СПОСОБЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АЛЬФА-1-АНТИТРИПСИНА (AAT) И КОМПОЗИЦИЙ НА ЕГО ОСНОВЕ

1. Способ получения рекомбинантного белка альфа-1-антитрипсина человека (AAT), включающий:
a) введение в клетку-хозяина экспрессионного вектора, содержащего фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий белок AAT человека;
b) культивирование клетки-хозяина в условиях, которые делают возможным экспрессию рекомбинантного белка AAT человека; и
c) выделение рекомбинантного белка AAT человека из культивируемой клетки-хозяина, таким образом продуцируя рекомбинантный белок AAT человека.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фрагмент нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую кодон-оптимизированную для клетки CHO последовательность AAT человека (и запускается оптимизированным конститутивным промотором).
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что стадия введения включает котрансфекцию экспрессионного вектора рекомбинантного AAT человека и экспрессионного вектора, кодирующего транспозазу.
4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что транспозаза представляет собой транспозазу piggyBac.
5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку.
6. Способ по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что клетка-хозяин представляет собой клеточную линию яичника китайского хомячка (CHO).
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что клеточная линия CHO представляет собой модифицированную клеточную линию CHO.
8. Способ по любому из пп. 1-7, отличающийся тем, что стадию культивирования осуществляют в культуральной среде, и культуральная среда содержит менее около 5% (об./об.) компонентов животного происхождения.
9. Способ по любому из пп. 1-8, отличающийся тем, что стадию культивирования осуществляют в культуральной среде, и культуральная среда содержит менее около 2% (об./об.) компонентов животного происхождения.
10. Способ по любому из пп. 1-9, отличающийся тем, что стадию культивирования осуществляют в культуральной среде, и культуральная среда состоит из композиции с определенным химическим составом и не содержит рекомбинантный инсулин человека или любой другой белок.
11. Способ по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что количество полученного рекомбинантного белка AAT человека составляет от около 1 г/л до около 10 г/л рекомбинантного белка AAT человека.
12. Способ по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что количество полученного рекомбинантного белка AAT человека составляет от около 2 г/л до около 6 г/л рекомбинантного белка AAT человека.
13. Способ по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что стадия культивирования включает:
отбор клетки-хозяина с фрагментом нуклеиновой кислоты, экспрессирующей рекомбинантный белок человека AAT, причем отобранные клетки представляют собой клетки, полученные клональным способом, экспрессирующие рекомбинантный AAT человека.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что стадия отбора включает:
a) культивирование клеток, полученных клональным способом, экспрессирующих рекомбинантный AAT человека, в культуральной среде;
b) подпитку полученных клональным способом клеток, экспрессирующих рекомбинантный AAT человека, по меньшей мере одной питательной добавкой;
c) выдерживание культуральной среды при температуре культивирования клеток;
d) снижение температуры культивирования клеток; и
e) культивирование полученных клональным способом клеток при сниженной температуре культивирования, при этом полученные клональным способом клетки экспрессируют рекомбинантный белок AAT человека с титром около 1 г/л или выше.
15. Способ по любому из пп. 13-14, отличающийся тем, что полученные клональным способом клетки экспрессируют рекомбинантный белок AAT человека с титром выше чем около 4 г/л.
16. Способ по любому из пп. 13-15, отличающийся тем, что полученные клональным способом клетки экспрессируют рекомбинантный белок AAT человека с титром выше чем около 6 г/л.
17. Способ по любому из пп. 14-16, отличающийся тем, что температура культивирования клеток находится в интервале от около 35°C до около 38°C.
18. Способ по любому из пп. 14-17, отличающийся тем, что указанную температуру культивирования клеток поддерживают от 0 дня до 3 дня или от 0 дня до 5 дня.
19. Способ по любому из пп. 14-18, отличающийся тем, что сниженная температура культивирования клеток находится в интервале от около 25°C до около 34°C.
20. Способ по любому из пп. 14-19, отличающийся тем, что среду для культивирования клеток выдерживают при сниженной температуре культивирования клеток от 3 дня до 17 дня, от 3 дня до 5 дня или от 5 дня до 17 дня или в течение их комбинаций.
21. Способ по любому из пп. 14-20, отличающийся тем, что по меньшей мере одна питательная добавка содержит нейтральную питательную добавку.
22. Способ по п. 19, отличающийся тем, что нейтральная питательная добавка составляет по объему от около 1 % до около 8 % от общего объема клеточной культуры.
23. Способ по любому из пп. 14-22, отличающийся тем, что по меньшей мере одна питательная добавка содержит щелочную питательную добавку.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что щелочная питательная добавка составляет по объему от около 0,1 % до около 0,8 % от общего объема клеточной культуры.
