Оценка генотоксичности сточных вод в системе экологического мониторинга пивоваренного предприятия

ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ ПРОИЗВОДСТВА

УДК 628:575:664

О. Б. Иванченко, Р. Э.Хабибуллин, О. А. Решетник

ОЦЕНКА ГЕНОТОКСИЧНОСТИ СТОЧНЫХ ВОД В СИСТЕМЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ПИВОВАРЕННОГО ПРЕДПРИЯТИЯ

Ключевые слова: сточные воды, биологическая очистка, генотоксическая активность, пивоваренные предприятия.

Загрязнение окружающей среды и нарушение экосистем - одна из наиболее актуальных проблем в мире. Краткосрочные биотесты на микроорганизмах in vitro (тест Эймса на Salmonella typhimurium и ДНК-повреждающий тест на Escherichia coli) были использованы для оценки генотоксического потенциала сточных вод пивоваренного предприятия. Исследованы нативный сток, его водная и органическая составляющие. Не было обнаружено мутагенной активности в исследуемых образцах. Использование генотоксических тестов является необходимым в биомониторинге сточных вод.

Key words: wastewater, biolocical treatment, genotoxic activity, brewery.

The pollution environmental and disruption of ecosystem is the most important problem of the world. Short-term in vitro bioassays with microorganisms (Ames test with Salmonella typhimurium and DNA-repair test on Escherichia coli) were used to evaluate genotoxic potential of brewery wastewater. It was studied native wastewater and its water and organic components. It is shown no mutagenic activity in the samples. The use of genotoxic assays for screening of environmental is an important in biomonitoring of wastewater.

Введение

В настоящее время решение экологических проблем пищевых предприятий носит комплексный характер и находится на стыке «экология-экономика», оно должно базироваться на внедрении эффективных технологий, позволяющих сочетать в себе решение экологических вопросов с получением вторичных продуктов, а также с сохранением энергоресурсов. Разработка технологий очистки и утилизации промышленных отходов требует использования экспресс-анализов, позволяющих быстро и качественно охарактеризовать отходы и сточные воды. На сегодняшний день качество сточных вод регламентируются по химическим, бактериологическим и паразитологическим показателям, которые невозможно оценить быстро. Кроме того, в большинстве случаев безопасность определяется допустимыми концентрациями, разработанными для отдельных химических веществ. Вместе с тем, в природе на организм действуют не отдельные соединения, а целый комплекс веществ, которые, влияя друг на друга могут повышать или понижать эффект воздействия, поэтому оценка качества вод по интегральным показателям представляется наиболее

перспективным подходом к выявлению реальной экологической безопасности сточных вод [1].

В системе контроля состояния природных сред и экосистем все более важную и самостоятельную роль занимает биотестирование. Биотестирование дает возможность быстрого получения интегральной оценки токсичности, что делает весьма привлекательным его применение при скрининговых исследованиях [2,3,4]. Однако, оценка токсичности, далеко не в полной мере отражает опасные, особенно токсикогенетические, последствия загрязнения природных объектов, т. к

известно, что наибольшую опасность для здоровья настоящего и будущих поколений представляют соединения, обладающие способностью вызывать отдаленные эффекты: мутагены и канцерогены. Показано, что рекомендуемое существующими нормативами определение токсичности не может заменить оценку генотоксичности в специальных тестах, поскольку между этими показателями не существует прямой корреляции.

Одним из подходов, позволяющих оценивать воздействие многокомпонентных антропогенных факторов на природные комплексы, является определение их суммарной мутагенной активности, характеризующей интегральное воздействие комплекса токсикантов на геном живых организмов. Кроме этого, такие исследования являются целесообразными при контроле безопасности сточных вод, подаваемых на биологические очистные сооружения с целью предупреждения проникновения опасных веществ в биоценозы активного ила [5] Поэтому изучение суммарной мутагенной активности представляет собой наиболее перспективный подход к выявлению реального мутагенного потенциала сточных вод [6].

