Влияние состояния неоангиогенеза на экспрессию белка нуклеофозмина/b23 и активность нуклеолярного аппарата клеток почечно-клеточного рака

6. Лазарев А.Ф., Авдалян А.М., Бобров И.П., Климачев В.В., Круглова Н.М. Клинико-морфологические факторы риска развития рецидива и метастазирования лейомиосаркомы тела матки // Онкология. Журнал им. П.А. Герцена, 2013. № 1. С. 27-33.

7. Tashikazu M. Studies on the utility of sequential staining technique using PCNA and AgNORs for assessing the degree of malignancy of gastric carcinoma // Acta med. Nagasak., 1993. Vol. 38. P. 226-231.

8. Ikeguchi M., Katano K., Oka A., Tsujitani S., Maeta M., Kaibara N. Number of argyrophilic nucleolar organiger regions is a good indicator of lymph node metastasis in patients with esophageal carcinoma // Langenbecks Arch. Chir., 1995. Vol. 380. P. 197-202.

9. Yang Y.F., Zhang X.Y., Yang M., He Z.H., Peng N.F., Xie S.R., Xie Y.F. Prognostic role of nucleophosmin in colorectal carcinomas // Asian. Pac. J. Cancer Prev., 2014. Vol. 15. P. 20212026.

10. Coutinho-Camillo C.M., Lourengo S.V., Nishimoto I.N., Kowalski L.P., Soares F.A. Nucleophosmin, p53, and Ki-67 expression patterns on an oral squamous cell carcinoma tissue microarray // Hum. Pathol., 2010. Vol. 41. P. 1079-1086.

11. LealM.F., Mazzotti T.K., Calcagno D.Q., Cirilo P.D., MartinezM.C., Demachki S., Assumpgao P.P., Chammas R., Burbano R.R., Smith M.C. Deregulated expression of Nucleophosmin 1 in gastric cancer and its clinicopathological implications // BMC Gastroenterol., 2014. Jan 10;14:9. doi: 10.1186/1471-230X-14-9.

12. Daskal Y., Smetana K., Buch H. Evidence from studies on segregated nucleoli that nucleolar silver stained proteins C23 and B23 are in fibrillar components // Exp. Cell Res., 1980. Vol.127. P. 285-291.

13. Бобров И.П., Авдалян А.М., Климачев В.В., Лазарев А.Ф., Гервальд В.Я., Долгатов А.Ю., Самуйленкова О.В., КовригинМ.В., Кобяков Д.С. Модификация гистохимического метода выявления ядрышковых организаторов на гистологических срезах // Архив патологии, 2010. № 3. С. 35-37.

14. Киселева Е.Г. Гетерогенность опухоли и механизмы естественной резистентности при метастазировании // Экспериментальная онкология, 1988. №1. С. 3-8.

15. Лобанов С.В. Значение опухолевой гетерогенности в метастазировании // Вопросы онкологии, 1992. № 4. С. 396-405.

INFLUENCE CONDITION OF NEOANGIOGENESIS AT EXPRESSION OF PROTEIN NUCLEOFOSMINUM/B23 AND ACTIVITY NUCLEOLAR APPARATUS OF RENAL CELLS CANCER Bobrov I.P.1, Cherdantseva T.M.2, Myadelets M.N.3, Lepilov A.V.4, Klimachev I.V.5, Dolgatov A.Yu.6, Lazarev A.F.7, Avdalyan A.M.8 (Russian Federation) Email: Bobrov539@scientifictext.ru

1Bobrov Igor Petrovich - Doctor of Medical Science, Senior Researcher; 2Cherdantseva Tatyana Mikhajlovna - Professor, Doctor of medical Science; 3Myadelets Mikchail Nicolaevich - Assistant; 4Lepilov Alexander Vasilevich - Professor, Doctor of medical Science, Head of Department; 5Klimachev Ilya Vladimirovich - Assistant; 6Dolgatov Andrey Yurievich - Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, DEPARTMENT OFPATHOLOHICAL ANATOMY, ALTAI STATE MEDICAL UNIVERSITY; 7Lazarev Alexander Fedorovich - Professor, Doctor of medical Science, Director of branch; 8Avdalyan Achot Miruzhanovich - Doctor of Medical Science, Senior Researcher, ALTAI BRANCH OF RUSSIAN ONCOLOGIC RESEARCH CENTER NAMED AFTER N.N. BLOKHIN,

