ЗАМЕЩЁННЫЕ ПИРАЗОЛОПИРИМИДИНЫ КАК АКТИВАТОРЫ ГЛЮКОЦЕРЕБРОЗИДАЗЫ
SUBSTITUTED PYRAZOLOPYRIMIDINES AS GLUCOCEREBROSIDASE ACTIVATORS

Настоящая заявка претендует на приоритет предварительной заявки на патент США No. 61/420946, поданной 8 декабря 2010 года, которая вводятся в данное описание во всей полноте посредством отсылки.
Настоящее изобретение, частично, было осуществлено при правительственной поддержке от Национального института здоровья (NIH). Правительство имеет определенные права на это изобретение.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Болезнь Гоше является редким заболеванием, поражающим 1 из 40000 новорожденных, особенно часто наблюдается у потомков восточноевропейских евреев ашкенази (около 1 на 800 живорожденных). Она вызывается наследственными генетическими мутациями в гене GBA (кислой бета-D-глюкозидазы), которые приводят к пониженной активности глюкоцереброзидазы (GC-азы или кислой бета-глюкоцереброзидазы), фермента, присутствующего в клеточных органеллах, называемых лизосомами, отвечающих за расщепление жирного вещества, называемого глюкоцереброзидом (или гликозилцерамидом). Накопление этого липида внутри клеток приводит к резкому увеличению их размеров, что вызывает проблемы во всем организме. Заболевание делится на три типа: нейронопатическая форма (типов 2, 3) и ненейронопатическая форма (типа 1) с симптомами от слабо до сильно выраженных, которые могут появиться в любой момент от младенческого возраста до периода полового созревания. Клинические проявления включают увеличенную селезенку/печень, анемию, недостаток тромбоцитов, нейродегенерацию и заболевание костей различной степени тяжести в зависимости типа болезни и времени установления диагноза. Снижение активности GC-азы было отнесено за счет недостатка белка в лизосоме. После продуцирования в эндоплазматическом ретикулуме (ER) белки с неподходящей укладкой расщепляются в ER и не переносятся в лизосому, где они могут гидролизовать глюкоцереброзид.
Современные способы лечения болезни Гоше включают заместительную ферментную (CEREZYME) терапию или субстрат-редуцирующую терапию (ZAVESCA), стоимость которых составляет от $100000 до >$200000 в год. Разработка иминосахара изофагомина (PLICERA) в качестве молекулярного шаперона была прекращена после Фазы 2 клинических испытаний, показавших увеличение количества GC-азы в лейкоцитах, но недостаточное уменьшение интенсивности висцеральных симптомов. Следовательно, существует потребность в разработке нового шаперонного препарата для лечения болезни Гоше. Настоящая заявка удовлетворяет эту потребность и предусматривает другие преимущества, указанные в нижеприведенном описании.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящей заявке описываются замещенные пиразолопиримидины и дигидропиразолопиримидины и родственные соединения, способы их получения, композиции, содержащие описанные соединения, и способы применения описанных соединений. Так, в первом аспекте предусматривается соединение Формулы (I) и фармацевтически приемлемые соли соединения Формулы (I):
, Формула (I)
где цикл
представляет собой циклическую систему формулы
5
6
7
(i) , в которой R обозначает необязательно замещенную винильную группу, а R и R имеют значения, определяемые ниже, или
5
6
7
(ii) , в которой R, R и R имеют значения, определяемые ниже.
1
1
6
2
6
2
6
0
4
0
4
1
1
6
2
6
2
6
1
6
2
6
1
6
0
4
1
6
1
6
1
6
1
6
1
2
1
2
1
4
1
4
1
4
1
4
2
1
6
3
7
0
2
R обозначает C-Cалкил, C-Cалкенил, C-Cалкинил, (моно- или бициклическая карбоциклическая система) C-Cалкил или (моно- или бициклическая гетероциклическая система) C-Cалкил, где каждый из R является незамещенным или замещенным одним или более заместителей, выбранных из галогена, гидроксила, циано, нитро, амино, -CHO, -COOH, C-Cалкила, C-Cалкенила, C-Cалкинила, C-Cалкокси, C-Cалканоила, (моно- или ди-C-Cалкиламино) C-Cалкила, моно- или ди-C-Cалкилкарбоксамида, сложной C-C алкилэфирной группы, C-Cалкилтио, C-Cалкилсульфонила, C-Cгалогеналкила и C-Cгалогеналкокси, и 0 или 1 заместителем, выбранным из Y-Z-, где Z обозначает ковалентную связь, C-Cалкилен, -S-, -O-, -NR-, -C(O)-, -NHC(O)- или -C(O)NH-, где R обозначает водород или C-Cалкил, a Y обозначает фенил или пиридил каждый из которых является незамещенным или замещенным 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, гидроксила, циано, нитро, амино, C-Cалкила, C-Cалкокси, трифторметила, дифторметила, и трифторметокси; и R обозначает водород, C-Cалкил, C-Cциклоалкил и (фенил)C-Cалкил.
1
2
1
2
1
2
Или R и R совместно образуют 5--7-членное гетероциклоалкильное кольцо, содержащее 0 или 1 дополнительный гетероатом, выбранный из N, O и S, причем это 5--7-членное гетероциклоалкильное кольцо, необязательно, конденсировано с фенилом или пиридилом; это 5--7-членное гетероциклоалкильное кольцо является незамещенным или замещенным одним или более заместителей, независимо выбранных из галогена, гидроксила, C-Cалкила и C-Cалкокси.
3
1
2
R обозначает водород или C-Cалкил.
5
1
4
1
4
R обозначает галоген, гидроксил, амино, циано, C-Cалкил, винил, циклопропил, циклопропилиденил, C-Cалкокси, дифторметил, трифторметил или фенил.
6
1
4
1
4
R обозначает галоген, гидроксил, C-Cалкил или C-Cалкокси.
7
1
4
1
4
R обозначает галоген, гидроксил, амино, циано, C-Cалкил, C-Cалкокси, дифторметил или трифторметил, или
7
7
1
4
1
4
1
4
7
1
4
1
4
1
2
0
4
1
2
1
2
R обозначает фенил или 5--7-членное гетероциклоалкильное кольцо, содержащее 1 или 2 гетероатома, выбранных из N, O и S, с этим кольцом каждый из R связан непосредственно ковалентной связью или связан с помощью C-Cалкильной, C-Cалкокси или C-Cалкиламиногруппы, и каждый из R является незамещенным или замещенным 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, гидроксила, C-Cалкила, C-Cалкокси, (моно- и ди-C-Cалкиламино)C-Cалкила, C-Cгалогеналкила и C-Cгалогеналкокси; или
6
7
1
2
1
2
R и R совместно образуют 5- или 6-членное карбоциклическое кольцо, не содержащее дополнительные ненасыщенные положения, это кольцо является незамещенным или замещенным 1-3 заместителями, независимо выбранными из C-Cалкила и C-Cалкокси.
