Конструирование лекарственных форм новых поколений

Наталья Литвинко

заместитель академика-секретаря Отделения химии и наук о Земле НАН Беларуси, доктор химических наук

УДК 577.152.3:547.92

Конструирование лекарственных форм

новых поколении

Немецкий бактериолог Пауль Эрлих в конце XIX в. предложил термин «волшебная пуля» применительно к гипотетическому хи-миопрепарату, который находит в организме и избирательно убивает опухолевые клетки без повреждения окружающих здоровых тканей. С тех пор селективный транспорт химиотерапевтических препаратов к опухоли in situ остается предметом многочисленных исследований. Одним из способов достижения этой цели является разработка липосомальной лекарственной формы противоопухолевых препаратов.

Использование замкнутых бислойных липидных мембран (липо-сом) для включения в них лекарственных средств давно привлекает внимание исследователей как новый вид их лекарственной формы [1]. В перспективе это альтернатива растворимым полиса-харидным капсулам, таблеткам и мазям (рис. 1) [2].

К настоящему времени накоплено достаточно сведений о липо-сомальном наноструктурном инкапсулировании лекарственных средств для лечения ряда заболеваний [3—9].

Липосомы имеют размер 100—400 нм с толщиной липидного бис-лоя около 4 нм. Неблагоприятная энтропия, вызываемая смешиванием нерастворимого липида с водой, приводит к образованию высоко упорядоченной совокупности концентрических закрытых мембран фосфолипида с заключенным в них водным раствором (рис. 2).

Внедрены в производство и в медицинскую практику девять лекарственных средств

ЦИТАРАБИН

ТИОГУАНИН

ЛЕЙКЛАДИН

ФЛЮДАРАБЕЛ

ЗАМИЦИТ

ФОСФАДЕН

НУКЛЕОВИР

ГЕФАЛ

АЛАМИН

находятся на разных стадиях внедрения в производство семь лекарственных средств

ЦИТОСОРБИН ГУАРАН РИБАВИРИН иТИРОКСИН КАРБОПЛАТИН ТИРОЛИБЕРИН НООТРОПНОЕ СРЕДСТВО

Рис. 1. Традиционные формы лекарственных препаратов, субстанции которых созданы в Институте биоорганической химии с участием Института микробиологии НАН Беларуси

Гидрофобная область

Внутреннее пространство, куда может включаться фармацевтическая субстанция

Липидный слой

фосфолипаз (рис. 4); в результате изменения активности последних в присутствии различных низкомолекулярных биорегуляторов; в связи с экранированием различными белками заряженной поверхности фосфолипидов и т.д. Следовательно, выявление структурно-функциональных закономерностей снижения в зависимости от состава чувствительности липосом к разрушающему действию фосфолипаз является одной из актуальных проблем конструирования лекарственных форм новых поколений.

Рис. 2. Схема строения липосомы

Такие фосфолипидные везикулы (липосомы) в качестве своеобразных контейнеров для доставки лекарственных средств по сравнению с традиционными лекарственными формами имеют веские преимущества: повышают терапевтическую эффективность за счет адресной доставки к органу-мишени, снижают токсичность и уменьшают аллергенный эффект действующего вещества лекарственного средства, обладают пролонгированным действием и самым высоким сродством к клеточным мембранам, наименее травматичны.

Эффективность транспортировки лекарственных средств в таких липидных контейнерах зависит от устойчивости липосом к воздействию различных факторов внутренней среды организма, таких как липолитическая активность плазмы крови или клеточной поверхности, обмен или перенос липидов мембраны липосом на компоненты плазмы или клеточных мембран, воздействие липоли-тических ферментов лизосом в процессе эндоцитоза (рис. 3) и др.

Существенным недостатком липосомальных форм является их быстрая опсонизация при внутривенном введении и последующий захват клетками ретикулоэндотелиальной системы (системы мононуклеарных фагоцитов).