BARNAUL

Abstract: in this scientific work, authors analyzed expression nucleoli protein nucleofosminum/B23 and options of morphofunctional activity of nucleolar apparatus of neoplasm's cells at renal-cell cancer depending on the neoangiogenesis of neoplasm. 109 resected kidneys was investigated about cancer. The following parameters was explored: the number of nucleoli per nucleus; area of nucleoli-forming zones and number of fibrillar centers, percentage ring-shaped, transitional and nucleolonemal morphofunctional variants of nucleoli per one nucleus. Expression of protein nucleofosminum/B23 and CD34 was found with immunohystochemical method. Is shown, that expression of nucleofosminum/B23 and options of nucleolar apparatus was authentically increased in cells of carcinoma with low density of microcirculary track. Hypoxia in badly-vascularized neoplasms caused hyperexpression of nucleofosminum/B23 and rising the nucleolar activity of neoplasm's cells, it is result ofprogression of renal-cells cancer. Keywords: neoangiogenesis, nucleofosminum, nucleus, kidneys cancer.

ВЛИЯНИЕ СОСТОЯНИЯ НЕОАНГИОГЕНЕЗА НА ЭКСПРЕССИЮ БЕЛКА НУКЛЕОФОЗМИНА/В23 И АКТИВНОСТЬ НУКЛЕОЛЯРНОГО АППАРАТА КЛЕТОК ПОЧЕЧНО-КЛЕТОЧНОГО РАКА Бобров И.П.1, Черданцева Т.М.2, Мяделец М.Н.3, Лепилов А.В.4,

5 6 7 8

Климачев И.В. , Долгатов А.Ю. , Лазарев А.Ф. , Авдалян А.М.

1 Бобров Игорь Петрович - доктор медицинских наук, старший научный сотрудник; 2Черданцева Татьяна Михайловна - профессор, доктор медицинских наук;

3Мяделец Михаил Николаевич - ассистент кафедры;

4Лепилов Александр Васильевич - профессор, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой;

5Климачев Илья Владимирович - ассистент кафедры;

6Долгатов Андрей Юрьевич - доцент, кандидат медицинских наук, кафедра патологической анатомии, Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего образования Алтайский государственный медицинский университет;

7Лазарев Александр Федорович - доктор медицинских наук, профессор, директор филиала; 8Авдалян Ашот Миружанович - доктор медицинских наук, старший научный сотрудник, Алтайский филиал Российского онкологического центра им. Н.Н. Блохина,

г. Барнаул

Аннотация: в работе авторы провели анализ экспрессии ядрышкового белка нуклеофозмина/B23 и параметров морфофункциональной активности нуклеолярного аппарата опухолевых клеток при почечно-клеточном раке в зависимости от состояния неоангиогенеза в опухоли. Исследовано 109 почек, резецированных по поводу рака. Изучены следующие параметры нуклеолярного аппарата: количество ядрышек на 1 ядро; площадь ядрышкообразующих зон и число фибриллярных центров на 1 ядро; процентное содержание на 1 ядро кольцевидных, переходных и нуклеолонемных морфофункциональных вариантов ядрышек. Экспрессию белков нуклеофозмина/B23 и CD34 выявляли иммуногистохимическим методом. Показано, что экспрессия нуклеофозмина/B23 и параметры нуклеолярного аппарата достоверно возрастали в клетках карцином с низкой плотностью микроциркуляторного русла. Гипоксия в плохо васкуляризированных новообразованиях вызывает гиперэкспрессию нуклеофозмина/B23 и повышение нуклеолярной активности опухолевых клеток, что приводит к прогрессии почечно-клеточного рака. Ключевые слова: неоангиогенез, ядрышко, рак почки.

В последнее время внимание исследователей обращено на изучение феномена гипоксии в опухоли [5, 15]. Показано, что гипоксия, возникающая в микроокружении опухолевых клеток, играет ключевую роль в активации метаболизма неоплазии и это имеет большое

54

клиническое и прогностическое значение [7, 4, 13]. Гипоксия индуцирует факторы активирующие транскрипцию генов, которые вызывают ответ на гипоксическое воздействие [8, 6]. К факторам, индуцируемым гипоксией, прежде всего, относятся наиболее изученные на сегодняшний момент белки семейства HIF (hypoxia-inducible factors): HIF-1a, HIF-2a, и HIF-3a [12]. Данные белки переключают метаболизм опухолевых клеток с аэробного на анаэробный путь получения энергии, что придает клеткам значительно большие возможности к инвазии и метастазированию.

