АНТИТЕЛО ПРОТИВ В7-Н3, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ИХ МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
ANTIBODY AGAINST B7-H3, ITS ANTIGEN-BINDING FRAGMENT AND THEIR MEDICAL USE

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к антителу против В7-Н3 или его антигенсвязывающему фрагменту, настоящее изобретение дополнительно относится к человеческому антителу, содержащему область CDR (от англ. complementary determining region - область, определяющая комплементарность) антитела против В7-Н3, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент, и ее применению в качестве диагностического реагента и терапевтического средства от заболеваний, связанных с В7-Н3.
Предшествующий уровень техники
Т-клеточный иммунный ответ играет чрезвычайно важную роль в противоопухолевом процессе организма, однако активация и пролиферация Т-клеток требует не только сигнала антигена, распознаваемого TCR (от англ. T-cell receptor - Т-клеточный рецептор), но также и второго сигнала, обеспечиваемого костимуляторными молекулами. Молекулы семейства В7 принадлежат к костимуляторной молекуле суперсемейства иммуноглобулинов. Все больше и больше исследований показало, что молекулы данного семейства играют важную регуляторную роль в нормальной иммунной функции и патологическом состоянии в организме.
В7-Н3 представляет собой член семейства В7 и принадлежит к трансмембранному белку типа I, который содержит сигнальный пептид на N-конце, внеклеточную иммуноглобулин-подобную вариабельную область (IgV) и константную область (IgC), трансмембранную область и цитоплазматическую хвостовую область, имеющую 45 аминокислот (Tissue Antigens. 2007 Aug; 70(2): 96-104). В настоящее время В7-Н3 главным образом включает два типа вариантов сплайсинга, В7-Н3а и В7-H3b. Внеклеточный домен В7-Н3а состоит из двух доменов иммуноглобулина IgV-IgC (также известен как 2IgB7-H3), в то время как внеклеточный домен В7-H3b состоит из четырех доменов иммуноглобулина IgV-IgC-IgV-IgC (также известен как 4IgB7-H3).
Белок В7-Н3 не экспрессируется или слабо экспрессируется в нормальных тканях и клетках, но на высоком уровне экспрессируется в разных опухолевых тканях и тесно связан с прогрессированием опухоли, выживаемостью пациента и прогнозом. Клинически сообщалось о том, что В7-Н3 сверхэкспрессируется при многих типах рака, в особенности при немелкоклеточном раке легкого, раке почки, эпителиальном раке мочевыводящих путей, коло ректальном раке, раке предстательной железы, мультиформной глиобластоме, раке яичника и раке поджелудочной железы (Lung Cancer. 2009 Nov; 66(2): 245-249; Clin Cancer Res. 2008 Aug 15; 14(16): 5150-5157). Кроме того, также в литературе сообщалось о том, что при раке предстательной железы уровень экспрессии В7-Н3 положительно коррелирует с клинической патологической малигнизацией (как, например, объемом опухоли, экстрапростатической инвазией или шкалой Глисона), и также ассоциирован с прогрессированием рака (Cancer Res. 2007 Aug 15; 67(16):7893-7900). Аналогично, при мультиформной глиобластоме экспрессия В7-Н3 обратно ассоциирована с бессобытийной выживаемостью, и при раке поджелудочной железы экспрессия В7-Н3 ассоциирована с метастазом лимфатических узлов и патологическим прогрессированием. Таким образом, В7-Н3 считается новым маркером опухоли и потенциальной терапевтической мишенью.
131
В настоящее время существуют терапевтические стратегии, специфичные в отношении мишени В7-Н3, для доклинических исследований, например, антитела, нацеленные на мышиный В7-Н3, будут увеличивать уровень инфильтративных CD8-позитивных Т-клеток в опухоли и ингибировать опухолевый рост (Mod Pathol. 2010 Aug; 23(8): 1104-1112). Кроме того, в патенте WO 2008/066691 показано, что антитела, распознающие вариант В7-Н3 В7-Н3а, демонстрировали in vivo противоопухолевое действие на аденокарциному. В клинических исследованиях ADC (от англ. Antibody-Drug Conjugate - конъюгат антитело-лекарственное средство) антитела против В7-Н3 мыши, конъюгированного с радиоактивным I, значимо ингибировал рост нейробластомы у пациентов (J Neufooocol 97(3):409-18 (2010)). Однако, антитела против В7Н3, исследуемые в настоящее время, представляют собой гуманизированные антитела, которые были сконструированы посредством гуманизации мышиных антител. Однако гуманизированные антитела при иммунизации обладают более высокой иммуногенностью, чем полностью человеческие антитела, которые не содержат никаких мышиных компонентов антитела. Это является неблагоприятным фактором в применении для человека.
Технология фагового дисплея относится к слиянию экзогенного белка или полипептида с фаговым белком оболочки, таким образом, чтобы экзогенный белок экспрессировался на поверхности фага. Библиотека фаговых антител представляет собой библиотеку антител, сконструированную посредством объединения технологии фагового дисплея, технологии ПЦР-амплификации и технологии экспрессии белков.
Наибольшее преимущество библиотеки фаговых антител заключается в получении полностью человеческого антитела посредством имитации трех процессов продукции антител in vivo без иммунизации in vivo. Кроме того, библиотека фаговых антител имеет следующие преимущества: 1) достигается унификация генотипа и фенотипа; кроме того, экспериментальный способ является простым и быстрым, тогда как традиционный способ получения антител посредством гибридомной технологии занимает несколько месяцев; а для сравнения, технология на основе библиотеки антител занимает только несколько недель. 2) Экспрессируемый продукт является полностью человеческим антителом, и его молекулярная масса является небольшой, антитело главным образом экспрессируется в виде активных фрагментов Fab (antigen-binding fragment -антигенсвязывающий фрагмент) и scFv (single-chain variable fragment - одноцепочечный вариабельный фрагмент); при сравнении с полным антителом, он имеет очевидные преимущества, заключающиеся в проницаемости ткани. 3) Способность осуществления скрининга велика: гибридомную технологию используют для осуществления скрининга среди тысяч клонов, а технологию на основе библиотеки антител можно использовать для осуществления селекции из миллионов или даже сотен миллионов молекул; таким образом, будет получено больше типов антител. 4) Широкое применение: использование прокариотической экспрессионной системы приводит к более очевидному преимуществу в крупномасштабном производстве (Curr Opin Biotechnol. 2002 Dec; 13(6):598-602; Immunotechnology, 2013, 48(13) 48(13): 63-73).
В настоящее время, в патентах, таких как WO 2008100934, WO 2010096734, WO 2012147713, WO 2015181267, WO 2016044383 и т.д., сообщается об антителах против В7-Н3, однако, большинство из них представляют собой мышиные антитела или гуманизированные антитела; и большинство из них все еще находятся на I фазе клинического исследования и фазе выявления, или внутри страны, или за рубежом, ни одного лекарственного средства на основе антител против В7-Н3 нет в продаже; таким образом, существует необходимость в дальнейшей разработке полностью человеческого антитела против В7-Н3 с более высокой активностью, высокой аффинностью и высокой стабильностью для лечения родственных заболеваний и применения.
Краткое изложение сущности изобретения
Одна цель настоящего изобретения заключается в предложении моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, которые связываются с аминокислотной(ыми) последовательностью(ями) или трехмерной структурой внеклеточной области В7-Н3. Кроме того, еще одна цель настоящего изобретения заключается в скрининге и получении высокоактивных и высокостабильных полностью человеческих антител против человеческого В7-Н3, которые конкурируют с моноклональным антителом или его фрагментами.
Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены ДНК, кодирующая антитело, вектор, содержащий данную ДНК, трансформант, полученный посредством трансформации данным вектором, способ получения антитела или его фрагмента с использованием данного трансформанта, и диагностический реагент или терапевтическое средство, в котором указанное антитело или его фрагмент служит в качестве активного вещества.
В одном аспекте согласно настоящему изобретению предложено антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с человеческим В7-Н3, где антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент выбраны из любого моноклонального антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из следующего (i)-(ii):
(i) моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие одну или более последовательностей области CDR, выбранных из следующих последовательностей или выбранных из аминокислотных последовательностей с по меньшей мере 95%-ой идентичностью со следующими последовательностями:
последовательности HCDR вариабельной области тяжелой цепи антитела, как показано в SEQ ID NO: 10, 11 и 12; и аминокислотные последовательности LCDR вариабельной области легкой цепи антитела, как показано в SEQ ID NO: 13, 14 и 15;
(ii) моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие одну или более последовательностей области CDR, выбранных из следующих последовательностей или выбранных из аминокислотных последовательностей с по меньшей мере 95%-ой идентичностью со следующими последовательностями:
последовательности HCDR вариабельной области тяжелой цепи антитела, как показано в SEQ ID NO: 16, 17 и 18; и последовательности LCDR вариабельной области легкой цепи антитела, как показано в SEQ ID NO: 19, 20 и 21.
В предпочтительном воплощении предложено антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где моноклональное антитело представляет собой рекомбинантное антитело.
В предпочтительном воплощении предложено антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где моноклональное антитело представляет собой человеческое рекомбинантное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.
В предпочтительном воплощении предложено антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где последовательности каркасных областей (от англ. framework region - каркасная область) вариабельных областей легкой цепи и тяжелой цепи человеческого рекомбинантного антитела происходят из легкой цепи и тяжелой цепи зародышевой линии человека, соответственно, или их мутантной последовательности.
В предпочтительном воплощении предложено антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где человеческое рекомбинантное антитело содержит вариабельную область тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 6 или 8, или ее вариант; где вариант имеет от 1 до 10 аминокислотных замен в последовательности вариабельной области тяжелой цепи, как показано в SEQ ID NO: 6 или 8.
В предпочтительном воплощении предложено антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где человеческое рекомбинантное антитело содержит вариабельную область легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 7 или 9, или ее вариант; где вариант имеет от 1 до 10 аминокислотных замен в последовательности вариабельной области легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 7 или 9.
В предпочтительном воплощении предложено антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где антитело против В7-Н3 дополнительно содержит константную область антитела человека, предпочтительно антитело против В7-Н3 представляет собой полноразмерное антитело, состоящее из последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 22 и 23, соответственно; или полноразмерное антитело, состоящее из последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 22 и 26, соответственно; или полноразмерное антитело, состоящее из последовательности тяжелой цепи и легкой цепи, как показано в SEQ ID NO: 24 и 25, соответственно.
