Этиопатогенетическое значение грамположительной и грамотрицательной бактериолактии в развитии бактериальных инфекций у детей первого года жизни

О. В. АНТОНОВ И АР. ОПЫТ ИЗУЧЕНИЯ ФАКТОРОВ РИСКА В ФОРМИРОВАНИИ ВРОЖАЕННЫХ ПОРОКОВ РАЗВИТИЯ

ческим критериям и требовало дополнительного лабораторного подтверждения (ПЦР, РИФ).

5. Серонегативным детям с ВПР при выписке из отделения новорожденных было рекомендовано повторное обследование на антигены вирусов. Однократный отрицательный результат ПЦР может указывать лишь на отсутствие виремии у пациента в момент забора крови и не исключает течения инфекционного процесса.

6. Массовое обследование новорожденных на наличие антигенов возбудителей ВУИ необходимо не только для получения популяционных результатов о частоте внутриутробного инфицирования и изучения этиологии ВПР. Лабораторная диагностика инфекционной патологии позволит проводить раннюю специфическую терапию инфекционного процесса на 1 и 2 этапе выхаживания новорожденных, а также обследование и лечение матерей.

7. Наряду с исследованием антигенов возбудителей ВУИ в сыворотке крови новорожденных, изучение антигенов целесообразно проводить в тканях плаценты с учетом концентрации возбудителей в органах и тканях. С этих позиций внедрение метода ПЦР в работу детских патологоанатомических отделений будет необходимо для изучения роли инфекционных факторов в генезе ВПР у мертворожденных детей или элиминированных плодов.

Литература:

1. Тератология человека: Руководство для врачей / Под ред.

Г. И. Лазюка. — М.: Медицина, 1991. — 480 с.

2. Состояние здоровья детей как фактор национальной безопасности / А. А. Баранов, Л. А. Щеплягина, А. Г. Ильин,

B. Р. Кучма // Рос. пед. журнал. — 2005. — № 2. —

C. 2.

3. Щепин О. П. Здоровье и физическое развития детей в России в 1985—2000 гг. / О. П. Щепин, Е. А. Тишук // Рос. пед. журнал. — 2004. — № 1. — С. 2—8.

4. Антонов О. В. Врожденные пороки развития у новорожденных в крупном промышленном центре Западной Сибири (аспекты эпидемиологии и профилактики): Автор. дис. ... к.м.н. — Омск, 1999.

5. Безнощенко Г. Б. Внутриутробные инфекции (вопросы диагностики и врачебной тактики) / Г. Б. Безнощенко, Т. И. Долгих, Г. В. Кривчук. — М.: Медицинская книга, Н. Новгород: Изд-во НГМА, 2003. — 88 с.

6. Дроздова С. Г. Внутриутробные инфекции в структуре заболеваемости и смертности новорожденных городского клинического перинатального центра / С. Г. Дроздова, Т. И. Долгих, Л. Н. Белослюдцева // Детские инфекции. — № 1. — 2004. — С. 60—62.

7. Долгих Т. И., Носкова Ф. В. Оппортунистические инфекции у детей. — Омск, 1999. — 99 с.

8. Изучение роли вируса краснухи в формировании врожденных пороков развития методом РТ-ПЦР // Е. М. Малкова и др. // Детские инфекции. — 2004. — № 3. — С. 5—8.

9. Клинические проявления врожденной краснухи / Л. Л. Ни-севич и др. // Педиатрия. — 1992. — № 10—12. — С. 6—10.

10. Значение различных вирусных инфекций в мертворождении, перинатальной и младенческой смертности / Л. Л. Нисевич и др. // Педиатрия. — 1999. — № 1. — С. 4—10.

11. Лаврова Д. Б. Этиология и показатели высокого риска внутриутробного инфицирования плода / Д. Б. Лаврова, Г. А. Самсыгина, А. В. Михайлов // Педиатрия. — 1997. — № 3. — С. 94—99.

