СТАБИЛИЗИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ НА ФЕРМЕНТ В ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ БИОСЕНСОРАХ
ENZYME STABILISATION IN ELECTROCHEMICAL BIOSENSORS

Область техники, к которой относится изобретение
В целом, настоящее изобретение относится к медицинским устройствам, используемым для анализа биологических жидкостей.
Уровень техники
Конкретнее, настоящее изобретение относится к биосенсорам, используемым для измерения количества анализируемых веществ в жидкостях организма, в частности измерения содержания глюкозы в пробах цельной крови. Оптические способы часто применяются для проведения таких измерений, однако данное изобретение касается усовершенствований электрохимических биосенсоров.
Хотя способы изобретения, которые будут описаны здесь, могут применяться к измерению других анализируемых веществ, измерение содержания глюкозы в пробах цельной крови представляет особый интерес. Изобретение также относится к электрохимическому прибору, в котором постоянное или переменное напряжение прилагается к электродам, контактирующим с пробой крови, а полученный ток измеряют через короткий промежуток времени. Измеренный электрический ток коррелируется с количеством анализируемого вещества в пробе. Такие приборы называют амперометрическими.
В биосенсорах глюкозы, используемых в амперометрических приборах, может применяться ряд систем реагентов, которые реагируют с глюкозой в пробе и создают поддающийся измерению электрический ток путем окисления окислительно-восстановительного соединения, называемого медиатором, согласно следующей общей последовательности этапов:
окисл.
восст.
Глюкоза + Е → Е + Окисленная глюкоза (глюконолактон)
восст.
окисл.
восст.
окисл.
Е + n Медиатор → n Медиатор + Е
восст.
окисл.
-
n Медиатор → Медиатор + n е
окисл.
восст.
окисл.
восст.
Здесь Е и Е - окисленная и восстановленная формы окислительно-восстановительного центра фермента, а Медиатор и Медиатор- окисленная и восстановленная формы медиатора. Глюкозооксидаза используется в качестве фермента в электрохимических биосенсорах, однако недавно было начато применение глюкозодегидрогеназы. Эти ферменты используются с коферментом или кофактором, таким как NAD, FAD и PQQ. Медиатор может быть феррицианидом или тетразолиевой солью, а также иным веществом, известным специалистам в данной области техники.
Глюкозодегидрогеназа (GDH), ее кофактор и медиатор объединены в композиции, которую помещают на пару электродов, называемых рабочим электродом и противоэлектродом. При приложении напряжения к электродам фермент/кофактор окисляет глюкозу (анализируемое вещество), а медиатор восстанавливается при повторном окислении фермента. Восстановленный медиатор перемещается к рабочему электроду, где повторно окисляется, и в ходе процесса высвобождаются электроны, которые перемещаются к противоэлектроду, создавая электрический ток, пропорциональный количеству глюкозы в пробе.
Поскольку каждый раз, когда пациент проводит тест на содержание глюкозы в крови, используется новый датчик, композиции реагента должны обеспечивать постоянные рабочие характеристики при использовании разных биосенсоров. Очевидна важность точности результатов, поскольку пациенты будут регулировать свою диету или прием лекарств в соответствии с результатами тестов. Поэтому, помимо соответствия другим требованиям, фермент должен обладать активностью на протяжении всего своего срока годности. Настоящее изобретение относится, в частности, к ограничению или предотвращению утраты активности системы фермента/кофактора [т.е. глюкозодегидрогеназы - пирроло-хинолин хинона (GDH-PQQ)], используемой в электрохимических биосенсорах.
Один способ поддержания активности GDH-PQQ предложен в патенте США №6656702, который раскрывает добавление сахаров к композициям реагентов, в частности трегалозы с GDH-PQQ. В одном примере гидрофильный полимер, карбоксиметилцеллюлоза, осаждается на электродах и высушивается. Затем смесь реагентов, включающую GDH-PQQ, трегалозу и феррицианид калия в качестве акцептора электронов (медиатора), осаждали "каплями" на высушенный слой карбоксиметилцеллюлозы, а затем высушивали для завершения формирования слоя реагентов на электродах. В патенте также предлагается возможность добавления гидрофильного полимера в содержащий реагенты слой. Предполагается, что в вышеуказанном патенте "капельное" формирование слоев реагентов означает, что их наносят путем подачи капель реагентов в трубку, в которой находятся открытые электроды.
