Генотипирование штаммов Burkholderia mallei на основе метода амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК

REFERENCES

1. World Health Organization. Global Tuberculosis Report 2014. WHO/ HTM/TB/2014.08. Geneva: WHO; 2014.

2. Infectious Morbidity in the Subjects of Russian Federation in 2011—2012. Information Collection of Statistical and Analytical Materials. Moscow: Federal Center of Hygiene and Epidemiology of Rospotrebnadzor; 2013; part 3.

3. Van Embden J., Cave M., Crawford J., Dale J., Eisenach K., Gicquel B. et al. Strain identification on Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology. J. Clin. Microbiol. 1993; 31: 406-9.

4. Kamerbeek J., Schouls L., Kolk A., van Agterveld M., van Soolingen D., Kuijper S. et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J. Clin. Microbiol. 1997; 35 (4): 907-14.

5. Gibson A., Huard R., Gey van Pittius N., Lazzarini L., Driscoll J., Kurepina N. et al. Application of sensitive and specific molecular methods to uncover global dissemination of the major RDRio Sublineage of the Latin American-Mediterranean Mycobacterium tuberculosis spoli-gotype family. J. Clin. Microbiol. 2008; 46 (4): 1259-67.

6. Mokrousov I., Narvskaya O., Vyazovaya A., Otten T., Jiao W., Gomes L. et al. Russian "successful" clone B0/W148 of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype: a multiplex PCR assay for rapid detection and global screening. J. Clin. Microbiol. 2012; 50 (11): 3757-9.

7. Narvskaya O., Mokrousov I., Otten T., Vishnevsky B. Molecular markers: application for studies of Mycobacterium tuberculosis population in Russia. In: Read M.M., Ed. Trends in DNA Fingerprinting Research. New York: Nova Science Publishers; 2005: 111-25.

8. Toungoussova O., Sandven P., Mariandyshev A., Nizovtseva N., Bjune G., Caugant D. Spread of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strains of the Beijing genotype in the Archangel Oblast, Russia. J. Clin. Microbiol. 2002; 40 (6): 1930-7.

9. Drobniewski F., Balabanova Y., Nikolayevsky V., Ruddy M., Kuznetzov S., Zakharova S. et al. Drug-resistant tuberculosis, clinical virulence, and the dominance of the Beijing strain family in Russia. J. A. M. A. 2005; 293 (22): 2726-31.

10. Baranov A., Mariandyshev A., Mannsäker T., Dahle U., Bjune G. Molecular epidemiology and drug resistance of widespread genotypes of Mycobacterium tuberculosis in northwestern Russia. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2009; 13 (10): 1288-93.

11. Mokrousov I., Otten T., Zozio T., Turkin E., Nazemtseva V., Sheremet A. et al. At Baltic crossroads: a molecular snapshot of Mycobacterium tuberculosis population diversity in Kaliningrad, Russia. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2009; 55: 13-22.

12. Dubiley S., Ignatova A., Mukhina T., Nizova A., Blagodatskikh S., Ste-panshina V. et al. Molecular epidemiology of tuberculosis in the Tula area, Central Russia, before the introduction of the Directly Observed Therapy Strategy. Clin. Microbiol. Infect. 2010; 16 (9): 1421-6.

13. Vyazovaya A.A., Zhuravlev V.Yu., Mokrousov I.V., Otten T.F., Pavlova E.P., Krishevich V.V. et al. Characteristics of Mycobacterium tuberculosis strains circulating in Pskov region. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2011; 6: 27-31.

14. Umpeleva T.V., Vyazovaya A.A., Kravchenko M.A., Eremeeva N.I., Narvskaya O.V. Genotyping of Mycobacterium tuberculosis isolate, non-Beijing group, circulating in Ural region. Ural'skiy meditsinskiy zhurnal. 2013; 2: 150-4.

15. Mokrousov I., Otten T., Manicheva O., Potapova Y., Vishnevsky B., Narvskaya O. et al. Molecular characterization of ofloxacin-resistant Mycobac-

terium tuberculosis strains from Russia. Antimicrob. Agents Chemother. 2008; 52 (8): 2937-9.

16. Mokrousov I. Insights into the origin, emergence, and current spread of a successful Russian clone of Mycobacterium tuberculosis. Clin. Microbiol. Rev. 2013; 26 (2): 342-60.