Исследования токсических и мутагенных свойств сточных вод различных промышленных предприятий в тест-системах разного уровня организации, направленные на практическое обоснование необходимости анализа

генотоксичности в комплексной оценке безопасности сточных вод, проводятся как в нашей стране, так и за рубежом [7, 8, 9, 10].

Так, учеными из Бразилии изучалась мутагенность 16 образцов промышленных стоков предприятий, относящихся к химической, целлюлозно-бумажной, нефтехимической и автомобильной промышленности. Стоки были выбраны из-за большого их объема, сбрасываемого

в реку. Показано, что хотя бы однажды мутагенность обнаруживалась в стоках всех предприятий. Из 16 образцов 10 давали позитивный результат, причем в 9 образцах мутагенная активность обнаруживалась и без предварительной экстракции [11].

В Дании также было проведено изучение генотоксичности сточных вод промышленных заводов. Было показано, что сточные воды девяти из четырнадцати заводов индуцировали хромосомные аберрации на статистически достоверном уровне в ЛШиш-тесте [12]. Уотерс с коллегами обнаружил цитотоксичность и мутагенность неконцентрированных сточных вод на клетках китайского хомячка и в тестах на микроорганизмах [13].

Экспериментальная часть

Целью данного исследования явилось изучение ДНК-повреждающего действия образцов сточных вод пивоваренного предприятия (г. Санкт-Петербург) и их мутагенных свойств в тестах на микроорганизмах с целью предварительной оценки их безопасности. Были изучены как нативная сточная вода, так ее эфирная и водная фракции.

Эфирную фракцию получали экстракцией сточной воды диэтиловым эфиром с последующим выпариванием эфирного слоя досуха и растворением твердого остатка в

диметилсульфоксиде (ДМСО). После растворения остатка 1 мл ДМСО содержал экстракт из 5 мл нативной сточной воды.

Водная фракция представляла собой остаток нативной сточной воды после экстракции эфиром. Стерилизация проб проводилась путем фильтрации через стерильные мембранные фильтры 8уирог с диаметром пор 0,45 мкм.

Оценка безопасности сточных вод в настоящее время не ограничивается оценкой их токсичности. Изучение суммарной мутагенной активности, характеризующей интегральное воздействие комплекса токсикантов на живые организмы, позволяет оценить возможность возникновения повреждений в молекуле ДНК. Вызванные изменения в геноме приводят к потере свойств клетками, в результате чего вероятна смена популяций в биоценозе.

Известно, что большинство повреждений ДНК могут быть восстановлены системами репарации. Этот феномен является основой широко распространенных методов тестирования химических соединений на ДНК-повреждающую активность, которая определяется по селективному ингибированию роста бактериальных штаммов, несущих мутации в генах, которые контролируют различные этапы репарации ДНК. Эти методы наряду с тестами на мутагенность, успешно применяются для первичного выявления мутагенов и канцерогенов.

Возможность соединений и комплексов веществ, входящих в состав сточной воды, индуцировать повреждения ДНК исследовано в ДНК-повреждающем тесте на тестерных штаммах микроорганизмов, способных регистрировать

повреждения для исправления которых необходимо функционирование пострепликативной или эксцизионной систем репарации [14].

ДНК-повреждающий тест. Оценку проводили на мутантных штаммах Escherichia coli, в которых подавлено функционирование одной из систем репараций:

WP-trp E, дикий тип.

uvrA- - trp 65, sul, uvr A 155 (нарушена экс-цизионная репарация).

recA- -trp-65, rec A (нарушена постреплика-тивная репарация).

Принцип метода заключается в селективном ингибировании роста мутантных штаммов по сравнению с диким типом. Была использована суспензионная модификация теста: индикаторные бактерии инкубировали в жидкой среде, содержащей исследуемый препарат.

