ОБНАРУЖЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ НАНОПОРЫ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ-МИШЕНЕЙ ИЗ ФОНА ОБРАЗЦА

1. Способ обнаружения наличия или отсутствия полинуклеотидной последовательности-мишени, предположительно присутствующей в образце, включающий
предоставление набора праймеров, причем по меньшей мере один из указанных праймеров гибридизуется с полинуклеотидом, содержащим указанную полинуклеотидную последовательность-мишень, и причем по меньшей мере один из указанных праймеров модифицирован таким образом, чтобы содержать сайт конъюгации, способный специфически связываться с молекулярным грузом;
осуществление реакции амплификации на указанном образце, причем указанный образец содержит указанный набор праймеров и реагенты для амплификации, так что ампликон, содержащий указанную полинуклеотидную последовательность-мишень, производимую указанной реакцией амплификации, будет содержать указанный сайт конъюгации;
связывание указанного молекулярного груза с указанным сайтом конъюгации;
загрузку указанного образца в устройство, содержащее нанопору, причем указанная нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема, и выполненное с возможностью пропускания нуклеиновой кислоты через одну или более пор, причем устройство содержит датчик для каждой поры, который выполнен с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору; а также
обнаружение наличия или отсутствия указанной полинуклеотидной последовательности-мишени в указанном образце путем определения того, прошел ли связанный с молекулярным грузом полинуклеотид-мишень через нанопору, с использованием данных от указанного датчика.
2. Способ по п. 1, при котором указанный образец загружают в указанное устройство перед указанной амплификацией.
3. Способ по п. 1, при котором указанный образец загружают в указанное устройство после указанной амплификации.
4. Способ по п. 1, при котором указанный молекулярный груз связан с указанным сайтом конъюгации указанного ампликона после указанной амплификации.
5. Способ по п. 1, при котором указанный молекулярный груз связан с указанным сайтом конъюгации указанного праймера перед указанной амплификацией.
6. Способ по любому из пп. 1-5, при котором указанный образец не подвергается стадии очистки между указанной амплификацией и указанным обнаружением в нанопоре.
7. Способ по любому из пп. 1-5, при котором указанный образец загружают в указанное нанопоровое устройство при разведении, составляющем по меньшей мере 1:20000, 1:10000, 1:5000, 1:2000, 1:1000, 1:500, 1:200, 1:100, 1:50, 1:20, 1:10, 1:5, 1:2, 1:1,5,1:1,2,1:1,1 или 1:1,05.
8. Способ по любому из пп. 1-5, при котором указанный образец загружают в указанное нанопоровое устройство без разведения.
9. Способ по любому из пп. 1-5, при котором указанный образец содержит полинуклеотиды-немишени и реагенты реакции амплификации.
10. Способ по любому из пп. 1-5, при котором диаметр указанной нанопоры составляет по меньшей мере 5 нм, 10 нм, 20 нм, 30 нм, 40 нм или 50 нм.
11. Способ по любому из пп. 1-5, при котором указанную реакцию амплификации выбирают из группы, состоящей из: полимеразной цепной реакции (ПЦР), ПЦР с обратной транскрипцией, опосредованной лигированием ПЦР, петлевой амплификации (LAMP), изотермической амплификации, амплификации с замещением цепей (SDA), амплификации с множественным вытеснением цепи, амплификации с замещением цепей, зависимой от геликазы амплификации, амплификации с использованием никующей эндонуклеазы или амплификации с рекомбинантной полимеразой.
12. Способ по любому из пп. 1-5, при котором указанную реакцию амплификации выполняют во внутреннем пространстве устройства.
13. Способ по любому из пп. 1-5, при котором полинуклеотид-мишень содержит двухцепочечную дезоксирибонуклеиновую кислоту (дцДНК), одноцепочечную ДНК (оцДНК), пептидную нуклеиновую кислоту (ПНК), одноцепочечную рибонуклеиновую кислоту (оцРНК), гибрид ДНК/РНК или двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (дцРНК).
14. Способ по любому из пп. 1-5, при котором полинуклеотид-мишень представляет собой природный полинуклеотид.
15. Способ по любому из пп. 1-5, при котором полинуклеотид-мишень представляет собой искусственно синтезированный полинуклеотид.
16. Способ по любому из пп. 1-5, при котором полинуклеотид-мишень представляет собой рекомбинантный полинуклеотид.