25. Способ по любому из пп. 14-24, отличающийся тем, что по меньшей мере одна питательная добавка содержит нейтральную питательную добавку и щелочную питательную добавку.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что количество щелочной питательной добавки составляет одну десятую (1/10) от количества нейтральной питательной добавки.
27. Способ по любому из пп. 14-26, отличающийся тем, что стадию подпитки осуществляют каждый день.
28. Способ по любому из пп. 14-26, отличающийся тем, что стадию подпитки осуществляют через день.
29. Способ по любому из пп. 1-28, отличающийся тем, что стадия культивирования включает осмолярность клеточной культуры около 550 мОсм/кг или более.
30. Способ по любому из пп. 1-29, отличающийся тем, что стадия культивирования включает осмолярность клеточной культуры около 550 мОсм/кг или более в 5 день или позже.
31. Способ получения рекомбинантного белка альфа-1-антитрипсина человека (AAT), включающий:
a) введение в эукариотическую клетку-хозяина первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека, и по меньшей мере дополнительной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу;
b) культивирование эукариотической клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека;
c) отбор эукариотической клетки-хозяина с фрагментом нуклеиновой кислоты, экспрессирующей белок AAT человека, причем отобранные клетки представляют собой клетки, полученные клональным способом, экспрессирующие рекомбинантный белок AAT человека; и
d) выделение рекомбинантного белка AAT человека из полученных клональным способом клеток, таким образом продуцируя рекомбинантный белок AAT человека.
32. Способ по п. 31, отличающийся тем, что эукариотическую клетку-хозяина трансформируют с помощью последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей рекомбинантный белок AAT человека.
33. Способ по п. 31 или 32, отличающийся тем, что стадия выделения включает очистку рекомбинантного белка AAT человека.
34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что стадию очистки осуществляют по меньшей мере одним из: эксклюзионной хроматографии, аффинной хроматографии, ионообменной хроматографии, хроматографии гидрофобных взаимодействий, обратно-фазовой хроматографии, гель-фильтрации, разделения с помощью магнитных носителей, селективного осаждения, мембранного фильтрования или вытеснения в зависимости от молекулярной массы, замены буфера, фильтрации вирусов, инактивации вирусов в зависимости от pH и тому подобного.
35. Способ по любому из пп. 1-34, отличающийся тем, что выделенный рекомбинантный белок человека имеет чистоту около или выше чем около 95%.
36. Способ по любому из пп. 1-35, отличающийся тем, что выделенный рекомбинантный белок человека имеет чистоту около или выше чем около 98%.
37. Экспрессионный вектор, содержащий фрагмент нуклеиновой кислоты, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую рекомбинантный белок AAT человека, при этом фрагмент нуклеиновой кислоты расположен в сайте множественного клонирования; интрон выше фрагмента нуклеиновой кислоты; промотор цитомегаловируса (CMV) выше интрона; 5'-инвертированный концевой повтор (5' ITR) выше промотора CMV; поли-аденозиновую хвостовую сигнальную последовательность ниже фрагмента нуклеиновой кислоты; последовательность начала репликации ниже фрагмента нуклеиновой кислоты; селектируемую маркерную последовательность ниже последовательности начала репликации; и 3'-инвертированный концевой повтор (3' ITR) ниже селектируемой маркерной последовательности.
38. Экспрессионный вектор по п. 37, отличающийся тем, что последовательность селектируемого маркера представляет собой ген устойчивости к пуромицину.
39 . Экспрессионный вектор по любому из пп. 37-38, отличающийся тем, что фрагмент нуклеиновой кислоты и последовательность селектируемого маркера расположены в противоположных рамках считывания и между 5' ITR и 3' ITR.
40. Экспрессионный вектор по любому из пп. 37-39, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность кодирует последовательность рекомбинантного полипептида AAT человека с по меньшей мере одной из: SEQ ID №:1, SEQ ID №:3, SEQ ID №:5 и SEQ ID №:6.
41. Экспрессионный вектор по любому из пп. 37-40, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность рекомбинантного полипептида AAT человека, содержит последовательность с по меньшей мере одной из: SEQ ID №:2, SEQ ID №:4, SEQ ID №:6 и SEQ ID №:8.
42. Экспрессионный вектор по любому из пп. 37-41, отличающийся тем, что экспрессионный вектор содержит SEQ ID №: 9.
43. Рекомбинантный белок AAT человека, содержащий полипептидную последовательность, которая на около 99% идентична SEQ ID №: 1.