Для определения силы влияния сточной воды на мутантный штамм определяли разницу оптических плотностей микробных суспензий АОопт между штаммами с «нормальным» и дефектным по репарации генотипами:

X =

) л, • к •

деф дик

•100%

К деф • О дик

где Одеф - ДЭопт дефектного штамма в опыте; Одик - АОопт дикого штамма в опыте; Кдик - АБопт ликого штамма в контроле; Кдеф - АБопт дефектного штамма в контроле.

Процент выживаемости 96 - 100% указывает на отсутствие ДНК-повреждающей активности, 86 - 96% -активность слабая (пограничная), менее 85%-свидетельствует о преимущественной гибели штамма. В качестве позитивного контроля использовали водный раствор фурацилина (500 мкг/мл).

На мутантных по репарации штаммах: иугЛ", гесЛ- была изучена способность сточной воды (общий сток предприятия), ее органической вытяжки и водной составляющих вызывать повреждения в ДНК, а также отдельно были оценены стоки после мойки отдельных цехов. Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Таблица 1 - ДНК-повреждающая активность сточной воды

ДНК-повреждающая

Вариант опыта активность, %

rec A- uvr A-

Нативный сток общий 95,6 93,5

Органическая вытяжка 98,4 95,3

Водная фракция 93,5 96,3

Нативный сток после

мойки бродильного цеха 92,1 86,1

органическая вытяжка 96,2 97,3

водная фракция 98,4 97,5

Нативный сток после

мойки варочного цеха 98,2 98,6

органическая вытяжка 97,3 96,8

водная фракция 96,6 97,4

При исследовании общего нативного стока, его органической вытяжки и водной составляющей

видно, что стоки в большей своей части обладают ДНК-повреждающей активностью. Их активность находится в интервале 86-96 %.

При изучении сточной воды, образуемой, после мойки и дезинфекции бродильного цеха показано, что данные воды обладают более сильным ДНК-повреждающим действием, которое зарегистрировано на штамме с нарушенной эксцизионной репарацией. Выживаемость штамма составила 86%. В опытах исследования органической вытяжки и водной составляющей стоков ДНК-повреждающая активность не зарегистрирована. Из анализируемых образцов при изучении сточной воды после мойки варочного цеха выявлено, что они не обладают ДНК-повреждающей активностью. Активность находится в интервале от 96-100%.

Чтобы исключить возможность получения ложноотрицательных результатов в тесте Эймса на мутагенность вначале исследовали токсические свойства образцов сточной воды по отношению к тестерному штамму Salmonella typhimurium путем посева проб на полноценную питательную среду.

Как показывают результаты, представленные в таблице 2, сами стоки и их фракции не угнетают выживаемость Salmonella typhimurium больше чем на 50%, поэтому далее можем их исследовать в тесте Эймса.

Таблица 2 - Токсичность образцов по отношению к штамму Salmonella typhimurium ТА 100

Вариант опыта Выживаемость, %

Контроль 100

Нативный сток общий 72

Органическая вытяжка 56

Водная фракция 54

Нативный сток с бродиль- 67

ного отделения 56

Органическая вытяжка 51

Водная фракция

Нативный сток с варочно- 63

го отделения 52

Органическая вытяжка 55

Водная фракция

Оценка мутагенного потенциала в тесте Эймса без метаболической активации. Методы тестирования мутагенного действия химических соединений с использованием в качестве тест-объекта микроорганизмов используются в мире. Это обусловлено высокой скоростью размножения микроорганизмов, простым и недорогим их содержанием, возможностью в короткие сроки не только получить результат, но и предположить механизм действия.

Тест Эймса используется в большинстве лабораторий мира как один из основных методов в просеивающих программах.

В работе использовали ауксотрофный по гистидину тестерный штамм Salmonella typhimurium TA100 (his G46,rfa,uvr, bio, pKM101), регистрирующий мутации типа замены пар оснований. Эксперименты проводили согласно Maron and Ames [15] в модификации Фонштейна [16]. Если число колоний-ревертантов в опыте превышает спонтанный фон

мутирования в 2,5-10 раз, это говорит о слабой мутагенной активности изучаемого соединения, если в 10-100 раз-то вещество обладает мутагенной активностью средней силы, если в 100 раз и более, то это соединение - сильный мутаген. В качестве позитивного контроля использовали раствор Ы-нитрозо-Ы-метилмочевины (НММ) (5 мкг/мл). Результаты опыта представлены в таблице 3.

