подклассу.
Используемый в данном документе термин "антиген-связывающая часть" или "антиген-связывающий фрагмент" антитела (или просто "часть антитела" или "фрагмент антитела") обозначает один или несколько фрагментов антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, hCD40). Было показано, что антиген-связывающую функцию антитела могут осуществлять фрагменты полноразмерного антитела. Такие варианты осуществления антитела также могут иметь форматы биспецифического антитела, антитела с двойной специфичностью или мультиспецифического антитела; в частности, они могут связываться с двумя или более различными антигенами. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антиген-связывающая часть" или "антиген-связывающий фрагмент" антитела, включают (i) Fab фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из VL-, VH-, CL- и СН1-доменов; (ii) F(abʹ)2 фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из VH- и СН1-доменов; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из VL- и VH-доменов одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., публикация согласно PCT WO 90/05144 Al, включенная в данный документ посредством ссылки), который содержит один вариабельный домен; и (vi) выделенную область, определяющую комплементарность (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, их можно соединить, с применением рекомбинантных способов, с помощью синтетического линкера, который позволяет получать их в виде единой белковой цепи, в которой VL- и VH-области образуют пару с формированием моновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см. например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Подразумевается, что такие одноцепочечные антитела также охватываются термином "антиген-связывающая часть" или "антиген-связывающий фрагмент" антитела. Также охватываются другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела. Диатела представляют собой бивалентные, биспецифические антитела, в которых VH- и VL-домены экспрессируются на единой полипептидной цепи, но с помощью линкера, который является слишком коротким, чтобы обеспечить возможность образования пары между двумя доменами одной цепи, тем самым заставляя домены образовывать пару с комплементарными доменами другой цепи и создавая два антиген-связывающих сайта (см., например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Такие связывающие части антител известны из уровня техники (Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5).
Используемый в данном документе термин "конструкция антитела" обозначает полипептид, содержащий одну или несколько антиген-связывающих частей по настоящему изобретению, связанных с линкерным полипептидом или константным доменом иммуноглобулина. Линкерные полипептиды содержат два или более аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, и применяются, чтобы соединять одну или несколько антиген-связывающих частей. Такие линкерные полипептиды хорошо известны из уровня техники (см., например, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Константный домен иммуноглобулина обозначает константный домен тяжелой или легкой цепи. Аминокислотные последовательности константных доменов тяжелой цепи и легкой цепи IgG человека известны из уровня техники и представлены в таблице 2.
Более того, антитело, или его антиген-связывающая часть могут составлять часть более крупных молекул иммунной адгезии, образованных с помощью ковалентной или нековалентной ассоциации антитела или части антитела с одним или несколькими другими белками или пептидами. Примеры таких молекул иммунной адгезии включают применение центральной области на основе стрептавидина для получения тетрамерной молекулы scFv (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) и применение цистеинового остатка, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки для получения бивалентных и биотинилированных молекул scFv (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Части антитела, такие как Fab- и Р(ab')2-фрагменты, можно получать из целого антитела с применением традиционных методик, таких как расщепление целых антител папаином или пепсином, соответственно. Более того, антитела, части антитела и молекулы иммунной адгезии можно получать с применением стандартных методик рекомбинантной ДНК, описываемых в данном документе.
Подразумевается, что используемое в данном документе выражение "выделенное антитело" обозначает антитело, которое практически не содержит других антител с иной антигенной специфичностью (например, выделенное антитело, которое специфически связывает hCD40 практически не содержит антител, которые специфически связывают антигены, отличные от hCD40). Однако выделенное антитело, которое специфически связывает hCD40, может характеризоваться перекрестной реактивностью в отношении других антигенов, таких как молекулы CD40 от других видов. Более того, выделенное антитело может практически не содержать других клеточных материалов и/или химических веществ.
Термин "химерное антитело" обозначает антитела, которые содержат последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепи от одного вида, а последовательности константных областей от другого вида, как, например, антитела с мышиными вариабельными областями тяжелой и легкой цепей, связанные с константными областями человека.
Термин "CDR-привитое антитело" обозначает антитела, которые содержат последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей от одного вида, но в этих последовательностях одна или несколько CDR-областей VH и/или VT заменены последовательностями CDR от другого вида, как, например, антитела с мышиными вариабельными областями тяжелой и легкой цепей, в которых одна или несколько CDR мыши (например, CDR3) были заменены последовательностями CDR человека.
Термины "нумерация по Kabat", "определения по Kabat" и "мечение по Kabat" используются в данном документе взаимозаменяемо. Эти термины, которые приняты в данной области техники, обозначают систему нумерации аминокислотных остатков, которые являются более вариабельными (т.е. гипервариабельными), чем остальные аминокислотные остатки в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей антитела или его антиген-связывающей части (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391 и Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). В случае вариабельной области тяжелой цепи гипервариабельная область расположена в пределах аминокислотных положений 31-35 для CDR1, аминокислотных положений 50-65 для CDR2 и аминокислотных положений 95-102 для CDR3. В случае вариабельной области легкой цепи гипервариабельная область расположена в пределах аминокислотных положений 24-34 для CDR1, аминокислотных положений 50-56 для CDR2 и аминокислотных положений 89-97 для CDR3.
Используемые в данном документе термины "акцептор" и "акцепторное антитело" обозначают последовательность антитела или нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает или кодирует по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или 100% аминокислотных последовательностей одной или нескольких каркасных областей. В некоторых вариантах осуществления термин "акцептор" обозначает аминокислотную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты антитела, которые обеспечивают или кодируют константную(-ые) область(-и). В еще одном варианте осуществления термин "акцептор" обозначает аминокислотную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты антитела, которые обеспечивают или кодируют одну или несколько каркасных областей и константных областей. В конкретном варианте осуществления термин "акцептор" обозначает аминокислотную последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты антитела человека, которые обеспечивают или кодируют по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или 100% аминокислотных последовательностей одной или нескольких каркасных областей. В соответствии с этим вариантом осуществления акцептор может содержать по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, которые не встречаются в одном или нескольких конкретных положениях антитела человека. Каркасная область акцептора и/или константная(-ые) область(-и) акцептора, например, могут происходить или быть получены из зародышевого гена антитела, зрелого гена антитела, функционального антитела (например, антител, хорошо известных из уровня техники, антител, находящихся в разработке, или антител, доступных коммерчески).
Используемый в данном документе термин "CDR" обозначает область, определяющую комплементарность, в пределах вариабельных последовательностей антитела. В каждой вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи имеется по три CDR, которые обозначаются CDR1, CDR2 и CDR3 в случае каждой вариабельной области. Используемый в данном документе термин "набор CDR" обозначает группу из трех CDR, которые находятся в одной вариабельной области, способной связывать антиген. Точные границы этих CDR были по-разному определены в различных системах. Система, описанная Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) и (1991)), не только обеспечивает однозначную систему нумерации остатков, применимую к любой вариабельной области антитела, но также обеспечивает точные границы остатков, определяющие три CDR. Эти CDR можно обозначать как CDR по Kabat. Chothia и сотрудники (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) и Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)) обнаружили, что определенные субфрагменты в пределах CDR по Kabat проявляют практически идентичные конформации пептидного остова, несмотря на то, что характеризуются большим разнообразием на уровне аминокислотной последовательности. Эти субфрагменты были обозначены L1, L2 и L3 или H1, Н2 и Н3, где "L" и "Н" обозначают области легкой цепи и тяжелой цепи соответственно. Эти области могут обозначаться как CDR по Chothia, которые имеют границы, которые перекрываются с CDR по Kabat. Другие границы, определяющие CDR, которые перекрываются с CDR по Kabat, были описаны в Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) и MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)). Также другие определения границ CDR могут не строго следовать одной из вышеперечисленных систем, но, тем не менее, будут перекрываться с CDR по Kabat, хотя они могут быть укорочены или удлинены в свете прогнозов или экспериментальных сведений о том, что конкретные остатки или группы остатков или даже CDR полностью значительно не воздействуют на связывание антигена. В способах, применяемых в данном документе, могут использоваться CDR, определенные в соответствии с любой из этих систем, хотя в предпочтительных вариантах осуществления применяются CDR, определенные по Kabat или Chothia.
Используемый в данном документе термин "канонический" остаток обозначает остаток в CDR или каркасной области, который определяет конкретную каноническую структуру CDR, определенную в Chothia et al. (J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992), оба включены в данный документ посредством ссылки). В соответствии с Chothia et al., важнейшие части CDR многих антител характеризуются почти идентичными конформациями пептидного остова, несмотря на большое разнообразие на уровне аминокислотной последовательности. Каждая каноническая структура обуславливает, в первую очередь, набор торсионных углов пептидного остова для непрерывного сегмента из аминокислотных остатков, образующих петлю.
Используемые в данном документе термины "донор" и "донорное антитело" обозначают антитело, обеспечивающее один или несколько CDR. В предпочтительном варианте осуществления донорное антитело представляет собой антитело от вида, отличного от того, из которого взято антитело, от которого получены или происходят каркасные области. В контексте гуманизированного антитела термин "донорное антитело" обозначает антитело от организма, отличного от человека, которое обеспечивает один или несколько CDR.
Используемый в данном документе термин "каркасная область" или "последовательность каркасной области" обозначает остальные последовательности вариабельной области за исключением CDR. Поскольку точное определение последовательности CDR может быть обусловлено различными системами, смысл выражения "последовательность каркасной области" устанавливается в соответствии с различными интерпретациями. Шесть CDR (CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 из легкой цепи и CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 из тяжелой цепи) также делят каркасные области легкой цепи и тяжелой цепи на четыре подобласти (FR1, FR2, FR3 и FR4) на каждой цепи, в которых CDR1 расположен между FR1 и FR2, CDR2 между FR2 и FR3, a CDR3 между FR3 и FR4. Без указания конкретных подобластей как FR1, FR2, FR3 или FR4, каркасная область, как обозначено в других случаях, представляет объединенные FR в пределах вариабельной области одиночной встречающейся в природе цепи иммуноглобулина. Используемое в данном документе выражение "одна FR" представляет одну из четырех подобластей, а "несколько FR" представляют две или более из четырех подобластей, составляющих каркасную область.
Акцепторные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи человека известны из уровня техники. В одном варианте осуществления по настоящему изобретению акцепторные последовательности тяжелой цепи и легкой цепи человека выбраны из последовательностей, описанных в таблице 3 и таблице 4.
Используемый в данном документе термин "зародышевый ген антитела" или "генный фрагмент" обозначает последовательность иммуноглобулина, закодированную в клетках, отличных от лимфоидных, которые не подверглись процессу созревания, приводящему к генетической перестройке и мутации для экспрессии конкретного иммуноглобулина. (См., например, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv. Exp. Med. Biol. 484:13-30 (2001)). Одно из преимуществ, обеспечиваемых различными вариантами осуществления настоящего изобретения, исходит из понимания того, что зародышевые гены антитела с большей вероятностью, чем зрелые гены антитела сохраняют необходимую структуру аминокислотных последовательностей, характерную для особей данного вида, следовательно, они с меньшей вероятностью будут считаться происходящими из чужеродного источника при терапевтическом применении у данного вида.
Используемый в данном документе термин "ключевые" остатки обозначает определенные остатки в пределах вариабельной области, которые обладают большим влиянием на специфичность и/или аффинность связывания антитела, в частности, гуманизированного антитела. Ключевой остаток включает без ограничений одно или несколько из следующего: остаток, который является смежным с CDR, потенциальный сайт гликозилирования (может представлять собой сайт либо N-, либо О-гликозилирования), редкий остаток, остаток, способный взаимодействовать с антигеном, остаток, способный взаимодействовать с CDR, канонический остаток, контактный остаток между вариабельной областью тяжелой цепи и вариабельной областью легкой цепи, остаток в пределах зоны Vernier и остаток в области, которая перекрывается между определением по Chothia CDR1 вариабельной области тяжелой цепи и определением по Kabat первой каркасной области тяжелой цепи.
Используемый в данном документе термин "гуманизированное антитело" представляет собой антитело или его вариант, производное, аналог или фрагмент, которые иммуноспецифично связываются с представляющим интерес антигеном (например, CD40 человека) и которые содержат каркасную (FR) область с аминокислотной последовательностью, которая практически представляет собой таковую антитела человека, и область, определяющую комплементарность (CDR), с аминокислотной последовательностью, которая практически представляет собой таковую из антитела вида, отличного от человека. Используемый в данном документе термин "практически" в контексте CDR обозначает CDR с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или по меньшей мере на 99% идентична аминокислотной последовательности CDR из антитела вида, отличного от человека. Гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов (Fab, Fab', F(abʹ)2, FabC, Fv), в которых все или практически все CDR-области соответствуют таковым из иммуноглобулина вида, отличного от человека (т.е. донорного антитела), и все или практически все каркасные области являются таковыми с консенсусной последовательностью иммуноглобулина человека. Предпочтительно гуманизированное антитело также содержит по меньшей мере часть константной области (Fc) иммуноглобулина, как правило, таковую иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит обе легких цепи, а также по меньшей мере вариабельный домен тяжелой цепи. Антитело также может включать СН1-, шарнирную, СН2-, СН3- и СН4-области тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированную легкую цепь. В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированную тяжелую цепь. В конкретных вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит только гуманизированный вариабельный домен легкой цепи и/или гуманизированную тяжелую цепь.
Гуманизированное антитело может быть выбрано из любого класса иммуноглобулинов, включая IgM, IgG, IgD, IgA и IgE, и любого изотипа, включая без ограничений IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Гуманизированное антитело может содержать последовательности из более чем одного класса или изотипа, и конкретные константные домены для оптимизации требуемых эффекторных функций могут быть выбраны с применением методик, хорошо известных из уровня техники.
Каркасная область и CDR-области гуманизированного антитела не должны точно соответствовать исходным последовательностям, например, CDR донорного антитела или консенсусной каркасной области могут быть подвергнуты мутагенезу с помощью замены, вставки и/или делеции по меньшей мере одного аминокислотного остатка, таким образом, остаток CDR или каркасной области в данном сайте не соответствует ни донорному антителу, ни консенсусной каркасной области. Однако в предпочтительном варианте осуществления такие мутации не будут распространенными. Обычно по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% остатков в гуманизированном антителе будут соответствовать остаткам в последовательностях исходных FR и CDR. Используемый в данном документе термин "консенсусная каркасная область" обозначает каркасную область в консенсусной последовательности иммуноглобулина. Используемый в данном документе термин "консенсусная последовательность иммуноглобулина" обозначает последовательность, образованную из наиболее часто встречающихся аминокислот (или нуклеотидов) в семействе родственных последовательностей иммуноглобулина (см. например, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987)). В семействе иммуноглобулинов каждое положение в консенсусной последовательности занято аминокислотой, которая встречается наиболее часто в данном положении у данного семейства. Если две аминокислоты встречаются с одинаковой частотой, любая из них может быть включена в консенсусную последовательность.
Используемое в данном документе выражение зона "Vernier" обозначает подмножество из остатков каркасной области, которые могут регулировать структуру CDR и оптимизировать подгонку к антигену, как описано в Foote and Winter (1992, J. Mol. Biol. 224:487-499, который включен в данный документ посредством ссылки). Остатки из зоны Vernier образуют слой, подстилающий CDR, и могут влиять на структуру CDR и аффинность антитела.
Термин "мультивалентный связывающий белок" применяют в данном описании для обозначения связывающего белка, содержащего два или более антиген-связывающих сайта. Мультивалентный связывающий белок предпочтительно разрабатывают так, чтобы он имел три или более антиген-связывающих сайтов, и он обычно представляет собой не встречающееся в природе антитело. Термин "мультиспецифический связывающий белок" обозначает связывающий белок, способный связывать две или более родственные или неродственные мишени.
Термин "двойной вариабельный домен", или "DVD", или "DVD-Ig", как используется взаимозаменяемо в данном документе, представляет собой антиген-связывающие белки, которые содержат два или более антиген-связывающих сайта и являются тетравалентными или мультивалентными связывающими белками. Такие DVD могут быть моноспецифическими, т.е. способными связывать один антиген, или мультиспецифическими, т.е. способными связывать два или более антигенов. DVD-связывающие белки, содержащие два DVD-полипептида тяжелой цепи и два DVD-полипептида легкой цепи, обозначаются как DVD-Ig. Каждая половина DVD-Ig содержит DVD-полипептид тяжелой цепи и DVD-полипептид легкой цепи, а также два антиген-связывающих сайта. Каждый связывающий сайт содержит вариабельный домен тяжелой цепи и вариабельный домен легкой цепи, содержащие в общей сложности 6 CDR, вовлеченных в связывание антигена, на антиген-связывающий сайт. В одном варианте осуществления CDR, описанные в данном документе (например, SEQ ID NO: 6, 42 и 8 (тяжелая цепь) и 21, 11 и 12 (легкая цепь)), применяются в DVD к CD40. Примеры структур DVD-Ig известны из уровня техники и описаны, например, в патенте США №7612181, который включен в данный документ посредством ссылки.
Используемый в данном документе термин "осуществление нейтрализации" обозначает нейтрализацию биологической активности цитокинового рецептора, когда антитело или его антиген-связывающая часть специфически связывают цитокиновый рецептор. Предпочтительно нейтрализующее антитело или его антиген-связывающая часть представляют собой нейтрализующее антитело, связывание которого с hCD40 приводит к подавлению биологической активности hCD40. Предпочтительно нейтрализующее антитело или его антиген-связывающая часть связывают hCD40 и снижают биологическую активность hCD40 по меньшей мере на приблизительно 20%, 40%, 60%, 80%, 85% или более. Подавление биологической активности hCD40 с помощью нейтрализующего антитела или его антиген-связывающей части можно оценивать путем измерения одного или нескольких индикаторов биологической активности hCD40, хорошо известных из уровня техники.
Термин "активность" включает виды активности, такие как специфичность/аффинность связывания антитела с антигеном, например, антитела к hCD40, которое связывается с антигеном hCD40, и/или нейтрализующая эффективность антитела, например, антитела к hCD40, связывание которого с hCD40 подавляет биологическую активность hCD40, например, связывание CD40L; участие в развитии В-клеток; участие в активации лимфоцитов; участие в функционировании антиген-презентирующих клеток; регуляция активности дендритных клеток, макрофагов и В-клеток; индуцирование выработки воспалительных цитокинов в макрофагах и дендритных клетках; повышающая регуляция презентирования антигена; повышающая регуляция стимуляции Т-клеток и способствование переключению класса иммуноглобулинов в В-клетках.
Иллюстративные анализы для оценки активности антител к CD40 по настоящему изобретению включают in vitro и in vivo анализы, изложенные в данном документе. В частности, анализы можно применять для определения того, является ли антитело к CD40 антителом-агонистом или антителом-антагонистом.
Например, связывание с CD40 человека и подавление взаимодействия CD40-CD40L можно проанализировать с применением линии клеток, экспрессирующих CD40 человека, посредством FACS-анализов. Антагонистическую и агонистическую активность можно оценивать с применением CD40-экспрессирующей линии клеток с геном-репортером, экспрессирующей CD40 человека, связанный с NFkB-активируемой щелочной фосфатазой (АР). Если сигнал получен благодаря CD40, активация NFkB приводит к секреции АР, которую измеряют с помощью колориметрического субстрата. В качестве иллюстративного анализа на антагонистическую активность линию клеток с геном-репортером для обнаружения CD40 можно культивировать либо с линией клеток Jurkat, экспрессирующих CD40L (для обеспечения физиологического взаимодействия с лигандом), либо с растворимым CD40L, и можно оценивать способность антител к CD40 блокировать сигнал с участием NFkB. В качестве иллюстративного анализа на агонистическую активность линию клеток с геном-репортером для обнаружения CD40 человека можно обрабатывать с помощью антител к CD40 и измерять сигнал с участием NFkB, как описано выше.
В качестве альтернативы можно использовать анализ на агонистическую активность с применением В-клеток, при котором В-клетки активируют с помощью низкой дозы антитела к IgM и IL4, перед добавлением антитела-антагониста к CD40. Усиление активации В-клеток можно измерять как повышение уровня CD86, что, в свою очередь, указывает на агонистическую активность. Аналогично можно использовать анализ на антагонистическую активность с применением В-клеток, в котором первичные В-клетки человека культивируют с CD40L-экспрессирующей линией Т-клеток человека, что приводит к активации В-клеток и повышению уровня экспрессии CD86 вследствие взаимодействия CD40/CD40L. Подавление повышения уровня CD86 в первичных В-клетках человека указывает на антагонистическую активность.
Термин "эпитоп" включает любую полипептидную детерминанту, способную обеспечивать специфическое связывание с антителом или его антиген-связывающей частью. В определенных вариантах осуществления эпитопные детерминанты включают химически активные поверхностные группы молекул, таких как аминокислоты, боковые цепи Сахаров, фосфорильная или сульфонильная группы, и, в определенных вариантах осуществления, могут обладать специфическими характеристиками трехмерной структуры и/или специфическими характеристиками заряда. В различных вариантах осуществления эпитоп может представлять собой линейный или последовательный эпитоп, т.е. линейную последовательность из аминокислот, в первичной структуре антигена, т.е. CD40. В качестве альтернативы, в других вариантах осуществления эпитоп может представлять собой конформационный эпитоп со специфической трехмерной формой, когда антиген принимает свою вторичную структуру. Например, конформационный эпитоп может содержать нелинейные, т.е. непоследовательные аминокислоты антигена.
В конкретном варианте осуществления эпитоп представляет собой область антигена, которая связывается антителом или его антиген-связывающей частью. В определенных вариантах осуществления говорится, что антитело или его антиген-связывающая часть специфически связывает антиген, когда они предпочтительно распознают свой антиген-мишень в сложной смеси белков и/или макромолекул.
Подразумевается, что термин "антитело человека", используемый в данном документе, включает антитела с вариабельными и константными областями, происходящими от последовательностей иммуноглобулина зародышевого типа человека. Антитела человека по настоящему изобретению могут включать аминокислотные остатки, не закодированные в последовательностях иммуноглобулина зародышевого типа человека (например, мутации, введенные с помощью случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или с помощью соматического мутагенеза in vivo), например, в CDR и, в частности, CDR3. Однако не подразумевается, что термин "антитело человека", используемый в данном документе, включает антитела, в которых последовательности CDR, происходящие из последовательностей зародышевого типа другого вида млекопитающих, такого как мышь, были привиты на последовательности каркасных областей человека.
Подразумевается, что термин "рекомбинантное антитело человека", используемый в данном документе, включает все антитела человека, которые были получены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью средств рекомбинантной технологии, такие как антитела, экспрессируемые с применением вектора для рекомбинантной экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина (описано далее в разделе IIC, ниже), антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки антител человека (Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H., and Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V., and Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое является трансгенным по генам иммуноглобулина человека (см., например, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al. (2000) Immunology Today 21:364-370), или антитела, которые были получены, экспрессированы, созданы или выделены с помощью любых других средств, что подразумевает сплайсинг последовательностей генов иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные антитела человека имеют вариабельные и константные области, происходящие от последовательностей иммуноглобулина зародышевого типа человека. Однако в определенных вариантах осуществления такие рекомбинантные антитела человека подвергаются in vitro мутагенезу (или, при применении животного, трансгенного по последовательностям Ig человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности VH- и VL-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и происходят из последовательностей VH и VL зародышевого типа человека и родственны им, могут не существовать сами по себе в пределах репертуара антител зародышевого типа человека in vivo. В одном варианте осуществления предусмотрены полностью человеческие антитела, способные связывать CD40 человека, которые можно получать с применением методик, хорошо известных из уровня техники, таких как без ограничения применение фаговых библиотек Ig человека, таких как раскрытые в Jermutus et al., публикация согласно РСТ № WO 2005/007699 А2.
8
Используемый в данном документе термин "поверхностный плазмонный резонанс" обозначает оптическое явление, которое обеспечивает возможность анализа биоспецифических взаимодействий в режиме реального времени с помощью обнаружения изменений концентраций белка в пределах матрицы биосенсора, например, с применением системы BIAcore (Pharmacia Biosensor АВ, Уппсала, Швеция и Пискатавэй, Нью-Джерси). Более подробные описания см. в  U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26;  U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, В., et al. (1995) J. Mol. Recognit. :125-131; и Johnnson, В., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.
on
Подразумевается, что термин "k", используемый в данном документе, обозначает константу скорости ассоциации для объединения антитела с антигеном с образованием комплекса антител о/антиген, как известно из уровня техники.
off
Подразумевается, что термин "k", используемый в данном документе, обозначает константу скорости диссоциации для отделения антитела от комплекса антитело/антиген, как известно из уровня техники.
D
Подразумевается, что термин "K", используемый в данном документе, обозначает константу диссоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген, как известно из уровня техники.
3
14
35
90
99
111
125
131
177
166
153
Используемый в данном документе термин "меченое антитело" обозначает антитело с включенной меткой, которая обеспечивает идентификацию антитела или его антиген-связывающей части. Предпочтительно метка представляет собой детектируемый маркер, например, включение аминокислоты с радиоактивной меткой или прикрепление к полипептиду биотинилированных фрагментов, которые могут быть обнаружены с помощью меченого авидина (например, стрептавидина, содержащего флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которые можно обнаружить с помощью оптических или колориметрических способов). Примеры меток для полипептидов включают без ограничения следующие: радиоизотопы или радионуклиды (например, Н, C, S, Y, Тс, In, I, I, Lu, Ho или Sm); флуоресцентные метки (например, FITC, родамин, люминофоры на основе комплексов лантанидов), ферментативные метки (например, пероксидазу хрена, люциферазу, щелочную фосфатазу); хемилюминесцентные маркеры; биотинилированные группы; заранее установленные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, последовательности пары лейциновых застежек, связывающие сайты для вторичных антител, металл-связывающие домены, эпитопные метки); и магнитные средства, такие как хелаты гадолиния.
nd
Используемые в данном документе термины "кристалл" и "кристаллизованное" обозначают антитело или его антиген-связывающую часть, которые существуют в форме кристалла. Кристаллы представляют собой одну форму твердого состояния вещества, которая отличается от других форм, таких как аморфное твердое состояние или жидкокристаллическое состояние. Кристаллы составлены из правильных, повторяющихся, трехмерных группировок из атомов, ионов, молекул (например, белков, таких как антитела) или совокупностей молекул (например, комплексов антиген/антитело). Эти трехмерные группировки расположены согласно специфическим математическим зависимостям, которые хорошо известны в данной области техники. Основная единица или структурный элемент, который повторяется в кристалле, называется асимметричной единицей. Повторение асимметричной единицы в порядке, который подчиняется данной, строго определенной кристаллографической симметрии, обеспечивает "элементарную ячейку" кристалла. Повторение элементарной ячейки с помощью регулярных переносов во всех трех направлениях обеспечивает кристалл. См. Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2 ed., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999)."
Используемый в данном документе термин "полинуклеотид" обозначает полимерную форму из двух или более нуклеотидов, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов, либо модифицированной формы любого типа нуклеотида. Термин включает одно- и двухнитевые формы ДНК, но предпочтительно представляет собой двухнитевую ДНК.
Под используемым в данном документе термином "выделенный полинуклеотид" следует понимать полинуклеотид (например, геномный, на основе cDNA или синтетического происхождения или их некоторую комбинацию), который в силу своего происхождения как "выделенный полинуклеотид": не ассоциирован со всем или частью полинуклеотида, с которым "выделенный полинуклеотид" встречается в природе; функционально связан с полинуклеотидом, с которым он не связан в природе, или не существует в природе как часть более крупной последовательности.
