Особенности биосинтеза и гистотопографии коллагенов i, II, III и IV типов при формировании волокнистого каркаса первичной и окончательной почек у эмбрионов человека

1. Астахова В. С. Вивчення властивостей матеріалів, які застосовуються в імплантології / В. С. Астахова, В. О. Маланчук, Л. М. Панченко // Стоматологічна імплантологія. Остеоінтеграція. Матеріали другого Українського міжнародного конгресу. - Київ, 2006. - С. 28-30.

2. Берсенёв А. В. Клеточная трансплантология - история, современное состояние и перспективы / А. В. Берсенёв // Клеточная трансплантология и тканевая инженения.- 2005.- №1.- С.49-56.

3. Волков А. В. Тканевая инженения: новые перспективы развития медицины / А. В. Волков // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.- 2005. - №1.- С.57-63.

4. Камалов Р. Х. Досвід використання остеотропних матеріалів в стоматологічній імплантології / Р. Х. Камалов, В. В. Коваленко, І. С. Сухан // Стоматологічна імплантологія. Остеоінтеграція. Матеріали другого Українського міжнародного конгресу. - Київ, 2006. - С.35-37.

5. Лысенок Л. Н. Клеточные аспекты замещения дефектов костной ткани стеклокристаллическими матеріалами / Л. Н. Лысенок // Клиническая имплантология и стоматология. - 2001. - № 3-4. - С. 109-111.

6. Опанасюк И. В. Костнопластические материалы в современной стоматологии / И. В. Опанасюк, Ю. В. Опанасюк // Современная стоматология. - 2002.- №3.- С.101

7. Применение костнопластического материала как носителя аутологичных стволовых клеток кролика для замещения костного дефекта челюсти / В. И. Куцевляк, В. Ф. Куцевляк, Ю. Е. Микулинский, Е. А. Щегельская // Стоматологічна імплантологія. Остеоінтеграція. Матеріали другого Українського міжнародного конгресу. - Київ, 2006. - С.72-84.

8. Development and in vitro characterisation of novel bioresorbable and bioactive composite materials based on polylactide foams and Bioglass for tissue engineering applications / Roether J.A., Boccaccini A.R., Hench L.L. [at al.] // Biomaterials. - 2002. - V. 23, N 18. - P. 3871-3878.

9. Marrow cell induced osteogenesis in porous hydroxyapatite and tricalcium phosphate: a comparative histomorphometric study of ectopic bone formation / Ohgushi H., Okumura M., Tamai S. [at al.] // J. Biomed. Mater. Res. - 1990. - Vol. 24, N 12. - P. 1563-1570.

БІОТЕХНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ТЕСТУВАННЯ СТОМАТОЛОГІЧНИХ ІМПЛАНТАЦІЙНИХ МАТЕРІАЛІВ Брашкин а.П.

Відпрацьована методика тестування матеріалів, використовуваних в стоматологічній практиці, для відновлення кісткової тканини і відбір матеріалу, придатного для перенесення стволових клітин в рану. Культивування фетальных фібробластів щурів на остеотропных матеріалах Коллапане-Л і Нурго^огЬ Р дають активне зростання. Таким чином, культуру кліток на даних носіях можна використовувати при підсадці в експериментальну рану для вивчення пропонованого нами способу оптимізації регенерат-торного процесу в кістці.

Ключові слова: фетальні фібробласти щурів, культивація, експериментальна рана.

BIOTECHNOLOGICAL METHODS OF TESTING OF STOMATOLOGICAL MATERIALS FOR IMPLANTATION Brashkin A.P.

The method of testing of materials, in-use in stomatological practice is exhaust, for renewal of bone issue and selection of material, suitable for the transfer of barrel cages in a wound. Cultivation of fetal rats’ fibroblasts on osteotrophic materials of Kollapane-l and Hypro-sorb F is given active growth. Thus, culture of cells on these transmitters it is possible to use for implantation in an experimental wound for the study of the method of optimization of regenerator process offered by us in a bone.

Key words: fetal rats’ fibroblasts,

cultivation, experimental wound.