Другой патент (патент США №6270637) описывает композицию для электрохимических биосенсоров, которая включает GDH-PQQ, а также гидроксиэтилцеллюлозу. Патент подчеркивает важность включения полиэтиленоксида с молекулярной массой 100-900 килодальтон (кДа). Способ нанесения композиции на электроды не описан подробно, однако можно предположить, что он осуществляется путем подачи реагента насосной системой.
Трафаретная печать слоев реагента использовалась в композициях и биосенсорах, описанных в патентах США №№5708247; 5951836; 6241862. Глюкозооксидаза использовалась в качестве фермента, и композиции реагентов также включают гидроксиэтилцеллюлозу и обработанный диоксид кремния, выбранный для достижения баланса между гидрофобностью и гидрофильностью. Это образует двумерные сетки, исключающие красные кровяные тельца.
Композиции реагента могут наноситься различными способами, включая пропитывание, нанесение полос, чернильную печать или микронанесение шприцевым насосом, что может предусматривать использование устройства формирования капель с микроэлектромагнитным клапаном. Трафаретная печать является способом, представляющим особый интерес, поскольку она эффективна и хорошо подходит для массового производства биосенсоров. Для этого необходимо, чтобы композиция (т.е. чернила), наносимая на электроды, обладала определенными физическими свойствами, чтобы ее можно было успешно наносить. В частности, чернила, наносимые путем трафаретной печати, должны обладать следующими свойствами: адгезия к подложке, сцепление, тиксотропность (разжижение при сдвиге) и оптимизированная реология вязкости и потока.
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что композиция, которая использовалась для трафаретной печати в случае, когда ферментом выступала глюкозооксидаза, не могла применяться при замене на GDH-PQQ, поскольку новый фермент быстро утрачивал активность. В результате проведенного исследования удалось определить, что некоторые компоненты, используемые для обеспечения необходимых физических свойств для трафаретной печати, приводили к утрате активности фермента. Следовательно, необходимо было найти компоненты, не вызывающие преждевременную инактивацию GDH-PQQ, но отвечающие требованиям трафаретной печати. Ниже описаны композиции реагентов.
Раскрытие изобретения
Один аспект настоящего изобретения представляет собой композицию реагентов для нанесения на электроды в электрохимических биосенсорах. Новая композиция может наноситься трафаретной печатью и не приводит к преждевременной утрате активности системой фермента-кофактора (GDH-PQQ), которая используется для окисления глюкозы в биосенсоре глюкозы. В предпочтительном варианте осуществления GDH-PQQ объединяется с гидрофильным полимером, предпочтительно, гидроксиэтилцеллюлозой, и аморфным гидрофильным порошком диоксида кремния в буферном растворе, поддерживающим рН на уровне 4,5-6,5, поверхностно-активным веществом и медиатором, предпочтительно, феррицианидом.
В одном варианте осуществления данное изобретение предлагает электрохимический биосенсор, в котором описанная выше реакционная композиция наносится методом трафаретной печати на рабочий электрод и противоэлектрод. В другом аспекте изобретение представляет собой способ поддержания активности GDH-PQQ в нанесенной методом трафаретной печати композиции реагентов.
Краткое описание чертежей
На Фиг.1а и b приведено покомпонентное изображение типичного электрохимического датчика.
На Фиг.2 приведен график фонового тока реагентов при использовании различных буферных растворов.
На Фиг.3 приведена столбчатая диаграмма, показывающая влияние некоторых компонентов в композициях реагентов на активность фермента.
На Фиг.4 приведена столбчатая диаграмма, показывающая влияние композиций реагентов согласно изобретению на активность фермента.
На Фиг.5 приведен график измерения глюкозы в сравнении со стандартным способом.
На Фиг.6 приведен график отклонений измерений согласно Фиг.5.
Осуществление изобретения
Измерение содержания глюкозы в крови
Измерение содержания глюкозы в крови может выполняться различными способами. Особый интерес представляют методы, используемые пациентами-диабетиками для проведения анализа на дому. Это оптические и электрохимические способы, причем в обоих из них может применяться окисление глюкозы ферментом. Количество присутствующей в пробе глюкозы определяется путем измерения появляющегося цвета индикатора или электрического тока, протекающего в результате окисления окислительно-восстановительного медиатора при приложении напряжения к паре электродов. Настоящее изобретение относится к последнему методу измерения содержания глюкозы в цельной крови, в частности к электрохимическим биосенсорам, в которых применяется глюкозодегидрогеназа (GDH) и кофактор пирроло-хинолин хинон (PQQ). GDH-PQQ объединяют с другими компонентами, в т.ч. медиаторами, полимерами, поверхностно-активными веществами, буферами и загустителями с образованием композиции, наносимой на пару электродов. При приложении напряжения к электродам реакция GDH-PQQ с глюкозой и окислительно-восстановительные реакции медиатора обеспечивают протекание электрического тока, пропорционального количеству глюкозы в пробе крови, контактирующей с композицией реагентов.