1
1
4
1
2
6
5
7
6
5
7
1
6
5
7
Согласно некоторым вариантам изобретения R не обозначает незамещенный фенил, дигидроинденил, бензо[b][1,4]диоксолил, бензо[d][1,3]диоксол-5-ил, циклогексил, пиридил или фенил, замещенный 1 или 2 заместителями, независимо выбранными из хлора, фтора, C-Cалкила, C-Cалкокси, ацетила и трифторметила, если R обозначает водород, R и R, оба, обозначают метил, или если R обозначает водород, а один из заместителей R и R обозначает метил, а другой обозначает фенил. Также R не обозначает 1-(4-фторбензил)-1H-пиразол-4-ил, если R обозначает водород, а один из заместителей R и R обозначает метил, а другой обозначает фенил.
В другом аспекте предусматривается фармацевтическая композиция, содержащая соединение Формулы I, или его соль, совместно с фармацевтически приемлемым носителем.
Также в настоящей заявке предусматривается способ лечения болезни Гоше у пациента, или предупреждение или уменьшения интенсивности симптомов болезни Гоше у пациента, имеющего мутацию в гене GBA, включающий предоставление пациенту эффективного количества соединения Формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли.
Еще один аспект предусматривает способ повышения уровня глюкоцереброзидазы в лейкоцитах пациента, имеющего мутацию в гене GBA, включающий предоставление пациенту эффективного количества соединения Формулы (I).
ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящей заявке описываются замещенные пиразолопиримидины и дигидропиразолопиримидины и родственные соединения, применимые в качестве шаперонов глюкоцереброзидазы. Некоторые замещенные пиразолопиримидины и дигидропиразолопиримидины и родственные соединения, описанные в настоящей заявке, являются эффективными и селективными активаторами глюкоцереброзидазы. Эти соединения применимы для лечения болезни Гоше и предупреждения симптомов болезни Гоше у людей, имеющих мутантный ген GBA.
Терминология
Соединения описаны с применением стандартной номенклатуры. Если не указано иначе, все технические и научные термины, применяемые в настоящей заявке, имеют общепринятое значение, понятное специалисту в области техники, к которой относится данное изобретение.
Термины, определяющие единственное число, не обозначают ограничения количества, но скорее обозначают наличие по меньшей мере одного из упоминаемых объектов. Термин "или" означает "и/или". Термины "содержащий", "имеющий", "включающий" и "вмещающий" следует интерпретировать как неограничивающие термины (т.е. означающие "включающий, но без ограничения"). Если иначе не указано в данном описании, перечисление интервалов величин предполагается только как сокращенный способ упоминания каждого отдельного значения в этом интервале, и каждое отдельное значение включается в описание как если бы оно было перечислено отдельно в настоящей заявке. Пределы всех интервалов включаются в эти интервалы и независимо комбинируются. Если не указано иначе или если это однозначно не вступает в противоречие с контекстом, все способы, описанные в настоящей заявке, можно осуществлять в требуемой последовательности. Если не заявляется иначе, применение любого примера и всех примеров или выражений в примерах (например, "такой как") предполагается только для того, чтобы нагляднее проиллюстрировать изобретение, и не ограничивает объем изобретения. Никакие формулировки (выражения) в описании не следует интерпретировать как указывающие на какой-либо незаявленный элемент как существенный для практического применения изобретения по данному описанию. Если не указано иначе, технические и научные термины, употребляемые в настоящей заявке, имеют общепринятое значение, понятное специалисту в области техники, к которой относится изобретение.
11
13
14
Понятно, что все соединения включают все возможные изотопы атомов, имеющихся в соединениях. Изотопы включают атомы, имеющие одинаковый атомный номер, но различные массовые числа. В качестве общего примера, но без ограничения, изотопы водорода включают дейтерий и тритий, а изотопы углерода включают C, C и C.
Термин "замещенный" означает, что любой один или более атомов водорода при названном атоме или в названной группе замещены на заместитель, выбранный из указанной группы, при условии, что нормальная валентность названного атома не превышена. Если заместителем является оксогруппа (т.е. =O), то замещаются 2 два атома водорода при (названном) атоме. Если в ароматических группах заместителем является оксогруппа, ароматический цикл изменяется соответствующим образом, становясь частично ненасыщенным циклом. Например, пиридильная группа с заместителем оксогруппой представляет собой пиридон. Комбинации заместителей и/или переменных допустимы только в том случае, если такие комбинации дают устойчивые соединения или подходящие синтетические интермедиаты. Предполагается, что устойчивое соединение или устойчивая структура означает соединение, достаточно стабильное для того, чтобы выдержать выделение из реакционной смеси и последующее приготовление эффективного лекарственного препарата.
2
6
Подходящие группы, которые могут присутствовать в "необязательно замещенном" положении, включают, но без ограничения, например, галоген, циано, гидроксил, амино, нитро, оксо, азидо, алканоил (например, C-C алканоильную группу, такую как ацильная, и т.п.); карбоксамидо; алкилкарбоксамид; алкильные группы, алкоксигруппы, алкилтиогруппы, включая такие группы, содержащие одну или более тиоэфирных связей, алкилсульфинильные группы, включая группы, имеющие одну или более сульфинильных связей, алкилсульфонильные группы, включая группы, имеющие одну или более сульфонильных связей, моно- и диаминоалкильные группы, включая группы, содержащие один или более атомов N, причем все из вышеуказанных необязательных алкильных заместителей вместо одной или более метиленовых групп могут содержать атом кислорода или -NH-, и иметь, примерно, от 1 до 8, примерно, от 1 до 6 или, примерно, от 1 до 4 углеродных атомов, циклоалкил; фенил; фенилалкильную группу, типичным примером которой является бензильная группа, фенилалкоксигруппу, типичным примером которой является бензоилоксигруппа.
Тире ("-"), стоящее не между двумя буквами или символами, применяется для указания положения, с которым связан заместитель.
1
2
Термин "алкил" включает как разветвленные, так и линейные насыщенные алифатические углеводородные группы, имеющие указанное число углеродных атомов. Выражение "C-Cалкил" означает алкильную группу, имеющую от 1 до 2 углеродных атомов, например, метильную и этильную, соответственно. Аналогично, термин "алкенил" означает разветвленную или линейную ненасыщенную углеводородную группу, имеющую указанное число углеродных атомов и по меньшей мере одну двойную углерод-углеродную связь, а термин "алкинил" означает разветвленную или линейную ненасыщенную углеводородную группу, имеющую указанное число углеродных атомов и по меньшей мере одну тройную углерод-углеродную связь.
"Алкилен" означает линейную или разветвленную насыщенную двухвалентную углеродную цепь, имеющую указанное число углеродных атомов.
"Сложный алкиловый эфир" означает алкильную группу по определению выше, связанную через сложноэфирную связь. Алкильная группа может быть ориентирована по-разному относительно сложноэфирной связи, т.е. группа имеет либо формулу -O(C=O)алкил, либо формулу -(C=O)Оалкил.