Нуклеофозмин/B23 полифункциональный ядрышковый фосфопротеин с молекулярной массой 38 kD и его функциями являются: участие в промежуточных и поздних стадиях сборки прерибосом, транспорт белковых компонентов рибосом из ядра в цитоплазму, контроль дублирования центросом [10]. Имеются данные, что синтез данного белка может активироваться гипоксией. Экспериментальными исследованиями показано, что при недостатке кислорода в ядрышках клеток культур злокачественных клеток отмечается гиперэкспрессия нуклеофозмина/Б23 [9]. Гиперэкспрессия нуклеофозмина/B23 имеет прогностическое значение при ряде локализаций рака [1, 11, 14]. Исследования морфофункциональной активности нуклеолярного аппарата и экспрессии нуклеофозмина/Б23 в условиях гипоксии при раке почки в литературе отсутствуют.

Целью исследования явилось изучение экспрессии белка нуклеофозмина/Б23 и морфофункциональной активности нуклеолярного аппарата в клетках почечно-клеточного рака в зависимости от фактора гипоксии.

Материалы и методы исследования

Материалом для исследования послужили 109 почек, резецированных по поводу рака в Алтайском филиале РОНЦ им. Н.Н. Блохина Росздрава России, г. Барнаул. Средний возраст больных составил 58,0±0,8 лет. Мужчин было 53 (48,6%), женщин - 56 (51,4%). При изготовлении гистологических препаратов применялся метод тканевых матриц. В каждом случае из парафиновых блоков (блоков-доноров) после предварительного просмотра гистологического препарата иглой-панчером с внутренним диаметром 2,0 мм забирали столбики ткани опухоли. Далее столбики (10-15 шт.) помещали в парафиновые блоки-реципиенты размером 20х20 мм. С парафиновых блоков-реципиентов при помощи полуавтоматического роторного микротома изготовляли серийные гистологические срезы толщиной 4 мкм и переносили на стекла (с двух парафиновых блоков на одно стекло).

Изучение ядрышек опухолевых клеток осуществляли при окрашивании гистохимическими и иммуногистохимическими методами. Гистохимическое окрашивание ядрышек проводили по методу Daskal Y., et al., 1980, в нашей модификации [2]. Докраску ядра осуществляли 1% раствором метилового зеленого. Ядрышки классифицировали в соответствии с морфофункциональной классификацией ядрышек Челидзе П.В. и Зацепиной О.В. (1988). [3]. Высчитывали следующие параметры нуклеолярного аппарата: среднее количество ядрышек на 1 ядро; среднюю площадь ядрышкообразующих зон (ЯОЗ) на 1 ядро; среднее количество фибриллярных центров (ФЦ) на 1 ядро; среднее содержание кольцевидных (КЯд), переходных (ПЯд) и нуклеолонемных (НЯд) типов ядрышек на 1 ядро.

Иммуногистохимическое выявление ядрышкового белка нуклеофозмина/Б23 проводили с применением моноклональных антител - nucleophosmin n/B23, клон mouse mAb23 (фирма «Labvision»). Оценивали интегральную оптическую плотность (ИОП) нуклеофозмина/Б23 в ядрышке с использованием системы компьютерного анализа изображения, состоящей из микроскопа Leica DME, цифровой камеры Leica EC3 (Leica Microsystems AG, Германия), персонального компьютера и программного обеспечения ВидеоТест-Морфология 5.2. Значения ИОП нуклеофозмина/Б23 выражали в условных единицах (у.е.).

В целях исследования плотности микроциркуляторного русла (ПМЦР) в опухоли проводили иммуногистохимическое окрашивание эндотелия сосудов на CD34 (клон QBEnd/10, фирма Ventana). Препараты фотографировали цифровым фотоаппаратом в 5 полях зрения при увеличении х 400 и сохраняли фотоснимок в формате JPG. Затем проводили обработку снимков в программе Adobe Photoshop 6.0. и осуществляли подсчет

среднего числа сосудов в 5 полях зрения в программе Image Tool 3.0. с помощью инструмента Count and Tag.

Статистический анализ проводили с использованием программы Statistica 6.0. При сопоставлении средних величин использовали критерий значимости Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05. Коррелятивные взаимоотношения оценивали с помощью критерия Пирсона.