17. Способ по любому из пп. 1-5, при котором молекулярный груз выбирают из группы, состоящей из: дендримера, двухцепочечной ДНК, одноцепочечной ДНК, ДНК-аптамера, флуорофора, белка, антитела, полипептида, наногранулы, наностержня, нанотрубки, наночастицы, фуллерена, молекулы ПЭГ, липосомы или гибрида холестерина-ДНК.
18. Способ по любому из пп. 1-5, при котором указанный молекулярный груз содержит электрический заряд.
19. Способ по п. 18, при котором указанный заряженный молекулярный груз выбирают из группы, состоящей из пептида, аминокислоты, заряженной наночастицы, синтетической молекулы, нуклеотида, полинуклеотида, металла или иона.
20. Способ по п. 18, при котором чувствительность или специфичность обнаружения наличия или отсутствия полинуклеотида-мишени увеличивается, когда указанный полинуклеотид-мишень связан с указанным заряженным молекулярным грузом, по сравнению с несвязанным полинуклеотидом-мишенью.
21. Способ по любому из пп. 1-5, при котором чувствительность или специфичность обнаружения наличия или отсутствия полинуклеотида-мишени увеличивается, когда указанный полинуклеотид-мишень связан с указанным молекулярным грузом, по сравнению с несвязанным полинуклеотидом-мишенью.
22. Способ по любому из пп. 1-5, при котором датчик содержит электродную пару, выполненную с возможностью приложения разности напряжений между двумя объемами и для измерения тока через нанопору, разделяющую два объема, производя сигнатуру токового события.
23. Способ по п. 22, при котором сигнатура токового события, производимая, когда полинуклеотид-мишень, связанный с молекулярным грузом, проходит через нанопору, отличается от сигнатуры токового события фоновых молекул средней глубиной, максимальной глубиной, продолжительностью, количеством уровней глубины, площадью глубины и продолжительности или уровнем шума.
24. Способ по любому из пп. 1-5, при котором сайт конъюгации и молекулярный груз связаны через ковалентную связь.
25. Способ по п. 24, при котором указанная ковалентная связь образована клик-химией.
26. Способ по п. 25, при котором клик-химия представляет собой медь-катализируемую.
27. Способ по п. 25, при котором клик-химия не содержит меди.
28. Способ по любому из пп. 1-5, при котором сайт конъюгации и молекулярный груз связаны через нековалентную связь.
29. Способ по п. 28, при котором указанная нековалентная связь представляет собой водородную связь, ионную связь, ван-дер-ваальсово взаимодействие, гидрофобное взаимодействие, полярную связь, катион-пи-взаимодействие, плоскостное стэкинг-взаимодействие или металлическую связь.
30. Способ по любому из пп. 1-5, при котором сайт конъюгации расположен на 3'- или 5'-конце указанного праймера.
31. Способ по любому из пп. 1-5, при котором сайт конъюгации расположен на 3'- или 5'-конце указанного ампликона.
32. Способ по любому из пп. 1-5, при котором сайт конъюгации содержит химическую группу, реакционноспособную группу, небольшую молекулу или пептид.
33. Способ по п. 32, при котором небольшая молекула содержит биотин.
34. Способ по п. 32, при котором реакционноспособная группа содержит дибензоциклооктил (DBCO) или азид.
35. Способ по любому из пп. 1-5, при котором два или более молекулярных груза связаны с указанным ампликоном.
36. Способ по любому из пп. 1-5, при котором указанное устройство содержит по меньшей мере две нанопоры последовательно, и причем указанный ампликон, связанный с указанным молекулярным грузом, одновременно находится в указанных по меньшей мере двух нанопорах во время транслокации.
37. Способ обнаружения наличия или отсутствия полинуклеотидной последовательности-мишени, предположительно присутствующей в образце, включающий:
предоставление набора праймеров, причем по меньшей мере один из указанных праймеров гибридизуется с полинуклеотидом, содержащим указанную полинуклеотидную последовательность-мишень, и причем по меньшей мере один из указанных праймеров связывается с молекулярным грузом;
осуществление реакции амплификации на указанном образце, причем указанный образец содержит указанный набор праймеров и реагенты для амплификации, так что ампликон, содержащий указанную полинуклеотидную последовательность-мишеньпроизводимую указанной реакцией амплификации, будет связан с указанным молекулярным грузом;
загрузку указанного образца в устройство, содержащее нанопору, причем указанная нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема, и выполненное с возможностью пропускания нуклеиновой кислоты через одну или более пор, причем устройство содержит датчик для каждой поры, который выполнен с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору; а также
обнаружение наличия или отсутствия указанной полинуклеотидной последовательности-мишени в указанном образце путем определения того, прошел ли связанный с молекулярным грузом полинуклеотид-мишень через нанопору, с использованием данных от указанного датчика.