12. Цинзерлинг В. А., Мельникова В. Ф. Перинатальные инфекции. Вопросы патогенеза, морфологической диагностики и клинико-морфологических сопоставлений: Практическое руководство. — СПб.: Элби, 2002. — 352 с.

ЭТИОПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГРАМПОАОЖИ-ТЕАЬНОЙ И ГРАМОТРИЦАТЕАЬНОЙ БАКТЕРИОААКТИИ В РАЗВИТИИ БАКТЕРИААЬНЫХ ИНФЕКЦИЙ У ДЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОДА ЖИЗНИ

Е. Е. Хасанова, В. А. Анохин, В. М. Бондаренко, О. А. Зинкевич, В. А. Саматов, Е. С. Герасимова

Городская инфекционная клиническая больница, Казань, Казанский государственный медицинский университет, НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. ф. Гамалеи, Москва, НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ Рф, Казань

В работе изучена частота встречаемости грамположительной и грамотрицательной бактериолактии, дана оценка кли-нико-бактериологических особенностей бактериальной инфекции у грудных детей в зависимости от этиологии бактериолактии, определена прогностическая значимость в развитии инфекционных процессов у детей, фенотипических и ге-нотипических признаков К. pneumoniae& выделенных из грудного молока.

Ключевые слова: грудное молоко, младенец, бактерии, клебсиелла, острая кишечная инфекция, генетические детерминанты патогенности, протеазная активность

В последние десятилетия в структуре острых инфекционных заболеваний у детей наряду с вирусными инфекциями лидирующие позиции стали занимать заболевания, вызываемые ассоциациями различных видов условно-патогенной флоры (УПф) [1]. Приходится признать, что убиквитарность флоры, разнообразие

путей и факторов передачи инфекции, отсутствие методов активного предупреждения заболевания снижают эффективность всего комплекса профилактических мероприятий. Практика показывает, что в половине случаев достоверно определить источник инфицирования ребенка, к сожалению, не представляется воз-

Е. Е. Хасанова и ар. Этиопатогенетическое значение бактериолактии в РАЗВИТИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКиИЙ V ЛЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОЛА жизни

можным. Поскольку грудное молоко в течение первого года жизни получают 98,9% детей [2], очевидно, что присутствие в нем патогенной микрофлоры может явиться реальным фактором угрозы заражения ребенка.

Согласно действующим на сегодня методическим рекомендациям по бактериологическому контролю грудного молока о6наружение массивного роста S. aureus и выделение даже единичных колоний представителей семейства Enterobacteriaceae или вида Ps. aerog/nosa является показанием для отказа от грудного вскармливания [3]. В настоящее время в литературе развернулась дискуссия о необходимости отмены «устаревших» методических рекомендаций МЗ СССР и сохранения грудного вскармливания, независимо от наличия бактериолактии [4]. Очевидно, что выяснение гено- и фенотипических характеристик лак-тофлоры может служить своеобразным референс-тес-том при решении вопроса об этиопатогенетической ее значимости в развитии бактериального инфекционного заболевания у детей грудного возраста.

Цель настоящей работы — оценить частоту встречаемости грамположительной и грамотрицательной бактериолактии, клинико-эпидемиологические особенности бактериальной инфекции у грудных детей в зависимости от этиологии бактериолактии, определить прогностическую значимость фенотипических и геноти-пических признаков наиболее часто встречающихся бактерий в грудном молоке.

Материалы и методы исследования

На базе ГИКБ № 3 г. Казани нами исследован микробный состав свежесобранного грудного молока от 2036 женщин и кала 2036 детей, получавших это материнское молоко. Бактериологическое исследование молока проводили в соответствии с методическими рекомендациями по бактериологическому контролю грудного молока МЗ СССР.

Исследование качественного и количественного состава бактерий толстой кишки — в соответствии с рекомендациями, разработанными в отраслевом стандарте «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» [5]. Бактериологическая диагностика ОКИ, вызываемых УПф осуществлялась согласно методическим рекомендациям [6].