17. Marttila H., Soini H., Eerola E., Vyshnevskaya E., Vyshnevskiy B., Otten T. et al. A Ser315Thr substitution in KatG is predominant in genetically heterogeneous multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates originating from the St. Petersburg area in Russia. Antimicrob. Agents Chemother. 1998; 42 (9): 2443-5.

18. Portaels F., Rigouts L., Bastian I. Addressing multidrug-resistant tuberculosis in penitentiary hospitals and in the general population of the former Soviet Union. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999; 3 (7): 582-8.

19. Narvskaya O.V., Mokrousov I.V., Otten T.F., Vishnevskiy B.I. Genetic marking of polyresistant Mycobacterium tuberculosis strains isolated in the north-west of Russia. Problemy tuberkuleza. 1999; 3: 39-41.

20. Narvskaya O.V. Genome Polymorphism of Mycobacterium Tuberculosis and its Significance in the Epidemic Process: Diss. St. Petersburg; 2003.

21. Dymova M., Liashenko O., Poteiko P., Krutko V., Khrapov E., Filipenko M. Genetic variation of Mycobacterium tuberculosis circulating in Kharkiv Oblast, Ukraine. BMC Infect. Dis. 2011; 28 (11): 77.

Received 29.12.14

MOLECULAR CHARACTERISTICS OF THE MULTIDRUG-RESISTANT MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS STRAINS IN THE NORTHWEST RUSSIA

'Vyazovaya A. A., 'Mokrousov I. V., 2Zhuravlev V. Yu, 2Solovieva N. S, 2Otten T. F, 2Manicheva O. A., 2Vishnevsky B. I., '¿Narvskaya O. V.

'St. Petersburg Pasteur Institute, St. Petersburg, Russia; 2Research Institute of Phthisiopulmonology, St. Petersburg, Russia

The goal of this work was to study the genotypic characteristics of the multidrug-resistant (MDR, i.e., resistant to at least rifampicine and isoniazid) Mycobacterium tuberculosis strains isolated in 2011-2012 from tuberculosis (TB) patients in the Northwest Russia. Spoligotyping of 195 M. tuberculosis isolates identified 14 different spoligotypes and assigned isolates to the genetic families Beijing (n = 162, 83%), LAM (n = 15), H3/URAL (n = 14), as well as T, Haarlem and X. Spoligotypes SIT1 (Beijing), SIT42 (LAM) and SIT262 (H3/URAL) were the most prevalent. Irrespective to the genotype, all the isolates were resistant to streptomycin. The multidrug resistance was accompanied by the resistance to ethionamide (56%), amikacin (31%), kanamycin (40%), and capreomycin (33%). The ethambutol resistance was found in 71% (n = 115) and 42% (n = 14) of the Beijing and non-Beijing strains, respectively (p < 0.05). In conclusion, the multidrug resistant M. tuberculosis population circulating in the Northwest Russia continues to be dominated by the Beijing family strains.

Key words: M. tuberculosis, multidrug resistance, spoligotyping, Beijing genotype

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-30-33

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 579.871.1:579.253].083.1

Бондарева О.С., Савченко С.С., Ткаченко Г.А., Леденева М.Л., Лемасова Л.В., Антонов В.А.

генотипирование штаммов burkholderia mallei на основе метода амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК

ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, 400131, Волгоград

Развитие методов генотипирования возбудителя сапа обусловлено его высокой патогенностью, отсутствием эффективных мер профилактики и угрозой использования Burkholderia mallei в качестве биологического оружия. В данной работе предложена схема типирования штаммов возбудителя сапа на основе метода амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК (Different Region Analysis, DFR). Выбор вариабельных локусов, дифференциально присутствующих у различных штаммов возбудителя сапа, осуществлен на основе анализа аннотированных полногеномных последовательностей штаммов B. mallei. К 9 выбранным локусам сконструированы праймеры и флуоресцентные зонды, оптимизированы условия амплификации дифференцирующих фрагментов в двух вариантах: с электро-форетической детекцией результатов и с гибридизационно-

флуоресцентной детекцией в формате стрипа. Оценка возможности применения метода DFR для генетической характеристики штаммов выполнена на 14 штаммах B. mallei. Определение генетических профилей исследуемых штаммов возбудителя сапа позволило установить, что разработанная схема DFR-типирования характеризуется высокой дискриминирующей силой (значение индекса Хантера-Гастона составило 0,92), воспроизводимостью, быстротой проведения анализа, легкостью интерпретации и возможностью использования в эпидемиологическом мониторинге за возбудителем сапа.