Результаты и их обсуждение

Результаты проведенного исследования показали, что ПМЦР в опухолях почки в среднем составила 30,9±2,2 в 5 полях зрения, пределы колебаний числа сосудов варьировали от 3,6 до 104, медиана составила 28 сосудов. Поскольку медиана количества сосудов была равна 28, то это значение нами было выбрано за критическую точку васкуляризации опухоли, позволяющую разделить больных на 2 группы. 1 группу составили больные с хорошо васкуляризированными опухолями, содержащими > 28 сосудов, 2 группу составили больные с плохо васкуляризированными опухолями, имеющими < 28 сосудов, т.е. находящимися в состоянии гипоксии.

При исследовании нуклеофозмина/В23 экспрессия белка была четко видна во всех опухолевых клетках, при этом выявлялась только ядрышковая локализация в виде окрашивания нуклеолы в цвета от светло-желтого до бурого. В целом в клетках ПКР ИОП белка нуклеофозмина/В23 составила 1551,1±51,35 у.е. на 1 ядро, пределы колебаний ИОП составили от 118,9 до 15779,1 у.е., медиана составила - 890 у.е. В группе больных с хорошо васкуляризированными карциномами ИОП белка составила 963,7±66,3 у.е., а в группе пациентов с плохо васкуляризированными опухолями ИОП достоверно возрастала до 2036,0±79,15 у.е. (p = 0,0000001) (рис. 1, 2; таблица 1). ИОП нуклеофозмина/В23 коррелировала с ПМЦР опухоли (r = 0,46; p = 0,0001); c наличием некроза в опухоли (r = 0,43; p = 0,0001); c размером опухоли (r = 0,45; p = 0,0001) и наличием метастазов (r = 0,40; p = 0,0001).

Рис. 1. Опухоль с высокой ПМЦР и низкой ИОП нуклеофозмина/Б23 на 1 ядро: а -иммуногистохимическая реакция на CD34, увеличение х 400; б - иммуногистохимическая реакция на

нуклеофозмин/Б23, увеличение х 1000

: ЯР •

' Ъг

' ( а

Рис. 2. Опухоль с низкой ПМЦР и высокой ИОП нуклеофозмина/В23 на 1 ядро: а -иммуногистохимическая реакция на СБ34, увеличение х 400; б - иммуногистохимическая реакция на

нуклеофозмин/В23, увеличение х 1000

При исследовании нуклеолярного аппарата обнаружено, что количество ядрышек в опухолях с высокой ПМЦР составило 1,6±0,05 на 1 ядро, а в карциномах с низкой ПМЦР оно достоверно возрастало до 1,8±0,04 (р = 0,0009). Средняя площадь ЯОЗ на 1 ядро в опухолях с высокой ПМЦР равнялась 1,7±0,06 мкм2, а с низкой - 2,9±0,08 мкм2 (р = 0,0000001). Содержание КЯд, ПЯд и НЯд в ядрах клеток опухолей с высокой ПМЦР составило 27,3%, 52,7%, 19,9%, а в карциномах с низкой ПМЦР 21,7%, 40,2% и 38,6% соответственно. В новообразованиях с низкой ПМЦР значимо возрастало количество ФЦ на 1 ядро до 10,9±0,4, по сравнению с карциномами с высокой ПМЦР (5,0±0,2) (р = 0,0000001) (таблица 1).

Таблица 1. Параметры нуклеолярного аппарата опухолевых клеток ПКР в зависимости от ПМЦР

опухоли

Параметры нуклеолярной активности ПМЦР

< 28 сосудов > 28 сосудов

ИОП нуклеофозмина/В23 (у.е.) 2036,0±79,15* 963,7±66,3*

Число ядрышек на 1 ядро 1,8±0,04* 1,6±0,05*

Площадь ЯОЗ (мкм2) 2,9±0,08* 1,7±0,06*

Число ФЦ на 1 ядро 5,0±0,2* 10,9±0,4*

Число КЯд на 1 ядро (%) 21,7 27,3

Число ПЯд на 1 ядро (%) 40,2 52,7

Число НЯД на 1 ядро (%) 38,6 19,9

Примечание: * р < 0,05.

Таким образом, результатами проведенного исследования показано, что в плохо васкуляризированных карциномах, по сравнению с хорошо васкуляризированными, отмечали возрастание экспрессии ядрышкового белка нуклеофозмина/В23. Данный феномен оказывал влияние на морфофункциональные характеристики нуклеолярного аппарата опухолевых клеток ПКР. Так, в клетках опухоли возрастали количество ядрышек и площадь ядрышкообразующих зон на 1 ядро. Также, гиперэкспрессия нуклеофозмина/В23 в ядрах клеток сопровождалась изменением распределения морфофункциональных типов нуклеол: в опухолях с низкой ПМЦР уменьшалось число кольцевидных и переходных вариантов ядрышек и возрастало содержание нуклеолонемных типов ядрышек. Данные перестройки нуклеолярного аппарата в конечном итоге проводили к значительному увеличению количества фибриллярных центров в ядрышках опухолевых клеток опухолей с низкой ПМЦР.

