Сравнительная характеристика секреторных продуктов нейтрофилов, полученных разными способами активации клеток

жз,Краткие сообщения

© 2003, СПб РО РААКИ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СЕКРЕТОРНЫХ ПРОДУКТОВ НЕЙТРОФИЛОВ, ПОЛУЧЕННЫХ РАЗНЫМИ СПОСОБАМИ АКТИВАЦИИ КЛЕТОК

Третьякова И.Е., Долгушин И.И., Коробейникова Э.Н., Кудревич Ю.В., Ильиных Е.И.

НИИ иммунологии Челябинской медицинской академии

Резюме. Изучены биохимические и иммунотропные свойства секреторных продуктов нейтрофилов, полученных в результате активации клеток частицами латекса и адгезией. Показано, что при стимуляции грану-лоцитов латексом в большей степени увеличивается содержание диеновых конъюгатов. При активации нейтрофилов адгезией происходит накопление диенкетонов и сопряженных триеновых. Выяснилось также, что при стимуляции нейтрофилов адгезией более чем в 2 раза больше выделяется белка. Не отмечено достоверных различий в содержании глюкозы, кальция, магния и лизоцима в составе медиаторов гранулоцитов, выделенных при использовании разных индукторов секреции. Показано, что супернатанты активированных разными способами нейтрофилов обладают практически одинаковым моноцитстимулирующим действием.

Ключевые слова: медиаторы нейтрофилов, индукторы секреции гранулоцитов, биохимический состав медиаторов нейтрофилов, моноцитстимулирующее действие.

Tretyakova I.E., Dolgushin 1.1., Korobeynikova E.N., Kudrevich Y. V., Ilyinykh E.I.

COMPARATIVE CHARACTERISTICS OF SECRETORY PRODUCTS OF NEUTROPHILS OBTAINED BY VARIOUS METHODS OF CELL ACTIVATION

Abstract. Biochemical and immunotropic properties of neutrophil secretory products obtained by means of cell activation by latex particles and adhesion have been studied. It has been shown that the number of dien conjugates increases considerably in stimulars of granulocytes by latex. In neutrophil activation by adhesion accumulation of dienketones and conjugated triens is observed. It was also revealed that twice as much production of protein was observed in neutrophil stimulation by adhesion. There was no significant difference in the content of glucose, calcium, magnesium and lysozyme in the composition of granulocyte mediators isolated by means various secretion inductors. Supernatants of neutrophils activated by different methods were shown to possess practically identical monocyte stimulating activity.

Введение проблемы. Гранулоциты рассматриваются как вспо-

Одной из актуальных проблем современной им- могательные эффекторные клетки-мишени для лим-мунологии является изучение процессов взаимодей- фоцитов, моноцитов, ростковых факторов [10]. Про-ствия между клетками иммунной системы и медиа- блема изучения полиморфноядерных лейкоцитов торов, обусловливающих межклеточные контакты как клеток - продуцентов медиаторов межклеточных [5, 9, 10]. Медиаторы иммунокомпетентных клеток взаимодействий стала предметом пристального вни-образуют регуляторную сеть, определяющую на- мания иммунологов лишь в последние годы, правленность и интенсивность различных иммуно- Целью настоящего исследования было дать срав-

логических реакций [5, 10]. нительную биохимическую и иммунотропную харак-

Вопрос об участии нейтрофилов в иммунных теристику секреторных продуктов нейтрофилов, реакциях и их взаимосвязи с другими иммуноцита- полученных разными способами активации клеток, ми остается наименее изученным аспектом данной

Адрес для переписки: МЭТбрИЗЛЫ И МеТОДЫ

454092, Челябинск, ул. Воровского, д. 64. Для реализации поставленной цели медиаторы

Тел.: (3512) 34-04-14, факс (3512) 34-02-26. гранулоцитов выделяли при использовании двух

E-mail: postmaster@vita. chel. su; www.vita.chel.su индукторов секреции: микросферы латекса диамет-

ром 1,7 мкм и поверхность пластика. Выделение секреторных продуктов нейтрофилов осуществляли из периферической крови 10 доноров.