В предпочтительном воплощении предложено антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящему изобретению, где антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечного антитела (scFv), димеризованной V-области (диатело), дисульфид-стабилизированной V-области (dsFv - от англ. disulfide-stabilized Fv -дисульфид-стабилизированный фрагмент) и CDR-содержащего пептида.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложено выделенное антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент, отличающиеся тем, что они конкурируют с антителом против В7-Н3 или его антигенсвязывающим фрагментом, как описано выше, за связывание с человеческим В7-Н3.
Согласно настоящему изобретению также предложена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество антитела против В7-Н3 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ.
Согласно настоящему изобретению также предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем изобретении.
Согласно настоящему изобретению также предложен рекомбинантный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, как описано выше.
Согласно настоящему изобретению также предложена клетка-хозяин, трансформированная рекомбинантным вектором, как описано выше, причем клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из прокариотической клетки и эукариотической клетки, предпочтительно эукариотической клетки, более предпочтительно клетки млекопитающего или дрожжевой клетки.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению, где способ включает культивирование клетки-хозяина, как описано выше, в культуре с образованием и накоплением антитела против В7-Н3 или его антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящему изобретению и выделения накопленного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ выявления или измерения иммунологическим образом В7-Н3, где способ включает использование антитела против В7-Н3 или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано в настоящем изобретении.
Согласно настоящему изобретению также предложен реагент для выявления или измерения человеческого В7-Н3, где реагент содержит антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем изобретении.
Согласно настоящему изобретению также предложен диагностический реагент для выявления заболеваний, ассоциированных с В7-Н3 позитивными клетками, при этом диагностический реагент содержит антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем изобретении.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ диагностирования заболеваний, связанных с В7-Н3 позитивными клетками, который включает выявление или определение уровня В7-Н3 или В7-Н3 позитивных клеток посредством использования антитела против В7-Н3 или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано в настоящем изобретении.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению также предложено применение антитела против В7-Н3 или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано в настоящем изобретении, для получения диагностического реагента для заболеваний, связанных с В7-Н3 позитивными клетками.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению дополнительно предложено терапевтическое средство для лечения заболеваний, ассоциированных с В7-Н3 позитивными клетками, при этом терапевтическое средство содержит антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем изобретении, или содержит фармацевтическую композицию, как описано выше, или молекулу нуклеиновой кислоты, как описано выше.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ лечения заболеваний, связанных с В7-Н3 позитивными клетками, который включает индукцию клеточной гибели В7-Н3 позитивных клеток посредством использования антитела против В7-Н3 или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано в настоящем изобретении, или фармацевтической композиции, как описано выше, или молекулы нуклеиновой кислоты, как описано выше.
В другом аспекте согласно настоящему изобретению также предложено применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, или фармацевтической композиции или молекулы нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем изобретении, в получении терапевтических средств для лечения заболеваний, связанных с В7-Н3 позитивными клетками.
Краткое описание графических материалов
Фиг. 1. Способность связывания разных антител с человеческим антигеном 2Ig-B7-H3.
Фиг. 2. Способность связывания разных антител с человеческим антигеном 4Ig-B7-H3.
Фиг. 3. Способность разных антител к перекрестному связыванию с мышиным антигеном В7-Н3.
Фиг. 4. Способность связывания разных антител с клетками U87MG.
Фиг. 5. Эффект эндоцитоза разных антител на клетках U87MG.
Подробное описание изобретения
1. Термины
Для более легкого понимания настоящего изобретения некоторые технические и научные термины конкретно определены ниже. Если где-либо в данном документе конкретно не указано иное, все другие технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно подразумеваемое одним из рядовых специалистов в данной области, к которой принадлежит данное изобретение.
В контексте данного документа трехбуквенный код и однобуквенный код для аминокислот представляет собой такой, как описано в J. Biol. Chem, 243, р3558 (1968).
В контексте данного документа термин «антитело» относится к относится к иммуноглобулину, структуре четырех пептидных цепей, соединенных вместе дисульфидными связями между двумя идентичными тяжелыми цепями и двумя идентичными легкими цепями. Разные константные области тяжелой цепи иммуноглобулина демонстрируют разные аминокислотные составы и порядки ранжирования, следовательно, представляют разные виды антигенности. Соответственно, иммуноглобулины могут быть подразделены на пять категорий или так называемых изотипов иммуноглобулинов, а именно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, с тяжелой цепью μ, δ, γ, α и ε, соответственно. В соответствии со своим аминокислотным составом шарнирной области и числом и локализацией дисульфидных связей тяжелой цепи, один и тот же тип Ig может быть подразделен на разные подкатегории, например, IgG может быть подразделен на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкие цепи можно подразделить на κ или λ, с учетом разных константных областей. Каждый Ig из данных пяти типов имеет цепь κ или λ.
В настоящем изобретении легкая цепь антитела, как описано в данном документе, дополнительно содержит константную область легкой цепи, где константная область легкой цепи содержит цепь κ, λ человека или мыши, или ее вариант.
В настоящем изобретении тяжелая цепь антитела, как описано в данном документе, дополнительно содержит константную область тяжелой цепи, где константная область тяжелой цепи содержит IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека или мыши, или ее вариант.
V
Последовательность из примерно 110 аминокислот рядом с N-концом тяжелой и легкой цепей антитела, сильно меняется, известная как вариабельная область (область F); остальная последовательность аминокислот рядом с С-концом является относительно стабильной, известная как константная область. Вариабельная область содержит три гипервариабельные области (HVR - от англ. hypervariable region) и четыре каркасные области (FR - от англ. framework region), имеющие относительно консервативную последовательность. Три гипервариабельные области определяют специфичность антитела, также известные как область, определяющая комплементарность (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (LCVR - от англ. light chain variable region) и каждая вариабельная область тяжелой цепи (HCVR - от англ. heavy chain variable region) состоит из трех областей CDR и четырех областей FR, причем последовательный порядок от N-конца до С-конца является следующим: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три CDR легкой цепи относятся к LCDR1, LCDR2 и LCDR3; три CDR тяжелой цепи относятся к HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Число и положение аминокислотных остатков CDR в областях LCVR и HCVR антитела или антигенсвязывающего фрагмента в данном документе соответствуют известным критериям нумерации Kabat (LCDR1-3, HCDE2-3) или соответствуют критериям нумерации Kabat и Chothia (HCDR1).
Термины «человеческое антитело» и «антитело человеческого происхождения» используются взаимозаменяемо и относятся к антителу, которое содержит одну или более вариабельных и константных областей, которые происходят из последовательности человеческого иммуноглобулина. Один из предпочтительных путей является таким, когда все вариабельные и константные области происходят из последовательностей человеческого иммуноглобулина, то есть «антитело полностью человеческого происхождения» или «полностью человеческое антитело». Данные антитела могут быть получены различными путями, включая антитела, полученные посредством использования технологии фагового дисплея, которая включает выделение В-клеток из человеческих РВМС (от англ. peripheral blood mononuclear cells - мононуклеарные клетки периферической крови), селезенки, ткани лимфатического узла, и конструирование библиотеки фаговых природных одноцепочечных человеческих антител, или посредством иммунизации трансгенных мышей, экспрессирующих легкую и тяжелую цепь человеческого антитела, и осуществления скрининга.
Термин «мышиное антитело», используемое в настоящем изобретении, относится к моноклональному антителу против человеческого В7-Н3, полученному в соответствии со знанием и умениями в данной области. Во время получения тестируемому субъекту инъецируют антиген В7-Н3, и затем отделяют гибридому, экспрессирующую антитела, имеющие желаемую последовательность или функциональные свойства. В предпочтительном воплощении изобретения мышиное антитело против В7-Н3 или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно сдержит константную область легкой цепи мышиной цепи каппа, лямбда или ее вариант, или дополнительно содержит константную область тяжелой цепи мышиного IgG1, IgG2, IgG3 или ее вариант.
Термин «химерное антитело» представляет собой антитело, которое образовано слиянием вариабельной области мышиного антитела с константной областью человеческого антитела таким образом, чтобы облегчить иммунный ответ, вызываемый мышиным антителом. Для создания химерного антитела создают гибридому, секретирующую специфичное мышиное моноклональное антитело, и ген вариабельной области клонируют из клеток гибридомы мыши, и затем желаемый ген константной области человеческого антитела клонируют и соединяют с генами вариабельной области мыши с образованием химерного гена, который может быть впоследствии вставлен в экспрессионный вектор, и, наконец, молекула химерного антитела экспрессируется в эукариотической или прокариотической системе. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения легкая цепь химерного антитела против В7-Н3 дополнительно содержит константную область легкой цепи, происходящую из цепи каппа, лямбда человека, или ее вариант. Тяжелая цепь химерного антитела против В7-Н3 дополнительно содержит константную область тяжелой цепи, происходящую из человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или ее вариант, и предпочтительно содержит константную область тяжелой цепи, происходящую из человеческого IgG1, IgG2 или IgG4, или вариант IgG1, IgG2 или IgG4 с аминокислотной мутацией (как, например, мутация YTE или обратная мутация).
Термин «гуманизированное антитело», также известное как антитело с привитыми CDR, относится к антителу, созданному посредством прививания мышиных последовательностей CDR в каркас вариабельной области человеческого антитела (то есть антитела, образованные из разных типов последовательностей каркаса антитела зародышевой линии человека). Гуманизированное антитело преодолевает гетерологичный ответ, вызываемый химерным антителом, которое несет большое количество мышиных белковых компонентов. Такие последовательности каркаса могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК, включающих последовательности генов антител зародышевой линии, или из опубликованных референсных последовательностей. Например, ДНК-последовательности зародышевой линии генов вариабельной области тяжелой и легкой цепи человека могут быть найдены, например, в базе данных последовательностей зародышевой линии человека «VBase» (доступна в интернете на веб-сайте www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), а также могут быть найдены в Kabat, ЕА, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.