Ключевые слова: сап; Burkholderia mallei; генотипирование; дифференцирующий фрагмент ДНК.

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-33-37

Сап - тяжелая антропозоонозная инфекция, в естественных условиях поражающая преимущественно представителей семейств лошадиных, кошачьих и верблюдов. Данное заболевание в прошлом было широко распространено, но на сегодняшний день сап встречается лишь в некоторых регионах Среднего Востока, Азии, Африки и Южной Америки, что связано с резким уменьшением поголовья скота в сельском хозяйстве и развитием методов диагностики. Однако высокая патогенность, устойчивость ко многим антибиотикам, отсутствие эффективных мер профилактики обусловливают возможность использования возбудителя сапа, Burkholderia mallei, в качестве биологического оружия. Для усовершенствования эпидемиологического надзора, расследования вспышек сапа и проведения филогенетического анализа необходимо развитие методов генотипирования B. mallei.

Особенности генетической организации возбудителя сапа определяют выбор метода генотипирования. Так, вследствие высокой консервативности выбранных мишеней - «генов домашнего хозяйства», метод мультило-кусного сиквенс-типирования оказался неэффективным для внутривидовой дифференциации штаммов возбудителя сапа [1]. С другой стороны, вариабельность генома B. mallei, обусловленная наличием большого количества повторов и мобильных генетических элементов [2], позволяет применять для внутривидового типирования методы, основанные на анализе таких полиморфных маркеров, как RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - случайно амплифицируемая полиморфная ДНК), VNTR (Variable Number Tandem Repeats - варьирующие по числу тандемные повторы), DFR (Different region -дифференцирующий фрагмент ДНК) [3-5].

DFR-типирование основано на выявлении с помощью ПЦР ДНК-мишеней, вариабельных у штаммов данного вида. Данный метод успешно применяется для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, показана его эпидемиологическая значимость для типирования штаммов возбудителя чумы [6, 7].

Цель - разработать схему типирования возбудителя сапа на основе амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК и оценить возможность ее применения для генетической характеристики штаммов B. mallei.

Материал и методы

Бактериальные штаммы. Объектами исследования служили 14 штаммов B. mallei из коллекции ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора. Подготовку проб и обеззараживание материала для молекулярно-генетических исследований проводили в соответствии с МУ 4.2.2831-11 «Лабораторная диагностика сапа». Штаммы возбудителя сапа выращивали на глюкозо-казеиновом агаре с глицерином при 37oC в течение 2 сут. Тотальную ДНК выделяли с помощью комплекта реагентов "АмплиПрайм РИБО-преп" (ФБУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва).

Выбор ДНК-мишеней. Для выявления вариабельных регионов генома возбудителя сапа in silico использовали аннотированные геномы 4 штаммов B. mallei, доступные в генетической базе данных GenBank (АТСС23344, NCTC10247, NCTC 10229, SAVP1). Поиск дифференцирующих регионов осуществляли с помощью программы MAUVE 2.3.1. Специфично сть по следова-тельностей дополнительно проверялась онлайн с использованием алгоритма nBLAST.

Праймеры и ПЦР Специфические олигонуклеотидные праймеры и флуоресцентно-меченые зонды к выбранным дифференцирующим фрагментам ДНК подбирали с помощью программы UGENE v. 1.5 (Unipro, Россия) и анализировали с использованием программного пакета Vector NTI Express v. 1.1.2 (Life Technologies, США) на предмет образования вторичных структур и димеров. Формирование правильных вторичных структур зондов проверяли в Mfold (http://mfold.rna.albany.edu).

Олигонуклеотиды синтезировали в ЗАО «Синтол» (Россия).