Настоящее изобретение не ограничивается конкретной структурой биосенсора, поскольку многие из них известны из уровня техники. Примеры подходящих биосенсоров описаны в патенте США №6531040, проиллюстрированном на Фиг.1а-b.
Биосенсор 10 представлен в виде покомпонентного изображения на Фиг.1. Он включает изолирующую основу 12, на которую последовательно наносят (обычно методом трафаретной печати) электропроводящую структуру 14, электродную структуру (части 16 и 18), изолирующую (диэлектрическую) структуру 20 и реакционный сдой 22. Формирование биосенсора завершается нанесением верхнего слоя 28. Капилляр 30, выполненный между верхним слоем 28 и слоем реагентов 22, обеспечивает путь для протекания пробы жидкости.
Реагенты в реакционном слое 22 реагируют с анализируемыми веществами в пробе жидкости (например, глюкозой в крови), обеспечивая протекание электрического тока, который измеряется и коррелируется с количеством присутствующего анализируемого вещества. Реакционный слой 22 обычно содержит фермент или ферменты и акцептор электронов. Фермент реагирует с анализируемым веществом с высвобождением электронов, которые переносятся к поверхности рабочего электрода акцептором электронов или медиатором, восстанавливаемым в результате реакции между анализируемым веществом и ферментом. В настоящем изобретении ферментом является глюкозодегидрогеназа (GDH), ее кофактором - пирроло-хинолин хинон (PQQ), a медиатором - соль феррицианид.
Две части 16, 18 электродной структуры образуют соответственно рабочий электрод и противоэлектрод, необходимые для электрохимического определения концентрации анализируемого вещества. Особенностью изображенной структуры является то, что рабочий электрод и противоэлектрод сконфигурированы таким образом, что основная часть противоэлектрода расположена ниже по потоку (согласно направлению потока жидкости по сформированному для нее пути) относительно открытой части рабочего электрода 16а.
Однако элемент противоэлектрода 18а расположен выше по потоку относительно верхнего элемента рабочего электрода 16а, поэтому когда количество жидкости пробы (например, пробы цельной крови), не достаточное для того, чтобы полностью покрыть рабочий электрод, поступает в капилляр, благодаря проводимости пробы цельной крови образуется электрическое соединение между элементом противоэлектрода 18 а и открытой частью рабочего электрода 16а. Однако область противоэлектрода для контакта с пробой цельной крови очень мала, поэтому между электродами, и, следовательно, через датчик тока может протекать очень малый ток. Если запрограммировать датчик тока таким образом, чтобы он выдавал сигнал ошибки при получении сигнала ниже определенного, предварительного заданного уровня, устройство будет информировать пользователя о том, что в емкость датчика поступило недостаточное количество крови и следует провести другой тест или добавить некоторое количество крови. Хотя конкретные размеры электродов не играют важной роли, площадь элемента противоэлектрода 18а обычно меньше, чем примерно 10% площади рабочего электрода, а конкретнее - меньше, чем приблизительно 6%. Этот элемент должен быть как можно меньшим.
В патенте США №6531040 также указывается на то, что реакционный слой 22 может не контактировать с элементом противоэлектрода 18а путем изготовления трафарета, препятствующего нанесению чернил с реагентом на элемент противоэлектрода 18а. Таким образом, данный элемент не будет контактировать с реагентом и не сможет функционировать как обычный противоэлектрод, поэтому состояние ошибки будет наступать в случае, если проба жидкости не будет контактировать с основной частью противоэлектрода 18. Хотя на чертеже элемент 18а физически контактирует с противоэлектродом 18 и является его частью, элемент 18а противоэлектрода 18 может не иметь физического соединения с остальной частью противоэлектрода, при условии, что у него есть собственное соединение, а датчик имеет третий контакт с датчиком тока.
