Разработка теоретических основ метода косвенного спектрофотометрического детектирования с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии

БИОМЕДИЦИНА • № 1 2008, с. 47-53

МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ

Разработка теоретических основ метода косвенного спектрофотометрического детектирования с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии

В.А.Злобин, Н.Н.Каркищенко, В.А.Павлов, А.А.Жиров, Г.В.Назаров

Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва

Разработка нового подхода к определению следовых количеств физиологически активных веществ (ФАВ), основой которого будет являться их косвенное детектирование, базирующееся на регистрации изменения структурного состояния среды. Данный подход позволит проводить детектирование ФАВ в тех концентрациях, в которых прямое детектирование анализируемых соединений невозможно из-за их малого содержания. Приводится теоретическое описание процессов.

Ключевые слова: модификатор, опиаты, химический потенциал, теоретическое описание.

За последние 10-15 лет в научной литературе появилось огромное количество сообщений о значительном биологическом эффекте разнообразных химических соединений, находящихся в живой клетке или в организме в концентрациях значительно ниже «обычной» — физиологической. Так, только в базе данных MEDLINE за 19942006 гг. можно найти более 1000 ссылок на публикации по этой теме. Наблюдаемые эффекты воздействий сверхмалых концентраций (СМК) физиологически активных веществ (ФАВ) часто лежат в интервале концентраций 10-6-10-19 М, и зачастую сравнимы (а иногда даже и превосходят) по величине эффекты тех же воздействий в «обычных», физиологических, дозах. Наличие такого биологического эффекта ФАВ обуславливает необходимость осуществления контроля их содержания. Однако прямое детектирование веществ в концентрациях примерно от 10-6 М и ниже обычно сопряжено со значительными трудностями, связанными с недостаточной чувствительностью существующих методов анализа.

Проблема снижения предела обнаружения ФАВ в различных матрицах, как правило, решается традиционными способами, такими, как использование специфичных высокочувствительных детектирующих систем, проведение предварительного концентрирования проб, либо путем химической модификации анализируемых соединений с целью последующего детектирования образующихся дериватов. Однако использование этих способов не всегда позволяет достичь требуемых пределов обнаружения ФАВ, в особенности содержащихся в СМК. В связи с этим, актуальны исследования, направленные на поиск и разработку новых подходов, которые позволяют обнаруживать ФАВ, содержащиеся в следовых количествах.

Результаты экспериментальных исследований с применением методов физикохимического анализа показывают, что разбавление ФАВ до предельных концентраций приводит к существенным изменениям физических свойств окружающего их раствора вследствие значительного измене-

ния структурного состояния водной среды. В связи с этим, для определения следовых количеств ФАВ наиболее перспективными могут быть методы анализа, чувствительные к изменениям структурного состояния исследуемой системы. Совокупность таких методов позволит разработать новый подход к определению следовых количеств ФАВ, основой которого будет являться их косвенное детектирование, базирующееся на регистрации изменения структурного состояния среды.

Такой подход позволит проводить детектирование ФАВ в тех концентрациях, в которых прямое детектирование анализируемых соединений невозможно из-за их малого содержания.

Обоснование наиболее перспективных методов определения следовых количеств наркотических анальгетиков проведено нами в работе [1]. Анализ свойств изучаемых соединений показал, что наиболее перспективными методами определения содержания их следовых количеств являются использование микромасштабной колоночной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с применением ее обращенно-фазового варианта и косвенного спектрофотометрического детектирования. При этом газохроматографическое определение препаратов этого ряда сопряжено с трудностями, связанными с деструкцией анализируемых соединений в системе ГХ и небольшой их летучестью.

Однако недостаточная изученность теоретических основ метода косвенного спектрофотометрического детектирования в видимой области спектра в настоящее время ограничивает его широкое применение.

Цель исследования: разработка теоретических основ метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с косвенным спектрофотометрическим детектированием.

