СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ИНФЕКЦИОННОГО МОНОНУКЛЕОЗА, АССОЦИИРОВАННОГО С ВИРУСОМ ЭПШТЕЙНА-БАРР
METHOD FOR IDENTIFYING INFECTIOUS MONONUCLEOSIS ASSOCIATED WITH EPSTEIN-BARR VIRUS

Изобретение относится к идентификации биомаркеров инфекционного мононуклеоза, ассоциированного с вирусом Эпштейна-Барр, и может быть использовано для изучения молекулярных механизмов патогенеза, а также для клинической диагностики и мониторинга заболевания.
Инфекционный мононуклеоз (ИМ) - это антропонозная вирусная инфекция с воздушно-капельным механизмом передачи возбудителя, характеризующаяся лихорадкой, интоксикацией, генерализованной лимфаденопатией, увеличением печени и селезенки [Поляков В.Е., Лялина B.Н., Воробьева М.Л. и др. Инфекционный мононуклеоз (болезнь Филатова) у детей и подростков // Эпидемиол. и инфекционные болезни. - 1998. - №6. - C. 50-55.]. В 90-95% случаев ИМ вызывается вирусом Эпштейна-Барр [Bravander Т. Epstein-Barr virus, cytomegalovirus, and infectious mononucleosis // Adolesc. Med. State Art Rev. - 2010. Vol. 21. №2. - P. 251-64.].
Вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ, Human gammaherpesvirus 4) является представителем семейства Herpesviridae, обладает тропностью к широкому спектру клеток, поражает преимущественно В-лимфоциты и клетки эпителия носоглотки, а также инфицирует нейтрофилы, Т-лимфоциты [Roberge Ch., McColl S., Larochelle В., Gosselin J. GM CSF enhances EBV-induced synthesis of chemotactic factors in human neutrophills // J. Immunol. - 1998. Vol. 160(5). - P. 2442-2448.], фолликулярные дендритные клетки, несущие на поверхности рецептор CD21.
+
-
На молекулярном уровне воздействие вирусов реализуется путем модуляции экспрессии генов, участвующих в активации клеток иммунной системы, их пролиферации, дифференцировке и апоптозе. Апоптоз играет значительную роль в клеточных взаимоотношениях хозяин-патоген, в частности, в регуляции иммунного ответа, развитии иммунодефицитных состояний и иммунопатологии. Особый интерес представляет участие апоптоза в патогенезе инфекционных заболеваний, так как их возбудители оказывают разнообразное влияние на апоптоз - стимулирующее или подавляющее. Показано, что различные вирусы (вирусы простого герпеса HSV-1 и HSV-2, вирусы парагриппа 1 и 2, респираторно-синцитиальный вирус) in vitro вызывают усиление экспрессии рецептора апоптоза Fas (CD95) на мембране "наивных" Т-лимфоцитов периферической крови человека, без повышения их чувствительности к апоптозу или с дальнейшим повышением чувствительности в случае продуктивной инфекции [Sieg S., Huang Y., Kaplan D. Viral regulation of CD95 expression and apoptosis in T lymphocytes // J. Immunol. - 1997. Vol. 159(3). - P. 1192-1199.]. Вирус гриппа, альфавирусы, вирус клещевого энцефалита индуцируют апоптоз в перевиваемых клеточных культурах [Исаева М.П., Леонова Г.Н., Кожемяко В.Б. Апоптоз как механизм цитопатического действия вируса клещевого энцефалита // Вопросы вирусологии. - 1998. - №4. - С. 182-186.; Lewis J., Wesseling S., Griffin D., Hardwick K. Alphavirus-induced apoptosis in mouse brain correlates with neurovirulence // J. Virol. - 1996. Vol. 70(3). - P. 1828-1836.; Takizawa Т., Matzukawa S., Higguchi Y. et al. Induction of programmed cell death (apoptosis) by influenza virus infection in tissue culture cells // J. Gen. Virol. - 1993. Vol. 74. - P. 2347-2353.]