Определение детерминант патогенности штаммов К. pneumoniae осуществляли с помощью ПЦР на базе лаборатории генетики вирулентности бактерий НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. ф. Гамалеи РАМН: fimA, s/gA, irp-2, cnf-1, stx, stx2 [7]. IgA проте-азную активность К. pneumoniae определяли иммуно-ферментным способом на базе Казанского НИИЭМ МЗ Рф [8].

Определение чувствительности штаммов К. pneu-mon ae к антибиотикам проводили дискодиффузиоз-ным методом; в работе использовались диски со следующими антибиотиками: ампициллин, доксициклин, тетрациклин, клиндамицин, амикацин, левомицетин, канамицин, цефалотин, цефамандол, цефотаксим, ципрофлоксацин, эритромицин, фуразолидон, гента-мицин, полимиксин, фурадонин, линкомицин.

Результаты и их обсуждение

Обнаружено, что у 1222 женщин (60% общего числа обследованных) в молоке присутствовали различные бактерии. S. epidermidis выделялся из молока 856 женщин (70% случаев), S. aureus — в 258 случаях (21,1%), S. saprofiticus выделен из молока 16 женщин (1,3%). У 88 женщин (7,2%) обнаружена грамотрицательная бактериолактия, грибы рода Candida — у 4 женщин (0,4%). Несмотря на то, что причиной бактериолактии в большинстве случаев был S. epidermidis (70%), колонизации кишечника ребенка этими бактериями, как показали сравнительные исследования, не происходит (0%). Реже из материнского молока выделяли S. aureus (21,1%), колонизация кишечника этим агентом также происходила достаточно редко — в 5,2% случаев. Сравнительно нечасто (7,2% всех случаев) нами выявлялась грамотрицатель-ная бактериолактия. Однако ее этиологическая значимость в колонизации кишечника и развитии болезни у детей была высокой (66% случаев). Настораживает тот факт, что феномен грамотрицательной бакте-риолактии в количественном отношении имеет тенденцию к росту: в 2001 году она составляла 4%, в 2002 году — 7,3%, в 2003 году — 11% от общего количества зарегистрированных случаев. Чаще всего развивалась клебсиеллезная бактериолактия — в 48,9% случаев. Кишечная палочка в молоке выявлена в 32,9% случаев грамотрицательной бактериолактии, бактерии рода энтеробактер выделены в 7,9%, си-негнойная палочка — в 6% случаев. При массивной колонизации кишечника грамотрицательные бактерии становились причиной острых кишечных инфекций у младенцев: такая ситуация при клебсиеллезной бактериолактии матери развивалась у 80% наблюдаемых детей. Синегнойная палочка была ответственна за развитие ОКИ ребенка в 75%, энтеробактер — в 50% случаев. У одной из женщин из грудного молока выделялась ЭПКП-075, которая стала причиной эшерихи-оза у вскармливаемого ребенка. При бактериолактии, обусловленной кишечной палочкой с нормальными свойствами, у получивших такое молоко детей развивался дисбактериоз кишечника.

Подробнее нами оценивались случаи клебсиеллезной бактериолактии. В преобладающем большинстве из свежесобранного грудного молока выделялась К. pneumoniae — в 35 из 43 случаев (81,4%), у 6 женщин (14%) обнаружена К. oxytoca, у 2 женщин (4,6%) — К. terrigena. Колонизация кишечника младенцев наблюдалась в случае бактериолактии, обусловленной К. pneumoniae. Женщины с данным феноменом отмечали в анамнезе заболевания грудных желез (маститы, трещины сосков, лактостаз) в 36% случаев, патологию мочеполовой системы (пиелонефриты, гинекологические заболевания) — в 20%. 12% женщин перенесли ОКИ или страдали дисфункцией кишечника накануне или после родов, 20% женщин получали антибиотики по поводу соматической патологии или кесарева сечения. Следует отметить, что у 30% матерей с клебсиеллезной бактериолактией из кишечника также выделяли бактерии вида К. pneumoniae.