Получение медиаторов полиморфноядерных лейкоцитов доноров с использованием частиц полисти-рольного латекса проводили с помощью метода, разработанного И.И.Долгушиным и др. [3]. Гранулоци-ты из крови доноров выделяли на двойном градиенте плотности фиколла - верографина («Pharmacia», Sweden; «Spofa», Чехия) по методу Wong L., Wilson R.D. [12], при этом чистота взвеси нейтрофилов была около 94%, 6% составляли мононуклеары. Полученные нейтрофилы разводили раствором Хенкса до концентрации 5 млн кл/мл. Активацию гранулоци-тов осуществляли в присутствии микросфер латекса в течение 1 часа при температуре 37° С из расчета 50 частиц на одну клетку. С помощью центрифугирования при 3000 об/мин в течение 15 минут и последующей фильтрации через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,22 мкм («Millipore», USA) получали супернатанты активированных нейтрофилов.

Для выделения медиаторов гранулоцитов, активированных адгезией, использовали пластмассовые лабораторные чашки Петри диаметром 40 мм. К 20,0 мл гепаринизированной периферической венозной крови доноров добавляли 10% раствор желатина в соотношении 10:1 и отстаивали при температуре 37°С в течение 30 минут с целью осаждения эритроцитов и получения лейкоцитарной взвеси. Определяли количество нейтрофилов в 1,0 мл лейкоцитарной взвеси, разводили гранулоциты до концентрации 5 млн кл/мл раствором Хенкса. Разливали по

1,0 мл клеточной суспензии в пластмассовые чашки Петри, инкубировали 1 час при температуре 37°С. Адгезированные при таком режиме клетки состояли на 92% из нейтрофилов, 8% составляли мононуклеары. Надосадок сливали, неадгезированные клетки удаляли из супернатанта центрифугированием

при 3000 об/мин в течение 10 минут и последующей фильтрацией через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,22 мкм («Millipore», USA).

Медиаторы нейтрофилов доноров, выделенные разными способами активации клеток, подвергали сравнительной оценке биохимических и иммуно-тропных свойств. Биохимическую характеристику проводили при изучении содержания в супернатантах активированных нейтрофилов продуктов ПОЛ, общего белка, глюкозы, кальция, магния и лизоци-ма. Содержание продуктов ПОЛ определяли экст-ракционно - спектрофотометрическим методом [2]. При этом оценивали содержание продуктов пере-окисления ацилов в структуре фосфолипидов, извлекаемых изопропанольной фазой. Общий белок определяли микрометодом, адаптированным к супернатантам активированных нейтрофилов с помощью реактива Бенедикта [7]. Содержание глюкозы в секреторных продуктах гранулоцитов оценивали ферментативным глюкозооксидантным методом с помощью тест-системы «Глюкоза - ФКД для in vitro диагностики ». Определение содержания кальция и магния в медиаторах нейтрофилов осуществляли унифицированным колориметрическим методом с помощью наборов фирмы «Ольвекс» (Санкт-Петербург). Изучение содержания лизоцима в супернатантах активированных нейтрофилов проводили по методу О.В. Бухарина [1].

При тестировании иммунотропных свойств супернатантов активированных разными способами нейтрофилов доноров in vitro в качестве клеток-мишеней использовали моноциты донора. Моноцитстимулиру-ющее действие секреторных продуктов гранулоцитов оценивали по их влиянию на фагоцитарную, лизосо-мальную и НСТ-редуцирующую активность клеток-мишеней [8]. Для этой цели моноциты донора инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С в присутствии 1,0 мл медиаторов нейтрофилов с пос-

Табл. 1. ПОКАЗАТЕЛИ ПОЛ В СУПЕРНАТАНТАХ АКТИВИРОВАННЫХ РАЗНЫМИ СПОСОБАМИ НЕЙТРОФИЛОВ ДОНОРОВ

Способы активации нейтрофилов Статисти- ческие показатели Общие полиеновые кислоты (у.е.) Диеновые конъюгаты (у.е.) Диенкетоны и сопряженные триеновые (у.е.) Шиффовые основания (у.е.) Индекс окисления

232/220 278/220

1. Раствор Хенкса М ± ш - - - - - -

2. Супернатанты активированных адгезией нейтрофилов М ± m 12,12 ± 1,5 7,38 ±1,0 2,94 ±0,36 0,81 ± 0,22 0,6 ±0,01 0,23 ±0,02

3. Супернатанты активированных латексом нейтрофилов М ± m 11,53 ±0,42 *14,0 ±0,38 *1,68 ±0,04 *0,16 ±0,03 *1,21 ±0,02 0,16 ±0,02

Примечание: * - показатель достоверности различий значений 3 группы по отношению ко 2 (р < 0,05).