Рабочий электрод и противоэлектрод обычно наносятся в виде электродных чернил, имеют толщину слоя приблизительно 14 мкм (0,00055") и содержат электрохимически активный углерод. Компоненты проводящих чернил могут представлять собой смесь углерода и серебра, которая обеспечивает путь с низким химическим сопротивлением между электродами и измерителем, к которому они подключены посредством контакта с проводящей структурой на краю типа "рыбий хвост" 26 датчика. Противоэлектрод может быть изготовлен из серебра/хлорида серебра, хотя предпочтительным является углерод. Для улучшения воспроизводимости результатов измерений диэлектрическая структура изолирует электроды от пробы жидкости, за исключением определенной области в центре электродной структуры 24. Эта определенная область играет важную роль в этом типе электрохимических измерений, поскольку измеренный ток зависит не только от концентрации анализируемого вещества и площади реакционного слоя 22, но также и от площади рабочего электрода 16а, на которую воздействует содержащая анализируемое вещество проба.
Типичный диэлектрический слой 20 содержит отвержденный УФ-лучами модифицированный акрилатный мономер, олигомер или полимер и имеет толщину приблизительно 10 мкм (0,0004"). Диэлектрический слой также может быть отверждаемым влагой или теплом. Крышка или верхний слой 28 выполнен соответствующим основанию для образования пространства, в которое будет поступать проба жидкости и в котором расположены рабочий электрод и противоэлектрод. Крышка 28 образует вогнутое пространство 30 и обычно формируется путем выдавливания рельефа на плоском листе деформируемого материала. Крышка 28 имеет отверстие для воздуха 32 и соединена с основанием 12 путем выполнения операции герметизации. Крышка и основание могут быть плотно соединены путем акустической сварки. При этом основание 12 и крышку 28 вначале выравнивают друг относительно друга, а затем прижимают друг к другу между вибрирующим термосваривающим элементом или рупором и неподвижной зажимной губкой, причем контакт осуществляется только в плоских (нерельефных) частях крышки. Рельефную крышку и основание можно соединить с помощью клея, наносимого на нижнюю часть крышки. Способ соединения крышки и основания более подробно описан в патенте США №5798031.
Подходящие материалы для изготовления изолирующего основания 12 включают поликарбонат, полиэтилентерефталат, безусадочные виниловые и акриловые полимеры и смеси полимеров, такие как поликарбонат/полиэтилентерефталат, и структуры с металлической фольгой (например, слоистый материал нейлон/алюминий/поливинилхлорид). Крышку обычно изготовляют из листа деформируемого полимерного материала, такого как поликарбонат, или из поддающихся тиснению полиэтилентерефталата, модифицированного гликолем полиэтилентерефталата или композиции с металлической фольгой (например, содержащей алюминиевую фольгу структуры).
В данном изобретении могут применяться и другие электрохимические датчики. Примерами электрохимических датчиков, которые могут использоваться для измерения концентрации глюкозы, являются датчики, применяемые в системах Ascensia™ AUTODISC и Ascensia™ ELITE производства Bayer HealthCare. Более подробное описание этих электрохимических датчиков приведено в патентах США №№5120420 и 5320732. Другие электрохимические датчики можно приобрести в компании Matsushita Electric Industrial Company. Еще один пример электрохимического датчика, который может использоваться в амперометрической системе мониторинга, раскрыт в патенте США №5429735.
Электрохимические датчики могут быть расположены в устройстве выдачи датчиков для определения уровня глюкозы в крови, в котором находится множество таких датчиков. Один из примеров набора датчиков, загруженного в устройство выдачи датчиков, описан в патенте США №5660791.
При помещении электрохимического датчика в подходящий измерительный инструмент и нанесении пробы крови к электродам прилагается напряжение, измеряется электрический ток, коррелируется с содержанием глюкозы в пробе, и значение сообщается пользователю.
Амперометрические датчики могут прилагать постоянное напряжение к электродам, и протекающий ток будет измеряться в течение предварительно определенного интервала времени, который может быть достаточно коротким, например 5-10 секунд, для внесения коррекции на смещение, которое может быть вызвано преждевременным восстановлением медиатора. Этот период называют "периодом сжигания". Ток повышается до пикового значения, а затем снижается, пока проба регидратирует слой реагентов, позволяя протекать реакциям окисления и восстановления. По окончании "периода сжигания" подача напряжения прекращается или, по меньшей мере, снижается в течение периода покоя, на протяжении которого могут протекать реакции. Затем подача напряжения возобновляется, и ток измеряется в течение предварительно определенного периода считывания (например, 10 секунд). Поскольку восстановленный медиатор присутствует в результате сопутствующего окисления фермента, создаваемый на начальном этапе ток высок, а затем снижается асимптотически и переходит в установившийся режим. Зарегистрированный в конце указанного короткого периода считывания ток используется для определения содержания глюкозы в пробе крови посредством предварительно полученной корреляции между током в конце периода считывания и количеством глюкозы в пробе с применением заранее известных концентраций.