2
3
"Алканоил" означает алкильную группу по определению выше, связанную через кетонный мостик (-(C=O)-). Алканоильные группы содержат указанное число углеродных атомов, причем углеродный атом кетогруппы включен в указанное число углеродных атомов. Например, Cалканоильная группа означает ацетильную группу формулы CH(C=O)-.
2
"Алкилсульфонил" означает группу формулы алкил-(SO)-, где алкильная группа означает алкильную группу по определению выше, имеющую указанное число углеродных атомов. Типичной алкилсульфонильной группой является метилсульфонильная группа.
"Алкилтио" указывает на алкильную группу по определению выше, связанную через атом серы, т.е. группу формулы алкил-S-. Примеры включают этилтио и пентилтио.
"Алкокси" означает алкильную группу по определению выше с указанным числом углеродных атомов, связанную через кислородный мостик.
"Циклоалкил" означает насыщенную циклическую углеводородную группу, содержащую указанное число углеродных атомов, обычно от 3, примерно, до 7 углеродных атомов. Примеры циклоалкильных групп включают циклопропил, циклобутил, циклопентил или циклогексил, а также мостиковые или каркасные насыщенные циклические группы, такие как норборнан или адамантан.
"Моно- или бициклический карбоциклический" заместитель означает 3--8-членный насыщенный, частично насыщенный или ароматический цикл, содержащий в цикле только атомы углерода, или 6-11-членную насыщенную, частично ненасыщенную или ароматическую бициклическую систему, содержащую в циклах только углеродные атомы. Если не указано иначе, карбоциклическая группа может быть связана с боковой группой по любому атому углерода, если в результате образуется стабильная структура. Указанные карбоциклические группы по данному описанию могут быть замещены по любому имеющемуся углеродному атому в цикле, если полученное в результате соединение является устойчивым. Карбоциклические группы включают циклоалкильные группы, такие как циклопропил и циклогексил; циклоалкенильные группы, такие как циклогексенил, мостиковые циклоалкильные группы; и арильные группы, такие как фенил.
"Галоген" или "галоид" означает фтор, хлор, бром или иод.
"Гетероциклоалкил" означает насыщенную циклическую группу, имеющую указанное число атомов в цикле, содержащем от 1, примерно, до 3 гетероатомов, выбранных из N, O и S, а остальные циклические атомы являются углеродными атомами. Примеры гетероциклоалкильных групп включают тетрагидрофуранильную и пирролидинильную группы.
"Моно- или бициклический гетероцикл" означает 5-8-членный насыщенный, частично ненасыщенный или ароматический цикл, содержащий от 1, примерно, до 4 гетероатомов, выбранных из N, O и S, а остальные атомы в цикле представляют собой углеродные атомы, или 7-11-членную бициклическую насыщенную, частично ненасыщенную или ароматическую гетероциклическую систему, причем каждый из циклов содержит по меньшей мере 1 гетероатом в сложной циклической системе, выбранный из N, O и S, и, примерно, до 4 гетероатомов, независимо выбранных из N, O и S, в каждом цикле конденсированной циклической системы. Если не указано иначе, гетероциклический цикл может быть связан с группой-заместителем по любому гетероатому или углеродному атому, если в результате образуется устойчивая структура. Там, где это указано, гетероциклические кольца по данному описанию могут замещаться по углеродному или азотному атому, если образующееся в результате соединение является устойчивым. Атом азота в гетероцикле, необязательно, может быть четвертичным (кватернизованным). Предпочтительно, чтобы общее число гетероатомов в гетероциклических группах не превышало 4 и чтобы общее число атомов S и O в гетероциклической группе не превышало 2, более предпочтительно, чтобы это число не превышало 1. Примеры гетероциклических групп включают пиридил, индолил, пиримидинил, пиридизинил, имидазолил, пиразинил, имидазолил, оксазолил, фуранил, тиофенил, тиазолил, триазолил, тетразолил, изоксазолил, хинолинил, пирролил, пиразолил, бензо[b]тиофенил, изохинолинил, хиназолинил, хиноксалинил, тиенил, изоиндолил, дигидроизоиндолил, 5,6,7,8-тетрагидроизохинолин, пиридинил, пиримидинил, фуранил, тиенил, пирролил, пиразолил, пирролидинил, морфолинил, пиперазинил, пиперидинил и пирролидинил.
"Моно- и/или диалкиламино" означает вторичную или третичную алкиламиногруппы, где алкильные группы имеют значение по определению выше и содержат указанное число углеродных атомов. Связывание алкиламиногруппы осуществляется по атому азота. Алкильные группы выбираются независимо. Примеры моно- и диалкиламиногрупп включают этиламино, диметиламино и метилпропиламиногруппы.
1
2
1
2
"Моно- или диалкилкарбоксамид" означает группу формулы -(C=O)Nалкилалкил, где группы алкил и алкил представляют собой независимо выбранные алкильные группы по определению в данном описании, связанные через карбоксамидную группу (связь). Карбоксамидная группа может быть ориентирована по-разному, например, -NH(C=O)- или -(C=O)NH- (т.е. аминогруппа может быть расположена с любой стороны относительно карбонильной группы).
"Галогеналкил" означает как разветвленные, так и линейные алкильные группы, имеющие указанное число углеродных атомов, замещенные одним или более атомов галогена, обычно вплоть до максимально допустимого числа атомов галогена. Примеры галогеналкилов включают, но без ограничения, трифторметил, дифторметил, 2-фторэтил и пентафторэтил.
"Галогеналкокси" означает галогеналкильную группу по определению выше, связанную через кислородный мостик (кислород спиртовой группы).
"Фармацевтические композиции" означают композиции, содержащие по меньшей мере один активный агент, такой как соединение или соль Формулы I, и по меньшей мере одно другое вещество, такое как носитель. Фармацевтические композиции отвечают стандартам надлежащей практики организации производства лекарств для человека и отличных от человека животных, установленным Управлением по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США (U.S. FDA′s GMP).
"Носитель" означает разбавитель, эксципиент или наполнитель, совместно с которым вводится активное соединение. "Фармацевтически приемлемый носитель" означает вещество, например, эксципиент, разбавитель или наполнитель, применимый для приготовления фармацевтической композиции, как правило безопасной, нетоксической и не являющейся неприемлемой ни с биологической ни с других точек зрения, и включает носитель, который приемлем для применения в ветеринарии, а также для фармацевтического применения по отношению к человеку. "Фармацевтически приемлемый носитель" включает как один, так и более чем один такой носитель.
"Пациент" означает человека и отличного от человека животного, нуждающегося в лечении (медицинской помощи). Лечение может включать лечение имеющегося состояния, такого как заболевание или нарушение, профилактическое или превентивное лечение или диагностику. Согласно некоторым вариантам изобретения пациентом является больной человек.
"Предоставление", "обеспечение" означает введение, применение, продажу, распределение, перевозку (коммерческую или нет), производство, приготовление или отпуск.