УДК 611.611: 611 -018+611 -013. 7/8

ОСОБЕННОСТИ БИОСИНТЕЗА И ГИСТОТОПОГРАФИИ КОЛЛАГЕНОВ I, II, III И IV ТИПОВ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ВОЛОКНИСТОГО КАРКАСА ПЕРВИЧНОЙ И ОКОНЧАТЕЛЬНОЙ

ПОЧЕК У ЭМБРИОНОВ ЧЕЛОВЕКА

Значение соединительной ткани для функции каждого органа очень велико. Для объединения отдельных структурно-функциональных элементов в целостную конструкцию органа огромное значение имеет соединительнотканная строма [2]. Она разнообразна в

каждом органе. В то же время строма является наименее изученной тканевой структурой. Изучению соединительной ткани окончательной почки посвящено довольно большое число работ [6; 8], однако результаты проведенных исследований далеки от полноты, некоторые данные противоречивы, причем большинство исследований проведено на лабораторных животных [7; 9]. Крайне скудны сведения о развитии волокнистого каркаса первичной почки и они получены в основном в нашей лаборатории [3]. Вместе с тем известно, что именно компоненты межклеточного вещества играют ведущую роль в морфогенезе и дифференцировке эпителиальных клеток [13]. Ранее нами на базе гистохимии охарактеризовано становление биосинтеза полисахаридов и волокнистого каркаса мезо- и метанефроса человека [5]. Появление современного метода иммуногистохимии позволяет с помощью моноклональных антител конкретизировать тип коллагена и сроки его появления в развивающихся почках и в процессе замены мезонефроса окончательной почкой, о чем отсутствуют сведения в доступной литературе. 19 известных типов коллагенов кодируется 33-мя генами [10]. Последовательная их активация и приводит к фенотипическому проявлению в виде появления коллагенов разных типов в эмбриональном периоде.

Целью работы было изучение сроков появления и локализации коллагеновых волокон, содержащих коллаген I, II, III И IV типов, в составе волокнистой стромы первичной и окончательной почки в процессе их развития, расцвета и регрессии у зародышей человека, развивавшихся в матке при отсутствии явно выраженных повреждающих факторов внешней и внутренней среды.

Материал и методы исследования. Изучены 124 зародыша человека в возрасте от 21 суток до 12 недель внутриутробного развития на стадиях последовательно от раннего периода нервного желобка до начала дефинитивного плодного периода. Обзорные препараты окрашивали гематоксилином и эозином.

Иммуногистохимическое исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5мкм, помещенных на адгезивные стекла, покрытые полилизином (“MenzelGlaser”, Германия). Для освобождения антигенов после фиксации формалином использовали тепловую демаскировку антигенов в микроволновой печи “Sumsung” при мощности 800 Вт в течение 10 минут в цитратном буфере при рН 6,0 [4].

Для изучения разных типов коллагена первичными антителами были моноклональные антитела к коллагену первого типа (Isotype Ig G1, Chemicon International), коллагену второго типа (клон COLL-II, Isotype Ms Ig G1-kappa, Chemicon International), коллагену третьего типа (Isotype Ig G1, Chemicon International) и коллагену четвертого типа (клон CIV 22, Dako Cytomation). В качестве растворителя антител использовали раствор Antibody Diluent (Dako Cytomation). Дальнейшую обработку проводили с помощью системы визуализации En vision (DAKO) в течение 10 минут с каждым реактивом с биотинилированными антителами и стрептавидин-пероксидазным комплексом. Затем проводили реакцию с хромогеном DAB (Dako Cytomation), оценивая качество взаимодействия под контролем микроскопа на протяжении от 20 секунд до 3 минут. Для адекватного представления структуры ткани срезы дополнительно окрашивались гематоксилином Майера в течение 3 минут. Дегидратация и заключение в бальзам осуществлялись в соответствии с распространенными подходами. Результат расценивали как позитивный при выпадении солей хромогена на коллагеновых волокнах мезо- и метанефроса. С целью контроля метода была проведена серия исследований с использованием позитивных и негативных образцов, которые служили эталонами. Волокна позитивные по отношению экспрессии маркеров изучали как минимум на 5-ти срезах. В каждом из них определяли количество окрашенных в коричневый цвет коллагеновых волокон в 10 полях зрения на площади 502,08 мкм2 (увел. х 400 микроскопа «Olympus CX-41») с помощью окулярной сетки по Г.Г. Автандилову [1].

