СРЕДСТВО, МОДУЛИРУЮЩЕЕ БИОЭНЕРГЕТИКУ МИТОХОНДРИЙ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
AGENT MODULATING BIOENERGY OF MITOCHONDRIA OF LIVER CELLS OF ANIMAL ORIGIN

Изобретение относится к биохимии и фармакологии германийорганических соединений и касается биологически активного вещества 6uc([μ-тартрато)ди(μ-гидроксо)герматран(IV) триэтаноламмония
которое может быть использовано в медицине для создания адаптогенных лекарственных средств.
В настоящее время существует необходимость поиска новых эффективных препаратов, обеспечивающих повышение адаптивных возможностей человека, например, при стрессовых состояниях. Стрессовые воздействия приводят к увеличению продукции активных форм кислорода (АФК) и активации перекисного окисления липидов (ПОЛ), способствуя формированию патологических состояний. Это связано с повреждением митохондрий - одним из основных источников АФК [см. Plotnikov Е., Chupyrkina A., Vasileva A., Kazachenko A., Zorov D. The role of reactive oxygen and nitrogen species in the pathogenesis of acute renal failure // BBA. 2008. 1777. S58-S59]. Следовательно, препараты, обладающие адаптогенными свойствами, в первую очередь должны влиять на генерацию АФК митохондриями, то есть на биоэнергетику митохондрий.
Органические соединения германия обладают биологической активностью в данном отношении [см. Лукевиц Э.Я. и др. Биологическая активность соединений германия. Рига: Зинатне, 1990, стр. 981]. Они способствуют вы-эаботке интерферона в организме человека (патент США 4473581, 1984 г. ) и защищают его от простуды (патент США 4898882, 1990 г.).
Заявляемое изобретение относится к приоритетному направлению развития науки и технологий «Биомедицинские и ветеринарные технологии жизнеобеспечения и защиты человека и животных» [см. Алфавитно-предметный указатель к Международной патентной классификации по приоритетным направлениям развития науки и технологий / Ю.Г. Смирнов, Е.В. Скиданова, С.А. Краснов - М.: ПАТЕНТ, 2008. - с. 75].
Ближайшим аналогом (прототипом) предлагаемому соединению бис((μ-тартрато)ди(μ.-гидроксо)герматран(IV) триэтаноламмония, краткое название вигетан, может служить 1-(2-аминоэтокси) герматран, имеющий формулу:
-5
Герматран снижает интенсивность флуоресценции продуктов ПОЛ, то есть он обладает антистрессовыми свойствами и наиболее эффективен в концентрации 10М [см. Жигачева К.В., Бинюков В.И., Миль Е.М., и соавт. Влияние германийорганического соединения на функциональное состояние митохондрий растительного и животного происхождения // Научный альманах (Биологические науки) 2015, №7 (9), с. 955-966]. Однако, герматран обладает недостаточной эффективностью в качестве адаптогенного соединения.
Источники информации о влиянии вигетана на дыхание митохондрий клеток печени в литературе не выявлено. Заявляемая биологическая активность вигетана не была известна.
Задачей заявляемого изобретения является установление влияния вигетана, как модулирующего средства, на дыхание митохондрий клеток печени животного происхождения.
Технический результат - повышение физиологической активности вигетана. Он достигается тем, что предложено применение бис(μ-тартрато)ди(μ-гидроксо) герматранат (IV) триэтаноламмония общей формулы
,
-
-
где Tart - остаток винной кислоты -ОС(O)СН(O-)СН(O)С(O)O, в качестве средства, модулирующего дыхание митохондрий клеток печени животного происхождения.
Вигетан может быть использован в медицине для создания препаратов, обладающих адаптогенным действием, не имеющих побочных эффектов. Вигетан может быть использован, также, в спортивной медицине в составе лекарственных средств, ускоряющих восстановление сил, повышающих работоспособность [см. Барышок В.П., Расулов М.М., Кудисов B.C., Моторика ИТ. и соавт. Патент РФ №2661616 // Б.И. №20 от 17.07.2018].
Возможность осуществления изобретения подтверждается на примерах, что подтверждает соответствие технического решения условию патентоспособности «промышленная применимость».