Прививание CDR может снижать аффинность антитела против В7-Н3 или его антигенсвязывающего фрагмента к антигену из-за остатков каркаса, которые находятся в контакте с антигеном. Такое взаимодействие может быть результатом гипермутации в соматических клетках. Таким образом, все еще может быть необходимым вставлять такие донорные аминокислоты каркаса в каркас гуманизированных антител. Аминокислотные остатки из антитела против В7-Н3, не являющегося человеческим, или его антигенсвязывающего фрагмента, которые участвуют в связывании антигена, можно идентифицировать посредством исследования последовательностей и структур вариабельной области мышиного моноклонального антитела. Каждый остаток в донорном каркасе CDR, который отличается от зародышевой линии, можно считать релевантным. Если наиболее тесно связанную зародышевую линию нельзя определить, последовательность можно сравнивать с общей последовательностью подтипа или мышиной последовательностью с высоким процентом сходства. Полагают, что редкие остатки каркаса являются результатом соматической гипермутации и, таким образом, играют важную роль в связывании.
2
Термин «антигенсвязывающий фрагмент» или «функциональный фрагмент» антитела относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфично связываться с антигеном (например, В7-Н3). Показано, что фрагменты полноразмерных антител могут быть использованы для функции антител, заключающейся в связывании антигена. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела, включают: (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из домена VL, VH, CL и СН1; (ii) F(ab')-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидными связями в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из домена VH и СН1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из домена VH и VL одного плеча антитела; (v) один домен или dAb фрагмент (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), состоящий из домена VH; и (vi) отдельную область, определяющую комплементарность (CDR); или (vii) возможно комбинацию двух или более отдельных CDR, возможно связанных синтетическим линкером. Кроме того, несмотря на то, что домен VL и домен VH Fv-фрагмента кодируются отдельными генами, они могут быть соединены посредством синтетического линкера с использованием метода генной инженерии таким образом, чтобы они могли образовывать одну белковую цепь с образованием одновалентной молекулы посредством расположения парой домена VL и VH (называемой одноцепочечным Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Также подразумевается, что такие одноцепочечные антитела охвачены термином «антигенсвязывающий фрагмент» антитела. Такие фрагменты антитела получают, используя традиционные методики, известные в данной области, и осуществление функционального скрининга фрагментов используют таким же образом, как и в случае интактных антител. Антигенсвязывающие сайты можно получать посредством методик генной инженерии или посредством ферментативного или химического расщепления интактного иммуноглобулина. Антитела могут представлять собой антитела разных фенотипов, например, антитело IgG (например, подтип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.
2
Антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению включают Fab, F(ab'), Fab', одноцепочечное антитело (scFv), димеризованную V-область (диатело), дисульфид-стабилизированную V-область (dsFv), CDR-содержащий пептид и т.д.
Fab представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу примерно 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью, такой фрагмент получают посредством обработки молекулы антитела IgG протеазой папаин (отщепляющей аминокислотный остаток в положении 224 цепи Н), где примерено половина N-концевой стороны цепи Н и полная L цепь связаны дисульфидной связью.
Fab по настоящему изобретению может быть получен посредством обработки моноклональных антител по настоящему изобретению, которые специфично распознают человеческий В7-Н3 и связываются с аминокислотной последовательностью или трехмерной структурой его внеклеточной области, папаином. Кроме того, Fab может быть получен в результате включения ДНК, кодирующей Fab антитела, в прокариотический экспрессионный вектор или эукариотический экспрессионный вектор, и введения вектора в прокариота или эукариота для экспрессии Fab.
2
F(ab') представляет собой фрагмент антитела, полученный в результате расщепления нижней части двух дисульфидных связей в шарнирной области IgG пепсином. Он имеет молекулярную массу примерно 100000 и обладает антигенсвязывающей активностью, и содержит две Fab-области, связанные в положении шарнира.
2
2
F(ab') по настоящему изобретению может быть получен посредством обработки моноклонального антитела по настоящему изобретению, которое специфично распознает человеческий В7-Н3 и связывается с аминокислотной последовательностью или трехмерной структурой его внеклеточной области, пепсином. Кроме того, F(ab') можно получать посредством связывания Fab', описанного ниже, тиоэфирной связью или дисульфидной связью.
2
2
Fab' представляет собой фрагмент антитела, имеющий молекулярную массу примерно 50000 и обладающий антигенсвязывающей активностью. Его получают в результате расщепления дисульфидной связи в шарнирной области F(ab'), упомянутого выше. Fab' по настоящему изобретению можно получать посредством обработки F(ab') по настоящему изобретению, которые специфично распознают человеческий В7-Н3 и связываются с аминокислотной последовательностью или трехмерной структурой его внеклеточной области, восстанавливающим агентом (таким как дитиотреитол).
Кроме того, Fab' может быть получен посредством включения ДНК, кодирующей Fab'-фрагмент антитела, в прокариотический экспрессионный вектор или эукариотический экспрессионный вектор, и введения вектора в прокариота или эукариота для экспрессии Fab'.
2
2
Термин «одноцепочечное антитело», «одноцепочечный Fv» или «scFv» относится к молекуле, содержащей вариабельный домен тяжелой цепи антитела (или область; VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (или область; VL), связанные линкером. Такие молекулы scFv имеют общую структуру: NH-VL-линкер-VH-COOH или NH-VH-динкер-VL-COOH. Подходящие линкеры в предшествующем уровне техники состоят из повторяющейся GGGGS аминокислотной последовательности или ее варианта, например, варианта, имеющего от 1 до 4 повторов (Holligeret al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448). Другие линкеры, которые можно использовать в настоящем изобретении, описаны в Alfthan et al., Protein Eng. 8:725-731, Choi et al (2001), Eur.J. Immunol. 31:94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanovet al. (1999), J.Mol. Biol. 293: 41-56 и Rooverset al. (2001), Cancer Immunol.
scFv по настоящему изобретению может быть получен посредством следующих стадий: получение кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению, которое специфично распознает человеческий В7-Н3 и связывается с аминокислотной последовательностью или трехмерной структурой его внеклеточной области; конструирование ДНК, кодирующей scFv; включение ДНК в прокариотический экспрессионный вектор или эукариотический экспрессионный вектор; и затем введение экспрессионного вектора в прокариота или эукариота для экспрессии указанного scFv.
Диатело представляет собой фрагмент антитела, в котором scFv димеризован, и представляет собой фрагмент антитела, обладающий двухвалентной антигенсвязывающей активностью. В двухвалентной антигенсвязывающей активности два антигена могут быть одинаковыми или разными.
Диатело по настоящему изобретению может быть получено посредством следующих стадий: получение кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению, которое специфично распознает человеческий В7-Н3 и связывается с аминокислотной последовательностью или трехмерной структурой его внеклеточной области; конструирование ДНК, кодирующей scFv, таким образом, чтобы длина линкерного пептида составляла 8 или меньше аминокислотных остатков; включение ДНК в прокариотический экспрессионный вектор или эукариотический экспрессионный вектор; и затем введение данного экспрессионного вектора в прокариота или эукариота для экспрессии диатела.
dsFv получают посредством замены одного аминокислотного остатка в каждой из VH и VL на остаток цистеина, и затем связывания полипептидов посредством дисульфидной связи между данными двумя остатками цистеина. Аминокислотный остаток, подлежащий замене остатком цистеина, может быть выбран на основе предсказания трехмерной структуры антитела в соответствии с известным способом (Protein Engineering, 7, 697 (1994)).
dsFv по настоящему изобретению можно получать посредством следующих стадий: получение кДНК, кодирующей VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению, которое специфично распознает человеческий В7-Н3 и связывается с аминокислотной последовательностью или трехмерной структурой его внеклеточной области; конструирование ДНК, кодирующей dsFv; включение данной ДНК в прокариотический экспрессионный вектор или эукариотический экспрессионный вектор; и затем введение данного экспрессионного вектора в прокариота или эукариота для экспрессии dsFv.
CDR-содержащий пептид конструируют посредством одной или более областей CDR VH или VL. Пептиды, содержащие несколько CDR, могут быть связаны прямо или через подходящий пептидный линкер.
CDR-содержащий пептид по настоящему изобретению может быть получен посредством следующих стадий: конструирование ДНК, кодирующей CDR VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению, которое специфично распознает человеческий В7-Н3 и связывается с аминокислотной последовательностью или трехмерной структурой его внеклеточной области; включение данной ДНК в прокариотический экспрессионный вектор или эукариотический экспрессионный вектор; и затем введение данного экспрессионного вектора в прокариота или эукариота для экспрессии указанного пептида. CDR-содержащий пептид может быть также получен способами химического синтеза, такими как способ на основе Fmoc (от англ. 9-fluorenylmethoxycarbonyl - 9-флуоренилметилоксикарбонил) или способ на основе tBoc (от англ. tert-Butoxycarbonyl - трет-бутоксикарбонил).
Термин «CDR» относится к одной из шести гипервариабельных областей в пределах вариабельного домена антитела, который главным образом содействует связыванию антигена. Одно из наиболее широко используемых определений для данных шести CDR было предложено Kabat Е.А. et al, (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242. В том виде, в котором оно используется в данном документе, определение CDR по Kabat относится только к CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельного домена легкой цепи (CDR L1, CDR L2, CDR L3 или L1, L2, L3), а также к CDR2 и CDR3 вариабельного домена тяжелой цепи (CDR Н2, CDR Н3 или Н2, Н3).
Термин «каркас антитела», в том виде, в контексте данного документа относится к части вариабельного домена VL или VH, которая служит скелетом для антигенсвязывающей петли (CDR) вариабельного домена. По существу он является вариабельным доменом без CDR.
Термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» относится к сайту на антигене, с которым специфично связывается иммуноглобулин или антитело (например, конкретный сайт на молекуле В7-Н3). Эпитопы обычно включают по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 последовательных или непоследовательных аминокислот в единственной пространственной конформации. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996).
-7
-8
-9
-10
Термины «специфичное связывание», «селективное связывание», «селективно связывает» и «специфично связывает» относятся к связыванию антитела с эпитопом на заданном антигене. Обычно антитело связывается с аффинностью (KD) меньше чем примерно 10 М, как например, приблизительно меньше чем примерно 10 М, 10 М или 10 М или меньше.