ПЦР проводили на термоциклере «Терцик» и ДНК-амплификаторе в «реальном времени» DTlite (ЗАО «НПФ ДНК-технология», Россия). В состав реакционных смесей входили 5х ПЦР-буфер и «ДиаТак-полимераза» (ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва), 2,5 мМ MgCl2 (Thermo Fisher Scientific), 0,2 мМ каждого дНТФ, 5 пмоль зонда и по 10 пмоль праймеров. При постановке реакции использовали «горячий старт», который обеспечивался разделением праймеров и Taq-полимеразы прослойкой воска. Режим ПЦР включал предварительный прогрев при 95oC - 5 мин, 10 циклов: денатурация при 95oC - 15 с, отжиг при 63oC - 30 с, элонгация при 72oC - 30 с; 35 циклов: денатурация при 95oC - 15 с, отжиг с детекцией флуоресценции при 64oC - 30 с, элонгация при 72oC - 30 с. Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле с окраской бромистым этидием и последующим сканированием в фоторегистрирующей системе GelDoc XR (Bio-Rad, США). Анализ результатов ПЦР с детекцией в режиме реального времени проводили с помощью программного обеспечения используемого прибора по оптическим каналам FAM (470/510 нм), HEX (530/555 нм), ROX (585/610 нм) и Cy5 (625/660 нм).

Анализ результатов. Для определения генетического профиля (DFR-типа) каждого штамма возбудителя сапа результаты амплификации по исследуемым локусам конвертировали в двоичную матрицу. Наличие ампликона обозначалось «1», а его отсутствие - «0». Кластерный анализ проводили в программе TreeCon for Windows v.1.3b методом Neighbor-Joining с коэффициентом генетической дистанции M. Nei и W.H. Li. Для оценки дискриминирующей способности метода использовали индекс Хантера-Гастона (HGDI).

Результаты и обсуждение

Выбор DFR-локусов. Поиск вариабельных фрагментов ДНК был проведен на основе анализа структурной организации хромосом четырех аннотированных полногеномных последовательностей штаммов возбудителя сапа [8]. Подбирали такие фрагменты ДНК, которые присутствовали только у части штаммов.

В результате было выбрано девять дифференцирующих фрагментов генома возбудителя сапа, к которым сконструированы специфические праймеры (см. таблицу). После проведения ПЦР проверяли соответствие длин полученных ампликонов ожидаемым размерам. Установлено, что выбранные праймеры позволяют выявлять различную комбинацию дифференцирующих фрагментов ДНК у разных штаммов возбудителя сапа. Для осуществления флуоресцентной детекции продуктов амплификации DFR-локусов возбудителя сапа были подобраны олигонуклеотидные гибридизационные зонды по типу «молекулярного маяка», комплементарные выбранным дифференцирующим фрагментам ДНК.

Разработка схемы DFR-типирования B. mallei. В ходе дальнейших исследований проводили оптимизацию условий ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией результатов. При этом изменяли состав реакционной смеси (концентрацию праймеров, зондов, по-лимеразы, MgCl2) и программу амплификации (температуру отжига праймеров, продолжительность каждого шага цикла амплификации, количество циклов, длительность предварительной денатурации). Затем был подобран универсальный для всех DFR-фрагментов режим амплификации. Для проведения реакций в одинаковых условиях в реакционные смеси, содержащие прайме-ры с более высокой расчетной температурой отжига (BmVAT2, BmVAT4, BmVAT8, BmVAT9), был добавлен бетаин до конечной концентрации 0,8 М.

Далее изучали возможность амплификации DFR-локусов в формате мультиплексной ПЦР. Установлена совместимость двух пар локусов: BmVAT1 с BmVAT5 и BmVAT6 с BmVAT7. Уменьшение количества реакций

Характеристика праймеров и зондов, сконструированных для амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК B. mallei

№

Название DFR-локуса

Название праймеров и зондов

Последовательность праймеров и зондов, 5/^ 3/

Локус в геноме B. mallei

Расчетная T отжига, oC

Длина амплико-на, п.н.