При прохождении липосом к органу-мишени через биологическое пространство возможно изменение устойчивости липидной капсулы: из-за их гидролиза под действием специфических ферментов—

Г Облегченная диффузия из адсорбировавшихся липосом

осхж

ФосфолипазаАг (ФЛАг) НгО КСОСЖ

К'СОО

жирная кислота ООС1*

о£О

фосфолипид

нет'

лизофосфолипид

Рис. 3. Опособы проникновения содержимого липосом в клетку

Рис. 4. Функционально активная единица панкреатической фосфолипазы А2-мономер

Учитывая вышеизложенное, в задачу наших исследований входило: формирование липосом как перспективных лекарственных форм новых поколений из различных фосфолипидов, в том числе конъюгатов с компонентами нуклеиновых кислот, обладающих противовирусным и противоопухолевым действием, и выявление в модельных системах их устойчивости к липолитической активности фосфолипазы А2 (ФЛА2) в условиях, воспроизводящих воздействие некоторых факторов внешней среды и внутреннего статуса организма с целью выбора наиболее оптимального варианта.

В рамках многолетнего изучения исследована чувствительность к липолитической деградации фосфолипидных везикул одно- и двухкомпонентных по липиду, а также в условиях, моделирующих воздействие факторов внешней (гамма-облучение) и внутренней среды (этанол, интегральные, периферические и растворимые белки) [10].

Природные фосфолипиды — это класс органических соединений, которые содержат жирные кислоты и фосфорилированный остаток аминоспирта (холин, этаноламин и т.д.), соединенные с глицериновым (фосфоглицериды) или сфингозиновым (сфинго-зинфосфатиды) скелетом. Первая гидроксильная группа глице-рофосфатного остатка ацилирована преимущественно насыщенными жирными кислотами либо алкилирована насыщенными жирными спиртами или енолами насыщенных жирных альдегидов. Ко второй гидроксильной группе глицерина сложноэфирной связью присоединены главным образом ненасыщенные жирные кислоты. Ацильные и алкильные углеводородные цепи в молекулах фос-фолипидов образованы жирными кислотами и спиртами с четным числом атомов углерода (рис. 5).

Липосомы получают разными способами. Однако только при действии ультразвука на водные дисперсии фосфолипидов и использовании гель-проникающей хроматографии (рис. 6) формируются

Рис. 5. Структурные формулы фосфолипидов, из которых конструировали липосомы

достаточно однородные везикулы. Более подробно о получении и свойствах липосом можно прочитать в монографиях [1, 11].

В результате была изучена устойчивость следующих форм липосом [12]:

• однокомпонентных по липиду (ФХ, ФС, ФГ, ФИ, КЛ, ФМ, ФЭТ, ФЭГЛ (рис. 5);

• двухкомпонентных по липиду:

оба компонента гидролизуются ФЛА2 (ФХ-ФМ; ФХ-ФЭТ, ФХ-ФЭГЛ; ФХ-ФГ);

один компонент (сфингомиелин, СМ) — не гидролизуется ФЛА2 (ФХ-СМ; ФЭ-СМ; ФГ-СМ; ФИ-СМ). Исследование устойчивости однокомпонентных липосом к ферментативной деградации показало, что надмолекулярные фос-фолипидные структуры из КЛ разрушаются в 7—10 раз быстрее, чем из ФХ [13]. Однако известно, что содержащие Фх липосомы

а)

б)

"А

Б

.....К"" Г"Ч(

Рис. 6. а) Электронные микрофотографии липосом:

1 — фосфатидилхолин+сфингомиелин+ЦР-450;

2 — фосфатидилинозит+сфингомиелин+ЦР-450;

3 — фосфатидилэтаноламин+сфингомиелин;

4 — фосфатидилэтаноламин+сфингомиелин+ЦР-450 (молярное соотношение липид/белок 1000-1);

б) Профили элюции: липосом из ФХ (А) и протеолипосом из ФХ с ЦР-450 (Б) при хроматографии на колонке с сефадексом в-50

нестабильны в кровотоке в результате массивного одностороннего переноса лецитина липосом на липопротеиды высокой плотности, а отрицательно заряженные липосомы включаются в клетки печени предпочтительнее, чем незаряженные или положительно заряженные [14]. В связи с этим целесообразно исследовать устойчивость двухкомпонентных липосом ФХ с анионными фос-фолипидами.