-7
-8
-9
-10
Термин «KD» или «Kd» относится к константе равновесия диссоциации для конкретного взаимодействия антитело-антиген. Обычно антитело по изобретению связывается с В7-Н3 с константой равновесия диссоциации (KD) меньше чем примерно 10 М, как, например, меньше чем примерно 10М, 10М или 10 М или меньше, например, как определено с использованием методик поверхностного плазмонного резонанса (SPR - от англ. surface plasmon resonance) на приборе BIACORE.
Термин «конкурентное связывание» относится к тому, когда антитело распознает и связывается с тем же эпитопом (также называемым антигенной детерминантой) или его частью внеклеточного домена человеческого В7-Н3, что и эпитоп, распознаваемый моноклональным антителом по настоящему изобретению. Антитело, которое связывается с тем же эпитопом, что и моноклональное антитело по настоящему изобретению, относится к антителу, которое распознает и связывается с аминокислотной последовательностью человеческого В7-Н3, распознаваемой моноклональным антителом по настоящему изобретению.
Термин «молекула нуклеиновой кислоты», в контексте данного документа относится к молекуле ДНК и молекуле РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Нуклеиновая кислота является «эффективно связанной», когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, если промотор или энхансер влияет на транскрипцию кодирующей последовательности, промотор или энхансер эффективно связан с кодирующей последовательностью.
Термин «вектор» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В одном воплощении вектор представляет собой «плазмиду», которая относится к петле кольцевой двухцепочечной ДНК, в которую может быть лигирован дополнительный сегмент ДНК. В другом воплощении вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительный сегмент ДНК может быть лигирован в вирусный геном. Векторы, раскрытые в данном документе, способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальный вектор, имеющий бактериальный репликатор, и эписомальный вектор млекопитающего), или могут быть интегрированы в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина и, таким образом, реплицируются вместе с геномом хозяина (например, вектор млекопитающего, не являющийся эписомальным).
Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны в данной области, как например, из руководства по экспериментальным технологиям с антителами Колд-Спринг-Харбор, главы 5-8 и 15. Например, мыши могут быть иммунизированы человеческим В7-Н3 или его фрагментом, и полученное антитело может быть ренатурировано, очищено и секвенировано посредством использования традиционного способа, известного в данной области. Антигенсвязывающий фрагмент также может быть получен традиционным способом. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты по изобретению генетически модифицируют с добавлением одной или более FR областей человека в CDR нечеловеческого происхождения. Последовательность(и) FR зародышевой линии человека может(гут) быть получена(ы) с помощью выравнивания последовательностей из базы данных генов вариабельных областей антител зародышевой линии человека и программного обеспечения МОЕ с вебсайта ImMunoGeneTics (IMGT) на http://imgt.cines.fr или из the Journal of Immunoglobulins 2001ISBN012441351.
Термин «клетка-хозяин» относится к клетке, в которую был введен экспрессионный вектор. Клетки-хозяева могут включать бактериальные, микробные, растительные или животные клетки. Бактерии, чувствительные к трансформации, включают члены семейства Enterobacteriaceae, такие как штаммы Escherichia coli или Salmonella; Bacillaceae, как например Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenzae. Подходящие микроорганизмы включают Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Подходящие линии животных клеток-хозяев включают СНО (от англ. - Chinese Hamster Ovary cell - клетка яичника китайского хомяка) и NS0.
Сконструированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению могут быть получены и очищены традиционными способами. Например, последовательность(и) кДНК, кодирующая(ие) тяжелую цепь и легкую цепь, можно клонировать и подвергать рекомбинации в экспрессионный вектор GS. Рекомбинантным экспрессионный вектором иммуноглобулина можно затем стабильно трансфицировать клетки СНО. В качестве более рекомендованного способа предшествующего уровня техники экспрессионные системы млекопитающих приводят к гликозилированию антител, в частности на высоко консервативном N-концевом сайте в области Fc. В результате экспрессии антител, которые специфично связываются с человеческим В7-Н3, получают стабильные клоны. Позитивные клоны размножают в культуральной среде, не содержащей сыворотку, в биореакторе для получения антител. Культуральную среду, содержащую секретированное антитело, можно очищать традиционной методикой. Например, очистку проводят с использованием колонки на основе сефарозы FF с белком А или G, которую уравновешивали совместимым буфером. Неспецифично связанные компоненты удаляют посредством промывки. Связанное антитело элюируют посредством градиента рН и фрагменты антитела выявляют посредством SDS-PAGE (от англ. sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) и собирают. Антитело можно фильтровать и концентрировать обычным способом. Растворимый агрегат и мультимеры можно также удалять традиционными способами, такими как гель-фильтрация или ионный обмен. Продукт должен быть сразу же заморожен, как например, при -70°С, или лиофилизирован.
Термины «введение» и «обработка», при применении к животному, человеку, экспериментальному субъекту, клетке, ткани, органу или биологической жидкости, относятся к приведению экзогенного фармацевтического, терапевтического, диагностического средства или композиции в контакт с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. Термины «введение» и «обработка» могут относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Обработка клетки охватывает приведение реагента в контакт с клеткой, а также приведение реагента в контакт с жидкостью, где данная жидкость находится в контакте с клеткой. Термины «введение» и «обработка» также означают обработки in vitro или ex vivo, например, клетки реагентом, диагностической, связывающей композицией или другой клеткой. Термин «лечение», при применении к субъекту-человеку, субъекту ветеринарии или исследования, относится к терапевтическому лечению, профилактическим или превентивным мерам, к исследовательским и диагностическим применениям.
Термин «лечить» означает вводить терапевтическое средство, такое как композиция, содержащая любое из связывающих соединений по настоящему изобретению, внутрь или наружно пациенту, имеющему один или более чем один симптом заболевания, в отношении которого данное средство обладает известной терапевтической активностью. Типично средство вводят в количестве, эффективном для облегчения одного или более чем одного симптома заболевания у пациента или популяции, подлежащих лечению, таким образом, чтобы вызвать регрессию такого(их) симптома(ов) или предотвратить прогрессирование до какой-либо клинически измеряемой степени. Количество терапевтического средства, которое является эффективным для облегчения какого-либо определенного симптома заболевания (также называемое «терапевтически эффективным количеством»), может варьировать в зависимости от факторов, таких как течение заболевания, возраст и масса пациента, и способности средства вызывать желаемый ответ у пациента. Был ли облегчен симптом заболевания можно оценить посредством клинического измерения, обычно используемого лечащими врачами или другими квалифицированными медицинскими работниками, для оценки тяжести или статуса прогрессирования того симптома. Даже если воплощение настоящего изобретения (например, способ лечения или продукт производства) может не быть эффективным в облегчении исследуемого(ых) симптома(ов) заболевания у каждого пациента, оно должно облегчать исследуемый(е) симптом(ы) заболевания у статистически значимого числа пациентов, как определено любым статистическим критерием, известным в данной области, таким как t-критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна - Уитни, критерий Краскела - Уоллиса (Н-критерий), критерий Джонкхира-Терпстры и критерий Уилкоксона.
«Консервативная модификация» или «консервативное замещение или замена» относится к заменам аминокислот в белке другими аминокислотами, имеющими похожие характеристики (например, заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформация главной цепи и жесткость и т.п.), таким образом, что замены могут быть часто сделаны без изменения биологической активности данного белка. Специалисты в данной области признают, что, в общем, единичная аминокислотная замена в заменимой области полипептида по существу не меняет биологическую активность (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224 (4th edition)). Кроме того, замены структурно или функционально похожих аминокислот маловероятно нарушат биологическую активность.
Термин «эффективное количество» охватывает количество, достаточное для смягчения или предупреждения симптома или состояния медицинского заболевания. Эффективное количество также означает количество, достаточное для обеспечения возможности или облегчения диагностирования. Эффективное количество для конкретного пациента или субъекта ветеринарии может варьировать в зависимости от факторов, таких как состояние, подлежащее лечению, общее здоровье пациента, путь и доза введения, и тяжесть побочных эффектов. Эффективное количество может представлять собой максимальную дозу или схему дозирования, которая позволяет избежать значимых побочных эффектов или токсичных действий.
Термин «экзогенный» относится к веществу, которое образуются вне организма, клетки или организма человека, в зависимости от ситуации. Термин «эндогенный» относится к веществу, которое образуются в клетке, организме или организме человека, в зависимости от ситуации.
Термин «идентичность» относится к сходству последовательностей между двумя полинуклеотидными последовательностями или двумя полипептидными последовательностями. Когда положения в двух последовательностях, подлежащих сравнению, заняты одной и той же мономерной субъединицей - основанием или аминокислотой - например, если каждое положение обеих двух молекул ДНК занято аденином, тогда данные молекулы считаются гомологичными в данном положении. Процент идентичности двух последовательностей является функцией числа совпадающих или гомологичных положений, являющихся общими у двух последовательностей, деленного на число сравниваемых положений х 100. Например, при оптимальном выравнивании последовательности(ей), если имеет место 6 совпадений или гомологов из 10 положений в двух последовательностях, тогда данные две последовательности считаются гомологичными на 60%; если имеет место 95 совпадений или гомологов из 100 положений в двух последовательностях, тогда данные две последовательности считаются гомологичными на 95%. В общем, сравнение осуществляют, когда получают максимальный процент идентичности посредством выравнивания двух последовательностей.
В контексте данного документа выражения «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» используются взаимозаменяемо, и все такие термины включают их потомство. Таким образом, слова «трансформант» и «трансформированная клетка» включают первичные исследуемые клетки или полученные из них культуры без учета числа переносов. Также следует понимать, что все потомство не может быть с точностью идентичным по содержанию ДНК вследствие целенаправленных или случайных мутаций. Включено потомство с мутациями, обладающее такой же функцией или биологической активностью, на что проведен скрининг для исходно трансформированной клетки. В случае отличного названия, это будет отчетливо понятно из контекста.