1. BmVAT 1

2. BmVAT2

3. BmVAT3

4. BmVAT 4

5. BmVAT 5

6. BmVAT6

7. BmVAT7

8. BmVAT8

BmVAT9

BmVAT1-Ch1s GAGGATGAAGGTGCCGTGG

BmVAT 1-Ch1as GACAACTACTTCATCGGCTATCTG

BmVAT1p ROX-CCGCGAGCACGCTCTCGACCGAGCGCACGCGG-BHQ2

BmVAT2-Ch1s GCAGGACGAGTTCGGCGAGC

BmVAT2-Ch1as GACGAAACCCACGCCCATTCC

BmVAT2p FAM-CGCGCTCGCCGCCTATCCGCTCGTGCTGCGCG-BHQ1

BmVAT3-Ch1s CACCCTGTTTAGGACGGAG

BmVAT3-Ch1as GATTGCGTGAACACGAAG

BmVAT3p ROX-ACAGCGTCGTCGACGACCGCGGGCCGCTCT-BHQ2

BmVAT4-Ch1s CGCCGTCACCCGCCAACTCAG

BmVAT4-Ch1as AACAACCGCCGCCCGACGAC

BmVAT4p HEX-ACGTCGCGCCCCGCGCCGCAACCGACGT-BHQ2

BmVAT5-Ch2s CCGTTGTCCTTCGTGTTCAT

BmVAT5-Ch2as AGCACACATTCGCCGTCCT

BmVAT5p HEX-CCCGAATTTCTCGCGCTCAATCCGTTCGGG-BHQ2

BmVAT6-Ch2s TGGCGGAGTATGGATGCTG

BmVAT6-Ch2as GAACGAGAACACCTACGACCTGAT

BmVAT6p Cy5-ACCGAGTTAGTTCCGTTCCTTCGGT-BHQ2

BmVAT7-Ch2s CTCACCTTCCTTGGAGAGCC

BmVAT7-Ch2as AGCGAATAGCCGTTGGTTTC

BmVAT7p HEX-CTTGCCTACATCATCGAAAAGCTGGGCAAG-BHQ2

BmVAT8-Ch2s GCTGCTTCGCCCACTTCG

BmVAT8-Ch2as AGCATCGGATTTCATCGTCGTC

BmVAT8p ROX-CCGCGATGCTGGTTTGCATGCGCCGCCGCGG-BHQ2

BmVAT9-Ch2s CGAACCCACACGAGCCTA

BmVAT9-Ch2as GCGAAGATTCCGAAGATGC

BmVAT9p Cy5-CGATCGCTGTATTCCATGCCGTCGATCG-BHQ2

BMA 0577* 64

BMA 0958* 63

BMA 2089*

BMA 2262*

BMAA 0107*

BMAA 0416*

BMAA 0871*

BMA 10247_ A0137**

63

70

65

62

61

67

BMA 10247_ 65 A1008**

480

613

795

365

259

606

166

444

472

Примечание. * - B. mallei ACTC 23344, ** - B. mallei NCTC 10247.

позволило осуществлять постановку типирования B. mallei в формате 8-луночного стрипа. При этом в 5 лунках анализировали по одному локусу, а в 2 лунках - по 2 локуса. Для обеспечения достоверности результатов типирования и контроля всех этапов проведения анализа 8-я лунка стрипа отведена для амплификации видоспе-цифичного фрагмента гена возбудителя сапа fliP.

В результате проведенных исследований подтверждена эффективность амплификации 9 дифференцирующих фрагментов ДНК, что позволило разработать алгоритм

типирования штаммов возбудителя сапа в двух вариантах: с электрофоретической детекцией результатов и в формате стрипа с детекцией в режиме реального времени. Пример результатов амплификации локуса BmVAT9 с электрофоретической и гибризационно-флуоресцентной детекцией результатов представлен на рис. 1.

Анализ результатов типирования штаммов возбудителя сапа. В результате работы были определены генетические профили коллекционных штаммов B. mallei, представленные комбинацией положительных и отрица-

Т—1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-г

1 6 11 16 21 26 31

Номер цикла

Рис. 1. Результаты амплификации локуса BmVAT9:

а - электрофореграмма, б - график нарастания кривых флуоресценции. 1 - B. mallei Ц4, 2 - B. mallei Ц5, 3 - B. mallei 8, 4 - B. mallei 11, 5 - B. mallei Muksuwar11, 6 - B. mallei 10230, 7 - B. mallei В-120, 8 - B. mallei "Zagreb", 9 - B. mallei Bogor-37, 10 - B. mallei 5584, 11 - B. mallei "Иванович", 12 -

B. mallei Р1, 13 - B. mallei "Будапешт", 14 - B. mallei Z12.

Рис. 2. Дендрограмма и DFR-профили штаммов B. mallei. Закрашенные области соответствуют наличию специфического ампликона.

тельных результатов амплификации по 9 анализируемым DFR-локусам (рис. 2). Следует отметить, что результаты DFR-типирования методом ПЦР с электрофоретической детекцией и ПЦР в формате «реального времени» были идентичны по количеству амплифицируемых фрагментов для исследуемых штаммов B. mallei. Продемонстрировано, что разработанная схема генотипирования, состоящая из 9 полимеразных цепных реакций, позволяет разделить 14 музейных штаммов возбудителя сапа на 8 типов.

