Метод культивации и фенотипическая характеристика гемопоэтических клеток костного мозга (мононуклеарной фракции) от доноров с геном зеленого белка

Биомедицина • № 3, 2013, С. 91-94

МЕТОДЫ БИОМЕДИЦИНСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Метод культивации и фенотипическая характеристика гемопоэтических клеток костного мозга (мононуклеарной фракции) от доноров с геном зеленого белка

О.И. Степанова, Н.В. Касинская, О.В. Баранова, Х.Х. Семенов, А.О. Ревякин

ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская обл. Контактная информация: к.б.н. Степанова Ольга Ивановна, olgsima50@mail.ru

Отработан метод раздельного выделения из костного мозга гемопоэтических стволовых и прогени-торных клеток от здоровых доноров с геном зеленого белка, отработан метод культивирования с фено-типированием их в культуре.

Ключевые слова: клетки костного мозга, гемопоэтическая фракция, ген зеленого белка.

В последние 30 лет в России, также как и во всем мире, стали отчетливо проявляться тревожные тенденции старения населения, неуклонного роста хронических заболеваний и инвалиди-зации людей трудоспособного возраста. Затраты на лечение, реабилитацию и социальную поддержку такого контингента больных ложатся тяжелым бременем на государственный бюджет и поглощают значительную часть средств, ежегодно выделяемых на здравоохранение. Указанные обстоятельства настоятельно требуют совершенствования современной системы здравоохранения, которая в значительной степени может быть достигнута благодаря освоению и внедрению в клиническую практику новых, бо-

лее эффективных и доступных методов восстановительного лечения больных. Приступив к изучению возможности применения стволовых и прогениторных клеток костного мозга в восстановительной медицине, мы убедились в том, что биологические возможности клеточной терапии стволовыми клетками вообще остаются еще мало изученными. В частности, в литературе отсутствуют четкие представления о различиях в технологии культивирования гемопоэтиче-ских и мезенхимальных (стромальных) стволовых клеток костного мозга перед пересадкой, не отработаны воспроизводимые технологические режимы для фи-бробластоподобной дифференцировки стромальной фракции стволовых клеток

костного мозга, а также не изучена эффективность применения и аллогенных, и изогеннаутологичных (в сравнении) пре-дифференцированных стволовых клеток для восстановления структуры и функции соответствующих пораженных органов.

Цель исследования - разработать технологические режимы культивирования и дать фенотипическую характеристику стволовым и прогениторным клеткам костного мозга. Идентифицировать их и использовать для восстановления структуры и функции соответствующих пораженных органов в модельных опытах на животных.

Задача исследования - отработать технологию раздельного выделения из костного мозга гемопоэтических стволовых клеток и фенотипировать их в культуре.

Материалы и методы

Эксперименты на животных проводились по двум основным направлениям: по пути отработки технологии культуральных исследований (выделения клеток, приготовления клеточных культур), а также по пути исследования терапевтических возможностей полученных клеточных культур.

В качестве доноров стволовых и про-гениторных клеток костного мозга мы использовали здоровых доноров: трансгенных мышей линии B10.GFP (п=30) с геном зеленого белка для маркировки введенных клеток в организм реципиента и фенотипически здоровых гетерозиготных мышей db/+ (п=30) для осуществления изогенной трансплантации. Использование изогенных клеток костного мозга (ККМ) от здоровых доноров вместо аутологичных ККМ было связано с тем, что последние у животных

с длительной хронической патологией в организме утрачивают свою биорегуля-торную активность и становятся мало пригодными для клеточной терапии.

Технология проведения культуральных исследований

Все работы по выделению клеток и их культивированию проводились в соответствии с общими принципами культуральных исследований на живых и трупных донорах (срок гибели животных 30-40 мин.). Исследовали жизнеспособность клеток гемоэтической и стромальной фракций ККМ по окраске трипановым синим, а также пролиферативную активность в культуре стромальных ККМ по скорости образования монослоя.

Получение и ведение культур ге-мопоэтических

Забор клеток костного мозга проводили у мышей-доноров под эфирным наркозом. Стерильно иссекали кости предплечья, плеча, голени и бедра вместе с суставами и отделяли их от мыши. Далее кости обрабатывали в 70% спирте, стерильно ножницами отсекали суставы и с помощью шприца (1мл и 2мл), вымывали ККМ раствором Хенкса (без Са+2 и Mg+2) из костномозгового канала. Полученную суспензию клетками центрифугировали вместе с Ficoll-P (удельная плотность 1,077г/см3) для градиентного разделения в течение 5 мин при 1500 об/мин и комнатной температуре ^=(22°С). Затем надоса-дочную фазу удаляли путем отсасывания. Отмытую полученную интерфазу клеток мононуклеарной фракции ресуспен-дировали в питательной ростовой среде Р\ 11,\ I (ПанЭко), содержащей 25мМ HEPES; 0,58 г/л глютамина; 100мкг/л гентамицина; 10% бычьей эмбриональной сыворотки (НуС1опе, ША); 5 мкг/л

Метод культивации и фенотипическая характеристика гемопоэтических клеток костного мозга (мононуклеарной фракции) от доноров с геном зеленого белка

выявляли на проточном цитофлуори-метре FC-500 (ША) с использованием комбинации крысиных моноклональных антител (МАТ) к дифференцировоч-ным и активационным маркерам (CD34-№Ь8158; CD45-Nab3088; фирма АЬсат, США), меченных FITC и фикоэритри-ном (РЕ). Полученный клеточный состав ГПККМ указан в таблице.