Реакционная композиция
Композиция, реагирующая с пробой крови в электрохимическом биосенсоре, должна обеспечивать постоянный отклик при использовании различных датчиков. Постоянный отклик важен для пациентов, регулирующих свою диету или прием лекарств в соответствии с результатами измерения. Это значит, что изменения активности реагентов на протяжении срока годности биосенсора должны быть как можно меньшими, но, по меньшей мере, предсказуемыми для того, чтобы можно было вносить корректировку в результаты. Настоящее изобретение решает проблему, обнаруженную при использовании фермента-кофактора GDH-PQQ в электрохимическом биосенсоре, когда реакционная композиция наносится методом трафаретной печати на электроды датчика. Авторы изобретения обнаружили, что GDH-PQQ в компонентах, обычно используемых для трафаретной печати, утрачивает свою активность.
Смеси GDH-PQQ с феррицианидом калия в качестве окислительно-восстановительного медиатора готовили в ряде буферов. Хотя известно, что для GDH-PQQ предпочтительно нейтральное значение рН, буферы, в т.ч. ацетатные, цитратные и сукцинатные буферы с рН в диапазоне от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,5, а конкретнее, от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0, оказались более предпочтительными, поскольку феррицианидный медиатор является более устойчивым при кислотном рН (см. Фиг.2).
2

Также было обнаружено, что некоторые полимерные материалы также, похоже, вызывают снижение активности, даже при использовании буферов с низким рН. Авторы испытали два полимера, используемых для формирования носителя для фермента и окислительно-восстановительного медиатора, с буферами 75 мМ ацетата кальция и 75 мМ сукцината натрия. Феррицианид калия в состав не входил. Результаты представлены на Фиг.3, где отображено начальное влияние на активность фермента, а также сравнение с влиянием через две недели при -20°С. Как видно из результатов, при наличии только сукцинатного и ацетатного буфера в растворе, содержащем 8,8 единиц GDH-PQQ на миллиграмм реагентных чернил и 10 мМ СаСl, но без феррицианида, буферы не вызывали значительного снижения активности по прошествии двух недель при -20°С. Активность фермента определяли прибором Beckman SYNCHRON CX 4 Delta, измеряющим скорость образования диформазана при 560 нм в результате восстановления нитротетразолиевого синего (NBT) феназинметосульфатом (PMS) при 37°С. Однако при включении ранее использовавшихся для получения чернил для трафаретной печати компонентов наблюдалась значительная утрата активности. В буферный раствор включали Bentone - бентонитовую глину - загуститель, поставляемый RHEOX, Inc. в количестве 1,3 мас.%. Результаты, представленные на Фиг.3, показывают, что в ацетатном буфере бентонитовая глина вызывала снижение активности фермента приблизительно на 10%, а в сукцинатном буфере приблизительно 90% активности фермента было утрачено по сравнению со свежим реагентом и реагентом, который хранился при -20°С в течение двух недель. Активность также уменьшалась при добавлении 7,4 мас.% полиэтиленоксида к буферным растворам, хотя наблюдалось различие во влиянии буферов. Можно сделать вывод, что композиции реагентов, содержащие GDH-PQQ в сочетании с бентонитовой глиной и полиэтиленоксидом демонстрировали меньшую активность ферментов. Поэтому они являются менее предпочтительными загустителями в реагентных чернилах для трафаретной печати.

Исследование влияния других загустителей, которые могли бы заменить собой бентонитовую глину и полиэтиленоксид, привели к открытию того, что некоторые материалы давали реагентные чернила, которые подходят для трафаретной печати и не вызывают снижение активности GDH-PQQ. Улучшенные результаты показаны на Фиг.4. В исследованиях, показанных на Фиг.4, 4-8 ед./мг GDH-PQQ, 1,6 мас.% CAB-О-SIL М5 необработанного пирогенного кремнезема, 4,5-6,5 мас.% гидроксиэтилцеллюлозы (НЕС) и несколько поверхностно-активных веществ добавляли в ацетатный буферный раствор. Активность фермента измеряли посредством способа определения ферментативной активности с PMS/NBT с помощью анализатора Beckman при 37°С. CAB-О-SIL М5 подходит для использования в сочетании с НЕС. Очевидно, что сочетание CAB-О-SIL М5 и НЕС не вызывало утрату активности фермента в течение срока испытаний.