Далее in silico определили DFR-типы 4 аннотированных штаммов возбудителя сапа и дополнили данные DFR-типирования коллекционных штаммов. В результате 18 исследуемых штаммов B. mallei удалось разделить на 11 типов. При этом одна группа состояла из 4, другая - из 3 штаммов, в 2 случаях DFR-профили образованы двумя штаммами возбудителя сапа, остальные 7 паттернов были уникальными (см. рис. 2). Значение индекса Хантера-Гастона (HGDI) для DFR-типирования штаммов B. mallei составило 0,92, что свидетельствует о высокой дискриминирующей способности данного метода.

Кластерный анализ, проведенный по результатам DFR-типирования, показал, что исследуемые штаммы возбудителя сапа образовали 4 группы (см. рис. 2). Самая многочисленная группа I включает 4 штамма восточно-европейского происхождения с одинаковым DFR-профилем. Также в данный кластер входит польский штамм B. mallei 8 и штамм SAVP1, который описан S.E. Schutzer и соавт. [9], однако не указано изначальное место выделения штамма, что затрудняет анализ полученных данных. Во вторую группу (II) включены штаммы из Югославии, России, а также штаммы NCTC 10229 и 10230, принадлежащие к одному DFR-типу. Штамм 10230 получен из английской коллекции, и вероятно соответствует штамму GB8 из коллекции USAMRlID [10], выделенному также как и NCTC 10229 в Венгрии в 1961 г. Группа III представлена тремя штаммами с единым DFR-профилем: двумя монгольскими и штаммом В120, выделенным на границе с Монголией - в г. Улан-Удэ. Четвертый кластер (IV) образован в основном штаммами азиатского происхождения. При этом на ден-дрограмме штаммы B. mallei NCTC10247 и АТСС23344, нуклеотидные последовательности которых представлены в базе данных GenBank, отличались от коллекционных штаммов возбудителя сапа, выделенных в Индии, Индонезии и Югославии.

В целом можно проследить некоторую взаимосвязь между образовавшимися филогенетическими группами и источниками происхождения штаммов. Так, штаммы первого и второго кластера выделены преимущественно на территории Восточной Европы, а штаммы третьего и четвертого кластеров - на территории Азии. Некоторую гетерогенность в филогенетическую схему исследованных штаммов возбудителя сапа вносят изоляты, выделенные на территории бывшей Югославии, которые распределены по 3 ветвям дендрограммы. Это можно объяснить циркуляцией на территории бывшей Югославии в разные годы генетически различных вариантов возбудителя, вариабельностью генома данных штаммов, неполноценностью информации о них или возможными ошибками при проведении коллекционной работы с данными штаммами. Повышение достоверности филогенетического анализа штаммов возбудителя сапа в дальнейшем может быть достигнуто при включении большего количества локусов или дополнении данных DFR-типирования результатами других методов.

Таким образом, впервые разработана схема типирова-ния штаммов возбудителя сапа на основе амплификации дифференцирующих фрагментов ДНК. В ходе работы выбраны вариабельные локусы, дифференциально присутствующие у различных штаммов возбудителя сапа. К ним сконструированы праймеры и флуоресцентные зонды, оптимизированы условия их амплификации в двух вариантах: с электрофоретической детекцией результатов и с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в формате стрипа. После проведения типирования определены генетические профили исследуемых штаммов B. mallei по 9 DFR-локусам. Установлено, что разработанная схема дифференциации штаммов возбудителя сапа позволяет разделить 18 штаммов B. mallei на 11 типов и характеризуется высокой воспроизводимостью, быстротой проведения анализа, легкостью интерпретации при использовании стандартного ПЦР оборудования. При проведении кластерного анализа отмечено, что штаммы, принадлежащие к одной генотипической группе, как правило, происходят из одной географической области, что говорит о возможности использования данного метода для эпидемиологического мониторинга за возбудителем сапа.