38. Способ по п. 37, при котором указанный образец загружают в указанное устройство перед указанной амплификацией.
39. Способ по п. 37, при котором указанный образец загружают в указанное устройство после указанной амплификации.
40. Способ по любому из пп. 37-39, при котором указанный образец не подвергается стадии очистки между указанной амплификацией и указанным обнаружением в нанопоре.
41. Способ по любому из пп. 37-39, при котором указанный образец загружают в указанное нанопоровое устройство при разведении 1:10000, 1:1000, 1:500, 1:200, 1:100, 1:50, 1:20,1:10, 1:5,1:2,1:1,5, 1:1,2, 1:1,1 или 1:1,05.
42. Способ по любому из пп. 37-39, при котором указанный образец загружают в указанное нанопоровое устройство без разведения.
43. Способ по любому из пп. 37-39, при котором указанный образец содержит полинуклеотиды-немишени и реагенты для реакции амплификации.
44. Способ по любому из пп. 37-39, при котором диаметр указанной нанопоры составляет по меньшей мере 5 нм, 10 нм, 20 нм, 30 нм, 40 нм или 50 нм.
45. Способ по любому из пп. 37-39, при котором указанную реакцию амплификации выбирают из группы, состоящей из полимеразной цепной реакции (ПЦР), ПЦР с обратной транскрипцией, опосредованной лигированием ПЦР, петлевой амплификации (LAMP), изотермической амплификации, амплификации с замещением цепей (SDA), амплификации с множественным вытеснением цепи, амплификации с замещением цепей, зависимой от геликазы амплификации, амплификации с использованием никующей эндонуклеазы или амплификации с рекомбинантной полимеразой.
46. Способ по любому из пп. 37-39, при котором указанную реакцию амплификации выполняют во внутреннем пространстве устройства.
47. Способ по любому из пп. 37-39, при котором полинуклеотид-мишень содержит двухцепочечную дезоксирибонуклеиновую кислоту (дцДНК), одноцепочечную ДНК (оцДНК), пептидную нуклеиновую кислоту (ПНК), одноцепочечную рибонуклеиновую кислоту (оцРНК), гибрид ДНК/РНК или двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (дцРНК).
48. Способ по любому из пп. 37-39, при котором полинуклеотид-мишень представляет собой природный полинуклеотид.
49. Способ по любому из пп. 37-39, при котором полинуклеотид-мишень представляет собой искусственно синтезированный полинуклеотид.
50. Способ по любому из пп. 37-39, при котором полинуклеотид-мишень представляет собой рекомбинантный полинуклеотид.
51. Способ по любому из пп. 37-39, при котором молекулярный груз выбирают из группы, состоящей из: дендримера, двухцепочечной ДНК, одноцепочечной ДНК, ДНК-аптамера, флуорофора, белка, антитела, полипептида, наногранулы, наностержня, нанотрубки, наночастицы, фуллерена, молекулы ПЭГ, липосомы или гибрида холестерина-ДНК.
52. Способ по любому из пп. 37-39, при котором указанный молекулярный груз содержит ионный заряд.
53. Способ по п. 52, при котором указанный заряженный молекулярный груз выбирают из группы, состоящей из пептида, аминокислоты, заряженной наночастицы, синтетической молекулы, нуклеотида, полинуклеотида, металла или иона.
54. Способ по п. 52, при котором чувствительность или специфичность обнаружения наличия или отсутствия полинуклеотида-мишени увеличивается, когда указанный полинуклеотид-мишень связан с указанным заряженным молекулярным грузом, по сравнению с несвязанным полинуклеотидом-мишенью.
55. Способ по любому из пп. 37-39, при котором чувствительность или специфичность обнаружения наличия или отсутствия полинуклеотида-мишени увеличивается, когда указанный полинуклеотид-мишень связан с указанным молекулярным грузом, по сравнению с несвязанным полинуклеотидом-мишенью.