Как было показано, гидроксиэтилцеллюлоза может использоваться в качестве компонента матрицы в слое реагентов электрохимических биосенсоров, в которых применяется GDH-PQQ, не вызывая слишком большой утраты активности фермента. Могут использоваться и другие соответствующие гидрофильные полмеры, чтобы сделать вязкость композиции, подходящей для трафаретной печати. Другие производные целлюлозы включают без ограничения: натрий-карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу или гидроксипропилметилцеллюлозу. Могут использоваться другие растворимые в воде полимеры, включая ксантановые камеди, гуаровую камедь, камедь рожкового дерева, каррагенан, агарозу и синтетические полимеры, в т.ч. поливиниловый спирт, поливинилпирролидон и т.п.

CAB-O-SIL М5 является аморфным необработанным пирогенным кремнеземом, который, как было показано, придает необходимые физические свойства чернилам, используемым при трафаретной печати реагентных слоев согласно изобретению. Этот необработанный гидрофильный диоксид кремния следует отличать от обработанного диоксида кремния, использование которого предусматривалось в нескольких более ранних патентах для балансирования гидрофобных и гидрофильных свойств. Альтернативные водонерастворимые загустители включают, без ограничения: тальк слюду, диатомовую землю, естественную или модифицированную глину, например бентонитовую глину, гекторитную глину (например, Optigel sH от IMV Nevada), сепиолиты (например, Sepiogel F от IMV Nevada), монтмориллониты (например, глина IGB от IMV Nevada), сапониты (например, Sepiogel F и IMVITE 1016 от IMV Nevada и Laponite от Southern Clay Products) и т.п.
Как показано на Фиг.4, выбор поверхностно-активных веществ также может повлиять на активность GDH-PQQ. Очень подходящим является алкиларилполиэфир-спирт Triton х-100, поставляемый Sigma. Однако другие, в т.ч. FC 170C производства 3М, Surfynol 485 производства Air Products and Chemicals, Inc. и Pluronic L62 D производства BASF, считаются подходящими для использования в композициях согласно изобретению.
Предпочтительные композиции реагентов для трафаретной печати биосенсора согласно изобретению включают:
- от приблизительно 30 до приблизительно 200 мМ, а конкретнее, от приблизительно 50 до приблизительно 150 мМ буфера, предпочтительно ацетата кальция;
2
- от приблизительно 5 до приблизительно 50 мМ СаСl;
- до приблизительно 0,5 мас.% поверхностно-активного вещества исходя из общей массы композиции;
- от приблизительно 2 до приблизительно 10 мас.% производного целлюлозы, предпочтительно гидроксиэтилцеллюлозы, исходя из общей массы композиции;
- от приблизительно 1 до приблизительно 6 мас.% аморфного необработанного диоксида кремния исходя из общей массы композиции;
- от приблизительно 10 до приблизительно 20 мас.% феррицианида калия в качестве медиатора исходя из общей массы композиции;
- от приблизительно 1 до приблизительно 8 ед. фермента-кофактора GDH-PQQ на каждый мг общей массы композиции;
- вязкость составляет от приблизительно 60000 до приблизительно 180000 сантипуаз (мПа·с).
Пример 1
2
Буфер 75 мМ ацетата кальция с рН=5,3 готовили путем добавления ацетата кальция и ледяной уксусной кислоты. К этому буферному раствору добавляли следующие соединения: 10 мМ СаСl, 0,05 мас.% поверхностно-активного вещества Triton Х-100, 1-3 мас.% порошка аморфного необработанного пирогенного кремнезема Cabosil M5 и 4-8 мас.% гидроксиэтилцеллюлозы. После 16 часов гидратации диоксида кремния и целлюлозы добавляли 15-20 мас.% феррицианида калия и 3-8 ед. GDH-PQQ на каждый миллиграмм реагентных чернил. Реагентные чернила перемешивали при 600 об/мин лопастной мешалкой в течение приблизительно 10-20 минут с образованием композиции реагентов, имеющей вязкость приблизительно 80000-140000 сантипуаз.
Композицию реагентов наносили методом трафаретной печати на содержащую электроды положку и сушили при 45-50°С в течение 5 минут.
Пример 2
Датчики глюкозы готовили с применением композиции реагентов согласно Примеру 1 и испытывали с использованием проб крови с известным содержанием глюкозы и гематокритом 40%. К электродам прилагали напряжение 200-400 мВ и измеряли ток по прошествии 10 с после приложения напряжения. Результаты измерения тока использовали для определения содержания глюкозы в пробах. Результаты этих испытаний представлены на Фиг.5, где результат, показанный глюкометром Ascensia™ AUTODISC, запрограммированным на 10 с время испытания, нанесен на график как функция содержания глюкозы, измеренного соответствующим стандартам отрасли прибором для определения глюкозы YSI. Как можно видеть, эта характеристика линейная, относительно не чувствительная к концентрации фермента-кофактора в исследуемом диапазоне.
