Способ получения наноразмерных систем олигопептид-полимерная частица на основе амфифильных сополимеров N-винилпирролидона с (ди)метакрилатами и их применение в качестве активного вещества в косметологии и медицине
METHOD FOR OBTAINING NANOSCALE SYSTEMS OF OLIGOPEPTIDE-POLYMER PARTICLE BASED ON AMPHIPHILIC COPOLYMERS OF N-VINYLPYRROLIDONE WITH (DI)METHACRYLATES AND THEIR USE AS ACTIVE SUBSTANCE IN COSMETHOLOGY AND MEDICINE

Изобретение относится к области косметологии и медицины, а именно к средствам трансдермальной доставки биологически активных олигопептидов, т.е. молекул, включающих аминокислоты, связанные пептидной связью, проявляющих биологическую активность. В качестве средства трансдермальной доставки предлагаются наноразмерные системы олигопептид-полимерная частица, полученные путем введения олигопептидов в наночастицы амфифильных сополимеров N-винилпирролидона с диметакрилатом триэтиленгликоля (разветвитель) или их сополимеров, модифицированных звеньями олигоэтиленгликоль метакрилата.
Введение биологически активных веществ через кожу имеет ряд преимуществ перед другими способами введения. Для решения задачи трансдермальной доставки биологически активных соединений в косметологии и медицине применяется несколько подходов, которые включают механические (микроиглы) или физические методы (ионофорез, электрофорез, магнитофорез, сонофорез) и применение наноразмерных систем разной природы: липосомы, наноэмульсии, дендримеры, полимерные глобулы, неорганические наночастицы и др. [Prausnitz M.R., Langer R. Transdermal Drug Delivery // Nat Biotechnol. - 2008. - Vol. 26. - No. 11. - P. 1261-1268].
Из патента [DE 10228837 B4] известен способ получения и применения в качестве космецевтического средства композиции, содержащей олигопептид Меланотан-2 (МТ2) в фосфолипидных липосомах. В патенте [US 20190374650 А1] представлены композиции биомакромолекул, включая пептиды, с большой группой полимеров для различных способов введения в организм, включая трансдермальный.
Задачей изобретения является получение наноразмерных систем олигопептид-полимерная частица, несущих биологически активные олигопептиды и обеспечивающих их проникновение через кожные покровы с целью достижения желаемого косметического и/или лечебного эффекта.
Задача решается предлагаемым способом получения наноразмерных систем олигопептид-полимерная частица, заключающимся во введении в водные, спиртовые или водно-спиртовые растворы сополимеров N-винилпирролидона с (ди)метакрилатами триэтиленгликоля водного раствора олигопептида - молекулы, включающей аминокислоты, связанные пептидными связями, с последующим удалением растворителей до получения сухих пленок, которые затем растворяют в водных растворах.
Также задача решается применением наноразмерных систем олигопептид-полимерная частица, полученных по заявляемому способу, в средства трансдермальной доставки биологически активных олигопептидов в составе косметических или лекарственных средств, наносимых на кожу.
Сополимеры N-винилпирролидона с (ди)метакрилатами триэтиленгликоля имеют трехмерную структуру с гидрофобной частью, состоящей из ветвящихся фрагментов, и гидрофильной частью, образованной линейными цепями из звеньев N-винилпирролидона. В водных растворах данные сополимеры образуют наноразмерные мицеллоподобные частицы, содержащие гидрофобное ядро и гидрофильную оболочку. Благодаря амфифильной природе, данные сополимеры способны взаимодействовать как с гидрофобными, так и с амфифильными соединениями, в частности, с олигопептидами. Получение наноразмерных систем олигопептид-полимерная частица проводится в полярных растворителях с последующим высушиванием, образуются наночастицы, способные к проникновению в кожные покровы и проявляющие биологическую активность олигопептида, используемого для получения системы олигопептид-полимерная частица.
2
Для получения доказательства заявляемых свойств были получены системы олигопептид-полимерная частица, несущие биологически активный олигопептид МТ2 (Ас-Nle-cyclo[Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys]-NH), структура которого приведена на фиг. 1, а также система флуоресцентный краситель-полимерная частица, несущая тетрафенилпорфиринат цинка (ZnTTP), позволяющего регистрировать полученную систему флуоресцентными методами.
Сополимеры N-винилпирролидона с (ди)метакрилатами получали описанным методом [Курмаз С.В., Образцова Н.А., Балакина А.А., Терентьев А.А. Получение полимерных наночастиц амфифильного сополимера N-винилпирролидона с диметакрилатом триэтиленгликоля и исследование их свойств in vitro // Известия Академии наук. Серия химическая. - 2016. - №8. - Р. 2097-2102]. Для получения систем олигопептид-полимерная частица и флуоресцентный краситель-полимерная частица применяли сополимеры ВП-ДМТЭГ и ВП-ОЭГМ-ДМТЭГ, структуры которых приведены на фиг. 2. Характеристики полимеров приведены в табл. 1.
