СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗНАЧИМОСТИ РАЗЛИЧИЙ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЯ СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОФЛЮОРИМЕТРИИ
METHOD FOR DETERMINE THE SIGNIFICANCE OF DIFFERENCES IN LYMPHOCYTE SUBPOPULATION MEASUREMENT RESULTS BY FLOW CYTOFLUOROMETRY

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для определения значимости различий результатов измерений субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитофлюориметрии.
Поиск адекватных биомаркеров для прогнозирования и оценки эффективности лечения является одной из главных и нерешенных проблем в применении иммунотерапевтических методов лечения. Такими маркерами могут стать параметры иммунного статуса, определяемые методом проточной цитофлюориметрии. Однако разработка подобных подходов затрудняется в связи с низкой воспроизводимостью результатов измерений [Finak, G., Langweiler, М., Jaimes, М., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. // Scientific Reports. - 2016. - Vol. 6. - 20686.][Bainbridge, J., Wilkening, C.L., Rountree, W. et al. The Immunology Quality Assessment Proficiency Testing Program for CD3(+)4(+) and CD3(+)8(+) lymphocyte subsets: a ten year review via longitudinal mixed effects modeling. // Journal of Immunological Methods. - 2014. - Vol. 409. - P. 82-90.].
Анализ субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитофлюориметрии основан на последовательном мануальном или автоматическом гейтировании. Как показали G. Finak и соавт. в исследовании, оценивающем вклад разных этапов определения субпопуляций лимфоцитов в вариабельность результатов, этот метод характеризуется неизбежными систематическими ошибками. Исследуя один и тот же образец периферической крови, можно исключить вариабельность, связанную с его биологическими характеристиками. Внедрение в лабораторную практику стандартных операционных процедур позволяет повысить воспроизводимость результатов благодаря стандартизации пробоподготовки, (однако такая стандартизация отсутствует для определения субпопуляций лимфоцитов), а проведение внешнего контроля качества направлено на снижение вариабельности, обусловленной оборудованием. Межлабораторную вариабельность можно снизить, организовав анализ результатов в центральной лаборатории. Также для некоторых субпопуляций лимфоцитов показано повышение воспроизводимости при использовании автоматического гейтирования по сравнению с мануальным. Однако, даже сочетание всех этих подходов не позволило исключить остаточную вариабельность при оценке субпопуляционного состава лимфоцитов [Finak, G., Langweiler, М., Jaimes, М., etal. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. // Scientific Reports. - 2016. - Vol. 6. - 20686.]. Очевидно, источником этой вариабельности является сам процесс гейтирования.
Таким образом, стандартизация преаналитического этапа, контроль качества, централизация и автоматизация гейтирования не позволяют полностью нивелировать вариабельность измерений субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитофлюориметрии. В связи с этим, при повторном измерении могут выявляться различия, которые будут являться ложноположительным результатом. Это требует разработки специальных подходов к сравнению результатов измерения субпопуляций лимфоцитов и их соотношений методом проточной цитофлюориметрии.
Стандартным способом оценки межисследовательской и внутриисследовательской вариабельности является метод Блэнда - Алтмана, который заключается в определении систематических ошибок и степени разброса полученных результатов в связанных выборках.
Недостатком данного способа является отсутствие принятых рекомендаций относительно применения значений вариабельности в клинической практике, а также необходимость выполнять подобные сравнения в каждой лаборатории для каждого показателя. Поэтому, данные, полученные с помощью метода Блэнда - Алтмана, используются для внешнего контроля качества в лабораториях или для изучения новых методов диагностики, однако способов их применения для сравнения индивидуальных или обобщенных результатов иммунологических обследований не разработано.
Решение, аналогичное заявляемому способу, при наличии подобных проблем, связанных с низкой воспроизводимостью, применялось при разработке критериев оценки ответа солидных опухолей на терапию (Response Evaluation Criteria for Solid Tumors, RECIST) с использованием радиологических методов оценки, которые также включают в себя погрешности, связанные с индивидуальными особенностями измерения очагов исследователем. Разработанные на основе критериев ВОЗ и пересмотренные в 2009 году, критерии RECIST 1.1 [Eisenhauer, Е.А., Therasse, P., Bogaerts, J. et al. New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1). // European Journal of Cancer. - 2009. - Vol. 45. - №2. - P. 228-247] и их модификация для оценки ответа на иммунотерапию irRC [Wolchok, J.D., Hoos, A., O’Day, S., et al. (2009). Guidelines for the evaluation of immune therapy activity in solid tumors: immune-related response criteria. // Clinical Cancer Research. - Vol. 15. - №.23. - P. 7412-7420] определяют ответ опухоли на лечение, соответствующим одной из 4 категорий: полный регресс (отсутствие всех образований), частичный регресс (снижение суммы наибольших размеров целевых образований более чем на 30%), прогрессирование заболевания (увеличение суммы наибольших размеров целевых образований более чем на 20%) и стабилизация заболевания (отсутствие ответа или прогрессирования). В связи со спецификой оценки результатов компьютерной томографии выбор границ ответа на лечение обусловлен вариабельностью измерений. Так, согласно мета-анализу, проведенному S.Н. Yoon и соавт., даже при замерах одним специалистом, 95% предел согласия относительного различия измерения для одного измерения очага по наибольшему диаметру определялся в диапазоне от -17,8% (95% ДИ, -23,6% - -11,9%) до 16,1% (95% ДИ, 10,1% - 21,8%), для суммы очагов - в диапазоне от -9,8 (95% ДИ, -19,0 - -0,3) до 13,1 (95% ДИ, 3,6 - 22,6). При оценке разными специалистами вариабельность результатов увеличивалась [Yoon, S.Н., Kim, K.W., Goo, J.М., Kim, D.W., Hahn, S. Observer variability in RECIST-based tumour burden measurements: A meta-analysis. // European Journal of Cancer. - 2016. - Vol. 53. - P. 5-15].
Результат сравнения двух измерений количества субпопуляций лимфоцитов может быть также расценен как уменьшение (снижение относительного или абсолютного количества), рост (увеличение показателя) или стабильное состояние. При этом необходимы четкие пороговые значения для отнесения результата сравнения к одной из этих категорий.
Таким образом, предлагаемый принцип сравнения результатов измерений уже используется в других системах для решения похожих задач, вместе с тем решение поставленной технической задачи, связанной со сравнением результатов оценки субпопуляционного состава лимфоцитов, отсутствует.
Технический результат, достигаемый заявляемым изобретением, заключается в определении минимальных пороговых значений (минимально определяемых различий между показателями) для определения значимости различий результатов измерения субпопуляции лимфоцитов при сопоставлении двух и более измерений.
Указанный технический результат достигается в способе определения значимости различий результатов измерения субпопуляции лимфоцитов методом проточной цитофлюориметрии, заключающемся в том, что определяют среднее значение М сравниваемых результатов измерения и абсолютное значение их разности D в выбранных единицах измерения, для среднего значения М определяют соответствующее значение минимального определяемого различия MDD между результатами измерения MDD по таблице соответствия, сравнивают абсолютное значение разности D со значением минимального определяемого различия MDD:
и при D>MDD различия в результатах измерения считают значимыми.
Как упоминалось выше, результат сравнения двух измерений количества субпопуляций лимфоцитов может быть оценен как снижение, увеличение или стабильное состояние измеряемого показателя (результата измерения), выраженного в абсолютных или относительных единицах.
В ходе исследования вариабельности измерений субпопуляций лимфоцитов было выявлено, что данный показатель зависит от размера субпопуляции и единиц измерения показателя (результата измерения) и не зависит от используемых для измерения маркеров. Это позволило определить минимальные определяемые различия MDD между показателями, в пределах которых невозможно достоверно отличить вариабельность измерений от истинного изменения значения показателя, что нашло отражение в табл. 1.
Способ осуществляют, например, следующим образом.
При измерении уровня субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитофлюориметрии определяют значимость различий двух и более проводимых измерений в соответствующих единицах измерения (абсолютных или относительных) или без таковых для соотношения показателей. Определяют среднее значение М сравниваемых результатов измерения и абсолютное значение их разности D и для среднего значения М определяют соответствующее значение минимального определяемого различия MDD по табл. 1, сравнивают абсолютное значение разности D со значением минимального определяемого различия и при D>MDD полученные различия в результатах измерения считают значимыми.
Способ подтверждается следующими клиническими примерами.
Пример 1. Пациент Д. Проходил лечение по поводу диссеминированной меланомы кожи. Для оценки эффективности лечения измеряли уровень и определяли значимость различий результатов измерений Т-лимфоцитов заявляемым способом. Последовательно наблюдали у пациента следующее содержание Т-лимфоцитов (CD3+CD19-): 0,7498×10^9/л, 1,0752×10^9/л, 0,6786×10^9/л, 0,6239×10^9/л. При простом сравнении можно сделать вывод о значительном отличии между каждым из этих показателей. При применении заявляемого способа становится ясно, что различий между третьим и четвертым измерениями нет, поскольку значение минимального определяемого различия MDD для определения значимости различий результатов измерений для этих показателей составляют 0,0764*10^9/л, а разница между измерениями составляет всего 0,0547×10^9/л.
Пример 2. У пациента С. проводилось сравнение результатов оценки относительного содержания CD4+ лимфоцитов. При первом измерении уровень составлял 30%, при втором - 44, 3%. Разница между значениями составила 14,3%, среднее значение - 37,15%. В соответствии с табл. 1 MDD для данных результатов измерения составляет 4,56%, поэтому различия между ними следует считать значимыми.
Пример 3. Заявленный способ может быть использован и для оценки результатов в рамках проведения исследования у группы пациентов.
В табл. 2 приведен пример оценки соотношения субпопуляций NK-клеток (CD3-CD16+CD56+) с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CD3+CD8+) при повторных измерениях одних и тех же образцов.
Медианы значений показателя в первой группе составили 0,5732 и 0,5888 для 1 и 2 измерения соответственно. При применении классических непараметрических методов сравнения двух зависимых наблюдений (критерий знаков для связанных выборок, критерий знаковых рангов Вилкоксона для связанных выборок) были обнаружены статистически значимые различия (р<0,001) для обоих критериев, что требует принятия утверждения о значимости различий двух измерений. При применении заявленного способа к каждому наблюдению получается, что ни одного действительно значимого отклонения не произошло. Если же применить критерий к полученным медианам показателей, то их различия также оказываются меньше минимальной определяемой разницы в заявленном способе оценки, что требует отвергнуть предположение о значимости различий. В данном примере эксперимент был специально построен для определения воспроизводимости методики. В случае оценки соотношения субпопуляций NK-клеток (CD3-CD16+CD56+) с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CD3+CD8+) до и после действия того или иного фактора в похожих условиях могут быть получены неверные и невоспроизводимые в дальнейшем результаты, которых можно избежать, применяя заявленный нами способ сравнения иммунологических показателей.
Заявляемый способ позволяет применять правила принятия решений для сравнения результатов измерений субпопуляций лимфоцитов и их соотношений методом проточной цитофлюориметрии. При этом определен диапазон значений, в пределах которого различия между измерениями не могут быть адекватно измерены с применением современной методологии подсчета субпопуляций лимфоцитов. Рассчитанные значения минимально определяемых различий могут быть использованы в качестве нулевой точки для качественной и полуколичественной системы оценки иммунологических изменений.