При изучении гидролиза одно- и двухкомпонентных липосом на основе глицерофосфолипидов обнаружено некоторое стимулирующее влияние анионных фосфолипидов ФМ (2), ФЭТ (3), ФЭГЛ (4) на эффективность гидролиза цвиттер-ионного ФХ в двухкомпо-нентных липосомах (соотношение 1:3 моль/моль) под действием ФЛА2 (рис. 7) [15].

Рис. 7. Эффективность гидролиза ФХ в двухкомпонентных липосомах с анионными фосфолипидами ФМ

Вместе с тем имеются сведения о том, что при включении в состав липосом ФЭТ существенно повышается степень инкапсулирования инсулина и ряда антибиотиков [16]. Варьируя соотношение ФХ и ФЭТ, было показано, что усиленный гидролиз цвиттер-ионного ФХ в зависимости от доли ФЭТ наблюдается в пределах содержания последнего в смеси от 40 до 80 моль%. Изменения гидролиза ФЭТ незначительны (рис. 8) [15].

Таким образом, наиболее устойчивы к действию ФЛА2 липосомы из ФЭТ и ФХ в соотношении до 2:3. Примечательно, что в липосомы именно такого состава включается максимальное количество лекарственного средства (до 90% антибиотика доксорубицина) [17].

Рис. 8. Степень гидролиза ФХ (1) и ФЭТ (2) мкмоль- мик'-мг1 по отношению к степени гидролиза соответствующего липида в однокомпонентных липосомах

Рис. 9. Гидролиз фосфолипидов (ФЛ) с позиционно различным (А, природные ФЛ) и одинаковым (Б, диолеоильные ФЛ) жирно-кислотным составом: А.1 — ФХ в липосомах из ФХ; 2 — ФГ в липосомах из ФХ и ФГ; 3 — ФХ в липосомах из ФХ и ФГ; 4 — ФГ в липосомах из ФГ. Б. 1 — ДОФХ в липосомах из ДОФХ; 2 — ДОФГ в липосомах из ДОФХ и ДОФГ; 3 — ДОФХ в липосомах из ДОФХ и ДОФГ; 4 — ДОФГ в липосомах из ДОФГ

Молекулярные виды фосфолипидов отличаются также и различным жирно-кислотным составом. В связи с этим было изучено влияние жирно-кислотного состава на чувствительность липосом к атаке ФЛА2 на примере природных фосфолипидов, имеющих, как правило, во втором положении глицеринового скелета остатки ненасыщенных жирных кислот, а в первом — насыщенных жирных кислот и синтетических фосфолипидов (анионного диолеоилфос-фатидилглицерина, ДОФГ, и цвиттер-ионного диолеоилфосфати-дилхолина, ДОФХ, рис. 9).

В обоих случаях наиболее устойчивы однокомпонентные липо-сомы из ФГ(4 А, Б), включение которого в бислой стабилизирует гидролиз ФХ (3 А, Б). Диолеоильные аналоги ФЛ удобны для формирования липосом в связи с их относительно высокой устойчивостью к перекисному окислению, длина остатков олеиновой кислоты сравнима со средней длиной жирно-кислотных остатков природных ФЛ, сформированный из них бислой находится при физиологических температурах в жидкокристаллическом состоянии так же как и у биологических мембран [18].

Для повышения устойчивости в состав липосом вводят холестерин, сфингомиелин, фосфолипиды с насыщенными жирно-кислот-

Рис. 10. Степень гидролиза под действием ФЛА2 двухкомпонентных липосом (2—6) по сравнению с однокомпонентными из ФХ (1): 2 — СМ + ФХ (эквимолярное количество); 3, 4 — ФХ + СМ + цитохром Р-450 в соотношении липид/цитохром 1000:1 и 500:1; ФХ + цитохром Р-450, в соотношении липид/цитохром 1000:1 и 500:1; 5,6 — цитохром Р-450 в соотношении липид/цитохром 1000:1 и 500:1

ными остатками [4]. Сравнительное изучение одно- и двухкомпонентных липосом на основе глицеро- и сфингофосфолипидов [19] показало, что наиболее устойчивы к липолитической деградации однокомпонентные липосомы из ФХ (рис. 10, 1). Интегральный белок цитохром Р-450 (рис. 10, 5,6, в соотношении липид/цитохром 1000:1 и 500:1) снижает устойчивость липосом в 5—7 раз. Включение СМ в состав липосом из ФХ (рис. 10, 2, в соотношении 1:1) и СМ с цитохромом Р-450 (рис. 10, 3,4, в соотношении липид/ цитохром 1000:1 и 500:1) увеличивает чувствительность к ферментативному разрушению липосом в 2,5 раза. СМ стабилизирует бислой при включении цитохрома Р-450.