Повышенное содержание гистидина в пробах может быть причиной ложноположительных результатов в тесте Эймса. Доза гистидина, необходимая для удвоения ревертантов должна быть не менее 232 мкг/мл [17]. Количество аминокислоты определяли методом тонкослойной хроматографии. Минимальная обнаруживаемая этим методом концентрация гистидина составляет 7 мкг/мл. В ходе наших анализов показано, что концентрация гистидина в исследуемых пробах составляет не более 100 мкг/мл, что не может быть причиной получения ложноположительных результатов в тесте Эймса.

Таблица 3 - Мутагенная активность сточной воды в тесте Эймса

Вариант опыта Среднее Превыше-

число коло- ние над

ний- спонтан-

ревертантов ным фо-

/чашке ном

Нативный сток общий 85 ± 3,0 1,4

Органическая вытяжка 80 ± 2,5 1,5

Водная фракция 90 ± 4,5 1,3

Нативный сток с бро- 87 ± 3,0 1,4

дильного отделения 86 ± 3,5 1,4

Органическая вытяжка 89 ± 3,0 1,5

Водная фракция

Нативный сток с ва- 74 ± 8,2 1,2

рочного отделения 74,5 ± 4,0 1,2

Органическая вытяжка 75 ± 6,5 1,2

Водная фракция

Негативный контроль 61 ± 5,0 -

Позитивный контроль 185 ± 12,3 3,0

Исследование сточной воды и ее фракций в тесте Эймса не выявило ее мутагенной активности. Число колоний-ревертантов в опыте и контроле достоверно различаются менее чем в 2,5 раза. Как с биологической, так и с гигиенической точки зрения, оптимальным методом изучения суммарной мутагенной активности сложных смесей - загрязнителей почвы и водоемов - является оценка мутагенности водных экстрактов, поскольку именно водорастворимая фракция представляет реальную угрозу попадания в организм человека в результате вымывания в грунтовые воды и перехода в растения.

Таким образом, на наш взгляд, представляется целесообразным комплексный анализ сточных вод в ряде тест-систем с целью изучения не только токсических свойств воды, но и обнаружения мутагенного потенциала. Наиболее приемлемыми инструментами изучения токсичности и мутагенной активности сточных вод являются методы с использо-

ванием природных организмов (микроорганизмов, простейших, растений, и др.), которые позволяют в короткие сроки получить интегральную оценку воздействия на экосистемы. Используемые в работе биотесты, позволили в короткий срок оценить генетическую безопасность сточных вод предприятия при выборе способа их отвода и утилизации и могут быть рекомендованы в качестве тест-систем в мониторинге экологической безопасности сточных вод.

Литература

1. Cizmas L., McDonald T.J., Phillips T.D., Gillespie A.M., Lingenfelter R.A., Kubena L.F., Donnelly K.C. Toxicity characterization of complex mixtures using biological and chemical analysis in preparation for assessment of mixture similarity // Environ.Sci.Technol.-2004.-V.38.- №.19.-P.5127-5133.

2. Иванченко О.Б., Хабибуллин Р.Э., Хусаинова Х.Р. Биотесты в мониторинге экологической безопасности сточных вод // Вестник Казанского технологического университета, 2006.- №4. - С.166-157

3. Халилова А.А., Яковлева А.В., Сироткин А.С. Сравнительная оценка токсичности сточных вод, содержащих ионы хрома и никеля с применением различных биотест-объектов // Вестник Казанского технологического университета 2010. - №10. - С.392-401.

4. Esimbekova E.N.,Kondik A.M., Kratasyuk V.A. Bioluminescent enzymatic rapid assay of water integral toxici-ty//Environ.Monit.Assess. -2013. - №. 185(7).- P.5909-5916.

