КЛОНИРОВАНИЕ, ЭКСПРЕССИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ КИСЛЫХ ФОСФОЛИПАЗ

1. Последовательность ДНК, которая кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, по существу без липазной активности, характеризующаяся тем, что последовательность ДНК выбирается из:
a) последовательностей ДНК, которые содержат нуклеотидную последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1,
b) последовательностей ДНК, которые содержат кодирующую последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 1,
c) последовательностей ДНК, которые кодируют белковую последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2,
d) последовательностей ДНК, которые кодируются плазмидой pPL3940-Topo2.5 с рестрикционной картой в соответствии с фигурой 7, которая депонирована под номером доступа DSM 22741,
e) последовательностей ДНК, которые гибридизуются при жестких условиях с одной из последовательностей ДНК в соответствии с а), b), с) или d),
f) последовательностей ДНК, которые связаны с последовательностями в соответствии с а), b), с), d) или е) из-за вырожденности генетического кода, и
g) комплементарных нитей к последовательностям в соответствии с от а) до f), где последовательность ДНК предпочтительно происходит из Aspergillus и более предпочтительно из Aspergillus fumigatus.
2. Нуклеотидная последовательность, которая содержит аналог одной из последовательностей по п.1, характеризующаяся тем, что последовательность кодирует полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, по существу без липазной активности, и
a) имеет по крайней мере 82% идентичность с одной из последовательностей в соответствии с а), d), е), f) и g); или
b) имеет по крайней мере 88% идентичность с одной из последовательностей в соответствии с b), с), е), f) и g); или
c) гибридизуется с одной из этих последовательностей при жестких условиях; или
d) является аллельным вариантом одной из этих последовательностей;
e) является комплементарной нитью к последовательностям в соответствии с от а) до d), где последовательность может быть получена замещением, делецией, инсерцией, добавлением или мутацией одной или более нуклеиновой кислоты последовательности ДНК в соответствии с SEQ ID NO: 1.
3. Экспрессионный конструкт, который содержит последовательность по одному из пп.1-2 в функциональном сцеплении с одной или более последовательностью, используемой для направления экспрессии полипептида, обладающего фосфолипазной активностью в подходящей клетке-хозяине, где последовательность, используемая для направления экспрессии полипептида, является предпочтительно промотором, выбранным из промотора глюкоамилазы или промотора α-амилазы рода Aspergillus, промотора целлюлазы (целлобиогидролазы) рода Trichoderma, промотора фермента в гликолитическом метаболическом пути, такого как фосфоглицераткиназа или глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, промотора ксиланазы или промотора энолазы, и который необязательно дополнительно содержит секретирующую лидерную последовательность.
4. Рекомбинантная клетка-хозяин, характеризующаяся тем, что она трансформирована посредством экспрессионного конструкта по п.3.
5. Рекомбинантная клетка-хозяин по п.4, характеризующаяся тем, что она происходит из грибной клетки рода Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor или Penicillium или из дрожжевой клетки рода Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Trichosporon, Schwanniomyces, Hansenula или Pichia.
6. Плазмида pPL3949-Topo2.5 с рестрикционной картой в соответствии с Фигурой 7, которая депонирована под номером доступа DSM 22741.
7. Полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, по существу без липазной активности, выбранный из
а) полипептида, который кодируется кодирующей частью последовательности ДНК по любому из пп.1-2,
b) полипептида, имеющего последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2, или последовательность, происходящую из нее, которая может быть получена замещением, добавлением, делецией одной или более аминокислоты,
c) полипептида, имеющего последовательность, которая имеет по крайней мере 83% идентичности с аминокислотами от 1 до 299 из SEQ ID NO: 2,
d) полипептида, который кодируется нуклеотидной последовательностью, которая гибридизуется при жестких условиях с
(i) нуклеотидами от 55 до 1106 из SEQ ID NO: 1,
(ii) последовательностью кДНК, содержащейся в нуклеотидах от 55 до 1106 из SEQ ID NO: 1,
(iii) частичной последовательностью (i) или (ii), длиной по крайней мере 100 нуклеотидов, или
(iv) комплементарной нити (i), (ii) или (iii),
e) варианта полипептида, имеющего SEQ ID NO: 2, содержащую замещение, делецию и/или инсерцию одной или более аминокислот,
f) аллельных вариантов аминокислотных последовательностей от а) до е).
8. Полипептид, обладающий фосфолипазной активностью, характеризующийся тем, что
- имеет молекулярную массу в интервале от 28 до 30 кДа;
- может гидролизовать по крайней мере одну из двух жирных кислот лецитина
- по существу не прояляет липазной активности;
- имеет устойчивость к высокой температуре;
- может быть выделен из организма рода Aspergillus.
9. Полипептид по п.8, характеризующийся тем, что он может быть выделен из Aspergillus fumigatus.
10. Полипептид по п.9, характеризующийся тем, что он является иммунологически реакционноспособным с антителом, направленным против последовательности SEQ ID NO: 2.
11. Полипептид по любому одному из пп.8-10, характеризующийся тем, что он содержит последовательность в соответствии с SEQ ID NO: 2.
12. Фосфолипазная композиция, характеризующаяся тем, что она содержит полипептид по любому из пп.7-11 вместе с добавками, и тем, что она необязательно дополнительно содержит один или более ферментов для пищи или корма для животных.
13. Применение полипептида по любому из пп.7-11 или фосфолипазной композиции по п.12 для дегуммирования растительного масла, для приготовления теста и/или хлебобулочных изделий, для приготовления молочных продуктов, в качестве добавки к корму для животных или при обработке текстильных сырьевых материалов.
14. Способ получения полипептида, обладающего фосфолипазной активностью по любому из пп.7-11, характеризующийся тем, что клетку-хозяина по любому из пп.4 или 5 выращивают при условиях, которые поддерживают экспрессию полипептида, и затем экстрагируют полипептид.
15. Способ дегуммирования растительного масла, характеризующийся тем, что
a) растительное масло, которое должно быть обработано, необязательно предварительно обрабатывают,
b) водный раствор, содержащий полипептид по любому из пп.7-11 или фосфолипазную композицию по п.12, добавляют к необязательно предварительно обработанному таким образом маслу,
c) реакционную партию в соответствии с b) нагревают от 1 до 12 ч до температуры между 30°С и 70°С и
d) разделяют водную и масляную фазы.