Следует отметить, что активность фермента к субстрату в ми-целлярной фазе, сформированной детергентом тритоном Х-100, который выполняет функцию нейтрального матрикса, когда химическая структура субстрата выступает на первый план, снижается в другом порядке: ФХ>ФИ>ФЭ>ФГ [20].

При включении в липосомы СМ, который не гидролизуется ФЛА2, по увеличению начальной скорости ферментативного расщепле2-ния наблюдается следующая картина: ФИ = ФЭ (рис. 11, 3, 2) > ФХ (рис. 11, 1) > ФГ (рис. 11, 4). Таким образом, См стимулирует гидролиз второго фосфолипида, который не имеет четвертично-аммониевой группы.

Обнаружена повышенная устойчивость к ферментативной деградации липосом, состав которых представляет собой эквимоляр-ную смесь ФГ и СМ (4): за 20 минут после начала гидролиза сохраняется 65% липида (в случае ФХ — 45%) (рис. 11).

Рис. 11. Гидролиз двухкомпонентных липосом СМ с эквимолярным количеством ФХ(1); ФЭ (2);ФИ (3); ФГ( 4). По оси абсцисс время гидролиза 2, 5, 10, 20 минут; по оси ординат — степень сохранения фосфолипида, одно деление — 10%

При исследовании стабильности липосом под действием экстремальных внешних факторов (гамма-облучение) выявлено существенное защитное действие СМ и физического состояния ФЛ от ферментативного разрушения липидных контейнеров [21].

Выяснены особенности гидролиза ДОФХ и ДМФХ (димиристо-илфосфатидилхолин), наблюдаемые в содержащих и не содержащих СМ облученных липосомах: защитный эффект СМ (2, 4, рис. 12) лучше проявляется в бислое, находящемся в гелеобраз-ном состоянии (ДМФХ, 4, рис. 12), чем в жидкокристаллическом (ДОФХ, 3, рис. 12).

Рис. 12. Гидролиз ДОФХ (1, 2) и ДМФХ (3, 4):

1,3 — в отсутствие СМ; 2, 4 — в присутствии СМ;

молярное отношение ДОФХ (ДМФХ): СМ — 1:1;

ось абсцисс — доза облучения, кГр; ось ординат — степень гидролиза, %

Стабильность липосом под действием внутренних факторов была исследована на примере действия этанола (рис. 13) и представителей основных типов клеточных белков: интегрального — цитох-рома Р-450, периферического — В5, растворимого — гистона Н и их модели — полилизина.

Известно, что этанол нарушает упорядоченность липидного би-слоя [22] и, следовательно, должна изменяться его чувствительность к гидролизу ФЛА2. Показано, что в присутствии этанола скорость гидролиза ДОФХ в двухкомпонентных липосомах по сравнению со скоростью его гидролиза в однокомпонентных липосомах в отсутствие спирта возрастает в 2—3,5 раза в зависимости от концентрации этанола. Скорость гидролиза ДОФЭт в двухком-понентных липосомах в присутствии максимально добавленного количества спирта (9%) увеличивается только в 1,3 раза. Наличие в среде этанола не влияет на ферментативный гидролиз ДОФХ в однокомпонентных липосомах [23].

