Ассоциация гена ССR5 с сахарным диабетом 1-го типа

Ассоциация гена CCR5 с сахарным диабетом 1-го типа

О.И. КОПЫЛОВА1, 2, д.м.н., проф. Т.Л. КУРАЕВА2, к.б.н. Е.Ю. ЛАВРИКОВА2, к.м.н. Е.В. ТИТОВИЧ2, к.б.н. А.Г. НИКИТИН1, 2, к.м.н. Г.Е. СМИРНОВА2, член-корр. В.А. ПЕТЕРКОВА2, акад. РАМН и РАН И.И. ДЕДОВ2, д.б.н., проф. В.В. НОСИКОВ1' 2*

Association of the CCR5 gene with type 1 diabetes mellitus

O.I. KOPYLOVA, T.L. KURAEVA, E.YU. LAVRIKOVA, E.V. TITOVICH, A.G. NIKITIN, G.E. SMIRNOVA, V.A. PETERKOVA, I.I. DEDOV, V.V. NOSIKOV

'ФГБУН «Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля» РАН; 2ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»; 3ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава РФ, Москва

Цель — изучить ассоциацию полиморфного маркера A/del32 гена ССR5 с сахарным диабетом 1-го типа (СД1). Материал и методы. В исследование включены больные СД1 (177 человек) и здоровые индивиды (408) русского происхождения. Определение аллелей и генотипов гена ССR5 проводилось с помощью амплификации «в реальном времени». Результаты. Как в группе больных СД1 (СД+), так и в группе здоровых индивидов (СД-) преобладал аллель гена ССR5 без делеции 32 п.н. (аллель A). Различия между частотами аллелей A и del32 в группах «СД+» и «СД-» были статистически незначимыми. В то же время нами обнаружено статистически значимое увеличение частоты генотипа del32/del32 (p=0,008) в группе больных СД1. Заключение. Носители генотипа del32/del32 гена ССR5 среди русских больных, проживающих в Москве, имеют повышенный риск развития СД1.

Ключевые слова: сахарный диабет 1-го типа, ген CCR5, делеция 32 п.н.

Aim of the study. To elucidate the association between the polymorphous marker A/del132 of the CCR5 gene with type 1 diabetes mellitus. Materials and methods. The study included 177 patients with type 1 diabetes mellitus (DM1) and 408 healthy subjects (ethnic Russians). CR5 alleles and genotypes were identified with the use of the real-time amplification technique. Results. It was shown that the CCR5 allele without 32 base pair deletion (allele A) predominated in both diabetic patients and diabetes-free subjects. The difference between their occurrence in the two groups was insignificant. At the same time, we documented a significant rise in the frequency of del132/del132 genotype in the diabetic patients compared with the healthy subjects (p=0.008). It is concluded that carriers of the CCR5-del32/del32 genotype in the Russian population of Moscow are at high risk of developing type 1 diabetes mellitus.

Key words: type 1 diabetes mellitus, CCR5 gene, 32 base pair deletion.

Сахарный диабет 1-го типа (СД1) является аутоиммунным заболеванием, характеризующимся лимфоцитарной инфильтрацией островков Лангер-ганса дендритными клетками фС), макрофагами и Т-лимфоцитами (CD4+ и CD8+) с последующим разрушением р-клеток [1], но с сохранением а-клеток, секретирующих глюкагон, и б-клеток, се-кретирующих соматостатин [1, 2]. Еще одним доказательством развития именно аутоиммунного процесса являются выявляемые в сыворотке крови антитела, специфичные для собственных белков организма. Наиболее важные из таких антител — антитела к инсулину, декарбоксилазе глутаминовой кислоты ^А065) и внутриклеточной тирозин-фосфатазе (1А2) [3].