Сведения об авторах:

Бондарева Ольга Сергеевна, bondareva0s@mail.ru; Савченко Сергей Сергеевич, gokmop@pochta.ru; Ткаченко Галина Александровна, tkachenko_g@,mail.ru; Леденева Маргарита Леонтьевна, volresin@yandex.ru Лемасова Людмила Викторовна, milka_lem@mail.ru Антонов Валерий Алексеевич, antonovava@rambler.ru Почтовый адрес организации: 400131, Волгоград, ул. Голубинская, 7.

ЛИТЕРАТУРА

1. Godoy D., Randle G., Simpson A.J., Aanensen D.M., Pitt T.L., Kinoshita R. et al. Multilocus sequence typing and evolutionary relationships among the causative agents of melioidosis and glanders, Burkholderia pseudomal-lei and Burkholderia mallei. J. Clin. Microbiol. 2003; 41 (5): 2068-79.

2. Nierman W.C., DeShazer D., Kim H.S., Tettelin H., Nelson K.E., Feld-blyum T. et al. Structural flexibility in the Burkholderia mallei genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101 (39): 14 246-51.

3. Бондарева О.С., Савченко С.С., Ткаченко Г. А., Абуева А.И., Муратова Ю.О., Антонов В.А. Современные подходы к генотипированию возбудителей особо опасных инфекций. Эпидемиология и инфекционные болезни. 2014; 1: 34-44.

4. Antonov V.A., Tkachenko G.A., Altukhova V.V., Savchenko S.S., Zinchen-ko O.V., Viktorov D.V. et al. Molecular identification and typing of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei: when is enough enough? Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 2008; 102 (Suppl. 1): S134-9.

5. U'Ren J.M., Schupp J.M., Pearson T., Hornstra H., Friedman C.L., Smith K.L. et al. Tandem repeat regions within the Burkholderia pseudomallei

genome and their application for high resolution genotyping. BMC Microbiol. 2007; 7: 23.

6. Duangsonk K., Gal D., Mayo M., Hart C.A., Currie B.J., Winstanley C. Use of a variable amplicon typing scheme reveals considerable variation in the accessory genomes of isolates of Burkholderia pseudomallei. J. Clin. Microbiol. 2006; 44 (4): 1323-34.

7. Li Y., Dai E., Cui Y., Li M., Zhang Y., Wu M. et al. Different region analysis for genotyping Yersinia pestis isolates from China. PLoS One. 2008; 3 (5): e2166.

8. Савченко С.С., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алексеева В.В., Зинченко О.В., Бондарева О.С. и др. Генотипирование штаммов B. mallei с использованием метода вариабельных ампликонов (VAT). В кн.: Материалы III Научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотреб-надзора. Оболенск; 2011; 131-4.

9. Schutzer S.E., Schlater L.R., Ronning C.M., DeShazer D., Luft B.J., Dunn J.J. et al. Characterization of clinically-attenuated Burkholderia mallei by whole genome sequencing: candidate strain for exclusion from Select Agent lists. PLoS One. 2008; 3 (4): e2058.

10. Harvey S.P., Minter J.M. Ribotyping of Burkholderia mallei isolates. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005; 44 (1): 91-7.

Поступила 26.08.14

REFERENCES

1. Godoy D., Randle G., Simpson A.J., Aanensen D.M., Pitt T.L., Kinoshita R. et al. Multilocus sequence typing and evolutionary relationships among the causative agents of melioidosis and glanders, Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei. J. Clin. Microbiol. 2003; 41 (5): 2068-79.

2. Nierman W.C., DeShazer D., Kim H.S., Tettelin H., Nelson K.E., Feldblyum T. et al. Structural flexibility in the Burkholderia mallei genome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004; 101 (39): 14 246-51.

3. Bondareva O.S., Savchenko S.S., Tkachenko G.A., Abueva A.I., Muratova Yu.O., Antonov V.A. Modern approaches to the genotyping of especially dangerous infections. Epidemiologiya i infektsionnye bolezni. 2014; 1: 34-44.

4. Antonov V.A., Tkachenko G.A., Altukhova V.V., Savchenko S.S., Zinchenko O.V., Viktorov D.V. et al. Molecular identification and typing of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei: when is enough enough? Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 2008; 102 (Suppl. 1): S134-9.

5. U'Ren J.M., Schupp J.M., Pearson T., Hornstra H., Friedman C.L., Smith K.L. et al. Tandem repeat regions within the Burkholderia pseudomallei genome and their application for high resolution genotyping. BMC Microbiol. 2007; 7: 23.

