СПОСОБ ИССЛЕДОВАНИЯ НАТИВНЫХ КЛЕТОК
METHOD OF NATIVE CELL RESEARCH

Способ исследования нативных клеток относится к области физиологии и морфологии клетки, и может быть использован для изучения живых клеток крови методом атомно-силовой микроскопии (АСМ).
2+
В области современной зондовой микроскопии используются разные способы сканирования клеток крови с помощью атомно-силового микроскопа. Известны способы исследования клеток крови [1], основанные на приготовлении мазков стандартными способами, либо при нанесении суспензии предварительно фиксированных клеток на предметные стекла, с последующим сканированием их в воздушной среде, при сканировании в жидкостных ячейках методами контактной и полуконтактной АСМ. Недостатком этого способа является исследование неживых, фиксированных клеток, предварительно обработанных химическими реагентами, которые искажают их морфометрические параметры. Жидкостные ячейки, используемые в зондовых микроскопах для сканирования клеток, не позволяют получить объективные результаты, так как подготовка образцов требует прочной адгезии клеток к подложке. Обработка клеточных поверхностей химическими агентами (например, полилизином, ионами Са и др.), вызывает разрушение или активацию клеточных структур и искусственное искажение их формы. Кроме того, в процессе сканирования возможно «сталкивание» с подложки клеток крови острием зонда или их прилипание к кантилеверу. Все это затрудняет получение сканов и объективных данных о форме и размерах клеток.
2+
Наиболее близким по своей сущности к заявляемому является способ подготовки биологических препаратов для сканирующей зондовой микроскопии [2]; включающий сканирование методом поуконтактной АСМ гемоцитов фиксированных метанолом или глутаровым альдегидом. Для этого производят забор крови и стабилизацию ее антикоагулянтом - гепарином, выделение клеток крови - нейтрофилов, нанесение суспензии клеток в растворе Хенкса, содержащем ионы Са, на предметное стекло и инкубацию в течение 60 мин при 24°С, в ходе которой происходит адгезия нейтрофилов к стеклянной подложке, сканирование нативных клеток в жидкой среде с применением полуконтактного метода, используя в процессе сканирования в жидкости предварительно затупленный кантилевер серии CSG 11 жесткостью 0,03 Н/м, с резонансной частотой 15-40 KHz, радиусом закругления 50-60 нм и высотой щупа 10-20 мкм. В результате сканирования получают сканы 20 клеток и измеряют их параметры с помощью программного обеспечения для компьютерной морфометрии.
2+
Недостатком описанного способа является фиксация клеток, которая искажает их нативную форму и размеры [2]. Кроме того, длительность приготовления препарата, модификация клеточной поверхности раствором Хенкса, содержащим ионы Са, создает опасность искусственных искажений формы клеток. Сканы, полученные при сканировании в жидкости, дают низкое пространственное разрешение [3], а значит не позволяют наблюдать характер повреждений клеточной мембраны. Использование гепарина в качестве антикоагулянта создает условия для появления возможных артефактов при сканировании клеточной поверхности, поскольку молекула гепарина, обладая сильными кислотными свойствами, несет отрицательный заряд [4], следовательно, модифицирует мембрану и создает дополнительные условия для взаимодействия клеточной поверхности с острием щупа.
Использование кантилевера серии CSG 11 жесткостью 0,03 Н/м, резонансной частотой 15-40 KHz приводит к взаимодействию его с поверхностью клетки. В результате клетка прикрепляется к щупу, отрывается от подложки и не удается отсканировать ее поверхность.
Задачей предлагаемого изобретения является создание способа исследования нативных клеток, который позволил бы проводить объективную оценку их геометрических параметров без воздействия на мембраны модифицирующих агентов, а также способа, исключающего механическое воздействие на поверхность клетки.
Для достижения указанного технического результата в способе, включающем:
- забор крови и стабилизацию ее антикоагулянтом - гепарином;
- выделение клеток крови (нейтрофилов);
2+
- адгезию их к стеклянной подложке путем нанесения суспензии клеток в растворе Хенкса, содержащем ионы Са, на предметное стекло и инкубацию в течение 60 мин при 24°С;
- сканирование нативных клеток в жидкой среде с применением полуконтактного метода;
- сканирование осуществляют в жидкости, в процессе которого используют предварительно затупленный кантилевер серии CSG 11 жесткостью 0,03 Н/м, длиной балки 50 мкм, резонансной частотой 15-40 KHz, с радиусом закругления 50-60 нм и высотой щупа 10-20 мкм;
- получение сканов 20 клеток и измерение их параметров с помощью программного обеспечения для компьютерной морфометрии;
предлагается внести следующие изменения:
- использовать кровь без добавления антикоагулянта, которую суспендируют в физиологическом растворе;
- готовить препарат путем нанесения суспензии с живыми клетками на предметное стекло в виде капли, без механического воздействия на нее;
- сканировать нативные клетки, используя влажную камеру для поддержания их нативной формы, при этом помещать подложку с живыми клетками в камеру, насыщенную парами воды и закрытую мембраной;
- проводить сканирование в парах воды в полуконтактном режиме, используя кантилевер серии NSG 03 с жесткостью 0,4 Н/м, длиной балки 100 мкм и резонансной частотой в пределах 62-123 KHz;
- получить сканы на воздухе с высоким пространственным разрешением, не менее 30 клеток крови.
Предлагаемый способ позволит получить объективные данные о геометрических параметрах (размерах и форме) нативных клеток, за счет исключения модифицирующих воздействий антикоагулянта, веществ, усиливающих адгезию клеток к подложке, исключения механического воздействия на клетку в процессе приготовления препарата, использования влажной камеры, создающей оптимальные условия для сохранения нативной формы клеток, и получать сканы клеток с высоким разрешением, кроме того, предлагаемый способ позволит сократить время исследования.