Датчики также продемонстрировали хороший дозовый отклик при сравнении с результатами, полученными с помощью прибора YSI (стандарт отрасли). Смещение относительно результатов по прибору YSI показано на Фиг.6. Это смещение было в пределах ±5% для проб с содержанием глюкозы ≤400 мг/дл и в пределах ±10% для проб с содержанием глюкозы 680 мг/дл.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ А
Композиция реагентов для трафаретной печати электрохимических биосенсоров, включающая:
(а) глюкозодегидрогеназу (GDH) и кофактор - пирроло-хинолин хинон (PQQ) для окисления глюкозы в биологической пробе;
(b) гидрофильный полимер, выбранный из группы, состоящей из производных целлюлозы, натуральных камедей и гелей, а также растворимых в воде синтетических полимеров;
(c) загуститель, выбранный из группы, состоящей из порошка аморфного необработанного диоксида кремния, талька, слюды, диатомовой земли и натуральных и модифицированных глин;
(d) буфер, способный поддерживать рН в диапазоне от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,5-6,0;
(e) поверхностно-активное вещество; и
(f) медиатор.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ В
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления А, отличающаяся тем, что указанный буфер является ацетатным, цитратным или сукцинатным буфером.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ С
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления А, отличающаяся тем, что указанное поверхностно-активное вещество является алкиларилполиэфиром-спиртом.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ D
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления А, отличающаяся тем, что указанный медиатор является феррицианидом калия.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Е
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления А, отличающаяся тем, что указанный буфер обладает рН от 5,0 до 6,0.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ F
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления Е, отличающаяся тем, что ее вязкость составляет от приблизительно 60000 до приблизительно 180000 сантипуаз (мПа·с).
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ G
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления А, отличающаяся тем, что указанный гидрофильный полимер является производным целлюлозы, выбранным из группы, состоящей из натрий-карбоксиметилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы и гидроксипропилметилцеллюлозы.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Н
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления G, отличающаяся тем, что указанный гидрофильный полимер является гидроксиэтилцеллюлозой.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ I
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления А, отличающаяся тем, что указанный загуститель является порошком аморфного необработанного диоксида кремния.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ J
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления I, отличающаяся тем, что указанный порошок аморфного необработанного диоксида кремния является гидрофильным.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ К
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления А, отличающаяся тем, что содержание GDH-PQQ составляет 1-8 единиц на каждый миллиграмм общей массы композиции.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ L
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления В, отличающаяся тем, что содержание буфера составляет от приблизительно 30 до приблизительно 200 мМ.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ М
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления С, отличающаяся тем, что содержание указанного полиэфира-спирта составляет до приблизительно 0,5 мас.% от общей массы композиции.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ N
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления D, отличающаяся тем, что содержание указанного феррицианида калия составляет от приблизительно 10 до приблизительно 20 мас.% от общей массы композиции.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ О
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления G, отличающаяся тем, что содержание указанного производного целлюлозы составляет от приблизительно 2 до приблизительно 10 мас.% от общей массы композиции.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Р
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления I, отличающаяся тем, что содержание указанного порошка аморфного необработанного диоксида кремния составляет от приблизительно 1 до приблизительно 6 мас.% от общей массы композиции.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Q
Композиция реагентов согласно альтернативному варианту осуществления А, также содержащая от приблизительно 5 до приблизительно 50 мМ хлорида кальция.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ R
Электрохимический биосенсор, включающий:
(a) непористую подложку;
(b) рабочий электрод и противоэлектрод, расположенные на указанной подложке;
(c) композицию реагентов, нанесенную методом трафаретной печати на указанные электроды и содержащую:
(1) приблизительно 1-8 единиц глюкозодегидрогеназы (GDH) и кофактора - пирроло-хинолин хинона (PQQ) для окисления глюкозы в биологической пробе на каждый миллиграмм общей массы указанной композиции;
(2) гидрофильный полимер, выбранный из группы, состоящей из производных целлюлозы, натуральных камедей и гелей, а также растворимых в воде синтетических полимеров;
(3) загуститель, выбранный из группы, состоящей из порошка аморфного необработанного диоксида кремния, талька, слюды, диатомовой земли и натуральных и модифицированных глин;
(4) буфер, способный поддерживать рН в диапазоне от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,5,
(5) поверхностно-активное вещество;
(6) медиатор; и
(d) защитную крышку для указанных электродов и указанной композиции реагентов.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ S
Электрохимический биосенсор согласно альтернативному варианту осуществления R, отличающийся тем, что указанный буфер является ацетатным, цитратным или сукцинатным буфером от приблизительно 30 до приблизительно 200 мМ.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Т
Электрохимический биосенсор согласно альтернативному варианту осуществления R, отличающийся тем, что содержание указанного поверхностно-активного вещества составляет до приблизительно 0,5 мас.% алкиларилполиэфира-спирта от общей массы композиции.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ U
Электрохимический биосенсор согласно альтернативному варианту осуществления R, отличающийся тем, что содержание указанного медиатора составляет от приблизительно 10 до приблизительно 20 мас.% феррицианида калия от общей массы композиции.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ V
Электрохимический биосенсор согласно альтернативному варианту осуществления R, отличающийся тем, что он содержит достаточные количества компонентов (с)(2) и (с)(3) для обеспечения композиции, пригодной для трафаретной печати.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ W
Электрохимический биосенсор согласно альтернативному варианту осуществления R, отличающийся тем, что указанная композиция имеет вязкость от приблизительно 60000 до приблизительно 180000 сантипуаз (мПа·с).