Главными генами, определяющими предрасположенность к СД1, являются гены класса II (ИЬА-БКБ1, Б0В1 и DQA1) главного комплекса гистосов-местимости (МНС). Однако манифестация СД1 про-

исходит только в том случае, если наряду с генами комплекса MHC индивид является носителем ряда других предрасполагающих генов. Одним из главных факторов является также воздействие внешней среды, природа которого пока не установлена.

К настоящему времени у русских больных СД1, проживающих в Москве, наряду с генами класса II MHC обнаружена ассоциация еще нескольких генов, предрасполагающих к СД1. Это ген CTLA4, кодирующий поверхностный рецептор Т-клеток [4], ген инсулина (INS) [5], гены PTPN22 и PTPN2, кодирующие тирозиновые фосфатазы [6], и ген SH2B3, кодирующий адаптерный белок Lnk [7].

За исключением гена инсулина, все вышеперечисленные гены кодируют факторы, связанные с формированием иммунного ответа. В связи с этим особое внимание обращает на себя рецептор хемо-кинов типа 5 (CCR5). Как и все рецепторы, сопряженные с G-белками, CCR5 имеет внеклеточный

© Коллектив авторов, 2013 ПРОБЛЕМЫ ЭНДОКРИНОЛОГИИ, 2, 2013

*e-mail: nosikov@genetika.ru

^концевой участок, 7 трансмембранных доменов, соединенных внеклеточными и внутриклеточными петлями, и цито плазматический С-концевой участок [8]. Одновременная экспрессия рецепторов CD4 и CCR5 наблюдается в Т-лимфоцитах, в частности Т-хелперах 1-го типа (ТЫ), а также в дендритных клетках, моноцитах и макрофагах [9]. Вариант гена ССЯ5, содержащий делецию 32 п.н. в кодирующей области, приводит к синтезу укороченного и функционально неактивного варианта рецептора из-за сдвига рамки считывания [10]. При этом у гетерозиготных носителей уровень синтеза рецептора CCR5 понижен, а у гомозиготных — синтез функционально активного рецептора CCR5 полностью отсутствует [11].

CCR5 играет важную роль в регуляции иммунного ответа типа ТЫ, ведущего к аллогенному подавлению р-клеток островков Лангерганса при СД1 [12]. Пониженная экспрессия хемокиновых рецепторов CCR5, ассоциированных с ТЫ, обнаружена в моноцитах периферической крови больных с недавно выявленным СД1 [13]. Хорошо изучена роль хемокинов в качестве аттрактантов для нативных и эффекторных Т-клеток [8, 14]. В ряде исследований [15] показано, что хемокины имеют важное значение и в регуляции Т-клеточной дифференцировки, а также влияют на поляризацию иммунного ответа по типу ТЫ или ТИ2.

Недавно обнаружено, что аллель йе!32 гена ССЯ5 с высокой частотой обнаруживается у носителей аллелей НЬЛ-БЯВ1*01 и БЯБ1*04 [16]. Ассоциация варианта йе!32 гена ССЯ5 была выявлена с такими аутоиммунными заболеваниями, как рассеянный склероз, целиакия и СД1 [17, 18]. Следует отметить, что носители генотипа йе132/йе132 гена ССЯ5 имеют пониженный риск развития СД1 [18]. Механизм развития данных заболеваний сходен и в значительной степени связан с аутоиммунной неспецифичной реакцией Т-лимфоцитов на периферические ткани организма и интолерантностью к антигенам, поступающим с пищей [18].

Однако в двух исследованиях, проведенных на шведской [19] и британской [20] популяциях, ассоциации с СД1 обнаружено не было. Таким образом, возникает вопрос, насколько существенен вклад гена ССЯ5 (вариант йе132) в формирование генетической предрасположенности к СД1 среди русских больных СД1, проживающих в Москве. Именно эта задача и была поставлена в данной работе.

Материал и методы

В работе использовали образцы крови от больных СД1 (177 человек) и здоровых индивидов (408) русского происхождения, любезно предоставленные сотрудниками ФГУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава РФ.