Как показано современными исследованиями, гипоксия оказывает значительное влияние на прогрессию и метастазирование опухоли, что имеет большое прогностическое значение. Данное исследование показало, что одним из патогенетических механизмов воздействия

фактора низкой оксигенации на прогрессию опухоли является активация экспрессии ядрышкового протеина нуклеофозмина/В23, гиперэкспрессия которого приводит к увеличению темпов роста опухолевых клеток за счет возрастания рибосомального синтеза. Понимание механизмов активации и регуляции экспрессии нуклеофозмина/В23 важно еще и в связи с тем, что в настоящее время активно разрабатываются таргетные препараты, ингибирующие данный белок, которые могут позволить улучшить качество и продлить жизнь онкологическим больным.

Список литературы /References

1. Авдалян А.М., Кобяков Д.С., Климачев В.В. и др. Экспрессия нерибосомального ядрышкового белка нуклеофозмина/В23 в гладкомышечных образованиеях тела матки // Бюллетень эеспериментальной биологии и медицины, 2015. № 8. С. 259-264.

2. Бобров И.П., Авдалян А.М., Климачев В.В, Лазарев А.Ф., Гервальд В.Я., Долгатов А.Ю., Самуйленкова О.В., КовригинМ.В., Кобяков Д.С. Модификация гистохимического метода выявления ядрышковых организаторов на гистологических срезах // Архив патологии, 2010. № 3. С. 35-37.

3. Челидзе П.В., Зацепина О.В. Морфофункциональная классификация ядрышек // Успехи современной биологии, 1988. № 2. С. 252-268.

4. Chang J., Erler J. Hypoxia - mediated metastasis // Exp. Med. Biol., 2014. Vol. 772. P. 55-81.

5. Dhani N, Fyles A, Hedley D, Milosevic M. The clinical significance of hypoxia in human cancers // Semin. Nucl. Med., 2015. № 2. P. 110-21.

6. Hashimoto T., Shibasaki F. Hypoxia-inducible factor as an angiogenic master switch // Front. Pediatr., 2015. № 3. P. 33-38.

7. Huang D., Li C., Zhang H. Hypoxia and cancer cell metabolism // Acta. Biochim. Biophys. Sin. (Shanghai), 2014. № 3. P. 214-219.

8. Kenneth N.S., Rocha S. Regulation of gene expression by hypoxia // Biochem. J., 2008. № 1. P. 19-29.

9. Li J., Zhang X., Sejas D.P., Bagby G.C., Pang Q. Hypoxia-induced Nucleophosmin Protects Cell Death through Inhibition of p53 // The Journal of biological chemistr., 2004. Vol. 279. P. 41275-41279.

10. Okuwaki M. The structure and functions of NPM1/Nucleophsmin/B23, a multifunctional nucleolar acidic protein // J. Biochem., 2008. № 4. P. 441-448.

11. Yang Y.F., Zhang X.Y., Yang M., He Z.H., Peng N.F., Xie S.R., Xie Y.F. Prognostic role of nucleophosmin in colorectal carcinomas // Asian. Pac. J. Cancer Prev., 2014. Vol. 15. P. 20212026.

12. Yang S.L., Wu C., Xiong Z.F., Fang X. Progress on hypoxia-inducible factor-3: Its structure, gene regulation and biological function // Mol. Med. Rep., 2015. № 2. P. 2411-2 416.

13. Yun Z., Lin Q. Hypoxia and regulation of cancer cell sternness // Adv Exp Med Biol., 2014. Vol. 772. P. 41-53.

14. Xu D.H., Liu F., Li X., Chen X.F., Jing G.J., Wu F.Y., Shi S.L., Li Q.F. Regulatory role of nucleophosmin during the differentiation of human liver cancer cells // Int. J. Oncol., 2014. Vol. 45. P. 264-272.

15. Zeng W., Liu P., Pan W., Singh S.R., Wei Y. Hypoxia and hypoxia inducible factors in tumor metabolism // Cancer Lett., 2015. № 2. P. 263-267.