"Терапия" или "лечение" означает предоставление активного соединения пациенту в количестве, достаточном для того, чтобы заметно уменьшить интенсивность любого симптома расстройства, опосредуемого бета-глюкоцереброзидазой, например, вызвать регрессию нарушения функции печени, ослабить анемию, повысить уровень тромбоцитов или уменьшить скорость нейродегенерации или дегенерации кости. Согласно некоторым вариантам изобретения лечение болезни Гоше можно начать до того, как у пациента появятся симптомы заболевания.
"Терапевтически эффективное количество" фармацевтической композиции означает количество, эффективное при введении пациенту, для того, чтобы принести терапевтическую пользу, например, уменьшить интенсивность симптомов болезни Гоше.
Значительное изменение означает любое заметное изменение, статистически значимое в стандартном параметрическом тесте статистической значимости, таком как T-тест Стьюдента, где p<0.05.
ОПИСАНИЕ ХИМИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ
Соединения Формулы I могут содержать одну или более асимметрических элементов, таких как хиральные (стереогенные) центры, стереогенные оси (оси хиральности) и т.п., например, асимметрические атомы углерода, так что соединения могут существовать в различных стереоизомерных формах. Эти соединения могут представлять собой, например, рацематы или оптически активные формы. Соединения с двумя или более асимметрическими элементами, помимо этого, могут являться смесью диастереомеров. Для соединений, имеющих асимметрические центры, охватываются все оптические изомеры в чистом виде и их смеси. В этих случаях единственные энантиомеры, т.е. оптически активные формы, можно получать асимметрическим синтезом, синтезом из оптически чистых предшественников или расщеплением рацематов. Расщепление (разделение) рацематов можно также осуществлять, например, обычными методами. Такими как кристаллизация в присутствии расщепляющего агента или хроматографией, например, на хиральной ВЭЖХ (HPLC) колонке. В данной заявке рассматриваются все формы вне зависимости от способов их получения.
Все формы (например, сольваты, оптические изомеры, энантиомерные формы, полиморфные формы, свободное соединение и соли) активного агента можно применять либо самостоятельно, либо в комбинации.
Термин "хиральный" относится к молекулам, которые обладают свойством не совмещаться со своим зеркальным изображением.
"Стереоизомеры" представляют собой соединения, которые имеют одинаковое химическое строение, но отличаются расположением атомов или групп в пространстве.
"Диастереомер" означает стереомер с двумя или более хиральных центров и молекулы которого не являются зеркальными изображениями друг друга. Диастереомеры имеют различные физические свойства, например, температуры плавления, температуры кипения, спектральные свойства и реакционную способность. Смеси диастереомеров можно разделять аналитическими методами высокого разрешения, такими как электрофорез, кристаллизация в присутствии расщепляющего агента или хроматография, например, на хиральной ВЭЖХ колонке.
Термин "энантиомеры" относится к двум стереоизомерам соединения, которые являются зеркальными изображениями друг друга, не совмещающимися друг с другом в пространстве. Смесь энантиомеров в соотношении 50:50 относится к рацемической смеси или рацемату, которые могут образовываться в том случае, когда химическая реакция или процесс не являются стереоселективными или стереоспецифическими.
Стереохимические определения и условные обозначения, употребляемые в настоящей заявке, в целом соответствуют определениям и условным обозначениям, приведенным в S.P. Parker, Ed., McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (1984) McGraw-Hill Book Company, New York; и Eliel, E. and Wilen, S., Stereochemistry of Organic Compounds (1994) John Wiley & Sons, Inc., New York. Многие органические соединения существуют в оптически активных формах, т.е. способны вращать плоскость поляризации плоскополяризованного света. При описании оптически активного соединения используют приставки D и L или R и S для обозначения абсолютной конфигурации молекулы относительно хирального(-ых) центра(-ов). Приставки d и 1 или значки (+) и (-) применяют для указания знака вращения плоскости поляризации плоскополяризованного света соединением, причем (-) или 1 означает, что соединение является левовращающим. Обозначения (+) или d показывают, что соединение является правовращающим.
"Рацемическая смесь" или "рацемат" означает эквимолярную (или 50:50) смесь двух энантиомеров, не обладающую оптической активностью. Рацемическая смесь может образовываться в том случае, когда химическая реакция или процесс не являются стереоселективными или стереоспецифическими.
"Фармацевтически приемлемые соли" включают производные раскрываемых соединений, исходное соединение для которых модифицировано с помощью образования его неорганических и органических нетоксических кислотно-аддитивных или основно-аддитивных солей. Соли соединений по настоящему изобретению можно синтезировать из исходного соединения, которое содержит основной или кислый фрагмент, обычными химическими методами. Как правило, такие соли можно получать реакцией свободных кислых форм этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания (такого как гидроксид, карбонат, бикарбонат и т.п. Na, Ca, Mg или K), или реакцией свободных основных форм этих соединений со стехиометрическим количеством соответствующей кислоты. Такие реакции обычно проводят в воде или в органическом растворителе или в их смеси. Обычно, если это возможно, применяют такие неводные среды как эфир, этилацетат, этанол, изопропанол или ацетонитрил. Кроме того, соли соединений по настоящему изобретению включают сольваты соединений и солей соединений.
2
n
Примеры фармацевтически приемлемых солей включают, но без ограничения, соли, образованные минеральными или органическими кислотами и основными остатками, такими как амины; соли щелочных или щелочноземельных металлов с кислыми остатками, такими как карбоновые кислоты и т.п. Фармацевтически приемлемые соли включают обычные нетоксические соли и четвертичные аммониевые соли исходного соединения, образованные, например, при использовании нетоксических неорганических или органических кислот. Например, обычные нетоксические соли кислот включают соли, полученные с применением неорганических кислот, таких как хлористоводородная, бромистоводородная, серная, сульфаминовая, фосфорная, азотная и т.п.; и соли, полученные с применением органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, стеариновая, молочная, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, памовая, малеиновая, гидроксималеиновая, фенилуксусная, глутаминовая, бензойная, салициловая, мезиловая, эзиловая, безиловая, сульфаниловая, 2-ацетоксибензойная, фумаровая, толуолсульфоновая, метансульфоновая, этандисульфоновая, щавелевая, изетионовая, HOOC-(CH)-COOH, где n означает 0-4, и т.п.. Перечень других подходящих кислот можно найти, например, в справочнике Remington′s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., p.1418 (1985).
В настоящей заявке раскрываются низкомолекулярные вещества, которые активируют фермент GC-азу. Данные говорят о том, что низкомолекулярные вещества могут вести себя как шапероны, которые способствуют корректному фолдингу белка с неправильным фолдингом (укладкой) и их попаданию из эндоплазматического ретикулума в лизосому. Большинство низкомолекулярных шаперонов, описанных в литературе, являются ингибиторами GC-азы, и, следовательно, теоретически могут ингибировать активность ферментов в лизосоме. Группа химических соединений по настоящему изобретению является предпочтительной, так как эти соединения не ингибируют, но скорее активируют GC-азу. Соединения класса пиразоло[1,5-a]пиримидин-3-карбоксамидов также отличаются от иминосахаров, которые часто в литературе описывают как шапероны, и являются многообещающими с точки зрения селективности по отношению к другим гликозидазам.