Подразумевается, что термин "вектор", используемый в данном документе, обозначает молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она была связана. Одним типом вектора является "плазмида", которая обозначает кольцевую петлю из двухнитевой ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, где дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их ввели (например, бактериальные векторы с бактериальной точкой начала репликации и эписомные векторы млекопитающего). Другие векторы (например, неэписомные векторы млекопитающего) могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина, и вследствие этого реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, определенные векторы способны управлять экспрессией генов, с которыми они функционально связаны. Такие векторы обозначены в данном документе как "векторы для рекомбинантной экспрессии" (или просто, "векторы экспрессии"). Как правило, векторы экспрессии, используемые в методиках рекомбинантной ДНК, зачастую находятся в форме плазмид. В настоящей заявке "плазмида" и "вектор" могут использоваться взаимозаменяемо, поскольку плазмида является наиболее часто используемой формой вектора. Однако подразумевается, что в настоящее изобретение включены иные подобные формы векторов, такие как вирусные векторы (например, ретровирусы с дефектом по репликации, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
Термин "функционально связанный" обозначает смежное расположение, где описанные компоненты находятся во взаимосвязи, позволяющей им функционировать присущим им образом. Последовательность контроля, "функционально связанная" с кодирующей последовательностью, лигирована таким образом, что экспрессия кодирующей последовательность достигается в условиях, соответствующих последовательностям контроля. "Функционально связанные" последовательности включают как последовательности контроля экспрессии, которые являются смежными с представляющим интерес геном, так и последовательности контроля экспрессии, которые действуют в тиране-положении или на расстоянии с осуществлением контроля представляющего интерес гена. Используемый в данном документе термин "последовательность контроля экспрессии" обозначает полинуклеотидные последовательности, которые необходимы для осуществления экспрессии и процессинга кодирующих последовательностей, с которыми они лигированы. Последовательности контроля экспрессии включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации транскрипции, промоторные и энхансерные последовательности; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования; последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую mRNA; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Kozak); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, в случае необходимости, последовательности, которые усиливают секрецию белка. Природа таких последовательностей контроля отличается в зависимости от организма-хозяина; у прокариот такие последовательности контроля, как правило, включают промотор, сайт связывания рибосомы и последовательность терминации транскрипции; у эукариот, как правило, такие последовательности контроля включают промоторы и последовательность терминации транскрипции. Подразумевается, что термин "последовательности контроля" включает компоненты, присутствие которых необходимо для экспрессии и процессинга, а также может включать дополнительные компоненты, присутствие которых является благоприятным, например, лидерные последовательности и последовательности партнера слияния. Белковые конструкции по настоящему изобретению могут быть экспрессированы и очищены с применением векторов экспрессии и клеток-хозяев, известных из уровня техники, в том числе кассет экспрессии, векторов, рекомбинантных клеток-хозяев и способов рекомбинантной экспрессии и протеолитического процессинга рекомбинантных полипротеинов и белков-предшественников из единой открытой рамки считывания (например, WO 2007/014162, включенная в данный документ посредством ссылки).
"Трансформация", как определено в данном документе, обозначает любой процесс, с помощью которого экзогенная ДНК попадает в клетку-хозяина. Трансформация может происходить в естественных или искусственных условиях с применением различных способов, хорошо известных из уровня техники. Трансформация может базироваться на любом известном способе вставки чужеродных последовательностей нуклеиновой кислоты в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина. Способ выбирают исходя из того, какая клетка-хозяин подвергается трансформации, и он может включать без ограничений вирусную инфекцию, электропорацию, липофекцию и бомбардировку частицами. Такие "трансформированные" клетки включают стабильно трансформированные клетки, в которых вставленная ДНК способна реплицироваться либо в качестве автономно реплицирующейся плазмиды, либо в качестве части хромосомы хозяина. Они также включают клетки, которые временно экспрессируют вставленную ДНК или РНК в течение ограниченных периодов времени.
Подразумевается, что термин "рекомбинантная клетка-хозяин" (или просто "клетка-хозяин"), используемый в данном документе, обозначает клетку, в которую была введена экзогенная ДНК. Следует понимать, что такие термины подразумеваются для обозначения не только конкретной подвергнутой воздействию клетки, но и потомства такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут происходить определенные модификации, обусловленные либо мутациями, либо воздействиями окружающей среды, такое потомство, фактически, может не быть идентичным исходной клетке, но оно все-таки включается в объем термина "клетка-хозяин", используемого в данном документе. Предпочтительно клетки-хозяева включают прокариотические и эукариотические клетки, выбранные из любого из царств живой природы. Предпочтительные эукариотические клетки включают клетки простейших, грибов, растений и животных. Наиболее предпочтительно клетки-хозяева включают без ограничений линию прокариотических клеток Е. coli; линии клеток млекопитающего СНО, HEK 293 и COS; линию клеток насекомого Sf9 и клетки гриба Saccharomyces cerevisiae.
nd
Стандартные методики могут применяться для работы с рекомбинантной ДНК, синтеза олигонуклеотидов, а также культуры тканей и трансформации (например, электропорация, липофекция). Ферментативные реакции и методики очистки можно осуществлять в соответствии с инструкциями производителя, или как обычно осуществляется в данной области техники, или как описано в настоящем документе. Вышеуказанные методики и процедуры можно в целом осуществлять в соответствии с традиционными способами, хорошо известными из уровня техники, и как описано в различных общих и более специальных библиографических ссылках, которые процитированы и обсуждаются по всему настоящему описанию. См., например, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2 ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), который включен в данный документ посредством ссылки для любых целей.
"Трансгенный организм", как известно из уровня техники и используется в данном документе, обозначает организм, имеющий клетки, которые содержат трансген, при этом трансген, введенный в организм (или в предка организма), экспрессирует полипептид, не экспрессируемый в организме естественным образом. "Трансген" представляет собой конструкцию ДНК, которая стабильно и функционально интегрирована в геном клетки, из которой развивается трансгенный организм, при этом управляет экспрессией закодированного продукта гена в одном или нескольких типах клеток или тканей трансгенного организма.
Термины "регулировать" и "модулировать" используются взаимозаменяемо и используются в данном документе для обозначения изменения или альтерации активности представляющей интерес молекулы (например, биологической активности hCD40). Модуляция может представлять собой повышение или снижение силы определенной активности или функции представляющей интерес молекулы. Иллюстративные виды активности и функций молекулы включают без ограничений характеристики связывания, ферментативную активность, активацию клеточных рецепторов и сигнальную трансдукцию.
Соответственно, используемый в данном документе термин "модулятор" представляет собой соединение, которое способно к изменению или альтерации активности или функции представляющей интерес молекулы (например, биологической активности hCD40). Например, модулятор может повышать или снижать силу определенной активности или функции молекулы по сравнению с силой активности или функции, наблюдаемой в отсутствие модулятора. В определенных вариантах осуществления модулятор представляет собой ингибитор, который снижает силу по меньшей мере одной активности или функции молекулы. Иллюстративные ингибиторы включают без ограничений белки, пептиды, антитела, пептидные антитела, углеводы или малые органические молекулы. Пептидные антитела описаны, например, в WO 01/83525.
Используемый в данном документе термин "эффективное количество" обозначает количество терапевтического средства, которое является достаточным для снижения или облегчения тяжести и/или периода протекания нарушения или одного или нескольких его симптомов, предупреждения прогрессирования нарушения, обеспечения обратного развития нарушения, предупреждения рецидива, развития, проявления или прогрессирования одного или нескольких симптомов, ассоциированных с нарушением, обнаружения нарушения или усиления или улучшения профилактического(-их) или терапевтического(-их) эффекта(-ов) другой терапии (например, профилактического или терапевтического средства).
Используемый в данном документе термин "пациент с отсутствием клинического ответа" применяют для обозначения субъекта с IBD (например, болезнью Крона или язвенным колитом), у которого отсутствовало улучшение или наблюдалось ограниченное или недостаточное улучшение статуса его клинического заболевания после лечения с помощью ингибитора TNFα (например, отсутствие снижения балла CDAI, отсутствие снижения в применении кортикостероидов). В одном варианте осуществления пациент с отсутствием клинического ответа при терапии, направленной на TNF, представляет собой субъекта с IBD, у которого не достигается снижение присущего ему балла индекса активности болезни Крона (CDAI) на 100 пунктов или более после лечения с помощью ингибитора TNFα. В одном варианте осуществления пациент с отсутствием клинического ответа при терапии представляет собой субъекта с IBD, у которого не достигается снижение присущего ему балла индекса активности болезни Крона (CDAI) на 100 пунктов или более в течение конкретного интервала времени после лечения с помощью ингибитора TNFα.
I. Антитела, которые связывают CD40 человека (hCD40)
В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрены гуманизированные антитела-антагонисты или их антиген-связывающие части, которые связывают CD40, включая CD40 человека (hCD40). Другие варианты осуществления настоящего изобретения включают мышиные моноклональные антитела или их антиген-связывающие части, которые связываются с CD40, а также химерные антитела, содержащие вариабельные области мышиных антител к CD40, описанных в данном документе. Предпочтительно антитела по настоящему изобретению представляют собой антитела-антагонисты к CD40 (например, к CD40 человека), не проявляющие значительную агонистическую активность.
1. Гуманизированные антитела-антагонисты к hCD40, происходящие из антитела 1 (Ab1)
Настоящее изобретение по меньшей мере частично основано на идентификации гуманизированных антител к CD40, обладающих антагонистическими характеристиками, а в определенных вариантах осуществления не проявляющих значительной агонистической активности.
Как описано в примере 1, были идентифицированы три мышиных антитела-антагониста к hCD40, т.е. Ab1 (последовательность VL-области описана под SEQ ID NO: 9, а последовательность VH-области описана под SEQ ID NO: 5), Ab2 (последовательность VL-области описана под SEQ ID NO: 76, а последовательность VH-области описана под SEQ ID NO: 75) и Ab3 (последовательность VL-области описана под SEQ ID NO: 48, а последовательность VH-области описана под SEQ ID NO: 44).
Консенсусные последовательности CDR определяли на основании выравниваний аминокислотных последовательностей CDR мышиных антител-антагонистов, Аb1, Аb2 и Ab3. Консенсусные аминокислотные последовательности для CDR1, CDR2 и CDR3 VH-областей описаны под SEQ ID NO 78, 79 и 80 соответственно, а консенсусные аминокислотные последовательности для аминокислотных последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 VL-областей описаны под SEQ ID NO 108, 109 и 110 соответственно. Все последовательности также описаны ниже в таблице 5 и на фигуре 4.
Консенсусная аминокислотная последовательность CDR1-домена тяжелой цепи изложена под SEQ ID NO: 78 (G(F/Y)TF(S/T)(D/S)Y(G/T)M(N/H)). Консенсусная аминокислотная последовательность СDR2-домена вариабельной области тяжелой цепи изложена под SEQ ID NO: 79 (YI(S/N)(S/P)(G/S)(R/S) (D/S/G)(N/Y)(I/P) (Y/N)Y(A/N)(D/Q)(T/K) (V/F)K(G/D)). Консенсусная аминокислотная последовательность CDR3-домена вариабельной области тяжелой цепи изложена под SEQ ID NO: 80 ((S/W)(W/G)(G/Y)(Y/S)FDV).
Консенсусная аминокислотная последовательность CDR1-домена вариабельной области легкой цепи изложена под SEQ ID NO: 108 ((K/R)SS(Q/K)SLL(N/H)S(G/-)N(Q/G) (K/N)(N/T)YL(T/Y)). Консенсусная аминокислотная последовательность CDR2-домена вариабельной области легкой цепи изложена под SEQ ID NO: 109 ((W/R)(A/M) ST (R/L) (E/A)S). Консенсусная аминокислотная последовательность CDR3-домена вариабельной области легкой цепи изложена под SEQ ID NO: 110 ((Q/M)(N/Q) (D/H)(Y/L)(T/E)YPLT).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть, содержащие вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 108, CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 109, CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 110, и содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 78, CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 79, CDR3 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 80.
После идентификации мышиных антител, Ab1, Ab2 и Ab3, антитела Ab1 и Ab3 были выбраны для гуманизации (описана ниже в примере 2). В таблицах 11 и 12 представлены аминокислотные последовательности CDR, VH- и VL-областей гуманизированных Ab1 и Ab3 соответственно. В частности, было создано девять различных гуманизированных антител на основе Ab3 (см. пример 2 и таблицу 12 ниже). Также было создано четыре различных гуманизированных антитела на основе Ab1, в том числе следующие:
A) huAb1 VH.1/VL.1 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 13, и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 6, 7 и 8 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 14, и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно);
B) huAb1VH.1A/VL.1 (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 15, и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 6, 7 и 8 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 14, и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно);
C) huAb1VH.1/VL.1A (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 13, и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 6, 7 и 8 соответственно; и аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 16, и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно); и
D) huAb1VH.1A/VL.1А (аминокислотная последовательность VH-области изложена под SEQ ID NO: 15, и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VH-области изложены под SEQ ID NO: 6, 7 и 8 соответственно; аминокислотная последовательность VL-области изложена под SEQ ID NO: 16, и последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 VL-области изложены под SEQ ID NO: 10, 11 и 12 соответственно).
Гуманизированные версии Ab1 модифицировали дополнительно, чтобы удалить потенциальный сайт дезамидирования в CDR1 легкой цепи. Анализировали шесть вариантов антител huAb1, и четыре из этих антител были идентифицированы как антагонисты CD40. Шесть антител обозначены в данном документе как Ab1v1, Ab1v2, Ab1v3, Ab1v4, Ab1v5 и Ab1v6 (последовательности CDR и вариабельных областей представлены в таблице 13 ниже). Из шести гуманизированных вариантов Ab1 huAb1v1 было отобрано как характеризующееся особенно превосходной антагонистической активностью. Последовательность вариабельной области тяжелой цепи huAb1v1 представлена под SEQ ID NO: 15, при этом последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 описаны под SEQ ID NO: 6, 7 и 8 соответственно. Последовательность вариабельной области легкой цепи huAb1v1 представлена под SEQ ID NO: 20, при этом последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 описаны под SEQ ID NO: 21, 11 и 12 соответственно.
CDR2 тяжелой цепи антитела huAb1v1 подвергали дополнительному мутагенезу, что привело к получению семнадцати вариантов (описаны ниже в примере 4). Эти варианты CDR2 тяжелой цепи huAb1v1 обозначены в данном документе как huAb1v1CDR2v1 - huAb1v1CDR2v17. Последовательности тяжелых цепей huAb1v1CDR2v1 - huAb1v1CDR2v17 представлены в таблице 16, из которых VH huAb1v1CDR2v7 был выбран как клон, характеризующийся особенно превосходной антагонистической активностью в отношении CD40, при этом оставаясь практически не проявляющим агонистическую активность. Последовательность вариабельной области тяжелой цепи huAb1v1CDR2v7 представлена под SEQ ID NO: 28, при этом последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 описаны под SEQ ID NO: 6, 42 и 8 соответственно.
После отбора VH-области huAb1v1CDR2v7 (VH-область под SEQ ID NO: 28, при этом последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 описаны под SEQ ID NO: 6, 42 и 8 соответственно) и VL-области huAb1v1 (VL-область под SEQ ID NO: 20, при этом последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 описаны под SEQ ID NO: 21, 11 и 12 соответственно) вариабельные области клонировали в две различные IgG-основы, что привело к получению двух антител-антагонистов к CD40, т.е. Ab101 и Ab102. В таблице 6 (и таблице 19) представлены последовательности полноразмерных тяжелой цепи и легкой цепи для конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, относящихся к этим IgG-антителам. В таблице 6 константные области подчеркнуты, а CDR-домены выделены жирным шрифтом.
Соответственно, в одном варианте осуществления настоящее изобретение направлено на антитело-антагонист к CD40, содержащее легкую цепь с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 40, и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: NO: 39 (Ab101). В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение направлено на антитело-антагонист к CD40, содержащее легкую цепь с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 40, и тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: NO: 41 (Ab102).
Таким образом, настоящее изобретение включает мышиные, химерные и гуманизированные антитела к CD40, обладающие антагонистической активностью. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть, включающие вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12 и/или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8. В конкретном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть включают CDR1 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 6, CDR2 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 42, CDR3 тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8, CDR1 легкой цепи с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 21, CDR2 легкой цепи с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11, и CDR3 легкой цепи с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12. В конкретном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть включают вариабельный домен тяжелой цепи с аминокислотной последовательностью, изложенный под SEQ ID NO: 28, и вариабельный домен легкой цепи с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 20. В одном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть включают тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 41; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 40. В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть включают тяжелую цепь с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 39; и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 40.
Антитела с аминокислотными последовательностями (вариабельной области или CDR), описанные в таблицах 5, 6, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18 и 19, включены в настоящее изобретение. Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающую часть, имеющие вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10, 17, 19 или 21; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12. В качестве альтернативы или в сочетании, антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть включают вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7 или 42; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8.
В конкретном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть имеют вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть имеют вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 19; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть имеют вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 17; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть имеют вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 21; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть имеют вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 21; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 42; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть имеют вариабельную область легкой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 108; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 109; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 110; и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 78; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 79; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 80.
В еще одном аспекте настоящего изобретения антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 5, 13, 15 или 22-38; и/или вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 9, 14, 16, 18, 20 или 43.
В конкретном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть включают вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 5, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 9.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть включают вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 13, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 14, 16 или 18.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть включают вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20 или 43.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть включают вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 28, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 20.
Антитела, описанные в данном документе, в частности антитело Ab102, проявляют антагонистическую активность без значительной агонистической активности в отношении CD40. Таким образом, в настоящее изобретение включены антитела, которые связываются с эпитопом, распознаваемым антителами Ab102 и Ab101. В конкретном варианте осуществления настоящее изобретение включает выделенное антитело или его антиген-связывающую часть, где указанное антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывают CD40 человека, таким образом, после связывания указанным антителом или его антиген-связывающим фрагментом эпитопа, определяемого топографическими областями Cys62-Phe67, Gln79-Cys83, Arg90-Thr99 и Thr24-Cys37 из SEQ ID NO: 1, подавляется связывание CD40 с лигандом CD40 (CD40L). В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антителу или его антиген-связывающему фрагменту, способным связывать CD40 человека, причем они связываются с эпитопом на CD40 человека, содержащем три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять, одиннадцать, двенадцать, тринадцать, четырнадцать, пятнадцать, шестнадцать, семнадцать, восемнадцать, девятнадцать, двадцать, двадцать один, двадцать два, двадцать три, двадцать четыре, двадцать пять, двадцать шесть, двадцать семь, двадцать восемь, двадцать девять, тридцать, тридцать один, тридцать два, тридцать три, тридцать четыре или все аминокислотные остатки Cys62-Phe67 (Cys62, Gly63, Glu64, Ser65, Glu66, Phe67), Gln79-Cys83 (Gln79, His 80, Lys81, Tyr82, Cys83), Arg90-Thr99 (Arg90, Val91, Gln92, Gln93, Lys94, Gly95, Thr96, Ser97, Glu98 и Thr99) и Thr24-Cys37 (Thr24, Ala25, Cys26, Arg27, Glu28, Lys29, Gln30, Tyr31, Leu32, Ile33, Asn34, Ser35, Gln36, Cys37) из SEQ ID NO: 1.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена CDR2-область тяжелой цепи с антагонистической активностью в отношении CD40. В частности, остаток 55 (остаток X) из аминокислотной последовательности CDR2 VH-области, YISSGRXNIYYADTVKG (SEQ ID NO: 112), был идентифицирован как играющий важную роль в усилении антагонистической активности антитела относительно исходной последовательности CDR2 с остатком S55. Остатки Thr, Asp, Val, Leu, Ile и Met в положении 55 CDR2 НС приводят к более низким уровням антагонистической активности в сравнении с другими аминокислотами в положении 55. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, содержащую CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 111, и вариабельную область легкой цепи, содержащую CDR2 с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 11. Аминокислотные последовательности CDR1- и CDR3-доменов, которые могут быть объединены с SEQ ID NO: 111 в рамках вариабельной области тяжелой и легкой цепей антитела, описаны по всему данному документу, в том числе, например, в таблицах 13 и 18.
В дополнительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена CDR1-область легкой цепи с остатком, идентифицированным как переключатель антагонистической/агонистической активности. Как описано ниже в примере 3, модификация мотива "NS" CDR1 VL-области, KSSQSLLNSGNQKNYLT (SEQ ID NO: 10), в остатке "S" может приводить к преобразованию антитела-антагониста в антитело-агонист. Таким образом, в одном варианте осуществления настоящее изобретение включает антитело-антагонист к CD40 с CDR1 VL-области, содержащей SEQ ID NO: 113 (KSSQSLLNXGNQKNYLT; где X не представляет собой аминокислотный остаток Pro).
Термин "конкурирующие антитела" в данном документе обозначает любое число антител, нацеливающихся на один и тот же молекулярный или стабильный, но не связанный ковалентными связями надмолекулярный объект, предпочтительно на одну и ту же молекулу, т.е. CD40, при этом по меньшей мере одно из антител способно специфически снижать измеряемое связывание другого антитела, предпочтительно путем стерического затруднения доступа другого антитела к своему целевому эпитопу (описано выше) или путем индуцирования и/или стабилизации конформации целевого объекта, что снижает аффинность целевого объекта в отношении другого антитела, более предпочтительно путем непосредственного блокирования доступа к эпитопу-мишени другого антитела путем связывания с эпитопом, расположенным в непосредственной близости от первого, перекрывающимся с первым или идентичным первому, наиболее предпочтительно перекрывающимся или идентичным, в частности идентичным. В данном документе говорится, что два эпитопа являются "перекрывающимися", если часть их химических структур, предпочтительно их аминокислотных последовательностей, является общей, и являются "идентичными", если их химические структуры, предпочтительно их аминокислотные последовательности, идентичны.
В конкретных вариантах осуществления конкурирующее антитело или его антиген-связывающая часть представляют собой антитело или его антиген-связывающую часть, которые конкурируют с любым из антител, представленных в данном документе. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено конкурирующее антитело, которое может конкурировать с антителами, описанными в данном документе (например, Ab101 или Ab102), и связывается с топографическим эпитопом CD40 человека, включающим остатки Cys62-Phe67, Gln79-Cys83, Arg90-Thr99 и Thr24-Cys37.
В конкретных вариантах осуществления антитело-агонист содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8; и вариабельную область легкой цепи, включающую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 74; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12.
В других конкретных вариантах осуществления антитело-агонист содержит вариабельную область тяжелой цепи, включающую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8; и вариабельную область легкой цепи, включающую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 17; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12.
В дополнительных вариантах осуществления антитело-агонист к CD40 или его антиген-связывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 15 или 13; и/или вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 77 или 43.
2. Гуманизированные антитела к CD40, происходящие из антитела 3 (Ab3)
Аминокислотные последовательности для гуманизированных версий тяжелой и легкой цепей мышиного Ab3 представлены в таблице 11 ниже. Таким образом, в настоящем изобретении дополнительно представлены антитела, содержащие последовательности вариабельной области и/или CDR из антитела 3 (Ab3).
В одном аспекте настоящего изобретения предусмотрено гуманизированное антитело или его антиген-связывающая часть, включающие вариабельную область легкой цепи, включающую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 49; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 50; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 51; и вариабельную область тяжелой цепи, включающую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 45; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 46; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 47.
Соответственно, в одном аспекте настоящее изобретение направлено на антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающую часть, имеющие вариабельную область легкой цепи, включающую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 49; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 50; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 51. В качестве альтернативы или в сочетании, антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть включают вариабельную область тяжелой цепи, включающую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 45; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 46; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 47.
В еще одном аспекте настоящего изобретения антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 44, 52, 54 или 55; и/или вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 48, 53, 56 или 57.
В конкретном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть включают вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 44, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 48.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть включают вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 52, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 53, 56 или 57.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть включают вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 54, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 53, 56 или 57.
В другом варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть включают вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 55, и вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 53, 56 или 57.
3. Химерные антитела к CD40
Химерное антитело представляет собой молекулу, в которой разные части антитела происходят от разных видов животных, например, антитела с вариабельной областью, происходящей из мышиного моноклонального антитела, и константной областью иммуноглобулина человека. Способы получения химерных антител известны из уровня техники. См., например, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; патенты США №№5807715; 4816567 и 4816397, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В дополнение, можно применять методики, разработанные для получения "химерных антител" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Set 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте), заключающиеся в сплайсинге генов молекулы антитела мыши с соответствующей антигенной специфичностью с генами молекулы антитела человека с соответствующей биологической активностью.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающую часть, имеющие вариабельную область легкой цепи, включающую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область тяжелой цепи, включающую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 42; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8. В конкретном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть имеют вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 76, и вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 75.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающую часть, имеющие вариабельную область легкой цепи, включающую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 49; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 50; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 51; и вариабельную область тяжелой цепи, включающую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 45; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 46; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 47. В конкретном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть имеют вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 48, и вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 44.
В другом аспекте настоящее изобретение направлено на антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающую часть, имеющие вариабельную область легкой цепи, включающую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 11; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 12; и вариабельную область тяжелой цепи, включающую (a) CDR1 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 7; и (с) CDR3 с аминокислотной последовательностью, изложенной под SEQ ID NO: 8. В конкретном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть имеют вариабельную область легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 9, и вариабельную область тяжелой цепи, включающую аминокислотную последовательность, изложенную под SEQ ID NO: 5.
Вышеизложенные последовательности CDR выделенного антитела к CD40 создают новое семейство антител к CD40 или их антиген-связывающих частей, выделяемых в соответствии с настоящим изобретением и включающих антитела, которые содержат последовательности CDR, перечисленные в таблицах 5, 11-13 и 15-18. Для получения и отбора CDR по настоящему изобретению, характеризующихся предпочтительным связыванием CD40 и/или нейтрализующей активностью в отношении hCD40, можно применять стандартные способы, известные из уровня техники, служащие для получения антител по настоящему изобретению и оценки характеристик связывания и/или нейтрализации CD40 у этих антител, в том числе без ограничения, специально описанные в данном документе.
4. Определение характеристик антител по настоящему изобретению
Антитела к CD40 по настоящему изобретению представляют собой антитела-антагонисты, и они могут обладать высокой производительностью в снижении или нейтрализации активности CD40, например, как оценивается с помощью любого из ряда in vitro и in vivo анализов, известных из уровня техники и описываемых в данном документе. В определенных вариантах осуществления антитела к CD40 по настоящему изобретению являются антагонистами и практически не проявляют агонистическую активность. Антагонистическую и агонистическую активность можно определять с помощью анализов, известных из уровня техники, включая анализы, описанные в данном документе. Например, связывание с CD40 человека и подавление взаимодействия CD40-CD40L можно проанализировать с применением линии клеток, экспрессирующих CD40 человека, посредством FACS-анализов.
В одном варианте осуществления антагонистическую или агонистическую активность в отношении CD40 у антитела к CD40 определяют с применением линии клеток с геном-репортером. Например, антагонистическую и агонистическую активность можно оценивать с применением CD40-экспрессирующей линии клеток с геном-репортером, экспрессирующей CD40 человека, связанный с NFkB-активируемой щелочной фосфатазой (АР). Если сигнал получен благодаря CD40, активация NFkB приводит к секреции АР, которую измеряют с помощью колориметрического субстрата. В качестве иллюстративного анализа на антагонистическую активность линию клеток с геном-репортером для обнаружения CD40 можно культивировать либо с линией клеток Jurkat, экспрессирующих CD40L (для обеспечения физиологического взаимодействия с лигандом), либо с растворимым CD40L, при этом можно оценивать способность антитела к CD40 блокировать сигнал с участием NFkB (от малых количеств до отсутствия АР, как определено с помощью стандартных способов). В качестве иллюстративного анализа на агонистическую активность линию клеток с геном-репортером для обнаружения CD40 человека можно обрабатывать с помощью антител к CD40 и измерять сигнал с участием NFkB (наблюдаемый как присутствие уровня АР выше отрицательного контроля), как описано выше. Примером линии клеток с геном-репортером для обнаружения CD40 являются клетки HEK-Blue™ CD40L (InvivoGen), которые используют для измерения биологической активности CD40L благодаря секреции эмбриональной щелочной фосфатазы (SEAP) при активации NF-κВ после стимуляции CD40. Взаимодействие CD40L-CD40 можно отслеживать путем оценки уровней SEAP с применением QUANTI-Blue (InvivoGen).