ледующим определением функциональной активности клеток-мишеней. В контрольной группе моноциты донора инкубировали с добавлением 1,0 мл раствора Хенкса при таком же режиме.

Статистическую обработку результатов исследований осуществляли с помощью программы «Statistic for Windows».

Результаты и обсуждение

При изучении биохимических и иммунотропных свойств секреторных продуктов нейтрофилов, полу-

ченных разными способами стимуляции клеток, отмечается повышение процессов переокисления липидов. Вместе с тем, при практически одинаковом моноцитстимулирующем действии супернатантов нейтрофилов содержание диеновых конъюгатов (первичных продуктов ПОЛ) увеличивается в большей степени при активации гранулоцитов латексом, о чем свидетельствует более высокий индекс окисления. В то время как при активации полиморфноядерных лейкоцитов адгезией происходит накопление диенкетонов и сопряженных триеновых (вторичных продуктов ПОЛ). Возможно, это объясняется разной

Табл. 2. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА БИОХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА СУПЕРНАТАНТОВ АКТИВИРОВАННЫХ РАЗНЫМИ СПОСОБАМИ НЕЙТРОФИЛОВ ДОНОРОВ

Способы активации нейтрофилов Статисти- ческие показатели Биохимический состав

общий белок

1. Раствор Хенкса М ± m - 5,25 ±0,56 0,36 ± 0,02 0,39 ± 0,01 -

2. Супернатанты активированных адгезией нейтрофилов М ± m 186,3 ±33,75 3,9 ± 0,29 0,42 ±0,12 0,94 ±0,01* 0,47 ±0,06

3. Супернатанты активированных латексом нейтрофилов М ± m 83,3 ±1,25** 3,38 + 0,12* 0,58 ± 0,03* 0,82 ±0,04* 0,47 ±0,06

Примечание: * - показатель достоверности различий значений 2 и 3 групп по отношению к 1 группе (р < 0,05); ** - показатель достоверности различий значений 3 группы по отношению ко 2 (р < 0,05).

Табл.З. ИММУНОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА СУПЕРНАТАНТОВ АКТИВИРОВАННЫХ РАЗНЫМИ СПОСОБАМИ НЕЙТРОФИЛОВ ДОНОРОВ

Условия культивирования клеток-мишеней Статисти- ческие показатели ИСЛЛ (у.е.) Фагоцитоз Спонтанный НСТ-тест Индуцированный НСТ-тест

активность

1. Контроль (раствор Хенкса) М ± тп = 10 262,5±12,9 53,3 ± 2,6 160,0±16,8 22,3±2,9 0,22±0,03 40,7±3,9 0,4±0,04

2. Супернатанты активированных адгезией нейтрофилов М ± тп = 10 399,3+12,6* 69,7±2,6 288,7±12,9* 40,0±3,9* 0,4±0,05* 67,3±3,9* 0,7±0,04*

% к 1 группе 152% 131% 180% 179% 195% 166% 178%

3. Супернатанты активированных латексом нейтрофилов М ± тп = 10 382,3±22,9 76,8±2,7 270,0+14,3* 40,3±5,6* 0,5±0,Г 65,5±3,5* 0,7±0,03*

% к 1, 2 группам 146%, 96% 144%, 110% 169%, 94% 180%, 101% 214%, 109% 161%, 97% 171%, 96%

Примечание: * - показатель достоверности различий значений 2 и 3 групп по отношению к контролю (р < 0,05).

активностью ферментов антиоксидантной защиты. Для более конкретного вывода требуется проведение дальнейших исследований (табл. 1).