1
7
Помимо соединений Формулы (I), показанных выше в разделе Сущность изобретения, также раскрываются соединения Формул II и III, которые являются "подформулами" Формулы I, и соединения, в которых заместители, например, R-R имеют нижеприведенные определения.
5a
1
4
3
7
В Формуле III R обозначает водород, C-Cалкил, C-Cциклоалкил или 4--7-членный связанный по атому углерода гетероциклоалкил, содержащий 1 или 2 гетероатома, независимо выбранных из N, S и O.
5a
В некоторых вариантах Формулы III R обозначает водород или циклопропил.
Данная заявка включает соединения Формул I и II и их соли, в которых:
2
R обозначает водород или метил; и
5
1
4
R обозначает C-Cалкил, дифторметил или фенил;
7
1
4
R обозначает C-Cалкил, дифторметил или фенил; и
5
7
R и R, оба одновременно, не обозначают фенил.
Кроме того, данная заявка включает соединения Формул I и II и их соли, в которых:
5
7
R и R, оба, обозначают метил; или
5
7
один из R и R обозначает метил, а другой обозначает фенил; или
5
7
один из R и R обозначает метил, а другой обозначает дифторметил.
Данная заявка включает соединения Формул I, II и III и их соли, в которых:
1
0
4
0
4
0
4
3
0
4
0
2
0
2
0
2
0
2
0
2
0
2
0
2
1
6
1
6
2
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
6
1
2
1
2
1
4
1
4
1
4
1
4
R обозначает (фенил)C-Cалкил, (пиридил)C-Cалкил, (пиримидинил)C-Cалкил, (C-циклоалкил)C-Cалкил, (пиразолил)C-Cалкил, (пирролил)C-Cалкил, (имидазолил)C-Cалкил, (тиенил)C-Cалкил, (фуранил)C-Cалкил, (оксазолил)C-Cалкил, (тиазолил)C-Cалкил, пирролидинил, нафтил, хинолинил, изохинолинил тетрагидронафтил, тетрагидрохинолинил, тетрагидроизохинолинил, тетрагидрофуранил, пиперазинил, морфолинил, пиперидинил, тиоморфолинил, дигидроинденил, бензо[b][1,4]диоксинил или бензо[d][1,3]диоксолил, каждый из которых является незамещенным или замещенным одним или более заместителей, независимо выбранных из галогена, гидроксила, циано, нитро, амино, -CHO, -COOH, C-Cалкила, C-Cалкокси, C-Cалканоила, моно- или ди-C-Cалкиламино, моно- или ди-C-Cалкилкарбоксамида, сложного C-C алкилового эфира, C-Cалкилтио, C-Cалкилсульфонила, C-Cгалогеналкила и C-Cгалогеналкокси, и при этом 0 или 1 заместитель выбран из Y-Z-, где Z обозначает ковалентную связь, C-Cалкилен, -S-, -O-, -NR-, -C(O)-, -NHC(O)-, или -C(O)NH-, где R обозначает водород или C-Cалкил, a Y обозначает фенил или пиридил, каждый из которых является незамещенным или замещенным 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, гидроксила, циано, нитро, амино, C-Cалкила, и C-Cалкокси.
Также настоящее изобретение включают соединения и соли Формулы I, II и III, в которых:
1
2
1
2
1
2
R и R совместно образуют 5-7-членное гетероциклоалкильное кольцо содержит 0 или дополнительные гетероатомы, выбранные из N, O и S, причем это 5-7-членное гетероциклоалкильное кольцо, необязательно, конденсировано с фенилом или пиридилом; это 5-7-членное гетероциклоалкильное кольцо является незамещенным или замещенным одним или более заместителей, независимо выбранных из галогена, гидроксила, C-Cалкила и C-Cалкокси.
Кроме того, настоящее изобретение включает соединения и соли Формулы I, II и III, где
1
0
2
3
1
3
6
1
1
1
4
1
4
2
4
1
4
1
2
1
2
R обозначает (фенил)C-Cалкил, замещенные по меньшей мере одним заместителем, выбранным из циано, трифторметила, CHC(O)NH-, ornR означает циклогексил, замещенный по меньшей мере одним трифторметильным остатком, C-Cалкил; или R обозначает дигидроинденил, хинолинил или изохинолинил; каждый из этих R может быть замещен одним или более заместителей, независимо выбранных из галогена, гидроксила, циано, нитро, амино, -CHO, -COOH, C-Cалкила, C-Cалкокси, C-Cалканоила, моно- или ди-C-Cалкиламино, C-Cгалогеналкила и C-Cгалогеналкокси.
Настоящее изобретение включает соединения и соли Формулы I, II и III, где:
2
7
1
4
7
R обозначает водород или метил; и R обозначает C-Cалкил, дифторметил или фенил. Согласно некоторым вариантам изобретения предпочтительным является, когда R обозначает дифторметил.
Настоящее изобретение включает соединения и соли Формулы I, II и III, где:
2
1
R обозначает водород или метил; и R обозначает метил или дифторметил; и
1
0
2
0
2
0
2
1
4
1
4
2
4
1
4
1
4
1
4
1
2
1
4
1
4
1
2
1
2
R обозначает (фенил)C-Cалкил, (пиридил)C-Cалкил, (циклогексил)C-Cалкил, пиразолил, фуранилнафтил, хинолинил, изохинолинил, тетрагидронафтил, тетрагидрохинолинил, тетрагидроизохинолинил, тетрагидрофуранил, морфолинил, пиперидинил, пиперазинил, тиоморфолинил, дигидроинденил, бензо[b][1,4]диоксинил или бензо[d][1,3]диоксолил, каждый из которых является незамещенным или замещенным одним или более заместителей, независимо выбранных из галогена, гидроксила, циано, нитро, амино, -CHO, -COOH, C-Cалкила, C-Cалкокси, C-Cалканоила, моно- или ди-C-Cалкиламино, моно- или ди-C-Cалкилкарбоксамида, сложного C-C алкилового эфира, C-Cалкилсульфонила, трифторметила, трифторметокси и дифторметила, и при этом 0 или 1 заместитель выбран из Y-Z-, где Z обозначает ковалентную связь, C-Cалкилен, -S-, -O-, -NR-, -C(O)-, -NHC(O)-, или -C(O)NH-, где R обозначает водород или C-Cалкил, a Y обозначает фенил или пиридил, каждый из которых является незамещенным или замещенным 1-3 заместителями, независимо выбранными из галогена, гидроксила, C-Cалкила, и C-Cалкокси.