50
50
50
50
В одном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающий фрагмент по настоящему изобретению характеризуются IC, составляющей 0,4 нМ или меньше, как определено с помощью анализа на антагонистическую активность с геном-репортером для обнаружения растворимого CD40L. В одном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающий фрагмент по настоящему изобретению характеризуется IC, составляющей 51 нМ или меньше, как определено с помощью анализа на антагонистическую активность с геном-репортером для обнаружения CD40 на клетках линии Jurkat. В одном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающий фрагмент по настоящему изобретению характеризуются IC, составляющей 3,4 нМ или меньше, как определено с помощью анализа на антагонистическую активность с геном-репортером для обнаружения CD40 на клетках линии Jurkat. В одном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающий фрагмент по настоящему изобретению характеризуются IC, составляющей 0,9 нМ или меньше, как определено с помощью анализа на антагонистическую активность с геном-репортером для обнаружения CD40 на клетках линии Jurkat.
В одном варианте осуществления антагонистическую или агонистическую активность в отношении CD40 у антитела к CD40 определяют с применением анализа на агонистическую активность с применением В-клеток. Например, можно использовать анализ на агонистическую активность с применением В-клеток, при котором В-клетки активируют с помощью низкой дозы антитела к IgM и IL4 перед добавлением антитела-антагониста к CD40. Усиление активации В-клеток можно измерять как повышение уровня CD86, что, в свою очередь, указывает на агонистическую активность. Аналогично можно использовать анализ на антагонистическую активность с применением В-клеток, в котором первичные В-клетки человека культивируют с CD40L-экспрессирующей линией Т-клеток человека, что приводит к активации В-клеток и повышению уровня экспрессии CD86 вследствие взаимодействия CD40/CD40L. Подавление повышения уровня CD86 в первичных В-клетках человека указывает на агонистическую активность.
В одном варианте осуществления антагонистическую или агонистическую активность в отношении CD40 у антитела к CD40 определяют с применением анализа на основании антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC). Антагонистическую и агонистическую активность можно оценивать по способности антитела опосредовать ADCC. Антитело-антагонист к CD40 будет эффективно опосредовать ADCC, тогда как антитело-агонист не будет приводить к ADCC-активности. Антителозависимой клеточной цитотоксичностью (ADCC) обозначают тип цитотоксичности, индуцируемый активацией макрофагов, NK-клеток, нейтрофилов и т.д., который распознает клетки-мишени путем связывания с константной областью антитела через Fc-рецепторы, экспрессированные на их поверхности. Комплементзависимой цитотоксичностью (CDC) обозначают тип цитотоксичности, индуцируемый активацией системы комплемента, который происходит благодаря связыванию антитела с антигеном. Снижение активности ADCC и CDC обозначает снижение такой активности в сравнении, например, с контрольным антителом-антагонистом к CD40, таким как моноклональное антитело, вырабатываемое гибридомой 4D11 (№ доступа FERM ВР-7758). В ЕР 1707627 В1, включенном в данный документ посредством ссылки в своем полном объеме, описаны анализы для определения активности ADCC и CDC.
Кроме того, для анализа агонистической активности можно применять оценку биологической активности дендритных клеток (DC), простимулированных с помощью иммобилизированного Ab к CD40. Считается, что DC представляют собой наиболее сильные антиген-презентирующие клетки, способные забирать Ag из нелимфоидных тканей и переносить их во вторичные лимфоидные органы для примирования Т-клеток в ответ на стимулы созревания, такие как сигналы опасности и хелперные сигналы. Напротив, презентация Ag с помощью DC без активации приводит к элиминации эффекторных Т-клеток, которые имеют когнатный TCR, или индукции регуляторных Т-клеток во вторичных лимфоидных тканях. Таким образом, присутствие или отсутствие сигналов созревания для незрелых DC в периферических тканях действует как переключатель для индукции либо адаптивного иммунного ответа, либо толерантности. Главный хелперный сигнал от CD4+ Т-клеток для созревания DC обеспечивается при взаимодействии между CD40, экспрессированным на DC, и лигандом CD40 (L) на активированных CD4+ Т-клетках. Таким образом, стимуляция CD40 индуцирует миграцию DC во вторичные лимфоидные ткани путем повышающей регуляции экспрессии CCR7. В Watanabe et al., 2003, J Immunol; 171:5828-5836 описаны анализы, которые можно применять для определения того, могут ли антитела к CD40 активировать DC, чтобы определить их агонистическую и антагонистическую активность. Такие иллюстративные анализы предусматривают определение экспрессии Ag МНС I/II класса и костимулирующих молекул на BM-DC, простимулированных с помощью иммобилизированного Ab к CD40, активности in vivo миграции BM-DC, простимулированных с помощью иммобилизированных Ab к CD40, активности in vitro миграции и экспрессии CCR7 в BM-DC, простимулированных с помощью иммобилизированного Ab к CD40.
В одном варианте осуществления агонистическую активность антитела к CD40 или его антиген-связывающей части определяют с помощью in vitro анализа активации моноцитов, такого как анализ, описанный ниже в примере 7. In vitro анализ активации моноцитов предусматривает воздействие на моноциты антитела к CD40 или его антиген-связывающей части, при этом если антитело или его антиген-связывающая часть являются активаторами CD40 (агонистами), тогда происходит повышение выработки TNF. При применении in vitro анализа активации моноцитов антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть, которые практически не проявляют агонистическую активность, будут приводить к отсутствию или минимальной выработке TNF, как описано в примере 7.
В одном варианте осуществления антитело-антагонист к CD40 или его антиген-связывающая часть, которые практически не проявляют агонистическую активность, характеризуются активностью, которая находится в пределах одного стандартного отклонения от отрицательного контроля в in vitro анализе на агонистическую активность в отношении CD40, например, анализе на агонистическую активность с применением моноцитов, описанном в примере 7.
Анализы на агонистическую активность дополнительно описаны в US 5786456, US 2011/0243932 и ЕР 1707627 В1, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в своем полном объеме. Анализы на антагонистическую активность для тестирования функции антитела дополнительно описаны в US 7361345, US 2011/0243932 и ЕР 1707627 В1, каждый их которых включен в данный документ посредством ссылки.
off
50
off
50
off
50
off
50
off
50
off
50
-1
-6
-2
-1
-7
-3
-1
-8
-4
-1
-9
-5
-1
-10
-5
-1
-11
В предпочтительных вариантах осуществления выделенное антитело или его антиген-связывающая часть связывают CD40 человека, при этом антитело или его антиген-связывающая часть диссоциируют от CD40 человека с константой скорости k, составляющей приблизительно 0,1 с или меньше, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, или они подавляют активность CD40 человека с IC, составляющей приблизительно 1×10 М или меньше. В качестве альтернативы, антитело или его антиген-связывающая часть могут диссоциировать от CD40 человека с константой скорости k, составляющей приблизительно 1×10 с или меньше, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, или могут подавлять активность CD40 человека с IC, составляющей приблизительно 1×10 М или меньше. В качестве альтернативы, антитело или его антиген-связывающая часть могут диссоциировать от CD40 человека с константой скорости k, составляющей приблизительно 1×10 с или меньше, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, или могут подавлять CD40 человека с IC, составляющей приблизительно 1×10 М или меньше. В качестве альтернативы, антитело или его антиген-связывающая часть могут диссоциировать от CD40 человека с константой скорости k, составляющей приблизительно 1×10 с или меньше, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, или могут подавлять активность CD40 с IC, составляющей приблизительно 1×10 М или меньше. В качестве альтернативы, антитело или его антиген-связывающая часть могут диссоциировать от CD40 человека с константой скорости k, составляющей приблизительно 1×10 с или меньше, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, или могут подавлять CD40 с IC, составляющей приблизительно 1×10 М или меньше. В качестве альтернативы, антитело или его антиген-связывающая часть могут диссоциировать от CD40 человека с константой скорости k, составляющей приблизительно 1×10 с или меньше, как определено с помощью поверхностного плазмонного резонанса, или могут подавлять активность CD40 с IC, составляющей приблизительно 1×10 М или меньше.
Антитела гуманизировали, как описано в примерах ниже. Обратные мутации каркасной области вводили в последовательностях CDR-привитого антитела с помощью de novo синтеза вариабельного домена или с помощью мутагенных олигонуклеотидных праймеров и полимеразной цепной реакции, или с помощью обоих способов, обеспечивая получение различных комбинаций обратных мутаций и других мутаций в каждом из CDR-графтов. Гуманизированные вариабельные области мышиных моноклональных антител к CD40 клонировали в векторы экспрессии IgG для определения функциональных характеристик.
В определенных вариантах осуществления антитело содержит константную область тяжелой цепи, такую как константная область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD. Предпочтительно константная область тяжелой цепи представляет собой константную область тяжелой цепи IgG1 или константную область тяжелой цепи IgG4. Кроме того, антитело может содержать константную область легкой цепи, либо константную область легкой каппа-цепи, либо константную область легкой лямбда-цепи. Предпочтительно антитело содержит константную область легкой каппа-цепи. В качестве альтернативы, часть антитела может представлять собой, например, Fab-фрагмент или одноцепочечный Fv-фрагмент.
5. Создание гуманизированных антител к CD40
Как описано выше, гуманизированные антитела представляют собой молекулы антитела, полученные с применением антитела от вида, отличного от человека, которое связывает необходимый антиген, и они имеют одну или несколько областей, определяющих комплементарность (CDR), из антитела от вида, отличного от человека, и каркасные области из молекулы иммуноглобулина человека. Известные последовательности Ig человека раскрыты, например, в www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html-; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html;
baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem-inar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/;
www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/frroducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983), каждый включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме. Такие импортированные последовательности можно применять для снижения иммуногенности или снижения, усиления или модифицирования связывания, аффинности, скорости ассоциации, скорости диссоциации, авидности, специфичности, времени полужизни или любых других соответствующих характеристик, известных из уровня техники.
Остатки каркасной области в каркасных областях человека могут быть заменены на соответствующий остаток из CDR-донорного антитела для изменения, предпочтительно усиления, связывания антигена. Эти замены в каркасной области идентифицируют с помощью способов, хорошо известных из уровня техники, например, с помощью моделирования взаимодействия CDR и остатков каркасной области, чтобы идентифицировать остатки каркасной области, важные для связывания антигена, и путем сравнения последовательностей, чтобы идентифицировать необычные остатки каркасной области в конкретных положениях. (См., например, Queen et al., патент США №5585089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), которые включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Общедоступными являются трехмерные модели иммуноглобулинов, и они хорошо известны специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, которые иллюстрируют и отображают возможные структуры трехмерной конформации выбранных последовательностей кандидатных иммуноглобулинов. Просмотр этих отображений обеспечивает анализ вероятной роли остатков в функционировании последовательности кандидатного иммуноглобулина, т.е. анализ остатков, которые воздействуют на способность кандидатного иммуноглобулина связывать его антиген. Таким образом, FR-остатки можно отбирать из консенсусной и импортированной последовательностей и комбинировать, чтобы достигнуть необходимой характеристики антитела, такой как повышенная аффинность в отношении антигена(-ов)-мишени(-ей). Как правило, CDR-остатки непосредственно и наиболее существенно вовлечены в воздействие на связывание антигена. Антитела можно гуманизировать с применением целого ряда методик, известных из уровня техники, таких как без ограничения описанные в Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); Presta al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska, et al., PNAS 91:969-973 (1994); публикация согласно PCT WO 91/09967, PCT/: US 98/16280, US 96/18978, US 91/09630, US 91/05939, US 94/01234, GB 89/01334, GB 91/01134, GB 92/01755; WO 90/14443, WO 90/14424, WO 90/14430, ЕР 229246, ЕР 592106; ЕР 519596, ЕР 239400, патенты США №№5565332, 5723323, 5976862, 5824514, 5817483, 5814476, 5763192, 5723323, 5766886, 5714352, 6204023, 6180370, 5693762, 5530101, 5585089, 5225539; 4816567, каждый включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме, в том числе библиографические ссылки, процитированные в них.
Примеры гуманизированных антител к CD40 представлены в разделах 1 и 2 выше и в примерах ниже.
II. Выработка антител и линии антителообразующих клеток
Антитела по настоящему изобретению можно получить с помощью любой из ряда методик, известных из уровня техники.
1. Получение моноклональных антител к CD40 с применением гибридомной технологии
nd
Моноклональные антитела можно получать с применением широкого спектра методик, известных из уровня техники, включая применения гибридомной технологии, рекомбинантной технологии и технологии фагового дисплея или их комбинации. Например, моноклональные антитела можно получать с помощью методик с применением гибридомы, в том числе известных из уровня техники и изложенных, например, в Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ed. 1988); Hammerling, et al., в: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981) (указанные библиографические ссылки включены посредством ссылки во всей своей полноте). Используемый в данном документе термин "моноклональное антитело" не ограничивается антителами, полученными благодаря гибридомной технологии. Термин "моноклональное антитело" обозначает антитело, которое происходит от одного клона, в том числе клона эукариотических клеток, прокариотических клеток или фагов, а не обозначает способ, с помощью которого его получают.
Способы получения и скрининга в отношении специфических антител с применением гибридомной технологии являются стандартными и хорошо известны из уровня техники. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены способы получения моноклональных антител, а также антитела, полученные с помощью такого способа, предусматривающие культивирование гибридомной клетки, секретирующей антитело по настоящему изобретению, при этом гибридому предпочтительно получают путем слияния спленоцитов, выделенных из мыши, иммунизированной с помощью антигена по настоящему изобретению, с миеломными клетками; и затем скрининг гибридом, полученных в результате слияния, в отношении клонов гибридом, которые секретируют антитело, которое может связать полипептид по настоящему изобретению (см. пример 1). Вкратце, мышей можно иммунизировать с помощью антигена CD40. В предпочтительном варианте осуществления антиген CD40 вводят с адъювантом для стимулирования иммунного ответа. Такие адьюванты включают полный или неполный адъювант Фрейнда, RIBI (мурамилдипептиды) или ISCOM (иммуностимулирующие комплексы). Такие адъюванты могут защищать полипептид от быстрого рассеивания путем изоляции его в местном депо, или они могут содержать вещества, которые стимулируют у хозяина секрецию факторов, которые являются хемотаксическими для макрофагов и других компонентов иммунной системы. Предпочтительно, если вводится полипептид, схема иммунизации будет предусматривать два или более введений полипептида, разнесенных на протяжении нескольких недель.
После иммунизации животного с помощью антигена CD40 от животного можно получать антитела и/или антителообразующие клетки. Сыворотку крови, содержащую антитело к CD40, получают от животного путем забора крови или умерщвления животного. Сыворотку крови можно применять в том виде, как она получена от животного, из сыворотки крови можно получить фракцию иммуноглобулинов или из сыворотки крови можно очистить антитела к CD40. Сыворотка крови или иммуноглобулины, полученные этим способом, являются поликлональными, то есть характеризуются гетерогенными свойствами.
Как только обнаружен иммунный ответ, например, в сыворотке крови мыши обнаружены антитела, специфические в отношении антигена CD40, собирают селезенку мыши и выделяют спленоциты. Затем спленоциты сливают с помощью хорошо известных методик с любыми подходящими миеломными клетками, например, клетками из линии клеток SP20, доступной из АТСС. Гибридомы отбирают и клонируют с помощью серийных разведений. Затем клоны гибридом анализируют с помощью способов, известных из уровня техники, в отношении клеток, которые секретируют антитела, способные связывать CD40. Асцитную жидкость, которая, как правило, содержит высокие уровни антител, можно получать путем иммунизации мышей с положительными клонами гибридомы.
В другом варианте осуществления антителообразующие иммортализованные гибридомы можно получать из иммунизированного животного. После иммунизации животное умерщвляют и В-клетки селезенки сливают с иммортализованными миеломными клетками, как хорошо известно из уровня техники. См., например, Harlow and Lane, выше. В предпочтительном варианте осуществления миеломные клетки не секретируют полипептиды иммуноглобулина (линий несекреторных клеток). После слияния и отбора с помощью антибиотиков гибридомы подвергают скринингу с применением CD40 или его части, или клетки, экспрессирующей CD40. В предпочтительном варианте осуществления первоначальный скрининг осуществляют с применением иммуноферментного анализа (ELISA) или радиоиммунологического анализа (RIA), предпочтительно ELISA. Пример скрининга с помощью ELISA представлен в WO 00/37504, включенного в данный документ посредством ссылки.
Гибридомы, вырабатывающие антитело к CD40, отбирают, клонируют и подвергают дополнительному скринингу в отношении необходимых характеристик, включая устойчивый рост гибридомы, высокий уровень выработки антител и необходимые характеристики антител, как дополнительно обсуждается ниже. Гибридомы можно культивировать и размножать in vivo в сингенных животных, в животных, у которых отсутствует иммунная система, например в безтимусных мышах, или в культуре клеток in vitro. Способы отбора, клонирования и размножения гибридом хорошо известны обычным специалистам в данной области.
В предпочтительном варианте осуществления гибридомы представляют собой гибридомы мышей, как описано выше. В другом предпочтительном варианте осуществления гибридомы получают у вида, отличного от человека и отличного от мыши, такого как крысы, овцы, свиньи, козы, крупный рогатый скот или лошади. В другом варианте осуществления гибридомы представляют собой человеческие гибридомы, в которых клетки несекреторной миеломы человека слиты с человеческой клеткой, экспрессирующей антитело к CD40.
С помощью известных методик можно получать фрагменты антител, которые распознают специфические эпитопы. Например, Fab- и Р(ab')2-фрагменты по настоящему изобретению можно получать с помощью протеолитического расщепления молекул иммуноглобулинов, с применением ферментов, таких как папаин (для получения Fab-фрагментов) или пепсин (для получения F(ab')2-фрагментов). Р(ab')2-фрагменты содержат вариабельные области, константную область легкой цепи и СН1-домен тяжелой цепи.
2. Получение моноклональных антител к CD40 с применением SLAM
В другом аспекте настоящего изобретения рекомбинантные антитела получают из одиночных выделенных лимфоцитов с применением процедуры, обозначаемой в уровне техники как способ получения антител из отобранных лимфоцитов (SLAM), описываемый в патенте США №5627052, публикация согласно РСТ WO 92/02551 и Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. В данном способе одиночные клетки, секретирующие представляющие интерес антитела, например, лимфоциты, полученные из любого из иммунизированных животных, описанных в разделе 1, подвергают скринингу с применением антиген-специфического анализа гемолитических бляшек, где антиген CD40, субъединица CD40 или его фрагмент связывают с эритроцитами овцы с применением линкера, такого как биотин, и применяют для идентификации отдельных клеток, которые секретируют антитела, характеризующиеся специфичностью в отношении CD40. После идентификации клеток, секретирующих представляющее интерес антитело, cDNA вариабельных областей тяжелой и легкой цепей извлекают из клеток с помощью ПЦР с обратной транскриптазой, и затем эти вариабельные области можно экспрессировать в связи с соответствующими константными областями иммуноглобулина (например, константными областями человека), в клетках-хозяевах, полученных от млекопитающего, таких как клетки COS или СНО. Клетки-хозяева, трансфицированные с помощью амплифицированных последовательностей иммуноглобулина, полученных из in vivo отобранных лимфоцитов, затем можно подвергать дополнительному анализу и отбору in vitro, например, путем пэннинга трансфицированных клеток для выделения клеток, экспрессирующих антитела к CD40. Амплифицированные последовательности иммуноглобулина далее можно обрабатывать in vitro, как, например, с помощью in vitro способов созревания аффинности, таких как описанные в публикации согласно PCT WO 97/29131 и публикации согласно PCT WO 00/56772.
3. Получение моноклональных антител к CD40 с применением трансгенных животных
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитела получают путем иммунизации животного, отличного от человека, содержащего некоторые или все локусы иммуноглобулина человека, с помощью антигена CD40. В предпочтительном варианте осуществления животное, отличное от человека, представляет собой трансгенную мышь XENOMOUSE, разработанную линию мышей, которые содержат большие фрагменты локусов иммуноглобулинов человека и не способны вырабатывать антитела мыши. См., например, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) и патенты США №№5916771, 5939598, 5985615, 5998209, 6075181, 6091001, 6114598 и 6130364. См. также WO 91/10741, опубликованную 25 июля 1991 года, WO 94/02602, опубликованную 3 февраля 1994 года, WO 96/34096 и WO 96/33735, обе опубликованы 31 октября 1996 года, WO 98/16654, опубликованную 23 апреля 1998 года, WO 98/24893, опубликованную 11 июня 1998 года, WO 98/50433, опубликованную 12 ноября 1998 года, WO 99/45031, опубликованную 10 сентября 1999 года, WO 99/53049, опубликованную 21 октября 1999 года, WO 00/09560, опубликованную 24 февраля 2000 года и WO 00/037504, опубликованную 29 июня 2000 года. Трансгенная мышь XENOMOUSE продуцирует репертуар полностью человеческих антител взрослого человека и вырабатывает антиген-специфические Mab человека. Трансгенная мышь XENOMOUSE содержит приблизительно 80% репертуара антител человека благодаря введению мегабазных YAC-фрагментов в конфигурации зародышевого типа из локусов тяжелой цепи и легкой цепи человека. См. Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits. J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), раскрытия которых настоящим включены посредством ссылки.
4. Получение моноклональных антител к CD40 с применением библиотеки рекомбинантных антител
9
In vitro способы также можно применять для получения антител по настоящему изобретению, при этом библиотеку антител подвергают скринингу для идентификации антитела с необходимой специфичностью связывания. Способы для такого скрининга библиотек рекомбинантных антител хорошо известны из уровня техники и включают способы, описанные, например, в Ladner et al., патент США №5223409; Kang et al., публикация согласно РСТ № WO 92/18619; Dower et al., публикация согласно РСТ № WO 91/17271; Winter el al., публикация согласно РСТ № WO 92/20791; Markland et al. публикация согласно РСТ № WO 92/15679; Breitling et al., публикация согласно РСТ № WO 93/01288; McCafferty et al., публикация согласно РСТ № WO 92/01047; Garrard et al. публикация согласно РСТ № WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology :1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; и Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982, публикация заявки на патент США 20030186374 и публикация согласно РСТ № WO 97/29131, содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки.
off
off
50
Библиотека рекомбинантных антител может быть получена от субъекта, иммунизированного с помощью CD40 или части CD40, такой как внеклеточный домен. В качестве альтернативы, библиотека рекомбинантных антител может быть получена от не подвергавшегося воздействию субъекта, т.е. субъекта, который не был иммунизирован с помощью CD40, как, например, библиотека антител человека от субъекта-человека, который не был иммунизирован с помощью CD40 человека. Антитела по настоящему изобретению отобраны с помощью скрининга библиотеки рекомбинантных антител с помощью пептида, содержащего CD40 человека, чтобы благодаря этому отобрать те антитела, которые распознают CD40. Способы проведения такого скрининга и отбора хорошо известны из уровня техники, как, например, описанные в библиографических ссылках в предыдущем абзаце. Для отбора антител по настоящему изобретению, которые характеризуются определенными значениями аффиности связывания в отношении hCD40, таких как антитела, которые диссоциируют от CD40 человека с определенной константой скорости k, можно применять способ поверхностного плазмонного резонанса, известный из уровня техники, чтобы отобрать антитела с необходимой константой скорости k. Для отбора антител по настоящему изобретению с определенной нейтрализующей активностью в отношении hCD40, таких как антитела с определенной IC, можно применять стандартные способы, известные из уровня техники, которые используются для оценки подавления активности hCD40.
В одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенным антителу или его антиген-связывающей части, которые связывают CD40 человека. Предпочтительно, антитело представляет собой нейтрализующее антитело. В различных вариантах осуществления антитело представляет собой рекомбинантное антитело или моноклональное антитело.
Например, антитела по настоящему изобретению также можно получать с применением различных способов фагового дисплея, известных из уровня техники. В способах фагового дисплея функциональные домены антител представлены на поверхности фаговых частиц, которые несут полинуклеотидные последовательности, кодирующие их. В частности, такие фаги можно использовать для представления антиген-связывающих доменов, экспрессируемых на основе репертуарной или комбинаторной библиотеки антител (например, человека или мыши). Фаги, экспрессирующие антиген-связывающий домен, который связывает представляющий интерес антиген, могут быть отобраны или идентифицированы с помощью антигена, например, с применением меченого антигена или антигена, связанного с твердой поверхностью или гранулой или захваченного на них. Фаги, применяемые в таких способах, как правило, представляют собой нитчатые фаги, включая fd и М13, связывающие домены, экспрессируемые за счет фагов с Fab-, Fv- или стабилизированными дисульфидными связями Fv-доменами антитела, рекомбинантным образом слиты с одним из гена белка III или гена белка VIII фага. Примеры способов фагового дисплея, которые можно применять для получения антител по настоящему изобретению, включают способы, раскрытые в Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); заявке согласно PCT № PCT/GB91/01134; публикациях согласно РСТ WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401 и патентах США №№5698426; 5223409; 5403484; 5580717; 5427908; 5750753; 5821047; 5571698; 5427908; 5516637; 5780225; 5658727; 5733743 и 5969108; каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей свой полноте.
Как описано в приведенных выше библиографических ссылках, после отбора фагов области, кодирующие антитело, можно выделять из фага и применять для получения целых антител, включая антитела человека или любой другой необходимый антиген-связывающий фрагмент, и экспрессировать в любом необходимом хозяине, включая клетки млекопитающего, клетки насекомого, клетки растения, дрожжи и бактерии например, как подробно описано ниже. Например, также можно использовать методики для рекомбинантного получения Fab-, Fab'- и Р(ab')2-фрагментов с применением способов, известных из уровня техники, таких как способы, раскрытые в публикации согласно РСТ WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); и Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); и Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (указанные библиографические ссылки включены посредством ссылки во всей своей полноте). Примеры методик, которые можно применять для получения одноцепочечных Fv и антител, включают методики, описанные в патентах США 4946778 и 5258498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); и Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).
В качестве альтернативы проведения скрининга библиотек рекомбинантных антител с помощью фагового дисплея другие методики, известные из уровня техники для скрининга больших комбинаторных библиотек, можно применять для идентификации антител с двойной специфичностью по настоящему изобретению. Одним типом альтернативной системы экспрессии является такая, в которой библиотека рекомбинантных антител экспрессируется в виде слияний РНК-белок, как описано в публикации согласно PCT № WO 98/31700 от Szostak и Roberts, и в Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl Acad. Sci. USA 94:12297-12302. В этой системе создают ковалентное слияние между mRNA и пептидом или белком, которые она кодирует, путем in vitro трансляции синтетических mRNA, которые несут пуромицин, пептидил-акцепторный антибиотик, на своем 3'-конце. При этом содержание специфической mRNA в сложной смеси mRNA (например, комбинаторной библиотеки) можно повышать за счет свойств закодированного пептида или белка, например антитела или его части, как, например, путем связывания антитела или его части с антигеном с двойной специфичностью. Последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие антитела или их части, излеченные после скрининга таких библиотек, можно экспрессировать с помощью рекомбинантных методов, как описано выше (например, в клетках-хозяевах, полученных от млекопитающего) и, более того, можно подвергать дополнительному созреванию аффинности либо с помощью дополнительных раундов скрининга слияний mRNA-пептид, в которые мутации были введены в изначально отобранную(-ые) последовательность(-и), либо с помощью других in vitro способов созревания аффинности рекомбинантных антител, как описано выше.
Согласно другому подходу антитела по настоящему изобретению также можно получать с применением способов дрожжевого дисплея, известных из уровня техники. В способах дрожжевого дисплея генетические способы применяют, чтобы привязать домены антитела к клеточной стенке дрожжей и представить их на поверхности дрожжей. В частности, такие дрожжи можно использовать для представления антиген-связывающих доменов, экспрессируемых на основе репертуарной или комбинаторной библиотеки антител (например, человека или мыши). Примеры способов дрожжевого дисплея, которые можно применять для получения антител по настоящему изобретению, включают раскрытые в Wittrup et al. (патент США №6699658), включенном в данный документ посредством ссылки.