56. Способ по любому из пп. 37-39, при котором датчик содержит электродную пару, выполненную с возможностью приложения разности напряжений между двумя объемами и для измерения тока через нанопору, разделяющую два объема, производя сигнатуру токового события.
57. Способ по п. 56, при котором сигнатура токового события, производимая, когда полинуклеотид-мишень, связанный с молекулярным грузом, проходит через нанопору, отличается от сигнатуры токового события фоновых молекул своей средней глубиной, максимальной глубиной, продолжительностью, количеством уровней глубины, площадью глубины и продолжительностью или уровнем шума.
58. Способ по любому из пп. 37-39, при котором праймер и молекулярный груз связаны через ковалентную связь.
59. Способ по любому из пп. 37-39, при котором праймер и молекулярный груз связаны посредством нековалентной связи.
60. Способ по любому из пп. 37-39, при котором молекулярный груз связан с 3'-или 5'-концом указанного праймера.
61. Способ по любому из пп. 37-39, при котором два или более молекулярных груза связаны с указанным праймером.
62. Способ по любому из пп. 37-39, при котором ампликон и молекулярный груз связаны через ковалентную связь.
63. Способ по любому из пп. 37-39, при котором ампликон и молекулярный груз связаны через нековалентную связь.
64. Способ по любому из пп. 37-39, при котором два или более молекулярных груза связаны с указанным ампликоном.
65. Способ по любому из пп. 37-39, при котором указанное устройство содержит по меньшей мере две нанопоры последовательно, и причем указанный ампликон, связанный с указанным молекулярным грузом, одновременно находится в указанных по меньшей мере двух нанопорах во время транслокации.
66. Способ обнаружения наличия или отсутствия полинуклеотидной последовательности-мишени, предположительно присутствующей в образце, включающий:
предоставление набора праймеров, причем по меньшей мере один из указанных праймеров гибридизуется с полинуклеотидом, содержащим указанную полинуклеотидную последовательность-мишень;
осуществление реакции амплификации на указанном образце, причем указанный образец содержит указанный набор праймеров и реагенты для амплификации, так что ампликон, содержащий указанную полинуклеотидную последовательность-мишень, производимую указанной реакцией амплификации, составляет по меньшей мере 100 п.н. в длину;
загрузку указанного образца в устройство, содержащее нанопору, причем указанная нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема, и выполненное с возможностью пропускания нуклеиновой кислоты через одну или более пор, причем устройство содержит датчик для каждой поры, который выполнен с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору; а также
обнаружение наличия или отсутствия указанной полинуклеотидной последовательности-мишени в указанном образце путем определения того, прошел ли связанный с молекулярным грузом полинуклеотид-мишень через нанопору, с использованием данных от указанного датчика, причем указанный амплифицированный образец не был очищен.
67. Способ по п. 66, при котором указанный образец загружают в указанное устройство перед указанной амплификацией.
68. Способ по п. 66, при котором указанный образец загружают в указанное устройство после указанной амплификации.
69. Способ по п. 66, при котором указанный ампликон составляет по меньшей мере 200, 500, 1000, 2000, 5000 или 10000 п. н. в длину.
70. Способ по любому из пп. 66-69, при котором указанный образец не подвергается стадии очистки между указанной амплификацией и указанным обнаружением в нанопоре.
71. Способ по любому из пп. 66-69, при котором указанный образец загружают в указанное нанопоровое устройство при разведении 1:10000, 1:1000, 1:500, 1:200, 1:100, 1:50,1:20, 1:10, 1:5,1:2,1:1,5, 1:1,2, 1:1,1 или 1:1,05.
72. Способ по любому из пп. 66-69, при котором указанный образец загружают в указанное нанопоровое устройство без разведения.
73. Способ по любому из пп. 66-69, при котором указанный образец содержит полинуклеотиды-немишени и реагенты для реакции амплификации.
74. Способ по любому из пп. 66-69, при котором диаметр указанной нанопоры составляет по меньшей мере 2 нм, 3 нм, 5 нм, 10 нм, 20 нм, 30 нм, 40 нм или 50 нм.