Работу проводят на крысах самцах Вистар массой 120-140 г, в соответствии с «Правилами лабораторной практики в Российской Федерации». Правила утверждены приказом Министерства здравоохранения РФ от 19.06.2003 г №267 (Правила лабораторной практики в Российской Федерации Министерства здравоохранения РФ Приказ от 19 июня 2003 года №267 http://www.kodeks.ru (24 апреля 2010 г)). Животных содержат в соответствии с правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемыми для экспериментальных и иных научных целей. По окончании эксперимента животным проводят эвтаназию цервикальной дислокацией 5 позвонка, соблюдая правила «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986).
Митохондрии выделяют из печени крыс по методу Шнайдера в модификации [Mokhova E.N., Skulachev V.P., Zhigacheva I. V. 1977, ВВА, 501, 415-423]. После декапитации животного печень быстро извлекают и охлаждают в течение 1 мин в среде выделения, замороженной до снегообразной массы (0.25 М сахароза, 10 мМ Tris-HCl, рН 7.4). Затем печень измельчают и гомогенизируют в среде выделения (соотношение ткань: среда - 1:8). Гомогенат центрифугируют в течение 10 мин при 600 g. Полученный супернатант подвергают второму центрифугированию при 9000 g в течение 10 мин. Осадок ресуспендируют в среде выделения. Соотношение ткань: среда - 1: 0.25.
2
4
Стресс митохондрий вызывают следующим образом. Изолированные митохондрии инкубируют при комнатной температуре в среде содержащей 70 мМ KCl, 10 мМ HEPES и 1 мМ KНРO, рН 7,4 в течение 20-25 минут. Инкубация митохондрий в гипотонической среде приводит эти органеллы к состоянию «физико-химический или осмотический стресс» [Жигачева И.В., Бинюков В.И., Миль Е.М., и соавт. Влияние германийорганического соединения на функциональное состояние митохондрий растительного и животного происхождения // Научный альманах (Биологические науки) 2015, №7 (9), с. 955-966].
-2
-4
-2
-4
-6
-4
-7
-9
-7
-9
-11
-9
-11
-13
Приготовление растворов «ех tempore» для модулирования дыхания митохондрий клеток печени: 1) 79,57 мг вигетана растворяют в 10 мл официального 0,9% раствора натрия хлорида, получая раствор 10 М. 0,01 мл (10 мкл) этого раствора добавляют в среду инкубации митохондрий (Объем среды инкубации в электроде Кларка - 1 мл, т.е. митохондрии инкубировались с 10 М препарата). 2) Затем из 10 М раствора отбирают 0,1 мл (100 мкл) и добавляют к 9,9 мл официального 0,9% раствора натрия хлорида (получают 10М препарата). 0,01 мл (10 мкл) этого раствора добавляют в среду инкубации митохондрий (10 М препарата). 3) 0,01 мл (10 мкл) 10 М препарата растворяют в 9,99 мл официального 0,9% раствора натрия хлорида (получают 10М препарата). 0,01 мл (10 мкл) этого раствора добавляют в среду инкубации митохондрий (10 М препарата). 4) 0,01 мл (10 мкл) 10 М препарата растворяют в 9,99 мл официального 0,9% раствора натрия хлорида (получают 10М препарата). 0,01 мл (10 мкл) этого раствора добавляют в среду инкубации митохондрий (10 М препарата). 5) 0,01 мл (10 мкл) 10 М препарата растворяют в 9,99 мл официального 0,9% раствора натрия хлорида (получают 10М препарата). 0,01 мл (10 мкл) этого раствора добавляют в среду инкубации митохондрий (10 М препарата).
2
4
4
-6
Интенсивность дыхания митохондрий определяют закрытым электродом типа Кларка на полярографе LP-7E (Чехия). Среда инкубации содержит 0.25 М сахарозы, 10 мМ трис-HCl, 2 мМ KНРO, 5 мМ MgSO, 10 мМ KCl, рН 7.5 (28°С). Дополнительные добавки: 200 мкМ ADP, 10М FCCP, 4 мМ глутамат, 1 мМ малат или 5 мМ сукцината. В полярографическую ячейку объемом 1 мл вносят митохондрии (2-3 мг белка).