Результаты исследования и их обсуждение. У зародышей в возрасте 37-41 суток (912 мм длины) первичные почки достигли наивысшего развития, простираясь от первого грудного до первого поясничного сегмента. Дифференцированный мезонефрос состоит из нефронов, располагающихся один над другим по вертикали. Капсула телец мезонефронов переходит в S-образно изогнутые канальцы, впадающие в Вольфов проток. Наиболее развиты мезонефроны в краниальном отделе органа. Здесь в строме наряду с небольшим количеством коллагеновых волокон первого типа встречаются в большем количестве

коллагеновые волокна третьего типа. Их соотношение составляет 2,6:6,1. В средних и особенно в каудальных отделах коллагеновые волокна отсутствуют.

На последующих сроках развития (зародыши 45-47 суток, 16-18 мм длины) в связи с продолжающимся обратным развитием мезонефронов в краниальной части первичной почки в их строме прослеживается наряду с коллагеновыми волокнами первого и третьего типа небольшое количество коллагеновых волокон второго типа. В строме средней части мезонефроса между эпителиальными закладками мезонефронов, находящихся в стадии расцвета, обнаруживаются коллагеновые волокна первого и третьего типа (рис. 1а и рис. 1б) в соотношении 2,5:5,8. В этом возрасте биосинтез волокнистой стромы развивающейся каудальной части первичной почки заключается в секреции периэпителиальными молодыми фибробластами коллагеновых волокон третьего типа.

а г -л • *Т1 иг б

Рис. 1 Срезы мезонефроса зародыша 47 суток, 18 мм длины. Окраска иммуногистохимическим методом. Дополнительное окрашивание гематоксилином Майера. Визуализация в системе En vision. а -позитивная реакция на коллаген первого типа; б - позитивная реакция на коллаген третьего типа.

Рис. 2 Срез мезонефроса зародыша 12 недель, 70 мм длины. Окраска иммуногистохимическим методом.

Дополнительное окрашивание

гематоксилином Майера. Визуализация в системе En vision. Позитивная реакция на коллаген четвертого типа в базальной мембране кровеносных капилляров стромы и клубочков и базальной мембране наружного листка капсулы.

У зародышей в возрасте 49-50 суток (20-21 мм длины) активно развиваются окончательные почки, которые располагаются на уровне первого-третьего поясничных позвонков, соприкасаясь с вентральной стороны с мезонефросами и надпочечниками. Окружающая эмбриональная соединительная ткань образует, располагаясь циркулярно, вокруг неё зачаток капсулы. На данном сроке пренатального онтогенеза впервые происходит преобразование Б-образных зачатков нефронов первой генерации в почечные тельца, что выражается в уплощении клеток будущего наружного листка капсулы. Однако окончательная дифференцировка почечных телец не происходит. В капсуле появляются многочисленные толстые коллагеновые волокна третьего типа. Вероятно, в эмбриональном периоде в различных органах первыми появляются именно коллагеновые волокна третьего типа [12]. Аналогичные волокна имеются в волокнистой строме вокруг почечных лоханок, больших чашечек и Б-образных зачатков нефронов первой генерации.

К 55-60 суткам эмбриогенеза (зародыши 25-30 мм длины) краниальные отделы мезонефроса полностью разрушились, а в средних отделах появились признаки

дегенерации, проявляющиеся в том числе и снижением биосинтеза коллагеновых волокон первого и третьего типа и появлением коллагеновых волокон второго типа. Их соотношение 1,9:1,7:4,8. В наиболее каудальной части первичной почки мезонефроны находятся в стадии расцвета. Волокнистая строма этих отделов преимущественно состоит их коллагеновых волокон третьего типа и небольшого количества коллагеновых волокон первого типа. Их соотношение 1,4:4,2. Волокна образуют нежную сеточку вокруг почечных телец и канальцев мезонефронов.

На этом сроке развития в метанефросе впервые обнаруживаются структурно сформированные почечные тельца округлой формы, имеющие сосудистый полюс, в области которого находится ножка клубочка капилляров. Петли гломерулярных капилляров развиты недостаточно и расположены по его периферии. В капсуле помимо коллагеновых волокон третьего типа появились коллагеновые волокна первого типа. Такие же волокна имеются вокруг почечных лоханок, больших чашечек и почечных телец и канальцев нефронов первой генерации.