75. Способ по любому из пп. 66-69, при котором указанную реакцию амплификации выбирают из группы, состоящей из: полимеразной цепной реакции (ПЦР), ПЦР с обратной транскрипцией, опосредованной лигированием ПЦР, петлевой амплификации (LAMP), изотермической амплификации, амплификации с замещением цепей (SDA), амплификации с множественным вытеснением цепи, амплификации с замещением цепей, зависимой от геликазы амплификации, амплификации с использованием никующей эндонуклеазы, амплификации с рекомбинантной полимеразой, петлевой изотермической амплификации (LAMP), самоподдерживающейся репликации последовательностей, амплификации целого генома или опосредованной лигазой ПЦР.
76. Способ по любому из пп. 66-69, при котором указанную реакцию амплификации выполняют во внутреннем пространстве устройства.
77. Способ по любому из пп. 66-69, при котором полинуклеотид-мишень содержит двухцепочечную дезоксирибонуклеиновую кислоту (дцДНК), одноцепочечную ДНК (оцДНК), гибрид ДНК/РНК, пептидную нуклеиновую кислоту (ПНК), одноцепочечную рибонуклеиновую кислоту (оцРНК) или двухцепочечную рибонуклеиновую кислоту (дцРНК).
78. Способ по любому из пп. 66-69, при котором полинуклеотид-мишень представляет собой природный полинуклеотид.
79. Способ по любому из пп. 66-69, при котором полинуклеотид-мишень представляет собой искусственно синтезированный полинуклеотид.
80. Способ по любому из пп. 66-69, при котором полинуклеотид-мишень представляет собой рекомбинантный полинуклеотид.
81. Способ по любому из пп. 66-69, при котором датчик содержит электродную пару, выполненную с возможностью приложения разности напряжений между двумя объемами и для измерения тока через нанопору, разделяющую два объема, производя сигнатуру токового события.
82. Способ по п. 81, при котором сигнатура токового события, производимая, когда полинуклеотид-мишень проходит через нанопору, отличается от сигнатуры токового события фоновых молекул своей средней глубиной, максимальной глубиной, продолжительностью, количеством уровней глубины, площадью глубины и продолжительностью или уровнем шума.
83. Способ по любому из пп. 66-69, при котором указанное устройство содержит по меньшей мере две нанопоры последовательно, и причем указанный ампликон одновременно находится в указанных по меньшей мере двух нанопорах во время транслокации.
84. Набор, содержащий
устройство, содержащее нанопору, причем указанная нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема, и выполненное с возможностью пропускания нуклеиновой кислоты через одну или более пор, причем устройство содержит датчик для каждой поры, который выполнен с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору;
набор праймеров, причем по меньшей мере один из указанных праймеров гибридизуется с полинуклеотидом, содержащим указанную полинуклеотидную последовательность-мишень, и причем по меньшей мере один из указанных праймеров модифицирован таким образом, чтобы содержать сайт конъюгации, способный специфически связываться с молекулярным грузом;
молекулярный груз для связывания с указанным сайтом конъюгации до, во время или после амплификации;
инструкции по применению для обнаружения наличия или отсутствия указанного полинуклеотида-мишени в образце.
85. Набор, содержащий
устройство, содержащее нанопору, причем указанная нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема, и выполненное с возможностью пропускания нуклеиновой кислоты через одну или более пор, причем устройство содержит датчик для каждой поры, который выполнен с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору;
набор праймеров, причем по меньшей мере один из указанных праймеров гибридизуется с полинуклеотидом, содержащим указанную полинуклеотидную последовательность-мишень, и причем по меньшей мере один из указанных праймеров связывается с молекулярным грузом;
инструкции по применению для обнаружения наличия или отсутствия указанного полинуклеотида-мишени в образце.
86. Набор, содержащий
устройство, содержащее нанопору, причем указанная нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема, и выполненное с возможностью пропускания нуклеиновой кислоты через одну или более пор, причем устройство содержит датчик для каждой поры, который выполнен с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору;
набор праймеров, причем по меньшей мере один из указанных праймеров гибридизуется с полинуклеотидом, содержащим указанную полинуклеотидную последовательность-мишень, где указанные праймеры производят ампликон, содержащий указанную полинуклеотидную последовательность-мишень длиной по меньшей мере 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 или 10000 пар оснований во время реакции амплификации; а также
инструкции по применению для обнаружения наличия или отсутствия указанного полинуклеотида-мишени в образце.
