Реконструкция филогении рода Rhododendron L. (Ericaceae) флоры России на основе последовательностей спейсеров its1-its2

УДК 575.86

М.Г. Куцев1 M.G. Kutsev

А.В. Каракулов2 A.V. Karakulov

реконструкция филоГЕнии РодА RHODODENDRON L.

ФЛОРЫ РОССии НА ОСНОВЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ СПЕЙСЕРОВ ITS1-ITS2

RECONSTRUCTION OF PHYLOGENY OF THE GENUS RHODODENDRON L. (ERICACEAE) FROM RUSSIA BASED ON ITS1-ITS2 SEQUENCES

Аннотация. Построение естественной классификационной схемы таксона является одной из задач систематики растений, при этом должны быть учтены эволюционные пути развития. Для анализа микроизменений вида наиболее подходят данные о нуклеотидном составе ДНК. Нами исследован участок ITS1-ITS2 (internal transcribed spacer 1, gene 5.8S ribosomal RNA, internal transcribed spacer 2) ядерной ДНК представителей рода Rhododendron L., произрастающих на территории России. На основе данных нуклеотидных последовательностей и статистического анализа подтверждена оправданность одной из альтернативных классификационных схем.

Ключевые слова: Rhododendron, internal transcribed spacer, филогения, Россия.

Summary. One of the tasks of systematics is the construction of a natural classification pattern of a taxon, moreover, evolutionary ways of development should be taken into account. Data on DNA nucleotide composition are best suited for analyzing microchanges of the species. ITS1-ITS2 (internal transcribed spacer 1, gene 5.8S ribosomal RNA, internal transcribed spacer 2) fragment of nuclear DNA of Rhododendron L. representatives growing in Russia was studied.

Noteworthy is a clear-cut distinction of the species of the subgenus Therorodion: Rh. redowskianum and Rh. kamtschaticum, which were considered by some researchers to be the same species - Rh. redowskianum as a highmountain ecological form of Rh. kamtschaticum.

Phylogeny of Russian Rhododendron species reconstructed on the basis of ITS1-ITS2 sequences corresponds to anatomical-morphological classification of D. Chamberlain (1996) with modification.

Key words: Rhododendron, internal transcribed spacer, phylogeny, Russia.

Введение работки детальной классификационной схемы

Виды рода Rhododendron L. являются ши- рода с применением как классических анатомо-

роко используемыми декоративными и лекарст- морфологических методов, так и молекулярновенными растениями. Однако, в настоящий мо- генетического анализа.

мент отсутствует единая общепринятая клас- Материалы и методы

сификационная схема таксона, что объясняется Материалы для молекулярно-генетичес-

объемом рода (более 800 видов) и наличием у кого анализа были взяты с живых растений, куль-

его представителей большого количества кон- тивируемых в Центральном сибирском ботани-

вергентных морфологических признаков, ослож- ческом саду СО РАН, привезенных из мест есте-

няющих построение естественных систем. Про- ственного распространения видов. Выделение

веденные ранее исследования (Gao et al., 2002; тотальной ДНК производили из высушенных в

Lanying et al., 2008) показали возможность ис- силикагеле листьев с помощью набора Diamond

пользования результатов RAPD-анализа и сек- DNA (ABT Llc., Россия) по протоколу фирмы-

венирования ITS-участка при выявлении фило- изготовителя. Амплификация ITS1-ITS2 региона

генетических связей на видовом и надвидовом проведена по методике Н. Фризена (2007) с мо-

уровнях, при этом полученные данные хорошо дификациями с использованием прямого праймера

коррелировали с существующей таксономией 5’-AAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’, обратного -

рода. В связи с этим имеется необходимость раз- 5’-TATGCTTAAACTCAGCGGG-3’ (Desfeux and

1 Алтайский государственный университет, пр-т Ленина, 61; 656049, Барнаул, Россия; e-mail: m_kucev@mail.ru

2 Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, ул. Золотодолинская, 101; 630090, Новосибирск, Россия; e-mail: krk007@rambler.ru

1 Altai State University; Lenina st., 61, 656049, Barnaul, Russia

2 Central Siberian Botanical Garden, Siberian Branch of Russian Academy of Sciences; Zolotodolinskaya st., 101, 630090, Novosibirsk, Russia

Поступило в редакцию 10.08.2010 г.

Submitted 10.08.2010

Lejeune, 1996). Для реакции амплификации использована ПЦР-смесь следующего состава: 31,5 мкл Н2О; 2 мкл ДНК; 5 мкл 10Х буфера; 5 мкл 25 мМ MgCl2; по 2 мкл 10 мМ каждого праймера; 2 мкл 20 мМ dNTPs (по 5 мМ каждого). Taq-полимеразу в объеме 0,2 мкл (5 ед./мкл) вносили после первого цикла прогрева непосредственно в ПЦР-смесь (так называемый «горячий старт»), что позволило повысить выход продукта амплификации, избавиться от неспецифичного отжига праймеров и образования димеров праймеров (ПЦР “в реальном времени”, 2009).