. Подтверждена роль вирусиндуцированного апоптоза в патогенезе СПИДа, клещевого энцефалита, энцефалита новорожденных мышей, вызванного вирусом Sindbis [Brugnoni D., Airo P., Timpano S. et al. CD8CD28 T cells in vertically HIV-infected children // Clin. Exp. Immunol. - 1997. Vol. 109(3). - P. 412-425.; Estaquier J., Idziorek Т., De Bels F. et al. Programmed cell death and AIDS: significance of T cell apoptosis in pathogenic and non-pathogenic primate lentiviral // Procl Nat Acad Sci USA. - 1994. Vol. 91(20). - P. 9431-9435.]. В то же время известен феномен защиты клеток от апоптоза, инфицированных ВИЧ-1, аденовирусами, полиовирусом, вирусом коровьей оспы [Dbaibo G., Hannun J. Molecule of the month. Cytokine response modifier A: a strategically deployed viral weapon// Clin. Immunol. Immunopathol. - 1998. Vol. 86(2). - P. 134-140.; Tolstaya E.A., Romanova L.I., Kolesnikova M.S. Apoptosis-inducing and apopto-sis-preventing functions of poliovirus // J. Virol. 1995. - Vol. 69(2). - P. 1181-1189.]. Установлено, что ряд вирусов защищают от апоптоза инфицированные клетки, одновременно усиливая апоптоз незараженных клеток, что может являться важным механизмом вирусиндуцированной иммуносупрессии [Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Новые иммунопатогенетические взгляды: апоптотические иммунодефициты // Иммунология. - 1998. - №6. - С. 17-18.]. Так, ВЭБ защищает инфицированные В-лимфоциты от апоптоза путем активации латентных генов и индукцией экспрессии Bcl-1 [Gregory C.D., Dive G., Henderson S., Smith S., Withams C.A., Goprdon G.I., Kickinson A.B. Activation of genes protects human В cells from death by apoptosis // Nature (London). - 1991. Vol. 349. - P. 612-614]. Важной особенностью ВЭБ является избирательное инфицирование В-лимфоцитов через специфический рецептор CD21 (CR2). При этом, снижается способность В-клеток к гибели путем апоптоза [Gregory С., Dive С., Henderson S. et al. Activation of Epstein-Barr virus latent genes protects human В cells from death by apoptosis // Nature. - 1991. Vol. 349. - P. 612-614.]. Связываясь с поверхностью моноцитов и нейтрофилов, ВЭБ индуцирует в них синтез хемотаксических факторов, таких как IL-8 и макрофагальный воспалительный протеин-1 (MIP-1 alpha). Инфицированные ВЭБ клетки миндалин усиленно синтезируют IL-1 beta, IL-6 и TNF-alpha, а нейтрофилы - IL-1 beta и рецепторный антагонист IL-1 (IL-1 Ralpha), ингибирующий IL-1-зависимые механизмы клеточного иммунитета [Larochelle В., Flamand L., Gourde P. et al. Epstein-Barr virus infects and induces apoptosis in human neutrophils // Blood. - 1998. Vol. 92(1). - P. 291-299.]. По некоторым данным, ВЭБ кодирует вирусный белок, гомологичный IL-1 Ralpha и обладающий его функциями [Bona С., Bonilla F. Textbook of immunology, second ed., Harwood Acad. Publ., Amsterdam, 1996, 406 p.].
Задачей изобретения является набор биомаркеров, включающий биомаркеры, которые дифференциально экспрессируются у больных ВЭБ-ассоциированным инфекционным мононуклеозом.
Технический результат заявляемого изобретения заключается в расширении возможностей изучения молекулярных механизмов патогенеза и иммуногенеза ВЭБ-ассоциированного инфекционного мононуклеоза, использовании для создания таргетных лекарственных препаратов, эффективной клинической диагностике и мониторинге заболевания.
Поставленная задача решается набором генов и транскриптов, регулирующих активацию, пролиферацию и апоптоз иммунокомпетентных клеток, выявленных в лейкоцитах периферической крови и включающим транскрипт 5 AR, транскрипт 4 ASCC1, ген CAD, мРНК FADD, транскрипт 2 HLA-DPA1 и транскрипт 4 RIPK1, изменение экспрессии которых положительно коррелирует с заболеванием.