5. Получение рекомбинантных антител к CD40
Антитела по настоящему изобретению можно получать с помощью любой из ряда методик, известных из уровня техники. Например, с помощью экспрессии в клетках-хозяевах, при этом вектор(-ы) экспрессии, кодирующий(-ие) тяжелую и легкую цепи, трансфицируют в клетку-хозяина с помощью стандартных методик. Подразумевается, что различные формы термина "трансфекция" охватывают широкий спектр методик, обычно применяемых для введения экзогенной ДНК в прокариотическую или эукариотическую клетку-хозяина, например, электропорация, осаждение с помощью фосфата кальция, трансфекция, опосредованная DEAE-декстраном и т.п. Хотя экспрессировать антитела по настоящему изобретению возможно либо в прокариотической, либо в эукариотической клетках-хозяевах, экспрессия антител в эукариотических клетках является предпочтительной, и наиболее предпочтительной - в клетках-хозяевах, полученных от млекопитающего, поскольку такие эукариотические клетки (и, в частности, клетки млекопитающего) с большей вероятностью, чем прокариотические клетки, могут собирать и секретировать правильно свернутое и иммунологически активное антитело.
Предпочтительные клетки-хозяева, полученные от млекопитающего, для экспрессии рекомбинантных антител по настоящему изобретению включают клетки яичников китайского хомячка (СНО) (включая клетки dhfr-CHO, описанные в Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, применяемые с селектируемым маркером DHFR, например, как описано в R.J. Kaufman and Р.А. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), NS0 миеломные клетки, клетки COS и клетки SP2. Когда векторы для рекомбинантной экспрессии, кодирующие гены антитела, вводят в клетки-хозяева, полученные от млекопитающего, антитела получают путем культивирования клеток-хозяев в течение периода времени, достаточного для обеспечения экспрессии антитела в клетках-хозяевах или более предпочтительно - секреции антитела в среду для культивирования, в которой клетки-хозяева выращиваются. Антитела можно извлекать из среды для культивирования с применением стандартных способов очистки белка.
Клетки-хозяева также можно применять для получения функциональных фрагментов антитела, таких как Fab-фрагменты или scFv-молекулы. Будет понятно, что вариации вышеописанной процедуры находятся в пределах объема настоящего изобретения. Например, может быть необходимо трансфицировать клетку-хозяина с помощью ДНК, кодирующей функциональные фрагменты одной из легкой цепи и/или тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению. Технологию рекомбинантной ДНК также можно применять для удаления некоторых или всех ДНК, кодирующих какую-либо одну или обе из легкой и тяжелой цепей, которые не являются необходимыми для связывания представляющих интерес антигенов. Антитела по настоящему изобретению также охватывают молекулы, экспрессируемые с таких усеченных молекул ДНК. В дополнение, можно получать бифункциональные антитела, в которых одна тяжелая и одна легкая цепи принадлежат антителу по настоящему изобретению, а другие тяжелая и легкая цепи являются специфическими в отношении антигена, отличного от представляющих интерес антигенов, путем сшивания антитела по настоящему изобретению со вторым антителом с помощью стандартных способов химического сшивания.
В предпочтительной системе для рекомбинантной экспрессии антитела или его антиген-связывающей части по настоящему изобретению, вектор для рекомбинантной экспрессии, кодирующий как тяжелую цепь антитела, так и легкую цепь антитела, вводят в клетки dhfr-CHO с помощью трансфекции, опосредованной фосфатом кальция. В пределах вектора для рекомбинантной экспрессии каждый из генов тяжелой и легкой цепей антитела функционально связан с регуляторными элементами энхансером CMV/промотором AdMLP, которые управляют высокими уровнями транскрипции генов. Вектор для рекомбинантной экспрессия также несет ген DHFR, который обеспечивает возможность отбора клеток СНО, которые были трансфицированы вектором, с применением отбора/увеличения численности в присутствии метотрексата. Отобранные трансформированные клетки-хозяева культивируют, чтобы обеспечить экспрессию тяжелой и легкой цепей антитела, и целое антитело извлекают из среды для культивирования. Применяют стандартные методики молекулярной биологии, чтобы получить вектор для рекомбинантной экспрессии, трансфицировать клетки-хозяева, производить отбор трансформантов, культивировать клетки-хозяева и извлекать антитело из среды для культивирования. Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрен способ синтеза рекомбинантного антитела по настоящему изобретению путем культивирования клетки-хозяина по настоящему изобретению в подходящей среде для культивирования до тех пор, пока не синтезируется рекомбинантное антитело по настоящему изобретению. Способ может дополнительно предусматривать выделение рекомбинантного антитела из среды для культивирования.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено гликозилированное антитело или его антиген-связывающая часть, при этом антитело или его антиген-связывающая часть содержат один или несколько углеводных остатков. Растущая при in vivo синтезе белковая цепь может подвергаться дополнительному процессингу, известному как посттрансляционная модификация. В частности, ферментативным путем могут быть добавлены остатки сахаров (гликозильные группы), этот процесс известен как гликозилирование. Полученные белки, несущие ковалентно связанные олигосахаридные боковые цепи известны как гликозилированные белки или гликопротеины. Антитела представляют собой гликопротеины с одним или несколькими углеводными остатками в Fc-домене, а также в вариабельном домене. Углеводные остатки в Fc-домене оказывают важное влияние на эффекторную функцию Fc-домена, при этом минимальное влияние на связывание антигена или время полужизни антитела (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11-16). В отличие от этого, гликозилирование вариабельного домена может оказывать влияние на активность связывания антигена у антитела. Гликозилирование в вариабельном домене может оказывать отрицательное влияние на аффинность связывания у антитела, по-видимому, вследствие стерического затруднения (Со, M.S., et al., Mol Immunol. (1993) 30:1361-1367), или приводить к повышенной аффинности в отношении антигена (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717-2723).
Один аспект настоящего изобретения направлен на получение мутантов по сайту гликозилирования, в которых был мутирован сайт О- или N-связанного гликозилирования антитела или его антиген-связывающей части. Специалист в данной области может получать таких мутантов с применением стандартных хорошо известных методов. Мутанты по сайту гликозилирования, которые сохраняют биологическую активность, но характеризуются повышенной или сниженной активностью связывания, представляют собой другой предмет настоящего изобретения.
В еще одном варианте осуществления гликозилирование антитела или антиген-связывающей части по настоящему изобретению является модифицированным. Например, можно получать агликозилированное антитело (т.е. антитело, в отношении которого отсутствует гликозилирование). Гликозилирование может быть измененным, например, для повышения аффинности антитела в отношении антигена. Такие углеводные модификации можно осуществлять, например, путем изменения одного или нескольких сайтов гликозилирования в пределах последовательности антитела. Например, можно сделать одну или несколько аминокислотных замен, которые приводят к исключению одного или нескольких сайтов гликозилирования вариабельной области, чтобы тем самым исключить гликозилирование в данном сайте. Такое агликозилирование может повышать аффинность антитела по отношению к антигену. Такой подход описан более подробно в публикации согласно РСТ WO 2003016466 A2 и патентах США №№5714350 и 6350861, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
В качестве дополнения или альтернативы, можно получать модифицированное антитело по настоящему изобретению, которое характеризуете измененным типом гликозилирования, как, например, гипофукозилированное антитело со сниженным количеством фукозильных остатков или антитело с повышенным содержанием структур с GlcNAc в точках ветвления. Было продемонстрировано, что такие измененные паттерны гликозилирования повышают способность антител к ADCC. Такие углеводные модификации можно осуществлять, например, путем экспрессии антитела в клетке-хозяине с измененным механизмом гликозилирования. Клетки с измененным механизмом гликозилирования был описаны в уровне техники, и их можно применять в качестве клеток-хозяев, в которых экспрессируют рекомбинантные антитела по настоящему изобретению с получением, таким образом, антитела с измененным гликозилированием. См., например, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, а также европейский патент № ЕР 1176195; публикации согласно РСТ WO 03/035835; WO 99/5434280, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
Гликозилирование белка зависит от аминокислотной последовательности представляющего интерес белка, а также клетки-хозяина, в которой белок экспрессируется. Различные организмы могут вырабатывать различные ферменты гликозилирования (например, гликозилтрансферазы и гликозидазы) и имеют различные доступные субстраты (нуклеотидные сахара). Вследствие таких факторов паттерн гликозилирования белка и состав гликозильных остатков могут отличаться в зависимости от системы хозяина, в которой экспрессируется конкретный белок. Гликозильные остатки, пригодные по настоящему изобретению, могут включать без ограничения глюкозу, галактозу, маннозу, фукозу, N-ацетилглюкозамин и сиаловую кислоту. Предпочтительно гликолизированное антитело или его антиген-связывающая часть содержат такие гликозильные остатки, что паттерн гликозилирования характерен для молекул человека.
Специалистам в данной области понятно, что отличающееся гликозилирование белка может приводить к отличающимся характеристикам белка. Например, эффективность терапевтического белка, полученного в хозяине-микроорганизме, таком как дрожжи, и гликолизированного с использованием эндогенного пути дрожжей, может быть сниженной по сравнению с эффективностью такого же белка, экспрессированного в клетке млекопитающего, такой как линия клеток СНО. Такие гликопротеины также могут быть иммуногенными для человека и демонстрировать уменьшенное время полужизни in vivo после введения. Специфические рецепторы у человека и других животных могут распознавать специфические гликозильные остатки и способствовать быстрому клиренсу белка из кровотока. Другие неблагоприятные эффекты могут включать изменения сворачивания белка, его растворимости, восприимчивости к протеазам, направленного перемещения, транспорта, компартментализации, секреции, распознавания другими белками или факторами, антигенности или аллергенности. Соответственно, специалист-практик может предпочитать терапевтический белок со специфическим составом и паттерном гликозилирования, например, составом и паттерном гликозилирования, идентичным или по меньшей мере аналогичным тому, который образуется в клетках человека или в видоспецифичных клетках предполагаемого субъекта-животного.
Экспрессия гликолизированных белков, отличная от той, которую может обеспечивать клетка-хозяин, может быть достигнута путем генетической модификации клетки-хозяина с тем, чтобы она экспрессировала гетерологичные ферменты гликозилирования. С применением методик, известных из уровня техники, специалист-практик может получать антитела или их антиген-связывающие части, проявляющие гликозилирование белков человека. Например, штаммы дрожжей были генетически модифицированы для экспрессии не встречающихся в природе ферментов гликозилирования, вследствие чего гликолизированные белки (гликопротеины), вырабатываемые в этих штаммах дрожжей, проявляют гликозилирование белков, идентичное гликозилированию, осуществляемому в клетках животных, в частности в клетках человека (публикации заявок на патент США №№20040018590 и 20020137134 и публикация согласно РСТ WO 2005100584 А2).
В дополнение к антителам или их антиген-связывающим частям настоящее изобретение также направлено на антиидиотипическое (анти-Id) антитело, специфическое в отношении таких антител или их антиген-связывающих частей по настоящему изобретению. Анти-Id антитело представляет антитело, которое распознает уникальные детерминанты, обычно ассоциированные с антиген-связывающей областью другого антитела. Анти-Id можно получать путем иммунизации животного с помощью антитела или его антиген-связывающей части, или его области, содержащей CDR. Иммунизированное животное будет распознавать и реагировать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела и вырабатывать анти-Id антитело. Анти-Id антитело также можно применять в качестве "иммуногена" для индукции иммунного ответа у еще одного животного с получением так называемого анти-анти-Id антитела.
Кроме того, специалисту в данной области будет понятно, что представляющий интерес белок можно экспрессировать с применением библиотеки клеток-хозяев, разработанных методами генной инженерии для экспрессии различных ферментов гликозилирования, так что клетки-хозяева, элементы библиотеки, вырабатывают представляющий интерес белок с вариантными паттернами гликозилирования. Затем специалист-практик может отобрать и выделить представляющий интерес белок с особыми новыми паттернами гликозилирования. Предпочтительно белок с особым образом отобранным новым паттерном гликозилирования проявляет улучшенные или измененные биологические свойства.
III. Способы применения антител-антагонистов к CD40
3
14
35
90
99
111
125
131
177
166
153
Исходя из их способности связываться с CD40 человека, антитела к CD40 человека или их части по настоящему изобретению можно применять для обнаружения CD40 человека (например, в биологическом образце, таком как сыворотка крови или плазма) с применением традиционного иммунологического анализа, такого как твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), радиоиммунологический анализ (RIA) или иммуногистохимия тканей. В настоящем изобретении предусмотрен способ обнаружения CD40 человека в биологическом образце, предусматривающий приведение биологического образца в контакт с антителом или частью антитела по настоящему изобретению и обнаружение либо антитела (или части антитела), связанного с CD40 человека, либо несвязанного антитела (или части антитела), с обнаружением тем самым CD40 человека в биологическом образце. Антитело прямо или опосредованно метят с помощью детектируемого вещества, чтобы упростить обнаружение связанного или несвязанного антитела. Подходящие детектируемые вещества включают различные ферменты, простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы и радиоактивные материалы. Примеры подходящих ферментов включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; примеры подходящих комплексов простетических групп включают стрептавидин/биотин и авидин/биотин; примеры подходящих флуоресцентных материалов включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин-флуоресцеин, дансилхлорид или фикоэритрин; пример люминесцентного материала включает люминол; и примеры подходящего радиоактивного материала включают Н С S, Y, Тс, In, I, I, Lu, Ho или Sm.
В качестве альтернативы мечению антитела CD40 человека можно количественно оценивать в биологических жидкостях с помощью конкурентного иммунологического анализа с использованием стандартов rhCD40, меченных детектируемым веществом, и немеченого антитела к CD40 человека. В данном анализе объединяют биологический образец, меченые стандарты rhCD40 и антитело к CD40 человека и определяют количество меченого стандарта rhCD40, связавшегося с немеченым антителом. Количество CD40 человека в биологическом образце обратно пропорционально количеству меченого стандарта rhCD40, связавшегося с антителом к CD40. Аналогично CD40 человека также можно количественно оценивать в биологических жидкостях с помощью конкурентного иммунологического анализа с использованием стандартов rhCD40, меченных детектируемым веществом, и немеченого антитела к CD40 человека.
Антитела и части антител по настоящему изобретению предпочтительно способны нейтрализовать активность CD40 человека как in vitro, так и in vivo. Соответственно, такие антитела и части антител по настоящему изобретению можно применять для подавления активности hCD40, например, в культуре клеток, содержащих hCD40, у субъектов-людей или у других субъектов-млекопитающих, имеющих CD40, с которым перекрестно реагирует антитело по настоящему изобретению. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ подавления активности hCD40, предусматривающий приведение hCD40 в контакт с антителом или частью антитела по настоящему изобретению, вследствие чего активность hCD40 подавляется. Например, в случае культуры клеток, содержащих или предположительно содержащих hCD40, антитело или часть антитела по настоящему изобретению можно добавлять в среду для культивирования, чтобы подавить активность hCD40 в культуре.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ снижения активности hCD40 у субъекта, преимущественно у субъекта, страдающего от заболевания или нарушения, при которых активность CD40 оказывает негативное воздействие. В настоящем изобретении предусмотрены способы снижения активности CD40 у субъекта, страдающего от такого заболевания или нарушения, при этом способ предусматривает введение субъекту антитела или части антитела по настоящему изобретению, вследствие чего активность CD40 у субъекта снижается. Предпочтительно, CD40 представляет собой CD40 человека, а субъект представляет собой субъекта-человека. В качестве альтернативы, субъект может представлять собой млекопитающее, экспрессирующее CD40, с которым способно связываться антитело по настоящему изобретению. Более того, субъект может представлять собой млекопитающее, в которое CD40 был внедрен (например, путем введения CD40 или путем экспрессии трансгена CD40). Антитело по настоящему изобретению можно вводить субъекту-человеку в терапевтических целях. Кроме того, антитело по настоящему изобретению можно вводить млекопитающему, отличному от человека, экспрессирующему CD40, с которым данное антитело способно связываться, в ветеринарных целях или в качестве животной модели заболевания человека. Что касается последнего, такие животные модели могут быть пригодны для оценки терапевтической эффективности антител по настоящему изобретению (например, тестирования доз и длительностей введения).
Подразумевается, что используемый в данном документе термин "нарушение, при котором активность CD40 оказывает негативное воздействие", включает заболевания и другие нарушения, при которых присутствие CD40 у субъекта, страдающего от нарушения, как было показано, является или предположительно является либо ответственным за патофизиологию нарушения, либо фактором, который вносит вклад в ухудшение нарушения. Соответственно, нарушение, при котором активность CD40 оказывает негативное воздействие, представляет собой нарушение, при котором снижение активности CD40, как ожидается, ослабит симптомы и/или прогрессирование нарушения. Доказательством таких нарушений может быть, например, повышение концентрации CD40 в биологической жидкости субъекта, страдающего от нарушения (например, повышение концентрации CD40 в сыворотке крови, плазме, синовиальной жидкости и т.д. субъекта), которое можно обнаружить, например, с применением антитела к CD40, как описано выше. Неограничивающие примеры нарушений, которые можно лечить с помощью антител по настоящему изобретению, а также их вариантов или их антиген-связывающих фрагментов, включают нарушения, обсуждаемые в разделе ниже, относящемся к фармацевтическим композициям на основе антител по настоящему изобретению. Например, подходящие нарушения включают без ограничений системную красную волчанку (SLE), дискоидную волчанку, люпус-нефрит, саркоидоз, ювенильный артрит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, синдром Рейтера, анкилозирующий спондилоартрит, подагрический артрит, отторжение трансплантата органа или ткани, реакция "трансплантат против хозяина", рассеянный склероз, гипер-IgE-синдром, узелковый полиартериит, первичный билиарный цирроз печени, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, целиакию (глютензависимую энтеропатию), аутоиммунный гепатит, пернициозную анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию, псориаз, склеродермию, тяжелую миастению, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, аутоиммунный тиреоидит, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, болезнь иммунных комплексов, синдром хронической усталости и иммунной дисфункции (CFIDS), полимиозит и дерматомиозит, криоглобулинемию, тромболизис, кардиомиопатию, обыкновенную пузырчатку, интерстициальный фиброз легких, саркоидоз, сахарный диабет I типа и II типа, гиперчувствительность 1, 2, 3 типа и 4 замедленного типа, аллергию или аллергические нарушения, астму, синдром Черджа-Строса (аллергический гранулематоз), атопический дерматит, аллергический и простой контактный дерматит, крапивницу, IgE-опосредованную аллергию, атеросклероз, васкулит, идиопатические воспалительные миопатии, гемолитическую болезнь, болезнь Альцгеймера и хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию. В конкретном варианте осуществления заболевание или нарушение представляет собой хроническое воспалительное нарушение. В конкретном варианте осуществления нарушение, при котором активность CD40 оказывает негативное воздействие, представляет собой воспалительное заболевание кишечника (IBD), в том числе без ограничений болезнь Крона или язвенный колит.
В других вариантах осуществления антитело к CD40 или антиген-связывающую часть по настоящему изобретению применяют для лечения нарушения, при котором активность TNFα оказывает негативное воздействие, в том числе без ограничений ревматоидного артрита, язвенного колита, гнойного гидраденита, ювенильного идиопатического артрита, псориатического артрита, псориаза, анкилозирующего спондилоартрита и болезни Крона. В одном варианте осуществления нарушение, при котором активность TNFα оказывает негативное воздействие, представляет собой увеит.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения субъекта-человека с воспалительным заболеванием кишечника (IBD).
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения язвенного колита.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения болезни Крона.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения системной красной волчанки (SLE).
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения саркоидоза.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения субъекта-человека с ювенильным артритом.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения ревматоидного артрита.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения псориатического артрита.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения субъекта-человека с анкилозирующим спондилоартритом.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения гнойного гидраденита.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения увеита.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения синдрома Шегрена.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения псориаза.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения атопического дерматита.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют для лечения склеродермии.
mAb к CD40 по настоящему изобретению будут обладать потенциалом для лечения как пациентов, не подвергавшихся воздействию биологических препаратов, так и группы с недостаточным клиническим ответом на антитела к TNF, вследствие центральной роли CD40 как во врожденном, так и в адаптивном иммунных ответах. В настоящем изобретении предусмотрено лечение, способное подавлять передачу сигнала с помощью CD40, что супрессирует молекулярные пути, такие как выработка TNF и IL-23, а также экспрессию молекул адгезии/костимулирующих молекул, которые поддерживают хроническое воспаление в пищеварительном канале. Исходя из определения профиля экспрессии у пациентов с болезнью Крона, получавших лечение с помощью антител к TNF, лечение с помощью антител к CD40 может обладать потенциалом выхода за рамки группы пациентов с клиническим ответом на антитела к TNF для лечения более широкой группы пациентов с болезнью Крона. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения подгруппы пациентов с IBD, у которых отсутствует клинический ответ на терапию антителами к TNF. Такие пациенты с IBD могут иметь болезнь Крона или язвенный колит, и у них либо отсутствовал клинический ответ, либо наблюдался ограниченный ответ на лечение с помощью ингибитора TNFα, такого как без ограничений инфликсимаб, адалимумаб, цертолизумаб пегол или голимумаб. Антитела-антагонисты к CD40, описанные в данном документе, можно применять для лечения пациента с отсутствием клинического ответа при терапии, направленной на TNF, который имеет болезнь Крона или язвенный колит. В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения пациента, проходившего лечение, например взрослого пациента с умеренной - тяжелой степенью активной болезни Крона, который представляет собой пациента с отсутствием клинического ответа при терапии, направленной на TNF.
Антитела по настоящему изобретению или их антиген-связывающие части могут применяться отдельно или в комбинации для лечения таких заболеваний. Следует понимать, что антитела по настоящему изобретению или их антиген-связывающую часть можно применять отдельно или в комбинации с дополнительным средством, например терапевтическим средством, причем указанное терапевтическое средство выбирает специалист в данной области, исходя из его целевого назначения. Например, дополнительное средство может представлять собой терапевтическое средство, считающееся в данной области техники пригодным для лечения заболевания или патологического состояния, которое лечат с помощью антитела по настоящему изобретению. Дополнительное средство также может представлять собой средство, которое придает полезное свойство терапевтической композиции, например средство, которое влияет на вязкость композиции. Также следует понимать, что комбинации, которые должны быть включены в настоящее изобретение, представляют собой комбинации, пригодные для их целевого назначения. Средства, изложенные ниже, приводятся с целью иллюстрации и не подразумеваются как ограничивающие. Комбинации, которые представляют собой часть настоящего изобретения, могут представлять собой антитела по настоящему изобретению и по меньшей мере одно дополнительное средство, выбранное из перечней ниже. Комбинация также может включать более одного дополнительного средства, например два или три дополнительных средства, если комбинация является такой, что сформированная композиция может выполнять свою предусмотренную функцию.
Комбинированная терапия может предусматривать один или несколько антагонистов CD40, например антитела к CD40 или их фрагменты, составленные и/или вводимые совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, например одним или несколькими ингибиторами цитокинов и факторов роста, иммуносупрессорами, противовоспалительными средствами (например, системными противовоспалительными средствами), противофиброзными средствами, ингибиторами метаболизма, ингибиторами ферментов и/или цитотоксическими или цитостатическими средствами, ингибиторами митоза, противоопухолевыми антибиотиками, иммуномодулирующими средствами, векторами для генной терапии, алкилирующими средствами, антиангиогенными средствами, антиметаболитами, борсодержащими средствами, хемопротекторными средствами, гормонами, антигормональными средствами, кортикостероидами, фотоактивными терапевтическими средствами, олигонуклеотидами, радионуклидными средствами, ингибиторами топоизомеразы, ингибиторами тирозинкиназы или радиосенсибилизаторами, как описано более подробно в данном документе.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют в комбинации со вторым средством для лечения воспалительного заболевания кишечника (IBD). В определенных вариантах осуществления второе средство представляет собой месаламин, балсалазид, азатиоприн, 6-МР, метотрексат, инфликсимаб, цертолизумаб, адалимумаб, голимумаб, натализумаб, ведолизумаб, устекинумаб или их комбинации.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют в комбинации со вторым средством для лечения SLE, при этом второе средство представляет собой нитропасту/нитроглицерин, нифедипин, силденафил, тадалафил или их комбинации.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют в комбинации со вторым средством для лечения SLE, при этом второе средство представляет собой кортикостероид, продуцент эндогенных стероидов, NSAID, противовоспалительное средство, болезнь-модифицирующее антиревматическое лекарственное средство (DMARD), иммуносупрессорное средство, антикоагулянт или их комбинации.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют в комбинации с кортикостероидом для лечения SLE. Примеры кортикостероидов, которые можно применять, включают преднизолон, метилпреднизолон, преднизон или их комбинации.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют в комбинации со средством, которое осуществляет выработку эндогенных стероидов, например кортикотропина (Актар), для лечения SLE.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют в комбинации с местным или инъекционным терапевтическим средством для лечения SLE. Пример такого терапевтического средства включает без ограничений кортизон, гидрокортизон, пимекролимус крем, такролимус мазь, имиквимод или их комбинации.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют в комбинации с нестероидным противовоспалительным лекарственным средством (NSAID) для лечения SLE. Пример NSAID, которое можно применять в комбинированной терапии, включает без ограничений индометацин, набуметон, целекоксиб, ибупрофен, напроксен, диклофенак или их комбинации.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют в комбинации с противовоспалительным лекарственным средством для лечения SLE. В дополнительных вариантах осуществления противовоспалительное лекарственное средство представляет собой ацетаминофен и/или салицилаты.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют в комбинации с болезнь-модифицирующими антиревматическими лекарственными средствами (DMARD) для лечения SLE. Пример DMARD включает без ограничений гидроксихлорохин (Плаквенил), хлорохин, метотрексат (Ревматрекс), лефлуномид (Арава), сульфасалазин или их комбинации.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102 применяют в комбинации с белимумабом (Бенлиста), ритуксимабом (Ритуксан), внутривенно вводимым Ig или их комбинациями.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающая часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют в комбинации с иммуносупрессорным средством для лечения SLE. Примеры иммуносупрессорного средства включают без ограничений азатиоприн (Имуран), циклофосфамид (Цитоксан), циклоспорин, такролимус и микофенолат.
В одном варианте осуществления антитело к CD40 или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению, например Ab102, применяют в комбинации с противосвертывающим средством для лечения SLE. Примеры противосвертывающего средства включают без ограничений аспирин, гепарин, варфарин и эноксапарин (Ловенокс).
Дополнительные примеры предпочтительных дополнительных терапевтических средств, которые можно вводить совместно и/или составлять с одним или несколькими антагонистами CD40, например антителами к CD40 или их фрагментами. Такие комбинации можно применять для лечения связанных с CD40 нарушений, изложенных в данном документе. Дополнительные примеры терапевтических средств, которые можно вводить совместно и/или составлять с одним или несколькими антителами к CD40 или их фрагментами включают одно или несколько из: антагонистов TNF (например, растворимый фрагмент TNF-рецептора, например р55- или р75-ТNF-рецептор человека или его производные, например TNFR-IgG размером 75 кДа (белок слияния TNF-рецептора-IgG размером 75 кДа, ENBREL)); антагонистов TNF-фермента, например ингибиторов TNF-превращающего фермента (ТАСЕ); антагонистов мускариновых рецепторов; антагонистов TGF-бета; интерферона-гамма; перфенидона; химиотерапевтических средств, например метотрексата, лефлуномида или сиролимуса (рапамицина) или их аналога, например CCI-779; СОХ2 и ингибиторов cPLA2; нестероидных противовоспалительных лекарственное средств (NSAID); иммуномодуляторов; ингибиторов р38, TPL-2, МК-2 и ингибиторов NFkB, в числе прочих.
Другие предпочтительные комбинации представляют собой супрессирующее(-ие) цитокины противовоспалительное(-ые) лекарственное(-ые) средство(-а) (CSAID); антитела или антагонисты к другим цитокинам или факторам роста человека, например IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-31, интерферонам, ЕМАР-II, GM-CSF, FGF, EGF, PDGF и эндотелину-1, а также к рецепторам этих цитокинов и факторов роста. Антитела по настоящему изобретению или их антиген-связывающие части можно объединять с антителами к молекулам клеточной поверхности, таким как CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (В7.1), CD86 (В7.2), CD90, CTLA или их лиганды, в том числе CD154 (gp39 или CD40L).
