Участие некоторых апоптотических механизмов в радахлорин-инициированном фотогемолизе

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

видно, что абсолютные величины лагЧ по АПК не зависят от концентрации эритроцитов. Ингибирующее действие фуллеренола также не изменялось при повышении количества эритроцитов в инкубационной смеси. Из получен-

ных результатов можно сделать вывод о том, что фуллере-нол в системе «сыворотка крови - эритроцит» проявляет свое защитное действие от активированного комплемента не на мембране эритроцитов, а в жидкой фазе.

© Коллектив авторов, 2012 г.

УДК 612.014:577.7

И. Л. Соловцова, Е. А. Воробьев, И. А. Курпас, М. А. Соловьева

УЧАСТИЕ НЕКОТОРЫХ АПОП-ТОТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ В РАДАХЛОРИН-ИНИЦИИРО-ВАННОМ ФОТОГЕМОЛИЗЕ

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени

академика И. П. Павлова

ВВЕДЕНИЕ

Фотодинамическое воздействие на эритроцит исходно связывают с генерацией синглетного кислорода, который в силу высокой химической активности участвует в цепных свободно-радикальных реакциях, окисляя аминокислоты в белках, вызывая перекисное окисление липи-дов и т. д. Установлено, что мембранные эффекты при фотодинамическом воздействии более выражены, чем цитозольные.

Несмотря на отсутствие у эритроцитов ядра и митохондрий, существует мнение, что при окислительном стрессе гибель клеток происходит с участием механизмов типичных для апоптоза, а именно - происходит сжатие клеток, «вспучивание» мембраны, нарушение фос-фатидилсериновой ассиметрии мембран. Апоптотичес-кое уменьшение обьема эритроцитов является следствием повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция, последующей активацией Са2+- зависимых калиевых каналов, приводящей к выходу из клеток катионов калия и анионов хлора совместно с водой.

Целью данной работы являлось оценить роль апопто-тических механизмов в фотоиндуцированном гемолизе.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовалась плазма крови здоровых доноров в возрасте 18-25 лет. Забор крови производился из локтевой вены в изотонический раствор цитрата натрия. Цитратную кровь центрифугировали в течение 20 минут при 3000 об./мин, плазму отделяли декантацией.

Осажденные эритроциты выдерживали в реактиве Олс-вера при 4 оС в течение суток с целью их стабилизации.

Перед экспериментом эритроциты трижды отмывали физиологическим раствором, готовили стандартную

взвесь, оптическая плотность (при 800 нм) которой после разведения в 8 раз равнялась 0,560±0,020. Эта величина находится в диапазоне линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией эритроцитов и соответствует 12,0±0,4 млн клеток/мл.

В работе использовался фотосенсибилизатор радах-лорин (РХ) производства фирмы ООО «РАДА-ФАРМА».

Регистрацию фотолизиса сенсибилизированных РХ эритроцитов проводили следующим образом. Стандартную взвесь эритроцитов, объемом 0,1 мл, доводили до объема 0,8 мл буферным раствором, содержащим РХ. Инкубационную смесь подвергали негемолизирующему облучению красным светодиодом с длиной волны 658 нм (мощность на выходе -12 мВт). Динамику лизиса эритроцитов регистрировали с помощью спектрофотометра при 800 нм с автоматической пятисекундной регистрацией светорассеяния в прямом потоке. Показателем скорости гемолиза являлась величина 1/Т50, где Т50 - время, необходимое для лизиса половины эритроцитов в инкубационной смеси. Для изучения влияния на фотогемолиз различных факторов в стандартную взвесь эритроцитов добавляли следующие препараты: избирательный хе-латор ионов кальция ЭГТА (Sigma) (10 мМ), 10 %-й раствор CaCl2, малоспецифический блокатор Ca2+- каналов L-типа Дилтиазем («Ланнахер», Австрия) в сублитической концентрации 0,625 мг/мл.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Этап облучения взвеси эритроцитов в присутствии РХ, предшествующий гемолизу, как было подтверждено микроскопическими исследованиями, всегда приводил к изменению морфоформы клеток и превращению их в эхиноциты. Время, необходимое для этих изменений, зависило от дозы облучения и было индивидуально для эритроцитов разных доноров. Далее происходила агломерация клеток, вследствие чего оптическая плотность инкубационной смеси повышалась на0,05-0,08 единицы.