Выводы. Результаты проведенных нами исследований [1] показывают, что в системе ВЭЖХ с косвенным спектрофотометри-

ческим детектированием наиболее вероятным механизмом сорбции является тот, в котором удерживание сорбата определяется его распределением между подвижной и жидкой стационарной фазами. При этом жидкую стационарную фазу, образованную граничным слоем, можно рассматривать как часть объемной фазы, но находящейся под воздействием поля поверхностных сил. В связи с этим модификатор подвижной фазы (ПФ) будет распределяться между подвижной и жидкой стационарной фазами изучаемой системы ВЭЖХ.

На основании вышеизложенного для системы ВЭЖХ с косвенным спектрофотометрическим детектированием в видимой области спектра нами предложена модель, представленная на рис. 1.

Рис. 1. Модель системы ВЭЖХ с косвенным спектрофотометрическим детектированием в видимой области спектра

В соответствии с положениями термодинамики неравновесных процессов, распределение вещества между соприкасающимися фазами зависит от величины химических потенциалов его молекул в этих фазах.

Известно, что химический потенциал компонента термодинамической системы в данной ее фазе определяется как частная производная (ЭС/Эи()Г;Л„^, где О — энергия Гиббса фазы, — число молей г-го компонента, Т — температура, р — давление, п — число молей всех остальных компонентов.

Ранее нами выявлена способность опиатов воздействовать на структуру граничного слоя раствора, находящегося у поверхности адсорбента. При изменении структуры фазы (к которой можно отнести граничный слой) будет изменяться и энергия

Гиббса этой фазы, что в свою очередь вызовет изменение химического потенциала модификатора ПФ, находящегося в граничном слое. Это и будет являться причиной появления сигнала в исследуемой нами системе.

Данный вывод основывается на том, что при введении сорбата в хроматографическую систему, в которой установлено динамическое равновесие красителя между подвижной и неподвижной фазами, изменяется структура граничного слоя неподвижной фазы и химический потенциал растворенного в нем красителя. Процесс установления равновесия вызовет изменение количества красителя находящегося в ПФ и, следовательно, появление детектируемого сигнала. При этом возможен перенос компонента против градиента концентраций, что не может быть объяснено механизмом сорбции, основанным на взаимодействии сорбат — адсорбент.

Перенос молекул модификатора из одной фазы в другую является процессом, протекающим во времени. В связи с этим с целью математического описания происходящих процессов необходимо решить задачу кинетики сорбции модификатора в изучаемой системе.

Согласно современным классическим представлениям [2, 3], подход к решению задачи кинетики адсорбции хроматографируемых соединений из растворов состоит в представлении адсорбции в виде последовательного двухстадийного процесса. Первая стадия заключается в диффузии (молекулярной или конвективной) из объема раствора к поверхностному слою, вторая — в переходе (в соответствии с ленгмюровс-кой кинетикой) в поверхностный слой, сопровождающимся накоплением вещества в слое. Процесс переноса сорбата из объема раствора в поверхностный слой, как правило, описывается реакцией первого порядка со всеми присущими ей характеристиками (константой прямой и обратной реакции, энергией активации и др.). Одна-

ко недостатком такого подхода является отсутствие критериев однозначного выбора кинетического уравнения адсорбции. Единственным критерием правильности полученного кинетического уравнения является его превращение в условиях равновесия в уравнение изотермы адсорбции. При описании одного и того же процесса различными кинетическими вариантами изотермы адсорбции будут различны и значения входящих в эти уравнения характеристик. Это значительно снижает практическую ценность результатов экспериментальных исследований, так как затрудняет изучение механизма происходящих в системе процессов.

B связи с этим для решения задачи кинетики сорбции модификатора из растворов ПФ в методе косвенного спектрофотометрического детектирования нами предлагается использовать диффузионный подход без применения кинетических уравнений. При этом кинетические характеристики будут выражены коэффициентом диффузии модификатора вместо коэффициентов скорости адсорбции и десорбции в случае применения кинетических уравнений.