Одной из актуальных возможностей применения липосом является заместительная ферментотерапия для лечения ферментной недостаточности у людей [24]. В связи с этим важно провести исследование чувствительности липосом к липолитической деградации в присутствии представителей разных классификационных типов белков. При исследовании устойчивости липосом в присутствии интегральных, периферических и растворимых белков по степени усиления воздействия на начальную скорость гидролиза как ФХ, так и ФГ белки располагаются в следующем порядке: полилизин< цитохром С<цитохром В5<гистон Нг

Таким образом, различные классы положительно заряженных белков при электростатическом взаимодействии с липидными везикулами могут экранировать отрицательно заряженные фос-фолипиды, снижая возможность ферментативной деградации липосом.

На украинский фармацевтический рынок выпущен липосомальный препарат «Липин» на основе ФХ (компания «Биолек», Харьков). Имеются сведения, что этот препарат эффективен при лечении заболеваний, связанных с патологическими изменениями системы сурфактанта, нарушениями со стороны тканевого дыхания и антиоксидантных систем организма [25]. Известны липосомаль-ные препараты, полученные из природных источников — легкого крупного рогатого скота (Сурфактант-ВЬ, РФ; Сурванта, США; Аль-веофакт, Германия), легкого свиньи (Куросульф, Италия), а также синтетический препарат Экзосульф (США — Великобритания), которые эффективны при лечении туберкулеза легких, бронхиальной астмы и хронических обструктивных болезнях легких [26].

Полученные нами результаты позволяют сделать следующие рекомендации при конструировании наиболее устойчивых к липоли-тической деградации липосом:

• формирование однокомпонентных липосом на основе ФЭ и ФГ;

• дополнительное введение в состав двухкомпонентных липосом, наряду с традиционным ФХ, вторым компонентом анионных ФЛ (ФГ — в соотношении 1:1 и ФЭТ — в соотношении 3:2, соответственно);

• использование диолеоильных производных ФЛ;

• включение СМ в липосомы из ДОФГ в эквимолярном количестве;

• исключение введения СМ вторым компонентом одновременно с ФИ и ФЭ.

Ученые нашей страны также имеют положительный опыт в создании липосомальных лекарственных препаратов [17, 27—32]. Однако при конструировании таких новых форм лекарств сложными проблемами остаются достижение максимального включения действующего вещества в такой липидный контейнер и его стабильность во времени [17, 32].

В развитие представленных выше исследований с целью исключения проблем, связанных с встраиваемостью фармсубстанций в липосомы и с учетом того, что наименее разрушаемым липидом под действием панкреатической ФЛА2 в мицеллярной фазе явля-

Рис. 13. Гидролиз ДОФХ (1) и ДОФЭт (2) в двухкомпонентных липосомах по сравнению с их гидролизом в однокомпонентных липосомах

Рис. 14 . Конъюгаты ФЭ с компонентами нуклеиновых кислот: а — 2', 3'-дидезоксицитидил, Ь — 2', 3'-дидезоксиуридил, с — аденозил, d — 9-[(2-гид-роксиэтокси)метил]-гуанозил (ацикловир) ^ , ^ — остаток жирной кислоты

Рис. 15. Электронные фотографии липосом из ацикловир-5' -монофосфата с ФЭ до (1) и после (2) обработки ФЛА2

ется ФЭ, синтезированы конъюгаты последнего с компонентами нуклеиновых кислот (КНК), которые обладают противовирусным или противоопухолевым действием [33—39] (рис. 14). Данная работа поддержана Белорусским республиканским фондом фундаментальных исследований (грант Б04-228).

Скорость ферментативного гидролиза химерных субстратов в мицеллярной фазе, в молекулах которых целенаправленно модифицирован этаноламиновый или холиновый фрагменты, втрое снижена по сравнению с природными фосфолипидами, что свидетельствует о существовании анионного катионсвязывающего сайта в активном центре ФЛА2 для электростатических взаимодействий фермента с организованной межфазной поверхностью «липид-вода» [36, 37]. В качестве перспективы практического применения данных результатов получены липосомы с использованием ко-ньюгата ацикловир-5-монофосфата с фосфатидилэтаноламином в виде липосом (рис. 15), которые практически не гидролизуются ФЛА2 поджелудочной железы в течение 30 мин [38, 39].