Использовали термостабильную ДНК-поли-меразу Taq производства ЗАО «Диалат» (Москва). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы ЗАО «Евроген» (Москва). Флуоресцентные зонды синтезированы ООО «ДНК-Синтез» (Москва). Геномную ДНК выделяли из цельной крови больных посредством экстракции фенолом-хлороформом после инкубации образцов крови с протеиназой К в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия [21].

Идентификацию генотипов гена CCR5, кодирующего рецептор хемокинов типа 5, проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (Taq-Man) на термоциклере ABI 7500 Fast («Applied Biosystems») в 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 70 мМ Трис-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ сульфат аммония, 0,01%-ный Твин-20, 2 мМ хлорид магния, 200 нМ каждого dNTP, 500 нМ праймеров, 100 нМ зондов, 1,5 ед. Taq ДНК-полимеразы, 50—100 нг геномной ДНК. В составе реакционной смеси для амплификации присутствуют флуоресцентномеченые олигону-клеотидные зонды, которые гибридизуются с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени и разрушаются Taq-полимеразой, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции в зависимости от наличия мутации. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала.

Условия амплификации фрагмента ДНК: 95 °С/ 2 мин — 1-й цикл; 94 °C/10 с, 58 °C/60 — всего 40 циклов. Анализ продуктов амплификации проводился методом детекции «по конечной точке» с помощью встроенных средств программного обеспечения версии SDS 1.4.

Статистический анализ распределения частот и генотипов проводили с использованием таблиц сопряженности и критерия хи-квадрат (х2). Значимыми считали различия при ^<0,05. Относительный риск развития заболевания рассчитывали по отношению шансов (OR). OR=1 рассматривали как отсутствие ассоциации, OR >1 как положительную ассоциацию (повышенный риск развития патологии), OR <1 — как отрицательную ассоциацию алле-ля или генотипа с заболеванием (пониженный риск развития патологии). Вычисления производили с помощью программы «Калькулятор для расчета статистики в исследованиях случай—контроль» [22].

Результаты и обсуждение

Как в группе больных СД1 («СД+»), так и в группе здоровых индивидов («СД-») преобладал аллель без делеции 32 п.н. (аллель A, более 80%), то же самое характерно и для генотипов (генотип A, более 70%) (см. таблицу). Различия между частотами аллелей A и del32 в группах «СД+» и «СД-» были стати-

Сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов гена ССR5 в группах «СД1+» и «СД1-»

Аллели и генотипы

Частота аллелей и генотипов

«СД1+»

«СД1-»

Значение х2

Аллель A Аллель del32 Генотип A/A Генотип A/del32 Генотип del32/del32

0,856 0,144 0,751 0,209 0,040

0,887 0,113 0,779 0,216 0,005

2,26 9,78

0,13 0,008

стически незначимыми. В то же время нами были обнаружены статистически значимые различия при сравнении частот генотипов в тех же группах больных (см. таблицу). Наблюдалось увеличение частоты генотипа del32/del32 (р=0,008) в группе больных СД1, что говорит об ассоциации этого генотипа с повышенным риском развития данной патологии и о повышенном риске развития СД1 у носителей генотипа del32/del32.

Наши данные противоречат результатам, полученным на британской популяции и подтвержденным на семьях из нескольких европейских стран [18]. В этом исследовании было показано, что носители аллеля del32 гена ССЯ5 имеют пониженный риск развития СД1. Следует отметить, что вклад гена ССЯ5 в формирование предрасположенности к СД1 минимален как в русской, так и в британской популяциях.

Кроме того, в двух исследованиях, проведенных на шведской популяции [19] и на другой выборке из британской популяции [20], ассоциации с СД1 вообще обнаружено не было. Эти противоречия, возможно, связаны с эпистатическим взаимодействием генов комплекса HLA класса II между собой и с генами, включенными в аутоиммунную реакцию, одним их которых является ССЯ5 [23].