В контексте данного документа термин «полимеразная цепная реакция» или «ПЦР» относится к способу или методике, в которой малые количества конкретного фрагмента нуклеиновой кислоты, РНК и/или ДНК, амплифицируют, как описано, например, в патенте США №4683195. Обычно существует необходимость в получении информации о последовательности с конца или за пределами исследуемой области, таким образом, чтобы можно было сконструировать олигонуклеотидные праймеры; данные праймеры будут идентичными или сходными с обратными нитями матрицы, подлежащей амплификации. 5'-Концевые нуклеотиды данных двух праймеров могут быть идентичны концам материала, подлежащего амплификации. ПЦР можно использовать для амплификации конкретных последовательностей РНК, конкретных последовательностей ДНК из тотальной геномной ДНК и кДНК, транскрибируемой с тотальной РНК клетки, последовательностей фагов или плазмид и т.д. Обычно см. Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant.Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.). В том виде, в котором она используется в данном документе, ПЦР считается примером (но не единственным примером) способа амплификации тестируемого образца нуклеиновой кислоты на основе полимеразной реакции с нуклеиновой кислотой, причем указанный способ включает применение известной нуклеиновой кислоты в качестве праймера и полимеразы нуклеиновой кислоты для амплификации или продукции конкретного фрагмента нуклеиновой кислоты.
Термин «возможный» или «возможно» означает, что событие или ситуация, описанная впоследствии, может происходить, (но не обязательно происходит), и данный термин включает примеры, в которых событие или ситуация происходит или не происходит. Например, фраза «возможно содержащий 1-3 вариабельные области тяжелой цепи антитела» означает, что вариабельная область тяжелой цепи антитела с конкретной последовательностью может присутствовать, но не обязательно присутствует.
Под термином «фармацевтическая композиция» подразумевается смесь, содержащая одно или более соединений, описанных в данном документе, или его(их) физиологически/фармацевтически приемлемую соль или пролекарство, вместе с другими химическими компонентами, такими как физиологически/фармацевтически приемлемый носитель и вспомогательное вещество. Целью фармацевтической композиции является содействие введению в организм и облегчение поглощения активного вещества, и оказание, таким образом, биологической активности.
Кроме того, настоящее изобретение относится к способу иммунологического выявления или определения уровня В7-Н3, реагенту для иммунологического выявления или определения уровня В7-Н3, способу иммунологического выявления или определения уровня клеток, экспрессирующих В7-Н3, и диагностическому реагенту для диагностики заболевания, связанного с В7-Н3 позитивными клетками, содержащему моноклональное антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению, которые специфично распознают человеческий В7-Н3, и связываются с аминокислотной последовательностью или трехмерной структурой его внеклеточной области, в качестве активного вещества.
В настоящем изобретении способ выявления или определения количества В7-Н3 может представлять собой любой известный способ. Например, он включает иммунологическое выявление или анализ.
Иммунологическое выявление или анализ представляет собой способ выявления или определения количества антитела или антигена посредством использования меченного антигена или антитела. Примеры иммунологического выявления или анализа включают иммунологический способ на основе антитела, меченного радиоактивным веществом (RIA - от англ. radioimmunoassay - радиоиммунологический анализ), иммуноферментный анализ (EIA - от англ. enzyme immunoassay или ELISA (от англ. enzyme-linked immunosorbent assay -твердофазный иммуноферментный анализ)), флуоресцентный иммуноанализ (FIA - от англ. fluorescent immunoassay), люминесцентный иммуноанализ, метод вестерн-блоттинг, физико-химические методы и т.д.
Упомянутые выше заболевания, связанные с В7-Н3 позитивными клетками, могут быть диагностированы посредством выявления или определения уровня клеток, экспрессирующих В7-Н3, посредством использования моноклональных антител или их фрагментов по настоящему изобретению.
Для выявления клеток, экспрессирующих полипептид, можно использовать известное иммунологическое выявление, и предпочтительно можно использовать иммунопреципитацию, флуоресцентное окрашивание клеток или иммуногистохимическое окрашивание и т.д. Кроме того, можно использовать способ окрашивания флуоресцирующими антителами и т.д. с использованием системы FMAT8100HTS (Applied Biosystem).
В настоящем изобретении живой образец для выявления или определения уровня В7-Н3 особым образом не ограничен в том случае, если есть возможность включения клеток, экспрессирующих В7-Н3, таких как клетки ткани, кровь, плазма, сыворотка, панкреатический сок, моча, кал, тканевая жидкость или культуральная жидкость.
Диагностический реагент, содержащий моноклональное антитело или его фрагмент по настоящему изобретению, может дополнительно содержать реагент для проведения реакции антиген-антитело или реагент для выявления данной реакции, в зависимости от желаемого способа диагностики. Реагент для проведения реакции антиген-антитело включает буферы, соли и тому подобное. Регент для выявления включает реагенты, обычно используемые в иммунологическом выявлении или измерении, такие как меченные вторичные антитела, которые распознают моноклональные антитела, их фрагменты или конъюгаты, субстраты, соответствующие меткам, и т.д.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения заболеваний, связанных с В7-Н3 позитивными клетками человека, в частности в лечении рака и воспаления.
2. Примеры и примеры анализов
Настоящее изобретение дополнительно описано ниже вместе с примерами, однако объем настоящего изобретения не ограничивается ими. В примерах настоящего изобретения, в которых не описаны конкретные условия, эксперименты обычно проводят в традиционных условиях, как описано в лабораторных инструкциях по технологии антител Колд-Спринг-Харбор, руководстве по молекулярному клонированию, или в условиях, рекомендуемых производителем сырья или продуктов. Когда источник реагентов конкретным образом не приведен, реагенты представляют собой имеющиеся в продаже традиционные реагенты.
Пример 1. Получение антигена В7-Н3 и белка для выявления
Конструирование антигена В7-Н3
Человеческий В7-Н3, как показано в SEQ ID NO: 1, использовали в качестве матрицы для В7-Н3 по настоящему изобретению, и конструировали аминокислотную последовательность антигена и белка для выявления, участвующего в настоящем изобретении. Если не указано иное, следующий антиген В7-Н3 представляет собой человеческий В7-Н3.
Человеческий полноразмерный белок В7-Н3: В7-Н3 (SEQ ID NO: 1):
Примечание
Фрагмент с двойным подчеркиванием представляет собой сигнальный пептид (сигнальный пептид: 1-28).
Подчеркнутый фрагмент представляет собой внеклеточный домен В7-Н3 (внеклеточный домен: 29-466), где 29-139 представляет собой Ig-подобный домен V-типа 1, и 145-238 представляет собой Ig-подобный домен С2-типа 1; 243-357 представляет собой Ig-подобный домен V-типа 2, 363-456 представляет собой Ig-подобный домен С2-типа 2.
Фрагмент, подчеркнутый пунктирной линией, представляет собой фрагмент трансмембранного домена (Трансмембранный домен: 467-487).
Фрагмент, выделенный курсивом, представляет собой внутриклеточный домен (Цитоплазматический домен: 488-534).
Полноразмерная аминокислотная последовательность мышиного В7-Н3 (SEQ ID NO: 2)
Примечание
Фрагмент с двойным подчеркиванием представляет собой сигнальный пептид (сигнальный пептид: 1-28).
Подчеркнутый фрагмент представляет собой внеклеточный домен В7-Н3 (внеклеточный домен: 29-248), где 29-139 представляет собой Ig-подобный домен V-типа, и 145-238 представляет собой Ig-подобный домен С2-типа.
Фрагмент, подчеркнутый пунктирной линией, представляет собой фрагмент трансмембранного домена (трансмембранный домен: 249-269).
Фрагмент, выделенный курсивом, представляет собой внутриклеточный домен (цитоплазматический домен: 270-316).
Человеческий антиген В7-Н3 (SEQ ID NO: 3), используемый для осуществления скрининга и выявления, представляет собой коммерческий продукт (R&D кат. № 1949-B3-050/CF, сокращенно 2Ig-B7-H3), и последовательность выглядит следующим образом:
Примечание: подчеркнутый фрагмент представляет собой внеклеточную область В7-Н3; фрагмент, выделенный курсивом, представляет собой маркер - His-метку.
Человеческий антиген В7-Н3 (SEQ ID NO: 4), используемый для выявления, представляет собой коммерческий продукт (SinoBiological кат .№11188-Н08Н, сокращенно 4Ig-B7-H3), и последовательность выглядит следующим образом:
Примечание: подчеркнутый фрагмент представляет собой внеклеточную область В7-Н3; фрагмент, выделенный курсивом, представляет собой маркер - His-метку.
Мышиный антиген В7-Н3 (SEQ ID NO: 5), используемый для осуществления скрининга и выявления, представляет собой коммерческий продукт (R&D кат. №1397-B3-050/CF), и последовательность выглядит следующим образом:
Примечание: подчеркнутый фрагмент представляет собой внеклеточную область В7-Н3; фрагмент, выделенный курсивом, представляет собой маркер - His-метку.
Пример 2. Скрининг позитивной(ых) последовательности(ей) в отношении специфичного связывания с человеческим В7-Н3
10
В-клетки выделяли из человеческих РВМС, селезенки и тканей лимфатических узлов, и выделяли РНК для конструирования библиотеки наивных фаговых антител scFv (емкость 3,2×10). Сконструированную библиотеку наивных фаговых антител scFv упаковывали с образованием фаговых частиц, и затем подвергали пэннингу жидкофазным способом. Фаг связывали с биотинилированным В7-Н3 в жидкой фазе и затем выделяли посредством магнитных частиц, покрытых стрептавидином. Для получения позитивной(ых) последовательности(ей), связывающейся(ихся) с человеческим В7-Н3 (R&D кат. №1949-B3-050/CF), для пэннинга использовали биотинилированный человеческий В7-Н3, и 500 моноклональных колоний отбирали и упаковывали в фаговые антитела scFv для тестирования фагов посредством ELISA. Активность связывания моноклонального фага с человеческим В7-Н3 (R&D кат. №1949-B3-050/CF) и мышиным В7-Н3 (R&D кат. №1397-B3-050/CF) тестировали по отдельности: 1 мкг/мл человеческого В7-Н3 или мышиного В7-Н3 и 1% BSA (от англ. bovine serum albumin - бычий сывороточный альбумин) наносили в виде покрытия на планшет ELISA, добавляли супернатант с фагами, разведенный в соотношении 1:1 блокирующим буфером, и осуществляли выявление с помощью антител против М13, конъюгированных с HRP (от англ. horseradish peroxidase - пероксидаза хрена); отбирали клоны со значением OD450 (от англ. optical density - оптическая плотность) по ELISA выше, чем 0,5, и с отношениями значений OD450 по ELISA для связывания с человеческим или мышиным В7-Н3 к значению OD450 по ELISA для связывания с 1% BSA больше, чем 2,0, и получали 9 клонов.