4
2
4
При исследовании влияния препаратов на скорости дыхания митохондрий в присутствии аскорбата и ТМФД среда инкубации содержит: 0,25 М сахарозы, 10 мМ Tris-HCl, 2 мМ MgSO, 2 мМ KНРO, 10 мM KCl, 2 мМ аскорбата, 5μМ ротенона, 0.9μM антимицина А, 0.5μМ FCCP (карбонил-цианид-n-трифторметокси-фенилгидразон) и 400μM ТМФД (рН 7.4).
Белок определяют биуретовым методом.
Контролем служат данные, полученные у интактных крыс.
Статистическую обработку данных проводят методом Стьюдента. Данные представляют в виде средних и стандартных значений ошибки - М и m, соответственно. Для относительных величин рассчитывают 95% доверительные интервалы. Достоверными считаются различия при р≤0,05 (см. Петри А., Сэбин К., 2009].
-6
При исследовании влияния вигетана в широком диапазоне концентраций на биоэнергетические характеристики митохондрий печени белых крыс вигетан в концентрации 10М повышает максимальные скорости окисления НАД-зависимых субстратов и сукцината в присутствии АДФ (таблицы 1, 2).
-6
-11
-13
В концентрациях 10 - 10 М вигетан оказывает разобщающее действие как при окислении НАД-зависимых субстратов, так и при окислении сукцината. При этом величина дыхательного контроля снижается на 19; 29 и 43% (при окислении малата+глутамат) и на 26,5 и 25,5% (при окислении сукцината). В концентрации 10 М вигетан почти не влияет на характеристики дыхания митохондрий.
Защитные эффекты и вигетана, и герматрана обусловлены их антиоксидантными свойствами. Снижение интенсивности процессов свободно-радикального окисления находит отражение в низкой интенсивности ПОЛ. Предотвращая активацию ПОЛ, и вегетан, и герматран способствуют сохранению функционального состояния митохондрий.
-5
-11
-6
Протекторные свойства, герматрана обусловлены их способностью активировать НАД-зависимые дегидрогеназы. Следует отметить, что комплекс I электрон - транспортной цепи митохондрий является главным пунктом поступления восстановителей, генерированных в матриксе митохондрий. Поскольку транслокация протона дыхательной цепи митохондрий вигетаном сопряжена с окислительным фосфорилированием, генерирующим АТФ, повышение активности НАД-зависимых дегидрогеназ активирует энергетические процессы в клетке, в результате чего повышается устойчивость организма к изменяющимся условиям внешней среды. При этом следует отметить, что максимальная эффективность окислительного фосфорилирования при применении герматрана (аналога) проявляется при его концентрации 10М (и 10 М,), а максимальная эффективность окислительного фосфорилирования при применении вегетана регистрируется в его концентрации на порядок ниже, то есть 10 М.
-6
-9
-11
-6
-4
Протекторные свойства вигетана обусловлены «мягким» разобщающим действием на окисление и фосфорилирование в концентрациях 10, 10и 10М. Это свидетельствует о наличии у вигетана стресс-протекторных свойств. С другой стороны, вигетан, в отличие от герматрана, при возрастающих концентрациях (от 10 до 10М) - служит разобщителем окислительного фосфорилирования.
Положительный эффект - вигетан можно считать модулятором биоэнергетики митохондрий клеток печени и перспективным соединением для создания нового ряда адаптогенов. Вигетан может применяться в виде биологически активной добавки, например, в капсуле, либо в виде различных приемлемых для приема лекарственных форм, в том числе - водных растворах для инъекций.
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ ПРИНЯТЫЕ ВО ВНИМАНИЕ
1. Plotnikov Е., Chupyrkina A., Vasileva A., Kazachenko A., Zorov D. The role of reactive oxygen and nitrogen species in the pathogenesis of acute renal failure// BBA. 2008. 1777. S58-S59.
2. Лукевиц Э.Я. и др. Биологическая активность соединений германия. Рига: Зинатне, 1990, стр. 981.
3. Патент США 4473581, 1984.
4. Патент США 4898882, 1990.
5. Жигачева И.В., Бинюков В.И., Миль Е.М., и соавт. Влияние германийорганического соединения на функциональное состояние митохондрий растительного и животного происхождения // Научный альманах (Биологические науки) 2015, №7 (9), с. 955-966. (прототип).