Предпочтительные комбинации терапевтических средств могут создавать препятствия в различных точках воспалительного каскада; предпочтительные примеры включают антагонисты TNF, подобные химерным, гуманизированным или человеческим антителам к TNF, адалимумаб (HUMIRA; D2E7; публикация согласно PCT № WO 97/29131), СА2 (REMICADE), CDP 571 и растворимые р55- или p75-TNF-рецепторы, их производные (p75TNFR1gG (ENBREL) или p55TNFR1gG (LENERCEPT), а также ингибиторы TNF-превращающего фермента (ТАСЕ); аналогично ингибиторы IL-1 (ингибиторы интерлейкин-1 - превращающего фермента, IL-1RA и т.д.) могут быть эффективными по той же причине. Другие предпочтительные комбинации включают интерлейкин 4.
Схемы приема можно регулировать, чтобы обеспечить оптимальный требуемый ответ (например, терапевтический или профилактический ответ). Например, можно вводить единую болюсную дозу, несколько разделенных доз можно вводить в течение некоторого времени или дозу можно пропорционально снижать или повышать сообразно потребностям терапевтической ситуации. Особенно целесообразно составлять парентеральные композиции в единичную лекарственную форму для простоты введения и однородного дозирования. Используемое в данном документе выражение единичная лекарственная форма обозначает физически дискретные единицы, подходящие в качестве однократных доз для субъектов-млекопитающих, подлежащих лечению; причем каждая единица содержит заранее установленное количество активного соединения, рассчитанное на то, чтобы вызвать необходимый терапевтический эффект, в сочетании с требуемым фармацевтическим носителем. Спецификация для единичной лекарственной формы по настоящему изобретению обусловлена и напрямую зависит от (а) уникальных характеристик активного соединения и конкретного терапевтического или профилактического эффекта, который нужно достигнуть, и (b) ограничений, свойственных для области техники составления такого активного соединения для лечения чувствительности у индивидуумов.
Следует отметить, что величины дозы могут варьировать в зависимости от типа и тяжести патологического состояния, которое требуется ослабить. Также будет понятно, что в случае любого конкретного субъекта, специфические схемы приема со временем следует корректировать в соответствии с индивидуальными потребностями и профессиональным мнением лица, вводящего или контролирующего введение композиций, и что диапазоны доз, изложенные в данном документе, являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения объема или применения заявленной композиции на практике.
В другом аспекте настоящей заявки представлен способ лечения (например, излечения, супрессирования, облегчения, отсрочки или предупреждения появления или предупреждения повторного появления или рецидива) или предупреждения нарушения, при котором активность CD40 оказывает негативное воздействие, у субъекта. Способ предусматривает введение субъекту CD40-связывающего средства (в частности, антагониста), например антитела к CD40 или его фрагмента, описываемых в данном документе, в количестве, достаточном для лечения или предупреждения нарушения, ассоциированного с CD40. Антагонист CD40, например антитело к CD40 или его фрагмент, можно вводить субъекту отдельно или в комбинации с другими терапевтическими способами воздействия, описываемыми в данном документе.
В другом аспекте настоящей заявки предусмотрен способ обнаружения присутствия CD40 в образце in vitro (например, биологическом образце, таком как сыворотка крови, плазма, ткань, биоптат). Заявленный способ можно применять для диагностики нарушения, например воспалительного нарушения. Способ предусматривает: (i) приведение образца или контрольного образца в контакт с антителом к CD40 или его фрагментом, описываемыми в данном документе; и (ii) обнаружение образования комплекса между антителом к CD40 или его фрагментом и образцом или контрольным образцом, где статистически значимое изменение в образовании комплекса у образца относительно контрольного образца указывает на присутствие CD40 в образце.
В еще одном аспекте настоящей заявки предусмотрен способ обнаружения присутствия CD40 in vivo (например, in vivo визуализация у субъекта). Заявленный способ можно применять для диагностики нарушения, например CD40-ассоциированного нарушения. Способ предусматривает: (i) введение антитела к CD40 или его фрагмента, описываемых в данном документе, субъекту или контрольному субъекту в условиях, которые обеспечивают возможность связывания антитела или фрагмента с CD40; и (ii) обнаружение образования комплекса между антителом или фрагментом и CD40, где статистически значимое изменение в образовании комплекса у субъекта относительно контрольного субъекта указывает на присутствие CD40.
Замены аминокислотных остатков в Fc-части для изменения эффекторной функции антитела известны из уровня техники (Winter et al., патенты США №№5648260; 5624821). Fc-часть антитела опосредует несколько важных эффекторных функций, например индукцию цитокинов, ADCC, фагоцитоз, комплементзависимую цитотоксичность (CDC) и время полужизни/иммунный клиренс антитела и комплексов антиген-антитело. В некоторых случаях эти эффекторные функции являются требуемыми для терапевтического антитела, но в других случаях могут быть ненужными или даже вредными, в зависимости от терапевтических целей. Определенные изотипы IgG человека, в частности IgG1 и IgG3, опосредуют ADCC и CDC путем связывания и FcuR и молекулы комплемента Clq соответственно. Неонатальные Fc-рецепторы (FcRn) представляют собой важнейшие компоненты, определяющие время полужизни для циркулирующих антител. В еще одном варианте осуществления по меньшей мере один аминокислотный остаток заменен в константной области антитела, например Fc-области антитела, вследствие чего эффекторные функции антитела изменяются.
В одном варианте осуществления предусмотрено меченое антитело или его антиген-связывающая часть, где антитело или часть антитела по настоящему изобретению являются дериватизированными или связанными с одной или несколькими функциональными молекулами (например, другим пептидом или белком). Например, меченое антитело или его антиген-связывающая часть по настоящему изобретению могут быть получены путем функционального связывания антитела или части антитела по настоящему изобретению (путем образования химических связей, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным способом) с одним или несколькими другими молекулярными объектами, такими как другое антитело (например, биспецифическое антитело или диатело), детектируемое средство, фармацевтическое средство, белок или пептид, которые могут опосредовать ассоциацию антитела или части антитела с другой молекулой (такой как центральная область на основе стрептавидина или полигистидиновая метка), и/или цитотоксическое или терапевтическое средство, выбранное из группы, состоящей из ингибитора митоза, противоопухолевого антибиотика, иммуномодулирующего средства, вектора для генной терапии, алкилирующего средства, антиангиогенного средства, антиметаболита, борсодержащего средства, хемопротекторного средства, гормона, антигормонального средства, кортикостероида, фотоактивного терапевтического средства, олигонуклеотида, радионуклидного средства, ингибитора топоизомеразы, ингибитора тирозинкиназы, радиосенсибилизатора и их комбинации.
Пригодные детектируемые средства, с помощью которых антитело или часть антитела по настоящему изобретению могут быть дериватизированы, включают флуоресцентные соединения. Иллюстративные флуоресцентные детектируемые средства включают флуоресцеин, флуоресцеина изотиоцианат, родамин, 5-диметиламин-1-нафталинсульфонилхлорид, фикоэритрин и т.п. Антитело может также быть дериватизировано с помощью детектируемых ферментов, таких как щелочная фосфатаза, пероксидаза хрена, глюкооксидаза и т.п. Если антитело дериватизировано с помощью детектируемого фермента, его обнаруживают с помощью добавления дополнительных реагентов, которые фермент использует для выработки детектируемого продукта реакции. Например, если присутствует детектируемое средство пероксидаза хрена, добавление пероксида водорода и диаминобензидина приводит к окрашенному продукту реакции, который является детектируемым. Антитело также можно дериватизировать с помощью биотина и обнаруживать с помощью непрямого измерения связывания авидина или стрептавидина.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрено кристаллизованное антитело или его антиген-связывающая часть. Предпочтительно настоящее изобретение относится к кристаллам целого антитела к CD40 и его фрагментов, раскрытых в данном документе, и составам и композициям, содержащим такие кристаллы. В одном варианте осуществления кристаллизованное антитело или его антиген-связывающая часть характеризуются большим временем полужизни in vivo, чем растворимый аналог антитела или его антиген-связывающей части. В другом варианте осуществления антитело или его антиген-связывающая часть сохраняют биологическую активность после кристаллизации.
Кристаллизованное антитело или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению можно получать в соответствии со способами, известными из уровня техники и раскрытыми в WO 02072636, включенном в данный документ посредством ссылки.
IV. Фармацевтические композиции
В настоящем изобретении также предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие антитело или его антиген-связывающую часть по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать "терапевтически эффективное количество" или "профилактически эффективное количество" антитела или части антитела по настоящему изобретению. "Терапевтически эффективное количество" обозначает количество, которое, при необходимых дозах и периодах времени, является эффективным для достижения требуемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество антитела или части антитела может определить специалист в данной области, и оно может варьировать в соответствии с факторами, такими как стадия заболевания, возраст, пол и вес индивидуума и способность антитела или части антитела вызывать необходимый ответ у индивидуума. Терапевтически эффективное количество также является таким, при котором любые токсические или вредные эффекты антитела или части антитела, перевешиваются терапевтически полезными эффектами. "Профилактически эффективное количество" обозначает количество, которое, при необходимых дозах и периодах времени, является эффективным для достижения требуемого профилактического результата. Как правило, поскольку профилактическую дозу применяют у субъектов до проявления заболевания или на его ранней стадии, профилактически эффективное количество будет меньше, чем терапевтически эффективное количество.
Фармацевтические композиции, содержащие антитела по настоящему изобретению, предназначены без ограничений для применения в диагностике, обнаружении или наблюдении за нарушением, в предупреждении, лечении, контроле или облегчении нарушения или одного или нескольких его симптомов и/или в исследовании. В конкретном варианте осуществления композиция содержит одно или несколько антител по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит одно или несколько антител по настоящему изобретению и одно или несколько профилактических или терапевтических средств, отличных от антител по настоящему изобретению, для лечения нарушения, при котором активность CD40 оказывает негативное воздействие. Предпочтительно, известно, что профилактические или терапевтические средства являются пригодными для или уже применялись или в настоящее время применяются в предупреждении, лечении, контроле или облегчении нарушения или одного или нескольких его симптомов. В соответствии с этими вариантами осуществления композиция может дополнительно содержать носитель, разбавитель или наполнитель.
Антитела и части антител по настоящему изобретению можно включать в фармацевтические композиции, подходящие для введения субъекту. Как правило, фармацевтическая композиция содержит антитело или часть антитела по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Используемый в данном документе "фармацевтически приемлемый носитель" включает любые возможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические средства и средства, замедляющие всасывание, и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают одно или несколько из воды, солевого раствора, фосфатно-солевого буфера, декстрозы, глицерина, этанола и т.п., а также их комбинации. Во многих случаях будет предпочтительно включать в композицию изотонические средства, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Фармацевтически приемлемые носители могут также содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие средства, консерванты или буферы, которые увеличивают срок хранения или эффективность антитела или части антитела.
Известны различные системы доставки, и их можно применять для доставки одного или нескольких антител по настоящему изобретению или комбинации из одного или нескольких антител по настоящему изобретению и профилактического средства или терапевтического средства, пригодного для предупреждения, контроля, лечения или облегчения нарушения или одного или нескольких его симптомов, например, инкапсуляция в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные к экспрессии антитела или фрагмента антитела, опосредованный рецепторами эндоцитоз (см., например, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), конструирования нуклеиновой кислоты как части ретровирусного или другого вектора и т.д. Способы введения профилактического или терапевтического средства по настоящему изобретению включают без ограничений парентеральное введение (например, интрадермальное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное), эпидуральное введение, внутриопухолевое введение и введение через слизистые оболочки (например, интраназальный и пероральный пути). Кроме того, можно использовать легочное введение, например, с помощью применения ингалятора или аэрозольного ингалятора и состава со средством для образования аэрозоля. См., например, патенты США №№6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 и 4880078; и публикации согласно РСТ №№ WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В одном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению, комбинированную терапию или композицию по настоящему изобретению вводят с применением технологии для легочной доставки лекарственного средства Alkermes AIR (Alkermes, Inc., Кембридж, Массачусетс). В конкретном варианте осуществления профилактические или терапевтические средства по настоящему изобретению вводят внутримышечно, внутривенно, внутрь опухоли, перорально, интраназально, в легкие или подкожно. Профилактические или терапевтические средства можно вводить с помощью любого традиционного пути введения, например с помощью инфузии или болюсной инъекции, путем всасывания через эпителиальные или кожно-слизистые выстилки (например, слизистую оболочку рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т.д.) и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или местным.
В конкретном варианте осуществления может быть желательно вводить профилактические или терапевтические средства по настоящему изобретению местно в участок, требующий лечения; этого можно достичь, к примеру и не для ограничения, путем местной инфузии, путем инъекции или с помощью импланта, причем указанный имплант представляет собой пористый или непористый материал, включающий мембраны и матрицы, такие как мембраны Sialastic, полимеры, волокнистые матрицы (например, TISSUEL) или коллагеновые матрицы. В одном варианте осуществления эффективное количество одного или нескольких антител-антагонистов по настоящему изобретению вводят местно в пораженный участок субъекта для предотвращения, лечения, контроля и/или облегчения нарушения или его симптома. В другом варианте осуществления эффективное количество одного или нескольких антител по настоящему изобретению вводят субъекту местно в пораженный участок в комбинации с эффективным количеством одного или нескольких терапевтических средств (например, одного или нескольких профилактических или терапевтических средств), отличных от антитела по настоящему изобретению для предупреждения, лечения, контроля и/или облегчения нарушения или одного или нескольких его симптомов.
В другом варианте осуществления профилактическое или терапевтическое средство по настоящему изобретению может доставляться в системе с контролируемым высвобождением или пролонгированным высвобождением. В одном варианте осуществления для достижения контролируемого или пролонгированного высвобождения можно применять насос (см. Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). В другом варианте осуществления для достижения контролируемого или пролонгированного высвобождения терапевтических средств по настоящему изобретению можно применять полимерные материалы (см., например, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; см. также Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); патент США №5679377; патент США №5916597; патент США №5912015; патент США №5989463; патент США №5128326; публикацию согласно РСТ № WO 99/15154 и публикацию согласно РСТ № WO 99/20253. Примеры полимеров, применяемых в составах с пролонгированным высвобождением, включают без ограничений поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поли(метилметакрилат), поли(акриловая кислота), сополимер(этилена и винилацетата), поли(метакриловая кислота), полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли(N-винилпирролидон), поли(виниловый спирт), полиакриламид, поли(этиленгликоль), полилактиды (PLA), сополимер (лактида и гликолидов) (PLGA) и сложные полиортоэфиры. В предпочтительном варианте осуществления полимер, применяемый в составе с пролонгированным высвобождением, является инертным, не содержит вымываемых примесей, стабилен при хранении, стерильный и биоразлагаемый. В еще одном варианте осуществления систему для контролируемого или пролонгированного высвобождения можно поместить вблизи профилактической или терапевтической мишени, в связи с этим требуется только часть системной дозы (см., например, Goodson, в Medical Applications of Controlled Release, выше, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
Системы для контролированного высвобождения обсуждаются в обзоре Langer (1990, Science 249:1527-1533). Любую методику, известную специалисту в данной области, можно применять для получения составов с пролонгированным высвобождением, содержащих одно или несколько терапевтический средств по настоящему изобретению. См., например, патент США №4526938, публикацию согласно РСТ WO 91/05548, публикацию согласно РСТ WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Proс. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854 и Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
В конкретном варианте осуществления, где композиция по настоящему изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую профилактическое или терапевтический средство, нуклеиновую кислоту можно вводить in vivo для обеспечения экспрессии закодированного в ней профилактического или терапевтического средства, путем конструирования ее как части соответствующего вектора для экспрессии нуклеиновой кислоты и введения ее таким образом, что она попадает внутрь клетки, например с помощью применения ретровирусного вектора (см. патент США №4980286), или с помощью прямой инъекции, или с помощью применения бомбардировки микрочастицами (например, генная пушка; биолистика, Dupont) или покрытия липидами, или рецепторами клеточной поверхности, или трансфицирующими средствами, или с помощью введения ее в сочетании с гомеобокс-подобным пептидом, который, как известно, проникает в ядро (см., например, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). В качестве альтернативы нуклеиновая кислота может быть введена внутрь клетки и встроена в ДНК клетки-хозяина для экспрессии с помощью гомологической рекомбинации.
Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению составляют, чтобы она была совместима с ее предполагаемым путем введения. Примеры путей введения включают без ограничений парентеральное, например внутривенное, интрадермальное, подкожное, пероральное, интраназальное (например, ингаляционное), трансдермальное (например, местное), трансмукозальное и ректальное введение. В конкретном варианте осуществления композицию составляют согласно традиционным процедурам как фармацевтическую композицию, предназначенную для внутривенного, подкожного, внутримышечного, перорального, интраназального или местного введения людям. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. В случае необходимости композиция может также включать солюбилизирующее средство и местный анестетик, такой как лигнокаин, для облегчения боли в месте инъекции.
th
Если композиции по настоящему изобретению должны вводиться местно, композиции можно составлять в форме мази, крема, трансдермального пластыря, примочки, геля, шампуня, спрея, аэрозоля, раствора, эмульсии или другой формы, хорошо известной специалисту в данной области. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19 ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). В случае нераспыляемых местных лекарственных форм, как правило, используют вязкие-полутвердые или твердые формы, содержащие носитель или один или несколько наполнителей, совместимых с местным нанесением и характеризующихся динамической вязкостью предпочтительно больше, чем у воды. Подходящие составы включают без ограничения растворы, суспензии, эмульсии, кремы, мази, порошки, жидкие мази, бальзамы и т.п., которые, в случае необходимости, стерилизуют или смешивают со вспомогательными средствами (например, консервантами, стабилизаторами, смачивающими средствами, буферами или солями) для воздействия на различные свойства, такие как, например, осмотическое давление. Другие подходящие местные лекарственные формы включают распыляемые аэрозольные препараты, где активный ингредиент, предпочтительно в комбинации с твердым или жидким инертным носителем, упакован в смеси с находящимся под давлением летучим компонентом (например, газообразным пропеллентом, таким как фреон) или в гибком флаконе. В случае необходимости, к фармацевтическим композициям и лекарственным формам можно также добавлять увлажнители или влагоудерживающие вещества. Примеры таких дополнительных ингредиентов хорошо известны из уровня техники.
Если способ по настоящему изобретению предусматривает интраназальное введение композиции, композиция может быть составлена в аэрозольной форме, спрее, мелкодисперсной форме или в форме капель. В частности, профилактические или терапевтические средства для применения в соответствии с настоящим изобретением в целях удобства могут доставляться в форме выпуска аэрозольного спрея из находящихся под давлением упаковок или аэрозольного ингалятора, с применением подходящего пропеллента (например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, углекислого газа или другого подходящего газа). В случае находящегося под давлением аэрозоля единица дозирования может определяться путем обеспечения клапана для доставки отмеренного количества. Капсулы и картриджи (например, составленные из желатина) для применения в ингаляторе или инсуффляторе могут быть составлены так, чтобы содержать порошковую смесь соединения и подходящей порошковой основы, такой как лактоза или крахмал.
Если способ по настоящему изобретению предусматривает пероральное введение, композиции можно составлять для перорального введения в форме таблеток, капсул, саше, желатиновых капсул, растворов, суспензий и т.п. Таблетки или капсулы можно получать с помощью традиционных способов с фармацевтически приемлемыми наполнителями, такими как связывающие средства (например, прежелатинизированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу); заполнители (например, лактозу, микрокристаллическую целлюлозу или гидрофосфат кальция); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк или диоксид кремния); разрыхлители (например, картофельный крахмал или натрия крахмалгликолят) или смачивающие средства (например, лаурилсульфат натрия). Таблетки могут быть покрыты с помощью способов, хорошо известных из уровня техники. Жидкие препараты для перорального введения без ограничений могут быть в форме растворов, сиропов или суспензий, или они могут быть представлены как сухой продукт для разбавления водой или другой подходящей средой перед применением. Такие жидкие препараты могут быть получены с помощью традиционных способов с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие средства (например, сорбитовый сироп, производные целлюлозы или гидрогенизованные пищевые жиры); эмульгирующие средства (например, лецитин или аравийская камедь); неводные среды (например, миндальное масло, масляные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-пара-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Препараты могут также содержать буферные соли, вкусоароматические, красящие и подслащивающие средства, в зависимости от обстоятельств. Препараты для перорального введения могут быть соответственно составлены для медленного высвобождения, контролируемого высвобождение или пролонгированного высвобождения профилактического(-их) или терапевтического(-их) средства(средств).
Способ по настоящему изобретению может предусматривать легочное введение композиции, составленной со средством для образования аэрозоля, например, путем применения ингалятора или аэрозольного ингалятора. См., например, патенты США №№6019968, 5985320, 5985309, 5934272, 5874064, 5855913, 5290540 и 4880078 и публикации согласно РСТ №№ WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903, каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В конкретном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению, комбинированную терапию и/или композицию по настоящему изобретению вводят с применением технологии для легочной доставки лекарственного средства Alkermes AIR (Alkermes, Inc., Кембридж, Массачусетс).
Способ по настоящему изобретению может предусматривать введение композиции, составленной для парентерального введения путем инъекции (например, путем болюсной инъекции или продолжительной инфузии). Составы для инъекции могут быть представлены в виде единичной лекарственной формы (например, в ампулах или многодозных контейнерах) с добавленным консервантом. Композиции могут принимать такие формы, как суспензии, растворы или эмульсии в маслянистых или водных средах, и могут содержать средства для составления, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие средства. В качестве альтернативы активный ингредиент может находиться в форме порошка для разбавления с помощью подходящей среды (например, стерильной воды, не содержащей пирогены) перед применением.
Способы по настоящему изобретению могут дополнительно предусматривать введение композиций, составленных как препараты-депо. Такие составы длительного действия можно вводить путем имплантации (например, подкожно или внутримышечно) или с помощью внутримышечной инъекции. Таким образом, например, композиции могут быть составлены с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, как эмульсия в приемлемом масле) или ионообменными смолами или в качестве умеренно растворимых производных (например, в качестве умеренно растворимой соли).
Способы по настоящему изобретению охватывают введение композиций, составленных в качестве нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, которые образованы с анионами, такими как происходящие от соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и соли, которые образованы с катионами, такими как происходящие от натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов трехвалентного железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.
В целом, ингредиенты композиций поставляются либо отдельно, либо смешанными вместе в единичную лекарственную форму, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, показывающие количество активного средства. Если способом введения является инфузия, композицию можно распределить в инфузионный флакон, содержащий стерильную воду фармацевтической степени чистоты или солевой раствор. Если способом введения является инъекция, может быть обеспечена ампула со стерильной водой для инъекции или солевым раствором, так что ингредиенты могут быть смешаны перед введением.
В частности, в настоящем изобретении также предусмотрено, что одно или несколько из профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по настоящему изобретению упакованы в герметично закрытый контейнер, такой как ампула или саше, показывающие количество средства. В одном варианте осуществления одно или несколько из профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по настоящему изобретению поставляются в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере и могут быть разведены (например, с помощью воды или солевого раствора) до концентрации, подходящей для введения субъекту. Предпочтительно, одно или несколько профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по настоящему изобретению поставляются в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в герметично закрытом контейнере из расчета единичной дозы, составляющей по меньшей мере 5 мг, более предпочтительно по меньшей мере 10 мг, по меньшей мере 15 мг, по меньшей мере 25 мг, по меньшей мере 35 мг, по меньшей мере 45 мг, по меньшей мере 50 мг, по меньшей мере 75 мг или по меньшей мере 100 мг. Лиофилизированные профилактические или терапевтические средства или фармацевтические композиции по настоящему изобретению следует хранить при температурах от 2°С до 8°С в их оригинальном контейнере и профилактические или терапевтические средства или фармацевтические композиции по настоящему изобретению следует вводить в пределах 1 недели, предпочтительно в пределах 5 дней, в пределах 72 часов, в пределах 48 часов, в пределах 24 часов, в пределах 12 часов, в пределах 6 часов, в пределах 5 часов, в пределах 3 часов или в пределах 1 часа после разведения. В альтернативном варианте осуществления одно или несколько из профилактических или терапевтических средств или фармацевтических композиций по настоящему изобретению поставляют в жидкой форме в герметично закрытом контейнере, показывающем количество и концентрацию средства. Предпочтительно, жидкая форма вводимой композиции поставляется в герметично закрытом контейнере из расчета по меньшей мере 0,25 мг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 0,5 мг/мл, по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 2,5 мг/мл, по меньшей мере 5 мг/мл, по меньшей мере 8 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 15 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл, по меньшей мере 75 мг/мл или по меньшей мере 100 мг/мл. Жидкую форму следует хранить при температурах от 2°С до 8°С в ее оригинальном контейнере.
Антитела и части антител по настоящему изобретению можно включать в фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения. Предпочтительно антитело или части антитела будут получены в виде инъекционного раствора, содержащего 0,1-250 мг/мл антитела. Инъекционный раствор может быть составлен в виде либо жидкой, либо лиофилизированной лекарственной формы в сосуде из флинтового или янтарного стекла, ампуле или заранее заполненного шприца. Буфер может представлять собой L-гистидин (1-50 мМ), оптимально 5-10 мМ, при рН 5,0-7,0 (оптимально рН 6,0). Другие подходящие буферы включают без ограничений сукцинат натрия, цитрат натрия, фосфат натрия или фосфат калия. Хлорид натрия можно применять для модифицирования токсичности раствора при концентрации, составляющей 0-300 мМ (оптимально 150 мМ в случае жидкой лекарственной формы). В случае лиофилизированный лекарственной формы могут быть включены криопротекторы, в первую очередь 0-10% сахарозы (оптимально 0,5-1,0%). Другие подходящие криопротекторы включают трегалозу и лактозу. В случае лиофилизированный лекарственной формы могут быть включены объемообразующие средства, в первую очередь 1-10% маннита (оптимально 2-4%). Стабилизаторы можно применять как в жидкой, так и в лиофилизированной лекарственных формах, в первую очередь 1-50 мМ L-метионина (оптимально 5-10 мМ). Другие подходящие объемообразующие средства включают глицин, аргинин, можно включать 0-0,05% полисорбата-80 (оптимально 0,005-0,01%). Дополнительные поверхностно-активные вещества включают без ограничений полисорбат 20 и поверхностно-активные вещества BRIJ. Фармацевтическая композиция, содержащая антитела и части антител по настоящему изобретению, приготовленная в виде инъекционного раствора для парентерального введения, может дополнительно содержать средство, пригодное в качестве адъюванта, как например применяемые для повышения всасывания или распространения терапевтического белка (например, антитела). Особенно пригодным адъювантом является гиалуронидаза, такая как HYLENEX (рекомбинантная гиалуронидаза человека). Добавление гиалуронидазы в инъекционный раствор улучшает биодоступность для человека после парентерального введения, в частности подкожного введения. Оно также делает возможным увеличение объема в месте инъекции (т.е. больше 1 мл) с уменьшением боли и дискомфорта и сведением к минимуму случаев реакций в месте инъекции. (См. WO 2004078140, US 2006104968, включенные в данный документ посредством ссылки).
В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая антитело по настоящему изобретению, например антитело Ab102, гистидин и полисорбат, например полисорбат 80. В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая антитело, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислоты под SEQ ID NO: 41, и легкую цепь, содержащую аминокислоты под SEQ ID NO: 40, гистидин и полисорбат, например полисорбат 80. В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция является лиофилизированной.
Композиции по настоящему изобретению могут быть в виде самых разных форм. Они включают, например, жидкие, полутвердые и твердые лекарственные формы, такие как жидкие растворы (например, инъекционные и инфузионные растворы), дисперсии или суспензии, таблетки, пилюли, порошки, липосомы и суппозитории. Предпочтительная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения. Типичные предпочтительные композиции находятся в форме инъекционных или инфузионных растворов, таких как композиции, аналогичные тем, которые применяются при пассивной иммунизации людей с помощью других антител. Предпочтительным способом введения является парентеральное (например, внутривенное, подкожное, внутрибрюшинное, внутримышечное). В предпочтительном варианте осуществления антитело вводят с помощью внутривенной инфузии или инъекции. В другом предпочтительном варианте осуществления антитело вводят с помощью внутримышечной или подкожной инъекции.
Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными и стабильными в условиях производства и хранения. Композиция может быть составлена в виде раствора, микроэмульсии, дисперсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Стерильные инъекционные растворы можно приготовить путем включения активного соединения (т.е. антитела или части антитела) в требуемом количестве в подходящий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, после стерилизации фильтрованием. В целом, дисперсии готовят путем включения активного соединения в стерильную среду, которая содержит основную дисперсионную среду и требуемые остальные ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных, лиофилизированных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами приготовления являются вакуумная сушка и сушка распылением, которая дает порошок активного ингредиента с любым дополнительным необходимым ингредиентом из их предварительно простерилизованного фильтрованием раствора. Надлежащую текучесть раствора можно поддерживать, например, с помощью применения покрытия, такого как лецитин, с помощью поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и с помощью применения поверхностно-активных веществ. Пролонгированного всасывания инъекционных композиций можно достигать путем включения в композицию средства, которое замедляет всасывание, например, солей моностеаратов и желатина.
Антитела и части антител по настоящему изобретению можно вводить с помощью различных способов, известных из уровня техники, хотя для многих терапевтических применений предпочтительным путем/способом введения является подкожная инъекция, внутривенная инъекция или инфузия. Как будет понятно специалисту в данной области, путь и/или способ введения будут варьировать, в зависимости от необходимых результатов. В определенных вариантах осуществления активное соединение можно получать с носителем, который будет защищать соединение от быстрого высвобождения, как например составы с контролируемым высвобождением, в том числе импланты, трансдермальное пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Можно применять биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота. Множество способов для получения таких составов запатентованы или в целом известны специалистам в данной области. См., например, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
В определенных вариантах осуществления антитело или часть антитела по настоящему изобретению можно вводить перорально, например, с инертным разбавителем или усваиваемым пищевым носителем. Соединение (и другие ингредиенты, в случае необходимости) также могут быть заключены в твердую или мягкую желатиновую капсулу, спрессованы в таблетки или введены напрямую в пищевой рацион субъекта. В случае перорального введения терапевтического средства, соединения могут быть объединены с наполнителями и применяться в форме проглатываемых таблеток, буккальных таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток и т.п. Чтобы ввести соединение по настоящему изобретению с помощью введения, отличного от парентерального, может быть необходимо покрыть соединение с помощью материала для предупреждения его инактивации или ввести соединение совместно с ним.
В других вариантах осуществления антитело или часть антитела по настоящему изобретению можно конъюгировать с молекулой на основе полимера, так что указанная молекула на основе полимера может придавать указанным антителу или части антитела по настоящему изобретению соответствующий размер, так что указанные антитело или часть антитела по настоящему изобретению имеют преимущества от улучшенного эффекта проницаемости и удержания (EPR-эффект) (см. также публикацию согласно РСТ № WO 2006/042146A2, и публикации заявок на патент США №№2004/0028687 А1, 2009/0285757 А1 и 2011/0217363А1, и патент США №7695719 (каждый из которых включен в данный документ посредством ссылки в полном объеме и для всех целей).
В композиции также можно включать вспомогательные активные соединения. В определенных вариантах осуществления антитело или часть антитела по настоящему изобретению составляют и/или вводят совместно с одним или несколькими дополнительными терапевтическими средствами, которые пригодны для лечения нарушений, при которых активность CD40 оказывает негативное воздействие. Например, антитело к hCD40 или часть антитела по настоящему изобретению можно составлять и/или вводить совместно с одним или несколькими дополнительными антителами, которые связывают другие мишени (например, антителами, которые связывают цитокины или которые связывают молекулы клеточной поверхности). Кроме того, одно или несколько антител по настоящему изобретению можно применять в комбинации с двумя или более из вышеописанных терапевтических средств. В таких видах комбинированной терапии можно с успехом использовать более низкие дозы вводимых терапевтических средств, таким образом избегая возможных проявлений токсичности или осложнений, ассоциированных с различными видами монотерапии.
В определенных вариантах осуществления антитело к CD40 или его фрагмент связаны со средой, удлиняющей время полужизни, известной из уровня техники. Такие среды включают без ограничений Fc-домен, полиэтиленгликоль и декстран. Такие среды описаны, например, в заявке на патент США с порядковым №09/428082 и опубликованной заявке согласно РСТ № WO 99/25044, которые настоящим включены посредством ссылки для любой цели.
В конкретном варианте осуществления последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие нуклеотидные последовательности, кодирующие антитело по настоящему изобретению или другое профилактическое или терапевтическое средство по настоящему изобретению, вводят для лечения, предупреждения, контроля или облегчения нарушения или одного или нескольких его симптомов с помощью генной терапии. Генная терапия обозначает терапию, осуществляемую путем введения субъекту экспрессированной или экспрессируемой нуклеиновой кислоты. В данном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеиновые кислоты вырабатывают закодированное в них антитело или профилактическое или терапевтическое средство по настоящему изобретению, которые опосредуют профилактический или терапевтический эффект.
Любой из способов генной терапии, доступных из уровня техники, можно применять в соответствии с настоящим изобретением. Общие обзоры способов генной терапии см. в Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993) и Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11 (5):155-215. Способы, общеизвестные в области техники технологии с использованием рекомбинантной ДНК, которые можно применять, описаны в Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993) и Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Подробное описание различных способов генной терапии представлено в US 20050042664 А1, который включен в данный документ посредством ссылки.
Специалисты в данной области легко поймут, что другие подходящие модификации и адаптации способов по настоящему изобретению, описанному в данном документе, являются очевидными, и их можно проводить с применением подходящих эквивалентов без отступления от объема настоящего изобретения или вариантов осуществления, раскрытых в данном документе. После приведенного подробного описания настоящее изобретение можно будет лучше понять с помощью ссылки на следующие примеры, которые включены только для целей иллюстрации и не предназначены ограничивать настоящее изобретение.
Примеры
Пример 1. Моноклональные антитела-антагонисты к CD40 человека (hCD40)
Чтобы идентифицировать антитела-антагонисты, специфические в отношении CD40, технологию с использованием гибридом применяли для выделения мышиных моноклональных антител к CD40.
Вкратце, мышей иммунизировали с помощью антигена CD40 человека и адъюванта. После иммунизации, которая предусматривала несколько введений антигена на протяжении нескольких недель, сыворотку крови собирали у каждого иммунизированного животного. Затем сыворотку крови тестировали с применением стандартных анализов ELISA и проточной цитометрии, чтобы идентифицировать сыворотку крови с антителами, которые способны обнаруживать CD40. Как только присутствие CD40-специфических антител было обнаружено в сыворотке крови мыши на основании анализов связывания, селезенку мыши собирали и антителообразующие клетки выделяли в соответствии со стандартными методиками. Затем спленоциты сливали с помощью известных методик для образования антителообразующих миеломных клеток. После слияния гибридомы подвергали скринингу с помощью ELISA и проточной цитометрии, чтобы определить различные характеристики блокирования и нейтрализации антител к CD40.
После скрининга, в то время как большинство антител было идентифицировано как обладающие агонистической активностью, три мышиных моноклональных антитела (Ab1, Ab2 и Ab3) были идентифицированы как обладающие антагонистической активностью в отношении CD40 без значительной агонистической активности. Аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей этих трех мышиных антител описаны ниже в таблицах 7-9. CDR в пределах вариабельной области тяжелой (VH) и вариабельной области легкой (VL) цепей показаны жирным шрифтом (CDR1, CDR2 и CDR3 соответственно).
Консенсусные последовательности CDR-областей из трех мышиных моноклональных антител-антагонистов к CD40 (Ab1, Ab2 и Ab3) были идентифицированы и представлены выше в таблице 5. Выравнивания аминокислотных последовательностей вариабельных областей трех мышиных антител также представлены на фигуре 4А (легкая цепь) и 4В (тяжелая цепь).
Мышиные вариабельные области тяжелой и легкой цепей (VH и VL) этих трех антител клонировали с применением ПЦР с обратной транскриптазой (RT-PCR). Эти VH- и VL-области (описанные выше в таблицах 7-9) впоследствии клонировали в векторы, содержащие константные области иммуноглобулина (Ig) человека, и затем экспрессировали в клетках-хозяевах, полученных от млекопитающих, как химерные антитела. У этих химерных антител человека (константные области человека и мышиные вариабельные области) затем определяли характеристики с применением in vitro анализов, чтобы определить, обладает ли каждое из них антагонистическим и/или агонистическим эффектом.
FACS-анализ применяли, чтобы определить, способны ли три химерных антитела к CD40 связывать либо huCD40, либо CD40 макака-крабоеда, экспрессированный на клетках эмбриональной почки человека (HEK). В то время как каждое из трех химерных антител могло связывать CD40 человека, экспрессированный на клетках НЕК, только два из химерных антител распознавали молекулу макака-крабоеда - химерное антитело 3 (cnAb3) не связывалось с CD40 макака-крабоеда. Результаты исследования по связыванию с использованием FACS обобщены в таблице 10.
50
FACS-анализ также применяли для определения того, могли ли три химерных антитела подавлять связывание растворимого лиганда CD40 (sCD40L) с CD40. С применением клеток НЕК, экспрессирующих CD40, измеряли значения IC. Как описано в таблице 10, каждое из химерных антител было способно блокировать связывание CD40 с его лигандом.
В дополнение к анализам связывания антагонистическую и агонистическую виды активности измеряли с применением CD40-экспрессирующей линии клеток с геном-репортером, экспрессирующей CD40 человека, связанный с NFkB-активируемой щелочной фосфатазой (АР). В CD40-экспрессирующей линии клеток с геном-репортером, если сигнал получен благодаря CD40, активация NFkB приводит к секреции АР, которую измеряют с помощью колориметрического субстрата. Чтобы определить антагонистическую активность, линию клеток (НЕК) с геном-репортером для обнаружения CD40 культивировали либо с линей клеток Jurkat, экспрессирующей CD40L (для обеспечения физиологического взаимодействия с лигандом), либо с растворимым CD40L (например, His-CD40L, упомянутым в таблице 10). Измеряли способность антитела к CD40 блокировать сигнал с участием NFkB. Для измерения агонистической активности линию клеток с геном-репортером для обнаружения CD40 человека напрямую обрабатывали с помощью антител к CD40 и измеряли сигнал с участием NFkB. Типичные данные анализов на антагонистическую и агонистическую активность в отношении CD40 для этих трех химерных антител обобщены в таблице 10 и на фигурах 1А и 1В.
Как описано в таблице 10 и на фигуре 1, химерные антитела к CD40 проявляли антагонистическую активность без детектируемой агонистической активности. Исходя из результатов приведенных выше экспериментов, вариабельные области тяжелой и легкой цепей из антител-антагонистов к CD40, Ab1 и Ab3, отбирали для гуманизации.
Пример 2. Гуманизация антител-антагонистов к CD40, Ab1 и Ab3
Гуманизация антитела-антагониста к CD40 Ab1
Гуманизированные антитела получали на основании последовательностей CDR вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) из Ab1. В частности, последовательности зародышевого типа человека отбирали для конструирования CDR-привитых гуманизированных антител на основе Ab1, в которых CDR-домены из VH- и VL-цепей Ab1 прививали на различные акцепторные последовательности тяжелой и легкой цепей человека. На основании выравниваний последовательностей VH- и VL-областей моноклонального антитела Ab1, следующие последовательности человека были отобраны как акцепторы:
1. IGHV3-21*01 и IGHJ6*01 для конструирования акцепторных последовательностей тяжелой цепи;
2. IGHV3-48*01 и IGHJ6*01 в качестве альтернативного акцептора для конструирования тяжелой цепи;
3. IGKV4-1*01 и IGKJ2*01 для конструирования акцепторных последовательностей легкой цепи;
4. IGKV2-40*01 и IGKJ2*01 в качестве альтернативного акцептора для конструирования легкой цепи.
Затем получали CDR-привитые антитела с помощью привития соответствующих CDR из VH- и VL-областей Ab1 в акцепторные последовательности, описанные в 1-4 выше.
Для получения гуманизированного антитела с обратной(-ыми) мутацией(-ями) каркасной области, мутации каркасной области идентифицировали и вводили в CDR-привитые антитела. Эти мутации вводили с применением стандартных методики, включая de novo синтез вариабельного домена с обратной(-ыми) мутацией(-ями) и мутагенными олигонуклеотидными праймерами в полимеразных цепных реакциях. Для каждого из CDR-привитых антител (содержащих CDR из антитела Ab1) конструировали различные комбинации обратных мутаций и других мутаций следующим образом. (Обратите внимание: номера остатков для упомянутых ниже мутаций основаны на системе нумерации Kabat).
В случае тяжелых цепей CDR-привитых антител подвергали обратному мутированию один или несколько из следующих остатков в зоне Vernier и на стыке VH/VL: V48I и/или S49A.
В случае легких цепей CDR-привитых антител повергали обратному мутированию следующий остаток в зоне Vernier и на стыке VH/VL: Y36F.
Описание вариабельных областей гуманизированных антител, происходящих от мышиного моноклонального Ab1, приведено ниже:
- гуманизированная Ab1 (huAb1VH.1) представляет собой CDR-привитую VH-область АЫ, содержащую последовательности каркасных областей IGHV3-21*01 и IGHV6*01;
- гуманизированная Ab1VH.1a (huAb1VH.1A) представляет собой гуманизированную тяжелую цепь, содержащую аминокислотные последовательности huAb1VH.1 со следующими двумя обратными мутациями каркасной области: V48I, S49A;
- гуманизированная Ab1VL.1 (huAb1VL.1) представляет собой CDR-привитую VL-область Abl, содержащую последовательности каркасных областей IGKV4-1*01 и IGKJ2*01;и
- гуманизированная Ab1VL.1a (huAb1VL.1A) представляет собой гуманизированную легкую цепь на основе huAb1VL.1 и содержит 1 предложенную обратную мутацию каркасной области: Y36F.
Обратите внимание: IGHV3-21_IGHJ6 обозначает антитело, содержащее
последовательности вариабельной области, соответствующие IGHV3-21*01 и IGHJ6*01.
Затем гуманизированные вариабельные области клонировали в векторы экспрессии IgG для определения функциональных характеристик четырех различных гуманизированных антител, основанных на следующих комбинациях вариабельных областей тяжелой и легкой цепей:
A. huAb1VH.1/VL.1
B. huAb1VH.1A/VL.1
C. huAb1VH.1/VL.1A
D. huAb1VH.1A/VL.1A
Аминокислотные последовательности вариабельной области и CDR вышеприведенных гуманизированных антител описаны в таблице 11 ниже.
Как описано выше, CDR гуманизированных версий VH- и VL- областей Ab1 были идентичны мышиному антителу Ab1.
Гуманизация антитела-антагониста 3 (Ab3) к CD40
Гуманизированные антитела также получали на основании последовательностей CDR вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) из Ab3. Последовательности зародышевого типа человека отбирали для конструирования CDR-привитых антител на основе гуманизированного Ab3, в которых CDR-домены из VH- и VL-цепей Ab3 прививали на различные акцепторные последовательности тяжелой и легкой цепей человека. На основании выравниваний последовательностей VH- и VL-областей моноклонального антитела Ab3, следующие последовательности человека были отобраны как акцепторы:
1. IGHV3-69*06 и IGHJ6*01 для конструирования акцепторных последовательностей тяжелой цепи;
2. IGHV1-18*01 и IGHJ6*01 в качестве альтернативного акцептора для конструирования тяжелой цепи;
3. IGKV2-29*02 и IGKJ2*01 для конструирования акцепторных последовательностей легкой цепи;
4. IGKV2-28*01 и IGKJ2*01 в качестве альтернативного акцептора для конструирования легкой цепи.
Получали CDR-привитые антитела с помощью привития соответствующих CDR из VH- и VL-областей Ab3 в акцепторные последовательности, описанные в 1-4 выше.
Для получения гуманизированного антитела с обратной(-ми) мутацией(-ми) каркасной области целый ряд мутаций каркасной области идентифицировали и вводили в CDR-привитые антитела. Эти мутации вводили с применением стандартных методики, включая de novo синтез вариабельного домена с обратной(-ми) мутацией(-ми) и мутагенными олигонуклеотидными праймерами в полимеразных цепных реакциях. Для каждого из CDR-привитых антител (содержащих CDR из антитела Ab3) конструировали различные комбинации мутаций, в том числе обратные мутации, следующим образом. (Обратите внимание: номера остатков для упомянутых ниже мутаций основаны на системе нумерации Kabat).
В случае тяжелых цепей Ab3 подвергали обратному мутированию один или несколько из следующих остатков в зоне Vernier и на стыке VH/VL: M48I, V67A, I69L. В дополнение, рассматривали возможность изменения Q1E. Мутацию Q1E вводили, чтобы предупредить образование пироглутамата.
В случае легких цепей Ab3 подвергали обратному мутированию один или несколько из следующих остатков в зоне Vernier и на стыке VH/VL: Y36F, L46Y.
Описание вариабельных областей гуманизированных антител, происходящих от мышиного моноклонального Ab3, рассмотрено ниже:
- huAb3VH.1z представляет собой CDR-привитую гуманизированную VH Ab3, содержащую последовательности каркасных областей IGHV1-69*06 и IGHJ6*01;
- huAb3VH.1 основана на huAb3VH.1z с изменением Q1E для предупреждения образования пироглутамата;
- huAb3VH.1A представляет собой гуманизированный формат, основанный на huAb3VH.1 и содержащий 3 дополнительных обратных мутации каркасной области: M48I, V67A, I69L;
- huAb3VH.1b представляет собой промежуточный формат между huAb3VH.1 и huAb3VH.l А и содержит 1 предложенную обратную мутацию каркасной области: I69L;
- huAb3VL.1 представляет собой CDR-привитую, гуманизированную VL Ab3, содержащую последовательности каркасных областей IGKV2-28*01 и IGKJ2*01;
- huAb3VL.1A представляет собой гуманизированный формат, основанный на huAb3VL.1 и содержащий 2 обратные мутации каркасной области: Y36F, L46Y;
- huAb3VL.1B представляет собой промежуточный формат между huAb3VL.1 и huAb3VL.1A. Он содержит 1 предложенную обратную мутацию каркасной области: L46Y.
Также обратите внимание, что * IGHV1-69_IGHJ6 получен из последовательностей зародышевого типа IGHV1-69*06 и IGHJ6*01.
Затем гуманизированные вариабельные области клонировали в векторы экспрессии IgG для определения функциональных характеристик девяти различных гуманизированных антител, основанных на следующих комбинациях вариабельных областей тяжелой и легкой цепей:
A. huAb3VH.1/VL.1
B. huAb3VH.1B/VL.1
C. huAb3VH.1A/VL.1
D. huAb3VH.1/VL.1A
E. huAb3VH.1B/VL.1A
F. huAb3VH.1A/VL.1A
G. huAb3VH.1/VL.1B
H. huAb3VH.1B/VL.1B
I. huAb3VH.1A/VL.1B
Аминокислотные последовательности вариабельной области и CDR вышеприведенных гуманизированных антител описаны в таблице 12 ниже.
Как описано выше, CDR гуманизированных версий VH- и VL- областей Ab3 были идентичны мышиному антителу Ab3.
Поскольку Ab3 не связывался с CD40 макака-крабоеда (см. пример 1), гуманизированные версии Ab1 отбирали для дальнейшего анализа.
Пример 3. Модификация CDR1 VL-области гуманизированных антител Ab1
Исследование гуманизированных последовательностей VH- и VL-областей антитела Аb1, описанных выше, идентифицировало последовательность потенциального мотива дезамидирования (мотив "NS"), располагаемого открыто в CDR1 легкой цепи. Идентифицировали сайт мотива "NS", который может приводить к дезамидированию и гидролизу, и приводит к сукцинимидному промежуточному соединению и аспартил-ASP или изо-ASP. Таким образом, последовательность мотива исключали из последовательностей CDR1 VL-области гуманизированного Ab1. Удаление мотива "NS" позволит улучшить производство антитела.
Дальнейшая разработка гуманизированного Ab1 привела к шести различным антителам. Примечательно, что четыре сохранили антагонистическую активность, в то время как два стали антителами-агонистами (huAb1v4 и huAb1v3). Как показано в таблице 14, huAb1v4 и huAb1v3 проявляли агонистическую активность, как определено с помощью анализа с геном-репортером для обнаружения huCD40, в то же время не проявляя антагонистическую активность, как определено в анализе с Jurkat/геном-репортером. Аминокислотные последовательности VH- и VL-областей, а также CDR вариантов гуманизированных антител Ab1 (huAb1v1-huAb1v6) описаны ниже в таблице 13.
В дополнение к модификации мотива "NS" в CDR1 VL-области, варианты huAb1v2 и huAb1v3, описанные выше в таблице 13, имеют дополнительные мутации каркасной области в своих VH-доменах.
В таблице 14 ниже представлено обобщение активности связывания, агонистической и антагонистической активности вариантов. Описание анализов можно найти выше в примере 2. Мотив "NS", который был подвергнут мутированию в CDR1 VL-области, подчеркнут в таблице 14 ниже. Как описано в таблице 14, антитела huAb1v4 (содержит мутацию "Р" в CDR1-домене VL-области) и huAb1v3 (содержит мутацию "L" в CDR1-домене VL-области и мутации каркасной области в пределах VH-области) проявляли агонистическую активность, несмотря на то, что они происходят из исходного антитела с антагонистической активностью.
*Дополнительные различия каркасных областей в VH-области.
Гуманизированное антитело к CD40 huAb1v1 отобрали для дальнейшего исследования и улучшения.
Пример 4. Разработка CDR2 НС антитела к CD40 huAb1v1
Из вариантов, описанных в примере 3, антитело huAb1v1 было отобрано для дальнейшего анализа. Чтобы дополнительно улучшить эффективность этого антитела, получали варианты тяжелой цепи (НС) huAb1v1, содержащие мутации в пределах CDR2-домена НС. Получали семнадцать дополнительных вариантов (обозначенных как huAb1v1CDR2v1 - v17). Вариантные НС-области объединяли в пару с LC huAb1v1 (SEQ ID NO: 20) для исследований активности, чтобы определить агонистическую и антагонистическую активность. Получали семнадцать вариантов тяжелых цепей, и исследования in vitro активности показали, что, в целом, варианты сохраняли свою антагонистическую активность и неоднородную эффективность по сравнению с huAb1v1. В таблице 15 показано, что хотя варианты антитела сохраняли антагонистическую активность, эффективность каждого варианта варьировала.
Все варианты НС huAb1v1 подвергали мутированию в положении S55, как описано ниже в таблице 16 (положение 55 подчеркнуто).
В таблице 17 ниже представлено сравнение CDR-2-областей НС описанных выше вариантов huAb1v1, после разработки остатка S55 (выделен жирным/подчеркнут). CDR2-область VH huAb1v1 соответствует аминокислотным остаткам 50-66 из SEQ ID NO: 15.
Вариабельную область тяжелой цепи huAb1v1CDR2v7 отбирали, как характеризующуюся особенно преимущественными свойствами в сравнении с остальными вариантами, которые были получены и описаны выше в таблицах 15-17. Примечательно, что huAb1v1CDR2v7 имеет мутацию в своей CDR2 НС, идентифицированную как S55G.
В частности, определили, что антитело, содержащее VL-область антитела huAb1v1 (SEQ ID NO: 20; см. таблицу 13) и VH huAb1v1CDR2v7, характеризуется 20Х повышенной антагонистической активностью в сравнении с антителом huAb1v1.
VL-область huAbv1 и VH-область huAb1v1 CDR2v7 экспрессировали с учетом двух различных константных областей IgG1 человека. Одну константную область IgGl выбирали, поскольку ее эффекторная функция была ослаблена (hCg1, z, без L234A, L235A или LALA), а другую константную область IgG1 выбирали, поскольку у нее была ослаблена эффекторная функция, и также она имела набор мутаций, которые усиливали связывание FcRn (hCg1, z, без L234A, L235A - T250Q, M428L или LALA-QL). В таблицах 18 и 19 ниже представлена информация об аминокислотной последовательности тяжелой и легкой цепей антител к CD40 человека Ab101 (VL-область huAbv1/VH-область huAb1v1CDR2v7/hCg1/k-LALA) и Ab102 (VL-область huAbv1/VH-область huAb1v1CDR2v7/hCg1/k-LALA-QL).
Аминокислотные остатки индивидуальных CDR каждой последовательности VH-или VL-области указаны жирным шрифтом. Константные области подчеркнуты в таблице 19.
Пример 5. Определение функциональных характеристик гуманизированных антител-антагонистов Ab101 и Ab102 к hCD40
In vitro анализ
50
50
50
Оба гуманизированные антитела к CD40, Ab101 и Ab102, демонстрировали антагонистическую активность, аналогичную результатам в анализе с геном-репортером, описанном в примере 1. Поскольку остаточная агонистическая активность связана с потенциальными рисками, разработали анализ на агонистическую активность с применением В-клеток. В данном анализе антитела оценивали в отношении подавления повышения уровня CD86 в В-клетках человека. В-клетки человека постоянно экспрессируют CD40, и передача сигнала через CD40 приводит к активации В-клеток, что измеряют по повышению уровня CD86 на поверхности. В-клетки активировали с помощью низкой дозы антитела к IgM и IL4 и добавляли антитела-антагонисты CD40. Усиление активации В-клеток измеряли как повышение уровня CD86, что наблюдали в присутствии Ab-агониста CD40, но не Ab-антагониста CD40, что позволяет предположить недетектируемую агонистическую активность у лидерного кандидата in vitro. Для измерения антагонистической активности первичные В-клетки человека культивировали с CD40L-экспрессирующей линией Т-клеток человека, что приводит к активации В-клеток и повышению уровня экспрессии CD86 вследствие взаимодействия CD40/CD40L. Измеряли способность антагониста CD40 подавлять повышение уровня CD86 в первичных В-клетках человека, и для антитела Ab101 к CD40 показана сильная антагонистическая активность, как показано на фигуре 2В. На фигуре 2А показано, что антитело Ab101 не обладает агонистической активностью. Примечательно, что, как описано на фигуре 2В, антитело Ab101 характеризуется значением IC, составляющим 1,337, в сравнении с антителом-антагонистом Bib (Boehringer Ingelheim), которое характеризуется значением IC, составляющим 4,213, и антителом-агонистом AD11 (Astellas), которое характеризуется значением IC, составляющим 0,1906. Таким образом, антитело Аb101 (и Ab102 при условии идентичных вариабельных областей) является сильным антагонистом CD40 и не демонстрирует значительной агонистической активности in vitro.
In vivo анализ
Чтобы протестировать in vivo активность антитела Ab101, разработали модель выработки антител человека и выживания В-клеток. Вкратце, когда РВМС человека, выделенные от здоровых доноров, переносили в scid-мышей с иммунодефицитом, выработку IgG человека в ответ на антигены мыши измеряли через 14 дней. В дополнение, FACS-анализ спленоцитов от этих мышей показал приживление и выживание В-клеток человека. Антиген-специфический ответ измеряли путем введения провокационной пробы с вакциной столбнячного анатоксина (TetTox) и измерения TetTox-специфических IgG (Naito, 2000; Jeurissen, 2004).
Обработка этих huscid-мышей с помощью еженедельных доз антитела к CD40 человека (Ab101, 5 мг/кг, IP) приводила к > 85% подавлению выработки IgG человека (фигура 3А) и выживания В-клеток (фигура 3В), что явно демонстрирует то, что антитело является активным in vivo. В частности, на фигуре 3А показано, что антитело Ab101 было способно подавлять выработку IgG в сравнении с контрольным Ig, а на фигуре 3В указано, что введение антитела Ab101 в описанную выше huscid-модель, подавляло выживание В-клеток.