Пример 3. Конструирование полноразмерных моноклональных антител
Полноразмерные антитела конструировали для данных 9 клонов, полученных посредством скрининга фаговой библиотеки, и затем у двух антител (h1702 и h1703, соответственно) анализом связывания ELISA подтверждали наличие сильной аффинности. Процесс конструирования полноразмерного моноклонального антитела выглядел следующим образом.
На основе последовательности(ей) антитела scFv, полученной(ых) в результате проведения скрининга, осуществляли дизайн праймеров для конструирования фрагмента гена VH/VK/VL последовательности каждого одноцепочечного антитела посредством ПЦР. Получали вариабельные области тяжелой и легкой цепи h1702 и h1703.
Последовательность вариабельной области тяжелой цепи h1702
Последовательность вариабельной области легкой цепи h1702
Последовательность вариабельной области тяжелой цепи h1703
Последовательность вариабельной области легкой цепи h1703
Примечание: порядок является следующим: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, фрагменты в последовательности, выделенные курсивом, представляют собой последовательности FR, и последовательности CDR подчеркнуты.
Последовательности CDR в легкой цепи и тяжелой цепи каждого антитела показаны в Таблице 1.
Затем осуществляли гомологичную рекомбинацию вариабельной области антитела с фрагментом гена константной области (CH1-FC/CL) с конструированием полного антитела VH-CH1-FC/VK-CL/VL-CL.
Последовательности сконструированных полных антител h1702-IgG1, h1703-IgG1 выглядят следующим образом:
h1702-IgG1:
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи h1702-IgG1: (SEQ ID NO: 22)
Аминокислотная последовательность легкой цепи h1702: лямбда (SEQ ID NO: 23)
h1103-IgG1:
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи h1703-IgG1: (SEQ ID NO: 24)
Аминокислотная последовательность легкой цепи h1703: каппа (SEQ ID NO: 25)
Для дополнительного улучшения стабильности антитела аминокислоты последовательности легкой цепи h1702 подвергали мутации, где конкретная мутация подразумевает, что первый аминокислотный остаток Q на N-конце легкой цепи заменяли D, первый аминокислотный остаток S на С-конце удаляли таким образом, чтобы получить более стабильное и однородное моноклональное антитело.
Аминокислотная последовательность легкой цепи h1702-1 с модификацией мутации: (SEQ ID NO: 26)
Пример 4. Экспрессия и очистка полностью человеческих антител
Клетки HEK293E трансфицировали плазмидами, экспрессирующими легкую и тяжелую цепь антитела, соответственно, в соотношении 1,5:1, и супернатант клеточной культуры собирали спустя 6 дней, и клеточный дебрис удаляли посредством высокоскоростного центрифугирования, и очистку проводили посредством колонки с белком А. Колонку промывали PBS (от англ. Phosphate buffered saline - фосфатно-солевой буферный раствор) до тех пор, пока измеренное значение А280 не падало до исходного уровня. Целевой белок элюировали кислотным элюентом с рН 3,0 - рН 3,5 и нейтрализовали 1 М Tris-HCl, рН 8,0-9,0. Элюированный образец соответствующим образом концентрировали и дополнительно очищали посредством гель-проникающей хроматографии на колонке Superdex 200 (GE), которую уравновешивали PBS с удалением агрегата. Пик мономера собирали и разделяли на аликвоты для применения.
Эффективность и полезное действие антител по настоящему изобретению анализировали следующими аналитическими методами: Пример анализа 1. Анализ связывания ELISA
Для анализа связывающей способности подвергаемых скринингу антител против В7-Н3 в отношении разных форм человеческого В7-Н3 in vitro, человеческий 2Ig-B7-H3 (кат. №1949-B3-050/CF, R&D) и человеческий 4Ig-B7-H3 (кат. №11188-Н08Н, Sino Biological) использовали для анализов связывания in vitro.
2
4
Человеческий белок В7-Н3 (2Ig/4Ig) разводили до концентрации 1 мкг/мл буфером PBS, рН 7,4 (Sigma, Р4417-100ТАВ) и добавляли в 96-луночный планшет Elisa в объеме 100 мкл/лунка (Corning, CLS3590-100 ЕА) и помещали при 4°С на ночь, на 16-20 часов. После отбрасывания жидкости добавляли блокирующий раствор, содержащий 5% обезжиренное молоко (сухое обезжиренное молоко GuangMing), разведенный буфером PBST (PBS, содержащий 0,05% твин-20, рН 7,4), в объеме 120 мкл/лунка, и смесь инкубировали при 37°С в течение 2 часов для блокирования. В конце блокирования блокирующий раствор отбрасывали, и планшет 4 раза промывали буфером PBST. Затем, добавляли 100 мкл/лунка соответствующих антител против В7-Н3 с серийным разведением. Исходная концентрация составляла 1 мкМ, затем разводили буфером PBST до 8 градиентов и инкубировали при 37°С в течение 1 часа в инкубаторе. После инкубации реакционный раствор в планшете отбрасывали, и планшет промывали 4 раза PBST. Специфичное вторичное антитело козы против человеческого фрагмента Fcγ IgG, меченное HRP (Jackson Immuno Research, 109-005-008), разведенное PBST (1:4000), добавляли в объеме 100 мкл/лунка и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. После промывки планшета PBST 4 раза, добавляли хромогенный субстрат ТМВ (от англ. tetramethylbenzidine - тетраметилбензидин) (KPL, 52-00-03) в количестве 100 мкл/лунка, инкубировали в течение 3-5 мин при комнатной температуре и добавляли 1 М HSO в количестве 100 мкл/лунка для остановки реакции. Значение поглощения считывали, используя микропланшет-ридер NOVOStar при 450 нм, и рассчитывали значение ЕС50 (полумаксимальная эффективная концентрация) для связывания антитела с антигеном. Результаты показаны в Таблице 2, Фиг. 1 и Фиг. 2.
Результаты показывают, что h1702 и h1703 обладают значимой способностью связывания с обоими человеческими антигенами 2Ig-B7-H3 и 4Ig-B7-Н3, и h11702 обладает более сильной связывающей способностью.
Пример анализа 2. Анализ перекрестного связывания с В7-Н3, происходящим из отличного вида
Для анализа способности связывания подвергаемых скринингу антител против В7-Н3 с В7-Н3, происходящим из отличного вида in vitro, для анализов связывания in vitro использовали мышиный В7-Н3 (кат. № 1397-B3-050/CF, R&D).
2
4
Белок В7-Н3, происходящий из отличного вида (мышиный В7-Н3), разводили до концентрации 1 мкг/мл буфером PBS, рН 7,4 (Sigma, Р4417-100ТАВ), добавляли в 96-луночный микропланшет в объеме 100 мкл/лунка (Corning, CLS3590-100 ЕА) и помещали при 4°С на ночь на 16-20 часов. После отбрасывания жидкости добавляли блокирующий раствор, содержащий 5% обезжиренное молоко (сухое обезжиренное молоко GuangMing), разведенный буфером PBST (PBS, содержащий 0,05% твин-20, рН 7,4), в объеме 120 мкл/лунка, и смесь инкубировали при 37°С в течение 2 часов для блокирования. В конце блокирования блокирующий раствор отбрасывали, и планшет 4 раза промывали буфером PBST. Затем, добавляли 100 мкл/лунка соответствующих антител против В7-Н3 в исходной концентрации 1 мкМ, разводили буфером PBST до 8 градиентов и инкубировали при 37°С в течение 1 часа в инкубаторе. После инкубации реакционный раствор в планшете отбрасывали, и планшет промывали 4 раза PBST, и специфичное вторичное антитело козы против человеческого фрагмента Fcγ IgG, меченное HRP (Jackson Immuno Research, 109-005-008), разведенное PBST (1:4000), добавляли в объеме 100 мкл/лунка, инкубировали в течение 1 часа при 37°С. После промывки планшета PBST 4 раза, добавляли хромогенный субстрат ТМВ (KPL, 52-00-03) в количестве 100 мкл/лунка, инкубировали в течение 3-5 мин при комнатной температуре и добавляли 1 М HSO в количестве 100 мкл/лунка для остановки реакции, значение поглощения считывали, используя микропланшет-ридер NOVOStar при 450 нм, рассчитывали значение ЕС50 для связывания антитела с антигеном (результаты показаны в Таблице 3 и Фиг. 3).
Результаты показали, что способность связывания h1702 и h1703 с мышиным В7-Н3 была слабой, что указывает на то, что два моноклональных антитела специфично связываются с человеческим В7-Н3.
Пример анализа 3. Biacore анализ аффинности антител Аффинность антител против В7-Н3 к человеческому и мышиному В7-Н3 при взаимодействии определяли, используя прибор Biacore, GE.
Биосенсорный чип с белком А (кат. №29127556, GE) использовали для аффинного захвата некоторого количества антитела, подлежащего анализу. Подвергаемый серийному разведению человеческий антиген 2Ig-B7-H3 (кат. №1949- B3-050/CF, R&D), человеческий антиген 4Ig-B7-H3 (кат .№11188-Н08Н, Sino Biological) или мышиный антиген В7-Н3 (кат. №1397-B3-050/CF, R&D) пропускали через поверхность чипа. Сигнал от взаимодействия в реальном времени выявляли с использованием прибора Biacore (Biacore Т200, GE) для получения кривых ассоциации и диссоциации. После завершения каждого цикла диссоциации биочип промывали и регенерировали регенерирующим раствором глицина-соляной кислоты (рН 1,5) (кат. № BR-1003-54, GE). Буфер, используемый в эксперименте, представлял собой буферный раствор HBS-EP (рН 7,4) (кат. №BR-1001-88, GE).
Экспериментальные данные аппроксимировали с помощью BIA ознакомительной версии 4.1 программного обеспечения GE в (1:1) модели Ленгмюра с получением значений аффинности. Результаты экспериментов показаны в Таблицах 4-6.
Результаты по аффинности анализа Biacore показывают, что h1702 обладает сильной аффинностью в отношении человеческого 4Ig-B7-H3, достигая нМ-ого уровня, тогда как аффинность к человеческому 2Ig-B7-H3 или мышиному В7-Н3 является относительно более слабой; h1703 обладает более слабой аффинностью в отношении человеческого 4Ig-B7-H3, человеческого 2Ig-B7-H3 и мышиного В7-Н3.