Е. Е. Хасанова и ар. Этиопатогенетическое значение бактериолактии в РАЗВИТИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКиИЙ V АЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОЛА жизни

Из 35 детей в возрасте от 6 дней до 3 месяцев, получавших в качестве основного питания грудное молоко, инфицированное бактериями К. pneumoniae, 28 перенесли острую кишечную клебсиеллезную инфекцию. Диагностическими критериями ОКИ были: клинические — цикличность процесса с острым началом заболевания, синдромы интоксикации и поражения желудочно-кишечного тракта, лабораторные — отсутствие в материале патогенных микроорганизмов, вызывающих ОКИ, выделение К. pneumoniae из кала в концентрации более 106 КОЕ/г в начале болезни и исчезновение микроба по мере выздоровления. Легкая форма ОКИ наблюдалась у 14 детей (50%), среднетяжелая — у 10 детей (35%) и тяжелая — у 4 детей. Исследования показали, что все тяжелые формы клебсиеллеза развивались у недоношенных детей с неблагоприятным акушерским анамнезом.

У остальных 7 детей мы наблюдали дисбактериоз кишечника (ДБК), обусловленный К. pneumoniae. Диагностическими критериями ДБК были: отсутствие цикличности процесса, постепенное развитие желудочно-кишечных расстройств, отсутствие в материале патогенных микроорганизмов, вызывающих ОКИ, высев К. pneumoniae из кала в концентрации до 106 КОЕ/г и возможное сохранение данного микроба после выздоровления. При всех легких формах ОКИ и дисбактериозах кишечника естественное вскармливание не прерывалось. В качестве этиотропной терапии в 70% случаев применялись специфические бактериофаги, в остальных — антибиотики. Бактерии К. pneumoniae, выделенные из грудного молока, были чувствительны к клебсиеллезному пневмонийному бактериофагу в 30% случаев, к клебсиеллезному поливалентному бактериофагу в 60% случаев, к цефалотину и цефо-таксиму в 67%, гентамицину — в 75%, амикацину — в 80%, фуразолидону — в 86%, ципрофлоксацину — в 91%, левомицетину и полимиксину — в 100% случаев соответственно.

С помощью ПЦР нами были изучены генетические детерминанты патогенности 20 пар штаммов К. pneumoniae, выделенных из свежесобранного грудного молока и из фекалий младенцев, получавших это инфицированное грудное молоко и перенесших острую кишечную клебсиеллезную инфекцию. Установлено, что парные штаммы К. pneumoniae, выделенные из

материнского молока и из кишечника грудных детей с ОКИ, имели одинаковый набор фрагментов ДНК, что подтверждает идентичность этих бактерий. Во всех 20 случаях (100%) у штаммов К. pneumoniae была обнаружена нуклеотидная последовательность s/gA-гена. К fimA-гену (фимбрии 1 типа) положительный сигнал был получен в 1 случае (5%), фрагменты irp-2 гена (железорегулируемый белок) выявились у 7 штаммов (35% случаев). Нуклеотидная последовательность cnf-1 гена (цитотоксический некротизирующий фактор) обнаружена у половины исследованных бактерий К. pneumoniae (50%), фрагменты sfx2-гена (шигапо-добный энтеротоксин-2) обнаружены у 1 изолята (5% случаев). Ампликоны, гомологичные sfxl-гену получены не были.

Нами установлено, что штаммы К. pneumoniae, выделенные из свежесобранного грудного молока и обусловившие развитие ОКИ у младенцев достоверно чаще (p < 0,05) несут в своем геноме фрагменты ДНК, специфичные известным генам кластеров пато-генности: s/gA в 18 раз, irp-2 почти в 3 раза, cnf-1 — в

8 раз, чем штаммы К. pneumoniae, выделенные из фекалий других детей при ДБК (в качестве контрольных использованы 45 музейных штаммов К. pneumoniae НИИ эпидемиологии и микробиологии им Н. ф. Гамалеи РАМН). Результаты представлены в таблице 1.