Пример 6. Эпитопный анализ Fab Ab102
Кристаллографические исследования осуществляли с применением Fab Ab102, чтобы определить эпитоп, с которым связывается Fab Ab101. Как описано выше, последовательности VH- и VL-областей антител Ab101 и Ab102 являются одинаковыми, и, следовательно, применение Fab Ab102 в следующем исследовании кристаллической структуры создает представление о свойствах связывания обоих антител Ab101 и Ab102.
Кристаллические структуры определяли для Fab Ab102 отдельно и для Fab Ab101 в комплексе с антигеном CD40. Получали кристаллы и данные собирали с помощью пучка синхротронного излучения IMCA-CAT 17ID. Кристаллическую структуру Fab Ab102 определяли до разрешения 1,74 , а структуру комплекса Fab Ab102/CD40 определяли до разрешения 2,84 . Кристаллические структуры обеспечивали идентификацию 3D-конформационного эпитопа Fab Ab102.
Идентификация 3D-конформационного эпитопа Fab Ab102
В контакты между Fab Ab102 и CD40 вовлечены как критические водородные связи, так и гидрофобные взаимодействия, которые стабилизируют поверхность контакта. Перечень молекулярных контактов (измеренных под 4,0 ) получали с применением программы NCONT в пакете программ ССР4. Контакты измеряли между двумя отдельными кристаллографическими мономерами CD40 и соответствующим образом связанными легкой и тяжелой цепями Fab Ab102. Дополнительные контакты наблюдали между Fab Ab102 и кристаллографическим димером CD40 (димер, образованный за счет контактов кристаллов). Исходя из этой информации эпитоп для связывания Fab Ab102 содержит топографическую область, определяемую Cys62-Phe67, Gln79-Cys83, Arg90-Thr99, Thr24-Cys37 из CD40.
Материалы и способы
Получение и очистка антигена CD40
Последовательность ДНК, кодирующую внеклеточный домен CD40 человека (аминокислоты 1-193) клонировали в вектор pHybE, за которой помещали в рамке считывания С-концевой сайт расщепления для Tev-протеазы и гексагистидиновую метку (SEQ ID NO: 115). Плазмиду трансфицировали в клетки HEK293 6е (MRL) из расчета 1×10е6 клеток/мл с применением реагента для трансфекции полиэтиленимина (PEI, Polysciences Inc) из расчета соотношения РЕI:ДНК, составляющего 4:1. Культуру трансфицированных клеток снабжали триптоном-N1 (до 0,5%) через 24 ч. после трансфекции. В день 7 после трансфекции культуру трансфицированных клеток очищали с помощью центрифугирования с последующей фильтрацией через 0,2 мкм фильтр PES (Corning). В очищенной среде проводили замену буфера на PBS, рН 7,4, с применением TFF-системы Kvick, оснащенной мембранами с порами 10 кДа (GE Healthcare), и загружали на 5 мл FF-колонку HisTrap (GE Healthcare), уравновешенную с помощью PBS, рН 7,4. Колонку промывали с помощью 25 мМ имидазола в PBS, рН 7,4, и связанный белок элюировали с помощью 250 мМ имидазола в PBS, рН 7,4. Элюированный белок концентрировали с применением устройств для фильтрования на центрифуге Amicon Ultra-15 (Millipore) с отсечением по молекулярной массе 10 кДа, и дополнительно очищали с помощью SEC на колонке 26/60 Superdex 200 (GE Healthcare), уравновешенной и прогоняемой с PBS, рН 7,4. Фракции, содержащие CD40, объединяли, концентрацию измеряли по поглощению при 280 нм, и образцы анализировали с помощью SEC, SDS-PAGE и масс-спектрометрии. [CD40(h)(21-193)]-Tev-His6 ("His6" раскрывается в SEQ ID NO: 115) хранили в аликвотах при -80°С.
Получение и очистка Fab-фрагмента Ab102 к CD40
Fab-фрагмент Ab102 к CD40 получали с помощью расщепления папаином исходного mAb, как подробно описано ниже. Папаин активировали с помощью 50 мМ цистеина в PBS, буфер с рН 7,4. mAb Ab102 к CD40 [hu IgG1/k] LALA QL в PBS, буфер с рН 7,4, смешивали с папаином из расчета весового соотношения 1:100 папаина и mAb и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Реакцию останавливали с помощью 5 мМ иодацетамида. Смесь очищали на 10 мл смолы Mab SelectSure (GE Healthcare), на которой Fab-фрагмент собирали как проточную фракцию. Проточную фракцию концентрировали с применением устройства для центрифугирования Ultrafree-15 Biomax (Millipore) с отсечением по молекулярной массе (MWCO) 10 кДа. Концентрированную смесь очищали на 2,6 см × 60 см колонке Sephacryl 200 HiPrep (GE Healthcare), предварительно уравновешенной с помощью 50 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, буфер с рН 7,5. Фракции, содержащие Fab-фрагмент (отслеживание с помощью UV-поглощения при 280 нм) объединяли и замораживали при -80°С. Чистоту образца оценивали с помощью аналитической SEC, SDS-PAGE и масс-спектрометрии.
Получение комплекса CD40/Fab Ab102 к CD40
Рекомбинантный CD40 человека экспрессировали в системе экспрессии на основе клеток млекопитающего и затем очищали с применением методик, хорошо известных из уровня техники. Рекомбинантный CD40 человека и белок Fab Ab102 к CD40 смешивали из расчета молярного соотношения 1,1:1 и инкубировали в течение 4 ч при 4°С. Образец с комплексом загружали на 2,6 см × 60 см колонку Sephacryl 200 HiPrep (GE Healthcare), предварительно уравновешенную с помощью 50 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, буфера рН 7,5, при скорости 1 мл/мин. Фракции, содержащие комплекс (отслеживание с помощью UV-поглощения при 280 нм) объединяли и концентрировали до 18 мг/мл с применением устройства для центрифугирования Ultrafree-15 Biomax (Millipore) с отсечением по молекулярной массе (MWCO) 10 кДа. Чистоту образца оценивали с помощью аналитической SEC и SDS-PAGE.
Кристаллизация Fab Ab102
Fab отдельно обеспечивали из расчета 22,5 мг/мл в 50 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, рН 7,5. Кристаллы росли за счет диффузии паров при 23°С. Резервуар содержал 25% (вес./об.) РММЕ 550, 0,1 М MES рН 6,5, 0,01 М сульфата цинка. Каплю получали путем добавления равных объемов белка и раствора из резервуара. Кристаллы росли в виде толстых призм и их подвергали криопротекции с применением раствора из резервуара с добавлением 10% (об./об.) пропиленгликоля. Кристаллы собирали, проводили через криораствор и подвергали криозамораживанию непосредственно в жидком азоте. Данные по дифракции до 1,74  собирали в газообразном азоте при 100 K в пучке синхротронного излучения 17ID в комплексе Advanced Photon Source, расположенном в Argonne National Laboratories (Аргон, Иллинойс).
Кристаллизация Fab Ab102 в комплексе с антигеном CD40
Комплекс Fab обеспечивали из расчета 18 мг/мл в 50 мМ HEPES, 50 мМ NaCl, рН 7,5. Применяемая конструкция антигена представляла собой [CD40 (h) (21-193)]-TEV-6His ("His6" раскрыт в SEQ ID NO: 115). Кристаллы росли за счет диффузии паров при 23°С. Резервуар содержал 2 М сульфата аммония, 0,1 М фосфата-цитрата, рН 4,2. Каплю получали путем добавления равных объемов белка и раствора из резервуара. Кристаллы росли в виде тонких палочек, и их подвергали криопротекции с применением 2,5 М сульфата лития. Кристаллы собирали, проводили через криораствор и подвергали криозамораживанию непосредственно в жидком азоте. Данные по дифракции до 2,84  собирали в газообразном азоте при 100 K в пучке синхротронного излучения 17ID в комплексе Advanced Photon Source, расположенном в Argonne National Laboratories (Аргон, Иллинойс).
Определение структуры Fab Ab102 и комплекса Fab Ab102 и CD40
Данные по дифракции для обеих кристаллических структур обрабатывали с применением программы autoPROC от Global Phasing Ltd.
1
free
work
Набор данных для Fab Ab102 обрабатывали в группе симметрии C222 со следующими размерами элементарной ячейки: а=64,65 b=130,4 с=132,6. Решение молекулярного замещения, полученное методом максимального правдоподобия, определяли с применением программы PHASER с применением модели поиска Fab, которая сообщалась ранее (номер доступа в Protein Data Bank 3Q0S). Координаты для 1 молекулы Fab получали, исходя из решения молекулярного замещения. Предварительную детализацию полученного решения проводили с применением REFMAC и программы BUSTER. Итеративное построение модели белка проводили с применением программы COOT и исследования карт электронной плотности 2Fo-Fc и Fo-Fc. Детализацию заканчивали добавлением молекул воды с применением BUSTER. Статистические исследования конечной детализации указали на значения R/R, составляющие 0,23/0,19.
1
1
free
work
Набор данных для комплекса Fab Ab102 и CD40 обрабатывали в группе симметрии P222 со следующими размерами элементарной ячейки: а=173,3 b=76,0 с=126,1. Решение молекулярного замещения, полученное методом максимального правдоподобия, определяли с применением программы PHASER с применением ранее решенного Fab Ab102, которое сообщалось выше. Координаты для 2 молекул Fab отыскивали, исходя из решения молекулярного замещения. Предварительную детализацию полученного решения проводили с применением REFMAC и программы BUSTER. Модель для CD40 строили вручную с применением программы COOT и исследования карт электронной плотности 2Fo-Fc и Fo-Fc. Детализацию заканчивали добавлением молекул воды с применением BUSTER. Статистические исследования конечной детализации указали на значения R/R, составляющие 0,25/0,20.
Пример 7. Эффективность нейтрализации и агонистическая активность Ab102 в анализе активации моноцитов
Следующие способы применяли в данном примере, в котором исследовали антагонистическую и агонистическую активность Ab102 in vitro.
6
2
Анализ на антагонистическую активность. Способность Ab102 блокировать CD40-опосредованную активацию моноцитов оценивали в анализе на антагонистическую активность. Очищенные моноциты смешивали с 1 мкг/мл MEGACD40L (Enzo) в присутствии 80 нг/мл GM-CSF и 80 нг/мл IFNγ при концентрации 2×10/мл. По 50 мкл на лунку вносили в 96-луночный планшет для культур тканей (ТС) с U-образным дном. Разведения тестируемых материалов готовили в среде для культивирования и по 50 мкл разведений добавляли к моноцитам человека, полученным от донора. Клетки культивировали при 37°С, 5% СО в течение двух дней перед тем, как собрали супернатанты для анализа в отношении цитокинов (TNF) с применением платформы для иммунологического анализа Meso Scale Discovery (MSD).
6
2
Анализ на агонистическую активность. Оценивали способность Аb102 индуцировать активацию моноцитов через CD40. MEGACD40L (Enzo) применяли в качестве положительного контроля для активации моноцитов. Очищенные моноциты человека разводили до 2×10/мл в среде для культивирования в присутствии 80 нг/мл GM-CSF и 80 нг/мл IFNγ и по 50 мкл/лунка вносили в 96-луночный ТС-планшет с U-образным дном. Разведения тестируемых материалов готовили в среде для культивирования и по 50 мкл разведений добавляли к моноцитам. Клетки культивировали при 37°С, 5% СО в течение двух дней перед тем, как собрали супернатанты для анализа в отношении цитокинов (TNF) с применением платформы для иммунологического анализа Meso Scale Discovery (MSD).
50
Поскольку миелоидные клетки играют важную роль в патогенезе болезни Крона, чтобы оценить функциональную активность Ab102 были разработаны упомянутые выше анализы на основе моноцитов. Передача сигнала с помощью CD40 индуцирует активацию моноцитов и, тем самым, выработку воспалительных цитокинов, таких как TNF. Типичные анализы на антагонистическую и агонистическую активность с применением моноцитов для Ab102 показаны на фигурах 5А и 5В соответственно. Как показано на фигуре 5А, Ab102 блокировало экспрессию TNF зависимым от концентрации образом. В формате анализа на агонистическую активность растворимый CD40L индуцировал выработку TNF моноцитами с ЕС, составляющей 1,9 нМ, в то время как Ab102 не индуцировало выработку TNF при концентрациях вплоть до 200 нМ. Как описано на фигуре 5В, уровни TNF при применении Ab102 были аналогичны уровням при применении отрицательного контроля (нерелевантного IgG), что указывает на уровень выработки TNF от небольшой до недетектируемой. Постоянные результаты получали для трех различных доноров, при этом значения IC50 показаны в таблице 20 ниже.
Итак, результаты тестирования Ab102 в обоих анализах на антагонистическую и агонистическую активность, описанных выше, показали, что Ab102 представляет собой антитело-антагонист к CD40, которое практически не проявляет агонистическую активность с отсутствием измеряемой агонистической активности.
Пример 8. Перекрестная реактивность Ab102
Тестировали перекрестную реактивность Ab102 в отношении CD40 от различных видов. При применении стандартных методики меченное Alexa 647 Ab102 демонстрировало аналогичную кинетику связывания с CD40 как человека, так и макака-крабоеда на поверхности В-клеток со значением ЕС50, составляющим 0,89±0,17 нМ для клеток человека и 1,4±0,15 нМ для клеток макака-крабоеда, как показано в таблице 21 ниже. Связывание Ab102 с CD40 мыши, крысы и кролика нельзя было обнаружить при концентрациях вплоть до 30 мкг/мл (200 нМ).
Итак, Ab102 связывалось с CD40 человека и макака-крабоеда, но не демонстрировало детектируемого связывания с CD40 мыши, крысы или кролика с применением стандартных анализов связывания.
Пример 9. Применение антитела 138 мыши к CD40 для лечения колита, развившегося в результате переноса Т-клеток
Следующие способы применяли в in vivo исследовании для определения способности антитела мыши к CD40 (антитела 138) лечить колит. Антитело 138 к CD40 мыши обладало характеристиками, аналогичными Ab102, например, антитело 138 представляет собой антитело-антагонист без значительной агонистической активности, как и Ab102. Таким образом, антитело 138 является репрезентативным относительно активности Ab102 на мышиной модели из примера 9. Далее описана in vivo модель колита, полученная путем переноса Т-клеток
Выделение и инъекция наивных Т-клеток
8
+
high
+
low
6
5
В день 0 селезенки собирали у мышей balb/c и помещали в среду RPMI, дополненную 4% фетальной бычьей сыворотки (полная среда), на льду. Суспензию из отдельных клеток получали с помощью механического разрушения и пропускания через 100 мкм сито для клеток в среду RPMI, дополненную 4% фетальной бычьей сывороткой (полная среда). Клети собирали с помощью центрифугирования (1250 об/мин в течение 10 минут при 4°С) и ресуспендировали в буфере Robosep (Stem Cell Technologies). Концентрацию клеток измеряли с применением счетчика Moxi Mini Cell Counter (Orflo) и доводили до 1×10 клеток/мл в буфере Robosep. CD4+ Т-клетки выделяли с применением набора магнитных гранул для негативного отбора (Stem Cell Technologies) в соответствии с указаниями производителя. Клетки дополнительно очищали с помощью FACS с получением популяций CD4CD45RB и CD4CD45RB, которые собирали как 42% самых светлых и 12% самых тусклых клеток соответственно. Клетки подсчитывали и доводили до 1×10 клеток/мл и 0,5 мл (1×10 клеток) инъецировали внутрибрюшинно (IP) в SCID-мышей.
Лечение
Затем антитело 138 мыши к CD40 вводили IP в различных дозах в PBS два раза/неделя SCID-мышам (описаны выше), начиная либо в момент инъекции клеток (профилактическое лечение), либо после того, как заболевание было подтверждено с помощью эндоскопии (терапевтическое лечение). В дополнение был включен ряд контрольных групп. Группы получали либо 1) IP 15 мг/кг антитела 951 (нерелевантный IgG) в PBS два раза/неделя, либо 2) IP антитело 138 (антитело, которое блокирует CD40L) в PBS, два раза/неделя. В дополнение, в исследованиях по переносу Т-клеток (ТСТ) либо антитело к p40(IL-12/23), либо моноклональное антитело к TNF вводили в качестве клинически релевантных контрольных препаратов для сравнения.
Эндоскопия
В различные моменты времени после инъекции клеток в мышей развитие заболевания оценивали с помощью колоноскопии. После проведения анестезии с помощью изофлурана гибкую иглу желудочного зонда медленно вводили в анальное отверстие и медленно инъецировали 300 мкл PBS, чтобы удалить фекальные гранулы. Животным позволяли отойти от анестезии и передвигаться, чтобы облегчить прохождение любых оставшихся гранул (приблизительно пять минут). Мышам вновь проводили анестезию изофлураном и эндоскопический зонд (Karl Storz) вводили в анальное отверстие на глубину 3 см. Фотографические изображения получали на расстоянии 3, 2 и 1 см от края анального отверстия. На основании изображений определяли баллы позже с применением шкалы, подробно описанной в таблице 22 ниже. Баллы каждого параметра для каждой из трех глубин объединяли с получением суммарного балла индекса активности заболевания мыши на основании эндоскопии (MEDAI), показанного в таблице 22. Максимальный балл, который можно было получить с применением суммарного балла MEDAI, составлял 24.
В случае терапевтического введения доз, определение балла на основании эндоскопии через три недели после инъекции клеток применяли для подтверждения развития заболевания и распределения животных в группы лечения.
Гистология
GI-образцы предоставляли в кассетах, ориентированных как вытянутые сегменты толстой кишки целиком, что обеспечивало возможность анализа толстой кишки по всей длине, и их обрабатывали как фиксируемые в формалине и заливаемые в парафин (FFPE) ткани. Блоки нарезали толщиной 5 микрон и помещали на стеклянные предметные стекла перед тем, как проводить иммуногистохимическое исследование для обнаружения молекулы 1 адаптора, связывающего ионизированный кальций (IBA1), с применением антитела к IBA1 (кат. №019-19741; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Маркер IBA1 применяли для идентификации макрофагов в срезах ткани. Предметные стекла докрашивали метиловым зеленым, обезвоживали и накрывали покровным стеклом.
Затем предметные стекла сканировали при увеличении 4х с помощью системы визуализации Vectra и мозаичные изображения 4х малого увеличения проверяли перед выбором участков для получения изображений при увеличении 20х.
С помощью системы визуализации Vectra повторно сканировали предметные стекла и захватывали выбранные изображения 20х большого увеличения при большом разрешении, которые затем подвергали алгоритмам анализа изображений в программном обеспечении inForm (Perkin Elmer). Применяемый набор алгоритмов inForm имеет три алгоритма: первый алгоритм задает порог окрашивания IBA1 и CD3 в спектрально отображенных файлах, чтобы исключить фоновую/постороннюю окраску. Последующие алгоритмы делят ткань на представляющие интерес ткани (собственная пластинка, эпителий, мышечный слой, подслизистый слой и фон) и количественно оценивают либо CD3, либо IBA1 в RGB-изображениях, полученных в результате применения первого алгоритма.
Данные inForm экспортировали в текстовые файлы, которые сливали в единые файлы данных для данных либо от каждого сегмента тканей, либо от сегмента клеток.
На основании валидации антагонистической активности в острых моделях, модель хронического колита применяли, чтобы провести исследование для подтверждения механизма действия. Три исследования проводили для тестирования эффекта блокирования колита после переноса наивных Т-клеток в хозяина с иммунодефицитом (SCID-мыши). Один уровень дозы изучали в режимах как профилактического, так и терапевтического лечения, при этом в режиме профилактического лечения проверяли эффект полной дозы.
Эффект дозы антитела 138 мыши к CD40, вводимого в момент переноса клеток
Эффект дозы профилактически вводимого антитела 138 мыши к CD40 определяли с применением модели колита, полученной путем переноса Т-клеток. Лечение, которое охватывало диапазон доз (0,5, 1,5, 5 и 15 мг/кг) начинали в момент переноса клеток. Дозы, уменьшающиеся вплоть до 1,5 мг/кг, приводили к максимальному снижению суммарного балла MEDAI, в то время как 0,5 мг/кг не оказывала значительного эффекта. Активность антитела 138 мыши к CD40 была эквивалентна стандартной дозе лекарственного препарата против p40IL-12/23, применяемого в качестве положительного контроля. Гистологический анализ срезов толстой кишки показал уменьшение числа макрофагов (общей меры воспаления), что хорошо коррелировало с эндоскопической оценкой заболевания, как описано на фигуре 6 и фигуре 7. В частности, на фигуре 6 описано дозозависимое снижение балла на основании эндоскопии с помощью профилактического введения антитела 138 мыши к CD40 в день 39 (конечный показатель). На фигуре 6 RBlow обозначает группу отрицательного контроля. Клетки CD45RBlow не опосредуют заболевание. В данной модели колита заболевание опосредуют клетки CD45RBhi, которые переносили в животных. На фигуре 7 показано число IBA1 + макрофагов в толстой кишке мышей (определено гистологическими способами) и описаны более низкие уровни макрофагов при дозах, превышающих 0,5 мг/кг, и более низкие, чем у р40 положительного контроля.
trough
Уровни циркулирующего антитела 138 мыши к CD40 измеряли через 96 часов после введения конечной дозы (эквивалентны C), и было показано, что они являются дозозависимыми, как описано на фигуре 8. Самый низкий уровень дозы (0,5 мг/кг) приводил к концентрации < нижнего предела обнаружения (LLOQ) у всех, кроме одного животного в данной группе.
Эффект дозы антитела 138 мыши к CD40, - вводимого через 3 недели после переноса клеток
1+
Если лечение с помощью антитела 138 мыши к CD40 начинали через три недели после инъекции клеток, после эндоскопического подтверждения заболевания, дозозависимое снижение суммарного балла MEDAI наблюдали в случае самой высокой дозы (15 мг/кг), при этом оно достигало статистической значимости (фигура 9А). Гистологический анализ IВА макрофагов в толстой кишке, в качестве меры миелоидного воспаления, давал аналогичные результаты, как описано на фигуре 9В. Среднее значение концентрации антитела 138 в сыворотке крови, измеренное через 72 часа после введения конечной дозы, составляло 191,9 мкг/мл у животных, которые получали дозу 15 мг/кг.
Пример 10. Т-клеточно-зависимые гуморальные иммунные ответы у макаков-крабоедов
Анализ Т-клеточно-зависимого гуморального иммунного ответа (TDAR) проводили у макаков-крабоедов. Макакам из расчета два животных/пол/группа вводили Ab102 при дозах, составляющих 0 (только среда) или
10 мг/кг, подкожно (SC) в течение 5 недель. Гемоцианин фисуреллы (KLH) вводили всем животным в день 8. Образцы сыворотки крови собирали от каждого животного в дни -11,-7, 0, 4, 7, 10,
14 и 21 относительно введения KLH. Всех животных возвращали в колонию животных испытательной лаборатории после завершения последнего запланированного сбора крови (фигура 10).
Было обнаружено, что Ab102 супрессировало оба Т-клеточно-зависимых гуморальных иммунных ответа с IgM- и IgG-антителами к KLH в сравнении с животными, получавших лечение только с помощью среды, как показано на фигуре 10.
Результаты данного исследования согласовывались с фармакологическим супрессированием
CD40-зависимой выработки IgM- и IgG-антител после парентерального введения прототипного чужеродного белка. Результаты позволили предположить, что применение Ab102 может иметь значение для лечения волчанки, при которой выработка аутоантител является частью заболевания. Эти результаты также подтвердили биологическое значение макаков-крабоедов в качестве подходящего вида для доклинических токсикологических исследований. Кроме того, исследование продемонстрировало перекрестную реактивность в отношении CD40 макака-крабоеда и показало in vivo активность Ab102 в механизме (Т-клеточно-зависимом гуморальном иммунном ответе), для которого, как известно, требуется CD40.
Пример 11. Применение антитела 138 мыши к CD40 для лечения системной красной волчанки (SLE)
rd
Вследствие антагонистической активности антитела 138 мыши к CD40, которая была показана в вышеприведенных острых моделях и в модели колита (см. пример 9), эффективность этого антитела мыши к CD40 проверяли на мышиных моделях системной красной волчанки (SLE). Применяли две SLE-модели: MRL/lpr и NZB/W-F1 (описаны в Theofilopoulos and Kono. 1999. Murine lupus models: gene-specific and genome-wide studies, в Lahita R. G., ed., Systemic Lupus Erythematosus, 3 ed., p. 145). Рациональное обоснование для оценки эффективности лекарственного препарата против CD40 на мышах MRL/lpr и NZB/W-F1 является двояким. Во-первых, модели отличаются по своим проявлениям SLE. У мышей NZB/W-F1 самопроизвольно развивается люпус-нефрит и сиаладенит, тогда как у мышей MRL/lpr развиваются проявления в суставах и коже в дополнение к нефриту и сиаладениту (Andrews et al. J. Exp. Med. 148: 1198-1215. 1978). Поскольку пациенты различаются своими проявлениями SLE, применение обоих моделей позволяет осуществить оценку потенциальной эффективности у большинства пациентов с SLE. Во-вторых, мыши MRL/lpr и NZB/W-F1 отличаются по генетической основе их заболеваний (Perry et al. J. Biomed. Biotech. 2011, Article ID 271694), и, следовательно, эффективность у разных моделей повышает уверенность при переводе на генетически гетерогенных людей.
11.1. MRL/lpr-модель SLE
Для определения эффективности мышам вводили антитело 138 мыши к CD40 с помощью внутрибрюшинной инъекции (i.р.), начиная в возрасте 10 недель из расчета доз, указанных в таблице 23 ниже. В исследовании инъекции PBS применяли в качестве отрицательного контроля, а преднизолон применяли в качестве положительного контроля.
Протеинурию отслеживали еженедельно с помощью Albustix (товарный знак тест-полосок для мочи, применяемых для тестирования на белок в моче). Сильная протеинурия, определяемая как ≥ 300 мг/дл, начинала развиваться вскоре после начала обработки, как показано на фигуре 11А. Как описано на фигуре 11А, к окончанию исследования в день 63, у 50-60% не получавших лечение PBS-контрольных мышей и мышей, получавших лечение с помощью 1,5 мг/кг антитела к CD40, развивалась сильная протеинурия. В отличие от этого, почти у всех мышей в других группах лечения сохранялся невысокая протеинурия на протяжении исследования. Группа лечения с дозой 15 мг/кг 1 раз в неделю значительно отличалась от PBS-контроля. Выживание также отслеживали и было обнаружено, что при введении доз из расчета 15 мг/кг 1 раз в неделю и 5 мг/кг 2 раза в неделю выживание значительно превышало выживание не получавших лечение PBS-контрольных животных, как показано на фигуре 11В. Следует отметить, что многих мышей умерщвляли из-за дистресса, вызванного лимфаденопатией, вызванной мутацией Faslpr, до того как у них развился нефрит. Таким образом, наблюдаемое снижение степени выживания нельзя приписывать исключительно нефриту. Несмотря на это, эти данные указывают на то, что антитело к CD40 дозозависимым образом предотвращало протеинурию и продлевало выживание мышей MRL/lpr, подверженных развитию волчанки.
Эффективность антитела к CD40 в лечении SLE также оценивали на окрашенных гематоксилином и эозином (Н&Е) срезах тканей, фиксированных в формалине и залитых в парафин (FFPE), полученных из почки, слюнной железы и голеностопного сустава мышей из различных групп обработки. Тяжесть заболевания во всех тестируемых органах у PBS-контрольных не получавших лечение мышей возрастала на протяжении 9 недель исследования, по мере того как мыши MRL становились старше с 10 недель в начале до 19 недель в конце.