Пример анализа 4. Анализ связывания с клеткой in vitro
5
В данном эксперименте связывание антитела оценивали на основе интенсивности сигнала флуоресценции антитела, связанного на клеточной поверхности. После инкубирования 10 мкг первичного антитела с 2×10 клеток U87MG на льду в течение 30 минут избыток антител удаляли посредством промывки. Клетки инкубировали с антителом против человеческого Fc IgG, меченным АРС (от англ. allophycocyanin - аллофикоцианин) (Biolegend, 409306), в течение 30 минут при комнатной температуре, и после удаления избытка антитела сигнал флуоресценции на клеточной поверхности считывали с использованием BD Verse (результаты показаны на Фиг. 4). Результаты указывают на то, что h1702 специфично связывается с опухолевой клеткой U87MG, которая сверхэкспрессирует В7-Н3.
Пример анализа 5. In vitro анализ эндоцитоза
5
В данном эксперименте воздействие эндоцитоза антитела оценивали на основе интенсивности сигнала флуоресценции, которую определяли для интернализированного антитела. Антитело против В7-Н3 и антитело против человеческого Fc IgG, меченное АРС (Biolegend, 409306), смешивали в молярном соотношении 1:2 и инкубировали на льду в течение 15 минут. После инкубирования смеси антител с 2×10 клеток U87MG на люду в течение 30 минут избыток антител удаляли посредством промывки, и затем клетки переносили в среду, предварительно нагретую до 37°С, и инкубировали при 37°С в течение 0, 15, 30, 60 и 120 минут, соответственно. Клетки центрифугировали и ресуспендировали в буфере, элюирующем антитела, для того, чтобы освободиться от антител. После инкубирования в течение 7 минут при комнатной температуре буфер, элюирующий антитела, удаляли посредством промывки, и внутриклеточный сигнал флуоресценции считывали, используя BD Verse (результаты, показанные на Фиг. 5). Результаты показывают, что оба антитела h1702 и h1703 эффективно подвергались эндоцитозу в клетки после связывания с клеткой U87MG.
Пример анализа 6. Оценка Т1/2 на крысах SD
4 крысы SD (от англ. Sprague Dawley - Спрег-Доули) (приобретенные у JSJ Experimental Animal Co., Ltd.), 2 самца и 2 самки, содержали в условиях цикла свет/темнота, настроенного на 12 часов света/12 часов темноты, при постоянной температуре 24 плюс/минус 3°С, влажности 50-60% и со свободным доступом к пище и воде. В день эксперимента крысам SD инъецировали тестируемое средство в хвостовую вену в дозе 3 мг/кг и объеме инъекции 5 мл/кг.
Время забора крови: в первые сутки введения кровь отбирали из вены глазного дна в моменты времени 5 мин, 8 ч, 24 ч, 2 суток, 3 суток, 5 суток, 8 суток и 15 суток после введения, 200 мкл в каждый момент времени (эквивалентно 100 мкп сыворотки); Отобранным образцам крови давали постоять при комнатной температуре в течение получаса до коагуляции и затем центрифугировали при 10000 × g в течение 10 минут при 4°С. Супернатант собирали и сразу же помещали на хранение при -80°С. Концентрацию антитела против В7-Н3 в сыворотке измеряли посредством ELISA, и проводили РК анализ. Результаты показаны в Таблице 7.
Результаты показывают, что период полужизни антитела по настоящему изобретению у крыс приблизительно составлял 185 ч (7,7 суток).
Пример анализа 7. Физическая стойкость антител против В7-Н3
2
ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) использовали для выявления термостойкости разных антител, и проводили сравнение термостойкости в разных буферных системах в разных условиях рН. Иллюстративные буферные системы, соответствующие разным рН, представляли собой 10 мМ РВ (рН 7) и 10 мМ ацетат (рН 5,2). Образец растворяли в соответствующем буфере, и концентрацию образца контролировали на уровне примерно 1 мг/мл. Выявление осуществляли, используя дифференциальный сканирующий калориметр MicroCal* VP-Capillary DSC (Malvern). Перед выявлением каждый образец и холостой буфер дегазировали посредством вакуумного дегазатора в течение 1-2 минут. 400 мкл образца или холостого буфера добавляли в каждую лунку планшета для образцов (загрузка прибора составляет 300 мкл). В последние две пары луночных планшетов соответственно добавляли 14% Decon 90 и ddHO для очистки. После загрузки планшета для образцов размещали пластиковую мягкую крышку. Температура сканирования начиналась с 25°С и заканчивалась на уровне 100°С. Скорость сканирования составляла 60°С/ч. Результаты показаны в Таблице 8. В некоторых тест-системах оба антитела h1702 и h1703 демонстрировали хорошую термостойкость.
Чистоту образца отслеживали посредством эксклюзионной ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) для исследования стабильности в условиях определенной концентрации. В качестве примера условий концентрацию образца контролировали на уровне примерено 40-50 мг/мл. Стабильность разных антител сравнивали в системе PBS (рН 7,4) и системе уксусная кислота/сахароза, рН 5,2, при 4°С, 30°С, 40°С на протяжении одного месяца хранения. Чистоту антитела исследовали с использованием колонки для ВЭЖХ Xbridge protein ВЕН SEC 200А (Waters). После одного месяца исследования оба антитела h1702 и h1703 демонстрировали хорошую стабильность. Результаты показаны в Таблице 9.
Результаты показывают, что оба антитела h1702 и h1703 демонстрируют превосходную стабильность и в буфере на основе уксусной кислоты и в буфере PBS.
Пример анализа 8. Химическая устойчивость антител против В7-Н3
Химическая модификация после получения антител представляет собой одну из распространенных причин, приводящих к проблеме стабильности продукта, особенно высокой степени дезаминирования, окисления или модификации изомеризации в некоторых аминокислотах в области CDR. Данных модификаций следует избегать или их уменьшать. 500 мкг антител, подлежащих тестированию, растворяли в 500 мкл PBS рН 7,4 и подвергали воздействию водяной бани при 40°С; образцы отбирали в сутки 0, 10 и 20, соответственно, для экспериментов по ферментативному гидролизу. 100 мкг образцов отбирали в разные моменты времени и растворяли в 100 мкл раствора 0,2 М His-HCl, 8 М Gua-HCl, рН 6,0; добавляли 3 мкл 0,1 г/мл ДТТ (Дитиотреитол) и подвергали воздействию водяной бани при 50°С в течение 1 часа; Затем, образцы дважды подвергали ультрафильтрации раствором 0,02 М His-HCl, рН 6,0, и добавляли 3 мкл 0,25 мг/мл трипсина. Смесь гидролизовали в течение ночи при 37°С на водяной бане. Возможные сайты модификации анализировали посредством масс-спектрометрии (результаты показаны в Таблице 10) с использованием Agilent 6530 Q-TOF. Результаты показывают, что у h1702 и h1703, описанных в настоящем изобретении, значимо не увеличивалась склонность к дезаминированию, окислению или неоднородности, указывая на то, что молекулы обладают превосходной химической устойчивостью.
Пример анализа 9. Стабильность антитела h1702-1
Тип лямбда имеет еще одну аминокислоту S на С-конце, в сравнении с легкой цепью типа каппа, и стерическое препятствие со стороны S может служить фактором, вызывающим нестабильность межцепочечной дисульфидной связи между легкой и тяжелой цепью. Можно осуществлять нокаутирование концевой аминокислоты S посредством молекулярного клонирования, и стабильность антитела в щелочных условиях будет значительно улучшена.
Когда первая аминокислота на N-конце легкой цепи «голого антитела» представляет собой Q, в антителе также может происходить частичная циклизация, и которая может приводить к увеличению неоднородности заряда образца, влияя на стабильность композиции и продукта. Первую аминокислоту Q на N-конце подвергали мутации до D посредством молекулярного клонирования для устранения неполной циклизации и значительного улучшения стабильности антитела. Упомянутая выше модификация не оказывала значимого влияния на аффинность сконструированного антитела в отношении его антигена.
Стабильность h1702 и h1702-1 тестировали посредством эксклюзионной хроматографии, аналитическим методом CE-SDS (от англ. capillary electrophoresis - Sodium Dodecyl Sulfate - капиллярный электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия) в невосстанавливающих условиях (рН 9,0) и аналитическим методом IEX.
Выявление на основе эксклюзионной хроматографии: использовали хроматограф Waters е2695 и колонку для эксклюзионной хроматографии Xbridge ВЕН 200А. Загружали 50 мкг антитела, и проводили элюирование, используя подвижную фазу PBS в постоянном градиенте.
Способ CE-SDS NR:
Образцы обрабатывали, используя набор Beckman SDS-MW Analysis. Буферный раствор добавляли к 100 мкг тестируемого антитела, осуществляли денатурацию посредством нагревания в буфере для образца, как описано во входящем в комплект протоколе. Данные собирали, используя прибор для капиллярного электрофореза РА800.
Способ IEX:
Использовали Waters Acquity H-Class и колонку Thermo MAbPac SCX-10. Загружали 50 мкг тестируемого антитела, и применяли линейный градиент с использованием набора буферов для создания градиента рН СХ-1 в качестве подвижной фазы; собирали ультрафиолетовый сигнал при длине волны 280 нм.