Исходя из предложенной выше модели системы BЭЖХ, распределение модификатора в хроматографической системе будет происходить между объемом раствора и граничным слоем.

Как известно, «движущей силой» диффузии является разность химических потенциалов. Исходя из этого, сорбцию модификатора можно рассматривать как процесс выравнивания его химического потенциала в объеме раствора и в граничном слое при его различных начальных значениях.

B условиях сорбционного равновесия химический потенциал модификатора ПФ в любой точке раствора, включая и граничный слой, будет равен

ц

где |j,(x) и y°(x) — химический потенциал модификатора ПФ в точке с координатой x

соответственно в данном (с активностью а(х)) и стандартном (с активностью 1) состояниях.

Используя уравнение (1) для двухслойной модели раствора, сравним граничный слой (0 < х < к, а(х) = а0, л0(х) = (и10) с объемом раствора (к < х < ц, а(х) = а , л 0(х) = = л20), где к — толщина граничного слоя. Исходя из того, что в условиях равновесия значения химического потенциала модификатора ПФ во всех частях раствора одинаковы, получаем

ц5-

Яоо 72(0 4 7

где 71(с0) и 72(с^) — коэффициент активности модификатора ПФ в граничном слое при концентрации с0 и в объеме раствора при концентрации см соответственно.

Представим уравнение (2) в виде

42

где K = cq/cm — константа распределения.

При введении в систему BЭЖХ анализируемой смеси в условиях динамического хроматографирования активность (концентрация) модификатора ПФ будет отличаться от равновесной. Следовательно, и химический потенциал модификатора ПФ в этих условиях будет зависеть не только от координаты, но и от времени

j

Используем уравнение (4) для областей раствора, расположенных на расстоянии х(а(х,0 = а^О, jQ(x) = j1q, J(x,t) = J1(x,t)) и бесконечно удаленных (а(х,0 = ам, jQ(x) =j2q, j(x,t) = j(yL,t)) от поверхности адсорбента, и вычитая одно уравнение из другого, получаем

ax(x,t) ' >

Из уравнений (5) и (3) для неравновесного граничного слоя следует

М-2

ci

модификатора ПФ в граничном слое при его концентрации сх(х,1). В случае идеального граничного слоя из уравнения (6) получим

М^О*5^) _ Ці(*>0 = + Ьі-

С1Ш)

Таким образом, концентрация модификатора ПФ в объеме раствора в любой момент времени может быть выражена через разность динамических химических потенциалов в граничном слое и в объеме раствора.

Согласно термодинамике необратимых процессов градиент химических потенциалов создает поток молекул (в нашем случае модификатора), величину которого можно вычислить из уравнения

/ = -яУц

где / — поток молекул модификатора; а -коэффициент массопроводности.

Найдем баланс числа молекул модификатора, входящих и выходящих из произвольного объема Vв единицу времени. Число молекул, входящих в объем в единицу времени, можно вычислить с использованием уравнения (9):

где интеграл берется по поверхности, окружающей объем V Знак минус означает, что поток направлен внутрь объема.

При этом изменение числа молекул в

объеме V равно Приравнивая

изменение числа молекул в объеме к числу молекул, в него приходящих, имеем

г M?Adv=ijds 1 dt J

Преобразовывая интеграл правой части уравнения (10) с использованием теоремы Остроградского-Гаусса [4], получим

(<teMdv=_(divJdv J dt 1

где у,(сЛх^)) — коэффициент активности Bвиду произвольности объема, выраже-

ние

dt

= —divJ

или

dt

ответствующих значениях коэффициентов D и а:

Щ?1=<иА<яАхЛ

at

Пренебрегая зависимостью коэффициента массопроводности от химического потенциала и считая а = const, можно записать

divaV ju

Учитывая, что div4n(x,t)= [3],

Эх

получим

divaV ju

dc(x, t) _ dfi(x, t) Эс

d t

dju2

= D,

dx2 d2jU2

, h(x(+о

0

dt * dx2

Mx,0) = ц0; ц2

a dfi2

dx

dx

Ai

dnx

^, и dt d/il

Как известно [6]

Ъ^1

ОС — = О, где Б— коэффициент диффузии. ОС

На основании этого уравнение (15) можно преобразовать к виду

Ъ[м{х, {) _ д ц{х, ?)