Это свидетельствует о том, что конъюгаты производных компонентов нуклеиновых кислот и фосфолипидов, как модифицированных бифункциональных фосфолипазных субстратов на основе КНК, обладают потенциально повышенной устойчивостью к липолити-ческой активности. Выявлена наибольшая устойчивость конъюга-тов ФЭ с пуриновыми нуклеозидами по сравнению с аналогами, содержащими пиримидиновые нуклеозиды, к действию панкреатической ФЛА2.

Наличие фосфолипидного «якоря», необходимого для образования липосомальных «контейнеров» и последующего внедрения в клеточную мембрану, представляется исключительно важным для целостной доставки в виде липосом противоопухолевых и противовирусных лекарственных средств на основе КНК к пораженным органам в условиях пищеварительного тракта, насыщенного панкреатической ФЛА2.

Таким образом, стабильность липосом в условиях воздействия липолитических ферментов определяется не только свойствами и сочетанием основных компонентов, но и рядом других факторов, рассмотренных в данной работе.

В практическом использовании липосом открываются неплохие перспективы. Для преодоления захвата липосом мононуклеарами

ретикулоэндотелиальной системы ученые Института биоорганической химии НАН Беларуси разработали липосомы-невидимки: с этой целью в липидный бислой липосом встраивают полиэтилен-гликоль [17, 30, 31]. Оригинальным направлением в липосомоло-гии является разработка иммунолипосом — липосом, к которым прикреплены моноклональные антитела [9]. Однако ни тот ни другой вид липосом не исследован на устойчивость к липолизу, что предполагает продолжение исследований в этой области.

Литература

1. Липосомы в биологических системах. М., 19B3.

2. Лахвич ФА, ^линиченко E.H. Стратегическая субстанция // Беларуская думка, 2006, № 2. С. B4—BB.

3. Aiora Р.Б., Энская НФ. Микрокапсулирование физиологически активных веществ и их применение в медицине // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М., 19B6. Т. 6. С. 6—52.

4. Шибанов AÄ, Бурханов СА, Трубецкой В.С. Химическая модификация ли-посом и создание новых форм физиологически активных препаратов // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М., 19BB. Т. B. С. 79—142.

5. Torchilin V.P., Papisov M.I., Bogdanov A.A. et al. Molecular mechanissm of liposome and immunoliposome steric protection with poly(ethylene glycol) in «Stealth Liposomes». D. Lasic, F. Martin (Eds), P. 51—62. CRC Press Boca Raton. FL. 1995.

6. Lasic D.D., Papahadjopoulos D. Liposomes revisited: Science. 1995. Vol. 267. P. 1275—1276.

7. ^плун A.K, Ле Банг Шон, ^^польский Ю.М. и др. Липосомы и другие наночастицы как средство доставки лекарственных веществ // Вопросы мед. химии, 1999. Т. 45, вып. 1. С. 3—13.

B. Harrington K.L., Lewanski C.R., Stewart S.W. Liposomes as vehicles for targeted therapy of cancer / Part. 2: Clinical development. Clin Oncol. 2000. Vol. 12. P. 16—24.

9. Барышников AЮ, Оборотов H.A. Иммунолипосомы — новое средство доставки лекарственных препаратов // Современная онкология, 2001. Т. 3, № 2.

C. 23—27.

10. Литвинко КМ., Юисель МА Эндогенные фосфолипазы A2. Структура и функция. Мн., 1991. С. 270.

11. Марголис Л. Б., Бергельсон Л. Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками. M., 19B6.

12. Литвинко НМ. Aктивность фосфолипаз A2 и С при биохимическом моделировании. Мн., 2002. С. 350.

13. Литвинко КМ., Дрожденюк A.K ^мплексообразование фосфолипазы A2 с фрагментами нуклеиновых кислот и способы их устранения // Прикладная биохимия и микробиология. 1996. Т. 32. № 6. С. 650—655.

14. Шерпоф Дж., Роердник Ф., Хекстра, Зборовски И., Виссе Е. Стабильность липосом в присутствии компонентов крови // Липосомы в биологических системах. М., 19B3. С. 1B3—210.

15. Литвинко КМ., ^чуро С.В., Жукова М.В. Динамика образования лизоформ при ферментативном гидролизе фосфатидилалканолов // Биохимия, 2002, т. 67, вып. 9. С. 1241—1245.