Отличительными признаками заявленного способа являются:
2+
- отсутствие воздействий модифицирующих агентов на клеточную поверхность в виде антикоагулянтов и веществ, усиливающих адгезию клеток к подложке (например, гепарин, полилизин, Са);
- использование нативных нефиксированных образцов крови в виде суспензии с живыми клетками, которые не подвергают распластыванию их по поверхности с помощью шлифовального стекла, таким образом исключая механическое воздействие на клетки;
- использование влажной камеры для создания условий, обеспечивающих сохранение нативного функционально активного и морфологически неизменного состояния клеток в течение времени, достаточного для сканирования образцов;
- сканирование в среде, насыщенной водными парами, что позволяет создавать оптимальное микроокружение для клеток, поддерживать их жизнеспособность, кроме того, сокращает время исследования и настройки прибора;
- использование для сканирования в полуконтактном режиме кантилевера серии NSG 03 с жесткостью 0,4 Н/м, длиной балки 100 мкм, резонансной частотой в пределах 62-123 KHz, что позволяет свести к минимуму взаимодействия щупа с поверхностью клетки, в результате чего исключается ее механическое повреждение.
Предлагаемый способ осуществляют следующим образом. Готовят суспензию клеток путем нанесения ее на предметное стекло, помещают предметное стекло с препаратом во влажную камеру, насыщенную водными парами, проводят сканирование в парах жидкости в полуконтактном режиме, используя кантилевер серии NSG 03 с жесткостью 0,4 Н/м и длиной балки 100 мкм и резонансной частотой в пределах 62-123 KHz, получают сканы 30 клеток, измеряют геометрические параметры клеток с помощью программного обеспечения для компьютерной морфометрии.
Для сравнения различных модифицирующих воздействий на клеточную морфологию был проведен сравнительный анализ геометрических параметров клеток крови, отсканированных во влажной камере и в жидкостной ячейке.
Пример 1. Способ исследования нативных клеток во влажной среде.
Производят забор крови человека без добавления гепарина, суспендируют клетки крови в физиологическом растворе, суспензию в виде капли наносят на чистое обезжиренное предметное стекло. Помещают препарат во влажную камеру, представляющую собой чашу, насыщенную водными парами, которую сверху накрывают мембраной с отверстием для держателя щупа. Устанавливают влажную камеру с образцом на предметный столик микроскопа. Проводят сканирование в парах воды в полуконтактном режиме, используя кантилевер серии NSG 03 с жесткостью 0,4 Н/м, длиной балки 100 мкм и резонансной частотой в пределах 62-123 KHz. Получают сканы не менее 30 клеток, которые сохраняют. На сохраненных изображениях проводят измерения геометрических параметров клеток крови с использованием программ компьютерной морфометрии.
Предлагаемый способ позволяет получать сканы с высоким пространственным разрешением (фиг.1).
Пример 2. Сканирование клеток крови в жидкостной ячейке.
Готовят мазок крови человека путем нанесения капли крови на предметное стекло и распластывая ее по поверхности с помощью шлифовального стекла. Для адгезии клеток к подложке фиксируют мазок 2-3 мин в метиловом спирте. Помещают мазок в жидкостную ячейку, прилагаемую к атомно-силовому микроскопу, заполненную физиологическим раствором. Сканирование производят по предлагаемому способу, но в водной среде, с использованием кантилевера марки NSG 03 с жесткостью 0,4 Н/м, длиной балки 100 мкм. Получают сканы 30 клеток, которые сохраняют (фиг.2). На полученных сканах проводят измерения геометрических параметров клеток.
Сравнительные результаты измерений представлены в таблице 1.
Таблица 1
Морфометрические параметры клеток крови при разных условиях сканирования
Условия сканирования
Диаметр, мкм
Высота клетки, мкм
Объем, мкм<sup>3</sup>
Нативные клетки во влажной камере
7,396±0,14
0,483±0,02
31,960±1,78
Фиксированные клетки в жидкостной ячейке
7,139±0,07
0,892±0,02
62,750±2,01
Как видно из представленных данных, геометрические параметры клеток, отсканированных во влажной камере и жидкостной ячейках, различаются. Различия обнаружены по высоте клеток. Высота клеток, отсканированных во влажной камере, почти в 2 раза снижена по сравнению с клетками, отсканированными в жидкостной ячейке. Наблюдаемые различия связаны с модифицирующим воздействием фиксаторов, усиливающих адгезию клеток к подложке, а также с низким разрешением сканов, получаемых в жидкостной ячейке.
Предлагаемый способ изучения нативных клеток технически прост, позволяет в парах воды сохранять жизнеспособность, нативные размеры и форму биологических объектов. Предлагаемый способ может быть использован в общей и клинической физиологии для любых живых организмов и биологических объектов.
Литература
1. Зайцев Б.Н. Изучение клеток крови // www.ntmdt.ru.
2. Гущина Ю.Ю., Плескова С.Н. Подготовка биологических препаратов для сканирующей зондовой микроскопии: влияние способа фиксации на морфологические параметры клеток крови // www.ntmdt.ru.
3. Nowakowski R, Luckham P, Winlove P. Imaging erythrocytes under physiological conditions by atomic force microscopy // Biochim. Biophys Acta. - 2001. - V.1. - P.1514 (2) - 1706.
4. Зубаиров Д.М. Биохимия свертывания крови. - М.: Медицина, 1978. - 174 с.