Полученные данные дают возможность предположить потенциальную патогенность бактерий К. pneumoniae, выделенных из материнского молока, и вероятность развития манифестных форм инфекционного заболевания у грудных детей, вскармливаемых инфицированным молоком.

На следующем этапе работы было поведено исследование, определяющее вероятность экспрессии s/gA-гена. Из 20 штаммов К. pneumoniae, выделенных из грудного молока, /g-протеазной активностью обладали 16, что составило 80%. Протеазную активность не проявили 4 штамма К. pneumoniae, активность сери-новых ферментов выявлена у 13 изолятов (81,25%), металлозависимых — у 14 (87,5%), тиоловых — у

9 (56,25%). В большинстве случаев /g-протеазная активность изолятов К. pneumoniae грудного молока была обусловлена ферментами металлозависимого типа (80,8%). Она в 8—9 раз превышала уровень активности сериновых и тиоловых ферментов этих микро-

Таблица 1. Частота обнаружения генов вирулентности у изолированных штаммов К. pneumoniae

Генетические маркеры патогенности Штаммы К. pneumoniae p1—2

1 группа, из кала с ОКИ

Абс.ч. % Абс.ч. %

fimA 1 5,0 ± 5,0 6 13,33 ± 5,12 p > 0,05

slgA 20 100 ± 0 1* 5,55 ± 5,55 p < 0,01

irp-2 7 35 ± 10,94 6 13,33 ± 5,01 p < 0,05

cnf-1 10 50 ± 11,47 3 6,66 ± 3,76 p < 0,01

stx-2 1 5,0 ± 5,0 0 0 p > 0,05

* — группа сравнения по искомому ампликону составила 18 человек

Е. Е. ХАСАНОВА и ар. ЭТИОПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ БАКТЕРИОЛАКТИИ в РАЗВИТИИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКиИЙ V ЛЕТЕЙ ПЕРВОГО ГОЛА жизни

Таблица 2. Уровень /¡д-протеазной активности штаммов клебсиелл, выделенных из кишечника детей с ДБК и детей с ОКИ, получавших инфицированное грудное молоко

К. pneumoniae Определяемая активность бактериальных изолятов

Общая Сериновая Металлозависимая Тиоловая

Из кишечника детей с ОКИ (n = 20) 0,1 ± 0,01 0,01 ± 0,003 0,08 ± 0,01* 0,009 ± 0,003

Из кишечника детей с ДБК (n = 21) 0,042 ± 0,008 0,027 ± 0,006 0,013 ± 0,003 0,002 ± 0,001

p < 0,001 < 0,001 < 0,001 > 0,05

* — разница в сравнении показателей сериновых и тиоловых протеаз достоверна

бов. Показатели /g-протеазной активности бактерий К. pneumoniae, выделенных из материнского молока и из кала детей, получавших инфицированное грудное молоко и перенесших ОКИ, были сходными, что еще раз подтвердило идентичность данных штаммов.

Установлена зависимость между величиной общей /g-протеазной активности и тяжестью ОКИ, обусловленной К. pneumoniae. Средние показатели общей /g-протеазной активности штаммов К. pneumoniae, вызвавших ОКИ средней тяжести в 3,75 раза (р < 0,001), а тяжелой — в 4,5 раза (p < 0,001) превышали показатели активности штаммов, вызвавших легкую ОКИ.

С целью оценки агрессивности /g-протеазного потенциала К. pneumoniae из грудного молока (вызвавших ОКИ у грудных детей), мы провели сравнительный анализ величины последнего с /g-протеазной активностью бактерий К. pneumoniae, выделенных при ДБК у детей (в качестве контрольных использован 21 музейный штамм К. pneumoniae лаборатории иммунологии и биохимии Казанского НИИЭМ МЗ Рф). Установлено, что /g-протеазная активность бактерий К. pneumoniae при ОКИ в 2 раза выше, чем у К. pneumoniae, выделенных из кишечника детей с ДБК (p < 0,001). Результаты представлены в таблице 2.