87. Способ определения количества полинуклеотидной последовательности-мишени, присутствующей в образце, включающий
предоставление контрольного образца, содержащего известное количество контрольного полинуклеотида, и экспериментального образца, содержащего неизвестное количество полинуклеотида-мишени;
амплификацию указанного контрольного образца для получения первого ампликона, содержащего указанный контрольный полинуклеотид, и амплификацию указанного экспериментального образца для получения второго ампликона, содержащего указанный полинуклеотид мишень;
загрузку указанного контрольного образца и указанного экспериментального образца отдельно в устройство, содержащее нанопору, причем указанная нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема, и выполненное с возможностью пропускания первого или второго ампликона через одну или более пор, причем устройство содержит датчик для каждой поры, который выполнен с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору; а также
сравнение частоты захвата указанного первого ампликона в нанопоре с частотой захвата второго ампликона в нанопоре для определения количества полинуклеотидной последовательности-мишени в указанном экспериментальном образце.
88. Способ по п. 87, при котором указанная амплификация выполняется после загрузки указанного контрольного образца или экспериментального образца в указанное устройство.
89. Способ по п. 87, при котором указанный контрольный образец и указанный экспериментальный образец амплифицируют в идентичных условиях.
90. Способ по п. 87, при котором указанный контрольный полинуклеотид и указанный полинуклеотид-мишень характеризуются одинаковой длиной или последовательностью.
91. Способ по п. 87, при котором частота захвата первого и второго ампликона определяется с использованием одной и той же нанопоры в одних и тех же условиях.
92. Способ по п. 87, при котором частота захвата первого и второго ампликона определяется с использованием нанопор аналогичного размера.
93. Способ по п. 87, при котором оценка концентрации полинуклеотида-мишени в экспериментальной образце производится математически путем объединения набора измерений датчиков, записанных с течением времени для указанного контрольного образца и указанного экспериментального образца, и сравнения двух наборов данных для преобразования частоты захвата в концентрацию.
94. Способ по п. 87, при котором после каждого цикла в реакции амплификации оценка концентрации полинуклеотида-мишени производится математически путем объединения набора измерений датчиков, записанных с течением времени для указанного контрольного образца и указанного экспериментального образца, и сравнения двух наборов данных для преобразования частоты захвата в концентрацию.
95. Способ по п. 94, дополнительно включающий определение количества полинуклеотида-мишени в указанном экспериментальном образце перед амплификацией из указанного сравнения измерений датчиков.
96. Способ определения количества полинуклеотидной последовательности-мишени, присутствующей в образце, включающий
предоставление контрольного образца, содержащего известное количество контрольного полинуклеотида, и экспериментального образца, содержащего неизвестное количество полинуклеотида-мишени;
разбавление указанного контрольного образца с образованием по меньшей мере двух различных известных концентраций указанного контрольного полинуклеотида;
загрузку указанного контрольного образца в устройство, содержащее нанопору в указанных по меньшей мере двух различных известных концентрациях указанного контрольного полинуклеотида, причем указанная нанопора разделяет внутреннее пространство устройства на два объема, и выполненное с возможностью пропускания контрольного полинуклеотида через одну или более пор, причем устройство содержит датчик для каждой поры, который выполнен с возможностью идентификации объектов, проходящих через нанопору;
обнаружение частоты захвата в указанной нанопоре контрольного полинуклеотида в каждой из указанных по меньшей мере двух известных концентрациях;
амплификацию указанного экспериментального образца с получением ампликона, содержащего указанный полинуклеотид-мишень; а также
загрузку экспериментального образца в указанное устройство, содержащее нанопору;
определение частоты захвата полинуклеотида-мишени в указанной нанопоре;
сравнение частоты захвата указанного первого ампликона в нанопоре с частотой захвата указанного второго ампликона в нанопоре для определения количества полинуклеотидной последовательности-мишени в указанном экспериментальном образце.
97. Способ по п. 96, при котором указанное разведение представляет собой серийное разведение.
98. Способ по п. 96, дополнительно включающий амплификацию указанного контрольного полинуклеотида.
99. Способ по п. 96, при котором указанное разведение проводят после загрузки указанного контрольного образца в указанное устройство.
100. Способ по п. 96, при котором указанную амплификацию проводят после загрузки указанного экспериментального образца в указанное устройство.