На основании полученных нами данных можно сделать вывод, что носители генотипа del32/del32 гена ССЯ5 среди русских больных, проживающих в Москве, имеют повышенный риск развития аутоиммунного СД1.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — А.Г. Никитин, В.В. Носиков, И.И. Дедов, О.И. Копылова

Сбор и обработка материала — Т.Л. Кураева, Г.Е. Смирнова, В.А. Петеркова, Е.Ю. Лаврикова, О.И. Копылова

Статистическая обработка данных — А.Г. Никитин, О.И. Копылова

Написание текста — А.Г. Никитин, О.И. Копы-лова, В.В. Носиков

Редактирование — В.В. Носиков Конфликт интересов и финансовая заинтересованность авторов отсутствуют.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (государственный контракт 16.512.11.2045) и Российского фонда фундаментальных исследований (проект 09-04-01443-а).

ЛИТЕРАТУРА

1. Devendra D., Liu E., Eisenbarth G.S. Type 1 diabetes: recent deve- 6 lopments. BMJ 2004; 328: 7442: 750—754.

2. Baker P.R., Steck A.K. The past, present, and future of genetic associations in type 1 diabetes. Curr Diabet Rep 2011; 11: 445— 453.

3. Haller M.J., Gottlieb P.A., Schatz D.A. Type 1 diabetes intervention 7. trials 2007: where are we and where are we going? Curr Opin Endocrinol Diabet Obes 2007; 14: 4: 283—287.

4. Chistiakov D.A., Savost'anov K.V., Nosikov V.V. CTLA4 gene polymorphisms are associated with, and linked to, insulin-dependent diabetes mellitus in a Russian population. BMC Genet 8. 2001; 2: 6.

5. Никитин А.Г., Лаврикова Е.Ю., Серегин Ю.А., Зильберман

Л.И., Цитлидзе Н.М., Кураева Т.Л., Петеркова В.А., Дедов 9. И.И., Носиков В.В. Ассоциация полиморфного маркера — 23HphI гена INS с сахарным диабетом 1-го типа. Сахарный диабет 2010; 2: 17—20.

Лаврикова Е.Ю., Никитин А.Г., Серегин Ю.А., Зильберман Л.И., Цитлидзе Н.М., Кураева Т.Л., Петеркова В.А., Дедов И.И., Носиков В.В. Ассоциация полиморфного маркера C1858T гена PTPN22 с сахарным диабетом 1-го типа. Мол биол 2009; 43: 6: 1040—1043.

Никитин А.Г., Лаврикова Е.Ю., Серегин Ю.А., Зильберман Л.И., Цитлидзе Н.М., Кураева Т.Л., Петеркова В.А., Дедов И.И., Носиков В.В. Ассоциация полиморфных маркеров генов ERBB3 и SH2B3 с сахарным диабетом 1-го типа. Мол биол 2010; 44: 2: 257—262.

Allen S.J., Crown S.E., Handel T.M. Chemokine: receptor structure, interactions, and antagonism. Annu Rev Immunol 2007; 25: 787—820.

Rottman J.B., Ganley K.P., Williams K., Wu L., Mackay C.R., Ringler D.J. Cellular localization of the chemokine receptor CCR5: correlation to cellular targets of HIV-1 infection. Am J Path 1997; 151: 1341 — 1351.

10. Samson M., Libert F., Doranz B.J., Rucker J., Liesnard C., Farber C-M., Saragosti S., Lapoumeroulie C., Cogniaux J., Forceille C., Muyldermans G., Verhofstede C., Burtonboy G., Georges M., Imai T., Rana S., Yi Y., Smyth R.J., Collman R.G., Doms R.W., Vassart G., Parmentier M. Resistance to HIV-1 infection in Caucasian individuals bearing mutant alleles of the CCR-5 chemokine receptor gene. Nature 1996; 382: 722—725.