Получение первичной смешанной культуры ККМ

Суспензию ККМ получали от животных по описанной выше методике и ресуспендировали в лизирующем растворе эритроциты (114 тМ ЫН4С1; 7,5 тМ КНС03; 100 мкМ EDTA). Полученную взвесь клеток ресуспендировали в растворе Хенкса (без Са+2 и Mg+2) и центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин и комнатной температуре ^=(22°С), затем удаляли надосадочную жидкость путем отсасывания и повторно центрифугировали. Полученный смешанный клеточный

А Б В

Рис. Культура гемопоэтических (мононуклеарных) клеток костного мозга мышей различных линий.

А, Б - 5-ти суточная культура неприкрепившихся гемопоэтических клеток (мононуклеарная фракция) от доноров мышей B10.GFP; А. - Увел. Х200 фазовый контраст; Б. - Увел. Х200; люминесцентная микроскопия; В - 5 суточная культура неприкрепившихся гемопоэтических клеток (мононуклеарная фракция) от доноров гетерозиготных мышей db/+, Увел. Х200 фазовый контраст.

Фенотипическая характеристика материал мы помещали в питательную гемопоэтической фракции стволовых среду (указанную выше) и культивирова-клеток костного мозга ли в течение 5-7 дней.

Отдельные популяции гемопоэтиче- Подготовка клеточного материала

ских стволовых и прогениторных ККМ для трансплантации

инсулина. Клетки культивировали во флаконах при +37°С в СО2-инкубаторе, атмосфере с 5% СО2 и 95% влажности в течение 4-х и 5-ти суток. Через 4-5 суток культура ККМ мышей содержала до 50% свободно плавающих в суспензии с питательной средой, округлых неприкрепив-шихся гемопоэтических клеток на разных сроках дифференцировки (гемопоэтиче-ские клетки, лимфоциты, моноциты) и до 50% прикрепившихся к пластику распластанных фибробластоподобных клеток ММСК КМ (рис.). Неприкрепившиеся к пластику клетки отбирали и затем использовали в опытах на животных для трансплантации как очищенную от стро-мальных (пластикадгезивных) клеток мононуклеарную фракцию гемопоэтиче-ских клеток. Полученная культура МНК, содержащая 2,5% СD34+/СD45+ клеток (табл.) была готова для трансплантации. От одного донора получали, в среднем, 40-60 млн МНК для трансплантации

93

Віоте&сіпе № 3, 2013

Таблица

Состав взвеси ГПККМ после культивирования в течение 5 суток

Соотношение клеточных популяций в концентрате стволовых клеток, % После культивирования

1. Лимфоциты*) 80,2±9,6

2. Моноциты*) 18,7±1,3

3. Гранулоциты*) 1,1±1,4

4. CD34+/CD45+(по данным проточной цитометрии) 2,5±0,3

Примечание: *) - окраска по Романовскому-Гимза.

Подготовка гемопоэтических клеток костного мозга (ККМ). После завершения этапа культивирования (4-5 суток) культуру МНК 2-3 отмывали от среды с сывороткой раствором Хэнкса без Mg2+ и Са2+ путем центрифугирования клеток при 1500 об/мин 5 мин при комнатной температуре (22°С).

Производили подсчет полученных клеток в камере Горяева и подготовленные для трансплантации клетки ре-суспендировали в 500-1000 мкл (при внутрибрюшинном введении) раствора Хенкса при комнатной температуре (22°С).

Выводы

1. Отработанная технология раздельного выделения из костного мозга и культивирования гемопоэтических стволовых клеток является адекватной (подтверждена методами фенотипического исследования), воспроизводимой и пригодной для применения в культуральной исследовательской работе.

2. Процедура культивирования клеток костного мозга является первым этапом клеточной терапии.

Method of cultivation and the phenotype characteristic of marrow hemotopoetic cells (mononuclear fraction) from donors with a of green fluoriscent protein gene

O.I. Stepanova, N.V. Kasinskaya, O.V. Baranova, Kh.Kh. Semenov, A.O. Revyakin

Tested process of separate allocation from the stem hematopoietic and progenitor cells from healthy donors with green fluorscent protein gene. Tested a method of cultivation with their phenotyping in culture.

Key words: stem cells, hematopoietic fraction, green fluorscent protein gene.