На 10-й неделе развития (зародыши 33-45 мм длины) в метанефросе явно видны нефроны трех генераций. Наиболее хорошо развиты нефроны первой генерации. Волокнистый компонент капсулы и стромы состоит из коллагеновых волокон первого и третьего типа, причем коллагеновые волокна третьего типа более толстые и преобладают количественно, особенно в капсуле и вокруг эпителиальной закладки больших чашечек и лоханок. В базальной мембране кровеносных капилляров стромы и клубочков и базальной мембране канальцев и наружного листка капсулы впервые обнаруживаются коллагеновые волокна четвертого типа.

В течение 11 -й недели (зародыши 46-56 мм длины) спектр типов коллагеновых волокон в эмбриональной соединительной ткани окончательной почки становится более разнообразным. В ней вокруг почечных лоханок и чашечек и капсуле обнаруживаются коллагеновые волокна второго типа. Ранее предполагалось, что коллагеновые волокна второго типа появляются только у 15-недельных эмбрионов человека [11]. Строма между закладками нефронов трех генераций не имеет коллагеновых волокон второго типа.

К концу 12-й недели эмбриогенеза (зародыши 57-70 мм длины) в оставшейся функционирующей наиболее каудальной части мезонефроса волокнистый каркас эмбриональной соединительной ткани состоит из коллагеновых волокон первого и третьего типов. Их соотношение равно 2,8:6,4. Коллагеновые волокна третьего типа более толстые и многочисленные. Также выявляются коллагеновые волокна четвертого типа в базальной мембране кровеносных капилляров стромы и клубочков и базальной мембране канальцев и наружного листка капсулы (рис. 2).

В окончательной почке сформировались нефроны четырех генераций. В эмбриональной соединительной ткани присутствуют коллагеновые волокна первого, второго и третьего типов. Наиболее грубые и многочисленные - коллагеновые волокна третьего типа. Самые нежные и редкие - коллагеновые волокна второго типа. В капсуле органа и строме вокруг почечных лоханок и больших чашечек всех видов волокон значительно больше. Коллагеновые волокна четвертого типа по-прежнему имеются в базальной мембране кровеносных капилляров стромы и клубочков и базальной мембране канальцев и наружного листка капсулы почечных телец.

1. В эмбриональной соединительной ткани первичной почки человека к 12-ти неделям эмбриогенеза присутствуют коллагеновые волокна I и III типов. Коллагеновые волокна IV типа имеются в базальной мембране эндотелия кровеносных сосудов стромы и клубочков и базальной мембране канальцев и наружного листка капсулы почечных телец мезонефронов только наиболее каудальных отделов.

2.В строме окончательной почки человека к 12-ти неделям эмбриогенеза присутствуют коллагеновые волокна I, II и III типов. Коллагеновые волокна IV типа имеются в базальной мембране эндотелия кровеносных сосудов стромы и клубочков и базальной мембране канальцев и наружного листка капсулы почечных телец метанефронов.

3. Первыми в мезо- и метанефросе появляются коллагеновые волокна III типа. Коллагеновые волокна I типа обнаруживаются позднее. Коллагеновые волокна I типа

повторяют динамику и гистотопографию коллагеновых волокон III типа, но их значительно меньше.

4. Коллагеновые волокна II типа присутствуют в строме окончательной почки на 11-й неделе (зародыши 46-56 мм длины) развития и заметно не увеличиваются количественно и в толщину до конца изученного периода эмбриогенеза. В первичной почке коллагеновые волокна II типа обнаруживаются только в регрессирующих участках.

1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия / Г.Г. Автандилов. - Москва: Медицина, 1991. - 380 с.

2. Галкина Ю.М. Развитие и строение органов человека и млекопитающих животных в онтогенезе / Ю.М. Галкина // Российские морфологические ведомости. - 1999. - N 1-2. - 49с.

3. Жарков С. В. Некоторые особенности биосинтеза полисахаридных комплексов мезенхимными производными в нефрогенезе у человека: первичная почка / С. В. Жарков, Е. Ю. Шаповалова // Український морфологічний альманах. - 2005. - Т. 3, № 1. - С. 96-98.

4. Коржевский Д.Э. Применение методов теплового демаскирования антигенов на парафиновых срезах головного мозга крысы / Д.Э. Коржевский, Е.А. Юмкина // Морфология. - 2005. - Т. 127, № 2. - С. 76-77.