Сополимер ВП-ДМТЭГ-1 состоял, в основном, из звеньев винилпирролидона, имел топологию полимерных цепей близкую к линейному поливинилпирролидону. Сополимер ВП-ДМТЭГ-2 содержал около 20 мол. % звеньев диметакрилата и имел ответвления в боковых цепях. Модифицированный звеньями ОЭГМ сополимер ВП-ОЭГМ-ДМТЭГ содержал менее 10 мол. % метакрилатных звеньев. Сополимер ВП-ДМТЭГ-1 в водном растворе существует в виде отдельных макромолекул, имеющих строение типа гидрофобное ядро/гидрофильная оболочка и их агрегатов с гидродинамическим радиусом, соответственно, равным 4 и 77 нм. Сополимер ВП-ДМТЭГ-2 в водном растворе представлен в виде агрегатов с гидродинамическим радиусом около 50 нм. Сополимер ВП-ОЭГМ-ДМТЭГ существует в растворе в виде отдельных макромолекул (2 нм) и их агрегатов (31 нм). Таким образом, сополимеры отличались мономерным составом, молекулярными массами, топологией полимерных цепей и размерами наночастиц в водных растворах.
Проникновение полученных систем в кожу и их биологическое действие исследовалось на лабораторных крысах. Системы флуоресцентный краситель-полимерная частица с ZnTTP или олигопептид-полимерная частица с МТ2 в смеси глицерин/вода наносили на выбритый участок кожи животных. Визуализацию флуоресценции ZnTTP в образцах проводили методом флуоресцентной микроскопии в неокрашенных срезах кожи. Влияние на синтетическую и митотическую активность меланоцитов кожи срезы окрашивали гематоксилин-эозином.
Сущность изобретения характеризуется примерами, приведенными ниже.
Пример 1.
Наноразмерные системы олигопептид-полимерная частица МТ2-сополимер ВП-ДМТЭГ-1 и ВП-ДМТЭГ-1.
В водные или спиртовые растворы сополимеров ВП-ДМТЭГ-1 и ВП-ДМТЭГ-1 вводили по каплям водный раствор МТ2 при постоянном перемешивании. Содержание олигопептида составляло 10 и 20% в расчете на сополимер. Растворы сополимеров в изопропиловом спирте (1.4 мг/мл) или их водные/водные буферные растворы (1 мг/мл) выдерживали в течение нескольких дней для установления равновесия. Сухой порошок МТ2 (10 мг) растворяли в 2 мл воды для инъекций. К раствору сополимера в изопропиловом спирте добавляли различные объемы водного раствора МТ2. Удаляли растворители на воздухе и в вакууме. Сухие пленки растворяли в водном буферном растворе с рН 6.8. Получали прозрачные водные растворы, в которых содержание МТ2 на сополимер варьировалось от 10 до 70%.
Результаты электронной абсорбционной спектроскопии указывали на взаимодействие олигопептид-сополимер в водных растворах. Зависимости оптической плотности в максимуме полосы поглощения МТ2 при λ=280 нм от его концентрации в растворе в отсутствие и в присутствии сополимеров ВП-ДМТЭГ-1 и ВП-ДМТЭГ-2 приведены на фиг. 3. Видно, что в исследованном интервале концентраций зависимости носят линейный характер, однако имеют разный угол наклона, что свидетельствует о различии в значении молярного коэффициента экстинкции МТ2. В присутствии сополимеров его значение снижается, что свидетельствует о влиянии сополимера на электронное состояние МТ2. Очевидно, сополимер ВП-ДМТЭГ-1 оказывает большее влияние на МТ2, чем сополимер ВП-ДМТЭГ-2.
h
Доказательством образования в растворе наноразмерных систем МТ2-сополимер ВП-ДМТЭГ-1 служили данные динамического рассеяния света. Кривые распределения интенсивности рассеяния света по гидродинамическим радиусам R частиц водного раствора МТ2-сополимер приведены на фиг. 4. Имело место резкое увеличение интенсивности рассеяния света (почти на порядок) по сравнению с исходным сополимером ВП-ДМТЭГ-1, а также изменение кривой распределения частиц по размерам в присутствии сополимера (фиг. 4, а). Увеличение интенсивности рассеяния света водными растворами наноразмерных систем МТ2-сополимер ВП-ДМТЭГ-2 было не значительным (лишь в 1.4 раза) по сравнению с исходным сополимером ВП-ДМТЭГ-2. Распределение частиц по размерам становилось унимодальным и уширялось. Как следствие, значение максимума основного пика на кривой распределения сдвигалось в область меньших значений и составляло 70-80 нм (фиг. 4, б).
-1
-1
-1
-1
-1
Результаты ИК-спектроскопии порошков исходных сополимеров ВП-ДМТЭГ-1 и ВП-ДМТЭГ-2 и наноразмерных систем на их основе, содержащих 50% МТ2 приведены на фиг. 5. Приведенные данные указывают на образование водородной связи между сополимерами и олигопептидом. В ИК-спектрах наноразмерных систем видна полоса поглощения МТ2 с частотой 1545 см. В области 3500-3000 см имеется характерная полоса валентных колебаний NH-групп МТ2. Для исходных сополимеров в области 3600-3300 см наблюдается полоса поглощения воды, связанной с сополимером водородной связью. В наноразмерной системе MT-2-сополимер ВП-ДМТЭГ-2 в области 3600-2200 см имеются полосы поглощения с максимумами при 3260 и 2360 см, не характерные для сополимера и МТ2. Это может свидетельствовать об образовании водородной связи между сополимером и NH-группами МТ2.