16. Kisel М.А., Kulik L.N., Tsybovsky I.S.,Vlasov A.P., Vorob'yov M.S.,Kholodova E.A., Zabarovskaya Z.V. Liposomes with phosphatidylethanol as a carrier for oral delivery of insulin: studies in the rat // Int. J. Pharm. 2001. Vol. 216. № 1-2. P.105—114.

17. Жукова М.В., Кисель М.А., Кузьмицкий Б.Б. и др. Инкапсулирование док-сорубицина в липосомы, содержащие фосфатидилэтанол. Физико-химическая характеристика и противоопухолевая активность жидкокристаллических липо-сом //Химико-фармацевтический журнал, 2006, т. 40, № 1. С. 31—33.

18. Литвинко Н.М., Шумилина Т.А., Наубатова М.К., Ахрем А.А. Изучение устойчивости липосом как потенциальных переносчиков лекарственных веществ к действию фосфолипазы А2 // Прикладная биохимия и микробиология, 1993, т. 29, вып. 3. С. 478—484.

19. Ахрем А.А., Шумилина Т.А., Литвинко Н.М., Кисель М.А. Влияние организации субстратсодержащих структур на активность фосфолипазы А2 // Докл. АН БССР, 1988, т. ХХХП, № 8. С. 751—754.

20. Ахрем А.А., Шумилина Т.А., Литвинко Н.М и др. Изучение специфичности фосфолипазы А2 на субстратсодержащих структурах, имеющих разную надмолекулярную организацию // Биохимия, 1989, т. 54, № 4. С. 687—693.

21. Кисель М.А, Литвинко H.M., Наубатова М.К, Шадыро О.И. Гидролиз фосфо-липазой А2 облученных липидных мембран // Радиационная биология. Радиоэкология, 1995, т. 35, вып. 6. С. 873— 879.

22. Stubbs C.D., Williams B.W., Pryor C.L., Rubin E. Ethanol-Induced Modifications to Membrane Lipid Structure: Effect of phospholipase А2 — Membrane Interaction // Arch. Biochem. Biophys, 1988. VoL-262. P. 560— 573.

23. Кисель М.А., Кучуро С.В., Литвинко Н.М. Влияние этилового спирта и фос-фатидилэтанола на активность панкреатической фосфолипазы А2 // Биохимия, 2001, т. 66, вып. 2. С. 211—216.

24. Грегориадис Г. Липосомы как носители лекарств. Развитие и будущее концепции // Липосомы в биологических системах. М., 1983. С. 9—94.

25. Черний В.И., Ахламова Ю.И.. Килимниченко О.И., Шаталов О.Д. Липин в лечении критических состояний. Донецк, 1996.

26. Русанов С.Ю., Черданцева Г.А. Применение отечественного препарата Сурфактант-BL в комплексной терапии респираторного дистресс-синдрома у недоношенных новорожденных // Российский вестник перинатологии и педиатрии, 2002, № 3. С. 52—64.

27. Гуревич Г.Л., Кисель М.А., Скурко М.Е., Белясникова М.В. Авт. св. 1476655 Способ получения изониазида в липосомальной форме, 03.01.89.

28. Гуревич Г.Л., Кисель М.А., Жукова М.В. Оптимизация химиотерапии туберкулеза с помощью липосомальных противотуберкулезных препаратов. Тез. докл. 5 съезда фтизиатров Беларуси. Мн.,1989. С. 236—238.

29. Гуревич Г.Л., Суркова Л.К., Дюсьмикеева М.И. и др. Итоги доклинического испытания липосомального рифампицина // Актуальные проблемы фтизиатрии и пульманологии. Мн., 2003. С. 233 — 237.

30. Бабицкая С.В., Власов А.П., Долгопалец В.И. и др. Инкапсулирование доксо-рубицина в липосомы, содержащие фосфатидилэтанол. II. Физико-химическая характеристика и противоопухолевая активность «твердых» липосом //Химико-фармацевтический журнал, 2006, т. 40, № 2. С. 37—39.