Соединения Формулы I имеют следующие таутомерные формулы:
Фармацевтические препараты
Замещенные пиразолопиримидины и дигидропиразолопиримидины по настоящему изобретению можно вводить в виде чистого химического вещества, но, как правило, их вводят в виде фармацевтической композиции, например, в виде фармацевтического препарата, содержащего замещенные пиразолопиримидиновое или дигидропиразолопиримидиновое соединение Формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, вместе по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтическую композицию можно приготовить в виде жидкости для инъекций, аэрозоля, крема, геля, таблетки, пилюли, капсулы, сиропа или трансдермального пластыря (патча).
Замещенные пиразолопиримидины и дигидропиразолопиримидины можно вводить перорально, топически (местно), парентерально, в виде ингаляций или спрея, подъязычно, трансдермально, трансбуккально, ректально, в виде глазных капель или другим способом, в виде лекарственных форм с однократной дозировкой, содержащих обычные фармацевтически приемлемые носители. Фармацевтическую композицию можно приготовить в любой форме для фармацевтического применения, например, в виде аэрозоля, крема, геля, пилюли, капсулы, таблетки, сиропа, трансдермального пластыря или глазных капель (офтальмологического раствора). Некоторые лекарственные формы, такие как таблетки и капсулы, делят на однократные лекарственные дозы, содержащие соответствующие количества активных компонентов, например, количество, эффективное для достижения заданной цели.
Носители включают эксципиенты и разбавители и должны быть достаточно высокой степени чистоты и иметь достаточно низкую токсичность для того, чтобы быть пригодными для введения пациенту, проходящему лечение. Носитель должен быть инертным или он сам по себе должен оказывать благотворное фармацевтическое действие. Количество носителя, применяемого в сочетании с соединением, достаточно для обеспечения практического количества вводимого материала на однократную дозу соединения.
Классы носителей включает, но без ограничения, связующие, буферы, красители, разбавители, разрыхлители, эмульгаторы, корригенты, глиданты, смазки, консерванты, стабилизаторы, поверхностно-активные вещества, агенты для таблетирования и увлажняющие агенты. Некоторые носители можно отнести более чем к одному классу, например, растительное масло можно применять в качестве смазки в некоторых препаратах и в качестве разбавителя в других. Типичные фармацевтически приемлемые носители включают сахара, крахмалы, целлюлозу, порошок трагаканта, солод, желатин, тальк и растительные масла. В состав фармацевтических композиций могут входить необязательные активные и/или неактивные агенты при условии, что такие агенты по существу не влияют на активность гидразонов и диацилгидразинов, применяемых в фармацевтических композициях. Необязательный активный агент представляет собой активный агент, не являющийся соединением Формулы I.
Фармацевтические композиции могут быть приготовлены для перорального введения. Эти композиции содержат 0.1-99 весовых % (% вес.) гидразона или диацилгидразина и обычно по меньшей мере около 5% вес. гидразона или диацилгидразина. Некоторые варианты изобретения содержат от около 25% вес. до около 50% вес. или от около 5% вес. до около 75% вес. гидразона или диацилгидразина.
СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ
Соединения Формулы I или их соли, а также фармацевтические композиции, содержащие эти соединения, применимы для лечения лизосомных болезней накопления, включая болезнь Гоше. Соединения Формулы I или их соли, а также фармацевтические композиции, содержащие эти соединения, применимы также для предупреждения проявления симптомов лизосомной болезни накопления, такой как болезнь Гоше, у пациента, имеющего мутацию в гене GBA. Способ лечения лизосомной болезни накопления у пациента включает предоставление пациенту эффективного количества соединения или соли Формулы I: Согласно одному варианту изобретения пациентом является млекопитающее, главным образом, примат, точнее говоря человек. Эффективное количество фармацевтической композиции может представлять собой количество, достаточное для того, чтобы ингибировать прогрессирование заболевания или нарушения; или для того, чтобы вызвать ремиссию заболевания или нарушения.
Эффективное количество соединения или фармацевтической композиции по настоящей заявке также предусматривает достаточную концентрацию замещенных пиразолопиримидинов или дигидропиразолопиримидинов, вводимую пациенту. Достаточная концентрация означает концентрацию соединения или соли Формулы I в организме пациента, необходимую для предупреждения нарушения или противодействия нарушению. Такое количество можно установить экспериментально, например, определяя концентрацию соединения в крови, или теоретически, рассчитывая биодоступность.
Способы лечения включают предоставление пациенту замещенного пиразолопиримидина или дигидропиразолопиримидина в определенной дозировке. Для лечения вышеуказанных состояний применимы уровни доз каждого соединения от около 0.1 мг до около 140 мг на килограмм массы тела в день (около 0.5 мг до около 7 г пациенту в день). Количество соединения, которое можно смешивать с материалами носителя для получения стандартной лекарственной формы, меняется в зависимости от пациента, проходящего лечение, и конкретного способа введения. Стандартные лекарственные формы содержат от около 1 мг до около 500 мг каждого активного соединения. Согласно некоторым вариантам изобретения пациенту ежедневно дают 25 мг-500 мг, или 25 мг-200 мг соединения Формулы I. Частота введения доз может меняться в зависимости от применяемого соединения и конкретного заболевания. Однако, для лечения большинства заболеваний и нарушений применяют схему приема 1 или 2 раза в день.
Однако, следует понимать, что конкретный уровень дозы для любого конкретного пациента зависит от различных факторов, включая активность конкретного применяемого соединения, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени введения, способа введения и скорости экскреции, комбинации лекарств и тяжести конкретного заболевания, подлежащего лечению.
Согласно одному варианту изобретение предусматривает способ лечения лизосомной болезни накопления у пациента, по определению нуждающегося в таком лечении, способ включает введение пациенту эффективного количества соединения Формулы I. Соединения и соли Формулы I по настоящему изобретению можно вводить самостоятельно или в комбинации с одним или более других активных веществ.
Способы лечения, предусматриваемые в настоящей заявке, также применимы для лечения млекопитающих, отличных от человека, включая применение в ветеринарии, такое как применение для лечения лошадей и сельскохозяйственных животных, например, крупного рогатого скота, овец, коров, коз, свиней и т.п., и домашних животных, таких как кошки и собаки.
Для применения в диагностике и в исследовательских работах подходящими субъектами являются различные млекопитающие, включая грызунов (например, мышей, крыс, хомяков), кроликов, приматов и свиней, таких как инбредные свиньи, и т.п. Кроме того, для применения in vitro, например, для применения в in vitro диагностике и в исследовательских работах, пригодны биологические жидкости (например, кровь, плазма, сыворотка, клеточная интерстициальная жидкость, слюна, кал и моча) и образцы клеток и тканей вышеуказанных субъектов.
ПРИМЕРЫ
Нижеприведенные примеры предлагаются в качестве иллюстрации, но не с целью ограничения. Если не указано иначе, все реагенты и растворитель были стандартными технически чистыми продуктами и применялись без дополнительной очистки. Исходные материалы получали от коммерческих поставщиков, таких как Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), или синтезировали по известным в уровне техники методикам.