Э/ дх2

Соотношение (16) по форме аналогично второму закону Фика, описывающему процесс массопереноса во времени. Исследуя с помощью полученного уравнения процесс изменения (выравнивания) химического потенциала модификатора в хроматографической системе, можно по уравнению (7) определить концентрацию модификатора в граничном слое и, следовательно, величину динамической сорбции Г: Й

Г ^[сДх,/)-с„\

о

Как известно, явления массопереноса описываются уравнениями параболического типа [5]. Поставим краевую задачу о выравнивании химического потенциала в объеме раствора и граничном слое при со-

= 0

Эх дх

Условие (19) соответствует изменению химического потенциала на величину 1п К при х = к в начальный момент времени. Граничное условие (20) характеризует равенство потоков модификатора с обеих сторон границы раздела фаз при х = к. Условие (22) характеризует отсутствие потока в соприкасающуюся фазу и неизменность химического потенциала модификатора в растворе на значительном удалении от поверхности.

Краевая задача о выравнивании химического потенциала в объеме раствора и граничном слое (18)-(22) аналогична задаче о нагревании пластины, приведенной в соприкосновение с полубесконечным телом, рассмотренной в работе. Решением этой задачи в случае граничного слоя будет уравнение (23):

1

-ХГ-хГх

Е п=1

(2п-\)-х/ (2п-\) + х

erf с------------------,_ + erf с -

,

где

КЕ=

Ка

4^

-А.. =-1~к*

1+ К,

Dj

h2

Fox = -jj- — число Фурье для граничного

слоя; n — номер члена ряда.

Используем значение | (x, t) для определения динамической адсорбции Г. Учитывая, что ад||/дс = D и д|/дс = 1/с, получим, что а(. = Dt • ct . Следовательно, в условиях равновесия для граничного слоя а1 = = Dj • Cj и объема раствора а2 = D2 • см. Используя полученные соотношения, выполним преобразования:

Ka=-=I^SL=I^-K = KDK (24) а2 D2  с_ D2

\ D V D

Значение коэффициента K при этом может изменяться от 1 (в начальный момент, когда в системе при отсутствии анализируемой пробы установлено динамическое равновесие модификатора) до равновесного значения при наличии в системе анализируемого соединения.

Принимая, что jQ = Q, из уравнений (7) и (22) получаем

e1

Учитывая, что

Го =

из уравнений (17) и (26) следует

где Г0 — равновесная сорбция; 0 — относительная степень заполнения граничного слоя сорбента молекулами модификатора.

С учетом уравнений (23) и (25) преобразуем уравнение (28) к виду:

0 =

1— Г

-ПА J

(K-l)h

К

1____£(-?)"“' erfc(ln l)*/h

1+kJXd „=і [ 2-Щ

Полученное уравнение позволит описывать сорбцию модификатора ПФ в исследуемой хроматографической системе.

При этом кинетической характеристикой модификатора ПФ является его коэффициент диффузии в граничном слое (поперек слоя) Dj. Используя полученные соотношения, по экспериментальным значениям параметров сорбции можно рассчитать значения величин Dx и h, характеризующих структурные и пространственные свойства граничного слоя.