Андрогенный рецептор (androgen receptor, AR) - фактор транскрипции, который регулирует экспрессию генов [Mooradian A.D., Morley J.Е., Korenman S.G. Biological actions of androgens // Endocrine reviews. - 1987. Vol. 8(1). - P. 1-28.] путем взаимодействия с ДНК, а также выполняет другие функции [Prostate cancer: biology, genetics and the new therapeutics / Eds. L.W.K. Chung et al. - Humana Press, 2001. - P. 219-239.].
Активирующий сигнал коинтегратор 1 (activating signal co-integrator complex 1, ASCC1) - белок, кодируемый одноименным геном, является транскрипционным коактиватором, который играет важную роль в трансактивации генов с помощью нескольких факторов транскрипции, включая активирующий белок 1 (АР-1), ядерный фактор каппа-в (NF-kB) и фактор ответа сыворотки (SRF) [Jung D.J., Sung H.S., Goo Y.W. et al. Novel transcription coactivator complex containing activating signal cointegrator 1 // Mol Cell Biol. - 2002. Vol. 22(14). - P. 5203-5211.].
Ген CAD кодирует трифункциональный белок, который связан с ферментативной активностью первых трех ферментов в шестиступенчатом пути биосинтеза пиримидина, необходимых для пролиферации клеток млекопитающих [Moreno-Morcillo М., Grande-Garcia А.1., Ruiz-Ramos A. Et al. Structural Insight into the Core of CAD, the Multifunctional Protein Leading De Novo Pyrimidine Biosynthesis // Structure. - 2017. Vol. 25(6). - P. 912-923.].
Fas-ассоциированный домен смерти (Fas-associated death domain, FADD) - адаптерный белок, олигомеризация которого необходима для последующей активации инициаторной прокаспазы 8 в апоптозиндуцирующем сигнальном комплексе (death inducing signaling complex, DISC). Белок FADD бифункционален и участвует в инициации не только апоптоза, но и пролиферации, тем самым регулируя клеточный цикл [Ashkenazi A., Dixit V.M. Death receptors: signaling and modulation // Science. - 1998. Vol. 281. №5381. - P. 1305-1308.].
HLA-DPA1 (major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1) - молекула главного комплекса гистосовместимости II класса, которая участвует в процессе контроля иммунного ответа [Jiang X., Ma Y., Cui W., Li M.D. Association of variants in HLA-DP on chromosome 6 with chronic hepatitis В virus infection and related phenotypes // Amino Acids. - 2014. Vol. 46. №8. - P. 1819-1826.].
Взаимодействующая с рецептором серин/треонин протеинкиназа 1 (receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1, RIPK1) является полифункциональным белком, входящим в состав сигнальных путей некроптоза, воспаления и активации NF-kB [Festjens N., Vanden Berghe Т., Cornelis S., Vandenabeele P. RIP1, a kinase on the crossroads of a cell's decision to live or die // Cell Death Differ. - 2007. Vol. 14. №3. - P. 400-410.].
Преобладающее большинство кандидатных маркеров являются сплайсированными вариантами мРНК генов, принадлежащих к разным функциональным группам. Часть транскриптов представляют собой единственный известный, либо «основной» вариант мРНК одного гена (мРНК FADD). Как правило, функция белков, кодируемых этими транскриптами, рассматривается как свойство самого гена. Другие транскрипты кодируют структурно-функциональные формы белка, отличные от «основного» варианта, но проявляющие схожие свойства (транскрипт 5 AR). Третью группу формируют сплайсированные варианты мРНК гена, отличающиеся от «основной» формы нуклеотидными последовательностями в 5'-НТР (транскрипт 2 HLA-DPA1, транскрипт 4 RIPK1). Белковый продукт таких транскриптов аналогичен продукту «основного» сплайсированного варианта мРНК, но стабильность самих транскриптов, как и активность их трансляции могут отличаться. В четвертую группу входят транскрипты, продукты трансляции которых имеют функцию, отличающуюся от таковой у «основной» формы или прямо противоположную ей (транскрипт 4 ASCC1 кодирует белок, который в отличие от «основной» формы не способен ингибировать экспрессию NF-kB и NF-kB-таргетных генов [Torices S., Alvarez-Rodriguez L., Grande L. Et al. A Truncated Variant of ASCC1, a Novel Inhibitor of NF-кВ, Is Associated with Disease Severity in Patients with Rheumatoid Arthritis // J. Immunol. - 2015. Vol. 195. №11. - P. 5415-5420.]).
