Применение турбидиметрического метода анализа для стандартизации и оценки качества антибиотиков группы аминогликозидов и лекарственных препаратов на их основе

Применение турбидиметрического метода анализа

для стандартизации и оценки качества антибиотиков группы

аминогликозидов и лекарственных препаратов на их основе

Ю. В. ОЛЕФИР, *Е. Н. СЕМЁНОВА, С. И. КУЛЕШОВА, Е. И. САКАНЯН, С. А. ПРОЦАК

Научный центр экспертизы средств медицинского применения МЗ РФ, Москва

Turbidimetric Method for Standardization and Quality Control of Aminoglycoside Antibiotics and Aminoglycoside-Based Products

YU. V. OLEFIR, *E. N. SEMENOVA, S. I. KULESHOVA, E. I. SAKANYAN, S. A. PROTSAK

Scientific Centre for Expert Evaluation of Medicinal Products of the Ministry of Health of the Russian Federation, Moscow

Рассмотрены микробиологические методы, позволяющие оценить биологическую активность антибиотиков, как фундаментальную основу, определяющую клиническую эффективность антибактериальных препаратов. На примере аминогли-козидного антибиотика гентамицина описана разработка и валидация количественного определения гентамицина турби-диметрическим методом, основанном на ингибирующем эффекте антибиотика на рост тест-штамма Staphylococcus aureus ATCC 6538Р в жидкой питательной среде. Полученные данные были подвергнуты обработке с помощью дисперсионного анализа и признаны линейными (r=0,9921) в диапазоне концентраций от 0,64 до 1,56 мкг/мл. Результаты валидационных испытаний методики количественного определения гентамицина свидетельствуют о перспективности и целесообразности применения метода турбидиметрии в стандартизации и последующей оценке качества аминогликозидных антибиотиков.

Ключевые слова: аминогликозидный антибиотик, количественное определение, турбидиметрический метод, стандартизация, оценка качества.

The article covers microbiological methods that help assess the biological activity of antibiotics, which is fundamental for determination of clinical efficacy of antimicrobial drugs. The authors chose gentamicin, an aminoglycoside antibiotic, to illustrate the development and validation of the turbidimetric assay, which is based on antibiotic's inhibitory effect on the growth of Staphylococcus aureus ATCC 6538Р test strain in liquid medium. The obtained data were assessed with ANOVA and were recognized as linear (r=0.9921) in the concentration range of 0.64—1.56 mg/ml. The results of gentamicin assay validation studies demonstrate great potential and applicability of the turbidimetric method for standardization and ensuing quality control of amino-glycoside antibiotics.

Keywords: aminoglycoside antibiotic, assay, turbidimetric method, standardization, quality control.

Введение

Аминогликозидные антибиотики относятся к числу наиболее важных в практическом отношении лекарственный препаратов, применяемых в лечении инфекционных болезней, ввиду их широкого спектра антимикробного действия, включающего основных представителей грамположитель-ных и грамотрицательных микроорганизмов [1, 2].

Гентамицин — аминогликозидный антибиотик, продуцируемый Micromonospora purpurea [1]. На российском фармацевтическом рынке гента-мицина сульфат представлен лекарственными препаратами в различных лекарственных формах (крем, мазь, капли глазные и ушные, раствор для парентерального введения) как самостоятельно,

© Коллектив авторов, 2018

*Адрес для корреспонденции: 127051 Москва, Петровский б-р, д. 8, стр. 2. НЦЭСМП

так и в комбинации с другими действующими веществами.

Оценивая место и значение гентамицина в современной антибиотикотерапии бактериальных инфекций, необходимо отметить, что лекарственные средства на его основе по-прежнему остаются препаратами выбора, предназначенными для лечения тяжёлых форм инфекционно-воспалитель-ных заболеваний, вызываемых чувствительными к нему микроорганизмами [1—3]. Гентамицин включён в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов для медицинского применения 2018 года. Вместе с тем, следует учитывать достаточно серьёзные нежелательные реакции (ото- и нефротоксичность, ней-ромышечная блокада), которые могут возникнуть в результате его передозировки. С другой стороны, использование противомикробных препаратов, в целом, сегодня требует особой осторожнос-

СТАНДАРТИЗАЦИЯ И КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

ти в связи со стремительным распространением антибиотикорезистентности микроорганизмов. К этому, как правило, приводит применение некачественных антибиотиков и неизбирательное их использование. Следовательно, особое внимание необходимо уделять вопросам стандартизации и обеспечения качества антибактериальных препаратов, и вытекающей из этого их клинической безопасности и эффективности. [4].