Пример 1. Схема синтеза замещенных пиразолопиримидинов и дигидропиразолопиримидинов
1
2
3
Приведенный в настоящей заявке ряд последовательных реакций (Схема 1), применявшихся для получения замещенных пиразолопиримидинов и дигидропиразолопиримидинов, начинали с конденсации 1,3-дикетона 6 с этил 3-амино-1H-пиразол-4-карбоксилатом 7 в уксусной кислоте. Такие реакции были описаны ранее. См., например, Международную патентную заявку WO 2008/134035 и Huppatz, J.L. Aust. J. Chem. 1985, 38, 221-230. Первоначальные попытки упростить оценку SAR амидов были сосредоточены на применении ацетилацетона в качестве дикетона во избежание образования региоизомеров (R=R=CH). С несимметричными кетонами образовывалась смесь региоизомеров (8, 9), которую обычно разделяли хроматографией. Последующий гидролиз сложных эфиров давал кислоту, которая реагировала с аминами с образованием соединений (10, 11) для анализа биологических свойств.
Пример 2. Синтез N-(4-этинилфенил)-5,7-диметилпиразоло[1,5-A]пиримидин-3-карбоксамид
Стадия 1. Синтез 5,7-диметилпиразоло[1,5-a]пиримидин-3-карбоновой кислоты (12)
6
Пентан-2,4-дион (1.46 мл, 14.2 ммоля), этил 3-амино-1H-пиразол-4-карбоксилат (2.00 г, 12.9 ммоля) нагревали в герметичной ампуле с уксусной кислотой (10 мл) при 110°C в течение ночи. Об окончании реакции судили по LCMS жидкостная хроматография - масс спектрометрия (LC-MS: rt (время удерживания, мин)=3.08). Уксусную кислоту удаляли, продувая воздух через сосуд, нагретый до 75°C. Сырой остаток этил 5,7-диметилпиразоло[1,5-a]пиримидин-3-карбоксилата (предположительно, 12.89 ммоля) суспендировали в MeOH (15 мл) и прибавляли 7.2 М раствор гидроксида натрия (5.37 мл, 38.7 ммоля). Смесь нагревали до 80°C (при этой температуре осадок растворялся), а затем перемешивали в течение 3 час. Реакционную смесь охлаждали и нейтрализовали до pH 6-7. Суспензию отфильтровывали на воронке Бюхнера под вакуумом, твердый осадок промывали водой, а затем диэтиловым эфиром, получали 5,7-диметилпиразоло[1,5-a]пиримидин-3-карбоновую кислоту (1.4 г, 7.3 ммоля, выход 57%). LC-MS: rt (мин)=2.61. 1H ЯМР (400 МГц, DMSO-d) δ м.д. 2.57 (s, 3H), 2.71 (s, 3H), 7.10 (s, 1H), 8.50 (s, 1H).
Стадия 2. Синтез N-(4-этинилфенил)-5,7-диметилпиразоло[1,5-a]пиримидин-3-карбоксамида (13)
2
2
6
1
5,7-Диметилпиразоло[1,5-a]пиримидин-3-карбоновую кислоту (722 мг, 3.78 ммоля), 4-этиниланилин (442 мг, 3.78 ммоля) и HATU (1436 мг, 3.78 ммоля) помещали в DMF (10 мл), а затем прибавляли диизопропилэтиламин (1.979 мл, 11.33 ммоля). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Продукт реакции выпадал в виде осадка из реакционной смеси. Реакционную смесь разбавляли водой, отфильтровывали через воронку Бюхнера в слабом вакууме. Остаток промывали водой (x2), затем CHCl, диэтиловым эфиром, сушили на воздухе, получали N-(4-этилфенил)-5,7-диметилпиразоло[1,5-a]пиримидин-3-карбоксамид (500 мг, 1.72 ммоля, выход 46%). LC-MS: rt (мин)=3.65. H ЯМР (400 МГц, DMSO-d) δ м.д. 2.71 (s, 3H), 2.77 (s, 3H), 4.11 (s, 1H), 7.21 (s, 1H), 7.49 (d, J=8.6 Hz, 2H), 7.77 (d, J=8.6 Hz, 2H), 8.65 (s, 1H), 10.31 (s, 1H).
Пример 3. Протокол анализа на глюкоцереброзидазную активность
Анализ qHTS на ингибиторы и активаторы N370S глюкоцереброзидазы в качестве возможного средства лечения болезни Гоше с помощью шаперонов: доказательство с помощью первичного скрининга
Этот анализ является ферментным анализом с участием флуорогенного фермента с 4-метилумбеллиферил-бета-D-глюкопиранозидом в качестве субстрата и N370S глюкоцереброзидазой из гомогената человеческой селезенки в качестве ферментного препарата. Продукт гидролиза этого флуорогенного субстрата, 4-метилумбеллиферон, может возбуждаться при 365 нм и испускает при длине волны 440 нм, что можно наблюдать с помощью стандартного флуоресцентного планшет-ридера. Результаты нормализовали по контрольным образцам базальной активности (без фермента) и 100% активности (с ферментом). Значения AC50 определяли из данных на кривой отклика в зависимости от концентрации, смоделированной с применением стандартного уравнения Хилла.
Гомогенат селезенки человека готовили, гомогенизируя селезенку с аналитическим буфером, содержащим 50 мМ лимонной кислоты (титрованной фосфатом калия до pH 5.0), 100 мМ хлорида калия, 10 мМ хлорида натрия, 1 мМ хлорида магния, 0.01% Tween-20. Примерная концентрация белка гомогената человеческой селезенки составляла 1.35 мкг/мкл.
Анализ проводили в 1536-луночных планшетах согласно следующему протоколу. (1) в каждую лунку добавляли 2 мкл гомогената селезенки (в конце 27 мкг). (2) в каждую лунку добавляли раствор 23 нл тестируемого соединения в DMSO. Конечная концентрация соединения в тест-лунке была от 0.5 нМ до 58 мкМ. (3) В каждую лунку добавляли 2 мкл субстрата (1 мМ в конце). (4) Инкубировали аналитические планшеты при 37°C в течение 40 мин. (5) В каждую лунку добавляли 2 мкл стоп-реагента (смесь 1M NaOH и 1M глицина, pH 10). (6) Считывали аналитические планшеты на планшет-ридере ViewLux (PerkinElmer) при возбуждении УФ-излучением с длиной волны 365 нм и испускании при длине волны 440 нм.