5. Хабибуллин Р.Э., Петров А.М. Разработка алгоритма оптимизации процесса очистки сточных вод молочного производства // Вестник Казанского технологического университета, 2012.- Т. 15. - № 19. - С. 127-129.

6. Иванченко О.Б., Хабибуллин Р.Э. Изучение генотоксического потенциала сточных вод мясоперерабатывающего предприятия // Известия Вузов. Серия Пищевые технологии.- 2005. - №4.- С.61-63.

7. Гольд З.Г.,Глущенко Л.А., Морозова И.И., Шадрин И.А. Оценка токсичности природных вод пруда Бугач по биотестам // Токсикологический вестник. - 2000. - № 5. - С. 28-33.

8. Bakare A.A., Okunola A.A., Adetunji O.A., Jenmi H.B. Genotoxicity assessment of a pharmaceutical effluent using four bioassays.// Genet.Mol.Biol. - 2009 .- № 32(2). - Р.373-381.

9. Rodrigues FP, Angeli JPF, Mantovani MS, Guedes CLB, Jordao BQ. Genotoxic evaluation of an industrial effluent from an oil refinery using plant and animal bioassays. // Genet Mol Biol. 2010.- № 33. Р.169-175.

10. Thewes M.R., Junior D.E., Droste A.Genotoxicity biomonitoring of sewage in two municipal wastewater treatment plants using the Tradescantia pallida var. purpurea bioassay// Genet.Mol.Biol 2011.-№ 34(4).-Р. 689-693.

11. Coinbrao C.A., Valent G.U., Sato U.J., Sanchez P.S., Garcia C., Hernandes T. Effect of bromacil and sewage sludge addition on soil ensimatic activity//Soil.Sci.Plant Nutr, 1992. - V.42. - №3.-P.191-195.

12. Nielsen M.H., Rank J. Screening of toxicity and genotoxicity in wastewater by the use of the Allium test // Hereditas. - 1994. - 121 p.

13. Waters L.C., Schenley R.L., Owen B.A., Walsh P.J., Hsie, Jolley R.L., Buchanan M.V., Condie L.W. Biotesting of wastewater: a comparative study using the Salmonella and CHO assay systems//Environ. Mol.Mutagen, 1989.- № 14(4). - P.254-263.

14. Абилев С.К., Порошенко Г.Г. Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Токсикология. - 1986. - Т.14, № 1. - С. 3174.

15. Maron D.M., Ames B.N. Revised metods for the Salmonella mutagenicity test // Mutat. Res. - 1983, № 113. - Р. 174- 210.

16. Фонштейн Л.М., Абилев С.К., Бобринев Е.В. и др. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем. Метод. указание. - М. - 1985. - 34 с.

17. Nylund L., Einisto P. Mutagenicity testing of protein-containing and biological samples using the Ames/Salmonella plate incorporation test and the fluctuation test // Mutat. Res. - 1992. - V. 272, № 3. - P. 205-214.

© О. Б. Иванченко - к.б.н., доцент кафедры химии и биотехнологии Санкт-Петербургского государственного торгово-экономического университета, obivanchenko@yandexl.ru; Р. Э. Хабибуллин - к.т.н., доцент кафедры технологии мясных и молочных продуктов КНИГУ, hrustik@yandex.ru; О. А. Решетник - д.т.н., профессор, зав. кафедрой технологии пищевых производств КНИТУ, reshetnik@kstu.ru.

© O. B. Ivanchenko - Candidate of Biological Sciences (Ph.D.), Associated Professor, Department of chemistry and biotechnology, obivanchenko@yandexl.ru; R. E. Khabibullin - Candidate of Technical Sci., Associate professor, Department of Meat and Milk Products Technology, KNRTU, hrustik@yandex.ru; O. A. Reshetnik - Doctor of Technical Sciences, Full Professor, Head of the Department of Technology of Food Productions, KNRTU, reshetnik@kstu.ru.

22б