Подобные превращения эритроцитов, по литературным данным, происходят под действием кальциевых ионо-форов, при помещении клеток в гипертоническую среду, после двухсуточного глюкозного голодания. Однако во всех перечисленных случаях это требовало гораздо большего времени, чем под воздействием светового луча в присутствии фотосенсибилизатора. Очевидно, сказывалась огромная реакционная способность образующихся активных форм кислорода и высокая скорость свобод-норадикальных процессов. Особенно чувствительна к по-

УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XIX • №2 • 2012

Рис. 1. Влияние Са2+ на относительные значения 1/Т50 РХ-ини-циированного фотогемолиза (658 нм, 1,2 Дж/см2, 6,25 мкг/мл

РХ). Концентрация Са2+ в инкубационной среде превышает физиологическую: 1 - 2 раза; 2 - 5 раз; 3 - 10 раз; 4 - 50 раз;

5 - 100 раз

ражению свободными радикалами Са2+-АТФ-аза, при этом происходит окисление БИ-групп, входящих в активной центр фермента и изменение конформации белка при контакте с мембранными липидами, подвергшимися пе-рекисному окислению. Поврежденная АТФ-аза не только перестает откачивать ионы кальция, но и превращается в канал для Са2+, позволяя ему входить в цитоплазму. Повышение внутриклеточной концентрации Са2+, последующая активация Са2+-зависимых калиевых каналов, выход К+, С1- и воды приводит к апоптотическому уменьшению объема клетки, превращению их в эхиноциты, что делает лизис клетки неизбежным.

По нашим данным добавление в инкубационную среду ЭГТА (10 мМ), не оказывало существенного влияния на скорость индуцированного гемолиза. Однако предварительной инкубации эритроцитарной взвеси с раствором ЭГТА в течение 30 минут уже было достаточно для существенного замедления процесса (на 40-60 %). Это указывает на важность примембранной концентрации Са2+ в изменении деформационных характеристик мембраны и последующего гемолиза.

Рис. 2. Влияние дилтиазема на относительные значения 1/Т50

РХ-инициированного фотогемолиза (658 нм, 1,2 Дж/см2, 6,25 мкг/мл РХ) в зависимости от времени предварительной инкубации эритроцитов с препаратом. Время инкубации: 1 - 0 мин; 2 - 60 мин; 3 - 90 мин; 4 - 120 мин

Ионы кальция при концентрациях в 100, 50, 10, 5 и 2 раза превышающих физиологическую норму ускоряли гемолиз на87, 85, 27, 16и 3 % соответственно (рис. 1). Предварительная инкубация (0,5-1,5 часа) эритроцитов в среде с концентрацией Са2+, в 10 и 5 раз превышающей физиологическую, также приводила к ускорению гемолиза, но степень ускорения была достоверно ниже, чем без инкубации. Степень ускорения фотогемолиза зависела от концентрации Са2+, но не зависела от времени инкубации. Ингибитор кальциевых каналов дилтиазем оказывал инги-бирующее действие на фотогемолиз, но лишь после инкубации с ним в течение часа (рис. 2).

ВЫВОДЫ

Факторы, вовлеченные в механизмы эриптоза, а именно - Са2+ и кальциевые каналы, оказывают существенное влияние на фотоиндуцированный лизис эритроцитов. Ингибирование гемолиза под действием ЭГТА и ингибитора кальциевых каналов, а также его ускорение при повышении концентрации Са2+ свидетельствуют о потенцировании эриптозом процесса фотогемолиза.

© Коллектив авторов, 2012 г. УДК 611.018.54:546.131

В. П. Фаенкова, И. Л. Соловцова, Е. А. Воробьев, А. Д. Денисенко, Л. В. Галебская

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ТРАНСПОРТА РАДАХЛОРИНА ПЛАЗМОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова; Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург

Препарат радахлорин (ООО «РАДАФАРМА») является мощным фотосенсибилизатором и находит все большее применение в фотодинамической терапии (ФДТ) злокачественных новообразований и других патологических состояний человека. Преобладающим компонентом препарата является растительный тетрапиррол хлорин е.

Для проведения процедуры ФДТ препарат вводят в кровь, после чего он разносится по всему организму и поглощается различными тканями. От взаимодействий фотосенсибилизатора с компонентами крови зависит его распределение в организме и, следовательно, эффективность ФДТ. Целью настоящей работы явилось выявление транспортных форм препарата среди белков плазмы крови человека.