6. Duangsonk K., Gal D., Mayo M., Hart C.A., Currie B.J., Winstanley C. Use of a variable amplicon typing scheme reveals considerable variation in the accessory genomes of isolates of Burkholderia pseudomallei. J. Clin. Microbiol. 2006; 44 (4): 1323-34.

7. Li Y., Dai E., Cui Y., Li M., Zhang Y., Wu M. et al. Different region

analysis for genotyping Yersinia pestis isolates from China. PLoS One. 2008; 3 (5): e2166.

8. Savchenko S.S., Antonov V.A., Tkachenko G.A., Alekseeva V.V., Zinchenko O.V., Bondareva O.S. B. mallei strains genotyping using the variable amplicons typing

9. Schutzer S.E., Schlater L.R., Ronning C.M., DeShazer D., Luft B.J., Dunn J.J. et al. Characterization of clinically-attenuated Burkholderia mallei by whole genome sequencing: candidate strain for exclusion from Select Agent lists. PLoS One. 2008; 3 (4): e2058.

10. Harvey S.P., Minter J.M. Ribotyping of Burkholderia mallei isolates. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005; 44 (1): 91-7.

Received 26.08.14

GENOTYPING OF THE BURKHOLDERIA MALLEI STRAINS BASED ON DIFFERENT REGION ANALYSIS

Bondareva O. S, Savchenko S. S, Tkachenko G. A., Ledeneva M. L, Lemasova L. V., Antonov V. A.

Volgograd Plague Control Research Institute, Federal Service for Surveillance on Consumer Rights Protection and Human Wellbeing, Volgograd, Russia

Development of the genotyping methods of glanders agent is urgent due to its high pathogenicity, lack of effective preventive measures and threat of the use of Burkholderia mallei as a biological weapon. In this work we proposed a scheme for the typing of the B. mallei strains based on different region analysis (DFR). The choice of variable loci differentially presented in various strains of glanders agents was performed by analyzing annotated whole-genome sequences of the B. mallei strains. Primers and fluorescence probes were designed for 9 selected loci. The amplification conditions for different regions were optimized in two variants: with electrophoretic detection and hybridization-fluorescence detection in the strip format. The possibility of applying the DFR analysis to genetic characterization of strains was assessed in 14 B. mallei strains. The genetic profiles of the studied B. mallei strains revealed that the developed DFR-typing scheme was characterized by high discrimination power (Hunter-Gaston index value was 0.92), reproducibility, rapidity, easy interpretation, and applicability for epidemiological surveillance of glanders. Key words: glanders, Burkholderia mallei, genotyping, different region analysis, DFR

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-33-37

© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 616.579

Евсеева В.В.1, Платонов М.Е.1, Говорунов И.Г.1, Ефременко Д.В.2, Кузнецова И.В.2, Дентовская СВ.1, Куличенко А.Н.2, Анисимов А.П.1

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИз MLVA25- И МЬУА7-ТИПИРОВАНИЯ ПО СПОСОБНОСТИ

определять очаговую принадлежность штаммов yersinia pestis на примере изолятов из центрально-кавказского высокогорного очага чумы

1ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, 142279, Оболенск; 2ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора, 355035,

Ставрополь

Проведен сравнительный анализ МГУА25- и МТУА7-типирования по способности определять очаговую принадлежность штаммов У. pestis на примере изолятов Ыг. medievalis из Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы. Для этого определили МТУА25-генотипы 82 изолятов с указанной территории и ввели эти данные в базу, включавшую информацию о 949 штаммах чумного микроба из других природных очагов России, ближнего и дальнего зарубежья. Для построения дендрограмм применяли метод UPGMA с категорическим коэффициентом, используя данные обо всех 25 имеющихся в ней локусах УПТГО или только о семи из них, рекомендованных специалистами Российского научно-

исследовательского противочумного института «Микроб» для дифференциации штаммов Y. pestis по очаговой принадлежности. Полученные результаты свидетельствуют о большей вероятности диагностических ошибок при использовании для определения внутривидовой принадлежности метода МТУА7-типирования и указывают на целесообразность подразделения Центрально-Кавказского высокогорного очага чумы на два мезоочага. Ключевые слова: MLVA25-munupoeaHue; MLVA7-типирование; VNTR; Yersinia pestis; филогеография.

DOI 10.18821/0208-0613-2016-34-1-37-40