Способность расщеплять секреторные иммуноглобулины является важным показателем, характеризующим способность микроорганизмов к персистенции и колонизации слизистых кишечника, а величина проте-азной активности бактерий служит показателем их потенциальной способности преодолевать защитные барьеры макроорганизма и вызывать инфекцион-но-воспалительный процесс. Наши исследования показали, что условно-патогенные бактерии К. pneumoniae, выделенные из грудного молока и вызвавшие ОКИ у младенцев, обладают высоким потенциалом /g-про-теазной активности. Очевидно, этот факт является значимым в развитии ОКИ клебсиеллезной этиологии. Более того, мы установили, что величина /g-протеазной активности клебсиелл имеет положительное прогностическое значение в отношении степени тяжести кишечной инфекции у грудных детей и может быть рекомендована как объективный критерий для определения тактики ведения пациентов с данной патологией.

Выводы

1. Бактериолактия, обусловленная S. epidermidis, не приводит к диагностически значимой колонизации кишечника младенцев. При бактериолактии, обусловленной S. aureus, колонизация кишечника детей

данным микроорганизмом происходит в 5,2% случаев, а при грамотрицательной бактериолактии — в 66% случаев.

2. В последние три года число женщин с грамотри-цательной бактериолактией возросло. В этиологической структуре грамотрицательной бактериолактии доминирует К. pneumoniae (50%), которая становится причиной ОКИ у вскармливаемых инфицированным молоком младенцев в 80% случаев.

3. К. pneumoniae грудного молока, обусловившие развитие острой кишечной клебсиеллезной инфекции у ребенка, достоверно чаще имеют в своем геноме фрагменты ДНК, специфичные известным генам кластеров патогенности: slgA, irp-2, cnf-1, чем бактерии, выделенные у здоровых людей.

4. Тяжесть ОКИ у ребенка, получающего инфицированное молоко матери, прямо пропорциональна величине протеазной активности бактерий К. pneumoniae, выделенных из грудного молока.

5. Препаратами выбора в случае бактериолактии, обусловленной К. pneumoniae, являются: клебсиеллез-ный поливалентный бактериофаг, амикацин, гентами-цин, ципрофлоксацин.

Литература:

1. Бондаренко В. М. Проблема патогенности клебсиелл /

B. М. Бондаренко, В. Г. Петровская, Н. И. Потатуркина-Не-стерова. — Ульяновск, 1996. — С. 6—7.

2. Питание детей грудного и раннего возраста в Нижнем Новгороде: выявленные нарушения и возможные последствия / О. В. Васильева, Е. ф. Лукушкина, О. К. Нетребенко, Л. В. Абольян // Педиатрия. — 2002. — № 1. — С. 66—69.

3. Методические рекомендации по бактериологическому контролю грудного молока. — М., 1984. — 4 с.

4. Коровина Н. А. К дискуссии по проблеме рационального вскармливания детей раннего возраста / Н. А. Коровина, И. Н. Захарова // Педиатрия. — 2002. — № 1. —

C. 56—60.

5. Отраслевой Стандарт «Протокол ведения больных. Дис-бактериоз кишечника». — М., 2003. — 28 с.

6. Клинико-бактериологическая диагностика острых кишечных инфекций. Методические рекомендации для микробиологов, инфекционистов, эпидемиологов. — Казань, 2003. — 80 с.

7. фиалкина С. В. Генетические детерминанты патогенности клинических штаммов Klebsiella pneumoniae: Автореф. дисс. ... к.б.н. — 2004. — 44 с.

8. Клинико-диагностическое значение оценки активности Ig-про-теаз у детей с дисбактериозом кишечника / О. Д. Зинке-вич и др. // Журн. микробиол. — 2004. — № 3. — С. 73—77.