Амплификация проводилась по следующей программе: 1 цикл: 95°С - 120 сек; 35 циклов: 95°С - 20 сек, 56 °С - 30 сек, 72 °С - 80 сек; завершающая стадия: 72 °С - 10 мин, охлаждение при 4°С.

Очистку амлификата перед секвенирова-нием проводили с побощью набора NucleoSpin Extract II Kit (Macherey-Nagel) по протоколу фирмы-изготовителя.

Секвенирование проведено на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3130xl. Впервые данный участок расшифрован для Calluna vulgaris L., Rh. adamsii Rehd., Rh. dauricum L., Rh. caucasicum Pall., Rh. fauriei Franch., Rh. japonicum (A. Gray) Su-

ring., Rh. ledebourii Pojark., Rh. parvifolium Adams, Rh. sichotense Pojark., Rh. smirnowii Trautv. Остальные использованные в анализе последовательности взяты из GenBank NCBI (таблица 1).

Результаты и обсуждение

Для изученных нами представителей выявлена невысокая степень вариабельности участка ITS1-ITS2. Проведен кластерный анализ нуклеотидных последовательностей с помощью метода ME (minimum évolution) в программе MEGA 4.1 (Kumar et al., 2008) и построено дерево бутстреп-консенсуса. Выравнивание нуклеотидных последовательностей проведено комбинированным способом - автоматическое с помощью ClustalW с дополнительной корректировкой «вручную». Общая длина выравнивания составила 638 пар нуклеотидов. Бутстреп-тест проведен в 10000 репликаций. В качестве out-group взята Calluna vulgaris L. - вид, показавший наибольшее родство к видам рода Rhododendron L. на основе анализа нуклеотидных последовательностей с помощью BLAST NCBI. На основе данного анализа получена реконструкция филогении ITS1-ITS2 региона, отображающая эволюционные связи между видами рода Rhododendron (рис. 1). Следует отметить, что кладограммы, построенные с

Рис. 1. МЕ-кладограмма представителей рода Rhododendron L. на основе последовательностей ITS1-5.8S-ITS2.

Таблица 1

Проанализированные последовательности ITS1-ITS2

Название вида Номер последовательности в GenBank Дата опубликования последовательности в GenBank Авторы

Calluna vulgaris L. HM854157 01-0CT-2010 Kutsev M.G., Karakulov A.V., Uvarova O.V

Rh. adamsii Rehd. HM854164 01-0CT-2010 Kutsev M.G., Karakulov A.V., Uvarova O.V

Rh. adamsii Rehd. (from Touva) HM854162 01-0CT-2010 Kutsev M.G., Karakulov A.V., Uvarova O.V

Rh. aureum Georgi AF393409 31-0CT-2002 Gao L.M., Li D.L., Yang J.B.

Rh. camtschaticum Pall. X97426 07-MAY-1996 Aert R., Hyam R., Chamberlain D., Karp A., Volckaert G.

Rh. caucasicum Pall. HM854165 01-0CT-2010 Kutsev M.G., Karakulov A.V., Uvarova O.V

Rh. dauricum L. HM854158 01-0CT-2010 Kutsev M.G., Karakulov A.V., Uvarova O.V

Rh. fauriei Franch. HM854166 01-0CT-2010 Kutsev M.G., Karakulov A.V., Uvarova O.V.

Rh. japonicum (A. Gray) Suring. HM854167 01-0CT-2010 Kutsev M.G., Karakulov A.V., Uvarova O.V.

Rh. ledebourii Pojark. HM854159 01-0CT-2010 Kutsev M.G., Karakulov A.V., Uvarova O.V.

Rh. luteum Sweet X96814 21-JUL-1998 Scheiber S.M., Jarret R.L., Robacker C.D.

Rh. mucronulatum Turcz. AF393412 31-0CT-2002 Gao L.M., Li D.L., Yang J.B.

Rh. palustre var. palustre (Rh. tomentosum (Stokes) Harmaja) AF393413 31-0CT-2002 Gao L.M., Li D.L., Yang J.B.

Rh. parvifolium Adams HM854160 01-0CT-2010 Kutsev M.G., Karakulov A.V., Uvarova O.V.

Rh. ponticum L. X97415 07-MAY-1996 Aert R., Hyam R., Chamberlain D., Karp A., Volckaert G.

Rh. redowskianum Maxim. AF393418 31-0CT-2002 Gao L.M., Li D.L., Yang J.B.

Rh. schlippenbachii Maxim. AF404816 31-0CT-2002 Gao L., Li D., Yang J., Zhang C.

Rh. sichotense Pojark. HM854163 01-0CT-2010 Kutsev M.G., Karakulov A.V., Uvarova O.V.