31. Бабицкая С.В., Жукова М.В., Кисель М.А. и др. Инкапсулирование доксору-бицина в липосомы, содержащие фосфатидилэтанол. III. Влияние на токсичность и накопление антибиотика в миокарде // Хим.фарм. журнал, 2006, т. 40, № 3. С. 36—38.

32. Бушмакина И.М., Дроздова Н.И., Мартынова М.А. Получение липосомаль-ной формы гидрофобного антибиотика эритромицина // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Материалы Междунар. Научн. конф., 2006. Минск—Раков. С. 302—305.

33. Жерносек Е.В., Калиниченко Е.Н., Литвинко Н.М., Кучуро С.В., Рахуба Г.Н. Синтез конъюгатов фосфатидовой кислоты с модифицированными компонентами нуклеиновых кислот и их чувствительность к действию фосфолипазы А2 // XVIII Междунар. научно-технич. конф. «Химические реактивы, реагенты и процессы малотоннажной химии». Мн., 2005. С. 33.

34. Калиниченко Е.Н., Жерносек Е.В., Литвинко Н.М., Кучуро С.В., Рахуба Г.Н. Синтез 2',3'-дидезоксицитидин-5'-монофосфат-фосфатидилэтаноламина-фос-форами-дата и его взаимодействие с фосфолипазой А2 // III Междунар. конф. «Химия и биологическая активность азотсодержащих гетероциклов». Черноголовка (Московская область), 2006.

35. Литвинко Н.М., Кучуро С.В., Рахуба Г.Н., Калиниченко Е.Н., Жерносек Е.В. Лекарственные формы новых поколений и их устойчивость // VI Междунар. научн. конф. «Сахаровские чтения 2006 года: экологические проблемы XXI века». Мн., 2006.

36. Литвинко Н.М., Кучуро С.В., Рахуба Г.Н., Скоростецкая Л.А, Калиниченко Е.Н., Жерносек Е.В. Действие фосфолипаз А2 на химерные субстраты, созданные на основе фосфолипидов и компонентов нуклеиновых кислот // Доклады НАН Беларуси, 2005, т. 49, № 4. С. 70-73.

37. Литвинко Н.М., Кучуро С.В., Рахуба Г.Н., Калиниченко Е.Н., Жерносек Е.В. Влияние модификации этаноламинового фрагмента субстрата на активность панкреатической фосфолипазы А2 // Весц НАН Беларуси, сер. ш. навук, 2006, № 3. С. 79-82.

38. Заявка № а20060557 (2006.06.05) на выдачу патента РБ Литвинко Н.М., Калиниченко Е.Н., Жерносек Е.В., Кучуро С.В. «Липофильное производное уридинсодержащего компонента нуклеиновых кислот, способ его получения и фармацевтическая композиция на его основе, обладающая антифосфолипаз-ной активностью».

39. Заявка № а20060558 (2006.06.05) на выдачу патента РБ Литвинко Н.М., Калиниченко Е.Н., Жерносек Е.В., Кучуро С.В. «Конъюгаты фосфолипидов с модифицированными компонентами нуклеиновых кислот, способ их получения и фармацевтические композиции, обладающие антифосфолипазной активностью».

Summary

Problems of the preparation of new generation drug form (liposomes) were discussed. Some phospholipids were used for preparing of mono-or bicomponent liposomes, such as phospatidyl: — choline (PC), — ethanolamine (PE), — serine, — inositol, — glycerol (PG), — ethanol (PET), — methanol, — ethylenglycol, diphospatidylglycerol, sphingomyelin (SM). The liposome stability toward hydrolysis by enzyme -Phospholipase A (PLA2) was studied. The results indicated that most stable liposomes were: monocomponent ones on base of PE or PG; bicomponent ones on base of PC and PG (1:1) or PC and PET (3:2) or PC and SM (1:1).

The stability of synthesized chimeras conjugate of some nucleotides with PE toward PLA2 hydrolysis were investigated too. It was shown that hydrolysis rate of the conjugates were three times lower than of natural PE. It is very important to form non-sensitive to lipolysis of liposomal «containers» to deliver anticancer and anti-inflammatory nucleotides to sick organs and further introduction into a cellular membrane.