5. Шаповалова Е. Ю. Особенности биосинтеза полисахаридов и волокнистого каркаса поджелудочной железой и окончательной почкой в раннем эмбриогенезе у человека при маточной имплантации / Е. Ю. Шаповалова, Т. А. Бойко, Н. И. Майструк // Таврический медико-биологический вестник. - 2008. - Т. 11, № 2. - С. 182-186.

6. Янин В. Л. Морфометрия тканевых и органных структур почки в раннем эмбриогенезе / В. Л. Янин, Л. В. Вихарева, С. М. Пантелеев // Российские морфологические ведомости. - 1999. - N I-2. - C. 174.

7. Alexander B. T. Fetal programming of hypertension / B. T. Alexander // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. - 2006. - V. 290, N 1. - P. R1-R10.

8. Awqatl Q. Architectural patterns in branching morphogenesis in the kidney / Q. Awqatl, M.R. Goldberg //Kidney Int. - 1998. - V. 54, N 6. - P. 1832-1842.

9. Borovecki F. Bone morphogenetic protein-7 from serum of pregnant mice is available to the fetus through placental transfer during early stages of development / F. Borovecki, M. Jelic, L. Grgurevic // Biochem Biophys Res Commun. - 2004. - V. 2, N 316. - P. 490-500.

10. Myers J.C. Biochemical and immunochistochemical characterization of human type XIX defines a novel class of basement membrane zone collagens / J.C. Myers, A. Bageris, V. Abraham // Am. J. Pathol. - 1997.

- V. 151, N 6. - P. 1729-1740.

11. Sandbera M. M.. Co-expression of collagens II and XI and alternative splicing of exon 2 of collagen II in several developing human tissues / M. M. Sandbera, H. E. Hirvonen, K. J. Elima // Biochem. J. - 1993. - V. 294, N 2. - P. 595-602.

12. Sandberg M. M. Construction of a human pro alpha 1 (III) collagen cDNA clone and localization of type

III collagen expression in human fetal tissues / M. M. Sandbera, J. K. Makela, P. Multimaki // Matrix. - 1989.

- V. 9, V 2. - P. 82-91.

13. Tremblay E. Differential expression of extracellular matrix components during the morphogenesis of human gastric mucosa / E. T remblay, D. Menard // Anat. Rec. - 1996. - V. 245, N 4. - P. 668-676.

ОСОБЛИВОСТІ БІОСИНТЕЗУ І ГИСТОТОПОГРАФІЇ КОЛАГЕНУ I, II, III І IV ТИПІВ ПРИ ФОРМУВАННІ ВОЛОКНИСТОГО КАРКАСА ПЕРВИННОЇ І ОСТАТОЧНОЇ НИРОК У ЕМБРІОНІВ ЛЮДИНИ Бойко Т.А.

Становлення колагенового складу волокнистого каркасу мезо- і метанефроса вивчене за допомогою методу іммуногистохимії у 124 зародків людини у віці від 21 доби до 12 тижнів внутрішньоутробного розвитку. Первинними антітіламі були моноклональні антитіла до колагену

I, II, III І IV типів. В ембріональній сполучній тканині мезонефроса до 12-ти тижнів присутні колагенові волокна I та III типів. Колагенові волокна II типу виявляються тільки в регресуючих ділянках. Колагенові волокна IV типу є в базальній мембрані ендотелію кровеносних судин строми і клубочків і

PECULARITIES OF BIOSYNTHESIS AND GISTOTOPOGRAPHY OF COLLAGEN TYPES I,

II, III AND IV AT FORMING FIBRIL FRAMEWORK OF MESONEPHROS AND METANEPHROS OF HUMAN EMBRYOS Boyko T. A.