В случае почки лечение с помощью антитела к CD40 было эффективным при введении из расчета 15 мг/кг в снижении степени проявления гломерулонефрита как в 29, так и в 63 день лечения, как показано на фигуре 12А. Поскольку тяжесть заболевания-гломерулонефрита усиливалась у мышей MRL с возрастом, лечение с помощью антитела к CD40 сохраняло эффективность в сведении к минимуму степени проявления гломерулонефрита при дозах 5 и 15 мг/кг. Антитело к CD40, вводимое в дозе, составляющей 15 мг/кг один раз в неделю, было настолько же эффективным, как и при введении дозы дважды в неделю. Антитело к CD40, вводимое в дозе, составляющей 5 мг/кг, дважды в неделю, характеризовалось практически такой же эффективностью. Антитело к CD40, вводимое в дозе, составляющей 5 и 15 мг/кг, было эффективным в снижении количества периваскулярных (PV) инфильтратов в почке в дни 29 и 63, как показано на фигуре 12В, при этом наблюдалась тенденция уменьшения тубулоинтерстициальных (TI) на ранних этапах заболевания, как показано на фигуре 12С.
В случае слюнной железы антитело к CD40, вводимое в дозе, составляющей 1,5, 5 и 15 мг/кг, было эффективным в снижении воспаления слюнной железы в день 29, в то же время доза 15 мг/кг сохраняла эффективность в день 63 терапии (фигура 13А). Инфильтрация в слюнных железах не изменялась значительным образом у не получавших лечение мышей после дня 29.
В случае ткани суставов предплюсны вводимые дозы антитела к CD40, составляющие 1,5, 5 и 15 мг/кг, были эффективными в снижении воспаления вокруг сустава в день 29, в тоже время доза 15 мг/кг сохраняла эффективность в день 63 терапии (фигура 13В). В случае суставов воспаление имело тенденцию к уменьшению у мышей возрастом 19 недель по сравнению с мышами возрастом 10 недель. Несмотря на это, лечение с помощью антитела к CD40 значительно снижало воспаление до практически нулевого при дозе 15 мг/кг в день 63 терапии.
Образование герминативных центров (GC) требует взаимодействия В- и Т-клеток за счет вовлечения CD40 на В-клетках GC с помощью CD40L на фолликулярных Т-хелперных клетках (Tfh). GC представляют собой анатомические структуры, в которых образуются плазмациты и В-клетки памяти и в которых происходит созревание аффинности и переключение класса Ig. Они являются критически важными для развития высокой аффинности и патогенных аутоантител при SLE.
Антитело 138 мыши к CD40 нарушает взаимодействие В- и Т-клеток и предотвращает образование GC. Чтобы оценить степень, в которой предотвращается образование GC, количество В-клеток GC и Tfh-клеток в селезенке определяли с помощью проточной цитометрии (фигура 14). Количество Tfh-клеток было значительно ниже, чем у контролей в день 29 у всех мышей, получавших лечение с помощью антитела 138 к CD40, независимо от дозы. Среди протестированных доз количество в группе дозы 5 мг/кг оставалось значительно более низким, чем у контроля, в день 63 (фигура 14, см. панели (i) и (ii)). Число В-клетки GC также было ниже, чем у контроля, в день 29 при всех дозах антитела к CD40, и их число оставалось более низким в день 63 у мышей, получающих антитело к CD40 в дозах, составляющих 5 и 15 мг/кг. Однако эти отличия от не получавших лечения контролей не были статистически значимыми. Независимо от этих результатов, в данных наблюдалась общая тенденция в направлении терапевтического эффекта для всех групп доз. Более того, в этих экспериментах, антитело мыши к CD40 продемонстрировало степень агонистической активности от небольшой до нулевой.
Уровни общего циркулирующего IgG, в дополнение к уровням аутореактивных антител, повышаются с течение времени при SLE у мышей и людей. Следовательно, для оценки эффекта антитела 138 к CD40 на выработку антител, исследовали уровни общих циркулирующих IgM и IgG. В дополнение также исследовали антитела к dsDNA, распространенное аутоантитело, ассоциированное с волчанкой. Было обнаружено, что уровни общего IgG у мышей, получавших лечение с помощью антитела к CD40 в дозах, составляющих 15 и 1,5 мг/кг, были значительно ниже таковых у не получавших лечение контролей в день 29, как описано на фигуре 15А. Значительно более низкие уровни общего IgG сохранялись вплоть до дня 63 у мышей, получавших лечение с помощью антитела 138 к CD40 из расчета 15 мг/кг, как описано на фигуре 15 В. В дополнение, значительно более низкие уровни наблюдали у мышей, получавших лечение с помощью антитела 138 к CD40 из расчета 5 мг/кг, в этот момент времени. Никаких отличий не обнаружили для уровней циркулирующего IgM.
Титры антитела к dsDNA не отличались значительно у мышей, получавших лечение с помощью антитела 138 к CD40, и у не получавших лечения контрольных мышей в день 29, как описано на фигуре 16А. Однако в день 63 титры антитела к dsDNA значительно возросли у не получавших лечение контрольных мышей, но снизились у мышей, получавших лечение с помощью 15 и 5 мг/кг антитела 138 к CD40, хотя разница не была значимой, как описано на фигуре 16В.
Результаты, полученные в описанном выше исследовании (пример 11.1), показывают, что антитело 138 к CD40 является эффективным в предупреждении развития нефрита у мышей MRL/1p, подверженных развитию волчанки. В дополнение, антитело 138 к CD40 предупреждало развитие воспаления слюнных желез и суставов. Данное исследование позволяет предположить, что антитело-антагонист 138 мыши к CD40, обладающее аналогичными свойствами с Ab102, является эффективным в лечении SLE человека.
1
11.2. Модель SLE на мышах NZB/W-F
Вторую мышиную модель SLE также тестировали, чтобы определить, является ли антитело-антагонист 138 мыши к CD40 эффективным для лечения заболевания. В частности, для определения эффективности антитела 138 к CD40, антитело тестировали на мышах NZB/W-F1, при этом применяли как профилактическую, так и терапевтическую схемы лечения в соответствии с графиком введения доз, описанным в таблице 24 ниже. Как и в исследовании 11.1, PBS служил в качестве отрицательного контроля, а преднизолон выступал как положительный контроль.
В случае профилактической схемы мышей начинали лечить в возрасте 26 недель. Проверяли, что все мыши имели уровень белка, составлявший <300 мг/дл. Для схемы терапевтического лечения применяли чередующееся распределение в группы; не получавших лечение мышей отслеживали еженедельно в отношении протеинурии и распределяли в одну из 3 групп схемы терапевтического лечения, когда у них развивалась протеинурия с ≥ 300 мг/дл.
Профилактическое лечение
Протеинурию отслеживали еженедельно, и, как показано на фигуре 17А, у приблизительно 50% не получавших лечение контрольных мышей протеинурия наблюдалась в возрасте 32 недели. В отличие от этого, только у 1 из мышей, получавших лечение с помощью антитела 138 к CD40, и ни у одной из мышей, получавших лечение с помощью преднизолона, не развивалась сильная протеинурия. Эти результаты были значимыми в сравнении с не получавшими лечение контролями. Выживание, как показано на фигуре 17В, отражало результаты по протеинурии, при этом все группы лечения значительно отличались от PBS-контролей. Таким образом, лечение при обеих дозах 15 и 1,5 мг/кг предупреждало протеинурию и продлевало выживание.
Терапевтическое лечение
Терапевтическое лечение с помощью антитела 138 к CD40 было также эффективным на этой второй мышиной модели SLE. Как показано на фигуре 18А и фигуре 18В, у мышей, получавших лечение с помощью антитела 138 к CD40, со временем развивалась слабая протеинурия, в то же время ни у не получавших лечения контрольных мышей, ни у мышей, получавших лечение с помощью преднизолона, не развивалась слабая протеинурия. Исходя из скорости излечивания от протеинурии, как показано на фигуре 18В, было оценено, что среднее время излечивания от протеинурии составляло 23±7 дней. Лечение с помощью антитела 138 к CD40 также значительно продлевало выживание, как описано на фигуре 18С.
Продуцирование слюны
Выработку слюны измеряли у обеих групп мышей, получавших профилактическое и терапевтическое лечение, чтобы оценить функцию слюнных желез. Подвергнутым анестезии мышам вводили пилокарпина нитрат и за период времени, составляющий 8 минут, слюну собирали на ватную палочку.
Продуцирование слюны измеряли как увеличение чистой массы ватной палочки. В случае исследования профилактического лечения было обнаружено, что выработка слюны у не получавших лечение контрольных мышей была очень изменчивой, но значительно отличалась от таковой у незаболевших более молодых мышей NZBWF-1, как описано на фигурах 19А и 19В. Изменчивость, по-видимому, была обусловлена уровнем развития заболевания, поскольку большинство мышей из группы контроля средой с самыми низкими значениями выработки слюны имели протеинурию (фигура 19А и 19В, пурпурный цвет по сравнению с черным цветом в группе, получавшей среду). Однако важно, что выработка слюны у мышей, получавших лечение с помощью антитела 138 к CD40, была сравнительно постоянной (фигура 19А) и значительно превышала таковую у не получавших лечение контрольных мышей. Хотя все когорты мышей, получавшие лечение с помощью антитела 138 к CD40, характеризовались более высоким уровнем выработки слюны, только у когорты, получавшей лечение с помощью дозы 1,5 мг/кг, сохранялась значимость при измерении в зависимости от массы тела (фигура 19В). Несмотря на это, эти данные показывают, что профилактическое лечение с помощью антитела 138 к CD40 может предупредить потерю функции слюнных желез.
В случае мышей, получавших терапевтическое лечение, было обнаружено, что мыши, получавшие лечение с помощью антитела 138 к CD40, имели значительно более высокий уровень выработки слюны, чем не получавшие лечение контроли (фигура 20А и 20В). На фигуре 20А и 20В показано, что выработка слюны сохранялась при терапевтическом введении дозы антитела к CD40. Это было очевидно независимо от того, рассматривали ли общее количество слюны или количество слюны, нормализованное по массе тела. Примечательно, что не получавшие лечение мыши имели протеинурию, в то время как ни одна из мышей, получавшая лечение с помощью антитела к CD40, не имела протеинурию. Следовательно, можно сделать вывод, что терапевтическое введение доз антитела-антагониста к CD40, которое практически не проявляет агонистическую активность, предупреждает или нормализует снижение функции слюнных желез.
Данное исследование показывает, что антитело-антагонист 138 к CD40 было эффективным в предупреждении развития нефрита у мышей NZB/W-F1, подверженных развитию волчанки, и в спасении этих мышей от нефрита. В дополнение, антитело к CD40 предупреждало развитие воспаления слюнных желез и суставов. Данное исследование подтверждает гипотезу о том, что антитело-антагонист к CD40, которое практически не проявляет агонистическую активность, будет эффективным при SLE человека.
Способы, применяемые в примерах 11.1 и 11.2, предусматривали следующее.
Мыши MRL/lpr
MRL/lpr: антитело к CD40 (антитело 138) вводили i. р. мышам MRL/lpr возрастом 10 недель в одной из 4 доз; 15 мг/кг, 5 мг/кг или 1,5 мг/кг дважды в неделю или 15 мг/кг один раз в неделю. Мышей, получавших лечение с помощью PBS (среда) i.р. дважды в неделю, включали в качестве отрицательного контроля, а мышей, получавших лечение с помощью 10 мг/кг преднизолона РО sid, включали в качестве положительного контроля.
1
1
NZB/W-F: антитело 138 к CD40 вводили мышам в NZB/W-F обеих схемах профилактического и терапевтического лечения. В случае схемы профилактического лечения мышам вводили антитело к CD40 i.р., начиная с возраста 26 недель в одной из двух доз, дважды в неделю из расчета 15 мг/кг или 1,5 мг/кг. Мыши, которым вводили преднизолон из расчета 10 мг/кг РО sid или вводили PBS, служили в качестве положительных и отрицательных контролей соответственно. Мышей тестировали в отношении протеинурии в начале и всех мышей с уровнем белка ≥300 мг/дл исключали из исследования профилактического лечения. В случае схемы терапевтического лечения мышей начинали лечить, когда у них развивалась протеинурия, составляющая ≥300 мг/дл. Мыши получали антитело к CD40 i.р. из расчета 15 мг/кг дважды в неделю. Мыши, которым вводили преднизолон из расчета 10 мг/кг РО sid или PBS, служили в качестве положительных и отрицательных контролей соответственно.
Протеинурия
Мочу каждую неделю исследовали на уровень белка с применением индикаторных полосок Albustix (Siemens 2191, Питтсбург, Пенсильвания). Мышей считали имеющими протеинурию, если уровни белка в моче были повышены до ≥300 мг/дл на протяжении по меньшей мере 2 последовательных тестов или перед смертью или умерщвлением.
Проточная цитометрия
+
Суспензии из одиночных клеток селезенки получали в забуференном солевом растворе Хенкса (Invitrogen) с 1% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen) и 1х пенициллином/стрептомицином (Sigma, Сент-Луис, Миссури). Эритроциты удаляли с помощью центрифугирования и клетки ресупендировали в буфере для окрашивания (PBS (Invitrogen) с 1,5% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки и 0,02% азида натрия (Sigma)). Клетки окрашивали с помощью антител против CD3 (145-2011, BD), CD4 (GK1.5 eBioSciences), ICOS (С398.4А, Biolegend), CXCR5 (L138D7, Biolegend), PD-1 (29F.1A12, Biolegend), GL7 (A488, Biolegend), CD19 (BUV395, BD), CD95 (Jo2, Biolegend). Антитела непосредственно связывали с флуоресцеина изотиоцианатом, фикоэритрином, фикоэритрином и цианином 5, аллофикоцианином, перидинином-хлорофиллом и цианином 5.5 или биотином. Все В-клетки идентифицировали как CD19+; В-клетки GC как CD19+, CD95+ и GL7; Tfh-клетки как CD3+, CD4+, ICOS+, CXCR5+ и PD-1+. Клетки анализировали с помощью проточного цитометра FACSCalibur (BD Biosciences) и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo (версия 8.5, Treestar Inc.).
Гистология
Когда мыши из группы контроля средой начинали агонизировать, у них собирали ткани почки, голеностопного сустава и слюнных желез и фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине. В дополнение, в определенные промежуточные моменты времени эти же ткани и кровь собирали у типичных мышей из каждой группы. Ткани фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 8 часов, обрабатывали и заливали в парафин для окрашивания Н&Е. Воспалительные инфильтраты оценивали в почке, слюнной железе и голеностопном суставе на основании оценки обычно окрашенных Н&Е срезов тканей, фиксированных формалином и залитых в парафин (FFPE). Для почки патоморфолог определял баллы по 3 мкм окрашенным Н&Е срезам по шкале от 0 до 4 в отношении гломерулонефрита, периваскулярной инфильтрации и тубулоинтерстициальной инфильтрации, на основании следующих критериев определения баллов. Гломерулонефрит: 0 = отсутствие заболевания; 1 = сегментарное утолщение мезангия в редких клубочках; 2 = сементарное - диффузное утолщение мезангия в большинстве клубочков; 3 = диффузное утолщение мезангия, повышенное содержание клеток, увеличенные подоциты, отсутствие спаек; 4 = диффузное утолщение мезангия с участками более сильно пораженными, чем остальные, с одним или несколькими из следующего: коагулированные белки, фиброз, пониженное содержание клеток, увеличенные подоциты, спайки и серповидные образования боуменовой капсулы. Периваскулярное воспаление почки: 0 = вплоть до небольшого числа редких лимфоцитов; 1 = небольшое число лимфоцитов, образующих рыхлые агрегаты; 2 = лимфоциты, образующие дискретные небольшие агрегаты; 3 = поляризованные агрегаты из лимфоцитов, которые выпячиваются в просвет прилегающей вены, но не могут полностью окружить дуговую артерию; 4 = агрегаты лимфоцитов полностью окружают дуговую артерию без поляризации. Тубулоинтерстициальная (TI) инфильтрация: 0 = отсутствие инфильтратов; 1 = от минимальных до слабых TI-инфильтратов; 2 = слабые инфильтраты между 20% канальцев; 3 = от слабых до умеренных инфильтратов между до 50% канальцев; 4 = умеренные инфильтраты между и вокруг > 50% канальцев по всей коре почки. Баллы воспаления слюнных желез и суставов были основаны на тех же принципах, при этом балл 0-4 указывал на увеличение инфильтратов внутри ткани.
Продуцирование слюны
Для измерения продуцирования слюнных желез мышей сначала успокаивали с помощью кислорода/изофлурана в небольшой изолирующей камере. После успокоения мышам i. р. вводили 30 мкл (60 мкг) пилокарпина нитрата (Sigma). Через две минуты после инъекции, предварительно взвешенные палочки для ухода за детьми (подрезанные до ~1,5 см, ватный тампон плюс стержень) помещали в рот животного за передними зубами. Мышей помещали на бок, чтобы обеспечить возможность сбора слюны за щекой и всасывания ватной палочкой. Через 8 минут палочки забирали и взвешивали, чтобы рассчитать чистую массу слюны.
ELISA
Уровни общих циркулирующих IgG и IgM определяли с помощью ELISA с применением наборов eBioscience (кат. №88-50400, 88-50470) в соответствии с инструкциями производителя.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ABBVIE, INC.
<120> АНТИТЕЛА К CD40 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 117813-10420
<140>
<141>
<150> 62/168,425
<151> 2015-05-29
<160> 117
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 277
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu Leu Thr
1               5                   10                  15
Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu
20                  25                  30
Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val
35                  40                  45
Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu
50                  55                  60
Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His
65                  70                  75                  80
Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr
85                  90                  95
Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr
100                 105                 110
Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly
115                 120                 125
Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu
130                 135                 140
Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys
145                 150                 155                 160
Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val Gln Gln
165                 170                 175
Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp Arg Leu
180                 185                 190
Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe Ala Ile
195                 200                 205
Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro Thr Asn
210                 215                 220
Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe Pro Asp
225                 230                 235                 240
Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr Leu His
245                 250                 255
Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg Ile Ser
260                 265                 270
Val Gln Glu Arg Gln
275
<210> 2
<211> 330
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210> 3
<211> 330
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325                 330
<210> 4
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 4
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1               5                   10                  15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20                  25                  30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
35                  40                  45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
50                  55                  60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65                  70                  75                  80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
85                  90                  95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100                 105
<210> 5
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 6
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met Asn
1               5                   10
<210> 7
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 7
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 8
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 8
Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val
1               5
<210> 9
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1               5                   10                  15
Glu Met Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ala Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210> 10
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 10
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Thr
<210> 11
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 11
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
<210> 12
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 12
Gln Asn Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210> 13
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210> 15
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ser Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210> 17
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 17
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Leu Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Thr
<210> 18
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210> 19
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 19
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Thr
<210> 20
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 20
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Arg
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210> 21
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 21
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Arg Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Thr
<210> 22
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 22
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 23
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 23
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Asp Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 25
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Val Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Leu Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 29
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ile Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Gln Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 31
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Trp Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Met Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 33
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Lys Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg His Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Phe Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Tyr Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ala Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Pro Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 39
<211> 446
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115                 120                 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130                 135                 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165                 170                 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180                 185                 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195                 200                 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260                 265                 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340                 345                 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405                 410                 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210> 40
<211> 220
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 40
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Arg
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115                 120                 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130                 135                 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145                 150                 155                 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165                 170                 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180                 185                 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195                 200                 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215                 220
<210> 41
<211> 446
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115                 120                 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130                 135                 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145                 150                 155                 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165                 170                 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180                 185                 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195                 200                 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210                 215                 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe
225                 230                 235                 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245                 250                 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260                 265                 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275                 280                 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290                 295                 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305                 310                 315                 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325                 330                 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340                 345                 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355                 360                 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370                 375                 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385                 390                 395                 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405                 410                 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His
420                 425                 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435                 440                 445
<210> 42
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 42
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 43
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 43
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Leu
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210> 44
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Pro Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Trp Gly Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 45
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Thr Met His
1               5                   10
<210> 46
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 46
Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Pro Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Asp
<210> 47
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 47
Trp Gly Tyr Ser Phe Asp Tyr
1               5
<210> 48
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Ser Val Ile Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Tyr Leu Ile Tyr Arg Met Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100                 105                 110
<210> 49
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 49
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1               5                   10                  15
<210> 50
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 50
Arg Met Ser Thr Leu Ala Ser
1               5
<210> 51
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 51
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210> 52
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 52
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Pro Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Trp Gly Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 53
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 53
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 54
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 54
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Pro Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Trp Gly Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 55
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 55
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20                  25                  30
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Asp Tyr Pro Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50                  55                  60
Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Trp Gly Tyr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 56
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 56
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Tyr Leu Ile Tyr Arg Met Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 57
<211> 112
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 57
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20                  25                  30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35                  40                  45
Pro Gln Tyr Leu Ile Tyr Arg Met Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro
50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His
85                  90                  95
Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100                 105                 110
<210> 58
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 58
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Thr Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 59
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 59
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Asp Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 60
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 60
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Glu Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 61
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 61
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 62
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 62
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Val Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 63
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 63
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Leu Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 64
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 64
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ile Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 65
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 65
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Gln Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 66
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 66
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Trp Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 67
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 67
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Met Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 68
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 68
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Lys Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 69
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 69
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg His Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 70
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 70
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Phe Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 71
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 71
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Tyr Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 72
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 72
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Ala Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 73
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 73
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Pro Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 74
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<400> 74
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Pro Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Thr
<210> 75
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 75
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Gly Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 76
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 76
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1               5                   10                  15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100                 105                 110
Lys
<210> 77
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид"
<400> 77
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Pro
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100                 105                 110
Lys
<210> 78
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (2)..(2)
<223> /замена="Tyr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (5)..(5)
<223> /замена="Thr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (6)..(6)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)..(8)
<223> /замена="Thr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (10)..(10)
<223> /замена="His"
<400> 78
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Gly Met Asn
1               5                   10
<210> 79
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3)..(3)
<223> /замена="Asn"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)..(4)
<223> /замена="Pro"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (5)..(6)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (7)..(7)
<223> /замена="Ser" или "Gly"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)..(8)
<223> /замена="Tyr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (9)..(9)
<223> /замена="Pro"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (10)..(10)
<223> /замена="Asn"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (12)..(12)
<223> /замена="Asn"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (13)..(13)
<223> /замена="Gln"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (14)..(14)
<223> /замена="Lys"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (15)..(15)
<223> /замена="Phe"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (17)..(17)
<223> /замена="Asp"
<400> 79
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Asp Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 80
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (1)..(1)
<223> /замена="Trp"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (2)..(2)
<223> /замена="Gly"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3)..(3)
<223> /замена="Tyr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)..(4)
<223> /замена="Ser"
<400> 80
Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val
1               5
<210> 81
<211> 105
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 81
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20                  25                  30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35                  40                  45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50                  55                  60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65                  70                  75                  80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85                  90                  95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100                 105
<210> 82
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 82
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
20                  25                  30
<210> 83
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 83
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
1               5                   10
<210> 84
<211> 32
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 84
Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210> 85
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 85
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210> 86
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 86
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met Gly
1               5                   10
<210> 87
<211> 32
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 87
Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210> 88
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 88
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1               5                   10
<210> 89
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 89
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser
20                  25                  30
<210> 90
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 90
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala His
1               5                   10                  15
<210> 91
<211> 32
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 91
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr
1               5                   10                  15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210> 92
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 92
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Leu Tyr Gly Phe Ser Leu Ser
20                  25                  30
<210> 93
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 93
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala
1               5                   10
<210> 94
<211> 32
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 94
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr
1               5                   10                  15
Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210> 95
<211> 32
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 95
Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr Met Glu
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20                  25                  30
<210> 96
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 96
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 97
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 97
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210> 98
<211> 32
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 98
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210> 99
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 99
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
1               5                   10
<210> 100
<211> 32
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 100
Gly Val Pro Ser Arg Ile Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210> 101
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 101
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 102
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 102
Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Arg Arg Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210> 103
<211> 32
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 103
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1               5                   10                  15
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys
20                  25                  30
<210> 104
<211> 23
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 104
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys
20
<210> 105
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 105
Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210> 106
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 106
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
1               5                   10
<210> 107
<211> 100
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 107
Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln Tyr Leu Ile Asn Ser Gln
1               5                   10                  15
Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys Leu Val Ser Asp Cys Thr
20                  25                  30
Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys Gly Glu Ser Glu Phe Leu
35                  40                  45
Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His Gln His Lys Tyr Cys Asp
50                  55                  60
Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys Gly Thr Ser Glu Thr Asp
65                  70                  75                  80
Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His Cys Thr Ser Glu Ala Cys
85                  90                  95
Glu Ser Cys Val
100
<210> 108
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (1)..(1)
<223> /замена="Arg"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)..(4)
<223> /замена="Lys"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (8)..(8)
<223> /замена="His"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (10)..(10)
<223> /замена=" "
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (12)..(12)
<223> /замена="Gly"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (13)..(13)
<223> /замена="Asn"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (14)..(14)
<223> /замена="Thr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (17)..(17)
<223> /замена="Tyr"
<400> 108
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Thr
<210> 109
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (1)..(1)
<223> /замена="Arg"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (2)..(2)
<223> /замена="Met"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (5)..(5)
<223> /замена="Leu"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (6)..(6)
<223> /замена="Ala"
<400> 109
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1               5
<210> 110
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (1)..(1)
<223> /замена="Met"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (2)..(2)
<223> /замена="Gln"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3)..(3)
<223> /замена="His"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (4)..(4)
<223> /замена="Leu"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (5)..(5)
<223> /замена="Glu"
<400> 110
Gln Asn Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr
1               5
<210> 111
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<220>
<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ_ОСТАТОК
<222> (7)..(7)
<223> Любая аминокислота, отличная от Thr, Asp, Val, Leu, Ile или Met
<400> 111
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Xaa Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 112
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<220>
<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ_ОСТАТОК
<222> (7)..(7)
<223> Любая аминокислота
<400> 112
Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Xaa Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 113
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: синтетический пептид"
<220>
<221> МОДИФИЦИРОВАННЫЙ_ОСТАТОК
<222> (9)..(9)
<223> Любая аминокислота, отличная от Pro
<400> 113
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Xaa Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1               5                   10                  15
Thr
<210> 114
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 114
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1               5                   10                  15
<210> 115
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетическая метка 6xHis"
<400> 115
His His His His His His
1               5
<210> 116
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (18)..(18)
<223> /замена="Met" или "Lys"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (24)..(24)
<223> /замена="Arg"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (27)..(27)
<223> /замена="Lys"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (31)..(31)
<223> /замена="His"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (33)..(33)
<223> /замена=" "
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (35)..(35)
<223> /замена="Gly"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (36)..(36)
<223> /замена="Asn"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (37)..(37)
<223> /замена="Thr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (40)..(40)
<223> /замена="Tyr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (56)..(56)
<223> /замена="Arg"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (57)..(57)
<223> /замена="Met"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (60)..(60)
<223> /замена="Leu"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (61)..(61)
<223> /замена="Ala"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (95)..(95)
<223> /замена="Met"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (96)..(96)
<223> /замена="Gln"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (97)..(97)
<223> /замена="His"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (98)..(98)
<223> /замена="Leu"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (99)..(99)
<223> /замена="Glu"
<400> 116
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1               5                   10                  15
Glu Ser Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20                  25                  30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85                  90                  95
Asp Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100                 105                 110
Lys
<210> 117
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетическая консенсусная последовательность"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (27)..(27)
<223> /замена="Tyr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (30)..(30)
<223> /замена="Thr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (31)..(31)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (33)..(33)
<223> /замена="Thr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (35)..(35)
<223> /замена="His"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (52)..(52)
<223> /замена="Asn"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (53)..(53)
<223> /замена="Pro"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (54)..(54)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (55)..(55)
<223> /замена="Ser"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (56)..(56)
<223> /замена="Ser" или "Gly"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (57)..(57)
<223> /замена="Tyr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (58)..(58)
<223> /замена="Pro"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (59)..(59)
<223> /замена="Asn"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (61)..(61)
<223> /замена="Asn"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (62)..(62)
<223> /замена="Gln"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (63)..(63)
<223> /замена="Lys"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (64)..(64)
<223> /замена="Phe"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (66)..(66)
<223> /замена="Asp"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (99)..(99)
<223> /замена="Trp"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (100)..(100)
<223> /замена="Gly"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (101)..(101)
<223> /замена="Tyr"
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (102)..(102)
<223> /замена="Ser"
<400> 117
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20                  25                  30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35                  40                  45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Arg Asp Asn Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Trp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly Thr Thr Val
100                 105                 110
Thr Val Ser Ser
115
<---