Для определения биологической активности лекарственных средств на основе гентамицина в отечественной фармакопейной практике применяется метод диффузии в агар [5]. Этот метод основан на способности молекул антибиотиков диффундировать в агаровых средах и образовывать зоны угнетения, в которых не развиваются тест-микроорганизмы, чувствительные к испытуемому антибиотику. Несмотря на то, что метод диффузии в агар прост, не нуждается в сложном оборудовании, обеспечивает удовлетворительную чувствительность и селективность, он характеризуется рядом недостатков: длительность проведения анализа; зависимость аналитического сигнала от свойств антибиотика (его растворимости, молекулярной массы и т.п.), не связанных с его активностью; чувствительность тест-культур к качеству используемого агара; сложность автоматизации и некоторые другие [6, 7].

Это привело к необходимости поиска альтернативного метода оценки биологической активности антибиотиков, среди которых наше внимание привлёк метод турбидиметрии, отличающийся, прежде всего, оперативностью, экономичностью, а также инструментальным способом регистрации аналитического сигнала.

Цель работы заключается в разработке турби-диметрической методики количественного определения гентамицина сульфата.

Материал и методы

Препараты антибиотиков, реактивы и материалы. В работе были использованы: препарат «Гентамицин, раствор для внутривенного и внутримышечного введения, 40 мг/мл», Россия; стандартный образец (СО) гентамицин сульфат — GS EPCRS (активность — 17352 IU/vial, batch 14, действительный на момент исследования). Для приготовления основных растворов стандартного и испытуемого образцов использовали воду очищенную, полученную на установке «Millipore», рабочие растворы готовили с буфером №4 (ОФС.1.2.4.0010.15 Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар). Для разработки методики были использованы химические реактивы отечественного и импортного производства c квалификацией не ниже «х.ч.».

Микроорганизмы, питательные среды. В работе использовали следующие штаммы микроорганизмов: Staphylococcus aureus ATCC 6538Р, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883 (для турбидиметрического анализа); Bacillus pumilus NCTC 8241 (для метода диффузии в агар), полученные из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России. При проведении турбидиметрического анализа применяли экспериментальную питательную среду (ЭПС), содержащую

компоненты отечественного производства: панкреатический гидролизат казеина (ПГК) (ТУ 9229-240-78095326-2016); гид-ролизат мяса ферментативный (ГМФ) (ФСП 42-0487-424503); экстракт кормовых дрожжей (ТУ 9385-090-14237183-08) и D-глюкоза (ГОСТ 6038-79). pH используемой среды составил 7,2+0,2. Определение биологической активности методом диффузии в агар проводили по 0ФС.1.2.4.0010.15 «Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар».

Условия эксперимента. Штаммы тест-микроорганизмов инкубировали в ЭПС при 37+1°С в течении 24 ч. В день испытания бульонную культуру разбавляли для достижения мутности суспензии 25+2% (коэффициент пропускания) с использованием спектрофотометра Agilent 8453 (США) и длины волны 580 нм. Полученную суспензию использовали в качестве посевного материала. Для турбидиметрического анализа была выбрана трёхдозная модель параллельных линий (3x3 дизайн; 3 дозы стандарта и 3 дозы образца). Первоначально соответствующий объём ЭПС инокулировали в количестве 0,5; 1,0 и 3,0%. Затем 9 мл инокулированной среды и 1 мл испытуемого или стандартного раствора (при концентрации 0,67; 1 и 1,5 мкг/мл) вносили в пробирку объёмом 20 мл. После этого анализируемые смеси инкубировали при 37+1°С в течение 4,5 ч. Одновременно инкубировали отрицательный контроль (9 мл стерильной ЭПС и 1 мл буфера №4) и положительный контроль (9 мл инокулированной ЭПС и 1 мл буфера №4). Все пробирки, содержащие стандартный и испытуемый образец в разных концентрациях, были подготовлены в шести экземплярах и распределены по схеме латинского квадрата.