Несмотря на то, что изобретение было подробно описано посредством графических материалов и конкретных воплощений с целью четкого понимания, описание и воплощения не следует воспринимать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Все общедоступное содержание литературных источников и патентов, процитированных в данном документе, явным образом включено посредством ссылки во всей полноте.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>  JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD; SHANGHAI HENGRUI
PHARMACEUTICAL CO.,LTD
<120>  АНТИТЕЛО ПРОТИВ B7-H3, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ИХ
МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ
<130>  780019CPCT
<160>  26
<170>  SIPO Перечень последовательностей 1.0
<210>  1
<211>  534
<212>  ПРТ
<213>  Homo sapiens
<220>
<221>  ПЕПТИД
<223>  Полноразмерная аминокислотная последовательность
человеческого B7H3
<400>  1
Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala
1               5                   10                  15
Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln
20                  25                  30
Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu
35                  40                  45
Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
50                  55                  60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala
65                  70                  75                  80
Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85                  90                  95
Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
100                 105                 110
Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp
115                 120                 125
Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys
130                 135                 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr
145                 150                 155                 160
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
165                 170                 175
Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr
180                 185                 190
Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Ile Leu
195                 200                 205
Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn
210                 215                 220
Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr Ile Thr Pro Gln
225                 230                 235                 240
Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val
245                 250                 255
Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro
260                 265                 270
Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr
275                 280                 285
Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly
290                 295                 300
Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln
305                 310                 315                 320
Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly
325                 330                 335
Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val
340                 345                 350
Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu
355                 360                 365
Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser
370                 375                 380
Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln
385                 390                 395                 400
Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu
405                 410                 415
Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala
420                 425                 430
Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp
435                 440                 445
Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro
450                 455                 460
Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu
465                 470                 475                 480
Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys
485                 490                 495
Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly
500                 505                 510
Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp
515                 520                 525
Asp Gly Gln Glu Ile Ala
530
<210>  2
<211>  316
<212>  ПРТ
<213>  Mus musculus
<220>
<221>  ПЕПТИД
<223>  Полноразмерная аминокислотная последовательность мышиного B7H3
<400>  2
Met Leu Arg Gly Trp Gly Gly Pro Ser Val Gly Val Cys Val Arg Thr
1               5                   10                  15
Ala Leu Gly Val Leu Cys Leu Cys Leu Thr Gly Ala Val Glu Val Gln
20                  25                  30
Val Ser Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Asp Thr Asp Ala Thr Leu
35                  40                  45
Arg Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn
50                  55                  60
Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr
65                  70                  75                  80
Glu Gly Arg Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Arg Thr Ala Leu Phe
85                  90                  95
Pro Asp Leu Leu Val Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val
100                 105                 110
Arg Val Thr Asp Glu Gly Ser Tyr Thr Cys Phe Val Ser Ile Gln Asp
115                 120                 125
Phe Asp Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys
130                 135                 140
Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asn Met
145                 150                 155                 160
Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val
165                 170                 175
Phe Trp Lys Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr
180                 185                 190
Ser Gln Met Ala Asn Glu Arg Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu
195                 200                 205
Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn
210                 215                 220
Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln
225                 230                 235                 240
Pro Leu Thr Phe Pro Pro Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser
245                 250                 255
Val Cys Leu Val Val Leu Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg
260                 265                 270
Lys Ile Lys Gln Ser Cys Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln
275                 280                 285
Asp Gly Asp Gly Glu Gly Ser Lys Thr Ala Leu Arg Pro Leu Lys Pro
290                 295                 300
Ser Glu Asn Lys Glu Asp Asp Gly Gln Glu Ile Ala
305                 310                 315
<210>  3
<211>  223
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ПЕПТИД
<223>  Человеческий антиген B7H3: 2Ig-B7H3
<400>  3
Leu Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr
1               5                   10                  15
Asp Ala Thr Leu Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu
20                  25                  30
Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val
35                  40                  45
His Ser Phe Ala Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg
50                  55                  60
Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg
65                  70                  75                  80
Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val
85                  90                  95
Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg
115                 120                 125
Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro
130                 135                 140
Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly
145                 150                 155                 160
Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val
165                 170                 175
His Ser Ile Leu Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys
180                 185                 190
Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr
195                 200                 205
Ile Thr Pro Gln Arg Ser Pro Thr Gly His His His His His His
210                 215                 220
<210>  4
<211>  439
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ПЕПТИД
<223>  Человеческий антиген B7H3: 4Ig-B7H3
<400>  4
Leu Glu Val Gln Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr
1               5                   10                  15
Asp Ala Thr Leu Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu
20                  25                  30
Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val
35                  40                  45
His Ser Phe Ala Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg
50                  55                  60
Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg
65                  70                  75                  80
Leu Gln Arg Val Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val
85                  90                  95
Ser Ile Arg Asp Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg
115                 120                 125
Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro
130                 135                 140
Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly
145                 150                 155                 160
Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val
165                 170                 175
His Ser Ile Leu Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys
180                 185                 190
Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Ser Ser Val Thr
195                 200                 205
Ile Thr Pro Gln Arg Ser Pro Thr Gly Ala Val Glu Val Gln Val Pro
210                 215                 220
Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu Arg Cys
225                 230                 235                 240
Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn Leu Ile
245                 250                 255
Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Thr Glu Gly
260                 265                 270
Arg Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe Pro Asp
275                 280                 285
Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val Arg Val
290                 295                 300
Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp Phe Gly
305                 310                 315                 320
Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys Pro Ser
325                 330                 335
Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr
340                 345                 350
Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp
355                 360                 365
Gln Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln
370                 375                 380
Met Ala Asn Glu Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val
385                 390                 395                 400
Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val
405                 410                 415
Leu Gln Gln Asp Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met
420                 425                 430
Thr His His His His His His
435
<210>  5
<211>  222
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ПЕПТИД
<223>  Мышиный антиген  B7H3
<400>  5
Val Glu Val Gln Val Ser Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Asp Thr
1               5                   10                  15
Asp Ala Thr Leu Arg Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu
20                  25                  30
Ala Gln Leu Asn Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val
35                  40                  45
His Ser Phe Thr Glu Gly Arg Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ser Asn Arg
50                  55                  60
Thr Ala Leu Phe Pro Asp Leu Leu Val Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg
65                  70                  75                  80
Leu Gln Arg Val Arg Val Thr Asp Glu Gly Ser Tyr Thr Cys Phe Val
85                  90                  95
Ser Ile Gln Asp Phe Asp Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala
100                 105                 110
Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu Pro Asn Lys Asp Leu Arg
115                 120                 125
Pro Gly Asn Met Val Thr Ile Thr Cys Ser Ser Tyr Gln Gly Tyr Pro
130                 135                 140
Glu Ala Glu Val Phe Trp Lys Asp Gly Gln Gly Val Pro Leu Thr Gly
145                 150                 155                 160
Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu Arg Gly Leu Phe Asp Val
165                 170                 175
His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala Asn Gly Thr Tyr Ser Cys
180                 185                 190
Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp Ala His Gly Ser Val Thr
195                 200                 205
Ile Thr Gly Gln Pro Leu Thr Phe His His His His His His
210                 215                 220
<210>  6
<211>  119
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  Домен
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи h1702
<400>  6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Ser
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Ala Arg Leu Tyr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Ala Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  7
<211>  110
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  Вариабельная область легкой цепи h1702
<400>  7
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser
20                  25                  30
His Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Met
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65                  70                  75                  80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Ile His Val Asp Arg
85                  90                  95
Asp Ile Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100                 105                 110
<210>  8
<211>  119
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  Вариабельная область тяжелой цепи h1703
<400>  8
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Tyr Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Gly Val Gly Pro Val His Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210>  9
<211>  108
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  Вариабельная область легкой цепи h1703
<400>  9
Asp Ile Arg Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Ile Leu Leu Ile
35                  40                  45
Asn Ala Val Ser Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Met
85                  90                  95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100                 105
<210>  10
<211>  8
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  h1702 HCDR1
<400>  10
Gly Phe Ile Phe Ser Ser Ser Ala
1               5
<210>  11
<211>  8
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  h1702 HCDR2
<400>  11
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1               5
<210>  12
<211>  12
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  h1702 HCDR3
<400>  12
Ala Arg Ser Ala Arg Leu Tyr Ala Ser Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>  13
<211>  9
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  h1702 LCDR1
<400>  13
Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser His Tyr
1               5
<210>  14
<211>  3
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  h1702 LCDR2
<400>  14
Asn Thr Asn
1
<210>  15
<211>  10
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<223>  h1702 LCDR3
<400>  15
Ala Ile His Val Asp Arg Asp Ile Trp Val
1               5                   10
<210>  16
<211>  8
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  h1703 HCDR1
<400>  16
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1               5
<210>  17
<211>  8
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  h1703 HCDR2
<400>  17
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1               5
<210>  18
<211>  12
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  h1703 HCDR3
<400>  18
Ala Lys Gly Val Gly Pro Val His Ala Leu Asp Val
1               5                   10
<210>  19
<211>  6
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  h1703 LCDR1
<400>  19
Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
1               5
<210>  20
<211>  3
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  h1703 LCDR2
<400>  20
Ala Val Ser
1
<210>  21
<211>  10
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  h1703 LCDR3
<400>  21
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Met Trp Thr
1               5                   10
<210>  22
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  Тяжелая цепь h1702-IgG1
<400>  22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Ser
20                  25                  30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Arg Ser Ala Arg Leu Tyr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
Lys
<210>  23
<211>  216
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  Легкая цепь h1702
<400>  23
Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser
20                  25                  30
His Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Met
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65                  70                  75                  80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Ile His Val Asp Arg
85                  90                  95
Asp Ile Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115                 120                 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165                 170                 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180                 185                 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195                 200                 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210                 215
<210>  24
<211>  449
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  Тяжелая цепь h1703-IgG1
<400>  24
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20                  25                  30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35                  40                  45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50                  55                  60
Lys Gly Arg Tyr Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85                  90                  95
Ala Lys Gly Val Gly Pro Val His Ala Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly
100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115                 120                 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130                 135                 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145                 150                 155                 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165                 170                 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180                 185                 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195                 200                 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210                 215                 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225                 230                 235                 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245                 250                 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260                 265                 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275                 280                 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290                 295                 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305                 310                 315                 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325                 330                 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340                 345                 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355                 360                 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370                 375                 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385                 390                 395                 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405                 410                 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420                 425                 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435                 440                 445
Lys
<210>  25
<211>  215
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  Легкая цепь h1703
<400>  25
Asp Ile Arg Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr
20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Ile Leu Leu Ile
35                  40                  45
Asn Ala Val Ser Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Met
85                  90                  95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100                 105                 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115                 120                 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130                 135                 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145                 150                 155                 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165                 170                 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180                 185                 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195                 200                 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210                 215
<210>  26
<211>  215
<212>  ПРТ
<213>  Искусственная последовательность
<220>
<221>  ДОМЕН
<223>  Легкая цепь h1702-1
<400>  26
Asp Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser
20                  25                  30
His Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Met
35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50                  55                  60
Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65                  70                  75                  80
Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Ile His Val Asp Arg
85                  90                  95
Asp Ile Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100                 105                 110
Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115                 120                 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130                 135                 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys
145                 150                 155                 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165                 170                 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180                 185                 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195                 200                 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys
210                 215
<---