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Х
Электрохимический биосенсор согласно альтернативному варианту осуществления R, отличающийся тем, что содержание указанного гидрофильного полимера составляет от приблизительно 2 до приблизительно 10 мас.% производного целлюлозы, выбранного из группы, состоящей из натрий-карбоксиметилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы и гидроксипропилметилцеллюлозы, от общей массы композиции.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Y
Электрохимический биосенсор согласно альтернативному варианту осуществления X, отличающийся тем, что указанный гидрофильный полимер является гидроксиэтилцеллюлозой.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ Z
Электрохимический биосенсор согласно альтернативному варианту осуществления R, отличающийся тем, что содержание указанного загустителя составляет от приблизительно 1 до приблизительно 6 мас.% порошка аморфного необработанного диоксида кремния от общей массы композиции.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ АА
Электрохимический биосенсор согласно альтернативному варианту осуществления Z, отличающийся тем, что указанный порошок аморфного необработанного диоксида кремния является гидрофильным.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ВВ
Электрохимический биосенсор согласно альтернативному варианту осуществления R, отличающийся тем, что указанная композиция реагентов содержит от приблизительно 5 до приблизительно 50 мМ хлорида кальция.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПОСОБ СС
Способ поддержания активности глюкозодегидрогеназы (GDH) и кофактора - пирроло-хинолин хинона (PQQ) в наносимой методом трафаретной печати композиции реагентов, используемой в электрохимическом биосенсоре, содержащем нанесенную методом трафаретной печати композицию реагентов, включающий следующие этапы:
(a) глюкозодегидрогеназу (GDH) и кофактор - пирроло-хинолин хинон (PQQ) для окисления глюкозы в биологической пробе;
(b) гидрофильный полимер, выбранный из группы, состоящей из производных целлюлозы, натуральных камедей и гелей, а также растворимых в воде синтетических полимеров;
(c) загуститель, выбранный из группы, состоящей из порошка аморфного необработанного диоксида кремния, талька, слюды, диатомовой земли и натуральных и модифицированных глин;
(d) буфер, способный поддерживать рН в диапазоне от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,5;
(e) поверхностно-активное вещество; и
(f) медиатор.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПОСОБ DD
Способ согласно альтернативному способу СС, отличающийся тем, что указанный гидрофильный полимер является производным целлюлозы, выбранным из группы, состоящей из натрий-карбоксиметилцеллюлозы, гидроксиэтилцеллюлозы, гидроксипропилцеллюлозы и гидроксипропилметилцеллюлозы.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПОСОБ ЕЕ
Способ согласно альтернативному способу СС, отличающийся тем, что указанный загуститель является порошком аморфного необработанного диоксида кремния.
АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПОСОБ FF
Способ согласно альтернативному способу СС, отличающийся тем, что рН поддерживается в диапазоне от 5,0 до 6,0.
В то время как в изобретение могут быть внесены различные модификации или использованы альтернативные формы в соответствии с ним, на чертежах в качестве примера изображены конкретные варианты осуществления изобретения, которые подробно здесь описаны. Однако следует понимать, что они не ограничивают данное изобретение конкретными формами, описанными здесь, а наоборот, изобретение охватывает все модификации, эквиваленты и альтернативы, соответствующие его сущности и объему, определенным в прилагаемой формуле изобретения.