11. Kantarci O.H., Morales Y., Ziemer P.A., Hebrink D.D., Mahad D.J., Atkinson E.J., Achenbach S.J., De Andrade M., Mack M., Ransohoff R.M., Lassmann H., Bruck W., Weinshenker B.G., Lucchinetti C.F. CCR5A32 polymorphism effects on CCR5 expression, patterns of immunopathology and disease course in multiple sclerosis. J Neuroimmunol 2005; 169: 1-2: 137—143.

12. Szalai C., CsaszarA., CzinnerA., Szabo T., PanczelP., Madacsy L., Falus A. Chemokine receptor CCR2 and CCR5 polymorphisms in children with insulin-dependent diabetes mellitus. Pediatr Res 1999; 46: 1: 82—84.

13. Lohmann T., Laue S., Nietzschmann U., Kapellen T.M., Lehmann I., Schroeder S., Paschke R., Kiess W. Reduced expression of Th1-associated chemokine receptors on peripheral blood lymphocytes at diagnosis of type 1 diabetes. Diabetes 2002; 51: 8: 2474—2480.

14. Weber C. Novel mechanistic concepts for the control of leukocyte transmigration: Specialization of integrins, chemokines, and junctional molecules. J Mol Med 2003; 81: 4—19.

15. Viola A., Molon B., Contento R.L. Chemokines: coded messages for T-cell missions. Front Biosci 2008; 13: 6341—6353.

16. Muxel S.M., Borelli S.D., Amarante M.K., Voltarelli J.C., Aoki M.N., de Oliveira C.E., Ehara Watanabe M.A. Association study of CCR5 delta 32 polymorphism among the HLA-DRB1 Caucasian

population in Northern Paraná, Brazil. J Clin Lab Analyt 2012; 22: 4: 229—233.

17. Favorova O.O., Favorov A.V., Boiko A.N., Andreewski T.V., Sudomoina M.A., Alekseenkov A.D., Kulakova O.G., Gusev E.I., Parmigiani G., Ochs M.F. Three allele combinations associated with Multiple Sclerosis. BMC Med Genet 2006; 7: 63.

18. Smyth D.J, Plagnol V., Walker N.M., Cooper J.D., Downes K., Yang J.H., Howson J.M., Stevens H., McManus R., Wijmenga C., Heap G.A., Dubois P.C., Clayton D.G., Hunt K.A., van Heel D.A., Todd J.A. Shared and distinct genetic variants in type 1 diabetes and cCeliac disease. N Engl J Med 2008; 359: 26: 2767—2777.

19. Gambelunghe G., Ghaderi M., Brozzetti A., Del Sindaco P., Gharizadeh B., Nyren P., Hjelmstrom P., Nikitina-Zake L., Sanjeevi C.B., Falorni A. Lack of association of CCR2-64I and CCR5-Delta 32 with type 1 diabetes and latent autoimmune diabetes in adults. Hum Immunol 2003; 64: 6: 629—632.

20. Yang B., Houlberg K., Millward A., Demaine A. Polymorphisms of chemokine and chemokine receptor genes in Type 1 diabetes mellitus and its complications. Cytokine 2004; 26: 3: 114—121.

21. Johns M.B., Paulus-Thomas J.E. Purification of human genomic DNA from whole blood using sodium perchlorate in place of phenol. Anal Biochem 1989; 180: 2: 276—278.

22. Никитин А. Калькулятор для расчета статистики в исследованиях «случай—контроль». Интернет 2009; доступен по адресу: http://test.tapotili.ru/calculator_or.php

23. Koeleman B.P., Lie B.A., Undlien D.E., Dudbridge F., Thorsby E., de Vries R.R., Cucca F., Roep B.O., Giphart M.J., Todd J.A. Genotype effects and epistasis in type 1 diabetes and HLA-DQ trans dimer associations with disease. Genes Immun 2004; 5: 5: 381—388.