По завершении процесса инкубации размножение микроорганизмов останавливали добавлением 0,5 мл 12% раствора формальдегида к каждой из пробирок, в том числе положительных и отрицательных контролей. Оптическую плотность бактериальной популяции в пробирках с испытуемым и стандартным образцами, а также контрольных пробирок определяли при длине волны 530 нм.

После установления оптимальных условий для получения кривой «доза—реакция», была проведена валидация методики путём определения следующих параметров: линейность, правильность, прецизионность, устойчивость и специфичность [5, 8]. Расчёт биологической активности антибиотиков, математическую и статистическую обработку результатов осуществляли в соответствии с существующими рекомендациями [5] с помощью программных обеспечений Microsoft Office Excel и CombiStats, version 5.0.

Результаты и обсуждение

Определение оптимальных аналитических условий. Турбидиметрический анализ оценки биологической активности антибиотиков основан на взаимодействии между тест-микроорганизмом и антибиотиком. Это взаимодействие выражается в логарифмической зависимости степени угнетения роста бактериальной популяции от концентрации антибиотика. Линейный отклик обычно происходит в ограниченном диапазоне концентраций антибиотика и определённой фазе роста тест-микроорганизма (фаза логарифмического роста).

Выбор микроорганизма является важнейшим вопросом в турбидиметрическом биотестировании, так как он должен характеризоваться чувствительностью к антибиотику и не очень высокими ростовыми потребностями, давая быстрый, равномерный рост в жидкой питательной среде без образования плёнки и выраженного осадка.

Таблица 1. Определение оптимальных условий количественного определения гентамицина турбидиметри-ческим методом

Параметр Проанализированные условия Быбранные условия

Тест-микроорганизм Б.аыгеыз АТСС 6538Р; 8.ер1йегт1й1ъ АТСС 12228; Крпеытотае АТСС 13883 Б.аыгеыз АТСС 6538Р

Концентрация инокулята (%) 0,5; 1; 3; 1

Диапазон концентраций антибиотика (мкг/мл) 0,5; 0,75; 1,125 0,64; 0,8; 1; 1,25; 1,56 0,5; 1; 2; 4 0,64; 0,8; 1; 1,25; 1,56

Время инкубации (ч) 3,5; 4,5; 5,5; 4,5

Таблица 2. Результаты дисперсионного анализа определения биологической активности гентамицина турби-диметрическим методом

Источник дисперсии (показатель) Число степеней свободы Сумма квадратов Средний квадрат ^набл. * критич. р, %

Регрессия 1 0,902609 0,902609 625,722 >8,1 99

Параллельность 1 0,000689319 0,000689319 0,478 <4,35 95

Линейность 2 0,000643511 0,000321755 0,223 <4,35 95

стандарт 1 0,000642937 0,000642937 0,446

испытуемый 1 0,00000104 0,00000104 0,001

Квадратичность 1 0,000313174 0,000313174 0,217 <4,35 95

Разность квадратичностей 1 0,000330337 0,000330337 0,229 <4,35 95

В ходе выполненных исследований были изучены основные параметры с целью определения наиболее оптимальных условий турбидиме-трического анализа (табл. 1). Подбор экспериментальных условий позволил установить оптимальную зависимость «доза—реакция» и определить корреляцию между оптической плотностью бактериальной популяции и концентрацией антибиотика. В результате растворы с концентрацией гентамицина в диапазоне от 0,64 до 1,56 мкг/мл оценивали, используя ЭПС инокулиро-ванную З.аыгвш АТСС 6538Р в количестве 1% после 4,5 ч инкубации.

Балидация методики. Для обоснования применения методики количественного определения гентамицина в лекарственных препаратах турби-диметрическим методом были выполнены вали-дационные испытания. Валидация проводилась на двух уровнях: путём определения валидацион-ных параметров (линейность, правильность, прецизионность, устойчивость и специфичность) и в сравнении с валидированным фармакопейным методом диффузии в агар.

Проверка линейности. Модель параллельных линий предполагает, что взаимосвязь между логарифмом доз и оптической плотностью бактериальной популяции должна быть представлена в виде прямой линии во всем диапазоне исследованных концентраций; прямая линия испытуемого образца должна быть параллельна соответствующей прямой линии стандартного образца [5, 9].