При определении белка микробиуретовой пробой выяснилось, что при стимуляции полиморфноядерных лейкоцитов адгезией более чем в 2 раза больше выделяется белка, что не противоречит литературным данным. Так, по сведениям Н. ТсБогсхубЫ а1 [11], отмечается, что при активации нейтрофилов адгезией выделяются средне- и высокомолекулярные пептиды. При использовании в качестве индуктора секреции частиц латекса образуются низкомолекулярные пептиды [6].

В процессе исследований не удалось установить достоверных различий в содержании глюкозы, кальция, магния и лизоцима в составе медиаторов нейтрофилов, выделенных при активации клеток разными способами (табл. 2). Глюкоза, как основной продукт энергии клетки, в равной степени извлекается из гранулоцитов при стимуляции клеток адгезией и латексом. При этом часть ее, по-видимому, затрачивается на активацию клеток, о чем может свидетельствовать более высокий ее уровень в растворе Хенк-са. Изучение содержания кальция и магния в супернатантах активированных нейтрофилов показало, что стимуляция полиморфноядерных лейкоцитов разными способами оказывает одинаковое влияние на выделение кальция и магния из клетки. При исследовании также выяснилось, что при активации нейтрофилов латексом и адгезией в равной степени из клеток выделяется лизоцим. Секреторная дегрануляция, в результате которой выделился лизоцим, сопровождает не только фагоцитоз, но и адгезию к любой нефагоцитируемой поверхности [4].

При тестировании иммунотропных свойств секреторных продуктов гранулоцитов было отмечено, что супернатанты активированных разными способами нейтрофилов обладают практически одинаковым моноцитстимулирующим действием. Функциональная активность моноцитов донора (лизосо-мальная, фагоцитарная, НСТ-редуцирующая) примерно в равной степени увеличивалась после инкубации клеток-мишеней в присутствии секреторных продуктов, выделенных при активации гранулоцитов частицами латекса и адгезией (табл.З).

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что секреторные продукты полиморфноя-

дерных лейкоцитов, полученные в результате стимуляции клеток частицами латекса и адгезией отличаются по некоторым биохимическим показателям. Однако их моноцитстимулирующее действие выражено в равной степени.

Список литературы

1. Бухарин О.В., Васильев П.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. - Томск: Изд-во Томск. Ун-та, 1974,- 208 с.

2. Волчегорский И.А., Налимов А.Г., Яровинский Б.Г., Лифшиц Р.И. Сопоставление различных подходов к определению продуктов перекисного окисления липидов в гептан-изопропанольных экстрактах крови // Вопросы мед. химии. - 1989. - № 1. -С.127-131.

3. Долгушин И.И., Зурочка A.B., Власов A.B. Способ получения иммуностимулирующих нейтрофи-локинов // А.С. № 1536977. - 1987.

4. Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. - Екатеринбург, 2001. - 277 с.

5. Завьялов В.П. Структурно - функциональная классификация и эволюция цитокинов // Вестн. Рос. АМН. - 1993. - № 2. - С.8-10.

6. Зурочка А.В. Иммунобиологические свойства секреторных продуктов нейтрофилов (нейтрофило-кинов): Дис. ...докт. мед. наук. - Санкт - Петербург,

1991.- 231 с.

7. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. - Москва: Высшая школа, 1980. -271 с.

8. Методические рекомендации М3 России. Изучение кооперации нейтрофилов с клетками иммунной системы в норме и патологии. - Челябинск,

1992,- 19 с.

9. Пальцев М.А., Иванов A.A. Межклеточное взаимодействие. - М.: Медицина, 1995. - 224 с.

10. Balkwill F.R., Burke F. The cytokine network // Immunol. Today. - 1989. - Vol.10. - № 9. - P.299-305.

11. Tchorzwshi H., Sulowska Z., Zeman K. Modulation of immune response in vitro and in vivo by human granulocyte factors // Immunol. Lett. - 1984. -Vol.8. - № 4. - P.187-195.

12. Wong L., Wilson R.D. The identification of Fc and С receptors on human neutrophils //J. Immunol. Meth. - 1975. - Vol.7. - P.69-76.

поступила в редакцию 28.10.2002 принята к печати 29.12.2002