Осуществление изобретения.
В изобретении представлен набор биомаркеров ВЭБ-ассоциированного инфекционного мононуклеоза, включающий гены и транскрипты, регулирующие активацию, пролиферацию и апоптоз иммунокомпетентных клеток, выявленные в лейкоцитах периферической крови.
Сущность способа поясняется примером.
Пример. Выбор биомаркеров проводили на основе анализа транскриптома лейкоцитов периферической крови детей и подростков в возрасте 7-18 лет с подтвержденным диагнозом «ВЭБ-ассоциированный инфекционный мононуклеоз» с помощью сплайсинг-ориентированных биочипов. В качестве группы сравнения выступали практически здоровые доноры сопоставимого пола и возраста без клинических и лабораторных признаков заболевания.
Материалом для исследования послужили образцы периферической крови, из которых была выделена лейкоцитарная фракция. Далее из лейкоцитов был получен пул тотальной РНК, которую подвергали реакции обратной транскрипции с получением кДНК. кДНК гибридизовали на ДНК-биочип собственного дизайна для получения амперометрического сигнала, который принимали за уровень экспрессии гена или транскрипта.
Селекцию дискриминирующих зондов, являющихся функциональной основой биочипа, производили с использованием алгоритма "Splice variants microarray design pipeline" [Солнцев Л.А., Старикова В.Д., Сахарнов Н.А. и др. Стратегия подбора зондов для изучения совокупности мРНК участников рецептор-опосредованного сигналинга апоптоза // Молекулярная биология. - 2015. - Т. 49, №3. - С. 515-524.]. Всего было выбрано 1115 зондов: 403 для оценки экспрессии генов, 712 для детекции уровней представленности индивидуальных транскриптов. Полный перечень генов и их транскриптов представлен в таблице 1. Синтез зондов на биочип осуществлялся in situ с помощью оборудования В3 Synthesizer и соответствующего комплекта реагентов в соответствии с рекомендациями производителя (CustomArray Inc., USA).
Обработку результатов гибридизации проводили с применением бинарной классификации и Т-теста с поправкой на ожидаемую долю ложных отклонений. В качестве маркеров ВЭБ-ассоциированного инфекционного мононуклеоза рассматривали гены и транскрипты, которые обладали высокой важностью для классификации, а также характеризовались высоким, статистически значимым (q<0,05) изменением экспрессии при патологии по сравнению с нормой. Пороговое значение важности и изменения уровня экспрессии устанавливали эмпирически, исходя из распределения данных. Для обоих показателей пороговое значение составило 75-ый процентиль.
Согласно описанной процедуре у пациентов с ВЭБ-ИМ были определены молекулярные маркеры: транскрипт 5 AR, транскрипт 4 ASCC1, ген CAD, мРНК FADD, транскрипт 2 HLA-DPA1 и транскрипт 4 RIPK1 (таблица 2).
Пояснения: тр. - транскрипт, НК - некодирующий белок транскрипт, мРНК - единственная известная последовательность мРНК гена.
Как видно из таблицы 2, для ВЭБ-ассоциированного инфекционного мононуклеоза характерна модуляция различных молекулярных механизмов регуляции пролиферации и апоптоза клеток в лейкоцитах периферической крови, в частности, снижение экспрессии промоторов пролиферации транскрипта 5 AR и транскрипта 4 ASCC1, гена CAD, мРНК адаптерной молекулы FADD, играющей ключевую роль в цитотоксическом иммунном ответе и апоптозе, а также повышение экспрессии транскрипта 2 HLA-DPA1 и транскрипта 4 RIPK1.
Таким образом, экспериментальные данные показывают, что заявлен набор биомаркеров, являющихся важными участниками патогенеза ВЭБ-ИМ и отражающих специфические черты его молекулярных механизмов, а также иммунного ответа на инфекцию.