Пример 4. Шаперонная активность N-(4-этинилфенил)-5,7-диметилпиразоло[1,5-A]пиримидин-3-карбоксамида (NGC00188758-01)
Шаперонную активность NGC00188758-1 (1 мкМ и 5 мкМ), изофагомина (1 мкМ) и контрольного носителя оценивали на фибробластах пациентов с мутацией N370S. GC-азу визуализировали окрашиванием красным цветом (R386 антителом к GC-азе), лизосому зеленым (LAMP), а ядра голубым (DAPI). Верхний слой всех окрашенных пятен имел ярко-желтый цвет (вследствие наложения красного и зеленого цвета), что указывало на присутствие GC-азы в лизосоме. Все параметры лазеров были постоянными во всех визуализированных областях. Как изофагомин, так и NGC00188758-1 проявили заметно повышенную GC-азную активность в лизосоме по сравнению с контрольным носителем.
Пример 5. Анализ селективности: qHTS анализ на ингибиторы и активаторы N370S глюкоцереброзидазы как потенциального шаперонного лекарственного средства для лечения болезни Гоше: Обратный скрининг относительно альфа-глюкозидазы
Для характеристики селективности соединения, лучшие примеры, выбранные в процессе первичного скрининга, подвергали скринингу против очищенной альфа-глюкозидазы, родственной гидролазы Сахаров. Альфа-глюкозидаза отвечает за гидролиз концевых невосстанавливающих связанных 1,4-связями остатков альфа-D-глюкозы с высвобождением альфа-D-глюкозы. Этот анализ является ферментным анализом с флуорогенным ферментом с применением 4-метилумбеллиферил-альфа-D-пиранозида в качестве субстрата и человеческой альфа-глюкозидазы в качестве ферментного препарата. Продукт гидролиза этого флуорогенного субстрата, 1.4-метилумбеллиферон, может возбуждаться при 365 нм и испускает при 440 нм. Эмиссию детектировали с помощью стандартного флуоресцентного планшет-ридера. Результаты нормализовали по контрольным образцам базальной активности (без фермента) и 100% активности (с ферментом). Значения AC50 определяли из данных на кривой отклика в зависимости от концентрации, смоделированной с применением стандартного уравнения Хилла (Hill).
Анализ проводили в 1536-луночных планшетах согласно следующему протоколу. (1) В каждую лунку добавляли фермент человеческую альфа-глюкозидазу 2 мкл/лунка (в конце 4 нМ) в аналитическом буфере (50 мМ лимонной кислоты (титрованной фосфатом калия до pH 5.0), 0.005% Tween-20, pH 5.0). (2) Добавляли раствор 23 нл соединений в DMSO. Конечная концентрация соединения была от 0.н нМ до 77 мкМ. (3) Добавляли 1 мкл субстрата (400 мкМ в конце). (4) Инкубировали при комнатной температуре в течение 20 мин. (5) Добавляли 2 мкл стоп-реагента (смесь 1M NaOH и 1M глицина, pH 10). (6) Считывали аналитические планшеты на планшет-ридере ViewLux (PerkinElmer) при Ex=365 нм и Em=440 нм.
Пример 6. Анализ транслокации в лизосомы: Шаперонная активность в фибробластах пациента, страдающего болезнью Гоше, после инкубации с соединением в течение нескольких дней
В этом анализе количественно определяли транслоцированный белок глюкоцереброзидазу в фибробластах пациента после продолжительной инкубации соединения. Фибробласты, анализированные в данном эксперименте, были гомозиготными по N370S глюкоцереброзидазе.
x
Первичные дермальные фибробласты из биоптатов кожи двух ранее описанных больных N370S/N370S болезнью Гоше (Goker-Alpan et al, 2008) и контрольные образцы засевали на 4-луночных предметных стеклах Lab-Tek (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). После обработки соединением фибробласты фиксировали в 3% параформальдегиде. Клетки пермеабилизовали 0.1% раствором Тритона-Х в течение 10 мин. и блокировали в PBS, содержащем 0.1% сапонина, 100 мкМ глицина, 0.1% BSA и 2% ослиной сыворотки с последующей инкубацией с моноклональным антителом мыши к LAMP1 или LAMP-2 (1:100, Developmental Studies Hybridoma bank, University of Iowa, Iowa City, IA) и кроличьим поликлональным антителом R386 к GC-азе (1:500). Клетки отмывали и инкубировали вторичными ослиными антителами против мышиного и кроличьего иммуноглобулинов, конъюгированными с ALEXA-488 или ALEXA-555, соответственно (Invitrogen, Carlsbad, CA), снова отмывали и заключали в среду VectaShield с DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
Клетки визуализировали с помощью лазерного конфокального сканирующего микроскопа Zeiss 510 META (Carl Zeiss, Microimaging Inc., Germany), используя аргоновый лазер (458, 477, 488, 514 нм) 30 мВт, HeNe лазер (543 нм) 1 мВт и лазерный диод (405 нм). Изображения с небольшим и большим увеличением получали с объективом Plan-Apochromat 20X/0.75 и иммерсионным объективом Plan-Apochromat 100x/1.4 oil DIC, соответственно. Изображения получены с одними и теми же параметрами лазера и все изображения сжаты с совмещением фокусов. Изображения показывают заметную транслокацию белка глюкоцереброзидазы в лизосомы в фибробластах, обработанных соединением по сравнению с необработанными фибробластами.
Пример 8. Дополнительные соединения
Нижеприведенные соединения получали по методикам, приведенным в Примерах 1 и 2. Специалисты в данной области техники понимают, что для получения перечисленных соединений необходимо менять реагенты и условия реакций. Такие вариации очевидны специалистам в области органического синтеза.
LC-MS время удерживания (r.t.) определяли следующим образом:
Способ 1: Колонка: Phenomenex Luna C18 (3 микрона, 3×75 мм). Время эксперимента (время элюирования): 8 мин. Градиент: от 4% до 100% ацетонитрила в воде в течение 7 мин. Подвижная фаза: ацетонитрил (0.025% TFA), вода (0.05% TFA). Скорость потока: 1 мл/мин. Температура: 50°C. УФ-спектр (UV), длина волны: 220 нм, 254 нм.
Способ 2: детекция UV214, колонка Gemini, Растворитель A: вода, Растворитель B: 90% ацетонитрила, 10% воды; 0.1% AcOH модулятор. Начальные условия градиентного элюирования 100% A со временем выдержки 0.5 мин; время градиентного элюирования 3 мин. Конечная концентрация градиентного элюирования 100% B. Время выдержки в конце градиентного элюирования 0.5 мин. Время эксперимента 5 мин. Скорость потока 1.5 мл/мин.
Способ 3. Детекция UV220, колонка Phenomenex Luna 2.5 микрона C18 100X2.00 мм, Растворитель A вода (0.05% TFA), Растворитель B ацетонитрил (0.025% TFA). Начальные условия градиентного элюирования 95% A, 5% B со временем выдержки 0.1 мин; время градиентного элюирования 2.1 мин. Конечная концентрация градиентного элюирования 100% B, 5% A. Время выдержки в конце градиентного элюирования 0.5 мин. Затем выдерживали дополнительно 0.3 мин при 98% A, 2% B. Время эксперимента 3 мин. Скорость потока от 0.30 до 0.5 мл/мин.
Если не указано иначе, LCMS указано время удерживания по Способу 1.