Зависимость «доза—реакция» для растворов стандартного и испытуемого образцов была построена с использованием среднего значения оптической плотности бактериальной популяции, полученного по результатам шести независимых определений, от логарифма концентрации анти-

Зависимость оптической плотности бактериальной популяции от концентрации гентамицина. Примечание. * — уравнения линейной регрессии и значения коэффициентов корреляции: у=-1(0421х+0,3876; [^=0,9921 для стандартного образца; у=-0,9922х+0,4114; [^=0,9987 для испытуемого образца.

биотика и продемонстрировала линейность в диапазоне концентраций гентамицина от 0,64 до 1,56 мкг/мл (рис. 1).

Дисперсионный анализ показал правильность результатов опыта: значительную регрессию (^<0,01) и отсутствие отклонений от линейности и параллельности, в соответствии с требованиями 0ФС.1.1.0014.15 «Статистическая обработка результатов определения специфической фармакологической активности лекарственных средств биологическими методами» [5] (табл. 2).

Прецизионность методики была оценена на двух уровнях: повторяемость (образец анализиро-

СТАНДАРТИЗАЦИЯ И КОНТРОЛЬ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Таблица 3. Результаты проверки правильности количественного определения гентамицина турбидиметри-ческим методом

Теоретическая активность Найденная активность Восстановление, Средний процент ^Б, %

стандартного образца, % стандартного образца, % % восстановления, %

80 78,95 98,69 99,76 0,93

100 100,2 100,2

120 120,45 100,38

Таблица 4. Результаты проверки устойчивости количественного определения гентамицина турбидиметриче-ским методом

Параметр Модифицированные условия Нормальные условия Устойчивость методики

Время инкубации, мин 265 275 270 Устойчива

Длина волны, нм 525 535 530 Устойчива

Объём среды в пробирки, мл 9,9 10,1 10 Устойчива

Концентрация инокулята, % 0,5 1 Не устойчива

1,5

Таблица 5. Сравнительная оценка биологических методов количественного определения гентамицина

Метод анализа Чувствительность, Время выполнения анализа Среднее содержание ^Б, %

мкг/мл (инкубации), ч гентамицина, %

Турбидиметрическая методика 0,64 4,5 97,1 1,25

Диффузия в агар 1 18-20 94,8 1,83

вали в 6 повторностях в одинаковых условиях) и промежуточная прецизионность (в течение 3 дней). Сходимость не превышала 1,05% (Я8Б), междневная прецизионность составляла 2,02% (Я8Б). В целом прецизионность указывает на хорошую согласованность результатов множественного анализа образца, что свидетельствует о точности валидируемой методики.

Правильность оценивали по результатам анализа модельных растворов с известными концентрациями антибиотика, приготовленными методом добавок (табл. 3). Полученные данные показывают, что валидируемая методика является правильной, так как средний процент восстановления при использовании концентраций в диапазоне 80, 100 и 120%, находится в пределах от 98 до 102%.

Устойчивость методики определяли путём анализа образца в различных условиях (табл. 4). Данные, полученные при изменении таких параметров, как время инкубации, длина волны и конечный объём среды в анализируемой пробирке статистически не отличаются от данных, полученных в стандартных условиях. Установлено, что вариации с концентрацией инокулята оказывают влияние на устойчивость методики, что свидетельствует о важности данного параметра и необходимости его контроля.

Специфичность методики была подтверждена использованием высокочувствительного к гента-мицину тест-микроорганизма S.aureus АТСС 6538Р, а также статистической обработкой результатов, полученных с применением валидиру-

емой турбидиметрической методики и фармакопейного метода диффузии в агар (табл. 5). На основании данных анализа можно сделать вывод о том, что с вероятностью 95% не существует статистически значимых различий между результатами, полученными с использованием обеих методик (1расч.= 1,9<1КрИт.=2,78).