44. Рекомбинантный белок AAT человека по п. 43, содержащий полипептидную последовательность, имеющую мутацию в SEQ ID №: 1, при этом мутация представляет собой замену фенилаланина на лейцин в положении 51 (F51L), замену метионина на валин в положении 351 (M351V), замену метионина на валин в положении 358 (M358V) или любую их комбинацию.
45. Рекомбинантный белок AAT человека по любому из пп. 43-44, содержащий сиаловую кислоту в количестве в диапазоне от около 3 молей сиаловой кислоты на моль AAT до около 12 молей сиаловой кислоты на моль AAT.
46. Рекомбинантный белок AAT по п. 45, отличающийся тем, что содержание сиаловой кислоты находится в диапазоне от около 4 молей сиаловой кислоты на моль AAT до около 6 молей сиаловой кислоты на моль AAT.
47. Рекомбинантный белок AAT по любому из пп. 45-46, отличающийся тем, что содержание сиаловой кислоты превышает таковое в белке AAT, полученном из плазмы, по меньшей мере на 10%.
48. Композиция, содержащая рекомбинантный белок AAT человека, полученный с помощью способа по любому из пп. 1-36, и фармацевтически приемлемый носитель.
49. Композиция, содержащая рекомбинантный белок AAT человека по любому из пп. 43-47 и фармацевтически приемлемый носитель.
50. Способ лечения субъекта, страдающего от дефицита альфа-1-антитрипсина, включающий введение субъекту эффективного количества рекомбинантного белка AAT человека по любому из пп. 43-47 для ослабления дефицита альфа-1-антитрипсина у субъекта, осуществляя таким образом лечение субъекта.
51. Способ лечения субъекта, страдающего от заболевания, которое приводит к вызванному протеазой повреждению тканей, включающий введение субъекту эффективного количества рекомбинантного белка AAT человека по любому из пп. 43-47 для ослабления вызванного протеазой повреждения тканей у субъекта, осуществляя таким образом лечение субъекта.
52. Способ по любому из пп. 50-51, отличающийся тем, что рекомбинантный белок AAT человека представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую рекомбинантный белок AAT человека и фармацевтически приемлемый носитель.
53. Способ по любому из пп. 50-52, отличающийся тем, что введение осуществляют с помощью по меньшей мере одного пути, выбранного из группы, состоящей из: внутривенного, парентерального, через слизистую, местного, трансдермального или путем ингаляции.
54. Способ получения рекомбинантного белка альфа-1-антитрипсина (AAT) человека, включающий: культивирование клетки-хозяина с первой последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок AAT человека, и по меньшей мере второй последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей транспозазу, причем стадию культивирования осуществляют в первый период времени при первой температуре и во второй период времени при второй температуре и необязательно в третий период времени при третьей температуре.
55. Способ по п. 54, отличающийся тем, что вторая температура меньше, чем первая температура.
56. Способ по п. 55, отличающийся тем, что третья температура меньше, чем вторая температура.
57. Способ по п. 56, отличающийся тем, что первая температура находится в диапазоне от около 31°C до около 37°C.
58. Способ по п. 57, отличающийся тем, что вторая температура находится в интервале от около 31°C до около 37°C.
59. Способ по п. 58, отличающийся тем, что третья температура находится в интервале от около 31°C до около 37°C.
60. Способ по п. 59, отличающийся тем, что первый период времени находится в диапазоне около 1-20 дней.
61. Способ по п. 60, отличающийся тем, что второй период времени находится в диапазоне около 1-20 дней.
62. Способ по п. 61, отличающийся тем, что третий период времени находится в диапазоне около 1-20 дней.
63. Способ по п. 62, отличающийся тем, что стадия культивирования дополнительно включает добавление первой питательной добавки и второй питательной добавки.
64. Способ по п. 63, отличающийся тем, что стадию добавления осуществляют через день.
65. Способ по п. 64, отличающийся тем, что стадию добавления осуществляют каждый день.
66. Способ по п. 65, отличающийся тем, что культуру для продуцирования насыщают кислородом только с помощью воздуха, избегая чистый кислород.
67. Способ лечения субъекта, страдающего от чрезмерного продуцирования иммунных факторов, включающий введение субъекту эффективного количества рекомбинантного белка AAT человека по любому из пп. 43-47 для снижения чрезмерного продуцирования иммунных факторов у субъекта, осуществляя таким образом лечение субъекта.
68. Способ по п. 67, отличающийся тем, что иммунный фактор выбран из ФНО, ИЛ-2 или тому подобного или их комбинаций.