Rh. smirnowii Trautv. HM854161 01-0CT-2010 Kutsev M.G., Karakulov A.V., Uvarova O.V.

Rh. tschonoskii Maxim. X96806 11-APR-1996 Aert R., Hyam R., Chamberlain D., Karp A., Volckaert G.

помощью метода MP (maximum parsimony) имели сходную топологию и бутстреп-поддержку клад.

Виды рододендронов распределились на филогенетическом древе в соответствии с ана-томо-морфологической классификацией, принятой в Западной Европе (Chamberlain, 1996).

Rh. adamsii и Rh. parvifolium обнаруживают тесную степень родства и выделение их в разные секции - соответственно, Pogonanthum и Rhododendron - сомнительно.

В подсекции Rhodorastrum (Maxim.) Cullen секции Rhododendron подрода Rhododendron, согласно классификации Д. Чемберлена, наблюдается низкая степень дифференциации видов Rh. mucronulatum, Rh. dauricum, Rh. ledebourii и Rh. sichotense, что указывает на недавнее обособление этих видов (рис. 1а). Кроме того, в данной кладе наблюдаются низкие уровни поддержки, что не дает возможности установить истинные филогенетические связи.

Нельзя достоверно определить положение Rh. schlippenbachii Maxim. и Rh. tschonoskii Maxim. в филогенетической схеме, т. к. образуемая данными видами клада имеет низкий уровень будстреп-поддержки. В отношении этих двух видов стоит придерживаться мнения М.С. Александровой (1972), выделяющей их в самостоятельные таксоны подродового ранга.

Следует отметить четкое разделение ви-

дов из подрода Therorhodion: Rh. redowskianum и Rh. camtschaticum, которые ранее часть исследователей считали одним видом, полагая Rh. redowskianum высокогорной экологической формой Rh. camtschaticum (Александрова, 1975).

Наконец, ставится под сомнение самостоятельность рода Ledum L.: Rh. tomentosum (Stokes) Harmaja (= Ledum palustre L.) расположен в самом центре дендрограммы рода Rhododendron, следовательно он является представителем этого рода, что уже отмечено в классификации Дэвида Чемберлена (Chamberlain, 1996).

Заключение

Таким образом, реконструированная на основе ITS1-ITS2-последовательности филогения видов рода Rhododendron L. соответствует анатомо-морфологической классификации D. Chamberlain (1996) с небольшими дополнениями. Реконструкция филогении на основе последовательностей ITS1-ITS2 возможна лишь в отношении хорошо обособленных видов рода Rhododendron L. Для выявления обособленности видов в Sect. Rhododendron необходимо проведение популяционно-генетических исследований на основе методов, позволяющих провести скрининг всего генома (ISSR, RAPD или AFLP).

Работа выполнена в рамках Государственного контракта П483 от 13 мая 2010 г. Федеральной целевой программы «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России».

ЛИТЕРАТУРА

Александрова М.С. Рододендроны природной флоры СССР. - М., 1975. - 112 с.

Коропачинский И.Ю., Встовская Т.Н. Древесные растения Азиатской России. - Новосибирск, 2002. -

707 с.

Малышев Л.И. О новых и редких видах с Восточного Саяна // Ботанические материалы Гербария Ботанического ин-та АН СССР. - М.-Л., 1961. - № 21. - С. 451-467.

ПЦР “в реальном времени”/ под ред. д. б. н. Д.В. Ребрикова. - М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. -

215 с.

Фризен Н. Молекулярные методы, используемые в систематике растений. - Барнаул: АзБука, 2007. - 64 с. Chamberlain D. The genus Rhododendron, its classification and synonymy. - Edinburgh, 1996. - 181 p. Clemet M., Posada D., Crandall K.A. TCS: a computer program to estimate gene genealogies // Molecular Ecology, 2000. - V. 9, № 10. - Р 1657-1660.

Desfeux C., Lejeune B. Systematics of Euromediterranean Silene (Caryophyllaceae): evidence from a phylogenetic analysis using ITS sequences // Comptes Rendus de l’Academie des Sciences de Paris, 1996. - Vol. 319, № 4. - P. 351-358.

Gao L. M., Li D.Z., Zhang C.Q., Yang J.B. Infrageneric and sectional relationships in the genus Rhododendron (Ericaceae) inferred from ITS sequence data // Acta bot. sin., 2002. - Vol. 44. - 11. - P. 1351-1356.

Kumar S., Dudley J., Nei M., Tamura K. MEGA: A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences // Briefings in Bioinformatics, 2008. - Vol. 9. - P. 299-306.

Lanying Z., Yongqing W., Li Z. Genetic diversity and relationship of Rhododendron species based on RAPD analysis // American-Eurasian J. Agric. & Environ. Sci., 2008. - Vol. 3, № 4. - P. 626-631.