Заключение

В результате проведённых исследований, разработана методика количественного определения гентамицина турбидиметрическим методом. Подобраны тест-микроорганизм, питательная среда, время инкубации и диапазон концентраций антибиотика, оптимальные для проведения анализа. Выполнена процедура ва-лидации методики и получены удовлетворительные результаты по всем валидационным параметрам. Статистический анализ показал, что метод диффузии в агар и турбидиметрический анализ могут считаться взаимозаменяемыми. Вместе с тем, турбидиметрический метод обладает преимуществами в отношении чувствительности, времени, затраченного на проведение анализа, и экономичности, ввиду уменьшения затрат на термостатирование.

Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России № 056-00023-18-02 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР АААА-А18-118021590049-0).

ЛИТЕРАТУРА

1. Навашин С.М., Фомина И.П, Сазыкин Ю.О. Антибиотики группы аминогликозидов. — М.: Медицина; 1977. / Navashin S.M., FominaI.P., Sazykin Yu.O. Antibiotiki gruppy aminoglikozidov. M.: Meditsina; 1977. [in Russian]

2. Durante-Mangoni E, Grammatikos A., Utili R. et al. Do we still need the aminoglycosides? International Journal of Antimicrobial Agents 2009; 33: 201-205.

3. Vakulenko S, Mobashery S. Versatility of aminoglycosides and prospects for their future. Clinical Microbiology Reviews 2003; 16: 3: 430—450.

4. Семенова Е.Н., Саканян Е.И., Кулешова С.ЖСравнительная характеристика методов количественного определения, используемых при стандартизации и последующей оценке качества антибиотиков. Вестн. военно-мед. академии. — 2017. — Т. 59. — № 3. — С. 140—146. / Semenova E.N., Sakanyan E.I., Kuleshova S.I. Sravnitel'naya kharakter-istika metodov kolichestvennogo opredeleniya, ispol'zuemykh pri standar-tizatsii i posleduyushchej otsenke kachestva antibiotikov. Vestn voenno-med akademii 2017; 59: 3: 140—146. [in Russian]

5. Министерство здравоохранения Российской Федерации. Государственная фармакопея РФ. XIII изд. М.: ФЭМБ, 2015. / Ministerstvo zdravookhraneniya Rossijskoj Federatsii. Gosudarstvennaya far-makopeya RF. XIII izd. M.: FEMB, 2015. [ in Russian]

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Олефир Юрий Витальевич — д. м. н., генеральный директор ФГБУ «НЦЭСМП» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

Семёнова Екатерина Николаевна — Эксперт 2 категории лаборатории антибиотиков Испытательного Центра экспертизы качества лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

Кулешова Светлана Ивановна — к. б. н., начальник лаборатории антибиотиков Испытательного Центра экспер-

6. Кулешова С.И. Определение активности антибиотиков методом диффузии в агар. Ведомости Научного центра экспертизы средств медицинского применения. — 2015. — № 3. — С. 13—17. / Kuleshova S.I. Opredelenie aktivnosti antibiotikov metodom diffuzii v agar. Vedomosti Nauchnogo tsentra ekspertizy sredstv meditsinskogo primeneniya. 2015; 3: 13—7. [ in Russian]

7. Берштейн Е.М. Современные биологические методы оценки активности антибиотиков. Антибиотики и химиотер. — 1991. — Т. 36. — № 6. — С. 50—53. / Bershtejn E.M. Sovremennye biologicheskie metody otsenki aktivnosti antibiotikov. Antibiotiki i khimioter 1991; 36: 6: 50—53. [ in Russian]

8. Юргель Н.В., Младенцев А.Л., Бурдейн А.В., Еетьман М.А., Малин А.А., Косенко В В. Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств. М.: Министерство здравоохранения и социального развития РФ, 2007. / Yurgel' N.V., Mladentsev A.L., Burdejn A.V., Get'man M.A., Malin A.A., Kosenko V.V. Rukovodstvo po validatsii metodik analiza lekarstvennykh sredstv. M.: Ministerstvo zdravookhra-neniya i sotsial'nogo razvitiya RF, 2007. [ in Russian]

9. Hewitt W. Microbiological assay for pharmaceutical analysis. Interharm/CRC; 2003.

тизы качества лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

Саканян Елена Ивановна — д. фарм. н., профессор, директор Центра Фармакопеи и международного сотрудничества ФГБУ «НЦЭСМП» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва

Процак Светлана Александровна — главный эксперт лаборатории антибиотиков Испытательного Центра экспертизы качества лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва