СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ НАЦЕЛЕННОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ПОСРЕДСТВОМ ОДНОЭТАПНОГО МНОЖЕСТВЕННОГО НАЦЕЛИВАНИЯ

1. Способ модификации целевого геномного локуса в клетке, включающий в себя:
(a) введение в клетку нуклеазного агента, который осуществляет одно- или двухцепочечный разрыв в пределах целевого геномного локуса;
(b) введение в клетку первого большого нацеливающего вектора (LTVEC), который имеет длину по меньшей мере 10 т.п.н. и содержит первую полинуклеотидную вставку, фланкированную первым 5' гомологичным плечом и первым 3' гомологичным плечом, и второго LTVEC, который имеет длину по меньшей мере 10 т.п.н. и содержит вторую полинуклеотидную вставку, фланкированную вторым 5' гомологичным плечом и вторым 3' гомологичным плечом,
причем первое 3' гомологичное плечо первого LTVEC имеет первую перекрывающуюся последовательность, гомологичную второму 5' гомологичному плечу второго LTVEC, и первое 5' гомологичное плечо первого LTVEC и второе 3' гомологичное плечо второго LTVEC гомологичны соответствующим геномным сегментам в пределах целевого геномного локуса,
при этом целевой геномный локус модифицирован путем интеграции первой полинуклеотидной вставки и второй полинуклеотидной вставки между соответствующими геномными сегментами; и
(c) отбор клетки с проведенным нацеливанием, содержащей первую полинуклеотидную вставку и вторую полинуклеотидную вставку, интегрированные в целевой геномный локус.
2. Способ по п. 1, в котором первая полинуклеотидная вставка и первое 3' гомологичное плечо и вторая полинуклеотидная вставка и второе 5' гомологичное плечо представляют собой перекрывающиеся фрагменты непрерывной нуклеиновой кислоты, которая подвергается реформированию путем интеграции первой полинуклеотидной вставки и второй полинуклеотидной вставки в целевой геномный локус.
3. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первая полинуклеотидная вставка, вторая полинуклеотидная вставка или обе получены от вида, который отличается от вида, к которому относится клетка.
4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первая полинуклеотидная вставка, вторая полинуклеотидная вставка или обе представляют собой человеческие нуклеиновые кислоты.
5. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором суммарный размер первой полинуклеотидной вставки и второй полинуклеотидной вставки составляет от приблизительно 50 т.п.н. до приблизительно 500 т.п.н., от приблизительно 50 т.п.н. до приблизительно 300 т.п.н., от приблизительно 50 т.п.н. до приблизительно 75 т.п.н., от приблизительно 75 т.п.н. до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 т.п.н. до 125 т.п.н., от приблизительно 125 т.п.н. до приблизительно 150 т.п.н., от приблизительно 150 т.п.н. до приблизительно 175 т.п.н., от приблизительно 175 т.п.н. до приблизительно 200 т.п.н., от приблизительно 200 т.п.н. до приблизительно 225 т.п.н., от приблизительно 225 т.п.н. до приблизительно 250 т.п.н., от приблизительно 250 т.п.н. до приблизительно 275 т.п.н., от приблизительно 275 т.п.н. до приблизительно 300 т.п.н., от приблизительно 300 т.п.н. до приблизительно 350 т.п.н., от приблизительно 350 т.п.н. до приблизительно 400 т.п.н., от приблизительно 400 т.п.н. до приблизительно 450 т.п.н. или от приблизительно 450 т.п.н. до приблизительно 500 т.п.н.
6. Способ по п. 5, в котором суммарный размер первой полинуклеотидной вставки и второй полинуклеотидной вставки составляет от приблизительно 100 т.п.н. до приблизительно 500 т.п.н.
7. Способ по п. 6, в котором суммарный размер первой полинуклеотидной вставки и второй полинуклеотидной вставки составляет приблизительно 300 т.п.н.
8. Способ по любому из пп. 1-4, в котором клетка с проведенным нацеливанием содержит геномную ДНК, содержащую вместе первую полинуклеотидную вставку и вторую полинуклеотидную вставку, которые имеют суммарный размер в диапазоне от приблизительно 5 т.п.н. до приблизительно 500 т.п.н.
9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором первая перекрывающаяся последовательность первого LTVEC по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или 99,9% идентична первой перекрывающейся последовательности второго LTVEC.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором размер первой перекрывающейся последовательности составляет от приблизительно 1 т.п.н. до приблизительно 70 т.п.н.
11. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором размер первой перекрывающейся последовательности составляет по меньшей мере 10 т.п.н. или по меньшей мере 20 т.п.н.
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором интеграция первой полинуклеотидной вставки, второй полинуклеотидной вставки или обеих в целевой геномный локус приводит к одному или более из:
(a) добавления экзогенной последовательности в целевом геномном локусе;
(b) делеции эндогенной последовательности в целевом геномном локусе;
и
(c) нокина, нокаута, точечной мутации, перестановки доменов, перестановки экзонов, перестановки интронов, перестановки регуляторных последовательностей, перестановки генов или их комбинации.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором комбинированное использование первого LTVEC и второго LTVEC приводит к повышению эффективности нацеливания по сравнению с использованием одиночного LTVEC.
14. Способ по п. 13, в котором повышение эффективности нацеливания составляет по меньшей мере 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 11 раз, 12 раз, 13 раз, 14 раз, 15 раз, 16 раз, 17 раз, 18 раз, 19 раз или 20 раз.
15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором общая длина 5' и 3' гомологичных плеч первого LTVEC или второго LTVEC составляет от приблизительно 10 т.п.н. до приблизительно 20 т.п.н., от приблизительно 20 т.п.н. до приблизительно 40 т.п.н., от приблизительно 40 т.п.н. до приблизительно 60 т.п.н., от приблизительно 60 т.п.н. до приблизительно 80 т.п.н., от приблизительно 80 т.п.н. до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 т.п.н. до приблизительно 120 т.п.н. или от приблизительно 120 т.п.н. до приблизительно 150 т.п.н.
16. Способ модификации целевого геномного локуса в клетке, включающий в себя:
(a) введение в клетку нуклеазного агента, который осуществляет одно- или двухцепочечный разрыв в пределах целевого геномного локуса;
(b) введение в клетку первого большого нацеливающего вектора (LTVEC), который имеет длину по меньшей мере 10 т.п.н. и содержит первую полинуклеотидную вставку, фланкированную первым 5' гомологичным плечом и первым 3' гомологичным плечом, второго LTVEC, который имеет длину по меньшей мере 10 т.п.н. и содержит вторую полинуклеотидную вставку, фланкированную вторым 5' гомологичным плечом и вторым 3' гомологичным плечом, и третьего LTVEC, который имеет длину по меньшей мере 10 т.п.н. и содержит третью полинуклеотидную вставку, фланкированную третьим 5' гомологичным плечом и третьим 3' гомологичным плечом,
причем первое 3' гомологичное плечо первого LTVEC имеет первую перекрывающуюся последовательность, гомологичную второму 5' гомологичному плечу второго LTVEC, второе 3' гомологичное плечо второго LTVEC имеет вторую перекрывающуюся последовательность, гомологичную третьему 5' гомологичному плечу третьего LTVEC, и первое 5' гомологичное плечо первого LTVEC и третье 3' гомологичное плечо третьего LTVEC гомологичны соответствующим геномным сегментам в пределах целевого геномного локуса,
при этом целевой геномный локус модифицирован путем интеграции первой полинуклеотидной вставки, второй полинуклеотидной вставки и третьей полинуклеотидной вставки между соответствующими геномными сегментами; и
(с) отбор клетки с проведенным нацеливанием, содержащей первую полинуклеотидную вставку, вторую полинуклеотидную вставку и третью полинуклеотидную вставку, интегрированные в целевой геномный локус.
17. Способ по п. 16, в котором первая полинуклеотидная вставка и первое 3' гомологичное плечо и вторая полинуклеотидная вставка и второе 5' гомологичное плечо представляют собой перекрывающиеся фрагменты непрерывной нуклеиновой кислоты, а вторая полинуклеотидная вставка и второе 3' гомологичное плечо и третья полинуклеотидная вставка и третье 5' гомологичное плечо представляют собой перекрывающиеся фрагменты непрерывной нуклеиновой кислоты, которая подвергается реформированию путем интеграции первой полинуклеотидной вставки, второй полинуклеотидной вставки и третьей полинуклеотидной вставки в целевой геномный локус.
18. Способ по п. 16 или 17, в котором одна или более из первой полинуклеотидной вставки, второй полинуклеотидной вставки и третьей полинуклеотидной вставки получены от вида, который отличается от вида, к которому относится клетка.
19. Способ по любому из пп. 16-18, в котором одна или более из первой полинуклеотидной вставки, второй полинуклеотидной вставки и третьей полинуклеотидной вставки представляют собой человеческие нуклеиновые кислоты.
20. Способ по любому из пп. 16-19, в котором суммарный размер первой полинуклеотидной вставки, второй полинуклеотидной вставки и третьей полинуклеотидной вставки составляет от приблизительно 50 т.п.н. до приблизительно 700 т.п.н., от приблизительно 50 т.п.н. до приблизительно 500 т.п.н., от приблизительно 50 т.п.н. до приблизительно 300 т.п.н., от приблизительно 50 т.п.н. до приблизительно 75 т.п.н., от приблизительно 75 т.п.н. до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 т.п.н. до приблизительно 125 т.п.н., от приблизительно 125 т.п.н. до приблизительно 150 т.п.н., от приблизительно 150 т.п.н. до приблизительно 175 т.п.н., от приблизительно 175 т.п.н. до приблизительно 200 т.п.н., от приблизительно 200 т.п.н. до приблизительно 225 т.п.н., от приблизительно 225 т.п.н. до приблизительно 250 т.п.н., от приблизительно 250 т.п.н. до приблизительно 275 т.п.н., от приблизительно 275 т.п.н. до приблизительно 300 т.п.н., от приблизительно 300 т.п.н. до приблизительно 350 т.п.н., от приблизительно 350 т.п.н. до приблизительно 400 т.п.н., от приблизительно 400 т.п.н. до приблизительно 450 т.п.н., от приблизительно 450 т.п.н. до приблизительно 500 т.п.н., от приблизительно 500 т.п.н. до приблизительно 550 т.п.н., от приблизительно 550 т.п.н. до приблизительно 600 т.п.н., от приблизительно 600 т.п.н. до приблизительно 650 т.п.н. или от приблизительно 650 т.п.н. до приблизительно 700 т.п.н.
21. Способ по п. 20, в котором суммарный размер первой полинуклеотидной вставки, второй полинуклеотидной вставки и третьей полинуклеотидной вставки составляет от приблизительно 100 т.п.н. до приблизительно 700 т.п.н.
22. Способ по п. 21, в котором суммарный размер первой полинуклеотидной вставки, второй полинуклеотидной вставки и третьей полинуклеотидной вставки составляет приблизительно 400 т.п.н.
23. Способ по любому из пп. 16-19, в котором клетка с проведенным нацеливанием содержит геномную ДНК, содержащую вместе первую полинуклеотидную вставку, вторую полинуклеотидную вставку и третью полинуклеотидную вставку, которые имеют суммарный размер в диапазоне от приблизительно 5 т.п.н. до приблизительно 700 т.п.н.
24. Способ по любому из пп. 16-23, в котором первая перекрывающаяся последовательность первого LTVEC по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или 99,9% идентична первой перекрывающейся последовательности второго LTVEC и/или вторая перекрывающаяся последовательность второго LTVEC по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или 99,9% идентична второй перекрывающейся последовательности третьего LTVEC.
25. Способ по любому из пп. 16-24, в котором размер первой перекрывающейся последовательности составляет от приблизительно 1 т.п.н. до приблизительно 70 т.п.н. и/или размер второй перекрывающейся последовательности составляет от приблизительно 1 т.п.н. до приблизительно 70 т.п.н.
26. Способ по любому из пп. 16-25, в котором размер первой перекрывающейся последовательности составляет по меньшей мере 10 т.п.н. или по меньшей мере 20 т.п.н. и/или размер второй перекрывающейся последовательности составляет по меньшей мере 10 т.п.н. или по меньшей мере 20 т.п.н.
27. Способ по любому из пп. 16-26, в котором интеграция одной или более из первой полинуклеотидной вставки, второй полинуклеотидной вставки или третьей полинуклеотидной вставки в целевой геномный локус приводит к одному или более из:
(a) добавления экзогенной последовательности в целевом геномном локусе;
(b) делеции эндогенной последовательности в целевом геномном локусе;
или
(c) нокина, нокаута, точечной мутации, перестановки доменов, перестановки экзонов, перестановки интронов, перестановки регуляторных последовательностей, перестановки генов или их комбинации.
28. Способ по любому из пп. 16-27, в котором общая длина 5' и 3' гомологичных плеч первого LTVEC, второго LTVEC или третьего LTVEC составляет от приблизительно 10 т.п.н. до приблизительно 20 т.п.н., от приблизительно 20 т.п.н. до приблизительно 40 т.п.н., от приблизительно 40 т.п.н. до приблизительно 60 т.п.н., от приблизительно 60 т.п.н. до приблизительно 80 т.п.н., от приблизительно 80 т.п.н. до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 т.п.н. до приблизительно 120 т.п.н. или от приблизительно 120 т.п.н. до приблизительно 150 т.п.н.
29. Способ по п. 12 или 27, в котором делеция эндогенной последовательности в целевом геномном локусе составляет от приблизительно 5 т.п.н. до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 10 т.п.н. до приблизительно 20 т.п.н., от приблизительно 20 т.п.н. до приблизительно 40 т.п.н., от приблизительно 40 т.п.н. до приблизительно 60 т.п.н., от приблизительно 60 т.п.н. до приблизительно 80 т.п.н., от приблизительно 80 т.п.н. до приблизительно 100 т.п.н., от приблизительно 100 т.п.н. до приблизительно 150 т.п.н., от приблизительно 150 т.п.н. до приблизительно 200 т.п.н., от приблизительно 200 т.п.н. до приблизительно 300 т.п.н., от приблизительно 300 т.п.н. до приблизительно 400 т.п.н., от приблизительно 400 т.п.н. до приблизительно 500 т.п.н., от приблизительно 500 т.п.н. до приблизительно 600 т.п.н., от приблизительно 600 т.п.н. до приблизительно 700 т.п.н. или от приблизительно 700 т.п.н. до приблизительно 800 т.п.н.
30. Способ усиления гомологичной рекомбинации в целевом геномном локусе в клетке, включающий в себя введение в клетку первого нацеливающего вектора и второго нацеливающего вектора, причем первый нацеливающий вектор содержит первую полинуклеотидную вставку, фланкированную первым 5' гомологичным плечом и первым 3' гомологичным плечом, а второй нацеливающий вектор содержит вторую полинуклеотидную вставку, фланкированную вторым 5' гомологичным плечом и вторым 3' гомологичным плечом,
при этом первое 3' гомологичное плечо и второе 5' гомологичное плечо содержат перекрывающуюся нуклеотидную последовательность; и
при этом первое 5' гомологичное плечо и второе 3' гомологичное плечо гомологичны соответствующим сегментам в целевом геномном локусе.
31. Способ по п. 30, в котором гомологичная рекомбинация усиливается в целевом геномном локусе без использования нуклеазного агента.
32. Способ по п. 30, дополнительно включающий в себя введение в клетку нуклеазного агента, который осуществляет одно- или двухцепочечный разрыв в целевом геномном локусе или вблизи него.
33. Способ по любому из пп. 1-29 и 32, в котором нуклеазный агент представляет собой нуклеазу с «цинковыми пальцами» (ZFN), эффекторную нуклеазу, подобную активатору транскрипции (TALEN), или мегануклеазу.
34. Способ по любому из пп. 1-29 и 32, в котором нуклеазный агент содержит белок (Cas), ассоциированный с короткими палиндромными повторами, регулярно расположенными группами (CRISPR), и гидовую РНК (гРНК).
35. Способ по п. 34, в котором белок Cas представляет собой Cas9.
36. Способ по любому из пп. 30-35, усиливающий гомологичную рекомбинацию первого нацеливающего вектора, второго нацеливающего вектора или обоих в целевом геномном локусе.
37. Способ по п. 36, в котором усиление гомологичной рекомбинации составляет по меньшей мере 1,5 раза, 2 раза, 2,5 раза, 3 раза, 4 раза, 5 раз, 6 раз, 7 раз, 8 раз, 9 раз, 10 раз, 11 раз, 12 раз, 13 раз, 14 раз, 15 раз, 16 раз, 17 раз, 18 раз, 19 раз или 20 раз.
38. Способ по любому из пп. 30-37, в котором перекрывающаяся последовательность первого нацеливающего вектора по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или 99,9% идентична перекрывающейся последовательности второго нацеливающего вектора.
39. Способ по любому из пп. 30-38, в котором перекрывающаяся последовательность составляет от приблизительно 1 т.п.н. до приблизительно 70 т.п.н.
40. Способ по любому из пп. 30-39, в котором перекрывающаяся последовательность составляет по меньшей мере 20 т.п.н.
41. Способ по любому из пп. 30-40, в котором первый нацеливающий вектор представляет собой первый большой нацеливающий вектор (LTVEC) в диапазоне от приблизительно 20 т.п.н. до приблизительно 200 т.п.н.
42. Способ по любому из пп. 30-41, в котором второй нацеливающий вектор представляет собой второй большой нацеливающий вектор (LTVEC) в диапазоне от приблизительно 20 т.п.н. до приблизительно 200 т.п.н.
43. Способ по п. 41 или 42, в котором общая длина 5' и 3' гомологичных плеч первого LTVEC составляет от 10 т.п.н. до приблизительно 200 т.п.н.
44. Способ по п. 42 или 43, в котором общая длина 5' и 3' гомологичных плеч второго LTVEC составляет от 10 т.п.н. до приблизительно 200 т.п.н.
45. Способ по любому из пп. 30-44, в котором перекрывающаяся нуклеотидная последовательность облегчает рекрутирование механизмов рекомбинации в целевой геномный локус.
46. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором клетка представляет собой человеческую клетку.
47. Способ по любому из пп. 1-45, в котором клетка представляет собой нечеловеческую клетку.
48. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором клетка представляет собой плюрипотентную клетку, гемопоэтическую стволовую клетку, нейрональную стволовую клетку или фибробластную клетку.
49. Способ по п. 48, в котором плюрипотентная клетка представляет собой эмбриональную стволовую (ЭС) клетку или индуцированную плюрипотентную стволовую (ИПС) клетку.
50. Способ по любому из пп. 47-49, в котором клетка представляет собой клетку млекопитающих.
51. Способ по п. 50, в котором клетка млекопитающих представляет собой клетку грызуна.
52. Способ по п. 51, в котором грызун представляет собой мышь или крысу.
53. Способ получения не относящихся к человеку животных поколения F0, включающий в себя:
(a) введение нечеловеческой ЭС-клетки в нечеловеческий эмбрион-хозяин, причем нечеловеческая ЭС-клетка получена способом по любому из пп. 1-45 и 47-52; и
(b) вынашивание нечеловеческого эмбриона-хозяина в теле суррогатной матери,
при этом суррогатная мать производит поколение F0 не относящегося к человеку животного, содержащего модификацию.
54. Способ по п. 53, в котором не относящееся к человеку животное представляет собой мышь или крысу.