Пример 2.
Наноразмерная система олигопептид-полимерная частица МТ2-сополимер ВП-ОЭГМ-ДМТЭГ.
Готовили раствор МТ2 в воде для инъекций (10 мг МТ2 на 2 мл). К 4 мл раствора сополимера ВП-ОЭГМ-ДМТЭГ (4 мг/мл) добавили 0.96 мл раствора МТ2 по каплям при постоянном перемешивании. Содержание МТ2 в расчете на сополимер - 30%. Затем к 5 мл глицерина по каплям при постоянном перемешивании добавляли 1.33 мл раствора наноразмерной системы МТ2-сополимер ВП-ОЭГМ-ДМТЭГ.
Пример 3.
Наноразмерная система флуоресцентный краситель-полимерная частица ZnTTP-сополимер ВП-ОЭГМ-ДМТЭГ.
В 8 мл раствора сополимера ВП-ОЭГМ-ДМТЭГ в изопропиловом спирте (4 мг/мл) добавляли по каплям 0.4 мл раствора ZnTTP в толуоле (0.7 мг/мл). Сушили от органических растворителей в вакууме и добавляли к полимерной пленке 8 мл бидистиллята. Затем к 5 мл глицерина добавляли 1.6 мл раствора наноразмерной системы при постоянном перемешивании при комнатной температуре. Растворы глицерин-вода, содержащие наноразмерную систему ZnTTP-сополимер ВП-ОЭГМ-ДМТЭГ, были прозрачными, имели желтоватый цвет и показывали высокую стабильность во времени, в спектрах поглощения наблюдали характерную для красителя полосу поглощения Соре при 425 нм и флуоресцировали в области 600-650 нм.
Пример 4.
Проникновение наноразмерной системы ZnTTP-сополимер ВП-ОЭГМ-ДМТЭГ в кожу.
Наноразмерную систему (см. Пример 3) наносили на выбритый участок кожи крыс в объеме 100 мкл образца путем его втирания массированием. Нанесение образца проводилось один раз в сутки в течение 3 дней. По окончании образцы кожи отбирались и фиксировались в 4% формалине для приготовления гистологических срезов. Для флуоресцентной микроскопии использовались неокрашенные срезы.
Результаты микроскопии представлены на фиг. 6. Исследовались контрольные образцы (фиг. 6, а и б) и образцы кожи после нанесения наноразмерной системы ZnTTP-сополимер ВП-ОЭГМ-ДМТЭГ (фиг. 6, в и г). Участки кожи визуализировали с помощью фазового контраста (фиг. 6, а и в) и флуоресцентной микроскопии (фиг. 6, б и г).
Из полученных результатов видно, что сигнал флуоресценции наблюдается как в поверхностных слоях кожи, так и в слоях, подлежащих дерму. Таким образом, полученная наноразмерная система обеспечивает трансдермальную доставку флуоресцентного красителя.
Пример 5.
Биологическая активность наноразмерной системы олигопептид-полимерная частица МТ2-сополимер ВП-ОЭГМ-ДМТЭГ.
Наноразмерную систему (см. Пример 2) наносили на выбритый участок кожи крыс в объеме 100 мкл образца путем его втирания массированием. Нанесение образца проводилось один раз в сутки в течение 10 дней. По окончании образцы кожи отбирались и фиксировались в 4% формалине для приготовления гистологических срезов. Для гистологического исследования срезы окрашивали гематоксилин-эозином. На фиг. 7 показаны результаты микроскопии контрольных образцов (фиг. 7, а) и образцов кожи после нанесения наноразмерной системы МТ2-сополимер ВП-ОЭГМ-ДМТЭГ (фиг. 7, б). В таблице 2 приведены результаты исследования синтетической и митотической активности меланоцитов в коже животных.
Как видно из представленных результатов, полученная наноразмерная система олигопептид-полимерная частица проявляет биологическую активность содержащегося в ней олигопептида МТ2. Это свидетельствует о том, что полученная наноразмерная система обеспечивает трансдермальную доставку олигопептида МТ2, который стимулирует меланогенез.
Таким образом, заявленное изобретение предлагает способ получения наноразмерных систем олигопептид-полимерная частица на основе амфифильных сополимеров N-винилпирролидона с (ди)метакрилатами, которые обеспечивают проникновение в кожу олигопептидов, в частности, Меланотана-2, который без системы трансдермальной доставки в косметических целях необходимо вводить путем инъекций. Полученные наноразмерные системы предназначены для применения в качестве средства, обеспечивающего трансдермальную доставку биологически активных пептидов, в составе косметических или лекарственных средств, наносимых на кожу.