Becoming of collagen composition of fibril framework of meso- and metanephros was studied by the method of immunohistochemistry on 124 human embryos in age from 21 days to 12 weeks of intrauterine development. Primary antibodies were monoclonal antibodies to the collagen types I, II, III and IV. It is received, that in 12 weeks aged embryo mesonephros connective tissue fibers consisted of types I and III collagen. Collagen fibers type II appeared only in regressing areas. Collagen fibers type IV located in the basal membrane of blood vessels’ endothelium of stroma and glomeruli, in basal

базальній мембрані канальців і наружного листка капсули ниркових тілець мезонефронів тільки найбільш каудальних відділів. У стромі мета-нефроса до 12-ти тижнів ембріогенезу присутні колагенові волокна I, II і III типів. Колагенові волокна

IV типу є в базальній мембрані ендотелію кровоносних судин строми і клубочків і базальній мембрані канальців і зовнішнього листка капсули ниркових тілець метанефронів. Першими в мезо- і метанефросе з'являються колагенові волокна III типу.

Ключові слова: мезонефрос, метанефрос, колагенові волокна, ембріони людини.

membrane of tubules and mesonephrons external layer of capsule of renal corpuscles only in the most caudal regions. In 12 weeks aged embryo metanephros stroma consisted of types I, II and III collagen. Collagen fibers type IV located in the basal membrane of blood vessels’ endothelium of stroma and glomeruli, in basal membrane of tubules and metanephrons external layer of capsule of renal corpuscles. In meso- and metanephros first appeared collagen fibers type III.

Key words: mesonephros, metanephros, collagen fibers, human embryos.

УДК: 616.36-018-085-092.9:612.014.4:612.015

УЛЬТРАСТРУКТУРА ПЕЧІНКИ ЗРІЛИХ ЩУРІВ ЗА ДІЇ ГІПЕРГІДРАТАЦІЇ ВАЖКОГО СТУПЕНЮ В УМОВАХ ЗАСТОСУВАННЯ МЕКСИДОЛУ

В умовах сьогодення на організм людини одночасно діє багато різних екологічних чинників. Біологічні ефекти такого поєднаного впливу поглиблено досліджувалися, але питання морфофункціональних перетворень печінки в умовах гіпергідратаційних порушень водно-сольового обміну майже не вивчалися [8,10]. Ця проблема ще знаходиться на етапі накопичення фактів. Вирішення її необхідно для попередження і лікування хвороб, які супроводжуються порушеннями водно-електролітного балансу [1,3], а також для попередження і лікування багатьох хвороб внутрішніх органів, що супроводжуються набряками [4].

Вивчення дії лікарських речовин на інтактну печінку і печінку при загальній гіпергідратації важкого ступеню є дуже важливою проблемою в наш час. Серед величезної кількості гепатопротекторів найбільш ефективними є препарати, що активують метаболізм і антиоксидантні ферментні системи [7]. Такими речовинами є природні і синтетичні оксиданти. Тому для корекції негативних наслідків різних чинників (в тому числі і отруєння водою) необхідне застосування антиоксидантів. Мексидол має широкий спектр біологічної дії, що дозволяє йому впливати на різні механізми регуляції функціональної і метаболічної активності печінкових клітин [9, 12]. Він має виражені антиоксидантні та цитопротекторні властивості. Мексидол тісно зв'язується з мембраною ендоплазматичного ретікулуму мозку і печінки, інтенсивно метаболізується з утворенням глюкуронокон'югованого метаболіту, а також попереджує зниження активності антиоксидантної системи, гальмує розвиток

синдрому пероксидації, сприяє гальмуванню гіперхолістеринемії, має гіполіпідемічну дію [11]. Тому застосування мексидолу як гепатопротектора є доцільним.

Метою роботи було в експерименті на білих безпорідних щурах-самцях зрілого віку з'ясувати ультраструктурну перебудову гепатоцитів за дії гіпергідратаційних порушень водно-сольового обміну організму важкого ступеню в умовах застосування мексидолу. Вперше нами зроблена спроба дослідити можливість застосування мексидолу як гепатопротектора для корекції структурно-функціональних порушень печінки, спричинених гіпергідратацією важкого ступеню.

Матеріал та методи дослідження. Для вивчення морфофункціональних змін печінкових клітин щурів зрілого віку при впливі на організм гіпергідрії важкого ступеню на тлі застосування мексидолу проведено дослідження на 24 безпорідних білих щурах-самцях 7-ми місячного віку масою 150 - 200г, що перебували в стаціонарних умовах віварію. Всі експерименти на тваринах проводилися з дотриманням міжнародних принципів

Європейської конвенції про захист хребетних тварин, які використовуються для

експериментальних та інших наукових цілей (Страсбург, 1985), а також згідно до "Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных [6].