Для оценки влияния опиатов на процессы, происходящие вблизи границы раздела фаз, была разработана компьютерная программа NB (turbo Pascal 6.0), реализующая расчет сорбционных кривых по уравнению (29). При этом по экспериментальным значениям параметров сорбции с использованием уравнения (27) рассчитывалась толщина граничного слоя, затем с использованием метода наименьших квадратов вычислялась величина коэффициента диффузии молекул красителя в этом слое так, чтобы сумма квадратов расчетной и экспериментальной зависимости 0 была минимальной.

Результаты вычислений для пика соответствующего времени удерживания фен-танила, представлены на рис. 2.

Из данных, представленных на рис. 2, видно, что для пика со временем удерживания, соответствующего по времени удерживания фентанилу, с увеличением содержания анализируемого соединения, коэффициент диффузии в граничном слое и его толщина уменьшаются. Известно, что коэффициент диффузии молекул в жидкости обратно пропорционален вязкости этой жидкости. Из этого следует, что происходящие с увеличением содержания фентанила

, (2л-1)+х/й1 +erfc-----'---' \

-1

Уравнение

изменения, наблюдае-^ мые на рис. 2, связаны с уменьшением толщины граничного слоя и ростом его вязкости.

Диффузия ♦ Толщина граничного слоя

о

Iі

£

&

Iі

I-

0 1 S

*

/4000 Ю0

-"l 91 0 10 ^E-14

7,9 14 £-15 5E-15

Is

:fй ¥-17 1E-17

-18

5E-19

10000

1000

100

10 s ,о

4? ^ ^ ^ ^ ^

Концентрация фентанила, моль/л

Рис. 2. Изменение толщины граничного слоя и коэффициента диффузии в этом слое для молекул красителя в зависимости от содержания фентанила

Аналогичный эффект проявляется, в частности, в граничном плавлении льда. Этот известный эффект можно наблюдать в строго цилиндрических тонких капиллярах с молекулярно гладкой поверхностью. При приближении температуры к точке плавления столбики льда становятся легкоподвижными в связи с образованием у поверхности лед-кварц незамерзающей водной прослойки, обладающей свойствами вязкой ньютоновской жидкости. При понижении температуры скорость сдвига столбиков льда падает в связи с уменьшением толщины незамерзающих прослоек и ростом их вязкости, что является свидетельством усиления структурных эффектов.

Таким образом, наблюдаемые с увеличением содержания фентанила в хроматографической системе явления происходят вследствие усиления вблизи границы раздела фаз структурных эффектов, аналогичных тем, которые могут наблюдаться в водных системах вблизи границы раздела фаз при понижении температуры.

Литература

1. Злобин В.А., Букреева Л.П., Кузнецов П.Е. и др. Использование ВЭЖХ в анализе опиатов с применением косвенного спектрофо-

тометрического детектирования // Химикофармацевтический журнал, 2000, т.34, № 5, с. 55-56.

2. Сакодынский К.И., Бражников В.В., Волков С.А. и др. Аналитическая хроматография. — М.: Химия, 1993.

3. Киселев А.В., Пошкус Д.П., Яшин Я.И. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии. — М.: Химия, 1986.

4. Арфкен Г. Математические методы в физике. — М.: Атомиздат, 1970.

5. Будак Б.М., Самарский А.А., Тихонов А.Н. Сборник задач по математической физике. — М. : Наука, 1972.

6. Левин В.Г. Физико-химическая гидродинамика. — М.: Физматгиз, 1959.

THEORETICAL BASIS FOR A METHOD OF INDIRECT SPECTRUM PHOTOMETRIC DETECTION USING HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY

V.A. Zlobin, N.N. Karkischenko, V.A. Pavlov, A.A. Zhirov, G.V. Nazarov

Research Centre for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow

We introduce a new theoretical basis for detection of physiologically active matters (PAM) in the trace quantities by indirect detection of changes in environmental structure. This method allows detecting PAM in very small concentrations which are not detectable by any other methods.

Key words: modifier, opiates, chemical potential, theoretical description.